hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
T細胞と非造血系細胞の相互作用による自己免疫疾患の発症機構の解明

我々の研究室では、インターロイキン-6(IL-6)の細胞内シグナル伝達分子であるgP130に変異を入れ、IL-6シグナルが亢進したマウスを確立し、このマウスが自己免疫性関節炎を自然発症することを報告した。さらにこの関節炎発症に非造血系細胞へのIL-6シグナル亢進が必要であること、IL-17Aを産生するヘルパーT細胞のサブセットであるTh17が関与することが、これまでに明らかになっている。線維芽細胞はIL-17AあるいはIL-6刺激によってIL-6を産生するが、このIL-6産生は、IL-17AとIL-6の両方の刺激により、相乗的に増加することが明らかになった。このことから、IL-17Aが非造血系細胞においてIL-6のポジティブフィードバックを起こし、これが自己免疫疾患発症の引き金となることが示唆された。そこで、IL-6のポジティブフィードバックを関与する分子の同定を試みた。IL-6産生のポジティブフィードバックに関与する分子を同定するために、スクリーニングを行った。そこで見出した候補分子について2次スクリーニングを実施し、さらに候補分子の絞り込みを行った。その結果、絞り込んだ候補分子について、IL-6の産生にどのように関与しているのか、詳細な分子メカニズムを検討している。具体的には、IL-17AとIL-6によるIL-6のmRNA発現までのシグナル伝達に関与するかどうかを確認するため、mRNAレベルでのIL-6発現に関与する分子であるかを確認し3ている。現在、mRNAレベルでのIL-6発現に関わる分子について、IL-6やIL-17によるシグナル伝達に関与するかを確認するために、STAT3やNF-κBなどのシグナル伝達に関わる分子に対する影響を検討している。この分子メカニズムが明らかになれば、自己免疫疾患の治療に有効な標的分子となることが期待される。我々の研究室では、インターロイキン-6(IL-6)ファミリーサイトカインの細胞内シグナル伝達分子であるgp130の759番目のチロシンをフェニルアラニンに置換することで、STAT3のリン酸化が亢進したノックインマウスgp130 F759/F759マウス(F759)を確立し、このマウスは自己免疫性の関節炎を自然発症することを報告した。さらに、このF759の関節炎に非造血系細胞へのIL-6シグナル異常が必要であること、IL-17を産生するヘルパーT細胞のサブセットであるTh17が関与することがこれまでに明らかになっている。今回、F759マウスの解析で得られた『免疫系細胞と非造血系細胞の相互作用により自己免疫疾患が発症する』という仮説が、IL-6依存的なより一般的な自己免疫疾患のモデルにも当てはまるかどうかを検討した。自己免疫疾患のモデルとして、多発性硬化症のマウスモデルである実験的脳脊髄炎(EAE)を用いた。このEAEもIL-6とIL-17に依存する自己免疫疾患であることがすでに報告されている。このモデルでeffector phaseにおけるIL-6シグナル影響を検討するため、EAEを発症しているマウスのT細胞を移入し、レシピエントマウスにEAEを誘導する系を確立した。Cre-Loxpシステムを用いて、Type I collagenを発現する細胞(線維芽細胞等の非造血系細胞)特異的にSTAT3を欠損するマウス(非造血系細胞にIL-6シグナルが入らないマウス)を作製し、そのマウスをレシピエントにT細胞移入によるEAEの誘導を試みた。その結果、非造血系細胞でSTAT3を欠損するマウスにおいてEAEが抑制されることが明らかになった。このことから、非造血系細胞へのIL-6シグナルがF759関節炎以外の自己免疫疾患にも関与することが示された。また、線維芽細胞はIL-17刺激によってIL-6を産生することから、IL-17がIL-6のポジティブフィードバックを起こし、これが自己免疫疾患発症の引き金をなることが示唆された。さらに、このF759の関節炎に非造血系細胞へのIL-6シグナル異常が必要であること、IL-17Aを産生するヘルパーT細胞のサブセットであるTh17が関与することがこれまでに明らかになっている。線維芽細胞はIL-17AあるいはIL-6刺激によってIL-6を産生する。この繊維芽細胞からのIL-6産生は、IL-17AとIL-6の両方の刺激により、相乗的に増加することが明らかになった。現在、IL-17AとIL-6によるIL-6のポジティブフィードバックに関与する分子を同定するために、スクリーニングを行い、見出だした候補分子の詳細な解析を行っている。IL-6のポジティブフィードバックを制御する分子が同定できれば、自己免疫疾患の引き金となる分子機構が解明され、自己免疫疾患の治療においても有力な標的分子となることが期待できる。また、Th17細胞の分化を抑制することは、自己免疫疾患を抑制する上で重要である。

外来の刺激により、肝臓で亜鉛トランスポーターの発現が変化し、血清中の亜鉛濃度が変化することが報告されている。そこで、非造血系細胞が関与する因子として亜鉛に着目し、亜鉛がTh17分化に関与するかを検討した。その結果、亜鉛投与により自己免疫疾患が抑制され、Th17細胞への分化が抑制されていることが明らかになった。さらに、亜鉛はSTAT3の活性化を阻害することでIL-6シグナル伝達を抑制することが分かった。これらの結果から、亜鉛によるTh17依存性自己免疫疾患の治療の可能性が示唆された。我々の研究室では、インターロイキン-6(IL-6)の細胞内シグナル伝達分子であるgP130に変異を入れ、IL-6シグナルが亢進したマウスを確立し、このマウスが自己免疫性関節炎を自然発症することを報告した。さらにこの関節炎発症に非造血系細胞へのIL-6シグナル亢進が必要であること、IL-17Aを産生するヘルパーT細胞のサブセットであるTh17が関与することが、これまでに明らかになっている。線維芽細胞はIL-17AあるいはIL-6刺激によってIL-6を産生するが、このIL-6産生は、IL-17AとIL-6の両方の刺激により、相乗的に増加することが明らかになった。このことから、IL-17Aが非造血系細胞においてIL-6のポジティブフィードバックを起こし、これが自己免疫疾患発症の引き金となることが示唆された。そこで、IL-6のポジティブフィードバックを関与する分子の同定を試みた。IL-6産生のポジティブフィードバックに関与する分子を同定するために、スクリーニングを行った。そこで見出した候補分子について2次スクリーニングを実施し、さらに候補分子の絞り込みを行った。その結果、絞り込んだ候補分子について、IL-6の産生にどのように関与しているのか、詳細な分子メカニズムを検討している。具体的には、IL-17AとIL-6によるIL-6のmRNA発現までのシグナル伝達に関与するかどうかを確認するため、mRNAレベルでのIL-6発現に関与する分子であるかを確認し3ている。現在、mRNAレベルでのIL-6発現に関わる分子について、IL-6やIL-17によるシグナル伝達に関与するかを確認するために、STAT3やNF-κBなどのシグナル伝達に関わる分子に対する影響を検討している。この分子メカニズムが明らかになれば、自己免疫疾患の治療に有効な標的分子となることが期待される。
回転する環状液層内のパターン形成と制御

