hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
肺癌診療におけるＸ線ＣＴ検査利用の最適化

肺癌診断、治療計画におけるCT新規技術の有用性、有効な使用法について、動態解析、線量低減法の面から検討した。逐次近似画像再構成を応用した線量低減法を使用し、CTを用いた動態撮影により肺実質の構造の動きおよびその胸壁に対する相対的挙動の画像化方法を確立した。低線量画像が標準的線量画像に画質面で劣らないことを胸部CTにおける代表的評価項目について示し、新規の線量低減法評価において低線量画像を比較対象にすることの妥当性を示した。全体の実施計画のうち、主として26年度以降に予定した三次元的データ収集による診断的付加価値の検証について、検討に必要なCT三次元結節の蓄積に時間を要する可能性が考えられたため、予定より前倒しして進めることとした。肺結節三次元的特徴の診断への影響評価のための結節データとして、悪性結節あるいは良性結節と診断確定が可能と判断できる結節を臨床データベースからスクリーニングを行い、これらの肺結節について三次元データ(0.5mm厚)を診断能評価のために準備した。結節の画像特徴評価項目として適したものを抽出するために、画像特徴に対する医師の判断の再現性、画像特徴の診断への寄与について評価する予備実験を行った。結節の形状特徴として診断に一般に用いられている所見項目に対し、各結節の性状(全体形状、輪郭、内部性状など)を5段階に数値化して記録した。2名の医師により独立に判断したものを記録した後に合議した結果を記録した。また、診断を選択する読影実験を二回実施し、医師による診断の正誤、再現性を解析した。これにより、診断の再現性の高い、あるいは低い結節の形状特徴と、正しい結節の診断に結びつく結節形状についての知見が得られた。これらが、三次元特徴と横断像による結節特徴の比較検討において着目すべき所見項目になると考えられる。これらの所見項目に対し横断像での評価を追加し、3次元画像による結節特徴評価結果との違いを検討する。動態解析による診断的付加価値の検証については、動態解析に必要な撮像時間、撮像間隔、撮像パラメータを最適化するための検討を行った。治療後経過観察時におけるX線線量低減技術の有用性検証の準備をするにあたり、本研究開始後に報告されたCT線量低減技術につきレビューを行い、検証時に使用する撮像法選択のための検討を加えた。肺病変の三次元的診断の必要性の評価のため、臨床データベースから診断(悪性、良性)が確定できると思われる肺結節を検索した。これらの肺結節についてThin slice(0.5mm厚)よりなる三次元データが得られた。結節の形状特徴として診断に一般に用いられている所見項目に対し、画像を三次元的に評価し、各結節の性状(全体形状、輪郭、内部性状など)を数値化して記録した。またこの観察に基づき推定される診断について記録した。これらの所見項目に対し横断像での評価をおこない、その結果と3次元画像による結節特徴、推定される診断の結果との違いを検討する。これにより診断における三次元画像の必要性について評価を行う。CT線量低減については、種々のアプローチが存在し、それらを組み合わせて適切に利用することが必要とされる。本研究開始後に報告された、あるいは実用化されたものを含めて文献調査、検討を行い、従来の方法との違い、有用性等に関しまとめて報告した。動態解析による診断的付加価値の検証につき、動態解析が可能なレベルまで線量を低減するための最適化検討を行い、CTにより呼吸運動を撮影するために適切な撮像法(時間、撮像間隔、撮像パラメータ)を設定した。また、肺実質の動態変化や異常を検出するのに適した肺実質構造の変位についての視覚的評価方法、コンピュータ解析を用いた定量化の方法について初期検討を加えた。さらに、肺病変に伴う長期的な肺実質、胸郭の変形を評価するための定量化方法について基礎的な検討を行った。肺癌診療におけるX線CT検査利用の最適化の方法として、線量低減技術および、線量低減技術の応用として、CTによる動態撮影の条件について検討した。動態撮影について呼吸による胸郭、肺の動きを定量化するための検討を行った。動きによるアーチファクトによる要素を避け、被ばく線量を下げるための条件として、被検者に1分間12呼吸での自然呼吸を指示し、低電圧、低電流条件を用い、呼吸同期により連続撮影をすることで自然状態での吸気・呼気の時相を含んだ撮影ができていることが確認できた。視覚的評価では、冠状断において、肺内の血管の動きを追跡しうる画質が確保できることが確認できた。より客観的な動態評価を得るためのひとつの手法として経時的な画像データから、各時相における肺の動きを計算し、肺と胸膜の動きを視覚化する方法を検討した。胸部低線量CTの標準設定のために、管電流50mAsによる低線量画像を150mAsの画像と比較し、胸部CT検査で評価対象となる代表的な異常所見の有無、肺結節評価について診断結果に差がないことが確認できた。胸部病変一般について、高頻度に認められる肺野の異常所見6項目、縦隔の所見7項目を検討した。評価対象の医師の所見と、基準とした標準線量画像の所見との乖離を全ての項目、患者について計算し、その違いに差があるかどうかを検討した。異常の種類、肺内の部位ごとの検討で、標準線量画像と低線量画像に有意差がないことが示された。

肺結節の性状については、標準線量画像、低線量画像の間で、肺結節の良悪性の判断に読影者内で有意差がないことが示された。低線量画像の臨床評価において、従来標準とされていた線量との直接比較をする代わりに、低線量画像の画像との比較を行うことで充分であることが示唆され、今後、低線量技術の診断能評価が容易になるとともに、各技術同士の相対的優劣が判断しやすくなることが期待される。肺癌診断、治療計画におけるCT新規技術の有用性、有効な使用法について、動態解析、線量低減法の面から検討した。逐次近似画像再構成を応用した線量低減法を使用し、CTを用いた動態撮影により肺実質の構造の動きおよびその胸壁に対する相対的挙動の画像化方法を確立した。低線量画像が標準的線量画像に画質面で劣らないことを胸部CTにおける代表的評価項目について示し、新規の線量低減法評価において低線量画像を比較対象にすることの妥当性を示した。三次元的データ収集による肺結節の診断的付加価値の検証に必要な症例データの集積は予定通り進行した。動態評価のためのデータ収集は実施に向けての初期的検討段階を終了して応用の段階にある。次年度以降に予定していたX線線量低減技術の有用性検証について予備的な検討がなされた。放射線診断学26年度までに収集された胸部CTの三次元的データに対し、横断像で評価した結節特徴と横断像での評価により推定された診断結果の記録を行う。診断結果を三次元的観察による評価から推定された診断結果と比較する。結節特徴の各項目についても横断像での評価における結果を三次元画像の評価による結節特徴と比較する。これにより診断における三次元画像の有用性の有無について検討を行う。胸部検査一般における低線量CTの可能性については、低線量CTでの異常所見の検出能、診断について、低線量CTの診断結果と従来の胸部CTとの診断結果との対比から明らかにする。低線量CTを用いた動態解析による診断能向上については、26年度までの検討結果に基づき、経時的な形態の変化、肺の運動の動的な評価ができるデータの収集を行う。このデータを利用して肺の運動解析を低線量CTを用いて行う手法の確立を目指す。また、CTを用いた肺病変に伴う経時的な肺実質や胸郭の形態変化についての評価方法確立と、病態解析への応用を進める。三次元的データ収集による肺結節の診断的付加価値の検証に必要な症例データの集積は予定以上に進展している。動態評価のためのデータ収集は基礎的検討の段階にある。各研究項目の進行度を鑑み、解析に必要な設備取得の一部(データ処理用ワークステーション、ディスプレイ)などを平成27年度に行うことにより、より有効に助成金使用ができると判断したため、次年度使用額を上記のとおりとした。三次元的データ収集による肺結節の診断的付加価値検証のための肺結節データは次年度に蓄積が継続される。横断像による結節結節特徴の記録をおこない、三次元的観察による診断が診断能向上に寄与するかどうかの検討を行う。動態解析による診断能向上については、経時的な形態の変化、すなわち組織の動きを解析するための手法検討も併せて行なう。これは、肺の動きに影響を及ぼしうる肺合併症を有する肺癌患者や肺癌再手術症例などの治療選択に寄与する可能性があり、これを低線量で実現するための具体的手法とその臨床的価値を検討する。
CBCLを用いた児童の心理学的問題の診断と評価に関する研究

