hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
乾燥肌やアトピー性皮膚炎へのコラーゲントリペプチドの内服効果

本研究は、アトピー性皮膚炎におけるコラーゲントリペプチドの効果を検討した。申請者はこれまで、乾燥肌モデルマウスにおいてコラーゲントリペプチドが真皮のヒアルロン酸のヒアルロン酸産生を促し、乾燥にともなう痒みを改善することを明らかにした。その機序を明らかにするために本研究では、炎症性サイトカインであるIL-13、TNF-α、IFN-γを添加したヒト表皮角化細胞にコラーゲントリペプチドを添加し、TARC、TSLPの産生を測定することにより、コラーゲントリペプチドが炎症時の表皮角化細胞に与える影響について解析を行った。TARCの産生をRT-PCRで測定した結果、コラーゲントリペプチドを添加していない表皮角化細胞と比べて、TARCの産生が抑制されていた。また、TSLPについても同様の結果が得られた。ELISA法でTARCの蛋白定量を行った結果、コラーゲントリペプチドにより表皮角化細胞のTARCが低下する傾向がみられたが、有意差はみられなかった。同様に、TSLPをウエスタンブロット法で確認したところ、コラーゲントリペプチドの添加によりTSLPのタンパク量が減少することが明らかになった。さらに、13人のアトピー性皮膚炎患者に対して、コラーゲントリペプチド(7人)、コラーゲンペプチド(6人)を12週間投与し、SCORAD、角質水分量、痒みの評価、血清中のTARC、IgE、LDHおよび好酸球数を測定した。その結果、コラーゲントリペプチド投与群でのみ、内服投与開始前と比べて皮疹面積、SCORAD、TEWLが改善していた。コラーゲントリペプチド群では投与前と比べてTARCの減少がみられた。血清中のIgE、LDHおよび好酸球数についてはいずれの群でも投与前後で有意差は認めなかった。コラーゲントリペプチドはコラーゲンの分解物で、3つのアミノ酸からなるペプチドである。申請者はこれまで、乾燥肌のモデルマウスを用いてコラーゲントリペプチドが真皮のヒアルロン酸産生を促し、乾燥にともなう痒みを改善することを明らかにした。当該研究ではその機序を明らかにするため、表皮角化細胞にコラーゲントリペプチドが及ぼす影響を確認することを目的の1つとしている。IL-13、TNF-α、IFN-γを添加したヒト表皮角化細胞にコラーゲントリペプチドを添加し、TARCの産生をRT-PCRで測定したところ、コラーゲントリペプチドを添加していない表皮角化細胞と比べて、TARCの産生が抑制されていた。また、同様にTSLPについても同様の結果が得られた。また、IL-13、TNF-α、IFN-γを添加したヒト表皮角化細胞にコラーゲントリペプチドを添加し、ELISA法でTAECのタンパク定量を行った。その結果、コラーゲントリペプチドにより表皮角化細胞でのTARC産生が減少する傾向がみられたが、有意差を認めるまでには至らなかった。同様に、IL-13、TNF-α、IFN-γを添加した表皮角化細胞にコラーゲントリペプチドを添加し、TSLPの産生をウェスタンブロット法で確認したところ、コラーゲントリペプチドの添加によりTSLPのタンパク量が減少することが明らかになった。コラーゲントリペプチドが炎症時の表皮角化細胞へ与える影響について、当初の予定通りに研究を進めることができた。表皮角化細胞の実験を中心に行ったために、培養ヒト皮膚3次元培養実験までには至っていない。これまで、ドライスキンモデルマウスに対してコラーゲントリペプチドが、乾燥、掻痒を改善することは確認されているが、アトピー性皮膚炎モデルマウスに対して効果が得られるかは明らかでない。今後、アトピー性皮膚炎モデルマウスに対して、コラーゲントリペプチドの内服を行い、その効果を確認する。

また、アトピー性皮膚炎患者に対して、コラーゲントリペプチド内服効果をTEWL、角質水分散量、痒みの評価(Visual analg scale)、皮疹のスコア、血清中のアトピー性皮膚炎のバイオマーカーの測定にて評価していく。表皮角化細胞の実験に予想よりも時間を費やしたため、計画していた真皮線維芽細胞の実験に至らなかったため。次年度以降に計画していた培養細胞の実験を遂行していく。
大腸癌細胞の腫瘍形成能を促進するヒストン修飾酵素の同定と機能解析

