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東アジア海域経済文化圏形成と展開に関する史的研究

本年度の個別研究成果は、日本側では大学・研究所の紀要等に発表された。鄒煥壬の報告「歴史上の東アジア海域経済文化圏における中国の日本・朝鮮との経済貿易関係」は、漢・魏から明・清に至る中国朝貢体制下の日本・朝鮮との経済・貿易関係を概観したものである。李世成の報告「東アジア文化圏『四元構造』の形成と展開」は、中国唐時代を中心にみた東アジア文化圏を、儒家・漢字・仏教・芸術の各文化圏の四元構造として把え直したものである。和田正広の報告「福建税監高〓の海外私貿易」は、大航海時代のオランダによる台湾占領直前期における明末の中国沿海密貿易について検証したものである。市川信愛(戴一峰論文の校閲)の報告「近代中日海上貿易史研究および旧税関保存書類の利用について」は、中日海上貿易史研究に価値をもつ旧厦門税関に保存された税関文書の内容と利用方法についての紹介である。曹瑞林の報告「大連を東北アジア地域の商業・貿易・金融・観光・情報等の中心としてその背景、予測及び若干の留意点について」は、東北アジア地域の商業・貿易・金融・観光・情報等のセンター化が進む大連経済の現状と将来予測を概観したものである。山下睦男の報告「中国型求償取引による物資協力について」は、物資と物資の物々交換や、物資と資金・技術・人材などの生産要素間の協力を意味するところの、条件付き取引きであると同時に、見返りの取引きでもある特殊な中国的取引きである「物資協力」の歴史や現状を分析したものである。金鳳徳の報告「東アジアの新時代」は、冷戦体制崩壊後の東北アジア地域(中国・香港・台湾・蒙古・日本・韓国・北朝鮮・ロシア)における経済圏の現状について、それを新「雁行型」の形成過程として把えたものである。市川信愛の報告である「近代中国海域交易圏の変容構造と在日華商」は、当該テーマについての共同研究による個別成果の概括と、残された課題に言及したものである。研究実績報告平成3年度の課題「東アジア海域経済文化圏の形成と展開に関する史的研究」においては、以下の如き経過と成果が見られた。九州国際大学と東北財経大学とは年3回(訪中によるものは実質上1回)の合同研究協議会をもち、両国の研究分担者が平等・互恵の原則に立脚して主体的に研究活動を行なうことを確認した。本年度は両大学ともに、課題の近・現代に関する史資料の輯集・選択に重点をおき、着実に活動を展開した。九国大側においては、前半は経済学部・経済研究所等をもつ近隣大学の蔵書目録より、近現代の経済文化交流関係の論文・著書等を現物又は複写によって輯集した。その過程で、今では日本に現存しない旧関東州及び満鉄関係資料を『東北地方文献聯合目録』として作成した。12月の訪中時には本目録を持参して、大連図書館の蔵書目録と参照し、その中から貴重資料を抽出して複写を行ない、又現在複写依頼中のものもある。財経大側においては、本課題を主導推進すべき鄒教授(客員交換教授として8月迄本学に滞在)の帰国が八月末となったため、それまでの間における中国側チ-ムへの十分な指導が行き届きかねないという悪条件も手伝い、研究態勢の確立がおくれた。だが秋以降、鄒教授を含む3名のスタッフは、東アジア海域の中国主要港口(上海・青島・烟台・北京・天津・錦州・瀋陽・大連・丹東〈旧安東〉営口等)に趨き、研究資料の輯集調査を精力的に行ない、目標の50%の資料収集を達成した。狭義の研究活動に関して本学では、計5回の研究会が行なわれ、大連・門司両港の海関統計及び泰益号文書の分析結果が報告された。又訪中時には、2名が研究発表を行なった。
非ウイルス性ベクターによる膵癌治療法の開発

本研究の目的は,トロージャンペプチドやHIVタット蛋白などのペプチド系ベクターを用いて,核酸ドラッグやペプチド系薬剤をin vitroで膵癌細胞内に導入し,遺伝子情報特異的な抗腫瘍活性を検討するとともに,in vivoの治療実験での有用性を証明することにある.1.膵癌細胞株にビオチン化トロージャンペプチドを接触させ,共焦点レーザー顕微鏡で核内蛍光強度を測定して核内移行度の経時的観察を行ったところ,ペプチド系ベクターの細胞内速やかな移行が確認された.2.Bcl-X遺伝子のアンチセンス・オリゴヌクレオチドとトロージャンペプチドの共有結合体(トロージャンBcl-X・AS)を作成し,Bcl-XLの遺伝子発現の異なる膵癌細胞株と放射線抵抗性Bcl-XL異常発現株において,トロージャンBcl-X・ASを作用させた.放射線及び抗癌剤誘導下のアポトーシス増強作用と細胞増殖抑制効果,及び塩基配列特異的mRNA翻訳阻害が認められた.3.膵癌で高頻度に見られるp16癌抑制遺伝子の活性中心ペプチド合成し,トロージャンペプチドの共有結合体(トロージャンp16)を作成しin vivo治療実験を行った.その結果,皮下腫瘍モデルにおける著明な抗腫瘍効果と,腹膜播種モデルにおける有意の延命効果が認められた.薬剤による有害事象は観察されず,癌細胞に直接遺伝子を導入するウイルスベクターによる遺伝子治療の問題点を解決する一つの方法として,ペプチド系ベクターを癌治療に応用することの有用性が示唆された.本研究の目的は,トロージャンペプチドやHIVタット蛋白などのペプチド系ベクターを用いて,核酸ドラッグやペプチド系薬剤をin vitroで膵癌細胞内に導入し,遺伝子情報特異的な抗腫瘍活性を検討するとともに,in vivoの治療実験での有用性を証明することにある.1.膵癌細胞株にビオチン化トロージャンペプチドを接触させ,共焦点レーザー顕微鏡で核内蛍光強度を測定して核内移行度の経時的観察を行ったところ,ペプチド系ベクターの細胞内速やかな移行が確認された.2.Bcl-X遺伝子のアンチセンス・オリゴヌクレオチドとトロージャンペプチドの共有結合体(トロージャンBcl-X・AS)を作成し,Bcl-XLの遺伝子発現の異なる膵癌細胞株と放射線抵抗性Bcl-XL異常発現株において,トロージャンBcl-X・ASを作用させた.放射線及び抗癌剤誘導下のアポトーシス増強作用と細胞増殖抑制効果,及び塩基配列特異的mRNA翻訳阻害が認められた.3.膵癌で高頻度に見られるp16癌抑制遺伝子の活性中心ペプチド合成し,トロージャンペプチドの共有結合体(トロージャンp16)を作成しin vivo治療実験を行った.その結果,皮下腫瘍モデルにおける著明な抗腫瘍効果と,腹膜播種モデルにおける有意の延命効果が認められた.薬剤による有害事象は観察されず,癌細胞に直接遺伝子を導入するウイルスベクターによる遺伝子治療の問題点を解決する一つの方法として,ペプチド系ベクターを癌治療に応用することの有用性が示唆された.
走査電顕用極微粒子蒸着装置の試作と応用

