hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
キラルアミノ酸メタボロミクスを基盤とするアミノ酸代謝障害の網羅的早期診断法開発

D体とL体を識別するキラルアミノ酸分析により、アミノ酸代謝障害の鋭敏な診断を可能にする高感度選択的な分析法を開発し、モデル動物を用いて有用性を検証した。キラルアミノ酸プロファイルは疾病時に劇的に変化する場合がある。本研究ではタンパク質構成アミノ酸に加えて代謝マップ上の様々な微量アミノ酸を対象とし、芳香族アミノ酸、分岐鎖アミノ酸、含硫アミノ酸の代謝障害、尿素サイクル異常などにおいて、光学異性体を識別する多次元HPLC分析法の開発を行った。その結果、いずれの疾患においても対象アミノ酸が血中・尿中で良好に分析可能であり、従来のアミノ酸分析では得られない新たなバイオマーカー候補が発見された。アミノ酸代謝障害は、代謝関連酵素が欠損または正常な活性を示さないために生じ、フェニルケトン尿症などの芳香族アミノ酸代謝障害、メープルシロップ尿症などの分岐鎖アミノ酸代謝障害、ホモシスチン尿症などの含硫アミノ酸代謝障害、シトルリン血症などの尿素サイクル障害といった様々な疾患が存在する。これらは代謝上流のアミノ酸蓄積や、下流のホルモンなどの不足が原因で発症するが、症状はいずれも発育障害、知能障害、嘔吐、痙攣など極めて類似しており、外見での鑑別は困難である。一方でアミノ酸代謝障害は、代謝マップでの障害部位が特定されると適切な食事療法が著効を示すことが多く、重篤な知能障害、発育障害などの発症を防止するため一刻も早い診断と早期治療の開始が切望される。応募者はこれまでの研究において、D体とL体を区別することで従来のアミノ酸分析値よりも数倍から数十倍の変動を示す鋭敏な指標が存在することを見出し、これをアミノ酸代謝障害の早期診断に利用することで罹患者の生涯QOLを大きく改善できると考えている。平成25年度は、アミノ酸代謝関連化合物についてD体とL体を切り分けて網羅的に分析するキラルアミノ酸メタボローム分析法を開発するため、タンパク質構成全アミノ酸20種に加えて代謝マップに存在する様々な関連アミノ酸について分離条件を確立した。具体的には芳香族アミノ酸代謝障害として、キヌレニン、キヌラミン、DOPA、尿素サイクル障害としてオルニチン、シトルリン、分岐鎖アミノ酸代謝障害としてアロイソロイシンの逆相分離条件および光学分割条件を決定した。併せて、含硫アミノ酸代謝障害としてこれまで不可能であったシステイン・シスチンのキラル一斉分析を達成した。アミノ酸代謝障害を網羅的に診断するため、タンパク質構成アミノ酸20種および代謝マップ上で主要な関連アミノ酸を分析対象に加え、「代謝関連キラルアミノ酸メタボローム一斉分析装置」を開発した。対象疾患としては、「芳香族アミノ酸代謝障害」、「分岐鎖アミノ酸代謝障害」、「含硫アミノ酸代謝障害」、「尿素サイクル障害」、「Dーアミノ酸代謝障害」を選択した。メタボローム一斉分析装置としては、逆相分離と陰イオン交換型光学分割カラムを組み合わせた二次元HPLC分析装置とした。平成25年度に各アミノ酸の一次元目の逆相分離条件、二次元目の光学分割条件を検討した結果を受け、平成26年度には一次元目および二次元目を統合した「二次元HPLC一斉分析装置」を開発した。分析装置の改良としては、長時間の全自動分析を可能とするため、青色LEDを用いる省エネルギー型LED蛍光検出器の開発検討を行い、検出器の試作を行った。また、各種アミノ酸代謝障害のモデルマウスについて、キラルアミノ酸メタボローム解析を実施した。その結果、芳香族アミノ酸代謝障害の一種であるフェニルケトン尿症モデルマウスでは、血中および尿中でDーおよびLーフェニルアラニンの有意な増加を認めた。また分岐鎖アミノ酸代謝障害の一種であるメープルシロップ尿症では、血中のLーバリン、イソロイシン、ロイシンの顕著な増加とと共に、尿中においてDーイソロイシンとLーアロイソロイシンの顕著な増加を認めた。特に尿中キラルアミノ酸はキラルを識別することで初めてバイオマーカーとなりうる指標であり、軽症期での診断も可能であった。アミノ酸代謝障害の新規診断法を構築するため、平成28年度にはタンパク質構成アミノ酸に代謝関連非タンパク質構成アミノ酸を加えたキラルアミノ酸メタボローム分析法の開発と利用を行った。対象疾患としては、「芳香族アミノ酸代謝障害」、「含硫アミノ酸代謝障害」、「尿素サイクル障害」を選択した。芳香族アミノ酸では関連アミノ酸としてフェニルアラニン、チロシン、DOPAを選択し、二次元HPLC一斉分析条件を確立した。一次元目には1m長のキャピラリーモノリスODSカラムを利用し、二次元目には7本の光学分割カラムを精査した結果、オリジナルカラムであるKSAACSP-001Sカラムを採用した。本条件によりいずれのアミノ酸鏡像異性体も分離度1.36以上で良好に分離され、尿試料に適用可能であった。含硫アミノ酸の代謝障害では、メチオニン、システイン、シスチン、ホモシステイン、ホモシスチンを分析対象とする二次元一斉分析システムを構築した。一次元目にはキャピラリーモノリスODSカラム、二次元目はKSAACSP-001Sカラムを使用した。本条件でいずれのアミノ酸も分離度3.0以上で良好に分離された。また、ホモシスチン尿症のモデルマウスについて、系統の安定確立に成功した。尿素サイクル障害ではシトルリンとオルニチンを分析対象アミノ酸とし、二次元一斉分析システムを構築した。一次元目の逆相分離には同じくキャピラリーモノリスODSカラムを使用し、二次元目の光学分割には強いππ相互作用を有し、立体識別能に優れたオリジナルカラムであるKSAACSP-105Sを使用した。いずれの非タンパク質構成アミノ酸も分離度2.44以上で良好に光学分割され、尿試料に適用可能であった。

