hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
球状メソポーラスシリカ粒子の吸着特性とその高機能化に関する研究

1.球状メソポーラスシリカ形成過程:親油性のテトラブトキシシラン(T BOS)を界面活性剤を溶解した水溶液に攪拌分散して球状メソポーラスシリカの微細構造形成過程を検討した。反応開始後3時間で水相の界面活性剤がTBOS相に水を伴って溶解し,TBOS相で直径3-0nm程度のマイクロエマルションを形成する。さらに反応開始後6時間くらいからTBOS相で規則的なナノ構造形成を示すX線散乱分布を示した。8時間後にはヘキサゴナル構造を有する球状メソポーラスシリカ粒子が得られた。この粒子は細孔が連続しているという細孔構造を有するという特徴がある。このために、水相中のフェノールを高濃度で可溶化することができた。2.官能基を導入した球状メソポーラスシリカ体の調整:テトラエトキシシラン(TEOS)とアミノ基を有するトリエトキシシラン(SAPS)を同時にアニオン性界面活性剤を溶解した水溶液中で、加水分解、重縮合反応を進行させ,シリカ表面をアミノ基で表面修飾した。この複合体はTEOS量が少ない条件ではラメラ構造を有しており,TEOS量が多くなるとヘキサゴナル構造に転移した。このヘキサゴナル構造のシリカ粒子から界面活性剤を溶媒抽出によって除去して、高比表面積のアミノ修飾のシリカ粒子を合成できた。この粒子は、シックハウス症候群の原因物質であるアルデヒドなどを効率よく吸着分離できることが期待できる。また、界面活性剤にラウリルアミンを用いてシリカ表面にチオール基を有するメソポーラスシリカ粒子を調製した。この粒子は水相中のソフト金属である銀イオンを高効率で吸着分離することができた。この結果から、同様なソフト金属であり有害な水銀イオンを、低濃度条件から吸着分離する分離剤としての利用が期待できる。1.球状メソポーラスシリカの吸着性能評価:比表面積が1,000m^2/gを超える直径が500μm程度の球状メソポーラスシリカを、テンプレートとして界面活性剤を用いて調製した。球状メソポーラスシリカ中の界面活性剤をそのままにして、水溶液中に溶解している有機物質の吸着分離特性について詳細な検討を行った。その結果、界面活性剤の疎水基からなる疎水領域に水相中の有機物質が可溶化され、その可溶化量は有機物質の疎水性の程度が高くなるほど大きくなった。2.官能基を導入した球状メソポーラスシリカ体の調製:調製した球状メソポーラスシリカから界面活性剤を焼成または溶媒抽出により除去した。表面のシラノール基にアミノ基を有するトリエトキシシランを縮合反応で表面修飾を行った。このようにアミノ基を表面に導入した球状メソポーラスシリカを用いて水溶液中のイオン性界面活性剤の吸着特性を評価した。3.球状ロソポーラスシリカ・チタニア複合体の調製:現在、球状のメソポーラスシリカを調製する際にチタンアルコキシドを共存させることによって、球状のシリカ・チタニア複合体を合成できることが明らかとなっているが、その強度が弱いという問題点があった。そこで、メソポーラスシリカの球状を保ったままチタニアを複合化し強度の大きな球状メソポーラスシリカ・チタニア複合体を合成した。得られた複合体を用いて、水溶液中のメチレンブルーの吸着特性および光分解特性を評価した。1.球状メソポーラスシリカ形成過程:親油性のテトラブトキシシラン(TBOS)を界面活性剤を溶解した水溶液に撹拌分散して球状メソポーラスシリカの微細構造形成過程を検討した。反応開始後3時間で水相の界面活性剤がTBOS相に水を伴って溶解し,TBOS

相で直径3.0nm程度のマイクロエマルションを形成する。さらに反応開始後6時間くらいからTBOS相で規則的なナノ構造形成を示すX線散乱分布を示した。8時間後にはヘキサゴナル構造を有する球状メソポーラスシリカ粒子が得られた。この粒子は細孔が連続しているという細孔構造を有するという特徴がある。このために、水相中のフェノールを高濃度で可溶化することができた。2.官能基を導入した球状メソポーラスシリカ体の調整:テトラエトキシシラン(TEOS)とアミノ基を有するトリエトキシシラン(SAPS)を同時にアニオン性界面活性剤を溶解した水溶液中で、加水分解、重縮合反応を進行させ,シリカ表面をアミノ基で表面修飾した。この複合体はTEOS量が少ない条件ではラメラ構造を有しており,TEOS量が多くなるとヘキサゴナル構造に転移した。このヘキサゴナル構造のシリカ粒子から界面活性剤を溶媒抽出によって除去して、高比表面積のアミノ修飾のシリカ粒子を合成できた。この粒子は、シックハウス症候群の原因物質であるアルデヒドなどを効率よく吸着分離できることが期待できる。また、界面活性剤にラウリルアミンを用いてシリカ表面にチオール基を有するメソポーラスシリカ粒子を調製した。この粒子は水相中のソフト金属である銀イオンを高効率で吸着分離することができた。この結果から、同様なソフト金属であり有害な水銀イオンを、低濃度条件から吸着分離する分離剤としての利用が期待できる。
チオールプローブを用いたアミノグリコシド耐性菌迅速検出法の開発

