hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
イネの光運動を制御するシグナル伝達系の解明

これらのイネ突然変異体、形質転換体を用いて,青色光依存の気孔開口および葉身運動とフォトトロピンの関係を解析する研究に着手した。(2)cpt2突然変異体(幼葉鞘の光屈性が特異的に低下した突然変異体)の原因遺伝子をマップベースクローニングにより82個の新規予測遺伝子が含まれる280kbの領域まで絞り込んだが,この領域は組み換え率が低いため,マップベースクローニングによる更なる絞り込みは困難になった。そのため,cpt2突然変異体ゲノムのBACクローンライブラリーから上記領域を含むクローンを分離し,領域の全配列を解読して,2つの候補遺伝子にまで絞り込んだ。その一つは葉緑体移行シグナルとキナーゼ領域をもつ遺伝子であった。この結果を受け,相補性検定のための形質転換体作出に着手した。(3)lazy1突然変異体では重力屈性の低下によって光屈性が増強されることを利用して,パスル光による光屈性の光量反応曲線の解析を可能にした。この光量反応曲線には,主要なピーク(従来の1次正屈曲)に加え,低光量側と高光量側にもピークが存在することが判明した。1次正屈曲は暗培養した芽ばえでも観測されるが,低光量側と高光量側の反応,および照射時間に依存する光屈性(従来の2次正屈曲)には赤色光前照射が必要なこと(フィトクロムに依存すること)が明確になった。これらの反応成分とフォトトロピンおよびCPT1との関係を明確にするために,lazy1と光屈性関連突然変異体との2重・3重突然変異体を作出する作業を進めた。本研究はイネを主要な材料にして光運動のシグナル伝達機構を明らかにすることを目的に計画された。本年度はイネを材料にして次の研究成果を得た。(1)葉緑体の光定位運動を解析する方法を検討し、PHOT1遺伝子(PHOT1a、b)欠損の2重突然変異体およびRNAi形質転換体を用いて、phot1はイネにおいても、シロイヌナズナ同様、葉緑体光定位運動の光受容体であることを証明した。(2)昨年度までの研究でcpt2突然変異体(幼葉鞘の光屈性が特異的に低下した突然変異体)の原因遺伝子候補を絞り込んだが、本年度は相補性検定のための形質転換体を作出した。(3)前年度、lazy1突然変異体(重力屈性が低下した突然変異体)を利用して、パルス光依存光屈性を含めた光屈性の光量反応曲線を解析する方法を確立した。本年度は、lazy1とphot1a/b2重突然変異体を掛け合わせて作出した3重突然変異体、およびlazy1とcpt1だ突然変異体を掛け合わせて作出した2重突然変異体を用いて、光量反応曲線で分離される全ての反応(3つのピークからなるパルス光依存光屈性、および照射時間依存光屈性)はphot1/CPT1光受容系に依存することを証明した。本年度は、光量反応曲線で分離される光屈性反応成分と光受容体およびシグナル伝達因子との関係を分子遺伝学的にさらに詳細に解析するため、シロイヌナズナ胚軸の光屈性の光反応曲線を解析する方法を検討し、確立した。この方法を用いて、パルス光依存光屈性と照射時間光屈性の詳細な光量反応曲線を求めた。現在、シロイヌナズナの各種突然変異体(phot1、phot2、phot1/2、nph3など)を用いて、光受容体・シグナル伝達因子と反応成分の関係を解析している。本研究はイネを主な材料にして光運動のシグナル伝達機構を明らかにすることを目的とする。本年度は主に次の成果を得た。(1)イネCPT2遺伝子の機能解析。cpt2突然変異体に原因遺伝子候補を導入した形質転換体を作出し、この形質転換体の光屈性を解析して、cpt2突然変異体はこの遺伝子の突然変異体であることを証明した。さらに、レポーター遺伝子との融合遺伝子(CPT2: CFPなど)を導入したイネ形質転換体を作出し、CPT2の機能を解析する研究を進めた。
軟骨下骨脆弱性の関節軟骨変性へ与える影響および骨形成薬の軟骨変性抑制効果の解析

変形性関節症は、加齢に伴い関節軟骨が変性し疼痛を伴う疾患であり、病期が進行すると外科的治療が必要になることも多い。現在まで関節軟骨の変性のメカニズムについての研究は多くなされてきたが、近年の臨床研究の結果から、関節周囲の骨の脆弱性および微小骨折の発生が関節症進行に寄与する可能性が指摘されはじめている。われわれは、先行研究において関節軟骨に侵襲を加えずに軟骨下骨のみに脆弱性を加える動物モデルの作成に成功し、軟骨下骨の脆弱性が関節軟骨の変性を増悪させる可能性を示した。新たに全身性の骨粗鬆症が軟骨下骨微小骨折による軟骨変性に与える影響を解明すべく、12週例のラットに両側卵巣切除を行い12週間待機し、全身性の骨粗鬆症モデルを作成した。このモデルに、脛骨近位端内側の軟骨下骨部位に関節面と平行に骨孔を0.5mmのmicrodrillを用いて7カ所作成し、膝関節軟骨下骨微小骨折モデルを作製した。これらを組み合わせて、Sham群、閉経後骨粗鬆症群、及び閉経後骨粗鬆症+軟骨下骨微小骨折群を作成した。全身性骨粗鬆症の影響により閉経後骨粗鬆症+軟骨下骨微小骨折群で閉経後骨粗鬆症群に比べて変形性関節症の進行の悪化が見られるかを、マイクロCTを用いた計測と、組織染色を用いた形態学的検索で検討した。マイクロCTでは閉経後骨粗鬆症群で骨梁数減少傾向が見られ、閉経後骨粗鬆症+軟骨下骨微小骨折群ではやや骨梁肥厚が見られたが、軟骨直下の皮質骨には差は見られなかった。組織学的染色では骨粗鬆症群と閉経後骨粗鬆症+軟骨下骨微小骨折群で表層に軽度の染色性の低下があるも毛羽立ちや亀裂・欠損等は認めず、閉経後骨粗鬆症+軟骨下骨微小骨折群で変形性関節症の進行の悪化は観察されなかった。おおむね予定通りに進んでいるが、関連する遺伝子解析までは行えていない。また、若年ラットでは全身性骨粗鬆症並存モデルで、軟骨下骨微小骨折による変形性関節症の悪化が見られなかった。全身性骨粗鬆症の検討では今後高齢のラットでの検討が必要と考える。本研究では、前述した目的を達成するために、引き続き軟骨下骨の微小骨折が軟骨の変性に影響を及ぼす遺伝子学的変化の解析を中心に行う。ラットの脛骨近位端内側の軟骨下骨部分に骨孔を開けた脛骨軟骨下骨微小骨折モデルを用いて、1)Sham群、2)軟骨下骨微小骨折群、3)既存変形性関節症モデル(内側側副靭帯切除+内側半月板切離モデル)、4)既存変形性関節症モデル+軟骨下骨微小骨折追加群の4群を作成し、網羅的遺伝子解析を施行する。具体的には関節軟骨、軟骨下骨よりRANを抽出しマイクロアレイ(GeneChip Gene 1.0/2.0 ST Array)を行うことにより、1)と2)の比較による軟骨下骨の変化によりもたらされる軟骨における遺伝子の変化を、1)と3)の比較による既存変形性関節症モデルにおける変化の相違を検討し、さらに2)、3)、4)間についての検討を行うことにより、両者の相乗効果もしくは相加効果を検討する。同時に軟骨下骨における遺伝子の変化を検討し、軟骨下骨・軟骨間の遺伝子発現のクロストークを検討する。発現型が変化した重要な変形性関節症関連遺伝子は、real-time PC Rを行いバリデーションを行う。上記で発現の変化を確認した遺伝子において、軟骨内、特に軟骨深層での発現の変化を検討するため、免疫組織染色を行う。また6ヶ月齢程度の高齢ラットを用いて、Sham群、閉経後骨粗鬆症群、及び閉経後骨粗鬆症+軟骨下骨微小骨折群を作成し、全身性骨粗鬆症と軟骨下骨脆弱性の合併が変形性関節症進行を促すかをマイクロCT及び組織染色を用いて調査する。

