hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
逆遺伝学的手法による新型狂犬病経口ワクチンの開発

本研究の目的は、最近我々が確立した狂犬病ウイルスのリバースジェネテックス(逆遺伝学)の手法を用いて、これまでにない高い免疫原性と安全な画期的な狂犬病不活化経口ワクチン製造株の創世に係わる基礎情報の確立と、それに基づいたワクチンの実用化を目指したものである。その結果、以下の成果が得られた。2.従来のワクチニアウイルスを使わずに組換え狂犬病ウイルスを効率よく回収するT7RNAポリメラーゼ恒常発現細胞系(BHK/T7-9)を確立した(Microbiol.Immnol.,2003)。3.BHK/T7-g細胞にM蛋白質発現プラスミドを導入し、リバースジェネテックスにより、M遺伝子欠損ウイルスを効率よく回収した。M遺伝子欠損ウイルスは現行ワクチンのRC-HL株より免疫原性および安全性の高いことが確認された(第51回日本ウイルス学会、2003)。以上、逆遺伝学的手法により遺伝子を配置換え、組換えあるいは欠損させた様々な変異狂犬病ウイルスを世界に先駆けて創出した。現在、これらの創出したウイルスの培養細胞における増殖性、マウスにおける免疫原性および安全性を調べている。本研究の目的は、最近確立されたモノネガウイルスのリバース・ジェネテックス(逆遺伝学)の手法を用いて、これまでにない画期的な狂犬病不活化経口ワクチン用のウイルス株を創世し、そのワクチンを実用化することである。そこで、計画初年度の本年は、新ウイルス株構築のために病原制御アミノ酸領域の特定並びに新たなcDNAクローンの確立を試みた。さらに、細胞に感染してウイルス蛋白質を合成するが子孫ウイルスを産生しない「半生」ワクチン創世のための基礎実験を行った。その結果、以下の成績を得た。1)弱毒のRC-HL株ゲノムをバックグランドにG遺伝子のみを西ケ原株由来に組換えたキメラウイルスを作出した。そのキメラウイルスはRC-HL株と同様に培養細胞で良く増殖し、一方、マウスでの免疫原性は西ケ原株と同等であった。(J.Virol.,2001)2)弱毒のRC-HL株ゲノムをバックグランドにG蛋白質のアミノ酸164-303位のみを強毒の西ケ原株由来に組換えたキメラウイルスのマウスに対する病原性から、164-303位の領域がマウスの致死性に強く関与していることを始めて明らかにした。(第49回日本ウイルス学会2001、発表)3)マウスに致死的病原性を示すが、比較的高い免疫原性を示す西ケ原株の感染性cDNAを確立した。(第133回日本獣医学会2002、発表予定)4)「半生」ワクチン用ウイルス株を作出するために、M遺伝子を欠損したゲノムプラスミドを構築した。また、最初の粒子形成に必要なM蛋白質を供給するため、M蛋白質を一過性に細胞内で発現させるためのプラスミドも作製した。現在、RC-HL株遺伝子操作系を用いてM遺伝子欠損ウイルス粒子の回収を試みているが、成功していない。今後は、「半生」及び遺伝子配置換えウイルスを構築し、それらの生物性状を調べる予定である。本研究の目的は、最近確立されたモノネガウイルスのリバース・ジェネテックス(逆遺伝学)の手法を用いて、これまでにない高い免疫原性と安全な画期的な狂犬病不活化経口ワクチン用のウイルス株を創世し、そのワクチンを実用化することである。そこで、研究初年度の昨年(H13年)は、現行ワクチン株の病原制御アミノ酸領域の特定と高い免疫原性を持つ西ケ原株の感染性cDNAを確立した。また、細胞に感染してウイルス蛋白質を合成するが子孫ウィルネを産生しない「半生」ワクチン創世のための基礎実験を行った。そこで、本年度は、確立した感染性cDNAを用いて、「半生」ワクチン株のM遺伝子欠損ウイルス作成および5つの遺伝子を配置換えしたウイルスの構築を行い、以下の結果を得た。1.まず、従来のワクチニアウィルスを使わずに組換え狂犬病ウイルスを効率よく回攻するT7RNAポリメラーゼ恒常発現細胞系を確立した。これはT7ポリメラーゼの供給にワクチニアを用いないので、細胞が破壊されずかつウイルス回収が簡便になることから、ワクチン開発にとって画期的なことと言える。2.T7

RNAポリメラーゼ恒常発現細胞にM蛋白発現プラスミドを導入し、リバースジェネテックス法により、M遺伝子欠損ウイルスを回収した。現在この系では約10^5/mlのM遺伝子欠損ウイルスが得られているが、さらにウイルス回収効率を上げるためにM蛋白が恒常的に発現しているT7RNAポリメラーゼ恒常発現細胞を構築中である。3.ワクチンに関連するG蛋白を大量産生するウイルスを創成するために、本来の遺伝子配列3'N-P-M-G-L5'に対して3'G-N-P-M-L5',3'G-N-P-M-G-L5'あるいは3'N-G-P-M-L5'に配列を変更したウイルスの回収を進めている。以上、これまでにないウク:チン製造株が構築されつつあり、今後創成ウイルスの免疫原性と安全性を確認する予定である。本研究の目的は、最近我々が確立した狂犬病ウイルスのリバースジェネテックス(逆遺伝学)の手法を用いて、これまでにない高い免疫原性と安全な画期的な狂犬病不活化経口ワクチン製造株の創世に係わる基礎情報の確立と、それに基づいたワクチンの実用化を目指したものである。研究の12年間で、わが国の現行動物用ワクチン株の病原制御アミノ酸領域を特定した(Microbiol.Immunol.,2001;J.Virol.,2001;J.Neurovirol.,2004)。また、細胞に感染してウイルス構造蛋白質を合成するが子孫ウイルスを産生しない、いわゆる「半生」ワクチン創世のための基礎実験を行い、従来のワクチニアウイルスを使わずに組換え狂犬病ウイルスを効率よく回収するT7RNAポリメラーゼ恒常発現細胞系(BHK/T7-9)を確立した(Microbiol.Immunol.,2003)。そこで、最終年度では、「半生」ワクチン製造用のM遺伝子欠損ウイルス株の構築と狂犬病ウイルスの5つの遺伝子のうち、免疫原性と密接な関わりのある糖(G)遺伝子を二重に加えたあるいは配置換えしたウイルスの作出を試みた。また、創世されたワクチン製造株の培養細胞での増殖性、マウスにおける免疫原性や安全性などを検討した。その結果、以下の成果が得られた。1.BHK/T7-9細胞にM蛋白質発現プラスミドを導入し、リバースジェネテックスにより、M遺伝子欠損ウイルスを効率よく回収した。M遺伝子欠損ウイルスは現行ワクチンのRC-HL株より免疫原性および安全性の高いことが確認された(第51回日本ウイルス学会、2003)。2.免疫原性を向上させるためにG遺伝子を二重に、あるいは3'末端側に配置換えしたウイルス(3'-G-N-P-M-G-L-5';3'-N-G-P-M-G-L-5';3'-N-P-M-G-G-L-5'など)を構築し、G蛋白質発現の増強を確認した(第137回日本獣医学会で発表予定、2004)。
高泌乳牛・低受胎における卵子成熟精動態の解明

