hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ＢＤＮＦとｐｒｏＢＤＮＦの陰陽効果による長期シナプス可塑性

記憶を獲得過程と固定過程に分けて考えるとき、前者の機構は海馬長期増強(LTP)と長期抑圧(LTD)というモデル系を利用して理解が進んでいるが、後者の機構は未解明である。私は海馬切片の安定培養を用い、LTPの繰返しによってシナプス新生が、LTDの繰返しによってシナプス廃止が起こることを見出し、これらをモデル系とした解析を提唱している。今回、シナプス新生が神経サイトカインの一種BDNFとその受容体TrkBを介して生起し、シナプス廃止がBDNFの前駆体分子proBDNFとその受容体p75を介して生起することを明らかにした。一見正反対なシナプスの新生と廃止が、同一の遺伝子で制御されていることになる。本研究課題は、BDNF(脳由来神経栄養因子)とその前駆体タンパクproBDNFという近縁分子が、長期記憶の細胞基盤と想定されるシナプスの新生と廃止にそれぞれクリティカルに関与している、という研究代表者らの独自仮説を、研究代表者ら自身が確立したモデル実験系を用いて実証することを目的とする。本年度は、目覚ましい成果が上がった。第一に、BDNFはTrkBと呼ばれる受容体と高親和性に、p75と呼ばれる受容体と低親和性に結合すること、および、逆にproBDNFはp75と高親和性に、TrkBと低親和性に結合することが知られているが、これに着目しての実験結果である。シナプス新生を導くはずの刺激を、TrkBを抗体で遮蔽した条件で行うと、単にシナプス新生が阻害されるのではなく、むしろシナプス廃止が導かれた。これはシナプス新生を導くはずのBDNF分泌が、TrB遮蔽のためp75受容体刺激にすり替わった結果であると解釈できる。また、その逆に、シナプス廃止を導くはずの刺激をp75の遮蔽下で行うと、単にシナプス廃止が阻害されるのではなく、シナプス新生が導かれた。これらの結果は、BDNF-TrkB信号がシナプス新生を、proBDNF-p75信号がシナプス廃止をもたらすという仮説を側面から裏付ける成果である。第二に、シナプス新生の時間経過について、同一細胞同一部位の継時的な観察による追跡に成功したことである。これまで、固定標本の統計的処理によって論じてきたシナプス新生が、間違いのないものであることが実証できたばかりでなく、この観察によって新しい事実が判明した。刺激からシナプス新生までの間に、何も起きていないように見える数日間の「潜伏期」のあることがこれまでに分かっていたが、この時期には実は「何も起きていない」のではなく、シナプスの新生と廃止がともに高進するため、ただ総和として増加していないという時期なのであった。つまり、シナプスは常時ゆらいでおり、いったんゆらぎが高進したあと、新生側にバイアスがかかって結果的に増加する、という動態が判明した。本研究の目的は、申請者らが発見し、記憶の固定過程のガラス器内再現と想定する、繰り返しLTP誘発後シナプス強化・増加現象(RISE)と繰り返しLTD誘発後シナプス弱化・減少現象(LOSS)に関して、それぞれ脳由来神経栄養因子(BDNF)とその前駆体(proBDNF)という姉妹分子がクリティカルに関与しているとする仮説を実証することである。本年度は、昨年度までの知見を発展させて学術論文として発表する一方、以下の新知見をえた。第一は、proBDNF→BDNF変換不全マウスで、PKA活性化によってRISEが起こらないことは昨年見出した通りだが、4日間外因的にBDNFを投与した場合には、RISEが起こることを確認した。このことは、このマウスがRISEを起こせないのは、構造可塑性を生起するための道具立てを欠くからではなく、ただBDNF信号を生み出せないためであることを意味する。第二に、BDNFスカベンジャーの投与期間をさまざまに変える実験から、BDNFの作用には少なくとも2つの異なる時期がある(3回目のLTP誘発後6時間以内と、同9時間後以降)ことがわかった。RISEでは、シナプス増加が結果するまでに、発出/退縮の「ゆらぎの増大期」と「ゆらぎのバイアス期」の2段階を経ることを明らかにしているが、BDNF作用のニ相性はこの各段階に対応している可能性がある。第三に、RISEにおけるPKAの役割をLOSSにおいて担う存在は、PKCであることを見出した。PKC阻害剤は野生マウスにおけるLOSSの成立を用量依存的に阻害した。すなわち、RISEとLOSSの鏡像性は、キナーゼ信号においても成り立つことがわかった。本研究課題は、BDNF(脳由来神経栄養因子)とその前駆体proBDNFという姉妹分子が、長期記憶の細胞基盤であるシナプスの新生・廃止にそれぞれ密接に関与している、という私たちの仮説を、私たち自身が樹立した実験系を用いて実証することを目的とする。

本年度は、昨年度の成果を定量的に裏付けるとともに、新たな展開をえた。第一の成果は、交差活性化である。BDNFはTrkB分子を高親和性受容体、p75分子を低親和性受容体として信号を伝達する。逆にproBDNFは、p75と高親和性、TrkBと低親和性に結合する。そこで、BDNFを介すると想定されるシナプス新生誘発刺激時にTrkBを遮蔽し、またproBDNFを介すると想定されるシナプス廃止誘発刺激時にp75を遮蔽しておくと、正反対の効果が生じると期待される。それを実行すると、その通りになった。このとき確かに逆の受容体が活性化されていることを、TrkB分子のリン酸化を定量することで裏づけた。第二の成果は、Tg動物で上記仮説が検証されたことである。(独)産業技術総合研究所で作成されたproBDNFをBDNFに変換できないTgマウスから作成した脳切片は、シナプス新生誘発刺激を与えても新生が起きないと予想されるが、実際その通りだった。一方、廃止刺激を与えた場合には廃止は正常に進むと予想したが、実際は何も起きなかった。この結果は仮説の否定ではなく、動物内ですでに廃止が起きており、それ以上の廃止を起こせないオクルージョン状態にあったと解釈できる。第三の成果は、これまで培養系でえてきた知見を動物に適用し、培養下のシナプス新生現象が、動物個体の長期記憶と関連している可能性に支持がえられたことである。マウス脳に薬物投与用のカニューレを留置し、文脈的恐怖学習を施した後、培養下のシナプス新生を阻害する薬物を投与したところ、期待通り学習が減弱した。9項に記したように、中心課題である仮説の検証が進んだばかりでなく、新たな知見がえられた。とくにゆらぎ原理にもとづくシナプス新生の解析は、これまで理解できなかった「潜伏期」の内容を明らかにするもので、意義が大きい。また、この結果は、すでに報告済みの細胞骨格調節タンパクの動態とも合致し、多くのデータに整合性を与えるものであった。25年度が最終年度であるため、記入しない。動物実験は最終年度である平成25年度に行う計画にしていたが、研究の進捗により早期に着手し、しかも期待通りの結果をえた。代表者らが発見し、本課題解析のための独創モデル実験系である「繰り返しLTP誘発後のシナプス新生:RISE」「繰り返しLTD誘発後のシナプス廃止:LOSS」が、動物個体の行動上の記憶とどのように関係しているか、という問題には、まだ解答が得られていない。もちろん、細胞レベルの解析モデル現象が、行動レベルの現象のすべてを反映する必要はないが(それはLTP、LTDの行動的意義についても同様)、重要な問題である。手掛けている遺伝子改変動物の検討を急ぎたい。またRISEの特異的阻害剤を脳内投与した動物個体の行動の解析も急ぎたい。研究そのものは大変順調に進展している。しかし。研究の実質的展開を急ぐあまり、論文執筆・発表が遅れていることには、反省を要する。私たちの仮説は、学界の主流的見解である「LTP(高頻度活動後のシナプス伝達増強で主として受容体の発現増加による現象)が長期記憶の細胞基盤である」とする通説に対して異を唱える形になるため、批判が強い。
代謝型グルタミン酸受容体2型をターゲットとするPETプローブの開発

