hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
コレラ菌の環境応答に対するべん毛運動と走行化の役割

コレラ菌のMLPと走化性システムに含まれる3つのCheAホモログの共役関係の推測と実験的検証を行った。che遺伝子クラスター1とIIIにはそれぞれ4つまたは2つのmlp遺伝子が含まれることから、これらのMLPは、CheA 1(システム1)またはCheA3(システムIII)と共役していると推測した。一方、システムIIにはmlp遺伝子が含まれない。システムIIと共役するMLPを予測するために一次構造を解析し、19のMLPは腸炎ビブリオ菌のMLPと相同であることを示した。腸炎ビブリオ菌はCheAを一つだけもち、コレラ菌のCheA2に相同であるので、これらのMLPはChneA2(システムII)と共役していると推測される。これらの推測を実験的に検証するため、メチル基転移酵素CheホモログによるMLPのメチル化について調べた。大腸菌MCPのChneR結合配列と同様なモチーフがlp01とMlp45のC末端にも保存されており、ChneR3はコレラ菌の3つのChneRホモログの中で大腸菌CheRと最も相同性が高かった。このモチーフが、おそらくChneR2との結合の場となることによって推定CheA2共役型MLPのメチル化に重要な配列であると示唆される結果が得られた。つづいて,走化性タンパク質にGFPを融合させ、細胞内局在を調べた.システムIIとシステムIの走化性タンパク質はべん毛側の極に局在すると推定された。詳しく局在条件を検討したところ、ChneA 1-GFPとGFP-ChneY2の局在は培養液を静置することで進行し、振盪すると失われることがわかった。また、局在が確立した後、試験管中の気体を窒素に置換して振盪した場合には、局在は維持された。以上の結果から、CheA1とChneY2は微嫌気条件依存的に局在性を示すと考えられた。システムIは、宿主体内など嫌気条件下で機能するのかもしれないことが判明した。前年度までに,コレラ菌の誘引物質の探索を行い,セリン,タウリンなどを見いだした.また,ビブリオ菌については,バイオインフォマティクスの手法を用い解析し,レセプター様タンパク質(MLP)が45種もあることを明らかにしている.本年度は,タウリンやアミノ酸を認識するレセプターを同定するため,MLP遺伝子のクローニングを行った.MLPsのうち相似が認められた.さらに,そのうちの6種の推定ペリプラズム領域は,緑膿菌や枯草菌のアミノ酸走性レセプターと共通な配列を有していた.したがって,これらのMLPsがアミノ酸走性に関与する可能性が考えられる.とくにMlp24はMcpXとも呼ばれ,マウス感染実験でコレラトキシンの産生に関与すると報告されている.そこで,O395N1株からmlp24遺伝子をクローン化し,Mlp24がセリン,アルギニン,プロリン走性を媒介する可能性を示した.一方,コレラ菌は,走化性の細胞質内シグナル伝達を担う相同なシステム(Cheシステム)を3組もつ.そのうちCheA2とCheY3を含むシステムIIだけが走化性に関与する.

そこで,45種ある走化性受容体様タンパク質(MLP)とCheタンパク質のネットワークを推測するため,MLPの一次構造を解析した.MLPは膜トポロジーより(A)二回膜貫通型でペリプラズム領域を持つ,(B)二回膜貫通型でペリプラズム領域を持たない,(C)膜貫通領域を持たないものに分類した.それらのメチル基転移酵素との相互作用と特異性やMLPとのGFP融合タンパク質を用いた細胞内局在化を調べた結果から,MLPとCheシステムの共役関係は細胞内局在に反映されると推測された.本年度、コレラ菌のMLPと走化性システムに含まれる3つのCheAホモログの共役関係の推測と実験的検証を行った。che遺伝子クラスターIとIIIにはそれぞれ4つまたは2つのmlp遺伝子が含まれることから、これらのMLPは、CheA1(システムI)またはCheA3(システムIII)と共役していると推測した。一方、システムIIにはmlp遺伝子が含まれない。システムIIと共役するMLPを予測するために一次構造を解析し、19のMLPは腸炎ビブリオ菌のMLPと相同であることを示した。腸炎ビブリオ菌はCheAを一つだけもち、コレラ菌のCheA2に相同であるので、これらのMLPはCheA2(システムII)と共役していると推測される。これらの推測を実験的に検証するため、メチル基転移酵素CheRホモログによるMLPのメチル化について調べた。大腸菌MCPのCheR結合配列と同様なモチーフがMlp01とMlp45のC末端にも保存されており、CheR3はコレラ菌の3つのCheRホモログの中で大腸菌CheRと最も相同性が高かった。このモチーフが、おそらくCheR2との結合の場となることによって推定CheA2共役型MLPのメチル化に重要な配列であると示唆される結果が得られた。つづいて,走化性タンパク質にGFPを融合させ、細胞内局在を調べた.システムIIとシステムIの走化性タンパク質はべん毛側の極に局在すると推定された。詳しく局在条件を検討したところ、CheA1-GFPとGFP-CheY2の局在は培養液を静置することで進行し、振盪すると失われることがわかった。また、局在が確立した後、試験管中の気体を窒素に置換して振盪した場合には、局在は維持された。以上の結果から、CheA1とCheY2は微嫌気条件依存的に局在性を示すと考えられた。システムIは、宿主体内など嫌気条件下で機能するのかもしれないことが判明した。
マラリアのワクチン開発を目指した,BCGからのSERA抗原発現の試み

