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LPS刺激とヒート・ストレスによるアポトーシス誘導を利用した歯髄再生療法の検討

これまでに私達は,歯髄創傷治癒過程にヒート・ストレスに伴う歯髄アポトーシスと象牙質・歯髄複合体の修復・再生に関わる細胞増殖・分化の関係と,歯髄アポトーシス誘導へのメカニカルおよびケミカル・ストレスの影響についてin vivo実験系で明らかにしてきた(J.Dent.Res.,2001;J.Dent Res.,2003;Oper.Dent.,2003;J.Endod.2003).また,私達はラット歯髄細胞株を用い,ヒートストレスを加えた時のアポトーシス誘導およびアポトーシス細胞の負食機構について検討し,ヒート・ストレス後の歯髄細胞は,熱抵抗性を有していること,ヒート・ストレスによってダメージを受けた歯髄細胞にはアポトーシスが誘導されること,またその熱抵抗性により生存した歯髄細胞自身がアポトーシスに陥った歯髄細胞を貧食処理すること,およびこの貧食能は,ヒート・ストレスによって増強されることを明らかにした(J.Cell Biochem.,2005).さらに,齲蝕等の感染後に窩洞形成によって傷害を受ける臨床的条件を想定し,歯髄細胞にLPS刺激後,ヒート・ストレスを加えた時の歯髄細胞の反航検討した結果,LPS刺激はHSF1,Aktを修飾することで,ヒート・ストレス早期のHSF1,Akt活性化を誘導し,活性化したHSP27およびNF-πBとともに短時間のヒート・ストレスに対する歯髄細胞の熱抵抗性を増強する可能性を示すこと,長時間のヒート・ストレスによる各分子の活性化と歯髄細胞の熱抵抗性にLPS刺激は影響しないことを明らかにした.さらに,低酸素状態が歯髄細胞アポトーシスと細胞周期停止に与える影響を検討したところ,低酸素環境下において培養歯髄細胞にアポトーシスと細胞周期停止が誘導されることを明らかにした.これまでに私達は,歯髄創傷治癒過程にヒート・ストレスに伴う歯髄アポトーシスと象牙質・歯髄複合体の修復・再生に関わる細胞増殖・分化の関係と,歯髄アポトーシス誘導へのメカニカルおよびケミカル・ストレスの影響についてin vivo実験系で明らかにしてきた(J.Dent.Res.,2001;J.Dent Res.,2003;Oper.Dent.,2003;J.Endod.2003).また,私達はラット歯髄細胞株を用い,ヒートストレスを加えた時のアポトーシス誘導およびアポトーシス細胞の負食機構について検討し,ヒート・ストレス後の歯髄細胞は,熱抵抗性を有していること,ヒート・ストレスによってダメージを受けた歯髄細胞にはアポトーシスが誘導されること,またその熱抵抗性により生存した歯髄細胞自身がアポトーシスに陥った歯髄細胞を貧食処理すること,およびこの貧食能は,ヒート・ストレスによって増強されることを明らかにした(J.Cell Biochem.,2005).さらに,齲蝕等の感染後に窩洞形成によって傷害を受ける臨床的条件を想定し,歯髄細胞にLPS刺激後,ヒート・ストレスを加えた時の歯髄細胞の反航検討した結果,LPS刺激はHSF1,Aktを修飾することで,ヒート・ストレス早期のHSF1,Akt活性化を誘導し,活性化したHSP27およびNF-πBとともに短時間のヒート・ストレスに対する歯髄細胞の熱抵抗性を増強する可能性を示すこと,長時間のヒート・ストレスによる各分子の活性化と歯髄細胞の熱抵抗性にLPS刺激は影響しないことを明らかにした.さらに,低酸素状態が歯髄細胞アポトーシスと細胞周期停止に与える影響を検討したところ,低酸素環境下において培養歯髄細胞にアポトーシスと細胞周期停止が誘導されることを明らかにした.これまでに私達はラット臼歯を用いたin vivo実験系で,窩洞形成によって障害を受けた象牙芽細胞や歯髄細胞の処理にアポトーシスが関与していること(J.Dent.Res.,2001),歯髄アポトーシスにはヒート・ストレスに関与する細胞内シグナル伝達分子が関与していること(J.Dent.Res.,2003),さらに歯髄アポトーシス誘導にはメカニカルおよびケミカル・ストレスが影響を与えることを明らかにした(Oper.Dent.,2003;J.Endod.2003).今回,私達はラット歯髄細胞株を用い,ヒートストレスを加えた時のアポトーシス誘導およびアポトーシス細胞の貪食機構について検討した.その結果,窩洞形成によって生じるストレスの1つであるヒート・ストレスによりラット歯髄細胞株にアポトーシスが誘導されること,また歯髄細胞自身がアポトーシスに陥った歯髄細胞を貪食処理することを明らかにした.さらに,この貪食能は,ヒート・ストレスによって増強されることを明らかにした.以上の結果は,第81回General Session and Exhibition of International Association for Dental Research(2003),および第119回日本歯科保存学会(2003)で発表し,現在投稿中である.さらに,低酸素状態が歯髄細胞アポトーシスと細胞周期停止に与える影響を検討したところ,低酸素環境下において培養歯髄細胞にアポトーシスと細胞周期停止が誘導されることを明らかにした.この結果は,第82回General Session and Exhibition of International Association for Dental Research(2004),および第120回日本歯科保存学会(2004)において発表する予定である.