これまでに申請者らは、mGluR2のpositive allosteric modulator(PAM)に対するPETプローブ化を行い、[11C]CMDCやCMDCの18F標識誘導体を開発した。これらの数種の11C/18F-標識プローブはインビトロにおいて、ラット脳切片を用いたインビトロオートラジオグラフィでは、線条体や大脳皮質などのmGluR2が高い領域に特異結合が認められたものの、ラット脳に対するPETでは、インビボ特異結合がほぼなかった。そこで、2018年度では申請者らは開発する化合物候補をPAMから、negative allosteric modulator(NAM)に変え、新規なPETプローブである[11C]1を開発した。インビトロオートラジオグラフィの実験では、大脳皮質、線条体、海馬、小脳などに高い[11C]1由来の特異結合が見られた。これらの分布パターンはげっ歯類動物脳におけるmGluR2分布と一致した。また、これらの放射能はmGluR2のNAMであるMNI-137によって阻害された。すなわち、インビトロにおいても、少ないながらもmGluR2に対する特異結合が認められた。代謝型グルタミン酸受容体2型(mGluR2)を標的とする数種の新規PETプローブを開発することができた。これらのプローブがインビトロにおいて高い特異結合を有し、また、インビボにおいても、低いながら脳移行性が認められた。これらの結果は有用なmGluR2のPETプローブ開発へ大きいヒントを与えた。これまで得られた結果を基に、2019年度からmGluR2のNAM化合物を中心に、新規NAM化合物を設計、標識合成し、インビトロ及びインビボ評価を行う予定である。また、米国などの研究機関と連携しながら、共同研究を推進し、有用なmGluR2のPETプローブ開発を促進したい。申請者らは代謝型グルタミン酸受容体(mGluR)各サブタイプ(mGluR1-mGluR8)の陽電子断層撮像法(PET)用分子プローブを開発し続けている。現在までヒト脳内mGluR1を画像化できる世界初のPETプローブを開発し、様々な患者に対する臨床研究に使用してきた。今回の研究は、ヒト脳内代謝型グルタミン酸受容体2型サブタイプ(mGluR2)を画像化できるPETプローブを創出することを目的とした。mGluR2は統合失調症、うつ、認知症等の広範な脳疾患との関与が知られていながら、現在までにヒト脳内mGluR2の画像化研究に有用なPETプローブは報告されていない。これまでに申請者らmGluR2のPETプローブ[11C]CMDCを開発した。しかしながら、[11C]CMDCはin vitroにおいて、ラット脳切片を用いたARGでは、線条体などのmGluR2が高い領域に特異結合が認められたものの、ラット脳に対するPETでは、in vivo特異結合が非常に少なかった。今年度、申請者らは[11C]CMDCをリード化合物として、ベンゼン環の異なる位置に異なる置換基を導入した数種の新規プローブを設計した。これらの化合物のmGluR2阻害活性を調べてところ、CMDCより高い親和性を有する2種の化合物を見出すことができた。また、これらを[11C]CH3Iあるいは[18F]FEtBrで標識し、良好な放射化学収率で、98%以上の放射化学純度を持つ2種のPETプローブを得ることができた。これらを評価した結果、[11C]CMDCより多い特異結合が検出された。一方、申請者はmGluR2のPAMであるCMDC誘導体以外にNAMである新規PETプローブ[11C]QCAを開発した。[11C]QCAは良好なin vitro結果を示したが、P糖蛋白質などの脳内トランスポーターであるため、脳移行性が低かった。代謝型グルタミン酸受容体2型を標的とする数種の新規PETプローブを開発することができた。これらのプローブがin vitroにおいて高い特異結合を有し、臨床有用なPETプローブ開発へのLead Compoundになり得ることを発見した。

代謝型グルタミン酸受容体2型(mGluR2)を標的とする数種の新規PETプローブを開発することができた。これらのプローブがインビトロにおいて高い特異結合を有し、また、インビボにおいても、低いながら脳移行性が認められた。これらの結果は有用なmGluR2のPETプローブ開発へ大きいヒントを与えた。昨年度から得られた結果を基にして、今後申請者らは、mGluR2のPAM化合物をベースにし、新規NAM化合物を設計、標識合成し、in vitro及びin vivo評価を行う予定である。また、外国の共同研究先と密に協議を行い、効率的な研究を推進する。これまで得られた結果を基に、2019年度からmGluR2のNAM化合物を中心に、新規NAM化合物を設計、標識合成し、インビトロ及びインビボ評価を行う予定である。また、米国などの研究機関と連携しながら、共同研究を推進し、有用なmGluR2のPETプローブ開発を促進したい。
小麦の品種開発主体と育種技術・成果に関する国際比較－公的育種か民間育種か－

本研究では、自家採種の使用が可能な小麦を事例に、公的機関が品種開発を行う国と民間企業が品種開発を行う国における品種開発体制の成立条件、品種開発主体の違いによる育種技術と育種成果への影響について比較分析する。そして、育種技術を発展させ、育種成果を高める品種開発体制を明らかにする。
シュワン細胞の発生・成熟における硫酸化糖脂質の生理的意義の解明

スルファチドは、髄鞘に豊富に含まれる主要糖脂質であり、中枢神経における機能解析は様々な視点から研究がおこなわれてきが、末梢神経系に関しては報告がない。スルファチドは、シュワン細胞成熟過程において様々な機能をもつであろうことは、スルファチド欠損マウスの表現型、髄鞘形成異常、無髄シュワン細胞が神経軸索を完全に囲むことができないなどの異常から明らかである。申請者は、シュワン細胞におけるスルファチド分子種の時空間的情報とそれらに付随する分子同定をおこなう。これらは、シュワン細胞系譜に新たな知見を加え、シュワン前駆細胞の成熟誘導という難治性神経疾患の未来医療への展開に貢献するであろう。
Ｉｍｉｑｕｉｍｏｄ乾癬モデルマウスにおける体内時計の関与

