hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
カオス・フラクタルに基づく魚類行動解析を用いた定置網のクラゲ被害防止技術の開発

クラゲ被害を防止する定置網システムの開発を目指してシステム工学と水産学を融合させた総合的な研究を展開した.クラゲが抜けて魚は入網する漁網の最適なメッシュサイズを決定するために,魚の複雑な適応行動にカオス・フラクタル理論を適用した.様々なメッシュサイズを持つ定置網に対する魚行動解析を実施し,複雑な魚行動を分析するための画像処理システムとカオス・フラクタル指標の開発に成功した.さらに,魚行動モデルをコンピュータシミュレーションすることで最適な漁網を決定する手法を確立した.クラゲ被害を防止する定置網システムの開発を目指してシステム工学と水産学を融合させた総合的な研究を展開した.クラゲが抜けて魚は入網する漁網の最適なメッシュサイズを決定するために,魚の複雑な適応行動にカオス・フラクタル理論を適用した.様々なメッシュサイズを持つ定置網に対する魚行動解析を実施し,複雑な魚行動を分析するための画像処理システムとカオス・フラクタル指標の開発に成功した.さらに,魚行動モデルをコンピュータシミュレーションすることで最適な漁網を決定する手法を確立した.本研究の目的は,カオス・フラクタル理論を用いてエッジ領域における魚類の複雑な適応行動を分析して魚行動モデルを構築し,定置網漁におけるクラゲ被害防止のためにクラゲと魚を分離する定置網漁法に応用させ,漁網に関するクラゲと魚の行動についてシステム工学と水産学を融合させた総合的な技術として完成させることにある.この目的に沿った平成22年度の研究計画に対する実績を以下に示す.1.魚遊泳画像から行動解析するシステムを用いて環境刺激を受けた魚の行動軌跡の抽出に成功しているが,環境ノイズを低減する処理を加えて実際的な環境における魚行動を計測できる画像解析手法を確立することができた.2.カオス・フラクタル理論により時系列データを分析する手法を開発し,これを用いて魚の遊泳行動が有するゆらぎやリアプノフ指数等のカオス量,自己アフィン指数等のフラクタル量を抽出することができ,魚の漁網壁認識行動を解析することができた.具体的には,クラゲは漁網のメッシュサイズが大きいと定置網から抜けるが魚は流れの中で自立行動を取ることができることから,魚はメッシュサイズがどの位の大きさで壁と認識して入網するかを実験で調べた.個体数を1匹として5cm,10cm,15cmサイズを用いて徳島県水産研究所に設置されている水槽で実験し,カオス・フラクタル理論による定量分析で15cm以下のメッシュで魚は漁網を壁と同様に認識して行動をとることがわかった.3.得られた研究成果を電子情報通信学会,日本水産学会,IEEE発表するとともに,本研究を進展させるのに有益な学術情報を収集することができた.以上により,研究計画による「フェーズ1:漁網のメッシュサイズと魚の漁網壁認識行動との関連についてカオス・フラクタル理論を用いて解析」することが達成された.本研究の目的は,カオス・フラクタル理論を用いてエッジ領域における魚類の複雑な適応行動を分析して魚行動モデルを構築し,定置網漁におけるクラゲ被害を防止するために魚とクラゲを分離する定置網漁法に応用させ,漁網に関するクラゲと魚の行動についてシステム工学と水産学を融合させた技術として確立することにある.この目的に沿った平成23年度の研究計画に対する実績を以下に示す.1.前年度はアジを試験魚とし1個体とした場合の行動解析であったが,本年度はアジ50匹を供試魚とした魚の群れが,定置網の道網部に設置するクラゲ防止システムの目合(漁網メッシュ幅)に対してどの様な行動をとるかを水槽実験し,統計解析により分析した.2.アジ50匹による魚群行動の水槽実験より取得した魚群サイズと魚群の空間的運動の時系列分析により,定置網に用いるメッシュ幅は体長の2倍程度以下であるなら「壁に対するのと同じ群れ行動:漁網を抜けることなく並進する」ことが判明した.3.魚行動のモデリングに関しては個体数が「1」の場合に,精度の高い行動シミュレーションが可能であることを水槽実験とコンピュータシミュレーションのデータをカオス・フラクタル解析することで比較し,明らかにした.具体的には,様々な形状の水槽で試験魚を遊泳させた場合に,そのエッジ領域の環境刺激に応じた壁並進性とコーナー脱出アルゴリズムに魚の泳速について主方向をガウス分布,泳速ノルムをアーラン分布でモデル化することで実現することができた.以上により,研究計画の「フェーズ2 :様々なメッシュサイズの漁網に対する魚の群行動についてシステム工学的アプローチを用いてモデリングを実施」が達成できた本研究の目的は,カオス・フラクタル理論を用いて魚の複雑な適応行動を分析して魚行動モデルを構築し,定置網漁におけるクラゲ被害を防止するために魚とクラゲを分離する定置網漁法に応用させ,漁網に関する魚行動についてシステム工学と水産学を融合させた技術として確立することにある.この目的に沿った平成24年度の研究計画に対する実績を以下に示す.1.前年度は漁網に対する魚群行動の統計解析であったが,本年度は魚群行動のカオス・フラクタル解析により定置網の道網部に設置するクラゲ防止システムの漁網メッシュ幅に対してどの様な行動をとるかを分析するため,3,6,12,24匹と魚群サイズを変えて水槽実験を実施した.2.水槽実験より取得した魚群行動の泳速に関する時系列データと遊泳軌跡の幾何データのカオス・フラクタル解析により,定置網に用いるメッシュ幅は体長の2倍以下で「壁に対するのと同じ魚群行動:漁網を抜けることなく並進する」ことを数値的に明らかにした.

3.魚行動のモデリングに関して,魚群行動を計算機シミュレーションが可能であることを水槽実験とコンピュータシミュレーションのデータをカオス・フラクタル解析することで比較して明らかにした.具体的には,魚群の遊泳水域におけるエッジ領域(:漁網の近傍)の誘引・忌避的刺激に応じた行動フィールドのポテンシャルを定義することで漁網に対する魚群行動をモデルを実現し,数値実験を実際の水槽実験と比較することで,漁網に対する魚群行動の定性的な見積もりができることが判明した.以上により,研究計画の「フェーズ3:魚の漁網壁認識行動とその群行動のシステム工学的考察を基にクラゲは抜けるが魚は抜けない最適なメッシュサイズの決定法を確立」は達成できたが,魚群サイズの違いによる漁網に対する魚行動パターンの詳細な分析と実際の定置網でにおける効果検証については今後の課題となった.・魚群行動のカオス・フラクタル解析が群れ構造の動的画像解析ソフトの開発の遅延により実施できていない,・実験資料数Nが不足しており,統計的議論ができない.・魚群の行動が単体よりも悪く(あまり動かない),漁網に対する刺激・行動モデルの指標が確定できない.24年度が最終年度であるため、記入しない。先の項目で遅延していることを補い,本研究の目的を達成するために今後取り組む研究計画を以下に示す.1.魚群中の各個体を画像から動的に分離してラベリングできるソフトウエアを開発中であるが,これを完成させて魚群のカオス・フラクタル解析を実施する.2.徳島県水産研究所との連携を密にして実験回数を増やして統計学的議論のできるNを達成するとともに,水流刺激などを考慮した現実に近い環境刺激を魚群に与えることで水産学的な議論ができる実験を実施する.3.上記の結果を用いてより精密な魚行動モデルを構築し,クラゲ抜き漁網の最適メッシュ幅を決定してクラゲ被害防止システムの設計指針を確立する.24年度が最終年度であるため、記入しない。
四肢の運動ニューロン特異的神経回路形成機構

