hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
細胞外マトリックス構成分子を標的とした動脈硬化症診断用核医学診断剤の開発

動脈硬化の臨床画像診断において、動脈硬化の根幹的原因である動脈内のプラークの不安定性を高精度に診断することが求められており、不安定プラークを特異的検出可能な分子プローブの開発が切望されている。そこで本研究では、動脈硬化病変のプロテオーム解析により、動脈内プラーク形成とともに発現増加が疑われた細胞外マトリックスタンパク質であるThrombospondin-4(TSP-4)に対する新規SPECT用分子イメージング剤を創製し、不安定動脈硬化プラークの診断に適した核医学分子イメージング法の確立を目指すこととした。本目的の達成を目指し、平成26年度は以下の検討を行った。まず、TSP-4に対する抗体に、6-Hydrazinopyridine-3-carboxylic acid(HYNIC)を導入した。次に、HYNIC導入TSP-4抗体と99mTc-Tricineを反応し、99mTc-HYNIC anti-TSP4-mAb (99mTc-HTA)を得た(放射化学的収率:17.6%、放射化学的純度:99.5%)。比較対照として抗TSP-4抗体と同じサブタイプのネガティブコントロール抗体についても同様の方法で99mTc標識した(99mTc-HNA)。得られた99mTc-HTAについて、マウス血漿中での安定性について確認したところ、24時間後まで98%以上未変化体で存在することを確認した。そこで、99mTc-HTAおよび99mTc-HNAを動脈硬化モデルマウス(ApoE KOマウス)および正常マウスに尾静脈投与し、投与24時間後に各臓器への放射能分布並びに大動脈のARG撮像を行った。その結果いずれの薬剤も正常マウス大動脈と比較してApoE KOマウス大動脈へ有意に高い集積を認めるとともに、その集積は動脈内プラーク形成部位に局在することを認めた。動脈硬化病変の画像診断においては、早期治療を必要とする“破綻しやすいプラーク"を高精度に診断することが求められており、不安定プラークを特異的に検出可能な分子プローブの開発が切望されている。そこで本研究では動脈硬化病変のプロテオーム解析により、動脈内プラーク形成に伴い発現増大が認められた細胞外マトリックスタンパク質であるThrombospondin-4(TSP4)に対する新規SPECT用分子イメージング剤を開発し、不安定動脈硬化プラークの診断に適した核医学イメージング法の確率を目指した。本目的を達成するため、平成27年度は下記の内容について検討した。平成26年度に創製したTSP4に対するSPECT用分子イメージング剤99mTc-TSP4-mAbおよび比較対照として、抗TSP4抗体のコントロール抗体を99mTc標識した99mTc-NC-mAbについて動脈硬化モデルであるApoE欠損マウスにおける体内動態について評価したところ、いずれも正常マウスと比べて大動脈への集積量が高く、オートラジオグラフィー法により動脈硬化病変に集積していることを認め、その集積はマクロファージ浸潤部位と類似していることを見出した。そこで、次に99mTc-NC-mAbについてマクロファージの極性化状態と集積量の関係について評価したところ、炎症惹起性細胞であるM1マクロファージにおいて高集積することを見出した。本研究での目的であるThrombospondin-4(TSP-4)に対する新規SPECT用分子イメージング剤を創製しており、in vivo検討において病変特異的な集積に関する評価についてはさらなる検討が必要なものの、動脈硬化病変への集積を認めたことから、本研究はおおむね順調に進展しているものと考えられる。放射性薬品化学平成26年度に作成した99mTc-HTAの動脈硬化病変描出能について、他のモデル動物(WHHL Rabbitなど)を用いてより詳細に検討する。また、99mTc-HNAの動脈硬化病変への非特異的集積に関するメカニズムについて、その集積局在と周辺細胞との関連性をin vitroレベルで解明する。平成27年4月より代表研究者が大学院薬学研究院へ異動することに伴い、本研究を遂行する上で新たに小動物用麻酔装置の購入が必要となり、本購入財源として確保したため次年度使用額が生じた。主な機器としては小動物用麻酔装置の購入、並びに新規薬剤の創製に必要となる抗体、放射性同位元素(99mTc)、その他反応用消耗品、細胞培養試薬、染色試薬、動物等の購入、本研究で得られた知見の外部発表(学会発表等)に本財源を充てる予定である。
ミクロなスラリー循環流れの制御および好適化による研磨能率の向上

半導体デバイスの高性能化に伴って、半導体デバイス製造工程で使用される化学的機械研磨(CMP)に高い技術的要求がなされ、研磨性能の向上のために研磨メカニズムを踏まえた技術開発が望まれている。報告者は、これまで見過ごされてきたウェーハと研磨パッドとの微細な隙間のミクロなスラリー流れに着目し、研磨メカニズムにおいて重要な役割を担っていると考えられるミクロな循環流れの存在を明らかにした。更に、ミクロなスラリー流れの制御が研磨性能の更なる向上(ブレークスルー)に繋がるのではないかとの着想に至った。そこで本研究では、品質工学で用いられる直交表を使用したパラメータ設計の手法を適用して研磨実験と流れの可視化観察を行い、ミクロなスラリー循環流れの制御が研磨能率の向上に繋がることを示す。ミクロなスラリー循環流れの制御は、ダイヤモンド・コンディショニングにより研磨パッド表面の微細な凹凸形状を制御することで実現する。平成30年度に実施した主な研究内容を以下に示す。(1)小型研磨機を購入するとともに必要な部品を作製し、発泡ウレタン研磨パッドのダイヤモンド・コンディショニングとガラス板の研磨を実施できるようにした。(2)押し付け荷重、初期コンディショニング時間、研磨パッド回転速度を変えてダイヤモンド・コンディショニングを実施した。(3)条件を変えてコンディショニングした研磨パッドでガラス板を研磨した時の研磨能率を測定するとともに、研磨パッド表面形状をレーザー顕微鏡で測定した。ダイヤモンド・コンディショナの入手に予想以上の時間を要したため、平成30年度中に複数種類のダイヤモンド・コンディショナで研磨パッドのコンディショニングを実施する予定であったが、1種類のダイヤモンド・コンディショナでのコンディショニングしか実施できなかった。また、研磨パッド表面形状の測定には外部機関に出向いてレーザー顕微鏡を借用しなければならないが、報告者の校務が予想以上に忙しく、その時間が思うように確保できなかった。ダイヤモンド・コンディショナの入手の問題と研磨パッド表面形状の測定の問題が重なり、ミクロなスラリー流れの可視化に必要な研磨パッド拡大模型の作製に遅れが生じている。予定よりやや遅れたが、複数種類のダイヤモンド・コンディショナを入手できたため、コンディショナを変えて研磨パッドのコンディショニングとガラス板の研磨を実施する。また、研磨パッド表面形状の測定について、次年度以降は平成30年度に比べて時間が確保できる見込みである。したがって、基本的な推進方策については当初の予定と変わらず、当面はアスペリティ形状/スラリー循環流れ/研磨能率の3者間の関係の把握に努める。(理由)ダイヤモンド・コンディショナの入手に予想以上の時間を要したため、実験回数が当初の予定よりも少なかった。その結果、発泡ウレタン研磨パッドの使用枚数が当初の予定より少なくなり、次年度使用額が生じた。(使用計画)複数種類のダイヤモンド・コンディショナを入手できたため、平成31年(令和元年)度に予定していた実験と併せて平成30年度に実施できなかった実験を実施する。実験に必要な発泡ウレタン研磨パッドの購入に、計画当初から計上していた予算と合わせて次年度使用額を使用する。
分子進化から見たタンパク質の折り畳み機構に関する研究

