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骨髄由来細胞動員による動脈硬化進展と組織再生機構の解明

いままでの研究で、動脈硬化の中核となる動脈内のプラークは、マクロファージをはじめとする骨髄由来の炎症細胞が血管内皮障害部位へと集簇が重要なプロセスであることが判明している。申請者らのこれまでの研究で、骨髄由来細胞の動員では、マトリックスメタロプロテアーゼ(MMP)および血液線維素溶解系(線溶系)因子に代表される、セリンプロテアーゼを含む各種プロテアーゼの活性化が起点となっていることが判明している。昨年度までの研究で、高脂肪食負荷による動脈硬化モデルマウスに同時に免疫抑制剤を投与して骨髄由来細胞を減少させたマウスと、免疫抑制剤を投与しないマウスを比較したところ、前者には明らかな動脈硬化巣の形成抑制が認められた。血清脂質上に大きな差異は認められなかったことから、骨髄由来細胞数の低下が動脈硬化抑制には重要であることが示唆された。次に、動脈硬化モデルマウスである程度プラーク形成を誘導したマウス群に、同様に免疫抑制剤を投与したところ、投与群ではプラークの増加および形成抑制が認められた。動脈硬化部位のMMP-2およびMMP-9の測定を行ったところ、免疫抑制剤投与群では、明らかな活性減少が認められ、炎症性細胞の浸潤抑制による炎症の低下がプラーク形成を抑制していると考えられた。具体的には、免疫抑制剤投与群では、マクロファージおよびリンパ球の浸潤の低下が病理所見で認められ、脾臓細胞の細胞表面マーカー解析においては、Tリンパ球のTh1細胞数の減少も認められた。マクロファージ分画の差異やプラークの退縮の可能性については、いましばらくの検討が必要である。今後は、後半のテーマである虚血性循環障害の再生修復における骨髄由来細胞動員の意義を、マウスの大腿虚血肢モデルを利用して行っていく予定である。昨年度までの研究では、骨髄由来の炎症性細胞群の末梢組織中へと動員抑制目的のため、動脈硬化モデルであるApoE遺伝子欠損マウスに高脂肪食を負荷後、免疫抑制剤(Cy)投与群、および対象群を作製した。大動脈組織を病理学的に観察したところ、Cy投与群では有意差を持って動脈硬化の形成が抑制されていることが判明した。プラーク内の動員細胞の種類と細胞数を組織染色にて確認したところ、マクロファージおよびT細胞、線維組織のいずれもCy投与群では減少していた。大動脈弓部のプロテアーゼ活性を測定したところ、炎症性のマトリックスメタロプロテイナーゼであるMMP-2およびMMP-9のいずれもが、Cy投与群では減少を認めた。以上のことより、この研究の目的である骨髄由来の炎症細胞の動員抑制が動脈硬化形成に重要な役割をしていることは明らかとなったが、プロテアーゼの抑制によるマクロファージ分画やT細胞分画への作用については、まだ検討が必要である。また、動脈硬化症のモデルマウスへの免疫抑制剤の投与は行えたが、マウスの繁殖不良も重なり、当初予定していたプロテアーゼ活性阻害剤の投与までは行うことができなかったことで、研究の遅れを生じてしまったと考える。実験の前半部分の「動脈硬化プラーク形成過程の骨髄由来細胞動員の意義」については、結果を得られており、後半の「虚血性循環障害の再生修復における骨髄由来細胞動員の意義」についての実験を進めつつあるため。昨年度までの研究では、動脈硬化症のモデルマウスへの免疫抑制剤の投与による骨髄由来の炎症細胞の動員抑制の過程の証明までは行えた。しかし、マウスの繁殖不良なども重なり、プロテアーゼ活性阻害剤の投与によるまでには至らなかった。
イヌ冠動脈における内皮依存性過分極反応に及ぼす吸入麻酔薬ハロセンの影響

1.本研究の前段階として、ウサギ腸間膜動脈において数々の吸入麻酔薬が内皮依存性弛緩反応に与える影響をを検討した。イソフルレンなどの吸入麻酔薬は、NOによる血管弛緩反応およびNO阻害薬の存在下で認められるEDHFによると考えられる弛緩反応も抑制することがわかった。2.イヌ冠動脈におけるハロセンの過分極反応への影響(1)ブラジキニンは、濃度に依存して、冠動脈平滑筋細胞に内皮依存性過分極反応を生じさせた。過分極反応は有意にACE阻害薬であるperindoprilat10^<-6>M存在下で増強された。(2)吸入麻酔薬ハロセンを3%まで上昇させても、平滑筋細胞膜の静止膜電位には変化が認められず、ブラジキニンによる内皮依存性過分極反応は抑制されなかった。高濃度のハロセンおよびヘプタノール(10^<-4>M)は、濃度に依存して静止膜電位を脱分極させたが、プラジキニンによる過分極反応は抑制しなかった。以上より、イヌ冠動脈においてブラジキニンによる内皮依存性過分極反応は、血管内皮と平滑筋細胞とのgap-junctionを介した電気的カップリングによるものではなく、血管内皮からブラジキニンにより放出されたEDHFという未知の強力な過分極因子(物質)による可能性が高いことがわかった。3.EDHFの同定に関する研究最近、アラキドン酸のP-450による代謝物epoxyeicosanoids(EETs)がEDHFの候補として注目されている。我々はP-450阻害作用を有する鉛の慢性曝露をラットに行ったところ、腸間膜動脈のアセチルコリンによる一酸化窒素による内皮依存性弛緩反応は抑制されなかったが、EDHFによると考えられる内皮依存性過分極反応は有意に抑制された。このEDHFによるイヌ冠動脈の弛緩反応を検討する前段階として、我々は先ず、ウサギ腸間膜動脈において数々の吸入麻酔薬が内皮依存性弛緩反応に与える影響について調べた。その結果、イソフルレン、セボフレン、およびエンフルレンの各吸入麻酔薬は、NOによる血管弛緩反応を抑制するほか、NO阻害薬の存在下で認められる内皮依存性弛緩反応(主にEDHFによる弛緩反応)も抑制することがわかった(Akata et al,1995)。これらのことから、吸入麻酔薬が動脈の血管内皮細胞を非特異的に抑制しEDHFの放出を抑制しているのか、あるいはEDHFの放出には影響を与えず平滑筋自体の弛緩反応を抑制しているのかが次の問題となった。今後は、同様の実験をイヌ冠動脈を用いて行い、ハロセンによってEDHFによる弛緩反応と同時に弛緩反応も抑制されているか否かについて検討を行う予定である。我々は先に、ウサギ腸間膜動脈において数々の吸入麻酔薬が内皮依存性弛緩反応に与える影響について調べた。その結果、イソフルレン、セボフレン、およびエンフルレンの各吸入麻酔薬は、NOによる血管弛緩反応を抑制するほか、NO阻害薬の存在下で認められる内皮依存性弛緩反応(主にEDHFによる弛緩反応)も抑制することを報告した(Akata,Nakashima et al.1995)。同様の結果はウサギ頸動脈においても確認された(Lischke et al.1995)。従ってイヌ冠動脈においても吸入麻酔薬はEDHFの放出を抑制しているものと予想された。

