hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
病原性の異なるレプトスピラの比較解析によるレプトスピラ症重症化メカニズムの解明

レプトスピラ症の重症化メカニズムを明らかにするために,シリアンハムスターに対して異なる病原性を示すLeptospira interrogans 2株を用いた感染実験を行った.感染96時間後に強毒株接種群で尿細管の崩壊および肺出血が顕著に認められた.また肝臓において強毒株接種群の菌DNA量が有意に多かった.さらに血液,肝臓および肺臓において,強毒株接種群で複数のサイトカイン遺伝子発現が有意に上昇していた.以上の結果から,強毒株は,ハムスター肝臓を増殖の場とし,弱毒株にはない特有の臓器障害因子およびサイトカイン誘導因子を有する可能性が考えられた.レプトスピラ症の重症化は感染したレプトスピラの有する毒性によるとされるが,その毒性が何に起因するかは明らかになっていない.そこで本研究では,レプトスピラ症のモデル動物であるハムスターに対して異なる病原性を示すLeptospira interrogans 2株を感染させ,比較解析を行った.シリアンハムスターに致死を引き起こすレプトスピラ強毒株UP-MMC-NIID,致死を引き起こすことができない弱毒株OP84それぞれ1×106細胞を6週齢メスの腹腔内に接種した.感染12,24,48,72,96時間後にハムスターを安楽殺し,採血および腎臓,肝臓,肺臓を採取した.各臓器についてHE染色による組織病理像観察を行うとともに, flaB遺伝子をターゲットとした各臓器中の菌数測定,免疫応答関連サイトカイン遺伝子の発現量をリアルタイムPCRにより測定した.強毒株接種ハムスターでは,腎臓,肝臓,肺臓いずれの臓器においても弱毒株接種ハムスターよりも顕著な症状が観察された.また,強毒株,弱毒株接種いずれのハムスターにおいても,血液および肝臓では感染後48,72,96時間,腎臓および肺臓では感染後96時間でレプトスピラDNAが検出されたが,肺臓を除く臓器におけるレプトスピラDNA量は強毒株接種ハムスターで有意に多かった.免疫応答関連サイトカイン遺伝子の発現量については検出限界を下回る遺伝子も多かったが,弱毒株および強毒株接種により,全ての臓器で炎症性サイトカイン遺伝子の発現量増加が見られた.感染後96時間の肝臓ではip-10およびil1β,腎臓ではil6の発現量が弱毒株接種ハムスターに比べ強毒株接種ハムスターで有意に高かった.これらの結果から,各臓器における障害と炎症性サイトカインの過剰発現が,UP-MMC-NIID株のハムスターに対する強毒性に寄与している可能性が示唆された.レプトスピラ症の重症化メカニズムを明らかにするために,シリアンハムスターに対して異なる病原性を示すLeptospira interrogans 2株を用いた感染実験を行った結果,レプトスピラDNA量およびサイトカイン遺伝子発現量は感染96時間後にピークとなり株間で差がみられた.今年度は感染96時間後の供試動物数を増やして実験を行った.強毒株UP-MMC-NIID接種群の肝臓におけるレプトスピラDNA量は,弱毒株OP84接種群に比べて有意に多かった.他の組織ではレプトスピラDNA量の差が認められなかったことから,強毒株は肝臓において高い増殖能を有することが明らかとなった.また強毒株,弱毒株両接種群において,全ての組織で炎症性および抗炎症性サイトカイン遺伝子の発現量増加が見られた.血液中におけるmip1alpha,肝臓におけるtgfbeta,il1beta,mip1alpha,il10,tnfalpha,cox2および肺臓におけるtgfbeta,il6,inos,tnfalpha,cox2については強毒株接種群で有意に発現が上昇していた.また昨年度行った感染実験において,腎臓,肺臓では顕著な病変の差が観察されるのに対し,肝臓では強毒,弱毒株接種群間で顕著な病変の差は観察されないことを明らかにした.このことから,強毒株UP-MMC-NIIDは,シリアンハムスター肝臓を増殖の場とし,弱毒株にはない腎臓,肺臓を障害する特有の病原因子を有する可能性が考えられた.また他のげっ歯類の配列を基にしたdegenerate PCRおよび5'-, 3'-RACEによるシリアンハムスターccl2,cxcl1,cxcl2,cxcl3 cDNAをクローニングし,レプトスピラ感染により発現が上昇することを明らかにした.レプトスピラ症の重症化メカニズムを明らかにするために,シリアンハムスターに対して異なる病原性を示すLeptospira interrogans 2株を用いた感染実験を行い,組織病理,組織中のレプトスピラDNA量およびサイトカイン遺伝子発現を比較した.感染96時間後に強毒株UP-MMC-NIID接種群の腎臓で尿細管の崩壊および肺出血が顕著に認められた.また肝臓においてUP-MMC-NIID接種群のレプトスピラDNA量が有意に多かった.さらに両接種群の全ての組織で炎症性および抗炎症性サイトカイン遺伝子発現量の増加がみられたが,血液中におけるmip1alpha,肝臓におけるtgfbeta,il1beta,mip1alpha,il10,tnfalpha,cox2および肺臓におけるtgfbeta,il6,inos,tnfalpha,cox2については強毒株接種群で有意に遺伝子発現が上昇していた.以上の結果から,強毒株UP-MMC-NIIDは,シリアンハムスター肝臓を増殖の場とし,弱毒株にはない腎臓,肺臓を障害する特有の病原因子を有する可能性が考えられた.ヒトのレプトスピラ感染では男性は女性よりも重症化しやすいことが知られている.そこで弱毒株感染120時間後のハムスター雌雄の比較を行った結果,雄ハムスターでのみ肺出血がみられることが明らかとなった.

