hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
オートファジーが関与する小胞体品質管理機構の解明

凝集体コラーゲンの機序を理解する上で、モデル基質としての役割を果たすこともわかり、今後の詳細な分解メカニズム解明の足掛かりになることがわかった。また現在、新たなオートファジー制御因子を同定し、機能解析を進めることが出来た。27年度が最終年度であるため、記入しない。小胞体に蓄積するミスフォールドタンパク質としてI型コラーゲンを用いることにする。I型コラーゲンはα1鎖2本とα2鎖1本の合計3本鎖から構成される三量体を最小単位とする。コラーゲン分子は生命活動に必須の分子であり、遺伝子変異による機能不全は骨形成不全に代表されるコラーゲン病を生じる。Mov13細胞はI型コラーゲンα1鎖をコードする遺伝子(COL1A1)の発現を欠損させたマウスに由来する繊維芽細胞であり、Mov13細胞ではα2鎖のみが発現している。我々はMov13細胞に変異型α1鎖を入れ戻した安定発現株を準備しており、ミスフォールドした三量体コラーゲンは小胞体に蓄積し、オートファジーによって分解がなされることがわかっている。凝集体コラーゲンに結合する因子をMS解析により同定し、凝集体コラーゲンの分解処理に関わる因子の解析を行っていきたい。巨大分子を形成するモデル基質としてコラーゲン、ATZ変異体、高分子量J鎖を用いて分解への影響を観察する。肝星細胞においてコラーゲン特異的分子シャペロンHsp47のノックアウトでコラーゲンの蓄積が観察され、これに伴う肝星細胞の細胞死は肝硬変の治療戦略に用いられている。我々は肝星細胞のオートファジーを阻害することによって、小胞体ストレスの亢進および細胞死を促進することを明らかにしている。結合因子が同定されれば、肝硬変の新しい治療ターゲットとなり得、研究室に用意されたこれらの細胞で詳細なメカニズムを解析することは意義深い。また、結合因子の同定に至らなかった場合、各種クロスリンカーを用いて条件検討を行う予定である。また、我々は小胞体環境で結合アッセイを行うことが出来るYeast Two-hybridシステムを持っている。ライブラリーに存在する小胞体内腔タンパク質と結合アッセイを行うことで結合タンパク質の同定に挑みたい。
牛馬生産地域における家畜所有の社会経済的意義と歴史的展開

本年度は、(1)史料調査と(2)研究成果の発表を中心に活動を行った。(1)史料調査では、まず牛の多頭所有者であった岡山県後月郡高屋村高木家の史料群(岡山県立記録資料館所蔵)を調査し、マイクロ化されている史料のうちより、牛経営帳簿を中心に紙焼き収集していった。高木家に関しては、目下分析検討中である。次に島根県立図書館と出雲市立図書館にて、『島根県統計書』、『島根県農事調査報告書』、『島根県農事統計』、『島根県の畜産』、『島根県飯石郡治一斑』といった家畜に関する統計書類の調査収集を行った。これは牛だけでなく馬の動向を探るのが目的であった。統計書の分析より、馬は主としてたたら製鉄の運搬業務に従事していたこと、近代以降の馬頭数の衰退傾向は、たたら製鉄の衰退傾向と軌を一にしていることが実証できた。この研究成果は近いうちに発表する予定である。また牛の品種改良へ着目していた、中国和牛研究会に関する史料も現在収集中である。その他、古老や家畜商への聞き書き調査も再開し、聞き書きノートを作成中である。(2)研究成果として、「牛生産地域における家畜所有の歴史的展開」(『日本史研究』545号、2008)を発表することができた。また日本農業史学会にて「中国山地における役牛生産と流通」と題する報告を行い、一定の評価は得られたと考えている。この報告内容は現在投稿中である。その他、鞍下牛に関する論考、家畜小作概念を再検討する論考を準備中である。本年度は今までの研究成果をまとめることと、新しい史料調査を中心に活動を行った。まずは、計画通り農文協図書館にて、『和牛の流通経済』(1954)、『家畜の流通過程に関する調査』(1954)、『牧野高度利用のための社会経済的条件』(1959)、『畜産における家畜小作の位置とその解消に関する研究』(1957)、等の1960年以前における農業経済学の研究成果の資料複写を行い、一定の成果を収めた。当時の農業経済学者達は当初想定していた以上に、牛馬の売買流通過程を把握しており、詳細なデータを研究成果にしていたことが判明した。しかし、家畜の所有関係に関しては、ほとんど把握できていなかった様子を確認した。次に、島根県仁多郡奥出雲町絲原記念館にて製鉄業関係史料の調査を行った。併せて附近の丸山家文書の史料調査も行ったが、当初の目論見は外れ、期待していたような牛馬に関する史料を見つけることができなかった。そこで、牛の多頭所有者であった岡山県後月郡高屋村高木家の史料群(岡山県立記録資料館所蔵)を調査することにした。その結果、高木家文書の中には、天明3年明治28年までの「牛売買預覚帳」が残存していることが確認でき、目下分析検討中である。併せて、明治17年畜産諮詢会(明治文献資料刊行会『明治前期産業発達史資料』第9集所収)の分析も行っている。今まで行ってきた、家畜の生産と流通、家畜所有に関する研究成果は、「中国山地における牛生産と家畜小作」(投稿中)、「牛生産地域における家畜所有の歴史的展開」(投稿準備中)として、発表していく予定である。
ｉＰＳ細胞由来腎臓前駆細胞から機能上皮への選択的誘導

我々はヒトiPS細胞からネフロン前駆細胞を経由して腎臓組織を誘導することに成功している。しかし現時点では糸球体、近位尿細管、遠位尿細管が混在してランダムに誘導される。そこで本計画では、前駆細胞から機能的な近位尿細管を選択的に誘導することを目的とする。まずマウスを用いて分化マーカを同定し、胎仔由来及びマウスES細胞由来のネフロン前駆細胞から近位尿細管への誘導法を確立する。それをヒトiPS細胞に応用し、ヒトでの誘導法を確立する。本計画は多くの細胞種からなる腎臓において近位尿細管の細胞運命が決定される過程を発生学として解き明かすとともに、産物としての近位尿細管は、抗癌剤等の薬剤動態解析、薬剤開発のプラットフォームになるとともに、疾患の病態解明にも貢献することが期待される。本年度はマウス発生の各段階で近位尿細管をFACSで単離し、遺伝子発現を網羅的に解析することで、この細胞系譜の分化・成熟マーカーを同定した。次いで前駆細胞が蛍光発色する遺伝子改変マウスからGFP陽性細胞を単離し、各ステップにおいて液性因子を組み合わせて添加することで、選択的に近位尿細管細胞を誘導する方法を探索した。検定FACS,qPCR,組織染色によって行ったが、マーカーによっては近位尿細管の誘導率を正確に反映しないものがあり、改善を試みている。またどの発生段階まで成熟しているか、それをどうやってさらに成熟させるかも大きな課題であり、検討中である。マーカーによっては近位尿細管の誘導率を正確に反映しないものがあり、改善中である。マウス胎仔由来のネフロン前駆細胞からの誘導法確立に注力したい。それと並行して機能を解析できる系を構築する必要がある。
細胞壁マトリックス成分の合成・梱包・輸送と堆積のダイナミクス