これまでに私達はラット臼歯を用いたin vivo実験系で,歯髄創傷治癒過程にアポトーシスが関与していること(J.Dent.Res.,2001),歯髄アポトーシスにはヒート・ストレスに関与する細胞内シグナル伝達分子が関与していること(J.Dent.Res.,2003),さらに歯髄アポトーシス誘導にはメカニカルおよびケミカル・ストレスが影響を与えることを明らかにした(Oper.Dent.,2003;J.Endod.2003).今回,私達はラット歯髄細胞株を用い,ヒートストレスを加えた時のアポトーシス誘導およびアポトーシス細胞の貪食機構について検討した.その結果,ヒート・ストレス後の歯髄細胞は,thermotoleranceを有していること,ヒート・ストレスによってダメージを受けた歯髄細胞にはアポトーシスが誘導されること,またそのthermotoleranceにより生存した歯髄細胞自身がアポトーシスに陥った歯髄細胞を貪食処理すること,およびこの貪食能は,ヒート・ストレスによって増強されることを明らかにした(J.Cell Biochem.,2004 in press).さらに現在,齲蝕等の感染後に窩洞形成によって傷害を受ける臨床的条件を想定し,歯髄細胞にLPS刺激後にヒート・ストレスを加えた時の歯髄細胞の反応を検討している.その結果,LPS刺激によりHeat Shock Protein 27(HSP27)が誘導され,その結果LPS処理歯髄細胞のthermotoleranceが増強されることが示唆された,現在,シグナル伝達経路を解析中である,さらに,低酸素状態が歯髄細胞アポトーシスと細胞周期停止に与える影響を検討したところ,低酸素環境下において培養歯髄細胞にアポトーシスと細胞周期停止が誘導されることを明らかにした(第82回IADR).この結果は,現在,投稿準備中である.これまでに私達は,歯髄創傷治癒過程にヒート・ストレスに伴う歯髄アポトーシスと象牙質・歯髄複合体の修復・再生に関わる細胞増殖・分化の関係と,歯髄アポトーシス誘導へのメカニカルおよびケミカル・ストレスの影響についてin vivo実験系で明らかにしてきた(J.Dent.Res., 2001 ; J.Dent.Res., 2003 ; Oper.Dent., 2003 ; J.Endod. 2003).また,私達はラット歯髄細胞株を用い,ヒートストレスを加えた時のアポトーシス誘導およびアポトーシス細胞の貪食機構について検討し,ヒート・ストレス後の歯髄細胞は,熱抵抗性を有していること,ヒート・ストレスによってダメージを受けた歯髄細胞にはアポトーシスが誘導されること,またその熱抵抗性により生存した歯髄細胞自身がアポトーシスに陥った歯髄細胞を貪食処理すること,およびこの貪食能は,ヒート・ストレスによって増強されることを明らかにした(J.Cell Biochem., 2005).さらに,齲蝕等の感染後に窩洞形成によって傷害を受ける臨床的条件を想定し,歯髄細胞にLPS刺激後,ヒート・ストレスを加えた時の歯髄細胞の反応を検討した結果,LPS刺激はHSF1,Aktを修飾することで,ヒート・ストレス早期のHSF1,Akt活性化を誘導し,活性化したHSP27とともに短時間のヒート・ストレスに対する歯髄細胞の熱抵抗性を増強する可能性を示すこと,長時間のヒート・ストレスによる各分子の活性化と歯髄細胞の熱抵抗性にLPS刺激は影響しないことを明らかにした.この結果は現在投稿中である.さらに,低酸素状態が歯髄細胞アポトーシスと細胞周期停止に与える影響を検討したところ,低酸素環境下において培養歯髄細胞にアポトーシスと細胞周期停止が誘導されることを明らかにした.この結果は,現在,投稿中である.
分断社会における〈不良少年〉像の解明

本研究の目的は、雑誌、新聞、インターネットの記事を分析することにより、2000年代以降の〈不良少年〉言説の特徴を明らかにすることである。そのために初年度である2018年度は、以下の3つのことを行なった。第一に、〈不良少年〉の言説に関する先行研究の収集と読解である。不良少年、ヤンキー、非行少年の言説に関する先行研究は数多い。それらを収集して知見を整理することで、本研究の学問上の位置付けおよび意義を明確化した。その作業を通じて明確化した本研究の意義とは、脱心理主義化しているであろう〈不良少年〉言説の特徴を明らかにすることである。第二に、インターネット上にアップロードされている、ある動画のコメント欄を分析した。その動画は2分に満たないものであるが、数千件のコメントがついており、現代日本のインターネット上で、〈不良少年〉(インターネットスラングでDQNと呼ばれる)がどのように捉えられているかを分析するためには、適切な対象である。分析の結果、1980年代にみられたような「学校や家庭でストレスが溜まった結果としての非行少年」というよりも、少年が非行に走る原因は親や地域にあり、学校や教師は被害者であるという捉えた方がなされていることがわかった。この分析結果を、Hong Kong Baptist Universityで行われたMedia Education Summitで報告した。第三に、朝日新聞のデータベース「聞蔵II」を用いて、1989年から2018年までの「非行」というワードが含まれる記事を収集・整理した。この作業は、次年度(2019年度)に行う新聞記事の分析の準備である。計画では、2018年度は、先行研究の収集・整理と、分析対象となる雑誌、インターネット、新聞の記事を収集・整理することであった。研究実績の概要で述べたように、すでにそれらの作業に加えて、実際に分析をして学会発表を行なっているため、本研究は順調に進展していると言える。ただし、まだ雑誌の記事については収集や整理ができておらず、これらの作業については、次年度に持ち越しとなっている。2019年度からは、実際に雑誌、インターネット、新聞の記事の分析にとりかかる。それらの分析の成果を2020年度、2021年度に公表できるように、分析を進めていく。また、雑誌の記事については、分析の焦点を定めなければ数が膨大になり、それらを全て収集することは不可能である。研究目的に対して適切に雑誌の記事を収集できるようにするためにも、インターネットや新聞の記事の分析を進めなければならない。そうした作業を通じて分析の焦点が定まり次第、雑誌の記事の収集も行う予定である。雑誌の記事を収集・整理が次年度に持ち越しとなったためである。次年度使用額については、この作業を行うために使用する計画である。
会計情報の質的特性としての真実性に関する相対性の計測

本研究は、金融ビッグバンによる会計基準のグローバル化により、企業の公開する会計情報が、従来の過去指向的な客観性を重視した情報(取得原価に基づく測定・評価)から、将来指向的な有用性を重視する情報(将来キャシュ・フローの割引現在価値に基づく測定・評価)へとその性格を大きく変化させていることに着目し、このような会計情報の性格の変化によって、会計情報に求められる真実性の意味内容がどのように変化しているかを科学的に計測することを研究目的としている。本年度は、前年度に引き続き、会計情報の真実性に関する相対性を規定する諸要因の確定と各要因による相対性への影響を計測するための測度の開発を行う目的で、国際会計基準との整合化をはかるために新たに設定された会計基準11種類について、その内容を詳細に分析した。相対性規定要因を確定するためには、会計情報は、会計事実が会計処理システムを通じて会計数値に描写された結果であるので、相対性に影響を与える要因を、(1)会計基準の内容、(2)会計基準の精度、(3)会計情報作成者による会計政策、(4)会計的判断・見積りの柔軟性、以上4つの範疇から分析する必要があり、上記の分析を行ったものである。また、当初予定していた上場企業(100社程度)の過去10年間のデータによる相対性への影響の差別化についての検証に入る前に、会計情報の質的特性としての真実性の程度にも直接間接に影響を及ぼすと考えられる企業リスク情報の開示について、開示すべき企業リスク情報の内容と会計情報との関係性分析を行うべく、主要6力国の上場会社7,910社に対する質問票調査を実施し、718社(回答割合9.60%)から回答を得、引き続き分析作業を行っている。本年度は、本研究で予定している目標のうち、会計情報の真実性に関する相対性(以下、「相対性」と言う。)を規定する諸要因の確定と各要因による相対性への影響を計測するための測度の開発について研究調査を実施した。相対性規定要因の確定については、会計情報は、会計事実が会計処理システムを通じて会計数値に描写された結果であるので、相対性に影響を与える要因を、(1)会計基準の内容、(2)会計基準の精度、(3)会計情報作成者による会計政策、(4)会計的判断・見積りの柔軟性、以上4つの範疇から分析し、当該諸要因を抽出した。相対性規定要因に対する測度の開発については、相対性規定要因はさまざまな性質を有し、一律に捕捉することは困難であるため、現在引き続き慎重に検討を行っている段階にある。つまり、上記規定要因それぞれの性質に応じた測度を開発すべく、隣接諸科学(計量経済学、統計学、数学、心理学、認知科学など)における同種の研究についてレビューを行っている。
Interleukin-10は炎症性腸疾患の治療薬となり得るか