我々はこれまでに、Eph受容体型チロシンキナーゼEphA3、EphA4がニワトリ胚運動ニューロンのサブタイプ特異的に、また発生過程に一過性に発現し、Ephファミリーのリガンドephrin-A2、ephrin-A5によりその軸索成長が阻害されることを見出し、これらのEph関連分子の生体内での機能を解析するため、機能阻害抗体を開発した。これらの機能阻害活性を持つ抗EphA4抗体と抗ephrin-A2抗体のエピトープを決定するために、それぞれのcDNAを用い、PCRにより部分cDNAをクローニングし、293細胞に発現させ細胞の免疫染色と培養上清のイムノブロットで解析した。その結果、抗EphA4抗体はシステインリッチ部分のほぼ中央、抗ephrin-A2抗体B3はN末端近くの約40アミノ酸にエピトープが存在することが明らかになり、さらに領域を小さくして解析中である。さらに、阻害抗体の作用を解析する基礎として腰部運動ニューロンと後肢筋における受容体EphA3とEphA4、リガンドephrin-A2とephrin-A5の発現分布を免疫染色により詳細に解析した。運動ニューロンには全体にEphA4が先に発現され、EphA3は極一部の運動ニューロンに発現される。運動ニューロンにはまたリガンドephrin-A2とephrin-A5のmRNAの発現が観察されていたが、蛋白レベルでも弱いながら発現が観察された。一部の筋の筋周膜と神経線維には受容体EphA3とEphA4、リガンドephrin-A2とephrin-A5共に発現されていた。
糖鎖関連分子を標的にした生活習慣病予防マーカーの開発

糖鎖はタンパク質の翻訳後修飾に関わる重要な生体分子の1つで、がん化、分化、増殖などにより変化する。本研究では、糖鎖解析技術を用いて生活習慣病予防マーカー開発のための基盤研究を行った。人間ドックの受診者から脂肪肝、耐糖能異常などで将来的な生活習慣病発症の危険群を絞り込み、その中から疾患に進展する確率が高い群と低い群を鑑別できる糖鎖マーカーを開発した。がんを中心とした多くの生活習慣病の原因と考えられる慢性炎症の指標として、ガラクトース欠損IgGを定量できるレクチンー抗体ELISAキットの開発に成功した。また、糖鎖改変マウスを用いて、糖鎖の生活習慣病における病態生理学的な意味を明らかにした。糖鎖はタンパク質の翻訳後修飾を担う重要な生体分子の1つで、がんや炎症と深く関わりをもつ。種々の疾患に伴う糖鎖の変化は、疾患マーカーとして臨床応用されている。特にがんにおいては、糖鎖の変化は疾患の発症初期に見られることから、疾患の予防マーカーや予測マーカーとしての応用が期待される。本研究では、糖鎖解析技術を用いて、新しい生活習慣病の予防マーカー開発の基礎的検討と血清を用いた大規模studyを行なう。本年度は、いくつかの糖鎖関連分子の測定法の開発、多検体処理可能なものへの改良、および大規模studyのための血清のプールおよび、データベースの作成を行なった。具体的には、これまで研究代表者が検討してきた糖鎖関連分子の中で、すでにキット化されたもの(α2-6ST)、キット化開発中のもの(α-HSGP)、他の方法で解析中のIgGの糖鎖解析、GnT-Vの活性測定など検討した。α2-6STは脂肪肝とNASHで大きな差は認めなかったが、年齢は地域によって差を認め、現在その意義について解析中である。α-HS GPについては、血中における様々な分子動態の解析を行ない、IgGの糖鎖解析とGnT-Vについては、多検体処理できるELISA系の構築を目指した。またアムス城見会の山田医院長のご協力により、数千名の人間ドック受診者の中から、肝機能、耐糖能異常などを認める数百名の患者血清を保管し、データベース化した。共同研究者との協力により、うっ病で香川大学医学部附属病院に入院中した患者の薬物治療前後での血清サンプルを収集し、うつ病の重症度の尺度であるHAM-Dの検査を行なった。また、動脈硬化が客観的に評価できる頸部ドップラーの人間ドックへの導入を行なった。その他、糖鎖の生物学的機能を探る基礎的な研究も行なった。昨年度に続き本年も、いくつかの糖鎖関連分子の測定法の開発、多検体処理可能なものへの改良、および大規模studyのための血清のプール(1500例)および、データベースの作成を行なった。具体的には、従来のHPLCを用いたIgGの糖鎖解析から、多検体処理可能なレクチン-ELISA系を開発した。GnT-VのELISA系の構築も試みたが、培養細胞の上清のみで血清で測定可能な感度が得られなかった。昨年度開発したELISAを用いて、健診者血清のα-HSGPを測定すると、頸動脈エコーの石灰化と逆相関が認められた。昨年度プールした1500症例の中で、いくつかの糖鎖関連分子の異常値を示した約300症例をfollow-upし、以前の1500症例とは別に、新たな健常者300例もfollow-upした。香川大学医学部附属病院に入院中したうつ患者の症例は、informed consentの関係で10例程度しか血清が得られなかったが、それらの糖鎖解析を行っている。また、これらの臨床的な解析だけでなく、糖鎖の生物学的機能を探る基礎的な研究も行ない、新たな検査法開発の基盤データとした。種々め疾患に伴う糖鎖の変化は、疾患マーカーとして臨床応用されている。

