hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
修辞的・統計的・文法的な情報を動的に重畳して表現するテキスト編集環境

本研究は,テキスト編集時に,テキストの状態や構造を踏まえた視覚的な表現を効果的に持ち込むことにより,書き手の認知プロセスに寄り添うテキスト編集環境の構築を目指すものであった.Dynagraph, Markleft, Markleft2という三つのツールを構築し、テキスト編集時に書き手に対して書きつつあるテキスト表現の現在の状態をフィードバックするようなビジュアルインタラクティビティのデザインと具現化を実施した。本研究は,テキスト編集をおこなう際に,テキストの状態や構造を踏まえた視覚的な表現を効果的に持ち込むことによって,より良いテキストをより快適に書いていくことができるテキスト編集環境を目指すものである.書きつつあるテキストが現状ではどのような状態・状況にあるのかということを,書き手に対して視覚的にフィードバックし,その視覚的表現が,書きつつあるテキストのrepresentational talkback (表現からの語りかけ)を増幅するものとして作用することを狙っている.研究初年度にあたる平成23年度は,書きつつあるテキストがいま状態どのような状況にあるかを視覚的に表現するための情報を動的に解析する技術の開発,およびその状況を編集環境に重畳表現するためのビジュアルインタラクティビティのデザインに着手した.二年目にあたる平成24年度は,単語やフレーズといったテキストの部分表現のバリエーションの作成と保持,およびシミュレーションを行うためのツールのインタラクティビティのデザインとプロトタイプ実装に着手した.言葉遣いやフレーズといったものを決めかねていたり,ここはこう書きたいけれどもこの部分はまだちょっと確信が持てずに逡巡していたりといった,書き手の,書いている言葉やフレーズに対する確信の度合いやそれを選ぶ上での迷いといったものを、テキストを書いていく際に表現し見てとることが出来るようにするテキスト編集ツールMarkleftを構築した.リールというコンセプトをプレーンテキストエディタに導入し,文書のバージョンを分岐することなく,生成した言葉に対する複数案を同時に操作できるような環境となった.本研究は,テキスト編集時に,テキストの状態や構造を踏まえた視覚的な表現を効果的に持ち込むことにより,書き手の認知プロセスに寄り添うテキスト編集環境の構築を目指すものであった.研究初年度に構築したDynagraphは,入力中の文章に対して動的なテキスト解析を高速に行う解釈エンジンをバックグラウンドで走らせ,名詞,動詞および形容詞からなる各内容語が,書かれつつある文章のどの部分にあるかを示すインデックスを作成することで,入力中の文章に洗われる単語の出現頻度や出現箇所をビジュアルに表現するツールを実現したものである.研究第二年度は,文章を編集するウィンドウ内でテキストを入力していく際に,指定した単語やフレーズ部分に対して,複数の案をブランチ(枝)として生成していけるようなテキスト編集ツールMarkleftを構築した.リール方式のインタラクティビティのメタフォを利用し,代替案(alternatives)を選択した単語やフレーズに対するインラインのコラムとして表示し,代替案の変更や選択をキーストロークで行えるようにした.研究最終年度に構築したMarkleft2では,現状テキスト,代替案リスト,予測テキストという三つのカラムを擁することで,語彙やフレーズの選択の揺れを代替案として列挙しながら,書きつつあるテキストの現状とそれに対して代替案を適用した場合のwhat-if状態の双方を見比べながら文章を書く,という行為を支援することを実現した.これらのツールの構築を通して,ビジュアルな表現を介して,書きつつあるテキストが現状ではどのような状態・状況にあるのかということを,書き手に対して視覚的にフィードバックし,その視覚的表現を書きつつあるテキストのrepresentational talkback (表現からの語りかけ)を増幅するものとして作用させる機構を構築することができた.本研究は,テキスト編集時に,テキストの状態や構造を踏まえた視覚的な表現を効果的に持ち込むことにより,書き手の認知プロセスに寄り添うテキスト編集環境の構築を目指すものであった.Dynagraph, Markleft, Markleft2という三つのツールを構築し、テキスト編集時に書き手に対して書きつつあるテキスト表現の現在の状態をフィードバックするようなビジュアルインタラクティビティのデザインと具現化を実施した。本研究は,テキスト編集をおこなう際に,テキストの状態や構造を踏まえた視覚的な表現を効果的に持ち込むことによって,より良いテキストをより快適に書いていくことができるテキスト編集環境を目指すものである.書きつつあるテキストが現状ではどのような状態・状況にあるのかということを,書き手に対して視覚的にフィードバックし,その視覚的表現が,書きつつあるテキストのrepresentational talkback (表現からの語りかけ)を増幅するものとして作用することを狙っている.研究初年度にあたる本年度は,(1)書きつつあるテキストがいま状態どのような状況にあるかを視覚的に表現するための情報を動的に解析する技術の開発,および,(2)その状況を編集環境に重畳表現するためのビジュアルインタラクティビティのデザインに着手した.編集環境において書きつつあるテキストの状況を示す情報として,書きつつあるテキストの中での単語やフレーズの頻度はどのようなものであって,それがどのように分布しているかのを編集中のテキスト情報に対して動的に解析する技術として,Squeak環境上に構築した簡易テキストエディタを利用して編集されつつあるテキスト情報の内容に対して,Bag-of-Wordsモデルをベースとした文書のスペクトルモデルを構築するツールのプロトタピングをおこなった.求めたテキスト情報を編集内容に対して重畳表現するためのビジュアルなインタラクティビティのための表現として,取り出した単語/フレーズおよびその語幹をそれぞれリストとして編集環境に添えて表現し,リスト中のある語やフレーズ,語幹を選択した際に,それが出現している箇所を,ハイライトする機能をSqueak環境上で実装した.本研究開始時に予定していた,テキスト情報のバリエーションやシミュレーションとして効果的に比較することができるような視覚的な表現のデザインと,テキスト情報の一部が異なるバリエーション表現手法の構築,およびテキスト解析情報を視覚的に表現するタイポグラフィック

表現手法の構築を個別にデザインした上でテキスト編集環境へと組み込むという計画を変更し,まずは初年度(平成23年度)に、テキスト編集環境と一体化したビジュアルインタラクションとしてデザインすることとして前倒しした.テキスト編集環境における書かれつつあるテキスト情報のリアルタイム解析処理機能の開発と,それを用いながらインタラクティブな視覚的表現のデザインを行った.平成24年度は,テキスト情報のバリエーションの視覚表現のデザインを重点的に行い,当初の計画通りの研究の進捗となった.本研究開始時には,初年度に,テキスト情報のバリエーションやシミュレーションとして効果的に比較することができるような視覚的な表現のデザインと,テキスト情報の一部が異なるバリエーション表現手法の構築,およびテキスト解析情報を視覚的に表現するタイポグラフィック表現手法の構築を行い,次年度以降に,それらの手法をテキスト編集環境と一体化し,書くという行為の認知モデルへと展開することとしていた.研究を開始し視覚的な表現のデザインへの取り組みを進めるに伴い,それらの視覚的表現を個別にデザインした上でテキスト編集環境へと組み込むよりも,むしろ,テキスト編集環境と一体化したビジュアルインタラクションとしてデザインしていくべきであるという結論に至った.そこで,当初,平成24年度に予定していたテキスト編集環境との一体化を平成23年度に実施することとして前倒しし,テキスト編集環境における書かれつつあるテキスト情報のリアルタイム解析処理機能を開発し,それを用いながらインタラクティブな視覚的表現のデザインに着手することとした.この結果,平成23年度に予定していた,テキスト情報のバリエーションの視覚表現のデザインは,平成24年度に重点的に行うこととなった.
光化学治療による腫瘍細胞死とBcl-2/Bax発現の関連

