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分子動力学計算による蛋白質水和水の水素結合組換えメカニズムの解明

分子動力学計算により生体分子水和水の水素結合の組換えメカニズムを原子レベルで捉えた。水分子の2つの水素原子がそれぞれ生体分子の異なるアクセプタ原子と水素結合している際、まれに別の水分子が近づいてくる。この水分子が同時に同じ場所に水素結合を作ると、水素結合の組換えが進む。組換え速度は、水和サイトの構造揺らぎによって決まる。さらに統一的な記述を得るには、生体分子表面の形状と電気的性質も含めた解析が必要となる。水和水の水素結合の組換えは、溶液中の化学反応など化学現象だけでなく、生命現象も含めた多くの動的分子過程における基本過程である。水和水の水素結合組換えは、生体分子の構造変化に必須であり、分子会合や蛋白質のフォールディングの律促段階に関係していることが知られている。従って、水和水の水素結合組換えを分子レベルで捉えることができれば、様々な生命現象の分子論的理解につながる。これまで、時間分解蛍光分光、NMR、中性子非弾性散乱、テラヘルツ分光などにより生体分子の動的水和特性が測定され、バルク水と異なるタイムスケールで運動していることなどが示されてきた。しかし、このような測定手法では、水和水全体の振舞いを捉えることはできても、個々の水分子の動きまで知ることはできない。そのため、本研究課題では、生体分子水和水の水素結合の組換えメカニズムを原子レベルで捉えることを目的に分子動力学計算による研究を行った。生体分子水和水の水素結合タイプは多様である。水分子の2つの水素原子がそれぞれ生体分子の異なるアクセプタ原子と水素結合するタイプについて、水素結合組み換えが次のようなメカニズムで起こっていることを明らかにした。1注目している水分子が生体分子表面に存在しているとき、まれに別の水分子が近づいてくる。この水分子が同時に同じ場所に水素結合を作る(多重水素結合)と、水素結合の組換えが進む。2多重水素結合の状態から組換えが進む速度は、水和サイトの構造揺らぎによって決まる。3他の水素結合タイプも含めて、生体分子水和水の水素結合組換メカニズムを統一的に記述するには、水素結合様式と構造揺らぎだけでなく、生体分子表面の形状と電気的性質も含めた4つの要素を考慮していかなければならない。そのため、本研究課題では、分子動力学計算を用いて生体分子水和水の水素結合の組換えメカニズムを原子レベルで捉えることを目的とした。今年度は、その中から対象を1つ(水分子の2つの水素原子が、それぞれ生体分子の異なるアクセプタ原子と水素結合するタイプ)に絞って調査し、その水素結合組み換えメカニズムを明らかにした。このタイプの水素結合では、組換えに多重水素結合が関係する。水素結合の組換えは、多重水素結合が形成された時に起こり、その頻度は、多重水素結合の出現率と水和サイトの構造揺らぎに依存することがわかった。この結果は、生体分子水和水の多様なダイナミクスを系統的に解析していく上で基盤となる。本研究課題の目的は、分子動力学計算により、生体分子水和水の水素結合組換えメカニズムを明らかにすることである。今年度は、1つのタイプの水素結合について、その組換えメカニズムを解明することができた。順調に進展していると考える。導いた水素結合の組換えメカニズムの詳細は次のようなものである。注目している水分子が生体分子表面に滞在している際、まれに別の水分子がやってくる。この水分子が同時に同じ場所に水素結合を作ると(多重水素結合)、水素結合の組換えが進む。また、この組換えの起こりやすさは、水和サイトの構造揺らぎによって決まることもわかった。この結果は、水和水の多様なダイナミクスを詳細に解析していく上で基本原理となり、本年度、それを捉えることができたことは重要である。また、誌上発表、口頭発表(国内、国外)を行うなど、成果発表についても予定どおり進めることができた。今年度は、1つのタイプについて水素結合組換えメカニズムを解明した。今後は、多様な水素結合タイプを、結合様式に基づいて整理しながら、それぞれの組換えメカニズムを系統的に解明していく。

具体的な推進方策は次の通りである。まず、水分子との水素結合様式に基づいて、生体分子表面の水和サイトを分類する。次に、各サイトごとに、関与している水素結合の時間変化、ライフタイム、パスウェイを求める。同時に、多重水素結合の有無、構造揺らぎを評価し、これらを比較検討し、水素結合組換えメカニズムの特徴を系統的に整理していく。水素結合のライフタイムは、時間相関関数を使って計算する。また、極性サイトだけでなく、非極性サイトについても同様に解析を進める予定である。平成23年度交付額のうち、海外出張、論文発表等の費用が予定していたより少額に抑えられ、320千円の次年度使用額が生じた。次年度の研究費は、これも合わせて、計算機の購入、成果発表等に使用する予定である。計算機は、分子動力学計算及び解析に利用する。これに、500-1000千円程度使用する予定である。研究成果を広く普及させるため、国内、海外の会議で成果発表を行う。その出張旅費に500千円程度使用する予定である。また論文の出版費に10-20千円程度利用する。
希少な異種マウスのES細胞樹立と４倍体胚盤胞補完法による系統保存と個体復元