全身性骨粗鬆症の影響により閉経後骨粗鬆症+軟骨下骨微小骨折群で閉経後骨粗鬆症群に比べて変形性関節症の進行の悪化が見られるかを、マイクロCTを用いた計測と、組織染色を用いた形態学的検索で検討した。マイクロCTでは閉経後骨粗鬆症群で骨梁数減少傾向が見られ、閉経後骨粗鬆症+軟骨下骨微小骨折群ではやや骨梁肥厚が見られたが、軟骨直下の皮質骨には差は見られなかった。組織学的染色では骨粗鬆症群と閉経後骨粗鬆症+軟骨下骨微小骨折群で表層に軽度の染色性の低下があるも毛羽立ちや亀裂・欠損等は認めず、閉経後骨粗鬆症+軟骨下骨微小骨折群で変形性関節症の進行の悪化は観察されなかった。おおむね予定通りに進んでいるが、関連する遺伝子解析までは行えていない。また、若年ラットでは全身性骨粗鬆症並存モデルで、軟骨下骨微小骨折による変形性関節症の悪化が見られなかった。全身性骨粗鬆症の検討では今後高齢のラットでの検討が必要と考える。本研究では、前述した目的を達成するために、引き続き軟骨下骨の微小骨折が軟骨の変性に影響を及ぼす遺伝子学的変化の解析を中心に行う。ラットの脛骨近位端内側の軟骨下骨部分に骨孔を開けた脛骨軟骨下骨微小骨折モデルを用いて、1)Sham群、2)軟骨下骨微小骨折群、3)既存変形性関節症モデル(内側側副靭帯切除+内側半月板切離モデル)、4)既存変形性関節症モデル+軟骨下骨微小骨折追加群の4群を作成し、網羅的遺伝子解析を施行する。具体的には関節軟骨、軟骨下骨よりRANを抽出しマイクロアレイ(GeneChip Gene 1.0/2.0 ST Array)を行うことにより、1)と2)の比較による軟骨下骨の変化によりもたらされる軟骨における遺伝子の変化を、1)と3)の比較による既存変形性関節症モデルにおける変化の相違を検討し、さらに2)、3)、4)間についての検討を行うことにより、両者の相乗効果もしくは相加効果を検討する。同時に軟骨下骨における遺伝子の変化を検討し、軟骨下骨・軟骨間の遺伝子発現のクロストークを検討する。発現型が変化した重要な変形性関節症関連遺伝子は、real-time PC Rを行いバリデーションを行う。上記で発現の変化を確認した遺伝子において、軟骨内、特に軟骨深層での発現の変化を検討するため、免疫組織染色を行う。また6ヶ月齢程度の高齢ラットを用いて、Sham群、閉経後骨粗鬆症群、及び閉経後骨粗鬆症+軟骨下骨微小骨折群を作成し、全身性骨粗鬆症と軟骨下骨脆弱性の合併が変形性関節症進行を促すかをマイクロCT及び組織染色を用いて調査する。
腰痛発生リスクの高い状況における腰部負担を軽減するおむつ交換技術の開発と臨床評価

本研究は、腰痛発生リスクの高い状況における腰部負担を軽減するおむつ交換技術を開発することを目的とした。その結果、「夜勤帯のケア回数の増加」、「ベッドの低さ」、「利用者の体格差・拘縮」などが影響していた。また、管理者の多くがスタッフの職業性腰痛に対する問題意識をもち、組織的な腰痛予防教育を行う一方、施設別で対策が異なることを明らかにした。さらに、作業時間帯による生体力学的評価には変化がみられず、バイタルサインズや主観的評価の変化が腰部負担につながりやすいことが示唆された。【目的】本研究は、腰痛をもつスタッフの日勤帯・夜勤帯別のケア実施状況に着目した高齢者施設における腰痛発生リスクの高いおむつ交換の実態を明らかにする.【方法】1.対象:高齢者施設32施設において日・夜勤帯両方に勤務し、最近1ヶ月に腰痛をもつ同意が得られたケアスタッフ708人. 2.データ収集方法:質問紙調査を行った.調査項目は、(1)属性、(2)日・夜勤帯の腰痛の程度(Visual Analog Scale)とケア回数、(3)ケア実施時の腰痛の程度(5段階リッカート尺度)、(4)腰痛を感じたときの環境と利用者の状態とした.【結果】1.属性:有効回答は659人(93.1%).平均年齢は40.5±12.1歳、性別は女性588人(89.2%)、男性71人(10.8%).職種は介護福祉±247人(37.5%)、看護師127人(19.3%)、ヘルパー123人(18.7%)の順で多かった. 2.日・夜勤帯の腰痛の程度とケア回数:腰痛の程度は、日勤帯5.1±2,5点、夜勤帯6.9±2.6点と夜勤帯の方が高かった(P<.001).おむつ交換回数は、日勤帯は110回が約40%、夜勤帯は31回以上が約40%を占めた.3.ケア実施時の腰痛の程度は、おむつ交換(2.5±1.0点)と特浴介助(2.4±1.0点)が、移乗介助・一般浴介助・体位変換より高かった(P<.001). 4.腰痛を感じたときの環境と利用者の状態:ベッドの高さが低いと約6割が答え、利用者の状態に違いがあるとした約8割の主な内容は、「体格差」、「寝たきり尾」、「拘縮」、「協力が得られにくい」、「弛緩や緊張などの身体的反応」であった.【考察】日勤帯・夜勤帯によるスタッフ数やケア内容の変化、および環境や利用者の身体・精神の状態など、複雑に絡み合う腰痛発生リスクへの対策が腰痛予防につながることが示唆された。【目的】本研究は、臨床における腰痛発生リスクの高いおむつ交換の実態を明らかにすること及び臨床応用による腰部負担を軽減するおむつ交換技術の有用性を検証することを目的とする。平成20年度は、腰痛発生リスクの高いおむつ交換には、夜勤帯のケア回数の増加、ベッドの低さ、利用者の体格差・拘縮などが影響することを明らかにした。さらに平成21年度は、高齢者施設における看護・介護管理者のスタッフの職業性腰痛に対する問題意識及び組織的な腰痛予防対策を明らかにする。【方法】対象は、北陸3県にある医療・介護療養病床、介護老人保健施設、介護老人福祉施設(特別養護老人ホーム)の看護・介護スタッフの管理者29人である。方法は、構造化面接調査を行い、職業性腰痛に対する問題意識の有無とその内容、腰痛予防教育の実施の有無とその内容、腰痛保護ベルトの紹介実施の有無とその方法について、記述的に分析した。また施設が所有している移乗支援機器やベッドの種類と台数は、量的に施設別で記述的に分析した。【結果】どの施設における管理者であっても80%以上が職業性腰痛に対する問題意識をもち、理由として「腰痛が原因で欠勤・離職につながる」が多かった。また対策として、腰痛予防教育は約50%以上の割合で行われていた。なお、腰痛保護ベルトの紹介は療養病床75%、老健28.6%、特養16.7%、電動で高さ調節できるベッドの総台数は療養病床32.9%、老健49.5%、特養85.3%と、施設による違いがみられた。【考察】管理者が看護・介護スタッフの職業性腰痛を定期的に把握し、スタッフ個人ではなく組織的な腰痛予防対策につなげていくため、教育内容や移乗支援機器の活用など検証を深める必要性が示唆された。【目的】本研究は、臨床における腰痛発生リスクの高いおむつ交換の実態を明らかにすること、および臨床応用による腰部負担を軽減するおむつ交換技術の有用性を検証することを目的とした。

