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継続的契約関係・信認関係における情報の役割

消費者契約と、信託法に主に焦点を当て、継続的契約関係や社会的信認関係の存在する場面での情報に対する法規制の在り方について、おもに比較法的な視点(フランス・イギリス・アメリカ)から考察を行い、論文を執筆した。そのほか、錯誤・瑕疵担保責任などについての小論を執筆した。本研究は,信認関係や継続的な契約関係を中心に,情報の役割を検討するというものであるが,初年度にあたる18年度は,主に契約における情報の役割についての基礎的な研究として、事業者・消費者概念の契約法における位置づけについて検討を行った。事業者と消費者は,情報力において格差が存在し,その非対等な関係が,消費者契約における諸問題を生じさせていわれているが、関係が非対等であるということの意味が、十分に考察されているとは言い難いように思われたからである。そこで、契約当事者の対等性の意味を考察するところから研究を始めたまずわが国における議論状況についての調査を行った。消費者概念については,消費者法を民法の中に取り込むかどうか,すなわち消費者を民法上の「人」概念の具体化として考えるかどうかについての議論の研究が比較的盛んであるため、この中から、消費者概念の抽出を試みた。また「事業者」概念については、近時の金融商品取引法、金融商品販売法の、特定商取引法など個別立法についての研究を、文献調査を中心に行った。また比較法研究としては、売主の瑕疵担保責任について、事業者・消費者での差異という点に着目した研究を行った。売買目的物の瑕疵は契約における重要情報の一つと考えられるからである。調査してみると,フランスにおける瑕疵担保責任制度の判例理論において,きわめて興味深い発展が見られた。すなわちフランスでは,事業者同士の売買と、非事業者同士の売買について、同じ対等な関係でも、異なる規律が見られるのである。現在,この点について,より詳しい考察をおこなった論文を執筆中である。平成19年度は、消費者契約に関する論文を1編公表した。消費者契約については、事業者間対消費者の関係は非対等であり、それ故に事業者に対する消費者の社会的な信頼を保護する必要があるとされる。具体的には、情報提供義務や、免責条項の制限等の手段によって、消費者は保護されなければならないのだとされている。しかし非対等であるということが、どのような論理的プロセスを経て、消費者保護に結びつくのかは、必ずしも明らかでない。このような問題意識から、「事業者対消費者」の関係と対置する形で、「事業者間の契約」と「非事業者間の契約」という、対等二当事者間の関係を比較検討するという作業を行った。その結果、非事業者間の契約は事業者間契約に比べて、情報を持たない契約当事者が契約に参加するという点から、法による積極的な介入を許容する余地があることを指摘した。ただし、これは比較法の対象としたフランス法のあり方とは異なった方向性であり、法のあり方の多様性を示唆する点でも興味深い成果が得られたと考えている。またその過程において、民法572条および消費者契約法8条1項5号の解釈論を示しており、解釈論的な実践的価値にも配慮したつもりである。こうした研究の結果、事業者対消費者の社会的な関係における情報の非対等性という問題について、一定の成果が得られたものと考えている。そのほか、平成19年度は信託法を中心とした基礎研究を行った。こちらはまだ発表できる段階にはないが、20年度前半に、関連するテーマにおいて業績を発表したいと考えている。イギリス法における、売買目的物に瑕疵がある場合の買主の救済手段についての研究は、昨年度の比較法学会でも報告をおこなったが、その後研究を進め、新たな情報も盛り込んだ上で、雑誌論文として公表を行った。事業者間契約関係と事業者消費者間関係において、買主の救済手段がどのように変化するかといった点について、買主の検査通知義務と救済の関係など、より詳細で正確な情報を提供できたものと考えている。パートナーシップ契約と慰謝料請求権に関する研究は、最判平成16年11月18日裁判所時報1376号3頁の判例評釈の形で公表した。裁判所が私的に形成された異性の非婚姻型の生活共同体関係にどこまで介入するべきか、また両当事者間で結ばれた関係形成の合意にどのような法的効力を認めうるかといった観点から研究を行い、私的な信頼関係が突然裏切られたというような場合に、裁判所が介入することの危険性、困難さといった問題を指摘した。生活共同体の関係は、開始当初にその後の経過を予測する情報が不足しており、契約的合意の有効性が疑われる反面、事実上の信認関係に基づく相互の義務負担を一定範囲で認めうるようにも思われ、新たな研究テーマとして興味深い。法律行為の要素の錯誤に関する研究は、最判平成元年9月14日家裁月報41巻11号75頁の判例評釈の形で公表予定である(年度内に執筆したが、事情により公表が遅れている)。財産分与合意における錯誤に関する判例であり、夫婦関係にあるものが離婚協議という特殊な環境において交渉の結果締結した合意に、情報の不十分さから誤りが生じたという紛争である。いわゆる動機錯誤に関する判例の立場の分析など、一般的なテーマにも言及しえた点で、一定の成果が上げられたものと考えている。
漁業種間漁獲努力量標準化のための漁獲性能評価手法の開発に関する研究

