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樹木の葉内のアクアポリンが葉の通水性および葉のガス交換特性に及ぼす影響

本研究では、生体膜の水透過性を制御するアクアポリンが、樹木の葉の通水性やガス交換特性に及ぼす影響を調べた。葉内のアクアポリンは、葉に光が当たった時の通水性の増加や気孔の開口、葉のガス交換速度の季節変化に関与しており、アクアポリンの活性化と葉のガス交換速度の増加に密接な関係が認められた。一方、高CO2環境や乾燥ストレスなどの環境変化と葉のアクアポリン活性の間に、明瞭な関係は認められなかった。アクアポリンは動物、植物、細菌など、ほとんどの生体に存在する膜タンパク質で、生体膜の水透過性を制御している重要な物質である。しかしながら、アクアポリンの発見は比較的新しく、樹木の葉の通水性、気孔開閉、光合成の制御機構に関するアクアポリンの働きについては未解明の点も多い。そこで、葉内のアクアポリン活性との関連が指摘されている葉の通水性の光依存性について陽葉と陰葉で比較し、葉が生育する光環境とアクアポリン活性との関係を明らかにすることを目的として研究を行った。野外に生育するコナラの成木から陽葉と陰葉を採取し、実験室内で葉に強光を照射しその前後における葉の通水性の変化を調べ、葉構造との関連性について検討した。弱光条件下で測定した葉の通水性は陽葉の方が陰葉よりも高かった。強光を照射したときには、葉の通水性の増加の程度は陽葉のほうが陰葉よりも大きく、陽葉の方がアクアポリン活性は高かった。葉構造では、陽葉の方が陰葉よりも葉脈密度が高く、維管束鞘延長部が発達していた。葉の通水性が増加すると葉肉細胞への水分供給が改善されるので,葉は水ポテンシャルを低下させずに気孔を開口しガス交換することができる。従って、今回明らかとなった陽葉における葉の通水性の顕著な光感受性は、陽葉の高い蒸散要求に対応した特性の一つであると考えられる。また維管束鞘延長部は光を通すので、陽葉における維管束鞘延長部の発達が光刺激によるアクアポリンの活性を助長し、陽葉の顕著な光感受性を達成させていたことが示唆され、光環境の違いによる葉構造の変化と葉の生理特性との結びつきが明らかとなった。アクアポリンは生体膜の水透過性を制御している重要な物質である。しかし、その発見は比較的新しく、樹木の葉の生理生態学的特性におけるアクアポリンの働きについては未解明の点が多い。アクアポリンはタンパク質で発現や消失が短時間で行われ得ることから、環境変化に対する樹木の生理生態的機能の反応において重要な役割を果たしている可能性がある。そこで、樹木の葉内のアクアポリン活性と個葉の通水特性やガス交換特性の季節変化との関連性について明らかにすることを目的として研究を行った。研究にはアカガシ、アラカシ、イチイガシ、ウラジロガシ、及びコナラの成木の陽葉を用いた。アクアポリン活性は、アクアポリンの水分子透過を阻害する水銀イオンを処理したときの葉の通水性低下の程度から求めた。その結果、5樹種中4樹種で、アクアポリン活性の季節変化と光合成速度や気孔コンダクタンスの季節変化には連動性があり、葉のガス交換が盛んな時期にアクアポリン活性が高いことが明らかになった。また、葉の通水性の季節変化と光合成速度や気孔コンダクタンスの季節変化には正の相関関係があり、アクアポリン活性の増加による葉内のシンプラストの通水性の増加がこの関係に重要な役割を果たしていることが明らかとなった。こうした結果は、樹木の二酸化炭素吸収能力の季節変化メカニズムの解明において、新しい知見となる。本研究では、生体膜の水透過性を制御する膜タンパク質であるアクアポリンが、環境変化に対する樹木の生理生態機能の反応においてどのような役割を果たしているかを明らかにすることを目的としている。これまでの研究から、陽葉のほうが陰葉よりも葉の通水性の光感受性が高く、蒸散要求の高い環境に適応した特性を持つことが明らかになり、それにはアクアポリン活性の違いが寄与している可能性が示唆された。そこで当年度は、アクアポリンの水チャネル機能を阻害する塩化水銀(II)溶液を用いて、アクアポリン活性が陽葉と陰葉における通水性の光感受性の差を決めているかどうかを検証した。葉を暗から明条件へ移行させると、通水性は陽葉では数十分で大きく増加したのに対して、陰葉ではほとんど変化しなかった。一方、アクアポリンの水チャネル機能を阻害すると、強光を照射しても陽葉の通水性は増加しなかった。強光下で葉に塩化水銀(II)溶液処理を行うと、陽葉では葉の通水コンダクタンスが16%低下したのに対して、陰葉では10%低下した。同じ葉の通水性で比較すると、陽葉のほうが陰葉よりも気孔コンダクタンスが高い傾向にあったが、塩化水銀(II)溶液処理を施すとその傾向はなくなった。

これらの結果から、葉の通水性の光感受性にはアクアポリン活性が関与しており、陽葉の方が陰葉よりも光感受性が高いのは陽葉でアクアポリン活性が高いためであることが実証された。また、アクアポリン活性が高い特性により、陽葉は強光条件下でも葉の水分状態を良好に保ちつつ気孔を開けて光合成を行う能力を持つと考えられた。アクアポリンは、生体膜の水透過性を制御する膜タンパク質である。本研究では、樹木の葉内に存在するアクアポリンが、環境変化に対する樹木の葉の通水性と気孔開閉において、どのような役割を果たしているかを明らかにすることを目的としている。今年度は、高CO2条件が葉の通水性およびとアクアポリン活性に及ぼす影響を調べた。自然光型環境調節室で、シラカンバとケヤマハンノキの2年生ポット苗を高CO2濃度720ppmと通常CO2濃度370ppm条件下で育成し、気孔コンダクタンスと葉の通水コンダクタンスを測定した。通水コンダクタンスは、アクアポリンの水透過性を制限する塩化第二水銀溶液を処理した葉でも測定し、未処理の葉の通水コンダクタンスと比較することでアクアポリン活性を調べた。その結果、ケヤマハンノキでは、高CO2条件下のほうが通常CO2条件下よりも葉の通水コンダクタンスは9%低かった。また高CO2条件のほうが通常CO2条件よりも葉のアクアポリン活性が低かった。一方、シラカンバでは、葉の通水性やアクアポリン活性に対する高CO2の効果は認められなかった。気孔コンダクタンスは、ケヤマハンノキでは高CO2条件と通常CO2条件でほぼ同じような値を示したのに対して、シラカンバでは15%ほど高CO2条件下で低かった。これらの結果から、高CO2に対する葉の通水性の応答には樹種間差があり、それにはアクアポリン活性が関与していることが示唆された。また、高CO2条件に対する気孔コンダクタンスの応答と葉の通水コンダクタンスの応答には明瞭な関係がなく、高CO2条件によって崩れる植物体の水バランスを、葉量など他の特性によって調整していることが示唆された。平成23年4月の人事異動による転勤に伴い実験計画を変更したが、研究対象樹種を変更するなどの対応により、ここまで研究目的の達成に向け順調に進展している。24年度が最終年度であるため、記入しない。冷温帯樹種のポット苗を用いて、土壌乾燥と高CO2環境がアクアポリン活性を通じて葉の通水性や気孔コンダクタンスに及ぼす影響を明らかにする。最終年度のため、これまで得られた成果を取りまとめ論文発表する。
腫瘍抑制遺伝子WT1を介する血液細胞の分化制御