ポプラの分化中木部より二次壁形成中の細胞をかき取り、超遠心法によりミクロソーム画分を得た。このミクロソーム膜画分を、さらに20、30、40、50%の不連続ショ糖密度勾配法により、密度の異なるミクロソーム膜を分画した。これらの画分の一部は、グルタルアルデヒドー四酸化オスミウム固定の後、エポキシ樹脂に包埋、切片作製後に抗キシランモノクローナル抗体で標識し、電子顕微鏡で観察した。免疫標識された画分は20-30%境界から得られた画分であった。キシランを含むゴルジ小胞はショ糖濃度20-30%境界で得られるミクロソーム膜の中に含まれているものと推察された。高アセチル化されたキシランの単離方法について検討した。上記の分化中木部から得られた細胞壁をシュウ酸アンモニウムで脱ペクチン処理しDMSO抽出を行った所、脱リグニン処理を行わなくてもキシランが抽出されることが判明した。今後の課題は、ショ糖濃度20-30%境界から得られるキシランやDMSO抽出して得られるキシランのアセチル化度を測定することである。堆積直後のヘミセルロースの挙動を調べるために、分化中木部をグルタルアルデヒドで固定し、バッファー洗浄後に放射面切片を作製して臨界点乾燥させ、白金コーティング後に高分解能走査電子顕微鏡で観察した。切片の一部はPATAg染色や抗キシランモノクローナル抗体標識したあと、同様に観察した。その結果、堆積直後のセルロースミクロフィブリルの周囲はアセチル化度の低いキシランが取り巻き、それらが数本集合してできたミクロフィブリル集合体の周囲はアセチル化度の高いキシランで充填されていることを示唆する結果が得られた。ゴルジ小胞中に含まれるキシランの単離方法に目処がつき、形成中の細胞壁から高アセチル化されたキシランの抽出方法も確立した。モノリグノール類の輸送に関する実験も平行して実施しており、p-クマリルアルコールの輸送がコニフェリルアルコールの輸送に類似していることを示唆する研究成果が得られつつある。今後は、ゴルジ小胞中に含まれるキシランや形成中の細胞壁由来のキシランを用いて、MALDITOFmass法や化学分析法などにより、形成中のキシランや堆積後のキシランのアセチル化度を測定する。p-クマリルアルコールの輸送に関する研究を進めるとともに、シナピルアルコールの輸送に関する研究を実施する。平成27年度の経費で設置した高圧凍結装置でユーカリ分化中木部を高圧凍結した。凍結試料はー80°Cに冷却された2%OsO4アセトン溶液で置換・固定し、室温にもどしてエポキシ樹脂に包埋した。コントロールとして、ユーカリ分化中木部を3%グルタルアルデヒド固定、1%OsO4固定し、エポキシ樹脂に包埋した。両者の試料から、光学顕微鏡用には1μm厚さの横断面切片を作製し、電子顕微鏡用にはおよそ0.1μm厚さの横断面切片を作製した。光学顕微鏡用切片には多糖類を選択的に染色するPAS反応を行った。細胞壁ならびに細胞質基質の染色性は明らかに高圧凍結試料で高く、水溶性多糖類や単糖類が細胞壁や細胞質基質に保持されていることが推察された。抗キシランモノクローナル抗体を用いて分化中木部を標識すると、高圧凍結法、化学固定法の試料とも、二次壁形成中の細胞壁が標識された。標識の局在、強さは両者で大きな違いはなかった。超薄切片は、酢酸ウラニル・クエン酸鉛染色して透過型電子顕微鏡で観察した。高圧凍結試料では、一部に無氷晶で良好な凍結像が得られたが、多くの細胞では高圧による細胞や細胞壁の破壊が起こっていた。試料を入れるホルダー内に気泡が存在するとこのような試料の破壊が生じるとのことから、脱気しながら試料をホルダーに入れ高圧凍結を試みたが、試料が破壊される現象の解消には至っていない。超遠心法による分化中木部からのゴルジ装置の単離は、実験方法の確立に至った。すなわち、分化中木部から超遠心法によりミクロソーム画分を得て、さらにミクロソーム画分から密度勾配遠心法によりゴルジ装置に富む画分を得るに至った。高圧凍結法と一般的な化学固定法の試料を比較すると、明らかに前者の方が多糖類の選択的染色法で強く染まる。これは、細胞壁中に存在するであろう水溶性多糖類が高圧凍結法で保持された結果と思われる。一方、想定外の出来事は、高圧凍結された細胞が、高圧により細胞が破断されてしまったような電子顕微鏡像を呈することである。この原因の1つが、試料中、あるいは試料周辺に気泡が入ることとされる。試料から脱気を行い高圧凍結に供しているが、現時点ではよい固定像が得られていない。超遠心法によるゴルジ装置に富む画分の取得は方法が確立した段階で、今年度は本格的なゴルジ装置の単離に入る。ヒノキ圧縮あて材の分化中木部を高圧凍結・凍結置換固定し、エポキシ樹脂に包埋した。包埋試料より超薄切片を作製し、抗グルコマンナン抗体、抗キシラン抗体、抗ガラクタン抗体を用いて、単独、又は組み合わせて免疫標識した。圧縮あて材の二次壁はS1層、S2層に分けられるが、S2層はさらに木化度の違いからoS2層(S2層外側)とiS2(S2層内側)に分けられる。