マラリアワクチン開発で,最も障害となっているのがアジュバントの問題である.動物実験等で,防御効果が確認されている抗原を,実際にヒトに投与するには,安全性と有効性を兼ね備えたアジュバントが必要であるが,未だ十分なものが無い.我々は熱帯医学研究所神原廣二教授との共同研究で,組み換えBCGのシステムを用いて,マウスを用いた赤内型マラリア原虫感染防御に成功し,その防御機構が,細胞性免疫をベースにした防御抗体産生誘導であることを,数年にわたる解析の結果,明らかにし,本年発表した(J.Exp.Med.,1998).さらに,BCGシステムを,ヒトに応用するため,熱帯熱マラリアの防御抗原SERAをα抗原をキャリアーとしてBCGから発現させることを試みた.SERAをコードする合成遺伝子をα抗原遺伝子の様々な場所に挿入し,合計7種類の組み換えBCGを作製した.それらを,試験管内で培養し,分泌抗原中の蛋白質を解析してきたが,現在までの所,十分量のSERA抗原を発現する,組み換えBCG菌は得られていない.この原因は,1;発現させるのにSERAの分子量が大きすぎる,2;SERA抗原の一定部位が分泌に適さない(不溶体を形成する),3;使用コドンの不適合,4;プロモーター活性が低い等の原因が考えられた.現在1,2の原因を解決すべく,SERA遺伝子を分割して,発現させることを試みている.また,α抗原以外のキャリアー蛋白質の検討を行い,抗体産生能の高いMDP1等の抗原とSERAの融合蛋白質を発現させる,プラスミッドを構築している.マラリアワクチン開発で,最も障害となっているのがアジュバントの問題である.動物実験等で,防御効果が確認されている抗原を,実際にヒトに投与するには,安全性と有効性を兼ね備えたアジュバントが必要であるが,未だ十分なものが無い.我々は熱帯医学研究所神原廣二教授との共同研究で,組み換えBCGのシステムを用いて,マウスを用いた赤内型マラリア原虫感染防御に成功し,その防御機構が,細胞性免疫をベースにした防御抗体産生誘導であることを,数年にわたる解析の結果,明らかにし,本年発表した(J.Exp.Med.,1998).さらに,BCGシステムを,ヒトに応用するため,熱帯熱マラリアの防御抗原SERAをα抗原をキャリアーとしてBCGから発現させることを試みた.SERAをコードする合成遺伝子をα抗原遺伝子の様々な場所に挿入し,合計7種類の組み換えBCGを作製した.それらを,試験管内で培養し,分泌抗原中の蛋白質を解析してきたが,現在までの所,十分量のSERA抗原を発現する,組み換えBCG菌は得られていない.この原因は,1;発現させるのにSERAの分子量が大きすぎる,2;SERA抗原の一定部位が分泌に適さない(不溶体を形成する),3;使用コドンの不適合,4;プロモーター活性が低い等の原因が考えられた.現在1,2の原因を解決すべく,SERA遺伝子を分割して,発現させることを試みている.また,α抗原以外のキャリアー蛋白質の検討を行い,抗体産生能の高いMDP1等の抗原とSERAの融合蛋白質を発現させる,プラスミッドを構築している.
次世代シークエンサーによる重症胎児疾患の原因解明と遺伝子ライブラリーの確立

水頭症、無脳児、骨系統疾患の原因追求のため、遺伝カウンセリングを含めた体制確立の基盤となる研究を行った。4回連続で無脳児のゲノム構造の精査を行ったが極めて稀な変異(多型)あるいはde novo変異のみで病気との因果関係を示すに至らなかった。骨系統疾患4例、全前脳胞症2例に対して遺伝カウンセリングの下、遺伝学的解析を行い、全前脳胞性は染色体分析結果を、骨系統疾患はにFibroblast growth factor receptor-3 (線維芽細胞増殖因子3)遺伝子のシークエンスの結果をご両親に提示し、疾患原因と次子への再発の情報提供を行うことができ、目的となる検査体制の確立を達成できた。無脳症(無頭蓋症)や重度水頭症は胎児期に診断されうる形態学異常でも、重篤で予後不良である。しかし、その発生頻度の低さから原因追及はされず、もしくは染色体異常以上の検索が行われない事が多い。しかし、染色体検査だけではその遺伝学的異常の有無を判断するには不十分であり、次の妊娠に向けての再発率や夫婦の不安除去や人生設計には十分な情報提供を行う必要があると考えられる。また、その遺伝学的検索の施行に於いては、遺伝カウンセリングは不可欠であり医学的・倫理的の双方からのサポートによる意思決定が重要と考える。本研究に於いては羊水染色体検査やSNPマイクロアレイで異常を認めない反復性の胎児形態異常や重篤な胎児奇形症候群についての網羅的な遺伝子エクソーム解析による原因となる遺伝子変異の同定を目的とし本研究は行われている。昨年度は3回連続で無脳児を妊娠したカップルについて両親に遺伝カウンセリングを行い、同意のもと胎児組織より染色体G-band核型解析、および高密度SNPマイクロアレイ(250万サイトを検索)によるゲノム構造の精査を行った。染色体G-band核型の結果は46,XXの正常核型であり、マイクロアレイで検出可能な範囲では病的な染色体微細欠失・重複は認めなかった。葉酸摂取中止後に施行した血中葉酸値、ホモシステイン値は正常であった。無脳児再発症例であったため、次回妊娠に向けてフォリアミン錠5mg/日を内服開始し再度妊娠が成立したが、前回と同様に無脳児であった。両親の血液からDNAを抽出した。両親および患児のMTHFRのexon 4,7についてのシークエンス解析を実施したが、患児に特異的な既報の遺伝子多型は見出されなかった。この症例は、表現型として明らかな同一発生異常を4回反復しており、次世代シークエンサーによるエクソーム解析中である。症例そのものが非常に稀であり、集積がスムーズに行かない。H28年度は研究対象である重度水頭症や無頭蓋症だけでなく、他の希少疾患(骨系統疾患や中枢神経系の異常症例など)に対象を広げた。重度水頭症や無頭蓋症と同様、重篤で予後不良である。遺伝学的検索をされてないことが多いため、その原因究明を行うことはご両親にとって次に妊娠に向けた非常に有用と思われる情報となりうるからである。しかし、重度水頭症や無頭蓋症は稀で症例登録が進まないため他の希少疾患(骨系統疾患や中枢神経系の異常症例など)にも遺伝カウンセリングにより同意を得られた症例のみを対象とすることにした。また、データベースに関しては全分娩症例を集積するデータベースに機能を拡張することで、本研究の症例蓄積様のデータベースとして用いることとした。最終年度である来年度も引き続き症例集積に務める。また他の遺伝学的検索であるNIPTによる評価も併せて用いていくことを計画している。研究期間中に発生する新たな先天性奇形の反復症例について、十分な遺伝カウンセリングのもと、希望があった場合に、原因遺伝子の同定を上述2症例と同様な遺伝子解析を行う。希少疾患のため登録がすすまない。4回連続で無脳児を繰り返し本研究に参加同意され染色体G-band核型解析、高密度SNPマイクロアレイによるゲノム構造の精査の結果、46,XXの正常核型、マイクロアレイでも病的な染色体微細欠失・重複は認めなかった。両親および患児のMTHFRのexon 4,7についてのシークエンス解析でも、患児に特異的な既報の遺伝子多型は見出さず、その後、以上の情報をご両親に提供し定期的遺伝カウンセリングを行うことができた。昨年度から希少疾患をして骨系統疾患と中枢神経疾患に対象を広げ最終H29年度までに骨系統疾患4例、全前脳胞症2例がエントリー出来た。全ての症例において、十分な体制のもと遺伝カウンセリングを行うことが出来た。遺伝カウンセリング体制の確立は本研究の目的の1つであり、染色体検査だけでは不十分であり、次の妊娠に向けての再発率や夫婦の不安除去や人生設計には十分な情報提供を行う事ができた。骨系統疾患4例に関して、娩出された児の口腔組織と血液を用いてDNAシークエンス法よりFibroblast growth factor receptor-3 (線維芽細胞増殖因子3)遺伝子のシークエンスを行った。ヘテロのc.746C>G (p.Ser249Cys)の遺伝子変異FGR3遺伝子の変異を同定し、タナトフォリック骨異形成症タイプ1であることを遺伝子診断を確定した。

