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近世期における王朝物語享受ネットワークについての研究

本研究では、近世において王朝物語がいかに読まれたか、特に校合や付注といった研究的態度をもって享受された様相について、人的ネットワークの観点から考究した。中でも中世から近世、近世から近代(明治)という時代の過渡期における具体相に注目し、前者については里村紹巴によって三条西家の注が近世へ、また後者については物語目録作成者(本研究では特に黒川春村に注目した)によって和学者たちの研究が近代(明治)へ、それぞれ受け継がれる様相の一端を解明した。本研究は、近世期の王朝物語享受について、(1)中世末期から近世初期の連歌師とその周辺、(2)近世末期の物語目録作成者とその周辺、という大きく2つの軸を設けて検討を行なっている。本年度は、(1)に関連して里村紹巴についての調査研究と、(2)に関する文献資料の調査収集を中心に活動した。まず(1)については、『源氏物語抄(紹巴抄)』を中心に検討を進めた。特に古活字本その他の奥書に名の見える三条西公条との関わりを、本文中の表現を手がかりに、公条の注釈書類と公条以後の注釈書類とを見合わせつつ検証した。その結果、紹巴は公条による複数の注釈体系を入手し『紹巴抄』に投影していることが明らかとなった。またそれに付随して、公条が従来知られているものとは別の注釈体系も有していた可能性と、その体系は『岷江入楚』や『山下水』といったいわゆる三条西家直流の注釈書類には反映されず、『紹巴抄』や『湖月抄』の「師説」等にその痕跡を留めているらしいこととが見えてきた。この問題については、国際会議(12th International Conference of the EAJS)および国内学会(広島大学国語国文学会平成20年度研究集会)にて報告を行なった。その後の調査結果も含め、次年度に論文化する予定である。(2)については、無窮会神習文庫蔵『風葉集類字抄』をはじめとする『風葉和歌集』およびその周辺資料、同文庫蔵『楽前日記』をはじめとする和学者たち(主として物語目録作成者)に関連する日記類を中心に、実見調査ならびに文献複写を行なった。『風葉集』は近世期においても物語研究の重要資料として用いられていたようであるが、その所有あるいは貸借、活用の実態はあまり解明されていない。しかし調査の結果、『風葉集類字抄』は、『風葉集』そのものを検討対象とした数少ない享受資料のひとつであること、『風につれなき』『八重葎』を書写したことで知られる会田安昌が書き入れを行なっていることがわかった。当時の『風葉集』享受の具体相を知る好資料と考えられるため、その他の『風葉集』伝本および和学者関連資料と併せ、今後さらに検討を進めることとしたい。本年度は、中世から近世、近世から近代という、それぞれ時代の過渡期において王朝物語がいかに受容され、研究成果や学問あるいはその基盤がいかに受け継がれ、展開したかという問題を重点的に扱った。まず中世から近世については、『源氏物語』をベースに、源氏学とそこに分かちがたく存在した有職学に的を絞って検討した。具体的には、宮内庁書陵部所蔵『源語装束抄并肖柏問答抄』を起点として検討を行い、一条兼良の源氏学が、後継者たちによって書名のとおり「装束」という側面に特化した形で受容された結果、近世においても有職家たちに受容されたことを明らかにした。また同じく中世から近世にかけての源氏学の展開について、『紹巴抄』に関する考察結果を論考化した。次に近世から近代については、黒川春村の『古物語類字鈔』を中心に検証した。『古物語類字鈔』が作成された背景には、江戸末期に和学者たちの間で物語を総合的に扱い考察する機運が高まったことが認められる。一方、『古物語類字鈔』は明治期において近代の国文学者たちにも大いに参照され、そのことが現代における『古物語類字鈔』利用にも繋がっていると思しい。このように『古物語類字鈔』が明治期に用いられたのは、春村が和学講談所に属していたこと、当時の同僚たちならびに黒川家の後続たちが明治期の国文学研究を担う立場にあったことが少なからず影響していることを明らかにした。この問題については、来年度論考化していくこととしたい。
会話エージェント研究共有プラットフォームの構築と利用技術の研究

