hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ホルモン・レセプターの機能と病態に関する研究

1.インスリンシグナル伝達インスリンによって細胞内から細胞膜に移動するGLUT4のトランスロケーションが、ミオシン軽鎖リン酸化酵素阻害剤であるML-9により抑制されることを明らかにした。更に、ML-9がMAPキナーゼを阻害することによりインスリンによる糖輸送活性の活性化を阻害する可能性を示唆した。また、PI3キナーゼ活性がインスリンにより亢進することを証明し、この際、IRS-1を含むチロシンリン酸化を受けた蛋白とPI3キナーゼが会合することがPI3キナーゼの活性化に重要であることを報告した。2.ナトリウム利尿ペプチドレセプターナトリウム利尿ペプチドファミリーの3種類のリガンドANP,BNP,CNPの3種類のレセプター、GC-A,GC-B,Cレセプターに対する選択性を明確にした。生体内では、大動脈中膜にGC-Aレセプターが主に発現しているのに対し、培養大動脈平滑筋細胞ではGC-BとCレセプターの発現しており、細胞表現型に伴うナトリウム利尿ペプチドレセプターのサブタイプの変換を見いだした。3.エンドセリンレセプターヒトのエンドセリンBレセプター遺伝子の構造を決定し、5'上流域の転写調節部位の構造を明らかにするとともに第13染色体上に存在することを証明した。4.甲状腺ホルモンレセプター全身型と下垂体型の甲状腺ホルモン不応症がともに甲状腺ホルモンレセプターβ1遺伝子の点突然変異によって、発症することを証明した。エンドセリン(ET)のヒトにおける病態生理的意義を明らかにする目的で,ヒトETレセプタ-(ETR)のクロ-ニングを行い,2種類のETRの構造を決定した。ETRAはETー1,ETー2に親和性が強く,血管平滑筋によく発現されていた。一方ETRBはETー1,ETー2,ETー3と同程度に結合し,脳,血管内皮に発現が強かった。従って内皮より分泌されるETは自身に働いて機能を調節する自己分泌のメカニズムを持つことが推測された。次に甲状腺ホルモン・レセプタ-(T_3R)について検討を加えた。T_3Rα,βにともに反応する抗体を用いT_3Rが下垂体前葉細胞や脳にも存在することを免疫組織化学的に明らかにするとともに,ウェスタンブロット法でその存在を確認した。また甲状腺ホルモン不応症の一家系でT_3Rβ,遺伝子について検討し,1612番目の塩基の点突然変異(A→G)により,438番目のアミノ酸Lys→Gluの置換が起こり,ホルモン結合能が著明に低下することを明らかにした。更にその他の家系についてもその変異の本体を分子生物学的に検討中である。次に甲状腺刺激ホルモンレセプタ-(TSHR)の構造が明らかになったので,バセドウ病甲状腺刺激抗体の結合部位を合成ペプチドを用いて検討した。その結果アミノ酸333343に担当するペプチドは抗体の甲状腺刺激活性を有意に抑制したが,TSHの作用には影響せず,抗体の結合部位の少なくとも一部になっているものと推測された。更にインスリンがそのレセプタ-に結合してからの情報伝達の仕組みについて検討し,糠輸送担体の膜への移行にアクトミオシン系が関与することをミオシンライトチェ-ンキナ-ゼ阻害剤ML9を用いて明らかにした。恐らくインスリンレセプタ-キナ-ゼはいくつかの蛋白のリン酸化を介して作用するものと考えられる。1、インスリンのシグナル伝達とその異常。(1)受容体後のシグナル伝達の解明。3T3-L1脂胞細胞を用いて、糖輸送担体へのシグナル伝達にMAPキナーゼの関与を示唆する成積を得た。Fao細胞を用いて、インスリンによってPI3キナーゼがインスリン受容体基質(IRS-1)と結合しその活性化が起こることを明らかにした。(2)前年度に引き続き、インスリン受容体後異常症と思われる一家系について作用障害部位の検討を行った。Gbut4のPCR-SSCPには異常がなかった。線組芽細胞のインスリンによるブドウ糖取り込みは低下していたが、MAPキナーゼの活性化には異常がなかった。2、甲状腺ホルモン不応症の異常

T_3受容体解析本邦で発見された全身型甲状腺ホルモン不応症(GRTH)患者のT_3受容体(IR)β遺伝子の解析を行い、4例においてホルモン結合領域に点突然変異を固定した。さらに下垂体型不応症(PRTH)の患者においても、アミノ酸333番めのArgがTryに点突然変異していることを発見した。PRTHの異常TRは、T_3結合能が著明に低下していた。PRTHのTR遺伝子異常は世界で最初の報告であり、PRTHとGRTHの発生機序に関し重要な知見を与えるものとなった。3、ヒトの2種類のエンドセリン受容体遺伝子の全構造の解明。エンドセリン(ET)は血管内皮細胞の産生する強力な血管収縮ペプチドである。ETファミリーの臨床的意義を明らかにする目的で、ヒトの2種類のET受容体(ET-A及びET-B受容体)の遺伝子のクローニングを行い、それぞれの遺伝子の隣接領域を含む全構造及び染色体位置を明らかにした。1.インスリンシグナル伝達インスリンによって細胞内から細胞膜に移動するGLUT4のトランスロケーションが、ミオシン軽鎖リン酸化酵素阻害剤であるML-9により抑制されることを明らかにした。更に、ML-9がMAPキナーゼを阻害することによりインスリンによる糖輸送活性の活性化を阻害する可能性を示唆した。また、PI3キナーゼ活性がインスリンにより亢進することを証明し、この際、IRS-1を含むチロシンリン酸化を受けた蛋白とPI3キナーゼを会合することがPI3キナーゼの活性化に重要であることを報告した。2.ナトリウム利尿ペプチドレセプターナトリウム利尿ペプチドファミリーの3種類のリガンドANP,BNP,CNPの3種類のレセプター、GC-A,GC-B,Cレセプターに対する選択性を明確にした。生体内では、大動脈中膜にGC-Aレセプターが主に発現しているのに対し、培養大動脈平滑筋細胞ではGC-BとCレセプターの発現しており、細胞表現型に伴うナトリウム利尿ペプチドレセプターのサブタイプの変換を見いだした。3.エンドセリンレセプターヒトのエンドセリンBレセプター遺伝子の構造を決定し、5'上流域の転写調節部位の構造を明らかにするとともに第13染色体上に存在することを証明した。4.甲状腺ホルモンレセプター全身型と下垂体型の甲状腺ホルモン不応症がともに甲状腺ホルモンレセプターβ1遺伝子の点突然変異によって、発症することを証明した。
胃未分化癌の発生と増殖機構

