hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
大学におけるPRTR適用の試み

京都大学への薬品納入業者に対する納入量調査、研究室への薬品の使用実態に関するアンケート調査、有機廃液処理施設に搬入される廃液の分析調査、ドラフトでの揮散量調査など、京都大学における化学物質の利用実態を調べ、大学内の物質フローを把握した。納入量調査を通じて、PRTR法の対象となる354物質のうち、ベンゼン、トルエン、ジクロロメタン、クロロホルム、アセトニトリルの5物質が京都大学内で年間1トン以上使用されていることが分かった。使用された後のこれらの化学薬品は、実験廃液として大学の有機廃液処理施設に搬入・処理されており、搬入される廃液について各化学物質濃度を測定した結果、薬品使用量の41%118%の量が処理されていることが確認された。なお排水として学外へ移動する量は使用量の1%以下であった。またビーカーに入れた有機溶媒をふたをしない状態でドラフト中に静置したところ、4時間で19%53%が揮散したことから、実験担当者へのヒアリング結果をふまえると、実験プロセスで使用する有機溶媒の10%程度が大気中に揮散していると推定された。化学物質の環境中への放出量を減らすために、実験プロセスにおける薬品の取扱方法や、廃液タンクの管理方法などを今後検討することが求められる。またPRTR法の報告対象となる5物質について、使用量の多い上位10番目までの研究室を選ぶと、大学全体での使用量の55%88%を占めており、化学物質を大量に使用する研究室が限られていることが明らかとなった。このように特定の化学物質を大量に使用している研究室に対して重点的に環境安全面での管理を行うことにより、大学全体としてより望ましい環境管理の仕組みを構築できることが期待される。来年度からPRTR法に基づく化学薬品の使用量と環境への移動量を報告する必要があることから,京都大学での化学薬品の使用実態と挙動調査を行い,大学におけるPRTR法への対応システムを模索した。薬品使用量(購入量)は,大学で統一したデータが存在しないことから,納入業者の納入実績を調査した。PRTR法の対象となる354物質の中で報告義務がある京都大学での年間使用量が1t以上の化学物質は,クロロホルム,ベンゼン,ジクロロメタン,トルエンの4物質であった。また,ホルムアルデヒドもホルマリンとしての使用量が多かった。環境への移動量としては,水系への移動量として大学キャンパスからの排水,大気への移動量として有機廃液処理装置からの排ガス,廃棄物としての移動量として,有機廃液処理装置からの処理残渣と無機廃液処理装置からの廃液処理残渣を分析測定し,年間排出量を算出した。水系への移動量は,ホウ素が30kg/年程度で最大であり,使用量と比較してかなり少なかった。大気への移動量は,有機廃液処理装置の排ガスに由来する移動量は非常に小さかった。しかしながら,実験室内への実験時の揮散量やドラフトを通じての大気移動量は,現在の所,全く不明であった。廃棄物としての移動量(残渣に含まれて排出される化学物質の量)は,無機廃液処理残渣中のマンガン,銅などが多かったが,いずれも10kg/年以下であり,使用量と比較して少なかった。さらに,薬品全体の物質収支を把握するためには,京都大学内での薬品処理量を把握する必要がある。無機廃液は性状及び処理量が把握できているため,推定が可能であったが,有機廃液については塩素濃度しか把握されておらず,その数字を用いて試算しても,購入量の半分程度しか説明できなかった。したがって,今後,実験終了後の廃液の性状を詳しく調査する必要があることが明らかとなった。

本研究において、薬品納入業者に対する納入量調査、研究室への薬品の使用実態に関するアンケート調査、有機廃液処理施設に搬入される廃液の分析調査、ドラフトでの揮散量調査など、京都大学における化学物質の利用実態とフローを把握するにあたって多面的な調査を行い、以下の知見を得た。納入量調査を通じて、PRTR法で規制対象となる354物質のうち、京都大学内で年間1トン以上使用されている化学物質は、ベンゼン、トルエン、ジクロロメタン、クロロホルム、アセトニトリルの5物質となることが分かった。使用された後のこれらの化学薬品は、実験廃液として大学の有機廃液処理施設に搬入・処理されており、搬入される廃液について各化学物質濃度を測定した結果、薬品使用量の41%118%の量が処理されていることが確認された。なお排水として移動する量は使用量の1%以下であった。またビーカーに入れた有機溶媒をふたをしない状態でドラフト中に静置したところ、4時間で19%53%が揮散する結果となり、実験担当者へのヒアリング結果をふまえると、実験プロセスで使用する有機溶媒の10%程度が大気中に揮散していると推定された。化学物質の環境中への放出量を減らすために、実験プロセスにおける薬品の取扱方法や、廃液タンクの管理方法など今後検討することが求められる。またPRTR法の対象となる5物質について、使用量の多い上位10番目までの研究室を選ぶと、大学全体での使用量の55%88%を占めており、化学物質を大量に使用する研究室が限られていることが明らかとなった。このように特定の化学物質を大量に使用している研究室に対して重点的に環境安全面での管理を行うことにより、大学全体としてより望ましい環境管理の仕組みを構築できることが期待される。
DHA摂取時の過酸化物蓄積抑制は多剤耐性関連タンパク質による体外排出に起因するか