IL-10の炎症性腸疾患での意義を明らかにするため、患者検体とマウスのデキストラン硫酸(DSS)大腸炎モデルを用いて検討を行った。1.患者検体でのin vivoの検討炎症性腸疾患でのサイトカイン産生に及ぼすIL-10の影響をみるため、腸粘膜組織、末梢単核球細胞に、種々の濃度のIL-10を添加し、培養後の上清中IL-1、TNFα、IL-1レセプターアンタゴニスト(IL-lra)濃度を測定した。IL-1、TNFα濃度は添加したIL-10の用量依存性に低下し、IL-lra濃度はIL-10の用量依存性に増加した。2.マウスDSS腸炎での検討(1)サイトカイン濃度の推移Balb/cマウスを、DSS飲水開始前から開始後7日目まで経時的に屠殺し、大腸組織中の炎症性サイトカイン濃度を測定した。IL-lβ、TNFα濃度は、myeloperoxidase活性と同様、DSS投与開始後5日目で頂値となり、IL-10濃度は遅れて頂値となった。(2)in vitroでのIL-10、抗IL-10抗体の添加DSS腸炎および正常マウスより採取した大腸組織に、IL-10または抗IL-10抗体を添加して培養し、上清中のサイトカイン濃度を測定した。IL-lβ、TNFα濃度は、IL-10添加により減少し、抗IL-10抗体添加により増加した。(3)in vivoでのIL-10、抗IL-10抗体の投与DSS腸炎マウスにIL-10または抗IL-10抗体を腹腔内投与し、DSS投与開始後7日目に屠殺し、腸炎の程度を評価した。IL-10の投与により、体重減少、便潜血反応、腸管長、組織学的所見などの指標は、コントロール群に比べて改善がみられた。一方、抗IL-10抗体の投与では、これらの炎症指標は増悪傾向がみられ、特に腸管長の短縮は有意であった。DSS腸炎においてIL-10が腸炎の制御に実際に関与しており、IL-10の投与が腸炎の改善をもたらすことが明らかとなった。今後、IL-10の治療薬としての応用が期待される。インターロイキン10 (IL-10)のin vitroでの各種サイトカイン産生におよぼす影響をみるため、炎症性腸疾患(クローン病、腫瘍性大腸炎)患者から腸粘膜組織および末梢血単核細胞を採取し、これに種々の濃度のリコンビナントIL-10を添加し、24時間培養後の上清中のIL-1、TNFα、IL-1レセプターアンタゴニスト(IL-1ra)濃度をELISAキットにより測定した。その結果、上清中のIL-1, TNFα濃度は添加したIL-10の用量依存性に低下し,逆に、上清中のIL-1ra濃度はIL-10の用量依存性に増加することが明らかとなった。また、炎症性腸疾患患者の腸粘膜分離単核細胞を用いても上記と同様の検討を行う予定であったが、これについては、実験に必要な細胞数を得るだけの組織量が生検材料ではなかなか得られず、まだ行えていない。

平成7年度に行った炎症性腸疾患の検体を用いたin vitroでの実験により, IL-10が炎症性サイトカインであるIL-1, TNFα産生を抑制するとともに、抗炎症性サイトカインであるIL-1ra産生を促進することにより、強力な炎症抑制効果を発揮し、炎症性腸疾患の治療薬として利用され得る可能性が示唆された。現在、同様の実験系を用いて、リコンビナントIL-10投与によるIL-1、TNFα、IL-1ra発現のmRNAレベルでの変化についても、Northern blot法を用いて解析中である。平成8年度は,炎症性腸疾患の実験モデルであるトリニトロベンゼンスルフォン酸惹起性腸炎を用いて、IL-10のin vivoでの投与効果についての検討を行う予定である。インターロイキン10が、炎症性サイトカインならびに大腸炎に及ぼす影響をみるため、炎症性腸疾患の実験動物モデルであるデキストラン硫酸惹起大腸炎を用いて、以下に示すようなin vitroおよびin vivoの実験を行った。まず、デキストラン硫酸惹起腸炎における腸管局所のサイトカイン濃度の経時的な変化を観察した。デキストラン硫酸飲水開始前と開始後1、3、5、7日目の大腸を採取し24時間培養を行ない、上清中のサイトカイン濃度をELISA法を用いて測定した。炎症性サイトカインであるTNFα、インターロイキン1β濃度が飲水開始後5日目にピークを認めるのに対して、抗炎症性サイトカインであるインターロイキン10濃度は、それより遅れて上昇を開始した。次に、in vitroでのインターロイキン10の炎症性サイトカイン濃度に及ぼす効果を検討した。デキストラン硫酸惹起腸炎及び正常マウスの大腸組織に種々の濃度のインターロイキン10を添加し、24時間培養後の上清中のサイトカイン濃度を測定した。TNFα、インターロイキン1産生は、添加したインターロイキン10の濃度依存性に抑制された。現在、今回の研究の最終目標であるデキストラン硫酸惹起大腸炎に対するインターロイキン10のin vivoでの投与効果について検討を開始し、良好な抗炎症効果が得られつつある(n=3)。今後、統計解析が可能な数までマウスの数を増やしてインターロイキン10の投与効果を検討する予定である。これまでの研究で、インターロイキン10が炎症性サイトカインの産生を抑制することによりデキストラン硫酸惹起腸炎に対し抗炎症効果を発揮し炎症性腸疾患の治療薬として応用される可能性が示唆された。
ハゲ山モデルによる森林破壊・土砂災害・治山砂防技術の時代変遷の研究

