hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
雲仙普賢岳災害被災者におけるトラウマティックストレスの長期経過研究

項目:General Health Questionaire 30(GHQー30)、Impact of Event Scale-Revised(IES-R)を主体とし、あわせて被災状況、現在の健康状態、社会経済的状況、教育歴等を尋ねるものとする。(これまでの調査の経験から、600名程度の返送を期待する。)1.2上記より得られたデーターを解析する。特に、主にIES-Rの結果を基にして、対象者をPTSD群と非PTSD群に分け、それぞれの該当者に対して研究の第2段階への協力依頼を行う。(データーがきちんとそろった対象者は、約400名程度と仮定。このうち、PTSD群は、10%程度約40名と推定)の予定でしたが、これを26年度に行う予定です、その後、これらの解析を基にして、一部を学会等で発表する予定です。そして、27年度に、以下の第2段階の調査を行う予定です。2.1同意を得られた方に対して、PTSD臨床診断面接尺度(Clinician,s Administered PTSD Scale;CAPS)を用いた面接を行い診断を確定する。この際にアルコール依存症、うつ病、Panic障害等の並存する精神神経疾患を持つものは、対象から除外する。新年度より実際に調査表の印刷を開始し、地域の関係機関と協力しながら、アンケートによる一次調査と、個別聞き取りによる二次調査を行う予定である。平成25年度は、アンケート調査の準備に時間を要し、アンケート調査に使用予定であった予算が未使用となっております。平成26年度は、当初の計画に沿って、予算執行の方針です。第1段階の調査として、長崎県島原市在住の3000名に対しアンケート調査への協力を依頼する。
HDL新生反応における脂質-アポリポタンパク質相互作用の物理化学

動脈硬化の防御機構として重要なHDLの生成機構の解明を目指し、脂質膜とアポリポタンパク質A-Iとの相互作用評価を行った。脂質組成やpHなどの膜環境が変化するとディスク状複合体が自発的に形成されることを見いだすとともに、ディスク状複合体の構造や構成脂質の動的挙動を観察し、この微粒子の特性を明らかにした。物理化学的な観点から両親媒性ヘリックスのモデル膜への結合を評価した。リン脂質膜へのスフィンゴミエリンの導入は膜を硬くし、ヘリックスの結合を抑制するのに対し、負の曲率を有するフォスファチジルエタノールアミンの導入は、膜表面の疎水性水和を高め、ヘリックスの結合を促進することを見いだした。アポリポタンパク質A-I(apoA-I)によるモデル膜の可溶化を追跡した結果、本来安定なPC膜に対しても、細胞内オルガネラ内の環境に近い低pH条件においてHDL様のディスク状複合体の形成が促進されることを見いだした。またこの現象が、apoA-Iの構造変化に起因することを明らかにした。超遠心分離と酵素呈色法によるコレステロールの粒子間移動評価法を確立し、膜からのコレステロールの排出はラフトではなく、非ラフト領域から起こることを明らかにした。またべシクル膜に比べ、ディスク粒子においてコレステロールの搬出が促進されることを明らかにした。蛍光を用いた粒子の構造評価によって、ディスク粒子中の脂質の密なパッキングがこのダイナミクスに影響を与えていることを定量的に明らかにした。このディスク状複合体の構造をさらに詳細に評価を行った結果、粒子の構造はそれを形成する脂質の特性に大きく依存し、飽和リン脂質により構成されたディスク粒子は1種類の平板状のディスクを形成するのに対し、不飽和リン脂質では3種の異なる大きさの粒子が生成し、小さい2種類のディスクでは脂質二重層が鞍状曲面を形成する構造を持つことを蛍光法により明らかにした。アポリポタンパク質A-Iとリン脂質混合物のコール酸透析によって生成するディスク状複合体とベシクルの生成量をゲル濾過によって分析し、生成比の温度依存性から、ベシクルとディスク状複合体の熱力学的安定性を評価した。その結果、ディスク状複合体は同じ量の脂質膜とタンパク質(遊離状態)と比べて、ディスク1モルあたり52kJ安定であると求められ、この安定化には主に、タンパク質のヘリックス形成によるエンタルピーの低下が寄与していることが判明した。一方、脂質膜のパッキングはディスク状複合体において高まっており、エントロピー的に不利な環境にあることが明らかとなった。時分割中性子小角散乱法によってリン脂質の粒子間移動速度を評価したところ、ディスク状複合体間のリン脂質移動はリポソーム間と比べ約20倍促進されていることが判明し、エントロピー的に不利な脂質環境を反映する脂質の動的特性が明らかになった。一方、ベシクルにアポリポタンパク質A-Iを添加した際のディスク状複合体の形成は非常に遅い反応であったことから、ディスク状複合体形成過程における高いエネルギー障壁の存在が示唆された。生体膜においては、膜タンパク質ABCA1がこのエネルギー障壁を下げることで熱力学的に安定な複合体の形成を促進していると予想される。さらに、ディスクの構造について蛍光分光法により評価を行った。その結果、脂質-タンパク質比に応じて複数のサイズのディスク粒子が形成可能であり、脂質含量の少ない粒子では、粒子中の脂質二重層が平面ではなく鞍状曲面を形成することを発見した。
タイト結合分子による腸上皮幹細胞の新規運命決定機構

本研究は、腸管上皮幹細胞やニッチ細胞の運命決定におけるタイト結合分子の役割を解明することを目的としている。まず初めに、腸管の幹細胞が存在する陰窩深部に発現しているタイト結合分子を特異抗体を用いた免疫染色により網羅的に検討した。その結果、CLDN2, CLDN3, CLDN4, CLDN7, CLDN15の発現があることが分かった。そのうち、CLDN15はノックアウトマウスの腸が巨大化する表現型を呈することが知られているが、その仕組みについては全くわかっていないので、CLDN15ノックアウト腸管オルガノイドを作成して詳細に解析することを計画した。まず、CLDN15を高効率でノックアウトできるTALENを設計したが、ES細胞を対象にして検討すると、その切断効率は必ずしも高くなかったため、CRISPR/Cas9を用いることとした。ES細胞に2種類のCRISPR/Cas9を同時に導入することによってCLDN15の翻訳開始領域を含む配列を大きく欠損させる戦略をとったところ、約1/4のクローンがホモ欠損体となった。今後、このCLDN15ノックアウトクローンを用いて腸管オルガノイドを作成し、腸が巨大化する分子機構を解明していく予定である。また、他のCLDNについても順次、切断効率の高いCRISPR/Cas9の設計を進めている。当初の目的通り、腸の幹細胞ニッチにおいて発現しているCLDNの検討を終えて、そのうちで候補となる遺伝子についてノックアウトESを作成できた。今後は、CLDN15ノックアウトES細胞を分化させて腸管オルガノイドの作成を試みる。また、先天性短腸症候群の原因遺伝子であるタイト結合因子CLMPについても同様の解析を試みる予定である。当初はオルガノイド作成に用いる培地の添加物を前年度に購入する予定であったが、長時間の保存により劣化する可能性も考え、次年度に購入することとした。次年度使用額は、予定通り添加物の購入に充てる予定である。
レーザープローブ法による炭酸塩試料中の炭素、酸素同位体比局所分析法の開発