Czochralski炉内の融液対流の制御を最終目的として、外管壁加熱、内管壁冷却された環状プール内の薄い液体層中に生じる表面張力対流の3次元振動流の発生条件および発生後の温度・流れの変動パターンに及ぼす、回転の影響について検討を行った。まず、スーパーコンピュータを利用して、出来る限り細かいメッシュを用いた数値解析を実行し、厚さ1mmのシリコンオイル液層内の流れと温度場の時空間変動を検討した。その結果、外管壁温度と内管壁温度の温度差(ΔT)がある臨界値を越えると、環状液層内の流れは軸対称定常流から、細かいスポーク状のパターンが、周方向に伝播するHydrothermal Waveが発生することを確認した。このスポークパターンの波数や臨界温度差は、強い液深依存性を示すことを明らかにした。この環状液層を、中心軸の周囲にゆっくりと回転すると、Hydrothermal waveの発生条件は回転数依存性を示すことを明らかにした。また、スポークパターンの挙動も変化することを確認した。しかし、当初予測していた、回転付与によってHydrothermal Waveの発生を強く抑制することは困難であることが判明した。様々なチェックを行った結果、予測に用いたシミュレーションに使用したメッシュが粗かったために、波数の大きなスポークが計算出来なかったためであることが判明した。このため現在、極めて細かいメッシュを用いた計算を実行した。現在線形安定解析との比較検討も行った。これまでの計算結果をまとめて、2005年7月に西安で開催される国際会議において発表する予定である。
がん細胞の酸素走性に関する研究

本研究では,がんの血行性遠隔転移メカニズムの解明を目指し,腫瘍細胞(MDA-MB-231細胞)が細胞外の誘導因子(cue)に従い方向性に遊走するかどうかを検討し以下の成果を得た.1in vitroで培養細胞組織内に安定した代謝物質/代謝産物濃度勾配を簡便かつ安価に形成可能な方法を新規に開発した,2濃度勾配下の細胞は、高酸素濃度方向もしくは低H+濃度方向へ遊走した,3ここで観察された方向性細胞遊走は、非生理的な高酸素濃度(21%)下でも見られた,4細胞外H+濃度勾配を人為的に変化させると方向性遊走が消失する場合があった,5以上より今回証明した方向性遊走のcueは細胞外H+濃度勾配の可能性がある.H26年度計画の"培養細胞組織内に酸素濃度勾配を形成する技術の開発"については、新規に考案・製作したgap cover glassを用いることで達成でき、成果は、大学院生が第12回がんとハイポキシア研究会で発表した。また、第54回日本生体医工学会大会(H27年5月)でも発表予定である。同じくH26年度計画の"細胞運動の長時間トラッキング"については、post EMT転移性乳がん細胞株であるMDA-MB-231細胞を用いることで、12時間にわたって位相差顕微鏡下で個別の細胞の動きを追跡することが可能であることが判明した。以上より、本研究の第1の目的である酸素濃度勾配下の細胞の遊走を長時間にわたり定量化する準備がほぼ完成したと言える。以上の成果をもとに本来H27年度以降の計画であった、酸素濃度勾配下の細胞の遊走の観察を開始している。Forwardmigration indexを用いて細胞遊走の方向性を定量したところ、酸素濃度勾配に直交する方向(すなわち酸素濃度勾配が存在しない方向)へはランダムな遊走が見られたが、一方で、酸素濃度勾配方向については、その方向に一致する遊走が見られた。また、この方向性遊走の強さは、細胞周囲の酸素濃度に依存することを思わせるデータが得られている。これらの成果は、国内学会(第54回日本生体医工学会大会)で大学院生が発表予定である。また、本年7月に中国武漢市で開催される国際学会(International Society on Oxygen Transport to Tissue)においても発表予定である。H27年度は、前年度に新規考案・製作したgap cover glass(GCG)を用いた組織内酸素濃度勾配のin vitroモデルにおいて以下の知見を得た。1. PreSens社製酸素感受性シートを用いGCG直下酸素濃度の蛍光イメージングを行ったところ、コンピュータシミュレーションの結果に合致する酸素濃度勾配が観察された。2.生理的な酸素濃度下でGCG直下のMDA-MB-231細胞の遊走を12時間にわたって観察したところ、酸素濃度勾配に沿って、酸素濃度の高い方向へ向かう細胞遊走が観察された(方向性遊走)。(ISOTT2015、第54回日本生体医工学会大会等で発表済み、査読付き論文印刷中)3.酸素濃度勾配を減少させるために細胞密度を低下させた所、2の方向性遊走は消失した。4. negative controlとして酸素濃度を生体内では見られない高値に設定した所、2と同様の方向性細胞遊走が観察された。これは、予想と反する結果である。以上より、細胞遊走の方向が酸素濃度勾配のみで決定されるのではない可能性が考えられた。そこで上記実験モデルにおいて、酸素濃度勾配と同時に形成されるであろう細胞外pH勾配の影響を検討することとした。細胞外pH勾配の蛍光イメージングにはBCECFを用いた。5. GCG直下にpH勾配の形成が確認できた。6. pH勾配は酸素濃度の設定条件により大きく変化しなかった。7.細胞密度を変えることでpH勾配が変化したが、pH勾配の変化が見られたGCG直下微小領域と3で述べた細胞密度低下により方向性遊走が消失した領域にオーバーラップが見られた。(第55回日本生体医工学会大会発表予定、ISOTT2016発表予定)以上の結果は、今回の腫瘍組織微小環境モデルにおいては、細胞外pH勾配がMDA-MB-231細胞の方向性遊走を誘導した可能性を示唆している。当初の計画どおり、in vitro実験モデルを確立し、それを用いMDA-MB-231細胞の方向性遊走を示すことができた。腫瘍細胞の方向性遊走の可能性は古くから予想されてきたが、それをin vitro系で初めて示し得たものと思う。この成果の一部は査読付き論文として印刷中である。以上より、研究は順調に進展してきた。一方で、既知の細胞内酸素センシングメカニズムからは予測できなかった方向性遊走が見つかり、酸素以外の細胞遊走誘導メカニズムを考察する必要が生じた。がんの血行性遠隔転移の初期メカニズム解明とその制御を目指し、本研究では、MDA-MB-231細胞(転移性乳がん細胞株)が、腫瘍組織中に形成される代謝物濃度勾配(metabolic gradients)を模擬したin vitro環境中で方向性遊走する可能性及びその誘導因子について検討した。これまでの研究で、上記環境中で方向性遊走が観察されること、また、それは細胞に内在する酸素センサーであるHIF-1αが誘導されるとは考えられない高酸素濃度環境でも見られること等が明らかとなったことから、今年度は酸素に代わる誘導因子として細胞外pH勾配を検討した。