そこで、イヌ冠動脈平滑筋細胞におけるブラジキニンによる過分極反応を電気生理学的手法で測定した。その結果、ハロセン投与下でも過分極反応は確認された。従ってハロセンはEDHFの放出それ自体には影響を与えず、むしろ過分極から弛緩を起こすまでのプロセスを抑制している可能性が示唆された。今後は、その抑制の詳細について検討を行う予定である。前年と同様、イヌ冠動脈におけるプラジキニンおよびアセチルコリンによる内皮依存性過分極反応に対するハロセンの影響を確認した。1.ブラジキニンおよびアセチルコリンともに内皮依存性過分極反応を惹起したが、ブラジキニンによる反応ががアセチルコリンに比し有意に大きかった。2.Gap-junctionの抑制効果を有するハロセンは、濃度依存的に冠動脈平滑筋細胞の静止膜電位を脱分極させた。しかし、高濃度のハロセン存在下においてもブラジキニンによる内皮依存性過分極反応は認められた。3.ハロセンと同様麻酔作用とgap-junctionの抑制効果を有するヘプタノール平滑筋細胞の静止膜電位を過分極させたが、ブラジキニンによる内皮依存性過分極反応は抑制しなかった。さらに、他の吸入麻酔薬インフルレンやセボフルレンも内皮依存性過分極反応を抑制しなかった。以上のことから、冠動脈の拡張に重要な役割を果たす血管内皮依存性過分極反応は、血管内皮の過分極がgap-junctionを介し平滑筋細胞に伝達されたものではなく、血管内皮からある種の過分極因子(物質)EDHFが放出されたことを強く示唆した。最近、内皮依存性弛緩反応が吸入麻酔薬によって抑制されるという報告がなされている。今回の実験結果をあわせて考えると、吸入麻酔薬による内皮依存性弛緩反応の抑制は、一酸化窒素(NO)による反応を抑制したものか、あるいは過分極反応から弛緩反応へのプロセスを抑制したものかを今後検討する必要がある。
嚢胞性線維症特異的スプライスバリアント発現調節機序の解明と新規治療戦略の開発

嚢胞性線維症(CF)は慢性気道炎症や粘液貯留を特徴とし、平均寿命約40歳の予後不良の遺伝性疾患である。これまでに申請者は、炎症制御や粘液産生に関与する2つの分子の変異体の発現がCF細胞特異的に上昇することを見出した。そこで本研究では、それら2つの分子の変異体発現調節メカニズムの解明と、変異体発現を絶対定量可能な評価系を用いて世界中の有用天然物由来の化合物を用いてスクリーニングを行い、新たな創薬に向けた基礎的検討を行う。
脊椎動物の初期におけるＲｈ式血液型遺伝子族の進化様式の解明

無顎類クロヌタウナギから、RhBG-like、RhBG-like2およびRhCGを得た。また、軟骨魚類アカエイのRhCGとネコザメのRhBGの配列も決定した。系統解析では、クロヌタウナギの2つのRhBG-likeは、他の脊椎動物のRhBGとRhCGとの共通祖先の枝に位置した。これは、クロヌタウナギのRhBG-likeにおいての収斂アミノ酸置換によるものであると考えられた。Rh遺伝子族は、脊椎動物の共通祖先ではアンモニウム排出に関与する器官で発現しており、2回の全ゲノム重複後に、RhBGやRhCGが本来の機能を担っているのに対し、RhやRhAGが血球系での発現に限定されてきたと考えられた。脊椎動物のRh式血液型遺伝子族には、本来の血液型遺伝子であるRh以外に、RhAG(Rh50)、RhBG、RhCGといった遺伝子が存在する。本研究は、ヌタウナギや軟骨魚類といった脊椎動物の初期に分岐した生物の相同遺伝子を決定することによって、Rh式血液型遺伝子族の重複と分岐のタイミングを明らかにすることを目的としている。駿河湾で採集されたクロヌタウナギ(Paramyxine atami)から抽出したtotal RNAを用いて、次世代シーケンサーによるトランスクリプトーム解析を行った。その結果、Rh式血液型遺伝子族に属する遺伝子のcDNAの塩基配列を3種類得ることができた。また、軟骨魚類のネコザメとアカエイからtotal RNAを抽出し、逆転写酵素を用いてcDNAを作製した。次に、脊椎動物におけるRh、RhAG、RhBG、RhCGそれぞれの遺伝子の多重整列からDegenerateプライマーをそれぞれ設計し、PCRを行った。その結果、他の脊椎動物のRh式血液型遺伝子族と相同性のある遺伝子の部分配列を得ることができた。得られた部分配列に新たなspecificプライマーを設計し、5'RACEと3'RACE法を用いて、cDNAの5'側と3'側の塩基配列を決定した。次に、cDNAの5'側と3'側の非コード領域に遺伝子特異的プライマーを設計し、PCRを行い、軟骨魚類のRh式血液型遺伝子族に属する遺伝子のcDNAの塩基配列を2種類得ることができた。他の脊椎動物のRh式血液型遺伝子族を含めて系統解析を行ったところ、今回得られた軟骨魚類の遺伝子は、他の脊椎動物のRhBGとRhCGの共通祖先とクラスターを形成した。無顎類に属するクロヌタウナギ(Eptatretus atami)の肝臓と鰓から抽出したRNAを用いて、Illumina HiSeq2000によるde novoトランスクリプトーム配列解析を行った。その結果、肝臓のサンプルから44,603,820、鰓のサンプルから47,144,366のclean readsが得られた。それぞれのclean readsを解析することによって、それぞれ104,126(平均314 bp)と115,795(平均378 bp)のcontigsを得ることができた。これらをまとめて相同性検索を用いた解析を行ったところ、28,520の既知のCDS配列とヒットし、これらのアノテーションを付けることができた。得られたクロヌタウナギのcDNA配列全体のGC含有量は46.1%であり、ヤツメウナギ類と比較しても、それほど高いGC含有率ではなかった。また、アリル間での塩基置換数を比較したところ、転位置換は66.0%と、転換置換(34.0%)よりも多くみられた。Rh式血液型遺伝子族においては、2つのRhBGと1つのRhCGの相同遺伝子を得ることができた。他の脊椎動物のRh式血液型遺伝子族を含めて系統樹を作成したところ、クロヌタウナギのRhCGは、他の脊椎動物のRhCGとクラスターを形成したが、クロヌタウナギの2つのRhBGは、他の脊椎動物のRhBGとRhCGとの共通祖先の枝に位置した。そのため、さらにサイトごとの系統解析を行ったところ、クロヌタウナギの2つを含む無顎類のRhBGでは、他の脊椎動物のRhCGに収斂するようなアミノ酸置換がいくつかみられ、これらが真の樹形を得ることの妨げになっているということが示唆された。