癌におけるエピジェネテイクス制御およびその異常の重要性が明らかになっている。本研究では大腸癌におけるエピジェネテイクス、とくにヒストン修飾制御の重要性を検討した。KDM4C遺伝子は、ヒストンH3の9番目リジンの脱メチル化酵素KDM4Cをコードし、その増幅が食道癌や乳癌で報告されている。この遺伝子が大腸癌組織の腫瘍部で高発現し、そのノックダウンが大腸がん細胞の腫瘍形成能を抑制しうることを見出した。数十にもおよぶヒストンメチル化、脱メチル化酵素群などから順次そのshRNA搭載レンチウイルスを作成し、そのウイルスベクターを用いて大腸がん細胞株で安定ノックダウン株を樹立してきた。その上で、がん細胞の形質変化をもたらすヒストン修飾酵素をスクリーニングしたところ、KDM4Cが大腸腫瘍形成にかかわることを見出した。KDM4Cノックダウン大腸がん細胞ではin vitro sphereassayでの腫瘍形成能が消失した。このKDM4Cについてはこれまでも食道がんで遺伝子増幅が認められ、Sanger centerのCONAN analysisによれば扁平上皮がんでもコピー数異常が同定されている。また乳がんでは正常部と比べた発現上昇が認められる。さらにGOEの登録データを解析すると腫瘍によってはその発現が生命予後と相関するデータもある。これらの知見からはこの分子ががん遺伝子として機能する可能性が示唆されている。本研究では網羅的発現アレイのデータからKDM4Cノックダウン細胞の腫瘍形成能に関わる下流責任遺伝子Jagged1を探索同定した。Jagged1はNotchシグナルにかかわる分子であり、そのノックダウンは腫瘍形成能を抑制した。KDM4Cノックダウンの表現型を再現したことから、Jagged1がKDM4Cの下流遺伝子として大腸がん細胞の腫瘍形成能を制御することを示唆した。さらにChIPアッセイの結果から、KDM4Cがβcateninの活性化とともにJagged1遺伝子の発現を誘導することを明らかにした。その上で、がん細胞の形質変化をもたらすヒストン修飾酵素をスクリーニングしたところ、KDM4が大腸腫瘍形成にかかわることを見出した。KDM4ノックダウン大腸がん細胞ではin vitro sphereassayでの腫瘍形成能が消失した。このKDM4についてはSanger centerのCONAN analysisによれば扁平上皮がんでコピー数異常が同定され、また乳がんでは正常部と比べた発現上昇が認められる。またGOEの登録データを解析すると腫瘍によってはその発現が生命予後と相関するデータもある。今年度はKDM4ノックダウン細胞の腫瘍形成能に関わる下流責任遺伝子を網羅的発現アレイのデータから探索同定した。逆にその分子を操作することで腫瘍形成能を抑制しうるかどうかを検討し、KDM4の下流遺伝子であることのvalidationを行ってきた。面白いことにその遺伝子のひとつはNotchシグナルの受容体遺伝子であることが明らかとなっている。癌におけるエピジェネテイクス制御およびその異常の重要性が明らかになった。本研究では大腸癌におけるヒストン修飾制御の重要性を検討した。方法として、ヒストン修飾ヒストンメチル化、脱メチル化酵素群などから順次そのshRNA搭載レンチウイルスを作成し、大腸癌細胞株で安定ノックダウン株を樹立し、癌細胞の表現型に影響を与える分子をスクリーニングした結果、KDM4Cの重要性を明らかにした。KDM4C遺伝子は、その増幅が食道癌や乳癌で報告されているヒストンH3の9番目リジン(H3K9)の脱メチル化酵素KDM4Cをコードする。その分子は大腸癌組織の腫瘍部で高発現し、そのノックダウン細胞がin vitroにおける腫瘍形成能の低下を呈することを見出した。マイクロアレイを用いた発現解析から、KDM4Cノックダウンにより発現変化を認めるおよそ400遺伝子を抽出し、それらの遺伝子の中から腫瘍形成能の低下に関連する標的遺伝子候補JAG1を同定した。JAG1はNotchシグナルリガンドであるJagged1をコードし、そのノックダウンにより腫瘍形成能の低下が再現されることを確認した。クロマチン免疫沈降実験の結果から、KDM4CがJAG1遺伝子に結合することが示されたことから、以上の結果は大腸癌細胞においてKDM4CがJagged1を介した腫瘍形成能に関与していることを示唆していた。さらには、腫瘍形成の際に活性化されるWntシグナルの下流でKDM4Cの発現が誘導され、それが同じくWntシグナルの下流で発現するJAG1の転写を活性化することでさらに腫瘍形成を促進する、というKDM4C依存的なFeed- forwardメカニズムの存在を明らかにした。以上の知見は論文が発表なされた(Carcinogenesis. 2013Oct;34(10):2380-8.)。消化器内科学本研究は大腸癌細胞の腫瘍形成能を促進するヒストン修飾酵素の同定と機能解析を目的としており、今回同定したヒストン脱メチル化酵素KDM4Cが大腸がん細胞の腫瘍形成能に関わることを明らかにした。

またその上流と下流の分子機構についても解析を行い、論文として報告した。上記のように、大腸腫瘍形成にかかわるヒストン修飾酵素を同定し、その下流遺伝子候補を見出している。今後はKDM4Cの臨床検体における発現を検討し、その発現と大腸がんの予後などの臨床情報との相関について前向きに検討する予定である。これまでのKDM4ノックダウン大腸がん細胞で見られた腫瘍形成能への影響を他の細胞株でも再現性を確認し、in vivoモデルでもそれを検証する。アレイデータから抽出され、その表現型の責任遺伝子候補のひとつと考えられるNotch受容体遺伝子の過剰発現およびノックダウンを行うことでその関与を裏付ける。またKDM4の臨床検体における発現を検討するため、RTPCR、ウエスタンブロット、免疫組織学的染色を行い、その発現が大腸がんの臨床情報などと相関があるかどうかを調べる。同時にNotch受容体とKDM4発現の相関についても検討する。これらの検討と並行して、KDM4およびNotch受容体の大腸がん細胞における発現調節機構をin vitroの実験系で検討する。次年度は主としてRTPCR、ウエスタンブロット、免疫組織学的染色を行うための試薬、消耗品購入に使用する予定である。またマウスへの腫瘍移植実験を行うため、マウスの購入、飼育費にも使用する予定である。
ビッグデータ時代の環境可視化　－半構造映像データの抽象化階層表示

