hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
遺伝子治療による次世代血友病治療法の開発と非ヒト霊長類を用いた前臨床研究

4頭では血中に期待レベルのFIXの長期発現は得られず、既感染に基づく抗AAV抗体はAAV8ベクターによる遺伝子治療を妨げることが明らかとなった。血友病A遺伝子治療:In vivoへのベクターの直接投与には染色体への組み込みがほとんどおこらないAAVベクターを用い、ex vivoにて細胞へ遺伝子導入し再移植するときには染色体への組み込みが必要であるためSIVベクターを用いることとしている。これまで、血友病イヌでの検討を視野に入れ、種々のプロモーターの下流にイヌFVIII遺伝子を搭載したベクターを作製し、血友病Aマウスで発現を検討したところ、AAV8ベクターと強力な肝臓特異的なHCRHAAT-プロモーターを用い肝臓に限定してイヌFVIIIを発現させることで、イヌFVIII活性を免疫抑制なしに正常イヌFVIII活性の100%以上に保つことができた。一方、ヒトFVIIIはマウスにおける血液半減期が極めて短く血液レベルを高めることがこれまで困難であったが、AAV8ベクターとHCRHAAT-プロモーターを用いることで血友病AマウスにおいてヒトFVIII活性を50-100%に維持することが可能となった。血友病B遺伝子治療:ヒトFIX特異的モノクロナル抗体で検出可能な変異カニクイザルFIX(FIXT262A:262位のThrをAlaに置換)を発現するAAV1ベクターを3頭のカニクイザル骨格筋に投与することで変異カニクイザルFIXの血液レベルを4-40%で長期間維持することが可能であった。マウスで1000%以上のFIX発現をえることができるAAV8ベクターをサルに末梢静脈あるいは腸間膜静脈枝から投与したところ、中和抗体陰性の3頭では治療レベルの導入遺伝子由来FIX発現が得られた。しかし、サルに既感染に基づくAAV8に対する中和抗体が低力価でも存在するサル4頭では血中に期待レベルのFIXの長期発現は得られなかった。血友病A遺伝子治療:肝臓以外の臓器に遺伝子発現を起こさないことが導入遺伝子産物への免疫反応を軽減することに重要であることが示された。ヒトFVIIIは血友病Aマウスでは血液レベルを高めることがこれまで困難であったが、AAV8ベクターとHCRHAAT-プロモーターを用いること、および免疫反応を制御することで、血友病AマウスにおいてヒトFVIII活性を50-100%に維持することが可能となった。中型血友病モデル動物の作製に成功した。遺伝子細胞治療として、AAV Rep遺伝子を用いた19番染色体AAVS1領域への部位特異的FVIII遺伝子組込が効率よく行えることが確認できた。トリグロビンHS4インスレーターを組込むことでSIVベクターによる遺伝子導入血液細胞のクローナルな増殖抑制効果が得られ、SIVベクターの安全性を高める可能性が示唆された。血友病B遺伝子治療:マウスでの検討を終え、カニクイザルを用いた前臨床実験を遂行している。ヒトFIX特異的モノクロナル抗体で検出可能な変異カニクイザルFIX(FIXT262A:262位のThrをAlaに置換)を発現するAAV8ベクターを作製した。このベクターはマウスで1000%以上のFIX発現をえることができる。
肝臓再生過程の形態学的分析と胃腸膵ホルモンの影響の検討

1.部分肝切除を行なったマウスとラットに各種の胃腸膵ホルモンを投与し、肝臓の再生と膵臓に対する効果を重量の変化と組織学的検索にもとづいて調べた。マウスでは、グルカゴン・インスリン投与で約50%の肝重量の増加が認められた。ラットでは、グルカゴン・インスリン投与とトリプシン阻害剤(以下TI)経口投与を組み合わせた場合に約20%の肝重量増加がみられた。同じ組み合わせで正常ラットに対して投与した場合には、肝重量には変化は生じなかった。したがって、グルカゴン・インスリン・TI投与は再生中の肝臓に対してのみ有効と考えられた。一方、セクレチン、CCK、TIそれぞれの単独投与では肝再生に対する効果はなかった。再生肝の組織像は、いずれの投与群とも対照群との違いはなかった。2.胃腸膵ホルモンが再生肝における肝細胞の分裂・増殖を促進するかどうかを確かめるため、BγαU抗体を用いて免疫組織化学的に調べた。部分肝切除したラットにグルカゴン・インスリン・TI、あるいはCCKを投与し分裂中の細胞を経時的に観察したところ、標識細胞の出現頻度や分布に対照群との差異は認められなかった。したがって、これらホルモンによって肝細胞の分裂が促進されるのではなく、細胞の肥大が引き起こされたものと考えられる。3.膵臓は、肝切除後いずれの群においても重量の増加と腺房の発達が認められた。この効果はグルカゴン・インスリン、セクレチン、CCK、TI、大豆餌の群で一層増強していた。その機序については今後の研究が必要であろう。4.再生が活発なときの肝細胞は腺房様配列をとり、血管との接触面が減少していた。毛細胆管は部分的に拡張し、そこから多数の細い側枝が出ていた。前者は腺腔に、後者は細胞間分泌細管に相当する。このような像は新生児や下等動物の肝臓でも認められることから、肝臓の原始的な構築と思われる。1.ラットとマウスを用いて種々の胃腸膵ホルモンが肝再生に及ぼす影響を検討した.いずれの動物でも肝の2/3をヒギンズとアンダーソンの方法により切除し,残存肝の増殖をしらべた.有系分裂は切除後2日以内に旺盛で,肝重量は10ー14日にほぼもとの重量に復する.2.そこでマウス約100匹を用いて,肝切除直後から(1)CCK 8 10μg/Kg,day,(2)大豆トリプシン阻害剤(1.5mg/mlを飲水とする),(3)トリプシン阻害剤(同上)とセクレチン140u/Kg,day,(4)グルカゴン(67μg,150μg,300μg)とインスリン(0.7u,1.5u,30u/Kg,day),(5)グルカゴン・インスリン(同上)とトリプシン阻害剤飲水,の投与を7日間行ない,屠殺して肝の重応と組織像をしらべた.重量(体重化)はグルカゴン・インスリン(150μg,1.5u)において約1.25倍の増加を示し(危険率〈0.01),ほかは有意の差がみられなかった.3.ラット(約100匹)においては,(1)セルレイン1μgまたは10μg/Kg,day,(2)大豆食飼育,(3)トリプシン阻害剤1.5mg/mlの飲水,(4)セクレチン140u/Kg,day,

