hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
有機溶媒耐性及び高温耐性シトクロムP450の精製と医薬品合成及び異物代謝への応用

好熱菌由来のチトクロームP450(P450)の三次構造安定性を利用して、有機溶媒中で有機物質を代謝できる酵素系の構築を目的とし、この反応系を医薬品合成や環境中のダイオキシンやPCBなどの異物分解に応用することを目標とする。まず、好熱菌Thermus thermophzlus由来のP450であるCYP175AlcDNAを単離し大腸菌で発現させ、これがβ-カロテンを代謝することを明らかにした。さらに、平成19年度においては、未知であったP450電子伝達系の精製・単離を試みた。Thermtus thermophilusの細胞質画分をイオン交換クロマトグラフィーにより大きく6つの画分(AF)に分画し、それぞれの画分とCYP175A1、NADPHを混合し、β-カロテンへの水酸化活性を測定したところ、画分Cと画分EとCYP175A1、NADPHを混合した時にのみ水酸化活性が検出された。このため、画分Cと画分Eをそれぞれアフィニティークロマトグラフィー(ADP-Sepharose)や疎水性クロマトグラフィー(butyl-Sepharose)などを用いてさらに分画し、どの画分に電子伝達系が存在しているかを確認するため、前記と同様にそれぞれの画分とCYP175A1、NADPHを混合しβ-カロテンへの水酸化活性を測定した。これらの因子が単一バンドにまで精製されたところで、MALDI-TOF/MSを用いて、そのバンドに含まれるタンパク質を同定したところ、画分Cに含まれるタンパク質はthioredoxin reductase、画分Eに含まれる電子伝達タンパク質はferredoxinであることが明らかとなった。この結果から、CYP175A1の電子伝達系はNADPHを電子供与体として、thioredoxin reductase及びferredoxinから構成されていることが明らかとなった。さらに、これらを大腸菌に発現させ精製して、熱安定性を確認した。シトクロムP450(P450)は、生体に進入した薬物や内分泌かく乱物質などの外来異物を酸化して代謝する酵素である。本研究は、P450のこの反応を有機合成に応用することを目的とする。P450を有機合成反応に利用するための最も大きな問題は、多くの場合有機合成反応は有機溶媒中で行われ、この条件下でタンパク質であるP450は変性してしまい、酵素活性が失われることである。そこで、本研究では好熱菌から熱安定性のP450を単離して、その三次構造安定性を利用して、有機溶媒中で安定な酵素反応系を構築する。好熱菌のP450としては、Sulfolobus solfataricus由来のCYPII9とThermus thermophilus由来のCYP175A1の二種類が知られているが、今回は動物の薬物代謝P450に比較的相同性のあるCYP175A1を単離し、酵素としての性質について検討した。遺伝子を単離して、大腸菌でタンパク質を発現し、まず熱耐性についてSoret帯450nmの吸収で検討した。比較のために用いたラットCYP1A1が50%の残存酵素活性を持つ温度Tm 41°Cに対し、CYP175A1はTm83°Cであり、熱耐性が確認できた。そこで、この酵素を用いて有機溶媒耐性を検討した。溶媒としてDMSOを用いた場合、CYP1A1は20%で残存活性50%であったが、CYP175A1は70%まで安定であった。酵素活性について、Sulfolobus solfataricusから単離した電子伝達系を用いて代謝活性を検討した。CYP175A1はβ-カロテン水酸化活性を有したが、多くの動物由来のP450基質である7-エトキシクマリンは代謝しなかった。今後、CYP175A1のアミノ酸置換を行い薬物が代謝できる酵素を設計することと、まだ明らかでないCYP175A1の本来の電子伝達系を単離することを行う予定である。

これらの因子が単一バンドにまで精製されたところで、MALDI-TOF/MSを用いて、そのバンドに含まれるタンパク質を同定したところ、画分Cに含まれるタンパク質はthioredoxin reductase、画分Eに含まれる電子伝達タンパク質はferredoxinであることが明らかとなった。この結果から、CYP175A1の電子伝達系はNADPHを電子供与体として、thioredoxin reductase及びferredoxinから構成されていることが明らかとなった。さらに、これらを大腸菌に発現させ精製して、熱安定性を確認した。
新規がん抑制遺伝子ASK2の発現制御機構の解析

我々は、ストレス応答MAPキナーゼ経路(JNKならびにp38経路)の制御因子である新規MAP3K分子ASK2を見出し、ノックアウトマウスを用いた二段階皮膚腫瘍形成実験により、ASK2が腫瘍形成の抑制に働くことを明らかにしている。ヒトにおいては、多くの消化器系がんの細胞株、とくに食道がん細胞株においてASK2の発現が低下しており、食道がん原発巣における免疫組織化学染色によるASK2の発現検討では、約半数の組織において、周囲正常組織と比較してASK2の発現が低下していた。このような結果からASK2が食道発がんに対しても抑制的に働くことを予想し、マウスへの4-NQO投与による食道発がん実験を行った。その結果、野生型マウスにおいては多数の扁平上皮がんが形成されたのに対して、ASK2ノックアウトマウスにおいては形成された腫瘍数が少ないことが明らかとなり、予想に反して、少なくともマウス食道における化学発がん系ではASK2は発がんの促進に働くことが示唆された。さらに、マウスの食道におけるASK2の発現をin situ hybridizationにて検討したところ、ASK2はおもに粘膜上皮の基底細胞層に発現していた。ASK2発現細胞層は4-NQOの短期投与に応答して肥厚し、ASK2ノックアウトマウスにおいてはその肥厚が少ない傾向が認められたことから、ASK2は4-NQOに応答した細胞増殖に関わっている可能性が考えられる。以上の結果より、ASK2は、恐らくは組織や発がん刺激の違いに応じて、がんの抑制にも促進にも働きうることが示唆され、その機能を制御する機構を明らかにしていくことが今後の重要な課題である。我々は、ストレス応答MAPキナーゼ経路(JNKならびにp38経路)の制御因子である新規MAP3K分子ASK2を見出し、ノックアウトマウスを用いた腫瘍形成実験により、ASK2ががん抑制因子として機能することを示す結果を得ている。実際、ヒトにおいても、子宮頸がん、卵巣がん、口腔がん、食道がん、胃がん、大腸がんの各がん細胞株について、mRNAレベルでの発現を定量的PCR法によって検討した結果、口腔がん、食道がん、胃がん、大腸がんの細胞株において,ASK2 mRNAの発現が明らかに低下している細胞株が多く検出された。この傾向は食道がん細胞株においてとくに顕著であったため、ヒトASK2を特異的に認識するモノクローナル抗体を作製し、約100例の食道癌原発巣におけるASK2のタンパク質発現レベルを免疫組織化学染色にて検討した。その結果、約半数の組織において、周囲正常組織と比較してASK2の発現が明らかに低下していることが明らかとなった.また、がん組織におけるASK2の発現低下機構を探るため、ASK2発現の低下しているいくつかの食道がん細胞株に脱メチル化剤を投与したところ、ASK2発現の回復が観察された。よって、ASK2の発現抑制の少なくとも一部にDNAメチル化が関与している可能性が考えられた。現在、ASK2発現低下の機構をさらに解析を進めるとともに、食道がんの発癌過程におけるASK2の役割を検討するため、マウスの食道発がんモデルを用いた解析を進めている。
三次元空間における顔知覚に関する発達的研究：立体としての顔・空間の中の顔