マウスNR-S1腫瘍に対する光化学治療(PDT)を行い、腫瘍細胞死とBcl-2/Bax発現の関連性の検討を行っている。まずC3Hマウスの背部にNR-S1扁平上皮癌細胞を移植し、径8mm程度まで増殖させ、担癌モデルを作製した。そこで、固形腫瘍に対し、フォトフリン及びNd/YAG色素レーザーを用いてPDTを行った。光化学治療施行一定時間後に組織を摘出し、H-E切片を作製した後画像解析を行い、全面積と組織壊死面積の比を算出してPDT効果の指標とした。結果、24時間後に最大の抗腫瘍効果が得られることがわかった。現在、組織切片上にて抗Bcl-2/Bax抗体を用いた免疫染色を行い、組織内部位特異性と陽性細胞のカウントによる経時的定量化を行っている。
弦理論のコンパクト化と現象論的性質についての研究

超弦理論は、重力を含む統一理論の有力な候補である。超弦理論が本当に素粒子物理として、意味がある理論であるならば、低エネルギー有効理論として標準模型を再現するはずである。本研究の目的は、素粒子物理学の様々な現象論的性質が超弦理論の枠組みからどのようにして導出されるのかを研究することである。本年度我々は、まずF理論の現象論への応用について研究を行った。F理論は、IIB型超弦理論の強結合理論を記述すると思われているが、最近そのF理論の現象論への応用が盛んに研究されている。これまでのF理論の模型構築のシナリオはE8群から一度SU(5)群等の大統一理論を経て、標準模型を導出するようなアプローチであった。本年度我々は、SU(5)等の大統一理論を経るのではなく、直接標準模型を構築するような可能性を試み、かなり現実的なスペクトルを得ることに成功した。今後は、そのような研究を更に進めて、我々が構築した模型の質量行列や陽子崩壊、超対称性の破れなどの現象論的な性質の解析をする計画である。一方で我々は、背景磁場のあるブレーン模型の現象論的性質、特にフレーバー構造についての研究を行った。その結果によるとこのような模型では特定の非可換離散群がフレーバー対称性として現れることを示した。その起源は、コンパクト空間の幾何学的対称性ともともと大きなゲージ対称性が背景磁場のために破れる際に残った離散対称性の組み合わせであることを示した。今後はこの解析の結果を生かし、現実的なクォーク・レプトンの質量行列を導出する研究を行う予定である。超弦理論が本当に素粒子物理として意味がある理論であるならば、低エネルギー有効理論として4次元の標準模型を再現するはずである。このように、超弦理論から我々の現実の世界がどのように導かれるかということが我々の研究テーマである。標準模型において3世代のフレーバー構造の起源を理解することは、重要な課題の1つである。実際に、クォーク、レプトンの質量、混合角などフレーバー構造にかかわるフリーパラメータが標準模型では最も多く含まれる。これまで交叉するD-ブレーンや背景磁場のあるD-ブレーンなどD-ブレーンを使った現実的な超弦理論の模型の試みがなされてきたが、完全に現実的な質量行列を導出するにはいたっていない。その原因は上述のような模型から導かれるフレーバー構造は比較的単純で対称性が高い質量行列しか得られない点である。本年度の我々の研究では、オービフォルド上に背景磁場のあるブレーン模型を提案した。そして、そのような模型ではより豊かなフレーバー構造を導出することが可能であることを示した。更に、3世代模型のフレーバー構造を系統的に分類し、いくつかの模型についてある程度現実的な質量行列が導出可能であることを示した。今後は、より現実的なフレーバー構造の導出に向けて、更なる系統的な解析が重要である。本年度我々は、背景磁場のあるコンパクト化により導かれる4次元有効理論の様々な現象論的性質を解析した。それは、導出されるゼロモードのスペクトルが現実的かどうか、そしてそのようなゼロモード間の4次元有効理論における結合の強さの計算やその結合項などを支配する対称性などの研究である。特にそのようなコンパクト化において、特定の離散的な非可換フレーバー対称性が現れることを示した。一方で、Kang-Sin Choi氏は、ヘテロ型オービファルド模型の枠組みで、近似的な対称性やアクシデンタルな対称性の出現を解析し、CP問題との関連を研究した。更に最近、F理論から素粒子現象論的に有望な模型の構築が盛んに行われるようになっているが、Kang-Sin Choi氏は、様々な群構造を導出するための研究を行った。

その起源は、コンパクト空間の幾何学的対称性ともともと大きなゲージ対称性が背景磁場のために破れる際に残った離散対称性の組み合わせであることを示した。今後はこの解析の結果を生かし、現実的なクォーク・レプトンの質量行列を導出する研究を行う予定である。
古事記伝形成過程の基礎的研究

1 57月の作業内容ー宣長自筆本古事記(以下書入本と称す)の初回の写真(本居宣長記念館・複製国文学研究資料館)は撮影に挿紙せず、表裏の文字等が重複し、小生の複写は更に悪く特に欄外の書入等は殆ど判読できぬ。従ってこの期は複写の判読困難部のチェック・符号等の記入、ノート類に判読時のための書入等の作業を行った。2 79月ー夏期上京し、資料館のマイクロ・プリンターの作業で、判読が進み、その部を複写とノートの不明部に記入作業を行った。(1)書入の第一はその所に関聯する万葉集の巻・丁数のオ・ウの書入。(2)ついで風土記等の上代文献の記入であり、此らにより実証に徹底する研究態度が如実に知られた。(3)寛永版の附訓の訂正・新付訓(空白部)延佳本等の文字の校定作業。(4)貼紙の多用ー此は序文の前にも多量の参考の書入等があり、至る所に貼紙があり、地方資料にも及び研究の多用性が見られた。(5)この期に記念館での挿絵を入れた再撮影の紙焼により判読進行の予定が撮影者の都合で入手延期となり、直接記念館で不明部の照合を行った。3 1012月ー引き継き複写の困難部の指摘・マイクロ・リーダーによる解読作業を行った。記念館での直接照合にも努めた。4 13月ー漸く書入本・記伝草稿(22冊)の紙焼到着不明部分減りその部分を記念館で照合した。5 4月以降は書入本を基礎に、草稿本の内容解読、古事記雑考との関聯浄書本・国会本(総論部)それらの複写(入手済)資料と天理図書館の記伝巻三自筆浄書本・神宮文庫の荒木田尚賢書写記伝(共に複写入手諒解済)を得て、此等全資料を比較考察することによって記伝の形成過程に綜合的な視野から研究を進める予定である。
活性酸素より促進されるEGFレセプターのリン酸化の機構とその意義

