hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
新規ｉｎ　ｖｉｖｏ胆管遺伝子導入法を用いた胆管の樹状構造解析

肝臓内には上皮管腔組織である胆管が樹状に張り巡らされており、重篤な肝障害時には胆管の樹状構造が大きく変化する(細胆管反応)。細胆管反応は肝障害を軽減する事が示唆されている。細胆管反応の制御機構に関しては胆管周囲の細胞集団の種類およびその細胞集団からのシグナルについては報告があるものの、胆管が樹上構造を形成する細胞内シグナルに関しては未だ多くの不明な点が残されている。研究者は、申請時に同定していた細胆管反応制御転写因子KLF5の機能解析を、肝臓上皮細胞特異的ノックアウトマウス(以下KLF5 LKOマウス)を用いて解析を行った。前年までにKLF5が細胞増殖を制御することを見出していた。今年度の研究においては以下の点が明らかになった。1前年まで、胆汁うっ滞性の肝障害のみをKLF5 LKOマウスにおいて試していた。細胆管反応の制御におけるKLF5の機能をより一般化するために、肝臓の実質細胞に酸化ストレスを引き起こす肝毒素をKLF5 LKOマウスに与えた。その結果、KLF5 LKOマウスにおいても対照群と同程度に細胆管反応が誘導され、KLF5に依存しない細胞内シグナルの存在が示唆された。細胆管反応を制御するシグナルには肝障害に応じて多様性があることが明らかになった。2胆管の三次元構造という視点からより詳細かつ定量的に表現型を解析した。その結果、KLF5 LKOマウスにおいて胆管の分岐点の数は減少していたが、長さや太さといった樹枝自体に差異は認められなかった。また、KLF5 LKOマウスでは、胆管細胞の一部が細胞塊として管から剥離していることも観察された。これらの結果から、KLF5が形態変化した胆管の樹枝構造を維持する可能性が新たに得られた。29年度が最終年度であるため、記入しない。肝臓は代謝等から生じる毒物の危険に常に晒されるが、高い再生能により、その機能を維持する。肝臓内には上皮管腔組織である胆管が樹状に張り巡らされており、胆管上皮細胞が重篤な肝障害時には増殖し胆管の樹状構造が大きく変化する。胆管には肝実質細胞の前駆細胞が存在するとされ、細胆管反応は肝臓の再生・恒常性維持に重要な役割を担っている。細胆管反応の制御が崩れることは肝癌、胆管癌の一つの原因だと考えられており、制御機構の理解は臨床的にも重要な命題である。細胆管反応の制御機構に関しては胆管外の細胞集団の種類およびその細胞集団からのシグナルについては報告があるものの、胆管が樹状構造を形成する細胞内シグナルについては未だ多くの不明な点が残されている。本研究では、新たに構築したin vivo遺伝子操作系を用いて胆管上皮の細胞内シグナルをマウス生体内で操作することで、胆管の構造変化の制御メカニズムを明らかにすることを目的としている。その一端として、胆管上皮細胞外から作用して細胆管反応を誘導するFGF7シグナルの下流、特に転写因子Klf5の機能解析から、胆管の増殖・枝分かれを制御するメカニズムを解明する。申請者は細胆管反応を胆管上皮細胞内で制御する転写因子の候補、KLF5の肝臓上皮細胞特異的遺伝子欠損マウス(KLF5 LKOマウス)を用いて解析を進めている。KLF5 LKOマウスでは細胆管反応が抑制されていることを見出していたが、当該年度ではその下流で働くこれまで報告のない細胞周期関連遺伝子を見出しており、現在論文投稿の準備を進めている。申請時に同定していた、細胆管反応制御因子である転写因子KLF5の機能解析を、主に肝臓上皮細胞特異的KO(Liver-specific KO ;以下LKO)マウスの解析を中心に行った。申請時にKLF5 LKOマウスでは肝障害時に細胆管反応が抑制されることを示していたが、より詳細な解析により、以下の表現型を明らかにした。1肝障害が増悪し、生存率が著しく低下していた。2肝障害時に細胞周期に入る胆管上皮細胞の割合が有意に低下していた。KLF5 LKOマウスとコントロール(野生型)マウスとで、胆管上皮細胞における遺伝子発現の違いを解析することにより、KLF5が制御する因子の探索を行った。上記2の結果を受け、細胞周期関連遺伝子等を中心にRT-qPCR法により解析したところ、3CDK inhibitorであるCdkn1a, Cdkn2a, Cdkn2bなどの発現が上昇しており、一方で、これまでにKLF5の標的因子として報告のないCyclin E1 (Ccne1)の発現が低下していた。この新規KLF5標的因子候補であるCcne1の発現制御について、現在までにルシフェラーゼアッセイおよびChIPアッセイにより『KLF5がCcne1の発現を直接プロモーターに結合し転写レベルで制御している』ということを示唆するデータも得ており、これらの結果をまとめて論文投稿を行う準備を進めている。肝臓内には上皮管腔組織である胆管が樹状に張り巡らされており、胆管上皮細胞が重篤な肝障害時には増殖し胆管の樹状構造が大きく変化する(細胆管反応)。

細胆管反応の制御が崩れることは肝癌、胆管癌の一つの原因だと考えられており、制御機構の理解は臨床的にも重要な命題である。細胆管反応の制御機構に関しては胆管周囲の細胞集団の種類およびその細胞集団からのシグナルについては報告があるものの、胆管が樹上構造をを形成する細胞内シグナルに関しては未だ多くの不明な点が残されている。本研究では、新たに構築したin vivo遺伝子操作系を用いて胆管上皮の細胞内シグナルをマウス生体内で操作することで、胆管の樹上構造変化の制御メカニズムを明らかにすることを目的としている。その一端として、胆管上皮細胞の外側から作用して細胆管反応を誘導するFGF7シグナルの下流、特に転写因子KLF5の機能解析から、胆管の増殖・枝分かれを制御するメカニズムを解明する。研究者は、申請時に同定していた細胆管反応制御転写因子KLF5の機能解析を、肝臓上皮細胞特異的ノックアウトマウス(以下KLF5 LKOマウス)を用いて解析を行った。前年までにKLF5 LKOマウスでは、肝障害時に細胆管反応が抑制されることで、障害の増悪および障害時における生存率が低下していることを見出していたが、当該年度では、単離分取困難であったKLF5 LKOマウスから胆管上皮細胞を分取することに成功し、遺伝子発現を網羅的に解析した。その結果、KLF5が既存のシグナル経路にない新規シグナル経路を制御することを示唆する結果を得た。前年までにKLF5 LKOマウスでは、肝障害時に細胆管反応が抑制されることで、障害の増悪および障害時における生存率が低下していることを見出していた。今年度の研究においては以下の点を中心に行った。1KLF5 LKOマウスの肝障害肝からの胆管上皮細胞の単離分取に成功した前年度までKLF5 LKOマウスでは胆管上皮細胞の単離分取が困難であった。その原因として野生型マウスに比べ胆管上皮細胞がより強く障害を受けていたためだと考えられる。今年度は肝障害の時系列を追って、単離分取に適した時期を検討し、肝障害のより初期の時点で細胞を単離分取することに成功した。2KLF5 LKOマウスの胆管上皮細胞における網羅的遺伝子発現解析1で単離分取した細胞の遺伝子発現解析を、野生型マウスに同じ肝障害を与えたものをコントロールとして、RNA-seqにより網羅的におこなった。得られたデータを用いてEnrichment解析およびPathway解析を行った。その結果、前年度までにin vitroの胆管培養系で報告していたものとは異なる細胞増殖関連の遺伝子が多数変動していることが明らかになった。このことは、細胞増殖マーカーKi67をマウス肝臓切片にて染色し、表現型としても確認している。今回のRNA-seqでは細胆管反応に関わる既存のシグナル経路(NotchやWntシグナル等)には殆ど影響が認められなかった。このことはKLF5は既存のシグナル経路にない新規シグナル経路を制御することを示唆している。ここまでの結果をまとめて、現在論文投稿準備を進めている。肝臓内には上皮管腔組織である胆管が樹状に張り巡らされており、重篤な肝障害時には胆管の樹状構造が大きく変化する(細胆管反応)。細胆管反応は肝障害を軽減する事が示唆されている。
ウェブ協調学習における図形を用いた数学問題の解法支援