本研究では,ビッグデータ時代に向けた環境可視化システムのラピッドプロトタイピングを実施した.そこでは,実社会で日夜生成され続けている映像データに隠されている半構造情報に着目し,その抽象化階層を入れ子グラフ構造に変換する.そして,オーディエンスの視線やジェスチャを深度付きカメラを用いて追跡し,そこから情動の変化を無意識的に捉え,レイヤを上下移動する人称変換の適応的制御を可能とする.この階層的ブラウジングと簡易立体視表示を利用すれば,デジタルサイネージ前やSNS越しにいるオーディエンスに対しても,的確に対象世界の全体像を把握し,即時に効果的な行動を起こせるような強力な支援を実現できると考えられる.本研究では,ビッグデータ時代に向けた環境可視化システムのラピッドプロトタイピングを実施した.そこでは,実社会で日夜生成され続けている映像データに隠されている半構造情報に着目し,その抽象化階層を入れ子グラフ構造に変換する.そして,オーディエンスの視線やジェスチャを深度付きカメラを用いて追跡し,そこから情動の変化を無意識的に捉え,レイヤを上下移動する人称変換の適応的制御を可能とする.この階層的ブラウジングと簡易立体視表示を利用すれば,デジタルサイネージ前やSNS越しにいるオーディエンスに対しても,的確に対象世界の全体像を把握し,即時に効果的な行動を起こせるような強力な支援を実現できると考えられる.本研究では,ビッグデータ時代の実社会で日夜生成され続けている静止画・動画データに隠れている構造情報に着目し,その抽象化階層を入れ子グラフ構造に変換する.そして,オーディエンスの視線や各種情動の変化を無意識的に捉え,そのレイヤを上下移動する人称変換の適応的制御を主軸とする環境可視化システムをラピッドプロトタイピングする.この階層的映像ブラウジングを利用すれば,デジタルサイネージ前やSNS越しにいるオーディエンスに対しても,的確に自身の環境を把握し,即時に効果的な行動を起こせるような支援環境を実現することができると考えられる.初年度に実施した研究内容の概要は以下の通りである.1)定められた対象世界の映像コンテンツ間の関係を求め,組織的に対象世界の特徴を要約し,効率的かつ効果的にコンテンツをブラウジングする手法やシステム開発に関連する国内外の先端的な研究事例について詳細に調査し,その結果を,台湾-日本情報可視化グラフ描画ワークショップの招待講演として発表した.2) 1)の内容に基づいて,目的とする環境可視化システムの基本設計を実施した.そのパイロットシステムと静止画による仮想都市景観ブラウジングへの応用評価に関する予備的成果を,Visual Computing 2013シンポジウムでポスタ発表(査読付)した.3) 2)と並行して,オーディエンスの視線の動きやジェスチャを深度付カメラを利用して無意識的に計測し,映像コンテンツに対するオーディエンスの情動をリアルタイム推定する基本機能を開発した.さらに,その基本機能を利用して,パブリックディスプレイにおけるコンテンツの見えを部分的に人称変換するパイロットスタディを実施した.これらの初期的成果は,Cyberworlds2013国際会議でのフルペーパー(査読付)及びACM SAP2013国際会議でのポスタ(査読付)として発表した.本研究では,ビッグデータ時代に向けた環境可視化システムをラピッドプロトタイピングする.そこでは,実社会で日夜生成され続けている静止画・動画データに隠されている半構造情報に着目し,その抽象化階層を入れ子グラフ構造に変換する.そして,オーディエンスの視線やジェスチャを深度付きカメラを用いて追跡し,そこから情動の変化を無意識的に捉え,レイヤを上下移動する人称変換の適応的制御を可能とする.この階層的映像ブラウジングを利用すれば,デジタルサイネージ前やSNS越しにいるオーディエンスに対しても,的確に自身の環境を把握させ,即時に効果的な行動を起こさせるような支援を実現することができると考えられる.最終年度に実施した研究内容の概要は以下の通りである.1)上記の環境可視化を軸とし,コンピュータネットワークやハイパフォーマンスコンピューティング,データベース管理等を援用して,事実伝達における説明責任を果たす報道本来の在り方を目指す「計算報道学」に関する総説を,画像電子学会英文論文誌の招待論文として刊行した.2)目的とする環境可視化システムの実装を進め,実際の都市の映像群に適用し,そのマルチスコピックなブラウジング効果を評価した成果を映像情報メディア学会技術報告としてまとめた.3)オーディエンスの視線やジェスチャから情動の変化を無意識的に捉えるシステム機能に関しては,その最新成果を,電子情報通信学会英文論文誌Dに論文として発表した.4)運動視差立体視やトリックアートの原理に基づく簡易立体視を組み合わせ,最終情報呈示における没入感を増強する補助機能を実装し,その初期的成果を,複数の国内会議で報告した.ビジュアルコンピューティング初年度の計画に記載した流れにそって,関連研究調査及びパイロットシステム開発を進められてきた.関連調査の成果については,国際会議において招待講演する機会には恵まれたが,当初の予定どおり国内学術誌へのサーベイ論文として刊行できれば目標を達成できる.一方,システム開発に関しては,その基本要素となる半構造映像ブラウジング機能と適応的人称変換について,個々の実装は完了しているものの,両者の統合化レベルがまだ弱く,また応用評価についても限定的である.この点は次年度の主要な開発課題として加えたい.以下の3点に注力して最終年度の研究を推進していく.1)初年度の関連研究調査において,環境可視化と関連の深いパブリックディスプレイ技術に近年特に注目が集まっていることがわかった.次年度も調査を鋭意継続し,最新のサーベイ論文として取り纏め,国内学術誌に投稿する.

2)映像間の意味階層を反映した半構造ブラウジング機能と非接触計測によるオーディエンスの情動推定に基づく適応的人称変換機能を統合し,最新の環境可視化環境を実現する.3) 2)の適用事例を実応用に求め,その実地的評価を行う.候補としては,実世界の地理情報システムや人間関係の相関,ゲームブラウジング等が考えられる.ノートPC2台の購入費が予定額を下回ったため.最終年度に開発する統合環境を搭載する予定のPCのスペックアップに役立てる.
取締役会の企業価値実現のプロセスから見た実効的なコーポレートガバナンスの再構築

アメリカでの調査研究の結果、新たな論点として、「機関投資家の水平的株式保有と反トラスト法」の問題が生じたことから、これにつき追加の研究を行い、これに関して学会発表と論文発表を行った。なお、予定していた上場企業に対するコーポレートガバナンスの実施状況に関するアンケート調査は、予算と期限との関係で、実行を断念した。研究の成果に関する公表は非常にうまくいっている。さらなるアメリカのジャーナルへ向けて、比較法の観点から、日本と米英とのコーポレート・ガバナンスにおける機関投資家の活動の法的枠組み・市場の状況につき論文を作成し、投稿する予定である。また、英米法につき追加の調査を行う予定である。本研究は、取締役会の経営判断を最大限尊重しつつ企業の中長期的利益の最大化を目的としたコーポレートガバナンス・モデルを基本として、取締役会による[目標設定、実行、評価、公表、フィードバック]の適正なプロセスと実効性ある監査の構築を提案するものである。初年度の目標は、長期インセンティブ報酬やclawback制度を導入して、目標達成に即した役員報酬の体系を見直すことにある。長期インセンティブ報酬を導入する場合、報酬の決定過程、内容、開示をどうするか、特に評価の前提としてどのような指標に連動させるのか、事後に不正等が発覚した場合のclawback制度における取戻し事由、取戻し対象の範囲・期間をどうするのかが重要となるが、本年度は以上の論点を調査、研究した。その成果として、「役員報酬とガバナンスーclawback条項を手掛かりとしてー」との演題で、国際取引法学会・国際企業法制部会研究会(2016-06)にて報告を行った。また「役員報酬とコーポレート・ガバナンス-clawback条項を手掛かりとして-」(筑波ロー・ジャーナル21号pp.19-36, 2016-11)を公刊した。その間、アメリカ会社法の権威であるStephen Bainbridge (UCLA)教授にインタビューを実施した。同教授からは2015年7月にSECが公表した規則案についてのその後の動向などにつき情報を得るとともに、アメリカ(法規制型)とイギリス(ソフトロー型)における報酬規制を含むコーポレート・ガバナンスの考え方の根本的違いなどにつき有益な意見交換を行った。初年度分は「研究実績の概要」記載のとおり、研究計画をすべてクリアし、順調に推移している。ただし、これと併行して、第2年度に計画しているイギリスでの調査研究の準備として、現地情報を得るとともに、現地関係機関との連携を開始し第2年度にスムーズな調査研究ができるよう準備をする予定であったが、これについては手がつかなかった。2006年イギリス会社法が施行されてから10年が経過し、「啓蒙的株主価値(Enlightened shareholder Value)」モデルはイギリスで実務上浸透しているのか、このモデル実現のため情報開示や取締役会評価はどのように実施され市場はそれをどう評価しているのかにつき本年度は調査研究を行った。日本のCGコードは英国財務報告書評議会(FRC)のコーポレートガバナンス・コード(以下「CGコード」)を手本にしたものである。同コードに関するFRCの「取締役会の実効性に関するガイダンス」は、取締役会で求められる情報や審議の質などを示しており、日本のCGコードの解釈にも役立つものである。以上に関するイギリスとアメリカの文献を入手し読み込むことができ、また研究者との交信によりいくつかの疑問を解消することができた。本年度の計画ではFRCやイギリスの研究者にインタビューをする予定であったが健康を害したため本年度の渡航は見送らざるを得なかったものの、それ以外の調査研究は堅調に行うことができた。そしてその結果をアメリカと日本で論文として公表することができた。特にアメリカのロー・ジャーナル掲載は、日本人の研究者としては珍しいことであり、理論と分析が評価されたものと思われる。また、取締役会の実効性評価に対する監査役の関わり方について提言を行ったが、これは最終年度の計画の一部先取りの実行と言える。平成29年度は、主としてイギリスにおいて調査研究を実施する予定である。日本のCGコードは英国財務報告書評議会(FRC)のコーポレートガバナンス・コードを手本にしたものであるが、同コードを説明した「取締役会の実効性に関するガイダンス」は、非業務執行取締役や業務執行取締役の役割分担、取締役会における情報や審議の質など16項目を列挙しており、日本のCGコードの解釈にも役立つものである。FRCに対し現状分析と現在・未来のガバナンス構想につきヒアリングを行い、種々の情報を得たい。また、研究者として、会社法のこの分野の権威であるOxfordやCambridgeの教授にヒアリングを行い、全般的な理解を深めたい。さらに、可能であれば、情報開示および取締役会評価の実務に携わっている大手会計事務所を訪問し実務情報を得たい。調査研究結果を論文や調査報告として順次公表する予定である。来年度は最終年度であり、アメリカ又はイギリスへ渡航して必要な調査研究を終えたい。これから得られた比較法研究の成果を、さらに日米で公表していく予定である。