走査電顕の分解能は最近飛躍的に向上している。従って観察試料に施す金属蒸着法も従来の方法(抵抗加熱型やグロー放電スパッタ型)では粒状性の点から高分解能観察には不適当となった。そこで我々はイオンビーム・スパッタリングを用いた走査電顕試料用の金着蒸着装置を試作し、走査電顕の高分解能化に対応すべく研究を行った。装置の構成は蒸着室(イオンビーム銃,蒸着金属,試料台,膜厚計)、真空排気系、コントロール部、の3部である。イオンビーム銃にアルゴンガスを導入しアルゴン・イオンビームを発生させ白金のスパッタ蒸着を行なった結果、直径1520【A!°】程度の細かい粒状性を持つ蒸着膜を得ることが出来た。この結果は従来の方法における5060【A!°】直径以上という粒状性に比べて、格段に優れていた。また、従来の方法では蒸着膜厚が増加するにつれ粒状性が悪化し、大きな島状構造を形成するが、今回の方法では粒状性は常に一定で蒸着膜厚に無関係であり、島状構造を形成しなかった。生物試料に10【A!°】厚の白金蒸着を施し超高分解能走査電顕で観察した所、導電性能や二次電子収量も十分で実用上全く問題はなかった。この装置では従来の方法では蒸着困難であったタンタルやタングステン等の蒸着も容易に行なう事が可能であり、優れた粒状性(直径10【A!°】以下)示したが、走査電顕試料への蒸着金属としては二次電子収量が白金に比較して少ないという難点があった。以上のように今回試作したイオンビーム・スパッタ蒸着装置は、従来の蒸着方法に比べてはるかに高性能であり、高分解能走査電顕観察においては非常に良い結果を示した。今後は、このような装置は走査電顕観察における蒸着に必須の装置となるであろう。1.装置の改良前年度試作したイオンビーム・スパッタ蒸着装置に新たにシャッターを取付けた。これにより作動開始時の不安定なビームによる蒸着の防止が可能となった。またイオン銃の性能の向上を画り設計上若干の考慮を加えたが、実験的には期待通りの性能向上はみられなかったため、従前のイオン銃を使用することとした。2.生物試料への応用オスミウム・DMSO・オスミウム法などによって作製した生物試料に白金を蒸着し、細胞内構造について超高分解能走査電顕(日立UHS-T1、分解能5Å)にて観察を行なった。その結果リボゾーム、ゴルジ装置などが非常に良い像質にて撮影可能であった。また膜厚4Å以下の蒸着では蒸着粒子そのものは解像されず、二次電子収量が増加しコントラストの良い像質が得られる事が判明した。膜厚7Å以上の蒸着では1520Åのサイズの蒸着粒子が明瞭に観察され、このサイズは膜厚には関係せず一定であった。これは前年度の透過電顕による観察結果に一致した。3.白金以外の蒸着と今後の方針白金単体の蒸着粒子(1520Å)は、超高分解能走査電顕では解像されてしまうので今後もっと小さな粒子の蒸着による走査電顕観察を行なう必要がある。現在タングステン、タンタルの2種について、単体もしくは白金との同時蒸着の基礎的実験および蒸着を行ない、白金単体の粒子サイズよりも細かい粒子を得ている。今後、生物試料への応用性の検討が必要である。(附)

尚、本研究の成果は第14回日本電子顕微鏡学会学術講演会(60年6月、札幌市)、第14回医生物走査電顕シンポジウム(60年11月、倉敷市)において逐次、発表報告された。
改良核燃料の高温物性に関する研究

1.Cr、La、Gd、TiドープUO_<2±x>の高温電気伝導率及び酸素不定比性(x)の酸素分圧依存性を測定した。(1)ドープ陽イオンがウランと置換した場合、電気伝導率及び酸素ポテンシャルは、ドープ陽イオンの原子価がウランより(4より)小さい時は上昇し、ドープ陽イオンの原子価が大きい時は低下した。これは前者の場合、ドープ陽イオンがホールの共与体となり、ウランイオンの酸化状態を増加させ、後者の場合は電子の共与体となり、ウランイオンの酸化状態を減少させる為と考えられる。(2)チタンをドープした場合、縄枠なUO_2に比べて電気伝導率及び酸素ポテンシャルは減少したが、これは上記の置換モデルでは説明できず、侵入型モデルを考える必要があった。(3)電気伝導率と酸素不定比(x)の酸素分圧依存性から、酸素のフレンケル対に基いた添加物入りUO_2の欠陥構造を提唱した。2.直接加熱型熱量計を用いて、UO_<2.004>、U_<0.956>Gd_<0.044>O_<2.000>、U_<0.927>Gd_<0.073>O_<1.998>、U_<0.899>Gd_<0.101>O_<2.001>、U_<0.858>Gd_<0.142>O_<1.998>の高温熱容量を3101500Kの温度範囲で測定した。(1)Gdをドープしたすべての試料は、高温で熱容量が急激に上昇し、Gd濃度が増すと熱容量異常(過剰熱容量)開始温度が低下した。(2)過剰熱容量を熱活性過程と考えて、活性エンタルピーと活性化エントロピーをそれぞれの試料について決定した。(3)活性化エンタルピーのGd濃度依存性を用いて、Gd濃度が零つまり純粋なUO_2へ外挿して得たエンタルピーの値は、酸素のフレンケル対形成エンタルピーの理論値よりも小さく、電子ーホール対形成エンタルピーの理論計算値よりは大きかった。(4)過剰熱容量が見い出された温度域で、7.3at%GdドープUO_2の電気伝導率の温度依存性に異常は見られなかった。以上の結果より、GdドープUO_2の高温域での過剰熱容量は、主として酸素のフレンケル対形成によって生じたものと考えられる。1.高燃焼度化をめざし、U【O_2】に【Gd_2】【O_3】,【Nb_2】【O_5】,Ti【O_2】,【Cr_2】【O_3】,【La_2】

