hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
細胞機能変化と同期する光学活性ハイドロゲルからなる細胞培養システムの構築

緩衝溶液(pH7.5)にポリマーを溶解し、500nmにおける種々の温度での透過率をUV-vis分光光度計を用いて測定した。精製水中で、P(L-HMPMA)は30°Cで濁度を生じて沈殿を形成したが、緩衝溶液中では、22°C付近から透過率が減少し、沈殿の形成が観察された。さらに、イオン強度を0.05から0.15Mにまで上げた場合、その透過率減少が開始する温度は一様に19°Cであった。P(L-HMPMA)は、光学活性なモノマーから構成されているため、側鎖間のパッキング状態が高く、高分子鎖全体としてもコンパクトな状態で水中に溶存していると考えられる。側鎖間に水素結合性相互作用が存在し、生理条件下の水溶液中では、より高い水和状態を示しその透過率変化は相対的に高い温度で観察されることが予測されたが、コンパクト状態のP(L-HMPMA)鎖は、塩存在下の緩衝溶液中で、さらに脱水和状態が誘引されたことは、動的光散乱の結果から、緩衝溶液中で高分子鎖がさらに大きな集合体に変化したことと関連している。精製水中で、約10nmと90nmに散乱強度分布を示したP(L-HMPMA)は、緩衝溶液中では、より大きなそして広い分布に変わり、塩析効果によりさらに脱水和状態を誘引し高分子鎖間で凝集したものと考えられた。また、高感度DSCより、水和から脱水和状態に変化するΔHは非常に小さく、水に溶解状態で既にある構造体を形成していることを示唆した。本研究で新規に合成したP(HMPMA)は、光学活性、不活性にかかわらず水中でLower Critical Solution Temperature (LCST)型の相転移挙動を示す。全く新しい感温性高分子であることがわかった。しかし、その挙動は、光学活性なP(l-HMPMA)と光学不活性であるP(dl-HMPMA)とでは、大きく異なっていた。P(l-HMPMA)の相転移挙動が、P(dl-HMPMA)のそれより低温側で観察され、さらに昇温時と降温時で相転移にヒステリシスが存在していた。また、光学不活性なP(dl-HMPMA)は、相転移温度以上でコアセルベートを形成し、固体沈殿は生成しなかった。すなわち、ポリマー自身の相転移挙動が、光学活性基により影響を受けた全く新しい感温性ポリマーであるといえる。さらに、これらのモノマーからなるハイドロゲルの膨潤度変化の温度依存性を測定すると、ポリマー水溶液の透過率変化と同様に、P(l-HMPMA)の相転移挙動が、P(dl-HMPMA)のそれより低温側で起こり、温度変化に対するヒステリシスも示した。その一方で、P(dl-HMPMA)はヒステリシスを全く示さない膨潤度変化を示した。さらに、P(l-HMPMA)とP(dl-HMPMA)は、収縮時のハイドロゲルがそれぞれ白濁と透明であり、収縮した状態での水和状態が異なっていることもわかった。
アミロイドβ蛋白凝集抑制作用を有するアルツハイマー病予防薬の開発

(1)釣藤鈎および牡丹皮には、in vitroおよびin vivoにおいてAβ蛋白の凝集を制御することが確認され、さらに、牡丹皮は細胞毒性作用を有するとされるAβオリゴマー(4量体および8量体)を減少させることが確認された。牡丹皮の有効成分が1,2,3,4,6-penta-O-galloyl-β-D-glucopyranose(PGG)であることが示唆された。また、このPGGは経口投与においても有効であることが示唆された。PGGはまたアルツハイマー病モデル動物の認知機能を改善した。これらの有効性はPGG以外の成分には認められなかった。さらに、これらの生薬およびPGGはアルツハイマー病モデル動物において、死亡率増加、体重、肝機能、腎機能、電解質バランスなど重篤な有害事象は認められず、安全性の面からも問題はないと考えられた。これらのことからPGGはAβ蛋白を指標としたアルツハイマー病disease-modifying drugの創薬研究において重要なリード化合物になりえることが示唆された。(2)神経疾患に有効であるとされる生薬でその化学構造式のわかっている生理活性物質78種について、アミロイド蛋白凝集抑制作用および脱重合作用に対する一次スクリーニングをThioflavinT法を用いて行ったところ、黄ごん、黄連、大黄、紫根などの生理活性物質にその活性が認められた。PGGと同様、その安全性や小動物における有効性を検討している。【方法】牡丹皮を水、メタノールおよびエタノールで抽出し実験に用いた。Aβ_<1-40>蛋白およびAβ_<1-42>蛋白の凝集抑制作用ならびに凝集蛋白脱重合作用は、Thioflavin-T法によって検討した。In vivoにおいては、APPトランスジェニックマウス(Tg2576)に牡丹皮およびPGGを経口投与し、脳切片を作成した後、Thioflavin-Sで染色して検討した。【結果】牡丹皮はAβ_<1-40>蛋白に対し10μg/mlで50%、Aβ_<1-42>蛋白に対し100μg/mlで40%まで凝集を抑制し、用量依存性が観られた。また、牡丹皮は凝集したAβ_<1-40>蛋白、Aβ_<1-42>蛋白ともに100μg/mlで20%まで脱重合し、この結果は原子間力顕微鏡でも確認された。さらに、牡丹皮をトランスジェニックマウス(Tg)に経口投与しても脳で用量依存的なAβ蛋白凝集老人斑の減少が認められた。牡丹皮からHPLC分析により同定された有効成分中、PGGに顕著なAβ_<1-42>蛋白の凝集抑制作用、凝集蛋白の脱重合作用を認めた。また、Tg2576にPGGを経口投与すると有意なAβ蛋白凝集斑の減少が認められた。さらに、脳内不溶性Aβ蛋白量および血漿中Aβ蛋白量の顕著な低下も確認した。【結論】牡丹皮及びその成分PGGは経口投与でAβ蛋白の凝集を制御することから、今後ADの治療や予防のための新たな漢方処方や機能性食品に応用しうる。また、PGGはAβ蛋白を指標としたアルツハイマー病の創薬研究において重要なリード化合物になりえる。
マダイの体色透明化異常の原因遺伝子特定に向けた染色体領域の詳細化

