hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
同種複合組織移植における免疫学的寛容の導入・維持に関する実験的研究

同種複合組織移植の臨床応用を目指して,免疫抑制剤(FK-506)を用いたラット同種四肢移植をモデルとした一連の実験を行い,以下の結果を得た。1.FK-506は低濃度でサイクロスポリン-Aと同等の生着効果をあげた。2.FK-506は14日間の短期投与で33%のラットに長期生着が得られ,長期生着群の免疫応答能はドナー抗原に特異的に低反応性を獲得していること。3.長期生着群ではその神経再生と移植肢の成長は同系群と同等に起こり得ること。4.長期生着群では移植肢の脛骨は同系群と同様な成長をきたし,それらの維持にはレシピエントの免疫学的寛容の導入・維持が必要であること。5.免疫応答能の評価より,同種複合組織移植の長期生着の機序として,レシピエントのドナー抗原に対するリンパ球クローンの不応答性(Clonal Anergy),とクローン消失(Clonal Deletion)の両者が関与していること。6.フリーラジカルの発生が再接着後の機能障害に深く関与していること。7.同種複合組織移植における移植片の至適保存法を検討するために,幼若ラット切断肢再接着モデルを作製し,移植肢の保存方法の違いによって骨長軸成長に差があるか否かを調査し,温阻血6時間以上では骨端線の部分閉鎖が出現し,成長障害が認められたが冷阻血群では9時間の阻血でも成長障害を来さなかった。8.筋ジストロフィーマウスに対して正常マウスの遊離筋肉移植を行い,移植した筋肉は正常に機能し組織移植の臨床応用への可能性を示唆した。今後は,同種複合組織移植の際により高率に免疫学的寛容状態を導入・維持するために,ドナーの骨髄細胞を数種の細胞濃度に調節しレシピエントに各種投与経路で投与し,短期間の免疫抑制剤(FK-506)を投与する。これらによって得られた長期生着群の免疫応答能を評価し,同種複合組織移植における移植免疫を発展確立し,臨床応用への道を追求する。同種複合組織移植における、免疫応答能を評価するため、MLC(リンパ球混合培養)反応、CML(細胞媒介性リンパ球溶解)反応、CDC(補体依存細胞障害)反応の至適培養条件の検討を行った。その結果、基礎実験で得られた条件を用いて十分に評価できることが判明した。今後は、この培養条件を用いて同種複合組織移植における免疫応答能を評価していく予定である。また、同種複合組織移植片の至的保存法の検討としては、ラットの大腿を中央部より完全切断し、一定時間保存後、再接着するモデルを用いて検討した。その結果、3時間保存群に比べ6時間保存群では生着率および筋質重量とも有意に低下しており、本モデルは移植モデルとして有用であることが判明した。また、筋質重量と相関し、筋収縮力も有意に低下しており、今回用いた装置により筋収縮力を測定でき、筋収縮力の測定は移植組織の機能評価法として有用であることが判明した。また、6時間保存群の生着率を向上させ、機能を温存させる保存法の開発が必要と考えられた。今後は、特異的なDNAプローベを用い、各種組織のpermiabilityの評価が可能か否かについて検討を加えたい。また、拒絶反応時に出現する免疫担当細胞やサイトカインの動態を調べるため、免疫学的手法の有用性についても検討を加えたい。

さらに、特異的免疫療法として、ドナーの各種細胞をレシピエントの種々の経路に免疫抑制剤FK-506と伴に投与し、組織学的に評価し、その有用性についても検討を加えたい。同種複合組織移植における,免疫応答能を評価するため,MLC(リンパ球混合培養)反応,CML(細胞媒介性リンパ球溶解)反応,CDC(補体依存性細胞障害)反応の至適培養条件の検討を行った.その結果,基礎実験で得られた条件を用いて十分に評価できることが判明した.今後は,この培養条件を用いて同種複合組織移植における免疫応答能を評価していく予定である.また,同種複合組織移植片の至的保存法の検討としては,ラットの大脳を中央部より完全切断し,一定時間保存後,再接着するモデルを用いて検討した.その結果,3時間保存群に比べ6時間保存群では生着率および筋質重量とも有意に低下しており,本モデルは移植モデルとして有用であることが判明した.また,筋質重量と相関し,筋収縮力も有意に低下しており,今回用いた装置により筋収縮力を測定でき,筋収縮力の測定は移植組織の機能評価法として有用であることが判明した.また,6時間保存群の生着率を向上させ,機能を温存させる保存法の開発が必要と考えられた.今後は,特異的なDNAプローベを用い,各種組織のpermiabilityの評価が可能か否かについて検討を加えたい.また,拒絶反応時に出現する免疫担当細胞やサイトカインの動態を調べるため,免疫学的手法の有用性についても検討を加えたい.さらに,特異的免疫療法として,ドナーの各種細胞をレシピエントの種々の経路に免疫抑制剤FK-506と伴に投与し,組織学的に評価し,その有用性についても検討を加えたい.同種複合組織移植の臨床応用を目指して,免疫抑制剤(FK-506)を用いたラット同種四肢移植をモデルとした一連の実験を行い,現実までに以下の結果を得ている。1.FK-506は低濃度でサイクロスポリン-Aと同等の生着効果をあげた。2.FK-506は14日間の短期投与で33%のラットに長期生着が得られ、長期生着群の免疫応答能はドナー抗原に特異的に低反応性を獲得していること。3.長期生着群ではその神経再生と移植肢の成長は同系群と同等に起こり得ること。4.長期生着群では移植肢の脛骨は同系群と同様な成長をきたし,それらの維持にはレシピエントの免疫学的寛容の導入・維持が必要であること。5.免疫応答能の評価より,同種複合組織移植の長期生着の機序として,レシピエントのドナー抗原に対するリンパ球クローンの不応答性(Clonal Anergy),とクローンの消失(Clonal Deletion)の両者が関与していること。6.フリーラジカルの発生が再接着後の機能障害に深く関与していること。7.筋ジストロフィーマウスに対して正常マウスの遊離筋肉移植を行い,移植した筋肉は正常に機能し組織移植の臨床応用への可能性を示唆した。本年度は同種複合組織移植における移植片の至適保存方法を検討するために,幼若ラット切断肢再接着モデルを作製し,移植肢の保存方法の違いによって骨長軸成長に差があるか否かを調査し,温阻血6時間以上では骨端線の部分閉鎖が出現し,成長障害が認められたが冷阻血群では9時間の阻血でも成長障害を来さなかったとの結果を得ている。
心筋細胞-非心筋細胞間ギャップ結合の致死性不整脈発生における役割