本システムを用いてマウスおよびヒト尿中においてD-シトルリンおよびD-オルニチンのピークが確認されており、その由来や臨床的意義の解明が期待される。D体とL体を識別するキラルアミノ酸分析により、アミノ酸代謝障害の鋭敏な診断を可能にする高感度選択的な分析法を開発し、モデル動物を用いて有用性を検証した。キラルアミノ酸プロファイルは疾病時に劇的に変化する場合がある。本研究ではタンパク質構成アミノ酸に加えて代謝マップ上の様々な微量アミノ酸を対象とし、芳香族アミノ酸、分岐鎖アミノ酸、含硫アミノ酸の代謝障害、尿素サイクル異常などにおいて、光学異性体を識別する多次元HPLC分析法の開発を行った。その結果、いずれの疾患においても対象アミノ酸が血中・尿中で良好に分析可能であり、従来のアミノ酸分析では得られない新たなバイオマーカー候補が発見された。平成26年度には「キラルアミノ酸メタボローム分析システム」の二次元化・統合を計画しており、計画通り装置開発を達成した。また、実際のアミノ酸代謝障害モデルマウスとして「フェニルケトン尿症モデルマウス」、「メープルシロップ尿症モデルマウス」を用いてキラルアミノ酸メタボローム解析を行い、キラルを識別することで新たなバイオマーカーを発見した。以上から研究はおおむね順調に進展していると判断した。27年度が最終年度であるため、記入しない。物理系薬学平成27年度は、平成26年までに開発した「キラルアミノ酸メタボローム二次元HPLC一斉分析装置」を用い、各種アミノ酸代謝障害モデルマウスにおけるメタボローム解析を実施する。代謝障害としては「フェニルケトン尿症」を引き続き解析すると共に、「ホモシスチン尿症」、「Dーアミノ酸代謝障害」などを検討する。併せて、ヒト試料におけるキラルアミノ酸メタボローム解析も実施する。分析装置の更なる改良としては、夾雑成分との分離を更に進めるため、質量分離を新たな次元として導入を試みる。これにより分析装置は三次元の分離モードを有することになり、多数の代謝関連アミノ酸について、光学異性体を識別した精密解析を可能とする。平成25年度には芳香族アミノ酸代謝障害として、キヌレニン、キヌラミン、DOPA、尿素サイクル障害としてオルニチン、シトルリン、分岐鎖アミノ酸代謝障害としてアロイソロイシンの逆相分離条件および光学分割条件を決定するとともに、含硫アミノ酸代謝障害としてこれまで不可能であったシステイン・シスチンのキラル一斉分析を達成している。特にシステイン・シスチンのキラル同時分析はこれまで不可能とされていた課題であり、研究計画は順調に進展していると考える。研究計画では二次元HPLC一斉分析装置の長時間安定稼働を実現するため、LED蛍光検出器の導入を予定していた。しかし、平成26年度には高性能なLED検出器の仕様を決定するための装置試作を研究協力者である株式会社資生堂と共に行ったため、高額な機器導入費用が発生しなかった。
ビタミンD3が前立腺癌抗増殖作用を規定するエピゲノム修飾を伴う転写制御機構の解明

ビタミンD3が前立腺癌に抗増殖作用を示すことが知られていたが、その分子機序にはまだ不明な点が多い。我々の予備的検討により、1前立腺癌に抗増殖作用を示す活性化ビタミンD3 (以下D3)の転写制御の一部が、ARとのクロストークを介したものであることが予想され、2前立腺癌細胞増殖への関連が疑われるMetallothioneinとHOXCsの遺伝子群がクロストークを介したD3とDHTの標的であることが明らかになりつつあり、これらの制御にはDNAのメチル化が関与すると予想されている。そこで本研究課題では、クロストークを介した遺伝子クラスター領域を網羅するエピゲノムの変化の解明を進めていく。
消滅する方言アクセントの緊急調査研究

1代表者の上野善道は,青森市方言,香川県伊吹島方言,山口県見島方言,鹿児島県枕崎市方言,同県黒島大里方言などを調査した。中でも詳しく調べたのは伊吹島と見島である。伊吹島方言では5拍・6拍の複合名詞につき,その全体・前部要素・後部要素の各アクセントを調べ,また,複合動詞の否定形などのアクセントも記録した。見島方言では,複合動詞のアクセント規則を明らかにし,論文にまとめた。その他,金沢市方言では,故人となった話者の複合動詞の資料を,協力者の新田とともに整理して公にした。話者が急逝するという予想外の事態になった青森市方言についても,複合名詞が複数のアクセント単位に分かれるという特異な現象を報告すべく,その資料をまとめているところである。2分担者の中井幸比古は,アクセント史重要な位置を占める岡山県日生町寒河方言を調べ,詳しい報告を書いた。また,伊吹島方言の最古の録音資料である和田実・妹尾修子録音のテープを聞き取り,3式の存在と2拍名詞の5型の対立を確認した。3協力者の新田哲夫は,石川県白峰村字白峰において動詞・形容詞の活用形と付属語のアクセント調査を行なった。形容詞に関しては,その語幹に現われる長音について検討をした。また,動詞活用形アクセントの通時的な関係の考察も行なった。4協力者の大和シゲミは,福井県上中方言アクセントの記述的研究を行ない,16拍名詞における型の弁別の仕方に個人差があることを明らかにした。また,この方言の式音調の成立過程に関する論文も書いた。1.調査地域-下記の地点で3名がそれぞれアクセントの調査研究を行なった。代表者の上野善道:青森市方言で複合名詞,石川県金沢市方言で複合動詞と後部1拍複合名詞,香川県観音寺市伊吹島方言で複合動詞と34拍名詞,鹿児島県三島村黒島大里方言で複合名詞,鹿児島県枕崎市方言でアクセント体系,をそれぞれ目的とする記述調査。分担者の中井幸比古:伊吹島方言で,現存する最古の録音テープのアクセントの分析と,2拍体言が独特の類の統合をしている岡山県和気郡日生町寒河方言の記述調査。協力者の大和シゲミ:福井県遠敷郡上中町方言の記述調査。2.調査成果上野:青森市の複合名詞は,内部に複合語を含んでいればその枝分かれ構造とは無関係に複数単位形になる。金沢市の6拍以上の複合動詞は2単位形となる。伊吹島方言の複合動詞は,第1要素の連用形の式を受け継いだ無核型になる。黒島大里方言の複合名詞の型は前部要素の型を引き継ぐ。枕崎方言は,下降式音調をもつ重起伏調の2型アクセントである。いずれも先人の研究では知られていなかった事実で,伊吹島と黒島については論文を発表した。残りについても公表を予定している。中井:昭和40年頃に録音された伊吹島方言のオープンリールを聞き取り,4拍語までの詳しい資料を報告。寒河方言についても,補充調査をし,調査資料の整理を進めた。大和:上中町方言は2つの式と核を持つ体系で,式音調に特徴があること,各型の所属語彙に偏りがあることを明らかにし,16拍名詞のアクセント資料を作成した。中井の伊吹島方言と大和の上中町方言の調査結果は,この班の報告書として刊行される。1代表者の上野善道は,特に青森市方言と香川県伊吹島方言を数次にわたって詳しく調査した。青森市では,複数のアクセント単位に分かれるという特異な現象が見られる複合語を調べ,その分かれる条件を解明した。伊吹島では,複合動詞の過去形と5拍の複合名詞のアクセント調査を行ない,それぞれの規則を明らかにした。今後,対象を他の活用形や6拍以上の複合名詞にも広げる予定である。その他,石川県金沢市方言,鹿児島県黒島大里方言の調査も行ない,その結果をともに論文にまとめた。青森・伊吹島・金沢の3方言については,日本と外国の地名のアクセントも調べた。2分担者の中井幸比古は,岡山県日生町寒河方言を調べ,4モーラ体言のアクセント体系は東京方言と同じで5つの型があり,所属語彙の面でも類似することを明らかにした。この方言は2拍名詞第2類が特異な現われ方をすることで知られるが,それに類する現象は4拍語では見られなかった。中井はまた,中央式諸アクセントめ整理も進めた。3協力者の新田哲夫は,石川県白峰村字白峰において動詞・形容詞の活用形のアクセント調査を行なった。従来の報告どおり「下降式」の存在を確認するとともに,近隣の方言には見られないパターンが存在することが明らかになった。4協力者の大和シゲミは,福井県上中方言アクセントの記述的研究を行ない,26拍名詞を調査した。対立する2つの式音調の実相と頻度,下降式語の核の有無およびその位置による対立,併用される音調などについて,方言内部の個人差の存在が分かった。