さらに平成21年度は、高齢者施設における看護・介護管理者の80%以上がスタッフの職業性腰痛に対する問題意識をもち、組織的な腰痛予防教育を約50%以上行う一方、腰痛保護ベルトの紹介や電動で高さ調節できるベッドの総台数が療養病床、老健、特養と施設により異なることを明らかにした。そして平成22年度は、腰痛発生リスクの高い状況下におけるおむつ交換時の腰部負担を生体力学的評価し、腰部負担を軽減するおむつ交換技術の臨床応用について検証することを目的とした。【方法】対象:被験者は研究協力の得られた看護・介護職(平均年齢31.2±4.4歳)。要介護者モデルは寝たきり度C2を想定し、テープ型紙おむつと尿とりパッドを装着した。測定方法:3次元動作解析、バイタルサインズ(体温、血圧、脈拍)、主観的評価(自覚疲労症状、眠気)を用いて、5つの時間帯(20、22、24、2、5時)におむつ交換作業を行った。【結果】作業時間帯による3次元動作解析には明らかな変化はみられなかった。一方、バイタルサインズは作業時間帯が遅くなるにつれて低下し、5時に上昇する変化がみられた。主観的評価も同様な変化がみられた。【考察】夜間帯のおむつ交換は、サーカディアンリズムによりバイタルサインズが低下しており、腰部負担につながりやすいと考える。そのため腰部負担軽減として、スタッフ個人がベッドの高さ調節や膝乗せ姿勢を活用することに加えて、組織的な腰痛予防対策(作業時間帯の調整など)が必要であることが示唆された。
原子間力顕微鏡による新規細胞操作法の開発

原子間力顕微鏡を利用した細胞操作法の開発を行うため、本年度は生体膜タンパク質に着目した。赤血球膜に存在するグリコフォリンAとバンド3タンパク質が、それぞれ小麦胚レクチン(WGA)およびコンカナバリンAとに特異的に結合する糖鎖を持つことを利用して、原子間力顕微鏡の探針にこれらのレクチンを固定した後、赤血球表面から膜タンパク質を引き出す実験を行った。この実験において重要な役割を果たす、WGAは2量体タンパク質なのでそのサブユニット間結合力を測定した。その結果、サブユニット間結合力は150pN程度のかなり強いものであることがわかった。そのloadingrate依存性の測定も行った。また、これまでの実験で、細胞骨格に結合しているバンド3と結合していないグリコフォリンAではその延伸曲線に違いがあることがわかっていたので、本年度は細胞骨格そのものの延伸力学的性質を解明することを目的とした。赤血球の細胞膜脂質をリン脂質分解酵素あるいは非イオン性界面活性剤により除去した後、細胞骨格だけをとりだし、これをガラス基板に固定し、コンカナバリンAおより抗アクチン抗体を固定した探針を用いて、細胞骨格の特異的部位からの引き出し実験を行った。コンカナバリンAはバンド3を通じてアンキリン結合部位から、また抗アクチン抗体はスペクトリンのネットワーク構造をまとめる部位にあるアクチンに結合して細胞骨格を延伸する。それぞれの部位からの延伸曲線には違いが見られることから、一様なネットワークと考えられていた赤血球の細胞骨格には局所により力学的性質が異なることを発見した。細胞内への遺伝子DNAの注入法の開発に関しては、注入するDNAの定量化を、原子間力顕微鏡探針先端に結合したDNA量の測定をけい光顕微鏡を用いて行っている。論文発表について現在準備中である。
タンハク質の生体内メイラード反応の免疫学的解析

