hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
味細胞の電気等価回路的解析

味覚の情報発生伝達機構の解明のための研究は、感覚生理学の分野において最も重要な課題のひとつであるが、感覚生理学の他の分野、例えば視覚、聴覚等の研究にくらべて著しく遅れている。その理由としては味覚受容器である味細胞が小型でしかも味蕾という特殊な構造内にあり、味雷は舌背面にまばらに存在し、しかも味蕾の膜は丈夫で外液の浸入を容易に許さないという形態的な問題がある。しかしながら味覚は生体にとってその生命維持と密接に関連した重要な事項であり、さらに今日需要が高まっている化学センサ-の開発の面においても味覚受容機構および味応答発現伝達機構を数理科学的にも解明する必要がある。すでに本研究者らによって、電気生理学的な味細胞内記録により次のようなことが明らかに成っている。1)蔗糖(甘味)、食塩(塩味)、キニ-ネ(苦味)、塩酸(塩味)によって味細胞は興奮を起こすが,蔗糖刺激によって脱分極性電位を示し、その際膜抵抗が増大するものでは確実に味細胞内に記録電極が入っていることが細胞内色素注入法によって判明した。ところが、同一の味細胞でも食塩刺激にたいしては脱分極電位変化を示し、その際膜抵抗は減少する。2)味細胞内電圧固定法による実験では蔗糖刺激では外向き電流が減少して膜抵抗が増大する。一方、食塩刺激では内向き電流が増大して膜抵抗が減少する。1)、2)のことから蔗糖刺激では味細胞受容膜に蔗糖が吸着することにより味細胞膜のK^+イオンの透過性が減少することによって味応答が発生すると推定された。このことはさらに味細胞内に細胞内二次伝達物質としてのcーGMPおよび細胞膜のK^+イオンチャンネルブロッカ-であるTEAを注入することによっても蔗糖応答と同様な電位変化、膜抵抗変化が記録され、K^+イオン透過性の減少によるという仮説を支持した(Tonosaki,K.& Funakoshi,M.:Nature,331,354ー356,1988;Brain Res.,445,363ー366,1988)。しかし、食塩、苦味、酸味応答の発生に関してはそのメカニズムはまだ不明である。これらの点については研究中である。蔗糖、食塩刺激に対する味細胞の応答の性質からそれらの刺激に対して味細胞膜の発生する膜の性質をその膜のイオン機構を考慮にいれて電気的等価回路として数理化学的に表現することを行ってみた。味細胞の興奮発生は刺激の受容から細胞内二次伝達物質を介して細胞膜の内液と外液のNa^+,K^+,Cl^-イオンの移動によって発生すると考えられる。一般の興奮性神経細胞や神経繊維では現在HodgkinーHuxley's equationが適応されることが判明している。そこでこの方程式に従ってE=m^ahg_<Na>V_<Na>+n^bg_KV_K+g_LV_L(E:電位変化、m^a:Na^+イオン活性価、h:Na^+イオン不活性価、n^b:K^+イオン活性価、g_<Na>,g_K,g_L:Na^+,K^+,その他のイオンのコンダクタンス、V_<Na>,V_K,V_L:Na^+,K^+,Lの平衡電位)として味細胞膜の電気的等価回路式を表しBasicによるプログラムを作成し、各々の値を変化させた時、どのような条件で蔗糖および食塩応答の様式を再現できるかを調べた。その結果、食塩応答、即ち脱分極電位変化で膜抵抗減少はa=4,b=3,m=0.053,h=0.6,n=0.32,v=-15の条件で再現でき、通常のHodgkinーHuxley's equationで説明出来る結果と相同となり膜のNa^+イオン(Na^+チャンネル)が活性化されて膜の脱分極、膜抵抗減少が説明されると考えられる。しかし、食塩が受容膜に吸着してNa^+イオンが受容膜を透過して細胞内のNa^+イオンが増加するとは実験事実からは考えにくいため、細胞内二次伝達物質(現在まだ不明)の関与があって受容膜以外の細胞膜でのNa^+イオンの透過性増大が生じて発生すると推定される。蔗糖応答発生のイオン機構においてもその膜の基本的性質は食塩の場合と同一と考えa=4,b=3として解析してみると、代表的値としてm=0.053,h=0.01,n=0.99,V=-15もしくはm=0.0053,h=0.001,n=0.99,V=-15という値をとらせるとNa^+イオン電位の変化は小さく、K^+電位の変化が増大して膜抵抗の増大を見ることができる。このことは、Na^+イオン活性価は一定でもNa^+イオン不活性価の値を小さくしてK^+活性価の値を大きくするか、Na^+活性価を小さくしてK^+活性価の値を大きくすれば蔗糖応答様の脱分極電位変化、膜抵抗増大を再現することができることが解った。しかしながら、そのような膜の特性の切り替えがどのようにしておこなわれるのかについては今後の研究が必要である。その理由としては味覚受容器である味