1.WT1遺伝子の細胞内導入及び細胞特性の検索平成7年度で作製したWT1発現ベクターを各種細胞株へトランスフェクションを施行したが、stableなトランスフェクタントが得られず、過剰発現によって細胞死にいたらしめることが考えられた。2.WT1遺伝子発現の調節上記の理由から、外部刺激によってWT1発現を誘導するものがあるか否かについて検討してきた。その結果、G-CSF刺激によりWT1遺伝子発現が誘導され、さらにこの誘導が分化と直接的に関わらないことを見い出した。WT1遺伝子と分化/増殖との関連性をさらに明かにするために、日夜研究を継続しているところである。1.WT1発現ベクターの作成WT1蛋白の機能を抑制することによって,脱分化及び癌化した細胞を分化誘導することを目的として各種のWT1発現ベクターを作成した。すなわち,WT1蛋白のZnフィンガードメインのみを発現するもの,全長WT1蛋白を発現するもの,WT1蛋白の認識するDNA結合部位などを発現するものなど既に作成した。現在,これらの発現ベクターを血液細胞株,上皮系癌細胞株に遺伝子導入している。2.WT1遺伝子の構造異常,発現異常の検索急性骨髄性白血病などの臨床患者より得られた材料においてRT-PCR法を用いて既に正常とは異なるサイズのmRNA発現があることを見いだした。現在この構造異常について塩基配列の決定など詳細な解析を行っているところである。3.WT1蛋白の調節機構の解析WT1蛋白自身の調節機構を把握する目的でWT1レコンビナント蛋白(GST-融合蛋白)を既に作成した。これをウェスタンブロット法を用いて確認しており,現在はこの蛋白と結合する新しい蛋白の同定をウエストーウェスタンブロット法を応用して行っているところである。
銀河系外起源超高エネルギー宇宙線(>10^<19>eV)の探索

昭和58年より宇宙線研究所明野観測所の西南20【km^2】の面積に右図の配置で空気シャワー観測装置を設置してきた。○印が電子成分検出器で昭和59年末に完成し、約1年間のデータが集積され、データ解析も順調に進んでいる。又A点に昨年度設置した20【m^2】ミューオン検出器は昨年9月26日より稼動開始した。【◯!1】.シューオン検出器昨年度設置したミューオン検出置は厚さ1mのコンクリートを吸収層として使用したが、吸収層に要する費用を節約するため地2.5mに埋没することに方針を変更した。このため直径10cm,長さ5mのステンレス製パイプを使用し、密封成比例政数管を製作した。土中に長期間放置するため、防食処置、高圧に対する放電処置、ガス密封処置学のテストの後110本製作し昨年末12月3日設置が完了した。データ収集回路系は現在調整段階にあり、3月中旬には稼動開始予定である。【◯!2】データ解析本研究の目的である超高エネルギー宇宙線の起源は、それらがひきおこす超大空気シャワー現象を観測することによりおこなう。従ってまず起大空気シャワーの特性を調べることにより、エネルギーや到来方向の決定方法およびその精度を知る必要がある。本年度はこの解析を中心にすすめその結果をまとめて発表した。これにもとづくエネルギー分布、到来方向分布の解析をすすめ、興味ある結果が得られつつある。(結果は研究成果報告書にまとめた。)昭和58年より宇宙線研究所明野観測所の西南20【km^2】の面積に右図の配置で空気シャワー観測装置を設置してきた。)
建築構造物の浅い基礎における地震動入力機構に関する基礎的研究

本研究では、地盤と構造物基礎との摩擦に注目して、砂と構造材料との摩擦実験を繰返し荷重下で行った。その結果に基づき、摩擦抵抗に影響を与える要因を解明した。また、摩擦面の滑動によるエネルギー消費についても検討した。本研究により、以下のような成果が得られた。〔砂-鋼材間の降状摩擦係数〕鋼材の表面粗さ・砂の平均粒径・砂の種類の影響が見られる。鋼材の表面粗さ(最大高さRmax)と砂の平均粒径との比(正規化粒さ)は、砂の種類ごとに降状摩擦係数と高い相関性を示す。〔鋼材との摩擦面における砂粒子の挙動〕一方向荷重下では、摩擦面が粗い場合は摩擦面に沿って砂の乱れが大きい滑り層が生ずる。摩擦面が滑かだと滑り層は見られない。繰り返し荷重下では摩擦面が滑かでもスベリ層(厚さ約5mm)が生ずる。〔繰り返し荷重下における砂-鋼材間の摩擦抵抗〕摩擦面が粗い場合、摩擦面に沿って生ずる滑り層のため、摩擦係数が載荷回数とともに低下して収束する。摩擦面が滑かな場合、摩擦面で砂の粒子破砕が生ずれば、正規化粗さが上昇して摩擦係数が高くなって収束する。〔砂-コンクリート間の降状摩擦係数〕コンクリートの表面粗さと砂の平均粒径の影響が見られる。コンクリートの表面粗さを評価する際、最大高さRmaxよりも中心線深さRpを用いたほうが、降状摩擦係数との相関性が高くなる。〔摩擦面におけるエネルギー消費〕摩擦面が降状する際に、摩擦面と砂層との塑性エネルギー分担率が変化する。摩擦面でのエネルギー消費は、摩擦面の滑動・滑り層の形成・滑り層の変形による三成分に分けることができる。
古細菌（アーキア）を標的とした口腔内微生物の検出・同定と口腔内の健康との関連調査