生物には24時間周期の概日リズムがある。概日リズムの分子的基盤として複数の時計遺伝子が同定され、24時間周期の振動を繰り返すことによって「体内時計」を形成する。私たちはイミキモド乾癬モデルをもちいて、gdT細胞のIL23 receptor (IL23R)が時計遺伝子Clockにより直接調整されていることを発見した。Clockの変異マウスは皮膚炎が抑制され、Period2の変異マウス(Period2はClockを抑制し、逆相関の関係にある)では増悪した。さらにクロマチン免疫沈降法ではCLOCKがIl23Rのプロモーター領域に結合しており、乾癬と体内時計のメカニズムにおける関連が明らかになった。時計遺伝子clockによる乾癬様皮膚炎の制御を調べた。時計遺伝子clock変異マウス及びWTマウスにToll like receptor7のagonistであるimiquimodを5連日(day1-5)剃毛した背部皮膚と両耳に外用し乾癬様皮膚炎を誘導した。臨床スコア(耳の厚さ、背部皮膚の紅斑、鱗屑の程度)は有意差をもって変異マウスで抑制されていた。あわせて頚部リンパ節ではIL-22産生gdT細胞の割合が変異マウスで少なかった。耳のmRNAの解析でも変異マウスではIL22が抑制されていた。このモデルではIL22はgdT細胞が真皮樹状細胞やマクロファージからのIL23をうけて産生される。WTマウスと変異マウスの耳のIL23p19のqPCRでは差がみられず、頚部リンパ節のIL23産生細胞の割合も差がなかった。次にWTマウスおよび変異マウスの脾臓からgdT細胞を抽出しIL23で3日間刺激した。上清中のIL17aおよびIL22は、WTマウスで有意差を持って高かった。vivoおよびvitroの結果よりIL23 receptorの発現に差があるか調べた。脾臓よりgdT細胞をMACSで抽出しIL23 receptorのqPCR、IL23Rの発現割合をフローサイトメトリーで確認した。mRNAレベル、蛋白レベルでWT gdT細胞の方が発現が高かった。またIL23 receptorのプロモーター領域にclockが結合するかgdT細胞を用いてCHIPアッセイを行ったところ、IL23 receptorをclockが直接制御していることが分かった。以上より乾癬モデルにおいてIL23 receptorを時計遺伝子が調整することで症状が変動することが証明できた。この結果は体内時計という新しいコンセプトを乾癬の発症、治療に提供できた。尋常性乾癬(以下、乾癬)は皮膚角化細胞の増殖が異常に亢進し紅斑や鱗屑などの皮膚症状を呈する慢性疾患である。IL-17やIL-22を産生するTh17細胞がこの疾患に重要な役割を果たしていると考えられているがその発症機序や病態、増悪因子およびその機序などは未だによく理解されていない。シフトワーカーは乾癬の発症リスクが高く、また乾癬患者では血圧の夜間低下がみられないなど、体内時計と乾癬の関連を示唆する報告があるが、基礎的な研究はされていないため谷内時計の制御をうけているか検討した。主要な時計遺伝子の1つであるclockの変異マウス(clockΔ19)にToll-like receptor 7のリガンドであるimiquimodをマウスの耳と背部皮膚に塗布し、乾癬様皮膚炎モデルを誘導したところ、WTに比べてclockΔ19では乾癬様症状が顕著に抑制された。病変皮膚のmRNAレベルにおいてIL-22や抗菌蛋白S100A8がclockΔ19で低下しており、所属リンパ節ではIL-22産生gdT細胞が有意に減少していた。次にna&iuml;veなWTおよびclockΔ19の脾臓からgdT cellを磁場分離し、リコンビナントIl23で3日間刺激し上清中のIL17およびIL22をELISA法で計測した。clockΔ19ではこれらのサイトカインの産生は顕著に抑制された。以上よりIL23Rに着目しna&iuml;veなWTの耳より継時的にmRNAをサンプリングしqPCR法を行った。Il23Rは他の時計遺伝子と同様に日内変動をしていた。さらにgd T細胞のIl23Rが直接clockによって制御されていることをCHIPアッセイにて明らかにした。体内時計が乱れclockの発現が変わると乾癬の発症や症状にも影響があることが十分に予測される。体内時計という新たな視点は、乾癬の治療や発症を考えるうえで重要である。clock変異マウスを用いてIL23 receptorがclock control geneであることを証明できた。2015年業績自己免疫imiquimodによる乾癬様皮膚炎のみならず、IL23を直接皮内に打って誘導する乾癬モデルでも同様にclock変異マウスが抑制されるか検討する。

IL23 receptorがclock control geneであれば、imiquimodを外用する時間によっても症状の差が出現することが予測されるので、外用する時間を変えて誘導する。イミキモドでの乾癬様皮膚炎誘導がスムーズに行え、使用したマウス数が予定より少なかったため。現在乾癬モデルとしてイミキモドを用いたモデルを作成して実験をしているが、次年度にマウス皮膚に直接リコンビナントIL23を注射して皮膚炎を誘導するモデルをつくる。Il23注射モデルでもclock変異マウスがWTより症状が抑制されるか検証する。マウスリコンビナントIl-23に100万円、マウス購入代金30万、免疫染色抗体20万、qPCRプライマー20万、ELISA抗体20万、その他消耗品60万で見積もっている。
敗血症の予後予測因子とβ遮断薬の有効性と機序の解明

