hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
植物スフィンゴ脂質代謝酵素の機能同定と分子育種への利用

植物のスフィンゴ脂質には親水性糖鎖構造の異なる複数のクラスが存在し、さらにセラミド骨格の不飽和化及び水酸化に起因する構造多様性により、少なくとも数百種に及ぶ分子種が存在する。植物スフィンゴ脂質が担う役割とその制御機構を分子レベルで解明するためには、このような多様な分子種を生み出す代謝系全体を包括的に理解することが必要である。昨年度までに確立した、植物のスフィンゴ脂質分子種を網羅的に定量解析するスフィンゴリピドミクスの手法を用い、本年度はさらにスフィンゴ脂質とストレス耐性との関連性を追求した。はじめに、低温ストレスに高い感受性を示すスフィンゴ脂質不飽和化酵素SLD変異体および細胞死抑制因子BI-1欠損シロイヌナズナの低温応答とストレス耐性におけるスフィンゴ脂質代謝動態の解析により、低温に曝されたシロイヌナズナでは、長鎖塩基不飽和化を中心としたスフィンゴ糖脂質合成系の体系的な制御によるスフィンゴリピドーム再構成が起こり、それがシロイヌナズナの長期低温ストレス耐性に寄与することを明らかにした。さらにスフィンゴ脂質代謝改変イネの脂質プロファイリングにより、長鎖塩基Δ4位及びΔ8位の不飽和化が、イネスフィンゴ糖脂質生合成系においてそれぞれ異なる様式で律速段階となっていることを明らかにした。このうち特にΔ4不飽和化酵素はBI-1と物理的・機能的に相互作用しており、過剰発現させることによりイネの酸化ストレス耐性が向上することを見出した。また本手法を膜脂質に拡張し、これまで解析が困難であった微量膜画分の脂質組成決定を容易に行うことができるようになった。以上の成果は、ストレス下における植物のスフィンゴ脂質代謝応答を分子レベルで初めて説明するものであり、今後の分子育種利用におけるスフィンゴ脂質代謝改変の有用性を期待させるものである。確立したスフィンゴリピドミクスの手法が様々な植物種に適用可能で、ストレス応答性や代謝改変の評価を迅速かつ網羅的に行うことができるようになったことは非常に大きな成果である。さらにこれまで困難であった膜脂質や酵素代謝産物等の微量成分への適用が可能であることも確認しており、より詳細な脂質分子や代謝酵素の機能解析、さらには代謝改変による分子育種に向けた今後の発展研究の基盤となる技術を確立することができた。本課題では、低温応答や酸化ストレスに対するスフィンゴ脂質の代謝応答や機能の一端を明らかにした。また代謝酵素の改変により、植物のストレス耐性が強化できることを見出した。今後はより詳細な分子機構に迫ると共に、様々なストレス種に対する応答性及び耐性機能を解析することで、スフィンゴ脂質代謝改変の有用性を検証していく必要がある。また確立した分析手法は、植物はもちろん他の生物種にも適用可能である点で優れている。今後は対象をモデル植物に限らず実用作物等に拡大することで、より現実的なストレス耐性分子育種を目指したスフィンゴ脂質機能研究の展開が期待される。植物には異なる親水構造をもつ複数のスフィンゴ脂質クラスが存在し、さらにセラミド骨格の多様性により分子種の数は数百種にも及ぶ。植物スフィンゴ脂質の役割とその制御機構を解明するためには、このような多様な分子種から構成される代謝系全体を理解することが必要である。初年度は、植物のスフィンゴ脂質分子種構造を同定し、それらを網羅的に解析するスフィンゴリピドミクスの手法を確立することを目指した。はじめにイネおよびシロイヌナズナからスフィンゴ脂質をクラス毎に簡便かつ高度に分画する方法を確立し、GC-MSによる分子種分析およびESI-MS/MSによる構造解析により、異なる糖鎖構造を有するスフィンゴ脂質クラスを同定した。さらにLC-MS/MSでの分析条件を最適化し、ハイスループットかつ高感度な植物スフィンゴ脂質分子種の一斉定量解析法(スフィンゴリピドミクス解析法)を確立した。本手法により、数百種におよぶ植物スフィンゴ脂質分子種を、ごく微量にしか存在しない分子種から主要分子種に至るまで幅広い検出ダイナミックレンジにおいて、短時間の内に定量プロファイリングすることが可能となった。さらに本手法を用いて長鎖塩基不飽和化酵素発現改変イネのスフィンゴリピドミクス解析を行い、セラミド長鎖塩基の不飽和化がイネのスフィンゴリピドーム全体に影響を及ぼしており、特にイネスフィンゴ糖脂質生合成系の律速段階となっていることを明らかにした。また本発現改変イネは酸化ストレス耐性に対して顕著な変化を示すことも見出した。これらの成果は、イネの酸化ストレス耐性におけるスフィンゴ脂質の生理的意義を初めて示すとともに、特定の代謝酵素を利用した植物スフィンゴ脂質代謝系の制御と、それによる植物機能の改変が可能であることを示唆している。はじめに、低温ストレスに高い感受性を示すスフィンゴ脂質不飽和化酵素SLD変異体および細胞死抑制因子