マウスは最も多用されている実験動物であり、近年では世界各地で捕獲され遺伝的隔たりの大きい野生由来の異種マウスとの遺伝子機能の比較研究が発癌や老化など様々な分野で進行している。我々は今までに数千系統の実験用マウスと亜種関係にあたる野生由来のマウス40系統の受精卵凍結保存および産子への復元に成功し報告してきた。しかしMus musculus以外の異種マウス系統の配偶子や受精卵による凍結保存は成功例の報告がなく、常に絶滅の危機に直面している。本研究で我々は異種マウスから高品質の受精卵を採取し、体外増殖および半永久的に保存の可能な多能性幹細胞であるES細胞の樹立および凍結保存を試み、ES細胞を用いる新しい系統保存法の確立を開始した。まず亜種マウスの中でも過剰排卵・体外受精・胚移植などの生殖工学技術の適応が困難なMus mus. castaneusのCASP系統を用いたところ、雌雄同居により低率ながら交配の確認できた2匹の雌から13個の形態的に良好な胚盤胞を獲得でき、最終的に3ラインのES細胞株の樹立に成功した。更に異種であるM. spicilegusのZBNおよびSPIの2系統は体外胚培養が困難なことから、体外受精直後の前核期胚を偽妊娠マウスの卵管内へ移植し、その3日後に子宮を灌流することで体内で発育した20個および5個の胚盤胞を獲得でき、それぞれ6ラインおよび4ラインのES細胞株を樹立し凍結保存できた。異種マウスのES細胞を樹立したという論文は報告されておらず、ES細胞を介した系統保存としては初めての例となる。今後は胎盤にしか寄与できない4倍体胚へのES細胞の注入を行い、ES細胞から初めての異種産子作出を試みる。産子作出が可能になれば、更にES細胞に遺伝子変異の導入も可能と考えられ、また母体と異種産子との胎盤や体細胞における相互作用など様々な解析への利用が期待できる。初年度の研究により、予定していた異種マウスであるMus spicilegusに属する2系統、Mus spretusに属する2系統、Mus caroliに属する1系統のうち、Mus spicilegusに属するZBNとSPIの2系統および亜種マウスであるM. m. castaneusのCASP系統の合計3系統でES細胞株の樹立に成功した。いずれも受精卵および発生の進行した高品質の胚盤胞の獲得や受精卵を用いた系統保存が困難な系統であったが、できる限りin vivoでの環境を利用するために体外受精直後の前核期で胚移植を行った偽妊娠雌や自然交配後の雌の子宮から発生の進んだ桑実期胚胚盤胞を回収できたことが成功に繋がったと考えられる。加えて、これらES細胞を注入するホスト胚の作出を進めた。ホスト胚は体外受精によって作出した2細胞期胚を電気融合法により1細胞(4倍体)とし、これが2細胞となった時点で凍結保存を行った。初年度のうちに、クローズドコロニーであるICR系統とGFPを導入したC57BL/6系統の保存を進め、かつ一部の胚を培養して形態的に良好な胚盤胞へ発生するまでの時間の計測を行った。まだ作出できていないES細胞の樹立を、Mus spretusおよびMus caroliに属する系統について進める。これらの系統は計画的な交配・過剰排卵・排卵卵子の採取・体外受精・体外胚培養と様々な生殖工学的作業が困難なことから、数多くの高品質な胚盤胞を獲得するのは難しいと予想される。一方で異種マウス系統においても、品質が良好であれば胚盤胞からES細胞の樹立が行えた初年度の実績から、少なくとも幾つかの発生能の高い胚を獲得できれば、ES細胞の樹立が期待できる。一方で初年度に樹立したES細胞株の評価を行う予定である。すなわち、未分化状態の確認(アルカリフォスファターゼ活性)および簡易核型解析と雌雄解析を行うことで、産子作出に用いるべきES細胞株を各系統あたり複数ライン選定する。次に選定されたES細胞を用いて、ES細胞由来の産子作出を進める。具体的には、昨年秋以降に発表されたNakauchiおよびOkumuraらの論文で報告されているように、ホスト胚の系統や発育段階と導入方法、更に用いるES細胞数等によってキメラの効率や寄与率が異なることから、ホスト4倍体胚の系統(3種類準備済み)、発育段階(8細胞期胚もしくは胚盤胞)、およびES細胞の導入方法(注入法もしくは凝集法)を検討し、ES細胞からの産子作出を進める予定である。

まず亜種マウスの中でも過剰排卵・体外受精・胚移植などの生殖工学技術の適応が困難なMus mus. castaneusのCASP系統を用いたところ、雌雄同居により低率ながら交配の確認できた2匹の雌から13個の形態的に良好な胚盤胞を獲得でき、最終的に3ラインのES細胞株の樹立に成功した。更に異種であるM. spicilegusのZBNおよびSPIの2系統は体外胚培養が困難なことから、体外受精直後の前核期胚を偽妊娠マウスの卵管内へ移植し、その3日後に子宮を灌流することで体内で発育した20個および5個の胚盤胞を獲得でき、それぞれ6ラインおよび4ラインのES細胞株を樹立し凍結保存できた。異種マウスのES細胞を樹立したという論文は報告されておらず、ES細胞を介した系統保存としては初めての例となる。今後は胎盤にしか寄与できない4倍体胚へのES細胞の注入を行い、ES細胞から初めての異種産子作出を試みる。産子作出が可能になれば、更にES細胞に遺伝子変異の導入も可能と考えられ、また母体と異種産子との胎盤や体細胞における相互作用など様々な解析への利用が期待できる。初年度の研究により、予定していた異種マウスであるMus spicilegusに属する2系統、Mus spretusに属する2系統、Mus caroliに属する1系統のうち、Mus spicilegusに属するZBNとSPIの2系統および亜種マウスであるM. m. castaneusのCASP系統の合計3系統でES細胞株の樹立に成功した。いずれも受精卵および発生の進行した高品質の胚盤胞の獲得や受精卵を用いた系統保存が困難な系統であったが、できる限りin vivoでの環境を利用するために体外受精直後の前核期で胚移植を行った偽妊娠雌や自然交配後の雌の子宮から発生の進んだ桑実期胚胚盤胞を回収できたことが成功に繋がったと考えられる。加えて、これらES細胞を注入するホスト胚の作出を進めた。ホスト胚は体外受精によって作出した2細胞期胚を電気融合法により1細胞(4倍体)とし、これが2細胞となった時点で凍結保存を行った。初年度のうちに、クローズドコロニーであるICR系統とGFPを導入したC57BL/6系統の保存を進め、かつ一部の胚を培養して形態的に良好な胚盤胞へ発生するまでの時間の計測を行った。まだ作出できていないES細胞の樹立を、Mus spretusおよびMus caroliに属する系統について進める。これらの系統は計画的な交配・過剰排卵・排卵卵子の採取・体外受精・体外胚培養と様々な生殖工学的作業が困難なことから、数多くの高品質な胚盤胞を獲得するのは難しいと予想される。一方で異種マウス系統においても、品質が良好であれば胚盤胞からES細胞の樹立が行えた初年度の実績から、少なくとも幾つかの発生能の高い胚を獲得できれば、ES細胞の樹立が期待できる。一方で初年度に樹立したES細胞株の評価を行う予定である。すなわち、未分化状態の確認(アルカリフォスファターゼ活性)および簡易核型解析と雌雄解析を行うことで、産子作出に用いるべきES細胞株を各系統あたり複数ライン選定する。次に選定されたES細胞を用いて、ES細胞由来の産子作出を進める。具体的には、昨年秋以降に発表されたNakauchiおよびOkumuraらの論文で報告されているように、ホスト胚の系統や発育段階と導入方法、更に用いるES細胞数等によってキメラの効率や寄与率が異なることから、ホスト4倍体胚の系統(3種類準備済み)、発育段階(8細胞期胚もしくは胚盤胞)、およびES細胞の導入方法(注入法もしくは凝集法)を検討し、ES細胞からの産子作出を進める予定である。
情報化社会への適応を目的とした大学生・社会人向け教育用CAIシステムの研究