過剰な状態にある漁獲能力を適切に削減するためには,その漁法において,漁獲性能を評価するとともに,その機構としての選択性と漁具能率を分離して評価する必要がある。本研究課題では,漁獲する倉肋や性能を正しく評価するための用語を明確に定義して,それらを求める方法を整備するとともに,特に,漁獲する能力や性能におけるサイズ選択性や努力量の利用について検討を加えた.漁業における能力を評価するために,漁具能率と漁獲努力量,漁獲効率の定義を明らかにした.以前に漁獲性能の評価のために多用された田内の漁獲性能指数を,CPUEの標準化の観点から,見直すことを行った.特に,現在世界中で行われているGLMによるCPUEの標準化と同様に,田内の漁獲性能指数は季節による資源の変化,および海域ごとによる資源の状態の違いを考慮して,それらに左右されない漁獲の性能を評価していることを明らかにした.さらに,その中で漁具選択性による性能への影響を指摘して,SELECTモデルにおける分割率パラメータがそうした選択性を除いた漁獲性能の相対値を表すことを示した.このSELECTモデルを拡張することで,漁獲努力量が明らかでない場合でも,アオリイカの餌木(擬餌針)と定置網を例として,同一海域で同一時期に操業された2種類の漁業から得られた漁獲物の体長組成から選択性を推定する方法を示した.また,マアナゴに対するかご網の操業実験を例として,SELECTモデルなどの比較操業実験において,漁獲努力量が変化するときの漁獲選択性の評価方法を示した.さらに,3種類以上の漁具間の比較操業実験から,相対的な漁獲性能もパラメータに加えながら選択性を解析する方法を開発した.刺網選択性に影響を及ぼす要因として,網目の大きさに次ぐ網糸の太さや材料の影響を明らかにした.具体的な漁業の例として,複数漁業(延縄,底曳網,かご,筒)によるマアナゴ漁業を取り上げて,その漁獲実態や漁獲特性および資源管理の方策について,検討を行った.過剰な状態にある漁獲能力を適切に削減するためには,その漁法において,漁獲性能を評価するとともに,その機構としての選択性と漁具能率を分離して評価する必要がある。本研究課題では,漁獲する倉肋や性能を正しく評価するための用語を明確に定義して,それらを求める方法を整備するとともに,特に,漁獲する能力や性能におけるサイズ選択性や努力量の利用について検討を加えた.漁業における能力を評価するために,漁具能率と漁獲努力量,漁獲効率の定義を明らかにした.以前に漁獲性能の評価のために多用された田内の漁獲性能指数を,CPUEの標準化の観点から,見直すことを行った.特に,現在世界中で行われているGLMによるCPUEの標準化と同様に,田内の漁獲性能指数は季節による資源の変化,および海域ごとによる資源の状態の違いを考慮して,それらに左右されない漁獲の性能を評価していることを明らかにした.さらに,その中で漁具選択性による性能への影響を指摘して,SELECTモデルにおける分割率パラメータがそうした選択性を除いた漁獲性能の相対値を表すことを示した.このSELECTモデルを拡張することで,漁獲努力量が明らかでない場合でも,アオリイカの餌木(擬餌針)と定置網を例として,同一海域で同一時期に操業された2種類の漁業から得られた漁獲物の体長組成から選択性を推定する方法を示した.また,マアナゴに対するかご網の操業実験を例として,SELECTモデルなどの比較操業実験において,漁獲努力量が変化するときの漁獲選択性の評価方法を示した.さらに,3種類以上の漁具間の比較操業実験から,相対的な漁獲性能もパラメータに加えながら選択性を解析する方法を開発した.刺網選択性に影響を及ぼす要因として,網目の大きさに次ぐ網糸の太さや材料の影響を明らかにした.具体的な漁業の例として,複数漁業(延縄,底曳網,かご,筒)によるマアナゴ漁業を取り上げて,その漁獲実態や漁獲特性および資源管理の方策について,検討を行った.過剰な状態にある漁獲能力を適切に削減するためには,各漁業種類ごとや漁船ごとの漁獲性能を評価する必要がある。一方,CPUE(Catch per unit effort,単位漁獲努力量当たりの漁獲量)は漁獲性能のみならず,時期や海域による資源の状態に依存する。そこで,魚種別時期別海域別CPUE資料からCPUEを標準化して,田内の漁獲性能指数を漁船別魚種毎に求めた。計算例として,沖秋底曳網漁船の魚種別漁獲性能指数を求めたところ,魚種によって,また漁法によって異なる値が得られた。カレイ類など底生性の強い魚種ではかけ廻し漁船の性能が高く,一方,スケトウダラやスルメイカなど遊泳力のある魚では二艘曳き漁船の性能が相対的に高かった。これは,かけ廻しと二艘曳きの漁具の構造や操業様式の違いによるものと考えられた。また,魚種毎に推定された年の効果は,漁獲性能や魚場,分布の違いを標準化した相対的な資源密度の変動を表していると考えられる。これらの結果は,魚種毎に決められたTAC(Total allowable catch,許容漁獲量)をそれぞれ満たすように漁獲するための漁法別努力量の配分間題を検討する材料となると考えられる。また,この相対的な漁獲性能に含まれる漁獲選択性と漁獲効率を分けて検討するために,SELECTモデルを適切に利用できる努カ量の合算条件を検討した。この解析で各操業回のデータを合算できる条件は,体長組成が同じ,もしくは試験漁具と対象漁具の漁具数の比が一定である。

さらに,この条件を満たさない場合のために,異なる分割率パラメータを設定した拡張SELECTモデルを開発した。これを5種類の目合(網目内径21.0,18.1,15.5,13.6,11.6,mm)のかご網によるマアナゴ漁獲試験操業実験の資料に適用して,漁獲選択性と相対漁獲効率を求め,適切な選択性を求めることができる。過剰な状態にある漁獲能力を適切に削減するためには,その漁法において,漁獲性能を評価するとともに,その機構としての選択性と漁具能率を分離して評価する必要がある。昨年度は,底曳網とかご漁具について,それぞれ漁獲性能を求める手法と選択性と漁具能率を求める解析手法の整備を行った。本年度は,まずこうした漁獲効率,漁具能率,漁具性能,漁獲選択性を求める手法に関する資料を集めて,総説を作成して,印刷公表した。また,特に日本の沿岸漁業でもっとも多用されている刺網について,重点的に選択性と漁獲性能を検討し,2報の論文をFisheries Science誌に投稿して受理された。まず,相対的な漁獲性能に含まれる漁獲選択性と漁獲効率を分けて検討するために,刺網の選択性と漁獲強度(=漁獲努力量×漁具能率)を操業実験資料から解析するための方法を開発した。これまで釣鐘型の選択性曲線を示す漁具の操業実験資料には適用できないとされてきたSELECTモデルに対して,マスターカーブ法の一種である北原の方法の考え方を導入して,多項分布を基礎に刺網選択性を求めるSELECTモデルを開発した。これによって刺網の性能を選択性と漁具能率に分けて推定することができる。さらに,刺網の選択性は,主に網目の大きさ(目合)に大きく依存する。漁獲強度に影響を及ぼす要因として,網目以外の2次要因が刺網の選択性と漁獲性能に及ぼす影響を検討するための実験と解析手法を開発した。具体的には網糸太さを例として,目合(41,46,51 mm),網糸太さ(0.8,3,5,7号)の異なる刺網を用いてニジマスを対象に水槽実験を行った。網糸太さを変えたことによる網目目合の変化を標準化する方法として,胴周長/網目内周長に対する選択曲線を推定する方法を開発して,これを実験結果に適用することで細い網糸がより小型の魚を漁獲すること,また高い漁獲能率を維持するには適切な網糸太さがあることを明らかにした。本研究課題では,漁獲する能力や性能を正しく評価するための用語を明確に定義して,それらを求める方法を整備するとともに,特に,漁獲する能力や性能におけるサイズ選択性や努力量の利用について検討を加えた.漁業における能力を評価するために,漁具能率と漁獲努力量,漁獲効率の定義を明らかにした.以前に漁獲性能の評価のために多用された田内の漁獲性能指数を,CPUEの標準化の観点から,見直すことを行った.特に,現在世界中で行われているGLMによるCPUEの標準化と同様に,田内の漁獲性能指数は季節による資源の変化,および海域ごとによる資源の状態の違いを考慮して,それらに左右されない漁獲の性能を評価していることを明らかにした.さらに,その中で漁具選択性による性能への影響を指摘して,SELECTモデルにおける分割率パラメータがそうした選択性を除いた漁獲性能の相対値を表すことを示した.
コーンビームX線を用いた3次元立体像再構成法に関する研究

