hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
膵内・外分泌細胞の再生機構：インクレチン受容体陽性細胞の膵再生における役割の解明

本研究では、GLP1受容体ノックインマウスを作成し、ヒト多能性幹細胞からのβ細胞分化誘導法を開発することを目的とした。遺伝子組換えベクターをマウスES細胞に導入し、遺伝子組換えマウスを樹立した。内分泌細胞の蛍光観察を行ったところ、いずれのマウスからも導入した蛍光発色が認められなかった。ヒトES細胞に、リポフェクション法で転写因子を導入し培養した。分化誘導二週間後には、インスリンなどの膵内分泌ホルモンの発現が確認された。ヒトES細胞から、膵内分泌細胞への細胞分化誘導技術が確立された。平成27年度の計画:Glp1受容体(Glp1-r)ノックイン(KI)マウスを作成と、細胞系譜追跡実験平成27年度は、Glp-1受容体のノックインマウスを作成し、Glp-1受容体を発現する細胞の蛍光標識と、Cre-ERT2システムとRosa26-Brainbowマウス、Rosa26-LacZマウスを用いることで、Glp-1受容体発現細胞の細胞系譜追跡実験を予定した。そこで、(1)Glp-1受容体遺伝子のノックインマウスを作成するためのノックインベクターの作成、(2)作成したノックインベクターを用いたマウスES細胞の組換え体の取得、(3)組換えマウスES細胞のマウス胚盤胞へのインジェクションと組換えマウスの作出、(4)キメラマウスを交配し、マウスGlp-1受容体ノックインマウスの作出を行った。作成したノックインマウスを用いて、組織での蛍光タンパクVenusの発現及び、Cre-ERT2遺伝子の発現をチェックしたところ、残念ながら組織でのVenusタンパクの発現は認められず、cre-ERT2遺伝子の発現は非常に弱くしか確認できなかった。我々のノックインマウス作成用ベクターは蛍光タンパクとcre-ERT2遺伝子をタンデムに繋いだコンストラクトであったため、2つのタンパクの発現量が非常に少なくなったと考えられた。そこで、平成27年度途中より、再度Venus及びcre-ERT2遺伝子を別々にGlp-1受容体遺伝子にノックインするためのコンストラクトを作成し、現在マウスES細胞に遺伝子導入することで、組換えES細胞を取得する準備を行っている。マウスGlp-1受容体ノックインマウスについては、当初予定通り作出が進行し、平成27年度途中にノックインマウスを得ることができた。しかしながら、当初Glp-1受容体の蛍光標識とcre-ERT2を用いた細胞系譜追跡実験の2つを同時に行えるようにベクターを設計していたが、このベクター設計では、Glp-1受容体遺伝子では両遺伝子の発現が予想より少なく、解析が困難であることがわかった。そこで、平成27年度途中より、再度ベクターを再設計し、ベクターのコンストラクションから開始した。現在、ふたつ目のベクターの作成は終了し、マウスES細胞への遺伝子導入も終了しており、順調に組換え体をえる準備が進んでいる。これまで、ヒトの膵内・外分泌細胞は、自己組織修復・再生能力が無いために炎症等で障害されると組織修復が不可能で、組織障害は進行することこそあれ、二度と改善しないと考えられてきた。私達は自己免疫性膵炎(AIP)の治療前後の膵機能を経時的に観察することで、成人(老人)の膵ですら消化機能として消化酵素分泌量が著明に回復し、更に組織再生することを発見し、ヒト成人膵での自己再生能力の存在を明らかにした。我々は、これまでの研究成果からGLP1受容体陽性細胞が、少なくとも膵内分泌細胞の前駆細胞である可能性を考え、マウスの膵でGLP1受容体とホルモンの局在を詳細に検討したところ、GLP1受容体発現細胞は強陽性細胞と弱陽性細胞があり、弱陽性細胞はβ細胞であるが、強陽性細胞は、非α,非β細胞であること、また他の前駆細胞マーカー染色との共染色により、GLP1受容体強陽性細胞は膵前駆細胞である可能性を見出した。平成28年度は、平成27年度に引き続きGlp1受容体ノックインマウスの作成を行った。ノックインマウスの作成は、当初予定では平成27年度に終了する予定であったが、平成27年度に作成したノックインマウスは、膵臓にレポーターたん白の発現を確認できなかったため、平成28年度に新たな遺伝子組み換えマウス作成用ベクターを構築し、組み換えES細胞を作成後、研究分担者熊本大学竹田グループにES細胞を送付し、マウスを作出した。Glp1-r KIは、Exon1のATGサイトの直後に蛍光タンパクmCherryを発現するユニットを組み込んだ。KIマウスの作出のためのベクター作製は、システム医学講座で行った。ノックインマウスは、慶應義塾大学医学部システム医学講座の動物飼育施設に移設し、飼育及び交配中である。現在、その発現解析を継続中である。平成27年度にGlp1受容体ノックインマウスの作成を予定していたが、最初に作成したノックインマウスの蛍光タンパク質の発現等が認められず、平成28年度に再度ノックインマウスを作成した。現在作成したノックインマウスを飼育し、研究を継続していることから、平成29年度にはこれらのマウスを用いた研究成果が期待される。我々はこれまで、ヒトの成人膵にも自己組織再生能力があり、炎症などによる大規模な組織障害から自己再生し、組織修復が起こることを解明した。現在、膵外分泌細胞だけでなく内分泌細胞においても、複数の幹/前駆細胞候補は報告されているものの、膵の組織再生機構は未だ不明な点が多い。