抗グルコマンナン抗体を用いた標識では、S1層形成期で観察されたゴルジ装置のうち82%が標識され、oS2層形成期では74%、iS2層形成期では60%のゴルジ装置が標識された。抗キシラン抗体を用いた標識では、S1層形成期で44%、oS2層形成期で90%、iS2層形成期で88%のゴルジ装置が標識された。抗ガラクタン抗体を用いた標識では、S1層形成期で46%、oS2層形成期で74%、iS2層形成期で20%のゴルジ装置が標識された。例えばoS2形成期を例に挙げれば、グルコマンナン標識されたゴルジ装置の割合が74%、キシラン標識が90%、ガラクタン標識が74%である。これらを合計すると238%となり、100%を越えている。このことは、1つのゴルジ装置で2種類以上のヘミセルロースが合成されていることを示唆している。ポプラ分化中木部を削り取り、スクロースを用いた密度勾配遠心法によりミクロソーム膜画分の分画を試みた。スクロース濃度0ー20%界面、20ー30%界面、30ー40%界面、40ー50%界面を取り出し、エポキシ樹脂に包埋した。包埋試料より、薄切片、超薄切片を切り出し、前者は抗キシラン抗体を用いた免疫蛍光標識、後者は免疫金標識に用いた。免疫標識は20ー30%界面、30ー40%界面に現れたことから、ゴルジ層板、あるいはゴルジ小胞由来のミクロソーム膜は上記の界面に存在していることが判明した。ヒノキ圧縮あて材の分化中木部を用いたヘミセルロースの免疫標識では、1つのゴルジ装置が2種類以上のヘミセルロースを生合成している可能性が示された。この結果により、ヘミセルロースの二重標識などを行うことでゴルジ装置の機能を詳細に解明することが可能となった。また、密度勾配遠心法によりゴルジ装置、あるいはゴルジ小胞に由来するミクロソーム膜画分が得られた。ゴルジ小胞由来の膜画分を大量に回収して、ヘミセルロースの化学構造を分析することが可能になった。ポプラの分化中木部より二次壁形成中の細胞をかき取り、超遠心法によりミクロソーム画分を得た。このミクロソーム膜画分を、さらに20、30、40、50%の不連続ショ糖密度勾配法により、密度の異なるミクロソーム膜を分画した。これらの画分の一部は、グルタルアルデヒドー四酸化オスミウム固定の後、エポキシ樹脂に包埋、切片作製後に抗キシランモノクローナル抗体で標識し、電子顕微鏡で観察した。免疫標識された画分は20-30%境界から得られた画分であった。キシランを含むゴルジ小胞はショ糖濃度20-30%境界で得られるミクロソーム膜の中に含まれているものと推察された。高アセチル化されたキシランの単離方法について検討した。上記の分化中木部から得られた細胞壁をシュウ酸アンモニウムで脱ペクチン処理しDMSO抽出を行った所、脱リグニン処理を行わなくてもキシランが抽出されることが判明した。今後の課題は、ショ糖濃度20-30%境界から得られるキシランやDMSO抽出して得られるキシランのアセチル化度を測定することである。堆積直後のヘミセルロースの挙動を調べるために、分化中木部をグルタルアルデヒドで固定し、バッファー洗浄後に放射面切片を作製して臨界点乾燥させ、白金コーティング後に高分解能走査電子顕微鏡で観察した。切片の一部はPATAg染色や抗キシランモノクローナル抗体標識したあと、同様に観察した。その結果、堆積直後のセルロースミクロフィブリルの周囲はアセチル化度の低いキシランが取り巻き、それらが数本集合してできたミクロフィブリル集合体の周囲はアセチル化度の高いキシランで充填されていることを示唆する結果が得られた。
Toll-like receptorを介した膵星細胞活性化機序の解明

平成19年度はラットならびにヒト膵星細胞におけるToll-like receptors (TLRs)発現ならびに細胞機能調節について検討した。いずれの膵星細胞においてもグラム陽性菌を認識するTLR2、グラム陰性菌のLPSを認識するTLR4をはじめTLR3、TLR5の発現がみられ、細菌のみならず真菌やウイルスを膵星細胞が認識しうることが明らかになった。膵星細胞をTLR2のリガンドであるlipoteichoicacid、TLR3のリガンドであるpolyinosinic-polycytidylicacid、TLR4のリガンドであるLPS、TLR5のリガンドであるflagellinにて刺激するとNF-kappaBやMAP kinases (ERK, JNK, p38MAP kinase)といった広範なシグナル伝達系の活性化が認められた。これらのTLRリガンドは膵星細胞からのMonocyte chemoattractant protein (MCP)-1やCINC-1(IL-8のラットホモログ)をはじめとするサイトカインやケモカイン、さらに誘導型NO合成酵素の発現を強く誘導した。さらに蛍光標識したdextranやlatex beads、大腸菌を用いた検討により、膵星細胞やendocytosisやphagocytosisにより非自己を認識、処理することが明らかになった。これらの知見は、膵線維化形成における細菌やウイルス感染の関与を示唆するとともに、膵星細胞が膵臓の局所免疫に関与する可能性を示唆する。成績:ラット活性化膵星細胞はTLR2、3、4、5を発現していた。PAMPs刺激により、細胞内シグナル伝達経路であるAP-1、NF-κB、MAP kinaseが活性化し、MCP-1、inducible NO synthaseの発現が誘導された。活性化膵星細胞は10kDa、70kDaのデキストラン、大腸菌、径1μmのラテックスビーズを取り込んだ。結論:活性化ラット膵星細胞はTLRsを発現しており、PAMPs刺激に応答した。更に、endocytosisやphagocytosisを行うことが示された。膵星細胞が膵臓における自然免疫に関与している可能性が示唆された。膵星細胞をTLR2のリガンドであるIipoteichoic acid、TLR3のリガンドであるpolyinosinic-polycytidylic acid、TLR4のリガンドであるLPS、TLR5のリガンドであるflagellinにて刺激するとNF-kappaBやMAP kinases (ERK,JNK,p38MAP kinase)といった広範なシグナル伝達系の活性化が認められた。
抗サイレンシング効果を有する小分子化合物の同定と作用機序解明

1)抗サイレンシング機序の解明:我々が同定したハロゲン化チミジン化合物の抗サイレンシング機序を解析し、この化合物がDNAメチル化には影響を与えず、ヒストン修飾を変化させることを明らかにした。2)ハロゲン化チミジン化合物と他の抗サイレンシング効果を有する小分子化合物との併用効果:ハロゲン化チミジン化合物をDNAメチル化阻害剤である5-aza-dCと併用すると強い相乗効果が認められた。類似の構造を有する化合物であるが、作用機序の違いにより相乗効果が認められるものと推測された。3)生体内における抗サイレンシング効果の解析:p16遺伝子、ウイルス抗原の発現がDNAメチル化で抑制されていることが確認されているATL株(ED,ATL-43T)を免疫不全マウスに接種し、腫瘤形成の後に同定した化合物(ハロゲン化ヌクレオシドを含む)を投与し抗腫瘍効果、抗サイレンシング効果を解析したが、ATL細胞ではp16,tax遺伝子の発現回復は認められなかった。DNAメチル化を始めエピジェネティックな変化は発がん過程に密接に関与しており、多くの癌抑制遺伝子が高メチル化により発現抑制されるだけでなく、低メチル化は癌遺伝子の異所性発現と関連している。エピジェネティックな変化は可逆性である点が大きな特徴であり、がんに対する治療上、優れた標的であることが予測される。新たながん治療標的療法を開発する目的で抗サイレンシング効果を有する小分子化合物の同定を試みた。レトロウイルスベクター内にレポーター遺伝子を組み込み、転写抑制(サイレンシング)が起こった細胞株(K562)を用いて、サイレンシングを解除する化合物をスクリーニングできる系を確立した。この系を用いて核酸系化合物をスクリーニングしハロゲン基を有する核酸系化合物が抗サイレンシング効果を有することを見出した。これらの化合物はDNAメチル化に影響を与えずレポーター遺伝子の転写抑制を解除していた。また高メチル化により転写抑制されている内在性遺伝子の転写も回復させ同様にDNAメチル化には変化を認めなかった。抗サイレンシング作用の機序を解析するためにクロマチン免疫沈降法を用いてヒストン修飾を解析したところヒストンH3のアセチル化が亢進しリジン9のメチル化が減少していることが示された。この結果よりハロゲン化チミジン化合物はDNAメチル化に影響を与えずヒストン修飾を転写活性型へ変換することによって転写抑制を解除していることが明らかとなり、新たな抗サイレンシング作用が示された。
高校生が遺伝子組換え実験を正しく理解できる条件の究明