本研究では、マダイの人工種苗生産において生じる体色透明化異常について、原因遺伝子の特定に向けた染色体領域の詳細化を行った。まず、前年度の科学研究費補助金奨励研究により得られた透明個体特異的一塩基多型(TP-SNP)の情報を用い、新規に開発したマダイ連鎖地図へのマッピングを試みた。両親の多形からTP-SNPそのものを連鎖地図上に配すことができなかったため、TP-SNPを含む遺伝子断片をマダイのゲノムアセンブル配列との相同性検索を実施し、TP-SNPを含むスキャフォールドを得た。さらに、メダカゲノムDNAデータベースからTP-SNPを含むスキャフォールドの相同性配列を探索したところ、TP-SNPはNel12a遺伝子のイントロン13に位置することが明らかとなった。そこでNel12a様遺伝子をマダイゲノムデータベースから探索し、同遺伝子配列中に存在するマイクロサテライトDNAを用いて連鎖地図へのマッピングを行なった。その結果、連鎖群4にNel12a遺伝子がマッピングされた。連鎖群4に配置されているマイクロサテライトDNAマーカーを用いて関連解析を行ったところ、Pma4_155とPma4_330において透明個体で単一のアリルがホモ接合を示した。しかしながら、正常個体においても同一の遺伝子型がホモ接合を示す場合もあり、正常個体と透明個体を完全に識別するマーカーを見出すには至らなかった。現在、透明個体特異的SNPを用いた実験家系の構築を行い、次世代シーケンサーを用いたRAD-seq解析による連鎖解析を行っており、マイクロサテイライトDNA情報と合わせたより詳細な連鎖地図の作成に取り組んでいる。マーカー密度を増やしたことで、有効な候補遺伝子領域を絞り込むことが可能になっており、現在、2つの原因候補遺伝子が得られている。
テトラフルオロボレイトアニオンをフッ素源として用いる電解フッ素化反応の開発

これまで、様々な二級アルコールを、Ph_3PおよびPh_3PH・BF_4共存下、CH_2Cl_2中で電解し、溶媒留去して得られる粗アルコキシトリフェニルホスホニウムテトラフルオロボレイト(I)をTHF中を加熱還流することにより、オレフィン体が副生するものの、対応するするフッ素化体が良好な収率で得られることを見いだしいる。本申請研究の目的である(1)このIの熱分解によるフッ素化体の合成の一般性の確立、ならびに(2)近年その生理活性が注目されているオリゴ糖の合成に欠かせないフッ化糖類の一般的な新規合成法としての本反応の有用性を評価するため、まず一級アルコール類のフッ素化反応について検討を行った。その結果、一級アルコール由来のIはDMEまたはジオキサン中加熱還流することにより対応するフッ素化体が良好な収率で得られること、特にジオキサンを溶媒に用いると短時間で反応が完結することを見いだし、本フッ素化反応が二級だけでなく一級アルコールにも適用可能であることが明らかにした。さらに、本手法の、糖類のアノマー水酸基の立体選択的フッ素化反応としての可能性を検討するため、2,3:5,6-ジ-O-イソプロピリデン-α-D-マノフラノースを用いて、そのものをPh_3PおよびPh_3PH・BF_4共存下、CH_2Cl_2中で電解したところ、対応するα-フッ素化体が35%の収率で立体選択的に得られ、糖類の場合、熱分解を要することなくホスホニウム塩Iを経るフッ素化反応が進行することを見いだした。そこで、本電解フッ素化反応について種々条件検討を行ったところ、溶媒としてCH_2Cl_2-DME(5:1)を用いると75%の高収率で、フッ素化体が生成することを明らかにした。現在、本電解フッ素化反応のフッ化糖の一般的な新規合成反応をしての有用性の確立するため、他の糖類のアノマー水酸基のフッ素化反応について引き続き検討中である。
インフルエンザA型ウイルスの宿主細胞膜由来糖タンパク質受容体の同定と機能解析

ヒト肺上皮細胞株A549の細胞膜由来糖タンパク質でインフルエンザA型ウイルスの受容体として機能しうるシアル酸含有糖タンパク質を検索した。なお、目的とする糖タンパク質の解析にあたり、宿主細胞膜抽出法やウイルス結合検出法を検討した。結論として、細胞膜抽出は細胞膜/オルガネラ膜抽出キット(S-PEK)を用い、TLC/immnunostaining法の変法でインフルエンザウイルスの結合性を検出している。この方法により、ウイルスノイラミニダーゼ(NA)活性をザナビルで抑制することで、抽出した細胞膜画分において4つの分子量領域(85kDa、20kDa、170kDa、200kDa以上)にウイルス粒子と特異的な結合を示す糖タンパク質が存在することを明らかとした。さらに、2DZOOMシステムで詳細に解析したところ、同様の分子量領域には複数(少なくとも2-5スポット)のウイルス粒子と特異的な結合する糖タンパク質が存在することを確認した。これらの領域の糖タンパク質とウイルスとの結合はザナビル非存在下、あるいはシアル酸糖鎖分解酵素(α2-3,6,8,9シアリダーゼなど)処理サンプルにより消失した。同様に、標識レクチン(MAA、SNA)染色法でも糖消化酵素処理により、ウイルス結合性を示すすべての分子量領域のバンドが消失したことから、4つの分子量領域のウイルス結合性糖タンパク質はシアル酸含有糖タンパク質であることを示している。このうち、少なくとも85kDa、120kDaの2つの領域の糖タンパク質はN-グリカナーゼF処理で消化されることから、この領域のウイルス結合糖タンパク質はN結合型糖鎖が関与することを明らかとした。以上を総括すると、85kDa領域、120kDa領域に存在した少なくとも6つのスポット領域(糖タンパク質)をウイルス結合性糖タンパク質候補として着目し、現在これらの糖タンパク質の同定を進めている。
乳歯う蝕と母親の育児不安との関連性-1歳6か月児と3歳児の追跡調査-