(5)グルカゴンとインスリン(150μg,1.13u/Kg,day),(6)グルカゴンとインスリンとトリプシン阻害剤(1.5mg/mlの飲水)の投与を7日間行ない,肝の重量と組織像をしらべた.その結果,グルカゴン,インスリン,トリプシン阻害剤の三者同時投与で,有意の両生促進効果が得られた.4.考察,消化管ホルモン,とくにCCKは膵に対する栄養効果をもっており,このことは本研究でも膵をしらべて確認している.肝に対しても同様の効果を期待して本研究にとりかかったが,グルカゴン,インスリン併用の効果は明らかであるが,消化管ホルモンの効果は,まだ認めていない.今後さらに検索を続けたい.1.胃腸膵ホルモンのひとつであるCCK投与による肝臓の再生への影響を調べた。2/3部分肝切除後、CCK_8投与群と、CCK分泌を促進することが知られているトリプシン阻害剤(以下、TI)投与群について、肝臓と膵臓の重量測定と組織学的検索を行なった(ラット)。その結果、膵臓重量の増加作用は認められたものの、いずれの群においても肝重量、肝小葉の形態、肝細胞の数などに対照群との差はなく、肝再生を促進する効果は認められなかった。2.昨年度の研究により、ラットではグルカゴン・インスリン投与とTI投与を併用した群で肝再生は促進されることが明らかになった。今年度は、これらの活性物質が肝細胞の分裂・増殖を促進するかどうかを確かめるため、分裂期の細胞をBrdUにより標識して免疫組織化学的に検出した。その結果、標識細胞の出現時期や小葉内での分布状態に対照群との差異は認められず、グルカゴン・インスリン・TI投与で観察された肝重量の増加促進効果は、肝細胞数の増加ではなく、細胞の肥大化・充実化が促進されたためと考えられる。3.肝再生過程における神経の関与を明らかにするため、マウスの肝臓に分布する神経線維を神経特異蛋白に対する抗体を用い免疫組織化学的に検索した。その結果、神経線維は小葉間結合組織に多く、肝細胞索の間にも数珠状の線維が散在していた。しかし、神経の分布や形態に明らかな経時的変化は認められず、マウスの場合肝細胞の増殖に対する神経の関与は少ないだろうと考えられた。4.ラット再生肝における毛細胆管の形態変化をゴルジ鍍銀法と走査電顕で観察した。肝切除後3日目になると、毛細胆管は部分的に拡張し、そこから多数の側枝を出すようになる。このとき肝細胞は板状の配列から膵臓のような腺房様配列を示した。拡張した部分は腺腔に、側枝は細胞間分泌細管に相当する。このような像は成長期や下等動物の肝臓でも観察される。
思春期特発性側弯症患者の3D骨形態解析による椎体内骨密度左右差の可逆性の検討

本研究の目的は、思春期特発性側弯症(AIS)における椎体骨密度の左右差およびその経時的変化を、3D骨形態解析を用いて詳細に検討することにより、側弯症治療に新たなエビデンスを確立することである。明らかにすべき問題点として、AIS患者において、椎体の外的環境の変化で椎体骨密度やその左右差に変化が起こりうるのか、術前後の側弯の改善度と椎体骨密度やその左右差に相関があるのか、術後も非固定カーブが進行する場合は術前の椎体骨密度やその左右差に関連があるのか、の3点を設定している。これらを明らかにするため、側弯の凹側凸側における椎体の3DCTからHU値の差やその経時変化、手術による側弯の矯正度と術前後の椎体HU値の変化の相関を比較検討していく予定である。椎体のHU値は骨密度とよく相関するといわれているが、実際の骨密度との定量的な関連性をもたせるため、2018年からCT撮像時にファントムを入れることにより定量化を可能にする試みを行っている。2018年度は、これまでの症例の画像データベースから本研究の対象に合致する17例の術前・術後の画像計測を後ろ向きに行った。(X線上の脊柱変形の変化、CTの非固定椎体におけるHU値の変動)を行った。非固定椎体である第3腰椎・第4腰椎ともに、左右とも術前より術後の椎体HU値が減少しており、術後の不動化(運動制限)が椎体骨密度の低下を生じさせていることが考えられた。また、椎体HU値の左右差は、術前と比べ術後では左右不均衡が是正されていた。このことは、側弯の矯正によってカーブが減少すると、椎体骨密度の不均衡も是正されたと考えられた。今後は前向きにファントムをいれて骨密度の定量化が可能な症例の蓄積を行っていく予定である。後ろ向き研究としての画像解析を2018年度は行っている。予定通りの症例数の解析を進めている。前向きに症例の蓄積を行っている。2018年度は7例の新規症例を追加することが可能であった。これらの症例の画像解析も2019年度に適時行っていく予定である。ファントム購入を当初予定していたが、他研究で使用しているファントムを当研究でも使用させていただくことが可能となったため、差額が生じた。
含窒素多環芳香族化合物の高次機能化

アザサーキュレンのヘテロ類縁体であるトリアザモノオキサ[8]サーキュレンの合成に成功した。これまで、ジアザジオキサ[8]サーキュレンとモノアザトリオキサ[8]サーキュレンの合成は報告されていたが、今回の分子は例がなく、また合成法も異なる。得られた構造は完全な平面で、発光量子収率も52%と高かった。また、ビス(2-ブロモフェニル)チオフェンと2,5-ビスピナコレートジボリルピロールのカップリング反応によりジチアジアザ[8]サーキュレンの合成もできており、構造バリエーションが大きく拡張している。ジチアジアザ[8]サーキュレンはDMSOのみに溶解する難溶性の化合物であるが、このような平面分子が極性溶媒に溶解すること自体が予想外の結果であった。コラニュレンの外周部に五重にインドールが縮合したペンタインドロコラニュレンの合成に成功した。単離が困難であったが窒素上をメチル化することで精製に成功し、X線結晶構造解析にも成功している。最安定構造は、隣接するインドール環同士が(PPMPM)のパターンでねじれた非対称化合物だった。目的とするボウル型化合物の合成まであと1ステップであり、今後合成収率の改善と変換反応の検討を行う。ヘテロサーキュレン類の置換基修飾による水溶化の検討も進んでいる。PEG鎖を導入することに成功し、PEG置換トリアザ擬[8]サーキュレンがTHF/H2O=1/99の比率にまで凝集することなく溶解し、発光のクエンチが起きないことを明らかにした。目的とする分子の合成は完全には達成できていないものの、当初予想していなかった新規分子を合成することができた。ヘテロサーキュレンの化学は導入する元素の特性を利用した様々な展開が模索できるため、多様性を明らかにできたことは重要な成果である。周辺部修飾反応の開発は少しずつではあるが着実に進んでいる。コラニュレンの周辺部修飾では大きな進展が見られ、ペンタインドロコラニュレンを合成することができた。この分子自体が多重ヘリセン構造を有しており興味深いが、今後はこの構造の詳細の検討に加え、さらなる縮合により巨大ボウル型化合物を合成することを試みたい。ヘテロサーキュレンの合成法が少しずつ改良されており、目的とする分子の合成のための下地が整いつつある。高効率な合成のためのさらなる条件検討を続けたい。コラニュレンの酸化反応によるボウル型分子合成は、現在のところうまく進行していないが、検討回数を増やして反応条件を精査するには限界がある。熱重量分析などを用いて、どういった生成物が得られているのかを詳細に追求していくことで効果的な反応条件の改善に努める。水溶性パイ電子系の合成は可能だが、精製が思いの外困難であることがわかった。HPLCなどを用いた精製方法を検討したい。