数学問題の解決過程で図形を用いて問題の題意、問題の性質を明示化させ、その解法を理解させる、または解法過程の意味を把握させることは問題の論理的な手順だけを把握するだけでなく、物理的な意味を大域的に理解し、創造的な思考法の育成を期待できる。本研究課題では創造性育成支援の立場から図形が有する問題の具体性、時空間的世界での意味を理解させることを目的として、学習者の解法過程で用いられる図形をシステムが理解し、図形を介して問題解決を図る学習支援機構について対処している。対象とした問題領域は2次関数であり、課題設定の点から問題の特性を明確にし、枠粗みを構成するに適切である。2次関数グラフを構成する直線、点、軸、さらには頂点、切片、交点などのグラフ構成要素に対して内部表現モデルを導入して対応した。この内部表現モデルは図形インスタンスの構造関係を表現しなければならないが、如何に構成するかが一つの課題で、我々は実体関連モデルを拡張して解決した。また、変化するグラフの構成要素間の図形を如何に処理するかが次の課題となる。そのために、ルール・ベースを用いて変形知識を表し、そのルールを内部表現モデルに適用・解釈することにより、解法の各手順に対応する図形操作の内容をシステムが理解するというアプローチを採用した。これにより、解法過程における変形・処理操作を論理的に扱うことが可能である。このような解法上の図形操作理解機構の下に、学習者が描いた図形を解釈してシステムで理解できる図形と対比し、図形表現を介して問題の理解、問題解法の理解を支援できる。この枠組みの下にプロトタイプ・システムを開発言語C, Prologを用いて実装した。異種言語系を用いたことは、図形構成要素間の単一化、照合、及びその推論にPrologの機能が有効であるためである。学習者が図形を描くための操作に多少手間取ることが一つの問題点ではあるが、研究目標は充分に達成できた。ウェブ上に実現されている協調学習支援システムHARMONYの学習者支援機能を、学習者の主体的学習を促進させ、より創造的な視点より学習活動を支援できる機構機能を探究することが本研究課題の主要な目標である。HARMONYでは高等学校数学の方程式求解問題に対してその解の導出過程、解法の概念的な意味理解を支援することを目的に実現され、さらに協調的学習の機構として学習者が積極的に議論でき、学習者の知識獲得、知識醸成を効果的に達成できるように補助、助長する視点から構成されている。本研究課題では、図形を用いてその思考を明示化ざせて、問題のより深い理解と思考的広がりと論理的・物理的な問題の意味を把握することによる知識の発見を目的として立案している。解法、解の意味を図的に理解することにより意識方程式の等号変換や写像関係として理解するのではなく、論理的な導出過程を物理的な現象として理解することが、能動的学習、主体的学習には重要であるというアイデアから課題としている。求解プロセス、解の意味付けを大局的に理解させることにより、発想的思考、創意的試行、物理的・論理的関係の把握などが可能となり、創造性豊かな学習支援環境を構築できる。研究の重要な視点は解法プロセスで発生する図形間の幾何的、位相的関係を問題の制約条件と照合し、描写事実・規則の知識ベースの下に動的に図形を生成することであり、また制約条件における解釈を論理的だけでなく、物理的に意味付ける構造にある。このようなことを実現するために、図形描写の知識ベース以外に、図形表示の内部モデルを導入し、内部モデルの下に知識ベースを用いて図形の動的変形を推定し、対処するアプローチを採用している。
1112世紀に平泉を拠点に権勢を誇った奥州藤原氏の財政基盤は、オオワシの尾羽や海獣皮といった北海道の産物と、北上産地をはじめとする北東北の砂金にあったとされる。しかし、具体的な砂金産地やその生産実態はもとより、北海道集団との交流の実態解明もほとんど行われていない。本研究では、奥州藤原氏と古代北海道集団の関係を明らかにするため、砂金を手がかりとし、化学分析により北海道と東北北部の砂金の成分的な異同を比較検討して、北海道産砂金が平泉に流通した可能性を検証した。平成26年度には次の調査・研究を実施した。1)東北各地31カ所の砂金サンプルについて研究協力者から提供を受け、函館高専において化学分析を実施した。その結果、微量元素の構成で北海道と東北の砂金に有意な差は認められなかったが、専門家のアドバイスを受け、今後比較検討する微量元素の数を増やすとともに、より精度の高い分析機器による分析を検討することになった。2)奥州藤原氏関連遺跡から出土している坩堝など金付着関連遺物について26年度に化学分析を行う予定であったが、平泉町教育委員会と協議を行い、来年度にこれら資料の化学分析を実施することになった。3)北海道厚真町では、常滑焼など奥州藤原氏関連遺物が出土し、近年奥州藤原氏の移住の可能性が指摘されていることから、移住と砂金の関係を明らかにするため、これまで砂金産出の記録がない同町の厚真川において26年度には砂金調査を2回にわたって実施し、砂金を得た。4)上記の東北各地砂金サンプルの化学分析結果とこれまでの研究遂行状況について、3月に函館高専において報告検討会を実施した。
脱社会主義ロシアにおけるジェンダー研究-旧ソ連諸国との比較を通して

