hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
身体－精神疾患の相互メカニズムに関する代謝内分泌学的研究

疲労度の高い人では、欠勤数が多いこと、またメタボリック症候群につながる生活習慣と疲労が関連していることを明らかにしてきた。心の問題と身体が問題は個別に考えがちであるが、関連が深い。本研究は、疲労が心身双方の問題の予測指標となりうるかその改善策含め、明らかにすることが目的で実施した。疲労は、身体の疾患において予測指標となりうる可能性が示唆された。また、食生活を改善することは疲労の回復につながるという結果が得られた。1.代謝内分泌疾患患者での検討:兵庫医科大学に登録されている患者357名のうち、心血管イベントの既往がなく、睡眠、疲労、アクティブトレーサーを用いた自律神経解析及び、血漿BDNF値等が評価可能であった150人を対象に解析を行った。BDNF(Brain-derived neurotrophic factor)は、自律神経機能調節作用と、心筋リモデリングへの関連が報告され、24時間の心拍変動から得られる自律神経機能の低下が心血管イベントの発症と関連しうることが報告されている。結果、BDNFはLF(Low Frequency)と強い関連を示したが、疲労や睡眠の自覚症状との関連は認められなかったが、疲労はLFと負の相関を示す傾向にあり、この関連が間接的に心血管イベント発症に関与する可能性が示唆された。2.うつ病患者での検討:うつ病患者での今年度の新規エントリーは実施できていないが、蓄積した復職希望のうつ病患者のデータのうち睡眠-身体活動レベルの解析を実施した。3.職域における疲労と心身疾患の発症に関連する追跡調査:A市職員を対象に2011年度から2013年度の定期健康診断に併せて調査を実施した。対象は健康診断を受診したものの中から調査の実施に同意し、質問票回答及び自律神経機能調査を行った全症例である。3年間の追跡可能な症例60例(男性54例/女性6例)を開始年の疲労有無で2群に分け、経時的な変化を検討したところ、メタボリック症候群の該当者数の増加がみられた。4.新規フィールド開発:今後の研究につなげるために、乳幼児・母子などの新規調査研究フィールドを開発した。特に母親の疲労・ストレスはその後の児童虐待につながるリスクファクターとして注目されており、その関連の検討を今後内分泌・神経機能含めて検討し、予防に努めることは極めて重要である。1.疾患モデルでの疲労の主観・客観評価、及びその特徴の探索1代謝内分泌疾患患者での検討:兵庫医科大学に登録されている心血管系危険因子を1つ以上有する患者コホートには375名が登録されている。そのうち心血管イベントの既往がなく、睡眠、疲労等の項目すべてが評価できた150人を対象に調査を実施した。その結果、疲労は自律神経機能のLF値を負の相関を示し、この関連が心血管イベント発症につながる可能性を見出した。2うつ病患者での検討:うつ病は入院が必要な重度の事例では復職支援プログラムに参加可能な段階の患者とコルチゾール反応の起床時からピークまでの時間が異なる可能性が示唆された。男女の差や起床時刻(午前9時以降とそれ以前)の差による起床時コルチゾールの差異が報告されているが、本研究では差は認められなかった。今年度、復職支援対象に関しては、更に6例のエントリーを行い、現在、延べ32例、20人の復職支援対象者での評価が完了している。2.職域における疲労と心身疾患の発症に関連する追跡調査:平成24年度には、97例の疲労及び加速度脈波、血糖値、脂質等の調査を完了した。平成25年度には、中間解析を予定している。3.疲労回復支援の検討:平成26年度に疲労回復支援を疾患モデルで実施する予定にしているが、それに先だって健常集団での効果的回復方法の検討を実施した。睡眠にやや問題がある女性32名を対象に栄養教育が睡眠と疲労に与える影響を並行群間比較にて検討した。その結果栄養教育群で有意な低下が認められた。開始前には多くの栄養素の摂取が不足していたが介入後には栄養教育群において摂取量基準値に近づいており、有意差は見られなかったものの介入による変化が見られた。1.代謝内分泌疾患患者での検討:兵庫医科大学に登録されている416名について睡眠状況・日中の活動量と心拍変動係数からみた自律神経機能及び夜間血圧変動について検討を行い、睡眠の質および日中活動量・睡眠量は夜間血圧変動及び自律神経機能と関連を示すことを報告した。夜間高血圧は心血管系イベント発生との関連が指摘されており、その病態機序の一部を提唱していると考えられる。2.うつ病患者での検討:復職支援プログラム受講中のうつ病患者および感情障害患者が馬介在療法を実施することで疲労やうつの軽減が行われるか検討した。結果、馬介在療法により一時的ではあるが、疲労得点が低下し睡眠の質も改善傾向にあることが明らかとなった。3.職域における疲労と心身疾患の発症に関連する追跡調査:A市職員を対象に2011年度から2014年度の定期健康診断に合わせて調査を実施した。

対象は健康診断を受診したものの中から調査の実施に同意し、質問票および自律神経機能調査を行った全症例であった。1年目にメタボリック症候群に該当しなかったが3年目に該当になった対象では職業ストレス得点と残業時間が非該当群に比べ有意に高いことが明らかとなり、メタボリック症候群発症にストレスや残業時間が関与している可能性が示唆された。4.新規フィールドにて母親の疲労と育児ストレス、乳幼児のストレスと内分泌指標の関連を検討した。予防医学代謝内分泌疾患コホートは、既に登録が300名を超え、順調に症例数を増やしており、当該年度には学会発表を実施した。一方、職域コホートは、3年目を経過したが、毎年100名程度の参加しており、3年間の追跡率は6割と、転出や定年での退職などがあることを考慮すると高い追跡率を誇っている。今年度は中間解析を実施し、学会発表も行う予定である。復職支援対象のうつ病患者においては、今年度新規のエントリーは行わず睡眠・活動リズムの解析を行った。その結果、活動度は、成人の同世代とほぼ同等程度まで回復していることが明らかとなった。特筆すべきは今後の研究につながる新規フィールド開拓であり、このような類の研究ではフィールドの開拓は重要事項であるが、今年度、関西地方の地域集団の母親及び抽出サンプルではあるが関東地方の母親の集団での母親の健康とその子どもの健康状態を検討可能なフィールドを開拓することができた。これは、今後、今までの結果を展開するために非常に重要な成果であったと考えている。代謝内分泌疾患モデルでの検証は、当初の予定より登録者が増加しており、また予後含めた検討が開始されている。うつ病患者での検討は、当初の予定通りエントリーが進んでいる。職域における疲労と心身疾患の発症に関する追跡調査は、今年度、予定通り終了しており、次年度中間解析を行う予定であり、こちらも順調に推移している。今年度は、平成26年度に予定している疲労回復支援による介入を既に健常者モデルで実施できたことから、次々年度に向けての準備も確実に実施できている。従って現時点では当初の計画以上に進展している。代謝内分泌疾患コホートは、さらにエントリー数を増やし、国際誌に発表可能なデータとして仕上げる予定である。一方、職域コホートは、次年度4年目を迎え、コホートそのものは5年目までであるので、次年度は最終年度につながる非常に重要なポイントを迎える。追跡率の現状維持ができるかが1つ重要な課題である。復職支援対象のうつ病患者においては、次年度は、今年度の解析結果をもとに、新規のエントリーを行い、再びデータを蓄積することを行うとともに、今年度の成果を学会などで発表することを目指す。次年度は、内分泌指標や神経生理評価が実施可能なフィールドを増やすことを目標にフィールド開拓を続けるとともに、疲労が身体疾患にもつながるリスクファクターであった場合、その緩和策をどのように考えればいいかについて更なる検証を進めることを目指す。また、身体ー精神の相関についてデータを総合的に検証する予定である。今後は、精神疾患・身体疾患モデルの双方での共通性・相違点を明らかにするために、特に精神疾患患者の例数を増やす必要がある。既に、分担研究者と新たにクリニック等での調査を加える等研究推進の方策を検討している。
デジタル技術を用いた子どものファンタジー傾向の理解と教育的応用