インクレチンGLP1受容体は、膵ではβ細胞に発現していると考えられてきたが、我々の検討ではnon-α、non-β細胞に存在し、GLP1-R強発現細胞は成体膵の前駆細胞である可能性が疑われた。そこで本研究では、GLP1受容体ノックインマウスを作成し、細胞系譜追跡実験や単離GLP1受容体陽性細胞の遺伝子発現パターン解析、in vitro分化誘導実験を行うことで、未だ仮説に過ぎない成体膵における組織幹細胞の実態を明らかにするとともに、今だヒトでは確立されていない多能性幹細胞からのβ細胞分化誘導法を開発し、将来の再生医療や自己組織幹細胞を用いた膵疾患治療法の確立に繋げることを目的とした。GLP1受容体ノックインマウスは、H27年、h28年に作出を行った。ノックインマウス作出用ベクターコンストラクト作成と組換えES細胞のスクリーニングにより、複数の組換えES細胞を取得した。この組換えES細胞を用いてキメラマウス個体を作出した。これらのキメラマウスからノックインマウス系統を交配により樹立した。これらのマウスでは、GLP1受容体遺伝子の片アレルに緑色蛍光タンパクを発現させたが、これらのマウス個体では、GLP1受容体の特異的蛍光発現は認められず、ノックインマウスでのマーカー遺伝子発現が最適でないことが考えられた。また、ヒト多能性幹細胞からの内分泌細胞分化誘導法については、ヒトベータ細胞への分化誘導に重要な転写因子を二つヒトES細胞に導入することで、分化誘導2週間という非常な短期間でヒトベータ細胞を分化誘導する技術が完成した。本研究では、GLP1受容体ノックインマウスを作成し、ヒト多能性幹細胞からのβ細胞分化誘導法を開発することを目的とした。遺伝子組換えベクターをマウスES細胞に導入し、遺伝子組換えマウスを樹立した。内分泌細胞の蛍光観察を行ったところ、いずれのマウスからも導入した蛍光発色が認められなかった。ヒトES細胞に、リポフェクション法で転写因子を導入し培養した。分化誘導二週間後には、インスリンなどの膵内分泌ホルモンの発現が確認された。ヒトES細胞から、膵内分泌細胞への細胞分化誘導技術が確立された。現在、作成中のマウスES細胞組換え体は、スクリーニングで組換え体が得られ次第、マウス胚盤胞にインジェクションし、遺伝子組換え体を得る予定である。また、ノックインマウスが得られ次第、解析を行う。平成29年度は、平成28年度までに作成したノックインマウスを使用して、研究を進める。29年度が最終年度であるため、記入しない。膵再生医学29年度が最終年度であるため、記入しない。
細胞周期分子Cdk4/6を利用した新規骨疾患治療法の開発

本研究は細胞周期関連分子(Cdk4/6)を利用した新たな骨粗鬆症・遺伝性骨疾患治療薬の開発を目指して計画された。まず、invitroにおいてCdk4あるいはCdk6を抑制するだけでなく、骨芽細胞分化能を促進するCdk活性阻害物質を同定した。さらに、その作用機序を解明するために、下流で働く因子を網羅的手法によって検索し、下流因子としてZincフィンガータンパクやGタンパク共有受容体等の存在を見出した。また、それらについて実際の細胞内遺伝子発現レベルの確認と細胞内機能解析を行った。invivoにおいては、ある遺伝子のヘテロ欠損マウスが呈する骨系統疾患の表現形が、細胞周期制御によって部分的にレスキューされることを明らかとした。すなわち、本研究によって、細胞周期制御を介して骨分化能がコントロール可能であること、また、骨系統疾患の治療が可能であることが示唆された。本研究では細胞周期関連分子(Cdk4/6)を利用した新たな概念に基づく骨粗霧症・遺伝性骨疾患治療薬の開発に向けた基礎的検討を行うことを目的として、細胞周期関連分子(Cdk4/6)の発現・機能を変化させることで、骨粗霧症・遺伝性骨疾患の改善が可能であるかを検討する。今年度は、まず基礎検討として、骨分化を向上させる可能性を持つと想定されるCdk活性阻害物質を骨芽細胞培養液に添加し骨芽細胞分化の変動を検討することで、in vitroにおけるCdk活性阻害物質の骨分化に対する影響を解析した。最初に想定した全ての候補物質のスクリーニングは終了していないが、数種類の安全なCdk活性阻害物質が骨芽細胞分化を促進することが確認出来ている。同時に、その作用メカニズムの解明を目指して、細胞周期関連分子(Cdk4/6)と転写因子(Runx2やNanogなど)の骨分化における関連性や骨分化・骨折修復とサイトカインの関連を分子細胞生物学的に考察している。また、本研究で使用する主な遺伝子操作マウスの飼育・ダブルノックアウトマウスの作製を開始した。現在のところ、解析に十分な数のマウスを得るため数を増やしている途中のため特に報告すべき知見は得られていないが、条件が整った時点で、各種マウスが呈する骨系統疾患表現形がレスキューされるかを検討する。その際の解析項目としては、全身のX線撮影により、鎖骨の形成、頭蓋骨縫合の骨化、全身骨格の骨化の程度などを比較検討するとともに、マイクロCTによる3次元レベルでの微細形態学的検討も予定している。(659字)本研究は細胞周期関連分子(Cdk4/6)を利用した新たな概念に基づく骨粗鬆症・遺伝性骨疾患治療薬の開発に向けた基礎的検討を行うことを目的として計画されたものである。具体的には、細胞周期関連分子(Cdk4/6)の発現・機能を変化させることで、骨粗鬆症・遺伝性骨疾患の改善が可能であるかを検討している。昨年度の解析では、Cdk活性阻害物質が骨芽細胞分化に及ぼす影響を解析して、in vitroにおいてCdk4あるいはCdk6を抑制するだけでなく、同時に骨芽細胞分化能を促進するCdk活性阻害物質を同定することが出来た。しかしながら、その作用機序は不明であったため、今年度はそのメカニズムに関する理解を深める目的で「さらに下流で働く因子」を網羅的手法によって検索した。その結果、細胞周期制御と骨分化の両方に関わる候補因子として複数のZincフィンガータンパクやGタンパク共有受容体等の存在を見出した。現在、これらの因子に関してシグナルの解析を進めている。また、in vivoにおいては、本研究で使用する主な遺伝子操作マウスの飼育・ダブルノックアウトマウスの作製を継続して行い、順次解析も進めている。解析項目として、全身のX線撮影を行って、鎖骨の形成、頭蓋骨縫合の骨化、全身骨格の骨化の程度などを比較検討しているが、現在のところ、in vitroだけでなくin vivoにおいても、細胞周期制御を介して骨量をコントロールすることが可能であることを示唆する結果を得ている。今後、各種マウスが呈する骨系統疾患表現形が細胞周期制御によってレスキューされるかを検証する予定である。(678字)本研究は細胞周期関連分子(Cdk4/6)を利用した、新たな概念に基づく骨粗鬆症・遺伝性骨疾患治療薬の開発に向けた基礎的検討を行うことを目的として計画されたものである。具体的には、細胞周期関連分子(Cdk4/6)の発現・機能を変化させることで、骨粗鬆症・遺伝性骨疾患の改善が可能であるかを検討した。

