hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
有限要素解析における補間誤差の研究

本研究では、三角形および四面体上のLagrange補間について、新しい誤差評価を与えた。Lagrange補間の誤差は、三角形や四面体が"ふっくらしている"(あるいは"平らに潰れていない")という仮定のもとで誤差評価がなされてきた。本研究では、本質的なのは三角形や四面体の(射影)外接半径であるということを明らかにし、それらが0に収束していけば、たとえ三角形や四面体が平らに潰れていてもLagrange補間の誤差は0に収束するということを示した。この研究成果は、数値シミュレーションの主要な手法の一つである有限要素法の誤差解析に大きな影響を与えるであろう。(1) 2次元三角形上の高次Lagrange補間の誤差解析が、ほぼ完成した。さらに、三角形上の1次Lagrange補間の誤差と「曲面の面積の定義」の間に意外な関係があることを指摘できた。(2)領域の摂動に関するHadamard変分については、Dirichlet境界条件の場合は座標系によらない形で第一変分、第二変分が計算ができた。また、論文も無事受理された。(1)まず最初の目標は、一般の四面体上のLagrange補間の誤差について、三角形と同様な評価式を得ることである。実は、2016年の3月から5月にかけての研究で、これに成功した。得られた評価式は、四面体の「射影外接半径」を使うもので、いままで全く知られていなかったものである。四面体は古代ギリシャの時代から研究されているものだが、四面体の「射影外接半径」は本研究で初めて発見されたものだと思われる。(2)次の目標は、潰れた三角形要素を使ってStokes方程式の有限要素解を求めることができるかどうかを調べることである。そのためには、潰れた三角形要素上で「inf-sup条件」が成り立つかどうかを調べることが必要である。(3)有界領域上のPoisson方程式を、三角形要素上のCrouzeix-Raviart要素で近似する場合、三角形分割に潰れた三角形が含まれるときに有限要素解の誤差がどのようになるかを調べることも重要な目標である。Crouzeix-Raviart要素はいわゆる不連続Galerkin有限要素法の特別な場合であるので、その研究は不連続Galerkin有限要素法で潰れた要素を使うことについての研究の足がかりになると思われる。上記は、研究期間中に発表した論文をまとめたレクチャーノートです。数値解析学、偏微分方程式に対する数値解法の数学的基礎2015年度では次のことを目標に研究を進める。(1) 2次元四角形要素上での補間誤差について、外接半径条件の立場からの研究を進める。(2)それをヒントにして、3次元四面体要素上の補間誤差の解析を始める。(3) 2次元三角形要素を使った混合型の有限要素法について、三角形が潰れていく場合の誤差の挙動について調べる。もし、三角形が潰れていっても誤差が十分小さくなっていくようであれば、その理由の解明を試みる。(4)領域の摂動に関するHadamard変分については、Neumann境界条件の場合について計算を進める。一年間、科研費を使ってきたが、最後に若干のお金が余った。次年度に繰り越すことにした。次年度で、図書の購入などに使用する予定である。いままでに発表した4つの論文をまとめたレクチャーノートです。
新たに発見された脳に分布する細胞外マトリックス構造の機能解析

私達が発見し新規の細胞外マトリックスとして命名、報告したDACS (Dandelion Clock-like Structure ; BBRC ; 364, 2007)は何らかのサブセットのアストロサイトである事が解っている。21年度はこの機能を示唆する裏づけとして以下の研究を行った。(1)このアストロサイト(DACS)はCS56抗体で検出されるが、CS56抗体のほかにCS-AやCS-C抗体、delta4S、delta6S、delta0S抗体で染色を行ったところ、CS-CではDACS様の形態が染色されたがCS-Aでは検出されなかった。これらの事から、DACSはCS-6Sエピトープを持つコンドロイチン硫酸で修飾されるアストロサイトである事が判った。(2) DACSは現在使用されているいかなるアストロサイトマーカーとも共存しない(GFAP-, s100beta-, glutamine synthetase-)。そこでGLASTやPSD95抗体による免疫染色を行い結果を詳細に観察すると、DACSの先端部が一部GLASTやPSD95とオーバーラップする事が判った。この事は、このアストロサイトはシナプス部に接触する部分が特に強くコンドロイチン硫酸により修飾されている事を示しており、シナプス機能への何らかの関与を示唆している。(3) DACSは哺乳類(マウス・ラット・ヒト・ブタ等)成熟脳では保持されているが、鳥類(アイガモ)では観察できなかった。又、マウスの発生過程において3週齢頃に大脳皮質に現れ、神経細胞のcritical periodとの相関関係を示した。この事は、脳の高次機能との関連を示唆するものである。本研究では、脳に存在する最も多い細胞であるアストロサイトのうち、新たなひとつのpopulationを明らかにした。又、このアストロサイトが脳の高次機能に強く関与する事を示唆できた。現在、本結果を纏めて、論文投稿中である。私達が発見し新規の細胞外マトリックスとして命名、報告したDACS(Dandelion Clock-like Structure; BBRC:364,2007)は何らかのサブセットのアストロサイトである。そして何らかのユニットの神経細胞(あるいはシナプス)と接触して機能していることを示唆してきた。20年度はこの機能を示唆する裏づけとして以下の研究を行った。1、この構造物を構成するアストロサイトとこれに囲まれる神経細胞のcharacterizationを試みた。(1)アストロサイトマーカーによる免疫組織学的検討により、GFAP(-),GLAST(-),s100beta(-),glutamine synthetase(-)であった。現在使用されているアストロサイトマーカーには全て陰性を示した。2、個体発生と系統発生について検討した。(1)マウスの発生過程において、DACSは3週齢頃に大脳皮質に現れ、神経細胞のcriticalperiodとの相関関係を示した。(2)マウス・ラット・ヒト・ブタ等の哺乳類の成熟脳でDACSは観察されたが、鳥類(アイガモ)では観察できなかった。脳の高次機能との関連を示唆するものである。3、脳の病的状態でどう変化するのか。(1)大脳皮質の視覚野のcritical piriodをかく乱させるbinocular deprivationの結果、視覚野におけるDACSの発現に影響はなかった。(3)アストロサイト特異的疾患モデルマウス(Alexander disease model)、大脳皮質の層構造に異常をきたすリーラーマウスでもDACSの発現に異常はなかった。21年度は引き続き新規マトリックスDACSの機能に迫りたい。
ストレスによるIP3受容体を介した内耳障害発生のメカニズムの解明