しかしながらレプトスピラDNA量およびサイトカイン遺伝子発現量に雌雄差は認められなかった.現在感染72および96時間後の比較を行っている.シリアンハムスターccl2,cxcl1,cxcl2,cxcl3のcDNAクローニングを行い,レプトスピラ感染により発現が上昇することを明らかにした.1分子リアルタイムシークエンシング法により弱毒株の全ゲノム配列決定を行い,現在先に決定した強毒株との比較解析を行っている.レプトスピラ症の重症化メカニズムを明らかにするために,シリアンハムスターに対して異なる病原性を示すLeptospira interrogans 2株を用いた感染実験を行った.感染96時間後に強毒株接種群で尿細管の崩壊および肺出血が顕著に認められた.また肝臓において強毒株接種群の菌DNA量が有意に多かった.さらに血液,肝臓および肺臓において,強毒株接種群で複数のサイトカイン遺伝子発現が有意に上昇していた.以上の結果から,強毒株は,ハムスター肝臓を増殖の場とし,弱毒株にはない特有の臓器障害因子およびサイトカイン誘導因子を有する可能性が考えられた.強毒株UP-MMC-NIIDおよび弱毒株OP84のシリアンハムスター体内における動態および感染組織におけるサイトカイン遺伝子発現の比較についてまとめ,論文として投稿することができた(現在,再投稿のための修正中).レプトスピラの病原因子の探索については現在OP84の全ゲノム配列決定を行っており,今後強毒株(全ゲノム配列決定済み)との比較解析を行う予定である.細菌学強毒株UP-MMC-NIIDおよび弱毒株OP84のゲノム比較を行い,強毒株に特有な遺伝子を同定する.強毒株に特有な遺伝子欠損株の作製を行い,感染実験により重症化に関与する遺伝を同定する.またハムスターのレプトスピラ感受性の性差を明らかにする.ハムスターを用いたレプトスピラ感染実験・評価系を確立できた.レプトスピラ強毒株特異的遺伝子群の同定については現在進行中である.当該年度の研究に必要な試薬等をすべて購入できたため,次年度に繰り越すことにした.レプトスピラ強毒,弱毒株で臓器中の菌数,炎症性サイトカイン遺伝子発現に差がみられた感染96時間後について,動物数を増やして再実験を行う.また炎症性細胞の浸潤を誘導するシリアンハムスターのケモカインCCL2やCXCL1, 2, 3などのcDNAをクローニングし,ΔΔCT法により発現比較を行う.レプトスピラ強毒株に特異的な重症化に関与すると考えられる遺伝子群の同定を行う.ゲノム解析に必要な試薬の購入に使用する当該年度の研究に必要な試薬等がすべて購入できたため次年度に繰り越すこととした遺伝子発現解析のための試薬購入費として使用する
ポスト冷戦のアジアにおける国際的地域開発協力の試み-メコン川開発再開の力学

本研究はポスト冷戦における開発の胎動から開発経済学の今後のあり方を展望することを意識して行なわれた。メコン川開発そのものに関してのより詳しい研究成果は、資料収集、シンポジウム参加といった本年度の活動をもとに来年度中に公刊する予定である。長き衰退過程にあった開発経済学に、外部性、規模の経済、収穫逓増、戦略的補完性の視角から新たな光があてられ、初期開発経済学の復権が叫ばれ始めている。これは、開発経済学における新古典派の席巻が開発の現実の中でもたらした災禍への理論面におけるひとつの反動であろう。実際、新古典派的構造調整政策への批判は多方面からなされてきた。しかしながらA.O.ハ-シュマンに代表されるように、開発論には復権させるべき、より重要な潮流が伏在している。経済開発における第一の課題とは、経済の活性化を指向しつつも開発の過程が必然的にもたらす不安定性をいかにして緩和し社会の持続を保証するのかということである。歴史的に国際的利害が錯綜し冷戦後の開発が指向されながら紛争の火種が消え去ったとは言えないメコン川流域の開発において必要とされるのも、まず何よりもこうした視点である。しかしながら外部性などを問い直し理論的彫琢が図られつつも、対立一掃を目的とする権力行使を暗黙のうちに受容してしまう開発経済学の傾向はいまだに払拭されていない。対立の火種を抱えつつ開発に歩みださねばならないポスト冷戦において必要なのは、市場経済擁護論に込められてきた人類史的課題の重みを継承しつつ、潜在的資源、外部経済の利用可能性のみならず相互依存を深化させる可能性を持つ市場経済の中で対立克服の具体的「戦略」を模索することである。メコン川開発を展望するにも、開発論におけるこうしたハ-シュマン的視角を陽表化することが重要である。
ストームグラス中の結晶挙動の研究

温度変動下のストームグラス中の結晶の見た目の特徴の理解を目的に実験を行った。試験管中の結晶集団には多層の構造があることがわかり、それぞれの層の成因は初期核形成、その後の樹枝状成長、樹枝状結晶上方の溶液中における核形成、さらには、樹枝状成長と核形成の繰り返しにあることが分かった。層ごとの層厚の時間変化の解析(多層解析)を行った結果、層はその起源によって厚さが「一定」、「減衰」、「パルス的」、「振動」の4つに分類され、サンプル溶液の成分数に依存してどの過程が関与するか異なることを見出した。このように、温度変動下の複雑な多結晶集団挙動を層ごとの解析という粗い基準を用いて特徴づけることができた。ストームグラスは、溶液内の結晶挙動を観察することで天気予報に利用された歴史的器具である。本研究は、温度変動下の結晶の形状や析出量などの見た目の特徴を生ずる機構の理解は現代科学の観点からも興味深いと考えて研究を行った。ストームグラスは5成分系のため、析出しない微量成分を除いた3成分系、さらには析出するカンファーとエタノールからなる2成分系との比較実験を行った。いずれのサンプルでも、温度変動条件下における無数の結晶の挙動を扱う必要があり、その理解は簡単ではない。この複雑な振る舞いを特徴づける指標を見出すために、今回新たに多層解析を行った。試験管に析出して下部に沈殿した結晶は、複数の層を形成しているためである。これらの層の成因は、初期の無数の核形成による微結晶の集合体、その後の樹枝状成長、さらには、樹枝上方の溶液中での無数の核形成による結晶の降り積もり、そして、この繰り返しにあることが分かり、それらの起源を明確に捉えた。昨年度までは、結晶集団の全高さの時間変化の解析しか行ってこなかったが、今年度は層ごとの層厚の時間変化の解析(多層解析)を行った。これにより、層はその起源により、厚さが「一定」、「減衰」、「パルス的」、「振動」の4つの項に分類され、5成分系においてそのすべてが関与し、3成分、2成分系へと関与する項が減るという多様な挙動の要素過程を見出した。さらには、同じサンプルであっても、静置した試験管内で結晶を溶解したものと、それを撹拌したものでは、初期の濃度場の有無の違いにより多層構造の形成の仕方に大きな影響を及ぼすことが明らかとなった。本研究対象は、核形成や成長・溶解を伴う多結晶集団の複雑な振る舞いを示すことが難しさであるが、この問題に対して特徴を定量化する指標を見出したことは今後の研究の進展にとっても意義深い。ストームグラスは、ガラス管中の5成分溶液中にカンファー結晶が析出したものであり、日々変化する結晶の見た目の特徴により天気予報にかつて利用されていた。他の結晶の結晶成長学的な研究においても、温度変動下の結晶挙動の理解は十分では無いため、本研究はこのような複雑な温度条件下における結晶挙動や形態形成の理解を目的にストームグラスの研究を行った。天気が当たるかどうかは目的外であることを断っておく。本年度は、単純な系としてカンファー・エタノールの2成分系と、水を追加した3成分系での温度変動実験(20°C30°C、10時間周期)を行い、5成分系での結果との対比により結晶の形状や析出した高さの変動の特徴を議論することを目的とした。溶液のカンファー組成は、最高温度でも結晶が完全に溶解(消滅)しない条件とした。以上より、3、5成分系では樹枝状に成長することが充填率の小さいふわりとした見た目を生じることや、充填率が小さいために温度変動に敏感に結晶の高さが変動することが明らかとなった。5成分系における結晶の見た目の変化の大きさは、当時の人々が気象条件と関連付けてストームグラスを観察した一因と推論できる。ストームグラスは、溶液内の結晶挙動の観察により天気予報に利用された歴史的器具である。本研究では温度変動下における結晶形状や析出量などの見た目の特徴の変化過程の理解が結晶成長学や形態形成の観点から興味深いと考えて実験的研究を行った。ストームグラスは5成分系(カンファー、エタノール、水、塩化アンモニウム、硝酸カリウム)のため、比較実験として3成分系(前者3成分)、2成分系(カンファー・エタノール)というシンプルな系も用いた。析出する結晶はカンファー結晶であり、濃度と平衡温度の関係(相平衡図)及び濃度と溶液密度の測定を行った。そして、周期的な温度変動を長期間与える実験を行い、結晶画像の解析を行った。試験管に析出して沈殿した結晶は、複数の層を形成した。