細胞が小型でしかも味蕾という特殊な構造内にあり、味雷は舌背面にまばらに存在し、しかも味蕾の膜は丈夫で外液の浸入を容易に許さないという形態的な問題がある。しかしながら味覚は生体にとってその生命維持と密接に関連した重要な事項であり、さらに今日需要が高まっている化学センサ-の開発の面においても味覚受容機構および味応答発現伝達機構を数理科学的にも解明する必要がある。すでに本研究者らによって、電気生理学的な味細胞内記録により次のようなことが明らかに成っている。1)蔗糖(甘味)、食塩(塩味)、キニ-ネ(苦味)、塩酸(塩味)によって味細胞は興奮を起こすが,蔗糖刺激によって脱分極性電位を示し、その際膜抵抗が増大するものでは確実に味細胞内に記録電極が入っていることが細胞内色素注入法によって判明した。ところが、同一の味細胞でも食塩刺激にたいしては脱分極電位変化を示し、その際膜抵抗は減少する。2)味細胞内電圧固定法による実験では蔗糖刺激では外向き電流が減少して膜抵抗が増大する。一方、食塩刺激では内向き電流が増大して膜抵抗が減少する。1)、2)のことから蔗糖刺激では味細胞受容膜に蔗糖が吸着することにより味細胞膜のK^+イオンの透過性が減少することによって味応答が発生すると推定された。このことはさらに味細胞内に細胞内二次伝達物質としてのcーGMPおよび細胞膜のK^+イオンチャンネルブロッカ-であるTEAを注入することによっても蔗糖応答と同様な電位変化、膜抵抗変化が記録され、K^+イオン透過性の減少によるという仮説を支持した(Tonosaki,K.& Funakoshi,M.:Nature,331,354ー356,1988;Brain Res.,445,363ー366,1988)。しかし、食塩、苦味、酸味応答の発生に関してはそのメカニズムはまだ不明である。これらの点については研究中である。蔗糖、食塩刺激に対する味細胞の応答の性質からそれらの刺激に対して味細胞膜の発生する膜の性質をその膜のイオン機構を考慮にいれて電気的等価回路として数理化学的に表現することを行ってみた。味細胞の興奮発生は刺激の受容から細胞内二次伝達物質を介して細胞膜の内液と外液のNa^+,K^+,Cl^-イオンの移動によって発生すると考えられる。一般の興奮性神経細胞や神経繊維では現在HodgkinーHuxley's equationが適応されることが判明している。そこでこの方程式に従ってE=m^ahg_<Na>V_<Na>+n^bg_KV_K+g_LV_L(E:電位変化、m^a:Na^+イオン活性価、h:Na^+イオン不活性価、n^b:K^+イオン活性価、g_<Na>,g_K,g_L:Na^+,K^+,その他のイオンのコンダクタンス、V_<Na>,V_K,V_L:Na^+,K^+,Lの平衡電位)として味細胞膜の電気的等価回路式を表しBasicによるプログラムを作成し、各々の値を変化させた時、どのような条件で蔗糖および食塩応答の様式を再現できるかを調べた。その結果、食塩応答、即ち脱分極電位変化で膜抵抗減少はa=4,b=3,m=0.053,h=0.6,n=0.32,v=-15の条件で再現でき、通常のHodgkinーHuxley's equationで説明出来る結果と相同となり膜のNa^+イオン(Na^+チャンネル)が活性化されて膜の脱分極、膜抵抗減少が説明されると考えられる。しかし、食塩が受容膜に吸着してNa^+イオンが受容膜を透過して細胞内のNa^+イオンが増加するとは実験事実からは考えにくいため、細胞内二次伝達物質(現在まだ不明)の関与があって受容膜以外の細胞膜でのNa^+イオンの透過性増大が生じて発生すると推定される。蔗糖応答発生のイオン機構においてもその膜の基本的性質は食塩の場合と同一と考え
全身炎症モデルにおける多能性前駆細胞の同定および急性・慢性炎症性疾患への応用研究

敗血症病態において、骨髄から動員される幼若球が、骨髄由来多能性前駆細胞である可能性を検討した。本研究の結果、細胞表面抗原(CD34)の違いにより少なくとも2種類の前駆細胞の存在が考えられた。CD34陰性前駆細胞は早期に肺に動員されるが、CD34陽性の前駆細胞の動員は遅いことが確認された。また、これら2種類では貪食能などに違いがあり、CD34陽性前駆細胞は貪食能が強く、CD34陰性前駆細胞は肺組織に対して保護的に働くと考えられた。これまで、肺高血圧症、ブレオマイシン肺線維症などの慢性肺傷害では、骨髄由来の前駆細胞が肺に誘導されることが確認されている。しかし、これらが上皮に分化することを、私たちの施行したような高解像度の多重免疫組織染色像で証明したものはない。さらに私たちは、今回の申請に先んじて、敗血症病態で骨髄由来前駆細胞を肺胞上皮分化細胞として呼び寄せるいくつかの方法を確認した。そして、骨髄由来前駆細胞の「立体的組織多重染色法」を敗血症モデル動物において確立した。予備実験では、敗血症病態で出現する幼若球と評価されている白血球系の中に、抗CD68抗体陰性(非マクロファージ性)、抗cytokeratin抗体陽性(上皮性)の特徴を持つ細胞を見出した。これらの細胞は、2型肺胞上皮細胞や血管内皮細胞に分化する特徴を持つと考えられるが、マクロファージに類似した作用は持たず、肺におけるアンチトロンビンIII(ATIII)や成長因子の活性に依存して、増加することが予測された。本研究は、敗血症病態における、おそらくは骨髄から動員されると考えられる骨髄由来多能性前駆細胞(bone marrow derived pluripotent progenitor cells ; BMDPPCs)を血液中に増加させ、急性肺傷害などの臓器傷害部位に誘導する新規治療原理を提案することを目的とする。本研究は、特に救急領域における創傷治癒促進に、血管内からの新しい治療原理を与えるものである。さらにまた、COPDなどの慢性肺疾患の肺胞再生、腫瘍切除後の欠損部位の再生、肺移植適用患者さんへの移植前延命的治療などにも新しい治療法のオプションをもたらすことが可能である。これまでに我々は、敗血症病態で出現する幼若球と評価されている白血球系の中に、抗CD68抗体陰性(非マクロファージ性)、抗cytokeratin抗体陽性(上皮性)の特徴を持つ細胞を見出している。これらの細胞は、2型肺胞上皮細胞や血管内皮細胞に分化する可能性が考えられ、あるいは2型肺胞上皮細胞や血管内皮細胞に対し生存を促す作用があると考えられた。平成22年度までに、LPS誘導敗血症モデル肺において、細胞表面抗原の違いにより少なくとも2種類のBMDPPCsの存在が考えられた。FACSを用いた解析の結果、CD34陰性BMDPPCsは非常にacuteに動員されることが明らかとなった。一方、CD34陽性のBMDPPCsは、CD34陰性BMDPPCsよりも動員が遅いことが確認された。2種類のBMDPPCsを培養した結果、CD34陽性のBMDPPCsのみ培養が可能で、貪食能を有することも観察された。免疫細胞化学による表面抗原の解析結果から、CD34陽性細胞はマクロファージ系抗原を示さず、増殖能および分化能を有する可能性が示唆された。従って2種類のBMDPPCsは、LPSによって肺に動員されてくるが、それぞれ細胞機能が異なることが推察された。in vivoでの細胞動態を明らかにするために、GFPマウスよりFACSを用いて調整したCD34陽性あるいはCD34陰性BMDPPCsを、LPSによって炎症誘導をかけたマウスに静脈投与し、肺への移行と増殖または分化能を確認する研究を行っている。本研究は、敗血症病態における骨髄から動員されると考えられる骨髄由来多能性前駆細胞(bone marrow derived pluripotent progenitor ceHs; BMDPPCs)を血液中に増加させ、急性肺傷害などの臓器傷害部位に誘導する新規治療原理を提案することを目的としている。これまでに我々は、敗血症病態で出現する幼若球と評価されている白血球系の中に、抗cytokeratin抗体陽性(上皮性)の特徴を持つ細胞を見出している。平成23年度までに、LPS誘導敗血症モデル肺において、細胞表面抗原の違いにより少なくとも2種類のBMDPPCsの存在が考えられた。FACSを用いた解析の結果、CD

