hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
唾液腺腫瘍細胞の中心体構成要素の分子細胞生物学的研究

1.対象:口腔原発の多形性腺腫3例、粘表皮癌1例、Warthin腫瘍1例、筋上皮腫1例を用いた。コントロールとして正常顎下線9例を用いた。2.結果:免疫組織化学的検討では正常の顎下腺では、ほとんどのすべての細胞にルートレットの染色陽性像がみられ、線条部導管では、ループを作ったり、分岐したりと多様な形態を示した。多形性腺腫ではほとんどの細胞にルートレットの強い染色陽性像を示した。Warthin腫瘍では、細胞すべてに陽性像がみられ、二層上皮の基底側の細胞とリンパ球では反応が弱いのに対して嚢胞腔側の細胞には強い反応が見られた。粘表皮癌および筋上皮腫では、ほとんどすべての細胞に陽性像がみられた。ルートレット径では各々のtypeの細胞約50個の平均を調べたところ、線条部導管部(コントロール)約4μm、終末部(コントロール)約1.5μm、多形性腺腫約3.8μm、Warthin腫瘍(Luminal border:約3.1μm,Basal cell border:約1.8μm),筋上皮腫、約2.3μmであった。R67で染色されるルートレットとおもわれる線状構造と中心子との係について多形性腺腫の例で検討した。ルートレットの一端は中心子と重なり合っていた。また、ルートレットに孤立線毛が存在するかどうか、孤立線毛はanti-acetylated α-tubulinにて染色した。正常の顎下腺では孤立線毛がほとんどみられなかったが、多形性腺腫では約10%に孤立線毛の形成がみられた。電顕所見については粘表皮癌の例では中心子に付随してルートレットが、伸長し、細胞質内に横紋構造をもったルートレットが観察され、正常顎下腺線条部導管においても、ルートレットは管腔近くの細胞質にみられ、中心子から核に向けて伸長していた。免疫電験においても同様であることが確認できた。3:結語:孤立線毛の有無に関わらず、ルートレットが存在しており、ルートレットはapical cytoplasm中のcentrosomeの安定に関係していると思われた。1.対象および方法:口腔原発の多形性腺腫3例、粘表皮癌1例、Warthin腫瘍1例、筋上皮腫1例を用いた。(2)電顕観察;観察用試料は組織を薄切後、2.5%グルタールアルデヒド+2%パラホルムアルデヒド、四酸化オスミニウムで二重固定し、エタノール系列で脱水後、EPON812に包理した。超薄切片は酢酸ウラン、クエン酸鉛で電子染色し、透過型電子顕微鏡(JEM200CX)にて観察した。2.結果:正常の顎下腺では、ほとんどのすべての細胞にルートレットの染色陽性像がみられた。導管部と終末部を比較してみると導管部ではルートレットは、長いものは10μmを越え、ループを作ったり、分岐したりと多様な形態を示した。多型性腺腫ではほとんどの細胞にルートレットの強い染色陽性像を示した。Warthin腫瘍では、細胞すべてに陽性像がみられ、二重上皮の基底側の細胞とリンパ球では反応が弱いのに対して嚢胞腔側の細胞には強い反応が見られた。R67で染色されるルートレットとおもわれる線状構造と中心子との位置関係について多形性腺腫の例で検討した。また、ルートレットに線毛が存在するかどうか、線毛をanti-acetylated tubulinにて染色した。正常の唾液腺では線毛がほとんどみられなかったが、多形性腺腫では約10%に線毛の形成がみられた。電顕所見については粘表皮癌の例では中心子に付随してルートレットが、伸長し、細胞質内に横紋構造をもったルートレットが観察された。3.結語:ルートレットに対する特異抗体を用いて、正常唾液腺と唾液腺腫瘍について免疫組織化学的および電子顕微鏡にて検討した。正常細胞、腫瘍細胞のいずれにおいても孤立線毛の形成の有無にかかわらず、ほとんどすべての細胞に陽性所見がみられた。中心子には線毛の形成と関係なくルートレットが形成されることが示唆され、今後、このようなルートレットの意義について検討の予定である。

R67で染色されるルートレットとおもわれる線状構造と中心子との係について多形性腺腫の例で検討した。ルートレットの一端は中心子と重なり合っていた。また、ルートレットに孤立線毛が存在するかどうか、孤立線毛はanti-acetylated α-tubulinにて染色した。正常の顎下腺では孤立線毛がほとんどみられなかったが、多形性腺腫では約10%に孤立線毛の形成がみられた。電顕所見については粘表皮癌の例では中心子に付随してルートレットが、伸長し、細胞質内に横紋構造をもったルートレットが観察され、正常顎下腺線条部導管においても、ルートレットは管腔近くの細胞質にみられ、中心子から核に向けて伸長していた。免疫電験においても同様であることが確認できた。3:結語:孤立線毛の有無に関わらず、ルートレットが存在しており、ルートレットはapical cytoplasm中のcentrosomeの安定に関係していると思われた。
患者由来膵癌を直接移植した肝転移ラットモデルの確立～オーダーメイドIVR治療へ～

ヒト腫瘍異種移植(Patient-Derived tumor Xenograft: PDX)動物モデルは、患者から切除した腫瘍を直接免疫不全動物に移植することによって、患者に代わり、前もって癌治療を動物内で行う事ができる、現在世界で最も期待されている癌治療スクリーニングプラットフォームである。本研究は、実際の患者腫瘍を用いて、動脈内投与可能なラット上でPDXモデルを確立することにより、癌化学療法における動脈内投与の有効性を上昇させることが目的である。本研究では、段階的に2つの研究を行う。1手術で摘出された新鮮な患者由来の原発膵癌組織を、直接免疫不全ラットの肝臓に移植した仮想肝転移モデルを作成する2肝転移モデルで、患者個人に代わって、肝動注療法や肝動脈塞栓術といったIVR治療(インターベンショナルラジオロジー:画像下低侵襲治療)を実施し、効果的な治療を探求する。この研究により、将来起こりうる患者それぞれの肝転移治療に、最良の治療法を還元でき、将来患者個人に特化したオーダーメイドIVR治療の実践を可能とする。実際の患者に対しては、複数の抗癌剤を同時に試す事が不可能であり、患者膵癌を移植した複数のラット上では、同時に複数の抗癌剤を試す事が可能となり、患者にもっとに適した抗癌剤を選定し、患者治療に適応できる。PDXモデルはオーダーメイド治療を実践する重要なツールとなる。当該研究は現在進行中であるため、公表した研究実績はない。ただし、下記の通り、順次研究を進めている段階である。2018年度、重症免疫不全FSGラットの独占的供給の契約が終え、現在FSGラットの繁殖に成功し、多数のラットを飼育することに成功した。そして、FSGラットの肝内に肝腫瘍の植え付けを開始した。植え付け後、ヒト腫瘍の生着を確認できた段階である。FSGラットの肝臓内にヒト腫瘍の生着を成功させた事例の報告はない。研究1年目として十分な成果であった。今後、生着した腫瘍の組織評価ならびに薬物療法による腫瘍退縮評価を検討する。研究としては、順調に進捗している状況であり、引き続き実験を進めていく。研究を進める上で、ラットの使用数が予想より下回ったためである。本年度多数のラットを使用とするため、次年度の繰越を必要とする。
磁性イオンとpi金属電子が共存する分子性伝導体の物性

