hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
コオロギ逃避行動解発を制御する脳内神経機構

これまで科学感覚情報によりコオロギの闘争行動が惹起され、その行動に対する一酸化窒素-サイクリックGMP(NO-cGMP)系の修飾作用が知られていた。そして負けた個体が逃避行動を解発する際にも化学感覚情報が重要な役割を担うと考えられていた。昨年度、嗅覚情報処理の一次中枢である触角葉のニューロンの自発活動にNOが影響を及ぼすことは既に確認していた。そこで、これまでに脳内微小構造の形態学的調査と細胞外誘導法を用いて脳内主要構成部位のひとつである触角葉からニューロンの活動を記録し、フェロモン刺激に対する応答、及びそれと同時にNO関連試薬を還流投与した際の応答の変化を解析した結果をオーストリアのウィーンで行われたヨーロッパ神経科学学会で発表した。又、一方でこれまでの行動観察等の結果から、この様な化学感覚情報は逃避行動を直接的に惹起するのではなく、まず、他種の感覚情報と統合されると考えられた。その中で考えられうる最も有力な候補である機械感覚情報の解析を始めた。最初に節足動物の機械感覚と化学感覚の研究では先端の研究を行っているウィーン大学に渡航しコオロギのほかドクシボグモ、ショウジョウバエの感覚子を用いて機械感覚子の機能解析に極めて重要なニューロンの活動記録の手方を習得した。またこれまでに作成したコオロギの脳の模式図と比較する目的でレーザー共焦点顕微鏡観察像から得られた形態情報をもとにドクシボグモの神経節の立体像構築も行った。それらの像の比較から、クモ類の脳神経節と昆虫類の脳神経節には相同の脳内微小構造は確認できたが、神経系の集約という点ではクモ類の方が進んでいることが解った。今後、これらの結果から逃避行動解発を制御する神経機構について、昆虫とクモ類とでの比較を検討している。コオロギでは、これまでに嗅覚情報により惹起される行動の存在とその行動に対する一酸化窒素(NO)による修飾作用が既に知られていた。そこで、anti-uNOS抗体染色法で脳をwhole-mount染色した結果、触角葉およびその周辺域にNO産生細胞の存在が確認された。そこで、行動解発を制御する神経機構の中でも特に嗅覚情報の伝達経路に対するNOの修飾作用を調査するため、当初目的としていた脳内主要構成部位の中から触覚葉を選択し、細胞外誘導法を用いて、NO関連試薬を還流投与した際の触角葉ニューロンの自発活動を記録、解析した。試薬としてNOSの基質であるL-アルギニン、NOS阻害剤のL-NAMEを投与、また、遊離NOのレベル調節の目的で、NO供与剤であるNOR3とNO除去剤であるPTIOを投与した。さらに標的細胞中のグアニル酸シクラーゼの活性を調査するため、阻害剤であるODQとサイクリックGMPの異性体である8-Br-cGMPを投与した結果、L-アルギニン投与時には、ニューロン群の活性は一時的に上昇し、L-NAMEの投与時には反対に低下した。また、NOR3投与時には発火頻度の顕著な増加、PTIO投与時には減少が観察された。また、8-Br-cGMP投与時には持続的な増強効果、ODQ投与時には持続的減少効果があった。これらの応答は、触角葉内の各部位によって活動状態に差異があった。このよう結果から、外界からの刺激を遮断した状態でもNOの修飾作用が発現することから、NOは脳内で恒常的に存在し、静止状態下の個体においても、ニューロン群の活性を調節することで入力される嗅覚情報の弁別に一役を担うものと考えられる。コオロギでは、これまでにフェロモン情報により闘争行動が惹起され、更にその行動に対する一酸化窒素-サイクリックGMP(NO-cGMP)系の修飾作用が既に知られていた。そして負けた個体が逃避行動を解発する際にもフェロモン情報が重要な役割を担うと考えられていた。昨年度、フェロモンを含む嗅覚情報処理の一次中枢である触角葉のニューロンの自発活動にNOが影響を及ぼすことは既に確認していた。そこで、脳内微小構造の形態学的調査と細胞外誘導法を用いて脳内主要構成部位のひとつである触角葉からニューロンの活動を記録し、フェロモン刺激に対する応答、及びそれと同時にNO関連試薬を還流投与した際の応答の変化を解析した。まず、レーザー共焦点顕微鏡観察像から得られた形態情報から触角葉の立体像構築を行い、触角葉内の微細構造を確認した。触角葉とその周辺の構造をもとに触角葉を4つの領域に区分し、領域ごとの揮発性体表物質(フェロモン)刺激に対する応答を調べた。この刺激に応答する領域は脳の中心線側にある二つの領域で、この領域では一過性の応答を示すユニットと持続性の応答を示すユニットが確認された。また、この領域ではこれらの応答に対するNOの修飾効果も確認された。NO供与剤NOR3投与時には、応答頻度が低下するユニットが存在し、また、NO消去剤投与時にはフェロモン刺激に対する応答が減少するユニットと増加するユニットが共存した。一方、フェロモンに応答しなかった側方領域ではこれらの明瞭な修飾効果はみられなかった。これらの結果から、触角葉に入力した情報は初期の段階でNOの修飾を受けていること、NO-cGMPシグナル系が、フェロモン情報処理の過程において、初期の入力段階で既に信号弁別の役割を担っていることが示唆された。

そして負けた個体が逃避行動を解発する際にも化学感覚情報が重要な役割を担うと考えられていた。昨年度、嗅覚情報処理の一次中枢である触角葉のニューロンの自発活動にNOが影響を及ぼすことは既に確認していた。そこで、これまでに脳内微小構造の形態学的調査と細胞外誘導法を用いて脳内主要構成部位のひとつである触角葉からニューロンの活動を記録し、フェロモン刺激に対する応答、及びそれと同時にNO関連試薬を還流投与した際の応答の変化を解析した結果をオーストリアのウィーンで行われたヨーロッパ神経科学学会で発表した。又、一方でこれまでの行動観察等の結果から、この様な化学感覚情報は逃避行動を直接的に惹起するのではなく、まず、他種の感覚情報と統合されると考えられた。その中で考えられうる最も有力な候補である機械感覚情報の解析を始めた。最初に節足動物の機械感覚と化学感覚の研究では先端の研究を行っているウィーン大学に渡航しコオロギのほかドクシボグモ、ショウジョウバエの感覚子を用いて機械感覚子の機能解析に極めて重要なニューロンの活動記録の手方を習得した。またこれまでに作成したコオロギの脳の模式図と比較する目的でレーザー共焦点顕微鏡観察像から得られた形態情報をもとにドクシボグモの神経節の立体像構築も行った。それらの像の比較から、クモ類の脳神経節と昆虫類の脳神経節には相同の脳内微小構造は確認できたが、神経系の集約という点ではクモ類の方が進んでいることが解った。今後、これらの結果から逃避行動解発を制御する神経機構について、昆虫とクモ類とでの比較を検討している。
アフリカにおける環境毒性研究と異物代謝系の種差に注目したリスク評価