最終的診断を両親に開示し、次子の発生リスク遺伝カウンセリングを行った。診断困難なSpondylocostal dysostosis(SCD)疑い症例の骨系統疾患のDNAシークエンスでは典型的Tbx6遺伝子異常を認めずexome解析を進めたが、現時点では有意な結果を得られていない。当施設の奇形を含む子宮内胎児死亡の調査を論文として報告した。水頭症、無脳児、骨系統疾患の原因追求のため、遺伝カウンセリングを含めた体制確立の基盤となる研究を行った。4回連続で無脳児のゲノム構造の精査を行ったが極めて稀な変異(多型)あるいはde novo変異のみで病気との因果関係を示すに至らなかった。骨系統疾患4例、全前脳胞症2例に対して遺伝カウンセリングの下、遺伝学的解析を行い、全前脳胞性は染色体分析結果を、骨系統疾患はにFibroblast growth factor receptor-3 (線維芽細胞増殖因子3)遺伝子のシークエンスの結果をご両親に提示し、疾患原因と次子への再発の情報提供を行うことができ、目的となる検査体制の確立を達成できた。集積を進めつつ解析を進める。新たなデータベース運用を開始する。症例集積のためのデータベースが完成したので、有効に活用したい。また、対象疾患を他の希少疾患(骨系統や中枢神経疾患)に広げ集積を進めたい。また、他の遺伝学的検索であるNIPTによる症例発掘に務める。胎児診断2015年度は計画が遅れたため、持ち越し分が多くなってしまった。登録症例が発生しないため、研究試薬等にかかる費用が想定以下でしか発生しなかったため。データベース作成を進める。その他希少疾患(骨系統疾患、中枢神経疾患)を対象疾患に入れることで登録症例を増やす
統計的に有意な部分構造を発見する巨大グラフマイニング手法の研究

本研究プロジェクトでは,巨大グラフにおいて統計的に有意に出現する部分グラフを発見することを目的とし,研究をおこなった.最初に,グラフの一種である木構造データに着目し,木パターンのマイニングアルゴリズムとTaroneの検定可能性と呼ばれる多重検定手法を融合することで,統計的に有意な木パターンを発見する手法を確立した.しかし,大規模なデータでは,(1)当初の想定以上にアルゴリズムの実行時間が増大してしまい,かつ(2)統計的に有意な部分グラフが大量に見つかり結果の解釈が困難である,という2つの課題があるという結果を得た.課題(1)を解決するためには,木パターンのマイニングアルゴリズムそのものを改善する必要があるが,これは本研究の主要な目的からは外れてしまう.そこで,より本質的な問題解決のために,情報幾何の理論を導入することで,解の探索において不必要な領域をより積極的に削除するための基礎理論を構築した.より具体的には,巨大グラフを半順序集合として扱うことで,情報幾何で基本的な構造として用いられている二重平坦な多様体の構造が自然に導入できることを示した.二重平坦構造を構成する2つの座標系が,それぞれ指数型分布族の自然パラメータと,各部分グラフの出現回数に対応することを明らかにした.これによって,探索領域の組み合わせ爆発を回避しつつ,統計的有意性の判定を実行することができる.最終年度では,課題(2)を解決するために,部分グラフの集合を要約するための手法を構築した.特に,確率的論理プログラミングによる学習を利用することで,部分グラフ集合を表す簡潔な表現を獲得することに成功した.さらに,得られた部分グラフ集合を適切に扱うための機械学習手法の研究を進めた.部分グラフ間の類似度を測るためのグラフカーネル手法について,広く利用可能なR及びPythonのパッケージを開発し,公開した.本研究の目的は,巨大グラフに統計的に有意に現れる部分グラフを効率的に列挙する手法の構築である.平成28年度は,プロトタイプの設計及び実装と,実データによる検証をおこなった.具体的には,グラフのサブクラスとしてXMLに代表される木構造データに着目し,巨大な木において統計的に有意に現れている部分木パターンを発見する手法の構築に取り組んだ.一般に,巨大グラフからの部分グラフ発見においては,各部分グラフの出現回数と親子関係の間の反単調性が成り立たない.したがって,これまでに提案されている統計的に有意なパターンを発見する手法は,必ず反単調性を利用して計算の効率化を実現しているため,巨大グラフに対してはこれらのアプローチがそのまま適用できない.これに対して,グラフが木構造を持つときは,反単調性が成り立つため,この問題を回避することができる.さらに,木からの部分木パターン発見においては,効率的な列挙アルゴリズムが多く研究されている.そこで本年度は,代表的なアルゴリズムFREQTを利用し,そこに検定可能性を用いた多重検定補正法を導入することで,検定可能な部分木パターンを列挙するアルゴリズムを構築及び実装した.実世界のXMLデータを用いて,構築したアルゴリズムの有効性を検証した結果,偽陽性の割合を制御しつつ,ベースラインとなるBonferroni補正を用いた手法よりも検出力を増加させることに成功した.しかし,実行時間が増大していまう,という結果を得た.統計的な観点からの改善には成功し,本年度の目的を達成したが,実行時間は改善の余地がある.本研究の目的は,巨大グラフから統計的に有意に現れる部分グラフを発見する手法の構築である.平成29年度までに,木構造データに着目することで,パターンマイニングと統計的検定及び検定可能性と呼ばれる多重検定手法を組み合わせた手法を構築し,その性能を検証した.その結果,大規模なデータでは実行時間が増大してしまい,効率的な部分グラフ発見が困難であるという結果を得た.そこで,平成29年度は,この問題を根本的に解決するために,パターンマイニングを基礎としたアルゴリズムの見直しによる軽微な改良でなはく,情報幾何の理論を導入することで,解の探索において必要の無い領域をより積極的に削除するための基礎理論の構築に取り組んだ.その結果,巨大グラフを半順序集合として取り扱うことで,情報幾何で知られている二重平坦な多様体の構造が自然に導入できることを明らかにした.ここで導入される2つの座標系は,それぞれ対数線形モデルで用いられる係数と,確率変数の期待値に対応し,さらにこの期待値はパターンマイニングで利用されるサポートと一致する.したがって,提案手法はパターンマイニングの自然な拡張としても定式化することができる.この枠組を利用することで,組合せ爆発する探索領域を直接扱うことなく,任意の部分グラフの統計的有意性を判定することが可能となる.さらに,ボルツマンマシンに代表される階層的確率モデルを導入することができるので,深層学習などで盛んに研究されている最適化アルゴリズムが適用可能となる.当初想定していた手法が効率的でないことが判明したが,この問題を解決するための新たな理論の構築に成功した.本研究プロジェクトでは,巨大グラフにおいて統計的に有意に出現する部分グラフを発見することを目的とし,研究をおこなった.最初に,グラフの一種である木構造データに着目し,木パターンのマイニングアルゴリズムとTaroneの検定可能性と呼ばれる多重検定手法を融合することで,統計的に有意な木パターンを発見する手法を確立した.しかし,大規模なデータでは,(1)当初の想定以上にアルゴリズムの実行時間が増大してしまい,かつ(2)統計的に有意な部分グラフが大量に見つかり結果の解釈が困難である,という2つの課題があるという結果を得た.課題(1)を解決するためには,木パターンのマイニングアルゴリズムそのものを改善する必要があるが,これは本研究の主要な目的からは外れてしまう.