本研究の目的は,Child Behavior Check List(CBCL)の日本版を作成し,その標準データを収集するとともに,自閉性障害他の障害や心理学的問題を示す幼児・児童を対象としてCBCLを実施し,その症状毎のCBCLプロフィールを健常児と比較検討することによってCBCLの臨床的検討を行うことであった.対象者は218歳の健常幼児,児童,青年568名(健常群),および,何らかの障害を持つ418歳の幼児,児童,青年133名(臨床群)であった.なお,臨床群の内訳は,自閉性障害21名,精神遅滞51名,注意欠損他動障害21名,学習障害8名,言語発達遅滞19名,その他の障害13名であった.また,小学校1年生児童78名を対象として,小学校入学後の学校適応とCBCLに対する回答の関連性が調査された.CBCLを翻訳,バックトランスレーションと日米の心理学者,および児童精神医学者による訳語の検討の後CBCL日本語版が作成された.保護者,または施設等の指導者に記入を求めた.本研究の結果,(1)健常群においてCBCL問題行動尺度を因子分析することによって幼児,児童,青年の示す問題行動の構造を明らかにする,(2)健常群,臨床群の両群において問題行動別の頻度を比較することにいよって,臨床群の特徴を明らかにする.(3)臨床群において障害別にCBCLプロフィールの特徴を比較することによって,CBCLによる診断可能性を検討する,および,(4)日米におけるCBCL問題行動尺度の因子分析結果を比較することによってわが国における幼児,児童,青年の問題行動の特徴を明らかにするという4つの観点から分析・考察された.本研究の目的は,Child Behavior Check List(CBCL)の日本版を作成し,その標準データを収集するとともに,自閉性障害他の障害や心理学的問題を示す幼児・児童を対象としてCBCLを実施し,その症状毎のCBCLプロフィールを健常児と比較検討することによってCBCLの臨床的検討を行うことであった.対象者は218歳の健常幼児,児童,青年568名(健常群),および,何らかの障害を持つ418歳の幼児,児童,青年133名(臨床群)であった.なお,臨床群の内訳は,自閉性障害21名,精神遅滞51名,注意欠損他動障害21名,学習障害8名,言語発達遅滞19名,その他の障害13名であった.また,小学校1年生児童78名を対象として,小学校入学後の学校適応とCBCLに対する回答の関連性が調査された.CBCLを翻訳,バックトランスレーションと日米の心理学者,および児童精神医学者による訳語の検討の後CBCL日本語版が作成された.保護者,または施設等の指導者に記入を求めた.本研究の結果,(1)健常群においてCBCL問題行動尺度を因子分析することによって幼児,児童,青年の示す問題行動の構造を明らかにする,(2)健常群,臨床群の両群において問題行動別の頻度を比較することにいよって,臨床群の特徴を明らかにする.(3)臨床群において障害別にCBCLプロフィールの特徴を比較することによって,CBCLによる診断可能性を検討する,および,(4)日米におけるCBCL問題行動尺度の因子分析結果を比較することによってわが国における幼児,児童,青年の問題行動の特徴を明らかにするという4つの観点から分析・考察された.
MEMS技術を用いたプラスチック基板への埋め込み・配線技術の確立