胃未分化癌の発生の場は腺頸部増殖帯である。このことは、極微小未分化癌の連続標本により証明可能であった。そして発生した癌細胞は正常腺上皮の流れから逸脱し増殖し早期に腺頸部を破壊、消失せしめる。実験的にも、犬の胃に未分化癌を作製した結果、癌細胞は腺頸部の増殖帯に初発することがわかった。更に胃未分化癌は粘膜内癌へと進展すると、正常腺管を模倣し層分化を示す。これを組織化学的に検索すると、粘膜下半分に分布する癌細胞は幽門腺型粘液に類似し、表層部分はCEA陽性で、正常幽門腺表層細胞に類似していた。このことは癌細胞も粘膜固有層間質の微小環境の影響を受けているものと解釈された。胃未分化癌のうち1cm以下の小胃癌の粘膜環境を調べると、約2/3の症例で中間帯付近に発生し偽幽門腺化生を伴うような萎縮性の変化を受けている領域であった。胃未分化癌はスキルス癌と髄様癌とに大別できるが、前者ではDNA量において異倍体のものが多く、髄様癌では2倍体のものが多かった。又、予後の点でも、スキルス癌は髄様癌より不良であった。未分化癌の大部分を占める直径6cm以上のびまん浸潤癌のリンパ管侵襲について調べると、全体が一様に微小癌胞巣からなる癌はリンパ管侵襲の程度が低く、索状から小腺管形成を示す癌胞巣と微小癌胞巣が混じっている癌ではリンパ管侵襲の程度が高かった。胃癌全般にわたる研究として、TGFαとHa-rasP21の発現を免疫組織化学的に調べると、早期癌では発現率が低く、進行癌では発現率が高かった。予後との関係では、TGF-αとHa-rasP21両者が発現している胃癌では極めて予後不良であった。ひと胃癌からhstという新しい癌遺伝子を見いだした。また培養株胃癌細胞からコラーゲンα1(I)mRANがかなり多くあることを新たに見出した。
心筋特異的遺伝子発現と心筋病態形成の遺伝子解析

(A)心機能に重要な遺伝子の心筋特異的な発現調節機構の解明心肥大のメカニズムについては、培養心筋細胞のin vitroストレッチ・モデルを用いた解析により心筋内アンジオテンシンIIの動態とMAPキナーゼ等の細胞内リン酸化カスケードを介する機序および、心筋内レニン・アンジオテンシン系が心筋細胞の肥大と間質の繊維化を惹起することが明らかとなった。また、心筋で発現するサイトカイン(IL-6)、ホルモン(ANP,BNP,レニン・アンジオテンシン)、Kチャンネル、カルシウムポンプなどの遺伝子の虚血・圧負荷・Ca・甲状腺ホルモンなどの外的負荷や病態時における発現調節機構・転写調節機構を明らかにした。さらに、心筋細胞分化を規定する遺伝子を解明するため、すでにマウスで単離した心筋特異的ホメオボックス遺伝子C_<SX>をプローブとしてヒトC_<SX>を単離したところ、マウスC_<SX>遺伝子とアミノ酸配列が非常に類似しており、種をこえて保存されていることが明らかとなった。(B)心筋病変形成の素因となる遺伝子の解明日本人の肥大型心筋症患者で心筋βミオシン重鎖遺伝子に計14種のミスセンス変異を同定し、このうち13種は欧米人と異なる変異であった。47多発家系中11家系については心筋βミオシン重鎖遺伝子との連鎖が否定され、日本人における本症の遺伝子的不均一性を示すと考えられた。心肥大を有するミトコンドリア心筋症患者ではロイシンtRNA遺伝子の点変異、多種類の遺伝子欠失を検出した。さらに、日本人の拡張型心筋症においてHLA-DR遺伝子と、QT延長症候群で11p15.5のHRASとD11S922と、それぞれ相関が認められた。本年度は、心筋特異的に発現する遺伝子とその制御機構について解析し、心肥大や心不全などの病態形成の原因となる遺伝要因について検討を行なった。心筋特異的に発現するホメオボックスCsxのcDNAと遺伝子がマウスおよびヒトで単離された。Csxは心筋特異的な遺伝子転写機構の解明だけでなく、不全心筋に対する遺伝子治療の重要な手掛かりを与えるものである。胎児心筋や不全心で発現するナトリウム利尿ペプチドBNPは、心負荷刺激に対し極めて迅速にその遺伝子発現が亢進する。BNPmRNAは3'非翻訳領域のATTTA反復配列によりANPに比べその半減期は著しく短く、emergency hormoneとして機能すると考えられた。筋小胞体Caポンプとその調節蛋白質ホスホランバン(PLN)の発現は甲状腺ホルモンによって制御される。Caポンプと変異PLNの同時発現により、相互作用部位をPLNドメインIaに同定し、変異Ca遊離チャンネルの検討により615Argの活性調節を示した。心臓肥大の線維化に関してはアンジオテンシンII(AII)が心筋線維芽細胞のコラーゲン合成を促進させる。高血圧自然発症ラット(SHR)では、心筋、線維芽細胞におけるアンジオテンシノーゲン(ATN)、renin、ACEの各mRNA発現量はすべて亢進しており、高血圧性肥大心における心筋の腺維化にAIIが重要な役割を果たしていることが示唆された。その他、肥大心での心筋電位存在性K^+チャンネルmRNAの減少、アシドーシスにおける機能抑制が明らかにされた。心筋細胞障害におけるスーパーオキサイドやIL-6の関与についても明らかになった。肥大型心筋症では心筋βミオシン連鎖遺伝子の構造解析を行い、172名の患者中20名に13種のミスセンス変異を見いだした。一方、本症多発家系の解析から、少なくとも25%は心筋ミオシン変異に起因しないことを明らかにした。

また心伝導障害にも関与するミトコンドリアDNA欠失症例が報告された。さらに拡張型心筋症の病因にHLA遺伝子群、またはHLA遺伝子と連鎖不平衡にある近傍の遺伝子が関与している可能性が示唆された。次の2つの研究目標に関して、以下の研究成果を得た。(A)心機能に重要な遺伝子の心筋特異的な発現調節機構の解明1.ヒトの心筋特異的ホメオボックス遺伝子Csxを単離したところ、成人心に比べて胎児心で多く発現していた。2.ウイルス性心筋炎においてウイルスRNAが長期間心筋内に存在し、superoxideやTNF-αが心筋障害に関与する。3.肥大心においてはレニン・アンジオテンシン系が心筋細胞の肥大と間質の繊維化を惹起している。4.心筋虚血時には血中IL-6が上昇し、その遺伝子の発現誘導には転写因子であるNF-IL6とNK-κBが関与している。5.心筋から内向き整流Kチャンネル遺伝子を単離したところ、このチャンネルには内因性のゲート機構がある。6.ホスホランバンによるカルシウムポンプ活性の調節には遺伝子発現による量的な変化を介する機序が存在する。7.肥大心では、電位依存性Kチャンネルの中で遅延整流型のKv1.5が著減し一過性外向き型のKv1.4が著増する。8.急性の心室負荷によりBNPはANPより早期に活性化する。BNPには定常状態における血圧調節作用がある。(B)心筋病変形成の素因となる遺伝子の解明1.日本人の肥大型心筋症患者で、心筋βミオシン重鎖およびαトロポミオシン遺伝子のミスセンス変異を検出した。2.心肥大を有するミトロンドリア心筋症患者でロイシンtRNA遺伝子の点変異、多種類の遺伝子欠失を検出した。3.拡張型心筋症患者においてHLAクラスII遺伝子のHLA-DRB1^*1401・-DQB1^*0503alleleの頻度が高率であった。4.日本人のQT延長症候群の家系で11p15.5に存在するHRASとD11S922のそれぞれについて、連鎖または組み換えを示す家系が認められた。
磁場配向二重膜を用いた生体膜中ペプチドの立体構造解析法の開発