本研究は、ヌタウナギや軟骨魚類といった脊椎動物の初期に分岐した生物の相同遺伝子を決定することによって、Rh式血液型遺伝子族の重複と分岐のタイミングを明らかにすることを目的としている。駿河湾で採集されたクロヌタウナギ(Paramyxine atami)の鰓、心臓、肝臓などの各組織からtotal RNAを抽出し、逆転写酵素を用いてcDNAを作製した。次に、脊椎動物におけるRh、RhAG、RhBG、RhCGそれぞれの遺伝子の多重整列からDegenerateプライマーをそれぞれ設計し、PCRを行った。その結果、他の脊椎動物のRh式血液型遺伝子族と相同性のある遺伝子の部分配列を得ることができた。得られた部分配列に新たなspecificプライマーを設計し、5'RACEと3'RACE法を用いて、cDNAの5'側と3'側の塩基配列を決定した。次に、cDNAの5'側と3'側の非コード領域に遺伝子特異的プライマーを設計し、PCRを行い、クロヌタウナギのRh式血液型遺伝子族に属する遺伝子のcDNA約1.7 kbの塩基配列を決定した。得られた塩基配列では、GC%は46.6であり、同じ円口類に属するヤツメウナギのようなGC含量の顕著な偏りはみられなかった。また、他の脊椎動物のRh式血液型遺伝子族を含めて系統解析を行ったところ、今回得られたクロヌタウナギの遺伝子は、他の脊椎動物のRhBGとRhCGの共通祖先とクラスターを形成した。次世代シーケンサーを用いたことによって、Degenerateプライマーでは得られなかったRh式血液型遺伝子族に属する遺伝子のcDNAの塩基配列をクロヌタウナギから得ることができた。また、軟骨魚類のRhBGとRhCGの相同遺伝子の塩基配列決定も進んだ。東日本大震災の影響で、研究活動全体が例年通りには進まなかった。そのため、円口類ヌタウナギからのRNA抽出及び相同遺伝子の塩基配列決定により重点を置いたので、脊椎動物の主だった種を用いたRh式血液型遺伝子族のプロモータ領域の解析が予定よりも進まなかった。次世代シーケンサーによって得られたクロヌタウナギのRh式血液型遺伝子族に属する遺伝子の解析に関しては引き続き進めるとともに、軟骨魚類の残りの遺伝子のcDNAの全長の塩基配列決定に着手する。また分子系統樹の作成も行う。分子系統樹は、近隣結合法、最尤法、ベイズ法など様々な系統樹作成法を用いて多角的に検討する。一方、脊索動物の主だった種を用いて、Rh、RhAG、RhBG、RhCGそれぞれのプロモータ領域の多重整列を作成し、保存領域の予備的解析を行う。まずDDBJ/EMBL/GenBankやEnsemblの塩基配列データベースから、ヒト(Homo sapiens)、マウス(Mus musculus)、ニワトリ(Gallus gallus)、ツメガエル(Xenopus tropicalis)、フグ(Takifugu rubripes)、ウミヤツメ(Petromyzon marinus)、ホヤ(Ciona intestinalis)、ナメクジウオ(Branchiostoma floridae)などの利用可能な生物種から、Rh式血液型遺伝子族のプロモータ領域を収集し、多重整列を作成する。ヒトのRhの制御領域に関しては、培養細胞を用いたdeletion解析の研究が存在するので、その情報を補足的に用いて解析を進める。Rh式血液型
クラスターを含むエネルギー移動と一電子酸化還元反応のダイナミックス

1.光電子・イオン同時計則法によるクラスターの光電子分光の研究(1)前年度に実験を行ったアルゴンのクラスターの光電子スペクトルについて解析を進め、三量体イオンの構造を明らかにした。(2)二酸化炭素のクラスター及び一酸化二窒素のクラスターについて実験と解析を行い、二量体等のイオン化エネルギーを決定した。(3)アルゴンのクラスターと一酸化炭素の衝突交換反応によってアルゴン原子n個と一酸化炭素一個とを含む二成分クラスターを作り、その光電子スペクトルを観測した。バンドの形状及びイオン信号強度の反応成分導入量に対する依存性から、共鳴電荷移動反応と振動前期解離に関する有力な情報を得た。2.飛行時間差型速度分解ペニング電子分光法の開発今年度は上述の研究に加えて、速度分布可変の超音速準安定励起原子ビーム源を開発し、励起原子と分子の間のエネルギー及び電荷の移動反応素過程のダイナミックスに関する研究に着手した。(1)ビーム源については、ノズル内に針状陰極を導入し、噴出口を経て金属製スキマーとの間で放電される方式を採用することにより、従来と比べて数十倍のビーム強度を達成した。また、放電電流を変えることにより、生成する励起原子の速度分布を広い範囲で制御することに成功した。(2)チョッパー使用によるパルスビーム法と電子分光法とを組合わせることにより、ビームと試料の衝突に伴うイオン化反応で生成する陽イオンの状態を選別してイオン化断面積の相対速度依存性を直接的に観測することに成功した。(3)試料として酸素分子を用いた場合には、陽イオンの状態によって、多様な速度依存性が現われることを見出した。さらに、放出電子の角度分布の観測も合わせて行うことにより、それぞれの陽イオンの生成機構について、詳細な知見を得ることがだきた。
DNAマイクロアレイを用いた哺乳動物小胞体ストレス応答遺伝子の網羅的同定と解析

本年度ではDNAマイクロアレイを用いて2万5000種のヒト遺伝子を対象とした解析を実施し、小胞体ストレスに応答して転写が誘導される約百種類のヒト遺伝子を同定した。小胞体シャペロン等に代表される既知の応答遺伝子もその中に含まれていたが、大部分の遺伝子は本研究により新たに小胞体ストレス応答遺伝子として同定されたものである。それぞれの遺伝子産物の機能は転写因子、トランスポーター、シグナル伝達因子など多種多様である一方で、機能が不明な遺伝子も多く見られた。そこで、機能未知の遺伝子の一つであるCGI-101に着目し、その転写制御機構ならびに機能について解析を行った。哺乳動物の小胞体ストレス応答はATF6経路、IRE1経路およびPERK経路の3つの転写誘導経路で構成されているが、CGI-101の転写誘導はIRE1経路に依存していた。また、CGI-101は膜蛋白質をコードしており、細胞内に発現させると小胞体に局在したことから、CGI-101が小胞体の機能保持に関与していることが強く示唆された。現在さらに詳しい機能解析を行うとともに、CGI-101のプロモーター配列を単離して転写制御機構についてもより詳細な解析を行っている。また、本研究の最終目的は、小胞体ストレス応答を構成する3つの転写誘導経路の役割を明らかにし、哺乳動物小胞体ストレス応答の全貌を把握することにあるが、そのための第一歩として、ATF6経路の活性化を抑制する薬剤の探索に取り組み、セリンプロテアーゼ阻害剤4-(2-aminoethyl)benzenesulfonyl fluoride(AEBSF)にその効果があることを見い出した。AEBSFはATF6経路の標的遺伝子の誘導も抑制することから、小胞体ストレス応答におけるATF6経路の役割と意義を明らかにする上でこの知見は有用であると考えている。
生物の表面微細構造から着想を得たオープン流路を応用した環境応答型液体操作法の開発