炭酸塩試料中の炭素及び酸素の同位体比を観察しながら分析することができるように、レーザープローブ法を開発するのが本研究の目的である。1.二酸化炭素の生成ラインとレーザー照射のためのサンプルホルダーを石英とアルミブロックを用いて製作した。真空中で炭酸カルシウムへの赤外レーザー照射を行うことが可能になった。2.強度の問題を解決するために、炭酸カルシウムに塩化ナトリウムを混ぜてペレットとした。しかし、レーザー照射時に未知の気体を発生し、同位体分析を妨害することが判明した。3.炭素、酸素のの同位体比組成が既知の炭酸カルシウムのみから成るペレットを作成した。強度的に脆いものの、かろうじて使用に耐えることが分かったので、これを使用した。4.レーザー照射間隔を変えることによって収量が変化した。照射間隔が短い程、収量が増加した。これは再結合反応が起こっていることを示している。また、レーザーパワーによる収量の変化を調べた。パワーの増加に従い収量も増加するが、増加幅はパワーの増加につれ小さくなった。5.炭素および酸素の同位体比は収量の増加につれて変化し、一定値に近づく傾向があった。炭素、酸素とも、その一定値値は従来法の値にかなり近い値を示したものの、数パーミルの差が残った。特に、酸素同位体比は従来法では同位体効果の補正が必要であるが、この方法では補正の必要はないことが分かった。再現性は0.5パーミル程度であり、従来法と比較すると劣った。以上より、炭酸塩の炭素、酸素同位体比測定のための本研究によって新しい技術が開発された。炭酸塩試料中の炭素及び酸素の同位体比を観察しながら分析することができるように、レーザープローブ法を開発するのが本研究の目的であるが、そのために以下の研究を行った。レーザー反応ラインの製作ヘリウムガスの通流、レーザー光照射による二酸化炭素放出反応、生成ガスの捕集、生成ガスから二酸化炭素ガスの精製等のための大気圧一真空ラインを製作した(ターボ分子ポンプ、ピラニ真空ゲージを使用)。CO2の精製には液体窒素トラップとn-ペンタントラップを用いて不純物を分離した。効率良く反応させた試料から瞬時に生成二酸化炭素ガスなどを集めることができるように液体窒素冷却管を内臓した試料反応チャンバーを作成した。この反応チャンバーはレーザー光を効率良く透過する石英窓を有する。反応時の様子を現有のCCDカメラでモニターできるようにした。同位体比スタンダードの作成同位体的に均一なスタンダードを主にNaCl等と混合した粉末炭酸塩試料を固めペレットすることにより作成した。同位体比精度のチェック確度については補正できるため、精度は確度に優先して重要であると考えられる。従来のレーザープローブ法の問題点は同位体比の精度の悪さであるが、冷却した反応部分との再結合反応が最も可能性の高い原因と考えて、反応チャンバー内に設置した冷却管に液体窒素の通流の有無が同位体比に与える影響を現在調査中である。その際に、レーザーのパワー、レーザー照射時のヘリウムガス通流速度、液体窒素冷却管に液体窒素を流すかどうか、また液体窒素冷却管と反応試料の相対位置などの可変条件が、同位体比の精度に与える影響を調べている。初年度に製作した装置を用いて、引き続き次の検討を行った。1.炭酸カルシウム+NaClペレットの有用性の検討炭酸カルシウムのみで作ったペレットでは強度的に弱く、レーザー照射の際にチッピングが起きる。この問題を解決するために、炭酸カルシウムに塩化ナトリウムを混ぜてペレットとした。精製法を試みたがその不純物を再現性良く分離することができなかった。

そこで、ペレットとしては強度的に不満が残るものの、炭酸カルシウムのみから成るペレットを、また、同位体比の不均一の点で不満が残るもののサンゴ試料を使い分けて、標準として用いることにした。2.遊離した二酸化炭素の再結合反応の確認レーザー照射間隔を変えることによって収量が変化した。照射間隔が短い程、収量が増加した。これは再結合反応が起こっていることを示している。また、レーザーパワーによる収量の変化を調べた。パワーの増加に従い収量も増加するが、増加幅はパワーの増加につれ小さくなった。ほとんど一定値を示したパワーを最適パワーとした。照射窓の外面に水蒸気が凝結したため、冷却管を使用することによって、収量が減少した。3.同位体比測定同位体比測定の際に質量分析計が故障し、諸条件の同位体比に与える影響は検討することができなかった。
フラボノイドの高機能化に関わるプレニル化酵素遺伝子ファミリーの機能解剖と酵素工学