1.プラスチック基板としては厚さ0.5mmのポリカーボネート基板を用い,その内部にディスプレイドライバとなる20mm×2mmのLSIチップの埋め込みプロセスを確立した.その埋め込んだ後のチップと基板表面は非常に平坦で後の金属配線には全く支障のないレベルにあることを確かめ,チップを埋め込み平坦化したプラスチック基板上に絶縁膜となるプラスチック層をスピンコーティングで成膜できる技術を確立した.2.プラスチック基板(ポリカーボネート)を用い,新たに購入したリアクティブイオンエッチング装置(サムコインターナショナル研究所製)を使用してチップ埋め込み用の穴を形成した.プラスチック基板へのドライエッチングによる穴あけは今まであまり多くの実験が行われておらず,深さ精度,壁面の垂直性,底面の平坦性などをガス種,パワー,電極間距離などを変えて最適化を行った.3.確立した埋め込みチッププロセスにITO作製技術を確立した.プラスチック基板を用いるためITOの蒸着温度の低減化が問題であったが,さらに,溶液エッチングの際に起きる基板の白濁化が問題になることがわかった.これの対処法としてエッチング溶媒とエッチング温度の最適化を行なった.4.作製した埋め込み様カスタムLSIの評価を行なった.このLSIは電子ペーパー駆動用であり,主な仕様は160端子出力,110V耐圧,3電位出力(グランドレベルも含む),中間電位ソース/シンク機能付き,カラム/ロウドライバー併用可である.5.先に述べたドライバーLSIを実際の電子ペーパーパネルと接続し,その表示特性を評価するために,電源,マイクロコンピューター,ラッチIC,コネクターを載せた評価用プリント基板を作製した.我々の作製したカスタムドライバーは単極三電位を出力できるために今までに無い駆動方法が可能となり,その駆動法による表示特性の向上が確認された.1.プラスチック基板としては厚さ0.5mmのポリカーボネート基板を用い,その内部にディスプレイドライバとなる20mm×2mmのLSIチップの埋め込みプロセスを確立した.その埋め込んだ後のチップと基板表面は非常に平坦で後の金属配線には全く支障のないレベルにあることを確かめ,チップを埋め込み平坦化したプラスチック基板上に絶縁膜となるプラスチック層をスピンコーティングで成膜できる技術を確立した.2.プラスチック基板(ポリカーボネート)を用い,新たに購入したリアクティブイオンエッチング装置(サムコインターナショナル研究所製)を使用してチップ埋め込み用の穴を形成した.プラスチック基板へのドライエッチングによる穴あけは今まであまり多くの実験が行われておらず,深さ精度,壁面の垂直性,底面の平坦性などをガス種,パワー,電極間距離などを変えて最適化を行った.3.確立した埋め込みチッププロセスにITO作製技術を確立した.プラスチック基板を用いるためITOの蒸着温度の低減化が問題であったが,さらに,溶液エッチングの際に起きる基板の白濁化が問題になることがわかった.これの対処法としてエッチング溶媒とエッチング温度の最適化を行なった.4.作製した埋め込み様カスタムLSIの評価を行なった.このLSIは電子ペーパー駆動用であり,主な仕様は160端子出力,110V耐圧,3電位出力(グランドレベルも含む),中間電位ソース/シンク機能付き,カラム/ロウドライバー併用可である.5.先に述べたドライバーLSIを実際の電子ペーパーパネルと接続し,その表示特性を評価するために,電源,マイクロコンピューター,ラッチIC,コネクターを載せた評価用プリント基板を作製した.我々の作製したカスタムドライバーは単極三電位を出力できるために今までに無い駆動方法が可能となり,その駆動法による表示特性の向上が確認された.我々は本年度、LISチップを精度良く基板に埋め込み,その後の表面が凹凸なく,微細配線が可能となるLSIチップ埋め込みプロセスの確立を行った.以下にそれによって得られた知見を示す.1.プラスチック基板へのLSIチップの埋め込みプラスチック基板としては厚さ0.5mmのポリカーボネート基板を用い、その内部にディスプレイドライバーとなる20mm×2mmのLSIチップの埋め込みプロセスを確立した.その埋め込んだ後のチップと基板表面は非常に平坦で後の金属配線には全く支障のないレベルにあることを確かめた.2.絶縁膜形成チップを埋め込み平坦化したプラスチック基板上に絶縁膜となるプラスチック層をスピンコーティングで成膜できる技術を確立した.3.プラスチック基板へのリアクティブイオンエッチングによる穴あけプラスチック基板(ポリカーボネート)を用い、新たに購入したリアクティブイオンエッチング装置(サムコインターナショナル研究所製)を使用してチップ埋め込み用の穴を形成した.プラスチック基板へのドライエッチングによる穴あけは今まであまり多くの実験が行われておらず,深さ精度,壁面の垂直性,底面の平坦性などをガス種,パワー,電極間距離などを変えて最適化を行った.3.金属成膜とパターニング平坦化しコンタクトホールを形成した基板にITO、Cr、Alなどの金属をスパッタ法で形成し、その後、10umのライン・アンド・スペースでパターニングすることが出来た.現在、我々が考えているチップ埋め込み方法および配線方法において通常のCOG(Chip on Glass)と違うところと、この実装方法の特徴は次の様になる.(a)チップは基板内に埋め込まれ、基板全表面が平坦となる.これにより基板全表面がディスプレイやタッチパネルなどに使用でき,とてもスマートなデバイスが実現可能である.(b)電極が面積は小さくなり、1チップの端子数が増える.COGではどうしても接続のため電極面積が大きくなり,ディスプレイドライバーLSIなどではチップ面積をこの電極面積が決めていた.

1チップあたりの端子数が増えるということは数を減らせドライバーLSIの面積が小さくなるということで二重のコストメリットが生まれる.これら特徴を最大限に生かすためにはLISチップを精度良く基板に埋め込み,その後の表面が凹凸なく,微細配線が可能とすることが重要である.そのために我々の研究室で初年度に達成したチップ埋め込み技術を更にためると共に、実際に埋め込んで駆動させるICチップの設計を主におこなった。1.埋め込み用カスタムLSIチップの作製埋め込みに使うカスタムLSIを設計・作製した.埋め込みチップの特性を発揮するためには電極面積が小さくし,1チップの出力電極数をできるだけ多くした.電極ピッチは埋め込みチップにおいて10um程度まで縮小可能である.したがって1cmのチップでは一列配置した場合,計算では出力端子数は1000程度まで増やすことが可能である.また,2列,3列で配置できるのならば,出力端子数は2000以上になり,1チップでXGAのディスプレイを駆動可能となる.しかしながら,今回設計しようとするドライバーは,我々が並行して研究を行っている電気泳動ディスプレイ駆動用ドライバーとするため,高耐圧プロセスでのLSIを使用する.このため,回路のデザインルールでそのピッチが制限され、160端子約160umピッチとなった.2.埋め込みチップへの高密度配線昨年度確立した埋め込みチップ・プロセスにITO作製技術を確立した。プラスチック基板を用いるためITOの蒸着温度の低減化が問題であったが、さらに、溶液エッチングの際に起きる基板の白濁化が問題になることがわかった.これの対処法としてエッチング溶媒とエッチング温度の最適化を行なった。我々は今年度の主に昨年度作製した埋め込み用電子ペーパードライバーLSIを評価をおこなった。研究期間において得られた研究実績は次のようになる。1.埋め込み用カスタムLSIチップの評価前年度に作製した埋め込み様カスタムLSIの評価を行なった。このLSIは電子ペーパー駆動用であり、主な仕様は160端子出力、110V耐圧、3電位出力(グランドレベルも含む)、中間電位ソース/シンク機能付き、カラム/ロウドライバー併用可である。まず、このLSIの単体での評価を行うためにスタッドバンプ処理を行った後、専用のフレキシブル・プラスチック。フィルム(FPC)上にフリップチップ実装を行い、コネクターを取り付けた入力プリント基板に接続した。入力信号の生成ははマイクロコンピューター(Atmel社製)を用いた。その結果、各端子から出力される波形を負荷を与えた状態でオシロスコープでモニターし、その負荷を変えながら立ち上がり、立ち下がり、論理などが設計どおり出力していることを確認した。2.電子ペーパー表示特性評価先に述べたドライバーLSIを実際の電子ペーパーパネルと接続し、その表示特性を評価するために、電源、マイクロコンピューター、ラッチIC、コネクターを載せた評価用プリント基板を作製した。
現代ドイツ映画を巡る「難民としてのドイツ人」：政治メディア論的研究