「ファンタジー的要素を付加する」ことに教育的効果はあるのか検証する。科学的な検証結果から「一般的な教育方法よりも高い効果がある」と判断できれば,ファンタジー的要素をデジタル技術で統制・操作する方法を用いて効果を「分解」し,効果を検証する。そして,「再構築」では,高い効果を実現していると思われる要素を統合・再設計し,さらに高い効果を得ることができるか挑戦する。
リビングラジカル固相重合法によるバイオ分子ハイブリッド体形成ポリマーの創製

リビングラジカル重合に用いる開始剤としてジチオカルバメート系の光イニファータを合成し、プロトンNMRおよび赤外吸収スペクトルから合成の確認を行った。リビングラジカル重合に用いるモノマーとして、バイオハイブリッド体調製においてバイオ分子の安定化が期待できる2-メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン(MPC)を選択した。プロトンNMRおよびゲル浸透クロマトグラフィーから分子量を見積もり、多分散度は1.2-1.4程度であることを確認した。得られたポリマーは、バイオ分子のモデルとしてのパパインに対して水溶性縮合剤によって化学的に固定化した。パパイン一分子あたりのポリマーの導入率は、パパイン中のアミノ基の定量より20-40%(5-7分子)であると見積もられた。MPCポリマー固定化パパインの酵素活性を検討したところ、酵素溶液の保存温度が40°Cの場合において未修飾のパパインと比較して15日間にわたって酵素活性が維持された。円二色スペクトルによるMPCポリマー修飾パパインの構造変化を検討したところ、αヘリックスやβシート構造に由来するスペクトルの変化は認められなかった。このようなバイオハイブリッド体形成ポリマーによる酵素の安定化機構については、ポリマーによるハイブリッド体形成時にパパイン分子の会合が誘起され、保存期間中に徐々に会合体の解離が起こるものと推察された。この点を明らかにするために、タンパク質用のゲル浸透クロマトグラフィーによる分子量の解析を行った。その結果、バイオハイブリッド体形成直後において、高分子量体のピークが確認されたものの、15日間の保存中にそのピークが徐々に減少していった。このことは、バイオハイブリッド体の会合、凝集の時間依存性を示していた。以上の結果よりリビングラジカル重合法による分子量分布の規定されたバイオハイブリッドポリマーの合成方法の確立と、バイオハイブリッド体の保存安定性の向上効果を明らかにした。リビングラジカル重合に用いる開始剤としてジチオカルバメート系の光イニファータを合成し、プロトンNMRおよび赤外吸収スペクトルより合成の確認を行った。プロトンNMRおよびゲル浸透クロマトグラフィーから分子量を見積もり、極めて多分散度が低いことを確認した。得られたポリマーは、バイオ分子のモデルとしてのパパインに対して化学的に修飾した。パパイン一分子あたりのポリマーの導入率は、パパイン中のアミノ基の定量より57分子であると見積もられた。MPCポリマー修飾パパインの酵素活性を検討したところ、酵素溶液の保存温度が40°Cの場合において未修飾のパパインと比較して著しい酵素活性の維持が15日間にわたって確認された。現在その詳細について解析を行っているが、MPCポリマーの修飾によって、バイオ分子であるパパインの構造の安定化が起きたものと考えられる。
新しい表面処理法を用いた極高真空アルミ真空システムの試作研究