生物表面を模倣した微細突起の配列構造の作製に関しては、1)フォトリソグラフィにより精密に作製した流路で流路機能の原理を解明し、2)三軸走査装置により多孔配列パターンを形成した基板の鋳型転写法を用いて簡便化・最適化を図る。刺激応答性部位の形成に関しては、感光性分子・温度応答性分子などの刺激応答性分子の表面修飾(SAM法)、表面化学反応、導電性・磁性・熱伝導性をもつ金属を酸化還元析出(無電解めっき)、蒸着、スパッタリング等により導入する。静的および動的濡れ挙動は、極小接触角計や転落角測定装置を用い、環境制御下での加液・減液や滑落などの液体の動きを評価する。特に、動的濡れ挙動を流速・流路方向・流量等に関しての指標化を試み、液体分離・液体輸送といった液体操作法との相関が可能かを探求する。本年度は、フナムシの脚構造を完全に模倣した微細構造の作製と流路機能解析を試みた。フナムシの脚の流路構造は、その幅が500ミクロン程度しかなく、動的な濡れ挙動を評価することは困難である。そこで、フナムシの脚の突起構造を完全に模倣した微細構造を数cm角で作製し、動的な濡れ挙動の評価、および、その流路機能の解析を試みた。流路機能解析には、垂直に立てた基板を液面につけた際に構造中を流れる液体をモニタリングし、その流速を解析した。フナムシ模倣微細構造はフォトリソグラフィにより作製し、その配列パラメータを変えることで流路を流れる流速を変化させ、動的な濡れ挙動との相関を図った。その結果、最適な流路構造を明らかにすることができた。当初の研究で購入を検討していた環境制御セルの購入延期、および、新規構造作製にかかる費用が当初計画より後回しになったため。本年度で明らかにした微細構造の最適配列を、簡便な方法で作製するために、三軸走査装置により多孔配列パターンを形成した基板の鋳型転写法を検討する。また、鋳型転写法による複製プロセスの持久性についても検討する。
ダイズの種皮着色を支配する遺伝子の分子遺伝学的解析

本研究では、黄ダイズの種皮着色抑制機構について調査してきた。黄ダイズ種子は、I遺伝子によって種皮着色が抑制されており、実際にIからiへの劣性突然変異体(以後、変異体と省略)では種皮が再び着色される。昨年度は、I遺伝子による種皮着色抑制が色素生合成に重要な酵素であるカルコンシンターゼ(CHS)をコードする遺伝子の転写後ジーンサイレンシング(以後、PTGSと省略)によることを明らかにした。この結果の正当性をさらに裏付けるため、本年度は以下の研究を行った。すなわち、特定の植物ウイルスは感染した黄ダイズの種皮に斑紋を形成させることがあるが、興味あることにこれらの植物ウイルスはいずれもPTGSを解除するサプレッサーを作り出すことがわかっている。このことから、黄ダイズ種皮の斑紋形成は、植物ウイルス由来のサプレッサーが着色抑制にかかわるCHS遺伝子のPTGSを部分的に解除しているためではないかという仮説が考えられた。この仮説を検証するために、本研究では斑紋形成する植物ウイルスに感染した個体と非感染個体間でCHS遺伝子転写産物量の定量比較を行った。PTGSは特定の遺伝子転写産物を分解する現象であるため、PTGSの部分的な解除によって、感染個体は非感染個体に比べ、CHS遺伝子転写産物量の増加が予想される。定量比較の結果、感染個体においてCHS遺伝子転写産物量の有意な増加が見られた。以上のことから、黄ダイズの斑紋形成に関する仮説を支持する結果が得られ、黄ダイズの種皮着色抑制機構がCHS遺伝子のPTGSであることをさらに裏付けるものとなった。黄ダイズ種皮ではInhibitor遺伝子(以後、I遺伝子と省略)によって種皮着色が抑制されており、実際にIからiへの劣性突然変異体(以後、変異体と省略)では種皮が再び着色される。近年、I遺伝子による種皮着色抑制が色素生合成のキーエンザイムであるカルコンシンターゼをコードする遺伝子のジーンサイレンシング(以後、CHSサイレンシングと省略)による可能性が強く示唆されている。また、黄ダイズゲノムでは5'コード領域の欠落したCHS遺伝子(truncated CHS3と命名)とCHS遺伝子のひとつ(ICHS1と命名)がわずか680bpの距離を隔てて逆向きにクラスターを形成している(以後、クラスターと省略)。今まで変異体ではいずれもクラスター内から構造変異を生じていることが明らかになっており、I遺伝子とクラスターとの関係が示唆されている。本年度は以下の知見が得られた。1.黄ダイズ品種ミヤギシロメ、系統刈系557号(CHSサイレンシングが起きている)およびそれらの変異体(CHSサイレンシングが起きていない)の各登熟段階の種子からそれぞれ種皮RNAを抽出し、CHS遺伝子プローブを用いたノーザンブロット分析を行った。その結果、黄ダイズでは25mg以下の種子から転写産物量が減少しておりCHSサイレンシングが種子形成初期から起きていることが明らかになった。2.未解析の2つの変異体(ミヤギシロメおよび刈系584号変異体)について、クラスターの解析を行ったところ、ミヤギシロメ変異体ではクラスター内から構造変異が起きていたのに対して、刈系584号変異体は今までの変異体と異なり、クラスターはすべて残り、そのわずか32bp上流から構造変異が起きていた。したがって、クラスターの上流域にもI遺伝子発現に関与する領域の存在が示唆された。本研究では、黄ダイズの種皮着色抑制機構について調査している。2.ダイズゲノムにおいてカルコンシンターゼをコードする遺伝子(CHS)は遺伝子ファミリーを形成しており、少なくとも8つのメンバー(CHS1-CHS8)が存在する。CHSサイレンシングが解除されている変異体種皮ではどのメンバーの転写産物が存在しているか、また黄ダイズ種皮ではその転写産物量が減少しているかを定量的PCRおよびノーザンブロット分析によって調査した。その結果、変異体種皮ではCHS7およびCHS8由来の転写産物が大部分を占め、黄ダイズ種皮ではその発現量が大幅に減少していることが明らかになった。

この仮説を検証するために、本研究では斑紋形成する植物ウイルスに感染した個体と非感染個体間でCHS遺伝子転写産物量の定量比較を行った。PTGSは特定の遺伝子転写産物を分解する現象であるため、PTGSの部分的な解除によって、感染個体は非感染個体に比べ、CHS遺伝子転写産物量の増加が予想される。定量比較の結果、感染個体においてCHS遺伝子転写産物量の有意な増加が見られた。以上のことから、黄ダイズの斑紋形成に関する仮説を支持する結果が得られ、黄ダイズの種皮着色抑制機構がCHS遺伝子のPTGSであることをさらに裏付けるものとなった。
9族遷移金属錯体を触媒とする多成分一挙結法の合成化学的展開