【O_3】など添加した核燃料試料を作成し、試料の各種温度、雰囲気での熱力学的安定性について検討した。その結果、【Cr_2】【O_3】や【La_2】【O_3】のような低原子価化合物をU【O_2】に添加した場合、電気伝導率や酸素ポテンシャルは増加するが、逆に【Nb_2】【O_5】のような高原子価化合物を添加した時には、それらの値は減少することが明らかとなった。これは添加物が、電子や正孔のドナーとして働らき、母体のウランイオンの酸化状態を変化させるためである。2.従来の直接加熱パルス型熱量計で、シールドの二重化、試料の温度計測のPt/PtRh熱電対から放射温度計への変更、ヒーターの容量増加などの改良を加え、高温化、高精度化を目指した。パイロメーターで、黒鉛の熱容量を測定した結果、従来の測定限界の1300Kを越える1630Kまでの測定が可能となり、その時の精度は約3%であった。より高温化のためには、ヒーターや試料指示棒の材料変更、シールド温度測定法などについて考慮する必要性があり、現在、材料の選定、シールドの温度測定用にパイロメーターの使用など検討中である。また、データ取り込み及びデータ処理を容易にするため、測定系のオンライン化と熱容量計算用のプログラムを完成した。3.直接加熱パルス型熱量計を用い、U【O_(2.004)】,【U_(0.956)】【Gd_(0.044)】【O_(2.000)】,【U_(0.927)】【Gd_(0.073)】【O_(1.998)】,【U_(0.899)】【Gd_(0.101)】【O_(2.001)】,【U_(0.858)】【Gd_(0.142)】【O_(1.998)】試料の高温熱容量を3101500Kの温度域で測定した。その結果、すべての試料が高温で過剰熱容量を有し、その値はガドリニウム含有量の増大と共に増大するという改良核燃料設計上重要な知見を得た。ガドリニウムの添加量増大と共に過剰熱容量が増大する原因究明のため、電気伝導率測定など他の測定手段を検討中である。1.UO_2にチタン0.7モル%添加した核燃料の酸素ポテンシャル測定を行った結果,純粋なUO_2と比べて酸素ポテンシャルは大巾な減少を示し,減少の最大巾は100KJ/mol程度であった.添加したチタンが3価イオンとし,ウランイオンと置換しているとすれば,前年度報告の3価イオンのガドリニウムやランタン添加した場合のように,一部のウランが酸化され,酸素ポテンシャルは増大するはずであるが,この予想とは逆の結果である.もし,チタンが4価イオンとしてウランと置換すれば,4価のトリウムやジルコニウムの添加の場合と同様,添加により酸素ポテンシャルはあまり影響をうけないはずであるが,これも実験事実と相反する.従って考えられるチタンの固溶形態としては,チタンが置換型ではなく,侵入型として立方体の格子間に入るモデルが考えられる.重量変化の酸素分圧依存性に加えて,電気伝導率の酸素分圧依存性から,チタンを添加した場合,格子間に入ったチタンは格子間酸素や酸素空格子と複合欠陥を形成することが明らかになった.2.直接パルス型熱量計を用い,UOD22.004_<,U>0.956_<Gd>0.044_O2.000_<,U>0.927.ニD2.Gd.ナD20.073.ニ_<O.ナ>1.998.ニD2,U.ナD20.899.ニ_<Gd>0.101_O2.00_<,U>0.858_<Gd>0.142_O1.998D2試料の高温熱容量を3101500Kの温度範囲で測定した.その結果,いずれの試料も,高温で過剰熱容量を示し,その値はガドリニウム含有量の増大と共に増大するという改良核燃料設計上重要な知見を得た.この原因究明のため,7.3モル%ガドリニウム添加UO_
痴呆CJCウイルス-治療の可能性のある痴呆-

老年者剖検脳200例の髄液をパポバ共通抗原を用いた抗体およびnestedPCR,Southern hybridization法にて検索した。12例に強陽性を認めたが、DNA検索では、すべて陰性であった。抗体強陽性例中80%は痴呆を有してい、そのうちの1例は、原因不明の痴呆と生前診断されていた。JCによる痴呆である可能性がある。また、剖検脳中1例は明きらかな進行性多巣性白質脳症(PML)の像を呈しており、免疫組織化学、PCRにてJCvirus陽性であり、電顕でもウイルスの存在が確認された。この例は、生前特に免疫不全を来たす疾患はなく、我々の主張している加齡に伴う免疫低下のみで発症した例であろう。なを、ヴィンスヴァンガータイプの痴呆と診断されながら、血管病変が明きらかでなかった10例の剖検脳を、PCR法にて調べたが、すべてJC陰性であった。JCウイルスの感染経路を明きらかにする目的で、血液疾患患者の血液・骨髄を用いてnested PCR法にて検索した。白血病患者で陽性例が存在した。免疫組織化学的に陽性細胞の種類を調べたところ、B cell系の細胞であった。また、剖検AIDS患者脳でJCウイルス陽性例を用い、全身臓器におけるJCウイルス存在部位を検索した。脾で強陽性であり、肝臓でも陽性細胞をみとめた。血液細胞を介して、進展する可能性が示唆された。今まで使用していた抗体は、パポバウイルス共通のVp1蛋白に対する抗体であり、JCウイルスに特異的なものではなかった。そこで特異性を上げるため、我々で、抗体の作製を行なった。構造解析により検索した抗原となりうるオリゴペプタイドを4種類合成し、これを抗原としてポリクローナル抗体を作製したところ、4種類全てに抗体が得られた。このうち1種類は、JCウイルスにのみ反応する特異性の高い抗体であった。他の3種類は、JC、BKのいずれのウイルスにも反応した。
ナノ粒子と近赤外線蛍光イメージングを用いた小型肺腫瘍局在診断法の開発