まず、上記in vitro環境中での細胞外pHをBCECF蛍光を用い画像化・定量したところ、1細胞外には最大で約-0.25 units/mmのpH勾配が形成されること、2このpH勾配は細胞密度によって変化すること、等が明らかとなった。この知見を利用し、細胞密度を変化させることでpH勾配を変化させ、その際の細胞遊走を観察・定量した。その結果、酸素濃度勾配の影響を排除可能な条件下で、細胞遊走の方向性はpH勾配の大きさに依存する可能性が示された。一方で、上記実験条件では、遊走する細胞どうしの衝突が遊走方向に影響することが明らかとなったため、細胞の衝突を回避しつつ遊走を定量できる新しい測定法を考案し、その予備的な実験を行った。今後、この新しい方法を用い、さらに細胞外pH勾配による遊走の誘導を検討していく予定である。また、今回は、細胞外酸素濃度を高くすることで、HIF-1αの関与を否定したが、今後HIF-1α遺伝子ノックダウン実験により酸素濃度勾配による細胞遊走誘導を検討する予定である。本年度の成果は、国内学研究会(4回)、国際学会(1回)、招待講演(1回)、査読付き原著論文(2本、うち1本はaccept)で発表した。本研究では,がんの血行性遠隔転移メカニズムの解明を目指し,腫瘍細胞(MDA-MB-231細胞)が細胞外の誘導因子(cue)に従い方向性に遊走するかどうかを検討し以下の成果を得た.1in vitroで培養細胞組織内に安定した代謝物質/代謝産物濃度勾配を簡便かつ安価に形成可能な方法を新規に開発した,2濃度勾配下の細胞は、高酸素濃度方向もしくは低H+濃度方向へ遊走した,3ここで観察された方向性細胞遊走は、非生理的な高酸素濃度(21%)下でも見られた,4細胞外H+濃度勾配を人為的に変化させると方向性遊走が消失する場合があった,5以上より今回証明した方向性遊走のcueは細胞外H+濃度勾配の可能性がある.実験手法の確立がスムーズであったため、次年度に計画していた実験を先行して開始することができた。その結果、本研究での仮説を支持するような新しい知見が得られ始めているため。現時点では、細胞外pH勾配を想定することで、これまでの実験結果を説明可能であることが判明している。これまでに方向性遊走を現象として捉えることに成功していることから、今後はその細胞内メカニズムの検討に発展することになる。具体的には、まず、当初予想しなかった細胞外pH勾配による細胞遊走誘導についてエビデンスを積み重ねる。培養液の調製法を工夫することで細胞外pH勾配を大きく変化させ、それに伴う細胞遊走の変化を観察する。次に、細胞遊走と細胞外pHを関係付けるファクターである焦点接着斑(FA)に注目して、方向性遊走に特異的なpH条件を探索する。一方で、これまでの実験結果から、細胞遊走の方向性を論じる際、細胞同士の衝突がアーチファクトとなる可能性が明らかとなった。今後、細胞同士の衝突を避けた上で遊走の方向を決定する手法を開発する。酸素の生理学当初研究計画を着実に実行する。
冗長な数表現による剰余数系演算回路および剰余数-重み数変換回路の研究

2進SD数表現を用いた剰余数系から従来の2進数系への変更を高速に実行できるハードウェアアルゴリズムを提案した。この方法では、SD数演算の並列処理特徴を生かした。変換に必要な演算をさらに高速に行うため、基本演算回路であるSD数加算回路の高速化方法を考案した。変換回路および算術演算の回路設計およびシミュレーションを行い、高速な回路が得られることを明らかにした。また、そろばん数表現を剰余数系の演算に適用し、高性能の剰余回路の実現が期待できることを設計と回路評価により確認した。本研究では,剰余数系における算術演算の高速化方法,および従来の重み数系(例えば,2進数)への高速変換のハードウェアアルゴリズムの提案を研究の目的としている。算術演算システムは,従来の2進数の入出力データを持ち,内部ではSD数表現を用いた高速剰余演算を行う。高速の剰余数系-重み数系の高速相互変換回路を使用すれば,従来の演算システムと同様に応用可能となる。今年度の研究成果として,2進SD数表現を用いた剰余数系から従来の2進数系への変更を高速に実行できるハードウェアアルゴリズムを提案した。この方法では,SD数演算の並列処理特徴を生かした。変化に必要なパラメータを演算に使いやすい形のSD数表現にすることによって,変換の基本演算回路は演算量が極めて少ないSD数加算回路と符号反転回路から構成される。また,得られたSD数表現の重み数を2進数への変換アルゴリズムを工夫した。木構造の桁上げ回路を考案し,従来の2進数アルゴリズムより高速性を有することが,回路設計およびシミュレーションによって確認された。もう一つの研究成果は,剰余乗算逆数演算の高速アルゴリズムの提案である。剰余数系の法を2^P-1の形にしたとき,剰余演算の効率が一番効率よい回路構成が設計できることが,以前の研究成果から明らかにされている。しかし,効率的な変換アルゴリズムは提案されていない。変換手続きの中,剰余乗算逆数を求める方法が最も重要である。本研究では,SD数演算を用いた剰余乗算逆数を求める方法を提案した。また,本研究の目的で,異なった数表現である「そろばん」数表現を着目した。今後10進数の剰余数演算システムの開発を研究内容として進めていきたい。本研究では、剰余数系における算術演算の高速化方法、および従来の重み数系(例えば、2進数)への高速変換のハードウェアアルゴリズムの提案を研究の目的としている。算術演算システムは、従来の2進数の入力データを持ち、内部ではSD数表現を用いた高速剰余演算を行う。高速の剰余数系-重み数系の高速相互変換回路を使用すれば、従来の演算システムと同様に応用可能となる。変換に必要な演算をさたに高速に行うため、基本演算回路であるSD数加算回路の高速化方法を考案した。剰余SD数加算回路の内部中間加算結果を2進数符号化にしたことにより、後続の加算入力数を減らし、回路全体の規模や遅延時間を小さくすることができた。変換回路および算術演算の回路設計およびシミュレージョンを行い、高速な回路が得られることを確認したまた、本研究の目的で、異なった数表現である「そろばん」数表現を着目した。そろばんアーキテクチャを用いることにより、10進数演算の遅延時間が従来のBCD符号を用いた演算より短いアルゴリズムを提案した。さらに、そろばん数表現を用いた剰余数系の演算に適用でき、剰余の法を使用しやすくなり、高性能の剰余回路の表現が期待できることを設計と評価により確認した。今後、10進数の剰余数演算システムの開発を研究内容として進めていきたい。
肝細胞癌におけるＰＫＲの役割とその宿主細胞機能修飾