BI-1欠損シロイヌナズナの低温応答とストレス耐性におけるスフィンゴ脂質代謝動態の解析により、低温に曝されたシロイヌナズナでは、長鎖塩基不飽和化を中心としたスフィンゴ糖脂質合成系の体系的な制御によるスフィンゴリピドーム再構成が起こり、それがシロイヌナズナの長期低温ストレス耐性に寄与することを明らかにした。さらにスフィンゴ脂質代謝改変イネの脂質プロファイリングにより、長鎖塩基Δ4位及びΔ8位の不飽和化が、イネスフィンゴ糖脂質生合成系においてそれぞれ異なる様式で律速段階となっていることを明らかにした。このうち特にΔ4不飽和化酵素はBI-1と物理的・機能的に相互作用しており、過剰発現させることによりイネの酸化ストレス耐性が向上することを見出した。また本手法を膜脂質に拡張し、これまで解析が困難であった微量膜画分の脂質組成決定を容易に行うことができるようになった。以上の成果は、ストレス下における植物のスフィンゴ脂質代謝応答を分子レベルで初めて説明するものであり、今後の分子育種利用におけるスフィンゴ脂質代謝改変の有用性を期待させるものである。当初の目的であったスフィンゴ脂質一斉解析法の確立と代謝酵素発現改変体における実用性の検証を遂行できた上、さらにLC-MS/MSを用いた新規脂質解析法(分子種分析や他の脂質分子種の同時解析)を確立することができた。さらに、これらの解析手法を用いた研究材料となるスフィンゴ脂質代謝関連形質転換植物や酵母系統の作出についてもおおよそ予定通りに進んでおり、全体として計画以上に進展したと考えられる。確立したスフィンゴリピドミクスの手法が様々な植物種に適用可能で、ストレス応答性や代謝改変の評価を迅速かつ網羅的に行うことができるようになったことは非常に大きな成果である。さらにこれまで困難であった膜脂質や酵素代謝産物等の微量成分への適用が可能であることも確認しており、より詳細な脂質分子や代謝酵素の機能解析、さらには代謝改変による分子育種に向けた今後の発展研究の基盤となる技術を確立することができた。本年度の成果として得られたスフィンゴ脂質解析法を様々な脂質代謝酵素の改変植物に応用し、個々の代謝酵素の機能をスフィンゴ脂質代謝系全体から理解することを目指す。また酵母発現系を用いた組換え酵素の解析を進展させ、これまでにほとんど明らかになっていない植物スフィンゴ脂質代謝酵素の生化学的機能同定を行う。さらに酸化ストレス耐性への関与が明らかとなった長鎖塩基不飽和化酵素や、その他関連代謝酵素の発現改変植物の表現型をストレス耐性を中心に解析を進めていくことで、スフィンゴ脂質代謝系がもつ生理的意義の解明を目指す。本課題では、低温応答や酸化ストレスに対するスフィンゴ脂質の代謝応答や機能の一端を明らかにした。また代謝酵素の改変により、植物のストレス耐性が強化できることを見出した。今後はより詳細な分子機構に迫ると共に、様々なストレス種に対する応答性及び耐性機能を解析することで、スフィンゴ脂質代謝改変の有用性を検証していく必要がある。また確立した分析手法は、植物はもちろん他の生物種にも適用可能である点で優れている。今後は対象をモデル植物に限らず実用作物等に拡大することで、より現実的なストレス耐性分子育種を目指したスフィンゴ脂質機能研究の展開が期待される。
階層構造制御型セラミック基生医材料の創製と生医機能の複合的発現

骨伝導能を有する水酸アパタイトセラミックスの生体吸収性と骨組織再生能を改善するために,ソーダライムシリカガラスの転換反応を利用して,リン酸カルシウム基生医材料を作製し,結晶相と非晶質相からなる二相構造モデルに基づいて生体内分解挙動を解釈した。生体吸収性制御因子であるストロンチウムイオンや炭酸イオンの水酸アパタイト結晶格子内への導入方法を詳細に検討し,各種イオン導入量と結晶配向性及び結晶形態に基づいて,階層構造制御型リン酸カルシウム基生医材料の形成機構及び生体内分解機構を提案した。Na_2O-CaO-SiO_2系ガラスを80°Cのリン酸塩水溶液に浸漬すると,ガラス表面からc軸配向性のヒドロキシアパタイト(HAp)のロッド配列構造が形成する。本技術を発展させることにより,生体アパタイトの高次構造を模倣するための結晶配向性の制御技術の開発を目的として,B_2O_3あるいはP_2O_5をNa_2O-CaO-SiO_2系ガラスに添加し,HApへの転換率およびHApロッド配列構造の結晶配向性を調べ,ロッド配列構造の形成機構を明らかにした。まず,20Na_2O・25CaO・xB_2O_3・(55-x)SiO_2(mol%)(x=0,5,10)ガラスを作製した。(それぞれBO,B5,B10と表記)リン酸塩水溶液に浸漬前後のガラス試片の重量から重量減少率およびHApへの転換率を求めたところ,B_2O_3の添加率が増加するほど重量減少率および転換率は減少し,pH変化は小さくなったことからB_2O_3の添加により,ガラス試片の加水分解反応速度が低下しHApの形成が阻害されたと考えられる。また,7日間浸漬後のガラス試片のXRDパターンから,検出された全てのピークはHAp(PDF#09-0432)に帰属され,20=26.0゚および53.0゚にそれぞれ002面,004面に帰属される強いピークが観察された。回折強度からHAp結晶のc軸方向へのLotgering配向指数を算出したところ,BO,B5,B10はそれぞれ0.79,0.41,0.26であった。このことから形成したHApのc軸方向への配向性がB_2O_3を添加するほど低下したことが分かった。一方,リン酸イオン種を所定量添加したアルカリ土類金属系ケイ酸塩ガラスの構造中にはHApの結晶構造中と同様にオルトリン酸イオン(PO_4^<3->)種が存在することを^<31>P固体NMR分光法によって明らかにした。(1-0.01x)(20Na_2O・25CaO・55SiO_2)・xP_2O_5(mo1%)(x=0,3,5)ガラスを作製した。(それぞれPO,P3,P5と表記)リン酸塩水溶液中に浸漬するとガラス表面に存在するP(V)(PO_4^<3->),Ca(II)イオン付近でアパタイトの核形成が誘起され,生成した核は,ガラスの溶解反応が進行するに伴い,水和シリカゲル反応層を介してガラス中のPO_4^<3->,Ca(II)イオン種と溶液中のP(V)イオンを取り込みながらガラス内部に向かって連続的に下方成長したと考えられる。SEM画像から求めたHApロッドの直径および長さは,POスとP3ガラスではほぼ同じであったのに対して,P5ガラスではPOガラスのものに比べて直径が約5倍,長さが約200倍であった。P5ガラス構造中のPO_4^<3->及びCa(II)イオンと溶液中のP(V)イオンが水和シリカゲル反応層を介して、HApロッドの成長末端に連続的に取り込まれることで、HApの結晶が大きく下方成長したと考えられる。生理活性金属イオンをアパタイト結晶格子内に導入し,「非化学量論的組成」と「構造の乱れ」を誘発させた階層構造制御型ロッド配列構造を作製することを目的として,Na2O-CaO-SrO-SiO2系ガラスを作製し,リン酸塩水溶液中でガラス表面に形成するHApのロッド配列構造の結晶配向性と結晶格子内のCaサイトへのSr部分置換に及ぼすSrOの含有量(010 mol%)の影響を調べた。ケイ酸塩ガラス中のSrO含有量が多いほど重量減少率およびHApへの転換率は減少し,リン酸塩水溶液のpHの増加は抑制された。ケイ酸塩ガラス中のSrO含有量が多いほどガラス表面に形成したHAp結晶の格子定数が増大したことから,CaサイトにSrが部分置換していると考えられる。また,Ca/Sr比から予想される化学量論組成のHApの格子定数と一致したことから,ガラス組成によってSr置換量を制御できることがわかった。c軸方向へのLotgering配向指数から,SrO含有量が多いほどc軸方向への結晶配向性が低下することがわかった。これらの情報に基づき,破骨細胞の活性を抑制するSrのアパタイト格子内への置換量とアパタイトの結晶配向性を同時に制御するには,ガラスのSrO含有量を5 mol%以下にする必要があることがわかった。炭酸塩イオンを添加したリン酸水溶液中でガラス表面に形成したHAp結晶の格子定数は,aが減少し,cは増大したことから,炭酸イオンがリン酸イオンサイトに部分置換していることが示唆された。

