hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
骨肉腫発癌機構におけるBMPシグナル伝達系分子の関与

1.ヒト骨肉腫におけるシグナル伝達系の変異解析:TGF-bのII型受容体、SMAD1及びCBFA1遺伝子に関して、変異解析を施行した。TGF-bRII及びCBFA1に関しては、ゲノムDNAを用いたPCR-SSCPによりスクリーニングを行い、塩基配列を解析した。SMAD1に関しては、RT-PCRにより全長を増幅して、その塩基配列を直接解析した。結果として、いずれの遺伝子にもシグナル伝達機構に影響を与えるゲノムの変異は検出されなかった。骨肉腫に加えて、TGF-bの作用が、軟骨細胞の分化・増殖に重要な役割を果たしていることより、ヒト軟骨肉腫25例に対して、同様な解析を行ったが、やはり変異は検出されなかった。2.ヒト骨肉腫におけるBMPシグナル伝達系の発現解析:8種類の骨肉腫細胞系におけるBMPシグナル伝達系因子、すなわちリガンドであるBMP2及び4、I型及びII型受容体、細胞内シグナル伝達物質であるSMAD1、更に最終的な転写因子の一つと考えられるCBFA1の発現を解析した。その結果、autocrine機構が作用しているものと、していないものが、存在することが示唆された。CBFA1を発現しており、分化形質を強く発現している細胞系として、Saos2株があり、逆にCBFA1の発現が殆ど認められず、自らは骨芽細胞としての形質を殆ど示さない細胞系としてOST株がある。これらを用いてCBFA1の骨肉腫における役割を解析するために、tetracyclin activatorを用いた発現誘導系を確立した。すなわちtetracyclinの添加により、センスあるいはアンチセンスのCBFA1遺伝子がをTetオペレーターによる発現制御べクターにセンス及びアンチセンスの方向に組み込み、それぞれOST及びSaos2で発現できるシステムを確立し、現在、その結果の解析中である。TGFのシグナル伝達における変異解析として、まずII型受容体の解析を行った。14個のエクソン中、変異のホットスポットであるexon4のpoly(A)領域及び機能的に重要であると考えられているkinase domainを含むexon7及び8に対して、50例のヒト骨肉腫を材料にPCR-SSCPにてスクリーニングを行い、direct sequencingにて塩基配列を確認した。その結果、いずれにおいても変異は検出されなかった。2.BMPシグナルの発現解析8種類の骨肉腫細胞系におけるBMPシグナル系の遺伝子のmRNAレベルでの発現を解析した。まずリガンドであるBMP2及び4の発現は、全く認められないものから、非常に強く発現しているものまで細胞間で著しい相違が認められた。I型及びII型受容体の発現にも差があり、リガンド発現陽性例に強い発現が認められた。更に細胞内シグナル伝達物質であるSMAD1の発現を調べると、やはりリガンド及び受容体を発現しているものに発現が認められ、autocrine機構が作用しているものと、していないものが存在することが示唆された。3.SMAD1遺伝子の変異解析8種類の骨肉腫細胞系において、RT-PCRにより全長cDNAをクローニングして、その塩基配列を解析したが、いずれも正常配列であり変異は検出されなかった。4.CBFA1遺伝子の変異解析BMPシグナルにより発現が制御されていると考えられるCBFA1遺伝子の変異を70例の骨肉腫において解析し、1例においてexon2内のGluの反復部位において9bpのdeletionが検出された。しかしこのdeletionは患者の体細胞にも存在しており、稀な多型性である可能性が考えられ、明らかな体細胞性変異と考えられるものは検出されなかった。1.ヒト骨肉腫におけるシグナル伝達系の変異解析:TGF-bのII型受容体,SMAD1及びCBFA1遺伝子に関して,変異解析を施行した。

SMAD1に関しては、RT-PCRにより全長を増幅して、その塩基配列を直接解析した。結果として、いずれの遺伝子にもシグナル伝達機構に影響を与えるゲノムの変異は検出されなかった。骨肉腫に加えて、TGF-bの作用が、軟骨細胞の分化・増殖に重要な役割を果たしていることより、ヒト軟骨肉腫25例に対して、同様な解析を行ったが、やはり変異は検出されなかった。2.ヒト骨肉腫におけるBMPシグナル伝達系の発現解析8種類の骨肉腫細胞系におけるBMPシグナル伝達系因子、すなわちリガンドであるBMP2及び4、I型及びII型受容体、細胞内シグナル伝達物質であるSMAD1、更に最終的な転写因子の一つとして考えられるCBFA1の発現を解析した。その結果、autocrine機構が作用しているものと、していないものが、存在することが示唆された。CBFA1を発現しており、分化形質を強く発現している細胞系として、Saos2株があり、逆にCBFA1の発現が殆ど認められず、自らは骨芽細胞としての形質を殆ど示さない細胞系としてOST株がある。これらを用いてCBFA1の骨肉腫における役割を解析するために、tetracyclin activatorを用いた発現誘導系を確立した。すなわちtetracyclinの添加により、センスあるいはアンチセンスのCBFA1遺伝子がTetオペレーターによる発現制御ベクターにセンス及びアンチセンスの方向に組み込み、それぞれOST及びSaos2で発現できるシステムを確立し、現在、その結果の解析中である。
カイコ卵の休眠開始と低温受容・伝達に係わる遺伝子の単離と作用機序の解明