当該研究では希少な生態系が成り立つアフリカを中心に、野生動物と環境試料の採集を行い、環境毒性研究を展開した。まず、野生動物に対する異物代謝系の種差を主に第II相抱合反応に注目し明らかにした。11種の哺乳類の尿を用いたスクリーニングでは、現在まで硫酸抱合活性が低いと考えられてきたブタで硫酸抱合化Pyreneが検出された。また、カイネティックス解析の結果、ブタの酵素効率はラットよりも高いことが明らかになった。一方、アフリカで行った調査では、両生類、哺乳類、鳥類の尿及び臓器を採取した。これらの試料について、重金属類や農薬類を中心に化学分析を行った結果、一部の地域からきわめて高濃度の化学物質が検出され、特に鳥類において他の生物種に比べ高い濃度で化学物質を蓄積している傾向が観察された。化学物質に対する最も基本的な生体防御機構は異物代謝系である。一方、これら異物代謝系の動物種差が、各動物の化学物質に対する感受性に強く寄与することが知られている。しかし、これら異物代謝系の動物種差に関する知見は、一部の実験動物を除くとほとんどの生物種で十分に解明されていない。そこで本研究では、第II相抱合反応に注目し、Pyreneを用い新たに開発した抱合体スクリーニング手法を用いることで各動物種の異物代謝系のCharacterizationを行った。急激に環境汚染が進行するにも関わらず、希少野生動物が生息するアフリカで採取したサンプルを含む、11種の哺乳類の尿を用いたスクリーニングでは、生物種により多様な代謝パターンがあることが明らかになった。中でも、現在まで硫酸抱合活性が低いと考えられてきたブタで硫酸抱合化代謝物が検出された。本事象を検証するため、ブタの肝サイトソル画分を用いて、カイネティックス分解析を行った結果、ブタの硫酸抱合転移酵素(SULT)のVmaxは比較対象として用いたラットに比べ低かったが、酵素効率を示すVmax/Kmはラットよりも高いことが明らかになった。近年ますます実験動物化が進むブタについて、本研究は薬物代謝の特徴を明らかにすることが出来た。一方、アフリカで行ったフィールド調査では、両生類、哺乳類、鳥類の尿及び臓器を採取した。しかし、種々の鳥類においてゲノム情報は極めて乏しく、蓄積濃度と異物代謝系との関係を解析する事は未だに困難であった。今後、次世代シーケンサーによる解析を加えることにより、より詳細な生態リスク評価を行うことが可能であると考えられた。これまでの研究により、これら異物代謝系の種差が、各動物の化学物質感受性に強く寄与することが知られている。例えば、異物代謝・第II相抱合反応において、ネコではグルクロン酸抱合、イヌではアセチル抱合およびブタでは硫酸抱合遺伝子が欠損していることが獣医学領域の研究から明らかになっており、投薬時に注意を要する。しかし、これら異物代謝系の種差に関する知見は、一部の実験動物を除くとほとんどの生物種で解明されていない。そこで本研究では、異物代謝系の中でも重要な第II相抱合反応に注目し、ピレンを蛍光標識として新たに開発した抱合体スクリーニング手法を用いることで各動物種の異物代謝系の特徴を悪鬼らかにした。7種の両棲類および13種の魚類を対象にその抱合体スクリーニングを行った結果、現在まで報告の無い抱合体を含む複数の代謝産物が検出され、更にその組成には種間差が観察された。特に知見の少ない両生類で詳細に解析を行った結果、両生類は全代謝産物に対する硫酸抱合体の割合が大きく、更に興味深いことに脊椎動物では報告の少ないグルコース抱合体が検出された。これら抱合体の種差の原因を明らかにするため、各抱合酵素に対するカイネティックス解析をおこなった結果、代謝産物の違いは代謝酵素活性の違いに基づいていると考えられた。一方、哺乳類の尿を用いたフィールドレベルの調査では、希少動物であるゾウやクマ、シカを含む11種から試料採集を行い、そのスクリーングを行った。興味深いことに、偶蹄類であるウシやシカで他の種と比べ数10倍のPyrene代謝産物の排泄が観察された。本研究成果は、現在まで異物代謝系に対し、極めて情報の乏しかった両棲類を含む希少生物に対し、新たな知見を提供するものであり、今後の生態リスク評価を行う上での重要な基礎になると考えられる。フィールド調査と試料採集試料採集は、当初予定していた通りアフリカ諸国を中心に行った。

H23年度はザンビア、ガーナ、南アフリカ、エチオピアの4か国に渡航し、共同研究実施体制の構築と野生げっ歯類やウシ、ヤギなどの偶蹄類の尿、血液および臓器、鳥類の臓器および土壌・大気粉塵の採集を行った。また、エジプトでは、共同研究者の協力の基、バッファローやラクダの尿に加え、特に環境汚染の激しい地域から魚類や甲殻類の試料採集を行った。アフリカ以外ではタイに渡航し、哺乳類の尿試料を採集した。これらのサンプルは既に日本に輸入し、第II相抱合体のスクリーニングを行うとともに、各動物の環境汚染に対する暴露評価を行っている。更に、これらのサンプルを用い、重金属や農薬を中心に化学分析を行い、各国に特徴的な環境汚染が進行していることを明らかにしている。一方、酸化ストレスマーカーやサイトカインなどの環境汚染物質に対するバイオマーカーは現在解析中である。当該研究では、各国からの試料採集が最も難関であると想定していたため本年度のフィールド調査および試料採集の達成度は順調といえる。各動物の異物代謝系の種差の解析第II相抱合反応を用いた異物代謝系の種差の解明では、上記フィールドより得られた各種哺乳動物に加え、鳥類や魚類、両生類、貝類、甲殻類も含め解析を行った。系統分類上、代表的な生物種を既に30種以上比較することが可能となっており、各生物種特有の異物代謝反応が観察されている。更に、知見が極めて少ない両生類や魚類において、現在まで報告のない抱合体を本研究で初めて検出したこともあり、抱合反応の種差に関するスクリーニングは計画通り進行している。一方、H23年度に計画していたメンブレンベクシルを持いた各種抱合体によるトランスポーター活性化能の解明については、新規抱合体の分取・精製を行っているため、現在解析中である。平成23年度に引き続き、平成24年度も可能な限りサンプル採集を行う。得られた各試料について引き続き化学分析と環境汚染バイオマーカーの解析、異物代謝系の解析を行う。平成23年度と平成24年度の調査によって得られた各種野生動物のデータセットは、極めて多変量になると予想される。土壌や底質、水質の環境データも併せて、多変量解析やGISを用いたマッピングとシミュレートを行い、野生動物への影響評価、環境保全に向けたインフォマティクスの構築を行う。一方、異物代謝系の種差を明らかにするため、発現メンブレンベシクルを用いた各種抱合体のトランスポーター活性能の解析を行う。抱合体は、その種類によりトランスポーター活性能が異なり、その排泄速度が異なることが知られている。そこで、本研究では、代表的な生体外異物のATP-binding casssette (ABC)トランスポーターであるMRPやBCRPの発現メンブレンベシクルを用いた解析を行うことで、本研究により初めて構造が明らかにされた抱合体を含む、各種抱合体の排泄速度を数値化する。これを基に、抱合体生成パターンと併せ、環境化学物質排泄能の動物種差を明らかにする。異物代謝系に加え、環境化学物質レセプターも併せて解析する事で、環境化学物質に対する高感受性動物のデータベースを構築する予定である。これらのデータセットを基に、高汚染地域に高リスク動物種生息するような、潜在的に化学物質が起因する疾患頻度が高いケミカルハザード地域の予測を行う予定である。
燃料電池用ポリマー電解質膜内の物質拡散係数リアルタイムセンシングの研究

