hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
クヌーセンセルを用いたコンドリュール再現実験生成物のMg,Fe,Si同位体比分析

基盤研究(B)「圧力制御システムを用いたコンドリュールの凝縮反応に関する実験的研究」(平成23年度平成26年度:今栄直也・代表)で導入した原始太陽系環境を再現する減圧制御炉にて作成したコンドリュールの再現生成物の主要元素であるMg, Si, Feの同位体測定を実施することが本研究基盤研究(C)の課題「クヌーセンセルを用いたコンドリュール再現実験生成物のMg,Fe,Si同位体比分析」の主目的である。実験では始原隕石を構成するI型コンドリュール組織・組成を再現した。実験はクヌーセンセル型の容器内部で行った。実験結果は、太陽系組成の出発物質が蒸発・凝縮を経てコンドリュール形成に至ることを強く示唆した。天然に産する還元的な鉱物組合せより構成されるI型コンドリュールはコンドリュールの最も主要な構成単位である。このMg, Si, Feの主要3元素には極めて小さい同位体分別しか認められていない。実験条件は、外との元素の交換は小さなオリフィスを通してのみしか行われないので、同位体分別を抑制することが期待できる。本研究課題は実際にこの予測を検証して、コンドリュールの形成環境の理解を深めることである。現在、平成25年度に国立極地研究所に新たに導入した2次イオン質量分析計(SHRIMP II)を用いた実験生成物のSi同位体測定の準備は着実に進んでいる。当年度では、実験生成物の測定結果を得るには至らなかったが、標準試料(NBS=28)、Hamersley BIF, Dharwar BIF, Dharwar quartzite, Napier quartziteの30Siの測定を実施し、0.1パーミルでの高精度測定が可能になった。他方、アメリカのNASAのジョンソン宇宙センターに2次イオン質量分析計(SHRIMP II)でのSi同位体測定用に、南極隕石申請を行った。この隕石は、最始原隕石に相当するDOM 08006CO3.00で、研究計画が受理された。本研究課題の目的は、国立極地研究所の2次イオン質量分析計(SHRIMP II)を用いて、コンドリュール実験生成物のMg, Si, Feの同位体測定を測定することにある。当該研究の研究分担者である堀江憲路助教は当装置運用の責任者であり、当分析を担っている。標準試料および地球産鉱物試料の測定により酸素の一次イオンビームを用い、特に質量が30のSiについて0.1パーミルの高精度測定が可能になり、測定手法を確立した。本研究課題で測定予定の実験生成物の測定は、準備が整い次第測定予定である。また、始原隕石の測定も計画に導入しておりコンドリュールとマトリックスのデータを取得予定で打ち合わせを進めている。実験生成物の同位体測定を行う。2018年度には国際隕石学会のワークショップで招待講演を予定している。この際に、予察的な同位体測定結果を発表予定である。最始原隕石に相当する隕石試料のSi同位体比測定が採択されているため,当研究課題の一つとして実施する。試料が到着次第早急に、光学顕微鏡、走査型電子顕微鏡およびエレクトロン・マイクロ・アナライザーで組織観察、主要構成鉱物組成の分析を行う。2019年度中に、Si同位体測定用のDOM 08006 CO3.00の2次イオン質量分析計(SHRIMP II)測定を実験生成物とともに実施し、比較を行う。平成29年度にはコンドリュール生成実験を行わず、その消耗品代は執行しなかったため。当初の研究計画に明記されている通り、Mg,Fe,Siの大きな同位体分別は認められないと予測できる。一方、真空中で強度の過熱を受けた試料については大きな同位体分別が予測される。
高性能FRPの代替を指向する分子複合材料の開発研究

分子複合材料(MC)は、FRPにおける強化繊維の代わりに剛直棒状分子を用い屈曲性分子をマトリックス樹脂の機能を持たせるものである。本研究では、ポリ(p-フェニレンテレフタラミド)(PPTA)を強化棒状分子とし、PPTAと分子相互作用の大きいナイロン6(Ny6)を屈曲性分子とし、共通溶媒の硫酸溶液から凝固析出してMCを調製した。FRPにおける問題点が強化繊維の強度の限界と、欠陥を含む組織の不均一性にあることを認識し、MCにおける棒状分子に分子レベルでの均一な分散性と、有効な分子特性の活用とにおいた。問題点は調製直後の分子分散性の安定性であり、結晶化による相合離によるMCの力学的性能の劣化である。。Ny6の分子量を1.8万から26万まで変えてMCを調製し、Ny6の融点以上での熱圧縮成形による試料のモルホロジーを検討した。分子量26万のNy6-C試料のみ、偏光顕微鏡下でMCは暗視野を保ち、相分離は認められず、同時にFTIRのN-H伸縮吸収も鋭い単一ピークであり、PPTAとNy6分子間の交差水素結合を推定し、MC内でのPPTAの分子分散が支持された。このとき、Ny6の結晶吸収も現れなかった。他のMCはPPTAとNY6の特性吸収とが混在して幅広になった。このようなMCの応力-歪曲線はPPTAの分子分散を反映して弾性率、強度ともに顕著に向上した。これより成果として(1)マトリックス分子の分子量巨大化により棒状分子の拡散・析出が阻害され安定なMCが得られる。(2)棒状分子の凝集はクラスターを形成して応力伝達の効率を落とす。この点で分子分散はもっとも効率が良い。その他(3)PPTAとNy6との分子間相互作用だけでは伸度が不足する。PPTA分子の両末端にNy6をブロック共重合することによりマトリックスへの応力波及効果により延性が顕著に向上した。このような強化分子の要学的変性が有効であることはFRPでは実現不可能である。。分子複合材料の調製方法の開発にあたって、pーアラミド(PPTA)を強化分子とし、屈曲分子に(1)ナイロン(NY)、(2)ポリアクリロニトリル(PAN)をモデル系に選んだ。PPTA/NY系は硫酸溶媒を用いたが、PPTAの高濃度では、液晶形成と結晶速度の速さがミクロ組織の均一性に不利であった。これに対し、PPTAポリアニオンのDMSO溶液は、高温濃縮により、高濃度でも光学的等方性であり、PANのDMSO溶液との相溶性も良好であるので、この系のレオロジ-挙動を検討した。先ず、PANは、分子量130,000から1,500,000までを用意し、レオメ-タ-(NRー1100:西鐵工所)により、DMSO溶液の粘弾性を測定し、分子の絡み合いの状態を検討した。他方、PPTAポリアニオン単独のDMSO溶液について、粘弾性測定を行った。分子量50,000のPPTAアニオン試料のDMSOの溶液では、2価の金属イオンとして、Zn^<2+>イオンを加えることにより、動的粘弾性がほぼ2倍増加する効果を見いだした。この効果は実質的にPPTAアニオンの分子量を増加したことを意味する。

