hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ＳＡＭ系マウスを用いた潰瘍性大腸炎の原因遺伝子の同定

腸粘膜での異物排出ポンプであるABCB1Aの機能喪失を共通して有するSAMP1とFVB/N系マウスを用いることにより、ABCB1Aの機能喪失を基盤とした潰瘍性大腸炎の発症が、第16染色体、および第13染色体上の修飾遺伝子により規定されることを明らかとした。さらに、第16染色体上の修飾遺伝子の存在領域を約7 Mbにまで限局することができた。この領域に存在する遺伝子の系統間多型検索の結果、修飾遺伝子の候補としてIfnar1遺伝子内のミスセンス塩基置換多型を同定した。しかしながら、この多型がABCB1A欠損条件下で潰瘍性大腸炎発症への感受性を規定するものであるか否かは完全には証明されなかった。SAMP1とFVB/N系マウスの間での多型を検索し、さらに(FVB/N x SAMP1)F2交雑仔のgenotypingを行なうことにより、潰瘍性大腸炎の発症に関与する修飾遺伝子の存在領域を第16番染色体上の55個の遺伝子を含む約7 Mbの領域に絞り込むことができた。このうち22個の遺伝子に関して変異(多型)検索を行なったが、潰瘍性大腸炎の発症に関与することが疑われるようなものは同定されなかった。この領域に修飾遺伝子が存在することを確認するために、SAMP1にFVB/N系マウスの染色体領域を導入したコンジェニック系マウスの作出を試み、N5世代まで進めた。また、N4F1世代を育種し、第16番染色体の当該領域がFVB/N由来のホモ型の個体を得た。現在、潰瘍性大腸炎の発症の有無を経過観察中である。同定したFVB/N系マウスのInterferon (alpha and beta) receptor 1 (Ifnar1)遺伝子内のミスセンス塩基置換多型の関与を検証するために、FVB/NにSAMP1の機能喪失型Abcb1a遺伝子をコンジェニック導入し、N4世代を得た。さらにIfnar1のノックアウト対立遺伝子を導入し、FVB/N型対立遺伝子とのヘテロマウスを作出導入して相補性試験を試みている。IFNAR1の活性測定法の確立を目指しつつ、塩基置換により生じるIFNAR1内のH274Rアミノ酸置換の影響の調査を試みた。野生型、およびH274Rアミノ酸置換を有するIFNAR1を発現するプラスミドを構築し、培養細胞にトランスフェクトして発現させた。これにマウスINF-αまたはINF-βを添加して反応を測定したが、予測される微妙な差を検出できるほどにはこのアッセイ系の感度が良くないと考えられた。Abcb1a遺伝子に機能喪失型突然変異をもつSAMP1系マウスを用いて、第16番染色体上のD16Mit203とD16Mit53マーカー遺伝子の間の約14.5 Mbの領域に存在し、潰瘍性大腸炎の発症に関与する遺伝子のポジショナルクローニングを試みた。NCBIのマウスゲノムのドラフトシークエンスデータを参照し、この染色体領域内に存在する遺伝子107個を抽出した。これらのうち25個の遺伝子に関して、PCRクローニングと塩基配列決定によりFVB/NとSAMP1マウス系統間での塩基配列多型(突然変異)を検索した結果、5個の遺伝子に関してマイクロサテライト多型、または一塩基置換多型が見つかった。同定された系統間多型のうち、Interferon (alpha and beta)receptor 1 (Ifnar1)遺伝子内のもの以外は機能的に重要とは考えられなかった。一方、Ifnar1遺伝子内の一塩基置換多型は第7エクソン内にあるミスセンス塩基置換であった。すなわち274番目のコドンの第2塩基がSAMP1ではA (cAt)、FVB/NではG (cGt)であるために、274番目のアミノ酸のヒスチジン(SAMP1)からアルギニン(FVB/N)への置換(H274R)が予測されるものであり、機能的多型である可能性が考えられた。そこでIfnar1遺伝子内のノックアウトマウスを入手し、SAMP1マウスとの交配によりAbcb1a遺伝子とIfnar1遺伝子内のダブルノックアウトマウスを作出した結果、これらのマウスでは潰瘍性大腸炎が発症しないことが確認された。この結果から、潰瘍性大腸炎の発症にはFVB/N系マウスの第13番染色体上に存在する遺伝子の関与が必須である可能性が考えられた。最終年度は、第16番染色体上の約7 Mbの領域に存在する26個の遺伝子のコード領域の塩基配列に関して変異(多型)検索を行なったが、潰瘍性大腸炎の発症に関与することが疑われるようなものは同定されなかった。

SAMP1にFVB/N系マウスの染色体領域を導入したコンジェニック系マウス(N4F1世代)を作出した。第16番染色体の当該領域がFVB/N由来のホモ型マウスの一部には軽度の潰瘍性大腸炎が認められたことから、当該領域に修飾遺伝子が存在することが確認された。FVB/Nに機能喪失型Abcb1a遺伝子、およびInterferon (alpha and beta) receptor 1 (Ifnar1)のノックアウト対立遺伝子をコンジェニック導入し、N7F1世代を得た。これらのマウスの一部には軽度の潰瘍性大腸炎が認められたが、FVB/N系マウスが有するIfnar1遺伝子内のミスセンス塩基置換多型がABCB1A欠損条件下で潰瘍性大腸炎発症への感受性を規定するものであるか否かは完全には証明されなかった。研究期間全体を通じてAbcb1a遺伝子の機能喪失依存的な潰瘍性大腸炎の発症に関与する修飾遺伝子の存在領域をFVB/N系マウスの第16番染色体上の55個の遺伝子を含む約7 Mbの領域に絞り込むことができた。しかしながら、この領域に存在する計48個の遺伝子の中には、Ifnar1遺伝子中のミスセンス塩基置換多型以外に潰瘍性大腸炎の発症に関与することが疑われるようなものは同定されなかった。塩基置換により生じるIFNAR1内のH274Rアミノ酸置換の影響に関する調査を試みたが、IFNAR1活性測定法の感度が低く、良好な結果が得られなかった。実験動物学昨年度までに第16番染色体上の原因候補遺伝子としてIfnar1遺伝子上の塩基多型の同定を完了し、その遺伝子のノックアウトマウスとSAMP1系マウスの交配実験を遂行することができた。しかしながらこの過程で、当初の我々の仮説とは異なり、潰瘍性大腸炎の発症にはFVB/N系マウスに由来する第13番染色体上の遺伝子が必須であることを示唆するデータが得られた。そのために、コンジェニック系マウスの確立が必要となった。マウスは1世代の進行に約3ヶ月を要し、コンジェニック系マウスの確立には最低8世代進める必要があるために、当初の計画よりも達成度が遅れている。また、I型インターフェロン受容体の活性測定法は過去には報告が無く、その確立が難航していることも達成度が遅れる原因となっている。本研究の目的はSAM系マウスを用いて潰瘍性大腸炎の発症に関与する第16番染色体上の比較的強い効果をもつ原因遺伝子、および第13番染色体上の弱い効果を持つ原因遺伝子をポジショナルクローニングし、疾患発症に至る分子遺伝学的メカニズムを解明することである。今年度までに第16番染色体上の原因候補遺伝子としてIfnar1遺伝子上の塩基多型の同定を完了し、その遺伝子のノックアウトマウスとSAMP1系マウスの交配実験を遂行することができた。そのために、マウス系統間の交配様式の再考察が必要となったために、当初の計画よりも達成度が遅れてしまった。コンジェニック系マウスを利用した潰瘍性大腸炎発症の修飾遺伝子が当該染色体領域内にあることの確認、当該染色体領域内にある未調査の遺伝子に関する多型(変異)検索、およびIfnar1遺伝子内のミスセンス変異がABCB1A欠損条件下で潰瘍性大腸炎発症への感受性を規定するものであるか否かの検証を併せて進める。
蓄積型放送のためのパーソナル視聴の研究