グルタルアルデヒド(GA)で架橋したウサギ血清アルブミン(RSA)を抗原(pRSA)として、ウサギより得られた抗体の認識能により、生体内でGAと同様の反応生成物を生じさせ得る化合物の検索を行った。メイラード反応によりタンパク質に結合することが報告されているフルクトースが、反応の経過と共に、抗体との高い親和性を示すようになった。グルコースとRSAの反応生成物も抗体との親和性を示したが、フルクトースと比較して、親和性の出現に長い反応時間を要した。そこで、ボロネートアフィニティークロマトグラフィー並びにHMFの定量により、RSAの糖化率と抗体との親和性の相関を調べたが、糖化の程度の低いフルクトースが高い抗体親和性を有しており、糖化されるだけでは、抗体の親和性は出現しないことが明らかとなった。そこで、ゲルろ過HPLCにより、分子量と抗体親和性との関係を調べた。フルクトース反応物は糖化の程度は低いものの、糖化によりRSA分子を分子間で架橋する傾向が、グルコースと比較して顕著に高いことが明らかとなり、さらに分取した高分子量画分で、明らかにタンパク質濃度当たりの抗体親和性が高いことが示された。従って、抗体の認識能から判断して、生体内には存在していないと思われるGAと同様の反応生成物が、RSAを分子間で架橋し得る分子で生成することが初めて示唆された。同様に、アスコルビン酸もRSAとの反応により抗体との親和性が生じることを認めた。その反応も、ゲルろ過HPLCによる分画により、分子間架橋物を生成させる傾向が強いことが明らかとなった。以上の結果は、生体内メイラード反応で生じる分子間架橋物が、アルブミン分子のin vivoにおける老化反応物として、B型肝炎ウイルスの感染等に関与していることを示唆するものである。グルタルアルデヒド(GA)で架橋したウサギ血清アルブミン(RSA)を抗原(pRSA)として、アジュバントを用いてウサギに注射免疫した。初めに、得られた抗血清を用いたGA架橋RSAのハプテン構造に対する酵素免疫測定(ELISA)法の開発から着手した。即ち、マイクロプレートにpRSAをコーティングし、これに段階希釈した抗血清を加えた。B/F分離後、peroxidaseで標識した抗ウサギlgG抗体を加え、インキュベートし、結合したperoxidase活性を測定した。本抗血清の力価は10^4であった。pRSAを階段希釈してコーティングし、本ELISAによるpRSAの定量を行ったところ、その最低検出限界は6ng/wellであった。RSAと同条件でGAを架橋した牛血清アルブミン(pBSA)、ヒト血清アルブミン(pHSA)を各々プレートにコーティングして、抗血清の結合能を調べたところ、これらのGA架橋タンパク質も高い結合性を示し、さらにその結合は遊離のpRSAと競合した。従って、抗血清中の抗pRSA抗体は他の動物由来のアルブミンに対するGA架橋物とも交差反応性を示すことが明らかとなった。pRSAの競合による結合の阻害率から、本抗体の親和性はpRSA=pBSA>pHSAの順であった。各種の糖をRSAと反応させたところ、フルクトースと共にRSAをインキュベートしたときに、他のグルコース、ラクトース等と比較して抗pRSA抗体の高い結合が生じた。この結果は、ある種の糖とアルブミンの間のメイラード反応により、GAと同様の架橋構造が生じる可能性を示唆するものである。

グルコースとRSAの反応生成物も抗体との親和性を示したが、フルクトースと比較して、親和性の出現に長い反応時間を要した。そこで、ボロネートアフィニティークロマトグラフィー並びにHMFの定量により、RSAの糖化率と抗体との親和性の相関を調べたが、糖化の程度の低いフルクトースが高い抗体親和性を有しており、糖化されるだけでは、抗体の親和性は出現しないことが明らかとなった。そこで、ゲルろ過HPLCにより、分子量と抗体親和性との関係を調べた。フルクトース反応物は糖化の程度は低いものの、糖化によりRSA分子を分子間で架橋する傾向が、グルコースと比較して顕著に高いことが明らかとなり、さらに分取した高分子量画分で、明らかにタンパク質濃度当たりの抗体親和性が高いことが示された。従って、抗体の認識能から判断して、生体内には存在していないと思われるGAと同様の反応生成物が、RSAを分子間で架橋し得る分子で生成することが初めて示唆された。同様に、アスコルビン酸もRSAとの反応により抗体との親和性が生じることを認めた。その反応も、ゲルろ過HPLCによる分画により、分子間架橋物を生成させる傾向が強いことが明らかとなった。以上の結果は、生体内メイラード反応で生じる分子架橋物が、アルブミン分子のin vivoにおける老化反応物として、B型肝炎ウイルスの感染等に関与していることを示唆するものである。
視覚障害者の歩行時動作解析と外部からの光通信技術による歩行誘導に関する研究

本研究では、白杖歩行する視覚障害者を、主に可視光通信によって誘導支援することを可能にするための基礎データの蓄積と解析を行い、よって歩行誘導システムの開発を進めることを目的として行った。本研究では、視覚障害者の誘導ニーズ調査からはじめ、交差点横断歩道の誘導支援における視覚障害者の歩行挙動分析といくつかのシステム改善策の提案、屋内歩行実験として地下鉄構内の支援システムの構築と評価を行い、多くの知見を得た。本研究では、平坦な歩道上での移動と、信号交差点の実横断歩道上(実際の段差等を含む)での移動について十分な実証実験と意識調査を行い、視覚障害者の個人特性及び歩行動作全体に対する理解と支援を考える上での基礎データを蓄積し、移動目標地点から出される通信光による歩行誘導技術について考察することを目的として行った。まず、視覚障害者の屋内・屋外歩行時における運動特性と障害物・危険回避状況の調査分析については限定的な調査の分析を行い、次年度以降の本調査に向けての下準備を行った。次に、信号交差点の実横断歩道における、視覚障がい者と健常者の歩行実験を行い、健常者についてはいくつかの異なる状況を想定して実験することによって、比較可能な基礎データを蓄積した。また、導入した動作解析ソフトを活用して、効率よく解析可能なシステムを構築し、歩行動作の分析を行った。実横断歩行での通信光による誘導実験の結果は良好で、今後さらに誘導の安全性を高める工夫を高める方法について検討できた。今年度の研究では、主に信号交差点の実横断歩道上(実際の段差等を含む)での移動についてこれまで蓄積したデータに基づいて、通信光を利用した場合に容易に歩行できる人と、導線からそれてしまう人がどのような原因で違いが生じているかなどが明確になることに注意してパターン分析を行った。その結果、この導線からそれてしまう幾つかの要因を挙げることができた。そこで次に、これらの要因の内で、重要な横断歩道を渡り終える側の数mで信号機からの通信光が届きにくくなるエリアが存在するために、渡りおえるところで通信光を探すため立ち止まってしまう問題の改善と、通信光を端末で受信することができる範囲がすこし広いことからくる正しい方向の読み間違えがあり、これによる導線からのずれの問題の改善に対してさまざまな検討をおこなった。信号機からの通信光の届きにくいエリアの対策では、信号機側の改良を繰り返すことによって、通信光が全ての横断歩道エリアで届くように改良できた。このような改善を行った場合とそうでない場合で横断歩行実験を行ったが、改善を行うことで最後まで渡りきるのがより容易になった。また端末の受信幅を狭めることなどを行うことにより、正しい方向に常に向かうように様々な改善を行った。その結果、導線から外れてしまう被験者がほとんどいなくなるなどの効果が得られた。しかしこれらの実験の中で新たな課題も発見され、次年度の課題も明らかとなった。今年度は本研究の最終年度として、これまでの研究成果を踏まえて以下の内容を並行して行った。1)屋内歩行誘導支援研究:平坦な通路(屋内)での可視光通信による白杖歩行者誘導にむけた、i)ニーズ調査とii)地下鉄構内誘導実験2)実信号横断歩道での信号機からの可視光通信による白状歩行誘導実験、i)信号機と受光器改良実験、ii)可視光誘導の慣れによる効果と動作挙動分析1-i)では、視覚障害者に実際に可視光通信による誘導をどんな場所でしてほしいか詳細に聞いたところ、自宅の通路誘導ではほとんど必要性を感じていないが、特に地下鉄構内での出口誘導などでのニーズが高いことが分かった。そこで1-ii)において、名古屋市の地下鉄構内において改札口から各出口まで可視光通信システムを構築して誘導実験を行い、安心など一定の効果がわかった。2-i)では、横断完了手前の受光困難状況の改善案と受光レンズ面に様々な素材を貼付する受光性能改良案を疑似全盲者と視覚障がい者に対して実験検討した。以上の改善案の結果、横方向変位等を抑制する可能性を示すことができた。2-ii)では、上記の改良をすることなく、何度も誘導横断練習することで誘導効果がどの程度改善されるかを実験検討した。その結果、ほとんどの被験者で慣れによる誘導改善がみられることがわかり、また誘導精度改善が見られない被験者の歩行時挙動や信号機方向の探索動作の特徴も明らかとなった。
明治期における近世戯作の享受に関する研究