本研究の目的は,高度な会話エージェントシステム開発のためのさまざまなチャレンジが円滑にできるようにするための研究基盤と方法論を確立することである.研究成果は,会話エージェントシステム構築用プラットフォーム,コンポーネント技術,没入型WOZを用いた会話エージェントシステム開発環境,会話コーパスに基づく会話行動モデル開発方法論の開発,コンテンツ制作支援システム,評価手法の8項目から構成される包括的なものである。人にやさしく,人に自然なインタフェースが求められる情報サービスにおいて実用に資する会話エージェントシステムを開発するためには,人々が日常的に行っている非常に広範で多様なコミュニケーション機能を実現する必要がある.会話エージェントシステムは,多数のコンポーネントを含んだ複雑なソフトウェアであるので,個人または小さな研究グループが本格研究に参入することは困難であった.この問題を解決するために,本研究では,次の5項目からなる取り組みを行う.(1)プログラミング環境としてのGECAプラットフォームの確立,(2)GECA上にECAを構築するために必要となる標準コンポーネントセットの開発,(3)コーパスに基づくECA行動モデルの研究開発,(4)ECA評価尺度の構成と実運用による実証実験,(5)標準化への発信を行なうことにより,実証研究用会話エージェントプラットフォームとして確立する.第1期は,GECAプラットフォーム開発,コンポーネント最小セット開発,会話コーパスづくり,評価手法開発を行う.第2期は,GECAプラットフォームの性能改良,コンポーネントの高度化,ECA開発支援環境の構築,コミュニケーションモデル自律構築方式の実現,統合評価方式の構築を行う.最終年は,成果を取りまとめる.本研究の目的は,高度な会話エージェントシステム開発のためのさまざまなチャレンジが円滑にできるようにするための研究基盤と方法論を確立することである.研究成果は,会話エージェントシステム構築用プラットフォーム,コンポーネント技術,没入型WOZを用いた会話エージェントシステム開発環境,会話コーパスに基づく会話行動モデル開発方法論の開発,コンテンツ制作支援システム,評価手法の8項目から構成される包括的なものである。会話エージェントシステム汎用プラットフォームGECAの基本的な枠組みの開発,会話エージェント行動モデルの構築,予備的検討を行った.GECA上では,並列分散環境で異種OS上で作られた部品が協調する.会話エージェントの行動スクリプト記述用言語(GSML)を開発した.頭部追跡,モーションキャプチャ入力,音声合成,シナリオ処理などのGECA用コンポーネントを開発した.ユーザ発話のタイミングの分析を行った.類義関係にある語の柔軟なマッチング,用言スキーマの研究,文語口語変換について研究を行い,知見を得た.会話におけるマルチモーダルインタラクションを記録・分析するための環境を構築し,計測データからの抽象的なインデクス抽出法について検討した.Wizard-of-Oz法を用いた会話エージェント対ユーザの対話収集実験により得られた頭部姿勢の計測データと発話音声を分析し,注視遷移パターンと会話参加態度の間の相関関係を見出した.アウグスブルグ大学と共同で,異文化コミュニケーションのコーパスを構築し,分析を行い,いくつかの興味深い知見を得た.会話モデルをベイジアンネットワークを用いて構築した.ザグレブ大学のグループと共同で,GECAを用いた多人数会話システムをeNTERFACE'08に共同提案し採択された.GECAを用いて開発したクイズエージェントシステムを2007年度につづき,2008年度の食品総合研究所の一般公開で展示する準備を進めた.研究協力者の黄が会話エージェントの行動記述標準化を行っているBMLの会合に参加し,動向調査を行った.非言語コンポーネント,音声コンポーネント技術,言語コンポーネント技術,コーパスからの会話モデル合成,会話エージェント評価,システム化・標準モデル,協力研究機関でのGECA実証評価を行った.これにより次の成果を得た.(1)GECAを用いて,エージェントと会話している多人数ユーザの状態をセンスし,自然なコミュニケーション機能をもつ,気配りのできるといった印象をユーザに与えられるようにした.(2)人間どうしの自然な音声会話を収録して,あいづちや視線などのパラ言語・非言語情報に着目した分析を行い,新規な知見を得た.(3)WWWに由来する16億文の日本語コーパスから得られる統計量に基づいて,文体や文末機能を評価するための定量尺度を構成した.機能的形態素のユニグラムモデルを用いた文生成確率を基準として,大規模なテキストコーパスから特定の文体に属する文を自動抽出する方法を開発した.文末表現の性質や文体の性質を機能的形態素との共起統計量を用いた特徴ベクトルの形で記述する方式を開発した.(4)様々なマルチモーダル入力に適用できる会話管理機構を構築するために,IS(Information State)の処理機構をカスタマイズする方式を実現した.(5)会話を収録し,指差し,視線,発話について非言語的なインタラクションの時間構造を抽出する手法を開発した.(6)GNAT(Go/No-go Association Task)を組み合わせて会話エージェントを評価する方法を開発した.(7)GECAを用いて,機器操作法をユーザの非言語行動に応じてインタラクティブに説明する会話エージェントシステムを試作した.(8)食品安全に関する喚起や研究成果の情報を発信するために食品総合研究所が開催している一般公開において来訪者が実際に体験できるオンサイトの食品安全クイズエージェントを展示した.GECAシステムに言語処理システムSynGraphをGECAシステムに追加する作業を進めた.GECAを用いた複数ユーザインタラクション機能の改良,SKGを用いたコンテンツ供給機能との接続を行った.GECAを用いてインタラクティブに機器操作説明を行う会話エージェントシステムを試作した.人間どうしの自然な音声会話において,聞き手が興味を示しているあいづちの形態的・韻律的パターンを同定し,会話音声からあいづちを自動検出する方法について研究を行った.WWW

コーパスの機械解析結果から計算される文要素関の共起尺度を観測変数として用い,変数間の相関を因子分析モデルによって分析した.CEBEと呼ぶ没入型WOZ環境の開発を進めた.現実空間をコンテンツ化するため,全方位カメラを用いて撮影した実空間を元に仮想空間を簡便に構築するシステムを開発した.3人会話データから特徴的な会話プロトコルの抽出を試みた.多人数会話エージェントの開発に向けた基礎データの収集と分析を行い,会話状況を検知できることを示した.社会的関係を特徴づけるパラメータを提案し,文化,社会的関係,そして非言語行動との相互関係を表現するモデルを構築した.人間の会話行動推定モデルを統合し,多人数会話における対話制御方式の提案と実装を行った.非言語的なインタラクション系列の模倣学習.教師なし学習と教師あり学習を組み合わせて,非言語的なインタラクションの模倣学習を実現するための基本アルゴリズムを構成した.会話エージェントとのインタラクションの自然さの指標作成.信号処理をもちいて生理指標からストレスの度合いを計測することにより,インタラクションの自然さを評価するシステムを構築した.エージェントによる場の盛り上がりと個人の盛り上がりの自動判別手法を実装した.(1)GECAプラットフォームのメンテナンスを行った.没入型協調的インタラクション環境内での複数エージェントとの言語・非言語の統合的インタラクションを可能にした.(2)音声認識エンジンJulius,自然言語解析パーザKNP,及び音声合成ソフトをモジュール間通信で結合した音声対話エンジンを実現した.音声認識エンジンの残響抑圧及び雑音抑圧のパラメータを最適化する方法を考案し,有効性を検証した.あいづちの音韻的・韻律的パターン同定,会話音声からのあいづち自動検出法の評価を行った.(3)マルチモーダルインタラクションの収集と分析,複数人ユーザ対応型会話エージェントにおける受話者推定機構を開発した.国語辞典の定義文からの語彙知識獲得,事典に現れる名詞句の自動分割を行なった.教師なし学習を用いた非言語行動モデルの推定とエージェントの行動生成手法を開発した.(4)通常の写真から,屋外の広い空間を,奥行き情報付きで没入型環境へ投影できる仮想空間構築システムを開発した.クラスタリング手法を適用して,ユーザの知識構造の再構築や目的の知識の円滑な閲覧を助けるシステムを実装した.書き言葉からの話し言葉変換プログラムの整理を行った.Web上のニュース記事やWikipediaなどを知識源として,ユーザとシステムが雑談する雑談対話システムを構築した.ユーザの選好構造の対話的な形成手法を開発した.
急性期病院における高齢患者に対する身体拘束適正化に向けた包括的ケアプロトコル開発