これらの層の成因は、初期核形成による微結晶の集合体、その後の樹枝状成長、さらには、樹枝状結晶上方の溶液中における核形成による結晶の降り積もり、また、樹枝状成長と核形成過程の繰り返しにあることが分かった。これらの層ごとの層厚の時間変化の解析(多層解析)を行った結果、層はその起源により厚さが「一定」、「減衰」、「パルス的」、「振動」の4つに分類され、5成分系においてすべてが関与し、3成分では「一定」、「減衰」、「振動」、2成分系では「一定」、「減衰」項が関与するという成分数ごとの要素過程を見出した。さらに今年度は、層の境界の判定基準を明確に定義し直すことで、多層解析における解析者依存性の要素を排除した。また、太い試験管を用いた比較実験や短時間周期実験を行いその詳細を議論した。主たる成果は上述の多層解析の成果の通りであった。結晶成長学当初の目的通り、ストームグラス溶液である5成分系、よりシンプルな系である3,2成分系での温度変動実験の対比を行い、その特徴を前述の多層解析により明らかにした。また、すべての成分数のサンプルにおいて、相平衡温度と密度のカンファー濃度依存性の測定も完了し、これらの基礎データは核形成温度や自然対流等の議論に生かされた。密度測定の結果、結晶の浮遊の可能性は完全に否定された。このため、試験管全体において無数の結晶が核形成したときに、その沈殿速度の遅さが見た目の特徴として「浮遊」と捉えられたと考えられる。そこで、当初の予測である液液分離が結晶の浮遊に関与するのではないかとの考えを改め、溶液の密度測定のデータは結晶の成長や溶解に伴う液相中の濃度分布の変化と対流の有無の議論に生かした。以上の通り、当初の予定とは異なる新事実も明らかとなりつつあり、おおむね順調に本研究が進展している。また、本年度の研究成果の一部は、査読付きの学術誌(J. Crystal Growth)にアクセプトされ、既にオンライン上に成果が公表されている。当初の目的では、成分数の少ない2成分溶液のみをサンプルとする予定でいたが、その予定を上回り、同じ実験条件下において3成分・5成分溶液中での実験も併せて行った。これにより、サンプルの成分数が析出した結晶の高さ変動に及ぼす影響を結晶粒の形や空間充填率の観点からの議論を実現しており、概ね研究は順調に進展している。研究実績の実施概要に記載の成果は、研究の1段階として重要であり、まとまった内容であるため、国際会議での発表を予定しており国際ジャーナルへの投稿も準備中である。また、次年度の目的の一つに、結晶の浮遊や液液分離に関する議論を予定しているため、本予算により購入した密度比重計によりサンプル溶液の密度のカンファー濃度依存性の測定を終了している。本研究の目的である温度変動下の結晶集団の挙動の理解を深めるために研究を推進し、その成果を国内外の学会において発表するとともに、学術論文としても公表していく。具体的には、温度変動下におけるストームグラス中の多結晶集団の成長・溶解過程における見た目の変化過程を特徴付けるために、結晶集団を構成する層ごとに多層解析を行う。この手法は今年度その有効性が示されている。今後、温度変動の周期や温度振幅を変えた実験や、さらには、複雑な温度変動を与える実験等へ移行する。これまで、同じ温度条件での周期的温度変動(シンプルな温度条件の与え方)にこだわった理由は、そもそもが複雑な挙動を示す結晶挙動の有効な定量的取扱い方が見いだせていなかったことにある。
集光レーザービームの光圧によるタンパク質の結晶化メカニズムと結晶配列制御の研究

本研究では、光圧研究の対象を従来のコロイド系からより小さな有機化合物の単一分子・クラスター系へと拡大し研究を進めてきた。その結果、世界で初めて光圧によるアミノ酸の結晶化に成功し、さらには結晶成長、結晶相、相分離を時空間的に制御できることを実験実証した。また、超分子タンパク質の結晶化並びに二次元ディスク形成にも成功し、これらすべての現象が気液界面と光圧とを効果的に統合した場合に誘起されたことから、界面の特性が種々現象の本質であるという重要な知見を得ることに成功した。本研究結果により、全く新しい光圧化学の研究分野が開かれるであろう。タンパク質をはじめとする様々な有機化合物をターゲットとし、集光レーザービームの光圧を利用した結晶化誘起、結晶相制御、超分子集合構造の制御、キラル結晶の作製などまったく新しい光圧効果を実証する。さらに、光圧により分子配列制御された結晶に対し、我々が先に開発した液中レーザーアブレーション法によるナノ粒子化により結晶の比表面積を増大させ、同時または逐次的に起こる光化学反応との統合により、高効率な固体光反応、光絶対不斉合成への展開を図る。1、倒立顕微鏡にXYZピエゾスキャンステージを設置し、捕捉用CWレーザーと同軸で、フェムト秒レーザーパルスをサンプル溶液中に集光させるシステムを新たに構築した。捕捉用CWレーザーをλ/4板により偏光状態を変化させ、対物レンズを通してレーザー光を試料に集光し、エナンチオ選択された結晶を作製するためのシステムとした。さらに、この開発されたシステムにポラライザー及びアナライザー等の各種顕微鏡光学部品を付け加えることにより、作製された結晶の光学純度をリアルタイムに判定し、作製された結晶のエナンチオ選択性を定性的にかつ瞬時に判断できるシステムに発展させた。2、シアニン系色素水溶液の溶媒蒸発過程に近赤外レーザーを集光し、光圧ポテンシャル内における色素J会合体形成過程について解析した。二光子励起蛍光スペクトルを解析することによって、光圧ポテンシャル内ではJ会合体の形成、成長が促進されることや、配向秩序構造の高いJ会合体が選択的に形成されることを見出した。光圧を利用して、優れた光機能を持つJ会合体のナノ構造を作製し、サイズや構造、電子状態を制御する全く新しい方法を提示した。3、光圧を用いた高分子集合体の配列・固定化法をさらに発展させ、ペリレンとポリスチレンの混合溶液の溶媒蒸発過程に光圧を作用させ、2成分分子集合体をレーザー集光位置に作製することに成功した。光圧の大きさによって集合体内のペリレンとポリスチレンの濃度比が変化することを見出し、両分子の分極率差に起因すると結論した。光圧が2成分系有機材料の組成比を局所的に制御できる可能性を初めて示した。4、可視、赤外、2波長のレーザー光を集光し、蛍光色素を含むポリスチレンナノ粒子の光圧ポテンシャル内での運動を、可視共鳴レーザー光の強度によって制御することに成功した。この原理を用いれば、特定の色素でラベルした生体分子の拡散運動を、共鳴レーザーで抑制できると期待できる。1.溶媒として水及び重水を用いて、グリシンの過飽和溶液を作製した。そこへ1.1Wの光強度を持つ連続発振赤外レーザーを対物レンズにより集光し、光圧によるグリシンの結晶化を試みた。その結果、どちらの溶媒を用いた場合も、グリシン結晶化を誘起することに成功した。本結果は,連続発振のレーザーのみで結晶化に成功した世界で最初の実験例である。連続発振レーザーの出力は、パルスレーザーの尖頭値に比べて低く,比較的マイルドな条件での結晶化が可能となる。このことにより,耐光性が低く,結晶になりにくい蛋白質や薬剤化合物に対する結晶化法として有用であるといえ、20年度のテーマである「光圧によるタンパク質結晶化」への実現性を大きく高めた結果といえる。2.光圧によるグリシン結晶化の結果により、分子・クラスターのレベルにおいて光圧は有効に作用するということが分かり、次に光圧による結晶成長促進の実験を行った。1の手法または自然に析出した結晶の近傍に連続発振赤外レーザーを集光した。その結果、集光スポットの方向に再度結晶の成長が始まり、またその成長速度はスポットに近づくにつれて増加することが分かった。また、本来の結晶成長方向でない方向に集光した場合も結晶成長は見られ、結晶成長を制御できるという大変斬新な結果を得ることに成功した。この結果は産業的な利用価値もあると考え、特許も出願した。3.光圧によるグリシン結晶化に対する照射レーザーの偏光依存性を調べた。溶媒として重水を用いた場合、直線偏光と円偏光で作製される結晶形は異なり、偏光を変える事により結晶形を作り分けられることがわかった。