心筋梗塞の修復期に増加する筋線維芽細胞(MF)が、心筋細胞(CM)との間にギャップ結合蛋白質コネキシン43(Cx43)を介して細胞間結合し、心臓に異常な興奮伝導を惹起するか否かを検証した。ラット心筋梗塞モデルでは、MF・CM間にCx43が発現し、CMからMFへ色素移行した。CMとMFの各単層組織をフィルター膜を挟み各々表裏に培養すると、CM層の伝導が遅延し旋回性の不整脈が生じ易くなった。また両細胞を人為的に電気的結合すると、細胞間抵抗の低下に伴いCMの脱分極や自発性興奮が発生した。以上、MFは心筋梗塞の重要な不整脈原性基質となることが判った。急性心筋梗塞おける致死的心室性不整脈発生の解剖学的基質解明のため以下の実験を行った。1.ラット心筋梗塞境界部における心筋細胞・非心筋細胞間のギャップ結合の解析雄ラットの左冠動脈を結紮し心筋梗塞を作製、結紮後5日目,25日目の心臓を固定後凍結切片を作成し、心筋細胞を抗sarcomericα-actinin抗体で、非心筋細胞を抗vimentin抗体で同定、ギャップ結合は、コネキシン(Cx)43,Cx40,Cx45の何れかの抗体で3重染色した。共焦点レーザ顕微鏡にて3次元画像を取得、3次元デコンボリューションし、心筋細胞-非心筋細胞間におけるギャップ結合の局在を詳細に検討した。その結果、結紮後5日目の梗塞境界部に残存心筋組織において、Cx43の発現を心筋細胞-非心筋細胞間に認めた。これらの非心筋細胞の多くはα-smooth muscle actinを発現しており筋線維芽細胞と考えた。Cx40やCx45の発現は認めなかった。2.心筋-心筋細胞の培養モデルを用いたギャップ結合の興奮伝播の解析新生仔ラット心からコラゲナーゼにより心筋細胞を単離した。単離にはpreplate法による非心筋細胞の除去(通常2回)を施行した。単離心筋細胞(約10^6個)を35mmコラーゲン塗布培養皿に4日間培養し、カルシウム蛍光指示薬を負荷した後マクロ蛍光顕微鏡にて心筋のカルシウムトランジェントを捉えた。この心筋細胞群に1Hz9Hzの通電刺激によって刺激部位から放射状に均一な興奮伝播することを確認した。さらにドミナントネガティブCx43遺伝子をアデノウイルスのベクターを用いて導入した単離心筋細胞群を対象に同様の通電刺激を行うと、興奮伝導が不均一化し伝導のスパイラル波が生じることが明らかになった。心筋梗塞おける死因の大部分を占める致死性不整脈の発生に、肉芽組織として出現する非心筋細胞(特に筋線維芽細胞)が関与していることを明らかにするため以下の実験を行った。1. in vivo scrape-loadin法を用いたラット心筋梗塞境界部における心筋細胞・非心筋細胞間ギャップ結合の機能解析ラットの冠動脈の結紮により作成した5日目の梗塞心を摘出後Langendorff灌流し、梗塞境界部から約1mm離れた心筋組織にメスで割を入れ、ギャップ結合の通過が可能なneurobiotinを5分間接触させた後、固定(4%PFA)し凍結切片を作成、Alexa488と結合したstreptavidinでneurobiotinを用いて共焦点顕微鏡で蛍光画像を取得した。その結果、梗塞境界部でneurobiotinが心筋から非心筋に移行している像が確認された。また両細胞間の色素移行は、ギャップ結合阻害薬heptanolにより抑止されたことから、両細胞間に存在するギャップ結合が、細胞間移行に関わっていることが明らかになった。2.心筋細胞・非心筋細胞間電気的結合の心筋の興奮性に及ぼす影響の解析ラットの冠動脈結紮5日後の梗塞境界組織から得た筋線維芽細胞と心筋細胞の膜電位をパッチ電極を用いて記録し、両者間の電気的結合抵抗を人為的に作成し、心筋細胞の膜電位に及ぼす影響を検討した。健常な心筋では静止膜電位は約-80mVであるのに対し、筋線維芽細胞では-30-10mVと分極が弱かった。両細胞間の結合抵抗を2GΩから下げていくと、次第に心室筋の膜電位が浅くなり、同時に活動電位の持続時間が延長、しばしば早期後脱分極が生じた。細胞間結合が3050MΩで両者の膜電位は一致した。以上より心筋の膜電位は、筋線維芽細胞との間の電気緊張効果により低下し、自発性興奮が生じ易くなることが明らかになった。急性心筋梗塞おける死因の大部分を占ある致死性不整脈の発生機序に、肉芽組織として出現する非心筋細胞(特に筋線維芽細胞)が大きく関与していることを証明し、致死的心室性不整脈発生の解剖学的基質を明らかにすることを目的とした。

A.ラット心筋梗塞境界部における筋細胞-筋線維芽細胞間のギャップ結合機能の解析心筋梗塞5日目の梗塞境界部における心筋細胞-筋線維芽細胞間の機能的結合を明らかにするため、色素注入法による実験を行った。ラット左冠動脈を結紮し5日目の梗塞心を摘出し、梗塞境界部より充分離れた健常心筋組織を切開し、同部にneurobiotinを滴下し、その細胞間移行を調べたところ、neurobiotinはギャップ結合を介して心筋細胞から筋線維芽細胞へ移行することが判った。B.共培養モデルを用いた心筋・筋線維芽細胞間ギャップ結合による興奮伝播の解析心筋細胞・線維芽細胞の共培養で興奮伝導の低下が知られていることから、両細胞間のギャップ結合コミュニケーション(以下GJC)が心筋の興奮・伝導性を変化させる可能性がある。しかし、両細胞間のGJC自体が心筋組織の興奮伝導に影響するか否かは不明である。そこで、多数の孔(8μm)を有するフィルター膜の表裏に、各々生後2日のラットより得た心筋細胞-心筋細胞または心筋細胞-線維芽細胞を培養することにより、両細胞が混在することなく両細胞層が接する共培養モデルを構築し、培養5日後に心筋組織の興奮伝導様式をCa^<2+>蛍光により解析した。GJCはCalcein色素の細胞間移行により解析した。心筋・線維芽細胞培養系での伝導速度は心筋・心筋細胞培養系に比し有意に低かった。Calceinは、心筋・心筋培養系と心筋・線維芽細胞培養系のいずれでも細胞間移行した。以上、心筋細胞は線維芽細胞とGJCを介して興奮伝導を抑制し、不整脈の発生基盤を形成する可能性が明らかとなった。
NAD+およびエピゲノムの制御による老化メカニズムの解明と新たな抗加齢介入の開発

超高齢社会に突入した我が国において、抗加齢により健康寿命を延長させることは喫緊の課題となっている。カロリー制限によってニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NAD+)依存性のヒストン脱アセチル化酵素であるサーチュインが活性化されることにより、様々なエピゲノム変化が生じ、長寿遺伝子群が発現していることが予想されている。本研究では、組織幹細胞の3次元培養技術であるオルガノイド培養法により腸管上皮からオルガノイドを樹立し、エピゲノム変化および遺伝子発現を網羅的に解析することで老化の分子機構を解明する。さらに、NAD+前駆体の投与および領域特異的なエピゲノム制御に基づく新たな抗加齢介入の開発を目指す。
GSK3βのがん細胞生存・増殖維持機能の解明と分子標的がん治療法の開発

