hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
在宅緩和ケアの質の簡便な評価方法の開発

在宅緩和ケアを専門的に提供する在宅療養支援診療所16施設から在宅診療を受け自宅死亡/在宅診療中止となった終末期がん患者911名を対象とした診療記録調査と、その自宅死亡患者の遺族175名を対象としたアンケート調査のデータを分析した。結果、終末期QOLの関連要因は明らかとならなかったため在宅緩和ケアの質の簡便な評価方法は開発できなかったが、在宅緩和ケアの実態の簡便な調査票の開発、在宅死亡の関連要因の同定、終末期の在宅ケアや介護負担の遺族評価の関連要因の同定を行うことができた。本研究は、信頼性、妥当性、実施可能性の保証された在宅緩和ケアの質の簡便な評価方法を開発することを目的とする。研究年度2年目では、在宅緩和ケアの質の評価項目案の信頼性・妥当性・実施可能性の検討として前向き調査を行った。具体的には、研究年度1年目に開発した調査票を用いて、在宅緩和ケアを受けて死亡した患者を対象に前向きカルテ調査を行った。【対象】対象施設は、終末期がん患者に専門的な在宅緩和ケアを提供する診療所の全国的な組織である緩和ケア診療所連絡協議会の会員施設のうち調査に協力した18施設とした。すべての施設が年間看取り数20名以上の在宅療養支援診療所である。対象者は、対象施設から在宅診療を受け、2013年6月11月に死亡・在宅診療中止した全てのがん患者とした。【方法】対象患者の死亡・在宅診療中止時に前向きにカルテ調査を行った。なお、在宅診療中止とは、在宅診療の中断後に在宅診療が再開されなかった場合とした(例:レスパイト入院などは含まない)。カルテ調査は、対象施設の事務職員または医療者が行った。倫理的配慮として、東北大学大学院医学系研究科倫理委員会の承認を得た。また、研究の目的や方法、対象者となることなどについて被験者となる患者に対してポスター掲示やホームページ掲載によって情報提供を行った。【項目】患者・家族背景、転記、在宅診療中止理由、療養場所の希望、症状、利用サービスなど【現在の進捗と来年度の計画】2014年3月末時点で、参加18施設のうち16施設から調査票を回収した。全施設から回収し次第、各施設に報告書をフィードバックする。研究年度3年目は、カルテ調査参加施設のうち協力の得られた施設で遺族調査を行い、在宅緩和ケアを受けた終末期がん患者のQuality of Care (QoC)やQuality of Life (QoL)の実態を明らかにする。カルテ調査のデータと連結し、QoLやQoCの関連要因を分析し、在宅緩和ケアの質の評価指標を同定する。初年度である平成24年度では、在宅緩和ケアの質の評価項目案の作成を実施計画した。まず、終末期医療、緩和ケア、在宅緩和ケアの質評価に関する文献レビューと緩和ケアに関する研究者と在宅緩和ケアに従事する医師のフォーカスグループインタビューを実施し、在宅緩和ケアの質の指標または実態を表す項目を内容的妥当性・網羅性・実施可能性の観点から抽出した。その結果、在宅緩和ケアの質の指標を抽出することは難しく、在宅緩和ケアの実態を表す項目を抽出できた。次に、専門的な在宅緩和ケアを提供する在宅療養支援診療所1施設の診療を受け、ある1か月間に死亡したがん患者を対象に、作成した項目案を実際に測定して表面的妥当性と実施可能性を検討した。以上から、在宅緩和ケアの実態調査の項目案を作成した。さらに、当初の計画では平成25年度に実施予定であった項目案の前向き実測調査を1年前倒しして行った。対象施設は、1年間に30名以上の看取りがん患者数を有する在宅療養支援診療所6施設であった。対象施設の医師が診療した終末期がん患者のうち、平成24年度の6か月間に死亡したまたは在宅診療を中止した患者について、作成した在宅緩和ケアの実態調査の項目案を測定した。調査票は、施設の医療者が前向きに記入した。また、評価者間信頼性の検討のため、施設とは独立した調査員が同様の患者について調査票を記入した。平成24年度末時点で、前向き調査の調査結果を分析中である。平成24年度は、文献レビューとフォーカスグループインタビューから在宅緩和ケアの質の指標・実態をあらわす項目を抽出して調査票を作成し、専門的な在宅緩和ケアを提供する在宅療養支援診療所1施設でのパイロット調査により表面的妥当性と実施可能性を確認した。平成25年度は、年間看取り数30名以上の在宅療養支援診療所16施設の在宅診療を受けて2013年6月11月に在宅診療中止・終了したがん患者を対象に、作成した調査票を用いた前向き調査を行った。平成26年度は、前向き調査の統計解析と前向き調査の対象者のうち死亡したものの遺族を対象とした緩和ケアの質評価の質問紙調査を行った。なお、遺族質問紙調査は、本研究の対象者を対象とする同内容の遺族調査が別の研究組織により実施されたため、その遺族調査データを二次利用することとした。【前向き調査の結果】2013年6月1日11月31日に在宅診療を終了・中止した全がん患者911名について前向きに診療録調査を実施した。

在宅診療の転帰は、自宅死亡792名(87%)、在宅診療中止119名(13%)であった。在宅診療中止の89%が入院のためで、そのうち38%(40名)が看取り目的の入院であった。施設を変量効果とした多重ロジスティック回帰分析により、患者・家族の看取り場所の希望、在宅診療開始時の呼吸困難感や全身状態の低下、配偶者が主介護者で介護力に問題がないこと、在宅療養中の入院歴が独立した関連要因であった。【遺族質問紙調査の概要(他研究組織が実施)】前向き調査の対象施設のうち「遺族によるホスピス・緩和ケアの質の評価に関する研究」への参加に同意した任意の6施設で、各施設にて2014年1月31日以前の死亡した患者80名の遺族を対象とし、緩和ケアの構造・プロセス・アウトカム評価について自記式質問紙調査を行った。平成2627年度には、平成25年度に行った診療記録調査データの分析と診療記録調査の対象患者の遺族アンケート調査データの分析を行った。【診療記録調査データの分析】(対象)対象施設は、年間看取り数が30名以上の任意の在宅療養支援診療所16施設とした。対象者は、対象施設から在宅診療を受け、2013年611月に死亡または在宅診療を中止した全がん患者911名であった。(手順)対象者の死亡または在宅診療中時に対象施設の医療者が前向きに調査票に記入した。(項目)患者・家族・介護背景、在宅診療開始時の患者・家族の問題、在宅診療の転帰などを調べた。(分析)在宅診療の転帰を在宅死亡(老人ホーム含む)と在宅診療中断の2値変数とし、在宅死亡の関連要因を探索した。(結果)多変量解析の結果、患者・家族の看取り場所の希望、呼吸困難や嘔気の問題、介護者不在の問題、在宅診療中の入院歴が自宅死亡/在宅診療中止の独立した関連要因であった。【遺族アンケート調査データの分析】(対象)診療記録調査対象施設のうち、6施設が遺族アンケート調査に参加した。対象施設から在宅診療を受け2013年6月11月に在宅死亡した363名のうち、175名(48%)から有効回答を得た。(方法)患者の主介護者であった遺族対象の自記式質問紙調査を行った。(項目)終末期のケア評価尺度Care Evaluation Scale, CES、終末期のQOL評価尺度Good Death Inventory, GDI、終末期の介護体験評価尺度Care Consequence Inventory, CCIを用いた。(分析)CES、GDI、CCIの関連要因を探索する。(結果)多変量解析の結果、CESやCCIの介護負担には患者の年齢や性別、患者や家族の看取り場所の希望等が独立した関連要因であり、GDIには患者の年齢・性別のみが独立した関連要因であった。在宅緩和ケアを専門的に提供する在宅療養支援診療所16施設から在宅診療を受け自宅死亡/在宅診療中止となった終末期がん患者911名を対象とした診療記録調査と、その自宅死亡患者の遺族175名を対象としたアンケート調査のデータを分析した。結果、終末期QOLの関連要因は明らかとならなかったため在宅緩和ケアの質の簡便な評価方法は開発できなかったが、在宅緩和ケアの実態の簡便な調査票の開発、在宅死亡の関連要因の同定、終末期の在宅ケアや介護負担の遺族評価の関連要因の同定を行うことができた。
フックス群と位相共役なPL同相群に関する研究

