hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
細胞分離用酵素剤の最適化とイオンチャネル制御の膵島移植への応用

膵島移植において、高い細胞収量と分離過程の細胞障害回避の両立は重要な課題である。ClassI/II比を最適化したcollagenaseにneutral proteaseを併用すると、従来法であるThermolysinの併用より高い収量が得られることが明らかにされた。また、膵島分離過程にClイオン阻害剤の添加、Clイオンフリーとした細胞外溶液の使用を導入して、膵島分離収量やViabilityはClイオンの制御により改善されることが明らかとなった。さらに、本邦での臨床背景にそって、心停止ドナーモデルを構築し、心停止モデルでも同様の結果が得られることを明らかにした。細胞分離から構築された移植片を用いる細胞・組織移植において、高い細胞収量と分離過程の細胞障害回避の両立は重要な課題である。特に膵島移植の分野では、膵島分離過程の特殊性から、収量の不安定性と分離過程で被る顕著な細胞障害が、臨床展開において大きな障害となっている。臨床膵島移植分野で使われるcollagenaseを用い、最も有効な併用するproteaseの種類を明らかにすること、さらにClチャネル阻害による細胞防御原理を応用することにより膵島・外分泌細胞を細胞障害から予防し、機能の良好な膵島を高収率で確保できる分離法を確立することを目的とした。前年度までに、classI/II比を最適化した純度の高いcollagenaseにneutral proteaseを併用すると、従来法であるThermolysinの併用より高い収量が得られることが、ラットを用いた基礎実験で明らかにされた。今年度は共同研究関係にある米国ミネソタ大学において実施したヒト膵島分離にこの概念を導入して、この組み合わせがヒト臨床膵島分離においても極めて有効な結果をもたらすことが証明された。またClイオン制御による膵島分離成績への影響と細胞保護効果については、前年度および今年度の研究により、膵島分離過程にClイオン阻害剤(DIDS,NPPB)の添加、Clイオンフリーとした細胞外溶液の使用を導入して、分離成績や細胞のViabilityへの影響を調べ、膵島分離収量やViabilityはClイオンの制御により改善されることが明らかとなった。また、本邦での臨床背景にそって、ラット心停止ドナーモデルを構築し、心停止ドナーでも同様の結果が得られるかどうかの検証に取り組み、心停止モデルでも同様の結果が得られることが示唆された。今後、臨床膵島移植への導入が可能な、重要な結果であると考えられる。今後の臨床膵島移植分野で使われるcollagenaseを用い、最も有効なproteaseの種類を明らかにし、その使用すべき最適なcollagenase/neutral protease unitの比を明らかにする。さらにClチャネル阻害による細胞防御原理を応用することにより膵島・外分泌細胞を細胞障害から予防し、機能の良好な膵島を高収率で確保できる分離法を確立し、膵島移植の成績向上を図ることを目的とした。平成23年度はラットを用いた基礎実験を施行した。膵島分離用酵素の最適化については、collagenaseをLiberase MTF(MTF, Roche社)、neutral proteaseをThermolysin (TH, Roche社)もしくはNeutral protease NB(NB, SERVA社)を用いた。結果、通常の組み合わせであるMTF+THより、MTF+NBの組み合わせが良好な結果をもたらしうる可能性が示唆された。Clイオン制御による膵島分離成績への影響と細胞保護効果については、膵島分離過程にClイオン阻害剤(DIDS,NPPB)の添加、Clイオンフリーとした細胞外溶液の使用を導入して、分離成績や細胞のViabilityへの影響を調べ、膵島分離収量やViabilityはClイオンの制御により改善されることが明らかとなった。また、この実験過程で、膵島分離が極めて強い小胞体ストレスをもたらすことが明らかとなり、Clイオン制御が小胞体ストレスへも影響を及ぼしうるかどうかの検討が必要と考えられた。臨床膵島移植分野で使われるcollagenaseと、有効なproteaseの種類が明らかになりつつある。その使用すべき最適なcollagenase/neutral protease unitの比については、動物種によって異なると考えられるので、臨床へそのまま還元出来る結果であるかどうかは検討が必要と考えられる。Clチャネル阻害による細胞防御原理を応用することにより膵島・外分泌細胞を細胞障害から予防し、機能の良好な膵島を高収率で確保できる分離法は確立しつつある。またその検討過程で、膵島分離が強い小胞体ストレスを及ぼすことが明らかになり、この点については当初の計画以上の成果に繋がる可能性がある。

一方、膵島分離環境の違いにより細胞が受ける質的・形態的変化を蛍光色素を用いて連続的、経時的に共晶点レーザー顕微鏡下で観察し、細胞の形態変化に加え、細胞内Clイオン濃度の変化もとらえ、分離酵素の違いが及ぼす細胞内Clイオンへの影響と細胞の形態変化のデータを蓄積するという計画については、未だ質の高いデータを蓄積し得ていない。膵島分離が細胞・組織に及ぼす障害においての、小胞体ストレスの関与を追求する。さらにClイオンの制御が、小胞体ストレスの軽減に繋がるかどうかを検討する。その結果、膵島分離法の改善のみならず、Clイオンの細胞保護効果の機序も明らかにしうる可能性を求める。さらに、ラットの基礎実験から得られた知見をもとに、実験群を選択し、ブタを用いた大動物実験を行う。評価項目は平成23年度の結果を参考にし、小動物での知見が大動物へ応用可能かどうかについて検討する。ヒトへの臨床応用に際しては、ヒト膵を用いた有効性の確認が理想的である。最終的には、海外研究機関(共同研究経験のあるミネソタ大学、あるいは共同研究提携を結んでいるマイアミ大学)と共同で、本研究で得られた知見をヒト膵を用いた実験に導入する。平成23年度と同様、実験動物の購入、および膵島分離用酵素の購入など、実験に必要な物品費に使用する計画である。
重症身障害者施設入所者の乳酸菌による免疫賦活効果およびQOL向上に関する検討