正常細胞のWnt経路制御作用からがん抑制的に働く機能分子と認識されているglycogen synthase kinase 3β(GSK3β)の大腸がんへの関与に着目した.そして, GSK3βの過剰発現やそのリン酸化による酵素活性調節の破綻ががん細胞の生存や増殖を維持・推進するという, Wnt経路抑制機能とは異なる病的作用を発見した.その後, GSK3β阻害の制がん効果を消化器がん細胞と担がん動物で実証し,本酵素が新しいがん治療標的であると提唱した.現在までに,その制がん効果ががん抑制分子経路に依存するという結果をえて,膵がんや脳悪性腫瘍などの難治性がんに対象を広げて分子機構を解析している.正常細胞のWnt経路制御作用からがん抑制的に働く機能分子と認識されているglycogen synthase kinase 3β(GSK3β)の大腸がんへの関与に着目した.そして, GSK3βの過剰発現やそのリン酸化による酵素活性調節の破綻ががん細胞の生存や増殖を維持・推進するという, Wnt経路抑制機能とは異なる病的作用を発見した.その後, GSK3β阻害の制がん効果を消化器がん細胞と担がん動物で実証し,本酵素が新しいがん治療標的であると提唱した.現在までに,その制がん効果ががん抑制分子経路に依存するという結果をえて,膵がんや脳悪性腫瘍などの難治性がんに対象を広げて分子機構を解析している.細胞生存と増殖の調節破綻を本態とするがんにおけるGSK3βの機能を明らかにするために我々は,大腸癌を中心に本酵素の発現,活性と機能を解析し,GSK3βが癌細胞の生存と増殖を維持・推進するという「がん促進機能」を発見した.本研究では,種々の消化器がんに共通するGSK3βの病的作用の検証,GSK3β阻害に基づく制がん効果の分子細胞メカニズムの解明と,本酵素の簡便で高精度の活性検出方法を開発する.本課題を通じて,GSK3β阻害によるがん抑制作用に基づく新しいがん治療法や制がん剤開発の知的基盤および,本酵素阻害物質のスクリーニングと同定のための基盤技術を創出することを目指す.1.異なるがん腫に共通するGSK3βの病的作用の検証:大腸癌の解析結果,すなわち,(1)癌細胞と癌の患部ではGSK3βの発現と活性が増強し,リン酸化による活性調節が破綻している;(2)GSK3βの活性と発現を小分子阻害剤とRNA干渉法により阻害・抑制すると,癌細胞の生存と増殖が抑制され,アポトーシスが誘導される;(3)非腫瘍性(正常)細胞ではこれらの現象は観察されない,という成果からGSK3βの「がん促進機能」を見いだしてきた.今年度は,種々の消化器がん(胃癌,膵癌,肝細胞癌)や,乳癌,脳腫瘍(神経膠芽腫)などについて,我々が発見したGSK3βの病的作用がこれらのがん腫に共通することを検証した.2.GSK3β阻害の制がんメカニズムの共通性の解明:大腸癌細胞でGSK3βをRNA干渉によりノックダウンして,cDNAマイクロアレイにより遺伝子発現の変化を解析した.その結果,GSK3βにより発現制御を受け,癌細胞の生存や増殖に関わる可能性のある遺伝子群を選定した.細胞生存と増殖の調節破綻を本態とするがんにおけるGSK3βの機能を明らかにするために我々は,大腸癌を中心に本酵素の発現,活性と機能を解析し, GSK3βが癌細胞の生存と増殖を維持・推進するという「がん促進機能」を発見した.本研究では,種々の消化器がんに共通するGSK3βの病的作用の検証, GSK3β阻害に基づく制がん効果の分子細胞メカニズムの解明と,本酵素の簡便で高精度の活性検出方法を開発する.本課題を通じて, GSK3β阻害によるがん抑制作用に基づく新しいがん治療法や制がん剤開発の知的基盤および,本酵素阻害物質のスクリーニングと同定のための基盤技術を創出することを目指す.昨年までに,ヒト大腸がん細胞株SW480のヌードマウス移植腫瘍に対して,小分子GSK3β阻害剤の腹腔内投与が有害事象を伴わずに腫瘍増殖を抑制することを明らかにした(Cancer Sci 2007 ; 98 : 1388-93).今年度は,別のヒト大腸がん細胞株HT-29のヌードマウス移植腫瘍モデルを作成し, GSK3β阻害剤の長期間(10週間)投与の抗腫瘍効果を実証した.金沢医科大学腫瘍内科学との共同研究により, gemcitabine耐性を示す膵がん細胞株PANC-1についても同様の結果を得た.いずれも,論文投稿中である.昨年,大腸がん細胞株においてGSK3βのRNA干渉により発現変動する分子群をcDNAマイクロアレイを用いて同定した.そこで,異なる細胞株についてGSK3β阻害によるこれらの分子群の個々の発現変化やリン酸化を定量的RT-PCRやウエスタンブロット法により検証し, JNK/c-Jun経路が複数のがん細胞株に共通して変動することが判明した.3.大腸がんおよび胃がん組織におけるGSK3βの発現,リン酸化と活性解析GSK3β阻害によるがん治療法を開発するためには,治療標的となるGSK3βの実際のがん腫における特性を明らかにする必要がある.そこで,胃がんと大腸がんを対象に,腫瘍組織非がん部粘膜におけるGSK3βの発現,その活性を制御するリン酸化(第9セリン,第216チロシン)と活性を比較解析した.その結果,がん組織におけるGSK3βの発現,第216チロシンリン酸化と酵素活性は同一症例の非がん粘膜に比べて亢進していた.

この結果から,消化管がんにおけるGSK3βの病的特性が推定され, GSK3βを標的とするがん治療法開発の理論と根拠を明らかにした(論文投稿中).
拡散強調画像とトラクトグラフィーを用いた緑内障の脳視覚路変性の検討