○研究目的高校生が正しく遺伝子組換え実験を理解できるための条件を究明する。○研究方法(1)高校生に教育用キットを利用した大腸菌の遺伝子組換え実験を実施し,遺伝子組換え実験の生徒の認識を質問紙法及び個人面接法によって調査する。(2)海外の教育を同的とした遺伝子組換え実験の生徒用テキスト,教師用指導所及び遺伝子組換え実験の教材化に関する先行研究を分析し,遺伝子組換え実験に関する学習内容の選択と構成を図る。○研究成果遺伝子組換え実験を生物の授業に導入する実践が増えてはいるものの,高校生が遺伝子組換え実験の全体の意味,及び遺伝子組換え実験を構成している各種の操作の意味を理解しているかどうか,その実態については解明されていない。本研究では,遺伝子組換え実験を導入した授業を実践し,この実態をフィールドワーク,質問紙調査,インタビュー調査によって,多面的に探った。その結果,次の3点が明らかとなった。(1)実験全体の意味を理解せずに実験に参加していた生徒が約5割いた。(2)実験に参加した約6割の生徒が,アンピシリン及びアラビノースを培地に加える意味等,重要な実験操作の意味を理解していなかった。(3)約4割の生徒にとって,実験に関する用語の難解さや馴染みにくさが,実験全体及び実験操作の意味の理解の妨げになっていた。
マスト細胞特異的シグナル分子を標的にした抗アレルギー療法の開発

SLP-76ファミリーに属するアダプター分子MISTは、I型アレルギーめ初期反応である肥満細胞の脱顆粒に至るFcεRIシグナル伝達において重要な役割を担っている。本研究では、抗アレルギー剤創薬の標的としてMISTと相互作用する分子のFcεRI受容体シグナル伝達における機能的関連性について解析を行い、またスクリーニング系を構築してMIST機能阻害物質の探索を行った。BLNKを欠損したニワトリB細胞株DT40細胞を用いてMISTによる再構築系を作製したところ、MIST単独の発現でB細胞抗原レセプターシグナル伝達の部分的な回復が認められ、これにはN末69と96番目のチロシン残基(Y69,Y96)のリン酸化が必要であり、Y96にはSH2ドメインを介してPLC_γが会合することが明らかになった。さらに、LATをMISTと共に発現させると、BLNK欠損DT40細胞のシグナル伝達が完全に回復し、このLATとMISTの協調作用には、MISTのY69/Y96は必要ないことが明らかになった。しかしながら、MISTのSH2ドメインあるいは6個のチロシン残基に変異を入れるとシグナル伝達の回復が不完全となることから、SH2ドメインならびに他のチロシン残基を介した分子会合がシグナル伝達に必要であることが判明した。また、MISTのC端のproline-rich領域にGrb2が会合し、この領域を欠失させるとMISTとLATとの会合、MISTのraftへの移行ならびに受容体刺激によるカルシウム反応が阻害されたが、MAPキナーゼの活性化には著変は認められなかった。一方、N端のproline-rich領域を欠失させた変異体はLATと会合し、raftへの移行が認められるにもかかわらず、受容体刺激に伴うカルシウム反応およびMAPキナーゼの活性化の低下が認められた。本領域にはSH3ドメインを介してPLC_γが結合することから、この結合がシグナル伝達に重要であることが判明した。以上の研究結果から、BLNK欠損B細胞株にMISTを導入した再構築系を作製することにより、シグナル伝達におけるMISTの機能部位、ならびにそれぞれの機能部位に結合するシグナル分子が同定され、MIST機能阻害の標的となる分子的基盤を確立することができた。今回の研究期間では、本MIST機能阻害スクリーニング系を用いた低分子化合物の大規模なスクリーニングを行う段階までに至らなかったが、本システムは、マスト細胞のFcεRIシグナル伝達系を特異的に遮断する新しい抗アレルギー剤の開発を行う上で有望なシステムであると考えられる。本年度は、MIST機能阻害剤スクリーニングシステムの構築ならびにそれを用いたMISTのシグナル伝達における役割についての解析を行った。チロシンキナーゼならびにBASH欠損DT40細胞に野生型ならびに変異型MISTを発現させ、B細胞抗原レセプター刺激に伴うMISTの機能について解析を行った結果、B細胞抗原レセプター刺激によりMISTは速やかにチロシンリン酸化され、MISTのリン酸化は、Lyn欠損株では著しく、Syk欠損株では軽度に低下し、またBtk欠損株では変化が認められなかった。

SLP-76、BLNKおよびMISTの間で良く保存されているN末69と96番目のチロシン残基をそれぞれフェニルアラニンに置換すると、MISTのチロシンリン酸化の程度が減少し、両方ともに変異を入れるとリン酸化が認められなくなることから、これらのチロシン残基がMISTのリン酸化に重要であることが判明した。また、BASH欠損DT40細胞に野生型MISTを発現させることにより、B細胞抗原レセプター刺激による細胞内カルシウム濃度の上昇、PLCγ2のリン酸化、ならびにERK2の活性化が部分的に回復することが明らかになった。さらに、膜型アダプター分子であるLATをMISTと共にBASH欠損DT40細胞に発現させると、B細胞抗原レセプターシグナル伝達の完全な回復が認められた。変異型MISTを用いた解析から、MISTの69番目のリン酸化チロシン残基にPLCγ、プロリンに富む領域にGrb2を介してLATが結合することが明らかになり、これらのMISTの機能ドメインが薬剤の標的になりうることが明らかになった。MISTはマスト細胞およびサイトカイン依存性細胞株に発現するSLP-76/BLNKファミリーに属するアダプター分子である。免疫レセプターシグナル伝達におけるMISTの役割を明らかにするために、BLNK欠損DT40細胞を用いて解析を行った。MIST単独の発現でB細胞抗原レセプター(BCR)シグナル伝達の部分的な回復が認められ、これにはN末69と96番目のチロシン残基(Y69,Y96)のリン酸化が必要であり、Y96にはSH2ドメインを介してPLCgが会合することが明らかになった。さらに、LATをMISTと共に発現させると、BCRシグナル伝達が完全に回復し、このLATとMISTの協調作用には、MISTのY69/Y96は必要ないことが明らかになった。しかしながら、MISTのSH2ドメインあるいは6個のチロシン残基に変異を入れるとBCRシグナル伝達の回復が不完全となることから、SH2ドメインならびに他のチロシン残基を介した分子会合がBCRシグナル伝達に必要であることが判明した。また、MISTのC端のproline-rich領域にGrb2が会合し、この領域を欠失させるとMISTとLATとの会合、MISTのraftへの移行ならびにBCR刺激によるカルシウム反応が阻害されたが、MAPキナーゼの活性化には著変は認められなかった。一方、N端のproline-rich領域を欠失させた変異体はLATと会合し、raftへの移行が認められるにもかかわらず、BCR刺激に伴うカルシウム反応およびMAPキナーゼの活性化の低下が認められた。本領域にはSH3ドメインを介してPLCgが結合することから、この結合がBCRシグナル伝達に重要であることが判明した。以上の結果から、MISTの各ドメインに会合する分子ならびにそのシグナル伝達における機能が明らかなり、このMIST/LATを発現させた細胞とBLNKを発現する細胞を用いて、MIST特異的に作用する薬物のスクリーニングを行う基盤が確立できた。
在宅医療推進に向けた遠隔看護の実証実験