その他,金沢市方言では,故人となった話者の複合動詞の資料を,協力者の新田とともに整理して公にした。話者が急逝するという予想外の事態になった青森市方言についても,複合名詞が複数のアクセント単位に分かれるという特異な現象を報告すべく,その資料をまとめているところである。2分担者の中井幸比古は,アクセント史重要な位置を占める岡山県日生町寒河方言を調べ,詳しい報告を書いた。また,伊吹島方言の最古の録音資料である和田実・妹尾修子録音のテープを聞き取り,3式の存在と2拍名詞の5型の対立を確認した。3協力者の新田哲夫は,石川県白峰村字白峰において動詞・形容詞の活用形と付属語のアクセント調査を行なった。形容詞に関しては,その語幹に現われる長音について検討をした。また,動詞活用形アクセントの通時的な関係の考察も行なった。4協力者の大和シゲミは,福井県上中方言アクセントの記述的研究を行ない,16拍名詞における型の弁別の仕方に個人差があることを明らかにした。また,この方言の式音調の成立過程に関する論文も書いた。
集落排水処理水と処理水利用水田における医薬品分解生成物の存在実態と対策手法の解明

生活排水由来の医薬品は,分解が不十分な場合には,生態系や人体への悪影響が,元の医薬品と同程度かそれ以上の分解中間生成物(TPs)となる可能性がある.本研究では,農村の代表的な生活排水処理施設である集落排水施設の処理水と,処理水利用水田でのTPsの検出濃度の実態を解明した.一方,集落排水施設で処理槽の微生物濃度を高く保つことや,水田での処理水滞留時間を長くすること等により,TPsの微生物分解や光分解が促進され,処理水や水田でのTPs濃度を低くできること等も解明した.これらの知見を活用すれば,集落排水施設の処理水の安全性と,処理水を水田に利用して更に浄化する方法の効果を大きく高めることができる.生活排水中の医薬品は,分解生成物にも毒性が残留したり,元の医薬品以上の毒性が発現する場合がある.そこで本研究では,その分解生成物を研究対象とし,「1日本農村での排出源として極めて重要と考えられる下水処理施設(集落排水施設)の処理水」と「2処理水の再浄化等を目的に処理水を灌漑した水田」での存在実態を明らかにし,集落排水施設と水田の「医薬品浄化システム」としての「安全性と有効性」を評価するとともに,それらを更に高める条件を解明することを目的とした.そして,平成25年度には,次年度以降の現場調査で主な検討対象とする「重要分解物」を選定するために,1集落排水施設の活性汚泥槽から採取した微生物,2実際の処理水利用水田から採取した水田土壌,に対して医薬品(純品)を添加して,医薬品の残留状況と分解物の生成状況をLC/MS/MSで分析,同定した.さらに,水田の湛水領域での光分解を模して,ガラス容器内で純水に溶かした医薬品(純品)に対する太陽光照射を行い,同様に医薬品の残留状況と分解物の生成状況を見た.その結果などから,生態系および人体への毒性が危惧される重要分解物として,4-Chlorophenol,Carbamazepine-10・11epoxide,Oxcarbazepine,1-(3-benzoylphenyl)ethane,3-ethylbenzophenone,Theobromine, 1,7-Dimethylxanthine, Theophyllineなどが選定できた.これらの元の医薬品はBezafibrate(高脂血症用剤),Clofibric acid (高脂血症用剤),Carbamazepine (抗てんかん剤),Ketoprofen(解熱鎮痛消炎剤),Caffeine(強心剤)などであり,これら医薬品と分解物を中心に次年度以降の研究を進める重要性が明らかとなった.生活排水中の医薬品は,分解が不完全である場合には,その分解生成物にも毒性が残留したり,元の医薬品以上の毒性が発現する場合がある.そして,昨年度(H25年度)の研究(文献調査と室内実験)からは,実際に生態系および人体への毒性が危惧される重要分解生成物(約10種類)と,その元となる医薬品原体を選定した.そこで,本年度(H26年度)は,愛媛県と茨城県に存在する多様な処理方式の農業集落排水施設(8施設)と,愛媛県の処理水無希釈利用水田でサンプリングを実施し,その重要分解生成物と原体の存在実態を調査した.その結果,多くの農業集落排水施設の流入下水と処理水,および水田からの流出水(表面流出水)から,様々な重要分解生成物が検出された.具体的には,Carbamazepine(抗てんかん剤)の分解物「Carbamazepine10,11-epoxide,Acridine」,Bezafibrate,Clofibric acid (高脂血症用剤)の分解物「4-Chlorophenol,4-Chlorobenzoic acid」,Ketoprofen(解熱消炎鎮痛剤)の分解物「3-Acethylbenzophenone,3-Ethylbenzophenone」が1100ng/Lオーダーで検出された.いずれの分解物も,集落排水施設では,流入下水に比較して処理水では濃度が低い傾向が見られたものの,成分によっては,処理水中の重要分解生成物が原体の濃度を上回る施設があった.一方,水田では,流入処理水よりも水田流出水で濃度が低下する成分と,逆に高まる成分があった.以上より,医薬品の分解生成物への対策の重要性が,実際の集落排水施設と処理水利用水田で明確になったとともに,その具体的対象となる成分を絞り込むことに成功した.平成27年度は,実稼働中の農業集落排水施設(接触曝気方式1施設,嫌気性ろ床接触曝気方式2施設,連続流入間欠曝気活性汚泥方式3施設)で,季節ごとに,生活排水由来医薬品と分解中間生成物に関して流入原水と処理水の調査を行った.また,さらに別の1施設(間欠曝気オキシデーションディッチ法)では,9月以降,毎月の調査を実施した.主な分析成分はKetoprofen,Carbamazepine,Crotamiton,DEET,Caffeineなどと,その分解中間生成物(3-Acethylbenzophenone, 3-Ethylbenzophenone,N-N-Diethyl Benzomide,Acridine,Acridone,Carbamazepine 10,11-epoxide,N-Ethyl-O-Toluidine,Theophylineなど)である.その結果,いずれの施設においても流入原水,処理水から多様な分解中間生成物が検出されたが,流入原水より処理水で大きく増加する成分は殆どなかった.また,それぞれの医薬品原体と,その分解中間生成物の処理水中の合計濃度に関しては,生物膜法より活性汚泥法で低い成分が複数見られた(Ketoprofenなど).

