hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ミコール酸含有細菌が刺激する放線菌の二次代謝産物生産の分子機構と普遍性

放線菌は医農薬として利用される有用天然物の生産者であり、近年のゲノム解析から一菌株当り20以上の有用天然物を生産する能力があることが示唆されている。本課題ではミコール酸含有細菌による放線菌休眠二次代謝遺伝子の活性化機構に関わる遺伝子の同定を目的に研究を行った。共培養時の網羅的転写再解析の結果、放線菌転写変動遺伝子の数は8時間で全遺伝子の約2割にも及んだ。また、非応答性の放線菌変異株スクリーニングを行い、現在16株のゲノムリシーケンスからいくつかの二次代謝産物生産に関わる変異遺伝子の同定に至った。今後の更なる解析により活性化の分子機構を明らかにすることを現在目指している。本研究ではモデル放線菌Streptomyces coelicolor A3(2)とミコール酸含有細菌(Tsukamurella pulmonis TP-B0596など)の接触を介した作用による、S. coelicolorの二次代謝産物(REDなど)の生産活性化機構を分子レベルで明らかにすること、また同様の接触様式による微生物間の他者認識機構の普遍性を明らかにすることを最終目的とした研究の一環として以下の実験を遂行した。Streptomyces coelicolor A3(2)とミコール酸含有細菌の相互作用に関して、申請書作成時までに行った網羅的転写解析において見いだされた変動遺伝子に関して、いくつかの遺伝子破壊株を作製し、放線菌の色素生産応答性を確認する実験を行った。しかしながら、期待する表現型形質をいずれも示さなかった。そこで重イオンビームを用いた放線菌突然変異株ライブラリーを作製し、その内15万コロニーをスクリーニングし、約130個の非応答性株の選抜に成功した。また、より詳細な放線菌の遺伝子発現変動を調べるために、経時的なRNA-seq解析を行い、発現遺伝子の動的な変動を観察した。舳倉島由来自然分離株とMACBの相互作用に関して、自然界より、放線菌とミコール酸含有細菌の組み合わせで分離された二組について高分解能質量分析器を用いて網羅的代謝産物解析を行った。分子ネットワーク解析などから、特異的に生産される代謝産物を同定した。また走査型電子顕微鏡などを用いた観察から、その共凝集様の相互作用様式を観察した。Streptomyces coelicolor A3(2)とミコール酸含有細菌の相互作用に関して、申請書作成時までに行っていた網羅的転写解析において見いだされた変動遺伝子に関して、いくつかの遺伝子破壊株を作製し、放線菌の色素生産応答性を確認する実験を行った。応答に関与する遺伝子が変動を伴わないもの(二成分制御系の膜蛋白質など)であること、また、二つ以上が同時に関与する可能性が示唆された。二次代謝産物の生産能力、形態や一次代謝への影響のないものを選抜し、8株の優良候補株を選抜に至っている。また、より詳細な放線菌の遺伝子発現変動を調べるために、経時的なRNA-seq解析を追加で行い、発現遺伝子の動的な変動を観察し、解析を進めている。分子ネットワーク解析などから、複数の特異的に生産される代謝産物のイオンの同定に至った。また走査型電子顕微鏡などを用いた観察から、その共凝集様の相互作用様式を観察し、現在接触依存性の刺激により起こる代謝変動の解析を進めている。放線菌のミコール酸含有細菌に対する二次代謝応答機構について、モデル放線菌を用いた解析を行った。当初の研究計画では複合培養時の放線菌網羅的転写解析の結果をもとに発現変動遺伝子を不活化するアプローチにより、ミコール酸含有細菌に対する放線菌Streptomyces coelicolorの二次代謝活性化応答に関与する遺伝子を同定する計画を立てた。しかしながら活性化遺伝子の中で候補遺伝子を選抜し、その変異株を取得し、二次代謝応答性試験を行ったが野生株の応答性と比較し、有意な変化を生じる変異株は得られなかった。また網羅的転写解析により同定された活性化遺伝子の上流非翻訳領域の推定プロモーター領域をクローニングしたレポーターアッセイも成功しなかった。そこで順遺伝学的手法を用いた遺伝子の同定を試みた。これまでにランダム変異株ライブラリーを重イオンビームを変異源として作製し、約15万株のスクリーニングから有望な非応答性の放線菌変異株を59株取得した。現在16株のゲノムリシーケンスを行い、それぞれの変異株の変異点の同定に至った。放線菌のミコール酸含有細菌に対する二次代謝応答機構についてその普遍性を検証するために、自然共分離菌を用いて解析を行った。舳倉島由来共分離菌の中で見いだされたStreptomyces属放線菌とMycobacterium属細菌の組み合わせを解析した。二種類の菌は共培養時にモデル菌の例と同様に共凝集することがSEM観察などから明らかになった。二層式フラスコ培養を用いた培養では、互いが接触する条件でのみ枯草菌に対する抗菌活性物質が生産されることが明らかになった。本活性物質は特徴的なUV吸収やマス強度を有していなかったため、容易に同定できず、構造決定に至ってないが、現在活性を指標に単離精製を試みている。

放線菌は医農薬として利用される有用天然物の生産者であり、近年のゲノム解析から一菌株当り20以上の有用天然物を生産する能力があることが示唆されている。本課題ではミコール酸含有細菌による放線菌休眠二次代謝遺伝子の活性化機構に関わる遺伝子の同定を目的に研究を行った。共培養時の網羅的転写再解析の結果、放線菌転写変動遺伝子の数は8時間で全遺伝子の約2割にも及んだ。また、非応答性の放線菌変異株スクリーニングを行い、現在16株のゲノムリシーケンスからいくつかの二次代謝産物生産に関わる変異遺伝子の同定に至った。今後の更なる解析により活性化の分子機構を明らかにすることを現在目指している。Streptomyces coelicolor A3(2)とミコール酸含有細菌の相互作用。重イオンビームを用いた放線菌突然変異株ライブラリーを作製し、その内15万コロニーをスクリーニングし、約130個の非応答性株の選抜に成功した。二次代謝産物の生産能力、形態や一次代謝への影響のないものを選抜し、8株の優良候補株を選抜に至っている。この8株を含めた非応答性株を選抜し、ゲノムリシーケンス解析を行い、変異点を同定する予定である。さらに同定した変異遺伝子に関して、相補実験、組換え破壊実験を行い、遺伝学的形質と表現型について詳細に調査する。舳倉島由来自然分離株とMACBの相互作用。走査型電子顕微鏡などを用いた観察から、その共凝集様の相互作用様式を観察できた。このことから自然界より放線菌とミコール酸含有細菌の組み合わせで分離された二組についてさらに二層式フラスコ培養を組み合わせた培養抽出物に関して比較網羅的代謝産物解析を、分子ネットワーク解析などを用いて行い、二種類の細菌が混ざった状態でのみ特異的に生産される代謝産物の精製・構造決定を行う予定である。応用微生物学
神経筋疾患や虚弱高齢者を対象とした安定同位体によるエネルギー消費量と筋量の評価