近年、多剤耐性緑膿菌による院内感染が深刻化している。抗生剤療法が困難な多剤耐性菌の早期検出は当該分野における重要課題である。近年、臨床分離される多剤耐性緑膿菌の多くが、外来性アミノグリコシド修飾酵素を産生し、薬剤を不活化することでアミノグリコシド耐性を獲得していることが分かってきた。本研究では、アミノグリコシド修飾酵素が薬剤を不活化する際にチオールを生成することに着目し、チオールプローブを用いた発色法あるいは蛍光法によるアミノグリコシド耐性菌の迅速検出を試みた。今年度は、チオールプローブを用いたアミノグリコシド(6')-N-アセチル基転移酵素(AAC(6'))産生菌の迅速検出法開発をめざし、反応条件の最適化を行った。アセチルCoA、チオールプローブ(DTNB)、およびアミノグリコシドを含む溶液を検出試薬として調整した。20ulの菌溶解液と180 ulの検出試薬を96 wellプレート上で混合し、37°Cで15分間反応させた後、412 nmにおいて呈色反応を観察した。各種界面活性剤を用いて菌体溶解液を調製し反応条件の最適化を試みたが、AAC(6')非産生菌においても呈色反応が見られたことから、DTNBがTNBに分解される反応を界面活性剤がAAC非依存的に促進している可能性が強く示唆されたため、超音波破砕による菌体液の調整が適していることが分かった。至適濃度を検討する実験においては、検出試薬に含まれるアセチルCoAおよびDTNBの濃度を変えた場合、濃度依存的に呈色反応が上昇する一方で、アミノグリコシドは濃度を変えても、呈色反応に影響がないことが分かった。臨床分離株を用いた本検出法の評価試験では、AAC(6')産生株において呈色反応が起こる一方で、感受性株においても呈色反応が確認され、現在の検出系では擬陽性が得られる可能性が強く示唆された。チオールプローブを用いた蛍光法による耐性菌検出に関しては、DTNBと同様に菌体溶解液を調製し蛍光反応を観察した結果、AAC(6')を産生株で蛍光反応は得られたものの蛍光シグナルは弱く、迅速診断法に適していないことが示唆された。チオールプローブを用いた発色法による耐性菌検出に関しては、各種界面活性剤を用いてNCGM2.S1、NCGM798、PAO1、ATCC27853の菌体溶解液を調製し、アミノグリコシド、アセチルCoA、およびDTNBを含むTris緩衝溶液を用いて呈色反応を観察した結果、アミノグリコシド(6')-N-アセチル基転移酵素を産生しているNCGM2.S1、NCGM798にのみ呈色反応が起こることを確認した。25°Cで反応させるよりも、37°Cで反応させる方が有効である事が明らかになった。チオールプローブを用いた蛍光法による耐性菌検出に関しては、上述の方法と同様にNCGM2.S1、NCGM798、PAO1、ATCC27853の菌体溶解液を調製し、アミノグリコシド、アセチルCoA、および蛍光チオールプローブを含むTris緩衝溶液を用いて呈色反応を観察した結果、アミノグリコシド(6')-N-アセチル基転移酵素を産生しているNCGM2.S1、NCGM798にのみ呈色反応が起こることを確認したが、蛍光シグナルは弱い事が明らかとなった。検出法開発と同時に、チオールプローブを用いて、本検出法の標的とするアミノグリコシド(6')-N-アセチル基転移酵素の反応機序の解析も実施した。酵素の3D予測構造を元に予測アミノグリコシド結合部位のアラニンスキャン解析を行い、呈色反応により反応の有無を観察した結果、アミノグリコシド6'-N-アセチル基転移に必須のアミノ酸を同定した。呈色反応が見られない変異体産生株は、各種アミノグリコシドのMICも低下していることを確認した。本年度は、研究計画に記載した実験をほぼ全て行う事ができた。臨床分離株を用いて、発色法あるいは蛍光法によるアミノグリコシド耐性検出の有用性を検証する。aac(6')遺伝子を保有しているアミノグリコシド耐性緑膿菌株、耐性機序が不明なアミノグリコシド耐性緑膿菌株、アミノグリコシド感受性緑膿菌株を試験対象とする。同時に、アミノグリコシド耐性および感受性アシネトバクターについても試験する。同時に、キット化を目指すためのプロトコールを確立する。具体的には、発色法の場合、基質を含む菌体溶解液の安定性の検討を行う。また、菌体溶解液にピペットを使用せずに基質を加えられるシステムを検討する。検出法開発に必須である抗生剤、チオールプローブ、バファー等のに購入する。病原細菌取り扱いのため、菌の培養容器や検出に使用する各種試験管、マイクロプレート、などは、基本的に使い捨てできるものを購入する。
間欠曝気方式による畜舎汚水の窒素除去方法の開発に関する研究

畜舎排水による水域への汚濁負荷を削減するために運転制御が簡単で管理費が安く、高効率に処理が行える排水処理プロセスが望まれている。本研究では、畜舎排水に含まれている高濃度の窒素化合物および有機物を効率的に除去するために間欠曝気活性汚泥法を用いた畜舎廃水処理システムの開発をめざした。いかに研究成果を示す。(1)畜舎排水の性状既往の研究の整理から、家畜尿汚水の特徴として、「汚濁負荷量が高い」、「汚水の汚濁成分濃度が高い」等が挙げられる。とくに豚舎排水は汚濁負荷量が高く、また尿汚水中の窒素濃度は高く、炭素:窒素の比が生物学的処理にそぐわないことがわかった。(2)間欠曝気活性汚泥法による豚舎排水の処理室内実験において、回分式活性汚泥法を間欠曝気で運転し、その好気・嫌気時間を各4時間に設定した。MLSSを3,000mg/l、BODを350mg/l総窒素(T-N)を450mg/lで処理したところ、BOD除去率が90%、硝化の進行が良好に行なわれた。さらに脱窒については有機炭素源としてメタノールを用いたところ効果的に窒素の除去が行えたが、さらに適正な運転方法の検討が必要であった。(3)パイロット試験装置による実証実験反応容積20m^2のパイロット実験装置を用いて豚舎排水の処理を行なった。MLSSが9,00011,000mg/l、BOD容積負荷として0.350.54kg/m^3/dayの範囲では、平均除去率はBODで96.9%、T-Nで92.6%となった。本実験の範囲内では曝気1時間、嫌気1時間であっても窒素除去は十分達成できた。一方、リンの除去率は11.7%にとどまり、生物学的手法では十分対応できないことが明らかになった。また活性汚泥中の生物相の観察からTeramitus sp.等指標生物として勝つようできる生物種の選択の可能性が示された。本研究では、畜舎の実態調査を踏まえたうえで、室内実験と現場ニミプラント実験を通じて、間欠曝気処理法による有機物、窒素の同時除去が可能な畜舎排水処理システムを確立することを目的として、豚舎からの汚濁負荷と処理状況の実態調査を行うとともに、地球温暖化ガスの発生を最小限に抑制するための窒素除去方法の開発を行った。室内実験では種活性汚泥として現在良好に稼働しているラグーン槽のものを用いて、MLSS 3000mg/lに調整した。原水としては豚舎の糞尿を分離した後の尿を用いた。実験条件は、12時間周期で曝気(好気)と嫌気時間を4通りに組み合わせ(間欠曝気)て行った。原水濃度がBOD350mg/l,T-N450mg/lの実験を行った。得られた結果は次の通りである。畜舎からの汚濁負荷の実態調査から、豚1頭当たりの汚濁負荷の発生量は、5.4kg・day^<-1>、BODにすると130g・day^<-1>となり、人間の一人当り1.5kg・day^<-1>、BOD13g・day^<-1>に比べて豚からのふん尿の発生量が多いことがわかった。また、間欠曝気の反応槽およびミニプラント装置の制作を行った。好気、嫌気各4時間の場合、BODの除去と硝化が良好に行われた。現在BOD1000m/l,T-N1000mg/lの実験が進行中である。また、処理効率と実験水槽内に出現する各種細菌(好気性細菌、嫌気性細菌、硝化細菌等)との関係を考察するために、好気性細菌、嫌気性細菌、硝化細菌、真菌類、放線菌等の測定も実施中である。MLSSが9,00011,000mg/

