hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
エナンチオ選択的アンチWacker型環化反応の開発

触媒量のルイス酸では十分な転化率が得られなかったが、光学活性ジオールに由来するボロン酸エステルおよびチタン酸エステルを化学量論量用いてエナンチオ選択的アンチWacker型環化反応を試みた。残念ながら、不斉収率は12% ee程度にとどまったが、各有機金属試薬に対応する環化条件を明らかにすることができた。また、パラジウム触媒および林・Jorgensen触媒を用いたアルキンーエナール基質と有機ホウ素試薬のエナンチオ選択的付加・環化反応について検討を行った。テザーが3元素の基質については、トルエン溶媒中、上述の2つの触媒に加え、フェノールを添加することで、良好な化学収率および不斉収率で付加・環化反応が進行することを見出した。筆者が開発した0価パラジウム触媒と有機金属試薬を用いた分子内求電子剤を有する不飽和結合のアンチWacker型環化反応の有用性を拡張するため、1)キラルルイス酸を利用した環状アルコールの不斉合成、2)キラルモノホスフィン配位子を利用したジイン化合物の非対称化、3)ラセミ体アレニルホスフェートの動的速度論的分割反応を利用したテトラヒドロピリジンの不斉合成を検討した。さらに、有機ホウ素試薬とキラルアミン共触媒を利用したアルキンーエナール基質のエナンチオ選択的付加・環化反応を開発した。また、プロ求核剤を用いた共役エンインへの付加反応およびアレニルアルコールに対する置換反応によるアレン合成も行った。平成28年度においては、キラルホスフィン配位子を用いたエナンチオ選択的アンチWacker型環化反応の開発を行う。すなわち、(1)ジイン化合物の非対称化反応、(2)「研究実績の概要」で述べた光学活性四置換アレンの合成、(3)ラセミ体アレニルホスフェートの動的速度論的分割反応による光学活性アレニルアミンへの変換反応とアンチWacker型環化反応を組み合わせた光学活性テトラヒドロピリジンの合成について検討を行う。(3)に関しては、アレニルアミンの調製段階ではジホスフィンが、環化反応においてはモノホスフィンが必須であることから、これらが互いの反応を阻害し合うことのないようにそれぞれの配位子を固相担体に担持するなどの工夫を行う。平成29年度においては、キラルルイス酸およびブレンステッド酸触媒を利用した環状アルコール・アミンの不斉合成法を開発する。キラルルイス酸としては、触媒的不斉向山アルドール反応やDiels-Alder反応に用いられる触媒を活用し、アルデヒド求電子剤へのエナンチオ選択的付加について検討を行う。また、有機ボロン酸のユニットを含むルイス酸触媒についても検討を行い、触媒配位子と化学量論量存在する有機ボロン酸を用いた系中での触媒調製について検討を行う。求電子剤としては、アルデヒドのみならず、1,2-ジカルボニル化合物についても検討し、キラルルイス酸触媒とのより強固なキレーションにより、エナンチオ選択性の制御を試みる。さらに、寺田・秋山らによって開発されたビナフチル骨格を含むキラルリン酸をイミンまたはエナミンに添加することで、生じるイミニウムイオンの対アニオンの不斉情報を活用したエナンチオ選択的環化反応を試みる。
ドメインスワッピングを利用した新規タンパク質ケージの開発

シトクロムcb562(cyt cb562)の多量体を作製し、cyt cb562 2量体がドメインスワップ構造を取ることを明らかにした。結晶中で3分子のcyt cb562 2量体は特異なケージ構造を形成し、タンパク質ケージは15個のZn2+と7個のSO42-から成るZn-SO4クラスターを内包していた。さらに、異なる2種類のホモ多量体タンパク質のサブユニットを3ヘリックスバンドルタンパク質で繋いだ融合タンパク質を設計した。設計した融合タンパク質を用いて4量体および6量体を構築し、それらの構造をX線小角散乱法および高速原子力顕微鏡観察により分析した。4ヘリックスバンドル構造を有するヘムタンパク質シトクロム(cyt)b562およびそのヘムをアミノ酸置換で導入した2個のシステインとのチオエーテル結合によりタンパク質部分に固定化させたc型cyt b562変異体(cyt cb562)を作製した。Cyt b562およびcyt cb562を酢酸添加、凍結乾燥、再溶解の操作によりそれぞれ多量化させることに成功し、作製したcytcb562多量体がcyt b562多量体より安定であることが分かった。吸収およびCDスペクトルから、cyt cb562の2量体が単量体に類似した活性部位構造と2次構造を有することが示唆され、cyt cb562の2量体の酸化還元電位は単量体の電位とほぼ同じ198 mV (NHE基準)を示した。Cyt cb562の2量体の詳細な立体構造をX線結晶構造解析により決定した。Cyt cb562はドメインスワッピングにより2量体を形成し、一方のプロトマーに属するN末端側の2本のαへリックスがもう一方のプロトマーに属するC末端側の2本のαへリックスと相互作用していることが明らかとなった。Cyt cb562の2量化では、N末端から数えて2番目と3番目のαへリックスを結ぶループ上のLys51-Asp54がヒンジループとして働いており、2量体のヘム配位構造は単量体の配位構造と類似していることも明らかとなった。さらに、結晶中で3つのcyt cb562の2量体が特異なケージ構造を形成していた。ケージの内部空間には15個のZn2+と6個のSO42ーから成るZn-SO4クラスターが存在し、クラスターに含まれない6個のZn2+もケージ内に観察された。ケージ構造はケージに内包されたZn2+とcytcb562の2量体のアミノ酸側鎖との配位結合により安定化されていた。本研究では、cyt cb562の2量体がドメインスワッピングにより形成することをX線結晶構造解析により示し、結晶中で3つのcyt cb562の2量体が特異なケージ構造を形成し、その内部空間にZn-SO4クラスターが存在することを明らかにした。これらの研究成果をChemical Science誌に発表した。本年度は、ドメインスワッピングによるタンパク質ケージの構築を発展させ、融合タンパク質を用いて様々な形状の構造体を構築できる手法を開発し、この手法を用いて四角形やケージ構造を有するタンパク質構造体の構築を試みた。安定なホモ2量体タンパク質のサブユニット(A)と別の安定なホモ2量体タンパク質のサブユニット(C)を3ヘリックスバンドルタンパク質(B)で繋いだ直線状の融合タンパク質(A-B-C)を設計した。サブユニットAのC末端αへリックスにタンパク質Bを連結し、タンパク質BのC末端にフレキシブルなリンカー(GSGSG)を介してサブユニットCを連結し、融合タンパク質A-B-Cを得た。融合タンパク質A-B-CのA部位は別のA-B-C分子のA部位、C部位は別のA-B-C分子のC部位とそれぞれ分子間で相互作用し、融合タンパク質A-B-Cが四角形の4量体を形成するように設計した。サイズ排除クロマトグラフィーとSDS-PAGEによる分析の結果、融合タンパク質A-B-Cは目的の4量体のほか、2量体や高次多量体も形成したが、精製した4量体はタンパク質濃度を変化させても安定に存在した。また、X線小角散乱分析および高速原子力顕微鏡観察により、4量体は溶液中でひずんだ四角形構造を取ることが分かった。さらに、融合タンパク質のC部位を安定なホモ3量体タンパク質のサブユニットに変えることにより、融合タンパク質は安定な6量体を形成し、X線小角散乱分析により6量体は構造が比較的強固な立体構造体であることが示唆された。以上の結果より、ホモ多量体タンパク質の融合タンパク質を利用することによりナノ構造体の構築に成功した。本研究で開発した手法は簡便であり、四角形やケージなど様々なナノ構造体の構築に適用でき、新規バイオ材料への利用が期待される。引き続き、新しい系でもドメインスワッピングを利用してタンパク質ケージの開発を行う。