これまで1) IP3Rtype1KOマウスの8Wの聴覚機能の測定、2) IP3Rtype1KOマウスの蝸牛におけるIP3Rtype1タンパク量の定量(Western Blotting法)、3) IP3Rtype1KOマウスにおけるBoettcher細胞の光顕レベルの形態、4) IP3Rtype1KOマウスの聴覚に対するVasopressinの影響について報告してきた。これらの結果をふまえ本年は、IP3Rtype1KOマウスにおけるBoettcher細胞の電顕レベルの形態の解明を目的に、重点的に実験を行った。13-17日齢の同KOマウス(理化学研究所、脳科学総合研究センター、発生神経生物研究チームより供与)、WT (+/+), hetero (+/-), homo (-/-)の各群を使用。通常通りの方法により、超薄切片を作製し観察した。その結果homo (-/-)群では小胞体が高度に膨化したBoettcher細胞を高頻度に認め、次いで、hetero (+/-)でも膨化したBoettcher細胞を認めた。ただしWT (+/+)では膨化はほとんど認められなかった。Boettcher細胞の小胞体の高度の膨化は、IP3受容体type1の機能の欠損に起因して、異常タンパク質の蓄積(小胞体ストレス)が生じた可能性も考えられる。同受容体は小胞体ストレスにより機能が低下することが報告されており、これらのことから蝸牛において特にBoettcher細胞、外らせん溝細胞をはじめとするIP3受容体type1が認められた細胞に小胞体ストレスが負荷されることによって小胞体からのカルシウムイオンの放出機能などを含む同受容体機能が低下し、その結果聴力が低下すること可能性が示唆された2018年12月より、研究分担者と打ち合わせを行いながら、研究結果を論文にまとめている。1.内耳蝸牛における、IP3受容体type1の局在:コルチ器内の外・内柱細胞、Deiters細胞、Boettcher細胞、外らせん溝細胞にIP3受容体type1の存在を免疫組織化学的に確認した。特にBoettcher細胞、外らせん溝細胞に強く免疫陽性反応が認められた。2.Boettcher細胞のIP3受容体type1局在:Boettcher細胞の側方細胞膜は隣り合う同細胞とmicrovilliとしてinterdigitationを形成しているが、その部位の細胞膜にはIP3受容体type1局在は認められなかった。Boettcher細胞においては、小胞体膜にIP3受容体type1局在を認めた。3.IP3受容体type1の蝸牛における機能への関与の検討(IP3受容体type1KOマウスにおける聴力障害の検討):全ての群において、十分な音圧による刺激では、典型的な6波の波形を認めた。heterogenous (+/-), homogenous (-/-)KOマウスは、WT (+/+)に対して、有意に聴力閾値の上昇を認めた。平成27年度において、研究がやや遅れている理由は、研究協力者の確保が困難であったこと、またIP3受容体type1KOマウスにおける聴力障害に関する研究で、ABRの測定が予想に反して困難で、得られた結果の信頼性の確認に時間を要したことが影響している。1) IP3Rtype1KOマウスの8W齢の聴覚機能の測定:IP3Rtype1ノックアウトマウスの成体(8W齢)の内耳蝸牛機能について検討し発表した。hetero(-/-)マウスのABR閾値はWT(+/+)のそれに比して有意に上昇した。この結果から、昨年発表したPND13-17daysのhetero(+/-)KOマウスの聴力低下を認めているが、それが成長の遅延に関連した聴力低下の可能性も考えられていたが、成長の遅延に関連した聴力低下でなく、IP3Rtype1(カルシウムイオンチャネル)の分子数の減少に関連した聴力低下であることが確認された。2) IP3Rtype1KOマウスにおけるBoettcher細胞の光顕レベルの形態:homo(-/-)KOマウスにおいて、Boettcher細胞とClaudius細胞の境界が不明瞭などの形態変化が認められた。Boettcher細胞にはIP3Rtype1が豊富に存在しているため、同細胞の発生に、IP3Rtype1が重要な役割を果たしていることが示唆された。3)IP3Rtype1KOマウスの蝸牛におけるIP3Rtype1タンパク量の定量:現在実験進行中であり、次年度に研究成果を発表する予定である。内耳蝸牛を使用して行っているが、蝸牛外側壁の骨の処理方法、Western Blotting法にどの程度のタンパク量が必要かを検討中である。4)IP3Rtype1KOマウスにおけるBoettcher細胞の電顕レベルの形態:現在実験進行中であり、次年度に研究成果を発表する予定である。昨年度は、研究の進捗はやや遅れていたが、本年度分は、順調に進展した。1) IP3Rtype1KOマウスの蝸牛におけるIP3Rtype1タンパク量の定量:Western Blotting法(WB)によるIP3R1のタンパクの半定量を行った。左右の蝸牛を摘出後、タンパクを抽出し-30°Cで凍結保存。

1匹分左右2耳・総タンパク量5μg/wellに調整しSDS-PAGE電気泳動・転写。1次抗体は抗IP3受容体type1 Rat抗体(モノクローナル):4C11(同施設より供与)を使用。増強化学発光させ解析した。実験1:homo (-/-)では陽性反応が全く認められなかった。実験2:WT (+/+)とhetero (+/-)の比較ではhetero (+/-)でIP3Rtype1のタンパク量は有意に減少していることが確認された。平成27年度においての研究の進捗はやや遅れていたが、平成28年度、29年度は、研究は順調に進展した。これまで1) IP3Rtype1KOマウスの8Wの聴覚機能の測定、2) IP3Rtype1KOマウスの蝸牛におけるIP3Rtype1タンパク量の定量(Western Blotting法)、3) IP3Rtype1KOマウスにおけるBoettcher細胞の光顕レベルの形態、4) IP3Rtype1KOマウスの聴覚に対するVasopressinの影響について報告してきた。これらの結果をふまえ本年は、IP3Rtype1KOマウスにおけるBoettcher細胞の電顕レベルの形態の解明を目的に、重点的に実験を行った。13-17日齢の同KOマウス(理化学研究所、脳科学総合研究センター、発生神経生物研究チームより供与)、WT (+/+), hetero (+/-), homo (-/-)の各群を使用。通常通りの方法により、超薄切片を作製し観察した。その結果homo (-/-)群では小胞体が高度に膨化したBoettcher細胞を高頻度に認め、次いで、hetero (+/-)でも膨化したBoettcher細胞を認めた。ただしWT (+/+)では膨化はほとんど認められなかった。Boettcher細胞の小胞体の高度の膨化は、IP3受容体type1の機能の欠損に起因して、異常タンパク質の蓄積(小胞体ストレス)が生じた可能性も考えられる。同受容体は小胞体ストレスにより機能が低下することが報告されており、これらのことから蝸牛において特にBoettcher細胞、外らせん溝細胞をはじめとするIP3受容体type1が認められた細胞に小胞体ストレスが負荷されることによって小胞体からのカルシウムイオンの放出機能などを含む同受容体機能が低下し、その結果聴力が低下すること可能性が示唆された2018年12月より、研究分担者と打ち合わせを行いながら、研究結果を論文にまとめている。1.IP3R type1 KOマウスの内耳形態の観察・解析(形態学的解析)1)IP3R type1 KOマウスの管理、作製:理化学研究所、脳科学総合研究センター、発生神経生物研究チームで系統維持されたIP3 type1 KOマウス:KO(+/-)、KO(-/-)マウスの管理・作製。2)WT、同KO(+/-)、同KO(-/-)マウスで内耳形態を解析し比較:抗IP3R type1モノクローナル抗体(4C11,18A10)を用いて免疫組織化学を行いIP3R type1の内耳局在を各群で比較する。2.内耳に誘導された小胞体ストレスの解析(形態学的解析)WT、同KO(+/-)、同KO(-/-)マウスで、小胞体ストレス誘導剤を用いて小胞体ストレスを内耳に誘導する。
ポスト社会主義エチオピア周辺地域の国家統合における学校教育と識字能力の役割

