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中国近代外交史の基礎的研究―19世紀後半期における出使日記の精査を中心として―

さらに駐仏公使館通訳の馬建忠の文集や旅行記、駐独公使の李鳳苞の書簡集や朝鮮の弔問使節の記録など、いくつかのものについて具体的な校合・解析・入力の作業をすすめ、清末時期の出使日記にかかわる全体的な見通しを得ることができた。その成果の一端として、「『奉使朝鮮日記』の研究」と題して、国内外の複数の学会で報告を行い、また論文として発表した。その一方で、研究代表者が従来からとりくんできた外交史プロパーの研究との接続をはかった。川島真と共同で組織する中国近代外交史研究会を開催して、本研究の活動を公開しつつ、ひろく明清史・近代史・外交史研究と関連づける活動を行った。またそうした研究活動の成果として、清仏戦争期の清朝・ヴェトナム関係を考察した「属国と保護のあいだ」と題する研究成果を東洋史研究会大会で報告し、また清末外交の立役者たる李鴻章の役割を再考した「「洋務」・外交・李鴻章」を中国現代史研究会ワークショップで報告した。本年度は昨年度にひきつづき、1870年代末より各国の在外公館に赴任した中国外交官が残した、執務日誌・日記体報告書である出使日記と総称する史料の調査を行う一方、研究報告書の作成に意を注いだ。現存する出使日記を、異本もふくめ、網羅的に収集し、在外使節と出使日記のリストアップ、関連史料の調査収集、それぞれの分析をも並行して行い、これらを文章・一覧表にする作業に入った。昨年度までの成果をふまえて、収集した出使日記の遺漏を補うのみならず、そのほかの文書・書簡、あるいは随行員などが残した日記・記録をもチェックして、最終的なとりまとめをすすめた。その過程で、清末時期の出使日記にかかわる全体的な見通しを論文として執筆すると同時に、大学院生らの研究協力を得て、具体的な校合・解析・入力の作業をすすめ、データベース化にとりくんだ。その成果の内容については、別途に提出する研究成果報告書、およびその概要にくわしいので省略する。ほかの中国近代外交史にかかわる研究会に出席して、本研究の活動を公開しつつ、ひろく明清史・近代史・外交史研究と関連づける活動を行った。そうした研究活動の成果として、清代の外交・貿易関係を考察した「「朝貢」と「互市」と海関」と題する研究成果を国際東方学者会議で報告し、また、関連する著書・論文を刊行した。
カドミウム誘導性発癌における、マトリックスメタロプロテアーゼの役割の解明

カドミウムによる発癌の分子メカニズムについては不明な点が多い。我々は、MAPキナーゼファミリーの一つであるJNKシグナルを欠失させたマウス胚性幹細胞にカドミウム曝露をすることにより、JNKシグナル依存的にMMP9、MMP13 mRNAの発現上昇が起こることを見出した。MMPは癌の転移および血管新生において重要な役割を果たすと考えられており、カドミウムが発癌を促進する遺伝子発現に関与する可能性が考えられた。我々は、in vitroにおいてマウス胚性幹細胞にカドミウム曝露をすることにより、MMP9、MMP13mRNAの発現上昇が起こることを見出した。次にカドミウム曝露によるMMP発現における細胞内シグナル伝達メカニズムを解明するため、ERK、JNK、p38の3つの主要なサブファミリーからなるMAPKの関与について、ノックアウト法を用いて検討した。JNKの活性化因子であるSEK1、MMK7両方を同時に欠失し、JNKシグナルを完全に遮断したES細胞にカドミウムを曝露したところ、MMP9、MMP13両遺伝子の発現誘導が著しく抑えられることを見出した。よって両遺伝子の発現誘導においてJNKシグナルが重要な役割を果たすことが考えられた。以上のようにin vitroにおいてカドミウム曝露によりMMP発現が上昇することを示したが、次にin vivoのカドミウム誘導性発癌においてもMMPの発現上昇が見られるかを調べることを目的に、前段階として既存のマウス腫瘍形成モデルを用いて検討した。B16メラノーマ細胞をマウスに移植し、皮下に腫瘍を形成させた。次に腫瘍よりMMP産生細胞の単離を試みた。腫瘍形成時、腫瘍と共に存在するマクロファージがMMPを産生し、血管新生や転移を促進することで腫瘍細胞の増殖を助ける可能性が近年報告されている。そこで腫瘍に存在するマクロファージが主なMMP産生細胞である可能性を考え、マクロファージのマーカーであるCD11bの抗体を固定化した磁気ビーズを用いて、腫瘍マクロファージを単離した。現在このマクロファージにおけるMMPの発現を検討中である。我々は、まずマウス胚性幹(ES)細胞においてカドミウム曝露をすることにより、MMP9、MMP13 mRNAの発現上昇が起こることを見出した。次にin vivoのカドミウム誘導性発癌においてもMMPの発現上昇が見られるかを調べるため、前段階として既存のマウス腫瘍形成モデルを用いて検討した。次に腫瘍よりMMP産生細胞の単離を行った。そこで腫瘍に存在するマクロファージが主なMMP産生細胞である可能性を考え、切除した腫瘍よりCD11bマイクロビーズを用いて腫瘍マクロファージを単離した。次に単離した腫瘍マクロファージに対して10μMのカドミウムを曝露し、24時間後RNAを回収し定量PCRによりMMP発現を調べた。腫瘍における発現が報告されているMMP2、3、7、8、9、10、13、14、19、21、28を調べた結果、MMP8、9、13、14、19の定常状態における発現が見られたものの、カドミウムによる発現上昇は見られなかった。一方でチオグリコレート誘導腹腔マクロファージに対して1μM、10μMのカドミウムを曝露し、上記MMPの発現を調べたところ、MMP8、9、13、14の定常状態における発現に加え、MMP19のカドミウム濃度に応じた発現上昇が認められた。以上より、マクロファージのカドミウム応答性MMP発現には組織特異性があることが示唆された。
マクロファージ極性変化による動脈硬化病変進展の分子機序解明と制御法の開発