タンパク質科学研究成果をまとめ、論文執筆を中心に行ったため。新しい系でタンパク質ケージの開発研究を行うため、タンパク質の作製や精製などの消耗品費として使用する。
免疫細胞の肺胞移植による肺高血圧症、心不全の治療の試み

肺胞蛋白症がGM-CSF受容体の変異により生じ、正常のマクロファージを肺へ移植することにより治療できることが報告されている。(Nature 2014;54:450)。これまでの研究において、マクロファージ選択的にHypoxia-induciblefactor (HIF)-1αを欠損したマウスでは低酸素暴露(10%O2, 3週間)による肺動脈圧の上昇が抑制されることを明らかにした(現在論文投稿中)。そこで、HIF-1α欠損マクロファージの肺胞移植に同様の効果があるかを本年度検討した。マクロファージ選択的HIF-1α欠損マウスの骨髄由来マクロファージを正常マウスの肺に移植した。浅い麻酔下で、口腔内後部に200万細胞/50μl(PBS)を投与し、呼吸により肺への移植をはかった。その後低酸素チャンバーにて3週間飼育した。正常マウス由来のマクロファージを投与した群に比べ、HIF-1α欠損マクロファージを投与したマウスでは肺高血圧が軽減されていた(右室収縮期血圧48mmHg対24mmHg, n=2)。HIF-1α欠損マクロファージを移植し、正常酸素濃度で飼育したマウスの右室収縮期圧は21mmHg(n=5)であったので、肺高血圧モデルの作成には問題なく、HIF-1α欠損マクロファージの移植により肺高血圧が軽減されたものと考えられる。このHIF-1α欠損マクロファージではCre&not;-recombinaseが発現している。その抗体により肺より抽出した蛋白をウエスタンブロット法にて解析したところ、弱いながらCreの発現があり、投与したマクロファージが肺内へ到達していると考えられた。まだ実験数が少ないため、今後再現性を確認するとともに、移植したマクロファージの局在や肺における遺伝子発現の変化などを検討していく必要がある。また左室肥大・心不全モデルなどでも検討したい。
哺乳類卵子・初期胚の常温長期保存に関する研究～遺伝資源保存への適用を目指して～

遺伝子改変マウスのような貴重な遺伝資源を保存するための方法として凍結保存に代わり得るような生殖機能細胞を常温で保存できる新規な真空乾燥・常温保存法を開発するために、本研究を実施する。本研究では、乾燥保護物質としてトレハロースに着目し、トレハロースを細胞内に取り込むことができるノックインマウスの作製を試みた。トレハロースは、乾燥に強い耐性を示すネムリユスリカの幼虫の体内(細胞内)に乾燥時に特異的に蓄積されており、トレハロースが乾燥時に細胞に対して高い生体成分保護機能を有していることがわかっている。そこで、マウス初期胚でもトレハロースによる乾燥耐性が獲得できるかどうかを確認することとした。しかし、トレハロースは、細胞膜を通過できないため、生体成分保護機能を細胞内で発揮させることができない。トレハロースのような糖が細胞膜を通過するためには、トランスポーターと呼ばれる膜蛋白質が介在することが知られている。そこで、トレハローストランスポーター1(Tret1)を初期胚の細胞膜で発現するノックインマウスの作製を試みた。ノックインマウス作製には、CRISPR/Cas9によるゲノム編集を適用し、ドナーベクター(CAG promoter-PvTret1-IRES2-AcGFP1; CTIG)をROSA26遺伝子座のセーフハーバー領域に対するsgRNA及びCas9蛋白質と共にマウス1-細胞期卵の細胞質内に顕微注入した。顕微注入後、生存していた受精卵268個をレシピエントマウスの卵管に移植したところ54匹(20%)の産仔が得られた。これらの産仔は、離乳後、尻尾よりDNAを抽出し、PCRによる解析を行ったところ、ROSA26遺伝子座のセーフハーバー領域にドナーベクターがノックインされていると思われるマウスが5匹(9%)得られた。研究遂行の時期に動物実験施設の改修工事があったため、施設が利用できず、一時的に研究が中断した時期があった。そのため、ノックインマウスの作製が遅れてしまった。また、ROSA26遺伝子座にドナーベクター(CAG promoter-PvTret1-IRES2-AcGFP1)をノックインしたマウスを作製するのに長時間を要し、5匹のノックインマウスが作製できたが、これらのマウスについてドナーベクターの伝達性を確認するために、繁殖を行っているが、解析するに充分な仔マウスが得られていない。更に、5匹のノックインマウスのゲノムについてPCRによる解析を行っているが、今だ、インタクトなベクターをROSA26遺伝子座のセーフハーバー領域にノックインしたマウスの同定までには至っていない。一方、ノックインマウス作製を行っていたため、もう一つのトレハロースの細胞内への取り込み方法として電気的穿孔法(エレクトロポレーション法)をマウス初期胚で試みることも動物実験施設の改修工事があったため、着手できなかった。従って、トレハロースを取り込んだノックインマウスの初期胚及び電気的穿孔法によって得られた初期胚の真空乾燥・常温保存後の生存性も確認することができなかった。ROSA26遺伝子座セーフハーバー領域のsgRNA, Cas9蛋白質及びドナーベクター(CAG promoter-PvTret1-IRES2-AcGFP1; CTIG)の1細胞期卵細胞質への顕微注入あるいは電気穿孔法(エレクトロポレーション)によりノックインマウス(ROSA26-CTIG-KI)を作製後、野生型のマウスと交配させることにより繁殖を行い、F2世代で遺伝的にホモのマウスを得る。これらのマウス由来の卵子及び初期胚(2細胞期胚、桑実期胚、胚盤胞)についてGFP発現を指標にして、割球の細胞膜でのトレハローストランスポーターの発現を確認する。その後、トレハロース及び抗酸化剤(エピカテキン、アスコルビン酸)あるいは3-O-Methyl-D-Glucose等を含むPB1, M2, Tris-EGTA及びmCZB-hepesを保存液として、これらの保存液にROSA26-CTIGノックインマウス由来卵子及び初期胚を浸漬し、マイクロチューブに移した後、デシケーター内で真空乾燥・常温保存後、復水させることにより、これらの卵子及び初期胚の生存性を確認する。一方、エレクトロポレーションを卵子及び初期胚に実施した後、rhodamine-dextran (3 kDa)を含む培養液に移し、蛍光顕微鏡下で細胞内の蛍光を確認する(細胞膜に孔が開いていればrhodamine-dextranが細胞内に取り込まれ、発色する。)。発色を確認後、前述した保存液に卵子及び初期胚を移し、真空乾燥・常温保存(保存期間:1日1年)を試み、復水後の生存性を確認する。生存が確認された卵子及び初期胚については、卵子は野生型♂マウスの精子と体外受精し、得られた受精卵は、卵管移植を行い正常な産仔への発生を確認する。また、初期胚についても同様に卵管移植あるいは子宮移植を行い正常な産仔への発生を確認する。