コラニュレンの酸化反応によるボウル型分子合成は、現在のところうまく進行していないが、検討回数を増やして反応条件を精査するには限界がある。熱重量分析などを用いて、どういった生成物が得られているのかを詳細に追求していくことで効果的な反応条件の改善に努める。水溶性パイ電子系の合成は可能だが、精製が思いの外困難であることがわかった。HPLCなどを用いた精製方法を検討したい。用いる予定だった試薬類が予定より安価に入手できたため、翌年度に使用することにした。翌年度も引き続き試薬購入と旅費、論文執筆経費などに使用する予定である。
細菌感染ストレスに対するホメオスターシス

近年、免疫系の調節物質であるサイトカインのレセプターが神経系細胞で検出される一方で、神経ペプチドや神経伝達物質のレセプターがマクロファージやリンパ球膜表面上に発現していることが報告され神経伝達物質がそのレセプターを介して免疫系の調節に関与することが示唆されている。我々はこれまで交感神経遮断作用を持つ6-hydroxydopamine(6-OHDA)投与マウスでは、リステリア感染に対する宿主抵抗性が増強されることを明らかにした。交感神経遮断マウスでは、リステリア感染防御に重要なTNF-α、IL-12およびIFN-γの産生が亢進され、LM特異的活性化T細胞の誘導が促進されることが示唆された。本研究では、アドレナリンレセプター(AR)アンタゴニストをマウスに投与し、リステリア感染モデルを用いて神経系と免疫系の相互作用におけるARの関与について検討した。リステリア感染1日後におけるphentramine(αARアンタゴニスト)およびpropranolol(βARアンタゴニスト)投与群の脾臓および肝臓の生菌数は、対照群と有意な差は認められなかった。感染2日後でも同様にARアンタゴニスト投与によるリステリア感染抵抗性の変化は認められなかった。感染4日後では、phentramine投与群の脾臓および肝臓で有意な生菌数の増加が認められた。リステリア感染防御において、感染初期における除菌はinnate immunityに依存し、感染後期ではリステリア特異的活性化T細胞が誘導され、感染細胞の除去に関与することが報告されている。Phentramine投与マウスにおいてリステリア感染4日後に感染増悪が認められたことから、αARを介するT細胞の活性化機構が存在することが示唆された。しかし、phentramineとpropranololを同時投与したマウスでは、phentramine単独投与と同様の影響は認められず、感染4日後の脾臓および肝臓の菌数は、対照群と比し有意な生菌数の差はなかった。以上の結果から、神経伝達物質はαARを介してT細胞の活性化を調節する可能性が考えられるが、αAR単独の関与ではなく免疫系の活性化において複数のカスケードが存在することが示唆される。ARアンタゴニストマウスにリステリアを感染させ、感染1日後の脾臓における内因性IFN-γ、TNF-α、IL-12およびIL-10を測定した。対照群に比し、Phentramine投与群ではIFN-γ、TNF-αおよびIL-12が増加していた。これらのサイトカインはリステリアの感染防御において重要なサイトカインである。感染後の菌数を比較すると、感染1日後ではいずれの群においても対照群と有意な差が認められないにも関わらず、サイトカイン産生性に変化が認められたことは興味深い知見である。ホメオスターシスの調節において、神経系と免疫系は重要な役割を担っている。近年、免疫担当細胞が神経ペプチドや神経伝達物質のレセプターを発現していることや、これらのリガンドが免疫応答に重要な役割を担うことが報告されているが、細菌感染防御における神経系の関与はまだ明らかではない。そこで、本研究では、交感神経終末遮断作用を持つ6-ヒドロキシドーパミン(6-OHDA)を用い、リステリア感染に対する宿主抵抗性における交感神経系の関与を検討した。交感神経終末遮断作用を示す6-OHDA投与マウスでは、血漿中および脾臓中のNEが有意に低下した。LM感染後の生残率を比較すると、6-OHDA投与マウスではLD50において約20倍の増加が認められた。感染6時間および2日後の臓器中の菌数に有意な差は認められなかったが、感染5日後では6-OHDA投与マウスで対照群に比べLMの生菌数が有意に低下していた。さらに、6-OHDA特異的阻害剤であるdesipramine投与により、6-OHDA投与による感染抵抗性の増強は抑制された。6-OHDA投与マウスでのPECおよび脾マクロファージの貪食・殺菌能およびNO^<2->産生能は対照群と差は認められず、交感神経遮断は特異免疫の誘導に影響することが示唆される。交感神経遮断マウスの脾細胞培養や免疫樹状細胞培養では、HK-LM刺激によりTNF-α産生が増加した。さらに、脾細胞培養では、抗CD3 mAb刺激によりIFN-γの産生が増加した。樹状細胞培養では交感神経遮断によりIL-12が増加していた。また、IFN-γ^-/^-マウスでは、交感神経終末遮断による感染防御能の増強は認められなかった。以上より、交感神経の遮断により、LM感染防御に重要なTNF-α、IL-12およびIFN-γの産生が亢進され、LM特異的活性化T細胞の誘導が促進されると考えられる。

本研究では、アドレナリンレセプター(AR)アンタゴニストをマウスに投与し、リステリア感染モデルを用いて神経系と免疫系の相互作用におけるARの関与について検討した。リステリア感染1日後におけるphentramine(αARアンタゴニスト)およびpropranolol(βARアンタゴニスト)投与群の脾臓および肝臓の生菌数は、対照群と有意な差は認められなかった。感染2日後でも同様にARアンタゴニスト投与によるリステリア感染抵抗性の変化は認められなかった。感染4日後では、phentramine投与群の脾臓および肝臓で有意な生菌数の増加が認められた。リステリア感染防御において、感染初期における除菌はinnate immunityに依存し、感染後期ではリステリア特異的活性化T細胞が誘導され、感染細胞の除去に関与することが報告されている。Phentramine投与マウスにおいてリステリア感染4日後に感染増悪が認められたことから、αARを介するT細胞の活性化機構が存在することが示唆された。しかし、phentramineとpropranololを同時投与したマウスでは、phentramine単独投与と同様の影響は認められず、感染4日後の脾臓および肝臓の菌数は、対照群と比し有意な生菌数の差はなかった。以上の結果から、神経伝達物質はαARを介してT細胞の活性化を調節する可能性が考えられるが、αAR単独の関与ではなく免疫系の活性化において複数のカスケードが存在することが示唆される。ARアンタゴニストマウスにリステリアを感染させ、感染1日後の脾臓における内因性IFN-γ、TNF-α、IL-12およびIL-10を測定した。対照群に比し、Phentramine投与群ではIFN-γ、TNF-αおよびIL-12が増加していた。これらのサイトカインはリステリアの感染防御において重要なサイトカインである。感染後の菌数を比較すると、感染1日後ではいずれの群においても対照群と有意な差が認められないにも関わらず、サイトカイン産生性に変化が認められたことは興味深い知見である。
短期のチアミン不足とエネルギー源の偏りが安静・運動時のエネルギー代謝に及ぼす影響