本研究では両親媒性ペプチドであるメリチンおよびダイノルフィンがリン脂質二重膜に組み込まれることによって生じる磁場配向二重膜の性質についての基礎検討を行った。モル比で1:10に混合したメリチンあるいはダイノルフィンとリン脂質であるDMPCをメタノールに溶かし、有機溶媒を完全に除去した後、20mMのtris緩衝液で水和してペプチドを取り込んだ脂質二重膜を調製した。メリチン-DMPC二重膜について^<31>PNMRスペクトルを観測したところ、脂質二重膜の液晶ゲル相転移点(Tm)以上の温度で脂質二重膜の膜面が磁場に平行に配向することが判明した。同様の磁場配向現象はダイノルフィン-DMPC二重膜おいても観測された。この磁場配向二重膜の形態を決定するために、カリウムイオン選択性電極を用いて、膜中に取り込まれたK^+の漏洩を測定した。この結果、磁場配向二重膜ではK^+の漏洩が観測されたので、この膜は小胞体を形成していることが明らかになった。このような小胞体が磁場に対して自発的に配向するためには、小胞体全体で磁気異方性を持つ必要がある。従って、この小胞体は球形ではなくて楕円体を形成していると考えられる。そこで磁場配向二重膜において観測した^<31>PNMRの線形を解析した結果、この小胞体は長軸が短軸に比べて、少なくとも5倍以上長い形状をもつ細長い楕円体であることが明らかになった。この磁場配向二重膜に結合したメリチン分子も磁場配向していることが^<13>CNMRの結果から確かめられた。さらにメリチンはα-へリックスを形成しており、分子の中央部が膜中に挿入された状態で脂質膜表面に結合していることが判明した。これらの結果は一般の膜蛋白質やイオンチャネルペプチドの構造解析に磁場配向膜が有用であることを示唆している。
Mg合金の革新マイクロ製造技術開発とそのマイクロ成形への応用

マグネシウム合金は,超軽量かつ高比強度,高比剛性の特徴と生体内での優れた生体適合性と分解特性を有することから新たな生体材料として注目されている.しかしながら,微細部品で構成された生体用医療機器部品を成形する場合,その成形性が劣ることなどが大きな問題となっている.本研究では生体用微細マグネシウム合金部材を成形するための素材製造法として,直径5mmのマグネシウム合金AZ31および純マグネシウムを対象にしたマイクロECAPを開発した.ECAP法は,屈曲したチャネル内に材料を押し通すことでせん断ひずみを加える強加工法である.マグネシウム合金棒材のマイクロECAPにおける各種加工条件(ルート,加工温度,押出い速度,潤滑条件)が表面特性,結晶組織,機械的性質に及ぼす影響を明らかにした.加工温度が低いほど結晶粒は微細化されることがわかった.また加工ルートBcの場合,双書変形が結晶粒界をまたぐ現象が生じることがSEM-EBSD観察結果から明らかとなった.また結晶塑性有限要素法による集合組織解析法を提案し,塑性変形後の集合組織の予測を行った.さらにECAP加工後の材料に対し,NaClを用いたin-vitro分解特性試験を行った.特にレーザ顕微鏡を用いて腐食の過程を逐次観察することで,どの部位から腐食が始まっているかを明らかにした.以上,マイクロECAP法によって創製した組織制御マグネシウム合金の開発指針を得ることができた.29年度が最終年度であるため、記入しない。29年度が最終年度であるため、記入しない。
サルコペニアにおける腸内細菌の役割

サルコペニアには単に骨格筋の廃用性萎縮だけではなく加齢にともなう消化吸収機能や腸内フローラの変化が寄与するという仮説を検証することを目的とした。震災の影響により高齢マウスおよびTLRノックアウトマウスの使用ができなくなったが、腸内細菌の除去が廃用性萎縮からの回復を著しく遅延させることを見いだした。ペプチドグリカンの経口投与は腸内細菌除去による骨格筋の損傷からの回復遅延を防ぐことはできなかった。1)腸内細菌除去マウス骨格筋にカルディオトキシンを投与し、再生修復が遅延することを確認。菌体多糖体により骨格筋修復遅延が回復することを確認した。繰り返しの観察により、筋重量の回復過程、筋線維周囲径の回復過程に統計的に有意な差があることを見出した。腸内細菌の成分が、損傷組織の修復過程に影響を及ぼすことを示すデータである。2)若齢マウス(8週)と高齢マウス(48週以上)にあらかじめ乳酸菌(プロバイオティクス)を経口投与しておいた後にカルディオトキシンの骨格筋内投与により筋損傷を作成、その後の再生修復過程を比較した。高齢マウスは若齢マウスに比べて再生過程の時間経過に有意な遅延が見られることが確認された。乳酸菌投与により、再生が促進され、筋重量、筋線維周囲径の増大がみられた。しかし損傷がなくても筋線維周囲径の増加傾向がみられた。この傾向は若年マウスにおいてより顕著であり、乳酸菌投与単独で損傷の有無に関わらず骨格筋量の変化が起こる可能性が示唆された。損傷の修復過程には差がみられなかったものの、高齢者において乳酸菌の摂取は骨格筋量と機能維持に有用である可能性が示唆された。乳酸菌の菌体成分投与によっても筋量の増加傾向がみられており、今後サルコペニア対策に有用である可能性が示された。本研究課題ではToll Like Receptorを豊富に発現する腸管平滑筋の萎縮あるいは機能低下が骨格筋損傷からの回復不全に関与するという仮説を検証し、そのメカニズムを明らかにすることを目的とした。平滑筋機能の維持には腸内細菌が重要である。腸内細菌除去により遠隔臓器である骨格筋の損傷からの回復過程に関与することを明らかにする挑戦的な課題である。外科手術後に早期に経口摂取を開始した方が、回復が早いといわれるが、そのメカニズムを明らかにすることにつながる研究課題である。われわれは抗生物質/抗菌剤による腸内細菌除去は、薬剤誘発性筋損傷の回復を遅延させることを、先行研究において明らかにしていたが、薬剤誘発性筋損傷には損傷範囲のばらつきがあるため、あらたにギブス固定による廃用性筋萎縮を作成し、ギブス固定解除後の筋損傷およびその回復過程を観察した結果、腸内細菌除去は廃用性萎縮からの回復も著しく遅延させることを明らかにした。腸内細菌除去マウスにおけるLPSの投与は筋損傷からの回復を促進したことから、腸内細菌除去マウスにProteoglycan(PG)あるいはPG豊富なLactobacilli2種の経口投与を行った。しかしPG、Lactobacilliいずれにも筋損傷からの回復促進効果は確認されず、TLR2の関与は否定的であった。高齢化マウスを用いた同様の実験を予定していたが、震災の影響により高齢化マウスが失われ、37週令のマウスにおける実験しか実施できなかった。またクロドロネートによるマクロファージ除去後の筋損傷からの回復過程にはばらつきがみられ、マクロファージの関与が骨格筋の回復に必須であるか否かについて結論を得ることはできなかった。
様々なデータを融合することによる新規交通サービスに対する需要予測分析に関する研究