しかし、トレハロースは、細胞膜を通過できないため、生体成分保護機能を細胞内で発揮させることができない。トレハロースのような糖が細胞膜を通過するためには、トランスポーターと呼ばれる膜蛋白質が介在することが知られている。そこで、トレハローストランスポーター1(Tret1)を初期胚の細胞膜で発現するノックインマウスの作製を試みた。ノックインマウス作製には、CRISPR/Cas9によるゲノム編集を適用し、ドナーベクター(CAG promoter-PvTret1-IRES2-AcGFP1; CTIG)をROSA26遺伝子座のセーフハーバー領域に対するsgRNA及びCas9蛋白質と共にマウス1-細胞期卵の細胞質内に顕微注入した。顕微注入後、生存していた受精卵268個をレシピエントマウスの卵管に移植したところ54匹(20%)の産仔が得られた。これらの産仔は、離乳後、尻尾よりDNAを抽出し、PCRによる解析を行ったところ、ROSA26遺伝子座のセーフハーバー領域にドナーベクターがノックインされていると思われるマウスが5匹(9%)得られた。研究遂行の時期に動物実験施設の改修工事があったため、施設が利用できず、一時的に研究が中断した時期があった。そのため、ノックインマウスの作製が遅れてしまった。また、ROSA26遺伝子座にドナーベクター(CAG promoter-PvTret1-IRES2-AcGFP1)をノックインしたマウスを作製するのに長時間を要し、5匹のノックインマウスが作製できたが、これらのマウスについてドナーベクターの伝達性を確認するために、繁殖を行っているが、解析するに充分な仔マウスが得られていない。更に、5匹のノックインマウスのゲノムについてPCRによる解析を行っているが、今だ、インタクトなベクターをROSA26遺伝子座のセーフハーバー領域にノックインしたマウスの同定までには至っていない。一方、ノックインマウス作製を行っていたため、もう一つのトレハロースの細胞内への取り込み方法として電気的穿孔法(エレクトロポレーション法)をマウス初期胚で試みることも動物実験施設の改修工事があったため、着手できなかった。従って、トレハロースを取り込んだノックインマウスの初期胚及び電気的穿孔法によって得られた初期胚の真空乾燥・常温保存後の生存性も確認することができなかった。ROSA26遺伝子座セーフハーバー領域のsgRNA, Cas9蛋白質及びドナーベクター(CAG promoter-PvTret1-IRES2-AcGFP1; CTIG)の1細胞期卵細胞質への顕微注入あるいは電気穿孔法(エレクトロポレーション)によりノックインマウス(ROSA26-CTIG-KI)を作製後、野生型のマウスと交配させることにより繁殖を行い、F2世代で遺伝的にホモのマウスを得る。これらのマウス由来の卵子及び初期胚(2細胞期胚、桑実期胚、胚盤胞)についてGFP発現を指標にして、割球の細胞膜でのトレハローストランスポーターの発現を確認する。
汎用メモリを使用した連想メモリの構成とその応用に関する研究