l、BOD容積負荷として0.350.54kg/m^3/dayの範囲では、平均除去率はBODで96.9%、T-Nで92.6%となった。本実験の範囲内では曝気1時間、嫌気1時間であっても窒素除去は十分達成できた。一方、リンの除去率は11.7%にとどまり、生物学的手法では十分対応できないことが明らかになった。また活性汚泥中の生物相の観察からTeramitus sp.等指標生物として勝つようできる生物種の選択の可能性が示された。本研究では,間欠曝気処理法による有機物,窒素の同時除去が可能な畜舎汚水の処理システムを確立することを目的に,畜舎排水処理の実態調査とともに室内実験装置および現場ミニプラントを用いた処理実験を行ない,処理効率の最適化の検討を行なった。まず豚尿汚水を用いた室内処理実験において,平成7年度で明らかにできなかった運転条件(窒素負荷,好気・嫌気のサイクル時間などの条件)と処理効率について検討したところ,1サイクル24時間,MLSS 3000mg/l,実際の豚尿汚水処理場における負荷条件の5倍と10倍の高負荷運転条件では,有機物はどちらも90%以上の除去率を得たが,全窒素の除去率は30%前後にとどまった。これは,硝化反応は進行したものの,脱窒素のための有機物の不足が考えられ,今後は人為的に有機物(汚水の間欠投入・メタノールなど)を投入する必要がある。また活性汚泥中の原生動物相を観察したところ,生活排水処理で見られる動物相と大きな違いはなく,安定していた。さらに畜舎の脇に反応槽容量20トンのミニプラントを設置した。すでに汚水を投入しているが,室内実験の結果を踏まえた運転条件にむけて調整中である。畜舎排水は、汚濁負荷量が極めて高いにもかかわらず、多くが零細企業のための処理が不完全のまま放流されている例がほとんどである。このような畜舎排水からの汚濁負荷の削減、とくに栄養塩類の適切な処理方法の確立は、水域の環境改善および保全にとって必要不可欠である。本研究では,畜舎の実態調査を踏まえたうえで,室内実験と現場プラント実験を通じて,間欠曝気処理法による有機物,窒素の同時除去が可能な畜舎排水処理システムを確立させることを目的としている。まず豚舎からの汚濁負荷と処理状況の実態調査を行うとともに,室内実験による間欠曝気方式による回分式活性汚泥法運転条件の最適化をはかったうえで,反応槽容積20トンの現場プラント装置を稼働させ,畜舎排水の高度処理の実用化に向けた最適運転条件の検討を行なった。得られた結果は次の通りである。1)間欠曝気運転を好気,嫌気各4時間に設定し,MLSS3000mg/l,原水濃度をBOD350mg/l,T-N450mg/lで処理実験したところ,BODの除去が90%となり,また硝化が良好に行われた。さらに脱窒に関しては,メタノールを効果的に用いることで目標水質を達成できた。2)活性汚泥中の生物相の観察から,高濃度窒素含有排水である畜舎排水に特異的に出現する原生動物を検出し,指標生物として活用できることを見いだした。3)間欠曝気回分式活性汚泥法による現場プラント実験の結果,処理水中のBODは140210mg/l,T-Nは62108mg/l,除去率はそれぞれ96%,94%となり,安定して除去することができた。一方,T-Pの除去率は最大33%となり,生物学的処理では十分対応できなかった。
骨再生を誘導する骨セメントの開発とその利用によるMasquelet法の革新的改良

本研究では、大きな骨欠損を患者の負担をできるだけ小さく治療する技術確立のために、骨再生能力の高い新規骨セメントを開発し、それを利用した治療法を提案することを目的とする。そのために、従来の治療における骨修復メカニズムを解明すると共に、その知見を利用した新規骨セメントの創製を行う。創製した骨セメントの材料学的および生物学的評価を行うことで、骨再生能力を評価すると共に、それを利用した治療法の検討を行う。
沈澱抑制剤による炭酸カルシウムマイクロカプセル調製の収率向上

炭酸カルシウム微粒子(粒径約1μm)を単粒子球殻状に配列させ炭酸カルシウムで結合した構造の壁を持つマイクロカプセルの調製法について研究を行った。同法ではまず水中の油滴を炭酸カルシウム粒子の単粒子層で覆い、炭酸カルシウムを粒子間に析出させ結合する。このバインダー炭酸カルシウムの析出法として当初は空気中の希薄な炭酸ガスをアルカリ性のカルシウム塩溶液に12-24時間吸収させていたが生成効率が低かったため,クエン酸ナトリウムなどの有機沈殿抑制剤の存在下でカルシウム塩と炭酸塩を混合する方法に改良したところ生成効率が大幅に向上した。例えば前法では1gの炭酸カルシウム粒子から得られる中空球体は0.2g以下であったのに対し改良法では1g以上(バインダー重量も含まれるため)となった。そこで本研究では,有機沈殿抑制剤や無機電解質の種類や濃度,水溶液のpH等の条件について詳細な検討を行い以下の結果を得た。(1)有効な有機沈殿抑制剤の検討:クエン酸塩の他に,酒石酸塩,乳酸塩及びEDTAをそれぞれ抑制剤に用いて結果を比較した。酒石酸塩ではクエン酸塩とほぼ同様の結果が得られたが,乳酸塩やEDTAでは生成効率は前2者より著しく低かった。さらにクエン酸塩でもアンモニウム塩では生成効率が低かった。これは有機酸の解離度,有機酸イオンとカルシウムイオンが生成する錯体の安定度,有機酸添加によるイオン強度やpHの変化等の条件が異なるためと考えられる。そこで以後抑制剤としてはクエン酸ナトリウムを採用した。(2)現在までに,1.0gの炭酸カルシウム粒子から中空球体を得るには,塩化カルシウム,クエン酸ナトリウム及び炭酸ナトリウムのそれぞれ0.07M(混合後)混合溶液300ml中でバインダー析出を行わせるのが,最適であることがわかった。各電解質の濃度が低い場合,クエン酸添加が過剰な場合,及び溶液量が小さい場合には生成効率は著しく低下した。バインダー析出の最適条件では溶液混合直後に,主に炭酸カルシウム微粒子からなる濃厚な懸濁液が炭酸カルシウム粒子に被覆された油滴を取り込んで生成し,この懸濁液の安定性及び溶液混合により生成した炭酸カルシウム微粒子の成長等の挙動が生成効率に密接に関わっていると推察された。
全ゲノム解析による先天多発奇形の病因解析