本研究では,新規交通サービスに対する需要予測手法に関して,柔軟なフレームワークを持ち,かつ操作性の高い非集計離散選択モデルによる需要予測に着目して研究を行った.まず,都市圏レベルでの新規交通サービスや政策に対する需要予測において一般的に用いられるパーソントリップ(PT)データに基づく予測手法について事後評価を行い,次いで,モデルの時間移転性やゾーニングが予測に及ぼす影響を詳細に分析し,その改良手法を提案した.次に,利用データの側面から需要予測精度を改善する方法論として,過去の行動データに加え,新規サービスへの利用意向を尋ねたSPデータ,交通需要の総量に関する情報を含む集計データなどを融合利用した統合型需要予測モデルを構築し,事例研究においてその有効性を検討した.また,操作性の高いSPデータは特に有効であると考え,個人レベルでの選好や行動変化を把握するために必要な調査設計法やそれに対応する数理モデルの開発を行った.加えて,交通行動を観測する手法としてここ数年注目を浴びているプローブ調査データに着目し,交通行動分析において特に研究が立ち遅れているドライバーの経路選択行動を対象として分析を行い,プローブデータが経路選択の動的側面を把握・モデル化するのに有効であることを確認した.さらには,需要分析においてデータと両輪をなす行動モデルについて,ITSやTDM施策の効果予測においては,より現実の意思決定を反映した限定合理性の概念に基づく交通行動モデルが有効であると考え,そのモデル化について検討を行った.具体的には,現実世界で最もよく観測される修正辞書編纂型の意思決定ルールに着目し,その操作性や推定特性の把握,ならびに効用最大化モデルとの現況再現性や予測精度の差について分析を行った.また,観測データからモデルを同定する方法論として,データマイニング手法の援用可能性についても検討を行った.本研究では,新規交通サービスに対する需要予測手法に関して,柔軟なフレームワークを持ち,かつ操作性の高い非集計離散選択モデルによる需要予測に着目して研究を行った.まず,都市圏レベルでの新規交通サービスや政策に対する需要予測において一般的に用いられるパーソントリップ(PT)データに基づく予測手法について事後評価を行い,次いで,モデルの時間移転性やゾーニングが予測に及ぼす影響を詳細に分析し,その改良手法を提案した.次に,利用データの側面から需要予測精度を改善する方法論として,過去の行動データに加え,新規サービスへの利用意向を尋ねたSPデータ,交通需要の総量に関する情報を含む集計データなどを融合利用した統合型需要予測モデルを構築し,事例研究においてその有効性を検討した.また,操作性の高いSPデータは特に有効であると考え,個人レベルでの選好や行動変化を把握するために必要な調査設計法やそれに対応する数理モデルの開発を行った.加えて,交通行動を観測する手法としてここ数年注目を浴びているプローブ調査データに着目し,交通行動分析において特に研究が立ち遅れているドライバーの経路選択行動を対象として分析を行い,プローブデータが経路選択の動的側面を把握・モデル化するのに有効であることを確認した.さらには,需要分析においてデータと両輪をなす行動モデルについて,ITSやTDM施策の効果予測においては,より現実の意思決定を反映した限定合理性の概念に基づく交通行動モデルが有効であると考え,そのモデル化について検討を行った.具体的には,現実世界で最もよく観測される修正辞書編纂型の意思決定ルールに着目し,その操作性や推定特性の把握,ならびに効用最大化モデルとの現況再現性や予測精度の差について分析を行った.また,観測データからモデルを同定する方法論として,データマイニング手法の援用可能性についても検討を行った.本研究は,人間の選択行動を表す非集計型離散選択モデルをベースに,通常用いられる過去の経験データを性質の異なる様々なデータソースと融合して用いる方法論を展開し,需要予測精度の向上を図るものである.今年度は,まず,交通需要の総量に関する情報を含む集計データを有効活用すべく,集計データを代表的個人を想定した非集計データに変換し,重み付き最尤推定法により未知パラメータを推定する方法論を開発した.その上で,全国規模での影響が予想される新規都市間高速鉄道の整備事業を対象に,通常のRPデータ,新規サービスへの利用意向を尋ねたSPデータ,全国の交通需要を反映した集計データである幹線旅客純流動データを同時に用いた統合型需要予測モデルを構築し,需要予測および便益評価を通じてその有効性を確認した.次に,プローブカーデータの経路選択行動分析への適用に関する研究を行った.まず,位置データであるプローブカーデータから選択経路を特定するアルゴリズムを開発し,次いで,簡便な経路選択モデルを構築して分析を行った.その結果,プローブカーデータは選択経路のみならず,道路ネットワークにおける交通状態についても詳しい情報が得られるため,経路変更などの動的な行動側面についての理解やモデル化に極めて有効であることが確認された.経路変更のような動的な行動側面の把握や交通情報に対する反応行動の分析には,人間の認知資源の限界を意識した限定合理性の概念に基づく選択モデルが有効であると考えられる.そこで,当該研究グループが開発した修正辞書編纂型意思決定ルールを採用した選択モデルを対象として,適用上問題となるモデル推定精度について分析を行った.その結果,選択結果のデータのみから意思決定構造を逆解析的に推定することは困難であるが,重視する属性の順番など意思決定の内面に関するデータ援用することで,推定精度が向上することを確認した.新規交通サービスに対する需要予測手法に関する研究として,(1)都市圏レベルでの需要予測において標準的手法であるパーソントリップ(PT)データに基づく予測手法の検証,(2)SPデータを活用した需要予測手法に関する研究(3)ITSやTDM施策の効果予測に有効であると考えられる限定合理性に基づく交通行動モデルに関する研究(4)車両の走行

