hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ピアノロールの計量的解析によるワルツ作品の演奏分析

初年度は当初の予定通り、資料の入手やそれを計測するためのソフトウェアの開発を行い、一つの曲のピアノロールのデータを実際にとり、分析することで、分析のプロセスや方法を検討し、それらについては概ねの方向性が定まった。中間年度は、スタンフォード大学(アメリカ)で客員研究員として研究活動する中で、ピアノロールだけでなくより多様なデータ(サウンド録音のデータとMIDI化したピアノロールのデータ)を用いることができ、かつより迅速に分析する方法が見つかったことから、データ取得や分析の手段を変更した。また、演奏分析を進めるかたわら、その手法を用いる際のデータ資料間の差異等、データの特性について詳細に検討し、それらの成果を博士論文としてまとめた。最終年度は、データ資料間の関係性をより明確に把握するための分析を進めると同時に、分析曲の対象の幅を広げ、演奏分析を進めた。また、今後の研究につなげるため、ヨーロッパ国内の関係機関における所蔵資料や各国の研究者らの研究状況を調査した。今後研究を進める上での指標となるデータ資料間の関係性についてはそれらを数値化して比較を行い、各資料の特性や分析時に留意すべき点が確認できた。研究の成果については、国内外の学会及びシンポジウムにおける発表の他、博士論文を含む複数の論文にまとめた。Sonic VisualiserとMIDI化されたピアノロール資料を用いることにより、ピアノロール資料と音源資料を比較することが可能となった。そこからピアノロール資料とその他の録音資料の関係性についても明らかにすることができた。分析からは、同一演奏家による同一曲の演奏が細部に至るまで互いに非常に酷似していることや、ピアノロールを演奏分析資料として用いる際の注意点が明らかになったほか、ワルツ演奏の分析については主にショパンのワルツ作品に限定して行なったが、演奏者ごとの解釈の相違点をセクション単位及び1小節単位の速度変化から解明できた。平成28年度は1年間にわたって、海外の研究機関(スタンフォード大学)で研究に特化して活動できるようになったことから、飛躍的に研究を進めることが期待できる。当大学は、本研究に必要な資料の多くを保有しているほか、学内に、本研究の関連内容(自動演奏ピアノ、演奏解析、演奏法研究)に詳しい研究者がいるほか、学外の研究者とのコネクションも強いことから、そうした環境を活用して、研究を進めたいと考えている。特に、ピアノロールや自動演奏ピアノについての文献資料の入手が非常に難しかったことから、そうした文献の調査も今年度は進めていきたいと考えている。これまでピアノロールを用いた演奏分析をどう進めるか、を模索してきたが、資料の入手をスムーズに行うことができるようになり、また資料からのデータの抽出や分析方法も固まったことから、今後、本来の主目的である、演奏傾向の分析に重点を移して研究を進めたい。
小腸移植における冷保存および虚血再潅流傷害に関する電子顕微鏡学的研究

小腸移植において小腸組織が冷保存・再潅流によって受ける傷害から回復するか否かは陰窩細胞のviabilityにかかっている。冷保存・再潅流時の陰窩細胞の形態を電顕レベルで把握し、その変性度と絨毛・陰窩の回復の有無との関連を検討することによって病態解明に寄与することが本研究の目的である。Lewisラットの空腸片をグラフトとして採取し、4°CのUW液による24時間または48時間の単純浸漬保存の後、Thiry-Vella loopを作成する同系移植を行った。グラフト採取時(対照)、冷保存終了後、移植再潅流開始30分後に組織を採取し検討材料とした。移植片は24時間冷保存群では全例10日以上生着、即ち絨毛・陰窩の回復がみられ、48時間冷保存群では全例で生着しなかった。冷保存終了時では24時間後、48時間後とも陰窩上部では細胞配列の破綻、個々の細胞の変性等形態変化が著しかった。陰窩下部では両群とも細胞配列は保たれていたが、48時間後では細胞核のヘテロクロマチンが増量し、ミトコンドリア顆粒の増大が認められた。再潅流後は、24時間冷保存群では陰窩上部では変性が強いが下部には核胞体比が大きく細胞小器官の比較的少ない幼若な細胞の集積がみられたのに対し、48時間冷保存群では陰窩下部においても上部同様に細胞変性、配列の破綻が顕著であった。24時間冷保存群の再潅流後にみられた陰窩下部の幼若細胞の集積は上皮細胞増殖能の保持を示唆するものと考えられる。一方48時間冷保存終了時の核ヘテロクロマチンの増量はクロマチンの不活性化の表れであり、ミトコンドリア顆粒の増大は虚血の結果と解釈されうる。光顕上では観察できないこれらの所見が、小腸組織が回復するか否かの要件をなすものと結論づけられた。小腸移植において小腸組織が冷保存・再灌流によって受ける傷害から回復するか否かは陰窩細胞のviabilityにかかっている。保存液や冷保存時間の違い、再灌流の有無によるこの陰窩細胞の状態の差異ならびに回復後の絨毛上皮細胞の形態・機能を電顕レベルで詳細に把握することが本研究の目的である。今年度は保存液の種類を一定し、冷保存時間の違いおよび再灌流の有無による陰窩細胞の傷害の差異を検討した。体重250350gの雄性Lcwisラットの近位側空腸25cmをグラフトとして採取し、〓°CUW液にて単純浸漬保存を行った。次いで24時間または48時間後にThiry-Vclla loopを作成する同系移植を行った。グラフト採取時(対照)、冷保存終了時、移植再灌流開始30分後に組織の一部を採取し、型通り電顕用試料を作成し、検鏡した。冷保存終了時では24時間後、48時間後とも陰窩上部では細胞配列の破綻、個々の細胞の変性など著しい形態変化がみられた。一方、陰窩下部では24時間後のみならず48時間後でも細胞配列は保たれ、細胞変性は軽微であった。