本研究において、歯周病患者から採取した口腔内の縁下プラーク由来のDNAから次世代シーケンサーを用いてアーキアの存在が確認できた。さらに、これまでに報告のあったMethanobrevibacter属のみならず、他のアーキアグループの存在も明らかとなり、口腔内においても多様なアーキア叢が構築されている可能性が示唆された。本年度は、これまでに当研究室において口腔細菌叢の解析に用いられた口腔内の各部位(唾液、舌苔、歯肉縁上、歯肉縁下)由来のゲノムDNAを用いて古細菌(アーキア)の検出が可能か否かを検討した。(方法)歯科医院を訪れた歯周疾患を持つ21名より採取された口腔内各部位の検体から抽出されたゲノムDNAをPCR用の鋳型とした。また、古細菌検出用のPCRプライマーとして、1)古細菌16S rRNAの共通配列(5'-TCCAGGCCCTACGGG-3'および5'-YCCGGCGTTGAMTCCAATT-3')、2)ヒト口腔内や腸内に存在が報告されている古細菌の一種であるメタン菌のマーカー遺伝子であるmethyl coenzyme-M reductase (mcrA)遺伝子の配列(5'-TTCATTGCRTAGTTWGGRTAGTT-3'および5'-GGTGGTGTMGGATTCACARTAYGCWACAGC-3')を用いた。(結果)各DNAサンプルについてPCRを行った結果、古細菌16S rRNAの共通配列プライマーにおいてほとんどのサンプルについて予想されるサイズでのDNA断片が得られた。しかし、それらのDNA断片について塩基配列を決定した結果、細菌由来の配列であった。次にmcrA遺伝子の共通プライマーを用いて、歯肉縁下由来DNAについてPCRを実施し、21中5サンプルについてDNA断片の増幅が認めらた。塩基配列を決定したところ、メタン菌の一種であるMethaonobrevibacter oralisのmcrA遺伝子配列であることが判明した。一方、唾液、舌苔、歯肉縁上ではPCRによる検出がほぼ認められなかった。(結論)歯周疾患を持つ被験者21名中5名について、歯肉縁下プラーク由来のDNAより古細菌であるMethonobrevibacter oralisが検出された。本年度の計画は、主に1)口腔内検体用のゲノムDNAの調整方法の検討および古細菌検出用のプライマーの設計であり、これらについてはほぼ達成できた。また、2)検体の採取に関しても、現在、協力医院において実施中である。歯科医院を訪れた21名の歯周病患者(35-76歳、平均57.6歳)について治療開始時に採取された歯肉縁下プラーク由来DNAを鋳型とし、古細菌(アーキア)および細菌の16S rRNA遺伝子のV3-V4領域を増幅する共通プライマー(Pro341F: 5'- CCTACGGGNBGCASCAG-3', Pro805R: 5'-GACTACNVGGGTATCTAATCC -3'にadaptor配列およびサンプル識別配列を付加)を用いて遺伝子を増幅し、その増幅断片の塩基配列を次世代シーケンサーにより決定した。各サンプルの全塩基配列に対する古細菌の割合は0.1-15%(平均1%)であった。また、これまでに口腔内に存在する古細菌として報告例のあるMethanobrevibacter属以外にも、その他のEuryarchaeota、さらにCrenarchaeota、DPANNなど幅広い古細菌グループが検出された。しかしながら、歯周状態の指標である歯周ポケットの深さと歯肉縁下プラーク由来DNA中の古細菌の割合には相関が認められなかった。また、20-30ヶ月間(平均26ヶ月)の歯周病治療を終えて採取された歯肉縁下プラーク由来DNAについても同様に古細菌・細菌叢解析を行い、古細菌の割合を求めた結果、0-3.54%(平均0.37%)となった。さらに、口腔内でも歯肉縁下プラークとは異なる細菌叢構成が認められる唾液、舌苔についても治療開始時のサンプルの解析を行ったが、古細菌は検出されなかった。このことから、Methanobrevibacter属のみならず他の古細菌においても、口腔内では歯肉縁下プラークに特異的に存在していることが示唆された。本年度検討した方法を用いて、古細菌(アーキア)の検出が可能であることが確認できたので、これらの方法を基本として、さらに口腔疾患を持つ被験者および健常口腔を持つ被験者の検体の採取および解析を行い、古細菌と細菌との相互作用、古細菌と口腔および全身疾患との関連について調査を進める。29年度が最終年度であるため、記入しない。微生物学29年度が最終年度であるため、記入しない。
ニューラルネットワークの対称、非対称構造における認知、記憶機構の計算論的研究

本研究では、いままで、われわれが導き出したニューラルネットの非対称構造の機能を、新たに、並列、対称構造であるが非線形性としてHalf-wave Rectificationを有する大脳皮質V1野およびV1野の入力を持ち、同様な非対称構造をもつMT野の出力までの機能を計算論的に導き出すことである。まとめとしてのcatfishの網膜構造の非対称構造の回路網の機能について2004年の英国(University of Stirling)で開催されたInt.Conf.on Brain Inspired Cognitive Systems(BICS2004国際会議)において発表した。さらに大脳皮質のV1およびMTの構造と機能について(University of Exeter)での国際会議、Int.Conf.on Intelligent Data Engineering and Automated Learning(IDEAL2004)にて、V1野とMT野の非対称構造回路の機能を計算論的に導き出した結果を発表し、BICSでは新しい解析アプローチとして、注目された。本研究では、全体としてのV1野およびMT野が並列、対称構造を有する中で、はじめにミクロな非対称構造に注目し、全体の並列、対称構造と機能上どのような関係を有するかを計算論的に明らかにしたことである。本研究では、最初、視覚系の網膜の非対称構造のネットワークの機能を計算論的に導き出したが、実際にこの機能を実現するための付加回路として存在し、相互相関関数により、これらの機能を実現できることを2004年のInt.Conf.on Knowledge Eng.Systems(KES2004国際会議)で発表した。ニューラルネットの非対称構造の機能を実現するための付加回路が相互相関関数で実現できることを計算論的に示した。以上の知見を取り入れ、V1とMTの2層構造のネットワークが情報機能として、十分となることを計算論的に示した。この論文はInt.Conf.IWANN(2005)で発表することが受理された。本研究では神経系における網膜、視覚野の大脳皮質V1およびMTなどに見られるネットワークの非対称性の構造および対称性の構造に注目し、視覚情報の生成がいかになされるか、生成された情報がどのように保存されるか、そして視覚系の上位レベルでどのように再構築されるかを明らかにすることが研究目的である。はじめに、非対称構造および対称構造のネットワークが空間的に動きのある刺激および時間的に強度変化のある刺激に対して、ネットワーク内で、どのような情報を生成し変換されるかを明らかにする。網膜レベルの非対称構造のネットワークでは、はじめに、刺激情報が線形性の経路と非線形性経路に分かれ、非対称の回路構造を形成することになる。この構造に、ウィーナの非線形解析手法を適用して相関解析を行った結果、刺激の変化の存在性を明らかにするα方程式および刺激の方向性を示す方程式の二つが独立に存在することを明らかにした。この網膜レベルの非対称構造は一般化することが出来て、奇数次の非線形性の経路および偶数次の非線形性の経路からなる非対称構造が上記の二つの方程式の存在性を示すことを明らかにした。視覚情報は網膜処理の後に、外側膝状体の神経系の中継核を経て視覚野の大脳皮質V1、そしてMT領域に至る。各々V1およびMTは動きのある刺激の大きさと方向性を検知する神経系として、研究がなされている。ここでV1およびMTの回路構造は並列で対称性の構造を有しているが各経路の出力に飽和のある半波整流の非線形性の関数を有している。この非線形性はテイラー展開により、多くの奇数次と偶数次の非線形性を内臓しており、上記の非対称構造の解析結果が適用できて、空間的に奇数次と偶数次の組み合わせが存在することにより、V1およびMTの神経回路においても、刺激の検出および方向性を示す二つの方程式を満足することが明らかになった。