本研究の一つの目的であったDCNQI-Cu系については、昨年に引き続いて低温X線ラウエ写真により金属-絶縁体-金属相転移がリエントラント構造相転移であることを証明する実験を行った。また従来はきわめて困難であった100K以下での構造研究をめざし、新たな低温X線構造解析装置の試運転を行った。現在約15Kまでの低温構造解析が可能であることが判明し、来年度以降、これを分子磁性の研究に活用することができると思われる。もう一つの成果はpi金属電子と磁性イオンとの相互作用を分子性伝導体の一般的な構造形態であるBechgaard塩型の伝導体に拡張したことである。具体的にはkappa-およびlambda-(BETS)_2FeCL_4をESRを中心に調べた。両塩ともFe^<3+>のシグナルが現れその強度変化からFe^<3+>間に反強磁性相互作用があることが分かった。lambda-型の方で観測された絶縁化は時期転移との協力的相転移であることが分かった。
民主化における政権中枢の認知転換のメカニズム-ミャンマーを中心に

本研究は認知転換と民主化の理論をベースに、内政・外交連動の視点を持ち、ミャンマー民主化における政権内部の認知転換の分析枠組みを構築し、1990年以降のミャンマー軍政の民主化への認知変遷を追跡する。その上で、3つの事例を用いて軍事政権中枢の中心人物を含む重要な当事者への直接聞き取り調査を通じ、民主化における政権中枢の認知転換のメカニズムを解明する。本研究の具体的な目的は以下の通りである。1ミャンマー民主化における政権内の認知転換の仮説と分析枠組みの構築、2政権中枢の民主化と内外情勢の認知の変遷を追跡、33つの典型的な事例を、認知の転換を軸に、系統的に調査・解明、4民主化の理論の充実を図る。
P-selectin中和抗体を用いた川崎病分子標的療法の開発

川崎病血管炎モデルマウスを用いて同血管炎病態におけるP-selectinの役割について実験病理学的手法により調べた。これまでの研究で急性期において大動脈基部起始部の内膜側を中心にP-selectinを検出している。川崎病で臨床上大きな問題となっている冠動脈後遺症との関連を探るため、起炎物質CAWSを投与後、1ヶ月飼育し、高度の後炎症性血管リモデリングを生じたマウス個体について、同部位のp-selectinの分布を免疫組織化学的方法で調べた。その結果、急性期と比較してP-selectinの沈着は極めてすくなく、P-selectinは主として急性期の炎症病態に関与し、遠隔期に生じる冠動脈の高度の内膜肥厚や狭窄への関与は少ないことが示唆された。またこの研究の過程で、遠隔期の冠動脈の肥厚した内膜層にIgMの沈着をみとめた。生化学的手法により、標的分子の探索を実施し、いくつかの分子を同定した(未発表)。上記モデルマウスを用いたP-selectin中和抗体による治療実験が進展していないため、市販の抗体を用いておこなうことを検討した。免疫沈降法より、nativeなP-selectinを補捉できるかどうかを調べている。マウスのin vivo実験に用いるのに適切な抗体がまだ得られておらず、所属機関における大学院生の研究指導等の増加もあって、予定よりも計画が遅れている。血中の可溶性P-selectinにたいする十分な中和活性を有する抗体を可能な限り早くに得て、川崎病マウスモデルにおける血管炎抑制効果の有無を明らかにすることを目指す。小児にみられる原因不明の血管炎として知られる川崎病血管炎の発症機序を明らかにすべく、カンジダ菌体成分CAWSで誘導される川崎病マウスモデルを用いた実験病理学的研究を実施した。2017年度は炎症病態と関連の深い蛋白質のひとつであるP-selectinの、同マウスモデルの炎症好発部位における発現、分布を主に免疫組織化学的手法により調べた。DBA/2マウス腹腔内にCAWSを反復投与し、処理群の全てのマウスで血管炎が発症した。P-selectinは正常マウスにおいて大動脈起始部の大動脈弁基部付近に弱い発現が認められた。炎症好発部位でもともと発現が見られることは興味深いが、複数の抗体で確認したところ検出できないモノクローナル抗体もあり、この点は、実験条件を含めて引き続き検討している。血管炎の発症に伴い同部位のP-selectinの発現は著明に増加した。p-selectinを発現する細胞については、血小板、内皮細胞が知られているが、本マウスモデルでは炎症部位の動脈の中膜層を構成する細胞群に強い発現がみられた。最近、血管平滑筋におけるP-selectinの発現とその病態生物学的意義について議論があることから、発現細胞の同定をすべく、各種マーカー抗体による多重染色やFACS解析を検討している。最近、ageと血管壁のP-selectinの変化に関する研究が報告されており、川崎病が小児に好発することを考えるとき興味がもたれる。私たちは現在、5週齢および8ヶ月齢のDBA/2マウスにCAWSを投与して血管炎の発症およびp-selectinの発現を調べている。現時点で、モデル作成から組織のサンプリングまで完了している。信頼できる抗体の入手に要した時間や免疫組織染色の条件検討等で実験が停滞し、計画に遅れが生じた。本年度の前半修了までに当初予定していた基礎的検討と基盤データの取得を目指す。血管炎部位におけるP-selectin産生細胞の同定のため免疫組織化学染色に加えてFACS解析を導入して、実験の多角的かつ迅速な進行を図る。さらに初代培養内皮細胞を用いたin vitroの実験系でP-selectinの役割を調べる。
二次リンパ器官ストローマ細胞ネットワークの構築と免疫・生理学的機能解析