動脈硬化病変、大動脈瘤の進展および腫瘍血管の形成過程では、これら組織リモデリング過程で形成された血管の脆弱性がその病態において重要な役割を果たしていることが知られている。本研究では、炎症細胞、特にマクロファージ極性に着目し、血管リモデリング過程における炎症惹起型、炎症抑制型マクロファージの役割について解析を行った。その結果、腫瘍を含む未熟な血管新生過程において、炎症惹起型マクロファージの持続的な集積が血管脆弱性の原因となっていることを明らかにした。血管増殖因子のみならず、マクロファージ亜集団の挙動を制御することで、血管リモデリングの正常化を引き起こせる可能性が示された。血管リモデリングにおけるマクロファージM1/2極性の役割につき、引き続き解析を行っている。動脈瘤誘発モデルであるマウスCaCl2投与モデル、および未熟な血管リモデリングモデルとしてマウス腫瘍内血管新生モデルでの検討を継続して行っている。本年度においては特に腫瘍血管新生モデルを用いた血管リモデリングにおけるM1/M2マクロファージの解析につき、フロータイトメーターを用いて血管リモデリングにおいて集積するマクロファージの極性を経時的に解析する系の樹立に成功している。更にM1/M2マクロファージ極性を制御する低酸素シグナルの活性化につき、同じくフローサイトメーターを用いて解析を行っている。その結果、腫瘍増大に伴う血管リモデリングに伴い、M1マクロファージが血管周囲に集積するとの予備的知見を得ることが出来た。現在、引き続き、集積するM1マクロファージを同じくフローサイトメーターを用いて回収することで、その機能解析および低酸素シグナルの役割につき解析を行っている。特にM1/M2マクロファージ特異的な活性化機構につき詳細な検討を行うことで、マクロファージ極性を介する血管リモデリング機構の解明に迫ることができると考えている。更に、今回の腫瘍血管解析により樹立した実験系を応用することで、引き続きCaCl2動脈瘤モデルにおける炎症細胞、マクロファージ極性変化の役割について解析系の樹立を試みることが可能であると考えている。腫瘍血管新生モデル、動脈瘤進展モデルにつき、引き続き解析を継続する。マクロファージM1/2極性変化と動脈硬化病変進展の関連性動脈硬化進展およびその不安定化の過程において、プラーク内の未熟な血管造生とその破綻が重要な役割を果たしていると考えられている。本研究では未熟な血管造生による動脈硬化病変進展モデルとしてApoEノックアウトマウスを用いたAngiotensinII負荷を行い動脈瘤進展過程において血管病変に集積する炎症細胞、マクロファージの解析を開始した。しかしながら現在までの検討により、動脈拡張部よりフローサイトメーターを用いて解析するのに十分な炎症細胞数を得ることが困難であることが分かった。そこでもう一つの動脈瘤進展モデルとして、局所の炎症をより強く誘発するCaCl2負荷モデルでの解析に着手している。上述のように、動脈硬化病変の安定性にはプラーク内血管の成熟、未成熟さが重要な役割を果たしていると考えられている。本研究での研究仮説はマクロファージM1/M2極性が血管の成熟度を制御することにより動脈硬化病変の安定性に貢献していることを明らかにすることであるが、残念ながらAngII負荷による動脈瘤進展モデルを用いた本仮説の検証が困難であることが分かった。そこで引き続きCaCl2負荷による解析を開始しており、現在まで既に動脈瘤の進展を確認している。今後、血管病変に集積する炎症細胞を回収し、そのマクロファージ極性を解析する予定である。併せて、未熟な血管造生のモデルとして確立されている腫瘍内血管新生モデルを用いた解析も今後開始する予定である。臓器恒常性において、各組織を灌流する血管機能の維持は極めて重要を果たしている。各組織の血管は、炎症、代謝、力学的負荷を含む様々なストレスに晒されているが、これら外的ストレスに応じて血管構造が変化することが知られており、血管リモデリングと呼ばれている。その中でも、動脈硬化病変や動脈瘤、および腫瘍内血管構造の再構築過程における未熟な血管形成はプラーク、動脈瘤の破綻や腫瘍内低酸素環境の原因となり、病態進展に大きく関わると考えられている。本研究では、動脈硬化病変、大動脈瘤および腫瘍内血管形成プロセスをモデルとして、血管リモデリングにおける炎症細胞、特にマクロファージ極性の役割につき解析を行った。動脈硬化病変モデルに先だっておこなった腫瘍血管新生モデルにおいて、下記の知見を得た。1.M2マクロファージに比して、M1マクロファージにおいて血管内皮細胞増殖因子が強発現していること、2.腫瘍増殖に伴いM1マクロファージが腫瘍内に浸潤すること、3.M1マクロファージの集積を特異的に抑制すると腫瘍内血管リモデリングが抑制されること。これらの知見により、M1マクロファージの集積が血管の未熟化過程において重要な役割を果たしていることが明らかになった。引き続き動脈硬化病変プラーク内血管新生、および動脈瘤進展過程においてM1マクロファージ由来の血管新生増殖因子が果たしている役割について解析を行っている。

引き続く解析により、マクロファージ極性を介する動脈硬化病異変、動脈瘤および腫瘍血管正常化に向けた新たなアプローチを構築できると期待される。循環器内科学本研究においては、動脈硬化病変不安定化におけるマクロファージM1/M2極性の役割を、動脈硬化進展モデル、腹部動脈瘤発症モデルを用いて解析することを目的としていた。動脈瘤モデルとして、当初予定していたApoEノックアウトモデルを用いたAngiotensinII負荷に加えて、より炎症細胞の解析が行いやすいCaCl2負荷モデルでの解析を行っている。一方で、当初動脈硬化プラークモデルにおいて集積する炎症細胞をフローサイトメーターを用いて解析する予定であったものの、集積する細胞数が限られており安定的な解析は困難であることが判った。そこで、まず血管リモデリングにおける炎症細胞、マクロファージ機能解析を詳細に行う系として、腫瘍血管新生モデルを用いて解析を行うこととした。本年は腫瘍内血管リモデリングにおいて集積するM1/M2マクロファージの経時的プロフィールおよびM1/M2特異的遺伝子発現につき、興味深い解析結果を得ることが出来た。これらの解析結果および解析系の樹立は、M1/M2マクロファージによる血管リモデリング機構の解明に重要であるだけでなく、動脈瘤モデルにおいてM1/M2マクロファージが果たす役割の解析においても極めて有用であると考えられる。本研究計画においては、動脈硬化病変不安定化におけるマクロファージM1/M2極性の役割を、動脈硬化進展モデル、腹部動脈瘤発症モデルを用いて検証することを目的としていた。特に動脈硬化プラークの不安定化には、プラーク内血管の未成熟な発達が大きな役割を果たしていると考えられている。当初の計画通り、動脈瘤発症モデルとして、ApoEノックアウトマウスにおけるAngiotensinII負荷を行い、既報通りの動脈瘤の進展を確認した。しかしながら、動脈瘤局所に集積する炎症細胞、マクロファージ数がフローサイトメーターでの解析に十分な量を得ることができなかった。その為、別の手法として動脈局所の炎症を惹起するCaCl2負荷モデルを用いて動脈瘤発症の誘導を行い、動脈径の拡大を確認している。今後本モデルを用いて、マクロファージ極性が血管の成熟度、動脈硬化病変の安定性にどのような役割を果たしているかを検証する予定である。更に未熟な血管新生におけるマクロファージ極性の役割を検証するために、動脈硬化モデルとは異なるものの、血管の成熟度を測るモデルとして良く用いられているTumor xenograftモデルを用いて、腫瘍内血管リモデリング過程におけるマクロファージ極性の変化を解析することとした。今後、M1/M2極性変化を経時的に解析することにより、マクロファージ極性が血管リモデリングにおいて果たしている役割の解析を遂行する予定である。
バッキーボウルをモチーフとする湾曲π造形