平成30年度は、前年度に取り組んだヌードマウス皮下腫瘍モデルを用いて、インドシアニングリーンを組み込んだLiposomally formulated ICG with an alkyl chain(LP-ICG-C18)の腫瘍への集積を確認した。具体的には、ヌードマウス(BALB/c Slc-nu/nu 8週齢雄)に対し、ヒト癌細胞(A549;腺癌)5.0×10E6個と細胞外気質マトリゲル100uLの混和液を背部皮下に局所注射し、ヌードマウス皮下腫瘍モデルを作成し、腫瘍の長径が10mm以上となった時点で、LP-ICG-C18を経静脈的に投与した。その後、6時間、24時間、2日、4日、7日にin-vivo蛍光発光イメージング(IVIS, LuminaII)を用いて蛍光を観察し、LP-ICG-C18の腫瘍への集積を定量評価した。LP-ICG-C18は経時的に皮下腫瘍への集積し、投与後2日に最も明るい蛍光を発した。一方、背景となる広背筋はLP-ICG-C18投与直後が最も明るかったが、その後、経時的に蛍光は消退した。広背筋をバックグラウンドしたときのSignal-to-background ratioは注射2日後に1.5と最大であった。また、前年度に引き続き、ヌードマウス肺腫瘍モデルの作成にも取り組んだ。具体的には、ヌードマウス(BALB/c Slc-nu/nu 8週齢雄)に対し、ヒト癌細胞(A549;腺癌)1.0×10E6個と細胞外気質マトリゲル50uLの混和液を気道内投与した。サージカルルーペを使用して、23G金属カテーテルをヌードマウス気管内に挿入し、カテーテルを通して混和液を注入した。手技的にも安定しつつあり、今後、ヌードマウス肺腫瘍モデルに対して、LP-ICG-C18を経静脈的に投与し、LP-ICG-C18の肺腫瘍への集積を検証する予定である。平成30年度は、皮下腫瘍モデルを用いて、LP-ICG-C18の腫瘍への集積を確認できた点では順調であった。しかしその一方で、ヌードマウスの気管内に腫瘍細胞混和液を注入して作成するヌードマウス肺腫瘍モデルの作成において、気管内投与時に窒息や気道損傷により死亡したり、うまく生着せずに投与後にCTで腫瘍が確認できないことなど、腫瘍形成の成功率が低かったために、LP-ICG-C18の肺腫瘍への集積については確認できなかった。今年度後半には手技的に安定し、腫瘍作成率が改善されたため、次年度にはLP-ICG-C18の肺腫瘍への集積について確認する予定である。本研究課題における目的は、LP-ICG-C18が腫瘍に集積する特性を利用して、近赤外線蛍光イメージングを用いて呼吸器外科手術における小型肺悪性腫瘍の局在診断に応用することである。そのために、まずはヒト肺癌細胞株を用いて皮下腫瘍を作成し、LP-ICG-C18が集積するかどうか、また至適用量や至適時間などを明らかにする必要がある。今年度は、皮下腫瘍モデルにLP-ICG-C18 100μlを静脈注射し、その後経時的に蛍光を観察し定量することで、投与後2日が最も傾向が強く、背景との比も大きくなることが明らかになった。来年度は、より実臨床に近づくために、ヒト肺癌細胞株から作成した肺腫瘍を用いて、LP-ICG-C18が集積するかどうかを確認する。このモデルについては、ようやく腫瘍作成率が安定してきたため、近日中に。LP-ICG-C18 100μlを静脈注射し、肺腫瘍への集積の程度や、背景肺との比を明らかにし、LP-ICG-C18を用いた肺悪性腫瘍の局在診断が可能かどうかを検討していく。皮下腫瘍については、マウスの皮下にヒト癌細胞混和液を注入後1か月程度で皮下腫瘍が生育するのが確認できた。腫瘍は長径10mmを越えるまで観察し、10mm以上となった時点で犠牲死させて摘出し、病理学的に腺癌であることを確認した。皮下腫瘍マウスモデルの作成に関しては技術的に問題なく施行できた。皮下腫瘍モデルは犠牲死させることなく、腫瘍の変化を確認できる点で重要である。今後は、LP-ICG-C18を経静脈的に投与し、その後、経時的にLP-ICG-C18が腫瘍に集積していく経過を観察する予定である。今年度は、肺腫瘍モデルの作成にも着手した。肺腫瘍モデル作成のためにはヒト癌細胞混和液を経気道的に肺内へ投与する必要がある。サージカルルーペを使用して、23G金属カテーテルを気管内に挿入し、カテーテルを通して混和液を注入した。しかしながら、手技的に難しく、気管内投与時に窒息や気道損傷により死亡したり、うまく生着せずに投与後にCTで腫瘍が確認できないことなど、腫瘍形成の成功率がまだ低かった。現在、肺腫瘍モデル作成手技の確立を試みている。モデル作成手技が安定し次第、LP-ICG-C18を経静脈的に投与し、LP-ICG-C18の肺腫瘍への集積を検証する予定である。本年度は皮下腫瘍モデルの作成は順調に進んだが、肺腫瘍モデルの作成に難渋した。

皮下腫瘍モデルの作成は高い成功率であり、手技的には安定していると考えている。しかしながら、肺腫瘍モデルについては、いまだ手技的に安定しておらず、モデル作成成功率は低い状態である。ヒト癌細胞混和液を気管内注入する際の麻酔深度や、注入後回復するまでの間のケアを調整する必要がある。また、癌細胞株をかえることで生着率が変わる可能性があるため、次年度に試す予定である。平成30年度は、前年度に取り組んだヌードマウス皮下腫瘍モデルを用いて、インドシアニングリーンを組み込んだLiposomally formulated ICG with an alkyl chain(LP-ICG-C18)の腫瘍への集積を確認した。具体的には、ヌードマウス(BALB/c Slc-nu/nu 8週齢雄)に対し、ヒト癌細胞(A549;腺癌)5.0×10E6個と細胞外気質マトリゲル100uLの混和液を背部皮下に局所注射し、ヌードマウス皮下腫瘍モデルを作成し、腫瘍の長径が10mm以上となった時点で、LP-ICG-C18を経静脈的に投与した。その後、6時間、24時間、2日、4日、7日にin-vivo蛍光発光イメージング(IVIS, LuminaII)を用いて蛍光を観察し、LP-ICG-C18の腫瘍への集積を定量評価した。LP-ICG-C18は経時的に皮下腫瘍への集積し、投与後2日に最も明るい蛍光を発した。一方、背景となる広背筋はLP-ICG-C18投与直後が最も明るかったが、その後、経時的に蛍光は消退した。広背筋をバックグラウンドしたときのSignal-to-background ratioは注射2日後に1.5と最大であった。また、前年度に引き続き、ヌードマウス肺腫瘍モデルの作成にも取り組んだ。具体的には、ヌードマウス(BALB/c Slc-nu/nu 8週齢雄)に対し、ヒト癌細胞(A549;腺癌)1.0×10E6個と細胞外気質マトリゲル50uLの混和液を気道内投与した。サージカルルーペを使用して、23G金属カテーテルをヌードマウス気管内に挿入し、カテーテルを通して混和液を注入した。手技的にも安定しつつあり、今後、ヌードマウス肺腫瘍モデルに対して、LP-ICG-C18を経静脈的に投与し、LP-ICG-C18の肺腫瘍への集積を検証する予定である。平成30年度は、皮下腫瘍モデルを用いて、LP-ICG-C18の腫瘍への集積を確認できた点では順調であった。しかしその一方で、ヌードマウスの気管内に腫瘍細胞混和液を注入して作成するヌードマウス肺腫瘍モデルの作成において、気管内投与時に窒息や気道損傷により死亡したり、うまく生着せずに投与後にCTで腫瘍が確認できないことなど、腫瘍形成の成功率が低かったために、LP-ICG-C18の肺腫瘍への集積については確認できなかった。今年度後半には手技的に安定し、腫瘍作成率が改善されたため、次年度にはLP-ICG-C18の肺腫瘍への集積について確認する予定である。【今後の研究の推進方策】本研究課題における目的は、LP-ICG-C18が腫瘍に集積する特性を利用して、近赤外線蛍光イメージングを用いて呼吸器外科手術における小型肺悪性腫瘍の局在診断に応用することである。そのために、まずはヒト肺癌細胞株を用いて皮下腫瘍を作成し、LP-ICG-C18が集積するかどうか、また至適用量や至適時間などを明らかにする。現時点で、皮下腫瘍モデルは安定して作成できており、次年度はLP-ICG-C18を経静脈的に投与してその体内動態を明らかにする。
遺伝子工学的アプローチによるウイルス性肝病態進展の予測と治療法の開発