昨年の我々の報告では、感染症等にかかり易い小児、特に重症心身障害者施設入所者ではカスピ海ヨーグルト(クレモリス乳酸球菌<LCFC>)の摂取により、栄養改善効果やインフルエンザワクチンの抗体価並びに免疫賦活効果を確認した。その他、元気に活躍しているお年よりの集団で同検討を行ったところ、免疫能と関係が深い好中球貪食能でカスピ海ヨーグルト群の有意の増加を認めるなど、ヨーグルト摂取と免疫能には関係があると考えられた。そこで食の乱れから慢性的な野菜不足や極端なダイエットなどで便秘気味な女性が増加傾向にあり、腸内環境が良好でないことが推測され、充分な栄養素を体に取り込みにくい状態が考えられる若い世代で検討を行った。充分な説明に対して同意の得られたS大学在学中の学生77名を対象にカスピ海ヨーグルト200gを毎日摂取してもらった。摂取前後には空腹時採血を含む健康診断、摂取中3回の採便回収と毎日、食事日誌と採便記録を付けてもらった。血液データの所見に特に問題はなく、8週間後の健診でも特に変化はなかった。免疫賦活効果に関わる貪食能もプラセボとの差はみられなかった。採便調査や日誌から「記入漏れ」や、「摂取率70%以下」の者を対象外とした30名(試験群15、プラセボ群15)の検討では、排便日数、排便回数では改善傾向がみられ、排便量で摂取前と比較し有意(p<0.01)な改善がみられた。さらに、便秘傾向者18名(試験群8名、プラセボ群10名)では、同じく排便日数、排便回数では改善傾向がみられ、排便量で摂取前と比較し有意な改善、プラセボ群と比較し3-4週目と7-8週目で有意(p<0.05)の群間差を認めた。回収した便の状態を示すPHではプラセボ群で有意(p<0.05)の悪化を確認し、アンモニア量では試験群の状態が良くプラセボ群と比較し有意なの群間差(p<0.05)を認めた。免疫力は食環境の改善によって高まる可能性が示唆されている。そこで、栄養成分の吸収能力低下など身体機能の衰えから、感染症等にかかり易いと言われている小児、特に重症心身障害者施設入所者を対象に、カスピ海ヨーグルト(クレモリス乳酸球菌<LCFC>)100gを毎日10週間摂取することで、栄養改善効果やインフルエンザワクチンの抗体価並びに免疫賦活効果の有無について検討した。有効対象者50名の検討で、インフルエンザA型(H1N1)抗原の抗体価が低値のグループではヨーグルト(Y)群で増加し、介入前後の変化率で群間に有意差(p<0.05)を認め、IgEでは対照(P)群において介入後で有意(p<0.05)の上昇を認めた。総蛋白、アルブミンにおいてP群が介入後に減少し、Y群と比べ群間で有意差(p<0.05)を認め、プレアルブミンではP群で介入後に有意(p<0.05)の低下を認めた。免疫能と関係するセレンではP群で介入後に有意(p<0.01)の低下を認めた。カスピ海ヨーグルトの摂取はインフルエンザ抗体価の低い重症心身障害者の抗体価を上昇させ、栄養価がほぼ等しいミルクの摂取と比較して、アルブミン、血清蛋白を有意に上昇させた。よって、同ヨーグルトは免疫の低下した障害者において蛋白質の吸収改善と免疫賦活効果があると結論できる。次に、若い世代の検討では、食の乱れから慢性的な野菜不足や極端なダイエットなどで便秘気味な女性が増加傾向にあり、腸内環境が良好でないことが推測され、充分な栄養素を体に取り込みにくい状態が考えられる。そこでS大学在学中の学生77名を対象にカスピ海ヨーグルト200gを毎日8週間摂取することで、血液検査や便通アンケート調査、24時間採尿や採便調査などにより、整腸作用や免疫賦活効果の有無の検討を行った。介入後健診を平成18年2月後半に行っており、現在結果データのまとめを行っている。

さらに、便秘傾向者18名(試験群8名、プラセボ群10名)では、同じく排便日数、排便回数では改善傾向がみられ、排便量で摂取前と比較し有意な改善、プラセボ群と比較し3-4週目と7-8週目で有意(p<0.05)の群間差を認めた。回収した便の状態を示すPHではプラセボ群で有意(p<0.05)の悪化を確認し、アンモニア量では試験群の状態が良くプラセボ群と比較し有意なの群間差(p<0.05)を認めた。
転写因子のタンパク質間相互作用ネットワークの解析

本研究では、新しいタンパク質間相互作用スクリーニング法を用いて、植物のタンパク質リン酸化経路における転写因子のタンパク質間相互作用ネットワークの解明を目的とする。本年度は、蛍光タンパク質の構造補完をベースにした二分子蛍光補完(BiFC)法を用いたタンパク質間相互作用のスクリーニング法を植物で開発するため、変異型緑色蛍光タンパク質GFP-S65Tの改良を行った。BiFC法とは、蛍光タンパク質を中央付近で切断した二つの断片を、結合を調べたい二つのタンパク質にそれぞれ融合し、細胞内で蛍光タンパク質の構造の再構築を蛍光で検出するin vivo解析法である。GFP-S65Tタンパク質は、現在、広く利用されている緑色蛍光タンパク質であり、多くの研究装置がGFP-S65Tタンパク質に最適化されている。実際、本研究で利用する殆どの装置がGFP-S65Tを検出するのに適していた。しかし、本研究で利用するタンパク質間相互作用スクリーニング法のベースとなるBiFC法にGFP-S65Tタンパク質を供した場合、構造の再構築後に検出される蛍光の輝度が非常に低い問題があった。そこで、高感度なスクリーニング法を構築するため、GFP-S65Tタンパク質を用いたBiFC法の蛍光輝度を上昇させる変異を探索した。その結果、GFP-S65Tタンパク質に点変異V163Aを導入することによって、蛍光輝度が従来の7倍ほど上昇することを発見した。また点変異V163Aの導入は、GFP-S65Tタンパク質の蛍光スペクトルに影響を与えないこともわかった。これらの結果は、GFP-S65T/V163Aタンパク質を用いた高輝度緑色BiFC法がGFP-S65Tタンパク質に最適化された解析装置によって利用できることを示している。今後、これを用いた新しいスクリーニング法を開発する予定である。
中国都市における地域社会再建の可能性に関する研究

本研究は3年間を通じて行う予定である。今年度は一年目で、関連文献、情報と資料の収集をするうえに、8月長春市で予備調査を行い、中国の都市における地域社会の把握と地域社会の類型化をした。1.地域社会を如何に把握するか。本研究は従来の街道委員会(1958年都市人民公社)の地理範囲を地域社会として把握しようと試みている。その理由と言えば、1.街道委員会は市の行政の末端機関として行政の機能が持っている。2、街道委員会では工場や商店など産業をもち、財政と雇用の面で自律性が生まれる可能性がある。3、街道委員会はもともと住民の居住地域によって区分されているから、それぞれの地域の独特な文化が堀り出せる可能性があるということである。2.地域社会の類型化。中国の都市の地域社会を考察する場合、その地域と職場集団との関わり方が重要な変数になっている。今年度は空間的には街道委員会と職場集団との関わりに基づいて三つの類型に分けられ、地域社会の財政と生活環境整備の状況を考察した。類型1、完全に重ねている地域。このような地域では現在生活環境整備がほとんど職場によって行われている。街道委員会の財政や行政サービスもその大企業のお陰で行うケースが多いである。類型2、部分的に重ねている地域。この地域ではいくつかの職場の宿舎とその間の零細住宅から構成されているため、地域の生活環境整備においては個々の職場宿舎の利益と地域全体の利益との調整が非常に重要な課題になっている。類型3、職場の宿舎と離れている地域。この地域では大きな企業に頼ることができないため、財政の源は非常に限られたため、地域の環境整備や行政サービスを行うことがなかなか無理である。
ヒト特異的な病原性連鎖球菌が分泌する新規グリコシダーゼの病原性に果たす役割の解析