本研究は,21世紀におけるドイツ映画賞(作品賞)受賞作に関し,戦後ドイツの政治的アイデンティティである「難民としてのドイツ人」という視点から,現代ドイツ映画の通史を作成することを目指す。本年度は昨年度から引き継いだテーマである「東ドイツ」および当初から予定に挙げていた「移民」の2テーマに取り組んだ。テーマ「東ドイツ」に関しては,映画《グッバイ、レーニン》に関する論文を執筆し公表した。前年度までの研究では,父親と祖国を巡るイメージ表現という観点から分析・考察を行い,政治的な「難民」を受け入れるという物語設定が新しいホームに気づくためのモチーフになっていたことなどが分かっていた。ところが,さらに研究を進めた結果,この映画には疑似的な聖書物語が通底していることが分かった。映画は旧約聖書における「楽園追放」のイメージから始まり,「キリストの磔刑」等を経て,「マリアの昇天」で終わる。よって映画の根底には楽園を追放された宗教的な「難民」としてのイメージが流れていると言える。テーマ「移民」に関しては,作品賞受賞作の中から「移民」を直接的・間接的に取り扱っている作品をピックアップし,その通史的つながりを意識しながら分析・考察を行った。2010年代の主流は,移民やドイツ国民がホームを失う物語,ホームを新たに創る物語であることが分かっていたが,近年の作品である《ヴィクトリア》や《女は二度決断する》などにもその傾向が顕著にあてはることが確認できた。また政府要人の演説に関しても随時,抄訳,分析,考察を進めている。特に2010年のクリスチャン・ヴルフ大統領による「ドイツ統一の日」のための記念演説(20周年)では,ドイツに住まうすべての人々が広い意味において移民であるという視点が提出され,大きな意義を持つことが分かった。なお抄訳を冊子化して学部授業に使用するための準備を進めているところである。21世紀におけるドイツ映画賞(作品賞)受賞作に関し,「難民としてのドイツ人」という視点から,現代ドイツ映画の通史を作成することを目指す上で,本年度の主なテーマは「移民」であり,その具体的な課題は次の5点であった。1)ドイツ映画賞(作品賞)受賞作50数本のうち,直接的・間接的に「移民」をテーマとした作品を洗い出す。2)それら諸作品に関し,「難民としてのドイツ人」というセルフ・イメージがどのように描かれているかを検証する。3)ドイツ要人の公式演説を分析して,現代の難民事情との連関を考察する。4)作品本体で表象される「難民としてのドイツ人」というセルフ・イメージと「公式演説」における政治的メッセージとを照合する。5)作品の政治的立ち位置が現代の難民事情に対して如何なる形で関与し得る可能性があるかを探る。以上の課題において,1)における作品の洗い出しについては概ね終了し,現在は,2)におけるセルフ・イメージの検証について取り組んでいるところである。「移民」をテーマとした近年の作品である《ヴィクトリア》や《女は二度決断する》などについて内容を検討したところ,当初の目論み通り,「ホームを失う」物語として2010年代の傾向が続いていることを確認した。3)におけるドイツ公式演説については,「第二次世界大戦終結」「ドイツ統一の日」「ヒトラー暗殺未遂7月20日事件」「白バラ事件」などをテーマとした公式演説の抄訳,分析,考察を試みた。この抄訳は冊子化して学部授業の副教材に使用する予定であり,現在もそうした一連の作業を継続中である。本年度もっとも力を注いだのはこの課題であり,全体の進捗として「やや遅れている」としたのは,予定よりもこの課題量を増量したからである。また前年度から引き継いだ《グッバイ、レーニン》についても,新たに宗教的視点からの分析を追加したことが進捗の遅れの一因となった。21世紀におけるドイツ映画賞(作品賞)受賞作のテーマは,主に「東ドイツ」「移民」「ナチ」「社会病理」の4テーマに類別することができるが,次年度は,前年度に引き続いて「移民」をテーマとした映画,それから「ナチ」をテーマとした映画に照準を合わせ,適宜,資料収集を行いながら,次のような手順で研究を進める。1)50数本あるドイツ映画賞(作品賞)受賞作の中から,直接的・間接的に「移民」と「ナチ」をテーマとした作品を洗い出す。2)「移民」「ナチ」関連の諸作品に関し,それらの中で「難民としてのドイツ人」というセルフ・イメージがどのように描かれているかを検証する。その際,特に次の点を明らかにする。「難民」のイメージが政治的か宗教的か?「良きドイツ国民」が描かれているか「凡俗なドイツ国民」が描かれているか?「ホームに帰る」「ホームに気づく」物語か「ホームを失う」「ホームを創る」物語か?以上の研究成果の進捗状況を見極めつつ,加えて次の研究を適宜進める。3)歴代のドイツ政府の要人が行った公式演説を分析,考察し,「難民」というドイツのセルフ・イメージの来歴を探る。そして,その抄訳を学部授業で使うための副教材として冊子化する。4)作品本体で表象される「難民としてのドイツ人」というセルフ・イメージと「公式演説」における政治的メッセージとを照合し,作品の政治メディアとしての立ち位置を洗い出す。5)作品本体が政治メディアの一種として提示する価値観が,現実の政治的文脈の中で,現代の難民事情に対して如何なる形で関与し得る可能性があるかを探る。以上の課題に関し,前年度から引き継いだ「移民」をテーマとする作品についての研究およびドイツ要人の公式演説に関しての抄訳の冊子化を優先的に進める。

本研究は前研究の課題を引き継ぎ、それを発展させるものである。前研究では2000年代以降のドイツ映画賞作品賞受賞作のうち、「ナチ」を題材とした作品を対象にしていた。しかし、「ナチ」という主題は、「東ドイツ」「移民」「社会病理」といった他の主要テーマと複合的な形で取り扱われている。そのため、新たに「難民としてのドイツ人」という上位テーマを設定し、研究を行うことになった。初年度の中心テーマは「東ドイツ」である。まずドイツ映画賞作品賞を受賞した作品のうち、「東ドイツ」というテーマと直接的・間接的に関わる作品を洗い出した。その中で特に注目したのが、直近の受賞作であった《アイヒマンを追え!ナチスがもっとも畏れた男(Der Staat gegen Fritz Bauer)》(2016受賞)と2000年代初頭の受賞作《グッバイ、レーニン!(Good Bye, Lenin! )》(2003年受賞)の2作品である。《アイヒマンを追え!》の中では、1950年代から60年代にかけて行われたナチを巡る戦後処理に関し、それが東西冷戦下において東ドイツとの関わりがあったことが描かれている。また近年フリッツ・バウアーやアイヒマンを題材とする同種の映画が複数公開された。こうした関心から本年度は作品を分析する前提として、映画が題材とする時代の思想的背景の分析に力を注いだ。具体的には、「集団の罪」およびヒトラー暗殺未遂事件を巡る政治家や思想家の言説について考察を行い、2本の論文にまとめ発表した。《グッバイ、レーニン!》については、父親と祖国を巡るイメージの問題について作品分析を行った。またそれに関連して東西ドイツの再統一を記念する政治家の演説を分析した。これについては改めて論文にまとめる予定である。さらに「難民」というセルフ・イメージの来歴に関し、チェコにおけるドイツ人追放問題について理解を深めた。本年度の主要課題は、2000年代以降のドイツ映画賞作品賞受賞作のうち、「東ドイツ」というテーマと直接的・間接的に関わる作品に関して、その時代的思想的背景も含め、「難民」というドイツ人の政治的なセルフ・イメージという観点から、分析・考察を行うことであった。その作業は主として次の2点に整理することができる。1)ナチを巡るドイツの戦後思想に関して、1940年代から70年代までの状況を東西冷戦下、対東ドイツとの関係を踏まえて考察した。映画《アイヒマンを追え!》は、1950年代から60年代の西ドイツを舞台とし、検事フリッツ・バウアーやナチ裁判を題材とした作品であるが、東ドイツとの関係が重要なモチーフとなっている。そこで、本研究では、ドイツにおけるその当時の戦後思想に関して、東西冷戦下の東ドイツとの関係を踏まえ、政治家や思想家の演説や著作を分析した。特に「集団の罪」と「7月20日事件」というヒトラー暗殺未遂事件を巡る政治演説や著作に関して分析を行った。その結果、「ドイツ的ディアスポラ」、「集団の罪」を巡るドイツ人とユダヤ人の重ね合わせ、「集団の恥」に対するドイツ人の名誉回復と欧州アイデンティティなど、「難民」という戦後ドイツのセルフ・イメージの来歴と関係する発想について理解を深めることができた。
サイトカインmRNAマッピングによる移植拒絶反応モニタリングの開発と治療への応用