X線コンピュータ断層像撮影装置(以下X線CT)は、体内組織をX線吸収係数の分布像として非観血的に、かつ具象的に観察できる装置である。しかしX線CTによって得られる断層像は、体軸に対して直角方向すなわち体の輪切り方向のものである。しかしながら、臨床診断や放射線治療計画には、病変部位や患部組織の立体情報が必要とされることも少なくない。そこで現在は、体軸方向にずらせて撮影した複数枚の断層像を演算装置の中で3次元的に並べ替えることによって3次元構造を得ているが、体軸方向の分解能が劣ることや、同時立体計測ができないことなどの問題点ば存在する。本研究では、対向して置かれたコーンビームX線源と2次元検出器を被検査体回りに360度回転させて計測された数学的には不完全な投影データからフィルタ補正逆投影法により被検査体の3次元的な吸収係数の分布像を算出するアルゴリズムについて検討した。本研究の結果、次のようなフィルタ関数(修正ρフィルタ)が良好な再構成像を得るために有効であることが明かとなった。この修正ρフィルタは以下の2つの成分に分解することができる。(1)X線ビームの斜入射の影響を考慮し、回転軸方向に垂直な成分と平行な成分に分解してそれぞれのぼけを回復する成分。(2)計測された不完全投影データの周波数空間での不完全性に注目し、回転軸方向の周波数を制御し、空間分解能を落とすことによりアーチファクトを大幅に低減することを目的とした場所依存形ローパスフィルタの成分。本研究ではさらに修正ρフィルタの効果を計算機シュミレーションによって確めた。その結果以下のことを確認した。(1)不完全投影データであってもほぼ正確にCT値の再現が可能である。(2)回転軸方向の分解能を制御することにより、投影データの不完全性によるアーチファクトを大幅に低減することができる。
岩澤理論の同変化と精密化

岩澤理論は,イデアル類群や楕円曲線といった数論的に興味深い対象を研究する,強力な理論である.本研究の目的は,様々な文脈で岩澤理論を同変的に拡張することである.ここで同変という用語は,従来はアーベル群としてしか調べていなかった対象を,ガロア群の作用も込めて調べる,というようなことを意味する.これにより,従来よりも精密な結果を得ることができる.岩澤理論は,イデアル類群や楕円曲線といった数論的に興味深い対象を研究する,強力な理論である.本研究の目的は,様々な文脈で岩澤理論を同変的に拡張することである.ここで同変という用語は,従来はアーベル群としてしか調べていなかった対象を,ガロア群の作用も込めて調べる,というようなことを意味する.これにより,従来よりも精密な結果を得ることができる.
電極酸化により発生させたハロゲン活性種によるオレフィン類の活性化とその応用

オレフィン類の酸化的活性化は高付加価値化合物の合成の見地から非常に重要である。本研究では電極酸化により生成する特異な反応性のハロゲンカチオン活性種[X^+]を利用したオレフィン類の活性化あるいは電極酸化によって合成できるエナミン型オレフィンの有効利用の研究を行い、以下の成果を得た。1.トリメチルオルトフォルメート(TMOFと略)中でのヨードの電極酸化により生成するヨードカチオン活性種[I^+]/TMOFをスチレン誘導体に作用させると一挙にフェニル酢酸誘導体が生成することは報告しているが、この反応にはTMOFが必須であり、また、塩化メチレンなどと共溶媒として使用可能であることを見いだした。2.電極酸化により環状アミンから得られる環状エナミン誘導体をβ-ハロ-α-メトキシ化し、次いで銀イオンで処理すると環縮小反応が起こることを見いだした。また、[I^+]/TMOFを環状エナミン誘導体に作用させると一挙に環縮小反応が起こることも見いだした。3.環状エナミン誘導体をβ-ハロ-α-メトキシ化、次いでα位をアリール化し、最後に銀イオンで処理することによりβ-アリール置換環状アミンが合成できることがわかった。この方法によりメセンブリン等のアルカロイドの合成も達成できた。4.電極酸化により生成する[I^+]活性種を利用してL-リジンから光学活性スラフラミン合成を試み、その鍵合成中間体である光学活性1-アセチル-2-メトキシカルボニル-5-トシルアミノピペリジンを合成できた。5.環状エナミン誘導体を経ることにより環状アミンのβ位にオキソ基を導入する一般法を見いだし、この方法をピペリジン誘導体に適用して天然物であるδ-アミノレブリン酸を合成できた。なお、光学活性ハロゲンイオンの開拓、ならびに環状エノールエーテルの環縮小反応については今後の検討課題として残った。1)環状エナミン誘導体の転位反応電極酸化反応を利用した環状アミンからのβ-アリ-ル置換環状アミン類の一般的合成法を確立できた。即ち、環状アミンから電極酸化により環状オレフィンの一種である環状エナミン誘導体を合成した。これをβ-ハロ-α-メトキシ化,次いでα-メトキシ基をアリ-ル基で置換してβ-ハロ-α-アリ-ル環状アミンを合成した。次いで脱ハロゲン化反応によりβ-カチオンを発生させてアリ-ル基の転位反応を行い,β-アリ-ル置換環状アミン類を合成できた。さらに,この方法をメセンブリンなどの天然アルカロイドの合成に応用できた。2)環状アミン類の環縮小反応電極酸化により環状アミンから合成したエナミン誘導体に,電極酸化によって発生させたハロゲン活性種,あるいは,銀塩を反応させることにより,環縮小反応が起こることを見い出した。この転位反応によって7員環環状アミンからピペリジン誘導体,ピペリジン誘導体からピロリジン誘導体を合成できた。3)α-アルキルアリ-ル酢酸エステルの合成筆者らが開発したヨ-ドイオンをメディエ-タ-とするアリ-ルアルキルケトンからのα-アルキルアリ-ル酢酸エステルへの転位反応の反応条件を検討した。その結果,溶媒としてオルソ蟻酸メチルが必須であり,また,その共溶媒として,塩化メチレン,ヘキサン,酢酸メチル,ジメトキシエタンが使用できることを明らかにした。4)レ-ソジンから光学活性スラクラミンの合成電極酸化により発生させたヨ-ドカチオン活性種を利用してレ-ソジンから光学活性スラクラミンの合成を検討した。この試みは未だ最終段階には達していない。