現代の高泌乳牛にみられる繁殖性低下の原因となる卵子の成熟・受精の動態の特性・異常について検討、排卵直前の成熟卵子微細構造の特徴と排卵時期が確認され、体内における精子移送・貯蔵時間、排卵卵子の老化時期を推定できた。また、体外成熟卵子を用いて発生能獲期・喪失期の特徴を捉えるとともに、初期胞状卵胞卵子の個別発育培養法を開発した。さらに、腟温変動を指標にした排卵時期と異常排卵の予知法、精漿成分投与による低受胎牛の治療法を開発した現代の高泌乳牛にみられる繁殖性低下の原因となる卵子の成熟・受精の動態の特性・異常について検討、排卵直前の成熟卵子微細構造の特徴と排卵時期が確認され、体内における精子移送・貯蔵時間、排卵卵子の老化時期を推定できた。さらに、腟温変動を指標にした排卵時期と異常排卵の予知法、精漿成分投与による低受胎牛の治療法を開発した本年度は、高泌乳牛・低受胎牛の体内における卵子の成熟・受精動態の検討に着手するとともに、モデルとなる体外成熟卵子の受精・発生能獲得動態と少数の体内発育卵子の成熟・受精動態の解明に必要な卵子の個別培養法の検討を行った。また、低受胎牛(リピートブリーダー)にみられる子宮内膜上皮成長因子(EGF)の発現異常についても検討した。体外成熟卵子の受精・発生能獲得動態については、核成熟動態を確認するとともに、成熟培養時間の異なる卵子の受精・発生能を調べた。その結果、受精・発生能は成熟培養22時間前後で高くなり、培養時間が長くなると受精・発生率が低下した。ついで、核成熟後(MII期到達後)の受精・発生能獲得動態を調べるために、卵丘細胞除去卵子(裸化卵子)の体外受精の条件について検討した。その結果、媒精培地にヘパリンとPHEを添加すると正常受精率が高くなることと、媒精時の気相の酸素濃度を5%にすると受精・発生率の高いことが分かった。また、この裸化卵子の体外受精系を用いて、MII期到達後の受精・発生能獲得動態について検討した結果、体外成熟卵子はMII期到達後6時間前後で受精・発生能が向上することが示された。卵子の個別培養法については、成熟培養と発生培養における個別培養法について検討を行い、小型Wellを用いた成熟培養とWell of Well(協力者試作品)を用いた発生培養により、従来の群培養(多数の卵子をdrop内で培養)と同等あるいはそれ以上の高い受精・発生率が得られることが分かった。低受胎牛の子宮内膜EGF発現異常については、牛の精漿(タンパク質成分)を腟内に注入することによって修復され、受胎性が恢復することを示唆する知見が得られた。本年度は、高泌乳牛・低受胎牛における卵子の成熟・受精動態を明らかにするため、まず、卵子の成熟・老化動態については、体外成熟卵子をモデルに第二成熟分裂中期(MII)期到達前後の異なる時期に体外受精を行い、卵子の核成熟後の受精・発生能の変化について解析した。その結果、受精・前核形成・発生能は、MII到達46時間後から徐々に上昇、1012時間後にピークとなり、1416時間後には急激に低下することが示された。また、GnRHにより排卵を誘起した牛の排卵直前の成熟卵胞から超音波ガイド経膣法により卵子を採取して微細構造を調べ、体内成熟卵子の細胞内微小器官の形態・分布の特徴を確認するとともに、GnRH未投与牛から採取した卵子(細胞質未熟卵子モデル)との相違点も明らかになり、成熟異常卵子の検討に必要な指標が得られた。2)卵子の受精動態については、正常排卵時期や排卵異常の予測が可能か否か、膣内に温度センサーを留置して連続測定し、発情・排卵期の膣温変化と排卵の時間的関係を調べた。その結果、正常排卵牛の膣温は発情時(エスラジオールのピーク時)に特異的な上昇を示し、膣温上昇から排卵までの時間は一定範囲(25±3時間)にあることが分かった。また、無排卵の牛では発情・排卵に特異的な膣温変化がみられず、排卵異常の予知ができる可能性も示唆された。さらに、体外受精モデル実験では、従来の媒精培地にPHE(ペニシラミン、ヒポタウリン、エピネフリン)を添加して、その受精促進効果を確認するとともに、低濃度精子でも雄牛のよる差異が少なく、高い受精・胚発生率も得られることが分かった。さらに、この受精系は選別精液(X-精子)でも雄牛のよる差異も少なく、高い受精・発生成績の得られることが分かり、選別精液を用いた体内受精動態の検討に必要な基礎データが得られた。卵子の成熟動態については、体外成熟・体外受精モデルを用い、第二減数分裂中期(MII期)到達後の精子侵入・受精時期と発生能を調べ、精子侵入(受精)時期を指標にしたMII期卵子の発生能について解析を行った結果、発生能獲得期(発生能向上期:MII到達07時間後)、成熟期(高発生能維持期: 816時間後)、老化期(発生能低下・喪失期: 1725時間後)を特定、解析中の各期の卵子機能特性を指標にした体内成熟動態の解明が可能になった。

また、超音波ガイド法により採取した体内成熟卵子と体外成熟卵子の発生能と超微形態(ミトコンドリアと表層顆粒の分布)を調べた結果、卵胞刺激ホルモン処置後に採取して体外成熟させた卵子は体内成熟卵子に近似する発生能と超微形態を示すことから、体内成熟卵子のモデルとして活用できることが明らかになった。さらに、発育途上の初期胞状卵胞の個別発育・成熟培養法について検討、体内発育・体外成熟卵子に近い発生能を有する卵子が生産可能な培養系(マイクロウェルを用い、発育培養12日、イソブチル・メチルキサンチン添加培地で成熟前培養1日)を開発、体外発育過程から各種ストレス(高泌乳、暑熱など)による卵子成熟動態への影響の検討(不受胎、低受胎の原因究明)にも利用可能になった。受精動態については、搾乳牛を用い、人工授精後6時間間隔で排卵時期を超音波診断装置で調べるとともに、授精一排卵間隔と受胎成績の関係を解析した。その結果、授精後6時間以内の排卵あるいは24時間以降の排卵では受胎率が低下することから、受精成立に必要な数の精子が卵管に移送・貯蔵されるためには、少なくとも612時間を要すること、排卵卵子は12時間以降老化すること、貯蔵精子は授精3036時間以降に減少することが明らかになり、受精動態異常の解明に役立つ指標が得られた。
マグネターの観測に立脚した超強磁場におけるX線放射機構の研究