これにより、PANの絡み合い効果とあいまって、PPTAの再生凝固時に、PPTA分子相互の凝集結晶化を抑制し、より均一な分子複合材料を調製する可能性が期待されることになった。別に、予備実験として、PPTAポリアニオン/PANの共存DMSO溶液より、剪断下、電析法により、より高い力学的異方性を示し、かつ、弾性率14GPa、強度370MPaを得た。PPTA単独の結晶組織より、より均一な組織が分子複合化により達成されることを示唆し、本研究にとり有利な成果を期待させるものである。なお、DMSO可溶で、より耐熱性をもつシアノアリ-ル系の母材樹脂をPANに替わるものとして探索している。FRPの強化繊維に対応する剛直棒状分子として、ポリ(p-フェニレンテレフタラミド)(PPTA)を用い、マトリックスとしての屈曲性分子には、PPTAとの分子間相互作用の大きいナイロン6(Ny6)を分子複合材料(MC)のモデル系に選んだ。FRPの問題点が強化繊維の強度の限界にあることの他に、FRPの材料組織が不均一であるために脆性を示すことにあり、分子レベルで均一な組織をもつMCの実現する条件を検討した。従来、PPTAとNy6の琉酸溶液からの析出によるMCの調製方法では、PPTAが凝集してNy6マトリックス中にミクロフィブリルの網目構造を形成してMCが脆くなる。本年度は、PPTAの拡散・凝集を阻止するため、Ny6の分子量を巨大化した場合の効果を検討した。すなわち、Ny6の分子量1.8万(A試料)、11万(B試料)、26万(C試料)を用いたMCの組織を比較した。偏光顕微鏡(POM)の直交偏光子下では、成形温度240°C(Ny6融点215°C)の試料は、Ny6-CのMCのみ暗視野となり、他は相分離を起こした。これらの試料のFTIRのN-H伸縮振動の吸収でも、Ny6-CのMCのみが単一の鋭いピークを示し、他はPPTAとNy6の特性バンドに分離して広幅な吸収になった。単一の吸収ピークは、PPTAとNy6のアミド間で交差水素結合の生成によるもので字義通りのMC生成を示し、POMの結果とも一致する。PPTA/Ny6の9/1から1/9の範囲のMCの応力-歪曲線を比較したところ、構造的に分子分散が証明できたNy6-CのMCが弾性率、強度共に他より優れており、分子分散の効果が有効であることが証明された。巨大分子量のマトリックス分子の内部粘性がPPTA分子の拡散・凝集を阻害して分子分散を可能にした。なお、PPTA過剰では、Ny6のIRの結晶特性吸収も消失し、DSC曲線にもNy6-Cの結晶化、融解ピークも消失して相分離が起こっていない。MCの変形挙動について、棒状分子間の応力伝達様式についての理論的考察も行った。
抗うつ薬作用機序の分子生物学的研究-三環系抗うつ薬と甲状腺剤併用の増強効果

要約:治療抵抗性の気分障害者に抗うつ薬に加えて甲状腺末を併用投与すると抑うつ症状が改善する事をしばしば経験する。これは両薬剤の併用が抗うつ作用を増幅した結果と考えられる。このような抗うつ作用の増幅の機序を明らかにするために、ラットにデスメチルイミブラミン(DMI)とレポチロキシンナトリウム(T_3)を併用投与したときの動物行動、脳内アミンおよびβ受容体、セロトニン(5HT)2A受容体について調べ検討した。対照群、DMI群、T3群、DMI+T3併用群の4群間で比較検討した。薬物の投与は単回(DMI 30mg/kg,T3 1mg/lkg)、反復投与(DMI 10mg/kg,T3 100μg/kg)7日間とした。DMI+T3併用群についての結果は、強制水泳テストで7日間の併用薬投与でのみ有意な無動時間の短縮(59%に減少)を認め、抗うつ作用の増幅作用を裏付けるものであった。その時の脳内アミンの変化は前頭前野皮質(PF)でノルアドレナリン(NE)の有意な増加、ドーパミン(DA)代謝回転の亢進、海馬(HIP)で5HT代謝回転の亢進を示した。反復東予によるβ受容体の変化はDMI群で従来報告されているようにPF,HIP,視床下部(HY)で有意な結合量の減少を示したが、T3群はPFで有意な増加を示し、併用薬群はいずれの部位でもその中間値を示し対照群との差を認めなかった。5HT2A受容体をは7日間の併用薬反復投与群でPFで結合量の減少を示した。この時、T3群も減少を示したが、DMI群では変化なくT3がその効果を高めたと考える。従来の抗うつ作用機序とされるβ受容体、5HT2Aの減少が言われているが、今回の結果は必ずしも一致するものではなかった。アミンおよび受容体の変化を主にPFで認めたことから抗うつ作用の責任部位の一部はPFが担っており、そこではDA,NE,5HTニューロンが相互に係わっている可能性を示唆した。内因性うつ病の15-30%は大量の抗うつ薬投与にもかかわらず難治であり、症状は遷延しうつ病治療の大きな問題になっている。このような症例に抗うつ薬と共に、甲状腺ホルモンを投与すると抑うつ症状の改善を認めることが多い。甲状腺ホルモンと抗うつ薬の併用投与で作動する脳内機序こそが、うつ病の修復機序と考え、三環系抗うつ薬、甲状腺ホルモンをラットに投与して動物行動と脳内アミンと受容体への影響を比較検討した。【方法】【結果】1.遷延性うつ病者に甲状腺末と抗うつ薬を併用投与すると、著効55%、有効18%、無効18%、悪化9%であった。(30mg/kg^<+1>mg/kg)群の2群で対照群に比較して無動時間の短縮をみた(61%,53%に減少)。7日間の反復投与ではDMI+T3群でのみ有意な差を認めた(59%に減少)。3.脳内モノアミン:反復投与7日間のNE代謝はDMI+T3併用群のPFで有意な増加をみた。5HT代謝については併用群およDMIの両群で視床下部の5HIAAの減少を認めた。DA代謝には大きな変化はなかった。4.β受容体結合実験:反復7日間の投与でDMI群のPF,HY,HIPの結合量が減少していた。一方、併用投与群においては、PF,HY,HIPのβ受容体結合量は対照群と差がなかった。【考察】抗うつ作用の指標になる強制水泳テストにおける無動時間の短縮は、DMI+T3群の7日間の反復投与で有意な短縮を認め、甲状腺ホルモンが抗うつ薬効果を増幅する所見を動物実験でも得たこの短縮効果をNEあるいはβ受容体レベルだけで説明することはできなかった。抗うつ薬と甲状腺ホルモンの増幅効果を細胞内情報伝達系レベルで調べる必要があると考える。

5HT2A受容体をは7日間の併用薬反復投与群でPFで結合量の減少を示した。この時、T3群も減少を示したが、DMI群では変化なくT3がその効果を高めたと考える。従来の抗うつ作用機序とされるβ受容体、5HT2Aの減少が言われているが、今回の結果は必ずしも一致するものではなかった。アミンおよび受容体の変化を主にPFで認めたことから抗うつ作用の責任部位の一部はPFが担っており、そこではDA,NE,5HTニューロンが相互に係わっている可能性を示唆した。
極性交互交換低電圧電解法によるバイオマテリアルナノ粒子の創製