たとえば、監査役の常勤性(上場会社)を生かしつつ「妥当性(効率性)監査」を含める解釈をとることにより、監査役が独自の情報収集力を駆使した監査を実施することで、取締役会の健全な牽制力となりえると考えるが、そうしたガバナンス・システムはわが国において実効的なのか。CGコードがわが国で運用されて3年ほどしか経過していないが、アメリカ、イギリスの研究から得た知見を基に、上場会社に対しアンケート調査を実施し、調査結果とこの分析結果を順次公表していく予定である。さらなるアメリカのジャーナルへ向けて、比較法の観点から、日本と米英とのコーポレート・ガバナンスにおける機関投資家の活動の法的枠組み・市場の状況につき論文を作成し、投稿する予定である。また、英米法につき追加の調査を行う予定である。アメリカ国内でヒアリングの予定であった対象者が、都合で不可能になったため、若干経費が余剰となった。FRCやイギリスの研究者にインタビューをする予定であったが健康を害したため本年度の渡航は見送らざるを得なかった。次年度(最終年度)は、イギリス又はアメリカへ渡航して、インタビューなどのフィールド調査を実施しつつ、次年度の残りの計画を遂行する予定である。予定していた上場企業へのアンケート調査は予算と期限から断念した。かわりに、追加のアメリカのジャーナルへの論文の投稿を行い、また追加の調査を行うこととする。イギリスでの国内調査費用に振り向けたい。
関係性としての自己:自己概念の対人的・文化的・そして時間的文脈からの総合的検討

本研究の目的は、自己概念を対人的・文化的・時間的文脈の3点から総合的に検討することであった。study1では「主語」の様態が自己概念の状況即応的組織化に及ぼす影響を検討し、状況即応性の程度は主語の様態によること、study2では自己概念の状況即応的組織化の対人状況における適応的機能を検討し、(1)肯定的な自己側面へのアクセスが求められる状況と否定的な自己側面へのアクセスが要求される場合では、同じ個人であっても情動反応が異なり、(2)後者は前者に比べて自己評価が低く、またうつ気分等の否定的情動が支配的になること、しかしこの後肯定的な自己側面へのアクセス強化をすると、自己評価や肯定的情動が再度高まること、study3では、自己概念の組織化における時間経過の影響を検討し、自己概念の組織化は時間経過より状況の影響をより強く受けることを見出した。以上の結果、特に、Study2とstudy3の結果は、否定的感情が喚起された場合、その制御に自己概念の肯定的側面・要素へのアクセスを強化することが効果的であることを示しており、将来的には企業現場での予防的メンタルヘルスの実現への一助になると考えられる。本研究の目的は、関係性としての自己という視点から、自己の形成を、対人的・文化的・時間的文脈から総合的に検討することである。平成19年度は(1)主語の相違が自己概念の状況即応的組織化に及ぼす影響の実験的検討、(2)他者概念の複雑化(others-complexity)測度の開発、(3)文化的文脈の影響の検討の準備、以上3点を実施した。(1)について:自己記述の際に使用する主語の様態と対人状況の様態の相互作用を検討すべく、先ず日本において実験を行った。対人状況は集団状況のみで、主語の様態(「わたし」・「固有名詞」)を独立変数とする、一要因実験を行った。その結果、固有名詞条件のほうが自己記述において、信条、性格特性、目標などの内的属性に関する記述が多く認められた。このことは、(1)日本においては内的属性に関する記述がアメリカより少ないというこれまで主張されてきた「文化的差異」を再検討する必要があること、(2)自己概念の組織化は「主語」という要因の関数であること、を示唆するものである。(2)について:他者概念の複雑化は、(1)2種類の他者概念複雑さ測度の開発と、(2)自他の視点の相対化に関する測度から検討した。(1)については、convoy方式など、cognitive mapを記述する方法を収集している過程である。(2)については、社会的かしこさ測度(白樫ら、2003)を再検討し、質問項目のワーディングを行った。本研究の目的は、関係性としての自己という視点から、自己概念を、対人的・文化的・時間的文脈から総合的に検討することである。平成20年度は(1)他者概念の複雑化測度の構築、(2)他者概念の複雑化と自己概念の対人状況即応的組織化との関係、(3)主語の相違が自己概念の状況即応的組織化に及ぼす影響についての比較文化的検討、を予定した。各テーマの研究経過は以下の通りである。(1)他者概念の複雑化とは、自己と対項関係にある他者がどれほど分化して自己の認知マップに位置づけられているかの程度である。平成19年度の予備調査を基に本年度は大規模調査を予定した。しかし臨床心理学の専門家を交えた共同検討から、半投影法的測度の有用性が明らかになり、本研究に於いては半投影法も含めた、よりエラボレイトされた測度構築がより生産的であるとの重要な知見を得た。(2)他者概念が複雑に分化している程、対人状況の違いに即応した自己概念の記述が顕著になり、またこのことは、対人状況における適応的行動と関連すると考えられるため、他者概念の複雑化を様々な適応指標との関係から検討した。本年度はこの予備段階として、(1)同じ個人であってもどのような自己概念が想起されるかは状況により異なること、(2)またその内容によって情動反応が同じ個人によっても変化することを検討した。