エネルギー消費量は安静時代謝量と活動量により左右され、安静時代謝量は除脂肪量の影響を大きく受ける。しかし、神経筋疾患患者や虚弱高齢者では、除脂肪量中の筋肉量の減少が大きく、通常の2成分モデルにより評価した除脂肪量と安静時代謝量の関係を検討しにくい。一方で、神経筋疾患患者や虚弱高齢者では体重の低下が予後の悪化の原因となっているため、適切なエネルギー補給が重要である。本研究では、クレアチン安定同位体を使用して筋肉量を評価する方法について日本人向けのプロトコールの開発と国内での分析の整備、角度計による日本人虚弱高齢者向けの姿勢判別方法の整備をまず行う。あわせて、二重標識水法を使用して患者や高齢者のエネルギー消費量を測定し、筋肉量、病態、生活内容を考慮してエネルギー必要量を推定するための方法を検討する。1.クレアチン安定同位体を使用した筋肉量評価については、予備投与のサンプルを使用して、分析条件等を検討し、サンプルの分析が可能な状態となった。2.虚弱高齢者を対象とした介護者による活動内容把握のための質問紙についての論文が掲載された。加速度計、角度計を使用した姿勢判別については、一部、データを追加し、それらを含むデータの解析を終了した。3.定期的な採尿が困難な対象における二重標識水法における血液サンプルと尿サンプルの違いについて解析が終了し、論文作成中である。4.高齢者及び患者を対象として二重標識水法を使用してエネルギー消費量の測定データを収集中であり、一部のデータについては論文として公表した。各データの収集は順調に進んでいる。患者を対象とした二重標識水法による測定については、条件にあう患者さんのみの測定となるため、まだサンプル数が不足しているため、次年度も測定を継続する。高齢者については、姿勢判別のデータ及びの二重標識水法による測定はほぼ終了し、解析もすすんでいるので、次年度に論文投稿を目指す。クレアチンの安定同位体をもちいた筋量評価については、当初、サンプルの分析方法の確立が遅れていたが、今年度、分析が可能となった。次年度、実際の測定に向けた食事、採尿時間、採尿日、採取後の保管などの各種条件設定のための検討を行う。1.患者のエネルギー消費量の測定については、今後も条件にあう患者のリクルートを進め、できるだけ次年度の早い時期にデータ数を集め、取りまとめができることを目指す。2.高齢者を対象とした姿勢判別のデータ及び二重標識水法のデータについては、データ数は足りており、解析もほぼ終了したので、次年度に論文投稿を目指す。3.二重標識水法における血液サンプルと尿サンプルの比較においては、解析は終了しており、論文化がやや遅れているが次年度の論文投稿を目指す。4.クレアチンを使用した筋量評価については、サンプルの分析が可能な状況となったので、食事、サンプル後の保管方法、サンプリングのタイミングなど測定条件を確立するための検討を次年度行う。本研究では、クレアチン安定同位体を使用して筋肉量を評価する方法について日本人向けのプロトコールの開発と国内での分析の整備、角度計による日本人向けの姿勢判別方法の整備を行い、患者や高齢者における二重標識水法によるエネルギー消費量を測定し、筋肉量の変化及び行動内容との関係を明確にすることを目的としている。当初の予定に比べて、各機材の購入と倫理審査に時間がかかり、予定が遅れたが平成28年度として以下の内容を行った。1.クレアチン安定同位体を使用した筋肉量評価については、採尿時間や食事の影響を検討するための予備実験について、検討すべき内容の文献的整理を行い、倫理審査を終了し、予備実験のための投与と尿サンプルの収集を開始した。2.虚弱高齢者を対象とした介護者による活動量把握のための質問紙を用いた方法のデータ収集を行った。また、加速度計及び角度計による姿勢判別については、虚弱高齢者や患者特有の動作についてのデータを収集した。二重標識水法については、血液サンプルと尿サンプルによる測定値の比較を行った。本測定のために購入した安静代謝量測定用の呼気代謝計について予備測定を行った。所属施設の統合により機器の購入手続きに時間を要したこと、輸入機器のためメーカー側の機器の手配にも時間がかかった。また、倫理審査規定の変更により、倫理委員会のスケジュールが変わったため倫理審査が予定よりおくれた。そのため、平成28年夏に予定していた予備実験ができなくなり、平成28年度末から29年度にかけて予備実験を開始した。平成28年度の研究費について繰越をしたが、平成28年度中に実施予定内容は、ほぼ平成29年夏までに終了した。

1.クレアチン安定同位体を使用した筋肉量評価については、採尿時間や食事の影響を検討するための予備投与が終了した。現在、サンプルの分析中であるが、分析の精度管理に時間を要している。この解析結果をもとに日本人の食事条件に適して、負担の少ないプロトコールを開発する。2.虚弱高齢者を対象とした介護者による活動量把握のための質問紙の検討が終了し、論文投稿中である。加速度計及び角度計による姿勢判別については、虚弱高齢者や患者特有の動作についてのデータの収集が終了し、姿勢判別精度に関する解析中である。尿サンプルと血液サンプルを使用した場合の違いについては、2017年5月のAsian and Oceanian Congress of Child Neurologyで発表し、論文作成中である。3.当初は、クレアチンによる筋肉量評価方法が確立した後に姿勢判別を含めて、エネルギー消費量測定の予定であったが、筋肉量評価方法の確立に時間を要している。そのため、筋肉量評価方法のプロトコール確立を待たずに、研究代表者及び研究分担者の施設での倫理審査を開始した。倫理審査が終了した施設においては、虚弱高齢者と患者のエネルギー消費量の測定を開始した。クレアチン安定同位体を使用した筋肉量評価については、サンプルの分析精度の確立に時間を要しているが、クレアチン安定同位体による筋肉量評価は国内では初の試みであるため、分析が順調に進まない可能性は当初より予測された。その他の質問紙の検討、加速度計、角度計による姿勢判別、尿サンプルと血液サンプルの比較は順調に準備が進んだ。倫理審査も終了し、虚弱高齢者及び患者の測定を開始したので、おおむね順調と判断した。エネルギー消費量は安静時代謝量と活動量により左右され、安静時代謝量は除脂肪量の影響を大きく受ける。しかし、神経筋疾患患者や虚弱高齢者では、除脂肪量中の筋肉量の減少が大きく、通常の2成分モデルにより評価した除脂肪量と安静時代謝量の関係を検討しにくい。一方で、神経筋疾患患者や虚弱高齢者では体重の低下が予後の悪化の原因となっているため、適切なエネルギー補給が重要である。本研究では、クレアチン安定同位体を使用して筋肉量を評価する方法について日本人向けのプロトコールの開発と国内での分析の整備、角度計による日本人虚弱高齢者向けの姿勢判別方法の整備をまず行う。あわせて、二重標識水法を使用して患者や高齢者のエネルギー消費量を測定し、筋肉量、病態、生活内容を考慮してエネルギー必要量を推定するための方法を検討する。1.クレアチン安定同位体を使用した筋肉量評価については、予備投与のサンプルを使用して、分析条件等を検討し、サンプルの分析が可能な状態となった。2.虚弱高齢者を対象とした介護者による活動内容把握のための質問紙についての論文が掲載された。加速度計、角度計を使用した姿勢判別については、一部、データを追加し、それらを含むデータの解析を終了した。3.定期的な採尿が困難な対象における二重標識水法における血液サンプルと尿サンプルの違いについて解析が終了し、論文作成中である。4.高齢者及び患者を対象として二重標識水法を使用してエネルギー消費量の測定データを収集中であり、一部のデータについては論文として公表した。
リンパ球の増殖・分化の制御及びその白血病化についての分子生物学的研究