軌跡を観測したプローブカーデータを用いた経路選択モデルの改良,の4点について研究を行った.(1)については,まず大幅な過大予測であった桃花台ピーチライナーを対象に,当時用いられた需要予測手法の検証,ならびに現在の標準的手法である非集計離散選択モデルの予測精度の評価を行った.次に,そこで特に問題となった,モデルの時間移転性及びアクセス時間短縮効果の評価に着目し,PTデータと独自に実施したアンケート調査データを用いて詳細な検証を行い,予測精度を改善する方法論の提案を行った.(2)については,まず,シミュレーションによって作成した様々な人工データを用いて分析を行い,SPデータから個々人の選好構造を精緻に推定するための調査設計および分析手法についての指針を提示した.また,需要予測においては,行動変化の臨界点すなわち選好無差別な情報を含むSPデータの活用が有効であると考え,それに対応したモデルを開発し,その有効性を確認した.(3)については,修正辞書編纂型の意思決定ルールのモデル化に関して,データマイニング手法における決定木がまさにそれを表現していることに着目し,その推定精度を離散選択モデルの枠組みでモデル化した場合と比較し,併せて両者を融合したモデル推定法の開発を行った.(4)については,前年度の知見を踏まえ,プローブ情報をフルに活用すべくトリップ途中での経路変更の意思決定を明示的に考慮した動的な経路選択モデルへの拡張を行い,従来の静的なモデルと比較してその有効性を確認した.
海洋性マンガン酸化物の地球化学的研究

海洋底に存在するマンガン酸化物にはマンガン・ノジュールとマンガン・クラストが知られている。それらの起源として海水、熱水、統成の3つの要因が考えられているが、マンガンクラストでは統成起源によるものはほとんどないとされている。これら起源と鉱物組成との関連性についてはすでにかなり明らかにされているが、化学組成との関連性は明確でない。本研究では、成因のわかっているマンガン酸化物を分析し、成因(起源)と化学組成との関連性を考察した。分析試料としては中部太平洋産のマンガン・ノジュール、熱水性マンガン推積物、伊豆小笠原孤産の熱水性マンガンクラストを選んだ。元素分析には非破壊中性子放射化分析と誘導結合プラズマ発光分光分析を用いた。得られた結果は次の様にまとめられる:(i)ノジュールはクラストに比べて、一般にCo、Ni、Znの存在度が大きいが、As、Sb、Wの存在度にはほとんど差がない、(ii)熱水性マンガンクラストにおいて、Ba、Srの存在度に地域差が認められる、(iii)日本海産のマンガンクラスト(熱水性と推定される)には、Ba、Srのほか、U、Thも高い濃度で存在する、(iv)Todorokiteの熱安定性の違いは化学組成に大きな差を与えない。統成起源のノジュールが熱水起源のクラストに比べCo等の金属元素を多く含有するのは、同ノジュールがこれら元素を構成要素とするbuseriteからなるためであるとされている。これに対して、As、Sb、W等の元素の存在度がマンガン酸化物の起源によらずほぼ等しいのは、buserite,todorolsiteへの捕集機構がこれらの元素で差がないことを示唆する。一般に希工類元素の含有量は熱水性のマンガン酸化物よりも、統成起源のマンガン酸化物の方が大きい。存在度パターンではCeの正及び負の異常を示すものが少なくなかった。Euの存在度異常も見られたが、Ceのそれより頻度的に少なく、またほとんどが負の異常であった。
セラミックス及びその溶射材の摩耗、転がり疲労の機構と強化

ばね負荷回転接触式セラミックス用転がり疲労試験機を試作し、窒化珪素セラミックス二種、及びサイアロン一種の転がり疲労試験を実施し、セラミックスの転がり疲労の機構、繰り返し速度の影響、疲労き裂進展の様相などについて検討した。さらに境界層にモリブデンを用いたアルミナプラズマ溶射材について転がり疲労試験を実施するとともに、ビンオンディスク方式の磨耗試験を行い、層間の剥離状況、転がり特性と磨耗特性の相関などについて調査、検討した。転がり疲労については、三種のセラミックスとも顕著な転がり疲労挙動がみられ、ヘルツ接触応力の増大とともに疲労寿命は低下した。この中でサイアロンが最も高い転がり疲労強度を示した。窒化珪素については、破断部近傍、途中除荷した試験片いずれも接触表面直下200-300μmの、繰返しせん断応力が最大となる位置に表面に平行な方向に数μmの微小き裂が多数観察され、繰り返し数の増大にともなってこの微小き裂が成長していることを確認した。転がり接触のように圧縮とせん断が重畳した応力状態下では、繰り返し疲労を起こしにくいとされるセラミックスにおいても金属同様の疲労を起こすこと、それがモードIIせん断型の疲労き裂であることを明らかにした。また、繰返し速度の遅い方が疲労強度は高いという結果が得られた。アルミナ溶射材においても顕著な転がり疲労挙動がみられ、転がり接触疲労試験が溶射材の強度評価試験となりうること、破壊はアルミナ層と中間のMo層の界面のすべりによって生じていることなどを明らかにした。摩擦磨耗特性は、溶射材、窒化珪素とも、速度、環境の影響を強く受けること、両材とも水環境中での高速磨耗に対しては優れた特性を示すことなどが明らかとなった。本年度は、試作したばね負荷回転接触式セラミックス用転がり疲労試験機を用いて窒化珪素セラミックス及びサイアロンの転がり疲労試験を実施した。試験機については、各部品の精度を上げ、荷重検定を厳密にするなどの改良を加え、当初の目的に沿ったすべりの少ない転がり疲労試験を行うことができるようになった。15EA02:いずれの材料とも転がり接触により繰返し疲労現象を示し、ヘルツの応力と破断寿命の間には金属と同様なS-N曲線が得られた。窒化珪素については破断した試験片の破断部近傍、途中除荷した試験片いずれも接触表面直下200-300μmの位置に表面に平行な方向に数μmの大きさの微小き裂が多数発見された。破断部の走査電子顕微鏡による破面観察においても発見された微小き裂の寸法に対応する階段状の平坦な破面がみられ、破壊は表面に平行な方向に多数形成されたせん断形のき裂の合体によって生じているものと思われる。また、繰返し速度を変化させた実験では当初の予測に反して繰返し速度の遅い方が疲労強度が高いという結果が得られた。これらの事実は破壊過程が大気の影響を受けない内部で進行していることを示している。実験に用いた窒化珪素の一種については大気中の引張・圧縮負荷においては繰返し数依存形の疲労は起こされず、時間依存形の遅れ破壊(応力腐食割れ)によって破壊することが確認されている。このことは金属疲労のような繰返し数依存形の疲労を起こしにくいとされるセラミックスにおいても、圧縮応力とせん断応力が重畳した条件下では繰返し数依存形のしかも金属と同様なモードII形のせん断き裂による破壊を生じることを示している。今後、き裂の成長過程を観察し、以上の現象の確認を進める予定である。