1.平成2年度で開発されたアルミニウム鏡面処理法ーOMCP(OrganoーMechanochemical Polishing)法ーを用いて極高真空容器を製作した.OMCP法は,数nmオ-ダという極めて薄い表面酸化膜厚を実現しつつ表面を鏡面化する初めてのアルミニウム表面処理技術で,本研究では真空容器のみならず,バルブ,液体窒素シュラウドの内面処理にも適用された.2.極高真空用排気ポンプとして新しいチタンサブリメ-ションポンプ(TSP)を開発した.これは従来のTSPの最終的性能が(1)動作時の発熱によるガス放出,および(2)ゲッタ-効果で取り込んだ不純物分子の再放出,の二者に規定されているとの認識に立ち,(1)に対しては従来のヒ-タ傍熱過熱方式からより加熱効率のよい電子衝撃直接加熱型へ,また(2)に対してはチタン蒸着面にヒ-タを組み込んで充分な吸着分子の追い出しが可能となる形に,それぞれ改良を行ったものである.3.従来から超高真空領域の全圧計として用いられてきたエクストラクタ-ゲ-ジを極高真空領域で使用する為の方法論を確立した.すなわち,同ゲ-ジのレフレクタバイアス電圧を変化させる事により,ゲ-ジ毎に異なるX線発生による測定誤差を正しく見積もれる事を見いだした.さらに極高真空用全圧計としてイオン分光ゲ-ジを開発した.これはイオン軌道を180゚偏向させてエネルギ-分光する事により,従来,極高真空測定のネックとなっていた(1)イオンコレクタからのX線発生による測定誤差,および(2)グリッドの電子衝撃脱離イオンによる測定誤差を同時に取り除くよう考案されたゲ-ジである.4.最後にこれらを組み合わせて極高真空排気試験を行い,排気開始後29時間のきわめて短時間に10^<ー12>mbar台の極高真空を実現する事に成功した.1.平成2年度で開発されたアルミニウム鏡面処理法ーOMCP(OrganoーMechanochemical Polishing)法ーを用いて極高真空容器を製作した.OMCP法は,数nmオ-ダという極めて薄い表面酸化膜厚を実現しつつ表面を鏡面化する初めてのアルミニウム表面処理技術で,本研究では真空容器のみならず,バルブ,液体窒素シュラウドの内面処理にも適用された.2.極高真空用排気ポンプとして新しいチタンサブリメ-ションポンプ(TSP)を開発した.これは従来のTSPの最終的性能が(1)動作時の発熱によるガス放出,および(2)ゲッタ-効果で取り込んだ不純物分子の再放出,の二者に規定されているとの認識に立ち,(1)に対しては従来のヒ-タ傍熱過熱方式からより加熱効率のよい電子衝撃直接加熱型へ,また(2)に対してはチタン蒸着面にヒ-タを組み込んで充分な吸着分子の追い出しが可能となる形に,それぞれ改良を行ったものである.3.従来から超高真空領域の全圧計として用いられてきたエクストラクタ-ゲ-ジを極高真空領域で使用する為の方法論を確立した.すなわち,同ゲ-ジのレフレクタバイアス電圧を変化させる事により,ゲ-ジ毎に異なるX線発生による測定誤差を正しく見積もれる事を見いだした.さらに極高真空用全圧計としてイオン分光ゲ-ジを開発した.これはイオン軌道を180゚偏向させてエネルギ-分光する事により,従来,極高真空測定のネックとなっていた(1)イオンコレクタからのX線発生による測定誤差,および(2)グリッドの電子衝撃脱離イオンによる測定誤差を同時に取り除くよう考案されたゲ-ジである.4.最後にこれらを組み合わせて極高真空排気試験を行い,排気開始後29時間のきわめて短時間に10^<ー12>mbar台の極高真空を実現する事に成功した.本年度は極高真空用アルミ表面処理法の開発ならびに評価試験を行った。1.各種アルコ-ル切削表面のX線光電子分光評価アルコ-ルを切削剤に用いたアルコ-ル切削処理アルミ表面についてX線光電子分光(XPS)評価を行い、(1)アルコ-ル切削アルミ表面には用いたアルコ-ルの種類によらず膜厚20ー30Aの酸化膜が形成されていること、(2)アルミ最表面は切削に使用したアルコ-ルに対応するアルコキシドに一層分覆われているが、酸化層内部への炭素取り込みはほとんど無いこと、(3)アルコ-ル切削処理においては切削中にすでに酸化が生じていること、を明らかにした。2.アルミ鏡面処理の開発XPSより明らかとなったアルコ-ル切削処理における酸化膜形成機構を基に、アルコ-ル切削をベ-スとした新しいアルミ鏡面処理技術の開発を行った。その結果、既存のアルミ鏡面処理に比べはるかに薄い、20ー30Aの酸化膜厚を実現する事が可能となった。3.スル-プット法によるガス放出率評価試験いくつかのアルミ表面処理について、実際に真空容器を製作しそのガス放出率を測定した。検討した表面処理は、人体に対する安全性および経済性の点から選択されたイソプロパノ-ル切削(IPL)、(2)の鏡面処理、および比較のためのエタノ-ル切削(EL)の3種類である。その結果、(1)イソプロパノ-ル切削はエタノ-ル切削と同様の極めて低いガス放出率を示すこと、(2)アルミ表面処理においては、処理表面の酸化膜厚が同程度の場合に限り、表面粗さとガス放出率の間に明確な相関関係が存在すること、が明らかとなった。

本年度の成果であるアルミ表面鏡面処理は極高真空用表面処理として極めて有望である。1.平成2年度で開発されたアルミニウム鏡面処理法-OMCP(Organo-Mechanochemical Polishing)法-を用いて極高真空容器を製作した.OMCP法は,数nmオ-ダという極めて薄い表面酸化膜厚を実現しつつ表面を鏡面化する初めてのアルミニウム表面処理技術で,本研究では真空容器のみならず,バルブ,液体窒素シュウラウドの内面処理にも適用された.2.極高真空用排気ポンプとして新しいチタンサブリメ-ションポンプ(TSP)を開発した.これは従来のTSPの最終的性能が(1)動作時の発熱によるガス放出,および(2)ゲッタ-効果で通り込んだ不純物分子の再放出、の二者に規定させているとの認識に立ち,(1)に対しては従来のヒ-タ傍熱過熱方式からより加熱効率のよい電子衝撃直接加熱型へ,また(2)に対してはチタン蒸着面にヒ-タを組み込んで充分な吸着分子の追い出しが可能となる形に,それぞれ改良を行ったものである.3.従来から超高真空領域の全圧計として用いられてきたエクストラクタ-ゲ-ジを極高真空領域で使用する為の方法論を確立した。すなわち、同ゲ-ジのレフレクタバイアス電圧を変化させる事により、ゲ-ジ毎に異なるX線発生による測定誤差を正しく見積もれる事を見いだした。さらに極高真空用全圧計としてイオン分光ゲ-ジを開発した.これはイオン軌道を180°偏向させてエネルギ-分光する時により、従来,極高真空測定のネックとなっていた(1)イオンコレクタからのX線発生による測定誤差,および(2)グリッドの電子衝撃脱離イオンによる測定誤差を同時に取く除くよう考案されたゲ-ジである.4.最後にこれらを組み合わせて極高真空排気試験を行い,排気開始後29時間のきわめて短時間に10-12mbar台の極高真空を実現する事に成功した.
新規ヒストンバリアント群の機能解析