本年度の成果は以下の如くである。(1)IL2受容体からのシグナル伝達機構に関して、IL2依存性ヒトT細胞株からTPA依存性ならびにCT依存性変異株を樹立し、これらの細胞を用いてIL2依存性増殖シグナル伝達機構においてCキナーゼ、Aキナーゼの関与しない伝達機構の可能性を示した。またヒトIL2Rβ鎖に対するマウス単クロン抗体を作製し、高親和性IL2Rの解析を促進した。(2)IL5受容体高発現細胞株を樹立し、IL5受容体に対する単クロン抗体を作製した。低親和性IL5レセプター(分子量約4.65万)に新たに同定された分子量12万の附加分子が関与することにより高親和性レセプターを形成する可能性を示した。また分子量約6万のIL5結合分子に対する単クロン抗体を作製した。現在IL5レセプターをコードするcDNAをクローニング中である。(3)IL6cDNAをマウスB細胞株に発現ベクターを用いて導入し、IL6を持続的に分泌し、IL6依存性に増殖する(オートクリン)B細胞株を樹立した。このオートクリン機序によって増殖する細胞株を同系マウス及びヌードマウスに接種し、強い造腫瘍性を有することを示した。(4)LGL(NK/T)細胞株を確立し、各発生段階におけるLGLについてT細胞レセプター遺伝子等の発現状況を調べた。ヒトIL2トランスジェニックマウスにおいて強いNK活性を示すLGLが選択的に肺、脾臓等の諸臓器および末梢血中において増加することを明らかにした。またIL3/IL2の組合せでは胸腺外でのT細胞型コミットメントが、IL7/IL2の組合せでは胸腺内において選択的な細胞増殖が誘導されることを示した。(5)骨髄ストロマ細胞のB細胞増殖支持能がIL7の産生能と密接に連携していることを示した。ストロマ細胞の増殖因子産生誘導に血液細胞との相互作用が必要であることを明らかにした。(6)ヒトH鎖エンハンサー内に新たなB細胞特異的に機能し得るDNAエレメントを同定した。新たに同定されたエレメントは、それ単独でB細胞特異的な遺伝子発現を誘導することを示した。このDNAエレメントの機能とB細胞分化との関連を解析した。また同エレメントに結合する核蛋白がB細胞に存在することを示した。
アルミニウムと共役電子系の複合化に立脚した反応開拓

本研究では、アルモールを始めとした含アルミニウム共役電子系化合物の創製と、小分子活性化に基づく物質変換反応への応用を検討した。アルモールを配位子とした遷移金属錯体の開発においては、アルモールー鉄錯体の合成に成功し、その構造を明らかにすることができた。また、アルモールと種々の小分子との反応を検討したが、アルキンやニトリルなどの一部の分子については反応の進行を確認したものの、水素や一酸化炭素といった無機小分子との反応の進行は認められなかった。さらに、アルミニウムとリンを含む共役電子系化合物としてAl=P二重結合化合物であるホスファアルメンの合成についても検討を行い、その前駆体を得ることに成功した。本研究では、アルミニウムと共役電子系を複合化した含アルミニウム共役錯体を用いた新規な物性・反応性開拓を目的としている。平成28年度の研究では、申請者がこれまでに見出したアルマシクロペンタジエン(アルモール)を用いた錯体形成を検討したところ、鉄カルボニルとの反応によってアルモールがパイ配位した鉄錯体が定量的に得られることを見出し、その構造をX線結晶構造解析により明らかにした。本錯体はアルモール環がブタジエン配位子として鉄に配位した構造を有し、アルミニウムと鉄の間には結合は見られなかった。本錯体とピリジンなどのルイス塩基との反応では、アルミニウム上にルイス塩基が配位した錯体が生じることが分かった。鉄に結合しているカルボニル配位子の交換についても検討を行ったが、光照射または加熱条件でホスフィンを作用させたところ、アルモール配位子が解離することが見出された。触媒反応への利用にあたっては、アルモール配位子と遷移金属との結合を強める必要があると考えられる。平成28年度から研究機関が現所属の茨城大学に変更となり研究環境が大きく変わったため、これまでの研究に加え空気や水に対し安定なアルミニウム共役錯体についても研究を開始している。具体的には、電子不足なアルミニウムポルフィリン錯体の開発とルイス酸としての応用について検討を行っており、新規なカチオン性アルミニウムポルフィリン錯体の発生に成功した。現在、本カチオン性錯体の単離構造決定、および触媒反応への利用を検討している。平成28年度から現所属の茨城大学に異動となっており、研究環境立ち上げに時間を要した。特に本研究で必須である高反応性化学種の取り扱いに必要な実験設備が無く、特殊ガラス器具を始めとする実験装置の導入が必要であった。平成28年度内に必要な実験設備の整備がほぼ完了したので、平成29年度から本格的に研究着手が可能となった。平成29年度の研究では、昨年度に発生を確認していたカチオン性アルミニウムポルフィリン錯体を用いた分子変換を検討した。具体的には、カチオン性アルミニウムポルフィリン錯体に対し、種々のカルボニル化合物と求核剤(有機ケイ素化合物など)を作用させ、カルボニル化合物への求核剤の付加を検討した。カチオン性錯体とカルボニル化合物の錯形成が起こっていることをNMR、UV/vis、およびIRスペクトルで確認したが、引き続く求核剤との反応は確認できず、錯体によるカルボニル基の活性化が不十分であることが示唆された。また、カチオン性錯体を種々のルイス塩基と錯形成させ、それらの単離構造決定を検討したが、良好な単結晶が得られず構造決定には至っていない。本研究では、含アルミニウムシクロペンタジエン(アルモール)の遷移金属錯体の合成と触媒反応への利用を検討した。目的とするアルモール金属錯体の合成と構造決定には成功したものの、錯体の安定性が低く、触媒反応の途中で錯体の分解が起こってしまうことが分かった。今後の展開としては、アルモール骨格に遷移金属との結合を補助する配位部位を追加することで、アルモール金属錯体の安定性の向上をはかる必要がある。具体的には、筆者が以前に報告したアルミニウム上にハロゲン置換基を持つアルモール誘導体を原料とし、アルミニウム原子上での求核置換によって、アルミニウム上に配位可能な官能基を導入することが挙げられる。また、茨城大学に異動後は、安定なアルミニウム錯体としてアルミニウムポルフィリン錯体を用いた触媒反応を検討した。新規なカチオン性アルミニウムポルフィリン錯体の合成に成功し、種々のルイス塩基との錯形成が可能であることを見出した。カルボニル化合物の活性化への利用を検討したが、目的とした分子変換反応には成功しておらず、ポルフィリンの修飾などによる反応性の制御が必要である。平成28年度の研究で新規なアルミニウムポルフィリン錯体の合成に成功しており、本錯体の単離構造決定を進めるとともに、ルイス酸触媒への利用を検討する。特に、アルミニウムとフッ素の高い親和性を活かして、安定結合の一つであるC-F結合の活性化による分子変換反応への利用と触媒化を検討する。