本研究は、フラーレン部分骨格であるおわん型π分子「バッキーボウル」の独特な特徴である、1)おわん構造に由来するカラム状積層構造を形成し、伝導特性等の物性を発現する(intrinsic-π)、おわん反転などの動的挙動により、π系の三次元構造や、双極子モーメントなどの物性のダイナミックな変化を誘起する(Dynamic-π)、3)フラーレンなどの同様なπ曲面との間に構造特異的な相互作用や超低摩擦特性が観測される(Elastic-π)などの現象を活用し、バッキーボウルの自在合成法の開発を通じて、湾曲π造形イノベーションを目指すものである。30年度の主な成果は2点である。第1は、スマネン骨格を配位子とした高分子錯体の合成に成功したことである。スマネンの持つ3次元性、柔軟性を反映し、生成する錯体は金属を変えるだけでその構造を変え、全く異なる骨格でかつ孤立空孔を形成する、これまでにない極めてユニークな性質を持つことを明らかにした。このようなスマネンが形成する孤立空孔を有するネットワーク錯体は、従来知られていたようなネットワーク錯体と孤立空孔分子の両方の性質を併せ持つ、これまでにない極めてユニークな構造であり、これまで困難であった、有機強磁性体などの開発にブレークスルーをもたらす可能性がある。第2は、お椀の凸面、凹面の異なる面にそれぞれ異なる性質の官能基、具体的には疎水性官能基、親水性官能基を完全に制御して導入した、いわゆるヤヌス型分子の合成に成功したことである。これまでに二つの異なる面を生成する芳香族分子はこれまでになく、従来開発されているヤヌス型脂肪族分子と比較しても、様々な用途が期待される。さらに、スマネンのボウル反転挙動とカップルさせることで、スイッチ分子やアクチュエーターとしての応用も期待される。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。本研究は、フラーレン部分骨格であるお椀型π分子「バッキーボウル」の独特な特徴である、(1)お椀構造に由来するカラム状積層構造を容易に形成し、電気伝導性などの物性を発現する、(2)おわん反転などの動的挙動により、π系の3次元構造や双極子モーメントなどの物性のダイナミックな変化を誘起する、(3)フラーレンなどの同様のπ曲面との間に構造特異的な相互作用や超低摩擦特性が観測される、などの現象を活用し、バッキーボウルの自在合成法の開発を通じて、歪みπ分子造形イノベーションを目指すものである。今年度はその中から、[1]スマネンおよびその誘導体の自在合成および大量供給手法の開発、[2]他の骨格を有するバッキーボウルおよびヘテロバッキーボウルの合成研究、[3]バッキーボウルの特殊環境下における挙動の観測と物性評価、の3項目を中心に検討を行った。今年度の主な成果としては、まずスマネンの大量合成法の開発については、これまで毒性の高い有機スズ化合物を用いて、化学量論量の銅錯体を用いて行っていたノルボルナジエンの3量化反応の改善について検討を行い、スズに代えてより程度9艇で汎用性の高い誘起素ホウ素化合物に変換可能であること、および銅錯体を触媒量に低減できる可能性があることを明らかにした。スマネン誘導体の研究については、スマネンのベンジル位をすべてオキソ化したスマネントリオンについて今回初めてX線単結晶構造解析に成功し、スマネン誘導体では初めて、お椀構造が完全に重なるエクリプスド型積層構造を示すことを明らかにした。またスマネントリオンの還元反応を行い、2電子還元過程までは可逆であり、電子受容体として用いられるフラーレンに匹敵する安定なプロセスであること、2電子還元体が可視/近赤外領域まで幅広い吸収を有していることなどを明らかにした。本研究は、フラーレン部分骨格であるお椀型π分子「バッキーボウル」の独特な特徴である1)お椀構造に由来するカラム状積層構造を形成し、伝導特性等の物性を発現する(Intrinsic -π)、2)お椀反転などの動的挙動により、π系の三次元構造や、双極子モーメントなどの物性のダイナミックな変化を誘起する(Dynamic-π)、3)フラーレンなどの同様なπ局面との間に構造特異的な相互作用や超低摩擦特性が観測される(Elastic-π)などの現象を活用し、バッキーボウルの自在合成方の開発を通じて、湾曲π造形イノベーションを目指すものである。今年度は、主として今後の集合体形成に関する研究のモチーフとなり得る分子群の設計及び合成を中心に行った。スマネン芳香環上への置換に関しては、芳香環上の6箇所すべての位置に置換機を導入した三回対称分子「ヘキサ置換スマネン」の合成に初めて成功した。すなわち、スマネンの芳香環部位をすべてブロモ化したヘキサブロモスマネンの合成及びその結晶構造解析に成功した。得られたヘキサブロモスマネンはほとんどの有機溶媒に不溶であったが、鈴木ー宮浦カップリング反応に利用することができ、対応するヘキサアリールスマネンの合成にも成功した。これらの成功は、その他様々なタイプの置換基を3回対称性を保ったまま導入することができることを意味しており、スマネン骨格をメソゲンとする液晶分子の設計・合成への大きな第一歩となった。一方、スマネンのベンジル位への官能基導入に関しては、今回、活性炭素化学種であるカルベンの導入に初めて成功した。スマネニルカルベンは基底3重項であり、そのスピン密度はπ曲面へ広く非局在化していることが明らかとなった。