本研究では、欠乏症を発症しない程度の短期的なチアミン不足が糖質および脂質代謝を含むエネルギー代謝全体に及ぼす影響を、動物実験にて明らかにする。短期的なチアミン制限により、安静時にのみ見られた脂質代謝の停滞に着目し、そのメカニズムを解明するとともに、運動することの意義やエネルギー源が糖質または脂質に偏った場合の影響も確認する。「安静」や「エネルギー源の偏り」は「運動不足」「糖質や脂質の過剰摂取」とそれぞれ言い換えることもでき、これらの条件に短期的なチアミン不足が重なるときに生じる糖質および脂質代謝への影響を明らかにすることは、チアミンを継続的に摂取することの新しい意義を示すことにつながる。
奈良時代鉛釉陶器および鉛釉瓦磚の基礎的研究

今年度は奈良時代の都である平城京内の寺院に注目した。東大寺をはじめとして、薬師寺、大安寺、興福寺、法華寺、唐招提寺、西大寺はこれまでに発掘調査を実施しており、さまざまな鉛釉三彩陶器、鉛釉瓦磚が出土している。これらの寺院を発掘調査した機関は、奈良文化財研究所をはじめ、複数の機関が担当し、遺物の管理も各所に分散しているため、出土状況の全体像の把握が困難であった。今年度は平城京寺院出土の鉛釉瓦磚の悉皆調査を実施した。各寺院から出土した鉛釉瓦磚を種類ごとに分類し、各種類の出土点数を明らかにした。また、主要な遺物について、その形状、釉色、焼成状況、胎土の状況、製作技法など、考古学的な観点から調査分析を実施した。各寺院の出土量と特徴を最後にまとめ、奈良時代における鉛釉瓦磚が各寺院でどの建物でどのように使用したのかを明らかにするとともに、奈良時代における鉛釉瓦磚の時代的変遷についても考察した。その結果、寺院でもっとも多い鉛釉瓦磚は磚であり、その使用場所は金堂の須弥壇上に敷き詰めていたことが明らかになった。また、その磚には浮彫で水波文を飾るものが古く、それが退化して沈線による表現に変化したものが新しいという傾向も明らかになった。そのほか、磚の形状は方形のほか、多角形のものが多く存在し、須弥壇のほか、仏像の台座に直接使用したものが各寺院に存在することもわかってきた。この成果については、本年6月刊行予定の『奈良文化財研究所紀要2019』においても、「平城京寺院出土の施釉瓦磚」と題して成果を公表する予定である。また、科研の最終年度に合わせて、4年間の成果をまとめて1冊の冊子とし、印刷して刊行した。平成27年度は研究計画の初年度にあたるため、研究の基礎データの収集を実施した。奈良時代の鉛釉陶器、瓦磚が多く出土する平城京を中心とした旧大和国(現奈良県)の発掘調査出土資料の集成を行い、出土遺跡、出土品の種類、出土数量、出土層位あるいは出土遺構、およびこれらのデータの出典(報告書名)をデータベースの必要項目とし、年度内にデータベースの作成を終了した。次年度はさらに範囲を広げ、同時の畿内(近畿地方)の出土資料データベースを作成する予定である。これらのデータベースをもとに、鉛釉陶器や瓦磚が平城京やその周辺のどのような場所から出土し、また、どのような状況(遺構や層位)から出土したのかを比較しながら、鉛釉陶器、瓦磚の性格や用途を明らかにする分析を開始した。おおまかな傾向としては、平城宮内および奈良時代創建の天皇家が造営に関わる大寺院での出土がほとんどだが、一部の資料は、平城京内の居住区に集中して出土する場所があり、むしろ宮内や寺院以外の場所での使用例についての検討、あるいはその出土遺跡がどのような性格の遺跡なのかを追究することが次年度の課題となった。また、出土遺物の製作技法や文様、出土状況から陶器、瓦磚の製作時期を絞り込む研究については、上記のデータベースをもとに次年度に実施する予定である。科学的な分析では瓦磚の胎土の分析を実施し、宮内や寺院ごとに胎土の成分がことなること、一部には陶器との共通性がみられるなどの結果を得た。次年度はこれらに対する考古学的な解釈を進め、さらに補足的な資料の分析を実施することとなる。目標としていた鉛釉陶器、瓦磚の奈良県内における出土資料のデータベースは完了し、引き続き畿内(関西地方)の出土資料の集成を開始している。また、釉薬の分析も陶器、瓦ともに数十点のサンプリングおよび分析を終了しており、大筋の傾向を把握することができた。次年度に補足すべきデータの方向性などを定めることが可能となった。本年度は昨年度に引き続き、奈良三彩および施釉陶器資料の修正作業を実施した。とくに畿内周辺の報告書等を捜索し、出土遺物の種類、点数、形状、出土状況などの項目別にリストを作成し、データベース化をおこなった。奈良時代から平安初期にかけての時代を対象とし、当時の都があった京都府、大阪府の資料を中心に集成した。考古学的考察としては、平城宮出土の奈良三彩陶器および施釉瓦磚の分析研究を実施した。三彩陶器と施釉瓦磚それぞれについて、平城宮内での出土地点、出土点数、各出土地点での種類などを整理し、平城宮内での出土傾向を分析した。これらの陶器や瓦磚と共伴する文字資料、具体的には墨書土器、木簡の遺物と、その他の遺物との相関関係を析出することで、平城宮内における奈良三彩陶器と施釉瓦磚の存在が仏教施設との関連を示すとの結論を得た。この成果の公表を来年度におこなうよう原稿の執筆をおこなった。将来の研究への展望として、日本古代の施釉技術の淵源となった韓国百済地域出土の瓦磚の調査を実施し、日本と共通する点、ことなる点を確認した。さらに施釉瓦磚の釉薬および胎土の成分分析を実施した。胎土については蛍光X線分析を用い、釉薬は鉛同位体比分析を採用した。平城宮内から出土した瓦磚計22点について実施した。このうちの数点については、スプリングエイトを使用し、分析をおこなった。この成果については一部、も来年度に公表すべく論文を執筆中である。同時に平城京寺院跡出土した施釉瓦磚の胎土分析を実施した。

