hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
誘発胆管細胞癌発生過程と胆汁酸負荷、DNA量変化と癌関連遺伝子発現

1.Syrian goldenhamsterにdiisopropanolnitrosamine(DIPN)を10週間投与し、実験開始よりハムスターに標準固型飼料(DIPN対照群)、コール酸飼料(DIPN-TCA群)およびデオキシコール酸飼料(DIPN-DCA群)を投与した。15,20および25週目に肝臓を検索した。2.15,20および25週目の各群ハムスターの肝臓内に増殖細胆管および嚢胞状細胆管病巣を、また、胆汁酸投与両群では15週目より、DIPN対照群では20週目より胆管細胞癌の発生をみた。これら病巣の発生率はいずれも胆汁酸投与群に高率であった。3.増殖細胆管病巣と胆管細胞癌における細胞核DNA量およびDNA distribution patternを解析した。各群の各病巣では、週を経るにつれ、DNA量の増加とヒストグラム上における細胞集団の分散がみられたが、胆汁酸負荷群で著明であった。胆汁酸負荷、特にDCA負荷では個々の病巣内でのDNA patternのheterogeneityあるいはpolyploidizationの促進が観察された。4.細胞核面積は増殖細胞胆管の両病巣および胆管細胞癌において経時的に増大したが、前者では胆汁酸負荷群とDIPN対照群の間に有意差があった。P^<53>蛋白の発現を増殖細胆管病巣と胆管細胞癌につき免疫組織化学的に検索し各群における陽性発現率を比較した。前者の病巣では低率であったが、DIPN-DCA群は25週目に他の群より高率であった。また、胆管細胞癌も同様で、有意ではないが、この群は高率(50%)を示した。1.実験群の作製と方法:100g前後のSyrian goldenhamsterに発癌物質のdiisopropanolnitrosamine(DIPN)500mg/kg体重を週1回の頻度で10週間腰部皮下に投与した。これらのハムスターを標準固型飼料投与のDIPN対照群、0.5%タウロコール酸ナトリウム経口投与のDIPN-TCA群および0.5%デオキシコール酸ナトリウム経口投与のDIPN-DCA群に分け、各群いずれも45匹づつにて実験を開始し、10,15,20および25週目に肝臓を摘出した。2.体重の変化:実験開始後に各群ハムスターの体重は経時的に増加したが、DIPN-TCA群では25週目に、DIPN-DCA群では20週と25週目にそれぞれDIPN対照群より有意に体重の減少がみられた(P<0.05-0.01)。なお、各群において経過中に3-5匹の死亡脱落を認めた。3.病理組織学的所見:10週目以後、胆汁酸投与の両群の肝表面は黄褐色を呈し光沢を減じ、肝縁は鈍化していた。また、胆汁酸投与の両群では、15週目より、DIPN対照群では20週目より胆表面に0.1-2.0cm大の乳白色を呈する腫瘍結節の発生をみた。この腫瘍は組織学的に胆肝細胞癌であった。肝内胆管の組織学的変化として、細胆管増生、裹胞状細胆管増生、乳頭状増生およびgoblet cell metaplasiaなどが観察された。胆汁酸投与の両群における胆管上皮の組織学的変化の発生率はDIPN対照群に比し高率であったが有意差をみなかった。4.胆管細胞癌発生率と腫瘍発生個数:胆汁酸投与両群の癌発生率と腫瘍個数は有意ではないが、DIPN対照群に比し高率または高値であった。顕微蛍光側光法によるこれら腫瘍のDNA量を測定したところ、DNA distribution patternにおいてdiploidあるいはaneuploid patternが観察された。

2.Cytofluorometric analysis:15,20,25週目に各群ハムスターの肝臓は摘出され、フォルマリン固定後、5mm間隔で5切片に切り出された。各切片は厚さ3μm標本とこれに接する5μm標本が切り出され、前者はH・E染色され病巣の同定に、後者はDAPIで染色され細胞核DNA量の測定に用いられた。内部標準(2C)として小リンパ球、増殖細胆管病巣および胆管細胞癌の蛍光強度(DNA量)が測定され、各々ヒストグラムが作成された。DNA distribution patternは、ヒストグラム上の細胞集団の分散程度より、TypeI(-A,-B)、II、IIIの3型に分類された。全ての群の増殖細胆管病巣は経時的に、4Cから6CへのDNA量の分散を示す細胞集団の増加を表わしたが、胆汁酸負荷群、特にDIPN-DCA群は有意にTypeI-BやIIの病巣の増加を生じた。胆管細胞癌におけるDNA distribution patternも前者と同様の変化を示したが、特にDIPN-DCA群はTypeIIやIIIの腫瘍の有意の増加を呈した。一方、個々の病巣内におけるDNA patternのheterogeneityが癌のみならず増殖細胆管にも観察された。これらの成績は胆汁酸負荷が癌や細胆管病巣のDNA distribution patternに影響することを示唆している。3.細胆管病巣や胆管細胞癌のPCNAとP^<53>の免疫組織化学的解析のためそれらの予備染色を行い、各々の陽性発現を認めた。2.細胞核面積:正常胆管細胞の平均核面積は26μm^2であった。各群の増殖細胆管および嚢胞状細胞胆管病巣の核面積は週を経るにつれ拡大し、DIPN-DCA群の両病巣における25週目の核面積は各々42および38μm^2で、DIPN対照群の34および30μm^2に比し有意差を示した。(P<0.01)。胆管細胞癌の核面積は著しく広く、25週目には63-65μm^2であった。しかし、各群間における有意差はなかった。3.PCNA陽性細胞率:正常胆管細胞のPCNA平均陽性細胞率は19%であった。各群とも細胆管および嚢胞状細胆管病巣の平均陽性率は週を経るにつれ高率となり、25週目では51-67%および48-60%であった。15、20週目にDIPN-DCA群とDIPN対照群との間で、25週目に胆汁酸負荷両群とDIPN対照群との間で有意差をみた(P<0.05,0.01)。胆管細胞癌のPCNA陽性細胞率は15-25週目に66-76%と高率であったが、各群間に有意差はなかった。一方、増殖細胆管病巣において胆汁酸負荷両群は核面積とPCNA陽性率との間に有意の相関を示した(P<0.05,0.01)。4.P^<53>蛋白陽性発現率:増殖細胆管病巣のP^<53>蛋白陽性発現率は、25週目に各群で10-37%にみられた。胆管細胞癌の陽性発現率は25週目において14-50%であった。両病巣ともにDIPN-DCA群は高率を示したが、各群間における陽性発現率に有意差はなかった。
血管機能改善ペプチドの生理作用解明と多疾病対応型予防食品の創製