アパタイトの溶解性を調節する因子である炭酸イオンの導入は,結晶成長と結晶配向性を低下させるため,炭酸イオンの導入量についてはSr同様に限界があることがわかった。しかし,リン酸水溶液中への炭酸イオンの添加がアパタイトの結晶成長を抑制したことにより,表面非晶質層の割合が顕著になって溶解性が促進される可能性が示唆された。固相反応法により作製したリン酸三カルシウム(α-TCP)およびSr含有α-TCP粉末0.5 gを超純水もしくは1.0 M Na2CO3水溶液25 mL中,90°Cで72時間静置し,その後,得られた沈殿物を超純水で洗浄してろ過し,105°Cで3時間乾燥した。超純水を用いて合成した試料をHAp, 0.1SrHAp, 0.2SrHAp, 0.3SrHApとし,Na2CO3水溶液を用いて合成した試料をCAp, 0.1SrCAp, 0.2SrCAp, 0.3SrCApとした。ICPによる元素組成分析の結果より,作製したHAp系試料はCa/P比の低いCa欠損型であることが分かった。XRDパターンより,HAp系試料ではHAp (PDF#09-0432)の単相,CAp系試料ではHApとCApの二つの結晶相が確認された。CAp系試料の炭酸置換量はそれぞれ7.99, 6.84, 7.84及び6.9 wt%であった。0.3SrHApの二次元1H→31P HETCOR-NMRスペクトルの解析により,1Hの投影スペクトルでは0.2 ppm付近にHAp格子中のOH基,6.1 ppm付近に試料表面の吸着水,9.8 ppm付近にP-OH基に由来するピークが観察された。31P断面スペクトルから,結晶構造中のオルトリン酸イオンに帰属される対称なピークが観測された。一方,試料表面のH2O近傍の31P周囲の局所構造と,P-OH基近傍の31P周囲の局所構造を反映する31P断面スペクトルの形状は互いに類似し,結晶構造中のオルトリン酸イオン由来のピークよりも幅広いことから,試料表面のH2O近傍にP-OHを持つプロトン化したリン酸イオン種であることがわかった。SrHApはSr(II)置換HApをコアとし,その周囲をP-OHを持つ化学種層が覆ったコアーシェル型構造であると考えられる。13C MAS-NMR分光法により,アパタイト結晶構造中のリン酸イオンサイトに炭酸イオンが置換したB-typeアパタイトであることがわかった。In vitro溶解性試験の結果から,Sr及び炭酸含有量のいずれを調節しても溶解性が変化し,Sr含有量の増加よりも炭酸含有量の増加による溶解性の向上が顕著であった。NaHCO3濃度が05.0 mMとなるように調製したリン酸塩水溶液に20Na2O・25CaO・55SiO2 (mol%)ガラス試片を浸漬して80°Cの恒温槽内に7日間静置してCHApを作製した。XRD分析では,水酸アパタイト(HAp)結晶のc軸方向へのLotgering配向指数は,NaHCO3濃度割合が0.3 mM以下で約0.9であり,NaHCO3濃度割合の増加に伴いLotgering配向指数が減少した。FT-IR分析では,水酸基の伸縮振動及び炭酸基の面外変角振動と非対称伸縮振動に帰属される赤外吸収ピークが検出されたことから,HAp結晶格子中のリン酸基の一部が炭酸イオンに置換した炭酸含有アパタイトCHApであった。SEM観察の結果から,Sr含有量に依存してガラス表面上に異なるナノメートルからマイクロメータースケールの表面微細構造を持つロッド配列構造が形成した。骨芽細胞様細胞(MC3T3-E1)をHAp層の表面に播種したところ,仮足を伸ばし,良好に接着した様子が観察されたが,細胞接着性が低い領域も確認されたことから,評価試片を緩衝液に浸漬するプリコンディショニングが必要であった。
農産加工品の輸出促進に資する消費者のニーズを考慮した青果物の最適乾燥理論の構築

農産加工操作の1つである乾燥工程は、加熱を伴う処理であるためエネルギ消費量が多く、環境負荷の大きなプロセスとされている。青果物の乾燥効率の向上を図る手段として、乾燥前にブランチング処理を行う方法がある。今年度は、乾燥パプリカを対象とし、ブランチング試料の乾燥速度の増加とそのメカニズムの解明に加え、乾燥速度の増加に伴う消費電力削減効果について検討した。その結果、過熱水蒸気ブランチングによりパプリカの遠赤外線乾燥過程における乾燥速度は約1.6倍増加し、それに伴い消費電力量は30%削減された。試料表面硬度および電気インピーダンスの測定結果より、乾燥速度が増加した要因は、試料表面硬化の抑制および細胞膜の損傷と推察された。また、ドライトマトの製造工程に減圧マイクロ波処理を適用し、リコペン残存率、DPPHラジカル消去活性、色調および官能評価を行い、減圧マイクロ波を用いた新たな高品質加工技術の確立について検討するとともに、単位蒸発水分当たりの消費電力量を評価し、減圧マイクロ波処理の持続可能性について検討した。その結果、減圧マイクロ波処理は既存の処理方法と比べて5倍29倍程度消費エネルギを削減する効果があることが示された。これは、減圧マイクロ波処理の乾燥時間が大幅に短縮したこと(減圧マイクロ波処理:0.5 h、熱風処理:72 h)に起因すると考えられた。また、DPPHラジカル消去活性、色調、官能評価の結果はいずれも減圧マイクロ波処理試料の値が良好な結果となったことから、減圧マイクロ波処理の高品質な加工処理技術としての有効性が確認された。本年度は、農産加工プロセスにおける品質変化の予測モデルおよびLCA手法による環境負荷に関わる解析を実施した。昨年度公表できなかった乾燥特性の解析も含め、得られた成果は2報の学術論文として、Journal of Food QualityおよびJournal of Food Processing and Preservationに公表された。当初予定していた品質変化予測に関わる研究成果に加え、次年度に実施予定であったLCAに関わる研究成果も一部先行して得られたことから、進捗状況はおおむね順調であると判断される。次年度は、乾燥キャベツのブランチングを一例として、すでに決定された最適条件に従って青果物を乾燥し、ブランチング処理試料の乾燥速度の増加を定量的に示すとともに、エネルギ投入量などの一次データを取得し、LCA手法により環境負荷の定量化を行う。これまでの研究機関で得られて結果を総合し、環境負荷やコストを低減しつつ、青果物の品質を保持できる新たな乾燥理論の構築に資するデータを取りまとめる。農産加工の1つである乾燥工程は、加熱を伴う処理であるためエネルギ消費量が多く、環境負荷の大きなプロセスとされている。今年度は、乾燥キャベツの製造工程における環境負荷をLCA手法を用いて評価し、ブランチング処理が環境負荷低減に及ぼす影響について予備的解析を実施した。また、乾燥後製品の栄養成分から環境効率を算出し、品質と環境負荷の関係について考察した。その結果、乾燥キャベツの製造時における環境負荷を低減するための手段として、ブランチング処理は極めて有効であることが明らかとなり、かつ栄養成分と環境負荷の双方からみても良好な処理方法であることが示された。また、トマトピューレの濃縮にマイクロ波処理を適用し、成分、食味および消費エネルギに及ぼす影響について評価するとともに、マイクロ波を用いた新たな高品質トマトピューレ製造法確立の可能性について考察した。減圧マイクロ波濃縮におけるリコピンおよびL-アスコルビン酸残存率は、他の濃縮方法(通常濃縮および常圧マイクロ波濃縮)におけるそれと比べて大きくなった。常圧マイクロ波濃縮による高温処理は、食味に好影響を与える可能性が考えられた。消費エネルギは常圧マイクロ波濃縮が最小となった。トマトピューレの濃縮工程への常圧マイクロ波処理の適用により、食味の良いトマトピューレの製造と消費エネルギの削減が期待される。本年度は、農産加工プロセスにおける品質変化の予測モデルおよびLCA手法による環境負荷に関わる予備的解析を前倒しして実施した。本年度に先行的に実施した品質評価データの蓄積により、次年度に実施予定の品質予測モデルの構築が直ちに実施可能な状況である。乾燥特性の解析については、データ解析に時間を要し、研究成果物として公表するには至らなかったものの、次年度早々に論文として公表できる見込みである。また、次年度以降の研究目標(品質変化予測モデルの最適化、およびLCA手法による環境負荷)に関わる検討を前倒しして実施したことから、進捗状況はおおむね順調であると判断される。