多くが原因不明とされるヒトの先天異常に対して、さまざまな網羅的ゲノム解析技術を応用して、その原因や発症メカニズムを明らかにした。診断法の確立、医療管理指針作成や、発生頻度の推定、さらには治療(症状軽減)法の手掛かりを得ることによる先天異常の予後改善を目標に据えた。研究期間内に180例の先天異常症例を臨床的にスクリーニングし、既知疾患120症例を除外、文書により同意が得られた60症例に対して、メンデル遺伝病責任遺伝子を中心とした臨床エクソームを行った。検出された変異に対しては、トリオシーケンスないしは細胞遺伝学的解析(CGHマイクロアレイ解析ならびにFISH解析)により検出変異の確定を行った。12症例で疾患原因となる遺伝子変異ないしはゲノム微細構造異常を検出した。検出された変異の5つの変異は未報告変異で、先天異常におけるゲノム変異と表現型(臨床症状)の相関関係を明らかにすることができた。具体的成果として、複雑なゲノム再構成により古典型Ehlers-Danlosを発症した男性で、マイクロアレイCGH解析とメンデル遺伝病エクソーム解析を組み合わせて、exon単位での複雑再構成を明らかにした(Kuroda et al., 2018)。現在まで、古典型Ehlers-Danlos症候群でゲノムの複雑再構成による発症例は極めてまれで、希少難病の発症メカニズムの一つとして考慮すべきと考えられた。ロングリードでの全ゲノムシーケンスなどによる再構成の際の方向性を明らかにすべきであることから、いくつかの課題が残った。既に、検出されたゲノムベースの変異と臨床症状(表現型)の相関関係、さらにヒトの発生異常をきたした変異の発症メカニズムに関する検討は、この第2年度までに総計5報の論文として公表するに至った。網羅的なゲノム解析技術を用いて先天多発奇形症例の表現型とゲノム変化の相関関係を明らかにし、異常表現型から正常発生の仕組みを明らかにする。今後は解析技術として全ゲノムシーケンス解析やRNAseqを導入し、遺伝子発現調節領域の変化も視野に入れる。さらに発症がその候補遺伝子の機能障害であることを確認するために、患者細胞を用いた機能解析を進める。具体的には、遺伝子転写産物の発現の定量化(多くは初期発生に関わる遺伝子である可能性が高いために、株化リンパ芽球をいったん樹立して異所性に発現するmRNAを定量する必要がある)など転写産物解析を行う。並行して、先天多発奇形症例800例のゲノムサンプルのスクリーニングにより、同じ遺伝子の変異を原因とする先天多発奇形を検出し、臨床症状を比較することにより、ヒトの発生に関わる遺伝子の普遍的な機能と病態の関連性を明らかにする。研究期間内に250例の先天異常症例を臨床的にスクリーニングし、既知疾患130症例を除外、文書により同意が得られた90症例に対して、メンデル遺伝病責任遺伝子を中心とした臨床エクソーム解析を行った。15症例で疾患原因となる遺伝子変異ないしはゲノム微細構造異常を検出した。検出された7つの変異は未報告変異で、先天異常におけるゲノム変異と臨床症状(表現型)の相関関係を明らかにすることができた。具体的成果として、精神遅滞・自閉症を主症状とする男児例において、SYNGAP1遺伝子に従来位報告のない新規の遺伝子変異を検出した(Kimura & Kurosawa, Cong Anom. 2018)。これまで報告された多くのSYNGAP1(シナプス性RAS-GTPase活性化タンパク1)変異症例は、小頭症、てんかん、精神遅滞を主症状とし、大頭症はほとんど記録がない。しかしながら、本例は大頭症と特徴的顔貌を有し、その変異はRasGAPドメインに位置していた。本例は本邦で最初のSYNGAP1変異症例で、かつ、ドメインの機能的重要性と結果としての臨床症状(表現型)の相関関係を検討する上で極めて重要な症例であった。既に、検出されたゲノムベースの変異と臨床症状(表現型)の相関関係、さらにヒトの発生異常をきたした変異の発症メカニズムに関する検討は、初年度に3報の論文として公表するに至った。

具体的成果として、複雑なゲノム再構成により古典型Ehlers-Danlosを発症した男性で、マイクロアレイCGH解析とメンデル遺伝病エクソーム解析を組み合わせて、exon単位での複雑再構成を明らかにした(Kuroda et al., 2018)。現在まで、古典型Ehlers-Danlos症候群でゲノムの複雑再構成による発症例は極めてまれで、希少難病の発症メカニズムの一つとして考慮すべきと考えられた。ロングリードでの全ゲノムシーケンスなどによる再構成の際の方向性を明らかにすべきであることから、いくつかの課題が残った。既に、検出されたゲノムベースの変異と臨床症状(表現型)の相関関係、さらにヒトの発生異常をきたした変異の発症メカニズムに関する検討は、この第2年度までに総計5報の論文として公表するに至った。網羅的なゲノム解析技術を用いて先天多発奇形症例の表現型とゲノム変化の相関関係を明らかにし、異常表現型から正常発生の仕組みを明らかにする。今後は解析技術として全ゲノムシーケンス解析を導入し、遺伝子発現調節領域の変化も視野に入れる。さらに発症がその候補遺伝子の機能障害であることを確認するために、患者細胞を用いた機能解析を進める。具体的には、遺伝子転写産物の発現の定量化(多くは初期発生に関わる遺伝子である可能性が高いために、株化リンパ芽球をいったん樹立して異所性に発現するmRNAを定量する必要がある)など転写産物解析を行う。並行して、先天多発奇形症例800例のゲノムサンプルのスクリーニングにより、同じ遺伝子の変異を原因とする先天多発奇形を検出し、臨床症状を比較することにより、ヒトの発生に関わる遺伝子の普遍的な機能と病態の関連性を明らかにする。今後は解析技術として全ゲノムシーケンス解析やRNAseqを導入し、遺伝子発現調節領域の変化も視野に入れる。1年度のみでは当初予定とした症例数に至っておらず、引き続きのゲノム解析が必要で、かつ得られた成果の公表と成果を用いた海外研究施設との国際共同研究への発展も視野にはいるので、次年度使用は必要である。第2年度のみでは当初予定とした症例数に至っておらず、引き続きのゲノム解析が必要で、かつ得られた成果の公表と成果を用いた海外研究施設との国際共同研究への発展も視野にはいるので、次年度使用は必要である。
生体膜をモデルとしてのリポソームと歯科材料の相互作用の研究

1.リポソームは生体膜モデルとして広く用いられている。歯科材料の生体膜損傷のメカニズムを明らかにするため、りん脂質二重層よりなるリポソームを用いて、これらの化合物との相互作用を示差走査熱量計(DSC)および^1H、^<13>CNMRで研究した。リポゾームはジパルミトイルホスファイチジルコリン(DPPC)を用いた。この結果重合性モノマー類はリン脂質リポソームに取込れることが明らかになった。モノマー類はDPPCリポソームの相転移温度を低温シフトさせ、エンタルピー(△H)を減少させた。Bis-GMAモノマーについても同様に検討した。OH基をもつBis-GMA、Iso-BisGMAはOH基をもたないBis-MEPP、Bis-MPPに比べ、DPPC-コレステロール(CS)リポソーム系に対し大きな相互作用を示した。これはOH基をもつ化合物は界面活性作用をもつのでリポソーム系と大きく相互作用したと考えられた。その他重合開始剤や禁止剤についても研究した。これらの相互作用は低濃度でも大きかった。2.フェノール誘導体(フェノール、ユージノール等)のDPPCリポソーム相互作用をDSC、NMRで検討した。本誘導体でもアルキル置換基の疎水性が増すにつれ、相転移温度が低温シフトし、△Hの減少も大きくなった。ユージノールはDPPCのアシル基と強く相互作用し、NMRのプロトン及びカーボンのケミカルシフトがみられなかった。3.歯科用金属塩類のDPPC-CS系リポソーム相互作用を前と同様な方法で研究した。多価カチオンは一価のカチオンより相互作用は大きかった。1.レジン充填材料,歯質接着性レジン,レジンボンデング剤に広く用いられている重合性モノマーの生体膜損傷作用のメカニズムを明らかにするため,生体膜のモデルとしてジパルミトイル・ホスファチジルコリン(DPPC)とコレステロール(CS)より成るリポソームを調製した.そしてモノマー類とDPPC-CS系リポソームの相互作用を示差走査熱量計(DSC)核磁気共鳴法(NMR)を用いて研究した.モノマは市販品を精製して用いた.とくにBis-GMAモノマーより液体クロマトグラフィーで異性体Iso-Bis-GMAを分離した.DPPC-CS系リポソームのDSCパラメーター(相転移温度,エンタルピー,エントロピー, DSCピークの半値幅)の変化は, Bis-GMA, Iso-Bis-GMAが最も大きかった.これらBis-GMAモノマーはOH基と疎水性の高いジフェニールプロパン基をもつ.同じBi_5-GMA関連モノマーの中でもOH基をもたないモノマー類のDSC変化は小さかった.以上のことより, OH基をもつBis-GMAモノマーは膜中のコレステロールに透入しやすく,膜構造を乱し易いことが明らかになった.OH基をもつBis-GMAモノマーの高い溶血性は膜中のコレステロールへのモノマーの透入によると結論づけた.2.生体膜とモノマーの相互作用を直接知る方法として, JNM-GX270NMRで実験を行なった.生体膜のモデルとしてDPPCリポソームを用いた. ^1H, ^<13>CNMRにより,重水中の系に添加したメチルメタクリレート(MMA)はDPPCリポソームに取込まれることが明らかになった.とくにモノマー中の二重結合部分がりん脂質二重層に取込まれ易いことが分かった.1.リポソームは生体膜モデルとして広く用いられている。歯科材料