今後スマネニルカルベンの特性をさらに精査し、またこれを結晶中で配列させることで、強磁性相互作用を示す物質の作成を目指す。計画項目ごとに多少の進捗の良し悪しはあるが、概ね期待通りに研究は進行している。本研究は、フラーレン部分骨格であるおわん型π分子「バッキーボウル」の独特な特徴である、1)おわん構造に由来するカラム状積層構造を形成し、伝導特性等の物性を発現する(intrinsic-π)、おわん反転などの動的挙動により、π系の三次元構造や、双極子モーメントなどの物性のダイナミックな変化を誘起する(Dynamic-π)、3)フラーレンなどの同様なπ曲面との間に構造特異的な相互作用や超低摩擦特性が観測される(Elastic-π)などの現象を活用子、バッキーボウルの自在合成法の開発を通じて、湾曲π造形イノベーションを目指すものである。今年度の特筆すべき成果として、第1に、A03班の木口らとの共同研究により、スマネンのおわん反転が金属表面上でも起こることを利用し、金表面に整列させてスマネンをSTM探針による物理刺激によってその反転挙動を制御し、かつ観測可能であることを明らかにした。これは湾曲したπ系の動的挙動(Dynamic-π)を利用し、分子レベルの大きさで0/1シグナルの発生が達成できる、すなわち理想的には超高容量メモリへ展開可能な現象を明らかにすることができた。第2は、スマネンの3箇所のベンジル位の全てにカルボカチオンを発生させた、スマネントリカチオンの単離に成功した。カチオン種を高密度に発生させた化学種は、極めて高い電子受容能を有することが期待され、多くの用途への応用が期待さえているが、一般に不安定であり、発生そのものが困難である。今回、スマネンの構造上の特徴を利用し、トリカチオン種を極めて安定な形で単離することに成功した。さらに、まだ初期検討の段階ではあるが、このトリカチオンは極めて特殊な酸化還元活性を示すこともわかってきたので、今後この化合物のIntrinsicな性質を明らかにすることで、ユニークな有機触媒の開発等へ展開できると期待できる。計画項目ごとに進捗の良し悪しはあるものの、概ね期待通りに研究は進行している。本研究は、フラーレン部分骨格であるおわん型π分子「バッキーボウル」の独特な特徴である、1)おわん構造に由来するカラム状積層構造を形成し、伝導特性等の物性を発現する(intrinsic-π)、おわん反転などの動的挙動により、π系の三次元構造や、双極子モーメントなどの物性のダイナミックな変化を誘起する(Dynamic-π)、3)フラーレンなどの同様なπ曲面との間に構造特異的な相互作用や超低摩擦特性が観測される(Elastic-π)などの現象を活用し、バッキーボウルの自在合成法の開発を通じて、湾曲π造形イノベーションを目指すものである。29年度の主な成果は2点である。第1は、28年度に初めて合成に成功したスマネニルトリカチオン種およびその関連化合物の研究である。当初予想していたように、スマネニルトリカチオンは高い酸化力を有しているが、特に2電子酸化された化学種が極めてユニークな性質を有しており、固体状態ではカラムナー構造の独特の結晶構造を得るのに対し、溶液状態では全く観測できず、速やかにもう1電子受け取るか、求核剤との反応が著しく早い、極めて活性の高い化学種であることがわかった。
新規アグリカナーゼの関節炎早期における誘導メカニズムとその役割・診断的応用

1:アグリカナーゼ誘導に関わる細胞内分子メカニズムWister系胎児ラットの膝関節から軟骨細胞を分離培養し、メカニカルストレスを加え、ストレス刺激時のアグリカナーゼ発現誘導を調べた。最終的に7%伸展(0.33または0.5Hz)で刺激後、0.5,2,6,12時間後にRNAを抽出し、各アグリカナーゼ発現の変化を検討したところ、アグリカナーゼ-2であるADAMTS 5は殆ど発現レベルに変化を生じないのに対して、ADAMTS1,4,9はいずれも発現が上昇している結果が得られた。次にADAMTS9の発現誘導に関わる細胞内転写因子およびその結合部位に関する研究を行った。まず、ヒトADAMTS9のプロモーター部位をgenomic PCRにて得ることに成功した。異なった長さのDNAをルシフェラーゼアッセイ用のベクターに組み込んでコンストラクトを作成しルシフェラーゼアッセイを行い最もプロモーター活性の強いコンストラクトを決定した。2:ラットOAモデルおよびマウス成長軟骨におけるADAMTS9発現動態の解析雄性Wisterラット(200-300g)を用いて変形性関節炎モデルを作成し免疫染色を行った。関節破壊が進行しているステージではADAMTS9陽性細胞を多数認めたが、一方進行した時期ではむしろADAMTS9陽性細胞は減少していた。次に、0週,7週,14週齢雄ICRマウスにおけるADAMTS-9のmRNA発現の検討を行った。マウス脛骨成長軟骨において、ADAMTS-9は成熟軟骨細胞層で一部陽性、肥大軟骨細胞においては、mRNAレベルで強く発現していた。成長軟骨における軟骨分化過程において、軟骨細胞が肥大化する際に、周辺のマトリックスを分解する手段の一つとしてADAMTS-9が関与する可能性があると考えられた。1:メカニカルストレスによるアグリカナーゼ誘導に関わる分子メカニズムWister系胎児ラットの膝関節から軟骨細胞を分離培養し、岡山大学成瀬教授らの開発した細胞培養伸展刺激装置を用いて、メカニカルストレスを加えて、ストレス刺激時のアグリカナーゼ発現誘導に関して調べた。7%または15%伸展(0.33-0.5Hz)の条件で刺激をまず実施したが、細胞に対するダメージなどから最終的に7%伸展(0.33または0.5Hz)の条件でまた刺激時間や回収までの時間等に関する条件設定を行った。刺激後、0.5,2,6,12時間後にRNAを抽出し、各アグリカナーゼ発現の変化を検討したところ、アグリカナーゼ-2であるADAMTS5は殆ど発現レベルに変化を生じないのに対して、ADAMTS1,4,9はいずれも発現が上昇している結果が得られた。2:ラットOAモデルにおけるアグリカナーゼ-3発現動態の解析雄性Wisterラット(200-300g)を用いてエーテル及びフェノバルビタール麻酔下に右膝関節前十字靭帯および内側側副靭帯を切除する。4%パラフォルムアルデヒド(PFA)固定後、パラフィンブロックを作成し、免疫染色を行った。経時的に関節を摘出したところ、Modified Mankin Scoreの進行を認め、関節破壊が進行していた。ADAMTS9の免疫染色では、関節破壊が進行しているステージではADAMTS9陽性細胞を多数認めたが、一方進行した時期ではむしろADAMTS9陽性細胞は減少していた。1:アグリカナーゼ誘導に関わる細胞内分子メカニズムADAMTS9の発現誘導に関わる細胞内転写因子およびその結合部位に関する研究を行った。全長が1485塩基対あり、1485、1301、659、483、339の合計5種類の異なった長さのDNAをルシフェラーゼアッセイ用のベクターに組み込んでコンストラクトを作成した。ヒト軟骨肉腫

