hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
下肢の筋シナジーと腱反射の協関を指標とした転倒予防トレーニング効果の評価

1.例え高齢者であっても,適度な負荷を加えたぺダリングトレーニングにより下肢筋力は維持,改善される.2.複雑な運動をつかさどる筋シナジーに対して高い寄与を示す単一筋群に着目することで,簡便にトレーニング効果を評価することができる.3.筋電図信号をウェーブレット変換することで得られた周波数情報は,既存の短時間フーリエー変換による分析よりも時間分解能に優れている.モルレーのカラーマップを作成することで,トレーニング効果を視覚的に容易に捉えることができるため,高齢者のトレーニングに対するモチベーションの維持,向上につなげることが可能となる.4.高齢者のぺダリングトレーニングは転倒予防に効果的である.近年,寝たきりを未然に防ごうとする視点から,高齢者や超高齢者における能動的な運動トレーニングの必要性が叫ばれるようになった.高齢者における筋のトレーニング効果に関しては,相当数の研究が1980年代以降に行われ,高齢者や超高齢者でも高強度のレジスタンストレーニングを行うことで筋力が向上することが確認されている.本学が立地する岩手県は積雪寒冷地に属し,冬期には転倒事故が地域特有のバリアとして続発する.そのため,屋外で気軽に運動トレーニングを行うことが困難な環境である.そこで,本研究では冬期においても屋内で運動することが出来るエルゴメータを用いたペダリング運動に着目し,ぺダリング運動のトレーニング効果を表面筋電図を指標として評価できないか検討した.ペダリング運動トレーニングは,1回15分を週2回,1カ月間行った.ペダリング運動トレーニング前とトレーニング後(1か月後)の下肢筋群の表面筋電図信号を測定し,筋電図評価尺度であるRMS値を算出し比較を行った.被験者は,ペダリング運動に習熟していない一般の学生(非サイクリスト)と,自転車競技部に所属している学生(サイクリスト)及び,日ごろから自転車を利用しない高齢者とした.その結果,関節自由度が低い単純な運動であるペダリング運動に関しては,運動の習熟過程の初期段階では主に前脛骨筋と腓腹筋の筋活動量が増加し,一方,ペダリング運動に十分に慣れているサイクリストでは,筋活動量を減じることによりペダリング運動の習熟度を上げている様態が分かった.高齢者においても,大腿直筋と前脛骨筋でRMS値の増加が認められた.ペダリング運動のトレーニング効果を評価する場合,その習熟度合いにより評価方法を変える必要があることが判明した.本年度は,1.高齢者でも1カ月間のレジスタンストレーニングにより,ぺダリング運動中の下肢筋群の発揮筋力や発火パターンに変化が生じるのか?2.ぺダリング運動を構成する筋シナジーとトレーニング効果が大きい筋との関連性の検討,および,3.下肢のレジスタンストレーニングが転倒予防に与える影響の分析,の3点について研究を行った.レジスタンストレーニングは,前年度に引き続き,8名(平均年齢72.1歳,最高年齢90歳)の地域の高齢者の協力を得て行った.得られたEMG信号にDaubechiesの離散ウェーブレット解析を適用し,20Hzから500Hzの周波数帯を5つに分割した後,それらのエネルギー情報をトレーニング前と1カ月後とで比較した.その結果,高齢者では,1カ月間のレジスタンストレーニングによって,ぺダリング運動の筋シナジーに寄与率が高い腓腹筋と前脛骨筋において,31.25Hzから125Hzの周波数領域でのエネルギーが統計的に有意に減少することが確認された.これは,例え高齢者であっても,トレーニング後では発揮筋力を減少させてより効率的にペダルを漕ぐことが出来るようになったためであると推察した.一方,若者では下腿部の筋活動に変化は認められず,上腿の筋群で62.5Hzから250Hzの有意なエネルギー成分の増加を認めた.これは,トレーニングによりMUの発火頻度が増加したことが原因であると考察した.さらに,理学療法の分野で知見の厚い転倒予防の文献をレジスタンストレーニングとの関連性という視点から横断的にサーベイし,メタ分析を行った結果,転倒予防と下肢筋群のトレーニング効果との関連性が定性的に明らかになった.2015年4月から1年間,米国ペンシルベニア州のピッツバーグ大学School of Healgh & Rehabilitation Scienceにおいて在外研究を行う機会を得て,本研究テーマに関する研究に専念することが出来た.本研究テーマを在外研究の受け入れ先機関と共同研究に発展させたことで,実験やデータ分析を効率的に行うことが出来,グローバルな視点で研究を推進することができたため.本研究課題をさらに発展させる形で,ぺダリング運動中の膝伸展・屈曲運動を一連の連続的(ダイナミック)な運動と捉える分析を行った.外側広筋,大腿二頭筋,前脛骨筋,腓腹筋から計測した表面筋電図信号にウェーブレット解析を施すことで,運動のトランジションポイント(変移点)前後の連続的な周波数変動を捉える事に成功した.膝伸展運動では大腿二頭筋と腓腹筋が,膝屈曲運動では外側広筋と前脛骨筋がそれぞれ中心的な活動を担っているが,活動している筋電図信号の周波数成分の割合を両者で比較してみると,トレーニングを受けた被験者の腓腹筋の活動を除き,膝伸展運動の位相では膝屈曲運動の位相よりも,より低周波数帯域を含む筋活動が行われている様態が明らかとなった.これらの研究結果は,歩行に関連するヒールコンタクト前後の下肢筋群の活動様式に類似していることから,今後,ぺダリング運動と歩行運動との動的な筋活動を比較することで,下肢筋群の基礎的な活動メカニズムにより深く迫ることが可能となろう.