本研究では,まず,ストリーム型の放送番組コンテンツのWebページへの動的統合システムの開発に取り組んだ.本システムは,ユーザがWebページの任意の個所を選択することにより,その内容を適切な長さのビデオによって補強するものである.また,Webページの意味構造を利用し,これに対してクエリを記述することによって,統合のためのテンプレートを実現する枠組を構築した.また,マルチメディア統合コンテンツを構築するためのスクリプトと,統合に用いられる素材に対して利用条件を表現するメターデータ記述を開発した.これらの記述によって,権利問題を解決しながら,コンテンツの動的な統合を実現する機構を構築した.次に,放送コンテンツと関連情報の複合化とパーソナル視聴方式として,放送コンテンツにおいて,映像と付帯するデータ(字幕テキスト)から,多重の詳細を持つWebコンテンツを自動的に生成し,詳細度をズーム・インタフェースで変更しながら個人的に視聴することが可能な手法に由り組んだ.本手法では,字幕データが付与された映像から,時間データを基に映像をクラスタリングし,映像サムネイルと付帯するテキストを抽出し,ユーザの閲覧時にWebページを動的に生成することが可能である.さらに,シーンの検索には,生成されたテキストを用いてシーンの特定を行い,関連情報と共に放送コンテンツを閲覧する機能を構築した.一方,Webページと映像の関連抽出や検索エンジンの統合利用についても検討を行った.本研究では,まず,ストリーム型の放送番組コンテンツのWebページへの動的統合システムの開発に取り組んだ.本システムは,ユーザがWebページの任意の個所を選択することにより,その内容を適切な長さのビデオによって補強するものである.また,Webページの意味構造を利用し,これに対してクエリを記述することによって,統合のためのテンプレートを実現する枠組を構築した.また,マルチメディア統合コンテンツを構築するためのスクリプトと,統合に用いられる素材に対して利用条件を表現するメターデータ記述を開発した.これらの記述によって,権利問題を解決しながら,コンテンツの動的な統合を実現する機構を構築した.次に,放送コンテンツと関連情報の複合化とパーソナル視聴方式として,放送コンテンツにおいて,映像と付帯するデータ(字幕テキスト)から,多重の詳細を持つWebコンテンツを自動的に生成し,詳細度をズーム・インタフェースで変更しながら個人的に視聴することが可能な手法に由り組んだ.本手法では,字幕データが付与された映像から,時間データを基に映像をクラスタリングし,映像サムネイルと付帯するテキストを抽出し,ユーザの閲覧時にWebページを動的に生成することが可能である.さらに,シーンの検索には,生成されたテキストを用いてシーンの特定を行い,関連情報と共に放送コンテンツを閲覧する機能を構築した.一方,Webページと映像の関連抽出や検索エンジンの統合利用についても検討を行った.(1)蓄積型TVのためのマルチメディアコンテンツのパーソナル視聴方式マルチメディアコンテンツを受動的・自動的に視聴するために,データ自身が自律的に情報を呈示する方式を開発した.本方式では,データ構造を解析し必要なデータを抽出する手法と,データ間の関連を基にデータを直列化して結合する手法を開発した.さらに,ストリーム型の放送番組コンテンツを変換し,視聴者の要求に応じて動的に複合化するために,番組コンテンツのメタデータを基にWeb型コンテンツに変換する技術を開発した.この技術では,番組の字幕情報をTV放送から自動的に取得し,時間情報と共に蓄積し,ビデオ映像を階層的に分割することでWebコンテンツに自動的変換を行う.また,視聴の際には,放送コンテンツとWeb型コンテンツをシームレスに切り替えることにより,放送コンテンツをパーソナルに視聴することが可能となった.(2)放送コンテンツと関連情報の複合化とパーソナル視聴方式放送コンテンツと関連情報の統合をコンテンツの制作者,利用者,統合スクリプト記述者の立場から考え,これら3者の意図を反映した形で,動的なコンテンツ統合を行うためのスクリプト言語を開発した.このスクリプト言語は統合コンテンツの構造記述と統合意図記述の2つの部分に分かれている.この言語の特徴は,1)統合コンテンツの構造記述と意図記述の分離,2)統合プロセスの分割による意図の分散記述の実現,3)意図を反映した動的な統合コンテンツの実現,の3点である.(1)蓄積型TVのためのマルチメディアコンテンツのパーソナル視聴方式ストリーム型の放送番組コンテンツのWebページヘの動的統合システムの開発を行い,国際会議・学術雑誌などにその成果を公表した.本システムは,ユーザがWebページの任意の個所を選択することにより,その内容を適切な長さのビデオによって補強するものである.また,Webページの意味構造を利用し,これに対して,統合のためのクエリを記述することによって,統合のためのテンプレートを実現する枠組を構築した.また,マルチメディア統合コンテンツを構築するためのスクリプトと,統合に用いられる素材に対して利用条件を表現するメターデータ記述を開発した.これらの記述によって,権利問題を解決しながら,コンテンツの動的な統合を実現する機構を開発した.(2)放送コンテンツと関連情報の複合化とパーソナル視聴方式放送コンテンツにおける,映像と付帯するデータ(字幕テキスト)から,多重の詳細を持つWebコンテンツを自動的に生成し,詳細度をズームインタフェースで変更しながら個人的に視聴することが可能な手法を開発し,国際会議などにその成果を公表した.本手法では,自覚データかが付与された映像から,時間データを基に映像をクラスタリングし,映像サムネイルと付帯するテキストを抽出し,ユーザの閲覧時にWebページを動的に生成する.表示範囲の変更には,映像の区間長を表すサムネイル・サイズをユーザが操作することで詳細度の変更を行う方式を開発した.さらに,シーンの検索には,生成されたテキストを用いてシーンの特定を行い,関連情報と共に放送コンテンツを閲覧する機能を開発した.
新しい海洋ジテルペン群の化学構造とその生合成の制御