マグネターは約1000兆ガウスの超強磁場を持つ中性子星である。磁気エネルギーの解放によりX線で輝くと提案されており、定常的にX線を放射し、ときおり間欠泉のように強烈にX線を放出するバーストを起こす。本研究の目的は、私が独自に提唱した「マイクロバーストモデル」を証明することにより、真にマグネターが強磁場を持ち、磁気エネルギーの解放によりX線で輝くというモデルを確立することである。
溶液内光励起反応プロセスと溶媒効果

理論化学により溶液内の光励起反応過程を研究していくには、理論的方法論としてまず、溶質の分極を記述するために電子状態を高精度で求めることができるようにしておく必要がある。そこで、我々は溶媒の分布があらわに考慮された条件のもとでの溶質の電子状態を求め、さらに溶質分子の電子状態が時間に依存してどの変化していくかを可能にする方法論の拡張を試み、数十フェムト秒領域の溶媒の分布を時間依存の形で記述する解析式を導出し、以前に我々が提案した緩和過程の理論的研究の方法論をさらに光励起直後の短時間領域での緩和過程プロセスへの適応が可能となる形式に拡張をすることを可能にした。本研究では短パルスレーザーによる分光実験データ等により指摘されてきているような、励起後特に約100フェムト秒前後で起こっているとされている溶媒和過程まで解析が可能になることを念頭におき、これらの方法論をベタイン色素分子系での光反応過程へ応用し、溶液内での短時間のダイナミクスの研究を計画、遂行した。相当する時間領域での電子状態変化を追跡、研究した結果からこれらの時間領域においても電子状態の変化は顕著に表れ、励起後の化学反応プロセスにおおきな効果をもたらしていることを示してきた。また溶媒和過程とほぼ同時に分子内電子移動反応が生じていることも示され、特にアセトニトリルにおける励起状態(S_1)での分子内電子移動反応についてはBetaine30を用いた場合の実験結果との非常によい一致がみられ、分子内電子移動反応の時定数などを求める際に本研究で提案したモデルと方法論が有効であることがわかった。
神経変性疾患に関わる小胞体ストレス関連分子の制御と医薬としてのケミカルシャペロン

小胞体ストレスが関与する神経変性疾患との観点でユビキチンリガーゼの一種である新規遺伝子HRD1はパーキンソン病で脱落が認められる黒質緻密層周辺のドパミンニューロンに発現していた。さらに、大脳皮質、海馬などにも発現していた。蛋白異常蛋白質の凝集を防ぐ働きを持つ化合物であるケミカルシャペロン4-PBAの誘導体および他の物質について、4-PBAと同等それ以上のケミカルシャペロン能を有する化合物が得られた。小胞体ストレスが関与する神経変性疾患との観点でユビキチンリガーゼの一種である新規遺伝子HRD1の機能解析を行うこと。さらに、4-PBAの誘導体および他の分子についてケミカルシャペロン機能を解析することで、ケミカルシャペロンとしての活性を決定する分子機構を明らかにし、神経変性疾患に対する新薬開発における新しい治療薬のターゲットとしての小胞体・変性蛋白質分解機構、および治療薬としてのケミカルシャペロン機能を明らかにすることを目的で研究を行い、初年度において以下の成績を得た。1)変性蛋白質の分解に促進的に関与する新規ユビキチンリガーゼHRD1について、抗HRD1抗体を用いてHRD1のマウス脳内組織局在を詳細に検討した結果、HRD1はパーキンソン病で脱落が認められる黒質緻密層周辺のドパミンZユーロンに発現していた。さらに、大脳皮質、海馬(歯状回、CA領域)、線条体および淡蒼球、そして小脳プルキンエ細胞にも発現していることを見出した。一方で、グリア細胞には発現していなかったことから、HRD1は脳内においては神経細胞特異的に発現していることが明らかとなった。また、HRD1にはパーキンソン病以外にも神経変性疾患に関与する可能性が示唆された。2)蛋白質の折りたたみを促進し,異常蛋白質の凝集を防ぐ働きを持つ化合物であるケミカルシャペロン4-PBAの誘導体および他の物質(共同研究にて化学合成した)についてケミカルシャペロンの作用機構を検討した結果、4-PBAと同等それ以上のケミカルシャペロン能を有する低分子有機化合物が得られ、今後ケミカルシャペロンとしての活性を決定する分子機構を明らかにする予定である。さらに、4-PBAの誘導体および他の分子についてケミカルシャペロン機能を解析することで、ケミカルシャペロンとしての活性を決定する分子機構を明らかにし、神経変性疾患に対する新薬開発における新しい治療薬のターゲットとしての小胞体・変性蛋白質分解機構、および治療薬としてのケミカルシャペロン機能を明らかにすることを目的で研究を行い、本年度において以下の成績を得た。1)変性蛋白質の分解に促進的に関与する新規ユビキチンリガーゼHRD1について、分子内にユビキチンリガーゼ活性以外の、折り畳み不完全の蛋白質の分解に関与する領域、蛋白質輸送に関与する領域などを有していることが明らかとなった。2)蛋白質の折りたたみを促進し,異常蛋白質の凝集を防ぐ働きを持つ化合物であるケミカルシャペロン4-PBAの誘導体および他の物質(共同研究にて化学合成した)についてケミカルシャペロンの作用機構を検討した結果、アルコール数の変化、あるいは炭素数を変化させることで、4-PBAと同等それ以上のケミカルシャペロン能を有する低分子有機化合物が得らた。現在ケミカルシャペロンとしての活性を決定する分子機構を明らかにする目的で、小胞体ストレスにより誘導される細胞死に対する保護作用における検討を行っている。
日本海溝のゆっくりすべりイベントは海溝軸まで達するか？