2012年度は、「顔」知覚特有の空間情報の処理について、特に、上下を逆さまにすると、顔は他の物体に比べてより同定し難くなるという倒立効果について検討した。前年度から実施していた乳児を被験者とした研究では、乳児が上半に要素が多い(top-heavy)図を下半に要素が多い(bottom-heavy)図よりも選好するという性質について運動情報による促進効果を明らかにし、欧文学術論文が1編が採択された。さらに、成人を被験者として脳磁図(Magnetoencephalography, MEG)を用いて実験を実施した。ヒトの視覚諸領野における「顔」知覚特有の空間情報の処理について以下の2つの実験を実施し、国際シンポジウムを含む5件の発表を行い、欧文学術論文国際誌に欧文学術論文が1編が採択された。さらに1編を投稿予定である。実験1:すべての画像は空間周波数成分の和で表すことができる。網膜への入力という視覚刺激という点において「顔」も例外ではない。ある視覚刺激に対する特有の活動とは、その刺激に含まれる各空間周波数成分に対する応答の和では説明できない活動と定義できる。「顔」特有の活動を適切に判断するためにも、空間周波数の影響という基本特性を検討することは重要である。本実験ではMEGを用いて、空間周波数の影響を視覚諸領野で比較し、ヒト視覚野の領野により空間周波数の影響が異なることを明らかにした。実験2:本実験では、MEGを用いて、顔図形・眼のみ・口のみ、およびそれらを上下反転させた図形に対する脳活動を計測した。その結果、潜時120-180msにピークを示す成分については、正立顔に対する応答は、同じ潜時における口への応答に眼への応答よりも類似し、一方、倒立顔に対する応答は、眼への応答に類似していることが示された。顔全体への応答は、下視野の要素に対する応答に類似ている可能性が示されたと言える。24年度が最終年度であるため、記入しない。本研究の目的は、三次元空間における「顔」知覚の発達について、乳児を対象とした行動実験により検討することである。H23年度には、「顔」を「立体」として知覚する能力および「顔」を用いて「空間」を知覚する能力の発達について、以下の2つの行動実験により検討した。まず、実験1では、実際にはお面の裏のようにへこんでいても出っ張って見えるという錯視(Hollow Face錯視)が、乳児にも見えているかを検討した。実験の結果から、立体形状を知覚できる生後7-8ヶ月児でも、成人と同様にはHollow Face錯視を知覚せず、へこんだ顔はへこんで見えることが明らかになった。このことは一般的な立体形状の知覚の発達に比して、「顔は出っ張っているものだ」という顔の立体形状についての仮定の発達が緩やかであることを示唆している。本研究の結果は、英語の学術論文としてi-Perception誌に掲載された。さらに実験2においては「顔」を用いて「空間」を知覚する能力の発達について、生後4-5ヶ月児でも、成人と同様に、大きな顔の方が小さな顔よりも近くにあるように見えることを明らかにした。本研究の結果は、国際学会であるThe 34th European Conference on Visual Perceptionで発表し、英語の学術論文として投稿中である。顔知覚は、空間情報の処理とは異なる、脳内の特定部位において処理されることが多くの研究により示されている(Kanwisher et al.,1997)。「顔」知覚においては主に腹側経路が活動し、立体および空間知覚においては主に背側経路が活動するというものである。本研究は、「顔」という社会的コミュニケーションをとる手段としての意義が大きい視覚刺激の三次元情報の処理の発達を明らかにできるとともに、腹側経路と背側経路の情報の統合の発達の解明にもつながるものである。

実験2:本実験では、MEGを用いて、顔図形・眼のみ・口のみ、およびそれらを上下反転させた図形に対する脳活動を計測した。その結果、潜時120-180msにピークを示す成分については、正立顔に対する応答は、同じ潜時における口への応答に眼への応答よりも類似し、一方、倒立顔に対する応答は、眼への応答に類似していることが示された。顔全体への応答は、下視野の要素に対する応答に類似ている可能性が示されたと言える。24年度が最終年度であるため、記入しない。本研究は、三次元空間における「顔」知覚の発達について、乳児を対象とした行動実験により検討することを目的としている。H23年度は「顔」を「立体」として知覚する能力について、国内外の共同研究者と共に一般的な立体形状の知覚の発達に比して、「顔は出っ張っているものだ」という顔の立体形状についての仮定の発達が緩やかであることを示し、英語の学術論文として発表した。さらに、「顔」を用いて「空間」を知覚する能力の発達についての英語の学術論文を1本投稿中である。本研究はおおむね問題なく進展していると言える。大きな変更として、H24年度は研究代表者の所属変更により、乳児を対象とした行動実験を国内外の研究協力者の研究室で実施する必要が生じている。このため、研究代表者が研究協力者の研究室に出張し、直接議論を重ね、実験準備および実験実施者へのインストラクションを行なうことを予定している。さらに、H24年度からの研究代表者の所属機関では、脳磁図(MEG)を用いた実験も可能であることから、本研究課題を発展させるものとして、「顔」の空間情報処理における成人の脳活動の測定も視野に入れ、研究協力者およびH24年度からの研究代表者の所属機関との調整を行なう。
沖合を航行する船舶のAISデータを転用する巨大津波の流速の計測とリアルタイム予測