1.アミジグサの新ジテルペン、とくに抗菌性ジテルペンの単離と構造-北海道忍路湾産アミジグサの疎水性分画からゲルマクランやグアイアン骨格がさらにプレニル化されたものとみなされる新骨格をもった新ジテルペン22個を単離し、構造を決定した。この結果、アミジグサはさまざまな様式の双環および三環性ジテルペンを産生し、かつ官能基配列においても多様であることがわかった。褐藻中の抗菌性物質はジクチオールCであることがわかったが、これはヒドロアズレンジオールに抗菌性を見出した最初の例である。ジロホールの立体配置は未決定であったが本研究により絶対配置を決定した。また、nmr、分子力学計算により、ジクチオフランTの9員環は一つの安定コンホマーに固定されており、ジロホールは二つの安定コンホマーの平衡にあることを見出した。2.アミジグサジテルペンに関する生合成仮説-ジロホールの絶対配置を明らかにしたことから、アミジグサジテルペンの多様な骨格について生合成仮説をたてた。3.マギレソゾの細胞毒トリテルペンエーテル-北海道周辺のマギレソゾからテウリレン及びチルシフェリル-23-アセタートを見出し絶対配置を含め構造を決定した。後者とその誘導体は顯著な細胞毒性を示した。
Aktシグナルのブロックによる造血器悪性腫瘍の制御の試み

我々は成人T細胞性白血病細胞においてセリン・スレオニンキナーゼAkt、及びその下流でcyclinD1やc-Mycなど細胞増殖を刺激する蛋白質の翻訳に関与しているmammaliantarget of rapamycin (mTOR)シグナルが活性化していることを見出した。更に、LY294002でAktを、またrapamycinでmTORを阻害すると成人T細胞性白血病細胞の増殖が抑制されることを見出した。興味深い事に、これら阻害剤を同時に投与すると細胞増殖抑制効果が増強することを見出した。以上は米国癌学会総会(2006年4月1日-5日、米国ワシントン)で発表を行いScholar-In-Training Awardを受賞した。急性骨髄性白血病患者の約三割はFLT3やc-KITなどのtype IIIレセプター・チロシンキナーゼに遺伝子異常を有しその下流シグナルAkt/mTORが活性化している。我々はこれらの症例から得られた白血病細胞において異常活性化しているAktがチロシンキナーゼ阻害剤SU11248で効果的に抑制され、細胞増殖がブロックされ更にはアポトーシスが誘導されることを報告した。またSU11248と同時にrapamycin誘導体RAD001を投与すると細胞増殖抑制作用が増強することを報告した。山根の水溶性抽出液がTリンパ芽球性白血病Jurkat細胞においてAktのキナーゼ活性を抑制しその細胞増殖を抑制することを報告した。我々は成人T細胞性白血病においてセリン・スレオニンキナーゼAkt、及びその下流でcyclinD1やc-Mycなど細胞増殖を刺激する蛋白質の翻訳に関与しているmammaliantarget of rapamycin(mTOR)シグナルが活性化してることを見出した。以上は米国癌学会総会で発表予定である(2006年4月1日-5日、米国ワシントン)。急性骨髄性白血病患者の約三割はFLT3やc-KITなどのtypeIIIレセプター・チロシンキナーゼに遺伝子異常を有しその下流シグナルAkt/mTORが活性化している。またSU11248と同時にrapamycin誘導体RAD001を投与すると細胞増殖抑制作用が増強することを報告した(2005年米国血液学会総会にて発表2005年12月10日-13日、米国アトランタ)。山椒の水溶性抽出液がTリンパ芽球性白血病Jurkat細胞においてAktのキナーゼ活性を抑制しその細胞増殖を抑制することを報告した(日本癌学会総会にて発表2005年9月14日-16日札幌市)。
LODの知識構造化手法と観光オントロジーの構築に向けた自治体CMS構成法の研究

Linked Open Data (LOD)は、Resource Description Framework (RDF)に基づき、ウェブ上のリソースを主語、述語、目的語の関係で表現したメタデータであり、Uniform Resource Identifier (URI)によってそれぞれのリソースの意味関係を横断的に表現できる特徴を有する。LODは、オープンデータの公開方法の1つとして脚光を浴びており、日本国内においても公共施設や統計情報などのデータがLODとして公開されつつある。しかし、LODの公開状況を調査したところ、各リソースのメタデータがURIで記述されることなく単独で存在しているLODが多く、また、それぞれのLODにおいて独自の述語が用いられている傾向が強いことが明らかになった。つまり、LOD間に横断的なリンクが形成されにくい状態にあり、意味概念が継承されないことが起因してLODを利用することが難しい現状にある。この課題を解決するため、LODを知識構造化するResource Propagation Algorithm (RPA)を提案し、リソース間の潜在的なリンクを推定して補完する技術を実装した。また、観光領域のLODを対象とした観光語彙基盤を提案し、既存のLODにおける述語を自動的に名寄せできるようにして、複数のLODを統一的に取り扱うことが可能な技術を実装した。福岡県糟屋郡新宮町の地域データを対象として実証実験を行ったところ、観光語彙基盤によって神社や寺院、史跡、公園などの観光に関する様々なリソースを横断的にリンクして関係付けられることが示された。また、正解データのLODを用いてRPAの有効性を検証したところ、潜在的なリンクを精度よく推定して補完できることが確認され、LODの二次利用促進に寄与する見通しが得られた。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。
肝臓星細胞のビタミンA取り込みの分子機序の解明