1.例え高齢者であっても,適度な負荷を加えたぺダリングトレーニングにより下肢筋力は維持,改善される.2.複雑な運動をつかさどる筋シナジーに対して高い寄与を示す単一筋群に着目することで,簡便にトレーニング効果を評価することができる.3.筋電図信号をウェーブレット変換することで得られた周波数情報は,既存の短時間フーリエー変換による分析よりも時間分解能に優れている.モルレーのカラーマップを作成することで,トレーニング効果を視覚的に容易に捉えることができるため,高齢者のトレーニングに対するモチベーションの維持,向上につなげることが可能となる.4.高齢者のぺダリングトレーニングは転倒予防に効果的である.ペダリング運動の実験において,実験に協力的な高齢者,サイクリスト,学生被験者を得ることができた.分析においては,前年度までの事前準備が功を奏し,基本的な分析を全て行うことが出来た.さらに,本研究をグローバルに発展させるため,来年度より米国のピッツバーグ大学School of Health & Rehabilitation ScienceのDr.Rory A.Cooperと共同研究を行う道筋をつけた.平成28年度が研究計画の最終年度になるため,研究成果を広く公開することに力を入れる.具体的には,これまでの研究で得た知見をまとめて国際会議で発表し,海外のジャーナルへ論文を投稿する.さらに,共同研究者と共に,7月に米国シカゴで行われる国際会議(ISEK2016)で発表する機会を得たため,国際会議開催日の前日に定例の研究会を開き,研究成果を報告し合うとともに,本研究テーマの総括を行う.福祉工学第二段階として,これまで行ったペダリングに関する実験データを用い,筋シナジーを抽出する.ペダリング運動に習熟すると筋シナジーが構築され,抽出した筋シナジーに対して寄与率の高い単一筋群のEMG信号にウェーブレット解析を施すことで,周波数領域の情報を指標にトレーニング効果を評価出来るものと予想している.筋シナジーとH反射の協関度に着目することで,個人差の少ないトレーニング評価尺度を見出すことが今後の研究目標である.実験装置の購入に際して値引き交渉を行い,当初の予算よりも低い価格で機器を購入することができたため.新規に購入予定のH反射誘発装置は次年度に購入することにし,初年度は既存の実験装置で可能な実験のみを行ったため.被験者の獲得が思いのほかスムーズに行えたため,より多くの標本を集めた統計解析を施すべく,可能な限り基礎実験を行い,得られたデータの検証に時間を費やしたため.差額分は次年度の物品費購入代金に充当する計画である.次年度は今年度の未使用分である300,000円を加える形で,刺激装置と分析装置が一体になった機器を購入し,より効率的に次の段階の実験およびデータ処理を行いたいと思っている.さらに,本研究をグローバルに進展させるため,米国のピッツバーグ大学と共同研究を行うことになったので海外への出張旅費を拡充して使用したいと計画している.
脊椎動物のゲノムDNAのメチル化調節機構に関する研究

高等動物のゲノムはメチル化修飾を受ける。メチル化修飾はコードする遺伝情報は変えずに、遺伝情報発現制御に働く。ゲノムメチル化を調節するDNAメチルトランスフェラーゼ(Dnmt)には、関連遺伝子を含め4つ、Dnmt1、Dnmt3a、Dnmt3b、Dnmt3L、がある。本研究では、DNAのメチル化がDnmtによりどのように調節されているかを明らかにすることを目指し、以下の結果を得た。メチル化模様維持を担うDnmt1はDNA鎖のヘミメチル化部位を順番にメチル化すること、予想以上にメチル基を入れ損なうことを明らかにした。Dnmt1のN末端は独立な領域構造をとり、DNAの狭い溝に結合する活性を持つこと、また、Dnmt1はヘミメチル化DNAのメチル化模様を維持するためにNp95と呼ばれる因子を必要とすることを明らかにした。以上の結果はDnmt1がどのようにゲノムのメチル化模様を維持しているのかの理解に寄与する。新たにメチル化模様の形成を担うDnmt3aはヒストンに巻きついたDNAをメチル化できないが、Dnmt3bはメチル化できることを明らかにした。また、Dnmt3aは裸のDNAを効率よくメチル化することを示した。Dnmt3aによるDNAのメチル化はヒストンH1により阻害され、ヒストンH1がDnmt3aによるゲノムのメチル化の制御に関わっていることを示した。ゲノム全体がメチル化される雄性生殖細胞ではDnmt3aのアイソフォームのDnmt3a2と補助因子Dnmt3Lが高発現する。この時期のメチル化模様形成にDnmt3Lは必須である。これは、Dnmt3a2が生理的な塩濃度でメチル化活性を示さないが、Dnmt3Lが存在すると活性が保たれるようになるためであることを明らかにした。以上の各Dnmt3の性質は、どのようにゲノムにメチル化模様が描かれるのかについての理解に寄与する。高等動植物ゲノムのシトシン塩基は生理的な条件下でメチル化修飾を受ける。この修飾は遺伝情報発現に抑制的に働く要因の一つである。DNAメチル化を書き込むDNAメチルトランスフェラーゼには、4つの酵素Dnmt1、Dnmt2、Dnmt3a、Dnmt3bが同定されている。これら酵素がどのようにDNAメチル化状態を制御するのかを明らかにすることが、DNAメチル化調節機構を理解する上で重要である。本計画では、組換型酵素と再構成ヌクレオソームを用いて触媒特異性を解析し、DNAのメチル化調節機構を明らかにすることを目指している。本年度は以下の点を明らかにした。Dnmt3aとDnmt3bがゲノムの特定の領域を見分けてメチル化する機構には、メチル化されるDNAの存在状態や相互作用する因子が重要な役割を果たすことが予想される。DNAは通常ヒストンを核とするヌクレオソーム構造を取っているので、ヌクレオソームを再構成してDNAに対するDNAメチルトランスフェラーゼDnmt3aとDnmt3bのメチル化活性を比較した。両酵素ともにヌクレオソームをメチル化する活性は著しく低かったが、Dnmt3aがヌクレオソーム核領域DNAをほとんどメチル化できなかったのに対して、Dnmt3bは有意にメチル化した。一方、Dnmt3aは裸のDNA部分に対して特に高い活性を示した。これらの性質が、生体内で両酵素が異なるゲノム領域をメチル化する分子基盤の一つであることを提案した。

DNAメチル化模様は、Dnmt1が複製・修復部位でヘミメチル化CpGを順次メチル化することにより維持される。Dnmt1によるヘミメチル化DNAの触媒特性を解析したところ、Dnmt1自身がDNA上をスキャンして順番にヘミメチル化CpGをメチル化していく性質をもつことを明らかにした。以上の成果は、ゲノムメチル化状態の創生と維持の分子基盤の理解に資するものである。高等動植物ゲノムのシトシン塩基は生理的な条件下でメチル化修飾を受ける。この修飾は遣伝情報発現に抑制的に働く。DNAメチル化を書込むDNAメチルトランスフェラーゼには、3つの遺伝子、Dnmt1、Dnmt3a、Dnmt3bが同定されている。本研究計画では、組換型DNAメチルトランスフェラーゼを用いて、触媒特異性を解析し、ゲノムDNAのメチル化の調節機構を明らかにすることを目指している。本年度は以下の点を明らかにした。マウス雄の16-18日胚生殖細胞ではゲノム全体のメチル化が再構築される。この時期の生殖細胞では、Dnmt3aのアイソフォームであるDnmt3a2とDnmt3Lが非常に高い発現をし、両者がゲノムのメチル化模様の形成には必須である。マウス16.5日胚の雄性生殖細胞を単離して、Dnmt3a、Dnmt3a2、Dnmt3Lを特異的な抗体を用いて定量した。その結果、Dnmt3aは検出限界以下で、専らDnmt3a2とDnmt3Lが同程度発現していた。また、組換型Dnmt3a2のDNAメチル化活性をDnmt3aと比較したところ、Dnmt3a2はDnmt3aと異なり、生理的な塩濃度下ではほとんどDNAメチル化活性を示さなかった。しかし、Dnmt3Lの存在下で有意な活性を示した。Dnmt3a2を専ら発現している雄性生殖細胞でゲノムメチル化にDnmt3Lが必須なのは、Dnmt3a2が生理的な塩濃度条件下で活性を発揮するためであることが明らかとなった。Dnmt1はアミノ末端でPCNAに結合して、複製時にメチル化模様を維持する。我々は、PCNA結合配列を含むアミノ末端(1-248)が領域構造をとること、そして、(119-197)にATに富むDNAの狭い溝に結合する活性があることを明らかにした。このDNAへの結合はPCNA結合活性と競合する。この結果は、Dnmt1が複製期以外の時期、あるいはPCNAと結合していないときには、Dnmt1がATに富む配列に偏在することを示している。このDNA結合活性は、メチル化修飾を受けるペリセントロメア領域などCpGアイランド以外の領域や、PCNA非依存的な塩基除去修復を受ける領域で、メチル化模様を維持するために寄与していると推察される。この修飾は遺伝情報発現に抑制的に働く。DNAメチル化を書込むDNAメチルトランスフェラーゼとして3つの遺伝子、Dnmt1、Dnmt3a、Dnmt3bが同定されている。本研究計画では、組換型DNAメチルトランスフェラーゼを用いて、触媒特異性を解析し、ゲノムDNAのメチル化調節機構を明らかにすることを目指している。
遠隔操作によるロボット内視鏡下手術装置の開発と臨床応用