本年度の研究成果は以下のようにまとめられる。[1]ポリマー膜内のメタノールの物質拡散係数の測定を行なうことを最終目標として,赤外波長のレーザーを加熱に用いるソーレー強制レイリー散乱法の装置設計を行った。高出力CO_2レーザー(10W)を導入し,ソーレー効果が小さい混合液系(S_T10^<-2>10^<-3>K^<-1>)であっても再現性良く測定が可能なパラメータ設定を検討した。[2]極めて微弱な拡散現象による信号だけを拡大すると,光電子増倍管が飽和してしまう問題を解決するために,2台のAOM(光学音響素子:Acoust-optic modulator)を導入し加熱・観察用の2つのレーザーのシャッター開閉タイミングを適切に制御する装置を開発した。[3]バルクのメタノール水溶液(80wt%)の拡散係数測定を常温で行い,開発した測定装置の有効性を確認した。また,信号を安定して検知するための最適な光学系の条件設定,及び試料セルの構造を検討した。[4]メタノール水溶液を十分に浸透させた高分子電解質膜(Nafion【○!R】)を試料として信号検知を行った。加熱終了直後に見られる減衰信号をメタノール水溶液の熱伝導による減衰波形と比較すると予想される拡散現象の時定数より大きく,乾燥状態のNafionを試料としたときの信号とも異なる信号であることが明らかになり,今後試料セルの検討や信号の理論的解釈が課題となった。
省資源・高経済性炉心用カドリニア分散型ウラン酸化物燃料の熱・機械特性測定

現在、軽水炉では炉心の初期反応度制御のためにUO_2に可燃性毒物であるGd203を固溶させた燃料を用いているが、このような固溶型燃料はUO_2に比べて試料ペレットの熱伝導率が大きく低下するという欠点を有している。発電コストの削減においてはウラン濃縮度増加による核燃料の高燃焼度化が有効であるものの、固溶型燃料ではGd_2O_3添加量増加に伴う燃料の熱伝導率低下が問題となることから、高熱伝導率を有する新規な燃料の開発が望まれている。本研究では、UO_2燃料の熱伝導率改善を日的として、従来の固溶型試料ではなくUO_2マトリックス中にGd203粒子を分散させた分散型試料を作製し、その熱伝導率、及び高温安定性の評価を行った。Gd_2O_3粒子(添加量10wt.%)、及びUO_2粉末を混合し焼結することで分散型試料を得た。分散型試料の熱伝導率は300-1373Kの温度域においてUO_2や固溶型試料と同様に温度の上昇に伴い減少する傾向を示した。分散型試料の熱伝導率はUO_2の熱伝導率よりは小さい値であったものの、10wt.%Gd_2O_3固溶型試料と比較して高い値を示し、最大で約1.5倍高い熱伝導率を得ることに成功した。分散型試料の熱伝導率の値と温度依存性は3wt.%Gd_2O_3固溶型試料の挙動に相当するものであった。試料の高温安定性に関しては、分散型試料を2793Kまで約40K/sで昇温させた場合においても試料は破砕せず、高温域においてもペレット形状を維持することが確認された。本研究により、Gd_2O_3粒子を分散させることでUO_2燃料の熱伝導率は固溶型試料に比べ大きく向上することが明らかとなり、また試料ペレットは実用に耐えうる機械特性を有することが示された。本研究の成果は核燃料の高燃焼度化、及び発電コストの低減に大きく貢献するものと期待される。Gd_2O_3を10wt%置換固溶させたUO_2試料(固溶型)、及びGd_2O_3を10wt%分散させたUO_2試料(分散型)をそれぞれ作成した。固溶型では(U,Gd)O_<2-δ>の単一相が、分散型ではUO_2とGd_2O_3の混合体が得られたことを粉末X線回折データにより確認した。得られた試料のSEM観察により、分散型に用いたGd_2O_3の粒径は25-53μmであり、均一ではないもののGd_2O_3粒子がUO_2試料中に幅広く分散している様子がわかった。また、いずれの試料も理論密度比95%の高密度焼結体であった。固溶型及び分散型試料の熱伝導率はUO_2及びGd_2O_3単体の熱伝導率よりも小さな値を示した。Gd_2O_3を添加したUO_2試料とUO_2単体の熱伝導率の差は低温域ほど顕著であり、温度の増加に伴い各試料の熱伝導率の差は小さくなる傾向を示した。固溶型と分散型の熱伝導率を比較した場合では、特に低温域で分散型の熱伝導率が固溶型よりも大きな値を示した。

この結果は同量のGd_2O_3を添加した場合でも添加物の存在状態により熱伝導率が大きく異なることを示しており、従来のUO_2-Gd_2O_3系固溶型酸化物燃料と比較してより高い熱伝導率を有する、つまりは高効率な酸化物燃料の開発に繋がるものと期待される。今後、固溶型及び分散型の試料における熱拡散率の違いについて詳細に検討を進める。Gd_2O_3分散型UO_2中には、UO_2よりも融点の低いGd_2O_3が存在するため、過度時・事故時の高温時の形態安定性(健全性)評価が重要である。今後、高温安定性評価の実験装置の設計・組み立てを行う予定である。現在、軽水炉では炉心の初期反応度制御のためにUO_2に可燃性毒物であるGd_2O_3を固溶させた燃料を用いているが、このような固溶型燃料はUO_2に比べて試料ペレットの熱伝導率が大きく低下するという欠点を有している。発電コストの削減においてはウラン濃縮度増加による核燃料の高燃焼度化が有効であるものの、固溶型燃料ではGd_2O_3添加量増加に伴う燃料の熱伝導率低下が問題となることから、高熱伝導率を有する新規な燃料の開発が望まれている。本研究では、UO_2燃料の熱伝導率改善を目的として、従来の固溶型試料ではなくUO_2マトリックス中にGd_2O_3粒子を分散させた分散型試料を作製し、その熱伝導率、及び高温安定性の評価を行った。Gd_2O_3粒子(添加量10wt.%)、及びUO_2粉末を混合し焼結することで分散型試料を得た。分散型試料の熱伝導率は300-1373Kの温度域においてUO_2や固溶型試料と同様に温度の上昇に伴い減少する傾向を示した。分散型試料の熱伝導率はUO_2の熱伝導率よりは小さい値であったものの、10wt.% Gd_2O_3固溶型試料と比較して高い値を示し、最大で約1.5倍高い熱伝導率を得ることに成功した。分散型試料の熱伝導率の値と温度依存性は3wt.% Gd_2O_3固溶型試料の挙動に相当するものであった。試料の高温安定性に関しては、分散型試料を2793Kまで約40K/sで昇温させた場合においても試料は破砕せず、高温域においてもペレット形状を維持することが確認された。本研究により、Gd_2O_3粒子を分散させることでUO_2燃料の熱伝導率は固溶型試料に比べ大きく向上することが明らかとなり、また試料ペレットは実用に耐えうる機械特性を有することが示された。本研究の成果は核燃料の高燃焼度化、及び発電コストの低減に大きく貢献するものと期待される。
血漿中スフィンゴシン-1ーリン酸測定の臨床検査への適用