研究は9族遷移金属錯体を触媒とした中性条件下での多成分一挙連結法に基づく炭素-炭素結合形成法の開発とその合成化学的展開を図ることを目的として企画、実施された。その結果、ロジウム錯体を触媒とした場合には、申請者らがかねてより提案している作業仮説に基づいた反応設計を行うことにより、一酸化炭素の取り込みを伴う環状骨格の組み立てに関しては、(1)ヒドロシラン、1,6-ジイン、一酸化炭素からビシクロ[3.3.0]オクテノン骨格の形成とその選択性制御およびその機構の解明とヒルステン骨格形成への応用、(2)アルキンと一酸化炭素を基質とする4,5,6員環ラクトン形成法の開発とスピロ型γ-ラクトンの双環性ケトンへの変換、(3)アルキン類と一酸化炭素を基質とする4,5,6,7員環ラクタム環形成法の開発とキノリチジン骨格形成およびアミノ酸をキラルプールとした光学活性ラクタム環形成、(4)五員環形成を伴う遠隔シリルホルミル化に成功した。また、中性条件下における三成分ハイブリッド型反応による炭素-炭素結合形成法の開発においては電子欠損性オレフィンに対するヒドロカルバモイル化、新規Mannich型カップリング法の開発、およびアリル位置換を鍵ステップとする形式的ヒドロアリル化反応の開発にも成功した。また、イリジウム錯体の化学においては、カチオン性イリジウム錯体がエノキシシランを反応剤とする向山型アルドール反応、α,β-エノン類へのMichael型付加、アリルアルコール類の直接的置換、およびプロパルギルエステル類の選択的置換反応に高活性触媒となること、およびイリジウムカチオン錯体がLewis酸としての能力も併せ持つことを見出した。本研究は9族遷移金属錯体を触媒とした中性条件下での、多成分一挙連結法の開発とその合成化学的展開を目的とした。この目的を達成させるため、本年度は1)ヒドロシランの低原子価ロジウム錯体への酸化的付加を基点とする炭素-炭素結合形成法の開発、2)イリジウム錯体を触媒とする炭素-炭素結合形成反応の探索、ならびにイリジウム錯体の特異的機能発現要因の解明に焦点を合わせて、研究を進めた。その結果、低原子価ロジウムを触媒前駆体とした、ヒドロシラン、α,β-不飽和カルボニル化合物、および極性二重結合化合物を出発基質とした、三成分カップリング反応が達成できた。本反応では、前記三成分に対して単一槽内で混合、撹拌操作を施すだけでアルドール型化合物、β-カルバモイルエステル類、およびMannich型化合物が選択的に生成することになるので、複雑な化合物の合成ブロックの簡便な組み立て手段としての用途はきわめて広い。これらの反応では、いずれもα,β-不飽和カルボニル化合物がRh-H結合へ挿入する段階が重要な鍵ステップであることが推測される。これに対して、Rh-Si結合への挿入を鍵ステップとして利用すると、先述の手法と同様に、単一槽での簡便な操作で、1,6-エンイン化合物に対する渡環的遠隔シリルホルミル化、1,6-ジイン類に対する渡環的遠隔ヒドロシリル化、アルキニルアルコールまたは、アルキニルアミンを出発基質としたラクトン環およびラクタム環骨格が形成できることを見出した。また、イリジウム(I)カチオン錯体を触媒量用いるだけで、多置換アリル型アルコールおよびプロパルギル型エステル類とエノキシシランの反応が、室温下でも容易に進行し、高効率的な炭素-炭素結合形成が達成できることも見出した。現時点では、アリル側における置換位置、および生成物のジアステレオ選択性の制御に関しては、必ずしも満足できるものではなく、次年度以降への課題となっている。本研究は9族遷移金属錯体を触媒とした中性条件下での、多成分一挙連結法の開発とその合成化学的展開を目的とする。

この目的を達成するため、本年度は1)環化シリルカルバモイル化を鍵ステップとする光学活性α-シリルメチレンラクタム骨格形成、2)ヒドロホルミル化類似の条件下におおける環状ケトン新規形成法の開発、ならびに3)低原子価ロジウム錯体の特異的機能発現要因の解明に焦点を合わせて、研究を進めた。その結果、低原子価ロジウム錯体およびDBU(1,8-diazabicyclo[5.3.0]undec-7-ene)を触媒として、ヒドロシランおよび一酸化炭素の共存下で反応させると、アルキニルアミンから一挙にα-シリルメチレンラクタム環が形成されることを見出た。現時点では、その収率は低いものの、この手法がピロリチジノン骨格、カルバペナム骨格など双環性ラクタム環の簡便な構築手段としても利用できることを明らかにした。また、天然アミノ酸から立体選択的に誘導したホモプロパルギルアルコールを出発基質として用いた場合には、アミノ酸由来の立体化学は保持したままで、γ-ラクトン骨格を経由してδ-ラクタム骨格に至る新ルートの確立に成功した。現在では、この方法を用いてプミリオトキシン251Dの基本骨格まで構築するに至っている。一方、報告者らが見出した1,6エンイン骨格の環化シリルホルミル化は温和な条件下でも容易に進行するのに対し、H_2/COを反応剤とした場合には、反応性は極端に低下するが、アルキン末端にアリール基を導入したエンインを用いると、7員環ケトンが主生成物となることを見出した。この方法は、鎖状出発基質から一挙に7員環ケトン類を構築するための新規ルートとしてきわめてユニークである。と同時に、この結果はRh-Si結合へはアルキン部位の挿入が、また、Rh-H結合へはアルケン部位の挿入が優先することも暗示しており、炭素-炭素結合形成のための反応設計においてきわめて重要なヒントを提供するものである。本研究は9族遷移金属錯体を触媒とした中性条件下での、多成分一挙連結法の開発とその合成化学的展開を目的とする。この目的を達成するため本年度は、1)1,6-ヘプタジイン誘導体を基質とするRh触媒を用いた環化シリルカルボニル化における生成物選択性制御、2)Rh触媒の存在下、α,β-不飽和カルボニル化合物、ヒドロシランからその場で調製される求核剤を利用したアリル位置換反応における位置選択性の制御、3)シリルカルボニル化生成物であるラクトン骨格の合成ブロックとしての応用、展開に焦点を合わせた。その結果、1)においては、Rh_4(CO)_<12>を触媒として、一酸化炭素加圧下で等モル量のN,N-ジイソプロピルエチルアミンを存在させると、1,6-ヘプタジイン骨格とヒドロシランから一挙にビシクロ[3.3.0]オクテン^<1,5>-3-オンが高収率かつ98%以上の選択性で得られるまでに改良できた。また、2)においては、反応基質である非対称置換したアリルエステル類のアリル末端炭素上にあらかじめトリアルキルシリル基を導入しておけば、ほぼ完全に置換位置選択性を制御することができた。位置制御支配因子としての役割を果たしたシリル基は特異的にプロトンに置換できることも併せて実証し、本方法が非対称置換アリルエステル類の置換反応における位置制御のための手法として有効であることを示した。さらに3)では、Rh触媒存在下で、ホモプロパルギル型アルコールおよびビスホモプロパルギル型アルコールから簡便な単一槽反応でのラクトン環形成が可能になった。
古代色素「貝紫」生合成酵素の高選択的臭素化反応メカニズムの解明と応用