バルブメタル上にリン酸カルシウムのナノ粒子を創製することを目的として,リン酸水溶液にハイドロキシアパタイト(HAP)を飽和させた電解液中で,バルブメタルを電極として極性を交互に反転させながら低電圧で電解処理をおこなった.その電解条件とナノ粒子のキャラクタリーゼーションを検討した.その結果,pH3の電解液では,TiとTaではHAPが,ZrではHAPとモネタイトが,NbではHAPとモネタイトおよびブルシャイトのナノ粒子が析出した.析出した結晶相は,電極近傍のOH^-の濃度と電解液中に存在するリン酸種に依存すると考えられる.TiとTaの場合,電解がすすむと,電極近傍のOH^-の濃度が高くなり,しかも,電解液中にリン酸種HPO_4^<2->が高濃度に存在するためにHAPが析出したと思われる.OH^-の濃度が低い場合は,ブルシャイトやモネタイトの両結晶が析出しやすいと思われる.析出したナノ粒子の形態は次のようであった.Tiでは約2μmの円盤状,六角柱状の結晶が集積していた.Zrでは,長径約200nmの楕円状と約100nmの細長い粒子の集合体であった.Nbでは,約50nmの粒状であった.また,Taでは約50nmのブロック状粒子が積層した状態であった.結晶の形態は,下地金属の結晶方位と陽極酸化によって生成した酸化被膜の性状に依存すると思われる.さらに,XPSの分析結果から,バルブメタルの酸化被膜中にP^<3+>,または,リン酸イオンが取り込まれることが分かった.この極性交互交換による低電圧の電解法は,リン酸カルシウム化合物のナノ粒子が生成しやすい表面特性を創製することを示唆している.バルブメタル上にリン酸カルシウムのナノ粒子を創製することを目的として,リン酸水溶液にハイドロキシアパタイト(HAP)を飽和させた電解液中で,バルブメタルを電極として極性を交互に反転させながら低電圧で電解処理をおこなった.その電解条件とナノ粒子のキャラクタリーゼーションを検討した.その結果,pH3の電解液では,TiとTaではHAPが,ZrではHAPとモネタイトが,NbではHAPとモネタイトおよびブルシャイトのナノ粒子が析出した.析出した結晶相は,電極近傍のOH^-の濃度と電解液中に存在するリン酸種に依存すると考えられる.TiとTaの場合,電解がすすむと,電極近傍のOH^-の濃度が高くなり,しかも,電解液中にリン酸種HPO_4^<2->が高濃度に存在するためにHAPが析出したと思われる.OH^-の濃度が低い場合は,ブルシャイトやモネタイトの両結晶が析出しやすいと思われる.析出したナノ粒子の形態は次のようであった.Tiでは約2μmの円盤状,六角柱状の結晶が集積していた.Zrでは,長径約200nmの楕円状と約100nmの細長い粒子の集合体であった.Nbでは,約50nmの粒状であった.また,Taでは約50nmのブロック状粒子が積層した状態であった.結晶の形態は,下地金属の結晶方位と陽極酸化によって生成した酸化被膜の性状に依存すると思われる.さらに,XPSの分析結果から,バルブメタルの酸化被膜中にP^<3+>,または,リン酸イオンが取り込まれることが分かった.この極性交互交換による低電圧の電解法は,リン酸カルシウム化合物のナノ粒子が生成しやすい表面特性を創製することを示唆している.1.研究目的極性交互交換低電圧電解法により,チタン表面にバイオマテリアルナノ粒子を創製することである.2.実験方法(1)チタン試料の作製と鏡面研磨:直径16mm,高さ5mmのチタン試料を自動研磨機にて鏡面研磨した.(2)電解処理:pH2のリン酸水溶液にハイドロキシアパタイト(HAP)を溶解し,試料と白金電極をパフ布でサンドイッチし,電流密度0.1A/cm^2の条件で直流を600秒間印加した.その際,60秒毎に極性を交互に交換した.水溶液の温度は37°Cに保った.通電後,蒸留水中で試料を超音波洗浄した.同様にpH3についてもおこなった.これらの試料をそれぞれpH2,pH3と呼ぶ.(3)試料をX線マイクロアナライザー(EPMA),プローブ顕微鏡(SPM),フェリー変換赤外分光(FTIR)およびX線光電子分析(XPS)を用いて分析した.3.研究成果(1)EPMA : pH2と3の両試料において,Pと0が分析域全体から検出されたが,Caは高濃度の部位と,ほぼバックグランドレベルの部位とがあった.極性交互交換低電圧電解法では,Pが酸化皮膜に導入された部位で,Caが高濃度となりリン酸カルシウムが析出した.(3)FTIR : pH2と3のFTIRスペクトルは,それぞれリン酸水素カルシウム二水和物(DCPD)とHAPのそれに一致した.(4)XPS : Ca/Pモル比はpH2では0.92,pH3では1.31であった.両試料ともCa欠損の組成であった.以上の結果から,極性交互交換低電圧電解法により,チタン表面にDCPDのナノ粒子を創製することができた.

生体親和性に優れるTi,Ta,Nb,Zrのバルブメタル上に,リン酸カルシウム化合物のナノ粒子を創製する目的で,リン酸水溶液にハイドロキシアパタイト(HAP)を飽和させた電解液中で,バルブメタルを電極として,その極性を交互に反転させながら20VDCの低電圧で電解した.電解条件とバルブメタル上に析出したリン酸カルシウム化合物のキャラクタリーゼーションを検討した.その結果,pH3の電解液中で電解すると,TiとTaではHAPが,ZrではHAPとモネタイトが,NbではHAPとモネタイトおよびブルシャイトのナノ粒子が析出した.結晶相は,電極近傍のOH^-の濃度と電解液中に存在するリン酸種に依存すると考えられる.TiとTaにHAPが析出した理由は,電解により電極近傍のOH^-の濃度が高くなり,しかも,電解液中にはリン酸種としてHPO_4^<2->が高濃度に存在するためと思われる.低いOH^-の濃度では,ブルシャイトやモネタイトの両結晶が析出しやすいと思われる.析出したナノ粒子の形態は次のようであった.Tiでは約2μmの円盤状,六角柱状の結晶が集積していた.Zrでは,長径約200nmの楕円状と約100nmの細長い粒子の集合体であった.Nbでは,約50nmの粒子の集合体であった.Taでは,約50nmのブロック状粒子が積層した状態であった.結晶の形態は,下地金属の結晶方位と陽極酸化によって生成した酸化被膜の性状の違いに依存すると思われる.また,XPSの分析結果から,バルブメタルの酸化被膜中にp^<3+>,または,リン酸イオンが取り込まれていた.これは,極性交互交換による低電圧電解法が,ナノ粒子のリン酸カルシウム化合物が析出しやすい表面特性を創製することを示唆している.
小腸パネト細胞機能の分子細胞と生理学的研究

