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第一次大戦前におけるイギリスの土地政策と土地財産の証券化に関する研究

本研究の目的は(1)第一次大戦前におけるイギリスの土地政策ないし「土地問題」を研究し,大土地所有制の崩壊の政策的要因を確定すること、(2)第一次大戦前におけるイギリス土地貴族による土地売却,売得金の内・外証券への投資の実態を分析し,土地貴族の株式・債券保有貴族への転身過程を解明することである。これまでに収集した『イギリス議会史料』(Parliamentary Debates,Fifth Series,House of Lords,vol.143,House of Commons,vol.1217)ならびに『土地貴族関係図書』を解読することによってえた主な成果は以下のとおりである。1、第一次大戦前のイギリスにおいて,土地財産の証券化,すなわち土地貴族による所領売却と売得金の内・外証券への投資が本格的に開始した。このような「資産転換」の要因は経済的諸事情(土地貴族の金融的逼迫)と政策的諸契機(自由党政府の農業=土地政策,財政政策,とくに相続税の重課)に求められること。2、イギリス土地貴族の株式・債券保有貴族への転身過程は次のような3段階を経て遂行された。(1)W・ハ-コ-トの相続税改正を契機とする第1段階(18941909年),(2)D・ロイド・ジョ-ジの「人民予算」の成立(1910年)を契機とする第2段階(19101914年),(3)「1919年歳入法」を契機とする第3段階(19191921年)。3、上記の転身過程は時期や方法の点で地域毎に,また土地所有者の階層毎に異なっており,イングランドの巨大土地所有者の経験を性急に一般化すべきではない。4、転身の第2段階における土地貴族による所領売却の増加は所領売却のための借地農の追放という全く新しい事態を生み出した。このことは「保有の保障」(`security of tenure')を中核とする新たな「土地問題」の到来を告知している。平成元年度においては、当初の研究計画どおり、土地政策史、財政政策史の基礎資料たる『イギリス議会史料』(Partiamentary Debates,5th series,House of Lords,vol.143(1909-1920)、House of Commons,vol1143(1909-1921))を入手し、これを解読することによって多大な成果を得た。新たに得られた知見としては、イギリス土地貴族の株式・債券保有貴族への転身過程はつぎの如き三段階を経て遂行されたことか判明した。W・ハ-コ-ト(William Harcourt)の相続税改正(1894年)を契機とする第一段階(1894-1909年)、この段階では、19世紀末「農業大不況」に伴う地代と地価の低落、長期抵当貸付の縮小によって金融的・財政的苦悶に陥った負債のある土地貴族が土地売却を開始し、売得金をもって負債を清算したのちに、剰余金を内・外証券への投資に振り向け、土地貴族の株式・債券保有貴族への転身が開始した。第二段階(1909-1914年)はD.ロイド・ジョ-ジ(David Lloyd George)の「人民予算」の成立(1910年)に対応する。この段階では、負債の有無にかかわらず、全ての土地貴族が土地売却を開始し、売得金を内・外証券により一層大規模に投資し、土地貴族の株式・債券保有貴族への転身が本格的に進展した。

「1919年歳入法」を契機とする第三段階(19191921年)、上記「歳入法」によって相続税が土地貴族にとって最大の支出項目となり、相続税を支払うために、土地売却が決定的に進展し、かつ内外証券への投資も顕著に増大し、ついに、土地貴族の所得の四分の三以上が利子・配当収入によって占められるに至り、土地貴族の株式・債券保有貴族への転身が完了した。以上の研究成果は後掲の共著として1990年3月に公刊される予定である。平成2年度においては,当初の研究計画どおり,「イギリス近代土地政策史」の基礎資料たる『イギリス議会史料』(Parliamentary Debates,5th series vol.144217〔19211928〕)を入手した。他方,D_0 Cannadine,The Decline and Fall of the British Aristocracy,1990等の「イギリス上地貴族関係図書」を入手し、これらを解読することによって多大な成果を得た。新たに得られた知見としては,イギリス「土地貴族」の「株式・債券保有貴族」への転身過程の多様性というこである。右の転身過程は時期や方法の点で地域毎に差異があり,イングランドの経験ー昨年度の実績報告書参照ーを性急に一般化しえないというこである。たとえば,アイルランドでは,1903年の「ウィンダム法」を頂点とする自作農創設法にもとづく,国家の助成により,イングランドに先んじて,1900年代に右の転身過程は決定的に進展した。これとは対照的にウエィルズでは国家の助成はなかったが,19世紀末農業大不況期に右の転身過程は早熟的に開始し,第一次大戦の直前及び直後の時期に決定的に進展した。以上に対し,スコットランドでは右の転身過程はもっとも緩慢かつ不完全であり,1930年代に転身を完了した。今一つ,注目すべき点としては,右の転身過程は土地所有者の階層毎に異なっていたということである。年間粗所得£100010,000の小土地所有者は転身に失敗し,早期にかつ完全に消滅し,年間粗所得£10,00030,000の中位の土地所有者もほぼ同断であったのに対比し,年間粗所有£30,000以上の巨大な土地所有者は概して土地売却によって得られた売得金をより有利な内・外証券に投資し,利子・配当金に主として依存する「株式・債券保有貴族」(利子取得者)に転身しえた。平成3年度においては、これまでに収集した『イギリス議会史料』(Parliamentary Debates,5th series)ならびに『イギリス土地貴族関係図書』に加えて,関係の末刊行学位論文等を収集し、現有の史料『借地農・所領売却調査部局委員会』の『報告書』、『証言録』(1912年)等をも併用し、平成元年度及び2年、3年度の研究を総括し、『研究成果報告書』にとりまとめることである。過去、3ケ年の研究によってえられた知見は以下のとおりである。1.第一次大戦前のイギリスにおいて、土地財産の証券化、即ち土地貴族による所領売却と売得金の内・外証券への投資が本格的に開始した。かような「資産転換」の契機(要因)は経済的諸事情(土地貴族の金融的逼迫)と政策的諸契機(自由党政府の農業=土地政策、財政政策、とくに相続税の重課)に求むべきであり、土地財産の証券化は土地貴族にとっては止むを得ない選択であった。2.イギリス土地貴族の株式・債券保有貴族への転身過程は次のような3段階を経て遂行された。
アルミニウムの製錬、電気めっき、電池負極化にむけた室温低粘性ＤＥＳ電解液の設計