電極酸化により特異な反応性を有するハロゲン活性種を創成し、これを用いてオレフィン類を活性化、その有効利用を計るのが本研究の目的である。本年度の研究成果は以下のとおりである。1)環状エナミン誘導体の環縮小反応環状アミンのN-メトキシカルボニル誘導体を、メタノール中で電極酸化し、その酸化生成物を酸触媒存在下、加熱することによって対応する環状エナミン誘導体に変換することができる。この環状エミナン誘導体に電極酸化によりオルト蟻酸メチル溶媒中で発生させたヨードカチオン活性種を作用させると環縮小反応が起こることを見いだした。7員環の環状アミンからピペリジン誘導体に、ピペリジン環からピロリジン誘導体に変換することができた。しかし、ピロリジン誘導体からアゼチヂン誘導体への変換は起こらず、α,β-ジ置換ピロリジン誘導体が生成した。2)環状エナミン誘導体を経由するβ-アリール-置換環状アミン類の合成1)に記した方法で合成した環状エナミン誘導体にメタノール中でブロムあるいはヨードカチオンを反応させると、β-ハロ-α-メトキシ体が高収率で得られた。次いで酸触媒によりα-メトキシ基をアリール基で置換した。さらに、その生成物であるβ-ハロ-α-アリール環状アミンに銀塩を反応させるとβ-位ハロゲンが脱利し、α-アリール基が効率良くβ-位に転移してβ-アリール置換環状アミン誘導体が合成できた。この方法で、入手容易な環状アミンからメセンブリンに代表される数種のアルカロイド合成に成功した。3)エノール型オレフィンへのハロゲンカチオン活性種の付加反応電極酸化によりメタノール中で発生させたヨードカチオン活性種を塩基性条件下にアルデヒドに作用させると、α-ヒドロキシジメチルアセタールが高収率で得られることは既に見いだしている。この反応はアルデヒドが塩基性条件下でエノール型オレフィンに一部変換しており、これにヨードカチオン活性種が付加する機構で説明できる。この方法を利用してシクロヘキサノンからδ-アミノ-γ-オキソバレリン酸誘導体の合成に成功した。オレフィン類の酸化的活性化は高付加価値化合物の合成の見地から非常に重要である。本研究では電極酸化により生成する特異な反応性のハロゲンカチオン活性種[X^+]を利用したオレフィン類の活性化あるいは電極酸化によって合成できるエナミン型オレフィンの有効利用の研究を行ない、以下の成果を得た。1.電極酸化により環状アミンから得られる環状エナミン誘導体をβ-ハロ-α-メトキシ化し、次いで銀イオンで処理すると環縮小反応が起こることを見いだした。また、ヨードをトリメチルオルトフォルメート(TMOFと略)中で電極酸化することによって調製した[I^+]/TMOFを環状エナミン誘導体に作用させると一挙に環縮小反応が起こることも見いだした。2.環状エナミン誘導体をβ-ハロ-α-メトキシ化、次いでα位をアリール化し、最後に銀イオンで処理することによりβ-アリール置換環状アミンが合成できることがわかった。この方法によりメセンブリン等のアルカロイドの合成も達成できた。3.電極酸化により生成する[I^+]活性種を利用してL-リジンから光学活性
新規高血圧遺伝子ATP2B1と頸動脈硬化症進展への病態解明と治療戦略の開発

また、我々は全身ヘテロATP2B1欠損マウスを用いて、Ca代謝に関わる表現型変化と血圧との関連に関して研究を行った。このマウスは高血圧を呈することは報告してきたが、低カルシウム血症とPTH分泌減少を同時に呈することがわかった。また、尿中カルシウム排泄と骨密度の増加も確認した。PTH分泌減少に関しては,副甲状腺細胞でのATP2B1遺伝子欠損によりPMCA1タンパク質が減少、細胞内Ca2+濃度が上昇したためPTH分泌が抑制されたと考え、PTH分泌抑制の影響で骨吸収が誘起されなかった事が骨密度増加の一因と考えた。また、尿中Ca排泄の増加に関しては、細胞基底膜側に存在するPMCA1の減少により、血中へのCa2+吸収が減少したためと考えられた。これらの研究結果を文献的考察を交え、我々は論文化し、Hypertension Reseach誌に掲載された。(Ehara Y, Yatsu K etal. Hypertens Res. 2018;41(2):699-707.)また、人において進めていた約1300名のSNP解析の本解析がまとまりつつあり、令和元年度に学会発表・論文化が見込まれる。平成28年度は共同研究施設である小林内科クリニック(院長小林英雄先生、横浜市泉区中田南2ー2ー2)に生活習慣病で通院中の患者のうち、CAVI検査(Cardio Ankle VascularIndex:心臓から大動脈、足首までの動脈の硬さを反映し、血圧に依存されない血管固有の硬さも反映する)を施行した患者約1300名から口腔粘膜や血液からDNAの採取を完了した。DNAに関しては、qualityチェック及び、量の確認を行い、1139検体において実験に問題ないことを確認した。残り161検体に関してqualityや量的問題で解析が行えなかった。そして我々が同定した新規高血圧感受性遺伝子ATP2B1の既報にある12個のSNPsをタイピングした。SNPタイピングの方法は、Agena Bioscience社のMassARRAYシステムを用いて行った。全1139検体のCall rateは99.9%と非常に高かった。現在、血圧、脂質や糖尿病プロフィール、CAVI値などとの関連を統計学的に解析中である。実際のタイピングデータに加え、HapMapデータ及び1000genomeを利用したimputation法を用いてSNPデータの補完を行っている。上記解析により、ATP2B1遺伝子と動脈硬化の程度を表すCAVI値、薬剤や暴露要因を総合的に検討し、ヒトにおける動脈硬化進展の交絡要因を除去した解析を行い、次年度以降の解析に繋げる。また、次年度以降の解析に備えてATP2B1遺伝子血管平滑筋特異的ノックアウトマウスと全身ヘテロマウス、及び、ATP2B1遺伝子血管平滑筋特異的過剰発現マウスの継代飼育を続けている。交付申請書に記載し平成28年度の研究実施計画通りに進んでいる。診療データ等が不足しており、実際に収集した約1300名(内、解析した1139名)の検体は、予定した患者1500名には届かなかったが、十分統計学的解析に足りうる人数であり問題ない。また、診察、同意を得てから実際にDNA採取するのは次回の診察になるタイムラグが生じたため、検体採取に若干の遅れが生じ、データ解析の終了まで至らなかった。平成29年度は共同研究施設である小林内科クリニック(院長小林英雄先生、横浜市泉区中田南2ー2ー2)に生活習慣病で通院中の患者のうち、DNAを採取した患者約1300名のSNP解析および集団のサブ解析を行った。サブ解析の臨床データに関して論文化し報告した(Kobayashi Y, et al. Clin Exp Hypertens. 2018Apr19:1-8.)。さらに、実際のタイピングデータに加え、HapMapデータ及び1000genomeを利用したimputation法を用いてSNPデータの補完を行った。上記解析により、ATP2B1遺伝子と動脈硬化の程度を表すCAVI値、薬剤や暴露要因を総合的に検討し、ヒトにおける動脈硬化進展の交絡要因を除去した解析や更なる追加SNP解析などを行っている。その結果を平成30年度での論文化および学会発表に繋げる。また、前年度含め、継続的に行ってきたATP2B1遺伝子血管平滑筋特異的ノックアウトマウスの薬剤応答性に関して、Hypertension誌に掲載された(Okuyama Y, etal. Hypertens Res. 2018Feb;41(2):80-87. )。同マウスにおける薬剤応答性に関しては機能解析に更なる余地を残しており、同マウスからの細胞培養を行いより詳細なメカニズム解明を始めた。ATP2B1遺伝子血管平滑筋特異的過剰発現マウスに関しては思うような結果を得られなかった。継代が進むたびに遺伝子発現量が減少し結果の解釈に支障をきたすことが予備実験でわかってきた。F0世代からの新たな系統の作成に着手するのは時間的に困難であり、やむを得ずこのマウスでの実験は中止とした。交付申請書に記載し平成29年度の研究実施計画通りに進んでいる。基本的なATP2B1遺伝子のヒトSNPsのタイピングは終了し、現在、解析中である。共同研究施設である小林内科クリニックでの患者約1300名でのサブ解析も同時並行で行えており、本年度中にデータをまとめて論文化及び学会発表を行っていく。