感染防御に関与するパネト細胞は小腸線部の奥深く少数存在するために生理学研究の対象とされず、他の線部上皮細胞と同様にCFTRによるサイクリックAMP(cAMP)依存性CI^-分泌を行うかなど不明の点が多いままである。そこで本研究では「パネト細胞はCFTR CI^-チャネルによってCI^-を行うか?」、という積年の疑問に初めて答えると共に、世界に先駆けて「パネト細胞における単一細胞レベルにおける生理学的研究」に端緒をきることが本研究の目的である。昨年度には、このCI^-チャネルの電機生理学的性質の詳細を解析し、これまでに明らかになっているCFTRCI^-チャネルの性質との異同を明らかにすることができた。そこで本年度は、単一パネト細胞のmRNAをパッチ電極に回収して逆転写ー遺伝子増幅(RT-PCR)を行うという単一細胞RT-PCR法(パッチRT-PCR法)を適用し、これによってパネト細胞におけるCFTR遺伝子の発現を確認すること、更にはCFTR抗体を用いてCFTR蛋白の発現をも確認することを目的とした。その結果、次の成果が得られた。パネト細胞のCFTR遺伝子の発現の証明パッチクランプ全細胞電流記録法によってcAMP依存性CI^-チャネルが機能的に発現していることが確認された単一パネト細胞から細胞質を、パッチ電極内へ陰圧をかけて吸い込み、陽圧をかけてPCRチューブへこの細胞質回収し、これに逆転写させた上でセンスおよびアンチセンス・プライマーとポリメラーゼを加え、PCR装置を用いて遺伝子増幅させて、CFTR遺伝子の発現を確認できた。パネト細胞におけるCFTR CI^-チャネル蛋白の発現の証明既にシークエンスのわかっているラットCFTRの細胞外ドメインの部分シークエンスに対する抗体をいくつか作製し、これを用いてラット単離腺における免疫染色体(蛍光抗体法)を行い、パネト細胞においてCFTR蛋白の発現を確認した。感染防御に関与するパネト細胞は小腸腺部の奥深く少数存在するために生理学研究の対象とされず、他の腺部上皮細胞と同様にCFTRによるサイクリックAMP(cAMP)依存性Cl^-分泌を行うかなど不明の点が多いままである。そこで本研究では「パネト細胞はCFTR Cl^-チャネルによってCl^-分泌を行うか?」、という積年の疑問に初めて答えると共に、世界に先駆けて「パネト細胞における単一細胞レベルにおける生理学的研究」に端緒をきることが本研究の目的である。具体的には、このCl^-チャネルの電気生理学的性質の詳細を解析し、これまで明かになっているCFTR Cl^-チャネルの性質との異同を明らかにすることを主たる研究内容とする。またこの後に、単一パネト細胞のmRNAをパッチ電極に回収して逆転写一遺伝子増幅(RT-PCR)を行うという単一細胞RT-PCR法(パッチRT-PCR法)を適用する。これによってパネト細胞におけるCFTR遺伝子の発現を確認することも行う。本年度はパネト細胞のcAMP依存性Cl^-チャネル電流の記録・解析を行った。まず、モルモット及びラット小腸から私達が開発した機械的振動法によって、腺部上皮を絨毛部上皮から分けてまるごと単離した。この中に、ニュートラルレッドによる細胞内顆粒の生体染色法によって生きたままパネト細胞を同定し、パッチクランプ全細胞記録法を適用した。実験後、更に抗ライソザイム抗体を用いた免疫染色法によってパネト細胞であることを確認した。全細胞パッチクランプ下にcAMP刺激カクテル(db-cAMP+forskolin+IBMX)を投与して細胞内cAMP濃度を増加させ、これによって活性化されるCl^-電流を記録することができた。

このCl^-電流が小腸腺部の他の上皮細胞で知られているCFTR Cl^-チャネルの電流と性質が同じであるかどうかを、次の6つのタライテリアによって判定した。:i)H89などのcAMP依存性蛋白キナーゼ阻害剤による抑制、ii)直線的「電流-電圧特性」、iii)時間非依存性活性化キナティクス、iv)Br^->Cl^->I^-というアイゼンマンIII型のアニオン選択性順序、v)グリベンクラミド感受性、vi)DIDS非感受性。その結果、これらすべてがCFTR型であることが判明した。しかし、グリベンクラミドはCFTRより高濃度必要であるなど、若干のちがいも確認された。感染防御に関与するパネト細胞は小腸腺部の奥深く少数存在するために生理学研究の対象とされず、他の腺部上皮細胞と同様にCFTRによるサイクリックAMP(cAMP)依存性CI^-分泌を行うかなど不明の点が多いままである。そこで本研究では「パネト細胞はCFTR CI^-チャネルによってCI^-分泌を行うか?」、という積年の疑問に初めて答えると共に、世界に先駆けて「パネト細胞における単一細胞レベルにおける生理学的研究」に端緒をきることが本研究の目的である。昨年度には、このCl^-チャネルの電気生理学的性質の詳細を解析し、これまで明かになっているCFTR CI^-チャネルの性質との異同を明らかにすることができた。そこで本年度は、単一パネト細胞のmRNAをパッチ電極に回収して逆転写-遺伝子増幅(RT-PCR)を行うという単一細胞RT-PCR法(パッチRT-PCR法)を適用し、これによってパネト細胞におけるCFTR遺伝子の発現を確認すること、更にはCFTR抗体を用いてCFTR蛋白の発現をも確認することを目的とした。その結果、次の成果が得られた。パネト細胞のCFTR遺伝子の発現の証明パッチクランプ全細胞電流記録法によってcAMP依存性Cl^-チャネルが機能的に発現していることが確認された単一パネト細胞から細胞質を、パッチ電極内へ陰圧をかけて吸い込み、陽圧をかけてPCRチューブヘこの細胞質を回収し、これに逆転写反応をさせた上でセンスおよびアンチセンス・プライマーとポリメラーゼを加え、PCR装置を用いて遺伝子増幅させて、CFTR遺伝子の発現を確認できた。パネル細胞におけるCFTR Cl^-チャネル蛋白の発現の証明既にシークエンスのわかっているラットCFTRの細胞外ドメインの部分シークエンスに対する抗体をいくつか作製し、これを用いてラット単離腺における免疫染色法(蛍光抗体法)を行い、パネト細胞においてCFTR蛋白の発現を確認した。
シンガポールの中等教育段階における探究型学習に関する研究-「生きる力」を備えた中高校生の育成を目指して-