また、ドライトマトの製造工程に減圧マイクロ波処理を適用し、リコペン残存率、DPPHラジカル消去活性、色調および官能評価を行い、減圧マイクロ波を用いた新たな高品質加工技術の確立について検討するとともに、単位蒸発水分当たりの消費電力量を評価し、減圧マイクロ波処理の持続可能性について検討した。その結果、減圧マイクロ波処理は既存の処理方法と比べて5倍29倍程度消費エネルギを削減する効果があることが示された。これは、減圧マイクロ波処理の乾燥時間が大幅に短縮したこと(減圧マイクロ波処理:0.5 h、熱風処理:72 h)に起因すると考えられた。また、DPPHラジカル消去活性、色調、官能評価の結果はいずれも減圧マイクロ波処理試料の値が良好な結果となったことから、減圧マイクロ波処理の高品質な加工処理技術としての有効性が確認された。本年度は、農産加工プロセスにおける品質変化の予測モデルおよびLCA手法による環境負荷に関わる解析を実施した。昨年度公表できなかった乾燥特性の解析も含め、得られた成果は2報の学術論文として、Journal of Food QualityおよびJournal of Food Processing and Preservationに公表された。当初予定していた品質変化予測に関わる研究成果に加え、次年度に実施予定であったLCAに関わる研究成果も一部先行して得られたことから、進捗状況はおおむね順調であると判断される。次年度は、決定された最適条件に従って青果物を乾燥し、含水率予測モデルを構築するとともに、エネルギ投入量などの一次データを取得する。これらのデータをLCA手法により解析し、環境負荷の定量化を行う。また、エネルギ投入量の削減効果について、各乾燥法の解析結果の相互比較により検討する。これらの項目を総合し、環境負荷やコストを低減しつつ、青果物の品質を保持できる新たな乾燥適性を青果物ごとに評価し、素材ごとの乾燥適性を明らかにする。次年度は、乾燥キャベツのブランチングを一例として、すでに決定された最適条件に従って青果物を乾燥し、ブランチング処理試料の乾燥速度の増加を定量的に示すとともに、エネルギ投入量などの一次データを取得し、LCA手法により環境負荷の定量化を行う。これまでの研究機関で得られて結果を総合し、環境負荷やコストを低減しつつ、青果物の品質を保持できる新たな乾燥理論の構築に資するデータを取りまとめる。本年度は、LCA解析ソフトウェアを購入する計画であったが、若手研究(C)(平成29年度延長課題)に関わる研究で購入予定のソフトウェアを使用する必要に迫られたことにより、本研究費から支出する必要がなくなった。また、若手研究(C)を優先的に実施する必要があったため、当初計画していた実験補助員を雇用する必要がなくなった。そのため、1,310,453円の残額が発生した。本年度実施できなかったデータ解析は次年度以降に実施する予定であるため、ソフトウェアの購入を予定している。さらに、各種成分分析に関わる実験補助員を雇用する予定であることから、今年度の残額分については全額執行する見込みである。本年度は、当初計画していたルーベン・カトリック大学(ベルギー)への出張費用を大学の予算と折半して支払うことになったため、本予算で全額を支出する必要がなくなった。
RNAの難容性を規定するRNAエレメントの同定