我々は、多重芳香キノン環を持つ植物色素カルホスチンCが扁平上皮癌細胞株NAや肺腺癌細胞株A549のEGFレセプターのSer/Thrリン酸化とインターナリゼーションを可視光依存的に促進することを見出した。EGFレセプターのリン酸化部位のホスホペプチドマップ法のよる解析から、MAPキナーゼの活性化が示唆された。そこで、カルホスチンC/可視光処理後、MAPキナーゼを免疫沈殿法で解析したところ、Tyrリン酸化が処理後5分で観察された。従って、MAPキナーゼがリン酸化により活性化され、MAPキナーゼによりEGFレセプターがリン酸化されインターナリゼーションの促進に至ると示唆された。カルホスチンCと側鎖の構造が異なる類似体カルホスチンDでもMAPキナーゼリン酸化、EGFレセプターリン酸化が見られたので、一連の応答は両物質に共通の構造、多重芳香キノン環が可視光依存的に活性酸素(一重項酸素)を発生させることに起因すると考えられた。MAPキナーゼのTyrリン酸化が、カルホスチンによるMAPキナーゼの直接の活性化か、あるいはMAPキナーゼをリン酸化する酵素の活性化かについて検討中である。さらに、各種の活性酸素によるEGFレセプターリン酸化の促進について検討した。一重項酸素及びスーパーオキシドを発生させる紫外線(短波長254nm)照射では、EGFレセプターのSer/Thrのリン酸化の促進と、鉄キレート剤ジピリジルによる抑制、MAPキナーゼのTyrリン酸化が観察された。一方、過酸化水素処理では、EGFレセプターの少なくとも4残基のTyrリン酸化の促進と塩化マンガンによる抑制が観察されたが、MAPキナーゼのリン酸化は見られなかった。レセプターTyrリン酸化はEGFの結合に伴うTyrリン酸化よりも顕著で、レセプターキナーゼ自身による自己リン酸化か、またレセプターと会合するTyrキナーゼによるかを検討中である。これらの結果から、活性酸素が未同定の蛋白キナーゼを含め増殖因子レセプターを介する細胞内シグナル伝達系の因子を細胞内標的とすると考えられた。さらに、発生する活性酸素の分子種や発生の細胞内局在の差異により異なる細胞応答を誘導することを示唆している。
シャルコ-関節滑膜組織中に発現した破骨細胞分化促進因子の解析

ムチランス型慢性関節リウマチ患者の経過観察中、しばしば認められる急速な骨吸収による関節破壊、我々はこれを急速骨破壊進行部位とし、この部位における破骨細胞の骨吸収能に着目し分子量約20kDの破骨細胞活性化蛋白を発見した。その後、シャルコー関節の滑膜組織中にも同様の蛋白を発見し研究を進めた。現在のところ構造決定には至っていないものの、分子量などの研究経過を整理し、投稿準備中である。我々のグループの研究経過を以下のように報告する。(a)シャルコー関節における急速関節破壊進行部位より採取した滑膜組織の培養開始一週後、培養上清を採取し濃縮後セファデックスG・15カラムにてゲル濾過し、分子量勾配に従って再び採取したサンプルを準備した。象牙片上に培養した破骨細胞に準備したサンプルを添加し、吸収孔形成への影響を測定したところ、コントロールと比較し有意に骨吸収が亢進した。(b)吸収孔形成の促進作用が認められるサンプルチューブを電気泳動法にかけ、含有する物質の分子量を確認したところ、20kDの破骨細胞活性化機能を有する活性蛋白質を確認した。(c)DE52カラムを用い、電気極性にてさらに含有蛋白を細分化し精製した後、再度破滑細胞培養系に添加し、破骨細胞活性化作用を確認した。その後、我々はシャルコー関節における急速骨破壊進行部位より採取した滑膜組織中にこの蛋白が存在することを免疫組織学的に確認した。この因子の破骨細胞活性化作用はIL・IRAや抗GP130中和抗体等の破骨細胞活性化サイトカインの阻害薬で抑制を受けなかった。これらの事実より、シャルコー関節における急速骨破壊は滑膜細胞にて産生されるこの活性蛋白質の発現を介して破骨細胞を活性化し発生する可能性が示唆された。現在のところ標的蛋白のアミノ酸配列の決定を急いでいるが構造決定には未だ至っていない。本研究はムチランス型慢性関節リウマチ患者の急速骨破壊進行部位における破骨細胞の骨吸収能の研究がきっかけとなり実験を開始したわけであるが、現在のところ蛋白の精製、および構造決定には未だ至っていない。シャルコー関節の滑膜組織中に認められた分子量約20kDのこの蛋白の構造決定には至っていないものの、その分子量など、途中経過までの実験結果を整理し、現在投稿準備中である。我々のグループの研究経過を以下のように整理し、報告する。まず、我々は(a)シャルコー関節における急速関節破壊進行部位より採取した滑膜組織の培養開始一週後、培養上清を採取し濃縮後セファデックスG・15カラムにてゲル濾過し、分子量勾配に従って再び採取したサンプルを準備した。今後、我々はシャルコー関節における急速骨破壊進行部位より採取した組織中より破骨細胞活性化作用を有し、約20kDの分子量を持つ活性蛋白質の分離に成功し、この因子の作用はIL・1RAや抗GP130中和抗体等の破骨細胞活性化サイトカインの阻害薬で抑制を受けなかった。今後、更に標的蛋白の精製作業を進め、アミノ酸配列の決定を急ぐ予定である。

これらの事実より、シャルコー関節における急速骨破壊は滑膜細胞にて産生されるこの活性蛋白質の発現を介して破骨細胞を活性化し発生する可能性が示唆された。現在のところ標的蛋白のアミノ酸配列の決定を急いでいるが構造決定には未だ至っていない。
リゾチームの加水分解反応と転移反応の制御とその応用に関する研究