本研究は網膜障害による脳視覚路変化を拡散強調画像(dRI)とトラクトグラフィーを用いて定量的に評価することを目的としている。緑内障は患者数は多いが視野障害程度、視野障害プロファイルが多彩なため、両眼に視野障害を来す加齢黄斑変性を視細胞障害モデル、レーベル遺伝性視神経症(LHON)を網膜神経節細胞障害モデルとして対比を行った。また、眼内リンパ腫、網膜静脈分枝閉塞症など、他の網膜障害疾患に関しても検討を行なった。H30年度は以下の研究成果を論文として報告した。1)眼内リンパ腫のAZOOR様の光干渉断層計(OCT)所見について(論文5)。リンパ腫による視細胞障害は多彩な臨床像を呈し、OCT像も多彩である。視細胞障害の定量化にはあらたな基準が必要かも知れない。2)緑内障の対比として、視細胞細胞が障害される加齢黄斑変性における視覚路変性を評価したところ、障害視野偏心度に依存した視放線変化を検出し、視細胞障害疾患でも視放線変化をきたすことを確認した(論文3)。3)dMRIに加えて、髄鞘体積と相関の高いT1緩和時間マップ(qT1値)を用いてヒト視覚路を評価した。以前に我々はqT1値がdMRIに比べてロバストな値であることを報告した。このqT1値の特性を用いると、dMRI単独にくらべてqT1のカットオフを加えたほうが正確な視放線を特定できた(論文4)。4)LHONにおける脳視覚路障害をdMRIに加えて、髄鞘体積と相関の高いT1緩和時間マップ(qT1値)を用いて評価した。dMRIでは既報と一致した異常値を検出したが、qT1値は正常範囲内に留まった。これはLHONによる視放線障害がミエリンの脱髄によらない可能性が示唆される(論文1)。5)緑内障における、既知の網膜神経節細胞数の算出方法の精度を静的視野検査との整合性を比較検討した(論文2)。実施計画においては対象を緑内障としていたが、対象を広く網膜疾患を対象に広げたことで様々な病態における脳中枢白に対する影響を評価することができた。具体的には、1)眼内リンパ腫、2)レーベル遺伝性視神経症、3)網膜静脈分枝閉塞症を対象にした研究を行った。引き続き緑内障に関しても、症例数を増やし視野障害パターン別の視覚路障害パターンを明らかにして行きたい。引き続き、東京慈恵会医科大学眼科および厚木市立病院での患者リクルート、玉川大学脳科学研究所でのMRIデータ取得を行っていく。網膜機能、構造測定としての静的視野計、光干渉断層計を合わせて収集している。緑内障患者データの取得には、年齢を一致させた正常視覚者のデータが不可欠となるが、患者群の年齢が高く、正常視覚者データの取得が課題となる。この点からも発症年齢が比較的若年となる遺伝性網膜疾患をターゲットとしていくことは、研究推進の効率の面からも有利である。これまでに取得したデータ、1)網膜色素変性症について。2)網膜感度と網膜光干渉断層計で測定した網膜厚の整合性に関して、に関する論文作成。次年度が最終年度となる。これまでに得られた成果を積極的に発表して行きたい。本研究は緑内障の脳視覚路変性を拡散強調画像とトラクトグラフィーを用いた脳視覚路障害の定量的な評価法の確立を目的としている。緑内障は患者数は多いものの視野障害程度、視野障害プロファイルが多彩なため、両眼に視野障害を来す加齢黄斑変性を視細胞障害モデル、レーベル遺伝性視神経症(LHON)を網膜神経節細胞障害モデルとして対比を行った。引き続き緑内障患者のデータ収集を継続している。H29年度は以下の研究成果を報告した。1)緑内障による網膜神経節細胞障害の定量化のため、静的視野計で計測した局所網膜感度と光干渉断層計で計測した網膜神経節細胞層厚から網膜神経節細胞数を推定する方法の評価を行い、長所と短所を報告した(学会報告2,3)。2)緑内障の対比として、視細胞細胞が障害される加齢黄斑変性における視覚路変性を評価したところ、障害視野偏心度に依存した視放線変化を検出した(学会報告1)。またこの成果を現在投稿中(Yoshimine et al. under review)である。3)緑内障と同様に網膜神経節細胞が選択的に障害されるレーベル遺伝性視神経症(LHON)において、現在唯一の治療法として期待されるイデベノン大量療法の治療前後で視覚路障害を定量評価した。結果は一部のLHON患者に自覚症状及び他覚的視力、視野改善が認められたが、拡散強調画像とトラクトグラフィーでは有意には検出が出来なかった(学会報告4,5)。4)LHONにおける脳視覚路障害を拡散強調画像に加えて、髄鞘体積と相関の高いT1緩和時間マップ(qT1値)を用いて評価した。拡散強調画像法では既報と一致した異常値を検出したが、qT1値は正常範囲内に留まった。これはLHONによる視覚路障害がミエリンの脱髄によらない可能性が示唆される(学会報告6)。5)緑内障に対する多剤併用治療に関するデータ解析と論文執筆の補佐を行った(論文1)。撮像プロトコルの最適化が完了。視細胞障害と網膜神経節障害の対比として、加齢黄斑変性、LHONのヒト患者データから、脳視覚路変化を評価検討し、それぞれで成果を報告することが出来た。緑内障患者データは、患者群の年齢が高く、正常視覚者の取得に苦慮している。

本研究は網膜障害による脳視覚路変化を拡散強調画像(dRI)とトラクトグラフィーを用いて定量的に評価することを目的としている。緑内障は患者数は多いが視野障害程度、視野障害プロファイルが多彩なため、両眼に視野障害を来す加齢黄斑変性を視細胞障害モデル、レーベル遺伝性視神経症(LHON)を網膜神経節細胞障害モデルとして対比を行った。また、眼内リンパ腫、網膜静脈分枝閉塞症など、他の網膜障害疾患に関しても検討を行なった。H30年度は以下の研究成果を論文として報告した。1)眼内リンパ腫のAZOOR様の光干渉断層計(OCT)所見について(論文5)。リンパ腫による視細胞障害は多彩な臨床像を呈し、OCT像も多彩である。視細胞障害の定量化にはあらたな基準が必要かも知れない。2)緑内障の対比として、視細胞細胞が障害される加齢黄斑変性における視覚路変性を評価したところ、障害視野偏心度に依存した視放線変化を検出し、視細胞障害疾患でも視放線変化をきたすことを確認した(論文3)。3)dMRIに加えて、髄鞘体積と相関の高いT1緩和時間マップ(qT1値)を用いてヒト視覚路を評価した。以前に我々はqT1値がdMRIに比べてロバストな値であることを報告した。このqT1値の特性を用いると、dMRI単独にくらべてqT1のカットオフを加えたほうが正確な視放線を特定できた(論文4)。4)LHONにおける脳視覚路障害をdMRIに加えて、髄鞘体積と相関の高いT1緩和時間マップ(qT1値)を用いて評価した。dMRIでは既報と一致した異常値を検出したが、qT1値は正常範囲内に留まった。これはLHONによる視放線障害がミエリンの脱髄によらない可能性が示唆される(論文1)。5)緑内障における、既知の網膜神経節細胞数の算出方法の精度を静的視野検査との整合性を比較検討した(論文2)。実施計画においては対象を緑内障としていたが、対象を広く網膜疾患を対象に広げたことで様々な病態における脳中枢白に対する影響を評価することができた。具体的には、1)眼内リンパ腫、2)レーベル遺伝性視神経症、3)網膜静脈分枝閉塞症を対象にした研究を行った。引き続き緑内障に関しても、症例数を増やし視野障害パターン別の視覚路障害パターンを明らかにして行きたい。引き続き、東京慈恵会医科大学眼科および厚木市立病院での患者リクルート、玉川大学脳科学研究所でのMRIデータ取得を行っていく。網膜データとしての静的視野計、光干渉断層計を合わせて収集している。緑内障患者データの取得には、年齢を一致させた正常視覚者のデータが不可欠となる。患者群の年齢が高く、正常視覚者の取得が課題となる。網膜機能、構造測定としての静的視野計、光干渉断層計を合わせて収集している。緑内障患者データの取得には、年齢を一致させた正常視覚者のデータが不可欠となるが、患者群の年齢が高く、正常視覚者データの取得が課題となる。この点からも発症年齢が比較的若年となる遺伝性網膜疾患をターゲットとしていくことは、研究推進の効率の面からも有利である。これまでに取得したデータ、1)網膜色素変性症について。2)網膜感度と網膜光干渉断層計で測定した網膜厚の整合性に関して、に関する論文作成。次年度が最終年度となる。
タングテスンブロンズ型強誘電体のプロント交換による光学的新機能の誘起