また,活性汚泥法では,水温が高い時期にKetoprofenと分解中間生成物の合計濃度が低いという特徴が分かった.すなわち,活性汚泥法の生物膜法に対する優位性が示唆された.さらに,土壌カラムと活性汚泥による分解試験などの室内実験を行い,集落排水施設や,処理水利用水田といった現場の調査結果と合わせて,分解中間生成物が分解しやすく蓄積しにくい条件を解明した.例えば,MLSS濃度が高く,光暴露時間が長いといった条件を明らかにした.また,本年度は最終年度であるため,これまでの成果を報告書としてとりまとめた.生活排水由来の医薬品は,分解が不十分な場合には,生態系や人体への悪影響が,元の医薬品と同程度かそれ以上の分解中間生成物(TPs)となる可能性がある.本研究では,農村の代表的な生活排水処理施設である集落排水施設の処理水と,処理水利用水田でのTPsの検出濃度の実態を解明した.一方,集落排水施設で処理槽の微生物濃度を高く保つことや,水田での処理水滞留時間を長くすること等により,TPsの微生物分解や光分解が促進され,処理水や水田でのTPs濃度を低くできること等も解明した.これらの知見を活用すれば,集落排水施設の処理水の安全性と,処理水を水田に利用して更に浄化する方法の効果を大きく高めることができる.当初予定していた,1実際の農業集落排水施設での実態調査,2処理水を無希釈利用した水田での実態調査,をいずれも実施し,当初目標としていた「農業集落排水施設と処理水利用水田での分解生成物の存在実態」と「その重要性」を明らかにすることができた.さらに,次年度の室内実験で,分解速度が速まる条件を検討するにあたって,特に対象とすべき重要分解生成物の絞り込みも行うことができた.27年度が最終年度であるため、記入しない。地域環境工学・計画学H26年度までは,おおむね順調に研究を進行させることができたため,H27年度についても,当初計画どおりの分担研究体制で研究を進めることを予定している.具体的には,土壌での分解実験は久米・斎藤が担当し,光分解試験は藤原が担当し,集落排水施設と処理水利用水田での調査は治多・黒田が担当する.ただし,現時点では,学会での口頭発表はあるものの,論文が投稿できていないため,投稿を迅速に実施する.また,H26年度には,農業集落排水施設の調査は,施設数は確保できたものの,年間を通じてのデータ採取が十分に行えていない.水田においても,調査回数が2回と少なかったため,よりデータを充実させる必要がある.そのため,H27年度は,当初予定していた室内実験に加えて,これらの作業も十分に実施する.集落排水施設と処理水利用水田の調査は,治多・黒田が担当する.当初予定していた,1処理槽を模した室内実験,2水田土壌を模した室内実験,3水田での湛水領域での光分解を模した室内実験,をいずれも実施し,当初目標としていた「重要分解物(約10種類)」の選定までには,十分に到達することができた.27年度が最終年度であるため、記入しない。分解生成物の分析の定量下限を下げるとともに,精度を高める分析条件設定に,当初予定よりも時間を要してしまった.そのため,H26年度に予定していた農業集落排水施設における年間変動調査は不十分(回数不足)であり,また,水田での調査も同様となった.
成長におけるインスリン様成長因子Iとインスリン様成長因子I受容体機能に関する研究

平成10年度は培養皮膚線維芽細胞膜上のIGF-1レセプター当たりの自己リン酸化能と成長との関係を検討を試みたが,十分な感度の測定系を確立することが出来なかった.そこで,平成11年度はIGF-I受容体をChinese hamster ovary(CHO)cellにIGF-I受容体をトランスフェクトし,IGF-I受容体を過剰発現させた細胞(CHO-IGFR)の供与を受け,測定系の問題点を明らかにする予定であった.しかしながら,この測定系ではスキャッチャー解析を行うまでの感度が得ることが出来ないことが判明した.そこで,単純に最大刺激のIGF-1に対する細胞あたりの自己リン酸化能を刺激前後で検討したが,遺伝歴を有するSFD低身長児,体質性低身長児,GHwithout growthが疑われる2名の高身長児,健常者間に有意差は認められなかった.成長障害児におけるIGF-1受容体の自己リン酸化能の成長に及ぼす影響は軽微であると推測された.平成10年度はIGF-I受容体自己リン酸化能測定系の開発を目的に研究を開始した.遺伝歴を有するSFD低身長児,体質性低身長児,GH without growthが疑われる2名の高身長児,正常成人から得られた培養皮膚線維芽細胞を種々の濃度のIGF-Iで刺激し,IGF-Iレセプターβサブユニットを自己リン酸化させた後,IGF-Iレセプターを可溶化させる.この可溶化したレセプターを用いた自己リン酸化能測定を抗IGF-1レセプター抗体,抗フォスフォチロシン抗体を用いたサンドウィッチ法にて測定する.さらに,レセプター数も他の抗体を用いて測定し,レセプター数当たりの自己リン酸化能を算出し,受容体の機能を検討する.これらの測定は十分な感度を得るために二次抗体をEu(ユーロピウム)で標識し,高感度イムノアッセイ法であるTR-FIA系で測定する.以上の計画で平成10年度の実験を開始した.まず,アッセイ系を確立するために,正常成人から得られた培養皮膚線維芽細胞を用いた系での感度を検討した.実験を何度か繰り返したが,刺激したIGF-Iの濃度と,Euカウントのdose-response curveを得ることが今年度は出来なかった.最大刺激と考えられたIGF-I濃度と,Blankのカウントにほとんど差がなかった.結果が得られなかった理由として,培養皮膚線維芽細胞上のIGF-Iレセプター数の問題でこの系の感度では,自己リン酸化能が不可能である可能性が考えられる.GF-I受容体をChinese hamster ovary(CHO)cellにIGF-I受容体をトランスフェクトし,IGF-I受容体を過剰発現させた細胞(CHO-IGFR)の供与を受け系の問題を解決する予定である.平成10年度は培養皮膚線維芽細胞膜上のIGF-1レセプター当たりの自己リン酸化能と成長との関係を検討を試みたが,十分な感度の測定系を確立することが出来なかった.そこで,平成11年度はIGF-I受容体をChinese hamster ovary(CHO)cellにIGF-I受容体をトランスフェクトし,IGF-I受容体を過剰発現させた細胞(CHO-IGFR)の供与を受け,測定系の問題点を明らかにする予定であった.しかしながら,この測定系ではスキャッチャー解析を行うまでの感度が得ることが出来ないことが判明した.そこで,単純に最大刺激のIGF-1に対する細胞あたりの自己リン酸化能を刺激前後で検討したが,遺伝歴を有するSFD低身長児,体質性低身長児,GHwithout growthが疑われる2名の高身長児,健常者間に有意差は認められなかった.成長障害児におけるIGF-1受容体の自己リン酸化能の成長に及ぼす影響は軽微であると推測された.
年金と医療の政策調整に関する研究