木版で印刷された江戸時代の小説が、明治時代になって、活版印刷が登場した結果、どの作品が、引き続き読まれることになったのか、印刷技術の革新のなかで生き残り読まれた作品をできるだけ可能な限り資料的に確認しようと試みた。明治期の刊行データを読売新聞などの新聞から集積し、実際に、国会図書館等の文庫や図書館で明治期刊行物を調査した。その結果、木版から活版への過渡期における様々な書物の形式についての試みや、江戸期の木版印刷物がどのような運命を辿ったか等の発見があった。本研究は、木版印刷による近世戯作が、明治期の印刷手段の変更(活版印刷等)をへてどのように流通し、近代読者に受容されていったかを考察する基礎研究である。次の(A)(B)2つの課題を設定し、調査を進めている。(A):明治期の新聞・雑誌の紙面、出版月報等の資料より、可能な限り近世戯作(ならびに古典)の明治期刊行に関するデータを集積するとともに、既存の目録類により今日現存する資料の所蔵先等の確認を行う。(B):(A)に関する現存刊行物(資料)確認のため、公共図書館等で閲覧調査を実施し、調査閲覧データ化する。平成23年度は(A)に少し重点を置き、古書店刊行目録や、既存の目録類、新聞紙面情報(読売新聞・東京日日新聞・出版書目月報など)によるデータ集積を行って来た。本年度(平成24年度)も(A)に関する調査作業として、引き続き明治期新聞紙面情報(いろは新聞・絵入自由新聞等)によるデータによる追加作業を執り行った。明治20年代後半から30年代までの基礎データ追加も読売新聞等で実施した。20年代よりはじまる叢書類については内容記載を簡略版としたが概ね計画通り情報収集している。(B)公共図書館等での閲覧調査に関しては、大阪府立中之島図書館・篠山市立青山文庫など関西圏の図書館や、国会図書館や千代田区立図書館、昨年度実施出来なかった東京大学明治新聞雑誌文庫への調査、東北の酒田市立光丘図書館、長野の上田市立図書館花月文庫、千葉の成田山仏教図書館等で効率的に書冊の閲覧をおこなうことが出来た。データ整理面で、まだ画像に関しては蒐集データ段階であるが、少しずつ利用可能データ加工を進めていく予定。本研究は、木版印刷による近世戯作が、明治期の印刷手段の変更(活版印刷、銅版印刷等)を経てどのように流通し、近代読者に受容されていったかを考察する基礎研究である。次の(A)(B)2つの課題を設定し、調査を進めていった。(A):明治期の新聞・雑誌の紙面、出版月報等の資料より、可能な限り近世戯作(ならびに古典)の明治期刊行に関するデータを集積するとともに、既存の目録類、古典籍商の目録より、今日現存する資料の所蔵先等の確認をおこなった。古書店目録、既存目録、新聞紙面情報(読売・東京日日・出版書目月報・いろは・絵入自由)などを調査し、データ化をおこない、最終年度である平成25年度は、そのデータ点検と国会図書館から公開されている官報記事の点検を主としておこない、当初予定した基礎的なデータ入力をほぼ完了した。明治期において近世戯作の諸ジャンルのうちどの作品が翻刻されていったか、把握可能なデータとなった。(B):(A)に関する現存刊行物(資料)確認のため、公共図書館等で閲覧調査を実施し、調査閲覧のデータ化をおこなうことを実施してきた。書影撮影は許可の点で至らなかったものもあったが、国会図書館や東大明治新聞雑誌文庫などの調査など想定していた文庫の訪問は達成できた。平成25年度は個人文庫蔵のものを借用でき、それを中心に撮影をおこなった。研究成果の総括の一部として平成25年度には論文を公表した。集約したデータそのものの公開も今後公開に向けて準備している。(A)明治期の新聞・雑誌の紙面、出版月報等の資料より、可能な限り近世戯作(ならびに古典)の明治期刊行に関するデータを集積する(B)公共図書館等で閲覧調査を実施する、の2つの課題を設定していたが、本年度は(A)に少し重点を置き進めていった。(A)公開されている目録類・DB等からの基礎情報の蒐集に関して、順調に当初予定していた抽出作業を進めた。目録類として、特に古書店の刊行目録などに絞りデータ入力を行った。作成にあたり、【既存の目録類】、【新聞紙面情報】、(B)の【調査閲覧データ】を1つのDB上で入力作業を行ったが、今後(B)での調査閲覧の進展により、【既存目録データ】のうち、所蔵機関の明示されたものを【調査閲覧データ】に更新していくこととなり、検証済みかそうでないかが一瞥できる。【新聞紙面情報】にあたるものとして、具体的には読売新聞・東京日日新聞・出版書目月報等の資料より、情報収集を執り行い、可能な限りDBに反映させることができた。紙面による進行度合いに違いはあるものの、概ね計画通り収集している。