由来細胞株(OUMS-27)を既報の通り培養し、軟骨特異的遺伝子(II型コラーゲン、IX型コラーゲン、アグリカン)の発現を確認し軟骨表現型を維持していることを確認した後に、ルシフェラーゼアッセイを行った。化学発光を検出することに成功し、最もプロモーター活性の強いコンストラクトを決定した。2:マウス成長軟骨におけるADAMTS9発現動態の解析0週,7週,14週齢雄ICRマウス脛骨近位骨幹端を固定後、パラフィンブロックを作成し、マウスADAMTS-9のcDNAを用いて、DIGラベルしたプローブを作成し、in situ hybridizationによりmRNA発現の検討を行った。マウス脛骨の成長軟骨において、ADAMTS-9は成熟軟骨細胞層で一部陽性、肥大軟骨細胞においては、mRNAレベルで強く発現していることが判明した。成長軟骨における軟骨分化過程において、軟骨細胞が肥大化する際に、周辺のマトリックスを分解する手段の一つとしてADAMTS-9が関与する可能性があると考えられた。
Tough構文の共時的・通時的研究

本研究においては最新の生成文法の枠組みに基づき、tough構文の派生と統語構造について、共時的視点と通時的視点の両面から調査を行ってきた。本年度の研究成果の一部は名古屋産業大学研究紀要(Nakagawa(2003)"Phonological Interpretation and Null Operator"に掲載されている。Chomsky(2001)等で提案されている極小主義理論によると、空演算子はそれが移動する限りにおいて音韻素性を持たなければならないが、実際に音声が具現化することはない。この事実に対する理論的理由付けが必要となるが、本年度の研究では空演算子がX^0範疇であるとする仮説をたて、それが、空演算子が音韻的に具現しないという事実と結びつくのかどうか、結びつくのであれば、どのように結びつくのかという点を中心に、理論的、経験的調査を行った。Chomsky(2001)はproやPROが移動しているにもかかわらずPied Pipingを伴わない理由として、それらがX^0範疇であるからという仮説を立てている。この仮説を空演算子にも援用できるば、空演算子が空である理由となるが、Chomsky仮説自体その真意が定かでない。まず、空演算子は音韻素性を持たないのか、それとも音韻素性を持っがそれを元位置に残したまま移動できるのか、という点から明らかにする必要がある。これについて本研究ではOPが長距離移動しなければならず、それゆえに音韻素性を持たなければならないという結論を理論的に導いた。すると、空演算子は音韻素性を持つがそれが具現することはないということになるが、これについて本研究においては空演算子がX^0範疇であるためDによる形態的認可を受けることが出来ず、音韻素性が具現できないという結論を理論的・経験的に導いた。
抗ＨＩＶ薬服用患者における脂質代謝異常の発現メカニズムの解明

本研究では抗HIV薬の長期服用で起こる脂質代謝異常の発現メカニズム解明を目的とし、HIV感染症患者を対象として、診療記録をもとに背景情報や臨床検査値、使用薬等を調査し、尿検体におけるグルココルチコイド活性化酵素11β-hydroxysteroid dehydrogenase type1(11β-HSD1)の活性をLC/MS/MSで評価した。その結果、脂質異常症治療薬を併用した患者および抗HIV薬使用後に血中LDLコレステロール値が上昇した患者においては、尿中代謝産物で推測する11β-HSD1の活性が高く、抗HIV薬による脂質代謝異常には11β-HSD1が関与することが示唆された。本研究では、抗HIV薬の長期服用により起こる副作用である脂質代謝異常やリポアトロフィーの発現メカニズムを解明することを目的とする。具体的には、副作用の出現状況等について診療記録をもとに調査するとともに、患者の尿検体を用いて共通の病態を示すメタボリックシンドロームでの関与が報告されているグルココルチコイド活性化酵素11β-hydroxysteroid dehydrogenase type1(11β-HSD1)の関与を検討する。平成25年度は、主に、以下のように兵庫医科大学病院において対象患者の抽出、診療記録(カルテ)による患者背景情報の収集、対象患者の随時尿の採取を行った。1、HIV感染症に対する治療を開始する患者が発生し次第、選択基準、除外基準に基づき対象患者として抽出。2、診療記録により、対象患者における年齢、性別、服用中の薬剤等の情報を調査。3、代謝異常やリポアトロフィー症状出現の有無を判定するため、患者の受診ごとに行う血液学的検査値を調査。また、抗HIV薬による治療前後における身長、体重、ウエスト周囲径、ヒップ周囲径、骨密度、内臓脂肪量の変化を測定し、随時尿を採取。1人の対象患者につき、HIV感染症に対する治療開始前6週間以内に背景情報の収集を実施し、治療開始後48週まで観察を続行した。平成25年度までに、対象患者の抽出および患者情報や尿検体の収集は完了した。加えて平成25年度は、尿検体における11β-HSD1の活性をLC-MS/MSで測定する条件の検討を実施した。11β-HSD1の活性は、細胞内のコルチゾンが11β-HSD1で代謝される前後の生成物で評価する。そこで、健常者の尿に11β-HSD1の代謝産物の標準試薬を添加し、検体の前処理および濃縮、LC-MS/MSの各種測定条件を検討した。本研究の目的は、抗HIV薬の長期服用により発生する脂質代謝異常やリポアトロフィーの発現メカニズムを解明することである。研究手法としては、診療記録をもとに対象患者の副作用の出現状況等を調査するとともに、共通の病態を示すメタボリックシンドロームでの関与が報告されているグルココルチコイド活性化酵素11β-hydroxysteroid dehydrogenase type 1(11β-HSD1)の活性を患者の尿検体を用いて解析する。平成26年度は、平成25年度に引き続き、尿検体における前処理および濃縮、11β-HSD1の活性をLC-MS/MSで測定する条件を詳細に検討した。コルチゾンは、細胞内の11β-HSD1により活性型のコルチゾールに変換される。最終代謝物としてコルチゾールはtetrahydrocortisol(THF)とallo-tetrahydrocortisol(allo-THF)、コルチゾンはtetrahydrocortisone(THE)の形で尿中に排出される。11β-HSD1の活性は尿中比と呼ばれるTHF、allo-THF、THEの濃度の比で評価できる。そこでまず、健常者の尿にコルチゾンやコルチゾールの最終代謝物の標準品を加えて加水分解反応、固相抽出、LC-MS/MSに供し、検出されたピークの妥当性ならびに回収率を検討した。また、内部標準物質の候補であるD3-PGDの有用性について検討した。その結果、尿中混雑物とD3-PGDのピークがそれぞれ異なる保持時間を示して検出されたことから、D3-PGDを内標準物質として使用することが妥当であると示された。次に、尿中のコルチゾンやコルチゾールの最終代謝物であるTHF、allo-THF、THEの回収率を確認したところ、LC-MS/MSにおいて各代謝物のピークは検出可能であったが、検出感度については更なる検討が必要であることがわかった。本研究では、抗HIV薬の長期服用で起こる脂質代謝異常の発現メカニズム解明を目的とする。平成27年度は、対象患者の尿中代謝産物の測定を完了し、臨床調査結果と統合して以下の結果を得た。抗HIV薬使用群は、脂質異常症治療薬の併用が多い傾向があり、治療前と比較してLDLコレステロール値の有意な上昇がみられた。また、LDL上昇群では、THF+A-THF/THEやウエスト径が高く、抗HIV薬使用期間が長い傾向があった。対象患者に使用された抗HIV薬は12種類で、TVD(テノホビル+エムトリシタビン)、EPZ(アバカビル+ラミブジン)中心の多剤併用療法が多く施行され、TVDによる併用療法はEPZに比べTHF+A-THF/THEが高い傾向がみられた。以上の結果から、抗HIV薬の多剤併用療法による脂質代謝異常には11β-HSD1が関与すること、抗HIV薬の種類や使用期間により代謝異常発現リスクが異なる可能性が示唆された。