昨年度に引き続いて試作したばね負荷回転接触式セラミックス用転がり疲労試験機を用いて窒化珪素セラミックス二種、及びサイアロン一種の転がり疲労試験を実施し、セラミックスの転がり疲労の機構、繰り返し速度の影響、疲労き裂進展の様相などについて検討した。さらに境界層にモリブデンを用いたアルミナプラズマ溶射材について転がり疲労試験を実施するとともに、ピンオンディスク方式の磨耗試験を行い、層間の剥離状況、転がり特性と磨耗特性の相関などについて調査、検討した。転がり疲労については、三種のセラミックスとも顕著な転がり疲労挙動がみられ、ヘルツ接触応力の増大とともに疲労寿命は低下した。この中でサイアロンが最も高い転がり疲労強度を示した。本年度は特に繰り返しせん断応力が最大となる接触表面下200-300μmの位置での微小き裂の進展状況を調べ、繰り返し数の増大にともなって接触面に平行に進展した内部微小き裂が成長していることを確認した。転がり接触のように圧縮とせん断が重畳した応力状態下では、繰り返し疲労を起こしにくいとされるセラミックスにおいても金属同様の疲労を起こすこと、それがモードIIせん断型の疲労き裂であることを明らかにした。アルミナ溶射材においても顕著な転がり疲労挙動がみられ、転がり接触疲労試験が溶射材の強度評価試験となりうること、破壊はアルミナ層と中間のMo層の界面のすべりによって生じていることなどを明らかにした。摩擦磨耗特性は、溶射材、窒化珪素とも、速度、環境の影響を強く受けること、両材とも水環境中での高速磨耗に対しては優れた特性を示すことなどが明らかとなった。
免疫クライオ電顕による新鮮膜細胞骨格ナノ分子システムの解明

膜細胞骨格の主成分であるアクチン線維の空間構造が明らかにされた.アクチン線維は空間的に膜に密着するタイプと膜面と平行に走り所々で接着するタイプおよびストレスファイバーに分類でき、独特の網目構造作り運動と関与する線維は第二のものであることが分かった.また、これらを制御するアクチン結合タンパク質にも空間特異性があることが明らかとなった.膜細胞骨格の主成分であるアクチン線維の空間構造が明らかにされた.アクチン線維は空間的に膜に密着するタイプと膜面と平行に走り所々で接着するタイプおよびストレスファイバーに分類でき、独特の網目構造作り運動と関与する線維は第二のものであることが分かった.また、これらを制御するアクチン結合タンパク質にも空間特異性があることが明らかとなった.細胞膜は外界と細胞形質を隔てる単なる限界膜ではなく、情報伝達、能動的イオン輸送を行う生命の最前線である。細胞膜の多様な機能はその細胞質側表面を覆う裏打ち構造と密接な関係にある。我々はごく最近、新しい膜標本作製技術の開発により膜の裏打ちを採取し、目的とする蛋白質を免疫金コロイドで標識し、急速凍結後ヘリウム電顕で直接観察することに成功した。本研究はこのような新しい方法と免疫フリーズエッチング法を組み合わせながら、膜と細胞骨格の相互作用、とりわけ運動や膜の動的機能変化に対して微小管やアクチン線維などが如何に再構築されるかを一つ一つ分子を同定しながら形態学的に調べた。アクチン線維は膜に密着する成分と細胞質内にある所謂細胞骨格とに分類される。膜に密着する線維は細胞膜をいくつかのドメインにわけていた(J.Cell Biol.174851-862 2006)。さらに細胞運動に関与するアクチン結合蛋白質であるIQGAP1はこの密着するアクチン線維に優先的に結合することが明らかになった。従来、アクチン結合蛋白質などのように結合標的性のある蛋白質は全ての標的蛋白質と結合するものと考えられてきた。しかし、IQGAP1の場合このような局所性があることが判明した。如何にして局所性が生じるのかは大変興味があり今後の課題でもある。一方、吸着法を用いて細胞膜を採取することにより、今回初めて新鮮、細胞膜裏打ち構造を観察することにも成功した。全体的にはフリーズエッチングレプリカ法による観察結果を支持するものであったが、フリーズエッチングレプリカ法でしか観察できなかったことが別の方法で、しかも新鮮状態で観察可能になったことの意味は大きい。新世代免疫フリーズエッチング法とクライオ電顕により膜細胞骨格の空間構造を研究した。膜細胞骨格はいわゆる細胞骨格とは別に膜に付着した形で多くのアクチン線維と微小管及び中間径線維からなっていた。クライオ電顕によるいっさいの前処理をおこなわず観察した例ではアクチン線維も微小管もスムーズで流れるように走行していた。一方、微小管はかなりフレキシブルのようで曲線を描いて走行しており、従来の固定後の試料観察とはことなるそうこうであった。またアクチン線維はその走行により3種類に分けられる。第一のタイプは膜に埋まるように密着する線維。第二は跳躍的に所々で膜に接触しながら膜に平行に走行するタイプ。第三はいわゆるストレス線維で、線維端でインテグリンを介して膜に接着するタイプである。そしてこれらの線維は走行が異なるだけではなく結合するアクチン結合タンパク質へのaffinityも違うことが発見された。すなわち、葉状仮足の形成に重要な役割を果たすCdc42やそのエフェクターであるIQGAP1は主に第二のタイプのアクチンに結合し、その他のアクチン線維にはあまり結合しないことが分った。特に不思議なのは膜に埋まるように密着するアクチン線維にはほとんどの結合タンパク質が付着しないことである。このようにアクチン線維結合タンパク質でも全ての線維に結合するわけではなく、空間特異性が存在する。一方、膜に平行に走行する微小管も存在し、良く観察すると端点ではなく側面で細い線維により膜と連結しているように観察される。また、本研究により滑面小胞体の網目が膜直下に存在することも明らかになった。これは従来の細胞像を塗り替える画期的なものである。本研究により免疫クライオ電顕や免疫フリーズエッチング法の基盤を築くことができ、膜の基本的な裏打ち構造が明らかになった(J. Cell Biol. 174 851-862 2006, Methods Cell Biol. 88 207-36 2008,生化学80 177-183 2008)。また,免疫標識法も進歩し、細胞骨格、膜の病的変化を捉えることも可能になった(Nature Cell Biol. 10 329-337 2008、Nature Neurosci. 8 923-31 2008)。さらに極最近ではアクチン結合タンパク質の中には空間特異性が存在することが明らかとなった.特に本年度は微小管と膜との空間的な位置関係において新しい知見を得た。アクチン線維と微小管は明らかに粒子状のタンパク質を介して結合していることが判明した.また、微小管に走行に沿って、数本のアクチン線維が伸びていることも明らかとなった.これらのアクチン線維の機能はまだ不明であるが、おそらく微小管がガイドとなり、アクチン線維を必要な場所に導いていると思われる.あるいは、アクチン線維東形成に何らかの役割を果たしているのかもしれない.