なお、上述の通り現所属である茨城大学にはグローブボックスを始めとした高反応性化学種取り扱い設備が不足しており、空気や水に比較的安定なアルミニウム錯体を用いた研究を主に推進する予定である。有機典型元素化学平成28年度より茨城大学に異動となり、研究に必要な実験設備の導入が必要となったが、特殊ガラス器具の一部の製造・導入が予定よりも遅れたため、発注・購入を次年度に行うこととし、必要な予算を次年度使用分として繰り越した。上記のとおり、本研究計画に必須である特殊ガラス器具の発注を平成29年度初頭に行う。平成28年度より繰り越した予算と合わせて、真空ラインなどの不安定化学種取り扱いに必須であるガラス実験装置の導入を行う。
戦後初期のドイツ専門裁判所における私人間効力論の展開――リュート判決を軸として

本課題は、ドイツにおける基本権の私人間効力論の展開に関し、連邦憲法裁判所とその他の裁判所および学説との間でどのような相互の影響関係があったのかという問題につき、憲法解釈論や司法政治学の視点から検討を行うというものであった。しかしその前提としての日本の私人間効力論の整理・検討に時間をとられ、その検討だけで研究期間が終了することになった。その概要は以下の通りである。戦後日本における私人間効力論は、三菱樹脂事件において最高裁(1978年)が間接効力説を採用したことで決着したと考えられている。だが私人間での基本権侵害といえる事例は戦後直後から取り扱われていた。それらの事例を見ると、民法上の一般条項などの解釈に憲法を反映させる間接効力説の形をとることが多かった。その大きな要因としては「使い勝手の良さ」が挙げられる。しばしば、日本の裁判所は柔軟な解決を可能とする判断枠組みを好む傾向にあると指摘される。直接効力説では判決が基本権によって縛られやすくなり、他方、無効力説では基本権を判決に反映させることが難しくなる。したがって事案によって基本権を使う/使わない、あるいはその程度を裁判所がコントロールしやすい間接効力説を裁判所が選択することは自然だったといえる(この点はドイツの裁判所も同様であろう)。また、日本には通常裁判所しか存在しないが、ドイツでは裁判所に複数の系列が存在しているため、憲法裁が介入するには当該事件に憲法問題が含まれる必要があり、私人間効力論を早い時期に確立する必要があったと考えられる。他方、日本ではその必要がなかったため、私人間効力に関する解釈枠組みを早く確立する動機が裁判所に生まれにくかったと思われる。三菱樹脂事件がその舞台に選ばれたのは、学説内での議論の高まりや、当該事件への世論の関心の高まりなどが組み合わさったことが理由ではないか、というのが本研究の推測である。初年度は以下の3点について取り組んだ。第一に、研究を進める上で最低限必要な基礎的文献(ドイツや日本の憲法学のコンメンタール、体系書、研究書など)の収集・整備である。これに関しては一定実現できたと考える(具体的には『ドイツ国法学ハンドブック』、マンゴルト=クラインの『基本法コンメンタール』など)。ただし、依然として文献やデータベース等に関し不足があるため、2年度以降も引き続き文献等の収集・整備に努めていきたい。第二に、私人間効力論に関する日本の憲法学説の整理を行った。まずは先行文献などを基に、戦後における日本の私人間効力論の展開を整理することに努めた。その結果、戦後においては私人間効力論が予想以上に継続的に論じられてきたことを確認できた。また、その成果の一部として、住友セメント女性結婚退職制事件などといった企業内の性差別に関する判例を整理し、さらにそれらに関する憲法学説の問題点を検討し、拙稿「周辺化された人々と人権」(佐々木弘道=宍戸常寿(編著)『現代社会と憲法学』所収)などの形で公表することができた。第三に、私人間効力論(および基本権保護義務論)に関するドイツの学説の整理を行った。この点は科研費獲得前から取り組んできたが、その成果の一部を、「ドイツ公法学における「国家の暴力独占」論と基本権保護義務論」として民主主義科学者協会法律部会・憲法分科会・夏合宿において発表することができた。交付申請書の研究計画・方法に記載した課題である「コンメンタールやデータベース、日独の基本文献など、研究基盤の整備」、「戦後日本の憲法学における私人間効力論の整理」、「収集した資料を基に、194060年代を中心とした、ドイツの民法・労働法学説における私人間効力論の整理」を、上記のごとく概ね進めることができたと考えるため。本年度の研究については以下の3点が挙げられる。第1に、昨年に引き続き研究に必要な文献収集を行った(主に、日本とドイツの憲法学に関する文献)。ただし、大型の文献は概ね昨年度収集したので、今年度はそれほど多くの量にはならなかった。また、論文・書籍などに関しては、十分な検索を行うことができなかった。第2に、昨年度に引き続き日本の私人間効力論に関する調査を行った。ただし、二次文献が中心で、戦後直後の資料を直接調査することはほとんどできなかった。したがって、調査結果を論文などで公表することもできなかった。本来、日本に関する調査は本年度で終わらせてドイツに専念する予定だったので、この点は大きな反省点である。第3に、ドイツの私人間効力論に関する調査はほとんど行えなかった。また、当初の予定ではドイツに文献調査に行くはずだったが、昨年度に引き続き実現できなかった。これも反省すべき点である。概して今年度は、当初の予定と比べて研究が遅れ、進捗しなかったといえる。その理由としては学内業務の増加や、科研費以外の研究に時間を要したこと、などが挙げられる。だが、最大の理由は2年目になって自分の中に緩みが生じ、科研費の研究がつい後回しになってしまった点にあると考える。次年度以降は、当初の計画を修正し、遅れを取り戻せるように努めたい。また、国内外の研究会への参加、成果の公表などに積極的に取り組んでいきたい。本年度は「戦後日本の憲法学における私人間効力論」について論文を公表し、ドイツの連邦憲法裁以外の裁判所における私人間効力に関する判例収集・整理し、成果を公表する予定だったが、いずれも実現できなかった。今年度はドイツにおける憲法の私人間効力論を検討する前段階として必要な、戦後日本における初期の私人間効力論の検討を行った。