乳歯う蝕の発生は様々な生活習慣の影響を強く受け、特に通園していない子どもの場合、養育者である母親の関与が深い場合が多い。本研究は乳歯う蝕と母親の育児不安の関連性を分析し、う蝕の発生予防ならびに歯科の立場からの育児支援について検討を行うことを目的に実施した。1歳6か月児健診にて会場ならびに自宅記入の質問票、親子のう蝕活動性試験を実施し、3歳児健診にて追跡調査を実施した。1歳6か月児は1375組で返信者は1100組、3歳児は1355組で返信者は1009組、追跡対象者は843名、その中で両年齢とも母親記入の739名を分析に用いた。両年齢間は、育児不安、社会的支援、間食摂取行動、子どもの気質の概念を構成するすべての項目において強い相関を認め、概念の変化を認めなかった。次に1歳6か月児の一部252組を分析し、否定的感情の認知の高い母親は、社会的支援が少なく、子どもの気質に問題があると思っており、子どもの間食摂取行動が不良であるとことを認め、基本モデルを作成した。基本モデルは、う蝕の発生が『問食摂取行動』の影響を受け、その背景には間食を安易に与えてしまう母親の存在があり、そこには『親からみた子どもの気質』が関与している。また『親からみた子どもの気質』には『育児不安』が関与しており、その背景には『社会的支援』の存在が影響するというモデルである。共分散構造分析により検証した結果、モデル適合度は、1歳6か月児はカリオスタット値をう蝕の指標に用いCFI=0.878、RMSEA=0.06であった。3歳児はd歯、f歯、COのいずれか保有の有無を用いCFI=0.882、RMSEA=0.060であった。CFIは0.95以上、RMSEAは0.05未満の場合、モデルの当てはまりがよいとされる。本研究の値はグレーゾーンである。今回、良いモデルが得られなかった理由として、分析対象者が質問票返信者でありバイアスがかかった可能性がある。実際、両年齢とも、う蝕有病者率およびカリオスタット値は返信者の方が有意に低く、う蝕を発生しやすい背景を持つ者が分析から除外された。今後、それらの母親を分析するために、健診会場での限られた時間内に母親の負担を最小限に留めた質問を選び、う蝕発生と母親の育児不安の関連性をさらに検討していきたい。目的:乳歯う蝕の発生は、間食の種類や回数、歯磨き習慣などの生活習慣の影響を強く受ける。乳幼児、特に通園していない子どもの生活習慣は、多くの場合、養育者である母親の関与が深いと思われる。近年、子育てに歪みが生じ、育児ノイローゼや虐待などが社会問題となっている。本研究は乳歯う蝕と母親の育児不安の関連性を分析し、乳歯う蝕の発生予防や歯科の立場からの育児支援について検討を行うことを目的に実施した。また母親の育児に関する不安や心配事は子どもの成長により変化するといわれていることから、1歳6か月児健康診査を受診した対象者に対し、3歳児健康診査を利用して追跡調査を実施し、経年的な検討を行う予定である。方法:対象は平成16年10月から平成17年2月までの5ヶ月間、岐阜市内保健センターにおいて、1歳6か月児健康診査を受診した1393組の保護者とその子どもである。すべての保護者に対し、研究代表者が調査の説明を行い、そのうち同意の得られた1375組に対し調査を実施した。調査内容は(1)会場記入の質問票(2)自宅記入の質問票(3)保護者のS.mutans測定(Dentocult^<【○!R】>SM)(4)子どものう蝕活動性試験(カリオスタット^<【○!R】>)である。(1)(2)は無記名自記式で、属性や生活習慣、歯科保健行動や意識、育児不安や社会的支援について質問をした。(3)(4)は48時間の培養が必要なため、その結果については(2)の返信(結果郵送先記入)があった者にのみ郵送により連絡した。結果・今後の予定:調査が終了して間もないため、結果を入力中である。自宅記入の質問票が返信されてきているが、現在、回収率は79.8%(4ヶ月分)である。今後、(1)(2)(3)(4)の結果と歯科健診や問診結果を分析し、1歳6か月児のう蝕発生リスクと母親の育児不安の関連性について検討し発表したいと考えている。また平成18年4月より5ヶ月間、3歳児での追跡調査を行う予定である。目的:乳歯う蝕の発生は、間食摂取状況、歯磨き習慣などの生活習慣の影響を強く受ける。本研究は乳歯う蝕と母親の育児不安の関連性を分析し、乳歯う蝕の発生予防ならびに歯科の立場からの育児支援について検討を行うことを目的に実施した。方法:平成16年10月から5か月間、1歳6か月児健康診査を受診した1393組の保護者と子どもに対し(1)育児に関する質問票調査(2)保護者のS.mutans測定(3)子どものう蝕活動性試験(カリオスタット^<【○!R】>)を実施した。

本年度はそのうち調査対象者252組について分析を行った。結果:1.う蝕経験や要観察歯のある子どもはカリオスタット^<【○!R】>値が高く、う蝕発生に関わる間食摂取行動が不良であった(P<0.05)。2.間食摂取行動が不良な子どもは、母親が子どもの気質に問題があると思っており、母親の否定的感情の認知が高かった(P<0.05)。3.否定的感情の認知の高い母親は社会的支援が少なく、子どもの気質に問題があると思っている者が多かった。また、そのような母親の子どもは間食摂取行動が不良であった(P<0.05)。結論:1歳6か月児ということもあり、う蝕有病者率が0.8%と非常に低く、子どものう蝕と母親の育児不安との関連性は認められなかった。しかし間食摂取行動と否定的感情の認知の間には、母親の認識する子どもの気質が関与しており、間接的に関連していることが推測された。今後の予定:母親の育児に関する不安や心配事は子どもの成長により変化するといわれている。平成18年4月より3歳児健康診査を利用して追跡調査を実施し、経年的な検討を行う予定である。また、1歳6か月児の残りのデータをさらに分析し、1歳6か月児のう蝕発生リスクと母親の育児不安の関連性について発表したいと考えている。乳歯う蝕の発生は様々な生活習慣の影響を強く受け、特に通園していない子どもの場合、養育者である母親の関与が深い場合が多い。本研究は乳歯う蝕と母親の育児不安の関連性を分析し、う蝕の発生予防ならびに歯科の立場からの育児支援について検討を行うことを目的に実施した。1歳6か月児健診にて会場ならびに自宅記入の質問票、親子のう蝕活動性試験を実施し、3歳児健診にて追跡調査を実施した。1歳6か月児は1375組で返信者は1100組、3歳児は1355組で返信者は1009組、追跡対象者は843名、その中で両年齢とも母親記入の739名を分析に用いた。両年齢間は、育児不安、社会的支援、間食摂取行動、子どもの気質の概念を構成するすべての項目において強い相関を認め、概念の変化を認めなかった。次に1歳6か月児の一部252組を分析し、否定的感情の認知の高い母親は、社会的支援が少なく、子どもの気質に問題があると思っており、子どもの間食摂取行動が不良であるとことを認め、基本モデルを作成した。基本モデルは、う蝕の発生が『問食摂取行動』の影響を受け、その背景には間食を安易に与えてしまう母親の存在があり、そこには『親からみた子どもの気質』が関与している。また『親からみた子どもの気質』には『育児不安』が関与しており、その背景には『社会的支援』の存在が影響するというモデルである。共分散構造分析により検証した結果、モデル適合度は、1歳6か月児はカリオスタット値をう蝕の指標に用いCFI=0.878、RMSEA=0.06であった。3歳児はd歯、f歯、COのいずれか保有の有無を用いCFI=0.882、RMSEA=0.060であった。CFIは0.95以上、RMSEAは0.05未満の場合、モデルの当てはまりがよいとされる。本研究の値はグレーゾーンである。今回、良いモデルが得られなかった理由として、分析対象者が質問票返信者でありバイアスがかかった可能性がある。実際、両年齢とも、う蝕有病者率およびカリオスタット値は返信者の方が有意に低く、う蝕を発生しやすい背景を持つ者が分析から除外された。今後、それらの母親を分析するために、健診会場での限られた時間内に母親の負担を最小限に留めた質問を選び、う蝕発生と母親の育児不安の関連性をさらに検討していきたい。
慢性心不全に対する交換神経抑制の中枢性と末梢性の差異