本研究では、有機スルホン(ジメチルスルホン)とグライム類を混合することで、両者の特徴、すなわち低粘性や低揮発性をあわせもつ新規なDES(deep eutectic solvent)を創製し、室温付近で金属アルミニウムを電析可能な浴を得ることを目指した。その結果、試みた範囲内ではいずれのスルホン類を用いた場合もジメチルスルホンとの複合化が粘性の増大と伝導度の低下をもたらすことを明らかにした。ジグライムのみからなる溶媒に塩化アルミニウムを加えた電解浴からは、室温で緻密な結晶性の金属アルミニウム薄膜を電析することに成功した。一方、これ以外のグライム類を用いた浴からはアルミニウムは電析しなかった。本研究では、有機スルホンとグライム類を混合とすることで、両者の特徴、すなわち低粘性や低揮発性をあわせもつ新規なDESを創製し、室温付近で金属Alを電析可能な浴を得ることを目的とした。研究ではまず、(1) DES構築による電解液創製を検討し、(2)それを用いたアルミニウム電析(電気化学実験)を行った。使用するグライム類としてはdiglyme (G2)、triglyme (G3)、tetraglyme (G4)、およdiethylene glycol di-n-butyletherとした。スルホン類にはdimethyl sulfone (DMSO2)、アルミニウム塩にはAlCl3を用いた。その結果、グライム類とAlCl3の2成分系(モル比5:1)では、いずれも建浴可能なものの、グライム類の分子量増大とともに浴の粘性は増大し、伝導度に低下傾向が見られた。最も低粘性の浴が得られたG2/AlCl3系について、さらにDMSO2を添加したところ、DMSO2の添加による粘性の低下(電気伝導度の向上)はほとんど見られないことが判明した。そこで、電気化学測定はDMSO2を添加しないグライム類とAlCl3の2成分系を中心に調べることにした。G2/AlCl3系以外の2成分系のボルタンメトリーには金属Alの析出/溶解波が観測されず、これはAlCl3とのモル比を変えても同様であった。一方、G2/AlCl3系からは、定電位電解により、平滑ではないが比較的緻密な金属Al薄膜を析出させることに成功した。Al電析の電流密度は、予備電解を行うことで改善した。また、浴温は60°Cが最適であった。電析Alの平滑性改善を目的に3種類の添加剤、triethylenetetramine、1,10-henanthroline、dimethylamine hydrochlorideを検討したが、効果はみられなかった。材料工学
固体NMRによる分子認識機構の研究

長距離秩序を持たない粉末試料で分子の立体構造を決定することは長年の構造科学における懸案であり,個体NMR法はそのような試料で構造情報を取得しうる手法として注目されてきた.本研究では,これまでに,我々により提案された固体NMR法により分子構造を決定する手法を,これまでに適当な分光学的手段が存在しなかったために構造が決まらず研究の進展が妨げられていた微視的な分子認識機構の研究に適用し,構造と機能の関係を究明することを目的とする.分子認識を行っている具体的な系として,コール酸・γ-バレロラクトンの包接系をとりあげた.コール酸はγバレロラクトンの鏡像異性体(S体,R体)を見分けて一方をより好んで包接することが知られている.この分子認識過程を研究するために,メチル基の水素を重水素で,炭素を炭素13で同位体置換したγ-バレロラクトンをコール酸に包接させた資料を作成した.この試料に対して、S, R体それぞれのメチル基の炭素13間の1次元スピン核散測定を行い,コール酸中のS体,R体の並び方を1次のマルコフ過程を仮定したモデルをもとにシミュレートして,解析することが出来た.その結果,例えば,R体が一旦包接されるとR体の鋳型ができ,引き続いてR体が包接されやすくなることを示すことが出来た.これは,分子の認識機構の主なメカニズムの一つの典型的な実験的な検証になっていると考えられる.また,スピン拡散測定の高効率化の模索の中で,^1H-^<13>C dipolar-assistedrotationalresonance法という手法を開発した.これは,多スピン系の試料を用いて,多数のおおまかな距離情報を一度に決定するという,これまでに希求されてきたが実現されていなかった固体NMR法であり,Chem. Phys. Lett.,344,631-637(2001)に報告した.この手法では,観測核スピンへのラジオ波照射を必要としないために,距離測定時間の制限が一般的に長い縦緩和時間になる.つまり,長距離の測定が行えるという大きな利点がある.また,観測は高分解能の条件で行うことが可能であり,他にも多スピン系への応用に適した特性を持っていることを示すことが出来た.長距離秩序を持たない粉末試料で分子の立体構造を決定することは長年の構造科学における懸案であり,個体NMR法はそのような試料で構造情報を取得しうる手法として注目されてきた.本研究では,これまでに,我々により提案された固体NMR法により分子構造を決定する手法を,これまでに適当な分光学的手段が存在しなかったために構造が決まらず研究の進展が妨げられていた微視的な分子認識機構の研究に適用し,構造と機能の関係を究明することを目的とする.分子認識を行っている具体的な系として,コール酸・γ-バレロラクトンの包接系をとりあげた.コール酸はγバレロラクトンの鏡像異性体(S体,R体)を見分けて一方をより好んで包接することが知られている.この分子認識過程を研究するために,メチル基の水素を重水素で,炭素を炭素13で同位体置換したγ-バレロラクトンをコール酸に包接させた資料を作成した.この試料に対して、S, R体それぞれのメチル基の炭素13間の1次元スピン核散測定を行い,コール酸中のS体,R体の並び方を1次のマルコフ過程を仮定したモデルをもとにシミュレートして,解析することが出来た.その結果,例えば,R体が一旦包接されるとR体の鋳型ができ,引き続いてR体が包接されやすくなることを示すことが出来た.これは,分子の認識機構の主なメカニズムの一つの典型的な実験的な検証になっていると考えられる.また,スピン拡散測定の高効率化の模索の中で,^1H-^<13>C dipolar-assistedrotationalresonance法という手法を開発した.これは,多スピン系の試料を用いて,多数のおおまかな距離情報を一度に決定するという,これまでに希求されてきたが実現されていなかった固体NMR法であり,Chem. Phys. Lett.,344,631-637(2001)に報告した.この手法では,観測核スピンへのラジオ波照射を必要としないために,距離測定時間の制限が一般的に長い縦緩和時間になる.つまり,長距離の測定が行えるという大きな利点がある.また,観測は高分解能の条件で行うことが可能であり,他にも多スピン系への応用に適した特性を持っていることを示すことが出来た.長距離秩序を持たない粉末試料で分子の立体構造を決定することは長年の構造化学における懸案であり,固体NMR法はそのような試料で構造情報を取得しうる手法として注目されてきた.本研究では,これまでに,我々により提案された固体NMR法により分子構造を決定する手法を,これまで適当な分光学的手段が存在しなかったために構造が決まらず研究の進展が妨げられていた分野に適用し,構造と機能の関係を究明することを目的とする.本年度は,ハードウエアの整備と,分子認識を行っている系であるコール酸・γ-バレロラクトン包接化合物を取り上げて,その特定の箇所を^2Hや^<13>Cでラベルした包接化合物を合成した.(1)高速回転プローブの改造多数のラベルした核スピンを含む試料で高分解能を達成するには少なくとも20kHz以上の速度でマジック角度回転(MAS)をする必要がある.