本研究では、ソ連時代およびそれ以後の統計資料から旧共和国のジェンダーについて見てきたが、1917年の革命によってさまざまな生活分野において一定のソビエト化が行われたということが確認できる。しかし、1998年8月、9月のロシア、サンクトペテルブルグでのインタビューや統計などによると、次のような傾向を指摘することができる。旧ソ連の女性の中で非ヨーロッパ地域の共和国では、統計などから判断すると、確かに一般に女性の就業率は高く、ソ連全体の平均とほぼ一致しているが、高学歴のスペシャリストを民族別にみると、ロシア人、タタール人、ウクライナ人などの比率が高く、現地の女性の占める割合は10%台である。これは、ロシア人入植者によってソ連化が推し進められたことの結果であろう。したがって、現地の女性の多くはソ連以前の伝統的な生活スタイルをある程度守っていたということもできる。一部の現地の女性は伝統の枠から抜け"ソ連女性"となっていたが、全体的な割合はそれほど高くない。また、ソ連邦崩壊後ロシア人のロシアへの帰還という傾向とともに現地の伝統・風習が強まってきていると考えられる。しかし、経済的に働くことを余儀なくされる状態にあることも否めない。よくソ連とロシア帝国が重なり合っていたと言われるが、これと同じ公式が女性にもあてはまり、ソ連女性とはすなわちロシア人女性のことであったのかというふうに考えることもできる。また、各共和国の文化的なファクターを考慮することなしにこれらの問題を考えることはできないが、筆者の分析からも大きな民族的・地域的な差異が存在することが検証された。奨励研究(A)において、脱会社主義ロシアにおけるジェンダー研究-旧ソ連諸国との比較を通して-という課題に沿って研究をすすめている。これまでの研究では、ロシアにおけるジェンダーの現状については、分析を行ない、記述することに成功しているが、それがロシア固有のものであるかは明らかではない。これには、同じ期間、同じ体制内で生活していた旧ソ連の他の民族との比較をすることが不可欠である。従って、本研究では、旧ソ連の諸国の脱会社主義におけるジェンダーの在り方と支援的なファクタとの関係を明らかにし、ロシアにおけるそれと比較することにより、脱社会主義ロシアにおけるジェンダーの特徴を明らかにする。平成10年度は、以下のことを行った。1.脱社会主義ロシアにおけるジェンダーの現状については、私の独自の調査結果、現地の新聞、雑誌、研究論文、統計資料などから明らかにしたが、本年度は、それとロシア固有の文化的ファクターとの関連の分析を行なった。しかし、文化的ファクターとの関連性については、科学的に説明できる性質のものでなく、仮定と考えている。2.旧ソ連の中のキリスト教圏であり、ヨーロッパの影響を強く受けているバルト地域のエストニア、ラトビア、ソトアニアの全体的なジェンダーに関する資料を、雑誌、研究論文、統計資料、そしてインターネットから収集した。また、独自の宗教と文化を在しているコーカサス地域のアルメニアグルジア、アゼルバイジャンの中からグルジアを選び、データ資料として文献をはじめインターネット、また日本に在住しているグルジア人へのインタビューを収集した。現在それらを分析、考察中である。しかし、ロシアとちがい、旧ソ連のデータを日本で入手することは非常に困難でありデータは少ない。
走化性バクテリアによって生じる生物対流の三次元的挙動に関する数値解析

本研究は,微生物の工学的・環境学的利用を目的として,容器内に存在する走化性バクテリアにより生じる生物対流に関する数値解析を行った.レーリー数や容器深さによる生物対流の変化や酸素とバクテリアの輸送特性を明らかにした.また,生物対流の三次元的挙動やプルームの伸長を捉え,さらにプルーム同士の干渉が輸送特性に及ぼす影響を明らかにした.これらの結果は既存の実験では得られていない初めての研究成果である.本研究は,微生物の工学的・環境学的利用を目的として,容器内に存在する走化性バクテリアにより生じる生物対流に関する数値解析を行った.レーリー数や容器深さによる生物対流の変化や酸素とバクテリアの輸送特性を明らかにした.また,生物対流の三次元的挙動やプルームの伸長を捉え,さらにプルーム同士の干渉が輸送特性に及ぼす影響を明らかにした.これらの結果は既存の実験では得られていない初めての研究成果である.本研究では,走化性バクテリアにより形成される生物対流に関して,微生物の挙動や酸素の輸送特性を調査することを目的とし,今年度は二種類の解析から以下の知見が得られた.1.生物対流の容器深さによる影響:本研究では,深い容器中の走化性バクテリアにより生じる生物対流の数値解析を行った.レーリー数の増加とともに非線形性の影響が現れ,臨界レーリー数では水面近傍に集まったバクテリア集団が沈降し,生物対流が発生した.レーリー数の増加とともに酸素とバクテリアの対流による輸送が大きくなった.深い容器では底面付近まで酸素が十分に供給されないため,底面近傍ではバクテリアは不活発となり,容器深さにより輸送特性が異なる.臨界レーリー数に達するまでバクテリアの酸素消費度は一定であるが,レーリー数の増加とともに容器中のバクテリアの酸素消費度は低下した.2.三次元生物対流の発生予測:本研究では,走化性バクテリアにより生じる生物対流に関する三次元数値解析を行った.レーリー数が臨界値に達すると水面近傍のバクテリア集団は三次元的なプルームを形成し,生物対流を発生させた.周囲の流体はプルームの影響で下方向へ引き込まれ,渦輪が形成された.さらにレーリー数を増加させると,プルームは底面に向って伸長し,生物対流は大きくなる.プルームの伸長が水面近傍のバクテリア量を減少させ,底面近傍では増加させた.プルームの形成までの遅れ時間は,レーリー数の増加によって早くなり,実験値と定性的に一致した.レーリー数が増加すると,酸素の拡散やバクテリアの遊泳による輸送と比較して,対流輸送が支配的となった.本研究では,走化性バクテリアにより形成される生物対流に関して,バクテリアと酸素の輸送特性を明らかにすることを目的としている.実際の生物対流現象では,容器内に複数のプルームが形成され,そのプルームまわりに生物対流が発生している.このとき,プルーム同士の干渉が生じ,バクテリアと酸素の輸送特性はこの干渉に影響されると考えられる.今年度はプルーム同士の干渉を明らかにするため,レーリー数による生物対流パターンの変化が輸送特性に及ぼす影響を調査している.レーリー数が臨界値に達すると,容器内では複数のプルームが水平方向に周期的に形成され,プルームまわりでは生物対流が形成される.さらにレーリー数を増加させると,容器内で発生するプルームの数は増加し,プルームの波長は短くなり,プルーム同士の干渉が強まる.レーリー数の増加とともに,プルームは容器底面へ向かって伸長し,対流速度は速くなるため,容器全体の底面付近におけるバクテリア量は増加する.一方,バクテリアによって酸素が消費されるため,底面付近の酸素量は減少するが,レーリー数の増加とともに底面付近のバクテリア濃度は飽和状態となるため,酸素量は増加していく.生物対流が発生したとき,対流による酸素とバクテリアの輸送は輸送形態の中で支配的となる.レーリー数を増加させることにより,プルーム同士の干渉も強まり,容器内全体における酸素とバクテリアの輸送特性は大きく向上する.
生体信号による操作者の特性を考慮した力覚提示機能を有する遠隔操作システム