本研究計画は、新規ヒストンバリアントを軸にしたクロマチン動態の解析によって、細胞分化にともなう遺伝子選択機能の解明を目的とした。2015年にコンピュータを用いたヒストン様遺伝子の探索法を開発し、新規14種のマウス、およびヒトのヒストン亜種(バリアント)遺伝子を報告していたが、これらの極めて配列の近いヒストンバリアント群がもたらす分子メカニズムは不明のままであった。そのなかで、マウスにおける新規H3バリアントであるH3mm7が、骨格筋組織の正常な再生に必要であることを示し、論文報告を行った。また、これ以外のヒト新規ヒストンバリアントについては、共同研究の成果(論文発表3報)を得た。本研究計画では、新規ヒストンバリアントを軸にしたクロマチン動態の解析によって、細胞分化にともなう遺伝子選択機能の解明を目的とする。高等生物で特徴的に発達したクロマチンを介する複雑な遺伝子発現制御のメカニズムを解明するためには、生体におけるヌクレオソーム再編成の実態と機能的意義を明らかにする必要がある。我々は2015年に、計算機による遺伝子探索法を開発し、新規14種のマウスおよびヒトのヒストン亜種(バリアント)遺伝子を同定した。遺伝子改変細胞を使った実験から、その一部バリアントのクロマチンへの取り込みが、細胞分化過程における遺伝子発現パターンを変容させることを明らかにした。しかし、わずかなアミノ酸の違いがもたらす分子メカニズムは不明のままであった。そこで本年度は、ヒストンの新規バリアントが果たす固有の機能を中心にして共同研究の成果を発表してきた。ヒストンバリアントの選択性については、精巣特異的ヒストンバリアントH3t(Cell Rep. 2017)、骨格筋特異的ヒストンバリアント(H3mm7)に着目し解析を行った。ヒストン修飾の面からは、新規ヒストン修飾をを発見し論文報告した。一方、ヒストンバリアントは種固有のものが多く、各動物種ごとの解析が欠かせない。そこで、本プロジェクトではヒト固有のバリアントについて、ヌクレオソーム形成能の解析やエピゲノムプロファイリングより、各ヒストン固有のクロマチン構造をゲノムワイドに明らかとし、本成果については論文投稿中である。新規マウスH3バリアントがもたらす骨格筋分化に特徴的なクロマチン構造の解析を順調に進めることができている。新規に同定したヒト・マウス新規バリアントについての共同研究成果もあがっており、当初の計画以上に順調に進展している。本研究計画は、新規ヒストンバリアントを軸にしたクロマチン動態の解析によって、細胞分化にともなう遺伝子選択機能の解明を目的とする。我々は2015年に、コンピュータを用いたヒストン様遺伝子の探索法を開発し、新規14種のマウスおよびヒトのヒストン亜種(バリアント)遺伝子を同定していた。遺伝子改変細胞を使った実験から、一部亜種のクロマチンへの取り込みが、細胞分化過程における遺伝子発現パターンを変容させることを明らかにした。本年度は、マウスにおける新規H3バリアントのひとつであるH3mm7が、骨格筋組織の正常な再生に必要であることを示し、論文報告を行った。解析結果から、H3mm7を含むヌクレオソームが、弛緩したクロマチン構造を形成しやすいことが示された。また、これ以外の新規ヒストンバリアントについては、共同研究の成果を発表してきた。ヒト固有のバリアントと考えられるH3.6, H3.7, H3.8については、これらを含むヌクレオソーム構造の安定性を評価し、ChIP-seqデータの解析によってゲノム上の特徴的な局在のパターンを明らかとし、論文報告を行った。マウスにおける新規H3バリアントのひとつが、骨格筋分化の過程に伴った遺伝子の発現を調整している可能性を見出しており、当面はさらなるデータ取得と解析の計画を進めながら、最終的な論文発表を目指す。また、当研究の過程で新たに創出してきたトランスクリプトーム解析技術や、ヌクレオソーム解像度のクロマチン構造解析手法についても、論文発表を目指して同時に計画を進める。エピジェネティクス
赤潮微細藻に走化性を示す殺藻細菌の分離とその"ミサイル"的利用による赤潮防除

殺藻細菌を用いた赤潮防除を実用化する目的で,殺滅する植物プランクトン種ができるだけ特定種に限定された細菌株,あるいは走化性により特定のプランクトン種に対して誘引されるような細菌株を分離し"ミサイル"的に赤潮防除に用いる方法を検討した.昨年度の研究により88株の殺藻細菌が新たに得られ,そのうちの23株が赤潮渦鞭毛藻Gymnodiniummikimotoiのみを殺滅した.しかしながらその活性は,継代培養をかさねるにつれて次第に消滅するなど,非常に不安定であることが分かった.一方,分離殺藻細菌の中には運動性を保有する株が12株あったため,これらを用いてG. mikimotoi・Skeletonema costatum・Chattonella antiqua・Heterosigma akashiwo・Heterocapsa circularisquamaの5種の赤潮プランクトンに対する走化性試験を行った.その結果,6株の殺藻細菌がいずれかの試験藻に対して有意な走化性を示した.しかしながら,走化性と殺藻活性の間にはほとんど相関が見られなかった.走化性を示した6株の細菌のうち,上記5種の試験藻のいずれもを殺滅するにもかかわらずC. antiquaに対してのみ走化性を示したUA40-2株を用いてさらに実験を行った.その結果,本菌株は藻類との二者混合培養ではC. antiquaおよびG. mikimotoiのいずれをも同様に極めて速やかに殺滅するにもかかわらず,両プランクトン種を混合した培養液に本菌株を接種する三者混合培養では,走化性を示すC. antiquaのほうをG. mikimotoiより速やかに殺滅することが分かった.本研究の結果から,特定の赤潮植物プランクトンに対して走化性を示す殺藻細菌が世界で初めて報告されるとともに,これまで分離された殺藻細菌のほとんどが様々な赤潮藻に対して広く阻害効果を示すにもかかわらず,現場では殺藻細菌の赤潮藻に対する阻害効果が種特異的に起こることが示唆されている理由がある程度説明可能となった.殺藻細菌を用いた赤潮防除を実用化する目的で,殺滅する植物プランクトン種ができるだけ特定種に限定された細菌株,あるいは走化性により特定のプランクトン種に対して誘引されるような細菌株を分離し"ミサイル"的に赤潮防除に用いる方法を検討した.昨年度の研究により88株の殺藻細菌が新たに得られ,そのうちの23株が赤潮渦鞭毛藻Gymnodiniummikimotoiのみを殺滅した.しかしながらその活性は,継代培養をかさねるにつれて次第に消滅するなど,非常に不安定であることが分かった.一方,分離殺藻細菌の中には運動性を保有する株が12株あったため,これらを用いてG. mikimotoi・Skeletonema costatum・Chattonella antiqua・Heterosigma akashiwo・Heterocapsa circularisquamaの5種の赤潮プランクトンに対する走化性試験を行った.その結果,6株の殺藻細菌がいずれかの試験藻に対して有意な走化性を示した.しかしながら,走化性と殺藻活性の間にはほとんど相関が見られなかった.走化性を示した6株の細菌のうち,上記5種の試験藻のいずれもを殺滅するにもかかわらずC. antiquaに対してのみ走化性を示したUA40-2株を用いてさらに実験を行った.その結果,本菌株は藻類との二者混合培養ではC. antiquaおよびG. mikimotoiのいずれをも同様に極めて速やかに殺滅するにもかかわらず,両プランクトン種を混合した培養液に本菌株を接種する三者混合培養では,走化性を示すC. antiquaのほうをG. mikimotoiより速やかに殺滅することが分かった.本研究の結果から,特定の赤潮植物プランクトンに対して走化性を示す殺藻細菌が世界で初めて報告されるとともに,これまで分離された殺藻細菌のほとんどが様々な赤潮藻に対して広く阻害効果を示すにもかかわらず,現場では殺藻細菌の赤潮藻に対する阻害効果が種特異的に起こることが示唆されている理由がある程度説明可能となった.殺藻細菌を用いた赤潮防除を実用化する目的で,殺滅する植物プランクトン種ができるだけ特定種に限定された細菌株,あるいは"ミサイル"的に利用するために運動性があり特定種の体外排出有機物に対して誘引されるような細菌株を分離しようとした.常法(Fukami et al.,1996)に従い,1999年4月から10月にかけて高知県浦ノ内湾から殺藻細菌の分離を試みた結果,G.mikimotoiを初めとした様々な植物プランクトンの増殖が活発であった47月中旬にかけては殺藻細菌がほとんど分離されなかったのに対し,赤潮プランクトンの発生が比較的低下していった7月中旬から10月初旬の期間に集中して殺藻細菌が分離されることが明らかとなった.また,今年度分離されたすべての殺藻細菌およびこれらの殺藻細菌が示すG.mikimotoi・Skeletonema costatum・Chattonella antiqua・Heterosigma akashiwo・Heterocapsa circularisquamaの5種の赤潮プランクトンに対する増殖阻害活性について調べた.その結果,G.mikimotoiを殺藻細菌分離用アッセイ藻に用いたため,当然ながら同藻に対する殺藻細菌がわずかな例外を除いてほとんどを占めていたが,比較的特異的な増殖阻害活性を示す殺藻細菌が数多く分離された.