一般のフックス群がPL化可能かという問題は非常に難しく一部のものがPL化可能である事が知られているだけである。実際,Ghys,Sergiescu 3によりSL(2,Z)が、またGhys松元、皆川により種数2以上の閉曲面上の双曲構造から得られるFuchs群はPL化可能であることが知られている。1つめのPL化は、treeのendに使用する群としての構造を用いたものであり、2つめは、有界コホモロジーを用いたものである。そこには、どちらにも双曲幾何が深く関係していると思われるのだが、今のところ、これといった共通性は見いだせない。これは大問題である。最近橋口,BrunelaによりAnosou流を用いた方法で三角群のPL化が独立に発見されているようである。私は、Ghys松元、皆川で用いた方法がココンパクトなフックス群に拡張できるのではないかという視点で研究を進めている。ココンパクトなフックス群は結晶群の構造をもつ。結晶群に対してはHomeo+S^1への表現に対してオイラー数が定ギできるが、これに対し、Milnor-Wood型の不等式が成立することがわかる。これが1つめの結果である。フックス群に対しては、自然に不等式が極大となる結晶群からの表現が見つかる。次が2つめの結果で、各結晶群からオイラー数が極大となるPL表現が存在する。これらは全てフックス群と位相共役になると予想される。今後の課題としては、これらのPL表現から得られる葉層S束を調べる必要がある。そのために、現在はそれらの表現がフックス群の場合と同様に単射になるかを調べている最中である。これは大問題である。
シンセティックCADのためのモデリング要素「知能モデロン」の開発

CAD(Computer Aided Design)の原点に帰って設計者の助けとなるシステムの開発を行わねばならない。これまでのシミュレ-タとしてのCADからさらにシンセシスが可能なCADへと発展させることが要望されている。本研究の目的はシンセティックCADを目指して知能化したモデリング要素“モデロン"とその作業空間としての知能環境を開発することである。設計者が彼の要求をそこに置けばモデロンが自発的に反応し、シンセティックに設計が進行するような環境である。ここでモデロンは次のように作業する。(1)モデロンが要求に答えられるとき、その答えを環境に返す。(2)モデロンが要求に答えるために必要な要求は他のモデロンへの要求として環境に置く。以上の要求と反応によって設計作業は進行し、最終的に設計者が必要としているものが得られる。この報告は開発した具体システムの仕様を中心に次の3部で構成される。第I部:知能モデロンシステムの概要第II部:開発した知能モデロンシステムの仕様第III部:知能モデロンに関する研究発表CAD(Computer Aided Design)の原点に帰って設計者の助けとなるシステムの開発を行わねばならない。第I部:知能モデロンシステムの概要第II部:開発した知能モデロンシステムの仕様第III部:知能モデロンに関する研究発表この研究は、モデロンと呼ぶモデリングエレメントにシンセシス機能としての自律性と自己組織化性を付与し、これを知能モデロンと呼んで、設計仕様に知能的に対応することを方法論の基礎とする。本年度は知能モデロン開発ツ-ルと知能モデロンベ-スの開発を行った。(1)知能モデロン開発ツ-ルモデロンの作成を助けるツ-ルであり、Xウインドウ環境下で設計者が対話によって作成するシステムを開発した。すなわち、モデロンはモデロンで構成されるという階層構造を成すので、OPEN MODELON<モデロン名>により新モデロンを開き、これにCALL MODELON<モデロン名>でモデロンベ-スから適当なモデロンを呼びこみ、これにオペレ-ションと称して準備した各種ユ-ティリティを配して、モデロン間の相互通信による組織化を行わせるようにした。相互通信はワ-キングスペ-スに要求メッセ-ジを置くとき、各モデロンがその知能によって判断して自発的にそれらを取り込み、情報を交換することによって行われる。すなわち自己組織化が実現している。なお、階層の最下位のモデロンをモデロン素と呼び、それぞれ問題向きに適当なプログラムを与えなければならない。(2)知能モデロンベ-スの開発知能モデロンを登録、管理すると同時に知能的検索システムを備えてモデロンの効果的検索を行わせるシステムである。CLOSE MODELONによってOPENに始まるすべてのステ-トメントを登録する。モデロンベ-スにおいてもその基本は自発性にある。検索要求のメッセ-ジに対応して自発的に対応するモデロンが名乗りを昨年度行った知能モデロン開発ツ-ルと知能モデロンベ-スの基本設計と詳細設計に基づき、本年度はそのコ-ディングを行うと共にその性能について実験を行い、次のような具体的成果を得た。1.知能モデロン開発環境の作成:知能モデロンは知能化したモデリング要素であり、CADにおいて対象とする設計モデルの要素毎にそれぞれの具体的な特性を基礎にして作成する必要がある。この作業を援ける目的で開発ツ-ルを作成した。LISPをベ-ス言語として用い、知能モデロンそのものはCやFORTRANによる記述を可能とした、モデロンベ-ス、モデロン辞書、オペレ-ション記述用ユ-ティリティ関数群、オペレ-ション関数群を用いて、モデロンの定義機能と、モデロン辞書作成機能を実現した。2.モデロン実行環境の作成:モデロン開発環境で作成したモデロンを呼び出し、実行する環境である。これをLISP上でモデロンコマンドインタプリンタを実装することにより実現している。3.システムの性能検定:本システムが特徴とする項目のうち次の2点について性能実験を行い、当初目標を一応満たすことが確認された。(1)自発的発火と要求駆動型発火;モデロン自身が自分の環境と自分自身の手続きの発火条件を参照して能率的に発火するしくみ(自発的発火)と他のモデロンからの要求により強制的に発火するしくみ(要求駆動型発火)の二つの仕組みについて性能検定を行い、所定の機能の実現を確かめた。(2)無指定の相互通信;