1)日本の山地における森林と表土の荒廃・再生の空間分布・時間分布を侵食現象から説明できる概念モデルを作成し,ハゲ山モデルと名付けた。2)モデルを構成する4構成域について,森林表土の荒廃過程と回復過程を侵食現象から分析し,同時に資料にもとづいて森林荒廃面積と表土荒廃面積の時代変化を過去300年間について推定した。3)ハゲ山モデルをもとにして,土砂災害と洪水災害の相互関係の時代変化を考察し,4時代に区分して,それら時代の土砂・洪水災害の特徴を分析した。それをもとにして,現在から将来の治山砂防技術のあり方について考察した。4)土砂災害防止対策としての治山砂防について,技術システムの面から考察を加え,一般工業技術との相異,システムの特徴などを明らかにした。1)ハゲ山モデルを改良して、新しいハゲ山モデルの構築を行った。2)ハゲ山モデルでは、ハゲ山の形成期を森林健全域(林齢30以上)、ハゲ山フロント予備域(森林伐採などにより樹木根系の劣化が起こって、土の強度補強が低下し、大雨時には表層崩壊多発が起こるところ)、ハゲ山フロント域(ハゲ山形成の最前線:表層崩壊多発に加えて根株掘り取りなどによる表面侵食多発により表土流亡激甚、土砂流出最高、天井川形成)、ハゲ山域(表土が殆ど流亡した裸地、潅木・草本疎ら、土砂流出は風化基盤の剥離流亡)の4域に分けた。ハゲ山からの回復期を森林件全域とハゲ山フロント予備域(伐採地と林齢30年以下の若齢林)、ハゲ山回復途上域(ハゲ山が緑化によって回復しつつある森林地)の3域とした。3)モデルを作成することによって、日本の山地における表土流亡と土砂流出、土砂災害を体系的に分析する基礎をつくった。実際の分析作業では、ハゲ山モデル構成域の面積の時代推移を各種資料から推定することを試みた。次に土砂災害タイプの新しい分類を行い、土砂災害タイプの時代的変化とその特徴をハゲ山モデルを使って分析した。4)これからは土砂災害対策システムの研究とシステムの時代変化を、ハゲ山モデルを使って行う。2)モデルを構成する千地域について,森林・表土の荒廃過程と回復過程を侵食現象から分析すると同時に,資料にもとづいて森林荒廃面積を表土荒廃面積の時代変化を過去300年間について推定した。3)ハゲ山モデルをもとにして,土砂災害と洪水災害の相互関係の時代変化を考察し,4時代に区分して,それらの時代の土砂・洪水災害の特徴を分析した。これをもとに現在から将来の治山砂防のあり方について考察した。4)土砂災害防止対策としての治山・砂防について,技術システムの面から考察を加え,一般工業技術との相異,システムの特徴などを明らかにした。
南極地域の地球規模環境変動に関する総合的研究

本研究では大気圏環境変動の研究として、イメージングリオメーター、及びHFレーダーによる磁気圏プラズマ対流の観測を行い、中間圏、熱圏とともにその長期観測の重要性が確認された(英国、デンマーク)。北極においてもオーロラの共役点観測を実施した(アイスランド)。また、関連観測データと地上からの観測データの比較を行い、通信観測網についての最新の情報が得られた(スウェーデン、ニュージランド、オーストラリア)。気水圏-固体圏の環境変動の研究としてはイオンマイクロプローブ質量分析計によるセールロンダーネの岩石形成年代の精密測定を実施した(オーストラリア)。さらに、新生代の周氷河作用と環境に関するデータの比較研究を行った(英国)。本研究分野では航空機観測および輸送網について検討するため、ロシア、オーストラリア、中国、米国、英国より研究者を招聘して、データ解析と研究打ち合わせを行った。その結果、航空機観測及び輸送の実質的な展望が描かれた。一方、南大洋の海洋環境変動の研究においては中・長期的な海洋環境変動に関するデータ解析を行った。インド洋区の海洋観測データの解析において、将来の海洋環境の時間変動とモニタリング観測の具体性について知見を得た(オーストラリア)。また、海洋観測船による共同観測の現状等、多くの資・試料、データを有している関係機関において実質的な調査研究がなされた(ノルウェー、カナダ、フランス、イタリア、南アフリカ)。さらにオーストラリア、イタリアより専門家を招聘して、インド洋区における環境変動のデータ解析を行い、具体的な共同観測の打ち合わせを行った。本研究は短期間に実施されたが、南極を中心とした環境変動は春から夏にかけて顕著に発生するといわれている折り、この時期の貴重な観測、データ解析、及び研究打ち合わせはきわめて時宣を得たものとなった。さらにオーストラリア、イタリアより専門家を招聘して、インド洋区における環境変動のデータ解析を行い、具体的な共同観側の打ち合わせを行った。本研究は短期間に実施されたが、南極を中心とした環境変動は春から夏にかけて顕著に発生するといわれている折り、この時期の貴重な観測、データ解析、及び研究打ち合わせはきわめて時宜を得たものとなった。
学校教育の道徳的社会化装置(DEVICES)に関するエスノグラフィー的日米比較研究

(1)アメリカでの観察調査データのエスノグラフィー的分析-アメリカの観察調査地域の小・中学校で収録したビデオテープから、主に授業場面での教師の指示や教師と子どもとの相互作用を集約したテープを編集し、そのテープに録音されている会話を聞き取って文章化する作業(transcriptionの作成)を行った。さらにこのtranscriptionのうち、教師が子どもの道徳的社会化に関与する行動表現を見せた場面を抽出し、日本語にも翻訳して、如何なるコンテキストからそのような行動が出現し、どんな社会化効果を持つのかを分析した。カメラやビデオの映像を静止画入力して、上記transcriptionと組み合わせた合成画面をマルチメディア・ファイリングソフトでデータベース化する試みも行ったが、国際的に通用するソフトが未だ開発されていないこともあって、外国の研究者との間で広くレヴュ-を受けるにはその汎用性および可搬性に課題を残した。2年間の研究計画の初年度である本年度は、「エスノグラフィー的調査データのマルチメディア・コンピューターによる一元管理及び分析」を目指して、コンピューター分析の環境整備と調査データのデジタル変換・入力に努めた。まず、アメリカの小・中学校でビデオを撮りながら観察調査した際の50巻余にのぼるビデオテープから、主に授業場面での教師の指示や教師と子どもとの相互作用を集約したテープを編集し、そのテープは録音されている会話を聞き取って文章化する作業(transcriptionの作成)を行った。また、上述のtranscriptionとビデオ映像とを一つの画面に合成して、マルチメディアのデータベース化を試みたが、現時点では動画とテキスト・データを有効に管理・保存できるハードとソフトウェアの適合化に成功していない。動画の静止画転換などで仮にデータベースの構築を果たし、来年度の本格的な内容分析に備えたい。研究成果の一部は、山口で開催された日本子ども社会学会第3回大会で「道徳的社会化に影響するアメリカの学校の社会化「装置」」と題して発表報告し、また、96年10月刊行の原田彰編『子育て「大変な時代」』(教育開発研究所)でも第4章「家庭生活と心の教育-道徳的社会化の国際比較」と題して報告している。
薬物分子-細胞膜間の静電的相互作用の電荷による差異とその消化管吸収性に及ぼす影響