培養心筋芽細胞細胞ではカルベジロールの、抗アポトーシス効果とテロメア長短縮の抑制を確認した。マウスCLP腹膜炎誘発敗血症モデルを用いた実験では、カルベジロール群での心機能低下が抑制効果および生命予後改善効果が示された。カルベジロール群では心筋でのp53の発現低下、pgc-1a, tertの発現増加を認め、さらに、ミトコンドリア機能が改善した。白血球中のテロメアQ-FISH解析でもテロメア長の延長を認めた。以上より、敗血症性心不全の治療において、カルベジロールが心筋ミトコンドリア機能の低下の抑制、心保護作用心臓、エネルギー代謝の改善による生命予後改善効果が期待できる。敗血症の予後予測因子とβ遮断薬の有効性と機序の解明についての研究について、初年度の進捗状況を報告する。培養心筋芽細胞細胞を用いた実験では、過酸化水素による酸化ストレス刺激でアポトーシスが誘導され、テロメア長が短縮することを確認した。プロプラノロール、カルベジロール、メトプロロールの前処理で、アポトーシスの抑制とテロメア長短縮の抑制を確認したが、カルベジロール群でより有効であった。マウスCLP腹膜炎誘発敗血症モデルによるカルベジロールの効果を検討したところ、カルベジロール1mg/kg連日経口投与により、1週間生命予後が改善した。連日の心エコー検査では未治療群は心拡大と心機能の低下をきたし、いわゆる敗血症性心筋症の病態を呈するのに対し、カルベジロール群では心機能低下が有意に抑制された。この心機能の低下はCLP作成後72時間でもっとも低下し、カルベジロール群で心機能低下が抑制された。また、2週間にわたり拡張機能は良好であった。1週間後の白血球のテロメア長を検討したところ、未治療群に比べカルベジロール群でテロメア長短縮が抑制された。また、心筋サンプルを用いた検討では、カルベジロール群でp53の発現低下、pgc-1a, tertの発現増加を認め、老化関連のシグナルであるtelomere-p53-pgc-1aを介する効果であることが示唆された。さらにMito trackerやCytochrome C活性の測定により心筋のミトコンドリア機能が改善することが示唆された。1年間の基礎実験および動物実験の結果が蓄積されている。当初の計画はプロプラノロールをメインに使用する予定だったが、培養細胞による基礎実験でカルベジロールの効果がより大きいと判断し、先にカルベジロールを用いた動物実験を遂行している。研究実績の概要で示した通り、概ね仮説通りに進捗している。本年度は国際学会での発表及び年度末までに論文投稿を予定している。敗血症における心機能低下は重篤な合併症の一つである。β遮断薬の有効性は一定の評価はあるが確立されておらず、その分子生物学的機序は明らかになっていない。我々は、心不全治療で有効性が証明されているカルベジロールの効果を検討した。敗血症モデルマウス(CLP)を作成し、カルベジロール1mg/kg連日投与を行った。sham ope群を含む4群比較にて、カルベジロール群はCLPマウスで有意な生存率の改善を得た。また、経過中の心エコーによる心機能評価では、未治療群では頻脈と低心機能に陥るところ、カルベジロール群でEFの改善、左室容量の低下、拡張機能の改善を得た。心筋のPCR解析では、p53の発現低下、tert, pgc1aの発現亢進、ミトコンドリア機能転写因子であるTFAM, ERR-alphaの発現を確認した。また、Q-FISH方における解析では、カルベジロール投与による白血球でのテロメア長の延長を確認した。敗血症性心不全の治療において、カルベジロールがtelomere-p53-pgc axisを介して心筋ミトコンドリア機能の低下を抑制し、心保護作用さらに心筋のエネルギー代謝の改善による生命予後改善効果があった可能性が示唆された。現在までの結果は、国際学会で発表し、投稿準備中である。さらにメカニズムの解明のために代謝に係わるシグナルを検討中。AHA米国心臓病会議、ESICM欧州集中治療学会、日本集中治療学会で発表。敗血症の予後予測因子とβ遮断薬の有効性と機序の解明について、3年間の研究結果を報告する。マウスCLP腹膜炎誘発敗血症モデルを作成し、カルベジロール(CAR)1mg/kg連日経口投与を行った。Sham ope群を含む4群間(CLP+-/CAR+-)で比較検討したところ、CLP(+)CAR(+)で有意に1週間生命予後が改善した継時的に心エコー検査を行ったところ未治療群は心拡大と心機能の低下をきたし、いわゆる敗血症性心筋症の病態を呈するのに対し、CAR(+)では心機能低下が有意に抑制された。この心機能の低下はCLP作成後72時間でもっとも低下し、CAR(+)で心機能低下が抑制された。

1週間後の白血球のテロメア長を検討したところ、未治療群に比べカルベジロール群でテロメア長短縮が抑制された。また、心筋のPCR解析では、カルベジロール群でp53の発現低下、pgc-1a, tertの発現増加を認め、老化関連のシグナルであるtelomere-p5 3-pgc-1aを介する効果であることが示唆された。さらにMito trackerやCytochrome C活性の測定により心筋のミトコンドリア機能が改善することが示唆された。白血球中のテロメアのQ-FISH解析では、カルベジロール群でテロメア長の延長を認めた。以上の結果より、敗血症性心不全の治療において、カルベジロールが心筋ミトコンドリア機能の低下の抑制、心保護作用心臓、エネルギー代謝の改善による生命予後改善効果が期待できる。培養心筋芽細胞細胞ではカルベジロールの、抗アポトーシス効果とテロメア長短縮の抑制を確認した。マウスCLP腹膜炎誘発敗血症モデルを用いた実験では、カルベジロール群での心機能低下が抑制効果および生命予後改善効果が示された。カルベジロール群では心筋でのp53の発現低下、pgc-1a, tertの発現増加を認め、さらに、ミトコンドリア機能が改善した。白血球中のテロメアQ-FISH解析でもテロメア長の延長を認めた。以上より、敗血症性心不全の治療において、カルベジロールが心筋ミトコンドリア機能の低下の抑制、心保護作用心臓、エネルギー代謝の改善による生命予後改善効果が期待できる。テロメア長が敗血症の病態を反映する可能性が示唆されたが、マイクロRNAの検討が遅れている。培養細胞では確認したが、動物モデルでの検討を継続する。また、β遮断薬のクラスイフェクトについても検討する予定である。PGC-1aを介した代謝制御に関するシグナルを検討し、敗血症性心筋症におけるβアドレナリン受容体、特にβ3の役割を検討する。心不全当初購入を予定していた、生体モニター装置については学内の設備を使用することで代用可能であったため、購入しなかった。一方、マウスから採取できる血液や心筋組織などの生体サンプルは、きわめて少量であるため、また、カルベジロールの用量設定にかかる予備実験が予定より増加したため使用するマウスの数は増加した。当初、植込み型の生体モニターを購入予定100(万円の予算処置)だったが、数匹分のモニタリングしか行うことができず、予算が足りず購入を断念したことが大きい。生体モニタリングは、既存の設備(Tail cuffによる血圧、血流測定、心臓超音波検査機器による心機能評価)で代用した。マウスの購入匹数および動物施設の管理にかかわるコストの発生がある。上記予算は、使用項目を変更し、心筋代謝にかかわるメタボローム解析、さらに、心筋ミトコンドリア評価のための電子顕微鏡検査に充てる予定である。
RhoファミリーG蛋白質を介した細胞機能及びその作用機構の解析