特に上記の5種の赤潮プランクトンのなかで,G.mikimotoiのみを殺滅する細菌株が新たに22株分離された.さらに,分離殺藻細菌の中から運動性を保有する株のスクリーニングを行ったところ,植物プランクトン種に対して比較的広く殺滅効果を示す多くの菌株において運動性が認められた.次年度は,これらの細菌株について特定種の赤潮プランクトンの体外排出有機物に対する走化性の有無について検討していきたい.殺藻細菌を用いた赤潮防除を実用化する目的で,殺滅する植物プランクトン種ができるだけ特定種に限定された細菌株,あるいは走化性により特定のプランクトン種に対して誘引されるような細菌株を分離し"ミサイル"的に赤潮防除に用いる方法を検討した.昨年度の研究により88株の殺藻細菌が新たに得られ,そのうちの23株が赤潮渦鞭毛藻Gymnodiniummikimotoiのみを殺滅した.しかしながらその活性は,継代培養をかさねるにつれて次第に消滅するなど,非常に不安定であることが分かった.一方,分離殺藻細菌の中には運動性を保有する株が12株あったため,これらを用いてG.mikimotoi・Skeletonema costatum・Chattonella antiqua・Heterosigma akashiwo・Heterocapsa circularisquamaの5種の赤潮プランクトンに対する走化性試験を行った.その結果,6株の殺藻細菌がいずれかの試験藻に対して有意な走化性を示した.しかしながら,走化性と殺藻活性の間にはほとんど相関が見られなかった.走化性を示した6株の細菌のうち,上記5種の試験藻のいずれもを殺滅するにもかかわらずC.antiquaに対してのみ走化性を示したUA40-2株を用いてさらに実験を行った.その結果,本菌株は藻類との二者混合培養ではC.antiquaおよびG.mikimotoiのいずれをも同様に極めて速やかに殺滅するにもかかわらず,両プランクトン種を混合した培養液に本菌株を接種する三者混合培養では,走化性を示すC.antiquaのほうをG.mikimotoiより速やかに殺滅することが分かった.本研究の結果から,特定の赤潮植物プランクトンに対して走化性を示す殺藻細菌が世界で初めて報告されるとともに,これまで分離された殺藻細菌のほとんどが様々な赤潮藻に対して広く阻害効果を示すにもかかわらず,現場では殺藻細菌の赤潮藻に対する阻害効果が種特異的に起こることが示唆されている理由がある程度説明可能となった.
終末期がん療養者に対する訪問看護師の感情・行動傾向

「死が間近である」ということを終末期がん療養者と周囲がどのように認識しているか(終末認識Awareness of dying)によって、訪問看護師がどのように対応しているのかを、感情・行動の面から明らかにすることを目的に質問紙調査を行った。訪問看護師387名(有効回答率59%)から得られたデータを量的に分析した。(1) 4つの終末認識(閉鎖認識/疑念認識/相互虚偽認識/オープン認識)の割合が明らかになった。(2)訪問看護師の対応における3つの因子が明らかになった。(3)終末認識のタイプによる対応や、終末認識のタイプによる対応とGOOD DEATHとの関連について、先駆的な知見が得られた。【具体的内容】(1)関連文献を検討すると共に、日本看護科学学会、エンドオブライフケアの国際セミナー、EAFONSに参加し、最新の情報を収集した。(2)研究者が過去に作成した尺度について、訪問看護師にも適用できるよう検討し一部修正した。(3)看取りケア尺度を作成した研究者らに尺度使用の承諾を得て訪問看護師にも適用できるよう検討し一部修正すると共に、尺度の使用方法や国内外の終末期看護についての講義を受けた。(4)兵庫県下503か所の訪問看護センターの管理者に研究協力の依頼を郵送にて行ない、127か所から返信があり、98か所の承諾を得た。うち6か所は、依頼の返信と共に質問紙の回答も得た。(5)平成28年4月28日、92か所の訪問看護ステーションに依頼文・研究説明書・質問紙を484部郵送した。【意義・重要性】在宅終末期がん看護において療養者と訪問看護師との関係性に焦点を当て、終末認識文脈についての研究を行なうことが有用であり、今回独自に、訪問看護に「死のアウェアネス理論」の視点を取り入れることで、わが国の在宅看取りの質向上に貢献できると考えた。当初は予備調査を行なったうえで質問紙を作成し本調査を実施する予定であったが、文献検討において本研究の一部で使用可能な尺度が開発されていることが判明したため、その尺度を開発した研究者に助言を得ながら質問紙を作成することができた。本調査実施の当初予定は平成28年68月であったが、既に初回の発送を4月に実施することができた。平成28年度内に学会発表を行なうためには6月もしくは9月に抄録を完成させる必要があるため、予定をやや早めた。以上のことから、計画より2か月早めに本調査を開始できており、おおむね順調に進展していると判断した。訪問看護師400名(回収率61%)から回答が得られ、387件(有効回答率59%)について量的に分析した。(1)終末認識の4つのパターン(閉鎖認識/疑念認識/相互虚偽認識/オープン認識)の割合が明らかになった。結果は、1999年に研究代表者が病棟で実施した調査結果と大きく異なっており、時代や場所による違いが明らかになった。諸外国の調査結果とも相違がみられ、日本の文化的・社会的特徴の反映が示唆された。同様の調査は本邦では殆どなされておらず、重要な知見が得られた。(2)訪問看護師の在宅終末期がん療養者に対する対応について尺度を作成し、3つの因子が明らかになった。(3)終末認識のタイプによる「訪問看護師の在宅終末期がん療養者に対する対応」について、量的に分析し重要な知見が得られた。結果は1999年の研究代表者の調査結果と類似していた。また、終末認識のタイプによる「訪問看護師の在宅終末期がん療養者に対する対応」とGOOD DEATHとの関連についても量的に分析した。これらの関連性に関する研究成果は世界において殆どなされておらず、先駆的な知見が得られた。今後は対象者数を増やすため、依頼に返信のなかった訪問看護ステーション管理者に再度往復はがきを使用して打診し2回目の質問紙発送を行なう予定である。また、学会発表や論文投稿に向けて再度先行文献を精査・整理する必要があり、文献整理ソフトの導入を検討している。今年度中に行なう学会発表は、日本看護科学会学術集会またはEAFONSを予定している。初回調査の返信締切は5月20日としており、得られたデータの質や量により検討する予定である。28年度が最終年度であるため、記入しない。医歯薬学28年度が最終年度であるため、記入しない。
高酸素濃度生物法による余剰汚泥の減量化