これまで、血管弛緩作用を有するVal-Tyrを基本骨格として、50種類以上のジペプチドを合成しその弛緩作用を評価したところ、Trp-His(WH)に顕著な弛緩作用を見出し、その作用は血管平滑筋におけるL型Ca^<2+>チャンネルブロック作用によるものであることを明らかとしてきた。そこで、今年度はこれら知見をもとに、さらなる活性ペプチドの探索と構造-活性相関の解明及び、当該機能を有するペプチドのin vivoにおける生報作用(動脈硬化予防作用)の検証を行った。1.新規血管弛緩性トリペプチドHis-Arg-Trpの発見これまでに見出した血管弛緩ペプチドであるWHを基本構造とし、ペプチドの吸収限界鎖長であると考えられるトリペプチドまでのペプチドを合成し、その弛緩作用を評価した。その結果、N末端及びC末端におけるHisイミダゾール基及びTrpインドール基中のプロトンの存在が重要であることが示唆された。また、中間位における塩基性アミノ酸残基も活性発現に重要であることが示され、高活性ペプチドとしてHis-Arg-Trpを見いだした。2.Apo E欠損マウス(動脈硬化モデル)を用いたWHの動脈硬化予防作用の検証血管弛緩作用の認められたWHのApo E欠損マウス(動脈硬化モデル)に対する9週間の長期投与試験を行ったところ脂質代謝及び成長には全く影響を与えずに、動脈硬化病変形成が抑制された。このことは、血管弛緩作用を有するペプチドが高血圧のみならず、動脈硬化に対しても改善作用を有することを示唆するものである。単一の低分子ペプチドが脂質代謝とは異なる作用により動脈硬化予防作用を示すとの知見は、本研究により初めて明らかとされた知見である。血管弛緩作用を有するペプチド(Val-Tyr)の発見を契機として、本研究では、高血圧改善のみならず、動脈硬化予防にも効果を発揮すると考えられる多機能性ペプチドによる多疾病改善作用を有した新たな食品(Multifunctional foods:高血圧、動脈硬化、糖尿病の同時予防)の開発を目的とした。今年度は新たに見出された血管機能改善作用に関する詳細な知見の獲得を行った。1.血管弛緩作用を有するペプチドの網羅的解明(構造-活性相関の解明)67種類に及ぶペプチドをFmoc固相合成法により合成し、それぞれの血管弛緩作用をSDラット由来胸部大動脈血管を用いた血管張力測定により評価した。その結果WHを始めとする血管弛緩性ペプチドが同定され、その特徴的構造の一つとして、N末端におけるTrp残基の存在が血管弛緩作用に重要である事があきらかとなった。この結果をもとに、さらなる構造的特徴(鎖長、立体構造等)に関する知見の獲得を目指す。2.ラット血管標本を用いたCalmotideの血管弛緩作用のex vivo実証血管弛緩作用を有するペプチドであるWHにおいて、内皮の有無及び各種阻害剤(Enalaprilat;ACE阻害剤,Nifedipine及びVerapamil;電位依存性L型Caチャンネルブロッカー)の影響を検討したところ、WHの血管弛緩作用は内皮非依存的であり、さらにVerapamil(Phenylalkylamine系)存在下の血管においてその作用は有意に減弱する事が明らかとなった。このことは血管弛緩性低分子ペプチドであるWHが電位依存性L型CaチャンネルにおけるVerapamilと同様の部位に作用している事を示唆している。天然低分子ペプチド(Val-Tyr)における新規血管機能改善作用の発見を契機に、高血圧の改善のみならず動脈硬化予防やインスリン抵抗性改善などの多機能性を有したペプチドに関する研究を行ってきた。今年度は新たに見出された血管機能改善作用を有するペプチドとその構造的特徴及び作用機序に関する詳細な検討を行った。1.血管弛緩作用-構造相関の解明これまでに見出した血管弛緩性ペプチドであるWHを基本構造とした種々のペプチドをFmoc固相合成法により合成し、それぞれの血管弛緩作用をSDラット由来胸部大動脈血管を用いた血管張力測定により評価した。その結果WHを基本構造としたペプチドにおいてはトリまでのペプチド鎖長が重要であり、トリペプチドの血管弛緩性発現にはN末端Hisの存在、特にイミダゾール環プロトンの存在が重要であると推察された。2.新規内皮非依存的血管弛緩作用を有するペプチド(Calmotide)の作用機序解明本研究で見出されたWHの血管弛緩作用は内皮及びACE阻害作用非依存的であること、さらにベラパミル(Phenylalkylamine(PAA)系L型Ca^<2+>チャンネルブロッカー)存在下におけるWHの作用が有意に減弱する事が明らかとなった。このことは、WHがベラパミルと同様の部位に結合している事を示唆していると考えられる。しかしながら、Murphyらの報告(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,80,860-864,1983)によると、Verapamilと結合位置が異なるDihydropyridine(DHP)系のブロッカーはPAA系の薬剤と互いにアロステリック阻害を示す。このアロステリック阻害作用を勘案すると、WHはDHP系の薬剤結合部位に作用している可能性も考えられる。

そこで、今年度はこれら知見をもとに、さらなる活性ペプチドの探索と構造-活性相関の解明及び、当該機能を有するペプチドのin vivoにおける生報作用(動脈硬化予防作用)の検証を行った。1.新規血管弛緩性トリペプチドHis-Arg-Trpの発見これまでに見出した血管弛緩ペプチドであるWHを基本構造とし、ペプチドの吸収限界鎖長であると考えられるトリペプチドまでのペプチドを合成し、その弛緩作用を評価した。その結果、N末端及びC末端におけるHisイミダゾール基及びTrpインドール基中のプロトンの存在が重要であることが示唆された。また、中間位における塩基性アミノ酸残基も活性発現に重要であることが示され、高活性ペプチドとしてHis-Arg-Trpを見いだした。2.Apo E欠損マウス(動脈硬化モデル)を用いたWHの動脈硬化予防作用の検証血管弛緩作用の認められたWHのApo E欠損マウス(動脈硬化モデル)に対する9週間の長期投与試験を行ったところ脂質代謝及び成長には全く影響を与えずに、動脈硬化病変形成が抑制された。このことは、血管弛緩作用を有するペプチドが高血圧のみならず、動脈硬化に対しても改善作用を有することを示唆するものである。単一の低分子ペプチドが脂質代謝とは異なる作用により動脈硬化予防作用を示すとの知見は、本研究により初めて明らかとされた知見である。
ヘテロダイン方式近赤外光干渉計