Streptococcus intermediusは,口腔内に常在する日和見感染菌で,主要病原因子インターメディリシン(ILY)を分泌する。本菌は,β-ガラクトシダーゼ活性やN-アセチルグルコサミニダーゼ活性などを示す多基質酵素MsgAを保有する。また、MsgAはノイラミニダーゼ(NanA)と協力して糖鎖を分解する。本菌を牛胎児血清中で培養するとILYを高産生するのであるが、この原因がMsgAとNanAによる糖鎖分解産物“ガラクトース"によるものであることを明らかにした。また、FBSにヒト血漿を添加するとILY高産生が抑制され、これが血漿中の抗体によるものであることも明らかにした。インターメディリシン(ILY)は,Streptococcus intermedius (SI)の主要病原因子である。この毒素をコードするily遺伝子の発現は,カタボライト抑制因子CcpAやガラクトース代謝に関わる遺伝子群が存在するlacオペロンのリプレッサーであるLacRによって抑制される。よって,生育環境中にガラクトースが存在するとily発現抑制が解除される。また,lacオペロン中には,β-Galactosidaseやβ-N-Acetylhexosaminidase活性などを保有する分泌型の新規グリコシダーゼMsgAをコードする領域が存在する。我々は,ccpA破壊株を用いることによりMsgAの産生もCcpAによるカタボライト抑制されることを確認した。また,この菌はAGSの中で唯一シアリダーゼ(NanA)を保有していることが報告されている。興味深いことに,SIをウシ胎児血清中(FBS)で培養するとILY産生量が飛躍的に増加する。そこで,この増加にMsgAやNanAによる糖鎖分解産物に含まれるガラクトースが関わっているのでは無いかと考え解析を行った。まず,SIから分泌されたMsgAの精製を行った。また,MsgAに2箇所存在するグリコシダーゼ活性に関わるドメインを分割した断片やNanAにHis-tagを付加し大腸菌内で過剰産生させることで大量精製に成功した。これら精製タンパク質を用いて,Km値などの種々の酵素反応パラメーターの決定や抗体の作製を行った。さらに,msgA破壊株だけではなくnanA破壊株を,FBS中で培養してもILY高産生は起こらないこと,精製MsgAとNanA両方をFBSに添加した場合のみILY発現に充分なガラクトースが生成することを明らかにした。これら結果から,MsgAとNanAがILY産生量を調節することでSIの病原性を制御している可能性が高いことを発見した。Streptococcus intermedius(SI)は,主要病原因子としてインターメディリシン(ILY)を分泌する。我々は,この毒素をコードするily遺伝子の発現が,カタボライト抑制因子CcpAやlacオペロンのリプレッサーであるLacRによって抑制されることを報告している。そこで,この増加にSIが分泌するグリコシダーゼMsgAとNanAによる糖鎖分解産物“ガラクトース"が関与しているのではないかと考え,精製MsgAとNanAをFBSに添加し遊離してくる糖の量を検討した。その結果,この条件下でILY発現亢進に充分なガラクトースが遊離することを確認した。しかしながら,ヒト血漿中でSIを培養しても溶血活性の増加は確認されなかった。そこで,ヒト血漿には,SIのily発現やILY活性を抑制する因子が存在する可能性を考え,ヒト血漿のily発現やILY溶血活性抑制効果の有無を検討した。実験は,複数のボランティアから得た血漿を2%添加したFBSでSIを培養し,培養上清の溶血活性を測定することで行った。その結果,約半数のヒト血漿は培養上清中の溶血活性を著しく低下させることがわかった。しかしながら,溶血活性の低下しない血漿もあり,個人差が存在することを発見した。そこで,その理由を調べる目的で,ILY,MsgA, NanAに対する抗体価や中和活性を検討した。その結果,溶血活性の抑制効果が強いヒト血漿は,ILYとMsgA, NanAに対して高い抗体価や中和活性を持つ傾向があることがわかった。これらの結果からSIは,血漿中に含まれる糖鎖を分解して炭素源にするだけではなくILY発現量を増加させることにより,その病原性を増加させる機構を保有していることが明らかになった。またヒト血漿は,それに対する防御機構を保持している可能性が高いこともわかった。本年度は交付申請書に記載した,ヒトの血漿に含まれる成分がFBSによるily発現上昇やそれによる溶血活性の亢進を阻害する理由が,血漿中のイムノグロブリンがILY,MsgA,NanAの活性を阻害する為であることを明らかにすることに成功した。さらに臨床分離株のMsgA活性とILY産生量に相関を見いだすことにも成功した。そこで,現在MsgAの酵素活性を指標にLacRなどの突然変異により病原性が増加したSI株を迅速に同定できるシステムの開発を進めている。このように,平成27年度に予定した実験の多くを行うことが出来た。このことから,我々の研究は順調に進展していると考えられる。しかしながら,まだデータとして不十分な部分があり,より詳細な解析を行う予定である。

Streptococcus intermedius(SI)は,日和見的に深部臓器に重篤な膿瘍感染症を引き起こすだけではなく,反復性咽頭炎や肺炎などの呼吸器感染症などの原因菌である可能性も報告されており,その臨床的重要性が増加している。SIの主要病原因子であるインターメディリシン(ILY)の発現は,LacRなどの制御を受けており,環境中にガラクトースが存在するとその発現量が増加する。我々は,SIがMsgA(β-ガラクトシダーゼ活性やN-アセチルグルコサミニダーゼ活性などを示す多基質酵素)を保有することを報告した。また,この菌はNanA(シアリダーゼ)も保有している。本研究から,SIをウシ胎児血清中(FBS)で培養すると,MsgAやNanAにより血清中に含まれる糖タンパク質などに由来する糖鎖が分解され,遊離したガラクトースやシアル酸によってILYだけではなくMsgAやNanAの発現も促進されることを発見した。そして,これらグリコシダーゼの発現量が増加すると,さらに糖鎖の分解が促進され,その結果ILY発現が強く促進されることもわかった。しかしながら,FBSにヒト血漿を添加してSIを培養すると,ILYによる溶血活性,MsgA活性,NanA活性が抑制された。そこで,この原因について解析した結果,ヒト血漿中の抗ILY,MsgA,NanA抗体がこれらタンパク質の活性を中和するためであることがわかった。また,10名の血漿のILY,MsgA,NanAの中和活性を比較した結果,この活性には個人差があることも明らかにした。以上の結果から,SIは糖鎖を分解することでグリコシダーゼやILYの発現を促進し,その病原性を増加させる可能性が高いと考えられる。しかしながら,ヒト抗体はILY,MsgA,NanAの活性を中和することで,SIの病原性を抑制している可能性があることもわかった。Streptococcus intermediusは,口腔内に常在する日和見感染菌で,主要病原因子インターメディリシン(ILY)を分泌する。本菌は,β-ガラクトシダーゼ活性やN-アセチルグルコサミニダーゼ活性などを示す多基質酵素MsgAを保有する。また、MsgAはノイラミニダーゼ(NanA)と協力して糖鎖を分解する。本菌を牛胎児血清中で培養するとILYを高産生するのであるが、この原因がMsgAとNanAによる糖鎖分解産物“ガラクトース"によるものであることを明らかにした。また、FBSにヒト血漿を添加するとILY高産生が抑制され、これが血漿中の抗体によるものであることも明らかにした。SIのMsgAやNanAの精製,酵素反応パラメーターを決定,抗MsgA抗体や抗NanA抗体の作製に成功した。また,MsgAの発現がCcpAによって制御されている可能性が高いことも明らかにすることが出来た。さらに,グリコシダーゼ遺伝子破壊株や精製タンパク質を用いた解析から,FBSでSIを培養した際に認められるILY産生量の増加がNanAとMsgAによる糖鎖分解産物であるガラクトースの可能性が高いことが分かった。このように,平成26年度に予定した実験の殆どを行うことが出来た。上記の結果から,MsgAやNanAなどのグリコシダーゼがSIの病原性発現に関与している可能性が高くなり,順調に研究が進展していると考えられる。
スピン偏極STM探針接触法による単一フタロシアニン分子を介するスピン伝導測定