NEAT1 lncRNAは、パラスペックルと呼ばれる核内構造体の形成に必須の役割を持つ。このNEAT1はRNA抽出に一般的に汎用されるAGPC試薬に溶解しにくいことを見出していた。私たちはこの性質を難溶性と名付けた。この難溶なRNAは熱処理により可溶化することを見出した。また、このNEAT1の性質には、NEAT1の中央領域の配列及びそこに結合するFUSなどのRNA結合タンパク質が特異的に寄与していることが明らかとなった。さらに、RNA-seqを用いて、網羅的に難溶性RNAを探索したところ、パラスペックルのように核内構造体を形成するRNAを複数同定することに成功した。細胞内のRNAを解析する上でRNAを抽出することは必須の実験手法である。AGPC法はこのRNA抽出の際に広く使用されている方法であり、近年はRNA-seqなどのアプリケーションにおいても広く利用されている。本研究室では、NEAT1 lncRNAの研究を行う中で、NEAT1が抽出されにくいことを見出してきた。さらにこのような性質を持つRNAはNEAT1以外にも存在することがわかってきた。本研究は、NEAT1 lncRNAを始めとする一群のRNAが一般的に汎用されるRNA抽出試薬で抽出されにくいことが、どのようなRNAの配列、結合タンパク質によるものかを明らかにし、そのような性質を持つRNAの生理機能に迫ることを目的とした。この抽出されにくい性質を難溶性と名付け、このような性質を持つRNAを"難溶性RNA"と呼ぶ。NEAT1 lncRNAの難溶性について、CRISPR/Cas9システムを用いて網羅的に難溶性に必要な領域の絞り込んだ。ここに関わるタンパク質についてもNEAT1結合タンパク質のノックアウト細胞を数十株樹立し、その中から抽出効率に影響を与えるものを見出した。また抽出方法として、種々の方法を試み、より簡便で多サンプルの処理にも適した方法の開発に成功した。また、このような性質を持つ新規RNAが細胞内構造体を形成している可能性を示唆する結果を得た。当初の計画通りCRISPR/Cas9システムを用いて、NEAT1を欠失させた細胞株の樹立が順調に進んでおり、その結果、NEAT1内に存在する難溶性に影響を与える領域を網羅的に探索し、領域の絞り込みに成功している。また、NEAT1に結合しているタンパク質群(パラスペックルタンパク質)を個々にノックアウトした細胞株を樹立し、その際の抽出効率を確認し、特に大きな影響を与える因子の同定にも成功している。また同様の性質を持つ新規のRNAも見出した。さらに、抽出手法については従来法に比べ、簡便な手法を確立した。以上の理由から計画通り順調に進行しているものと判断した。細胞内のRNAを解析する上でRNAを抽出する操作は必須の手法である。RNAの抽出方法として、汎用されるAGPC法はRNA-seqなどをはじめとして、様々なアプリケーションに利用される。私たちの研究室では、パラスペックルと呼ばれる核内構造体の骨格として働くNEAT1 lncRNAを解析する中で、このNEAT1がAGPC法で抽出されづらいことを見出し、これを"難溶性"と呼び、このような性質を持つRNAを"難溶性RNA"と命名した。種々の方法を試みた結果、NEAT1は、注射針に100回程度通すことや熱処理によって可溶化することを見出した。さらに、このNEAT1の難溶性に影響を与えるタンパク質を同定するため、ヒト一倍体細胞株HAP1を用いて、20種類以上のパラスペックルタンパク質ノックアウト細胞株を樹立した。これらを用いた解析の結果、いくつかのパラスペックルタンパク質(プリオン様ドメインを持つタンパク質を含む)が難溶性を与えていることが明らかとなった。さらに、NEAT1の特定のRNA領域を欠失させると、難溶性が低下したことから、この領域と同定したパラスペックルタンパク質が結合することで難溶性を生んでいる可能性が示唆された。加えて、この領域はパラスペックル形成に必須の領域であったことから、この難溶性と構造体の形成に関連があることが示唆された。そこで、この難溶性を持つRNAをRNA-seqを用いて網羅的に探索すると、多様なRNA種が同定され、少なくともこれらのうち一部は、構造体を作るRNAの候補であると考えられた。さらに複数の細胞株やストレス条件下における難溶性RNAをRNA-seqを用いて解析した結果、それぞれ異なるセットの多様なRNAが同定されたことから、難溶性RNAは細胞特異的なマーカーとして利用できる可能性が示唆された。主な成果は論文として公表した。今後は当初の計画通り、絞り込んだ領域にある重要なエレメントの同定のために、特定したタンパク質の結合配列を解析し、より詳細なエレメントの同定を試みる。

また、異なる種のNEAT1についても同様の解析を進めることで詳細なエレメントの一般性についても検討する。また、新たに同定したRNAについても順次解析を進める。分子生物学、生化学、細胞生物学
情動焦点型コーピングの機能的メカニズムにかかわる潜在的・顕在的感情の役割

最終年度は、仮想的ストレス状況下における潜在的・顕在的感情の変動が情動焦点型コーピングの使用に与える影響を検討した。まず、大学院の講義のオリエンテーション内で同意を得られた研究対象者に対し、ベースライン(Time1:T1)の測定と、1ヶ月後に2回目(Time2: T2)の測定(いずれも潜在的・顕在的感情、情動焦点型コーピング)を行った。また、仮想的ストレス状況設定のために、2回目の測定の前には同講義内で予告のない小テストを5分程度実施した。すべての研究終了後には研究主旨などについて説明した。T1と比較し、T2の各変数に変動が見られたかを確認するため、各変数について時期と性の2要因分散分析を行った。その結果、顕在的正感情は時期の主効果ならびに交互作用が有意であったが、それ以外の変数(コーピング、潜在的感情など)については有意な差が確認されなかった。次にT1の各感情がT2のコーピングへどのような影響を与えるのかを確認するため、T1の潜在的あるいは顕在的正負感情を独立変数、T2の各コーピング変数を従属変数として重回帰分析を行った。その結果、T1における潜在的負感情の高さが、T2の感情表出コーピングを低める結果を確認した。なお、T2からT1の各感情の差が、T2でのコーピングに与える影響も同様に確認したが、有意な回帰係数は確認されなかった。本研究では、一部潜在的感情がコーピングに与える影響が確認されたものの、各変数においてT1とT2との間に有意な差がほとんど確認されなかったことから、その介入操作が上手くできていない可能性があった。また、今回は介入群のみの検証であったが、本来であれば統制群も設定した上での検証を行う必要がある。今後はより検証制度を高め、追研究を実施したい。そして研究全体を通じ、現時点で考え得る情動焦点型コーピングの機能的メカニズムに関するモデルを提唱した。今年度は、まず、情動焦点型コーピングに的を絞って開発された、EAC(Emotional Approach Coping Scales)特性版の標準化作業を行った。特性版とは、コーピングを比較的安定したものと捉え,普段のストレッサーに対するそれを測定可能な版を指す。本邦用作成の承諾を得ており,トランスレーション,バックトランスレーションなどの作業は既に終了していた。よって、標準化検証に必要な、内的整合性、安定性、因子的妥当性、併存的妥当性、ならびに弁別的妥当性の検証を行った。その結果、下位因子は原盤と同様に、感情処理と感情表出の2因子が抽出され、いずれも精度高い数値が確認された。結果は現在分析中であり、今年度の学会で発表予定である。特性版に続き、EAC状況版の作成を研究2として予定していた。しかし、トランスレーション作業に慎重を期すためと、EAC特性版の標準化が完了したことを受け、次年度に予定していた研究3を先に検証する運びとなった。研究1については高い精度を持つ尺度が完成し、混迷を極める情動焦点型コーピングの有効な検証材料となることが期待される。また、研究3についてもIAの測定により、EAも含めたコーピングや健康適応との関連について貴重なデータを得ることが出来た。早急に分析を完了したいと考える。今年度は、昨年度に開発が完了したEAC(Emotional Approach Coping Scales)特性版をベースに、状況版の開発を行った。特性版とは、コーピングを比較的安定したものと捉え,普段のストレッサーに対するコーピングが測定可能な版を指し、状況版とは、特定の時点における特定のストレスフルな出来事に対して行われるコーピングが測定可能な版を指す。特性版と状況版は先行研究にならい、共通項目を使用し、双方が比較検討可能なものとする。研究1において既に項目のトランスレーション作業は終了しているため、本研究では教示文ならびにリッカートについて翻訳作業を行った。因子構造の確認、標準化、ならびに各変数間の因果結果は現在分析中であり、今年度の学会で発表予定である。今年度は研究2として予定していた、EAC状況版の作成と、研究4として予定していた、IAならびにEAが情動焦点型コーピングに与える影響の縦断的検討を行った。縦断的検討は3ヶ月以上の期間を空けることが一般的であるが、実施期間の確保が難しかったため、その期間を1ヶ月間とし、短期縦断的検討に変更した。しかし、この点については、検討が難航する場合の対応策として、あらかじめ計画されていたため、おおむね順調に進展していると判断する。今年度は予定通り、研究5・6を実施する方向で準備する。