その結果、(1)positiveな自己側面へのアクセスが求められる状況とnegativeな自己側面へのアクセスが要求される場合では、同じ個人であっても情動反応が異なり、(2)後者は前者に比べて自己評価が低く、またうつ気分などの否定的情動が支配的になること、しかしこの後positiveな自己側面へのアクセス強化をすると、自己評価や肯定的情動が再度高まることが示された。(3)自己記述における「主語」の様態の違いが自己概念の状況即応的組織化におよぼす影響について、日米で比較文化的検討をすべく、今年度はBurnstein教授(ミシガン大学)と実施計画を検討した。その際、東欧圏でのデータ収集が比較文化的研究に生産的との助言を得た。本研究の目的は、関係性としての自己という視点から、自己概念を、対人的・文化的・時間的文脈の3点について、総合的に検討することであった。平成21年度は、(1)主語の様態が自己概念の状況即応的組織化に及ぼす影響、(2)他者概念の複雑化測度の構築を主として探求した。(1)については、自己記述の際に使用する主語の様態(代名詞・固有名詞)と4つの対人状況((1)集団条件、(2)友人条件、(3)指導教員条件、(4)個別条件)との交互作用が見出されること、即ち、状況即応的自己概念の構造化がより顕著なのは、「わたし」という代名詞を用いる時であり、固有名詞を用いて自己を想起する場合は状況の変化を受けにくく、内的特性に言及したより一貫した内容になるであろうと予想した。一部は現在分析中であるが、これまでのところ、予想を支持する傾向が見出されている。(2)他者概念の複雑化測度の構築については、より精緻に検討すべく、実験的手法を用いた。他者概念が複雑に分化している程、対人状況の違いに即応した自己概念の記述が顕著になり、またこのことは、対人状況における適応的行動と関連すると考えられるため、他者概念の複雑化を様々な適応指標との関係から吟味できると予想した。即ち、(1)同じ個人であってもどのような自己概念が想起されるかは状況により異なること、(2)またその内容によって情動反応が同じ個人によっても変化することを検討した。その結果、(1)肯定的な自己側面へのアクセスが求められる状況と否定的な自己側面へのアクセスが要求される場合では、同じ個人であっても情動反応が異なり、(2)後者は前者に比べて自己評価が低く、またうつ気分等の否定的情動が支配的になること、しかしこの後肯定的な自己側面へのアクセス強化をすると、自己評価や肯定的情動が再度高まることが示された。以上の傾向は、学生のみならず、企業現場の社会人についても同様に観察された。これは、否定的感情が喚起された場合、その制御に自己概念の肯定的側面・要素へのアクセスを強化することが効果的であることを示しており、将来的には企業現場での予防的メンタルヘルスの実現への一助になると考えられる。
線条体ニュ-ロン回路の統合的発達に対する外来ド-パミン線維の役割

1.疾患モデルラット大脳のカテコ-ルアミン線維について疾患モデルラットの探索中、線条体や大脳皮質のチロシン水酸化酵素(TH)免疫活性線維にvaricosityがきわめて少ないラットをみいだした。当該ラットはkohnら(1981年)によりHTXと名付れられ、線条体・大脳皮質ニュ-ロン構築の低形滑・顕著な脳室拡大を呈し、非発症ラットに比して運動機能異常が著しい。中脳腹側部と前帯状皮質におけるTH線維の形態変化を系統的に検索した。生後12日齢のHTXでは、varicosityが比較的保存されていたが、14日齢以降のHTXではいずれもTH線維は狭小化し、屈曲蛇行を示し、表面が平滑であった。この形態変化に関しては、雄雌のHTXともに、脳室拡大のグレ-ドにかかわらず出現すること、HTXの非発症群にもみられること、大脳白質の浮腫・空隙などの傷害に起因するものではないこと、を明らかにした。以上より、この形態変化は、発達の段階的経過を踏まえて形成される、HTXにきわめて特徴的な変化であると結論した。2.ド-パミン受容ニュ-ロンの検出ド-パミン線維を受容する大脳ニュ-ロンをモニタ-するため、ラットD2ド-パミン受容体に対する抵抗(P3抗体)をオリゴペプチド法によって作製した。SDラットとHTXの固定脳切片をABC法で免疫染色し、P3陽性産物を側座核と腹側被蓋野において同定した。両ラットにおいて側座核のP3陽性産物は、主要(中型ないし大型)ニュ-ロンの主として細胞体膜面と樹状突起に局在した。側座核のニュ-ロピルにおいては、顆粒状の反応産物が細い神経線維にも出現した。腹側被蓋野では少数の主要ニュ-ロンが標識された。SDラットに比しHTXのP3陽性産物は全般的に凝集して神経組織に局在した。免疫吸収試験の結果、P3陽性産物は減弱ないし消失した。
心臓形態形成を制御する新規シグナル伝達ネットワークの解明とその意義