【目的】ドコサヘキサエン酸(DHA)は、非常に酸化され易く過酸化脂質(LPO)を生成し易いが、DHAの摂取は従来から予想されている程には組織のLPOを増加させず組織傷害も与えないことをこれまで明らかにしてきた。この要因として抗酸化成分・酵素に加えて、解毒・排出機構の関与が推測される。しかし、DHA摂取時に生成する酸化物の解毒・排出に関する報告はほとんどない。私は最近、DHA摂取時に肝臓において多剤耐性関連タンパク質(MRP)3のmRNA発現が増加することを見出した。本年度は、過酸化脂質ならびにその分解産物の尿中排出を担う腎臓に着目し、腎臓における有機アニオンならびに生体異物のトランスポーターの発現と、五PO分解物のGSH抱合体(メルカプツール酸)の尿中排出について検討した。【結果と考察】EHBRの腎臓TBARSはSDRのそれと比べて、LA摂取では有意差はなかったが、DHA摂取では有意に低かった。しかしaトコフェロールは、仏摂取およびDHA摂取ともにEHBRとSDRの問で有意差はなかった。一方、FHBRのMRP1とMRP3の腎臓mRNAレベルはSDRのそれと比べて、LA摂取では有意差はなかったが、DHA摂取では増加ないし増加傾向を示した。従って、EHBRの腎臓では、MRP2欠損に対する代償機構としてMRP1とMRP3が発現し、LPOが腎臓から血流へ輸送されてTBARSが低下した可能性がある。さらに、EHBRの尿中メルカプツール酸はSDRと比べて減少しなかったことから、MRP2以外のトランスポーターの尿中排出への関与が推察された。現在、投稿準備中。ドコサヘキサエン酸(DHA)は、過酸化脂質・フリーラジカルを生成しやすく、この関連物質は生体組織に種々の傷害を引き起こすことが知られている。しかし、DHAの摂取は従来から考えられているほどには過酸化脂質・フリーラジカルを生成せず組織傷害を与えない。我々は、この要因として抗酸化成分・酵素に加えて、解毒・排出機構の関与を推測した。DHA摂取に伴う過酸化脂質生成は肝臓において顕著である。肝臓における生体異物の解毒・排出は、P450酵素代謝、抱合体生成、膜輸送タンパク質による排出からなり、異物は膜輸送タンパク質により振り分けられ血中および胆汁中に排出される。しかし、DHA由来酸化物の解毒・排出に関する知見はほとんどない。本研究では、DHA摂取に伴い生成する組織過酸化脂質の解毒・排出機構について、多剤耐性関連タンパク質(MRPs:Multidrug Resistance-associated Proteins)の役割を中心に検討した。4週齢SD系オスラットを用いて、AIN-76組成に準じて調製した飼料を14日間自由摂取させた。飼料脂質(10wt%)は、リノール酸(LA)群のLAレベルを52.2g/100glipid(11.3en%)、DHA群のLAレベルとDHAレベルをそれぞれ11.0g/100g lipid(2.4en%)、38.6g/100glipid(8.4en%)とした。飼料中のビタミンE(VE)は68mg/kg dietに調製し、DHA-lowVE群のみ7.7mg/kg dietとした。その結果、肝臓の過酸化脂質(TBARS)レベルはLA群に比べDHA群で増加し、逆にVEレベルは低下した。一方、DHA-lowVE群の肝臓VEレベルはDHA群に比べて顕著に低下したのにもかかわらず、TBARSレベルはDHA-lowVE群とDHA群との間で差は認められなかった。このとき、MRP1とMRP3のタンパク質レベルおよびmRNAレベルについて、LA群に比べDHA群で、さらにDHA群に比べてDHA-lowVE群で、増加ないし増加傾向が認められた。従って、肝臓では様々な抗酸化成分・酵素等によってDHAの酸化は抑制されるが、一旦生成した傷害性の高い酸化物はMRPsを介した解毒・排出機構により処理されることが推測された。

さらに、EHBRの尿中メルカプツール酸はSDRと比べて減少しなかったことから、MRP2以外のトランスポーターの尿中排出への関与が推察された。現在、投稿準備中。
脳虚血障害に対するミクログリアVNUTによる保護作用とその分子メカニズムの解明

生体のエネルギー通貨ATPは、細胞外へ放出されて細胞間情報伝達物質として機能する。脳卒中等の、脳虚血障害時にも細胞外ATPの上昇が起こるが、これは傷害を受けた細胞からの漏出であり、これまで脳に対して傷害性に働くと考えられていた。我々は、ATP開口放出の必須分子である小胞型ヌクレオチドトランスポーター(VNUT)が、脳虚血後ミクログリアで発現亢進すること、VNUT欠損マウスは虚血に脆弱であることを見出した。本研究は、脳虚血後にミクログリアがATPを漏出ではなく開口放出により細胞外に放出することで、むしろ脳保護作用を引き起こす、との仮説を提唱し、その検証及び脳保護作用の分子メカニズムの解明に取り組んだ。中大脳動脈閉塞(MCAO)にてマウス脳梗塞モデルを作製し、マイクロダイアリシスを用いて虚血後の細胞外ATP濃度を測定したところ、野生型マウスは虚血前と比較して5倍程度上昇していた。一方、VNUT欠損マウスでは虚血後のATP濃度上昇は起こらなかった。また、非選択的ATP受容体阻害薬suraminあるいはATPの代謝産物であるアデノシンの受容体であるA2A受容体の阻害薬SCH58261の投与により、MCAOによって惹起される脳梗塞傷害が顕著に悪化した。これらのことから、虚血後のミクログリアはVNUTを介してATPを放出し、ATP受容体あるいはA2A受容体を介して脳保護作用をもたらすことが示唆された。脳虚血障害に対するミクログリアVNUTによる保護作用とその分子メカニズムの一端を明らかにすることができており、本研究は順調に進展している。引き続き、脳虚血障害に対するミクログリアVNUTによる保護作用とその分子メカニズムの解析を行う。特に、ミクログリアにおけるVNUT発現亢進メカニズムの解析を中心に研究を進める。他大学から異動してきたため、動物実験の申請やセットアップに時間がかかり、予定よりも実験量が少なくなった。次年度は実験量を増やし、本研究を円滑に進めていく。翌年度分の費用について、動物実験や細胞培養実験に使用する消耗品、試薬等の物品費(1,516,022円)、学会・研究会・ミーティングに参加するときの旅費(376,020円)、論文校正等で使用する人件費・謝金(100,000円)、その他(62,200円)に使用し、研究を進める。
ベンザインを基軸とする多置換複素環化合物の新規合成法の開発と天然物合成への展開

本研究では、ベンザインの高い反応性を基盤として、従来法では合成困難な多置換複素環化合物の新規合成法の開発を行った。その結果、マグネシウムビスアミドが、ベンザインを発生させる穏和な塩基として優れており、環形成後に生じたアニオン種はさまざまな求電子剤と反応することが分かった。確立した反応条件を用いて、イソバツェリン類およびディスコハブディン類の三環性骨格を構築した。重要な生理活性を示す天然物や医薬には多置換複素環構造を母核として有するものが数多く存在するが、立体的に込み合った複素環化合物の一般性合成法は確立されていない。今回、これまで合成研究にほとんど用いられてこなかったベンザインの潜在的な有用性に着目し、求核付加と続く求電子剤による捕捉により一挙に二カ所を官能基化する、多置換複素環化合物の新規合成法を確立することを目的として研究に着手した。まず、含窒素複素環の構築について検討を行ったところ、かさ高いアミド型塩基であるLiTMPを用いると芳香環上のハロゲン原子のオルト位の脱プロトンに引き続くベンザインの生成を経て、分子内の窒素アニオンからの付加によりインドリンが生成することを確認した。しかし、求核付加により生じるアリールリチウム種の反応性が比較的高く、続く求電子剤での捕捉が困難であった。様々な塩基に関して検討を行った結果、文献既知ではあるもののベンザインの生成には用いられてこなかったMg(TMP)_2が本反応にきわめて有効であることが分かった。求電子剤によってはアリールマグネシウム種から銅へのトランスメタル化が必要ではあったが、おおむね中程度から良好な収率で望みの7位置換インドリンを得ることができた。さらに、インドリン形成後にパラジウム触媒存在下クロスカップリングをワンポットで実施することにも成功している。また、生成する環の員数についても調べた結果、テトラヒドロキノリン骨格も構築することができた。今年度は、多置換複素環構造を母核として有する、重要な生理活性を示す天然物や医薬の一般的合成法の確立を目的として研究を行った。前年度に得られた知見から、マグネシウムビスアミドがベンザインの生成とインドリン形成にきわめて有効であることが分かった。本年度は、確立した反応条件を用いて、本手法の一般性を調べた。その結果、求電子剤によってはアリールマグネシウム種から銅へのトランスメタル化が必要ではあったが、中程度から良好な収率で望みの7位置換インドリンを得ることができた。検討の結果、本反応は立体的に込み合った位置においても円滑に進行することが分かり、従来困難であった多置換複素環の合成法を提示することができた。本方法論を元にして、テロメラーゼ阻害活性を示すディクティオデンドリン類の全合成を達成した。また、マグネシウムビスアミドがベンザインを円滑に生成させることに着目し、1,3-イソベンゾフランとの[4+2]環化付加反応を行ったところ、本塩基がエステルやアルデヒドを損なうことなくベンザインを発生させることを見出した。また、塩基については、マグネシウムに対して二当量のアミドおよびリチウム塩が必須であることを見出した。さらに、今回確立した方法を用いてイソバツェリンの合成研究を行っており、三環性骨格の構築に成功した。今後、酸化段階の調整を経て全合成を達成する予定である。
ノックアウトマウスを用いた異種移植片拒絶反応機序の解析