情報処理の主要な操作の一つに、大量のデータ中から、所望のデータを効率良く検索する操作がある。この操作を直接実行する装置として、連想メモリ(CAM : Content Addressable Memory)が用いられている。本研究は、CAMと同等の機能を通常の汎用メモリ(RAM)と論理回路を用いて構成する方法を開発し、いくかの応用分野について、CAMの各応用の特徴を明確にし、それに合わせたCAM機能の構成法を考案しその評価を行った。インターネット用アドレス生成回路を複数の中規模メモリを用いて構築する手法を検討した。1.アドレス生成回路のBCAM(Binary Content Addressable Memory)機能を模擬する回路を考案した。現在使用されているインターネットのIPアドレスは、32ビットで表現されているものが多い。アドレス表は、与えられたIPアドレスに対して、宛先の詳細が掲載されているメモリのアドレスを生成する。宛先数が40000と仮定すると、アドレス生成回路の入力数は32、出力数は16となる。宛先のアドレスは、ランタムに分布している。アドレス生成回路を通常のランダム論理回路として合成すると、非常に大きな回路となる。また、アドレスが変更になった場合、回路も再設計する必要がある。ハッシュメモリとLUTカスケードを用いたアドレス生成関数の実現法(ハイブリッド法)を開発した。ハイブリッド法を用いた回路のハードウェア量を定性的に求める方法を開発した。2.登録ベクトルを更新する方法も開発した。本手法をFPGA上に実現し、従来手法と比較を行った。面積に関しては実験に用いたパラメータでは、Xilinx社の4入力LUTを用いたCAMのIPの12%となり、Xilinx社のBRAMを用いたCAMのIPの8%となり、LUTカスケードのみで設計した場合の35%となった。またハイブリッド法での登録ベクトルを更新するプログラムは多くのメモリを必要とするが、実用可能な量であった。本手法は従来の手法でFPGA上に実現したCAMに比べ、登録ベクトルの更新には余分の時間がかかるものの、必要なハードウェアは大幅に削減可能である。インターネットのIPアドレス表は,与えられたIPアドレスに対して、宛先の詳細が掲載されているメモリのインデックスを生成する。IPアドレスに対応するインデックスを生成する回路をインデックス生成回路という。また、その回路が実現する関数をインデックス生成関数という。インデックス生成回路をドントケアを利用して簡単化する手法を開発した。まず、最小被覆を用いて依存変数を最小化する方法について検討した。次に、線形変換を利用して多重化変数を生成し、依存変数を削減する方法について、理論的に検討した。1.インデックス表のベクトルの数をkとしたとき、殆どのアドレス生成関数は、2[log_2k]-1個の変数を用いて表現可能なことを実験的に示した。2.線形変換を用いて変数を削減するためのアルゴリズムを開発し、削減可能な変数の個数に関して実験データを集積した。3.変数削減をおこなうヒューリスティック法として「情報利得法」を考案した。不完全定義インデックス生成関数の入力変数削減について、もとの変数(原始変数)のみを用いる場合と、線形変換した変数(多重化変数)を用いる場合の実験結果を示し、変数の多重化が不完全定義インデックス生成関数の入力変数削減に効果があることを実験的に確かめた。(電子情報通信学会VLSI設計技術研究会2009-03で発表)これらの方法は、種々のパターンマッチング回路を構成する際有用である。1.インデックス生成回路を汎用メモリで構成する一般的構成理論インターネットのIPアドレス表は、与えられたIPアドレスに対して、宛先の詳細が掲載されているメモリのアドレス(インデックス)を生成する。この回路をドントケアを利用して簡単化する手法を開発した。まず、最小被覆を用いて依存変数を最小化する方法について検討し、次に、線形変換を利用して依存変数を削減する方法について、理論的に検討した。線形変換を実現するための回路の大きさと、線形変換を用いて削減可能なメモリの面積の関係を調べた。2.順序回路構成への応用順序回路の構成に用いられるCAM(Content Addressable Memory)の替わりに汎用メモリが使用できると、安価な回路が構成できる。ここでは、アンチウイルス・ソフトウェアであるClamAVと侵入検知ソフトウェアであるSNORTのパターンの違いに注目し、侵入検知システム用とは異なるウイルス検出エンジンの構成について考察した。ウイルス検出エンジンはMPUとFIMMで構成し、第一段階では、CAM機能を用いた並列ハードウェアフィルタで高速に部分マッチングを行い、第二段階では、MPUを用いて厳密にマッチングする。大量のウイルスパターンを効率よく格納するため、並列ふるい法を提案した。外付けSRAMボードとFPGA1個でClamAVのウイルスパターン514287個全て格納した。単位面積で正規化したスループットにおいて、提案手法は従来手法よりも1.41倍-31.36倍優れている。
Misfit転位近傍における結晶成長

研究期間中に、我々は特殊高温セルを用いるSi1-XGeX-MBE装置をSTMと接続し、これらを同一の除振台に乗せることで、MBEにおける成長表面を原子分解能で観察できる装置を作成した。MBEにおけるレート制御、組成制御性などの基本性能チェック後、実際にSi結晶基板にSi1-XGeX薄膜をエピ成長させ、その表面モフォロジーの変化の過程を原子分解能で詳細に観察した。観察は、表面ストレスの影響がステップ形状に直接反映されるSi(001)基板を中心に行った。この結果、Si(001)表面上でのSi1-XGex成長では、0.46nm程度の膜厚までは,膜厚と共に表面に点欠陥が導入され、その後これらは線状のdimer vacancy line(DVL)を形成すること、(DVL)間の間隔は膜厚と共に減少し、1.3nm程度でSi表面格子の8倍程度になること、DVLの出現と共にそれまで平坦だった表面は細かいテラスがあちこちで局所的に積み重なったラフ表面に変化すること、またこの時平坦な表面ではwavyであったSBステップが直線的になることを見出した。さらにSi(001)基板上に成長したSi1-XGeX表面上に再びSi薄膜を成長させると、表面のテラスサイズが大きくなり表面は平坦さを回復すること、ただしこの時DVLはかなりの膜厚まで残ることが明らかになった。またこの研究に関連してSi(111),(001)表面上にAg等の金属薄膜を成長させる場合、基板表面上の原子点欠陥の存在により小さな島が高密度で核形成されることや、Si/Ge界面歪みによるミスフィット転位が、ヘキカイ表面上に特殊なステップ構造を作りその周囲では表面歪みの蓄積/開放により表面超構造が局所的に変化することなどがSTMを用いた研究から明らかになった。さらにこうした表面の局所歪みを伴う欠陥が表面2次元電子状態に与える影響を調べるため、結晶格子の反転対称性の破れに敏感な光第二高調波発生(SHG)における励起光波長依存性を測定する装置を立ち上げ、Si(111)7x7、√<3x>-Ag等の表面超周期構造に特徴的な電子状態間遷移がSHG強度の励起光波長依存性スペクトルにおけるピークとして捕らえられることを実証した。超高真空電子顕微鏡(TEM)を用いて関連する表面構造について構造解析も行った。本研究課題に対する科学研究費補助金により、超高真空排気システム、超高真空ゲージシステム、超高真空直線導入機を購入し、小型MBE装置を構築した。この装置は超高真空直線導入機により、既存のSTM装置との間で、真空を破らず試料を搬送することができる。またMBE装置では、STM試料ホルダーにセットした試料上にそのままSi、Geの成長が行えるような工夫がなされている。本年度は、このMBE装置を作成し、実際にSTM装置との間を超高真空でドッキングさせた。MBE装置は単独で排気した場合には1×10-8Paの到達真空度が実現され、またSTM装置とのゲートバルブを開いて試料の搬送を行った場合にも、5×10-8Pa以下の真空度が保たれることを確認した。