平成12年度の成果は以下の通りである。(1)第14回国際エチオピア学会において研究発表Education in Cultural Conflictを発表した。また平成12年4月の日本ナイル・エチオピア学会、および5月の日本アフリカ学会において、やはりエチオピア南部の周辺民社会における学校教育の現状に関する研究発表を行った。これらの内容は、発表要旨集に収録されている。(2)これらの報告活動の結果、エチオピアの学界においてすら学校教育の政治的側面は等閑視されたままであり、その人類学的研究はまったくなされていないことを痛感した。現段階ではエチオピア周辺社会において教育をめぐる紛争が多発しており、そこにはエチオピアの国内植民地的状況とその政治的側面、国家の中央と周辺の文化的闘争の側面、さらに近年のプロテスタント活動もが問題に含まれることが判明した。学会報告に対する他の研究者からの示唆により、当初私の研究目的には含まれていなかったジェンダーが、教育問題を考える上で非常に重要であることを認識し、今後の研究課題の針路修正を検討している。(3)平成12年度中の発表論文は別表の通りである。本課題に関する研究論文は平成13年度中にも出版される予定である。平成11年度の作業内容は以下のようなものである。(1)文献資料の収集:エチオピアの教育学関連の文献、および異文化間教育学、教育人類学関連の文献を収集した。エチオピアの教育に関連する文献はそれほど多くはないが、多くが絶版であり未だ網羅するには至っていない。国内出張により、金沢大学の柘植洋一教授の研究室を訪ね、研究についてのレヴューを受けた。また柘植教授所蔵の文献資料の閲覧をさせていただいた。文献資料収集は次年度も引き続き行う。(2)統計資料の分析:1960年代から今日までのエチオピアの統計資料の一部を入手できたので、これに基づいて、教育実績の統計的な分析を行った。エチオピア全体では就学率は向上しているが、1991年の政権交代後は南部の周辺地域において就学率の低下が懸念される。また識字キャンペーンが終了したことで、全国的な識字率の低下が見込まれる。(3)調査資料の整理:別の科研費(国際学術研究「民族と国家/地方と中央における動態的関係:北東アフリカ諸社会の再編成の比較研究」(代表:福井勝義京都大学教授))による現地調査の際に収集した資料の整理分類を行った。とくにエチオピア南部の現地民の学生に対するインタビュー資料を重視し、この資料から問題の再構成を行っている。インタビュー資料に基づいた研究の中間発表を平成12年4月に日本ナイル・エチオピア学会で、5月に日本アフリカ学会で、また11月には国際エチオピア学会でそれぞれ行う予定である。
心肥大の病態生理における自然炎症の役割及びその分子機構の解明

本研究では、自然免疫受容体に着目して心肥大における自然炎症の役割を検討した。まず、Toll様受容体2(TLR2)に着目して検討を行った結果、心臓に圧負荷が加わると、心組織より分泌される熱ショック蛋白質70がTLR2シグナルを活性化し、その結果誘導されるインターロイキン1β(IL-1β)が代償性心肥大の誘導に重要な役割を果たすことが分かった。さらに、NOD様受容体の形成するNLRP3インフラマソームが、圧負荷後の心組織における活性型IL-1βの産生及び代償性心肥大の誘導に深く関与することが分かった。以上より、圧負荷心肥大の病態生理における自然炎症の重要性及びそのメカニズムの一端が明らかとなった。平成25年度は、圧負荷心肥大の病態生理における病原体センサーであるToll様受容体2(TLR2)の役割及びそのメカニズムについて検討を行った。野生型及びTLR2ノックアウト(TLR2KO)マウスの心臓に大動脈縮窄術による圧負荷を加えると、TLR2KOマウスでは圧負荷後の心組織における炎症反応が抑制されており、心筋細胞肥大及び心線維化は軽減したが、心機能の低下を認め、代償性心肥大が障害されることが分かった。骨髄移植実験を行うと、骨髄由来細胞ではなく、心組織に発現しているTLR2が重要な役割を果たしていることが分かった。細胞実験では、TLR2特異的リガンドを心筋細胞、線維芽細胞及び血管内皮細胞に負荷すると、転写因子NF-κB及び炎症性サイトカインIL-1β依存性に心筋細胞肥大及び線維芽細胞増殖、血管内皮細胞増殖を誘導することができた。実際、野生型マウスにNF-κB阻害薬やIL-1βに対する中和抗体を投与すると、圧負荷に対する代償性心肥大が抑制された。また、細胞実験及び動物実験において、熱ショック蛋白質(HSP)70がTLR2シグナルを活性化しうることを見出し、さらに圧負荷心肥大を誘導したマウスの血液中でHSP70濃度が上昇していることが分かった。野生型マウスにHSP70に対する中和抗体を投与して圧負荷を加えると、心組織における炎症反応及び代償性心肥大が抑制された。以上から、細胞外HSP70により誘導されるTLR2を介した非感染性炎症反応が、心臓の圧負荷に対する適応応答に重要な役割を果たすことが分かった。以上の結果は論文として報告した。以上の結果は、心リモデリングにおける自然免疫受容体及びその内因性リガンドの重要性を示唆するものであり、その制御機構の今後の解明が、高血圧性心疾患や心不全の新たな治療法の開発につながるものと考えられる。本研究では心肥大の病態生理における自然炎症の役割及びその分子機構の解明を目指した。まず、自然免疫受容体であるToll様受容体2(TLR2)に着目し、その圧負荷心肥大における役割を検討した。野生型及びTLR2ノックアウト(TLR2KO)マウスの心臓に大動脈縮窄術による圧負荷を加えると、TLR2KOマウスでは代償性心肥大の誘導が障害され、心不全となることが分かった。実際、野生型マウスにNF-κB阻害薬やIL-1βに対する中和抗体を投与すると、圧負荷に対する代償性心肥大が障害された。また、細胞実験及び動物実験において、熱ショック蛋白質(HSP)70がTLR2シグナルを活性化し、圧負荷後の心組織における炎症反応及び代償性心肥大の誘導に重要な役割を果たすことが分かった。以上から、細胞外HSP70により誘導されるTLR2を介した非感染性炎症反応が、心臓の代償性心肥大の誘導に重要な役割を果たすことが分かった。次に、NOD様受容体の形成するNLRP3インフラマソームに着目して検討した。野生型及びNLRP3ノックアウト(NLRP3KO)マウスに圧負荷を加えると、NLRP3KOマウスでは心組織におけるIL-1βの産生が抑制され、代償性心肥大の誘導が障害された。以上より、代償性心肥大の誘導に重要であるIL-1βの産生には、TLR2シグナルに加えてNLRP3インフラマソームの活性化が必要であることが分かった。本研究の成果により、心肥大における自然炎症の重要性が明らかとなった。今後、その制御機構のさらなる解明が、高血圧性心疾患や心不全の新たな治療法の開発につながるものと考えられる。医歯薬学平成25年度は、圧負荷心肥大の病態生理における自然免疫受容体TLR2の役割及びそのメカニズムの解明を計画していた。