海溝型地震の巨大化の鍵を握るプレート境界浅部に注目し,日本海溝北部で近年発見された自発的・周期的スロースリップがそこで発生していることを実証する.本研究では,プレート境界浅部の直上の深海底での観測から,次のスロースリップ発生時におけるプレート境界浅部の動きを,断層すべりに伴う地殻変動とすべりの加速に同期する多様な低周波地震波放射イベントの活発化を通して捉え,自発的・周期的スロースリップの発生範囲を特定する.さらに,こうした観測事実とプレート境界浅部における物性の空間変化の情報をもとに,自発的・周期的スロースリップの発生メカニズムをモデル化する.日本海溝沿いにおいて、超巨大地震は2011年の東北沖地震の発生域でのみで繰り返されている。本研究は、隣接する日本海溝北部を対象に、地震が巨大化しない原因が自発的・周期的スロースリップという現象にあるという仮説を検証する。そのため、海域での地震・地殻変動観測およびデータ解析を行う。また、現象の普遍的理解を目指したモデル化も行う。対象地域における超巨大地震の発生可能性とその理由について、観測事実から制約が与えられる。プレート境界における歪エネルギーの蓄積や解消のメカニズムの一つの可能性が検証されることにより、プレート境界地震の発生機構について、理解の進展が期待される。海溝型地震の巨大化の鍵を握るプレート境界浅部に注目し,日本海溝北部で近年発見された自発的・周期的スロースリップがそこで発生していることを実証する.本研究では,プレート境界浅部の直上の深海底での観測から,次のスロースリップ発生時におけるプレート境界浅部の動きを,断層すべりに伴う地殻変動とすべりの加速に同期する多様な低周波地震波放射イベントの活発化を通して捉え,自発的・周期的スロースリップの発生範囲を特定する.さらに,こうした観測事実とプレート境界浅部における物性の空間変化の情報をもとに,自発的・周期的スロースリップの発生メカニズムをモデル化する.
胚中心B細胞におけるテロメラーゼ活性誘導機構の解析

肺中心B細胞におけるテロメラーゼの発現を解析した。Balb/cあるいはC57/BL6マウスにT細胞依存症抗原であるSRBC、DNP-KLH、NP-CGGなどを腹腔内、もしくはfootpadに免疫して脾臓、所属リンパ節に胚中心(GC)を形成させ、これらの臓器から細胞を単離しGCのマーカーであるPNA、抗GL-7抗体、抗GANP抗体(Kuwahara,K.et al.,Blood in press)とB細胞特異的マーカーである抗B220抗体で二重染色し、セルソーターによってGCB細胞のみを分離した。分取した細胞を可溶化し、定量的TRAP法によってテロメラーゼ活性を測定した。GCB細胞は抗原の種類によらず、非GCB細胞に較べ高いテロメラーゼ活性を示した。またRT-PCRによりテロメラーゼの鋳型RNA成分であるTERC、構成蛋白であるTERT、TEP-1の発現をみるとGCB細胞ではTERCおよびTERTの発現増強を認めた。T依存症抗原からのテロメラーゼ誘導シグナルを解析するために未免疫のマウスの脾臓からB細胞を精製し、抗CD40抗体によるCD40シグナルの存在下、II-2、-3、-4、-5、-6、-7のサイトカイン類を共刺激として加え、3日間in vitroで培養を行い、テロメラーゼ活性の誘導を定量的TRAP法で検討した結果、IL-4およびIL-7が有意にテロメラーゼの誘導を促進した。また同時にRT-PCRによりTERCおよびTERTの発現増強を認めた。これらの結果からGCB細胞でのテロメラーゼの誘導にはCD40、IL-4、IL-7が重要な役割を果たすことが示唆された。in vitroの系においてチロシンキナーゼ阻害剤、PCK阻害剤、MAPKK阻害剤、PI3-K阻害剤はすべてテロメラーゼの誘導を阻害することからリン酸化カスケードがテロメラーゼ活性の誘導に重要であると考えられた。
生物生産システムのエネルギー分析

「生物生産システムのエネルギー分析」班では、農学の各分野の専門家と応用統計ならびに情報工学の研究者との学際的協力により、(1)稲作・園芸・畜産・林業等において個別の生物生産システムにおけるエネルギー分析の研究に成果をあげるとともに、(2)それらを基礎として生物生産の行なわれている生態系、ならびにそれらを産業にしている地域社会におけるエネルギー収支を需要と供給の両面から的確に計量するための手法を開発することができた。前者では、稲作,畜産,林業等の各サブシステムのエネルギーフローのモデル構成およびエネルギー収支の実験的・統計的解析が行なわれた。特に、肥料・農薬等の間接的投入エネルギーの評価方法、バイオマス蓄積量の推定法、自然植生の生産力、放牧地・草地におけるエネルギー収支などが明かにされた。後者では、秋田県大潟村,新潟県味方村,埼玉県川里村,そして、島根県隠岐郡を対象に標本調査による聞き取り調査と既存の統計調査の結果を結合して、それぞれの地域における産業ならびに生活用のエネルギー需給量を把握し、生物生産システムのエネルギーフローモデル構築の資料とした。この結果、地域にえすく分布している自然生態系のローカルエネルギーを、どのような種類のエネルギー源としてどの程度利用可能であるかを明かにすることができた。他方、この研究を通じて、調査単位間の需要量のばらつきの把握、そのばらつきを考慮した調査の方法、外れ値の検出やその処理に関する探索的データを手法等調査・統計作成に関する多くの成果を得て、調査方法論およびデータ解析法の進展にも寄与することができた。
分子構造の動的および静的側面から見た転写制御機構に関する研究