遠隔操作において,力覚提示の感度を高めることで安全性と作業効率の向上を目指し,操作者の力み具合を生体信号からリアルタイムに測定し,その特性に合わせて提示する反力を可変に制御する方法を提案した.提案手法をマスタスレーブ型手術支援ロボットに実装し,複数の被験者実験によってその有効性を評価した.さらに力の方向を提示するデバイスとして,操作者の人差し指に正圧と負圧が発生できる空気噴流を発生するものを試作し,その有効性を実験によって確認した.遠隔操作において,力覚提示の感度を高めることで安全性と作業効率の向上を目指し,操作者の力み具合を生体信号からリアルタイムに測定し,その特性に合わせて提示する反力を可変に制御する方法を提案した.提案手法をマスタスレーブ型手術支援ロボットに実装し,複数の被験者実験によってその有効性を評価した.さらに力の方向を提示するデバイスとして,操作者の人差し指に正圧と負圧が発生できる空気噴流を発生するものを試作し,その有効性を実験によって確認した.本研究は,遠隔操作システムにおいて,操作性と安全性向上を目指し,操作者の力み具合等を生体信号からリアルタイムに測定し,その特性を考慮した力覚提示方法を提案することを目的として,研究1年目として下記の成果を得た.はじめに力覚提示の有効性を評価する実験として,報告者らが開発したスレーブ側の駆動に空気圧アクチュエータを採用した力覚提示機能を有する手術支援ロボットシステムを用いて,模擬縫合作業を5名の被験者に対して実施した.その際にスレーブ側にかかる外力をマスタ側に反力として提示する力のスケーリング比を0(マスタに反力が返らない),0.3,0.5,0.7および1.0(スレーブの外力と等しい力が反力として操作者に提示される)の5種類の場合について,作業中の外力の時間変化を測定した.その結果0.5以上のスケーリング比において,作業にかかる最大力が低下することが明らかとなった.これは被験者が知覚できる最小の力と相関があることを確認し,手術作業中の力覚提示の有効性が明らかとなった.次に生体信号として筋電信号に着目し,スケーリング比を可変にする方法を提案し,上記ロボットシステムに実装して,その有効性を評価した.具体的には力みが力覚感度の低下を引き起こし,作業に要する力の増加を招くことら知られているため,操作者の親指つけ根部分の筋電を測定し,操作者の力み具合を把握して,力みが見られた場合にスケーリング比を線形的増加させる方法を提案した.5名の被験者に対して実験を実施し,4名において有効性を確認した.また残りの1名については力みによる力覚特性の変化が他の4名と逆であったことから,スケーリング比を線形的に増加させるのではなく,減少させることでその有効性を確認した.力の知覚には個人差があり,各被験者の特性を事前に把握することが重要であることがわかった.本研究は,遠隔操作システムにおいて,操作性と安全性向上を目指し,操作者の力み具合等を生体信号として測定し,その特性を考慮した新たな力覚提示方法を提案することを目的として,研究2年目として下記の成果を得た.昨年提案した,筋電信号から操作者の力み具合を判断し,スレーブ側での外力をマスタ側へ反力として提示する際の力の比率を可変にする制御において,種々の条件で実験を行った.力の比率は操作者の親指つけ根部分で計測した筋電信号に比例ゲインを掛け,それに一定値を足したものを与えた.報告者らが開発した力覚提示機能を有するマスタスレーブ型手術支援ロボットを用いて,スレーブ側での目標押し付け力の実現度合を評価する実験を3種類の比例ゲインに対して実施した.提案した手法が,力の比率を一定にした場合より,目標押し付け力の再現性が高いこと,また複数試行回数間のばらつきが抑えることを確認した.また,操作者に単に反力として力覚提示を行うだけでなく,2つの方法を提案し,手術支援ロボットのマスタ側に実装した.1つは力の方向をより操作者に知覚しやすくするために,人差し指に4つの孔から空気噴流を与える方法である.空気噴流は正圧だけでなく負圧も発生可能とし,流体力を用いる利点を活用した.手術支援ロボットを用いて,模擬臓器への針の縫合実験を行い,提案した方法がより正確に作業が実施できることを明らかにした.もう1つは,人間は弱い力を知覚できないことから,操作者に反力を温度として提示する方法である.結紮動作を模擬して,縫合糸を10回繰り返し引っ張る実験を行った.その結果,提案した方法では,各回の引張力のばらつきが少なく,力提示のみと比較して有意な差があることを確認した.本研究は,遠隔操作システムにおいて,操作性と安全性向上を目指し,操作者の力み具合等を生体信号として測定し,その特性を考慮した新たな力覚提示方法を提案することを目的として,研究最終年度として下記の成果を得た.マスタ・スレーブ型の手術支援ロボットを用いた力覚提示の評価実験として,より実際の手術に近いタスクとして胆管腸管吻合術に着目し,模擬臓器を用いて同術式を実施した.被験者として,医学部の学生,手術経験6年を有する医師が参加し,力覚提示による学習効果,力覚提示の有無による操作時間,筋電計による力み具合などを測定した.その結果,初心者ほど力覚提示による学習効果が高く,また十分熟練した状態において,力覚提示有りと無しの場合を比較した結果,力覚提示がある場合に2割程度作業時間を短縮できることが明らかとなった.

これは,特に同術式では,裏側の縫合など視覚では捉えきれない情報を手に感じることができた結果であると考える.また,昨年提案した,人差し指に4つの孔から空気噴流を与える方法について,評価実験を行った.手術支援ロボットを用いて,模擬臓器への湾曲針の針かけ操作を行い,針の出る位置,軌道などを測定した.それぞれ同一被験者で20回の実験を行った結果,平均位置は空気噴流を与えた場合と与えない場合で大きな差は見られなかったが,そのばらつきに有意な差が見られた.噴流を与えない場合5mm程度のばらつきが生じたが,噴流を与えた場合には, 2mm程度にばらつきを抑えることができた.さらに,力覚情報を反力として操作者の手に反すだけでなく,モニタにスレーブ側で検出した0.53Nの外力を6段階の色で同時に提示する方法を実装し,その有効性を実験によって明らかにした.26年度が最終年度であるため、記入しない。人間機械システム26年度が最終年度であるため、記入しない。本研究の目的である生体信号を用いた力覚提示方法として,操作者の力み具合を筋電計で測定し,その測定値によってスレーブ側の外力をマスタ側に反す際の力の比率を可変にする方法を提案し,研究者らが開発しているマスタスレーブ型の手術支援システムに実装し,その有効性を実験的に示すことができた.ほぼ計通りに推移したことから,概ね順調に研究が進展している.本研究の目的である生体信号を用いた力覚提示方法として,操作者の力み具合を筋電計で測定し,その測定値によってスレーブ側の外力をマスタ側に反す際の力の比率を可変にする方法の有効性を実験的に示すことができた.また,新たな力覚提示方法として2つの方法を提案し、手術ロボットを用いて実験的に評価を実施した.それらの成果を特許出願するとともに,国際学会で発表した.以上より,ほぼ計通りに推移したことから,概ね順調に研究が進展している.26年度が最終年度であるため、記入しない。筋電信号を用いる力覚提示方法の有効性を示すことができたことから,次年度は脳波や視覚情報を融合した力覚提示方法を提案し,その有効性を遠隔操作対応型の手術支援ロボットに実装して評価する.研究最終年度として,1年目に提案した筋電から力み具合を推定し,操作者に反す力を可変にする制御方法と,昨年提案した,空気噴流および温度による力提示を組み合わせた方法を提案する.提案手法を研究者らが開発を進めている手術ロボットに実装し,その有効性を実験的に検証する.医学部と連携し,実際に外科医師での操作実験を実施し,より操作効率,安全性が高まることを実証する.26年度が最終年度であるため、記入しない。研究1年目は,生体信号として筋電を用いる方法で良い案が出たことから,そちらを実験によって評価することを優先したため,当初1年目に購入予定であった脳波計と2年目に予定していたマスタデバイスを入れ替えた.よって,2年目は脳波計を備品購入して,その信号を力覚提示に活用する方法を探求する.研究は概ね順調に推移したが,一部の実験には,マスタデバイスの改造が必要であり,本年度の残額では対応しきれなかったことから,次年度分の予算と合わせて実施する.マスタデバイスの改良の費用として支出予定である.
アラキドン酸の筋肉におけるインスリン抵抗性改善効果 : 代謝物に着目した作用機序解明