国際海事機関(IMO: International Maritime Organization)のSOLAS(Safety of Life at Sea)条約に基づき、海上の安全を確保し、海運・海上貿易の動向を把握するために、規定の船舶は、その位置情報を含む所定の情報を、AIS(Automatic Identification System)データとして、連続的に発信する規則になっている。発信されたAISデータは、沿岸の固定受信局または低高度軌道衛星で受信され得る。研究代表者は、IMO規則によって収集されているAISデータが、特別な付加情報無しで、津波に伴う流れを検知できるかを調査している。現状、2011年の東北地方太平洋沖地震に伴う巨大津波による流れが、当時に沖合を航行していた船舶のAISで、定量的に検出できることを確認した。この結果は、沖合を航行する無数の船舶が、特別な設備投資を行うことなく現時点で、津波の流れを検知するセンサーとしての機能を有していることを示している。研究代表者は、この成果を学術論文として発表した。国際誌に掲載されたこの論文は、研究アウトリーチの出版社に、ハイライト記事として取り上げてもらった。研究の現状では、2011年の単一の地震津波についてのみの調査しかなされていない。今後、津波検出レベルの詳細評価、および、日本だけでなく海外も含めその他の地震津波イベントを対象に調査を拡大する予定である。研究計画時の期待と同等かそれ以上の成果が出てきている。マグニチュード9に達する超巨大地震津波に対しては、AISデータは、十分に津波を検知できることを確かめた。今後、国内外の中規模(マグニチュード78)な津波イベントを対象に調査を拡大する予定である。予定していた国内出張のうち1回が不要になったため。
突発的な遅延・欠航発生時の航空旅客の対応行動を考慮した損失便益推計手法の構築

(1)2018年理:前々年度,関係主体(大手航空会社2社,空港管理者)に行なったヒアリング調査に基づき,事故発生後の対応行動を時系列で整理した.(2)既往研究レビュー:交通サービス途絶時の旅客の対応行動に関する既往研究について整理し,また機会損失の経済価値の評価に関する既往研究を収集した.(3)旅客の対応行動の特性分析:2017年の大韓航空機エンジン火災事故,および2018年1月の大雪による突発的なフライトキャンセルにより,移動に制約を強いられた旅客の,行動データ等をインターネット調査により収集した.(4)突発的フライトキャンセル発生時の旅客の対応行動について体系的整理を行い,モデル推定のフレームワークを構築した.(5)構築したフレームワークに基づき,旅客の階層的な対応行動の検証を行った.その結果を踏まえて,対応行動のモデル推定に着手した.平成30年度に,突発的フライトキャンセル発生時の旅客の対応行動について体系的整理を行い,モデル推定のフレームワークを構築した.また大韓航空機エンジン事故および平成30年1月の大雪を対象にして行った2度のインターネット調査データを用いて,構築したフレームワークに基づき,旅客の階層的な対応行動の検証を行った.その結果を踏まえて,対応行動のモデル推定に着手した.当初の研究計画のにおいては,年度末までに対応行動のモデル推定を終える予定であったが,行動モデルのパラメータ推定に必要なデータ整備に時間を要したことから,現段階ではモデル推定を完全には終えていない状況にある.上記の内容を鑑み,「やや遅れている」と自己評価した.平成30年度に終える予定であった「旅客の対応行動モデリング」については,早めに対応を図ることとする.その上で,以下に記す平成31年度の研究計画を着実に実施し,本研究課題の遂行を目指す.(平成31年度の計画)・旅程変更に対する旅客の支払意志額WTP,受取意志額WTAのモデルを推定する.・幹線旅客純流動データを用意し,時間帯別,空港OD別の旅客数データを作成する.・突発的な遅延・欠航が生じた際の損失便益・機会損失の推計を行なう.・運航が早期再開されたケースを想定し,損失便益・機会損失がどれだけ減少するかを推計する.・調査・分析の結果を纏め,研究成果を総括する.(1)大韓航空機エンジン火災事故発生後の対応の整理:前年度,関係主体(大手航空会社2社,空港管理者)に行なったヒアリング調査に基づき,事故発生後の対応行動を時系列で整理した.(2)既往研究レビュー:交通サービス途絶時の旅客の対応行動に関する既往研究について整理し,また機会損失の経済価値の評価に関する既往研究を収集した.(3)旅客の対応行動の特性分析:大韓航空機エンジン火災事故により移動に制約を受けた方々を被験者として実施したアンケート調査のデータを用いて,事故後の対応行動を分類した.その結果,新幹線が航空機の代替機能を果たしていたこと,関東と北海道・四国・九州とを結ぶ路線の旅客の多くが,当日中の移動を諦めていたこと,さらに旅行自体も中止する旅客が多くいたことが明らかとなった.(4)突発的フライトキャンセルの発生に備え,本調査用のアンケート調査票(基本形)を作成した.(5)2018年1月22日から23日未明にかけて降った大雪により,成田・羽田空港を中心に国内線400便以上が欠航し,また成田空港では約10,000人が空港で一夜を明かすという出来事が発生した.本研究の調査事象と捉え,2月22日2月24日にインターネット調査を実施し,計515サンプルの標本を収集した.(6)新たに収集したデータを用いて対応行動の特性分析が進められるよう,周辺情報(代替交通手段のサービス水準など)の整備を行なっている.平成29年度に予定していた調査や分析(ヒアリング結果の整理,関連研究のレビュー,調査票の設計)については概ね進めることができた.特に,いつ生じるか予見できない突発的フライトキャンセルが,1月に大雪という形で発生し,移動の制約を受けた旅行者を対象にしたアンケート調査が実施できたことで,本研究を遂行する上での貴重なデータを収集することができた.一方,突発的フライトキャンセルが生じた際の,旅行代理店や宿泊施設の対応については,未だヒアリング調査が実施できていない.(1)2018年理:前々年度,関係主体(大手航空会社2社,空港管理者)に行なったヒアリング調査に基づき,事故発生後の対応行動を時系列で整理した.(2)既往研究レビュー:交通サービス途絶時の旅客の対応行動に関する既往研究について整理し,また機会損失の経済価値の評価に関する既往研究を収集した.(3)旅客の対応行動の特性分析:2017年の大韓航空機エンジン火災事故,および2018年1月の大雪による突発的なフライトキャンセルにより,移動に制約を強いられた旅客の,行動データ等をインターネット調査により収集した.(4)突発的フライトキャンセル発生時の旅客の対応行動について体系的整理を行い,モデル推定のフレームワークを構築した.(5)構築したフレームワークに基づき,旅客の階層的な対応行動の検証を行った.その結果を踏まえて,対応行動のモデル推定に着手した.平成30年度に,突発的フライトキャンセル発生時の旅客の対応行動について体系的整理を行い,モデル推定のフレームワークを構築した.また大韓航空機エンジン事故および平成30年1月の大雪を対象にして行った2度のインターネット調査データを用いて,構築したフレームワークに基づき,旅客の階層的な対応行動の検証を行った.