ビタミンAは細胞の増殖・分化の制御や形態形成、遺伝子の発現制御などに関与する分子である。食物から摂取したビタミンAは消化管から吸収されて肝臓へ輸送される。ビタミンAは肝臓実質細胞に一時的に貯蔵され、レチノール結合蛋白質(以後RBPと記す)との複合体として細胞外に放出され、その近傍の肝臓類洞周囲腔内に存在する肝臓星細胞(以後星細胞と記す)に取り込まれると考えられている。星細胞は、生体内ビタミンAの80%以上をその細胞質内に豊富に存在する脂質滴に貯蔵し、生体の必要性に応じてビタミンAを取り込みまたは放出することにより、ビタミンAの生体内恒常性を調節・維持する重要な細胞である。星細胞のビタミンA取り込みの機序に関しては、星細胞の細胞表面に存在する分子にビタミンA-RBP複合体が結合して細胞の中に取り込まれることが既に報告されているが、ビタミンAの取り込みに関与するこの分子の詳しい解析はまだ行われていない。昨年度の研究で、腎臓近位尿細管でRBPと特異的に結合し,その再吸収を行うメガリンが、星細胞に発現していることをRT-PCRで確認した。(1)昨年度の研究により,星細胞においてメガリンが,発現していることがRT-PCRにより明らかにした。再確認を行うために,実験系の陽性対照として,ラット腎臓より調製した全RNAおよび星細胞のmRNAを用いるRT-PCRを行った。PCRにより増幅される特異的なバンドのサイズおよびその塩基配列は,星細胞において確認されたものと同一であった。(2)メガリンの発現をタンパク質レベルで確認するため,Western blot解析を行った。すなわち,培養肝臓星細胞のタンパク質抽出を行い,5%SDS-ポリアクリルアミドゲルを用いる電気泳動後,PVDF膜に転写,次いで抗メガリン抗体を用いて検出を行った。その結果、肝臓星細胞の抽出液中にメガリンの分子量に相当する330kDのサイズのタンパク質が検出された。以上の結果,メガリンが肝臓星細胞において発現していることをRNAレベルおよびタンパク質のレベルで確認できた。肝臓星細胞(以下星細胞と記す)は、生体内ビタミンAの80%以上をその細胞質内に豊富に存在する脂質滴中に貯蔵する。星細胞は、生体の必要性に応じてビタミンAを取り込みまたは放出することにより、ビタミンAの生体内恒常性を維持していると考えられている。しかしながら、星細胞のビタミンAの取り込みの詳細な機序に関しては、明らかにされていない。本研究の目的は、星細胞のビタミンA取り込みの分子メカニズムにおける、細胞膜上の受容体またはトランスポーター分子の存在を明らかにすることである。星細胞は、正常ラット肝臓をコラゲナーゼ灌流を施した後Percoll-密度勾配遠心法を行って調製した。(1)ビタミンAなどの取り込みに関与すると考えられる分子群の遺伝子スーパーファミリーから共通に保存されている領域を検索、選択して、PCRプライマーを設計した。これを用いて星細胞より調製したcDNAを用いてRT-PCRを行った。目的の分子の発現量が非常に微弱であるということが実験の結果、判ったので、cDNA作製のための鋳型として用いたRNAはtotal RNAではなく、本研究申請時に記載したμMACS systemを用いて精製したmRNAを用いた。このmRNAを用いてcDNAを作製し、RT-PCRに用いた。増幅された約300bpについてTA-cloningを行い、塩基配列を確認した。得られた配列情報を元にデータベース検索を行い、既報の遺伝子かどうか調ベた。その結果、GP330として知られるMegalinというタンパク質と相同であるということが明らかになった。(2)塩基配列解析より明らかとなった蛋白質の一次配列から、このMegalinに特異的な抗体を作成した。この抗体を用いて、免疫組織染色を行った。培養星細胞において、細胞膜表面および細胞質内に、この分子が発現していることを確認した。

すなわち,培養肝臓星細胞のタンパク質抽出を行い,5%SDS-ポリアクリルアミドゲルを用いる電気泳動後,PVDF膜に転写,次いで抗メガリン抗体を用いて検出を行った。その結果、肝臓星細胞の抽出液中にメガリンの分子量に相当する330kDのサイズのタンパク質が検出された。以上の結果,メガリンが肝臓星細胞において発現していることをRNAレベルおよびタンパク質のレベルで確認できた。
マグネシウム新素材の製造

本研究は、マグネシウム-リチウム合金にカルシウム、ナトリウムなどの元素を添加し、溶解・凝固を行い、この系の合金の鋳造組織、減衰能特性、機械的性質、耐食性などを調べることを目的とした。マグネシウムーリチウム合金に金属ナトリウムを加えるには、本実験装置内のるつぼに直接挿入できないので、金属ナトリウムをガラス管内に封入し、その状態のまま、マグネシウム合金と一緒に溶解し凝固させた。このときの雰囲気にはアルゴンガスを使用した。その結果、ナトリウムは、凝固に伴い粒界あるいは粒内に塊状で晶出する。従って、組織観察中においても、この試料は表面が燃焼しはじめるため実用材料として好ましくないことがわかった。一方のカルシウムを加えたマグネシウム合金は比較的安定した試料が得られた。これら合金の鋳造欠陥である割れは、合金の固液共存領域の大小に左右され、他の合金系と同様な傾向を示した。1%以上のナトリウム、カルシウム添加は、この鋳造割れを助長させる傾向を示した。また、マグネシウムにリチウムを15%以上加えると著しく耐食性を害することがわかった。そして、カルシウムの添加はこの耐食性を改善するような傾向も示さなかった。さらにリチウム量の多いマグネシウム合金にカルシウムを添加えるとミクロポロシティ発生量が多くなる傾向を示した。マグネシウムーリチウム合金の組織はカルシウム添加量の増加に伴い徴細化される傾向を示した。これに伴い、硬さも増加し、機械的性質の改善が認められた。そして、カルシウム量1%までのマグネシウムーリチウム合金は高い減衰能を示した。以上、まとめると、比較的良好な特性を示した組織範囲は35%リチウム、0.10.5%カルシウム、残マグネシウムであり、将来の材料として有望であることがわかった。
集約型都市構造に向けた地域拠点の実態と実現化のための計画技術に関する研究

本研究は集約型都市構造に向けてその核を担う「地域拠点」の実態と役割、実現化のための計画技術に着目する。地域拠点は、都市構造の核としての研究が不足し、各地で曖昧に様々な概念で用いられてきたため明確な目標像と実現化方策が立てられていない。地域拠点の実態と役割を明確に定義し、公共、民間、市民の間で有益な議論を可能にする必要がある。本研究は、全国地方都市の地域拠点を詳細に調査分析し、広域的な都市構造から見た計画方針とその配置の実態、地域拠点内の都市機能の集合形態の実態とその役割を明らかにすること、さらに先進的な地域拠点を抽出し実現化のための計画技術を明らかにすることを目的とする。
磁気ディスクの摩擦特性と耐久性に関する研究