(1)臨床検体を用いた,血漿中Sph-1-Pの定量我々が以前開発したスフィンゴシン-1ーリン酸(Sph-1-P)定量法(Anal.Biochem.230:315-320,1995),つまり,^3H標識無水酢酸によりNアセチル化することにより(これにより、^3H標識C_2-セラミド-1ーリン酸が生成される),健常人の血漿Sph-1-Pの測定を行った.血漿中には,191±79pmol/ml(平均±標準偏差,n=8)の濃度でSph-1-Pが存在することが判明した.患者血漿として劇症肝炎,肝硬変症例12例の測定を行ったが,健常人との比較で有意な差を認めなかった.また,人の尿・髄液・胸腹水に関しても検討を行ったが,これらではSph-1Pは検出されなかった.大量の検体のSph-1-P測定を速やかに行えるように,^3H標識C_2-セラミド-1ーリン酸をHPLCにより解析できる系(シリカゲル-オクタデシル基充填カラムを用いた逆相分配クロマトグラフィー)を開発し,標準Sph-1-Pの測定は可能になっている.しかし,最終的な検出に用いるRIモニターの感度が悪いせいか,血漿検体で明瞭なピークが形成されていない.方法を変え,液クロ/イオンスプレーイオン化MS/MSによる検討を行った.この方法で血漿検体中のSph-1-Pのピークが検出された.^3H標識Sph,Sph-1-Pを用いた検討で,血小板は血漿のSphを積極的に取り込んでSph-1-Pへと変換して放出し,放出されたSph-1-Pは血漿中で代謝的に安定であることが判明した.(1)臨床検体を用いた,血漿中Sph-1-Pの定量我々が以前開発したスフィンゴシン-1ーリン酸(Sph-1-P)定量法(Anal.Biochem.230:315-320,1995),つまり,^3H標識無水酢酸によりNアセチル化することにより(これにより、^3H標識C_2-セラミド-1ーリン酸が生成される),健常人の血漿Sph-1-Pの測定を行った.血漿中には,191±79pmol/ml(平均±標準偏差,n=8)の濃度でSph-1-Pが存在することが判明した.患者血漿として劇症肝炎,肝硬変症例12例の測定を行ったが,健常人との比較で有意な差を認めなかった.また,人の尿・髄液・胸腹水に関しても検討を行ったが,これらではSph-1Pは検出されなかった.大量の検体のSph-1-P測定を速やかに行えるように,^3H標識C_2-セラミド-1ーリン酸をHPLCにより解析できる系(シリカゲル-オクタデシル基充填カラムを用いた逆相分配クロマトグラフィー)を開発し,標準Sph-1-Pの測定は可能になっている.しかし,最終的な検出に用いるRIモニターの感度が悪いせいか,血漿検体で明瞭なピークが形成されていない.方法を変え,液クロ/イオンスプレーイオン化MS/MSによる検討を行った.この方法で血漿検体中のSph-1-Pのピークが検出された.^3H標識Sph,Sph-1-Pを用いた検討で,血小板は血漿のSphを積極的に取り込んでSph-1-Pへと変換して放出し,放出されたSph-1-Pは血漿中で代謝的に安定であることが判明した.(1)臨床検体を用いた,血漿中Sph-1-Pの定量我々が最近開発したスフィンゴシン-1ーリン酸(Sph-1-P)定量法(Anal.Biochem.230:315-320,1995),つまり,^3H標識無水酢酸によりN-アセチル化することにより(これにより、^3H標識C_2-セラミド-1ーリン酸が生成される),健常人の血漿Sph-1-Pの測定を行った.血漿中には,191±79pmol/ml(平均±標準偏差,n=8)の濃度でSph-1-Pが存在することが判明した.大量の検体のSph-1-P測定を速やかに行えるように,^3H標識C_2-セラミド-1ーリン酸をHPLCにより解析できる系を工夫した.シリカゲル-オクタデシル基充填カラムを用いた逆相分配クロマトグラフィーにより,標準Sph-1-Pの測定は可能になっている.しかし,まだ感度が悪く,血漿検体を測定できるまでには至っていない.次年度の課題としたい.血小板よりスフィンゴシンキナーゼを部分精製し,市販の^3H標識スフィンゴシンを基質として反応させることにより,^3H標識Sph-1-Pを作成した.このアイソトープ標識Sph-1-Pの血漿中での代謝を検討したところ,極めて安定であることが判明した.(1)臨床検体を用いた,血漿中Sph-1-pの定量我々が以前開発したスフィンゴシン-1ーリン酸(Sph-1-P)定量法(Anal.Biochem.230:315-320,1995),つまり,^3H標識

無水酢酸によりN-アセチル化することにより(これにより、^3H標職C_2-セラミド-1ーリン酸が生成される),健常人の血漿Sph-1-Pの測定を行った.血漿中には,約190pmol/mlの濃度でSph-1-Pが存在することが判明した.患者血漿として劇症肝炎,肝硬変症例12例の測定を行ったが,健常人との比較で有意な差を認めなかった.また,人の尿・髄液・胸腹水に関しても検討を行ったが,これらではSph-1-Pは検出されなかった.大量の検体のSph-1-P測定を速やかに行えるように,^3H標織C_2-セラミド-1ーリン酸をHPLCにより解析できる系(シリカゲル-オクタデシル基充填カラムを用いた逆相分配クロマトグラフィー)を開発し,標準Sph-1-Pの測定は可能になっている.しかし,最終的な検出に用いるRlモニターの感度が悪いせいか,血漿検体で明瞭なピークが形成されていない.方法を変え,液クロ/イオンスプレーイオン化MS/MSによる検討を行った。この方法で血漿検体中のSph-1-Pのピークが検出された.^3H標識Sph,Sph-1-Pを用いた検討で,血小板は血漿のSphを積極的に取り込んでSph-1-Pへと変換して放出し,放出されたSph-1-Pは血漿中で代謝的に安定であることが判明した.
メロンつる割病レース1.2抵抗性遺伝子F1,2yのRAD-seq解析と育種利用