その結果、顕在的正感情は時期の主効果ならびに交互作用が有意であったが、それ以外の変数(コーピング、潜在的感情など)については有意な差が確認されなかった。次にT1の各感情がT2のコーピングへどのような影響を与えるのかを確認するため、T1の潜在的あるいは顕在的正負感情を独立変数、T2の各コーピング変数を従属変数として重回帰分析を行った。その結果、T1における潜在的負感情の高さが、T2の感情表出コーピングを低める結果を確認した。なお、T2からT1の各感情の差が、T2でのコーピングに与える影響も同様に確認したが、有意な回帰係数は確認されなかった。本研究では、一部潜在的感情がコーピングに与える影響が確認されたものの、各変数においてT1とT2との間に有意な差がほとんど確認されなかったことから、その介入操作が上手くできていない可能性があった。また、今回は介入群のみの検証であったが、本来であれば統制群も設定した上での検証を行う必要がある。今後はより検証制度を高め、追研究を実施したい。そして研究全体を通じ、現時点で考え得る情動焦点型コーピングの機能的メカニズムに関するモデルを提唱した。今年度は研究2として予定していた、EAC状況版の作成と、研究4として予定している、IAならびにEAが情動焦点型コーピングに与える影響の縦断的検討を行う。前者については、EAC特性版をベースに、トランスレーション作業を完了し、標準化作業を行う。後者については次の尺度を使用する。情動焦点型コーピングにはEAC状況版を,IAの測定にはIPANATの日本語版を,EAの測定にはPANASの日本語版を,健康変数には抑うつ測定のためCES-Dの日本語版を使用する。なお、縦断的検討は3ヶ月以上の期間を空けることが一般的であるが,検討が難航する場合にはその期間を1ヶ月間など,短期縦断的なものに変更する。研究5では、仮想的ストレス状況を設定し、その状況下においてIAとEAの変動が情動焦点型コーピングに与える影響を検討する。仮想的ストレス状況を講義時間に設定する予定のため、既に授業のシラバスには授業内に研究を目的とした評価等が行われる旨を記載し、準備を進めている。研究6では、これまでの研究結果の総括として、情動焦点型コーピングが機能的・非機能的に働くメカニズムに関するモデルの構築を試みる。なお、研究5の遅延を考慮し、研究6のモデル構築の試みを同時に進めたい。縦断的検討調査のための旅費が予定より多くかかる可能性が予見されたため。データ処理補助依頼に伴う謝金の増額、ならびに学会への参加・発表予定が増えたことによる旅費の増額が予想されたためである。よって次年度使用額は、謝金と旅費に約50%ずつ使用する予定である。旅費やアンケート用紙作成のための物品費に使用する計画である。
ハプスブルク君主国における宗教の地域形成機能に関する研究

本研究の目的は、ハプスブルク朝ハンガリー王国を対象として、近世多民族帝国における地域社会形成に宗教が果たした役割を多面的に分析することにあった。研究期間内には、17世紀末から18世紀前半に時代を限定し、まず国王の政策や議会決議の分析を通じて政策レベルでの宗教の位置を確認した。また、地域社会での教会の活動や教会を巡る地域と王権の関係を検討するため、改革派教会文書館と、ジチ家文書館の関連史料、諸教会の巡察記録を中心に検討を行った。その結果、諸教会が勢力を競いつつ、また多民族からなる住民との摩擦を抱えながらも、復興期の地域社会の「準公共財」として不可欠の役割を果たしていたことを確認した。2年目にあたる当該年度には、初年度に実施した研究状況の整理と資料状況調査にもとづき、現地での史料収集と分析を集中的に実施した。本研究は、18世紀のハプスブルク君主国東部における宗教の地域形成機能を明らかにするという目的のもと、1君主の統治における宗教政策の位置づけと、2地域社会における諸教会の社会的活動の両面について分析を進めるものである。本年度の調査では、地方社会の宗教状況を把握し、地方からの訴状を統治者へと媒介していた「宗教エージェント局」の史料群を中心に調査、分析をおこなった。昨年の調査の結果、この史料群は、1と2の主題を分析するための最適の史料であることが確認されたためである。「宗教エージェント局」は、統治者と地方社会との間にあって宗教問題に関する中心的な情報集積センターとなっていた。また、同局は単なる情報収集にとどまらず、オスマン朝のヨーロッパ撤退という権力空白のなかで宗派や民族集団が混在する社会を再建していく際、中央と地方、カトリックとプロテスタントの間で重要な利害調整機能を果たしていたと考えられる。こうした「宗教エージェント局」が統治の安定化と秩序形成に果たした重要性は、かつてハプスブルク君主国を構成した諸国家の研究においてはほとんど認識されておらず、またその膨大な史料群も断片的にしか利用されていない。それゆえ、この史料群を用いて研究をさらに進めることで、国際的発信に値する新たな知見が得られるものと見込まれる。なお、初年度に実施した研究状況の整理と史料調査の成果の一部は、昨年度から本年度にかけて国内の学会、研究会でそれぞれ報告し、本年度にはそれをもとにした原稿を雑誌論文として発表した。本研究の目的は、ハプスブルク家統治下のハンガリーを対象として、近世多民族帝国における地域社会形成に、宗教というファクターが果たした役割を明らかにすることであった。最終年度にあたる本年度には、(1)当初予定していた史料収集を完了してその分析を行い、(2)研究発表および成果のとりまとめを進めた。(1)に関しては、昨年度に実施した「宗教エージェント局」(地方のプロテスタント信者らの宗教問題に関する訴状を受け付け、中央当局に解決を陳情する組織)の史料群の補遺収集を行った他、ジチ家という大貴族家の文書館に範囲を限定して、地方で直接信者らと交わった領主側史料の収集を行った。あわせて、すでに公刊されている改革派教会の教会巡察記録の分析を進めた。(2)に関しては、ハンガリー西部地区を中心に、戦乱後の復興期に出自や母語を異にする諸集団がコミュニティー形成をするなかで教会が果たした役割や、その際にみられた宗派間の協力とせめぎ合いについて研究会での報告等をおこなった。ただし、史料の分析を時間内に終えることに想定以上の時間を要したため、全体の成果発表は最終年度以降にずれ込む見通しとなってしまった。全体の成果発表においては、復興期の社会の中で諸教会が地域のいわば「準公共財」として様々な領域で地域形成・発展に大きな役割を果たしたこと、ハプスブルク王権が宗教(教会)を媒介に統治を強化しようとした際にも、自ら奉ずるカトリックの信仰のみを強要するのでなく、各宗派の役割に配慮していたこと、などを具体的な諸問題に即して提示する。本研究の目的は、ハプスブルク家統治下のハンガリーを対象として、近世多民族帝国における地域社会形成に宗教が果たした役割を明らかにすることにある。今年度は、(1)基礎的文献の収集・分析、(2)現地文書館における予備調査、(3)内外研究者との協力体制確立に重点を置いて研究を進めた。(1)に関しては、主にドイツ語圏の宗教改革、宗派化研究の近年の動向、ならびに当該主題に関するハプスブルク君主国を対象とした個別研究のフォローに努めた。また、国内およびハンガリーおよびスロバキアの図書館において、関連文献の調査・収集を行った。(2)に関しては、ハンガリーの国立文書館、教会文書館において史料状況調査と若干の史料収集を試みた。この結果、当初予定していたハンガリー北東部のほか、ハンガリー西部の改革派拠点(Papa)やヴェスプレーム県文書館において、教会の社会統合機能の分析に有益な史料群(多数の遺言状や救貧施設関連文書など)が存在することを確認した。