通常の通信に見られるような送信先を指定することなく、不特定な相手に向けての通信によって所定の処理が行えるしくみについて性能を検討し、十分機能することを確かめた。CAD(Computer Aided Design)はモデリング技術を核として構成される。現在まで発展してきたシミュレ-ション型CADにおいてもモデリング技術が中心的役割を果たしてきたが、シンセシス型CADに対しては、その同じモデリング技術を適用するだけでは不十分で、新しいモデリング技術の開発が必要である。本研究はモデルがモデリング要素「モデロン」の集合によって構築されるものとしたとき、各モデロンにシンセシス機能としての自律性と自己組織化性を付与し、これを知能モデロンと呼んで設計仕様に知能的に対応することを方法論の基礎とする新しいシンセティックCADの方法を提案することを目的として、次の5項目の研究を遂行した。(1)知能モデロン開発ツ-ルの作成(2)知能モデロンベ-スとそのマネ-ジメントシステムの開発(3)知能モデロンによるシンセティックCAD実行システムの開発(4)主な機械要素、すなわち、軸受、歯車、軸、軸継手等の知能モデロンを作成する。(5)ウインチの設計を例にとって本システムの性能実験を行う。昨年度までの研究として「知能モデロン開発ツ-ルの開発」と「知能モデロンベ-スの開発」を目標に本研究のインフラストラクチュアの開発を行ってきた。本年度は計画の最終年度として、上記の各システムを完成すると共に、これを利用して具体システムのプロトタイプを作成し、シンセティックCADが実現することを検証した。すなわち、主な機械ユニット、軸、軸継手、軸受、歯車減速機構、ブレ-キ、モ-タ、ドラム、ロ-プなどの知能モデロンを作成し、これを用いてウインチのシンセティックCADを進める実験を行った。得られた結果は本システムがほぼ所期の目的を達したと考えている。
養分動態の特徴を反映する植物根圏の画像の収集と栄養診断への応用

植物根圏はある土壌環境に生育する植物の個有の領域であり、いわばいろいろな表情を見せる植物と土壌の顔である。根圏のpHは植物の栄養条件の嗜好性や選択性によって独特のパターンを示す。また、根圏pHの変化はある栄養環境にさらされた時の植物の一つの応答でもある。したがって、根圏pHは、因果関係の特定はできないが、植物の栄養状態を把握するためのマクロな指標、いわば根圏の「顔色」と位置づけられる。そこで根圏pHに着目し、その変化のパターンを画像として観察し、土壌一植物系の栄養状態を評価する方法を考案した。作物、雑草、緑肥用植物などの硝酸態窒素とアンモニア態窒素の嗜好性を調べた。また、アミノ酸やタンパク質を窒素源とした場合の植物根圏pHの変化、鉄欠乏植物の植物根圏pHの変化、リン酸欠乏および難溶性リン酸塩に対する植物pHの変化について観察した。コムギは硝酸態窒素が多い培地にあってもアンモニア態窒素などのカチオンの吸収能力が高いため、コムギの根圏pHは水耕液供給後、一旦低下した後に再び上昇する。一方、ハクサイは窒素源として硝酸態窒素が多い培地におけるアンモニア態窒素などのカチオンの吸収能力はコムギほど高くないため、根圏pHは常に上昇すると解析した。検定した植物の多くはコムギと同じタイプであること、マメ科植物の根圏pHは低いこと、鉄欠乏やリン酸欠乏によって根圏は酸性化されること、難溶性のリン酸塩に遭遇すると根圏pHは低下することを明らかにした。従来、根色などを「定性的」に評価して、根の健全性を判断してきたが、画像処理を用いることによって[定性的」な判断を「定量化」することができる。画像には多くの情報が含まれるので、画像処理法は現場での土壌・作物の栄養診断技術への活用が期待される。水耕法は養分環境を設定しやすく、植物根をインタクトなまま取り出せるので植物根の観察によく用いられるが、水耕法では根を水耕液中に浮遊させることになるので、2次元および3次元的に展開した根系を得ることはできない。水耕に近い条件でインタクトな根系を得るためには、砂、バ-ミキュライト、パ-ライト、ロックウ-ル、ガラスビーズやウレタン樹脂などを根の支持体として利用するがこれらは、養分環境を設定しやすく、インタクトな植物根を取り出せるという水耕法の利点を失わせる。また、根圏の養分環境を可視的にとらえるために根系プロフィールに直接的に着色する場合に、これらは必ずしも都合のよい素材ではない。野菜や挿し木苗の育苗に用いられる発砲フェノール樹脂は、固相率が低く、表面はウレタン樹脂よりもなめらかで吸水性がよいので水耕に近い条件でインタクトな根系を得ることができる、かつ根系プロフィールを直接的に着色するのにも都合のよい素材である。そこで発砲フェノール樹脂で根箱を作成し、発色薬で根系プロフィールを着色して、根圏のpHや養分の分布を可視的に観察する方法を考案した。前年度開発した、発泡フェノール樹脂による根系プロファイルの観察手法を、シコクビエの根系観察に応用した。シコクビエは、アフリカミオンボ地帯で、焼畑約1ヶ月後に播種されるが、その植物生理学的特性はまだ解明されていない。焼畑後しばらく放置することにより、焼土効果により土壌中に放出されたアンモニア態窒素が硝酸化成を受けることが報告されている。このことから、培養液中の窒素濃度や窒素肥料の種類を変化させ、シコクビエの根系プロファイルを観察することによって、最適窒素濃度および最適窒素形態を推定した。