アクチン細胞骨格は細胞の形態や接着、運動など、様々な細胞機能を担っており、そのアクチン細胞骨格の制御において、Rhoファミリーの低分子量G蛋白質が重要な働きをしていることが明らかになりつつある。申請者は今年度において、1)中枢神経系におけるR%hoGの発現パターンの発達による変化について、2)新規Rhoファミリー低分子量G蛋白質Rnd2と特異的に結合する蛋白質について明らかにした。1)申請者のこれまでの研究において、RhoGが神経突起の伸展に重要な役割を担っていることがわかっている。そこで、RhoGが中枢神経系の発達期においてRhoGの発現部位を同定する目的でin situ hybridization法を用いて解析を行った。その結果、RhoGは胎児期においては、その時期に神経細胞の増殖・分化が行われるventricular zoneにその発現が見られ、出生後、その部位の発現は見られなくなった。一方、出生後には脳全体のオリゴデンドロサイトにその発現が強く見られ、中枢神経系におけるRhoGの発現は発達に従って大きく変化することが明らかとなった。2)Rnd2はその多くが脳の神経細胞に発現していることが報告されているがその機能について不明であった。そこで、Rnd2の神経系における機能を明らかにする目的で、Yeast two-hybrid法によりラット脳のcDNAライブラリーを用いてRnd2と結合する蛋白質を検索した。その結果、新規蛋白質Rapostlin、及び小砲輸送に関わるVps4-AがRnd2と特異的に結合することが明らかとなった。RapostlinはRnd2と協同して神経突起の分枝を促進することも明らかになった。アクチン細胞骨格は細胞の形態や接着、運動など、様々な細胞機能を担っており、そのアクチン細胞骨格の制御において、Rhoファミリー低分子量G蛋白質が重要な役割を果たしている。申請者は今年度において、1)神経細胞による神経突起形成過程におけるRac1及びRhoAの役割とそれらのクロストークについて、2)新規RhoファミリーG蛋白質Rndと特異的に結合する蛋白質のクローニング及びそのアクチン細胞骨格の制御への関与について明らかにした。1)神経細胞のモデルとして多用されているPC12細胞の神経成長因子(NGF)による神経突起形成過程において、NGFはRac1をPI3キナーゼ依存的に速やかに活性化し、細胞膜の突起形成部位に活性化されたRaclを集積させ、そこで局所的なアクチン重合を起こし、よって神経突起が形成されることを見いだした。一方、NGFはRac1を活性化すると同時にRhoAの活性を抑制すること、またRhoAを活性化状態に保っておくとNGFによるRac1の活性化とそれに伴う神経突起の形成が抑制されることが明らかとなった。このように、Rac1とRhoAの活性化のバランスが神経突起の形成に重要であることが見いだされた。2)新規RhoファミリーG蛋白質Rndは、繊維芽細胞におけるストレスファイバーの消失や細胞体の退縮など、RhoAの機能を抑制するような作用が見られるが、そのメカニズムに関しては何もわかっていない。そこで申請者はtwo-hybrid法を用いてRndと特異的に結合する蛋白質の探索を行い、全長485アミノ酸からなる新規蛋白質をクローニングし、Sociusと名付けた。SociusはそのC末端側でRndと直接結合し、他のRhoファミリーG蛋白質とは結合しなかった。また細胞質に存在するSociusは、Rnd依存的に細胞膜へ運ばれ、ストレスファイバーの消失を引き起こすことも見いだした。以上のことから、SociusはRndによるアクチン骨格の制御に関与する分子の1つであることが示唆された。
高齢者(80歳)の口腔領域に由来する全身健康促進因子の研究

本研究の目的は、口腔の健康状態と全身の健康促進因子との関連を解明することである。口腔は人体の入り口であり、常に病原体と接していることから、口腔領域に存在する分子は全身の健康に大きな影響を与えることが想定される。そこで、長寿をもたらす因子や生活習慣を明らかにし、歯や口腔領域に由来する全身健康促進因子が実際に存在するのか否かを検証するため、80歳の高齢者を対象として、口腔と全身の健康診査、微生物学検査、生活習慣全般に関する疫学調査を行った。さらに、口腔領域に由来する生体機能分子について生化学解析を行った。研究代表者(花田)と研究分担者(米満、稲葉)は8020(80歳時において自分の歯を20本維持すること)を達成した80歳老人の歯科検査、血液検査、運動機能検査を行い、対照群との比較、及び、資料の統計解析を行った。具体的な測定項目は以下の通りである。細菌検査:真菌(カンジダ属)、肺炎レンサ球菌、ミュータンスレンサ球菌、黄色ブドウ球菌、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌(MRSA)、緑膿菌、肺炎桿菌など。唾液検査:総タンパク質、アルブミン、クレアチニン、血糖、GOT、GPT、γ-GTP、総コレステロール、中性脂肪、カルシウム、リン、IgG、IgA、IgMなど。さらに研究代表者(花田)と研究分担者(江藤)は口腔領域に由来する全身健康促進因子として唾液中の抗菌因子に着目し、ディフェンシン、ヒスタチンなどの分子について、活性測定、同定法の確立など主に生化学的な手法を用いた解析を行った。人体の入り口である鼻腔、口腔と咽頭には絶えず全身感染症の病原体が侵入している。研究の初年度である平成年度は、高齢者の歯や義歯にはどのような病原体が定着しているのかを調べた。調査は、滋賀県内で行った。まず、カンジダ属の中ではCandida albicansが歯面から68.6%、咽頭ぬぐい液から57.1%検出された。レンサ球菌ではStreptococcus pneumoniae(肺炎レンサ球菌)や各種の溶連菌が分離された。歯面からHaemophilusinfluenzae(インフルエンザ菌)が検出できる場合もある。その他に.Klebsiella pneumonia(肺炎桿菌)、Pseudomonas aeruginosa(緑膿菌)が分離された。Staphylcoccus aureus(黄色ブドウ球菌)は歯面と咽頭ぬぐい液からそれぞれ14.3%検出された。通常の黄色ブドウ球菌の他に、院内感染菌であるメチシリン耐性色ブドウ球菌(MRSA)も検出できた。インフルエンザ菌と同じ、ヘモフィルス属のHaemophilus parainfluenzaeは、腎症や急性咽頭炎を引きこすが、歯面から17.1%、咽頭ぬぐい液から8.9%分離できた。上気道炎、肺炎の原因菌であるブランハメ(Branhamera catarrhalis)は画面から14.3%、咽頭ぬぐい液から14.3%分離できた。このように口腔から呼吸器系感染症に関連する病原体が検出されるので、これらの病原菌を除去する全身健康促進因子を探索する必要がある。そこで、引き続き70歳と80歳の歯科健診、血液検査、運動機能検査を行ったのち、唾液約2000名分を収集し、国立感染症研究所の超低温冷凍庫に保存した。現在、唾液成分と血液成分を解析し、唾液に由来する全身健康促進因子を探索中である。高齢者(80歳)の口腔領域に由来する全身健康促進因子を探る目的の一環として、介護の必要な特別養護老人ホーム入居者38名の細菌検査を行った。また、80歳の健康な高齢者591人の唾液検査を行った。[唾液検査]生化学測定項目:総蛋自質、アルブミン、クレアチニン、血糖、GOT、GPT、γ-GTP、総コレステロール、中性脂肪、カルシウム、リン、IgG、IgA、IgM。