昨年度に続き本年も、いくつかの糖鎖関連分子の測定法の開発、多検体処理可能なものへの改良、および大規模studyのための血清のプール(1500例)および、データベースの作成を行なった。これらの症例と2010年度から新たに集めた一般検査データで異常のない300症例の血清マーカーを測定した。一昨年度に開発したELISAを用いて、健診者血清のα-HS GPを測定すると、頸動脈エコーの石灰化と逆相関が認められた。本年度は、さらに症例を増やして検討した。香川大学医学部附属病院に入院中したうつ患者10例の検討では、明らかな糖鎖マーカーの異常は現在までのところ見つかっていない。IgGの糖鎖解析法としてレクチンー抗体ELISA法を開発したが、必ずしもHPLCの結果と相関しなかった。そこで、IgGを精製し、2種類のレクチンとの組み合わせによる変法を作ったところ、HPLCのデータと相関し、炎症性疾患の代表的なものであるクロー病において、疾患活動性の良いマーカーであることがわかった(IBD Journal in press)。本研究のテーマの1つであるGnT-VのELISAキットは、感度の問題で作成できなかったが、GnT-Vトランスジェニックマウスの解析から、皮膚の創傷治癒促進、高脂肪食負荷による脂肪性肝炎の発症抑制が認められた。今後、これらの疾患と血中GnT-V活性の関係をヒトの症例でも検討し、何らかの疾患マーカーになるかどうか検討して行きたい。糖鎖はタンパク質の翻訳後修飾を担う重要な生体分子の1つで、がんや炎症と深く関わりをもつ。種々の疾患に伴う糖鎖の変化は、疾患マーカーとして臨床応用されている。特にがんにおいては、糖鎖の変化は疾患の発症初期に見られることから、疾患の予防マーカーや予測マーカーとしての応用が期待される。本研究では、糖鎖解析技術を用いて、新しい生活習慣病の予防マーカー開発の基礎的検討と血清を用いた大規模studyを行なう。2010年度から開始した1800人の健診受診者の検査情報と血清の保存を続けた(データベース化)。脂肪肝の健診受診者に関して詳細な解析を行った結果、Mac2-BPはNASH(Non-alcholic steatohepatitis)を鑑別できる単一のバイオマーカーであることがわかった。また従来から腫瘍マーカーをとして取り上げて来たFucosylated haptoglobinは、NASH患者の病理学的な異常(balooning hepatocyte)と関連していることが明らかになった。2013年度は、以上の2つの発見を論文化した。ガラクトース欠損IgGに関して、当大学で大規模な研究を行っている双子研究の血清でpreliminaryな検討を行ったところ、ガラクトース欠損IgG量の変化に遺伝的な要因は少なく、環境因子が大きいことがわかり、そのデータを論文化した。糖転移酵素GnT-Vの遺伝子改変マウスを用いて、GnT-Vの病態生理学的意義を明らかにし、様々な生活習慣病に関与する可能性を示した(論文、投稿準備中)。肝臓から分泌される糖タンパクの1つであるFetuin(alpha 2HS-glycoprotein)は、肝臓の綿維化に深く関与するTGF-betaの作用を阻害し、健診患者の血清Fetuin量は頸部動脈硬化の進行度と逆相関することを見いだし、論文として公表できた。
非病原力遺伝子変異を指標としたいもち病抵抗性遺伝子持続性予測システムの確立

AVR遺伝子のうち、欠失型変異を起こすAVR-Pita、AVR-Pia、AVR-Pii、AVR-Pikと非欠失型変異を起こすAVR-Piztの変異様式および、国内外より分離した新規いもち病菌菌株における分布を比較した。これにより、AVR-Piztは周辺のゲノム構造の安定性(寄生性の異なるいもち病菌を比較した場合少なくとも数百kbが保存されている)、変異様式(変異菌の分離頻度は低いが、すべてトランスポゾン挿入変異かアミノ酸置換による)から比較的変異の起こりにくい遺伝子であることを支持するデータが得られた。AVR-Pizt遺伝子の変異に関して、以下のような実験を行った。日本国内で採集されたAVR-Pizt変異菌10菌株を供試し、変異様式を解析した。このうち、MAFFジーンバンクより取り寄せた6菌株については、登録されているイネ菌約600菌株からレース番号に基づき選抜したものである。これらに加えて、宮城大学圃場で分離されたササニシキ(Pia)病斑上の菌(非変異菌)とこれが変異してとりで1号(Piz-t)に感染した菌(変異菌)を合わせて供試した。上記変異菌全体としての変異の種類は、トランスポゾン挿入(プロモーター領域、コード領域)、塩基置換(終止コドンへの変異、アミノ酸変異)のいずれかに類別され、何らかのかたちで元の遺伝子配列が保持されていた。転写の有無を調査したところ、ほとんどの変異菌株において転写されていることが明らかとなった。これらのうち、宮城大学で分離された菌株は、AVR-Piztプロモーターへのトランスポゾン挿入変異によってとりで1号に対する病原性を獲得したことが判明した。非変異菌・変異菌におけるAVR-Piztの発現量を比較したところ、接種後ともにAVR-Pizt遺伝子は発現していたが、変異菌においてはプロモーターへのトランスポゾン挿入によって、発現量が有為に低下していたことが明らかとなった。一方、イネ菌以外の菌株が持つAVR-Piztホモログについては、イネ菌に導入してとりで1号に接種することで、すべて抵抗性反応を誘導することを確認した。Multiple translocationを起こしたAVR-Pia, AVR-Pita等の主な変異機構が遺伝子の全欠失であることと比較すると、AVR-Pizt遺伝子はいもち病菌集団において、機能的にも遺伝子配列の有無においても高く保存されており、本遺伝子が安定な遺伝子であるという仮説が支持されたと言える。2014年度はAVR遺伝子分布および変異の地理的相関および菌株間の遺伝子交換の可能性について検討した。(1)AVR遺伝子とR遺伝子の地理的相関の検討フィリピン、ベトナム、イタリアより分離したイネいもち病菌およびメヒシバいもち病菌について、AVR遺伝子の保有状況を調査した。これまでに調査した日本および外国産の菌株におけるAVR遺伝子の分布の特徴と顕著に異なる分布を示す集団は見出されなかった。同一採集地における異なる菌株間の遺伝子交換の痕跡等も検出されなかった。(2)異なる菌株間の遺伝子交換の可能性異なる菌株間での遺伝子交換を再現するために、まず菌糸融合が起こる可能性について検討した。異なる2菌株の分生胞子を混合し、PDA液体培地、寒天培地において共存培養を試みたが、胞子細胞からのconidial anastomosis tubeによる細胞融合は観察されなかったが、いくつかの菌株の組み合わせにおいて発芽管細胞の融合が認められた。また、菌糸片の対峙培養により、伸長した菌糸先端で細胞融合が確認された。「LTH monogenic linesを用いた各種AVR遺伝子のR品種上での変異菌検出頻度の比較」については、現在、ササニシキBL(同質遺伝子系統)とTALENによる遺伝子導入イネ菌の組み合わせで実験を開始している。植物病理学増殖したLTH monogenic linesの種子を用い、AVR-Pizt保有菌と非保有菌に対する感受性を確認するための予備実験を行った。LTH(感受性)およびLTH-Pizt(Piz-t保有)のいもち病菌に対する感受性が、それぞれ、日本産判別品種新2号(感受性)およびとりで1号(Piz-t保有)とは異なっており、日本産イネ菌を用いた病原性検定には適当ではない可能性があることが判明した。(2) AVR遺伝子とR遺伝子の地理的相関の検討現在のところ、イタリア産のイネ菌・メヒシバ菌を用いて非病原力遺伝子の分布調査を行っているが、採集地におけるイネ品種が保有する抵抗性遺伝子と病原菌のもつ非病原力遺伝子の分布に関して予想に反する相関は見出されていない。東南アジア産いもち病菌の輸入が予定より遅れているため、実験がやや遅れている。AVR遺伝子変異の再現について、いもち病菌分生胞子の共存培養実験と形質転換いもち病菌を用いた変異選抜実験を、予定通り遂行する。AVR遺伝子のR品種上での変異菌検出頻度の比較については、コシヒカリまたはヒノヒカリnear isogenc linesを入手し、実験を行おうとしている。
正常プリオン蛋白から異常型プリオン蛋白への構造変換抑制因子の検索