そこで,より本質的な問題解決のために,情報幾何の理論を導入することで,解の探索において不必要な領域をより積極的に削除するための基礎理論を構築した.より具体的には,巨大グラフを半順序集合として扱うことで,情報幾何で基本的な構造として用いられている二重平坦な多様体の構造が自然に導入できることを示した.二重平坦構造を構成する2つの座標系が,それぞれ指数型分布族の自然パラメータと,各部分グラフの出現回数に対応することを明らかにした.これによって,探索領域の組み合わせ爆発を回避しつつ,統計的有意性の判定を実行することができる.最終年度では,課題(2)を解決するために,部分グラフの集合を要約するための手法を構築した.特に,確率的論理プログラミングによる学習を利用することで,部分グラフ集合を表す簡潔な表現を獲得することに成功した.さらに,得られた部分グラフ集合を適切に扱うための機械学習手法の研究を進めた.部分グラフ間の類似度を測るためのグラフカーネル手法について,広く利用可能なR及びPythonのパッケージを開発し,公開した.来年度は,まず本年度で構築したアルゴリズムを改良して,実行時間を短縮する.これまでに構築した手法では,パターンの列挙と検定可能性の判定を独立におこなっているが,これらを融合して,パターンを列挙しつつ検定可能性を判定することで,マイニングのプロセスの効率化を実現する.さらに,統計的に有意なアイテム集合の発見で既に提案されている,ランダム置換を用いた多重検定補正法を導入することで,さらなる検出力の増加を実現する.その後,このアルゴリズムをもとにして,木構造だけでなくグラフ一般に対して適用可能なアルゴリズムを構築する.その際,頻度ではなく,反単調性をみたす尺度NMIを用いることで,列挙の効率化を実現する.平成30年度は,平成29年度に構築した情報幾何に基づく解析手法を実装する.この手法は,巨大グラフを半順序構造を持った階層的な確率モデルと捉えることで,情報幾何的,情報理論的な操作を可能とする.さらに,グラフを処理するためのアルゴリズムをより洗練するために,深層ボルツマンマシンの学習で用いられているコントラスティブダイバージェンスの学習アルゴリズムを利用し,より効率的な手法を構築する.この提案手法を実際に巨大グラフに対して適用することで,特徴的な部分グラフを発見する.
椎間板の変性に関連する腰痛性疾患の病態の解明と、低侵襲治療システムの開発

予算との関係から、本年度は遺伝子導入による椎間板変性の抑制効果に関する研究に対する支出はほとんどなく、論文作成を行った。したがって、本研究費を使用した研究の進捗はなかった。予算の大半は、大型動物を用いた棘突起間プラントとその周辺機器の開発に当てられた。ブタ3頭を用いた学外での実験を遂行し、さらにスペーサー、周辺機器の改良を行った。スペーサーのスリットを大きくすることで、内部に人工骨等を入れることができるデザインとした。周辺機器に関しては棘突起間の下穴を作成するためのオールと、棘突起基部から椎弓間にかけて皮質骨を削り、骨移植の母床を作成するためのリーマーを作成した。チタン性、PEEK性の2種類のスペーサーに人工骨を入れ、目的とする棘突起椎弓間を小皮切から新たに開発した機器を用いて前処理をした上で、一頭につき3個のスペーサーを留置した(n=9)。挿入後の動物に特に有害事象は認めなかった。3ヶ月後に屠殺し、腰椎を回収して観察した。いずれのスペーサー内にも骨誘導を観察することができ、スペーサー挿入椎間の可動性は消失していた。したがって、これらのシステムを用いて、低侵襲下に脊椎後方要素の骨癒合を得ることが可能であることが確認できた。さらに、該当期間中に新たな特許申請を行った。今後は、これらの基礎データを元に、企業との共同研究を進め、低侵襲下に背椎後方要素の骨癒合を得るためのシステムの構築を推し進め、製品化を目指す予定である。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。1椎間板変性研究全般:本研究のH27年度の目的は、バイオロジカルアプローチに適した椎間板再生椎間板変性モデルの作成と、変性の鍵になる遺伝子を特定し、これをRNA干渉によりノックダウンすることで椎間板変性の抑制あるいは再生することである。1)椎間板変性モデルに関してはほぼ安定して再現が可能なモデルが完成したといって良い。2)椎間板変性のkey遺伝子としてMMP-3を最有力候補としてあげていたが、もっと上流での遺伝子発現をターゲットとすべく、The mammalian target of rapamycin (mTOR)シグナル経路に着目した研究を開始した。mTOR経路は細胞の成長と恒常性維持に重要であることが知られ、mTORはRaptorと複合したmTORC1とRictorと複合したmTORC2を形成する。mTORC1はAktに制御を受け、蛋白合成に関わるp70/S6Kを調節し、細胞自食機構オートファジーを抑制する。椎間板髄核細胞株を用いたRNA干渉法によるmTORシグナル経路解析を施行した結果、Raptor干渉群ではAktを活性化しつつ、mTORC1関連経路のみを抑制できた。Raptorを介した選択的なmTOR経路の抑制は、抗老化、MMP-3の抑制をはじめとしたより広い範囲の基質分解抑止効果に加え、細胞生存に関わるAktの活性化を介して細胞死も抑制できる可能性が示唆された。したがって、今後の椎間板治療のターゲットとしてRaptorを使用予定とする。2腰部脊柱管狭窄症に対する棘突起間スペーサーの開発:本研究のH27年度の目的は、棘突起と周辺機器を改良することであった。スペーサーは棘突起間に挿入するスクリュー形状部分に2重螺旋構造を取り入れ、ネジ山の形状改良を加えた。透視下での可視化のためにマーカーを改善し、周辺機器も種々の改良を加えた。1椎間板変性モデルに関しては概ね順調2椎間板変性に関するKey遺伝子に関しては、基質分解の抑制みに頼るのではなく、より包括的な再生あるいは変性の抑制を目指して、新たなターゲット遺伝子の検討を要した。したがって、新たな実験を追加したため、遅れを生じた。しかし、結果的にはより良いターゲット遺伝子として、mTOR経路におけるRaptorを候補として選択することができた。3椎間板ヘルニアに関する新治療に関しては他実験等で時間と予算が確保できず、あまり進捗していない。4腰部脊柱管狭窄症に対する最小侵襲治療としての棘突起間スペーサーに関しては、スペーサー自身にいくつかの問題点が確認されたため、それを補うべくさらに大幅な改良を加え、周辺機器への改良や追加も施工した。企業とのやりとり等で時間を要したが、概ね予定通り。1椎間板変性研究全般1)椎間板変性モデルに関してはin vivoの尾椎への静的圧迫力を加えるモデルと、静的圧迫力を数日で解除し、より緩徐な変性を生じるモデルの2種類が完成。さらにin vitroで椎間板を器官培養し、動的圧迫力を継続して加えるモデルも完成している。2)椎間板変性のkey遺伝子としてThe mammalian target of rapamycin (mTOR)シグナル経路に着目した研究を開始。mTORC1は、細胞自食機構オートファジーを抑制する。今後の椎間板治療のターゲットとしてRaptorが主たる候補になった。