カイコ胚休眠の開始に関わる遺伝子として知られていたpnd-1及び-2遺伝子をポジショナルクローニング法とRNA干渉法の併用により単離した。休眠ホルモン・シグナルとpnd遺伝子発現を結ぶと考えられる遺伝子をDNAマイクロアレイ解析から単離した。5°Cシグナルを伝達する因子として熱ショックファクター(HSF)転写因子の遺伝子を単離した。HSFが早期低温誘導性遺伝子のSamuiとHSP70発現の活性化の要因であることを示した。カイコ胚休眠は休眠ホルモンが雌蛹期の発育卵巣に作用することで誘導されるが、実際休眠が生じるのは産卵受精後の嚢胚期である。両親がともにpnd(pigmented and diapausing egg)突然変異体であると、その卵は、着色することから休眠ホルモン・シグナルを受容したと考えられるが、非休眠性になる。従って、pndが休眠開始に関わる遺伝子と考えられ、現在少なくとも2種類の突然変異体が知られている(pnd-1とpnd-2)。(1)pnd-1とpnd-2遺伝子はそれぞれ第11染色体と第12染色体に座上していることが判明している。カイコのゲノムDNA解読も終了し、各遺伝子の各染色体上での配置も判明しつつある。(2)そこで、ポジショナルクローニング法により、pnd-1とpnd-2遺伝子を単離することを目指した。まず非休眠性pnd/pndと休眠性pnd/+を交配させ、F1の休眠性pnd/+♂に非休眠性pnd/pnd♀を戻し交配させる。分子マーカーを用いて、各個体のゲノムDNAの遺伝子型を判定し、候補遺伝子領域を絞り込み続けた。(3)pnd-1遺伝子候補として6種類、pnd-2遺伝子候補として3種類に絞り込んだ。次に、各遺伝子に対応する二本鎖RNAを合成し、カイコ休眠卵の多核性胞胚期に注射し、休眠ステージを越えて発育する卵を調査したところ、pnd-1およびpnd-2で各1遺伝子ずつのRNA干渉で非休眠化された現象を認めた。さらにRNA干渉法の再現性と精度を上げることが求められた。(4)また、低温伝達に関しては。低温誘導性遺伝子として、熱ショックタンパク質70a(Hsp70a)およびグリセロールキナーゼ-3の2遺伝子を新たに単離することができた。カイコの胚休眠は休眠ホルモンが雌蛹期の発育卵巣に作用することで誘導されるが、実際休眠が開始される時期は産卵受精後の中胚葉形成完了の胚両端部が肥大した直後である。したがって、本課題では、休眠開始および5°C処理による休眠覚醒に係わる遺伝子を単離することを目的とする。(1)休眠開始遺伝子と考えられるpnd-1およびpnd-2遺伝子の単離をポジショナルクローニング法により進めた。(2) pnd-1およびpnd-2の候補遺伝子の二本鎖RNAを初期の休眠性卵に注射し、非休眠化することに成功しているが、その非休眠化率の向上をめざし、pnd-2遺伝子に関しては50-60%の非休眠化まで高めることができた。(3) pnd-1およびpnd-2遺伝子の発現解析を進めている。(4)食道下神経節を除去し、休眠ホルモン・シグナルを遮断した成熟(完成)卵と休眠ホルモン・シグナルを受容した完成卵において遺伝子発現の差異を網羅的に調査し、休眠ホルモン・シグナル受容卵で著しく発現が抑制される遺伝子を単離した。この遺伝子は、塩酸処理や5°C処理による休眠覚醒期に発現が回復することから、休眠ホルモン・シグナルと休眠開始遺伝子とを結ぶ可能性が考えられる。(6) Gel shift assayにより、HSFがHsp70aおよびSamui遺伝子のHSEsに結合することを明らかにした。(7) 5°Cシグナルは、HSFを活性化させ、Hsp70aおよびSamui遺伝子のHSEsに結合することで発現を促進していると考えられる。(1)カイコ母親蛹の発育卵巣に休眠ホルモンが作用することで、卵母細胞内に胚休眠にむけての準備がなされる。この一つの例として、休眠中に蓄えられる耐寒性剤であるソルビトール及びグリセロールの前駆体であるグリコーゲンの卵母細胞内蓄積が認められる。この研究では、休眠ホルモンが膜貫通型トレハラーゼ遺伝子2(trehalase-2)を活性化させ、卵母細胞膜上のTrehalase-2タンパク質発現を促進し、酵素活性を上昇させることを明らかにした。

(2)休眠開始遺伝子であるpnd-1及びpnd-2では、前者が分泌型タンパク質、後者が膜貫通型タンパク質をコードすることを明らかにした。mRNA発現及びタンパク質発現の解析を、in situ hybridization、免疫組織化学法及びウエスタンイムノブロット法を用いて進めた。(3)5°Cによる休眠覚醒に関しては、ソルビトール利用酵素であるソルビトール脱水素酵素遺伝子2ab (sorbitol dehydrogenase-2a, 2b)の2遺伝子を新たに単離した。これらの遺伝子は、第21染色体上にタンデムに並んでいることを明らかにした。塩基配列の変異から、sorbitol dehydrogenaseがsorbitol dehydrogenase-1と-2に分かれ、さらにsorbitol dehydrogenase-2から2aと2bに分岐したと考えられた。(4)低温誘導性遺伝子の網羅的単離のために、DNAマイクロアレイ解析を進め、いくつかの新規遺伝子を単離した。
認知症早期発見に向けた高齢者の対話データベース構築と認知症傾向検出

85歳以上の超高齢者を中心に大規模な対話データベースを構築するとともに,対話音声から認知症傾向を抽出する.認知症の早期発見のためには精神的・肉体的負担をかけずに日常の中から迅速かつ的確に診断できることが望ましい.認知症の症状は主に記憶障害,アパシー,言語障害,構音障害などである.対話音声には発話の抑揚・リズム・テンポなどの韻律情報や話した内容に関わる言語情報が含まれている.これらはいずれも認知症の症状に表れる情報を多く含んでおり,対話音声の言語的・音響的情報は認知症傾向の検出に有用である.以上のように,本研究では日常会話の中から精度良く検出可能な認知症判断手法を提案する.85歳以上の超高齢者を中心に大規模な対話データベースを構築するとともに,対話音声から認知症傾向を抽出する.認知症の早期発見のためには精神的・肉体的負担をかけずに日常の中から迅速かつ的確に診断できることが望ましい.認知症の症状は主に記憶障害,アパシー,言語障害,構音障害などである.対話音声には発話の抑揚・リズム・テンポなどの韻律情報や話した内容に関わる言語情報が含まれている.これらはいずれも認知症の症状に表れる情報を多く含んでおり,対話音声の言語的・音響的情報は認知症傾向の検出に有用である.以上のように,本研究では日常会話の中から精度良く検出可能な認知症判断手法を提案する.
食道癌における新規癌抑制遺伝子の同定:18qLOH領域に着目して

対象となる18q領域の中でPCRをかけるマイクロサテライトマーカーを約50等分(約1cMごと)する領域をカバーするように配置決定した。食道癌臨床検体48症例(内訳:stage1 10例stage2 15例stage3 15例stage4 8例)の癌部あるいは非癌部のゲノムDNAを抽出した。マイクロサテライトマーカーのForword primerには、蛍光標識(6FAM, VIC, NED)をつけ、Reverse Primerにはtailingをつけることによって、安定した結果および、同サイズのマーカーでも10種類同時に泳動できるようになった(コントロールスタンダードは、LIZを用いた)。マイクロサテライトを8グループに分け、ABI PRISM310(Applied Biosystems社)にて症例ごとに一度に泳動し、解析ソフトGene MapperにてGeneMapperを用いて癌部および非癌部の波形を比較しLOH解析を行った。LOHは48症例中28症例にみられ、マーカー毎のLOHは18.4238.46%と高頻度であり、LOHが18q全体に及ぶと思われる症例が48例中8例(16.7%)にみられた.臨床病理学的因子および予後と関連する18qLOH領域を同定し、食道癌に関連した癌抑制遺伝子を同定することを目的として本研究を開始したが、結果は予想以上に高頻度に広範囲にLOHが存在し、18qのなかで狭い領域を同定することは困難と考えた。そのため、LOHが18q全体に存在する8例に加え、18qのテロメア側3分の2が欠失する症例が6例存在するため、これら14例においては18qのテロメア側3分の2欠失がみられる。この18qの欠失と臨床病因学的因子との関連を調べると、18qの欠失例においてリンパ節転移、脈管侵襲が有意に多く見られた。予後を含めてその他の因子との関連はみられなかった。18qのテロメア側3分の2の領域には、リンパ節転移や脈管侵襲と関連した遺伝子が存在する可能性が示唆されたが、LOHは広範囲にみられており、その候補遺伝子を特定することはできなかった。現在、論文投稿中である。対象となる18q領域の中で、PCRをかけるマイクロサテライトマーカーを、約50等分(約1cMごと)する領域をカバーするように配置決定した。マイクロサテライトマーカーのForword primerには、蛍光標識(6FAM, VIC, NED, PET,)をつけ、Reverse Primerにはtailingをつけることによって、安定した結果および、同サイズのマーカーでも10種類同時に泳動できるようになった。(コントロールスタンダードは、LIZを用いた)約10000PCRで、泳動はマイクロサテライトを8グループに分け、症例ごとに一度に泳動することにした。我々はまず、18qのLOHの欠失領域を臨床因子及び予後の異なる食道癌臨床検体48例を用いて同定したい、と考えている。そのうちで、最も臨床病理学的因子(予後、またはT因子、N因子)と関連する領域を解析において、最優先させるべき領域と考えている。現在までに計10000PCRのうち、5000PCRは終了し、アガロースゲルによる予備実験では、バンドが確認されているため、今後Genetic Analyzerへの泳動へ移行していく予定である。LOHの解析については、Gene Mapperのソフトを購入し、解析をオートメーション化の予定である。LOHのみられた領域に関しては、癌抑制遺伝子候補領域として、解析をすすめていきたいと考える。