PrPmRNAの発現量と異常プリオン蛋白(PrPSc)の蓄積量との間には必ずしも相関はみられない。そこで、そうした部位を検索することによって、異常プリオン蛋白への変換を制御する因子を見い出すヒントが得られるのではと考え、その一つである腎臓について検討した。プリオン感染腎臓では、PrPScが蓄積している証拠は見出せなかったが、組織学的に糸球体にIgA、IgG、C3、C1q、fibronectinの沈着がみられ、免疫的な関与が想定された。cDNA subractionでは、NADH oxidase(NOX)やNADH dehydrogenase、cytochrome CなどのROSに関連した遺伝子の発現元進が認められ、尿中の不可溶性イムノグロブリンの存在との関連が考えられる。NOXの一種であるtNOXにはプリオンと同じ特性があることや、緑茶の成分のカテキンに、このtNOXの効果を押げらえる。事実、細胞レベルにおいて、抑制効果を確認しており、現在、in vivoでの効果判定を行なっている。また、osteopontinの高発現も認められたが、感染脳のmicrogliaに高発現している反面、PrPScが多く蓄積されている脾臓のmacrophageには発現しておらず、プリオン病のpathogeneslsを考えるうえで興味深い。クロイツフェルト・ヤコブ病(CJD)や狂牛病をはじめとするプリオン病は、神経細胞表面に発現する糖蛋白の一種であるプリオン蛋白PrPC)からできた異常蛋白分解抵抗性プリオン蛋白(異常型プリオン;PrPScが病原因子の実体であると考えられているが、PrPScの蓄積は、脳・脊髄以外では、PrP遺伝子発現が低いか検出限度以下の唾液腺や脾臓などで多く、逆に、PrP遺伝子発現が高く、実際に蛋白発現も認められる心臓、睾丸、腎では検出できないという奇妙な現象がある。しかし、近年、CJDの患者尿中に腎由来ではないがPrPScが存在するという報告がなされている。そこで、この事を確認すると共に何故、腎由来のPrPScが同定出来ないかを検討した。まず、腎におけるPrPの局在をin situ hybridization法と免疫組織化学法を用いて行った。その結果、PrP mRNAの発現は腎近位尿細管に発現しているが、蛋白自体はWestern blotで僅かではあるが存在しているにもかかわらず、明確な局在を同定することは出来なかった。一方、尿中においてはPrPは同定できるもののPrPScの存在は報告と異なって同定出来なかった。このことは、尿中に存在する免疫グロブリンの存在と関連しているようであるが、それについては検討中である。また、腎においてPrPCからPrPScへの構造変換を抑制する何等かの抗プリオン活性因子が存在していることも示唆されるため、現在、正常腎と感染腎との間でsubtraction法を用いて検討している。プリオン病は、神経細胞表面に発現する糖蛋白の一種であるプリオン蛋白(PrPC)からできた異常蛋白分解抵抗性プリオン蛋白(異常型プリオン;PrPSc)が病原因子の実体であると考えられているが、PrP遺伝子発現部位とPrPScの蓄積部位の間には必ずしも相関はなく、PrPScへの変換を抑制する因子の可能性が示唆される。平成15年度では、そうした臓器の一つである腎臓におけるプリオン感染腎に特異的に発現している遺伝子を、PCR-selected cDNA subtraction法を用いて検討すると共に、以前、我々が同定したDoppel/PrPLPが、PrPScへの変換に関与しているかを調べるために、transgenic mouseの作成を行った。PrPScへの変換を抑制する因子そのものは同定出来なかったが、感染腎では、NADH oxidase、cytochrome oxidaseが高発現しており、腎組織や尿中にproteinase K抵抗性蛋白が存在することより、Kelkerらが報告しているtNOXと類似機構が働いている可能性が考えられた。そこで、感染細胞にtNOXに拮抗的に働くcatechinを投与すると、PrPScへの変換が抑えられることが証明されたため、感染マウス脳に直接投与して検討した結果、生存日数が有意差はないものの延びる傾向にあり、効果があると思われた。
再灌流時の不整脈に関する研究(カリウムイオン電極を用いての新しい解析法)

62年度に引続きラット摘出灌流心、左冠動脈前下行枝(LAD)結紮モデルを用いて再灌流時不整脈に関する実験を行なった。本年度は、虚血、再灌流時の心筋細胞をとりまくイオン環境変化の中で不整脈発生に重要な関わりを持つと考えられる細胞外カリウムイオン濃度(Ke)の変化を検討するためにカリウムイオン感受性電極測定を同モデルにおいて実用化することを目的とした。拍動心における測定のための柔軟性を持った電極は外径1mmのポリエチレンチューブを加熱して引き延ばし、内径70-100μmの部位で切断して作成した。当初はガラス微小電極用の液体ion exchangerを用いたが安定性に欠け、実用にいたらなかった。そこでHill5(Hill.T.L.etal,Circulation61,1980)により開発されたK^+sensitive Valinomycin-PVC matrixmembraneを応用してラット摘出灌流心用の電極を作成した。この電極は充分な安定性を持ち、これによりラット心筋でのKeの経時的変化の測定が可能となった。K^+濃度5、10、20mMの標準液でcalibrationを行なった後に心筋LAD領域中心部に電極を刺入しKeを測定すると、LAD結紮0、2、5、10分後のKe値はそれぞれ4.58±0.27、8.06±0.27、8.30±1.0、8.20±1.2mMと、虚血直後2分まで急上昇し、以後Ke値はほとんど変化せず虚血10分まではプラトーを形成した。次に5分(I群)、10分(II群)虚血後再灌流し、再灌流時のKe変化と不整脈発生の関連性を検討した。両群とも再灌流でKeは速やかに虚血前値に復したが、Keの下降速度を△Keの1/2の変化に要した時間(T1/2)で表現するとI群(n=5)23.0±8.9sec、II群(n=4)10.0±4.4sec(p=0.03)と、II群において有意に速い変化を示した。心室細動発生頻度はI群0%、II群100%であった。この結果より、再灌流時のKeの変化速度すなわち虚血により脱分極した心筋が再分極する速度が不整脈発生に関係している可能性が示唆された。我々はこれまで再潅流時不整脈(RA)の発生機序を明らかにする目的で,ラットのin vivoおよびin vitroモデルなどを用い研究を重ねてきた.これらの結果からRA発生にはCa^<++>,K^+, Na^+などのイオンの変化が関与していると推察された.この仮説を立証するため今回は細胞内へのCa^<++>イオン流入とRAとの関係についての検討を行った.ラット潅流心再潅流不整脈モデルを用い, Ca拮抗薬であるdiltiazem(D)とその光学的異性体isomer(I)(Ca channel blockerとしての作用はなく, Na channel blockerとしてはDと同程度の作用をもつ)の抗不整脈効果を比較した.その結果,低濃度のDは心室頻脈(VT)の発生率を100%から17%(P<0.05)へ,心室細動(VF)の発生率を60%から0%(P<0.05)へと低下させた.一方同濃度のIではVT, VFの発生率は各々83%, 67%とRAに対して無効であった.ところが高濃度投与ではD群だけでなくI群においてもVT, VFの発生は1例も認められなかった.冠潅流量と心拍数の変化薬剤の抗不整脈効果とは無関係であり,また虚血心筋中のATP, CP, Lactate含量は全群において有意な差を認めなかった.以上よりdiltiazemのRA抑制効果は,虚血に対する保護作用よりはむしろ細胞内Ca^<++>流入抑制の直接作用によるものであり,さらに高濃度isomerが不整脈発生率を低下させた事実より, Na^+流入抑制作用も関与していると考えられた.このようにCa^<++>やNa^+イオンなどによる電気生理学的環境の変化が再潅流時における不整脈発現性に重要な役割を果していることが確認された.細胞外K^+濃度の変化は虚血や再潅流にともなうこのような心筋の電気的現象の変化を表わす最も適切な指標の1つであり,これを直接連続的に推定すべく, K^+イオン電極を応用した測定装置(多現象メモリアルオシロスコープ, 4チャンネル記録装置を含む)を開発し,ラット潅流心モデルに併用した.現在このシステムの〓当性を検討するために基礎実験を遂行している段階である.62年度に引続きラット摘出灌流心、左冠動脈前下行枝(LAD)結紮モデルを用いて再灌流時不整脈に関する実験を行なった。