平成13年度にオリンパス光学工業社製視野移動式腹腔鏡システム(ImageTrac System)を購入し,種々の泌尿器科内視鏡下手術を施行し,視野移動操作の安全性、確実性が実証された.光ファイバー回線に対応可能な通信ソフトを用いて遠隔手術用コンピューター装置,ソフトを開発した.同一手術室内に遠隔操作ユニットおよび視野移動システムを設置し,これらを光ファイバーで接続し遠隔手術を施行した。平成14年度は当学泌尿器科外来に遠隔操作装置を、手術室に視野移動式腹腔鏡システム設置し、これらを光ファイバーで接続し、ATMシグナルを用いて遠隔ロボット操作を伴う腹腔鏡下副腎摘除術に成功した。しかし、光ファイバーを用いた超高速大容量情報伝達システムを利用するためにはATM方式による信号伝送方式をEthernet方式に変更する必要があるため,デジタルビデオEthernet変換機器を内蔵した画像出力装置を開発した.平成15年度は本学研究棟と約300m離れた本学付属病院手術室との間を光ファイバイーで結び遠隔内視鏡下手術を施行した.本機器を用いて、光回線および100メガビットの容量を確保した学内LANを末端としたブロードバンドネットワークを経由し、高速画像転送によるテレロボティックエンドサージャリーを実施した。100メガビットのブロードバンド,インターネットプロトコールを用いた遠隔操作においても,内視鏡画像,音声,モニターレイアウトが的確にリアルタイムに転送され,遠隔手術は安全・確実に施行可能であった.平成16年度には,オリンパス社製ImageTrac Systemを用い,本学研究棟と中央手術室との間で遠隔操作によるカメラコントロールおよび音声,アノテーションによる遠隔支援手術を施行した.遠隔地からのカメラコントロールはリアルタイムに正確に伝送された.今後、本学と遠隔地医療施設との間で本機器を用いたテレロボティックエンドサージャリーを実施するためには、個人情報保護のための情報暗号化システムの開発や遠隔手術における法的問題点などを整備することが急務である.平成13年度にオリンパス光学工業社製視野移動式腹腔鏡システム(ImageTrac System)を購入し,種々の泌尿器科内視鏡下手術を施行し,視野移動操作の安全性、確実性が実証された.光ファイバー回線に対応可能な通信ソフトを用いて遠隔手術用コンピューター装置,ソフトを開発した.同一手術室内に遠隔操作ユニットおよび視野移動システムを設置し,これらを光ファイバーで接続し遠隔手術を施行した。100メガビットのブロードバンド,インターネットプロトコールを用いた遠隔操作においても,内視鏡画像,音声,モニターレイアウトが的確にリアルタイムに転送され,遠隔手術は安全・確実に施行可能であった.平成16年度には,オリンパス社製ImageTrac Systemを用い,本学研究棟と中央手術室との間で遠隔操作によるカメラコントロールおよび音声,アノテーションによる遠隔支援手術を施行した.遠隔地からのカメラコントロールはリアルタイムに正確に伝送された.今後、本学と遠隔地医療施設との間で本機器を用いたテレロボティックエンドサージャリーを実施するためには、個人情報保護のための情報暗号化システムの開発や遠隔手術における法的問題点などを整備することが急務である.1.ロボット内視鏡下手術装置の開発:オリンパス光学工業社製視野移動式腹腔鏡システム(ImageTrac System)を購入し,種々の泌尿器科内視鏡下手術を施行した.内視鏡下手術用鉗子に装着したコントローラーを用いて術者がカメラコントロールを行った。視野移動操作の安全性、確実性は実証されたが、今後の改良点として装置の軽量化、光学視管の細径化、1-CCDから3-CCDカメラへの変更などが指摘された。2.画像転送装置の小型化・高速化:遠隔手術用情報伝達装置の小型化,軽量化を実現した.光ファイバー回線に対応可能な通信ソフトを用いて遠隔手術用コンピューター装置,ソフトを開発した.3.豚を用いた基礎的検討:本学泌尿器科医局に遠隔操作ユニットを、本学動物実験センターに視野移動式腹腔鏡システムを設置し、これらを光ファイバーで接続した。動物実験センターにて豚を用いた内視鏡下手術を施行し、泌尿器科医局からの遠隔操作による内視鏡視野の移動、音声および手術用テレビモニター上の矢印による遠隔地手術指導を行った。内視鏡画像、音声、モニターレイアウト表示はリアルタイムに鮮明、的確に伝送され、遠隔内視鏡下手術の安全性が確認された。4.上記の結果を踏まえて、臨床応用を行った。手術は患者から文書によるインフォームドコンセントを得た後施行した。安全性を期するため、同一手術室内に遠隔操作ユニットおよび視野移動システムを設置し,これらを光ファイバーで接続し、遠隔手術(腹腔鏡下前立腺全摘除術)を施行した。テレロボティックカメラコントロールは的確に作動し、内視鏡画像および遠隔地からの手術指導は鮮明に伝送された。