本研究では、いままで、われわれが導き出したニューラルネットの非対称構造の機能を、新たに、並列、対称構造であるが非線形性としてHalf-wave Rectificationを有する大脳皮質V1野およびV1野の入力を持ち、同様な非対称構造をもつMT野の出力までの機能を計算論的に導き出すことである。まとめとしてのcatfishの網膜構造の非対称構造の回路網の機能について2004年の英国(University of Stirling)で開催されたInt.Conf.on Brain Inspired Cognitive Systems(BICS2004国際会議)において発表した。さらに大脳皮質のV1およびMTの構造と機能について(University of Exeter)での国際会議、Int.Conf.on Intelligent Data Engineering and Automated Learning(IDEAL2004)にて、V1野とMT野の非対称構造回路の機能を計算論的に導き出した結果を発表し、BICSでは新しい解析アプローチとして、注目された。本研究では、全体としてのV1野およびMT野が並列、対称構造を有する中で、はじめにミクロな非対称構造に注目し、全体の並列、対称構造と機能上どのような関係を有するかを計算論的に明らかにしたことである。本研究では、最初、視覚系の網膜の非対称構造のネットワークの機能を計算論的に導き出したが、実際にこの機能を実現するための付加回路として存在し、相互相関関数により、これらの機能を実現できることを2004年のInt.Conf.on Knowledge Eng.Systems(KES2004国際会議)で発表した。ニューラルネットの非対称構造の機能を実現するための付加回路が相互相関関数で実現できることを計算論的に示した。以上の知見を取り入れ、V1とMTの2層構造のネットワークが情報機能として、十分となることを計算論的に示した。この論文はInt.Conf.IWANN(2005)で発表することが受理された。
膜界面におけるスピン化学

生体系を含む膜界面における常磁性種の動的挙動に関して、光化学とスピン化学的手法を中心に、その反応動力学の解明と電子スピン間の相互作用に関する研究を国際的協力を得て行うことを目的として2年間にわたり研究を遂行した。特に、ミセル中における多くのラジカル対系の研究を対象に用い、さらに生体膜に研究対象を発展させた。手法は1)時間分解ESR法と、2)マイクロ波のパルス照射後に現われる反応の変化を検出することにより行われた。この研究により、膜界面におけるスピンダイナミックスをラジカル対レベルで明らかにした。初年度及び最終年度を通し、多くの研究者との討論・研究打ち合せを行いながら本題目の研究を行った。代表者村井及び分担者前田はオックスフォード大学のHore助教授の研究室を訪問し、二重膜に関して研究打ち合せを行った。最終年度は、理論的情報交換のためシカゴ大学のJ.Norris教授を招へいした。また、このフィールドの若手研究者5名を国外から招へいして討論・研究打ち合せの機会を持った。研究対象としては、一重項ラジカル対の系としてテトラフェニルヒドラジン、三重項の系としては、TMPDの光反応をミセル中で観測し、これらラジカル対のダイナミクス及び速度論的情報を得ることに成功した。前者においては、SDSミセル中でマイクロ波パルスによるスピンフリップにより、三重項・一重項間の効率の良い遷移を達成させ、再結合反応速度が5x10^6s^<-1>と決定できた。また、マイクロ波によるスピンの量子ビートの観測に成功をおさめた。後者においては逆ミセルを用い時間分解ESR法により、ミセル構成分子における結合開裂と界面におけるTMPDのイオン化と溶媒和電子の観測に成功し、その機構及び動力学を研究した。さらに、二重膜を用い光増感反応により膜構成分子に電子ラベルする試みの研究が現在進められている。本研究は、ミセルや生体膜界面における化学反応機構を、磁気共鳴をはじめとするスピン化学的手法を用い、国際的協力により明らかにすることを目的としている。本年度は、米国ノースキャロライナ大学化学科M.D.E.Forbes教授を東北大学に招へいし、ミセル界面に関する時間分解電子スピン共鳴法による研究の情報交換を行なった。また、代表者は研究協力者である大学院学生とノースキャロライナ大学を訪問し共同研究を行なった。時間分解Q-バンドESR装置にレーザーを組合わせ、高周波領域におけるミセル界面における光反応を研究し、ラジカル対のスピンダイナミクスを明かにする計画であったが、装置の故障で訪問期間に結果を出すには至らなかった。しかし有意義な情報交換をすることができ、東北大学における成果につながった。また、イギリスOxford大学のP.Hore助教授を招へいし生体膜関連のスピンダイナミックスに関して討論を行った。この研究に関しては、研究分担者である前田博士をオックスフォード大学に派遣し、タンパク質におけるホールディングの新しい研究手法に関して新しい情報を得た。この共同研究に於いては、将来の本題目の発展を見据えた生体系への応用発展の基盤づくりを行うことができた。本年度の具体的成果としては、上記共同研究から新しい知見が得られたことと、それと関連して、ミセル中におけるテトラフェニルヒドラジンの光分解から得られた一重前駆体ラジカル対のスピンダイナミクスに関して、交換相互作用の揺らぎによる緩和過程を明らかにでき、学術誌に発表に及んだことである。また、ミセル中におけるラジカル対のダイナミクスに及ぼす電磁波効果の研究が進行しており、早急に学術論文として発表すべく準備をしている。さらに、次の計画ではジシアノベンゼンとビレンの系等、電子移動をともなう反応を用い、膜界面におけるイオンラジカルの輸送の問題に発展させる計画である。

生体系を含む膜界面における常磁性種の動的挙動に関して、光化学とスピン化学的手法を中心に、その反応動力学の解明と電子スピン間の相互作用に関する研究を国際的協力を得て行うことを目的として2年間にわたり研究を遂行した。特に、ミセル中における多くのラジカル対系の研究を対象に用い、さらに生体膜に研究対象を発展させた。手法は1)時間分解ESR法と、2)マイクロ波のパルス照射後に現われる反応の変化を検出することにより行われた。この研究により、膜界面におけるスピンダイナミックスをラジカル対レベルで明らかにした。初年度に引き続き、本年度はさらに多くの研究者との討論・研究打ち合せを行いながら本題目の研究を行った。村井はオックスフォード大学のHore助教授の研究室を訪問し、二重膜に関して研究打ち合せを行った。理論的情報交換のためシカゴ大学のJ.Norris教授を招へいした。さらにこのフィールドの若手研究者5名を国外から招へいして討論・研究打ち合せの機会を持った。本年の研究対象としては、一重項ラジカル対の系としてテトラフェニルヒドラジン、三重項の系としては、TMPDの光反応をミセル中で観測し、これらラジカル対のダイナミクス及び速度論的情報を得ることに成功した。前者においては、SDSミセル中でマイクロ波パルスによるスピンフリップにより、三重項・一重項間の効率の良い遷移を達成させ、再結合反応速度が5x10^6s^<-1>と決定できた。また、マイクロ波によるスピンの量子ビートの観測に成功をおさめた。後者においては逆ミセルを用い時間分解ESR法により、ミセル構成分子における結合開裂と界面におけるTMPDのイオン化と溶媒和電子の観測に成功し、その機構及び動力学を研究した。さらに、二重膜を用い光増感反応により膜構成分子に電子ラベルする試みの研究が現在進められている。
寄生虫による宿主免疫系の修飾ーフィラリアおよび糞線虫感染のT細胞変調作用と成人T細胞白血病ウィルスの細胞内増殖との関連ー