ただし、ATP2B1遺伝子血管平滑筋特異的過剰発現マウスは、遺伝子発現が増加していなく、今後の解析には不適であることがわかり、同マウス関連の予定していた機序解明ができなくなった。また、ATP2B1遺伝子ノックダウン血管平滑筋細胞の作製も、予備実験で血管平滑筋の単細胞からの培養が難しく、平成30年度も作製を試みるが困難が予想される。また、我々は全身ヘテロATP2B1欠損マウスを用いて、Ca代謝に関わる表現型変化と血圧との関連に関して研究を行った。このマウスは高血圧を呈することは報告してきたが、低カルシウム血症とPTH分泌減少を同時に呈することがわかった。また、尿中カルシウム排泄と骨密度の増加も確認した。PTH分泌減少に関しては,副甲状腺細胞でのATP2B1遺伝子欠損によりPMCA1タンパク質が減少、細胞内Ca2+濃度が上昇したためPTH分泌が抑制されたと考え、PTH分泌抑制の影響で骨吸収が誘起されなかった事が骨密度増加の一因と考えた。また、尿中Ca排泄の増加に関しては、細胞基底膜側に存在するPMCA1の減少により、血中へのCa2+吸収が減少したためと考えられた。これらの研究結果を文献的考察を交え、我々は論文化し、Hypertension Reseach誌に掲載された。(Ehara Y, Yatsu K etal. Hypertens Res. 2018;41(2):699-707.)また、人において進めていた約1300名のSNP解析の本解析がまとまりつつあり、令和元年度に学会発表・論文化が見込まれる。上記SNPタイピングによる結果に基づき、患者背景との関連を同定していく。特徴的なSNPが同定されれば、機能解析を検討していく。また、当初の計画通りに、ATP2B1遺伝子血管平滑筋特異的ノックアウトマウスと全身ヘテロマウス、及び、ATP2B1遺伝子血管平滑筋特異的過剰発現マウスを利用し、血管の経年による組織学的変化、および炎症性マーカー・酸化ストレスの変化を評価していく。また、実験の匹数が十分に確保できているなら、保護的薬剤(降圧薬やスタチンなど)の投与による動脈硬化病変の変化などを観察する予定である。また、当初の計画通りに、ATP2B1遺伝子血管平滑筋特異的ノックアウトマウスと全身ヘテロマウスに関しては論文化に値する解析ができており、引き続き機能解析を進める。ただし、ATP2B1遺伝子血管平滑筋特異的過剰発現マウスは継代が進むたびに遺伝子発現が減少し結果の解釈に支障をきたすため、これ以上の解析が難しくなった。そのため、平成30年度の最終年度は、ATP2B1遺伝子の全身ヘテロノックアウトマウスおよびヒトATP2B1遺伝子のSNPs解析をメインに行い発表していく。想定したSNPタイピングの費用が安く済んだこと、およびデータ解析が終わらなかったことから当初の学会発表等ができずに旅費が当初より安く済んだため。ATP2B1遺伝子血管平滑筋特異的過剰発現マウスの解析において、遺伝子発現量が継代を経るごとに低下し、実験に耐え得る系統にならなかったため、予定していた実験ができず費用が持ち越しなった。また、CRISPER-Cas9システムの実験が行えなかったことも、予算が余ってしまった。
金属人工格子ー総括班ー

本重点研は2年目に入り、本総括班では全組織の円滑な運営を図り、研究を一層推進することを目的に以下の諸活動を行った。1.研究遂行方法、研究討論会、研究成果発表会、次年度研究計画などについて数回にわたり総括班会議を開いて検討し、それぞれ実施した。2.研究討論会(7月45日、京大会館):計画研究と公募研究を含めた組織全研究者とそれぞれの共同研究者、それ以外の本研究テ-マに関心を持つ大学、国公立研究機関、民間研究機関の研究者を合わせて総勢140人が集まり活発な討論を行った。その際、討論用資料集を作り、討論時ばかりでなくその後の研究資料として広く配布し本研究の活性化に役立てた。3.ニュ-スレタ-の発行(No.3,No.4):研究組織グル-プ間の連絡、情報交換の便を図る目的で、今年度もニュ-スレタ-を発行し、各グル-プの研究設備、活動状況、論文リスト速報等で大いに有効性を発輝した。4.研究成果発表会(1月8日10日、名古屋):組織全研究者から本年度の研究成果を報告し、討論を行った。その際、組織以外の国内関連研究者へも参加を呼びかけ討論に加わってもらい、本研究の実を上げた。5.研究成果報告書の発行(3月):本年度の全体の研究成果を1冊の報告集として発行した。その際、全てを英文で記述し広く全世界のこの分野の研究者へ提出し本重点研究の今後の発展に役立てることにした。6.本年度の成果総括と次年度以降の研究計画:各班の実績概要に記した通り、本研究は昨年と今年で多くの世界的注目の成果を上げた。よって、次年度以降もさらに充実すべく、綿密なる計画を立て申請した。また、平成4年度最終時に国際会議を開くこととし、準備は順調に進んでいる。各種委員会を組織し実際の活動に入った。第一回サ-キュラ-をすでに発行し、近々、第二回サ-キュラ-(講演募集)を発行する。
分化・増殖の細胞内情報処理機構に関する研究-ガングリオシドによるモジュレーション