患者末梢血全血よりRNAをAGPC法にて抽出し、各種サイトカインDNA配列より設定した約20bpのプライマーをDNAを合成機で作製し、RT-PCR法を行うことによりサイトカイン活性化を迅速且つ容易に測定する系を開発した。この測定系を用いて、種々の病態下におけるサイトカインmRNAのマッピングを行った。即ち、腎移植患者や腎移植後の慢性拒絶反応患者について検討した結果では、正常人や術前患者ではいずれのサイトカインmRNAも活性化されていないにもかかわらず、腎移植患者ではIL-1,IL-2R,TNFのmRNAが検出された。さらに、サイトカインmRNAマッピングにより移植拒絶反応のモニタリングが可能か否かを明らかにする目的で、腎移植以外の病態で末梢血中のサイトカインmRNAを検討した。対象としては、慶應義塾大学外科に入院し胃全摘や胆嚢摘出術などの手術を行った12症例と重症感染症10症例である。これらの患者から末梢血を採取し、IL-1,IL-2,IL-2R,TNFのmRNAをRT-PCR法にて測定したところ、術前にはいずれのサイトカインmRNAも検出されなかったが、術後1日目にはIL-1,TNFのmRNAが検出されたが、術後3日目には再びいずれのサイトカインmRNAも検出されなくなった。重症感染症症例でも、IL-1,TNFのmRNAは検出されたが、術後患者と同じくIL-2,IL-2RのmRNAは検出されなかった。これらの事は、末梢血中のIL-2RmRNAは腎移植患者もしくは腎移植後の慢性拒絶患者にのみ特異的に発現することを示しており、末梢血中のサイトカインmRNAマッピング行うことにより拒絶反応のモニタリングが行える可能性を示唆している。今後は、IL-2RmRNAの定量化を試み,IL-2RmRNA発現量と拒絶反応の重症度が一致するかどうかなどを検討して行きたいと考えている。サイトカイン活性化を簡単にかつ迅速の判定する方法が開発されれば、臓器移植時の免疫学的モニタリングをはじめとして多くの病態解明に貢献しうる。そこで、RT-PCR法を用いて末梢血中でのサイトカインmRNA発現を検出する方法を開発し、腎移植患者における変動を検討した。患者末梢血3mlよりAGPC法に準じRNA抽出を行った。既に報告されている、IL-1,TNF,IL-2,IL-2R DNA配列の一定領域を挟むやく20bpのプライマーをDNA合成機で作製し、抽出したRNAよりrandom hexamerを用いてcDNAを合成した。PCR産物を電気泳動し、サイトカインmRNA発現を検討した。陽性コントロールとしては、IL-1,TNFについては全血を10μg/ml LPS(lipopolysaccharide)で2時間刺激したものを、IL-2,IL-2Rについてはヒトリンパ球を10μg/ml PHAで24時間刺激したものを用いた。また、OK-432にて刺激された患者から得られた全血およぴFicoll-Hypaqueで単離したリンパ球についてIL-1,TNF mRNA発現を比較した。その結果、末梢血全血3mlから各種サイトカインmRNAを検討するのに充分なRNA量が得られた。全血から得られたRNAでIL-1,TNF mRNAを測定した結果は、単離リンパ球から得られた結果と完全に一致していた。腎移植術および腎移植後の拒絶反応症例について、末梢血全血3mlを採取しIL-1,IL

-2,IL-2R,TNFのmRNAを検討すると、術前にはいずれのサイトカインも活性化されていなかったが、3例の腎移植術後および2例の拒絶反応症例ではIL-1,IL-2,IL-2R,TNFいずれのmRNAも発現していた。今後は各種病態下の動態について検討し、移植後の免疫学的モニタリングに有用であることを明らかにしたいと考えている。昨年度は、種々のサイトカインmRNAを直接末梢血より測定する系を開発し、腎移植患者や腎移植後の慢性拒絶反応患者について検討した結果、正常人や術前患者ではいずれのサイトカインmRNAも活性化されていないにもかかわらず、これらの患者ではIL-1.IL-2R,TNFのmRNAが検出されることを報告した。今年度は、サイトカインmRNAマッピングにより移植拒絶反応のモニタリングが可能が否かを明らかにする目的で、腎移植以外の病態で末梢血中のサイトカインmRNAを検討した。対象としては、慶應義塾大学外科に入院し胃全摘や胆嚢摘出術などの手術を行った12症例と重症感染症10症例である。これらの患者から末梢血を採取し、IL-1,IL-2,IL-2R,TNFのmRNAをRT-PCR法にて測定したところ、術前にはいずれのサイトカインmRNAも検出されなかったが、術後1日目にはIL-1,TNFのmRNAが検出されたが、術後3日目には再びいずれのサイトカインmRNAも検出されなくなった。重症感染症症例でもIL-1,TNFのmRNAは検出されたが、術後患者と同じくIL-2,IL-2RのmRNAは検出されなかった。これらの事は、末梢血中のIL-2RmRNAは腎移植患者もしくは腎移植後の慢性拒絶患者にのみ特異的に発現することを示しており、末梢血中のサイトカインmRNAマッピング行うことにより拒絶反応のモニタリングが行える可能性を示唆している。今後は、IL-2RmRNAの定量化を試み,IL-2RmRNA発現量と拒絶反応の重症度が一致するかどうかなどを検討して行きたいと考えている。
松果体細胞の神経細胞への分化とグルタミン酸の入出力機構