本研究の目的は、一般病院での身体拘束の適正使用に向けて必要となる高齢者と家族に対するケア方法を明らかにすることである。調査2として、一般病院において、高齢患者とその家族に対して身体拘束実施時にどのようなケアを行っているかを明らかにすることとした。対象は、250床以上の一般急性期病院1000施設、1病院あたり各病棟1名ずつ計2名に依頼し、看護師2000名とした。調査期間は2019年2月3月とした。方法は、無記名自記式質問紙調査法とし、内容は、属性、身体拘束の実施状況、身体拘束開始時・実施時のケア(事故予防や二次障害のケア等)、身体拘束の解除に向けた取り組み状況とした。その結果、回収数は592(回収率29.6%)、このうち所属病棟は、外科系28.5%、内科系34.1%、混合病棟27.7%であった。この中で身体拘束が行われるという回答は98.5%であった。身体拘束中にいつも実施しているケアで最も多かったのは、「皮膚損傷の有無についての観察」であった。また、身体拘束実施中の高齢患者に対して行われているケアで最も多かったのは、「センサー類などの機器を使用して患者の動きを把握している」であった。二次障害の予防ケアは9割以上の病棟で実施されており、いつも実施しているケアで最も多かったのは、「皮膚損傷の有無についての観察」であった。結果から、多くの病棟で事故予防と併行して身体拘束の解除に向けた取り組みを多角的に行っていることが明らかになった。質問紙ならびに面接調査の倫理審査に時間を要したため、面接調査の実施が遅れている。また、調査の実施が遅れたことで研究2の専門家会議の開始もやや遅れている。調査2の実態調査に詳細かつ具体的なケア内容の把握ならびに探索が必要となったため、今年度中に追加した面接調査を実施する。また、研究2として、様々な形態の専門家会議を数回開催し、得られたデータを基に身体拘束の適正化に向けた包括的なケアプロトコルを検討していく予定である。本研究は、急性期病院で高齢者に行われる身体拘束の適正化を目指し、高齢者だけでなく家族も含めた包括的なケアプロトコルの開発を目的とする。今年度は調査1として、急性期病院で高齢者に行われている身体拘束の適正なケア方法、特に家族ケアに関する適正かつよりよいケア方法を探索することとした。対象は、老人看護専門看護師10名とし、急性期病院における高齢者の身体拘束前ならびに身体拘束中における家族への説明やケア、看護師からみた家族の身体拘束への認識などについてヒアリングを行った。その結果、身体拘束時における家族ケアは、身体拘束の承諾を得る際の説明、面会時の身体拘束解除の対応が行われていた。しかし、家族ケアを意識して行っているところは多くはなく、決まり事として実施されていることが多かった。家族の身体拘束への認識においては、特に身体拘束の実施に抵抗がないようにみえる家族もおり、家族から身体拘束を希望する事例も多いことが明らかになった。また、対象者が家族側になって感じた身体拘束の認識については、身体拘束に関することを言える雰囲気がなかった経験も語られた。身体拘束の解除への取り組みについては、主治医や管理者の力が大きく、同じ病院の中でも病棟により、取り組みの差があると感じていた。今後は、ヒアリング調査の結果から明らかになった家族への説明やケア方法を基に更に調査を行い、急性期病院における身体拘束時の適正なケア方法を明らかにしていきたい。調査1は終了し、調査2である急性期病院で高齢者に行われる身体拘束時の適正なケア方法に関する質問紙調査の準備を行っている。現在、調査1の結果を基に調査2で使用する質問紙の構成を検討している段階で倫理審査の申請が遅れている。しかし、平成30年度内には、調査を実施、分析まで行い、次年度に実施する研究2への示唆を得る予定である。

結果から、多くの病棟で事故予防と併行して身体拘束の解除に向けた取り組みを多角的に行っていることが明らかになった。質問紙ならびに面接調査の倫理審査に時間を要したため、面接調査の実施が遅れている。また、調査の実施が遅れたことで研究2の専門家会議の開始もやや遅れている。調査1のヒアリング調査から抽出した内容を反映させた質問紙調査を行う予定である。予定していた時期からは少し進捗が遅れるが、今年度中の実施を目指し、現在、質問紙の構成内容を検討している。今後は、全国調査から急性期病院で行われる身体拘束の代替ケアや家族ケアの実施状況や内容だけではなく、プロトコルの実施可能性につながる形を明らかにしていく予定である。調査2の実態調査に詳細かつ具体的なケア内容の把握ならびに探索が必要となったため、今年度中に追加した面接調査を実施する。また、研究2として、様々な形態の専門家会議を数回開催し、得られたデータを基に身体拘束の適正化に向けた包括的なケアプロトコルを検討していく予定である。調査1のヒアリング調査の調整が遅れたため、次年度使用額が生じた。しかし、ヒアリング調査が実施できたため、今後は、調査2の質問紙調査の郵送費や印刷費、データ入力等の業務委託費、調査に関する消耗品費での支出を予定している。また、臨床における実施可能性の高いプロトコルを作成するため、老人看護専門看護師や老人看護の専門家を集めて意見交換を主とした専門家会議を定期的に行うための会議費や交通費で使用していく予定である。面接調査の調整・実施が遅れていること、それに伴い、研究2の専門家会議の開催が遅れているために次年度使用額が生じた。使用計画としては、面接調査において、調査のための交通費、テープ起こし等の業者委託費や人件費、消耗品、郵送費での使用、研究2で予定している老人看護専門看護師や老年看護の専門家による定期的な専門家会議の開催での会議費や参加者の交通費、学会参加のための出張費で使用していく予定である。
電荷注入された量子スピン鎖におけるスピン-電荷ダイナミクスの研究