近年,社会の高学歴・高齢化と並行して,情報化社会の大学教育や社会人教育が重要課題になっている。本研究は,こうした社会情勢に合わせた大学教育・社会人教育の学習環境を作ることを目的に始められ,最終的には時や場所を選ばず学習者の都合に合わせて随意に個別学習の可能なコンピュータ援助型教授システム(CAI:Computer Assisted Instruction)の設計とその実現としてまとめられた。本研究は,教授方略と学習教材と教材管理の3課題からなる。教授方略の観点からは,フレーム型CAIをベースに,学習者の理解度に合わせて学習進度や学習教材を制御する学習機構を設計した。具体的には,ファジィ理論に基づく試行錯誤型学習モデルや,人口知能技法の意味ネットワークとアクター・モデルによる複合概念学習モデルなどの教授方略モデルを定式化した。さらに,国際投資,コンピュータ・リテラシー教育,食品栄養教育,美術教育などの学習教材を試作して,これら教授方略の有用性を確認した。教育ソフトウェアや学習教材の管理については,これらをフレームワークやモジュールに細分してデータベースに格納し,実際には階層構造に組み立てて利用する。こうしたデータベース中のフレームワークやモジュールはファイル転送に都合よく,LANを介してCAIを使う遠隔地の学習者にも適している。本研究で開発されたCAIモデルは,システム構成の中に情報処理と並行して情報管理と情報通信を考慮しているので,様々な応用に活用されることが期待できる。また,情報化社会における基盤技術の効果的活用の観点からも,本研究の成果は,将来の情報通信網の充実とマルチメディア技術の進歩によって,さらに現実味のあるものになるであろう。本年度は、本研究の第一目的であるCAIの遠隔地からの個別利用を可能にするCAIシステムの構成と機能、およびコースウェアの編成方法などに関する基本的なモデル設計を試みた。その内訳は、次の3点に要約される。1.一括集中管理と分散個別利用の情報通信網による結合:教材およびCAIソフトウェアは、総てワークステーション上で一括して管理する。利用者は、教材およびCAIソフトウェアの必要部分を、通信回線を介して自分の学習支援用パソコンに転送する。その後は、パソコン上で、通常のCAIと同様に学習支援を受けることができる。2.コースウェアの階層性とデータベース化:コースウェアは、取扱い方法に合わせて、マンマシン・インターラクションの単位となる「フレーム」、ワークステーションからパソコンへの通信回線を介した教材転送の単位となる「クラスター」、および一まとまりの学習単元となる「コースウェア」の3階層で構成される。さらに、そうした多数のコースウェアを集めて教材データベースを形成する。3.学習支援ソフトウェアの知識ベース化:学習支援ソフトウェアは、個々のコースウェアに対応させて、1つずつ作られることを原則にする。ワークステーションからパソコンに転送されたソフトウェアは、パソコン上で稼働する方式で記述されており、通常のCAIと同じように利用される。また、学習支援ソフトウェアは、多数の利用者による共同利用されることを想定して、コースウェア・データベースとも連なった知識ベースとしてワークステーション上で管理される。以上のシステム構成の実現可能性を確認せるために、BASIC言語による作図演習支援のCAIを題材にプロトタイプを試作した。本年度は、前年度のネットワーキングをベースにしたCAIの集中管理と分散利用、コースウェアの階層性、コースウェアの知識ベース化の研究を踏まえ、マルチメディアとコンピュータ・ネットワークの視点から、共同利用のためのCAIと教材データベースのモデルを研究した。1.(CAIソフトウェアのLANによる遠隔地利用)プログラミング教育を事例に、ワークステーション上のCAIソフトウェアおよびコースウェアを、LANを介して手持ちのパソコンから随意に学習できるCAIのシステム構成を明らかにし、ほぼ実用化に成功した。2.(多様な内容を含む学習教材のデータベース)大学生・社会人向け学習教材は、複雑多様な内容を扱うために、フレーム型などのモデルでは扱えない場合がある。また、マルチメディアへの対応を想定すると、教材の構造はさらに複雑になる。

こうした課題への対応として、生涯学習のテーマである美術教育を事例に取り上げ、そのための教材管理と活用を目的にしたデータベースとその研削利用をCAIの観点から研究し、その理論的モデルを明らかにし、実用化への試作が進行中である。3.(コースウェア及び教材の共同利用)コンピュータ・リテラシー教育で扱われるワープロ、表計算、BASIC言語の教材を事例に、ワークステーションをファイル・サーバとして、LANを介したそれらのパソコンによる教材の利用形態を明らかにした。以上、CAIと学習教材データベースのモデルは、情報通信の整備された社会状況の下で、場所や時間に制約されない学習環境を提供するCAIに適した教材構造を具体的な事例で確認した。本研究では、学習目標を十分に自覚し得る社会人や大学生を対象としたCAIの機構やマンマシン・インターフェイスの数理モデルを定式化し、そのプロトタイプの試作と実践使用を試みた。特に最終年度である本年度は、過去2年間の研究成果として開発された教育用ソフトウェアや学習教材を教育現場に持ち込み、これまでの研究の評価を試みた。その過程で、CAIの持つ知識処理機能や効率的なシステム構成も重要であるが、マルチメディアやコンピュータ・ネットワークなど急速に進歩する情報環境の中で、本研究で開発したCAIの有用性を確認したと同時に、教育におけるCAIの効用と限界をも認識した。本年度は、ワープロ、表計算、BASIC言語を事例教材として、コンピュータ・リテラシー教育にCAIを活用し、演習授業におけるCAI活用の実践的方策を知ることに重点を置いた研究を進めた。CAIの効果的活用には、教授方略を抽象的に定式化した数理モデルに対して、その特徴を十分に反映し得る教材を選んで組み合わせる必要がある。本研究では、主として人工知能技法やファジィ理論をベースに、CAIの数理モデルの定式化をそのシステム設計、及びそのプロトタイプの試作を行った。これらCAIやその学習教材の利用環境を作り、実際に学生に使わせて教育効果を確認したが、CAIは初期の構想通りに駆動し一応の成果を得た。ただし、マンマシン・インターフェイスへの個人の対応の巧さ・まずさが大きく影響するために、CAIが機能を十分の効果を発揮するにはマンマシン・インターフェイスの一層の改善が必要である。この点は、近年のマルチメディア技術を導入することで、大きな改善が期待できるので、今後の研究に引き継いでいく予定である。
水分移動を含む着衣の伝熱機構の研究

繊維集合体の吸湿速度の測定と、寝床の就寝時の温湿度変化の測定を行ない、熱伝導方程式と物質拡散方程式に従って解析を行なった。以下、交付申請書の実施計画の項目番号に対応させて研究成果の概要を記す。1.衣服素材の各特性値の測定代表的な素材としてポリエステルわた,木綿わた,ウールわたの3種を選び、水分を吸収してゆく過渡現象を、吸湿が飽和する時定数と飽和水分量で表し、次の結論を得た;(1)吸湿過程は、概ね1次遅れ系として表わされ、時定数で評価できる。(2)時定数、飽和水分量とも素材によって固有の値を持つ。(3)時定数、飽和水分量とも、環境の相対湿度の関数として変化する。なお、実験環境に敏感で、恒温・恒湿の条件が必要なことが明らかとなり、外部機関の助力を得て始めて実験を遂行できた。この不便から遂行が遅れた面もあるが、以下に述べる現象の基礎として、更に広範な測定を続けてゆく。2.潜熱の出入を確認するための実験および解析(1)吸湿量が微小なポリエステルわたは、高湿度の環境に入れられても、特異な温度上昇は示さない。(2)ウールわたと木綿わたは吸湿量が大きく、吸湿初期に顕著な温度上昇を示し、その後漸次環境温度に近づく。(3)上記現象は、吸湿された水蒸気の潜熱放出を仲介として、熱伝導方程式と拡散方程式を考えることによって合理的に解釈できる。3.着衣円柱モデルによる伝熱量の計算上記2の研究が旨くいったので、数理モデルよりは実際の人体のまわりの実験を行ない、そのデータを上記1,2の考え方に従って解析することに変更した。ポリエステルわた寝床に就寝したときの温湿度を測定し、この場合でも、熱伝導方程式と物質拡散方程式に適合した現象であることがわかった。
ミセル化パクリタキセルによる頭頸部癌次世代治療戦略と薬剤耐性克服への応用