我々はこれまで、抗癌剤であるCyclophospamide(CP)をもちいたマウスにおける薬剤誘導性免疫寛容系について考案研究しその成果を報告してきた。この寛容系の原則は、抗原として同種脾細胞を用い経静脈投与(Day 0)後、200m/kg(LD50)のCPをDay 2)に投与することにより抗原特異的寛容状態が誘導されるというものである。この実験系は、MHC抗原は一致しマイナー抗原のみ違う組み合わせでは皮膚移植寛容状態とキメラ状態が誘導される(1984,Transplantation)が、MHC抗原の違う組み合わせでは一時的キメラ状態と中等度皮膚片生着延長が誘導される(1985,Transplantation)。この寛容系を大動物に応用するにあたり、Discordant異種の組み合わせにおける免疫反応性及び皮膚移植片拒絶におけるT細胞の果たす役割を解明することが必須である。その目的で、我々はDiscordant異種皮膚移植片拒絶におけるCD4+及びCD8+T細胞の役割をより明らかにするために、C57BL/6CrSLCマウスをバックグラウンドとしたCD4及びCD8ノックアウトマウスを用いて検討を行った。ヒトの皮膚をB6マウス及びCD8ノックアウトマウスに移植すると、共に移植後12日以内に拒絶された。しかしCD4ノックアウトマウスにおいてはヒトの皮膚移植片は有意に生着期間が延長した(平均19.3日、標準偏差1.6日、中央値19日)。完全に異系なC3H/HeSlcマウスの皮膚移植片はCD4ノックアウトマウスにおいて14日以内に拒絶された。このことからCD4ノックアウトマウス中の非CD4+T細胞は異系移植片の拒絶能を有すると考えられる。これらのレシピエントマウスの脾細胞においてはCD4^+及びCD8^+T細胞はともにヒトの皮膚移植後10日目には活性化していた。CD4ノックアウトマウス中のCD8^+T細胞の役割をより詳細に検討するために、CD4ノックアウトマウスにヒトの皮膚移植後0日目、5日目、14日目に抗CD8抗体を投与した。抗CD8抗体を投与によりヒトの皮膚移植片は有意に生着が延長した。また、免疫組織染色で、CD4ノックアウトマウスに移植されたヒトの皮膚移植片においてマウスCD8^+T細胞の浸潤が明らかになった。これらの結果から1)discordant異種であるヒトの皮膚移植片の急性拒絶にはCD4^+T細胞が必須である。2)しかしCD8^+T細胞によってもdiscordant異種であるヒトの皮膚移植片は拒絶されうるということが解明された。(目的)我々は免疫学的により厳密な解析を行うべくノックアウトマウスをレシピエントに,我々がCABG手術時に患者の同意を得て採取したHuman大腿部のskinをドナーとしたdiscordant xenogeneic skin graft modelにおいて以下の2点を中心に検討を行った1)CD4^+T細胞が移植片拒絶のMain Effectorであるのか?

2)CD4^+T細胞以外特にCD8^+T細胞が移植片を認識拒絶し得ないか。(結論)1)Discordant異種移植抗原の認識・拒絶には主にCD4^+T細胞が関与する。2)CD8^+T細胞の関与は少ないものの、異種移植片を認識・拒絶可能である。(考案)本研究においてはノックアウトマウスを用いたためDirect Evidenceを得ることが可能であったが、ノックアウトマウスに特有に観察される非生理的細胞が実際に拒絶にどう関与するかについては今後の検討を有すると考えられる。さらにCD4 knockoutマウスのbackgroundの違いにより違った結果が得られるのかについては今後の検討が必要である。我々はこれまで、抗癌剤であるCyclophosphamide(CP)をもちいたマウスにおける薬剤誘導性免疫寛容系について考案研究しその成果を報告してきた.この寛容系の原則は、抗原として同種脾細胞を用い経静脈投与(Day0)後、200mg/kg(LD50)のCPをDay2)に投与することにより抗原特異的寛容状態が誘導されるというものである.この実験系は、MHC抗原は一致しマイナー抗原のみ違う組み合わせでは皮膚移植片寛容状態とキメラ状態が誘導される(1984,Transplantation)が、MHC抗原の違う組み合わせでは一時的キメラ状態と中等度皮膚片生着延長が誘導される(1985,Transplantation).この寛容系を大動物に応用するにあたり、Discordant異種の組み合わせにおける免疫反応性及び皮膚移植片拒絶におけるT細胞の果たす役割を解明することが必須である.その目的で、我々はDiscordant異種皮膚移植片拒絶におけるCD4+及びCD8+T細胞の役割をより明らかにするために、C57BL/6Cr-SLCマウスをバックグラウンドとしたCD4及びCD8ノックアウトマウスを用いて検討を行った.ヒトの皮膚をB6マウス及びCD8ノックアウトマウスに移植すると、共に移植後12日以内に拒絶された.しかしCD4ノックアウトマウスにおいてはヒトの皮膚移植片は有意に生着期間が延長した(平均19.3日、標準偏差1.6日,中央値19日).完全に異系なC3H/HeSlcマウスの皮膚移植片はCd4ノックアウトマウスにおいて14日以内に拒絶された.このことからCD4ノックアウトマウス中の非CD4+T細胞は異系移植片の拒絶能を有すると考えられる.これらのレシピエントマウスの脾細胞においてはCD4+及びCD8+T細胞はともにヒトの皮膚移植後10日目には活性化していた.CD4ノックアウトマウス中のCD8+T細胞の役割をより詳細に検討するために、CD4ノックアウトマウスにヒトの皮膚移植後0日目、5日目、14日目に抗CD8抗体を投与した.抗CD8抗体の投与によりヒトの皮膚移植片は有意に生着が延長した.また、免疫組織染色で、CD4ノックアウトマウスに移植されたヒトの皮膚移植片においてマウスCD8+T細胞の浸潤が明らかになった.これらの結果から1)discordant異種であるヒトの皮膚移植片の急性拒絶にはCD4+T細胞が必須である.2)しかしCD8+T細胞によってもdiscordant異種であるヒトの皮膚移植片は拒絶されうるということが解明された.
詐害的会社分割における残存債権者保護-会社法・民法・倒産法の交錯の比較法的研究-