免疫応答が誘導される二次リンパ器官では、ストローマ細胞のネットワークが組織構造や免疫細胞活動の基盤となっているが、その機能はいまだ不明な部分が多い。また、ストローマ細胞を調べるための新たな研究手法が必要である。我々は、マウスのリンパ節からストローマ細胞を単離培養する手法を開発し、試験管内でリンパ球の機能を支持することに成功した。また、網目状の足場素材を用いてストローマ細胞の三次元的なネットワーク構造を再現した。一方、ストローマ細胞特異的に誘導性遺伝子改変が可能なモデル動物の作製を試みた。獲得免疫応答誘導の現場として機能するリンパ節などの二次リンパ器官では、間葉系由来のストローマ細胞のネットワークが基本的な組織構造や免疫細胞の活動のための基盤を提供している。しかし、そのネットワークの構築原理や活発に活動するリンパ球動態および免疫系のホメオスタシスを制御するするメカニズムの詳細は未だ明らかにされていない。我々は、マウスリンパ節由来ストローマ細胞株を利用して三次元的なネットワーク構造の再現を試みているが、現在までのところ細胞成分のみから二次リンパ器官に類似する構造を再現することは困難であるため、網目形状で細胞の足場となり得る様々な人工素材を検討し、市販のスポンジ素材のひとつが繊維径や網目サイズなどの点からこの目的に適していることが判明した。この素材に細胞外マトリクスをコートしストローマ細胞株を播種した結果、生体内に見られる組織構造の状況を良く反映した細胞ネットワークを形成させることに成功した。一方、生体内の二次リンパ組織におけるストローマ細胞の役割を直接的に調べるため、ストローマ細胞特異的に誘導性遺伝子改変が可能なモデル動物を作製する必要がある。この目的のためにストローマ細胞を含む間葉系細胞においてエストロゲン受容体のリガンド結合ドメインにCreリコンビナーゼを融合させたCreERT2やGFP遺伝子を発現させたトランスジェニックマウス作製を試み、いくつかの系統を得ている。現在、エストロゲン誘導体であるタモキシフェン投与によりDNA組換えを誘導し、ストローマ細胞の機能阻害を引き起こすことが可能なDNA配列も構築中であり、今後これについてもトランスジェニックマウス作製を進めていく。免疫応答誘導の場として機能する二次リンパ器官では、間葉系由来のストローマ細胞ネットワークが組織構造や免疫細胞の活動のための基盤を提供している。しかし、ネットワークの構築原理やリンパ球動態を制御するするメカニズムの詳細は明らかになっていない。これらを検討するためには新たな研究手法が必要であった。我々は、マウスリンパ節からストローマ細胞分画を単離培養する手法を開発し、これにより形成させた単層上においてマウスT細胞を効率よく遊走させることに成功した。この系を用いてT細胞がケモカインやインテグリンに依存してストローマ細胞上を移動することを明らかにした。また、繊維径や網目サイズが適したスポンジ素材に、リンパ節由来初代ストローマ細胞を播種し三次元的なネットワーク構造の再現を試み、生体内に見られる組織構造の状況を良く反映した細胞ネットワーク構造を形成させることが可能となった。一方、マイクロアレイ解析によりリンパ節ストローマ細胞分画とマウス胎仔線維芽細胞を比較し、ストローマ細胞に特異的に発現する多数の遺伝子を同定し、今後の研究の手掛かりを得た。生体内の組織におけるストローマ細胞の役割を直接的に調べるためには、ストローマ細胞特異的に誘導性遺伝子改変が可能なモデル動物を作製する必要があるが、この目的のためにストローマ細胞を含む間葉系細胞においてエストロゲン受容体のリガンド結合ドメインにCreリコンビナーゼを融合させたCreERT2やGFP遺伝子を発現させたトランスジェニックマウス作製した。これによりストローマ細胞の特異的機能を検討することが可能となった。
特殊な多様体上で消滅する大域切断を有する豊富なベクトル束

Xをn次元の非特異複素射影代数多様体とし、Eを、n-r(【greater than or equal】1)次元のXのある部分多様体Z上で消滅するような大域切断を有する階数r(【greater than or equal】2)のX上の豊富なベクトル束とする。rが1であれば、これは、与えられた多様体Zを豊富な因子として含むことのできるXの構造を決定するという、豊富な因子による多様体の分類という意味から、偏極多様体の分類に関して極めて重要な位置を占める問題の仮定と全く一致している。この研究の目的は、Zが特殊な多様体のときの(X,E)を分類し、Eが豊富な直線束の場合に知られてい本年度においては、イタリアのミラノ大学のAntonio Lanteriと共同で、Zが楕円曲線の場合を扱った。まず、Zの標準直線束が、Eの行列式直線束det Eに付随したアジョイント束Kx+det E(KxはXの標準直線束)のZ上への制限として得られることに目をつけ、この場合にはKx+det Eが豊富にならないことを導いた。次に、Kx+det Eが豊富にならないような(X,E)の構造を調べることによって、Zが楕円曲線となるようなn次元特異射影代数多様体X上の階数n-1の豊富なベクトル束Eを分類することに成功し、Eが豊富な直線束の場合の結果を一般次元へ完全に拡張した。しかも、これは、1991年に3次元多様体上の階数2の豊富なベクトル束に限って考察したBallicoの不完全な結果を修正したものにもなっている。
ケミカルジェネティクスによる細胞運動制御機構解析