フラボノイド特異的なプレニル基転移酵素SfN8DT-1の配列を元に、さらにクララ培養細胞からイソフラボンに特異的なSfG6DT、カルコンに特異的なSfiLDTを取得した。これらはいずれも、9回の膜貫通ドメインとプラスチド配向性シグナルを持ち、ビタミンEの生合成酵素ファミリーに類似であることが判明した。またダイズのファイトアレキシン生産に重要なプレニル化酵素GmG4DT、またマメ科以外のオオバギ(トウダイグサ科)からもそれぞれ基質ならびに生産物特異性の高い酵素をクローニングした。さらに性質の異なるSfN8DT-とSfG6DTの間でキメラ酵素を作成し、基質認識部位の絞り込みに成功した。またプレニル化化合物の代謝工学を、植物および微生物ホストにおいて行った。本年度は、フラボノイドのプレニル化酵素のアミノ酸配列情報を充実させるために、プレニル化酵素遺伝子のリソースを増やすことに注力した。まず、カルコンやナリンゲニンといったフラボノイド、ならびに苦味酸として知られるフルログルシノールのプレニル化化合物を大量に含むホップを材料とし、その雌花からcDNAライブラリーを作成した。プレニル化化合物は雌花の中でもルプリン(腺鱗)に局在しているため、ライブラリー作成には、ルプリン部分のみを集めたものを材料としたが、そのため、ルプリンのマーカー遺伝子であるバレロフェノン合成酵素が濃縮された質の良いライブラリが作成できた。EST解析の結果、膜結合型のプレニル化酵素をコードしていると思われるcDNAフラグメントが複数認められ、クラスタリングを行った所、これらは互いにアミノ酸相同性の高い2種類のcDNAであることが分かった。既にRACEにより、全長cDNAを得ており、アサ科に属する植物のプレニル化酵素として、そのアミノ酸配列は重要なリソースとなった。現在、酵母、植物など膜結合性の蛋白質を発現させられる系に導入して、形質転換体を得ようとしている段階である。これとは別に、トウダイグサかに属する樹木であるオオバギは、果実の腺鱗に大量のプレニル化化合物を含む。この植物のプレニル化フラボノイドの特徴は、B-環にゲラニル基を有していることで、トウダイグサ科、という新たな科に属するプレニル基転移酵素というだけでなく、B-環特異的な酵素機能を持つクローンが得られることが期待される。この植物に関しても、同様のアプローチで、腺鱗特異的なcDNAライブラリを作成した。これまでに、断片ではあるが、6種類のcDNAがプレニル化酵素遺伝子の候補として得られている。天然には約1000種類ものプレニル化ポリフェノールが存在し、様々な生理活性を持つことから、多くの研究者の興味の対象となっている。その生合成上の鍵酵素である芳香族のプレニル基転移酵素は、30年以上の長きに渡り不明とされてきた。最近、研究代表者はマメ科のクララを材料にフラボノイドのナリンゲニンをプレニル化する遺伝子SfN8DT-1をクローングし、これを切っ掛けに本酵素ファミリーの機能と全貌を明らかにすべく、研究を進めている。今年度は、リソースを増やすことを目的に、アサ科のホップ、及びトウダイグサ科のオオバギから、それぞれフロログルシノール及びフラバノンをプレニル化する酵素遺伝子の取得を試みた。ホップから得られたHlPT-1は、昆虫の培養細胞に発現させてその活性を調べた結果、ホップの苦味成分であるα酸やβ酸の生合成に関わるプレニル基転移酵素であり、フロログルシノール系の芳香族基質を広くプレニル化する活性を持つことが示された。このクローンは、他のフラボノイドプレニル化酵素とはかなりアミノ配列の類似性が低く、酵素機能と分子進化について興味が持たれる。オオバギに関しても、EST解析データを元に5種類の候補cDNAを単離した。その内、2種類に関して、現在予試験的なデータではあるが、フラボノイドをゲラニル化する活性があることを見いだしている。特にこのオオバギには、フラボノイドのB-環がゲラニル化されているものが多く含まれており、B-環特異的なプレニル基転移酵素の取得が期待されている。現在詳しい酵素機能の解明を行っている。もう一つのトピックとして、プレニル化される芳香族にクマリンがあり、今回レモンを材料にして、クマリンのプレニル化酵素遺伝子の候補を1種単離することができた。クマリンのプレニル化酵素はこれまでクローニング例が無く、新規な遺伝子として、更なる解析が期待される。植物由来の膜結合性プレニル化酵素ファミリーの全体像をつかむため、トウダイグサ科のオオバギ、並びに朝かのホップからプレニル機転移酵素の候補遺伝子をクローニングし、前者は出芽公募にて活性を検定し、その性質を調べた。

後者のホップの酵素については、バキュロウイルスの系を用いて昆虫培養細胞にて初めて酵素活性を検出することができた。特に、ホップのリコンビナント酵素について詳細に調べたところ、この酵素は本ファミリーのメンバーにしては珍しく基質特異性が広く、フロログルシノール誘導体のみならず、フラボノイドのナリンゲニンカルコンも基質にして、そのA環の水酸基の隣の炭素にジメチルアリル基を導入できること、また二価カチオンに関しては、Mgに対する狭い要求性を示した。既知の膜結合型プレニル機転移酵素の分子系統樹を描いたところ、このホップのプレニル化酵素HIPT-1は、ほかのフラボノイド特異的な分子首都は明らかに異なるクレードに分類された。これがHIPT-1の特徴的な基質特異性によるものか、あるいは植物の系統分類上の距離を反映しているのかは、今後の解析を待たねばならないが、今回の実績により、初めてマメ科以外の植物種から二次代謝系のポリフェノールプレニル化に関わる酵素遺伝子が同定できたことは意義深い。なお、HIPT-1はホップの苦み成分である、フムロン、ルプロンの生合成に関わる分子種として、数十年来探索されてきた遺伝子で、産業上の意味も大きい。本ファミリーに属する酵素の分子解剖の点からは、フラバノン特異的なSfN8DT-1とイソフラボン特異的なSfG6DTがいずれもクララ(Sophora flavescens)から得られており、そのキメラを作ることで、基質特性を決定している部分を約30アミノ酸の領域まで絞り込むことができた。代謝工学による生産系の構築に関しても、徹底的な代謝デザインの検討により、プラスチド局在の必要性やホスト依存的な酵素機能の改変など新たな知見を得ることができた。
マルチメディアの進展に対応した著作権法制の研究

本研究は、マルチメディアやその他保護著作物をデジタル利用する技術の開発によって環境が変化する中、近未来における著作権制度の在り方につき、検討しようとするものである。著作物、実演、レコードなどにつき、デジタル送信による、あるいは、DVD、フラッシュメモリーなどを用いた、新たな利用形態や、それと同時に、放送のデジタル化とデジタル送信の間のような、新旧メディア間のインターフェイスの問題に直面している。今や、音楽配信、電子出版、デジタル放送など、デジタル利用の範囲が広がりつつある中、技術的手段と密接に連携した著作権保護の新たなシステムを見出すことが急務となってきた。この点、1996年12月のWIPO著作権条約及びWIPO実演・レコード条約に対応した国際、外国及びわが国における動きを検討することができた。その結果、暗号化、電子透かしなどの技術を組み込んだ権利処理システムを構築する可能性を明確に認識することができた。それは、電子商取引電子認証、電子決済というビジネスの領域で検討されているシステムと結合した「電子的著作権処理システム」である。そこにおいては、著作権の「電子的」行使、著作物利用の「電子的」許諾を論ずることができるように思う。今年度は研究初年度であることから、情報化の著しい進展と社会状況の変化に対応する著作権制度の在り方について、最新の技術動向を分析し、今後の開発状況を調査する研究を中心に行った。調査の対象としては、(1)マルチメディア関係技術及びデジタル処理技術(2)ネットワークを利用した著作物流通の現状と電子透かしなどのデータ保護技術(3)複製防止技術及びコピープロテクト解除装置技術を採り上げ、各々について著作権法制上の問題点を整理した。また、ヨーロッパの動き、とりわけ1997年12月10日の著作権及び著作隣接権の調和に関する指令案並びにEC委員会における技術に関するその後の検討状況の調査も行った。平成10年度には、前年度の調査結果の分析、検討を進めるとともに、欧米諸国の動向を調査し、その上で、電子図書館システムを含め、電子的著作権管理システム(コピーライト・マネージメント・システム)の在り方を模索し、これらのモデル法制を作成する計画である。モデル法制の作成に際しては、内外の関係者からの意見の聴取も予定している。デジタル環境下、デジタル送信など、著作物のデジタル利用の範囲が広がりつつある。それは新たなビジネスの起ち上げであり、それに応じて著作権処理の新たなシステムの構築も模索される。本研究は、情報の圧縮、流通など、著作物の利用に関する新たな技術、これらの技術を用いた新たなビジネスの現況、著作物のそのような新たな利用と著作権の管理の3点につき、最先端の専門家をお招きするなど、最新の情報に接しつつ、行うことができた。その際、情報の圧縮技術の急速な普及と著作物流通、情報セキュリティの技術、音楽配信などのビジネスと著作権の管理につき新たな知見を得ることができた。幸い、著作物を含む情報のデジタル利用につき、権利者とビジネスの間で、権利の管理をも視野に入れたシステムを構築する作業も進められている。ビジネスの側も家電業界のみならず、コンピュータ業界も関与しはじめている。ここに、著作物の創作→デジタル利用→端末の連鎖の中で、著作権の管理も、アナログ対応とは違う、しかもこれまでよりも簡易迅速で、より個別的な権利の処理をも含む、新たなシステムが視界に入るようになった。このようなシステムの実用化は、著作権を制限する諸規定の見直しを促すことになり、著作権法制の在り方に大きな影響を与えるものとなる。
過栄養化した港湾でも自立・永続可能な繊維基質を用いた藻場創出技術に関する実証研究