家庭排水は標準的な活性汚泥法で処理されているが、この場合、余剰汚泥が大量に発生し、問題になっている。この研究では、高い溶存酸素(DO)濃度の環境で生存する新種の微生物群(活性汚泥)を適用した汚泥減量化型の生物学的汚水処理法の開発を試みた。高DO濃度の環境下では、成長率は基質の除去速度の減少に関わらず低下した。そして、沈降性は従来のプロセスにおけるものより良好であった。遺伝子工学分析より、高DO濃度の環境下で培養は、従来のプロセスとは異なった微生物種を得ることが確認された。余剰汚泥発生量の極めて少ない新型活性汚泥法について、密封型反応槽と沈降分離槽から構成される活性汚泥処理装置を構築してその最適培養条件を決定した。さらに、微生物群の分類・同定の一部を行った。以下、それぞれの検討結果を報告する。1.最適培養条件の決定容積3Lの曝気槽および2Lの分離槽を有する活性汚泥装置に、スキムミルクを主成分とした模擬排水を1日6Lを投入し、純酸素曝気によってDO濃度を1024mg/L付近に調製し汚泥濃度を測定した。その結果、汚泥濃度は、12mg/L以下では約3500mg/Lであったが、17mg/L以上では200mg/Lに減少した。その際の水質処理能力はいずれのDO濃度においても、95%以上の高除去率であった。さらに、窒素:酸素を1:4で混合した曝気により同様の実験を試みたところ、純酸素曝気と同様の結果を示した。したがって、安価な圧縮空気曝気の利用が示唆できた。2.微生物群の同定高DO濃度における微生物群がどのようなものか、6S-rRNA遺伝子を対象とするPCR-DGGE法などの遺伝子工学的手法を用いて、その菌種の構成を調べた。調査対象として、DO濃度1.7mg/L、10.2mg/Lおよび16.7mg/Lにおける生育微生物について行ったところ、いずれの微生物も異なる種であり、特に16.7mg/Lに生育していたDesulfotaleaXXXなどは、異化率の高い微生物と考えられた。今後は、異化率の高い微生物を優先的に増殖させる操作条件、あるいは低DO条件で成育する微生物の抑制条件の検討が必要と考える。さらに、より密封度の高い曝気を用いた実験も必要である。平成21年度は、余剰汚泥発生量の極めて少ない新型活性汚泥法について、本法の基本設計に必要な基礎研究として、新型活性汚泥の最適DO濃度、汚泥を構成する微生物群の解析、汚泥の増殖分離特性を検討した。以下、検討結果を報告する。1.新微生物群の最適DO濃度の決定容積3Lの曝気槽および2Lの分離槽を有する活性汚泥装置に、スキムミルクを主成分とした模擬排水を1日6L投入し、純酸素曝気によってDO濃度を1024mg/L付近に調製し、各DO濃度における平衡汚泥濃度を決定した。その結果、DO濃度10mg/Lでは、汚泥濃度3500mg/L、以下13mg/Lで3800mg/L、15mg/Lで2800mg/L20mg/Lで1500mg/L、24mg/Lで200mg/Lであった。さらに境界DOは、15mg/Lであった。その際の水質処理能力はいずれのDO濃度においても、BOD・TOCともに95%以上の高除去率であった。さらに、汚泥の沈降特性であるSVI値は、DO濃度15mg/L以上において約1/2(220ml/g)へと大幅に改善された。窒素:酸素を1:4で混合した曝気により同様の実験を試みたところ、純酸素曝気と同様の結果を示した。2.新型微生物群の分類と同定DO濃度15mg/Lである17mg/L(窒素混合曝気)及び23mg/L(純酸素曝気)において、汚泥を採取しDNAを抽出して16S-rDNAをプライマーとしてPCR法により増幅後、アガロースゲル電気泳動を行って16S-rDNAを増幅してところ、正しく増幅できた。3.今後の課題DO濃度と汚泥濃度の関係では、酸素・窒素ガス量、DO濃度、汚泥濃度の関係をより明確化する。遺伝子工学的検討では、菌種の構成割合の調査と菌種の同定を行う。さらに、全プロセスの評価を行う。平成22年度では、本法の基本設計に必要な基礎研究として、新型活性汚泥の最適培養条件、汚泥を構成する微生物群の解析を明らかにして、プロセス設計と運転管理指針を作成し、さらに設備・運転コストの試算を行い、総合評価を行った。1.新微生物群の最適培養条件の決定純酸素および窒素混合酸素を用いて汚泥の減量化を検討した。

その結果、純酸素曝気ではDO=20mg/Lで最も汚泥量の抑制ができ、窒素混合曝気ではN_2:O_2=1:1が1:4に比べ汚泥減量効果が大であった。水質処理能力はいずれも良好であった。BOD容積負荷を0.5kg-BOD/(m^3・d)から0.9kg-BOD/(m^3・d)へ変更したところ、汚泥濃度の増加が見られ、負荷限界はこのあたりと思われた。2.新型微生物群の分類・同定と諸特性の決定微生物の同定は、PCR-DGGE法により、純酸素曝気ではDO濃度=2,10,15mg/L、窒素混合曝気ではDO=8mg/Lおよび空気曝気について行った。その結果、各DO濃度、各曝気条件によって成育する微生物群に相違があることが判明した。また、高濃度酸素培養によって成育した微生物の多くは粘質物を産出する微生物であった。3.プロセス設計及び運転管理指針溶存酸素濃度の管理、運転条件の主催名決定等について課題を残したので、プロセス設計全般については今後の検討を待つ必要がある。4.総合評価高酸素濃度生物法による余剰汚泥の減量化について、DO濃度の増大に応じて汚泥量の減少を確認できた。さらにこの場合、各DO濃度によって微生物種が異なることを確認した。実用化に対するプロセス全体についてはさらに詳細な実験を行い、総合的な検討を必要とする。
口腔常在菌による誤嚥性肺炎発症機構の分子的解析と宿主リスク評価法