昨年度の解析では、初年度に発見したCdk6あるいはCdk4を抑制すると同時に骨芽細胞分化能を促進するCdk活性阻害物質の作用機序を明らかとする目的で、「さらに下流で働く因子」を網羅的手法によって検索し、細胞周期制御と骨分化の両方に関わる候補因子として複数のZincフィンガータンパクやGタンパク共有受容体等の存在を見出した。本年度は、これらの因子に関して実際の細胞内遺伝子発現を確認するために、まずリアルタイムPCRを行った。実際に細胞内で、その遺伝子発現が変化することが確認された分子については、遺伝子抑制により、細胞内機能解析へと進んだ。また、in vivoにおいては、遺伝子操作マウスの飼育ならびにダブルノックアウトマウスの作製を継続し、順次解析を進めた。その中でも、ある因子のヘテロ欠損マウスが呈する骨系統疾患の表現形が、Cdk6とのダブルノックアウトマウスを作成することで部分的にレスキューされることが判明した。すなわち、本研究によって、in vitroだけでなくin vivoにおいても、細胞周期制御を介して骨分化能がコントロール可能であること、また、骨系統疾患の治療が可能であることが示唆された。Cdk活性阻害物質が骨芽細胞分化能を制御することを見出し、その作用機序の解析を進めているとともにダブルノックアウトマウスに関しての知見が得られつつある点において当初の目標を達成出来ていると考える。24年度が最終年度であるため、記入しない。引き続きダブルノックアウトマウスの解析を継続することで当初の目標を達成出来るものと考えている。問題点を挙げるならば、同胞内での比較が必須であるため、統計解析に十分な数のマウスを順調に得られるかに関して多少不透明な部分が残る。
鱗翅目幼虫中腸における栄養・解毒の複合系代謝制御機構の解明

鱗翅目昆虫におけるFACs生合成酵素の同定に成功した。ハスモンヨトウ週齢幼虫を解剖し、得られた粗酵素液のミクロソーム画分よりFACs生合成能を指標に活性酵素を精製した。LCMSMS及びMALDI-TOF-MS分析とデータベースサーチの結果、鱗翅目特異的なエステラーゼファミリーの一種であることが示唆された。この候補遺伝子の大腸菌や昆虫細胞-バキュロウィルス発現系を用いた異種発現では、どちらもFACs生合成能は検出できなかったが、ハスモンヨトウ幼虫虫体を使ったRNAiで該当する酵素をノックダウンしたところ、腸管内のFACs量が減少した。ゲノム編集によるノックアウトに進むにあたって極めて重要な成果である。クチナシイリドイドの解毒について、gardenosideとグルコースを同時に摂食させた場合に、クチナシ生葉を食べた時と同程度のβ-alanineが腸管内で誘導されることを確認した。このような共力活性は他のマンノース等の糖では見られなかったことから、配当体の糖が遊離している点が重要であると示唆された。配糖体型の植物毒に対する昆虫側の解毒応答に遊離した糖が関わっていた例はほとんど知られていない。また、クチナシ葉抽出物中の有機層にはハスモンヨトウのβ-alanine誘導活性を抑制する活性成分が含まれることを明らかにした。これらの成果について、応用動物昆虫学会2019年度大会の公開シンポジウムで招待講演を行ったところ非常に高い評価を得た。本研究課題で最も難関だったFACs生合成酵素の同定に成功した。この進捗に問題があれば、予定を変更して餌を用いたFACsの擬似的ノックダウンに進むことも考えていたが、計画変更せずにゲノム編集に進むことができる。また、ハスモンヨトウの解毒戦略について、糖の関与があることは昨年度の成果で報告したが、糖の主成分であるマンノースではなく、グルコースだけがβ-alanine誘導活性に関与していたことが明らかになった。どうやって認識しているかは今後の課題となるが、何故それを認識するかについては、「配糖体からアグリコンが遊離している」状況を検出するためと考えれば説明できる。本研究課題の前半を締めくくるのに十分な結果が揃ったと考える。FACs生合成酵素に関しては、今回確率した昆虫細胞を使ったアッセイ系でSiRNAに挑戦するとともに、ゲノム編集を試みる。ハスモンヨトウを用いたTALENは予備試験的にほぼ手法が確立できており、crispr/cas9系を用いたゲノム編集も共同研究者の尽力により確立されつつある。FACsノックアウト系統のハスモンヨトウを作出し、通常のハスモンヨトウと比べて窒素代謝にどのような影響が出ているか、また解毒能力にも何らかの影響があるかを明らかにしていく。また、β-alanine生合成阻害剤や生合成酵素のノックダウンを行い、ハスモンヨトウにおけるクチナシ毒の解毒応答への影響を評価する。さらに、人工飼料の窒素養分含量を段階的に調節したものにgardenosideを添加して摂食させることで、餌中の栄養条件と解毒メカニズムの量的関係を明らかにする。クチナシ由来イリドイドgardenosideを摂食したハスモンヨトウの解毒機構の詳細を明らかにした.Gardenosideはハスモンヨトウ腸管内でβ-グルコシダーゼにより開環し,タンパク質等に非特異的に吸着することで毒性を発揮する.これに対し,ハスモンヨトウは腸管内に多量のβ-アラニンを誘導し,競合的に結合させることで毒性を中和することがわかっていたが,どのようなメカニズムでβ-アラニンを誘導するのかはわかっていなかった.そこで,クチナシ葉抽出物を用いたβ-アラニン誘導化合物を精製・同定した.予想ではβ-グルコシダーゼによって遊離したgardenosideアグリコンにβ-アラニン誘導活性があると思われたが,予想に反し,遊離したグルコースにβ-アラニン誘導活性があることが明らかになった.グルコースはクチナシに限らず様々な植物に普遍的に含まれることを考えれば,驚くべき発見である.イリドイドに対抗してアミノ酸を分泌する鱗翅目は他にも多数報告があるが,糖に応答してアミノ酸を誘導したとする報告は無く,新しい知見である.しかも,ハスモンヨトウはグルコースだけでなくマンノース等,他の糖にも同様に応答してβ-アラニンを誘導した.β-アラニンはイリドイドだけでなくグルタルアルデヒド様の毒性を持つ植物二次代謝物に対しても同様に無毒化できると考えられ,幅広い食性を持つハスモンヨトウがより普遍的な植物有毒成分配糖体に適応している可能性が出てきた.一方,無毒な植物でも糖を含有する場合,無駄にβ-アラニンを誘導することになるが,そのことが生理的に不利に働く可能性もある.キャベツはハスモンヨトウの主食となりうるが,糖が多量に含有される.実際にキャベツを食べたハスモンヨトウでβ-アラニンの誘導を確認したが,生育速度は他の野菜を食べた場合と比較して有意な差は見られなかった.ハスモンヨトウの優れた解毒戦略がまた一つ明らかになりつつある.ハスモンヨトウの驚くべき解毒戦略が明らかになってきた.広食性昆虫は狭食性昆虫と異なる戦略を取ることが予想されていたが,狭食性昆虫の研究に比べて遅れている面がある.