二臭化インディゴの分子構造をもつ貝紫は,紀元前1,600年以前から使用されている希少な動物性天然染料である。本研究では,アカニシガイの鰓下腺から貝紫色素前駆体の臭素化反応を触媒するブロモペルオキシダーゼ(BPO)の精製を試みた。BPOは鰓下腺に微量しか存在していないため,均一精製には至らなかったが,膜画分に存在するBPOの活性発現に,可溶性活性化タンパク質が必要であることを明らかにした。2成分で構成されるBPOはこれまでに報告例のない新規の酵素である。近年,海洋性天然物である含ハロゲンヘテロ環有機化合物が抗菌・抗がん活性を示すことが明らかになり,含ハロゲン有機化合物が注目されている。二臭化インディゴの分子構造をもつ貝紫は,色素前駆体である臭化インドール誘導体2分子が縮合して生成するが,この色素前駆体の位置特異的臭素化反応のメカニズムは未だ明らかではなく,この反応を触媒する酵素ブロモペルオキシダーゼは巻貝に微量しか含有しないため単離されてもいない。そこで本研究では,能登産のアカニシガイRapana venosaを研究材料に本酵素の精製を試みた。研究初年度には,ブロモペルオキシダーゼ活性測定系の開発と,アカニシガイにおける同酵素活性の検索を行った。アカニシガイの鰓下腺を摩砕し,その抽出液を調整したが,既報のモノクロロジメドンを基質とする活性測定では,抽出液に臭素化活性がほとんど検出されないことが明らかになった。そこで,市販の海藻由来のブロモペルオキシダーゼを用いて,基質及び活性測定系の検討を行った。貝紫色素前駆体の母核であるインドール,構造の近いトリプトファンを基質に用いてブロモペルオキシダーゼを作用させたところ,臭素化反応が進行し,基質のスペクトルが経時的に変化した。したがって,貝紫色素前駆体に近い構造の化合物を基質とする新規活性測定系の構築に成功した。また,ブロモペルオキシダーゼによるトリプトファンを基質とする臭素化反応はこれまでほとんど報告がないことから,今後,生成物を単離精製し,臭素化部位の特定などを行う予定である。アカニシガイ10 kgから鰓下腺を取り出し,氷温下で海砂・アルミナを用いて乳鉢で摩砕した。遠心分離後,上清を回収し,これを粗酵素液とした。一般的な臭素化反応基質であるモノクロロジメドンを基質に用いて粗酵素液の臭素化活性を測定したところ,微弱な活性しか検出されなかった。そこで,1)基質及び活性測定反応系の改善,2)粗酵素液に含まれると考えられる反応阻害物質の除去,3)鰓下腺以外の内臓組織を対象としたブロモペルオキシダーゼ活性の検索の3つの方針で活性検出方法の改善を図ることとした。現在までに,貝紫色素前駆体に近い構造を持つインドール系化合物を基質とする活性測定系の構築に成功しており,これを用いてアカニシガイ内臓を対象に臭素化活性の探索を行っている。含ハロゲンヘテロ環有機化合物は抗菌・抗がん活性を示すことから,海洋性天然物由来の含ハロゲン有機化合物が注目されている。動物性色素の貝紫は二臭化インディゴの分子構造をもち,前駆体である臭化インドール誘導体2分子が縮合して生成するが,この色素前駆体の位置特異的臭素化反応のメカニズムは未だ明らかではなく,この反応を触媒する酵素ブロモペルオキシダーゼは巻貝に微量しか含有しないため単離されてもいない。2年目に当たる今年度は,初年度に引き続きトリプトファン誘導体を基質とするブロモペルオキシダーゼ活性測定系の検討と,アカニシガイにおける同酵素活性の検索を行った。アカニシガイの鰓下腺及び周辺組織を組織毎に摩砕し,その抽出液を調整した。モノクロロジメドンを基質とした場合は,どの組織の抽出液にも臭素化活性がほとんど検出されないことが明らかになった。そこで,トリプトファン及びその誘導体を基質として用いる活性測定系を開発し,抽出液の活性を測定したが,顕著な臭素化活性は検出できなかった。トリプトファンを基質に市販の海藻由来のブロモペルオキシダーゼを用いて活性測定を行ったところ,インドール環上の置換基の位置によって臭素化反応速度が異なることが明らかになった。したがって,海藻由来のブロモペルオキシダーゼの臭素化反応は,インドール環の置換基を識別していると考えられる。アカニシガイ約10 kgから鰓下腺及び周辺組織を取り出し,それぞれ組織別に氷温下で海砂・アルミナを用いて乳鉢で摩砕した。モノクロロジメドン,トリプトファン及びその誘導体を基質に粗酵素液の臭素化活性を測定したが,顕著な活性は検出されなかった。そこで,1)粗酵素液に含まれると考えられる反応阻害物質の除去,2)アフィニティークロマトグラフィー用樹脂の開発とその樹脂を用いる酵素精製の2つの方針で,活性検出方法の改善を図ることとした。反応阻害物の除去では,透析や脱塩などの方法で粗酵素液から貝紫色素の除去,色素形成を抑制するため暗所で粗酵素液を調製するなどの方法を用いると,活性回収率に改善が見られた。今後も反応阻害物質の除去を中心に酵素の調製を進めたい。