C型肝炎ウイルスでは、HCV-RNA量と治療効果の関連が強く指摘され、またHCV-RNA量とウイルスのgenotypeとは表裏の関係にあることが示されてた。さらに、治療抵抗性のC型肝炎ウイルスでは遺伝子変異をきたし易いHypervariable regionの変異率が高いことが示され、SSCPでウイルスの変異を検討したところ、インターフェロン治療にもかかわらず一部のC型肝炎ウイルスのバンドが消失せず、これはインターフェロン抵抗性のウイルスである可能性が示された。さらに、SSCPの検討によるウイルスの変異は、病期の進行にともない変異株が多くなることも示された。また、急性C型肝炎ウイルス感染の初期血清には、C型肝炎ウイルスのコア蛋白に対する抗体が産生されていることが明かとなった。このことは、中和抗体産生、ワクチン開発の突破口となる可能性があり、vitroの培養系の開発に期待がもたれた。しかしながら、この抗体に対しC型肝炎ウイルスが変異し持続感染を示す可能性が指摘された。B型肝炎ウイルスでは、肝炎の重症化症例ではコアの変異株が高頻度に認められた。しかしながら、ダックの感染実験から、これら変異株の増殖能は野生株より低いことが明かとなった。また、B型肝炎ウイルスの各抗原蛋白発現の研究では、X遺伝子発現の調節機構にpromotor,enhancerの制御が明かとなった。B型およびC型肝炎の慢性炎症の病態にHLA class Iに表出されている蛋白が標的になっている可能性が示された。
複合応力負荷と粒子線重照射を考慮した高性能・高信頼性プラズマ対向材料開発の新展開

ナノ組織制御型タングステン合金の核融合炉プラズマ対向機器への適用性を検討することを目的とし、応力負荷下ヘリウムイオン照射による表面損傷挙動を評価した。その結果、現状のナノ組織制御型タングステン合金は、1000°C程度の高温における低エネルギーヘリウムイオン照射による表面損傷耐性は、ある一定程度の照射量(本研究では1 x 10^<22>He/m^2)を超えた場合、従来の純タングステンと顕著な差がなく、また、応力負荷の影響も顕著ではないことが示された。本研究は、耐粒子線照射特性に優れるナノ組織制御型タングステン合金の核融合炉プラズマ対向機器への適用を目標とし、実機における複合応力負荷とヘリウムイオン照射による表面損傷挙動の関係に着目し、以下3つの事項を達成することを目的とする。(1)実負荷条件を考慮した複合応力負荷下ヘリウムイオン照射によるナノ組織制御型タングステンの表面損傷挙動の評価とそのメカニズムの解明(2)複合応力負荷下におけるナノ組織制御型タングステンの表面損傷挙動の解析予測モデルの構築(3)実負荷条件における複合応力負荷を考慮したナノ組織制御型タングステンの最適材料設計指針の策定平成20年度は、まず、現有のイオン照射装置に取り付け可能な、高温超高真空中において試験片に曲げ応力を負荷可能な高温応力負荷照射ステージとその計測システムを設計・製作した。次に、この装置を用いて、純タングステンに対し応力負荷有り/無しの条件においてヘリウムイオンを照射し、表面損傷挙動と応力負荷状態との関係を評価した。その結果、ブリスタリングなどの表面損傷は、弾性変形内の応力負荷により促進されるが、塑性変形を伴う応力負荷ではその促進の程度が小さいことを明らかにした。さらに、平成21年度以降における研究のため、アルゴン雰囲気におけるメカニカルアロイング法により、ナノ組織制御型タングステン合金作製した。本合金は、チタンカーバイドを添加し結晶粒の超微細化と粒界強度の向上を図ることにより、室温においても充分な強度と靱性を有するものとした。研究は、耐粒子線照射特性に優れるナノ組織制御型タングステン合金の核融合炉プラズマ対向機器への適用を目標とし、実機における複合応力負荷とヘリウムイオン照射による表面損傷挙動の関係に着目し、以下3つの事項を達成することを目的とする。(1)実負荷条件を考慮した複合応力負荷下ヘリウムイオン照射によるナノ組織制御型タングステンの表面損傷挙動の評価とそのメカニズムの解明(2)複合応力負荷下におけるナノ組織制御型タングステンの表面損傷挙動の解析予測モデルの構築(3)実負荷条件における複合応力負荷を考慮したナノ組織制御型タングステンの最適材料設計指針の策定平成21年度は、平成20年度に製作したイオン照射装置の最高試験温度を、常用1000°Cまでとするための改造を施し、その性能確認をした。この装置を用いて、純タングステンに対し、応力負荷有り/無しの条件においてヘリウムイオンを照射し、表面損傷挙動と応力負荷状態との関係を評価した。また、平成20年度に製作したナノ組織制御型タングステンに対し、応力負荷無しの条件においてヘリウムイオンを照射し、表面損傷挙動の照射条件依存性を評価した。その結果、照射温度約500°Cにおいては、純タングステンに比べて、ナノ組織制御型タングステンにおける極めて優れた表面損傷耐性が見出された。また、この温度領域においては、応力負荷により表面損傷がわずかに促進される傾向が観察された。一方、照射温度900°Cにおいては、ナノ組織制御型タングステンにおいても、ヘリウムのフルエンスの上昇とともに表面損傷が生じ、材料表面が著しく劣化することが明らかとなった。照射温度900°Cにおける応力負荷の影響については次年度評価する予定である。平成22年度は、まず、平成21年度に製作した最高試験温度1000°Cまでのイオン照射装置用に、試験片に曲げ応力を負荷することができる高温応力負荷照射ホルダーを設計・製作した。照射ホルダーの曲率半径は25mmおよび50mmとした。次に、この装置を用いて、ナノ組織制御型タングステンの曲げ応力負荷下におけるヘリウムイオン照射を実施した。試験片は厚さ0.15mmとし、表面は粒度0,5μmのアルミナ研磨剤により鏡面状態になるまで研磨した。応力負荷照射ホルダーへの取付け時に試験片に発生する最大引張応力は、曲率半径25mmのときが800MPa、50mmのときが400MPaである。試験温度が最高900°C、引張応力が400MPaのヘリウムイオン照射においては、応力負荷無しのヘリウムイオン照射による表面損傷の状態と顕著な差は見られなかった。一方、引張応力800MPaのヘリウムイオン照射においては、試験片が照射ホルダー取付け時に破断してしまった。ナノ組織制御型タングステン素材自身の曲げ強度は従来研究からは1000MPaを超えると考えられるため、この破断の原因は、研磨時に微細欠陥が導入され、それがき裂発生の起点となってしまったことにあると考えられる。

本研究の結果から、現状のナノ組織制御型タングステン合金は、1000°C程度の高温における低エネルギーヘリウムイオン照射による表面損傷耐性は、ある一定程度のフルエンスを超えた場合、従来の焼結タングステンと顕著な差がなく、また、研磨条件などによる表面状態のばらつきに応じて、応力負荷時にき裂などの欠陥が導入される可能性が示唆された。よって、プラズマ対向機器の信頼性向上のためには、表面損傷が部材自身の機械特性(例えば熱機械疲労特性)などに及ぼす影響を調査し、温度やフルエンスなどをパラメータとした使用限界を明らかにすることが必要である。
炎症性皮膚疾患浸潤細胞の組織分布による遺伝子発現変化の解析