平成5年度科学研究費補助金研究成果報告書概要本年度は昨年度からの続きで神経栄養因子ファミリーの受容体であるTrkA,B,Cに対する抗体作成を試み高力価の良質なポリクロナール抗体を得た。このうち、TrkAについてはヒト末梢神経系にその発現をmRNAと蛋白(免疫組織化学的)の存在から証明した。また、小児の悪性腫瘍の一つである神経芽細胞腫患者手術標本中にTrkAが発現していることを証明し、その発現の程度と臨床予後が逆相関することをつきとめた。しかし、抗リン酸化チロシン抗体による検討からこれら患者腫瘍細胞中に存在するTrkAは不活性な状態にあることが示唆された。したがって、TrkA蛋白の発現だけでなくその発現された受容体が実際に生体内で機能しているか否かの検討が今后重要問題となってくることが予想された。一方、昨年度の成果からGM1ガングリオシド(GM1)がTrkAと直接何らかの関係を有しその機能を制御している可能性が示唆されたため、TrkAに対する抗体(α-TrkA)を用い種々の細胞から免疫沈降を行い、その免疫沈降物を用いた免疫複合体チロシンキナーゼ(TK)活性の測定系を樹立した。そして、その測定系を用いin vitroに於けるTrkAのTK活性に及ぼすGM1の影響を検討した。その結果、GM1は直接TrkAのNGFによる自己燐酸化能を増大させた。この事実は、従来知られてきたGM1のNGF作用の増強作用の分子的基盤を明らかにするものであり重要な成果と考えられた。現在、この現象のさらに詳細な分子メカニズムと生体内に於けるTrkAとGM1との細胞内相互関係について検討を急いでいる。本年度は主にPC12細胞を用い,内在性ガングリオシド(Gg)の存在様式状態を変化させたときの分化・増殖各々の細胞内情報伝達系への影響を調べた。即ち,従来コレラ毒素Bサブユニット(CTB)はガングリオシドGM1(GM1)に特異的かつ高親和性に結合することが知られており細胞膜上にCTBが結合するとヒレセプタ-であるGM2は細胞骨格と相互作用をしていわゆる“Capping formation"を起こす。CTBの結合により細胞膜上のGM1の存在様式は大きく変化する訳である。このような処理が本細胞系にとって分化促進因子である神経成長因子(NGF)と増殖因子である上皮成長因子(EGF)の情報伝達系への影響を観察した。その結果1,NGFのPC12細胞からの神経突起伸展作用はCTBの共存下で著明に増大した。2,[ ^3H]チミドン取込実験から,CTBはNGFの[ ^3H]チミドン取込抑制作用を著明に増強させた。3,CTBの処理によりNGFのPC12細胞への結合能には有意な変化はなかった。4,NGFの情報伝達系として重要なキナ-ゼリン酸化カスケ-ド中にあるS6蛋白キナ-ゼ及びelongation factor2(EF2)キナ-ゼ活性はNGF単独よりもCTB共存下でより著明な活性化が起きた。5,whole cellの系でリボゾ-ムS6蛋白の燐酸化はCTB共存下でNGF単独群に比し著明なリン酸化状態を示した。6,CTB処理は本細胞系ではEGFの生物学的効果を減弱させた。またEGFの結合も減少させた。7,NGF作用増強効果はサイトカラシンBの前処理で消失したがコルヒチンによる前処理の影響はうけなかった。8,代謝疾患でGM1の細胞膜上への蓄積を来たすGM1ガングリオシ-ドシス患者細胞でもEGFの結合は著明に減少していた。

以上の結果は,細胞膜上でのGgの存在様式を変化させるだけで細胞の分化・増殖過程に大きな影響を与え得ること,またGgの生理機能発現に細胞骨格との相互作用が重要な役割を占めていることを明らかにした。昨年度までの検討よりNGFの細胞内情報伝達系にガングリオシドGM1(GM1)が特別な関係を有し、特にNGFの機能的受容体であるp140^<trk>の機能をpositiveに制御する生理活性物質である可能性が示唆されたため、本年度はこの点をより詳細に検討した。[方法]1)p140^<trk>に対する特異的抗体(ポリクローナル)を作製し、2)この抗体を用い、PC12Cell、NBー1Cell、ヒト脳よりp140^<trk>を部分精製しそのチロシンキナーゼ活性(TK-活性)に及ぼすGM1の作用をin vitroの系で検討する。3)上記の酵素源よりp140^<trk>に対する抗体で免疫沈降し、その沈降物中にGM1が存在するか否か、また存在した場合αGM1の分子特性を検討する。4)比較検討のため、増殖因子の上皮成長因子(EGF)受容体に対する抗体を用い同様の免疫沈降をしGM1を始めとする他のガングリオシド(Gg)とのassociationの有無を検討する。5)抗GM1抗体を用い上記酵素源からの免疫沈降でp140^<trk>が共沈されるか否かの検討をする。[結果]a)p140^<trk>のC末14アミノ酸残基よりなるペプチドを免疫源とし抗血清を得た。ELISA法による検討より12,000倍以上の高力価を有し、免疫組織化学、免疫沈降、Western blot、免疫複合体Tkー活性測定に使用可能な良質の抗体を得た。b)p140^<trk>のTKー活性はGM1により活性化された。しかし、1mMの高濃度では逆に抑制された。c)p140^<trk>の免疫沈降物にはGM1がassociateしていた。この検出には我々の新たに開発した方法を用いた。d)EGF受溶体にはGM1はassociateしていなかった。e)抗GM1抗体を用いたWesternーblotではp140^<trk>に相当する位置に陽性バンドを検出したがEGF受容体に相当する位置にはバンドはなかった。以上の研究より、GM1はp140^<trk>の生理的調節因子としてその機能調節に重要な役割を果たしており、またp140^<trk>とはかなり強い複合体を形成している可能性が推定された。[目的]細胞の分化・増殖の制御がガングリオシド(Gg)により如何なる影響をうけるかを、増殖に関しては増殖因子の、また分化に関しては分化促進因子である神経成長因子(NGF)を主にこれらの因子の細胞内情報伝達系に与える影響を詳細に検討することによりその実態を明らかにすることを目的とする。[方法]増殖に関しては、ある特定のGgが増量していることを証明したヒト患者培養皮膚線維芽細胞を用い上皮成長因子(EGF)の細胞内情報伝達系の活性を正常の対照のそれと比較し蓄積しているGgの作用を明らかにする。一方、分化に関しては、PC12細胞を用いNGFの細胞内情報処理に及ぼす影響を細胞内キナーゼカスケードの活性、形態学的、免疫組織化学的に解明する。また、NGF以外の神経栄養因子(例えば脳由来神経栄養因子BDNFなど)の細胞内情報伝達系についても同様の検討を行った。[結果及び考察]Ggの中のGM1ガングリオシド(GM1)は、EGFの細胞内情報伝達系のリガンドに対する反応性を抑制した。
駿河湾の深海底棲性魚類相に関する研究

近年,深海底棲性魚類は未利用資源の有効活用として食料利用等が活発に進んでいる.それら深海底棲性魚類のなかには未だ新種や日本初記録種が報告され,分類学的知見が充実しているとは言い難い分類群も多い.また,資源量が豊富で漁獲対象となりやすい深海底棲性魚類は類似種が多く,漁業者や水産試験場の食品利用関係者には正確な同定が極めて困難である.そこで,駿河湾の深海底棲性魚類,特に有用深海底棲性魚類相に関する知見を充実させること,および種の特徴を拡大した写真を用いて簡易に同定できる小冊子を配布することによって,利用者の分類学的知識の向上を図ることを目的とした.駿河湾において,釣り調査を13回(水深約200-1400m),底曳網調査を5回(水深約250-550m),ビームトロール調査を23回(水深約500-2200m)実施した.その結果,得られた深海底棲性魚類は, 23目66科112属155種あるいはタイプに識別された.これら分類群の285個体を用いて生鮮時の写真撮影を行い,その後10%ホルマリンで保存した.撮影は,全体の側面部のみでなく,頭部や腹部など各分類群の同定に重要な部位でも行った.これらの写真を用いて,最も多く収集できたソコダラ科(27種)において同定が容易となる冊子の原案を作成した.しかし,駿河湾内でみられる種を十分に収集できたとは言えず,今後も調査を継続し,掲載種を増やし県の水産試験場や漁業者に配布する予定である.近年,深海底棲性魚類は未利用資源の有効活用として食料利用等が活発に進んでいる.それら深海底棲性魚類のなかには未だ新種や日本初記録種が報告され,分類学的知見が充実しているとは言い難い分類群も多い.また,資源量が豊富で漁獲対象となりやすい深海底棲性魚類は類似種が多く,漁業者や水産試験場の食品利用関係者には正確な同定が極めて困難である.そこで,駿河湾の深海底棲性魚類,特に有用深海底棲性魚類相に関する知見を充実させること,および種の特徴を拡大した写真を用いて簡易に同定できる小冊子を配布することによって,利用者の分類学的知識の向上を図ることを目的とした.駿河湾において,釣り調査を13回(水深約200-1400m),底曳網調査を5回(水深約250-550m),ビームトロール調査を23回(水深約500-2200m)実施した.その結果,得られた深海底棲性魚類は, 23目66科112属155種あるいはタイプに識別された.これら分類群の285個体を用いて生鮮時の写真撮影を行い,その後10%ホルマリンで保存した.撮影は,全体の側面部のみでなく,頭部や腹部など各分類群の同定に重要な部位でも行った.これらの写真を用いて,最も多く収集できたソコダラ科(27種)において同定が容易となる冊子の原案を作成した.しかし,駿河湾内でみられる種を十分に収集できたとは言えず,今後も調査を継続し,掲載種を増やし県の水産試験場や漁業者に配布する予定である.
堆積物中の環境ＤＮＡを用いた魚類相変遷の観測