本研究は、シンガポールの中等教育段階における探究型学習に関する実態調査を通して、日本の総合的な学習や探究型学習への示唆を得ることを目的とし、政策面および実践面の両面からその特質を検討した。政策分析を通して、シンガポール教育省は学力の幅を広げ、新たな知識の創造を目指して知識活用能力、課題解決能力、多様なスキルの育成を強調していることが明らかになった。具体的には、教育省は1997年以降、21世紀の知識基盤経済に向けた教育政策を発表し、2005年には生徒の能動的学習を推進するTeach Less, Learn More政策を導入した。また、後期中等教育カリキュラムの「知識スキル科目群」には「プロジェクトワーク」「ジェネラルペーパー」に加え、2006年には「知識と探究(K&I)」という科目が登場した。それらはいずれも教科横断的な知識を活用し、創造的・批判的思考力、コミュニケーションスキルを主眼とした探究型の学習として特に注目されるものである。従来の知識伝達型の教科・科目とは全く異なる概念を持つそれらの科目は、大学入試に直結する評価システムによってその重要性を保持している。現場における政策の具現化についての検証と実践レベルの詳細な情報を収集するために実施した現地調査では、これまで知られていなかった新科目K&Iの実態や、知識スキル科目担当教師の教育観、課題意識を探索できた。現場の教師も、詰め込み教育を脱却し、今後求められる知の統合や創造、批判的・論理的思考力の養成を重視し、平常の授業を革新しようと努力している。例えば、少人数のチュートリアル形式や異なる専門分野を持つ複数の教師によるT-T授業、グループあるいは個人でのリサーチを基盤とした授業等が展開されている。我が国においても、活用能力やリテラシー等を含めた探究型学習や「生きる力」が強調されている。しかし、評価システムの整備や大学入試との連携の面では課題が多い。この点で、シンガポールの事例は参考になる。
ＰＰＡＲγ刺激薬による膵臓がん治療法の開発

ヒト膵臓がん細胞に対するPPARγ刺激薬トログリタゾンの作用を検討したところ、トログリタゾンは濃度依存的に抗腫瘍効果を示した。また、その作用において、PPARγは関与しないことを明らかにした。Panc-1細胞では、重要な経路を見出すことはできなかったが、MIA Paca-2細胞においては、JNK経路がトログリタゾンの作用に一部関与していることを明らかにした。さらにMIA Paca-2細胞を用いて雄性ヌードマウスに移植後、トログリタゾンを経口投与したところ、有意な差はないものの、腫瘍体積並びに重量は低下傾向を示し、in vivoにおいても抗腫瘍効果を示す可能性を示した。膵臓がんは早期発見が難しく、最も予後の悪いがんの一つとして知られている。また、膵臓がんに対する化学療法は限られており、新たな化学療法の探索が急務の課題である。これまで、腎臓がんに対するPPARγ刺激薬の抗腫瘍効果を明らかにしてきた。そこで、膵臓がんに対するPPARγ刺激薬の抗腫瘍効果を明らかにすることを目的に、研究を実施している。前年度までにPPARγ刺激薬インスリン抵抗性改善薬であるトログリタゾンならびにピオグリタゾンの抗腫瘍効果を検討し、ヒト膵臓がん細胞株Panc-1ならびにMIA Paca-2に対して、トログリタゾンは濃度依存的に細胞増殖阻害効果を示すものの、ピオグリタゾンは効果を示さないこと、またトログリタゾンの効果はPPARγ非依存的であることを明らかにしてきた。今年度は、さらにその細胞増殖阻害効果に関与する因子を明らかにする目的で、種々のシグナル伝達系タンパク質の発現をWestern blotting法により検討した。その結果、どちらの細胞においてもJNKのリン酸化レベルが上昇し、MIA Paca-2細胞においては、JNK阻害剤であるSP600125の併用処置により、生存率が有意に回復した。一方、Panc-1細胞においては、生存率の変動は認められなかった。したがって、MIA Paca-2細胞においては、トログリタゾンがJNK経路を介して細胞死を引き起こすこと、Panc-1細胞ではJNK経路が活性化するものの細胞死への寄与は小さいことが示唆された。さらにどちらの細胞においても、ERKおよびAktリン酸化レベルの上昇、DNA修復関連酵素ERCC1の低下等も確認された。さらに、膵臓がんに汎用されるゲムシタビンと糖尿病治療薬の併用効果の検討についても着手し、一部の経口糖尿病薬でゲムシタビンの作用増強効果を確認した。そこで、膵臓がんに対するPPARγ刺激薬の抗腫瘍効果を明らかにすることを目的に、研究に着手した。まず、PPARγ刺激薬として、インスリン抵抗性改善薬であるトログリタゾンならびにピオグリタゾンの抗腫瘍効果を検討した。すなわち、ヒト膵臓がん細胞株Panc-1ならびにMIA Paca-2に対する細胞増殖阻害効果を検討した。Panc-1細胞では、ピオグリタゾンの効果は認められなかったものの、トログリタゾンは濃度依存的に細胞増殖阻害効果を示した(IC50=51.3 μM)。MIA Paca-2細胞においてもピオグリタゾンの効果は弱く、トログリタゾンは濃度依存的に細胞増殖阻害効果を示した(IC50=49.9 μM)。いずれの細胞においても、PPARγタンパク質の発現はWestern blotting法により確認できたものの、PPARγ阻害剤GW9662の併用により生存率の回復は認められなかったことから、PPARγ非依存的な効果であることが示唆された。また、トログリタゾン処置によりクロマチン凝集は認められたものの、全カスパーゼ阻害剤Z-VAD-FMK併用により生存率の回復は認められなかったことから、トログリタゾンはアポトーシスを引き起こすものの、カスパーゼを介さないことが示唆された。そこで、本課題では膵臓がんに対するPPARγ刺激薬の抗腫瘍効果を明らかにし、新たな膵臓がん治療法への応用を目的とした。前年度までにヒト膵臓がん細胞株Panc-1ならびにMIA Paca-2を用いて、PPARγ刺激薬であるトログリタゾンの細胞増殖阻害効果を検討し、PPARγ非依存的であり、MIA Paca-2ではJNK経路を介して細胞死を引き起こすことを明らかにしてきた。今年度ではさらに詳細な作用機序を明らかにするとともに、in vivoにおける効果を検討した。