その結果を踏まえて,対応行動のモデル推定に着手した.当初の研究計画のにおいては,年度末までに対応行動のモデル推定を終える予定であったが,行動モデルのパラメータ推定に必要なデータ整備に時間を要したことから,現段階ではモデル推定を完全には終えていない状況にある.上記の内容を鑑み,「やや遅れている」と自己評価した.突発的フライトキャンセルが発生した際の旅客の対応行動に関するデータを,プレ調査(平成28年5月大韓航空機エンジン火災事故)を含めて2回の事象について収集することができた.今後は,これらのデータを用いて,旅客の対応行動の特性分析(旅行実施/キャンセルの選択要因の特定,移動手段の選択要因の特定,旅行延期・中止の選択要因の特定)を通じて,対応行動の数理モデルの構築を進める予定である.また旅行に係わる関係主体へのヒアリングを積極的に行ない,突発的フライトキャンセル発生時に移動を制約された旅客への対応方法に関する意向と,その可能性についてヒアリングを通じて整理する予定である.平成30年度に終える予定であった「旅客の対応行動モデリング」については,早めに対応を図ることとする.その上で,以下に記す平成31年度の研究計画を着実に実施し,本研究課題の遂行を目指す.(平成31年度の計画)・旅程変更に対する旅客の支払意志額WTP,受取意志額WTAのモデルを推定する.・幹線旅客純流動データを用意し,時間帯別,空港OD別の旅客数データを作成する.・突発的な遅延・欠航が生じた際の損失便益・機会損失の推計を行なう.・運航が早期再開されたケースを想定し,損失便益・機会損失がどれだけ減少するかを推計する.・調査・分析の結果を纏め,研究成果を総括する.突発的フライトキャンセルの発生と,その規模は,不確実の下での出来事であるため,調査の規模(収集サンプル数,調査項目)を事前に確定することは困難である.平成29年度の調査は,515サンプルと比較的小サンプルであったため,予定したよりも少額の支出となった.当該年度においては,北海道胆振東部地震により突発的なフライトキャンセルが生じたものの,その影響範囲は限定的であることから,本研究の調査対象事例とはしなかった.そのため,昨年度は調査を実施するに至らなかった.そこで予算立てしていた費用については,次年度に使用することとした.また旅行関連事業者からの専門知識の獲得(供与)を図り,突発的フライトキャンセルが発生した際に,移動制約を受けた旅客への対応方法について議論を進める予定である.
創造的思考力と論理的思考力に関する科学的教育課程基準の編成原理の研究

本研究は、科学を通じて生徒の創造的思考力と論理的判断力を体系的に育成する科学教育課程を編成する基準について検討する基礎的研究資料として有用となる海外(英米)とわが国の以下の状況について調査を行ったものである。(1)英国に関する調査ナショナルカリキュラムでの関連事項、GCSE及びGCE試験シラバスでの関連事項、科学とテクノロジーとの関連、「デザイニング」の学習に関する関連事項、教科書事例の分析、SATIS、CASEプロジェクトでの関連事項、北アイルランドにおける事例、その他(2)米国に関する調査科学教育スタンダードでの関連事項、Project2061での関連事項、AP試験制度、科学とテクノロジーとの関連、教科書事例の分析、FOSS、DASH、BSCSプロジェクトでの関連事項、ノースカロライナ州における事例、その他(3)わが国に関する調査昭和26年改訂学習指導要領とその検定教科書事例の分析、その後の学習指導要領の変遷過程の分析、理科と他教科との関連、スーパーサイエンスハイスクールに係わるカリキュラム事例の分析、児童生徒の意識形成に関する分析、その他これらの調査に基づく主たる研究上の示唆は、(1)英米と比較して、わが国では、科学に関する教育に何を含むべきかの検討が不十分であること、(2)今後の初等中等教育で、科学の社会的側面や技術的側面を含めた理科の応用場面や課題研究などを重視し体系的に発展させることが、英米での先進的実践を広く活用することを可能とし、またわが国独自の高度な科学教育プログラムの創出にもつながると考えられること、である。
固体表面構造を配位圏にもつ有機金属錯体の光活性化による触媒設計

本研究では、固体表面に固定化した有機金属錯体を光活性化し、新規な光触媒を設計することを目的とした。固体としては、光透過性に優れている多孔質バイコールガラス(PVG)を、有機金属錯体としては金属-金属間の結合を有さず、ロジウム原子間が塩素原子で架橋されているクロロジカルボニルロジウム(I)ダイマー、[RhC1(CO)_2]_2、を研究対象とした。PVG上のロジウムダイマー錯体の光照射による構造変化を紫外可視吸収分光法で検討した。担持直後のロジウムダイマー錯体の吸収スペクトルは、溶液中の吸収スペクトルとほぼ同じであり、錯体はPVG表面上に構造を保持したまま存在していることが判明した。担持錯体に脱気下で光照射を行うと、元々の吸収スペクトルが減少し、新たに230nm付近に幅広い吸収が現れ、光照射による構造変化が示唆された。光照射下で担持錯体から脱離するガスは、ロジウムダイマー錯体の配位子である一酸化炭素であることが質量分析法により確認された。このことから、配位子の一酸化炭素が光脱離し、ロジウムダイマー錯体の構造が変化したと推察される。15EA03:プロピレンの水素化反応をテスト反応として、ロジウムダイマー錯体の構造と光触媒活性との関連を検討した。その結果、担持直後のロジウムダイマー錯体は光触媒活性を示さず、光照射を続けることで誘導期を伴って徐々に定常活性が現れてくることが明かとなった。また、予備光照射を行うことで誘導期は短くなることも明かとなり、光照射下で構造変化したロジウムダイマーが光活性種であることが明かとなった。また、プロピレンの光水素化反応について、反応速度に対するプロピレン圧および水素圧の依存性に基づき、反応機構を提案した。
19C日本語研究資料が記した標準日本語の基礎的調査と研究