新規がん細胞遊走阻害物質UTKO1のEGF刺激によるヒト扁平上皮癌A431細胞の細胞遊走の阻害作用は、UTKO1が14-3-3ζに結合してその機能を阻害した結果、Rac1活性化を抑制することにより引き起こされることを見いだした。つぎに14-3-3ζがUTKO1の標的であることを裏付けること及びA431細胞の遊走における14-3-3ζの役割を明らかにすることを試みた。その結果EGF刺激が誘導するA431細胞の遊走においては、14-3-3ζによるTiam1及びβPixの一方、もしくは両方のGEF活性の調節が重要である可能性が示唆された。1)UTKO-1の標的タンパク質およびその結合部位の同定UTKO-1のビオチン標識体をA431細胞の細胞抽出液に添加し、アビジンビーズを用いてUTKO-1の結合タンパク質を回収し、SDS電気泳動で分離後、トリプシン消化を行った後MALDI-TOF-MSで分析した。その結果、複数のUTKO-1結合タンパク質を同定した。このうち、細胞遊走に関わると予想されるタンパク質およびそのアイソフォームをコードする遺伝子をクローニングし、実際にそのタンパク質がUTKO-1と結合するかどうかを確認した。2)UTKO-1による細胞運動阻害機構のパスウエイ解析UTKO-1はラメリィポディア形成を阻害したことからRac活性化に及ぼす影響を検討した。その結果、UTKO-1は濃度依存的にRac活性化を阻害し、その有効濃度は細胞遊走を阻害する濃度域と完全に一致した。3)細胞運動を阻害する小分子化合物の探索A431細胞にEGF刺激すると30分以内にフィロポディア形成が観察される。このフィロポディア形成も細胞運動に関与すると考えられている。そこでフィロポディア形成を阻害する小分子化合物を微生物培養液から探索した。その結果、放線菌の一株が活性物質を生産する事を見いだしので。単離精製・構造解析を行った結果ピエリシジンである事がわかった。我々は阻害剤を用いた検討により,5-リポキシゲナーゼがEGF刺激によるヒト扁平上皮がん細胞A431細胞の遊走に関与することを初めて見出した.そこで今回,がん細胞の遊走における5-リポキシゲナーゼの役割について詳細に検討した.5-リポキシゲナーゼはロイコトリエンB_4(LTB_4)やロイコトリエンC_4(LTC_4)の生成に関与する.5-リポキシゲナーゼを阻害することによってA431細胞の遊走を阻害した時,LTC_4を添加することにより細胞遊走が回復した.このことからA431細胞の遊走にはLTC_4が必要であることが示唆された.LTC_4は受容体CysLT1またはCysLT2に結合してシグナルを伝達するが,CysLT1の特異的アンタゴニストMK-571がA431細胞の遊走を完全に阻害した.このことからLTC_4はCysLT1を介して細胞遊走を引き起こしている可能性が示唆された.一方,細胞遊走にはアクチンに富んだ構造体であるラメリポディア形成が重要であるが,MK-571はラメリポディア形成を阻害した.そこでラメリポディア形成に必要なRho family低分子量G蛋白質Rac1の活性化にMK-571が与える影響について検討した結果, MK-571はRac1の活性化を阻害した.以上のことから, EGF刺激によるA431細胞の遊走には5-リポキシゲナーゼを介して生成されるLTC_4がCysLT1に結合し, Rac1の活性化とそれに伴うラメリポディア形成を誘導して細胞遊走を引き起こすことが示唆された.新規がん細胞遊走阻害物質UTKO1のEGF刺激によるヒト扁平上皮癌A431細胞の細胞遊走の阻害作用は、UTKO1が14-3-3ζに結合してその機能を阻害した結果、Rac1活性化を抑制することにより引き起こされることを見いだした。その結果EGF刺激が誘導するA431細胞の遊走においては、14-3-3ζによるTiam1及びssPixの一方、もしくは両方のGEF活性の調節が重要である可能性が示唆された。さらに、EGF刺激によるA431細胞の遊走において、LTC_4がCysLT1に結合し、CysLT1からのシグナルが14-3-3zの発現上昇を促した結果、Rac1の活性化とそれに伴うラメリポディア形成を誘導して細胞遊走を引き起こすことが示された。

さらに興味深いことに、EGF刺激はLTC_4の産生のみでなくCysLT1の発現上昇を誘導することが明らかとなった。またEGF刺激によるCysLT1の発現上昇機構は転写・翻訳レベルによらず、プロテアソームによるタンパク質分解の抑制に起因する可能性が示唆された。
環境・都市問題を解決するスマートグロースＩＴＳに関する研究

ITS実証実験モデル都市の一つに選定された千葉県柏市では、産官学が一体的に最新のITSを活用した交通まちづくり手法を議論するITS推進協議会が立ちあげられると共に、新たな道路情報サービスを実現するITSスポットの集中的な配備が見込まれた。そこで、この柏市を対象に交通に係る都市の諸課題を分析・整理し、ダイナミック・パーク・アンド・ライド、駐車場連携、観光案内促進、マルチモーダル交通情報連携といった新たなITSサービスによる都市・交通課題解決手法の適用性を、行政機関との密な連携の下に実証的に検討した。研究の初年度となる平成23年度は、(1)スマートグロースITSの全体像の整理、(2)基盤システムの検討、(3)評価のための行動モデルの検討、(4)ITSを活用した具体的なアプリケーションの検討を行った。(1)については、内閣府社会還元プロジェクトの「ITSモデル都市」である千葉県柏市と同規模の都市である長崎県佐世保市を対象に、都市の課題を整理し、スマートグロースITSの全体像について検討を行い、成果の一部を平成23年2月2日に開催された柏市ITSセミナーで発表した。(2)については、スマートグロースITSの表現の基盤となる四次元都市空間を構築するため、車載カメラを活用して都市空間をデジタル化するシステムを構築し、表現方式の差による違和感について検討を行い、その成果を論文発表した。(3)については、利用者が交通状況に応じて鉄道に乗り換えるか自動車を継続利用するかを選択するダイナミックパーク&ライドについて、利用者がどのような状況でどの交通機関を選択するかを求める行動モデルを構築した。また、Activity-based Modelの考え方を用いて休日の活動による効用のモデル化を行い、目的地での滞在時間増加による社会的な効用の増分を推定できるようにした。これらの成果を論文発表した。(4)については、具体的なアプリケーションとして滞在時間や周遊行動を促すための車両IDを活用した複数駐車場の管理システムの提案を行い、特許を出願した。また、ダイナミックパークアンドを実現するためのモード乗り換えニーズに関する現地調査を行い、それらの成果を論文発表した。平成23年度は、研究体制を強化することを主眼として東京大学と柏市で共同研究をスタートした。柏市の職員を共同研究員として迎え、柏市の都市問題について行政の視点からの分析を行った。具体的には、昨年度整理したスマートグロースITSの全体像と平成23年3月11日の東日本大震災という大災害の教訓を踏まえ、(1)大災害時にこそ機能するスマートグロースITSの在り方検討、(2)柏市の都市問題の分析と対応するアプリケーションの整理、(3)駐車場問題と中心市街地の活性化の検討、(4)パーク・アンド・ライドを成功させるためのITSの基礎的研究を行った。(1)については、東日本大震災という大災害の重大性に鑑み、研究メンバーが土木学会の調査団のメンバーとして参加し、スマートグロースITSが災害時に機能すべき内容について検討を行った。その成果の一部は、土木学会・電気学会合同の「ICTを活用した耐災施策に関する総合調査団提言」に反映されるとともに、各種シンポジウムで発表を行い、最終成果を論文として発表した。(2)については、柏市との共同研究として進め、柏市の都市交通問題を分析し、プローブカーデータや、プローブパーソンデータを分析することで、国道6号、16号の渋滞が中心市街地に及ぼす影響を把握し、滞在時間と中心市街地の活力に関係があることを分析した。これについては今後論文で発表予定である。(3)については、これまでの中心市街地の分析より駐車場ITSアプリケーションの持つべき要件を整理し、国際学会で広く世界に発表した。(4)については、柏市の都市交通問題とパーク・アンド・ライド導入の可能性を検討し、駐車場内のITS導入によりアプリケーションが機能するための基礎的な研究を行い、論文として発表した。平成25年度は、昨年度に引き続き柏市の職員を共同研究として迎えた東京大学との共同研究フレームを中心に、1.ITSを活用したサスティナブルな中心市街地駐車場連携サービス導入手法をとりまとめる一方で、研究成果の社会還元の一環として一般ユーザを対象にした2.柏駅中心部を対象にした中心市街地まち歩き情報配信および鉄道・バスのマルチモーダル連携情報配信の社会実験と3.御殿場市内施設を対象にした立ち寄り型周遊観光活性の社会実験を実施し、提案するスマートグロースITSの有用性を一部検証した。1.については、昨年度に引き続き主催する柏ITS推進協議会関連部会および参加した柏地区での関連意見交換会での議論、ITS世界会議といった国際研究集会での議論を通じて提案内容を精査してとりまとめた。2.については、ITS世界会議2013東京のテクニカルビジットおよびブース展示に絡めた情報配信実験を行い、公共交通利用者を対象にした場合にも渋滞状況等の道路交通状況を提供する必要性を確認した。3.については、コストを抑えたITSツールを用いた周遊観光促進の案内実験を行い、マイカー利用者を主な対象として大型商業施設内案内所を発地とした着地型観光交通の発生を実証した。