Lasermicrodissectionの技術を皮膚疾患の解析に応用する目的で、まず、表皮細胞の基底層を含む下層と顆粒層を中心とした上層での遺伝子発現分布を解析した。filaggrin遺伝子発現を上層と下層で比較したところ、予想通りfilaggrin遺伝子発現は表皮上層で優位に増強していた。そこで、それを用いて、表皮における鉄代謝関連酵素の発現を検討したところ、表皮の分化に伴う鉄排出関連遺伝子の発現増強が確認でき、この所見は実際の表皮内鉄分布と一致した。最後に、乳房外パージェット病における免疫制御遺伝子RANKLの発現を検討し、病変部表皮における当該分子の発現増強を確認した。1.表皮細胞の分化にともなう遺伝子発現変化の解析:表皮細胞は,基底層から有棘層、顆粒層、角層にいたる角化という分化過程で遺伝子発現を著しく変化させる。そこで、filaggrin遺伝子に注目して、LMにより表皮下層と上層から遺伝子を採取し発現の変化を定量RT-PCR (qPCR)にて比較した。その結果、filaggrin発現が表皮上層で著しく発現が亢進することを確認できた。3.乳房外パジェット病におけるRANKL遺伝子の発現(最終年度):我々は、最近免疫染色により乳房外パジェット病の腫瘍細胞が特異的にRANKL遺伝子を発現していることを見いだした。そこで、果たしてその免疫染色の結果が染色上のアーティファクトでないか、また、タンパク発現は転写レベルで調節されているか否かをLaser microdissectionによる遺伝子発現解析により検討した。その結果、遺伝子発現、タンパク発現の間で極めて良好な相関が得られた。炎症性皮膚疾患の病態解析において、これまだあまり顧みられてこなかった浸潤細胞の組織学的局在部位の相違による遺伝子発現変化をlaser microdissectionの手法を用いて明らかにすることを目的に研究をおこなった.昨年度は,まず,円形脱毛症患者より採取した組織を用いて,通常のreal-time PCR法により,浸潤細胞のサイトカイン遺伝子,転写因子などの遺伝子発現が解析可能かを検討した.コントロールとしては,抗CD3/CD28抗体を用いてin vitroで刺激したT細胞より採取したRNAを用いた.その結果,一部のサンプルで,IL-10,IL-13, INF-g等のサイトカイン遺伝子, GATA3, Tbet, RORgamma(t), FoxP3の発現を定量することができた.また,in vitro刺激T細胞から採取したmRNAと比較すると,円形脱毛症病変部サイトカインのmRNA発現パターンは,IL-13優位,IL-10,IFN-g発現低下が認められた.また,転写因子では,GATA3の発現亢進が亢進してたが,FoxP3に関しては明らかな抑制は認められなかった.しかし,この解析からも,炎症性皮膚疾患病変部の微細な解剖学的部位による違いの検討性が示唆され,皮膚筋炎組織をlaser microdissectionを行いmRNAを回収し遺伝子発現を検討した.まず,非定量的PCRによりG3PDH遺伝子の発現を検討したところゲル電気泳動,エチジウムブロマイド処理により明らかなバンドを検出できた.次に,定量的PCRをおこなったところ,局所におけるG3PDHは,10枚の切片から約50コピー回収できることが明らかとなった.まだ,サイトカイン発現を定量する段階には至っていないが,切片数を増加することにより解析が可能となることが予測される.現在,検討中である.当初,予想していたよりもlaser microdissectionにより回収されるmRNA量が少なく,組織中の含有量の少ないサイトカインのmRNAを増幅できていない.今後は,更に症例数を増やすとともに,切片中のmicrodissectionを行う範囲を拡大しmRNAをより多く回収することを務めるとともに,RNAレベル,cDNAレベルでの遺伝子増幅を工夫することにより微量なmRNAからの遺伝子増幅に改良を加える.次年度に計画している研究の遂行に使用する予定である。
炭素線治療に対する実測ベースRBE計算モデルの開発と高精度臨床解析

本研究では、炭素線治療に対して、腫瘍や正常組織毎に生物線量を計算できる実測ベースRBE計算モデルを構築することが第一の目的である。そして、その手法を組み込んだ炭素線治療に対する高精度臨床解析システムを開発し、より正確な臨床解析を行うことが第二の目的である。本研究により、炭素線治療の有用性の評価はもちろん、高精度な臨床解析により、有害事象の知見を深め、有害事象の予測や予防に役立てることが本研究の意義であるとも考えている。
動物細胞,分裂酵母菌を宿主にしたcDNA発現クロ-ニングシステムの開発

動物細胞と分裂酵母を宿主とする遺伝子相補cDNAクロ-ニング法を完成した。この方法は、これまでに開発を終えた高効率完全長cDNAクロ-ニング法、cDNA発現ベクタ-,高効率動物細胞トランスフェクション法に加え、今回新たに開発し従来の方法を数十倍の効率が得られる分裂酵母遺伝子導入法と酵母へのcDNAバンク導入ベクタ-から成る。その結果これまでは、ほとんど不可能であった動物細胞の遺伝子を適切な分裂酵母の変異株を宿主として、迅速かつ容易に単離することができるようになった。我々は、この方法を用いて動物細胞の増殖制御、細胞周期制御遺伝子の単離を進めている。すでに、分裂酵母のG2期制御遺伝子でありcdc2蛋白のチロシンの脱リン酸化を行い、これを活性化するcdc25遺伝子とcdc2蛋白のチロシンリン酸化を行い、それを不活性するwee1遺伝子とに対応するヒト及びラットのホモロ-グ遺伝子の単離に成功した。このことから、高等動物のG2期制御機構は、分裂酵母のそれとよく類似していることが判明した。更に、G1及びG2期で働く細胞周期制御遺伝子cdc2に酵母の性分化の調節因子であるpat1遺伝子の温度感受性変異株を相補する数種のヒト遺伝子の単離に成功した。これらの遺伝子は、RNA結合ドメインを持つ蛋白や未知の蛋白をコ-ドし、その機能は現在不明ではあるが新しい動物細胞に特異的に細胞周期制御遺伝子である可能性がある。この遺伝子単離法は、増殖制御遺伝子に限らず有核細胞の間で進化的によく保存されている遺伝子に関しては、変異株の樹立と操作が非常に容易な分裂酵母を宿主として、それに対応する動物遺伝子を極めて迅速に単離することができる。今後、広範な応用が期待される。本年度の実施計画通り、高効率酵母トランスフェクション法、cDNAバンク導入と回収を容易にする高効率酵母ベクタ-、少量のmRNAから非常に大きなcDNAバンクが作れる高効率大腸菌コンピ-テント細胞作製法を完成した。これらの手法と、従来我々が開発してきた、高効率完全長cDNAバンク作製法、cDNA発現ベクタ-、cDNAバンク導入法と統合し、世界で初めて動物細胞と分裂酵母菌を同時に宿主とできるcDNA発現クロ-ニングシステムを完成した。高効率酵母トランスフェクション法は、リチュウム酢酸法の変法で、従来の方法より50100倍程効率が高く、1μgのDNA当り100万個のコロニ-が得られる。従って、酵母変異株の遺伝子相補を用いて、数百万個に一つしかない程、少量のcDNAクロ-ンも容易に単離できる。cDNAクロ-ンが安定に維持され、なお高い効率でcDNAバンクを酵母に導入できるベクタ-は、分裂酵母のARS配列、ura及びleu遺伝子とpBR322から成る。高効率大腸菌コンピ-テント細胞作製法は、従来のカルシウム法の変法であるが、1μgのDNA当り10億個以上のコロニ-が得られ、エレクトロポ-レ-ション法と比較し、効率では大差ないものの、かなりの高い塩濃度でも働き、細胞を凍結保存できるという利点を持つ(特許出願準備中)。従って、数μgのmRNAより数千万個のクロ-ンからなるcDNAバンクを作成することが可能となった。このクロ-ンニングシステムを用いて、細胞周期遺伝子cdc25に相当するヒト遺伝子、wee1,pat1,cdc13変異株を相補するヒト遺伝子の単離に成功している。今後、このクロ-ニングシステムを用いて、従来、単離が不可能であった多くの遺伝子が単離されると期待される。すでに完成している動物細胞を宿主とするcDNA発現クロ-ニングシステムと合体する分裂酵母を宿主とするcDNA発現クロ-ニングシステムの開発を完了した。