本研究では,ハスモンヨトウが解毒物質β-アラニンを誘導するにあたって,糖に誘導活性があることを発見した.普遍的な解毒戦略を説明しうる,全く新しい知見であり,予想外の展開になった.今後の研究を進める上で極めて重要な成果である.一方,計画では一年目に終わらせる予定だったFACs生合成酵素の同定については,あと一歩及ばず,現在,スケールアップして酵素精製を進めている.MALDI-TOF-MSにより解析する手法を確立できたことは重要な成果であり,引き続き,同定を試みる.鱗翅目昆虫におけるFACs生合成酵素の同定に成功した。ハスモンヨトウ週齢幼虫を解剖し、得られた粗酵素液のミクロソーム画分よりFACs生合成能を指標に活性酵素を精製した。LCMSMS及びMALDI-TOF-MS分析とデータベースサーチの結果、鱗翅目特異的なエステラーゼファミリーの一種であることが示唆された。この候補遺伝子の大腸菌や昆虫細胞-バキュロウィルス発現系を用いた異種発現では、どちらもFACs生合成能は検出できなかったが、ハスモンヨトウ幼虫虫体を使ったRNAiで該当する酵素をノックダウンしたところ、腸管内のFACs量が減少した。ゲノム編集によるノックアウトに進むにあたって極めて重要な成果である。クチナシイリドイドの解毒について、gardenosideとグルコースを同時に摂食させた場合に、クチナシ生葉を食べた時と同程度のβ-alanineが腸管内で誘導されることを確認した。このような共力活性は他のマンノース等の糖では見られなかったことから、配当体の糖が遊離している点が重要であると示唆された。配糖体型の植物毒に対する昆虫側の解毒応答に遊離した糖が関わっていた例はほとんど知られていない。また、クチナシ葉抽出物中の有機層にはハスモンヨトウのβ-alanine誘導活性を抑制する活性成分が含まれることを明らかにした。これらの成果について、応用動物昆虫学会2019年度大会の公開シンポジウムで招待講演を行ったところ非常に高い評価を得た。本研究課題で最も難関だったFACs生合成酵素の同定に成功した。この進捗に問題があれば、予定を変更して餌を用いたFACsの擬似的ノックダウンに進むことも考えていたが、計画変更せずにゲノム編集に進むことができる。また、ハスモンヨトウの解毒戦略について、糖の関与があることは昨年度の成果で報告したが、糖の主成分であるマンノースではなく、グルコースだけがβ-alanine誘導活性に関与していたことが明らかになった。どうやって認識しているかは今後の課題となるが、何故それを認識するかについては、「配糖体からアグリコンが遊離している」状況を検出するためと考えれば説明できる。本研究課題の前半を締めくくるのに十分な結果が揃ったと考える。ハスモンヨトウにおいて糖がβ-アラニン誘導を引き起こすことの生態学的意義について検証を進める.ヒトリガ科の幼虫の口器にあるmedial styloconic感覚子にある神経細胞がイリドイドと糖を認識することが報告されている.ハスモンヨトウにおいても同様のメカニズムでシグナルとして糖が認識されることでβ-アラニンが誘導されるのかを確認する.また,糖そのものが代謝されてβ-アラニンに変換されている可能性もあり,13Cラベル体の糖を摂食させてβ-アラニン及び他のアミノ酸のラベル化率を比較する.狭食性昆虫,広食性昆虫の対象を広げて,糖に対してβ-アラニンの誘導がどれほど一般的なのかを明らかにする.
認知症対応型看護実践のための教育プログラムの開発

本研究の目的は、急性期病院における認知症高齢者対応型実践能力の向上を目指した教育プログラムを構築することである。急性期病棟に勤務する看護師12名のインタビューをもとに質的帰納的分析を行い、「急性期からの離脱」等の7つの概念を抽出した。これらの結果を踏まえて、急性期の状況に適合した看護師の教育プログラムとして1急性期の認知症対応アセスメント能力(「『認知』の仮診断」)、2見守りのためのチームワーク(「見守りの相互協力」「踏み込んだ働きかけ」「認知症対応への切り替え」)3認知症看護のストレス・マネージメント能力(「ハプニングを楽しむことへの転換」)が示唆された。看護の基礎教育を修了した看護師の多くは、急性期病院等、医療の場に勤務しており、認知症高齢者に関する教育・研修を受ける機会が少なく、治療優先の場で高齢者からの理解が得られないことや、せん妄による転倒事故防止など対応に苦慮している。そのため、本研究は、1.急性期病院における認知症高齢者対応型看護実践能力の向上を目指した教育プログラムを構築すること、2.教育プログラムの評価方法を開発するために評価指標を作成すること、3.看護実践の場に適用するために看護学生及びスタッフに対する教育プログラムを実施・評価し、その結果に基づきプログラムの内容を洗練することを目的とした。今年度(初年度)の計画として、1.先行研究より、急性期病院に勤務する看護師を対象とした質的研究のデータより抽出した認知症高齢者対応型看護実践能力の分析を継続、2.教育プログラムを構築するための最初の段階として、文献検討を含めて、現時点で抽出した看護実践能力から急性期病院での看護実践の要素とは何か検討した。現段階の成果として、急性期病院における認知症高齢者にかかわる看護実践能力として、現時点では見守りの常態化・ルーチン化、予測をつけること、認知症の強みを活用すること、ハプニングを楽しむ余裕等を抽出している。看護師の体験から、認知症を病む人に対する看護師側の認識や向き合い方が変化する過程も示唆されており、教育的介入の中核となる要素として更に検討することが必要であることが示唆された。次年度も継続し、急性期勤務する看護師を対象とした標準的な指標を抽出し、教育プログラムの評価方法を開発するために評価指標を作成する。本研究は、急性期病院における認知症高齢者対応型実践能力の向上を目指した教育プログラムを構築することを目的としている。教育プログラムを作成するために、2年目の研究では急性期病棟に勤務する看護師(臨床経験年数3年以上)に対するインタビュー・データから、認知症高齢者との関わりにおける看護師の認識・対応を抽出した。これらは教育プログラムの元となる主要な概念になる可能性があり、分析は修正版グラウンデッド・セオリー・アプローチを参考に行った。看護師の認識として、急性期は治療上の制限が多く、認知症高齢者の安全を確保することが困難であることから早期の「急性期からの離脱」がゴールとなり、対応として治療に対して「踏み込んだ働きかけ」(医師に術後のチューブ類の抜去を提案する等)が行われていた。また、認知症高齢者は、看護師には「常に意識下にある存在」と認識され、認知症の診断が無くても看護師による「『認知』の仮診断」があれば、チューブ類の抜去や転倒のリスクを予見し、「見守りの相互協力」が強化されていた。「任務を超えた見守り」では、看護師個人の責任範囲でなくても自発的に高齢者の様子を観察・情報収集が行われていること、認知症による不測の行動・症状に対して「ハプニングを楽しむことへの転換」(不測の事態があっても楽しむ、高齢者の行動を肯定的に受けとめる等)を抽出した。以上のことから、「急性期からの離脱」が優先すべき課題であり、看護師としての積極的な関与(「踏み込んだ働きかけ」「任務を超えた見守り」)、自律性の高い援助が必要とされていること、認知症に対する看護師自身の認識の転換(「ハプニングを楽しむことへの転換」)等が認知症高齢者の安全な回復を促し、特有な葛藤やストレスの緩和、スタッフ間の情報共有を促進していることから、特有な看護実践能力となりうることが示唆された。急性期病院において、認知症高齢者の入院は増加傾向にある。認知症高齢者の場合、入院初期に新しい環境に適応することが困難で、認知症の行動・心理症状(BPSD)が起こりやすく、入院中の転倒事故や医療事故のリスクも問題となっている。そこで本研究では、急性期病院における認知症高齢者対応型実践能力の向上を目指した教育プログラムを構築することを目的とした。急性期病院に勤務する看護師のインタビュー・データから、認知症高齢者の看護体験における認識・対応を抽出し、質的帰納的分析を行った。急性期で認知症高齢者を看護する場合、中核カテゴリーとして「急性期からの離脱」が優先すべき課題であり、主要なカテゴリーとして「『認知』の仮診断」「常に意識下にある存在」「見守りの相互協力」「認知症対応への切り替え」「踏み込んだ働きかけ」「ハプニングを楽しむことへの転換」を抽出した。これらのカテゴリーを検討し、急性期看護の現状に合った教育内容として、1急性期を早期に離脱するためのアセスメント能力(「『認知』の仮診断」)、2見守りのための看護師間のチームを形成、連携する能力「「見守りの相互協力」「認知症対応への切り替え」)、3看護師としての自律性(「踏み込んだ働きかけ」)を高めることが必要であることが示唆された。