本研究は、モデル地区での遠隔看護の実施と評価を行った。実施方法は、クラウドベースで構築したシステムを試験的に実施した。メインセンターは、モデル地区のA訪問看護ステーションに設置し、クラウド上にデータベースを設置した。訪問看護師は、クラウドのデータベースにアクセスして情報共有するシステムとした。今回の実証実験は、新しい医療環境のなかで看護専門職が果たすべき新しい役割を提案することである。とくに、1セルフケアレベルに応じた健康管理、2生活習慣病者への自立支援3手術後の患者の回復管理、4退院後患者の継続看護、5介護者および看護者への知的支援など、遠隔看護技術を用いた継続ケアの手法の提案を行った。23年度は、遠隔看護実施の初期整備を行いながら、対象とするモデル地区の医療状況や、健康課題などの実態把握と、当該地区の費用対効果について、現状を把握した。モデル地区の診療所や対象地域を管轄する保健所と連携を図り、現在、取り組んでいる健康教育や療養指導を明らかにし、「医療状態や生活状況」、「モデル地区内外における医療・保健サービスの利用状況」について実態を把握した。調査事項は以下のものである。1健康教育や療養指導では、教育・指導内容:目的、方法、教育・指導する者の職業、参加募集方法、参加率など、2医療状態や生活状況では、医療状態、人口動態、医療費、罹病患者数、死因別死亡数、定期健康診断受診率、要介護度、生活習慣病患者数、生活状況など、3モデル地区内外における医療・保健サービスの利用状況では、診療所の受診率、診察時の交通手段(方法・時間・費用)、往診の利用状況と理由、診療上への紹介率と紹介基準、提携医療機関との連携方法、診療施設の規模、交通手段、医療費、受診時の重症度など、4訪問看護ステーションでは、利用者の特性(利用目的、要介護度、ケア内容、利用頻度、指示書発行医療機関)、利用している訪問看護ステーションの場所や訪問する看護師の交通手段(方法・時間・費用)など。また、同時に次年度からの遠隔看護の実施に向け、広報活動と情報リテラシーの普及に努め、モデル地域の遠隔看護への支援ニーズなどの調査を実施した。24年度の準備として、上記で明らかになった実態を踏まえ、当該地区のユーザビリティに即したシステム開発・設計を行った。基盤としたシステムは、先行研究で行っている「臨床応用に向けた遠隔看護システムの開発」(科学研究費基盤研究(A))を基本に、クラウドベースのシステム構築に向けた取り組みを行い、実際の運用に向けた試験的取り組みを実施した。モデル地区にあわせた遠隔看護システムを構築にむけた現状把握を行った。モデル地区のインフラストラクチャーの整備状況やデジタル通信機器の普及状況など、遠隔看護開始に伴う必要な整備や費用を調査した。また、遠隔看護を実施する対象者に合わせたユーザビリティを配慮した機能開発に向けて、モデル地区住民の携帯電話やコンピュータの基本的操作や知識などの把握を行った。モデル地区(土浦市)の特性に応じた遠隔看護システムの構築に向けて、当該地区のユーザビリティに即したシステム開発・設計を行った。基本にしたシステムは、「臨床応用に向けた遠隔看護システムの開発」(科学研究費基盤研究(A))において開発し、効果を実証した外来通院中糖尿病患者向けのプロトタイプである。それらの実施に向けて、1)モデル地区の健康支援ニーズに個別的かつ柔軟に対応可能であるシステムの構築、2)看護師や保健師のみならず医師や栄養師、理学療法師ら多職種とも連携可能なシステムを構築、を考慮したシステムとするため、ソフトアプリケーションなどユーザビリティの整備を行った。遠隔看護の実証実験において開発する、遠隔看護クラウドシステムは、タブレット端末からバイタルサイン等のデータをクラウド上のデータベースに保管し、患者・看護師・医師と情報共有を図り、遠隔看護の実施を支援するシステムである。本システムは、システムの基盤部分と、端末から血圧、体重、体温のほか、生体情報を収集するための「在床行動計(SleepVision)」と「加圧脈派計(VitalVision)」)により構成するものである。平成25年度より本システムの基盤部分を作成し、その基盤部分の検証と今後のシステムについての第一段階検討を行った。平成26年度においては、その検討を行った結果から改修と拡充を行った。この年度内に実証実験を行うための最終段階の完成版を目指していたが、以下の想定外の事態が発生した。当初、Apple社のiPad上でのシステム構築を目指していたが、アンドロイド端末(Nexus7)でのシステム構築に変更しなければならなくなった。そこでデバイスの変更によるプログラムデザイン等の再検討の必要性が生じた。本年度は、モデル地区での遠隔看護の実施・評価を行った。遠隔看護実施の基本モデルは、情報処理のメインセンターとして設定したメインセンター(筑波大学)と、地域でのサテライト拠点となるサブセンター(らふえる(株)訪問看護ステーション)により構成する計画でシステム化を進めた。サブセンターはモデル地区の対象者から情報を収集し、メインセンターで情報処理および管理が行われ、結果の専門的な知識の提供とあわせて、メインセンターからサブセンターに情報処理を行ったデータが返される仕組みである。本システムの目的は、超高齢社会の到来、および在宅型医療の変化に伴って、21世紀型の新しい医療環境のなかで、看護専門職が果たすべき新しい臨床応用と、その役割を提案することである。