心臓の発生・形態形成の制御機構の研究は、先天性心疾患の病因解明だけではなく、再生医療や新規治療戦略の開発に必須のテーマである。特に、心臓中隔や弁の前駆組織である「心内膜床」は心臓形態形成に特有の複雑な構造をつくりだすために非常に重要な役割を担い、その形成異常は様々な先天性心奇形の原因となる。そこで本研究では、心内膜床形成におけるBMP9/BMP10およびALK1受容体の意義を明らかにするため、Hrt転写因子を中心とした新規のALK1シグナル下流因子の発現制御機構と機能に焦点をあて、発生学的・分子生物学的手法を用いて多面的な解析を行った。心内膜床形成におけるBMP9→ALK1シグナルのターゲット因子を同定するために、ヒト臍帯動脈内皮細胞(HUAEC)にBMP9を添加し、その遺伝子発現の変化を網羅的に解析したところ、Tmem100と命名された新規膜タンパクをコードする遺伝子の発現が亢進していた。また、興味深いことに、HesやHrtなど、Notchシグナルの下流転写因子の発現亢進も認められた。そこでTmem100およびHrt遺伝子欠損マウスの解析を行ったところ、これらのマウスは心臓形態に異常を示し胎生致死になることが明らかとなった。心内膜床形成過程におけるTmem100およびHrt遺伝子の役割を検討するために、心内膜床形成に重要とされる様々なシグナル伝達系のターゲット因子の発現を免疫染色を用いて検討したところ、Tmem100欠損マウスでは細胞内カルシウムシグナルのマーカーであるNFATc1の局在異常が、またHrt欠損マウスではTGFbシグナルの下流ターゲット因子であるSlugの発現が低下していることを見出した。以上の結果から、BMP9/10→ALK1シグナルはカルシウムシグナルやNotchシグナルとクロストークして心内膜床形成を制御していることが示唆された。心臓中隔や弁は、初期胚心臓の房室管と流出路に認められる1対の隆起「心内膜床」により形成される。したがって、この心内膜床の形成不全は心室中隔欠損や弁形成異常など様々な先天性心疾患の原因となる。これまでの研究により、心内膜床は心筋から分泌されるTGFb2およびBMP2のシグナルを受けた内皮細胞が間葉細胞へと形質転換(Endothelial-mesenchymal transformation; EMT)することによって形成されることがわかってきている。しかしながら、最近の研究ではこれらの成長因子以外にも心内膜床形成に関与する新たなリガンドやレセプターの関与が示唆されている。そこで本研究では、BMP9およびBMP10の特異的受容体であるALK1欠損マウスが心血管系の形成異常により胚性致死となることに注目し、心内膜床形成におけるこれらのシグナル伝達の関与を検討した。上述のように、ALK1欠損マウスは血管形態形成異常を示して胎生致死となることが報告されているが、我々は組織学的解析からALK1欠損マウスが心内膜症の形成異常を示すことを見出した。また、心内膜床形成培養モデルを用いてBMP9がTGFb2と協調して心内膜内皮細胞のEMTを誘導できることが明らかとなった。そこで我々は、BMP9-ALK1シグナルの下流ターゲット因子をMicroarrayを用いて解析したころ、Notchシグナルのターゲット因子として同定されたHrt遺伝子(Hrt1/Hrt2)が含まれていた。興味深いことにHrt1/Hrt2ダブルノックアウトマウスも心内膜床形成不全を示すことから、BMP9/BMP10-ALK1シグナルとNotch-Hrtシグナルはクロストークしており、このシグナル伝達クロストークが心内膜床形成を制御する新たなメカニズムであることが示唆された。心臓中隔や弁の前駆組織である「心内膜床」は心臓形態形成に特有の複雑な構造をつくりだすための重要な組織であり、その形成異常は様々な先天性心奇形の原因となることが知られている。したがって、心内膜床の形成を制御するメカニズムを解明することは基礎医学のみならず小児循環器学を中心とした臨床医学においても非常に重要であると考えられる。本研究では、Bone Morphogenetic Protein (BMP)9およびBMP10とその受容体であるALK1によるシグナル伝達に注目し、心内膜床形成を制御する新規分子メカニズムの同定を試みている。前年度までの研究により、Notchシグナルのターゲット因子として知られるHrt転写調節因子の発現がBMP9/10-ALK1シグナルの活性化によって誘導されることが示された。そこで、本年度は心内膜床形成におけるHrt転写因子の意義について検討を行った。Hrt転写因子はHrt1/Hrt2/Hrt3の3つのアイソフォームを持ち、単独のノックアウトマウスでは心内膜床形成に顕著な異常は認められないことが知られている。我々はHrt1/Hrt2のダブルノックアウトを作製し、心内膜床形成に必須のプロセスである内皮-間葉形質転換(EMT)が誘導されず、心内膜床形成不全なることを見出した。また、このダブルノックアウトマウスでは、TGF-betaシグナルによって制御されるSlugおよびSnailの発現が低下していたことから、心内膜床形成の制御機構としてALK1シグナル、NotchシグナルおよびTGF-betaシグナルのクロストークが重要であることが示唆された。

特に、心臓中隔や弁の前駆組織である「心内膜床」は心臓形態形成に特有の複雑な構造をつくりだすために非常に重要な役割を担い、その形成異常は様々な先天性心奇形の原因となる。そこで本研究では、心内膜床形成におけるBMP9/BMP10およびALK1受容体の意義を明らかにするため、Hrt転写因子を中心とした新規のALK1シグナル下流因子の発現制御機構と機能に焦点をあて、発生学的・分子生物学的手法を用いて多面的な解析を行った。心内膜床形成におけるBMP9→ALK1シグナルのターゲット因子を同定するために、ヒト臍帯動脈内皮細胞(HUAEC)にBMP9を添加し、その遺伝子発現の変化を網羅的に解析したところ、Tmem100と命名された新規膜タンパクをコードする遺伝子の発現が亢進していた。また、興味深いことに、HesやHrtなど、Notchシグナルの下流転写因子の発現亢進も認められた。そこでTmem100およびHrt遺伝子欠損マウスの解析を行ったところ、これらのマウスは心臓形態に異常を示し胎生致死になることが明らかとなった。心内膜床形成過程におけるTmem100およびHrt遺伝子の役割を検討するために、心内膜床形成に重要とされる様々なシグナル伝達系のターゲット因子の発現を免疫染色を用いて検討したところ、Tmem100欠損マウスでは細胞内カルシウムシグナルのマーカーであるNFATc1の局在異常が、またHrt欠損マウスではTGFbシグナルの下流ターゲット因子であるSlugの発現が低下していることを見出した。以上の結果から、BMP9/10→ALK1シグナルはカルシウムシグナルやNotchシグナルとクロストークして心内膜床形成を制御していることが示唆された。これまでの研究により、BMP9/BMP10-ALK1シグナルの下流にHrt転写因子が存在することが示唆され、このHrt転写因子が心内膜床形成に必須のシグナル伝達であるTGF-beta経路を制御していることが明らかとなってきており、Hrt転写因子に関連する研究においては予定以上に解析が進展している。しかし、当初予定していたin vivo ChIPシークエンスの進行は使用する抗体の選定などにより停滞している。したがって、これら2つの達成度を合わせて評価するとおおむね順調に進展していると判断できる。当初の計画ではすでに終了しているはずのSmad1/5抗体を用いたin vivo ChIPシークエンスの進行が停滞していることから、最終年度はこの解析を重点的に行う予定である。また、ALK1-Hrt-TGFbetaシグナルのクロストークを制御する分子メカニズムを解明するために、Hrt転写調節因子のターゲット因子の同定をMicroarrayおよびreal-time RCR解析似て検討する。平成25年度の研究計画において、最大の目的は心内膜床形成におけるBMP9-ALK1シグナルとHrt転写因子の意義を検討することにある。我々は研究計画を遂行し、以下の結果を得ている。1培養内皮細胞にBMP9を添加するとHrt遺伝子の発現が上昇する。2ALK1欠損マウスの内皮細胞ではHrt遺伝子の発現低下が認められる。3ALK1欠損マウスは心内膜床形成不全を示す。4BMP9はTGFb2と協調して内皮ー間葉形質転換を誘導する。5Hrt1/Hrt2
光学測定による大容積高温高圧装置の精密化と650km不連続層の解明