さらにオートファジー阻害は様々な副次作用を生じる可能性があることから、RNA干渉によりオートファジー必須因子であるATG-5の発現抑制を行い、オートファジーが椎間板の恒常性維持に重要であることを確認した。2腰部脊柱管狭窄症に対する棘突起間スペーサーの開発:本研究のH28年度の目的は、棘突起と周辺機器をさらに改良することであった。スペーサーは棘突起間に挿入するスクリュー形状部分に2重螺旋構造を取り入れ、より簡便なスペーサー挿入のために先端部を少し尖らせる形状とした、さらにネジ山の形状改良を加えた。透視下での可視化のためにマーカーを改善し、周辺機器も種々の改良を加えた。大型動物(ブタ)を用いて実験を行った。結果としてより効率よく低侵襲でのスペーサー挿入が可能となったが、脱転例が生じたためにさらに改良の必要性があることが明らかとなった。棘突起間スペーサーの開発が難航している。デザインの変更から実際のインプラントの作成、周辺機器の作成(木下技研)にも予想以上に時間を要し、この研究に関して大幅な遅れが生じている。したがって、予算を繰り越すことで、引き続き29年度もインプラントと機器の改良を継続するとともに動物実験を遂行する。椎間板ヘルニアの新規治療に関しては、予算やマンパワーの問題から現在休止状態である。1)椎間板研究1私共が開発したin vitroにおいて椎間板に動的圧迫力を負荷する器官培養モデルを用いた研究を施行した。動的負荷を加えたものと、加えないものを比較検討し、動的負荷により椎間板基質代謝の異化が亢進し変性が誘導されていた。椎間板の恒常性に必須といわれる脊索細胞由来椎間板細胞は、動的負荷によりそのマーカー陽性細胞が著減していることが判明した。2)椎間板研究2手術にて採取したヒト椎間板髄核細胞を用いたin vitro実験を遂行した。無血管組織である椎間板においてはその恒常性維持のためにオートファジーが重要であることが示唆された。RNA干渉法を用いたオートファジー阻害実験を施行した。オートファジー必須因子であるATG-5のRNA干渉により髄核細胞生存率の低下と細胞死/老化の増大を認めた一方で、細胞外基質代謝への影響は少なく、椎間板の恒常性維持にオートファジーが重要であることが示唆された。これらの成果を学会にて報告した。3)棘突起間スペーサーの開発引き続き低侵襲かつ簡便に目的とする棘突起間にスペーサーを留置するためにスペーサーの改良を行った。スペーサー導入部の形状を工夫することでより短時間に少ない手順でのスペーサーの留置が可能になったことが大型動物実験により確認された。その一方、体内留置時にスペーサーの脱転例が生じることが判明し、その対策がさらに必要となった(後述)。上記の成果をもとに国際特許出願を行った(PCT/JP2018/013602)。棘突起間スペーサーの開発が思うように進捗せず、全体としての計画進行に遅れが生じている。低侵襲かつ簡便に目的とする棘突起間へスペーサーを挿入するために、スペーサーと周辺機器の開発と改良を引き続き行っている。スペーサーの改良を行い動物実験を施行した。その結果、好ましい効果を認めた一方で上記のような予想外の有害事象が出現したために、さらなる改良の必要性が生じた。
機械学習を活用したフォトニック結晶共振器の高性能化

フォトニック結晶共振器は波長程度の微小領域への強い光閉じ込めを可能にする技術であり、これを用いて従来にない様々な光機能が創出されてきた。しかし、その構造が高い自由度を持つ一方、光学特性の解析には計算量の多い第一原理計算が必要であるため、その潜在能力を十分に活用した設計ができていない。本研究では、第一原理計算で求めた、構造と光学特性の対を複数個用意し、これを訓練データとして機械学習モデルを構築し、学習済みモデルに光学特性を高速に予測させつつ高次元の設計パラメータ空間中での構造最適化を可能にする手法を開発する。これを応用上重要な様々なフォトニック結晶共振器に適用し、その潜在能力を最大限引き出す。
弓部置換術低侵襲化のための大動脈人工血管吻合器の設計・作製

【目的】弓部大動脈瘤に対する弓部人工血管置換術の飛躍的向上のためには、短時間で出血のない確実な遠位側吻合を行うことが鍵である。本研究は、遠位側吻合のための吻合器を作製し、その有効性について基礎的実験を行い検討した。【方法】マニー株式会社が製造しているマニセプスをもとに、新たな吻合器を作製した。本吻合器はマットレス縫合を容易に行う機構を有している。摘出牛胸部大動脈とウーヴンダクロン人工血管(外径20mmと26mm)を使用した。大動脈外側にはEPTFEフェルトを使用した。縫合針は長さ9.0mmの直針付き縫合糸を使用した。【結果】1.大動脈壁厚と針受け渡しの確実性:大動脈壁厚4.6mmまでは吻合器により確実に針の受け渡しが可能であったが、壁厚4.8mm以上では困難な場合があった。2.隣接するマットレス縫合同士の距離2.0mmの場合、隣接するマットレス縫合の間に比較的容易に小曲がりペアンが貫通するスペースを認め、水注入試験では吻合部からのリークを認めた。1.0mmの場合とオーバーラップ1.0mmの場合では、隣接するマットレス縫合の間に関しては、容易に貫通するスペースを認めず、水注入試験では吻合部からのリークを認めなかった。3.吻合器の針間距離:針間距離5.0mmでは、針の受け渡し機構に支障はなく、マットレス縫合自体に貫通するスペースを認めなかった。針間距離7.5mmでは、大動脈湾曲面と組織の硬さから針の屈曲から針受け渡し機構に支障がみられることがあった。隣接するマットレス縫合がオーバーラップでない場合、マットレス縫合自体に貫通するスペースを生じ、水注入試験において吻合部からリークを認めることがあった。【結論】今回作製した大動脈人工血管吻合器では、針間距離5.0mm、隣接するマットレス縫合の間隔1.0mmの条件で、今後実用可能な大動脈人工血管吻合器が作製可能と考えられた。弓部置換術低侵襲化のための大動脈人工血管吻合器の設計・作製についての実績報告を記載する。本年度は初年度として、まず、当施設で行った弓部人工血管置換術のビデオを再度十分検討し、断端を約1センチ外反した人工血管を大動脈に内挿することにより遠位側の人工血管・大動脈吻合に器械吻合が可能であることを確認した。本大動脈人工血管吻合器は医療器械会社マニー社が販売している縫合器マニセプスを基礎に考案したものであるが、次にマニセプスと牛大動脈、人工血管を使用して、in vitroで吻合シミュレーションを行った。この実験では、適切な人工血管・大動脈吻合における縫合針のバイトの深さ、両端針の針間距離、隣り合う両端針の間隔、針の長さ、針および糸の太さについて検討を行った。実験方法としては、マニセプスを使用して人工血管・大動脈吻合を行った後、大動脈内に100ないし120mmHgで水を注入し、吻合部の状態を観察した。また、吻合器の扱い易さについて検討した。このシミュレーションから、縫合針のバイトの深さ5ないし8ミリ、両端針の針間距離5ないし7ミリ、隣接する両端針の間隔2ミリ、針の長さ7ないし9ミリ、針および糸の太さ3-0相当がそれぞれ適切であると考えられた。