誤嚥性肺炎は高齢者、障害者さらには周術期の患者さんなどで重要な感染症のひとつである。口腔常在菌が不顕性誤嚥により肺に侵入し、免疫抵抗力が低下した状態で肺炎を引き起こす。誤嚥性肺炎は複数の種類の細菌による複合感染が多く、原因菌の特定は単純ではないが、本研究で対象にしているアンギノーサスグループレンサ球菌は代表的なものである。細菌と宿主組織との分子的な結合は感染の第一歩であり、相互の結合因子を同定して結合機構を解明することは感染予防、治療に際して重要である。これまでに新規の病原因子として菌体表層の線毛様構造物を報告しており、いずれも宿主への初期付着に関与していた。そこで、それらによる肺炎発症機構との関連の解析を目的としている。当該年度では3種類の菌体表層物質のリコンビナントタンパク(Saf2, Saf3, AgI/II)を結合したプラスチックビーズによる、マウス肺の標的物質の分離、同定を行った。その結果、チップタンパクであるSaf2が細胞のチューブリンタンパクと結合することが明らかになった。しかしチューブリンは全ての細胞が有するものであり、肺に特異的なものではないことから、肺組織の細菌結合物質は他にあるのか、あるいは肺に特異的なチューブリンの構造が存在しているのか検証を進めている。Saf2の全アミノ酸配列からデータベースで類似物質を検索したとろ、レンサ球菌由来のコラーゲン結合タンパクが同定できた。また相同性の高い場所はSaf2タンパクの中間の約100アミノ酸から構成される部分であった。次年度の計画では結合配列を詳細に決定すべく、この部分の合成ペプチドを用いて菌と肺組織の結合阻害反応、ペプチドと肺由来のチューブリンあるいは未知の標的因子の直接結合試験を実施する予定である。この結果により、分子構造レベルでの結合様式を決められるものと期待している。感染機構の解析のために細菌由来の表層タンパク3種類(Saf2, Saf3, AgI/II)を用意していた。これを結合したプラスチックビーズの作成は順調に進み、マウス肺の抽出液を用いて親和性のある物質を精製、同定した。本菌は肺に感染することから、得られた物質は肺に特異的な物質であることが期待された。しかし最終的に得られた物質はチューブリンタンパクであった。この物質は肺特異的とは言い難く、広く体内に分布しているものである。従って、本当の標的物質は別にある、あるいは肺に特異的なチューブリン構造があるという2つの仮説が考えられる。この点について現在検証を進めている。一方で細菌側の因子として最も有力視しているのがSaf2タンパクである。アミノ酸配列は既に分かっていたため、コンピューターによる分子構造解析を行った。相同性の解析から類似の機能を持った物質が数個検出され、さらに宿主に結合するための機能構造、約100アミノ酸配列が推定できた。この結果に基づいて次年度はより必須の配列を決定すべく、当該部分の合成ペプチドを用意して結合への関与を解析する予定である。以上のことから「おおむね順調に推移している」から「やや遅れている」という判断をしている。上述のようにマウス肺由来の口腔レンサ球菌の標的物質を同定できたものの特異性を欠いていた。現在、新たな特異物質の同定、あるいは得られたチューブリンの肺特異的構造の検出について研究を進めている。一般的にはチューブリンに臓器特異的な構造があるとは考えにくく、おそらく別の肺特異物質が存在しているのではないか、という仮説を持って更なる精製を進めている。一方、相同分析で得られたSaf2の類似物質はコラーゲン結合性タンパクであった。チューブリンは線維様の構造を持っており、コラーゲン類似の構造である。このためSaf2の標的物質として十分な候補と考えられる。コンピューター分析によりSaf2およびチューブリンの分子構造的な相互作用はシミュレーションが可能であり、詳しく解析することができる。さらにSaf2の結合部分と考えられる100アミノ酸からなる配列をカバーする合成ペプチドによりさらに詳細な結合機構の解析を予定している。平行して健常人あるいは患者由来の口腔細菌を分離して、アンギノーサスグループレンサ球菌が有するいくつかの病原因子の有無について評価する。本菌は全ゲノムが決定されているため、各病原因子遺伝子の塩基配列は公表されている。そのためPCR法による遺伝子解析が可能である。本方法は簡便であり、感度も高いので比較時容易に解析が可能と考えている。この結果により、各個人での本菌種の有無、各病原因子の有無が分かることから、少なくとも本菌に由来する肺炎に対するリスクを判定することができることが期待される。この解析に際して前半の肺の標的物質の特定は不要であり、本来の研究計画通りに進行することができる。

そこで、それらによる肺炎発症機構との関連の解析を目的としている。当該年度では3種類の菌体表層物質のリコンビナントタンパク(Saf2, Saf3, AgI/II)を結合したプラスチックビーズによる、マウス肺の標的物質の分離、同定を行った。その結果、チップタンパクであるSaf2が細胞のチューブリンタンパクと結合することが明らかになった。しかしチューブリンは全ての細胞が有するものであり、肺に特異的なものではないことから、肺組織の細菌結合物質は他にあるのか、あるいは肺に特異的なチューブリンの構造が存在しているのか検証を進めている。Saf2の全アミノ酸配列からデータベースで類似物質を検索したとろ、レンサ球菌由来のコラーゲン結合タンパクが同定できた。また相同性の高い場所はSaf2タンパクの中間の約100アミノ酸から構成される部分であった。次年度の計画では結合配列を詳細に決定すべく、この部分の合成ペプチドを用いて菌と肺組織の結合阻害反応、ペプチドと肺由来のチューブリンあるいは未知の標的因子の直接結合試験を実施する予定である。この結果により、分子構造レベルでの結合様式を決められるものと期待している。感染機構の解析のために細菌由来の表層タンパク3種類(Saf2, Saf3, AgI/II)を用意していた。これを結合したプラスチックビーズの作成は順調に進み、マウス肺の抽出液を用いて親和性のある物質を精製、同定した。本菌は肺に感染することから、得られた物質は肺に特異的な物質であることが期待された。しかし最終的に得られた物質はチューブリンタンパクであった。この物質は肺特異的とは言い難く、広く体内に分布しているものである。従って、本当の標的物質は別にある、あるいは肺に特異的なチューブリン構造があるという2つの仮説が考えられる。この点について現在検証を進めている。一方で細菌側の因子として最も有力視しているのがSaf2タンパクである。アミノ酸配列は既に分かっていたため、コンピューターによる分子構造解析を行った。相同性の解析から類似の機能を持った物質が数個検出され、さらに宿主に結合するための機能構造、約100アミノ酸配列が推定できた。この結果に基づいて次年度はより必須の配列を決定すべく、当該部分の合成ペプチドを用意して結合への関与を解析する予定である。以上のことから「おおむね順調に推移している」から「やや遅れている」という判断をしている。上述のようにマウス肺由来の口腔レンサ球菌の標的物質を同定できたものの特異性を欠いていた。現在、新たな特異物質の同定、あるいは得られたチューブリンの肺特異的構造の検出について研究を進めている。一般的にはチューブリンに臓器特異的な構造があるとは考えにくく、おそらく別の肺特異物質が存在しているのではないか、という仮説を持って更なる精製を進めている。一方、相同分析で得られたSaf2の類似物質はコラーゲン結合性タンパクであった。チューブリンは線維様の構造を持っており、コラーゲン類似の構造である。このためSaf2の標的物質として十分な候補と考えられる。
培養網膜神経細胞死の保護因子と神経再生の分子細胞学的,遺伝学的研究

