hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
胚性幹細胞を用いた効率的なトランスジェニックニワトリの作成技術の確立

由来の細胞塊は、アルカリホスファターゼもESCマーカーも共に陰性を示した。キンカチョウとニワトリでこのように結果が異なるのは、産卵時の成長度合いが違うためだと考えられる。我々は当初の予定通り、キンカチョウES細胞培養法を確立した。鳥類に哺乳動物ES細胞の培養法(2iおよび3i培養)が適用できることを、キンカチョウを用いて証明したのである。これは哺乳類以外の動物を用いて胚性幹細胞の研究を行う重要な手がかりとなる。キンカチョウを発生生物学研究に用いた前歴がないため、多数の有精卵を得るためには最適な飼育方法を考案する必要があった。また、ニワトリとの発生ステージに差があることから、キンカチョウの胚盤葉を培養するには独自の新しい培養条件をつくる必要があった。このため当初の計画よりもやや遅れているが、ようやくキンカチョウの細胞培養ができるようになり、今後は早く結果が出せる予定である。24年度が最終年度であるため、記入しない。1.キンカチョウ胚盤葉の特質に関する論文を投稿する。(現在執筆中。)2.鳥類ES細胞様の細胞培養条件の最適化を続ける。(細胞を維持するために必要な因子を見つける。)3.ES細胞マーカーの発現を確定することによって鳥類ES細胞様の細胞を特性化する。4.これらの細胞について遺伝子導入の可能性を探り、ウイルスを用いない鳥類キメラを作成する。
神経筋接合部はレジスタンストレーニング後の筋力増強率決定因子か？

本研究の目的は、レジスタンストレーニングの負荷強度の違いが神経筋接合部(NMJ)に及ぼす影響について検討し、NMJの適応の程度が筋力の規定要因なのか明らかにすることである。さらに、分子レベルでの検討も行い、レジスタンストレーニングがNMJに影響を及ぼす機序についても明らかにする。これまでは筋サイズをどの程度増大させるか、ということがレジスタンストレーニングの主たる評価項目であったが、本研究の成果は、その評価項目にNMJの適応度という新たな指標を加えるきっかけとなりうる。本年度は、一過性の高強度レジスタンス運動後にサンプル採取を行い、NMJ形成に関連する分子シグナル応答の検討を行った。11週齢のSprague-Dawley系雄ラットを対象に、麻酔下において右後肢腓腹筋に対する経皮的電気刺激を与え、等尺性最大筋収縮を行った。筋収縮直後、1、3、6、24時間後にサンプル採取を行った(各n=5)。現在、NMJ形成に関連するシグナル伝達応答について、ウエスタンブロッティング法を用いて分析中である。筋肥大を惹起する運動に対するNMJの適応について、これまでに統一した見解は得られていない。一過性レジスタンス運動後のNMJ関連シグナル伝達応答について明らかにすることは、基礎的知見の提供という点から、運動に対するNMJ適応の解明に貢献できる。さらに分子シグナル応答の解明は、ヒトを対象とした応用的研究を行う際にも重要となる。当初、針筋電による神経を介した電気刺激を計画していたが、予想した結果が得られず、実験準備に多大な時間を要してしまったため。計画上は実験1として長期トレーニング実験を行う予定であったが、実験準備に時間を要してしまったため、計画を変更し、まず一過性運動後のシグナル伝達応答について明らかにする。その後、長期的応答について明らかにしていく予定である。計画よりも進行が遅れているため、研究費使用が少なかった。来年度は、今年度実施できなかった内容も行うため、使用額が大きくなる予定である。
エチゼンクラゲ由来降圧活性ペプチドの起源タンパク質の探索とその体内動態

分子・細胞で起こるダイナミックな現象を高解像で直接可視化できる高速原子間力顕微鏡を世界に先駆けて完成させた。その結果、いくつかの機能中のタンパク質分子の動的構造変化や動的分子プロセス、生きた細胞で起こる動的現象を撮影することに成功し、この新規顕微鏡の有効性、革新性を実証した。クラゲの主要タンパク質はグリシンの繰り返し〔Gly-X-Y〕_n構造を持ったコラーゲンであるが、Morinagaらが発見した降圧活性ペプチドYYAPFEはグリシンを有しておらず、そのペプチドの由来がコラーゲンなのか非コラーゲンタンパク質なのかを明らかにするために検討した。まず、エチゼンクラゲより三浦らの方法で非コラーゲンタンパク質を調製し、さらにそれをペプシン処理することによって生成するペプチドについて、そのACE阻害活性およびアミノ酸組成を、YYAPFEの精製の中間物質と比較した。非コラーゲンタンパク質を高濃度ペプチド溶液調製と同じ条件でペプシン処理し、ACE阻害活性を有するペプチド溶液が得られるか検討したところ、ACE阻害活性(IC_<50>)は、ペプシン処理した非コラーゲンタンパク質で、2.54mg/mlと、20%ペプチド溶液をSep-Pakで分画した40%CH3CN画分の2.50mg/mlとほぼ同値であった。次に、ACE阻害活性を有する3つのペプチドのアミノ酸組成を比較検討した。非コラーゲンタンパク質をペプシン処理した試料は40%CH_3CN画分のアミノ酸組成とほぼ一致した。これに対して、出発物質の粉末クラゲの37°Cペプシン処理試料はグリシンが3割含まれており、またコラーゲンに特有のヒスチジルプロリンとヒスチジルリシンが含まれ、粉末クラゲはコラーゲンが主要タンパク質と考えられた。しかし、40%CH_3CN画分の収率は6.6%であり、Sep-Pakで粗分画した40%CH_3CN画分にエチゼンクラゲの非コラーゲンタンパク質が分画されたものと考えられた。以上、これまでの結果を総合すると、この40%CH_3CN画分から得られたYYAPFEはエチゼンクラゲの非コラーゲンタンパク質から、得られたのではないかと考えられた。研究代表者がエチゼンクラゲから発見した降圧活性を有するペプチドYYAPFEはクラゲの主要タンパク質であるコラーゲンのグリシン繰り返し〔Gly-X-Y〕_n構造を持たず、その由来タンパク質は非コラーゲンタンパク質と推測された。そこで、遺伝子の配列による由来タンパク質の検証を行おうとしたが、ペプチドYYAPFEが短鎖ペプチドであったためプライマーの設計およびクローニングが困難であった。そこで、YYAPFE構造を含み、より長鎖の非コラーゲンタンパク質由来のペプチドの探索を行った。YYAPFEはドラムドライヤー法により熱変性したエチゼンクラゲから見出されたが、熱変性しているため短鎖ペプチドになった可能性が考えられたため、生のエチゼンクラゲより三浦らの方法で非コラーゲンタンパク質を抽出した。この酢酸可溶のコラーゲを硫安-リン酸緩衝液で抽出し、硫安可溶物質と硫安不溶物質に分画した。また、YYAPFEは37°Cの条件でペプシン処理したため、短鎖ペプチドが得られた可能性が考えられたため、本研究ではこの硫安不溶物質を低温でペプシン処理した。硫安不溶タンパク質およびペプシン処理した硫安不溶タンパク質を20%SDS-PAGEで比較するとペプシン処理により低分子化したこと示された。さらに、生成したペプチドのアミノ酸組成をYYAPFEの精製の中間物質と比較した結果、本研究で得られた硫安不溶タンパク質のアミノ酸組成が、活性ペプチドYYAPFEの粗分画のアミノ酸組成に非常に類似していた。この結果より、この新規タンパク質から活性ペプチドYYAPFEを含む長鎖の非コラーゲンタンパク質由来のペプチドが得られるのではないかと考えた。研究代表者がエチゼンクラゲから発見した降圧活性を有するペプチドYYAPFEはクラゲの主要タンパク質であるコラーゲンのグリシン繰り返し〔Gly-X-Y〕n構造を持たず、その由来タンパク質は非コラーゲンタンパク質と推測された。この酢酸可溶のコラーゲンを硫安ーリン酸緩衝液で抽出し、硫安可溶物質と硫安不溶物質に分画した。