本年度はまず,マルチアンビル型超高圧発生装置における光ファイバーを用いたルビー蛍光測定技術の確立を行なった.これには,本研究費で購入されたマルチチャンネル・ダイオードアレイ検出器と光学モニター装置が用いられた.従来行なわれた類似の試みは,光ファイバーが高圧容器に出入りする部分で著しい損傷を受け透過光量が減少するためうまくいかなかったが,本研究では適切な力学特性を持った光ファイバー見つけ出し,超高感度検出器と組合せることによりこの困難を克服し,従来不可能であった30kbar領域まで測定が可能になった.さらにもう一段の改良を加えることにより,マルチアンビル装置では従来困難であった超高圧領域における精密で連続的な圧力測定が可能になると期待される.さらに,焼結ダイヤモンドをアンビルとして用いるための技術的な問題点を研究し,その試作に入っている.試作に用いられた焼結ダイヤモンドは,従来アンビルとして用いられていた超硬合金に較べて飛躍的に硬度が高く形状も本研究の装置に合致したものが成形可能となったため,本研究に必要とされる30GPaを安定して発生するめどが立てられた.また精密な高温実験に必要な,均一な温度分布を持った高圧室埋め込み用小型電気炉の設計も,シュミレーションを用いて完成した.これらの技術開発と平衡して,地球深部で重要な役割を果たすと考えられているケイ酸塩ペロブスカイトのひとつである, CaSiO_3の高温高圧下の相転移と弾性的性質に関する半定量的研究がダイヤモンドアンビル装置を用いて完成した.これらの成果の上に,来年度はMgやFeを含むケイ酸塩ペロブスカイトの高温高圧下における精密な定量的実験を推進する予定である.本年度はまず,マルチアンビル型超高圧発生装置における光ファイバーを用いたルビー蛍光測定技術の確立を行なった.これには,本研究費で購入されたマルチチャンネル・ダイオードアレイ検出器と光学モニター装置が用いられた.従来行なわれた類似の試みは,光ファイバーが高圧容器に出入りする部分で著しい損傷を受け透過光量が減少するためうまくいかなかったが,本研究では適切な力学特性を持った光ファイバー見つけ出し,超高感度検出器と組合せることによりこの困難を克服し,従来不可能であった30kbar領域まで測定が可能になった.さらにもう一段の改良を加えることにより,マルチアンビル装置では従来困難であった超高圧領域における精密で連続的な圧力測定が可能になると期待される.さらに,焼結ダイヤモンドをアンビルとして用いるための技術的な問題点を研究し,その試作に入っている.試作に用いられた焼結ダイヤモンドは,従来アンビルとして用いられていた超硬合金に較べて飛躍的に硬度が高く形状も本研究の装置に合致したものが成形可能となったため,本研究に必要とされる30GPaを安定して発生するめどが立てられた.また精密な高温実験に必要な,均一な温度分布を持った高圧室埋め込み用小型電気炉の設計も,シュミレーションを用いて完成した.これらの技術開発と平衡して,地球深部で重要な役割を果たすと考えられているケイ酸塩ペロブスカイトのひとつである, CaSiO_3の高温高圧下の相転移と弾性的性質に関する半定量的研究がダイヤモンドアンビル装置を用いて完成した.これらの成果の上に,来年度はMgやFeを含むケイ酸塩ペロブスカイトの高温高圧下における精密な定量的実験を推進する予定である.
培養細胞仮足においてアクチン繊維伸長を制御する因子群の機能解析

WASPおよびEna/VASPファミリーに属するタンパク質は、RacやCdc42などのRhoファミリー低分子量Gタンパク質ファミリーの下流で起こるアクチン細胞骨格の再編に関与していると考えられているが、その機能の詳細は不明である。そこでラメリポーデイアを伸展したラット線維芽細胞株3Y1を用いて、WASPファミリーのWAVEとN-WASPおよびEna/VASPファミリーのMenaの細胞内局在を解析した。各タンパク質の局在は間接蛍光抗体法と免疫電子顕微鏡法によって観察した。N-WASPはラメリポーディア内マイクロスパイクのアクチン繊維に添って局在したのに対し、WAVEはラメリポーディアとマイクロスパイクの先端に局在した。MenaはWAVEと相似な局在を示したが、WAVEよりもマイクロスパイクの先端に強く集積する傾向を示した。WAVEとMenaの局在を制御する機構を明らかにするために、各タンパク質の機能をドメインを細胞に発現させ、その局在を観察した。WAVEでは分子のN端側に存在するSCARホモロジードメインのみでもWAVEと同様な局在を示し、Menaでは分子のC端側に存在するEVH2ドメインがMenaと同様な局在を示した。従って、WAVEとMenaの局在にはそれぞれSCARホモロジードメインとEVH2ドメインが重要なことが明らかになった。SCARホモロジードメインとEVH2ドメインのアミノ酸配列には明らかな相同性がないことから、WAVEとMenaの局在は異なった機構によって制御されてると考えられる。細胞表層のアクチン細胞骨格構造の制御には、低分子量Gタンパク質RhoファミリーのRacとCdc42が関与している。これまでにそれらの下流で、WASPファミリーやEna/VASPファミリーのタンパク質がアクチン細胞骨格に作用していることが報告されている。しかし、それらのタンパク質が細胞内で果たしている機能の差異は明らかにされていない。そこで、WASPファミリーに属するN-WASPとWAVEおよびEna/VASPファミリーに属するMenaのラメリポーディアにおける局在を解析した。ラット胚由来の3Y1細胞は、ポリ-L-リジン処理したカバーガラス等に接着すると細胞の周囲にラメリポーディアを形成する。そのような3Y1細胞を抗N-WASP抗体、抗WAVE抗体や抗Mena抗体を用いて免疫染色し、各抗原のラメリポーディアにおける局在を観察した。フィロポーディアの伸長に関与するN-WASPは、マイクロスパイクのアクチン束全体に分布した。N-WASPの活性制御因子であるCdc42も同様な局在であったことから、N-WASPはラメリポーディア内ではアクチン繊維の重合ではなく束形成を制御していることが示された。ラメリポーディアの伸展に関与しているWAVEとMenaは、共にラメリポーディアの先端に沿って局在した。またMenaはラメリポーディア内のマイクロスパイク先端へ濃縮したが、そのような分布はWAVEでは観察されなかった。これらの結果から、アクチンの重合に関してMenaがWAVEよりも直接的な役割を果たしていることが示唆された。WAVEとMenaのラメリポーディア先端への局在に関わるタンパク質分子内のドメインを決定したところ、それぞれSHDとEVH2であった。これらのドメイン間に明らかな相同性がないことから、WAVEとMenaの局在は異なった機構で制御されていることが明らかとなった。
ナノ粒子化点眼薬の眼内炎治療に関する研究：抗炎症効果とその機序について