またMBEを度キングした後のSTM装置は、除振に工夫を凝らすことでSTM単独の場合と変わらない振動伝達関数をキープでき、原子分解能観察が十分可能であることを、Si(111)表面のSTM観察により確認した。以上の準備を終え、STM装置にドッキングさせたMBE装置を用いてSi(001)基板表面上へのSi、Ge成長の実験を開始した。Si、GeはともにKセルから蒸発させる方式で成長させる。また同じにHBO2セルからBの供給も行った。現在までにビームフラックスモニターを用いて、各セルの温度とビーム強度の相対的な関係を測定し、またRHEED振動周期の観察から、ビーム強度の絶対値計測を行った。さらにこれらの結果を元に、SiGe混晶の成長および成長表面のSTM観察を開始している。Si基板上のSi_<1-X>Ge_X薄膜のエピタキシャル成長では、SiとGe間のMisfitによりストレスや歪みが導入される。本研究は、走査トンネル顕微鏡(STM)にSi_<1-X>Ge_X分子線エピタキシャル装置(MBE)を接続した装置を作成し、Misfit起源のストレスや歪みが、その後の成長過程に与える影響を原子レベルで明らかにすることを目的として行われた。研究期間中に、我々は特殊高温セルを用いるSi_<1-X>Ge_X-MBE装置をSTMと接続し、これらを同一の除振台に乗せることで、MBEにおける成長表面を原子分解能で観察できる装置を作成した。MBEにおけるレート制御、組成制御性などの基本性能チェック後、実際にSi結晶基板にSi_<1-X>Ge_X薄膜をエピ成長させ、その表面モフォロジーの変化の過程を原子分解能で詳細に観察した。観察は、表面ストレスの影響がステップ形状に直接反映されるSi(001)基板を中心に行った。この結果、Si(001)表面上でのSi_<1-X>Ge_X成長では、0.46nm程度の膜厚までは,膜厚と共に表面に点欠陥が導入され、その後これらは線状のdimer vacancy line(DVL)を形成すること、(DVL)間の間隔は膜厚と共に減少し、1.3nm程度でSi表面格子の8倍程度になること、DVLの出現と共にそれまで平坦だった表面は細かいテラスがあちこちで局所的に積み重なったラフ表面に変化すること、またこの時平坦な表面ではwavyであったSBステップが直線的になることを見出した。さらにSi(001)基板上に成長したSi_<1-X>Ge_X表面上に再びSi薄膜を成長させると、表面のテラスサイズが大きくなり表面は平坦さを回復すること、ただしこの時DVLはかなりの膜厚まで残ることが明らかになった。
葉緑体から核へのシグナル伝達機構の分子基盤

前年度に実施したSuperSAGEによる遺伝子発現解析の結果、プラスチドシグナルに応答し、核内での光合成関連タンパク質遺伝子の発現を制御していると考えられるAtGLK1(Golden2-like1)を同定し、詳細な解析を行った。まず、ppi2変異体においてAtGLK1を過剰発現させたところ、本来ppi2変異体で発現抑制される遺伝子群の発現回復が観察された。さらに、形質転換体の総クロロフィル量を測定したところ、ppi2変異体に比べ有意にクロロフィル量が増加していた。以上のことから、AtGLK1はプラスチドシグナルの下流において光合成関連タンパク質遺伝子の発現を制御していることが示唆された。これまでの知見からppi2変異体では葉緑体シグナル伝達経路に変化が生じていること予想されたが、この変化に既知の葉緑体シグナル伝達因子が関与しているか否かを明らかにするため、葉緑体に局在しプラスチドシグナル伝達因子として同定されているGUN1との遺伝学的関係について解析を行った。gun1 ppi2二重変異体はwalking-stick stageにおいて胚致死の表現型を示した。このことから、胚発生初期においてGUN1とTocl59双方の機能が必要であることがわかった。葉緑体包膜状に存在するタンパク質透過装置の一部(Toc159)が欠失している変異体(ppi2変異体)では、核遺伝子の発現パターンが変化していることから、葉緑体-核間のシグナル伝達経路が恒常的に活性化/不活化していることが予想されていた。本年度は、葉緑体から核へと伝達される葉緑体シグナルを同定するため以下の2点について解析を行った。1,遺伝子発現のプロファイリングリアルタイムPCR・ウェスタンブロット法により、ppi2変異体における葉緑体タンパク質遺伝子の発現を解析した。ウェスタンブロットの結果、解析に供した13種類の核コード葉緑体タンパク質のうち、RubisCO small subunit, LHCP, PORA等の光合成関連タンパク質の蓄積が顕著に減少していることが分かった。さらに、リアルタイムPCRの結果から、これらのタンパク質をコードする核遺伝子の発現も合わせて抑制されていた。一方で、核コード葉緑体タンパク質ではあるものの、光合成に直接関係しないと考えられるピルビン酸脱水素酵素Elaやプラストキノン合成経路のメチルトランスフェラーゼであるIEP37等はタンパク質蓄積・遺伝子発現共に野生型と同様であった。以上のことから、ppi2変異体では光合成関連遺伝子の発現をコントロールする葉緑体シグナルが特異的に変化していることが示唆された。Toc159の発現減少が核コード葉緑体タンパク質遺伝子に与える影響を経時的に解析するために、エストロゲンにより発現が誘導されるプロモーターの制御下にToc159のRNAiカセットを挿入したコンストラクトを作製し、シロイヌナズナに導入した。20uMのエストロゲンを24時間処理した結果、RNAiカセットの発現誘導およびToc159の発現抑制がみられた。次年度はこの形質転換体を用いて、詳細な発現解析を行う予定である。前年度までに明らかにした、「葉緑体タンパク質輸送装置欠失変異体ppi2では特定の核コード葉緑体タンパク質遺伝子の発現が抑制される」という現象をより詳細に理解するため、主に以下の2項目について解析を行った。1)既知の葉緑体シグナル伝達経路との遺伝学的関係これまでの知見からppi2変異体では葉緑体シグナル伝達経路に変化が生じていること予想されたが、この変化に既知の葉緑体シグナル伝達因子が関与しているか否かを明らかにするため、それらの因子が欠失している変異体(gun1変異体およびabi4変異体)とppi2変異体の二重変異体を作出し、遺伝子発現解析を行った。その結果、いずれの二重変異体もppi2変異体と同一の遺伝子発現プロファイルを示したことから、ppi2変異体においてはGUN-ABI4以外の因子がシグナル伝達に関与していることが示唆された。2)SuperSAGE法による遺伝子発現解析ppi2変異体における遺伝子発現の変化を包括的に理解するため、SuperSAGE法による遺伝子発現解析を行った。SuperSAGE法の実施においては、(財)岩手生物工学研究センター・寺内博士に協力を頂いた。野生型由来の126,000タグおよびppi2変異体由来の204,000タグのシークエンスを決定し、Gene Ontologyに基づく遺伝子の分類を行った結果、ppi2変異体において発現が減少(野生型の40%以下)する遺伝子の約30%は葉緑体・プラスチドに局在するタンパク質をコードしていると予測された。今後SuperSAGE法において興味深い発現変動を示す遺伝子について詳細な機能解析を行う予定である。