すなわち、MEK阻害剤であるU0126およびERK阻害剤であるERK inhibitor IIを用い、トログリタゾンのIC50値付近の濃度と併用処置した。その結果、トログリタゾン単独処置と比較して生存率の回復は認められなかったことから、MEKおよびERKの経路は関与しないことが示唆された。次にMIA Paca-2をBalb/c雄性ヌードマウスの背部に皮下移植した。MIA Paca-2が生着したことを確認し、移植後14日後をDay 0として、Day 1から週3回トログリタゾンを200 mg/kgの用量で2週間経口投与した。腫瘍体積は(長径×短径×短径)/2で算出して評価するとともに、体重を安全性の指標とした。移植後28日に腫瘍を摘出し、その重量も測定した。その結果、トログリタゾン投与群において、有意な差は認められないものの、ビークル投与群と比較して腫瘍体積ならびに重量は低下傾向を示した。したがって、トログリタゾンはin vivoにおいても抗腫瘍効果を示す可能性が考えられた。医療系薬学平成25年度では、PPARγ刺激薬による細胞増殖抑制効果の作用機序解明として、p38 MAPK経路を中心とした寄与の解明を予定しており、ほぼ予定通りに達成していると考えている。この経路の寄与が大きいと予想していたが、結果としては、それほど顕著でないことが明らかとなった。計画通り進まない時の対応として、トランスクリプトーム解析、プロテオーム解析等の網羅的な解析を計画していたが、DNA修復系が関与することが認められ、今後はDNA修復系を着目して研究を進める予定である。また、ゲムシタビンと糖尿病治療薬との併用効果についても着手し、一部の結果を得ることができた。このこともおおむね予定通りである。平成24年度では、PPARγ刺激薬が、膵臓がん細胞に対して抗腫瘍効果を示すのか、示すとすればその細胞死形態や作用機序を明らかにすることを計画しており、ほぼ予定通りに達成していると考えている。また、そのシグナル経路の検討にも着手しており、これも予定通りといえる。平成26年度では、さらにin vitroにおいて、トログリタゾンの作用機序として、DNA修復系の関与を明らかにすること、ゲムシタビンとトログリタゾンを含む糖尿病治療薬の併用効果について明らかにすることを予定している。また、in vivoにおける検討にも着手する予定で、まず第1段階としてJNK経路の関与が示唆されたMIA Paca-2細胞の担がんマウス作成から実施する予定である。平成25年度では、さらにこの作用がトログリタゾン選択的なのか、あるいは他のPPARγ刺激薬についても検討するとともに、トログリタゾンの作用機序について、特にそのMAPK経路を中心に検討する予定である。一方で、臨床上膵臓がんに対してはゲムシタビンが用いられていることから、ゲムシタビンの有用性を高めるための方策についても検討に着手する。すなわち、他の抗がん剤との併用や、膵臓がんでは糖尿病を発症することから、他の糖尿病治療薬との併用により、ゲムシタビンの有用性が高めることができるのか、できるとすればどのような作用機序なのかについて検討する予定である。
マウス腎虚血再灌流障害モデルにおけるEgr-1の役割

C57BL/6Jマウスを用い、右腎を摘出した後、左腎に45分間の虚血を行い、採血および左腎の摘出を施行した。再灌流後12時間以降においてBUN, Cre値の有意な上昇とHE染色による急性尿細管壊死像を認めた。腎組織中のTNF-αおよびMPO活性の測定では、各々再灌流後3時間と6時間において有意な上昇を認めた。また、ウエスタンブロットによる解析では、再灌流後6090分においてEgr-1の発現の促進が認められた。これらの結果から、マウスにおける腎虚血再灌流によるTNF-αの産生上昇、好中球の集積および腎障害の形成にEgr-1の発現の促進が関与する可能性が示唆された。初年度である、平成25年度の研究内容は、マウス腎虚血再灌流よる腎障害モデルが、再現性が確保された正確なモデルであることを確認することを目的として開始した。実験内容は、C57BL/6J雄マウス(20-25g, 8-12週)を使用し、ペントバルビタール50mg/kgの腹腔内投与により麻酔した後、腹部正中切開をおき、まず右腎臓を摘出する。つぎに左腎茎部において、血管鉗子によって動静脈を遮断し、45分間の虚血を行い、これを解除し再灌流を行った。いったん閉腹したのち、虚血再灌流後24時間において、腹部大動脈より採血を行い、ただちに頸椎脱臼により、安楽死させた。この採血によって得られたサンプルから、血清BUN、Cre値の測定をそれぞれウレアーゼ法、酵素法により測定した。これにより、Sham operationを施行したcotrol群と比較し、腎虚血再灌流群では、有意なBUNおよびCreの上昇を認め、再現性も確認された。また、これらの実験結果のデータを保存、解析するために、PCおよび統計ソフトなどを購入した。平成25年1月9日13日まで、第43回SCCM(Sosiety of Critical Care Medicine) congressに当教室より発表された演題(ポスター)の共同演者として参加した。同学会は世界を代表する集中治療学会であり、本研究に関連するsessionもいくつか見られた。特に敗血症におけるmicroRNAを用いた炎症性反応の解析結果や新たな治療ターゲットとしての炎症性メディエーターなどの講演は今後の研究に役立つものと思われた。目的)マウス腎虚血再灌流障害モデルにおいて、transcription factorの1つであるEgr-1が腎障害にどのように関与しているかを調べる。研究内容)マウス腎虚血再灌流障害モデル:C57BL/6J雄マウス(20-25g, 8-12週)を使用し、ペントバルビタール50mg/kgの腹腔内投与により麻酔した後、腹部正中切開をおき、まず右腎臓を摘出する。つぎに左腎茎部において、血管鉗子によって動静脈を遮断し、45分間の虚血を行い、これを解除し再灌流を行う。虚血再灌流後24時間において腹部大動脈より採血を行い、ただちに頸椎脱臼により安楽死させ、左腎臓を速やかに摘出しH.E染色により組織学的に評価するため、冷凍保存を施行した。現在、採血結果によるBun, Cre値およびH.E染色による腎組織評価は、45分の虚血とその後の再灌流による再現性のある腎障害として確認されている。また、虚血再灌流障害によって、腎組織中のEgr-1の発現が促進されることが確認されている。次の課題として、Egr-1の発現を選択的に抑制した場合、この急性腎障害が軽減されるかどうかについての実験に取りかかる予定である。目的)出血性ショックにおける腎の虚血再灌流障害の発生機序として、単球により産生されるTNF-αは重要な役割を果たすことが示されている。本研究ではTNF-αの転写因子のひとつであるEarly growthresponsefactor(Egr)-1が、マウスの虚血再灌流性腎障害の発生にどのように関与するかを明らかにし、これをターゲットとした治療の可能性を検討することを目的とした。研究内容)C57BL/6J雄マウス(8週12週)を用い、麻酔後、腹部正中切開で開腹し、右腎臓を摘出後、左腎茎部において血管鉗子を用いて45分間の虚血を行い、これを解除し再灌流を行った。再灌流後6,12,24、48時間で腹部大動脈より採血および左腎の摘出を施行し、BUN, Cre値の測定とH.E染色による組織学的評価を行った。12時間以降においてBUN, Cre値の有意な上昇と急性尿細管壊死像を認めた。また、摘出された虚血再灌流後の腎組織中のTNF-αのERISAによる解析では、再灌流後3時間以降で有意な上昇を認めた。ウエスタンブロットによる腎組織中のEgr-1の解析では、再灌流後6090分においてEgr-1の発現の促進が認められた。これらのことから、マウス腎虚血再灌流障害モデルによって、Egr-1の発現が促進され、TNF-αの産生を促進し、腎虚血再灌流障害によるBUN, Cre値の上昇を引き起こす可能性が示唆された。今後の課題としては、Egr-1のアンタゴニスト、あるいはノックアウトマウスの使用などによって、Egr-1の発現を選択的に抑制した場合、腎虚血再灌流障害が軽減されるかどうかについて検討が必要と考えられる。