慢性心不全患者への末梢性αβ交感神経遮断薬カルベジロールと中枢性α2作用を介する中枢性交感神経抑制薬クロニジン投与時の心臓と血管交感神経活動の変化を調べ比較した。それぞれ心臓交感神経活動を心電図の心拍変動スペクトル解析で,末梢血管交感神経活動を橈骨動脈の脈波を用いたトノメトリー法による非観血的血圧変動スペクトル解析を用いて分析した.同意を得た心不全患者2名と高血圧患者7名を対象とした。心拍変動解析では交感神経系の指標であるLF/HF比は高血圧群でカルベジロール投与前1.47、1時間値3.39、2時間値1.78と1時間値で一時的に上昇していたが、クロニジン投与では明らかな上昇は見られなかった。しかし心不全群ではカルベジロール投与により1時間値はむしろ低下、クロニジン投与では逆に上昇しており、高血圧群と異なる変化を示した。末梢の交感神経指標とされる血圧変動のLF/HF比はカルベジロール、クロニジンともに高血圧群では1時間値で上昇を示し2時間値では低下するのに対し、心不全群では徐々に上昇を示しており、末梢では交感神経活性が亢進している可能性があった。副交感神経の指標とされるHFはLF/HFとはおおむね逆の反応を示したが、心不全群のクロニジン投与後は明らかに低下を示していた。クロニジンは中枢性に交感神経を抑制するがカルベジロールに比べて副交感神経活性でも抑制する可能性が示唆された。血中のノルエピネフリンは高血圧群へのカルベジロール投与では1時間では低下するが2時間値はむしろ有意な上昇を示した。心不全群では持続的な上昇を示した。クロニジン投与では逆に高血圧群で1時間値は増大し、心不全群で持続的に低下を示した。体液性因子への作用はカルベジロールとクロニジンでは逆の変化を示していた。本研究は慢性心不全患者を対象に末梢性αβ交感神経遮断薬であるカルベジロールと中枢性α2作用を介する中枢性交感神経抑制薬クロニジンを単回投与および1週間投与により心臓と血管交感神経活動の変化を調べ比較することを目的としている。それぞれ心臓交感神経活動を心電図のRR変動スペクトル解析で,末梢血管交感神経活動を撓骨動脈の脈波を用いたトノメトリー法による非観血的血圧変動スペクトル解析を用いて分析した.本年度は軽症心不全の対象者にカルベジロールおよびクロニジンの単回投与を行った。検査前日より畜尿を開始し,検査当日までの24時間尿を採取し、一日尿中ノルエピネフリン・エピネフリンの測定に提出した。1分間15回の調節呼吸下で10分間心電図と血圧を記録し、心電図によるRR変動解析(HF,LF/HF),トノメトリー法による血圧変動解析(HF)をそれぞれ解析したところRR変動では交感神経系の指標であるLF/HF比は投与前1.26、一時間値0.67、2時間値0.72と低下し、副交感神経の指標とされるHFも95.68、1時間値43.74、2時間値21.55と低下した。血圧変動およびクロニジン投与後の解析は現在進行中である。
認知バイアスを用いた動物の共感測定－社会・発達環境の影響とその神経基盤－

本研究の目的は、単純な共感基盤を解明するのに適切なげっ歯類を用い、共感の進化的機能と神経機構を明らかにすることである。今年度はラットを用いて以下の目的に基づき研究を遂行した。1認知バイアス課題の装置及び最適なプロトコルを確立する2情動を操作された他個体を観察することにより実験個体の認知バイアスが変化し情動推定が可能かを検討する。SDラットを用いて認知バイアス課題のためのオペラント訓練を行った。オペラント箱に2つのレバーを用意し、低報酬の強化子と高報酬の強化子を割り振った。ラットに低報酬強化子への弁別刺激時にレバーAを、高報酬強化子への弁別刺激時にレバーBを押すことを条件づけした。十分な正答率の上昇が認められたら、プローブ試行へ移り低報酬と高報酬の刺激の中間音を提示し、低報酬レバー(A)と高報酬レバー(B)の選択頻度を観察した。訓練で正答率が85%以上に達した1個体に対して、プローブ試行を実施した(コントロール条件)。その後実験個体に他個体を呈示した。呈示直後のプローブ試行ではコントロール条件より高報酬レバーへの選択が減少した。すなわち、負の情動が喚起され、中間音の刺激を低報酬レバーと認知する確率が増えたと考えられる。次に、拘束をされている他個体を観察した直後の実験個体にプローブ試行を実施した。すると、実験個体の高報酬レバーへの選択がコントロール条件より少し増加した。これは、拘束された他個体を観察することで正の情動が喚起され、中間音の刺激を高報酬レバーと認知した結果かもしれない。呈示に利用した個体は、実験個体よりも体重が重く、順位が上だった。呈示個体が拘束されることで攻撃性が減少し、実験個体にとってより温和な環境が担保されたことにより負の情動が減少し、高報酬レバーへの選択が増加したのかもしれない。しかし、この結果は1個体のみであるため、今後も実験し慎重に解釈する必要がある。プローブ試行を実施したが、高報酬レバーへの選択選好がみられ、レバーへの選択に偏りが出た。そのため、プローブ刺激を低報酬強化子の弁別刺激に近い周波数に設定しなおした。その場合も、やはり期待通りのレバー選択にはならなかったため、適切なプローブ刺激を模索するのに時間がかかっている。今後はコントロール条件のプローブテストにおいて、中間音に対する中立なレバー選択確率が得られなかったため、残りの個体を用いてより理想的なレバー選択がみられるようなプローブ刺激を模索中である。また、新しくラットの訓練を開始し、今後の実験を展開していく予定である。ヒトの社会環境やコミュニケーションの基盤として共感は重要な役割を果たす。しかし、ヒトの共感には、複雑な情動が関連し単純化するのが難しい。したがって、動物を用いた基礎的な共感基盤を研究する必要がある。動物で共感性の観察には客観的な情動評定手法の確立が必要である。本研究は、認知バイアス課題を用いて、文脈特有の表出行動に頼らずに動物の内部情動を推定し、げっ歯類の共感行動とその神経基盤を明らかにすることが目的である。認知バイアス課題とは、中立な刺激に対する反応の偏りにより情動状態を推定する方法である。この課題は情動の方向と強度を定量化でき様々な場面で利用可能である。本年度は、認知バイアス課題のプロトコルの検討、実験装置のセットアップ、ラットを用いたオペラント条件付け訓練から、認知バイアスを計測する方法を確立することを目標としていた。しかし、研究者の出産・育児による研究中断のため研究期間が短く動物行動実験を始めることは難しいと判断した。そのため、具体的な成果としては、文献情報の収集と整理により認知バイアス課題の最適なプロトコルの検討とオペラント箱など実験装置のセットアップを含む研究環境の整備を主に行った。これまで情動測定に利用されていた認知バイアス課題は、動物に強化子と罰子の回避を選択させる方法であった。しかし、強化子よりも罰子の弁別刺激への学習効率が遅く、正答率が低くなるという問題がある。文献調査によると、この問題を回避するために、近年では無条件刺激として罰子と強化子を用いるのではなく、強化子の価値に差をつけ認知バイアスを測定する方法も試されている。この方法だと弁別刺激への学習効率が上がり、正答率も高くなる。これらの調査から本計画では、強化子の価値に差をつけた認知バイアス課題を行い、それに伴うオペラント箱の整備をすすめている。平成27年7月から出産・育児のため研究が行えなかったため。また、動物を用いて実験を始めるには研究期間が短すぎたため、環境整備等に絞って研究を行ったためである。翌年度の復帰後に延長期間を含め、計画通り進行していく予定である。本研究は、単純な共感基盤を解明するのに適切なげっ歯類を用いて、共感の進化的機能と神経機構を明らかにすることが目的である。共感研究に動物を用いる場合、情動評価の難しさという問題点がある。本研究は、動物の種特異的な行動による情動評価ではなく、認知バイアス課題を用いた汎用的な情動評価をすることで正と負の両方の情動を定量的に測定する。そして、ラットの共感性の表出具合を検討し、社会及び発達環境の共感性への影響を定量的に評価する。本年度は、環境調整・実験装置の作成を主に遂行した。具体的には、オペラント実験用装置の作成とオペラント訓練用、共感提示用箱の作成を進めている。