過栄養化した尼崎港で藻場を自立的に定着させること,さらにそこで形成された生物を活用した環境改善の仕組みを作ることができた.特に,ビニロン基質を用いると,設置後6年間にわたって,自立的にワカメ藻場が形成されることができた.またワカメやムラサキイガイを回収し,循環利用するといった協働の取り組みによって,「汚いけど,楽しい,私たちの海」といった環境意識へと変化させ,地域課題の解決にもつながった.過栄養化した尼崎港で藻場を自立的に定着させること,さらにそこで形成された生物を活用した環境改善の仕組みを作ることができた.特に,ビニロン基質を用いると,設置後6年間にわたって,自立的にワカメ藻場が形成されることができた.またワカメやムラサキイガイを回収し,循環利用するといった協働の取り組みによって,「汚いけど,楽しい,私たちの海」といった環境意識へと変化させ,地域課題の解決にもつながった.本研究によって,次の6つの成果を得ることができた.(1)ワカメが分布するDL-1.5mより浅い水深帯では貧酸素化することはなかったが,夏期には透明度は約1.0m程度しかなかった.(2)2009年1月には,ワカメの発芽が見られたが,繊維の種類によって発芽数は異なり,最も多かったビニロンには,長さ10cmの繊維基質1個あたり平均32株ものワカメがみられ,春には葉長1.8mにも生長した.なおワカメは繊維基質以外にはほとんど定着しなかった.(3)繊維基質への付着物と二枚貝の個体数との関係を見ると両者には正の相関があったが,それらの量と発芽数との間には明確な関係は見られなかった.ワカメの発芽数は,海中観察によると波を受けて揺動しつつも直立している繊維上に多く,直立できず団子状に絡み合うような柔らかい繊維には,発芽数が少ない傾向にあった.(4)繊維基質を設置した水深で比較すると,水深DL-1.0mに設置したものに比較して,DL-1.5mのものの方が発芽数は多かった.この原因は,浅いDL-1.0mの方で,夏期により低塩分化したためと思われる.(5)2010年1月にも従来と同様に基質繊維上でワカメは発芽した.特にビニロンの基質上の生物を鉛直方向に見ると,ワカメは水深DL-0.0m-1.5mで発芽し,同水深帯ではシロボヤ,ユウレイボヤ,尋常海綿綱などの動物も多く付着していた.(6)以上のように,過栄養化した海域でも,二枚貝などの付着動物に阻害されることなく,自立的に世代交代し,ワカメ藻場を形成させることのできる繊維材料を見出すことができた.特に適度な弾性を持つ繊維であれば,他の動物と棲み分けを可能,つまり場をめぐる競争を回避することのできる環境を提供することができるというメカニズムも把握することができた.(1)ワカメの生育量の変化:当水域では12月にキンランからのワカメの発芽が見られ,34月に最大となる.2009年,10年にそれぞれ設置したビニロン繊維上から収穫できたワカメの量を2011年4月に計測したところ,2年前(2009年設置)のものにもワカメは自生,生長していた.その量は,1年前(2010年設置)に設置したものよりも多く,2年程度ではビニロンのワカメ基質としての機能は劣化していなかった.(2)適切な設置水深:2009年,2010年に設置したいずれの繊維でもワカメは,水深D.L.-1.0mの方が生育量は多かった.なお,ビニロン上で生育する量は,種苗ロープは2/3程度であった.(3)繊維材料の劣化:設置後20カ月後のビニロン繊維の残存本数を水深別に調べた,初期にはロープ1目あたり12本のビニロンがあり,D.L.-1.5mでは本数は維持されていた.しかし,最も浅いD.L.-0.5mでは約半数に減少しており,繊維が流出しないような製作上の工夫が必要であることがわかった.(4)繊維上の生物相:ワカメが最盛期を迎える3月は,ビニロン繊維材料上にも,壁面と同様にムラサキイガイが出現し,夏季にかけて優占した.その後壁面には,カンザシゴカイ科が優占し続けるが,ビニロン繊維上では海綿動物門が優占し,その他の水深帯では,大型の動物が多量に付着することなく,再びワカメの繁茂期を迎えた.2年を経ても,ワカメは繊維材料上で,主に繊維先端に定着し,ムラサキイガイなどの二枚貝は繊維基部に付着するといった棲み分けがなされていた.また夏季に優占したムラサキイガイは平均して殻長2cm以下と壁面に比較して小型のものであった.(5)ワカメの消失する夏季の役割:夏期にはワカメは胞子として繊維に付着し,休眠する.しかし,2010年7月の貧酸素化した時期には,底生魚類であるカサゴやマダコがビニロン繊維材料上で多数確認できた.例えば,カサゴは単位長あたり20個/m観察でき,これは貧酸素時の避難場所として繊維が機能していたようである.1.目的最近,大阪湾の一部では栄養塩不足が指摘されるようになったが,尼崎港のような湾奥では未だ赤潮,青潮が発生する状態にあり,環境改善の取り組みが必要とされている.