この結果は、以前に報告されているパルスレーザーによる結晶化誘起と逆の結晶形をもつ結晶が得られており、本手法のメカニズムは大変興味深く、20年度の研究テーマとする。20年度得られた研究成果について以下に列記する。1.光圧による、結晶内分子配列の制御に成功グリシンの過飽和重水溶液を試料とし、光圧により作製した結晶の結晶相を赤外吸収スペクトルにより調べた。その結果、光圧捕捉結晶化を時間的及び空間的に制御しつつ、本実験条件では析出しない分子配列を有する結晶の作製に成功した。2.光圧による、結晶成長の制御に成功溶液中で成長が既に停止している結晶にレーザー光を集光することにより、結晶が集光点の方向に一軸的に再成長させることに成功した。さらに、結晶が集光点付近に数個存在した場合には、成長と溶解を同時に誘起できることを実証した。本結果は、多結晶化結晶を単結晶化できる新技術として大いに期待できる。3.光圧捕捉結晶化における液面変形の観測単一有機低分子に働く光圧捕捉力は非常に弱く、通常の実験条件では結晶化を誘起することはできない。本基盤研究を遂行する中で、レーザー照射中によって誘起される液面変形が、本光圧補足結晶化において大変重要な因子であるが分かって来た。そのため、液面変形を購入したレーザー変位計を用いて定量的に測定し、液面変形挙動が集光点に強く依存していることを見出した。本結果は、光圧捕捉結晶化メカニズム解明への重要な知見であり、今後も詳細に検討を行う。4.液中レーザーアブレーション法による有機ナノ結晶作製本基盤研究における有機固体光反応の高収率化並びに固体光絶対不斉合成への展開に対して、その光学的基礎データの充実を目的とし、先に我々が開発した「液中レーザーアブレーション法」による種々有機化合物のナノ化を行った。その結果、顔料、蛍光性有機色素、炭素材料など幅広い有機化合物ナノ粒子作製に成功し、本手法が十分汎用性的であることを示した。この結果は、光圧により結晶内の分子配列が制御された結晶に対してナノ化が十分可能であることを実証するものである。1.光圧による結晶化誘起と結晶相制御グリシンの軽水及び重水の飽和及び過飽和溶液を試料とした。集光近赤外連続発振レーザービームの光圧を、気液界面に作用させることにより結晶化を誘起し、作製した結晶の赤外吸収スペクトル、単結晶X線構造解析の結果から結晶相を同定した。その結果、自然蒸発による結晶化では析出しない結晶相や非常に特異な条件下のみ生成する結晶相が確認され、それらの生成確率がレーザー光強度、偏光、溶液濃度に依存することを見出した。2.光圧による不飽和溶液からの結晶化グリシンの不飽和重水溶液を試料とし、1と同様の実験を行った。通常、溶液から結晶化を誘起するためには、少なくとも溶液全体が過飽和になる必要があるが、本実験では、光圧により溶液中の分子を効率よく液面に捕捉することにより、不飽和溶液から非接触に結晶化を誘起することに世界で初めて成功した。3.光圧による液-液相分離誘起1と同様の実験条件下において、ガラス基板上にレーザーを集光すると結晶化は誘起されず、液面変形後に液-液相分離による高濃度液滴が形成されることを見出した。これまでに、グリシン水溶液の液-液相分離の報告例はなく、本現象も世界初の成功例である。また、生成液滴の表面に光圧を作用させると、瞬時に結晶化が誘起される事も見出している。4.光圧による結晶キラリティー制御への展開
立方晶チッ化ホウ素(cBN)単結晶切削工具材料