これについては日本文化財科学会第33回大会で発表している。奈良三彩陶器、施釉瓦磚の出土資料集成については当初の予定より若干遅れており、現状では奈良時代から平安時代初期の都があった、奈良県、京都府を終了し、大阪府が集成途中である。考古学的研究については本年度でへ平城宮内の分析を終了し、一定の成果を得ることができた。この成果については来年度の早い段階に発表すべく原稿を作成しており、まもなく『奈良文化財研究所紀要2017』に掲載される予定である。奈良三彩陶器、施釉瓦磚の鉛同位体比、胎土分析が予定よりも進展がはやく、平城宮および平城京の出土資料については一通り実施した。この成果については一部、本年度に日本文化財科学会で発表した。また、韓国百済地域出土の関連資料を見学したことにより、日本における奈良三彩陶器、施釉瓦磚の機能を考えるうえで参考になる事例があることを確認した。平成29年度は当初の計画にもどづき平城京出土の施釉陶器、瓦磚について考古学的観察や分析を実施した。西大寺出土の施釉陶器の実測図作成、整理研究をおこない、正倉院御物、その他の遺跡で出土した奈良三彩および同時期の土師器、須恵器との比較をおこない、施釉陶器の編年研究を実施した。これによって、従来、不明確であった施釉陶器の奈良三彩の時期について、確度の高い年代観を提示することができた(神野恵)。施釉瓦磚については平城京内で施釉瓦磚が集中して多量に出土した平城京二条二坊の施釉瓦磚の考古学的分析をおこなった。出土分布図を作成し、坪ごとに出土した施釉瓦磚の種類、紋様、釉薬の色調、胎土がことなることを明らかにした。その結果、同地区には紋様と胎土がことなる施釉瓦磚がすくなくとも2種類あることが判明し、一方は、平城宮内や東大寺前身寺院出土の施釉瓦磚と共通することから、その生産の時期や工房、契機については、東大寺、平城宮と密接に関連することが予測された。また施釉瓦磚の年代についても検討した、遺構の時代や他遺跡出土の施釉瓦磚との比較から、奈良時代中期であることを明らかにした(今井晃樹)。施釉瓦磚および施釉陶器の自然科学分析についても昨年度につづき実施した(降幡順子)。以上を踏まえ、2017年10月21日に奈良文化財研究所において研究会を開催した。当日の報告は以下の通り。今井晃樹(奈良文化財研究所)「平城京左京二条二坊の施釉瓦」、神野恵(奈良文化財研究所)「西大寺食堂院井戸SE950出土の奈良三彩陶器の再整理」、岡田雅彦(奈良県教育委員会)「唐招提寺出土の施釉瓦」、降幡順子(京都国立博物館)「平城京寺院出土の施釉陶器瓦磚の分析」研究会では多くの専門家の参加を得、施釉陶器や瓦磚を実見ながら各種の問題について議論をした。昨年度に引き続き、関西地方の施釉陶器、瓦磚のデータベースを作成した。昨年度までに平城宮出土の施釉瓦磚と施釉陶器の考古学的な分析研究、平城京出土の施釉瓦磚と施釉陶器の考古学的な分析研究、平城宮および平城京出土の施釉瓦磚および施釉瓦磚についての釉薬および胎土の自然科学的分析を実施した。以上の成果をもとに2017年度に中間成果の報告として、以下のような研究会を実施し、成果のまとめと公表を実施した。今井晃樹(奈良文化財研究所)「平城京左京二条二坊の施釉瓦」、神野恵(奈良文化財研究所)「西大寺食堂院井戸SE950出土の奈良三彩陶器の再整理」、岡田雅彦(奈良県教育委員会)「唐招提寺出土の施釉瓦」、降幡順子(京都国立博物館)
犬の重症筋無力症に対する血清学的診断法の確立

後天性重症筋無力症(MG)は、骨格筋における神経筋接合部シナプス後膜のアセチルコリン受容体(AChR)に対する自己抗体(抗AChR抗体)により神経筋伝達不全をきたす自己免疫性疾患である。抗AChR抗体はACh結合領域(α183-200)を認識する阻止型AChR抗体とそれ以外を認識する結合型AChR抗体とに大別される。そこで、本研究ではACh結合領域および結合型AChR抗体の約2/3が認識するとされるmainimmunogenic regionとよばれる領域(MIR,α67-76)の両方を含む組換AChRα-subunit蛋白を、大腸菌発現系ならびに昆虫細胞発現系を利用して作製し、これを抗原としたELISA系の確立を試みた。結果的に感受性、特異性ともに認められず、この抗原は抗AChR抗体の検出には有用ではないことが明らかになった。これは、大腸菌発現蛋白ならびに昆虫細胞発現系においてはMIRの立体構造修飾がうまく復元できなかった、あるいは細胞内蛋白がACh結合領域のペプチドの生理活性に影響を与えた等の理由が考えられた。次に、我々はヒト横紋筋肉腫細胞由来AChRα-subunitを抗原とした、ヒト用抗AChR抗体測定キットをイヌに応用した場合の抗体価の評価と測定系の有用性について検討した。臨床学的に後天性MGと診断された14症例のイヌ血清の従来の測定系(カリフォルニア大学)とコスミックIIにおける抗体価を比較した。コスミックIIによる抗体価は従来の測定系による抗体価に対して、4症例は相対的低値を示し、また6症例において相対的高値を示した。この結果はコスミックIIをイヌに応用した場合のAChRの動物種特異性による感受性の低下と、コスミックIIの抗原であるヒト横紋筋肉腫細胞由来AChRが従来の測定系のイヌ胎児由来AChRよりも多くの成熟型AChRを含んでいることによる感受性の増強を意味するものと思われた。臨床応用に当たって、前者は低い抗体価で発症する症例における偽陰性反応を示唆し、また後者は抗AChR_<canine>抗体価が陰性であった場合の次の段階の検査法としての有用性を示唆した。後天性重症筋無力症(MG)は,神経筋接合部の筋肉側アセチルコリン受容体(AChR)に対する自己抗体により誘発される自己免疫疾患であり、ヒト、イヌ、ネコでの発症が知られている。AChRは、5つのサブユニットからなり、なかでもa-サブユニットはMGとの深い関連が注目され、人では分子レベルでの発症機構の解明がすすんでいる。本研究は、AChRa-サプユニット遺伝子の分子構造を解析することにより、診断用合成ペプチドを作製して、イヌのMG診断法の開発を目的とした。三頭のイヌの骨格筋からmRAAを分離し、RT-PCR法を用いて遺伝子の増幅を行い、イヌAChRα-サブユニット遺伝子を分離してダイレクトシークエンス法によりその構造を解析した。その結果、イヌAChRα-サブユニット遺伝子は1373塩基対からなり、458残基のアミノ酸をコードしていた。イヌのAChRα-サブユユニット遺伝子は、ヒトのAChRα-サブユニット遣伝子とアミノ酸レベルで95.9%のホモロジーを示した。次に、塩基配列に基づき、イヌのAChRにおけるアセチルコリン結合部合成ペプチドを作製し、ウサギに免疫レて結合部への特異抗体を作製した。