2年間にわたる本研究は年金と医療を対象にして、2つの方法、すなわち理論研究と実態調査研究を実施してきた。まず年金については、企業年金による公的年金一部肩代わりの事例を理論的、文献的に研究する傍ら、実態調査を実施して現実的に応用できる条件を探った。理論研究としては、(1)アメリカの個人退職勘定(IRA)型年金、(2)アメリカのカフェテリア型年金、(3)イギリスのコントラクト・アウト型年金、等について資料を収集・分析して日本への適応方法について検討を加えた。他方、実態調査を通じてポスト・バブルのため企業年金の財務が急速に悪化して企業年金の補完能力に減退傾向が見られること、給付建てから拠出建てへの転換希望が高まりつつあることが確認できた。もし拠出建てに変換することになれば、給付額は低下するであろうが、従来より確実な所得源としてむしろ再評価されるとの感触を得るに至った。医療面の研究では、日本で「マネジド・ケア」型の費用抑制策を採る可能性を探るために、医療現場における聞き取り調査を実施する一方で、域医療の観点から、市町村や県のレベルでの医療、福祉行政の問題点を聴取した。とくに医療費用の抑制の観点からは、定額型の診療報酬方式よりも、疾病の種類を分けた上で重度の疾病に重点的に保険資源を分配する方が患者サイドには受け入れられやすいと思われた。また地域の規模においては、従来より広い地域をカバーしてサービスを給付するのが効率的であろうとの判断を得た。以上の点から社会保障の構造調整については、従来の個別政策の分断的な立案方式を見直し、総合的、広域的な視点からリスクの不安定な医療分野に資源を集中的に投入するのがより効率的だと考えるに至った。平成7年度では、年金と医療のそれぞれの内部問題の把握を目的に作業をおこなった。まず年金については、公的年金の所得代替率の見直しに留意して、企業年金の補完的役割のありかたを実態に則して検討するために、有力な厚生年金基金を中心に予備調査と聞き取り調査を実施した。その結果、積立金運用の予定利率が達成できない基金が多く、このままでは公的年金を補完する機能に支障がでることが分かった。ポスト・バブルのため企業年金の財務が急速に悪化して当初の給付予定額を賄えないために中には解散を真剣に検討しているところも散見された。企業年金の補完能力の減退傾向から見て、今後、「給付建て」から「拠出建て」に変換する年金がでてくるのは確実と見られる。そのため、実態調査をおこなうにあたっては、平面的なアンケート調査よりも重点的に有力な年金基金について集中的に「聞き取り調査」を実施する方がより効果的と判断している。また医療については、理論研究を主体とするため、費用抑制の合理的方法に関して、内外の文献・資料の収集をおこない、その第1次的解析をおこなった。わが国では年間に1兆円づつ増加している国民医療費のうち相当部分が老人医療費の上昇によって拡大している。診療評価方式の合理化をいっそう進めるためには、アメリカ型の「マネジド・ケア」をわが国に適用できるよう改善して採用することが必要と考えられる。今後はアメリカで主流となりつつある「カフェテリア型」企業福祉を参考に年金と医療の統合化と弾力化をはかる条件を調査・研究する計画である。そのため平成8年度の研究計画では、年金だけでなく医療についても聞き取り調査を精力的に実施したいと考えている。平成8年度の研究計画は2つの部分から成っていた。第1の年金については、平成7年度に実施した実態調査をもとに企業年金による公的年金一部肩代わりの可能性を探り、現実的な改革のための条件について整理し、析出することを課題としてきた。そのために、(1)アメリカの個人退職勘定(IRA)型年金、(2)アメリカのカフェテリア型年金、

(3)イギリスのコントラクト・アウト型年金、等について具体的に資料を収集・分析し、諸条件を吟味の上、日本的適応の仕方について検討を加えた。他方では、実態調査を通じてポスト・バブルのため企業年金の財務が急速に悪化して企業年金の補完能力に減退傾向が見られること、給付建てから拠出建てへの転換希望が高まりつつあることが確認できた。もし拠出建てに変換することになれば、給付額は低下するとしても従来に比してより確実な所得源としてむしろ再評価されるとの感触を得た。第2の医療面では、日本で「マネジド・ケア」型の費用抑制策を採る可能性を探るために、医療現場における聞き取り調査とともに地域医療の観点から、市町村や県のレベルでの医療、福祉行政の問題点を担当者から聴取した。とくに医療費用の抑制の観点からいえば、定額型の診療報酬方式よりも、疾病の種類を分けた上で重度の疾病に重点的に保険資源を分配する方が患者サイドには受け入れられやすいと思われた。また地域の規模においては、従来より広い地域をカバーしてサービスを給付するのが効率的であろうとの判断を得た。以上の点から社会保障の構造調整については、従来の個別政策の分断的な立案方式を見直し、総合的、広域的な視点から政策の優先度と財源配分の基準づくりをおこなうのが適切と考えるに至った。
インドシナ3国の伝統的村落における居住環境と土着技術の比較研究

ベトナム・ラオス・カンボジアの3国はこれまで旧仏領インドシナとして植民地支配を受け、その後独立・内戦・東西対立とその解決後、市場原理の導入を経てきた。この地域の伝統的村落は独立後変貌を遂げてきた。そこで、定点的・比較検討的に居住環境と土着技術に絞り,、調査・研究するのが目的である。調査研究方法は、伝統的村落選び、居住環境と土着技術の変化を総合的・学術的に調査・研究し、比較検討を行ってきた。共通テーマは人文と自然の諸学と地域研究を包摂するもので、立地と地形、家宅配置と近隣耕地、近隣森林と家畜放牧、屋敷地共住と親族組織、村人大工と農閑期作業、煉瓦製法、伝統織機、養蚕などのテーマである。特に、カンボジア西北部のシェムリアップ州北スラスラン村の高床住宅、トンレサップ湖沿岸の杭上住宅、ベトナム北部バクニン省ティエンソン県ディンバン社を中心とした地域のディン(亭)、土間式住宅の調査をおこなった。カンボジアでは文化・情報省、アプサラ(アンコール地域遺跡整備機構)の協力を得て調査を実施、ベトナムでは社会利学院、考古学院の協力を得た。特に、民家の分布と平面分析、大工技術などについて実測、聞き込みを行った。ベトナムでは集落の中心となっているディン(亭、村落集会所)の調査を起点として、各村落の住居環境調査を行った。さらに、亭などの公共建築に関わった大工集団と村との関係資料を収集した。もう一つは、村落集会所(ディン)など木造建築遺構の平面図、断面図、断面詳細図、拓本などである。とくに考古学院の配慮で貴重な写真などを多数撮影し、フォトCD化してベトナム側と共有した。本年度は入念な準備作業の後、カンボジア西北部のシェムリアップ州北スラスラン村(プノンペンから北西へ約313km)、トンレサップ湖沿岸、人口約670人)にのゼネラルサーベイ、ベトナム北部ナムディン省ハンティエン村(ハノイ市の南東約270km、人口約4,000人)の事前調査をおこなった。カンボジアの北スラスラン村は文化・情報省などの協力を得て民家及び社会経済調査の予備調査が実施できたが、ベトナムでは公安・治安上の問題があって、外国人の村人への直接的聞き込みは許可がでなかった。今後も粘り強く情報文化省に要請を続けるが、本年度は村の核となっている寺院(神光寺、外ケオ寺)、ハンティン村の集会施設である「亭」、「殿」などと村との関係を調査した。本年度の中心は、建築的な資料の収集を目的したため、(1)立村と地形土壌、(2)村落形成と繁茂した多雨林地帯、(3)家宅配置と近隣耕地展開、(4)近隣森林と家畜放牧、(5)屋敷地共住と親族組織、(6)河川と配水・潅概、(7)生活用水と雨季・乾季の貯水・排水、(8)農産物と市場などのテーマに絞って調査をおこなった。当該地域における地域別・分野別の調査・研究はこれまでないために、変貌を余儀なくされている伝統的村落の科学的解明に向けて居住環境に関しては多くの基礎データを収集できた。このデータは次年度の土着技術、社会・経済、地形、土壌、植生・森林、水利環境など6分野において総合的に調査・研究する事前準備は整ったといえる。本年度はカンボジア西北部のシェムリアップ州北スラスラン村の高床住宅、トンレサップ湖沿岸の杭上住宅、ベトナム北部バクニン省ティエンソン県ディンバン社を中心とした地域のディン(亭)、土間式住宅の調査をおこなった。カンボジアでは文化・情報省、アプサラ(アンコール地域遺跡整備機構)の協力を得て調査を実施、ベトナムでは社会科学院、考古学院の協力を得た。