光領域においてファイバベースのヘテロダイン周波数変換技術を確立できれば、電波干渉計のように光を波として受信し、位相情報を得ることができる。これを用いることで大きな口径の望遠鏡を合成することができ、高角度分解能化が期待できる。さらに光ファイバ部品で全て構成が可能な場合、光軸アライメントの必要がなくなり、望遠鏡受光部と相関処理部を独立したシステムとして構成できる。光領域においてもヘテロダイン周波数変換が可能な場合、干渉のためのコヒーレンス長を周波数変換比分だけ長くすることが可能となる。光位相データを用いた高分解能光干渉計実現のため光ヘテロダイン技術の有効性の検証を行う。光領域においてヘテロダイン周波数変換技術を確立できれば、電波干渉計のように光を波として受信して位相情報を用いることで、複数の望遠鏡で受信した信号を掛け合わせて実効的に大きな口径の望遠鏡を合成でき高角度分解能化が期待できる。さらに光ファイバ部品で光干渉計の構成が可能な場合、光軸アライメントの必要がなくなり、望遠鏡部と相関処理部を独立なシステムとして構成でき大型望遠鏡への応用の可能性が期待できる。今回、近赤外領域において、ファイバベースでのヘテロダイン方式光干渉計の基本技術開発を本研究の目的とする。本研究により光位相を用いた超高空間分解能の干渉計を実現するための技術を実証する。平成28年度は、基本的なヘテロダイン光干渉計のアナログ部を製作した。実際の太陽観測を行いフリンジ(相関)が回転した状態での相関を得ることで光ヘテロダイン方式の基本実証を行った。パンチルト雲台とファイバコリメータをそれぞれ2式購入し、太陽のプログラム追尾系の製作、狭線幅レーザを用いた光ヘテロダイン干渉計アナログ部の製作を行った。実際の太陽プログラム追尾による干渉実験を行い弱いフリンジ信号を検出した。今後、フリンジ回転を止めることで、よりはっきりとしたフリンジが得られるものと思われる。しかしながら、実験途中にパンチルト雲台の1台の電源が落ちる問題が発生したため、メーカにて修理を行っている。また、ファイバコリメータの空間光とのカップリング及び光・電気変換部性能が想定より低いことが分かり、この点も改修予定である。最も基本的なファイバベースのヘテロダイン光干渉計を製作した。ファイバコリメータ(小型レンズでファイバと自由空間とを結合)を購入し、光分配・合成器、高感度光検出器(フォトミキサ)を2素子分とローカル周波数用高安定レーザを用いた最も基本的なヘテロダイン光干渉計アナログ部を製作した。また、購入したパンチルト雲台を用いた太陽のプログラム追尾系を製作した。実際の太陽プログラム追尾観測を行いフリンジが回転した状態での弱い相関を得ることができ、光ヘテロダイン方式の可能性が見えてきた。パンチルト雲台の故障、ファイバコリメータの空間光とのカップリング及び光・電気変換部性能が想定より低いなどの改修点はあるが、概ね計画に乗っている。光領域においてヘテロダイン周波数変換技術を確立できれば、電波干渉計のように光を波として受信し、位相情報を用いることで複数の望遠鏡で受信した信号を掛け合わせて実効的に大きな口径の望遠鏡を合成でき高角度分解能化が期待できる。さらに光ファイバ部品で全て構成が可能な場合、光軸アライメントの必要がなくなり、望遠鏡部と相関処理部を独立したシステムとして構成できるため大型望遠鏡への応用が期待できる。光領域においてもヘテロダイン周波数変換が可能な場合、干渉のためのコヒーレンス長を周波数変換比分だけ長くすることが可能となり、低周波でのサンプリング後に相関(フリンジ)検出が行え、光の位相も測定対象になるため高角度分解能が望める。また、マイクロ波まで周波数を落とせるので、高周波数分解能での光スペクトル解析を行うことができる。共通光雑音を狭帯域レーザ光で独立に周波数変換し、相関を得ることに成功した。次にヘテロダイン方式光干渉計の実現性を探るため、太陽を観測対象とし、昨年度より一回り大きな2つのコリメータレンズを集光器とし、高感度光検出器と小型パンチルト追尾駆動系を有した光干渉計を製作した。これに必要な太陽のプログラム追尾の高精度化、地球回転で生じる相関フリンジ周波数・加速度・遅延追尾計算システムを開発した。アナログ的にフリンジ回転補正を試みたが雑音同士の相関が大きく真の相関との分離が不十分であることが判明した。そこで計画を拡張しデジタル的にフリンジ回転補正・積分が可能なXFタイプの相関処理システムを導入した。これを用いた実験を行い相関フリンジと考えられる信号を検出したが、更なる広帯域化作業中に高感度光検出器の静電破壊が生じてしまった。上記の得られた信号が相関フリンジである確証を得る必要があるため、新たな高感度光検出器を内部予算で購入し、検証を行うことで真の相関である確証を得た後に論文化を行う。

ヘテロダイン方式を用いることで新たに考慮しなければならないことがある。その一つが相関フリンジの高速回転である。フリンジの回転は、ヘテロダイン周波数変換を行うことで必然的に発生する。このフリンジ周波数は、天体と基線ベクトルとの位置関係で変化する。このため従来の周波数変換を行わない光干渉計では遅延追尾のみで良かったものが、遅延追尾と同時にフリンジ回転補正も考慮しなければならなくなる。フリンジ回転補正は、外部発振器を用いてアナログ的にフリンジ周波数の逆回転を行うことでフリンジ回転を止めて短時間積分を行うためのものである。全てデジタルで行うことが理想であるので、可能ならデジタルボードを用いたフリンジ補正信号発生器の製作やデジタル相関器を用いることも試みる。ファイバコリメータ・光電気変換部の性能向上を図ると同時にパンチルト雲台の修理完了を待ち、フリンジ回転補正を行える簡易システムの構築を図ることで相関振幅の信号対雑音比の向上が望め、高角度分解能干渉計の実現の可能性を探る。フォトニックマイクロ波年度末にパンチルト雲台が故障し、修理のための費用を用意しておく必要があったため。また、システムの改善点(ファイバコリメータ・光電気変換部の性能向上)が明確になったのでそれに充てるため。ファイバコリメータ・光電気変換部の性能向上を行う。新年度予算で行うフリンジ回転補正と合わせ、相関振幅の信号対雑音比の向上が望め、高角度分解能干渉計の実現の可能性を探る。
高密度な細胞外マトリックスを持つ革新的な正常・動脈硬化三次元血管壁モデルの創製