再灌流を開始すると、24時間冷保存群では陰窩上部では変性が強いが下部には核胞体比が大きく細胞小器官の比較的乏しい幼若な細胞の集積がみられたのに対し、48時間冷保存群の再灌流開始後にみられた陰窩下部の幼若細胞の集積は上皮細胞増殖能が保たれていることを示唆するものと考えられた。一方48時間冷保存群の再灌流後には陰窩下部においても変性が著しく、この後の絨毛回復は不可能であることが推測された。以上、保存時間により再灌流後の陰窩細胞の傷害に差のあることが明らかとなった。小腸移植において小腸組織が冷保存・再灌流によって受ける傷害から回復するか否かは陰窩細胞のviabilityにかかっている。保存液や冷保存時間の違い、再灌流の有無によるこの陰窩細胞の状態の差異、ならびに回復後絨毛上皮細胞の形態・機能を電顕的に把握し、病態解明に寄与することが本研究の目的である。今年度は冷保存時間の違いおよび再灌流の有無による陰窩細胞の傷害の差異についてより詳細な検討を行った。体重250350gの雄性Lcwisラットの近位側空腸25cmをグラフトして採取し、4°CのUW液にて単純浸漬保存を行った。次いで24時間または48時間後にThiry-Vclla loopを作成する同系移植を行った。グラフト採取時(対照)、冷保存終了時、移植再灌流開始30分後に組織の一部を採取し、型通り電顕用試料を作成し検鏡した。冷保存終了時の陰窩下部を比較すると、24時間後、48時間後とも陰窩上部と異なり細胞配列は保たれていたが、48時間後では細胞核のヘテロクロマチンが増量し、ミトコンドリア顆粒の増大が認められた。再灌流を開始すると、24時間冷保存群では陰窩下部に核胞体比が大きく細胞小器官の比較的乏しい幼若な細胞の集積がみられたのに対し、48時間冷保存群では陰窩下部においても上部同様細胞変性、配列の破綻が顕著であった。細胞形態学的には48時間冷保存終了時に陰窩細胞でみられた核のヘテロクロマチンの増量はクロマチンの不活性化の表れであり、ミトコンドリア顆粒の増大は虚血の結果である可能性がある。48時間冷保存群は再灌流後に陰窩下部の顕著な変性・破綻をきたしており、これらの所見は冷保存終了の時点で再灌流後の回復不能を示唆するものであると考えられた。
客観的な評価をめざすルーブリックの研究開発

インターネットを利用して様々な場面で用いられるルーブリックを大量に収集した。また、ルーブリックに関する文献調査を行い、ルーブリックの長所と短所、効果的な使用方法等についてまとめた。類似の語であるチェックリストとベンチマークとの違い及びルーブリックの特徴についても考察した。ルーブリックを使用すると、次のような利点があると言われている。・評価がより客観的で首尾一貫したものになる・評価基準を事前に示すことで、児童生徒はどのように評価され、どのようなことが期待されているかが分かり、不安が減り、学習が促進される・学習の進歩を測定するための判断基準となり、児童生徒や保護者に対する学習進捗状況の説明責任を果たすことが容易になるしかしながら、ルーブリックがあれば直ちに誰でも客観的で首尾一貫した評価ができるというわけではなく、やはり評価者を対象にしたトレーニングが必要であるということが多くの利用者から指摘されている。そこで、海外のウェブサイトから教師の研修で使われているサンプルを紹介した。具体的な生徒の作文に対するルーブリックによる採点のトレーニングができるような仕組みがなされているものである。海外ではルーブリックをプロジェクト学習で利用することがある。平成14年度から小学校と中学校で導入された「総合的な学習」でもルーブリックの活用が有効であると考え、同様な課題追究のプログラムを有する国際バカロレアの中等教育課程のパーソナルプロジェクトの評価方法と評価基準を紹介した。最後に、インターネットを利用することによりルーブリックが入手できる主な海外のウェブサイトをまとめ紹介した。本年度はルーブリックについてインターネットを中心にして情報を集めた。ルーブリックとはどのようなものか(チェックリストとの違いは何か等)、ルーブリックの種類(holistic vs. analytic、教科等)、効果的な使用法、使用上の注意点などについて主な論文、報告書を読み、価値あるものを翻訳した。また、ルーブリックを使って授業を行っている教師たちのメーリングリスト(http://www.middleweb.com/MWLISTCONT/MSLrubrics.html)から、教師や生徒のルーブリックについての意見・感想を知ることができ、日本の学校への導入の参考とするためにまとめた。米国調査では、CRESSTで、米国でのルーブリックについての利用状況等の情報を得た。また、ヨーロッパ調査では国際的なカリキュラムである国際バカロレア実施校を訪問し、国際バカロレアの評価基準とその評価の研修の実態について研究を進めた。
全反射型空間光変調器の開発

本空間変調素子はプリズムの底面に種々の光学薄膜を堆積し、それらの膜の光学定数が書き込み光の強度により変化することで、読み出し光の反射率を変調すものである。本素子の最も基本的な構成はプリズム/誘導体薄膜1/誘電体薄膜2/誘電体3である。この構成で、プリズムと誘電体薄膜2の屈折率は誘電体薄膜1と誘電体3の屈折率より高い必要がある。この系において、プリズム側から光を入射した場合、誘導体2が光導波路として作用する。誘電体の少なくとも1つに吸収がある場合、導波モードに対応した入射角において、反射光は鋭い吸収を示す。計算機シミュレーションによりこの吸収ディップの特性を調べた結果、以下のことが分かった。1)吸収ディップの幅は薄膜の消衰係数(屈折率の虚部)が大きいほど広くなる。2)吸収ディップの深さは薄膜の消衰係数がある値のときに最も深くなり、その値から離れるにしたがって浅くなる。3)吸収ディップが最も深くなる消衰係数の値は誘電体薄膜2の厚さに依存する。4)高次の導波路モードほど屈折率変化に対するディップのシフト量が大きい。5)吸収ディップの屈折率変化に対するシフト量と幅の比を、表面プラズモンを用いた変調素子のそれと比較した結果、変調効率が約3倍に向上することなどが分かった。スライドグラス上に誘電体薄膜1、2として、それぞれテフロン薄膜、ポリメタクリル酸メチル(PMMA)薄膜をスピンコートにより累積することを試みた。PMMA膜に関しては堆積した膜の表面状態が溶媒により著しく影響を受けることが分かった。種々の溶媒を試した結果、酢酸エチルセルソルプが最も良い結果を与えた。PMMA膜はテフロン膜の上に直接累積することは出来なかったが、間にSiO_2膜をスパッタすることにより累積が可能となった。
T2緩和差を利用した31P-NMRによる骨塩量・新生骨量測定法