カーボン保護膜を有するめっきディスクとスパッタディスク試料に硬い球面及びフェライトとAl_2O_3TiCのヘッドを比較的低速ですべらせる実験を行ない、薄膜ディスクの基礎的な摩擦特性と損傷について調べた。摩擦係数μは一般に荷重に依存しないが、0.01m/s以下の低速域では速度に依存し速度増加でかなり増加した。また、摩擦は潤滑液膜やテキスチャの存在によって影響されない。球面すべりで生ずる損傷は磁性膜の著しい破壊を伴い、摩擦を増加する。球面すべりから求められたカーボン膜のすべり接触部のせん断強さは150MPa前後であった。この値に基づいにヘッドのすべり接触は完全に弾性的と推定された。ヘッドを定速で回転するディスクに繰り返しすべらせるときのμとすべり回数Nの関係を、種々の表面状態を有するディスク試料について調べたところ、μは一般にN増加で増件するが、このμ増加は20nm前後のきわめて薄い潤滑膜によって抑制され、一方、テキスチャの存在によって容易に起り易いことが明らかになった。μはNが大きいときに1.0程度にも大きくなり得る。かかる大きいμ発生の原因の一つは潤滑膜のスティクション作用による場合である。ヘッドの繰り返しすべりによるディスク損傷はカーボンの薄い小片が付着して生じる光学的に黒い少数の微小領域であるにすぎなく、摩擦変化に対応するような機械的損傷は一般に生じない。摩擦変化の主原因は繰り返し摩擦におけるカーボンの変質と考えられるが、カーボンの摩擦耐久性はきわめて優れているといえる。繰り返しすべりにおけるμの変化は複雑であり、Nが大きいときに、N増加によって増加したμが、さらに繰り返しすべりを続けると減少して後、増加する場合も認められた。なお、CS/S繰り返しで生ずる低速域でのμの変化やディスク面損傷は定速繰り返しすべりにおけるμ変化や損傷と本質的に違わないことが明らかにされた。球面スライダーのすべりにおける磁気ディスクの摩擦特性と損傷鋼,サファイヤ及びフェライトの球面を低速でめっきディスクとスパッターディスクに種々の荷重ですべらせるときの摩擦及び接触の特性を調べ,この場合のディスクの摩擦損傷を観察した.接触特性は,ディスク基板が軟質のAl板の上に硬い下地層を有することから,通常の固体接触ときわめて異なる.すなわち,接触面積Aと荷重Wの関係はAαW^mであるがm>1の接触が起り得るほか, m=1の場合において接触圧力PがWに依存しないときでも,半径Rの小さい球面でPが大になる.これらの特性から摩擦係数〓は, Rが小さいときに減少するし, Wが大になったときに〓の凝着成分が増加するという特異な摩擦特性が現われる.高接触圧力条件ではディスクの磁性膜のはく離的損傷が生ずるが,特にフェライトでは生じやすい.磁性膜の損傷はぜい性破壊的であって,摩擦トラックの一部で起り,損傷発生は摩擦増加を生ずる.2.磁気ヘッドが低速で繰り返しすべるときの磁気ディスクの摩擦と損傷フェライトヘッドをめっきディスクとスパッターディスクに9.5gfで低速で繰り返しすべらせるときの摩擦係数〓と損傷を調べた.〓はすべり回数Nの増加によって増加するがトラックの一部において大きさが異なるようになる.〓の増加は損傷によって凝着が強い接触状態になるためと,塗布潤滑剤があるときの表面張力に起因するものがあるが,後者による〓増加はきわめて著しい場合がある.塗布潤滑剤は摩擦低下に有効でないが,摩擦損傷の抑制に効果的である.一方,ディスクのテキスチュヤは損傷を発生しやすくする.ディスクのヘッドによる摩擦損傷は一般にきわめてせまい幅の細長い形状で起るにすぎないが,〓を著しく増加するものであることが注目される.

このことは磁気ディスクの摩擦特性として重要である.なお,損傷はカーボン保護膜のみで起る場合もあると考えられる.1.薄膜ヘッドの定速繰り返しすべりにおける磁気ディスクの摩擦と損傷Al_2O_3・TiCの薄膜ヘッドを10及び50rpmで回転するカーボン保護膜を有するめっきディスクとスパックディスクに繰り返しすべらせたときの摩擦係μとすべり回数Nの関係を求め、さらに実験後のディスク面を光学顕微鏡と走査電子顕微鏡により詳細に調べた。μ-Nの関係は、薄膜ヘッドの場合も既に調べたフェライトヘッドと似たものであり、20nm程度のきわめて薄い潤滑液膜がN増加によるμ増加の抑制に有効であること、また、ディスク表面のテクスチャはμ増加を生じ易くすることがさらに明確になった。一方、表面観察から、N増加によるμ増加に対応するようなディスク面の機械的損傷は検出されなかった。損傷的様相としては、一般にカーボンの薄い小片が付着して生ずるきわめて微少で少数の光学顕微鏡下で黒く見える領域が発生するにすぎないことが知られた。このことはヘッド摩擦におけるカーボン保護膜の耐久性はきわめて優れていることを示すが、一方、繰り返し摩擦による何からの変質によってμ増加が現れることを示唆している。なお、ヘッドとディスクの接触は完全に弾性的であることも推定された。2.フェライトヘッドのCS/S繰り返しにおける摩擦と損傷フェライトヘッドのCS/S繰り返しにおいて低速域のμと回数Nとの関係を求め、実験後のデぃスク面を光学顕微鏡で調べた。μのNによる変化は10rpmの定速繰り返しすべりの場合と似た傾向を示すこと、また、特に高い摩擦を発生し始めるCS/S回数と定速すべり回数とは密度な関係にあることが明らかにされた。さらに、CS/S繰り返しで生ずるディスク面の損傷も定速すべりの場合と本質的に同様であることが知られた。このことから定速すべり繰り返しをCS/Sと同様の目的に利用可能と考える。
小学校算数科における文章題アニメーション教材へのスタイラスペンの活用と実践

平成26年度に実施された全国学力学習状況調査によれば,小学校算数科では基礎的・基本的な問題に比べ,応用力を問う問題の正答率が極めて低い。応用力の代表的な問題として,文章題が挙げられる。文章題を解くことが苦手な児童は多く,児童にとって文章題をイメージ化して図解することは難しい。現在の教科書やデジタル教科書は,文章題に対して数直線図等で表されている場合が多い。しかし,数直線図等を見ても解けない児童も存在する。もし,児童が与えられた情報から必要な値を見つけ出し,場面の状況や問題の条件をイメージ化するための手立てを工夫し,そこに自分や仲間の考え方を書き加えることができれば,文章題を解く力が育成できるのではないかと考えた。そこで,文章題に関係するイラストや数直線図等の挿絵にアニメーション機能を活用し,段階的に数量関係を表す図(以下,数量関係図)に変化していく教材を作成し,そこにスタイラスペン(本申請品)で自分や仲間の考え方を記入し,記入したものを保存させていった。初めに、小学校算数科第6学年を対象に文章題アニメーション教材を作成し、自分の力にあったアニメーションから文章題を解いたり,繰り返し見たりする実践を行った。子どもたちはスタイラスペンを活用することで,画面上に自分や仲間の考え方を書き込んだり,友達に説明したりする姿が見られた。また、子どもたちは本教材に加点方式が取り入れられていることから、授業だけでなく、休み時間等も活用し、何度も繰り返し挑戦する姿が見られた。その後、対象児童に事後テストと意識調査を行い,文章題アニメーション教材に対してスタイラスペンを活用した授業が,文章題を解く力にどのような効果をもたらすのか検証を行った。その結果,題意を捉え,自分や仲間の考え方を記録し,振り返ることで,文章題を解くことに自信をもち、他の文章題に対しても苦手意識が少なくなり、解く力の育成につながった。
赤痢菌エフェクタータンパクによる宿主免疫応答抑制機構の解明