リゾチームは加水分解反応と同時に高能率な糖転移反応を触媒する.この高能率な糖転移反応の発現機構は明らかでない.本研究は糖転移反応の発現機構を明らかにし,加水分解反応と転移反応を分別制御する方法を確立し,リゾチームの利用に関する基礎資料を得ることを目的としている.昨年度は基質結合部位のAC部位の右側に沿って存在するループ領域(101105残基)にアミノ酸の置換があるリゾチームやF部位のArg114(ニワトリリゾチーム)がHisに置換しているホロホロチョウリゾチーム(GHL)の活性変動を詳細に検討した.本年度は,さらにこれらのリゾチームの置換アミノ酸を化学修飾し,活性変動を検討した.GHLのHis114をジエチルピロカーボネートやモノヨード酢酸で修飾すると,GHLの(GlcNAc)_5を基質とした反応タイムコースは未修飾リゾチームから大きく変動した.すなわち,反応20分後の反応生成物は(GlcNAc)_1>(GlcNAc)_4>(GlcNAc)_2>(GlcNAc)_3>(GlcNAc)_5であった.この変動は未修飾リゾチームからE,F部位の結合エネルギーがそれぞれ-0.2kcal/molづつ減少し,転移反応の速度定数が35sec-1から2018sec-1に減少したためであった.Glu35とTrp108をエステル結合させると触媒基周辺の構造を変えることなく,触媒作用がなくなるので,Glu35とTrp108をエステル結合させたGHLの基質(GlcNAc)_6との結合を検討した.修飾リゾチームは(GlcNAc)_6存在下で^1H-NMRスペクトルを測定した結果,His114のシグナルに全く変動が無く,(GlcNAc)_6がHis114の周辺に結合していないと判断された.すなわち,基質はE,F部位のレフトサイドに結合していると考えられた。これらの結果から,基質はまずレフトサイドに結合し,つぎにライトサイドに移動すると同時に空いたレフトサイドにアクセプターが結合し,酵素-基質-アクセプター複合体が形成されると推定された.リゾチームは加水分解反応と同時に高能率な糖転移反応を触媒する.この高能率な糖転移反応の発現機構は明らかでない.本研究は糖転移反応の発現機構を明らかにし,加水分解反応と転移反応を分別制御する方法を確立し,リゾチームの利用に関する基礎資料を得ることを目的としている.昨年度は基質結合部位のAC部位の右側に沿って存在するループ領域(101105残基)にアミノ酸の置換があるリゾチームやF部位のArg114(ニワトリリゾチーム)がHisに置換しているホロホロチョウリゾチーム(GHL)の活性変動を詳細に検討した.本年度は,さらにこれらのリゾチームの置換アミノ酸を化学修飾し,活性変動を検討した.GHLのHis114をジエチルピロカーボネートやモノヨード酢酸で修飾すると,GHLの(GlcNAc)_5を基質とした反応タイムコースは未修飾リゾチームから大きく変動した.すなわち,反応20分後の反応生成物は(GlcNAc)_1>(GlcNAc)_4>(GlcNAc)_2>(GlcNAc)_3>(GlcNAc)_5であった.この変動は未修飾リゾチームからE,F部位の結合エネルギーがそれぞれ-0.2kcal/molづつ減少し,転移反応の速度定数が35sec-1から2018sec-1に減少したためであった.Glu35とTrp108をエステル結合させると触媒基周辺の構造を変えることなく,触媒作用がなくなるので,Glu35とTrp108をエステル結合させたGHLの基質(GlcNAc)_6との結合を検討した.修飾リゾチームは(GlcNAc)_6存在下で^1H-NMRスペクトルを測定した結果,His114のシグナルに全く変動が無く,(GlcNAc)_6がHis114の周辺に結合していないと判断された.すなわち,基質はE,F部位のレフトサイドに結合していると考えられた。これらの結果から,基質はまずレフトサイドに結合し,つぎにライトサイドに移動すると同時に空いたレフトサイドにアクセプターが結合し,酵素-基質-アクセプター複合体が形成されると推定された.リゾチームは糖加水分解酵素であるが,加水分解反応と同時に高能率に糖転移反応を触媒する.この高能率な転移反応の発現機構は明らかでない.本研究は糖転移反応の発現機構を明らかにし,加水分解反応と転移反応を分別制御する方法を確立し,リゾチームの利用に関する基礎資料を得ることを目的としている.リゾチームは6個のサブサイト(A-F部位)が存在し,それぞれに1個ずつの糖残基が結合する.まずサブサイトに関与するアミノ酸残基に置換が生じている各種鳥類リゾチームの活性をニワトリリゾチーム(HEL)と比較検討した.その結果,A-C部位の右側に沿って存在するループ領域(Asp101-Met105)のアミノ酸の置換は大きく活性を変動させることが明かとなった.例えば,HELのAsn103gaHisに置換したニホンウズラリゾチーム(JQL)はHis103の解離したイミダゾール基がB部位の糖残基と相互作用し,結果としてB部位の基質結合力が減少することにより活性を変動させることが明かとなった.

糖転移反応のアクセプターが結合するE・F部位のPhe34とArg114が他のアミノ酸残基に置換した場合も活性変動を生じる.すなわち,Phe34→Tyr(アヒルリゾチーム)に置換はE・F部位の結合力が増加した.一方,Arg114→His(ホロホロ鳥リゾチーム:GHL)に置換はE・F部位の結合力に影響せずに転移反応の速度定数を減少させた.つぎに,活性変動の原因となったアミノ酸残基の化学修飾を行った.GHLのHis114を修飾するとN-アセチルグリコサミンの5量体を基質に用いた活性測定では,反応生成物のパターンが大きく変化した.これを解析した結果,リゾチームの高能率な転移反応はE・F部位で酵素・基質・アクセプターの1:2複合体が形成されるためと推定された.リゾチームは糖加水分解酵素であるが,加水分解反応と同時に高能率な糖転移反応を触媒する.この高能率な糖転移反応の発現機構は明らかでない.本研究は糖転移反応の発現機構を明らかにし,加水分解反応と転移反応を分別制御する方法を確立し,リゾチームの利用に関する基礎資料を得ることを目的としている.昨年度は基質結合部位のAC部位の右側に沿って存在するループ領域(101105残基)にアミノ酸の置換があるリゾチームやF部位のArg114(ニワトリリゾチーム)がHisに置換しているホロホロチョウリゾチーム(GHL)の活性変動を詳細に検討した.本年度は,さらにこれらのリゾチームの置換アミノ酸を化学修飾し,活性変動を検討した.GHLのHis114をジエチルピロカーボネイトやモノヨード酢酸で修飾すると,GHLの(GlcNAc)_5を基質とした反応タイムコースは未修飾リゾチームから大きく変動した.すなわち,反応20分後の反応生成物は(GlcNAc)_1>(GlcNAc)_4>(GlcNAc)_2>(GlcNAc)_3>(GlcNAc)_5であった.この変動は未修飾リゾチームからE,F部位の結合エネルギーがそれぞれ-0.2kcal/molづつ減少し,転移反応の速度定数が35sec-1から2018sec-1に減少したためであった.Glu35とTrp108をエステル結合させると触媒基周辺の構造を変えることなく,触媒作用がなくなるので,Glu35とTrp108をエステル結合させたGHLの基質(GlcNAc)_6との結合を検討した.修飾リゾチームは(GlcNAc)_6存在下で^1H-NMRスペクトルを測定した結果,His114のシグナルに全く変動が無く,(GlcNAc)_6がHis114の周辺に結合していなと判断された.すなわち,基質はE,F部位のレフトサイドに結合していると考えられた.これらの結果から,基質はまずレフトサイドに結合し,つぎにライトサイドに移動すると同時に空いたレフトサイドにアクセプターが結合し,酵素-基質-アクセプター複合体が形成されると推定された.
漢字かなまじり文を入力とする実時間音声出力システムの開発