この結果より、この新規タンパク質から活性ペプチドYYAPFEを含む長鎖の非コラーゲンタンパク質由来のペプチドが得られるのではないかと考え、新規タンパク質のペプシン消化物をHPLCにより分画し、ペプチドを得た後、アミノ酸配列を決定した。その結果、NKPLAGSPAASELYTEAGGの配列の長鎖ペプチドであることが分かった。しかし、このペプチドにACE阻害活性は見られなかった。ペプチドYYAPFEが短鎖ペプチドであったためプライマーの設計およびクローニングが困難であり、より長鎖のペプチドの探索を行ったため。24年度が最終年度であるため、記入しない。生のエチゼンクラゲから得られた非コラーゲンタンパク質由来の新規硫安不溶タンパク質をペプシン処理し、得られたペプチドの分離精製を行い、長鎖のペプチドの配列を決定し、プライマーの設計およびクローニングを行う。
イヌリン分解酵素の遺伝子解析とオリゴ糖生産への応用

1.黒麹菌AspergillusnigerNo.12株はそのゲノム上に重複したエンド型イヌリナーゼ遺伝子inuAとinuBを保有する。イヌリン、フルクトース、またはグルコースを炭素源として本菌株を液体培養後、それぞれの菌体がら調製したポリ(A)+RNAの逆転写反応とそれに続くPCRで、本酵素をコードするcDNAを増幅した。いずれの炭素源で増殖した菌体から調製したcDNAもinuBに特異的なプローブとのみハイブリダイズし、inuA由来のcDNAは検出されなかった。inuB遺伝子の上流に4ケ所の転写開始点、翻訳開始コドンの116 bp上流にTATAボックス(TATATA)が認められた。inuB転写産物のポリ(A)付加部位は、翻訳終止コドンの94297bp下流に多数存在した。2.A.niger No.12株が生産する細胞外エンド型イヌリナーゼをブロムアセチル・セルロース(BAC)、セルロース・カーボネート(CC)およびCNBr一活性化セフアロース4B(CAS)に共有結合により固定化した。固定化酵素は重金属や阻害剤に対して抵抗性を増大した。CAS固定化酵素は、イヌリン分解の最適温度が45°Cから60°Cに上昇した。PH安定領域はBAC固定化酵素はアルカリ側に、CC固定化酵素は酸性側に移動した。Km値はBAC固定化酵素では低下し、CAS固定化酵素では上昇した。3.Penicillium sp.TN一88株由来エンド型イヌリナーゼ遣伝子(inuC)の0RF(1,545bp)は介在配列を含まず、N末端のアミノ酸25残基からなるシグナルペプチドと490残基の成熟酵素をコードした。成熟酵素には、3個のシステイン残基、10ケ所のN-グリコシル化部位が存在した。inuC遺伝子の推定アミノ酸配列はA.nigerとPenicillium purpurogenum起源の同酵素とそれぞれ72%と85%の相同性を示した。分子系統樹は,糸状菌エンド型イヌリナーゼは細菌レバナーゼに近縁であることを示した。1.エンド型イヌリナーゼはイヌリン内部のβ-2,1-フルクトフラノシド結合を切断し、イヌロオリゴ糖を生成する.昨年度、黒麹菌Aspergillus niger No.12株のゲノムDNAから2つの重複したエンド型イヌリナーゼ遺伝子inuAおよびinuBをそれぞれEcoRI断片としてクローニングし、構造解析を行った.これらの1,548bpのORFを含む断片にはいずれも約45bpの短い上流領域が存在するのみであった。今年度は、それぞれの遺伝子の上流領域のクローニングと構造解析を行った。制限酵素PstIで切断したゲノムDNAのライブラリー(pUC18)を作成した.本遺伝子に特異的なプローブを用いてコロニー・ハイブリダイゼーションを行い、inuA上流領域を含む断片1.8kbpと、inuB上流領域を含む断片1.6kbpをそれぞれインサートに持つクローンを得た.これらのシークエンスを解析した結果、inuA上流領域にはTATA boxならびにCCAAT boxに相当する配列が確認されたが、inuB上流領域にはCCAAT boxは認められなかった.また、本菌株の培養においてinuAおよびinuBのどちらの遺伝子が発現しているかについてRNAを単離して検討した.

2.エンド型イヌリナーゼ遺伝子をコードする遺伝子を新たに青カビの一種Penicillium sp.TN-88株のゲノムDNAから単離し、そのシークエンスを解析した。本酵素のN末端アミノ酸配列等を基に合成した2種のオリゴヌクレオチド(24mer)をプライマーとしてPCRでエンド型イヌリナーゼ遺伝子の一部(621bp)を増幅した.このPCR産物をジゴキシゲニンで標識し、本酵素遺伝子に特異的なプローブとした.種々の制限酵素で切断したゲノムDNAについてサザン・ハイブリダイゼーションを行った結果、3.0 kbp BamHI、7.0 kbp KpnIおよび8.0 kbp XbaI断片とそれぞれハイブリダイズした.このことはエンド型イヌリナーゼ遺伝子が本菌株のゲノムDNA上に1コピー存在するとを示唆した.ゲノムDNAライブリー(pUCl8)から本遺伝子を単離し、そのシークエンスを他の糸状菌起源の同遺伝子と比較した。1.黒麹菌Aspergillus nigerNo.12株はそのゲノム上に重複したエンド型イヌリナーゼ遺伝子inuAとinuBを保有する。inuAとinuBに特異的なDNAプローブを両遺伝子間でホモロジーが認められないそれぞれの3'非コード領域を基に作成した。イヌリン、フルクトース、またはグルコースを炭素とする本菌株の液体培養後の菌体からそれぞれポリ(A)+RNAを調製した。各RNAから逆転写反応とそれに続くPCRで、本酵素をコードするcDNAを増幅した。いずれの炭素源で増殖した菌体から調製したcDNAもinuBに特異的なプローブとのみハイブリダイズし、inuA由来のcDNAは検出されなかった。本菌株のゲノムDNAから両遺伝子のプロモータ領域をクローニングし、塩基配列を決定した。inuB遺伝子の上流に4ヶ所の転写開始点、翻訳開始コドンの116bp上流にTATAボックス(TATATA)が認められた。inuB転写産物のポリ(A)付加部位は、翻訳終止コドンの94297bp下流に多数存在した。2.A nigerNo.12株が生産する細胞外エンド型イヌリナーゼをブロムアセチル・セルロース、セルロース・カーボネートおよびCNBr-活性化セフアロース4Bに共有結合により固定化した。固定化反応の最適条件において、それぞれ11.3、24.1、19.3%の活性収率が得られた。いずれの固定化酵素においても重金属や阻害剤に対して抵抗性を増大した。特に、CNBr-活性化セフアロース4Bに固定化した場合、イヌリン分解の最適温度が45°Cから60°Cに上昇した。PH安彦領域はブロムアセチル・セルロースに固定化した場合にはアルカリ側に、セルロース・カーボネートに固定化した場合には酸性側に移動した。Km値はブロムアセチル・セルロースに固定化した場合では低下し、CNBr-活性化セフアロース4Bに固定化した場合では上昇した。
老人性難聴関連遺伝子の解明と蝸牛局所療法の開発