著者らは,ワカメを用いて,海中の栄養塩を陸上に取り上げ,循環する取り組みで,参加者の多様性と継続性を高めること,確実に環境を改善させ,かつ工業専用地区である尼崎南部の地域課題の解決の一助とすることを考えた.本研究では,その活動の効果の定量化と課題抽出を行う2.成果a)方法:健全な環境では,食物連鎖の中で物質は循環利用されるが,ヘドロの堆積が進行する環境中では,堆積する栄養塩を人為的に循環させる必要がある.そこで,尼崎港でワカメを養殖,取り上げ,陸上で堆肥利用した.堆肥は菜の花や野菜の栽培に利用し,廃棄物処分場の緑化に資することとした.菜の花の種は搾油し,食用,使用後はバイオディーゼル燃料(BDF)にした.b)評価方法と結果:本取り組みの狙いは,環境改善と地域課題解決の大きく二つに大別できる.環境改善では,(1)栄養塩の系外除去による水質浄化効果と,(2)夏場に脱落する付着生物の取り上げによる環境汚濁防止効果がある.前者は,2013年には,Nで0.86kg,Pで0.16kg分の生物を取り上げた,(3)回収生物量をTOC換算すると8.5kgで,これが全て脱落,分解されるとすると,飽和海水2.8m3中の酸素が消費されると試算された.地域課題の解決では,(4)廃棄物最終処分場の緑化,(5)低炭素社会の推進,(6)自然体験学習の機会提供と海への関心,意識の向上,(6)多様な主体の参加と継続といった点から評価できる.特に,(4)については,場内の草と混合させ,191kgの堆肥を作った.枯葉や青草など混和材料を変えたが,いずれの堆肥でも施肥量に応じて,菜の花の生長は良くなるなど,施肥効果は認められた.(5)については300mLのBDFを実際に得ることができた.1.繊維基質根元に付着するムラサキイガイの脱落要因についてムラサキイガイの脱落現象が発生する環境条件とその条件に対するムラサキイガイの付着活性への影響を複数年,複数地点における現地調査とムラサキイガイの足糸数を評価対象とした室内実験により評価した.その結果,これまでの知見に無かった,数時間スケールの海洋現象による水温変動により,足糸生産活性が高まること,塩分低下による影響は水温条件による足糸生産活性の向上効果より強く発現し,塩分低下速度の増大に伴い,足糸生産活性の低下が著しくなることわかった.最後に,これらの結果を踏まえて,脱落予測方法に関する考察と今後の課題について検討を行った.2.繊維基質上のワカメの生育a)ワカメの生育量の変化:当水域では12月にビニロン繊維にワカメの幼葉が見られ,34月に最大となった.b)適切な設置水深: 2009年,2010年に設置した,いずれのワカメ育成実験系でも水深D.L.-1.0mの方がワカメ生育量は多かった.c)繊維の劣化:波あたりの強い水深帯や設置期間に伴い,ビニロン繊維には劣化が生じていた.d)繊維上の生物相:ワカメが最盛期を迎える初年度の3月には,ビニロン繊維材料には,壁面と同様にムラサキイガイが7月にかけて優占した.その後壁面にはカンザシゴカイ科が優占したが,海綿動物門を除き,大型の動物が優占するこなく,再びワカメの繁茂期を迎えたe)
First-principle device simulation

非平衡グリーン関数(Nonequilibrium green's functions NEGF)によるデバイスの第一原理電気伝導計算. NEGFとorder-N density functional theory (DFT)を組み合わせ、電子とフォノンの輸送を研究しました。導電性高分子、金属デバイス、ハイブリッドシステムについて研究した。特に私たちはミクロンスケールのチャネル材料とナノ構造システムを目指しています。アプリケーションは高性能な計算(ハイ・パフォーマンス・コンピューティングHigh performance computing, HPC)に最適化されています。28年度が最終年度であるため、記入しない。
精子GPIセリンアンカープロテアーゼTESP5による細胞機能制御

精子表層でGPIアンカーしているセリンプロテアーゼTESP5/PRSS21がどのように細胞機能を制御しているのかを調べ、次のような成果を得た。PRSS21の一部は精子表層ですでに活性化しているが、生体外で精子セリンプロテアーゼACRを添加することによってPRSS21の活性化が著しく助長される。そこで、PRSS21による精子機能制御をさらに明らかにするために、PRSS21とACRの両方を欠損するダブル欠損マウスを作製し、PRSS21とACRそれぞれ単独の欠損マウス精子と比較検討を行った。このダブル欠損オスマウスの妊孕率は、野生型のほぼ半分まで低下していることが明らかになった。また、交尾後に受精卵を回収しほぼ同等の受精率が得られたため、この低受胎性は初期胚発生での異常が原因でないことを確認した。次に、体外受精系でダブル欠損精子の機能を調べてみると、まったく受精できないことが判明した。卵子透明帯結合能や卵子融合能などの顕著な不全も見いだされた。さらに詳しい検討の結果、このダブル欠損精子の受精不全は、精子が卵子卵丘細胞塊へ侵入しないか、侵入してもほとんど卵子透明帯へ到達できないことに起因していることが明確になった。ACR欠損精子も類似の機能不全が見いだされたが軽度であり、さらにPRSS21欠損精子にはその不全がほとんど見られなかった。したがって、PRSS21とACRは協調して精子の卵子卵丘細胞塊侵入と通過で機能していることが示唆された。TESP5欠損マウス精子は、子宮を通過すれば受精能を保持しているが、その精巣上体精子は体外での受精能が著しく低下している。そこで、まず野生型精子と比較しながら、TESP5欠損精子の諸性質を検討した。生体外での精子タンパク質のチロシンリン酸化にともなう受精能獲得や自発的アクロソーム反応に異常は検出できず、精子機能に関与するさまざまな膜タンパク質の欠損やプロセシングも見いだせなかった。また、TESP5はADAM3のような卵子透明帯結合能も保持していなかった。したがって、TESP5欠損精子で低下している体外受精能は、TESP5がほかの精子機能タンパク質を分解していることに起因しておらず、おそらくTESP5による卵子側のタンパク質分解のためであると推測した。実際に、可溶化した卵子透明帯を組換え型TESP5に作用させたところ、同じ酵素量のトリプシンやアクロシンとは異なり、透明帯を限定的に分解することが判明した。おそらく、TESP5によるこの透明帯限定分解が透明帯上のアクロソーム反応と密接な関係があると考えられる。一方、TESP5欠損マウス精子への受精能付与因子を子宮分泌液より同定することを試みた。HPLCによってその因子を精製し、現在、化学構造の決定を行っている。さらに、アクロシンとTESP5の両方を欠損するダブルノックアウトマウスを作製し、その変異オスマウスの産仔産生能を調べたどころ、野生型と比較してほぼ半分まで産生能が低下していることが明らかになった。
スフィンゴ脂質生合成阻害剤のライブラリー構築と医薬品創製への展開