本研究は、文節単位で入力された日本語漢字かなまじり文から自然な発話の合成音声を実時間で出力する音声規則合成システムをパーソナル・コンピュータとディジタル・シグナル・プロセッサを用いたコンパクトなシステムとして実現し、実用化の検討を行うことを目的とするもので、以下の実績をあげた。1.単音・韻律記号列の導出に適した形の単語辞書として、形態素項目、音素表記、品詞・活用型、アクセント型、重要度からなる辞書をパーソナル・コンピュータのハード・ディスク装置上に作成した。また、最長一致を基本とする辞書照合方式を作成した。2.組合せが多く、辞書登録が非現実的な数詞+助数詞の読みとアクセント型を決定する促音化規則、アクセント結合規則を開発した。3.隣接句読点間で統語解析を行い、その結果を文・連節・節・ICRLB(左枝分れ境界のみからなる語連鎖)の境界で表現する手法を開発した。4.辞書照合結合、統語解析結果をもとに単音・韻律記号列を導出するプログラムを作成した。5.音節蓄積パターンをハード・ディスク装置上に作成した。特に、破裂音については改良を加え、高品質のものを得た。6.記号列から音響パラメータ時系列を導出するプログラムを作成した。7.ディジタル・シグナル・プロセッサ(DSP)合成フィルタ、制御用IC、DA変換用IC、パワーアンプ等からなるホルマント音声合成器を作成し、パーソナル・コンピュータと接続して音声出力システムを構成した。聴取の結果、特に自然な韻律の合成音声が得られた。以上、音声出力システムの実用化の見通しが得られ、研究目的はほぼ達成された。今後、本研究を発展させ、言語処理機能を拡充した高機能システムの構築を進める予定である。(平成元年度試験研究申請中)本研究は、文節単位で入力された日本語漢字かなまじり文から自然な発話の合成音声を実時間で出力する音声規則合成システムをパーソナル・コンピュータとディジタル・シグナル・プロセッサを用いたコンパクトなシステムとして実現し、実用化の検討を行うことを目的とするもので、以下の実績をあげた。(平成元年度試験研究申請中)
病虫害応答に関与する新規葉緑体機能の探索

本研究は、モデル植物シロイヌナズナのタグラインを用いて、葉緑体が持つ新規機能を調べることを目的として、2つのテーマに関して実験を行った。一つは、病害応答に関与する葉緑体タンパク質の機能解析であり、もう一つは、虫害応答に関与する葉緑体タンパク質の機能解析である。葉緑体は病原菌の感染による免疫応答に関わるCa2+シグナル伝達やROS(reactive oxygen species)を発生する場としての機能を持ち、病害応答において病原菌の侵入を認識するシグナルを受けることで免疫応答を誘導することがわかり始めている。そこで、植物の防御応答メカニズムであるPTI(pattern-triggered immunity / PAMP-triggered immunity)を引き起こす、細菌の鞭毛を構成するフラジェリンのN末端に保存されている22個のアミノ酸flg22を用いて、葉緑体の機能と病害応答の関係を解明するため、葉緑体タンパク質の遺伝子破壊株のスクリーニングを行い、flg22の感受性株としてDs.190とDs.210、非感受性株としてDs.73が得られた。GFP蛍光による細胞内局在観察では、3つの原因タンパク質が葉緑体に局在することが確認され、防御応答メカニズムであるPTIに関与する葉緑体タンパク質単離に成功した。また、虫害応答に関与する葉緑体タンパク質を探索するために、葉緑体タンパク質遺伝子破壊株について、ハモグリバエの加害の程度を指標にスクリーニングを行った結果、虫食い跡に見えると考えられる斑入り変異体の食害は野生型より多く、老化に関与する葉緑体タンパク質の遺伝子破壊株は、食害が少ない傾向が観察された。葉緑体の機能として光合成、脂肪酸合成、アミノ酸合成、亜硝酸還元などが知られている。さらに近年では、葉緑体は病原菌の感染による免疫応答に関わるCa2+シグナル伝達やROS(reactive oxygen species)を発生する場としての機能を持ち、病害応答において病原菌の侵入を認識するシグナルを受けることで免疫応答を誘導することがわかり始めている。そこで、植物の防御応答メカニズムであるPTI(pattern-triggered immunity / PAMP-triggered immunity)を引き起こす、Pseudomonas aeruginosaの鞭毛を構成するフラジェリンのN末端にある22個のアミノ酸配列(flg22)を用いて、葉緑体の機能と病害応答の関係を解明するため、葉緑体タンパク質の遺伝子破壊株のスクリーニングを行った。シロイヌナズナの葉緑体には、3500以上の葉緑体タンパク質が存在していることが示されている。我々は葉緑体への局在が予測された2090の葉緑体タンパク質の遺伝子破壊株をバイオリソースセンターより集め、約2000ラインの葉緑体タンパク質の遺伝子破壊株を収集した。収集した遺伝子破壊株を培地に無菌播種し、5日後の実生に1μM flg22処理し、野生型より生育阻害を受ける感受性株、または、野生型より生育阻害を受けない非感受性株を選抜した。その後、2μM flg22処理し、表現型の再現性を確認した。病害応答に関与する葉緑体タンパク質の解明と同様に、虫害応答に関与する葉緑体タンパク質を探索するために、葉緑体タンパク質遺伝子破壊株について、ハモグリバエの加害の程度を指標にスクリーニングを行う準備を始めた。まず、老化に関与する葉緑体タンパク質の遺伝子破壊株を用いて、野生型とハモグリバエの加害の程度を比較する。フラジェリンのN末端にある22個のアミノ酸配列(flg22)を用いて、葉緑体タンパク質の遺伝子破壊株1284ラインのスクリーニングを行った。2次スクリーニングによって表現型の再現性が得られたラインは16ラインであった。表現型の再現性が得られた16のタグライン(葉緑体タンパク質の遺伝子破壊株)のアレルを探索し、アレルでの表現型の再現性の確認を行った結果、確認できたものは3ラインであった。3ラインのそれぞれの原因遺伝子はAt1g60590(Pectin lyase-like superfamily protein), At3g63510(FMN-linked oxidoreductase superfamily protein)とAt1g78815(Light sensitive hypocotyls 7)であった。この3ラインのうちflg22非感受性変異体は、At1g60590の遺伝子破壊株であり、他の2ラインAt3g63510とAt1g78815の遺伝子破壊株はflg22感受性変異体であった。上記の3つの遺伝子破壊株の遺伝子発現をRT-PCRを用いて調べた結果、いずれの遺伝子破壊株も転写産物は検出されず、完全な遺伝子破壊株であった。葉緑体タンパク質と虫害応答の解明のために、葉緑体タンパク質の遺伝子破壊株のハモグリバエの加害の程度を指標にスクリーニングを行う準備を始めた。共同研究者の安部らにより、古い葉のみがハモグリバエにより加害されることが報告されたので、まず、老化に関与する葉緑体タンパク質の遺伝子破壊株を用いて、野生型とハモグリバエの加害の程度比較する。老化に関与するSAG2,SEN1の遺伝子破壊株、虫に食われたような模様に見える斑入り変異体や黄緑変異体、stay green変異体などを準備したが、担当者の休学により実験は進んでいない。