わが国では、詐害的(濫用的)会社分割における分割会社の残存債権者の保護類型として、会社法上の直接の履行請求権、倒産法上の否認権および民法上の詐害行為取消権等が併存していると考えられる。各類型の適用は濫用的会社分割の詐害性の内容により判断されるが、濫用的会社分割は狭義の詐害性も偏頗性も含んでいるため、画一的な判断基準は容易に示されない。ドイツ法の分析を参考にすると、個別の事案における保護類型のあてはめは、会社法上の直接の履行請求権、否認権および取消権行使の相手方が、自己の態様(支払不能の恐れ、債権者を加害する認識等)をどのように捉えていたか、実質的な判断をもとに導かれるということが示唆される。本研究は、詐害的会社分割の局面における分割会社の残存債権者の保護の問題について、破産法上の否認権および詐害行為取消権の相互関係にも着目し、検討を行うものである。平成25年度は研究の初年度であるため、当該研究課題についての基礎知識の整理を重点的に行った。まず、日本法における裁判例および学説の問題状況を概説的に整理分析し、比較法的観点からドイツ組織再編法および倒産法の状況について詳細に分析を行うため、日本語文献およびドイツ語文献の渉猟を進め、研究の進捗状況に合わせて所属する研究会において研究報告を行った。これらの過程で、ドイツの組織再編法制発展の経緯および本研究が対象とする問題に対係るドイツ法上の論点を整理し、分割会社の残存債権者の保護手法である担保提供請求および全ての会社分割当事会社に課される連帯債務の内容について簡明に述べ、ドイツ組織再編法133条1項が連帯債務を規定していることにより残存債権者の保護は十分であり、それゆえその他の保護手法は日本とは異なり有効なものとはされていないという見解を、現在の検討結果として示した。なお、本年度の最終時期において、ドイツにおいて関連資料の渉猟およびマックスプランク研究所において現地研究者からの意見聴取の機会を得て非常に有益な教示を受けた。平成25年度の主な研究成果として「ドイツ組織再編法における債権者保護規定ー会社分割法制の考察ー」を公表し、当該研究課題のアウトラインを示した。平成26年度は、前年度に引き続き日本法およびドイツ法の文献調査を行い、本研究の対象である詐害的会社分割から、組織再編についてより体系的に研究を進めた。本研究の対象は、民法、訴訟法および倒産法との関連が強い。日本では、平成26年改正会社法において組織再編行為等の差止請求規定が新設されたが、当該請求権の行使が仮処分申立事件としてされる場合の効果について、組織再編無効の訴えとの関連が問題となりうるところである。平成26年度は、これとの比較対照として、ドイツにおける組織再編の効力を争う訴えについて、ドイツ組織再編法および株式法の規定を分析し、その機能について検討した。その結果、ドイツの組織再編法制は、組織再編無効の訴えという事後的な解決手法を有せず、組織再編に係る株主総会決議の効力を争う訴えを事前の差止め制度として機能させ、組織再編を早期に安定させることを目指し、組織再編の効力発生が事後的に阻止されないようにしており、わが国とは全く異なる法状況であることが判明した(この成果は、論文集『ドイツ会社法研究』所収の論稿「組織再編に係る決議の効力を争う訴え」(平成26年度内脱稿済)で公表する。)。この成果は、上記の日本法における差止請求規定の機能を検討する際にも一助になると考えられる。本研究は、詐害的会社分割の局面における分割会社の残存債権者の保護の問題について、会社法・民法・倒産法の交錯に着目しながらドイツ法を比較対象として分析するというものであった。平成27年度は、本研究の最終年度として、平成25年、26年度の研究を踏まえて、「詐害」の意味や各法の交錯について総括的な研究を行った。この成果として、(1)「ドイツ法における『詐害』の意義ー組織再編法制の検討」(大分大学経済論集、2016年5月10日投稿)、(2)「新設分割に対する破産法上の否認権の行使」(大分大学経済論集、第67巻第6号(2016年3月)がある。(1)では、ドイツ組織再編法は、会社分割における債権者保護について濫用的会社分割を想定して規定しているが、濫用的ないし詐害の意味については明らかにしていないことから、債権者取消権法および倒産法の諸規定から、組織再編法制が整備された時期の前後に分けて、詐害の意味の分析を試みた。(2)では、いわゆる濫用的会社分割に対する破産法上の否認権の行使について、詐害性の判断基準等を中心に、判例研究を行った。

組織再編全般の規定の研究および訴訟法分野との交錯について一定程度の調査を終えることができた。民法および倒産法との交錯の研究については進捗状況は十分とはいえないが、最終年度において挽回する予定である。民事法学最終年度となる平成27年度においては、詐害的会社分割の「害する」の意味について、(1)民法上の詐害行為との関係、(2)倒産法上の偏頗行為との関係から検討を深める。本研究を開始後、多くの詳細な先行論文が現れているため、それらを詳細に検討するとともに、ドイツ法からの知見を参考にして研究を進める予定である。平成25年度中に成果の一部を公表することができた点は当初の計画どおりである。物品費について7万円弱の次年度使用額が発生した。これは、研究計画に従い必要となる外国文献の選定について慎重に検討し、最新の文献を今年度購入する計画を立てたためである。旅費について3万円強の次年度使用額が発生したが、これは諸般の事情により出張回数を抑制したためである。当該研究対象に関する会社法と倒産法の交錯について分析を進める。平成25年度中、ドイツ倒産法に関する部分については文献収集まで進めたので、平成26年度はその点についても一層の進展を図り、所属の研究会で適宜報告を行う予定である。物品費については、平成27年度の研究に必要となる文献購入費の一部にあてる。旅費については、最終年度の研究を取りまとめるに必要なインタビューおよび調査のための旅費の一部として使用する予定である。必要な書籍の価額の関係で、次年度使用額として1,510円が計上された。当該研究は平成25年度から27年度において実施することを計画しており、平成26年度以降使用する。平成26年度の研究に必要な文献購入費の一部にあてる。
機能性ミクロ粒子固相を特異的反応・検出場とするオプトセンシング流れ分析システム