平成24年度は柏市の職員を共同研究員として迎え昨年度開始した東京大学との共同研究フレームにより、サスティナブルな駐車場ITSアプリケーションサービス具体化に関する検討を実施した。具体的には柏駅中心部付近の駐車場に関連する都市・交通問題に焦点を当て、1.道路渋滞解消と中心市街地活性化に寄与する駐車場エリアマネジメントアプリケーションの整理、2.関連ITSインフラ配備計画と整合する駐車場ITSサービスの導入手順案の整理、3.来街者の視点を取り入れた駐車場問題と中心市街地の活性化の実証的検討を行った。1.については前年に引き続き柏ITS推進協議会関連部会での議論、土木計画学やITSシンポジウムの国内学会での発表、ITS世界会議やWCTR関連部会の海外研究集会の発表を通じて駐車場エリアマネジメントアプリケーションの整理を深度化した。その結果、昨年度に提案した複数駐車場のエリアマネジメントを実現する駐車場ITSアプリケーションの段階的構築における留意事項を整理した。2.については柏市や関東地方整備局における関連検討会の議論に参画し、高品位の情報提供とプローブ情報の取得が可能なITSスポットの配備計画を踏まえて、柏市中心市街地の道路交通渋滞緩和と来訪者の滞在時間延長を両立する駐車場ITSサービスの現実的な導入手順案を整理した。成果の一部は、柏市との共同研究中間報告としてとりまとめた。3.については柏市中心部と同様の都市・交通課題を抱える他都市を取り上げた分析を行った。交通結節点の機能強化がまちの活性にもたらす効果に関して、広島・横川駅を例にした事前・事後の分析結果を国内学会で発表した。郊外都市の商業・観光施設(御殿場)や高速道路(常磐道)サービスエリアの窓口案内業務分析の結果から、車を用いた来街者の滞在時間延長に繋がる現地駐車場での情報案内強化方策案をまとめて国内学会で発表した。大学の研究者だけの視点ではなく、柏市という行政組織と共同研究を実施することで、柏市域の都市交通問題の本質について深く問題点の分析を行うことが可能となり、順調に進展している。25年度が最終年度であるため、記入しない。(理由)駐車場入退場口への配備を検討していたITS機器の整備スケジュールが遅れ、予定していた柏市中心部での社会実験が実施できなかった。一方で、国内外での意見交換や他都市での関連検討を実施することで、より着実な駐車場ITSサービス導入手順案を得るに至っており、総じて順調に進展していると判断している。柏市との共同研究を踏まえ、具体的に地域で導入すべきスマートグロースITSアプリケーションの議論を進め、中心市街地の活性化や環境問題の解決するための実際に使われていく交通施策を研究していく。特に、駐車場問題は、中心市街地の滞在時間との関係があることが明らかとなってきているため、駐車場のマネジメントを効率的、低コストで行うことのできるITSアプリケーションについては、行政のみならず地元商業者の関心も高いことから地域導入も含めたアプリケーション開発を同時に進めていくことを考えている。
生活習慣病患者の脈波伝播速度と心理行動学的特性の関連についての検討

本研究では,タイプAが動脈硬化の性差に影響するかどうかを検討した.収縮期血圧,baPWVは男性が女性よりも高かった.男性では,タイプAがストレス性の飲酒行動を介してγGTPを高め,それによってbaPWVを高めるとの結果を得た.女性では,タイプAはストレス性の飲酒行動に影響したが,γGTPとbaPWVには影響しないことが分かった.臨床的に,タイプAが顕著な男性の動脈硬化予防対策として,身体的な査定や治療に合わせて,心理行動面でのケアも女性以上に必要不可欠であろう.本研究では,タイプAが動脈硬化の性差に影響するかどうかを検討した.収縮期血圧,baPWVは男性が女性よりも高かった.男性では,タイプAがストレス性の飲酒行動を介してγGTPを高め,それによってbaPWVを高めるとの結果を得た.女性では,タイプAはストレス性の飲酒行動に影響したが,γGTPとbaPWVには影響しないことが分かった.臨床的に,タイプAが顕著な男性の動脈硬化予防対策として,身体的な査定や治療に合わせて,心理行動面でのケアも女性以上に必要不可欠であろう.現在,動脈硬化性疾患による死亡率は,癌による死亡率を上回る値となっている.動脈硬化性疾患においては,性差が認められており,男性が女性に比し疾患の罹患率が高い.動脈硬化性疾患にこのような性差が見られる-因として,心理行動学的特性であるタイプA行動パターンが関連することが想定される.本研究では,新しい動脈硬化の指標であるbrachial-ankde Pulse Wave Vblocitv (以下, baPWVl)を指標として,生活習慣病患者のタイプA行動パターンが,動脈硬化に及ぼす影響を,性差に注目して検討する.対象は,肥満,高血圧,高脂肪血症,高血糖のいずれか1つ以上があり,東北労災病院勤労者予防医療センターを受診した投薬治療を受けていない男性230名(50.5±115歳),女性141名(50.0±10.9歳)であった. Foml PWV/ ABIを用いて, baPWV,上腕血圧,心拍数の測定を行った.並びに,早朝空腹時採血,体組成分析装置In Bodvにてウエスト・ヒップ比, BMIをそれぞれ測定した心理行動学的特性に関しては,タイプA行動パターン(前田式)特性不安・状態不安(STAI),抑うつ感(SRO-D)と共に,独自に作成したストレス性の食行動(喫煙,飲酒,過食)査定用紙を用いて検査を行った.今年度は,統計ソフトを導入後,正確な統計解析を行うと共に,文献研究も同時進行で進める.特に,共分散構造分析においては,ダイブA,倉行動,牛化単検査値,面圧等が, baPWVをどの程度修飾するのかを詳細に検討する.これにより,タイプAがbaPWVに影響を与えるメカニズムのモテルが確立される可能性がある.本研究では,動脈硬化の指標であるbrachial-ankle Pulse Wave Velocity(以下,baPWV)を指標として生活習慣病患者のタイプAが動脈硬化に及ぼす影響を性差に注目して検討した.対象は肥満,高血圧,高脂肪血症,高血糖の何れか1つ以上を有す未治療の男性230名(50.5±11.5歳),女性141名(50.0±10.9歳)であった.身体指標はbaPWV,上腕血圧,心拍数の血行動態測定,並びに,生化学データ,体組成データであった.心理指標はタイプA,不安,抑うつ感,ストレス性の食行動(喫煙,飲酒,過食)であった.全指標中,性差のみられた項目は,baPWV,タイプA,ストレス性の食行動(飲酒,喫煙)であり,それぞれ男性の値が女性よりも高値であった.相関分析では,男性のbaPWVと肝機能(γGTP)の間には相関が認められたが女性では認められなかった.baPWVと肝機能の関連についての性差検討のため,男女毎にタイプA,ストレス性の飲酒,γGTP,baPWVを観測変数とした共分散構造分析を行ったところ,男性では,タイプAがストレス性の飲酒行動を介してγGTPを高め,それによってbaPWVを高めるとの結果を得た.女性では,タイプAはストレス性の飲酒行動に影響したが,γGTPとbaPWVには影響しないことが分かった.男性では,タイプAゆえの過重労働等により,ストレスが増大し,飲酒量が多くなることで肝機能と動脈にダメージを与えるのかもしれない.女性のタイプAは,過重労働等により,飲酒行動が増加しても,肝機能と動脈へのダメージが少ない可能性がある.タイプAが,男性においてのみ身体に悪影響を与えるという点は,先行研究とも合致する.臨床的に,タイプAが顕著な男性の動脈硬化予防対策として,身体的な査定や治療に合わせて,心理行動面でのケアも女性以上に必要不可欠であろう.
ヒト乳頭腫ウイルス(HPV)5型遺伝子の転写制御について