頭頸部癌の化学療法においてキードラッグであるシスプラチンについて検討した。シスプラチン併用の化学放射線療法が頭頸部癌における標準療法の一つである。しかしシスプラチンは骨浸潤した腫瘍に対しての制御が悪く、また有害事象として腎機能障害が問題である。近年、drug delivery systemを応用した薬剤の開発が盛んとなっており、特に骨浸潤における問題を解消するためにシスプラチンにリン酸基をつけ電荷型にした薬剤が開発された(3Pt)。今回、頭頸部癌細胞株を用いて、3Ptとシスプラチンの抗腫瘍,腎機能障害について検討した。in vitroでの抗腫瘍効果に関しては3P tはシスプラチンよりも劣る結果であった。しかし頭頸部癌移植モデルマウスを用いた検討では、両者の薬剤は抗腫瘍効果については同等であった。腎機能障害については、シスプラチン投与群では3Pt投与群に比して、尿細管上皮細胞でのアポトーシスが亢進しており、3ptが腎機能障害が軽減していることがわかった。さらに舌癌細胞株を下顎骨に移植したモデルマウスにおいて下顎骨浸潤をCT画像にて評価検討した。3Pt投与群がコントロール群やシスプラチン群に比べて、下顎骨の骨破壊の抑制効果が高かった。以上のことから電荷型シスプラチンである3Ptは従来のシスプラチンに比して特に骨浸潤のあるような腫瘍において高い抗腫瘍効果が期待でき、また腎機能障害の軽減が図れることが分かった。以上の研究成果を現在英文論文にて投稿中である。頭頸部癌の化学療法においてキードラッグであるシスプラチンについて。シスプラチン併用の化学放射線療法が標準療法の一つである。しかしシスプラチンは骨浸潤した腫瘍に対しての制御が悪いことが問題である。in vitroでの抗腫瘍効果に関しては3Ptはシスプラチンよりも劣る結果であった。さらに下顎骨浸潤モデルマウスにおける検討では3Pt投与群がコントロール群やシスプラチン群に比べて、骨破壊の抑制効果が高かった。以上から3Ptは従来のシスプラチンに比して特に骨浸潤のあるような腫瘍において高い抗腫瘍効果が期待でき、また腎機能障害の軽減がはかれることが分かった。現在、3Ptとシスプラチンに関して頭頸部癌に対するさらなる抗腫瘍効果、骨浸潤における腫瘍制御メカニズムの解明にとりくんでいる。Drug deliverysystemの観点から我々は頭頸部癌治療において新しいプラットフォームである薬剤の有用性を検討してきた。電荷型シスプラチンが下顎骨浸潤マウスモデルにおいて有意に抗腫瘍効果を示すことが今回認められた。

腎機能障害については、シスプラチン投与群では3Pt投与群に比して、尿細管上皮細胞でのアポトーシスが亢進しており、3ptが腎機能障害が軽減していることがわかった。さらに舌癌細胞株を下顎骨に移植したモデルマウスにおいて下顎骨浸潤をCT画像にて評価検討した。3Pt投与群がコントロール群やシスプラチン群に比べて、下顎骨の骨破壊の抑制効果が高かった。以上のことから電荷型シスプラチンである3Ptは従来のシスプラチンに比して特に骨浸潤のあるような腫瘍において高い抗腫瘍効果が期待でき、また腎機能障害の軽減が図れることが分かった。以上の研究成果を現在英文論文にて投稿中である。今後はミセル化パクリタキセルを用いて、頭頸部癌における有用性の検討を行う予定である。頭頸部癌細胞株、頭頸部癌移植マウスを用いて従来のパクリタキセルと抗腫瘍効果を比較する。またパクリタキセルの有害事象である骨髄抑制や神経障害についても検証する。さらにシスプラチン耐性の細胞株についても検証し、薬剤耐性の頭頸部癌における有用性も検証する予定である。DDSの観点から開発されたミセル化パクリタキセルを用いて、頭頸部癌における有用性の検討を行う予定である。細胞培養、薬品、マウス購入費が想定より低かったため予定マウスや薬品が想定よりも少なく済んだため、次年度に繰り越す。繰越額は165,276円であり、引き続き本研究のためのヌードマウス購入にあてる予定である。次年度、物品(動物、薬品)等の購入にあてる予定である。
血管新生制御因子CUL3によるmicroRNA制御を標的にした大腸癌治療法の開発

血管新生能が極めて高い大腸癌治療においては、血管新生の新規分子基盤の解明は、抗血管新生医薬品の開発標的の創出の観点からも極めて重要である。近年、申請者らの研究グループは血管新生の新規制御分子として、ユビキチンE3リガーゼ複合体CUL3/KCTD10を同定した。本研究では、生化学と細胞生物学の手法を用いてCUL3/KCTD10依存的な血管新生の分子基盤をRNAの品質管理の観点から詳細に解明する。さらに、当該分子基盤を新規抗血管新生医薬品の開発標的として、抗血管新生医薬品の新規シーズ化合物を導出する。具体的には、コムギ無細胞タンパク質合成系とアルファスクリーンを技術基盤にKCTD10と基質タンパク質の結合阻害剤を探索し、血管内皮細胞及び、マウス大腸癌細胞移植モデルでの血管新生阻害活性を評価する。
ホルモン耐性前立腺癌における細胞周期制御因子によるアンドロゲン受容体転写調節機構