そこで、植物の防御応答メカニズムであるPTI(pattern-triggered immunity / PAMP-triggered immunity)を引き起こす、細菌の鞭毛を構成するフラジェリンのN末端に保存されている22個のアミノ酸flg22を用いて、葉緑体の機能と病害応答の関係を解明するため、葉緑体タンパク質の遺伝子破壊株のスクリーニングを行った。葉緑体タンパク質の遺伝子破壊株1284ラインから、flg22の感受性株としてDs.190とDs.210、非感受性株としてDs.73が得られた。病害応答に関与する葉緑体タンパク質の解明と同様に、虫害応答に関与する葉緑体タンパク質を探索するために、葉緑体タンパク質遺伝子破壊株について、ハモグリバエの加害の程度を指標にスクリーニングを行った。まず、老化に関与する葉緑体タンパク質の遺伝子破壊株、虫食い跡に見えると考えられる斑入り変異体とstay green変異体を用いて、野生型とハモグリバエの加害の程度を比較した。Stay green変異体の食害は野生型と変わらず、予想に反し斑入り変異体の食害も野生型と顕著に異ならなかった。老化に関与する葉緑体タンパク質の遺伝子破壊株は、食害が多い傾向が観察された。フラジェリンのN末端にある22個のアミノ酸配列(flg22)を用いて、葉緑体タンパク質の遺伝子破壊株1284ラインのスクリーニングを行った。2次スクリーニングによって表現型の再現性が得られたラインは16ラインであった。表現型の再現性が得られた16のタグライン(葉緑体タンパク質の遺伝子破壊株)のアレルを探索し、アレルでの表現型の再現性の確認を行った結果、確認できたものは3ラインであった。3ラインの遺伝子発現をRT-PCRを用いて調べた結果、いずれも転写産物は検出されず、完全な遺伝子破壊株であった。flg22の感受性株としてDs.190とDs.210、非感受性株としてDs.73が得られた。Ds.210ではflg22の受容体FLS2、SA(サリチル酸)合成遺伝子ICS1とWRKY22の発現低下がみられた。また、flg22非感受性株Ds.73、感受性株Ds.190においてWRKY22、WRKY29の発現の変動が観察されたが、発現変動とflg22感受性、非感受性の表現型を説明する情報は得られなかった。葉緑体タンパク質と虫害応答の解明のために、4週間栽培したシロイヌナズナのロゼット葉を5X5mmの穴をあけたろ紙で覆い、産卵場所を限定し、ハモグリバエ雌成虫を1匹放飼し、24時間自由に食害させ、野生型とハモグリバエの加害の程度比較した。老化に関与するSAG2,SAG12,SEN1,SEN2の遺伝子破壊株、虫に食われたような模様に見える斑入り変異体や黄緑変異体、stay green変異体を調査した結果、SAG12,SEN2の遺伝子破壊株が特にハモグリバエの加害が少なく、SAG2とSEN1も加害が少なかった。stay green変異体の加害は野生型と変わらず、斑入り変異体は野生型に比べて加害が多かった。
薬剤による腎障害の早期発見を目的とした尿蛋白解析法に関する研究

本研究は尿蛋白をキャピラリー電気泳動により分析し、その泳動像から薬剤による腎障害を早期に検出することを目的とした。初年度はキャピラリー電気泳動法による蛋白分析法の基礎的検討を詳細に行った。同時に対照法として用いるセルロースアセテート膜電気泳動法の感度が著しく低いため、この感度を向上させる高感度染色法の開発をも併せ検討し、正常人の原尿のままで、蛋白分画が可能なセルロースアセテート膜電気泳動法を開発した。これは本研究の副産物ではあるが、その後の研究の進展に大きく貢献した。第2年度はキャピラリー電気泳動法で正常人尿で、220nmに吸収を有する蛋白およびその他の物質44の成分を観察し、逐次その同定を行った。また微量尿蛋白の変化を呈することが知られている糖尿病患者を対象として腎症の進展と尿蛋白分画との関連を検討し、蛋白の分画定量が腎障害の早期発見だけでなく、特に低分子蛋白の分画定量できる利点は糸球体性と尿細管性との鑑別および予後予測に有用であることを確認し、その成果を報告した。第3年度には、本格的にキャピラリー電気泳動法を用い、腎障害を呈しやすい薬剤を投与した際の尿蛋白の動態を解析しつつある。現時点では研究を継続中であるが、近くその成果を発表する予定である。我々はこれまでの成果から薬剤による腎障害の早期発見へもキャピラリー電気泳動法が極めて効果的であるとの結論が得られると確信している。本研究の主力機器であるキヤピラリー電気泳動装置BIOFOCUS 3000(日本バイオラッド)は昨年8月に導入された。直ちに尿蛋白解析への応用に関する基礎的研究を開始した。まずキヤピラリー電気泳動法による尿蛋白分析法の基本法をゲル濾過カラムによる分子量分画で行うこととし、24μm×12cmのノンコーディング・キヤピラリーを用いる方法を中心に検討した。その結果、尿中に含まれる220340nmに吸収をもつ蛋白以外の物質を分析に先立ち除去する必要があった。そのための前処理操作を検討した結果、尿を凍結乾燥後、ウルトラフィルターで干渉物質を除去する方法が最も適切であることが判明し、これを前処理法とした。ついで、キヤピラリー電気泳動法の各種基本的条件を種々検討の結果、ほぼ満足すべき標準的操作法を確立することが出来た。この方法によれば健常人の尿を用いて、約10本の蛋白バンドが観察され、これら蛋白についてその同定を行い、その蛋白種を確認した。本分析法の再現性もほぼ満足すべき結果が得られ、微量蛋白の定量に十分利用できることを確認された。これらの研究成果については、明年度の日本電気泳動学会あるいは日本臨床病理学会等で、発表する予定で現在準備中である。またキヤピラリー電気泳動装置を用い、ゲル濾過による分子量分画法だけでなく、等電点分画法による分析についても、同様にその基礎的検討を行っている。現在、これら成果により利用が可能と確認されたキヤピラリー電気泳動法による蛋白分析法とSDS-PAGE法を併用し、賢障害をきたす可能性のある薬剤として、まずインターフェロンおよびアミノグリコシド系の抗生物質をとりあげ、その投与患者の投与前および後の尿蛋白の解析結果の比較を行い、尿蛋白解析による腎障害の早期発見への手がかりを得るための実験を開始したところである。我々は平成7年度においては、キヤピラリー電気泳動法を用いた尿タンパク解析の前例が全くないことから、カラムの選択と分析条件の検討を行ない、当面ゲル濾過カラムを利用することおよび尿タンパクへの応用における条件設定を完了した(日本電気泳動学会春季大会東京1997)。同時に対照法としてはセルロースアセテート膜電気泳動法によるタンパク分画および代表的なタンパクについては免疫測定法による定量法とした。