このシミュレーションをもとに、CADソフトにて吻合器の設計図を作成した。その後、マニー社の担当者とカンファレンスを行い、実際に今回の研究費の予算で作成可能な吻合器を決定し、人工血管・大動脈吻合器の作成依頼を行った。現在マニー社で吻合器を作成中であり、近日完成するとの報告を受けている。吻合器完成後、さらにin-vitroにおける、大動脈・人工血管吻合のシミュレーションを行う予定である。【目的】弓部大動脈瘤に対する弓部人工血管置換術の飛躍的向上のためには、短時間で出血のない確実な遠位側吻合を行うことが鍵である。本研究は、遠位側吻合のための吻合器を作製し、その有効性について基礎的実験を行い検討した。【方法】マニー株式会社が製造しているマニセプスをもとに、新たな吻合器を作製した。本吻合器はマットレス縫合を容易に行う機構を有している。摘出牛胸部大動脈とウーヴンダクロン人工血管(外径20mmと26mm)を使用した。大動脈外側にはEPTFEフェルトを使用した。縫合針は長さ9.0mmの直針付き縫合糸を使用した。【結果】1.大動脈壁厚と針受け渡しの確実性:大動脈壁厚4.6mmまでは吻合器により確実に針の受け渡しが可能であったが、壁厚4.8mm以上では困難な場合があった。2.隣接するマットレス縫合同士の距離:2.0mmの場合、隣接するマットレス縫合の間に比較的容易に小曲がりペアンが貫通するスペースを認め、水注入試験では吻合部からのリークを認めた。1.0mmの場合とオーバーラップ1.0mmの場合では、隣接するマットレス縫合の間に関しては、容易に貫通するスペースを認めず、水注入試験では吻合部からのリークを認めなかった。3.吻合器の針間距離:針間距離5.0mmでは、針の受け渡し機構に支障はなく、マットレス縫合自体に貫通するスペースを認めなかった。針間距離7.5mmでは、大動脈湾曲面と組織の硬さから針の屈曲から針受け渡し機構に支障がみられることがあった。隣接するマットレス縫合がオーバーラップでない場合、マットレス縫合自体に貫通するスペースを生じ、水注入試験において吻合部からリークを認めることがあった。【結論】今回作製した大動脈人工血管吻合器では、針間距離5.0mm、隣接するマットレス縫合の間隔1.0mmの条件で、今後実用可能な大動脈人工血管吻合器が作製可能と考えられた。
一酸化窒素を利用した喘息予防機序におけるタンパク質ニトロソ化の役割の解明

本研究の目標は、喘息の新しい予防法を開発することである。喘息においては一酸化窒素が重要な役割を果たすことが知られている。一酸化窒素は気管支の拡張作用などを有することが知られているが、その機構には不明な点が多い。本研究では、喘息を人為的に誘導したマウスを用いて、肺における一酸化窒素修飾タンパク質や一酸化窒素化合物の濃度・種類の変化を調べた。喘息においては、一酸化窒素修飾タンパク質や一酸化窒素化合物の濃度がやや増大していた。一酸化窒素(NO)に関連した分子の濃度の喘息モデルマウスの肺組織における変化を明らかにするためにNOxの一部であるNO2-など個々の分子の変化を測定したが、個体間のバラツキなどがあり統計的有意になるほどの変化は検出できなかった。喘息モデルマウスの作成成功は肺におけるアルギナーゼタンパク質の発現上昇によって確認している。喘息モデルマウスの肺におけるシステイン残基のニトロソ化修飾の量が変化するタンパク質をさらに同定することを試みた。ビオチン交換法を行う際の条件を変えたり、免疫沈降・イムノブロッティングの際に用いる抗体を変えるなどした。同定されたタンパク質については、複数のマウスの肺サンプルを用いて再現性を確認した。単離されたニトロソ化タンパク質の中には現在まで明らかに喘息と関連すると既に知られているタンパク質などは見出されなかったが、さらなる検討が必要である。単離したタンパク質の1つは、Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH)であった。このタンパク質は培養細胞などですでにニトロソ化されていると知られているタンパク質であり、ビオチン交換法がうまく機能したことを証明している。GAPDHのニトロソ化レベルは喘息においてやや上昇していた。また、喘息を含めた炎症において重要な役割を果たすと知られている転写因子であるNF-kBについてニトロソ化レベルの変化を調べた。NF-kBの生理的なニトロソ化レベルはマウス1匹分の肺からではビオチン交換法の検出感度限界ぎりぎりでありバラツキが大きいので、複数のマウスに由来する高濃度の肺サンプルで追試を行う必要があるが、NF-kBのニトロソ化レベルは喘息においてやや上昇しているようであった。一年目である平成24年度の研究は、主に以下の二つに分けられる。1.喘息モデルマウスの肺においてシステイン残基のニトロソ化修飾の量が変化するタンパク質を同定することを試みた。健康なマウスと喘息モデルマウスの肺組織を単離して、ビオチン交換法によってニトロソ化修飾を受けるタンパク質を網羅的に精製した。精製したニトロソ化タンパク質を変性ゲル電気泳動で分離して銀染色したところ、10-20のバンドが検出できた。これらのタンパク質を個別にゲルから切り出して、質量分析にかけて同定した。同定したタンパク質の中で抗体が入手可能である1つのタンパク質について、健康なマウスと喘息モデルマウスにおけるニトロソ化量の変化を調べるために、ビオチン交換法によって精製されたタンパク質画分に対して抗体を用いて、リバースウエスタンブロッティングを行った。その結果、このタンパク質のニトロソ化レベルは、喘息モデルマウスにおいて増加していることを突き止めた。2.喘息モデルマウスの肺組織における一酸化窒素(NO)関連分子の濃度変化は、フィードバック機構なども存在するためにはっきりとは分かっていない。NOx(亜硝酸イオンと硝酸イオンの合計)濃度はこれまでは統計的に有意な変化は確認されていなかったが、今回測定したNOx濃度では、喘息モデルマウスでは健康なマウスに比べてむしろ増加していた。1, 2の結果は一酸化窒素化合物の濃度が喘息モデルマウスにおいて全般的に上昇している可能性を提示するが、この結果に普遍性があるかを調べるためには、数種類以上のタンパク質のニトロソ化レベルを調べたり、亜硝酸イオンと硝酸イオンそれぞれの濃度変化を測定したりする必要がある。当初の計画どおりに、喘息モデルマウスでシステイン残基のニトロソ化レベルの変化するタンパク質を同定するという実験は成功した。うち1つのタンパク質についてはニトロソ化が増加することを明らかにできた。ただし、同定したタンパク質に関する既知の情報から判断するかぎりにおいては、これらのタンパク質のニトロソ化が喘息の発症や病態に重要であるかは判断できない。また、一酸化窒素(NO)化合物であるNOxが喘息モデルマウスに比べて有意に上昇することも明らかにすることができた。ビオチン交換法に限らず、タンパク質の生化学的精製による網羅的同定では、多量に存在するタンパク質が主に精製されてしまい、重要だが微量に存在する転写因子などは精製されにくい。したがって、喘息の発症に機能的に重要と示唆されていて、かつニトロソ化修飾を受ける可能性があるタンパク質について、個別にビオチン交換を行なってニトロソ化量の変化を調べる予定である。喘息の発症に機能的に重要なニトロソ化タンパク質については、その詳細な解析を行う予定である。また、亜硝酸イオンと硝酸イオンなど個別の一酸化窒素化合物の喘息モデルマウスにおける濃度変化を測定する。