昨年に引き続き、カンボジアでは民家の分布と平面解析、大工技術などについて実測、聞き込みを行った。ベトナムでは集落の中心となっているディン(亭、村落集会所)の調査を起点として、各村落の居住環境調査を行った。とくに、亭などの公共建築に関わった大工集団と村との関係資料を収集した。もう一つは、村落集会所(ディン)など木造建築遺構の平面図、断面図、断面詳細図、拓本などである。とくに考古学院の配慮で貴重な写真などを多数撮影し、フォトCD化してベトナム側と共有した。また、ディンバン村のディンには創建時とみられる村人の寄進銘が多数発見され、氏族グループの解明の手かがりをえた。次年度に社会・経済班の協力を得てこれらの氏族グループの追跡を行いたい。本年度はカンボジア西北部のシェムリアップ州北スラスラン村の高床住宅、トンレサップ湖沿岸の杭上住宅、ベトナム北部バクニン省ティエンソン県ディンバン社を中心とした地域のディン(亭)、土間式住宅の調査をおこなった。カンボジアでは文化・情報省、アプサラ(アンコール地域遺跡整備機構)の協力を得て調査を実施、ベトナムでは社会科学院、考古学院の協力を得た。昨年に引き続き、カンボジアでは民家の分布と平面分析、大工技術などについて実測、聞き込みを行った。ベトナムでは集落の中心となっているディン(亭、村落集会所)の調査を起点として、各村落の住居環境調査を行った。
寒冷な環境下での野外石造遺跡の保存法についての研究

北海道には、野外の石造遺跡として、小樽市手宮洞窟、余市町フゴッペ洞窟などがある。いずれも、第三紀凝灰岩から構成され、劣化に対しての抵抗性は弱い。こうした石造遺跡の劣化の要因として、北海道では冬季の寒冷条件が考えられる。そこで、遺跡周辺の環境条件特に冬季の温度変化を掌握し、次に岩石が凍結によって破砕される機構や過程についての現地観測に基づく推定・考察を行った。小樽市手宮洞窟の内外に温度センサーを設置し、ほぼ二年間の温度計測を実施した。その結果、外壁ではかなりの回数での凍結-融解の繰り返しが発生していることが分かった。どの程度の温度変動に対して凍結破砕が発生するかについて、実験を行ったところ、日変動が-5°C+5°CK範囲を越えると破砕が有効に発生することが分かった。そこで全国的なこうした凍結-融解の発生頻度分布をAMEDASデータに基づいて推定した。北海道では最大で20回程度、小樽では6回程度出現するとが判明した。遺跡の長期保存法としては、環境制御によってこうした凍結-融解が発生しないような、人工的環境を実現するのが有効である。直接的に劣化した岩石に対して、合成樹脂を塗布し、凍結抵抗性を増加させるための基礎実験を併せて行った。エポキシ樹脂、アクリル樹脂シリコン樹脂の3種について、その有効性の試験を行った。その結果シリコン樹脂(SS-101)が最も有効であることが判明した。凍結抵抗性が発生するメカニズムとしては、単に劣化した岩石の強度を補強することによるのではなく、むしろSS-101の持つ撥水性によることが分かった。北海道との対比で、中国敦煌莫高窟の遺跡の保存状態について、比較研究を行った。乾燥した条件が石造遺跡の保存に有利に働いていることが確認された。本年度は凍結-融解によって破砕されやすい岩石試料として、栃木県大谷産の凝灰岩を選び、その物理的性質を実験的に求めた。とくに、新しく国立東京文化財研究所が開発したシリコン系合成樹脂(SS-101、メチルエチルトリキシシラン)を塗布し、その結果岩石表面に吸着した水分量の変化を、あらたに研究所に導入されたパルス型NMRで測定した。凍結時に岩石内で破砕が発生するのは、土の凍上現象と同じように、0°C以下でも液体状態の水(不凍水)が存在しているからである。凍結時に発生する試料内の温度勾配に沿って、この不凍水の化学ポテンシャル勾配が発生する。そのため、より低温側でポテンシャルが低くなるために水分輸送が起こり、岩石内の氷の形成とそれに伴う凍上力が岩石の力学的強度を超えると破砕が発生する。こうした破砕のメカニズムを確認するため、シリコン系樹脂で表面構造を変化させ、それを定量的に把握するためにパルス型NMRによる実験を行った。結果はおおよそ予想通りで、樹脂含有量の増加に伴い不凍水分量は現象した。さらに凍結時に発生するクラックとその発生時温度を知るためにアコーステックエミッシオン(AE)の測定を行った。岩石内2cm位置で氷の集積が確認されたが、その際に200-500cpmのAEを観測した。この時の推定凍上力は1.4MPaで、岩石の引張り強度にほぼ等しくなった。以上の結果をGround Freezing誌へ発表した。小樽市手宮洞窟などの現地調査も併せて実施した。(1)寒冷地域での石造遺跡保存の調査小樽市の手宮洞窟の保存についての基礎研究を2ケ年にわたって実施した。調査の内容は、洞窟基盤の温度、湿度、変位、地下水位の各季節変動である。現地調査は、遺跡を管理する小樽市教育委員会の協力を得た。記録期間は1994年5月-1995年3月である。これらの記録について解析を行っている。