また、認知症に対する認識を肯定的に転換することも必要とされており(「ハプニングを楽しむことへの転換」)、葛藤の回避や仕事上のストレス緩和、スタッフ間の情報共有を促進していることから、看護実践能力となる可能性があることが示された。認知症高齢者対応型実践能力を教育プログラムとして展開するうえで、今後の展開として高齢者側の評価、倫理的な視点も不可欠であるため更なる検討が求められる。本研究の目的は、急性期病院における認知症高齢者対応型実践能力の向上を目指した教育プログラムを構築することである。急性期病棟に勤務する看護師12名のインタビューをもとに質的帰納的分析を行い、「急性期からの離脱」等の7つの概念を抽出した。これらの結果を踏まえて、急性期の状況に適合した看護師の教育プログラムとして1急性期の認知症対応アセスメント能力(「『認知』の仮診断」)、2見守りのためのチームワーク(「見守りの相互協力」「踏み込んだ働きかけ」「認知症対応への切り替え」)3認知症看護のストレス・マネージメント能力(「ハプニングを楽しむことへの転換」)が示唆された。平成26年度は、教育プログラムの基盤となる認知症高齢者対応型看護実践能力の構成要素(主要概念)を抽出するところまで実施した。当初の計画では、教育プログラムの試案作成までを目標としており、遅れの理由として、研究代表者が入院したため一定の期間療養が必要となったことが挙げられる。遅れに対して、平成27年度の計画を修正し、これまで抽出した構成要素に基づき教育プログラムを作成、研究フィールドを絞り込み、研究期間内に試案の実施・評価までを実行できるよう調整する。高齢者看護平成26年度より課題として、教育プログラムの試案作成が残されている。そのため、当初の計画を修正し、平成27年度は認知症高齢者対応型看護実践能力の向上を目指した教育プログラム及び評価方法(試案)を作成する。計画当初は教育プログラムの対象範囲を広く捉え、看護学生(基礎教育)・急性期病院の看護師(卒後の継続教育)の双方のプログラム構築を計画したが、研究期間内に実行可能か検討した結果、急性期病院での質的データの分析結果より、これまで抽出した概念も多様であることから、平成27年度は急性期病院における看護師の継続教育に焦点を絞り、教育プログラムを作成、実施、評価できるよう計画を一部変更する。平成25年度平成26年度は、先行研究より明らかとなった認知症高齢者対応型看護実践能力より、看護の基礎教育・スタッフ教育の構成要素を明らかにすることを目標とした。現時点では、認知症高齢者対応型看護実践能力の分析結果を継続、教育プログラムを構築するための最初の段階として、急性期病院での看護実践の要素の検討を行う時期として計画しており、現時点では概ね計画の通り進行している。今後は成果の公表と、次の段階として教育プログラムの評価方法を作成したうえで専門家を対象にしたインタビュー等を予定しており、対象者の選定や倫理的配慮のため、当初設定した計画よりも時間がかかることも予測されるため今後の進行を早めることも必要と考える。物品費において、予定金額より安価で購入することができ、18,424円の差額が生じた。今後の研究の方針について、当初の計画通り看護の基礎教育・スタッフ教育の構成要素・評価指標を作成し、看護学生及びスタッフ教育に不可欠な要素は何か検討後、研究者間で検討、教育プログラム(試案)を作成する。
赤外線無線ネットワーク上の適応型メディアアクセス制御方式に関する研究