(3)国内の近接領域の研究者とは、年度中に複数の研究会で意見交換を行った。また、ハンガリーおよびスロバキアでは、18世紀史を専門とする研究者、文書館員、教会関係者らと意見交換を行い、今後の本格的な史料調査と研究成果発表へ向けての協力をとりつけた。なお、本年度は予備調査に重点を置いて研究を進めたが、その成果の一部を「近世ハンガリー王国再統合期における所領と教会」と題して2011年度西洋史研究会のシンポジウムで報告することができた。本研究では、初年度から2年度までに研究動向の整理と把握、史料状況の調査と史料分析を行うことを目標のひとつとしたが、これについてはほぼ予定通りに進めることができた。また、その成果の一部を発表することもできた。なお、史料調査の過程で、本研究の遂行にとって最適となる史料群を発見することができた。以上から、現在までに当初の研究計画に沿って本研究を遂行するための見通しをつけることができた。ただし、今回確認した史料群は内容が豊かであるだけでなく量的にも膨大であるため、その体系的分析には、当初想定した以上の時間が必要となることが判明した。もっとも、これについては次年度に集中的に史料収集、分析を進めることで、対処可能と判断している。また、研究動向を整理した結果、当該研究が現地における研究がきわめて手薄な領域に属することも判明した。このためいくつかの予備的研究を発表することが必要と判断されたが、これについても現在発表へ向けた執筆を進めており、研究計画の遂行に大きな障害となるものではないと判断している。23年度の主要目的は、図書館・文書館での予備調査と内外研究者との協力体制の確立であった。図書館における史料調査・収集はおおむね順調に進展した。文書館での予備調査に関しては、当初予定していた地域で十分な調査を行えなかったが、他の地域でそれを補うに足る史料群を発見することができた。内外研究者との協力体制の構築については、新たに複数の国内関連学会、研究会に入会・参加し、人脈形成と情報・意見交換を行うことができた。また、外国研究者についても、ハンガリーおよびスロバキアの複数の大学研究者、文書館員を訪問して意見交換を行い、協力体制を築くことができた。本研究課題の最終年度にあたる次年度には、収集した史料の分析を進めつつ、これまでの研究結果の取りまとめを行う。また、近世ヨーロッパにおける宗教の地域形成機能を地域比較し、ハプスブルク君主国の政治社会の特質を把握するためのモデル化をも試みる。この研究成果の取りまとめと並行して、本研究を通じて重要性を発見することができた「宗教エージェント局」について、更に情報を収集し、またその豊富な史料群の体系的分析にとり組む。なお、これら研究成果については、国内外の学会、研究会での発表、成果公表を行っていく予定である。当初の研究計画に従い、今後は(1)基礎研究の収集と問題点の整理、(2)文書館史料の収集完了と分析、(3)研究成果の発信を重点的に行う。(1)については、日本には蓄積の薄い研究主題であることを鑑み、研究動向の整理を公にする。(2)については、すでに予備調査を済ませたハンガリーの文書館において、史料収集・分析を進める。
口腔保健医療従事者を対象とした禁煙指導のための教育訓練プログラムの開発

口腔保健医療の場で喫煙者に対して禁煙を勧め、禁煙希望者の禁煙をサポートするために、口腔保健医療従事者を対象とした禁煙指導のための教育訓練プログラムを開発することを目的として本研究を行った。まず、禁煙についての意識が高いと思われる日本禁煙推進医師歯科医師連盟の歯科医師会員に歯科医師の禁煙指導の実態と禁煙指導を行う上での障壁について調査を行った。その結果、禁煙指導についての意識が高い集団においても、禁煙指導のレベルには、喫煙についての質問をするレベルからニコチンガムを用いた高度な指導に至るまで多様でありことが判明した。そして、医科用の禁煙指導訓練を受けた者は高いレベルの禁煙指導を行っていた。禁煙指導を日常診療の場で行う際に障壁となり得る項目については、『紹介できる機関がない』、『患者の抵抗や不満』、『時間がない』ことが示された。また、『患者教育のための教材がない』ことも障壁と考えていた。本調査では、試作した歯科用の禁煙指導教本を配布し現場での適用についての意見を聞いたが、高い評価を得た。この調査結果をふまえて、(1)多くの歯科医師・歯科衛生士により禁煙指導が行えるように、禁煙指導の普及を第一に考えた、患者に喜ばれ短時間でできる禁煙指導のための教育訓練プログラム、(2)ニコチンガムを用い、患者個人のプライベートな部分にまでふみこんだ高度なサポートを考えた教育訓練プログラム、に分けて開発する必要があることが判明した。次いで、呼気中の一酸化炭素濃度測定器を歯科診療室で使用した結果、患者の禁煙の動機付け、禁煙の継続に有効であることが歯科患者においても確認された。一方、米国における歯科用の禁煙指導訓練プログラムについての文献調査を並行して行い、これらの結果を総合して、口腔保健医療従事者を対象とした禁煙指導のための教育訓練プログラムを試作した。まず、医科用禁煙プログラムを考察した。その結果、喫煙者には禁煙についての意識レベルに段階があり、この段階に応じた指導を行うことが有効であることが判明した。従って、禁煙サポートの方法は、患者の意識レベルに応じた内容により行う方法を採用することとした。また、禁煙を難しくする理由として、心理学的要因とニコチン依存の薬理学的要因の二つの因子があることが判明し、行動科学的サポートと薬理学的サポートのふたつのアプローチを禁煙プログラムに取り入れることとした。次いで、海外の文献を考察した。その結果、禁煙サポートを行う側の口腔保健医療従事者にも禁煙についての意識レベルに段階があることが判明し、プログラムの構成については、禁煙指導の導入からはじめて、専門的な介入に至るまでの段階を設けて構成することとした。また、歯科医院における禁煙サポートの行為の主体は歯科衛生士であり、歯科医師のみの教育では有効でないことが判明した。従って、訓練プログラムの対象は歯科医師および歯科衛生士などのチームアプローチを重視した手法をとることとした。さらに、禁煙サポートを行う側にもさまざまな恩恵があることが判明した。これらを訓練プログラムの導入に際して強調することが、口腔保健医療従事者による禁煙サポートの啓発に有効であることが示唆された。これらの知見および収集した医科用禁煙プログラム資料をもとに、教育禁煙訓練プログラムを試作した。今後、歯科医療の現場において試用し、修正を重ねることによりより実用的なプログラムを完成させたい。