1.網膜分化を誘導する遺伝子のクローニング生後0,2,10日目のマウスの全眼球から抽出したmRNAを用いてcDNAマイクロアレイを行い、新規遺伝子をクローニングした。2.クローニングされた遺伝子の網膜の局在性の検討1.で得られた新規遺伝子は、生後2日目には網膜全層で発現がみられたが、生後7日目には、網膜神経節細胞および内網状層にのみ特異的な強い発現がみられたことから、この新規遺伝子は網膜の発達、分化に関与する遺伝子と考えられた。3.パッチクランプ法による細胞膜イオン電流の検討磁気細胞分離システムによる網膜神経節細胞(RGC)にパッチクランプ行い,グルタミン酸受容体サブタイプ(NMDA受容体,AMPA受容体,カイニン酸受容体)が電気生理学的に発現し機能していることを確認した。保護因子では、神経ステロイドがグルタミン酸受容体(主にNMDA受容体)を抑制したことから、グルタミン酸誘発神経毒性を抑制する可能性が考えられた。4.グルタミン酸誘発性細胞内カルシウム濃度の上昇に対するbetaxololの作用の検討培養RGCにグルタミン酸とbetaxolol同時投与したところ細胞内カルシウム濃度の上昇率は有意に抑制された。5.グルタミン酸誘発性培養網膜神経節細胞死に対するbetaxololの作用培養RGCにルタミン酸とbetaxolol同時投与したところ生存率が上昇し、神経保護作用が認められた。6.グルタミン酸刺激による網膜神経節細胞での一酸化窒素合成の検討RGC培養細胞を用いて、免疫組織化学染色を行ったところ網膜神経節細胞に一酸化窒素合成酵素(NOS)が発現していた。新規一酸化窒素(NO)蛍光指示薬であるdiaminofluorescein-2 diacetate(DAF-2DA)でグルタミン酸刺激による培養網膜神経節細胞での細胞内NO合成が認められた。またNOSの阻害剤によってNO合成は有意に抑制された。1.培養網膜神経節細胞の細胞内カルシウム濃度測定実験における至適グルタミン酸濃度の決定培養網膜神経節細胞に対し種々の濃度のグルタミン酸を暴露し、カルシウム画像解析装置を用いて細胞内カルシウム濃度の上昇を測定し,実験に最適な至適濃度を決定した。2.グルタミン酸誘発性培養網膜神経節細胞死に対する至適グルタミン酸濃度の決定培養網膜神経節細胞に種々の濃度のグルタミン酸を24時間暴露し、暴露前後での生存細胞数を比較し生存率を計測した。10μMでは60.6%,100μMでは39.6%と濃度依存的に生存率が低下するのを認めた。現在高濃度グルタミン酸短時間暴露による遅発性細胞死のモデルを検討中である。3.グルタミン酸誘発性細胞内カルシウム濃度の上昇に対するbetaxololの作用の検討1のモデルを用いて、10μMグルタミン酸暴露に対しbetaxololを前処置及び同時投与した。Betaxolol 100μM投与により細胞内カルシウム濃度の上昇率は66.7%に抑制された。4.グルタミン酸誘発性培養網膜神経節細胞死に対するbetaxololの作用3のモデルに用いてbetaxolol 100μMを同時投与した。グルタミン酸10μM暴露による生存率は64.4%であったが、betaxolol 100μM同時投与により生存率は79.9%に上昇し、神経保護作用が認められた。5.網膜分化を誘導する遺伝子のクローニング生後2週間以内のマウスの網膜から、Differential Display法を用いて、一時的に発現の上昇する新規遺伝子を単離した。その後、マウスのcDNAライブラリーからその遺伝子の全長をクローニングした。

6.クローニングされた遺伝子の網膜の局在性の検討幼少マウスの眼球組織切片を作製し、得られた新規遺伝子が網膜に限局性に発現していることをIn Situ Hybridization法を用いて確認した。1.網膜分化を誘導する遺伝子のクローニング生後0,2,10日目のマウスの全眼球から抽出したmRNAを用いてcDNAマイクロアレイを行い、新規遺伝子をクローニングした。2.クローニングされた遺伝子の網膜の局在性の検討1.で得られた新規遺伝子は、生後2日目には網膜全層で発現がみられたが、生後7日目には、網膜神経節細胞および内網状層にのみ特異的な強い発現がみられたことから、この新規遺伝子は網膜の発達、分化に関与する遺伝子と考えられた。3.パッチクランプ法による細胞膜イオン電流の検討磁気細胞分離システムによる網膜神経節細胞(RGC)にパッチクランプ行い,グルタミン酸受容体サブタイプ(NMDA受容体,AMPA受容体,カイニン酸受容体)が電気生理学的に発現し機能していることを確認した。保護因子では、神経ステロイドがグルタミン酸受容体(主にNMDA受容体)を抑制したことから、グルタミン酸誘発神経毒性を抑制する可能性が考えられた。4.グルタミン酸誘発性細胞内カルシウム濃度の上昇に対するbetaxololの作用の検討培養RGCにグルタミン酸とbetaxolol同時投与したところ細胞内カルシウム濃度の上昇率は有意に抑制された。5.グルタミン酸誘発性培養網膜神経節細胞死に対するbetaxololの作用培養RGCにルタミン酸とbetaxolol同時投与したところ生存率が上昇し、神経保護作用が認められた。6.グルタミン酸刺激による網膜神経節細胞での一酸化窒素合成の検討RGC培養細胞を用いて、免疫組織化学染色を行ったところ網膜神経節細胞に一酸化窒素合成酵素(NOS)が発現していた。新規一酸化窒素(NO)蛍光指示薬であるdiaminofluorescein-2 diacetate(DAF-2DA)でグルタミン酸刺激による培養網膜神経節細胞での細胞内NO合成が認められた。またNOSの阻害剤によってNO合成は有意に抑制された。