成人T細胞白血病(ATL)の感染にフィラリアや糞線虫感染が相乗的に関与していることを、我々は長崎県五島、沖縄県豊城村、鹿児島県喜界島、熊本県芦北町などの住民検診により明らかにした。本研究において、フィラリアおよび糞線虫感染が及ぼす宿主T細胞変調作用やサイトカインおよびレセプタ-に対する作用、および、ATLウイルスのT細胞内増殖への影響を細胞レベルで、ある程度解明することに成功した。まず、糞線虫感染のATLウイルス増殖に及ぼす影響についてであるが、ATLウイルスを糞線虫抗原と共に、EBウイルスで活性化したヒトリンパ球共存下で培養したが、ATLウイルスの細胞内増殖は観察されなかった。しかし、細胞培養系ではなく宿主の全体の内で観察すると、糞線虫感染は確かにATLウイルスの抗体価を上昇させる作用のあることが確かめられた。すなわち、糞線虫は宿主体内を複雑な経路をたどって体内移行し、感染を完了する。その間に、糞線虫は様々な代謝産物を放出し、直接・間接に宿主の免疫系を修飾し、その結果、ATLウイルスのT細胞内増殖を容易にしているものと思われる。一方、フィラリアによる宿主免疫系の修飾のついては、フィラリア感染が宿主の1).CD8^+T細胞の反応性を非特異的に低下させる。2).リンフォカインのうちILー2およびILー2レセプタ-の数を減少させる。3).Natural killer(NK)細胞およびリンフォカイン刺激細胞傷害性(LAK)細胞などの機能低下を誘導するなどの成界を得た。以上によりフィラリアおよび糞線虫感染の宿主免疫系の修飾と成人T細胞白血病ウイルスの細胞内増殖との関連について、その機序の一端を明らかにすることができた。寄生虫感染のなかには、宿主の免疫系に直接的あるいは間接的に作用して、本来宿主がもっている免疫応答に変調を起こさせるものがあることが知られている。たとえば、フィラリアや糞線虫感染は、宿主のT細胞に働くことによって免疫変調をもたらすことが我々のこれまでの研究で明らかにされてきた。また、成人T細胞白血病(ATL)発症におけるフィラリアおよび糞線虫感染の関与が、血清疫学的に示唆された。これらの成果の上に、フィラリアおよび糞線虫感染の宿主T細胞変調作用の機序、それがもたらすATLウイルスのT細胞内増殖への影響を細胞レベルで解明することを本研究の目的としている。今年度は上記目的の達成のため、まず、Brugia pahangi-Lewisラットの系を用いて、感染ラットにおけるspecificおよびnonspecificなT細胞の変動について調べた。その結果、conA、PWA、PHAのmitogenに対する感染ラットの脾細胞の反応は、非感染ラットに比べて有意な低下を示した、そして、この免疫反応の低下にnon-adherent cellの関与が明らかとなった。また、感染ラット脾細胞をCD4^+TcellとCD8^+Tcellに分離し、正常ラット脾細胞に加えると、CD8^+Tcellを加えた時、conAに対する反応低下がみられた。しかし、正常ラットCD8^+Tcellは抑制効果を示さなかった。また、感染ラットCD4^+Tcellは正常ラットCD4^+Tcellと同様な反応を示すことがわかった。さらに、ATLウイルスが感染しているTcell培養系へのフィラリア感染血清および抗原の関与についても検討中である。寄生虫は何故、宿主の免疫応答に逆らってぬくぬくと生き続けることができるのであろうか.寄生虫のなかには、宿主の免疫系に直接的あるいは間接的に作用して、本来宿主が持っている免疫応答に変調を起こさせるものが知られている.

われわれは、宿主の免疫の場であるリンパ系に寄生しながら他の寄生虫に比べ、より長期間宿主体内に寄生するフィラリアについて、それらの変調作用を研究してきた.本年は主としてフィラリアによる宿主免疫系の修飾について、その一部の成果を報告する.昨年度までの研究は、フィラリア感染は宿主に特別なCD8+細胞を産生し、この細胞が宿主の非特異的な免疫応答の低下を誘導していることを明らかにした.本年度は、フィラリア感染が宿主に非特異的な抗体産生の低下以外に、特異的な抗体産生の抑制や免疫学的な細胞性傷害の減弱を、別の機序によって誘導している可能性を明らかにした.今回、われわれはフィラリアの一種<Brugia>___ー<pahangi>___ーをLewis系ラットに感染させ、ラットのリンパ系のインタ-ロイキンー2レセプタ-(ILー2R)の発現能力を比較した.ラットの末梢血リンパ球をPhytohemaggrutinin(PHA)で刺激し、ILー2Rの陽性率を調べた.その結果、ミクリフィラリア(mf)出現ラット群の陽性率増加が、mf非出現群や対照群に比べ、有意に低かった.また、この現象がmf出現後にみられること、リンパ球を正常ラット血清で培養することにより、ILー2R発現が回復することが観察された.以上の結果は、mfに関係ある血清中の何らかの因子がILー2Rの発現を抑制し、これが抗体産生や宿主の虫に対する細胞性傷害反応の抑制を誘導し、フィラリアという虫が宿主体内でぬくぬくと生き続け得る状況を作り出しているものと思われる.フィラリアや糞線虫は宿主体内を複雑な経路をたどって体内移行し、感染を完了する。これまでの我々の研究によって、これらの虫は虫体の代謝産物に由来する様々な抗原物質を持続的に流血中に放出し、それらは速やかに血中の特異抗体と反応してこれを消費し、抗体による虫体への直接的な免疫攻撃や細胞性の傷害反応を減弱させていること、そして、この免疫複合体は、マクロファ-ジや好酸球というエフェクタ-細胞の働きを阻害することなどが明らかにされた。寄生虫の宿主体内移行時における虫体の代謝産物によって、宿主の免疫系は、前述した以外にも様々に修飾されていることが今回の研究によって明らかにされた。B細胞に関しては、虫体産物のたえまない刺激によって、ポリクロ-ナルにB細胞が活性化し、ついにB細胞の疲弊を誘導すること、T細胞に関しては、時に抑制性Tリンパ球の活性化を起こすこと、種々のサイトカインについても影響を及ぼし、例えば、ILー2のレセプタ-の数を減少することなどである。これらはすべて結果として宿主の免疫能低下を誘導するものである。そして、本年度に得た我々の研究成果は次のようなものである。すなわち、宿主の免疫監視機構のうち細胞傷害作用を有する細胞傷害性T細胞、Natural Killer(NK)細胞、リンフォカイン刺激細胞傷害性細胞(LAK)などのフィラリア感染における役割はこれまで見られていない。非ステロイド系抗炎症剤として汎用されているインドメタシンはCycrooxygenaseに作用してプロスタグランジン(PG)E_2合成を抑制し、PGE_2はILー2やインタ-フェロン(IFN)ーγの合成を抑制し、最終的にNKやLAKが活性化される。インドメサシン投与によって、今回我々はフィラリアの感染抵抗性を誘導することが出来た。そして、この感染性は抗asialo GM_1抗体の腹腔内投与により阻害された。
デジタル音響技術による新たな物語表現研究