以前我々は疣贅状表皮発育異常症の皮膚癌から細胞を培養し,株化に成功している.また,同じ患者よりHPV5型遺伝子をクローニングし,その全塩基配列を決定した.そのなかで癌遺伝子の可能性があるE6とE7領域についてPCR法を用いてクローニングを行なった.また同じプライマーを用いて他の疣贅状表皮発育異常症患者の良性皮疹,悪性腫瘍から別の型のHPVのE6,E7領域の増幅に成功し,さらに現在クローニング中である.この新しい型のHPVについてもE6,E7の転写制御領域について検討し,それぞれの転写制御領域の遺伝子塩基配列を比較することによって,疣贅状表皮発育異常症に特異的な転写因子が存在するのかどうかさらに検討を進めたい.以前我々は疣贅状表皮発育異常症の皮膚癌から細胞を培養し,株化に成功している.また,同じ患者よりHPV5型遺伝子をクローニングし,その全塩基配列を決定した.そのなかで癌遺伝子の可能性があるE6とE7領域についてPCR法を用いてクローニングを行なった.また同じプライマーを用いて他の疣贅状表皮発育異常症患者の良性皮疹,悪性腫瘍から別の型のHPVのE6,E7領域の増幅に成功し,さらに現在クローニング中である.この新しい型のHPVについてもE6,E7の転写制御領域について検討し,それぞれの転写制御領域の遺伝子塩基配列を比較することによって,疣贅状表皮発育異常症に特異的な転写因子が存在するのかどうかさらに検討を進めたい.
先天性橈尺骨癒合症の候補遺伝子SMPDL3Aの機能解析

本事業ではsmpdl3a遺伝子改変動物を作製し、表現型の確認と主要なシグナル伝達を明らかにする。また細胞実験を用いて上記現象を確認しsmpdl3a遺伝子の詳細な役割を明らかにする。最終的にはsmpdl3a遺伝子が先天性橈尺骨癒合症の病態に関与する分子メカニズムを明らかにする。
複数の反応点をもつ糖質化合物と有機金属化合物との反応における反応方向の制御

1.グリカ-ルとメチルアニオノイド試薬との反応:3-0-メシルグリカ-ル(1)にMeMgBrを反応させると、選択的に1-C-メチル誘導体が生成するが、α-異性体(2-α)とβ-異性体(2-β)の生成比は1:1.52となることが分かっている。これに対して、HMPAを共存させてこの反応を行ったところ、2-αと2-βの生成比は1:10になった。一方、グリニヤ-ル試薬の代わりにMe_3Alを反応させた場合には、2-αと2-βの生成比は5:1に逆転した。なお、この二種の反応系では3-C-メチル誘導体も生成し、全体としての収率もあまり良くないので、最適条件の検討の必要がある。2.縮環系環状アセタ-ルの合成:各種の2,3-アンヒドロ糖から位置選択的に対応する2-アリル(一般式3)を合成し、側鎖の官能基変換と分子内アセタ-ル交換反応により種々の縮環系環状アセタ-ル、例えば4aや4bを合成した。縮環系環状アセタ-ルは色々な生理活性天然有機化合物に含まれている骨格であるから、それらの合成への展開が期待できる。3.マクロリド抗生物資のフラグメントの合成:アンヒドロ糖5から、幾つかの16員環マクロイド抗生物資のC-3C-9フラグメントの共通な前駆対となる化合物6を合成した。
細胞の電気力学的操作とそのチップテクノロジーへの応用