平成25年度における本研究の目的は、これまでに培養細胞系で見出したアラキドン酸によるインスリン抵抗性抑制効果を動物試験によって検証すること、およびそれと並行してアラキドン酸依存的なシグナル伝達と有効なアラキドン酸代謝物を培養筋肉細胞を用いた試験によって検討することである。動物試験では予備試験としてC57/BL6マウスにコーン油、パーム油、ならびにラードを14週間混餌摂取させることにより、特に長鎖飽和脂肪酸を組成に多く含むラードによって顕著にインスリン抵抗性が誘導されることを確認したが、アラキドン酸の効果を検証するには至っていない。L6筋管細胞を用いた試験では、アラキドン酸がパルミチン酸によって減少する乳酸産生量を正常レベルまで回復させ、また、アラキドン酸単独で処理した場合にも産生量を増加させることがわかった。グルコース取り込み量についても同様に、アラキドン酸は改善効果とともに単独で取り込み量を増加させた。これらのことはアラキドン酸がパルミチン酸とは独立して糖代謝を促進することを示している。一方でインスリン抵抗性の発症に寄与する炎症性サイトカインPKCθのリン酸化体については、アラキドン酸はパルミチン酸による増加を抑制したが、意外にも単独ではわずかに増加させた。以上のことから、アラキドン酸によるインスリン抵抗性改善効果はPKCθの活性化抑制によるものであると考えられる。また、当初予定していたアラキドン酸カスケードの特定酵素を阻害した場合のグルコース取り込み量の測定による有効代謝物の絞り込みは実施できていないが、アラキドン酸の作用がパルミチン酸との共作用時と単独時とで効果の異なる部分があることから、パルミチン酸の作用によって増産されるアラキドン酸代謝物が特にインスリン低抗性の改善に有効である可能性が高いと考えている。(抄録なし)平成25年度における本研究の目的は、これまでに培養細胞系で見出したアラキドン酸によるインスリン抵抗性抑制効果を動物試験によって検証すること、およびそれと並行してアラキドン酸依存的なシグナル伝達と有効なアラキドン酸代謝物を培養筋肉細胞を用いた試験によって検討することである。(抄録なし)
東海・関東地方における完新世テフラと人類遺跡の対比・編年に関する研究

富士火山や東伊豆の大室山単成火山群・伊豆諸島の完新世テフラを調査し、これらのテフラ累層中から考古学的な発掘によって発見された人類遺跡の遺物・遺跡との層位関係を明らかにした。その成果の要約は次の通りである。1.伊豆半島東部の伊東市三の原遺跡では,厚さ34mの褐色風化火山灰層が分布し、上位から大室山スコリア層、鬼界ーアカホヤ火山灰層、小室山スコリア層、姶良Tn火山灰層、地久保スコリア層の4枚の示標テフラが認められた。このうち鬼界ーアカホヤ火山灰を狭んで、大室山スコリア層と小室山スコリア層の間の層準から、縄文草創期・早期・前期の遺物が発見された。2.千葉市神門遺跡は村田川低地に立地する数少ない縄文時代早・前期の遺跡である。この遺跡では、自生と考えられるオキシジミと廃棄された貝殻に混じって茅山式(縄文早期後半)と・黒浜式(縄文前期中葉)の土器が出土する。オキシジミについて^<14>C年代測定を行い、テフラ試料について鬼界ーアカホヤ火山灰を検出するために鉱物分析、屈折率測定を行ったほか電子線マイクロアナライザ-による分析を検討中である。3.伊豆半島南部の蛇石火山・大池で、約6mのボ-リングを行ない、カワゴ平軽石層、鬼界ーアカホヤ火山灰、姶良Tn火山灰を採取し、これらの示標テフラの年代を明らかにするために、ボ-リング・コア(泥炭)について^<14>C年代測定を行った。このうち,カワゴ平軽石層については中部日本に広域に分布することが明らかにでき、縄文後期から晩期にかけての土器形式との層位関係を調査した。4.以上の成果を総合して、火山活動史と考古学編年に関する考察を行なった。
河川増水時の橋台背面盛土の浸食・流出機構の解明と粘り強い対策工法の提案

本年度は,橋台の構造形式が異なる際の被災形態に着目した実験と,通水性能を有する壁面材を用いた補強土壁とジオセルを敷設したのり面保護工を想定した対策工の効果検証実験を行った.その結果,1)盛土の侵食は橋台と盛土の境界の構造物境界部で進行し,橋台内盛土へと進行した.特にピアアバット形式橋台では,逆T型形式橋台と比較して橋台内盛土の侵食と流出が顕著であり,最終的には橋台内盛土に上流から下流方向へ向かうトンネル状の空洞が発生し,支持力を失った舗装面が完全に陥没した.2)橋台形式に依らず,盛土のり面および橋台内盛土の侵食・流出や盛土の崩壊時における圧力水頭(間隙水圧)の有意な増減は確認できず,今回の実験の範囲では有効応力の増減は盛土の侵食・流出に与える影響は小さい可能性がある.3)対策工として,壁面工に通水性能を有するギャビオン補強土壁を用いた場合には,補強土壁部が部分的に崩壊した.また,ジオセルを用いたのり面保護工を用いた場合には,のり面工背面盛土の流失に伴って中詰め材が流失した.しかし,道路路面の陥没に至るような橋台内盛土の流出は発生せず,河川増水に対する粘り強い対策工としての有用性を確認した.本年度は,対策工として壁面工に通水性能を有するギャビオン補強土壁およびジオセルを用いたのり面保護工の対策効果の検証について,昨年度用いた屋内開水路による模型実験を実施した.その結果,両対策工ともに河川増水に対する粘り強い対策工としての有用性を確認した.以上のことから,現時点では当初の計画通り,おおむね順調に進展しているものと考えている.平成30年度の成果として2つの対策工に関する模型実験を行い,その結果,本研究で提案する2つの工法ともに河川増水に対する対策工としての有用性を確認した.今後は,対策工に作用する流体力など,対策工の設計に資するデータの取得を目的とした実験を実施する予定である.2016年北海道豪雨災害で顕在化した被害の一つとして,橋台背面盛土の侵食・流失と,それに伴う道路陥没があった.そこで本研究では,既設道路橋と旧鉄道橋の橋台背面盛土の地盤性状を把握するために物理探査やボーリング調査を実施し,橋台背面盛土の地盤工学的な特徴について検討した.また,流水作用時における橋台背面盛土の侵食過程を観察するため,縮尺模型によって再現した橋台背面盛土に対して移動床水理模型実験を行い,橋台背面盛土の侵食状況,間隙水圧挙動,天端沈下の進行過程などについて,詳細に検討した.橋台背面盛土に対する一連の地盤調査結果から,右岸と左岸では盛土材料の土質は大きく変わらないものの,密度や含水状態が異なっているためにS波速度分布が異なり,盛土支持地盤の性状についても異なる場合があることが確認された.すなわち,盛土や支持地盤の性状が右岸と左岸で異なっている状態で河川増水によって同程度の外力を受けた場合には,盛土の侵食やそれに伴う道路路面・鉄道軌道の崩壊形態が右岸と左岸で異なることが予想され,河川増水によって侵食を受けた橋台盛土を調査する際には,盛土や支持地盤の違いを詳細に把握することが不可欠であると分かった.橋台を含む模型盛土に対する開水路実験結果から,盛土の侵食は橋台との構造物境界部で進行し,橋台内盛土の侵食と流失が顕著であった.さらに盛土が流失した上部の舗装面でオーバーハング状態となった.このような実験結果は,現地の被災状況と概ね一致していた.また,橋台背面盛土の侵食は橋台と盛土の構造物境界部から局所的に発生し,この侵食が橋台内部へ進行するが,それより背後の盛土のり面付近では,止水域の影響で変状や崩壊の発生は限定的であることがわかった.この結果は,具体的な対策工法の検討や,その施工範囲を決める際に有用な情報になると考えられる.今年度は,橋台背面盛土に対する地盤調査を行い,橋台背面盛土の地盤性状について数は限定的ではあるものの特徴的な地盤性状とその把握手法について検討することができた.模型実験については,当初は実験前後の模型橋台に対してX線CTスキャンを行い,その結果から弱部を把握して対策工の実施範囲を検討する予定であったが,先述した地盤調査結果に加えて,橋台背面の内部状況を可視化可能なアクリル製の模型橋台を実験に用いたことで,橋台背面盛土の崩壊メカニズムや対策工の実施範囲について十分な知見を得ることができた.以上のことから,現時点では当初の計画通り,おおむね順調に進展しているものと考えている.本年度は,橋台の構造形式が異なる際の被災形態に着目した実験と,通水性能を有する壁面材を用いた補強土壁とジオセルを敷設したのり面保護工を想定した対策工の効果検証実験を行った.その結果,1)盛土の侵食は橋台と盛土の境界の構造物境界部で進行し,橋台内盛土へと進行した.特にピアアバット形式橋台では,逆T型形式橋台と比較して橋台内盛土の侵食と流出が顕著であり,最終的には橋台内盛土に上流から下流方向へ向かうトンネル状の空洞が発生し,支持力を失った舗装面が完全に陥没した.