細胞周期制御因子は細胞増殖を制御する重要な因子であり前立腺癌のホルモン耐性にも関与している可能性がある。同じホルモン依存性癌である乳癌の予後、悪性度等に細胞周期制御因子が関与するという報告をもとにしてアンドロゲン受容体と細胞周期制御因子との関係を解析した。アンドロゲン受容体の転写活性化にはサイクリンが主に関与しており、サイクリンEはin vitroでアンドロゲン受容体の転写活性をアンドロゲン依存性に約8倍上昇させ、抗アンドロゲン剤の投与により活性は約2倍まで抑制された(J. Cell Biol. 150(4),873-880,2000)。前立腺癌のホルモン耐性を獲得する実験モデルを作成するために、アンドロゲン依存性前立腺癌細胞株LNCaPをアンドロゲン非存在下(チャコール処理した血清を10%含有する培養液)で約1年間継代培養することを試み、アンドロゲン非依存下でも増殖する前立腺癌細胞株LNCaP-HRを樹立することに成功した。これらの細胞株間で細胞増殖力を比較したところ、LNCaP-HRはLNCaPの1.25倍の増殖能を示した。また、これらの細胞間で細胞周期制御因子をmRNA、蛋白レベルで調べたが、発現量に差は認められなかった。次に同じホルモン依存性癌である乳癌で約60%、卵巣癌で約40%の発現率を示し、これらの癌の再発や予後などに関連があると報告がされている、ステロイド受容体転写共役活性化因子(SRC)に注目し、これらの因子の前立腺癌のホルモン耐性機構および増殖におよぼす影響を検討した。LNCaP、LNCaP-HR細胞株を用い、発現を比較した結果、SRCがLNCaP-HRでLNCaPの約20倍発現していた(投稿中)。SRCはステロイド受容体を介した転写をホルモン依存性に活性化することは知られているが、以上の予備実験結果から、我々はSRCの発現量が高くなると前立腺癌の悪性度も高くなり癌細胞増殖能を高め、ホルモン耐性能、転移能を獲得し、アンドロゲン非存在下でも増殖が可能になると考えている。細胞周期制御因子は細胞の増殖を正と負に調節する重要な因子である。前立腺癌のホルモン依存性、非依存性増殖にこれらの分子の発現が不可欠であることは言うまでもない。我々は今回の研究で、これらの細胞周期制御因子がアンドロゲン受容体を介した転写調節にどのように作用しているかをin vitroで明らかにした。1.アンドロゲン受容体を有する細胞に正の細胞周期制御因子(サイクリンA、D、E)とアンドロゲン受容体の転写活性を測定するリポーター遺伝子の発現プラスミドを同時にトランスフェクションした。サイクリンEはアンドロゲン受容体の転写活性を強く活性化したが、サイクリンAは逆に抑制した。また、サイクリンEによるアンドロゲン受容体の転写活性化はサイクリンEの濃度依存性であり、アンドロゲン存在下では約7倍、非存在下では約3倍上昇させた。アンドロゲン非存在化でもサイクリンEがアンドロゲン受容体の転写を活性化することは、サイクリンEが前立腺癌のホルモン抵抗性獲得、ホルモン非依存性増殖に関与する可能性が示唆される。2.サイクリンEはサイクリン依存性キナーゼ(Cdk2)と複合体を形成し細胞周期を正に調節する。Cdk2との結合領域を変異させた変異体サイクリンEが野生型サイクリンEと同様にアンドロゲン受容体の転写を活性化したことから、サイクリンEのアンドロゲン受容体転写活性はサイクリン依存性キナーゼ非依存性であると思われる。3)アンドロゲン受容体の各種変異体を用いた、免疫沈降法によりサイクリンEのアンドロゲン受容体結合領域はアンドロゲン受容体のアミノ酸配列144から535番目に位置することが確認された。3.以上の結果から、アンドロゲン受容体に関しては細胞周期制御因子が受容体転写共役因子としても働き前立腺癌の増殖、内分泌療法抵抗性に影響を与える重要な因子であることが示唆される。

LNCaP、LNCaP-HR細胞株を用い、発現を比較した結果、SRCがLNCaP-HRでLNCaPの約20倍発現していた(投稿中)。SRCはステロイド受容体を介した転写をホルモン依存性に活性化することは知られているが、以上の予備実験結果から、我々はSRCの発現量が高くなると前立腺癌の悪性度も高くなり癌細胞増殖能を高め、ホルモン耐性能、転移能を獲得し、アンドロゲン非存在下でも増殖が可能になると考えている。
アクティブレストを用いたインターバル泳の開発

本研究では,水泳のインターバルトレーニングにおけるアクティブレストという休息状態に着目し,パッシブレストと比較して,そのトレーニング負荷がどのように異なるのかを検討することで,トレーニングの目的に応じたインターバル泳に関する実践的な示唆を与えることを目的とした.被験者は日頃から非常によくトレーニングを行なっている大学競泳選手を対象とし,主運動を100%VO2maxで60秒,休息を30秒のアクティブレストとパッシブレストという組み合わせによって,実験を実施した.その結果,アクティブレストはパッシブレストと比較して休息時間中の再酸素化が制限されていることが示唆された.水泳のインターバル泳におけるトレーニング負荷は泳速度だけでなく,休息時間や休息状態からも影響を受け,その休息状態には,身体を全く動かさないで休息するパッシブレストと低強度で運動をしながら休息するアクティブレストの2種類が存在するが,科学的な根拠に基づいた有益な情報が少ないため,トレーニング現場では指導者の経験や勘に基づいてその休息状態が決定されることが多い.そこで本研究では,インターバル泳における休息状態であるアクティブレストに着目し,トレーニングの目的に応じたインターバル泳に関する実践的な示唆を与えることを目的とした.そのために,平成26年度では,インターバル泳における全身代謝特性に関する先行研究を収集し,専門家とのディスカッションを含めた情報収集を行なった.さらに,アクティブレストとパッシブレストを用いたインターバル泳について実験を行ない,その局所筋の代謝特性について検討した.それらの研究成果をオーストラリアのキャンベラで開催された国際学会(Be Active 2014 : Australian Conference of Science and Medicine in Sport)にて発表を行なった.水泳のトレーニングは通常インターバルトレーニング形式を用いられており,そのトレーニング負荷は,インターバルトレーニング中の休息状態からも影響を受ける可能性が考えられる.その休息状態は,大きくアクティブレストとパッシブレストの2種類に分類することができ,トレーニング現場でも広く用いられているが,科学的根拠に基づいた情報が少ないために,指導者の経験によって使い分けられていることが多い.そこで本研究では,アクティブレストという休息状態に着目し,トレーニングの目的に応じたインターバル泳に関する実践的な示唆を与えることを目的とした.平成27年度では,水泳のトレーニング現場で実際に行われている典型的なアクティブブレストを用いたインターバル泳を用いてトレーニング負荷の検討を行なった.被験者は日頃から非常によくトレーニングを行なっている大学競泳選手を対象とし,主運動の時間を60秒,休息状態の時間を30秒という組み合わせによって,実験を実施した.運動強度は,主運動を100%VO2maxとし,アクティブレスト(休息状態)を50%VO2maxとした.また測定項目は,酸素摂取量および筋酸素動態,心拍数とした.その結果,アクティブレストを用いたインターバル泳は,パッシブレストを用いたインバール泳と比較して,酸素摂取量には大きな差は生じないものの,休息時間中の筋酸素動態が大きく異なり,再酸素化が制限されていることが示唆された.本研究の目的を達成するために,キック泳における大腿部分の筋酸素動態を測定すると同時に,キック頻度やキックのけり幅の測定も画像解析によって試みたが,水泡の影響で画像解析をすることが困難であった.そこで試行錯誤しながら,実験を積み重ねることによって,水中用の自発光マーカーを用いることでこれらの問題を解決することができた.このような状況から,予定よりも多少の遅れが生じているが,研究自体は少しずつ前進しているため,進捗状況を「やや遅れている」と判断した.水泳のトレーニングのほとんどはインターバルトレーニング形式で実施されているが,そのトレーニング負荷は,泳速度だけでなく,休息時間や休息状態からも影響を受け,その休息状態には身体を全く動かさずに休息するパッシブレストと低強度で運動しながら休息するアクティブレストの2種類が存在するが科学的根拠に基づいた有益な情報が少ないために,指導者の経験に基づいてその休息状態が決定されている.そこで,本研究はアクティブレストという休息状態に着目し,アクティブレストをもちいたインターバル泳についてトレーニングの目的に応じた実践的な示唆を与えることを目的とした.平成2627年度では,アクティブレストとパッシブレストを比較して,休息状態の違いがトレーニング負荷にどのような影響を与えるかを調査してきたが,平成28年度では,アクティブレストの運動強度に着目し,その強度がインターバル泳のトレーニング負荷にどのような影響を与えるか検証を行なった.被験者は日頃から非常によくトレーニングを行なっている大学競泳選手を対象として,主運動の時間を60秒,休息状態であるアクティブレスト時間を30秒という組み合わせによって実験を実施した.測定項目は,酸素摂取量および局所筋の酸素動態,心拍数とした.その結果,アクティブレスト強度の違いによって,酸素摂取量には有意な差は見られなかったものの,筋の酸素動態には影響を与えることが示された.これらの結果から,アクティブレストの強度は全身の代謝応答には影響を与えないが,アクティブレスト強度が高い場合,筋の再酸素化が制限されていることが示唆された.研究代表者が日本水泳連盟ナショナルチームのコーチングスタッフとして複数の遠征が急遽入ったため,当初計画していた研究協力者とのディスカッションが遅れたことにより,1年間の延長を行なった.以上の理由から進捗状況を「遅れている」と判断した.水泳ではインターバルトレーニング形式によるトレーニングが広く用いられており,そのトレーニング負荷は,インターバルトレーニング中の休息時間によって影響を受けるが,休息状態の違いによっても影響を受ける可能性が推測される.そこで本研究では,アクティブレストという休息状態に着目し,トレーニングの目的に応じたインターバル泳に関する実践的な示唆を与えることを目的とした.