C57BL/6Jマウスを用い、右腎を摘出した後、左腎に45分間の虚血を行い、採血および左腎の摘出を施行した。再灌流後12時間以降においてBUN, Cre値の有意な上昇とHE染色による急性尿細管壊死像を認めた。腎組織中のTNF-αおよびMPO活性の測定では、各々再灌流後3時間と6時間において有意な上昇を認めた。また、ウエスタンブロットによる解析では、再灌流後6090分においてEgr-1の発現の促進が認められた。これらの結果から、マウスにおける腎虚血再灌流によるTNF-αの産生上昇、好中球の集積および腎障害の形成にEgr-1の発現の促進が関与する可能性が示唆された。次の段階として、Egr-1の発現をアンタゴニストを用い選択的に抑制した場合、腎障害が軽減されるかどうかについての検討を行う予定である。しかしながら、当初の実験計画書においてアンタゴニストとして使用予定であったPD98059 (ERK1/2の発現を抑制することで、Egr-1の産生を抑制する。)のin vivoでの使用が困難であることが明らかとなり、今後、Egr-1ノックアウトマウスを使用し、この問題に対処することを検討している。救急医学目的)腎虚血再灌流障害モデルにおいて、Egr-1の発現が急性腎障害にどのように関与しているかについて検討する。研究内容)マウスを以下に示す3群に分ける。3,Egr-1ノックアウトマウスgroup:Egr-1ノックアウトマウスを用い、右腎を摘出し、左腎に虚血再灌流を行う群、これら3群について、採血によるBUN, Cre値、腎組織中のTNF-α、Egr-1の発現に関して比較検討し、Egr-1の発現が臓器障害にどのように関与しているか検討する。当初予定されていた予定では、腎虚血再還流におけるTNF測定およびEgr-1などの腎組織における発現について検討する予定であったが、現時点では、組織学的な分析はまだ行われていない。しかしながら、実験モデルの再現性が確認されたため、平成26年度はこれらについても実験を開始する予定である。しかしながら、国際学会参加により、本研究分野での新たな知見も得られたため、今後の研究に大いに活かしてゆく予定である。Egr-1の発現を抑制するアンタゴニストを用いて、腎障害が軽減されるかどうかについての検討を行う予定であったが、当初の実験計画書において、Egr-1のアンタゴニストとして使用予定であったPD98059 (ERK1/2の発現を抑制することで、Egr-1の産生を抑制する。)のin vivoでの使用が困難であることが明らかとなり、実験に遅れが生じてしまった。今後は、虚血再灌流障害による腎組織中のTNF-αの測定を行うとともに、免疫染色法による腎組織における単球、およびマクロファージのEgr-1発現の解析に取り組む予定である。実験内容としては、以下に示す。虚血再灌流後、1, 3, 6, 12, 24時間において左腎を摘出し、ただちに2% paraformaldehydeで固定する。パラフィン切片を作成し、一次抗体としてrabbit Egr-1 IgG antibodyとインキュベーションした後、二次抗体にて処理し、腎組織における単球、およびマクロファージにおいて、腎虚血再灌流によってEgr-1の発現が上昇している否か、組織学的評価を行う。研究を遂行する上で、腎組織中でのEgr-1の上昇はすでに多くの先行研究で示されているが、単球、マクロファージにおける発現上昇の確認は、先行研究が少ないため、これを再現性のある結果として確認することが重要であると考えられる。
ブドウおよびカキからのウイルス・ウイロイドの探索と高精度診断法の開発

本課題では、国内に発生するブドウのウイルス・ウイロイド病やカキに発生する接ぎ木伝染性果皮障害について発生実態調査を行い、病原の究明と症状や被害との関係を明らかにすることを目的の一つとした。国内で栽培されているブドウの主要品種であるピオーネおよび巨峰で問題となっているルゴースウッド症状について重点的にウイルスとの関連を調査し、発症樹の全てからRupestris stem pitting-associated virus (RSPaV)が検出され、RSPaVが病原であることが強く示唆された(Nakaune et al., 2006;中畝ら、2007)。また、カキからはウイルスは検出されなかったものの、4種のウイロイドが検出され、そのうち1つは新種のウイロイドであると推定された。今のところ接ぎ木伝染性の果皮障害との関連は判然とせず、今後の研究の継続によって原因の究明が期待される。一方、ブドウからウイルスの変異系統の探索・収集と塩基配列解析を行うとともに、得られた塩基配列情報に基づいて変異に影響されない高精度な検出・診断法の開発を試みた。国内から広くブドウ試料を採集し、RSPaVの系統解析を行ったところ、海外で報告されている4種の遺伝的変異系統を含む6種の系統が見いだされた。これら系統のゲノム解析に基づいて、全ての系統を高精度・高感度で検出できるPCRプライマーを設計することができた(Nakaune and Nakano, 2006)。また、ブドウの枝からウイルス診断に利用可能な磨砕試料の調製法を開発した。従来、果樹の枝から磨砕試料を調製するためには、乳鉢。乳棒等を用いた時間と労力を必要とする作業を強いられてきた。本課題において開発したサンドペーパー法を利用することで、ブドウウイルスのRT-PCRやエライザによる診断に使用する磨砕試料を従来法の約1/10の時間で調製できるようになった。ブドウの休眠期における枝を用いたウイルス診断が容易となり、1年を通してウイルス診断を実施できるようになった(Nakaune and Nakano, 2006)。カキでは、各地でバッテン果やイレズミ果と呼ばれる原因不明の果皮障害が発生し問題となっている。本障害は接ぎ木で伝染するとの報告があるため、ウイルスやウイロイドが病原として考えられている。そこで、17年度は、山形県、新潟県、和歌山県、岡山県および広島県のカキからウイルスおよびウイロイドの探索を行った。その結果、Pear blister canker viroidを検出するために設計されたPCRプライマーを用いたRT-PCRによって多くのカキから増幅断片が得られた。それらの塩基配列を解析した結果、異なる4種の配列が確認された。塩基配列データベースに対する相同性検索の結果、3種はApple fruitcrinkle viroid、Citrus viroid OSおよびGrapevineyellow speckle viroid 1とそれぞれ95%以上の相同性を示し、これらウイロイドがカキに感染していることを明らかにした。さらに残りの1種はCitrus Viroid I-LSSと部分的に高い相同性を示すものの、既報のウイロイドとは明らかに異なることから、新種のウイロイドである可能性が示された。現在、これらカキから検出されたウイロイドについて全長配列を解析している。一方、果樹ではこれまでにひも状ウイルスが多く確認されている。そこで、数種のひも状ウイルスの検出が期待できるプライマーを用いてRT-PCRを行ったが、ウイルス様の配列は検出されなかった。今後は、カキからのウイルスおよびウイロイドの探索を進め、接ぎ木伝染性果皮障害との関連を調査する予定である。ブドウについては、盛岡県、秋田県および山形県の一般ブドウ栽培園から試料を採集し、現在、それらについてウイルス診断ならびに塩基配列の解析を行っている。得られた情報に基づき、より高精度な診断法の開発を行う予定である。

乳棒等を用いた時間と労力を必要とする作業を強いられてきた。本課題において開発したサンドペーパー法を利用することで、ブドウウイルスのRT-PCRやエライザによる診断に使用する磨砕試料を従来法の約1/10の時間で調製できるようになった。ブドウの休眠期における枝を用いたウイルス診断が容易となり、1年を通してウイルス診断を実施できるようになった(Nakaune and Nakano, 2006)。
π電子イオニクス：電荷を有するπ電子系の合成と自在な集合化