2)橋台形式に依らず,盛土のり面および橋台内盛土の侵食・流出や盛土の崩壊時における圧力水頭(間隙水圧)の有意な増減は確認できず,今回の実験の範囲では有効応力の増減は盛土の侵食・流出に与える影響は小さい可能性がある.3)対策工として,壁面工に通水性能を有するギャビオン補強土壁を用いた場合には,補強土壁部が部分的に崩壊した.また,ジオセルを用いたのり面保護工を用いた場合には,のり面工背面盛土の流失に伴って中詰め材が流失した.しかし,道路路面の陥没に至るような橋台内盛土の流出は発生せず,河川増水に対する粘り強い対策工としての有用性を確認した.本年度は,対策工として壁面工に通水性能を有するギャビオン補強土壁およびジオセルを用いたのり面保護工の対策効果の検証について,昨年度用いた屋内開水路による模型実験を実施した.その結果,両対策工ともに河川増水に対する粘り強い対策工としての有用性を確認した.以上のことから,現時点では当初の計画通り,おおむね順調に進展しているものと考えている.先述したとおりに平成29年度の成果として,一連の地盤調査から既設道路橋や旧鉄道橋における橋台背面盛土について,弱部となり得る領域を判断することができた.また,開水路を用いた一連の模型実験から河川増水時の橋台背面盛土の浸食・流出機構と崩壊範囲を把握することできた.平成30年度以降では当初の予定通り,平成29年度の成果を活かして,橋台背面盛土の浸食・流出機構および崩壊範囲を反映した効果的かつ効率的な対策工について,模型実験を行って検討を進める予定である.平成30年度の成果として2つの対策工に関する模型実験を行い,その結果,本研究で提案する2つの工法ともに河川増水に対する対策工としての有用性を確認した.今後は,対策工に作用する流体力など,対策工の設計に資するデータの取得を目的とした実験を実施する予定である.
海洋沿岸におけるヨウ素循環の解明－有機物分解に伴うヨウ素の化学形態変化－

2018年4,5,6,8,10,12月、2019年3月に北海道大学練習船うしお丸にて、北海道噴火湾で海洋観測を実施した。また、2018年6-7月に同大学練習船おしょろ丸にて、北部ベーリング海および南部チャクチ海で海洋観測を実施した。海洋表面から海底直上の水を鉛直的に採取して、有機ヨウ素ガス種(ジヨードメタン、クロロヨードメタン、ヨードエタン、ヨードメタン)の濃度を測定した。また、マルチプルコアラーもしくはアシュラ採泥器を用いて、海底堆積物の柱状サンプルを採取した。堆積物表面から1cmごとに酸化還元電位とpHを計測したのちに、堆積物を切り分けて間隙水を絞り取った。間隙水中の栄養塩類、有機ヨウ素ガス種の濃度を測定した。北海道噴火湾では、2018年3月に珪藻のブルームが発生したのを確認しており、その1か月後から海底付近でヨードエタンの濃度が上昇して6月に最高濃度を記録した。噴火湾でもベーリング海でも、堆積物中では、表面0-1 cmでヨードエタンの濃度が著しく高いことを発見した。両海域とも、主な基礎生産者は植物プランクトンの大型珪藻類である。堆積物表面に降り積もった珪藻細胞が死滅・分解する際にヨードエタンが発生することが考えられた。2019年3月の噴火湾観測にて、珪藻ブルーム時に珪藻の懸濁物を集めて、珪藻細胞を微生物分解させる培養実験を行った。培養ボトルの中が無酸素になるとヨードエタンが発生することがわかった。新鮮な珪藻細胞に含まれる糖類がエタノール発酵して、ヨウ素分子と反応することでヨードエタンが発生する仮説を立てるにいたった。次に解決すべき課題は、海底付近でヨウ素分子が発生するメカニズムの解明である。これが沿岸海域におけるヨウ素循環解明の鍵になる。沿岸堆積物でのヨウ素循環の解明に近づくことができた。珪藻細胞がエタノール発酵する過程、ヨウ素分子が発生する過程が鍵になることが推測された。ヨウ素分子発生については、マンガンや鉄の酸化水酸化物の溶解(還元反応)により、海水中のヨウ化物イオンが酸化される過程が推測される。これらを証明する実験に取り組み始めたので、順調に進展していると判断した。珪藻細胞を微生物により分解させる室内実験を行う。珪藻細胞がエタノール発酵する過程、ヨウ素分子が発生する過程を再現する。ヨウ素分子発生については、マンガンや鉄の酸化水酸化物の溶解(還元反応)により、海水中のヨウ化物イオンを酸化させる。これによりヨードエタンの発生を確かめる。室内培養実験と並行して、海洋観測を継続する。海洋観測の実施2016年4,5,7,8,10,12月, 2017年2,3月に北海道噴火湾で海洋観測を実施した。表面から海底直上まで鉛直的に海水を採取して、無機ヨウ素栄養塩類、有機ヨウ素ガス、酸素の濃度を測定した。観測結果と解析2016年3月に春季珪藻ブルームが起こったことが確認されている。それから1ヶ月以上経過して、48月に底層で溶存酸素濃度が低下、栄養塩濃度が上昇したので、有機物の分解が進行したことが明らかになった。底層では、リン酸の再生量に対して、窒素栄養塩(硝酸、亜硝酸、アンモニア)の再生量が不足しており、貧酸素化した底質で硝酸還元が起こっていることが考えられた。窒素栄養塩の不足が進行するとともに、同じ底層水でヨウ素酸の減少とヨウ化物イオンの増加が捉えられた。これは、硝酸還元と同時にヨウ素酸の還元が進行したことが原因と考えられた。つまり、底質に浸みこんだ海水中のヨウ素酸が還元され、ヨウ化物イオンが発生する。そのヨウ化物イオンが底層水に拡散して、底層水中のヨウ化物イオンの濃度が上昇したと思われる。底層水では、ヨードエタンの濃度が上昇しており、貧酸素化した環境でヨードエタンが発生・蓄積する可能性が示唆された。培養実験法の開発植物プランクトンを石英ガラスボトルに密封し、密封ボトル中の酸素濃度とクロロフィル濃度をモニターする手法を開発した。石英ガラスボトルの内側に酸素スポットセンサーを貼りつけ、ボトルの外側から励起光を照射して蛍光を測定する原理である。後者は、そのボトルにクロロフィル色素を励起する光を照射して、その蛍光強度を測定してクロロフィル濃度に換算する原理である。今後、酸素濃度をモニターしつつ、有機ヨウ素ガスの発生と無機ヨウ素の化学形態の変化を調べる予定である。2016年の観測では、噴火湾の低層水でヨウ素酸の還元を捉えることに成功した。また、ヨウ素酸還元と脱窒のタイミングが一致することを確認することができた。バイアル瓶での培養方法の確立に向けて、密封ボトル内の酸素濃度とクロロフィル濃度を測定することができた。したがって、おおむね順調に進展していると判断した。2017年4,5,6,8,10,12月、2018年3月に北海道大学練習船うしお丸にて、北海道噴火湾で海洋観測を実施した。また、2017年6-7月に同大学練習船おしょろ丸にて、北部ベーリング海で海洋観測を実施した。