そこで25kHzで高速回転可能なプローブを購入し,現有の9.4Tの超電導マグネットを基にしたNMR装置で^<15>N,^<13>C,^1H三重共鳴実験を行えるように改造した.(2)試料の合成メチル基を^<13>C,^2Hで同位体置換したγ-バレロラクトンを合成した.重水素化は緩和時間を長くするために必要である.また,カルボニル基を^<13>Cで同位体置換したコール酸を購入し,γ-バレロラクトンとの包接体を合成した.今年度は,これまでに開発したさまざまな固体NMR法を用いて,これまで適当な分光学的手段が存在しなかったために構造が決まらなかった包接化合物の構造,特に,ゲスト-ホスト分子間相互作用を研究する目的で,前年度に合成したメチル基の水素を重水素で,炭素を炭素13で同位体置換したγ-バレロラクトンをカルボニル基炭素を炭素13で同位体置換したコール酸に包接させた試料を作成した.コール酸はγ-バレロラクトンの鏡像異性体(S体,R体)を見分けて一方をより好んで包接することが知られているが,S, R体の並びの構造は決定されていない.この試料に対して,S, R体それぞれのメチル基の炭素13間の1次元スピン拡散測定を行い,コール酸中のS体,R体の並び方をn次のマルコフ過程を仮定したモデルをもとにシミュレートして,解析することが出来た.その結果,例えば,R体が一旦包接されるとR体の鋳型ができ,引き続いてR体が包接されやすくなることを示すことが出来た.これは,分子の認識機構の主なメカニズムの一つの典型的な実験的な検証になっていると考えられる.さらに,γ-バレロラクトンのメチル基炭素13とカルボニル基の1炭素13間のスピン拡散測定を行い,ホスト-ゲストの相互作用位置を検討した.また,スピン拡散測定の高効率化の模索の中で,^1H-^<13>C dipolar-assistedrotationalresonance法という手法を開発した.これは,多スピン系の試料を用いて、多数のおおまかな距離情報を一度に決定するという,これまでに希求されてきたが実現されていなかった固体NMR法であり,Chem. Phys. Lett., 344, 631-637 (2001)に報告した.この手法では,観測核スピンへのラジオ波照射を必要としないために,距離測定時間の制限が一般的に長い縦緩和時間になる.つまり,長距離の測定が行えるという大きな利点がある.また,観測は高分解能の条件で行うことが可能であり,他にも多スピン系への応用に適した特性を持っていることを示すことが出来た.
乳児をもつ父親に対する育児支援

本研究の目的は、乳児をもつ父親の育児不安や育児ストレス、ワークライフバランスの現状と今後の課題を明らかにすることである。しかしながら、震災の影響により以前協力頂いた保健センターが研究の受け入れが困難になったこと、当初予定のなかったWHOへの長期研修が入ったこと、国際協力のための海外出張が多く入ったことから、調査フィールドの調整や倫理的な配慮を全国統一した見解で取り組むための調整が不十分となり、分析や一般化するために十分な対象者を獲得することができなかった。小児看護における対象の1人である父親を、母親と同様の介入ではなく、父親特有の関わりがあることを理解し介入する必要があると考える。このため、父親特有の関わりを理解するため、父親はどのような育児観を持ち育児しているか、パパママクウォーター制度を導入している市町村を含む全国11の保健センターの協力を頂き、子どもの乳児健診や予防接種のために来所された父親58名に対して半構成的面接を実施した。これにより、父親の育児観として5つのカテゴリーが作成された。この育児観とした5つのカテゴリーは、全国の父親であること、父親が様々な労働条件であること、人数を確保した質的研究結果であることから、これまでの父親を対象とした研究における課題(牧野、2011)をクリアするものとなっている。このため、この質的研究結果を基に父親の育児観を量的に実施できるよう尺度を作成し、父親の育児不安尺度(川井、2008)、父親の育児ストレス尺度(清水、2006)の3つの尺度を用いて、父親独自の育児不安・育児ストレスを明らかにする。本研究は、父親を対象とし、父親要に開発された尺度を用いて、乳児を持つ父親独自の育児不安や育児ストレス、ワークライフバランスの現状と今後の課題を明らかにすることができる独創的なものである。東日本大震災の影響により、以前協力を頂いた保健センターが研究の受入れが困難になっていること、また当初予定していなかったWHOへの長期研修や国際協力における出張が相次ぎ、日本にほとんど滞在していなかったため調査フィールドの調整や倫理的配慮を全国統一した見解で取り組むための調整ができなかった。平成27年度は、調査フィールドの開始をしたものの統一した見解を得るに至らず、調査を実施することができなかった。この育児観とした5つのカテゴリーは、全国の父親であること、父親が様々な労働条件であること、人数を確保した質的研究であることから、これまでの父親を対象とした研究における課題(牧野、2011)をクリアするものとなっている。このため、この質的研究結果を基に父親の育児観を量的に実施できるよう尺度を作成し、父親の育児不安尺度(川井、2008)、父親の育児ストレス尺度(清水、2006)の3つの尺度を用いて、父親独自の育児不安、育児ストレスを明らかにする。本研究は、父親を対象とし、父親のために開発された尺度を用いて、乳児をもつ父親独自の育児不安や育児ストレス、ワークライフバランスの現状と今後の課題を明らかにすることができる独創的なものである。各地で起きている震災の影響により、研究の受入れが困難になっていること、また当初予定していなかったWHOへの長期研修や国際協力における出張が相次ぎ、日本にほとんど滞在していなかったため調査フィールドの調整や倫理的配慮を全国で統一した見解で取り組むための調整ができなかった。平成28年度は調査フィールドの開始したものの統一した見解を得るに至らず、調査を実施することができなかった。小児看護学における対象の1人である父親を母親と同様の介入ではなく、父親特有の関りがあることを理解し介入する必要があると考える。このため、父親特有の関りを理解するため、父親はどのような育児観をもち育児しているか、パパママクウォータ制度を導入している市町村を含む全国11の保健センターの協力を頂き、子どもの乳児健診や予防接種のために来所された父親58名に対して、半構成的面接を実施した。このため、この質的研究結果を基に父親の育児観を量的に実施できるよう尺度を作成し、父親の育児不安尺度(川合、2008)、父親の育児ストレス尺度(清水、2006)の3つの尺度を用いて、父親独自の育児不安、育児ストレスを明らかにする。本研究は、父親を対象とし、父親用に開発された尺度を用いて、乳児をもつ父親独自の育児不安や育児ストレス、ワークライフバランスの現状と今後の課題を明らかにすることができる独創的なものである。