目的:T2緩和差を利用した、31P NMRによる非侵襲的な新生骨信号量、骨塩量の測定法の確立を目指した。方法:11種類の合成リン酸カルシウムのT2緩和動態をCarr Purcell Meiboom Gill法を用いて測定し、新生骨量または骨塩量の描出測定条件の5候補を抽出後に2,4,6,9ヶ月齢のマウス脛骨近位部の信号を各6匹測定した。得られた信号量はT1緩和利用新生骨信号量測定法での信号量、DXAでの骨塩量との相関を解析した。結果:繰り返し時間30秒,積算20回とT1緩和利用新生骨信号量の相関が最も強く(r=0.740)、新生骨信号量測定に適していた。一方、骨塩量の測定は困難であった。31P-NMRによる基礎検討:JEOL社NMR装置、JNM-ECA600を使用し、測定対象核を燐に設定して11種類の合成リン酸カルシウム(1TCP:トリカルシウムホスフェート;非晶質,2β-TCP;三方晶,3α-TCP;単斜晶,4OCP:オクタカルシウムホスフェート;三斜晶,5HA:ハイドロキシアパタイト;六方晶,6HA;単斜晶,7Ca欠損HA,8TTCP:テトラカルシウムホスフェート;単斜晶, 9FAP:フルオロアパタイト;六方晶,10ACP:アモルファスカルシウムホスフェート;三菱,11CHAP:カーボネートアパタイト)のT2緩和動態をCarr Purcell Meiboom Gill法(τstep、Calculation delay, relaxation delay、積算回数を変数)により数々の条件下でarray測定を行った。測定結果は解析ソフトDELTAによりフーリエ変換した後に信号強度として算出した。過去に検討したT1緩和条件下での合成燐酸カルシウムと骨の磁気緩和動態の結果とT2緩和の理論、および測定時間を30分以内とすることを考慮して、今回の測定結果から骨塩量、新生骨量の測定条件候補を各々2つ抽出した。コントロールのデータとする、骨塩量の測定はHologic二重エネルギー吸収骨密度測定装置(以下DXA)discoveryを使用し、small animal modeで2,3,6,9ヶ月齢のマウス頚骨骨塩量と骨密度を測定した。また、新生骨量の測定ではJNM-ECA600を用いて、過去の研究で得られたT1緩和条件下新生骨測定条件でマウス骨サンプルを測定した結果、信号が得られることを確認した。研究方法:予備検討として、11種類の合成リン酸カルシウムのT2緩和動態をCarr Purcell Meiboom Gill法(τstep、Calculation delay(CD)、relaxation delay(PD)、積算回数を変数とした。)を用いて測定した。その後、様々の測定条件で得られたT2緩和動態の結果から、以下に示す新生骨量または骨塩量の描出測定条件の候補を抽出した。抽出した測定候補はτstep=186μsec、CD=0.348msecで1PD=10sec,積算60回,測定時間10分2PD=30sec,積算20回,測定時間10分3PD=100sec,積算4回,測定時間6.7分。4PD=200sec,積算3回,測定時間10分5PD=600sec,積算2回,測定時間20分である。次に2,4,6,9ヶ月齢のマウス脛骨近位部の31-PNMR信号は測定候補の条件で各々6検体、計24検体を測定した。測定によって得られた信号量はすでに確立されているT1緩和利用新生骨信号量測定法(T1 single pulse法:PD=0.5sec,積算480回,測定時間4分)で得られた結果、および、DXA(Hologic Discovery;小動物モード)で得られた骨塩量との相関を解析した。結果:T2緩和差を利用した31-PNMRによる新生骨量測定法(Carr Purcell Meiboom Gill法)の測定条件は測定候補2のPD=30sec,積算20回,測定時間10分とT1緩和利用新生骨信号量測定法(T1 single pulse法:PD=0.5sec,積算480回,測定時間4分)の相関が最も強かったことから(r=0.740 P<0.0001)、この条件が新生骨信号量の測定に適していると考えられた。一方、骨塩量の測定条件はDXAとの相関がどの測定条件の候補とも悪く31-PNMRでの骨塩量測定は困難であった。すなわち31-PNMRはリンの信号を描出しているために、カルシウムなどの他のミネラルの信号は含まれないことが原因と考えられた。また、骨燐酸カルシウムの組成は加齢により異なる可能性が示唆された。

口腔外科1.骨塩量の測定:合成リン酸カルシウムからみた骨塩量の測定はτstep、calculation delayを可及的に短くすることが重要であり、機器の性能から各々0.182m秒、0.348m秒となる。しかし、relaxation delayは長くする必要があることが判明した。また、relaxation delayを長くすると測定時間が長くなることから、その場合には積算回数を可及的に少なくする必要があることが判明した。これらの測定結果から骨塩量の測定条件の2つの候補を抽出した。2.骨組成の測定:τstep、calculation delay、relaxation delayの組み合わせ次第で成熟骨、新生骨の信号が得られる可能性が示唆され、新生骨の測定条件の2候補を抽出した。また、結果の一端としてcalculation delayが0.348から11m秒では三斜晶・三方晶の信号の描出は得られず、100msec以上では三斜晶・三方晶のみの信号が得られた。この設定条件で得られる信号は、T1緩和の検討から成熟骨のリン酸カルシウム由来の可能性がある。以上の結果は初年度の計画とほぼ一致している。31P-NMRによりマウス脛骨の骨塩量および新生骨量の測定条件の候補での信号強度の測定を行う。31P-NMRで測定した骨塩量候補の信号強度はDXAで得られた骨塩量との相関を解析することで有用性を検証する。一方、新生骨量候補の信号強度はT1緩和新生骨測定条件で測定した信号強度との相関を解析することで有用性を検証する。これらの骨塩量、新生骨量の測定候補で得られる信号はあくまでも基礎検討と過去のT1測定からの結果および理論からの仮説に基づくものである。したがって、これだけの検証では不十分である。そこで、これらの信号を測定部の面積で除して信号密度として算出しておき、骨形態計測(骨端間骨、皮質骨、一次・二次海綿骨)で得られる新生骨の割合、成熟骨の割合、総骨量の割合との関係について重回帰分析を行うことで測定法の有用性を二重に検証する。11種類の合成燐酸カルシウムを用いたT2緩和動態の結果から骨塩量、新生骨量の測定条件の候補を各々2つ、計4つ抽出した。次に、マウス骨サンプルを用いて、これらの4条件で骨信号が得られるか検討する必要があった。この測定は最終的な骨の測定条件を決定する重要な測定であるため日間測定誤差を除外する必要があった。そして、測定費用に要する費用は残額では不足したため、次年度費用を合算して行う必要性が生じた。故に、次年度使用額としての残金が生じた。11種類の合成燐酸カルシウムを用いたT2緩和動態の結果から得られた骨塩量、新生骨量の測定条件の候補、各々2つ、計4つの測定は次年度の費用で不足分を補い、次年度、早々に測定を行う予定であり、骨サンプルの準備はできている。
プロテオミクスと分子イメージングの融合による精子鞭毛運動制御因子の解析