赤痢菌より宿主細胞内に分泌されたIpaH9.8は、炎症反応の中心的な役割を担う転写因子NF-κBの活性化に必須なIKKγ/NEMOタンパクを標的として攻撃する。IpaH9.8は、自身の有するE3ユビキチンリガーゼ活性によりNEMOをユビキチン化し、プロテアソーム分解へと導く。この結果、NF-κBの活性化が抑制され、赤痢菌感染に対抗するための免疫応答が抑制され、菌は腸管上皮内で感染を持続・拡大する。我々の免疫系は、病原微生物の侵入を感染早期に検知して、素早く免疫系を誘導することで感染を防いでいる。しかしながら、赤痢菌はこの宿主免疫応答を看過するのではなく、III型分泌装置と呼ばれる特殊なタンパク分泌装置よりエフェクター(病原因子)であるIpaH9,8タンパクを細胞内へ分泌し免疫系に対抗する。宿主細胞内に分泌されたIpaH9.8は、炎症反応の中心的な役割を担う転写因子NF-κBの活性化に必須なIKKγ/NEMOタンパクを標的として攻撃する。IpaH9.8は、攻撃目標となる宿主タンパク質を標識するためのE3ユビキチンリガーゼ活性を有しており、このE3ユビキチンリガーゼ活性によりユビキチンで標識化されたNEMOは、宿主細胞のフロテアソームタンパク分解装置により分解される。この結果、NF-κBの活性化が抑制され、赤痢菌感染に対抗するための免疫力が一時的に失われる。菌はこの間に生き延びて腸管上皮内で増殖を継続する。この細菌の驚くべき作用は、マウスを用いた動物感染実験においても証明された。即ち、IpaH9.8タンパクのE3ユビキチンリガーゼ活性により、赤痢菌感染に伴うNF-κB依存的な免疫応答が抑制され、定着菌数の著しい増加が認められた。一方、IpaH9.8のE3ユビキチンリガーゼ活性変異体を発現する赤痢菌感染においては、NEMOのユビキチン化とタンパク分解は認められず、NF-κB活性化に伴い菌は速やかに排除されていた。これらの結果は、侵略者である病原細菌が宿主による攻撃から自身の身を守る手段として、免疫応答抑制という高度な生存戦略により対抗し、感染を成立させていることを裏付けている。IpaH9.8と類似なタンパク質は、赤痢菌以外にサルモネラを始めとするヒト、動物、魚、植物等の病原菌も有していることから、本病原因子を標的とする創薬は、未だ有効で安全なワクチンが存在しない赤痢菌を始め、上述の病原細菌に対する新たな治療法となる可能性があり、また、IpaH9.8によるNEMOへの作用を通じて新たな免疫抑制剤の開発につながると考えられる。多くの病原細菌は感染を成立、持続させるために様々な生存戦略を備えている。細胞内侵入細菌である赤痢菌は宿主の様々な生体防御機構に感知され、激しい炎症を引き起こす。この宿主による過度の炎症反応は菌を排除する方向へと働くため、赤痢菌の感染持続を困難にする。しかし、赤痢菌はこのような宿主免疫応答による攻撃を看過するのではなく、菌の有するIII型分泌装置より分泌される一群の病原因子(エフェクター)の働きにより、それらを回避、抑制するといった生存戦略を備えている。赤痢菌のエフェクターの一つであるIpaH9.8は、炎症反応の中心的な役割を担う転写因子NF-κBの活性化に必須なIKKγ/NEMOタンパクを標的とし、宿主の炎症反応を抑制する。IpaH9.8は、攻撃目標となる宿主タンパク質を標識するためのE3ユビキチンリガーゼ活性を有しており、このE3ユビキチンリガーゼ活性によりNEMOをユビキチン化修飾する。ユビキチン修飾されたNEMOは、宿主細胞のプロテアソームタンパク分解装置により分解される。この結果、NF-κBの活性化が抑制され、赤痢菌感染に対抗するための免疫応答が一時的に失われる菌はこの間に腸管上皮内で増殖する。このIpaH9.8による応答制作用は、マウスを用いた動物感染実験においても証明された。IpaH9.8タンパクのE3ユビキチンリガーゼ活性依存的に、赤痢菌感染に伴うNF-κB依存的な炎症反応が抑制され、定着菌数の著しい増加が認められた。一方、IpaH9.8のE3ユビキチンリガーゼ活性変異体を発現する赤痢菌感染においてはNEMOのユビキチン化とタンパク分解は認められず、NF-κB活性化に伴い菌は速やかに排除されていた。これらの結果は侵略者である細菌が宿主による攻撃から自身の身を守る手段として、免疫応答抑制という高度な生存戦略により対抗し、感染を成立させていることを裏付けている。

IpaH9.8と類似なタンパク質は、赤痢菌以外にサルモネラを始めとするヒト、動物、魚、植物等の病原菌も有していることから、本病原因子を標的とする創薬は未だ有効で安全なワクチンが存在しない赤痢を始め、上述の病原細菌に対する新たな治療法となる可能性があり、また、IpaH9.8によるNEMOへの作用を通じて新たな免疫抑制剤の開発につながると考えられる。
多極小ポテンシャル面とトンネル問題を扱える精密振動回転解析理論の開発と応用