今日の情報社会を支えているのは、ナノスケールの微小な磁石である。我々の身の回りのパソコンをはじめ、情報の記憶・書き込み・読み込みは、磁石のN極S極の向きを利用している。磁石の向きを読み取るために、磁気ヘッドを使う。磁気ヘッドは、2つの小さな磁石の間に金属などの無機物は挟んだものである。ひとつの磁石の向きは常に固定であり、他方は検出する磁石の向きにより、その方向を変える。この2つの磁石の間に電流を流しておくと、2つの磁石の向きが平行な場合電流は多く流れ、反平行では減少する。この効果は巨大磁気抵抗(GMR)効果と呼ばれる。これまで、磁気ヘッドは無機物で作られてきた。これに代わる新たな物質として有機物がある。我々は、インクなどの色素分子として広く普及・使用されてきているフタロシアニン分子を2つの小さな磁石の間にいれ、さらに単一分子を使用することで1ナノメートル(十億分の1メートル)の大きさのGMRヘッドを作成した。有機分子と磁石との電子スピン相関の解明を、スピン偏極走査トンネル顕微鏡(STM)を用いて行った。平成22年度は、コバルトナノ磁石の上につけた単一フタロシアニン分子(H2Pc)に、STM磁性探針(Co薄膜をコートしたW探針)を接触させ、この2つのコバルト磁石の向きが平行な場合と、反平行な場合の電子伝導測定を行ったところ、60%のGMR比を得た。有機分子の無い場合に比べて、1ケタ大きい値であった。有機分子を利用することで、無機物には無い新たな特性の発現を確認した。研究と並行して、ドイツ・カールスルー工大学から千葉大学へのSTM装置の移動を完了した。鉄ウィスカ単結晶上のマンガン膜を新たな基板として使用する。これを用いることで、弱い外磁場で容易に磁化方向を反転できる。外磁場印加のためのコイル系の設置、また磁性探針の向きを制御するための回転機構の取り付け・改造を行った。
在宅障害高齢者の食行動上の問題と介入効果についての質的研究

本研究は、食行動上のプロセスに障害がある在宅独居高齢者の食行動と食満足との関連性を明らかにし、さらに集団的介入を試み、その効果を質的に分析した。その結果、以下の事項が明らかになった。1.在宅障害高齢者の食行動は、入手行動では「自分で買い物をする」「買ってきてもらう」「野菜づくり」「買い物に行けない理由」「食材入手の要因」、調理行動では「自分でつくる」「つくってもらう」「自分でつくる意欲」「調理できない理由」「調理サポートの受けとめ」、摂食行動では、「自分の手で食べたい」「食事環境」「食べる理由」から構成されていた。2.食満足は「おいしい」「食べたい」「食の伝承」から構成され、食満足に影響する食行動の要素は、「自分の手で」「好きなもの」「食の情報」「味へのこだわり(自分の味・昔の味)」であった。3.食満足に影響する調理・摂食行動の要素は、「温かいもの」「食べたいとき」「誰かと食べたい」「外で食べたい」であった。これらの要素を充足する方法としてグループで調理をして一緒に食べる集団的介入(食事会)を実施した。その結果、食事会では、「みんなでつくる」「みんなで食べる」という共同作業と場の共有から「楽しい」「おいしい」体験が得られ、それらが「つくる意欲」に関連しており有効であった。さらに、定期的な開催の要望があり、生活の意欲にも影響を及ぼしていることが明らかになった。4.本研究の対象は、都市環境で生活している独居高齢者で厚生労働省生活自立度(寝たきり度)判定のJとAランクにある比較的障害が軽度である者であった。今後、障害の程度が重度である高齢者に対する食満足を高めるための介入方法の検討、在宅障害高齢者を取り巻く地域環境の差を考慮した高齢者の食生活の質を高める援助策を検討する必要がある。今年度は研究の第一段階として、障害をもち在宅で生活する高齢者の食行動を把握し、一連の食行動のどのような要因が生活の質と関連するのかを明らかにする目的で、調査を行った。調査対象は、65歳以上の男女で重度の痴呆がなく、上肢の運動が可能で、食事を自分で摂取できる状態にある在宅高齢者である。訪問看護ステーション及びディサービス施設より紹介を受け、研究の趣旨を説明し、了承の得られた6名を対象に調査を行った。調査は、食行動((1)食材入手行動(2)調理行動(3)摂食行動(4)消化と吸収)、日常生活の状況、家族や近隣との関係、食に関する自己決定、食の満足感、生活に対する満足感について、半構成的面接法を用いて実施した。インタビューは自宅に訪問し、会話をテープレコーダーに録音し、内容を逐語録にして分析している。質的分析を行っているプロセスにおいて、心疾患やリウマチなどの疾病の進行による日常生活動作の機能低下は、調理行動を制限し、食事内容(献立、摂取量、栄養バランス)、食欲や食に対する関心、食の満足感に影響を及ぼしていた。さらに、食生活以外にも、趣味や近隣・知人との交流などの生活に対する意欲や行動にも影響していた。調理行動の制限は、台所の配置や調理器具の種類(形態、重量など)、自助具の活用状況などが関連していた。平成14年度の食行動プロセスへの個別の介入に向けて、調理器具や自助具、調理方法の検討、ビデオによるデーター収集の内容(行動、表情、発語及び発語内容の変化)、分析方法の検討を行っている。