アフィニティー樹脂の開発では,アフィニティーリガンドに基質アナログであるトリプトファン誘導体を用い,NHS-activated Sepharose 4B樹脂(GEヘルスケア製)と反応させることでリガンドを固定化したオリジナル樹脂を作製した。含ハロゲンヘテロ環有機化合物は抗菌・抗がん活性を示すことから,海洋性天然物由来の含ハロゲン有機化合物が注目されている。動物性色素の貝紫は二臭化インディゴの分子構造をもち,前駆体である臭化インドール誘導体2分子が縮合して生成するが,この色素前駆体の位置特異的臭素化反応のメカニズムは未だ明らかではなく,この反応を触媒する酵素ブロモペルオキシダーゼ(BPO)は巻貝に微量しか含有しないため単離されてもいない。そこで本研究では,能登産のアカニシRapana venosaを研究材料に本酵素の単離精製を試みた。これまでにアカニシ内蔵抽出液から同酵素活性の検索を行ってきたが,微弱な活性しか検出できていなかった。これは,地中海産ツロツブリMurex trunculusから部分精製されたBPO活性が鰓下腺抽出液の膜画分に存在すると報告されていることから,アカニシ内蔵抽出物を超遠心分離して得た沈殿(膜画分)を対象に酵素活性の検索を行ったことが原因であった。内蔵の破砕条件を検討することで,初めて高いBPO活性を有する抽出液の調製に成功し,膜画分だけでは微弱な酵素活性しか示さないことが明らかになった。超遠心分離後の可溶性画分には全くBPO活性は観察されなかったが,懸濁した膜画分に可溶性画分を添加することでBPO活性が回復することから,可溶性画分が酵素活性に必須であることが明らかになった。また,沸騰水浴中で加熱した可溶性画分では活性が回復しないことから,可溶性の活性化成分はタンパク質であることが示唆された。この可溶性活性化タンパク質を各種クロマトグラフィーにより部分精製することができた。可溶性活性化タンパク質を加えた膜画分懸濁液を用いて,モノクロロジメドンのハロゲン化反応を検討したところ,アカニシの酵素は臭素化反応を触媒したが,塩素化反応は触媒しないことが明らかになり,本酵素がBPOであることを初めて示すことに成功した。二臭化インディゴの分子構造をもつ貝紫は,紀元前1,600年以前から使用されている希少な動物性天然染料である。本研究では,アカニシガイの鰓下腺から貝紫色素前駆体の臭素化反応を触媒するブロモペルオキシダーゼ(BPO)の精製を試みた。BPOは鰓下腺に微量しか存在していないため,均一精製には至らなかったが,膜画分に存在するBPOの活性発現に,可溶性活性化タンパク質が必要であることを明らかにした。2成分で構成されるBPOはこれまでに報告例のない新規の酵素である。これまでの研究から,鰓下腺から得られる目的のブロモペルオキシダーゼは非常に微量だと考えられる。これを効率的に精製するために,アフィニティークロマトグラフィー法の使用を試みる。アフィニティーリガンドには基質アナログであるインドール誘導体,またはトリプトファン誘導体を用い,CNBrやエポキシで活性化したスペーサーを持つ樹脂と反応させることでリガンドを固定化したオリジナル樹脂を作製する。これら自作アフィニティー樹脂によるクロマトグラフィーと,市販樹脂による各種クロマトグラフィー,または電気泳動法などを駆使して酵素精製条件の検討を行う。さらに,ブロモペルオキシダーゼによるトリプトファンの臭素化生成物をクロマトグラフィーで単離・精製し,各種機器分析法を用いて臭素化部位の検討を行う予定である。
摩擦の物性理論的研究

摩擦は、物理学上、非常に興味ある問題であり、古くから多くの研究がなされているが、その基本的な問題についてまだまだ明らかでない点が多い。さらに最近の技術の進歩により、新しい状況下での摩擦が研究され始めている。これらの基本的な問題や、新しい状況下での問題を理論的に明らかにすることを目的として、我々は摩擦の研究を行ってきた。そしてこれまでに定常状態の摩擦力の一般的な計算方法を明らかにし、それにより清浄表面の場合の摩擦を原子を古典的な粒子と見なすモデルの1次元版に基づいて研究し、その特異な振る舞いを明らかにした。本研究ではこれらの成果を基に清浄表面、及び乱れがあるときの摩擦のモデルを調べ、摩擦の3法則の成り立つ原因、適用範囲、範囲外での摩擦の振る舞いを明らかにすることを目的とした。原子的なスケールで乱れのない清浄表面の場合、上下の結晶の格子間隔の比が無理数の場合には、最大静摩擦力が0の状態があり得ることがわかっているが、そのような状態が乱れのある場合にも安定に存在しうるのか否かは不明であった。我々は、変分法、数値計算及び有限サイズスケーリング法を組み合わせた議論により、乱れがある場合には常に最大静摩擦力は有限になることを示した。通常の摩擦の問題では、その表面は原子的なスケールから見れば非常に乱れて凸凹しており、清浄表面とはほど遠い。この場合に、摩擦を起こすのは接触している2つの物質の凸同士の凝着と変形である。この凸の部分に注目し、乱れのある場合摩擦の有効モデルを構成した。そりてこのモデルに基づいても最大静摩擦力は常に有限になることがわかった。このモデルのダイナミクスおよび、3次元の清浄表面の摩擦のモデルの数値的研究は現在進行中である。
食品機能研究を革新する酵素活性一斉分析技術の開発

食や栄養分野において、代謝制御の中心を担う酵素の生体内での活性を広範に把握することは重要と言える。しかしながら酵素活性測定の多くは手作業であるため複数酵素を分析する際には相当な時間と労力を要する。そこで申請者は生化学自動分析装置による酵素活性の一斉分析系の構築を目指した研究を行い、ラット肝臓を用いて16種類の栄養代謝関連酵素を自動で迅速に測定可能であることを示した。また、DNAマイクロアレイ解析を行い、遺伝子発現と酵素活性との応答の違いについても示した。「研究の目的」のとおりに、生化学自動分析装置を用いて栄養代謝関連酵素を自動測定可能であることを示し、一部は従来手法により再現性を確認した。分子栄養学16種類全ての酵素について従来手法によるバリデーションを行い再現性を確認する。その後、新たに動物実験を行い各種栄養条件による応答などが、従来法と同様に認められるかを確認する。さらに、遺伝子発現解析など生体分子の網羅的解析を行い酵素活性データと併せて統合的な解析を行う。
地下鉄軌通の防振性評価と最適設計手法の構築に関する研究