加齢モデル動物としてC57B6マウスを用いて、その1・3・6ヶ月における聴性脳幹反応(ABR)での聴覚閾値を測定した(4kHz,8kHz,16kHz)。動物間でのばらつきが見られたものの平均聴覚閾値は1ヶ月で各約30dBであった。3ヶ月ではそれぞれ約510dBの閾値上昇を、6ヶ月では約20dBの閾値上昇を認めた。加齢モデルマウスと若年モデルマウス間の、蝸牛、蝸牛神経核および下丘における遺伝子発現および消失の加齢性変化をcDNAマイクロアレイ法にて比較検討した。蝸牛においては安定したtotal RNAの抽出は困難で蝸牛神経核と下丘で加齢モデルと若年モデルとの比較をおこなった。蝸牛神経核においてEcm1,Polk,Clps,Pkc-_,Mbtd1,とCacna1aが、下丘においてはGrin,Sftpc,Gsn,4930429B21Rik,2410004N11Rik,Stag1,and Vamp2が加齢モデルにおいて若年モデルと比較してdown-regulateしていた。また、加齢モデルにおいて若年モデルと比較しUp-regulateしている遺伝子としては、蝸牛神経核においてBhlhb3,Ctss,Calb1,Gatm,Phyhが、下丘においてYwhaz,Bmp4,Stam,Mcm2,Gatm,Taf1bが検出された。real time PCRを行ったところ、サイクルの閾値においてマイクロアレイによる結果とほぼ一致する結果を得た。またPKC-εの蝸牛神経核における発現をin situ hybridization法にて確認した。内耳局所療法のためのドラッグデリバリーシステム開発のため、内耳局所投与時の濃度について浸透圧ポンプとマイクロカテーテルを用いて、モルモット内耳における局所薬物濃度を検討した。外リンパ腔に直接薬剤を投与(デキサメサゾン)し、濃度動態をラジオイムノアッセー法にて測定した。浸透圧ポンプを用いた群では基底回転からの外リンパ液と頂回転からの外リンパ液との濃度は差が無く、投与13日目の基底回転にて平均25.66μg/dlであった。マイクロカテーテルを用いた群では30-40ng/dlと低濃度に希釈されていた。またマウスを用い浸透圧ポンプを使って内耳局所投与モデルを検討した。半規管にカテーテルを挿入してカナマイシンを持続投与した。投与後蝸牛および前庭有毛細胞の消失と聴性脳幹反応での閾値変化および平衡機能を観察し、有毛細胞消失と聴覚および前庭機能障害を認め、マウス内耳への薬剤局所投与に成功した。C57B6

マウスを用いてその1・3・6ヶ月において聴性脳幹反応(ABR)を用いて聴覚閾値を測定した(4kHz、8kHz、16kHz)。動物間でのばらつきが見られたものの各4匹ずつの平均聴覚閾値は1ヶ月で4kHz:29.5dB、8kHz:32.5dB、16kHz:36dBであった。3ヶ月ではそれぞれ平均32.8dB、34dB、38.3dBで、6ヶ月のマウスは検討中である。なお中耳炎を併発しているものは除外した。また各月齢のマウスのsurface preparationによる蝸牛有毛細胞の観察と蝸牛軸での切片作成による蝸牛らせん神経節細胞の観察を行った。6ヶ月のマウスにおける蝸牛有毛細胞およびらせん神経節細胞については若干の変性が見られたが、量的比較のためにマウスの蝸牛有毛細胞およびらせん神経節細胞のカウント方法について検討中である(正常マウスでの平均有毛細胞数をデータ化およびらせん神経節細胞では細胞密度の算定)。C57B6マウスを1・3・6ヶ月それぞれの月齢で蝸牛および脳幹を採取し、感覚上皮細胞を含む部分と蝸牛らせん神経節を含む蝸牛軸と中心とした部分、血管条を含む部分および蝸牛神経核に分けTotal RNAを抽出した。Total RNAの品質チェックのためにアジレント2100バイオアナライザを用いて純度を測定した。平均して高純度で各グループ間の再現性あるTotal RNAを得るため、処理過程でのプロトコールの検討を行っている。浸透圧ポンプとマイクロカテーテルを用いて、外リンパ腔に直接薬剤を投与(デキサメサゾン)を投与し、濃度動態をラジオイムノアッセー法にて測定した。浸透圧ポンプを用いた系では基底回転からの外リンパ液と頂回転からの外リンパ液との濃度は差が無く、約300倍に希釈されていた。マイクロカテーテルを用いた系ではより低濃度に希釈されている傾向にあり、両者の比較検討中である。加齢モデルマウスと若年モデルマウス間の、蝸牛神経核および下丘における遺伝子発現および消失の加齢性変化をcDNAマイクロアレイ法にて比較検討した。マイクロアレイ法の前段階としてRNA抽出する際、3プロトコールを比較し、Quiashredder併用のRneasy法により品質の高いRNA抽出を行うことができた。品質の評価についてはAgilent 2100バイオアナライザーを用いた。加齢モデルと若年モデルとの比較では、60以上の遺伝子発現の差異が認められ、データの再現性と各遺伝子の役割について検討中である。浸透圧ポンプを用いた場合の内耳局所投与時の濃度については、外リンパへ薬剤を投与し(経正円窓および直接投与)、薬剤の外リンパにおける濃度動態をラジオイムノアッセー法にて測定した。外リンパにおける濃度は約300倍に希釈されていた。内耳局所療法の前段階として、三環系抗うつ剤であるAmitriptylineを騒音暴露前のモルモットに全身投与しその効果を検討した。モルモットをAmitriptyline投与群と非投与群にわけ、投与後騒音暴露(4kHz、octave band noise、120dB、24時間)を行い、暴露前後の聴力閾値変化をABRを用いて確認した。結果として、Amitriptyline投与群で閾値変化が少なく、Amitriptylineの音響外傷に対する保護作用を示唆するものであった。その後行った内耳有毛細胞の消失率の測定からもAmitriptylineの保護作用を示唆する結果が得られた。現在はその作用機序につき検討中であるが、Amitriptylineの薬理作用から、GDNF産生とNMDA受容体遮断作用の両面で検討中である。
在宅や施設の高齢者ケアにおける非侵襲的ヘモグロビン濃度測定の臨床有用性