分子進化の観点からタンパク質の折り畳みを解明する本研究において、共通の祖先タンパク質から派生したセルピンファミリーに属するタンパク質の折り畳み機構と熱ショックタンパク質の認識配列の変遷について解析した。機能的な側面から、セリンプロテアーゼに対して阻害活性を示すα1-アンチトリプシン(API)と阻害活性を示さないニワトリ卵白アルブミン(OVA)の折り畳み機構を比較した。まず、OVAの熱変性過程をCDスペクトルによって調べたところ、OVAは76°C以上の温度で熱変性し、そのときの状態はポリペプチド鎖が大きく揺らいだアンフォールド状態にあるが、変性剤中において観察されるような典型的なランダムコイル状態ではないことが判明した。80°Cにおいて熱変性させたOVAを徐冷すると天然状態に巻き戻ったが、一方、急冷すると、誤って折り畳まれた変性分子を生じ、その後常温において徐々に天然状態に復元した。このような2相性の復元反応は、塩酸グアニジン中からのAPIの復元反応においても観察された。次に、急冷することによって得られた変性分子の会合について調べた。変性した急冷分子は生理的塩濃度の存在下で線状的に会合し、その会合体の形成にはOVA分子の中央部に位置するβシートAの分子表面への露出が関与することを明らかにした。この分子会合へのβシートAの関与は、血栓症を引き起こすAPIの突然変異体の会合体形成の分子機構と類似していた。ところで、4つの糖鎖結合部位をもっているAPIとは異なり、OVAはβシートAの近傍に1つの糖鎖をもっているので、糖鎖が変性分子の会合に与える影響を調べた。大腸菌シャペロニンGroELに対する急冷分子の親和力を比べることによって、糖鎖の有無は変性分子の表面疎水性に大きな差を与えることを明らかにした。APIとOVAを含むセルピンファミリーに属する数種類のタンパク質の一次配列に従って熱ショックタンパク質BiPが結合する配列を検索した。その結果、タンパク質分子の進化系統樹において近縁の関係にあるものほどBiP結合配列の分布に高い相同性があることを見出した。分子進化の観点からタンパク質の折り畳みを解明する本研究においては、今年度は、共通の祖先タンパク質から派生したセルピンファミリーに属するタンパク質の折り畳み機構と熱ショックタンパク質(Hsp)の認識モチーフについて解析し、以下の成果が得られた。1.ニワトリ卵白アルブミン(OVA)の熱変性状態とそのフォールディングを調べた。今回購入した機器により加熱温度を厳密に制御し、OVAの熱変性過程をCDスペクトルによって追跡したところ、OVAは76°C以上の温度で熱変性し、その状態はポリペプチド鎖が大きく揺らいだアンフォールド状態にあるが、変性剤中において観察されるような典型的なランダムコイル状態ではないことが判明した。80°Cにおいて熱変性させたOVAを徐冷すると天然状態に巻き戻ったが、一方、急冷すると、誤って折り畳まれた変性分子を形成し、徐々に天然状態に復元した。このような2相性の復元反応は、同じセルピンファミリーに属するα1-アンチトリプシン(API)の復元反応においても観察されている。2.急冷によって誤って折り畳まれた変性OVA分子は生理的塩濃度の存在下で線状的に会合し、その会合体の形成にはOVA分子の中心部に位置するβシートAの分子表面への露出が関与することをHspおよびモノクローナル抗体を用いた実験から明らかにした。

3.OVAの一次配列に従って4残基ずつシフトさせながら12残基のペプチドをマルチピンシステムを用いて化学合成し、Hspの一つであるBiPが結合するペプチドをELISA法により検索した。BiPが結合するペプチドは、疎水性の高い領域に存在し、疎水性と親水性残基が比較的交互に存在するモチーフによって説明できること、APIにおけるBiP結合領域もOVAの領域と概して一致することを見出した。分子進化の観点からタンパク質の折り畳みを解明する本研究において、共通の祖先タンパク質から派生したセルピンファミリーに属するタンパク質の折り畳み機構と熱ショックタンパク質(Hsp)の認識モチーフについて解析し、以下の成果が得られた。1.加熱変性後、急冷によって誤って折り畳まれた卵白アルブミン(OVA)の急冷分子は生理的塩濃度の存在下で数珠玉状に会合し、その会合体の形成にはOVA分子の中央部に位置するβシートAの分子表面への露出が関与することをHspおよびモノクローナル抗体を用いた実験から明らかにしてきた。この分子会合へのβシートAの関与は、OVAと共通の祖先タンパク質から派生したα1-アンチトリプシン(API)の突然変異体の会合体形成の分子機構と類似していた。ところが、OVA(A1分子種)は、四つの糖鎖結合部位をもっているAPIとは異なり、βシートAの近傍に1つの糖鎖をもっている。そこで、OVAの糖鎖が変性分子の会合に与える影響を調べた。天然状態において、糖鎖をグリコペプチターゼFによって切断した分子種(dgA3)の熱変性温度は5°C低下した。急冷分子に硫酸ナトリウムを添加し変性分子の線状会合度を光散乱法を用いて調べたところ、dgA3分子種の急冷分子はA1分子種のそれよりも容易に重合した。大腸菌シャペロニンGroELに対する両者の親和力を比べると、A1分子種の解離定数が930nMであるのに対して、dgA3分子種は120nMであり、糖鎖の有無は変性分子の表面疎水性に大きな差を与えることが判明した。2.セルピンファミリーに属するタンパク質の一次配列に従ってBiPが結合する配列を推定した。α1-アンチトリプシン(API)、α1-アンチキモトリプシン(ACT)、アンチトロンビン(ATM)、プラスミノーゲン活性化インヒビター(PAI)と卵白アルブミン(OVA)の結合配列の分布を比較した。その結果、タンパク質分子の進化系統樹において近縁の関係にあるものほどBiPが結合する配列の相同性が高いことを見出した。
三次元浸透破壊メカニズムの理論的・実験的究明