当初はガラス微小電極用の液体ion exchangerを用いたが安定性に欠け、実用にいたらなかった。そこでHill5(Hill.T.L.etal,Circulation61,1980)により開発されたK^+sensitive Valinomycin-PVC matrixmembraneを応用してラット摘出灌流心用の電極を作成した。この電極は充分な安定性を持ち、これによりラット心筋でのKeの経時的変化の測定が可能となった。K^+濃度5、10、20mMの標準液でcalibrationを行なった後に心筋LAD領域中心部に電極を刺入しKeを測定すると、LAD結紮0、2、5、10分後のKe値はそれぞれ4.58±0.27、8.06±0.27、8.30±1.0、8.20±1.2mMと、虚血直後2分まで急上昇し、以後Ke値はほとんど変化せず虚血10分まではプラトーを形成した。次に5分(I群)、10分(II群)虚血後再灌流し、再灌流時のKe変化と不整脈発生の関連性を検討した。両群とも再灌流でKeは速やかに虚血前値に復したが、Keの下降速度を△Keの1/2の変化に要した時間(T1/2)で表現するとI群(n=5)23.0±8.9sec、II群(n=4)10.0±4.4sec(p=0.03)と、II群において有意に速い変化を示した。心室細動発生頻度はI群0%、II群100%であった。この結果より、再灌流時のKeの変化速度すなわち虚血により脱分極した心筋が再分極する速度が不整脈発生に関係している可能性が示唆された。
ナノ粒子を用いたセメント水和物の変質制御

異なる水セメント比のセメントペーストにチタンナノ粒子を添加すると長期の水和の停滞と乾燥収縮ひずみの増大が生ずる。これらの反応・物性の変化は、チタンナノ粒子がセメントの主要水和生成物であるカルシウムシリケートと相互作用し、析出サイトとして機能しない部分が生ずるためにビーライトの反応を遅延させ、かつ、そのようにしてできた水和物が収縮に対して大きな変質を生じやすいからであることが示唆された。平成26年度には,1)TiO2ナノ粒子を用いたセメントペーストの混練に関する技術の修得,および,2)炭化水素系ナノ分子を用いたセメントペーストの物性評価,の2通りについて研究を実施した。1)については,市販の懸濁液として販売されているTiO2ナノ粒子を取り出し,セメントに混連する手法について検討を行った。TiO2粒子の分散性状は,既往の他研究に示されているように,超音波分散法によって実施することで,適切に分散できることを確認した。現在は,セメントペーストを硬化させているので,次年度は,収縮挙動と乾燥挙動について,水蒸気吸着等温線と長さ変化等温線の測定について検討する予定である。2)については,収縮低減剤として販売されている炭化水素を参考にいくつかの炭化水素を合成し,2nm20nm程度の分子をセメントペーストに混連して,その物性について検討した。2nm程度と非常に短い分子については,セメントペーストにおけるカルシウムシリケート水和物の近傍と気液界面の近傍に存在する傾向が示され,セメントペーストの収縮に関わる挙動に大きく影響することが明らかになった。今後,他の大きさの分子を混連したペーストについてもデータを取得して,それらの挙動について明らかにしていく。異なる水セメント比(W/C=0.55と0.40)のセメントペーストにTiO2の混和の有無をパラメータとした実験を行った。その結果、TiO2の添加は、コンクリートの長期強度増大に大きな影響をもつビーライトと呼ばれる鉱物の長期の水和挙動が抑制される傾向にあることがわかった。また、今回、研究の目的のひとつとした乾燥収縮ひずみについて検討した結果、TiO2の添加はおおむね、収縮を増大させる傾向にあることがわかった。このことは、水和物の結晶化をはばんでいたり、あるいはC-S-Hの析出箇所を変化させているものに起因すると考えられた。一般にセメントの乾燥収縮ひずみは,水和の進行にともなって大きくなる傾向があるが,前述したようにビーライトの水和が遅延しているにも関わらず,TiO2ナノ粒子を混和した場合には,乾燥収縮が大きくなる傾向が確認されたからである。熱分析や水蒸気吸着等温線試験によれば、TiO2を混和したセメントペーストのすいわぶつ表面は、非常に親水性表面となっていると示唆された。400度以上の脱水は,カルシウムシリケート水和物の脱水と構造変化が伴う段階と知られているが,この部分においてTiO2ナノ粒子の混和の影響が多く,より高い温度にならなければ脱水(シラノール基とCa-OHの脱水縮合)が生じないという傾向が確認された。これはTiO2粒子が一部は,カルシウムシリケート水和物と結合している可能性を示唆している。FE-SEMによってTiO2ナノ粒子はカルシウムシリケート水和物周辺にあることが確認できたものの、結合自体は確認できなかった。ナノ粒子の添加によってカルシウムシリケート水和物の変質を生じさせうることがあきらかになったので,今後は,より多くのナノ粒子を混和することによって収縮を低減する粒子を検討していく必要があると考える。ナノ粒子の入手に手間取ったが,その後はおおむね実験は適切に実施されていると考えられる。次年度は,TiO2粒子を含むペーストの物性について評価する。予算の減額により,直接的に海外研究者のサポートを得られなくなったので,その点の進捗の不足はやむを得ないと考える。建築材料学平成27年度では,TiO2を異なる混和量,混連したセメントペーストの物性について取得する。物性は,密度,超音波伝搬速度(硬化の程度を測定する)の上で,湿度制御型TMAによる長さ変化等温線の測定と,水蒸気吸着装置による吸着等温線の測定を実施する。現在まで,TiO2などのナノ粒子がセメントペーストの水和反応速度に関しては,析出サイトとして機能していくことは,水和物の架橋をメソスケールには役立つことなどが明らかになってきているが,乾燥時の変質にどのように影響するかについては,あきらかになっていない。処女乾燥下のペーストの収縮の大部分は,カルシウムシリケート水和物(C-S-H)の変質によるところが大きいので,TiO2の混和が,C-S-Hの変質にどのように作用するかについて,湿度と長さ変化に着目して評価する。特に長さ変化等温線における非回復成分の量とTiO2量に差があるかどうか,などが着眼点となる。炭化水素系ナノ分子についても,引き続き,どうような形で性能評価を実施していく。
人工骨・軟骨複合材料の開発に関する研究