高齢者の貧血は要介護リスク要因であり、フレイル状態の高齢者の早期発見が重要である。本研究は高齢者に貧血の症状を疑った時、フィジカルアセスメントツールのひとつとして携帯型医療機器を用いた非侵襲的ヘモグロビン濃度の測定が在宅や施設の高齢者ケアのどのようなケア場面に有用であるのかを検討する。介護士が多く看護師が少ない介護老人保健施設をはじめ、在宅など高齢者ケアの場は多岐にわたる。ケア提供者が観察した情報について痛みを伴わず、簡便な方法でヘモグロビン値をみえる化し、継続的に評価する。高齢者ケアに携わる誰もが高齢者の貧血に対して根拠に基づく安全なケアの提供をめざす臨床研究である。
心臓交感神経ブロックが^<123>I-MIBG心筋像及び心拍変動に及ぼす影響

心疾患を有しない患者(頚椎症、頚肩腕症候群など)を対象とし、上部胸椎(T5/6間)からレントゲン透視下で硬膜外カテーテルを頭側に5cm進め造影剤+2%リドカイン3mlを注入し両側T1からT6までの広がりを確認し温覚消失範囲も両側T1からT6以上であることを確認し、心臓交感神経ブロックが確実に行われていることを確認した。翌日、2%リドカイン6mlを硬膜外注入しその後2%リドカイン6ml/hで持続硬膜外注入し、^<123>I-MIBGを静脈内投与しearly phaseとdelay phaseにおいて撮像を行った。後日、^<123>I-MIBG単独の撮像を行い胸部硬膜外ブロック時と比較検討した。結果はearly phaseとdelay phaseともに心臓交感神経ブロック時でも^<123>I-MIBGカウントは低下せずやや増加する傾向を認めた。washout ratioは一定の傾向を示さなかった。心拍数は硬膜外ブロック時には低下したが、血圧は低下傾向を示したが上昇する場合もあった。心拍変動は交感神経活性が抑制され、副交感神経活性が上昇する傾向があった。血清カテコールアミン値(アドレナリン、ノルアドレナリン)はともに低下傾向を認めた。以上の結果から、ヒトにおける心臓交感神経ブロック(胸部硬膜外ブロック)時には心筋の交感神経終末における^<123>I-MIBGカウントは低下しておらず交感神経活性は温存されている可能性が示唆せれた。
食料廃棄物を用いた有機資材による高付加価値黒大豆生産のための環境創造型農業の構築

低温発酵有機資材HYS-LOMは、乳酸菌が発酵過程で出現するが、肥効成分は減少しないことが判った。このHYS-LOMを黒大豆に施肥したところ、生育や収量には差異はなかったが、中耕施肥で大豆種皮ポリフェノール含量が増加した。また、黒大豆の品種としてクロツルでは、丹波黒より大豆種皮ポリフェノール含量が高いことを見いだした。さらに、抗酸化能も高いことも判った。多様な大豆種皮ポリフェノールの機能性を明確にし、生産者に対してセミナーを実施し、HYS-LOMを用いた黒大豆生産の向上のための啓蒙活動を実施した。低温発酵有機資材HYS-LOMを用いた環境創造型農業技術構築のため、以下の試験を実施した。1 HYS-LOMの開発と評価:低温発酵有機資材の微生物叢の分布特性について調べた。発酵前と発酵後のサンプルについて微生物叢を調べた結果、発酵後のサンプルにおいてのみPediococcus acidilacticiおよびP. pentosaceusに属すると考えられる乳酸菌が見られた。続いて、豊岡市の河谷営農組合で調製された低温発酵有機資材について発酵直後と1か月後のサンプルについて同様にMRS培地似て調べた結果、Lactobacillus acidipiscisおよびL. pobzihiiに属すると考えられる乳酸菌が検出された。そこで、乳酸菌検出に特化したプライマーを用いてPCR-DGGE解析をした結果、L. acidipiscisおよびL. pobzihii由来と思われる増幅断片のみが見られ、その他の細菌由来のものは検出されなかった。よって、低温発酵有機資材中の優占微生物は乳酸菌であることが明らかとなった。また、河谷営農組合の圃場で土壌サンプリングをし、0-30cmコアの土壌観察の結果から、土性粘質強粘質で土色が灰褐色を呈する灰色低地土であり、分析結果から、農耕地土壌分類に基づくと「細粒灰色低地土、灰褐系(13D)」であると命名した。2.農産物の評価:黒大豆の主要ポリフェノールであるアントシアニンを蛍光検出器付き高速液体クロマトグラフィーを用いた分析系を構築した。施肥条件の異なる黒大豆種皮を分析したところ、市販の有機資材よりHYS-LOMを施肥した黒大豆種皮種皮抽出物のポリフェノール含量と抗酸化能が高いことが分かった。特に、施肥を元肥で施すより、中耕で施す方が、ポリフェノール含量と抗酸化能が高いことが分かった。以上のことから、HYS-LOMの優位性が明らかとなった。低温発酵資材であるHYS-LOMは、発酵過程で乳酸菌を優先的に生育させることが分かったこと、試験区圃場の土壌分析ができたこと、生産した黒大豆種皮の機能性成分であるポリフェノール含量が、市販有機資材よりHYS-LOMで高くなること、施肥法として中耕時に施肥するとより効果が高いことが分かった。また、肥料成分・土壌成分の分析も進行中である。以上のことから判断すると概ね順調に進展していると評価できる。1.HYS-LOMによる環境創造型農業技術の構築:HYS-LOMの開発と評価に関して、昨年度の実績に基づいて、実験室レベルで15度での発酵を行い、経時的にサンプリングして特性を調べた。その結果、水分、pH、窒素・リン酸・カリの含量には変化がなかった。また、HYS-LOMから乳酸菌用培地(MRS培地)を用いて単離した乳酸菌は、16S rRNA遺伝子解析からEnterococcus casseliflavus、E. faecalis、Lactobacillus acidipiscis、L. plantarum、L. pobuzihii、Pediococcus acidilactici、P. pentosaceusに分類されることがわかった。上記の実験室レベルで調製し経時的にサンプリングしたHYS-LOMからもそれらの乳酸菌が検出できた。次に、HYS-LOMの圃場試験を兵庫県内2箇所で実施したところ、収量には変化がなかった。2.農産物の評価:兵庫県立農林水産技術総合センター北部農業技術センターで実施した圃場試験で収穫したクロツルと丹波黒(兵系黒3号)の評価を行った。丹波黒はHYS-LOM元肥区で化学肥料区や慣行区と比較して、高値を示したが、クロツルでは差がなかった。アントシアン含量は、HYS-LOMを施肥することで化学肥料区や慣行区より高くなった。エピカテキンやプロシアニジン三量体もHYS-LOM施肥区で高値傾向を示した。すなわち、収量に変化がなくとも、機能性成分であるポリフェノールがHYS-LOMにより増えることが判った。3.農業経営評価:生産者へのセミナーを実施した。また、本年度は品質特性と普及性について協議し、次年度に総合的評価する基盤を作った。低温発酵有機資材HYS-LOMの開発と評価、圃場試験を実施して収穫量と生産性の評価等の項目について順調に進んでいる。また、農作物の評価についても順調であり、複数の圃場からの黒大豆中のポリフェノール分析からHYS-LOMの優位性を見出している。一方で、農業経営に及ぼす効果については、生産者へのセミナーを行い、効果の定量的な評価の協議を実施した。以上のことから、本課題は概ね順調に進んでいると評価できる。低温発酵有機資材HYS-LOMを用いた環境創造型農業技術構築のため、以下の研究を実施した。