本研究では生物から環境中に放出されたDNAである環境DNAを検出する環境DNA分析手法を用いて、過去の水中堆積物に含まれる生物のDNAを検出する。魚類を対象に、過去の堆積物から環境DNAを検出することで数十から百年前にどのような生物がいたのかの過去復元を行い、例えば肉食外来魚の侵入、埋め立てや護岸整備のような人間活動や環境変化により種類や量が変化したのかを観測する。また、それにより外来種が侵入する前の健全な生物多様性を見ることで復元目標の設定が期待されるほか、多種多様な生物との相互関係の変化の様相を観測することが可能になると考えられる。
TDP43の病態機序に基づいたALSの血中バイオマーカーの単離

ALSの病態機序にTDP-43が深く関与している.我々はTDP-43の機能喪失が深く関わっていると考え研究を進めている.これを明かとし,この機能喪失時に起こる変化を本症のマーカーとして開発することを目的とした.まず、ヒトグリア由来細胞であるU87さらにヒト神経芽細胞腫由来のSH-SY5Y用い、TDP-43をターゲットとしたRNA抑制法にてTDP-43を効率よく減少させる系を確立した。本方法により、TDP-43を極めて効率よく発現を抑制できることが確認できた。確立した方法を用い培養細胞を用い、エクソンアレイ(選択的スプライシングの検索)、及びジーンアレイ(発現量の検索)を用い、特定のエクソンの発現の変化、もしくはmRNA量の減少が認められないか検討した。その結果、複数の培養細胞において特定の遺伝子のスプライシングの変化を同定した。このスプライシング変化が、ALS患者組織にて変化していることを検討した。その結果、ALS患者、脊髄、大脳にて、特定の遺伝子のスプライシング変化が起こっていることを確認した。さらにALS患者運動神経細胞をレーザーマイクロダイセクション法にて取り出し、運動神経細胞でも同様にスプライシング変化が起こっていることを見いだした。この成果は、ALS患者罹患組織でTDP-43機能が減少していることを示した物である。さらに、この遺伝子のスプライシング変化は正常ではほとんど認めないため、この遺伝子のスプライシング多様体が、本症の病態を反映するバイオマーカーとなる可能性が示された。ALS病態モデルとして,ヒトグリア由来細胞であるU87さらにヒト神経芽細胞腫由来のSH-SY5Y用い,TDP-43をターゲットとしたRNAiによりTDP-43を効率よく減少させる系を確立した.確立した方法を用い培養細胞から,mRNAを回収した,TDP-43の機能異常としては,つまりスプライシングに影響を与えるという観点から,選択的スプライシングの比率が変わる可能性と,frameがずれることによりナンセンス依存性mRNA分解機構が働きmRNA量が減少する可能性がある.本計画では,この両者をarrayを用い検討した.回収したmRNAを用い,Exon array(選択的スプライシングの検索),及びGene array(発現量の検索)を用い,特定のエクソンの発現の変化,もしくはmRNA量の減少が認められないか検討した.その結果,複数の条件において特定の遺伝子のスプライシングの変化をみとめ,同遺伝子がグリア細胞で発現していることを確認した.さらに,スプライシング変異体特異的な抗体を作成し,その特異性を検討した.本遺伝子のスプライシング異常は,ALS患者組織でも変化があることが確認された.一方,遺伝子量の変化では明確な変化を認める遺伝子を同定することが出来なかった.本成果に伴い,このスプライス変異体の高感度検出方法の開発が重要である.さらにこのスプライシング変異体の機能解析を行い,この変異体は正常の機能を失っていることを培養細胞系で明らかとした.ALS病態モデルとして、ヒトグリア由来細胞であるU87さらにヒト神経芽細胞腫由来のSH-SY5Y用い、TDP-43をターゲットとしたRNA抑制法にてTDP-43を効率よく減少させる系を確立した。本方法により、TDP-43は極めて効率よく発現を抑制できることが確認できた。確立した方法を用い培養細胞から、mRNAを回収した。TDP-43の機能異常としては、つまりスプライシングに影響を与えるという観点から、選択的スプライシングの比率が変わる句能性と、フレームがずれることによりナンセンス依存性mRNA分解機構が働きmRNA量が減少する可能性がある。本計画では、この両者をアレイを用い検討した。回収したmRNAを用い、エクソンアレイ(選択的スプライシングの検索)、及びジーンアレイ(発現量の検索)を用い、特定のエクソンの発現の変化、もしくはmRNA量の減少が認められないか検討した。

その結果、ALS患者、脊髄、大脳にて、このスプライシング変化が起こっていることを確認した。さらにALS患者運動神経細胞をレーザーマイクロダイセクション法にて取り出し、運動神経細胞でも同様にスプライシング変化が起こっていることを見いだした。この成果は、ALS患者罹患組織でTDP-43機能が減少していることを示した物である。さらに、この遺伝子のスプライシング変化は正常ではほとんど認めないため、この遺伝子のスプライシング多様体が、本症の病態を反映するバイオマーカーとなる可能性が示された。
血清中の遊離DNAによる肺癌の早期発見と診断に関する基礎研究