水泳のトレーニング現場で実際に行われている典型的なアクティブブレストを用いたインターバル泳を用いてトレーニング負荷の検討を行なった.被験者は日頃から非常によくトレーニングを行なっている大学競泳選手を対象とし,主運動の時間を60秒,休息状態の時間を30秒という組み合わせによって,実験を実施した.運動強度は,主運動を100%VO2maxとし,アクティブレスト(休息状態)を50%VO2maxおよび65%VO2maxとした.また測定項目は,酸素摂取量および筋酸素動態,心拍数とした.その結果,アクティブレストを用いたインターバル泳は,パッシブレストを用いたインターバル泳と比較して,酸素摂取量には大きな差は生じないものの,休息時間中の筋酸素動態が大きく異なることが示された.さらに,アクティブレストの運動強度の違いによる比較では,酸素摂取量には有意な差は見られなかったものの,筋の酸素動態には影響を与えることが示された.以上の結果から,アクティブレストを用いたインターバル泳は,パッシブレストと比較して,再酸素化が制限されていることが示唆された.またアクティブレストの運動強度は全身の代謝応答には影響を与えないものの,その運動強度が高い場合,筋の再酸素化が制限されていることが示唆された.これらの研究成果について,日本水泳連盟強化コーチと議論し,アクティブレストを用いたインターバル泳に関して,トレーニング現場への活用方法について検討した.本研究では,水泳のインターバルトレーニングにおけるアクティブレストという休息状態に着目し,パッシブレストと比較して,そのトレーニング負荷がどのように異なるのかを検討することで,トレーニングの目的に応じたインターバル泳に関する実践的な示唆を与えることを目的とした.被験者は日頃から非常によくトレーニングを行なっている大学競泳選手を対象とし,主運動を100%VO2maxで60秒,休息を30秒のアクティブレストとパッシブレストという組み合わせによって,実験を実施した.その結果,アクティブレストはパッシブレストと比較して休息時間中の再酸素化が制限されていることが示唆された.本研究では,水泳中の局所筋の酸素動態を測定するため,水中環境下で使用可能なレーザー組織血液酸素モニター(NIRS)を用いる必要があり,測定を成功させるために遮光対策や防水対策について特殊な技術を要するため,試行錯誤しながら予備実験を積み重ねた.また遮光対策に必要なラバー性の水着を用いたが,その水着による圧迫が実験データに影響しないかどうかを検証する必要があったため,検証実験も行なった.
修復物の長期臨床経過に関する実態調査と再修復のための判定基準の確立

歯冠修復物の臨床成績に関する文献を纏めるとともに、以下の研究を行った。コンポジットレジン修復に関しては、田上、稲井は修復処置1051症例のうち、修復処置の原因は、初発齲蝕は46.1%、2次齲蝕は34.0%を占めた。岩久、福島は化学重合型コンポジットレジンの咬合面修復物116例のl0年間の機能残存率は71%で、また窩縁部の相対的平均摩耗量は100μm以下であり、臨床的に許容のできる範囲内としている。新谷は13年間の観察を行い、辺縁適合性、摩耗、修復物の変色・着色は4年、7年、10年間はほぼ同じ成績を示したが、13年経過後はやや劣化が認められた、また二次齲蝕も10年後の評価と比べ若干増加しているとしている。久保は5年以上のコンポジットレジン修復310症例のうち75症例が再治療され、その年数は平均6.2年であり、窩洞別では3級窩洞7.4年、5級窩洞4.5年と有意差が認められたとしている。福島、久保は共に再修復の主たる理由は歯髄処置(歯髄炎)、破折、脱落を挙げている。また久保はくさび状欠損66症例にClearfil liner bond IIとSingle Bondを用いてコンポジットレジン修復を行い、接着システムによる差がなかったと報告している。河野、高水はセルフエッチングプライマーシステムは口腔内で少なくとも7年間の接着耐久性があることを観察している。臨床成績を向上させる方法として加藤、新海はベベル付与するときは、小窩裂溝の延長線上に限局した小範囲にとどめるべきで、また咬合面の光重合型コンポジットレジン修復は光透過型圧接子の使用を推奨している。井上、北野は修復時に適切なフィールドコントロールと的確な修復技術とがコンポジットレジンの長期間機能を可能にするとしている。小松は再治療の判断を辺縁のgapに焦点を置き、gapの識別能について検討した。辺縁のgap幅、50μは触診により概ね識別が出来るとし、より確実な再治療の判定基準確立のためには、視診、触診による識別能を向上させること、客観的な観察法としてボアスコープなどで拡大観察を行うこととしている。鋳造修復について久保は100例中21例に再修復が行われ、その年数は平均6.3年と報告している。竹重はセラミックインレーのような脆性の高い材料では、製作時にflowやmicro crackが生じないよう予め傷を修復することが極めて重要で、修復物辺縁を中心にSEMによる微細な分析を行うことにより亀裂の進展が検知出来、予後の判定に利用出来る可能性があることを示唆した。新谷は、2種の臼歯用コンポジットレジンの長期臨床経過例をUSPHS法に準じた評価を行い、10年経過例は7年経過例に比べ辺縁適合性、磨耗について若干の劣化が認められたが、他は良好な臨床経過を示したとしている。中村、河野等は57年経過しコンポジットレジン722例については、完全な状態で使用されていたものは35%で、再修復の必要あるもの8、7%、またインレー修復では完全な状態で使用されていたものは68%あったとしている。井上、北野らは非接触型3次元位置測定装置を用い、15年経過例を検討している。加藤は臼歯用コンポジットレジン修復時の窩縁形態と填塞法が修復物の経時的変化に与える影響について、in vivoでの検討を開始した。小松はCCDカメラを使用し口腔内で直接辺縁適合性を観察し、辺縁部空隙の存在の確認に有効であることを見出だした。久保は歯頚部レジン修復の辺縁封鎖性の検討を行いブラキシズムなどの異常な咬合は辺縁封鎖性に大きく影響を与えること、また窩洞形態および接着システムによって、漏洩パターンの異なることを見出だしている。田上、稲井はサルを使用し、Liner bond II,AP-xを用いたin vivoの実験を行い、1年経過した充填物と歯質との界面における接着強さと形態学的な考察では、接着強さは初期の値と比較して統計学的有意に低下しないが、接着破断面ではフィラーがマトリックスレジンから脱落する傾向が強いことを観察している。竹重は長期経過のレジン、ポーセレンインレーの症例を審査し、レジンセメントの磨耗の激しい箇所のマトリックス部分に亀裂が多く認められる傾向にあり、また生じた微小亀裂は時間とともに成長し、やがて大規模な辺縁破折を生じることを観察している。岩久、福島は分担研究機関が共同で行なう、長期臨床経過症例の評価基準を作成中で、次年度はこの評価基準を基に再修復の判定基準の確立をはかりたいと思う。