今年度は昨年に引き続き、在宅障害高齢者の食行動と生活の質の関連を明らかにする目的で、インタビューによる調査の対象数を追加して、分析を行い、要素を構造化した。調査対象は、65歳以上の男女で、重度の痴呆がなく、上肢の運動が可能で、食事を自力で摂取できる状態にある在宅高齢者で、研究承諾の得られた10名である。調査は、食行動、日常生活状況、サポートの状況、食に対する満足感などについて半構成的面接を行い、逐語録を作成し、要素を抽出してデータ分析を行った。食の満足感に関連する基本軸として「食への関心」と「調理の対処行動」が見いだされ、以下の4つのタイプに分類された。1つは、食への関心が高く調理の対処行動が出来ているタイプ、2つ目は、食に対する関心が高いが調理の対処行動が出来ていないタイプ、3つ目は、食に対する関心が低いが調理の対処行動が出来ているタイプ、4つ目は、食の関心が低く調理の対処行動が出来ていないタイプである。「食への関心」の要素としては、"食べたい献立""食べる理由""誰かと食べたい"が抽出された。「調理の対処行動」には、身体要因、サポート、過去の調理行動が関連し、要素としては、"食べたいものが手に入る""自分でつくる・つくってもらう""自分でつくる意欲""自分の手で食べる"が抽出された。生活意欲や生活の刺激、個々人の信念や考え方などの変数は、「食への関心」と「調理の対処行動」の2つの基本軸と相互に関連しあっていることが示唆された。平成15年度には、食行動のプロセスへの介入を実施する予定である。データ分析により、明らかになった「食への関心」と「調理の対処行動」に関連する要素から食行動への介入方法を検討して、グループアプローチを行い、分析・評価する方向で検討して準備している。今年度は、昨年までの研究結果をもとに、在宅障害高齢者の食行動と食満足の関連を明らかにするためにグループによる介入を実施した。昨年までの研究から、在宅障害高齢者の食満足には、食行動のすべてのプロセスで、「自分の手で」「好きなもの」「味へのこだわり(自分の味、昔の味)」「食の情報」が関連していた。入手行動では、「新鮮なもの」「安くておいしい」、調理行動では、「温かいもの」「食べたいとき」、摂食行動では、「誰かと食べたい」「外で食べたい」が食満足と関連していた。そこで今回は、抽出された調理行動と摂食行動の要素を充たすために集団支援として食事会を開催し、食満足への効果を分析、評価した。今年度の研究対象は、昨年度の対象10名(65歳以上で、重度の痴呆がなく、上肢の運動が可能で食事を自力で摂取することが可能な在宅者)から、健康状態の悪化により参加が困難であったものを除外し、承諾の得られた4名とした。介入方法は、グループで調理をして、一緒に食べる支援を2回にわたり実施した。データは、調理や摂食場面をビデオ撮影し、また、グループインタビューにより収集し、分析した。その結果、集団で調理を行うことにより「一緒につくる」という食満足に関わる要素が新たに抽出され、「つくったものを一緒に食べる」という要素も食満足に影響していることが確認できた。食事会では、簡単に調理ができて、栄養バランスが良く、季節感のあるメニューを提供し、食材の選択や調理方法を自宅で取り入れるという効果も見られた。2回目の食事会では、食事に関する満足に加えて、再会を通して自分や仲間が健康で過ごせてきたことに喜びを見出していた。
頭頸部癌における新規メチル化遺伝子の同定のその臨床応用

癌の発生においてgeneticな変異が重要な役割を果たしていることはいうまでもないが、最近ではepigeneticな変異もまた注目されている。特にプロモーター領域の異常DNAメチル化は多くの癌において認められている。我々は頭頸部癌を対象に、マイクロアレイを用いることによりGenome-wideにメチル化遺伝子を探索、同定することを試みた。頭頸部癌細胞株を5Aza-dCにて処理したのち、マイクロアレイ解析を行い網羅的に遺伝子の発現の変化を検討した。メチル化により発現が抑制されている遺伝子は5Aza-dC処理により再び発現が認められるようになると考えられる。我々は頭頸部癌細胞で発現が抑制されおり、かつ5Aza-dC処理により再発現した遺伝子群を同定した。これらの遺伝子群には癌抑制遺伝子が含まれている可能性があると考えられる。さらに複数の細胞株や臨床サンプルを用いて、遺伝子群についてより詳細な検討を行った。PGP(Protein Gene Product)9.5は、ヒトの神経細胞由来のユビキチンC末端加水分解酵素であるが、細胞内物質の分解・調節を行うシグナルタンパクと考えられている。我々は遺伝子の網羅的な検討から、このPGP9.5が頭頸部癌において異常DNAメチル化されていることを発見した。頭頸部癌の手術サンプルでは72例中46例(64%)にメチル化を認め、正常コントロール群は非メチル化であった。Stable cloneを用いたコロニーフォーメーションアッセイではコロニーの形成に有意差を認め、またUV照射後のアポトーシス誘導にも差が認められた。以上の点から頭頸部癌において高頻度にメチル化されているPGP9.5はtumor suppressiveな機能を持つ遺伝子と考えられた。このような背景、目的に基づき本研究を開始したが、研究助手の雇用の困難や細胞培養の不具合など予想し得なかった理由により、実験計画の遅れが生じた。これらの対処に追われたため、実験開始およびサンプル調製が結果的に約半年間の遅れが生じ、平成18年度科学研究費補助金の一部を平成19年度に繰越した。その後、実験計画は順調に進行した。さらに複数の細胞株や臨床サンプルを用いて、これらの遺伝子群についてより詳細な検討を行い、腫瘍抑制作用をもつ遺伝子を同定する予定である。

これらの遺伝子群には癌抑制遺伝子が含まれている可能性があると考えられる。さらに複数の細胞株や臨床サンプルを用いて、これらの遺伝子群についてより詳細な検討を行った。PGP(Protein Gene Product)9.5は、ヒトの神経細胞由来のユビキチンC末端加水分解酵素であるが、細胞内物質の分解・調節を行うシグナルタンパクと考えられている。我々は遺伝子の網羅的な検討から、このPGP9.5が頭頸部癌において異常DNAメチル化されていることを発見した。頭頸部癌の手術サンプルでは72例中46例(64%)にメチル化を認め、正常コントロール群は非メチル化であった。Stable cloneを用いたコロニーフォーメーションアッセイではコロニーの形成に有意差を認め、またUV照射後のアポトーシス誘導にも差が認められた。以上の点から頭頸部癌において高頻度にメチル化されているPGP9.5はtumor suppressiveな機能を持つ遺伝子と考えられた。
海洋微生物群集の解析と利用