(B)公共図書館等での閲覧調査に関して、当初本年度に実施予定であった地域を変更し、国文学研究資料館や都立中央図書館などの東京圏ならびに関西圏の機関で実施した。予備調査段階で、冊子目録や、外部公開DBとは別に、所蔵館内用のDBなども利用して記載データの充実を図るなどし、効率的に書冊の閲覧ならびに撮影にあたった。今年度の調査のなかで、明治期活版翻刻本のなかで紙型の流用による刊行が具体的に検証できた点、ならびに紙型流用ではないものの、活版を元版としている書冊の確認や、広告で述べていることとの差違などを具体的に確認できる作品を数点を見いだしえた。今後の公表にむけ、現在、論文を構想中である。また調査時に確認しえた書冊での発見をもとに論文を1本公表した。(A)新聞記事等からの情報収集に関しては概ね順調と言える。データ収集では、いろは新聞や絵入自由新聞などを今回追加したが、この小新聞と称されるものに多く広告がなされているため、貴重な情報も多い。入力に時間のかかる面は否めないが、今後も相応の時間をあてるため支障はない。昨年度出来なかった新聞広告の画像データ収集は進捗状況をみて本年度スタートさせた。安売りで有名な兎屋などの広告類も年次をおって整理しているため、近世戯作のボール表紙本等が如何にどの程度の期間を経て廉価に流通したかも考察しうる基礎データが整ってきた。(B)各図書館等の機関への調査閲覧ならびに収集に関しては、各所蔵機関目録や書目DBなどから、ある程度、一図書館での点数を掌握した上で調査収集にあたっているため、どうしても年度後半にずれ込んでいる。しかし近年の大学業務の多様化により、集中しての調査日数を確保できない点があり、時間の調整に問題を残している。それでも酒田光丘文庫をはじめ多くの図書館・文庫に調査に赴くことができた。本年度、調査時に確認しえた書冊をもとに論文を1本公表した。また研究成果を踏まえたアウトリーチ活動として、勤務校貴重資料室での展覧を企画し(勤務校が大会実施した真宗保育学会日時にあわせ一般にも開放)、その展覧解説リーフレットを作成。ほかに、昨年度の調査で、明治期活版翻刻本のなかで紙型の流用による刊行状況が具体的に検証でき論文構想中としたが、その原稿を執筆(発表誌を検討中)。また、活版翻刻本に顕著に確認できる序文を巡って、近世戯作と近代活版本を対象にしデータを整理(その成果は次年度に論文公表予定)。出版書目月報などからのデータ収集では、今回の研究対象が近世戯作の明治期刊行物ということもあり、ある年次に集中して出版申請がなされているため、情報件数も多く、入力に時間のかかる面は否めないが、相応の時間をあてるため今後も支障はない。新聞広告の場合、同一書冊の広告でも掲載紙あるいは時期によって文面に変更がみられることも多く、現状のデータ化においては一点一点のデータとして進めている。新聞広告の画像データ収集は進捗状況をみて集中的に執り行うことにした。(B)各図書館等の機関への調査閲覧ならびに収集に関し、本年度は北海道東北地区調査を中心に研究を予定していた。しかし、今般の未曽有の東北の震災の影響を鑑み変更し、東京圏や関西圏での調査を実施した。変更した上での達成度については、概ね順調といえるが、画像撮影の点で、業者依頼のみで可能な場合もあり、研究成果公表を将来ウェブ上で行うことは許可しないという機関もあるため、そうした場合、ひとまず文書データのみでの収集を行っている。
cDNAマイクロアレイを用いた臓器虚血障害、再潅流障害における遺伝子発現の解明

虚血、再潅流傷害の過程を遺伝子発現の面から網羅的に捉えようとする目的でマウス肝、腎の虚血、再潅流モデルを作成しcDNAマイクロアレイによる解析を行った。肝、腎の虚血再潅流モデルでは血清逸脱酵素の上昇、組織所見によるアポトーシスの増加から有用なモデルであると判断した。このモデルを用い時関経過にそって多くのポイントで臓器を採取しその時点での遣伝子発現状況をマイクロアレイを用いて解析した。時間軸に沿った実験数を多くとることにより、より詳細なクラスター解析が可能となった。得られたデータは縦軸に最大約40,000種類の遺伝子、横軸に実験数(813)をプロットし、遺伝子軸(縦軸)にone way clusteringを行うことにより虚血、再潅流ストレスにより共発現する遺伝子達がクラスターを形成した。その結果、既知の遺伝子を核としたクラスターの解析により遺伝子同士の新たなネットワークが予測可能であった。次に虚血、再潅流傷害を抑制する現象として知られているischemic preconditioning(IP)のモデルをマウスの肝で作成しその傷害抑制効果を血清逸脱酵素やアポトーシス数で確認した後、同様にマイクロアレイによる解析を行った。この結果を先のデータペースと比較することによりIPで誘導されている遺伝子を調べた。上位に誘導されている遺伝子には既知の細胞保護因子も多く含まれこの中にはシグナル伝達に関わるもの、抗酸化作用を持つもの、シャペロンの作用をもつもの、機序が不明のものが含まれた。ここからIPは多様な細胞保護機構を持つと考えた。そうであれば誘導された機能の未知な遣伝子の中に新たな細胞保護因子が見つかる期待がある。現在、培養細胞において虚血、再潅流傷害に匹敵する系をつくり上記で細胞保護因子の候補となった遺伝子を導入しその効果を判定する段階に入っている。
ｉＰＳ細胞技術を基盤とした歯槽骨吸収リスクの術前診断法の創生

個々の患者から作製可能なiPS細胞(人工多能性幹細胞)は、試験管内で患者固有の生体反応を再現するツールとなる可能性を秘めている。本研究では、患者歯肉細胞から、エピソーマルプラスミドを用いてウイルスフリーのiPS細胞株の作製を試み、これに成功した。次に、マウス歯肉由来iPS細胞を用いた検討を行い、iPS細胞を凝集体の状態で分化誘導することにより、ハイドロキシアパタイト結晶構造を有する成熟な骨芽細胞への分化が可能であることを明らかにした。本研究の成果は、将来的に染色体に遺伝子挿入のないiPS細胞を骨芽細胞に分化誘導することで分化過程の個体差を検出していく技術に繋がる可能性が期待される。歯槽骨増生術を施した部位における骨組織再生の程度や速度には大きな個人差がある。ただし、現在の補綴歯科治療には歯槽骨再生の個人差を評価するための分子生物学的な診断法はなく、治療経過は患者の治癒能力に頼らざるを得ないのが現状である。一方で、個々の患者から作製可能なiPS細胞(人工多能性幹細胞)は、どんな細胞にもなれる万能細胞であるため、試験管内で患者固有の生体反応を再現するツールとなる可能性を秘めている。本研究では、患者の歯肉から作製したiPS細胞を試験管内で骨芽細胞に誘導し、その分化能の評価が、骨組織再生の術前診断技術の基盤技術となる可能性を探索することを目的とした。まず、歯科治療の際に切除された歯肉から分離した線維芽細胞からiPS細胞を作製した。ただし、ウイルスベクターを用いてiPS細胞を樹立した場合、染色体上に遺伝子を挿入してしまうため、予期しない遺伝子の活性化や抑制が起こる可能性があり、iPS細胞の個体差の解析に影響を及ぼすことが危惧される。そこで、ウイルスベクターの代わりにエピソーマルプラスミドを用いてiPS細胞の樹立を試みた。作製した細胞株は、ES細胞特異的な遺伝子発現および多分化能を有したiPS細胞であることが確認された。次に、iPS細胞の確実な骨芽細胞分化誘導法を確立するため、マウス歯肉線維芽細胞由来iPS細胞を用いた検討を行い、iPS細胞を凝集体の状態で分化誘導することにより、骨基質の豊富なハイドロキシアパタイト結晶構造を有する成熟な骨芽細胞への分化が可能であることを明らかにした。本研究の成果は、将来的に染色体に遺伝子挿入のないiPS細胞を骨芽細胞に分化誘導することで分化過程の個体差を検出していく技術に繋がる可能性があり、今後の研究の発展が期待される。総義歯装着者の顎堤、あるいはインプラント治療で骨増生術を施した部位の歯槽骨は、徐々に吸収されていくが、歯槽骨吸収の程度や速度には大きな「個人差」がある。ただし、現在の補綴歯科治療には、歯槽骨吸収の個人差を評価するための分子生物学的な診断法はなく、治療経過は患者の治癒能力に頼らざるを得ないのが現状である。本研究では、患者の歯肉から作製したiPS細胞を、試験管内で骨代謝関連細胞に誘導し、これら細胞の骨代謝機能を評価することで、歯槽骨吸収リスクの術前診断技術に繋げようとする戦略を提案する。本年度は、大阪大学歯学部附属病院・口腔補綴科を受診した患者を対象に、歯科治療の際に切除された歯肉から線維芽細胞を分離培養した。分離培養した歯肉線維芽細胞から、江草らの方法(PLoS ONE, 2010)に従いiPS細胞を作製した。そこで、ウイルスベクターの代わりにエピソーマルプラスミドを用いてiPS細胞の樹立を試み、これに成功した。作製したiPS細胞株について、リアルタイムRT-PCR解析(ES細胞特異的な遺伝子発現の評価)およびテラトーマ形成実験(多分化能評価)を用いて評価した結果、ES細胞と同様の性質を有していることが確認された。今後、これらの患者由来iPS細胞を骨芽細胞/破骨細胞へ分化誘導する技術を確立し、分化過程の個体差を解析していく予定である。iPS細胞樹立時の無作為な遺伝子挿入は、各患者由来のiPS細胞の性質を比較する際に予期せぬ影響を及ぼしてしまう可能性がある。本年度に、患者の歯肉から染色体への遺伝子挿入のない方法を用いてiPS細胞を樹立する技術を確立することができたため、研究計画はおおむね順調に進展していると考える。