久保は5年以上のコンポジットレジン修復310症例のうち75症例が再治療され、その年数は平均6.2年であり、窩洞別では3級窩洞7.4年、5級窩洞4.5年と有意差が認められたとしている。福島、久保は共に再修復の主たる理由は歯髄処置(歯髄炎)、破折、脱落を挙げている。また久保はくさび状欠損66症例にClearfil liner bond IIとSingle Bondを用いてコンポジットレジン修復を行い、接着システムによる差がなかったと報告している。河野、高水はセルフエッチングプライマーシステムは口腔内で少なくとも7年間の接着耐久性があることを観察している。臨床成績を向上させる方法として加藤、新海はベベル付与するときは、小窩裂溝の延長線上に限局した小範囲にとどめるべきで、また咬合面の光重合型コンポジットレジン修復は光透過型圧接子の使用を推奨している。井上、北野は修復時に適切なフィールドコントロールと的確な修復技術とがコンポジットレジンの長期間機能を可能にするとしている。小松は再治療の判断を辺縁のgapに焦点を置き、gapの識別能について検討した。辺縁のgap幅、50μは触診により概ね識別が出来るとし、より確実な再治療の判定基準確立のためには、視診、触診による識別能を向上させること、客観的な観察法としてボアスコープなどで拡大観察を行うこととしている。鋳造修復について久保は100例中21例に再修復が行われ、その年数は平均6.3年と報告している。竹重はセラミックインレーのような脆性の高い材料では、製作時にflowやmicro crackが生じないよう予め傷を修復することが極めて重要で、修復物辺縁を中心にSEMによる微細な分析を行うことにより亀裂の進展が検知出来、予後の判定に利用出来る可能性があることを示唆した。歯冠修復臨床調査表が出来上がり使用を開始した。過去に記録した症例は書き写すこととし、おおむね良好な使用感を得た。小松は前年度に有効性を確認した内視鏡とSEMを用い、グラスアイオノマーセメントの経時的変化を観察している。田上、稲毛はDIAGNOdent(カボ社)よるウ蝕検知の有効性を確認し、また2次ウ蝕の原因を調査し、516例中2次ウ蝕152(29.5%)、修復物脱離22(4.3%)が多く、331(64.1%)は初発ウ蝕であると報告している。中村、河野、倉地は修復物の長期観察症例を追加しており、インレー修復の10年後について検討している。高水はOCC56症例の経過観察をし、初期に破折が多いのは術式の不備や使用セメントの接着性に問題があったとしている。岩久、福島は臼歯用コンポジットレジン修復の10年経過症例の検討とラミネートベニア修復のリコールを行っている。また、歯頚部修復の臨床成績を根面ウ蝕とクサビ状欠損とにわけて検討している。加藤は光重台型と化学重合型のコンポジットレジンをベアで修復し、窩洞の形態、填塞法の違いによる影響を検討し、耐摩耗性にはフィラーの性状が、変色にはモノマーの種類が原因となるとしている。井上、北野は臼歯用コンポジットレジン修復の15年の経過症例を詳細に検討し、レジンの摩耗量は3.4年間に多いとしている。竹重は、ポーセレンインレーの臼歯部修復の臨床観察を継続しており、新谷はP10とクリアフィルポステリアの15年経過例の比較をし、現在メタルインレーとレジンインレーの経過を観察している。久保は5年以上経過した各種修復症例339例について詳細に検討し、再修復に至った症例はレジンでは3年、インレーでは4年未満には見られないとしている。福島を中心に再修復の判定基準の確立にむけて各診査項目の基準に対する考え方を挙げ、今後、臨床経過との相関について検討することにした。
植物Small RNAの特異性とウイルスの病原性に関する研究