1.HYS-LOMによる環境創造型農業の構築:昨年度見いだしたHYS-LOMから乳酸菌が検出されたことについて、その原因を調べた。その結果、有機酸の分泌に伴ってpHの低下が生じ、これがHYS-LOM中で乳酸菌が優占種になる要因と考察した。一方で、乳酸菌由来の抗菌活性も調べたが、堅調な活性は認められなかった。また、肥料の成分分析を行ったが、発酵温度による成分の差は認められなかった。2.土壌分析の結果:HYS-LOMの施肥による表層土壌と土壌断面層位別試料を分析したところ、いずれの分析項目も標準的な値であり,特筆すべき値は認められなかった。3.農産物の評価:昨年度に続いてHYS-LOMを用いて栽培した但馬地方在来種のクロダイズであるクロツルと慣行農法で栽培した丹波黒に含まれるポリフェノールの定量を行った。過去5年間に栽培したこれらのクロダイズを分析した結果、種皮のフラバンー3ーオールと子実のイソフラボンは、いずれもクロツルの方が丹波黒より有意に高いことが判った。年次変化を調べたところ、天候不良等の環境要因により、いずれの品種も2015年産の豆で種皮ポリフェノール含量が低かった。また、加工特性を調べたところ、煮豆よりも煎り豆の方が、種皮ポリフェノールがより残存しやすいことが判った。さらに、黒大豆種皮ポリフェノールの機能性として、肝細胞の酸化的DNA損傷抑制効果、高血糖・肥満抑制効果、肝繊維化抑制効果、非アルコール性脂肪肝疾患予防効果などを見いだした。4.農業経営評価:定量的な農業経営評価はできなかったが、今年度も生産者へのセミナーを実施し、クロツルの生産意欲向上に勤めた。これらの啓蒙活動を通じて、産地では、クロツルの加工品を用いて機能性表示食品の申請を検討することになった。低温発酵有機資材HYS-LOMは、乳酸菌が発酵過程で出現するが、肥効成分は減少しないことが判った。このHYS-LOMを黒大豆に施肥したところ、生育や収量には差異はなかったが、中耕施肥で大豆種皮ポリフェノール含量が増加した。また、黒大豆の品種としてクロツルでは、丹波黒より大豆種皮ポリフェノール含量が高いことを見いだした。さらに、抗酸化能も高いことも判った。多様な大豆種皮ポリフェノールの機能性を明確にし、生産者に対してセミナーを実施し、HYS-LOMを用いた黒大豆生産の向上のための啓蒙活動を実施した。低温発酵有機資材中の優占微生物が乳酸菌であることが分かったことから、平成28年度は乳酸菌に特化して資材中の乳酸菌のさらなる特定とその推移について調べる。まず、実験室にて調製温度および通気条件を変えながら有機資材を作製し、優占種の単離を試みる。つづいて、単離した乳酸菌を低温発酵開始前に摂取し、有機資材の特性を共同研究者とともに調べる。また、有機資材を施肥した水田・畑土壌中の残存乳酸菌量も明らかにする。肥料成分・土壌成分の分析については継続するとともに、圃場の土壌断面標本を作製し、土壌特性を明確にする。上記の製造条件を変えたと各種HYS-LOMを用いた小規模ポット試験を実施する。農作物の評価は、前年度同様に新たに栽培した黒大豆について実施するとともに、種皮抽出物を投与した実験動物の血中ポリフェノール含量も測定する。
抗酸化酵素を標的としたマングローブの耐塩性機構解明

今年度は抗酸化酵素遺伝子発現に及ぼす塩ストレスの影響を調べた。30日間3%濃度の塩ストレスを負荷したオヒルギにおいてはCu/ZnSOD1、Cu/ZnSOD2、CCSOD、FeSOD、MnSOD遺伝子の発現が上昇し、Cu/ZnSOD3遺伝子の発現に変化は認められなかった。90日間の塩処理によってはCu/ZnSOD3、CCSOD遺伝子の発現は増加するが、MnSOD遺伝子の発現は低下した。他の遺伝子発現に変化は観察されなかった。CAT1とCAT2の発現は両者とも30日間の塩処理により増加するが、90日間の処理においては、CAT2の発現は対照群と同程度であった。試験期間が30日の場合、APX1及びAPX2は塩濃度に依存して1.5%濃度までは上昇するが、それ以上の塩濃度(3%)では低下していく傾向にあった。APX3の発現は塩ストレス負荷により、若干の上昇が認められた。90日間の処理においては、APX3の発現に塩ストレスの影響は認められず、APX2の発現は低下した。GPXについては、30日間の処理によりGPX5以外の遺伝子の発現が塩濃度依存的に上昇した。90日間の処理においては、GPX4とGPX5の発現は塩濃度依存的に低下する一方、他のGPX遺伝子の発現は上昇した。これらのことから、塩ストレスによる抗酸化イソ酵素遺伝子群の誘導は相互補償的に制御されていることが示唆された。26年度が最終年度であるため、記入しない。抗酸化酵素は植物の塩分等の環境ストレス耐性において重要な役割を演じている。マングローブは汽水域に生育できる耐塩性の木本類である。本研究はマングローブの耐塩機構における抗酸化酵素群の機能解明を目的とする。まず沖縄に生育する9種のマングローブ(オヒルギ、ヤエヤマヒルギ、メヒルギ、ヒルギモドギ、ヒルギダマシ、ミズガンピ、ハマザクロ、サキシマスオウノキ、シマシラキ)の葉及び根における抗酸化酵素群(SOD、POD、CAT、APX、GR、MDHAR、DHAR、GST)の活性及び脂質過酸化指標であるMDAの濃度分布を調べた。殆どの抗酸化酵素活性を各マングローブの根及び葉において検出したが、樹種によって分布は異なっていた。CATとGPXは根よりも葉の活性が高いが、他の抗酸化酵素は根の活性が強かった。また、最も強い活性を示す主要な抗酸化酵素はマングローブの種類によって異なっていた。すなわち、メヒルギ、ヤエヤマヒルギにおいてはPODの活性が最も高く、オヒルギ、シマシラキ、ヤエヤマヒルギにおいてはAPX、CAT、MDHRの活性が比較的高かった。一方、植物体の脂質過酸化指標であるMDA濃度は葉よりも根で高く、根はより強い塩ストレスの影響を受けていること示すものと解釈された。これらの結果から、塩負荷にともなう酸化ストレスに対抗して植物を保護する抗酸化酵素の種類及び活性はマングローブ樹種によって異なることが明らかになった。本研究はマングローブ植物における塩分の毒性除去機能、特に抗酸化酵素を新たな標的としてマンローブの塩耐性機構を複合的に解明することを目的として、25年度は以下の点について検討した。1.代表的な抗酸化酵素(SOD、CAT、APX、GST、GR等)について、塩分負荷後の活性変化を追跡し、塩ストレス応答的な変動を示す酵素の絞り込みを行う。2.上記の結果に基づき、マングローブ植物から塩ストレス応答性の抗酸化酵素遺伝子のクローニングを行い、塩基配列を基にしたタンパク質構造を明らかにする。3.塩分負荷後のマングローブについて、抗酸化酵素の活性、タンパク質濃度、mRNA濃度を測定し、抗酸化酵素の変動についての時系列的なプロファイリングを行う。以下の成果を得た1.メヒルギ、オヒルギ及びヤエヤマヒルギの長期間(1、2、3か月)における塩分濃度応答性を検討した。概してSOD活性は塩分濃度に依存して葉では低下するが根においては増加した。GPX活性は葉と根の両方において塩分濃度により増加し、APX活性もほぼこれに類似した応答パターンであった。これらの成果より、APX, GPX及びCATのような過酸化水素の除去に関与している抗酸化酵素がマングローブにおける長期間の塩ストレス耐性においては重要な役割を演じていることが示唆された。2.ギガシーケンサーのデータをアセンブルして作成したオヒルギのcDNAのコンティグ配列から、抗酸化酵素のモチーフ配列を指標としてすべての抗酸化酵素の塩基配列を推定することができた。3.オヒルギの苗木を塩水処理した後の経日的(0.5、1、2、4、8、12、16、24、32日)な抗酸化酵素活性の変化を追跡した。SOD活性は処理後1日目に急激に上昇し、以降時間の経過に従って低下した。GPX活性は処理時間の経過に伴い増加し、APXとCATは4日目までは増加するが、その後は減少した。