PI320052 ×PI364475の交雑により約600のF2分離集団の種子が得られた。このうちF2分離集団99個体について自殖を行い、F3の種子を得た。このF3系統に対するメロンつる割病レース1,2y抵抗性検定を行うことでF2のF1,2y遺伝子型を推定できる。PI320052 ×PI364475のF2分離集団におけるRAD-seq及びSNP検出については、ライブラリ調製の結果、11.4ng/Lの濃度のライブラリが得られ、これらのサンプルをシーケンスにかけたところ、合計で467,632,885本のリードが得られた。このリードを各個体のリードに分け、短いリードの除去が行われ最終的にStacksの解析に用いた。F2分離集団99個体の中で最もリード数が少ないのはF2_28の538,534本、最も多いのはF2_81の5,521,180本であった。これらのリードをdenovo_map.plにかけ個体ごとに遺伝子座の検出を行った。個体ごとの遺伝子座の平均リード数(Coverage depth)は最小のCoverage depthを示したのはF2_28の8.63、最大はF2_93の23.36であった。PI 320052及びPI 364475からは173,886個の総遺伝子座と23,929個のSNPが検出された。それらの結果をもとにgenotypesによってF2分離集団のSNP検出を行った結果、99個体中70個体以上で検出できたSNPマーカーは1,548個であった。F3系統を十分な数量得ることができた。またF2のRAD-seq解析についても進んでいる。今後、リファレンスを利用した解析を行うためにC.anguria自身の解析を検討する。C.anguriaについては過去の報告によりメロンおよびキュウリのリファレンスの利用が困難とされている。一方で、リファレンスを用いない連鎖解析は不具合が想定されることから、C. angruiaについて解析を行いリファレンスを用いた形での連鎖解析を進める。概ね計画通り執行したものの202円の端数が発生した。この残額で年度内での適正な執行は困難であることから次年度使用額が生じることとなった。202円については物品費等で2019年度と併せて使用する。
食中毒菌の産生する不快臭増強成分の探索とそれを利用した食中毒菌検出法の開発

食中毒菌が産生する固有の不快臭を用い、簡易・迅速に食中毒菌の有無を判定できる微生物検査法の確立を目的として、黄色ブドウ球菌が産生する不快臭の前駆体の探索及び本菌がその不快臭の前駆体を代謝することによって生じる臭気物質の同定・定量を行った。黄色ブドウ球菌が産生する不快臭の前駆体は、L-leucine(Leu)、L-tyrosine(Tyr)、及びL-methionine(Met)であった。前駆体により生じる臭気物質としてLeu由来のisovaleric acid、2-hydroxy-4-methypentanoic acid及びTyr由来の2-phenypropanoic acidを同定した。不快臭の前駆体は、本菌の増殖と毒素の産生には影響を及ぼさなかった。これまでに、食品に含まれる食中毒菌の高感度測定法や迅速検出法などについて報告がなされているが、それらの方法の実施は個人経営では設備的、知識的に対応困難である。そこで、本研究では、食中毒菌の産生する不快臭の前駆体の探索及びその不快臭の前駆体を利用した微生物検査法の開発を行う。本年度は、以下のことを明らかにした。1.握り飯等の食品中で黄色ブドウ球菌が増殖した場合、不快臭を生じないが、BHI培地等の培地中で培養すると不快臭を生じる。そこで、不快臭の前駆体を探索するため、各種培地成分を用いて、黄色ブドウ球菌培養時に最も強く不快臭が生じる成分を探索した。その結果、トリプトン添加培地で最も強い不快臭が生じた。2.トリプトン由来の不快臭の前駆体の精製を各種クロマトグラフィーを用いて行い、得られた物質を各種機器分析で同定した。トリプトン由来の不快臭の前駆体は、L-leucine(Leu)、L-tyrosine(Tyr)、L-methionine(Met)であり、これらを少なくとも2種類以上混合することで不快臭が生じた。生じる不快臭として、Leu由来のisovaleric acid、2-hydroxyisocaproate、Tyr由来のphenylcarboxylic acid、Met由来のmethanethiol等が関与していることが推察された。本研究は、食中毒菌が産生する固有の不快臭を用い、特別な研究設備や機器等を使用しない簡易・迅速に食中毒菌の有無を判定できる微生物検査法の確立を目的として、黄色ブドウ球菌が産生する不快臭の前駆体の探索及び本菌が不快臭の前駆体を代謝することによって生じる臭気物質の同定・定量を行った。その結果、以下のことを明らかにした。1.黄色ブドウ球菌が産生する不快臭の前駆体はL-leucine(Leu)、L-tyrosine(Tyr)、L-methionine(Met)であり、これらを少なくとも2種類以上混合することで不快臭が生じることを明らかにした。3.2H4M及び2PPAは、単独では臭気を生じない濃度であるがIAと混合することにり、IA単独時より臭気が増強され、黄色ブドウ球菌がLeu及びTyrを代謝することによって生じる臭気物質の臭気に対する相乗効果が認められた。4.不快臭の前駆体が菌の増殖と毒素の産生に及ぼす影響について調べたところ、基礎培地のみで培養した場合と、Leu及びTyrを添加したて培養した場合で、菌数も毒素産生量もほぼ変動しなかったことから、不快臭の前駆体は、菌の増殖と毒素の産生に影響を及ぼさないことが示唆された。今後、食品に対するLeu及びTyrの添加方法等の検討を行うことで、食中毒菌の有無を判定するための特別な設備を必要としない微生物検査法を確立することが可能となる。
マウス乳ガン細胞における脂質代謝の研究

1.マウス乳ガン細胞はATCCのCCL51を用いた。イーグルMEM培地(MEM)およびインシュリンを含むダルベッコ変法イーグルMEM培地(DMEM-H)で生育させた。いずれの培地で生育させてもリン脂質組成は同じであったが、個々のリン脂質の脂肪酸組成で比べるとホスファチジルコリン(PC)とホスファチジルイノシトール(P1)に培地による差が観察された。即ち、MEMで生育させた時PCとPIのアラキドン酸の割合はそれぞれ6%、26%であった。ところが、DEM-Hで生育させた場合はこれらPC、PIのアラキドン酸の割合が2%、6%と著しく減少し、逆にオレイン酸が1.52.5倍と著しく増大した。この原因としてはDMEMに添加したインシュリンによるものと考え、現在この現象の機構を解明中である。2.(1)ラットの皮膚にトコフェロールを含む大豆油やココナツ油を長期間1週間に1度の割合で注射すると、肉芽あるいはFibrosacomaが発生した。肉芽のリン脂質にはBis-monoacylglycerophosphateが含まれていることを見いだした。そして、このリン脂質には22:6が20%以上も含まれており、ホファエチジルエタノールアミン(PE)よりも著しく高かった。(2)fibrosarcomasのPC、PEの分子種組成を調べた。PCの16:0-16:0、16:0-18:0分子種は20%以上で正常な肝臓・心臓・赤血球・血小板等と比べると著しく高い割合であった。18:0-20:4分子種は14%位いで一般に知られている値よりも低かった。PEの場合はガン細胞に多いといわれているプラズマローゲン型40%以上含まれていた。ジアシル型・プラズマローゲン型の分子種組成は一般の組織の場合とにかよっていた。
ヒトの造血幹細胞抑制因子LD78の骨髄における発現と、造血及び骨代謝の制御