強誘電体材料のうち、タングステンブロンズ(TB)型強誘電体単結晶は光通信や非線型光学の分野で光機能材料として優れているもの多い。その構造は化学式(A_1)_2(A_2)_4C_4(B_1)_2(B_2)_8O_<30>で表され、その中で、Sr_XBa_1 _xNb_2O_6(SBN)単結晶は唯一の完全に各サイトが充填されたTB型構造であるので、光損傷を受けないこと、多くの場合には、LiNbO_3単結晶よりも電気光学効果や電圧効果が大きいこと、ブルーの第二高調波発生ができること、光導波路素子に有望であることなど、という特徴を有しており、注目を集めている。これらの素子応用での利用のためには薄膜作成や組成の一部をプロチウムに交換するプロトン交換の技術が有効であり、LiNbO_3では研究例が多いが、SNBのプロトン交換や薄膜化については研究例がほとんどない。本研究ではプロトン交換-光導波路作製をめざして、化学溶液堆積法による薄膜作製を行い、光学特性の評価を行った。その結果、焼成温度-昇温速度を変えて成膜を試み、SBNの結晶成長に関する知見を得た。薄膜の焼成温度が700°CではSBN薄膜は目的としているTB構造とはならず、低温相を形成することが示された。品質のよいTB層を得るためには1000°Cの高温が必要であった。しかし、昇温速度を遅くして1°C/秒ほどにすると、700°CでもTB構造型のエピタキシャル膜が得られることを見出した。次に、得られたSBN薄膜のプロトン交換処理を試みた。低温相の膜では効果が見られなかった一方で、TB相では膜の剥離が見られ膜の特性評価は行えなかったが、これはプロトン交換による内膜ひずみの誘起のためと考えられる。
一電子酸化還元を活用したホウ素医薬品の合成手法の開発

本研究では近年注目されているホウ素含有医薬品の迅速かつ効率的に合成するための触媒反応の開発を目指す。炭素ホウ素結合を有する環状アルキルボロールとボロアミノ酸を構築するために、一電子酸化還元を利用した炭素ホウ素結合形成反応を開発する。具体的に、ルイス酸と遷移金属触媒を用いた環状エーテルへの形式的なホウ素原子挿入反応とルイス塩基光触媒を用いたアルキルアミンのα位ホウ素化反応を検討する。ホウ素化学の学識と手法に基づき、金属触媒、有機分子触媒、および光酸化還元触媒作用を融合させた触媒システムを構築する。ホウ素医薬品は新たな低分子医薬品の骨格として注目を集めている。現在までに報告されているホウ素医薬品の骨格パターンは大まかにボロアミノ酸と環状ボロールとの2つに分けられる。ホウ素官能基は比較的安定ではあるものの、酸化還元反応によって分解する恐れがあるため、比較的合成後期で導入するのが望ましい。たとえば、ボロアミノ酸や環状アルキルボロール合成においては、未だ困難とされる炭素ホウ素結合形成を直裁的かつ選択的に実現するかが鍵となる。本研究では、遷移金属触媒あるいは光酸化還元触媒による一電子還元に基づいた炭素ホウ素結合形成反応を用いて、入手容易な化学原料からホウ素含有医薬品や医薬品リード化合物を合成する手法の開発を目的とする。入手容易な環状エーテル化合物の炭素酸素結合への形式的なホウ素原子挿入反応を開発した。1環状エーテル化合物をルイス酸であるハロゲン化アシルで一度開環、2ハロゲン化アルキル部位に銅触媒によるホウ素置換基の導入、3アシル基の除去と再環化の三段階で環状エーテル化合物から対応する環状アルキルボロールを合成することが出来た。当初の予定したホウ素系のルイス酸ではなく、ハロゲン化アシルで環状エーテルを開環し、銅触媒でホウ素官能基を導入することとした。適切なハロゲン化アシルの選択により、環状エーテルから高収率で開環体を得ることが出来た。本反応によって5員環エーテル構造に形式的にホウ素原子を導入し、6員環アルキルボロールを合成することが可能となった。ルイス酸と銅触媒によるホウ素化を組み合わせることで環状エーテルから環状アルキルボロールの新たな合成方法を開発することが出来た。本成果はこれまで合成方法が確立されていなかった環状アルキルボロールの合成方法の指針を示すことが出来た。これにより、天然や医薬品に含まれる環状エーテル化合物から対応する環状アルキルボロールを迅速に合成することが可能になり、創薬研究の加速につながると期待される。開発したアルキルボロールのルイス酸によるエーテルの開環、銅触媒ホウ素化、脱保護の各段階の最適化を行う。最適化後、様々なエーテル化合物に対して本反応を適用し、対応する環状アルキルボロールの合成を行う。ワンポット合成への展開も行う。光酸化還元触媒を利用したボロアミノ酸合成の反応開発に着手する。

最適化後、様々なエーテル化合物に対して本反応を適用し、対応する環状アルキルボロールの合成を行う。ワンポット合成への展開も行う。光酸化還元触媒を利用したボロアミノ酸合成の反応開発に着手する。
合成ヘリセンオリゴマーによる金表面二重ラセンの形成と刺激応答性機能性物質の開発