本研究の目的は、生体を模した高密度な細胞外マトリックス(ECM)を持つ三次元血管壁モデルの創製である。申請者は平成29年度の研究において、細胞外マトリックス(ECM)の主成分の一つであるコラーゲンをマイクロファイバー化し、平滑筋細胞と共培養することで高密度なECMを持つ三次元組織を構築できることを報告した。さらに内皮細胞を組織上に播種することで一層の内皮細胞とECMと平滑筋細胞の層からなる大動脈血管壁を模倣した組織が可能であることも確認している。平成30年度は、コラーゲンに加えて血管壁のECMの主成分であるエラスチンを用いて組織を構築することで、組織収縮が少なくより生体に近いECM比を持つ組織の構築が可能であることを確認した。これらの血管壁モデルに、炎症性サイトカインであるTNFαや酸化低比重リポタンパク質といった動脈硬化の促進に関連するとされる因子や、免疫細胞の分化に寄与するホルボールエステルと共にヒト単球細胞を処理し、その応答について評価を行なった。その結果、それぞれの因子の違いにより免疫細胞の浸潤程度に大きな差が見られ、これまで報告されている免疫細胞の浸潤過程に一致した結果が得られた。また一方で、この血管壁模倣組織の構築の際に動脈硬化組織に特異的な成分であるコレステロールなどの脂質を混合することで、動脈硬化を模した脂質領域を持つ組織が構築できることも確認した。これらの結果から、今回の研究で構築された血管壁モデルは、動脈硬化の薬剤開発や進展機序の基礎研究等への有用性が期待できる。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。本研究の目的は、高密度なECMを持つ三次元血管壁モデル及び動脈硬化血管壁モデルの創製である。動脈硬化好発部位である大動脈は、血管内皮細胞からなる内層、平滑筋細胞と細胞外マトリックス(ECM)からなる中層、繊維芽細胞とECMからなる外層の三つの層からなっている。その中で動脈硬化の進展には、それぞれの細胞とECMの相互作用が大きく関わっていることが知られている。大動脈血管壁においてECMは乾燥重量で約70 %とその大半の質量を占めているが従来のモデルではこのような高密度なECMを持つ三次元組織は報告されていない。本研究の遂行は、ECMと各種細胞の相互作用の影響も含めた総合的な評価を可能とし、動脈硬化の発生・進展の機序の解明や新たな予防法・薬物標的の発見に貢献することが期待できる本年度はまず通常の三次元血管壁モデルの構築を目指した。まずECMの主成分の一つであるコラーゲンを細断化し、コラーゲンマイクロファイバーを作成した。このコラーゲンマイクロファイバーと平滑筋細胞を共培養することで高密度なECMを持つ三次元培養組織を作成することに成功した。さらにこの培養組織上に血管内皮細胞を加えることで、一層の内皮細胞層の再現にも成功した。さらに、現在この血管壁モデルに動脈硬化危険因子である酸化LDLなどを処理し、その沈着などの評価を行なっている。またこの時、単球細胞と共培養を行いながら実験することで、免疫細胞の血管壁の侵入などの評価についても同時に行なっている。本年度の予定であった、血管壁モデルの構築およびそれを用いた動脈硬化危険因子の評価までは順調に実験が遂行されている。組織の収縮の影響を排除するために、組織構築の条件の検討に時間を要したが大きな遅れには繋がっていない。引き続き血管壁モデルと危険因子の応答評価を行いつつ、並行して動脈硬化モデルの構築を目指す。具体的には、本年度に作成された血管壁モデルに動脈硬化の脂質沈着を再現する脂質や酸化LDLを混合して作成する。また動脈硬化の進展には、マクロファージの浸潤と脂質の貪食による泡沫細胞化が関わっており、動脈硬化モデルとマクロファージの共培養によってマクロファージ浸潤モデルの作成を行う。構築されたモデルの細胞機能などを評価したのちに、動脈硬化治療薬への評価試験への有効性などを評価する。

スタチン系薬剤や高比重リポタンパク質(HDL)などを処理し、動脈硬化モデルの応答について詳細に評価する。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
甲状腺癌幹細胞を標的とした新たな治療法の開発

甲状腺未分化癌を分化誘導することが本研究の目的であったが、まず甲状腺幹細胞における詳細な解析をおこなった。マウス甲状腺組織からSide Population cellを分離し、それを培養することによりSPTL(Side Population Thyroid Cell Line)を樹立した。この細胞株は、甲状腺分化マーカーであるTg、TPOは発現せず、甲状腺特異的な転写因子であるNKX2-1は発現しているが、PAX8は発現していなかった。この細胞株と甲状腺未分化癌および甲状腺乳頭癌の遺伝子プロファイルを比較することにより、SPTLは甲状腺未分化癌の遺伝子プロファイルに似ていることが明らかとなった。さらにEMT関連遺伝子であるSnai1, Snai2, Twistなどの遺伝子が高発現していることが明らかとなった。次に、甲状腺幹細胞の起源を調べるために、Nkx2-1(fl/fl);TPO-creマウスを用いて解析をおこなった。このマウスは甲状腺濾胞上皮細胞でNKX2-1がノックダウンされることにより甲状腺のTurn overが早くなるマウスである。このマウスの甲状腺組織を観察すると気管近くにNKX2-1陽性、PAX8陰性、Tg陰性の濾胞を形成しない細胞群が存在し、SPTLの発現パターンと似ていることから、この細胞群が甲状腺幹細胞の可能性があると推測された。SPTLにNKX2-1を強制発現させるとAKTのリン酸化が確認できることは昨年度の研究で明らかにしたが、Nkx2-1(fl/fl);TPO-creマウスの甲状腺気管側の濾胞を形成しないNKX2-1陽性の細胞群ではAKTのリン酸化が確認でき、分化にAKTのパスウェイが関連することを明らかにした。マウスにおいて甲状腺幹細胞の存在は推測できたが、甲状腺未分化癌とNKX2-1の関連性を明らかにしていない。TPO-cre/BRAFマウスは甲状腺癌を発生することが知られている。さらにp53変異マウスの掛け合わせで未分化癌が発生する。このマウスの癌部のNKX2-1,PAX8,AKTのリン酸化を詳細に検討することにより、未分化癌の発生メカニズムを解明できると考えている。本研究ではマウス甲状腺SP(Side Population)細胞の分化誘導メカニズムを解析し、そのメカニズムを甲状腺未分化癌に応用することを目的としている。平成28年度はマウス甲状腺SP細胞とマウス甲状腺MP(Main Population)細胞の遺伝子発現を検討し、甲状腺分化マーカーであるTshr、NIS、Tg、TPOだけでなく甲状腺分化に重要と報告されているNkx2-1、Pax8、Foxe1の遺伝子発現がMP細胞よりもSP細胞でmRNAの発現が低いことを明らかにした。さらに、GFPを発現させた甲状腺SP細胞株をNOD/SCIDマウスの甲状腺に直接注入しNKX2-1を発現したGFP陽性甲状腺SP細胞株が甲状腺濾胞上皮の一部を構成しており、甲状腺分化にNKX2-1の発現が重要であることを明らかにした。マウス甲状腺SP細胞株にテトラサイクリン誘導型のNKX2-1発現細胞株を作製する。NKX2-1遺伝子発現の相違により甲状腺分化マーカーや他の転写因子の遺伝子発現を検討する。さらに、ヒト甲状腺癌細胞においてNkx2-1のmRNAやタンパク発現解析をおこなう。臨床検体の解析にも着手する。マウス甲状腺SP細胞株にドキシサイクリン誘導型のNKX2-1発現細胞株を作製した。NKX2-1を過剰発現した結果、転写因子であるPAX8は発現せず、E-cadherinも発現しなかった。以上のことからNKX2-1の発現誘導のみでは分化誘導できないことが明らかとなった。また、ドキシサイクリンによりNKX2-1を発現誘導をおこなうとAKTがリン酸化されることを明らかにした。NKX2-1の過剰発現のみでは分化誘導を確認できていないため。