これまでの知見からppi2変異体では葉緑体シグナル伝達経路に変化が生じていること予想されたが、この変化に既知の葉緑体シグナル伝達因子が関与しているか否かを明らかにするため、葉緑体に局在しプラスチドシグナル伝達因子として同定されているGUN1との遺伝学的関係について解析を行った。gun1 ppi2二重変異体はwalking-stick stageにおいて胚致死の表現型を示した。このことから、胚発生初期においてGUN1とTocl59双方の機能が必要であることがわかった。
小規模島嶼におけるジオツーリズムと地域イノベーションに関する実証的研究

小規模島嶼とその関連地域を対象に、実質的にジオツーリズムが展開されている地域のイノベーションと観光学の果たすべき役割について、実証的研究にあたった。研究手法としては、文献調査(先行研究や新聞記事等の資料収集と分析)、島民や観光客及び関連地域の自治体を対象とした聞き取り調査(インタビュー調査、質問紙調査)である。1.小規模島嶼とその関連地域を対象としたジオツーリズム推進のための基盤的認識の把握2015年に「明治日本の産業革命遺産」の構成資産の1つとして世界遺産登録された端島(通称:軍艦島、長崎市)、且つ、2016年4月に成立・公布の国境離島新法における対象島嶼から構成される五島列島ジオパーク構想(長崎県五島市)、島嶼で唯一ユネスコエコパーク認定を受けている世界遺産・屋久島(鹿児島県)、国境島嶼のうち、韓国が国内ジオパークに認定したとされる竹島(島根県隠岐の島町)を主対象として、地域資源を活かしたジオツーリズムや、その前提となる小規模島嶼の価値意識の把握を試みた。結果、ジオツーリズムの推進には島嶼のもつ固有性・地域的完結性の事前認識の必然性が明らかになった。2.小規模島嶼とその関連地域を対象としたジオツーリズムの動態的展開過程の把握ジオツーリズムは、エコツーリズムや世界遺産における観光現象も包含する意味合いを有している。この観点から、端島のほか、2018年に世界遺産登録された「長崎と天草地方の潜伏キリシタン関連遺産」の構成資産の位置する五島列島や平戸島、黒島(佐世保市)等を事例として、ジオツーリズムと世界遺産登録により生じる観光現象との関わりについて、地域イノベーションの視点から検討を加えた。結果、地域イノベーションの伸長には観光の持続可能性への指向が不可欠な要素であることが分かった。それらの成果は、日本観光研究学会、進化経済学会、経済地理学会、全国地理教育学会等で発表した。本年度は、持続可能な地域づくりを目指す小規模島嶼を対象として、実質的にジオツーリズムが展開されている地域におけるイノベーションと観光学の果たすべき役割について、実証的に明らかにすることを目的に研究をすすめた。具体的には、次の2点について重点的に取り組んだ。研究手法としては、現地に赴くに先立っては文献調査(先行研究や新聞記事の収集・分析)、島民などの当事者と当該地域の自治体職員を対象とした聞き取り調査を軸にした。1.小規模島嶼を対象としたジオパークにおけるジオツーリズムの現状把握2015年9月に、「三島村・鬼界カルデラジオパーク」に認定され、且つ、2016年4月に成立・公布の有人国境離島地域の保全及び特定有人国境離島地域に係る地域社会の維持に関する特別措置法(通称:国境離島新法)における対象島嶼から構成される鹿児島県鹿児島郡三島村を対象として、ジオパークの認定の前と後でのとりわけ島民のそれに対する意識の変遷を、地域イノベーションの視点からの把握に従事した。2.小規模島嶼及びその関連地域を含む条件不利地域を対象としたジオツーリズムの現状把握ジオツーリズムは、「Geo as Eco」と表す言葉があるように、エコツーリズムや世界遺産における観光現象も包含しうる意味合いを有している。この観点から、2015年7月に世界遺産に登録された「明治日本の産業革命遺産」を構成する端島(通称:軍艦島、長崎市)や高島(長崎市)、2017年の登録を目指す「長崎と天草地方の潜伏キリシタン関連遺産」の構成資産の位置する五島列島やその関連地域(本土側に位置する長崎市外海地区)を事例として、ジオツーリズムと世界遺産の観光との関わりについて、地域イノベーションの視点から検討を加えた。それらの成果は、全国地理教育学会大会、日本観光研究学会大会、観光学術学会研究集会、進化経済学会大会企画セッション等で発表した。過去におこなった類似調査により得られた聞き取り調査結果に加え、今年度新たに地域イノベーションの視点からの聞き取り調査を実施することで、経年的かつよりリアルな発話等のデータを得ることができた。それらの成果は、論文として公表したのをはじめ、各種学会大会等において口頭発表をおこない、ダークツーリズム研究の世界的権威として知られるR.シャープリー教授をはじめとする海外研究者との意見交換の機会を得た。以上のことから、当初の予定以上に調査の進展がみられた。本年度は、持続可能な地域づくりを指向する小規模島嶼とその関連地域を対象として、実質的にジオツーリズムが展開されている地域のイノベーションと観光学の果たすべき役割について、引き続き実証的に明らかにすることを目的に研究をすすめた。研究手法としては、現地に赴くに先立っては文献調査(先行研究や新聞記事等の資料収集と分析)、島民や関係する地域住民等の当事者と当該地域の自治体を対象とした聞き取り調査である。1.小規模島嶼とその関連地域を対象としたジオツーリズムの現状把握2015年に「明治日本の産業革命遺産」の構成資産の1つとして世界遺産に登録された端島(通称:軍艦島、長崎市)、且つ、2016年4月に成立・公布の有人国境離島地域の保全及び特定有人国境離島地域に係る地域社会の維持に関する特別措置法(通称:国境離島新法)における対象島嶼から構成される甑島(鹿児島県薩摩川内市)を対象として、地域資源を活かしたジオツーリズムに対する当事者の意識を、とりわけポリティクス的視点から把握を試みた。2.小規模島嶼及びその関連地域を含む条件不利地域を対象としたジオツーリズムの動態的展開過程の把握ジオツーリズムは、エコツーリズムや世界遺産における観光現象も包含する意味合いを有している。