さらに、焼却灰により添加された養分の有効利用法を、pH指示薬を含んだ寒天培地上にシコクビエを栽培し、その根圏pHの変化を観察することから検討した。また、各種土壌環境における植物の栽培とその根圏画像の収集および分類法に関して、研究手法の開発を行った。具体的には、施肥法を異にする黒ボク土水田におけるコシヒカリ根圏画像の収集とその画像分類である。画像分類は、現有の画像解析処理システムを用いて、Adobe photoshopの色分類を用いて、根色分類をコンピューター画面上で行った。その画像のヒストグラムから、着色された根色のビクセル値を記録することにより、根色の定量化を実現した。数値化されたそれぞれの根色と植物栄養成分や根の酸化力との関連性を検討した。栽培現場において根の色が黒色であると「不健全」、褐色であると「健全」であると定性的に判断されている。その判断基準となっている、褐色根色と黒色根色の画像解析・定量化を前年度開発した画像解析手法を用いて行った。さらに、作物体の元素含量、土壌溶液中の元素含有量との関連性を吟味した。その結果、堆肥施用・科学肥料無施用区では、堆肥無施用・化学肥料施用区に比較して、褐色根が多く認められるという定量的判断が可能となった。これは、栽培現場での定性的評価法を画像処理により、定量的に評価できる手法を開発したことになる。また、イネ体の元素分析によれば、堆肥施用・化学肥料無施用区では、堆肥無施用・化学肥料施用区に比較して、根のFe/S比や出穂期のイネの葉身、葉鞘・茎、穂のケイ酸含量が高い値を示していた。これらの事実は、堆肥施用・科学肥料無施用区の根の酸化力が堆肥無施用・化学肥料施用区に比較して強いことを示し、このため前者が褐色根色を呈する根面積が広くなると推論された。以上の研究結果は、根色により、地上部や地下部の元素組成を予測することがある程度可能であることを示すものであり、根色の定量化による作物体の栄養診断が実現可能であることを示唆するものである。
女性活躍推進時代に働く女性と男性の地域包括子育て母乳育児支援プラットフォーム構築

本研究では、1.妊娠期から子育て期までの働く女性・男性の子育て・母乳育児支援に関する情報収集とニーズ調査、2.「働く女性・男性の子育て・母乳育児支援パッケージ」の開発、3.子育て世代地域包括支援のための多施設・多職種の連携・協働チームビルディング、4.オンラインネットワーク構築、5.それらの実効性と有効性を検証する。2018年度は、主に文献や現地調査による情報収集、フィールドにおける多職種との関係性づくりを実施した。1.子育て・母乳育児支援に関する情報収集1)国内文献レビュー:就労女性の母乳育児支援に関して文献検索とレビューを行い、83件を検討した。主に母親対象に、保育園・幼稚園、産後・乳幼児健診、職場等において、仕事復帰後の母乳育児継続の希望や実施の有無、母乳継続方法、職場で利用できる制度・環境(育児時間や搾乳場所など)が調査され、母親への情報提供、職場での支援制度や環境の改善、保育士への情報提供等が課題であった。2)海外調情報収集:ノルウェー、スウェーデン、フィンランドおよびオーストラリアにおける、母乳育児支援に関する国の方針や、保育施設や職場の方針や支援内容に関して、関連省庁・支援団体のホームページ情報などを収集し情報を報告書としてまとめ、各国の特徴を分析した。3)フィンランド訪問:2019年2月、タンペレ市のネウボラ、ファミリーサポートセンター、タンペレ大学病院産科病棟および産後ケア施設、ヴァンター市の保育園、ヘルシンキの外国人家庭支援NPO、タンペレ大学での専門家教育状況を視察し訪問レポートを作成した。2.渋谷区内の保健所長、健康推進部、保健相談所長・保健師ら、有識者との複数回の会合を持ち、関係性づくり、地区における課題、渋谷区版ネウボラ体制づくりに向けて情報共有と地区ごとの課題等について意見交換し、定期的な意見交換会を開始した。2018年度予定していた国内外の情報収集や文献検討、フィールドにおける多職種との関係づくり等を進めることができた。一方、フィールドとなる地方自治体のキーパーソンの人事異動により、新たに関係構築を行う必要も発生した。地方自治体の人事異動により、一部のメンバーとは新年度新たに関係構築を行う。収集した情報のさらに詳細な分析を行い、ニーズ調査計画を立案して実施、分析する。多職種協働できる可能性のある人材(特に保育園、地域保健師)とさらにネットワークづくりを行い、関係性の構築を進める。具体的ネットワーク構築計画を立案するため、オンラインネットワーク構築関連会社を含む情報をさらに収集する。
翻訳システム改変による人工細胞創成

大腸菌の翻訳プロファイル改変を目的に、リボソームの改変を行った。様々な環境よりメタゲノムより16S rRNA遺伝子をPCR増幅した。得られた増幅産物を16S rRNA遺伝子発現ベクターに組み込み、次いで大腸菌16S rRNA遺伝子欠損株Δ7株を形質転換した。ショ糖によるカウンターセレクションにより機能相補株を選抜し、数万規模のライブラリーを構築した。コロニーの大きさなどの観点からいくつかの変異株を選抜し、16S rRNA遺伝子の配列解析を行った結果、大腸菌の属するプロテオバクテリアとは門(Phylum)のレベルで異なる遺伝子が生育を相補することを示した。これらの変異株の生育速度は野生株(Δ7株を大腸菌16S rRNAで機能相補した株)と比較して遅い値を示したが、実験室内進化を行うことにより、生育速度の短縮した変異株を得ることに成功した。変異株に含まれる16S rRNA遺伝子を解析した結果、大腸菌に残存する16S rRNA遺伝子断片と一部の領域で組換えが生じていることが判明した。25年度が最終年度であるため、記入しない。様々な環境よりメタゲノムを調製し、これを鋳型として16S rRNA遺伝子をPCR増幅した。各環境から得た16S rRNA遺伝子を環境ごとに個別に大腸菌16S rRNA遺伝子発現ベクターの相同部分と交換、Δ7株を形質転換した。ショ糖によるカウンターセレクションの有無により機能相補率を判定した結果、環境により程度の差こそあれ、5 60%程度の割合で生育を相補した。相補株の総計は数千規模に上り、当初の数値目標(100種類以上)を大幅にクリアーした。いくつかの相補株を選抜し、増殖速度の観点から詳細に評価した。また、相補性の分子基盤を明らかにするために、二次構造、立体構造の観点から考察を行った。その結果、相補配列に共通する性質として、二次構造の維持が重要であることが判明した。今回我々が得た結果は、既存のリボソーム変異データを大幅に塗り替えるものであり、リボソームの構造・進化に対して多くの新たな知見を与えることができたものと考えている。生物進化の観点からは、大腸菌の属するγ-プロテオバクテリアとは綱(クラス)のレベルで異なる遺伝子が生育を相補することを示した。生物の系統解析の分子マーカーである16S rRNAが異種間で機能相補的であることは、水平伝播の可能性を示唆し、微生物系統解析の手法に再考を促す。また、Lakeらの唱えるComplexity仮説を否定するものである。大腸菌16S rRNAの遺伝子欠損の相補実験により、目標値を大幅に上回る異種生物由来の16S rRNA遺伝子を得ることができた。またその過程で、環境ごとの相補率を算定することで、機能遺伝子の取得に必要なノウハウを蓄積することができた。異種16S rRNAを組み込んだ大腸菌の変異宿主ライブラリーも構築した。生育速度の評価を行った結果、必ずしも大腸菌自身の16S rRNAではなく異種のものがより効率的であることを予備的な結果として得た。この発見は、今後の有用宿主の改良という観点で大きな意義を持つ。また異種遺伝子発現という観点からも、大腸菌自身の16S rRNAよりも異種の16S rRNAを宿した変異株でより大きな発現がなされる例も見出し、工学的な利用を考える上で多くの重要な知見を得た。このように、目標を大幅に上回る規模の相補遺伝子を得たこと、それを利用した大規模な宿主ライブラリーを短期間のうちに構築することができ、当初計画以上に進捗していると判断した。なお、成果の一部はPNAS誌に発表し、関連するプレスリリースも行った。異種16S rRNA遺伝子を含む大腸菌変異体ライブラリーをより多様な観点でスクリーニングする。とくに異種遺伝子発現については、翻訳の素過程をあらわにするレポーター遺伝子を設計し、リボソームの機能解析を加速するとともに、難発現性遺伝子の高発現化など、工学の観点でも有効な手法を確立する。さらに、相補遺伝子間でのファミリーシャッフリングを行い、遺伝子多様性を天然の多様性とともに人工的な多様性にまで拡張する。