海洋は、地球表層の約2/3を占め、陸上とは異なるさまざまな特徴を有している。中でも、海底熱水活動域やガスハイドレード海域、油田採掘・石油汚染海域などには様々な未知微生物の存在が期待されるが、分離培養困難なものが多いためその機能の多様性や有用性についてはほとんど不明なままである。そこで本研究では、従来の標的遺伝子特異的プライマー検出法に加え転移制御遺伝子領域を標的とした未知遺伝子探索手法の導入、改良を図り、上述した海洋の極限・汚染環境微生物試料を対象に効率的なメタゲノム解析手法として確立するとともに、環境指標性の高い機能遺伝子情報の収集や解析、利用を図ることを主な目的とした。今年度は、前年度までに開発した新しいプライマーセットを用い、海底熱水活動域試料よりさらに多くの機能遺伝子情報を取得した。その中には、Transporter, Transferase, Oxidoreductase, Aminopeptidase, Glutamate synthetase等に近縁な機能性タンパク質が含まれ、その計40個余りのほとんどが新規性の高いものであることを明確にした。また、この系を制御している酵素(Integrase)遺伝子についても、見出した11個の内のほとんどが新タイプのものと推定された。前者の一部遺伝子については、大腸菌での発現も可能であった。これらの結果は、これまで人間活動周辺環境試料で蓄積されてきた知見を大きく塗り替えるものであることから、その信頼性や特殊性等について検討を、さらに海外の専門家と共同で実施した。国際誌に論文投稿を行なうとともに、知財の確保を図った。海洋は、地球表層の約2/3を占め、陸上とは異なる様々な特徴を有している。中でも、海底熱水活動域やガスハイドレート海域、油田採掘・石油汚染海域などには様々な未知微生物の存在が期待されるが、分離培養困難なものが多いためその機能の多様性や有用性についてはほとんど不明なままである。そこで本研究では、従来の標的遺伝子特異的プライマー検出法に加え転移制御遺伝子領域を標的とした未知遺伝子探索手法の導入、改良を図り、上述した海洋の極限・汚染環境微生物試料を対象に効率的なメタゲノム解析手法として確立するとともに、環境指標性の高い機能遺伝子情報の収集や解析、利用を図ることを主な目的としている。今年度は、微生物間で広く外来遺伝子の獲得・発現系を制御している遺伝子領域を対象に、その検出・解析系の導入や改良を図った。その結果、海底熱水活動域試料等を対象に効率的な遺伝情報収集を可能とする新しいプライマーセットをデザインするとともに、高温熱水噴出孔周辺試料より数十個の新規性の高い遺伝子を取得することに成功した。具体的には、プロテアーゼやアミノペプチダーゼ、シャペロン等に関連する遺伝子を見出した。また、この系の発現に重要な役割を果たしている遺伝子領域においても、新規な配列情報を見出した。さらに、今後の比較研究ため、冷湧水・ガスハイドレート海域や石油や重金属汚染海域等により、多数の貴重な環境微生物DNA試料を採取した。(604字)海洋は、地球表層の約2/3を占め、陸上とは異なるさまざまな特徴を有している。
機能型T細胞の分化決定におけるSOCSファミリー分子の役割

胸腺において成熟・分化したT細胞は、抹消の免疫器官において特定のサイトカイン環境下で刺激を受け、それぞれ異なる特異的なサイトカインを産生するTh1・Th2と呼ばれる機能型T細胞へとさらに分化する。この分化過程においてサイトカインシグナルは重要な働きを担っている事から、ヘルパーT細胞の分化誘導過程がサイトカインシグナル伝達を抑制的に調節する機構を誘導し、これがサイトカインシグナルを修飾することにより分化の方向性に影響を与えている可能性が考えられる。SOCSファミリー分子はサイトカインシグナルを抑制的に制御する分子である。T細胞機能分化過程におけるSOCSファミリー分子の関与を検討するためクローン化Th1、Th2細胞株のパネルを用いてSOCSファミリー分子のmRNAの発現を解析した結果、SOCS3はTh2においてのみ発現していた。SOCS3の発現がTh2細胞で高いことから、SOCS3の発現がTh2型免疫反応を原因とするアレルギー性疾患でも高いことが予想された。そこで、アトピー性皮膚炎をもつ小児患者および成人アトピー性喘息患者の末梢血より回収したCD3T細胞におけるSOCS3の発現を解析した。通常、SOCSファミリー分子は炎症時に発現が誘導されてくるので、われわれは複数のSOCS分子がアレルギー炎症時にも発現が上昇していることを予想していたが、CIS-1、SOCS1、SOCS5に関しては健常人群と患者群では発現に差は認められなかった。これに対し、SOCS3の発現はアトピー性皮膚炎患者および喘息患者いずれにおいても健常人に比べ有意に高い値を示し、症状が重篤になるにしたがい、その傾向はさらに顕著に認められた。I型アレルギー患者では血中のIgE値がその病態と相関性が高いことがわかっており、SOCS-3の発現が高い患者は血中IgEも高い傾向にあった。このように、アレルギー患者にみられるSOCS-3の発現亢進は、単なる炎症反応の結果ではなく、SOCS3の発現がTh2反応亢進によって引き起こされるアレルギーの発症に深く関与していた。機能型T細胞の機能分化誘導には、抗原刺激時に存在するサイトカインが大きな決定要因となる。我々はIL-4Rシグナル伝達系がTh1細胞において機能障害を起こしている事、この機能障害にはTh1分化誘導時に発現してくるJak1とIL-4Rα鎖の会合を阻害する未知の分子が関与している事を明らかにした。本研究では、この分子を同定することを目的とし解析を行った。我々は、Th1ではα鎖に会合してJak1の会合を障害している分子の存在を想定し、この分子の同定を試みる目的でα鎖上においてJak1と会合するbox1領域のGST融合タンパクを作製し、これに会合するTh1特異的に発現している分子を解析した。その結果、Th1細胞ではJak1以外に70kDaの分子SOCS5がα鎖のbox1領域に会合している事が明らかとなった。Th1およびTh2細胞におけるSOCS5の発現パターンを解析した結果、SOCS5の発現はTh1特異的に認められ、ナイーブT細胞やTh2細胞では認められなかった。SOCS5の発現は分化初期過程に存在するサイトカインIL-12によって制御されており、その結果としてTh1細胞で有意に発現の上昇していた。次に、SOCS-5のIL-4シグナル伝達系における機能を、STAT6の活性化をモニターしうるレポーター遺伝子を用い解析したところ、T細胞におけるIL-4依存的に起こるSTAT6の活性化は、SOCS5分子によりほぼ完全に抑制された。以上の結果より、Th1細胞特異的に見られたIL-4シグナル伝達系の機能障害はTh1分化初期過程においてSOCS5分子が特異的に発現し、α鎖のbox1領域に会合することにより、Jak1のα鎖への会合を阻害するために起こると考えられた。