本研究では抗HIV薬の長期服用で起こる脂質代謝異常の発現メカニズム解明を目的とし、HIV感染症患者を対象として、診療記録をもとに背景情報や臨床検査値、使用薬等を調査し、尿検体におけるグルココルチコイド活性化酵素11β-hydroxysteroid dehydrogenase type1(11β-HSD1)の活性をLC/MS/MSで評価した。その結果、脂質異常症治療薬を併用した患者および抗HIV薬使用後に血中LDLコレステロール値が上昇した患者においては、尿中代謝産物で推測する11β-HSD1の活性が高く、抗HIV薬による脂質代謝異常には11β-HSD1が関与することが示唆された。LC-MS/MSを用いた尿検体中の11β-HSD1活性測定における代謝物の標準品を検出する実験で、試薬の追加発注トラブルや納品の遅延により、健常者の尿検体を使用したLC-MS/MSの各種測定条件の確立に時間を要した。そのため、すでに採取が終了している対象患者の尿検体における11β-HSD1の活性を測定するところまで達成できず、研究は計画と比べてやや遅れが生じている。臨床薬学平成27年度にはまず、尿検体の前処理および濃縮、LC-MS/MSの各種測定条件の確立を目指す。コルチゾンやコルチゾールの最終代謝物標準品(THF、A-THF、THE)の回収率を算出して、検出感度の向上を検討する。また、尿中にはコルチゾンやコルチゾール代謝産物のグルクロン酸抱合体や硫酸抱合体が存在するため、これらの分解に関して更なる検討を行う。具体的には、尿検体にそれらのグルクロン酸抱合体や硫酸抱合体の標準品を添加し、加水分解反応効率、固相抽出回収率を求め最終的な回収率を求める。検体の前処理およびLC-MS/MSの測定条件が確立したら、患者の尿検体における11β-HSD1の活性を測定する。尿検体中のTHF、allo-THF、THEの濃度をLC-MS/MSで測定して、尿中比を算出する。続いて、これまでに得られた臨床調査の結果および尿中比の算出結果を用いて解析を実施する。代謝異常やリポアトロフィーなどの副作用の発現有無と、尿中比やリポアトロフィー症状に関連する臨床検査値などのパラメーターで変動に相関がみられるものを検出して、副作用発現における11β-HSD1の関与を明らかとする。それによって、尿中比の抗HIV薬服用患者における脂質代謝異常等の病態を診断するマーカーとしての妥当性を検討する。また、リポアトロフィーや代謝異常の出現有無の患者間で各種患者背景情報、検査値で多変量解析を実施し、副作用発現のリスクファクターを明らかとする。本課題では、兵庫県エイズ治療中核拠点病院である兵庫医科大学病院においてHIV感染症に対する治療を開始する患者が発生し次第、対象患者として抽出し調査を実施した。診療記録による臨床調査は、各々の対象患者に対し抗HIV薬による治療開始後48週まで継続するが、平成25年度までに、解析に必要とされる患者数について調査および尿検体の採取を終了した。臨床記録による調査結果はデータベース化してまとめ、尿検体はすべて凍結保存している。また、LC-MS/MSを用いた尿検体による11β-HSD1活性の測定についても条件検討が進行しており、研究は順調に進展している。
浅水湖における低溶存酸素領域の発生・破壊に関する研究

湖における富栄養化現象が問題になって以来、多くの湖で流入栄養塩の削減、底泥の浚渫などが検討され実行に移されている。しかしながら、流入栄養塩に関しては、ある程度の精度で評価が可能となっているが、底泥からの栄養塩の溶出に関しては、実地観測の困難さから実験的に検討がなされているのが現状で、しかも水深の比較的浅い湖では底泥の物質特性が場所的に大きく変化しており、底泥からの溶出量を精度良く評価できていない。しかも、この溶出量に関して溶存酸素が大きく影響しており、まず、この溶存酸素の特性を把握することが必要である。そこで、本研究では湖山池を対象にして、夏期と冬期に溶存酸素の連続観測を行った。その結果、夏期には低層で溶存酸素が低下する現象がみられ、この現象が1日周期で発生していることが明らかになった。すなわち、朝ではほぼ鉛直方向に一様な分布をしているが、日中にかけて表層で過飽和、底層で嫌気状態という分布を形成し、夜にまた一様化するというものである。しかしながら、冬期ではこのような現象は生じない。さらに、場所的にも変化はなく、池全体でほぼ同様な挙動を示すことも明らかになった。したがって、湖山池では、夏期の正午から夕方にかけて底層で貧酸素領域が発生していることが判明し、底泥からの栄養塩の溶出に影響を及ぼしている可能性が認められた。
集積回路設計における高位レベル情報抽出に関する研究