(2)風化基盤岩石の物理的性質の計測手宮洞窟を構成する基盤岩体(新生代第三紀凝灰岩)から20mのボーリングコアー採取を行い、これらのサンプルについての空隙率、超音波伝播速度の物理計測を行った。その結果、空隙率が20%を超え、また超音波伝播速度も1.5km/sec以下であることから、風化に伴う空隙孔の拡大と造岩鉱物の化学的溶脱が進行していることが分かった。こうした物理的性質を反映して、現地での洞窟背後からの地下水浸透とそれによる塩類の集積がさらに岩石の劣化を促進するものと判断された。(3)合成樹脂による劣化岩石の処置とその評価風化し劣化した岩石をシリコン樹脂(メチルエチルトリキシシラン-SS-101)で処理すると、凍結破砕への抵抗性が増加することが知られている。そこで手宮洞窟の場合にも、この樹脂による効果が発生するかの判定試験を行った。処理後の含脂率は8-12%であった。他の樹脂(アクリル系やエポキシ系)と比べて、シリコン系樹脂は岩石への浸透性に優れる。凍結-融解試験(-10°C+10°C)で10サイクルの試験を行った。底部にクラックが発生した1試料を除いて、凍結による破砕は生じることはなく、シリコン系樹脂の有効性が確認出来た。(4)結果のまとめ手宮洞窟の管理者(小樽市教育委員会)の協力を得て、現在調査報告書をまとめつつある。6月中旬には出版する予定である。
女性アスリートの低用量ピル活用プログラムの提案

本研究は女性アスリートを対象に、Female Athlete Triad(以下FAT)と月経前症候群(以下PMS)の改善に関する低用量ピル(以下OC)の活用を検討することを目的とした。その結果、FATアスリートはOCを服用することで骨密度が高まり、骨吸収が抑制され、骨質も有意に上昇した。またPMSアスリートは、「体重が増える」「首や肩がこる」といった身体症状6項目と、「泣きたくなる」「勉強などへの根気がなくなる」といった精神症状6項目が有意に低下し、経血量も有意に減少した。このことより、OCはFATアスリートの骨の保護(疲労骨折の予防)や、PMS症状を軽減させる可能性が示唆された。本研究は女性アスリートの低用量ピルの服用による骨密度の変化を検討した。方法は女子長距離ランナー12名を正常月経群7名と無月経で医師の診断により低用量ピルを処方された5名(以下ピル群)に分類し、骨密度、身体組成およびホルモンを測定し、10ヶ月後の変化および群間の比較をおこなった。その結果、正常群は体重48.5±3.24kg、体脂肪量8.5±1.56kg、除脂肪量40.1±3.31kg、体脂肪率17.6±2.06%、ピル群は体重51.5±4.15kg、体脂肪量9.8±4.19kg、除脂肪量41.7±2.20kg、体脂肪率18.6±6.88%であり、両群に差はなかった。正常群はLH2.64±0.93mIU/ml、FSH3.71±0.90mIU/ml、E220.71±9.48pg/ml、PRG0.47±0.21ng/mlで、ピル群はLH8.26±9.62mIU/ml、FSH3.83±2.57mIU/ml、E2 18.40±5.73pg/ml、PRG0.0.51±0.40ng/mlであり両群に差はなく、両群ともにE2が低い傾向がみられた。骨密度は、正常群の事前値が腰椎0.945±0.08 g/cm2、10ヶ月後0.963±0.08 g/cm2、大腿骨の事前値0.842±0.08 g/cm2、10ヶ月後0.864±0.08 g/cm2、ピル群の事前値は腰椎0.947±0.08 g/cm2、10ヶ月後0.993±0.10 g/cm2、大腿骨の事前値0.912±0,08 g/cm2、10ヶ月後0.974±0.10 g/cm2であった。群間および両群ともに事前と10ヶ月後に差はなかったが、両群ともに骨密度が低い傾向がみられた。また、正常群の腰椎骨密度は事前値に比べ10ヶ月後に低い傾向(p<0.07)がみられ、ピル群の大腿骨骨密度は事前値に比べ10ヶ月後に高まる傾向(p<0.06)がみられた。本研究は女性アスリートの低用量ピルの服用による骨密度等の変化を検討した。方法は女子長距離ランナー10名を正常月経群5名と無月経で医師の診断により低用量ピルを処方された5名(以下ピル群)に分類し、骨密度(腰椎)、身体組成および骨代謝マーカー等の測定し、10ヶ月後、16ヶ月後、21ヶ月後の変化および群間の比較をおこなった。その結果骨密度は、正常群の事前値が0.900±0.016g/ cm2、10ヶ月後0.920±0.028 g/cm2、16ヶ月後0.925g/0.012 cm2、21ヶ月後0.933±0.019g/ cm2であり、有意(p<0.05)に上昇した。ピル群の事前値は0.884±0.420g/ cm2、10ヶ月後0.993±0.10 g/ cm2、10ヶ月後0.912±0.107g/ cm2、ピル16ヶ月後0.948±0.090 g/ cm2であり、事前値に比べ10ヶ月後に骨密度が高まる傾向(p<0.07)がみられた。また群間の交互作用はみられなかったが、正常群に比べピル群の方が有意(p<0.05)に骨密度が低い集団であった。骨吸収を表す尿NTXは、ピル群の事前値が53.30±27.66nmolBCE/mmolCREで10ヶ月後に28.26±11.46nmolBCE/mmolCREに有意(p<0.05)に低下がみられた。このことより、無月経アスリートはピルの服用10ヶ月後に骨吸収が抑制され、ゆるやかに骨密度が高まる可能性が示唆された。大学生女子長距離ランナーで、正常月経および無月経を有する対象者に対し、年間を通した統制と定期的な測定を実施することができている。そのことにより、着々とデータを増やすことができている。また、先行研究で「低用量ピル服用による骨密度増加」に否定的な研究者にインタビューをしたところ、「骨密度だけを見るのではなく、骨代謝マーカーをおさえることで新たな知見がみられるかもしれない」とアドバイスをもらった。