しかしながら、震災の影響により以前協力頂いた保健センターが研究の受け入れが困難になったこと、当初予定のなかったWHOへの長期研修が入ったこと、国際協力のための海外出張が多く入ったことから、調査フィールドの調整や倫理的な配慮を全国統一した見解で取り組むための調整が不十分となり、分析や一般化するために十分な対象者を獲得することができなかった。平成28年度の研究目的は、調査フィールドとの調整、全国統一の倫理的配慮をに取組み、保健センターに来所される父親に対するアンケート調査を実施する。平成29年度の研究目的は、調査フィールドとの調整、全国統一の倫理的配慮に取り組み、保健センターへ来所される父親に対するアンケート調査を実施する。医歯薬学平成27年度は、当初予定していなかったWHOへの長期研修や国際協力による出張が相次ぎ、調査フィールドとの調整ができず、繰越金が発生した。平成28年度は、当初予定していなかったWHOへの長期研修や国際協力による出張が相次ぎ、調査フィールドとの調整ができず、繰越金が発生した。平成28年度の目的は、調査フィールドとの調整と全国統一した見解で倫理的配慮を行い、全国の父親に対するアンケート調査を実施することである。平成29年度の目的は、調査フィールドとの調整と全国統一した見解で倫理的配慮を行い、全国の父親に対するアンケート調査を実施することである。
物質表面波伝播現象のピコ秒時間分解2次元リアルタイムイメージング

異方性物質における表面フォノンフォーカシング現象のイメージは、音響エネルギー伝達速度の方向依存性を反映した複雑な形状を示し、興味深い。また産業的な観点からは、同イメージング技術は、GHz帯表面音響波デバイス開発において中心的な役割を果たすと期待される。異方性物質におけるMHz-GHz領域の表面フォノンフォーカシング現象の動画的観測を行うことにより、表面音響波の分散関係、複雑なナノスケール構造をもつ試料(表面音響波デバイス)における音響波伝播についての多くの知見が直接的に得られる。本研究では、表面音響波伝搬の実時間2次元イメージング技術の開発を行った。この技術は超高速光ポンププローブ法と共通光路型干渉計を組み合わせて、透明および不透明試料における表面音響波伝播を動画として観測するものである。ダイアモンド基板上に金薄膜を烝着した試料では最高2GHz程度の周波数成分を持つ表面音響波を観測した。また、等方性・異方性の透明・不透明試料における表面音響波伝搬の実時間イメージ測定結果から複数の表面音響波モードの分散関係を直接的に取得する解析方法を構築した。新しい不透明基板イメージング方法としては、可動鏡を使うイメージ測定方法を開発した。また、干渉計を用いた測定方法に加えて、反射率変化による測定方法を開発した。これに関連して不均一な光学定数分布を持つ試料に垂直または非垂直に入射する光の散乱理論の構築を進めた。応用研究としてはCu多結晶試料表面を伝搬する表面音響波の実時間イメージ測定を行った。結晶粒界通過時の表面波の屈折現象を観測し、FDTD法によるモデル計算と比較した。これにより表面波イメージングによる物質の内部構造評価の可能性が示された。以上、ピコ秒時間分解能・ミクロン空間分解能を持つ汎用的な表面音響波伝播観測技術の開発を行い、MHz-GHz表面音響波伝播の物理を明らかにした。異方性物質における表面フォノンフォーカシング現象のイメージは、音響エネルギー伝達速度の方向依存性を反映した複雑な形状を示し非常に興味深い。異方性物質におけるMHz-GHz領域の表面フォノンフォーカシング現象の動画的観測を行うことにより、表面音響波の分散関係、複雑なナノスケール構造をもつ試料(表面音響波デバイス)における音響波伝播についての多くの知見が直接的に得られることが期待される。われわれが開発を進めているリアルタイム表面音響波2次元イメージマッピング技術はこのような要求に応えるものである。この技術は超高速光ポンププローブ法と共通光路型干渉計を組み合わせて、ミクロンサイズの点音波源より伝播する表面音響波による表面変位や反射率変化を動画として観測するものである。本研究の目的は、このマッピング技術を発展させ、5GHzまでの表面音響波伝播を観測可能なピコ秒時間分解能・ミクロン空間分解能を持つリアルタイムマッピング技術を開発し、表面音響波伝播の物理を解明することである。本年度は透明および不透明試料における表面音響波伝搬の2次元リアルタイムイメージマッピングの研究を行った。時間分解能はピコ秒オーダー、空間分解能は透明試料で数ミクロン程度、不透明試料ではそれより若干悪くなる。ダイアモンド基板上に金薄膜を烝着した試料において2GHz程度の周波数成分を持つ表面音響波を観測した。また新しい不透明基板イメージング方法として、2枚の可動鏡を使う方法の予備実験を行い、良好な結果を得た。表面波検出方法についても、不均一な光学定数分布を持つ試料に垂直または非垂直に入射する光の散乱の理論の構築を進め、理解を深めた。異方性物質における表面フォノンフォーカシング現象のイメージは、音響エネルギー伝達速度の方向依存性を反映した複雑な形状を示し、非常に興味深い。

また産業的な観点からは、同イメージング技術は、GHz帯表面音響波デバイス開発において中心的な役割を果たすと期待される。異方性物質におけるMHz-GHz領域の表面フォノンフォーカシング現象の動画的観測を行うことにより、表面音響波の分散関係、複雑なナノスケール構造をもつ試料(表面音響波デバイス)における音響波伝播についての多くの知見が直接的に得られることが期待される。われわれが開発を進めている実時間表面音響波2次元イメージング技術はこのような要求に応えるものである。この技術は超高速光ポンププローブ法と共通光路型干渉計を組み合わせて、ミクロンサイズの点音波源より伝播する表面音響波による表面変位や反射率変化を動画として観測するものである。本研究の目的は、このイメージング技術を発展させ、5GHzまでの表面音響波伝播を観測可能なピコ秒時間分解能・ミクロン空間分解能を持つ汎用技術となし、これによりMHz-GHz表面音響波伝播の物理を解明することである。本年度は等方性・異方性の透明・不透明試料における表面音響波伝搬の実時間イメージ測定結果から複数の表面音響波モードの分散関係を直接的に取得する解析方法を構築した。新しい不透明基板イメージング方法としては、可動鏡を使うイメージ測定方法を発展させた。応用研究としてはCu多結晶試料表面を伝搬する表面音響波の実時間イメージ測定を行い、結晶粒界通過時の表面波の屈折現象を観測し、FDTD法によるモデル計算と比較した。これは表面波イメージングによる物質の表面および内部構造評価手段の可能性を示唆する。
新規ヒトIAPファミリータンパクApollonの機能解析