地下水位の高い地点における掘削工事では、掘削底面におけるボイリングやパイピングなど浸透破壊が問題となる。浸透破壊は、技術が進展した現在においても発生することがあり、いまだ問題点を残している。現場の条件は、通常三次元的であり、浸透破壊問題も本質的には三次元的に取扱う必要がある。三次元浸透破壊理論を構築するためには、まず、その基礎となる一次元流、二次元流、二次元集中流、軸対称集中流、二次元放射流、軸対称放射流等の問題に関して総合的な観点から考察を行う必要がある。ここでは、特に三次元浸透破壊現象をモデル化した軸対称浸透破壊問題について考察した。理論的には、Prismatic failureの考え方を軸対称地盤の浸透破壊問題に拡張するとともに、二次元流(2Dflow)、二次元集中流(2DCflow)、軸対称流(AXSflow)条件における地盤内浸透流、限界水頭差H_cについて議論した。軸対称浸透流問題でおこる三次元的な浸透流の集中が、等ポテンシャル線分布、限界水頭差の値、及び、地盤の浸透破壊形状に及ぼす影響について明らかにした。実験的には、軸対称浸透破壊に関して条件の異なる25ケースの実験を行い考察を行った。そして、水頭差の増加に伴う等ポテンシャル線分布及び地盤形状の変化、水頭差H流量Q_<15>関係、変形開始時水頭差、破壊時水頭差などについて明らかにした。浸透破壊理論の進展には、実例解析の重要性が指摘される。実際に浸透破壊が起こった事例や安全に施工できた事例について資料を収集し、現状把握、原因究明、対策工法の考案を行うことが重要である。ここでは、三次元(または軸対称)浸透破壊が問題となった3つの事例:(1)第一新川橋基礎工におけるボイリング発生事例、(2)K線高架橋下部工の深礎掘削に伴うボイリング発生事例、(3)美園立坑工事における掘削地盤の浸透破壊に対する安定性を取り上げ、FEM浸透流解析、及び、浸透破壊に対する安定解析から、現状把握、原因究明、対策工法について詳しい考察を行った。浸透破壊に関しては、いまだ未知の部分が多く残されている。浸透破壊問題の解明に向けて、体系的な研究が望まれているところである。浸透破壊理論の進展には、理論的、実験的な検討はもちろんのこと、事例研究から理論の実際問題への適用性について研究を行うことが重要である。本研究で得られた成果をもとにして、「地盤の浸透破壊における総合評価」に向けてさらに研究を進めてゆく予定である。地下水位の高い地点における掘削などの土木工事では、掘削底面におけるボイリングやパイピングなど浸透破壊が問題となる。浸透破壊は、技術が発展した現在においても発生することがあり、いまだ問題点を残していると考えられる。現場の条件は、通常三次元的であり、浸透破壊問題は本質的には三次元的に取り扱う必要がある。ここでは、まず、三次元浸透破壊実験装置を試作し、現有の水頭負荷装置・計測システムを組み合わせることによって、三次元浸透破壊実験ができることを確認した。三次元浸透破壊理論を構築するためには、まず、その基礎となる一次元、二次元、二次元集中流、軸対称問題に関して十分考察を行っておく必要がある。

理論的には、本年度は特に、二次元集中流、軸対称集中流問題に関して、広範な解析を行い、これまでにすでに得ている一次元(仮定)流、二次元流に関する解析結果と比較検討し、これら諸条件における浸透破壊特性の相互関係を明らかにした。そして、これらの問題を統一的に取り扱うことができることを示した。考察結果については、本年度、学会等で報告したが、今後、論文集等にまとめ投稿する予定である。さらに、今後、三次元浸透破壊に関して、安定解析手法の開発、その実際問題への適用を通して、理論的なアプローチを進め、実験結果との比較検討から、理論の構築に向けて研究を進めて行く予定である。また、限界水頭差を簡単に求めるための無次元化に対する試みを行った。今回作成した図表を用いると、bを掘削半幅、Dを矢板の根入れ深さ、Tを地盤の層厚としたとき、b/D及びD/Tがいかなる条件の問題に対しても、浸透破壊に対する限界水頭差を容易に求めることができることを示した。今後、さらに考察を進め精度の高い図表の作成を試みるとともに、学会等で報告し、学会論文等に発表する予定である。地下水位の高い地点における掘削工事では、掘削底面におけるボイリングやパイピングなど浸透破壊が問題となる。浸透破壊は、技術が発展した現在においても発生することがあり、いまだ問題点を残していると考えられる。現場の条件は、通常三次元的であり、浸透破壊問題は本質的には三次元的に取扱う必要がある。しかしながら、三次元浸透破壊理論を構築するためには、まず、その基礎となる一次元、二次元、二次元集中流、軸対称集中流、二次元放射流、軸対称放射流等の問題に関して総合的な観点から考察を行っておく必要がある。実験的には、まず、軸対称地盤の浸透破壊に関して条件の異なる25ケースの実験を完了し考察を行い、成果について学会発表を行った。三次元浸透破壊現象は近似的には軸対称問題として取扱うことができると言われており、三次元浸透破壊問題を取扱う前に取組んでおくことが重要であると考えられる。今後、実験結果にさらに考察を加え学会論文として投稿する予定である。次に、二次元集中流浸透破壊実験に新たに取組み、2ケースの実験を行った。現在考察を行っているところであり、今後この考察をふまえ種々のケースについて実験を行ってゆく予定である。理論的には、掘削問題における一次元仮定流、二次元流、二次元集中流及び軸対称集中流、復水工法における二次元放射流及び軸対称放射流に関して広範な解析を行い、種々の流れ条件における浸透破壊特性の相互関係を明らかにした。そして、これらの問題を統一的に取扱うことができることを示した。考察結果について、今後、論文集等にまとめ投稿する予定である。また、三次元浸透破壊に関して、安定解析手法の開発、その実際問題への適用を通して、理論的なアプローチを進め、実験結果との比較検討から、理論の構築に向けて研究を進めて行く予定である。また、浸透破壊理論の進展のためには実際に問題のあった事例を取上げ解析を行う必要がある。
細胞イメージングによる白金４価錯体の輸送・代謝動態の解明