34陰性BMDPPCsは非常にacuteに動員される(敗血症惹起後1時間以内)ことが明らかとなった。一方、CD34陽性のBMDPPCsは、CD34陰性BMDPPCsよりも動員が遅いことが確認された。2種類のBMDPPCsを培養した結果、CD34陽性のBMDPPCsのみ培養が可能で、貧食能を有することも観察された。免疫細胞化学による表面抗原の解析結果から、CD34陽性細胞はマクロファージ系抗原を示さず、増殖能および分化能を有する可能性が示唆された。同定された2種類のBMDPPCsをGFPマウスからFACSによって単離し、敗血症を惹起した野生型マウスに投与したが、炎症状態の肺にはほとんどリクルートされず、他の網内系組織等でトラップされていることが示唆された。現在までに、急性心筋梗塞モデルなどで傷害部位にリクルートされる単球/マクロファージは脾臓がリザーバーとなっていることが示唆されているので、本研究で同定したBMDPPCsは脾臓を一時的な待機場所としているのかも検討した。腓摘モデル等の検討結果から、BMDPPCsは脾臓を経由せず、骨髄から直接リクルートされることが強く示唆された。今後は骨髄から直接BMDPPCsを単離し、炎症肺にダイレクトに投与する方法やex vivo系による経時的な可視化の系を構築することによってBMDPPCsの可能性を検討したい。
次世代手術シミュレーション骨モデルの開発

立体骨モデルは,あらかじめ撮影したCT画像をもとにインクジェッ粉末積層装置を用いて作製。同意のもとに,数十例の症例に対して術前のCT画像を元にコンピュータの仮想空間上で手術計画を行うと同時に,実物大骨モデルを用いた手術シミュレーションを実施した。特に形態変形の高度な症例対して,安全で正確な手技の遂行に有用であった。実際の手術に際してスタッフ間のイメージの補完に有用であった。今後の課題はシミュレーションと同様の手術を実施するためのナビゲーションシステムとの連携を行い長期的な効果判定を行うことである。(1)最適な素材の同定と骨モデルの作成立体骨モデルは、あらかじめ撮影したCT画像をもとに三次元積層法を応用したインクジェッ粉末積層装置を用いて作成した。粉末材料として石膏を主に用いた。実物大モデルの表面には樹脂コーティングを施した。当初のモデルにはクラックが入りやすい脆弱性があったので、骨の弾性や硬度を反映させるために、石膏への特殊樹脂の配合と表面コーティングを工夫することで骨モデルの特性を改良した。その結果、具体的には、骨盤骨切り術(寛骨臼回転骨切り術)や骨切り用のボーンソーの使用、人工股関節手術シミュレーションのための手術器具(寛骨臼リーマー)の使用への対応および耐滅菌性の獲得を行うことができた。(2)手術シミュレーション前述の骨モデルの改良成果を踏まえて、初年度に複数の手術シミュレーションを行った。具体的な対象症例として、高度の臼蓋形成不全を伴う身長-1.6SDの小柄な症例に対する寛骨臼回転骨切り術の手術計画。RAPADILINO syndromeの小柄な変形性股関節症に対する小型の人工股関節の検討。不完全二重体に対する大腿骨矯正骨切り術の手術計画であった。まず各々のケースに対して、術前のCT画像を元にCADソフト(Mimics 10;Materialise社製)を用いてコンピュータの仮想空間上で手術計画を行なった。次に実物大の骨モデルを作成し、実際の手術シミュレーションを行った。骨モデルは複数作成して実際の作業をシミュレーションすることができた。このように通常の解剖に比べて特に形態が異なるケースに対しては、術前のシミュレーションは術者のイメージを補完する上で有効であった。(1)最適な素材の同定と骨モデルの作成立体骨モデルは,あらかじめ撮影したCT画像をもとに三次元積層法を応用したインクジェッ粉末積層装置を用いて作成している。材料として石膏が主に使用されるが,骨モデルの特性が改良された結果,骨切り用のボーンソーの使用,人工股関節置換用手術器具(寛骨臼リーマー)の使用への対応が可能である。(2)骨モデルの特性問題点は「ねじれ」と「衝撃」が負荷された時の脆弱性で,弾性の付与が課題である。(3)手術シミュレーションへの応用前年度に引き続き,新たな複数症例に対して,術前のCT画像を元にコンピュータの仮想空間(Mimics10;Matehahse社製)上で手術計画を行うと同時に,実物大の骨モデルを用いた手術シミュレーションを行った。A)骨切り術については,寛骨臼の前壁欠損の強い症例や臼蓋形成不全が特に高度な症例対して,骨切りの位置や移動回転骨片の設置位置を再確認でき,精確な手技の遂行に有用であった。B)人工関節置換術及び人工関節再置換術については,人工関節の設置位置と設置方法は,術後の予後に大きく影響すると同時に,神経,血管などの損傷を来たさず,安全に手技を遂行するためには重要であるが,実際の手術を安全に遂行するために有効であった。C)矯正骨切り術は,病的に変形した骨を一旦切り離して正常に近い形に再直合するものである。骨切りの位置,ノミやボーンソーの進行方向,骨切り片の大きさ,矯正の具合をシミュレーションすることが可能であった。D)高度な骨変形を伴う奇形あるいは骨系統疾患症例に対する手術については,既存の人工関節とカスタムメイド人工関節の適応が適格に判断できた。(4)外科医の技量向上のための教育ツールとしての利用通常の解剖に比べて特に形態が異なるケースに対しては,術前のシミュレーションは術者のイメージを補完し助手が共有する上で有効あった。(1)骨モデルの作製立体骨モデルは、あらかじめ撮影したCT画像をもとにインクジェッ粉末積層装置を用いて作製している。材料として石膏が主に使用されるが、骨モデルの作製工程が改良に伴い骨切り用のボーンソーの使用、人工股関節置換用手術器具(寛骨臼リーマー)の使用への対応が可能となった。(2)骨モデルの特性圧縮試験ISO604(JIS K7181)準拠の結果、圧縮応力は平均5.73MPa、圧縮ひずみ0.4%、圧縮弾性率は2400MPaであった。(3)手術シミュレーションへの応用同意のもとに、数十例の症例に対して術前のCT画像を元にコンピュータの仮想空間(Mimics 10 ; Materialise社製)上で手術計画を行うと同時に、実物大骨モデルを用いた手術シミュレーションを実施した。