平成25年度における検討により、その目的を達成することができ、さらに次年度に計画していたTLR2に対する内因性リガンドの同定を一部ではあるが行うことができ、論文報告をすることができた。よって、本研究はおおむね順調に進展しているものと考えらえる。平成25年度に予定していた研究計画はおおむね順調に進めることができたため、引き続き研究計画に従い、圧負荷心肥大における他の自然免疫受容体の役割について検討していく。平成25年度は研究計画が予想よりも順調に進んだため、平成25年度使用額が予定よりも低い額でおさまった。平成26年度は、本研究における新たなサブテーマに取り組む予定であり、そのテーマに予定よりも多くの予算をあてることで、研究計画の推進力の向上を得る。
複雑系科学の視点を用いたボールゲームの戦術研究-ブレイヤー間の関係性に着目して-

本研究の目的は,複雑系科学の概念をボールゲームの戦術を解釈するための基礎理論に導入し,構成要素であるプレイヤーがチームを形成し,システムとして機能する戦術行為の本質的な特性を適切に記述できる戦術研究の一領域を新たに創設することであった.平成17年度に行った理論構築を基にして,平成18年度はより指導現場に有効な知見を得るために戦術および戦術行動のタイプに焦点を当て,以下の4点について検討した.1.戦術的準備の段階2.戦術の階層構造と自己の二重構造3.戦術のタイプに応じた設計方法4.戦術のタイプとプレーヤーに求められる自律性その結果,1.戦術的準備においては,理論としての戦術を設計することによって理論的基礎を設計する段階と,能力としての戦術達成力を養成することによって実践的課題を解決する段階が必要である.2.戦術達成力の養成を養成においては,プレーヤーが自己中心的に行為を行う能力と,プレー状況全体の中で場所中心的に行為を行う能力の育成が必要である.3.戦術には,フォンノイマン型の直列プログラムによって二者択一性と連続性を効果的に設計する場合と,グループ戦術を拘束条件にしてプレー・状況に応じて二者択一性と連続性を自律的に設計する場合がある.4.プレーの拘束条件をコーチが外的に設計する戦術において必要とされる自律性は「予め準備された選択肢の中から選ぶ」状況判断的能力であり,プレーの拘束条件をプレーヤーが内的に設計する戦術において必要とされる自律性は「拘束条件となるグループ戦術そのものを決定する状況創造的能力であり,以下の3つの創出能力である(1)プレー状況の中に戦術的に有意味な関係を創出する(2)プレー状況の展開を創出する(3)プレー状況に最適な戦術行動を創出する今後は,本研究によって得られた知見を個人戦術の指導およびチーム戦術の指導に応用していく本研究の目的は,生物,進化,生態系,環境,経済,組織等の様々な対象の研究に応用されている複雑系科学の概念をボールゲームの戦術を解釈するための基礎理論に導入し,構成要素であるプレイヤーがチームを形成し,システムとして機能する戦術行為の本質的な特性を適切に記述できる戦術研究の一領域を新たに創設することであった.平成17年度は,理論構築を主な課題とし,以下の5点について検討した.1.ボールゲームの戦術システムと生命システムとの類似性2.戦術が効果的に機能している状態の特性3.戦術の有効性を評価する観察カテゴリーの作成4.理論としての戦術および戦術行為のタイプ分類5.プレー状況の種類と用いる戦術のタイプ理論構築の結果以下のことが明らかになり,ボールゲームの戦術の解釈に複雑系科学とシステム論の視点が適用可能であることを概念的に確立することができた.1.プレイヤーが構成要素となってチームを形成するボールゲームの戦術行為と,要素が階層的に集まることによって創発的特性が生まれる生命現象と間には類似性がある.2.戦術が効果的に「機能している」あるいは「機能していない」状態とはどのような状態であるのかを,創発,動的相互作用,動的秩序,自己組織化,引き込み,拘束条件,場,等の複雑系科学の概念を用いて質的に記述することができる.平成18年度は,平成17年度の理論構築の成果を研究論文として発表すると同時に,2006年FIBAバスケットボール男子世界選手権の戦術分析に応用する.本研究の目的は,複雑系科学の概念をボールゲームの戦術を解釈するための基礎理論に導入し,構成要素であるプレイヤーがチームを形成し,システムとして機能する戦術行為の本質的な特性を適切に記述できる戦術研究の一領域を新たに創設することであった.平成17年度に行った理論構築を基にして,平成18年度はより指導現場に有効な知見を得るために戦術および戦術行動のタイプに焦点を当て,以下の4点について検討した.1.戦術的準備の段階2.戦術の階層構造と自己の二重構造3.戦術のタイプに応じた設計方法4.戦術のタイプとプレーヤーに求められる自律性その結果,1.戦術的準備においては,理論としての戦術を設計することによって理論的基礎を設計する段階と,能力としての戦術達成力を養成することによって実践的課題を解決する段階が必要である.2.戦術達成力の養成を養成においては,プレーヤーが自己中心的に行為を行う能力と,プレー状況全体の中で場所中心的に行為を行う能力の育成が必要である.3.戦術には,フォンノイマン型の直列プログラムによって二者択一性と連続性を効果的に設計する場合と,グループ戦術を拘束条件にしてプレー・状況に応じて二者択一性と連続性を自律的に設計する場合がある.4.プレーの拘束条件をコーチが外的に設計する戦術において必要とされる自律性は「予め準備された選択肢の中から選ぶ」状況判断的能力であり,プレーの拘束条件をプレーヤーが内的に設計する戦術において必要とされる自律性は「拘束条件となるグループ戦術そのものを決定する状況創造的能力であり,以下の3つの創出能力である(1)プレー状況の中に戦術的に有意味な関係を創出する(2)プレー状況の展開を創出する(3)プレー状況に最適な戦術行動を創出する今後は,本研究によって得られた知見を個人戦術の指導およびチーム戦術の指導に応用していく
造血幹細胞への遺伝子導入マウスモデルの開発