遠隔操作による視野移動、手術指導の有用性が確認された。今後、全国を網羅する光ファイバーネットワークを利用するために必要な信号伝送方式の変更などを計画している。5.以上の研究成果を国内外で発表した。1.学内光ファイバー回線を用いた遠隔内視鏡下手術:当学泌尿器科外来に遠隔操作装置を、手術室に視野移動式腹腔鏡システム設置し、これらを光ファイバーで接続し、遠隔ロボット操作を用いた腹腔鏡下副腎摘除術に成功した。遠隔支援手術は手術室から約100メートル離れた外来にコントロール室を設け、光ファイバーを配線し施行した。手術室にはデジタル画像伝送装置、視野方向を遠隔地から制御可能な腹腔鏡カメラ(ImageTrac Video System^<TM>、オリンパス社製)、室内用カメラを設置した。コントロール室には画像伝送コントローラー、デジタル画像伝送装置、腹腔鏡カメラコントローラー、室内用カメラを設置した。音声はヘッドマイクロフォンをつけて双方向で会話した。通信には大容量デジタル回線を用いた。手術画像はコントロール室のモニターに表示され、コントロール室からのカメラコントロールおよびポインティングは、逆の経路でされた。また、外来の画像伝送コントローラーには症例の画像、他症例の手術ビデオを取り込んでおき、必要に応じて端末モニターに表示した。手術中に機器のトラブルはなく、リアルタイムに鮮明な画像を送受信することができ、離れた場所からのカメラ視野コントロールもスムーズに行うことができた。2.画像転送システムの改良:光ファイバーを用いた超高速大容量情報伝達システムを利用するためにはATM方式による信号伝送方式をEthernet方式に変更する必要があるため、デジタルビデオEthernet変換機器を内蔵した画像出力装置を開発した.3.以上の研究結果を世界泌尿器内視鏡学会、第5回テレサージャリー研究会等にて発表するとともに、遠隔支援手術、泌尿器腹腔鏡下手術に関する発表を行った。(1)遠隔ロボット内視鏡下手術の開発:我々は既に本学泌尿器科外来と手術室を光ファイバーで直接接続し,遠隔地からの操作によるテレロボティック内視鏡下手術を施行した.光ファイバーを用いた大容量高速伝達シグナルにはATM方式を使用した。手術室から約100m離れた場所からの遠隔操作においても,内視鏡画像,音声,モニターレイアウトが的確にリアルタィムに転送され,遠隔手術は安全・確実に施行可能であった.これらの成果を踏まえて、今年度は本学研究棟泌尿器科学教室と約300m離れたと本学付属病院手術室との間を光ファイバイーで結び(本学にすでに設置されている光回線を使用)以下に述べる方法で遠隔内視鏡下手術を施行した.
DNAと加齢-ミトコンドリアを中心に

今年度は引き続き、ミトコンドリアDNA(mtDNA)と核DNA(nDNA)の量比の加齢に伴う変動をラットの各組織を対象に行った。測定をより正確に行うため、内部標準としてnDNAに存在する高度繰り返し配列"LINE"を用いる事とした。LINE配列のうち、制限酵素SalIとPstIで切り出される2kbpの断片に対応するプローブを合成しビオチン化した(プローブN)。ラットの種々の組織から野精製DNAをEcoRI,SalIとPstIで消化したものをサザンブロッドし、mtDNAのプローブとプローブNを同時に加えてハイブリッドさせる。このようにするとビオチン化プローブの発色の程度は、mtDNAとnDNAに対するものが同時に測定できる程度なので、この発色強度の比をmtDNA/nDNAの値とした。mtDNAプローブの方はLINEの2kbpと分離の良いEcoRIのA断片(62kbp)に対応するプローブを用いることにした。心筋では、前年度までに24ヶ月齢で減少が認められていたが、30ヶ月齢も測定した。その結果、肝と同様に30ヶ月齢では2ヶ月齢の30%以下となっていた。また、これまでの実験は餌を60%に制限したラット群の値であったが、自由食の群と比較し、餌の効果を調べた。その結果、肝臓では制限食の場合と同様にmtDNA/nDNAの量比は加齢と共に減少した。心筋では、この比の減少は少なくなった。腎臓では逆に、制限食の時は減少せず、自由食の方は減少傾向を示した。さらに、自由食ラットの脳についてmtDNA/nDNAの量比を測定した結果では、大脳では減少が認められたが、小脳を含む部分では減少しなかった。私達はこれまでに、ラットのミトコンドリアDNA(mDNA)上の3つの配列をプローブとして、肝細胞での加齢に伴うmDNA量の核DNA量に対する減少を明らかにしてきた。4年度には、新たにmDNAの複製起点を含む約1kbの配列をはさむプライマーを用い、PCR法で増やした配列をプローブに加えた。これら4つのプライマーを使って、ラットの心筋、大腿骨格筋におけるmDNAの加齢変化を、既報に従って測定した。その結果、心筋においては、肝ほどではないがやはりmDNA量の減少が観察され、24ヶ月齢ラットでは、2ヶ月齢ラットの約60%になっていた。また、老齢ラットの大腿骨格筋では、サザンブロットの結果、若ラットや肝では見られない異常なバンドが観察され、mDNAに制限酵素分解に抵抗性の異常が起きている事が予想された。これらの結果から、いずれの組織においても正常なmDNAは加齢とともに減少することが明らかとなった。すなわち、これらはmDNAの変化が老化と深い関連性を有するという私達の仮説を支持するものである。今後は、引き続き他の組織についても同様な試みを広げると共に、個体差からくる実験結果の振れを小さくするために、例数を増やす等してこの仮説を確かにして行きたい。一方、mDNAの減少に働いていると予想されるミトコンドリアのヌクレアーゼについても研究を開始している。いままでに、ミトコンドリアに少なくとも2つのヌクレアーゼを見つけている。これらは、既報のDNaseとは異なっていることが明かとなった。現在これらの精製を進めている。測定をより正確に行うため、内部標準としてnDNAに存在する高度繰り返し配列“LINE"を用いる事とした。LINE配列のうち、制限酵素SalIとPstIで切り出される

2kbpの断片に対応するプローブを合成しビオチン化した(プローブN)。ラットの種々の組織からの精製DNAをEcoRI,SalIとPstIで消化したものをサザンブロットし、mtDNAのプローブとプローブNを同時に加えてハイブリッドさせる。このようにするとビオチン化プローブの発色の程度は、mtDNAとnDNAに対するものが同時に測定できる程度なので、この発色強度の比をmtDNA/nDNAの値とした。mtDNAプローブの方はLINEの2kbpと分離の良いEcoRIのA断片(6.2kbp)に対応するプローブを用いることにした。心筋では、前年度までに24ヶ月齢で減少が認められていたが、30ヶ月齢も測定した。その結果、肝と同様に30ヶ月齢では2ヶ月齢の30%以下となっていた。また、これまでの実験は餌を60%に制限したラット群の値であったが、自由食の群と比較し、餌の効果を調べた。その結果、肝臓では制限食の場合と同様にmtDNA/nDNAの量比は加齢と共に減少した。心筋では、この比の減少は少なくなった。腎臓では逆に、制限食の時は減少せず、自由食の方は減少傾向を示した。さらに、自由食ラットの脳についてmtDNA/nDNAの量比を測定した結果では、大脳では減少が認められたが、小脳を含む部分では減少しなかった。
マツ材線虫病の被害を受けたクロマツ海岸林の炭素収支と被害木の分解呼吸速度