本研究には、オペラント箱、共感提示箱、防音箱などの実験装置が必要であり、既製のオペラント装置を用いると安易に実験を行うことができるが、サイズと装置の制御プログラムの自由度が制限されるため本実験には向かなかった。また、多くのサンプル数を短時間に収集するためには、実験装置を数多く必要とするが、予算には限界があった。そのため、これらの装置をできるだけ簡易で丈夫にまた安価に制作することにした。オペラント箱、共感提示箱の外枠には、アルミフレームを用い、オペラント箱にはmed社製格納可能レバーと給餌器、給餌皿を用いた。これらの装置とスピーカーの制御は小型マザーボードラズベリーパイIIIに拡張ボードを接続し作成した。プログラム言語はpython2を使用した。このように、装置の一部のみを既製品にすることで簡便でかつ自由度が高く、全て既製品で揃えるよりも安価な装置を作成することができた。今後は、個体の訓練を開始し、認知バイアステストを進めていく。本年度は研究者の育休による研究中断を含んだため、研究時間に制限があった。また、環境調整・実験装置の作成に予想以上に時間が取られてしまった。しかし、研究の延長期間を含めると計画通りに研究を遂行できると予想している。本研究の目的は、単純な共感基盤を解明するのに適切なげっ歯類を用い、共感の進化的機能と神経機構を明らかにすることである。今年度はラットを用いて以下の目的に基づき研究を遂行した。1認知バイアス課題の装置及び最適なプロトコルを確立する2情動を操作された他個体を観察することにより実験個体の認知バイアスが変化し情動推定が可能かを検討する。SDラットを用いて認知バイアス課題のためのオペラント訓練を行った。オペラント箱に2つのレバーを用意し、低報酬の強化子と高報酬の強化子を割り振った。ラットに低報酬強化子への弁別刺激時にレバーAを、高報酬強化子への弁別刺激時にレバーBを押すことを条件づけした。十分な正答率の上昇が認められたら、プローブ試行へ移り低報酬と高報酬の刺激の中間音を提示し、低報酬レバー(A)と高報酬レバー(B)の選択頻度を観察した。訓練で正答率が85%以上に達した1個体に対して、プローブ試行を実施した(コントロール条件)。その後実験個体に他個体を呈示した。呈示直後のプローブ試行ではコントロール条件より高報酬レバーへの選択が減少した。すなわち、負の情動が喚起され、中間音の刺激を低報酬レバーと認知する確率が増えたと考えられる。次に、拘束をされている他個体を観察した直後の実験個体にプローブ試行を実施した。すると、実験個体の高報酬レバーへの選択がコントロール条件より少し増加した。これは、拘束された他個体を観察することで正の情動が喚起され、中間音の刺激を高報酬レバーと認知した結果かもしれない。呈示に利用した個体は、実験個体よりも体重が重く、順位が上だった。呈示個体が拘束されることで攻撃性が減少し、実験個体にとってより温和な環境が担保されたことにより負の情動が減少し、高報酬レバーへの選択が増加したのかもしれない。しかし、この結果は1個体のみであるため、今後も実験し慎重に解釈する必要がある。プローブ試行を実施したが、高報酬レバーへの選択選好がみられ、レバーへの選択に偏りが出た。
RAGEを標的とした加齢黄斑変性の新規治療法の開発

加齢黄斑変性は本邦の失明の主要な原因の一つであり、眼内に異常な血管新生を来す疾患である。本研究では加齢によって生体内に増加し血管新生を引き起こすと考えられる終末糖化産物を標的とし、その新規抗体の探索を行った。本研究で得られた新規抗体はいずれも有意な血管新生阻害作用を示さなかったが、今後さらなる探索を進めていく上で基盤となる成果が得られた。加齢黄斑変性は失明に至る難治性の眼疾患であり、加齢とともに蓄積する炎症原因タンパク(終末糖化産物,アミロイドβ)による酸化ストレスや慢性炎症を背景として発症する。本研究は、終末糖化産物とその受容体であるRAGEに着目し、終末糖化産物による酸化ストレスや慢性炎症に対する新規化合物の抑制効果を明らかにし、加齢黄斑変性の新たな治療法開発の基盤となる研究を行う。平成26年度は、1)終末糖化産物の中でも特に毒性が強いとされているグリセルアルデヒド由来の終末糖化産物を作成した。2)網膜を構成する細胞のうち、加齢黄斑変性の発病に関与する網膜色素上皮細胞について、ヒト人工多能性幹細胞から網膜色素上皮細胞を分化誘導した。平成27年度に、終末糖化産物が網膜色素上皮細胞の機能に及ぼす影響を検討する基盤を形成できた点で、重要な成果であると言える。申請者らはこれまでに、これらの炎症原因タンパクとその関連因子の阻害が脳や心血管疾患の進行を阻害することを明らかにしてきた。また、予備実験において、炎症原因タンパクの共通の受容体であるRAGEを阻害する新規化合物を探索し、候補となる物質を見出した。今年度は、RAGE阻害剤の候補となる新規化合物を用いて、その阻害効果を細胞培養系と動物モデルを用いて検討した。細胞培養径では網膜色素上皮細胞における酸化ストレスの阻害効果をARPE-19を用いて検討した。また、動物モデルでは、レーザー誘導脈絡膜新生血管モデルを用いた。現時点で、これらの検討の結論を出すには至っていないが、検討方法は確立されており、今後さらに検討を進めていく。特に細胞培養系では、網膜色素上皮細胞の機能障害についてこの新規化合物の酸化ストレス阻害効果を検討する。また、動物実験については、蛍光眼底造影や網膜組織切片を用いて有意な差がみられたら、血管内皮細胞を用いた検討を平行して行い、阻害効果のメカニズムを更に検討する予定である。また、上記で得られた成果をまとめ、学会発表、英文論文発表を行う。現在の加齢黄斑変性治療は患者の期待に真に応える治療法とは言えない。また、加齢黄斑変性におけるAGEやAβなどの炎症原因タンパクの重要性が認識されて10年以上が経過するが、いまだに有効な治療法の開発には至っていない。本研究によってこれらの問題点が解決されれば、加齢黄斑変性の予防的治療が可能となり社会的意義は極めて大きい。細胞培養研究と動物研究を平行して行えているため。加齢黄斑変性は本邦の失明原因の第4位であり、今後患者数が急増すると考えられている。加齢黄斑変性では、網膜(黄斑部)に病的な血管新生が起こり、血管新生からの滲出や出血によって視細胞が障害を受け視力が著しく低下する。近年、病的な血管新生に対して抗VEGF抗体による治療が行われているが、ひとたび血管新生が起こると視細胞の障害は不可避であり、そのため、患者の期待に真に応える治療法であるとは言えない。加齢黄斑変性では血管新生が生じる前に、黄斑部にドルーゼンと呼ばれる黄色の沈着物が形成される。近年、ドルーゼンが終末糖化産物(AGE)やアミロイドβ(Aβ)などの炎症原因タンパクから構成されることが判明した。本研究において、申請者らはAGEを阻害する抗体の探索を行ない、これまでに、iPS由来網膜色素上皮細胞やARPE-19を対象として、これらの阻害抗体の有効性を検討してきた。本年度は、新規抗体の中で、これまでに他分野で血管透過性亢進阻害効果や抗炎症効果が実証されているHMGB-1に対する抗体をマウスの加齢黄斑変性モデルに対して投与し、脈絡膜新生血管に対する阻害効果を検討した。今回の検討では、本研究で得られた新規抗体はいずれの投与方法(腹腔内投与、硝子体内投与)、投与量を用いても脈絡膜新生血管に対する有意な阻害効果を示さなかった。今後さらなる新規阻害物質の探索を進め、加齢黄斑変性の新たな治療法開発の基盤となる研究を行うことが課題である。終末糖化産物の中でも特に毒性が強いとされているグリセルアルデヒド由来の終末糖化産物を作成したこと、そして、終末糖化産物による細胞機能への影響を検討する上で、最もヒト生体の網膜色素上皮細胞に近い性質を持つと考えられるヒト人工多能性幹細胞