本研究では,外部刺激応答性固体表面の開発を目的として.外部刺激に対して可逆的応答を示す分子骨格の構築に成功した.ヒドラジノヘリセン型ビアクリジン誘導体TBAの酸塩基刺激による可逆的電子移動不均化反応を見出し,その詳細を明らかにした.また,ジブロモアザアントラセンの一段階環化二量化により,スリット構造という新規三次元パイ電子系分子シクロビスアザアントラセンを高収率で得た.分子内N-N結合形成によりヒドラジノビスアンテン類に変換した.ヒドラジノビスアンテン類が良好な電子ドナー骨格であることも見出した.本研究は外部刺激応答性固体表面の開発を目的としている.その達成には外部刺激に対して可逆的応答を示す分子骨格の構築が不可欠である.平成26年度は2,7-ジtBu-ジメチルアクリジンをC-CおよびN-N結合で連結したテトラメチルビアクリジン誘導体(TBA)を合成し,酸添加/中和という化学的刺激に応答して可逆的な電子移動反応を起こすことを見出した.すなわち新規刺激応答性分子の開発に成功した.機能性有機電子材料分野を主として,基礎/応用科学技術において重要な成果である.この結果は一流国際化学雑誌であるChemical Scienceに採録が決定した.酸性条件下では,TBAのN-N結合開裂が起こりビラジカル中間体を経て,2分子の1電子酸化体のラジカルカチオンおよび1分子の2電子還元体のジアミン塩を与える.逆反応について,トリエチルアミンにより中和することでジアミンからラジカルカチオンへの選択的な逆電子移動反応が起こる.再び生じたビラジカル中間体のN-N結合形成反応が進行し,原料TBAを定量的に再生することで反応が完結する.可逆的電子移動反応実現の要因として,1)N-N結合切断/形成反応の酸によるスイッチング,2)TBAの多電子供与・受容能,3)極めて安定なラジカルカチオンの生成,4)高選択的電子移動反応が重要であった.この成果は,有機分子を用いる酸塩基刺激に応答する電子移動反応系の開発および制御において重要な知見である.tBu基置換TBAの脱tBu化を行い,嵩高い置換基を持たないTBAの合成にも成功した.X線結晶構造解析により,結晶中では1次元方向に積層したカラム構造を形成した.本化合物も酸存在下において,同様の電子移動反応が進行した.このとき生じたラジカルカチオンは溶液中分解せず,極めて安定であることから,嵩高い置換基による速度論的安定化を必要としないことがわかった.本研究では,外部刺激応答性固体表面の開発を目的としている.その達成には外部刺激に対して可逆的応答を示す分子骨格の構築が不可欠である.前年度は,2,7-ジtBu-ジメチルアクリジンをC-CおよびN-N結合で連結した,ヘリセン型のテトラメチルビアクリジン誘導体(TBA)が,酸添加・中和という化学的刺激に応答して可逆的な電子移動反応を起こすことを明らかにした.この結果は,ヘテロ原子を導入した三次元π電子系ヘテロ環化合物が外部刺激応答性分子として有望であることを示している.今年度は,新たな三次元π電子系ヘテロ環化合物を合成し,新奇な物性・機能を探索した.分子中央部にスリット構造を有する新規な三次元バタフライ型π電子系分子シクロビスアザアントラセン類が,対応するジブロモ単量体のC-C結合形成を経る環化二量化によって高収率で得られることを見出した.さらに分子内N-N結合形成によりスリットを閉環し,三次元バタフライ型または二次元平面のπ電子構造を有するヒドラジノビスアンテン類を得た.特徴的な性質として,ヒドラジノビスアンテン類は低い酸化電位を示し,可逆的な2電子酸化が可能であった.すなわち,良好な新規電子ドナー骨格であることがわかった.これを反映して,この化合物は酸存在下で容易に酸素酸化を起こし,一電子酸化されたラジカルカチオンを与えた.これは安定ラジカルであり,空気中溶液状態でも分解しない.生じたラジカルをトリエチルアミンおよびヒドラジンで処理すると,原料を定量的に再生できることも見出した.本研究では,外部刺激応答性固体表面の開発を目的として.外部刺激に対して可逆的応答を示す分子骨格の構築に成功した.ヒドラジノヘリセン型ビアクリジン誘導体TBAの酸塩基刺激による可逆的電子移動不均化反応を見出し,その詳細を明らかにした.また,ジブロモアザアントラセンの一段階環化二量化により,スリット構造という新規三次元パイ電子系分子シクロビスアザアントラセンを高収率で得た.分子内N-N結合形成によりヒドラジノビスアンテン類に変換した.ヒドラジノビスアンテン類が良好な電子ドナー骨格であることも見出した.外部刺激応答性を有する新規ヘリセン骨格を見出したことは,評価すべき達成である.可逆的な電子移動反応を起こし,生成物のラジカルカチオンが極めて安定なので,物性研究への展開が容易である.また無置換体が結晶中で1次元のカラム構造を持つことから,固体状態における分子間の電子および磁気的相互作用の発現に有利である.このように新規ヘリセン骨格に関する研究において大きな進展があった.ただし金表面との複合化についての進展が遅れている.以上2点から判断して,評価区分を(2)とした.物理有機化学電子供与基または電子吸引基を持つTBA誘導体を合成し,現象の一般性および電子効果について調べる。イオウ官能基を導入したものも合成し、金表面との複合化を試みる。固体表面における外部刺激応答性について検討を行う。
深海底炭素固定量の現場観測と深海生態系への貢献度のモデル統合

「光合成に依存していると考えられていた深海生態系に、化学合成の貢献はどの程度あるのか」を、さまざまな環境の深海底で炭酸固定量を現場測定することで明らかにした。添加した無機炭酸からの有機物生産量は海域ごとに大きく異なり、相模湾漸深海帯で最も高く、深海平原ではほとんど検出されなかった。また、炭酸固定を行うと期待される微生物の存在量と炭酸固定量との間には明確な相関は見られなかった。相模湾における海底での有機物生産量を定量化すると、沈降有機物供給量の1-2%を占める。沈降有機物が難分解性の有機物で占められることを考えると、海底で微生物により生産される有機物の役割は無視できない量であろう。地球の表面積の半分以上は深海底であり、深海底の海水-堆積物間の物質の挙動は全球の物質循環に非常に重要な役割を果たしている。従来、深海底では光合成由来の沈降有機物が唯一のエネルギー源であると思われてきたが、通常の深海底でも独立栄養細菌による化学合成が行われている可能性が堆積物中の微生物遺伝子解析などから示唆されている。本研究では、「光合成に依存していると考えられていた深海生態系に、はたして化学合成の貢献はどの程度あるのか」を、さまざまな環境の深海底で炭酸固定量を現場測定することで明らかにする。本年度は、2013年9月と11月に、赤道太平洋の水深4200mの地点において、化学合成一次生産量の定量化を行う現場培養実験を行った。深海底にコア型の培養装置をのべ15本設置し、13C-標識重炭酸のみを添加した系、13C-標識重炭酸に加えて15N-標識アンモニアも添加した系、炭素源として13C-標識グルコース、13C-標識酢酸を添加した系など、5つの基質条件を用意し、0、2、51日間、深海底で培養した。その結果、これまでの漸深海帯などでの実験結果と異なり、51日間という長期培養後でも、深海平原では無機炭酸からの有機物生産がほとんど検出されなかった。また、これまでに行った現場固定量測定実験試料の堆積物中の微生物相の解析を進め、アンモニア酸化菌、亜硝酸酸化菌、嫌気的アンモニア酸化細菌などの分布と炭酸固定速度との関連を検討した。地球の表面積の半分以上は深海底であり、深海底の海水-堆積物間の挙動は全球の物質循環に非常に重要な役割を果たしている。従来、深海底では光合成由来の沈降有機物が唯一のエネルギー源であると思われてきたが、通常の深海底でも独立栄養細菌による化学合成が行われている可能性が示唆されている。本年度は、現場培養実験において使用する予定の培養装置を、コア型の、物質の収支を解明する目的に特化した培養装置と、開放型の、現場の環境を維持して培養することに特化した培養装置の2種類の製作を行い、25年度9月および11月に行われる航海の準備を行った。また、これまでに行った現場固定量測定実験試料の、間隙水の栄養塩濃度の分析や、堆積物中の微生物相の解析を進め、海底での炭酸固定量がどのような環境要因や生物相と関連があるのかを検討した。これらの結果について、2012年12月に行われた13th Deep-Sea Biology Symposiumで報告するとともに、諸分野の若手研究者に声をかけて共同研究の計画を進め、25年度、26年度の研究計画を議論した。本研究では、「光合成に依存していると考えられていた深海生態系に、はたして化学合成の貢献はどの程度あるのか」を、さまざまな環境の深海底で炭酸固定量を現場測定することで明らかにした。平成26年度は、5月と7月に、西部北太平洋の水深5350mの地点において、化学合成一次生産量の定量化を行う現場培養実験を行うとともに、これまでの赤道太平洋、大陸縁辺部などでの実験結果との比較を行った。詳細は現在も解析中であるが、貧栄養の赤道太平洋、冨栄養の西部北太平洋ともに、深海平原では長期間の培養でも無機炭酸からの有機物生産がほとんど検出されなかった。一方で、相模湾、インド洋の漸深海帯では、数日間の培養で有意に検出可能な有機物が無機炭酸から合成されていた。