今後は、初年度に確立したiPS細胞を用いて、骨芽細胞あるいは破骨細胞へ分化誘導することで、分化過程の個体差を検出していく。また、各患者由来の骨芽細胞あるいは破骨細胞に、骨形成促進剤(BMP-2)あるいは骨吸収抑制剤(ビスフォスフォネート)などの生理活性因子を添加して各細胞の分化能・機能を分子生物学的に検討し、各細胞に対する薬剤の効果に患者間の相違(個人差)があるか否かを検討する予定である。さらに、被験者が骨増生術を施した場合には、経時的に撮影される口腔内写真およびX線写真の資料から施術部位の歯槽堤量(頬舌的幅系)を評価する。この評価結果を、同じ患者由来のiPS細胞を用いた骨代謝機能の評価結果と比較し、関連性の有無を検討する。その結果、患者から作製したiPS細胞が歯槽骨吸収リスクの術前診断に用いることが可能であるか否かを検討していく予定である。次年度の研究費の使用は、主にiPS細胞の培養や分子生物学的な解析に必要な消耗品を主に予定している。また、研究成果を学会にて発表し、論文を作成するための費用も予定している。
脂肪由来幹細胞の異所性石灰化におけるDNAメチル化異常の解析と新規治療法への応用

健常人脂肪由来間葉系幹細胞を骨芽細胞分化に誘導する実験系において、IL-6/STAT3シグナル刺激を加えることで、有意な骨芽細胞分化促進が観察され、脱メチル化酵素であるTET1 mRNAの発現上昇効果の抑制と自己複製能マーカーであるOct3/4 mRNAの発現抑制効果の持続を認めた。脂肪分化抑制因子や脂肪細胞分化マーカーへの影響は認めなかった。健常人細胞ではIL-6/STAT3シグナル刺激による脂肪分化促進・抑制因子の破綻効果は確認できなかったが、TET1の発現を抑制することで自己複製を制御して分化を促進していると考えられた。健常人脂肪由来間葉系幹細胞が骨芽細胞に分化する過程において、骨芽細胞分化誘導のみを行った場合と骨芽細胞分化誘導系に炎症性サイトカイン刺激(IL-6シグナル経路)を添加した場合のDNA methylationをRT-PCR法によるmRNAの発現レベルを比較した。骨芽細胞分化誘導で、DNMT(DNA methyltransferase)1、DNMT3b mRNAの発現レベルは刺激3日後をピークに上昇を認めたが、IL-6/sIL-6R刺激による影響は認めなかった。DNMT3a mRNAの発現レベルはいずれの場合でも変化は認めなかった。TET(ten-eleven translation)1、TET2、TET3 mRNAの発現レベルは、骨芽細胞分化誘導で刺激後8時間をピークに上昇が認められたが、IL-6/sIL-6R刺激によりTET1 mRNAの発現レベル上昇の抑制効果を認めた。次に、幹細胞のself-renewing markerであるNanog、Oct3/4遺伝子の転写制御を確認したところ、Nanog mRNAの発現レベルは骨芽細胞分化誘導系のみ、IL-6/sIL-6R刺激の両方で刺激後8時間をピークに抑制が認められたが、Oct3/4 mRNAの発現レベルはIL-6/sIL-6R刺激でのみ特異的に低下が認められた。これはTNFα刺激では認めなかった。既報では、TET1がDNMTと競合的に働きNanog遺伝子の転写制御を行うことが報告されており、以上の結果より、骨芽細胞分化誘導系では、Nanog遺伝子の抑制が誘導され骨芽細胞分化に誘導する可能性が示唆された。一方で、骨芽細胞分化誘導系においてIL-6/sIL-6R刺激は、TET1の発現抑制を誘導しOct3/4遺伝子の発現抑制を誘導することで、骨芽細胞分化促進作用を引き起こす可能性が示唆された。以上の結果を異所性石灰化患者の脂肪由来間葉系幹細胞と比較することで炎症性疾患における異所性石灰化治療のブレイクスルーを期待する。健常人脂肪由来間葉系幹細胞を用いて、骨芽細胞様の分化機序を介した実験系で炎症性サイトカイン刺激(IL-6/STAT3シグナル経路)を添加した場合のDNA methylationをRT-PCR法によるmRNAの発現レベルで比較検討を行った。まず骨芽細胞様の分化誘導のみでの検討では、DNMT(DNA methyltransferase)1、DNMT3b mRNAの発現レベルの上昇を認めたが、IL-6/STAT3シグナル刺激による影響は認めなかった。TET(ten-eleven translation)1、TET2、TET3 mRNAの発現レベルは、骨芽細胞様の分化誘導のみでもmRNAの発現上昇を認めたが、IL-6/STAT3シグナル刺激によって、TET1 mRNAの発現上昇効果が抑えられた。一般的な幹細胞のself-renewing markerであるNanog、Oct3/4遺伝子の転写レベルを確認したところ、Nanog mRNAの発現は骨芽細胞様分化誘導系のみ、IL-6/STAT3シグナル刺激添加系の両方で抑制効果が認められたが、Oct3/4 mRNAの発現はIL-6/STAT3シグナル刺激でのみ低下が認められた。同様の実験系でTNFα刺激を行ったがNanog、Oct3/4遺伝子の転写制御に影響は認めなかった。骨芽細胞様の分化誘導系では、Nanog遺伝子抑制が誘導、IL-6/STAT3シグナル刺激系では、TET1の発現抑制とOct3/4遺伝子の発現抑制を介して、骨芽細胞様の分化促進作用を引き起こす可能性が示唆された。これらの結果をもとに、実際に異所性石灰化を合併する炎症性疾患の患者検体を用いてDNA methylationを解析を行っている。症例の蓄積を行い、病因解明と新たな治療戦略を開発する。患者検体(血清・脂肪組織)を用いて、1実際の異所性石灰化合併患者における血清および脂肪組織中の病因因子を同定し、有効かつ簡便な診断方法を創出する。2病因因子同定物質のin vitroおよびin vivoでの阻害実験を行い、有効な治療戦略を創出する。現時点で患者検体の蓄積は予定通りと判断している。健常人脂肪由来間葉系幹細胞に骨芽細胞分化誘導を行うと骨芽細胞分化に伴ってメチル化酵素であるDNMT(DNA methyltransferase)1、DNMT3b mRNAの発現上昇、DNMT3a mRNAは不変、脱メチル化酵素であるTET(ten-eleven translation)1、TET2 mRNAの発現上昇、TET3の発現低下、自己複製能のマーカーであるNanog、Oct3/4 mRNAの発現低下を認めた。IL-6/STAT3シグナル刺激を加えることで、有意な骨芽細胞分化(RUNX2/COL1A mRNA発現上昇・石灰化)促進が観察され、TET1 mRNAの発現上昇効果の抑制とOct3/4 mRNAの発現抑制効果の持続を認めた。脂肪分化抑制因子(WNT family)や脂肪細胞分化マーカー(PPARγ)への影響は認めなかった。