cBN単結晶切削工具は現在実用の域に達しているわけではなく、今後の問題が山積している。cBN単結晶の育成に成功したのは著者らの5年前の報告で世界で最初である。ところが、cBN単結晶の高温・高圧合成はダイヤモンド単結晶の育成よりもはるかに困難である。しかも。結晶合成に必要な基礎的デ-タも非常にすくない。本研究はcBN単結晶の合成に不可欠な基礎デ-タをまず蓄積することにした。ダイヤモンドとちがって、cBNは熱力学的安定条件以外で合成できていない。したがって、高温・高圧条件で合成するが、cBNが安定な圧力ー温度条件が確かではない。今回行った実験結果では、平衡線はP=T/200ー3.5(°C、GPa)と決定した。これは、従来と大きく違った結果で、cBNは高圧相ではなく、低温相である。単結晶育成溶媒には種々考えられるが、アルカリ、アルカリ土類ほうちっ化物が代表的である。それゆえ、これら化合物とhBNを共存させた系からcBNが合成できる圧力・温度条件を実験的に求めることがまず必要である。Li、Ca,Mg,LiーCaほうちっ化物でcBNの合成領域をきめたところ、最低合成圧力は大部分5GPa,最低合成温度は1000ー1200°Cであった。BNー溶媒系でcBNが合成される最低温度は液相線と一致するはずで、原理的にはこれが最低の結晶成長温度になる。ところが、アルカリほうちっ化物溶媒では1700°C以上でないと顕著な成長がみられない。そこで、5.5GPa、1200ー1300°C付近でダイヤモンドあるいはcBN結晶を種とした成長実験を行ったところ、核形成の制御をうまく行えば種結晶上に適当な厚さのcBNが成長する条件で確認できた。たとえば、Mg_3BN_3を約5wt%添加したhBNは、5.5GPa1500°Cで容易にcBN焼結体に転換し、精密加工工具材料として有望なことが筆者らによってすでにみいだされている。このような特異な転換機構をさらにくわしくみるために、Mg3BN3の結晶構造解析、少量の水分を添加した場合の分解反応によるcBNの合成を行い、構造に含まれているN=B=N一次元結合が重要な役割をはたしていることをみいだした。しかも。立方晶チッ化ホウ素単結晶を合成し、鉄合金系超精密加工用切削工具を試作評価することが本研究の目的である。立方晶チッ化ホウ素単結晶は上記の目的に適用できる唯一の材料と考えており、工具に加工可能な良質単結晶が望まれている。研究年度内で次の点を改善し、実用化に結びつける。(1)単結晶の成長過程を研究し、工具として望ましい形態とサイズを有する結晶の育成方法を確立する。(2)単結晶の摩耗、熱的変化に対する実用的知見を得る。(3)単結晶の加工方法及び表面改質を研究し、工具材料としての高度化技術を確立する。

本年度は結晶育成装置であるFB30H型超高圧装置のプレス部分、温度圧力制御システムを試作設計すると共に、新規FB30Hの設計に必要な実験(特に粉末成形圧縮性ガスケットに関するもの)を行い、十分な見通しが得られたのでFB30H型高圧容器の設計を行った。また、育成圧力温度領域を決定するため、厳密なhBNとcBNの相境界線を決定し、これまでのデ-タを修正した。本年度において、立方晶チッ化ホウ素(CBN)単結晶育成用溶媒の研究を中心に行った。また、CBN超高圧合成の基礎となる、CBNの安定圧力・温度条件に実験及び熱力学計算を行い、新たな相境界線を決定した。(1)ホウチッ化マグネシウム溶媒の挙動従来不確実であった組成をMg_3BN_3と決定し、これが粉末X線リ-トベルト構造解析の結果とも一致することを見出した。常圧で合成されるMg_3BN_3は高圧相に転移するが、その相境界を実験的に決定した。さらにMg_3BN_3は少量の水分と共存するとき,MgO+NH_3+CBNに分解し、CBN結晶が析出することを見出した。この分解反応はMg_3BN_3構造に存在するNーBーN鎖の活性に由来し,従来より低圧の4GPaで十分進行する。この反応は工業的なCBN切削,研削材料の合成方法として有望である。同様な超高圧分解反応がアルカリ、アルカリ土類ホウチッ化物で可能と考えられるので,現在検討中である。(2)CBN安定圧力・温度領域従来の実験結果には相互予盾があり,新たに検討した。特に36GPa領域で精密な実験を行い,新しい境界線としてP__ー=3.50ー5.00T^<-3>(GPa,°C)を決定した。これによればCBNは常圧下700°Cまで安定相であるとの,従来と大幅に異なる結果が得られた。この妥当性は、熟力学計算及び低圧領域のMg_3BN_3分解反応による合成領域によっても確認された。本年度も引きつづき高純度CBN単結晶を育成するための基礎的研究を行った。溶媒系の探索については、Ca_2B_2N_4-BN,Li_3BN_2-BN,Sr_2B_2N_4-BNおよびLiCaBN_2-BN系でのCBNの合成圧力-温度領域を各々決定した。これらの結果ではCBNの合成最低温度が10001100°C付近になった。例えばLi_3BN_2-BN系では従来最低合成温度が約1500°Cとされていたがそれよりも400°C低い温度でも,少量ではあるが確実にCBNが合成できることが明らかになった。以上の結果はCBN単結晶の低温度育成に必要な条件の一部分をそろえたことになる。つづいて,11001300°C領域でcBNの単結晶が成長するか否かに関して実験的に明らかにする目的で,ダイヤモンドおよびCBN単結晶を種結晶とする育成実験を行った。この実験にはLiCaBN_2を溶媒に用いた。CBNの自発核形成のみられない低圧領域ではCBNの成長はまったく見られなかった。CBNの自発核発生のある高圧領域においては,ダイヤモンド種結晶上にはCBNが成長せず,CBN種結晶上には成長が起ったと思われるがさらに検討を要する。いずれにおいても,種結晶以外の部分にはCBNが生成しているので,CBNの自発核発生を制約するような層をもうければ種結晶上に成長が行えると思われさらに実験を続行する。従来の単結晶育成方法ではCBN結晶の形態制御が著しく因難である。そこで形態の整ったダイヤモンド結晶を種として,その上にヘテロエピタキシャルにCBN層を成長させる方法を開発した。ダイヤモンド上へのヘテロ
国際保健分野における多職種連携をふまえた学生教育支援と国際協力モデルの開発