Protein kinase R (PKR)は、非癌部の肝組織に比べてHCV関連肝細胞癌において強発現している。しかし強発現したPKRのHCV関連肝細胞癌の発癌と進展における役割については不明であった。申請者らはHCV感染肝癌細胞株、ヒト肝細胞癌組織を用いて、PKRがHCV関連肝細胞癌において細胞増殖能を亢進させており、その作用はErk1/2→c-Fos, JNK→c-JunのMAPK経路に依存していることを同定した。HCV感染に伴う肝細胞癌で高発現するPKRが、癌の進展を亢進させ、を調節することが治療に結びつく可能性が示唆された。Protein kinase RNA-dependent (PKR)は肝細胞癌において最も頻度の高い原因であるC型肝炎ウイルス(HCV)感染によって増加し、HCV増殖を阻害する細胞内蛋白である。またインターフェロン(IFN)により誘導され、IFNの抗HCV作用を有する細胞内分子である。一方、PKRはC型肝炎患者の肝細胞癌組織において非癌部組織に比べて高発現している。肝細胞癌で高発現するPKRの役割と宿主細胞機能修飾について解析した。Huh7.5.1細胞を用いてHCV感染肝細胞癌株としてJFH1, H77sを作成した。同細胞株にPKR siRNA、およびPKR発現プラスミドを用いてPKRの発現を増減させ、それにともない細胞内で変化する遺伝子をPCRアレイ、リアルタイムRT-PCR、ウエスタンブロット法で同定した。細胞増殖への影響に注目しスクラッチアッセイ、MTSアッセイを行った。PKRの発現の増減によりMAPK関連遺伝子であるc-Fos, c-Junの発現、リン酸化が連動して増減した。またPKRはc-Fos, c-Jun各々の上流にあるErk1/2およびJNKのリン酸化を誘導しMAPK pathwayを増強した。スクラッチアッセイ、MTSアッセイの結果、PKRによる細胞増殖亢進作用が確認された。また、MAPK pathwayの阻害薬を用いた検討において、PKRの細胞増殖亢進作用はErk1/2→c-Fos, JNK→c-Junの両経路ともに依存していることが明らかになった。HCVに関連する肝細胞癌において、PKRは肝癌の細胞増殖能を亢進させ、癌の進展に寄与している可能性があり、その作用はc-Fos, c-Junの両経路の活性化に依存していた。C型肝細胞癌において過剰発現するPKRは、肝細胞癌においては治療標的となり得る可能性が示唆された。Protein kinase R (PKR)はC型肝炎ウイルス(HCV)を含むRNAウイルスが増殖する際に生じる二本鎖RNAによって活性化する。申請者は過去の検討でPKRが、HCV関連の肝細胞癌において非癌部の肝組織に比べて強発現することを同定した。しかしPKRの肝細胞癌における役割については不明であり、その生理的意義について明らかにすることを研究の目的とする。平成24年度、まず肝細胞癌株であるHuh7.5.1細胞を用いて、HCV genotype 2型の全遺伝子を複製する肝細胞癌株JFH1と、HCV genotype 1型の全遺伝子を複製する肝細胞癌株H77sを作成した。また作成したPKR siRNAと、PKRの全遺伝子をコードしたプラスミド(pPKR)を用いて、C型肝細胞癌株にトランスフェクションしてPKRの発現をノックダウン、あるいは過剰発現させ、修飾される細胞内遺伝子をPCRアレイで網羅的に検討した。その結果、PKRの増減により、MAP kinase関連遺伝子、とくにc-Fos、c-Junに変化がみられた。これらの遺伝子変化はHCV複製により増強した。JFH1およびH77sにおいてPKRノックダウンに伴うc-Fos,c-Junの発現低下、およびPKR過剰発現による発現増加をリアルタイムPCRにより確認した。またリン酸化c-Fos、c-JunもPKRノックダウンで低下、過剰発現で増加することをウエスタンブロット法で確認、さらに各々の上流にあるErk1/2、JNK1のリン酸化蛋白も同様に変化していた。これらの結果より、C型肝炎に関連する肝細胞癌において強発現するPKRはMAP kinase関連遺伝子に作用して、癌進展など病態に関わっている可能性が示唆された。昨年度までの研究で、HCV感染肝癌細胞株を用いて、PKRがHCV関連肝細胞癌において細胞増殖能を亢進させており、その作用はErk1/2→c-Fos, JNK→c-JunのMAPK経路に依存していることを同定した。

本年度は手術あるいは肝生検時に得られたヒト肝細胞癌組織34例(HCV陽性17例、陰性17例)より、mRNAを抽出し、PKR mRNAの中央値からPKR高発現群と低発現群に分けた。次に3.で同定し得た細胞内癌関連遺伝子について、mRNAおよび蛋白をリアルタイムRT-PCR、ウエスタンブロット法で測定し、PKR発現量によって増減するかどうかを検討した。またHCV陽性群と陰性群に分けて検討を加えた。その結果、肝細胞癌でPKR高発現群においてPKR低発現群よりc-Jun mRNAが増加していた。その差は、HCV陰性例ではみられず、HCV陽性例で有意差がみられた。また、Western blotによる検討で、PKR高発現群ではPKR低発現群よりリン酸化c-Fosとリン酸化c-Junの発現が増加しており、in vitroのデーターと合致した。つまり、特にHCV陽性肝細胞癌において高発現するPKRはc-Fos、c-Junを活性化しており、腫瘍の増殖、進展に関わる可能性が示唆された。これらの結果より、HCV関連肝細胞癌においてPKRは治療標的となり得ると考えられた。医歯薬学本年はPKRの肝細胞癌における役割についてin vitroのアッセイ系を中心に実験が進み、PKRはC型肝炎ウイルスの複製を阻止する作用を持つにもかかわらず、肝細胞癌で過剰発現した際には、MAPK pathwayの活性化を介して細胞増殖を促し、病態を増悪させる可能性が示唆された。ヒト肝細胞癌組織を採取し得た34例(HCV陽性17例、陰性17例)においても、PKRと同定した分子との関連をRT-PCR、ウエスタンブロット法で追加検討し、PKRの発現量はリン酸化c-Fos,リン酸化c-Junの発現増加と関連していたことを証明した。これらの追加データーも加えて論文を作成し、PLoS Oneに投稿してアクセプトされ、掲載された。計画以上の進展といえる。平成24年度に計画していたHCV複製細胞の樹立、PKR発現量を調整しうる実験系を確立し、PKRの発現に関わる候補蛋白を同定できた。今後の研究の展開について以下の検討を予定している。1. PKR発現変化による宿主肝癌細胞のDNAメチル化、蛋白リン酸化への影響PKRが影響を与える細胞内遺伝子としてMAPKを同定したが、その下流のAP-1遺伝子群はDnmt1を介してDNAメチル化に寄与することが知られている。PKR発現の増減により修飾される細胞内遺伝子に対するDNAメチル化の関与について、抽出したDNAよりメチル化DNAを精製し、Bisulfite反応処理後real-time PCRで解析する。PKRによる宿主肝癌細胞へのエピジェネティックな影響について解析し、癌細胞への生理的影響を評価する。また、PKRはリン酸化蛋白であり、そのリン酸化修飾による肝細胞癌への影響について、2D-WesternおよびEttan DIGEシステムを用いて網羅的かつ経時的に比較解析する。2.肝癌とPKR、インターフェロンとの相互作用インターフェロン(IFN)には肝細胞癌においても抗癌作用があると考えられている。しかしながらIFNによる抗癌作用のメカニズムは未だによくわかっていない。IFNはPKRをはじめ2'5'-OAS, MxA, IL-8など様々なインターフェロン誘導遺伝子(ISG)を誘導する。
肘関節運動を力源とした前腕能動義手の適応の拡大と実用性の検証