本研究課題は電荷が導入された一次元量子スピン系であるNd2-xCaxBaNiO5の良質な単結晶を育成し、一次元ハルデン系におけるスピン励起状態および電荷(ホール)のスピン-ホールダイナミクスを観測することを目的とした。本研究では三種類の異なるホール濃度の試料について単結晶育成をおこない、中性子非弾性散乱実験を実施した。ハルデン鎖の明瞭な励起状態の全体像を観測することに成功。またホールドープ状態での運動状態も明確に観測し、ハルデンギャップ内に新たな動的構造が出現すること、その構造の電荷濃度依存性を測定し、これは高温超伝導(二次元)で実現するホールのダイナミクスと酷似していることが明らかになった。本課題は無機物質でハルデンギャップを有するNd2BaNiO5のNd3+イオンの一部をCa2+で置換することにより、Ni一次元ハルデン鎖にホールを導入し、量子スピン鎖中におけるホールの運動状態を明らかにすることを目的としている。Nd2BaNiO5は無機化合物の特性である元素置換が比較的容易にできる系で、系統的なCa置換をおこなった試料の単結晶育成を行い、中性子散乱を用いて量子スピン鎖とホール導入による励起状態の研究を行う。今年度は(Nd1-xCax)2BaNiO5でCaドープ量x=0.035と0.1についての中性子非弾性散乱を行った。実験はJ-PARCの物質生命科学実験施設、高分解能チョッパー分光器を用いた。パルス中性子の利点を生かし、一度の測定でエネルギー-運動量空間における励起状態のマッピングを観測した。ブリルアンゾーン全域に亘って100 meVまでの全体像を捉えることに成功した。量子一次元鎖によるスピン揺動は10 meV近傍にスピンギャップ(ハルデンギャップ)を有し、ゾーン境界では60 meVの分散を示す。一方、20 meVと40 meV近傍には分散を示さないフラットな励起が観測された。これはNdイオンの結晶場励起と考えられる。またスピンギャップより低いエネルギー領域においても、ホール導入に伴う特徴的な励起が観測された。高温で非常に大きな揺らぎを示していたゾーン中心付近のスペクトルは三次元秩序が発達する温度(ネール点に相当)ではっきりとした励起スペクトルを示し、ギャップ内に状態を示す。ネール点以下の温度領域では4 meV付近にフラットなモードが突然出現する。本研究課題では電荷導入された一次元量子スピン系(Nd2-xCaxBaNiO5)における電荷ダイナミクスの観測と量子スピン鎖に与える効果の研究を目的としている。まず各電荷組成に対して良質かつ十分な量の単結晶育成とその評価を行った後、磁化率など熱力学的諸量の測定と中性子散乱を用いた電荷・スピンのダイナミクス測定を行う。当該年度は前年度までに得られた単結晶(電荷ドープ量x=0.035およびx=0.1)の中性子散乱実験とその解析を行った。パルス中性子の特長を最大限利用することによって、両組成とも一次元スピン鎖によると考えられるスピン分散関係がブリルアン領域全体に亘って観測された。ゾーン境界エネルギーは60meVで、電荷濃度依存性および温度依存性は見られなかった。このことからも観測された分散は量子スピン鎖由来の分散を示していることがわかる。一方、ゾーン中心近傍は大きな温度変化を示すことが明らかになった。磁気転移点より高温側では、本来電荷導入されていない系において摂動を受けない量子スピン鎖による寄与のみが期待される温度領域であるが、加えて電荷導入によると考えられる動的相関が観測された。ゾーン中心近傍のハルデンギャップ(10meV)以下の領域である。その組成依存性を現在詳しく解析中である。また、23meVおよび38meV付近にフラットで強い励起が観測された。これは端数依存や温度依存を示さないことから、Ndイオンの結晶場励起と考えている。さらに、最低温(10K)の測定では、およそ4meV付近に全く新しい励起が出現する。これについても現在解析を進めているところである。当初予定していた研究計画に照らし合わせて、全体としては概ね順調に進展している。しかしながら、度重なるJ-PARCの運転停止により予定していた中性子散乱実験はやや遅れ気味である。H28年度は早々に実験を予定しており、遅れを取り戻す。本研究課題では電荷導入された一次元量子スピン系であるNd2-xCaxBaNiO5における電荷(ホール)と一次元鎖(ハルデン鎖)について中性子非弾性散乱によりスピン-ホールダイナミクスを観測し、導入されたホールが量子スピン鎖に与える効果を明らかにすることを目的とする。当該年度はこれまでに行ったホール濃度x=0.035およびx=0.1に加えてx=0、すなわちホールの導入されていない系における非弾性散乱実験を実施した。まずFZ法により良質な単結晶を得ることに成功し、3つの単結晶の方位を揃えた状態で試料を用意した。中性子非弾性散乱実験はJ-PARCの高分解能チョッパー分光器(HRC)を利用した。これまでに観測されたハルデンギャップ近傍を詳細に調べるための入射中性子エネルギーEi=30 meVの測定および一次元スピン鎖の励起全体を観測出来るEi=100 meVでの測定を、またそれぞれのエネルギーについて詳細な温度依存性の測定を行った。データは現在解析中であるが、一次元鎖励起状態について、ゾーン境界近傍までの非常に明瞭な動的構造の全体像を観測することに成功した。

これはハルデン状態の磁気励起について完全な形で観測した初めての例である。また、ゾーン中心におけるスピンギャップの温度変化を観測し、反強磁性秩序が発達した状態にかけてそのギャップの変化の詳細をとらえることに成功した。これまでに報告した4 meVに観測された新しい励起についての温度変化も詳しく解析中である。当初予定していた研究計画に照らし合わせて解析とまとめがやや遅れ気味であるが、全体としては概ね順調に進展している。特に一年延長をした結果、今後の方策で述べるようにホール濃度のさらに濃い組成についての研究が行えるようになった。本研究課題は、電荷が導入された一次元量子スピン系であるNd2-xCaxBaNiO5の良質な単結晶を育成し、中性子非弾性散乱を用いて一次元ハルデン鎖におけるスピン励起状態および電荷(ホール)のスピン-ホールダイナミクスを観測することを目的とした。これにより、導入されたホールが量子スピン鎖に与える効果を明らかにする。これまでの先行研究で、Ni-O一次元鎖に対しておおよそx=0.2程度まで電荷導入できること、電荷導入に伴い抵抗率が3桁下がるが依然半導体的な振る舞いを示すことが知られている。磁気的にはx=0で反強磁性転移(TN=48K)を示すが、電荷導入に伴い転移点が10K(x=0.2)まで下がり、磁化にヒステリシス成分が現れることが報告されている。本研究ではホール濃度x=0、0.035および0.1について単結晶育成をおこなった。FZ法を用いた育成条件を詳細に検討することによって、中性子非弾性散乱実験可能な量(おおよそ1020グラム)の良質な単結晶を得ることに成功した。中性子非弾性散乱実験はJ-PARCの高分解能チョッパー分光器(HRC)を利用した。ハルデン鎖励起状態について、全ブリルアンゾーンにわたる非常に明瞭な動的構造の全体像を観測することに成功した。電荷導入によってゾーン境界でのエネルギーは変化しないことも明らかになった。最大の発見は電荷導入に伴い、ギャップ内に新たな動的構造(不整合構造)が出現すること、その構造の電荷濃度依存性を明らかにした。これは高温超伝導(二次元)で実現するホールのダイナミクスと酷似していることがわかった。本研究課題は電荷が導入された一次元量子スピン系であるNd2-xCaxBaNiO5の良質な単結晶を育成し、一次元ハルデン系におけるスピン励起状態および電荷(ホール)のスピン-ホールダイナミクスを観測することを目的とした。本研究では三種類の異なるホール濃度の試料について単結晶育成をおこない、中性子非弾性散乱実験を実施した。ハルデン鎖の明瞭な励起状態の全体像を観測することに成功。またホールドープ状態での運動状態も明確に観測し、ハルデンギャップ内に新たな動的構造が出現すること、その構造の電荷濃度依存性を測定し、これは高温超伝導(二次元)で実現するホールのダイナミクスと酷似していることが明らかになった。当初予定していた結晶育成、評価ならびに中性子散乱実験を遂行できた(している)ため。
好酸球のO∇⊆産生機構とO∇⊆の肥満細胞に対する影響について