IAPファミリータンパクであり、ユビキチン化酵素でもあるApollonの、抗アポトーシス作用の一因として、Apollonがアポトーシス促進分子のSMACを直接ユビキチン化し分解を促進することを示した。Apollonは幾つかの癌において高発現が認められており、癌化との関連が期待される。また、ApollonによるSMACのユビキチン化を阻害する分子の一つとして、抗アポトーシス分子であるFLIPを見出した。FLIPは、ApollonによるSMACのユビキチン化のみならず、他のユビキチン化酵素複合体によるユビキチン化基質(XIAP、β-catenin、HIF-1αなど)のユビキチン化やその分解を阻害することが分かった。実際に、FLIPの過剰発現はβ-catenin、とHIF-1αのユビキチン化および分解を阻害することで、発現量を増加させ、WntおよびHIFシグナルを強く誘導することが分かった。その際、FLIPは、それぞれの分解系であるGSK3β/APC-SCF、VBCには直接作用しなかった。FLIPによるユビキチン化阻害の機構に関しては、FLIPの大量発現によりFLIP自身が局在化し、ユビキチンがFLIPと共局在するようになることで、その場所以外でのユビキチン化が阻害されると考えられた。実際に、FLIPの発現量の多い細胞株である肺癌細胞株A549において、内在性FLIPがドット状に局在化していること、および内在性FLIPをsiRNAでノックダウンすることにより、A549細胞でのβ-catenin/TCF活性、およびHIF活性が低下することを明らかにした。このことは、A549細胞のような一部の癌細胞においては、FLIPが局在化し、ユビキチン化を阻害することで、β-cateninやHIFなど、癌の悪性化に関わる因子を増強している可能性があることを示唆するものである。これまでの研究から、ヒトIAPであるApollonの抗アポトーシス作用の一因として、Apollonがアポトーシス関連分子のSMACを直接ユビキチン化し分解を促進することがわかっている。そこで、ApollonによるSMACのユビキチン化を阻害する分子のスクリーニングを行ったところ、抗アポトーシス分子であるFLIPがApollonのユビキチン化活性を阻害することが分かった。FLIPは、Apollonに直接作用せず、また、ApollonによるSMACのユビキチン化以外にも、XIAP、β-catenin、S100A10など、数多くのユビキチン化基質のユビキチン化やその分解を阻害した。ユビキチン化阻害により、FLIPはApollonを含め多くのシグナル伝達系に影響を与えることが推測されたので、個々の分子に対する影響の一つとして、β-cateninのシグナル系に対する作用について検討した。その結果、FLIPの過剰発現によりβ-cateninのSCFによるユビキチン化および分解が阻害され、強くWntシグナルを誘導する(もしくはWntに対する反応性が向上する)ことが分かった。またその際にFLIPはβcateninの分解系であるGSK3β/APCやSCFには直接作用せず、ユビキチンの局在を変えることでβcateninやSMACなど様々な分子のユビキチン化を阻害することが分かった。このように、ApollonによるSMACのユビキチン化やSCFによるβ-cateninのユビキチン化をはじめとして様々な分子のユビキチン化を阻害活性を持つFLIPは、従来知られてきたようなcaspase活性阻害のみではなく、様々なアポトーシス関連分子のユビキチン化を阻害することで細胞死に影響を与え得ることが推測される。このことは、A549細胞のような一部の癌細胞においては、FLIPが局在化し、ユビキチン化を阻害することで、β-
裂型に着目した唇顎口蓋裂における３次元顎顔面形態解析と遺伝要因の解明

本研究は、多様な裂型を伴う唇顎口蓋裂を、出生時の裂幅や組織欠損量の程度の違いをも含めて、より詳細に3つの裂型(片側性唇顎裂、片側性唇顎裂、および両側性唇顎口蓋裂)に分類し、全エクソームシーケンスを用いた遺伝子解析とCBCTを用いた顎顔面領域の三次元的な形態解析を行い、裂型や顎顔面形態の差異に関与している遺伝子を探索・同定する。
キナーゼのクオリティーコントロールに関わるCdc37の構造と機能の解析

Cdc37はさまざまな細胞内シグナル伝達経路に関わるキナーゼと複合体を形成し、Hsp90と共に働いてターゲットキナーゼの構造と機能を保証する分子シャペロンである。本研究では、Cdc37の機能が保存されたN末端領域のSer13のCK2によるリン酸化で制御されることを見いだした。このリン酸化サイトに変異を持つCdc37は、Raf1,Akt, Cdk4,MOK等のクライアントキナーゼとの結合能が著しく減弱していた。従って、CK2によるリン酸化がCdc37のキナーゼに対するシャペロン機能に必須である。CK2の特異的阻害剤による細胞処理でCdc37のリン酸化が低下し、Cdc37のクライアントキナーゼは不安定化した。一方でCdc37は細胞質でCK2に直接結合し、この結合がCK2のキナーゼ活性を上昇させた。従って、CK2-Cdc37は互いに相手の機能を必要とするポジティヴ・フィードバックループを形成して多数のシグナル伝達キナーゼの活性発現を保証する一種のマスタースイッチとして働き得ることが明らかになった。ショウジョウバエの脳のサイズが小さい変異体Minibrainの責任遺伝子Mnbは哺乳類のDyrkファミリーキナーゼのホモログであり、ヒトのDyrk1Aはクロモソーム21番のダウン症候群責任領域に存在する。Dyrkファミリーキナーゼは細胞の発生・分化に関与し、細胞分裂やタンパク質分解の制御等の重要な生理作用を持つ事から注目されている。Dyrkファミリーの細胞内結合タンパク質の探索を行ない、Dyrk1B, Dyrk4が細胞内でHsp90及びCdc37と複合体を形成することを明らかにした。Hsp90の機能を阻害するとDyrk1BとDyrk4は細胞質でアグリゲーションを形成し、Cdc37/Hsp90がこれらのキナーゼが細胞内で可溶性に安定して存在するのに必須であることが示された。Cdc37は細胞内のさまざまなシグナル伝達に関わる多様なキナーゼと複合体を形成し、Hsp90と共に働いてターゲットキナーゼの構造と機能を保証する分子シャペロンである。本研究において、Cdc37の機能がCK2によるリン酸化で制御されることを見いだした。精製したCdc37はin vitroでCK2によってリン酸化され、そのリン酸化サイトは進化上良く保存されたSer13と同定された。また、Ser13は細胞内でのCdc37の唯一のリン酸化サイトであった。重要な事に、CK2によるリン酸化がCdc37の機能に必須であり、リン酸化サイトの変異体Cdc37は、Cdc37のターゲットとして調べたRaf1・Akt・Aurora-B・Cdk4・Src・MOK・MAK・MRKのいずれのキナーゼに対してもその細胞内での結合能が著しく低下していた。更に、Cdc37のリン酸化部位の変異によりCdc37-キナーゼ複合体へのHsp90の結合も抑制された。一方でCdc37のHsp90への結合能はCK2によるリン酸化によって影響を受けなかった。細胞をCK2の特異的阻害剤で処理すると、細胞内でのCdc37のリン酸化は抑制され、それとともにCdc37のターゲットキナーゼであるRaf1やMOKの存在量が著しく減少した。これらの結果は、細胞内におけるCdc37のキナーゼに対するシャペロン機能がCK2によるリン酸化によって制御されていることを示し、CK2とCdc37のこれまでに知られていなかった繋がりを提示している。またこの事は、CK2がCdc37のシャペロン機能を介してさまざまなジグナル伝達に関わる多様なキナーゼを制御するという新しいタイプのシグナル伝達カスケードがあることを示し、なぜCK2が極めて多様な細胞現象に関わるのかというこれまで充分理解されていなかった問題に対する、分子的実体を示唆する結果である。