とくに重合性レジンモノマーの生体膜損傷のメカニズムを明らかにするため、ジパルミトイルホスファチジルコリン(DPPC)を用いてルポソームを調整し、モノマーとの相互作用を核磁気共鳴装置(NMR)を用いて検討した。その結果、Methy1 Methacrylate Ethylene Dimethacrylateはそのプロトン1およびカーホン13ケミカルシフトを高磁場シフトさせた。このことから、モノマー類はりん脂質に取込まれることが明らかになった。メチルメタクリレート:41%、エチレンジメタクリレート:74%(取込量)。Bis-GMAモノマー/DPPCリポソーム系においては、モノマー類がDPPCと強く相互作用するための、数万回の積算後モノマーのカーボン13ケミカルシフトが検出できた。一級アルコールのBis-GMA異性体(Iso-Bis-GMA)はDPPCとより強く相互作用した。特くに、酸化亜鉛ユージノールセメントに用いられるユージノールは、DPPCと強く相互作用し、DPPCのアシル基の運動を制限させた。これに反し、フエノールの相互作用は小さかった。ケミカルシフトの高磁場シフトは見られなかった。2.歯科用金属塩類とDPPC/コレステロール系リポソーム相互作用を示差走査熱量計(DSC)により検討した。多価カチオン(Fe^<+3>、Zn^<2+>、Ca^<2+>)は1価カチオン(Na^+、K^+、Ag^+)よりDSC相互作用が大きかった。Ca^<2+>は膜安定作用を示した。アニオン類では、F^-に比べOCl^-の相互作用が大きかった。
光干渉断層画像装置による根管観察および象牙質切削に関する検討

本研究課題では、内部に根管もしくは歯髄腔を有する象牙質を光干渉断層装置(OCT)で観察した。上顎大臼歯髄床底の観察では、近心頬側第2根管の検出率を調査した。肉眼や歯科用実体顕微鏡(DOM)による検出率と比較したところ、OCTにより、検出率が高まる可能性が判明した。下顎大臼歯の歯冠部象牙質の観察では、象牙質の厚み2.33mm以下で歯髄腔の位置を検出することができた。歯根根尖部では、側枝やイスムス形態を観察できた。以上より根管治療時、OCTの使用は、より正確かつ確実な診断および処置をもたらすと推察される。本研究課題では、内部に根管(歯髄腔)が含まれている歯冠部象牙質および髄床底部象牙質を光干渉断層画像装置(以下OCT)で観察する。これにより、髄腔開拡時や根管探索時により正確かつ確実な診断および処置を行うことが可能かどうかを検討することである。根管治療において、未処置の根管が存在すると感染壊死歯髄の残存・死腔の存在により予後に悪影響を与えると考えられる。上顎大臼歯の第4根管は抜去歯を用いた研究において上顎第一大臼歯で5579.8%存在すると報告されている、しかし臨床的には歯科用実体顕微鏡(以下MS)を用いても33.157.9%しか発見できないと報告されている。OCTを用いて観察・処置を行うことで第4根管を見逃さずに治療を施行することが可能となれば根管治療の成功率も上がると考えられる。上顎大臼歯の髄床底をOCT(Santec OCT-2000®, Santec,小牧)にて観察し、根管口付近の形態評価を行った。ヒト抜去上顎大臼歯40本を髄腔開拡、3根管の上部形成まで行った状態で、第4根管(近心頬側第2根管)の観察を行った。被験歯は、予めマイクロフォーカスX線CT(inspeXio SMX100CT®,島津製作所,京都)撮像を行い、非破壊的かつ正確に第4根管の有無の確定を行った。3人の評価者が肉眼・歯科用実体顕微鏡(OPMI®pico, Carl Zeiss,ドイツ)・OCTを用いて第4根管の有無についてスコア化し、統計学的解析を行った。その結果、OCTを用いる事で第4根管の検出率が上がること、観察者間の一致度も高く、客観的な評価が可能であることが判明した。また、OCTとEr:YAGレーザーを併用し、OCTで髄腔を観察しながらMS下でEr:YAGレーザーを用いて歯質を切削し、髄腔開拡を行うことが可能であることを確認した。本研究課題では、内部に根管もしくは歯髄腔を有する歯冠部象牙質を光干渉断層装置(OCT)で観察する。根管治療時の髄腔開拡は、歯軸の方向やレントゲン写真上での歯髄腔の位置を参考にしながら行われる。しかし、歯髄腔の狭窄や歯軸の頬舌的な傾斜等により歯髄腔の三次元的な方向の把握が困難な症例に遭遇することがある。髄腔開拡を誤った方向に進めてしまった場合に穿孔が起きてしまう恐れがある。髄腔開拡時の穿孔は歯頸部付近に起きることが多く、その場合の予後は特に悪く、抜歯に至る可能性がある。また、歯髄に近接するう蝕治療の際、歯髄保存の成否は露髄の有無に大きく左右される。事前にう蝕除去による露髄が予測される場合には非侵襲性歯髄覆罩(AIPC)を選択することも可能となる。また、生活歯における支台歯形成の際には歯髄腔までの距離が十分に確保できていることが予後を左右する。しかしながら術中に歯髄腔までの象牙質の厚みを把握することは困難で、偶発的に露髄し、抜髄が適応となる症例もある。研究では、ヒト抜去下顎大臼歯10歯を用い、最大豊隆部で歯冠を切断し、切断面から髄角までの距離をMicro CT, CBCT, OCTを用いて計測した(SL, CL, OL)。SLをGold Standardとし, SL, OL, CLの3者間の相関関係を解析した。SL 2.33mm以下では、OCTで髄角を検出できた。SLとOL, SLとCL,CLとOLはそれぞれ強い正の相関関係を認めた(r =0.96, 0.87, 0.86)。残存象牙質が2.33mm以下の場合、OCTで髄腔の位置を把握できる可能性がある。またOCTとCBCT画像による計測値が正の相関関係にあることから、それぞれを複合させた画像診断により臨床的な非破壊検査に応用できる可能性が示唆された。本研究課題では、内部に根管を有する象牙質を光干渉断層計(OCT)で観察する。外科的歯内療法を行うにあたり、根尖部の解剖学的形態の評価には、現在歯科用コーンビームCT(CBCT)を用いている。しかし、解像度やアーティファクトにより微細な解剖学的形態を検出することは困難なことが多い。そこで本研究では、OCTを用いてヒト上顎小臼歯根尖切断面の観察を行い、CBCT、歯科用実体顕微鏡(DOM)と比較し、その有用性を検討することを目的とした。ヒト抜去上顎小臼歯