本研究は、複数の赤外線無線通信機器が近接した場所に存在する場合に,それらの赤外線無線通信が干渉しあうことを回避するプロトコルの研究開発を目的としている.目的とするプロトコルの研究開発には,赤外線無線通信機器同士の干渉量を定量的に評価する必要性がある.そのため,複数の赤外線無線通信機器,例えば,IrDA(Infrared Data Association)規格のPDA(Personal Digital Assistant)や家庭用リモコンなど,を用いた実験系を構築した.構築した実験系において,各赤外線無線通信機器の波形を横河電機のディジタルオシロスコープで確認した.次に、ノートPCとPDA間の赤外線無線通信に,干渉源として家庭用リモコンを配置し,距離を変化させて干渉量を測定した.ノートPCとPDA間に放出される赤外線より干渉源となる家庭用リモコンの赤外線の強度が大きいため,ARQ(Automatic Repeat request)が実装されているIrDAにおいても通信を行うことが困難になりうることが判明した.実際ノートPCとPDA間の距離が30cmで,家庭用リモコンが90cmから100cm内にある場合,IrDAによる赤外線無線通信が不可能であった.それ故,複数の赤外線無線通信機器が近接した距離に存在する場合,各機器に干渉回避プロトコルを実装する必要性が確認された.本研究において赤外線無線通信の干渉測定実験で得られたデータは,赤外線無線通信機器に干渉回避のプロトコルを実装するために基礎となるデータである.本研究では、コンピュータとその周辺機器間のデータ伝送に赤外線を利用した方式を取り扱っている。また、コンピュータとその周辺機器間のメディアアクセス制御方式として、ポーリング方式による一対多通信を想定した。これら複数の赤外線無線通信システムが互いに近接した場所に存在する場合、相異なるシステム間においてパケットの衝突が発生する危険性がある。本研究では、従来提案されていた、システム間の干渉を自律分散的に回避するアルゴリズムに改良を施したアルゴリズムを提案し、提案アルゴリズムの性能解析を計算機シミュレーションによって評価した。最初に異なるシステム間のパケットが衝突する条件を詳細に解析し、従来のアルゴリズムでは考慮されていなかった、制御局となるコンピュータが送出するパケットの衝突を計数するアルゴリズムを提案している。これらのパケット衝突の回数から得られる統計情報を基にパケットの衝突を回避する処理を制御局側に実装することによりシステム間干渉を低減する。計算機シミュレーションの結果、システム間干渉を回避するまでに要する時間は、データ転送速度が75kbpsの場合、1秒程度となり従来方式と比較して大幅に改善されている。さらに、従来の研究は想定するシステム全てが相互に干渉するモデルに関して検証されているのに対し、本研究では赤外線の指向性を考慮に入れて部分的に干渉するモデルを提案し、それらのモデル上においても提案アルゴリズムが正常に動作することを計算機シミュレーションにより確認している。本研究は、複数の赤外線無線通信機器が近接した場所に存在する場合に,それらの赤外線無線通信が干渉しあうことを回避するプロトコルの研究開発を目的としている.目的とするプロトコルの研究開発には,赤外線無線通信機器同士の干渉量を定量的に評価する必要性がある.そのため,複数の赤外線無線通信機器,例えば,IrDA(Infrared Data Association)規格のPDA(Personal Digital Assistant)や家庭用リモコンなど,を用いた実験系を構築した.構築した実験系において,各赤外線無線通信機器の波形を横河電機のディジタルオシロスコープで確認した.次に、ノートPCとPDA間の赤外線無線通信に,干渉源として家庭用リモコンを配置し,距離を変化させて干渉量を測定した.ノートPCとPDA間に放出される赤外線より干渉源となる家庭用リモコンの赤外線の強度が大きいため,ARQ(Automatic Repeat request)が実装されているIrDAにおいても通信を行うことが困難になりうることが判明した.実際ノートPCとPDA間の距離が30cmで,家庭用リモコンが90cmから100cm内にある場合,IrDAによる赤外線無線通信が不可能であった.それ故,複数の赤外線無線通信機器が近接した距離に存在する場合,各機器に干渉回避プロトコルを実装する必要性が確認された.本研究において赤外線無線通信の干渉測定実験で得られたデータは,赤外線無線通信機器に干渉回避のプロトコルを実装するために基礎となるデータである.
社会的課題解決に貢献する開発途上国の市場参入

事例分析、モデル化、具体的な提言の三段階で研究を進める。事例分析として、ソーシャル・ビジネスを研究する研究機関、開発途上国で事業展開する企業と非営利組織のヒアリングを行う。多角的なアプローチにより、社会的課題解決と営利の追求を同時に実現する事例を重層的に捉えることを目的とする。それにより、ソーシャルビジネスの成功要因と障壁を抽出しながらモデルを構築し、可能性と限界を明らかにし、具体的な提言を行う。
HPAと時計遺伝子―感情障害との関連

時計遺伝子の本体は転写因子あるいはその機能を修飾する遺伝子であり、転写促進系因子としてCLOCK、BMAL1が、転写抑制系因子としてPER1,CRY1などが知られている。時計遺伝子は概日リズムの振動の発現のみならず、様々な遺伝子の日内変動を直接あるいは他の転写因子を介して駆動していることが知られるようになった。私たちはBmal1のクローニングを初めて報告するとともにそのゲノム構造および発現調節に係わるプロモーター領域の同定を行ってきているが、本研究課題ではBmal1のリズム性発現に関与する転写因子およびプロモーター領域、発現調節様式を解析するとともに、視床下部諸核でリズム性の発現を示す遺伝子の転写解析を行った。Bmal1プロモーター/ルシフェラーゼコンストラクトおよびその変異体を作成し、ルシフェラーゼアッセイによるプロモーター活性の測定によりスクリーニングを行った。その結果Bmal1の転写はRORα、RORβおよびRORγによって促進を、Rev-Erbβによって抑制を受けること、また促進活性はRORαが一倍高いことを見いだした。またゲルシフトによってこれらの因子は転写開始点近傍にあるRORレスポンスエレメントに結合することから、ROR-レスポンスエレメントを介して直接転写調節を受けることが明らかになった。次に視床下部に発現しHPA axisに関連するCRHのプロモーターを解析したところ、RORレスポンスエレメント様配列が存在すること、RORα、RORβによって負に制御されている可能性が示された。私は時計遺伝子を構成する分子の中心は転写因子であると想定し、時計遺伝子のクローニングを行ってきたが、新規bHLH-PAS型転写因子のクローニングに成功し、脳と骨格筋に強く発現することからBMAL1(Brain and Muscle Arnt like protein 1)と命名した。BMAL1は生物時計の中枢である視交叉上核に特異的に発現しており、しかもその発現は暗期にピークを有すサーカディアンリズムを示した。また行動リズム周期の延長を示す変異マウスより単離された転写因子CLOCKと相互作用があり、BMAL1-CLOCKがPer1プロモーターに結合して転写を活性化することも明らかになり、今では時計遺伝子の一つと考えられている。視交叉上核ではBmal1のmRNAは暗期にピークを持つリズム発現を示すが(Honma S. et al.,BBRC1999)、同部位でのPer1、Per2などのいわゆる抑制系因子のmRNAは明期にピークを示すリズムがあり、Bmal1に対して正反対の位相を有している。また視交叉上核以外の器官においても、位相は異なるものの、Per1などの抑制系因子とBmal1発現のピーク位相は逆位相となっているが、発現は保存されている。私達はこの逆位相転写機構が時計発振や時計の出力に重要な役割を果たしていると想定し、その分子機構を明らかにするためマウスBmal1 BACクローン塩基配列の解析、5'RACE法による転写開始点の決定およびマウスBmal1プロモーター領域の同定を行なった。これらの解析から抑制系因子の転写抑制因子であるCRY1、PER2がマウスBmal11プロモーターに対しては促進因子として働いていることが明らかになった。促進系時計遺伝子Bmal1は視交叉上核(SCN)では暗期に高いリズム発現を示すが、これに対して抑制系の時計遺伝子であるPer1,Per2などは明期にピークがあり、ほぼ半日異なった位相を持っている。しかもこの逆位相性の発現はSCN特有ではなく、末梢組織においてもピーク位相はSCNと異なるものの保存されている。Bmal1はリズム性発現を制御するキーファクターとして機能していると考えられており、Bmal1の発現機構を解析することは、視床下部でリズム性発現をする様々な因子の発現機構を解明するためにも重要なことである。Bmal1の発現調節領域の解析を行うためBmal1転写調節領域を同定し、解析を行ってきているが、本年度は発現調節領域2kbに4箇所あるRORレスポンスエレメント(ROE-RE)の役割について詳細に検討した。時計遺伝子Bmal1の発現調節機構を検討するためBmal1発現調節領域