A)骨切り術については、寛骨臼の前壁欠損の強い症例や臼蓋形成不全が特に高度な症例対して、骨切りの位置や回転骨片の設置位置を再確認でき正確な手技の遂行に有用であった。B)人工関節置換術及び人工関節再置換術については、人工関節の設置位置と方法は術後の予後に大きく影響すると同時に、神経・血管などの損傷を来たさず安全に手技を遂行するためには重要であるが、実際の手術を安全に遂行するイメージの補完に有用であった。C)高度な骨変形を伴う奇形や骨系統疾患に対する矯正骨切り術は、病的に変形した骨を一旦切り離して正常に近い形に再接合するものである。骨切りの位置、手術器具の進行方向、骨切り片の大きさ、矯正の具合をシミュレーションすることが可能であった。D)骨系統疾患症例に対する人工関節手術については、既存の人工関節とカスタムメイド人工股関節の適応が適正に判断できた。(4)外科医の技量向上のための教育ツールとしての利用正常の解剖に比べて特に形態が異なる症例に対しては、術前シミュレーションは術者のイメージを補完し助手とイメージを共有する上で有効あった。(5)課題シミュレーションと同様の手術をするためのナビゲーションシステムとの連携とその効果の評価を科学的に行うことが今後の課題である。
糖尿病遺伝子の同定・単離ならびに機能解析:ヒトとモデル動物の染色体対応に基づいたアプローチ

糖尿病は複数の遺伝子と環境因子の相互作用により発症する多因子疾患である。このため、従来単一遺伝子疾患で用いられてきた遺伝解析法では遺伝子のマップはできても、責任遺伝子の同定・単離ならびに機能解析には必ずしも結びついていないのが現状である。本研究では遺伝的に均一な純系モデル動物ならびにそのコンジェニック系統・コンソミック系統を用いて遺伝子の同定・単離・機能解析を進めながら、その情報に基づいてヒトのカウンターパートの解析を進めた。2型糖尿病モデル動物NSYマウスのゲノムスキャンにより同定した耐糖能を規定する遺伝子Nidd1nの局在する第11染色体のみを導入したコンソミック系統ならびに第2の遺伝子Nidd2nの局在する第14染色体を単独で有するコンソミック系統を確立し、機能解析を進めた結果、第11染色体上のNidd1nは肥満や内臓脂肪蓄積を介することなくインスリン抵抗性ならびに血糖上昇をきたすのに対し、第14染色体上のNidd2nは肥満・内臓脂肪蓄積を介することなくインスリン抵抗性をきたすが、耐糖能には影響を与えない遺伝子であることが明らかとなった。Nidd1nのマップされた領域に存在する候補遺伝子Tcf2のヒト対応遺伝子多型と一般の2型糖尿病との間には有意の関連を認めなかったことから、Tcf2が2型糖尿病の疾患感受性に関与する可能性は低いと考えられた。
通電式水素・メタン醗酵の検討

有機性廃棄物から水素を回収する技術が確立できれば持続可能な社会の構築に寄与する事ができる。水素発酵は高効率に水素を回収できるが安定性に欠ける。電気化学システムを用いて微弱の電流を流して水素発酵を安定化できる事を見出した。通電式水素発酵では3電極方式を採用しており、電極として比較的に安価な炭素電極を使用して、作用電極上の電位を-0.9V(vs. Ag/AgCl)に設定している。微生物学的な知見として、メタン菌を抑制し水素生成に好適である酢酸/酪酸の生成が優先化している事を明らかにした。さらに、Corynebacterium glutamicumの増殖時に乳酸収率を高められる事を確認した。現在までに、電気化学システムをメタン発酵や水素発酵に適用する事により、安定的にメタン・水素の回収が可能である事を実証してきた。この理由として、電気化学システムが酸化還元電位をメタン菌ないしは水素生成菌に対して好適に維持する事により、複雑な微生物群集の中でも鍵となる微生物を維持できるからである。特に電気化学システムを使用したメタン発酵槽は数Lにまで大型化して運転する事が可能であり、電気化学システムを微生物培養に適用して実規模レベルで運転する基礎的知見を得る事ができた。本年においては、Corynebacterium glutamicumという工業的アミノ生産株に対して電気化学システム下で培養する事により、その効果を確認した。すなわち、C. glutamicumは好気条件で糖にて培養開始後に増殖の開始に伴い酸素を消費して酸化還元電位が下がるとともに、増殖は停止し糖消費は酸生成に向かう事が知られている。電気化学システムにより増殖開始時から酸化還元電位を低下させ、酸生成に対する効果を調べた。その結果、C. glutamicumの増殖は抑制され、酸生成量が増加した。中でも乳酸の収率を増加させる事に成功した。乳酸はバイオプラスチックの原料である。本研究においてC. glutamicumの増殖時において乳酸の収率を増加できる事が明らかとなった。しかし、C. glutamicumの非増殖時の乳酸収率は増加しなかったために、電気化学システムをC. glutamicum以外に適用する場合は、システム全体の構築については再考する必要がある。有機性廃棄物から水素・メタンを高効率に回収する、新規の電気化学的リアクターの開発を目的として研究を進めてきた。まず、炭素板を電極として使用し、三電極方式を採用した、安価な電気化学的リアクターを構築した(こちらのリアクターでは陽イオン交換膜も使用していない)。本電気化学的リアクターに極めて微量の電流を流す事により、つまり投入エネルギーを最小限で抑えながら、水素発酵の構築に成功し、より多くのエネルギーを水素として回収した。これはドッグフードスラリーのように、複雑な基質である模擬有機性廃棄物を使用した場合も可能であり、有機性廃棄物からの高効率水素回収に展望を示した。また電気化学的リアクターを使用した水素発酵は、従来の水素発酵に比べて高いpH(6.5近傍)での運転が可能である事が明らかとなった。高いpHの利点としては、微生物による酪酸/酢酸発酵を優先化する事が可能となり、従来の水素発酵のように低いpHで優先化しやすい乳酸発酵を抑制して、水素回収率を高く維持する事に成功した(乳酸発酵では水素回収率が低く、酪酸/酢酸発酵では水素回収率が高い)。さらに、電気化学的リアクターを採用した水素発酵の残存物を利用して、メタン発酵にも成功し、水素・メタンの同時回収に展望を示した(メタン発酵には固定床式を採用している)。電気化学的水素発酵リアクターより遺伝学的解析方法を用いて微生物群集構造を詳細に解析した結果、水素を消費するメタン生成菌の生育が抑制されているものの、水素を生成する細菌の生育は抑制されておらず、これが理由となって、高効率の水素生成が可能であると考えられた。また、電気化学的手法により対極上の電位を調べた結果、メタン生成菌が生育可能な酸化還元電位よりも高く維持されており、この高い電位がメタン菌の効率的な抑制に繋がっている事が明らかとなった。電気化学的リアクターを用いて、模擬有機性廃棄物からの水素・メタンの回収に成功し、数か月間、安定的に運転する事に成功した。微生物群衆構造の解析も終了しており、微生物学的な知見を得る事に成功した。研究実績で得られた内容を学会で発表し、興味を持って頂けた。シンポジウムにおいて招待講演を行い、発表内容について興味を持って頂けた。本研究により得られた成果を、企業にも使用して頂けるように、企業向けの雑誌に掲載して頂いた。当成果が企業の目に止まる事を望んでいる。学術論文としてまとめて投稿しアクセプトされた。当研究で構築した電気化学システムを、水素発酵だけでなく、他の微生物にも適用する事を予定している。