本研究では、血球分化に関わる転写制御因子Runx1,CBFβおよびEts1等を中心に、これらの標的プロモーター(エンハンサー)における活性制御機構を解析するために、X線結晶構造解析、核磁気共鳴法による分子の揺らぎの解析、および表面プラズモン法や培養細胞による転写活性化実験等の機能実験を行った。DNA結合性の転写制御因子Runx1の活性は、DNA非結合性の転写制御因子CBFβによってアロステリックに制御されている。CBFβ存在下および非存在下におけるRunx1-DNA複合体中でのRunx1の揺らぎをNMRを用いて解析した。また、動的構造解析から、制御にとって重要であると予想される残基に変異を導入し、生化学的機能を解析した。その結果、Runx1の分子の揺らぎの変化が、転写制御因子の機能制御と密接に関連することを見出した。複数の転写制御因子による協調的DNA結合活性制御機構および転写制御因子の化学修飾による転写制御因子複合体形成への影響を解析するため、T細胞抗原受容体α鎖のエンハンサーに形成される、Runx1-CBFβ-Ets1-DNA複合体およびRunx1-CBFβ-リン酸化Ets1-DNA複合体の形成機構について、X線結晶構造解析による静的構造解析と、ゲルシフトアッセイおよび転写活性化実験による機能解析を行い、Runx1およびEts1の転写制御領域と制御様式を詳細に決定した。転写制御因子Runx1のDNA結合活性は、DNA非結合性の転写制御因子CBFβとヘテロダイマーを形成することにより上昇することが知られている。本研究室では、以前Runx1-CBFβ-DNA複合体の結晶構造解析を報告し、CBFβによるRunx1のDNA結合活性の上昇がRunx1の構造的揺らぎの安定化によってもたらされることを示唆した。今回、揺らぎと機能との関連を詳細に調べるため、核磁気共鳴法を用いた磁気緩和時間測定を行った。現在までに、Runx1-DNA複合体およびRunx1-CBFβ-DNA複合体中でのRunx1のアミドプロトンシグナルの帰属をほぼ完了した。磁気緩和パラメーター測定法について、R1,R2およびSteady-state NOEのTROSY化を行い、各複合体中でのRunx1のこれらの磁気緩和パラメーターの測定を終了した。さらに揺らぎの時間スケールを詳細に解析するために、現在T1rhoについて、Mulderらが報告したOff-resonance T1rhoを独自にTROSY化したパルスプログラムを用いて測定中である。C/EBPは、塩基性ロイシンジッパー型の転写制御因子であるが、他の転写制御因子と異なり、ホモダイマーとして多様な塩基配列を認識することが知られている。この分子機構について調べるため、C/EBPが認識する様々な天然プロモーターの塩基配列を含むDNAとC/EBPとの複合体を形成させ、X線結晶構造解析を行った。また、これらのDNAとC/EBPとの結合活性を生化学的に解析した。現在、C/EBPの1次構造および3次構造から、C/EBPに特徴的な残基を同定し、その残基に変異を導入して同様の解析を行っている。Runx1は、血球分化に関わる転写制御因子であり、その異常は急性白血病を引き起こすことが知られている。Runx1は、DNA非結合性の転写制御因子CBFβとヘテロダイマー形成することによりDNA結合活性が上昇する。Runx1-DNA複合体およびRunx1-CBFβ-DNA複合体中でのRunx1のアミドプロトンシグナルを帰属し、磁気緩和パラメーターR1,R2,Steady-state NOEおよびR1ρの測定を行った。

その結果、Runx1-DNA複合体中におけるRunx1は、DNAを認識するループ領域では比較的遅い時間スケール(数百マイクロからミリ秒スケール)の揺らぎが存在しており、Runx1のCBFβ結合部位では速い時間スケール(数ナノ秒まで)の揺らぎが存在していることが明らかになった。一方、Runx1-CBFβ-DNA複合体では、これらの揺らぎが抑えられていた。Runx1の揺らぎの制御に関与すると予想される残基に変異を導入し、機能解析を行ったところ、CBFβによるRunx1の機能制御機構が破綻していた。このことから揺らぎの制御と機能活性制御との相関が示唆された。現在、Runx1に変異を導入した変異型Runx1を用いて、Runx1-DNAおよびRunx1-CBFβ-DNA複合体中でのRunx1の揺らぎをNMRを用いて解析している。
ゲーミングによる災害情報伝達訓練プログラム

本研究は、発災時の応急対応に関わる防災担当者ならびに被災者たる一般市民の情報連絡能力の向上を計るための訓練プログラムの開発を目的としたものである。研究は昨年度までに、既存の訓練プログラムの実態と評価及び、過去の災害事例における情報連絡の実態と訓練プログラムニーズの調査を行い、それを踏まえて、災害対策本部員を対象とした負傷者の救急搬送に関する情報伝達訓練プログラムを開発した。本年度は、新たに消防の部隊運用に関する情報伝達訓練プログラムを開発するとともに、さらに進んで一般市民の発災後の避難誘導に関する情報伝達についてもプログラム開発に着手した。しかし、避難誘導情報についてはコンピューター制御部分の設計に止まり、訓練用ゲーミングの設計にまでは至らず、訓練シナリオをマニュアルの形でまとめるに留まっている。消防部隊運用訓練プログラムでは、部隊の署所運用を担当する消防署長以下作戦本部員が、発災後時々刻々と時間遅れを伴って入ってくる火災覚知情報を如何に判断し、現場部隊に適切な情報を伝え指揮をとるかを訓練するプログラムとして開発したもので、エキスパートシステムを組み合わせた訓練プログラムとして設計している。避難誘導情報伝達訓練プログラムは浮動人口の集中する新宿の駅周辺地区を対象としており、その構成は、避難者の挙動をコンピューター内に再現し、訓練主体である誘導員(この場合は駅職員、警察、災害対策本部員)が誘導情報をインプットすると、避難者がそれに従って避難路を変更し、避難場所へ収容されるというシミュレーションモデルを柱として、それて対話しながら適切な誘導情報の出し方を訓練するという形城としている。
児童公園が地域に根付くためのシステムづくりに関する基礎的研究

福山市の戸建て計画住宅地の町内会を事例とし、公園監視員の所属する町内会・子供会・老人会などの地域組織の構成・相互関係・活動内容に注目し、地域組織による公園利用・維持管理の関わり方の評価指標に児童公園の雑草地率を用いて公園が地域に根付くシステムづくりのための計画要件を考究し、以下のような結果を得た。1.町内会組織、子供会・老人会の結成状況、公園監視員の委嘱・職務では、(1)市の会則に準じた部署で町内会は組織構成され、町内会単位で子供会や老人会も結成されるが、会員が少ないと老人会は複数にまたがる場合もあり、(2)監視員の所属は1公園の場合は町内会で、複数公園の場合は町内会と子供会・老人会の組み合せか老人会であり,老人会は清掃までの関わりが多く、無職の監視員の方が監視業務が頻繁であることなどが把握できた。2.地域活動による集会所・児童公園の利用では、(1)活動内容の有無は町内会による違いが大きく、町内会が所有する集会所がその活動拠点になっており、老人会や子供会による多様な利用もみられ、(2)町内会などの地域組織による活動は小公園ではみられないが、ある程度まとまった規模の児童公園では多様な活動が展開されていることから、町内会の屋外活動の活性化の必要条件として町内会規模に適合した面積の公園設置が重要といえる。3.公園に関わる地域組織と雑草地率の関係では、(1)公園が1つの町内会は全員が公園清掃に関与するが、複数の場合は班ごとの関与となるため各公園に対する意識差が生じやすく、(2)複数公園の町内会では公園の清掃・除草などに老人会の関与が目立ち、雑草地率には公園自体の物的要素のほかに町内会などの地域組織による公園利用や清掃・除草の仕組みの影響が顕著であることなどが理解でき、児童公園の雑草地率から概ね300世帯以上の町内会単位に2,500m^2程度以上の公園が1つ設置されることが地域に根付きやすい計画要件として指摘された。
次世代の脳動脈瘤治療用ステントのストラットパターンの構築に関する研究