マツ材線虫病によるマツ類の集団枯死が,マツ林生態系の炭素動態に与えるインパクトを調べることを目的として,東京大学愛知演習林新居試験地において,固定プロット内での毎木調査による純一次生産量(NPP)の調査と同試験地に残存している被害木の分解呼吸量の調査を実施した.調査を実施した新居試験地は,1929年より海岸の砂丘にクロマツを主体とした造林をおこなわれ,1998年からマツ材線虫病被害が本格化し,最近,その被害が収束し,生き残ったクロマツと枯死したクロマツが混在しているような試験地となっている.毎木調査によるNPP推定結果と分解呼吸速度を用いて,マツ材線虫病被害が甚大であった過去10年間における同試験地(23ha)のマツ林生態系の炭素収支を見積もった結果,同試験地は75 tC 23ha^<-1> 10yr^<-1>の炭素を大気に放出していることがわかった.また,現時点で分解されていない枯死木が,今後数十年にわたって,同試験地の炭素循環に影響を与え続けると考えられた.分解呼吸速度の測定は,大型の測定チャンバーを用いて,同試験地内にハイ積みされているクロマツ枯死木の丸太を対象に実施された.その結果,丸太の分解呼吸速度と丸太の温度および体積含水率の間には,正の相関が認められた.本研究のように,林地に残存する倒木の分解呼吸速度を調べた事例は非常少ないため,本研究で得た結果は,今後の森林の炭素循環と病虫害による集団枯死との関係を論じる際の基礎的な知見として重要である.マツ材線虫病によるマツ類の集団枯死が,マツ林生態系の炭素動態に与えるインパクトを調べることを目的として,東京大学愛知演習林新居試験地において,固定プロット内での毎木調査による純一次生産量(NPP)の調査と同試験地に残存している被害木の分解呼吸量の調査を実施した.調査を実施した新居試験地は,1929年より海岸の砂丘にクロマツを主体とした造林をおこなわれ,1998年からマツ材線虫病被害が本格化し,最近,その被害が収束し,生き残ったクロマツと枯死したクロマツが混在しているような試験地となっている.毎木調査によるNPP推定結果と分解呼吸速度を用いて,マツ材線虫病被害が甚大であった過去10年間における同試験地(23ha)のマツ林生態系の炭素収支を見積もった結果,同試験地は75 tC 23ha^<-1> 10yr^<-1>の炭素を大気に放出していることがわかった.また,現時点で分解されていない枯死木が,今後数十年にわたって,同試験地の炭素循環に影響を与え続けると考えられた.分解呼吸速度の測定は,大型の測定チャンバーを用いて,同試験地内にハイ積みされているクロマツ枯死木の丸太を対象に実施された.その結果,丸太の分解呼吸速度と丸太の温度および体積含水率の間には,正の相関が認められた.本研究のように,林地に残存する倒木の分解呼吸速度を調べた事例は非常少ないため,本研究で得た結果は,今後の森林の炭素循環と病虫害による集団枯死との関係を論じる際の基礎的な知見として重要である.
2次元電子格子の位相と伝導現象

最近Si-MOSFETの系で外部磁場を加えなくても電子密度を適当にとればWigner結晶が生成できる事がPudalovらによって実験的に示された。本研究ではこのような半導体MOS構造の界面に生成される準2次元的電子がWigner結晶を作った時の電子伝導度を理論的に解析し実験と比較した。電子の散乱体として界面のラフネスまたはイオン化した不純物を考えた。この時Wigner結晶中のフォノンは散乱のために波数0の点でエネルギー・ギャップが生じ、不純物の存在に敏感な電気伝導に顕著な影響を与える。このエネルギー・ギャップを定めるために、Wignerフォノンの分散を自己無撞着調和近似を用いて解いた。自己無撞着調和近似においてはフォノンの分散は電子の密度相関関数の汎関数で表わされるが、この密度相関関数は時間と空間に依存した動的なDebye-Waller因子に依存し、またDebye-Waller因子はフォノンの分散に依存する。このような意味で密度相関関数およびフォノンの分散が自己無撞着に定まる。得られたフォノンの分散関係より伝導度を計算すると、絶対零度では直流の線形伝導は消失し、またあるしきい電場以上で非線型伝導が期待される。有限温度ではArrhenius型より若干ずれた型の伝導を示す。交流伝導度はエネルギー・ギャップに対応する有限周波数より始まりフォノンのバンド幅程度の範囲で有限となる。この幅はWignerフォノンの位相の乱れが原因で生ずる。しかしながら得られたギャップの濃度依存性は実験と定性的に異なり、更に検討が必要である事が判明した。
フグのウオジラミがフグの鰭のみに寄生する分子メカニズムを探る

(1)ウオジラミ類のcopepodid期(広義)数は6であり、一部の種の成体は宿主交替を行うと推測された。カワハギ類の鰭に特異的に寄生するペンネラ類Peniculus minuticaudaeの生活史を明らかにした。寄生性カイアシ類にとって鰭は感染が容易である反面、栄養摂取面では制限的であると推測される。(2)バイオアッセイとサブトラクティブPCRの結果、トラフグ類の鰭に寄生するウオジラミ類Caligus fuguの感染期の誘因物質は水溶性であり、鰭で発現量が多い遺伝子のうち分泌タンパク質または酵素をコードする少なくとも10個のうちのいくつかが誘因に関与する可能性がある。トラフグ鰭由来cDNAを発現ベクターに組み込み、昆虫細胞High Fiveにトランスフェクトした。このように得られた細胞ライブラリー(多様性約100万)を培養し、得られた培養上清に対するPseudocaligus fuguの反応性について検討した。コントロールにはインサートを含まない発現ベクターをトランスフェクトさせた細胞の培養上清を用いた。Y字型試験管を用いた感染期コペポディド幼体の選択実験では、鰭由来cDNAをインサートした昆虫細胞の培養上清や宿主飼育水への嗜好性を明らかに示した。以上の結果は、トラフグ鰭で発現している分泌性タンパク質のいずれかがP. fuguの感染期を寄生部位である鰭に誘引していることを強く示唆している。サブトラクティブPCRに関しては、昨年度から継続して候補遺伝子の探索を行っている。これまでに約350クローンについて塩基配列を得ることができた。これらの中に分泌性タンパク質が多数含まれていた。ウオジラミ類の感染メカニズムについての化学的アプローチに加えて、P. fuguを含むウオジラミ類の生活史における成長段階数、成体の再感染能力の有無について現在でも活発な議論のある問題に関しても顕著な成果を得らることができた。つまり、ウオジラミ類においても通常のカイアシ類と同様、コペポディド期に相当するステージは6期(Pseudocaligus属、Caligus属などではコペポディド幼体1期、カリムス幼体4期、成体1期、Lepeophtheirus属などではコペポディド幼体1期、カリムス幼体2期、前成体2期、成体1期)存在し、成体でも再感染機能のある種が存在することの確証を得た。(1)昆虫細胞を用いた細胞表面ディスプレイ法についてこれまで生じた問題の解決を試みた結果、本手法は細胞表面に提示させたトラフグ由来の膜タンパク質とウオジラミ類由来の膜タンパク質との相互作用を調べるのには適していない、という結論に至った。これは、膜タンパク質の可溶化に用いる界面活性剤によるもので、酵母を利用した系のように界面活性剤に耐性のあるものを利用する必要があることが明らかとなった。サブトラクティブハイブリダイゼーション(SSH)法による、胸鰭において皮膚よりも発現量の多い候補遺伝子の探索についてはシーケンスを収集することができ、392個の配列が得られ、このうち独立した配列数は135個であった。これらは118個の遺伝子をコードしていた。このうち、分泌タンパク質あるいは誘引物質の合成・修飾に関与すると思われる酵素47個を選び出し、実際に両組織で発現量が異なるのかをRT-PCRによって調べた結果、10個の候補にまで絞り込むことができた。SSH法では網羅性に問題があることや得られた候補の真偽判定が煩雑であるため、次世代シーケンサーを用いたRNA seq法を導入することでこれらの問題を解決できる。(2)カワハギ類の鰭に寄生するカイアシ類Peniculus minuticaudeの生活史、全発生ステージを解明した。本種の属するペンネラ科では成体雌のみが別な宿主あるいは同一宿主の別な寄生部位に替わる生活史が知られていたが、本種では成体雌も含む全ステージが同一宿主の鰭上で過ごすパターンであった。この生活史の相違は宿主への感染の容易さ、宿主からの栄養吸収のしやすさ、寿命、産卵量等との関連があると推定される。また、ウオジラミ類全般のcopepodid期(広義)の発生ステージ数が通常のカイアシ類同様に6期であることを明らかにした。トラフグの鰭に発現しているレセプターとウオジラミ類Pseudocaligus fuguの感染期であるcopepodid期の虫体表面に存在するリガンドとの結合が寄生部位特異性をもたらしているのではないか、という仮説のもと以下の研究を進めた。まず昆虫細胞を用いた細胞表面ディスプレイ法によって、モデルとして選んだトラフグの膜タンパク質2種類について発現および細胞表面への提示が確認されたことから、鰭由来のcDNAライブラリーをトランスフェクトさせた場合でも膜タンパク質を昆虫細胞表面に発現できるであろうと考えられた。