PVAを液相の間に多孔性の人工骨孔内に含浸させゲル硬化過程で両者を結合することにより人工骨・軟骨複合材料を作成し新しい表面置換型人工関節を開発する目的で行った研究成果は下記の通りである。1.PVAハイドロゲルの改良:PVAの重合度やannealingの温度と時間を変更するなど様々の工夫をすることによりPVAゲルの引張り強度、耐摩耗性の向上を得ることができた。2.PVA原液の人工骨孔内への含浸:多孔性人工骨としてチタンファイバーメッシュを選び、チタンファイバーの孔径と孔形を改良し、PVAの含浸と新生骨進入に最適の人工骨に改良した。しかし、含浸させたPVAがゲル硬化過程で縮小し、結合強度が減弱するという、新たな問題の解決に当たりつつある。3.新しいFEMソフトを用いた股関節の応力解析により新しい表面置換型人工関節によって生体関節に似た応力分布の得られることを明らかにし、またインプラントした人工骨周囲の骨リモデリングについてもFEMによるシミュレーションを行った。4.ガラス板と材料表面間の隙間が荷重を加えることによって如何に変化するかをレーザー変位計を用いた新しい試験装置により検索しPVAゲルではより広い隙間がより長時間保たれ、液体膜潤滑の可能な材料であることを確かめた。5.人工骨軟骨複合材料を作成し、犬の膝関節にインプラントする手術を行った。1.PVAハイドロゲルの改良:PVAの重合度を3,000から11,000の原液に変更し、annealingの温度を100度、時間を48時間に延長するなど様々の工夫をすることによりPVAゲルの引張り強度、耐摩耗性の向上を得ることができた。2.PVA原液の人工骨孔内への含浸:多孔性人工骨としてチタンファイバ-メッシュを選んだが、硬化したゲルと人工骨との剪断強度は最高2.2MPaである。チタンファイバ-の孔径と孔形がPVAの含浸ならびに新生骨侵入に最適な200μm径になるように改良を重ねつつある。3.PVAハイドロゲルの耐摩耗性:1.に記したPVAゲル合成方法の改良により耐摩耗性も向上し、一方向型ピンオンディスク試験機の結果ではポリエチレンと同じ摩耗量を示した。本材料は低速回転で摩擦係数の高くなる傾向があり往復動試験機の結果はポリエチレンのそれよりも悪く、1.に記した改良をさらに進める必要がある。4.新しいFEMソフトを用いた股関節の応力解析により現行の人工股関節ではストレスの集中とシ-ルドが不可避であるが新しい表面置換型人工関節によって生体関節に似た応力分布の得られることを明らかにした。また骨頭デバイスの最適設計についても多くの新しい知見を得た。5.犬ならびに猿にインプラントする本材料のデザインが出来次第動物実験を行い、また潤滑の働き得る新しい摩擦・摩耗試験機を作成して本材料の耐摩耗性の試験を行う。1.PVAハイドロゲルの改良:PVAの重合度やannealingの温度と時間を変更するなど様々の工夫をすることによりPVAゲルの引張り強度,耐摩耗性の向上を得ることができた。2.PVA原液の人工骨孔内への含浸:多孔性人工骨としてチタンファイバーメッシュを選び,チタンファイバーの孔径と孔形を改良し,PVAの含浸と新生骨進入に最適の人工骨に改良した.しかし,含浸させたPVAがゲル硬化過程で縮小し,結合強度が減弱するという,新たな問題の解決に当たりつつある.3.新しいFEMソフトを用いた股関節の応力解析により新しい表面置換型人工関節によって生体関節に似た応力分布の得られることを明らかにし,またインプラントした人工骨周囲の骨リモデリングについてもFEMによるシミュレーションを行った.

4.ガラス板と材料表面間の隙間が荷重を加えることによって如何に変化するかをレーザー変位計を用いた新しい試験装置により検索しPVAゲルではより広い隙間がより長時間保たれ,液体膜潤滑の可能な材料であることを確かめた.5.人工骨軟骨複合材料を作成し,犬の膝関節にインプラントする手術を行った.
備後産業文化情報連環都市圏に関する総合的研究