機能性ミクロ粒子固相を特異的な反応と検出に、また光ファイバー吸光光度法によるモニタリングを用いる流れ注入(FI)システムが提案された。このFIシステムはシーケンシャルインジェクションモードで、かつコンピューター制御自動運転される。機能性ミクロ粒子の懸濁液は特別のフローセルに送られ、粒子がそこで捕捉される。セルに導入された分析成分はイオン交換樹脂の微粒子(50-150μm)に固定化された発色試薬と反応し、吸光度変化が光ファイバー分光光度法でモニターされる。分析測定が終わると、粒子はキャリヤーの流れでセルから排出される。この新しいタイプのFIシステムを評価するためにミクロ粒子(SP Sepharose Fast Flow)上に固定化されたマラカイトグリーン(MG)との反応を利用する微量SO32-の検出定量についての実験を行った。その結果、このシステムにより10-6MまでのSO32-の検出が可能であった。このオプトセンシングFIシステムを自然水中の極微量鉄の定量に応用した。バソフェナントロリンジスルフォン酸を固定化した陰イオン交換樹脂(QSepharose Fast Flow)を濃縮と反応のための固相として用いることにより河川水中の5ppbまでの鉄が11%以内の相対標準偏差で定量できた。このオプトセンシングFIシステムの特徴は反応と検出の場としての液相が機能性ミクロ粒子固相で置き換えられ、かつ集積化され、このことはより単純で、より高感度な分析システムの開発につながることである。(1)「流れ分析における反応と検出の場を溶液相から機能性固相表面に可能な限り置き換え、しかもそれらを一体化することでシステムの単純化やミクロ化に加えて、感度、精度、選択性および汎用性などの高度化をはかる」という本研究の第一段階として、測定セル内に導入したミクロ粒子表面での着色や退色反応を光ファイバーと超小型CCDマルチチャンネル分光検出器を用いたオプトセンシングによって直接測定できる新たなタイプの流れ分析システムを構築した。このシステムでは全ての操作はコンピューターにより自動化されている。(2)ソフト面では官能基を導入したり、試薬を坦持した機能性マイクロ粒子(数十μm径)を調製し、このミクロ粒子固相表面をオプトセンシングの反応検出の場として活用できる指示反応の確立である。最初のモデル実験として、酸塩基反応によるH^+イオン濃度の測定システムを検討した。これはパラローズアニリンをはじめとする数種類の酸塩基指示薬をイオン交換樹脂上に吸着させたものを機能性ミクロ粒子として用い、H^+イオン濃度に応じての鋭敏な変化をモニターするものである。このモデル実験によって(1)で構築した流れシステムがうまく機能すること、また、このミクロ粒子を使うシステムが酸塩基の連続モニタリングにも応用展開できる見通しを得た。(3)現在は第二段階として、錯生成反応による重金属イオン定量への本流れシステムの展開を進めいる。PSAAを吸着させたミクロ粒子(セファロース)の調製を行い、その粒子上で極微量Co,Ni,Feなどとの錯体生成による吸収スペクトルや吸光度と濃度との相関がうまく測定できることがわかった。これら金属イオンの高感度定量や同時定量など特色ある流れ分析法開発へと発展させたいと考えている。(i)本研究では「流れ分析における反応と検出の場を溶液相から機能性固相表面に可能な限り置き換え、しかもそれらを一体化することでシステムの単純化やミクロ化に加えて、感度、精度、選択性および汎用性などの高度化をはかる」ことを目標とし、第一段階として、測定セル内に導入したミクロ粒子表面での着色や退色反応を光ファイバーと超小型CCDマルチチャンネル分光検出器を用いたオプトセンシングによって直接測定検出できるシステムを構築した。今年度は測定精度を確保するためのセルの幾何学的特性やミクロ粒子の材質と性状などについてより詳細な検討を行った。(ii)ソフト面では官能基を導入したり、試薬を坦持した機能性マイクロ粒子(数十μm径)を調製し、このミクロ粒子固相表面をオプトセンシングの反応検出の場として活用できる指示反応の確立である。

錯生成反応による重金属イオン定量への本流れシステムの展開の一環としてPHENやバソクプロインを吸着させたミクロ粒子(セファロース)の調製を行い、その粒子上で極微量Cu,,Feなどとの錯体生成による吸収スペクトル及び吸光度の測定を行い、これら金属イオンの高感度定量が可能であることを示すことができた。さらに、マラカイトグリーンとSO3を吸着させたミクロ粒子による微量ホルムアルデヒドの定量への応用を現在進行中であり、新しいタイプの化学センシングシステムヘ発展させたいと考えている。(1)これまでに構築したオプトセンシング流れ分析システムの適正化、高度化をさらに進めた。特に、これまでのセル室の形状では導入したミクロ粒子の幾何学的配置の再現性に問題があることが判明したので、取り敢えず入射光側のファイバーをセル上方から垂直に設置することで再現性の改善を図った。(2)バソクプロインスルフォン酸(BPS)を陰イオン交換樹脂(Q Sepharose Fast Flow、平均粒子径90μm)表面に吸着させた機能性ミクロ粒子の調製とそれを用いるオプトセンシング流れ分析法による極微量鉄の定量法を確立した。調製したミクロ粒子のFe(III)に対する錯化容量は3.9x10^<-5> molFe/mlであり、通常の使用に際しての配位子の脱離は観察されなかった。50μlのBPS担持ミクロ粒子懸濁液をセルに送った場合、セル中に捕捉充填されたミクロ粒子はセルの約50%を占める。ミクロ粒子の充填量が増えるとともに透過光量が減少し、錯生成に基づく微小な吸光度変化の測定の際に不利となるので、ここでは50μlを充填した。ミクロ粒子固相で生成した錯体の吸収スペクトルは均一液相でのそれとほぼ同じでλmaxは540nmであった。100μlのサンプル(Fe標準溶液)を注入した場合の検出限界は約0.005ppmFeであったが、サンプル注入量を200μlに増やすことでさらに感度は増大することが確かめられた。これは均一液相でBPSによる方法の約510倍の感度である。すなわち、ミクロ粒子固相表面での一種の濃縮効果によるものである。流速を2μl/secから6μl/secに上げるとピークの吸光度がやや低下するが、これは反応時間の短縮によるものと考えられる。検量線は00.2ppmの範囲で直線となり、10倍量のV,As,Ni,Mn,Mo,Pb,Cd,Al,Ca,Mg,Cr(VI),の共存は影響しなかった。本研究では流れシステム内へのミクロ粒子の供給と排出を自動的に、しかも分析の都度行うことができるので、常に新しいミクロ粒子を測定に用いることができ、また、ミクロ粒子上での反応をその場測定できるという大きな特徴がある。
グリオーマ幹細胞を標的とした光線力学療法の開発：ポルフィリン排泄と分化の制御