1.モルモット好酸球の【O(^-_2)】産生に対する種々の可溶性刺激剤の影響について、好中球のそれと比較検討した。(1).刺激剤による【O(^-_2)】産生は、好酸球の方が好中球に比べてかなり高い値を示した。好中球のA23187及びconcanavalinA(ConA)刺激による【O(^-_2)】産生は、cytochalasinB(cyt.B)前処理により著しく促進されたが、好酸球では少しも促進されなかった。(2).phorbolmyristate acetate及びA23187で活性化されたNADPHoxidaseのKm値は、両白血球で殆ど同じ値を示したが、Vmaxは好酸球の方が遙かに高い値を示した。(3).N-ethylmaleimide(NEM)前処理により、ConA,CytE及びdigitoninによる【O(^-_2)】産生は阻害されたが、A23187及びNaFによる【O(^-_2)】産生は阻害されないことから、好酸球も好中球と同様、少くとも2つの活性化機構の存在が考えられるが、好酸球の方が好中球に比べて、NEMの阻害効果に対してより強い抵抗性を示した。以上の実験結果から、好酸球の【O(^-_2)】産生酵素系は、活性化機構に幾分相違はみられるが、質的には好中球のそれと同じであり、相違は量的であるという可能性が示唆された。2.好酸球により多量に産生される【O(^-_2)】の肥満細胞の機能に及ぼす影響を調べた。今回は問題を簡素化するため、ラジカルの供給源としてXanthine-Xanthineoxidase(X-XOD)を用いた。(1).compound48/80によるヒスタミン放出は、細胞のX-XODとの接触時間の増加と共に阻害され、37゚C、60分間で殆ど完全に阻害された。(2).種々の活性酸素scavengerの中、catalaseのみがX-XODの阻害効果を完全に除去した。(3).SH基の還元剤であるdithiothreitolの添加により、X-XOD阻害効果は保護された。これらの結果から、X-XODによる肥満細胞からのヒスタミン放出阻害は、X-XODにより産生される【H_2】【O_2】によって、細胞の顆粒放出過程に関与しているSH基が酸化されるためではないかと考えられる。
TRAF6複合体によるシグナル伝達の構造学的解明

シグナル分子と受容体の結合によって引き起こされる細胞内シグナル伝達は,個体の恒常性に関わる生命現象を制御しており,ヒトにおけるその異常は様々な疾患の原因となる.本研究対象のTRAF6は,TNFR系のみならずTLR/IL-1R系にも関与するユニークなシグナル分子で,TRAF6の異常は,リウマチや骨粗しょう症などの疾患と密接に関与することが報告されている.本課題では,TRAF6およびその相互作用因子であるTRAF6BPについて構造学的研究を行う.TRAF6およびTRAF6BPの構造から,TRAF6を中心としたシグナル伝達機構を原子レベルで解明する.本年度は,X線小角散乱によりTRAF6BPの溶液中の構造を決定した.これまでに決定した結晶構造とあわせることで,X線結晶構造解析・X線小角散乱から,シグナル伝達に重要なTRAF6BPの基本構造を明らかにした.さらに,TRAF6BP変異体の結晶構造を新たに決定し,その構造からTRAF6との複合体モデルを構築した.26年度が最終年度であるため、記入しない。26年度が最終年度であるため、記入しない。シグナル分子と受容体の結合によって引き起こされる細胞内シグナル伝達は,個体の恒常性に関わる生命現象を制御しており,ヒトにおけるその異常は様々な疾患の原因となる.本研究対象のTRAF6は,TNFR系のみならずTLR/IL-1R系にも関与するユニークなシグナル分子で,TRAF6の異常は,リウマチや骨粗しょう症などの疾患と密接に関与することが報告されている.本研究では,TRAF6およびその相互作用因子であるTRAF6BPについてX線結晶構造解析を行う.TRAF6およびTRAF6BPの結晶構造から,TRAF6を中心としたシグナル伝達機構を原子レベルで解明する.本年度は,TRAF6BPの結晶構造解析を行った.野生型TRAF6BPについて, 2.6 A分解能で構造精密化を完了した.また,シグナルON時の状態を反映した結晶構造を決定するために作成した変異型TRAF6BPについても2.9 A分解能で構造精密化を行った.これらの構造から,TRAF6BPの会合様式および会合に重要な役割を果たすアミノ酸残基の相互作用を明らかにした.また,TRAF6の負の制御因子であるTRAF6BPホモログについては発現系の構築を完了し,大量調製を行っている.TRAF6Δ(TRAF6のTRAF6BP結合領域)-TRAF6BP複合体については,結晶化条件の検討を進めている.シグナル分子と受容体の結合によって引き起こされる細胞内シグナル伝達は,個体の恒常性に関わる生命現象を制御しており,ヒトにおけるその異常は様々な疾患の原因となる.本研究対象のTRAF6は,TNFR系のみならずTLR/IL-1R系にも関与するユニークなシグナル分子で,TRAF6の異常は,リウマチや骨粗しょう症などの疾患と密接に関与することが報告されている.本課題では,TRAF6およびその相互作用因子であるTRAF6BPについて構造学的研究を行う.TRAF6およびTRAF6BPの構造から,TRAF6を中心としたシグナル伝達機構を原子レベルで解明する.本年度は,X線小角散乱によりTRAF6BPの溶液中の構造を決定した.これまでに決定した結晶構造とあわせることで,X線結晶構造解析・X線小角散乱から,シグナル伝達に重要なTRAF6BPの基本構造を明らかにした.さらに,TRAF6BP変異体の結晶構造を新たに決定し,その構造からTRAF6との複合体モデルを構築した.26年度が最終年度であるため、記入しない。野生型および変異型TRAF6BPの構造精密化を行い,TRAF6BPの会合に関する構造学的知見を得た.その他については,構造解析に向けた結晶化スクリーニングを進めており,研究は順調に進展している.昨年度に引き続き,1) TRAF6BP変異体,2) TRAF6BPホモログ,3) TRAF6Δ-TRAF6BP複合体のX線結晶構造解析を行う.TRAF6BP変異体については,他の種類の変異体の構造解析を行い,より精度の高いシグナルON時のTRAF6BPの構造を明らかにする.TRAF6BPホモログについては大量調製系の構築から,TRAF6Δ-TRAF6BP複合体については結晶化スクリーニングから進めていき,構造解析を行う.またX線小角散乱も取り入れ,それぞれの溶液中の会合状態も明らかにしていく.
中心体複製開始機構の研究