真菌のスフィンゴ脂質生合成経路における阻害剤であるkhafrefunginは、抗真菌剤の候補として有力な化合物であり、筆者らによって立体構造の決定及び初の全合成が達成されている。Khafrefunginはスフィンゴ脂質生合成経路においてinositol phosphorylceramide(IPC)合成酵素の阻害剤として機能することが明らかにされているが、その阻害機構は不明である。そこで筆者らは阻害機能の解明を指向した有機化学的アプローチ及び活性の高い化合物の探索を目的として、khafrefunginの種々の類縁体を合成し、構造活性相関研究を行った。Khafrefunginはその構造上の特徴としてエステル部位やアルドン酸部分を有し、これらの部分を中心に種々の類縁体をデザインした。合成法としては筆者らが開発した大量合成の可能な効率的合成ルートを活用した。エステル部分をケトン、アミド、エーテル、チオエステルとしたものについてはいずれも活性が消失し、このエステル部位の重要性が示された。また、アルドン酸部分の一級水酸基とカルボキシル基がラクトンを形成した類縁体においては、天然のkhafrefunginと同等の活性がみられた。これらの実際の活性種は同一なのではないかと予想される。また、マクロラクトン型の類縁体やNMRデータを元にした湾曲構造を持つ類縁体もデザインしたが、この場合は活性の消失がみられた。これらの知見から、khafrefunginは生体内においてその構造が厳密に識別されていると考えられる。
アジア企業の研究者移動とイノベーション能力構築の関係

近年、主体的なイノベーション活動によって急激に成長してきている韓国や中国、台湾などの企業群のイノベーション・プロセスを明らかにするために、それらの企業によって取得された特許をデータ化する事を通して、特許とイノベーションとの関係、発明者の移動とイノベーションとの関係、および、研究開発における主軸発明者の役割を明らかにしている。企業のグローバル化が進む中、韓国や中国、台湾などのアジア企業群は先進国企業に遅れながらも短期間で急成長を遂げ、現在世界市場に台頭してきている。その急成長の背景には、政府のバックアップ体制や時代背景、OEM主義や提携の活用など、国特殊性やビジネス・スタイルにおける各国の違いが影響を及ぼしているだけでなく、それら企業群の主体的な活動や戦略が重要な要因となっている。特に、イノベーション能力の構築は目覚ましいものがあり、先進国企業の脅威となっているが、その構築プロセスは明らかにされていない。これまで進めてきた研究において、韓国や台湾、中国のエレクトロニクス企業を中心とした聞き取り調査によってそれらの背景を解明しようとしてきたが、インタビューのみでは実証に限界があるだけでなく、「イノベーション」というデリケートな題材に対して研究を質的に深めることにも限界があった。本研究では、これまでの知見に対して実証を踏まえた理論展開を行うために、「特許」という定量的な観点を取り入れ、特許取得研究者の動きに注日することで、イノベーション構築プロセスを論証していくことを研究目的としている。本年度は、各国の資料の分析、および、韓国特許庁の産業財産人力課長であるJung Sung-Chang氏(三星経済研究所出版の著書『知識財産戦争-韓国の特許経済力と対応戦略』の執筆者)のインタビュー調査を通して、近年の韓国の大企業は日本の大企業と類似した特許戦略を取っている点、米国が最も重要な特許出願先であり続いて日本での出願が重要である点、また、イノベーションと特許の間には一定の関連性を認められるという点を確認することができた。更に、韓国の三星電子のアメリカと日本における特許出願状況のデータベース化が終わっており、次年度にはその分析が可能となる。中国、台湾企業における特許戦略、特許状況と合わせて分析を行う予定である。米国や日本をはじめとする多くの先進国が金融危機や産業の成熟化による経済の停滞を懸念する中、韓国、台湾、中国から出発した企業群は近年急激に技術力を向上させ成長を続けており、先進国企業にとっての脅威となっている。それらの企業群は独自のイノベーション・プロセスを持っているが、それらの企業における重要性を認識しながらもイノベーション能力の構築プロセスを明らかにする研究はあまり見られない。本研究ではそれら企業群のイノベーション能力構築を明らかにするために、研究者の移動とそのマネジメントが企業に与える影響に着目し、実証的に明らかにすることを研究目的としている。本年度においては、企業内部で特許出願とそれによる商品化を繰り返す研究者の経歴を追うことで、技術の蓄積プロセスを実証的に明らかにするために、昨年度の研究に引き続き、韓国の三星電子だけでなく同じくLG電子、台湾のAcerにおける米国への特許出願データを収集・整理、また、中国企業の特許出願状況を確認する作業を行った。その結果、韓国の三星電子やLG電子は他国に比べて急激に特許出願、登録件数を伸ばしている一方、台湾や中国企業は特定の企業による積極的な特許戦略はあまり見られない。従って、主要な研究者を割り出す作業は韓国企業に絞り、国内の主要な研究者(特許件数多数保持者)および外国人研究者のデータベースを構築した。また、企業のイノベーション戦略を国際的な観点で検討する方向で今後の研究を進めるために、消費者行動における国をまたがった文化的な差異の重要性に関する研究を行った。米国や日本をはじめとする多くの先進国企業がグローバル化の進展による競争の激化、世界的同時不況、および、産業の成熟化によって経済の停滞に苦しむ中、韓国や中国、台湾などのアジア企業群は先進国企業に遅れながらも短期間で急成長を遂げ、世界的なシェアを伸ばしてきている。その急成長は、政府のバックアップ体制や時代背景など、国特殊性の違いが影響を及ぼしているだけでなく、主体的な活動や戦略による独自のイノベーション・プロセスを持っていると考えられる。しかし、それらのイノベーション・プロセスに関連する情報は社外秘によって成り立っており、重要性を認識しながらも研究が進んでいないのが現状である。これまで、それらの企業への聞き取り調査を中心に研究を進めてきたが、実証に限界がある点、および、公に情報を提供できないなどの点から研究を質的に深めることに限界があった。従って、本研究では、「特許」という定量的な観点から、特許取得研究者の動きに注目しイノベーション構築プロセスを論証していくことを研究目的としている。最終年度である本年度は、これまで収集した三星の特許データを詳細に分析することで研究者の移動とその影響を明らかにすること、また、三星技術研究院で10年以上主席研究員として勤務していた元研究員とのインタビューで三星電子における特許取得とイノベーションの関係、および、研究者の移動とイノベーションの関係に関する聞き取り調査を行うことで理論構築を試みている。

その結果、早期に外部から移動してきた研究者がその後内部や新規で採用された研究者と共同研究をすることで主軸の研究者としての役割を果たすことを特許の出願状況から把握することができ、また、そのような主軸の研究者は比較的長期間三星に留まることが分かった。さらに、単年度(2004年)における研究者間の関係を図示することで実証的な説明力を付加することに成功した。
内向き整流性K^+チャネル(Kir7.1)変異体を用いた生理機能および病態解析