本研究では,自動設計,特に論理合成の逆変換にあたる機能情報抽出技術の確立を目指して研究を行なった.本研究の成果は,以下の3点にまとめられる.1.論理回路から機能情報を抽出する手法の確立本研究では,自動論理設計の逆変換にあたる論理回路からの機能情報の抽出手法を確立を主目標とした.まず,組み合わせ回路に対する機能情報抽出手法を研究し,2分決定木と付加情報の利用という新しいアイディアを基に,論理機能だけでなく規則的な算術演算機能を抽出する手法を確立した.我々の方法は,抽出対象となる回路の構造には依存しない実用的な手法である.試作システムとして機能情報抽出システムFINESを試作した.さらに,この技術を順序回路からの機能情報抽出へ拡張した.2.レイアウト情報から回路情報を抽出する技術との接続に関する研究レイアウトからの回路抽出技術と我々の機能情報抽出技術を結合すれば,レイアウト情報からの機能情報抽出が可能となる.本研究では,レイアウトからの回路抽出で得られるトランジスタ回路から直接機能情報抽出を行なう手法の検討を行ない,試作システムを作成評価した.3.自動設計技術のなかでの機能情報抽出の利用に関する研究機能情報抽出の技術を,機能レベルシミュレ-ションモデルの自動生成やドキュメント/マニュアルの作成支援,設計検証などへ応用する手法についても検討した.これらの研究成果の一部は,国内/国外の学会で発表するとともに,学会誌にも論文として公表している.本研究で対象とした問題は,ディジタル回路だけではなく,アナログ回路やソフトウェア工学などへの応用も期待できる.設計が情報と制限の付加による具体化のプロセスであるとすれば,情報抽出は逆に抽象化のプロセスであるといえる.本研究の成果を基に,広範囲の応用を考慮したより本質的な理論の研究を進めて行きたい.本研究では,自動設計,特に論理合成の逆変換にあたる機能情報抽出技術の確立を目指して研究を行なった.本研究の成果は,以下の3点にまとめられる.1.論理回路から機能情報を抽出する手法の確立本研究では,自動論理設計の逆変換にあたる論理回路からの機能情報の抽出手法を確立を主目標とした.まず,組み合わせ回路に対する機能情報抽出手法を研究し,2分決定木と付加情報の利用という新しいアイディアを基に,論理機能だけでなく規則的な算術演算機能を抽出する手法を確立した.我々の方法は,抽出対象となる回路の構造には依存しない実用的な手法である.試作システムとして機能情報抽出システムFINESを試作した.さらに,この技術を順序回路からの機能情報抽出へ拡張した.2.レイアウト情報から回路情報を抽出する技術との接続に関する研究レイアウトからの回路抽出技術と我々の機能情報抽出技術を結合すれば,レイアウト情報からの機能情報抽出が可能となる.本研究では,レイアウトからの回路抽出で得られるトランジスタ回路から直接機能情報抽出を行なう手法の検討を行ない,試作システムを作成評価した.3.自動設計技術のなかでの機能情報抽出の利用に関する研究機能情報抽出の技術を,機能レベルシミュレ-ションモデルの自動生成やドキュメント/マニュアルの作成支援,設計検証などへ応用する手法についても検討した.これらの研究成果の一部は,国内/国外の学会で発表するとともに,学会誌にも論文として公表している.本研究で対象とした問題は,ディジタル回路だけではなく,アナログ回路やソフトウェア工学などへの応用も期待できる.設計が情報と制限の付加による具体化のプロセスであるとすれば,情報抽出は逆に抽象化のプロセスであるといえる.本研究の成果を基に,広範囲の応用を考慮したより本質的な理論の研究を進めて行きたい.本研究では,集積回路設計における高位レベル情報を下位レベルの情報から抽出する手法を研究している.本年度は,自動論理設計の逆変換にあたる論理回路からの機能情報の抽出手法に絞って研究を進めた.具体的には,1.すでに開発していた組み合わせ回路からの機能情報抽出手法を発展させて,さらに複雑な算術演算機能など,高度な機能情報の抽出法について研究し,繰り返しパタ-ンの抽出という新しい手法を確立した.この手法により,機能が既知でないような場合にも人間にわかりやすい形で機能情報を提示することが可能となった.2.電子回路からの機能情報抽出のプログラムを作成し,既存のレイアウトパタ-ンからの電子回路情報抽出技術と組み合わせてレイアウトパタ-ンからの機能情報抽出の可能性を示した.3.順序回路からの機能情報抽出に関しても,種々の検討を行ない,次年度の実現に向けて新しい知見を得た.4.回路素子の接続に関する情報のほかに情報抽出に利用できる種々の付加的な情報を整理し,その利用法を検討した.5.新しく開発された共有2分木マニュピレ-タを利用して,機能抽出システムを改良し,処理の高速化を計って実用に近付けた.さらに,この機能情報抽出の技術を,機能レベルシミュレ-ションモデルの自動生成やドキュメント/マニュアルの作成支援,設計検証などへ応用する手法についても検討した.研究成果は,電子情報通信学会誌やICCAD90をはじめ国内外の学会や研究会などで発表した.本研究では,集積回路設計における高位レベル情報を下位レベルの情報から抽出する手法を研究している。本年度は,順序回路からの機能情報の抽出手法と機能情報抽出の応用技術を中心に研究を進めた。具体的には,1.すでに開発していた組み合わせ回路からの機能情報抽出手法を発展させて,順序回路からの機能情報の抽出法について研究した。単純に同期式順序回路の動作をクロックの切れ目で分解し,組み合わせ回路からの機能情報抽出法を利用する方法を発展させ,算術演算など複数クロックでまとまった機能を実現する回路からの機能情報抽出を行なう手法を提案した。さらにこれらの機能を,試作している機能情報抽出システムFINESに組み込んだ。

2.回路のライブラリに依存しない電子回路からの機能情報抽出手法を考案し,プログラムを試作して,評価を行なった。これは,既存のレイアウトパタ-ンからの電子回路情報抽出技術と組み合わせてレイアウトバタ-ンからの機能情報抽出の可能性を示したことになる。3.抽出した機能を機能記述言語を用いて表現する手法を検討するとともに,言語の意味論と機能情報抽出技術との関係について検討した。4.機能情報抽出の技術を,機能レベルシミュレ-ションモデルの自動生成やドキュメント/マニュアルの作成支援,設計検証などへ応用する手法についても検討した。さらに,設計の種々のレベルの記述を含む統合ベンチマ-クの作成に,機能情報抽出技術が有効に利用できることを示した。研究成果は,電子情報通信学会や情報処理学会をはじめ国内の学会や研究会などで発表した。
グルコキナーゼ活性化による膵β細胞の運命決定