研究室に既に存在するサンプルや安価な試薬などを有効活用することによって、平成24年度に使用したビオチン交換等の実験の経費を当初の計画よりも約13万円少なくする事に成功した。一方で、サンプルの前処理や反応条件を工夫して、より高感度なビオチン交換反応を再度行うことによって重要な微量タンパク質を同定するための経費として、この約13万円を平成25年度に繰り越した。
微小管ダイナミクスの試験管内再構成

細胞骨格の一つである微小管は、構成要素であるチューブリンタンパク質が重合することにより形成される円筒状の繊維構造である。微小管はチューブリンタンパク質の重合・脱重合により伸長と短縮を繰り返す動的な重合体であるが、様々な細胞イベントにおける機能においては、複数のタンパク質による微小管プラス端の伸縮制御が必須である。細胞周期の間期においては伸長・短縮に加えて、ほとんど長さが変化しない休止状態を含み、3つの状態をランダムに繰り返す様子が観察される。一方、分裂期に入ると伸長速度や短縮頻度が上昇し、より動的になることが知られている。これまでに試験管内実験系で各制御タンパク質の分子活性が逐一調べられてきたが、いまだに間期の3状態や分裂期進入時に見られるより動的な状態への転換を再現できていない。前年度までに、ショウジョウバエ由来のチューブリンおよび5つの微小管制御タンパク質を用いて微小管動態の試験管内再構成を行った。その結果、5つの制御因子が存在する条件下では、間期に見られるランダムな3状態(伸長、短縮、休止)の遷移が再現された。本年度は、分裂期進入時の微小管動態の変化の再現を試み、分裂期特異的なタンパク質リン酸化酵素が微小管動態を制御している可能性を検討した。前年度までに構築した5つのタンパク質を含む試験管内実験にリン酸化酵素を加えて評価したところ、ある1つの分裂期特異的リン酸化酵素が微小管動態を制御しうることが明らかとなった。また、この時の変化は細胞内でこの酵素を阻害した結果と傾向が一致した。これらのことから、本研究で用いた5つのタンパク質が、細胞内の微小管動態を生み出す中心的なプレイヤーであり、分裂期においてはこれらのタンパク質がリン酸化修飾を受けることで微小管動態が変化することが示唆された。28年度が最終年度であるため、記入しない。α/β-チューブリンダイマーの重合体である微小管は、伸長と短縮を繰り返す動的な構造物であり、真核生物の生命活動の広範にわたって重要な役割を果たす。また、それには微小管結合タンパク質(MAP)による微小管プラス端の動態制御が必須である。これまで、複数のMAPとチューブリンを反応させることで微小管プラス端動態のin vitro再構成が試みられてきた。しかし、伸長期、短縮期、休止期がランダムに現れる細胞内の動態は再現されていない。また、細胞分裂期の動態は場所的に異なり、分裂期中心体から伸長する微小管(中心体微小管)は休止期が少なく動的なのに対し、分裂期染色体上の動原体に結合した微小管(動原体微小管)は低速度で伸長し続ける。これらの細胞周期や部位による動態の違いの分子基盤も明らかではない。本研究では、ショウジョウバエ細胞で微小管プラス端動態に影響を与えることが知られている5因子およびショウジョウバエS2細胞由来のチューブリンを精製し、in vitroの微小管動態再構成実験により解析した。その結果、全ての因子を反応させたときに伸長、短縮、休止を繰り返す微小管が生み出され、このときの伸長速度、短縮速度も細胞内のものに近い値が得られた。興味深いことに、動態の様式は因子の1つのタンパク質の濃度に依存して、大きく変化した。低濃度の条件では動的に伸長と短縮を繰り返しながら、ある頻度で休止期が観察された。また、高濃度の条件では短縮頻度が減少し、全体として緩やかに伸長する微小管が観察された。この結果から、微小管プラス端動態のin vitroでの忠実な再現に近づいたと考える。微小管はα/β-チューブリンダイマーの重合・脱重合により伸長と短縮を繰り返す動的な重合体であるが、様々な細胞イベントに応じた、複数のタンパク質による微小管プラス端の伸縮制御が必須である。細胞周期においては、間期には伸長・短縮期に加えて、ほとんど伸長、短縮をしない休止状態を含む3つの状態をランダムに繰り返す様子が観察される。一方、分裂期に入ると伸長速度やカタストロフ頻度が上昇し、より動的になることが知られている。これまでに試験管内実験系で各制御タンパク質の分子活性が逐一調べられてきたが、いまだに間期の3状態や、分裂期進入時に見られる、より動的な状態への転換を再現できていない。今年度は、ショウジョウバエ由来のチューブリンおよび5つの微小管制御因子を用いて微小管動態の試験管内再構成を行った。興味深いことに、5つの制御因子が存在する条件下では、間期に見られるランダムな3状態の遷移が再現された。また、各因子を除去する実験を行ったところ、あるひとつの因子を除去すると休止状態がほとんど認められなくなったことから、この因子が動的な微小管に休止状態を誘発するのに必須の因子であると結論した。保存された5つの因子が、細胞内の微小管動態を生み出す中心的なプレイヤーであることが示唆された。5因子を加えたin vitro再構成実験を行い、細胞内に近い微小管動態を生み出すことに成功した。この際、同種由来のチューブリンを用いることで、より理想的な再構成系が構築された。