DNAを様々な長さに切断し、これをルシフエラーゼレポーター遺伝子上流に挿入したコンストラクトを構築した。Bmal1プロモーター領域には結合因子予測プログラムからSP1、ROR-REなど様々なDNA結合因子結合配列が存在する。転写開始点より上流約2kbのBmal1プロモーター領域にある4箇所のROR-REは、マウスとヒトでは保存されており、また下流にある2箇所のROR-RE周辺の配列はきわめてよく保存されている。転写開始点近傍のROR-RE2個を含むBP/527-LUCレポーターとRORα、RORβ、RORγをそれぞれNIH3T3細胞に共発現させると、そのすべて転写活性化が誘導された。しかし同じオーファン核内レセプターファミリーであるREV-ERBでは変化が認められなかった。これらのROR-RE 2箇所を同時に欠失させたところ、RORα、β、γによる転写活性化は消失した。これらの結果からROR-REはBmal1転写活性化に重要であることが示された。時計遺伝子の本体は転写因子あるいはその機能を修飾する遺伝子であり、転写促進系因子としてCLOCK、BMAL1が、転写抑制系因子としてPER1,CRY1などが知られている。時計遺伝子は概日リズムの振動の発現のみならず、様々な遺伝子の日内変動を直接あるいは他の転写因子を介して駆動していることが知られるようになった。私たちはBmal1のクローニングを初めて報告するとともにそのゲノム構造および発現調節に係わるプロモーター領域の同定を行ってきているが、本研究課題ではBmal1のリズム性発現に関与する転写因子およびプロモーター領域、発現調節様式を解析するとともに、視床下部諸核でリズム性の発現を示す遺伝子の転写解析を行った。Bmal1プロモーター/ルシフェラーゼコンストラクトおよびその変異体を作成し、ルシフェラーゼアッセイによるプロモーター活性の測定によりスクリーニングを行った。その結果Bmal1の転写はRORα、RORβおよびRORγによって促進を、Rev-Erbβによって抑制を受けること、また促進活性はRORαが一倍高いことを見いだした。またゲルシフトによってこれらの因子は転写開始点近傍にあるRORレスポンスエレメントに結合することから、ROR-レスポンスエレメントを介して直接転写調節を受けることが明らかになった。次に視床下部に発現しHPA axisに関連するCRHのプロモーターを解析したところ、RORレスポンスエレメント様配列が存在すること、RORα、RORβによって負に制御されている可能性が示された。
睡眠時無呼吸症候群における摂食中枢刺激ホルモン(グレリン)の関与と治療法の模索

睡眠時無呼吸症候群における摂食中枢刺激ホルモン「グレリン」の関与を明らかにする目的で以下の臨床研究を企画した.対象者は20歳以上の成人であり,当科外来を受診し,フラガ社製(アイスランド)EmblaS7000を使用し終夜睡眠ポリソムノグラフ検査(以下PSG)を行った結果,閉塞性睡眠時無呼吸症候群(以下OSAHS)と診断されたもので,本研究に同意が得られたものとした.OSAHSの診断は無呼吸・低呼吸指数(以下AHI)が5以上のものとした.解析は専任の技師により解析を行った.治療は原則として経鼻的持続陽圧呼吸(以下n-CPAP)を選択した.検討項目は血液中の活性化グレリン値とレプチン値とし,n-CPAP治療前後で被験者より採血を行った.活性化グレリンはELISA法により測定し,レプチンはRIA法によって測定した.OSAHSと診断され,n-CPAP治療を受けたのは合計32症例であった.治療前後でAHIは有意に減少した(中央値前:23.85,後4.45),またEpsworth-Sleepiness Testも治療前後で有意に低値を示した(中央値前:9,後5).活性化グレリンは治療前後で治療後に有意に減少していた(中央値前:9.0,後7.5).レプチンについては治療前後で有意な変化を認めなかった.n-CPAP治療の前後で臨床症状とAHIは改善を示した.活性化グレリン値は治療前に高値を示し,後で低値を示した.OSAHS患者は無呼吸・低呼吸による低酸素血症が頻回に起こるが,これを回避するために呼吸中枢ドライブを賦活化させる必要がある.呼吸中枢への刺激は脳波上の覚醒を伴うため,深睡眠がとれず浅睡眠になりやすい.グレリンには深睡眠を誘発する作用があることから,睡眠改善を目的に増加しているのではないかと推定された.またグレリンは本来摂食中枢刺激ホルモンである.このことから「摂食行動の亢進→肥満→OSAHSの重症化」の仮説が見いだされた.今後は長期的に体重とグレリンの関係を検討する予定である.睡眠時無呼吸症候群における摂食中枢刺激ホルモングレリンの関与を明らかにする目的で,以下の臨床研究を企画した.対象者は20歳以上の成人であり,精密検査で終夜ポリソムノグラフィー検査(以下PSG)を施行した結果,閉塞性睡眠時無呼吸症候群(以下OSAHS)と診断されたもので,本研究に同意を得られたものとした.OSAHSの診断は無呼吸・低呼吸指数(以下AHI)が5以上のものとした.治療は原則として経鼻的持続陽圧呼吸法(以下n-CPAP)を選択した.n-CPAPが困難な者は適宜oral plateなどを考慮した.n-CPAP治療前後で採血を行い,得られた検体から活性型グレリン値を測定した.現在のところ,PSG検査を施行した症例数は30例であり,このうちOSAHSと診断されたのは23例であった.このうち現在のところ治療前後で測定できたのはレプチン12例であり,活性型グレリンは現在測定中である.n-CPAP治療前の血性レプチン値の平均値は6.2であり,治療後は6.86であった.目標とする症例数に達しておらず,有意差が得られるようかどうかの検討には至っていないが,今後症例を重ね,SASにおける摂食中枢刺激ホルモン,グレリンの働きを明らかにする予定である.睡眠時無呼吸症候群における摂食中枢刺激ホルモン「グレリン」の関与を明らかにする目的で以下の臨床研究を企画した.対象者は20歳以上の成人であり,当科外来を受診し,フラガ社製(アイスランド)EmblaS7000を使用し終夜睡眠ポリソムノグラフ検査(以下PSG)を行った結果,閉塞性睡眠時無呼吸症候群(以下OSAHS)と診断されたもので,本研究に同意が得られたものとした.OSAHSの診断は無呼吸・低呼吸指数(以下AHI)が5以上のものとした.解析は専任の技師により解析を行った.治療は原則として経鼻的持続陽圧呼吸(以下n-CPAP)を選択した.検討項目は血液中の活性化グレリン値とレプチン値とし,n-CPAP治療前後で被験者より採血を行った.活性化グレリンはELISA法により測定し,レプチンはRIA法によって測定した.OSAHSと診断され,n-CPAP治療を受けたのは合計32症例であった.治療前後でAHIは有意に減少した(中央値前:23.85,後4.45),またEpsworth-Sleepiness Testも治療前後で有意に低値を示した(中央値前:9,後5).活性化グレリンは治療前後で治療後に有意に減少していた(中央値前:9.0,後7.5).レプチンについては治療前後で有意な変化を認めなかった.n-CPAP治療の前後で臨床症状とAHIは改善を示した.活性化グレリン値は治療前に高値を示し,後で低値を示した.OSAHS患者は無呼吸・低呼吸による低酸素血症が頻回に起こるが,これを回避するために呼吸中枢ドライブを賦活化させる必要がある.呼吸中枢への刺激は脳波上の覚醒を伴うため,深睡眠がとれず浅睡眠になりやすい.グレリンには深睡眠を誘発する作用があることから,睡眠改善を目的に増加しているのではないかと推定された.またグレリンは本来摂食中枢刺激ホルモンである.