多能性かつ自己複製能のある造血幹細胞にin vivoで遺伝子導入できれば、正常造血を模倣した形で特定の遺伝子の機能を探ることができる。本研究で、我々は麻疹ウイルスのSLAM分子指向性をもつ組換えレンチウイルスを作製し、造血幹細胞を標的とした新規in vivo遺伝子導入システムの確立を試みた。本年度は、麻疹ウイルス蛋白をもつレンチウイルスの作成、ヒト骨髄造血細胞のSLAM蛋白発現について検討した(1)麻疹ウイルスH蛋白およびF蛋白をもつレンチウイルスの作製ウイルスをいかにして高いタイターで回収することができるかが、in vivo遺伝子導入を目的とするこのプロジェクトの最重要課題である。我々は、293f細胞をパッケージング細胞として用い、通常エンベロープ蛋白として用いられるVSV-G蛋白の代わりに、麻疹ウイルスH蛋白およびF蛋白(柳雄介研究室より供与)をレンチウイルスベクターコンポーネント発現ベクターとともにトランスフェクションした。こうして細胞上清中に、麻疹ウイルスのH蛋白およびF蛋白で被包されたレンチウイルスの回収を試みたが、現時点では高いタイターでの回収はできておらず、今後さらなるトランスフェクション条件の至適化が必要である。(2)ヒト骨髄造血細胞のSLAM蛋白発現我々は麻疹蛋白発現レンチウイルスが感染しうるヒトSLAMが骨髄造血細胞のどのような集団に発現しているかについてフローサイトメトリーを用いて解析した。ヒトSLAMは骨髄中のCD34+CD38+Lin-造血前駆細胞の集団に高く発現していることが判明し、このSLAM陽性細胞集団がどのような造血ポテンシャルを持つかについてはさらに詳細に解析していく必要がある。本年度の研究は、麻疹ウイルスH蛋白およびF蛋白をもつレンチウイルスの作製とヒト造血細胞におけるSLAM発現の分布の解析を行った。(1)麻疹ウイルスH蛋白およびF蛋白をもつレンチウイルスの作製レンチウイルスベクターの高いウイルスタイターを得るために、麻疹ウイルスH蛋白およびF蛋白発現ベクターとレンチウイルスベクターコンポーネント発現ベクターのモル比を変えて調整をはかった。また、トランスフェクションにおける異なるリポフェクタミン法や異なるパッケージング細胞の使用についても検討した。しかしながら、現在までin vivoの実験にまで十分なタイターは得られておらず、今後さらなる条件設定が必要である。最近、SLAM発現にて純化したマウス造血幹細胞へレンチウイルスによる遺伝子導入が成功した報告があることより、ヒトSLAMノックインマウスを使用することにより、我々のウイルスベクターの造血幹細胞選択的なin vivo導入は十分可能と予想される。(2)ヒト造血細胞におけるSLAM発現の分布の解析ヒト造血細胞の一部にSLAM陽性を認めたためにそれらの細胞集団の純化を試みたが、造血幹細胞と特定できなかつた。この結果は、造血幹細胞におけるSLAM発現パターンがマウスとヒトでは大きく異なるという最近の報告に一致する。以上より、我々のSLAM分子を介した造血幹細胞選択的な遺伝子導入の系は、現時点ではヒトでは使用困難が示唆される。
ヒトの舌下神経と舌神経の交通枝に関する基礎的研究

1.緒方重光:舌下神経と舌神経の交通枝を実体顕微鏡下で観察し,交通枝の形態分類を行った。舌下神経と舌神経の交通枝は,通常容易に観察される舌骨舌筋の前部筋束上以外に,オトガイ舌筋中の舌中部と舌尖部の計3箇所で確認された。また左右側の両神経の交通枝は,舌体部では舌中隔に阻まれて存在しないが,舌尖部の舌中隔が途切れる辺りに見られた。両神経の交通は,さらに末梢側の舌中部と舌尖部でも観察された。特に舌尖部では舌神経と舌下神経が神経叢とも言えるほど複雑な網の目をつくっている。また,舌下神経は基本的に舌筋の運動を支配する純運動性の神経とされているが,舌神経と交通することによって,いくらかの知覚線維も含んでいると考えられる。舌神経は,舌内では本幹から78本の細枝が分かれており,それらが網目状に多数のループを形成しながら舌背に分布していた。特に舌尖部では神経線維の蛇行が強く複雑に分岐していることが解明できた。2.田松裕一:舌筋と関連の深い舌骨の構造解析のために,極微小焦点X線断層撮影装置(マイクロCT)を用いて撮影した。さらに3次元構築ソフト(SURF DRIVER)により神経の走行の3次元立体画像作成を行った。3.峰和治:舌の神経線維と周囲組織との識別を容易にするために簡易組織鍍銀法を施した。その材料を,実体顕微鏡下で観察しながら,舌下面より舌の外側部分から末梢側へと両神経の走行を舌尖部まで肉眼解剖的に観察した。その際に,実体顕微鏡による観察や神経解析を行った。1.緒方重光:ヒトについて,舌下神経と舌神経の交通枝に関する所見を採取した。結果として,舌下神経と舌神経の交通枝は,通常容易に観察される舌骨舌筋の前部筋束上以外に,オトガイ舌筋中の舌中部と舌尖部の計3箇所で確認された。特に舌尖部では神経線維の蛇行が強く複雑に分岐していた。以上について,さらに解析を進める予定である。2.田松裕一:舌筋と関連の深い舌骨の構造解析のために,極微小焦点X線断層撮影装置(マイクロCT)(東京歯科大学設置既存設備)を用いて撮影している。さらに3次元構築ソフトにより神経の走行の3次元立体画像作成を行っている。3.峰和治:成人の舌を用い,神経線維と周囲組織との識別を容易にするために材料にたいし簡易組織鍍銀法を施した。その際に,実体顕微鏡による観察やそれらの筋への神経解析を行っている。

舌下神経と舌神経の交通枝は,通常容易に観察される舌骨舌筋の前部筋束上以外に,オトガイ舌筋中の舌中部と舌尖部の計3箇所で確認された。また左右側の両神経の交通枝は,舌体部では舌中隔に阻まれて存在しないが,舌尖部の舌中隔が途切れる辺りに見られた。両神経の交通は,さらに末梢側の舌中部と舌尖部でも観察された。特に舌尖部では舌神経と舌下神経が神経叢とも言えるほど複雑な網の目をつくっている。また,舌下神経は基本的に舌筋の運動を支配する純運動性の神経とされているが,舌神経と交通することによって,いくらかの知覚線維も含んでいると考えられる。舌神経は,舌内では本幹から78本の細枝が分かれており,それらが網目状に多数のループを形成しながら舌背に分布していた。特に舌尖部では神経線維の蛇行が強く複雑に分岐していた。以上について,さらに解析を進める予定である。2.田松裕一:舌筋と関連の深い舌骨の構造解析のために,極微小焦点X線断層撮影装置(マイクロCT)を用いて撮影した。さらに3次元構築ソフト(SURF DRIVER)により神経の走行の3次元立体画像作成を行っている。3.峰和治:舌の神経線維と周囲組織との識別を容易にするために簡易組織鍍銀法を施した。その材料を,実体顕微鏡下で観察しながら,舌下面より舌の外側部分から末梢側へと両神経の走行を舌尖部まで肉眼解剖的に観察した。その際に,実体顕微鏡による観察や神経解析を行っている。1.緒方重光:舌下神経と舌神経の交通枝を実体顕微鏡下で観察し,交通枝の形態分類を行った。特に舌尖部では神経線維の蛇行が強く複雑に分岐していることが解明できた。さらに3次元構築ソフト(SURF DRIVER)により神経の走行の3次元立体画像作成を行った。その際に,実体顕微鏡による観察や神経解析を行った。
NB_2リンパ腫細胞を用いた生物学的活性からみた難治性プロラクチノ-マの病態研究