白金4価[Pt(IV)]錯体は、抗がん性白金2価[Pt(II)]錯体のプロドラッグであり、Pt(II)錯体シスプラチンの耐性化問題を克服できることが期待されている。本研究では、シスプラチン感受性あるいは耐性をもつヒト卵巣がん細胞を用いて、Pt錯体の細胞内動態、Pt(IV)錯体による耐性克服機構の解明を試みた。その結果、シスプラチンのPt(IV)錯体であるcis-Pt(IV)の細胞内動態は、シスプラチンと同一であるが、シスプラチン耐性ヒト卵巣がん細胞に対して細胞障害性を示し、その過程で活性酸素種を産生していることが明らかとなった。この成果は、Pt(IV)錯体の最適化に貢献できると考えられる。平成25年度は、シスプラチンおよびその白金4価錯体を用いて、DNAに対する結合性、細胞内取り込み・排出挙動、および細胞障害作用等について検討した。in vitro評価系においてシスプラチンは明らかなDNA結合性を示し、その白金4価錯体では生体内還元物質共存下でのみDNAに結合した。その結合様式は、シスプラチンと同様であることをCDスペクトル測定により明らかにした。これらの2種の錯体についてヒト卵巣がん細胞に対する障害性を評価した結果、シスプラチンおよびその白金4価錯体は同等の細胞障害性を示し、さらに白金4価錯体はシスプラチン耐性株に対しても効果を発揮した。この白金4価錯体による高い細胞障害活性のメカニズムを明らかとするために、シスプラチンおよび白金4価錯体の細胞内取り込み・排出挙動をICP-MSを用いて測定した。その結果、両化合物ともに同等の取り込み・排出パターンであった。また、白金錯体の薬理ターゲットであるDNAへの結合量にも差は認められなかった。さらに、ヒト卵巣がん細胞に対して塩化銅を前処理することにより、白金錯体の取り込みに関与する銅トランスポーター(CTR1)を競合阻害すると、白金取り込み量はおよそ20%まで減少するが、シスプラチンおよび白金4価錯体間に違いは見られなかった。以上のことから、白金4価錯体は一部シスプラチンと同様に取り込まれているが、その薬理効果は従来提案されているシスプラチンの作用メカニズムとは異なる経路で発現していると考えられる。平成25年度はさらに、薬物処理したヒト卵巣がん細胞のアポトーシスあるいは細胞死をリアルタイムでモニターできる細胞死タイムラプス解析法を確立したので、平成26年度以降は細胞に対するシスプラチンおよび白金4価錯体の細胞障害イベントを時間経過とともにモニターし、毒性メカニズムを詳細に解析する。本年度は、白金2価錯体と白金4価錯体の細胞障害性の違いを明らかにするべく、シスプラチンとその白金4価誘導体[cis-Pt(IV)]を用いてヒト卵巣がん細胞株に対する細胞障害性を詳細に検討した。また、細胞内における白金の分布についても測定した。その結果、cis-Pt(IV)はシスプラチンよりも早期にアポトーシスが誘導されていることが明らかになった。これは、DNA結合依存的な細胞増殖抑制を主な細胞障害機構とするシスプラチンとは異なり、cis-Pt(IV)自身が細胞障害性を直接的に引き起こしていることを示唆している。このときの細胞内白金量は、全細胞内、細胞質画分、ミトコンドリア画分、核画分で比較したところ、シスプラチンとcis-Pt(IV)間に大きな差は見られなかった。また、DNAに結合している白金量にも差が見られなかった。したがって、白金4価錯体は細胞内局在に依存しない細胞障害作用を引き起こしていると考えられる。今後は、細胞内でどのようなイベントが起こっているのかを細胞内酸化ストレスレベル、ミトコンドリア膜電位変化、カスパーゼ3/7活性などに着目してタイムラプス解析する。白金4価[Pt(IV)]錯体は,抗がん性白金2価[Pt(II)]錯体のプロドラッグであり,cisplatinの長期投与による耐性化を克服することが期待されている.本課題では、Pt(IV)錯体の細胞内動態および細胞障害機構を明らかにすることを目的として、ヒト卵巣がん細胞A2780およびそのcisplatin耐性株A2780cisに対してcisplatinのPt(IV)誘導体であるcis-diammine-dichloro-platinum(IV)[cis-Pt(IV)]が引き起こす細胞内イベントを解析した。その結果、cisplatinおよびcis-Pt(IV)は細胞内取り込み・細胞外排出動態に明らかな差異は認められなかった。また、取り込まれたPtの細胞内分布についても違いは認められなかった。したがって、cis-Pt(IV)は細胞内で還元的代謝を受ける過程でcisplatinとは異なる細胞影響を引き起こすことが示唆された。われわれは以前の研究において、cis-Pt(IV)が生体内還元物質により還元される過程で活性酸素種(ROS)産生を介した酸化的DNA損傷を誘発することを明らかにしている。確かに、本課題で細胞株を用いた検討においても、細胞障害性に先んじて細胞内ROSレベルが上昇し、このROS上昇はcisplatinと比べてcis-Pt(IV)において有意に高いことがハイコンテンツイメージングシステムを用いたタイムラプス解析によって明らかとなった。このとき、細胞内の還元型グルタチオンレベルは有意に低下していた。一方、cisplatinの標的器官であるミトコンドリアに対しては、ROS上昇が認められたタイムポイントにおいて膜電位の異常は認められなかった。したがって、Pt(IV)錯体によるcisplatin耐性の克服には、細胞内グルタチオンの低下が関係していることが示唆された。白金4価[Pt(IV)]錯体は、抗がん性白金2価[Pt(II)]錯体のプロドラッグであり、Pt(II)

錯体シスプラチンの耐性化問題を克服できることが期待されている。本研究では、シスプラチン感受性あるいは耐性をもつヒト卵巣がん細胞を用いて、Pt錯体の細胞内動態、Pt(IV)錯体による耐性克服機構の解明を試みた。その結果、シスプラチンのPt(IV)錯体であるcis-Pt(IV)の細胞内動態は、シスプラチンと同一であるが、シスプラチン耐性ヒト卵巣がん細胞に対して細胞障害性を示し、その過程で活性酸素種を産生していることが明らかとなった。この成果は、Pt(IV)錯体の最適化に貢献できると考えられる。平成26年度は、各種イメージング装置を活用して細胞障害メカニズムを経時的に観察するシステムを構築し、シスプラチンおよびその白金4価誘導体の細胞障害作用の違いを解明することを目的とした。昨年度構築したアポトーシスのタイムラプス解析に加えて、本年度は活性酸素レベルおよびミトコンドリア膜電位変化を解析できる実験系の立ち上げにも成功した。これにより、より詳細な時間分解能をもつ細胞イベントの解析が可能となった。また、細胞内分布挙動を解析することにより、白金4価錯体が特定の細胞内小器官をターゲットとした作用ではなく、細胞生存に広く関わる何らかの因子に作用(グルタチオンの枯渇など)することによりシスプラチンよりも高い細胞障害性を示すことが示唆された。このように、両薬物の作用機構の違いの本態が明らかとなりつつあるという点から、本研究は「おおむね順調に進展している。」と判断した。衛生薬学まず、平成26年度に立ち上げた活性酸素レベルおよびミトコンドリア膜電位変化のタイムラプス解析を実施し、シスプラチンおよびその白金4価誘導体の効果の差異を明らかとする。また、そのメカニズムとして、白金4価錯体が還元される過程で消費するグルタチオンに関係している可能性があるため、両薬物とグルタチオンとの反応性の違いを各種スペクトル解析によって明らかにするとともに、細胞内におけるグルタチオンの消費およびその分布の変動を経時的にモニターし、白金4価錯体の高い細胞障害作用の本態を明らかとする。平成25年度は、白金4価錯体による細胞障害メカニズムについて詳細に検討した。シスプラチンと白金4価錯体の間には明らかな薬理効果の差が認められているが、その詳細な分子メカニズムは明らかとなっていない。平成26年度以降は、実際に各種イメージング法を活用して、その違いの解明に取り組む。また、細胞のアポトーシスあるいは細胞死をリアルタイムでモニターできる細胞死タイムラプス解析法を確立しており、平成26年度以降は細胞に対するシスプラチンおよび白金4価錯体の細胞障害イベントを時間経過とともにモニターし、毒性メカニズムを詳細に解析する。白金4価錯体のシスプラチン耐性ヒト卵巣がん細胞に対する障害作用メカニズムを明らかにするために、細胞内小器官レベルでの白金分布の測定、細胞障害イベントのタイムラプス解析などを進める。
テンサイにおける殺虫性外来遺伝子の発現効率の高い新システム開発に関する基盤研究