本研究では“FlowDiverterStent"を超える次世代の脳動脈瘤治療用ステントのストラットパターンを構築する方法を見いだすこと目的とする.そこで,アスペクトレイシオに加えて,親血管形状を考慮した流体力学に基づいた新しい脳動脈瘤の分類方法の提案を行った.これにより,ステント設計の効率が上げることが可能となる.ステント設計に血管壁と動脈瘤壁に柔軟性を持たせる流体構造連成解析の導入する.流体構造連成解析を導入することで,これまでの数値流体力学解析より精度高いシミュレーションが可能となり,人に適した脳動脈瘤用ステントの開発が可能となる.次世代ステントストラットパターンを見いだす方法を開発した.平成25年度は,数値流体力学解析において流体構造連成解析ソフトの決定と親血管形状を考慮した動脈瘤の分類について検討を行った.流体構造連成解析ソフトに関しては,平成24年度に各ベンダーに対してベンチマークテストを依頼し,同時にベンダーからトライアルコードを借り受けで機能・性能について検討を引き続き行い,本研究を遂行するに必要とする機能・性能を満たすか否かについて慎重に検討を続け,平成25年度にその結果が出たので慎重な選定作業の結果,一本に絞り込むことができた.ステント開発に関しては親血管形状が瘤内流れに非常に強く影響を及ぼすことが平成24年度の研究で分かったので,まず親血管形状を考慮した動脈瘤の分類について検討を行った.医療用画像診断装置から出力される画像をもとに,親血管の3次元形状を作成,血管の中心線を抽出して,親血管の曲がりを測定した.脳動脈瘤は構築した親血管形状に対して,いろいろな位置に設置し,従来の流体力学解析を用いて血液流れの解析を行った.この結果より,脳動脈瘤ネックの血液流れは大別して2通りであることがわかった.2013年11月アルゼンチンのブエノスアイレスで開催された医学工学の研究者が同時に集まる“IntraCranial StentMeeting(ICS Meeting) 2013",同じく11月にアメリカサンディエゴ開催されたアメリカ機械学会(ASME)で,今回の結果を報告し,臨床医師および生体力学の専門家とディスカッションを行った.これまでの研究業績が認められ,2014年1月に開催された日本機械学会が主催するバイオエンジニアリング講演会のメインの実行委員に選ばれ,講演会の運営に大きく貢献した.本研究では“FlowDiverterStent"を超える次世代の脳動脈瘤治療用ステントのストラットパターンを構築する方法を見いだすこと目的とする.そこで,アスペクトレイシオに加えて,親血管形状を考慮した流体力学に基づいた新しい脳動脈瘤の分類方法の提案を行った.これにより,ステント設計の効率が上げることが可能となる.ステント設計に血管壁と動脈瘤壁に柔軟性を持たせる流体構造連成解析の導入する.流体構造連成解析を導入することで,これまでの数値流体力学解析より精度高いシミュレーションが可能となり,人に適した脳動脈瘤用ステントの開発が可能となる.次世代ステントストラットパターンを見いだす方法を開発した.平成24年度は,数値流体力学解析において流体構造連成解析を導入するために,先行研究をもとに,その方法について予備検討を行った.予備検討では,生体における流体構造連成解析分野における先駆者である北京工業大学のQiao教授のもとに,8月中旬からの約1ヶ月間,先進技術調査と技術獲得のために滞在し,流体構造連成解析について学んだ.帰国後,学んだことを基にして,本研究で必要となる流体構造連成機能・性能について吟味し,本研究で必要なる機能・性能を満たし,今後の発展に対応出来ることを焦点にコードの選択を行った.メーカーからトライアルでコードを借り受けて機能・性能について検証を行い,同時にメーカー側にもベンチマークテストを依頼し,本研究を遂行するに必要とする機能・性能を満たすか否かについて聞き取りを行った.これにより,2つのコードまで絞り込めた.ステント開発に関しては従来の流体力学解析のみを使った方法で検討を続けている.理想形状動脈瘤をサイズで分類,そしてステント最適化を実行し,2012年10月,アメリカで開催された,医学工学の研究者が同時に集まる“IntraCranial Stent Meeting(ICS Meeting) 2012"にて結果報告を行った.この発表はICS主催者から“Award for ICS Presentation"として表彰を受けた.動脈瘤の分類に関しては瘤のサイズによる分類だけでなく,血管形状を考慮した分類方法の検討を始めた.動脈瘤内の流れは親血管形状に起因し,親血管形状をなくして検討を行えない親血管形状を考慮したことで,これまで以上に人の体の中に近い環境で,ステントストラットパターンの検討が可能となる.これに関しては,2013年1月,茨城県つくば市開催された日本機械学会主催バイオエンジニアリング講演会で報告を行い,生体力学の専門家とディスカッションを行った.平成26年度は,流体力学において流体ー構造連成解析の実施,血管分類において親血管形状を考慮した脳動脈瘤の分類法の考案を行った.脳動脈瘤およびステントの流体ー構造連成解析では,ストレートな親血管円柱と半球を組み合わせ,アスペクトレイシオが1である理想動脈瘤形状を対象に行った.この結果より,ストレートな親血管は脳動脈瘤を基点としてややU字型に変形,ネック部分の親血管形状は横方向に広がり,脳動脈瘤方向へ押しつぶされた.ステント留置ケースにおいて,ステントにより親血管の変形は抑えられ,ステントは親血管方向へ押される傾向が見られた.