トランスジェニックマウス作製用ベクターの構築とチャネル蛋白質発現の確認Kir7.1変異体トランスジェニックマウスを作製するため、アクチン(CAG)プロモータの下流にKir7.1AAA変異体遺伝子をつないだベクターを構築した。当ベクターをHeLa細胞に一過的に導入しチャネル蛋白質を発現させた後、Kir7.1に対する抗体でウエスタンブロッティングを行ったところ、Kir7.1の理論分子量に相当する付近に1本のバンドを検出した。このことから当ベクターで用いたプロモータは機能的であると考えられた。現在、北里大学医学部遺伝子高次機能解析センターにおいてトランスジェニックマウスを作製中である。哺乳類腎臓由来新規培養細胞の樹立と機能解析SV40LTマウスを用いて腎尿細管由来培養細胞を新規に樹立しKir7.1内在性電流を高濃度Ba^<2+>感受性電流として測定した。樹立した細胞においてKir7.1 mRNAを確認したが(RT-PCR,RNase protection assay)、膜電流の全細胞記録では有意な高濃度Ba^<2+>感受性電流は観察されなかった。その理由はKir7.1 mRNA後確認後、細胞の継代によって形質が変化したものと考えられた。今後、活性測定のためには腎尿細管細胞にKir7.1野生型遺伝子を導入しチャネルを再構成することが必要と考えられ、現在そのためのベクター(Kir7.1WT-IRES-EGFP)を構築中である。
作動流体のフラッシュ蒸発を伴う超音速マイクロノズルのチョーク現象の解明と応用

本研究により得られた成果の概要はつぎのとおりである。1.高温高圧の圧縮液がノズルにより等エントロピー膨張を行う場合の流れは、圧縮液の状態で流れがノズルスロートで臨界状態に達する場合、液体が飽和状態に達すると同時に流れが臨界状態となる場合、及びノズル内でフラッシュ蒸発が起こって気液二相流となり、その後ノズルスロートで臨界状態に達する場合の三つのケースに分類される。フラッシュ蒸発が起こると、流れの音速が不連続に減少する。2.上記の三つのケースについて、流れがチョークする条件を明らかにした。チョーク条件は圧縮液の初期圧力とサブク-ル度に依存する。また、それぞれのケースに対して、フラッシュ蒸発により発生する気泡は均質に分散し、かつ気泡と液体の流速は等しいとして、臨界流量を算出する流れモデルをつくり、数値計算を行った。計算結果は実験結果とかなりよく一致する。3.流れがスロートで臨界状態に達した瞬間にスロートより上流に伝播する過渡的圧力変動が生じる。これはチョークにより流れを調節するための圧力波で、圧力波が気泡を含む気液二相流中を伝播すると、圧力は不連続的に上昇した後、時間とともに周期的に変動する。これは圧力変動に伴う気泡体積の変動に起因する。圧縮性気液二相流中の圧力波の伝播速度とボイド率の関係を明らかにした。4.気体のみの単相流に対する超音速マイクロノズルの特性は、マッハ数のみならず、ノズル出口状態を基準とするレイノルズ数にも依存する。ノズルの過膨張、適正膨張、不足膨張の範囲を明らかにするとともに、このような臨界流量に関する資料が得られた。本年度の研究により得られた成果の概要は次の通りである。1.高温高圧の圧縮液がノズルにより等エントロピー膨張を行う場合、ノズル上流のよどみ点状態の圧力P_oから、等エントロピー変化により温度と圧力が減少し、飽和状態(この状態の圧力をP_sとする)に達すると、液体の中に小さな気泡が多数発生する。このフラッシュ蒸発により、液体の圧縮性は飽和状態に達した瞬間に急激に大きくなる。2.飽和状態に達することによる圧縮性の急激な増大により、飽和状態を堺にして、音速は不連続的に減少する。このため、P_oがP_sより十分大きい場合には、飽和状態に達した瞬間に流れのチョークが起こり、スロートを通る質量流量はスロート上流の状態のみに依存し、下流の状態には依存しないようになる。3.P_oがP_sよりあまり大きくない場合には、飽和状態に達して流れはチョークせず、そのままノズル内で膨張が続けられ、気液二相流となり、膨張とともに全質量に対する気相質量が増加する。このため、流れのチョークが起こる。4.気体のみの単相流が超音速ノズルで加速される場合、気体の粘性によりノズル壁面に乱流境界層が発生する。境界層の排除厚さと運動量厚さとの比は、主流マッハ数に強く依存し、流れ方向の距離と主流の条件に基づいたレイノルズ数にはほとんど依存しない。また、運動量厚さと境界層厚さの比はマッハ数にもレイノルズ数にもほとんど依存しない。なおノズル内に発達する乱流境界層を計算するために妥当な速度分布指数と局所摩擦係数を明らかにした。本年度の研究により得られた成果は次の通りである。1.高温高圧の圧縮水が先細ノズルにより等エントロピー膨張を行う場合の流れは、(1)圧縮水の状態で流れがノズルスロートで臨界状態に達する場合、(2)等エントロピー変化により温度と圧力が減少し、飽和状態に達すると同時に流れが臨界状態となる場合、(3)飽和状態に達しても流れはチョークせず、そのままノズル内で膨張が続き、フラッシュ蒸発が起こって気液二相流となり、その後ノズルスロートで臨界状態に達する場合の三つに分類される。