本研究の目的は、我々が開発した肘システム義手(肘関節運動を体内力源とした前腕能動義手)の適応(装着可能な切断レベル)の拡大を図るために、新たなソケットと懸垂法による肘システム義手を試作し、その実用性を切断者によって検証することである。平成30年度までには、ソケットの材料であるアクリル樹脂の硬度の違いによる肘関節可動範囲、ソケット内圧、剪断力を比較し、その結果からソケットの形状と義手の懸垂方法を考案していた。平成30年度は考案したソケットと懸垂方法による模擬肘システム義手を作製しその有効性について検討巣を進めた。作製した模擬肘システム義手は、(1)スタンプシュリンガーに断端を挿入し、CRSソケットに類似した構造のソケット(ソケットの近位内外側面を一部くり抜いた形状)とスタンプシュリンガーに貼付したベルクロとソケットに取り付けたベルクロで義手を懸垂するもの、(2)外ソケットを柵状にし、外ソケットの上からスタンプシュリンガーで義手を懸垂するもの、3)上腕カフの内側部にシリコーンコーティングし、その摩擦で義手を懸垂するもの(ソケットは(1)と同様のCRSに類似した構造)、の模擬肘システム義手を製作し、これらの実用性を検証した。また、新たな義手懸垂機構としてスノーボードやアウトドア用フックウェアに使用される「BOAシステム」は、ダイヤルを回すだけでソケットを断端に固定できる可能性があり、(4)番目の模擬肘システム義手として検討を進めた。ソケットのアクリル樹脂硬度からソケット形状(CRSソケットに準じたものまたは近いもの)を抽出することはできた。その後、義手の懸垂方法を検討していたが、平成30年西日本豪雨により被災したため、被災後に研究が十分にできない時期が続いた。これにより現在の研究状況はやや遅れていると判断している。作製した3本の模擬肘システム義手の操作性と装着性を検証し、その結果から実際の上肢切断者へ肘システム義手を作製する。また、BOAシステムの導入の検討も同時に行う。対象者の切断レベルは、前腕中断端から手関節離団までの2名を予定している。作製した肘システム義手の使用評価から新たなソケットと懸垂法による肘システム義手の実用性を検証する。肘関節運動を体内力源とした前腕能動義手(肘システム義手)を開発した。肘システム義手のメリットはハーネスが不要となることで従来の前腕能動義手よりも装着感や両手動作能力の向上であった。しかし、義手の懸垂に既製品のシリコーンライナーを使用したことで、ライナーロックアダプタを義手の中に組み込むためのスペースが必要となった。これにより、肘システム義手の適応(切断レベル)は限定された。本研究は肘システム義手の適応の拡大を図るために、新たな懸垂法による肘システム義手を試作し、その実用性を実際の切断者によって検証することである。平成28年度は、肘システム義手が肘関節運動に及ぼす影響を分析し、肘システム義手におけるソケットとカフのズレの原因を解明することを目的に実験を行った。2名の健常者を対象に陰性モデルを作製し、測定用の模擬肘システム義手を作製した。模擬肘システム義手の作製にあたってはカフ内とソケット内に貼付するセンサ(ショッカクチップ:タッチエンス株式会社)取り付け方法とアクリル樹脂硬度を検証した。その結果、センサはカフ中央部の後面と両側面に3か所とソケット近位端に4ヶ所と決定した。アクリル樹脂の硬度はHard(617H21)とSoft(617H17)を検証し、その結果、2種類のアクリル樹脂硬度(H60%とS40%、H50%とS50%)とした。今後は決定した内容で模擬肘システム義手を作製しデータの収集を行い、その研究成果を第34回日本義肢装具学会で発表する予定である。模擬肘システム義手作製までのセンサ取り付け方法とアクリル樹脂硬度の組み合わせに時間を要し、平成28年度までに予定していた健常者データが収集できなかった。現在、決定した内容で模擬肘システム義手を作製しており、模擬肘システム義手が完成した健常者からデータの収集を行っている。平成29年度の研究目的は、ソケットのアクリル樹脂硬度を従来の硬度(以下、硬性ソケット)と軟性材料のみ(以下、軟性ソケット)とした時のソケット内の剪断力と圧力を計測し、ソケットのアクリル樹脂硬度の違いが肘システム義手の装着感や操作性に影響する要因となり得るかを検討することであった。対象者は健常成人5名であった(そのうちの2名はソケット内の剪断力と内圧および肘関節の可動域(以下、ROM)を計測し、3名は肘関節のROMのみを測定した)。その結果、肘関節のROMは、屈曲が硬性ソケット124±9.70°・軟性ソケット134±8.60°(p=0.00)、伸展が硬性ソケットで-6±8.00°、軟性ソケットで-4±5.83°(p=0.18)であった。硬性ソケットと軟性ソケットの剪断力(X軸・Y軸)の差は、前面・後面・内側面・外側面において2名ともすべて1N以内にあった。硬性ソケットと軟性ソケットの圧力(Z軸)の差は、前面では1名が軟性ソケット、1名が硬性ソケットで大きく、後面と内側面では2名ともに硬性ソケットが大きかった。