グルコキナーゼ活性化薬(GKA)により発現上昇するタンパクの一つにDamage-associated molecular pattern molecules (DAMPs)S100A8がある。膵β細胞から分泌されたS100A8は、TLR4のリガンドとして作用し、マクロファージにおいて炎症性サイトカインの発現を誘導する。高血糖および高遊離脂肪酸により惹起される膵β細胞とマクロファージとの相互作用を介した膵島炎症における悪循環が存在することを明らかにし、論文化した。新鮮単離ヒト膵島においても、S100A8が発現していることを確認し、ヒト膵島とヒト単球細胞株U937、パルミチン酸との共培養でS100A8が誘導され、S100A8中和抗体により、S100A8とマクロファージの相互作用による「膵島炎症」に伴うヒト膵β細胞のアポトーシスが抑制されることを見出した。S100A8-floxedマウスを作製し、視床下部への発現を認めない膵β細胞特異的なCre発現MIP-Creマウスと掛け合わせ、膵β細胞特異的S100A8ノックアウトマウスを作製した。さらに脂肪組織特異的S100A8ノックアウトマウスも作製した。高脂肪食負荷やdb/dbマウスと交配することにより、膵β細胞におけるS100A8の生体内での役割を検討した。我々は以前消化管ホルモンTFF2が膵β細胞増殖を促進することを示した(Endocrinology 2013)が、膵β細胞特異的TFF2過剰発現トランスジェニックマウスを作製したところ、生後初期に膵β細胞増殖促進を示すものの、その後膵β細胞アポトーシスが増大し、膵β細胞量低下を伴う耐糖能障害を呈した。グルコキナーゼと同じく増殖刺激の慢性刺激が膵β細胞アポトーシスを示すモデルと考えられ、その分子メカニズムの解析を行い、グルコキナーゼ慢性活性化との共通シグナルを検討した。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。膵島においてグルコキナーゼ活性化薬(GKA)にてグルコキナーゼを慢性的に活性化させた時のプロテオミクス解析を行い、有意に発現上昇するタンパク群と有意に発現低下するタンパク群を同定した。マウス単離膵島において,Fbln5の遺伝子発現は高グルコースおよびGKA刺激により上昇した。単離膵島におけるグルコースシグナルを介したFbln5の発現誘導は,グルコキナーゼ阻害薬・KATPチャネル阻害薬・Caチャネル拮抗薬,カルシニューリン阻害薬により阻害され,DYRK1A阻害薬により増幅したことから,膵島におけるFbln5の発現は,膵β細胞機能に重要な役割を果たしているグルコキナーゼ/カルシニューリン/NFATシグナルにより制御されていることが示唆された。GKAにより発現上昇するタンパクのEGFRにも着目して、IRS-2欠損マウスやdb/dbマウス等のモデルマウスを用いてin vivo膵島での発現変化を解析し、糖代謝におけるEGFRの役割を検討した。GKAにより発現上昇するタンパクの一つにDamage-associated molecular pattern molecules (DAMPs)S100A8があることを見出した。db/dbマウスおよびob/obマウスでは、炎症性サイトカインやマクロファージマーカーとともにS100A8の膵島における遺伝子発現が有意に上昇した。高グルコースおよび遊離脂肪酸、マクロファージとの共培養により膵β細胞におけてS100A8の発現が誘導され、その過程はTLR4に非依存的であった。膵β細胞から分泌されたS100A8は、TLR4のリガンドとして作用し、マクロファージにおいて炎症性サイトカインの発現を誘導した。高血糖および高遊離脂肪酸により惹起される膵β細胞とマクロファージとの相互作用を介した膵島炎症における悪循環が存在することが明らかになった。研究計画書にほぼ沿って研究が進んでいる。膵島におけるFbln5の発現は,膵β細胞機能に重要な役割を果たしているグルコキナーゼ/カルシニューリン/NFATシグナルにより制御されていることを明らかにし、論文化した。この成果を論文投稿中である。高血糖および高遊離脂肪酸により惹起される膵β細胞とマクロファージとの相互作用を介した膵島炎症における悪循環が存在することが明らかにした。GKAにより発現上昇するタンパクのEGFRに着目して、IRS-2欠損マウスやdb/dbマウス等のモデルマウスを用いてin vivo膵島での発現変化を解析し、糖代謝におけるEGFRの役割を解明し、論文化した。GKAにより発現上昇するタンパクの一つにDamage-associated molecular pattern molecules (DAMPs)S100A8がある。高血糖および高遊離脂肪酸により惹起される膵β細胞とマクロファージとの相互作用を介した膵島炎症における悪循環が存在することが明らかにし、論文化した。

慢性的なグルコキナーゼの活性化により、オピオイドペプチドPdynが膵島で有意に発現上昇することに着目、慢性的にグルコキナーゼが活性化される高脂肪食負荷マウスの膵島においても通常食と比較してPdynの発現は有意に上昇していたため、Pdyn欠損マウスを用いて膵島におけるグルコキナーゼ活性化によるPdyn誘導の生理的意義を検証した。IRS-2欠損マウスの膵島ではPdynの発現は上昇していた。癌抑制遺伝子であるLKB1の膵β細胞特異的ノックアウトマウスにおいて膵β胞量増加とPdynの発現上昇が報告されており、Pdynが膵β細胞の無秩序的な細胞増殖に対し負の制御を行うことにより膵β細胞量のホメオスターシスを維持している可能性がある。Pdyn欠損マウスでの膵β細胞アポトーシスの評価を行い、グルコキナーゼ活性化がPdyn発現を誘導する転写調節機序について、Pdynプロモーター領域を含んだluciferaseコンストラクトを用いたレポーターアッセイおよびPdynの既知の転写因子に対するChIP assayにより検討した。当初の研究計画通りに研究が進み、今年度も数編論文化できた。最終年度は、膵β細胞グルコキナーゼ抑制が細胞運命決定機構に及ぼす影響の解明に挑む予定である。グルコキナーゼ活性化薬(GKA)により発現上昇するタンパクの一つにDamage-associated molecular pattern molecules (DAMPs)S100A8がある。膵β細胞から分泌されたS100A8は、TLR4のリガンドとして作用し、マクロファージにおいて炎症性サイトカインの発現を誘導する。高血糖および高遊離脂肪酸により惹起される膵β細胞とマクロファージとの相互作用を介した膵島炎症における悪循環が存在することを明らかにし、論文化した。新鮮単離ヒト膵島においても、S100A8が発現していることを確認し、ヒト膵島とヒト単球細胞株U937、パルミチン酸との共培養でS100A8が誘導され、S100A8中和抗体により、S100A8とマクロファージの相互作用による「膵島炎症」に伴うヒト膵β細胞のアポトーシスが抑制されることを見出した。S100A8-floxedマウスを作製し、視床下部への発現を認めない膵β細胞特異的なCre発現MIP-Creマウスと掛け合わせ、膵β細胞特異的S100A8ノックアウトマウスを作製した。さらに脂肪組織特異的S100A8ノックアウトマウスも作製した。高脂肪食負荷やdb/dbマウスと交配することにより、膵β細胞におけるS100A8の生体内での役割を検討した。我々は以前消化管ホルモンTFF2が膵β細胞増殖を促進することを示した(Endocrinology 2013)が、膵β細胞特異的TFF2過剰発現トランスジェニックマウスを作製したところ、生後初期に膵β細胞増殖促進を示すものの、その後膵β細胞アポトーシスが増大し、膵β細胞量低下を伴う耐糖能障害を呈した。