とくに本研究における具体的な遠隔看護の介入対象は、1)セルフケアレベルに応じた健康管理、2)生活習慣病者への自立支援、3)術後患者の回復管理、4)退院後患者の継続看護、5)介護・看護者への支援、を目的とし、特定機能病院などでの先端的・集中的な治療を終えた患者への継続看護システムの確立を含めた地域医療での貢献も目指している。緊急度が高い場合は、これまでの人間対人間の看護実践の基本を守りながら、担当看護師および担当医師が直接的な介入を行うことが優先される。遠隔看護を実施したことによる利便性、経済性(費用対効果)、効率性、効果性などの評価を、以下評価項目をモデル地区の「医療状態や健康課題」、「モデル地区内外における医療・保健サービス利用の状況」、実施した住民と遠隔看護に関わったスタッフからの意見などをもとに、最終的には多様な生活環境においても運用可能となりうるために必要な各種プロトタイプの提案を行った。本研究は、モデル地区での遠隔看護の実施と評価を行った。実施方法は、クラウドベースで構築したシステムを試験的に実施した。メインセンターは、モデル地区のA訪問看護ステーションに設置し、クラウド上にデータベースを設置した。訪問看護師は、クラウドのデータベースにアクセスして情報共有するシステムとした。今回の実証実験は、新しい医療環境のなかで看護専門職が果たすべき新しい役割を提案することである。とくに、1セルフケアレベルに応じた健康管理、2生活習慣病者への自立支援3手術後の患者の回復管理、4退院後患者の継続看護、5介護者および看護者への知的支援など、遠隔看護技術を用いた継続ケアの手法の提案を行った。本システムの目的は、超高齢社会の到来、および在宅型医療の変化に伴って、21世紀型の新しい医療環境のなかで、看護専門職が果たすべき新しい臨床応用と、その役割を提案することである。とくに本研究における具体的な遠隔看護の介入対象を、1)セルフケアレベルに応じた健康管理、2)生活習慣病者への自立支援、3)術後患者の回復管理、4)退院後患者の継続看護、5)介護・看護者への支援、を目的とし、特定機能病院などでの先端的・集中的な治療を終えた患者への継続看護システムの確立を含めた地域医療での貢献も目指す。27年度が最終年度であるため、記入しない。基礎看護学遠隔看護を実施する対象地域の地域特性の把握と同時に、対象となった訪問看護ステーションの情報リテラシー及びユーザビリティーを前提としたシステム構築の必要性に迫られたために、24年度に予定していたシステム構築の実施を前倒しで行った。そのシステム構築では、近年の情報技術の進歩に合わせたクラウドベースのシステム構築の必要性に迫られたために、当初に予算立てした支出とは異なる使用内訳で研究が一部前倒しに進んでいる。実施対象とした訪問看護ステーションと、メインセンターとしている筑波大学健康医科学イノベーションセンターにおいて、連携をとりながら、クラウドベースでの情報処理および管理をおこなう予定である。その他、訪問看護ステーションのみならず、クラウドベースのシステムを生かし、サブセンターが設置される場所は、複数の訪問看護施設や、コンビニエンスストア、県民局、地域に展開する各種ケア施設、および産業保健分野における健康管理部門などであり、担当看護師から直接的なケアおよび遠隔看護が実施されることになる。
光エネルギーの低損失伝播集約による新規光機能開拓

本研究課題では緻密に構造設計されたプラズモン活性が高い金属ナノ粒子の二次元配列構造を用いて光を高効率に捕集し、低損失で光エネルギーを伝搬・集約させる系を構築することを試みる。さらには、電気化学手法等を駆使することで、光の散乱問題を解決し、集約光エネルギーを利用した新奇光学物性の発現を目指す。2018年度は高効率光エネルギー集約システム構築の基盤となる、六方格子型Auフォトニック結晶の構築を試みた。フォトニック結晶の光学性能は格子間隔、粒子形状、表面状態に強く依存することが知られている。電子線描画法を用いて粒子形状の制御を行い、さらには電気化学的手法を用いて表面状態を最適化することによって、単粒子プラズモンに誘起されるLSPと比較して数十倍高いエネルギー効率を有する二次元材料の構築を達成した。この構造では単一粒子と比較して系内に光を長時間閉じ込めることが可能となり、色素励起子などの光アクティブな物質との強い相互作用が期待される。実際に最適化したフォトニック結晶に、エネルギーの近接した色素分子を担持したところ、強固な電磁場相互作用によってプラズモンと色素励起子間に新たな光学準位の形成が確認された。この光物質相は強結合と呼ばれており、光吸収波長の広帯域化や光励起寿命の長寿命化といった光学特性を示すことから、光エネルギーの高効率利用に向けて応用が大いに期待される。プラズモンによる散乱光を抑制し、ナノ空間へ高度に光を閉じ込める構造の作製に向けて、電子線描画法と電気化学手法による緻密な構造設計を通じて、単粒子と比して数十倍のエネルギー閉じ込め効率を有する六方格子型金ナノディスク基板の作製に成功し、本年度の研究課題である高効率光捕集系の構築を達成した。さらに、当該研究員は系内に閉じ込めた光エネルギーを効率よく遠方へと伝搬させる系の構築に向けて、シアニン色素など種々の励起子エネルギーを発現する分子を数多く検討した。その結果、金ナノ構造と色素励起子との間に強結合と呼ばれる新たな光学状態を形成させることに成功した。この新規光物質相の形成は、本年度計画の見込みを上回る期待以上の成果である。この強結合状態は、光吸収波長の広帯域化や光励起寿命の長寿命化といった光学特性を示すことから、光エネルギーの高効率利用に向けて応用が大いに期待される。本年度では、従来のプラズモニックデバイスと比較して高効率に光エネルギーを捕集システムの構築を達成し、さらには、このシステムを用いて新規光学物性の発現に成功したと言える。したがって本年度の研究課題は十分に達成できたと言える。次年度の取り組みとしては、角度分解スペクトル装置を新たに光学系へ導入し、光学バンドや光エネルギー伝搬・集約の評価を試みる。また、系に対して電気化学電荷注入発光測定を行うことで、電荷注入密度と発光強度の相関からエネルギー伝搬の平均自由行程を明らかとする。以上の評価を通じて、これまでに報告例がない強結合準位と真空準位との相関を明確化する。

本年度では、従来のプラズモニックデバイスと比較して高効率に光エネルギーを捕集システムの構築を達成し、さらには、このシステムを用いて新規光学物性の発現に成功したと言える。したがって本年度の研究課題は十分に達成できたと言える。次年度の取り組みとしては、角度分解スペクトル装置を新たに光学系へ導入し、光学バンドや光エネルギー伝搬・集約の評価を試みる。また、系に対して電気化学電荷注入発光測定を行うことで、電荷注入密度と発光強度の相関からエネルギー伝搬の平均自由行程を明らかとする。以上の評価を通じて、これまでに報告例がない強結合準位と真空準位との相関を明確化する。
分化誘導による癌治療の試み-ヒトembryonal carcinoma(EC)細胞モデルを用いた基礎的研究