本研究で得られた知見により、電気化学システムは微生物の代謝に影響を与える事が示されている。この知見より、有用物質を生成する微生物に適用する事により、生成効率を上げる培養法を確立する事を目的として進めていく。電気化学システムの改良に使用する事を予定している。また、学会発表にも使用する事を予定している。
遺伝子タイピングによる中毒作用発現リスクの判定

チトクロームP-450(CYP)は、薬物の代謝に中心的な働きをする酵素であり、特に中毒学領域で重要視されている。本研究では、CYP分子種の中で特に基質特異性が高く、毒性・副作用の発現の個人差に注意を要するCYP2C19のジェノタイプを調べ、その変異がもたらす毒性や薬効の発現について、検討をおこなった。ヒト末梢血白血球部分をプロテナーゼK/SDS処理し、フェノール/クロロホルム抽出した後、エタノール沈殿によってDNAを回収し、PCR-RFLP法によって塩基配列を解析した。すなわちCYP2C19遺伝子型の判定において、5'-AATTACAACCAGAGCTTGGC-3'と5-'TATCACTTTCCATAAAAGCAAG-3'および5'-TATTATTATCTGTTAACTAATATGA-3'と5'-ACTTCAGGGCTTGGTCAATA-3'の2組のプライマーを作成し、allele-specific PCR法により増幅を行った。RFLP法は、SmaI、BamHIで消化後、10%ポリアクリルアミドゲルで泳動し、銀染色を行った。その結果、allele-specific PCR法により増幅した産物からRFLP法でCYP2C19の遺伝子型の判定が可能で、CYP2C19wtの他に、CYP2C19m_1およびCYP2C19m_2が検出された。さらにこれらについては、OmeprazoleをプローブとしてHPLCにより、血清中のOmeprazole/OH-Omeprazole値からCYP2C19の酵素活性を調べた。その結果、wt型に比べて著しい活性の低下が認められ、遺伝子型と表現型の結果は一致していた。以上のことから、薬物代謝能における遺伝的素因は薬物動態の個人差を根本的に左右する因子であり、薬物代謝酵素の遺伝子型の判定は中毒学的診断に今後極めて有用になる、と確信する。本研究では、CYP分子種の中で特に基質特異性の高い、毒性・副作用の発現の個人差に注意を要するCYP2C19のジェノタイプを調べ、その変異がもたらす毒性や薬効の発現について、検討をおこなった。すなわちCYP2C19遺伝子型の判定において、5'-AATTACAACCAGAGCTTGGC-3'と5-'TATCACTTTCCATAAAAGCAAG-3'および5'-TATTATTATCTGTTAACTAATATGA-3'と5'-ACTTCAGGGCTTGGTCAATA-3'の2組のプライマーを作成し、allele-specificPCR法により増幅を行った。その結果、allele-specificPCR法により増幅した産物からRFLP法でCYP2C19の遺伝子型の判定が可能で、CYP2C19wtの他に、CYP2C19m1およびCYP2C19m2が検出された。今後の研究の展開として、CYP2C19の酵素活性を調べるためにOmeprazoleをプローブとして用い、血清中のOmeprazole/OH-Omeprazole値を測定する計画である。

さらに、このOmeprazole testによる表現型の判定法とPCR-RFLPによる遺伝子型の判定法との相関を調べ、薬物濃度の測定に加えて、代謝能の遺伝子診断をおこなうことの法医中毒学および臨床診断学的な意義を検討する予定である。チトクロームP-450(CYP)は、薬物の代謝に中心的な働きをする酵素であり、特に中毒学領域で重要視されている。本研究では、CYP分子種の中で特に基質特異性が高く、毒性・副作用の発現の個人差に注意を要するCYP2C19のジェノタイプを調べ、その変異がもたらす毒性や薬効の発現について、検討をおこなった。ヒト末梢血白血球部分をプロテナーゼK/SDS処理し、フェノール/クロロホルム抽出した後、エタノール沈殿によってDNAを回収し、PCR-RFLP法によって塩基配列を解析した。すなわちCYP2C19遺伝子型の判定において、5'-AATTACAACCAGAGCTTGGC-3'と5-'TATCACTTTCCATAAAAGCAAG-3'および5'-TATTATTATCTGTTAACTAATATGA-3'と5'-ACTTCAGGGCTTGGTCAATA-3'の2組のプライマーを作成し、allele-specific PCR法により増幅を行った。RFLP法は、SmaI、BamHIで消化後、10%ポリアクリルアミドゲルで泳動し、銀染色を行った。その結果、allele-specific PCR法により増幅した産物からRFLP法でCYP2C19の遺伝子型の判定が可能で、CYP2C19wtの他に、CYP2C19m1およびCYP2C19m2が検出された。さらにこれらについては、OmeprazoleをプローブとしてHPLCにより、血清中のOmeprazole/OH-Omeprazole値からCYP2C19の酵素活性を調べた。その結果、wt型に比べて著しい活性の低下が認められ、遺伝子型と表現型の結果は一致していた。以上のことから、薬物代謝能における遺伝的素因は薬物動態の個人差を根本的に左右する因子であり、薬物代謝酵素の遺伝子型の判定は中毒学的診断に今後極めて有用になる、と確信する。
eラーニング教材の質保証を目的とした直感的操作環境モデルの構築