この結果、数μg程のmRNAで数千万個の独立したcDNAクロ-ンからなるcDNAバンクを作成することと、このバンクを用いて、分裂酵母を宿主とした遺伝子相補に基づいて数百万個に1個しかないほど稀なcDNAクロ-ンを迅速かつ容易に単離できるようになった。なお、cDNAバンクの導入ベクタ-として、大腸菌への回収作業を容易にする目的でアンピシリン耐性遺伝子の代わりにテトラサイクリン耐性遺伝子を持ったベクタ-を作成した。この結果、酵母コロニ-からcDNAプラスミドのみを選択的に回収することができるようになった。今年度は、更に、このシステムの有効性を検討するために、動物細胞の細胞周期制御遺伝子の単離を進めている。すでに、分裂酵母のG2期細胞周期の正の調節因子であるcdc25に対応する2種類のヒト遺伝子、1種類のラット遺伝子、負の調節遺伝子であるweelに対応するヒト遺伝子、更に、増殖と分化のスイッチであるpat1を相補する9種類のヒト遺伝子、細胞周期調節の中心的役割をしているcdc2遺伝子の変異株を相補する8種類のヒト遺伝子を単離することに成功した。これらの遺伝子の解析の結果、動物細胞のG2期細胞周期制御機構が分裂酵母と非常に類似しているが複雑であること、ある種の癌細胞に見られる染色体異常がcdc25の過剰発現によって引き起こされている可能性が明らかとなった。すでに完成した分裂酵母を宿主とする遺伝子相補cDNAクロ-ニング法を活用して、ヒト細胞のG2期細胞周期制御遺伝子の単離を進めた。分裂酵母では、cdc2蛋白キナ-ゼの活性化によって細胞の分裂が開始する。cdc2蛋白キナ-ゼはwee1と呼ばれるチロジンキナ-ゼによってリン酸化を受けることによって活性が抑制され、cdc25と呼ばれる脱リン酸化酵素によって活性化される。DNA複製完了のシグナルと細胞小器官の生合成の進行状況によって、この二つの制御機構が調節されている。我々は昨年度単離した二種のcdc25遺伝子ヒトホモロ-グとwee1ヒトホモロ-グ以外に、wee1遺伝子の変異株を強力に相補する新しいヒトcDNAの単離に成功した。このcDNAは、これまでに知られている蛋白とは類似性を持たない塩基性蛋白質をコ-ドする。wee1変異株の相補形質から、wee1及びcdc25とは独立してcdc2蛋白キナ-ゼの活性を抑制する制御因子であることが示唆された。最近、出芽酵母では、wee1、cdc25以外の制御機構で細胞分裂の開始が制御されていることが示唆されている。今回単離したヒト遺伝子は、この制御機構の一因子である可能性が浮かび上がった。一方、昨年度単離したcdc25及びwee1のヒトホモロ-グは、塩基配列を決定し、分裂酵母及び動物細胞での機構を調べた結果、これらのホモロ-グが、分裂酵母の制御遺伝子に対応する遺伝子であることが判明し動物細胞の細胞分裂の制御機構を解明するための大きな手掛かりになると期待される。
液体^3Heにおける第ゼロ音波吸収の量子効果の検証

これまでに,高性能の400MHzのZn0トランスデューサ,W/SiO_2の反射防止膜が出来上がり,液体ヘリウム3を実際に冷却して,400MHzの第ゼロ音波の観測に成功した。Laで希釈したCMN温度計が未完成であるので(H^^3e融解圧温度計を使って実験),液体H^^3eそのものの温度は測れていないが,ゼロ音波領域(10mK以下)で温度の下降とともにT^2に比例して信号が大きくなっていくことが確認されている。液体H^^3eの最低温度は現在のところ約1.5mkで,超流動転移には到っていない。しかしながら,絶対零度への外挿によて,超音波吸収の量子極限の値がランダウの予想した程度以上あるのではないか,というところまでの知見が得られている。第ゼロ音波吸収の量子効果の大きさは,やはり小さく,その検証には高精度の実験が要求される。本補助金で購入したBoxer積分器等でS/N向上を目指しているが,現在よりもう一桁上げる必要がありそうである。さらにcoolingとwarmingとで信号にヒステリシスが見られるので,厳密には吸収のT^2依存性は見ていないことになるが,第ゼロ音波の信号はすでに捕らえ,絶対値のおおよその見積が出来たのは大いなる成果であると言える。この結果は本年8月にアメリカで開催される国際低温物理学会議で発表する予定である。今後(次年度),Laで希釈したCMN温度計,Pr-NMR温度計を完成させ,液体H^^3e自信の温度を正確に測り,信号の絶対値をもう一桁上げて測定することにより,標記のテーマに結論を出せるものと期待している。また,400MHzでの音速測定も開始しており,音速の量子極限についても知見を得たいと考えている。
単分子架橋ナノ粒子二量体配列による単分子表面増強ラマン分光