KYMAやIRCAM Toolsなどの音響技術を用いることで、映像における物語表現の中に「異化効果」をもたらせることが確認できた。研究者の過去作品や奥山重之助、ウォルター・マーチ、アンドレイ・タルコフスキーの映画における音響、そしてハンス・ジマーの映画音楽などを表現、技術の両面から検証することにより、現在のデジタル技術を用いた制作環境についての重要な先行研究になることが確認できた。そして、テスト作品として作成した『Roadside Picnic』によって、「サウンドデザインを出発点とした映像作品制作」という新しいワークフローの可能性を発見できた点も大きな成果である。25年度前半に本研究の原点である研究者が過去にサウンドデザインを行った映画『エンジェルダスト』(1994年制作石井聰亙監督作品)、『エリ・エリ・レマ・サバクタニ』(2005年制作青山真治監督)に関する討議、およびそれに基づく講義を東京藝術大学芸術情報センター開講の授業『サウンド・デザイン概論』で5回にわたって行った。また、年度後半には東京藝術大学写真センター開設の授業『イメージ環境論』において「視覚イメージとサウンドデザインの関連性」をテーマに、上記の『エンジェルダスト』、『エリ・エリ・レマ・サバクタニ』、そして本研究の研究成果作品である『Roadside Picnic』を題材に5回にわたって講義を行った。また、日本におけるサウンドデザインの歴史をめぐって、インタビュー集『日本の電子音楽続インタビュー編』を書籍化し、雑誌『詩と音楽のための雑誌洪水』の特集「松平頼暁「What's next?」」の編集に参加し、新たな研究分野の展開に関して広く公表することができた研究成果に基づいて昨年度から継続的に修正を加えてきた作品『Roadside Picnic』は、加藤直輝監督による映像を加えて最終的に映像作品として完成し、シニギワ(長嶌寛幸+松井茂)名義で招聘された瀬戸内国際芸術祭2013とカリフォルニア大学マーセドでの研究成果発表講演を含む上映会を経て、研究成果書を含むDVD発表と配布、Webによる無料配信を行い、研究成果を社会に広く公開することができた。24年度前半、「デジタル音響技術による新たな物語表現研究」の基礎研究として、『エンジュル・ダスト』(1994年製作、石井聰亙監督作品)と『エリ・エリ・レマ・サバクタニ』(2005年製作、青山真治監督作品)の検証を行った。『エンジュル・ダスト』では、現場で収録した音声(現実音)を「楽器」として扱い、劇中音楽の主要な構成要素とすることで、単なる演出以上のサウンド・デザインを行っている。オリジナルDVD音声を抽出し、KYMA、IRCAM Toolsなどを用いて、音声モーフィングを含んだ音響テストを行なった。『エリ・エリ・レマ・サバクタニ』では、物語のクライマックスで主人公が演奏するミュージック・コンクレートを含んだノイズ・ミュージックの構成要素を、劇中に主人公達がフィールド・レコーディングした音源を多く用いた。サウンド・デザイン自体が、物語表現と密接に関わり、単なる音楽以上のサウンド・デザインを行っている。『エリ・エリ・レマ・サバクタニ』については、作品が制作された2004年当時のデジタル音響技術と現在の技術の比較を行なった。また、研究の過程で「デジタル音響の再生環境」にも注目し、現在の映画における音響再生環境のスタンダードである5.1チャンネルと、映像を含まない場合のマルチ・チャンネル音響の基本である8チャンネルでの映像と音響の相関性を比較、検証するために『エリ・エリ・レマ・サバクタニ』のクライマックス・シーンの5.1チャンネル・ヴァージョンと8チャンネル・ヴァージョンを作成した。KYMA、IRCAM Toolsなどの新しい音響ソフトを用いた『エンジュル・ダスト』、『エリ・エリ・レマ・サバクタニ』の再構成のテストはおおむね完了しており、石井聰亙監督、青山真治監督との討議を踏まえた上での発表を準備している段階である。今回の研究の大きな目的の一つである音声モーフィングに関しても、KYMA、IRCAM Toolsを用いることで、来年度に予定しているテスト撮影への準備は完了している。また、テスト撮影の「ドラマ部分」を補強するための実景撮影はすでに完了しており、先行して映像は実景をベースとし、音声に関しては音声モーフィング技術をフューチャーした8チャンネル音響映像作品『Roadside Picnic』として作品化し、発表を行なった。年度前半は、現段階の『エンジュル・ダスト』、『エリ・エリ・レマ・サバクタニ』を元に、石井聰亙監督、青山真治監督と「デジタル音響技術と物語表現の接点について」の討議を行う。討議の結果をフィードバックした上で、『エンジュル・ダスト』、『エリ・エリ・レマ・サバクタニ』のマルチ・チャンネル版(5.1ch、8ch)を完成させ、上映を行なう。石井聰亙監督、青山真治監督との討議内容は出版物として公開する。年度後半は、「デジタル音声モーフィングに基づく物語表現のカタログ」となるテスト・ムービーを作成する。すでに制作を開始している『Roadside Picnic』のドラマ部分を制作し映像作品として完成し、公開する予定である。
アジア諸国の親子法にみる「子の最善の利益」概念の再考