多職種、多文化の学生及び若手専門職者の合同チームを編成し、学校保健プログラム、研究調査活動を実施した。2013年の学校保健プログラムを含め2016年迄に日本、ネパール、韓国より述べ46名が参加した。言語、習慣及び価値観の違いを受入れ協力しあうことの困難さを体験し、同年代のメンバーと共通の目的を持って活動することにより、人間関係を構築し、協働力を向上した。途上国の保健医療現場を体験し、自己の専門性の役割を明確にする機会となった。ネパール人参加者には日本の医療福祉機関での研修を行った。国際保健活動の環境を継続的に提供し対象地域に貢献するため、新たなヘルスプロモーション事業をたちあげ実施中である。1.カトマンズ市内の視覚障害のある生徒対象のダンス療法による生徒・教員の健康と運動の認識についての研究調査:平成26年4月6月、昨年度のネパール村落部学校保健実施メンバーにより、カトマンズ市内学校生徒を対象に、ダンス療法を実施した。実施前後に参加者に個人面接を行い、健康と運動についての認識の変化を調査した。運動をしていないことは不健康である、という認識が学校生徒にあり、ダンス療法により運動ができることの自信が芽生え、継続的に行う意欲が高まったことが明らかとなった。2.2014年度夏期ネパール学校保健プログラム:日本より、薬学、法学、看護学分野より計3名、ネパールから、看護学、医学、公衆衛生学分野計7名の学生が参加した。韓国から文化人類学分野の学生1名が参加し、6分野の職種、3か国の国籍からな計11名の多職種、多国籍の学生チームを編成した。7月上旬より学生間でSKYPEによりプログラムの打ち合わせを始めた。平成26年8月13-21日の期間に村落部の学校2校において、手洗い、栄養、生殖の3つのテーマに分けて、健康教育を実施した。実施前に学生間の相互理解を深めるため、合宿をして文化交流を行った。事前に学校及び村落を訪問し、村落の生活状況を調査し学校教員とプログラム内容について協議した後、学校教員、現地NGOの協力を得て、クラス毎にプログラムを実施した。結果として、学生間の交流は深まったが役割分担の明確化、共通言語として常に英語で話す必要性が挙げられた。活動期間最終日は、現地協力機関を招待してプログラム実施報告会を行った。実施内容報告:平成26年11月に国際保健医療学会において、活動内容をポスター発表した。3.夏期プログラム事後調査:ネパール参加学生により、プログラム実施学校の事後調査を行い、手洗い活動が積極的に行われていることを確認した。1.ネパール地震被災後調査:5月上旬に現地協力機関との調査予定を、2015年4月25日発生した地震後のカトマンズ周辺地域の被災状況調査に切り替えた。政府の対応不足で各国から届けられた支援物資が被災地に送られない中、現地の医療機関、民間人が独自で復興作業に取り組んでおり民間の対応能力の向上がみられた。2.2015年夏期ネパール学校保健プログラム:日本より情報工学、語学、看護学の学生及び行政若手職員4名と、ネパールより、看護学、医学、公衆衛生学、社会学、情報工学学生及び若手看護職者12名の多国籍、多職種チームを編成した。首都近郊のNGO経営学校及び村落部の公立学校に2か所において、歯磨きプログラムと身体・視力測定を行った。また情報工学の学生によるコンピューターのプログラミングクラスも同時に開催し、コンピューター教育への学習意欲向上を促した。身体・視力測定の備品は寄付し、測定値は学校付属PCに保管するようデータを入力した。半年に1回同様の身体・視力測定ができるように教員とともにプログラムを実施した。同年4月におこった地震の被害が大きかった村落部の学校では、同時に上級生を対象にPTSDの影響についてのアンケートを実施した。実施結果からPTSDの影響はみられるが、多くの子供が回復過程にあることが示唆された。3.ネパール学生の日本研修旅行及び学会発表:ネパールより日本での保健医療機関視察のため看護学生、医学生、看護職者の3名を招聘した。2015年11月に開催された日本国際保健医療学会において、今年度の活動報告及び2014年に実施したダンスプログラムの研究報告について、発表を行った。研修チームは日本の公衆衛生研究施設、大学病院、看護学部、医学部の視察を行い、日本の医療と看護教育について研修を受け、ネパールでのこれからの学習や職場に日本の技術やシステムの適用を検討することができた。1.学校保健プログラム:2015年の地震により現地協力機関が被災し、予定していた活動が半分できなかったが、あらたにコンピュータープログラムを加えることにより、活動内容を充実させることができた。被災後でインフラが整わなかったが、学生の積極的な活動により被災者となった住民の健康増進に貢献することができた。あらたに加えたコンピュータープログラムは今後の持続的な保健活動をめざし、学校のコンピューターで身体測定の記録ができること、生徒が自分自身でプログラムを管理できるようになることを、目標に、日本人チームが預かった被災地寄付金によりモニター、簡易ハードウェアを購入し、現地情報科学学部学生とともに学校で使用できるように設置し、コンピューター教育担当者と使用方法を確認した。日本チーム帰国後、コンピュータークラスではこのプログラムを継続して使用し、生徒の教材となっていることが報告されている。2.ネパールからの研修チーム招聘:2013年度からネパール学校保健プログラムにかかわった日本の参加者から7名が研修活動をサポートし、ネパールチームとの交流を深め、この研究の目的である多文化理解と協働力の向上につながった。

また日本の医療機関、大学に協力していただき、日本の医療サービスと医療設備、保健所での公衆衛生活動、医学部・看護学部での教育活動について研修を受け、将来の国際保健人材としての研鑽をつむことができた。学会発表ではネパールチームの研究活動をポスター発表によって報告し、国内外の学会参加者から高い評価をうけることができた。【はじめに】21世紀の国際保健協力推進のために、グローバル人材の育成は必須である。多文化・多職種の学生及び若手専門職者が協働し、ネパールの村落部において学校保健教育を実施することにより、政治的、経済的、民族的背景が複雑に関連しあう国際社会の現状を体験し、多文化コミュニケーション技術、協働力、多職種連携力の向上を図った。【概要】2014年より毎年8月に日本及びネパールの学生・若手専門職者の合同チームを編成し、カトマンズ周辺の村落部の学校において保健教育を実施した。合同チームは保健康教育と身体計測の企画、教材準備を対象学校職員と協力して実施した。定期的な身体計測を対象学校が継続的に実施できるよう、教材と計測結果をコンピューター管理できるようIT教育の推進を図った。2015年、2016年にはネパールの学生及び若手専門職者を招聘し、高等教育機関、医療福祉機関での研修及び学会での発表を行った。【考察】多文化、多職種の同世代のメンバーが共通の目的のもと活動し、言語、習慣、価値観の違いを受け入れ困難を乗り越えて協力する達成感を体験する機会となった。学校保健活動を通じて国際社会における保健医療サービスの現状を体験し、医療だけでなく多角的な視野をもって保健協力を実施する必要への認識へとつながった。参加者は国際保健協力を目指して進路をすすめている。2013年から2016年の4年間にて日本、ネパール、韓国より延べ46名の学生及び若手専門職者が参加した。日本の研修旅行にはネパールより、2015年と2016年で計6名が参加した。【まとめ】同世代の若者が国際保健現場で主体的に活動する環境を提供することで、国際保健人材育成推進となる。国際保健活動の環境を継続的に提供するため、国内外の民間、高等教育機関及び保健医療機関が連携と支援が今後も必要とされる。ネパールでは本研究の継続事業を2か所で実施予定である。多職種、多文化の学生及び若手専門職者の合同チームを編成し、学校保健プログラム、研究調査活動を実施した。2013年の学校保健プログラムを含め2016年迄に日本、ネパール、韓国より述べ46名が参加した。言語、習慣及び価値観の違いを受入れ協力しあうことの困難さを体験し、同年代のメンバーと共通の目的を持って活動することにより、人間関係を構築し、協働力を向上した。途上国の保健医療現場を体験し、自己の専門性の役割を明確にする機会となった。ネパール人参加者には日本の医療福祉機関での研修を行った。国際保健活動の環境を継続的に提供し対象地域に貢献するため、新たなヘルスプロモーション事業をたちあげ実施中である。ネパール参加学生の意欲が高く、研究調査に積極的に関わった。
木曽ヒノキ標準年輪曲線を用いた過去1000年間の気候復元