予後を含めてその他の因子との関連はみられなかった。18qのテロメア側3分の2の領域には、リンパ節転移や脈管侵襲と関連した遺伝子が存在する可能性が示唆されたが、LOHは広範囲にみられており、その候補遺伝子を特定することはできなかった。現在、論文投稿中である。
オプト・ケモロボットを用いたマルチスケール細胞解析システム

大きさ数十数umの細胞1個単位および集団を対象として,温度,pH等の生理状態の計測,刺激に対する応答計測等の微細作業を実現するための,光を用いて駆動・計測・刺激を行うオプト・ケモロボットの基盤技術確立を目的とする.本研究により,(1)光で駆動し計測や刺激を行うカプセル型オプト・ケモロボット,(2)細胞培養環境に設置して計測や刺激を行うチップ型オプト・ケモロボット,の基盤技術を確立し,オプト・ケモロボットを用いて単一細胞および集団細胞を対象としたウイルス感染細胞内生理状態計測に基づくインフルエンザウイルス等の増殖・拡散メカニズム解明を目指す.大きさ数十数umの細胞1個単位および集団を対象として,温度,pH等の生理状態の計測,刺激に対する応答計測等の微細作業を実現するための,光を用いて駆動・計測・刺激を行うオプト・ケモロボットの基盤技術確立を目的とする.本研究により,(1)光で駆動し計測や刺激を行うカプセル型オプト・ケモロボット,(2)細胞培養環境に設置して計測や刺激を行うチップ型オプト・ケモロボット,の基盤技術を確立し,オプト・ケモロボットを用いて単一細胞および集団細胞を対象としたウイルス感染細胞内生理状態計測に基づくインフルエンザウイルス等の増殖・拡散メカニズム解明を目指す.
ソーダ酸化揮発分離法によるSe-As系廃棄物の完全分離・回収方法の開発

Se-As系廃棄物からのセレンと砒素の分離・回収方法として,酸化燃焼法にひと味加えたソーダ酸化揮発分離法の開発を目的として研究を行い,以下の知見を得た。1.真空熱分解法ならびに酸化燃焼法の適用性真空熱分解法ならびに酸化燃焼法を熱力学的に検討した。前者は適用困難であることが分かったが,後者については条件設定により適用性が考えられたため,実験により確認した。その結果,単純な酸化燃焼法のみではセレンと砒素の分離・回収は困難であることが分かった。2.ソーダ酸化揮発分離法の検討ソーダ系フラックスを用いて,添加フラックス量,吹き込みガス種(酸素分圧),フラックス種の影響について,それぞれ検討した。その結果,いずれの条件においても良好な結果は得られなかった。したがって,本法はセレンと砒素の完全分離・回収には不向きであり,その適用性は低い。3.セレン-鉛合金法による分離・回収本法はセレンを鉛と合金化させSe-Pb合金として固定し,砒素を揮発させ,両者を分離する方法である。適当量の鉛を添加して溶融することにより,セレンはほぼ全量,鉛と合金をつくり固定され,揮発・凝縮した砒素の純度は98%以上となることが分かった。添加鉛量を過剰にすると,セレンの蒸発率は減少し,鉛中の固定量が増加するものの,砒素の蒸発率も大幅に減少するため,分離性・純度の両面から悪影響を与えることが分かった。また,処理後に排出されるSe-Pb合金については,酸化燃焼法を適用することにより,セレンと鉛の分離・回収が可能であることが分かった。したがって,Se-As系廃棄物の完全分離・回収にはセレン-鉛合金法が適用可能である。Se-As系廃棄物からのSeとAsの分離・回収方法としてソーダ酸化揮発分離法を開発するにあたり,本年度はまずベースとなる酸化燃焼実験を試みるとともに,ソーダ系フラックスとしてNaOHを取り上げ以下の知見を得た。1.酸化燃焼法によるSe-As系化合物の分離・回収酸化物の蒸気圧を比較しただけでは,本法の適用性を単純に検討できないため,Se-O系,As-O系の安定状態図を作成した。これから温度を600K以上にし,酸素分圧を10^5Pa程度まであげれば,SeはSeO_2(g)の形で蒸発し,AsはAs_2O_5(s)の形で蒸発せずに残留することが期待できることが分かった。そこで,700Kにおいて酸化燃焼実験を試みたところ,予想とは逆にAsはほとんど蒸発し,また,Seの3/4程度が蒸発,1/4程度が残留するという結果となった。したがって,単純な酸化燃焼法のみではSeとAsの分離・回収は困難であることが分かった。2.NaOHによるソーダ酸化揮発分離法の検討実験後の坩堝中の残留物をX線回折で分析したところ,Asの複合酸化物であるNa_3AsO_4とSeの複合酸化物である。Na_2SeO_3が混在していた。また,反応容器上部に付着した凝縮物中にはAs_2O_3,SeO_2が確認された。予想通り,Asはほぼ全量がソーダ系フラックス中に固定されたが,酸化燃焼法の結果とは逆にSe,Asともほとんど蒸発しなかった。したがって,蒸発・凝縮物中のSeの純度は比較的高純度となることが分かった。ただし,完全分離には不十分であるため,今後はSeとAsの分離・回収をより促進するために,フラックス添加量ならびに吹き込みガス種の影響について検討するとともに,他のソーダ系フラックスの探索も実施する。