マウスにおいて甲状腺幹細胞の存在は推測できたが、甲状腺未分化癌とNKX2-1の関連性を明らかにしていない。次年度は細胞株を用いたメカニズム解明および動物実験の準備をおこなう。ヒト甲状腺癌組織を用いた免疫組織染色もおこなう。NKX2-1の発現は甲状腺幹細胞を分化誘導することはできないが、シグナル伝達が変化することは確認できた。今後はマウスの実験系を使用し、NKX2-1陽性細胞のシグナル伝達について解析を進める。TPO-cre/BRAFマウスは甲状腺癌を発生することが知られている。さらにp53変異マウスの掛け合わせで未分化癌が発生する。このマウスの癌部のNKX2-1,PAX8,AKTのリン酸化を詳細に検討することにより、未分化癌の発生メカニズムを解明できると考えている。次年度は動物実験の準備にある程度の金額が必要のため。本年度は倫理審査通過後にマウスを購入する予定であったが、購入できなかったため。マウスの研究が遅れているため動物実験を行うことにより、甲状腺分化および甲状腺癌の分化の可能性について検討していく
保型表現の研究

吉田はHilbert modular形式の周期を研究し、志村のP,Q不変量についての予想をほぼ解決した。保型L函数の零点を多くの場合に計算した。この過程で次の予想を得た。π_1,π_2をそれぞれGL (n_1, Q_A), GL (n_2, Q_A)の既約unitary cuspidal保型表現、π_1, π_2のcentral characterは位数有限、π_1とπ_2は同値ではないすると、L (s, π_1)とL (s, π_2)はs=1/2を除けば共通零点を持たないであろう。これはArtin予想を含んでいる非常に強い予想である。さらにArtin L函数の0での微分と虚数乗法をもつアーベル多様体の周期の関係を発見した。これをabsolute CM-periodについての予想という形で精密に定式化した。池田はEisenstein級数のresidueを研究し、Siegel-Weil公式をEisenstein級数が絶対収束しない場合に証明した。さらにtriple L函数のガンマ因子を研究し、幾つかの重要な場合についてガンマ因子を決定した。平賀はsemisimple Lie群Gとその離散的部分群Γに対して、L^2 (Γ/G)に現れるGのdiscrete seriesの表現の重複度を研究した。さらにGのintegralinfinitesimal characterを持つ表現のunitarizabilityについて研究を進めた。梅田は、Roger Howeによるdual reductive pairの概念を量子群について考える、という方針で研究をすすめた。Capelli等式の量子群版などの多くの結果が得られた。土方は、Eichler-Kneserによる古典的近似定理の一般化をDedekind環の商体の上の半単純多元環について予想した。これと関係して多元環のorderの構造定理、orderの上のlatticeについての多くの結果をえた。平井は、無限次元Lie群の典型である多様体のdiffeomorphism groupの表現論を研究した。Hilbert modular形式についての、志村のP不変量に関する予想をほぼ解決した。これにより、n次の総実体上のHilbert modular形式の周期は、2n個の基本周期によって表されることがわかる。結果は今年Amer.J.Math.に発表される予定となっている。周期の研究をmotiveのmoduliとの関連の考察に拡大した。保型L函数の零点についての過去4年間の研究をまとめた論文を完成した。次の予想をえた。π_1,π_2をそれぞれGL(n_1,Q_A),GL(n_2,Q_A)の既約unitary cuspidal保型表現、π_1とπ_2のcentral characterは位数有限、π_1とπ_2は同値ではないとすると、L(s,π_1)とL(s,π_2)はs=1/2を除けば共通零点をもたないであろう。これはArtin予想を含んでいるとも言える非常に強い予想で、将来重要になる可能性がある。他に、池田によるtriple L函数のガンマ因子の計算、土方によるDedekind環の商体上のBass orderの分類の完成、平井による無限次元Lie群び既約unitary表現の新しい構成、梅田による量子群に対するカペリ等式の類似物の証明とそのdual pairの理論への応用等の成果が上がった。吉田はHilbert modular形式についての、志村のP不変量に関する予想をほぼ解決した。

これにより、n次の総実体上のHilbert modular形式の周期は、2n個の基本周期によって表されることがわかる。周期の研究をmotiveのmoduliとの関連の考察に拡大した。保型L函数の零点についての過去4年間の研究をまとめた論文を発表した。さらに、志村の周期不変量に関連する問題を広く考察する過程で、次の関数を発見した。KをQ上GaloisであるCM体、ψをG=Gal(K/Q)の“odd"な表現でψの指標Xψは有理数値をとるとする。このときここにPKは志村の周期記号を表す。この関係式はKがQのアーベル拡大体の場合は証明でき、Chowla-Selbergの公式の一般化になっている。Gが非アーベルの時、数値実験により、この式の正しさを強く支持する結果を得た。さらに予想を(A)の左辺へのGalois群の作用を表す形に深めた。吉田はArtin L函数の0での微分と虚数乗法をもつアーベル多様体の周期の関係についての予想を研究した。A_0型量指標のL函数の特殊値を用いて精密な予想を定式化した。この精密化した予想は一種の相互法則を与えていると考えられる。虚2次体のときには満足すべき結果が得られた。さらにKronecker型の極限公式、Eisenstein級数の積分との関係を調べた。極限公式に現れる函数は1次元のDedekindのeta函数の場合以外は甚だ複雑であるが、高次元のときも極限公式に現れる種々の函数の数論的性質について新しい知見が得られた。池田はTriple L函数のガンマ因子を研究し、GL(2,R)またはGL(2,C)の3個の表現が全てunramified、または全てholomorphicの場合にガンマ因子を完全に決定した。平賀は、semisimple Lie群のintegral infinitesimal characterをもつ表現のユニタリー性を研究した。finite centerではないLie群も含めて、かなり一般的な結果に達しつつある。梅田はsemisimple Lie群の普遍包絡環の中心を調べた。特にCapelli等式によって得られる中心の元と、Gelfandが構成した中心の元と関係を調べNewtonの公式の一般化を証明した。土方は多元環の整数論を研究し、Eichler-Kneserによる古典的近似定理の一般化をDedekind環の商体の上の半単純多元環について予想した。さらにこれと関係して多元環のorderに関するLatticeについての多くの結果を得た。
英国の公共図書館政策の構造的変化：利益団体とその役割を中心に