また、外側面では2名ともに軟性ソケットが大きかった。これらの結果より、軟性ソケットは、硬性ソケットよりも軟部組織の移動を許容し、ソケットそのものの形状が変化することで肘関節の可動範囲が広がることやソケット内の剪断力はわずかではあるが、ソケット内の圧力は肘関節の屈曲と伸展に伴い増減することが示された。ソケットのアクリル樹脂硬度の検討やそれに伴う軟部組織の形状変化とソケットの適合を検討することは、肘関節のROMの拡大、肘システム義手の装着感や操作の改善の要因と成り得ると思われた。今年度の成果より、ソケットのアクリル樹脂硬度は可能な限り柔らかくすることが肘システム義手の操作性や装着感に良い影響を与えることが分かった。しかし、義手の懸垂においては上腕カフの検討も重要であり、この部品の検討に時間を要している。現在はこの部品と義手の懸垂の検討を行っており、決定次第、健常者を対象として模擬肘システム義手を作製する予定としている。本研究の目的は、我々が開発した肘システム義手(肘関節運動を体内力源とした前腕能動義手)の適応(装着可能な切断レベル)の拡大を図るために、新たなソケットと懸垂法による肘システム義手を試作し、その実用性を切断者によって検証することである。平成30年度までには、ソケットの材料であるアクリル樹脂の硬度の違いによる肘関節可動範囲、ソケット内圧、剪断力を比較し、その結果からソケットの形状と義手の懸垂方法を考案していた。平成30年度は考案したソケットと懸垂方法による模擬肘システム義手を作製しその有効性について検討巣を進めた。作製した模擬肘システム義手は、(1)スタンプシュリンガーに断端を挿入し、CRSソケットに類似した構造のソケット(ソケットの近位内外側面を一部くり抜いた形状)とスタンプシュリンガーに貼付したベルクロとソケットに取り付けたベルクロで義手を懸垂するもの、(2)外ソケットを柵状にし、外ソケットの上からスタンプシュリンガーで義手を懸垂するもの、3)上腕カフの内側部にシリコーンコーティングし、その摩擦で義手を懸垂するもの(ソケットは(1)と同様のCRSに類似した構造)、の模擬肘システム義手を製作し、これらの実用性を検証した。また、新たな義手懸垂機構としてスノーボードやアウトドア用フックウェアに使用される「BOAシステム」は、ダイヤルを回すだけでソケットを断端に固定できる可能性があり、(4)番目の模擬肘システム義手として検討を進めた。ソケットのアクリル樹脂硬度からソケット形状(CRSソケットに準じたものまたは近いもの)を抽出することはできた。その後、義手の懸垂方法を検討していたが、平成30年西日本豪雨により被災したため、被災後に研究が十分にできない時期が続いた。これにより現在の研究状況はやや遅れていると判断している。平成29年度前期は、2種類のアクリル樹脂硬度による模擬肘システム義手を用いたカフ内とソケット内の内圧とズレ力を測定する。後期には、この結果からカフとソケットの適合性向上に必要な要素を取り入れた模擬肘システム義手を作製し、カフ内とソケット内の内圧とズレ力を測定する予定である。平成30年度前期は、上腕カフによる義手の懸垂機構の研究を行い、模擬肘システム義手の作製とその操作性と装着感を検証する。この結果から、後期には実際の上肢切断者に対して肘システム義手を作製し、その使用状況から実用性を検証する。作製した3本の模擬肘システム義手の操作性と装着性を検証し、その結果から実際の上肢切断者へ肘システム義手を作製する。また、BOAシステムの導入の検討も同時に行う。対象者の切断レベルは、前腕中断端から手関節離団までの2名を予定している。
卵成熟誘起ステロイドホルモンの細胞膜受容体遺伝子の単離と構造解析

魚類の卵成熟誘起ステロイドホルモン(MIH)受容体は細胞膜結合型の新しい型のステロイド受容体である。これまでにこのMIH受容体分子についての化学的な情報は全く得られていなかった。MIH受容体遺伝子の単離の手がかりを得る為に生化学的解析を行ない、MIH受容体を含む細胞膜画分中にアデニル酸シクラーゼ活性が定常的に発現しており、MIHの投与によりその活性が阻害されることを見出した。MIH受容体がアデニル酸シクラーゼと連関していることから、その仲介成分として予想されたGTP結合蛋白質(G蛋白質)の関与について解析し、MIH受容体は、三量体型G蛋白質複合体を介してホルモン情報を卵母細胞内部に伝達していることが分かった。MIH受容体と連関するG蛋白質は百日咳毒素感受性型であるが、そのサブタイプの同定までには至っていない。現在、サブタイプ特異的な抗G蛋白質抗体を用いて同定を行っている。G蛋白質と相互作用する細胞膜受容体遺伝子に共通してみられる塩基配列を元に設計したプローブを用いて、既にMIH受容体を発現している時期のメダカ卵母細胞から調製したmRNAからRT-PCR法により増幅された数種類のcDNA断片を得ている。現在、これらの塩基配列の解析を進めており、配列決定後、これらをプローブにして、既に調製済みのメダカ卵母細胞cDNAライブラリーからMIH受容体遺伝子の単離を開始する。
減塩食／高塩分食摂取による塩味感受性・嗜好性・唾液成分変化に関わる分子基盤の解明