Se-As系廃棄物からのSeとAsの分離・回収方法としてソーダ酸化揮発分離法を開発するにあたり,本年度は種々の条件において実験を行い,その適用性を検討した。また,SeとAsの新たな分離・回収方法としてセレン-鉛合金法を提案し,以下の知見を得るとともに,本研究のとりまとめと報告を行った。1.ソーダ酸化揮発分離法の検討前年度はNaOHをフラックスに用いて検討したが,今年度はフラックスとしてAsの吸収能が高いNa_2CO_3を用いることにより,Se-As系化合物からより選択的にAsを分離吸収可能か検討した。フラックスをNa_2CO_3としてもNaOHとの有意さは認められず,効果は上がらなかった。昨年度からの検討結果を総合すると,ソーダ酸化揮発分離法はSeとAsの完全分離・回収には不向きであり,その適用性は低い。2.セレン-鉛合金法によるSe-As系化合物の分離・回収本法はSeをPbと合金化させPb中に固定し,Asを揮発させ,両者を分離する方法である。適当量のPbを添加して溶融することにより,Seはほぼ全量Pbと合金をつくり固定され,揮発・凝縮したAsの純度は98%以上となることが分かった。添加Pb量を過剰にすると,Seの蒸発率は減少し,Pb中の固定量が増加するものの,Asの蒸発率も大幅に減少するため,分離性・純度の両面から悪影響を与えることが分かった。また,処理後に排出されるPbSe合金については,酸化燃焼法を適用することにより,SeとPbの分離・回収が可能であることが分かった。したがって,Se-As系廃棄物の完全分離・回収にはセレン-鉛合金法が適用可能である。
光-分子強結合反応場のための微細光学素子の創成と集積化

色素で標識したタンパク質の高感度検出を目的として、グレーティング結合型表面プラズモン共鳴(GC-SPR)による蛍光顕微鏡観察について研究した。ランダム偏光でのGC-SPRの高効率励起のために、銀コート表面レリーフ回折格子のデザインおよび作製に成功し、スライドガラス基板に比べ100倍明るい蛍光イメージングに成功した。表面プラズモン共鳴場やエキシトンのエネルギーによって化学反応に関わる微弱な信号光を高感度に検出したり、界面での化学反応そのものを制御できる可能性がある。その様なエネルギーの局在化には、回折格子、フォトニック結晶、極微導波路等の利用が有望である。我々はこれまでに、金薄膜の表面プラズモン共鳴場を利用した人工生体膜(脂質膜)の高感度蛍光検出や、シリコンナノ粒子の局在エキシトンを使った希土類イオンの高効率発光等の研究に取り組んできた。本研究では、金属薄膜表面に形成されるプラズモンエネルギーと波長レベル以下の周期構造とを組み合わせた、化学反応に関わる微弱信号の高感度検出あるいは信号増幅のための素子化技術について検討することを目的とする。特に、回折格子上で表面プラズモン共鳴(SPR)を励起場として発生させ、その界面の蛍光分子を励起させる表面プラズモン励起増強蛍光分光(SPFS)の開発と応用に関する研究を実施している。表面プラズモン共鳴場やエキシトンのエネルギーの局在化には、回折格子、フォトニック結晶、極微導波路等の利用が有望である。我々はこれまでに、金薄膜の表面プラズモン共鳴場を利用した人工生体膜の高感度蛍光検出や、シリコンナノ粒子の局在エキシトンを使った希土類イオンの高効率発光等の研究に取り組んできた。本研究では、金属薄膜表面に形成されるプラズモンエネルギーや半導体ナノ粒子に生成するエキシトンエネルギーと、波長レベル以下の周期構造とを組みあわせた、化学反応に関わる微弱信号の高感度検出あるいは信号増幅のための素子化技術について検討することを目的とする、特に、表面プラズモン共鳴を利用した表面や界面の高感度検出技術の構築を目指し、波長レベルの周期構造と金属薄膜との組み合わせで生まれる表面プラズモン励起増強蛍光を使って、化学反応場等のその場解析に有用な超高感度二次元蛍光計測システムを構築することを目指している。まずは、波長オーダーの周期構造を基板表面に作製した。ガラス基板に対しては、現有的紫外線レーザーを用いた干渉露光や電子ビーム描画、プラスチック基板に対しては、熱的なのナノインプリントによる転写を行った。目標とした3mm^2の面積で均一な周期構造を作製することができ、これに金属薄膜をコーティングした。プラズモン場の強度を強めるために、周期構造の周期と深さの最適化も行うことができた。作製した周期構造基板上に蛍光標識バイオ物質(抗体や蛋白質等)を結合させ、蛍光強度を定量評価することで、電場増強度を解析した。また計算機シミュレーションとしてFDTDやRCWAによる計算を併用し、構造と電場増強度の関係をより明確にすることができた。そしてこの基板を用いて、蛍光標識細胞の増強蛍光による蛍光顕微鏡画像も得ることができ、超高感度二次元蛍光計測システムとして通常の24倍という増強度を示すことができた表面プラズモン共鳴(SPR)を励起場として界面の蛍光分子を励起させる表面プラズモン励起増強蛍光分光(SPFS)は、高感度蛍光検出が可能なため、蛍光バイオチップに応用することができる。当研究班では、作製したサブ波長オーダーの周期構造基板を金属薄膜でコーティングし、その金属回折格子に結合した表面プラズモン共鳴場(GC-SPR)を利用した蛍光標識蛋白質や細胞の蛍光検出、および蛍光イメージングに取り組んだ。ガラス基板に対しては、現有の紫外線レーザを用いた干渉露光や電子ビーム描画、プラスチック基板に対しては、光ナノインプリントによる転写を行った。光インプリントで作製された基板においても、目標とした3mm^2の面積で均一な周期構造を作製することができ、これに金属薄膜をコーティングした基板は、インプリント基板においても増強蛍光検出をすることができた。一方、プラズモン場の強度を強めるために、周期構造の溝深さと表面形状の最適化をガラス基板表面に作製された周期構造を用いて検討し、それぞれ最適な構造を決定することができた。最適な基板に蛍光標識蛋白質を結合させ、蛍光強度を計測した結果、40倍の増強蛍光を得ることができた。また、計算機シミュレーションとしてFDTDやRCWAによる計算を併用し、電場増強のための最適な構造を求めたところ、実験結果と一致した結果を得ることができた。さらに、二次元周期構造の作製にも取り組み、同じ周期、溝深さをもつ一次元周期構造基板よりも明るい蛍光を検出することに成功した。表面プラズモン共鳴(SPR)を励起場として界面の蛍光分子を励起させる表面プラズモン励起増強蛍光分光(SPFS)は、高感度蛍光検出が可能なため、蛍光バイオチップに応用することができる。当グループでは、作製したサブ波長オーダーの周期構造基板を金属薄膜でコーティングし、その金属回折格子に結合した表面プラズモン共鳴場(GC-SPR)を利用した蛍光標識蛋白質や細胞の蛍光検出、および蛍光イメージングに取り組んだ。