国内外に点在する日本語研究資料(文法書・辞書・テキスト等)は,それぞれに背景を持っている。それは,時代,人物が深く関与して,現在の状況を形成していることによる。そして,これらの研究は,先学によって着実に行われてきている。しかしながら,近年まで,インターネットやデジタルカメラといった電子デバイスすら存在しない状況での資料の所蔵確認,閲覧,書誌情報の記載,データ保管は,とても困難なものであったと推察される。そのために,本調査を行うまで,書誌的な情報が残されながらも,実際の存在自体が明瞭ではなかったものも存在した。これらの問題点をクリアできた大きな要因は,事前に現地の機関のOPACなどにアクセスし,連絡を取りながら,現地におもむくことができたことによる。さらに,数十年前に比して,大量のデータを簡便に撮影,保存することが可能となったも重要である。一方,時間や労力をかけての実地踏査は不可欠であることを再認識する機会ともなった。実地におもむき,資料や担当者と対面して閲覧することで,見込み違いや誤りをあらためることができたためである。収集した資料については,継続して解析を行いながら,資料の公開,また研究成果を発表していく予定である。並行して,幕末・明治期の辞書のデータベースを構築しつつある。データに関しての整理,検討を加えながら,自身の研究に寄与するように進めている。さまざまな日本語研究資料の電子化は実際の図版ともども急務であり,特に資料の劣化と正面から向き合う必要があることを実感している。以上,入手した資料や情報をもとに,継続して,次年度も取り組んでいきたい。19Cの日本語研究資料を検討するために,さまざまな資料を実見,確認することを継続して行った。また,あわせて関連する資料群についても考慮しながら進めた。国内では長野,関西での調査を行い,資料を収集することができた。海外での調査ではオランダに赴いての機会を得ることができた。これらの資料については,引き続いての調査を行うべきものばかりである。また,シンポジウム(日本,中国)での発表を計3回行うことができた。漢字文化圏における日本語研究資料のとらえ方をはじめ,有意義な意見交換が行えた。今後に活かしたい。継続して,国内外で外国人宣教師等によって作成・刊行された日本語研究資料の資料収集,また解析を行う。特に,江戸期から明治期にかけての標準日本語の成立と展開を日本人による資料群から探ることには,各資料の趣旨や性質,そして対象の異なりなどから,一元化しがたく不明瞭になる面がある。一方,日本語の解析という立場と,実際の日本語の使用の必要性から編まれた日本語研究資料を中心に据えることで,19Cの標準日本語を導き出せる可能性があると考える。様々な日本語研究資料における個々の基準軸に配慮しながら諸資料との比較検証を行うことで,19Cの標準日本語の実態を現代日本語への展開を考慮しながら追究することとしたい。19Cの日本語研究資料からことばの常用性をはかる一環として,諸点からその解析を試みた。・1870年代の独和辞書と和独辞書の序文について翻訳を行い,さらに各辞書の代表的な見出し語の訳語比較を試みた。主に訳語との関わりとなるが,対象とした辞書間だけでも大きな変化があったため,それ以後のドイツ語の影響力による訳語の展開を検討していく要がある。また,先行する日本語研究資料からの関わりについても整理を行った。あわせて,印刷,出版に加え,使用される字体,分量(収録語数・頁数など),形態・内容(見出し語・品詞表示・語義・用例・類義語など),構成・体裁(段組・大きさ・巻数・装丁など)といったことも対象とした。・キリシタンから現代への日本語のローマ字転写の変遷から,標準日本語の音価について史的観点から整理を行った。母語の影響による異なりと,概念による異なりと,それぞれの事由を体系的にとらえなおすことを試みた。・現代の「自然」に該当する外国語と,それに付された日本語の訳語について,16Cから19Cの対訳辞書を中心に,先行研究のとらえ方について疑問となる点などを含め検討を行った。それぞれの文献資料における記述から相互の関連性と言ったことも見出すことができるものと考える。・代表的な19Cの文語文の資料を中心に用いることで,漢文訓読文と和文といったものへの当時の意識,また近現代的な文体への展開などについて考察を加えた。以上,さまざまな角度からの調査・考察となっているが,中心軸となる日本語の指標の整備を継続して行い,上記のそれぞれの事象をひとつの手掛かりに日本語研究資料のさらなる調査・考察を展開する予定である。19Cの標準日本語の軸を定めるべく,さまざまな日本語研究資料を実見・確認することに努めた。さらに,日本語研究資料をなし得た人物に関わる資料(例,書簡,日記)についても同様である。国内では京都,福岡で調査と資料収集を行った。また,海外でのシンポジウム発表(中国),資料調査(アメリカ),シンポジウム参加(韓国)では,貴重な意見交換や資料閲覧の機会を得た。何よりも原資料の確認が欠くことができないことをあらためて実感している。なお,収集した資料の解析も並行して行っている。19Cの日本語研究資料からことばの常用性をはかる一環として,今年度も継続して諸点からその解析を試みた。

・日本人のとらえた外国語と,外国人がとらえた日本語,それぞれの軸足の違いを考慮しながら,オランダ語,英語,ドイツ語,フランス語,ロシア語に関わる対訳辞書について,整理し,検討を加えた。特に,蘭学から英学へのシフトとは密接に関わりを持ちながら,蘭学と英学の成果をベースとして諸対訳辞書が編まれている。そして,基底にはオランダ語の蓄積が大きく影響していることを全体的に再確認を行った。また,海外で編まれた語彙集も大きな影響を与えている。・日本語のローマ字綴りの相違は,個人によるものなのか,母語干渉によるものなのか,一時的な齟齬であるのか,さまざまな事由が考慮される。これらをひとつひとつ紐解いて,おおきな枠組みというものを検討した。解析を行うことで,語彙などによって相関関係を把握すると同時に,日本語のローマ字綴りの異なりが指標になると考える。・日本語研究資料の位置づけを考える際に,国内での日本語の評価というものに視点が及びがちであるが,そこにいかなる時代,また人が関与したのか,俯瞰的な視点で解釈を行うことに留意した。特に,印刷技術,交通,条約,制度といったものが,標準日本語の流布に大きな影響力をもたらしている。以上,さまざまな角度からの調査・考察となっているが,継続して,日本語研究資料を解析していくことで,その実態に迫り得るものと考えている。19Cの日本語研究資料を検討するために,さまざまな資料を実見,確認することを継続して行った。また,あわせて関連する資料群についても考慮しながら進めた。国内では関西,九州地区での調査を行い,資料を収集した。海外での調査ではヨーロッパに赴いての機会を得ることができた。これらの資料については,引き続いての調査を行うべきものばかりである。また,シンポジウム(イギリス)で発表を行い,海外からの視点で日本語をとらえなおすという積極的な意見交換が行えた。今後にいかしていきたい。国内外に点在する日本語研究資料(文法書・辞書・テキスト等)は,それぞれに背景を持っている。それは,時代,人物が深く関与して,現在の状況を形成していることによる。そして,これらの研究は,先学によって着実に行われてきている。しかしながら,近年まで,インターネットやデジタルカメラといった電子デバイスすら存在しない状況での資料の所蔵確認,閲覧,書誌情報の記載,データ保管は,とても困難なものであったと推察される。そのために,本調査を行うまで,書誌的な情報が残されながらも,実際の存在自体が明瞭ではなかったものも存在した。これらの問題点をクリアできた大きな要因は,事前に現地の機関のOPACなどにアクセスし,連絡を取りながら,現地におもむくことができたことによる。さらに,数十年前に比して,大量のデータを簡便に撮影,保存することが可能となったも重要である。一方,時間や労力をかけての実地踏査は不可欠であることを再認識する機会ともなった。実地におもむき,資料や担当者と対面して閲覧することで,見込み違いや誤りをあらためることができたためである。収集した資料については,継続して解析を行いながら,資料の公開,また研究成果を発表していく予定である。並行して,幕末・明治期の辞書のデータベースを構築しつつある。データに関しての整理,検討を加えながら,自身の研究に寄与するように進めている。
日本語文法研究史における『春樹顕秘抄』と『春樹顕秘増抄』の位置づけについて