Dyrkファミリーの細胞内結合タンパク質の探索を行ない、Dyrk1B, Dyrk4が細胞内でHsp90及びCdc37と複合体を形成することを明らかにした。Hsp90の機能を阻害するとDyrk1BとDyrk4は細胞質でアグリゲーションを形成し、Cdc37/Hsp90がこれらのキナーゼが細胞内で可溶性に安定して存在するのに必須であることが示された。
ぜん動運動を備えたヒト十二指腸シミュレーターの開発による固形食品の消化特性の解析

十二指腸内容物の混合・消化挙動の評価は、消化管下流における栄養成分の吸収特性を理解し、制御するためにも重要である。本研究では、ヒト十二指腸の構造および機能が単純化されたヒト十二指腸消化シミュレーターを新たに開発した。腸壁運動と消化液の分泌を具備したヒト十二指腸消化シミュレーターの利用により、ぜん動運動に駆動される内容物の流動、ならびに人工胃消化物と人工消化液の混合・消化に関する基礎特性を定量的に評価することができた。十二指腸を含むヒト小腸の構造および機能について把握した結果をもとに、十二指腸の構造および機能が単純化されたヒト十二指腸消化シミュレーターの基本設計を固めた。ここで決定された基本設計にもとづいて、ヒト十二指腸消化シミュレーターのプロトタイプが試作された。ヒト十二指腸消化シミュレーターは、胃消化物の導入部、腸管部、十二指腸消化物の排出部、消化液の供給部、およびぜん動運動駆動部から構成されている。また、ヒト十二指腸消化シミュレーターの腸管部には、消化挙動を直接観察できるように透明な観察面を設置した。また、消化液の供給部は、胆汁と膵液が十二指腸の中央部で混合・分泌されていることを考慮した位置に設置した。このように、物理的消化プロセスと化学的消化プロセスが模擬された、ヒト十二指腸消化シミュレーターを新たに開発できた。試作したヒト十二指腸消化シミュレーターにおいて、十二指腸壁を模した変形可能な壁面上にぜん動運動を安定的に駆動させることができた。液状のモデル胃消化物をヒト十二指腸消化シミュレーターに導入した結果、モデル胃消化物がぜん動運動の駆動によって排出部へと移動する様子が観察された。また、腸管部へ消化液の供給速度も制御可能であることが示された。以上の結果より、新たに開発したヒト十二指腸消化シミュレーターは、十二指腸における食品の消化特性を観察・評価する上で有用なシステムとなり得ることが示唆された。本年度は、十二指腸の構造および機能が単純化されたヒト十二指腸消化シミュレーターの試作を達成し、モデル胃内容物を導入した状態で試作機を連続駆動させることも実現した。これらは、本研究課題の研究目的に合致する基礎的知見である。以上より、現在までの達成度に関して選択した自己評価が妥当であるといえる。本研究課題ではまた、本年度の研究で期待される成果をおおむね達成した。平成27年度に試作したヒト十二指腸シミュレーターにおいて、まず、人工胃消化物の導入機構および内容物の排出機構の改良を行った。人工胃消化物の導入機構に関しては、内容物がヒト十二指腸シミュレーターから前記容器への逆流を防止する弁を設置した。また、内容物がヒト十二指腸シミュレーターの出口から安定的に排出可能な弁を設置した。改良を施したヒト十二指腸シミュレーターを用いて、粘度を調整したモデル液状食品(水飴水溶液)とモデル消化液(色素水溶液)の混合状態について検討した。水飴水溶液は導入用容器から送液されたとともに、色素水溶液は腸管中央部から一定流量で分泌された。ヒト十二指腸シミュレーターにおける内容物の混合挙動は、腸管部のぜん動運動の有無や水飴水溶液の粘度の影響を受ける様子が観察された。ヒト十二指腸シミュレーターから排出された液体における色素濃度の経時変化を測定した結果、水飴水溶液の粘度が消化液との混合状態に影響することが示された。以上の検討結果より、十二指腸内部における液状胃消化物と消化液の混合挙動に関する基礎的知見を蓄積することができた。小腸上部における重要な構造と機能を単純化した機器の設計および試作を行った。さらに、食品の物理的・化学的特性と消化挙動との基礎的な知見を検討、蓄積するため、ヒト十二指腸シミュレーターを用いた検討に適する食品を選定した。選定された食品を含む胃消化物をヒト十二指腸シミュレーターに導入して消化試験を行い、食品における消化挙動を評価についても検討を進める。本年度は、平成27年度に試作したヒト十二指腸消化シミュレーターにおける人工胃消化物の導入機構および内容物の排出機構の改良を達成した。また、ヒト十二指腸消化シミュレーターの利用によって、モデル液状食品とモデル消化液の混合特性に関する有意義な結果も得られた。これらの基礎的知見は、本研究課題の研究目的に合致したものである。最終年度である平成29年度では、本研究で試作・改良したヒト十二指腸シミュレーターを用いた混合・消化特性について検討を行い、以下の成果を出すことができた。改良型のヒト十二指腸シミュレーターには、逆流防止機構を持つ人工胃消化物の導入部および安定排出機構を持つ十二指腸消化物の排出部が装備されている。本年度は、改良型のヒト十二指腸シミュレーターを用いて、液状食品モデル(基質となるペプチドを含む水飴水溶液)とタンパク質消化酵素(トリプシン)を含む人工膵液の混合・消化挙動について検討した。液状食品モデルが、ヒト十二指腸シミュレーターの腸管内を定常状態で流動している状態で、腸管中央部から人工膵液を瞬時に導入した後の消化挙動は、液状食品モデルの粘度に影響されることが強く示唆された。