400-480nmのピッチをもつ一次元あるいは二次元の周期構造を基板表面に作製した。ガラス基板に対しては、現有の紫外線レーザを用いた干渉露光や電子ビーム描画、プラスチック基板に対しては、光ナノインプリントによる転写を行った。光インプリントで作製された二次元周期構造基板においても、目標とした3mm^2の面積で均一な周期構造を作製することができ、これに金属薄膜をコーティングした基板は、増強蛍光検出をすることができた。一方、蛍光顕微鏡観察においてより高感度なイメージングを行うため、対物レンズからの光を有効に利用できる二次元周期構造基板を用い、蛍光標識蛋白質を基板表面にパターン化して結合させたときの蛍光像は、ガラス基板上と比べて100倍以上明るい像であった。また、励起場の増強効果とあわせて蛍光のプラズモンへの再結合を利用して蛍光を検出することで、励起場の増強度のさらに4倍以上の蛍光強度を検出することができ、高感度計測が行えることが実証できた。表面プラズモン共鳴を励起場として界面の蛍光分子を励起させる表面プラズモン励起増強蛍光分光は、高感度蛍光検出が可能なため、蛍光バイオチップに応用することができる。本研究では、銀コート回折格子に結合した表面プラズモン共鳴場(GC-SPR)を利用した蛍光標識蛋白質や細胞の蛍光イメージングとタンパク質の光誘起結晶化に取り組んだ。最終年度は、格子表面での蛍光消光の抑制効果があるシリカ膜の膜厚と消光傾向との相関を定量的に求めた。その結果、シリカ膜厚20nm付近で蛍光強度が最大になることが実験的に確かめられた。一方、金属表面での蛍光消光の理論的予測に使われるCPSモデルと、時間領域差分法で求まる表面プラズモン電場強度分布の両者の積が最大となる距離を計算したところ、金属表面から20nm付近であることが明らかとなった。蛍光増強だけでなく、金属格子上でのタンパク質の光誘起結晶化についても検討した。具体的には、金コート回折格子上にリゾチウム水溶液を滴下し、光励起による結晶化の促進効果を光学顕微鏡で観察した。その結果、ガラス基板上あるいは平坦な金コート基板上に比べ、金コート回折格子基板上では、リゾチウムの結晶析出頻度が2桁以上高いことがわかった。照射した光が格子とプラズモン結合し、表面に局在した電界エネルギーによって水溶液に溶解したリゾチウムの核生成および結晶成長が促進されたと考えられる。
血漿リポタンパク質の酸化修飾に伴う薬物結合能の変化

リポタンパク質が疎水性薬物や塩基性薬物と強く結合して、薬理効果の発現や体内動態に影響を与えることが知られている。血中で最も高濃度で存在するリポタンパク質である低密度リポタンパク質(LDL)は生体内で酸化修飾されるが、それに伴なう薬物結合性の変化は不明である。また、リポタンパク質の構成成分であるアポリポタンパク質や一部の脂質成分は光学活性な化合物であるので、光学活性な薬物との結合は立体選択性を示す可能性がある。そこで我々は、独自に開発した高性能先端分析(HPFA)法をキャピラリー電気泳動(CE)に組込んだHPFA/CE法を利用することにより、LDLの酸化が薬物結合性に及ぼす影響を定量的かつ立体選択的に評価することを試みたところ、以下の知見を得た。1)モデル薬物(ベラパミル、ニルバジピン、ジソピラミドや高脂血症治療薬フルバスタチン)とLDLとの結合は酸化に伴って強くなることが判明した。2)酸化型LDLの薬物結合は非特異的で分配的な性質を示し、酸化型LDL濃度が一定ならば薬物総濃度が増加してもタンパク結合率に変化は見られなかった。また、今回使用したいずれの光学活性薬物でも、光学異性体間のタンパク結合率に有意な差はなかった。3)LDL脂質成分の酸化修飾の影響を解明するために、アシル鎖構造や電荷が異なる数種のモデルリポソームを調製し、モデル塩基性薬物(ベラパミル、プロプラノロール)との結合分析を行った。その結果、LDL酸化に伴う結合増大は正電荷の減少によって引き起こされ、アシル鎖の変化の影響は小さいことが示唆された。血漿リポタンパク質は疎水性薬物や塩基性薬物と強く結合して、その体内動態や薬理効果の発現に影響を与える。低密度リポタンパク質(LDL)は生体内で酸化修飾されるが、LDLの酸化に伴って薬物との結合が変化すると、薬物の体内動態に影響が生じて個人間変動や病態時変動の原因となるおそれがある。また、血漿リポタンパク質の構成成分であるアポリポタンパク質や一部の脂質成分は光学活性な化合物であるので、血漿リポタンパク質と光学活性な薬物の結合は光学異性体間で異なる可能性がある。そこで我々は、独自に開発した高性能先端分析(HPFA)法を利用することにより、LDLの酸化が薬物結合性に及ぼす影響を定量的かつ立体選択的に評価することを試みた。まず、超遠心法によりヒト血漿から分取、精製したLDL溶液に銅イオンを添加してLDLを酸化した。この時、酸化時間1時間、2時間、4時間、12時間と変えて酸化程度の異なるLDLを調整した。次にLDLと強く結合することが知られている光学活性な薬物であるニルバジピン(NV)をモデル薬物に選び、キャピラリー電気泳動(CE)と先端分析を結合したHPCE/FA法により結合実験を行い、total binding affinityを算出した。その結果、NVとLDL並びに酸化型LDLとの結合には立体選択性が見られないこと、並びに、LDLの酸化時間の増加に伴なってNVとの結合が強くなることを見出した。今後、クロフィブラートやパンテチンのような動脈硬化治療薬とLDLとの結合における酸化修飾の影響について検討する予定である。

そこで我々は、独自に開発した高性能先端分析(HPFA)法をキャピラリー電気泳動(CE)に組込んだHPFA/CE法を利用することにより、LDLの酸化が薬物結合性に及ぼす影響を定量的かつ立体選択的に評価することを試みたところ、以下の知見を得た。1)LDL酸化に伴って、ベラパミル、ニルバジピンや高脂血症治療薬であるフルバスタチン等のモデル薬物との結合が強くなった。LDLの2時間酸化によりフルバスタチンとのnK値は約2倍増加した。2)モデル薬物と酸化LDLとの結合は非特異的で分配的な性質を示し、薬物濃度が増加してもタンパク結合率に変化は見られなかった。また、今回使用したいずれの光学活性薬物でも、光学異性体間のタンパク結合率に差はなく、立体選択性は見られなかった。3)LDL脂質成分の酸化修飾の影響を解明するために、アシル鎖構造や電荷が異なる数種のモデルリポソームを調製し、モデル塩基性薬物(ベラパミル、プロプラノロール)との結合分析を行った。その結果、LDL酸化に伴う結合増大は正電荷の減少によって引き起こされ、アシル鎖の変化の影響は小さいことが示唆された。
血圧降下作用を持つペプチドアドレノメデュリンの受容体クローニングとその機能解析-電気生理学を用いた新しい機能性クローニング法によるアプローチ-