このことから「摂食行動の亢進→肥満→OSAHSの重症化」の仮説が見いだされた.今後は長期的に体重とグレリンの関係を検討する予定である.
成人の定常状態造血を維持するエリスロポエチン産生制御機構と病態との関係

エリスロポエチン(Epo)は、赤血球産生の刺激因子であり、成体では腎臓から産生される。本課題では、出生後に重度のEpo欠乏を呈するマウス(ISAM, Inherited Super Anemic Mice)を報告し、Epo欠乏による骨髄前赤芽球及び塩基性赤芽球の減少とEpo制御下の遺伝子群を特定した。また、腎臓及び胎仔期神経系のEpo産生細胞を同定した。さらに、片側尿管結紮実験により、腎臓のEpo産生細胞の筋繊維芽細胞への変化が、Epo産生低下と腎繊維化が引き起こすことを示した。この変化は回復可能であり、腎繊維化と腎性貧血の新規治療法として、炎症因子の抑制が有効である可能性が示唆された。エリスロポエチン(EPO)は赤血球造血を促進する因子である。成人では主に腎臓から分泌され、出血による貧血や高地環境などの組織の低酸素分圧状況を感知して腎臓における産生と分泌が亢進する。腎不全の症例では、EPO産生が低下するために貧血となり(腎性貧血)、その後、ほぼ生涯にわたるEPO製剤の投与が必要となる。腎不全時にEPO産生が低下する機序が解明されれば、腎性貧血の予防につながることが期待された。EPO遺伝子にGFPを挿入したノックイン/ノックアウト遺伝子座をホモに持ち、肝臓で飲みEPOを産生するトランスジーンを導入されたマウス(ISAM)は、腎臓が主要なEPO産生部位となる出生1週間後付近から貧血が進行し、成体マウスでは重篤な貧血を呈する。このマウスについて24年度から引き続いて研究を行い、成体マウスの造血動態の変化と腎臓のEPO産生細胞について報告した(Yamazaki,2013).ISAMマウスの腎臓で蛍光を発する細胞(EPO遺伝子発現細胞)は、同座位のヘテロマウスでは腎臓の皮質と髄質の境界付近に集中しているのに対して、腎臓の皮質全体に非常に多数認められた。そこで、EPO遺伝子発現が活性化した細胞がCREを発現するマウス(EPO-CRE)を作成し、ISAMと交配することにより、EPO遺伝子活性化能を持つ細胞(赤)と、現在EPO遺伝子が活性化している細胞(緑)を同時に観察可能なマウスを創出し、腎不全に伴う線維化とEPO産生の関係を明らかにした(Souma, 2013).さらに、これらの遺伝子改変動物を用いて、EPO産生細胞が胎生期には神経および神経堤細胞に存在することを明らかにした(Suzuki, 2013)。エリスロポエチン(EPO)は赤血球造血を増強する因子である。成人では主に腎臓から分泌され、腎機能が低下するとEPOの産生が低下し腎性貧血となる。しかし、EPOの造血組織における作用点、および、腎性貧血の分子病態などについては未だ未解明の点が多い。研究代表者らは、本研究開始時までに、EPO遺伝子に緑色蛍光タンパク質遺伝子(GFP)を挿入したノックイン(EPO-GFP-KI)マウスや、EPO遺伝子を含むBAC (Bacterial Artificial Chromosome)を導入したトランスジェニックマウスを作成し、腎臓でのEPO産生細胞が、神経系の性質を併せもつ線維芽細胞であることを示した。また、EPO-GFP-KIマウスにトランスジーンとしてEPO遺伝子断片を導入したマウス(ISAM, Inherited Super Anemic Mouse)を作成した(Yamazaki et al. in revision)。ISAMでは、トランスジーンの活性による肝臓のEPO産生によりEPO欠損による胎性致死性を免れて出生するが、EPO産生組織が肝臓から腎臓に移行する生後3週から重篤な貧血を呈した。そこで、24年度には、このマウスを用いて造血組織の解析を行い、また、EPO投与によって発現が変動する遺伝子群を明らかにした。一方、ISAMの腎臓では、EPO遺伝子の転写活性によってGFPを発現している細胞が、広く皮質から髄質までの間質に多数分布していた。平常時のEPO産生細胞は腎臓の皮髄境界付近に局在しているが、潜在能力としてEPO産生能を持つ細胞は腎臓間質により広く分布していることが示された。今後は、ISAMを用いてEPOの標的となる遺伝子の同定を進め、また、GFP発現を指標に、腎不全時にEPO遺伝子の発現を抑制する分子機構などの解析を進める予定である。ISAM (Inherited super-anemic mice)の解析からはEPO投与早期(6時間)に赤血球系転写因子(Tal1、Maff)や、赤血球の機能遺伝子(解糖系酵素、赤血球膜蛋白質等)の発現上昇が観察された。そこで、これら遺伝子の発現制御に関わり赤血球造血の主要な制御転写因子であるGATA1、および、GATA1と競合して赤血球への分化を抑制するGATA2について解析を行った。EPOシグナル下流ではMAPK p38、AKTがGATA2をリン酸することが知られており、2014年にはMAPKp38によるGATA2リン酸化が報告された。また、GATA2の176スレオニン残基がcyclin B-cyclin-dependent kinase 1によってリン酸化され、Fbw7との結合を介してユビキチン依存性に分解されることを共同研究として見出した。このリン酸化残基はMAPKリン酸化残基の近傍にあり、構造変化や複合体形成などに双方のリン酸化が影響することが示唆された。GATA1には両残基に相同な部位は認められず、このリン酸化による影響はGATA2に独自なものであると予想された。