海洋表面から海底直上の水を鉛直的に採取して、海水中の無機ヨウ素(ヨウ化物イオンとヨウ素酸イオン)、有機ヨウ素ガス種(ジヨードメタン、クロロヨードメタン、ヨードエタン、ヨードメタン)の濃度を測定した。また、マルチプルコアラーもしくはアシュラ採泥器を用いて、海底堆積物の柱状サンプルを採取した。堆積物表面から1cmごとに酸化還元電位とpHを計測したのちに、堆積物を切り分けて間隙水を絞り取った。間隙水中の無機ヨウ素と栄養塩類、有機ヨウ素ガス種の濃度を測定した。北海道噴火湾では、2017年3月に珪藻のブルームが発生したのを確認しており、その1か月後から海底付近でヨウ素酸濃度が低下して、ヨウ化物イオンの濃度が上昇した。底層水中でのヨウ素酸濃度の最低値とヨウ化物イオンの最高値は8月に記録した。底層水におけるヨウ化物イオンの増加傾向は、海底堆積物から溶出する栄養塩の再生傾向と類似していた。噴火湾の底層では、硝酸還元を示す状況証拠が見つかっているため、海底堆積物中における硝酸還元とヨウ素酸還元が同期して起こっていることが考えられた。海底堆積物中の無機ヨウ素濃度を調べると、ヨウ素酸に比べてヨウ化物イオンのほうが圧倒的に多く濃縮していることも明らかになった。ベーリング海でも似たような傾向がみられた。ベーリング海においては、海底堆積物の表面0ー1cm層では、ヨードエタンが高濃度にあることが明らかになった。大気や海水中ではマイナー成分であるヨードエタンであるが、堆積物中においてはメジャー成分になることが分かった。その理由を解明することが、沿岸海域におけるヨウ素循環解明の鍵になると思われた。計画通りの海洋観測と分析ができたため。堆積物(表面から15cm深まで)と海水(海洋表面から堆積物直上まで)の無機ヨウ素、有機ヨウ素ガス、栄養塩類の鉛直分布を世界で初めて測定することができたため。堆積物表層にて、ヨードエタンが特異的に濃縮している現象を発見したため。2018年4,5,6,8,10,12月、2019年3月に北海道大学練習船うしお丸にて、北海道噴火湾で海洋観測を実施した。また、2018年6-7月に同大学練習船おしょろ丸にて、北部ベーリング海および南部チャクチ海で海洋観測を実施した。海洋表面から海底直上の水を鉛直的に採取して、有機ヨウ素ガス種(ジヨードメタン、クロロヨードメタン、ヨードエタン、ヨードメタン)の濃度を測定した。間隙水中の栄養塩類、有機ヨウ素ガス種の濃度を測定した。北海道噴火湾では、2018年3月に珪藻のブルームが発生したのを確認しており、その1か月後から海底付近でヨードエタンの濃度が上昇して6月に最高濃度を記録した。噴火湾でもベーリング海でも、堆積物中では、表面0-1 cmでヨードエタンの濃度が著しく高いことを発見した。両海域とも、主な基礎生産者は植物プランクトンの大型珪藻類である。堆積物表面に降り積もった珪藻細胞が死滅・分解する際にヨードエタンが発生することが考えられた。2019年3月の噴火湾観測にて、珪藻ブルーム時に珪藻の懸濁物を集めて、珪藻細胞を微生物分解させる培養実験を行った。培養ボトルの中が無酸素になるとヨードエタンが発生することがわかった。新鮮な珪藻細胞に含まれる糖類がエタノール発酵して、ヨウ素分子と反応することでヨードエタンが発生する仮説を立てるにいたった。
細胞内活性酸素種の生理学的至適環境維持機構の解析とその生物影響評価