I型アレルギー患者では血中のIgE値がその病態と相関性が高いことがわかっており、SOCS-3の発現が高い患者は血中IgEも高い傾向にあった。このように、アレルギー患者にみられるSOCS-3の発現亢進は、単なる炎症反応の結果ではなく、SOCS3の発現がTh2反応亢進によって引き起こされるアレルギーの発症に深く関与していた。
穀物サイロの水分むら発生機構の解明と水分分布のモニタリングに関する研究

本研究は、大型サイロ内での穀物水分むらによるカビや品質劣化の発生原因を追究して、これに関与する水分移動機構を実験的かつ理論的に解明するとともに、サイロ内の穀物水分分布の異常がモニタリングできる計測システムを開発することを目的としている。本年までのサイロ内の水分移動に関する研究から、サイロ内の水分むら発生の主な原因がサイロ上部空間の温度差による壁面結露であることが明らかになるとともに、マイクロ波反射式のTDR、および透過式のTDT法による水分分布計測のから、籾層水分分布の異常を検知しうることが分かった。本年度は、最終年度にあたり、これまでのサイロ内水分移動に関する研究と、マイクロ波反射式のTDRおよび透過式TDT法による水分分布計測の研究成果をふまえ、厚い籾層内部の水分のモニタリング方法をさらに追求・確認するとともに、新たに、籾層表面の水分分布について、近赤外分光法による可視化計測実験を試みた。まず、厚い層として、1mの穀物層にマイクロ波を投射し、反射波を受信して波形や反射時間などを解析した結果、平均水分の計測や、水分分布状態や異常を検知することができた。次に、小規模の籾層表面に対し、近赤外域の水分吸収波長である970nm付近の複数の波長を用いて、分光画像を得た。各種の画像処理を行って、水分分布の可視化を試みた結果、籾層表面の水分分布画像を得ることができた。本研究は、大型サイロ内での穀物水分むらの発生原因を追求して、これに関与する水分移動機構を実験的かつ理論的に解明するとともに、サイロ内の穀物水分分布の異常がモニタリングできる計測システムを開発することを目的としている。穀物貯蔵サイロでは、本来均一的な水分の穀粒を投入しておいても、穀物層内に新たに水分むらが発生する。その原因は、夜間の冷却などによってサイロ内壁面に結露が発生したり、サイロ内部の穀物の発熱や外壁からの日射加熱などによって温度差が生じ、この穀物温度差に伴う水分移動によるものと考えられる。そこで先ず、均一な水分の穀物層に温度差を与え、この温度差に伴う水分移動を定量的に把握するための基礎実験を行った。その結果、穀物温度差によって新たな水分むらが発生することが明かとなった。次に、穀物水分分布のモニタリングが自動的に行えるような、サイロ内の水分分布の計測システムを構築するため、厚い穀物層に対して電磁波TDR計測を行った。このTDR計測では、購入設備備品の(TDR機能付き)ディジタイジングオシロス-コープを用いて、電磁波パルスを発生させ厚い穀物層中に投射して、その反射波形を受信・解析して穀物層の水分分布の異常を発見するための実験を行った。厚い穀物層中に投射するには、長い平行線センサを穀物層に埋没させる法と、1つのホーンアンテナを発信および受信用に用いて非接触測定する方法を試みた。その結果、高水分穀物層では電磁波パルスは低速度で伝わり、低水分穀物層では高速度で伝搬し、また、穀物水分の異なる境界面では反射が生じることが明かとなり、パルスの反射波形から水分むらなどに伴う異常を検知し水分むらの位置を特定できることが明かとなった。本研究は、大型サイロ内での穀物水分むらの発生原因を追究して、これに関与する水分移動機構を実験的かつ理論的に解明するとともに、サイロ内の穀物水分分布の異常がモニタリングできる計測システムを開発することを目的としている。穀物貯蔵サイロでは、均一な水分の穀粒を投入しておいても、数カ月で穀物層内に水分むらが発生することがある。そこで先ず、均一な水分の穀物層に温度差を与え、この温度差に伴う水分移動を定量的に把握するための基礎実験とコンピュータシミュレーションを行った。その結果、サイロ内の穀物温度差による穀物層内での直接的水分移動は意外に少なく、サイロ内壁面に一度結露してから滴下する水分移動量が大きいことが明かとなった。

次に、穀物水分分布のモニタリングが自動的に行えるような、サイロ内の水分分布の計測システムを構築するため、厚い穀物層に対してマイクロ波TDT計測を行った。このTDT計測では、購入設備備品のディジタイジングオシロスーコープ等を用いて、電磁波パルスを発生させ厚い穀物層中に投射して、その透過波形を受信・解析して穀物層の水分分布の異常を発見するための実験を行った。今年度は1m程度の厚い穀物層を挟んで、発信および受信用ホーンアンテナを設置し非接触測定する方法を試みた。その結果、高水分穀物層では電磁波パルスは低速度で伝わり、低水分穀物層では高速度で伝搬することが非接触測定においても計測可能なことが明かとなった。また、穀物水分の異なる境界面では反射が生じるが、パルスの反射波形から水分むらなどに伴う異常を検知し水分むらの位置を特定する方法を検討中である。本研究は、大型サイロ内での穀物水分むらの発生原因を追究して、これに関与する水分移動機構を実験的かつ理論的に解明するとともに、サイロ内の穀物水分分布の異常がモニタリングできる計測システムを開発することを目的としている。穀物貯蔵サイロでは、均一な水分の穀粒を投入しておいても、数カ月で穀物層内に水分むらが発生することがある。その原因は、夜間の冷却などによってサイロ内壁面に結露が発生したり、外壁からの日射加熱などによって温度差が生じ、この穀物温度差に伴う水分移動によるものと考えられる、そこで先ず現地において、巨大籾サイロ内と周辺の温度・湿度分布を計測した。次に、水分移動を定量的に把握するための基礎実験とコンピュータシミュレーションを行った結果、サイロ内の穀物温度差による穀物層内での直接的水分移動は意外に少なく、サイロ内壁面に一度結露してから滴下する水分移動量が大きいことが明かとなった。さらに、穀物水分分布のモニタリングが自動的に行えるような、サイロ内の水分分布の計測システムを構築するため、厚い穀物層に対してマイクロ波TDT計測を行った。今年度は、送受信用ホーンアンテナを用い、非接触表面反射を測定する方法を試みた結果、穀物層表面の水分の異なる境界では反射の状態が変化し、パルスの反射波形から水分むらなどに伴う異常を検知しうることができた。本研究は、大型サイロ内での穀物水分むらによるカビや品質劣化の発生原因を追究して、これに関与する水分移動機構を実験的かつ理論的に解明するとともに、サイロ内の穀物水分分布の異常がモニタリングできる計測システムを開発することを目的としている。本年までのサイロ内の水分移動に関する研究から、サイロ内の水分むら発生の主な原因がサイロ上部空間の温度差による壁面結露であることが明らかになるとともに、マイクロ波反射式のTDR、および透過式のTDT法による水分分布計測のから、籾層水分分布の異常を検知しうることが分かった。本年度は、最終年度にあたり、これまでのサイロ内水分移動に関する研究と、マイクロ波反射式のTDRおよび透過式TDT法による水分分布計測の研究成果をふまえ、厚い籾層内部の水分のモニタリング方法をさらに追求・確認するとともに、新たに、籾層表面の水分分布について、近赤外分光法による可視化計測実験を試みた。
母子健康手帳交付における保健師の特徴の明確化