分担課題別研究成果1.生物資源と地域開発因島、向島周辺の海域における漁業の新しい展開の方向として、(1)イワシ類の仔魚「しらす」の陸上での工業的プロセスによる養殖の提案、(2)冬期の栽培魚種としてアユとマスを取り上げ、その飼育実験の結果を報告している。この2つが実現すれば、地域の産業の活性化に大きく寄与するであろう。2.備後産業文化情報連環都市圏(備後都市圏)の一体的形成の条件の研究(1)福山市の市民の買物行動の地域比較は、圏域の一体的形成に対する条件を示唆する、(2)また、造船不況に悩む向島町の産業振興策の提案は、備後都市圏のモデルとなる、(3)重厚長大型の産業が圏域市町の税収構造に与えている影響が解明された、(4)地域の一体化のための条件の一つである、情報化の進展の実態が明らかにされた。3.交通網の形成と地域の変容備後都市圏の一体性のカギを握るのは道路網の整備である。(1)山陽自動車道西インタ-チェンジの開設を前にした地元住民の意識が調査され、その結果に基づいて、地域発展のための実践システムが構想された、(2)交通渋滞に悩む国道2号線の交通量予測方式が開発された。4.人口の高齢化とその対策人口の高齢化にともなう老人問題の中で、高齢者の社会参加プログラムが提案された。5.環境動態と保全(1)芦田川の水質が調査され、(2)今後の整備方針について提案がなされた。また、(3)福山市の建築物に用いられている石材の調査が行われ、その都市美との関係が明らかにされた。6.教育と文化高等教育と都市圏の関連について調査、分析した。7.総括2年間、研究によって、本研究課題の基礎的部分における成果が予定どおり得られた。備後工特地域(福山、尾道、笠岡、沿岸島しょ部、芦田川中流部)を中心とする備後地域の産業社会の変容を意識しつつ、その長期的な発展の可能性を、地域の文化、商業、地域活性化、交通体系、都市環境、産業フィージビリティ調査など、多角的なアプローチによって探る。本年度は主として研究分担者、あるいは研究グループによって個別の研究が進められ、部分的な成果をまとめている。主たる成果は次のようである。1.福山の買い物行動調査。福山の商業が備後地域の商業中心地として発展することを構想するための基礎資料とするため、福山商工会議所の協力を得てアンケート調査を実施する。アンケートはライフスタイルの調査を核に具体的な買い物行動を聞いたものである。(中間報告書完成)。2.備後都市環境調査。(1)芦田川の水質調査。(報告書完成)。(2)石材を中心とする都市(建造物)景観調査。(報告書完成)。(3)山陽自動車道インターチェンジ周辺(福山西インター)の住民意識調査。インターが立地することの、地域の活性化、生活環境への影響をどのように考えているのかを調査する。(報告書完成)3.産業の可能性調査。(1)パソコン通信に焦点を当てて、地域の情報化の実態とその可能性を調査・研究する。地域の実態を、自治体を中心にアンケートと聞き取りによって調査する。(中間報告完成)。(2)因島周辺の海洋微生物調査(中間報告完成)。(3)松永周辺のい泥の調査。い泥の成分分析をしてセラミックス材料としての利用可能性を調査する。(報告書完成)。

その他、地域文化の研究、備後地域内の行政単位別の地域活性化の事例研究、備後の交通体系の整備構想に対する基礎調査、福山市を中心とする備後の財政分析が分担者によって進められている。備後工特地域(福山、三原、尾道、笠岡、瀬戸内海沿岸島しょ部、芦田川中流部)を中心とし、その周辺部と備北地域、さらには瀬戸内海を隔てた四国の諸都市をも包含する広域都市複合体の可能性を展望するわれわれの研究は、人口とその動態、産業経済、地方自治、自然環境、情報化、交通体系、地方文化など、多面的・学際的なアプロ-チによって、先ず、福山市を中心とする広域都市圏の成立と発展の可能性を探ろうとするものである。本年度は、主として研究分担者、あるいは研究グル-プによって個別の研究が進められ、その成果がまとめられた。1.福山市における買物行動の地域比較分析、NKKの立地によって急速に工業化し、行政地域を拡大してきた福山市での一体化の現状を、市民の買物行動という観点から調査・分析し、圏域一体化の指針が得られる(報告書完成)。2.備後都市環境調査(1)芦田川の水質調査(報告書完成)。(2)製造業の構造変化が固定資産税に及ぼす影響を福山市について解明した。この研究は重厚長大型の産業構をもつ備後都市圏に一般化しうる。(3)山陽自動車道福山西インタ-チェンジ開設をにらんだ地域発展システムの予測(報告書完成)。(4)高齢化の進行に伴う老人対策の提案(報告書完成)。(5)道路交通量の予測方式の開発(報告書完成)。3.産業の可能性調査(1)典型的な重厚長大型の町である向島町について、第1次産業、第3次産業との連関を考慮した第2次産業の振興策を提案(報告書完成)。この研究も他市町に適用しうる。(2)因島周辺の水温が冬期の間低温状態にあることに着目し、冬期栽培用魚種としてのアユとマスの飼育実験を行う。この可能性の確認は、因島周辺の海域での養殖漁業に新しい展望を開くものである。
A群連鎖球菌保有各種病原因子による免疫応答解析に基づくDNAワクチン作製基礎研究

A群溶血性連鎖球菌感染症は軽微な咽頭炎から重篤となる劇症型連鎖球菌感染症と種々の病態を示す。我々は各種病原因子に注目し、菌株から病原因子が含まれる蛋白分画を精製し、それをマウスの骨髄細胞をGM-CSFでマクロファージ、樹状細胞に分化させた細胞に作用させた。細胞から遊離される多種のサイトカインやケモカインのmRNAをqRT-PCRで、またその産生蛋白を蛍光磁性マイクロビーズを使ったEIA法により検出した。その結果、炎症性サイトカインであるTNF-α, IFN-γ,IL-1β, IL-12p40, KC(CXCL2)の発現が生菌で顕著にまたIL-6、iNOS、KC、MIP-2の上昇も見られた。A群溶血性連鎖球菌(A群溶連菌)臨床分離株の収集が2013年8月に終了し、2,708株を収集した。詳細は産婦人科、泌尿器科の検体から250株、小児科、耳鼻咽喉科等の検体から2,297株、外科、皮膚科領域の検体から161株である。そしてそのデータベース化を進めてきた。その基礎となる毎月平均約1.2千件の検体のデータから知見を得た。従来、A群溶連菌感染咽頭炎は小児科が多い。今回、産婦人科、泌尿器科の検体である膣分泌物、尿からの分離株数は咽頭ぬぐい液、扁桃陰窩ぬぐい液からの分離株数の1/2から1/3であり、少なくない事が判明した。これは研究目的である5類感染症、小児科定点の年間15から27万に及ぶA群溶連菌咽頭炎の原因として母子垂直感染が示唆された。A群溶連菌にPenicillin系薬耐性はないと思われて、一部のPenicilin系薬に耐性の株が見られた。保存株ではErythromycinがTelithromycinの耐性を誘導する評価法について検討した。(第62回日本化学療法学会、第88回日本感染症学会合同学会、平成26年6月18日20日、福岡、発表予定)また韓国と共同研究を行っており、韓国で分離されたMacrolide耐性A群溶連菌株と本邦分離株の比較を行い、論文作成が決まっている。そして東北大学との共同研究で急性中耳炎の患者から分離されたA群溶連菌について解析を行った。(Tohoku J. Exp. Med., 2014, 232, 301-304)ヒトCD46トランスジェニックマウスに接種したM1型(emm1)劇症型A群溶連生菌の免疫応答として、Interleukin-1βの発現を見出した。(J. of Exp and Clin. Med., 2013;5(6):227-230)これはMi型A群溶連菌の持つ病原因子とその免疫応答を解析する上で重要と考えている。A群溶連菌の各種発赤毒素をコードするspeA, speB, speC, speF, speG, speH, speJ遺伝子、細胞分裂促進毒素をコードするsmeZ遺伝子、その他、スーパー抗原をコードするssa遺伝子やsagA遺伝子等をそれぞれ個々に持ち、全ての遺伝子を含むように6菌株を選び、毒素の産生が可能なNCTC135 mediumを使用し培養した。培養上清をUltrafiltration法にて50 kDa以上、30から50kDa、10から30kDa、10kDa以下の蛋白に分けた。そしてマウス骨髄から採取したBM-cellをG-CSFを添加し、分化させた後、培養プレートのウエルに先の粗分画蛋白を100ng添加し培養した。その培養上清50μl中のNOをグリース法、TNF-αをELISA法で定量した。その他のIL-1β, IL-6, IL-1β, IL-17α, IFN-α, CD14, iNOS, SNAP3, TGFβ, actinβについてはqRT-PCR法で細胞のRNA解析を行った。その結果、一部の菌株では50kDa以上の粗分画については幾つかのサイトカインの上昇が認められた。詳細については現在解析中であり、後日、国内外の論文、学会にて発表する予定である。その他、菌株収集の過程でErythmycinによる誘導型Telithromycin耐性株を見出し、その評価基準を明確にするためチェッカーボード法を行い、効率よく検出できることを発表した。(第88回日本感染症学会学術講演会・第62回日本化学療法学会総会,2014.6.18-20,福岡市)A群溶血性連鎖球菌(GAS)の粗分画をGM-CFSでマウス骨髄細胞(BM-cell)に添加し、骨髄由来単核球誘導した細胞に反応させ、qRT-PCR法で各種サイトカイン、ケモカインのmRNA解析を網羅的に行った。その結果、株毎に産生蛋白の種類に多様性があり、speC産生株には生菌と30-50KDa蛋白による刺激でTNF-α産生が増幅された。熱処理株(HK GAS)でも生菌同様にiNOSが増幅された。ケモカインやIL-1βは生菌と>50KDa蛋白で増加した。よってTh1タイプの炎症を惹起する粗分画のあることが判明した。