本年度の研究計画は、O2Hラジカルに適用可能な曲線座標の開発及び内部回転を含む系への拡張であった。O2Hラジカルのモード結合は非常に強く、開発した二次の曲線座標ではモード結合が十分小さくできないことが明らかになっていた。そこで、本年度の研究では、より高次の直交曲線座標の表式を導出するための方法を新たに開発した。一般の曲線座標では直交条件が連立二次偏微分方程式で表されるためその表式を導くことは困難であった。本研究では座標軸を表す行列であるヤコビ行列が直交行列を使って表されることを仮定し、ヤコビ行列と曲線座標の媒介変数表示の関係を明らかにすることで、この困難を克服し曲線座標の多項式表示を無限次まで拡張することに成功した。本研究ですでに開発した二次の曲線座標と同様に、この座標系のヤコビ行列がヘッセ行列を対角化するような座標系として定義し、多項式表示の係数を摂動論的に決定する方法を開発した。その結果、無限次まで拡張された方法は、二次で展開を打ち切るとすでに開発した二次曲線座標と全く同じであることが分かった。この座標系を用いたVSCF, VCI, VQDPT計算を、まずは振動解析の結果がすでに蓄積されているNH3で行った。NH3は基準座標の代わりに二次の曲線座標を用いることでVSCFの計算悔結果が大幅に改善される系であるが、縮重モードの振動数が悪くなる事が分かっていた。三次の曲線座標を用いたVSCF計算の結果、縮重モードについても振動数か改善されることを示した。より高次の振動モード結合を解くことが出来たといえる。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。本年度の研究計画は、NH3分子及びH3O+分子イオンを標的として、(1)剛体回転子近似を超えた振動回転の解析及びIRスペクトルシミュレーションを行うプログラムの開発、(2)NH3分子及びH3O+分子イオンで応用計算を行い、その結果を考察し論文で報告する事であった。本年度の研究では、昨年度開発した曲線座標を用いてH3O+分子イオンの振動SCF(VSCF)計算を行い、この曲線座標の問題点が座標の非直交性にある事を明らかにした。これを受け、座標原点近傍で直交するような二次媒介変数で表される曲線座標を新しく開発し、VSCFの計算結果をさらに改善させた。具体的なH3O+分子イオンのVSCF計算結果は、昨年度の手法では傘反転と伸縮の基音振動数に150cm-1以上の実験値との差があったのに対し、今年度新たに開発した手法ではこの差が100cm-1以下になった。これにより、研究目的である振動及び回転の遷移波数を精密に計算するプログラムの為の理論が更に発展し、正確なIRスペクトルシミュレーションを行う事が出来るようになった。また、開発した曲線座標のハミルトニアンの一般的な表式を導出した。これにより、この曲線座標は特に強い三次2モード結合がある系には適さない場合がある事を理論的に明らかにした。また、曲線座標の導出に摂動論的手法を用いる為縮重モードや疑縮重モードがある系に適用できない事も明らかになった。これらをうけ、縮重モードや強い伸縮の結合が原因で直交する曲線座標が利用できないモードのあるH3O+分子を引き続き標的とし、曲線座標を変分的に作る事が出来るか検討する事を計画している。本年度の研究計画は、NH3分子及びH3O+分子イオンを標的として剛体回転子近似を超えた振動回転の解析及び赤外吸収スペクトルシミュレーションを行うプログラムの開発、及びNH3分子及びH3O+分子イオンで応用計算を行い、その結果を考察し論文で発表する事であった。一つ目のプログラム開発において、去年度開発した振動の座標系の取り方がH3O+分子イオンの振動SCF計算には適していない事を計算結果から明らかにした。これを受け新たな座標系の取り方を模索し、H3O+分子イオンにおける去年度の振動座標系の非直交性に問題がある事を明らかにして精密な赤外吸収スペクトルシミュレーションを行うプログラム開発の為の理論を発展させた。また、この曲線座標系を一般化し、曲線座標におけるハミルトニアンの変換を導出し他の分子にも適用できる理論を開発した。従って、期待通りの進展があったと言える。二つ目の計画であった論文での報告には至っていないが、必要な計算のデータ及び考察はできており、投稿に向け準備中である。本年度の研究計画は、内部回転を含む系であるN2(O2)H2O錯体を標的とし、昨年度開発した振動理論が内部回転を含む系に適用可能であるか調べ内部回転を含む系まで振動解析理論を拡張する事、N2(O2)H2O錯体の精密なポテンシャル局面を描く方法を開発する事及びN2(O2)H2O錯体の振動数を計算する事であった。また、昨年度の研究結果を受けて伸縮モード間に強い結合がある系に適用可能な曲線座標を開発する事であった。本年度の研究では、水分子の伸縮モード間に強い結合があり基準座標や昨年度の曲線座標による振動SCF(VSCF)の精度が悪いことを明らかにした。この二モードはローカルモードに取り直すことでモード結合が小さくなることが知られているため、反対称伸縮の遠方でローカルモードに収束するような振動座標系の開発を行い、この二モードに適用した。

この結果を考察し、曲線座標におけるVSCFが水分子の伸縮モードに対して失敗する理由は曲線座標の特異点にあることを明らかにし、伸縮の二モード平面でこれを解決する方法を開発した。この結果、この二モードを用いた振動解析で対称伸縮の基音、倍音振動数をVSCFレベルでFull-CIと誤差一桁cm-1の精度で計算することに成功した。また、内部回転を含む系に類似した系として、角度成分で表すことのできる振動モードに対して2極小のポテンシャルを持ち、それが非常に大きい振幅の領域にあるO2Hラジカルを標的として取り直した。この系に本研究の曲線座標を適用し振動数を計算し、内部回転を含む系へ拡張する準備を行った。本年度の研究計画は、N2(O2)H2O錯体を標的とし内部回転を含む系の振動解析理論開発及びポテンシャル局面計算と振動数計算、昨年度扱ったH3O+分子イオンにおいて振動モード結合を小さくする方法の開発であった。計画ではN2(O2)H2O錯体を標的としていたが、振動自由度が多く、内部回転の安定構造が基準座標空間において非常に離れているために精密なポテンシャル局面の計算が困難であった。振動解析に適切な座標系を見出すためには精密なポテンシャル局面が必要であるので、まず振動自由度の小さい系においてN2(O2)H2O錯体の回転のモードと類似したポテンシャル局面をもつ分子としてO2Hラジカルを発見し、標的にとりなおした。O2Hラジカルは水素原子が一方の酸素原子側からもう一方の酸素原子へ移動するような振動モードを持ち、そのモードに対して二極小ポテンシャルをもつ。また、水素移動のモードとOO伸縮のモードが強く結合しており、この二モード平面上に二つの極小が存在する。これらの極小はN2(O2)H2O錯体と同様に基準座標平面上で大きく離れていることが計算の結果明らかになった。この系における振動モード分割手法を開発することにより内部回転を含む系への応用も期待されるため、進展があったと考えられる。昨年度扱ったH3O+分子は、伸縮モードの強い結合の為に曲線座標が適していないという問題の他に、縮重モードが存在する為曲線座標を定義することが出来ないという問題もあった。そこで、水分子の伸縮モードにも同様のモード結合があることを明らかにし、水分子を標的に取り直した。水分子の伸縮の2モード平面上において対称伸縮に適切な新しい振動座標系を発見し、VSCFでも倍音までの振動数をFull-CIと一桁cm-1の誤差で計算することを可能にした。従って、十分な進展があったと考えられる。本年度の研究計画は、O2Hラジカルに適用可能な曲線座標の開発及び内部回転を含む系への拡張であった。O2Hラジカルのモード結合は非常に強く、開発した二次の曲線座標ではモード結合が十分小さくできないことが明らかになっていた。そこで、本年度の研究では、より高次の直交曲線座標の表式を導出するための方法を新たに開発した。一般の曲線座標では直交条件が連立二次偏微分方程式で表されるためその表式を導くことは困難であった。本研究では座標軸を表す行列であるヤコビ行列が直交行列を使って表されることを仮定し、ヤコビ行列と曲線座標の媒介変数表示の関係を明らかにすることで、この困難を克服し曲線座標の多項式表示を無限次まで拡張することに成功した。本研究ですでに開発した二次の曲線座標と同様に、この座標系のヤコビ行列がヘッセ行列を対角化するような座標系として定義し、多項式表示の係数を摂動論的に決定する方法を開発した。
総腓骨神経を欠損する突然変異マウスの原因遺伝子の解明