申請者は、本研究において(1) kendrinのカルボキシル末端領域と中心小体複製開始に関与するCep152のカルボキシル末端領域が相互作用する事を明らかにした。また、(2) Cep152は、G2/M期では中心体にほとんど局在が見られず、細胞質分裂が起きる頃に再び中心体に集積することがわかった。(3) siRNA処理によるkendrinの発現抑制により、Cep152の蛋白質発現量が増加し、中心体に効率よく集積できることがわかった。以上より、kendrinが中心体から脱離する事でCep152が効率よく中心体へと集積し、新規中心小体複製を開始する機構がある可能性を明らかにすることができた。申請者は、S期における中心体蛋白質kendrinの機能解析を通して、中心小体複製開始の分子機構を解明する事を目的として研究を行っている。平成25年度の研究計画は、第1にkendrinとCep152の相互作用及び機能的連関を明らかにする事である。申請者は、kendrinが中心小体複製の開始に関与する蛋白質Cep152と相互作用する事を見出している。そこで、kendrinとCep152が、どの領域を介して相互作用するのかをそれぞれの欠失変異体を用いて検討したところ、kendrinのカルボキシル末端領域とCep152のアミノ末端領域が相互作用する可能性を見出した。また、免疫染色を行ったところ、細胞周期を通してkendrinとCep152の中心体局在が変化している可能性を示すデータを得た。現在はkendrin、またはCep152をRNAiにより発現抑制した際の表現型について解析を行っている。第2に、Cep152以外のkendrinに結合する蛋白質の解析に関して、中心小体複製開始に関与する事が報告されている蛋白質をkendrinとHEK293T細胞内にて共発現させ、免疫沈降を行った。その結果、いくつかの蛋白質とkendrinが相互作用する可能性を示す結果が得られた。同時に、G1/S期に同調した細胞の抽出液中からkendrinを免疫沈降し、共沈されてくる結合蛋白質を質量分析により同定したいと考えており、現在、解析を進めている。本研究は、S期におけるkendrinの機能解析を通して、中心小体複製開始の分子メカニズムを解明する事を目的とするものである。これまでに、kendrinがカルボキシル末端領域を介してCep152のアミノ末端領域と相互作用する事を明らかにしている。そこで、siRNAによりkendrinまたはCep152の発現を抑制した際の、それぞれのタンパク質の中心体局在について検討した。結果は、どちらのタンパク質を発現抑制しても、互いに中心体での局在が減少していた。従って、相互依存して中心体に局在している可能性があると考えられた。また、kendrinのsiRNA処理を行った細胞では、G0/G1期に一次繊毛が形成されていない細胞が増える可能性を見出した。繊毛の形成異常は、個体において左右逆位や嚢胞腎など様々な疾患との関連が報告されている。従って、現在は細胞周期と繊毛形成との関連にも注目しており、kendrinの中心体局在の変化を細胞周期および繊毛形成時において詳細に観察したいと考え、培養細胞や組織レベルでの免疫電顕を用いた実験を行っている。本年度の研究計画は、分裂前期におけるkendrinのリン酸化が中心小体複製に関与する可能性についての検討することであった。そこで、kendrinとPLK4の相互作用について検討したところ、免疫沈降により内在性のkendrinとPLK4が弱く相互作用している可能性を見出した。次に、kendrinの欠失変異体を用いて免疫沈降した結果、PLK4との相互作用は見いだせなかった。これらの結果よりPLK4が他のタンパク質を介してkendrinと相互作用している可能性が考えられた。今後は、PLK4意外のリン酸化酵素を含めkendrinをリン酸化する分子を探索したいと考えている。本研究は、S期におけるkendrinの機能解析を通して、中心体複製開始の分子メカニズムを解明する事を目的とするものである。これまでに、kendrinがカルボキシル末端領域を介してCep152と相互作用する事を見出した。さらに、siRNAによるkendrinおよびCep152の発現抑制を行った細胞の中心体領域では、一方のタンパク質局在が減少すると他方のタンパク質局在も減少する事が分かった。従って、kendrinとCep152が複合体を形成する事が中心体局在に必要である可能性が考えられた。また、免疫沈降実験よりkendrinは中心体複製の開始に重要な役割を果たすリン酸化酵素PLK4との間で内在性分子同士の相互作用を見出した。しかしながら、KendrinとPLK4の相互作用についてkendrinの欠失変異体を用いて免疫沈降実験を行ったところ、PLK4との相互作用が検出できなくなった。そこで、我々は細胞周期をG1/S期に同調した条件でkendrin欠失変異体とCep152の相互作用についての解析を行ったが、この条件においてもやはり相互作用は検出されなかった。現在はkendrinが他の分子を介してCep152と相互作用する可能性も考えられるため、Yeast Two Hybrid法を用いてkendrinとCep152の両方に相互作用する分子の検討を行っている。この研究を実施していた過程で、kendrinのsiRNAを行った細胞ではG0期に繊毛形成が著しく低下する事が明らかになった。

これは、kendrinがM期からG1期において中心体複製のライセンシング機構としてSeparaseに切断を受けた後も、すぐに中心体に再集積し繊毛形成機構に関与する可能性を示すものであり、今後の中心体研究においても非常に重要な発見であると考えられる。申請者は、本研究において(1) kendrinのカルボキシル末端領域と中心小体複製開始に関与するCep152のカルボキシル末端領域が相互作用する事を明らかにした。また、(2) Cep152は、G2/M期では中心体にほとんど局在が見られず、細胞質分裂が起きる頃に再び中心体に集積することがわかった。(3) siRNA処理によるkendrinの発現抑制により、Cep152の蛋白質発現量が増加し、中心体に効率よく集積できることがわかった。以上より、kendrinが中心体から脱離する事でCep152が効率よく中心体へと集積し、新規中心小体複製を開始する機構がある可能性を明らかにすることができた。所属の変更があり、教育や実習に関する準備に割く時間の増加や、新たな環境で研究を開始する為のセットアップに時間を要したため全体としてやや研究実施計画が遅れている。現在は、研究環境が整い今後の実験の遂行には問題ないと考えている。また、siRNAの解析結果が予想していたよりも分子機構が複雑である可能性を示唆しており、今後は研究目標を達成するために柔軟に対応して行きたいと考えている。機関変更後は、kendrinの詳細な中心体局在を電子顕微鏡を用いて解析しており、この計画に関しては概ね順調に進んでいると考えている。細胞生物学中心小体におけるkendrinの詳細な局在を検討する為に、細胞を細胞質分裂期からG1期に同調し、免疫電顕にて解析を行いたいと考えている。さらに、kendrinのsiRNA処理を行った細胞では、G0/G1期に一次繊毛が形成されていない可能性あるので、一次繊毛形成時や、S期に繊毛が細胞内に吸収される際に、kendrinの中心体局在の詳細な解析も免疫電顕にて検討したい。また、PLK4が他のタンパク質を介してkendrinと相互作用している可能性が考えられるので、今後はPLK4意外のリン酸化酵素を含めkendrinをリン酸化する分子を探索したいと考えている。申請者が、平成25年度の研究計画として予定していたのは、(1) kendrinとCep152の相互作用及び機能的連関を明らかにする事と、(2) G1/S期の細胞においてCep152以外のkendrinに結合する蛋白質を明らかにする事、の2点である。前者に関しては、kendrinのカルボキシル末端領域とCep152のアミノ末端領域が相互作用する事を明らかにする事ができ、当初の計画をおおむね達成できたと考えている。また、kendrin及びCep152のRNAiによる表現型の解析も進んでおり研究計画は順調に進展しているものと考えられる。後者に関しても、kendrinと相互作用を示す可能性のある蛋白質を何種類か見出しており、研究計画に問題はないと考えている。
成人T細胞白血病に対する遺伝子工学を用いた治療の開発