金ナノ粒子二量体は,その粒子連結方向と入射光偏光方向が一致した際に,巨大な電磁場増強を引き起こすことが知られている.本研究では,巨大な増強を得るために,ナノトレンチを用いたセルフアセンブルによって方向が揃ったナノ粒子二量体アレイを基板上に生成した.入射光偏光方向と粒子連結方向が一致した際に最大のラマン強度が得られることを,実験による評価によって実証した。さらに,二量体間距離に最適値があることを明らかにし,構造の最適化を達成した。その結果,4,4'-ビピリジン分子を10 pMの極低濃度で検出することに成功し,また100 nMの溶液では0.2 sの短時間で検出できることを示した。平成25年度は,ナノギャップにおける電磁場増強理論を基本とした表面増強ラマン分光(SERS)増強メカニズムの理解と最適構造導出,および超高感度検出への応用に関する研究を行った。本研究課題では,ナノ粒子間の電磁場増強理論を基本として,SERS増強メカニズムの理解を進めている。粒子間ナノギャップの局在プラズモン共鳴(LSP)によるSERS増強度はナノ粒子のサイズ,ナノ粒子二量体連結方向,二量体間隔に大きく依存すると考えられる。平成25年度は,1上記のパラメータを変化させたナノ粒子二量体配列構造の電磁場解析とSERS分析実験により,それらの影響を明らかにし,最適構造を導出するとともに,2それを用いた農薬成分分子のpMレベルの超高感度検出を実現した。1ナノ粒子二量体配列構造の電磁場解析とSERS分析実験ナノ粒子のサイズ,ナノ粒子二量体連結方向,二量体間隔をパラメータとし,解析および実験の両面からそれらのSERS信号強度への影響を明らかにした。サイズに関しては,ナノ粒子密度との関係から100nmの粒子径が最適であることを明らかにした。また,連結方向依存性を実験的に調べ,電磁場解析結果との比較から,電磁場増強が支配的であり,一方向に配列した構造が適していることを明らかにした。さらに,ナノ粒子二量体間隔には最適値があることを初めて明らかにした。二量体において発生した双極子が作る電磁波が隣り合う二量体へ及ぼす影響を解析し,その影響による現象であることを明らかにした。これらの結果から最適な配列構造を導出するとともに,増強メカニズムに理解を進めることができた。2最適配列構造を用いた高感度分子検出実験的・解析的に導出した最適配列構造を用いて,農薬成分分子の一つである4,4'-ビピリジンのSERS分析を行った。その結果,検出限界濃度は10pMであり,高感度検出が可能であることが明らかになった。平成24年度は,単分子感度SERS特性の効率的評価に向けて,単分子架橋ナノ粒子二量体が一定方向に配列した構造(単分子架橋ナノ粒子二量体アレイ)を高収率で生成する技術の構築を行った。そのために,1分析対象分子溶液と銀ナノ粒子溶液から単分子架橋ナノ粒子二量体を高収率で生成する技術構築,2単分子架橋ナノ粒子二量体を申請者の保有技術によって基板上へ高収率で配列する技術構築を行った。1分子架橋ナノ粒子二量体の高収率生成技術分析対象分子溶液と銀ナノ粒子溶液を混合速度を制御可能なマイクロ流体デバイス内で混合し,粒子を凝集させることで単分子架橋ナノ粒子二量体を生成した。まずナノ粒子が分子を介して凝集するプロセスおいて,ナノ粒子凝集反応速度定数をパラメータに混合・凝集反応の数値解析を行い,実験結果と比較することにより,未知であった凝集反応速度を明らかにした。これにより,混合速度および粒子濃度,分子濃度をパラメータとした数値解析が可能となり,最適な条件を導出するとともに単分子架橋ナノ粒子二量対の高濃度生成を可能とした。この研究成果により,マイクロ流体デバイスにより混合速度を高めることによって,高い二量体濃度の溶液が生成可能であることを明らかにした。また,詳細な数値計算により支配的な要因を明らかにし,設計指針を示すことができた。2ナノ粒子の基板上への高収率配列技術申請者が保有するナノ粒子配列技術により,一定方向に揃えられたアレイパターンを基板上に作製するプロセス構築および条件最適化を行った。ここでは,これまでに得ている知見を基に,ナノ粒子濃度,テンプレート溝の長さ・幅・密度,塩濃度をパラメータとし,最適な条件を導出することでナノ粒子二量体の高収率な配列プロセスが可能となった。また,電磁場解析により,ナノ粒子二量体の電場増強度を計算し,最適なナノ粒子直径を明らかにした。

単分子感度の表面増強ラマン散乱(SERS)化学分析を発展させるために,巨大なSERS増強を生み出すナノ粒子二量体アレイの高効率生成基盤技術を確立するとともに,ナノ粒子二量体構造が電磁場およびラマン散乱光増強に及ぼす影響を明らかにすることで,超高感度SERS基板を目指した。平成26年度は,それまでに導出した最適構造を用いて単分子感度が得られているかどうかの実証実験を行った。検出時間,検出対象分子濃度を変化させた実験により,得られたラマン強度に特徴的なピークが複数見られ,単分子感度が得られていると考えられる結果が得られた。また,マイクロ流体デバイスへの金ナノ構造集積技術を構築した。さらに,配列のためのテンプレート基板を,電子ビーム描画装置を用いずにフォトリソグラフィを主体としたプロセスにより作製可能とし,より簡易的に低コストで配列を実現するための,より実用的な手法を構築した。研究期間全体を通して,(1)金ナノ粒子二量体アレイの高収率配列手法を確立し,(2)金ナノ粒子径および二量体間隔などの最適構造を実験的,理論的に導出し,設計指針を明確にするとともに,(3) 0.1 fMの検出下限濃度を有するSERS基板を実現し,かつ10 pM濃度では0.5秒での検出に成功するなど,高感度高速な分子検出技術を構築した。(4)さらに,単分子検出特性を明らかにし,単分子検出が可能であることを実験的に明らかにした。これらの成果により,単分子検出可能な,高感度SERS基板を高収率に作製することを可能とし,残留農薬や爆薬成分物質などの高感度検出とともに,生体分子の動的解析技術への適用と発展が期待される。ナノマイクロ加工単分子感度の表面増強ラマン分光(SERS)化学分析を発展させるために,(1)巨大なSERS増強を生み出すナノ粒子二量体アレイの高効率生成基盤技術(単分子感度SERS分析プラットフォーム)を確立するとともに,(2)ナノ粒子二量体構造の電場増強およびラマン光増強の効率的な特性評価を行うことによって,SERSのメカニズム解明および単分子超高感度化学分析を目的としている。平成24年度の高収率ナノ粒子二量体アレイ配列技術の構築に続いて,平成25年度に実施予定としていた最適ナノ粒子配列構造の導出とそのメカニズム解明を順調に達成した。さらに,平成26年度に計画していた超高感度化学分析のためのSERS分析に関して,農薬成分分子のpMレベルの検出を実現した。これは単分子レベルの検出感度と考えられる。さらに,ナノ/マイクロ流路中にナノ粒子配列を作製する技術を構築し,より効率的なメカニズム解明および単分子感度分析検証が可能となった。これらの結果から,平成26年度には単分子感度の実験的検証および理論的考察によるメカニズム解明,さらに他分子の分析・多成分分析,に関する研究を当初の計画より進展させることができると考えられる。そのため,現状では当初の計画以上に研究が進展したと評価した。単分子感度の表面増強ラマン散乱(SERS)化学分析を発展させるために,(1)巨大なSERS増強を生み出す単分子架橋ナノ粒子二量体アレイの高効率生成基盤技術(単分子感度SERS分析プラットフォーム)を確立するとともに,(2)単分子架橋ナノ粒子二量体構造の電場増強およびラマン光増強の効率的な特性評価を行うことによって,SERSのメカニズム解明を目的としている。目的実現のためにまず取り組むべきことは,単分子架橋ナノ粒子二量体が一定方向に揃ってアレイ化された配列を高収率で大量に生成する技術の構築となる。