地下鉄軌道の防振対策を目的として,以下の数値解析手法を構築し,解析例を通してその有効性を検証した.1.平成13年度三次元達成解析手法の構成道床・トンネル・地盤を三次元場としてモデル化した.その際にトンネル奥行き方向に波動場をFourier変換し,問題を準二次元問題に帰着して解く方法を採った.また,PCクラスタを構築し,並列計算を実施した.解析と測定データおよび二次元モデルとの比較を通し,妥当性を検証した結果,三次元モデルを用いることで,地盤振動で重要となる100Hz以下の周波数域での振動特性が適切に再現し得ることがわかった.2.平成14年度軌道系未知物性値の同定手法の構築軌道パッド・防振パッドの減衰係数およびバラスト道床のせん断弾性係数を未知物性値とし,測定された加速度スペクトルの再現性に基づいた同定手法を構成した.同定の過程では,多数の順解析が必要であり,多大な計算時間を要する.そこで,未知物性値を入力,まくらぎ/レール,待避所/レールのスペクトル比を出力としたニューラルネットワークを構築し,これを順解析の代用とした.同定手法には遺伝的アルゴリズム(GA)を用いた.数値モデル・実測データを対象に,本同定手法の有効性を検証し,その妥当性を確認した.3.平成15年度軌道構造の最適設計手法の構築最適設計における目的関数として,防振効果,建設費用,レール寿命の3つを設定した.一方,設計変数には,これまでの研究で防振効果の認められた(1)トンネル覆工厚,(2)まくらぎ重量,(3)防振パッドのバネ定数の3つを選定した.なお,本問題は各目的関数間にトレードオフの関係が存在する,いわゆるパレート問題となる.パレート解の探索には多目的GAを用いた.具体例への適用を通し,構築した手法の妥当性を確認した.また,パレート面の分布特性や,幾つかの代表的なパレート解の設計条件について調べた.地下鉄軌道の防振対策を目的として,以下の数値解析手法を構築し,解析例を通してその有効性を検証した.1.平成13年度三次元達成解析手法の構成道床・トンネル・地盤を三次元場としてモデル化した.その際にトンネル奥行き方向に波動場をFourier変換し,問題を準二次元問題に帰着して解く方法を採った.また,PCクラスタを構築し,並列計算を実施した.解析と測定データおよび二次元モデルとの比較を通し,妥当性を検証した結果,三次元モデルを用いることで,地盤振動で重要となる100Hz以下の周波数域での振動特性が適切に再現し得ることがわかった.2.平成14年度軌道系未知物性値の同定手法の構築軌道パッド・防振パッドの減衰係数およびバラスト道床のせん断弾性係数を未知物性値とし,測定された加速度スペクトルの再現性に基づいた同定手法を構成した.同定の過程では,多数の順解析が必要であり,多大な計算時間を要する.そこで,未知物性値を入力,まくらぎ/レール,待避所/レールのスペクトル比を出力としたニューラルネットワークを構築し,これを順解析の代用とした.同定手法には遺伝的アルゴリズム(GA)を用いた.数値モデル・実測データを対象に,本同定手法の有効性を検証し,その妥当性を確認した.3.平成15年度軌道構造の最適設計手法の構築最適設計における目的関数として,防振効果,建設費用,レール寿命の3つを設定した.一方,設計変数には,これまでの研究で防振効果の認められた(1)トンネル覆工厚,(2)まくらぎ重量,(3)防振パッドのバネ定数の3つを選定した.なお,本問題は各目的関数間にトレードオフの関係が存在する,いわゆるパレート問題となる.パレート解の探索には多目的GAを用いた.具体例への適用を通し,構築した手法の妥当性を確認した.また,パレート面の分布特性や,幾つかの代表的なパレート解の設計条件について調べた.地下鉄軌道系の三次元振動解析手法を構成し,さらに連成振動解析を実施してモデル化の妥当性や振動特性など,基本的事項について検討した.1.三次元振動解析手法の構成走行車輪・レール・まくらぎ・道床・トンネル・地盤から成る連成振動モデルを構築した.車輪・レール・まくらぎから成る部分系についてはこれまで構築してきた数値モデルを用い,道床以下については新たに三次元場としてモデル化を行った.その際にトンネル奥行き方向に波動場をFourier変換し,離散化波数法を適用し,問題を像空間における準二次元問題に帰着して解く方法を採った.また,解析手法には有限要素・境界要素結合法を用い,その際に必要となるGreen関数を,Lameポテンシャルに基づき誘導した.以上に構成した三次元モデルを用い,道床上面に単位パルス力を入力した場合の応答解析を行い,数値的Green関数を作成した.これと車輪・レール・まくらぎから成る部分系とを結合することで,車輪・軌道・地盤系全体の三次元応答解析手法を構成した.2.連成振動解析による検討計算機環境としてPCクラスタを構築し,以上に構成した手法で連成振動解析を実施した.本解析と測定データおよび二次元モデルによる解析結果との比較を通し,モデル化の妥当性を検証した結果,三次元モデルを用いることで,地盤振動で重要となる100Hz以下の周波数域での振動特性が適切に再現し得ることがわかった.また,軌道に近い待避所より,むしろトンネル上部付近において100Hz以下の振動レベルが高くなる傾向にあり,地盤振動の評価には,トンネル断面の振動特性を適切に再現し得る数値モデルの構成が非常に重要となることが,本研究により明らかとなった.

昨年度に構築した三次元地下鉄軌道振動解析手法を用い,測定された振動応答を加速度レベルで再現し得る,各種未知物性値の同定手法を構成した.具体的な未知物性値として,軌道パッド・防振パッドの減衰係数およびバラスト道床のせん断弾性係数を対象とした.これらの物性値を反映し得る動特性として,レール・まくらぎ・待避所において測定された加速度スペクトルを採用し,それらの再現性に基づいて未知量同定を実施した.未知量の同定過程においては,物性値の現設定値の下での軌道振動応答を,上述の三次元解析手法を用いて実行する必要がある.しかし,同定の過程では,非常に多くの未知物性値の組に対する順解析が必要であり,多大な計算時間を要することとなるので,これは現実的でない.そこで,未知物性値を入力,レール/まくらぎ,レール/待避所のスペクトル比を出力としたニューラルネットワーク(NN)を構築し,これを上述の順解析の代用とした.なお,同定に用いるスペクトル比には,その大きさに10^5程の開きがある.そこで,これらをオーダーによらず一定の相対精度で再現し得るNNを構成した.同定手法としては遺伝的アルゴリズム(GA)を用いた.GAによる場合,同定過程で導関数の評価が不要となるため,NNに対して導関数レベルでの再現精度を要求する必要が無くなる.まず,数値モデルによる順解析で得たデータを対象に,本同定手法の有効性を検証し,その妥当性を確認した.次に,実測データに対して同定を行ない,得られた未知物性値の下で行なった順解析による加速度応答の再現性について検討した.その結果,レールの加速度応答や,トンネル部における100Hz以下の主要な振動応答などが概ね良好に再現でき,本同定手法の妥当性が確認された.平成13年度に構築した三次元地下鉄振動解析手法に基づき,地下鉄軌道構造の最適設計手法を構成した.最適設計における目的関数として,防振効果,建設費用,レール寿命の3つを設定した.防振効果は地下鉄トンネル天井部の鉛直方向振動加速度レベル(dB)により評価した.建設費用は軌道方向単位長さ当りの建設に要する費用(円/m)により定義した.またレール寿命は,レール底部に初期亀裂を設定し,絶対最大曲げモーメントに基づき応力進展解析を行い,通過トン数により評価した.一方,設計変数には,これまでの研究より得られた知見に基づき,防振効果の認められた(1)トンネル覆工厚,(2)まくらぎ重量,(3)防振パッドのバネ定数の3つを選定した.最適設計は遺伝的アルゴリズム(GA)に基づき構成した.なお,例えばトンネル覆工厚を増すと防振性能を向上させることができるが,一方では建設費用の増大を伴う結果となる.したがって,各目的関数間にトレードオフの関係が存在する.このようないわゆるパレート最適解は目的関数空間内に埋め込まれた曲面により与えられる.この曲面の探索にはGAが適しており,そのため本研究ではGA(多目的GA)により最適化手法を構築した.加速度振動レベルは上述の三次元振動解析に基づき評価する.ただし,GAでは上記3つの設計変数の様々な値の組み合わせ(個体)毎に振動解析を実施する必要がある.しかし,1ケースの振動解析の実行には数日を要する.したがってこの振動解析を極めて多数の個体に対して逐次実行するのは事実上不可能である.
防災教育における記憶継承は兵庫県下の子どもたちに何を与えてきたか

兵庫県下の防災教育は、子どもたちに何をもたらしてきただろうか?災害の記憶を「継承」することの本質は何なのだろうか?本研究は、阪神・淡路大震災被災地域の学校で続けられてきた防災教育における〈記憶継承〉の取り組みに着目し、過去の災害の記憶に触れてゆくことが児童生徒にどのような発達を促すのかを、現象学的分析により明らかにする。とくに外傷的な記憶を聞いて受け止めること自体の外傷性に注目し、そうした受け止め体験が児童生徒の感受性の発達に及ぼす影響を、小学校・高校の防災教育に参加しつつ検討する。