並行して各種サイトカイン等の産生をLuminexによる蛋白測定を行いTNF-α、KC、IL-6、MIP-2の産生が50kDa以上の粗分画で増加し、DNAワクチン産生を増強するCpG-ODN添加において各種サイトカインの高度の増加が見られた。(新井和明,第64回日本感染症学会東日本地方会学術総会発表2015.10.2123、札幌)またIL-6とCD86の発現を著しく抑制する作用、NALP3、IL-18産生促進作用等、特異的なGAS株とその蛋白分画が確認された。これらの結果はIL-6主体の炎症と、菌体から分泌される蛋白によるNALP3の応答は独立し、前者にregnaseの寄与は少なかった事が分かり発表した。(山本夏男、前述同総会発表)以上のことから今まで行われてこなかった炎症性サイトカイン、ケモカインを解析し病原性定量化検査を試み、それを発表した。(研究代表者:新井和明、第27回日本臨床微生物学会総会・学術集会,2016.1.2931、仙台)A群溶血性連鎖球菌感染症は軽微な咽頭炎から重篤となる劇症型連鎖球菌感染症と種々の病態を示す。我々は各種病原因子に注目し、菌株から病原因子が含まれる蛋白分画を精製し、それをマウスの骨髄細胞をGM-CSFでマクロファージ、樹状細胞に分化させた細胞に作用させた。細胞から遊離される多種のサイトカインやケモカインのmRNAをqRT-PCRで、またその産生蛋白を蛍光磁性マイクロビーズを使ったEIA法により検出した。その結果、炎症性サイトカインであるTNF-α, IFN-γ,IL-1β, IL-12p40, KC(CXCL2)の発現が生菌で顕著にまたIL-6、iNOS、KC、MIP-2の上昇も見られた。25年度は「やや遅れ気味であった」がA群溶連菌の病原因子である各種発赤毒素やスーパー抗原における免疫応答を当初の方法としてフローサイトメトリー解析を実施することにより明らかにする事を目指したが、近年、免疫応答細胞のRNAを解析し、しかも定量するqRT-PCR法を実施することにより、多くの菌株に対する免疫応答が効率よく各種サイトカインを始め、CD細胞の解析を行うことが出来るようになった。またその結果に基づき、最初から単一精製を目指すことなく、Ultrafiltration法により、分子量ごとに病原因子蛋白である各種発赤毒素やスーパー抗原を粗分画として精製し、それを分化したBMcellに投与することにより、免疫応答が有った分画をその後のゲルろ過や等号電点電気泳動を行うことにより、単離につなげることを見出した。これにより特定する抗体産生に関わる蛋白を迅速に検出できるようになるであろう。感染症内科学該当する粗分画をゲルろ過そして等電点電気泳動により、それぞれの蛋白を単一精製し、その蛋白のアミノ酸分析を行い、関連する蛋白である各種発赤毒素、細胞分裂促進毒素そしてスーパー抗原の挙動を単一でマクロファージの培養細胞に添加するのが良いのか。それとも複数の蛋白を組み合わせて添加するのが良いのかをどのような免疫反応があり、その蛋白は何かを蛋同定する。それは各種サイトカインやTNF-αの発現により、マクロファージを介しHelper T-cellに働き、IL-12の発現によりB-cellに働き、抗体産生に至る経路を確認するのが第一方策である。第一の方策に従いその蛋白をコードする遺伝子配列にCpGモチーフを挿入し、今度は単球から樹状細胞を分化し、その樹状細胞付近に発赤毒素やスーパー抗原コード遺伝子-CpGを導入することにより、各種サイトカインやTNF-α、その他の免疫応答を抗体産生の観点から見るのが第二の方策である。それにより各種蛋白遺伝子-CpGを作成し、CpGモチーフの導入部位、複数蛋白遺伝子の場合の効率よく抗体産生に繋がるデザインを模索していきたい。各種蛋白遺伝子-
肺血流増加モデルマウスを用いた慢性血栓塞栓性肺高血圧症への新規治療介入の探索

慢性血栓塞栓性肺高血圧症(CTEPH)では器質化血栓非存在部の血管でもリモデリングは生じることが明らかとなっているが、その機序は明確となっていない。また、現行の治療は器質化血栓存在部の血管に対しての介入であるが、これらの治療では血行動態の改善は得られるが、酸素化の正常化はえられず、新規介入手法が求められている。われわれはこの課題の介入の目的とし、左肺切除により、残存した右肺動脈の肺血流を増大させ、右肺動脈に定量的な容量負荷(High flow)を引き起こすモデルマウス(PAOVモデル)作成した。このモデルでは右肺に血流が集中することで、血栓非存在部の血管リモデリングを表している。同モデルでは血管リモデリングを生じることが明らかとなり、その機序にマクロファージが関与していることが明確となった。本年、これらの結果を論文として発表した。(Int Heart J. 2019Mar 20;60(2):451-456.)さらに、実際に肺組織に集積する炎症細胞の時系列profileにつき、免疫染色(CD11b, F4/80, CD206, Ly6G, CD3)により評価を行う。特にマクロファージのM1/M2極性については、フローサイトメーター(M1; Ly6chi, M2; Ly6clo)を用いてその肺血管への集積について経時的解析を行い、現在解析中である。特記なし当初の計画を遂行する。機材購入の手続きに遅延が生じたため。