各種化学環境の分析と、現在進行中の微生物相などの解析結果から、深海底での化学合成による有機物合成には、有機物量のほか、底層の酸素濃度、栄養塩濃度と、それに影響されて分布を変える微生物群集組成が大きく影響していることが明らかになりつつある。深海生態学2013年の航海において、深海平原での現場培養実験を無事に終え、結果を得つつある。また、微生物相、機能遺伝子の解析結果も順調に蓄積されており、順調に進展しているが、結果の解釈の部分では、炭酸固定を行っている微生物群に関して予想に反する点もあり、別手法を用いての検証を検討している。培養装置の作成などは終了し、25年度の航海に向けての準備は順調に進んでいる。また、研究協力者との協議も同時に進め、実験計画も固まりつつある。微生物相、機能遺伝子の解析についても徐々に軌道に乗りつつあり、これまでの試料の解析を進めることで、炭酸固定量と微生物相との間の関係についても知見が深まっていくと期待される。26年度は、5月及び6月に北太平洋深海平原の調査航海を行う予定であり、この航海をもって一連の現場培養実験を完了し、分析と結果の解釈に注力する。前年度得られた、深海平原での非常に低い炭酸固定速度が、富栄養の深海平原でも同一なのかどうかを検討する。同時に、これまで得られた堆積物試料の微生物膜脂質の炭素同位体比測定や、微生物の炭酸固定能に関する遺伝子解析などを進めることで、深海底での炭酸固定量を支配する要因とその生物に関して明らかにする。25年度は、9月及び11月に太平洋深海平原の調査航海が行われる予定であり、その際に行う現場培養実験が今年度の研究の中心となる。実験計画の策定を進めるとともに、航海で必要になる消耗品、試薬などを準備する。また、それら航海で得られる試料と、これまでに行った実験試料の微生物相、機能遺伝子解析を進める。解析にあたっては、全試料を行う余裕はないため、特に炭酸固定量の高かった堆積物深度や、栄養塩濃度の特徴的な堆積物深度にあたりをつけ、傾向を捉えた後に全体にフォーカスしていく。航海で採取された試料が天候の理由により予定より少なくなり、分析用消耗品費が抑制された。2014年度の航海で採取する試料の分析消耗品費に使用する予定である。25年度の航海日程が、年度当初に見込んでいた期間より長く、また入出港の場所が当初の見込みと異なったため、外国旅費が多く見込まれることとなった。そのため、航海に参加するための旅費(協力研究者も含む)を確保するため、24年度の支出予定の一部を変更し、25年度の旅費としての使用を予定している。また、航海消耗品などへの支出も予定している。
アフリカ現代社会における無形文化遺産の役割

「音楽」という明治以来の西洋語の翻訳概念ではくくれない、身体表現や太鼓等の音具と結び合わされたアフリカの豊かな「音の文化」を、現地調査に基づいて1995(平成7年)以来アフリカ人研究者も交えて行った。研究成果は被調査国の公用語英語か仏語で書き6巻を刊行、被調査国の研究機関に送って成果の還元と反批判受理を実行。ユネスコの無形文化遺産計画と協働し、消滅の危機にある音文化の存続に務めた。平成24年度は、3年度にわたる研究計画の初年度に当たり、研究代表者、研究分担者、研究協力者とも、現地調査による資料収集を行なった。別紙個別報告書の通り、研究代表者川田(ブルキナファソで、旧モシ王国太鼓言葉の現状)、研究分担者鈴木(コートジボワールとギニアで、語り部出身の音楽家とワールド・ミュージックの関わり)、鶴田(タンザニアで、伝統芸能の雨乞いにおける役割)、川瀬(エチオピアで、歌唱集団ラリベロッチの活動の現状)、研究協力者松平(ジンバブエで、薄板鳴音具ラメラフォン「ンビラ」を伴う愚依儀礼の社会的機能)と、各自がこれまでも行なって来た現地研究を、現代社会における役割という全体の研究課題の観点から、さらに深化させることができた。川田が研究対象としている、演奏の習得に幼時からの長期間の訓練を必要とし、同時にその基盤をなす伝統的王制が若い世代に関心を持たれなくなっている、旧モシ王国太鼓言葉のように、何らかの人為的保護策を講じなければ消滅の危機に瀕している無形文化遺産もある。だが一方で、松平が優れた参与調査を行っている、ショナ族の愚依儀礼とンビラの演奏のように、現金収入ではなく奏者の祖霊への強い信仰心に支えられて現に社会的機能をもっている慣行は、もしそれが無形文化遺産に指定されて、国家レベルで称揚され経済的な保護も受けた場合、かえってその音文化自体が損なわれる可能性がある例も存在する。他の研究分担者が調査している対象も、現に十分な社会的機能をもっていると考えられる。そしてユネスコの無形文化遺産課が登録の条件としているのも、現代の社会において機能をもつということなので、ユネスコのような国際機関による認定自体が孕んでいる微妙な問題が、われわれの現地調査から逆に提起されているとも言える。次年度の現地調査と報告書作成を通じて、この問題を追求してゆきたい。昨年度までの研究の蓄積を踏まえ、今年度は当該音文化の変容の側面に研究の重点を置いた。音文化を支えている社会の、政治・宗教・生活面での変化(選挙における政党支援への要請、キリスト協会からの依頼、経済生活全般の変容などに由来する変化)に注目して、現代のアフリカ社会で生き、変化しているものとしての、音文化の様相を明らかにすることに努めた。消滅の危機に瀕しているアフリカの無形文化遺産が、現在以後の社会で存続し得る条件および現代社会において果たしうる役割を、現地調査に基づいて地域社会との関係で追求し、現地人当事者の認識や主張も明らかにしつつ、ユネスコの保存計画が求める条件とも照合して、その問題点をアフリカ諸地域間で比較検討した。具体的には、旧モシ王国(ブルキナファソ)の太鼓言葉、旧ダホメー王国(ベナン)の歌舞、マンデ・ポップスを担うグリオ(語り部)の音楽表現、マンデ社会に共有されているスンジャタ叙事詩、タンザニア中央部の民族ゴゴの伝統芸能ngoma、エチオピア北部高原を広範に移動して歌唱を行なう世襲の吟遊詩人集団ラリベラ、ジンバブエ共和国における楽器ンビラなどを調査対象として、一次資料の収集を行った。研究実績の概要に記載の調査が順調に進み、詳細な報告書を作成する材料が整ったため。2014年度までの調査に基づき、本研究課題の総まとめとして詳細な報告書("THE TECHNIQUES OF THE BODY", "CULTURES SONORES D'AFRIQUE V")を作成した。この報告書は調査対象国や世界の関連研究者及び研究機関に配布し、調査成果の還元を行うことができた。英語またはフランス語で詳細な報告書を作成し、調査対象国や世界の関連研究機関に贈呈することで、調査成果の現地還元をはかる。27年度が最終年度であるため、記入しない。文化人類学研究代表者、各研究分担者、研究協力者相互の十分な合意と、各自が長年馴染んで来た調査対象社会への十分な参入の結果、所期の研究目的が達せられているため。現地調査による研究はほぼ終了しており、現在共同研究者相互の交流の中で、内容を練り、問題を明確にしている。2013年度の研究成果をふまえ、2014年5月15日から18日まで幕張メッセで開催された第47回国際人類学民族学会議においても"Sound cultures of Africa"と題する4時間のパネル発表を行い、研究代表者、研究分担者、連携研究者5人が英語で研究成果を報告し、外国からの参加者も含めて討論し、さらに研究を深めることができた。本研究課題の締めくくりとして、これまでの研究成果をまとめた詳細な報告書を作成する予定であった。