現在、実際のライブラリーのスクリーニングを行っている最中である。これと並行して、鰭で多く発現している遺伝子をサブトラクティブPCR法によって同定することを試みた。鰭、特にその表面は皮膚とほぼ同じ構造をもつため、発現している遺伝子の大部分は同一であると考えられた。そこでこれら2つの組織からcDNAを調製し、鰭において皮膚よりも発現量の多い遺伝子の断片を得た(サブトラクション)。G3PDHはほとんどすべての細胞において発現量がほぼ同じと考えられる遺伝子だが、これに対するプライマーを用いたPCRの結果、サブトラクト前のcDNAを鋳型とした場合にはバンドが認められたがサブトラクト後の場合は認められなかった。このことから、サブトラクトは問題なく行えたと考えられた。このライブラリーをクローニングベクターに組み込み、これまで約200クローンについてシーケンスを得ている。現在、さらに多くのクローンについてシーケンシングを進めている最中である。さらに、ウオジラミ類の感染期の感染行動を観察した。感染期は宿主の鰭に第2触角、顎脚で付着後、第2小顎で鰭組織を掘削する行動を示し、感染後約2日目にfrontal filamentの形成が完了し、chalimus期に変態した。鰭cDNA発現昆虫細胞ライブラリーはもともと膜タンパク質のスクリーニング系として確立したものだが、分泌性タンパク質の遺伝子もライブラリー内に含まれるため培養上清中にこれらが分泌されていることが想定された。本年度、Pseudocaligus fuguの誘引活性を調べるためのアッセイ系を確立することができ、さらには培養上清に対して実際に誘引活性を示すという知見を得ることができた。この成果は今後誘引分子の同定に向けて重要なものであるといえる。サブトラクティブPCRに関しては、本年度も引き続き配列解析を進め、部分配列の数を順調に増やすことができた。これらは誘引活性の有無を調べるための候補分子となるもので、より多くの候補が得られたことは今後の誘引分子の同定につながると考えられる。また、ウオジラミ類の生活史に関して混乱していた成長段階数、成体の再感染機能に関して新たな知見を得ることに成功した。以上、来年度において今後研究を進展していく上で欠かせない成果を得ることができ、おおむね順調に進展しているものと判断される。細胞表面ディスプレイ法に関しては、鰭cDNAライブラリーからレセプターのスクリーニングを試みるところまで研究を実施できた。その過程においていくつかの問題に直面したが、既にそれらに対する対策を練って研究を進めている最中で、平成24年度の早い段階で克服できるものと考えられる。サブトラクティブPCR法に関しては、トラフグの皮膚および鰭において皮膚よりも発現量の多い遺伝子をいくつか拾い上げることに成功した。サブトラクト後のcDNAライブラリーにはこれまで同定できていない断片がまだまだ含まれていると思われ、この中に直接的あるいは間接的にウオジラミ類の感染期の感染、変態を誘発するような分子が含まれていることが期待される。感染期の感染行動を時間的スケール上でほぼ把握できたが、感染行動を実験室内で人工的に誘発できるような方法を現在、模索中である。
低酸素応答に関わる細胞内情報伝達の細胞外環境依存的な制御機構の解析