この間の付帯的成果として、尿タンパクのセ・ア膜電気泳動法において、試料の濃縮を行わず染色が可能な極めて感度の高い染色法を開発し、これを発表した(世界臨床化学会ロンドン1997)。平成8年度においては、キヤピラリー電気泳動法による尿タンパク解析の第1歩として、健常人および糖尿病患者の尿につき分析を行い、他の分析法にくらべ、極めて多彩な情報が得られることを確認した。独立して検出されるピーク数は健常人で23ピークあり、糖尿病患者では36ピークと非常に多く、分子量1万以下のピークが23ピーク、1万から33万が13ピークであった。当面は分子量1万以上のタンパクのピークの解析に重点をおくが、将来はへ異分子のペプタイドの動態も注目すべきであると思われる。現在、これらのピークの同定をおこなっているが、近くその主なものについては完了する予定である。また近く抗生物質あるいはインターフェロンなど副作用として腎障害を来す可能性をもつ薬剤の尿タンパクへの影響を検討する最終的な実験計画が実施されるところで、最終年度において、これらが完結する予定である。本研究は尿蛋白をキャピラリー電気泳動により分析し、その泳動像から薬剤による腎障害を早期に検出することを目的とした。初年度はキャピラリー電気泳動法による蛋白分析法の基礎的検討を詳細に行った。同時に対照法として用いるセルロースアセテート膜電気泳動法の感度が著しく低いため、この感度を向上させる高感度染色法の開発をも併せ検討し、正常人の原尿のままで、蛋白分画が可能なセルロースアセテート膜電気泳動法を開発した。これは本研究の副産物ではあるが、その後の研究の伸展に大きく貢献した。第2年度はキャピラリー電気泳動法で正常人尿で、220nmに吸収を有する蛋白およびその他の物質44の成分を観察し、逐次その同定を行った。また微量尿蛋白の変化を呈することが知られている糖尿病患者を対象として腎症の進展と尿蛋白分画との関連を検討し、蛋白の分画定量が腎障害の早期発見だけでなく、特に低分子蛋白の分画定量できる利点は糸球体性と尿細管性との鑑別および予後予測に有用であることを確認し、その成果を報告した。第3年度は、本格的にキャピラリー電気泳動法を用い、腎障害を呈しやすい薬剤を投与した際の尿蛋白の動態を解析しつつある。現時点では研究を継続中であるが、近くその成果を発表する予定である。我々はこれまでの成果から薬剤による腎障害の早期発見へもキャピラリー電気泳動法が極めて効果的であるとの結論が得られると確信している。
デルフィニウムの早期抽だい株の生理生態的特性

実験材料として、デルフィニウム`ブルーバード'の実生を用いた。昨年の冷夏の影響で、早期抽だい株の発生はほとんどみられなかったため、播種から抽だいまでの期間の長い晩生の個体と、抽だいまでの期間が短い早生の個体間で成育の比較を行ったが、早生の個体は、晩生の個体よりも栄養成長期間が短いにもかかわらず、早期抽だい株にみられるような極端な花穂の小型化がみられなかった。また主枝(一番花)が開花した後株もとから発生した一次側枝(二番花)が開花するまでの日数については、主枝の早晩との間に相関は認められなかった。同じく実生を用いて、ロゼット株と低温処理を行ってロゼット打破した株との間で成育を比較したところ、本葉展開前の小苗に低温処理を施した場合、極端に小苗のうちに抽だいして夏期に発生する早期抽だいに似た形態を示し、ロゼット株と早期抽だいは互いに生理的に反対の状態にあり、ロゼット打破株と早期抽だい株は生理的に類似した状態にある可能性が考えられた。また、一次側枝(二番花)が開花するまでの日数についても、ロゼット株とロゼット打破株との間に差は認められなかった。光合成速度はロゼット化した株とロゼット打破した株との間で差は認められなかったが、呼吸速度はロゼット打破した株で大きくなる傾向がみられ、炭水化物の蓄積や転流パラーンが抽だいたロゼット化と密接に関係している可能性が考えられた。デルフィニウムの実生苗については遺伝的に非常に雑ばくであり、早期抽だい株とロゼット株について、栄養繁殖個体を用いて呼吸、光合成活性のほか炭水化物の動態について比較を行う必要がある。
超音波とラジオ波を用いる水溶性フラーレンによる新規深部癌治療薬の開発

我々が開発した交換反応法により高濃度でC_<60>を取り込んだC_<60>含有リポソームの作製に成功した。このC_<60>含有リポソームに可視光を照射することで、活性酸素を発生しがん細胞を死滅することが可能なことから光線力学治療法への応用が期待される。しかし、光線力学治療法では可視光を利用するため、表層がん治療には有効であるが、深部がんには働かない。そこで、本課題では、このC_<60>含有リポソームに、可視光に変え、より深部まで照射することが可能なラジオ波、超音波もしくは電磁波を照射することで、深部がんにも有効ながん治療法の開発を目指した。しかし、昨年度はラジオ波のパワーが小さく温度変化が確認できなかったことから、温熱療法(ハイパーサーミア)への応用が難しかった。本年度は電磁波を照射することによる温度上昇の検討を行った。フラーレンを含むリポソーム水溶液と含まないリポソーム水溶液をそれぞれ準備し、電子レンジを用いて電磁波照射時間に依存した温度変化を測定した。その結果、フラーレンの有無により、温度変化に若干の差があるものの、大きな差がないことが確認された。従って、電子レンジとフラーレンを利用したハイパーサーミアへの利用は難しいことがわかった。今後は、電磁波の波長を変えられる電磁波の発生装置を用いて検討を行う。また、ラジオ波の利用に向け、病院などでハイパーサーミア治療において実際に用いられているようなさらに強いラジオ波を発生可能な装置を探し、共同研究として検討を行う必要がある。本申請者が開発した新規調製を用いると、高濃度でC_60を取り込んだC_60含有リボソームが調製でき、C_60を水溶化できる。この_C60含有リボソームは可視光を照射することで、活性酸素を発生しがん細胞を死滅することが可能なことから光線力学治療法への応用が期待される。そこで、本課題では、このC_60含有リボソームに、可視光に変え、より深部まで照射することが可能なラジオ波もしくは超音波を照射することで、深部がんにも有効ながん治療法の開発を目指す。これらのエネルギーを直接、もしくは間接的にフラーレンが吸収し、がん細胞の温度上昇あるいは活性酸素の発生を引き起こすことにより温熱療法(ハイパーサーミア)または超音波力学治療法が可能となるものと予測される。本年度は、ラジオ波を照射して、その効果を検討した。大阪大学よりお借りしたラジオ波発生装置(NF Electronic Ins., FG-161)を用いて、これまでの報告でC_60の温度上昇が確認されている13.56MHzの波長をC_60含有リボソーム水溶液に12時間照射した。しかし、水溶液の顕著な温度上昇は確認されなかった。これは、ラジオ波の強度が弱いためであると考えられる。そこで、増幅器を接続し、さらに検討を行ったが結果は同じであった。今後、病院などでハイパーサーミア治療において実際に用いられているようなさらに強いラジオ波を発生可能な装置を探し、共同研究として検討を続ける。
DREADDシステムを利用した脊髄後角HCN4をターゲットとした疼痛治療開発