真核生物の鞭毛繊毛運動制御機構を明らかにするため、本申請課題の研究期間においては、材料として扱いやすく反応が顕著に観察できる海産生物精子を用いて、「鞭毛運動活性化」、「鞭毛波形の非対称性制御」の現象に着目し、運動解析・イメージング技術とプロテオミクス技術を融合することにより、鞭毛繊毛運動制御に重要な新規調節因子の解析とその機能解明を目指している。今年度は、平成29年度に構築したUVLEDを組み込んだ実験系を使用し、膜透過性ケージドcAMPを取り込んだカタユウレイボヤ精子の細胞内cAMP濃度上昇に伴う鞭毛運動変化を高速カメラおよびカルシウムイメージングシステムにより解析した。運動活性化前の精子に精子頭部、鞭毛それぞれ局所的なcAMP濃度上昇を誘導した結果、形成された鞭毛波に違いが見られた。また運動中の精子にUV照射を行った結果、cAMP増加により波形の非対称性の増加とその後の対称化が連続的に起こったが、カルシウム非存在下では波形の対称化のみが生じた。これらの結果から、cAMPがカルシウムイオンによって決定される鞭毛波の対称・非対称性に対して調整的な役割を果たしていることが示唆された。さらにリン酸化部位を認識する抗体を用いて運動変化に対応してリン酸化するタンパク質の特定に取り組んだ。これらの成果の一部について、第13回国際精子会議、日本生物物理学会第56回岡山大会において口頭発表を行った。解析に関する総説をMicroscopy誌に発表した。ホヤ精子走化性物質受容機構に関する共同研究成果をSci. Rep.誌に発表した。本研究で構築改良した運動解析系を活用した共同研究をSci. Rep.誌、Zool. Sci.誌、Biol. Open誌、J Photochem Photobiol B.誌に発表した。真核生物の鞭毛繊毛運動制御機構を明らかにするため、本申請課題の研究期間においては、材料として扱いやすく反応が顕著に観察できる海産生物精子を用いて、「鞭毛運動活性化」、「鞭毛波形の非対称性制御」の現象に着目し、運動解析・イメージング技術とプロテオミクス技術を融合することにより、鞭毛繊毛運動制御に重要な新規調節因子の解析とその機能解明を目指し、研究を進めている。平成28年度は「鞭毛波形の非対称性制御」を調節する因子を明らかにするために除膜・再活性化したカタユウレイボヤ精子を高濃度カルシウム条件下と低濃度カルシウム条件下で比較しプロテオミクス解析を行った。抗リン酸化抗体を用いたウェスタンブロッティングを行い、リン酸化状態の異なるスポットに着目し質量分析により同定を行った。その結果、運動制御に関わると考えられる複数の因子を同定することができた。また新規因子の機能解析を行うための実験系、解析系の構築を行った。ケージドATPを用いて精子鞭毛波形が形成される様子を高速カメラにより詳細に解析するためのUVLEDを組み込んだ実験系を確立した。カルシウムによる鞭毛波形制御に関わる因子のプロテオミクスによる同定が順調に進んだ。また機能解析に向けてケージド化合物を用いた実験系の開発に取り組み、カルシウムに依存した波形形成について新しい知見が得られた。波形形成過程を定量化するための解析系についても改良を行い、次年度以降の機能解析に向けての準備が整った。今年度は、平成28年度に構築したUVLEDを組み込んだ実験系を使用し、膜透過性ケージドcAMPを取り込んだカタユウレイボヤ精子の細胞内cAMP濃度上昇に伴う鞭毛運動変化を高速カメラおよびカルシウムイメージングシステムにより解析した。また平成28年度に同定したカルシウム依存的に運動制御に関わると考えられる複数の因子に関して抗体作製を行い機能の解明を目指した。これらの成果の一部について、日本動物学会第88回富山大会、国際会議Dynein2017、2018年生体運動研究合同班会議において口頭発表を行った。またカルシウムと鞭毛波形の関係について動物精子と単細胞藻類において比較解析した研究の成果をJ Plant Res.誌に、ウニ繊毛におけるカルシウム結合タンパク質の役割を解析した研究成果をSci. Rep.誌に発表した。カルシウムによる鞭毛波形制御に関わる因子のプロテオミクスによる同定が順調に進んでいる。ケージド化合物を用いた実験系と高速カメラによる波形解析およびカルシウムイメージングシステムを組み合わせることにより、非常に短時間で生じる運動の変化とシグナルとの関係を解析することが可能になった。ケージドcAMPを用いた実験により、カルシウムに依存的な波形変化とカルシウムに非依存的な波形変化を捉えることに成功し、精子の的確な方向変換についての新しい知見が得られた。

真核生物の鞭毛繊毛運動制御機構を明らかにするため、本申請課題の研究期間においては、材料として扱いやすく反応が顕著に観察できる海産生物精子を用いて、「鞭毛運動活性化」、「鞭毛波形の非対称性制御」の現象に着目し、運動解析・イメージング技術とプロテオミクス技術を融合することにより、鞭毛繊毛運動制御に重要な新規調節因子の解析とその機能解明を目指している。今年度は、平成29年度に構築したUVLEDを組み込んだ実験系を使用し、膜透過性ケージドcAMPを取り込んだカタユウレイボヤ精子の細胞内cAMP濃度上昇に伴う鞭毛運動変化を高速カメラおよびカルシウムイメージングシステムにより解析した。運動活性化前の精子に精子頭部、鞭毛それぞれ局所的なcAMP濃度上昇を誘導した結果、形成された鞭毛波に違いが見られた。また運動中の精子にUV照射を行った結果、cAMP増加により波形の非対称性の増加とその後の対称化が連続的に起こったが、カルシウム非存在下では波形の対称化のみが生じた。これらの結果から、cAMPがカルシウムイオンによって決定される鞭毛波の対称・非対称性に対して調整的な役割を果たしていることが示唆された。さらにリン酸化部位を認識する抗体を用いて運動変化に対応してリン酸化するタンパク質の特定に取り組んだ。これらの成果の一部について、第13回国際精子会議、日本生物物理学会第56回岡山大会において口頭発表を行った。解析に関する総説をMicroscopy誌に発表した。ホヤ精子走化性物質受容機構に関する共同研究成果をSci. Rep.誌に発表した。本研究で構築改良した運動解析系を活用した共同研究をSci. Rep.誌、Zool. Sci.誌、Biol. Open誌、J Photochem Photobiol B.誌に発表した。平成28年度に同定した因子の機能解析を中心に進めたい。機能阻害抗体の作製など機能阻害実験系を構築し、平成28年度に確立したケージド化合物を用いた実験、鞭毛波形の定量解析およびカルシウムイメージングを行うことで機能解析を行う予定である。ケージド化合物を用いた実験から行った鞭毛波形の定量解析およびカルシウムイメージングによって得られた知見をもとに、これらの変化を引き起こすタンパク質の同定およびその機能解析を進めたい。機能阻害抗体の作製など機能阻害実験系を予定している。またケージドATPおよびケージドcAMPを用いることにより明らかになった「鞭毛運動活性化」、「鞭毛波形の非対称性制御」に関する新たな知見に関して論文投稿準備中である。
ピロン類の[4+2]型増環反応の開発とその反応機構的研究