しかし調査及び取りまとめに予想以上の時間がかかったため、この作成を次年度に行うこととしたため。27年度が最終年度であるため、記入しない。これまでの研究成果をまとめた詳細な報告書作成費用として使用する。これまでも良好だった研究代表者、研究分担者、研究協力者の連携を、さらに緊密にして、2年度目の再度の現地調査に臨む。そして3年度目の数回の総括討議を活発に行ない、日本語および欧文報告書"Cultures sonoresd'Afrique"VIの完成を目指す。3年目、研究期間最終年度である本年度は6月に東京外語大AA研で行われる科研の大集会「海外科研フェスタ」、9月およびび12月に研究打合せ会合を開き、最終報告書に向けた準備を進める。研究期間終了までに最終報告書を作成・発行し、調査対象国や世界の関連研究者および研究機関に配布することで、調査成果の還元をはかる。昨年度は研究費を効率的に使用したため若干の残額が発生した。その残額を含めた今年度の研究費は、2年度目の再度の現地調査費および調査に必要な物品購入(音声分析ソフト等)に充てる計画である海外出張について、当初の予定から変更したことが大きな理由である。報告書作成の費用に充てる。
質量分析を用いた糖脂質解析法の確立と先天性代謝異常症の診断への臨床応用

本研究では、スフィンゴ糖脂質の網羅的定量解析系を確立することにより、スフィンゴ糖脂質の各分子種の代謝変動の解析をする事を目的にした。主に有機合成物における光学異性体分析に用いられているキラルカラムを用いることにより、従来用いられている疎水カラムでは難しかった糖鎖構造およびセラミド骨格構造の違いによりスフィンゴ糖脂質を分離可能な条件を見出した。また生体サンプルへの適応として、HeLa細胞およびブタ脳より抽出したスルファチド中のスフィンゴ糖脂質における脂肪酸分子種ごとの定量解析を行った結果、以前に報告のあった分子種以外の分子種も多く存在することが確認できた。27年度の研究計画として「スフィンゴ糖脂質の分子種を対象とする網羅的な解析系の構築」を目標に、1)糖脂質の抽出、2)液体クロマトグラフィーの分離系の検討、3) LC-MS/MS解析条件の検討を掲げた。まず、ブタの脳から抽出した酸性スフィンゴ糖脂質であるガングリオシド混合物、および中性スフィンゴ糖脂質であるセレブロシド混合物を用いてスフィンゴ糖脂質のセラミド部との疎水性に着目し分離の検討を行った。C18逆相カラムとメタノールーイソプロパノールーギ酸アンモニウムのグラジエントにより分離が可能になった。しかし、この条件では疎水部での分離は可能であるが、親水基が違う糖脂質も同時に溶出される傾向にあった。よって、次にキラルカラム、およびHILICカラムによる分離の検討に着手した。これまでのところ、ダイセルよりレンタルしたDCpakPTZのHILICカラムではセラミドの疎水部による分離が行われず、スフィンゴ糖脂質の分離には適さない事が分かった。またヘキサン系またはアセトニトリル系の順相溶媒、メタノールーイソプロ系またはアセトニトリルーメタノールーイソプロ系の逆相溶媒による分離をダイセルよりレンタルした4種類のキラルカラムを現在まで試し、さらに分離条件を良くする為に内径の細いキラルカラムの使用を検討している段階である。また、LC-MS/MS解析条件の検討においては、イオンソースの最適化を行い、今後使用するイオンソースの条件を決定した。また、それぞれの標品を用いて構造解析の為のフラグメントイオン生成条件を見いだした。さらに生体内サンプルとしてHeLa培養細胞よりメタノール抽出した脂質をMRM解析を行った結果、ガングリオシド、パラグロボシド、セレブロシド、トリヘキソシルセラミド、ラクトシルセラミド、グルコシルセラミドを検出することができた。解析対象である糖脂質は多くの糖鎖構造(脂質クラス)があることに加え、セラミド部分の脂肪酸、スフィンゴ長鎖塩基のバリエーションが多様であることから、網羅的な解析を行えるようにする為にはカラムによる分離を詳細に検討する事が重要と考え、カラムの検討を重点的に行って来た。このカラムの検討に予測した以上に時間がかかっているが、今の所C18逆相カラムとメタノールーイソプロパノールーギ酸アンモニウムのグラジエントによる分離が一番良い結果を得ている。しかし、さらに分離の良い条件を模索し、キラルカラムの検討を行っている段階である。28年度前期までにカラムの検討を終える予定である。元来の28年度の研究計画は「実験動物を用いた組織におけるスフィンゴ糖脂質の網羅的解析、およびヒトペルオキシソーム病患者サンプルのスフィンゴ糖脂質解析」を目標に掲げた。しかし、27年度より行っていた液体クロマトグラフィーの分離系の検討に予想以上の時間がかかった為、28年度のほとんどは液体クロマトグラフィーの分離系の検討に費やした。これまでは糖脂質の分離はC18逆相カラムで行うのが一般的であったが、この条件では疎水部での分離は可能であるが、親水基が違う糖脂質もほぼ同時に溶出される傾向にあり、糖脂質の網羅的解析はほとんどなされていない。よって、疎水部での分離を保持したまま、親水部での分離も可能な条件を模索するためにキラルカラムによる分離の検討を行った。ダイセルよりレンタル可能な6種類のキラルカラムを試し、従来用いられてきたC18逆相カラムより疎水部のみならず、親水部での分離、感度が良いキラルカラムIF-3を見出すことができた。その後、それぞれの糖脂質の標品を用いて、このカラムにおける最適なLC-MS/MS解析条件の検討を行った。キラルカラムを用いて確立したLC-MS/MS解析条件をまとめ、投稿論文を書いているところである。また、確立したLC-MS/MS解析条件を用いて、HeLa細胞の野生株およびABCD1遺伝子ノックアウト細胞より抽出した生体サンプルにおけるスフィンゴ糖脂質の測定を行い、解析を行っている段階である。解析対象である糖脂質は多くの脂質クラスがあることに加え、セラミド部分の脂肪酸、スフィンゴイド長鎖塩基のバリエーションが多様であることから、網羅的な解析を行えるようにするためにはカラムによる分離を詳細に検討することが重要と考え、これまでカラムの検討を重点的に行ってきた。このカラムの検討に予想以上の時間がかかったが、結果として、従来用いられてきたカラムより分離および感度の良いカラムが見つかった。今後はこのカラムで、生体サンプルを用いた解析に進んで行く予定である。スフィンゴ糖脂質は哺乳類では細胞膜の外側に分布し、スフィンゴ糖脂質が蓄積するスフィンゴリピドーシスと言われる一連の先天代謝異常症が知られている。しかしながら、各スフィンゴ分子種の網羅的な定量解析系が構築されておらず、スフィンゴ糖脂質の分子種レベルの代謝変動は十分に解析されていない。