唾液の採取はOraScreen唾液採取器を使用して唾液を採取した。唾液希釈液が測定した各生化学項目試薬に影響を及ぼさないことを確認した。試験した測定項目には、血清と唾液の相関性は無かった。ただし、それぞれの項目は唾液中でも測定でき、また、微量ながら唾液中に存在することが確認され、さらに各個人により存在量が異なることが見いだされた。本研究は、高齢者(80歳)の口腔領域に由来する全身健康促進因子を解明することを目的としており、今年度は新潟県を中心に、保健所等の協力を得て追跡調査を行った。検査項目は、歯垢と咽頭の微生物検査、唾液の微生物検査、生化学検査である。歯垢サンプル、咽頭拭い液からは、MRSA、MSSA、緑濃菌、β溶連菌、肺炎球菌、H.influenzae、K.pneumoniae、S.marcescens、M.catarrhalis、カンジダを検出した。唾液サンプルは、総連鎖球菌数、ミュータンスレンサ球菌数、乳酸桿菌数の測定と、歯周病関連菌の検出等を行った。唾液の生化学検査は総タンパク質、アルブミン、クレアチン、血糖、GOT、GPT、γ-GTP、総コレステロール、中性脂肪、カルシウム、リン、免疫グロブリン等を測定した。さらに、全身健康促進因子の有力候補と想定される唾液中の抗菌ペプチドの検出方法の確立を試みた。対象とした抗菌ペプチドはディフェンシン、ヒスタチンなどである。ヒスタチンは元来、唾液中で発見されたものであるが、ディフェンシンは好中球や皮膚で発見された分子であり、まず、唾液腺由来のmRNAを用いてヒト唾液中で発現している分子を明らかにした。タンパク質レベルの検出は、ウェスタンブロット法、及び、HPLCによる分離を行った。ヒスタチンの検出のため、ボリクローナル抗体を作成したが、抗体価が低く、現在、新たな抗原を用いて作製中である。本研究は、長寿をもたらす健康促進因子と生活習慣を明らかにすることを目的とし、80歳の人を対象に、主に口腔領域に由来する生体機能分子について解析を行っている。研究代表者(花田)と研究分担者(米満、稲葉)は8020(80歳時において自分の歯を20本維持すること)を達成した80歳老人が実際に対照群よりも身体機能が優れているのかどうか、歯や口腔領域に由来する全身健康促進因子が実際に存在するのか否かを検証するため、高齢者の口腔と全身の軒昂診査、微生物学検査と生活習慣に全般に関する調査を行ってきた。この高齢者の断面調査の際に得た資料、採取した血液や口腔由来の試料の再分析を行い、同じ調査対象者の追跡調査を行い、口腔領域に由来する全身健康促進因子や全身健康を促進する生活習慣について、主に統計解析と生化学解析の2方向から解明を試みた。1)全身健康促進因子に関する統計解析前年度までの8020者の調査から得られた資料の統計解析をさらに進め、統括した。2)全身健康促進因子に関する生化学解析昨年度までの成果を基に、全身の健康に影響を与えると考えられる口腔領域由来の因子について、主に唾液サンプルを用いて同定、定量を試みた。
高温下における乳化燃料液滴の相分離・ミクロ爆発機構の解明

燃料油と水を乳化混合した乳化燃料滴を燃焼させた場合、燃料油と水の沸点の違いによりミクロ爆発と呼ばれる燃料滴の自己微粒化現象が生じ、燃焼性が向上する。しかしながら、乳化燃料滴がミクロ爆発を引き起こすメカニズムに関する検討は十分でない。本研究課題では、単一乳化燃料滴がミクロ,爆発に至るメカニズムを実験および理論的に明らかにすることを目的として研究を遂行した。平成19年度は、単一乳化燃料滴における伝熱および分散水滴における気泡核生成を考慮した数値解析モデルを構築し、気泡核生成速度から推算したミクロ爆発強度を基にミクロ爆発発生メカニズムを検討した。さらに、水滴において発生した気泡核の成長挙動を数値解析し、単一乳化燃料滴の加熱過程における気泡核の生成・成長によりミクロ爆発の発生に至るまでのメカニズムについて考察した。実験および数値解析結果より、ミクロ爆発は乳化燃料滴の表面付近の存在する水滴が過熱限界温度に達した時に急激に沸騰することより発生することが示唆された。また、ミクロ爆発強度の推算結果より、乳化燃料滴の加熱温度が高いほどミクロ爆発が発生する温度が高くなる傾向が得られた。一方、水滴における気泡成長挙動に関しては、発生した気泡核は初期水滴径に比べて最大で約10倍程度の気泡径に数μSオーダーで成長することが示された。以上の結果より、乳化燃料滴中における水滴同士の凝集・合一などの相分離挙動、さらには気泡発生・成長過程における気泡同士の合体がミクロ爆発の発生に大きく影響すると考えられる。今後、本研究課題で提案した解析モデルを改良し、水滴同士の凝集・合体、気泡同士の合体を考慮したミクロ爆発に関する解析モデルの構築が望まれる。しかしながら、乳化燃料中の分散水滴がミクロ爆発を引き起こすメカニズムに関する検討は十分でない。本研究課題では、油中水滴(W/O)型乳化燃料液滴における燃料油と水の相分離挙動に着目し、乳化燃料滴がミクロ爆発に至るまでの移動現象を実験および理論的に明らかにすることを目的として研究を遂行した。平成18年度は、乳化燃料滴のミクロ爆発挙動に及ぼす分散水滴径の影響を実験的に検討するとともに、乳化燃料滴の伝熱・相分離解析モデルの構築に着手した。乳化燃料滴のミクロ爆発挙動に及ぼす分散水滴径の影響に関しては、懸垂線に保持した乳化燃料液滴を加熱した場合の液滴温度の測定と高速度ビデオカメラを用いたミクロ爆発挙動の観察を行った。平均水滴径および水滴径分布の異なる2種類の乳化燃料(乳化燃料A:平均水滴径0.96μm、乳化燃料B:平均水滴径=2.86μm)を用いて実験を行った結果、液滴の加熱開始からミクロ爆発が起こるまでの待ち時間に対する水滴径の影響は小さいことが示された。しかしながら、水滴径分布が狭い乳化燃料Aの場合(水滴径範囲=約0.82.0μm)、ミクロ爆発発生時の乳化燃料滴径と液滴温度の間に相関があるのに対し、水滴径分布が広い乳化燃料Bの場合(水滴径範囲=約0.96.0μm)、両者の間に相関は見られなかった。一方、乳化燃料滴の伝熱・相分離モデルの構築に関しては、分散水滴を考慮した単一乳化燃料液滴内の熱移動をモデル化し、ミクロ爆発に対する水分量および水滴径の影響を検討した。水分量とミクロ爆発に至るまでの待ち時間に関しては定性的な相関が見られたが、解析モデルの妥当性をより詳細に検証し、モデルの改良を行う必要があることが示唆された.燃料油と水を乳化混合した乳化燃料滴を燃焼させた場合、燃料油と水の沸点の違いによりミクロ爆発と呼ばれる燃料滴の自己微粒化現象が生じ、燃焼性が向上する。
フォトニック結晶微小共振器を用いた単一原子検出