過分極誘発陽イオンチャネル(HCN14)は細胞内cAMPによって電流が増大するという特徴を持ち、痛覚伝導路において重要な機能を果たす。一方我々は、最もcAMP感受性が高いサブタイプであるHCN4を発現するニューロンが、脊髄では後角浅層にのみ特異的に存在することを見出した。先行論文によると、脊髄におけるHCN4発現ニューロンは抑制性介在ニューロンであるとの報告があった。そこで、このニューロンをchemogeneticに刺激してcAMP濃度を増加させることにより、HCN4チャネルを活性化することを試みた。そのためにGs-DREADDをテトラサイクリン応答配列の下流に挿入したコンストラクトをAAV9ウイルスベクターにサブクローニングした。このベクターをHCN4翻訳開始点上流にtetracycline transactivatorとその応答配列(TRE)をノックインしたマウス(HCN4+/tTA_TRE)に髄注する計画とした。一方、GAD67ーGFPノックインマウスや、VGAT-GFP BACトランスジェニックマウスとHCN4+/tTA_TREを交配して得たdouble transgenic mouseでHCN4抗体を使って、免疫染色をした結果、両者のシグナルはほとんど重ならないことが反面した。すわなちHCN4発現ニューロンは抑制性よりもむしろ興奮性介在ニューロンである可能性が高くなった。そこで上述の仮説とは逆に、HCN4電流を抑制することにより、興奮性シナプス電位の加重が増強される可能性を検討するために、優性抑制性HCN4チャネル優性抑制性変異体をTRE配列下流に挿入したコンストラクトをAAV9ウイルスベクターにサブクローニングした。今後、これらのウイルスベクターを用いて、脊髄後角におけるHCN4を操作することで、痛み行動がどのように変化するか確認する予定である。
転写因子 LRH-1 による黄体ホルモン産生の分子機構解明

転写因子LRH-1のヒト卵巣顆粒膜細胞特異的な転写開始点、転写活性化領域および転写調節因子の同定を行った。顆粒膜細胞においてLRH-1は、転写因子SF-1およびSp1/3により協調的に制御されていることが明らかとなった。LRH-1は、卵巣における黄体ホルモン産生に必須な転写因子である。本研究により、黄体ホルモン産生に関わる分子機構の一端が明らかとなった。LRH-1遺伝子の卵巣顆粒膜細胞特異的な発現に関わる転写活性化領域および因子の同定を行った。ラット卵巣顆粒膜細胞の初代培養細胞を用いたレポーターアッセイを行い、転写活性化領域として転写開始点上流-157/-130領域を同定した。ラット顆粒膜細胞を用いたゲルシフトアッセイにより、-157/-130領域に結合する転写因子としてSF-1を同定した。前年度に同定した転写因子SpファミリーおよびSF-1の効果を検討するために、ヒト卵巣顆粒膜細胞腫由来KGN細胞あるいはSpファミリーが欠失しているSL2細胞を用いてレポーターアッセイを行った。SF-1を発現させたKGN細胞においては、LRH-1のプロモーター活性が顕著に亢進された。SL2細胞においては、Sp1あるいはSp3の存在下で顕著なプロモーター活性の亢進が認められた。また、SF-1をSpファミリーと共発現させることにより、更に相乗的なプロモーター活性の増強が認められた。これら活性の亢進は、GCボックスあるいはSF-1結合配列への変異導入により、著しく阻害された。KGN細胞においてSF-1のノックダウンを行ったところ、内因性のLRH-1発現はmRNAレベルで減衰した。アデノウィルスベクターを用いてKGN細胞においてSF-1を過剰発現させたところ、内因性のLRH-1発現はmRNAおよびタンパク質レベルで顕著に亢進された。これらの結果から、ヒト卵巣顆粒膜細胞におけるLRH-1遺伝子の転写調節は、SpファミリーおよびSF-1により協調的に制御されていることが明らかとなった。SF-1とLRH-1は同じファミリーに属する転写因子だが、卵巣顆粒膜細胞においてSF-1はLRH-1の機能を完全に補完することはできないことが知られている。卵巣機能維持に関わる遺伝子の発現制御機構の一部には、SF-1からLRH-1を介した経路が存在すると考えられる。ステロイドホルモン産生異常症の治療には、ホルモン補充療法が用いられるが、継続的な投与の必要性に加えて副作用が存在することから、これに代わる治療法の開発が求められている。黄体機能不全に対する新たな治療法の開発に向け、卵巣におけるプロゲステロン産生のメカニズムを明らかにし、その産生を増強させる新たな技術開発を行うことを目的として、黄体におけるステロイドホルモン産生のマスター転写因子LRH-1の転写制御機構の解明を試みた。ヒト卵巣顆粒膜細胞腫由来KGN細胞におけるLRH-1の転写開始点を同定したところ、LRH-1遺伝子の転写は従来とは異なる新規エキソンから開始され、この卵巣型LRH-1は肝臓型LRH-1に比べ、アミノ酸にしてN末端が40残基短いことが明らかとなった。RT-PCR法により、この新規エキソンは卵巣特異的に発現していることが確認された。転写開始点上流3kbpのゲノムDNA配列を用いたレポーターコンストラクトを構築し、ラット卵巣顆粒膜細胞の初代培養細胞を用いたレポーターアッセイを行ったところ、著しいプロモーター活性が認められた。更に、デリーションコンストラクトおよび変異を導入したコンストラクトを構築し、転写活性化領域として転写開始点上流-67/-58の10bpを同定した。ゲルシフトアッセイにより、この領域に結合する転写因子としてSp1およびSp3を同定した。Sp1は、リン酸化による修飾を受けて活性化され、組織特異的な転写調節に関わることも知られている。これらの結果から、転写因子Sp1/3を活性化させる薬剤を用いることで、LRH-1の発現増強が可能になると考えられる。本研究の目的は、LRH-1の卵巣顆粒膜細胞特異的な転写制御機構を解明し、内因性LRH-1の発現誘導を介してプロゲステロン産生能を増強する薬剤を開発することである。平成23年度の研究実施項目は、卵巣顆粒膜細胞においてLRH-1遺伝子の転写開始点、転写活性化領域を決定し、誘導因子を同定することである。平成23年度内に、これらは全て達成している為、当初の予定通り研究は進展しているものと判断できる。平成24年度は、前年度に引き続き、卵巣顆粒膜細胞におけるLRH-1遺伝子の誘導因子の同定を行う。前年度に同定した転写開始点上流-67/-58の10bp以外にも、転写活性化領域の同定に成功している。今後は、この領域に結合してLRH-1の発現に必須な因子を同定する。実施する研究は、前年度同様にレポーターアッセイとゲルシフトアッセイをメインに行い、選定された転写因子のノックダウンや過剰発現実験を培養細胞において行う予定である。