本研究は、「使いやすさ」と「教育の質」の2つの志向から、eラーニングシステムのユーザインターフェース(UI)の新しい志向について検討するものである。1つ目の「使いやすさ」に関しては、ゲームニクス的(テレビゲームのように誰でも説明書を見ずに使い始められるUI等の工夫)な志向を元に、eラーニングシステムを初めて使う教員のための新しいUIとして、必要な機能を優先的に表示するアダプティブなUIを設計し、実装した。2つ目の「教育の質」に関しては、インストラクショナルデザイン的な考え方を活用したUIを検討することで、グループワークやプロジェクト学習(PBL)に特化したUIを検討し、開発した。初年度は、本研究課題を遂行するための環境構築および準備調査を行うという計画で実施計画申請を行っており、実際にそれを遂行した。以下に環境構築と準備調査の詳細について述べる。環境構築としては、eラーニングで導入実績の多い学習管理システム(LMS)の一つである「Moodle」をベースとして使用するための準備(サーバ構築および開発環境の整備)を行った。また、後述する準備調査の結果からLMSへ再現する実験の仕組みとして学習活動をモデル化するツール「LAMS」の整備も同時に行った。これらをベースとして、本研究課題で構築する「新しいLMSインタフェース」の開発環境を導入するとともに、これまで事前研究として開発してきたものを含め動作検証を行い、これから開発を進めるための環境を整えた。準備調査としては、これからの本研究課題の検証環境開発に必要な情報の収集を行った。その一つ目は、大学におけるeラーニングの現状把握のための調査である。協力を依頼できる教員やeラーニング関係学会等において、eラーニングの利用状況の調査を行った。eラーニングを活用している大学や教員を訪問し、講義・演習等での活用について聞き取り調査をした。それらの調査結果を用いて、eラーニングの活用についてmoodleとLAMSにて再現する実験を試みた。2つ目は、国内外学会においてはeラーニングやWebのユーザインタフェース(UI)、インストラクショナルデザイン(ID)などの最新知見について調査し、本研究課題で達成する新しいLMSインタフェースにもユーザインタフェースをめぐる環境の進化に対応するような方略を立てられるような情報を収集したことである。これらの準備により来年度以降の研究が滞り無く進められる環境が整えられた。本研究課題2年目の平成27年度は、初年度に実施したゲームニクス的(テレビゲームに代表される誰でも操作できるインターフェースの工夫・デザイン志向)操作パターンの検証結果を元にeラーニングシステム(LMS)で教員が使う機能の検証範囲を広げて、本研究課題の一つであるゲームニクスインターフェースの機能拡充を行うこと、本研究が将来的に実用化し教員が使用することを考慮し、ゲームニクス的な操作パターンとIDモデルどのように実現させるかといったことのシミュレーションを行いながら開発することの2つについて取り組みを行った。1つ目のゲームニクス的インタフェースの拡充について、ユーザインタフェースの知見とeラーニング活用の知見を広げるため、過去から現在までの様々なユーザインタフェース理論について研究し、ゲームニクスとの違いが明らかになるような基礎作りを行った。また、ゲームニクス的インターフェースの機能拡充の内容を定義するために、eラーニング研究やeラーニング活用の実態についての見聞を広げ、ゲームニクス的インタフェースでサポートできる教員モデルを充実させた。2つめのシミュレーションを行いながら進める点に関して、eラーニング初心者の教員の協力を得ながら、従来通りのeラーニングシステムとゲームニクスインタフェースでの違いについて検証を行っているところである。IDモデルによるインタフェースについて、これまでeラーニングでは中々実現できなかった、グループワークやPBLについての機能実現に向けて研究を進めている。本研究のゲームニクスを活用するインタフェース、IDモデルを活用するインタフェースの2本の大きな柱について、知見の蓄積とモデル開発について概ね順調に進んでいることから、進捗についての問題はないと考えている。最終年度の平成28年度は、昨年度までに実施してきたゲームニクス的(テレビゲームに代表される誰でも説明書を見ずに使い始めることができるユーザインターフェースの工夫・デザイン志向)操作パターンの検証結果を元に、インターフェースを搭載したeラーニングシステム(LMS)の研究成果についてまとめること、またインストラクショナルデザイン的なインターフェースを持ったeラーニングシステムとはどのようなものであるか検討を行った。1つ目のゲームニクス的インターフェースを搭載したeラーニングシステムにおいては、eラーニングシステムを使ったことが無い大学教員が、初めてeラーニングシステムを使う上でどのようなインターフェースが使い始めやすいかを検討することを行った。一つはゲームニクス以外のユーザインタフェース理論とゲームニクスの理論の比較について行うこと、もう一つが開発しているゲームニクス的eラーニングシステムの検証である。ユーザエクスピリエンスデザイン(UX)の理論やユーザインタフェース検証の方法を参考に開発したシステムの検証を行った。2つ目のインストラクショナルデザイン的なインタフェースを持ったeラーニングシステムは、これの一つとしてグループワークやPBLなどに特化したeラーニングシステムの開発を行い、論文にまとめて投稿した。このシステムではグループワークやPBLの進め方について教員がそのステップについて逐一eラーニングシステムで設定や指示することなく、eラーニングシステムに提示された手順を活用することで学生のグループワークをアシストできるものである。

当初計画において達成する事項は満たしており、調査については進んでいる。各調査結果を検証し成果を公表することについて次年度に実施したい。現在までに進めてきた2本の柱について、3年目においてはそれぞれの知見を発信する活動を行うこと、また本研究課題の最終段階である革新的授業設計インターフェースの実用化に向けた準備について進めていく方針である。教育工学初年度に実施した検証結果を用いて「新しいLMSインタフェース」へ実装していくとともに、このインタフェースの機能について整理し、結果について公表していきたい。平成27年度末頃に1件の調査旅費を予定していたが、学内の公務と重なり断念したため。平成28年度の調査費に使用する予定である。
中国全域の産業集積の複眼的考察：地点データ企業GIS地図の作成と空間計量経済分析