哺乳類の概日リズムの中枢は「視交叉上核」と呼ばれる神経細胞集団にあり、この活動シグナルが交感神経を通じて松果体に伝えられる。松果体はこのシグナルをメラトニンという液性情報に変えて血中に放出する。放出されたメラトニンは受容体を介して時間情報を細胞に伝達する。従って、松果体は時間情報の変換器であり、メラトニンの合成・分泌機構は概日リズムを理解するために極めて重要な課題である。我々は、(1)松果体細胞がグルタミン酸作動性の神経内分泌細胞であること、(2)松果体細胞はグルタミン酸をメラトニン合成の負の制御因子として用いていること、を明らかにしてきた。ホルモンの合成・分泌が神経と類似の機構で制御されていることは全く新しい概念であり、その制御機構の解明は、松果体の内分泌制御のみならず、細胞間情報伝達における普遍性のある有用な知見を提供するものと考えられる。以上の観点に立ち、本年度は以下の項目の研究を行い成果を得た。(1)マイクロベジクルの構成蛋白につき、SV2AではなくSV2Bが存在することを見いだした。(2)マイクロベジクル内にはLグルタミン酸以外にLアスパラギン酸が含まれており、エキソサイトーシスされる。このアミノ酸も強力なメラトニン合成阻害効果を示す。(3)一方、松果体細胞の細胞質にはDアスパラギン酸が高濃度含まれており、エキサイトーシスとは別経路で細胞外に放出され、メラトニン合成を強く阻害する。この阻害機構も解明した。これは哺乳類においてDアスパラギン酸の生理作用とその機構がわかった初めての例である。(4)エキサイトーシスされたグルタミン酸やアスパラギン酸は急速に再吸収される。この反応はNa^+-dependent glutamatetransporter(GLT-1 type)が司っている。(5)メラトニン合成を抑制する受容体を特定し、その細胞内シグナル伝達系路を決定した。
貯水池の対流混合機構に関する研究

1.永瀬ダム湖における観測結果:(1)表面に表れる対流セルの大きさは円形は少なく,楕円形や,温水塊としか表現できないような不定型が多い。(2)対流セルの大きさは等価直径(同じ大きさの円形に換算したもの)が15cm程度のものから8090cmのものまである。(3)対流セルの発生・消滅の1サイクルは,ほぼ一定の温度分布の水面上に小さな対流セルが一様に分布発生し,これらがしだいに大きな対流セルに集合発達してゆく。次いで,大きなセルがしだいに小さなセルに分解し,再び一定温度分布に近ずく。1サイクルの時間は520分程度と大きな幅がある。2.水槽実験:直径20cmの透明ポリエステル製水槽に130cmの深さに水を入れて使用した。(1)全水深において幅11.5cm程度の帯状の対流セルが並ぶが,その形状と並び方は一定でない。(2)(1)の他に等価直径7mm程度の多数の対流セルが成長して等価直径50mm程度の対流セルになった。(3)湧昇流が突然噴き上がりまた減衰する現象が見られた。(4)下面から加熱しても上面から冷却しても同じような熱映像が得られた。(5)水温センサーを水深1cm間隔で10本並べて対流現象を測定しようとしたが,センサーの精度のためか有意なデータが得られなかった。3.鉛直2次元対流の数値解析:Navier-Stokes方程式,連続式及びエネルギー方程式を差分化し,Rayleigh数100010^6の範囲で,縦横比1:10の薄い平板間に水を満たし下面から加熱した場合について定常対流を計算した。Ra=1000程度で対流が発生,Ra=5000(12セル)で規則的対流。Raがさらに大きくなるにつれて対流は不規則になり,Ra=10^5(16セル)付近から乱流に似た状態を示した。これらの計算は平板に挟まれた部分に対するものであるが,今後は境界条件を変え,3次元の場合まで拡張するべく検討中である。
分泌型マイクロＲＮＡは骨格筋可塑性のバイオマーカーとして有効か

本研究は、循環血液中に存在する分泌型マイクロRNAが骨格筋可塑性のバイオマーカーとして有効か検討することを目的とした。骨格筋量変化、骨格筋萎縮および萎縮筋の再成長に伴い筋肉中はもちろん血漿中でも特徴的な変化を示すmiRNAが86種確認された。これらのmiRNAが骨格筋可塑性発現のバイオマーカーの第1候補として考えられた。今後、miRNAの定量評価ならびに培養細胞を用いた実験系による骨格筋可塑性発現時に分泌されるmiRNAを特定することで、運動に対する骨格筋の応答のバイオマーカーが確立できるものと考えられた。循環血液中に存在する分泌型microRNA(miRNA)が骨格筋の可塑性の指標となるか検討することを目的として、2年計画で実施する。初年度である本年度は、マウスヒラメ筋廃用性萎縮モデルを用いて、ヒラメ筋の萎縮とその後の再荷重による再成長に伴う血漿中のmiRNAをマイクロアレイにて網羅的に解析した。その結果、筋萎縮に伴い2倍以上増加したmiRNAは105種、2分の1未満に低下したmiRNAは38種であった。逆に、対象群には認められず筋萎縮時にのみ認められたmiRNAは75種、その後4週間継続した発現が認められたものは22種であった。対照群に発現が認められるのにもかかわらず筋萎縮時に消失したmiRNAは9種認められた。萎縮後の再荷重2週目にのみ発現が認められたmiRNAは7種、逆に再荷重2週目にのみ消失したmiRNAは37種類であった。また、萎縮直後ならびに再荷重2週目にのみ発現が認められたmiRNAは18種であった。一方、ヒラメ筋におけるmiRNAで、対象群では認められないが、萎縮時にのみ認められるmiRNAは25種、逆に対照群に認められるものの萎縮時には確認できないものは64種、その内で萎縮直後にのみ発現が認められないものは19種、それぞれ認められた。。また、萎縮直後と再荷重2週目にのみ認められるmiRNAは21種、再荷重2週目にのみ消失するmiRNAは5種観察された。こうしたヒラメ筋の量的変化に伴い血漿中と筋肉中で共に特徴的な変化を示すmiRNAがバイオマーカー候補が確認された。今後、miRNA発現量の定量評価ならびにマウス筋芽細胞C2C12を用いた骨格筋可塑性に特異的な分泌型miRNAを特定し、運動に対する骨格筋応答のバイオマーカーの確立を目指すための基礎資料が得られた。本研究では、運動に対する生体応答のバイオマーカーの確立を目指す基礎的研究として、運動刺激により骨格筋細胞から分泌される分泌型microRNA(miRNA)が骨格筋の可塑性の指標となるか検討することを目的として、2年計画で実施する。。今後、miRNA発現量の定量評価ならびにマウス筋芽細胞(C2C12)を用いた骨格筋可塑性に特異的な分泌型miRNAを特定し、運動に対する骨格筋応答のバイオマーカーの確立を目指す。本研究は2年計画で実施され、平成24年度で最初の1年間の研究が終了した。これまで、骨格筋可塑性のバイオマーカーの候補を探索するために、骨格筋の量的変化に伴う血漿中のマイクロRNA(miRNA)量ならびに骨格筋中のmiRNA発現について、両者ともにマイクロアレイを用いて網羅的に検索し、血液中のバイオマーカーとしていくつかの候補を得ることができた。今後、これら候補miRNAが骨格筋細胞から分泌されるかについて培養骨格筋細胞を用いた検討を行う段階となっており、2年間の研究目標の達成は十分可能となっている。