6歯の根尖部をMicro CTで撮像し、Gold Standardとした。その後、CBCTで撮像を行った。それから、根尖部を1mm切断し、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)製剤を塗布後、生理食塩水で洗浄した。切断面にメチレンブルー染色を行い、DOMとOCTで観察し、根管数の検出精度を評価した。この操作を3回繰り返し、最終的には根尖から3mmの切断面の観察を行った。CBCTで検出できなかった微細な根管を、OCTにより検出することができた。CBCT撮像時、歯根周囲組織の影響により、生体においてはさらに検出困難となる可能性がある。一方、OCTは根尖切断面の表層部の解剖学的構造物を検出でき、リアルタイムで非侵襲的に観察できる。OCTは術中の使用が可能であり、外科的歯内療法における根尖部形態の評価に有用である可能性が示唆された。以上のように、歯根端切除標本の観察において、根尖切断面の観察にOCTが有用である可能性が示唆された。本研究課題では、内部に根管もしくは歯髄腔を有する象牙質を光干渉断層装置(OCT)で観察した。上顎大臼歯髄床底の観察では、近心頬側第2根管の検出率を調査した。肉眼や歯科用実体顕微鏡(DOM)による検出率と比較したところ、OCTにより、検出率が高まる可能性が判明した。下顎大臼歯の歯冠部象牙質の観察では、象牙質の厚み2.33mm以下で歯髄腔の位置を検出することができた。歯根根尖部では、側枝やイスムス形態を観察できた。以上より根管治療時、OCTの使用は、より正確かつ確実な診断および処置をもたらすと推察される。本年度は、残存象牙質の厚みが2.33mm以下の場合に、象牙質内部の歯髄腔をOCTで検出できる可能性が判明した。これにより、う蝕処置や根管治療の際に、被曝せずにリアルタイムで歯髄腔の位置を把握することが可能となり、過剰な歯質切削や抜髄を避けられる可能性が示唆された。本年度の研究報告として、国際学会では4報、国際論文では1編を発表した。昨年に引き続き、さらに研究内容を深めることができた。またそれを国外で発表することにより、OCTの歯科領域での有用性、特に歯内領域における根管探索や象牙質内部の歯髄腔検出時の有用性を報告することができた。従って、本研究課題である、OCTを用いた根管観察および象牙質切削に関する検討に対しておおむね順調に進捗していると言える。歯内療法今後の方針としては、引き続き当初の申請通り以下の検討を行う。実験には髄腔開拡モデルとしてヒト抜去下顎前歯30本を、根管探索モデルとして上顎大臼歯30本を用いる。被験歯は修復がなされていないものと1級修復がなされているもので明らかな実質欠損が無いものを選ぶ。1被験歯をマイクロX線CTにて撮像を行う。2下顎前歯は歯髄腔までの距離が1 mm程度になるように歯冠を歯軸に垂直に切断する。3上顎大臼歯は通法通り髄腔開拡・天蓋除去を行う。OCT群:OCTで象牙質および歯髄腔や根管を観察しながら、ダイヤモンドポイント・超音波チップ・レーザー照射チップを用いて、象牙質の切削を行う。肉眼群:肉眼で象牙質を観察しながら、ダイヤモンドポイント・超音波チップ・レーザー照射チップを用いて、象牙質の切削を行う。歯科用実体顕微鏡群:歯科用実体顕微鏡で象牙質を観察しながら、ダイヤモンドポイント・超音波チップ・レーザー照射チップを用いて、象牙質の切削を行う。すべての群で下顎前歯は露髄するまで、上顎大臼歯は近心頬側第2根管の有無の判定をするまで切削を行う。4各群の切削後にマイクロCT撮影を行い、切削方向・切削量・穿孔の有無の評価を行い、近心頬側第2根管の有無の判定の正確さも含めて、各群間の比較検討を行う。
L函数の特殊値、零点と保型形式の研究

数年前,池田は一変数の保型形式から多変数のジーゲル保型形式へのリフティングを構成した.このリフティングの対角集合への制限を核関数にして,宮脇リフティングを含む新しいリフティングを構成することができる.このリフティングが自明でない条件をある種のL函数の値と関係付ける予想を定式化することができた.平賀はZelevinskiinvolutionとArthurの予想したA-packetとの関係について予想を提出し,その根拠として,fundamental lemmaと呼ばれる仮定の下で,endoscopic liftとZelevinski involutionが可換であることを証明した.さらに,Arthurにより提出された保型表現に関する予想について研究を行った.梅田は不変微分作用素の等式であるCapelli恒等式から発した典型Lie環の普遍包絡環の中心についての三つの問題(生成系の具体的な記述,他の生成系との関係,生成系の具体的表現)について研究を行なった.藤原はHecke環の構造についてのTaylor-Wiles-藤原の理論を用いてp進regulatorについてのLeopoldt予想を研究し,代数体と双曲幾何学との類似という新しい視点に達した.数年前,池田は一変数の保型形式から多変数のジーゲル保型形式へのリフティングを構成した.このリフティングの対角集合への制限を核関数にして,宮脇リフティングを含む新しいリフティングを構成することができる.このリフティングが自明でない条件をある種のL函数の値と関係付ける予想を定式化することができた.平賀はZelevinskiinvolutionとArthurの予想したA-packetとの関係について予想を提出し,その根拠として,fundamental lemmaと呼ばれる仮定の下で,endoscopic liftとZelevinski involutionが可換であることを証明した.さらに,Arthurにより提出された保型表現に関する予想について研究を行った.梅田は不変微分作用素の等式であるCapelli恒等式から発した典型Lie環の普遍包絡環の中心についての三つの問題(生成系の具体的な記述,他の生成系との関係,生成系の具体的表現)について研究を行なった.藤原はHecke環の構造についてのTaylor-Wiles-藤原の理論を用いてp進regulatorについてのLeopoldt予想を研究し,代数体と双曲幾何学との類似という新しい視点に達した.1.吉田はSiegel modular formに附随すると予想されるmotiveの基本周期(基礎理論はAmer.J.Mathに発表済)について研究した.志村多様体のzeta函数について予想されている公式と,motive論的に予想されるzeta函数の特殊値が完全にconsistentであることを確かめた.これを一般化して,保型形式の幾何学的構造とそのL函数との関係について,研究を開始した.また絶対CM周期についての過去数年来の研究も継続した.L函数の二階微分を用いて,周期記号の一般化も定義した.3.藤原はHecke環の構造についてのTaylor--Wiles-Fujiwaraの理論を用いてp進regulatorについてのLeopoldt予想を研究し,Leopodt予想がEisensteinidealを生成する元の最小個数で言い表せることを示した.梅田は普遍包絡環U(gl_n)の二つの中心元の間のWronsky型の関係式を研究した.池田は市野氏との共同研究でtriple L函数の特殊値について,新しい結果を導いた,藤井はリーマンゼータ函数の零点のpair correlation,およびエプシュタインゼータ函数の特殊値を研究した.藤原はHecke環の構造についてのTaylor-Wiles-Fujiwaraの理論を用いてp進regulatorについてのLeopoldt予想を研究し,双曲幾何学との類似という新しい視点に達した.吉田はAbsolute CM-periodに関係する諸問題について研究した.また保型形式から,Eichler-志村積分を分解して,コホモロジー類を得る直接的方法を発見した.研究をAbsolute CM-periodsについての著書にまとめ,アメリカ数学会から出版した.また博士課程学生の加塩朋和氏と共同でAbsolute CM-periodについての予想のp進化を研究した.p進類似が完全な形で成り立つ強い根拠があり,これについて共著論文を執筆中である.数年前,池田は一変数の保型形式から多変数のジーゲル保型形式へのリフティングを構成した.このリフティングの対角集合への制限を核関数にして新しいリフティングを構成することができる.このリフティングが自明でない条件をある種のL函数の値と関係付ける予想を定式化することができた.これについては既に論文を書き上げて近々発表予定である.平賀は保型表現に関する予想について研究を行った.SL_nのinner formのp-進体上のtemperedな局所L-packetについて研究し,temperedな局所L-packetを構成する既約表現と,S-群の既約表現でその中心指標がinner formと対応しているものが,1対1に対応していることを証明した.この対応はendoscopyに関するcharacter relationをみたすことを跡公式を用いて証明し,ArthurとVoganによる予想が正しいことを示した.梅田は不変微分作用素の等式であるCapelli恒等式から発した典型Lie環の普遍包絡環の中心についての三つの問題(生成系の具体的な記述,他の生成系との関係,生成系の具体的表現)について研究を行なった.
樹立した微乳頭肺腺癌細胞株を用いた種々の腫瘍特異的マーカー獲得戦略