本研究は細胞のエレクトロポレションや融合の過程の高効率化を目標とした。昨年度には(1)細胞膜電圧の解析手法ならびに数値計算手法を開発し、(2)それらの過程にマイクロオリフィスによる電界集中の効果が有用であることを解析的に明らかにした。今年度はその解析結果に基づき、電界集中を用いる電気細胞融合を実験した。電気細胞融合の実験を行うために顕微鏡下で細胞融合が容易に観察できるような流路構造を採用し、チップを設計した。流路内でオリフィスの両側に細胞を引き寄せ、固定するには流れの圧力を制御する手法が不利なため、高周波電界による誘電泳動力を使用した。誘電泳動の電界と、細胞融合を誘導する低周波電界はチップのカバーに適切なギャップを持つ電極を設けた。本研究の細胞融合チップは非常にシンプルな構造を持つため、Single-Maskリソグラフィによって作製ができる。チップは使い捨てできる様にPDMSで作られた。以上述べたチップに別々の実験で植物プロトプラストまたは白血病細胞(Jurkat細胞)をそれぞれ導入した。誘電泳動力でオリフィスに固定された細胞に周波数変調電界を印加し、電気融合を起こした。本研究の実験から以下の結果が得られた。(1)効率が約数%より低い従来の手法と比べて、高効率(90%以上)の電気細胞融合に成功した。(2)オリフィスを用いることによって大きさが相違する細胞の融合が可能であった。(3)細胞が長いチェーンを成形した場合にも1対1の融合が確実に制御できた。さらに印加電圧は数Voltの程度で、高電圧の電源を必要としない。本研究の結果から、マイクロオリフィスを用いる高効率な細胞融合法が解析的、実験的に実証できた。今後の展望としてはプロセスの並列化などによって様々な応用が期待される。本研究は電界の解析手法を用いて、細胞のエレクトロポレションや融合の過程における膜電圧の変化を調べた。これらの過程は細胞膜の可逆的な破壊の現象を利用するため、細胞膜を適度に充電させなければならない。更に、電気による細胞融合をさせるには膜電圧が二つの細胞の接触点付近で最大値を持っことが望ましい。本研究の解析では、マイクロオリフィスによる電界集中の細胞膜電位への効果を調べて、オリフィスなしのときの膜電位との比較を行った。解析手法は多重極展開法と境界要素法を用いた。多重極展開法の解析結果では、オリフィスなしのときに、一様電界下で接触している細胞の最大膜電位が接触点付近ではなく反対側の極に位置した。そのため、細胞融合の成功率が低いことが分かった。数値的な境界要素法は、細胞がマイクロオリフィスにある場合に適用された。その解析結果から(1)エレクトロポレションのときに、オリフィス上の膜電位が他の部分よりはるかに高い(2)細胞融合のときに細胞がオリフィス上下に位置すると、その接触点に最大膜電位を起こす、ということが分かった。さらに、オリフィスの大きさ、オリフィスと細胞とのリーク、これらが十分小さければ、ほとんどの印加電圧がオリフィス上下にある細胞膜にかかることが分かった。以上の解析結果からマイクロオリフィスの有用性が明らかとなった。
ナノファイバーを用いたバイオハイブリッド材料の創製と幹細胞の微小環境制御

本研究では,幹細胞の培養の足場に適したバイオハイブリッド材料の創製を目的に,異方性構造を有するナノファイバー基材上での間葉系幹細胞の分化制御をおこなった。生体組織の微小環境はナノメートルサイズの繊維構造が配向した構造から成る細胞外マトリクスで構成されていることから,配向性を有したナノファイバーに着目した。細胞としては,造血支持能を有するヒト骨髄由来間葉系幹細胞(MSC)を用いた。まず,エレクトロスピニング法を用いて,配向性の異なるナノファイバー基材を作製し,この上での細胞分化挙動への影響を検討した。その結果,配向性の違いによって分化が異なることを見出した。さらに高密度培養を可能とする足場材料への展開を目的に,配向性ナノファイバー基材の積層により3次元培養をおこなった。その結果,厚みがありかつ異方性を有するバイオハイブリッド材料の構築に成功した。得られたバイオハイブリッド材料は,幹細胞の高密度培養足場への応用が期待された。造血幹細胞は,白血病などの難治性血液疾患の治療や次世代の再生医療に有効な細胞ソースとして期待されており,造血幹細胞の効率的な増幅培養手法が強く望まれている。しかしながら,その未分化能を維持したまま増幅することは,今なお実現していない。本研究では,造血幹細胞の増幅に適した微小環境の設計を目指し,3次元基材上で造血支持細胞をハイブリッドさせることで,造血幹細胞の増殖を制御する因子を担持させる。本研究では、3次元基材として,生体組織がナノメートルサイズの繊維構造が配向した構造から成る細胞外マトリクスで構成されていることから、配向性を有したナノファイバーに着目した。また、細胞としては、造血支持能を有するヒト骨髄由来間葉系幹細胞(MSC)を用いた。今回,目的に合致したナノファイバー基材を開発すべく,配向性の異なるナノファイバー基材上でMSCの増殖および分化を評価した。平成23年度では,まずナノファイバー基材の設計・作製および評価として,エレクトロスピニング法を用いて、ポリウレタン溶液からナノファイバーを基板上に作製した。ファイバーの配向性を,コレクタ部の回転速度により制御することに成功した。つづいて,間葉系幹細胞の培養によるナノファイバー基材のハイブリッド化として,作成した配向性の異なる名のファイバー上で,間葉系幹細胞を培養した。この基材上で間葉系幹細胞の増殖および分化挙動を定量的に評価した。その結果,配向性の違いによって増殖・分化が異なることを見出した。これにより,造血幹細胞の培養足場に適したバイオハイブリッド材料の設計にむけての基礎となる有効な知見が得られた。本研究では,造血幹細胞の増殖に有用なバイオマテリアル基材の開発をすすめており,その前段階となる間葉系幹細胞の分化制御をおこなっている。間葉系幹細胞の分化制御に関しては,基材の配向性によりコントロールすることに成功しており,今後この基材上での造血幹細胞の培養を実施する。造血幹細胞の培養に関しては,倫理委員会の承認の遅れより実施がずれ込んだが,すでに承認され準備は完了したため順次実施できる状況にある。24年度が最終年度であるため、記入しない。当初予定していた骨芽細胞方向への分化促進ではなく,脂肪細胞の分化抑制というかたちで,分化の制御が可能となった。幾何構造が異なる基材上での共培養により造血幹細胞の効率的な増幅が可能になるかどうかを,共培養後の細胞の表面抗原解析,および関連遺伝子の発現解析を中心に検証する。
有害渦鞭毛藻シストの休眠および発芽の誘導・制御機構の解明