したがって、当初の研究目的はおおむね順調に達成されていると判断している。昨年度の研究により骨格筋可塑性発現のバイオマーカー候補として挙げられたmiRNAの有効性を、培養細胞系を用いて検証する。マウス筋芽細胞(C2C12)を各種条件下で培養し、増殖および分化に伴う筋細胞(筋芽細胞および筋管細胞)内のmiRNAの発現および筋細胞から培地中に分泌されるmiRNAの発現を明らかにする。解析の対象とするmiRNAは昨年度の検討により、萎縮および再荷重による再成長時に血漿中で検出あるいは不検出となったmiRNAとする。以上より、骨格筋可塑性のバイオマーカーとしての骨格筋由来の分泌型miRNAの有効性を明らかにし、今後のスポーツ現場での臨床応用へ向けた研究基盤の確立を目指す。基金の特性に基づき、当該年度の研究費の執行可能範囲内で執行したため、わずかな次年度使用額が生じた(2,180円)。次年度はこの金額を合わせて研究費を執行するが、当初の研究費の使用計画を大きく変更させるような金額ではないものとなっている。予定している主な支出は、細胞培養実験で使用する培地、血清、無血清培養用添加剤、ならびに細胞および培地からmiRNAを抽出する各種キット、そして候補として挙げられたmiRNAを定量するためのreal time RT-PCR関係試薬キットである。また、研究成果を発表するための学会出張旅費も計上する予定である。
受容体刺激で収縮させた単離平滑筋細胞の刺激除去による自然弛緩の解析

収縮した平滑筋は収縮刺激物質が無くなっただけで、弛緩物質がなくまた張力を懸けずとも平滑筋は自然に弛緩する。本研究において我々は、平滑筋の自然弛緩はプロテインキナーゼC(PKC)による燐酸化制御によって調節を受けていることを明らかにした。本研究は、ストレプトリジン-O(SL-O)で高透過性化したモルモット胃底部単離平滑筋細胞を用いることで初めて達成された。我々は、PKC阻害薬や偽其質ペプチドである阻害物質を処理したSL-O高透過性化単離平滑筋細胞は受容体刺激で短縮するが、阻害薬を処理しない場合と異なり短縮刺激を除去しても自然弛緩が起こらないことを見いだした。さらに、この自然弛緩の抑制は、SL-Oで高透過性化した細胞に外からPKCを組み込むと自然弛緩が回復した。すなわち、弛緩の収縮刺激時のPKCによる燐酸化調節がその後の弛緩反応を制御していることを示している。SL-Oで高透過性化した初代培養平滑筋細胞を用いて自然弛緩の条件時のアクチン繊維を観察した。Ca^<2+>とムスカリン受容体刺激もしくはCa^<2+>単独刺激によりアクチン繊維の再構築が生じたが、洗浄による短縮刺激除去で静止時における構造に回復した。PKC阻害薬を処理してもCa^<2+>単独刺激では刺激除去によりアクチン繊維は静止時における構造に戻ったが、Ca^<2+>とムスカリン受容体刺激では、PKC阻害薬を処理すると刺激除去を行ってもアクチン繊維の静止時への回復は起こらなかった。モルモット胃底部平滑筋組織標本において、張力の懸かった状態では、ムスカリン受容体刺激で収縮した筋肉の自然弛緩に対してPKC阻害薬は弛緩を阻害しなかった。以上のことにより、受容体刺激により収縮した平滑筋の自然弛緩は、単にその張力による復帰のみではなく、PKCによる燐酸化制御によって能動的に調節を受けていることが示された。そして、受容体依存性刺激による自然弛緩機構では、収縮性刺激時にPKCがアクチン繊維の再構築を介して自然弛緩の準備をしていると考えられる。我々は、プロテインキナーゼC(PKC)阻害薬を処理した単離平滑筋細胞は受容体刺激で短縮するが、阻害薬を処理しない場合と異なり短縮刺激を除去しても自然弛緩が起こらないことを見いだした。受容体刺激依存性の短縮に特徴的なPKCに依存した自然弛緩の生理的意義とその分子的解析を目的として本研究を開始し、平成7年度では以下の知見を得た。まず、溶血性レンサ球菌の産生する外毒素であるストレプトリジン-O(SL-O)を用いてモルモット胃底部単離平滑筋細胞で高透過性化細胞の確立を行った。このSL-O高透過性化単離平滑筋細胞は、ムスカリン受容体の機能が保持されており、Ca^<2+>

単独刺激依存性のみならずムスカリン受容体刺激依存性に短縮し、収縮刺激を除去すると自然に弛緩した。PKC阻害薬を処理した単離平滑筋細胞は受容体刺激依存性の短縮には影響を及ぼさなかったが、阻害薬を処理しない場合と異なり短縮刺激を除去しても自然弛緩が起こらなかった。一方、Ca^<2+>単独刺激依存性短縮の自然弛緩に対しては影響を及ぼさなかった。同様のことはPKCの偽基質ペプチドである阻害物質を処理した場合にも観察された。さらに、この自然弛緩の抑制は、SL-Oで高透過性化した細胞に外からPKCを組み込むと自然弛緩が回復した。一方、モルモット胃底部平滑筋組織標本において、張力の懸かった状態では、ムスカリン受容体刺激で収縮した筋肉の自然弛緩に対してPKC阻害薬は弛緩を阻害しなかった。これらの知見は、本来受容体刺激により収縮した平滑筋の自然弛緩は、単にその張力による復帰のみではなく、PKCによる燐酸化制御によって調節を受けていることを初めて示唆するものである。収縮した平滑筋は収縮刺激物質が無くなっただけで、弛緩物質がなくまた張力を懸けずとも平滑筋は自然に弛緩する。本研究の平成7年度では、受容体刺激により短縮した単離平滑筋細胞の自然弛緩は、単にその張力による復帰のみではなく、プロテインキナーゼ(PKC)による燐酸化制御によって調節を受けていることを初めて明らかにした。そこで平成8年度では、受容体刺激依存性の短縮に特徴的なPKC依存性の自然弛緩機構の生理的意義を明らかにすることを目的として検討を行った。線維芽細胞や脱分化型(増殖型)平滑筋細胞は、発生する張力は分化した平滑筋に比べて極めて小さいが、受容体刺激に伴って張力を発生することが知られている。そこで、モルモット胃底部より単離した平滑筋細胞を培養することにより脱分化させた細胞を用いて、受容体刺激依存性の短縮に特徴的なPKC依存性の自然弛緩機構の平滑筋の分化依存性との関連性を検討した。培養平滑筋細胞にムスカリン受容体のm3サブタイプを発現させたクローン細胞は、アセチルコリンで受容体を刺激することにより細胞の短縮を引き起こす。その後洗浄して収縮刺激を除去すると、細胞は弛緩することなくさらに短縮した。この結果は、受容体刺激により短縮した単離平滑筋細胞は収縮刺激を除去すると自然弛緩が生じることと対照的である。収縮刺激除去後の短縮は、アセチルコリンの濃度を下げて部分的に短縮が生じる濃度にしても観察されることから、洗浄により除去できなかったアセチルコリンがさらに短縮を引き起こしているとは考えられない。むしろ、平滑筋細胞が脱分化型に移行すると、受容体刺激依存性の短縮に特徴的な自然弛緩機構が働かなくなると考えられた。これらの知見は、受容体刺激依存性の短縮に特徴的な自然弛緩機構は、分化型の平滑筋細胞に備わる機構であることを初めて示唆するものであるとともに、培養平滑筋細胞を用いての今後の検討が、自然弛緩機構の分子的解析に有用であることを示すものである。
抗体遺伝子を用いた神経機能解析法の開発