具体的には、まず日本における私人間効力論の第一人者である芦部信喜の学説を改めて検討した。日本では三菱樹脂判決(1973年)が有名であるが、最も早い時期に憲法の私人間効力論が意識された事件として東急電鉄判決(1951年)をあげることができる。芦部も本件を契機に私人間効力論の検討を本格化させていったことが改めて確認できた。戦後ドイツにおける私人間効力論の判例としてはリュート判決(1958年)が有名であるが、両判決とも「社会的権力」に対する名誉毀損が問題となっている点で共通している点、他方で、東急電鉄判決では表現の自由があっさりと退けられているのに対し、リュート判決では民主政への意義を考慮して表現の自由を重視している点が興味深い。本来であればすでにドイツにおける憲法の私人間効力の検討を終えているはずであったが、日本における戦後初期の議論で検討すべき内容が予想外に多かったため、まだ日本の議論の検討が終わっていない。本課題は、ドイツにおける基本権の私人間効力論の展開に関し、連邦憲法裁判所とその他の裁判所および学説との間でどのような相互の影響関係があったのかという問題につき、憲法解釈論や司法政治学の視点から検討を行うというものであった。しかしその前提としての日本の私人間効力論の整理・検討に時間をとられ、その検討だけで研究期間が終了することになった。その概要は以下の通りである。戦後日本における私人間効力論は、三菱樹脂事件において最高裁(1978年)が間接効力説を採用したことで決着したと考えられている。だが私人間での基本権侵害といえる事例は戦後直後から取り扱われていた。それらの事例を見ると、民法上の一般条項などの解釈に憲法を反映させる間接効力説の形をとることが多かった。その大きな要因としては「使い勝手の良さ」が挙げられる。しばしば、日本の裁判所は柔軟な解決を可能とする判断枠組みを好む傾向にあると指摘される。直接効力説では判決が基本権によって縛られやすくなり、他方、無効力説では基本権を判決に反映させることが難しくなる。したがって事案によって基本権を使う/使わない、あるいはその程度を裁判所がコントロールしやすい間接効力説を裁判所が選択することは自然だったといえる(この点はドイツの裁判所も同様であろう)。また、日本には通常裁判所しか存在しないが、ドイツでは裁判所に複数の系列が存在しているため、憲法裁が介入するには当該事件に憲法問題が含まれる必要があり、私人間効力論を早い時期に確立する必要があったと考えられる。他方、日本ではその必要がなかったため、私人間効力に関する解釈枠組みを早く確立する動機が裁判所に生まれにくかったと思われる。三菱樹脂事件がその舞台に選ばれたのは、学説内での議論の高まりや、当該事件への世論の関心の高まりなどが組み合わさったことが理由ではないか、というのが本研究の推測である。交付申請書の研究計画・方法に記載した2年目の課題である、「連邦憲法裁以外の裁判所、とりわけ連邦通常裁と連邦労働裁の私人間効力に関する判例収集・整理」に取り組んでいきたい。また、引き続き研究基盤(基本文献など)の整備を行っていきたい。まずは「戦後日本の憲法学における私人間効力論」についてまとめ、成果を公表することを目指す。
キアリ奇形の発生機序と胎内手術の可能性について

平成7年度胎生12日に手術をし、胎生14日に胎児を取り出して検索した。25胎児中13胎児が生存していた。このうち9胎児に神経管閉塞不全がみられた。透過光による観察では、外科的に二分脊椎を作成した胎児ではコントロールに比較してテント上・テント下の脳室ならびに脳表くも膜下腔のスペースがかなり狭かった。これに対して二分脊椎を作成しようとしたが結果的に作成しえなかった胎児では、テント上下の脳室・脳表くも膜下腔のスペースは、コントロール群との間に差は認めなかった。組織学的には上記の結果が確認された。頭蓋頚椎移行部を観察するとChiariII型奇形と判定しうる所見は見られなかったが、脳幹の変形、後頭蓋窩内容の尾側への偏位などのChiariII型奇形様の変化がみられた。平成8、9年度胎生12日に手術をし、胎生16日に胎児を取り出して検索した。2胎児のみが生存していた。このうち1胎児に神経管閉鎖不全がわずかにみられた。透過光による観察では、外科的に二分脊椎を作成した胎児ではコントロールに比較して胎生14日に取り出したものと同様、脳室、脳表くも膜下腔のスペースがかなり狭かった。頭蓋頚推移行部を観察するとChiariII型奇形と判定しうる所見は見られなかったが、脳幹の変形、後頭蓋窩内容の尾側への偏位などのChiariII型奇形様の変化がみられた。しかし明瞭にChiariII型奇形と言える所見ではなかった。われわれはこれまでに先天性二分脊椎マウス(delayed Splotch,Spd/Spd)やビタミンA誘発二分脊椎マウスモデルで、胎生初期の脳室が正常マウスの脳室に比べて小さいことを報告し、McLoneらの仮説(Unified theory)と同様の考えを持っている。また、取り出した胎児を外科的に手術することで作製したspina bifidaのマウスモデルでも胎生の比較的早い時期には正常のマウスに比べて脳室の発達が著しく悪いことを観察し報告した。平成6年までの研究では、C57系のマウスで胎生12日に体内手術を施行し、胎生14日まで継続培養(腹腔内)することで、脊髄レベルに髄膜瘤様の変化を作成できたマウスではコントロールマウスに比べ、頭蓋内の容積、特に髄液腔の狭小化が認められていた。われわれの今までの研究では、脊髄髄膜瘤に伴うChiari奇形では、その原因に髄液循環動態の変化の存在することが示唆されている。平成7年は、さらに胎生16日まで継続培養することで、数匹の胎児で、後頭蓋窩内容の脊髄内への陥入と思われる解剖学的な変化が認められた。このことは、前記の仮説を裏付ける所見と思われる。平成8年は、さらに手術する胎児の数を増やし、これらの所見が、統計学的に意味のあるものか否かを検討する。さらに、これらの所見が、先天的に脊髄や脳に奇形を有するSpd/Spdマウスの所見とどのような点で相違があるかまた類似性があるかを検討する。今までの、最大の問題点は、胎内手術の困難さである。これは、単に手術の困難さのみならず、その後の、胎内培養の困難さが克服されていないためと思われる。平成8年度:胎内手術を継続し、脊髄を胎生の比較的早い時期に、手術をしたら、後頭蓋窩にどのような変化が生じるかを調べる。さらには、Spd/Spdマウスの後頭蓋窩の変化と比較検討する。平成9年度:胎内手術を施行したマウスの手術部位ならびに後頭蓋窩を免疫組織学的に検索する。さらに、これらの結果をSpd/Spdマウスと免疫組織学的に比較検討する。