薬物の膜透過に及ぼす細胞内負の膜電位の影響を明らかにする目的で、細胞外メディウム中のイオン強度を変えずに静止電位を支配しているカリウムイオンの濃度を変えることにより膜電位を変化させ、イオン型薬物のCaco-2細胞(ヒト大腸癌細胞由来)透過への影響を検討した。メディウム中のカリウムイオンの増大により内部負の膜電位は減少し、これに伴いカチオン型薬物の経細胞透過におけるみかけのラグタイムは遅延した。我々はすでに小腸刷子縁膜小胞を用いた検討から、小胞内負の膜電位はカチオン型薬物の膜透過における駆動力であることを報告しており、この結果と併せて細胞内負の膜電位はカチオン型薬物の経細胞透過に強く関与していることが示唆された。また、パッチクランプ法による直接的な細胞の膜電位測定より、脂溶性の高いカチオン型薬物であるイミプラミンはCaco-2細胞内に取り込みまれることにより、膜電位を減少させることが明らかとなった。一方、アニオン型薬物では何ら変化は認められなかった。昨年度および本年度の結果より、カチオン型薬物は自己の膜吸着による膜表面電位の減少と、それに続く細胞内負の膜電位の減少により経細胞透過が減少することが示唆された。またアニオン型薬物の経細胞透過は膜表面電位の影響を受けるものの、膜電位は関与しないことが明らかとなった。したがって、アニオン型薬物に比べカチオン型薬物の消化管吸収性が低い原因として、薬物分子と細胞膜間の静電的相互作用の電荷による差異が大きく関与していることが強く示唆された。本実験結果は関係学会(日本薬学会、日本薬物動態学会)において発表し、現在学術雑誌に投稿する予定である。細胞レベルで薬物の膜透過に及ぼす膜表面電位の影響を明らかにする目的で、細胞外メディウム中のイオン強度を変えることにより、膜表面電位を変化させ、イオン型薬物のCaco-2細胞(ヒト大腸癌細胞由来)内への薬物の取込への影響を検討した。メディウム中のイオン強度増大に伴い、カチオン型薬物の細胞内への取込は減少し、アニオン型薬物の取込は逆に増大した。また、培養カップに単層培養した細胞を介した透過速度もイオン強度変化に伴って変化した。さらに透過速度と膜表面電位の変化度との関係をみたとろこ、薬物の取込量の増減と膜表面電位の変化度との間には良好な相関が認められ、薬物の消化管吸収性に膜表面電位が影響を及ぼすことが示唆された。本実験結果は関係学会(日本薬学会等)において発表するとともに、学術雑誌に投稿する予定である。今後は、膜表面電位とともに静電的相互作用の大きな因子であると考えられる細胞内負の膜電位が薬物吸収に及ぼす影響を明らかにする予定である。
ホジキン病病因におけるEpstein-Barr virusの関与-特にスーパー抗原との関連-

(1)未治療ホジキン病患者末梢血中T cellsにおけるV_βレパトワの検索。リンパ腫治療研究会(事務局:金沢大学)を通して、12名の未治療ホジキン病患者末梢血を得ることができた。これらの末梢血よりリンパ球を分離し、T cells中のV_β2,V_β3,V_β5,V_β6,V_β8を発現の頻度をCD4とCD8別々に調べた。このうちの6名はさらにV_β13.6,V_<ββ>17,V_β21.3の頻度も検索した。健常人(福井医大学生)80名と比較したところ、V_β6を除き他のV_βはすべてcontrol群の分布内にきた。V_β6に関しては、2例においては健常人の最大値の2倍以上の増加があり、他の10名に関しては健常人の下限あるいはこれ以下の値をとった。著しい増加をみた1例を寛解後検索したところ、V_β6^+T cellsの頻度は正常域にあった。以上より、ホジキン病においてはスーパー抗原様の物質がV_β6^+T cellsを特異的に活性化しその結果細胞増殖をひきおこし、さらにアポトーシスに至る可能性が考えられる。この現象がホジキン病の病因と関係するのか否かは現在のところ推測の域を出ない。しかし、ホジキン病において、リンパ球の著しい浸潤を見るtypeとの関連が考えられる。
原子の量子増幅効果を利用したニュートリノ質量測定に向けた基礎研究

今年度は標的原子であるXeの準安定状態6s ^2^[3/2]_2に励起するためのレーザーの整備を主に行った。選択則よりこの状態への励起にはE1の3光子励起を通じてのみ可能である。高効率な励起およびコヒーレンス生成のためには狭線幅(100MHz)かつ大強度(mJ/pulse)の高品質パルスレーザーが必要である。原子に余分な運動量を与えないために、3つのレーザー光の波長を596 nmの2光子と298 nmの1光子とを反対方向から対向させてガス状原子標的に照射する系を実現した。596 nmの光はNd-YAGレーザー(355 nm)と増幅されたTi-Saパルスレーザー(876 nm)とを非線形光学結晶(LBO)で差周波をとることで実現した。この598 nmのパルス光の一部を再度LBO結晶にて2倍波(298 nm)に変換することで、必要な298 nmと598 nmのパルス光を5 mJ/pulseの強度で発生させることに成功した。準安定状態への励起の確認はこの状態から298 nmの1光子吸収イオン化を観測することで達成できる。そのため、まずシステムチェックとして298 nmの非共鳴3光子イオン化実験を実施し、Xeイオンの再結合後の蛍光線を分光器で観測することで、イオン化した後に6pから6sに脱励起する遷移を確認できた。非共鳴イオン化と準安定状態への励起を通じた共鳴イオン化の効率をoptical-Bloch方程式の数値計算で推定し、来年度にレーザー周波数を精密に掃引して励起実験を実施する準備まで至った。当初予定していた準安定状態への励起のためのパルスレーザー光源の整備まで漕ぎつけ、システムチェックの測定実験を実施できたので。これまでの光源の整備、期待されるXe準安定状態への3光子励起効率を基に、励起の達成を確認する作業に入る。準安定状態からの1光子イオン化を確認することになるが、再結合後の蛍光の検出、またはイオン化電子の捕集・検出等を並行して行い、効率の良い手法を確立する。
感染機作の化学的解析に基づく病態植物診断システムの構築