分化誘導による癌治療の試みとして、我々はヒト胚細胞性腫瘍の一つである胎児性癌培養株のin vitroでの分化誘導を行った。(1)まず、ヒト胚細胞性腫瘍由来の培養株9種類の個々の分化能を調べる目的で、ヌードマウスに移植し、出来た腫瘤を検討した。その結果、NEC14株(睾丸胎児性癌embryonal carcinoma(EC)由来)が腺、軟骨、trophoblastなどへ分化することが見い出された。(2)そこで、分化誘導をおこす物質としてすでに他の系で知られているレチノール酸、DMSO、dbcAMP、プロゲステロン、HMBAが、in vitroでこのNEC14株が偏平な分化型colonyを形成する効果を調べ、この株に対し最も強い分化誘導効果を示す薬剤として10^<-2>MのHMBAが選ばれた。(3)分化の指標となる細胞表面抗原の変動としては、ヒトEC細胞抗原のSSEA-3抗原が減少し、分化抗原であるSSEA-1、HLA-A、B、C抗原が草加してくることがFACSTer解析で明らかになった。(4)更に、他の形質発現につき検討を加えたところ、分化誘導後は培養用シャーレへの接着性が亢進し、組織プラスミノーゲン活性化酵素が誘導されて来た。又、免疫組織染色よりサイトケラチン、デスミン、ビメンチンが確認された。これと平行して、胚細胞性腫瘍の診断の目的で、ヒト抗F9 embryoglycanの免疫化学的解析を行った。この抗体はdgsgermnoma、良性奇形腫を除く悪性胚細胞性腫瘍29例中16例に検出され、反応する抗原決定基はGalα1-3Gal、構造が末端を占めることが判明した。更に、神経特異エノラーゼ(NSE)の胚細胞性腫瘍の血清診断的意義についても検討を加えた。その結果、Immature teratoma 8例中4例、Dysgerminoma6例中5例が高値を示し、臨床的有用性が見い出された。胚細胞性腫瘍培養株ならびに摘出腫瘍でもNSEが確認された。3.形態的に分化したNEC14細胞の増殖はin vitroで停止し,ヌードマウスへ異種移植できなかった.4.機能面からの分化は, 1)SSEA-3抗原↓2)組織プラスミノーゲ活性化酵素↑の2点が顕著に認められた.5.NEC14細胞のクローンであるC7細胞を, 10^<-2>M HMBAで3日間処理後,長期間に渡って増殖してくる細胞をひろったところ,分化形態に近くしかも継代培養可能なC7H細胞がえられた.6.このC7H,細胞は未分化と分化の中間型の細胞と考えられ, in vitroで自然に容易に形態的に分化した.分化誘導による癌治療の試みとして、我々はヒト胚細胞性腫瘍の一つである胎児性癌培養株のinvitroでの分化誘導を行なった。

(2)そこで、分化誘導をおこす物質ろしてすでに他の系で知られているレチノール酸、DMSO、dbcAMP、プロゲステロン、HMBAがinvitroでこのNEC14株が扁平な分化型colonyを形成する効果を調べ、この株に対し最も強い分化誘導効果を示す薬剤として10^<-2>MのHMBAが選ばれた。(3)分化の指標となる細胞表面抗原の変動としては、ヒトEC細胞抗原SSEA-3抗原が減少し、分化抗原であるSSEA-1、HLA-A、B、C抗原が増加してくることがFACSTer解析で明らかになった。(4)更に、他の形質発現につき検討を加えたところ、分化誘導後は培養用シャーレへの接着性が亢進し、組織プラスミノーゲン活性化酵素が誘導されて来た。又、免疫組織染色よりサイトケラチン、デスミン、ビメンチンが確認された。これと平行して、神経特異エノラーゼの胚細胞性腫瘍における診断的意義につき検討した。ヒト胚細胞性腫瘍培養株9種およびControl培養株16種につき、細胞抽出液および培養上清中の神経特異エノラーゼ(NSE)値を測定したところ、胚細胞性腫瘍中で神経系への分化能をもつ培養株(PA-1、TeraII)で非常に高いNSE値を示した。そこで、実際の胚細胞性腫瘍患者の血清中におけるNSE値を測定したところ、Immature Teratoma8例中4例、Dysgerminoma6例中5例が正常の上限を越え高値を示した。それに反し良性の分化したTeratomaでは30例中2例がわずかに正常より高いNSE値を示したにすぎなかった。
プラズマ対向壁における複合イオン照射下トリチウムリサイクリング定量評価と能動制御

本研究は、核融合炉プラズマ対向材料表面での複合イオン照射下におけるトリチウムリサイクリングを定量的に評価することを目的とした。また、トリチウムリサイクリングと材料照射損傷との関連を明らかにすることで材料の影響を加えたリサイクリングモデルを提案しようとするものである。そこで、重水素照射したタングステン(W)からの重水素滞留挙動を明らかにするとともに、炭素イオン照射したWへの水素イオン照射下における放出ガス種測定を行い、高配向性グラファイト(HOPG)および炭化タングステン(WC)からの放出ガス種との比較から、スパッタリングによる放出ガス種の炭素化学状態依存性を明らかにした。また、エバポレータ法を用いてW表面の改質を行い、トリチウムリサイクリングの能動制御法について検討した。本研究は核融合炉プラズマ対向材料表面での複合イオン照射下におけるトリチウムリサイクリングを核融合炉環境のみならず種々の照射条件において実験により定量的に評価しようとすることを目的とした。また、トリチウムリサイクリングと材料照射損傷との関連を明らかにすることによりトリチウムリサイクリングに材料の影響を加えたリサイクリングモデルの提案しようとするものである。今年度は炭素・重水素イオン同時照射した試料の重水素滞留量に相関性のある材料中照射損傷の欠陥形成過程について透過型電子顕微鏡を用いて検討した。炭素・重水素同時照射量が1×10^<20>D^+m^<-2>、0.2×10^<20>C^+m^<-2>で、転位ループの核形成はすでに終了し欠陥の成長段階であることがわかった。また、1×10^<21>+m^<-2>、0.2×10^<21>C^+m^<-2>で欠陥の蓄積は飽和状態に達し、欠陥に滞留する重水素は飽和することが考えられた。ヘリウム損傷による重水素滞留影響評価では、ヘリウムイオン予照射や追照射が、重水素滞留・放出特性に著しく影響を及ぼすことを明らかにした。比較的低いヘリウム照射量では、これらの欠陥が重水素の強いトラッピングサイトとして機能し、高照射量では隣接したバブル同士が合体し、結合したバブルが表面に到達することで重水素の脱離パスとして機能したと考えられた。また、リサイクリング評価のためのダイナミック放出測定では、高感度質量分析装置を同時イオン照射装置に付加し、ダイナミック放出粒子の測定を試みた。その結果、炭化水素系ガスの放出量が、炭素イオンが試料に対し55°で入射する条件において最大になることがわかった。今後さらに詳細にそのメカニズムについて検討する予定である。さらに、プラズマ対向壁が損耗し生成された浮遊物質であるダスト粒子への水素同位体滞留特性を明らかにした。プラズマ対向壁として同様の履歴を持つと考えられるバルク材に関する報告例と比較すると、100-200K程度放出温度が高い傾向にあった。本研究は核融合炉プラズマ対向材料表面での複合イオン照射下におけるトリチウムリサイクリングを核融合炉環境のみならず種々の照射条件において実験により定量的に評価することを目的とした。また、トリチウムリサイクリングと材料照射損傷との関連を明らかにすることによりトリチウムリサイクリングに材料の影響を加えたリサイクリングモデルの提案するものである。今年度は炭素による重水素滞留挙動への影響を評価するため、タングステンに対し重水素イオンおよび炭素イオンを種々の条件にて照射した試料における重水素の滞留挙動を昇温脱離法およびグロー放電発光分光分析にて、試料の表面状態をX線光電子分光法および透過型電子顕微鏡を用いて明らかにした。その結果、炭素イオン照射によりタングステン中に転移ループや原子空孔が形成し、重水素は表面、転移ループ、原子空孔およびバルクに滞留することが示された。さらに炭素照射によりタングステン中にW-C結合およびC-C結合が生成し、重水素単独照射したタングステンと比較し、炭素イオンの打ち込み深さである10nm以降の深い領域において重水素滞留量が減少することが明らかとなった。このことからW-C結合と照射欠陥を含むタングステン-炭素混合層が重水素のバルク方向への拡散を抑制すると考えた。また、リサイクリング評価のための照射中のスパッタリング粒子測定では、炭素イオンを予照射したタングステンへD_2^+照射すると、主にD、CD_2、CD_3が放出されることがわかった。さらに、X線光電子分光法による表面化学状態の測定の結果から、試料表面の炭素はC-W結合とC-C結合の化学状態をとっており、D_2^+照射に伴うスパッタリングによりC-W結合が選択的にスパッタされ、炭化水素として放出されることが示された。さらに、能動的な滞留量制御のための表面改質エバポレータを整備した。