C_<57>/_<b1>妊娠マウスを使用し、その胎児の脊髄を皮膚と同時に切開し、exo-uteroに培養する実験を行ってきた。胎生12日に体内手術をし、胎生14日まで腹腔内で培養した結果は既に報告した。すなわち上記処置で脊髄レベルに髄膜瘤様の変化を作成しえた。マウスではコントロールマウスに比して頭蓋内容積、特に髄液腔の狭小化がみられた。培養を16日まで継続した数匹の胎児では後頭蓋窩内容の脊椎管内への陥入と思われる所見がみられたが、統計学術処理をしうるまでには至っていなかった。もしこれが明らかとなればキアリ奇形は脊髄髄膜瘤のために髄液が抜け、その結果二次的に生じるものであることが立証されることになる。これまでの所、胎生12日に処理し、16日まで培養を継続することを試み、試料を増やそうとしたがなかなか困難であった。これは胎内手術の困難さと胎児培養の困難さとに起因するものである。胎内手術については胎生12日での処理の場合、使用器具・装置の改善、手術手技の改善・安定化によりかなりの成功率を得られるようになってきた。胎児培養についてはやはり長期培養に問題点が残り、今年度も完全には解決しえていない。当初は胎内手術、培養を繰り返していたが、2つの困難さが相乗すると考え、後には対象手術のみを行い技術的問題の解決をはかった。すなわち胎生12日に妊娠マウスを腹腔内投与全身麻酔下に開腹し、子宮壁を切開し胎児を取り出す。この胎児を脊髄切開をせずに再び腹腔内に戻し、胎生16日目に胎児を取り出し検索した。子宮壁の切開方法、処置する胎児の数などに工夫を加えることにより成績は少しずつ向上してきた。今年度は予定よりも遅れている胎生12日処理、16日まで培養群の数を増やし、統計処理まで持ってゆきたいと考えている。また、手術部位、後頭蓋窩を免疫組織学的に検索する。さらに脊髄を胎生のより早い時期に手術をし、後頭蓋窩にどのような変化が生じるか調べる。C_<57/b1>妊娠マウスを使用し、その胎児の脊髄を皮膚と同時に切開し、exo-uteroに培養する実験を行ってきた。今までに報告してきたように、胎生12日のマウスの胎児に手術を施行したところ(脊髄を縦切開する)胎生第14日までは比較的良好に育ち、かつ手術部に髄膜瘤を認めた例で後頭蓋窩の容積が狭小化していた。そこで、ヒトで見られるChiari奇形様の異常がマウスでも認められるか否かを調べる目的で、手術後の胎児をさらに長期に培養することを試みている。しかし、第15日目より長く胎内培養することが困難であった。第15日以降は当初は手術後胎児の死亡率がほぼ100%に達していた。その原因は明らかではないが、手術時に体温に近くした生理的食塩水を腹腔内に満たしたり、羊膜等をより愛護的に扱い、かつ切開した羊膜を胎児処理後に縫合することで死亡率が減ってきている。一年間に約100胎児を手術したが、その内胎児が生存しているものの、正常のコントロール群と比較して明らかに胎児の体長や体重が小さかったり、体の一部に異常が認められる個体が多く、後頭蓋窩の容積を正常群と比較出来るレベルまで達していない。その為に、胎生14日に得られたような有意なデータは得られなかった。前記のように、その原因は未だ明らかでないが、手術時に羊水が羊膜腔から抜けてしまうことが最大の因子であると思われた。徐々に手術・培養成績は向上してきているが、さらに技術の向上が必要であると考えられた。今後も、改良を加えていく所存である。
偏波と輻射輸送に基づく星形成過程の研究：星間磁場の解明

ハーシェル衛星と星間偏光観測から、分子雲がフィラメント状で星間磁場に垂直であることが示されている。垂直な磁場によって支えられた等温ガスの平衡形状を自己無撞着場の方法で計算し、重力に抗して支えられる最大の線質量を得た。この力学平衡状態の安定性について磁気流体力学シミュレーションを用いて解析した。フィラメント方向の揺らぎにある臨界波長が存在し、臨界波長より長い波長が不安定となること、また臨界波長の約2倍の波長が最も不安定となることが分かった。さらに、最も不安定な波長でフィラメントは分裂し、ガスが等温である限り、ほぼ軸対称で、磁場と垂直に伸びて、収縮を続ける擬円盤が形成されることが分かった。1、Herschel衛星によるダスト熱輻射の観測から、分子雲がフィラメント状の要素からなることが知られるようになった(Menshchikovら2010)。一方で、近赤外線領域の星間偏光の観測からは、このフィラメントが星間磁場に垂直であることが示された(Sugitaniら2011)。観測に対応する、垂直な磁場によって支えられた等温ガスの平衡形状(重力と「磁場によるローレンツ力」、圧力、及び、周囲の星間外圧の力学的釣り合い)を自己無撞着場の方法で計算し、重力に抗して支えられる最大の線質量λmaxを得た(Tomisaka 2014)。線質量が最大線質量以下のフィラメントに対して、予想されるダスト熱輻射の偏波構造、すなわち、星間磁場が連続波電波でどう観測されるかを調べた。熱輻射の偏波は星間磁場と垂直方向に星間ダストの長軸が整列していることによって生じる。観測する方向による予測される偏波の違いを調べた。フィラメントの軸をz軸、大域的な磁場の方向をy軸、この2つに垂直な軸をx軸と呼び、z軸からの角度θとx軸からの角度φで指定される任意の方向(θ, φ)から観測した時の偏波構造を計算するプログラムを開発し、フィラメントの偏波構造の特徴を調べた。2、磁場が星形成過程で与える影響を調べるために、非理想磁気流体力学シミュレーションを用いて分子雲コアの収縮と星・円盤の形成、またジェット・アウトフローの駆動について調べた。1、任意の方向(θ,φ)から観測したダスト熱輻射の偏波構造を計算するプログラムを用いて、力学平衡にある垂直な磁場を持つフィラメントの偏波構造を調べた結果、観測方向とフィラメントの中心と表面の密度比によって、いくつかの特徴的な解が得られることがわかった。たとえば、θ=80度、φ=90度、つまり、z方向に伸びるフィラメントのほぼ真横で、大局的な磁場Bの方向から観測した場合を見てみる。このとき、(1)フィラメントの中心と表面の密度比が10倍程度の低密度フィラメントの場合、一般に偏波は弱くなることが予想されたが、(2)密度比が300倍程度の高密度フィラメントの場合、磁場の方向から観測しているにもかかわらず、横向きに星間磁場が貫いているときの偏波構造を示すことがわかった。このことは、高密度フィラメントを考えることで、フィラメントの軸と星間磁場が垂直であるように見える観測例がたいへん多いことと対応している可能性がある。2、平衡状態にある分子雲コアからの重力収縮過程を非理想磁気流体力学シミュレーションによって調べた結果、(1)円盤の形成過程には、磁場の散逸が重要な役割を果たすこと。(2)磁場の再増幅によって原始星近傍から非定常の高速ジェットが駆動することがわかった。磁気流体力学とダスト熱輻射の偏波シミュレーションを組み合わせることで、星形成過程における磁場の役割を明らかにする研究の手がかりを得たと言うことができる。(1)星間雲の主要な存在形態であると考えられる横向きに磁場に貫かれたフィラメント状の形態について、力学平衡状態の安定性について磁気流体力学シミュレーションを用いて解析した。(A)初期に正弦波的な密度ゆらぎを加えても、無秩序な密度ゆらぎを加えても、収縮の様子に、収縮に要する時間以外は定性的な差は生じないことが分かった。(B)貫く磁場が強くない場合は、フィラメント方向の揺らぎにある臨界波長が存在し、臨界波長より長い波長が不安定となること、また臨界波長の約2倍の波長が最も不安定となることが分かった。(C)一方で、磁場が強い場合、(調査された範囲で)揺らぎが成長しなかった。これから、臨界的な磁場強度を超えると、どのような波長の揺らぎに対してもフィラメントは重力安定であることを示している可能性があることが分かった。(2)星形成後期過程での星周円盤の形成と進化を解明するために、3次元非理想磁気流体シミュレーションを用いて分子雲コアの進化の計算を行った。特に円盤への降着率と円盤形成の関係を調べるために、円盤へのガス降着率をパラメータとして計算を行い、降着率が高いほど後期段階のより早い段階で大きな円盤が出来ることを求めた。(1)平衡状態の安定性の調査を開始した。微少な密度ゆらぎを導入しそれの成長を非線形磁気流体力学シミュレーションによって調べる方法を取った。その結果、ジーンズ波長程度に分裂し、その中で起こる暴走的収縮を追跡できることが分かった。星形成の初期条件についての理解が深まった。