発病した植物体内には毒性物質,防御物質,ストレス物質,色素化合物など各々の病気に特徴的な成分が生成すると考えられる。そのような特徴的な低分子化合物成分の分析を植物病害診断へ応用することを目的とした。まず,疾病などストレス状態にある植物のストレス源を特定するためのマーカー成分を探索した。傷害あるいは病原の感染に対応して植物体内に特異的に生合成される二次代謝物質の変動をジャガイモ,サツマイモ,ソライロアサガオ(サツマイモのモデル植物)を材料に分析し,種々ストレス条件に対応する生理変化に由来すると考えられる特徴的な化合物を見いだした。次に,病原を特定する指標として有用であると考えられる病原菌由来の植物毒素について検討した。Alternaria属およびBipolaris属病原菌が生産する毒素のうち,ナシ黒斑病菌が生産するAK-toxin,リンゴ斑点落葉病菌が生産するAM-toxin,Bipolaris葉枯病菌が生産する植物毒素,サツマイモつる割れ病菌が生産する植物毒素について分析のための標準化合物の取得および化学合成に成功した。しかし今回は以上の植物二次代謝成分あるいは植物毒素いずれについても,種々ストレス条件を変化させた場合の植物体中含量変動に関する十分なデータを蓄積するには至らなかった。今後さらに種々の生育条件下におけるマーカー化合物の変動をデータベース化し,各種ストレス条件との関連を詳細に検討していく必要がある。本年度の研究では,弱毒性フザリウムに感染したサツマイモの組織中に特異的に生合成される二次代謝産物の解析に際して,西洋アサガオをモデル植物として導入し,その抽出物の分析を紫外線検出器と高速液体クロマトグラフィーを用いて行った.その結果,変動する成分の定量化ができ,感染に伴う二次代謝産物のプロフィールの変化を追跡することが可能となった.また高速冷却遠心機といくつかのフィルター類を組み合わせることにより,抽出物の前処理操作をより簡便にし,多くの試料を高い再現性で分析することが出来た.一方,ジャガイモ疫病菌の細胞壁成分に類似した構造とエリシター活性を有するラミナリン水溶液を塗布したジャガイモ塊茎組織での変動成分の分析について同様の方法を用いたところ,エリシターによって引き起こされるフェノール性アミド化合物の変動を追跡することが出来た.本方法は他の様々な植物-病原の系でも応用可能であると思われ,病態診断データーベース構築に際して強力なツールとなると期待される.またAlternaria alternataの生産する宿主特異的毒素に関して,その分離と検出法の検討を行った.汚染土壌や植物体内など様々な試料中からの目的成分の分離ではシリカゲルカートリッジによる前処理と高速液体クロマトグラフィーを用いることにより,簡便で迅速な分離を実現した.さらに大気圧イオン化質量分析器もしくは紫外線検出器を併用することによりこの宿主特異的毒素の類縁体を検出することが出来た.しかし検出感度に関しては高い感度が得られなかったため,蛍光検出法を利用するなど改良が必要である.また毒素の存在量と植物の病態の関係に関しては,毒素検出並びに植物代謝変動検出システムの併用による更なる解析が必要であると考えられる.概要傷害あるいは病原の感染に対応して植物内に特異的に生合成される二次代謝物質の検索とその変動の分析を以下の系をもちいておこなった。1.ジャガイモ特徴的な二次代謝成分として,カフェオイルプトレシン,クロロゲン酸,チラミンおよびパラ-クマロイルオクトパミンに着目した。傷害をうけたジャガイモ組織では,カフェオイルプトレシンとクロロゲンの酸のレベルが上昇した。一方,病原菌との相互作用モデルとしてエリシター処理をした組織では,この2つの成分のレベルに顕著な変化はみられないかわりに,チラミンとパラ-クマロイルオクトパミンのレベルが大きく上昇し,植物組織に対するストレスの種類によって二次代謝物の組成変化のパターンが異なることが示された。2.ソライロアサガオサツマイモつる割れ病の病原菌-植物相互作用を調べる実験室モデル植物としてソライロアサガオを検討した。幼苗に非病原性のFusarium oxysporumを接種したところ,特異的にレベルが変化する成分がみつかり,同成分を単離精製して構造解析した結果,クマリン誘導体の一種scopolinと同定した。

また関連化合物であるscopoletinのレベルも非病原菌接種により有意に増加した。これらの変化は,病原性のFusarium oxysporum(つる割れ病菌)接種では顕著でなく,相互作用する微生物の種類によって異なる特異的な反応であると考えられた。また,ソライロアサガオを被験植物としてサツマイモつる割れ病菌が生産する植物毒素を探索した。培養物から幼苗の生育阻害作用を示す成分を単離し構造解析をおこなった結果,ergosterolとfusalanipyroneの2化合物を同定した。1.病態植物の二次代謝変化についてさらに情報を得るために,病原微生物成分に対する植物の反応をジャガイモをもちいて解析した。ジャガイモに主要病原菌である疫病菌の細胞壁構成成分と類似構造を持つβ-1,3-オリゴサッカライド,ラミナリンを処理するとフェノール性アミド化合物のひとつであるパラクマロイルオクトパミン(PCO)が顕著に生成蓄積する。一方,ジャガイモではテルペン化合物のリシチンがファイトアレキシンとして病原微生物の感染に抵抗して生成することが知られている。ラミナリン処理したジャガイモ塊茎組織抽出物をGCMSを用いて分析したところ,同様にリシチンが検出され,ラミナリン処理が病原菌感染の場の相互作用を再現していることがわかった。さらに疫病菌の特徴的代謝成分である不飽和脂肪酸アラキドン酸を塊茎組織に処理したところ,ラミナリン処理の場合と同様にPCOが誘導されることが判明した。この結果より,ラミナリン処理によって生じるPCOが有効なジャガイモの疫病病態マーカー化合物となりうることが示されたと言える。タイムコースを検討したところ,PCOの蓄積はファイトアレキシンとして知られているリシチンの蓄積に比べより速やかに観察することができ,この点もマーカー化合物として有利であると考えられた。
SPIMを用いた左右性決定機構の解明と細胞移動4Dマップ構築

哺乳類胚発生における左右性の決定機構の解明と、さらに広くマウス初期発生その他発生学の研究一般への応用を目指して、欧州分子生物学研究所(EMBL)が開発したライトシート型顕微鏡SPIMの改良版であるDSLM(Digital Scanned Light-sheet Microscope)を、開発者のErnst Stelzer博士らの協力の下に導入した。さらにDSLMでマウス胚のライブイメージングを可能するための改良を加え、6.5日胚全体の一細胞レベルの鮮明な光学断面像を得ることに成功した。原腸陥入に伴い原条から外胚葉・内胚葉間に中胚葉が入り込んでいく様子、外胚葉細胞がエレベータ運動する様子を動画としてはじめて可視化できた。SPIM (Single Plain Illumination Microscope)については、当初の計画では本年度の秋のうちにを開発した、ドイツ・ハイデルベルクにあるEMBLのStelzer博士の研究室を訪問しその技術を習う予定だったが、先方の都合で実施が延び延びになってしまった。大きな原因は、EMBL内部の事情なので詳細はわからないが、伝え聞く限りではこの顕微鏡の商品化の権利をCarl Zeiss社が有するため、競合他社のある日本への技術移転にEMBLのTLOが難色を示していたことによるらしい(権利とはあくまで商品化についてで、アカデミックの研究者間の協力は何ら制限を受けるものではないにもかかわらず)。ともかく9月にこの問題は解決して、ようやく導入について具体的な話し合いに入れることになった。導入するSPIMの仕様についてメールで相談し、さらに12月にはStelzer博士を当研究室に招いてlaser ablation用の装置の付加など細かい点の打ち合わせを行った。現在は、この仕様に従って必要な部品を揃えている段階である。EMBLのマシンショップで製造する特注部品もあり時間がかかっているが、これらが揃ったところでEMBLを訪問し、その場でSPIMを1台組み立て動かすことで技術を習い、分解して岡崎に持ち帰り再度組み立てる予定である。訪問できるのは平成19年度の6月頃になりそうだという返事をStelzer博士から得ている。次に、マウス胚培養については、研究室を立ち上げたばかりで必要なものが一切無かったので、器材を揃えてラット血清を含む培養液の調製と回転培養を行える系を立ち上げた。今後はSPIMの到着後、その寸法に合わせた試料チャンバーを作製する予定である。今年度は、マウス胚全体を細胞レベルで4Dイメージングするための鍵となる、EMBLのErnst Stelzer博士らが開発したライトシート型顕微鏡DSLM(digitalscannedlight-sheet microscope)を導入した。この顕微鏡の特徴は励起光の照射と蛍光の検出を別々のレンズを用いることである。なお一般の蛍光顕微鏡は同一の対物レンズを用いる。DSLMでは、励起光として細いビームを細かく振動させながら試料に入れる。そして、ビームの運動が作り出す面と直角に配置した検出用レンズから画像を撮ることで、文字通りの光学切片(XY画像)を得ることができる。さらに試料を検出系レンズの方向(Z方向)に動かすことで3次元画像を得ることができる。DSLMは3次元画像取得という目的では共焦点顕微鏡と同じだが、それと比較して、1)点の走査ではなくCCDで2次元画像を一度に撮れるため高速である(ビデオレートで画像取得可)、2)観察しない部分には励起光が当たらないため褪色や光毒性の問題が最小限に抑えられる、3)はるかに深い場所の像を得られるため大きな試料を切らずに丸ごと扱える、などの特徴を有する。特に大きな試料のライブイメージングを必要とする発生学分野では強力なツールになると期待される。経過としては、平成19年8月2026日にかけてStelzer研究室を訪問し、主に大学院生のPhillip KellerからDSLMの組み立て・調整・使用方法について指導を受けた。その後、組み立てに用いた部品を送ってもらい、当研究室にて再度組み上げて12月より画像が得られるようになったところである。現在はより鮮明な画像を得るための調整を行いつつ、マウス胚をチャンバー内で培養できるように装置を改造している。また、得られた画像を処理するためのコンピュータ環境を整備しているところである哺乳類胚発生における左右性の決定機構の解明と、さらに広くマウス初期発生その他発生学の研究一般への応用を目指して、欧州分子生物学研究所(EMBL)が開発したライトシート型顕微鏡SPIMの改良版であるDSLM(Digital Scanned Light-sheet Microscope)を、開発者のErnst Stelzer博士らの協力の下導入した。昨年度までにDSLMの光学系の導入をほぼ完了し画像は取得できるようになったが、一方で膨大な画像データを扱うには通常のPCでは力不足であることがわかったため、今年度は画像処理用の高スペックPC導入など画像処理系の構築を行った。また、DSLMは試料をアガロースゲル中に包埋する仕様のため、マウス胚のライブイメージングにはそのまま使うこと,ができない。