アドレノメデュリンは1993年に発見されたペプチドで、副腎髄質、血管壁、脳などに分布しており、cAMPの上昇を介する血管拡張作用により血圧を降下させる。このことからアドレノメデュリン並びにアドレノメデュリン模倣薬は、高血圧の治療薬としての応用が期待されている。薬物開発にはまず、その受容体の特性ならびに構造を分子レベルで明らかにすることが重要である。しかしながら受容体研究はまだ緒についたばかりで、蛋白精製やクローニングといった分子レベルの仕事はほとんど進んでいない。一般的に蛋白精製の行われていない受容体クローニングは、受容体刺激により起こる細胞反応を指標とする機能的性クローニング法が用いられてきた。例えば、5HT1c、エンドセリンなどの細胞内カルシウムを上昇させるタイプの受容体クローニングには、アフリカツメガエル卵母細胞の持つCa^<2+>-activatedClチャネルの電気生理学的応答を指標として行われてきた。その反面、アドレノメデュリンのようなcAMPを介する受容体には上記方法に匹敵するような方法は報告されていなかった。今回申請者は、cAMP依存性キナーゼによりその開閉が調節されているシスティックファイブロ-シスClチャンネルをセンサーとして用いて受容体刺激によって起こるcAMPレベルの変化を電気生理学的にアッセイし、アドレノメデュリン受容体を機能的にクローニングする可能性について検討した。まずラット各種臓器よりmRNAを抽出しアフリカツメガエル卵母細胞に発現させ、アドレノメデュリンによって電気信号が引き起こされる臓器を検討したところ、大脳及び大動脈血管平滑筋のmRNAを発現させた卵母細胞にアドレノメデュリンによるClカレントが検出された(これらの結果は、1994年北米神経科学会並びに第12回脳腸ホルモン学会にて発表済みである)。そこで今後は、これらのmRNAよりcDNAライブラリーを作製し、それらをスクリーニングすることにより、アドレノメデュリン受容体を機能的にクローニングしていく予定である。また、アドレノメデュリンの生体レベルでの血圧調節のメカニズムの解明、並びに模倣薬開発などに寄与するものとして、クローン化された受容体を用いた、分子レベルでの解析実験も行いたいと考えている。
側鎖に芳香環を有する共役ジインポリマ-の合成と物性に関する研究

1.ウンデシン酸およびその誘導体の熱分解機構について1,3ーブタジインー1,4ービス(ウンデシン酸βーナフチルエステル)の前駆体であるウンデシン酸βーナフチルエステルおよびウンデシン酸等のTGーDTAおよびGCーMassの測定を行ない,その結果より熱分解機構に関する知見を得た。2.共役ジアセチレン化合物(モノマ-)の合成側鎖に芳香環と8ケのメチレン基を有する下記の新規共役ジアセチレン化合物(ROCO(CH_2)_8ーC≡CーC≡Cー(CH_2)_8OCOR)を合成した。各々の化合物について,その合成の中間体も含めて元素分析,IR,NMRおよびMassスペクトルの測定結果より、それらの構造を確認した。3.ジインポリマ-の合成と物性1.で得られた(a)(d)のモノマ-について,光,加熱,加圧で固相重合を行なった。(a),(b)は加熱,加圧ではほとんど重合しないが光では重合した。(a)は(b)よりも重合率は大だが,そのポリマ-は有機溶媒に不溶であった。(b)のポリマ-は数種の有機溶媒に溶解し,その溶液の色変化が認められた。(c),(d)はどの条件でも重合しないことがわかった。今後は,(b)のポリマ-が有機溶媒に可溶なので,色変化,重合度等についてさらに詳細に検討するとともに,さらに新しい置換基を有するジアセチレンの合成と重合について研究を進めたい。
西域南道ニヤ遺跡群の総合的研究

平成11年3月21日・22日の2日間にわたって、日中共同による尼雅遺跡学術調査の第二回研究発表会(第一回は平成10年、京都・佛教大学大学四条センターにて開催)を中国、新疆ウイグル自治区ウルムチ市環球飯店ホールにて開催し、日中それぞれ7名ずつの代表者が発表した。この研究発表会に合わせて、切畑健教授は、ウルムチ考古研究所に保存の尼雅遺跡出土文物の調査を一日問おこなった。切畑教授は、平成9年度・10年度にわたって、すでに2回同研究所を中心に、ニヤ出土染色工芸文物(染色織物)の調査研究を行ってきたが、今回がその研究の一応最終となるものであった。井上正教授は、ニヤ遺跡内のN5寺院出土壁画の研究を平成9年度・10年度にわたってウルムチ考古研究所を中心に実施してきたが、仏像・菩薩像壁画(断片)の特徴や歴史的流れを明確にするためには、タリム盆地内に存在するベゼクリク千仏洞・キジル千仏洞・クムトラ千仏洞その他千仏洞内に見られる壁画との比較研究を実施する必要性から、平成9年度・10年度にこれらの課題を実施してきた。今回のウルムチでの研究発表会に参加後、キジル千仏洞・クムトラ千仏洞その他の千仏洞内における仏教壁画を調査しニヤ出土の壁画と比較研究材料を集めた。また、遺跡分布調査を担当する真田康道は、第二回研究発表を基礎として、ニヤ遺跡衛生写真を解析することによって尼雅川々床と遺跡との関連性を解明する手がかりをまとめた。今年度の調査は、夏期ウルムチにおける既収集済み文物の調査と、秋期ニヤ遺跡現地調査を行った。概要は以下の通りである。[ウルムチでの調査](1)8月にウルムチの新疆文物考古研究所にて既収集文物のリスト,撮影記録,実測を行って98年度出版「第2巻報告書」掲載の資料造りを行った。(2)N5寺院から出土した壁画の調査と,96MN墓地から出土した錦や工芸品についての初歩的調査を行った。[ニヤ遺跡調査]ニヤ現地調査は,考古学調査,遺跡分布調査,地質学調査の3部門で行った。以下の通りである。*考古学調査:(1)N14住居址東に広がる4つの炉跡と2つの窯跡及び池跡と見られる個所を中心とした工房跡を調査・測量した。(2)仏塔西南1kmにある遺跡群中の保存状態のよい窯跡の調査,測量をおこなった。(3)95MN墓地に接するMN6墓地の調査。刳り貫き式棺などの調査,測量を行った。(4)新たに発見された97A3墓地は箱式棺が露出おり、緊急保護のための調査を行った。6人の被葬者が納められ、絹がかけてあった。*遺跡分布調査:(1)ニヤ遺跡から北に伸びる古代ニア川々床を20kmさかのぼって調査をした。93A3,93A4墓地を発見した他は遺跡を見いだせなかったが、(2)ニヤ遺跡では新たに8個所の遺跡(住居址4,墓地2,寺院1,窯跡1,炉跡1)を登録した。特に新仏教寺院が注目されている。(3)N24住居址など9戸の住居址と寺院、さらに小屋,並木,垣根を含む遺跡群の測量をした。*地質学調査:(1)ニヤ遺跡の地盤を形成する古代ニヤ川の川床の地質調査とサンプル採取。(2)古代ニヤ川の川床形成に大きな関わりを有すると考えられる隆起帯(民豊隆起帯)の調査。[研究発表・シンポジュウム・ニヤ遺跡文物の開催]佛教大学に於いて97年9月22日23日の2日間(文物展は7日間)