英国における公共図書館閉館への抗議運動等を中心に,市民の政策過程への関与の実態,その影響力,政府,官僚,各種の利益団体等の他の政策アクターとの関係について検証した。政策関連の集会における観察調査,関係者へのインタビュー調査等を行った結果,抗議や制度的な市民参画を通し,市民が,利用者としての受動的存在から,政策過程に積極的に関与する存在に変化しつつあることが明らかとなった。しかし抗議運動を展開する市民が,従来の直営に維持を望む一方で,政府側は,財政的理由から,市民がサービス実施や経営に自ら関与することを求めており,両者の意見の相違は大きいことが明らかとなった。1英国の利益団体に関する理論研究の成果を整理した。ただし調査を進める中で,利益団体に加え,社会運動の概念が有用であると気づき,P. Byrneの研究等に基づき,社会運動の概念の検討にも着手した。市民団体を社会運動の概念で解釈することの有用性について述べた学術論文を執筆中である。2平成25年6月29日に,イングランド芸術評議会の図書館政策担当者と全国的規模で活動する市民団体や個人の活動家との意見交換会が開催された。意見交換会の開催を知り,両者の意見を知る非常によい機会であることから,急遽,イギリスに出張して意見交換会に参加した。意見交換会への参加を通し,さまざまな立場の関係者の意見の共通点と相違点を知ることができると共に,有力な市民団体の関係者や活動家と信頼関係を構築することができた。さらに個別地域で活動する団体の活動概況を把握するため,新聞・雑誌記事,webサイトなどから,継続的に,情報を収集した。平成26年2月にイギリスに出張し,3つの市民団体の関係者を対象に,構成員,戦術,財源,全国的な頂上団体を含めた他の利益団体との関係等について,インタビュー調査を実施した。インタビュー調査を通し,個々の団体の具体的な活動内容について詳細な情報を得ることができた。現在,インタビュー調査の結果の分析を進めている。3平成26年2月に開催された,図書館政策に関する地方議員向けセミナーに参加し,地方議員の立場での政策展望について情報を収集した。市民団体の主張に加えて,市民団体の交渉の相手方となる個々の地域の行政担当者の意見を知ることは,政策に関わるさまざまな関係者の立場の違いや相互の関係を理解するうえで非常に役立った。1.英国において公共図書館の閉館に反対する市民運動(図書館運動)を展開している団体・個人の活動概況を把握するため,新聞・雑誌記事,webサイト等から継続的に情報を収集した。3.イギリスのキャメロン政策のもとでの公共図書館政策の概要についての論文を執筆し,図書館運動展開の背景と実態についてまとめた。1.英国における公共図書館の閉館に反対する住民運動,ならびに政府が設置した公共図書館政策に関する助言機関であるタスクフォースの活動の概況を把握するため,新聞,雑誌記事,webサイト等から継続的に情報を収集した。2.平成27年11月に英国に出張し,住民運動団体The Library Campaignの主催した全国的集会Speak up for Librariesに参加し,各地の住民運動団体,専門職団体,政府側のタスクフォース委員などの関係者の発言や行動を参与観察した。合わせてタスクフォース委員であり,図書館長会の会長であるCiara Eastell氏に,全国的な図書館政策の状況と図書館長会の活動について,個別にインタビューを実施した。3.地方自治体による運営,地方自治体から委託を受けてボランティアが運営する形態に加え,最近,新しい図書館経営形態として,図書館員・市民が経営組織としての図書館の所有権を獲得する手法が登場した。この新たな経営形態に着目し,新聞,雑誌記事,webサイト等から継続的に情報を収集した。4.平成27年11月に,従業員・住民所有組織による経営を導入した図書館2館(YorkとSuffork)を訪問し,経営の現状を調査した。合わせてSufforkの館長Alison Wheeler氏と,3例目として導入準備中のDevonの館長Ciara Eastell氏(図書館長会会長)に対し,個別にインタビューを実施した。5.英国の公共図書館の閉館に反対する住民運動,及び,従業員・住民所有組織による公共図書館経営について,それぞれ訪問記録と論文を執筆中である。現在進行中の政策動向を研究の対象としているため,現状の把握と,その中から具体的な研究対象と作業課題を見定める作業を並行して進めた。政府の助言機関であるタスクフォースが本格的に活動を始めたこと,従業員・市民所有組織という新しい経営体が出現したことから,これらの新たな動向の把握を優先し,論文のとりまとめにはやや遅れが生じた。しかし,Speak up for Librariesの集会への参加等を通し,政策関係者の発言を実際に聞くことができるなど,データの蓄積を行い,次年度の論文執筆にむけての準備を進めることができた。1.昨年度の従業員・住民が共同で運営する相互扶助組織による図書館運営の補足調査として,平成28年11月に,全国で3例目として相互扶助組織に移行したDevonの図書館を訪問し,相互扶助組織のCEOに相互扶助組織への移行後の様子について話を聞いた。各館の運営に参加する市民はほぼ順調に集まっていること,ものづくりを支援するコーナーの開設など,新規のサービスにも積極的に取り組んでいる状況を確認することができた。2.直営から別の運営方法に移行する際のプロセスと,そのプロセスに対する市民の関与について知るために,パブリック・コンサルテーションを経て,分館運営を各地域の下位自治体等に移管したCornwallの事例を検証した。地方紙の報道,Cornwall議会の議事録等の文献から,一連の経緯を調査した。

そのうえで,平成28年11月に現地を訪問して図書館を見学すると共に,自治体の担当者2名(図書館長と図書館が属する部門の責任者)に,Cornwallにおける図書館運営方法の見直しについてインタビューを実施した。その結果,パブリック・コンサルテーションや議会での議論を経て,財政削減に伴う図書館運営のあり方の見直しについて,自治体の当初の希望とは異なる形で政治的決着が図られたこと,パブ内のミニ図書館の開設・出張所にあたるワンストップ・ショップと図書館との統合・下位自治体への分館運営の移管といった多様な変革が進められたことなどが明らかとなった。また分館の職員と地方議員各1名にもインタビューを実施し,Cornwallの図書館や自治体行政の実情等について背景となる知識を得た。3.昨年度の相互扶助組織に関する調査の結果をもとに,原著論文を執筆した。英国における公共図書館閉館への抗議運動等を中心に,市民の政策過程への関与の実態,その影響力,政府,官僚,各種の利益団体等の他の政策アクターとの関係について検証した。政策関連の集会における観察調査,関係者へのインタビュー調査等を行った結果,抗議や制度的な市民参画を通し,市民が,利用者としての受動的存在から,政策過程に積極的に関与する存在に変化しつつあることが明らかとなった。しかし抗議運動を展開する市民が,従来の直営に維持を望む一方で,政府側は,財政的理由から,市民がサービス実施や経営に自ら関与することを求めており,両者の意見の相違は大きいことが明らかとなった。同時代の政治現象を研究対象としているため,現実の政治動向を把握すること,その中で適切な研究対象と作業課題を見定めることを並行して進めた。あらかじめ設定した枠組みに沿って研究を進めるというより,研究を進めながら枠組みの設定も同時に進めなければならないため,結果の分析と論文執筆の作業にはやや遅れが生じた。しかし,図書館運動の中心的な人物や団体の協力を得て,順調に調査を進め,次年度以降の論文執筆に向けてのデータを十分に蓄積することができた。平成28年度は,次の順序で研究を進める。1.政府側の助言機関であるタスクフォースの活動が本格化するとともに,住民運動の活動も活発化するなど,公共図書館政策をめぐる事態がきわめて流動的である。当初の予定では,最終年度である平成28年度は論文の執筆に専念し,英国出張は行わない予定であった。しかし新しい状況の把握を中心に補足の調査を行う必要が出てきたため,平成28年度にも英国への出張を行うこととした。2.住民運動の活動について,研究論文の材料とするため,これまでの調査結果をとりまとめた記録を作成する。これらの記録は,専門団体の機関誌等での発表をめざす。3.従業員・住民所有組織による経営を中心に,これまでの研究成果をとりまとめるための論文の執筆を行う。情報学平成27年度は,次の順序で研究を進める。1.これまでに引き続き,政治的アクターや制度など,研究で用いる基本概念について,政治学の研究成果をもとに検討を加え,理論的な分析の枠組みの精緻化を進める。
Srcキナーゼの活性制御と浸潤・転移に決定的なシグナル伝達系の解析