CAT1とCAT2の発現は両者とも30日間の塩処理により増加するが、90日間の処理においては、CAT2の発現は対照群と同程度であった。試験期間が30日の場合、APX1及びAPX2は塩濃度に依存して1.5%濃度までは上昇するが、それ以上の塩濃度(3%)では低下していく傾向にあった。APX3の発現は塩ストレス負荷により、若干の上昇が認められた。90日間の処理においては、APX3の発現に塩ストレスの影響は認められず、APX2の発現は低下した。GPXについては、30日間の処理によりGPX5以外の遺伝子の発現が塩濃度依存的に上昇した。90日間の処理においては、GPX4とGPX5の発現は塩濃度依存的に低下する一方、他のGPX遺伝子の発現は上昇した。これらのことから、塩ストレスによる抗酸化イソ酵素遺伝子群の誘導は相互補償的に制御されていることが示唆された。26年度が最終年度であるため、記入しない。塩ストレス適応における抗酸化酵素の役割を解明するに先立って、植物体内での抗酸化酵素群の分布を明らかにする必要がある。申請者は当初の計画に沿って沖縄産のマングローブ全種の葉及び根における抗酸化酵素群の活性及び脂質過酸化指標であるMDA濃度を明らかにしており、研究目的の達成度は"概ね順調に進展している"と判断した。本研究においては塩ストレス負荷後の抗酸化酵素群の経時的或いは経日的な活性変化を追跡し、塩耐性機構全体における抗酸化酵素群の役割を明らかにすることを計画している。今年度はマングローブ植物の抗酸化酵素群の塩濃度に対する応答性及び時間経過に伴う活性変動を検討し、塩分負荷に対する活性発現レベルでの大まかなパターン1を明らかにしている。また、ギガシーケンサーによるオヒルギのトランスクリプトーム解析を行い、すべての抗酸化酵素のcDNA塩基配列を推定できており、研究目的の達成度は概ね順調と判断した。今後は塩ストレス負荷後の抗酸化酵素群の経時的或いは経日的な活性変化を追跡し、塩耐性機構全体における抗酸化酵素群の役割を明らかにする予定である。次年度は以下の研究を計画している。1代表的な抗酸化酵素群(SOD,CAT,APX,GST,GR等)について、塩分負荷後の活性変化を追跡し、塩ストレス応答的な変動を示す酵素の絞り込みを行う。2上記の結果に基づき、マングローブ植物から塩ストレス応答性の抗酸化酵素遺伝子のクローニングを行い、塩基配列を基にしたタンパク質構造を明らかにする。今後は、オヒルギをモデルとして活性と遺伝子発現のデータを比較ることにより、塩ストレス適応における抗酸化酵素群の役割を、タンパク質及び遺伝子レベルで明らかにする予定である。そして、これらの知見とヤエヤマヒルギにおける経時的なトランスクリプトーム解析のデータとを連結し、耐塩機構全体における抗酸化酵素の役割を解明したいと考えている。
危険運転の最適な制御を目指してー刑事制裁の多様化の視点から