高悪性である微乳頭構造を示す肺腺癌を特徴づける因子の解明は不明瞭のままである。申請者は微乳頭構造を取る肺腺癌由来の細胞株を樹立した。この研究では、樹立した細胞株の特徴を明らかにすること、この細胞と種々のプロテオーム解析技術を駆使して、この腫瘍を特徴付けるマーカー候補タンパク質の獲得を目指した研究を展開した。この細胞の特徴や獲得したマーカー候補タンパク質について述べる。微乳頭肺腺癌(MPPAC)は、初期から高度のリンパ管侵襲・転移を起こし予後不良であり、さらに肺癌だけでなく、様々な臓器の腫瘍でも共通して予後不良である事が報告されている。この研究では、世界で初めて樹立した微乳頭肺腺癌細胞株を用いた各種プロテオーム手法を駆使して、新規腫瘍マーカーを獲得することが目的である。そのために、まずは腫瘍細胞株の特許出願を行い、さらに獲得した新規マーカーを出来るだけ特許出願していくことを目指した。H27年3月16日に「ヒト微乳頭肺腺癌細胞株及びその利用」という発明の名称で特許出願した(研究成果参照)。H27年度中に国際特許を出願予定。樹立した細胞名はKU-MPPAC細胞とした。また、今年度の実験計画の一つである、この細胞のAMeX固定細胞を免疫源に、最終的にKU-MPPAC細胞と反応する単クローン性抗体を62個作製し、10%ホルマリン固定パラフィン包埋されたMPPAC組織と反応する20個のクローンを選別した。現在、免疫沈降法を用いて抗原の同定中。さらに、KU-MPPACの生細胞を免疫源に膜に対する抗体の作製を行っている。KU-MPPAC細胞をSCIDマウス皮下に移植し、移植腫瘍の作製に成功した。さらに。その細胞塊を新たなSCIDマウスに移植した。2代目の細胞も腫瘍塊を作った。これらの腫瘍組織を培養系に持って行ったところ、元の細胞株と同様の増殖形態で培養できることを確認した。また、SCIDマウス腫瘍をホルマリン固定し、HE染色したところ、臨床材料で認められる構造に類似したMPP構造を取っていることを確認した。MPPACのモデル動物として治療実験等に応用可能な系の樹立が出来た。その他、この細胞株の二次元電気泳動法、分泌タンパク質のセクレトーム解析、この細胞株の基となる患者の血清とこの細胞を用いた自己抗体解析等を順調に進行中である。治療抵抗性の原因の一つは、腫瘍内に存在する癌幹細胞の存在と言われている。しかし、通常その存在量は少ないことから、それら細胞の詳細な解析が出来ていないことが挙げられる。MPPAC細胞に存在する癌幹細胞を豊富にしてそれら細胞の特徴を明らかにする目的でKU-MPPAC細胞のiPSを考えた。今年度の目的は、KU-MPPAC細胞を用いて癌iPS細胞化を行うための基礎的方法の確立を行い、癌iPS細胞を樹立することを第一の目的とした。その結果、様々な条件を振りながら、最終的に癌iPS細胞の樹立をすることが出来た。樹立した細胞はKU-MPPAC4Fと命名した。この細胞は、導入した山中4因子の発現が亢進しており、これまでに様々なiPS細胞で報告のある分子の発現が亢進していた。この細胞は親株であるKU-MPPAC細胞と同様の分子の発現が認められると同時に各種幹細胞マーカーの発現が亢進していた。また、KU-MPPAC, KU-MPPAC4F細胞をSCIDマウスの皮下に移植することで、移植腫瘍を作製することも出来た。形態的には両者とも同様で、外科組織中のMPP様形態を示していたが、幹細胞マーカーの発現は異なっていた。両者の細胞をmRNA解析、プロテオーム解析などを駆使し、両者の発現プロファイリング、特にその癌幹細胞で発現している分子の同定を今後していく予定である。微乳頭肺腺癌細胞株KU-MPPAC細胞を用いた各種プロテオーム解析法を駆使した腫瘍特異的マーカー候補タンパク質の解析や染色体解析、mRNAの発現解析は修了している。しかし、これらマーカー候補タンパク質の更なる解析は今年度出来なかった。来年度に行う予定である。申請者は、初期から高度の血管やリンパ管侵襲を来たし、予後不良である肺の微乳頭腺癌(MPPAC)から細胞株を樹立した(KU-MPPAC細胞と命名)。この細胞は血清加RPMI-1640培地や無血清培地H-SFM培地、無タンパク培地PFHM-II培地で継代・維持している。また、この細胞に山中4因子を導入して作成したcancer iPS細胞も作製し維持している(月)KU-MPP4F細胞と命名)。今年度は、KU-MPPAC細胞の培養上清中のタンパク質を二次元電気泳動法で解析した結果とKU-MPPAC細胞と腺癌の代表的な細胞株であるA549細胞のmRNA解析した結果をQIAGENのINGENUITY Pathway analysisを行った。その結果、MPPAC細胞ではタンパク質、mRNA解析に共通してP53タンパク質に関連したタンパク質群やmRNA群の発現亢進が認められた。また、このソフトを用いたUp stream解析の結果でも共通して、さらにmRNA解析では最も重要な上流の制御因子としてP53が同定された。この腫瘍の進展にP53シグナル系が関与している可能性がある。