非天然16S rRNAの有する機能を増殖や異種遺伝子発現の観点で評価し、リボソーム改変に基づく細胞工学の技術体型を構築する。25年度が最終年度であるため、記入しない。
アンギオテンシン II を用いた成功率の高い意図的歯牙再植術の開発

歯の保存治療の1つに意図的再植法があり、難治性の根尖病変の除去や、破折した歯の口腔外接着後の再植時に応用される治療法である。現在のところ、抜歯の際に歯根膜組織へのダメージを最小限にする以外に、再植後の治癒を促進するような薬は開発されていない。そこで本研究では、アンギオテンシノーゲンの代謝産物であるアンギオテンシンII (AngII)が、抜歯再植後の歯根膜組織の治癒に及ぼす影響について検討するために、歯牙再植実験モデルラットを作製し、その歯根膜組織の治癒に及ぼす影響と、AngIIをさらに細かく分けたペプチドが歯根膜細胞に及ぼす影響について明らかにすること目的とした。その結果、AngIIにて処理されたラットの歯根膜組織において、歯根膜組織中の血管形成が促進し、異所性の骨形成が抑制された。またAngIIペプチドが、未分化なヒト歯根膜細胞に対して、腱/靱帯関連遺伝子の発現を誘導し、さらに歯根膜細胞の起源である歯小嚢のマーカーの1つとされるトロンボスポンディン2の発現を亢進することが明らかになった。以上の結果より、意図的歯牙再植を行う際に、AngIIを応用することによってアンキローシスを抑制し、歯根膜組織の治癒を促進しうる可能性が示唆された。本研究では、意図的歯牙再植の際に、歯根膜細胞をアンギオテンシンIIまたはその一部の配列を含んだペプチドを用いて賦活化することによって、歯根膜組織の治癒を促し、意図的歯牙再植術の成功率を向上させる治療法を開発することを目的とした。本年度では、Ang IIの意図的歯牙再植実験モデルラットへ応用による効果について検討した。まず再植歯歯根膜の治癒期間について検討した結果、2週間以内に瘢痕が消失することを明らかにした。そこで、本研究では、再植後7-10日で組織の観察を行うことにした。4週齢の雄性SDラットの上顎右側第1臼歯を抜歯後、PBSにて血液を洗浄し、アンギオテンシンIIを10 ug/mLに調整したコラーゲンゲルを抜歯窩に注入し、そこへ洗浄した歯の再植を行った。対照群は、アンギオテンシンII非含有のコラーゲンゲルのみを注入し、再植を行った。7日後固定し、脱灰後パラフィン切片を作製した。その結果、対照群では歯根膜組織中に島状の骨形成が認められたのに対し、実験群では、歯根膜組織中に同様の骨形成はほとんど観察されなかった。また実験群の中には、歯根膜組織中の血管形成が促進した像が認められた。また、アンギオテンシンIIは8個のアミノ酸(DRVYIHPF)から構成されていることから、これをDRVY、IHPF、VYIHPFの3種類のペプチドを作製し、10 ug/mLの濃度で、未分化なヒト歯根膜細胞株に投与した結果、腱/靱帯関連遺伝子の発現が促進することを明らかにした。以上の結果より、意図的歯牙再植を行う際に、アンギオテンシンIIを応用することによってアンキローシスを抑制し、歯根膜組織再生を促進することを示唆する結果が得られた。本研究では、意図的歯牙再植の際に、生体外で歯根膜細胞をアンギオテンシンII(Ang II)またはその一部の配列を含んだペプチドを用いて賦活化することによって、歯根膜組織の治癒を促し、意図的歯牙再植術の成功率を向上させる治療法を開発することを目的とした。まずAng IIがヒト歯根膜細胞の増殖および分化に及ぼす影響について解析を行った。Ang IIは歯根膜細胞の増殖に対しては、抑制的に働くことが示唆された。つぎにAng IIが歯根膜細胞の骨芽細胞分化ならびに線維芽細胞分化に及ぼす影響について検討した。その結果、Ang II刺激によって、骨関連タンパクである、骨シアロタンパク、オステオポンチン、ペリオスチンの発現を促進した。また線維芽細胞関連因子である、I型ならびにIII型コラーゲン、そしてalpha平滑筋アクチン、そして結合組織成長因子(CTGF)の発現を促進した。