1)テンサイの葉緑体形質転換系を開発テンサイ葉緑体にcry遺伝子を組み込み、葉緑体で毒素タンパクを多量に生産させる形質転換系を開発することを目的に実験を進めた。選抜因子(aadA),標識因子(GUS)、プロモーター(rrn)、ターミネーター(rps16)を組み込んだプラスミドをパーティクルガンを用いてテンサイのシュート基盤組織に撃ち込み、培養したが、再分化個体を得るまでに至っていない。再度プラスミドを構築し、テンサイヘの導入した。2)テンサイオルガネラヘのタンパク質局在化システムの開発テンサイオルガネラヘの毒素タンパク質局在化システムの開発を目的に、タバコからクローニングした葉緑体への輸送ペプチドをコードする塩基配列をGUS遺伝子配列上でタンパク質のN末端をコードする位置に連結させたプラスミドを構築した。アグロバクテリウム法で形質転換体の作出を試みたが、再分化個体を得られていない。3)形質転換体テンサイにおけるcry遺伝子の発現cryIA(b)遺伝子が組み込まれた再分化個体について、PCRサザン、ICPタンパクの検出、PCRサザンブロット法によりcry遺伝子の導入を大凡半数の個体で確認された。cryIA(b)遺伝子導入が確認された個体の葉部(主に葉身部)を3齢のヨトウガ幼虫に給餌し、その毒性を検討した結果、非道入個体では、ヨトウガ幼虫の成長に全く影響はなかったが、導入個体では、明らかにヨトウガ幼虫の成長を抑制する個体があった。4)ヨトウガ幼虫の殺虫に一層有効なcry遺伝子のスクリーニングヨトウガ幼虫に対し、殺虫能力の高いタンパクを産生するcry遺伝子をスクリーニングした結果、cryIC遺伝子がcryIA(b)遺伝子より高い殺虫性を持つことが分かった。1)テンサイの葉緑体形質転換系の開発相同組み換えを利用したテンサイ葉緑体形質転換系を開発するため、テンサイのrbcLやrRNA16Sの近傍の塩基配列を決め、そのた配列をサブクローニングし、選抜因子としてaadA、標識因子としてGUS、プロモタ-として、rrnまたはpsbA、タ一ミネーターとしてrps16を組み込むプラスミドを構築中である。2)テンサイオルガネラへのタンパク質局在化システムの開発葉緑体およびミトコンドリアへの輸送ペプチドをコードする塩基配列をタバコよりPCR増幅することによって得た。この配列をGUS遺伝子配列上でタンパク質のN末端をコードする位置に連結させ、これをCaMV35Sプロモーターによって発現させるプラスミドを構築中である。3)形質転換体テンサイにおけるcry遺伝子の発現cry1A(b)遺伝子をアグロバクテリウム法で導入し、再分化した10個体の幼葉から全DNAを抽出し、調整し、cry1A(b)遺伝子の両端の配列をプライマーとし、PCRにより増幅し、cry1A(b)遺伝子配列をプローブとして、サザンハイブリダイゼーションを行い、cry1A(b)遺伝子の導入を確認した。また、幼葉から可溶タンパクを抽出し、タンパク質濃度を調整した抽出液を一定量づつ、ナイロンメブレン上にブロットし、ICPに特異的に結合する一次抗体を反応させ、さらにパーオキシダーゼで標識した二次抗体を一次抗体に結合させ、呈色反応によりICPの検出した。4)テンサイのヨトウガ幼虫に有効なcry遺伝子のスクリーニング選ばれた3株のcry遺伝子を大腸菌に組み込み、ICPを生産させ、人工飼料に混ぜ、ヨトウガ幼虫を飼い、殺虫性を調査中である。

1)テンサイの葉緑体形質転換系の開発相互組み合わせを利用したテンサイ葉緑体形質転換系を開発するために、テンサイのrbcLrやRNA16Aの近傍の塩基配列をサブクローニングし、選抜因子(aadA)、標識(GUS)、プローモーター(rrnまたはpsbA)、ターミネーター(rps16)を組込んだプラスミドを構築した。このプラスミドをパーティクルガンを用いてテンサイのシュート基盤組織に打ち込み、再分化個体を得るべく、培養中である。2)テンサイオルガネラへのタンパク質局在化システムの開発葉緑体およびミトコンドリアへの輸送ペプチドをコードする塩基配列をタバコよりPCR増幅よって得られた。この配列をGUS遺伝子配列上でタンパク質のN末端をコードする位置に連結させ、CaMV35Sプロモーターによって発現するプラスミドをアグロバクテリウムを用いてテンサイのシュート基盤組織に導入した。現在、導入個体を培養中である。3)形質転換体テンサイにおけるcry遺伝子の発現cry遺伝子導入に成功したテンサイ個体から最新成熟葉および成熟葉の葉片をサンプルし、ヨトウガ幼虫に供与し、産生タンパクの毒性を評価した。その結果、最新成熟葉を供与した区では、ヨトウガ幼虫の成長がほとんど観察されず、cry遺伝子は最も生長の盛んな器官で多く発現していることがわかった。4)テンサイのヨトウガ幼虫の殺虫に一層有効なcry遺伝子のスクリーニングヨトウガ幼虫に特異なICPを産生するcry遺伝子を大腸菌に組み込み、ICPを生産させた。ヨトウガ幼虫を飼い、より毒性の強い有効なCry遺伝子菌株をスクリーニングした。1)テンサイの葉緑体形質転換系を開発テンサイ葉緑体形質転換系を開発することを目的に実験を進めた。選抜因子(aadA),標識因子(GUS)、プロモーター(rrn)、ターミネーター(rps16)を組み込んだプラスミドをパーティクルガンを用いてテンサイのシュート基盤組織に撃ち込んだ。選抜培地で培養中に全て枯死した。再度プラスミドを構築し、テンサイへの導入を準備中である。2)テンサイオルガネラへのタンパク質局在化システムの開発タバコからクローニングした葉緑体への輸送ペプチドをコードする塩基配列をGUS遺伝子配列上でタンパク質のN末端をコードする位置に連結させたプラスミドをアグロバクテリウムに組み込み、アグロバクテリウム法で形質転換体の作出を試みたが、再分化固体を得られるまでに至っていない。3)形質転換体テンサイにおけるcry遺伝子の発現cryIA(b)遺伝子が組み込まれたアグロバクテリウムをテンサイのシュート基盤組織に感染させ、選抜培地で再分化した個体について、PCRサザンブロット法によりcry遺伝子の導入を大凡半数の個体で確認された。cryIA(b)遺伝子導入が確認された個体の葉部(主に葉身部)を3齢のヨトウガ幼虫に給餌し、その毒性を検討した結果、非導入個体では、ヨトウガ幼虫の成長に全く影響はなかったが、導入個体では、明らかにヨトウガ幼虫の成長を抑制する個体があった。4)テンサイのヨトウガ幼虫の殺虫に一層有効なcry遺伝子のスクリーニングテンサイのヨトウガ幼虫の殺虫性のより高いタンパク質を産生する遺伝子をスクリーニングした結果cryIC遺伝子がより高い殺虫性を持つことが分かった。
臨床応用可能な脳虚血耐性獲得法の開発-経頭蓋磁気による耐性獲得およびメカニズムの解明-