シナプトタグミン1はシナプス小胞に局在する膜タンパクで、Ca2+依存性の神経伝達物質の放出過程を制御する。また、シナプトタグミン1は神経突起伸長時の成長円錐小胞にも局在する。本研究は今までにカルシウム依存性の神経伝達物質放出に関与するシナプトタグミンの機能ドメインであるC2Aドメインに対する抗体遺伝子を単離ずみで、その細胞内発現により神経突起伸長を抑制出来る事を示していた。しかしこの阻害活性が、シナプトタグミンのC2Aドメインに抗体が結合することによるかを明らかにするためには、C2Aドメインに結合できない変異型抗体遺伝子の単離が必要であった。そこでPCRを用いた突然変異導入法により、シナプトタグミンのC2Aドメインに結合できない変異抗体遺伝子を単離した。シナプトタグミン1/2はカルシウム依存性の神経伝達物質の放出過程を制御する分子であるが、この機能を単離した抗体遺伝子が抑制するかをPC12細胞を用いて検討した。変異型抗体遺伝子と比較して、有為にカルシウム依存性の神経伝達物質の放出過程を阻害することが明かとなった。抗体遺伝子はGFP融合蛋白質として発現が可能であり、また、これら抗体遺伝子を神経細胞特異的であるp35プロモーターを用いて初代培養DRGニューロンに安定に発現させることが可能になった。野生型抗体遺伝子の発現は変異型と比べ有為に神経突起伸長を阻害する事が分かり、これらの抗体遺伝子がシナプトタグミンの機能解析のための強力なツールとなる事が明かとなった。神経突起伸長には細胞膜の膜面積の増大が必要とされる。この膜面積の増大には恒常的な成長円錐小胞の細胞膜への融合が関与するとされており、この過程をシナプトタグミン1/2のC2Aドメインが制御している可能性が考えられる。従って、上記の抗体遺伝子を用いた解析法は機能が既知の分子の新たな機能を探索するうえで非常に有効であると考えられ、今後様々な分子の機能解析に応用されると期待される。本研究ではCa^<2+>依存的な神経伝達物質放出に関与するシナプトタグミン1及びそのアイソフォームの個体レベルでの時間、空間特異的な機能解析のため、抗体遺伝子を用いた新規な神経機能解析法の開発を目的とする。シナプトタグミンファミリーのC2AドメインはCa^<2+>依存的または非依存的にリン脂質やシンタキシンと結合する事が生化学的に明らかになっていることから、これらの分子間相互作用はシナプトタグミンのin vivoにおける機能に重要と考えられている。従って各C2Aドメインに対する抗体はこれらの分子間相互作用を阻害することでシナプトタグミンの機能を抑制出来ることが期待される。既に本研究ではシナプトタグミンのC2Aドメインに結合する抗体遺伝子が神経突起伸長を阻害できることを明らかにしてきた。そこで平成13年度はPCRを用いた突然変異導入法によりシナプトタグミンのC2Aドメインに結合できない変異抗体遺伝子を単離した。また、これら抗体遺伝子を神経細胞特異的であるp35プロモーターを用いて初代培養DRGニューロンに発現させることが可能になった。
海馬神経組織におけるβアミロイド蛋白質による一酸化窒素の誘導と神経細胞毒性

1.海馬スライスにおけるβアミロイド蛋白質毒性の経時的影響について検討海馬スライスを数週間培養し、経時的な組織学的変化について超微細構造を含め光学顕微顕及び電子顕微顕(JEOL 2000EX)を用いて解析した。βアミロイド蛋白質による刺激を加えていない培養22日目の海馬スライスを固定し電子顕微鏡にて観察したところ、神経細胞では細胞質内にリボゾーム、ミトコンドリア、ゴルジ装置を認め、二重の核膜に包まれた核内にはやや肥大した核小体を認めたが明らかな組織学的異常は見られなかった。2.海馬スライスにおけるβアミロイド蛋白質毒性の定量海馬スライスに対するβアミロイド蛋白質の毒性発現を生化学的、組織学的に、特にアポトーシスに焦点をあてアポトーシス関連蛋白質の定量、組織学的検索をIn Site Apoptosis DetectionKitを用いて行った。海馬スライス組織を用い、βアミロイド蛋白質による刺激後、パラフィン固定を行いTACS2による染色を行ったところ、lipopolysaccharide投与にて海馬錐体細胞のアポトーシスが確認され、さらにそれは1-40までのアミノ酸配列を持つ10μM βアミロイド蛋白質による刺激で増強された。3.NO消去剤を用いた、細胞毒性に対する保護作用の検討NO消去剤を用い、βアミロイド蛋白質が持つ、細胞毒性の中和作用について生化学的な解析を行ったがコントロールとの有意差は認められなかった。1.海馬スライスカルチャーを用いAβで刺激することにより発生するNOの定量2.抗iN0S抗体を用いた、免疫組織化学的検討上記と同様に海馬スライス組織を作成しβアミロイド蛋白質による刺激後、パラホルムアルデヒドにより組織固定を行い、一次抗体に市販のラビットポリクローナル抗iNOS抗体を用い蛍光抗体による発色を共焦点レーザー顕微鏡により観察した。神経細胞を特異的に認識する抗ニューロフィラメント抗体との二重染色によりこれまで報告されていたミクログリアに加え神経細胞でもβアミロイド蛋白質によるiNOSの誘導が引き起こされていることが確認された。3.海馬スライスにおけるβアミロイド蛋白質毒性の経時的影響について検討次に誘導されたNOによる神経細胞の影響を測定するため海馬スライス組織を用い、βアミロイド蛋白質による刺激後、培養液中に放出される乳酸脱水素酵素(lactate dehydrogenase, LDH)量を経時的に測定した。その結果放出されたLDHは全LDHの0.1%以下でありコントロールとの有意差は認められなかった。