腫瘍性血液疾患の中でも最も予後不良である成人T細胞白血病(ATL)の新しい治療法の開発につながる研究を目指している。ATL細胞は活性化Tリンパ球の性質を有しておりFas-FasL系の活性化によってアポトーシスを効率よく誘導できることよりFas-FasL系のシグナルを介した治療法の開発を行う。1) ATL細胞はTPA,ConA刺激によってもFasLの発現誘導が認められずFasL遺伝子の発現抑制が起こっていると考えられる。我々はFasL遺伝子にメチル化が起こっていることをMethylation-speciflc PCRで証明した。また脱メチル化を起こす5-aza-2'-deoxycytidine(5-Aza-CdR)で処理するとFasLの発現誘導が認められ、この発現はTPAなとの刺激で相加的に増強された。2) 5-ka-CdRによりFasL遺伝子を発現させたATL細胞株ではアポトーシスが誘導されることをAnnexinVを使った解析で明らかにした。また、このアポトーシスはFas-Fc chimeraによって抑制されることよりFas-FasL系のシグナルが、このアポトーシスに関与していることが示された。3) ATL細胞においてはFasL遺伝子のメチル化に加えてp16遺伝子のメチル化も高率に(89%)存在しており脱メチル化を起こす5-Aza-CdRがp16遺伝子の再発現と増殖抑制を起こすことを明らかにした。
超高密度地震観測による深部マグマ探査

全国の大学の研究者が集まり,日光周辺域において合同地震観測を行なった.観測の主たる目的は,これまでの研究で異常構造のみえているこの地域下の地殻・最上部マントルの不均質構造を従来にない空間分解能で探り,火山の深部構造を調べることにある.地震波速度構造推定の空間分解能と探査可能深度を考慮して次の2種類の観測網を構築した.1)広域エレメータ観測日光地域の60Km×60Kmの領域に合計38点のテレメータ観測点を設置した.各観測点からの信号は無線または有線テレメータにより日光戦場ケ原の宇都宮大日光演習林に集めた。集められたデータは計144チャンネルとなり,16bit,200HzでA/D変換され,ワークステーションにより自動処理・収録された.2)超多点アレイ観測日光・足尾地域のS波反射面のほぼ真上に約7Km×7Kmの十字型の測線を展開し,それに沿って約100Km間隔で計200点の観測点を設置した.各観測点には3成分地震計と無線による遠隔制御方式のディジタル・レコーダを置いた.この新しい観測方式の最大の特徴は,見通し外でも届く60MHz帯10Wの電波を使用して,各観測点に設置されたレコーダーを一斉制御することにある.観測は,1993年9月中旬11月末の2.5ヶ月間にわたり行なわれた.自動処理により震源決定された地震数は約800個,アレイ観測で収録された地震数は約100個である.解析作業は現在も継続中であるが,多くの成果が期待される.例えば,超多点アレイ観測で得られた人工地震の記録では顕著な後続波が認められたが,これはアレイ直下からの反射P波(PxP波)と思われる.日光・足尾地域下の反射面について,マグマ溜まりではなく水で満たされた層であるという議論もあるが,このような問題を解決する上でこの波は,重要な情報を与えてくれると思われる.全国の大学の研究者が集まり,日光周辺域において合同地震観測を行なった.観測の主たる目的は,これまでの研究で異常構造のみえているこの地域下の地殻・最上部マントルの不均質構造を従来にない空間分解能で探り,火山の深部構造を調べることにある.地震波速度構造推定の空間分解能と探査可能深度を考慮して次の2種類の観測網を構築した.1)広域エレメータ観測日光地域の60Km×60Kmの領域に合計38点のテレメータ観測点を設置した.各観測点からの信号は無線または有線テレメータにより日光戦場ケ原の宇都宮大日光演習林に集めた。集められたデータは計144チャンネルとなり,16bit,200HzでA/D変換され,ワークステーションにより自動処理・収録された.2)超多点アレイ観測日光・足尾地域のS波反射面のほぼ真上に約7Km×7Kmの十字型の測線を展開し,それに沿って約100Km間隔で計200点の観測点を設置した.各観測点には3成分地震計と無線による遠隔制御方式のディジタル・レコーダを置いた.この新しい観測方式の最大の特徴は,見通し外でも届く60MHz帯10Wの電波を使用して,各観測点に設置されたレコーダーを一斉制御することにある.観測は,1993年9月中旬11月末の2.5ヶ月間にわたり行なわれた.自動処理により震源決定された地震数は約800個,アレイ観測で収録された地震数は約100個である.解析作業は現在も継続中であるが,多くの成果が期待される.例えば,超多点アレイ観測で得られた人工地震の記録では顕著な後続波が認められたが,これはアレイ直下からの反射P波(PxP波)と思われる.日光・足尾地域下の反射面について,マグマ溜まりではなく水で満たされた層であるという議論もあるが,このような問題を解決する上でこの波は,重要な情報を与えてくれると思われる.
高分子の協同効果を利用した不斉伝播・増殖系の構築