本研究では、木曽ヒノキ現生木および埋没木を用いた標準年輪曲線の作成と過去1000年間の気候復元を当初の目的とした。そのために、木曽ヒノキ現生林の分布域全体にわたって17の地域で現生木円板試料(30-110個体/地域)を、またその中の一部の地域では倒木、埋没木、根上台木(試料点数計377)を得た。所定の方法で年輪幅計測を行い、目視及び移動相関法(クロスデーティング)による年輪年代決定を行い、標準年輪曲線を作成した。その結果木曽地域全体で8地域について220350年長の地域標準年輪曲線を作成した。さらに埋没木等が利用できる地域では当初の計画を上回るAD645年から現在に至る1358年長の標準年輪曲線が得られた。各地域標準年輪曲線について、肥大成長に影響する月別気象要素の分析(応答関数解析)を行い、全ての最終地域で、木曽ヒノキの年輪幅が、早春期(2-4月)の気温に対して正の相関を、また一部の地域で例外が見いだされたが、前年7-8月の気温に対して負の相関を示すことが明らかとなった。この結果をもとに、気候復元のための伝達関数モデルを作成し、中世温暖期から小氷期、そして現在に至る早春期の気候変動を復元した。復元結果を東アジア地域における従来の研究成果(古文書(日本、中国)、年輪等(韓国、モンゴル、欧州、北半球平均気温等))と比較・検証し、良好な対応を得た。木曽ヒノキ年輪による気候復元は、数年から数10年のオーダーで特に良好な結果を示し、これまでに無い高い時間分解能で過去の気候を復元する能力を持つことが明らかとなった。また本研究で得られた標準年輪曲線は奈良時代までを十分にカバーし、歴史考古学における出土木製品等の年代測定にも利用可能である。年輪年代学で作成される標準年輪曲線は、年代測定の道具として使用されるだけでなく、気候復元や森林生態系の変動の解明など古環境学へ応用されている。得られる古環境の情報は、環境考古学的な文脈でも非常に重要となっている。年輪年代学の世界的な動向を考慮して、環境変動を大域的・地域的なものに統計的に分離して、復元精度を向上させる必要がある。本研究では、現有の現生木標準年輪曲線(AD1650)を空間的に拡充し、本州中部域での、過去1000年間の気候の復元を目指している。さらに、この結果を、気象観測データや他の代理データと比較することで妥当性を検証し、時系列解析及びスペクトル解析などの手法を用いて、気候変動の10年から数十年変動成分を明らかにする。平成15年度には試料の収集及び標準年輪曲線の作成と延長を重点的に行なった。年輪試料に関する現地調査を行い、既存の標準年輪曲線の作成に加えて、さらに調査地域を拡大して、木曽ヒノキ林分布の全域から現生木(伐採年代既知)について標高別に試料を約3040個体ずつ採取した。また埋没木試料を278個体収集した。1μmの精度で年輪幅を測定し、クロスデーティングにより、林分ごとに国際基準(20個体2方向以上)を十分に満たす標準年輪曲線と埋没木標準年輪曲線を作成した。試料点数の充実により、年輪曲線がカバーする年代範囲の拡張と年輪曲線の統計学的な信頼性の確保が達成できた。その結果、本研究を申請した時点で想定していた過去千年を超える奈良時代までをカバーする埋没木標準年輪曲線が得られた。

現在は、平成16年度年度以降の研究の進展に向けて、埋没木と現生木をつなぐ試料群の探索とデータ解析方法の検討を行っており、既に予備的な気候復元に着手した。本年度では、新たな試料の探索を行い、当初の計画(平安後期鎌倉時代)をはるかに越える年代範囲(AD645)での標準年輪曲線の延長に成功した。年輪年代学の国際的な研究機関であるハンブルク大学木材生物研究所において、年輪曲線の性能検証を行い、良好な結果を得た。また年輪年代学の国際会議(EuroDendro 2004)において成果を公表し、欧州地域での当該領域研究との比較を行った。現生木標準年輪曲線については、さらに試料を採集し、新たに二つの地域標準曲線を作成した。さらに本年度は、データ解析に着手した。応答関数解析の結果、木曽ヒノキ標準年輪曲線を用いて冬期(11-12月)、早春期(2-4月)及び夏期(7-8月)の気温の復元が可能であることが明らかとなった。またいくつかの回帰分析法を用いて、気候復元のための伝達関数を作成し、小氷期後期の早春期気温を復元した。これまでに東アジア地域で得られている気候復元結果と相互検証を行った結果、木曽ヒノキ標準年輪曲線から復元した気候はそれらと調和的な結果を示すばかりでなく、高い時間分解能で歴史時代の気候を復元できることが明らかとなった。また、年輪年代学の分野では、国際的に要求される水準で統計的に有意に検証された気候復元は、本研究が初めての事例である。この成果は、現在、投稿中である。夏期、冬期の気温については、やや復元性能が劣ることから、最終的な応答関数の確定を保留したが、最終年度には複数の地点での標準年輪曲線を用いることで十分に有意な復元を行う予定である。本研究では、木曽ヒノキ現生木および埋没木を用いた標準年輪曲線の作成と過去1000年間の気候復元を当初の目的とした。そのために、木曽ヒノキ現生林の分布域全体にわたって17の地域で現生木円板試料(30-110個体/地域)を、またその中の一部の地域では倒木、埋没木、根上台木(試料点数計377)を得た。所定の方法で年輪幅計測を行い、目視及び移動相関法(クロスデーティング)による年輪年代決定を行い、標準年輪曲線を作成した。その結果木曽地域全体で8地域について220350年長の地域標準年輪曲線を作成した。さらに埋没木等が利用できる地域では当初の計画を上回るAD645年から現在に至る1358年長の標準年輪曲線が得られた。各地域標準年輪曲線について、肥大成長に影響する月別気象要素の分析(応答関数解析)を行い、全ての最終地域で、木曽ヒノキの年輪幅が、早春期(2-4月)の気温に対して正の相関を、また一部の地域で例外が見いだされたが、前年7-8月の気温に対して負の相関を示すことが明らかとなった。この結果をもとに、気候復元のための伝達関数モデルを作成し、中世温暖期から小氷期、そして現在に至る早春期の気候変動を復元した。復元結果を東アジア地域における従来の研究成果(古文書(日本、中国)、年輪等(韓国、モンゴル、欧州、北半球平均気温等))と比較・検証し、良好な対応を得た。木曽ヒノキ年輪による気候復元は、数年から数10年のオーダーで特に良好な結果を示し、これまでに無い高い時間分解能で過去の気候を復元する能力を持つことが明らかとなった。また本研究で得られた標準年輪曲線は奈良時代までを十分にカバーし、歴史考古学における出土木製品等の年代測定にも利用可能である。
幹細胞を用いた脂肪組織再生と血管新生における分子機構の解明