副腎由来の培養細胞を低マグネシウム下に曝すと、低酸素応答の阻害因子であるIPASの発現量が増加し、低酸素応答を抑制していることがわかった。さらに低マグネシウム時のIPASの発現誘導機構も解明した。低マグネシウム血症のマウスでは副腎や頸動脈小体における低酸素応答が欠如することがわかった。酸素センサーとして働くこれらの組織の活性化が起きないことは循環機能に負担をかけ、心臓疾患の発病原因になる可能性が示唆される。細胞の低酸素応答機構は近年その研究が急速に進んでおり多くの知見が得られてきている。その中で特にHIF-1とそのファミリー分子が低酸素応答において重要な基本因子であることが見出されている。当研究室の予備的実験において、ラットの副腎髄質クロム親和性細胞であるPC12細胞を異なる培地で培養すると低酸素応答に差が生じ、その原因は培養液中のマグネシウム濃度と数種のアミノ酸濃度が重要であることがわかってきていた。またマウスにおいても同様に栄養状態依存的に低酸素応答に差が生じることが見出されていた。しかし、その詳細な分子機構に関しては未解明なままであり、本研究においてはその解明を目的とした。栄養状態依存的な低酸素応答の違いが起こる要因として、近年同定されたHIF-1転写活性化経路の阻害因子であるIPASが候補であるという証左が得られてきているので、その低酸素応答の変化への寄与の程度を調べるため培養細胞を用いた実験を行った。PCl2細胞にIPASを過剰発現させたところ、コバルト依存的な低酸素誘導が抑制された。さらに内在性のIPASをsiRNAによって減少させた場合、栄養状態依存的な低酸素応答の差が部分的に見られなくなった。このことから上記の現象にはIPASが重要な因子であることがわかった。また、他の細胞種を用いた研究から上記のような現象は内分泌系の細胞種に特有の現象である可能性が示唆された。今後上記の結果を元にして、マウスのおいての解析を進展させる予定である。細胞の低酸素応答においてHIF-1alphaとそのファミリー分子が重要な基本因子であることが明らかにされている。前年度までの研究において、ラットの副腎髄質クロム親和性細胞であるPC12細胞を異なる培地で培養すると低酸素応答に差が生じ、この現象にはHIF-1転写活性化経路の抑制因子であるIPASの低マグネシウム時の発現誘導が重要な要素であることがわかった。今年度の研究で、PC12細胞を用いた実験から、このマグネシウムの要求性は活性酸素を引き起こすようなコバルトや間欠的低酸素の曝露時にだけ見られ、恒常的低酸素曝露時には起こらないことがわかった。低マグネシウム血症のマウスにおいても、コバルトや間欠的低酸素依存的な副腎や血管内の酸素センサーとしての機能を持つ頸動脈小体におけるHIF-1の標的であるチロシン水酸化酵素の発現誘導が欠如することがわかった。低マグネシウム血症時にこれらの組織の活性化が起きないことは、循環機能に負担をかけ心臓疾患などの発病原因になる可能性が考えられる。さらにマグネシウムが様々なカルシウムチャネルの阻害剤として機能する点に着目して、IPAS遺伝子の発現活性化メカニズムの解析を行った。その結果、コバルトによって活性化されたPI3キナーゼ経路と低マグネシウムによって抑制を解除されたカルシウムチャンネルより活性化された細胞内カルシウム経路の両方が引き金となってNF-kappaBを経由してIPASの発現誘導が引き起こされることがわかった。IPASのような抑制因子の発現機構や活性化機構の解明は、細胞の低酸素応答機構の研究の発展に貢献すると考えられる。
大容量分取キャピラリーGCを用いた脂質バイオマーカーの水素同位体比の測定

有機化合物、特に環境中のバイオマーカーなどの微量有機化合物の水素同位体比の測定は、これまで全く行われてこなかったが、それには2つの方法が考えられた。1つは、本研究で昨年度来、取り組んで来た「有機化合物を分子レベルで1つ1つ分離して大量に回収し、それをOff-Lineで酸化・還元して含有水素原子を水素ガスに変え、質量分析計に導入する方法」、もう1つは、米国のWoodHole海洋研究所などで先駆的に開発されて来た「有機分子をガスクロマトグラフで分離し、On-Lineで熱分解炉に導入し含有水素原子を水素ガスに変え、そのまま質量分析計に導入する方法」である。前者は後者に対し、「On-Line水素同位体比測定用の特殊な質量分析計を必要とせず、既存の真空ラインなどの組み合わせで測定が実現可能」という利点があった。本年度は、昨年度に引き続き、当研究室に既存の「大容量分取キャピラリーガスクロマトグラフ(PCGC)装置」を用いて脂質化合物の分子種毎の分取を進めると共に、真空ラインを使って、水素同位体比の測定条件の検討を進めた。しかし一方で、本年度には「当研究室へのOn-Line水素同位体比測定用の質量分析計の導入」という新たな事情が、予想外に早く発生したことにより、On-Lineでバイオマーカーの水素同位体比を測定できる方式の検討を合わせて行うことになった。本方式には、「試料が極微量でも測定可能であり、処理にも長時間を要しない」などのメリットが有り、明らかに今後の応用に置いては、その中心になることが予想できる。本研究で検討された「大量の試料分取によるバイオマーカーのOff-Line水素同位体比測定」の方式は、今後は、「On-Line方式」の検証用、及び「分子内同位体比分布(アイソトポマー)測定」などの、更に進んだ研究目的を先駆的に実行していくための基礎技術になると言える。本研究では、「有機化合物を分取用キャピラリーGCを用いて、100μgオーダーで各分子種毎に大量に分取する方法(PCGC法)」と「真空装置中で化合物を酸化・還元してH_2ガスを作り、それを同位体質量分析計(IRMS)に導入して水素同位体比を測定する方法(Off-Line法)」を組み合わせることで、アルカンや脂肪酸、ステロール、ホパン等々の各種脂質バイオマーカーの個別水素同位体比の測定を可能にすることを目指している。本年度は、その測定のための準備段階として、以下の課題に取り組んだ。第一に、新たに脂質化合物の分離・精製に使用するロータリーエバポレーターなどの各種実験器具を購入し、化合物の分離・精製条件の検討を進めるとともに、本研究室に既設の設備である「大容量分取キャピラリーガスクロマトグラフ(PCGC)装置」を用いて脂質化合物の分子種毎の分取条件の検討を進めた。その結果、100μgオーダーの有機化合物を分子種毎に短期間に回収する条件を決定できた。第二に、真空ラインを整備して、単離した100μg程度の脂質化合物をH_2ガスに変換させる条件を検討した。また、本研究室に既設の同位体比質量分析計を整備し、スタンダードガスの調整などを行って、水素同位体比の測定条件を決定した。これらの結果、単離された各化合物をそれぞれH_2ガスに変換して、その水素同位体比を測定する条件を整えることが出来た。来年度は、これらの技術を用いて、実際の環境中の脂質バイオマーカーの分子レベル水素同位体比を測定・解析し、それらの同位体比情報が、バイオマーカーの起源生物の生息環境や生理状態等、どのような因子に規定されて決まるのかについて議論する。
全身性カルニチン欠乏マウス(JVSマウス)における妊よう性低下の病態に関する検討