マウス胚は常に新しい培養液に触れていなければ育たないからである。そこで、アガロースを使わず胚の一部を穴にはめこんで試料ホルダーに固定する方法および試料チャンバーを37°C、5%CO_2環境に保つ方法を開発し、さらに基生研の藤森俊彦博士から供与を受けたH2B-GFPトランスジェニックマウス胚を用い、6.5日胚全体の一細胞レベルの鮮明な光学断面像を得ることに成功した。原腸陥入にともない原条から外胚葉・内胚葉間に中胚葉が入り込んでいく様子、外胚葉細胞がエレベータ運動する様子を動画としてはじめて可視化できた。所期の目的である左右性の解析、マウス初期胚全体の細胞分裂・移動を網羅的に調べた4D(3次元+時間)マップの構築については、顕微鏡導入のスケジュールが遅れたことで残念ながら期間内に完了することができなかった。現状は技術的基盤が完成した段階にある。それぞれ、この装置を使った細胞内カルシウム測定と繊毛の動かないiv変異マウスを使った解析、得られた画像のsegmentationとtrackingを行うことにより達成できる見込みである。
障害者の生涯にわたる口腔のＱＯＬ向上を目的とした地域連携クリニカル・パス運用

本研究の目的は、地域の障害者の歯科的支援を生涯にわたってサポートするための、地域連携パスの効率的な運用システムの構築を行なうことである。地域医療連携のスムーズ運用には、地域の一次医療機関の協力が不可欠になってくる。そのため、障害者のニーズに対応できる医療関係者への教育・育成・啓発支援をおこなうための障害者歯科に関するセミナー・臨床実習をおこないスムーズな運用のためのシステムを構築した。本研究の目的は、地域の障害者の歯科的支援を生涯にわたってサポートするための地域医療連携クリニカルパスの効率的な運用システムの構築を行なうことである。そのため、平成25年度は受け入れの一次医療機関である倉敷歯科医師会の会員への、障害者歯科に関するセミナー、臨床実習を開催した。そして参加した歯科医師に対してのアンケート調査をおこない、医療関係者への教育・育成・啓蒙支援システムの構築を検討した。また、歯科医療関係者が障害の理解を深めやすくするために、自閉症者の歯科での行動調整法についての論文を発表した。本研究の目的は、地域の障害者の歯科的支援を生涯にわたってサポートするための地域医療連携クリニカル・パスの効率的な運用システムの構築を行うことである。地域医療連携の運用には、地域の医療関係者の協力が不可欠になってくる。そのため、障害者のニーズに対応できるクリニカル・パスの開発と医療関係者の教育・育成・啓蒙を行うことが必要となる。高次医療機関である大学病院、地域の歯科医師会が主宰する口腔保健センター、地域の開業歯科医院とを連携するクリニカル・パスの開発と運用システムの構築を行う。.本研究では、クリニカル・パスを地域の障害者に標準化した、切れ目のない(シームレス)医療を効率的に提供するためのツールとして位置づける。クリニカル・パスは電子文書として、大学病院に置いたホスト・コンピューターを中心とし、地域の第1次、第2次、第3次医療機関を結ぶネットワーク上で運用する。本研究者は平成2123年度で「障害者の生涯にわたる口腔のQOL向上を目的とした地域連携クリニカル・パス開発」の研究を行っているが、23年度までに作成しているクリニカル・パスをより障害者のニーズに合うように改良をおこなっていくこととする。また、医療関係者の教育・育成・啓蒙のために、香川県歯科医師会および倉敷歯科医師会においてセミナーを開催した。また、運用実績を学会にて発表し、専門家の意見を伺った。本研究の目的は、地域の障害者の歯科的支援を生涯にわたってサポートするための地域連携クリニカルパスの効率的な運用システムの構築を行なうことである。研究の結果、地域医療連携の運用には、一次医療機関となる開業歯科医の協力が不可欠になってくることがわかった。そのため、障害者のニーズに対応できるよう地域医療関係者への教育・育成・啓発を行うことが必要となる。平成25年度は受け入れの一次医療機関である倉敷歯科医師会の会員への、障害者歯科に関するセミナー、臨床実習を開催した。平成26年度も引き続き同様のセミナー・臨床実習を改善しながら施行した。そして、参加した歯科医師に対してのアンケート調査をおこない、受け入れ先となる医療関係者への教育・育成・啓発の支援システムを構築した。以上より受け入れ先の医療機関が増えることにより効率的な障害者歯科における地域医療連携が可能になってくると考えられる。障害者歯科学平成25年度は、地域連携クリニカルパスの受け入れ一次医療機関である歯科医師会センターでの障害者歯科に関するセミナーおよび臨床実習をおこない、医療関係者への教育・育成・啓蒙支援システムの構築の検討ができたため。また歯科医療関係者への自閉症者の歯科医療対応についての論文を発表することで、歯科医療関係者への障害の理解を深めることができたと考えられる。23年度までに作成している「障害者の生涯にわたる口腔のQOL向上を目的とした地域連携クリニカル・パス」をより障害者のニーズに合うように改良をおこなった。また、香川県歯科医師会、倉敷歯科医師会において歯科医療関係者への教育セミナーをおこなった。平成26年度も引き続き、地域連携クリニカルパスの受け入れ一次医療機関である歯科医師会センターでの障害者歯科に関するセミナーおよび臨床実習をおこない、医療関係者への教育・育成・啓蒙支援システムの構築を行なう。そして、実際に地域連携クリニカルパスの運用を行い、スムーズに医療連携ができているかを検討する。また、この研究を国内外の関係学会で発表し、障害者歯科における地域医療連携クリニカルパスの評価や改善点を検討する。クリニカル・パス運用のための、地域医療連携となる医療関係者への教育・育成・啓蒙支援システムの構築1)クリニカル・パス運用にあたり、障害者のニーズに対応できる医療関係者への教育・育成・啓蒙支援システムの構築を行い、運営について協議、実施を行う。2)クリニカル・パスの運用について、国内外の関係学会で発表および論文投稿を行う。地域連携クリニカルパスの受け入れ先である、一次医療機関の医療関係者へのトレーニングセミナー開催が年度をまたがって開催されるため、それにともなう経費が繰り越された。