細胞膜細胞質側表面に置いて、アクチン線維はfocal contactとは明らかに異なる集積を所々で形成している.そこから放射状にアクチンが伸びているように見えるが、よく観察するとそこに開始点が有る訳ではなく、それぞれのアクチン線維は膜に接触するものの通過している.すなわち、各方面からのアクチン線維が一点を通過するかのように見える.このような集積は細胞内にも認められるので細胞内および膜面を空間的にドメイン化していると考えられる.このような集積点には常に微小管も存在するので、機能の理解にはアクチン線維と微小管の関係についての更なる研究が必要である.
放射線照射を生き延びた癌細胞に秘められた謎:癌根絶への多角的アプローチ

放射線後生き残った細胞(以下IRとをす)の遺伝子発現をcDNAアレイにより調べた。マウス線維肉腫細胞のセルラインQRsPを使用し10Gyの照射を施行した。コロニーアッセイとともに6つのクローンの樹立が行われた。照射を生き延びた細胞では、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤(CKI)、p16 p57の著明な発現低下;14.8および12.0の低下、また耐性クローン(IR)をマウスに移植したところ移植比100%がえられた。この細胞株にCD34がふくまれていることをかんがみると、がん幹細胞が放射線耐性に含まれていた可能性がある。QRsP(mouse sarcoma cell line)にX線により10Gyを照射し、コロニーをいくつか採取した。このうち最も放射線に耐性を示したクローン(QRsP-IR)と親株を3次元コラーゲン中で培養し細胞形体を位相差顕微鏡で観察し、コロニーがspheroid(球状)およびnon-spheroid(多数の突起を出している)に分類した。それぞれ50個のコロニーを観察したところ、親株のspheroidの比率は80%であり、QRsP-IRは16%であった(p<0.01)。細胞形体をつかさどる分子を解明するのは困難であるが、例として培養液にHGFを40nMになるように処理をし、6日間培養したのち、コラーゲン中で培養したところ、すべてのコロニーがnon-spheroid形体を示した。親株とIR株において細胞分泌物に違いがないかを検証するため、2次元フラスコ培養下における親株とIR株の培養培地を銀染色した。銀染色の手法に定量性はないものの、75kDおよび25kD付近において、親株はIR株よりも何かしらのタンパク質を多く発現している可能性が示唆された。親株とIR株において細胞塊形態を変化させている因子を特定するため、培養6日目の試料からmRNAを抽出しRT反応を行い、PCR反応を用いmRNAの発現に着目した。細胞形態に関連があるとされるHGF, cMET, VEGF, EGF, FGF-1, FGF-2, TGFβ-1の発現の差を調べたところ、親株ではTGFβ-1が発現しているのに対しIR株では発現が見られなかった。また親株においてc-MET, FGF-2の発現が強いことが判明した。研究の目的:10GyのX線照射を生き抜いた癌細胞(IR株)がどのような特性(遺伝子的、あるいは蛋白発現)をもっているか明らかにすること。研究実施計画:浸潤能についてはマトリゲル、遊走能はコラーゲンほう埋方法、さらに移植能についてヌードマウスを用い生着率を調べた。結果:マトリゲルを通過する細胞の%は有意差をもってIR細胞が高かった。コラーゲンゲル法ではtime lapseでの観察が可能なため、個の細胞を任意に抽出し、それを5分間隔で観察し動きをトレースした。いずれも浸潤能・遊走能において有意な差を持ってIR細胞が高い値を示した。マウス移植実験をA549(肺がん)細胞株を用い施行した。生着率はRI細胞では100%、親株で0%であった。このことは親株に照射した結果、癌幹細胞がIR細胞において高い比率を占めている可能性があり、両者の間でcDNA arrayを施行した。IR細胞において親細胞に比較しがん幹細胞のマーカーの一つであるATP-bindingcassette, sub-family C(CFTR/MRP), member2(ABCC2),mRNA[NM_000392]が50%上昇していた。またin vitro, in vivo両条件下において細胞増殖カーブを描いたところ有意差を持ってIR細胞の増殖能が高かった。考察:10Gyの放射線照射を生き抜いた細胞は様々な側面で、親株にはない悪性化がみられた。今後の方向性は、その悪性化が親株にものもの少ない%の割合で存在したものか、あるいは放射線照射によって引き起こされる遺伝子変化によるものかについて限界気釈放を用いて探求する予定である。またこの現象が普遍的なものであるかについて同じように肺がん細胞株であるH1299をもちいて実験を開始する予定である。放射線を照射し生き伸びた細胞はある期間を経て急に増殖スピードがます。この現象は"Re-population"とよばれている。1963年から知られている概念であるがその分子メカニズムは知られていなかった。急速な増殖は放射線治療において再発、残存の原因となる。今回QRsPというマウス肉腫細胞を用い、まず10Gyを照射し放射線耐性株を作成した。これら耐性株と全く照射を行わなかった親株との間でcDNAアレイを施行した。その結果細胞周期のブレーキ役であるCNDN(p16,p57)のmRNA

発現上昇がみられ、またこの結果はqPCRによっても確認され、臨床上、放射線生物学上の謎を少しでも解明できたと考えている。されに興味深いことには耐性株において腫瘍の周囲の組織を溶解するMMPの発現が高まっていることである。つまり放射線耐性株はcell cycle,invasionにおいてより悪性度が高まったといえる。ではなぜ悪性化するのか、われわれは放射線耐性株において恒常的にHIF1-alphaが高まっていることを発見した。cDNA arrayを用いてIR細胞において発現の高いmRNAを調べたところ間質を融解するmatrix metalloproteinase(MMP)の発現が顕著であった。研究代表者は臨床的に低酸素細胞の存在が悪性腫瘍の根絶に障害となっていることをヒントにHIF-1alphaによるMMP1の転写活性をLuciferase assayをもちいて調べた。その結果、IR細胞においてHIF-1alphaによるMMP1のpromter活性が顕著に高まっていることを発見した。別の表現をすると、低酸素下で腫瘍塊に存在する低酸素細胞が放射線治療や化学療法に耐性をもつため再発や残存、転移の原因となると考えられる。
東アジア君主制国家における臣下服喪儀礼の比較史的研究

日本古代では、天皇・太上天皇、后が死去すると、臣下は喪に服さなければならなかった。この臣下の服喪儀礼は、中国の制度を取り入れたものであり、中国でも皇帝や后の死去時に臣下の服喪儀礼が実施された。本研究の目的は、この日本古代と中国の服喪儀礼を比較し、日中の官僚機構や君主制の特質を明らかにすることである。天皇や中国皇帝といえども、父帝や母后の死去に際しては、自ら喪に服した。そして、君主が父帝や母后のために喪に服し続けている限り、臣下も服喪をやめるわけにはいかなかった。本研究の考察のポイントは、この君主に従って喪に服し続ける日中の臣下がどのような立場の官人たちであったかを明確にすることである。
自己集合性錯体の内部空間における高効率・高選択的合成反応の開発