本研究の目的な難治性プロラクチン産生下垂体腺腫患者の髄液中プロラクチンが,生物学的活性を有するか,有するとすればheterogeneityが有るか否かを検討するものであり,特に本症患者の髄液プロラクチンの分子量的構成のなかの大分子型プロラクチンの生物活性について検討することであった。Bioassay系としてラットリンフォ-マ細胞(Nb_2リンパ腫細胞)を用いた。リンフォ-マ細胞10%ウシ胎児血清をFischer液に加えると37°C炭酸ガス培養器の中で,約20時間で倍増する速度で成長する。培養細胞を1%ウシ胎児血清加Fischer液に戻し増殖速度を緩除にした。1%ウマ血清加Fischer液に加え5×10^4個/mlの細胞濃度にして2mlずつ培養皿に分注し,72時間後の細胞増多を東亜送用製血球測定器で算定した。10pg/mlから1ng/mlの濃度のhPRL(NIAMDD)を添加し標準曲線を作成し,これをもとにプロラクチン産生下垂体腺腫患者のプロラクチンのsige heterogeneityを検討した。血清プロラクチンをゲル濾加し,このtube毎の濃度を測定し,RIAと比較した。RIAと同じ部位に1ケのピ-ク認め,little型と同定したが,大分子型すなわちbig型とbigーbig型の同定は不可能であった。今後は更に糖度を向上させ,大分子型プロラクチンが本当に生物活性を有しないのかrechromatographyを行ない検討する予定である。種々の治療によっても内分泌症状が改善しないプロラクチン産生下垂体腺腫のなかに、髄液プロラクチン値が異常高値を示す症例が存在することが知られるようになってきた。しかし髄液プロラクチンの生理作用については未だ解明されていない。私たちはこれまでにプロラクチン免疫活性をRIA法で、またレセプタ活性をRRA法で、血清と髄液プロラクチンのsize heterogemeityの面から検討してきたが、生物活性との差異が重要と考えられた。最近NB_2リンフォーマ細胞を用いたbioassay法が評価されており、この方法を用いてプロラクチンのsize hetergeneity、特に大分子型プロラクチンの生物活性を測定しようとした。NB_2ラットリンフォーマ細胞は国立小児病院小児医療センター田中敏章博士より提供を受けた。リンフォーマ細胞の培養にはFischer液を用いペニシリン・ストレプトマイシンを加えた。10%ウイ胎児血清をFischer液に加えると、37°C炭酸ガス培養器の中で、約20時間で倍となる速度で成長した。培養細胞を1%ウシ胎児血清に移すことにより増殖速度を緩やかにする。10%ウマ血清液に代え5×10^4細胞個/mlの細胞濃度にして2mlずつ培養皿にうえた。標準hPRL(NIAMDD)を0.01、0.1、1、10ng/mlの量を加え72時間目の細胞数をCoulter Counter(東亜医用F-300)で計数した。現在この標準hPRLを用いた標準曲線を求めているところである。本研究の目的は難治性プロラクチン産生下垂体腺腫患者の髄液中プロラクチンが、生物学的活性を有するか否かを検討するものである。これまでの申請者らの研究によれば、本症患者の髄液中プロラクチンには分子量的組成のなかで大分子型プロラクチンが多いことが示されたが、髄液プロラクチン、なかんずく大分子型プロラクチンの生物学的活性についての研究は少なかった。申請者らは国立小児病院内分泌研究室田中敏章博士により提供を受けたラット・リンフォ-マ細胞を用いてプロラクチンの生物学的活性を測定しようとした。リンフォ-マ細胞の培養の際用いる培養液はFischer液で、10%

ウシ胎児血清をFischer液に加えると37°C炭酸ガス培養器の中で、約20時間で倍増する速度で成長した。培養細胞を1%ウシ胎児血清加Fischer液に戻すと増殖速度を緩かにし得た。1%ウマ血清加Fischer液にかえ、5×10^4個/mlの細胞濃度にして2mlずつ培養皿に分注した。72時間後の細胞増多を東亜医用製血球測定器で算定した。当初hPRLの添加によっては安定した細胞増多が得られなかったため、同じlactogenic factorを有するhGHを用い、dose dependentの博遅曲線が得られるようになった。そこでhPRL(NIAMDD)を用いての実験を行うに安全性が得られたと判断した。hPRLを添加すると10pg/mlから1ng/mlの間で細胞増多が認められ、博遅曲線を描出し得るようになった。この博遅曲線を用いてプロラクチンの生物活性の測定を次年度に行なう予定である。プロラクチン産生下垂体腺腫(以下プロラクチノ-マ)のなかには,種々の治療に抵抗性を示す,いわゆる難治性プロラクチノ-マが存在することが多くの臨床例を経験するなかゝら指摘されるようになってきた。これら症例のなかで,髄液プロラクチン値が血清プロラクチン値に比し著しく高値を示す症例が存在し,特に麦角アルカロイドであるブロモクリプチン投与によっても髄液プロラクチン値は決して正常化しない。しかもこのような症例では臨床症状の改善が得られない。我々はこのような事象の解明に,まずプロラクチンのsige heterogeneityから追求することを目的に,RIAを用いてプロラクチノ-マ患者のプロラクチンのsize heterogeneityを測定し,血清と髄液では異なること,またブロモクリプチン投与後にはそのパタ-ンが変化することを示した。即ちブロモクリプチン投与後には投与前に比し,大分子型プロラクチンが増加した。更に髄液プロラクチンの生理,生物作用を知る事は重要と考え,RRA法を用いて生物活性を知ろうとした。RRAは種々の標品の検討し,ウシ卵巣が最も簡便,かつ高精度と判断した。これを用い,ゲル濾過した患者血清と髄液のRIA法,RRA法でのsize heterogeneityを検討した。その結果,血清ではbig型,bigーhig型の占有率が高く,髄液ではRIAとRRA法は同じ傾向を示した。この〓は血清PRLと髄液PRLでは,生物活性が異なることが推察された。PRLの生物活性を更に検討するためNb_2リンフォ-マ細胞を用いてbioassayを行なった。現在血清PRLのみの測定であるが,プロラクチノ-マ血清ではRIA法とbioassay法ではlittle型80%,big型18%bigーhig型か2%であった。今後はこれらの精度をより高めて髄液PRLについて検討を行なうことが必要である。
熱帯樹木の湛水ストレスに対する形態的および生化学的耐性機構の解明