Juvenile Visceral Steatosis(JVS)mouseにはカルニチン輸送担体の活性がない(BBRC223:283,1996)。即ち、ヒトのprimary carnitine deficiencyのanimal modelである。このマウスのオスでは妊よう性の低下があるので、その原因を検索した。研究実績の概要は以下のとおりである。1.原因遺伝子の同定2.精巣の分析JVSマウスのオスは生殖能が極めて悪く、その原因を知る目的で組織学的分析を行った。その結果、精巣上体の体部と尾部の間で、閉塞(6例中5例が完全、1例が不完全)し、完全閉塞の場合、尾部には精子が見られなかった。精巣上体は精子を通過させながら、成熟させていく極めて大切なorganであり、JVSマウスがヒトの閉塞性無精子症のanimal modelになりうる可能性を示した。3..カルニチン輸送に対する阻害剤の発見3-〈2,2,2-trimethylhydrazinium)propionateがカルニチン輸送に対する阻害剤であることを見い出した。将来本研究を推進させるのに有力な武器になりうると考えられた。Juvenile Visceral Steatosis (JVS)mouseはカルニチン輸送担体の活性がない(BBRC174:1090,1991)。このため腎でのカルニチンの再吸収が障害され(BBA 1226:25,1994)、血中と全身の組織(肝、心、骨格筋)でのカルニチン濃度が低下する(J Mol Cardiol 30:773,1998)。平成10年度の研究実績の概要は以下のとおりである。1)原因遺伝子の同定2)精巣の分析JVSマウスのオスは生殖能が極めて悪く、その原因を知る目的で組織学的分析を行った。その結果、精巣上体の体部と尾部の間で、閉塞(6例中5例が完全、l例が不完全)し、完全閉塞の場合、尾部には精子が見られなかった。1991年、我々は全身性カルニチン欠乏マウス(JVSマウス)を報告し、1996年にそれがカルニチン輸送担体欠損マウスであることを示した。また1998年にはマウスoctn2 (Na^+ dependent camitine transpoter)をCloningしその第6transmembranedomainにあるcodon 352のCTG(Lue)がJVSマウスではCGC(Arg)に変異していることを報告した。JVSマウスのオスの生殖能は極めて悪く、その原因は不明であった。精子の中間部はらせん状のミトコンドリアが密に詰まっていることでよく知られているので、心臓に見られるような、ミトコンドリア増殖・変性を期待し電子顕微鏡学的に分析した。しかし、正常と全く変わらなかった。そこでオス生殖器を組織学的に系統的に分析することにした。その結果、肉眼的に精巣上体の体部と尾部の間で、閉塞(6例中5例が完全に、1例が不完全)していることを発見した。電子顕微鏡学的には、体部の精巣上体管内には多数の精子が見られその上皮細胞が平坦化し、間質に突入している所見も得られた。一方、尾部精巣上体管内には精子は見られなかった(6例中5例)。カルニチン輸送担体の特異抗体を作成しこれを用いて免疫染色を行うと、精巣上体ではJVSマウスも正常対照と同程度に染色された。本研究をすすめるためには、JVSマウスだけを用いるには限界があるので我々はJVSマウスを可逆的に作成する方法をさがしていた。そして、ついに、心不全治療薬として開発中であった3-(2,2,2-trimethylhydrozinium)がカルニチン輸送に対し、competitive inhibitorであることを発見した。将来本研究の成就には、この物質が有力な武器になると考えられた。
運動学習における腹側被蓋野の役割解明と同領域の賦活化による運動機能調節の試み

中脳のドーパミン神経核(腹側被蓋野)から運動野皮質への神経投射の役割解明を試みた。一次運動野皮質の神経活動を膜電位イメージング法で解析した結果、腹側被蓋野が一次運動野皮質の神経応答を数十ミリ秒の時間窓で制御していることが明らかになった。また、腹側被蓋野は高次運動野の神経活動も直接・間接的に調節している可能性が示された。さらに、運動学習中の腹側被蓋野に電気刺激を与えることにより、歩行の運動パフォーマンスが改善される可能性が示唆された。本研究課題は、腹側被蓋野と一次運動野の活動相関を調べ、運動学習中の腹側被蓋野に適切なタイミングで電気刺激を行う介入操作により、学習効果に改善が見られるかどうかを検証することを目的とする。本研究アプローチでは、腹側被蓋野と一次運動野の活動相関・活動タイミングを明らかにすることが極めて重要な鍵となる。そこで本年度は、麻酔下動物を用い、腹側被蓋野と一次運動野の賦活化のタイミングによって、筋活動を生じさせる一次運動野皮質の脳神経活動がどのように調節されるのかについての解析を試みた。実験ではラットを用い、一次運動野皮質を露出後、皮質神経活動の膜電位イメージングを試みた。刺激電極を腹側被蓋野および一次運動野5層に留置し、両部位間の賦活化タイミングを電気刺激により0350msの時間ウィンドウで制御した。この結果、腹側被蓋野の活動が30-50ms先行する時は一次運動野皮質の活動を抑制、一方、100-350ms先行するときは促進することが明らかとなった。光シグナルの解析では、イメージング画像の全画素に対し、刺激時間間隔のタイムシフト操作を行ってフレーム間差分を行うことで、光シグナルの振幅値および応答時間幅の比較解析処理を行った。今回の結果から、先行する腹側被蓋野の賦活化タイミングが、運動開始に係る一次運動野皮質の活動より概ね100ms以内か以降かにより、その効果が異なる可能性が示唆された。この結果から、運動学習においては一次運動野皮質活動の促進だけでなく、その学習ステージに依存し、皮質活動の抑制が求められる状況があり得るのではないかと推測された。今後、現在までに得られた知見に基づき、運動学習中の腹側被蓋野への電気刺激タイミングの条件を検証する。本研究課題遂行の鍵となる「腹側被蓋野と一次運動野の活動タイミング」に関し、本年度は膜電位イメージング手法を用いた解析を進め、新しい知見を得ることができた。両脳部位の賦活化タイミングにより、促進/抑制の相反する影響を生じさせるタイミング・ウィンドウの条件が明らかになった。得られた条件を、次年度以降、腹側被蓋野の電気刺激実験のパラメータに組み入れる。また、脳損傷モデル動物作成の予備実験と、タスクトレーニング装置の改良設計を開始しており、研究計画は順調に進展していると評価できる。昨年度までの研究において、先行する腹側被蓋野の賦活化タイミングが、運動開始に係る一次運動野皮質の活動より概ね100ms先行する時間ウィンドウにあるか否かにより、筋運動の発現に促進的に働くか抑制的に働くかその効果が逆転する可能性が示唆された。この実験では、運動関連皮質の膜電位イメージング法を利用したが、その際、腹側被蓋野の電気刺激が惹起する神経興奮が、ある条件下では、一次運動野だけでなく高次運動野皮質にまで伝搬する現象が確認された。そこで本年度は、運動関連皮質(一次および高次)領域間の情報伝達様式についてより詳細な解析を行った。結果、高次運動野皮質が一次運動野を中継して情報を受け取る神経回路の存在が明らかになった。この情報伝達においては皮質下神経核の関与はなく、大脳皮質2/3層と5層を使って皮質ー皮質間神経情報伝達が行われていることを、大脳皮質の部分切除術や薬剤による不活化実験、電流源密度解析法などを用いて示すことができた。これらの実験結果から、運動学習における腹側被蓋野の電気刺激の作用について、介入条件(電気刺激パラメータ)を適切に選択することにより、一次運動野皮質だけでなく高次運動野皮質までも動員し、より大規模な運動関連皮質ネットワークの活動を制御することによる運動調節の可能性が示唆された。今後、現在までに得られた知見を利用して、運動学習中の腹側被蓋野への電気刺激条件と学習効果の検証を進める。本研究課題遂行の鍵となる「腹側被蓋野と一次運動野の活動タイミング」に関し、膜電位イメージング手法などを用いた解析を進め、新しい知見を得ることができた。両脳部位での賦活化タイミング・ウィンドウ条件に加え、高次運動野皮質を動員するための腹側被蓋野への電気刺激条件が明らかになった。次年度以降、得られた知見を腹側被蓋野の電気刺激実験のパラメータに組み入れる。また、脳損傷モデル動物作成の予備実験とリーチング・タスクトレーニングを開始し、研究計画は順調に進展していると評価できる。腹側被蓋野に電気刺激用電極を留置し、運動学習課題のトレーニングを行った。