由来の網膜色素上皮細胞を継続的に分化誘導できるシステムを構築することに成功したことによって、今後順調に研究を進めていくことができるようになったため。細胞培養研究と動物研究をさらに進めていく。また成果の発表も積極的に行う。眼科はじめに、終末糖化産物が網膜色素上皮細胞の機能に及ぼす影響を検討する。そして、終末糖化産物の受容体であるRAGEの新規阻害物質の探索を行う。その上で、新規阻害物質が網膜色素上皮細胞の機能に及ぼす影響を検討する。現時点で研究計画の変更予定はない。
CVD装置を用いた固体酸触媒の調製

私は、CVD装置による固体酸触媒の調製に関する研究を一貫して行い、これまでに自ら工夫した回転型の流通式CVD装置によりSi、B、Pの酸化物を種々のアルミナ等の粒状担体に蒸着させて触媒を調製し成果を上げてきました。この装置では粒状担体にCVDを行なう場合には効率よく担体を攪拌できましたが、触媒担体に粉体を用いると攪拌効率が悪く活性種を均一に蒸着させることができませんでした。そこで、本研究においては、この攪拌効率の悪さを克服するために、粉末状担体を流動状態に保つことのできる流動層CVD触媒調製装置を試作しました。この流動層CVD装置により種々の複合酸化物型の固体酸触媒を調製すること、さらにそれらの触媒特性の検討を目的としました。まず、始めにCVD時の流動状態を確認できるようにガラス製の流動層反応管を設計し、反応管を試作しました。流動状態を良好に保つように改良を加え反応管を完成させました。これまで使用していたCVD装置の原料供給系と今回新しく購入した大型の管状電気炉と温度制御装置を用いて流動層CVD装置を作成しました。この流動層CVD装置によりオルトケイ酸エチルを原料に用いてシリカ成分をマグネシア担体上に担持させたシリカ-マグネシア触媒を調製しました。この触媒には、マグネシア担体にはない酸点の発現が認められました。この装置によりチタニア、ジルコニアなどの粉末状担体にシリカ成分を均一に分散した担持型のシリカ-チタニア、シリカ-ジルコニア固体酸触媒の調製を試みようと計画しています。さらに、これらの触媒性能および物性について検討する予定である。
線虫・トロポミオシン遺伝子の多型

線虫染色体DNAのラムダファージライブラリーを、クロニンしたトロポミオシン遺伝子断片をプローブとしてスクリーンした。ニケの陽性株が得られ、挿入断片の解析を行っている。一方、併行して行っている線虫パラミオシン遺伝子の塩基配列決定実験で、これまでイギリスMRC分子生物学研究所で行ってきた実験方法の設定を行った。まず目的とするDNA断片をハイブリッドラムダファージから制限酵素を使って切り出し、アガローズ電気泳動で分画、抽出する。リガーゼで環状にした後、超音波処理をして300-500bpの断片を集め、クレノー酵素で末端を修復してM13ファージに挿入、常法どうり単鎖DNAを調製する。この方法だと両鎖のランダムな断片が得られるので、特殊な制限酵素を使用しなくても全長の正確な塩基配列決定が行える。得られた塩基配列は、パソコンによる自動連結ソフトを用いれば短時間で決定できる。多数のクローンを処理するので放射性同位元素は少し多量に使わねばならない。実験条件の設定に少し時間を要したので、今後目的のトロポミオシン断片を単離・精製して一気に塩基配列決定を行う予定である。蛋白質レベルの実験では、他の生物に比べて少し大きい分子量を持っていることを確かめた、特異的抗トロポミオシンと反応するものはSDSPAGEで一本しか認められなかった。今後クローン化し、塩基配列決定を行った結果をもとに線虫の運動異常と筋肉形態形成との関係を研究していく予定である。
国内現存史料の目録化を中心とする近世書籍文化についての基礎的研究