1996年,NawrozらとChenらはに頭頚部癌と肺小細胞癌患者血清からゲノムDNAを単離し,癌化に伴うミクロサテライトDNAの変化を報告した.これは,ゲノムDNAが癌細胞や細胞死に由来いする可能性のほか血流中で安定に依存する可能性を示唆した.血清で遺伝子検査が可能であれば,疾患の病態解明に広く臨床応用が可能となる.しかし,彼らの報告にはコントロールがなく,健常者にもゲノムDNAが存在する可能性は未解決であった.我々は健常者血液中の遊離ゲノムDNAの存在につき,変性ゲルシステムにより基礎的検討を行った.【対象・方法】健常者および患者血液から血清(血漿)や血球を分離した.ゲノムDNAはQlggenのQIAamp DNA Blood Kitを用いて単離し、そのゲノムDNAを鋳型として,ミクロサテライトおよびp53遺伝子断片の遺伝子増幅を行った.ミクロサテライト・マーカーはAR(X染色体の繰り返し配列(CAG)19(CAA)),SAT(6番染色体のCAGリピート),UT762(21番染色体のAAAGリピート)を用いた.PCR産物の解析は,非変性ゲル電気泳動後に銀染色を行い,PE Bio-Systemのキャピラリー電気泳動装置310Gene Scan(変性ポリマーPOP4)において蛍光標識PCR産物をサイズマーカーに対し見積もった.【結果】血清400μlからは肺小細胞癌で184±36ngのDNAが回収され,全てのサンプルでミクロサテライトDNAあるいはp53遺伝子断片が増幅できた.保存血清(6°C1ヵ月,-30°C3年)でも同様の結果が得られた.肺小細胞癌患者のでは,一部に多型の消失や電気泳動移動殿違いが認められた.【まとめ】健常者の血清中にも遊離ゲノムDNAが存在した.血清がミクロサテライトのわずかな変化の解析に耐えうる試料かどうかについては,更なる研究が必要と考えられる.1996年,NawrozらとChenらはに頭頚部癌と肺小細胞癌患者血清からゲノムDNAを単離し,癌化に伴うミクロサテライトDNAの変化を報告した.これは,ゲノムDNAが癌細胞や細胞死に由来いする可能性のほか血流中で安定に依存する可能性を示唆した.血清で遺伝子検査が可能であれば,疾患の病態解明に広く臨床応用が可能となる.しかし,彼らの報告にはコントロールがなく,健常者にもゲノムDNAが存在する可能性は未解決であった.我々は健常者血液中の遊離ゲノムDNAの存在につき,変性ゲルシステムにより基礎的検討を行った.【対象・方法】健常者および患者血液から血清(血漿)や血球を分離した.ゲノムDNAはQlggenのQIAamp DNA Blood Kitを用いて単離し、そのゲノムDNAを鋳型として,ミクロサテライトおよびp53遺伝子断片の遺伝子増幅を行った.ミクロサテライト・マーカーはAR(X染色体の繰り返し配列(CAG)19(CAA)),SAT(6番染色体のCAGリピート),UT762(21番染色体のAAAGリピート)を用いた.PCR産物の解析は,非変性ゲル電気泳動後に銀染色を行い,PE Bio-Systemのキャピラリー電気泳動装置310Gene Scan(変性ポリマーPOP4)において蛍光標識PCR産物をサイズマーカーに対し見積もった.【結果】血清400μlからは肺小細胞癌で184±36ngのDNAが回収され,全てのサンプルでミクロサテライトDNAあるいはp53遺伝子断片が増幅できた.保存血清(6°C1ヵ月,-30°C3年)でも同様の結果が得られた.肺小細胞癌患者のでは,一部に多型の消失や電気泳動移動殿違いが認められた.【まとめ】健常者の血清中にも遊離ゲノムDNAが存在した.血清がミクロサテライトのわずかな変化の解析に耐えうる試料かどうかについては,更なる研究が必要と考えられる.ChenらやNawrozらは肺症細胞癌や頭頚部癌患者の血清から遊離ゲノムDNAを単離し,癌化に伴うミクロサテライトDNAの変化を見いだした(1996年).このことは流血中には遊離DNAが安定に存在することを示唆する.正常者血清に遊離DNAが存在するのかどうか,他疾患の遺伝子診断への応用を目的に基礎的検討を行った.肺癌患者或いは正常者の血清と白血球からゲノムDNAを単離した.p53遺伝子エクソン7と3つのミクロサテライトDNA(AR:X染色体;SAT:第6染色体;UT762:第21染色体)のプライマーを合成し,PCRを行った.PCR産物は非変性ゲル電気泳動後,銀染色した.ミクロサテライト多形の検出は,変性材存在下キャピラリー電気泳動Gene Scanにより行った.結果は正常者血清ゲノムから,PCR・非変性ゲル電気泳動にてp53遺伝子とミクロサテライトの各目的DNA断片を得た.同一者の血清と白血球のミクロサテライトDNAの比較では,血清で一部多形の消失や分子サイズの違いが見られた.正常患者血清中にも遊離DNAが存在した.血清と白血球のミクロサテライト解析では必ずしも同じ多型が得られるわけではなく,結果を慎重に解釈する必要がある.肺癌の染色体分析及びFISH法による対比のための準備として,検体の扱いが容易な造血器腫瘍のうち.多発性骨髄腫での癌抑制遺伝子(RB-1)の検討を行った.骨髄細胞の中から骨髄腫細胞の純化が最も困難な手技となったが,骨髄塗抹標本に直接FISHを行う方法を考案し,それにより腫瘍細胞そのものの遺伝子異常を確認することができた.

1996年,NawrozらとChenらはに頭頚部癌と肺小細胞癌患者血清からゲノムDNAを単離し,癌化に伴うミクロサテライトDNAの変化を報告した.これは,ゲノムDNAが癌細胞や細胞死に由来いする可能性のほか血流中で安定に存在する可能性を示唆した.血清で遺伝子検査が可能であれば,疾患の病態解明に広く臨床応用が可能となる.しかし,彼らの報告にはコントロールがなく,健常者にもゲノムDNAが存在する可能性は未解決であった.我々は健常者血液中の遊離ゲノムDNAの存在につき,変性ゲルシステムにより基礎的検討を行った.【対象・方法】健常者および患者血液から血清(血漿)や血球を分離した.ゲノムDNAはQiggenのQIAamp DNA Blood Kitを用いて単離し,そのゲノムDNAを鋳型として,ミクロサテライトおよびp53遺伝子断片の遺伝子増幅を行った.ミクロサテライト・マーカーはAR(X染色体の繰り返し配列(CAG)19(CAA)),SAT(6番染色体のCAGリピート),UT762(21番染色体のAAAGリピート)を用いた.PCR産物の解析は,非変性ゲル電気泳動後に銀染色を行い,PE Bio-Systemのキャピラリー電気泳動装置310 Gene Scan(変性ポリマーPOP4)において蛍光標識PCR産物をサイズマーカーに対し見積もった.【結果】血清400μlからは肺小細胞癌で184±36ngのDNAが回収され,全てのサンプルでミクロサテライトDNAあるいはp53遺伝子断片が増幅できた.保存血清(6°C1ヵ月,-30°C3年)でも同様の結果が得られた.肺小細胞癌患者のでは,一部に多型の消失や電気泳動移動殿違いが認められた.【まとめ】健常者の血清中にも遊離ゲノムDNAが存在した.血清がミクロサテライトのわずかな変化の解析に耐えうる試料かどうかについては,更なる研究が必要と考えられる.