健常人細胞ではIL-6/STAT3シグナル刺激による脂肪分化促進・抑制因子の破綻効果は確認できなかったが、TET1の発現を抑制することで自己複製を制御して分化を促進していると考えられた。その他の炎症性サイトカイン(TNFα、IL-1β、Il-17)刺激では有意な影響は認めなかった。異所性石灰化を合併する炎症性疾患の患者検体(血清・皮下脂肪組織)を用いた解析では、IL-6/STAT3シグナルによるTET1発現への影響を確認するとともに、疾患特異的な脂肪分化破綻因子の特定を行う目的で、患者血清中の石灰化抑制因子である(futuin-A)の測定、皮下脂肪組織でのIL-6産生細胞、TET1発現細胞の割合を確認している。症例の蓄積を行い、非炎症性疾患の患者検体と比較検討を行っていくことで病因解明と新たな治療戦略開発を期待したい。健常人脂肪由来間葉系幹細胞を骨芽細胞分化に誘導する実験系において、IL-6/STAT3シグナル刺激を加えることで、有意な骨芽細胞分化促進が観察され、脱メチル化酵素であるTET1 mRNAの発現上昇効果の抑制と自己複製能マーカーであるOct3/4 mRNAの発現抑制効果の持続を認めた。脂肪分化抑制因子や脂肪細胞分化マーカーへの影響は認めなかった。今回、健常人脂肪由来間葉系幹細胞を用いたin vitroでの解析を行ったが、脂肪由来間葉系幹細胞における骨芽細胞分化を誘導する炎症性サイトカイン(IL-6/TNFα)の作用メカニズム(細胞内シグナル・mRNA発現)、ヒト脂肪由来間葉系幹細胞の正常な脂肪分化作用および骨芽細胞分化への異常な誘導作用のメカニズム(脂肪細胞分化・骨芽細胞分化マーカーのmRNA発現・細胞内シグナル・骨芽細胞分化におけるDNA methylationの解析および炎症性サイトカインによる影響について解明できた。患者検体(血清・脂肪組織)を用いて、骨芽細胞様の分化促進因子あるいは抑制因子の破綻、脂肪分化促進因子の破綻について、DNA methylationを解析することで、炎症性疾患における異所性石灰化の病院解明を行う。膠原病・リウマチ学今回の健常人脂肪由来間葉系幹細胞における骨芽細胞分化経路における炎症性サイトカインのDNA methylationへの影響についての結果をもとに、患者検体(血清・脂肪組織)を用いて、骨芽細胞分化促進因子あるいは抑制因子の破綻、脂肪分化促進因子の破綻について、DNA methylationを解析することで、炎症性疾患における異所性石灰化の病院解明を行う。
サイトメガロウイルス中和ヒト抗体の網羅的単離と応用研究

本研究は、サイトメガロウイルス(CMV)感染症の新たな予防あるいは治療法の一つとして期待されるヒト抗体療法の製剤化を将来的な目標として、完全ヒト抗体の作製を目指すものである。方法としては、CMV既感染者の成分血由来のヒト抗体ライブラリーを用い、抗CMV抗体クローンの網羅的単離をおこなった。前年度までに、抗CMV抗体クローン14種(H01H14)を単離し、今年度は、表面プラズモン共鳴を用いた抗原エピトープ解析および培養細胞を用いたCMV実験室株(TowneおよびAD169)に対する中和活性解析をおこなった。抗原エピトープ解析では、同じgBを認識する抗体クローンのうち、異なるエピトープを認識するクローン(H05,H09,H14)を同定した。そのうちの、H05クローンの完全ヒト化IgG抗体は、抗CMV薬であるガンシクロビル耐性株、およびガンシクロビル感受性株のいずれに対しても、中和活性効果を示した。また、CMVはcell-cell感染によって伝播することが知られていることから、既に感染している細胞から周囲の非感染細胞への感染拡大抑制効果を検討したところ、H05およびH14のIgG抗体は、顕著な抑制効果を示すことが明らかとなった。以上より、本研究で得られた抗体は、感染を防ぐ中和効果に加えて、cell-cell感染を抑制する効果も期待できることから、これらについて今後、in vivoでの効果を検討していく必要があると考えられる。本研究の開始以前に本申請者らが単離したヒトモノクローナル抗体全14種(H01-H14)について、表面プラズモン共鳴を用いた抗原エピトープ解析および、培養細胞を用いたヒトサイトメガロウイルス(HCMV)のTowne株およびAD169株に対する中和活性解析を行い、平成21年度にMicrobes and Infection誌に報告した。HCMVのgB(ウイルス粒子のエンベロープ糖タンパク)以外の中和抗原(gH/gL)に対する抗体を単離するため、分泌型組換えタンパクgHの発現コンストラクトを作成した。現在、gHタンパクを効率よく精製するための条件検討を行っている。また、gHは他の糖タンパク(gLあるいはgO)とヘテロ複合体を形成して、エンベロープに局在する事が知られているので、gLおよびgOとの共発現系の構築も試みている。一方、既に単離したモノクローナル抗体14種が結合する抗原分子を同定するため、抗原タンパクである糖タンパクgBの部分発現系を作成し、検討を行っている。この発現系を利用して、部分欠損gBタンパク質への各抗体の結合能をウェスタンブロッティング、ELISAあるいは表面プラズモン共鳴を利用した生化学的解析をおこない、エピトープを決定する。今後は、このエピトープ解析に加えて、感染細胞から近接する細胞に直接cell-to-cellに感染する経路を本研究で作製した抗体によって抑制できるかを検討する予定である。