まず、禁煙についての意識が高いと思われる日本禁煙推進医師歯科医師連盟の歯科医師会員に歯科医師の禁煙指導の実態と禁煙指導を行う上での障壁について調査を行った。その結果、禁煙指導についての意識が高い集団においても、禁煙指導のレベルには、喫煙についての質問をするレベルからニコチンガムを用いた高度な指導に至るまで多様であることが判明した。そして、医科用の禁煙指導訓練を受けた者は高いレベルの禁煙指導を行っていた。禁煙指導を日常診療の場で行う際に障壁となり得る項目については、『紹介できる機関がない』、『患者の抵抗や不満』、『時間がない』ことが示された。また、『患者教育のための教材がない』ことも障壁と考えていた。本調査では、試作した歯科用の禁煙指導教本を配付し現場での適用についての意見を聞いたが、高い評価を得た。この調査結果をまえて、(1)多くの歯科医師・歯科衛生士により禁煙指導が行えるように、禁煙指導の普及を第一に考えた、患者に喜ばれ短時間でできる禁煙指導のための教育訓練プログラム、(2)ニコチンガムを用い、患者個人のプライベートな部分にまでふみこんだ高度なサポートを考えた教育訓練プログラム、に分けて開発する必要があることが判明した。次いで、呼気中の一酸化炭素濃度測定器を歯科診療室で使用した結果、患者の禁煙の動機付け、禁煙の継続に有効であることが歯科患者においても確認された。一方、米国における歯科用の禁煙指導訓練プログラムについての文献調査を並行して行い、これらの結果を総合して、口腔保健医療従事者を対象とした禁煙指導のための教育訓練プログラムを試作した。
メトホルミンによる酸化ストレス応答と新免疫監視研究

これまでのCD8TIL解析結果では、コントロール担癌(MethA)マウスのCD8TILでは、ROSの蓄積はみられるがGlut-1の発現はない。メトホルミン(Met)投与または抗PD-1抗体投与によりROSおよびGlut1の両方が発現してくるが、発現パターンは明らかに異なる。MetではGlut1の発現が高い程逆にROSの蓄積が少なくなるが、抗PD-1抗体の場合はGlut1の発現が高い程ROSの蓄積は多い。この結果は、Metの場合は解糖系亢進と同時にROSを消去するための抗酸化ストレス応答が発動している可能性があり、抗PD-1抗体の場合は作動しておらず、ROSは蓄積し続ける可能性が考えられる。ROS蓄積は早晩,細胞に障害が起こる可能性がある。Metと抗PD-1抗体の併用は、単剤に比べて優れた抗腫瘍効果をもたらすが、これは抗PD-1抗体によるTCRシグナル復活とそれに伴う解糖系促進効果、これに加えてMetによるROS消去機構が加わることが一つのメカニズムである可能性がある。そこで、MethA線維肉腫からCD8TILを取り出し、in vitroで数時間培養することにより、MitoSOXで検出可能なミトコンドリア由来の活性酸素(ROS)とグルコーストランスポーターGlut-1の発現を2次元で同時解析した。その結果、Met投与群では抗酸化ストレス応答に必須の転写因子Nrf2が作動することが明らかになった。一方、抗PD-1抗体の投与群ではNrf2の活性化は認められなかった。両者の併用群では、Met単独群と同様にNrf2の活性化が認められ、ROSの消去が観察された。以上の結果は、MetによりCD8TILsに蓄積するROSの除去が行われ、抗PD-1抗体と併用によりCD8TILsの細胞数を飛躍的に増加させる機構が明らかになったと考えられる。免疫治療によるCD8TILsのGlut-1上昇機構を明らかにするために、以下の実験を行った。MethA線維肉腫からCD8TILを取り出し、in vitroで数時間培養することにより、MitoSOXで検出可能なミトコンドリア由来の活性酸素(ROS)とグルコーストランスポーターGlut-1の発現を2次元で同時解析した。メトホルミン投与マウス由来のCD8TILではGlut-1(high)ROS(low)の集団が見られるが、グルタチオン添加でGlut-1(low)ROS(low)の集団に置き換わった。即ち、Glut-1上昇をもたらすためには、ROSが必須であることが示唆された。一方、Nrf2、G6PDHに対する阻害剤ではGlut-1上昇は変化ないが、ROS(low)がROS(high)へと変化した。即ち、Nrf2やペントースリン酸経路の駆動はROSの消去に必須であることが明らかになった。抗PD-1抗体の投与によってもGlut-1上昇は認められるが、Glut-1(high)ROS(low)の集団は見られず、Glut-1(high)ROS(high)の集団のみが観察された。また、グルタチオン、Nrf2およびG6PDHに対する阻害剤でもGlut-1(high)ROS(high)の集団には大きな変化は認められなかった。従い、メトホルミンと抗PD-1抗体はともにGlut-1上昇をもたらすが、その分子機構は全く異なることが推察された。平成30年度までにメトホルミン(Met)投与によるCD8TILsのNrf2依存性の抗酸化ストレス応答が惹起されること、しかし一方で、抗PD-1抗体の場合は抗酸化ストレス応答が誘導されないことが明らかになった。今後の重要な課題は、Nrf2が如何なるメカニズムで活性化されるのか(核内移行するのか)、解糖系亢進とNrf2の活性化はどのような関係にあるのか、Metと抗PD-1抗体の併用がどのようなメカニズムで相乗効果を生むに至るのかをより詳細に解明していく。以上のことを明らかにするために、mTORC1の活性化の有無、Ki67発現を指標としたCD8TILsの細胞増殖との関連性、さらには、ここにNrf2活性化阻害剤を入れた場合に如何なることが起こるのかetc.について検証を試みる。これらのex vivoの実験と並行して、すでに作成済みのNrf2floxマウスとグランザイム-Creマウスとの交配で得られるコンディショナルKOマウス(腫瘍内で活性化されたCD8TILsのみでNrf2が欠損する)を用いて、Met単独、あるいは抗PD-1抗体との併用効果がどのように変化するのかにつき、さらなる検討を積み上げることが必要である。コンディショナルKOマウスの固形腫瘍から回収されたCD8TILsを用いて、これまでと同様の解析、即ち、ROS産生、Glut-1発現、mTORC1およびKi67の上昇の有無などを解析する。In vivo, in vitro双方のアプローチにより、より生理学的な抗腫瘍免疫応答の分子メカニズムを明らかにしていく。