中国から8人の学者(徐苹芳・孟凡人・林梅村・王炳華・于志勇・沙比提・張鉄男)を招へいし、また、日本の学者9人(真田康道・田辺昭三・伊東隆夫・蓮池利隆・樋口隆康・長沢和俊・井上正・赤松俊彦)が参加し、研究発表会およびシンポジュウムを開催した。98年度は、ニヤ遺跡調査は行なわず、ウルムチの新彊文物考古研究所にて収集済み文物の調査研究を実施した。調査には7回に分かれて延べ19名の研究者が参加し、4分野の領域(木質学・カローシュティー木簡・仏教壁画・染織工芸・考古学)から調査研究を行った。概要は以下の通り。〔木質調査〕収集済み木製品から43点のサンプルを選び出し、プレパラートを作成して顕微鏡で樹種同定調査を行い、15点のサンプルからプレパラートを作成し日本に持ち帰った。さらに、18点の木製品のC14分析をして、木製品の年代測定をおこなった。〔カローシュティー木簡調査〕ニヤ出土の10点の木簡について、次の調査研究を行った。(1)日本に於いて写真からでは判読困難な文字を実物から再度確認する調査。(2)中国隊が付けた木簡番号との照合確認。(3)木簡出土場所の再確認。(4)木簡の写真撮影。〔仏教壁画調査〕ニヤ遺跡の《N5寺院址》から出土した小規模の壁画仏陀と菩薩像について、その画法の特徴と年代の確定に関する解決法を試みた。すなわち、周辺の仏教寺院址壁画との比較調査である。今年度は、ケリヤ川のカラドン遺跡・ベゼクリク石窟・北庭西寺を視察した。〔出土文物調査〕ニヤ遺跡から過去に出土した文物は、膨大であってその全体像を掴むため文物の実測等の調査が考古学の分野から行われた。〔その他〕設備備品として購入した衛星写真(スポット衛星写真)は、ニヤ北方45kmに存在する新遺跡(ニヤ北方遺跡)が旧ニヤ川々床にほぼ沿ってあることが確認できた。衛星写真は、今後の新遺跡調査の分析についても活用したい。また、90年度から97年度までのニヤ遺跡において撮影した写真は膨大で、その中、貴重なフィルムについては劣化を防ぐためCD-ROMに納めて保存する処理を行った。本年度は、報告書の完成が遅れ国家文物局からの現地調査許可が得られず、本年度はニヤ出土文物に関連する調査研究と日中共同ニヤ遺跡学術調査研究発表会に研究を方針転換した。それらは成果として後日まとめる予定。(1)7名の中国研究者を佛教大学に招聘して、ニヤ遺跡の日中共同による学術調査に対する総括と研究発表会を開催して二日間に亘って、それぞれ3名の学者が発表した。後日東京に移動し、来年度より日本側考古学調査の中心メンバーとなる予定の國學院文学部吉田恵二教授(考古学)を訪れて、現地調査について意見交換をした。(2)第二回の日中共同ニヤ遺跡学術調査研究発表会を開催し、中国側研究者11名と日本側研究者6名が研究発表をした。その後考古学班は新疆文物考古研究所にて収集文物の調査、仏教美術班は1日間の新彊文物研究所で収集済み染織工芸品の調査を行い、その後、ニヤ遣跡N5寺院出土の仏教壁画と比較研究するためキジル及び周辺の千仏洞壁画を調査した。カローシュティー木簡研究班は、1日間の新疆文物研究所保存のニヤ遺跡出土カローシュティー木簡の調査をした。その後キジル千仏洞に保存されているカローシュティー木簡の調査を要請したが、既に展示場を閉鎖したとのことで研究所倉庫内のトカラ語木簡について調査した。
亜鉛プロトポルフィリンIX形成機構の解明とその応用

発色剤無添加食肉製品における亜鉛プロトポルフィリンIX(ZPP)形成機構の解明と、ZPPを利用して食肉製品の色調改善に応用することを目的とした。塩漬食肉製品でZPPが形成されない機構を明らかにした。豚肉での3成分以上がZPP形成に不可欠であること、パルマハム中に形成された水抽出可能なZPPは、ある解糖系酵素と結合していることを明らかにした。レバーを用いて食肉製品の色調改善を試みたところ、ZPPを多量に形成することができ、酸の種類によって非加熱食肉製品における形成能は異なり、色調の望ましい食肉製品の開発につながることが示唆された。ZPPの前駆物質であるPPIXの形成機構について、PPIX形成に及ぼすヘム合成酵素の影響と、ヘムからのPPIX形成反応を検討した。また、亜硝酸塩によるZPP形成阻害機構および、水溶性ZPPの存在形態について検討することによりZPPの形成機構を明らかにすることを目的にした。ヘム生合成経路からのPPIX形成は、BPG以降の物質より合成されたコプロポルフィリノーゲンIIIがCPOによってプロトポルフィリノーゲンIXとなり、プロトポルフィリノーゲンIXが非酵素的に酸化されてPPIXが形成されることが示唆された。一方で、ミオグロビンやヘミンもPPIXの形成量を増加させたことから、PPIXはヘーの生合成経路とミオグロビン中のヘムからの両方から形成されていることが示唆された。また、ヘムからのPPIX形成反応には、ミオグロビン中のヘムよりも遊離のヘムの方が利用されやすいことが示唆された。亜硝酸塩によりZPPが形成されないのは、亜硝酸塩が示す酸化作用の影響ではなく、亜硝酸塩より発生する一酸化窒素が、ヘム生合成に関与する酵素の活性を阻害したり、ヘムと結合してPPIXの基質を減少させることでPPIXの形成を阻害したためであることが示唆された。パルマハムの中の水溶性ZPPはミオグロビンではなく、アルブミンをはじめとする特定の水溶性タンパク質と弱い結合で複合体を形成していることが示唆された。パルマハム中の水溶性ZPPは、PPIXより形成されたZPPがアルブミンなどの限られた水溶性タンパク質と弱い結合をして可溶化し、パルマハム中に存在していることが示唆された。発色剤無添加の食肉製品に特異的に形成される亜鉛プロトポルフィリンIX(ZPP)形成機構を明らかにすることは、発色剤無添加でも色調の望ましい食肉製品の開発が可能となるかもしれない。豚肉中のZPP形成に寄与する成分として、我々はこれまで水溶性成分と不溶性成分の2成分が必要であると明らかにしたが、平成20年度の研究において水溶性成分を中心に検証したところ、成分について特定することはできなかったが、限外ろ過等により10kDa以下の成分と100kDa以上のタンパク質が不可欠で、10kDa以上の成分は前駆物質のプロトポルフィリンIX(PPIX)の形成にも寄与するため、亜鉛ではない可能性が示された。イタリアで実際に販売されている発色剤無添加のサラミを測定したところ、多量のZPPが形成されており、色調も望ましいものである。効率的にZPPを産生させるために、ZPP形成能について可食できる組織を検討したところ、肝臓(レバー)と腎臓が高く、肝臓では骨格筋(食肉)のおよそ10倍高いことが示された。そこで、ZPP形成能が著しく高い豚レバーを用いて、加熱ソーセージの色調改善効果を検討したところ、ZPPは多量に形成するものの、レバーの色調が強く出るために、色調改善することができなかった。一方、非加熱のサラミ中にZPPを形成させて色調改善を試みたところ、レバー添加によりZPP形成量は増大した。しかし、ZPPは劇的には増加しなかった。この原因としてレバー添加するとZnケラターゼ活性は増加したが、乾燥・熟成中にその活性が大きく低下したことが原因と考えられた。パルマハムなどの無塩漬食肉製品で特異的に形成される亜鉛プロトポルフィリンIXについて、その形域メカニズムの解明とその応用法について検討した。メカニズム解明について、我々の構築したモデル実験系により、豚肉中のZPP形成に寄与する成分の探索を行った。豚肉の水溶性面分をグルろ過により分離したものと、豚肉の水抽出残渣を混合して保持したところ、ヘムを含有するミオグロビンではなく、ある筋漿タンパク質と水抽出残渣との混合により、ZPPが形成することが示さ、ヘム(ポルフィリン)がなくてもZPPが形成される可能性が示された。次に、パルマハムから水抽出可能なZPPをゲルろ過により分離したところ、単一ピークで溶出することができ、SDS-PAGEで分離されたバンドとZPPの蛍光強度との相関、ならびにMALDI-TOFMSとPMF法より、ある解糖系酵素であると同定することができた。