1.ピロン類の[4+2]型環化反応:α-ピロン、クマリンおよびクロモンなどをシリルトリフレートによりシロキシピリリウム塩として活性化後、各種の共役ジエンと反応する[4+2]型環化反応を開発した。2.活性化クマリンの不斉[4+2]型環化反応:光学活性な3-フェニルメンチルオキシカルボニルクマリンと共役ジエンとのDiels-Alder反応において、面選択的に単一生成物のみが良好な収率(89%)で生成した。この生成物の構造は各種スペクトルにより決定した。特に環接合部の立体配置は、X線結晶解析によりシス配置でR-立体配置であることが明らかとなった。2-メチル-1,3-ブタジエンや共役シリルオキシジエンとの反応では、高い位置および立体選択性で環化生成物が得られた。3.活性化クロモンの不斉[4+2]型環化反応:塩化亜鉛の存在下、塩化メチレン溶液中、室温で3位に(-)-8-フェニルメンチルオキシカルボニル基を導入したクロモン誘導体に2,3-ジメチル-1,3-ブタジエンを反応させると、高い立体選択性(100%de)で環化生成物が得られた。この際も2-メチル-1,3-ブタジエンと反応すると位置及び立体選択性とも非常に高くなった。環化生成物の環接合部はシス配置で、立体配置はクマリンの場合から推定して2S,3Sと考えられる。4.クマリン、クロモンの[4+2]型環化反応の反応機構:反応中間体の捕捉や生成物の立体化学の考察およびモデル化合物のHuckel拡張法で求めた反応部位のπ-軌道の対称性などを考慮して反応機構を推定した。クマリンと共役ジエンとの反応は活性化した場合も活性化しない場合にもDiels-Alder反応にみられる典型的な協奏的な反応機構であるが、ピリリウム塩として活性化したクロモンと共役ジエンとの反応はアリルカチオン中間体を経由する段階的な反応機構で進んでいろものと思われる。1.4Hークロモンをシリルトリフラ-トでシリルオキシピリリウム塩誘導体に変換後,種々の共役シリルエノ-ルエ-テルを作用させると[4+2]型増環反応が起こった。生成物の環接合部の立体化学はいずれもシス配置であった。ある種のシリルエノ-ルエ-テルの場合には,反応初期で環化していない反応中間体を単離することができた。これらの事実に基づいて,この増環反応はシリルオキシカルビニルカチオン中間体を経由する二段階反応機構で進行していると推定した。2.4Hークロモンの3位にアルコキシカルボニル基を導入し,種々の活性化クロモンを合成した。(1)メトキシカルボニル置換体が1,3ーブタジエンと容易に[4+2]型増環反応をすることを見い出した。この生成物の環接合部の立体化学もまたシス配置であった。(2)アルコキシカルボニル部が不斉炭素を有するlーメンチル基,(-)ー8ーフェニルメンチル基である活性化クロモンを合成した。後者のNMRスペクトルの解析により,ルイス酸の存在下でもフェニル基が反応部位の近傍に位置していることがわかった。これらの活性化クロモンは,ルイス酸触媒としてtーBuMe_2SiOTfのほか四塩化スズ,塩化亜鉛,四塩化チタンを用いて増環反応をすることがわかった。

(3)lーメンチル基の場合,収率はtーBuMe_2SiOTfが最もよく80%で,面選択性は20%deであった。四塩化スズを用いると収率47%,面選択性34%deと少しよくなった。(4)(-)ー8ーフェニルメンチル基の場合,四塩化スズを用いると収率50%,面選択性80%deと向上し,塩化亜鉛触媒を用いると収率91%,面選択性82%deといずれも良好な結果を得た。次年度は,この[4+2]型増環反応の反応機構をさらに詳細に検討するとともに,面選択性を向上させ,他の被素環化合物への面選択的置換基導入について研究する計画である。1.活性化クマリンの不斉[4+2]型環化反応: 3-アルコキシカルボニルクマリンのアルコキシ部分にl-メンチル基や(-)-8-フェニルメンチル基を導入したクマリン誘導体と共役ジエンとのDiels-Alder反応における面選択性について調べた。アルコキシ部分がl-メンチル基の場合は45%deで2種のジアステレオマーが高収率(99%)で生じた。(-)-8-フェニルメンチル基の場合は単一生成物のみが良好な収率(89%)で生成した。この生成物の構造は各種のスペクトルにより決定した。特に環接合部の立体配置はX線結晶解析により、シス配置でR-立体配置であることが明らかとなった。2-メチル-1,3-ブタジエンや共役シリルオキシジエンとの反応では、高い位置および立体選択性で環化生成物が得られた。2.活性化クロモンの不斉[4+2]型環化反応: 3位にアルコキシカルボニルクロモンのアルコキシ部位にl-メンチル、(-)-8-フェニルメンチル基を導入した化合物の面選択性について検討した。種々のルイス酸で[4+2]型環化反応を行なった結果、塩化亜鉛の存在下塩化メチレン溶液中、室温で2,3-ジメチル-1,3-ブタジエンと反応させると高い立体選択性(100%de)で環化生成物が得られた。この際も2-メチル-1,3-ブタジエンと反応すると位置及び立体選択性とも非常に高くなった。環化生成物の環接合部はシス配置で、立体配置はクマリンの場合から推定して2S,3Sと考えられる。3.クマリン、クロモンの[4+2]型環化反応の反応機構:反応中間体の補捉や生成物の立体化学の考察およびモデル化合物のHuckel拡張法で求めた反応部位のπ-軌道の対称性などを考慮して反応機構を推定した。クマリンと共役ジエンとの反応は活性化した場合も活性化しない場合にもDiels-Alder反応にみられる典型的な協奏的な反応機構であるが、ピリリウム塩として活性化したクロモンと共役ジエンとの反応はアリルカチオン中間体を経由する段階的な反応機構で進んでいろものと思われる。
脾臓髄外造血制御とその破綻の分子機構解明と造血幹細胞培養系の確立