本研究は中・近世に流布されたテニヲハ論書の記述を通して、当時の日本人の文法意識の変遷を明らかにする通時的なテニヲハ論研究の中に位置づけられる。取り上げる文献は、初期のテニヲハ論書「姉小路式」の増補本系列に属する『春樹顕秘抄』と『春樹顕秘増抄』である。その記述の調査と分析を通して、両書の著者がどのように「姉小路式」の記述を踏襲し、また自らのテニヲハ観を取り入れて後世に伝えようとしたのかを明らかにする。テニヲハ論書が具体的にどのように江戸期の日本語学研究へ繋がったのかという日本語文法研究史の断片史を明らかにする。本年度は、『春樹顕秘抄』と『春樹顕秘増抄』の日本文法研究史における位置づけを明らかにするために、テニヲハ論研究史の整理を行った。中世を中心に行われた和歌におけるテニヲハの使い方を論じる歌学書、即ちテニヲハ論書は、その内容の文法研究における価値が現代の視点から見て低いことから、さほど焦点を当てられて来なかった。福井(一九六四イ、ロ)、根来(一九八〇)、テニハ研究会(二〇〇三)、根上(二〇〇四)といった専著のほか、飯田、井上、佐田、佐藤、永山らによる一連の個別研究が挙げられるが、決して主要な研究テーマとはされていない。テニヲハの研究史に関しては、山田孝雄の『国語学史要』(一九三五)『国語学史』(一九四三)をはじめとしていくつかの記述があるが、この数十年の間に世に出された日本語史の概説書に、説かれている内容は、いずれも井上(一九六四)と根来(一九八〇)の域を出ていない。研究代表者は、近年の最新研究成果をも取り入れつつ、漢文訓読に触発されたテニヲハ意識から日本語の特徴に即したテニヲハに関する言及、そして秘することに徹した和歌作法上のテニヲハ専論からその秘伝主義から脱しようとする過渡期のテニヲハ論へという流れを追ってテニヲハ論研究史の再整理を試みた。本年度はまず研究対象となる『春樹顕秘抄』と『春樹顕秘増抄』の複数の影印資料を入手し、また手がかりとなる同時代の資料の分析を進めている。テニヲハ研究史を最新の研究成果を取り入れて再整理を行っている。日本語学史研究におけるテニヲハ研究の流れを明かにすることを試みている。しかし、この間に全く進展が見られなかったわけではない。先学によって明らかにされてきた学恩に負いつつ、近年の研究成果をも取り入れて、漢文訓読に触発されたテニヲハ意識から日本語の特徴に即したテニヲハに関する言及、そして秘することに徹した和歌作法上のテニヲハ専論からその秘伝主義から脱しようとする過渡期のテニヲハ論へという流れを追ってテニヲハ論研究史を再整理することを試みる。概ね当初の計画書通り、『春樹顕秘抄』と『春樹顕秘増抄』の翻刻作業と校勘作業を行い、「『姉小路式』の記述を踏襲した項目」「新たに加えられた項目」を中心に項目の増減について調査を行った。旧派テニヲハ論書と江戸期の日本語研究とのつながりを考えるために、先学の学恩を負いつつ、従来の知見にさらに近年の研究成果を取り入れて旧派テニヲハ研究史の流れを整理した。また、旧派テニヲハ論書に見られる当時の日本人による日本語に対する文法意識が、現代日本語教育に相通ずる点があることから、通時論的視点を部分的に取り入れた現代日本語における古語の名残的表現の指導に関する一試論を発表した。人文学言語学日本語学研究自体は順調に捗っておりますが、考察及び分析が進む中で新たな課題が出てまいりました。

この課題は、研究代表者が従来行われてきた主張を増強できるものと考えられますが(「今後の研究の推進方策」を参照されたい)、これを整合的に説明を行うのに当初の研究計画に比べてやや遅れている現状です。資料の翻刻など少しは時間がかかっておりますが、研究自体はおおむね順調に展開していると思われます。これまで「姉小路式」の直系増補本系列のみを研究対象としておりましたため、『春樹顕秘抄』と『春樹顕秘増抄』が直接な研究資料となっておりました。考察と分析に進むにつれ、『春樹顕秘増抄』の著者である有賀長伯による別の著作『和歌八重垣』の記述にも目を配る必要が出てまいりました。今後は、直系増補本系列に軸を置きつつ、有賀長伯のテニヲハ観を明らかにすることにより、『春樹顕秘抄』と『春樹顕秘増抄』の日本文法研究史における位置づけを整合的に論じてまいります。『春樹顕秘抄』と『春樹顕秘増抄』の記述内容を中心に、両者の著者による増補の態度の相違点を明らかにしてゆく予定です。主として「姉小路式」に挙げられている項目に関する記述を中心に考察を行います。本年度予定していた研究発表が、新たな問題点を調査するため来年度にずれこむことになりました。これに伴い、投稿論文の日本語母語チェックに対する謝礼も来年度に支払うことになります。以上の事情により、次年度使用額が生じた次第です。参考資料の購入、資料調査と研究内容の打合せ学会発表による出張・次年度以降に国内の学会で発表する予定・購入予定をしていた参考資料の一部が24年度ではなく次年度以降に延期した
国内承認医薬品に新たな急性放射線障害治療プロトコールを見出す！