ヒト骨組織及び骨髄における、造血幹細胞抑制因子(Stem cell Inhibitor)であるLD78の局在を免疫組織化学的に検討したところ、骨髄特にエオジン好性骨髄球に強い染色性が認められた。骨基質には全く染色性は認められなかったが、骨芽細胞に染色性が認められた。そこでLD78遺伝子のヒト骨組織における発現をin situハイブリダイゼーション法を用いて検討した。T7及びT3プロモーターを有するプラスミドBlue-scriptに組込まれたLD78・DNAを用いて^<35>S標識RNAプローブを作成した。甲状腺機能亢進症あるいは変形性股関節症の患者より得た骨髄を含む骨片を蟻酸脱灰後パラフィンに包埋し、4μm切片を作成した。アンチセンス、センスプローブを用いハブリダイゼーションを行ないオートラジオグラフィーを行なった。結果、エオジン好性骨髄球のみならず他の骨髄細胞にも発現が認められた。骨細胞には発現は認められなかったが骨芽細胞にはLD78の発現が認められた。破骨細胞により形成された吸収窩には新たなる骨芽細胞が誘導され吸収窩を埋めて(新生骨により)いくのであるが、そのような吸収窩に誘導された骨芽細胞にも高い発現が認められた。ところで破骨細胞分化系においてLD78タンパクが破骨細胞の分化(形成)を促進する活性を有することを見出しており、LD78タンパクが、骨芽細胞による破骨細胞分化誘導因子のひとつである可能性が示唆された。また、本研究により、ヒトStem cell InhibitorであるLD78が骨芽細胞により恒常的に分泌されていることが見出され、骨組織による造血制御のひとつの局面を浮き彫りにすることができた。現在、LD78の属するケモカインファミリーの他のタンパクについても詳細な検討を行なっている。
非受容体型タンパク質チロシンキナーゼの関与するシグナル変換・伝達機構

1.Src相同領域3(SH3)は、タンパク質チロシンキナーゼ(PTK)の活性化によるシグナル伝達において、シグナル伝達・変換タンパク質の分子会合を仲介する。Fyn・PTKのSH3に結合する新しいリガンドタンパク質に対するcDNAをクローン化した。クローン化cDNAは、FynのSH3領域をプローベとして用い、マウス胎児のcDNA発現ライブラリーをスクリーニングすることにより得た。このタンパク質は、成体でも脳において重ね継ぎ変異体が発現されている。この新しいタンパク質は、FynおよびSrcのSH3と特異的に結合するプロリンの多い配列を2個有し、また同時に、新しいSH3領域、更に、SH2領域に対するリガンド構造を有していた。このタンパク質に対する特異抗体を調整し、奇型腫細胞株およびcDNAを導入。発現したCOS-7細胞からこのタンパク質を免疫沈降し、イムノブロットにより固定した。COS-7細胞でFynを共発現すると、このFynによりクローン化タンパク質はチロシンリン酸化された。2.FynのSH3領域のGST融合タンパク質を固相化したアフィニティーカラムを用い、培養jurkat細胞抽出液から、FynSH3領域に特異的に結合する70kDaのタンパク質を固定した。この70kDaタンパク質をSDS-PAGEゲルから抽出後、トリプシン消化し、得られたペプチドを逆相HPLCで分離した。各ピークのアミノ酸配列を気相シークエンサーで分析した結果、GAP結合性リン酸化タンパク質p62であることが示唆された。SH3領域はプロリンを多く含む配列に結合することが知られている。p62の配列中に複数見出されるプロリンに富む配列をそれぞれGST融合タンパク質として発現させ、一連のSH31GST融合タンパク質との結合を調べた所、p62の各配列がSH3の異なったサブセットとそれぞれ特異的に結合することが見出された。1.T細胞受容体(TCR)/CD3複合体ζ鎖およびB細胞抗原受容体Ig-α鎖のリン酸化チロシン領域を認識・結合するシグナル伝達タンパク質のクローン化。(1)^<32>P-標識ζ鎖およびIg-α鎖ペプチドプローベの調製。ζ鎖およびIg-α鎖のD/EX_2YX_2LX_7YX_2L/Iモチーフを含むペプチドを合成し、Srcファミリー・タンパク質チロシンキナーゼ(PTK)であるLckを用いてin vitroで^<32>P標識した。Lckはマウスlck cDNAをバキュロウイルス発現系によりSF9細胞で発現し、これをSepharoseに固相化した抗Lck抗体を用いて集め、このLck・抗体複合体に上記ペプチドを加え、[γ-^<32>P]ATPにより高比活性に標識した。^<32>P-標識ペプチドはHPLCにより精製した。(2)ヒトT細胞白血病株Jurkatおよびヒト脾臓のcDNAライブラリーをそれぞれ^<32>P-標識ζ鎖あるいは^<32>P-標識Ig-α鎖ペプチドプローベでスクリーニングし、それぞれ数個のクローンを得た。得られたクローンをBluescriptベクターにサブクローニングし、その塩基配列を決定した結果、未知のタンパク質をコードするcDNAであることを確認した。2.TCR/CD3複合体ζ鎖とSrcファミリーPTK、Fyn、との会合。ζ鎖とFynおよびLckをバキュロウイルス発現系を用いてSF9細胞で発現し、ζ鎖とFynおよびLckとの直接結合の可能性を検討した。FynやLckのSF9細胞における発現に伴い、これらのPTKの自己リン酸化とSF9細胞内タンパク質のリン酸化昂進が見られ、産生PTKの少なくとも一部が活性型になっていることが示された。FynまたはLckとζ鎖との同時発現を行ったところ、ζ鎖のリン酸化とそれに伴うSDS-PAGE