三次元的に孤立した自己集合性の分子空間を特異な反応場(=分子フラスコ)と見なし、その空間に置かれた分子の反応性が、空間の形状やサイズに応じて厳密に制御できること、すなわち「空孔制御反応」が進行することを見出した。自己集合性のかご状錯体内に取り込まれた有機分子は互いに近接し(=濃縮効果)、さらに空孔の形状に応じてその配向が規制されることから、分子間での光反応が高効率・高選択的に進行することを期待した。今回、かご状錯体およびボウル状錯体内でナフトキノンまたはアセナフチレンの分子間[2+2]光環化反応が著しく加速され、しかも高選択的にシン体を与えることが明らかになった。また、反応後の生成物の結晶構造も明らかにした。一方、同様の光反応について錯体を用いずに行った場合では、低収率でしかもアンチ体が主に生成した。また、非対称型の2-メチルナフトキノンを用いた光反応では、その立体選択性のみならず位置選択性の制御にも成功し、定量的にシンのhead-to-tail体を与えた。さらに、かご状錯体内に2種類の異なる基質(ナフトキノン誘導体とアセナフチレン)を1:1の比で選択的に包接できることを見出した。これにより高効率・高選択的な異種分子間[2+2]光環化反応にも成功した。通常、このような異種分子間での光反応を有機溶媒中で行うと複雑な混合物を与える。以上、本研究では自己集合性の分子空間が[2+2]光環化反応の特異な反応場として機能することが明らかになった。
疼痛に対する異種オピエ-ト分泌腫瘍細胞封入カプセルの髄腔内移植による細胞療法

異種細胞を移植する際の免疫拒絶を克服する手段として、ポリマーカプセルに細胞を封入して移植する方法が注目されている。我々は、遺伝子導入によりオピエ-トとしては非常に強力なベータエンドルフィンを分泌するようにしたマウス神経芽細胞腫をカプセルに封入して、異種動物の疼痛治療に応用する可能性を検討している。Pro-opiomelanocortin遺伝子を導入したNeuro2Aをポリマーカプセルに封入してラット髄腔内に移植すると、ベータエンドルフィンが髄腔内に分泌され宿主のラットに除痛効果が得られた。1ケ月後にカプセルを取り出して細胞の生着を確認した。しかし、宿主動物をマウス細胞Neuro2Aにとってはdiscordantの関係にあるニホンザル髄腔内に移植してみると、ラットに植えたときと比べて細胞のviabilityは悪かった。この原因はconcordantでは作用しない自然抗体、補体がカプセルを透過して細胞を攻撃しているためと考えられた。そこでin vitroにおいてカプセル内にヒツジ感作赤血球を封入し、10%健常ヒト血清入り培養液中で24時間incubationし、溶血の有無を検討することで、補体の透過性を検討したところ、アミコン社のPM30とクラレ社の6305番のカプセルを二重構造にすることでほぼ完全に補体の侵入を抑えることができた。そこでこのカプセルを使い現在、ニホンザル髄腔内に移植してそのin vivoにおける有用性を検討中である。この細胞療法の欠点としては、分泌オピエ-トの量をコントロールするのが困難であることだが、テトラサイクリンを投与することでdose dependentに転写をコントロールするシステムが開発され、このシステムを組み入れた遺伝子導入をすることによって、分泌されるオピエ-トの量を外的にコントロールできるよう、現在遺伝子組み換えを行っている。異種細胞を移植する際の免疫拒絶を克服する手段として、Agarose-polysty sulfonic acidカプセルに細胞を封入する方法や、ポリマーカプセルに細胞を封入する方法があり、我々は両者の方法を、疼痛治療に応用する可能性を検討した。細胞をmicrocarrierに生着させてからAgarose-polystyrene sulfonic acidカプセルに封入すると、我々が使用した細胞は自らの増殖能によって、約1ケ月後にはカプセルを破壊してしまい、本法は不適であった。一方、ポリマーカプセル(AMICON Co)に細胞を封入すると、カプセル内腔を細胞が埋め尽くし、細胞塊の中心部が壊死になった状態で推移していた。ポリマーカプセルに封入したAtT-20、Proopiomelanocortin遺伝子を導入したNeuro2Aをラット髄腔内に移植すると、各細胞胞株よりβ-endorphinが分泌され除痛効果が得られた。この方法を臨床応用するために、ポリマーカプセルに有窓シリコン外套を装着して、カプセルの挿入および除去を易しく、かつ確実にする方法を考えた。In vitroでは有窓シリコン外套を装着した状態でも、カプセル内細胞からのペプチド分泌は安定に保たれていたが、これをニホンザル髄腔内に移植して、1ケ月後に取り出してみると、細胞のviabilityは悪く、シリコン外套を装着することで封入細胞の新陳代謝が悪くなっている可能性が示唆された。今後、現在使用しているフィンガー構造のポリマーカプセルに代えて、スポンジ構造のカプセル等、カプセルの材質の検討を行っていく予定である。我々は、遺伝子導入によりオペエ-トとしては非常に強力なベータエンドルフィンを分泌するようにしたマウス神経芽細胞腫をカプセルに封入して、異種動物の疼痛治療に応用する可能性を検討している。

Pro-opiomelanocortin遺伝子を導入したNeuro2Aをポリマーカプセルに封入してラット髄腔内に移植すると、ベータエンドルフィンが髄腔内に分泌され宿主のラットに除痛効果が得られた。1ヶ月後にカプセルを取り出して細胞の生着を確認した。しかし、宿主動物をマウス細胞Neuro2Aにとってはdiscordantの関係にあるニホンザル髄腔内に移植してみると、ラットに植えたときと比べて細胞のviabilityは悪かった。この原因はconcordantでは作用しない自然抗体、補体がカプセルを透過して細胞を攻撃しているためと考えられた。そこでin vitroにおいてカプセル内にヒツジ感作赤血球を封入し、10%健常ヒト血清入り培養液中で24時間incubationし、溶血の有無を検討することで、補体の透過性を検討したところ、アミコン社のPM30とクラレ社の6305番のカプセルを二重構造にすることでほぼ完全に補体の侵入を抑えることができた。そこでこのカプセルを使い現在、ニホンザル髄腔内に移植してそのin vivoにおける有用性を検討中である。この細胞療法の欠点としては、分泌オピエ-トの量をコントロールするのが困難であることだが、テトラサイクリンを投与することでdose dependentに転写をコントロールするシステムが開発され、このシステムを組み入れた遺伝子導入をすることによって、分泌されるオピエ-トの量を外的にコントロールできるよう、現在遺伝子組み換えを行っている。