本研究は、チロシンキナーゼ型がん遺伝子v-srcを用いて、がん細胞の浸潤・転移に決定的なシグナル伝達系を同定する事を目指している。即ち、細胞間接着、細胞骨格蛋白質、基質コラーゲンの変化をもたらし、浸潤を活性化するシグナル伝達系を、標的蛋白質の同定と種々のdominant negative遺伝子の導入によって明らかにする。合わせて、酸化・還元反応に依存する新規のSrcキナーゼ活性化機構についてその詳細を解析する事を目的として立案された。その結果、以下の諸点を明らかにした。1.Src、ConA刺激によるMMP-2の分泌亢進と活性化には、c-Rasの機能が必須である。2.卵巣癌培養細胞株のフィブロネクチン刺激は、Src下流のFAK,Rasシグナル伝達系を活性化し、MMP-9分泌の亢進と、癌細胞の浸潤・転移を活性化する。この時、FAK,Ras依存シグナル伝達系が決定的な役割を果たす。3.バキュロウイルスにより大量産生、精製されたSrcキナーゼを用いて、塩化第2水銀等によるTyr527非依存キナーゼ活性化が確認された。塩化第2水銀とともに、NOもSrcキナーゼ活性可能を持つことを発見した。4.塩化第2水銀の標的となるSrcキナーゼのシステイン残基の内、496Cys及び498Cysは、Srcキナーゼの構造安定性に重要であることが判明した。
ガングリオシドの生物学的機能発現調節機構

ガングリオシドは、微量ではあるが全ての高等動物に存在するシアル酸含有スフインゴ糖脂質である。現在までにセラミド構造の異なる100種以上のガングリシド分子種が報告されているが、その機能は、未だ不明な点が多く残されている。本研究は、ガングリオシド、特に微量のガングリオシド成分についてそれらの新しい生物学的役割を分子・遺伝子レベルで明らかにするための方法論の確立、その実験的応用、ガングリオシドの新しい機能発現機構の解明等を目的として計画された。研究が行われた2年間に、(1)微量ガングリオシドの効果的分画法の開発、(2)ガングリオシドおよびその誘導体に対するモノクロ-ナル抗体の作成技術の開発、(3)これによる超微量ガングリオシドの解析、(4)細胞機能発現の捕捉法の開発などについて成果が得られた。これらの方法論により、(5)発癌遺伝子(ras oncogene)導入による癌化に伴うガングリオシド発現の異常、(6)ウイルス(インフルエンザウイルスおよび近縁のパラミクソウイルス群、ヒト免疫不全症ウイルス)の受容体機能および感染成立のガングリオシドによる制御、(7)細胞増殖、分化、発生に伴うガングリオシドの発現およびガングリオシドによる制御、(8)ガングリオシドによる生物学的リガンドに対する受容体機能の制御、(9)脳の病的老化や神経細胞の増殖におけるガングリオシドの役割、(10)細胞内情報伝達、タンパク質リン酸化反応などにおけるモジュレ-タ-としてのガングリオシド等、ガンドリオシドの生物学的機能のいくつかの側面が明らかにされ、多彩な機能を有していることが明らかとなった。これらの成果から、本研究の当初の目的は概ね達成され、今後益々ガングリオシド研究の重要性が増すものと期待される。本研究は、ガングリオシドの新しい生物学的機能を新しい視点から明らかにすることを目的としている。本年度の実績は下記の通りである。1.大量のウシ脳ガングリオシドを速やかに且つ高分解能に分画、分取する新しい方法を開発した。これにより極微量成分であるGM_<10>ガングリオシドの単離に成功した。本法は陰イオン交換樹脂(Qセファロース)を用いるが、FPLCシステムを導入することにより、効果的分画が可能となった。2.インフルエンザウイルスの赤血球凝集素、ノイラミニダーゼの遺伝子変異にともなうガングリオシドの認識の変化を調べた。遺伝子の点変異はシアル酸の結合様式(α2-3、α2-6)の相違に現われること、Ser(205)はシアル酸の結合様式の認識に重要であることを見いだした。3.ras発癌遺伝子(K-ras,H-ras)導入細胞において、ガングリオテトラオース系ガングリオシド、GD_3ガングリオシドの特異的減少を見いだした。この変化は細胞の種類でなく遺伝子特異的であった。4.ガングリオシドに対するいくつかの単クローン抗体を作製し、エピトープを決定した、マウス脳神経細胞に対する単クローン抗体のいくつかはCシリーズガングリオシドを認識すること、これらのガングリオシドは脳の発生、分化に伴ない変化することを見いだした。5.GM_3ガングリオシド合成酵素の精製で満足すべき結果を得た。6.脳ガングリオシドをイヌに投与(筋注)し、投与後の血中濃度を高感度免疫染色法により追跡する方法を確立した。7.ガングリオシドのセラミド部位のN-アシル基を切断する新しい酵素を見い出した。本研究は、ガングリオシドの新しい生物学的役割を新しい視点から明らかにすることを目的にしている。本年度は、本研究の最終年度であることを鑑み、当該研究を纏め、結論を引き出すことを考慮した。今年度は、昨年度に引続き以下の成果が得られた。