本データもみてもらい、非常に興味をもってもらった。対象者数が増えることで、かなり高い確率で仮説を検証できるのではないかと考えている。<目的>Female Athlete Triad(以下FAT)の改善は「エネルギーの充足=食習慣の改善」となるが、時間がかかるため、日本ではその間にOral Contraceptives(以下OC)を服用するのが一般的である。しかし、OC服用期間と骨への効果については明らかにされていない。そこで本研究は、無月経女性アスリートのOC服用による骨動態の変化を検討しOC活用プログラムを提案することを目的とした。<方法>対象者は大学生女子中長距離ランナー10名であり、月経のある正常群5名と、視床下部性無月経で医師よりOCを処方されたOC群5名に分類した。測定項目は、腰椎骨密度測定、体組成の測定、血液検査、尿検査、および自作の調査票であった。これらを、実験前、10ヶ月後、16ヶ月後、21ヶ月後に実施した。<結果>事前値は、腰椎骨密度は正常群(0.900±0.02g/cm2)、OC群(0.89±0.12g/cm2)ともに1.00 g/cm2の基準を下回っており、エストロゲン値(E2)は無月群、LEP群ともに、日本臨床スポーツ医学会が「疲労骨折のハイリスクグループ」と定める20pg/mlのレベルであった。腰椎骨密度は時間にのみ主効果が認められ、OC群は事前値と10ヶ月後に有意な差(p<0.05)がみられた。尿NTXは、OC群にのみ事前値に比べ10ヶ月後に有意(p<0.03)に低下がみられた。また、ペントシジンは、OC群のみ有意(p<0.007)に上昇し、正常群とOC群の10ヶ月後の値に有意(p<0.01)な差が認められた。体組成は、両群ともに有意な差はみられなかった。<考察>このことより、無月経ランナーは食習慣の改善がみられるまでの間、OCを服用することで、「骨の保護=疲労骨折の予防」に貢献する可能性が示唆された。本研究は女性アスリートを対象に、Female Athlete Triad(以下FAT)と月経前症候群(以下PMS)の改善に関する低用量ピル(以下OC)の活用を検討することを目的とした。その結果、FATアスリートはOCを服用することで骨密度が高まり、骨吸収が抑制され、骨質も有意に上昇した。またPMSアスリートは、「体重が増える」「首や肩がこる」といった身体症状6項目と、「泣きたくなる」「勉強などへの根気がなくなる」といった精神症状6項目が有意に低下し、経血量も有意に減少した。このことより、OCはFATアスリートの骨の保護(疲労骨折の予防)や、PMS症状を軽減させる可能性が示唆された。本研究の目的達成のため、順調にデータ取りができている。今後は対象者の健康状態およぼび運動量を統制しながら、定期的なデータ収集を実施する。そして、できるだけ早くデータをまとめ、「低用量ピル服用で骨密度は上昇しない」という欧米諸国での定説に対し、日本の女性アスリートの骨密度の変動について、骨代謝マーカーを用いて説明したい。さらに、PMS(Premenstrual syndrome)症状のある女性アスリートに対する低用量ピル服用の効果についても検討をすすめている。女性スポーツ、コーチング科学今後は対象者を増やし、データを蓄積することにより、データの精度が高まると思われる。学会発表および論文作成を同時進行し、他の研究者から広く意見をもらいながら進めていきたい。
造血細胞の運命を決定するエンハンサーの同定とその制御機構の解明

我々は独自の先行研究において、LSD1阻害剤によって白血病細胞が分化誘導されることを明らかにした。LSD1は活性化ヒストン修飾を消去する方向に働くヒストン修飾因子である。阻害剤投与後の活性化ヒストン修飾マーカーH3K27acの変化をクロマチン免疫沈降(CHIP)法で解析すると、GFI1遺伝子座近傍に位置するスーパーエンハンサーが著しく再活性化されることが明らかとなった。GFI1は好中球分化に必須のマスター転写因子であるので、GFI1スーパーエンハンサー(GFI1-SE)に着目して、白血病における役割を解明することとした。LSD1阻害剤に感受性がある白血病細胞株では、GFI1-SEがLSD1阻害剤によって活性化しGFI1の発現が上昇していたが、感受性がない白血病細胞株では、GFI1-SEは活性化されず、GFI1の発現も上昇しなかった。感受性を示す細胞株において、複数のマスター転写因子がGFI1-SEに結合していたが、定常状態でGFI1-SEを活性化することはできなかった。しかし、LSD1阻害剤を投与した後に、ChIP法でGFI1-SE上の分子の結合・離脱状況を詳細に検討した結果、新たに転写因子がリクルートされることはなく、かわりにLSD1, CoREST, HDAC1, HDAC2といった転写補酵素群がGFI1-SEから外れることが明らかとなった。GFI1-SEを遺伝子編集技術でノックアウト(GFI1-SE-KO)した白血病細胞株を樹立して、LSD1阻害剤を投与したところ、白血病細胞の分化誘導が起こらなくなった。遺伝子プロファイリングによって、LSD1阻害剤で誘導される好中球分化に関わるプログラムが、GFI1-SE-KOでは誘導されなくなることが明らかとなった。以上から、GFI1-SEは、LSD1阻害剤が白血病細胞の分化誘導を行う上で重要な標的ゲノム領域であることが判明した。先行研究において、我々はLSD1阻害剤によって白血病細胞が分化誘導されること、複数の分化誘導遺伝子のスーパーエンハンサー(SE)が脱抑制されること、を発見した。そこで本研究の第一の目的は、造血分化に必須な遺伝子のSEが、LSD1によって選択的に抑制されることが白血病発症に重要であると仮設し、これを証明することとした。本年度は、先行研究で同定した造血分化に必須の転写因子GFI1のスーパーエンハンサー(SE)に注目して次の実験結果を行った。1白血病細胞株において、CRISPR/CAS9システムを用いてGFI1-SEのノックアウト細胞株を樹立した。2この細胞株にLSD1阻害剤で処理しても最早分化誘導は起らないことを確認した。3LSD1阻害剤添加後の遺伝子プロファイリング比較の結果、GFI1-SE-KOマウスでは白血病プログラムが維持されることを確認した。以上の結果は、GFI1-SEを一つ欠失するだけで、白血病細胞の薬剤による分化誘導が消失してしまうことを示しており、このSEが白血病維持に関わっている可能性を強く示唆する。本研究の第二の目的は、LSD1複合体を同定し、SEがLSD1によって抑制される詳細なメカニズムを明らかにすることとした。LSD1に対する免疫沈降産物を用いて、質量分析を行ったところ、既知のクロマチン調節因子の他に、これまでLSD1との結合が報告されていない造血に必須の転写因子が複数同定された。この結果は転写因子とLSD1が協調してSEの制御に働いている可能性が示唆された。当初計画の白血病細胞株でのスーパーエンハンサーノックアウト細胞の樹立と分化誘導実験はほぼ終了し、想定通りの結果が得られた。また質量分析によるLSD1複合体の同定も当初計画の通り進行し、候補となる転写因子の同定もできている。我々は独自の先行研究において、LSD1阻害剤によって白血病細胞が分化誘導されること、特定の造血分化関連遺伝子が白血病細胞株において共通して上昇すること、それら遺伝子のスーパーエンハンサー(SE)が特異的に脱抑制されること、を明らかにした。そこで本研究では、1LSD1の支配下にあるSEが白血病や造血分化異常に果たす役割を明らかにすること、2なぜ特異的なSEがLSD1阻害剤によって脱抑制されるのかを解明すること、を目的として研究を行っている。1については、好中球分化に必須の転写因子GFI1のSEがLSD1阻害剤によって脱抑制される白血病細胞株だけで、LSD1阻害剤による白血病細胞の分化誘導が認められた。次に、Gfi1のSEをCISPR-CAS9システムを用いてノックアウトしたマウス(Gfi1-SE-KO)を作出した。造血幹細胞・前駆細胞でGfi1の発現が予想通り低下することが確認された。好中球数の異常や幼弱細胞の増加などといった変化は、これまでのところ認められないが、造血幹細胞に対する影響について、現在検討を行っている。2については、LSD1を中心としたSEを制御する分子メカニズムを解明することに取り組んだ。具体的には、白血病細胞の溶解物を用いてLSD1に対する免疫沈降を行い、その免疫沈降産物を質量分析計にて網羅的に解析した。すると複数のLSD1と結合する因子が同定され、その中には造血分化の決定に重要な転写因子が含まれていた。また我々のLSD1阻害剤は、特定の転写因子とLSD1との結合のみが阻害されることも発見した。この結果は、白血病発症の主要メカニズムの一つである分化停止は、少なくともいくつかの白血病細胞において、LSD1と特定の転写因子との協調作用に依存しているらしいことが判明した。