本研究は、中国製造業企業の地点データ(社区村)を構築し、GIS地図と集積地マップを作成し、空間統計分析をもちいて、中国の産業集積の現状と変動を調査・分析し、地域・産業・企業所有制から総合的に中国の産業集積を考察するものである。平成28年度では、企業センサス個票データベースをもちいて、GIS地図データを作成・加工した。そのうえで、産業分布マップを作成した。平成29年度では、中国の産業集積に関する空間統計分析をサーヴェイしたうえで、自動車とアパレル産業の集積マップを作成した。その際、Tango(2008)の解析手法をもちいた。管見の限り、これは、中国の製造業企業の点データをスキャンして作成されたはじめての中国本土全域の産業集積マップである。さらに、自動車産業について、従業員数加重のDuranton and Overman(2005)のK-density関数をもちいて、業種内、業種間、それに所有タイプ×業種のカテゴリ間の集積・共集積を計測した。どのような企業がどのような企業とどう分布しているのかについて、解明を試みた。管見の限り、これは、所有制と産業を総合的に分析視野に入れた初めての中国本土全域に対する産業集積空間統計分析である。平成30年度では、産業集積の要因分析に着手した。内生性問題を回避・軽減するため、過年次の説明変数をもちいて、2008年の集積地に対する各要因のインパクトを分析すると考えており、そのため、2004年の製造業企業の地点データの構築が必要になった。莫大な時間がかかった大変繁雑な作業ではあったが、すでに2004年の地点データの作成に成功し、空間二項選択モデルをもちいた要因分析を実施しており、学会での発表を予定している。また、習近平時代において、国有企業改革に関する新しい動きが出てきており、これからの産業集積の行方を占うために、国家資本の行方にかかわる政策も調査した。平成28年度は、APIを利用して、手作業ならおよそ10年がかかるGIS地図データの作成に成功した。それでも、予想外にセンサスデータベースに対応した社区村の調査、それに社区村の経緯度調査に莫大の時間がかかった。平成29年度は、なるべく時間を取り戻したく、計算作業機械を増やして、産業集積マップの作成と共集積のK-density関数計算に臨んだ。しかし、広大な国土と膨大の企業数を有する中国の産業集積分析は、ハードウェアと時間の両面で大きな制約を受けた。たとえば、FleXScanをもちいて集積地を検出した場合、α1を0.3、最大のクラスターサイズを60に設定して実施してみたところ、6週間が経っても1業種だけであっても、計算作業が1/3しか進まなかった。K-density関数の計算についても、たいてい1回(1カテゴリあるいは1ペアのカテゴリ間)の計算に数時間から10日前後はかかった。平成30年度は、北海道地震時の停電などを受け、計算が幾度中断され、計算機の調整にも時間がかかった。また、すでに構築した2008年経済センサスのGISデータをもちいて、集積地の要因分析をこころみた。そこで、やはり説明変数の内生性問題に対処するため、古い年次のデータを回帰分析に利用する必要性が出てきた。そのため、2004年の第1次経済センサスのデータセットをGIS化するのに、莫大な時間がかかったが、すでに2004年のGISデータセットの構築に成功し、空間二項選択モデルによる集積要因分析を進めており、学会での発表を予定している。以上の理由により、計画よりやや作業が遅れている。本研究において、ハードウェアと時間からかなり大きな制約を受けた。しかし、研究のためのGISデータの構築は一段落になり、これによって、研究の品質が保障された。これからも時間と精力を惜しまずに、研究の円滑の実施と高水準の研究成果の確保に努めたい。本研究は、中国全域・全製造業の地点データの企業GIS地図を作成し、空間計量分析をもちいて、中国の産業集積の現状およびその変動を調査・分析し、地域・産業・企業所有制から総合的に中国の産業集積を考察するものである。平成28年度では、計画通り、企業個票データベースをもちいて、GIS地図データを作成・加工した。具体的には、2008年の経済センサス個票データベースを利用して、社区村のGIS地図データを作成した。中国全国の社区(都市部の街道より下位の住民組織)と村(農村部の郷鎮より下位の住民組織)は約70万を数える。これは、中国の民政局が把握している最も細かい地域レベルである。今、中国の産業集積分析に最も利用されている県(約3千)のGIS地図データと比べると、我々が作成したGIS地図データの容量は格段に大きくなった。このGIS地図データを利用して作成した企業GIS地図も、従来のものと比べて精度が飛躍的に向上して、産業集積の高度な分析に資するであろう。なお、当初は個票データベースの企業住所を利用して、それぞれの企業のGIS地図データの作成を予定していた。現に極めて少数ではあるが、幾つかの地域に限定した先行研究も存在する。しかし、試作により、その作成の有効性と必要性が疑われた。その第1の理由は、都市部以外の企業では、その住所は実際に村までしか記されていないことが一般的に観察された。もしかして現状では村よりも詳細な住所を記すこと自体が不可能かもしれない。したがって、農村部の企業住所を調べても、実質的に村にまでしか掘り下げられない。

第2の理由は、都市部の社区はかなり地理的に範囲が小さいので、高い精度も保証できる。第3に、Geocode APIをもちいて企業住所を転換した場合,その精度がかなり低い。とはいえ、数百万の住所をすべて手作業でその経度と緯度を調べるのも不可能である。前記の理由で、我々は社区村の経緯度を調べ、GIS地図データを作成することにした。ところが、実際に作業してみると、2008年の統計区画コードが公表されなかったため、改めて2008年の統計区画コード対応の社区村を調べなくてはならなかった。そこで、我々は数百万に上る個票データを利用して、2009年の統計区画コードと比較しながら、2008年のコードに対応した社区村を調べることにした。この作業には予想外に時間がかかった。そのうえで、APIを利用して各社区村の経度と緯度を調べたが、もう1つの問題が発生した。APIで調べられなかった(結果がブランク)社区村とAPIの結果が間違っている社区村は合わせて約4万も残る。これらの莫大な地理データは手作業で調べるしかない。これは予想を大幅に超えて大変な時間と手間を要した。ちなみに、APIを利用しなければ、今回のGIS地図データの作成にはおよそ10年はかかる。以上の理由により、計画より若干作業が遅れた。本研究は、中国の地点データ製造業企業GIS地図を作成し、空間統計分析をもちいて、中国の産業集積の現状と変動を調査・分析し、地域・産業・企業所有制から総合的に中国の産業集積を考察するものである。平成28年度では、企業センサス個票データベースをもちいて、GIS地図データを作成・加工した。そのうえで、産業分布マップも作成した。平成29年度では、1これまでの中国の産業集積に関する空間統計分析をサーヴェイし、既存の研究の到達点と問題点を調べた。そのうえで、2自動車とアパレル産業に対して、10km×10kmグリッドをベースに、Tango(2008)の解析手法をもちいて、集積地を検出し、集積マップを作成した。管見の限り、これは、中国の製造業企業の点データをスキャンして作成された初めての中国本土全域の産業集積マップである。さらに、3従業員数加重のDuranton and Overman (2005)のK-density関数を計測した。自業種内の集積だけではなく,2業種間の共集積も測った。さらに国有企業と民間企業,ならびに外資系企業と地場企業の2通りに分けて,それらの企業所有×業種のカテゴリ間の集積・共集積も計測した。どのような企業がどのような企業とどう分布しているのかを,0ー800kmの間の各距離レベルにおいて調べた。管見の限り、これは、所有制と産業を総合的に分析視野に入れた初めての中国本土全域に対する産業集積空間統計分析である。平成28年度は、APIを利用して、手作業ならおよそ10年がかかるGIS地図データの作成に成功した。それでも、予想外にセンサスデータベースに対応した社区村の調査、それに社区村の経緯度調査に莫大の時間がかかった。平成29年度は、なるべく時間を取り戻したく、計算作業機械を増やして、産業集積マップの作成と共集積のK-density関数計算に臨んだ。しかし、広大な国土と膨大の企業数を有する中国の産業集積分析は、ハードウェアと時間の両面で大きな制約を受けた。
サイトカインストームが主な病態とされる急性脳症の病態解明の試み