SODは有害活性酸素種スーパーオキシドを過酸化水素に触媒する。高等真核細胞では細胞内局在性が異なる3種のSODが知られている。我々はニワトリDT40細胞のConditionalなSOD1,SOD2ノックアウト細胞を作成し、これら遺伝子産物の枯渇が細胞内活性酸素代謝にどのような異常をもたらし、どの抗酸化物質がそれら異常を抑制できるのかを明らかにするため、種々のROSプローブを用いて解析し以下のを得た。SOD1は細胞の生存に必須である。SOD2は細胞増殖機能には重要な役割を担っている。両遺伝子産物の枯渇によるいかなる細胞内異常もアスコルビン酸(APM)でしか抑制できない。細胞内活性酸素種(ROS)は、放射線や環境変異原が原因で生じるだけでなく、通常の生理作用でも絶えず生じている。このような細胞内因性ROSは、抗酸化酵素や蛋白の働きで生理学的に至適な活性酸素環境に維持され、細胞の健全な生理機能に寄与する。本研究は、これら至適環境維持を担う抗酸化酵素や蛋白に着目し、その遺伝子を欠損させた細胞を作製することで結果的に内因性ROSを増加させ、その解析結果から、内因性ROSの生物影響評価とその至適環境維持機構について、生物学的意味を明らかにすることを目的としている。24年度は、SOD1枯渇による細胞内酸化度の上昇に伴う娘染色体交差の発生頻度を尿酸が有意に減少させることを見いだした。また、アスコルビン酸とは異なり、尿酸では細胞致死の回復はできなかったことから、細胞内酸化レベルの増加による細胞致死は、必ずしもDNA損傷を経由しないことも暗示された。しかし、娘染色体交差はすでに修復が完了したことを示す指標であり、致死性を示す損傷マーカーとして充分とは言えない。そこで25年度は、直接DNA鎖切断の指標として用いられる染色体断裂とRad51蛋白の核への集積をマーカーに加えて解析を試みた。Rad51の集積データは取れていないが、より直接的な染色体断裂はSOD1枯渇で生じること、また生じた染色体断裂は、尿酸処理により抑制されることを見いだした。これらは、細胞内の酸化度の増加に伴うDNA損傷が必ずしも細胞致死性をもたらさないことを示している。上記と平行して解析を進めているPrdx1条件欠損株においても、Prdx1枯渇に伴う細胞死の過程において、染色体断裂が生じないことも見いだした。これらの結果から、DCFH解析など、種々の細胞内酸化マーカーによる解析ではなく、細胞内の微細環境における細胞内酸化レベルの解析が必要であると考えている。脊椎動物細胞に存在する活性酸素種(ROS)は、放射線や環境変異原が原因で生じるだけでなく、通常の生理作用でも絶えず生じている。本申請期間における研究は、これら至適環境維持を担う抗酸化酵素や蛋白に着目し、その遺伝子を欠損させた細胞を作製することで結果的に内因性ROSを増加させ、その解析結果から、内因性ROSの生物影響評価とその至適環境維持機構について、生物学的意味を明らかにすることを目的としている。24年度は主に、既に作成したSOD1とSOD2の条件欠損細胞を用いた抗酸化剤の機能解析を行った。その結果、既に成果を発表したアスコルビン酸以外で、尿酸がSOD1枯渇による細胞内酸化度の増加に伴う娘染色体交差の頻度を有意に減少させることを見いだした。さらに、PRDX条件欠損細胞を用いて条件変異型のPRDX1変異蛋白の発現細胞のためのベクターの構築を行い、これら変異型蛋白をTet-Off型で発現する細胞のスクリーニングを行なった。細胞内活性酸素(ROS)はDNAに損傷を与え、突然変異や癌化の一因と考えられている。しかし、ROSは正常な生理作用で絶えず生じ、至適環境下では細胞内情報伝達因子として機能し、抗菌や抗炎症にも必須な役割を果たすことから、細胞内在性ROSの至適環境を維持する機構が生命活動に重要と考えられる。この機構解明のため、遺伝子破壊が容易なニワトリDT40細胞を用いて解析を進めてきた。抗酸化蛋白SOD1,SOD2,Prdx1の条件欠損細胞を作製し、内在的にROSを増加させる手法での細胞影響を解析し成果発表した。25年度は、染色体断裂やDNAニ本鎖切断認識蛋白Rad51の免疫染色法を用い、内在的ROSの増加によるDNA損傷誘発が必ずしも細胞死の原因ではないことを確認した。26年度には、DNA単鎖切断を評価できるアルカリコメットアッセイを導入した。細胞内ROSバランスを攪乱する薬剤による生理効果についても解析を始め、26年度は腫瘍細胞特異的致死効果と細胞内ROS増加効果のある薬剤Piperlongumineの作用機序について、DT40修復遺伝子欠損細胞パネルを用いて解析した。この薬剤がROS増加作用と共にDNA二本鎖切断を誘導すること、二本鎖切断の主要な修復経路である相同組換え修復自体を阻害することを見出し、Genes and Cancerに発表した。細胞内酸素濃度に依存して細胞致死効果を与える薬剤Tirapazamine(TPZ)の機能解析も行っている。腫瘍組織は低酸素状態だが、TPZは低酸素下で腫瘍細胞特定的な致死効果が期待される。TPZの低酸素領域と通常酸素領域での致死効果をDT40を用いて解析した。TPZが低酸素環境特異的にDNA-topoisomerase非解離型損傷を生み出すこと、TPZが通常酸素下でもROS依存的にDNA損傷を生み出し、細胞致死性を持つことを明らかにした。

延長期間となった27年度は、低酸素応答による酸化ストレス誘導について、マウス造腫瘍系を確立してin vivo腫瘍系での抗酸化効果の解析を進めた。また、細胞レベルでのアルカリコメット法によるDNA損傷定量評価から、酸化ストレスによる細胞応答の評価を行った。当課題で行った研究の成果について、延長期間中に新たに遂行した実験データを含め、国際放射線研究会議で発表した。SODは有害活性酸素種スーパーオキシドを過酸化水素に触媒する。高等真核細胞では細胞内局在性が異なる3種のSODが知られている。我々はニワトリDT40細胞のConditionalなSOD1,SOD2ノックアウト細胞を作成し、これら遺伝子産物の枯渇が細胞内活性酸素代謝にどのような異常をもたらし、どの抗酸化物質がそれら異常を抑制できるのかを明らかにするため、種々のROSプローブを用いて解析し以下のを得た。SOD1は細胞の生存に必須である。SOD2は細胞増殖機能には重要な役割を担っている。両遺伝子産物の枯渇によるいかなる細胞内異常もアスコルビン酸(APM)でしか抑制できない。25年度に染色体損傷(DNA損傷)のマーカーとして確立した染色体断裂と損傷認識蛋白であるRad51の細胞免疫染色に加えて、26年度はアルカリコメットアッセイの解析系を確立することが出来た。前者が主にDNA二本鎖切断の指標であるのに対して、後者は、DNA単鎖切断を評価することが可能な系である。また26年度には、細胞内酸化度を増加させると共に腫瘍細胞特異的致死をもたらす薬剤Piperlongumineの作用機序の解析をDT40の遺伝子破壊細胞パネルを用いて行った。25年度に見出したDNA二本鎖切断誘発機能に加えて、この薬剤が相同組み換え修復自体を阻害することを確認した。この結果は、26年度のGordon Conference (Genomic Instability)で報告すると共に、Genes and Cancer誌に発表した。さらに26年度は、腫瘍細胞特異的微細環境の一つである低酸素環境下で毒性を示す薬剤Tirapazamineの機能解析について、同様にDT40の遺伝子破壊細胞パネルを用いて行った。特にこの薬剤が通常酸素圧でもマイルドな致死効果を与えること、その致死効果はこの薬剤の還元作用で生じる活性酸素種によること見出した。活性酸素種によるDNA損傷が主にDNA単鎖切断であることから、26年度に確立したアルカリコメットアッセイを用いて、現在解析を進めている。放射線生物学研究期間を延長し、アルカリコメットアッセイを用いた手法で、酸素濃度依存的に異なるDNA損傷誘発機構の解明を試みる。染色体損傷(DNA損傷)のマーカーとして、24年度までは娘染色体交差を用いていたが、娘染色体交差は致死損傷マーカーとして十分とは言えない。25年度は、直接的な致死損傷マーカーとして、染色体断裂と損傷認識蛋白であるRad51の免疫染色法を導入し、確立した。また、条件欠損細胞を用いた解析と平行して、細胞内酸化度を増加させる薬剤を用いた解析も進めた。