作製した抗体の特異性は、骨格筋から分離したAChRα-サブユニット蛋白および大腸菌にて発現させたAChRα-サブユニット蛋白に対する結合能をウエスタンブロット法にて解析した。また、骨格筋から分離したAChRα-サブユニット蛋白の精製度はa-ブンガロトキシンとの反応性で確認した。さらに、臨床診断への応用を目的に合成ペプチドを抗原としたELISA法を開発し、イヌ末梢血中のAChRα-サブユニットに対する自己抗体価の測定を行ったが、特異性の高い抗体は得られなかった。今後は、ペプチドの選択、ELISAでの発色法などを検討して、さらに検出感度の高いELISA法を確立していきたい。イヌ後天性重症筋無力症(MG)は、神経筋接合部におけるアセチルコリン受容体(AChR)が自己抗体によって崩壊するために神経筋伝達不全が生じ、全身的または局所的な筋虚弱を臨床症状として呈する疾患である。AChR抗体価の陽性所見は後天性MGの診断において非常に特異的であり、イヌ胎児筋由来AChRを抗原とした放射性免疫沈降法(RIA法)によって測定される。今回我々は、日本で利用可能であるヒト用抗AChR抗体測定キット`コスミックII^<【○!R】>'をイヌに応用した場合の抗体価の評価ならびに測定系としての有用性について検討した。臨床学的に後天性MGと診断された14症例のイヌ血清を用いて、従来の測定系による抗体価(抗AChRcanine抗体価)とコスミックII^<【○!R】>における抗体価(抗AChR_<TE671>抗体価)を測定した。コスミックII^<【○!R】>はヒト横紋筋肉腫セルライン(TE671)より抽出したAChRを抗原としたRIA法である。従来の測定系の陽性率43%(6/14)に対して、コスミックII^<【○!R】>は0.25nMを参照上限値とした場合71%(10/14)という高い値を示した。また、両抗体価の比較によりAChRの種特異性による抗体の結合親和力の低下と、コスミックII^<【○!R】>が従来の測定系と比較して多くの成熟型AChRを含有していることにより、εサブユニット特異性抗体の検出が可能となり陽性率の向上をもたらした可能性が示唆された。本研究において、コスミックII^<【○!R】>は従来の測定系よりも感度が高く、イヌのAChR抗体価の測定法として高い有用性が示唆された。しかし、本研究では認められなかったが、εサブユニット特異性抗体が優勢ではないMG血清においてはAChRの種特異性の理由から偽陰性結果を呈する可能性が考えられ、今後より多くの症例で検討することによってコスミックII^<【○!R】>の有用性を確実にする必要がある。
ＥＧＦＲ阻害剤耐性に関わる新規分子機構の解明と治療法開発

EGFR阻害薬やALK阻害薬は、各遺伝子陽性の肺がん患者さんに対する治療薬として用いられるが、約1年で耐性が生じ、効かなくなってしまうことが大きな問題となっている。そこで、これら耐性機構の解析を行なった。(1)EGFR阻害薬への耐性化に、EGFRに結合するAki1が関与していることを明らかにした。一方、Pimキナーゼは耐性化との有意な相関は認められなかった。EGFR阻害薬への耐性克服に用いられるc-Met阻害剤Tivantinibのチューブリン阻害活性を見出した。(2)ALK阻害薬耐性患者さん検体より細胞株を樹立し、第二世代ALK-TKIへの耐性化に関わる遺伝子変異を同定することに成功した。EGFRを標的にした薬剤であるErlotinibなどのEGFRチロシンキナーゼ阻害剤(EGFR-TKI)は、活性型遺伝子変異を有する肺がん患者さんに対して高い抗腫瘍効果を示すが、自然耐性の患者さんが4人に1人いることや、一旦効いたと思われた患者さんでも約1年で効かなくなってしまう獲得耐性が起きることが問題となっている。これまでに、野生型EGFRあるいは変異型EGFRを発現していると報告のある肺がん細胞株などを集め、これら細胞株におけるAki1などの発現を検討するとともに、siRNAによるノックダウンと遺伝子導入による過剰発現細胞株を樹立し、EGFR-TKI耐性との相関を検討した。具体的には、EGFR-TKIに感受性を示す細胞株と耐性を示す細胞株の定常状態におけるAki1発現を、Western法で検討したところ、耐性を示す細胞株の幾つかでAki1過剰発現を認めた。(2)Aki1遺伝子ノックダウンによるEGFR-TKI感受性変化の検討Aki1は、EGFR活性化に伴いEGFRと結合する足場タンパク質である。そこで、EGFRとAki1の結合を免疫沈降法にて検討した。その結果、変異EGFRとAki1の恒常的な結合を見いだした。さらに、Aki1遺伝子ノックダウンによりEGFR-TKIに耐性を示す細胞にアポトーシスが誘導されることを確認した。Aki1遺伝子ノックダウンにより、EGFRの下流に位置するAktの活性化体であるリン酸化Aktも低下することが確認された。(3)EGFR-TKI感受性・耐性を示す肺がん細胞株におけるPimキナーゼの発現変化の検討肺がん・胃がん細胞株におけるPimアイソフォーム発現とEGFR-TKI耐性との関連を検討したが、Pim1、Pim2、Pim3ともに有意な相関は認められなかった。1、Aki1を標的にしたEGFR-TKI耐性克服法の開発これまでは、細胞バンクから入手したEGFR-TKI耐性細胞株を用いて検討してきたが、臨床との整合性を確認するために、平成25年度では、患者由来組織から樹立した肺がん細胞株での検討を行なった。研究代表者が所属するがん研究会の臨床研究倫理審査委員会における承認の元、様々な培養条件での事前検討を行なうことで、EGFR-TKI耐性症例4例とEGFR-TKI投与前の症例3例から細胞株を樹立することに成功した。さらに、樹立されたEGFR-TKI耐性症例由来臨床細胞株は、細胞株にしたあとでもGefitinibやElrotinibなどのEGFR-TKIに耐性を示すが、EGFR-TKI耐性症例に対しても抗腫瘍効果を示す不可逆的EGFR-TKIのBIBW2992に対しては感受性となっていることを確認した。これら臨床細胞株を用いることにより、Aki1発現とEGFR-TKI耐性との相関が明確になるものと期待される。c-Met阻害剤として知られるTivantinibのEGFR-TKI耐性細胞に対する増殖阻害効果・細胞周期への影響を検討した結果、Tivantinibは他のc-Met阻害剤とは増殖阻害効果・細胞周期への影響が異なることが判明した。詳細に解析した結果、Tivantinibはc-Met非発現細胞にも増殖抑制効果を示すとともに、M期での細胞周期停止を引き起こすことが確認された。Tivantinibの抗腫瘍効果プロファイルから、標的分子がチューブリンであることを同定し、Tivantinibがチューブリン重合阻害薬であることを明らかにした。本年度は、第三相臨床試験が行われているc-Met阻害剤Tivantinibの抗腫瘍効果に関わる標的分子の解析と、ALK阻害薬への耐性化に関わる分子機構を、臨床検体も含めて解析した。具体的には、(1)Tivantinibの抗腫瘍効果はチューブリン阻害によりもたらされている可能性が示唆されていた。そこで、チューブリン阻害剤のコルヒチンとビンクリスチンなどのビンカアルカロイド系抗がん剤を用いた競合実験により、結合部位探索を行なった。その結果、Tivantinibはコルヒチン結合部位に結合することを見出した。