本年度は平成19年度に設計した、フォトニック結晶(PC)微小共振器の作成と光の入出力を行うための光学系の組み立てを行った。PC共振器は原子の共鳴波長である1.529μmに共振を持つように設計・製作する必要があるが、実質的にはナノメートルの精度で共振周波数を制御することは難しい。また、PC共振器も様々なデザインで作成し、Q値などを実験的に評価する必要がある。そのため、おおよその共振器の特性を知るためにいくつか異なるパラメータで共振器を試作した。その結果、実際に共振モードが存在することは確かめられたものの、共振波長がシミュレーションと比較して7%近くずれるという結果になった。このままでは当初の目的である単一原子検出に用いることが出来ないため、今後、共振波長のずれを補正して新たにPC共振器を作成する必要がある。また、PC共振器の特性を調べるため、テーパーファイバを用いて共振器へレーザー光を入出力するため光学系を作製した。このシステムは単一原子検出実験を行う際には超高真空中に導入することができる。本年度の当初の計画では、(1)PC共振器の製作、(2)真空装置への導入、(3)単一原子観測実験の3つをすべて行うことになっていた。しかし、上記の通りPC共振器製作に関して問題が生じたため、(2)と(3)については達成することができなかった。しかし必要な真空装置やPC共振器のマウントなどはすでに用意できているため、今後求める共振波長を持ったPC共振器が作製できれば(2)、(3)について速やかに実験を行うことが可能である。研究初年度の平成18年度は、主に単一原子検出を行うためのフォトニック結晶(PC)共振器の設計及び数値シュミレーションによる性能評価を行った。これまでに開発されてきたPC共振器でも単一原子検出を行うには十分な性能があるものの、これらはPC基板の媒質内で共振器内電場が最大になるように設計されていた。これは自由空間中に存在する気体原子と相互作用させる用途では明らかな欠点となる。そこで我々は既存の共振器に微小幅のスリットを空けた、新しいPC共振器のデザインを考案した。この共振器は、スリット導入前とほぼ同じモード体積を持ち、さらにスリット内で媒質の誘電率の不連続性に起因する局所電場増強効果によって、光電場が増強されるという特徴を持つ。これは従来の共振器よりも強い相互作用を実現できるため、単一原子検出実験を行う際には有利であると考えられる。またスリット内まで原子が進入できるため、強結合領域で実験を行うための空間領域を従来の共振器よりも2倍程度広げることができた。この設計に関して、現在投稿論文を準備中である。また、真空ガラスセル中に設置したPC共振器へプローブ光を導入するための方法を幾つか比較検討した。その結果、太さを500nm程度まで細く引き延ばした光ファイバーを用いてエバネッセント光でPC共振器と結合する方法が有力であると結論付けた。このファイバーは平成19年度の研究で実験に使用する予定である。
金融機関による資金供給メカニズムとその企業ダイナミクスへの影響に関する実証分析

本研究では、企業と金融機関(銀行・ベンチャーキャピタル)との間における金融取引関係に基づいて構築されたデータセットを用いて、金融政策の変化や株式市場の変動といった外生的なショックが金融機関の資金供給行動へ与える影響を分析した。分析の結果、(1)金融政策の引き締め期において手元流動性の乏しい銀行による融資が減少すること、(2)株式市場の低迷時に投資経験の乏しいベンチャーキャピタルによる投資が減少することが確認された。これらの結果は、企業による資金需要要因をコントロールしたうえで得られたものであり、異なる属性を有する金融機関を通じて外生的なショックが増幅・減衰されることを意味している。2014年度においては、第一に、企業と銀行のペアレベルデータを構築すると共に、Japan Venture Research社から購入した「未公開企業・調査継続企業ラウンド明細」データを用いて、スタートアップ企業とベンチャーキャピタルのペアレベルデータを構築した。第三に、構築した企業と銀行のスタートアップ企業とベンチャーキャピタルのペアレベルデータを用いて、両者の属性に関する相関関係(マッチングパターン)を分析した。当該分析結果については、経済産業研究所ディスカッションペーパーシリーズより「共同投資メンバーの構成パターンとその含意:ベンチャーキャピタルによる投資ラウンド明細を用いた分析」RIETI Discussion Paper Series 15-J-009(滝澤美帆氏との共著、査読無)として公表した。スタートアップ企業とベンチャーキャピタルのペアレベルデータについては、2014年度に購入したデータベースを用いて分析用データセットを構築した上で、2015年度の分析に向けた予備的な分析を行い、経済産業研究所ディスカッションペーパーシリーズより「共同投資メンバーの構成パターンとその含意:ベンチャーキャピタルによる投資ラウンド明細を用いた分析」RIETI Discussion Paper Series 15-J-009(滝澤美帆氏との共著、査読無)として公表済みである。当初計画では2014年度の具体的な計画としてデータセット構築のみを挙げていたが、上記論文の刊行を実現した点は、当初計画を越える進展度合いと評価できる。尚、当該論文については、査読付英文ジャーナル(Journal of Business Venturing)への投稿に向けた改訂作業を継続中である。2014年度に構築したスタートアップ企業とベンチャーキャピタルのマッチレベルデータへ、2015年度に購入したデータセットを接続した上で、企業iのベンチャーキャピタルjからの投資額の伸び率を被説明変数として、当該変数を(1)ベンチャーキャピタルjの属性変数、(2)当該属性変数と株式市場の状態を示す変数(例:株価)との交差項、(3)当該属性変数とベンチャー企業関連の政策動向を示す変数(例:ベンチャーキャピタルへの補助金額)との交差項、(4)時点ダミー、に加えて、(5)時間を通じて変化する観察できない企業レベルの固体効果へ回帰するパネル推計を行った。分析結果のうち、(2)および(3)の係数に関する推定値を用いることで、外部環境が変化した際に異なる属性を有するベンチャーキャピタルの投資額が相対的にどう変化するかを分析した。2014年度に実施した企業と銀行のペアレベルデータを用いた研究を通じて、分析手法については確立済みである。今後については、2014年度に購入したデータベースを用いて構築済みの分析用データセットへ、2015年度購入予定のデータベースを追加した上で、当該分析手法をスタートアップ企業とベンチャーキャピタルのペアレベルデータに応用した分析作業を進める予定である。併せて、刊行済みの二本の論文については、査読付英文ジャーナルへの投稿に向けた改訂作業を継続する予定である。27年度が最終年度であるため、記入しない。金融論27年度が最終年度であるため、記入しない。
癌原性化学物質への感受性に関するチトクロームPー450遺伝子の発現とその調節