2.上記の三つのケースにつき、フラッシュ蒸発により発生する気泡は均質に分散し、かつ気泡と液体の流速は等しいと仮定して、臨界流量を算出する流れモデルをつくり、数値計算を行った。この流れモデルによれば、臨界流量はスロート上流の状態のみに依存し、下流の状態には依存しない。計算結果は従来の実験結果とかなり良く一致する。3.実験によれば流れがスロートで臨界状態に達した瞬間にスロートより上流に伝播する過渡的圧力変動が生じる。これはスロートの位置で圧力波が発生し、流れを調節するために上流に伝わるためと考えられる。圧力波が気泡を含む気液二相流中を伝播すると、圧力は不連続的に上昇した後、時間とともに周期的に変動する。これは圧力変動に伴う気泡体積の変動に起因すると思われる。4.気体のみの単相流に対する超音速マイクロノズルの特性に関して実験と数値計算の両面より研究を行った。その結果、ノズル出口マッハ数が約3以下の場合、マイクロノズルの過膨張、適正膨張、及び不足膨張の範囲は通常の大きさの超音速ノズルとほぼ同じであるが、出口マッハ数が約3より大きいノズルでは異なってくることが明らかになった。このようなノズルに対する臨界流量に関する資料が得られた。本年度の研究により得られた成果はつぎのとおりである。1.高温高圧に圧縮された液体が先細ノズルによって膨脹加速され、フラッシュ蒸発が起こる場合の流れを解析し、流れのチョーク現象を明らかにした。チョーク条件は圧縮液の初期圧力とサブク-ル度に依存し、ノズルスロートでチョークする場合と、スロート以外の断面でチョークする場合があることを示した。2.上記の各ケースについて、等エントロピー流れで、気相の液相間の相対速度がなく、熱力学的に平衡であると仮定して、臨界質量流量を算出する流れモデルをつくった。臨界質量流量はサブク-ル度が一定の場合には初期圧力が大きいほど、また初期圧力が一定の場合にはサブク-ル度が大きいほど増加する。このモデルによる計算値は実験結果とよく一致する。3.フラッシュ蒸発によって生じる圧縮性気泡流内を伝播する圧力波の特性を実験的に調べるとともに、管の弾性を考慮しない場合とする場合の圧力波の伝播速度を解析的に求めた。ボイド率が約1%以下の場合、圧力波の伝播速度の実験値は管の弾性を考慮に入れた解析結果とよく一致し、約1%以上の場合の実験値は管の弾性を考慮しなくても解析結果と一致する。4.気体のみの単相流に対する超音速マイクロノズルからの噴流の特性は、出口マッハ数のみならず、ノズル出口直径を代表長さとし、出口状態の速度や粘性係数に基づくレイノズル数に依存する。しかしこのレイノズル数が約3000以上あれば、出口マッハ数のみに依存し、レイノズル数にほとんど無関係になる。
合成ペプチドのハイブリッド化による効率的細胞内導入と転写因子活性化制御

近年、細胞内情報伝達に関与する種々の蛋白質の相互認識部位に対応する10-20残基程度のペプチドにより、これらの蛋白質間の相互作用がブロックできることが報告されてきている。このアプローチによって、例えばある疾病の引き金を引くような細胞内情報伝達を阻止できれば、新しい疾病の治療法の開発への糸口になりうると考えられる。申請者らは、膜透過ペプチドにより蛋白質相互認識部位に対応するペプチドを細胞内に導入するために、膜透過性のキャリアペプチドの検討を行った。その結果、既知のHIV-1 Tat由来ペプチドの他、HIV-1 RevなどのRNA結合性塩基性ペプチドが高効率的にマウスマクロファージ由来RAW264.7細胞やサル腎臓由来COS-7細胞内に移行し、核に集積することを確認した。ついで、これらのペプチドとハイブリダイズすることによりカルボニックアンヒドラーゼ(分子量26,000)も細胞内に容易に導入できることを見いだし、上記のペプチドが合成ペプチドの細胞内導入に極めて有用なキャリア分子となることを示した。次いで、合成ペプチドを用いた細胞内蛋白相互作用の調節の可能性を検討するため、モデルとして近年種々の疾病に関与することで注目されている一酸化窒素合成酵素(iNOS)の誘導の調節を試みた。すなわち、上記のキャリアペプチドと、iNOSの誘導の主たる引き金とされる転写因子、NF-kBの活性化に関与する蛋白質IkBのリン酸化部位、およびユビキチン化部位に対応するペプチドのハイブリッドペプチドを合成し、iNOSの誘導をRT-PCR法で検出することによりNF-kBの活性化の評価を行った。これらのペプチドをRAW264.7細胞に投与した結果、全体としてiNOSの発現の抑制傾向が見られたが、再現性に問題があり、レポータ遺伝子等を用いたNF-kB発現の直接的評価等を現在検討中である。近年、細胞内情報伝達に関与する種々の蛋白質の相互認識部位に対応する10-20残基程度のペプチドにより、これらの蛋白質問の相互作用がブロックできることが報告されてきている。申請者らは、膜透過ペプチドにより蛋白質相互認識部位に対応するペプチドを細胞内に導入するために、まず、膜透過性が報告されている幾つかのペプチドを蛍光標識し、蛍光顕微鏡を用いてペプチドの細胞内移行性の評価を行った。その結果、HIV-1ウイルスのTat蛋白質由来の15残基からなる塩基性ペプチドが容易に神経培養細胞PC-12の細胞膜を通過し、核に集積することを確認した。ついで、このペプチドをキャリアとして用いた細胞内蛋白相互作用の調節の可能性を検討するため、モデルとして近年種々の疾病に関与することで注目されている一酸化窒素合成酵素(iNOS)の誘導の調節を検討することにした。すなわち、iNOSの誘導の主たる引き金とされる転写因子、NF-@@S2K@@E2Bの活性化に関与する蛋白質I@@S2K@@E2Bのリン酸化部位、およびユビキチン化部位に対応するペブチドを合成し、選択的ジスルフィド架橋によりTatペプチドとのハイブリッドを合成した。さらに、iNOSの誘導をRT-PCR法で検出するアッセイ系の確立を現在行っている。今後、このアッセイ系を用いて、ハイブリッドペプチドによる細胞内導入及びiNOS誘導阻害活性について検討を行う予定である。

このアプローチによって、例えばある疾病の引き金を引くような細胞内情報伝達を阻止できれば、新しい疾病の治療法の開発への糸口になりうると考えられる。申請者らは、膜透過べプチドにより蛋白質相互認識部位に対応するペプチドを細胞内に導入するために、膜透過性のキャリアペプチドの検討を行った。その結果、既知のHIV-1Tat由来ペプチドの他、HIV-1RevなどのRNA結合性塩基性ペプチドが高効率的にマウスマクロファージ由来RAW264.7細胞やサル腎臓由来COS-7細胞内に移行し、核に集積することを確認した。ついで、これらのペプチドとハイブリダイズすることによりカルボニックアンヒドラーゼ(分子量26,000)も細胞内に容易に導入できることを見いだし、上記のペプチドが合成ペプチドの細胞内導入に極めて有用なキャリア分子となることを示した。次いで、合成ペプチドを用いた細胞内蛋白相互作用の調節の可能性を検討するため、モデルとして近年種々の疾病に関与することで注目されている一酸化窒素合成酵素(iNOS)の誘導の調節を試みた。すなわち、上記のキャリアペプチドと、iNOSの誘導の主たる引き金とされる転写因子、NF-kBの活性化に関与する蛋白質IkBのリン酸化部位、およびユビキチン化部位に対応するペプチドとのハイブリッドペプチドを合成し,iNOSの誘導をRT-PCR法で検出することによりNF-kBの活性化の評価を行った。これらのペプチドをRAW264.7細胞に投与した結果、全体としてiNOSの発現の抑制傾向が見られたが、再現性に問題があり、レポータ遺伝子等を用いたNF-kB発現の直接的評価等を現在検討中である。