(2)星形成を数値シミュレーションと最新のALMA望遠鏡での観測結果を比較するために、シミュレーションの観測的可視化を行った。その結果、円盤の形状や、磁場の構造などをよく再現することが出来た。円盤の形状などの一部の結果は査読論文として出版済みである。また、磁場の構造に関する研究をまとめて論文として出版する予定である。1、Herschel衛星によるダスト熱輻射の観測から、分子雲がフィラメント状の要素からなることが知られるようになった。一方で、近赤外線領域の星間偏光の観測からは、このフィラメントが星間磁場に垂直であることが示された。観測に対応する、垂直な磁場によって支えられた等温ガスの平衡形状(重力と「磁場によるローレンツ力」、圧力、及び、周囲の星間外圧の力学的釣り合い)を自己無撞着場の方法で計算し、重力に抗して支えられる最大の線質量を得た。2、力学平衡状態の安定性について磁気流体力学シミュレーションを用いて解析した。(A)初期に正弦波的な密度ゆらぎを加えても、無秩序な密度ゆらぎを加えても、収縮の様子に、収縮に要する時間以外は定性的な差は生じないことが分かった。(B)貫く磁場が強くない場合は、フィラメント方向の揺らぎにある臨界波長が存在し、臨界波長より長い波長が不安定となること、また臨界波長の約2倍の波長が最も不安定となることが分かった。さらに、最も不安定な波長でフィラメントは分裂し、ガスが等温である限り、ほぼ軸対称で、磁場と垂直に伸びて、収縮を続ける擬円盤が形成されることが分かった。(C)一方で、磁場が強い場合、(調査された範囲で)揺らぎが成長しなかった。これから、臨界的な磁場強度を超えると、どのような波長の揺らぎに対してもフィラメントは重力安定であることを示している可能性があることが分かった。3、力を及ぼさない一様磁場と等温軸対称の円柱状密度分布を持つフィラメントの場合、この簡単化された平衡形状の安定性について、線形解析を行った。その結果、磁場が外側境界で固定されている場合は、重力不安定に対して、磁場によって顕著に安定化されることが見られた。一方で、外側境界で電流0の場合、安定化に寄与しない場合があることが分かった。ハーシェル衛星と星間偏光観測から、分子雲がフィラメント状で星間磁場に垂直であることが示されている。垂直な磁場によって支えられた等温ガスの平衡形状を自己無撞着場の方法で計算し、重力に抗して支えられる最大の線質量を得た。この力学平衡状態の安定性について磁気流体力学シミュレーションを用いて解析した。フィラメント方向の揺らぎにある臨界波長が存在し、臨界波長より長い波長が不安定となること、また臨界波長の約2倍の波長が最も不安定となることが分かった。非理想磁気流体力学シミュレーションとダスト熱輻射の偏波シミュレーションを車の両輪とし、(動的)計算で得られた磁場構造を観測される偏波構造に変換する道具立ての準備ができた。次年度、フィラメント状星間雲の動的収縮シミュレーションに取り組みその磁場進化および偏波構造進化を明らかにする事に取り組む。
痛み情報の化学計測とｉｎ　ｖｉｖｏ蛍光イメージング