1.P450I遺伝子群の構造と発現:メチルコラントレン(MC)を投与したハムスター肺P450MCのCDNA全塩基配列を決定し、mRNAの発現には臓器特異性が認められた。ポリ塩化ビフェニイル投与の犬肝ではラット肝と類似したP450IA1とIA2の2つが認められた。MCに応答してP450IA1遺伝子の発現を調節する遺伝子上の領域、XREを同定し、これに特異的に結合する因子について調べた。その一部はMCに対する受容体であることがわかった。ラットの発育過程や下垂体摘除やアロキサン糖尿のときの肝P450IA2蛋白の変動から、成長ホルモンが抑制的に働くことがわかった。ウサギP450IA1の小胞体膜への挿入はシグナル認識粒子に依存し、N末端の29ケのアミノ酸がその粒子を認識している。ラット肝癌発生過程におけるP450IA群のmRNAの発現を調べると、オパール細胞の出現する3週目で明らかな誘導が起こるが、過形成結節のみられる12週目では低下していた。2.P450II遺伝子群の構造と発現:ラット肝より雄特異的P450cDNAを分離した。成熟雌ラットではmRNAの発現がみられなかったが、フェノバルビタールなどで雄性レベルまで誘導された。3.ヒトP450の発現:P450IA1とIIE1遺伝子のRFLPを胃癌と肺癌患者の白血球で調べた。肺癌患者では異常なバンドは認められなかったが、胃癌患者ではP450IA1に対して19%、P450IIE1に対して50%の割合で異常なバンドの出現がみられた。4.将来への展望:癌原性化学物質に対するヒト細胞の感受性を規定する要因には多くある。その一つに化学物質の代謝的活性化能がある。そこで、ヒトP450の種特異性を遺伝子、mRNA、そして蛋白レベルで調べるとともに、遺伝子の転写活性を調節する受容体蛋白の分離とその機能の検討が緊急の研究課題となってきている。
乳幼児用活動量計の開発

本研究の目的は、測定が困難な幼児のエネルギー消費量を二重標識水(DLW)法により実測し、同時に3次元加速度及び心拍数を測定し、簡便かつ精度よく身体活動量を推定する方法について検討することである。山形市内の幼稚園に通う36歳の男女を対象に実測した結果、対象児の日常生活におけるエネルギー消費量は日本人の食事摂取基準に示されている値に近似であった。心拍数と加速度の相関は低く、身体的運動以外の要因でも心拍数の変動しやすい幼児においては、心拍計のみでは身体活動量を精度よく推定することが困難であり、3次元加速度計や活動記録法等を効果的に組み合わせる必要性が示唆された。身体活動量測定のゴールドスタンダードである二重標識水法は高額かつ分析施設が限られており、特に日本の乳幼児について本法で実測した例は非常に少ない。また、身体活動量の簡便な評価方法として歩数計等の機器が市販されているが、子ども用は見当たらない。以上のことをふまえ、本研究は、二重標識水法を用い、測定が非常に困難な乳幼児を対象にエネルギー消費量を実測し、同時に3次元加速度を終日測定し、高額な二重標識水法によらずに、簡便かつ精度よく乳幼児のエネルギー消費量および身体活動レベルを推定するための機器を開発することを目的とする。初年度は、乳幼児用の軽量な身体活動計を製作するために、複数の企業に技術的な相談をし、また、いくつかの従来品の試用等を行い、検討した。動作性、データの容量や加工性、精度面等検討した結果、限られた予算の中で新たな試作機を複数個用意することはコスト的にも極めて難しいことが判明し、3次元加速度計については、従来品の中でも軽量かつ小型のタイプを活用してデータを収集することとし、装着方法および装着箇所について、子どもに適した方法を検討した。乳幼児の心拍の測定方法についても、本研究においては加速度計とは別に装着する方法も視野に入れて複数の企業および研究者から情報を収集し、終日の連続測定が可能かどうか検討を行った。子どもの安静時代謝量の縦断的測定を継続し、3か月おきに実施した。二重標識水法に関する国際学会および身体計測の研修会に参加し、測定方法の技術習得と情報収集を行った。これまでの成果について、弘前で開催された学会において口頭発表を行った。次年度の本調査に向けて、被験者の確保の準備を行った。大学附属幼稚園と打ち合わせを重ね、次年度に入園した幼児を含め、調査協力の内諾を得た。本研究は、ゴールドスタンダードであるが高額な二重標識水法によらずに、簡便かつ精度よく乳幼児のエネルギー消費量および身体活動レベルを推定するための機器の開発を目指し、測定が非常に困難な乳幼児を対象に二重標識水法によりエネルギー消費量を実測し、同時に3次元加速度および心拍数を終日測定し、機器開発のための基礎資料を得ることを目的とする。今年度は、市内の幼稚園において被験者を募集し、同意の得られた3歳から6歳の幼児男女計15名を対象とし、2015年10月12月に、二重標識水法により日常生活におけるエネルギー消費量の実態調査を実施することができた。同時に、8日間にわたり三次元加速度および心拍数も連続的に測定を行った。実測を通して、幼児に適した機器の装着箇所や装着方法等について具体的な知見を得ることができ、小型軽量の乳幼児用活動量計開発のための有益な資料を得ることができた。また、実測の結果、園庭での自由遊びの時間において活動量が最も高く、次いで、登・降園時の身支度の時間、遊戯室での行事の練習活動時に高い活動量を示し、心拍数の変化もそれに呼応している様子がみられた。加えて、通園方法が徒歩の幼児は一日の活動量が高く、日常生活において積極的に歩くことが、幼児期の身体活動量の増加に有効であることが示唆された。今後、実測した3次元加速度および心拍数の分布や二重標識水法により算出したエネルギー消費量との相互関連性等を詳細に解析し、日常生活における幼児の身体活動量を簡便かつ精度よく推定する方法について具体的に検討を行う。市内の幼稚園の協力を得て、3歳から6歳の幼児を対象に、二重標識水法によるエネルギー消費量の実測、ならびに心拍数と三次元加速度の同時実測を行うことができた。従来の食事指導においては、身体活動レベルの代表値から算出した推定エネルギー必要量を用いているが、より正確なエネルギー必要量を求めるためには、個人の身体活動レベルを正確に評価する必要がある。身体活動量測定のゴールドスタンダードである二重標識水法は高額かつ分析施設が限られており、特に日本の乳児について本法で実測した例は報告されていない。以上のことをふまえ、本研究の目的は、二重標識水法を用い、測定が非常に困難な乳幼児を対象にエネルギー消費量を実測し、同時に3次元加速度を終日測定し、高額な二重標識水法によらずに、簡便かつ精度よく乳幼児のエネルギー消費量および身体活動レベルを推定ための機器を開発することである。平成28年度は、前年度に引き続き、3歳から6歳の男女計16名を対象として二重標識水法により調査した尿サンプルの分析を行い、日常生活におけるエネルギー消費量の実測値を得ることができた。