γ線7Gy全身照射マウスの約10%が27日間生存後,30日目には全て死亡する.この放射線曝露マウスに,国内承認薬である顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF),エリスロポエチン(EPO),ロミプロスチム(RP)及び蛋白同化ステロイドであるナンドロロンデカン酸エステル(ND)の組み合わせ投与を検討した.その結果,ND投与を1回または2回にG-CSF+EPO+RPの組み合わせを照射後3日間もしくは,G-CSF+EPO+RPの組み合わせを5日間投与する事で,30日生存率は100%となった.本研究から,国内承認品の組み合わせによりARSに対する有効な薬物治療が可能である事が示唆された.γ線,7 Gy全身照射マウスの10%が27日間生存後30日目には全て死亡する.こうした放射線曝露マウスに,国内承認医薬品である顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF),エリスロポエチン(EPO),血小板減少症治療薬(トロンボポエチン(TPO)受容体作動薬,romiprostim, RP)及び蛋白同化ステロイド(nandrolone decanoate, ND)の組合せを検討した.その結果,G-CSF (100 μg/Kg) + EPO (100 U/Kg) + RP (50 μg/Kg) + ND (50 μmol/Kg)の組合せが最も効果的であり, ND投与を1回又は2回にG-CSF + EPO + RPの組合せを3日間,もしくはG-CSF + EPO + RPの組合せを5日間投与する事で30日目生存率は100%となった.一方,生存個体の末梢血球数,骨髄細胞数,骨髄中の前駆細胞数にはコントロールとの間に有意差は見られなかった.また,ND1回投与にG-CSF + EPO + RPを3日間投与した個体を100日目まで観察したところ,末梢血中の赤血球数,白血球数,血小板数は依然として非照射コントロールに比べ有意に低下したままであった.然しながら,骨髄細胞数と造血前駆細胞数には差が認められず照射前のレベルに回復している事が確認された.得られた成果の一部は,Radiation Emergency Medicineに投稿・掲載された他,日本放射線影響学会第56回大会(2013年10月18日,青森市)で発表した.γ線7Gy全身照射マウスの約10%が27日間生存後,30日目には全て死亡する.この放射線曝露マウスに,国内承認薬である顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF),エリスロポエチン(EPO),ロミプロスチム(RP)及び蛋白同化ステロイドであるナンドロロンデカン酸エステル(ND)の組み合わせ投与を検討した.その結果,ND投与を1回または2回にG-CSF+EPO+RPの組み合わせを照射後3日間もしくは,G-CSF+EPO+RPの組み合わせを5日間投与する事で,30日生存率は100%となった.本研究から,国内承認品の組み合わせによりARSに対する有効な薬物治療が可能である事が示唆された.γ線,7 Gy全身照射マウスの10%が27日間生存後30日目には全て死亡する.こうした放射線曝露マウスに,国内承認医薬品である顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF),エリスロポエチン(EPO),血小板減少症治療薬(トロンボポエチン(TPO)受容体作動薬,romiprostim, RP)及び蛋白同化ステロイド(nandrolone decanoate, ND)の組合せを検討した.その結果,G-CSF + EPO + RP +NDの組合せが最も効果的であり,照射後30日で62.5%の生存率をもたらした.さらに,RPの濃度を臨床量の25倍に増加し,ND投与を2回にしてG-CSF + EPO + RPを5日間投与する事で30日目に75%のマウスが生存した.一方,生存個体の末梢血球数,骨髄細胞数,骨髄中の前駆細胞数にはコントロールとの間に有意差は見られなかった.その後さらに検討をすすめ,TPO受容体作動薬であるRP単独を35日間腹腔内投与することで30日目に全個体の生存が認められた.この時,薬物投与後8日から骨髄細胞数の急激な回復が認められるが,30日目の生存個体では依然として骨髄抑制が起こっており,末梢白血球数も正常レベルの40%程度の回復であった.この時末梢血中の赤血球数,白血球数,血小板数において著明な差はなかった.両大腿骨中の骨髄細胞数,さらに骨髄細胞中の未熟T細胞,B細胞,NK細胞,顆粒球細胞,赤芽球細胞においても著明な差はなかった.一方,RP投与群では,照射後8日目から骨髄細胞数の増加が観察された.骨髄細胞表面の発現抗原解析から,おもに多能性造血幹細胞や骨髄系造血前駆細胞,マクロファージや顆粒球,さらには樹状細胞が810日目で急激に増加していた.得られた成果の一部は,日本放射線影響学会第55回大会(2012年9月7日,東北大学)で発表した.平成24年度の研究から、TPO受容体作動薬であるromiprostim単独投与で100%の30日生存率がもたらされる事を見出した.本知見から下記特許出願に繋がった.「放射線被ばく治療剤及び放射線被ばく治療方法」

発明者:柏倉幾郎、伊藤巧一、中野学、門前暁、千葉満、吉野浩教、廣内篤久.権利者:弘前大学.特願2012ー250880(平成24年11月15日).平成25年度は,TPO受容体作動薬による放射線曝露個体の救命効果と作機序の解明を目的とする.この目的達成のため,致死放射線曝露マウスモデルを用い,造血・免疫機能及び消化管機能を指標に本剤の許容線量,至適投与量,投与方法の検討から標準となる投与プロトコールを確立する.次に,標準プロトコールをもとに本剤の作用機序について検討する.具体的には,薬物代謝,組織移行及び分布,各種生体幹細胞への作用,2次的なサイトカイン産生の促進効果について検討する.さらに,標的組織や細胞における遺伝子発現の変化についても評価解析する.併せて本剤投与生存個体の長期間観察を行い,致死を回避した個体における白血病などの発がん等晩発的な有害事象発生の有無を染色体や遺伝子レベルで検討する.得られた成果の一部については論文作成を進めており,次年度は情報発信に努める.次年度も放射線曝露マウスを用いた動物実験が中心となる為,実験動物(360千円)及び投与医薬品(200千円)を購入する.放射線曝露後の個体を経時的に造血障害や消化管障害を中心とした解析を行う為骨髄細胞発現抗原解析や組織染色の為の蛍光抗体色素,骨髄細胞中の造血前駆細胞や各種細胞の培養に必要な培地や,培養用消耗品,さらには特異的な細胞培養誘導に必要な各種サイトカイン等高額な試薬が必要となる(200千円).また動物への照射実験は環境科学技術研究所(青森県六ケ所村)で行う為,担当者の旅費(300千円)及び大学院生による実験補助経費(200千円)を計上した.また次年度は,得られた成果発表の情報発信の為,研究代表者の国際学会参加旅費(400千円)及び国内専門学会での発表の為の研究代表者及び分担者の旅費(50千円×3名)を計上した.また,論文投稿に向け文献検索(50千円),英文校閲(100千円)及び投稿料(120千円)の執行を予定している.
喘息死の発症メカニズムに関する基礎的臨床的研究