この観点から、端島(通称:軍艦島、長崎市)のほか、2018年の世界遺産登録を目指す「長崎と天草地方の潜伏キリシタン関連遺産」の構成資産の位置する五島列島やその関連地域(本土側に位置する長崎市外海地区)を事例として、ジオツーリズムと世界遺産登録により生じる観光現象との関わりについて、地域イノベーションの視点から検討を加えた。それらの成果は、日本観光研究学会大会、日本島嶼学会大会、進化経済学会大会企画セッション等で発表した。過去におこなった類似調査により得られた聞き取り調査結果に加え、今年度新たにポリティクス視点からの調査を実施することで、経年的かつよりリアルな発話、関連する資料等のデータを得ることができた。それらの成果は、論文として公表したのをはじめ、各種学会大会等において口頭ならびにポスター発表をおこなった。また、アウトリーチとして、NHKラジオ第一への出演や、山陰中央新報、八重山日報等の取材を受け、研究成果の還元の機会を得た。以上のことから、おおむね順調に進展していると判断している。小規模島嶼とその関連地域を対象に、実質的にジオツーリズムが展開されている地域のイノベーションと観光学の果たすべき役割について、実証的研究にあたった。研究手法としては、文献調査(先行研究や新聞記事等の資料収集と分析)、島民や観光客及び関連地域の自治体を対象とした聞き取り調査(インタビュー調査、質問紙調査)である。1.小規模島嶼とその関連地域を対象としたジオツーリズム推進のための基盤的認識の把握2015年に「明治日本の産業革命遺産」の構成資産の1つとして世界遺産登録された端島(通称:軍艦島、長崎市)、且つ、2016年4月に成立・公布の国境離島新法における対象島嶼から構成される五島列島ジオパーク構想(長崎県五島市)、島嶼で唯一ユネスコエコパーク認定を受けている世界遺産・屋久島(鹿児島県)、国境島嶼のうち、韓国が国内ジオパークに認定したとされる竹島(島根県隠岐の島町)を主対象として、地域資源を活かしたジオツーリズムや、その前提となる小規模島嶼の価値意識の把握を試みた。結果、ジオツーリズムの推進には島嶼のもつ固有性・地域的完結性の事前認識の必然性が明らかになった。2.小規模島嶼とその関連地域を対象としたジオツーリズムの動態的展開過程の把握ジオツーリズムは、エコツーリズムや世界遺産における観光現象も包含する意味合いを有している。この観点から、端島のほか、2018年に世界遺産登録された「長崎と天草地方の潜伏キリシタン関連遺産」の構成資産の位置する五島列島や平戸島、黒島(佐世保市)等を事例として、ジオツーリズムと世界遺産登録により生じる観光現象との関わりについて、地域イノベーションの視点から検討を加えた。結果、地域イノベーションの伸長には観光の持続可能性への指向が不可欠な要素であることが分かった。それらの成果は、日本観光研究学会、進化経済学会、経済地理学会、全国地理教育学会等で発表した。
個体・組織での１細胞機能イメージングを可能にする光活性化機能センサータンパク質

申請者はこれまでにFRET(蛍光エネルギー移動)を利用したカルシウムイオン濃度センサータンパク質Cameleon YC3.6を元に光活性化カルシウムイオン濃度センサータンパク質PA-Cameleonを作製していた。このセンサータンパク質はFRETのエネルギーのドナーであるPA-GFP(光活性化GFP)、エネルギーのアクセプターである色素タンパク質、そしてセンサードメインとしてのカルシウム結合タンパク質Calmodulin-M13ペプチドから構成されていた。PA-CameleonはHeLa細胞内でのカルシウム応答の可視化に成功していたが、神経細胞内で自発的なカルシウム濃度変化等を検知することが出来なかった。そこで、センサー部分をニワトリ骨格筋由来トロポニンCに入れ替えて新たにPA-TNXLを開発し、ラット海馬神経の初代培養細胞内で1細胞レベルの光活性化、細胞内の自発的なカルシウム振動を可視化することに成功した(Matsuda T. et. al. Sci. Rep. 2013)。さらに、FRETとは異なる原理で光活性化カルシウムイオン濃度センサーを開発した。光刺激によって蛍光波長を変化させることができる蛍光タンパク質mMapleに円順列変異を導入し、蛍光発色団付近に新たに出来たN末端、C末端にそれぞれM13とカルモジュリンを繋げたコンストラクトを基に、遺伝子改変により新規カルシウムイオンセンサータンパク質GR-GECOを開発した。GR-GECOは光刺激により緑色から赤色に蛍光色を変化させ、カルシウム濃度上昇に伴い蛍光強度の増大させることができる。本センサーについてもHeLa細胞内とラット海馬神経細胞での光活性化とカルシウムイメージングに成功した(Hoi H., Matusda T. et. al. J. Am. Chem. Soc. 2013)。24年度が最終年度であるため、記入しない。申請者はこれまでに連携研究者の作製したFRET(蛍光エネルギー移動)を利用したカルシウムイオン濃度センサータンパク質Cameleon(Nagai T et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,101,10554-10559,2004)を元に光活性化カルシウムイオン濃度センサータンパク質を作製している。このセンサータンパク質はFRETのエネルギーのドナーであるPA-GFP(光活性化GFP)、エネルギーのアクセプターである赤色蛍光タンパク質、そしてセンサードメインとしてのカルシウム結合タンパク質Calmoduhn-M13ペプチドから構成されていた。改良にあたって、まず赤色蛍光タンパク質の部分を、既に報告のあるクラゲ、イソギンチャク、から単離された色素タンパク質のうち、その吸収スペクトルが活性化型PA-GFP蛍光スペクトルとオーバーラップのあるものに交換した。センサーのスクリーニングはHeLa細胞内に発現させて行い、(1)発現細胞内で凝集体形成が起こっていないこと(2)共焦点顕微鏡下で光刺激を行った際刺激後に有意な蛍光強度の増加が得られていること(3)細胞にhistamine刺激を与えた際のカルシウム変動をモニター出来ていることを指標に選択した。FRETを利用した機能タンパク質の開発においては、蛍光タンパク質中の蛍光発色団の相対的な位置関係の最適化が必須であるため、センサーの構成要素間のリンカー長の改変や色素タンパク質の円順列変異導入による相対角度の最適化を行い、黄色蛍光タンパク質Venusの無蛍光変異体DimVenusの円順列変異体をアクセプターとして持つPA-Cameleonを開発した。交付申請時に目標としていたPA-Cameleonの開発を達成しているため。PA-Cameleonの光活性化蛍光タンパク質部分のPA-GFPを光刺激により可逆的に蛍光のon、offを行うことのできるPadron等の可逆的な光活性化蛍光タンパク質に入れ替えることにより蛍光出現と消失を自由にコントロールできるような光活性化カルシウムイオン濃度センサータンパク質の開発を試みる。
固体/溶液界面層の極微構造のその場観察と超高速ダイナミクス