本年度は,タイ南部の湿地周辺に自生するSyzygium属5種を主に実験材料とした。5種のうち,比較的非湿地環境に生育するS.grandeとS.pseudosubtilisは,湛水処理によって地上部の成長が抑制されたのに対し,より湿地環境に生育するS.oblatumとS.kunstleri,S.spicatumは,対照区と比べて成長が大きくなる傾向があった。いずれの樹種も湛水耐性をもっているが,その程度に違いがあり,それが分布域の違いに反映されていると推察された。またいずれの樹種でも,湛水処理に伴い通気組織に富む不定根を水面近くに発達させており,それらの根のエネルギー充足率が高く維持されされていることが明らかになった。また,主根の気相率を測定することによって通気組織の定量化を試みた。S.grandeは湛水の有無に関わらず気相率が低かったが,他の4樹種は湛水処理によって気相率が増加した。特にS.oblatumとS.kunstleriは湛水せずとも気相率が比較的高かった。さらに,湿地性樹種の,特に湛水処理開始後に発達した側根では,高いエネルギー充足率を維持していることが明らかになった。一方,湛水耐性の比較的低い樹種では,醗酵系を司るアルコール脱水素酵素の活性が湛水処理初期に高まることが明らかになった。非湿地性の樹種でも,一時的な短期間の湛水に対しては,不定根の発達や無気呼吸系が賦活化によって根系の機能を保てるが,湿地性の樹種では,さらに地中深くに発達させた根系での好気呼吸が確保されるため,より長期間の湛水に対して根系の機能を維持できると考えられる。湛水ストレス条件下での生育が観察されている熱帯性樹種Melaleuca cajuputi,Azadirachta excelsa,Syzygium grandis,Paraserianthes falcatariaの種子をタイ南部より入手した。実生苗を環境制御温室内で成育させ,根系すべてを水中に没させる処理区と半分まで没させる処理区を設け,まったくストレスを与えない対照区との成長反応を比べた。3樹種とも湛水処理により樹高成長が抑制されたが,部位別の乾重を測定したところ,A.excelsaは湛水条件下でより少ない根で地上部の成長を維持していることが示された。半湛水区の成長を見ると,湛水部分の根系の発達は抑えられるが,湛水面より上部で根系の発達が捉され,対照区と同程度かそれ以上の地上部成長を可能にしていた。A,excelsaとS.grandisについては葉の気孔コンダクタンスを測定したところ,湛水区では根からの水分供給が妨げられていることが示唆された。根のエネルギー状態を調べたところ,3樹種とも湛水後1日でエネルギー充足率が低下し,1週間経っても回復しなかった。根のエネルギー状態の悪化が養水分の吸収を妨げる一因となっていることを示唆している。また湛水区の水面付近に新たな根を発達させていることが観察された。現在,これらの根のエネルギー状態を測定すると共に,その解剖学的特徴を調べている。S.grandisの近縁種で,より湛水耐性の高いと思われる樹種の種子を入手できたので,これらについても来年度に同様の試験をおこない,湛水ストレスに対する耐性機構を明らかにしていく。
アミロイド形成防止による実験的治療実験

家族性アミロイドポリニューロパシーは常染色体優性遺伝病であり、異型トランスサイレチン分子が全身にアミロイドとして沈着する疾患である。アミロイドの沈着に到るには、4量体であるトランスサイレチン分子の解離、修飾、凝集、アミロイド形成、血清アミロイドP成分の付着のステップが考えられている。これらのステップの重要性を検討するため、マウスのトランスサイレチン遺伝子は破壊しつつ、ヒト遺伝子を自在に挿入できる可変マウスの作製を試みた。そのため、我々が開発した変異型lox71を含む相同組換えベクター、ジフテリア毒素フラッグメントA遺伝子-ヒトTTRの第1エクソンの一部も含む上流約2.6kbの配列-lox71-PGKneo-loxP-polyA-lox2272-第1エクソンの後半も含み第1イントロン約7.9kbを構築した。この相同組換えベクターをES細胞に導入し、相同組換えクローンを単離し、キメラマウスを作製した。一方、腸内細菌叢のアミロイド沈着への影響を解析したところ、コンベンショナルな腸内細菌叢では、共生菌が減少し、逆に弱毒病原微生物が増加し、腸管にアミロイドが沈着すること、好中球の浸潤が著しいことが分かった。また、10番日のCysが、分子間でS-S結合を行なうことが、単量体の凝集に重要で、それが引き金となり、アミロイド形成が開始するといわれている。このことを明らかにするため、10番日のCysをSerに置換し、かつ30番目がMetという遺伝子を構築し、トランスジェニックマウスを作製した。これらのマウスを解析したところ、アミロイド沈着が観察されなかった。よって、10番日のCysが、アミロイド沈着にとって重要なかぎを握ることが分かった。さらに、SAPの除去剤をヒトSAPトランスジェニックマウスに投与したところ、血中およびアミロイド部位からSAPが速やかに減少することが明らかとなった。家族性アミロイドポリニューロパシーは常染色体優性遺伝病であり、異型トランスサイレチン分子が全身にアミロイドとして沈着し末消・自立神経障害を引き起こす疾患である。アミロイドの沈着に到るには、4量体であるトランスサイレチン分子の解離、凝集、アミロイド形成の3つのステップが考えられている。従って4量体の解離を阻止することにより、結果的にアミロイド形成も阻止できると考えられている。非常に興味あることに、119番目のThrのMetへの変異(Thr119Met)では、例えば30番目のValがMetに置換した変異(Val30Met)とのコンパウンドヘテロ接合体になると、むしろ4量体が安定し、アミロイド沈着もあまり観察されないと報告されている。そこで、マウスのトランスサイレチン遺伝子は破壊しつつ、ヒト遺伝子自在に挿入するため、我々が開発した変異型lox71を含む相同組換えベクターを構築した。非常に複雑な構造であり、左端から、ジフテリア毒素フラッグメントA遺伝子ーヒトTTRの第1エクソンの一部も含む上流約2.6kbの配列ーlox71ーPGKneoーloxPーpolyAーlox2272ー第1エクソンの後半も含み第1イントロン約7.9kbである。翻訳開始点は、第1エクソンの後半にあるので、このベクターが挿入されることにより、マウス遺伝子は完全に破壊されることとなる。また、lox71とlox2272間のDNAは、別にlox66ー挿入したい遺伝子ーlox2272を含むプラスミドを準備し、これをCreの発想ベクターとともにES細胞に導入することで、効率良く置換できることを明らかにした。