ステント留置位置が親血管方向へ移動する現象は血流により生じていると考えられる.ことにより,剛体血管モデルと比較すると脳動脈瘤内での血液の流れ方(フローパターン)が異なる可能性を示し,今後のステントストラットパターンについて更なる検証の必要性を示唆した.親血管形状を考慮した脳動脈瘤の分類では,親血管形状のネック付近の血流影響を考慮する必要性を学会で提案したことで,他の研究者たちも注目し研究を始めだした.医用システム平成24年度に問題となった親血管形状と脳動脈瘤内の流れが平成25年度に明確化された.しかしながら,この問題が大きく,全体の研究の進展に影響を及ぼした.初年度,研究は計画以上に進展していた.しかしながら,研究を進める過程で親血管形状が瘤内流れに非常に強く影響を及ぼすことが判明したので,親血管形状を考慮した脳動脈瘤の分類が必要になった.当初予定していた予備検討に目処が付き,当初の計画になかった脳動脈瘤の分類を行っているためである.平成24・25年度において,親血管形状が脳動脈瘤内の血液流れに非常に強く影響を及ぼすことが分かり,親血管形状と脳動脈瘤内の血液流れについて検討を行ってきた.今年度は親血管形状と脳動脈瘤内の血液流れについての詳細な分類法を構築する.昨年度導入した流体ー構造連成解析システムを用いて,脳動脈瘤内にステントを留置した場合のシミュレーションを行い,そのシミュレーション結果の検討を行う.その後,申請者がこれまでに開発した脳動脈瘤用ストラットパターンの最適設計法を用いて,最適なステント設計法を構築する.昨年度,研究を進める過程で親血管形状が瘤内流れに非常に強く影響を及ぼすことが分かった.今年度,まず親血管形状を考慮した動脈瘤の分類を行う.これにより脳動脈瘤付近の血流パターンがこれまでの研究で用いたものより人体に近い血液の流れになる.そもそも,我々の研究対象は脳動脈瘤用ステントであり,動脈瘤の患者さんたちに世界最高のステント提供するためにも,動脈瘤の分類に親血管形状を強く考慮する必要がある.上記の分類作業を推進すると同時に,昨年度予備検討を行っていた流体構造解析方法と申請者らがこれまでに開発した脳動脈瘤用ステントストラットパターンの最適設計法の融合方法の探る.さまざまな脳動脈瘤形状に対して流体構造連成解析を行い,これに対して,脳動脈瘤用ステントストラットパターンの最適設計法を実行し,融合可能性について検討を行う.旅費として計上していたが,テレカンファやメールの利用により,当初案より費用を抑えることができた.今年度は最終年度であるため,研究総括ためにディスカッションが増えることが考えられる.そこで,最終年度の旅費として使用する.当初,初年度に流体構造連成解析用ソフトウェアを計上していたが,メーカーに依頼したベンチマークテストに当初計画より時間を必要とした.そのため,慎重な見極めが必要となったので,購入時期を平成25年度とすることにした.平成25年度請求額と合わせて使用する予定である.
オオムギにおけるβグルカン合成酵素遺伝子の単離と機能解析

(1, 3 ; 1, 4)-β-D-グルカンはイネ科の組織で高濃度でみられ、特にオオムギの細胞壁多糖の主要な成分である血糖値や血中コレステロール濃度を下げるなど健康効果がある。我々は、オオムギのゲノム中にある7種類のβグルカン合成酵素様遺伝子のうち、HvCslF6が主要な合成酵素であることを明らかにした。β-グルカンレス突然変異体OUM125のβグルカン欠失性(bgl, beta-glucanless)遺伝子を分子マーカーを用いてマッピングした。OUM125に皮麦品種ニシノホシ(Ni)を3回戻し交雑して育成した準同質遺伝子系統bgl-Ni(裸性)とニシノホシの交雑集団227個体を用いてマッピングを行ったところ、bglは7H染色体の動原体付近に位置することが明らかになった。この付近にはセルロース合成酵素様遺伝子の1種であるHvCs1F6遺伝子が位置することが報告されている(BurtonらPlant Physiology 146 : 1821-1833, 2008)。そこで、OUM125、原品種赤神力およびニシノホシそれぞれからHvCs1F6のデータベース配列を元に設計した遺伝子特異的プライマーでPCR増幅を行い、塩基配列を決定した。その結果、OUM125の第3エキソン中に1塩基多型(G→A)が見つかり、これにより660番目のグリシンがアスパラギン酸に変化すると推定された。ニシノホシのこの部分の塩基配列は赤神力と同一であった。この一塩基多型部位は制限酵素BanIの認識部位に相当するので、これを元にOUM125およびbg1-Niとニシノホシ間の多型を検出するCAPSマーカーを開発しマッピングを行った。その結果、HvCs1F6の多型はβ-グルカンレスの表現型と共分離することが明らかになり、OUM125のβ-グルカン欠失性はHvCslF6の機能欠損突然変異による可能性が高いと考えられた。さらに、別のマッピング集団OUMI25×BowmanのF2集団104個体を用い、半粒法により胚を含まない半粒でキットを用いβ-グルカン含量を定量し、胚を含む半粒を生育させてDNAを抽出しマーカー多型を調査した。その結果、bgl遺伝子は三倍体の胚乳細胞でドース効果を示すことが明らかになった。β-グルカンレス突然変異体OUM125のβグルカン欠失性(bgl,beta-glucanless)遺伝子を分子マーカーを用いてマッピングした。OUM125×Bowanの交雑F2 104個体を用いてマッピングを行った。この際、種子は半切し、胚の無い側を用いてβグルカン含量を個別に測定するとともに、胚のある残りの半粒は発芽させてDNAを葉から抽出しマッピングに使用した。その結果、βグルカンレス性とセルロース合成酵素様遺伝子HvCslF6の塩基多型は完全に共分離することが確認された。OUM125のHvCslF6遺伝子は第3エキソン中に1塩基多型(G→A)が見つかり、これにより660番目のグリシンがアスパラギン酸に変化すると推定された。したがって、OUM125のβ-グルカン欠失性はHvCslF6の機能欠損突然変異による可能性が高いと考えられた。さらに、OUM125は冬場の寒さの厳しい関東以北に栽培すると茎葉の先端が黄色く枯れることがわかっている。この冬場の葉枯れを指標にオオムギ品種サチホゴールデンの突然変異体集団約2,000系統をスクリーニングすると、10系統が葉枯れを示した。これらの系統の種子のβグルカンを測定したところ、2系統(KM27およびKM30)がβグルカンレスであることが明らかになった。それぞれの系統をOUM125と交配して対立性検定を行ったところ、いずれも同じ遺伝子座であることがわかった。現在これらの系統のHvCslF6遺伝子の塩基配列を調査しているところである。(1,3;1,4)-β-D-グルカン(混合型グルカン)はイネ科の組織でみられ、オオムギで特徴的に高い値を示す。本研究では(1,3;1,4)-β-D-グルカンレス突然変異体を3系統特定し、それらが調査した全ての組織で(1,3;1,4)-β-D-グルカンを完全に欠くことを示した。(1,3;1,4)-β-D-グルカンレスの表現型は7H染色体長腕に座乗するHvCslF6の多型と完全に連鎖していた。(1,3;1,4)-β-D-グルカンレス突然変異体のそれぞれはコード領域内の異なる位置に1塩基置換を有し、高度に保存されたアミノ酸残基の置換を引き起こすことがわかった。