塩味感受性は外部環境に存在するナトリウム(Na+)を検出し、その体内への取り込みに影響する重要な感覚である。体内ナトリウム量が減少すると、血圧調節ホルモンであるアンジオテンシンII濃度が上昇する。本研究により、このアンジオテンシンIIがマウス味細胞に発現する受容体AT1を介して塩味応答を抑制することが分かった。さらに興味深いことに甘味応答を増強させることも分かった。末梢の味覚器にはアンジオテンシンIIによる塩味および甘味感受性調節メカニズムが存在しており、この味覚感受性の変化が体内ナトリウム/グルコースホメオスタシス維持に重要な役割を担っている可能性が示唆された。塩味感受性は外部環境に存在するナトリウム(Na)を検出し、その体内への取り込みに影響する重要な感覚である。体内Na濃度の恒常性維持にはアンジオテンシン-アルドステロン系が重要な働きをすることはよく知られている。近年、長年不明であった塩味受容体がアミロライド感受性上皮性Naチャネル(ENaC)であることが明らかにされ、このENaCの細胞膜発現はアルドステロン投与により亢進されることが報告されていたため、塩味感受性がアンジオテンシン-アルドステロン系により修飾され、この塩味感受性の変化がNa濃度の恒常性維持に重要な働きを担っている可能性が推定された。アンジオテンシンおよびアルドステロンは、体内Na欠乏および水分欠乏時にその血中濃度が上昇することが知られているため、23時間絶水させたマウスをもちいて解析を行なった。味神経(鼓索神経)応答解析の結果、アミロライド感受性塩味応答は非絶水マウスに比べて有意に低下していることが明らかとなった。また驚いたことに甘味感受性の増強がみられた。その他の味質である酸味、苦味、うま味感受性には変化がみられなかった。行動応答解析では、通常嫌う高濃度0.3M食塩水に対する飲水量が増加した。また甘味溶液の飲水量の増加もみられた。発現解析の結果、味細胞においてアンジオテンシンII 1型受容体AT1およびアルドステロン受容体MRが発現していることが明らかとなった。以上の結果から、体内Na/水分欠乏により血中アンジオテンシンIIおよびアルドステロン濃度が上昇し、味細胞に発現するそれぞれの受容体に結合し、ENaCを介する塩味応答を抑制することで塩分摂取量を増加させ、さらに甘味感受性を増強することで糖摂取量を高めている可能性が示唆された。本研究により、塩味/甘味感受性変化を介した体内Na/糖恒常性維持機構の分子基盤の一端が明かとなった。実験動物には、高食塩嗜好性/アミロライト高感受性系統C57BL/6マウスを用いた。食塩嗜好性に直接的に影響する塩味受容体がアミロライド感受性上皮性ナトリウム(Na)チャネル(ENaC)であることが近年実証され、このENaCの味細胞における膜発現は副腎皮質ホルモン・アルドステロンにより亢進されることが報告されていたため、体内Na濃度の恒常性維持に重要な働きをするレニン-アンジオテンシン-アルドステロン系に注目して解析を進めた。このホルモン系は体内Na欠乏および水分欠乏時に分泌促進されることが知られているため、23時間絶水による神経応答、行動応答の変化について解析を行なった。鼓索神経応答解析の結果、23時間絶水によりアミロライド感受性塩味応答の抑制がみられた。行動応答解析では、23時間絶水により通常嫌う高濃度0.3M食塩水に対する飲水量が増加した。また甘味-苦味混合溶液に対する飲水量の増加もみられた。この他の味質に対する行動応答の変化はみられなかった。血中アンジオテンシンIIおよびアルドステロン濃度解析の結果、23時間絶水により両ホルモンともに有意な濃度上昇がみられた。発現解析の結果、味細胞においてアンジオテンシンII 1型受容体AT1、アルドステロン受容体MRが発現していることが明らかとなった。以上の結果から、体内Na/水分欠乏により、血中アンジオテンシンIIおよびアルドステロン濃度が上昇し、味細胞に発現する受容体に結合し、ENaCを介するアミロライド感受性塩味応答を抑制することで塩分摂取量を増加させ、さらに甘味感受性を増強することで糖/Na共輸送体を介してNa吸収を高める、味細胞における塩味/甘味受容を介した体内Na恒常性維持機構の存在が示唆された。本研究課題による研究成果の一部は以下の国際雑誌に掲載された。さらにThis Week in The Journalの中で特に重要な論文として取り上げられた。DNAマイクロアレイ解析: “減塩食" vs “高塩分食"条件下で味細胞、視床下部、唾液腺、それぞれで発現に変化があった遺伝子を検出する。

また、3組織で共通の発現様式示す遺伝子(橋渡し遺伝子)を検出する。さらにデータマイニング、ホモロジー検索、配列解析などからパスウェイ予測を行なう。定量RT-PCR、2重in situ hybridizationおよび免疫組織化学法:候補遺伝子の発現変化について解析するために0, 1, 4, 12週に採取したマウスの茸状乳頭味蕾、視床下部、唾液線から抽出したtotal RNA(DNAマイクロアレイ解析に使用しなかったもの)をもちいて定量RT-PCRを行なう。候補遺伝子の細胞レベルでの発現変化について解析するためにそれぞれの週の味覚器(茸状、有郭乳頭)、視床下部、唾液腺における発現をin situ hybridizationおよび免疫組織化学法により経時的に解析する。この場合、候補遺伝子がどの味質と関連があるのかについて解析するために、味細胞マーカーにGFP/YFPを発現する遺伝子改変マウス(I型:オキシトシン受容体(OXTR) - YFP knock-in mice, II型: Trpm5-GFP mice (甘味/うま味/苦味), T1r3-GFP mice (甘味/うま味)、III型: GAD67-GFP mice (酸味)を用いて共発現性の解析を行なう。マウス飼育代として40万円、薬品・試薬代として220万円、手術道具代として5万円、ガラス/プラスチック器具代として5万円、成果発表費として20万円、実験補助費として20万円を使用する予定である。
日本語学習者に有効な読解教育実現のための読解技術の開発とその効果に関する研究

本研究では、日本語学習者に有効な読解教育を実現するための読解技術について検討した。(1)文章を読む過程で文章の論理関係の把握、および文章全体の構造への注目が深い理解に影響を及ぼす可能性があることがわかった。(2)文章の要点関係を図で示す要点関係図を作成するという読解技術(要点関係図作成)は,図を作成することに対する意識要因,(3)文章の全体構造の明確さ要因も理解に影響を及ぼすことが示唆された。第二言語としての日本語習熟度が発展途上であっても、留学生は日本語で文献や資料を読み、文章全体の内容を把握することが求められている。母語と比べて日本語での読解は、単語の認知や1文レベルの文法解析に費やす認知的負担が大きい。そのため、文章の要点と詳細情報を区別し、要点と要点、要点と詳細情報を関係づけるといった2文以上の文章処理に制約が大きい。本研究課題では、文章処理を促進させるための具体的な読解技術として、文章の要点間の関係を示した図を作成する要点関係図の作成活動を取り入れ、どのような学習者がどのような文章を読むときに文章の理解が促進されるかを明らかにすることを目的としている。要点関係図作成が有効に働く条件を解明するために、学習者の認知的特性と読む文章のタイプに着目した。研究期間の初年度は、本調査で扱う文章を選定すること、日本語学習者の要点関係図作成に対する認知的特性を探るための予備調査を行う計画であった。今年度は、以下の2点を実施した。1点目については文章構造の明確さに着目し、文章を選定した。さらに、その文章を用いて要点関係図作成活動を行う調査を試験的に行い、データを収集した。データを分析した結果、文章構造の明確さの違いによって要点関係図作成活動が理解に及ぼす影響は異なることが明らかになった。2点目は要点関係図作成活動のプロトコルデータの収集、質問紙調査を行い、認知的特性の観点から分析を進めた。研究期間の初年度は、本調査で用いる文章を選定して試験的にデータを収集すること、また日本語学習者の要点関係図作成に対する認知的特性を探るためのプロトコルデータの収集、質問紙調査を行うことを目的とした。1つ目については、構造の異なる文章の理解に要点関係図作成活動が影響を及ぼすことが明らかになった。その結果をまとめて国際シンポジウムで口頭発表を行った。2つ目のプロトコルデータはデータの書き起こしと翻訳が終わり、分析を行った。質問紙調査も分析を進めている。本研究では、日本語学習者に有効な読解教育を実現するための読解技術を検討する。日本語を使って知識を得ようとする学習者は、第二言語としての日本語習熟度が発展途上であっても文章から単に単語や文の意味を知るだけでなく、そこから目的に沿った情報を引き出し、活用していく読解が必要である。しかし、母語と比べて日本語での読解は、単語の認知や1文レベルの文法解析に費やす認知的負担が大きく、文章処理に制約が大きい。そこで、文章処理を促進させるための具体的な読解技術を取り入れ、どのような学習者がどのような文章を読むときに理解が促進するのかについて検討した。2016(平成28)年度は、以下の2点を実施した。1点目は、昨年度の予備調査で選定した文章を用いて要点関係図作成活動を取り入れて読む調査を中国の大学で日本語を専攻する学生を対象に実施した。データ分析の結果、要点関係図作成活動で適切に要点と詳細情報を区別する段階、選び出した要点を論理的に関係づける段階が難しい学習者には理解の阻害要因になりうることが明らかにされた。また、図を作成することに対する意識も影響を及ぼすことが示唆された。2点目は、上級日本語学習者のプロトコルデータの分析を進め、内容理解を目的に日本語で文章を読む過程で用いられている読解ストラテジーと理解の質の関係を調査した。データ分析の結果、文章を読んでいく過程で文章の定義と例示を関連づけていくとともに、全体の構造に注目しながら読み進めていく学習者は、文章から得た情報を新しい状況に応用できる深い理解に達していることが示された。1年目に実施した予備調査、選定した文章に基づいて調査を進める。調査の目的は、日本語学習者の認知的特性、及び文章のタイプによって要点関係図作成が理解に及ぼす効果が異なるかどうかを検討することである。要因、理解の質についても多面的に検討するためにインタビューと質問紙調査も併用し、より多くの示唆が得られるように工夫する予定である。日本語教育人件費が当初の予定よりも少なかったため、残額が生じた。次年度以降も先行研究の資料収集を継続するため、使用する予定である。
24時間型社会に危惧される疾病に対する食事性フラボノイドの予防的機能に関する研究