細胞周期の間期においては伸長・短縮に加えて、ほとんど長さが変化しない休止状態を含み、3つの状態をランダムに繰り返す様子が観察される。一方、分裂期に入ると伸長速度や短縮頻度が上昇し、より動的になることが知られている。これまでに試験管内実験系で各制御タンパク質の分子活性が逐一調べられてきたが、いまだに間期の3状態や分裂期進入時に見られるより動的な状態への転換を再現できていない。前年度までに、ショウジョウバエ由来のチューブリンおよび5つの微小管制御タンパク質を用いて微小管動態の試験管内再構成を行った。その結果、5つの制御因子が存在する条件下では、間期に見られるランダムな3状態(伸長、短縮、休止)の遷移が再現された。本年度は、分裂期進入時の微小管動態の変化の再現を試み、分裂期特異的なタンパク質リン酸化酵素が微小管動態を制御している可能性を検討した。前年度までに構築した5つのタンパク質を含む試験管内実験にリン酸化酵素を加えて評価したところ、ある1つの分裂期特異的リン酸化酵素が微小管動態を制御しうることが明らかとなった。また、この時の変化は細胞内でこの酵素を阻害した結果と傾向が一致した。これらのことから、本研究で用いた5つのタンパク質が、細胞内の微小管動態を生み出す中心的なプレイヤーであり、分裂期においてはこれらのタンパク質がリン酸化修飾を受けることで微小管動態が変化することが示唆された。5因子を加えたin vitro再構成実験を行い、細胞内に近い微小管動態を生み出すことに成功した。この際、同種由来のチューブリンを用いることで、より理想的な再構成系が構築された。分裂期に活性化することが知られているキナーゼがリン酸化修飾により5因子(のうちのいくつか)の活性を調節し、微小管をより動的にしているのではないかとの仮説を検証すべく、in vitroとin vivoの実験を進める予定である。28年度が最終年度であるため、記入しない。現在は細胞周期や場所による微小管動態の違いの分子基盤を解明するため、タンパクの修飾状態が動態に影響するかを解析していく予定である。
平滑筋フィラメントリモデリングによる力学応答変調を「はかる」

平滑筋細胞における収縮フィラメント・リモデリングと細胞の力学応答の関係を定量的に検討する為に、力学特性を測定した標本の筋フィラメント構造の量的変化を電子顕微鏡観察、蛍光エネルギー移動法解析、電気泳動法等の手法を用いて測定した。更にX線回折法を用いて力学応答とフィラメント動態変化の同時測定を行い、筋フィラメント格子上配列に由来する反射が収縮・弛緩サイクルによって動的に変化することをとらえることに成功した。本研究では、高輝度光科学研究センター(SPring-8)および高エネルギー加速器研究機構(KEK)・放射光施設においてモデル平滑筋標本のX線回折実験を行い、標本の太いフィラメントと細いフィラメントのリモデリングの程度と力学応答を同時に「はかり」、両者の関係を定量的に評価する。又、研究代表者所属研究室で標本の詳細な力学特性測定・生化学特性の解析を行い、最終的には細いフィラメントと太いフィラメントのリモデリング動態と平滑筋収縮弛緩サイクルの関係を細胞・組織レベルで解明することを、本研究の具体的な研究目的とする。本年度の研究計画に基づき、以下の2項目の実験を実施した。1)モデル実験系開発モルモット盲腸紐の細胞膜を化学的に破壊したスキンド平滑標本を用いて、まずフィラメントリモデリングを可能にする実験系を開発した。太いフィラメントの解離を促す可能性がある様々なミオシンATPase阻害薬のうち平滑筋に対して強い作用持つブレビスタチンが、平滑筋スキンド標本の収縮を抑制する際に、太いフィラメント構造を長時問にわたって撹乱することを、筋収縮実験・光学顕微鏡および電子顕微鏡による形態観察から明らかにし、ブレビスタチン処理筋を実験モデルとすることに決定した。2) X線回折実験条件の設定平滑筋のX線回折像は非常に微弱であるため、筋フィラメント量の定量化には筋フィラメント由来反射が明瞭にあらわれる回折像を得る必要がある。そこで、そのための予備実験として、標本厚、標本伸展の程度・実験温度・ATP濃度・X線照射強度・X線照射時間・X線照射面積などを変え、もっともはっきりとしたコントラストが明瞭な筋フィラメント由来反射が観察される実験条件を決定した。具体的には、非常に高輝度の放射光施設であるSPring-8(兵庫県佐用町)の理化学研究所所有の生体試料専用ビームライン、BL-45XU小角散乱ステーションにて、モルモット盲腸紐スキンド標本のX回折実験を3回行った。更にブレビスタチン処理筋のX線回折を行い、リモデリングに伴うX線回折像変化を捉えることに成功した。1)X線回折実験条件の設定:まず、昨年度に引き続き標本厚、標本伸展の程度・実験温度・ATP濃度・X線照射強度・X線照射時間・X線照射面積などを変え、もっともはっきりとしたコントラストが明瞭な筋フィラメント由来反射が観察される実験条件を決定した。具体的には、高輝度放射光施設であるSPring-8(兵庫県佐用町)の理化学研究所所有の生体試料専用ビームラインBL45XU小角散乱ステーションで4回、また大学共同利用機関法人・高エネルギー加速器研究機構・放射光実験施設BL-15A小角散乱ステーションにて、モルモット盲腸紐スキンド標本のX回折実験を1回行った。2)弛緩・収縮・硬直サイクルに伴うX線回折像変化の測定:Ca^<2+>非存在下での弛緩条件のみならず、3μMCa^<2+>存在下で収縮反応時、又、ATP非存在下でいわゆる硬直条件が出現した状態におけるX線回折像を記録した。特に硬直条件時にミオシン主体の太いフィラメントとアクチンフィラメントおよび制御タンパク質で構成される細いフィラメント由来の反射パターンに変化がみられ、いわゆるフィラメント・リモデリングが平滑筋細胞で可逆的に起こっていることが確認された。(財)高輝度光科学研究センター(SPring-8)および大学共同利用機関法人・高エネルギー加速器研究機構(KEK)の放射光実験施設において、本研究代表者(渡辺)及び連携研究者(石田行知文京学院大学教授、木村雅子東京慈恵会医科大学助教)が細胞膜を化学的に除去したスキンド平滑筋標本のX線回折実験を行い、標本の太いフィラメントと細いフィラメントのリモデリングの程度と力学応答を同時に「はかり」、両者の関係を定量的に評価した。本年度は特に、X線回折像における赤道反射に着目してその由来を検討した。従来、盲腸紐の幅広の赤道反射は、11-12nm周期の細いフィラメント格子様配列に由来するとされ、生筋活動時の反射強度増強が観察されてきたが、定量的な解析が行われていないからである。そこで今年度は、1)11-12nmにピークを持つ反射の他に筋フィラメント配列由来の赤道反射が存在するか確認すること、2)筋フィラメント配列由来の赤道反射強度の定量的な解析を行うこと、を目的として、イメージングプレートに記録した赤道反射パターン分析を解析ソフトウエアMATLABを用いて行った。【結果と考察】