喘息死は臨床的に重要であるが、これまでは発症メカニズムが不明だった為、多くの研究にもかかわらず喘息による死亡数はむしろ増加傾向にあると言われている。我々は最近,重症喘息発作により人工換気の経験を有する患者(Near-fatal asthma患者)では、低酸素に対する換気反応及び呼吸困難感が低下していることを見いだし、この二つが喘息死発症の重要な要因であることを報告した(Kikuchi et al.New Engl J Med 1994;330:1324).さらに我々は、これを引き起こす素因として末梢化学受容器(頚動脈体)の機能が低下している可能性を提唱した。本研究ではこの可能性をさらに検討し、喘息死発症と呼吸困難感及び低酸素換気反応の関係、さらには頚動脈体機能低下との関係を調べた。本研究において次のような研究結果が得られた。(2)抵抗や低酸素、炭酸ガス等を負荷したラットに於いてC-fos oncogene発現をin situ hybridization(c-fos mRNA測定)および免疫染色法(c-fos蛋白測定)にて測定した実験では、帯状回、視床、等と共に、視床下部、橋等において発現がみられ、これらの部が呼吸困難や呼吸負荷時の上位脳による呼吸の調節に関与していることが推定された。(3)健常人7名において呼吸刺激剤:ドキサプラムを点滴静注(2.0mg/kg/hr)投与中に低酸素換気反応および抵抗負荷時の呼吸困難感の測定を行い、生理食塩水を点滴静注投与した時と比較した。ドキサプラム投与時には低酸素換気反応は増加し抵抗負荷時の呼吸困難感も有意に増加した。更に抵抗負荷時の呼吸困難と低酸素換気反応には有意の相関があり、頚動脈体機能は呼吸困難の発生要因として関係している可能性が考えられた。本研究の目的は、喘息死発症と呼吸困難感及び低酸素換気反応の関係、さらには頸動脈体機能低下との関係を明らかにすることである。我々の平成7年度の研究において、これまでに次のような研究結果を得ている。健常人及びNear-Fatal-Asthma患者それぞれ6名において、18FDGを静注後30cmH_2O/liter/secの外部抵抗負荷呼吸を30分間行なわせ、大脳賦活部位をグルコース代謝を用いて測定した。健常人に於いてはこの負荷により、帯状回、前運動野、視床等が賦活された。他方呼吸困難感の低いNear-fatal asthma患者では同部位での18FDG取り込みが低下する傾向が見いだされ、呼吸困難と同部位の活動関連しているものと考えられた。2)抵抗負荷ラットに於けるC-fos oncogene発現の測定。気管カニューレを挿入したラットに覚醒下でカニューレを通して外部抵抗を20分間負荷した後、脳を摘出。この脳標本を用い、脳の神経活動増強と関係が知られているc-fos oncogene発現をin situ hybridization (c-fos mRNA測定)および免疫染色法(c-fos蛋白測定)にて測定した。測定は頸動脈体摘出群及び非摘出群で行なったが、摘出群ではc-fos発現が大脳辺縁系、視床下部等の部位で低い傾向があり、呼吸困難感の感受性と頸動脈体機能が深く関係しているものと考えられた。我々の平成8年度の研究において次のような研究結果を得ている。1)呼吸刺激剤ドキサプラムの換気応答に対する効果。健常人7名において呼吸刺激剤であるドキサプラムを点滴静注(2.0mg/kg/hr)

投与中に低酸素換気反応および低抗負荷時の呼吸困難感の測定を行い、プラシーボとして生理食塩水を点滴静注投与した時と比較した。ドキサプラム投与時には低酸素換気反応は増加し低抗負荷時の呼吸困難感も有意に増加した。更に抵抗負荷時の呼吸困難と低酸素換気反応には有意の相関があり、頸動脈体機能は呼吸困難の発生要因として関係している可能性が考えられた。この結果はNear-fatal asthma患者では呼吸困難と低酸素換気反応が低下しているという、我々の以前の報告(NEJM330:1329,1994)と一致しており、頸動脈体機能低下が喘息死の要因となっている可能性を示している。2)抵抗増加時の呼吸停止に対する頸動脈体の役割。頸動脈体摘出群及び非摘出群のラットをウレタン麻酔後自発呼吸下にカニューレを通してメサコリンを吸入させ、抵抗(食道バルーン及び気流速度のより肺抵抗で測定)を呼吸停止を起こすまで上昇させた。頸動脈体摘出群では低濃度のメサコリンで低酸素血症となり呼吸停止を起こしやすい傾向が見られた。このことは低酸素換気反応の低下が喘息発作時呼吸停止の重要な要因であることを示している。
二分子蛍光補完による複数サイトカインシグナルの入力部位同時検出法の開発

本研究課題では、神経幹細胞のアストロサイト分化に必須である細胞外シグナル(IL6-FC : IL-6ファミリーサイトカイン)のシグナル入力を観察する手法として、受容体膜タンパク質と転写因子が会合することを利用した二分子蛍光補完(BiFC)法の開発を行った。また、現在まで分かっていなかった生体内におけるIL6-FC分泌細胞を探索し、脳を覆っている軟膜がLIF, CNTF, CLCといった複数のIL6-FCを高発現していることを発見した。申請者は、IL-6ファミリーサイトカイン(IL6-FC)群及び骨形成因子群が相乗的に作用して神経幹細胞のアストロサイト分化を誘導することを明らかにした。しかし生体内において、神経幹細胞が実際にこれらアストロサイト誘導性サイトカインのシグナルを受け取っているのか、さらに細胞のどの部分で受け取っているかについては不明のままである。そこで本研究では、サイトカインシグナル入力の際に、受容体膜タンパク質と転写因子が会合することを利用したこれまでにない二分子蛍光補完(BiFC)法により、異なるサイトカインシグナルの入力同時観察、及びその入力部位同定を行う技術を開発する。さらにこの結果と申請者らのこれまでの成果を統合して、アストロサイト分化能獲得から分化まで、その一連の過程を説明する概念の提示を目指す。予備的実験より、軟膜細胞の培養上清存在下に神経幹細胞を培養することでアストロサイトへの劇的な分化が観察されたため、軟膜細胞がIL6-FC発現細胞であるかを検討した。IL6-FCに応答することが明らかなアストロサイト特異的GFAP遺伝子プロモーターを持つレポーターコンストラクトを神経幹細胞に導入し、軟膜細胞培養上清に対してレポーターアッセイを行った。軟膜細胞培養上清によってレポーター活性の上昇が観察されたが、この活性は全てのIL6-FCのシグナル伝達を阻害できるgp130阻害抗体や優性抑制型STAT3によって抑制されたため、軟膜細胞培養上清中のアストロサイト誘導因子がIL6-FCであることが示唆された。そこで、実際にIL6-FCが軟膜細胞において発現されているかを同定するために、各IL6-FCに対するプライマーを用いてRT-PCR法を行った結果、LIF,CNTF,CLCを高発現していることを同定した。今後、BiFC法を用いてこれらサイトカインシグナル入力の観察及び入力部位の同定を行う。予備的実験より、軟膜細胞がIL6-FC発現細胞であることを同定している。そこで、生体内でIL6-FCのシグナル入力を観察するため、BiFC法の開発を試みた。IL6-FCは、膜タンパク質gp130を介してJAKチロシンキナーゼを活性化する。JAKはgp130の細胞内領域をリン酸化し、STAT3はそのリン酸化チロシン残基に会合する。本研究ではこの会合を利用して、二分子蛍光補完(BiFC)法によりシグナル受領の検出とその細胞部位を同定する。まず、gp130と緑色蛍光タンパク質Kusabira-Green(KG)のN末側約半分の融合タンパク質(gp130-NKG)及びSTAT3とKGのC末側約半分の融合タンパク質(STAT3-CKG)の発現コンストラクトを作成した。これは、細胞がシグナルを受け取り両者が結合した場合にのみKGの立体構造が再構築され蛍光が観察されるという原理に基づいたものである。作成したコンストラクトを細胞に導入した結果、数種の組み合わせで蛍光を確認した。