本研究では、突然変異により先天的に総腓骨神経が欠損し尖足を示すperoneal muscular atrophy (pma)マウスの原因遺伝子を同定し、発症の分子機序を明らかにすることを目的としている。これまでに連鎖解析により同定したゲノム候補領域内に存在する全ての遺伝子の配列を決定し、ナンセンス変異やフレームシフト変異が無いことを明らかにしている。本研究の開始後に、実施したRNA-seqのデータと、それより前に実施した候補領域のリシークエンスの結果を解析したところ、候補領域内のある遺伝子に正常マウスでは見られない挿入配列があることを見出した。そこで、CRIPSR/Cas9法により、この挿入配列を除去したマウスを作製し、表現型を解析した。このゲノム編集マウスは、新学術領域研究「先端技術基盤支援プログラム」の「先端モデル動物支援プラットフォーム」に採択され、筑波大学生命科学動物資源センターで作製された。この遺伝子改変マウスはpmaの表現型を示さなくなったことから、この配列の挿入が原因であることが分かった。しかしながら、この異常配列の挿入により、挿入部位の遺伝子の発現も変化していることから、この遺伝子発現変化が原因である可能性が考えられる。そこで、CRIPSR/Cas9法を用いてこの遺伝子を改変したマウスも作製し、その表現型を観察した。当施設で用いているCRIPSR/Cas9によるゲノム改変法では卵割途中で遺伝子組換えが起こる結果、体の中で異なる組換えが起こった細胞が混在するキメラ状態になる場合がある。そこで、本研究における解析は全て交配した子孫のマウスを用いて行っている。現在は、これら確立したマウス系統を用いて、表現型解析、遺伝子解析を進めている。本研究は、突然変異により総腓骨神経を欠損したperoneal muscular atrophy (pma)マウスの原因遺伝子を同定することを目的としている。pmaマウスは総腓骨神経が欠損しているために腓骨筋に神経原性の萎縮が生じ、下肢が内反尖足を示す。これまでの研究代表者の研究により、脊髄運動神経軸索が下肢に投射する時期に既に総腓骨神経が欠損していることを明らかにしている。しかしながら、どのような機序で総腓骨神経の欠損が起こるかは不明である。そこで、次世代シークエンスなどを用いて原因遺伝子を特定し、発症の分子機序を解明することを目指している。昨年度、連鎖解析により原因遺伝子があると想定されるゲノム領域を含む約2 Mbの配列をエンリッチして次世代シークエンスにより決定した。今年度は、胎生13.5日のpma(ホモ)マウスとヘテロマウスのトータルRNAを用いてRNA seqを行った。その結果、多数の遺伝子の発現量がpmaマウスで減少していたが、その中に候補領域内の遺伝子も含まれていた。さらに、得られた配列を注意深く解析したところ、候補領域内の遺伝子のイントロン中に、野生型マウスには存在しない配列が挿入されていることが明らかとなった。また、この挿入配列を含む異常な転写産物が作られていることも明らかとなった。今後は、この挿入配列が異常を生み出す原因を明らかにすることを目指す。また、成獣脳における遺伝子発現異常についても解析を進める計画である。本年度に実施したRNA seqにより、pma胎児で発現が変化している遺伝子が明らかになった。さらに、詳細な解析から、候補領域内の遺伝子の1つに野生型では見られない配列が挿入されていることを見出し、研究が大きく進展した。本研究で対象としているperonealmuscular atrophy (pma)マウスは、自然発生の突然変異マウスであり、先天的に腓骨神経が欠損するため腓骨筋が萎縮し、内反尖足を示す。研究代表者のこれまでの研究により、脊髄運動神経が下肢に投射する胎児期から総腓骨神経が欠損していることが分かっているが、原因は不明である。本研究では、pmaマウスの遺伝子異常を明らかにし、発症の分子機序を明らかにすることを目的としている。これまでに連鎖解析を行い、原因となる遺伝子が存在する領域を同定している。前年度、次世代シークエンスを用いて胎生13.5日pmaマウスのRNA-seqを行ったところ、候補領域内の遺伝子発現に異常が見られた。得られたデータを注意深く解析し、以前に行ったゲノム解析結果と照らし合わせたところ、候補領域内のある遺伝子のイントロンに9kbの挿入配列があることが分かった。今年度、in situハイブリダイゼーション法とRT-PCRを用いて当該遺伝子の発現を調べたところ、pmaマウスで遺伝子発現の低下が見られ、挿入配列の転写が起こっていることが分かった。そこで、この異常配列の挿入が原因となっている可能性を考え、CRISPR/Cas9法を用いて異常配列を除去し表現型が消失するかどうかを検討することとした。新学術領域研究「先端技術基盤支援プログラム」の「先端モデル動物支援プラットフォーム」に採択され、目的とする遺伝子編集マウスの一部を作製することができたので、今後そのマウスのラインを確立し、それらを用いてpmaマウスの原因について解析を進める計画である。前年度に実施した次世代シークエンス解析で見つけた異常な挿入配列が転写されていることを見出した。さらに、ゲノム編集技術を用いて異常配列を除去したマウスを作製することに成功し、原因同定に向けて大きく進展した。

これまでに連鎖解析により同定したゲノム候補領域内に存在する全ての遺伝子の配列を決定し、ナンセンス変異やフレームシフト変異が無いことを明らかにしている。本研究の開始後に、実施したRNA-seqのデータと、それより前に実施した候補領域のリシークエンスの結果を解析したところ、候補領域内のある遺伝子に正常マウスでは見られない挿入配列があることを見出した。そこで、CRIPSR/Cas9法により、この挿入配列を除去したマウスを作製し、表現型を解析した。このゲノム編集マウスは、新学術領域研究「先端技術基盤支援プログラム」の「先端モデル動物支援プラットフォーム」に採択され、筑波大学生命科学動物資源センターで作製された。この遺伝子改変マウスはpmaの表現型を示さなくなったことから、この配列の挿入が原因であることが分かった。しかしながら、この異常配列の挿入により、挿入部位の遺伝子の発現も変化していることから、この遺伝子発現変化が原因である可能性が考えられる。そこで、CRIPSR/Cas9法を用いてこの遺伝子を改変したマウスも作製し、その表現型を観察した。当施設で用いているCRIPSR/Cas9によるゲノム改変法では卵割途中で遺伝子組換えが起こる結果、体の中で異なる組換えが起こった細胞が混在するキメラ状態になる場合がある。そこで、本研究における解析は全て交配した子孫のマウスを用いて行っている。現在は、これら確立したマウス系統を用いて、表現型解析、遺伝子解析を進めている。候補領域内に見られた挿入配列が異常を引き起こすメカニズムを探求する。そのために、挿入配列を含むどのような転写産物が作られているかをRT-PCRで調べ、胎児や成獣脳に発現しているかどうかをin situハイブリダイゼーションにより明らかにする。ゲノム編集技術を用いて異常配列を除去したマウスの表現型の有無、胎児期の腓骨神経形成を調べる。また、元来挿入があった遺伝子を含み野生型/ヘテロマウスとの間に発現量の差がみられた遺伝子の発現回復がみられるかをRT-PCR並びにRNA-seqを用いて検証する。さらに異常な配列の挿入のために遺伝子発現が低下したことが原因であるのか、異常配列の発現が原因であるのかを区別するため、異常挿入を受けた遺伝子を破壊したマウスを作製し、その解析を行う。