1.書籍文化史研究に関する基礎的データの集積・整備・公開(a)明治以後に作成された和漢書古典籍を含む蔵書目についてのデータ集積を行ない、史料調査の指針としたほか、既調査分は『増補改訂近世書籍研究文献目録』・「『増補改訂近世書籍研究文献目録』補遺」に加えた。(b)書籍文化史関連研究文献を調査・収集し、データ整序のうえ『増補改訂近世書籍研究文献目録』・「『増補改訂近世書籍研究文献目録』補遺」(『書籍文化史』第9集所収)として公表した。(c)書籍文化史料所在情報の収集・整備・公開・史料調査を各地の文書館・図書館、また寺社や個人宅で行い、近世から明治前半期の書籍文化に関連する未刊史料についてのデータの集積を図った。・既紹介の書籍文化史料の渉猟とデータ化を行ない、分類・整序し、研究成果報告書(冊子)に「書籍文化史料分類目録」として分類目録の形で公表した。(d)書籍関連業者に関るデータの収集・整備・近世から明治前期までの書籍流通業者のデータ、および書籍製作に関る下職(彫工・摺師・本仕立職等)についてのデータの集積を継続した。2.研究者間の情報疎通促進・成果の公開・各年度1集のペースで『書籍文化史』第69集を発行し、研究機関・研究者に配布した。・研究成果報告書(「書籍文化史料分類目録」)を広く研究者に配布した。1.書籍文化史研究に関する基礎的データの集積・整備(a)和漢書古典籍を含む蔵書目についてのデータの集積と目録化中央大学図書館、および国文学研究資料館所蔵の蔵書目についてデータベース化に着手し、中央大学図書館所蔵のものについては、目録化を終えた。また、所蔵の無いものについて、文書目録を中心に購入した。(b)書籍文化史研究文献目録の整備・公開2004年10月末までに収集したデータを整備し、『書籍文化史』第6集に「近世書籍文化史研究文献目録-補遺6-」として公開した。(C)書籍文化史料所在情報の収集・整備・公開国立公文書館内閣文庫・国文学研究資料館史料館・桐生市立図書館・岐阜県立図書館・岐阜県立文書館・栃木県立文書館・信州大学図書館・福井県立歴史館・沼津市明治史料館・上尾市教育委員会、また大桑村定勝寺・王滝村鳳泉寺・小千谷市魚沼神社・同小船井家・松本市高美家所蔵の史料について調査した。そのうち書籍文化史関連の史料と目されるものについては、写真撮影および翻字を行い、書誌をデータベース化した。また、定勝寺所蔵の蔵書目録については『木曽須原定勝寺所蔵和古書および大般若波羅蜜多経目録』(中央大学近世文学ゼミナール発行)に翻字を掲載した。また、既刊の史料については、中央大学図書館所蔵の県史・市史等について調査を行い、データベース化した。2.研究者間の情報疎通促進・成果の公開『書籍文化史』第6集を2005年1月に発行し、関係機関および研究者に配布した。5本の寄稿論文を掲載したほか、「書籍文化史研究文献目録-補遺6-」を掲載した。本年度(平成18年3月31日)の研究実績概要1.書籍文化史研究に関する基礎的データの集積・整備(a)和漢書古典籍を含む蔵書目についてのデータの集積と目録化明治以後に作成された和漢書古典籍を含む蔵書目についてのデータ集積を継続し、既調査分は『書籍文化史』第7集所掲「近世書籍文化史研究文献目録-補遺7-」に加えた。(b)書籍文化史研究文献目録の整備・公開日本近世を中心とした書籍文化史関連研究文献の収集、データ化を継続し、2005年末までに収集したデータについて「近世書籍文化史研究文献目録-補遺7-」としてまとめ、2006年1月発行の『書籍文化史』第7集に掲載、公開した。

なお、2006年度中に、これまでの補遺データをすべて盛り込んだ補訂版をまとめるべく、業者と打合せを行なった。(c)書籍文化史料所在情報の収集・整備・公開・翻刻・影印等既紹介の書籍文化史料の渉猟と目録化作業を継続した。本年度は論文所収のものを中心に行なった。・原本の調査については、松本高美家・王滝村鳳泉寺・小千谷市図書館・大阪市立図書館・杏雨文庫沼津市明治史料館等で行なった。(d)書籍関連業者に関るデータの収集・整備・公開近世から明治前期までの書籍流通業者のデータの増補、および書籍製作に関る下職についてのデータの集積を継続した。2・研究者間の情報疎通促進・成果の公開『書籍文化史』第7集を発行した。1.書籍文化史研究に関する基礎的データの集積・整備(1)和漢書古典籍を含む蔵書目についてのデータの集積と目録化文書目録を中心に購入、また各地の文書館において閲覧し、和漢書古典籍類に厚い文書目録について、データ化した。(2)書籍文化史研究文献目録の整備・公開2006年9月末までに収集したデータを整備し、『増補改訂近世書籍研究文献目録』として2007年3月に発行した。なお、初校時までに過眼しえた文献についてはその中に補った。(3)書籍文化史料所在情報の収集・整備・公開国文学研究資料館史料館・埼玉県立文書館・茨城県歴史館・長野県中野市山田家・沼津市歴史民俗資料館・熱海市立図書館・三島市郷土館・王滝村鳳泉寺・小千谷市魚沼神社・同小船井家・川口町真島家所蔵の史料について調査した。そのうち書籍文化史関連の史料と目されるものについては、写真撮影および翻字を行い、書誌をデータベース化した。そのうち、魚沼神社・真島家の所蔵典籍については目録化し公表した。また、既刊の史料については、各地文書館所蔵の県史・市史等について調査を行い、データベース化した。(4)書籍関連業者に関るデータの収集・整備・公開各地文書館において引札・営業文書等の調査を行い、写真撮影・データ整理を行なった。また、古書店を通じて、同様の史料の購入を行なった。2.研究者間の情報疎通促進・成果の公開『書籍文化史』第8集を2007年1月に発行し、関係機関および研究者に配布した。3本の寄稿論文を掲載したほか、魚沼神社・真島家所蔵典籍の目録を掲載した。魚沼神社の目録については、単冊のものも作成した。1.書籍文化史研究に関する基礎的データの集積・整備・公開(a)和漢書古典籍を含む蔵書目についてのデータの集積と目録化明治以後に作成された和漢書古典籍を含む蔵書目についてのデータ集積を継続し、既調査分は『書籍文化史』第9集所収「『増補改訂近世書籍研究文献目録』補遺」に加えた。(b)書籍文化史研究文献目録の整備・公開『増補改訂近世書籍研究文献目録』発行以後に収集しえた日本近世を中心とした書籍文化史関連研究文献をまとめて分類を施し『書籍文化史』第9集所収「増補改訂近世書籍研究文献目録』補遺」として公表した。(c)書籍文化史料所在情報の収集・整備・公開・翻刻・影印等既紹介の書籍文化史料の渉猟とデータ化を行ない、研究成果報告書(冊子)に「書籍文化史料分類目録」として分類目録の形で公表した。
小脳変性マウスにリハ運動とＤ型アミノ酸投与で抗運動失調効果を示す機序の研究