渦鞭毛藻には赤潮や貝毒の原因となる種が多く含まれる。その数種は生活史の中でシストを形成する。シストの存在は分布拡大や新たな海域への定着に影響を与える。しかしながら、分子生物学的なシスト発芽の誘導や制御の機構は不明である。本研究では有毒渦鞭毛藻Gymnodinium catenatumシストの休眠や発芽誘導の制御機構を分子生物学的に明らかにすることを目的として,シストに特異的に発現している遺伝子配列を解析した。その結果,休眠シストから光捕集タンパク質や膜輸送体などの複数の発現遺伝子が得られ,シストの発芽準備が休眠期間中から進行していることが示唆された。有害渦鞭毛藻の出現動態は,栄養細胞や休眠接合子(シスト)などの機能的に分化した細胞が環境の変化に応じて出現する生活史によって大きく変化する。本研究は,これまで現象の観察に止まっている渦鞭毛藻の生活史の制御機構の解明を目指すものであり,特にシストの休眠から発芽の過程で特異的,差次的に発現する遺伝子を特定し,シストの休眠および発芽の誘導・制御機構を明らかにすることを目的としている。本年度は,昨年度に引き続き,有毒渦鞭毛藻Gymnodinium catenatumの栄養細胞とシストのそれぞれの細胞から得られたcDNAを基に,ランダムプライマーを用いてPCR増幅し,得られた産物のディファレンシャルディスプレイ法(DD法)を実施した。得られた増副産物のうち,シストのcDNAから得られた増副産物について,プラスミドベクターを用いてクローニングした後,DNAシーケンサーで塩基配列を解析した。得られた塩基配列のBLAST検索により,新たに真核生物被子植物であるSilene latifoliaのmetal transporterタンパク質と比較的高い相同性を示す配列(E-valu 2e-08,相同性55%)が得られた。しかし,得られた配列のほとんどはデータベースの配列との相同性が認められないか,相同性が低く配列長が短い(100 bp以下),機能不明な遺伝子であることがわかった。次に,シストの発芽を誘導して経時的に得られた2つの試料について,これまでと同様の方法でcDNAを得たのち,ランダムプライマーを用いて得られたPCR増副産物のDD法を実施した。しかしながら,得られた増副産物が少なく,明確に差次的に発現していると判断できる遺伝子を得ることができなかった。今後さらに,PCR増幅に用いるプライマー配列の変更により,得られる増副産物を増やす工夫が必要である。有害渦鞭毛藻の出現動態は栄養細胞や休眠接合子(シスト)などの機能的に分化した細胞が環境の変化に応じて出現する生活史によって大きく変化する。本研究はこれまで現象の観察に止まっている渦鞭毛藻の生活史の制御機構解明を目指すものであり、特にシストの休眠から発芽の過程で特異的、差次的に発現する遺伝子を特定して、シストの休眠および発芽の誘導・制御機構を明らかにすることを目的としている。今年度は、下記の研究を実施した。1.有毒渦鞭毛藻Gymnodinium catenatumのシストに特異的に発現している遺伝子の配列解析:G. catenatumの栄養細胞とシストから得られたcDNAを基にランダムプライマーを用いてPCR増幅し、得られた産物のディファレンシャルディスプレイ(DD法)を実施して、シスト試料に特異的に得られる増幅産物を抽出した。これをクローニングした後、DNAシーケンサーで塩基配列を解析した。得られた配列についてBlast検索を実施した結果、Chlamydomonas reinhardtiiのDNA methyltransferase(E-value 0.011, ident 73%)、Symbiodinium sp.の光合成関連タンパク質light-harvesting protein(E-value 3e-29, ident 67%)と高い相同性を示す配列が得られた。2.シスト発芽の各過程で特異的に発現する遺伝子の解析準備:実験に用いる材料を得るためG. catenatumのシスト形成を試みたが、今年度はシストが全く形成されなかった。そこで、新たに天然細胞から培養株を複数分離し、既存の培養株と混合培養したところ、シスト形成可能な培養株を得ることができた。これを培養して得られたシストを約1000細胞分離し、10°C暗所でシストを休眠させている。本年度は,培養細胞から得られた有毒渦鞭毛藻Gymnodinium catenatumのシストを材料として,微量シスト試料からのcDNAライブラリーの構築方法の確立,および至適環境条件下で休眠から発芽の過程を誘導したシストをもとにcDNAライブラリーを構築して各生活史段階で特異的あるいは差次的に発現している遺伝子の塩基配列を解析することを目指した。まず,培養株から形成した100細胞程度のシストからcDNAを調製し,ライブラリーを構築することができた。

次に,栄養細胞および休眠期のシストからcDNAを調製し,得られたcDNAをもとにランダムプライマーを用いてPCR増幅した後,増幅産物のディファレンシャルディスプレー法により,シストのcDNAのみから得られたPCR産物,すなわちシストに特異的に発現している遺伝子断片を複数得た。これをプラスミドベクターを用いてクローニングしたのち,DNAシーケンサーで塩基配列を解析した。Blast検索により相同性が高い遺伝子を検索した結果,ほとんどが新奇の配列であり,その機能は不明であった。一方,得られた配列の一つは細菌等原核生物のマンガンや鉄の輸送に関わるタンパク質(mntHあるいはNRAMP family)と比較的相同性の高い配列(相同性75%)であることがわかった。今後この遺伝子がG. catenatumに由来するものであるか,確認を進める必要がある。有毒渦鞭毛藻Gymnodinium catenatumのシストから得られたcDNAをランダムプライマーA22およびA29(和光純薬)で増幅して得られたPCR増幅産物の断片をクローニングし、遺伝子配列解析および得られた配列の相同性解析を実施した。その結果、得られた配列から同じ渦鞭毛藻類であるSymbiodinium sp.やHeterocapsa triquetraの光捕集に関与するタンパク質light-harvesting protein、同じく渦鞭毛藻Kryptoperidinium foliaceumのABC transporter ATP-binding subunitなどに高い相同性を示す配列が得られた。G. catenatumシストの発芽において、光は発芽の過程を促進させる役割を果たしていると推測される。しかし、休眠中のシストでは光合成色素(クロロフィル)の活性が確認されず、発芽に向かう過程でその活性が復活することが観察されており、光捕集タンパク質の発現は発芽における重要な反応の一つであると推察される。今後、このような観察と得られた光捕集関連遺伝子の発現の動態との関連を明らかにするため、定量PCRを用いて経時的な発現量の解析を検討している。また、次世代シーケンサーを用いた網羅的mRNA解析による発現解析を実施するため、昨年度分離した1000細胞のG. catenatumシストのうち300細胞からtotal RNAを抽出した。解析には6μg以上で濃度200ng/μl以上の試料が必要であったが、得られたtotal RNAは全量で280 ng,濃度5.6 ng/μlで、mRNA-Seq解析するのに十分な量・質RNAを得られなかった。この結果から、解析に必要な試料を得るためには少なくともシスト試料は6000細胞程度は必要になると推測された。有害渦鞭毛藻の出現動態は、栄養細胞や休眠接合子(シスト)などの機能的に分化した細胞が環境の変化に応じて出現する、生活史によって大きく変化する。本研究は、これまで現象の観察にとどまっている渦鞭毛藻の生活史の制御機構解明を目指すものであり、特に、シストの休眠から発芽の過程で特異的、差次的に発現する遺伝子を特定して、シストの休眠および発芽の誘導・制御機構を明らかにすることを目的としている。昨年度までに有害渦鞭毛藻Gymnodinium catenatumの栄養細胞およびシストからRNAを抽出、cDNAを作製した。