痛覚や温度覚を担うバニロイド受容体のゲスト認識部位、及び補助的に作用するヘリックス上の結合部位(いずれもアミノ酸10量体)を含んだポリペプチドを分子設計し、基板表面への固定化のためにHisタグを組み込んだ人工ペプチドホストを合成した(VB-His、VB2-Hi)。VB-Hisは、匂い物質であるバニリンを認識して結合し、蛍光スペクトル応答を示した。VB2-Hisについても同様に検討したが、痛み物質であるカプサイシンと吸収が一致する問題があり、種々検討したが十分な結果が得られなかった。当初予定した分子イメージングは未達に終わったもののVB-Hisを利用した匂い物質センサーを開発することに成功した。末梢感覚神経に特異的に発現する温度受容体が持つ一過性受容体電位チャネルタンパク質のうち、バニロイド受容性サブタイプ(TRPV1)に着目し、その細胞膜結合部位のうち3番目と4番目のヘリックスが形成する受容器部位を抜き出して化学合成し、バニラ香の成分であるバニリン、あるいは辛み成分であるカプサイシンに対するホスト分子として利用することを試みた。ペプチドの分子設計にあたっては、トランスデューサーやナノ粒子などへの固定化のために、ヒスチジン(H)6量体も同時に組み込んだ:SEILFFVQS-HHHHHH-SLAMGWTNML(S3HS4)。均一系での円二色性スペクトル測定により、S3HS4は期待されるヘリックス構造をとることが確認できた。さらに、トリプトファン残基由来の強い蛍光を示すだけでなく、バニリンが共存すると蛍光強度が著しく低下することもわかった。これは、S3HS4とバニリンが会合することで起こる蛍光共鳴エネルギー移動によるものと考えられた。今後蛍光センシングへの応用が期待できる。次に、His-tag法と組み合わせてS3HS4を固定化することを試み、赤外吸収スペクトル測定、エリプソメトリーによる膜厚測定、さらには原子間力顕微鏡による分子イメージングにより表面のキャラクタリゼーションを行った。その結果、S3HS4は、金基板表面で自己組織化膜を形成することが明らかとなった。このような知見に基づき、水晶振動子重みセンサを用いた微小重量測定によりカプサイシンとの相互作用を検討したところ、10-4 Mレベルのカプサイシンと可逆的に結合することが分かった。カプサイシンは代表的な辛み物質であり、辛み物質応答は痛覚(痛み)が担っている。本研究の成果は、化学的な痛み物質センサーを実現していく上で重要な知見であり、極めて意義深いものと考えている。本研究では、痛覚や温度覚を担うバニロイド受容体(TRPV1)に注目し、痛みを定量的に表したり、炎症部位を特定したりできるようなバイオセンサーに取り組んだ。この目的に、TRPV1模倣ペプチドを合成して水晶振動子センサーに適用した。さらに、ペプチドホストの蛍光を利用した分子イメージングも視野に入れて研究を行った。1.新規ペプチドホスト分子の化学合成:TRPV1は6本のへリックスのバンドル構造を持ち、ゲストと相互作用するヘリックス(結合部位)と、それに対向して存在するもう1本のヘリックス(対向部位)がゲストを挟み込むようにして結合したモデルが提案されている。そこで、1)結合部位の10量体アミノ酸を抜き出したポリペプチド、2)そのヒスチジン六量体ハイブリッド、さらに3)結合部位と対向部位をヒスチジン六量体で繋いだバンドルペプチドを合成した。2.蛍光法によるバニロイドの結合平衡解析:結合部位ペプチドとHisハイブリッドについて、芳香族性アミノ酸残基由来の蛍光を利用してホストーゲスト相互作用を調べた結果、バニリンを結合して蛍光共鳴エネルギー移動現象を起こすことが分かった。バンドルペプチドではカプサイシンについても検討したが、両者のUV吸収がほぼ一致するため分離して定量することが出来なかった。非天然の蛍光性アミノ酸の利用や合成後修飾も検討したが、現在までのところ十分な結果は得られていない。このため当初予定した蛍光イメージングは未達に終わった。3.水晶振動子バニロイドセンサー:Hisハイブリッドとバンドルペプチドでは、His-tag法を利用すると自己組織的な表面修飾が可能であることが分かった。水晶振動子センサーと組み合わせたところ、バニリン、及びカプサイシンの検出がそれぞれ可能であった。いずれもサブmMレベルのゲスト分子に応答し、選択性も比較的良好であった。バイオ分析化学平成25年度は、1)TRPV1のへリックスバンドル結合モチーフの化学合成、2)蛍光スペクトル測定による結合平衡解析、および3)水晶振動子センサ、表面プラズモン共鳴センサを用いた結合挙動解析を計画した。このうち1)については、所定のペプチド(S3HS4)の合成に成功しており、また所定の性質を持つことも確認している。次に2)については、S3HS4はバニリン応答性を示すことを明らかにしている。

ただしカプサイシンについては、親化合物であるバニリンとは吸収スペクトルが大きき異なることが分かり、今後の検討を残している。最後に3)については、金基板表面でS3HS4が自己組織化するという想定外の結果を得た。これは、ヘリックスペプチドの自己組織化単分子膜形成という従来にない新たな超分子組織体の研究を拓くものであり、大変興味深いものと考えている。また、水晶振動子センサを用いて微小重量測定を行ったところ、カプサイシンの添加によりS3HS4単分子膜の重量が増加し、S3HS4がカプサイシンに対するホスト分子として機能することが分かった。以上のように、当初の研究計画をほぼ達成したことに加えて新たな超分子組織体を見出すことに成功しており、当初の計画以上に進展していると判断した。平成26年度は、1)培養細胞を用いたin vivoイメージング、および2)タンパク質発現系への組込みを計画している。またS3HS4のゲスト分子としてはバニリン、およびカプサイシンが対象である。このうち前者は想定した実験が可能であるが、後者はバニリンとは吸収スペクトルが大きく異なっておりそのままでは実験が出来ない。そこで、平成25年度の研究として、トリプトファンをダンシル基修飾リシンに置換することで蛍光特性の改善を試み、その結果、所定の新規ペプチドを得ることに成功した。今後は、膜融合性ペプチドであるアルギニン8重合体(R8)とのコンジュゲート化を利用して受容体ペプチドモチーフをRAW264.7(マウスの単球性白血病由来の細胞)に取り込ませることに着手する。蛍光顕微鏡観察下にてバニリンやカプサイシン投与に伴う蛍光イメージの変化を観察することを試みる。また、バニロイド化合物以外にも、プロトン(酸)、熱など他の侵害刺激を用いた場合の蛍光イメージの変化等も併せて検討する。申請者らは、以前からFmoc法を用いたペプチド固相合成反応を利用しており、原料については一定のストックがあった。また検討したペプチド化合物が想定外に効率良く合成出来たこともあり、細かな条件検討や繰り返し合成も必要なかった。一方、既設の水晶振動子バイオセンシングシステムに組み合わせる測定チャンバーを当該予算で購入できたことで測定の精度が向上し、この点も高額な消耗品の使用が少なくて済んだ。平成26年度には培養細胞を使った蛍光イメージングやタンパク質発現系への組込みを計画している。実験には高額な生体成分や細胞の購入などかなりの支出が見込まれることから、当初より研究費が不足することをが懸念としてあった。そこで、本年度に生じた次年度使用額を充当したところ、申請書に記載した消耗品類だけでなく、本来の実験に必要な細胞や細胞培養のための試薬等の購入が可能になることが分かった。平成26年度交付額(直接経費1,100千円)に次年度使用額(1,150千円)を加えた支出計画を以下に示した。ペプチド合成用試薬及び消耗品200千円(申請額)、遺伝子発現用キット及び消耗品900千円(申請額より増額)、分析用試薬類100千円(申請額)、顕微鏡用消耗品100千円(申請額)、細胞および細胞培養試薬類950千円(新規に追加額)