ウイルスが植物に感染すると、RNAサイレンシング機構による抵抗性反応が引き起こされる。この際、大量に生じるウイルス由来小分子RNA (vsiRNA)が主にAGO1に取り込まれた後に、配列特異的なRNAの分解が起こる。本研究では、AGO1-vsiRNA複合体の配列特異性を明らかにし、ウイルス感染時にウイルスRNA以外のどのmRNAが副次的に分解されているのかを予測できるようにすることを目指した。本研究の結果から、これまで詳細に解析されていなかった植物AGO1の特異性決定機構の一部が明らかとなり、植物ウイルス感染時の遺伝子発現抑制におけるvsiRNAの役割を評価することが可能となった。AGO1に取り込まれたウイルス由来のsiRNA (vsiRNA)の特異性を予測するために、AGO1-miRNAを用いて標的mRNAの認識特異性に関する検証実験を行った。本研究では、ホタルルシフェラーゼ遺伝子(FLuc)を用いてNicotiana benthamianaで一過的に遺伝子発現抑制を検証する系を構築した。はじめに、FLucの3'UTRに挿入した標的配列とmiRNAの間に一つのミスマッチが生じる21区を検証した。その結果、miRNAの5'側の塩基対が遺伝子発現抑制に重要なことが明らかとなった。次に、FLucの3'UTRに挿入した標的配列とmiRNAの間に二つのミスマッチが生じる区を検証した。その結果、miRNAの中央付近の塩基対が遺伝子発現抑制に重要なことが明らかとなった。ルシフェラーゼアッセイの結果を元に、既報のCMV-vsiRNAの標的mRNAを予測した。その結果、6種類のvsiRNAがArabidopsis thalianaの遺伝子発現抑制を誘導する可能性が予測された。並行して、AGO1中に取り込まれるvsiRNAの宿主間での差異を検証するために、N. benthamianaのAGO1 (NbAGO1)に対する抗血清を作出した。このNbAGO1抗血清の特異性を確認するために、CRISPR-Cas9を用いてNbAGO1遺伝子の破壊を試みている。これまでに、gRNAのデザインとプラスミドの構築まで完了した。現在、Cas9-NbAGO1 gRNA形質転換体の選抜を行っている。ほぼ計画通りに進展したため。AGO1に取り込まれたウイルス由来のsiRNA (vsiRNA)の特異性を予測するために、引き続きAGO1-miRNAを用いて標的mRNAの認識特異性に関する検証実験を行った。ホタルルシフェラーゼ遺伝子(FLuc)を用いてNicotiana benthamianaで一過的に遺伝子発現抑制を検証する実験を行ない、FLucの3'UTRに挿入した標的配列とmiRNAの間に三つのミスマッチが生じる区を網羅的に検証した。その結果、miRNAの中央領域とシード領域の間の塩基対、及び3' supplementary領域の塩基対が遺伝子発現抑制に重要なことが明らかとなった。2年間で完了したルシフェラーゼアッセイの結果は、AGO1-vsiRNAの標的となりうるmRNAの予測アルゴリズムの構築に活用できる実験に基づくデータとして、非常に有用である。並行して、実際にウイルス感染時にAGO1中に取り込まれるvsiRNAを調べる目的で、N. benthamianaのAGO1 (NbAGO1)に対する抗血清を作出した。ウエスタンブロッティングによって、NbAGO1タンパク質のシングルバンドが確認されたため、抗血清がうまく作用したことが示唆された。この抗NbAGO1抗血清を用いれば、NbAGO1の免疫沈降が可能であり、NbAGO1に入りやすいvsiRNAを実験的に検証できるようになる。多犯性のCMV由来のvsiRNAが他の宿主植物でAGO1に取り込まれて働くかどうかを評価するための有用な材料となるであろう。また、ウイルス感染時にNbAGO1の発現量が変化するかどうかを調べた結果、その発現量が上昇しないことが確認できた。ウイルス感染時に一定量のvsiRNAがAGO1中に取り込まれることを考えると、本来AGO1に取り込まれて働くはずの一部のmiRNAが働けない状況が生じている可能性が想定された。引き続き当初計画に従い研究を進めていく。FLucの3'UTRに挿入した標的配列とmiRNAの間に三つのミスマッチが生じる区の検証を完了させ、CMV vsiRNAの標的mRNA予測の精度をさらに高める。予測された標的mRNAがCMV感染時に減少するかどうかをリアルタイムPCRによって検証する。nbago1変異体を作出し、抗NbAGO1血清の特異性を確認した後、次世代シークエンスによってAGO1に取り込まれるCMV vsiRNAの宿主植物間での差異を検証する。植物ウイルス学
在宅診療用ユニットの感染防止に関する研究

細菌による汚染を指標として,エアータービンハンドピース,マイクロモーターハンドピース及びスリーウェイシリンジについて在宅診療用ユニットにおける汚染の波及状況を調べるとともに,在宅診療用ユニットの給水にソフト酸化水を用いることによる汚染防止の有効性を検討した。ハンドピース汚染モデル実験系を用いて,エアータービンハンドピース,マイクロモーターハンドピース及びスリーウェイシリンジを汚染させ,ハンドピースや在宅診療用ユニット内部への汚染波及の状況を調べた。汚染後,再作動時にはエアータービンハンドピース,マイクロモーターハンドピース及びスリーウェイシリンジから細菌の放出が認められた。しかし,給水タンク中には細菌の侵入は認められなっかた。エアータービンの給気管と排気管に生理食塩水を通過させて調べると,給気管には少量,排気管には多量の細菌の侵入は認められた。エアータービンの給水管では少量の細菌が認められたが,マイクロモーターの給水管では細菌は認められなかった。ユニットの給水にソフト酸化水を用いると,エアータービンハンドピースとその給水管および給気管,マイクロモーターハンドピースおよびスリーウェイシリンジには細菌が認められなかったが,エアータービンの排気管には細菌が認められた。給水管の材質は塩素による腐食の可能性があるといわれているが,使用後直ちに蒸留水で洗浄していると短期使用では著明な変化は認められなかった。ニニットの給水にソフト酸化水を用いても,エアータービンおよびマイクロモーターの回転数や注水量には影響は認められなかった。以上の結果よりユニットの給水にソフト酸化水を用いると,汚染防止に効果があると考えられる。在宅診療用ユニット給水系の細菌汚染の測定を行った。まず,ハンドピース汚染モデル実験系を用いて,エアータービンハンドピースを汚染させ,ハンドピースや在宅診療用ユニット内部への汚染波及の状況を調べた。ハンドピース汚染後,再作動時には診療室と同様に細菌の放出が認められた。ホースの給水管内や給水タンク中には細菌の侵入は認められなかった。給気管と排気管に生理食塩水を通過させて調べると,給気管には少量,排気管には多量の細菌の侵入は認められた。現在口腔内に使用されている抗微生物性薬剤を調べ,在宅診療用ユニットの給水系に添加の可能性を検討したが,ポピドンヨードは表面着色と金属の錆の問題があり,塩化ベンザルコニウムは芽胞やウイルスには無効であることや結晶化する問題があり,適している薬剤は認められなかった。そこで,手指の消毒に有効である食塩水を電気分解して得られる電解水について検討した。その電解水のなかで,殺菌力が強くpH値が中性のため金属腐蝕性が弱いハイクロソフト水のユニット給水系への利用を検討した。まず,ハイクロソフト水の実験供試菌株に対する殺菌効果を確認した。次に,ハイクロソフト水を在宅診療用ユニットに給水し,エアータービンの回転数や注水量を測定した。エアータービンの回転数に変化はなく,注水量にも変化は認められなかった。使用後直ちに蒸留水で洗浄しているが,給水管の材質は塩素による腐食の可能性があり長期使用での観察が必要であると思われる。細菌による汚染を指標として、エアータービンハンドピース,マイクロモーターハンドピース及びスリーウェイシリンジについて在宅診療用ユニットにおける汚染の波及状況を調べるとともに,在宅診療用ユニットの給水にソフト酸化水を用いることによる汚染防止の有効性を検討した。しかし,給水タンク中には細菌の侵入は認められなかった。エアータービンの給気管では少量の細菌が認められたが,マイクロモーターの給水管では細菌は認められなかった。