(1,3;1,4)-β-D-グルカンレス突然変異体では胚乳から抽出した膜画分での(1,3;1,4)-β-D-グルカン合成酵素活性が完全に欠損していた。Nicotiana benthamianaの葉にHvCslF6 cDNAを導入し一過的に発現させた系でも、(1,3;1,4)-β-D-グルカンレス突然変異体の(1,3;1,4)-β-D-グルカン合成酵素活性が欠損していることが確認された。これらの結果より、オオムギゲノム中に存在する7種類のCslFおよび1種類のCslHの中でHvCslF6は特異な性質を有しており、(1,3;1,4)-β-D-グルカン合成の鍵となる酵素であることが明らかとなった。
母乳中プロスタグランディン代謝酵素抑制物質による新生児壊死性腸炎の予防と治療

Prostaglandin代謝酵素(prostaglandin dehydrogenase)を不活化するヒト母乳由来抑制物質の抽出・精製を繰り返し行い、十分な分析に必要な量を確保した。母乳を採取し、遠心、下層を分取した。アセトン、ジエチルエーテル処理後、薄層クロマトグラフィー(展開溶媒クロロホルム:アセトン=96:4)で展開し、inhibitor分画をジエチルエーテルで回収し、次の展開溶媒(石油エーテル:ジエチルエーテル=4:1)を用いて薄層クロマトグラフィーを行った。inhibitorをエーテルに溶解させ、4°Cで保存し量を確保した。このinhibitorをGas chromatography/Mass spectrometry(GC/MS)で成分分析を行った。条件はキャピラリーカラムURBON HR101(25m×0.25mm)でカラム温度は50°Cから1分間に10°Cづつ280°Cまで昇温し、QC/MS-QP2000Aにapplyした。分析の結果は全て低分子量の脂肪酸であり、CH_3C_8H_<12>(C_4H_9)_2OH、C_<13>H_<27>COOH_3(ミリスチン酸メチル)、C_<13>H_<27>COOH(ミリスチン酸)、C_<18>H_<29>COOH(ヘキサデセノイック酸)、C_<16>H_<31>COOH(パルミチン酸)、C_<17>H_<31>COOH(オクタデシノイック酸)、C_<17>H_<33>COOH(オクタデセノイック酸)、C_<17>H_<35>COOH(ステアリン酸)、C_4H_8(COOC_8H_<17>)_2と分析された。この中で量的に多く主なものはミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸の3つでほぼ同量であった。これら全ての脂肪酸の合成品を作ることは不可能と考えられ、主な3つの脂肪酸の混合品を作ることにした。同量づつをエーテルに溶解N_2gasでevaporateし、濃縮させ、代謝酵素の活性抑制実験を行ったところ、用量依存的に活性を抑制し、最大90%まで活性を抑えた。今後はラットの胃潰瘍作成モデルを用いて、この混合品の潰瘍抑制効果を検討する予定である。1.Prostaglandin代謝酵素(prostaglandin dehydrogenase)をヒト胎盤より抽出し、単一な蛋白質にまで精製した。ヒト胎盤を細切、ホモジネート後、遠心分離し上層を分取した。これを等電点沈殿させ、DEAEイオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、PGF_<2α>アフィニィティクロマトグラフィーにて精製、SDS電気泳動にて単一bandであることを確認した。2.精製された酵素の活性を抑制することを示標にして、母乳より抑制物質を抽出、精製した。

10分間2000rpmで遠心分離し、上層の脂質を除去し下層を分取した。これをアセトン沈殿し、沈殿物をジエチルエーテル溶解し、薄層クロマトグラフィー(展開溶媒クロロホルム:アセトン=96:4)で展開し、inhibitor分画をジエチルエーテルで回収した。更に、展開溶媒石油エーテル:ジエチルエーテル=4:1で薄層クロマトグラフィーを行い、inhibitor分画をジエチルエーテルで回収し、N_2 gasでevaporateし、エーテル溶解、4°C下に保存した。Prostaglandin代謝酵素(prostaglandindehydrogenase)を不活化するヒト母乳由来の抑制物質の抽出、精製を行った。ヒト母乳を1000rpm×10分間遠心し、下層を分取した。等量のアセトンを加えて上層を分取し、更にこれに等量のジエチルエーテルを加えた。上層を分取し、N_2gasでevaporate後、残渣をエーテルに溶解した。これを薄層クロマトグラフィー(展開溶媒クロロホルム:アセトン=96.4)で展開し、inhibitor分画をジエチルエーテルで回収(Rf値:0.56)し、更に展開溶媒(石油エーテル:ジエチルエーテル=4:1)を用いて薄層クロマトグラフィーを行った。inhibitor分画をジエチルエーテルで回収(Rf値:0.26)し、エーテルに溶解した。まずこのinhibitorの性質につき生化学的に検討した。4°Cで1ヶ月間暗所保存後、そのinhibitor活性は90%以上保たれた。熱処理(100°C、10分間)後では約30%inhibitor活性が失われた。更にリパーゼ処理では40%inhibitor活性が失われたのに対して、トリプシン処理ではほとんど失活しなかった。以上よりinhibitorは脂質であると考えられた。このinhibitorの組成や構造分析を行うためのgas chromatography/mass spectrometryにapplyする前に予備実験としてgas chromatographyにapplyした。その結果、inhibitorは少なくとも2種類の脂肪酸、オレイン酸、パルミチン酸、ステアリン酸から成ることが明らかになった。またそれ以外の脂肪酸も組成にかかわっている可能性が示唆され、さらにgas chromatogtaphy/mass spectrometryによる詳細な検討を行う予定である。Prostaglandin代謝酵素(prostaglandin dehydrogenase)を不活化するヒト母乳由来抑制物質の抽出・精製を繰り返し行い、十分な分析に必要な量を確保した。母乳を採取し、遠心、下層を分取した。アセトン、ジエチルエーテル処理後、薄層クロマトグラフィー(展開溶媒クロロホルム:アセトン=96:4)で展開し、inhibitor分画をジエチルエーテルで回収し、次の展開溶液(石油エーテル:ジエチルエーテル=4:1)を用いて薄層クロマトグラフィーを行った。inhibitorをエーテルに溶解させ、4°Cで保存し量を確保した。このinhibitorをGaschromatography/Mass spectrometry(GC/MS)で成分分析を行った。条件はキャピラリーカラムURBONHR101(25m×0.25mm)でカラム温度は50°Cから1分間に10°Cづつ280°Cまで昇温し、QC/MS-QP2000Aにapplyする。