本研究ではらせん構造に代表されるような高分子に特有な二次構造に基づくキラリティーに着目し、低分子キラル源に比べ非常にサイズが大きく、フレキシブルな「場のキラリティー」を不斉触媒反応に適用し、低分子不斉触媒にはない不斉認識能・触媒機能の実現を目指した。1.らせん高分子への金属錯体の導入ビピリジンイソシアニドを合成し、これをモノマーとして(l)-メントキシカルボニルフェニルイソシアニドとともにμ-エチンジイル白金-パラジウム二核錯体を開始剤として重合し、骨格となるブロック共重合体を得た。この高分子は溶液中でも安定ならせん構造をとることを円二色性スペクトルにより確認した。次にこの高分子に銅(II)過塩素酸塩を添加し、錯形成について検討した。その結果、高分子内に導入されたビピリジンユニットに対して1:1錯体を選択的に形成し、高分子間錯体や高分子内での2:1錯体の形成は認められなかった。銅(II)は4配位であることから、この高分子錯体内では2座が空いており、低分子の配位が可能であるものと考えられる。今後さらに他の金属種についても錯形成を検討することで、触媒反応への応用に展開できるものと期待される。2.ポリイソシアニドの新規リビング重合法の探索共役高分子のリビング重合法はこれまでにポリチオフェンとポリイソシアニドなどの数例しか報告されていない。キラルならせん高分子としてはポリイソシアニドで、π-アリルニッケル錯体またはμ-エチンジイル白金-パラジウム二核錯体を開始剤として用いた系が報告されているが、これらの重合系では不活性ガス雰囲気が必要であり、開始剤そのものの合成も多段階に及ぶ点が問題であった。そこで本研究では触媒反応の探索の傍ら、新規で簡便ならせん高分子のリビング重合法の探索を行ってきた。その結果、Norteらにより報告されているアミン配位テトラキス(t-ブチルイソシアニド)開始剤を用いた系において、アミンとイソシアニドモノマーの分子構造を最適化することにより、空気雰囲気下・室温で極めて低分散性のポリイソシアニドが得られることを見出した。高分子の二次構造に起因する「場のキラリティー」が不斉伝搬・増殖の過程で重要な位置を占めているのではないかという考えを基に、本研究ではこのような「場のキラリティー」を不斉源とした新たな不斉反応系の構築を目指している。本年度は、溶液中で安定ならせん構造を形成するポリイソシアニドを中心に検討を行った。1.主鎖構造の選択キラルモノマーとしてメントキシカルボニルフェニルイソシアニドを合成し、重合することにより安定ならせん構造を有するポリイソシアニドを得た。次に、対掌体であるd体とl体のモノマーを、比率を変えて重合させたところ、ジブロック共重合体ではモノマーのエナンチオマー過剰率(ee)の増大に伴って円二色性が直線的に増加するのに対して、ランダム共重合体ではeeに対して非線形的な挙動を示し、約60%eeで100%eeとほぼ同等のピーク強度を示すことを確認した。2.モノマーの設計・合成触媒反応部位として金属錯体を用いることを想定し、配位子となるビピリジンおよびフェナントロリン部位を有するイソシアニドモノマーを設計、合成した。これらのモノマーは開始剤としてμ-エチンジイル白金-パラジウム二核錯体を用いたリビング重合においても良好なリビング性を維持していることが判った。今後、これらの触媒反応部位を導入したらせん高分子を合成し、種々の不斉反応系に適用する予定である。また分子内不斉増殖系の構築を目指し、光反応性のスピロピラン誘導体およびスピロオキサジン誘導体のイソシアニドモノマーを設計、合成した。今後これらについても重合を検討する予定である。

そこで本研究では触媒反応の探索の傍ら、新規で簡便ならせん高分子のリビング重合法の探索を行ってきた。その結果、Norteらにより報告されているアミン配位テトラキス(t-ブチルイソシアニド)開始剤を用いた系において、アミンとイソシアニドモノマーの分子構造を最適化することにより、空気雰囲気下・室温で極めて低分散性のポリイソシアニドが得られることを見出した。
表皮ケラチノサイトにおける新規MAPキナーゼBMK1の研究

MAPキナーゼカスケードは、細胞成長因子、細胞分化因子、ストレス刺激などの細胞外刺激を細胞内に伝達する重要なシグナル伝達経路であり、MAPKKK、MAPKK、MAPKの三段階のキナーゼによるカスケードからなる。MAPKとして、MAPK/ERK、p38、SAPK/JNKが知られていたが、最近、ERK5/BMK1の存在が明らかとなった。BMK1はEGFによる刺激でリン酸化され、核内に移行し、転写因子MEF2Cを活性化することが明らかとなっている。注目すべきことに、不活性型BMK1を発現した細胞では、GO/G1期に集合し、増殖停止を起こすことが知られている。EGFファミリー細胞成長因子は、10数種類存在するが、表皮細胞では、TGF-alpha、amphiregulin、HB-EGF、epiregulinが産生され、au t ocrine様式で作用する。このようなEGFファミリー細胞成長因子による作用の表皮内シグナル伝達経路については、表皮細胞では研究されておらず、他の細胞における報告から、Raf、MEKl/2、MAPK/ERKのカスケードの関与が想定されていた。しかし、最近のBMK1に関する研究は、むしろERK5/BMK1が重要であることを示唆するものである。表皮細胞におけるEGFファミリー細胞成長因子のautocrine作用機構の検討EGFファミリー細胞成長因子によるBMK1リン酸化の検討TGF-alpha、amphiregulin、HB-EGF、epiregulinを表皮ケラチノサイトの培養上清に添加し、細胞抽出物を回収しウェスタンブロツト法にてBMK1のリン酸化を検討したところ、表皮角化細胞においてはBMK1のリン酸化は認められなかった。Ad-DNBMK1およびのAd-DNERK5のautocrine機構への影響の検討TGF-alpha、amphiregulin、HB-EGF、epiregulin添加時の表皮ケラチノサイトの増殖促進効果がAd-DNBMK1およびのAd-DNERK5のtransfectにより抑制されるかどうかを、DNA合成を示標に検討したところ、DNA合成の抑制は認められなかった。Ad-DNBMK1およびAd-DNERK5をtransfectした表皮細胞に、TGF-alpha、amphiregulin、HB-EGF、epiregulinを添加し、それぞれのmRNAの誘導されるかについて、RT-PCR法を用いて検討したところ、EGF familyのautoinduction,ならびに、cross-inductionともに影響を与えなかった。以上の結果をまとめると、表皮角化細胞においてはBMKの経路はほとんど作用していないことが明かとなった。MAPキナーゼカスケードは、細胞成長因子などの細胞外刺激を細胞内に伝達する重要なシグナル伝達経路であり、MAPキナーゼとして、最近、BMK1の存在が明らかとなった。今回の研究は表皮ケラチノサイトのEGFファミリーautocrine機構におけるBMK1の役割を明らかにすることを目的とし、平成12年度は以下の実験を行った。Dominantnegative効果を持つアデノウイルスベクターの作成:BMK1に対してdominant negative効果を持つcDNAをPCR法を用いて作成した。各々のcDNAをプラスミドに導入し、E.coliにtransfectさせ大量に培養・精製した。これをコスミドカセットに組み込み、Eco T221制限酵素にてE1部を切断したアデノウィルスベクターDNA-TPCとともに293細胞にco-transfectした。数日間培養し、homologous recombinationにより、dominant negative BMK1が組み込まれたアデノウィルスベクターを作成・分離した。さらに、アデノウィルスベクターを293細胞に感染させ、大量培養を行い、293細胞を回収し、超音波処理にて破砕後、塩化セシウム密度勾配法にてウィルスを精製、濃縮を行った上で、PBSに透析し、得られたウィルス液は力価検定を行った後、分注し超低温槽にて保存した。EGF familyのmRNAを一度に解析可能とする目的で、RNase protection assay用のプローブを作製した。EGFfamily memberのcDNAより各々特異的な配列部分を15-30base pairずつずらしてPCRにて作製しプラスミドに導入した。各々精製し、RNase protection assayを行い、すべてのプローブが良好にハイブリダイズすることを確認した。表皮細胞におけるEGFファミリー細胞成長因子のautocrine作用機構の検討EGFファミリー細胞成長因子によるBMK1リン酸化の検討