本研究課題では、新たなπ電子系イオンを創製し、その集合化および電子機能材料・デバイスへの展開、さらに物性や集合体形態に関わる学理の解明に挑戦した。今年度は電荷を有するπ電子系の合成および集合化を中心に検討した。とくに、拡張π電子系であるポルフィリンのAu(III)錯体が+1価のπ電子系カチオンとしてふるまうことに着目し、多様な対アニオンの導入やポルフィリンの周辺修飾によって構成ユニットの規則配列に基づく次元制御型集合体(超分子ゲル・液晶)の形成を新たに見出した(iScience 2019, Chem. Asian J. 2019)。また、π電子系に導入した酸ユニットの脱プロトン化によるπ電子系アニオンの修飾を実現し、π電子系の拡張とアニオンの安定化(Chem. Eur. J. 2019)や液晶中間相の発現(Chem. Eur. J. 2018)、新規π電子系骨格への展開(Chem. Commun. 2018)を報告した。また、アニオン会合能を有するπ電子系のアニオン会合挙動および次元制御型集合体への展開を行い、ヘテロ芳香環導入による動的挙動の検証(Chem. Asian J. 2019)や環状構造形成による高いアニオン会合能の発現(Org. Lett. 2018)、アニオン会合を利用した有機触媒への展開(Org. Lett. 2018)を報告した。一方、π電子系へのカチオンおよびアニオン部位の導入による双性イオンの形成と自己会合挙動の形成も実現した(Chem. Eur. J. 2018)。さらに、自己集合体(ナノキューブ)におけるゲスト種であるπ電子系アニオンの効果(Nature Commun. 2018, 2019)に関する内容を共同研究で実施した。π電子系イオンからなる集合体の構成ユニットの形成手法として、イオン会合体を形成するπ電子系の合成、酸ユニットを導入したπ電子系の開発、さらにπ電子系の金属錯化による電荷付与を実現した。またイオン種の交換手法を検証し、多様な組み合わせを得る方法を開拓した。とくに、安定性や誘導体展開に優れたポルフィリンAu(III)錯体を基盤とした集合体形成に成功し、π電子イオニクスを確立する基礎的な事項を発表論文としてまとめ、公表することができたため。電荷を付与したπ電子系骨格の設計・合成、周辺修飾・誘導体の合成、電荷付与手法の開拓・検証、集合化に関わる最適化、さらに得られた集合体(材料)の物性・機能性への展開を継続して実施する。
アドレノメデュリン-RAMP2システムによる血管不全治療法の検討

血管作動性ペプチドであるアドレノメデュリンの受容体活性調節蛋白(RAMP2)が血管不全の新たな治療標的となるか検討を行った。血管内皮細胞特異的RAMP2ノックアウトマウスを用いた検討では、血管障害後、コントロールマウスに比較して、新生内膜肥厚と炎症性サイトカインや酸化ストレスレベルの亢進を認めた。一方、新たに樹立した血管内皮細胞特異的RAMP2過剰発現マウスでは、コントロールマウスに比較して、血管障害部位の新生内膜形成や炎症が抑制されていた。これらのことから、RAMP2の活性を調節することにより、血管不全に対する新たな治療標的となり得ることが明らかとなった。アドレノメデュリン(AM)は、全身の組織で広範に産生され、多彩な生理活性を有するペプチド因子である。これまでに我々は、AMが血管の恒常性維持に必須であることを報告してきた。AMの受容体システムは、Gタンパク共役型受容体であるCLRに、受容体活性調整タンパクであるRAMPが結合し、受容体としての機能が調整されている。RAMPのサブアイソフォームの中でも、RAMP2ノックアウトマウス(RAMP2-/-)のみが、AM-/-マウスの血管の異常を再現して胎生致死となることから、我々は、RAMP2がAMの血管における生理機能を制御しており、AMに代わる新たな治療標的分子となる可能性を考えた。本年度の研究では、成体が得られるRAMP2ヘテロノックアウトマウス(RAMP2+/-)、および新たに樹立した血管特異的RAMP2過剰発現トランスジェニックマウス(E-RAMP2Tg)を用いて、血管傷害におけるRAMP2の病態生理学的意義を検討した。経皮的冠動脈インターベンション(PCI)術後の血管再狭窄の病態モデルとして、マウス大腿動脈内にワイヤーを挿入し、血管内皮の剥離と血管の拡張処理を行い、術後の動脈硬化病変を評価した。RAMP2ヘテロノックアウトマウス(RAMP2+/-)の血管では、野生型マウス(WT)と比較して、RAMP2の発現は半分に低下していた。RAMP2+/-では、ワイヤー傷害後4週間後の新生内膜形成が増悪しており、αSMA陽性の平滑筋細胞数の増加を認めた。一方、E-RMAP2Tgの血管では、RAMP2の発現が約7倍に上昇していた。E-RMAP2TgはWTに比較して新生内膜形成が抑制されており、病変部のマクロファージ浸潤も抑制されていた。更にE-RMAP2Tgの血管では、IL-1β, IL-6などの炎症サイトカインの発現低下と、NADPH oxidaseの発現低下を認めた。アドレノメデュリン(AM)は、全身で広範に産生され、多彩な生理活性を有するペプチドである。我々はこれまで、AMおよびAMの受容体活性調節タンパクの一つであるRAMP2のノックアウトマウスが、共に血管の発達不全により胎生中期に致死となることから、AM-RAMP2系による血管新生作用を明らかとしてきた。さらに血管内皮細胞特異的RAMP2ノックアウトマウスも、そのほとんどが血管の構造異常により周産期に致死となることから、血管内皮細胞のAM-RAMP2系の重要性を報告してきた。本研究では、AM-RAMP2系の病態生理学的意義を明らかとするため、成体が得られるRAMP2ヘテロノックアウトマウス(RAMP2+/-)を用いて、Wire injury modelを作成し、動脈硬化病変部の検討を行なった。Wire injury 4週間後、RAMP2+/-では野生型マウス(WT)に比較して、有意に新生内膜肥厚が亢進していた。RAMP2+/-では再内皮化が抑制され、平滑筋の増殖が亢進していた。さらにRAMP2+/-では、新生内膜および外膜でのマクロファージ浸潤が亢進しており、炎症性サイトカインの発現や酸化ストレスレベルの亢進を認めた。次に、成体において血管内皮細胞のRAMP2欠損を誘導することができる、薬剤誘導型の血管内皮細胞特異的RAMP2ノックアウトマウス(DI-E-RAMP2-/-)を用いて、同様の検討を行った。DI-E-RAMP2-/-ではWTに比較して、血管病変部のRAMP2発現が30%程度に低下していた。DI-E-RAMP2-/-ではWTに比較して、新生内膜が肥厚し、炎症性サイトカインや酸化ストレスレベルの亢進を認めた。以上の結果から、血管におけるAM-RAMP2系は、炎症や酸化ストレスを抑制することで、新生内膜形成を抑制し、抗動脈硬化作用を有することが明らかとなった。26年度が最終年度であるため、記入しない。循環器内科学26年度が最終年度であるため、記入しない。