【目的】脳虚血が予測される場合、何らかの処置で虚血耐性を獲得させておくことは臨床上、極めて重要であるが短時間脳虚血なとの侵襲を伴う処置によって発現することが知られているのみで、臨床応用可能な方法は未だ開発されていない。そこで非侵襲的経頭蓋磁気刺激による虚血耐性導入の可能性を調べる目的で以下の二つの実験を行った。実験1 (in vivo study)【方法】ペットボトルに無麻酔下で拘束した雄性ラットをソレノイドコイル中央に置き、0.1-40mTの平均磁場強度で、10-25ヘルツの正弦波磁場に20分間-24時間曝露した。2日後、4vessels modelによる5分間または8分間の前脳虚血モデルを作製、再灌流一週間後に海馬CA1細胞の生存率を指標として、虚血耐性獲得の有無を非曝露ラットと比較した。また、磁場暴露のみ施行したラットの一週間後の形態学的変化も検討した。【結果】磁場暴露中ペットボトル内の温度上昇は認められなかった。また暴露中、痙攣などは誘発されなかった。磁場暴露のみを施行した一週間後の脳切片に形態学的変化は認められなかった。前脳虚血による遅発性細胞死については、磁場暴露群のうち25ヘルツ磁場暴露群で細胞死は抑制された。実験2 (in vitro study)【方法】雄性ラットを実験1と同様に、0.1-40mTの平均磁掲強度で、10-25ヘルツの正弦波磁場に20分間-24時間曝露した。2日後、大脳を抽出し、厚さ0.4mmの矢状断海馬スライス標本を作成、灌流装置記録槽に置き、実験的脳虚血負荷(酸素・グルコース除去液灌流)による反応を、1)細胞内記録法による膜電位変化と、2)細胞内Ca濃度変化を指標として虚血耐性獲得の有無を非曝露ラットと比較検討した。【結果】非曝露群では虚血負荷開始約6分後に急激且つ急峻な脱分極電位が発生し、この直後に正常液(酸素・グルコース含有液)を再灌流しても脱分極は持続、電気生理学的に神経細胞は機能不全に陥った。細胞内Ca濃度は急峻脱分極電位発生と同時に急激に増加し、再灌流すると徐々に低下した。一方、曝露群では虚血負荷後に同様な脱分極電増加が発生したが、再灌流により静止電位まで再分極し、電気生理学的にも機能回復を示すニューロンが出現した。また虚血によって増加した細胞内Caの再灌流による回復過程は非曝露群に比して速かった。実験3以上の実験結果のメカニズムを探るために、拘束ストレス負荷ラットと正弦波暴露ラットとにおいてc-Fos mRNAの発現について検討した。拘束ストレスのみでは負荷後6時間までの経時的変化に有意差はなかった。25Hzの正弦波暴露ラットにおいては荷後早期にc-Fos mRNAの発現を確認した。通常、20ガウス程度ではそれに伴ううず電流は発生しないとされており、磁気刺激による耐性獲得がうず電流を介さずとも細胞内伝達機構賦活化させる可能性を示唆した。

一方、曝露群では虚血負荷後に同様な脱分極電増加が発生したが、再灌流により静止電位まで再分極し、電気生理学的にも機能回復を示すニューロンが出現した。また虚血によって増加した細胞内Caの再灌流による回復過程は非曝露群に比して速かった。実験3以上の実験結果のメカニズムを探るために、拘束ストレス負荷ラットと正弦波暴露ラットとにおいてc-Fos mRNAの発現について検討した。拘束ストレスのみでは負荷後6時間までの経時的変化に有意差はなかった。25Hzの正弦波暴露ラットにおいては荷後早期にc-Fos mRNAの発現を確認した。通常、20ガウス程度ではそれに伴ううず電流は発生しないとされており、磁気刺激による耐性獲得がうず電流を介さずとも細胞内伝達機構賦活化させる可能性を示唆した。我々は初年度として、修正型電気けいれん療法を用いた虚血耐性獲得に着目し基礎研究を行った。1)方法(1)ECS前処置ラツトの作製イソフルレン-酸素吸入麻酔下に耳介にクリップ電極を装着し、1回のみ電気けいれん処置を与えるsingle-ECS群(sECS群)および連続9日間ECSを行うRepeated-ECS群(rECS群)を分けた。クリップ装着までは行うが通電による痙攣誘発を行わないラットをコントロール群とした。その後、上記3群に致死的な(1)前脳虚血あるいは(2)局所脳虚血を負荷した。(2)脳虚血負荷と脳組織障害の評価コントロール群ではクリップ装着、sECSでは単回ECS、rECSでは最終ECSのそれぞれ2日後に以下の脳虚血を負荷した。sECS群およびrECS群の一部では、ECS自体の脳障害の有無を調べるため虚血負荷を加えずに、sECSでは単回ECS、rECSでは最終ECS7日後にHE染色下で脳皮質および皮質下の病理学的検索を行った(Sham群)。前脳虚血モデル4%イソフルラン吸入で麻酔導入、気管内挿管後、40%酸素、2.0%イソフルラン吸入下にPaCO235-42mmHgの範囲で人工呼吸を行い、直腸温は37°Cに調節した。椎骨動脈焼却と総頚動脈の一時的牽引を組み合わせた前脳虚血を、イソフルラン1%吸入下に8分間負荷したあと再灌流した。再灌流7日後に犠死させ、摘出脳をHE染色により海馬CA1細胞の生存率をカウントし比較した。局所脳虚血モデル前脳虚血モデルと同様の準備を行った後、塞栓糸を用いた中大脳動脈閉塞を45分間負荷したあと再灌流させた。脳虚血負荷時は吸入麻酔から覚醒させた。再灌流2日後に犠死させ、摘出脳をTTC染色し梗塞に陥った体積を計測した。2)結果(1)Sham群においては、病理組織上いかなる傷害も認めなかった。(2)前脳虚血モデル7日後の海馬CA1領域の遅発性細胞死は、sECS群、rECS群いずれにおいても細胞死が少なかった。(3)局所脳虚血モデル作製2日後の梗塞体積はコントロール群と比較し、sECS群、rECS群いずれにおいても有意に細胞死を防いだ。sECS群においてより脳保護作用が強かった。【日的】脳虚血が予測される場合、何らかの処置で虚血耐性を獲得させておくことは臨床上、極めて重要であるが短時間脳虚血などの侵襲を伴う処置によって発現することが知られているのみで、臨床応用可能な方法は未だ開発されていない。そこで非侵襲的経頭蓋磁気刺激による虚血耐性導入の可能性を調べる目的で以下の二つの実験を行った。実験1(in vivo study)【方法】ペットボトルに無麻酔下で拘束した雄性ラットをソレノイドコイル中央に置き、20ガウスまたは150ガウスの平均磁場強度で、8、25、50ヘルツの正弦波磁場に20分間曝露した。
麻酔薬の耐性とカンナビノイド関連薬剤