上での電気泳動移動度の変化が観察された。Fynはチロシン残基リン酸化ζ鎖にそのSH2領域で会合した。この会合はLckではFynに比べ弱い。炭酸ガスインキュベーターは、Sf9細胞の培養に使用した。本年度は、タンパク質チロシンキナーゼの活性化によるシグナル伝達において、シグナル伝達・変換タンパク質の分子会合を仲介するSrc相同領域3(SH3)の新しいリガンドタンパク質をクローン化した。この目的のために、シグナル伝達タンパク質Src、Fyn、Lck、Vav、PLCgamma2およびPI3'-Kinase p85の各々に存在するSH3領域cDNAをPCR法で調製し、pGEXベクターに組み込みGST融合タンパク質を得た。このSH3領域とGSTとの融合タンパク質をビオチン化し、SH3領域結合タンパク質をcDNAライブラリーでスクリーニングする際のプローベとして用いた。スクリーニングには、マウス胎児cDNAのlambdaEXloxライブラリーを用いた。現在までのスクリーニングにより、FynのSH3に結合するクローンを1個得た。このクローンが発現するタンパク質は、FynのSH3と特異的に結合する371個のアミノ酸から成っていた。その構造中には、プロリンの多いSH3結合部位と思われる配列が2ケ所に存在した。現在このクローンの5′側を含めた全塩基配列の決定と特異坑体の調製を行っている。T細胞受容体/CD3複合体のチロシンリン酸化zeta鎖およびepsilon鎖に結合するタンパク質のクローン化は、昨年度から継続して研究している。zeta鎖およびepsilon鎖にあるダブルチロシンモチーフの2個のチロシンを共にリン酸化することが重要と考え、十分量のATPを基質として用いリン酸化反応を行い、これをビオチン標識してプローベとした。これを用いて、上記cDNAライブラリーをスクリーニングした所、陽性クローンを得ることが出来た。
データ科学を援用した高出力オールプラスチック二次電池の創出

フィルム状の樹脂に電気を貯める"オールプラスチック二次電池"の実現を目的として、高分子固体条件で優れた電子・イオン輸送、酸化還元能を有する新規ポリマーの設計と精密合成を検討する。深層学習の手法も駆使して、従来報告されてきた化合物群の統計情報から上記機能を完備可能な最適設計を抽出するとともに、迅速な設計・合成・評価サイクルの確立を図る。
機能性材料のモデルとしての血管平滑筋細胞の力学特性計測に関する研究

血管平滑筋細胞は収縮・弛緩により血管径を変化させるほか,コラーゲンなど細胞外基質を産生して壁を能動的に作り変えている.その収縮特性や物質産生は加えられる力学刺激に応じて変化し,例えば能動収縮を繰返すと収縮速度が上昇し,収縮状態で放置すると消費エネルギが減少するなど,アクチュエータとしても興味深い特徴を有する.そこで本研究では胸大動脈平滑筋細胞の力学特性,収縮特性を単一細胞レベルで詳細に調べ,力学的刺激との関連を明らかにすることを目的として,3年間に亙る研究を進めてきた.初年度には,正常血圧に比べてと高血圧のラット胸大動脈から得られた平滑筋細胞の弾性率が半分程度であること,次年度は正常家兎の血管平滑筋細胞は弛緩状態に比べて収縮状態ではその初期弾性率は10倍近く上昇していることなどを見出した.最終年度には細胞の力学特性に大きな影響を与えると予想されるアクチンフィラメントを染色し,その量と力学特性の関係を調べた.まず,正常血圧ラット胸大動脈より単離した直後の平滑筋細胞(FSMC)およびこれを継代培養した49代目の細胞(CSMC)を対象とし,それぞれを細胞用引張試験機で引張試験して力学特性を求めた.また,ローダミン・ファロイジンでアクチンフィラメントの構成成分であるFアクチンを蛍光染色し,両者のフィラメント量の違いを調べた.初期弾性率は,FSMCで11kPa程度(n=8)であったのに対し,CSMCでは2.6kPa程度(n=10)であった.FSMCではFアクチンが細胞全体に強く染色され,個々のフィラメントは識別不可能であったのに対し,培養細胞ではストレスファイバーが明瞭に識別され,明らかにアクチンフィラメント量は低下していた.このようなアクチンフィラメント量の違いが力学特性に差をもたらしたものと考えられる.今後は,細胞骨格が単離平滑筋細胞の力学特性に与える影響を定量的に計測する必要がある.血管平滑筋細胞は収縮・弛緩により血管径を変化させるほか,コラーゲンなど細胞外基質を産生して壁を能動的に作り変えている.その収縮特性や物質産生は加えられる力学刺激に応じて変化し,例えば能動収縮を繰返すと収縮速度が上昇し,収縮状態で放置すると消費エネルギが減少するなど,アクチュエータとしても興味深い特徴を有する.そこで本研究では胸大動脈平滑筋細胞の力学特性,収縮特性を単一細胞レベルで詳細に調べ,力学的刺激との関連を明らかにすることを目的として,3年間に亙る研究を進めてきた.初年度には,正常血圧に比べてと高血圧のラット胸大動脈から得られた平滑筋細胞の弾性率が半分程度であること,次年度は正常家兎の血管平滑筋細胞は弛緩状態に比べて収縮状態ではその初期弾性率は10倍近く上昇していることなどを見出した.最終年度には細胞の力学特性に大きな影響を与えると予想されるアクチンフィラメントを染色し,その量と力学特性の関係を調べた.まず,正常血圧ラット胸大動脈より単離した直後の平滑筋細胞(FSMC)およびこれを継代培養した49代目の細胞(CSMC)を対象とし,それぞれを細胞用引張試験機で引張試験して力学特性を求めた.また,ローダミン・ファロイジンでアクチンフィラメントの構成成分であるFアクチンを蛍光染色し,両者のフィラメント量の違いを調べた.初期弾性率は,FSMCで11kPa程度(n=8)であったのに対し,CSMCでは2.6kPa程度(n=10)であった.FSMCではFアクチンが細胞全体に強く染色され,個々のフィラメントは識別不可能であったのに対し,培養細胞ではストレスファイバーが明瞭に識別され,明らかにアクチンフィラメント量は低下していた.このようなアクチンフィラメント量の違いが力学特性に差をもたらしたものと考えられる.今後は,細胞骨格が単離平滑筋細胞の力学特性に与える影響を定量的に計測する必要がある.血管壁の主要構成要素である平滑筋細胞は種々の刺激に応じて収縮・弛緩し血管径を変化させるほか、コラーゲンなど様々な物質を産生して血管壁を能動的に作り変えている。その収縮特性や物質産生は加えられる力学刺激に応じて変化し、例えば慢性的な繰返し引張により物質産生が増加するほか、収縮を繰返すと収縮速度が上昇し、収縮状態で放置すると消費エネルギーが減少するなど、能動的アクチュエータとしても興味深い特徴を有する。そこで本研究ではラット胸大動脈平滑筋細胞の力学特性、収縮特性を単一細胞レベルで詳細に調べ、力学的刺激との関連を明らかにすることを目的とした。研究初年度である本年度は、正常血圧および腎性高血ラット胸大動脈から得られた平滑筋細胞を弛緩状態で引張試験し、両者の力学特性を比較した。胸大動脈より酸素法にて平滑筋細胞を単離した後、最近、我々が開発した単離細胞用引張試験機にてその引張特性を計測した。即ち、細胞両端を細胞接着剤Cell-Takでコートしたガラスマイクロピペット(内径315μm)で吸引・固定し、一端のピペットを移動させつつ細胞の形状変化を計測した。細胞の長軸長は両群間で有意差はなかったが、短軸長は高血圧群の方が正常血圧群よりも有意に太かった。細胞の初期弾性率は正常血圧群、高血圧群でそれぞれ10.2±1.7kPa(n=5)、4.3±0.5kPa(n=6)であり、高血圧群の方が正常血圧群に比べて有意(P<0.05)に小さかった。