本年度は炭素イオン照射したタングステン(W)への水素イオン照射下における放出ガス種測定を行い、高配向性グラファイト(HOPG)および炭化タングステン(WC)からの放出ガス種との比較から、スパッタリングによる放出ガス種の炭素化学状態依存性を明らかにした。その結果、HOPGやWCにおいて、照射した水素は主にCH4として放出されるのに対し、炭素照射試料からは主にCH3およびCH2が放出した。過去の研究より、HOPGやWCに重水素を照射すると照射により形成した炭素のダングリングボンドと重水素との非熱平衡過程を経た反応や、炭素に隣接した原子空孔中に滞留した重水素との熱平衡過程を経た反応により、C-D結合を形成することが明らかになっている。一方で、炭素照射Wへの重水素照射では、ほとんどC-D結合を形成しなかった。これはW中では炭素がダングリングボンドを形成しづらく、また、WはHOPGに比べ重水素イオンの反射率が高いとともに重水素の溶解度が低いためと考えられる。このため、水素照射下においてHOPGやWCでは炭素一個に対する水素の捕捉量が多くCH4として放出するのに対し炭素照射タングステンにおいてはCH3やCH2形で放出がすることが示された。さらに結晶方位依存性について明らかにするために単結晶モリブデンにヘリウムイオン照射を行い、表面損傷の程度および試料内のヘリウム滞留挙動に顕著な結晶方位依存性が見られた。複合的な照射環境下においては,結晶方位の制御が水素滞留挙動の制御にも有効であると考えられる。ヘリウムイオン照射下におけるWの微細組織発達過程について、その場観察の手法を用いて系統的に調べた。損傷の密度,サイズを照射量と温度の関数として整理した。特に,1473K程度の高温照射では,近年問題となっているナノ構造の形成が観察され,その形成条件に関する知見を得ることができた。当初の計画の通り23年度の研究は順調に進展しており、トリチウムリサイクリング評価を種々の条件下で行っている。また表面改質エバボレータの整備も完了し、今後滞留量制御を試みる予定である。24年度が最終年度であるため、記入しない。今後は照射欠陥形成と水素同位体の滞留・移行過程の相関について種々の条件で明らかにしサイクリングモデルの妥当性評価を行う。さらに表面改質エバポレータによる表面改質を試み、滞留量制御の可能性について検討する。
ウシ白血球粘着不全症の病態解析とDNA診断

ウシ白血球粘着不全症牛(BLAD)の病態とDNA診断に関する研究を実施し下記の結果を得た。1.好中球機能の解析-BLADの好中球膜上に接着分子CD18が欠損していることを認め,好中球の付着性,走化性,貧食性,化学発光反応および酸素代謝能は意に低下していることを明らかにした。1gG-Fc受容体の代償的発現をBLADの好中球で認めた。BLADの病態は,好中球CR3を介する機能不全とよく合致し,臨床像,臨床病理学ならびに形態学的な特徴所見を示すことを認めた。2.単核球の機能解析-BLAD牛の単核球(リンパ球・単球)には、明らかにCD18が欠損しており,リンパ球のT,B-比および幼若化能などの機能には正常牛との間に有意差を認めなかった。免疫グロブリン(1gG,M,A)は有意な増加を示した。単球の付着性とCR3を介する貧食性が有意に低下していることを明らかにした。3.骨髄機能の検索-BLAD牛の骨髄中有核細胞数は、正常のそれの2.98.8倍増加していた。M:E比は、2.412であり著増していた。電顕による好中球の観察では,“偽足"の形成が乏しく,球状を呈していた。4.BLAD牛およびキャリヤ-牛のDNA-PCR法による診断-BLAD牛8頭およびホルスタイン乳牛260頭を対象に、DNA診断を実施した。BLAD牛は、DNA-PCRで特有の制限酵素切断パターンを示した。キャリヤ-牛の頻度は、10%(26/260)に検出され、牛群で2.6-15.2%、年齢で210万に分布していた。キャリヤ-牛の野外での分布を,国内で初めて明らかにした。以上の研究から、BLADの病態と本疾患(遺伝病)を起こす不良遺伝子(BLAD、BLAD-キャリヤ-)保有牛の診断が可能となった。雌側のキャリヤ-率は、約10%であった。我国におけるBLADの制圧モデルに貢献した。ウシ白血球粘着不全症(以下BLAD)牛の白血球機能の解析を実施し、下記の成績を得た1.好中球機能の解析末梢血好中球膜上のCD18は、BLAD牛で明らかな欠損をフローサイトメトリーで認めた。好中球の付着性、走化性、貧食能および化学発行反応は、いずれもBLAD-牛では、正常牛のそれに比較して有意に低下していた。好中球の刺激に伴う接着分子の発現率は、正常牛の好中球では、Ppz,PMAにより有意に増加したが、BLAD-牛のそれは、発現を認めなかった。2.リンパ球・単球機能の解析BLAD-牛の末梢血リンパ球・単球に、CD18の明らかな欠損を認めた。PNA,Slg陽性細胞数、幼若化能には、正常牛のそれとの間に有意な差を認めなかった。単球の付着性および化学発光反応は、正常牛のそれに比較して有意に低値であった。以上から、単核球のCD18欠損の機能への影響は、ic3bを介した機能異常が明白であることを証明した。