亜酸化窒素投与によるラット脳CB1受容体遺伝子発現量をRT-PCR法で測定した結果、線条体におけるCB1受容体遺伝子の発現が減少した。CB1受容体はProtein kinase C(PKC)を活性化するGs蛋白に共役する可能性があり、亜酸化窒素の吸入でCB1受容体が減少し、PKC活性や急性耐性形成に関与することが示唆された。セボフルラン(Sev)投与ラットの鎮静作用の変化をロータロッド試験で観察した。今回の研究ではSevの鎮静作用に対する急性耐性形成は確認できなかった。ロータロッド試験は脊髄での無動化作用を観察していると考えられ、その作用は長時間のSev投与でも変化しないことが明らかとなった。現在臨床利用されている全身麻酔薬には、連用投与でその作用に対して耐性が形成されることが、臨床上、動物実験双方で報告されている。本研究の目的は全身麻酔薬に対する耐性形成のメカニズムを神経化学的に解明することである。亜酸化窒素の鎮痛作用に対する急性耐性が形成されることが明らかなWistarラットを用いて、急性耐性形成に関与するとされる細胞内情報伝達系のProtein-kinase C(PKC)活性に影響を与えるカンナビノイドCB1受容体遺伝子の発現変化を検討した。雄性Wistarラットに75%亜酸化窒素を4時間吸入させた後、断頭し脳を取り出し、大脳皮質、小脳、海馬、線条体、脳幹の5部位に分けて、RT-PCR法を用いてCB1受容体遺伝子の発現量を測定した。対象ラット脳と比較した結果、線条体でCB1受容体遺伝子の発現量が減少する傾向を認めた。最近、PKC阻害薬を脳室内投与すると、マウスにおける亜酸化窒素の鎮痛作用に対する耐性形成が阻止されることが報告された。CB1受容体はPKCを活性化するGs蛋白に共役していることから、今回の結果は線条体における変化と鎮痛作用との関連は不明であるが、亜酸化窒素の吸入によってCB1受容体が減少し、PKC活性や急性耐性形成に関与していることを示唆するものである。また、ラット脳波の観察においてセボフルランの鎮静作用は、90分程度の短期間のでも耐性が形成されることが報告されている。これを行動学的に評価するために、ロータロッド試験を用いてその運動行動に耐性が形成されるかを検討した。セボフルラン0.3 MAC投与下にロータロッド試験を行った。正向反射は継続して保たれたが、ロータロッド試験は麻酔薬投与下では抑制されたままであった。この結果から、吸入麻酔薬の脳での耐性は早期に形成されるが、脊髄レベルでは作用が継続し、麻酔作用を発揮している可能性が示唆された。現在臨床使用されている全身麻酔薬の中には、連用投与によりその作用に対して耐性が形成されることが臨床上、動物実験双方で報告されているものがある。本研究の目的は、全身麻酔薬に対する耐性形成のメカニズムを神経化学的に解明することである。全身麻酔薬である亜酸化窒素の鎮痛作用に対する急性耐性が形成されることが明らかなWistarラットを用いて、急性耐性形成に関与するといわれている細胞内情報伝達系のProtein-kinase C(PKC)活性に影響を与えるカンナビノイドCB1受容体遺伝子の発現変化を検討した。雄性Wistarラットに75%亜酸化窒素を4時間吸入させた後、断頭して脳を取り出し、大脳皮質、小脳、海馬、線条体、脳幹の5部位に分けて、RT-PCR法を用いて、CB1受容体遺伝子の発現量を測定した。ごく短時間の全身麻酔薬セボフルラン吸入下に断頭したラットを対照として比較した結果、線条体におけるCB1受容体遺伝子の発現量が減少している傾向が認められた。CB1受容体はPKCを活性化するGsタンパクに共役していることから、今回の結果は、線条体における変化が鎮痛作用とどのように関連しているかは不明であるが、亜酸化窒素の吸入によってCB1受容体が減少し、PKC活性や急性耐性形成に関与していることを示唆するものである。計画当初、静脈麻酔薬プロポフォールの鎮静作用に対する耐性形成モデルを作成し、亜酸化窒素と同様にCB1受容体の拮抗薬を投与して、耐性形成にCB1受容体の影響を検討する計画であったが、最近、PKC阻害薬を脳室内投与してマウスにおける亜酸化窒素の鎮痛作用に対する耐性形成が阻止されることが他施設より報告されたため、次年度の計画であったPKC活性の測定を前倒しで行うことを考えたが、準備に手間取り、その間に確立された手法を用いて行えるCB1受容体遺伝子の発現量測定を行った。したがって、当初の計画は準備段階であり、遅れているといえるが、関連する成果をあげることができたため、上記の評価とした。

今後は、亜酸化窒素によるCB1受容体遺伝子発現の減少を確実なものとし、さらにCB1受容体タンパク量の検討、当初の計画にあるPKC活性の検討を進めるとともに、当初の計画で遂行できなかった、静脈麻酔薬プロポフォールの鎮静作用に対する耐性形成モデルの作成、CB1受容体の拮抗薬投与による耐性形成への影響を検討する。最近、PKC阻害薬を脳室内投与してマウスにおける亜酸化窒素の鎮痛作用に対する耐性形成が阻止されることが他施設より報告されたため、次年度の計画であったPKC活性の測定を前倒しで行うことを考えたために、次年度使用額が生じた。次年度は、当初の計画で遂行できなかった、静脈麻酔薬プロポフォールの鎮静作用に対する耐性形成モデルの作成、CB1受容体の拮抗薬投与による耐性形成への影響を検討するため、次年度使用額はラットや試薬の購入費として使用する。
遠隔国際交流の促進を図る提示教材の効果的多言語表示法の開発と伝送画質の評価