微乳頭肺腺癌患者血清中で同定されたHSP27について、多数例のMPPACと非MPPAC患者の血清中の自己抗体量を比較したところ、AUC = 0.731 (P = 0.029)と有意に両者を鑑別することが可能であった。また、MPPAC患者に比して非MPPAC患者で有意に高値を示していた。免疫染色ではMPPAC組織に比して非MPPAC組織でHSP27の陽性率や染色スコアが亢進していた。HSP27は肺腺癌組織では悪性度の低い群での発現が亢進しており、予後良好のマーカーであることが推測された。今後、これまでのデータを解析し、論文に結びつけていく予定である。高悪性である微乳頭構造を示す肺腺癌を特徴づける因子の解明は不明瞭のままである。申請者は微乳頭構造を取る肺腺癌由来の細胞株を樹立した。この研究では、樹立した細胞株の特徴を明らかにすること、この細胞と種々のプロテオーム解析技術を駆使して、この腫瘍を特徴付けるマーカー候補タンパク質の獲得を目指した研究を展開した。この細胞の特徴や獲得したマーカー候補タンパク質について述べる。まず大きな成果として、特許出願したことがあげられる。このことにより、今後獲得したMPPAC腫瘍マーカーの更なる特許申請が可能となる。1)単クローン性抗体の作製:AMeX固定したKU-MPPAC細胞を免疫源に、この細胞標本を免疫染色によるスクリーニング法を用いることにより、62個の単クローン性抗体を作製した。その中で10%ホルマリン固定パラフィン、パラフィン包埋されたMPPAC組織と反応する20個の抗体を選択した。現在、免疫沈降法による抗原同定を行っている。さらに生細胞を免疫源に治療標的分子の獲得に向けて、細胞膜に対する抗体の作製を行っている。2)自己抗体解析:KU-MPPAC細胞株を二次元電気泳動法で展開し、この細胞の元となった治療前の患者血清を一次抗体として用いることにより、自己抗体が反応するタンパク質を同定する。申請時、すでに21個のタンパク質を見出しており、今年度は新たな実験は行わなかった。3)セクレトーム解析:無血清培地で生育しているKU-MPPAC細胞株の培養上清をアセトン沈殿法で濃縮し、低分子量タンパク質を対象としたトリシンを用いた二次元電気泳動法を行うことで、この細胞の分泌タンパク質の検討を行った。その結果、116のタンパク質スポットを確認し、現在まで25スポットについてタンパク質名を決定した。4)移植腫瘍の樹立:SCIDマウス皮下に腫瘍細胞を注射することにより、移植腫瘍の作製に成功した。5)二次元電気泳動法による検討:KU-MPPAC細胞と既知の肺腺癌細胞株(A549とLC2-ad細胞)をトリシン・二次元電気泳動法で分離し、両者のタンパク質発現を比較した。KU-MPPAC細胞で発現が1.5倍以上ある13の低分子量タンパク質を同定した。高悪性である微乳頭肺腺癌の新たなマーカー候補タンパク質、特に治療抵抗性である癌幹細胞のマーカーを獲得するためにKU-MPPACとKU-MPPAC4F細胞を用いて以下の実験を行う。
母体-胎盤-胎児軸における胎児毒性の発現機構に関する多面的解析

本研究の目的は、母体-胎盤-胎児を単位として、環境化学物質の示す胎児毒性の発現機構を分子・遺伝子のレベルで多面的に解析することである。Ethylnitrosoureaを用いた検索では、胎児中枢神経傷害の修復期に働く遺伝子の発現プロファイル等を明らかにした。5-Azacytidineを用いた検索では、傷害機構にp53依存的なものと非依存的なものがあり、このような傷害に対し胎児脳が修復能を有することを示した。HydroxyureaおよびVP-16でも、マウス胎児での脳細胞周期停止とアポトーシスのp53に関連した誘導が示された。また、Cytosine arabinosideについては、胎盤にも胎児中枢神経とほぼ同様な機構でアポトーシスが惹起されることを示した。妊娠期のラット母体肝臓の薬物代謝酵素発現について検討し、妊娠期間から出産にかけて多くのCYP isozymesの発現が抑制され、離乳時に回復することを明らかにした。妊娠ラットにCYP誘導剤を投与した際の母体肝臓、胎盤および胎児肝臓での第II相薬物代謝関連遺伝子の発現プロファイルは、第I相薬物代謝関連遺伝子と同様であった。T-2 toxinでは、母体肝臓、胎盤および胎児肝臓にapoptosisが観察され、その発現には酸化ストレスによるMEKK1-JNK-c-Jun pathwayの活性化が重要な役割を果たしていることが示された。このように本研究により、従来から知られていた化合物の胎児への直接作用のみならず、胎盤への影響、さらには妊娠期の母体薬物代謝能の変動も明らかとなった。化合物による胎児毒性発現はきわめて複雑な要素から構成されており、その多面的な解析が重要であることが示唆された。本年度は、この他、5-Azacytidine(5AZC)、hydroxyurea(HU)、Ara-C等による胎児中枢神経毒性の発現機構についても検索を行い、それぞれの化学物質によって惹起される細胞周期停止およびアポトーシスの発現時期の特徴を明らかにした。また、Ara-Cについては、特定の胎盤構成細胞にも胎児中枢神経とほぼ同様な機構でアポトーシスが惹起されることを示した。また、CYP inducersによる母体-胎盤-胎児軸における遺伝子発現プロファイルについても検討した。本年度はまず、妊娠・秘乳がラット母体肝臓におけるCYP isozymesの発現に及ぼす影響について検討し、妊娠期間から出産にかけて多くのCYP isozymesの発現が抑制され、離乳時に元に戻る事を明らかにした。ついで、妊娠ラットにCYP誘導剤を投与した際の母体肝臓、胎盤および体に肝臓で第II相薬物代謝関連遺伝子の発現プロファイルを検索したところ、第I相薬物代謝関連遺伝子と同様の結果を得た。また、T-2 Toxinを投与した妊娠ラットでは、母体肝臓、胎盤および胎児肝臓に共通してapoptosisが観察され、その発現には酸化ストレスによるMEKK1-JNK-c-Jun pathwayの活性化が重要な役割を果たしている事が示された。ついで、5AzC誘発胎児脳傷害のメカニズムについて細胞周期制御異常および細胞死の発現機構を中心により詳細な検索を行った。また、細胞周期の進行には神経前駆細胞の核の移動が必要なことを明らかにした。5AZCは、マウス胎児脳において、神経前駆細胞にアポトーシスを誘導し、その増殖を抑制する。神経前駆細胞は細胞周期進行と連動して脳室帯領域を移動しながら、細胞分裂とその後の細胞分化を果たすが、5AZCで処置したマウス胎児脳ではS期の神経前駆細胞に5AZCが取り込まれDNA障害が起こる結果、その後のG2期あるいはM期において細胞周期の進行が停止し、細胞の多くは正常な移動が停滞し、アポトーシスを起こす。中には細胞分裂を果たすものもあるが、分裂後の娘細胞もその後のG1期で細胞周期が停止し、アポトーシスに陥る。このアポトーシスの発現機構はp53遺伝子に依存的であるのに対して、G2/M期の細胞周期