高血圧に曝されることにより、血管平滑筋は物質合成能が亢進し、これにより細胞内の収縮要素であるアクチンフィラメントが減少すると予想される。細胞内の生合成に関与するゴルジ体や粗面小胞体は膜主体の構造であり、線維主体のアクチンフィラメントに比べて剛性が低いと考えられる。高血圧ラットより得られた細胞の軟化はこのような線維性成分の減少により生じたと考えられた。血管壁の主要構成要素である平滑筋細胞は種々の刺激に応じて収縮・弛緩し血管径を変化させるほか,コラーゲンなど様々な物質を産生して血管壁を能動的に作り変えている.その収縮特性や物質産生は加えられる力学刺激に応じて変化し,例えば慢性的な繰返し引張により物質産生が増加するほか,収縮を繰返すと収縮速度が上昇し,収縮状態で放置すると消費エネルギーが減少するなど,能動的アクチュエータとして興味深い特徴を有する.そこで本研究ではラット胸大動脈平滑筋細胞の力学特性,収縮特性を単一細胞レベルで詳細に調べ,力学的刺激との関連を明らかにすることを目的として,3年間に亙る研究を進めている.初年度は,正常血圧と高血圧のラット胸大動脈から得られた平滑筋細胞の弛緩状態における引張特性を計測し,高血圧ラットより得られた細胞が柔らかくなっていることを見出した.研究2年目の本年度は,弛緩状態と収縮状態の平滑筋細胞の力学特性の違いを計測した.即ち,正常血圧ラット胸大動脈をコラゲナーゼおよびエラスターゼで分解することにより平滑筋細胞を単離し,これを自作の細胞用引張試験機に取付け,引張試験した.試験の際の細胞把持方法をマイクロピペットで吸着し把持する方法から,接着剤としてウレタン樹脂を塗布したマイクロロッドに接着させる方式に改良し,実験操作の簡便化を図った.弛緩状態の平滑筋細胞の初期弾性率は16kPa程度であったのに対し,10^<-5>Mのセロトニンで収縮させた平滑筋細胞の初期弾性率は156kPaと遥かに硬い結果が得られた.一方,血管壁全体の弾性率は0mmHg付近ではセロトニンによる収縮によって1.3倍程度しか増加せず,血管壁全体の力学特性の変化と細胞の力学特性の変化の間には極めて大きな隔たりがあることが明らかとなった.血管平滑筋細胞は,収縮・弛緩により血管径を変化させるほか,コラーゲンなど細胞外基質を産生して壁を能動的に作り変えている.その収縮特性や物質産生は加えられる力学刺激に応じて変化し,例えば能動収縮を繰返すと収縮速度が上昇し,収縮状態で放置すると消費エネルギが減少するなど,アクチュエータとしても興味深い特徴を有する.そこで本研究ではラット胸大動脈平滑筋細胞の力学特性,収縮特性を単一細胞レベルで詳細に調べ,力学的刺激との関連を明らかにすることを目的として,3年間に亙る研究を進めてきた.これまで,正常血圧に比べてと高血圧のラット胸大動脈から得られた平滑筋細胞の弾性率が半分程度であること,正常血圧ラットの血管平滑筋細胞は弛緩状態に比べて収縮状態ではその初期弾性率は10倍近く上昇していることなどを見出した.最終年度である今年度は細胞の力学特性に大きな影響を与えると予想されるアクチンフィラメントを染色し,その量と力学特性の関係を調べた.まず,正常血圧ラット胸大動脈より単離した直後の平滑筋細胞(FSMC)およびこれを継代培養した49代目の細胞(CSMC)を対象とし,それぞれを細胞用引張試験機で引張試験して力学特性を求めた.また,ローダミン・ファロイジンでアクチンフィラメントの構成成分であるFアクチンを蛍光染色し,両者のフィラメント量の違いを調べた.
コポリマー中へのコモノマーの溶解度および拡散係数の測定及び推算

ポリエチレンを主体としたコポリマーに関して、その製造条件やプロセス制御の上で非常に重要である、コモノマーの溶解度と拡散係数を以下の系について測定した。溶融状態における溶解度については、本研究で用いたポリマーでは温度・圧力と溶質が同じであればどのポリマーにおいても全て同じ溶解度を示した。この事からコモノマー含量が20mol%程度の範囲では溶質の溶解度には影響を及ぼさないことが明らかになった。溶融状態における拡散係数に関しては、溶解度と同様に温度・圧力と溶質さえ同じであればポリマーによらずほぼ同程度の拡散係数を示した。ただし、HDPEのみ約40%程度低い値となった。これは、用いたHDPEのみ分子量が他と比較して高く、溶融粘度の違いが影響したものと思われる。また、融点以下の温度では各コポリマーの結晶性の違いを反映し、溶解度は各コポリマーにより大きく異なる結果が得られた。そこで本研究では溶融状態で得られた溶解度を用いて融点以下ので溶解度を推算し、この値を用いて結晶化度を算出した。この結果、結晶性の高いHDPEでは溶質の溶解により結晶化度が上昇し、結晶性の低い他のポリマーでは溶質の溶解により結晶化度が低下していることが明らかになった。コポリマー成分である1-ヘキセンの組成の異なる2種のLinear low density polyethylene(LLDPE)中のエチレンの溶解度と拡散係数の測定を、LLDPEがゴム状態である温度60°C,80°Cと溶融状態である130°C,160°Cにおいて圧力3.5MPaまでの範囲において測定を行った。LLDPE中のエチレンに溶解度はほぼ圧力に対して直線的に増加し、またコポリマー組成の違いによる影響は、溶融状態においては見られなかったが、ゴム状態においては大きな溶解度の差が観察された。これはコポリマー組成が異なるため、結晶化度が異なることに起因するものと考えられた。そこで各温度においてLLDPE中のエチレンのHenry定数を決定し、溶融状態のHenry定数をゴム状態に外挿した値とゴム状態におけるHenry定数の差より結晶化度を決定した。本研究で得られた結晶化度は融点に近い60°C,80°Cでは温度により変化しており、また室温下ではX線回折による測定値とよく一致した。本研究で得られた結晶化度を用い、ポリマー中の非晶質部のみにエチレンが溶解すると仮定して溶解度を整理すると、両LLDPE中へのエチレンの溶解度は良好に一致した。両LLDPE中のエチレンの拡散係数は、圧力に対して直線的に増加した。LLDPEの溶融状態において拡散係数はほぼ一致したが、ゴム状態においては大きな偏差がみられた。これは、アモルファス中に含まれる結晶の影響によりエチレンの拡散が妨げられるため、結晶化度の違いにより拡散係数の値に差が生じたものと推定される。