今回の研究で、我々は、脂肪幹細胞を用いた組織再生と幹細胞生着においては血管新生能が重要な役割を果たすこと、とくに脂肪幹細胞が血管新生作用を有する増殖因子であるVEGF、FGF-2、HGFなどの増殖因子を多く産生すること、そして低酸素条件下においてHIF-1αの発現を介し、それらの産生が促進されることを明らかにした。組織生着や組織再建には局所の血流や血管新生が重要な役割を果たすため、脂肪幹細胞を用いた組織再建における幹細胞の担う重要な役割が明らかになった。近年,脂肪組織中に存在する多能性幹細胞の存在が報告され、骨髄に代わる幹細胞として再生医療への応用が期待されている。再生医学を構成するコンポーネントとして、(1)細胞、(2)細胞が3次元的に効率よく増殖・分化するうえで必要な足場、(3)細胞が効率よく適切に目的とする組織に向かうための液性因子の3.点が重要と考えられている。また、幹細胞の再生医療応用においては、少量のドナー組織から分化能を有する幹細胞を大量調製することが求められる。関西医科大学形成外科では、倫理委員会の承認を得て、ヒト腹部脂肪組織から分離培養した脂肪組織由来幹細胞を用いて多系統への分化誘導実験を確認し、組織再生を行ってきた。その中でも、脂肪組織幹細胞に対する適切な足場の検討として、3次元培養担体を用いた複合組織の作成を行うとともに(Kakudo N, 2008.)、効率よく増殖・分化を行うための液性因子として、FGF-2やTGF-βをはじめとする種々の液性因子の検討を行った(Kakudo N, 2007.)。これにより増殖因子の添加培地を用いて少量のドナー(脂肪組織)から分化能を有する幹細胞を大量に調製することが可能であることが示唆されるようになった。脂肪組織由来幹細胞を用いた、脂肪組織の構築を目的とするため、我々はサイトカイン、特に血管新生因子に着目し、本年度は、脂肪組織由来幹細胞を無血清下にて経時的に培養、上清のサイトカインをELISA法にてTGF-βと、血管新生因子PDGF、VEGF、bFGF、HGF、IGFを測定し脂肪幹細胞自身も液性因子を産生するオートクリン能を持つことを明らかにした。また、PRPの脂肪組織由来幹細胞に対する効果-血管新生効果および増殖効果についても探索を行った。来年度はvivoでの脂肪組織再生、特にサイトカインを用いた組織再生について研究を進める予定である。再生医学を構成するコンポーネントとして、(1)細胞、(2)細胞が3次元的に効率よく増殖・分化するうえで必要な足場、(3)細胞が効率よく適切に目的とする組織に向かうための液性因子の3点が重要と考えられている。その中でも、脂肪組織幹細胞に対する適切な足場の検討として、3次元培養担体を用いた複合組織の作成を行うとともに、効率よく増殖・分化を行うための液性因子として、FGF-2やTGF-βをはじめとする種々の液性因子の検討を行った。本年度の研究結果として、1)分化誘導をおこなっていない脂肪由来幹細胞(C期)と、2)分化誘導初期の脂肪由来幹細胞(A1期)、3)分化誘導後期の脂肪由来幹細胞(A2)それぞれを同細胞数ヌードマウス皮下に移植し、4週間後に摘出し組織学的検索をおこなった。その結果、C期、A2期に比較しA1期の移植組織は脂肪滴を貯溜した脂肪組織および血管構造を示していることが明らかになった。また、脂肪幹細胞において脂肪分化に伴い、VEGF,FGF-2等の血管新生関連因子の発現が増加することが認められた。これらにより、脂肪由来幹細胞において、細胞の脂肪分化度が脂肪組織形成および血管新生に関連することが明らかになった。近年、脂肪組織の中に成体幹細胞が存在することが明らかになった。この脂肪幹細胞は、骨髄間葉系幹細胞と同等の性質・分化能を有し、腹部から切除脂肪・吸引脂肪より調製ができるため、簡便に侵襲少なく採取することができる。骨髄由来幹細胞に比べ採取に伴う侵襲や倫理的問題、培養時の増殖能、分化能などで優位性があるといわれており、脂肪組織由来幹細胞は骨髄由来幹細胞に代わる再生医療の細胞源としての関心を集めている。

再生医学を構成するコンポーネントとして、1細胞、2細胞が3次元的に効率よく増殖・分化するうえで必要な足場、3細胞が効率よく適切に目的とする組織に向かうための液性因子の3点が重要と考えられている。今回は1細胞と3細胞が効率よく適切に目的とする組織に向かうための液性因子(血管新生因子)に着目し、研究計画を立案した。関西医科大学形成外科では、倫理委員会の承認を得て、ヒト腹部脂肪組織から分離培養した脂肪組織由来幹細胞を用いて多系統への分化誘導実験を確認し、組織再生を行っている。今回の研究で、我々は、脂肪幹細胞を用いた組織再生と幹細胞生着においては血管新生能が重要な役割を果たすこと、とくに脂肪幹細胞が血管新生作用を有する増殖因子であるVEGF、FGF-2、HGFなどを多く産生すること、そして低酸素条件下においてHIF-1αの発現を介し、それらの産生が促進されることを明らかにした。組織生着や組織再建には局所の血流や血管新生が重要な役割を果たすため、脂肪幹細胞を用いた組織再生促進効果における幹細胞の担う重要な役割が明らかになった。今後は、血管新生因子の自己分泌・傍分泌作用により脂肪幹細胞自身の増殖と血管内皮細胞の増殖・遊走・管腔形成を誘導し、血管新生を促進するかどうかを明らかにしたいと考えている。当該研究目的に沿った研究が遂行され、学会発表をおこなうことができた。現在、論文投稿準備中である。25年度が最終年度であるため、記入しない。来年度は、通常酸素下および低酸素下における脂肪組織由来幹細胞のVEGF,FGF-2等の血管新生関連因子の発現および細胞外分泌、そのシグナル伝達経路につき探索をおこなう予定である。
新機能性RNA,7SL-RNAの神経細胞生存活性と作用機序の解明

私達は、ニワトリの自然細胞死が起こる胚期の運動ニューロンに対し生存活性を示す物質を骨格筋から分離精製したが、最終的に単離されたものはタンパクではなくRNAであると結論された。そこで、筋よりtotal RNAを抽出してDEAE sepharose fast flow columnにより分画し、活性画分よりcDNAライブラリーを作製した。各クローンの塩基配列を決定して、候補と考えられるcDNA断片を得た。その配列を元に全領域をクローニングした結果、得られた遺伝子は、7SL-RNAのニワトリ相同遺伝子であることがわかった。in situ hybridizationの結果、7SL-RNAはニワトリ胚発生期の神経筋接合形成直後の6日目胚腰部において、骨格筋、脊髄運動ニューロンさらに後根神経節で検出されたが、この時期以前においては、脊髄運動ニューロン・後根神経節でのシグナルは認められ素、骨格筋での特異的発現が認められた。このような局在の特異性は発生が進むに従って消失していった。さらに、ラットにおいても同様の発現パターンがみられた。このことは、運動ニューロン自然細胞死に関わる物質として、タンパクではなくRNAが関与している可能性を示唆するものであり、RNAの新しい機能を示すことになる。現在、7SL-RNAが骨格筋から運動ニューロンへ逆行性に運ばれる可能性、および7SL-RNAによる運動ニューロン生存活性の作用機序を解析している。