Tlx1は免疫器官の中で脾臓特異的に発現する転写因子である。申請者らはこのTlx1を発現する細胞(Tlx1発現細胞)を追跡可能なTlx1CreER-Venusマウスを作製する事によって、Tlx1発現細胞が赤脾髄に局在する間葉系前駆細胞である事を明らかにしてきた。さらにTlx1発現細胞は、LPS誘導性脾臓髄外造血時に自身のTlx1の発現量を増加させていた。このTlx1発現量増加の意義を調べる為、Tlx1発現細胞特異的にTlx1欠損可能なTlx1CreER-Venus/flox(CKO)マウスを作製し、Tlx1欠損誘導後LPSを投与した所、CKOマウスにおいて脾臓髄外造血が完全に抑制された。従って、LPS誘導性脾臓髄外造血はTlx1発現細胞におけるTlx1の発現上昇によって誘導される事を明らかにした。興味深い事にTlx1CreER-Venus;Rosa26-Tlx1(Tg)マウスを作製し、Tlx1発現細胞特異的にTlx1の発現を上昇させた所、それだけで脾腫を伴う脾臓髄外造血が誘導された。従って、脾臓Tlx1発現細胞におけるTlx1の発現量が、脾臓髄外造血を制御しているマスターレギュレーターである事を証明した。さらにTlx1を長期的に過剰発現させたTgマウスでは、脾腫以外に末梢血における顆粒球を主体とする白血球増多ならびに重度な貧血を呈し、骨髄における赤芽球系細胞、巨核球の消失、肝臓や肺への骨髄球系細胞の浸潤など、骨髄増殖性疾患様の造血異常が認められた。これらの症状を呈したTgマウスの骨髄または脾臓細胞を放射線照射したCD45.1レシピエントマウスへ移植した結果、約6ヶ月後には末梢血の解析で貧血ならびに白血球増多が認められ、骨髄芽球などの幼弱な細胞も出現していた。従って、脾臓髄外造血制御機構の破綻によって、骨髄性白血病を発症する事が明らかとなった。長期間のTlx1過剰発現によって骨髄性白血病様の症状を呈する事が明らかとなったので、これらの白血病様細胞の中に、自立増殖性を有する白血病細胞が含まれているかどうかを検証する為に、白血病症状を呈したTgマウス(CD45.2)の骨髄または脾臓細胞を放射線照射したCD45.1レシピエントマウスへの移植実験を行った。その結果、脾腫が誘導され末梢血中にCD45.2陽性のCD11b+Gr1+顆粒球を主体とする白血球増多ならびに重度な貧血を呈し、長期間Tlx1を過剰発現したTgマウス同様の表現型が再現された。これらの実験は、長期の時間を要するため、同結果を得られた事は研究の地盤を築くという意味で当該研究を順調に進展できたと言う事ができる。今後、白血病症状を呈したTgマウスの骨髄または脾臓細胞をin vitroにて培養する事によって、株化する事を目的に自立増殖性を有するかどうかの実験を進めたい。さらに骨髄造血と脾臓髄外造血における相違性と共通点を、双方の間葉系前駆細胞の特性を分子レベルで明らかにし、脾腫を伴う髄外造血の病態生理学的な特異的な役割を明らかにしていく。今後の展望として、脾腫と骨髄性白血病との関係を明らかにするために、コントロールマウスと脾腫を有するマウスとの比較において、骨髄性白血病細胞移入時における骨髄及び脾臓へのhoming、増殖、病態変化、そしてsurvivalの違いについて明らかにする。野生型マウスへの骨髄性白血病細胞移入において、移入直後は骨髄へのhomingし、そこで増殖が起こる事が知られているが、その後の急性転化期に脾腫が誘導され、脾臓でも骨髄性白血病のリクルートと増殖が亢進する。この時のTlx1発現細胞におけるTlx1の発現状態や、CKOマウスを用いたときの病態変化についても検証を行う。そして、骨髄造血と脾臓髄外造血における相違性と共通点を、双方の間葉系前駆細胞の特性を分子レベルで明らかにすると同時に、脾臓髄外造血誘導時の骨髄造血ニッチの状態・変化について解析を行う。これらの結果は、通常白血病細胞が骨髄で増殖し骨髄微小環境を破綻し、脾臓髄外造血を誘導するプロセスの分子メカニズムを提供する。さらに、慢性的に誘導される脾臓髄外造血は、脾臓髄外造血ニッチが白血病ニッチになっているのか、もしくは、脾臓髄外造血ニッチが骨髄造血ニッチの減弱化を誘導しているのかの知見についても明らかとなる事が期待される。それらが白血病の病態進行や悪化に影響するのかを明らかにする事は、白血病進行の遅延に関わる新たな視点を提供すると考えられる。このTlx1発現量増加の意義を調べる為、Tlx1発現細胞特異的にTlx

1欠損可能なTlx1CreER-Venus/flox(CKO)マウスを作製し、Tlx1欠損誘導後LPSを投与した所、CKOマウスにおいて脾臓髄外造血が完全に抑制された。従って、LPS誘導性脾臓髄外造血はTlx1発現細胞におけるTlx1の発現上昇によって誘導される事を明らかにした。興味深い事にTlx1CreER-Venus;Rosa26-Tlx1(Tg)マウスを作製し、Tlx1発現細胞特異的にTlx1の発現を上昇させた所、それだけで脾腫を伴う脾臓髄外造血が誘導された。従って、脾臓Tlx1発現細胞におけるTlx1の発現量が、脾臓髄外造血を制御しているマスターレギュレーターである事を証明した。さらにTlx1を長期的に過剰発現させたTgマウスでは、脾腫以外に末梢血における顆粒球を主体とする白血球増多ならびに重度な貧血を呈し、骨髄における赤芽球系細胞、巨核球の消失、肝臓や肺への骨髄球系細胞の浸潤など、骨髄増殖性疾患様の造血異常が認められた。これらの症状を呈したTgマウスの骨髄または脾臓細胞を放射線照射したCD45.1レシピエントマウスへ移植した結果、約6ヶ月後には末梢血の解析で貧血ならびに白血球増多が認められ、骨髄芽球などの幼弱な細胞も出現していた。従って、脾臓髄外造血制御機構の破綻によって、骨髄性白血病を発症する事が明らかとなった。長期間のTlx1過剰発現によって骨髄性白血病様の症状を呈する事が明らかとなったので、これらの白血病様細胞の中に、自立増殖性を有する白血病細胞が含まれているかどうかを検証する為に、白血病症状を呈したTgマウス(CD45.2)の骨髄または脾臓細胞を放射線照射したCD45.1レシピエントマウスへの移植実験を行った。その結果、脾腫が誘導され末梢血中にCD45.2陽性のCD11b+Gr1+顆粒球を主体とする白血球増多ならびに重度な貧血を呈し、長期間Tlx1を過剰発現したTgマウス同様の表現型が再現された。これらの実験は、長期の時間を要するため、同結果を得られた事は研究の地盤を築くという意味で当該研究を順調に進展できたと言う事ができる。今後、白血病症状を呈したTgマウスの骨髄または脾臓細胞をin vitroにて培養する事によって、株化する事を目的に自立増殖性を有するかどうかの実験を進めたい。さらに骨髄造血と脾臓髄外造血における相違性と共通点を、双方の間葉系前駆細胞の特性を分子レベルで明らかにし、脾腫を伴う髄外造血の病態生理学的な特異的な役割を明らかにしていく。今後の展望として、脾腫と骨髄性白血病との関係を明らかにするために、コントロールマウスと脾腫を有するマウスとの比較において、骨髄性白血病細胞移入時における骨髄及び脾臓へのhoming、増殖、病態変化、そしてsurvivalの違いについて明らかにする。野生型マウスへの骨髄性白血病細胞移入において、移入直後は骨髄へのhomingし、そこで増殖が起こる事が知られているが、その後の急性転化期に脾腫が誘導され、脾臓でも骨髄性白血病のリクルートと増殖が亢進する。この時のTlx1発現細胞におけるTlx1の発現状態や、CKOマウスを用いたときの病態変化についても検証を行う。そして、骨髄造血と脾臓髄外造血における相違性と共通点を、双方の間葉系前駆細胞の特性を分子レベルで明らかにすると同時に、脾臓髄外造血誘導時の骨髄造血ニッチの状態・変化について解析を行う。これらの結果は、通常白血病細胞が骨髄で増殖し骨髄微小環境を破綻し、脾臓髄外造血を誘導するプロセスの分子メカニズムを提供する。さらに、慢性的に誘導される脾臓髄外造血は、脾臓髄外造血ニッチが白血病ニッチになっているのか、もしくは、脾臓髄外造血ニッチが骨髄造血ニッチの減弱化を誘導しているのかの知見についても明らかとなる事が期待される。それらが白血病の病態進行や悪化に影響するのかを明らかにする事は、白血病進行の遅延に関わる新たな視点を提供すると考えられる。
鳥類代謝特性支配因子としての一酸化窒素(NO)-家禽生産機能開発の基盤-