研究期間一貫して,「外国法制研究会」の共同研究者と,内外国の親子関係,子の最善の利益を含む家族法の諸問題について,毎月研究会を開催し,雑誌『戸籍時報』に成果を公表してきた。2018年9月22日から10月2日に,南アフリカ共和国・ヨハネスブルグ大学のAmanda Boniface上級講師を招聘し,南アフリカの家族法・親子関係に関するインタビューと法律情報の提供を受け,同国家族法,要保護児童保護,同性婚,生殖補助医療に関する連続セミナーおよび講演を名古屋大学で実施し,研究者および学生にも情報提供の機会を提供した。南アフリカは南・東南アジアにも植民地経営をしたポルトガル・オランダの法制度の移植を受けており,比較的見地からも重要である。2019年1月22日から1月31日には,バングラデシュ・ダカ大学のShahnaz Huda教授を招聘し,バングラデシュ家族法・親子関係に関するインタビューと法律情報の提供を受けるとともに,同国家族法・子ども法・ジェンダー・バングラデシュ家族法の法多元性および一般法と各パーソナル・ロー(コミュニティの法)間における女性・子どもの法的保護に関する差異に関する連続セミナーおよびシンポジウムを開催した。シンポジウムは二日開催され,初日は同教授のほか,池田恵子教授(静岡大学),藤崎文子氏(特法シャプラニール)を招聘し,家事労働者として労働する女児の権利保護および女性一般の権利保護をとりあげた。二日目は「外国法制研究会」の共同研究者が加わり,バングラデシュ家族法における男児優先,男児を産むことへの圧力,さまざまなDV,女性差別と法的保護について報告を受けた。研究代表者は南アジア一般について導入的な問題定義をすると共に,バングラデシュに関する報告と対比させたインドの状況について報告し,総括した。平成28年度の研究実施計画としてあげていた2点については、次のような実績をあげた。(1)南アジアの親子法調査9月15日18日にムンバイのインド工科大学ボンベイ校を訪問し(Partthasarathy教授との面談と資料収集)Nari Gursahani Law CollegeのChandiramani学長から家族法の聞き取り調査を行った。9月18日20日にはデリーのNational Law Universityにおいて資料収集を行った。また、9月、12月および平成29年3月にシンガポール大学を訪問し、南アジアを含むアジアの家族法に関する法律情報を収集すると共に、同大学およびSOASのMenski名誉教授を通じてPrakash Shah教授(Queen Mary University, UK)と交流し情報交換をした。(2)親権および監護権法に関する調査9月のシンガポール訪問時にLeong Wai Kum教授およびWing Cheong Chan准教授と面談し、家族法・子ども法に関する情報交換と共同研究の打ち合わせをした。その後、Chan准教授との共同研究をさらに進め、平成29年2月4,5日に名古屋大学で離婚後の親権・監護権に関する国際シンポジウムを開催し、Chan准教授の他、Mogana Subramaniam准教授(マレーシア・マラヤ大学)、Euis Nurlaewati准教授(インドネシア・イスラミック大学)と日本人報告者2名(小川富之・福岡大学教授、立石直子岐阜大学准教授)を招聘し、2日間の会議を開催した。現在、会議成果物の公表準備中である。また3月20日24日にはフィリピンを訪問しEmirio Enginco学部長(ラサール・リパ大学)、Elizabeth Aguiling-Pangalangan教授(フィリピン大学ディリマン校)と面談し情報交換した。平成28年度の計画対象であった南アジアの親子法に関する調査および外国人専門家との共同研究を遂行し、従来のネットワークも拡大した。同時に、平成29年度の対象であった東南アジアのシンガポールおよびマレーシアの専門家を招聘して、国際会議を開催し、研究計画を前倒しして一定の成果をあげている。国際会議は相当な趣旨説明と打合せを行ったため、従来日本で明確に示されてこなかった日本法上の親権・監護概念との異同が明確に示された。会議成果物は平成29年中の公表準備段階にある。平成29年度の研究実施計画としてあげていた3点について、次のような実績をあげた。(1)親子・監護法に関する内外の文献・資料収集、理論面からの子の権利保護と親権・監護権原理に関する研究。平成28年に実施した離婚後の子の監護に関する国際会議の報告を商業雑誌に出版したほか、7月にオランダで開催されたWorld Conference of the International Society of Family Lawで日本法上の親子関係につき報告をした。(2)南アジアの2カ国の研究者と連携と両国の法制度上の異同と背景の分析。シンガポール大学での複数回の文献調査および平成30年3月のインド調査時にNilima Chandiramani教授をはじめとするNari Gursahani Law Collegeの家族法担当教員との情報交換および同校での講演および質疑応答で日本およびバングラデシュ法との異同につきディスカッションを行った。(3)シンガポールとマレーシアとの共同研究。9月、12月および3月にシンガポール国立大学を訪問し、Leon Wai Kum教授およびWing Cheong Chan准教授からの聴き取り調査と資料収集、マレーシアの専門家であるMogana Subramanium弁護士とも引き続き連携した。また、前年度の国際会議で、国により「親権」「監護」の概念が異なることが明らかになったため、周辺国・関連国における異同をさらに掘り下げるため、被虐待児の保護における「親権剥奪・制限」「後見」「監護」に対象と対象国を拡大して共同研究を行い、12月にはシンガポールでスタディ・ツアーを実施した。平成30年2月に被虐待児の保護法制に関する国際会議を開催し、日本およびシンガポールでの調査報告をすると共に、中国・韓国・フィリピン・南アフリカの専門家を招聘し、情報交換を行った。

共同研究者・研究協力者との情報交換を国際会議として公開し、開催報告を出版することにより比較的早い段階で研究過程・成果の公表をしている。この国際会議は、最終的な成果公表を目的とするより、共同研究者以外の日本の実務家・専門家に公表することにより、研究者とは異なる視点での示唆をえること、そして学生への教育的効果もねらうものである。共同研究者とは、相互に国や社会背景に基づく異同を認識したうえで、交流・質疑応答と情報交換を会議の後も継続しており、日本と相手国の双方で最終的な成果物が得られフィードバックもされると期待できる。当初の対象国たる4カ国について研究を進展させつつ、「親権」概念の射程範囲を拡大かつ深度を深めた研究をする目的で研究2年目にスタディ・ツアーと2回目の国際会議を開催した。シンガポールでのスタディ・ツアーでは、日本の家族法・憲法研究者および弁護士と共に関連省庁・保護機関での聞き取りおよび裁判所の保護手続の見学・裁判官との質疑応答を行い、この成果は国際会議でシンガポール法の紹介というかたちで公表した。被虐待児の保護法制について刑事・行政・民事の側面から各国の状況を把握し、「子の最善の利益」を追求するためには、民事法上の「親権制限」や「里親・養子縁組」は最終的手段であり、そこに至る以前の緊急保護的な措置は、多くの国で共通した枠組をもつことが示された。しかし報告対象であった諸国における「親権」、「父」の権限の強さおよびアジア域内での多様性が示された。以上の理由から、当初の計画より進展していると言える。研究期間一貫して,「外国法制研究会」の共同研究者と,内外国の親子関係,子の最善の利益を含む家族法の諸問題について,毎月研究会を開催し,雑誌『戸籍時報』に成果を公表してきた。2018年9月22日から10月2日に,南アフリカ共和国・ヨハネスブルグ大学のAmanda Boniface上級講師を招聘し,南アフリカの家族法・親子関係に関するインタビューと法律情報の提供を受け,同国家族法,要保護児童保護,同性婚,生殖補助医療に関する連続セミナーおよび講演を名古屋大学で実施し,研究者および学生にも情報提供の機会を提供した。南アフリカは南・東南アジアにも植民地経営をしたポルトガル・オランダの法制度の移植を受けており,比較的見地からも重要である。2019年1月22日から1月31日には,バングラデシュ・ダカ大学のShahnaz Huda教授を招聘し,バングラデシュ家族法・親子関係に関するインタビューと法律情報の提供を受けるとともに,同国家族法・子ども法・ジェンダー・バングラデシュ家族法の法多元性および一般法と各パーソナル・ロー(コミュニティの法)間における女性・子どもの法的保護に関する差異に関する連続セミナーおよびシンポジウムを開催した。
味細胞の生理機能と発現分子との連関:シングルセルRT-PCR法による解析