24時間型社会の到来により、働き盛りの世代に乳がんや心血管系疾患が増加することが危惧されている。本研究では、これら疾患の増加機序の解明や予防を目的としてマウスを用いて検討し、暗期の光曝露が心臓の血液線溶系および凝固系に影響を与えること、二交代制シフトをモデルとした明暗シフト条件下では、生体リズムが撹乱され、時計遺伝子の発現や血中生化学指標など多様な因子に影響を与えること、動脈硬化の発症・進展には影響がなかったものの、乳がん細胞のリンパ行性転移を促進すること、さらに、食事性フラボノイドであるケルセチンが乳がん転移プロセスにおいて予防効果を示す可能性を明らかにした。現代社会は、経済のグローバル化に伴い24時間型社会となり、労働時間や勤務形態の多様化が進み、深夜交代制勤務者だけでなく、サービス業や小売業においても夜間の照明に曝露される機会が増加している。また、我々の日常生活も夜型化している。本研究では、24時間型社会において危惧される疾患として、乳がん、心血管系疾患(血栓症、動脈硬化)に着目し、カテコールアミンとPAI-1の変動をリスク因子としてとらえ、光環境の変化に伴うこれら疾患の増加機序の解明と食事性フラボノイドの予防的機能について検討することを目的とした。本年度は、マウスを用いた光環境ストレス負荷モデルとして、以前に、1、2時間の光曝露を暗期に行ったので、3時間の光曝露について検討した。4週齢の雄性C3H/Heマウスを12時間周期の明暗サイクル下で4週間順化し、ZT14(照明の点灯時刻をZT0とする)から3時間250ルクスの光を曝露後、経時的に解剖を行い、血中コルチコステロン、ACTH、PAI-1、カテコールアミン類濃度、肝臓および心臓の血液線溶系、凝固系遺伝子の遺伝子発現量を測定した。その結果、ZT17において血中のアドレナリン濃度が有意に増加し、血中のACTHおよびコルチコステロン濃度がZT20でピークとなり有意な増加が見られた。血中のPAI-1濃度はZT20において有意に増加した。一方、ZT14以降において心臓中のPai-1遺伝子およびTF遺伝子の発現は有意に増加し、線溶系のtPA遺伝子の発現は有意に低下した。これらの結果から、暗期の光曝露がストレス応答系のSAM系及びHPA系を活性化し、血液線溶系が抑制され、血液凝固系が促進される可能性が示唆された。さらに、別の光環境条件として明暗シフト条件について予備的に検討したが、12時間シフトモデルを次年度にさらに詳細に検討することとした。平成27年度は、既述したようにマウスを用いた光環境ストレス負荷モデルの構築を目的に、暗期における3時間の光曝露の検討を主に行ったが、明暗シフト条件の検討を新たに追加したため、乳がん細胞移植試験モデルの確立が当初の予定より遅れている。前年度の結果から、暗期の3時間の光曝露によりストレス応答系のSAM系及びHPA系が活性化され、心臓中のPai-1遺伝子およびTF遺伝子の発現が有意に増加し、線溶系のtPA遺伝子の発現が有意に低下することがわかり、血液線溶系が抑制され、血液凝固系が促進される可能性が示唆された。そこで、4週齢の雄性C3H/Heマウスを12時間周期の明暗サイクル下で4週間順化した後、ZT14から光を曝露する1時間前に、βアドレナリン受容体のアンタゴニストであるブトキサミン、ケルセチン抱合体を投与し、Pai-1遺伝子の発現に対する影響を検討したところ、低下傾向が見られた。一方、心臓のどこの部位が特に影響を受けるのか検討したところ、上部組織が影響を受けることがわかった。4週齢の雌性BALB/cマウスを12時間周期の明暗サイクル下で1週間順化した後、マウスにマウス乳がん細胞を第4乳腺パッドに移植して、通常飼育条件下と12時間の明暗シフトモデル条件下でマウスを飼育し、7週間後に腫瘍の進展と転移の様子を観察したところ、明暗シフトモデル条件下飼育の方が腫瘍がやや大きく、転移数も多い傾向があり、また、リンパ節の腫脹も多く見られた。移植後の時間経過についてさらに検討中である。ヒト乳がん細胞を免疫不全マウスに移植する試験を行うにあたり、浸潤能が高い細胞をinvasion assayを行って選別した。現在、アポE欠損マウスを用いた動脈硬化の進展に対する明暗シフトの影響についても検討を進めている。マウス乳がん細胞移植試験については順調に進んでいるが、ヒト乳がん細胞を免疫不全マウスに移植する試験については検討中である。血管内皮細胞への影響の検討が遅れている。24時間型社会の到来により、深夜交替制勤務者に関する疫学調査の結果や夜型化した現代のライフスタイルを考えると、働き盛りの世代に乳がんや心血管系疾患が増加することが危惧される。今年度は、まず、明暗シフトによる光環境条件下で、運動量計測装置nano tagをマウスの頸部皮下に埋め込んでマウスを飼育し、生体リズムが撹乱していることを確認した。その条件下で、乳がん移植マウスやApoE欠損マウスを飼育し、明暗シフトによる生体リズムの撹乱が乳がん転移や動脈硬化病巣の発生に及ぼす影響について検討した。雌性BALB/cマウス(8週齢)の右第4乳腺にBJMC3879luc2乳がん細胞を移植し、通常明暗サイクル条件下(8:00-20:00照明)