また、薬剤排出トランスポーターは多くの抗がん剤の耐性化に関わるが、Tivantinibは他のチューブリン阻害剤とは異なり、薬剤排出トランスポーターの基質にはならずに排出されないことが確認された。よって、薬剤トランスポーターが高発現した耐性細胞に対しても、Tivantinibは高い抗腫瘍効果を発揮する可能性が示唆された。(2)ALK阻害薬としては、クリゾチニブが第一選択薬として用いられ、第二選択薬としてアレクチニブやリチニブが用いられている。クリゾチニブ投与後に見られる耐性には、標的分子の二次変異とともにバイパス経路の活性化による耐性化が報告されていた。そこで、現在の第二選択薬であるアレクチニブとセリチニブへの耐性に関わる分子機構を、実験室レベルで解析するとともに、耐性患者さん由来の検体を用いて検討を行なった。その結果、アレクチニブへの特異的な耐性を示すI1171T変異とV1180L変異を、セリチニブへの特異的な耐性を示すF1174C/V変異を、両薬剤ともに耐性となるG1202R変異を見出すことに成功した。さらに、標的分子に変異が認められない検体の全エクソームシーケンスやRTKアレイ解析により、バイパス経路の活性化による耐性化の可能性を新たに見出すことに成功した。26年度が最終年度であるため、記入しない。がん化学療法学26年度が最終年度であるため、記入しない。交付申請書に記載の計画に沿った形で、EGFR-TKIへの耐性を示す細胞株においても、AkilがEGFRからのシグナル伝達に重要な役割を果たしていることが証明できたが、PimキナーゼとEGFR-TKI耐性との相関は示せなかったため。平成25年度は、Aki1とc-Metを標的にしたEGFR-TKI耐性克服法開発を中心テーマに研究を進めた。平成25年度では、臨床との整合性を確認するため、患者組織から樹立した肺がん細胞株を用いてAki1のEGFR-TKI耐性への関与を検討することを計画した。しかし、その肺がん細胞株の樹立は困難を極め、様々な培養条件を検討することでやっとEGFR-TKI耐性症例から高頻度に臨床細胞株を樹立する手法が確立できた。樹立したEGFR-TKI耐性臨床細胞株では、GefitinibやElrotinibなどのEGFR-TKIに対して耐性を示しているため、より臨床に近い腫瘍でAki1のEGFR-TKI耐性への関与を証明できる可能性がでてきたため。c-Met阻害剤として知られるTivantinibなどの薬剤を用い、EGFR-TKI耐性細胞に対する増殖阻害効果・細胞周期への影響を検討した。その結果、Tivantinibは他のc-Met阻害剤とは増殖阻害効果・細胞周期への影響が異なることが判明した。Tivantinibの抗腫瘍効果プロファイルがチューブリン重合阻害剤であるビンカアルカロイド類と同様なプロファイルを持つことを見出し、実際にTivantinibがチューブリン重合を阻害することを確認した。本結果は、現在臨床試験が進められているTivantinibの抗腫瘍効果がチューブリン阻害によってもたらされていることを意味しており、非常に大きなインパクトを持つ成果が得られたものと考えている。
妊娠、産褥期における保健指導を考える -骨密度の変化と関連因子の検討から-

本研究は、妊娠・産褥期における女性の骨量の保持と産後の骨量のスムーズな回復のために、望ましい保健指導とは何かを明らかにすることを目的とする。昨年度に引き続き、妊娠初期から産後1年まで縦断調査を行う。昨年と同様の調査対象者に対し、超音波骨密度測定器による骨密度測定、採血・採尿による骨代謝マーカー測定、生活習慣などの聞き取り、アンケートによる食事摂取量調査を行った。平成14年3月現在で骨密度測定調査を実施した者は、妊娠初期(1113週)39名、妊娠中期(2427週)34名、妊娠末期(36週以降)37名、産後1週以内38名、産後40日38名、産後3ヶ月29名、産後6ヶ月25名である。また、採血・採尿を行った者は、妊娠初期38名、妊娠中期33名、妊娠末期31名、産後40日30名、産後3ヶ月25名、産後6ヶ月21名である。調査結果:妊娠各期のスティフネスの平均値は、妊娠初期89.9±12.0、妊娠中期91.2±11.4、妊娠末期88.7±11.3、産後1週以内85.7±11.4、産後40日87.6±11.6、産後3ヶ月86.0±12.0、産後6ヶ月86.7±12.3であった。産褥1年については現在調査中である。結果は、年齢、食事内容、活動、出産回数、児の栄養方法、産後の無月経期間などの因子との関連を分析中である。本研究では、妊娠・産褥期における女性の骨量の保持と産後の骨量のスムーズな回復のために、望ましい保健指導とは何かを明らかにすることを目的とする。1.調査対象者:骨密度に影響のある疾患を有しない妊娠初期の妊娠に調査を依頼し了解を得られたもの48名のうち、妊娠期間中に他施設分娩を希望した者、早産した者を除く43名を対象とした。対象者の内訳は、20歳以上30歳未満14名(平均年齢26.0±2.9歳)、30歳以上29名(平均年齢34.0±3.0歳、40歳以上1名を含む)、また、初産婦20名(平均年齢31.1±5.7歳)、経産婦23名(平均年齢31.7±3.9歳)であった。2.調査期間:調査は、妊娠初期(妊娠12週前後)から産後1年の間に計8回にわたり縦断調査を行う。平成12年8月より調査を開始し、平成13年3月現在で調査を実施した者は、妊娠初期(1113週)43名、妊娠中期(2427週)38名、妊娠末期(36週以降)18名、産後1週以内12名、産後40日4名である。3.調査内容および方法:調査内容は、超音波骨密度測定器による骨密度測定、採血、採尿、個人の背景や生活習慣などの聞き取り、アンケートによる食事摂取量調査を行った。妊娠中は妊娠健診時に、産後40日は産後健診時に、出産後入院中は対象者に外来に来てもらい調査を行った。4.調査結果:妊娠各期のスティフネスの平均値は、妊娠初期89.7±11.4、妊娠中期90.5±11.5、妊娠末期92.3±10.6であったが、詳細は現在分析中である。また、妊娠末期の一部と産褥期については現在調査中である。
アディポネクチンの肺癌転移抑制効果の検証