がん幹細胞の治療抵抗性の一因であるABCG2は、5-ALA光線力学治療(5-ALA PDT)のポルフィリン(PpIX)を細胞外に排出する。従って、ABCG2制御は、5-ALA PDTの効果を高め、がん幹細胞の治療抵抗性を克服の鍵となる。本研究では、ABCG2の阻害剤によるPpIX排泄の抑制が、細胞内PpIXを上昇させ、5-ALA PDT効果を増強することを明らかにした。一方、A172グリオーマ幹細胞では、5-ALA PDTでの治療感受性がであった。従って、5-ALA PDTはがん幹細胞の制御に有用であり、ABCG2併用によりこの効果が増強される可能性が示唆された。2)ABCG2をチロシンキナーゼ阻害剤のGefitinibを投与することで、ポルフィリンの細胞外排泄が阻害され、細胞内ポルフィリン濃度が上昇し、光線力学効果を増強することを、脳腫瘍細胞株を用いたin vitroの実験で明らかにし、論文に投稿した。3)現在、ヒトグリオーマ細胞A172から誘導した腫瘍幹細胞様細胞を確立し、5-ALA光線力学療法の治療抵抗性を評価した。その結果、A172腫瘍幹細胞様細胞には、コントロールのA172wild typeに比べて治療抵抗性はなくむしろ著しい治療感受性を認めた。また、A172腫瘍幹細胞様細胞は、化学療法治療抵抗性及び放射線療法治療抵抗性を有することは確認した。ABCG2によるポルフィリンの細胞外輸送をグリオーマ細胞株で証明し、チロシンキナーゼ阻害剤のGefitinibがABCG2を阻害することで細胞内ポルフィリンの上昇と5-ALAによる光線力学治療効果の増強を示した。本研究によりABCG2阻害による光線力学治療の効率が上がることが理論的およびin vitro研究により示された。更に、gefitinib以外の高効率なABCG2阻害剤においても、PDT効果が増強されることを示した。本研究では、腫瘍幹細胞の性質を獲得し、化学療法および放射線療法に対して治療抵抗性を有する細胞株A172腫瘍幹細胞様細胞において、5-ALA PDTではむしろ治療感受性が有り、更にはABCG2阻害により治療効果が増強されることを見出した。この様な特質は、5-ALA光線力学治療とABCG2阻害薬との併用が腫瘍幹細胞をターゲットとした治療法となりうることを示唆している。今後、多くの腫瘍細胞株での確認、in vivo実験系での確認を行う予定である。腫瘍幹細胞の想定外の治療感受性が確認し得た。現時点での研究は順調であり、成果が出てきている。腫瘍幹細胞は5-ALA光線力学治療にたいして感受性を有する現象が普遍的なものかを検証する。具体的には、複数の腫瘍幹細胞を用いて感受性評価を行う。現在、cancer stem cell likeな細胞株の確立することが可能となった。予備的解析では、ABCG2の発現が非常に高いことが判明した。これは、これから本研究を進展させる上で非常に重要なステップであり、次年度の研究ではcancer stem cell likeな細胞のABCG2を効果的に抑制する薬剤を選定し、がん幹細胞にも有効な光線力学療法を施行する予定である。実験装置は、概ね整備されており、研究費は主として薬剤や実験動物の購入費用として使用する予定である。また、平成23年度未使用額が、334,267円あるが、次年度研究で予定しているcancer stem cellの培養維持費がかさむことが想定されるので、培養維持のための培養液などの試薬代として使用する予定である。
新しい層状超伝導体の創製(インターカレーションとイオン交換を駆使して)

我々は、FeSe1-xTex (0. 6≦x≦1)のas-grownと真空アニールした単結晶を用いて比熱測定を行い、電子比熱を見積もった。アニールを施した0.6≦x≦0.9の単結晶は、超伝導転移温度:Tcで明瞭な比熱のトビが観測されたことから、バルク超伝導がアニールによって誘起されることが分かった。これらの単結晶のT=0Kにおける超伝導凝縮エネルギー: U0,熱力学的上部臨界磁場: Hc(0),超伝導ギャップ:Δ0そしてΔC/(γn-γ0)Tc [ΔC :転移温度における比熱のトビ、γn :常伝導状態の電子比熱係数、γ0 :超伝導状態の0Kにおける残留電子比熱係数]を見積もった。これらより、x=0. 7において超伝導が最も強く、シングルバンドを仮定したBCS理論で見積もられた2Δ0/kBTcとΔC/(γn-γ0)Tcの値は、4.29と2.76になり、強結合超伝導が実現していることが分かった。2008年、鉄を構成元素に含む層状物質である鉄系超伝導体が発見され、超伝導転移温度T_cも50Kを超えることから、世界中で、高温超伝導体発見以来の研究の高まりを見せている。鉄系超伝導体の中でも、ブロック層が無く、最も単純な構造を持つFeSe系超伝導体について、元素置換とインターカレーションという手法を用いて、T_cの向上を目指した。さらに、低温で磁気秩序(SDW)を示すFeTeの超伝導化を目指した。Liインターカレーションは、ブロック層がないFeSe系超伝導体に対して有効なキャリアドーピングの手法である。本研究では、固相反応法で多結晶試料を作製し、電気化学法でLiのインターカレーションを試み、成功した。しかし、磁化率を測定したところ、T_cはインターカレーションの前後で変化しなかった。また、Fe_<1.09>Teの磁気転移温度T_<SDW>も変化しなかった。したがって、今回Liインターカレーションによって変化させたキャリア濃度の範囲では、超伝導特性も磁性も変化しないと結論した。T_cが変化しない理由は、キャリアドープによって状態密度が変化していないことが考えられる。したがって、この系はキャリアドーピングによる物性の変化が少ないと考えられる。FeTeにおける低温での磁気秩序を消失させ超伝導を発現させる目的で、Feサイトの他元素置換をおこなった。固相反応法によりFe_<1.1-x>M_xTe(M=Ti,Cr,Mn,Ni,Cu,Zn)の試料を作製し、X線回折を測定した結果、M=Mn,Niのx≦0.1、M=Cuのx≦0.2で単相試料が得られたことがわかった。格子定数を見積もったところ、M=Mnの試料においては、格子定数の変化は見られなかったが、M=Ni,Cuの試料では、置換量xの増加に伴って、それぞれc軸長の減少と、a軸長の増加が見られた。電気抵抗率と磁化率を測定したところ、M=Ni,Cuの試料ではxの増加に伴ってT_<SDW>が減少していることがわかった。このことから、T_<SDW>が構造に敏感であるという知見が得られたが、超伝導化には至らなかった。「鉄系超伝導体の研究」近年発見された鉄系超伝導体の中でも最も単純な構造を持つ11系と呼ばれるFeSe_<1-x>Te_xに着目し、単結晶を育成し物性を調べた。ブリッジマン法で単結晶の育成を試みた結果、0.5≦x≦1の組成で単結晶の育成に成功した。as-grownでは、x=0.5近傍のみでバルク超伝導となかったが、真空中で400°C100時間アニールすることにより、0.5≦x≦0.9全ての組成においてバルク超伝導を確認した。これは、格子歪の軽減と、SeとTeの均一化によるものと思われる。さらに、x=0.6の組成に対し、異方性パラメータγを電気抵抗率の磁場中角度依存性から見積もった結果、γ≒2.7という値が得られた。この値は、Cu系高温超伝導体に比べて小さく、より3次元に近い物質であり、応用上有利であることを示唆する結果となった。「インターカレーションによる新超伝導体合成の研究」