本研究は、マウスの舌上皮・味蕾標本を用いることにより味覚受容器の構築を大きく損なうことなく細胞の生存性を高め、ルーズパッチ法により味細胞の味刺激に対する応答を記録し、その細胞における発現遺伝子をマルチプレックス・シングルセルRT-PCR法により検索することにより、受容体などの味覚関連分子の味細胞での発現と味細胞の応答特性との関連を解析することを目的とする。マウス茸状乳頭味細胞のNaCl応答をルーズパッチ法で解析した結果、およそ半数の細胞が上皮性ナトリウムチャネル(ENaC)の阻害剤であるアミロライドに感受性があり(AS細胞)、残り半数はアミロライドに感受性を示さなかった(Al細胞)。AS細胞はNaClに特異的な応答を示し、Al細胞はNaCl以外にも電解質溶液(KCI、HCIなど)に応答を示した。アミロライドの効果は味孔側に与えられた場合に限られ、基底外側膜側に与えた場合には効果がなかった。これらの味細胞の応答特性や存在比は、鼓索神経にみられる2つのタイプ(アミロライド感受性のNタイプと非感受性のEタイプ)の線維のそれらと一致することが示唆された。シングルセルRT-PCRにより、これらの細胞でのENaCの発現を調べたところ、AS細胞ではα-ENaCの発現が検出され、Al細胞ではENaCサブユニットの発現は検出できなかったことから、AS細胞ではENaCがNaCl応答に関与している可能性が示唆される。また、味細胞のグルタミン酸(MSG)応答を解析した結果、MSG応答細胞はサッカリンに応答する細胞、NaClに応答する細胞、MSGのみに応答する細胞に大別された。これらの応答特性の違いと、発現遺伝子との関連性については、現在の所、まだ明らかにはできていない。マウス(C57BL/6N)より単離した茸状乳頭味蕾標本を用い、味細胞の受容膜側のみに味刺激を与え、基底外側膜側よりルーズパッチクランプ法により基本味刺激(NaCl、サッカリン、HCl、キニーネ、MSG)に対する味細胞応答を活動電位頻度の変化を指標として記録した。その結果、これら刺激に対し様々な応答特性を持つ多数の味細胞より記録が得られた。NaCl応答細胞のアミロライド感受性を調べた結果、アミロライド感受性細胞と非感受性細胞が存在した。また例数は少ないが甘味応答細胞におけるグルマリン感受性細胞の存在、およびうま味応答細胞におけるMSGとIMPの相乗効果が観察された。応答記録後、パッチピペットを用いて細胞を吸引回収し、マルチプレックス・シングルセルRT-PCR法により発現遺伝子検索を行った。甘味応答味細胞において甘味受容体(T1r3)、Gタンパク質αサブユニット(Gαgust)、シナプス関連遺伝子(SNAP)の発現を調べた結果、SNAPの発現はほとんどの甘味応答味細胞では見られず、T1r3とGαgustの発現パターンは多様であることが明らかとなった。これらの結果から、味細胞から神経への情報伝達に古典的なシナプス以外の機構が関与する可能性、およびマウスの甘味受容・情報伝達機構が複数存在する可能性が示唆された。他の味質に応答する細胞、および詳細な味細胞の応答特性と発現遺伝子との連関は、現在の時点で例数が少なく不明である。
眼特異的多機能型DDSによる革新的眼アミロイドーシス治療法の構築

本研究の目的は、トランスサイレチン(TTR)型家族性アミロイドポリニューロパチー(TTR-FAP)における眼アミロイドーシスの新規治療薬の創製を目指し、発症の要因となる眼からのTTR産生およびアミロイド線維形成の両過程を同時に抑制しうる新規治療薬として、1眼特異的多機能型ドラッグデリバリーシステムの構築、2TTR産生抑制効果の検証、3アミロイド線維形成抑制効果および作用機序の解明を実施し、難治性眼アミロイドーシス克服への新たな道を切り開くことである。平成30年度は、前年度に構築した眼標的型キャリアを用いて、眼標的型キャリア/siRNA複合体によるTTR産生抑制効果をヒト網膜色素上皮細胞株ARPE-19およびマウスにおいて評価した。さらに、疾患モデルとして、TTR-FAPモデルマウスを用いて、よりTTR-FAP病態に近い条件での検討を実施した。具体的には、眼標的型キャリア/TTR標的siRNA (siTTR)との複合体を用いてTTR産生抑制効果をARPE19において評価した。その結果、眼標的型キャリア/siTTR複合体は、市販のsiRNA導入試薬と同等のTTR産生抑制効果を示すことが明らかとなった。また、眼標的型キャリア/siTTR複合体をマウス硝子体内投与することで、網膜色素上皮におけるTTR発現は有意に低下した。さらに、眼標的型キャリア/蛍光標識siRNA複合体をマウス点眼投与した場合にも、網膜色素上皮細胞近傍にsiRNAの分布が観察された。本研究で用いた眼標的型キャリア/siRNA複合体は、我々のオリジナル化合物であり、他者による報告は皆無である。さらに、眼アミロイドーシスにおいて、原因タンパク質の産生抑制効果とアミロイド線維形成抑制効果を併せ持つ治療法は報告されておらず、これまでに無い治療法となるものと確信する。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。本研究の目的は、トランスサイレチン(TTR)型家族性アミロイドポリニューロパチー(TTR-FAP)における眼アミロイドーシスの新規治療薬の創製を目指し、発症の要因となる眼からのTTR産生およびアミロイド線維形成の両過程を同時に抑制しうる新規治療薬として、1眼特異的多機能型ドラッグデリバリーシステム(DDS)の構築、2TTR産生抑制効果の検証、3アミロイド線維形成抑制効果および作用機序の解明を実施し、難治性眼アミロイドーシス克服への新たな道を切り開くことである。平成29年度は、眼特異的DDSの構築を行い、siRNA複合体によるTTR産生抑制効果およびアミロイド線維形成抑制効果の評価を実施した。具体的には、眼標的型キャリアを合成し、TTR標的siRNAとの複合体を用いてTTR産生抑制効果をARPE19において評価した。その結果、眼標的型キャリア/siTTR複合体はTTR産生を抑制し、その細胞内取り込みは細胞膜表面上に発現する葉酸受容体を介することが明らかとなった。さらに、TTRへ眼標的型キャリア/siRNA複合体を処理後のアミロイド線維形成能を検討した結果、本複合体はTTRアミロイド線維形成を抑制可能であることが示唆された。交付申請書記載の研究計画通りに進捗している。

さらに、マウスにおける予備的検討にも着手しており、当初の計画通りあるいはそれ以上に研究が進展しているものと考えられる。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。申請時の研究計画に従い、平成30年度には、評価系にヒト網膜色素上皮細胞株ARPE-19に加え、マウスによる動物実験を実施する。さらに、疾患モデルとして、TTR-FAP患者由来iPS細胞またはTTR-FAPモデルマウス(Tyr114Cys Tgマウス)を用いて、よりTTR-FAP病態に近い条件での検討を予定している。