A549肺癌細胞株においてアディポネクチンの腫瘍増殖抑制効果を明らかとした。A549細胞はアディポネクチン受容体を発現していたが、アディポネクチンによるA549細胞増殖抑制効果は認められなかった。一方、GFP transgenicマウスの骨髄移植モデルを用いて、移植腫瘍に集積される骨髄由来細胞を評価したところ、アディポネクチン治療群の腫瘍内における骨髄由来細胞が減少していた。以上から、アディポネクチンの抗腫瘍効果は、骨髄由来細胞の集積阻害を介している事が示唆された。In vitro実験では、ヒト全長アディポネクチンをヒト肺癌細胞(A549)へ直接投与し、MTS assayを行って細胞増殖能を評価した。その結果、ヒト全長アディポネクチンは肺癌細胞の増殖に影響を及ぼさない事がわかった。また、マウス全長アディポネクチンをA549細胞に投与しても、同様に細胞増殖には影響をおよぼさなかった。次に、ヌードマウスへ肺癌細胞を皮下移植し、そのマウスヘヒト全長アディポネクチンを投与したところ、早期の段階で(14日未満)腫瘍増殖を抑制する事が示された。このことから、ヒトアディポネクチンが肺癌腫瘍に対して直接的に効果を及ぼすものではなく、腫瘍の環境、とくに腫瘍間質に影響を与える事が示唆された。腫瘍間質を評価するため、まず、移植腫瘍切片を抗CD31抗体で免疫染色を行ったところ、腫瘍血管と思われるCD31陽性細胞数がアディポネクチン投与群で減少していた。また、ヌードマウス骨髄をGFPトランスジェニックマウスの骨髄で置換した骨髄移植モデルを作成した。これにより骨髄細胞がGFPトランスジェニックマウス由来となり、骨髄細胞のみGFPで標識することができる。これらの骨髄移植マウスへ同様にアディポネクチンを投与した結果、腫瘍切片における骨髄由来細胞(GFP陽性細胞)が投与群で減少している事が示された。以上から、ヒト全長アディポネクチンは宿主の骨髄油彩細胞の腫瘍集積抑制効果を介して腫瘍増殖を抑制するものと考えられた。次年度では、上記を再検証・再確認するとともに、マウス肺癌肺転移モデルを用いて、ヒト全長アディポネクチンの転移抑制効果を検討する。アディポネクチンの肺癌肺転移抑制効果を検証するため、ヌードマウス肺癌肺転移モデルを利用した。まず、我々は肺癌肺転移モデルを確立させた。肺癌細胞にはGFPタンパクもしくはDsRedタンパクを発現したA549ヒト非小細胞肺がん細胞株を用いた。ヌードマウスにはCD1-Foxn1nu/nuマウスを用いた。ヌードマウスの尾静脈より標識A549細胞を注射し、肺癌肺転移モデルを作成した。それらマウスから肺を取り出し、肺組織中に存在するGFPもしくはDsRed発現A549細胞を蛍光顕微鏡で観察した。また、マクロでは、蛍光実体顕微鏡を用いて、マウスの肺に含まれる肺癌転移巣を同定・評価した。上記の肺癌肺転移モデルのヌードマウスに、アディポネクチンを尾静脈注射で投与した。プラセボ群にはBSAを含有した生理食塩水を投与した。アディポネクチンの投与方法は、肺癌を尾静脈注射した1週後に連日投与して最大14日間の投与を行う方法を用いた。アディポネクチンの最終投与1週後に、ヌードマウスから肺実質・組織を取り出し、その中に含まれている肺転移病巣の個数を、前述の方法(マクロ・ミクロ)で比較・評価した。その結果、アディポネクチン投与群とプラセボ群とでは、ミクロ・マクロの双方において、肺癌肺転移の個数に有意差を認めなかった。今回我々が行った研究では、ヌードマウス肺癌肺転移モデルを用いたアディポネクチンの転移抑制効果は証明されなかった。我々が用いた肺転移モデルでは転移抑制効果が認められなかったものの、前年度のヌードマウス肺癌皮下移植モデルを用いた実験ではアディポネクチンの抗腫瘍効果が確認された。実験条件の違いで結果が異なった可能性が考えられた。我々が用いた肺癌肺転移モデルの条件などを見直し、アディポネクチンの転移抑制効果を再検証していくことが今後の課題となった。
分子動力学法によるナノ切削機構の原子論的アプローチに関する研究

銅単結晶およびシリコン単結晶の超精密切削実験を行い、透過型電子顕微鏡によって加工変質層を結晶学的に解析した。また、分子動力学法によるナノ切削シミュレーターを開発し、原子レベルでの材料の変形挙動を動的に観察した。切削実験および計算機シミュレーションから得られた知見に基づいて、ナノ切削機構を考察した。得られた結果をまとめると次のとおりである。(1)銅単結晶のナノ切削機構(1)すべり面をすべり方向に切削した場合の変形は,主に切削面と平行なすべり面の活動によって起こる.このため,切削面表層では積層不整が起こるが,結晶の回転はほとんど起こらない.(2)上記(1)以外の結晶方位に切削した場合には,切削面表層で結晶の回転が起こる.さらに,結晶の回転は細長い結晶粒を単位として起こり,(110)面を[110]方向に切削した場合のように,切削方向とすべり方向が同じときには結晶粒の長手方向と切削方向とは一致する.(3)切削面の変形機構は結晶方位によって大きく異なるが,切込み量が微小な超精密切削においては,このような変形は表面あらさなどの切削面性状の違いとしては現れない.(4)加工変質層は結晶方位によらず、表層の微細多結晶層と切削面に平行なトルセル組織の層状構造からなる。(5)切削初期段階の変形挙動に関してシミュレーション結果と実験結果に整合性が認められた。これにより、微小領域での材料の変形挙動の動的観察が可能となった。(2)シリコン単結晶のナノ切削機構(1)加工変質層は表層のアモルファス層と内部の転位層からなる。また、流れ型の切りくずが得られる場合には、その構造は完全なアモルファス相となっている。(2)内部に導入される転位は、被削材の結晶方位および工具形状に依存する。(3)微小領域での脆性-延性遷移はすべり変形の起こり易さに大きく依存する。(4)上記(3)の結果に基づき、すべり変形の起こり易さを数値化するためのSlip modelを提案し、結晶方位に依存する脆性-延性遷移点の違いを予測可能とした。(5)銅単結晶の計算機シミュレーションとシリコンの切削実験の間の相関を見いだし、すべり変形の動的観察の結果に基づき、工具形状(すくい角)に依存する脆性-延性遷移点の違いを明らかにした。
疎水性物質との相互作用に関わる環境汚染物質分解菌表層分子機構の解明とその応用

本研究では、筆者らが単離したトルエン分解菌A.genospecies Tol5と疎水性界面との強相関作用を解明するため、疎水性基質であるトルエンまたは親水性基質である乳酸のどちらかを炭素源として同菌を培養した。その結果、乳酸培養時には疎水性度が減少し、ポリウレタン担体への付着能力も失われることが明らかとなった。ところが、乳酸で培養しても担体を入れておくと、担体付着能力は失われず、疎水性も維持することがわかった。以上から、疎水性基質の取り込みメカニズムが、細胞表層の疎水性と疎水性担体への付着能力の両方に関係していることが示唆された。さらに、疎水性界面に付着した微生物細胞は、非イオン界面活性剤の添加により、固体表面から剥離させることはできなかったが、あらかじめ界面活性剤が存在すると、固体表面への付着が阻害されることが示された。そこで筆者らは、微生物細胞の付着機構として、まず微生物細胞は疎水性相互作用により固体表面に一次の弱い付着をし、続いて菌体外ポリマー(EPS)のような接着物質を分泌してより強い二次の付着を達成するという、二段階付着機構を提案した。実際、細胞表層がEPS様物質でコーティングされていることが電子顕微鏡により観察された。一方、Tol5株のトルエン分解能力は、分離源である汚泥より約10倍高いことが、分解速度実験より明らかにした。そこで担体付着能を利用してポリウレタン担体にTol5株を固定化し、パイロットスケールのTBABを構築した。これを用いてトルエンの除去性能を調べたところ、運転開始24時間以内に十分な処理性能を示した。活性汚泥等を用いる通常のTBABでは、馴致期間に数週間を要することが通常であるので、強相関作用をもつ細菌を利用することで、馴致期間の大幅な短縮が可能であることを示した。