ヒト十二指腸シミュレーターから排出された液体を採取し、消化生成物の濃度に関する経時変化を測定した結果、液状食品モデルの粘度によらず、消化生成物の濃度は時間に対して極大を示すことがわかった。液状食品モデルの粘度の増大に伴い、消化生成物の極大値は大きくなったとともに、極大を示す時間の延長も認められた。以上の結果は、ヒト十二指腸シミュレーターの腸管内における、液状食品モデルと人工膵液の混合状態が、基質の消化挙動に大いに影響していることを示したものである。本研究で得られた成果より、胃消化物の主要な物性である粘度は、ヒト十二指腸内で分泌される膵液等の消化液との混合および含有栄養成分の消化反応特性に影響をおよぼす因子である可能性が示唆された。十二指腸内容物の混合・消化挙動の評価は、消化管下流における栄養成分の吸収特性を理解し、制御するためにも重要である。本研究では、ヒト十二指腸の構造および機能が単純化されたヒト十二指腸消化シミュレーターを新たに開発した。腸壁運動と消化液の分泌を具備したヒト十二指腸消化シミュレーターの利用により、ぜん動運動に駆動される内容物の流動、ならびに人工胃消化物と人工消化液の混合・消化に関する基礎特性を定量的に評価することができた。本年度の研究はおおむね順調に進展したので、次年度以降の研究は当初の計画をベースに実施する予定である。具体的にはまず、本年度に試作したヒト十二指腸シミュレーターに関する人工胃消化物の導入方法および内容物の排出方法の検討を行うとともに、ヒト十二指腸シミュレーターの基礎的知見も蓄積していく。また、異なるモデル胃消化物を用いたヒト十二指腸シミュレーター研究についても着手する。一方、本年度の研究を実施してきたなかで、十二指腸の排出部の先に位置している小腸上部も簡易的に模擬することが重要であることがわかった。そのため、小腸上部における重要な構造と機能を単純化した機器の設計および試作を行う。本年度までの研究はおおむね順調に進展したので、最終年度である次年度の研究も当初の計画をベースに実施する予定である。ヒト十二指腸シミュレーターに関しては、混合試験や消化試験の結果をもとに、人工胃消化物の導入方法および内容物の排出方法の改良を図る。異なるモデル胃消化物を用いたヒト十二指腸シミュレーター研究についても推進していく。本年度に選定された食品を含む胃消化物を十二指腸シミュレーターに導入して消化試験を行い、十二指腸消化挙動に関する知見を蓄積する。また、本年度に試作した、小腸上部を単純化した機器を利用した研究についても検討する。食品工学、生物化学工学次年度使用額441,067円は、研究費を効率的に使用して発生した残額である。本研究課題の推進のため、次年度の研究費は交付申請時の計画通り使用する。また、次年度に請求する研究費と合わせて研究遂行のために使用する。
HBV感染による肝線維化進展機序の解析

B型肝炎ウイルスに感染したヒト肝細胞置換キメラマウスに自然免疫担当分子であるToll-like receptor 4(TLR4)に対する新規の抗体を投与したところ,肝線維化進展を予防する一定の効果を認めた.また,抗体を投与したキメラマウスでの目立った副作用は認められず,これらの点から新規抗体の有用性が明らかとなった.今後はこの新規抗TLR4抗体を共同開発した製薬メーカーと共に,医薬品としての開発を進めていく.B型肝炎ウイルスに感染したヒト肝細胞置換キメラマウスに自然免疫担当分子であるToll-like receptor 4(TLR4)に対する新規の抗体を投与したところ,肝線維化進展を予防する一定の効果を認めた.また,抗体を投与したキメラマウスでの目立った副作用は認められず,これらの点から新規抗体の有用性が明らかとなった.今後はこの新規抗TLR4抗体を共同開発した製薬メーカーと共に,医薬品としての開発を進めていく.B型慢性肝炎の持続的な感染により肝臓の線維化が進展するが,その機序は不明のままである.申請者らは,ヒト肝細胞置換キメラマウスを利用することでB型肝炎ウイルス(HBV)感染を起因とする線維化モデルを確立した.本研究では,これまでの結果から推測された活性酸素種(ROS)とToll-like receptor4(TLR4)を中心に,その上流と下流経路を解析することで,線維化の発症と進展の機序を明らかとしていく.本年度では,市販の抗TLR4抗体と共同研究により取得した抗TLR4抗体を用いてTLR4の中和により本経路の阻害試験を行った.その結果,市販の抗TLR4抗体では,十分な阻害を得ることが出来ずに,LPS刺激等でTNF-alphaやNK-k Bの産生を誘導する結果となった.一方で,我々で取得した抗TLR4抗体ではin vitroとin vivoでの予備試験でTLR4経路の阻害が確認でき,マウスでの毒性も低いことがわかった.引き続いてこの抗体を利用したin vivo試験を行う準備を進め,HBV感染後に毎週本抗体を投与し続けることで線維化の抑制が行われるか検討を続けた.試験期間は6ヶ月を予定しており,飼育終了が3月末の予定である.来年度以降で組織の病理学的解析,血液中のサイトカイン量の測定,肝臓での線維化関連遺伝子の発現プロファイルを確認していく.特に,線維化形成過程で観察される肝細胞の多核化についても解析を進め,前癌病変の出現機構についての分子生物学的な解析を進める.(1)肝線維化進展におけるTLR4経路の解析マクロファージ,NK細胞に対して,新規に取得した抗TLR4抗体を作用させ,その阻害効果をin vitroで確認した.その効果をin vivoで検討するためにヒト肝細胞置換キメラマウスへ抗TLR4抗体を投与した.抗体としては,ヒトTLR4特異的な抗TLR4抗体,マウスTLR4特異的な抗TLR4抗体を準備した.HBV感染させたキメラマウスに抗TLR4抗体を毎週適量投与し,6ヶ月飼育した時点で剖検した.その結果,マウス抗TLR4抗体を投与した群において肝線維化の抑制が観察された.一方で,ヒト抗TLR4抗体ではその効果が認められなかった.これらのことから,ヒト肝細胞が発現するTLR4の関与は否定された.マウス肝臓内のTLR4高発現細胞としては,クッパー細胞と肝星細胞が挙げられる.今後は,いずれの細胞がTLR4経路を介した線維化に大きな影響を与えているか検討する.(2)核分裂異常と細胞周期異常に関連する因子の解析これまでの解析から,Chk1のリン酸化状態や機能異常が中心体の機能異常へとつながることが明らかとなっている.HBV感染におけるこの現象の確認と新たな経路の有無についてHBVを恒常的に発現する培養細胞株(HepG22.15)とHBV感染キメラマウス肝臓について中心体の配置を蛍光顕微鏡により観察し,Chk1との相互作用を解析したが,Chk1のリン酸化異常などは認められなかった.(3)TLR4に対するリガンドの探索TLR4とその下流の活性化を示す予備データは得られているが,この経路が活性化された原因は不明のままである.HBV発現している培養細胞とHBV感染キメラマウス由来の肝臓を用いて,質量分析装置による探索研究の準備を進めた.来年度以降の新規研究でそのリンガンド候補分子の探索を行なっていく.長期飼育を要する動物実験を順調に終えたため,残りの期間で組織や血中マーカーについて検討する段階に到達した.ほぼ当初の予定通りであり,残りの期間でおおよその結果を得ることができると推定されるため.キメラマウスから得られた肝臓の凍結組織やパラフィンブロックを病理染色もしくはDNA,蛋白を抽出した上で分子生物学的な解析を進める.特に,抗TLR4抗体が線維化の予防に効果があるか否かが重要な点であるため,このTLR4経路の阻害が線維化と関連しているかを線維化マーカー遺伝子を定量することで行なっていく.これらの系は既報の論文で確立しており,予定通りに進むものと推察される。
真菌細胞壁β-1, 6-グルカン生合成機構の解明