以上より、Ang IIは、歯根膜細胞の骨芽細胞分化ならびに線維芽細胞分化を促進する働きがあり、歯根膜組織の治癒に対してプラスに働く可能性があることが示唆された。つぎに、意図的歯牙再植実験モデルラットの樹立を試みた。4週齢雄性ラットの右側上顎第1臼歯を抜歯した後、PBS中で洗浄し、さらに10分間浸漬した後に抜歯窩に戻し、施術後2週目に屠殺し、歯根膜組織の治癒経過について観察した。その結果、歯槽中隔部の骨はほとんどが吸収されたが、根周囲の骨は吸収されず、治癒が進行した部位では、歯根膜組織のほぼ完全な治癒が観察された。しかしながら、歯根の直径が小さい根は破折して根吸収が生じていた。また抜歯後20分間、PBSに浸漬した場合、治癒が進んでいなかった。以上より、体外での処理時間は10分程度とし、施術後2週間以内で、系の太い根の治癒について評価するのが良いと判断された。Ang IIが歯根膜細胞の増殖ならびに分化に及ぼす影響について、明らかにすることができた。また意図的歯牙再植実験モデルラットの樹立では、基本となる条件設定を行うことができた、と考えている。このモデルラット作製に関しては、当初は1本の抜歯に20-30分程度を要しており、その結果、歯根膜組織や歯槽骨へのダメージが大きくなっていたが、ラットの抜歯用器具の改良により、所要時間が数分に短縮できたことから、上記組織へのダメージを下げることができた。(1)意図的歯牙再植実験モデルの樹立の達成とAng IIによる歯根膜組織の治癒の評価を行う。方法:抜歯した歯根をAng II中またはPBS中に浸漬する。その後、抜歯窩に戻し固定後、1週、2週そして3週目に屠殺し、Ang II処理による歯根膜組織の治癒経過について、PBSを用いたvehicleコントロール群または非抜歯群と組織学的に比較検討し、Ang II処理の有効性について明らかにする。(2)AT2に特異的に結合するAng II中のアミノ酸配列の同定を行う。方法:Ang IIのアミノ酸配列に基づき、長さの異なる幾つかのペプチドを合成し、各々をbiotinにて標識する。つぎにAT2ならびにAT1に対する抗体を用いた免疫沈降法によって、AT2に結合するペプチドを絞り込む。これによって、血管拡張性に働くとされているAT2に結合するペプチドを同定する。さらに合成ペプチドがヒト歯根膜細胞の分化および増殖に及ぼす影響について解析する。方法は、上記の段階で明らかにしたペプチドを用いてヒト歯根膜細胞ならびにヒト歯根膜幹細胞株を刺激し、細胞増殖に及ぼす影響について(1)と同様に検討する。つぎに分化に及ぼす影響を見るために、歯根膜細胞株をこのペプチドで刺激し、ALPおよびTGF-beta1の発現に加え、骨関連タンパクである、骨シアロタンパク、オステオポンチン、ペリオスチン、また線維芽細胞関連因子である、I型ならびにIII型コラーゲン、そしてaplpha平滑筋アクチン、そして結合組織成長因子(CTGF)の遺伝子発現への影響についても比較検討する。上記計画に沿って、物品費として、ペプチド合成、細胞培養用器具試薬、ガラス・プラスチック製品、遺伝子解析用試薬、実験動物購入費、組織解析用試薬を、加えて旅費、謝金等、そして成果発表のための費用を申請する計画である。
衛星観測による環境情報を用いたコレラ流行予測モデルの開発

近年アオコの発生が増えているケニア西部のビクトリア湖・ヴィーナム湾沿岸の病院における週毎下痢症患者数とMODIS等の衛星データから抽出したビクトリア湖の生態環境情報(各病院周辺の植生指標(NDVI)、地表温度、湖水温度・水位・ホテイアオイ面積・降水量)を用いて時系列解析を行い、これら生態環境情報が同地域の下痢症発生を予測する因子として有効であることが明らかとなった。ケニア共和国ビクトリア湖ヴィーナム湾の富栄養化、湖面水温・水位、気象因子などの生態環境因子と周辺地域におけるコレラおよび下痢症流行動態との関連を明らかにするため、現地共同研究機関であるマセノ大学の研究倫理委員会の承認を得たのち、ヴィーナム湾沿岸に立地する8病を訪問し、日毎下痢症患者数の時系列データを収集した。曝露因子であるビクトリア湖生態環境データの収集に関しては、各病院周辺の植生指標や地表温度データ、および湖水温度・水位・ホテイアオイ植生指標、気象データなどを作成した。曝露因子の測定誤差をできるだけ少なくするために、病院を中心とした同心円内の地表指標や、病院へのアクセス(道路網)を考慮した指標の開発を試みた。また、平成25年に湖畔に設置した定点観測カメラでビクトリア湖水面のアオコ発生状況と水位をモニタリングし、リモートセンシングによるアオコとホテイアオイの区別を試みたが、現状では技術的に困難であることが判明した。ホテイアオイの植生指標として、湖面のNormalized Difference Vegetation Index(NDVI)を用いた指標の開発を試みた。上記、時系列患者数データをクリーニングした上で、環境データと統合した時系列データベースを作成し、関連を探索するための統計解析を開始した。記述的解析、相関解析などの探索的解析の後、交絡因子を考慮した時系列解析を行う予定である。1.衛星データからの環境情報抽出手法の研究とデータセット作成ビクトリア湖の表面水温、アオコ・ホテイアオイの分布面積、降雨量、地表面温度、NDVI等の情報を衛星情報を用いてデータ化した。調査対象地域の診療所で収集した下痢症患者データをクリーニングし、環境情報データと合わせて時系列データセットを作成した。2.下痢症流行予測モデルの開発上記で作成したデータセットを用い、ビクトリア湖周辺生態環境因子と下痢症発生の関連を定量化する目的で時系列解析を行った。Cross-correlation解析によりこれら環境因子と患者数とのラグタイムを把握したのち、一般化線形ポアソン回帰モデルを用いてリスク反応曲線を確認した。今後、distributed lag model等を用いてラグパターンを考慮した相対リスクの定量化を進めるとともに、予測モデルの開発につなげる。当初計画通り、環境因子・患者数統合時系列データセットの完成後、相関解析及び時系列解析をすすめ、中間解析結果を2015年11月に開かれた日本リモートセンシング学会平成27年度秋季学術講演会にて発表した。東アフリカ、ケニア西部のビクトリア湖では近年アオコの発生が増え、水環境とコレラ流行の関連が疑われている。コレラの病原体Vibrio. Choleraeは水中のアオコなど植物性プランクトンに付着し流行期以外でも環境水中に存在することが確かめられていることから、本研究では、衛星観測によるビクトリア湖のアオコ分布、表面水温や降雨量データを用いてコレラ患者数との関連を時系列解析により検証し、コレラ流行予測モデルを開発することを目的とした。昨年度収集したキスムからビタ地区にかけてヴィーナム湾沿岸の8病院における下痢症患者数の時系列データ解析を継続した。曝露因子であるビクトリア湖生態環境データに関しては、衛星データから抽出した環境情報(各病院周辺の植生指標や地表温度データ、および湖水温度・水位・ホテイアオイ面積・気象データ)を抽出し、時系列解析を行い、患者数との関連を精査した。タイムラグを考慮した一般化線形回帰モデルを用い、各ラグタイムにおける環境指標と患者数のリスク反応曲線を確認した。より詳細に関連を調べるため、病院周辺の道路網を考慮し各病院の診療圏を推定し、診療圏の環境指標を組み合わせた解析を行うことで、より精度の高い推定の試みを行っている。昨年度に引き続き、ビクトリア湖・ヴィーナム湾沿岸の8病院における下痢症患者数の時系列データ解析を行った。MODIS等の衛星データから抽出したビクトリア湖の生態環境情報(各病院周辺の植生指標(NDVI)、地表温度データ、およヴィーナム湾の湖水温度・水位・ホテイアオイ面積・降水量)を用いて時系列解析を行い、患者数との関連を精査した。Cross-correlationおよびタイムラグを考慮した一般化線形回帰モデルを用い、各ラグタイムにおける環境指標と患者数のリスク反応曲線を確認した。また病院周辺の道路網を元に各病院の診療圏を想定して、想定診療圏内のこれら環境因子と患者数との関連を解析した。結果、気温、降水量との関連が観察され、一定の精度で予測が可能であることが示唆された。同様の解析を同時に収集したマラリア患者数についても行い、下痢症と環境因子との関連と比較した。