前年度に実験動物(種、系統、日齢)、リポポリサッカライド(LPS)投与量、加温処置のタイミングなどの条件設定を行った。平成30年度は生後8日目のICRマウスに大腸菌由来LPS (50100μg/kg)の腹腔内投与、ヒーターによる加温処置を行い、発熱、痙攣を誘発させた。その後、FITC(蛍光色素)溶液を灌流させ、皮質における血管原生浮腫の評価を組織学的に行った。LPS100μg/kgの投与、加温処置を行った群は、コントロールに比して有意に皮質におけるFITCの血管外漏出を認め、血液脳関門(BBB)の破綻を組織学的に示すことができた。LPS100μg/kg + HT群では、ミクログリアの活性化、アストロサイトの形態変化(clasmatodendorosis)を認め、一部の個体では皮質に左右非対称の虚血性変化を疑う組織像を得た。これらの所見は報告されている急性壊死性脳症(ANE)、Hemorrhagic shock encephalopathy症候群(HSES)の脳組織像に比べ、BBB破綻、血管原生浮腫の程度は軽度であるものの、その特徴を有するものであった。肝臓、腎臓の組織像はLPS投与、加温処置による変化は認めなかった。サイトカインストームを主な病態とする急性脳症の脳組織所見の特徴を、幼若動物に少量のLPS投与と加温処置を行うことで比較的簡便に再現することができた。今後、他の動物種への応用や、薬剤を用いた治療法の研究、急性脳症発症のメカニズム、遺伝的背景の検討などが課題である。急性脳症の実験動物モデルとしてのさらなる有用性を検討していきたい。比較的簡便な方法で急性脳症モデル動物を作成するという当初の目標は達成できたものの、研究代表者の異動により、当初予定していた脳波測定、行動解析や薬物を用いた治療法の検討などは実施できていない。実験動物を用いての更なる研究は困難でるが、これまで得られた研究成果を検討し、研究成果の公表や、学術誌への投稿を行う。急性脳症の病態は、興奮毒性が主体とされるものや、サイトカインストームを主な病態とするものなどが推定されている。急性脳症の研究が遅れている主要な原因の一つは、良いモデル動物が存在しない事である。本研究は予後不良とされるサイトカインストームを主な病態とする急性脳症モデル動物を作出し、発症メカニズムの解明や治療方法の開発を目指すものである。平成29年度は実験動物(種、系統、日齢)、LPS投与量、加温処理のタイミングなどの条件設定を行った。生後8日目のICRマウスに大腸菌由来LPS (50100μg/kg)の腹腔内投与、ヒーターによる加温を行い、発熱、痙攣を誘発した。脳摘出直前にFITC溶液を灌流させ、皮質における血管原生浮腫の評価を組織学的に行った。サイトカインストームを主な病態とする急性壊死性脳症(ANE)剖検例の報告では、血液脳関門(BBB)破綻による血管原生浮腫の所見を認めている。我々はFITCに染まる脳組織の面積を定量化することで比較を行ったが、少量のLPS投与、加温を行った群は、コントロールに比して有意に皮質におけるFITCの血管外漏出を認めた。また、一部の個体では皮質に左右非対称の虚血性変化を疑う組織像を得た。LPS投与、加温により幼若マウスの脳組織においてBBB破綻、血管原生浮腫を組織学的に示すことができ、ANE類似の脳組織像を得ることができた。ANEと同じく、サイトカインストームの関与が推定されているHemorrhagic shock encephalopathy症候群(HSES)では、急性期の頭部画像で細胞性浮腫を示唆する所見を認める症例があり、急性期以降には脳組織のネクローシス、虚血性変化を認めることがあるとされている。今回、一部の個体の皮質に認めた虚血性変化に関してはHSESの脳組織に類似している可能性が示唆された。幼若マウスにLPS少量投与、加温処置を加えることで、当初の目標であった脳組織におけるBBB破綻の組織像を得ることができた。

サイトカインストームを主な病態とする急性脳症の脳組織所見の特徴を、幼若動物に少量のLPS投与と加温処置を行うことで比較的簡便に再現することができた。今後、他の動物種への応用や、薬剤を用いた治療法の研究、急性脳症発症のメカニズム、遺伝的背景の検討などが課題である。急性脳症の実験動物モデルとしてのさらなる有用性を検討していきたい。比較的簡便な方法で急性脳症モデル動物を作成するという当初の目標は達成できたものの、研究代表者の異動により、当初予定していた脳波測定、行動解析や薬物を用いた治療法の検討などは実施できていない。急性脳症モデル動物としての妥当性の評価、治療方法の検討などを行う。実験動物を用いての更なる研究は困難でるが、これまで得られた研究成果を検討し、研究成果の公表や、学術誌への投稿を行う。交付決定前に必要な実験機器、試薬を既に購入していたため。翌年度分と合わせて、引き続き試薬などの物品購入費、動物飼育料、研究成果発表のための経費として使用する。実験に必要な直腸音計や小動物用のプローブなどは事前に購入しており、免疫組織化学的解析に使用した一次抗体、二次抗体などの試薬も、可能な限り事前に購入していたものを使用した。次年度使用額に関しては、得られた研究成果の解析のための統計ソフトなどの購入費用、研究成果の公表、学会発表に必要な経費、学術誌への投稿に必要な費用として使用したい。
卵巣癌の増殖に対するFSHの促進作用に関与する蛋白とセカンドメッセンジャーの解析

FSHは、FSH受容体を介し上皮性卵巣癌の増殖を促進するが、この促進作用に関与するsecond messengerと蛋白について、ヒト漿液性嚢胞腺細胞(HRA株)を用いて解析を試みた。その結果、1)second messengerの同定:HRA株の増殖は、FSHで用量依存性に促進され、protein kinase阻害剤であるH7、HA1004により抑制された。しかも、protein kinase C(PKC)阻害剤であるH7による抑制作用のみがFSHの併用添加で用量依存性に抑制されたが、PKCには作用を示さないHA1004の抑制作用には拮抗しなかった。また我々は以前FSHによりHRA株のCAMP産生は影響されないことを明らかにしており、以上の結果より卵巣癌の増殖に対するFSHの促進作用において、PKCがsecond messengerとして作用することを示唆した。次にPKCについて分子生物学的に解析を行い(Westen,Nertten blot)、HRA株はPKC type II,IIIを発現しており、その発現はFSHで増強することを明らかにした。2)FSHの増殖促進に関与する蛋白の抽出と同定:FSHは、HRA株の増殖においてtoggle switch的に作用し、FSH添加824時間以内にHRA細胞で産生される蛋白が増殖促進作用を直接的に司さどることを明らかにしたが、HRA株の蛋白リン酸化実験において、HRA株の約80KDの蛋白のリン酸化はFSHにより増強し、またこのリン酸化はH7の併用で減弱することを今回明らかにした。以上より、FSHによる卵巣癌細胞の増殖促進作用のsecond messengerとしてPKC type II,IIIが作動し、約80KDの蛋白の自己リン酸化が関与することを本年度の研究にて明らかにした。