当該研究課題において、我々が発見した新奇の小脳変性マウスの病態が小脳プルキンエ細胞の変性と確定した。さらに平成28年度、29年度に次世代シークエンサーを用い遺伝子の異常を精査したところ、原因遺伝子候補を特定した。その遺伝子の確定を行うにあたり平成30年度は、以下の実験を行った。まず、原因遺伝子の遺伝子産物のタンパク抗体を入手し、Wild Typeと比較したところ明らかに当該マウスのタンパク発現が弱かった。一方当該マウスの種々の脳機能性成分を投与する一連の研究において、これまで多数の食機能性成分の食餌投与した。これまでの成果として、D型セリンの飲水投与および新鮮えごま実混餌投与を行った試験に成果が見られた。D型セリンは5%飲水を1-3か月投与し続け1か月ごとに歩行解析を行い、ロータロッド試験では、回転棒上の滞在時間を測定した。その結果、経時的に、滞在時間の向上が見られ、非投与群に対し有意に歩行失調の改善が見られた。一方投与継続を中止すると、滞在時間が減少しはじめ、2か月目では、非投与群との間に有意な差が見られなくなった。一方、再度投与を開始すると滞在時間が回復した。えごま実混餌投与実験では、妊娠中から開始し、出産後も親仔が自由に摂取できる環境下で1年間投与を行った。その間、ロータロッド試験を行い半年後から有意に滞在時間が延長し非投与群に対し有意に差が見られた。これらの実験群を安楽死し、大脳の海馬、小脳のプルキンエ細胞を観察したところ、海馬に対象に差がなく、投与群のプルキンエ細胞には、変性脱落が見られるものの、明瞭な正常なプルキンエ細胞の温存が確認された。以上のことから、D型セリンは濃度依存的に歩行失調を改善し、えごま実はプルキンエ細胞の変性を抑制するものと考えられた。当該研究の目的は、小脳変性マウス小脳内のD型アミノ酸濃度を高める脳栄養介入と、我々が開発した強制運動装置および環境エンリッチメント飼育で運動訓練の介入を行い、運動失調の改善を目指す研究である。小脳変性症は、運動失調を呈し、小脳プルキンエ細胞とつながる経路に変性病変をもつ神経変性疾患である。申請者は、これに類似する自然発症の小脳変性マウスB6-wob/tを管理・維持している。先行研究報告において、小脳薬剤変性マウスや遺伝子改変マウスを用いD型セリン静脈投与による抗運動失調効果(西川ら)、D型セリンの小脳アストロサイトおよびシナプスでの役割(柚崎ら)が報告されている。我々はこれらの先行研究を参考に、小脳変性マウスB6-wob/tマウスに応用し運動失調の改善につながるかを明らかにすることとした。本年度までの研究は、当該マウスにD型セリン粉末を0.5%から3%に溶解した飲料水を、自由摂取させた。その時の平均飲水量は3.7mL/日/匹であった。一方D型セリン飲水中に、回転ホイールを用いて強制歩行訓練を負荷させた。対照群は飲料水のみとした。強制歩行訓練は、50分の負荷後10分間の休息を設け連続3回行った。その1か月ごとに1,2回協調運動能力をRota-rod試験で評価し、3か月間まで行った。その結果、D型セリン摂取群は訓練開始前、非摂取群に対し、ロッド上の歩行時間が有意に高かった。よって運動能力の向上が見られた。一方、休薬期間では能力が低下し再投与で改善した。以上の結果から当該マウスにおいてD型セリン摂取・歩行訓練介入は、運動失調の改善が示唆された。研究対象実験動物であるB6-wob/tマウスの繁殖および週齢のグループ層別に、多少時間をかけてしまった。しかし研究1を行う週齢や匹数が整い、試験を予定通り進めることができた。我々の当該研究課題は平成28年度までほぼ計画通り進められた。また原因遺伝子を次世代シークエンサで解析しその遺伝子欠失を突き止めた。しかし当該研究申請者の所属する大学附置研究所(藤田記念七栗研究所:三重県津市在)は、平成29年4月1日に急遽閉鎖されることになった。したがって、当該研究申請者は、愛知県豊明市の藤田保健衛生大学医療科学部臨床検査学科に配属されることになった。よって平成29年4月から9月まで、研究所の一切の事務備品、研究機器、研究消耗品、実験動物実験施設設備および動物を配属先に移動させ研究を中断するとともに新施設での研究環境を整えることにさらに半年を費やした。また当該研究で用いるB6-wob/tマウスは、移転中に原因遺伝子解明のためにトランスジェニック(Tg)マウス作製を行うこととし、雌雄20匹を繁殖させ、委託研究機関に引き渡し、胚移植用卵を採取後凍結保存を繰り返し平成29年12月にこの作業を終えた。一方Tgを行うために、Tgマウス作製用ベクター構築を試みた。最終コンストラクトは20kbpと大きいもので、6種のベクタ-分割で進め3月末現在作製中である。さらに、安楽死した当該マウスの原因遺伝子を特定した証拠を確認するために、生後5日から25日齢の大脳、小脳、肝臓、腎臓における当該遺伝子発現タンパクをmRNAの濃度で定量を行い、Wildマウス検討したところ、肝臓、腎臓には少なく大脳、小脳に認められたが小脳は生後早い次期に多く存在し、その後1か月目には減少していった。

また、同タンパクの抗体を用い免疫染色を行ったところ、プルキンエ細胞錐体に陽性細胞が見られた。本研究開始時の研究施設が閉鎖となり、同大学他県校地に移転することになったため研究作業がすべてストップすることとなった。研究所解体から、移転研究室での立ち上げに約8か月を有したため、当該研究対象マウスの繁殖実験にとどまった。当該研究課題において、我々が発見した新奇の小脳変性マウスの病態が小脳プルキンエ細胞の変性と確定した。さらに平成28年度、29年度に次世代シークエンサーを用い遺伝子の異常を精査したところ、原因遺伝子候補を特定した。その遺伝子の確定を行うにあたり平成30年度は、以下の実験を行った。まず、原因遺伝子の遺伝子産物のタンパク抗体を入手し、Wild Typeと比較したところ明らかに当該マウスのタンパク発現が弱かった。一方当該マウスの種々の脳機能性成分を投与する一連の研究において、これまで多数の食機能性成分の食餌投与した。これまでの成果として、D型セリンの飲水投与および新鮮えごま実混餌投与を行った試験に成果が見られた。D型セリンは5%飲水を1-3か月投与し続け1か月ごとに歩行解析を行い、ロータロッド試験では、回転棒上の滞在時間を測定した。その結果、経時的に、滞在時間の向上が見られ、非投与群に対し有意に歩行失調の改善が見られた。一方投与継続を中止すると、滞在時間が減少しはじめ、2か月目では、非投与群との間に有意な差が見られなくなった。一方、再度投与を開始すると滞在時間が回復した。えごま実混餌投与実験では、妊娠中から開始し、出産後も親仔が自由に摂取できる環境下で1年間投与を行った。その間、ロータロッド試験を行い半年後から有意に滞在時間が延長し非投与群に対し有意に差が見られた。これらの実験群を安楽死し、大脳の海馬、小脳のプルキンエ細胞を観察したところ、海馬に対象に差がなく、投与群のプルキンエ細胞には、変性脱落が見られるものの、明瞭な正常なプルキンエ細胞の温存が確認された。以上のことから、D型セリンは濃度依存的に歩行失調を改善し、えごま実はプルキンエ細胞の変性を抑制するものと考えられた。D型セリンは脳細胞、神経細胞の栄養因子との概念から、脳栄養介入と運動介入の併用で抗運動失調効果を検討する。試験は運動とD型セリン介入と単独介入における比較、小脳プルキンエ細胞および小脳アストロサイト、大脳細胞への影響を形態学的に観察する。神経変性の軽減が観察される場合、神経変性症に対する運動失調の改善、神経細胞の変性軽減のメカニズムの解析に研究を進めたい。現在最終コンストラクションを行い、大きいサイズのため各領域をサブクローニングして最終6種類のベクタ-を完成する予定である。その後1)当該マウスにTGによるレスキュ-を行う。2)表現型を確認する。Tg成功マウスをとりわけ3)陽性マウスに交配、世代交配を行いより表現型を精査する。などを計画している。当該研究関連において、次年度の実験計画に遺伝子解析を予定している。これまで遺伝子解析の試験は、他の科研費経費(基盤研究B)から捻出いていたが、研究最終年度の爲、来年度は本研究経費から一部充てることとしました。当該研究成果が予定どおりの結果に近づいた場合、B6-wob/tマウスの運動失調原因の遺伝子の欠失の有無がその重要な証明となるので、運動失調を発症する原因遺伝子の解析を並行して進めたい。