マラリアについてはさらに標高15002000メートルの高地の病院における患者数についても気温、降水量、インド洋大気海洋現象との関連についても解析を行い、ビクトリア湖周辺と高地ではマラリア流行と関連する気象因子が異なることが示唆された。近年アオコの発生が増えているケニア西部のビクトリア湖・ヴィーナム湾沿岸の病院における週毎下痢症患者数とMODIS等の衛星データから抽出したビクトリア湖の生態環境情報(各病院周辺の植生指標(NDVI)、地表温度、湖水温度・水位・ホテイアオイ面積・降水量)を用いて時系列解析を行い、これら生態環境情報が同地域の下痢症発生を予測する因子として有効であることが明らかとなった。現地共同研究機関の研究倫理委員会の承認を得るのに予想以上に時間がかかったが、当初計画通り、病院データを収集しクリーニングを行い、また衛星観測によるビクトリア湖および調査対象地域の環境データを作成し、時系列統合データベースを完成させることができた。時系列解析を引き続き進め、環境因子との関連を定量化した後、予測モデルとしての精度や特異度などを精査する。年度末までに研究成果を国内と国際学会で発表するとともに、国際誌に論文を投稿する。研究目的の精緻化を図るため、当初計画に加えて医療機関へのアクセスを考慮し診療圏を設定したうえで、診療圏環境と患者数の関連をより詳細に調べるための解析を行う。29年度が最終年度であるため、記入しない。環境疫学感染症流行予測モデルの開発時系列データベースを用いて、コレラ流行の関連因子を特定するため、衛星観測によるビクトリア湖の表面水温やホテイアオイの分布、降水量および地上観測の気象データ(降水量、気温、湿度等)とコレラ患者数との時系列解析を行い、関連性を明らかにする。予定していたデータ入力や資料収集のための補助作業員への謝金が、これら作業を自分で行ったため不要となったこと、また予定していたケニアへの渡航費が、想定より安く済んだことで、繰り越しが発生した。時系列解析による各環境因子のリスク評価を精緻化するため、当初計画に加えて医療機関へのアクセスを考慮し診療圏を設定したうえで、診療圏環境と患者数の関連をより詳細に調べるための解析を行うことになった。予定していた現地データ収集のための人件費が抑えられたため、多少の余剰が生じた。論文掲載料、論文校正費等が十分計上できていなかったため、これらの経費として使用する。追加データ収集のための渡航費用および論文投稿のための費用を計上する。必要な消耗品の購入に充当する。
光遺伝学を用いたゼブラフィッシュ脊髄運動系神経回路機能の解析

本研究の目的は、新技術である光遺伝学を用いて、ゼブラフィッシュの遊泳行動に関わる脊髄神経回路の機能を解明することであった。研究開始当初、光遺伝学を個体の行動解析に使用する方法は発展途上であったが、本研究ではゼブラフィッシュを用いて、遺伝学的に同定した神経細胞集団を光により任意に制御する実験系を確立することに成功した。しかし、遊泳行動に関わる脊髄神経回路の解析は、標的とした神経細胞の特性が理由で、困難であった。代わりに、確立した実験系を用いて、脊髄ではなく後脳で遊泳行動に必要な神経細胞を光遺伝学的解析で同定した。これは、脊椎動物のロコモーションに関わる神経回路を解明する上で、重要な成果である。脊髄運動系神経回路の機能メカニズムの解明のために、従来、特定の種類の脊髄神経細胞群の個々のニューロンの性質が調べられ、運動系回路における役割を推定されてきた。しかし、直接その役割を検証することはできていなかった。そこで、本研究ではゼブラフィッシュに光遺伝学を用いて、特定の種類の神経細胞の集団としての活動を直接制御することで、予想されるロコモーションの制御が実際に起こることを直接的に示し、脊髄運動系神経回路の機能メカニズムを明らかにすることを目的としている。今年度は転写因子Chx10陽性ニューロン特異的に、光遺伝学ツールを発現させたトランスジェニック魚を解析した。脊髄Chx10ニューロンは脊髄遊泳リズム生成回路の主要な要素であるとの仮説を証明する実験を行った。Chx10ニューロンに光活性型カチオンチャネルを発現させ、脊髄に光照射して強制的に活動させると、一定の割合で遊泳行動が起こったが、予想していたほどの強い遊泳誘起は観察されなかった。これは、光遺伝学ツールを大量に発現させるために用いたGal4-UASシステムではChx10の脊髄後端での非特異的発現が増幅されるため、解析可能な領域が脊髄前方の小さな領域に限られてしまったためと考えられる。現時点では技術的な問題から脊髄Chx10ニューロンの解析は難しいことが分かった。一方で、後脳のChx10ニューロンを光遺伝学的手法により強制的に興奮させると遊泳行動が誘起され、抑制すると停止することが新たに分かった。遊泳を誘起する後脳ニューロンがChx10で特定できることを初めて直接示す結果であり、運動系神経回路の解明に役立つ重要な結果である。また、後脳Chx10ニューロンの解析により、光遺伝学的手法により特定ニューロン集団の機能的回路における働きを解析する手段をゼブラフィッシュで確立するという本課題の目的の一つも達成することができた。これまで研究代表者は、脊髄運動系神経回路の機能解明を目的に、特定種類の脊髄神経細胞群の個々のニューロンの性質をゼブラフィッシュを用いて調べてきた。その結果から、特定神経細胞群の運動における役割を推定したが、直接の検証はできなかった。しかし、新技術の光遺伝学を用いれば、特定種類の神経細胞集団の活動を直接制御することが可能になり、予想される運動が実際に起こるか直接的に示せると期待された。そこで、ゼブラフィッシュに光遺伝学を用いる手法を確立し、ロコモーション時に、特定種類の脊髄神経細胞が集団で果たす役割を光遺伝学で明らかにし、脊髄運動系神経回路の機能メカニズムを解明することを本研究の目的とした。まず、特定の種類の神経細胞に光遺伝学ツールを発現させる遺伝子組み換え魚を作製した。神経細胞の光遺伝学的制御には光遺伝学ツールの大量発現が必要で、予定外の困難があったが、Gal4-UASシステムを用いて解決した。次に、ロコモーションへの関与が予想された脊髄ニューロンの中で、転写因子Chx10及びSim1陽性ニューロンの光遺伝学的解析を試みた。しかし、Chx10ニューロンに関しては、Gal4-UASシステムの性質上、バックグラウンドの発現も増幅されるため、脊髄のChx10ニューロンで光遺伝学ツールの特異的な発現を得られず、解析を断念した。代わりに、後脳Chx10ニューロンの光遺伝学的解析を行い、論文を発表した。Sim1ニューロンに関しては、光遺伝学的解析を行ったが、現在のところ運動系回路に関わる表現型を得られず、運動系回路の主要な構成要素ではない可能性が高い。現在の解析系で観察できない表現型かもしれず、さらに解析が必要である。脊髄運動系神経回路の光遺伝学的解析という目的は達せなかったが、ゼブラフィッシュで特定の神経細胞の活動を光遺伝学的に操作する系を確立できたことは大きな成果である。