今後は直接的な方法により結合性について検討する必要がある。水抽出不可能なZPPは界面活性剤による抽出では、ZPPが解離することが示され、分離法として望ましくないことが示された。尿素等の変性剤の使用により、ZPPを分解することなく、パルマハムの水抽出残渣を溶解することができ、水不溶性のZPPを分離できる可能性が示された。また、食肉製品中のZPP形成を高める技術を検討したところ、我々がこれまで報告したようにpHがZPP形成ならびに色調改善に重要であることがサラミを用いた試験で明らかにした。さらに、pHを調製する酸の種類によっても、形成能は異なることが示され、酸の選択とpHの調製により、多くのZPPが形成されて色調の望ましい食肉製品の開発につながることが示唆された。
3次元接触多様体および4次元シンプレクティック多様体の研究

3次元コンタクト多様体論への応用を念頭において、4次元シンプレクチック多様体上のモノポール方程式について研究した。特に4次元シンプレクチック多様体であって3次元コンタクト多様体を凸なエンドとするものをとり挙げ、コンタクト=ホモロジーに値をとるようなモノポール不変量を構成することを試みた。その結果、上の目的を達成するまでには至らなかったものの、このような4次元シンプレクチック多様体において、クロンハイマー=ムロウカの定義したモノポール不変量とグロモフ=ウイッテン不変量が等価であることが示せた。クロンハイマー=ムロウカの不変量は、私の立場からみると、コンタクト=ホモロジーの最低次数の値を読みとることに相当するとおもわれる。この主結果は、閉4次元シンプレクチック多様体においてタウベスにより示されたモノポール不変量とグロモフ=ウイッテン不変量の等価性の極めて自然な拡張であるが、その証明にあたって、非コンパクトな多様体における大域解析学上の技術的困難を克服する必要があった。主結果の応用として、3次元球面の標準的なコンタクト構造を有限群の自由な作用でわってえられる3次元コンタクト多様体を考えた時、それを凸な境界として持つ4次元シンプレクチック多様体の位相に関するある制約を得た。すなわち、そのインターセクション形式は負定値であり、カノニカル直線束は自明である。鍵となる観察は、このようなエンドにはこのシンプレクチック形式とコンパチブルなハイパー=ケーラー構造がはいる事である。この結果は代数幾何における有理特異点の理論の、シンプレクチック幾何における類似であるといえる。また、凸なエンドが曲面上の主円周束と実半直線の直積であり、かつシンプレクチック形式のエンドへの制限が、この主円周束上の正曲率の接続(これはコンタクト構造になる)のシンプレクチック化になっている時、非自明な境界条件を持つモノポール不変量の定義が可能であることが観察できた。3次元接触多様体へのゲージ理論の応用について成果を得た。閉な4次元シンプレティック多様体Mにおいて,モノポール方程式のモデュライ空間から定義されるサイバーグ・ウィッテン不変量と,擬正則曲線のモデュライ空間から定義されるグロモフ・ウィッテン不変量が等価であることがタウベスにより示されている.一方,クロンハイマー・ムロウカはMが凸なエンドを持つ場合に対して,モノポール方程式の適当な解析的設定をおくことにより,サイバーグ・ウィッテン不変量をこのようなMに対しても定義できることを示した.本研究では,この2つの結果を結びつけることに成功した.すなわち,Mが凸なエンドをもつ場合の,両不変両の等価性を示した。さて,一般の閉な4次元多様体において,モノポール方程式は,スピノル束の複素構造の向きを逆にすることにより,(Jを-Jにする)デュアリティをもつことが分かるが,クロンハイアームロウカの設定においては,もはやこのことは一般には成立しない.しかし,凸な境界にあらわれる接触構造がイソトピーによって裏返しにできるときは,このデュアリティが成立する。これを逆手に取ると,裏返し可能な接触多様体を凸な境界をもつシンプレクティック多様体は,そのカノニカル直線束が自明であるか,または,その交叉形式が正の固有空間をもつことが,上の結果を応用することにより示される。裏返し可能性のシンプクレティック幾何における対応物は,ハイパー・ケーラー多様体と思えるので,裏返し可能な接触多様体は複素幾何と深いつながりをもつことが予想できる。
C型ナトリウム利尿ペプチド(CNP)の生理的・臨床的意義の解明-ノックアウトマウス及びトランスジェニックマウスの開発と解析-

1.CNPノックアウトマウス及びトランスジェニックマウスの開発と解析:マウスCNP遺伝子の第1、第2エクソンをネオマイシン耐性遺伝子にて置換したターゲティングベクターを作製し、相同組替え法によりCNP^<-/->マウスを開発した。CNP^<+/+>マウスの脛骨成長板軟骨では、CNP遺伝子発現は主に増殖軟骨層に検出されたが、CNP^<-/->マウスでは認められなかった。CNPの特異的受容体であるB型グアニル酸シクラーゼ(GC-B)遺伝子発現は増殖軟骨層から前肥大化軟骨層に認められた。CNP^<-/->マウスにおいて、野生型マウスに比較して四肢体幹の短縮が認められ、CNP^<-/->マウスの吻殿長は野生型マウスの約60%であり、CNP^<+/+>マウスに比較してCNP^<-/->マウスでは増殖・肥大化軟骨細胞層の短縮が認められた。また、軟骨細胞特異的にCNPを発現させたCNPトランスジェニック(Tg)マウスと交配することにより得られるCNP-Tg/CNP^<-/->マウスでは、吻殿長はCNP^<+/+>マウスと同程度に回復し、組織学的変化もCNP^<+/+>マウスと同程度にまで改善した。以上より、CNPが骨軟骨局所因子として内軟骨性骨化に重要な役割を果たすことが個体レベルで証明された。2.BNP過剰発現トランスジェニックマウスとGC-Aノックアウトマウスの交配実験:ナトリウム利尿ペプチドファミリーの内軟骨性骨化促進作用がGC-Aを介するか否かを検討する目的でGC-A欠損(GC-A^<-/->)BNP-Tgマウスを作製した。BNP-TgマウスとGC-A^<-/->マウスの交配により、BNP-Tg/GC-A^<-/->マウスを作製した。雄性マウスの心重量体重比およびtail-cuff法にて測定した収縮期血圧は、BNP-TgマウスではGC-A^<+/+>マウスと比較して有意に低下していたが、BNP-Tg/GC-A^<-/->マウスにおいてはGC-A^<-/->マウスと比較して差は認められなかった。また、雄性マウスにおいてBNP-TgマウスあるいはBNP-Tg/GC-A^<-/->マウスの腰椎および脛骨長軸長は、それぞれGC-A^<+/+>マウスあるいはGC-A^<-/->マウスと比較して同程度に有意に伸長していた。以上より、ナトリウム利尿ペプチドファミリーの内軟骨性骨化促進作用はGC-A以外の受容体を介することが示唆された。