本研究の目的は、母子健康手帳交付(妊娠の届出)の実態を明らかにすること、および子育て支援の観点から保健師による母子健康手帳交付の特徴を明確にすることである。本年は母子健康手帳交付に関する情報収集と整理、アンケート調査を行った。情報収集は、文献やWEB等により、交付時の妊婦への調査、周産期からの虐待予防に関することや、住民への母子健康手帳交付の周知方法・内容等を把握した。アンケート調査は、51市町村を対象に自記式郵送法にて配布し、33市町村(64.7%)より回答を得た。交付体制について、交付場所が1箇所のみの市町村は17(51.5%)で、他市町村は複数箇所であった。また電子申請を併用している市町村もみられた。交付担当者が必ず常勤保健師である市町村は8(24.2%)、主に常勤保健師である市町村は、10(30.3%)であった。通常のおおよその交付時間は、全市町村の平均が12分で、最多回答は10分、9市町村であった。交付時にはほとんどの市町村において、何らかの指導や情報提供を行っていた。交付をきっかけとした要支援者の把握は、実際に交付した担当者の判断による市町村が27、指標による把握が8市町村(重複回答有)であった。要支援者に対する妊娠期の支援担当者は、母子保健担当保健師が最も多く、次いで地区担当保健師であり、その支援方法は担当者が個別に必要に応じて支援するという回答が約半数を占めた。また、現行の交付体制で十分であると回答した市町村は17(51.5%)、十分でないと回答したのは10(30.3%)であった。今後はアンケート調査の分析をさらにすすめることと、保健師による交付の特徴の明確化に取り組む予定である。
ゼブラフィッシュ卵成熟過程におけるサイクリンＢ１　ｍＲＮＡ翻訳制御機構の解析

本年度は,1)IMP3の機能に関する解析,2)サイクリンB1 mRNAのORF中のシス配列による翻訳制御機構の解析,3)サイクリンB1 mRNAの輸送に関する解析を実施した。1)については,IMP3のコンディショナルノックアウトゼブラフィッシュの作出を試みたが,変異体を得ることはできなかった。しかし,IMP3の強制発現による卵成熟の遅れがサイクリンB1翻訳の遅れであることを証明することに成功し,IMP3はサイクリンB1 mRNAの新規翻訳抑制タンパク質である可能性を示した。2)については,実験系を改良することで,シス配列に結合する可能性のある候補タンパク質を数種類得ることに成功した。しかし,候補タンパク質をトランス因子として同定するには至らなかった。トランス因子がシス配列を直接認識する以外の機構も考慮した実験系を組む必要があるように思われる。3)については,昨年度,サイクリンB1 mRNA結合タンパク質と同定したStaufen1の機能を解析した。その結果,ゼブラフィッシュ卵母細胞におけるサイクリンB1 mRNAの局在化には,Staufen1とKinesin1の作用によってmRNAが微小管の+端に向かって能動輸送されることが重要であることが明らかとなった。この機構は,アフリカツメガエル卵母細胞においてmRNAを植物極へと輸送する機構と類似しているが,輸送方向が逆である。この発見は,脊椎動物卵母細胞におけるmRNA輸送機構の普遍性と多様性を示した重要なものである。28年度が最終年度であるため、記入しない。ゼブラフィッシュの卵成熟には,翻訳を抑制された状態で蓄えられたサイクリンB1 mRNAがホルモンの刺激に応答して翻訳を活性化されることが必要である。本研究では,卵成熟過程におけるサイクリンB1 mRNAの翻訳制御機構を明らかにすることを目的とし,次の(1)(3)の研究を行なった。(1)「新規翻訳制御タンパク質IMP3に関する解析」では,サイクリンB1 mRNAの翻訳制御因子の候補として同定したIMP3について,ノックアウトによる機能解析とシス配列の同定を行なった。現在はさらなる機能解析のため,コンディショナルノックアウトの作出にとりかかっている。(2)「サイクリンB1 mRNAタンパク質コード領域(ORF)中のシス配列による翻訳制御機構の解析」では,シス配列に結合する翻訳制御タンパク質の探索を行なった。ゼブラフィッシュ卵母細胞において,サイクリンB1 mRNAは動物極直下の細胞質に局在化した状態で蓄積されている。先行研究から,サイクリンB1 mRNAの局在化は翻訳の制御と密接に関連していることが明らかとなっている。しかしながら,その局在化の機構については明らかとなっておらず,サイクリンB1 mRNAの翻訳制御機構の包括的な理解のためには,サイクリンB1 mRNAの輸送メカニズムに関する解析が必要である。(3)「サイクリンB1 mRNAの輸送に関する解析」ではサイクリンB1 mRNAの輸送を担うタンパク質の候補を同定し,機能解析を行なっている。(1)新規翻訳制御タンパク質IMP3に関する解析本研究ではサイクリンB1 mRNAの3' UTR中にあるとみられるIMP3結合配列の同定のため,UVクロスリンク法とゲルシフト法による解析を進めていたが,現在までその同定には至っていない。IMP3中に6つあるRNA結合ドメインによるRNAプローブへの非特異的な結合が原因であると考えられ,実験のさらなる条件検討が必要である。CRISPR/Cas9によりIMP3のノックアウトゼブラフィッシュを作成した結果,発生に重篤な影響が生じ卵母細胞における解析はできなかった。IMP3は卵母細胞におけるサイクリンB1 mRNAの翻訳制御のみならず,発生を司るmRNAの翻訳にも関与していることが推察される。(2)サイクリンB1 mRNAタンパク質コード領域(ORF)中のシス配列による翻訳制御機構の解析シス配列に結合する翻訳制御タンパク質同定のため,ビオチン化したプローブを用いたプルダウン実験を行なった。しかしシス配列に変異を導入したコントロールとの間に有意な差はみられず,同定は難航している。(3)サイクリンB1 mRNAの輸送に関する解析本研究では,先行研究よりIMP3と協働してmRNAの輸送に関与するとされるStaufen1に着目して解析を行なっている。現在までに,Staufen1は,1)サイクリンB1 mRNAが輸送されるより以前から一定して発現している,2)未成熟卵においてサイクリンB1 mRNAに結合している,3)未成熟卵においてサイクリンB1 mRNAと共局在している,4) IMP3とはmRNAを介して結合していることが明らかとなった。