そこで、本研究ではゼブラフィッシュに光遺伝学を用いて、特定の種類の神経細胞の集団としての活動を直接制御することで、予想されるロコモーションの制御が実際に起こることを直接的に示す。その結果により、特定の種類の脊髄神経細胞の個々のニューロンが機能的回路において果たす役割と、集団として実際にロコモーションで果たす役割を統合し、脊髄運動系神経回路の機能メカニズムを明らかにすることを目的としている。23年度は特定のニューロンに光遺伝学のツールを発現させたトランスジェニック魚の作成、及びその魚を用いて転写因子Chx10を脊髄で発現するニューロンの解析を行う計画であった。光遺伝学のツールを発現させたトランスジェニック魚の作成に際して、特定の転写因子の制御配列に直接光遺伝学のツールを制御させる従来の方法では、行動を解析したい発生段階において、光遺伝学のツール分子の十分な発現量が達成できなかったため、Gal4-UAS系を用いた発現系を使用することにした。ゼブラフィッシュにおけるGal4-UAS系は発現がモザイクである、次世代で発現が弱まるなどの問題点はあるが、解析に使用可能なトランスジェニックフィッシュを作出することに成功した。ただし、この系では用いる転写因子の制御配列によって、非特異発現が増える場合があり、脊髄でのChx10ニューロンの解析は脊髄前方に限られることが分かった。翌年度にChx10ニューロンの本格的な解析を行う。脊髄Chx10ニューロンの光遺伝学的解析は、期待通りの結果が得られなかった。しかし、後脳Chx10ニューロンの解析を行うことで、光遺伝学的手法により特定ニューロン集団の機能的回路における働きを解析する手段をゼブラフィッシュで確立するという目的は達成することができた。一方、今年度行う予定であったSim1ニューロンの解析に関しては、解析を進める前に遺伝子組み換え魚の健康状態が悪化し、解析を進めることができなかった。このため、研究目的の達成はやや遅れている。光遺伝学のツールを発現させたトランスジェニック魚の作成において予想外のトラブルがあったため、時間がかかった。トラブルの克服には概ね目途が付いているので、翌年度の計画遂行には問題ないと考えている。(i)、脊髄Sim1ニューロン集団のロコモーションにおける役割の解析。Sim1を発現する脊髄の興奮性介在ニューロンは自発的な遊泳行動の維持に働くと推測している。この仮説を検証するためにChx10ニューロンと同様な解析を行う。光遺伝学のツールをSim1ニューロンに発現させたトランスジェニック魚を用いて、脊髄に任意の光照射を行い、脊髄Sim1ニューロン集団の活動を制御する。その結果生じる行動変化を観察する。(ii)ChR2を用いたSim1ニューロンシナプス結合様式の解析。Sim1ニューロンのシナプス結合ターゲットは未解明な為、光遺伝学と電気生理学的な解析を組合せて調べる。シナプス前細胞にChR2を発現させることにより、電極を使用せずに、光刺激によってシナプス前細胞にスパイクを誘発する。この方法により、シナプス後細胞のみの電気生理学的記録によって、2神経細胞間におけるシナプス結合様式を迅速かつ容易に解析することが可能となる。この解析をSim1ニューロンで行い、Sim1ニューロンの結合ターゲットを網羅的に明らかにする。
X染色体不活性化におけるレトロポゾンを介したRNAネットワーク

哺乳類の雌では、初期胚で2本あるX染色体のうち片方を不活性にすることで、雄との間にあるX染色体連鎖遺伝子量の差を補償している。この仕組みにはXist RNAが大きな役割を果たしているが、Xist RNAがX染色体全体に伝播するためにレトロポゾン由来LINE1配列から転写されたRNAが関与していると考え、着床前の胚盤胞期におけるLINE1の役割について解析を行った。その結果、LINE1配列はX染色体に他の染色体と比較して2倍程度存在するにもかかわらず、ES細胞では見られるX染色体特異的なLINE1配列の発現を検出することはできなかった。また、初期胚におけるX染色体不活性化機構を詳細に解析するために、MacroH2A-GFPトランスジェニックマウスを使い、胚盤胞期胚でXist RNAのFluorescent in situ hybridizationやH3K27me3の免疫組織染色を行った。その結果、MacroH2Aは8細胞期から不活性X染色体に局在し始めることが明らかとなった。またこのマウスを使えば、X染色体不活性化現象のみならず、内部細胞塊において一度不活性化されたX染色体の再活性化もモニターできることが明らかとなった。現在ラムダファージのNタンパク質がBoxB配列に結合する性質を利用してXist RNAの標識を試みており、MacroH2A-GFPと組み合わせることで、X染色体不活性化や再活性化過程をより詳細に追跡できると考えている。哺乳類の有性生殖では、XXとXYという性染色体の組み合わせにより雌雄を表現するという戦略をとった。そのため、雌では2本あるX染色体のうち片方を不活性にすることで遺伝子量補償を行う。この仕組みにはXist RNA等が大きな役割を果たしているが、不活性化のシグナルがX染色体全体に伝播する分子機構や関与する因子群は詳細には理解されていない。我々は、X染色体に豊富に存在するレトロポゾン由来LINE1配列に着目し、由来するRNAが初期胚におけるX染色体のクロマチン構造制御になんらかの役割を果たしているのではないかと考え、まずLINE1の発現時期について検討した。その結果、LINE1 RNAは卵核胞期卵に豊富に存在し、卵成熟後の未受精卵および受精卵で減少し、2細胞期胚から再び豊富に転写されていた。レトロポゾンであるIAPも同様の発現パターンを示していた。X染色体不活性化に重要なXist RNAは、2細胞期胚から豊富に転写されていたことから、LINE1 RNAは、Xist RNAと時期を同じくして転写量が増加することが明らかとなった。また、すでに培養細胞で不活性X染色体を標識できることを明らかにしているMacroH2A-GFP融合タンパク質の発現コンストラクトを用いて、トランスジェニックマウスを作製した。このマウスの初期胚で融合タンパク質を追跡したところ、雌の胚盤胞期において核内に緑色に強く光るシグナルが1点観察できた。Xist RNAに対するRNA FISHを行った結果、強いシグナルとXist RNAのシグナルは共局在したことから、作製したマウスを用いて初期胚を生かしたまま、不活性X染色体を追跡できることが明らかとなった。今後、胚におけるレトロポゾン由来配列のプロファイリングを進めると共に、確立した不活性X染色体追跡システムを利用して、レトロポゾン由来配列とX染色体不活性化との関連を解析する予定である。