家族性アミロイドポリニューロパシーは常染色体優性遺伝病であり、異型トランスサイレチン分子が全身にアミロイドとして沈着し末梢・自立神経障害を引き起こす疾患である。アミロイドの沈着に到るには、4量体であるトランスサイレチン分子の解離、凝集、アミロイド形成の3つのステップが考えられている。従って4量体の解離を阻止することにより、結果的にアミロイド形成も阻止できると考えられている。非常に興味あることに、119番目のThrのMetへの変異(Thr119Met)では、例えば30番目のValがMetに置換した変異(Val30Met)とのコンパウンドヘテロ接合体になると、むしろ4量体が安定し、アミロイド沈着もあまり観察されないと報告されている。そこで、マウスのトランスサイレチン遺伝子は破壊しつつ、ヒト遺伝子自在に挿入するため、我々が開発した変異型Iox71を含む相同組換えベクターを構築した。非常に複雑な構造であり、左端から、ジフテリア毒素フラッグメントA遺伝子-ヒトTTRの第1エクソンの一部も含む上流約2.6kbの配列-Iox71-PGKneo-IoxP-polyA-Iox2272-第1エクソンの後半も含み第1イントロン約7.9kbである。翻訳開始点は、第1エクソンの後半にあるので、このベクターが挿入されることにより、マウス遺伝子は完全に破壊されることとなる。構造が複雑で、クローニングがかなり困難を伴うものであった。現在、この相同組換えベクターをES細胞に導入し、相同組換えクローンの単離を試みているところである。また、腸内細菌叢による腸内環境が、腸におけるアミロイド沈着に影響を与えることが示唆された。血清アミロイドP成分の除去剤の開発に成功した。家族性アミロイドポリニューロパシーは常染色体優性遺伝病であり、異型トランスサイレチン分子が全身にアミロイドとして沈着し末消・自立神経障害を引き起こす疾患である。そこで、マウスのトランスサイレチン遺伝子は破壊しつつ、ヒト遺伝子自在に挿入するため、我々が開発した変異型lox71を含む相同組換えベクターを構築した。非常に複雑な構造であり、左端から、ジフテリア毒素フラッグメントA遺伝子-ヒトTTRの第1エクソンの一部も含む上流約2.6kbの配列-lox71-PGKneo-loxP-polyA-lox2272-第1エクソンの後半も含み第1イントロン約7.9kbである。現在、この相同組換えベクターをES細胞に導入し、相同組換えクローンを単離し、キメラマウスを作製したところである。一方、10番目のCysが、分子間でS-S結合を行なうことが、単量体の凝集に重要で、それが引き金となり、アミロイド形成が開始するといわれている。
超高速シーケンシング法による三日熱マラリア原虫近縁サルマラリア原虫のゲノム解読

三日熱マラリア原虫は系統的には旧世界サルマラリア原虫に近縁であるが、ヒトにのみ寄生する。この原虫の宿主転換・ヒト寄生化に関わる遺伝的基盤の解明のため、サルマラリア原虫Plasmodium cynomolgiのゲノムを解読し、比較ゲノム解析を行った。その結果、約1割の遺伝子が種特異的で、それらは多重遺伝子族に属していた。興味あることに、原虫の宿主赤血球への侵入に関与する分子であるDBP及びRBPの遺伝子の数が種間で異なっていた。1.三日熱マラリア原虫(Plasmodium vivax)によって引き起こされる三日熱マラリアは、世界で毎年約8千万人が感染している。原虫の培養法が未確立なこともありP.vivaxの研究は遅れている。本研究ではP.vivaxに系統進化的に最も近縁なマカクサルマラリア原虫P.cynomolgiのゲノムを超高速シーケンシング法により解読し、ゲノム比較から、P.vivaxゲノムに独自な特徴、ヒト寄生化の遺伝的基盤を解明することを目指している。2. P. vivaxがマカクサルに感染しないかどうかを調べた。P. vivax Sal-II株の凍結原虫を脾摘ニホンザル(Macaca fuscata)、カニクイザル(M. fasculata)に静注し、感染の成立をPCR診断で見たところ、感染が認められなかった。3.ニホンザル(M. fuscata)にP. cynomolgi B株を感染させることに成功し、感染サルから原虫を得た。原虫ゲノムDNAを調製し、超高速シーケンシングシステム(GS FLX法)によって平均リード長250塩基、総塩基107Mb、冗長度約3.7倍、ゲノムの約8割をカバーするシーケンスを得た。4.得られたリード群を阪大微研ゲノム情報解析分野の並列ワークステーションを使用してコンティグを作成し、P. vivax, P. knowlesiのゲノム情報を参照にP. cynomolgiのゲノム地図を作成した。5.リードはP. vivax, P. knowlesiの遺伝子の大部分(約5千個)にマッピングできた。しかし、抗原変異に関与すると考えられているpir遺伝子群(P. vivaxのvir, P. knowlesiのSICAvar, kir)やPv-fam遺伝子群など、多重遺伝子族ではマップされていな箇所もあり、種間における遺伝子の欠失・挿入が示唆された。【目的】三日熱マラリア原虫(Plasmodium vivax)によって引き起こされる三日熱マラリアは、世界で毎年約8千万人が感染している。本研究ではP. vivaxと系統進化的に最も近縁な旧世界サルマラリア原虫P. cynomolgiのゲノムを超高速シーケンシング法により解読し、比較ゲノム解析から、P. vivaxゲノムに特徴的なゲノム変化を解明し、ヒト寄生化の遺伝的基盤を探ることを目的としている。【結果】1.昨年に続き、P. vivaxがマカクサルに感染するかどうか調べた。P. vivax6株の凍結原虫を脾摘ニホンザル(Macaca fuscata)、カニクイザル(M. fasculata)に静注し、感染の成立をPCR診断で見た。結果、感染は認められなかった。また、サルの赤血球Duffy抗原の抗体反応性も調べた。2.昨年度得た次世代シーケンサーFLXによるリード群を各種プログラムを使用して結合し、コンティグ群を作成した。同時にフォスミドライブラリーの作成、及び、PCRによってコンティグ群を結合し、15本の長大スカホールドの作成に成功し、予想ゲノムの約80%以上を構築した。3.別の次世代シーケンサーであるイルミナGAIIによってもシーケンシングを実施し、平均リード長75bp、5000万リードのシーケンスを得た。これによってFLXによるシーケンスエラーの修正が可能となった。4. 2008年10月に発表されてたP. vivax及び、P. knowlesiのゲノム情報と本研究で得たP. cynomolgiのゲノム情報を用いて比較ゲノム解析を行い、3種のマラリア原虫に共通する遺伝子、種固有な遺伝子を分類した。種固有な遺伝子には多重遺伝子族が約9割含まれることが明らかとなった。なかでもマラリア原虫の赤血球結合に関与するDuffy結合タンパク遺伝子の数がP. vivax, P. cynomlgi, P. knowlesiでそれぞれ1個、2個、2-3個と違っていることが判明した。【目的】三日熱マラリア原虫Plasmodium vivaxは系統的にはアジアの旧世界サルマラリア原虫に近縁で、宿主転換によってサルからヒトの寄生虫になったというユニークな進化的背景を持つ。この宿主転換にはゲノム変化が関与していると考えられる。従って、P.vivaxに特異的なゲノム変化を同定すれば、ヒト寄生の分子基盤の解明につながる。