本研究では、高血糖・インスリン抵抗性などの鳥類特異的糖代謝特性を支配する要因の一つは一酸化窒素(NO)であるとの仮説を、鳥類の細胞内代謝特性とNO応答の特異性から明示することを目的とした。本年度は、鶏グルコース輸送とインスリン情報伝達系に対するNOの作用を、NO産生阻害剤を用いてin vitroで明示することを試みた。(1)鶏骨格筋細胞培養系におけるグルコース輸送に対するNO供与体添加の作用2日齢のブロイラー骨格筋(浅胸筋)より単離した筋衛星細胞を、サブコンフルエントになるまで培養し、培地血清濃度を低下させることにより分化を進行させ、筋管が成熟した約5日目のステージの細胞を用いて試験を行った。NO供与体であるNOC5を骨格筋細胞の培養培地に1100μMの濃度で添加し、細胞へのグルコース輸送能を非代謝性グルコースである2-Deoxyglucoseの取り込み能で評価したところ、細胞のグルコース輸送能はNOC5濃度依存的に上昇する傾向が認められた。一方、インスリン存在下(5μg/ml)では、NOC5添加によるグルコース輸送能の上昇は抑制され、NOC5 100μMの添加時のみ、若干の増加が認められたに過ぎなかった。(2)鶏骨格筋細胞培養系におけるグルコース輸送に対するNOS阻害剤添加の作用前試験と同様の培養条件下で、培地にNO合成酵素阻害剤であるL-NAMEを0100μMの濃度で添加し、細胞のNO産生を抑制した時のグルコース輸送能を検討した。骨格筋細胞へのL-NAME添加は、濃度依存的にグルコース輸送能を低下させる傾向を示し、50μM以上の添加では、無添加の細胞に比べ、グルコース輸送能が有意に低下した。一方、インスリン存在下(5μg/ml)では、L-NAMEの添加により、グルコース輸送能が上昇する傾向が観察された。これは、哺乳動物の骨格筋細胞とは異なるNO応答性であった。以上の結果より、鶏糖代謝にはNOが関与していることが細胞レベルでも明示され、哺乳動物とは異なる鳥類のインスリン応答性特性にも、NOが関与していることが示唆された。本研究では、高血糖・インスリン抵抗性などの鳥類特異的糖代謝特性を支配する要因の一つは一酸化窒素(NO)であるとの仮説を、鳥類の細胞内代謝特性とNO応答の特異性から明示することを目的とする。今年度は、NO供与体存在下での、骨格筋のグルコース輸送能およびインスリン応答性をin vitroおよびin vivoで測定し、鶏糖代謝に対するNOの関与を明らかにすることを試みた。(1)NO供与体投与鶏の代謝変動まず、非放射性Deoxyglucoseを用いた、鶏グルコース輸送能測定系を作成した。次に、NO供与体(NOC12)を2週齢の鶏に0.3755mg/kgで投与すると、血中NO濃度は投与量30分後に投与量依存的に増加した。そこで、NOC12 1.125mg/kg投与後30分の骨格筋グルコース輸送能を測定したところ、長肢伸筋(EDL)におけるグルコース輸送能がNOC12投与区で対照区に比べ有意に増加した。すなわち、鶏でもNOが骨格筋グルコース輸送に関与していることが明らかとなった。(2)鶏骨格筋組織培養系におけるNO供与体添加の影響1週齢ブロイラーヒナのEDLを採取し、KHB buffer中で組織培養した。この培養系に、NO供与体(NOC5)を200μMまで添加したが、グルコース輸送能に変動は認められなかった。よって、現時点では鶏における骨格筋グルコース輸送に対して、直接的な作用は小さいものと推定された。しかし、組織培養でのグルコース輸送は筋肉の厚みなども考慮しなければいけないため、今後は、細胞培養系も用いて再検討する必要がある。(3)NO存在下におけるインスリン応答性上記のin vivoおよびin vitro実験系で、インスリン存在下におけるグルコース輸送系の応答を観察したが、NO供与体の影響は認められなかった。これは、哺乳動物とは異なる特異性である。すなわち、鶏のインスリン応答性の特異性(インスリン抵抗性)は、NOに対する特異性とも関連している可能性が示唆された。(2)鶏骨格筋細胞培養系におけるグルコース輸送に対するNOS阻害剤添加の作用

前試験と同様の培養条件下で、培地にNO合成酵素阻害剤であるL-NAMEを0100μMの濃度で添加し、細胞のNO産生を抑制した時のグルコース輸送能を検討した。骨格筋細胞へのL-NAME添加は、濃度依存的にグルコース輸送能を低下させる傾向を示し、50μM以上の添加では、無添加の細胞に比べ、グルコース輸送能が有意に低下した。一方、インスリン存在下(5μg/ml)では、L-NAMEの添加により、グルコース輸送能が上昇する傾向が観察された。これは、哺乳動物の骨格筋細胞とは異なるNO応答性であった。以上の結果より、鶏糖代謝にはNOが関与していることが細胞レベルでも明示され、哺乳動物とは異なる鳥類のインスリン応答性特性にも、NOが関与していることが示唆された。
細胞内におけるアクチン構造多型の検出とその生理的意義の解明