危険運転(危険運転致傷罪や飲酒運転罪等を構成する危険な運転)については、犯罪とされる範囲が拡張され、刑罰も引き上げられた。しかし、その後も危険運転は発生しており、(懲役刑、罰金刑以外の)より効果的な刑罰の構想が求められる。そこで、危険運転に至る心理的、生理的側面に着目し、危険運転という犯罪の原因を再検討した。そして、犯罪原因を除去する動機付けが可能な様々な制裁を、刑罰論のみならず、法と経済学、社会学の知見も動員して想定し、これを刑罰として整理できるかを検討した。研究の1年目では、危険運転の制御を目指す諸方策を概観し、問題点を整理した。各分担者の研究成果は、年度末の研究集会において報告し、相互の検証を行った。具体的な研究活動としては、自動車運転死傷行為処罰法の成立を受けて、そこで再整理された危険運転致死罪(関連規定)の概要が検討された。同罪は、従来のそれ(刑法典に規定されていたもの)を前提としつつ、適用範囲を広げたものである。これは、刑法、行政刑法の観点から、危険運転の制御にとって有効なものと思われるが、関連規定の適用に際しては、犯罪成立要件の厳格な解釈が必要であることも、確認された。同罪の成否は、裁判員裁判において争われるので、裁判員裁判に特有の問題(裁判員の心理的な対応を踏まえた、刑罰規定の厳格な解釈、適用)が同時に問われることも、確認された。この課題に対応するには、被害者(危険運転致死罪による被害を受けたと思われる者)の死傷の状況を客観的かつ医学的に検証することが前提となる。そこで、交通事故と法医学の観点からのアプローチを、引き続き重視していく必要があることも、確認された。同時に、裁判員裁判における量刑の動向(被害者の処罰感情の高まりから、量刑が、非・裁判員裁判の場合と比較して、重くなりやすいという傾向の当否等)も、併せて確認された。これらの、本研究に関わる課題は、各分担者が専門的に研究している問題であり、今年度においても、その新たな研究の進展が認められた。そこで、2年目において、これらの課題(刑事法的規制の適正性、裁判員裁判と法心理学、法医学、および量刑理論)のより具体的な検討をめざし、検証対象の再確認がなされた。第一に、危険運転致死傷罪の適用が問題となった近時の事案を、各自の専門的知見を踏まえて検討した。具体的には、北海道小樽市で起こった飲酒運転による死傷事案や、砂川市で起こった同種事案の裁判過程を検証した。第二に、危険運転の制御のために、更なる制度的手当が可能な領域は何かを検討した。その結果、1近時、社会的にも関心を呼んでいる自動化運転の利用可能性、2飲酒運転(典型的な危険運転)の更なる予防を図るための啓発活動の効果測定が、当面の課題として取り上げられた。第三に、上記二つの課題の分析が開始された。1(自動化運転の利用可能性)については、刑法総論、法哲学、法と経済学、法社会学の領域にまたがる難問(緊急避難の可否等)が複数、存在しており、それらの基礎的な研究が開始された。2(飲酒運転の防止に向けた社会的啓発活動)については、北海道が関連する条例を施行したところであり、飲酒運転の防止にどの程度の効果があるのか、調査を開始した(関係者からのヒアリング等を行った)。第四に、危険運転を起こしてしまった者(運転者、同乗者等)から、そうした運転に至った経緯、他の交通関与者に損害を与えた場合の対処法等、経験者としての意見を聴取して、対策を練る必要性が認識された。そこで、こうした調査、ひいては市民アンケート調査を実施する前提として、経験者の権利擁護のため、秘密保持のあり方についても、基礎的な研究が開始された(弁護士秘匿特権の検討等)。第五に、こうした経験者が民事、刑事の裁判当事者となった場合の、権利保護のあり方について、法と心理学、量刑論の観点からの分析を継続した。危険運転の抑止に向けた施策は、法的にも、社会的にも、増える傾向にあるところ、それらの有効性が、研究メンバー各員の専門的知見を踏まえつつ、継続的に検討がなされている。年度末には、メンバーがそれぞれ一年間の研究成果を報告し、メンバーで共有すべき研究到達点が確認されている。危険運転を制御する最適な法的施策を、多角的に検討した。危険運転の代表として、危険運転致死傷罪を取り上げ、その成否が裁判上、争われた事案を検討した。同時に、危険運転を防止する技術として、自動運転の法的位置づけを試みた。危険運転致死傷罪の成否が問題となった事案として、学会でも注目を集めている著名な事例が、北海道・小樽で生じた事故と、北海道・砂川で生じた事故である。そこで、これらを取り上げ、それらの分析を継続した。具体的には、北海道でのマスコミ報道の収集、学術論文の検討、裁判例の追跡と分析、飲酒に起因する危険運転致死傷罪を防止するための、社会学的、心理学的施策の検討、飲酒が運転に与えた影響を確認するための刑事訴訟法的及び法医学的検討、飲酒運転全般に係る量刑の動向とその理論的検討を、各分担者が行った。自動運転の法的位置づけについては、海外の文献調査、外国政府、自動車メーカーの取り組み、日本政府の対応(道路交通法や自動車運転致死傷行為処罰法との調整、条約との関係性)という、極めて先進的課題について、各分担者の専門的知見から、検討を開始した。

これらの検討の成果は、年度末の科研集会で開陳され、活発議論により、理論的深度が深められた。その結果、危険運転を制御する最適な法的施策を目指すには、今年度の検討方法が適切であることも確認され、次年度も、この方法が採られることが確認された。本研究は、危険運転を防止し、危険運転をした者を適切に処罰等する体制を、法学的、社会学的、心理学的、法医学的見地から、総合的に検討するものである。そのための素材としては、本年度の対象となった、危険運転致死傷罪(特に飲酒運転によるもの)の処理の分析と、危険運転を防止するための自動運転のシステムを検討することが、不可欠である。本研究では、これに取り組んできており、各分担者の専門的知見から、学術的提言内容もまとまりつつあるところである。以上から、本研究は、おおむね順調に進展していると考えられる。危険運転を、より効果的に制御するための諸施策を、刑事法学のみならず、隣接諸科学(法社会学、法医学、法と心理学、法と経済学)の知見を動員して検討した。刑事法学的見地からは、危険運転に対する刑罰を更に引き上げるとともに、その摘発率、その訴追率を高めることが、一般予防機能を強化するために、適当な対応と考えられた。他方で、法医学、法と心理学の観点からは、飲酒運転に対する肉体的、心理的抵抗が減少している者との関係では、そうした厳罰化を指向する対策ではなく、適切な治療的措置を選択肢として用意することが必要だとの結論が導かれる。この発想は、環境(過程、職場、住居地域、ひいては文化的単位としての地方)の特性(飲酒に対する積極的、消極的な態度)に応じた法政策を検討するのが経済合理性に合致するとの発想になじみ、法社会学や、法と経済学の観点からも正当化されうる。そこで、刑事罰の適正な執行方法に資する施策(飲酒運転の検挙件数を高めるための方策等)と並び、そもそも飲酒運転に対する抵抗力が弱い者による飲酒運転を未然に防止するための施策(アルコール・イグニッション・インターロックの義務化。この義務づけを新たな刑事制裁として構成すること)や、飲酒運転の機会を減らすための社会政策(都市交通政策の再考)とも、より具体的に検討されるべきだとの結論に至った。これらの検討経過と結論は、地方の交通ボランティア等との共有も図られつつあり、今後とも、本研究で得られた発想を、社会的に施行することで、法概念としての刑罰につき、新たな視点を加えることができると予想される。危険運転(危険運転致傷罪や飲酒運転罪等を構成する危険な運転)については、犯罪とされる範囲が拡張され、刑罰も引き上げられた。しかし、その後も危険運転は発生しており、(懲役刑、罰金刑以外の)より効果的な刑罰の構想が求められる。そこで、危険運転に至る心理的、生理的側面に着目し、危険運転という犯罪の原因を再検討した。そして、犯罪原因を除去する動機付けが可能な様々な制裁を、刑罰論のみならず、法と経済学、社会学の知見も動員して想定し、これを刑罰として整理できるかを検討した。研究の1年目においては、危険運転の最適な制御を目指すべく、危険運転の現状、これに対する法的規制の最新状況、および、これに係る関連(重要)事項の確認と問題点の解明が目指された。こうした、概括的な問題点の掘り起こしと確認は、様々な研究領域を専攻する分担者の参加と積極的な貢献により、順調に推移していると思われる。昨年度までの研究方針を継続する。
ジオスタティスティクスを用いたユーラシア寒冷地域における土壌有機物動態の解析