(1)ガングリオシドの生物学的リガンドに対する受容体機能としてインフルエンザウイルスヘマグルチニン(HA)およびノイラミニダ-ゼ(NA)が認識する細胞膜ガクリオシドの構造をそれらの遺伝子の変異との関連で明かにした。すなわち、HA分子内Ser(205)は、シアル酸の結合様式(α2,3,α2,6)に対する認識に重要なエピト-プであることをHA分子の三次元構造の解析と共に明かにした。また、ある種の合成ガングリオシド誘導体が、インフルエンザウイルスNAの特異的インヒビタ-となることを見いだし、ウイルス感染におけるNAの役割を解明する上で極めて有益な情報が得られた。さらに、ウイルスレセプタ-ガングリオシドに対するモノクロ-ナル抗体の作成に成功し、それが、ウイルス感染を阻止することから、ガングリオシドが細胞膜のウイルスレセプタ-として確かに機能していることを明らかにした。(2)脳内超微量ガングリオシドの分離方法の確立、それらの構造決定、機能解析を行った。脳内には、想像以上に多様な微量ガングリオシドが存在し、このうち、GM1b,GD1αの構造決定、モノクロ-ナル抗体の作成に成功した。これを用いて、GM1bは、ニワトリ胚脳や癌細胞に特異的に現れるonco-developmental antigenであることを明かにした。また、ラット胚脳に0ーアセチルシアル酸を持つCーシリ-ズガングリオシドが特異的に発現していることを突き止めた。以上、本研究においては、ガングリオシドの機能を探るうえで必須な超微量ガングリオシドの分画、解析法、さらに分子・遺伝子レベルによるガングリオシドの新しい機能発現を探る方法論等が開発され、これによりいくつかのガングリオシドの確かな新しい機能、細胞内調節機構を見いだすことが出来た。従って、本研究の目的は概ね達成されたと考えられる。
全身性エリテマトーデスにおけるCD4+CD52+細胞の免疫調節に関する研究

全身性エリテマトーデス(SLE)は自己抗原に対する免疫寛容の破綻により様々な免疫異常を呈する疾患である。SLE患者の末梢血中ではCD4+CD52loT細胞という免疫担当細胞の割合が増加し、その数は病勢や自己抗体産生と相関することをなどを証明した。またケモカインであるTARCはCD4+CD52loT細胞の分化を誘導することを明らかにした。この細胞分画の機能異常がSLEの病態形成に影響している可能性が示された。【目的】全身性エリテマトーデス(SLE)は皮疹,関節炎,腎炎,中枢神経症状など多彩な症状を呈する自己免疫疾患であり,その制御性メカニズムにおいて制御性T細胞の働きが重要視されている.CD4+CD52high細胞は自己免疫疾患において制御性の機能を持つことが報告されている.我々はSLE患者においてCD4+CD52lowT細胞が増加し,SLEDAI,IgG値,抗ds-DNA抗体価と正の相関を示していることを証明した.CD4+ CD52lowT細胞は自己抗体産生を介してSLEの病態形成に関与している可能性があり,このpopulationの機能解析を行うことが病態形成のメカニズムの解明の糸口になるのではないかと考えた.【方法】SLE患者N=64,関節リウマチ患者N=23,健常人(HC) N=33の末梢血単核細胞を分離しフローサイトメーターにてCD4+CD52highT細胞とCD4+CD52lowT細胞を解析した.【結果】SLE患者は健常人や非SLE患者と比較しCD4+CD52lowT細胞の割合が高かった.SLE患者のCD4+CD52lowT細胞の割合はSLEDAIや抗ds-DNA抗体価と正の相関を示した.FollicularHelper Like T細胞(Tfh like細胞)はSLE患者で増加しており,CD4+CD52lowT細胞の割合と正の相関を示した.CD4+CD52highT細胞とCD4+CD52lowT細胞の遺伝的特徴を解析するため行ったcDNAマイクロアレイにおいてSLE患者のCD52lowT細胞ではCCR8が発現更新しており,そのリガンドであるTARCはSLE由来のCD4+T細胞からCD52lowT細胞を誘導した.CD4+CD52+細胞は従来の制御性T細胞とは異なる機能を有している可能性が示唆されており,この点に着目をして自己免疫疾患であるSLEにおける新規標的分子となり得るかについて研究を行っている.平成28年度の研究で以下のことを明らかにした.SLE患者は,健常人,非SLE患者と比較し,有意にCD52lowT細胞を多く認めた.SLE患者のCD52lowT細胞はSLEの疾患活動性指標であるSLEDAIと有意に相関を示した.血清中の可溶性CD52をELAISA法で解析を行った結果, SLE患者は,健常人,非SLE患者と比較し,有意に可溶性CD52の低下を認めた.胚中心における形質細胞分化誘導へ関与しているTfh like細胞はSLE患者で発現亢進しており,CD4+CD52lowT細胞の発現と正の相関を示した.SLE患者のCD4+CD52lowT細胞においてCCR8のmRNA発現が亢進しており,そのリガンドであるTARCはCD4+CD52lowT細胞を誘導した.これらの結果2015年,2016,2017年日本リウマチ学会,2015年,2016年米国リウマチ学会,2015年11月日本臨床免疫学会において発表しており,近日中に論文投稿予定である.次にSLE患者においてCD52loT細胞を誘導する因子を同定するためCD52loおよびCD52hiT cellにおけるcDNAマイクロアレイを行い遺伝子情報の比較解析を行なった。CD4+CD52loT細胞においてはケモカインレセプターの発現に着目したところCCR2、CCR5、CCR8、CXCR2のmRNA発現が亢進していた。次にSLE患者より分離したCD4+T細胞と上記4つのCCRに対応するリガンド(GRO、MCP-1, RANTES、TARC、IL-8)とともに24時間培養を行った後にCD4+CD52lo T細胞発現を解析した。その結果、CCR8のリガンドとして報告されているTARCがCD4+CD52loT細胞を誘導することが明らかとなった。この結果より、TARCはCD4+CD52loT細胞の誘導を介した機序によりSLEの病態形成に関与している可能性が示された。TARCがSLE病態に影響する機序をさらに検討するため,培養実験を予定している.SLE由来のCD4+細胞をTARC有無の条件で培養を行い,CD52lowおよびHighの分画を分取し,それぞれのサイトカイン(IFNgやIL-21)産生能の変化や,CD52low細胞とB細胞の共培養によるIgG産生能の変化などを検討する予定としている.

また今回の検討でCD52low細胞の割合をSLE患者の男女間で比較したところ両群間で疾患活動性に差がないのにもかかわらず女性においてCD52low細胞が増多していることが明らかとなっている.性差における因子がCD52 lowT細胞を介した機序によりSLE病態に関わっている可能性があり,エストロゲンなどの性ホルモン添加によるCD52 low T細胞誘導実験なども検討する予定としている.リウマチ・膠原病内科学分野2017年3月時点においては実験に必要な物品に残存があったため.2017年4月以降に予定している培養実験に使用する抗体,培養液,リンパ球分離液などの購入を予定している