Bi化合物、BiOCl,BiOI,Bi_2Se_3にLiをインターカレーションすることで、新超伝導物質を合成することを目的として研究を行った。インターカレーションの手法としては、nブチルリチウムヘキサン溶液に浸す化学法と、電気化学法とで行った。化学法では、BiOClとBiOIは分解してしまったが、Bi_2Se_3は、Li量が大きくなるとc軸が伸びることから、インターカレーションに成功したと思われる。電気化学では、BiOClは、BiOClとLiBiOClに相分離している可能性が大きいことが分かった。BiOIでは、Li量が変化した試料作製に成功した。現在のところ、いずれの試料においても、超伝導は確認されていない。他方、MNCl(M=Zr,Hf)は、Liインターカレーションで超伝導が発現する事が知られている。我々は、Mgをインターカレートすることで、Liインターカレーションと同等の超伝導転移温度を確認した。本年度は、近年発見された鉄系超伝導体の中でも最も単純な構造を持つFeSe_<1-x>Te_xの良質な単結晶を育成し、比熱測定により超伝導特性を調べた。単結晶育成を、二重真空封入したブリッジマン法で試みた結果、FeSe_<1-x>Te_x、(0.6≦x≦1)の良質単結晶育成に成功した。as-grownと真空アニールした単結晶の比熱を測定した結果、真空アニールによりx=0.6-0.9において、bulk超伝導に起因する超伝導転移温度:T_cでの明瞭な比熱のトビを観測した。これは、磁化測定の結果で、as-grown試料ではx=0.6でのみ超伝導を示唆する反磁性が観測され、真空アニールすると超伝導がx=0.6-0.9の範囲に拡大することと同じ結果となり、真空アニールによりbulk超伝導が誘起されることが、比熱測定によっても検証された。次に、真空アニールした単結晶の電子比熱を見積もり、超伝導凝集エネルギー、熱力学的臨界磁場、超伝導ギャップ:Δ_0を求めた結果、Δ_0/k_BT_cがx=0.7において最も大きく、弱結合であるBCS値より大きいことから、強結合的な超伝導が実現していることが分かった。また、超伝導転移する試料でのT=0Kにおける残留比熱係数:γ_0は、x=0.6-0.7ではゼロになるが、x=0.8-0.9では有限であることから、この領域では超伝導になっても常伝導電子が存在することが分かった。x=1であるFeTeは、反強磁性秩序を形成することにより超伝導にはならないことから、x=0.8-0.9では、超伝導と磁性が共存もしくは競合した状況にあると考えられる。つまり、x=0.8-0.9では相分離のような実空間での不均質や、実空間では均質であるが超伝導を担うバンドと磁性を担うバンドが別々に存在するような状態が起こっているのではないかと考えられる。
遺伝性肥満マウス糖尿病性心筋症に見られる冠微小血管再構築に果たすアンジオテンシンの役割

耐糖能異常、肥満、高血圧、高脂血症等複数の危険因子が合併する生活習慣病ではレニンアンジオテンシン系が活性化することで線浴系は低下し、易血栓性状態にある。Dr. Zamanは易血栓性と血管再構築が冠微小循環異常を介して心機能障害を来すと仮定し研究を精力的に進めた。肥満及び軽症インスリン非依存性糖尿病モデルのC57BL/6J ob/obを用いた。ob/obマウスに10週から10週間アンジオテシン変換酵素(ACE)阻害薬、アンジオテンシンII(AII)受容体拮抗薬を投与した。血液パラメーターの測定としてインスリン濃度PAI-1濃度などを測定した。心筋組織の病理学的評価として血管のリモデリングの定量評価を行なった。血液線溶系の変化と心組織での変化として血液中の線溶系阻害因子PAI-1活性レベルを生化学的方法で定量した。組織での線溶系因子の蛋白発現を測定した。発現する細胞の同定は免疫染色にて行った。今後ACE阻害薬およびAII受容体拮抗薬による線維化改善に組織中の凝固・線溶系が関与するかを検討するため心筋組織のフィブリノゲン量をウエスタンブロットで定量する計画である。心筋線維化に中心的に働くTGFβ等の成長因子の発現やコラーゲンなどの細胞外基質集積も生化学的、組織学的に評価している。今後Northern blotを用いてより定量的な解析を行なう。心機能は新規に開発した高速高周波超音波探触子を用いて検討する予定である。生活習慣病モデルでの早期冠微小循環異常の発症機序を明らかにすることで、高齢化社会で患者増加が予想されるハイリスク心疾患患者の新たな治療方法の開発や、サブクリニカルステートでの発症予防法の発見をめざす。成果は既に第19回国際心臓研究学会日本部会(2002.10.31-11.2山形)で発表された。また、平成15年3月の第67回日本循環器学会総会学術集会でもFeatured Research Sessionで発表することが決まっており、彼の研究が着実に遂行され成果を上げていることを明確に示している。
運動器不活動に伴う慢性痛の病態責任解明に基づく新しい理学療法戦略