本研究課題の目的は,1)教材の効果的な多言語表示法の開発,2)日韓遠隔交流における伝送画質の教育的評価,3)日韓遠隔交流に関する実証実験授業の実践と評価であった。その成果として,以下のことが挙げられる。1)教材の効果的な多言語表示法の開発に関して・Web上に配置される語句の多言語表示は,相手の国への関心を高めることが分かった。・母国語に依存しないコミュニケーション手法として,絵カードによる非言語対話の可能性が示された。・Web-GIS教材及び日韓遠隔交流用翻訳チャットシステムの開発により,効果的なコミュニケーションが実現できた。2)日韓遠隔交流における伝送画質の教育的評価に関して・日韓遠隔交流時のトラフィック評価,伝送画質の客観的評価,伝送画質の主観的評価を行うことができた。・DV及びHD動画の使用による言語,非言語情報の伝達特性について明らかにした。・DV及びHD動画による遠隔立体視を試行し,十分な機材の準備とネットワークの確保で,遠隔立体視による交流が可能であることが分かった。3)日韓遠隔交流に関する実証実験授業の実践と評価に関して・日韓間の中学校及び大学において,高精細動画と翻訳チャット,Web-GIS教材を用いた遠隔授業が実践できた.・主観評価から,これらの遠隔授業は学習者,教師等にとって,有用性の高い授業であった.・日韓遠隔交流を進めるに当たっては,教育内容や伝送システム等について,日韓両側に協力者が不可欠であった。・中学生,大学生ともに,遠隔国際交流により国際性に関する意識の変容が見られ,国際交流の効果が確認できた。本研究課題で得た成果は,次の3点である.1.遠隔国際交流を促進させるための,教材の効果的な多言語表示法開発とWeb-GIS教材の開発.教材の効果的な多言語表示法として,Webページ内でのメニューや説明文,地名等を日本語,英語,韓国語で同時に表示させる方法,及びカーソル位置の韓国語の読みをポップアップ表示させる方法を開発した.メニューや説明文等の比較的短い語句の多言語同時表示は,数行以上の説明文より「ごちゃごちゃ」感が少なく,有効であることが分かった.また,Webページ内におけるスクロール文章の多言語同時表示については,主となる言語の文節単位での停止スクロールタイミングに合わせて文章を停止させると,無意味綴りの記憶再認課題においては普通のスクロールと同等の成績を示し,主観評価においては文章の理解に関する項目について普通スクロールより有意に高い評価を示すことが分かった.さらに,Web-GIS教材の初期バージョンを開発した.2.伝送画像品質の教育的評価遠隔授業で用いるDV動画の画質に関する心理物理評価については,プレゼンソフトを用いて行う説明型授業と対面型授業の違いにかかわらず,画質因子について4段階での主観評価2.5を示す心理物理評価値(PQR値)は4.4,臨場感因子ではPQR値で3.6,遠隔利点因子ではPQR値3.3,授業内容因子と分り易さ因子ではPQR値で10以上で得られることが分かった.3.実証実験(DV動画とHDTV動画による遠隔授業)DV動画による実証実験授業として,長崎大附属中と全南大附属中(韓国光州市),九州産業大学(福岡)の3地点間を結ぶ遠隔授業を実践した.この実践では,長崎-福岡間画質はPQRで2.43.1,全南-福岡間画質はPQRで811.4を示した.HDTV動画による実験授業として,長崎大附属中と広島大間を結ぶ遠隔授業を実践した.本研究課題で得た成果は,次の通りである.1.遠隔国際交流を促進させるための,教材の効果的な多言語表示法開発とWeb-GIS教材の開発.教材の効果的な多言語表示法として,平成16年度の成果を論文投稿するとともに,絵カードを用いた非言語対話環境の検討を行った.

これは,200×200ピクセルの絵カードに動作やその対象,表情等をイラストで描画し,それを用いて非言語による対話を行うシステム構築に着手した.また,日本語と韓国語間で,単語単位での翻訳を可能にする,チャットシステムの開発にも着手した.2.伝送画像品質の教育的評価今年度実施した日韓での実証遠隔授業(2005年9月実施)について,前回(2004年2月実施)のシステムを改善した成果として,高精細な動画伝送を実現した.すなわち,釜山大→九州産業大での受信映像はPQRで1.7,長崎大→九州産業大での受信映像はPQRで1.6を示した.また,画像に関する主観評価としては,4段階評価で3.0(前回は2.7)の結果を得た.3.実証実験DV動画を利用した実証遠隔授業として,2005年9月に長崎大学と釜山大学,そして九州産業大学を接続した日韓遠隔授業を実践した.この実践は,前回(2004年2月実施)と同じ内容であったが,被験者を日韓の大学生を用い,前回同様国際性の変容を調査した.その結果,中学生同様,大学生でも遠隔授業により国際性が変容することが分かった.なお,前回の実証実験については,学会に論文投稿し,掲載された.HDTV動画の利用については,Visual Literacyに焦点を当て,日韓の大学生でDV動画との比較実験を行うべく,準備中である.次年度に,その実験を実施予定である.本研究課題の目的は,1)教材の効果的な多言語表示法の開発,2)日韓遠隔交流における伝送画質の教育的評価,3)日韓遠隔交流に関する実証実験授業の実践と評価であった。その成果として,以下のことが挙げられる。1)教材の効果的な多言語表示法の開発に関して・Web上に配置される語句の多言語表示は,相手の国への関心を高めることが分かった。・母国語に依存しないコミュニケーション手法として,絵カードによる非言語対話の可能性が示された。・Web-GIS教材及び日韓遠隔交流用翻訳チャットシステムの開発により,効果的なコミュニケーションが実現できた。2)日韓遠隔交流における伝送画質の教育的評価に関して・日韓遠隔交流時のトラフィック評価,伝送画質の客観的評価,伝送画質の主観的評価を行うことができた。・DV及びHD動画の使用による言語,非言語情報の伝達特性について明らかにした。・DV及びHD動画による遠隔立体視を試行し,十分な機材の準備とネットワークの確保で,遠隔立体視による交流が可能であることが分かった。3)日韓遠隔交流に関する実証実験授業の実践と評価に関して・日韓間の中学校及び大学において,高精細動画と翻訳チャット,Web-GIS教材を用いた遠隔授業が実践できた。・主観評価から,これらの遠隔授業は学習者,教師等にとって,有用性の高い授業であった。・日韓遠隔交流を進めるに当たっては,教育内容や伝送システム等について,日韓両側に協力者が不可欠であった。・中学生,大学生ともに,遠隔国際交流により国際性に関する意識の変容が見られ,国際交流の効果が確認できた。