基礎、応用の両面で益々その重要視が増しつつある固体/溶液界面反応を厳密に理解する事を目的に、STM、AFM等やシンクロトロン放射(SOR)光を利用した表面X線散乱(SXS)及びX吸収分光(XAS)により固体/溶液界面の三次元構造を原子・分子レベルで解析し、二次元高調波発生(SHG)/和周波発生(SFG)といった超高速非線形分光により固体/溶液界面反応プロセスを超短時間領域に拡大して詳細に検討した。具体的には以下の項目について検討した。1.金属・半導体電極上への異種金属の電析過程の構造解析金属・半導体単結晶電極上に、異種金属を単分子層以下で電析し、STM/AFMにより電析構造を詳細に解析した。また、電析構造に及ぼす影響として、下地層構造、溶液種吸着、水和などを取り上げ、その影響について、SXS/XASによる三次元構造解析により厳密に評価した。2.機能性有機分子層の構造/配向の評価と有機分子層反応の超高速追跡前年度の検討に引き続き、溶液のpHやイオン強度を変化させる事により、有機単分子層と溶液内化学種との相互作用さらには電子移動特性の制御を試みた。また、前年度開発したSHG/SFGシステムを利用して有機単分子層内の電子移動反応を超高速追跡した。3.電池反応時の電極表面の構造解析と高速反応追跡一般に使われている鉛蓄電池やリチウム二次元電池の反応時の電極表面構造をSTMその場観察した。基礎、応用の両面で益々その重要視が増しつつある固体/溶液界面反応を厳密に理解する事を目的に、STM、AFM等やシンクロトロン放射(SOR)光を利用した表面X線散乱(XSW)及びX吸収分光(XAS)により固体/溶液界の3次元構造を原子・分子レベルで解析し、二次元高調波発生(SHG)/和周波発生(SFG)といった超高速非線形分光により固体/溶液界面反応プロセスを超短時間領域に拡大して詳細に検討した。具体的には、1)金属・半導体単結晶電極表面構造の再配列反応及び溶液種吸着の影響の評価金属・半導体単結晶表面の真空中とは異なる再配列構造を、溶液種(カチオン種、アニオン種、溶存種)吸着の影響や下地層の構造による影響を探りながら、STM/AFM/SXS/XSW/XASにより厳密に解析し、溶液種吸着構造をRAS/SFGによって解析した。2)機能性有機分子層の構造/配向の評価と有機分子層反応の超高速追跡種々の末端官能基をもった修飾分子を合成し、自己組織化法により固体表面に配列し、配向性をSTM/AFM及びIRASに用いて決定した。なお、反応素過程における電子移動速度をSHG/SFGによって検討するシステムを開発しつつある。1.金属・半導体電極上への異種金属の電析過程の構造解析金属・半導体単結晶電極上に、異種金属を単分子層以下で電析し、STM/AFMにより電析構造を詳細に解析する。
美しい金属樹の平面展開とフィルム保存法からの発展

美しい金属樹の平面展開(平面的につくる)の研究を行い、最も美しく、簡単に短時間でつくる条件を確立した。同時に美しくラミネートフィルムに固定する技術を確立した。(1)過去の金属樹研究では、金属結晶のデータとともに成長速度を正確に表現する方法がなかった。本研究では、金属樹をラミネートフィルム化することにより、データとして半永久的に保存できるものとし、金属結晶を成長させる条件(金属溶液の濃度、金属種、温度、時間)によりどのように変わるかを明らかにした。本研究により、次の金属の金属樹が的に成長するデータが蓄積された。(1)金、(2)銀、(3)銅、(4)錫(2)本研究により、表のように経費と短時間を大幅に少ない条件で美しい金色の金樹をつくる方法を確立した。生徒実験がなかった金樹について、生徒実験を開発し、実践した。(3)インパクトのある実験を開発し、9月に都立葛西工業高等学校で教育実践するとともに、東京化学教育研究会(CEAT)において教員への実験講習を行なった。また、7月末に科学技術館で行われた青少年科学の祭典において、子供や大人を対象とした体験実験を展開し、一般市民の科学リテラシーの向上に努めた。(4)本研究の研究成果は、平成24年度全国理化教育大会・北海道大会、及び東京都理化教育研究会研究発表会で研究発表した。
行動タイミングを計る大脳皮質-基底核マルチニューロン活動

ラットの大脳皮質や基底核の回路がどのように運動指令を生成し、行動タイミングを計るのかについては、いまだに大きな謎に包まれている。研究代表者は、前肢を使うオペラント学習課題にマルチニューロン記録法や傍細胞(ジャクスタセルラー)記録法を組み合わせて、ラットの自発性運動の発現を担う大脳皮質(一次運動野)と大脳基底核(背外側線条体)の回路機構に関する行動・生理学的研究を推進してきた。本研究では、ラットが自発性運動を発現するために行動タイミングを計る大脳皮質と基底核の多領域間回路の情報伝達を、独自の行動・生理学的手法と光遺伝学的手法を駆使して解明し、小動物の「こころの時間」の神経基盤に迫ることを目指した。本年度は、行動タイミング課題を遂行しているラットの大脳皮質や大脳基底核における神経活動をマルチニューロン記録する行動・生理実験を開始した。まずラットを馴化した後、イソフルラン吸入麻酔下で頭部固定具と接地・参照電極を頭部に取り付ける手術をおこなった。手術回復後、飲水制限を課し、多個体行動課題訓練装置を活用して、頭部固定下で前肢を使ってレバーを操作するオペラント学習課題の訓練を施した。学習効率を大幅に向上させるために、レバーとスパウト(報酬飲み口)が一体化した「スパウトレバー」を採用した。この訓練装置をもちいると、ラットは右前肢でレバーを押し切って、一定時間(1秒間など)保持後に自発的にレバーを引いて報酬を獲得することを学習した。このような学習行動の実験を計3頭のラットをもちいて実施した。本研究は、他研究課題(科研費新学術領域研究計画研究)の新規開始に伴い、本年度途中で廃止することとなった。26年度が最終年度であるため、記入しない。