複雑局所性疼痛症候群I型,線維筋痛症などに代表される難治性の慢性広範囲痛(CWP)の病態責任の解明は発展途上の段階で,決定的な治療法の開発には至っていない.そこで我々は,CWPの機序解明に基づく新たな理学療法戦略の構築を目指し,ギプス固定後慢性痛chronicpost-cast pain(CPCP)モデルラットを開発した.本研究ではCPCPモデルラットにおけるCWPの中枢要因として脊髄グリア細胞の活性化に,またその末梢要因として固定肢における虚血再灌流障害/酸化ストレスに着目した.CPCPモデルの機械痛覚増強の非固定側への拡大には脊髄ミクログリアの活性化が関与し,その維持には,脊髄アストロサイトの活性化が関与することが示された.ギプス固定肢に生じた虚血再潅流障害/酸化ストレスは,CPCPモデルラットにおける機械痛覚増強の発症ならびに脊髄グリア細胞活性化をトリガーすることが示唆された.今回得られた知見に基づくCPCPモデルのCWPの末梢および中枢機序のさらなる解明は,CWPに対する新たな理学療法の臨床応用に繋がる可能性がある.複雑局所性疼痛症候群I型,線維筋痛症などに代表される難治性の慢性広範囲痛(CWP)の病態責任の解明は発展途上の段階で,決定的な治療法の開発には至っていない.そこで我々は,CWPの機序解明に基づく新たな理学療法戦略の構築を目指し,ギプス固定後慢性痛chronicpost-cast pain(CPCP)モデルラットを開発した.本研究ではCPCPモデルラットにおけるCWPの中枢要因として脊髄グリア細胞の活性化に,またその末梢要因として固定肢における虚血再灌流障害/酸化ストレスに着目した.CPCPモデルの機械痛覚増強の非固定側への拡大には脊髄ミクログリアの活性化が関与し,その維持には,脊髄アストロサイトの活性化が関与することが示された.ギプス固定肢に生じた虚血再潅流障害/酸化ストレスは,CPCPモデルラットにおける機械痛覚増強の発症ならびに脊髄グリア細胞活性化をトリガーすることが示唆された.今回得られた知見に基づくCPCPモデルのCWPの末梢および中枢機序のさらなる解明は,CWPに対する新たな理学療法の臨床応用に繋がる可能性がある.本研究は、下肢不動化後の痛覚過敏行動の拡大に関わる神経可塑性機序の一つとして脊髄グリア細胞の動態に注目している。ラット片側後肢をギプス固定する不動化モデルを作製し、痛覚過敏行動拡大と脊髄グリア細胞の活性化の関係について解析を行った。これまでに、本実験モデルにおいて、固定部局所より離れた足底部へ両側性の機械痛覚過敏行動が出現するギプス除去後1日目に、第4腰髄においてミクログリアの活性化が確認された。また足底部の両側性の機械的痛覚過敏行動が極大を示すギプス除去後5週目においては、第4腰髄においてアストロサイトの両側性の活性化が認められた。そこで痛覚過敏行動の出現におけるミクログリア活性化の関与を明らかにするため、ミクログリア抑制剤のminocycline(100μg/day、髄腔内投与)をギプス固定8日目から除去後1日目までの計8日間連続投与した。投与後、足底部の機械痛覚過敏行動は、反対側のみ有意に改善した。本実験モデルにおける機械痛覚過敏行動の反対側への広がりは、ミクログリアの活性化により誘導されることが示唆された。現在、痛覚過敏行動の極大期におけるアストロサイト活性化の関与について解析を進めている。神経因性疹痛モデルの痛覚過敏行動は障害側のみであり、脊髄グリア細胞の活性化も障害側のみである。一方、本実験モデルの痛覚過敏行動は、両側性であり、遠位部の尾部にまで広がりを見せる。これらの相違から肢体不動化後に誘発される慢性痛と神経損傷由来の慢性痛とは、明らかなメカニズムの違いが想定され、新たな細胞内情報伝達系の解明および治療戦略の創成が期待できる。本研究は、後肢不動化後に誘発される広範囲機械痛覚増強(足底、下腿皮膚・筋、尾)の出現および維持に関わる神経可塑性機序の一つとして、脊髄グリア細胞の動態に注目し、そのトリガーとして不動化後肢における酸化ストレスに着目している。本実験モデルにおける広範囲機械痛覚増強の出現におけるミクログリア活性化の関与を明らかにするため、ミクログリア抑制剤のminocycline(100μg、200μg/day、i.t.)をギプス固定8日目から除去後1日目までの計8日間連続投与した。投与後、足底部、下腿皮膚・筋の機械痛覚増強は、反対側のみ有意に改善し、ミクログリアの活性化(OX42免疫染色)がminocyclineの用量依存性に抑制されることが明らかとなりつつある。さらに,痛覚増強の極大期におけるアストロサイト活性化の関与を明らかにするため、アストロサイト抑制剤のL-α-aminoadipate(150nm/10μl,i.t.)をギプス除去後5週目に投与した。投与後,足底、下腿皮膚・筋の機械痛覚増強は両側性に一部減弱を認めた。一方、尾の痛覚増強の減弱は認められなかった。さらにギプス除去後24時間後のFree radical scavengerのTbmpol(100mg,250mg/kg,i.p.)の投与により、極大を示していたギプス除去後5週目のすべての部位の機械痛覚増強が抑制された。また同時期に出現していたアストロサイトの活性化(GFAP染色)は抑制された。

以上により,ギプス固定肢に生じた酸化ストレスは本実験モデルにおける長期持続性の広範囲機械痛覚増強の発症において主要な役割を担い,この痛覚増強の広がりにミクログリアの活性化が関与し、維持にアストロサイトの活性化が一部関与している可能性が明らかとなりつつある。また、広範囲機械痛覚増強行動の維持に他の中枢機序の存在が示唆される。後肢不動化後に誘発される広範囲機械痛覚増強の発症および維持に関わる可塑性機序の一つとして,脊髄グリア細胞の動態に注目し,ミクログリア抑制剤のミノサイクリンをギプス固定中から痛覚増強の発症期(固定8日目から除去後1日目)まで髄腔内投与した.投与後,足底部,下腿皮膚・筋の機械痛覚増強は,反対側のみ有意に改善し,また同抑制剤投与群において第四腰髄のミクログリアの活性化が用量依存性に抑制された.次に,アストロサイト抑制剤L-α-AAを痛覚増強の維持期(ギプス除去後5週目)に髄腔内投与した.投与後,足底,下腿皮膚・筋の機械痛覚増強は両側とも改善し,尾の痛覚増強は一部改善を認めた.またこの群において足底,下腿の支配髄節にあたる第4腰髄のアストロサイトの活性化は抑制されたが,このとき同時に活性化する第一尾髄ミクログリアは活性化を維持していた.肢不動化後に誘発される広範囲機械痛覚増強における脊髄グリア動態について,発症期における機械痛覚増強の反対側への広がりには腰髄ミクログリアの活性化が関与し,痛覚増強の維持は腰髄アストロサイトの活性化が関与していることが示唆された.また不動肢より離れた尾部の痛覚増強について,尾髄ミクログリアの活性化が関与する可能性が示唆された.広範囲機械痛覚増強の発症における酸化ストレスの関わりについて検討するため,ギプス除去後24時間後に活性酸素除去剤Tempolを腹腔内投与したところ,痛覚増強が極大を示すギプス除去後5週目のすべての部位の機械痛覚増強が用量依存性に改善した.また同時期に出現する第四腰髄アストロサイトの活性化は抑制された.以上により,ギプス固定肢に生じた酸化ストレスは本実験モデルにおける長期持続性の広範囲機械痛覚増強の発症において主要な役割を担うことが明らかとなった.本年度の目標であった痛覚増強抑制時の免疫組織学的検証がおおむね達成された。さらなる再現性の確認および詳細な検証を行い確実な結論を導き出す課題を遂行する必要がある。24年度が最終年度であるため、記入しない。途中経過であっても発見された新しい事象については適宜、学会発表(国際疼痛学会、日本疼痛学会、日本理学療法学術大会など)を行うことで計画実行の円滑化に努める。解剖学講座および学際的痛みセンター(兼任)における教授・講師陣からの助言、実験機器・助手などの人財を含めた資源を有効利用し,計画円滑な遂行、遅延の是正に勉める。研究チームとして月に2回のペースで研究カンファレンスにてデータのプログレスレポートと詳細な検討を行なっており、研究計画ついて常にフィードバックを行う。