酵母の生存に必須な細胞壁構成成分のうち、β-1, 6-グルカンの生合成機構は未だ明らかでない。β-1, 6-グルカン合成に必須な、多糖加水分解酵素と配列類似なKre6とSkn1が、小胞体にあるタンパク質Keg1と相互作用すること、これらが機能するには正しくフォールディングし、一部が生長する芽の細胞質膜に移行する必要があること、芽への移行には機能未知だったKeg1やCne1などが結合して介助する必要があることを、本研究で明らかにした。真菌細胞にとって必須な細胞壁多糖β-1,6-グルカンの生合成機構を明らかにするため、我々が発見した必須遺伝子産物Keg1と結合し、グルカナーゼと相同性がある、Kre6を中心に調べた。部分ペプチドを抗原として得たウサギ抗Kre6血清は、非特異的なシグナルもあるが、活性を保持するHAタグ標識タンパク質と同様に、細胞壁合成が盛んな芽が強く染まる蛍光染色像を示した。これが細胞質膜にあるか、その近傍の膜構造体にあるか明らかにするため、細胞周期を同調させ大きさの揃った芽をもつ細胞を温和に破砕し、条件を様々に変え、庶糖密度勾配遠心で分画したところ、Kre6タンパク質は、小胞体膜マーカーと常に同じ画分に検出された。更に詳細な構造を見るため、免疫電子顕微鏡観察を始めた。予備検討では、ウサギ血清は非特異シグナルのため使えず、抗HA抗体のみだが、細胞質膜より内側に多くシグナルが認められ、芽の細胞質膜近傍の小胞体への局在が支持された。他のグルカン合成関連タンパク質の抗体作製と相互作用の解析は、各タンパク質の不安定性などのため難航し、断片の位置を変えるなど次年度継続する。浸透圧ショック法で透過性にした酵母細胞で、無細胞グルカン合成系構築を検討した。^<14>Cでグルコースを標識したUDP-グルコースを基質とし、30°Cで反応後、煮沸により反応停止し、基質から転移された^<14>Cグルコースについて、様々な検討を行った。熱水不溶・クロロホルム不溶の放射性カウントは、温度依存的に孵置時間とともに増加した。その一部がβ-1,3-グルカナーゼ処理で水溶化されたことから、細胞壁合成の一部はこの系で進行したことが確認され、β-1,6-結合をもつ産物について次年度検討する基礎ができた。真菌細胞にとって必須な細胞壁多糖β-1,6-グルカンの生合成機構を明らかにするため、我々が発見した必須遺伝子産物Keg1と結合し、かつアミノ酸配列にグルカナーゼと相同性がある、Kre6を調べた。昨年度、ウサギ抗Kre6血清で、活性を保持するHAタグ標識タンパク質と同様に、細胞壁合成が盛んな芽が強く染まる蛍光染色像を示した。このように見えるKre6が、細胞質膜にあるか、他の膜構造体にあるか明らかにするため、さらに条件を様々に変え、庶糖密度勾配遠心で分画したところ、大部分のKre6は、小胞体画分に検出されるが、一部は輸送小胞と細胞質膜にも存在すると考えられた。更に異なる方法で確認するため、免疫電子顕微鏡で観察した。ウサギ血清は非特異シグナルのため使えなかったが、抗HA抗体によると、大部分は小胞体だが一部は細胞質膜に存在するという局在が支持された。この局在とKre6の機能との関連を調べるため、グルカナーゼ相同領域はそのままにして、N末端の細胞質側の一部の配列を欠損させることで、小胞体にはあるが芽の細胞質膜に運ばれない変異体を調べたところ、β-1,6-グルカン合成に障害が認められたことから、Kre6の局在場所はその活性に必須であることが分かった。Kre6と結合する必須遺伝子産物Keg1の温度感受性株では、準許容温度においてKre6の安定性が低下することと、芽の細胞質膜に集まる蛍光染色像が見られなくなることを発見した。即ち、小胞体膜に存在するKeg1はKre6の正常な構造や局在の獲得に寄与する介助分子である可能性が考えられた。他のKre6と相互作用するタンパク質の関与を含めて、Kre6の構造形成と局在化の関連を明らかにする解析が重要なことが分かった。真菌の細胞に必須な細胞壁多糖β-1,6-グルカンの生合成機構を明らかにするため、小胞体(ER)の必須遺伝子産物Keg1と結合し、かつβ-1,6-グルカン合成に必須で、多糖分解酵素と相同性をもつ、Kre6とSkn1を調べた。昨年度、多くのKre6はERにあるが、一部が出芽部の細胞質膜(PM)に存在し、Kre6変異体の解析からこのPMへの局在が活性に必須なことを明らかにした。

本年度、温度感受性Keg1-1変異株で、Keg1とKre6の結合が低下し、Kre6がERのタンパク質品質管理機構ERADで分解され易くなること、この分解だけ防いでもKre6は芽のPMに局在できないことを示した。また真核生物ERで広くタンパク質の高次構造形成に働く、カルネキシンサイクルを構成する4タンパク質の酵母相同体(Cwh41,Rot2,Kre5,Cne1)の変異株でも、β-1,6-グルカン量の低下が知られていたが、Keg1がKre5及びCne1と結合し、Kre6はKeg1及びCne1に結合した。Δcne1破壊株でもKre6が芽PMに集積できなくなることから、ERのKre6が正しい高次構造を形成して芽のPMに移行し機能を発揮するために、複数のERのシャペロン様タンパク質が働く必要があると考えられる。Kre6とSkn1を両方失った細胞は致死的で、両者はタンパク質問相互作用や局在もほぼ同等だった。Keg1には更に別の膜タンパク質が結合していることも分かり、UDP-[14C]グルコースと膜透過性化細胞或いは膜小胞画分を使った無細胞系で、膜に結合した低分子量のグルカン前駆体と予想される物質の合成にも成功した。具体的な場所も不明であったβ-1,6-グルカン合成が、ERでの前駆体生成とPMへの移行・成熟化、即ち酵素反応と小胞輸送の共役からなることを示した本研究成果は、真菌の細胞生物学で重要な意義をもつ。