アクチン構造は細胞機能に重要である。しかし、アクチンの構造多型は細胞内では検出されておらず、その生理学的な関連についてもわかっていない。本研究では細胞内のアクチン構造多型を検出するため、分子内FRETシステムを用いた。FRETプローブを結合させたアクチンをPtK2細胞に接着細胞用のエレクトレポレーターを用いて導入し、共焦点顕微鏡により観察した。PtK2細胞内のFRETレシオ値は局所的に異なっており、このことは細胞内においてもアクチン構造は多様であることを示している。細胞内のアクチンは複数の構造をとり、細胞機能に関与していることが考えられる。アクチンは様々な生理機能にとって重要な役割を果たしている。また、アクチンの分子構造に多様性があることがin vitroの実験系において示唆されている。しかし、これらの構造多型が細胞内でも実際に起きているのかについては不明であり、また、実際に起きている場合でも、細胞機能との関連性については分かっていない。本研究では細胞内でアクチンの構造分布を検出可能なFRETプローブアクチンを構築し、細胞内に導入することで細胞内におけるアクチン状態の多様性とその機能解明することを目的としている。まず細胞内アクチンの構造分布検出のため、蛍光色素を特異的に結合させるための変異を導入したアクチンの発現と精製、蛍光ラベルを行うことで、新規FRETプローブアクチンを構築した。これが構造検出用のプローブとしての機能を確認するため、重合時の蛍光を測定したところ、重合に伴いアクセプターとドナーの蛍光強度が逆相関的に変化する様子が測定され、FRETプローブとしての機能を有していることを確認した。膜透過試薬やエレクトロポレーターによるFRETプローブアクチンの細胞内への導入を試みたが、導入量が少なく、導入されたアクチンの多くも小胞体と思われる構造体に入ってしまう様子が観察された。しかしその一方で、微量ながらも細胞質に存在するFRETプローブアクチンからは局所的に構造状態の異なるアクチンが細胞内に存在することが示唆された。アクチンは細胞運動や細胞分裂など多くの細胞機能において重要な役割を担う蛋白質である。これまでin vitroの研究によりアクチンの構造多型が観察されている。一方、細胞内においてもアクチンが多様な構造を取り、そのことが細胞機能にどのような影響を与えるのかについては不明な点が多い。本研究では細胞内でアクチンの構造分布を調べることで、細胞機能とアクチン構造との関連を調査することを目的とした。そのためにはまず、アクチンの異なるドメインにドナーとアクセプターとなる蛍光色素を結合させた分子内FRETプローブアクチンを調製した。このFRETプローブアクチンをエレクトロポレーション法によりPtK2細胞に導入し、FRET強度を観察した。その結果、細胞内のFRET強度は一様ではなく、アクチン構造が特定の領域により異なる可能性が示された。アメーバ運動中の細胞においては細胞前後でFRET強度が異なる様子が観察されたことから、アクチン構造が細胞の極性に関与している可能性がある。また、これまでの研究によりある特定の変異をアクチンに導入するとアクチンの構造変化を抑制することがわかっていることから、この変異アクチンを調製し、細胞内に導入した。変異アクチンは細胞内において、導入直後は変異アクチンも正常なアクチンと同様に局在したが、一定時間経過後には、局在がなくなり、細胞が収縮する様子が観察された。これらの結果は、多様なアクチン構造は細胞が正常に機能するために必須であることを示唆している。生物物理アクチンの細胞内導入に予想以上に条件検討が必要であり時間を要したが、その一方でFRETプローブアクチンの構築が順調に進んだため、全体としてはおおむね順調であったと判断できる。今後はより効率的な細胞内へのアクチンの導入方法を検討する。その一方、構造変化を抑制した変異アクチンや、架橋試薬により架橋した架橋アクチンを細胞内に導入し、細胞の機能に影響があるか確認する。また、アクチンの構造状態に違いが見られた領域に局在する結合蛋白質を同定し、生化学的にアクチン構造との関連を調べる。
新規protein conjugationシステムと共役した小胞輸送機構の解明

AAA-ATPaseのひとつであるSKD1とその結合蛋白質が、新規protein conjugationシステムを利用した細胞内小胞輸送(特にエンドソーム・リソソームにおける)を制御しているという作業仮説に基づいて研究を行った。昨年度はSKD1のATPase活性欠損型であるSKD1(E235Q)をアデノウイルスを用いて発現させるシステムを用いて、SKD1がエンドソームを介する様々な小胞輸送の過程に関与していることを明らかにした。さらにSKD1(E235Q)の発現によりリソソーム酵素(cathepsin D)の細胞外分泌も認められ、SKD1の機能異常が酵母細胞におけるいわゆるClass E Vpsのフェノタイプと同じであることを明らかにした。(J.Cell Sci 116(1)401-414(2003))今年度はさらに酵母Two-hybrid法により同定したSKD1結合蛋白質について機能解析を行い、以下の点を明らかにした。(2)SBP1のヒトホモログがChediak-Higashi Syndrome原因遺伝子lyst(lysosomal traficking regulator)に結合する蛋白質の一つであり、SKD1(E235Q)発現によりlystの局在が膜画分へと変化することを見い出し、SKD1/SBP1/lyst複合体がエンドソーム膜上で機能している可能性があることを明らかにした。(3)SBP3がユビキチンシグナル依存的膜蛋白質輸送を制御する因子である酵母ESCRT-IIIのサブユニットの一つであるVps2のマウスホモログであることを明らかにした。さらにSBP3のN末側Coiled-coilドメインがSKD1(E235Q)の膜結合に重要であることも明らかにした。(J.Cell Sci(2004),accepted)以上のようにSKD1とその結合蛋白質がユビキチンシステムを含むエンドソーム・リソソームへの小胞輸送において重要な役割を果たしていることを明らかにすることに成功した。AAA-ATPaseのひとつであるSKb1とその結合蛋白質が、新規protein conjugationシステムを利用した細胞内小胞輸送(特にエンドソーム・リソソームにおける)を制御しているという作業仮説に基づいて研究を行っている。今年度はSKD1のATPase活性欠損型であるSKD1(E235Q)をアデノウイルスを用いて発現させるシステムを用いて、SKD1が1)エンドソームを経由して形質膜へとリサイクルする経路2)エンドソームを経由してトランスゴルジ網へとリサイクルする経路3)形質膜からエンドソームを経由してリソソームへと輸送される経路4)後期エンドソーム・リソソームが融合して形成れるハイブリッドオルガネラからのリソソームの再形成という、エンドソームを介する様々な小胞輸送の過程に関与していることを明らかにした。(J. Cell Sci 116(1)401-414 (2003))これらの結果はSKD1がもつATPase活性が動物細胞のエンドソーム・リソソームにおける膜融合(fusion)・小胞の出芽(budding)・選別(sorting)のいずれかを制御していることを示唆するものである。以上の成果をふまえて、現在SKD1が関与する小胞輸送の分子機構について1)SKD1結合蛋白質の果たす役割2)ユビキチンシグナル依存性の膜蛋白質の選別輸送におけるSKD1/SKD1結合蛋白質の関与等について検討中である。(J.Cell Sci(2004),accepted)