トラニラストナノ分散点眼液(TLn)の抗炎症効果についてエンドトキシン誘発ぶどう膜炎(EIU)ラットモデルを用いて評価した。また、RAW264.7細胞を用いて抗炎症機序について検討した。TLnはEIUの臨床病態、組織病理学的ならびに免疫組織学的検索において抗炎症効果を示した。RAW264.7細胞を用いたTLnの抗炎症機序は、少なくともp-IKKの活性抑制とIκB分解抑制およびHO-1の早期発現によるNF-κB経路とp-JNKの活性抑制を介するAP-1経路の両活性抑制によるものであることが示唆された。これらのことからTLnは眼科領域を含めた炎症治療物質として有望な薬となりうることが期待される。ぶどう膜炎治療には、ステロイドと非ステロイド系抗炎症薬のみが利用されている。しかし、眼感染症や角膜疾患をもつ症例では、その使用は禁忌であり治療に苦慮する。「これらの問題を解決する眼内炎点眼治療薬はないか?」というう観点から、本研究は、ナノテクノロジーを応用した薬剤送達システムによる眼内炎治療につながるナノ化トラニラスト点眼液について、炎症抑制効果とその機序解の基礎研究を目的としている。本年度は、エンドトキシン誘発ぶどう膜炎(EIU)モデルを用いたin vivo試験ならびに培養細胞を用いたin vitro試験による抗炎症効果の機序について実験を行った。1.EIUモデルを用いた抗炎症効果の機序についての検討:ナノ化トラニラスト点眼液の抗炎症機序は、免疫組織学的検索より、LPS投与後3時間の毛様体上皮において、HO-1の発現を誘導すること、同様にNF-κBの発現を抑制することで抗炎症効果を示すことを明らかにした。2.RAW264.7細胞におけるin vitro試験による検討:ウエスタンブロット法により、RAW264.7細胞にLPSとナノ化トラニラストを添加後24時間において、COX-2とiNOSの発現を有意に抑制した。しかし、眼感染症や角膜疾患を持つ症例では、その使用は禁忌であり治療に苦慮する。「これらの問題を解決する眼内炎点眼治療薬はないか?」という観点から、本研究は、ナノテクノロジーを応用した薬剤送達システム(DDS)による眼内炎治療につながるナノ化トラニラスト点眼液について、炎症抑制効果とその機序解明の基礎研究を目的としている。そこで本年度は、エンドトキシン誘発ぶどう膜炎(EIU)ラットモデルを用いたin vivo試験ならびに培養細胞を用いたin vitro試験による抗炎症評価を行った。1.EIUを用いたin vivo試験による検討:ナノ化トラニラスト点眼液は、その濃度依存的に房水中の浸潤細胞数と蛋白濃度、房水中の炎症マーカー(TNF-α、PGE2とNO)濃度を有意に抑制した。また、組織病理学的評価においても抗炎症効果を確認した。2.RAW264.7(マクロファージ)細胞におけるin vitro試験による検討:現在、培養細胞へのLPSの添加量と感作時間ならびにナノ化トラニラストの添加量と感作時間についての条件の検討を確認し本試験を予定している。3.犬毛様体無色素上皮培養細胞の確立:細胞の分離方法と培養液検討を進めている。ナノテクノロジーを応用した薬剤送達システム(DDS)による眼内炎治療を目的としてナノ化トラニラスト(n-TL)点眼薬の抗炎症効果とその機序をin vivoとin vitro系で評価することを目的とした。前年度までにIn vivoによる評価系であるエンドトキシン誘発ぶどう膜炎(EIU)ラットモデルを用い、nTL点眼は、抗炎症効果が得られることを明らかにしている。本年は、nTLの詳細な抗炎症機序解明を目的として、RAW264.7細胞を用いたin vitro試験を行った。実験方法: RAW264.7細胞の培養液中に前処置として25μM nTLを24時間添加と非添加した各群に、1μg/mLのLPSを30分感作後のp(リン酸化)-IKK、IκB-α、p65 (NF-κBのサブユニット)、p-c-Jun(AP-1のサブユニット)、分裂促進因子活性化蛋白質キナーゼ(MAPKs)のリン酸化(p-JNK、p-p38、p-ERK)、HO-1ならびにLPSを12-24時間感作後のCOX-2、iNOS、HO-1の各種抗体を用いてその発現を蛍光免疫染色法ならびにウェスタンブロット解析により検討した。結果:25μM nTL添加群は、LPS添加30分後のIKKのリン酸抑制、IκB-αの分解抑制とp65の核内移行(免疫蛍光染色法による)の抑制ならびにJNKとc-Junのリン酸化抑制が認められた。一方、nTLはp38とERKのリン酸化を抑制しなかった。

HO-1の発現増加が確認された。また、LPS添加24時間後のCOX-2とiNOSの発現を有意に抑制した。結論:nTLは、1IKKのリン酸化抑制によるIκBの分解あるいは直接的なIκBの分解抑制とHO-1の早期発現によりNF-κBの活性化阻害と、2c-Junのリン酸化を抑制することでAP-1の転写活性の一部を阻害した。nTLは、二つの転写因子であるNF-κB経路とAP-1経路の一部を阻害することを明らかにした。NF-κBとAP-1経路を阻害するnTLの抗炎症効果は、眼内炎の新たな治療戦略となりうることが期待される。獣医眼科学EIUラットモデルにおけるナノトラニラスト点眼液の抗炎症機序が、虹彩毛様体上皮細胞におけるNF-kBの活性化を抑制することを明らかにした。さらにこのナノ点眼液が、へムオキシゲナーゼ-1 (HO-1)の発現を誘導することを明らかにした。しかし、RAW264.7細胞をもちいたIn vitro試験において、ナノトラニラストがCOX-2とiNOS発現を抑制することをウエスタンブロティング法により明らかにしたが、詳細な抗炎症機序解明が思うように進んでいないため。また、犬の毛様体上皮細胞確立の着手も遅れているため。EIUラットモデルにおけるナノ化トラニラスト点眼液の抗炎症効果の指標である房水中の浸潤細胞数、蛋白濃度、炎症マーカー濃度(TNF-α、PGE2とNO)は、ナノ化トラニラスト点眼液の薬剤濃度に依存して抑制され、病理組織標本でもそれらの効果を確認し、当初の計画以上に進展しているが、RAW264.7細胞を用いたin vitro試験での予備試験が終了し、次年度に本試験(平成25年度)をおこなうため、また犬毛様体無色素上皮細胞培養確立のための条件検討中であり予定より遅くなっているため。RAW264.7細胞を用いたin vitro試験における詳細な抗炎症機序、特に転写調節因子の発現・調節の解明を蛋白ならびにmRNAレベルで解明する。EIUモデルを用いたin vivo試験において、免疫組織化学染色による抗炎症効果の機序解明を進める。培養細胞を用いたin vitro試験では、抗炎症効果の速やかな評価のために人毛様体無色素上皮細胞を購入し、眼内特異的なナノ化トラニラスト点眼薬の抗炎症効果を討することで、その機序解明の早期実施に努める。犬の毛様体培養細胞の確立が実験計画通りに進行しなかったため翌年度分の助成金と合わせて培養細胞関連費として研究を進めていく次年は、基本的には申請時に準ずるが、in vitro試験をより効率的に研究を実施するために培養細胞関連試薬とその消耗品割合を高くする。