ユーラシア寒冷地生態系における土壌有機物動態を調べた本研究の主要な成果は、以下の通りである。1)緯度あるいは標高に伴う土壌および植生の遷移を、カザフスタン南東部山間地、フィンランド、西シベリア、カナダ平原において調査した。一般に、これら個々の地域内では土壌・植生分布の明瞭な成帯性が見られたことから、土壌有機物動態もまた基本的には位置情報に基づいて規則的に理解しうるものと考えられた。2)テンシャン北部の山間地5地点において、^<13>C安定同位体標識法を用いて植物体の分解速度定数および利用された基質の重比重画分移行率を実測した。双方ともに、温度・水分条件のみでは補正されない地点間の差異が明瞭に観察されたことから、有機物分解機構におけるその原因の追及が今後の課題として挙げられた。3)テンシャン北部より採取した土壌試料を用いて、土壌微生物の基質利用パターンの詳細を検討した。低レベルのグルコースを土壌に添加し、微生物による利用(同化と呼吸)を追跡した結果、微生物が貯蔵物質より自身の構成体の合成を開始し、呼吸/同化の割合が増加し始めるような、基質添加量の閾値が存在することが明らかとなった。また酸性土壌や被攪乱土壌では、より高い割合の基質が容易に無機化されることが明らかとなった。後者のような状況は、実際に根圏や残渣圏において起こりうるものである。4)土壌有機物減耗を回避するように作付体系を最適化するために、土壌有機物収支の時系列的・空間的変異を、カザフスタン北部の穀作圃場において測定した。その結果、地形適応型作付体系の可能性が示されるとともに、ここで用いたジオスタティスティクスの手法が、地形・作付体系に伴う土壌資源の空間的不均一性を考慮に入れた上で土壌有機物動態をシミュレーションしようとする際、強力なツールとなりうることが示された。ユーラシア大陸の寒冷地における土壌および土壌有機物の分布パターンを把握するために、カザフスタン共和国南東部国境近くのKetmen山塊および西シベリア・北極海沿岸のツンドラ地帯において現地調査を行った。1)Ketmen山塊における土壌の分布バターンは、明瞭な垂直成帯性を示した。標高1,400m以下には、砂漠の景観の中にCalcisolsやGypsisolsが分布する。標高が上がるにつれて、乾燥ステップから北側斜面に森林を交えた草原、高山地帯まで景観は変化し、土壌としてはKastanozems(1,4001,550m)、Chemozems(1,5501,700m)、北側斜面のPhaeozems, Umbrisols(1,7002,400m)、南側斜面のChernozems, Phaeozems(同標高帯)、Umbrisols(2,400m以上)が卓越する。このような土壌分布の垂直成帯性は、山間地における降水量増加を強く示唆している。また土壌pHおよび土壌有機物蓄積量(OC30)は以下のような式で表現された。すなわち表層30cm土壌中の有機炭素蓄積量は、標高が上がるにつれて、また北向き斜面において、おそらく好適な水条件を反映した一次生産量および土壌有機物投入量の増加と、温度逓減に伴う土壌有機物分解速度の抑制の双方の影響を受けて増加したものと考えられた。なお蓄積された有機物のCN比は、標高が上昇するにつれて増大する傾向を示した。2)西シベリア北部のツンドラ地帯には、泥炭性の土壌と鉱質土壌が同程度モザイク状に存在する。このうち鉱質土壌分布地域において調査を行った結果、土壌有機物および未分解植物遺体の現存量は微地形によって規定されており、相対的な低位部で増加する傾向が見られた。

このように調査地域における土壌有機物蓄積パターンには明瞭な規則性が見られたため、標高、地形などのデータを用いてその空間分布を把握することが可能である。現在その手法を含め解折中である。平成19年度には,カザフスタン国北東部アルタイ山脈の中・高標高地およびフィンランド国において,土壌有機物蓄積量に関するデータ収集を目的とした広域土壌調査を行った。アルタイ山脈北西部では,低標高草地において成帯性土壌としてKastanozems(KS), Chernozems(CH)が分布したのに対し,同南東部では乾燥地帯(Calcisols(CL)分布域)から草地帯(KS, CH分布域)への移行が標高500m付近で見られ,より東方でステップの下限が上昇する傾向を示した。また北西部では,5001,500mにかけて落葉広葉樹,ついで針葉樹林下にLuvisols(LV)が出現し,さらにより高標高帯ではUmbrisols(UM), Cambisols(CM)が分布した。一方南東部ではLVの分布を欠き,KS, CHを経て,1,6001,800m以高では主として酸性のCMが分布した。このようにアルタイ山脈では,偏西風の影響を受けて西側でより湿潤であり,東方へ向けて乾燥するといえる。一方フィンランド国においては,全土において排水の良好な地点にPodzols(PZ)が,排水の不良な相対標高の低い地点や岩体上にHistosols(HS)が分布した。さらに氷河地形がPZの性質に影響していた。すなわちモレーン,砂質堆積物,粘土質堆積物上に出現したPZ間で,土壌の炭素含量や粒径分布等に差異が生じていた。高緯度になるにつれ植物生育の抑制が観測されたが,氷河地形に比べPZの性質に与える影響は小さかった。以上観察された寒冷地における土壌分布の成帯性に基づき,現在土壌有機物蓄積分布図を作成するとともに,各生態区における土壌有機物動態を解析中である。
生体模擬分子モジュール(ATPジェネレーター)の創製

硫黄酸化細菌Thiobacillus thiooxidansは耐酸性を有し、細胞外の低pHと細胞内の中性のpHのギャップを利用してエネルギー(ATP)を獲得している。本研究では、細菌の耐酸性に関与していると思われる諸因子のうち、cytochrome cとATP合成酵素であるH^+-ATPaseを細胞膜より分離し、その性質を調べた。1.cytochrome cの精製と性質:菌体を破砕して得られた無細胞抽出液を遠心分離により、細胞膜画分と水溶性画分に分画した。膜画分に存在した膜結合型cytochrome cは塩基性タンパク質で、その分子量は18kDa、等電点は8.2であった。水溶性cytochromecの分子量は10.1kDaで、酸化型は409.5nmに、還元型は416.5、522.0、および551.0nmに吸収スペクトルを持っていた。等電点は8.5であった。2.H^+-ATPaseの性質:菌体の細胞膜に存在するATPaseは、F_0F_1型であった。ATP分解活性は、pH8.0、温度60°Cにおいて最大となった。また、活性はMg^<2+>の濃度に依存して増大し、4mM-Mg^<2+>で最大となった。T.thiooxidansのATPaseに特徴的な性質として、ATP分解活性が亜硫酸(SO_3^<2->)濃度に依存して増大することが分かった。1.膜結合型cytochrome cの精製:菌体を破砕して得られた無細胞抽出液を遠心分画して得られた沈殿を細胞膜画分として調製した。細胞膜画分からTritonX-100を用いて可溶化した膜結合型cytochrome cを含む溶液を、TritonX-100を含むpH7のリン酸緩衝液で平衡化したCM-celluloseおよびHydroxyapatiteカラムクロマトグラフィーで精製した。cytochromec特有のスペクトルをもつ蛋白が得られた。この標品をSDS電気泳動した結果、1本の蛋白バンドが検出され分子量は18kDであることが明らかとなった。2.水溶性cytochrome cの精製:菌体を破砕して得られた無細胞抽出液を更に超遠心して得られた上澄みを水溶性cytochrome cを含む粗抽出液として調製した。粗抽出液を硫安分画した。画分をリン酸緩衝液(pH7.0)で透析した後、同緩衝液で平衡化したCM-celluloseおよびHydroxyapatiteカラムクロマトグラフィーで精製した。精製標品のNative-PAGEおよびSDS-PAGEを行ったところ、単一バンドが検出され、完全精製できていることがわかった。還元型吸収スペクトルの測定からヘムc蛋白特有の吸収ピークが認められた。また等電点の測定から本標品は塩基性蛋白であることが確認された。1.cytochrome cの分離精製:菌体を破砕して得られた無細胞抽出液を遠心分離により、細胞膜画分と水溶性画分に分画した。2.H^+-