地域連携クリニカルパスの受け入れ先である、一次医療機関の医療関係者へのトレーニングセミナーを、4月から2回目を計画していて、それにともなう講師料、講師交通費等に経費を予定している。クリニカル・パス運用のための、地域医療連携となる医療関係者への教育・育成・啓蒙支援システムの構築のためにセミナーを開催する。そのための、会場費、講師料等を予定している。クリニカル・パスを運用しながら電子システムの修正も予定している。そのためのシステム修正を専門家に依頼する。クリニカル・パスの運用について、国内外の関係学会で発表および論文投稿を行う。・次年度使用額(BーA):100.836円が生じた状況は、医療関係者への教育・育成・啓蒙支援システムの構築のためにセミナーの開催が平成25年3月6月を予定していいて年度をまたがっている。そのため、平成25年度に開催のセミナーに使用予定です。
劣化脂質による胆道がん発症機構とその制御に関する検討

肥満などの生活習慣病と発がん(および癌死)の関連性が注目されている。本研究では変性脂質の胆道発がんへの関与を検討した。リソリン脂質は胆管上皮細胞のG2A発現を増加させるとともにアポトーシスを惹起した。さらにその変化は劣化脂肪酸の共存によりsynergisticに増強した。さらに、LPCは胆管上皮細胞に対し酸化ストレスを介して細胞老化を誘導し、SASP因子の産生により周囲の微小環境に影響を与えて発癌に寄与することが示された。以上より、肝内結石症、原発性硬化性胆管炎、膵胆管合流異常症では持続する胆道炎における胆汁脂質メディエーターの関与が胆道発がんに関与することが推察された。本研究では脂質成分,特に劣化脂質と発がんの因果関係に着目して、胆汁脂質の劣化とそれが常時接触する胆道(胆嚢・胆管)の発がんリスクを検討するとともに、その調節による予防的治療戦略の提案を目指している。前年度の臨床的検討に引き続いて、胆道疾患患者胆汁をドレナージおよび経鼻内視鏡的に採取して新規バイオマーカーとしてペリオスチンを定量して臨床的意義を検討した。加えて、基礎的検討としてSASP関連遺伝子のプロファイリングをDNAマイクロアレイによる網羅的比較解析を行った。その結果、1.線維性変化を伴う硬化性胆管炎や胆道癌ではペリオスチンが高値を示す傾向を認め、そのバイオマーカーとしての臨床的意義が示唆されるとともに、2.劣化脂質の曝露によるウ胆道組織におけるIL8などの炎症性サイトカインの発現増強が認められた。以上より、前年度に得られた、劣化脂質曝露による胆道上皮細胞アポトーシスに加えて、脂質分子をリガンドするGタンパク共役型受容体G2Aなどの脂質代謝関連遺伝子発現変動がSASPに連動することが示された。次年度はその防御機構の検証を進める予定である。本研究では脂質成分(特に劣化脂質)と発がんの因果関係に着目して、脂質に豊富な胆汁に曝露される胆道(胆嚢・胆管)発がんへの劣化脂質の関与と、その調節による予防的治療戦略を提案することを目指して遂行している。当該年度においては、臨床的には、胆道疾患患者胆汁をドレナージおよび経鼻内視鏡的に採取して劣化脂質分析を施行してその病的意義を検討すべくサンプルの集積を遂行した。一方、基礎的検討として、劣化脂質曝露による胆道上皮細胞アポトーシスと、脂質分子をリガンドとするGタンパク共役型受容体G2Aなどの脂質代謝関連遺伝子発現プロフィリングの評価と、防御機構となる生体成分の拾い上げを開始した。まず、ヒト胆管癌細胞Hucct-1、正常ヒト胆管上皮細胞にLPC 1100μM, 9-HODE(G2Aリガンド) 0.110μM, LPC+9HODEを添加し、1)G2A発現をWestern blot、2)細胞障害をMTT assay(細胞数カウント)、LDH assay(生存細胞機能確認)、3)アポトーシスを4',6-diamidino-2-phenylindole(DAPI)染色による形態評価、Annexin-V/PI二重染色によるフローサイトメトリー法、Caspase活性(Caspase-3, -8, -9)Assayにて評価した。その結果、リソリン脂質は胆管上皮細胞のG2A発現を増加させるとともにアポトーシスを惹起した。ヒト不死化胆管上皮細胞株MMNK-1にLPCを添加し、細胞増殖能、ROS産生、脂質過酸化、8-OHdG発現定量による酸化的DNA傷害、DNAメチル化を評価するとともにマイクロアレイによる網羅的遺伝子発現解析を行った。細胞老化はp16,p21の発現とSA-β-gal活性で評価し、SASP因子はqPCR, cytokine assayにて遺伝子・蛋白発現を解析した。その結果、LPCは胆管上皮細胞に対し細胞障害作用を示し、抗酸化剤N-acetylcysteine(NAC)の併用で細胞生存率は有意に改善した。さらにLPCは濃度・時間依存的にROS産生を誘導し、これらはNACの併用で抑制された。またmalondialdehydeの有意な増加を認めたことから、これらの酸化ストレスに伴い、8-OHdGの産生も有意に増加し、酸化的DNA傷害が惹起されることが示唆された。さらにトータルゲノムのDNAメチル化は胆管癌細胞株であるHuCCT-1と同程度まで低下していた。マイクロアレイによる遺伝子発現変化の検討では、LPC刺激によりIL-8, IL-6をはじめとするSASP因子の発現誘導を認めた。このため、LPCによる細胞老化を評価したところSA-β-gal活性の有意な上昇を認め、p16, p21の遺伝子発現も有意な発現誘導を認めた。