hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
相変態による新しい異常粒成長現象の解明

Cu-Al-Mn及びFe-Mn-Al-Ni合金において,α→α+β→β相変態を伴う温度域をサイクル熱処理することにより生じる異常粒成長現象について研究を行った.単相から冷却すると,第二相の析出に伴って亜結晶粒が形成されることがわかった.加熱後の単相においても,微細な亜結晶粒組織が残存し,さらに高温まで加熱することで異常粒成長が起こることがわかった.また,移動した粒界の後には亜結晶フリーゾーンとなっていることもわかった.以上より,亜結晶粒界における粒界エネルギーを粒成長の駆動力として考慮することで,本異常粒成長現象をよく説明することができた.Cu-Al-Mn合金における異常粒成長挙動を詳細に把握するため、今年度はα+β→β相変態が生じる加熱過程の組織解析を、EBSDを用いて行った。α+β2相組織中にはα相周りに亜結晶粒が形成されており、加熱中も亜結晶粒はそのまま存在していた。β単相になった状態においても、元の大角粒界内部に微細な亜結晶粒組織となっていた。さらに高温まで加熱することで異常粒成長が起こることも確認できた。加熱速度を変化させて異常粒成長粒のサイズを測定したところ、一定以下の速度で加熱することにより、効果的に異常粒成長が起こる確率が高いことが判明した。以上より、異常粒成長を生じる熱処理時の組織変化を観察することができ、さらに、異常粒成長が効果的に生じるための条件を特定することができた。亜結晶粒界が異常粒成長の駆動力となっていると考えられるため、亜結晶粒の粒成長挙動は重要である。そこで、β相における亜結晶粒の粒成長速度を調査した。大角粒界の正常粒成長に比較し、亜結晶粒の粒成長速度は顕著に遅く、異常粒成長熱処理中もほとんど成長しないことがわかった。これは、亜結晶粒界の粒界エネルギーと易動度の両者が小さいことに起因すると考えられる。この実験事実は、異常粒成長における駆動力が時間とともにほとんど減少しないことを意味しており、異常粒成長速度が低下しにくいという重要な結論が得られた。また、Fe-Mn-Al-Ni系合金のおいても異常粒成長が生じることがわかり、今後、詳細な調査を行っている予定である。Cu-Al-Mn合金で生じる繰り返し熱処理による相変態誘起異常粒成長現象は、冷却中のα相析出に伴い形成される亜結晶粒組織に起因することが明らかになってきた。そこで、本年度は、β相内に析出するα相の組織解析を行い、亜結晶粒組織形成についての考察を行った。β単相から各温度まで冷却してα相を析出させ、EBSDを用いて亜結晶粒の形成挙動を調査したところ、析出温度が低いほど顕著に亜結晶粒が形成されることが判明した。また、冷却速度が遅いほど亜結晶粒が形成された。これはα析出物のサイズに関係していると考えられ、粗大なα相が形成されるほど、亜結晶粒が形成されることがわかった。このことはα/β相の整合性に関係していると考えられる。そこで、α/β相の方位関係を調査したところ、K-Sの関係、Pの関係、N-Wの関係が確認された。両相は半整合であり、高分解能透過型電子顕微鏡観察によりミスフィット転位が観察できた。緩和転位の観察も試みたが、適切な場所の観察を行うことができず、この観察を行うことはできなかったが、両相の結晶構造・格子整合性を考慮すると緩和転位が存在すると考えられ、析出に伴い形成される亜結晶粒界はこれらの転位のポリゴニゼーションに起因するものと考えられる。以上のことから、効果的に亜結晶粒組織を形成するための冷却熱処理(析出熱処理)プロセスの指針を立てることができた。また、同様の手法に基づく異常粒成長が他の合金系で生じるかどうかを検証した。Fe-Mn-Al-Ni合金においては、冷却・加熱に伴うα→α+γ→α相変態に基づき異常粒成長が生じていることが確認できた。Cu-Al-Mn合金に比較して駆動力はやや小さいものの、数センチレベルの単結晶を得る見通しを立てることができた。予定していた実験が順調に進展し、α相析出に伴う組織変化と亜結晶粒形成の関係を明らかにすることができた。これにより異常粒成長の機構に密接に関係する亜結晶粒形成についての考察を行うことができ、適切な熱処理プロセス考案の指針を立てることができた。また、他の合金系の異常粒成長についても調査を行うことができた。はじめに、冷却・加熱のサイクル熱処理条件を変化させて亜粒界組織を変化させた。この組織をEBSDにより解析し、亜結晶粒界における粒界エネルギーを決定した。さらに、異常粒成長を生じたときの粒成長速度の決定を行った。その結果、亜結晶粒の粒界エネルギーの高い試料において異常粒成長速度が速くなることがわかった。このことは、亜粒界エネルギーが異常粒成長の駆動力として働いていることを意味する。一方で、上記のEBSD解析の結果から決定した亜結晶粒界における粒界エネルギーを用いて、異常粒成長の駆動力を見積もった。大角粒界からなる結晶粒間の結晶粒径差から得られるGibbs-Thomson効果による駆動力に比較し、亜結晶粒界の駆動力は大きいことがわかり、本異常粒成長現象の主たる駆動力が亜結晶粒界エネルギーであることが判明した。さらに、モビリティを文献値あるいはモデル式より算出した。以上の駆動力とモビリティより粒成長速度の見積もりを行った。

その結果、亜結晶粒界エネルギーの違いにより異常粒成長速度の違いを説明することができた。以上より、亜結晶粒界エネルギーを駆動力とする新しい異常粒成長現象の機構を解明することができた。また、異常粒成長を利用して結晶粒径を変化させたFe-Mn-Al-Ni形状記憶合金の線材および板材を用いて超弾性特性を評価した。結晶粒径/試料断面サイズ比を変化させて超弾性特性を測定したところ、線材および板材において、強い比結晶粒径依存性が見られた。変態ひずみの方位依存性やテイラー因子を計算により求めたところ、Fe-Mn-Al-Ni合金の結晶粒間の拘束力はCu-Al-Mn合金と同程度に強いことがわかった。このことから、異常粒成長を利用して結晶粒を粗大化させることが極めて重要であることが判明した。Cu-Al-Mn及びFe-Mn-Al-Ni合金において,α→α+β→β相変態を伴う温度域をサイクル熱処理することにより生じる異常粒成長現象について研究を行った.単相から冷却すると,第二相の析出に伴って亜結晶粒が形成されることがわかった.加熱後の単相においても,微細な亜結晶粒組織が残存し,さらに高温まで加熱することで異常粒成長が起こることがわかった.また,移動した粒界の後には亜結晶フリーゾーンとなっていることもわかった.以上より,亜結晶粒界における粒界エネルギーを粒成長の駆動力として考慮することで,本異常粒成長現象をよく説明することができた.当初予定していた通り、異常粒成長が生じる熱処理中の加熱過程の組織変化を観察することができ、さらに、亜結晶粒成長速度においては重要な知見も得ることができたため。Fe系合金においても同様の異常粒成長が起こることを見出し、顕著な進展も見られた。今後、異常粒成長した組織と材料特性の関係を調査していく。特に、Fe系超弾性合金についての調査を深く行っていく予定である。28年度が最終年度であるため、記入しない。金属材料科学今後は、異常粒成長熱処理における他の過程での組織変化を調査し、TEMやX線回折なども併用しながら異常粒成長を総合的に理解することに努める。次年度、研究補助のために研究員を雇用する予定があるため。次年度、組織解析を実施するための消耗品が多数発生する見込みのため。また、人件費を計上する予定も発生したため。研究補助のための研究員を雇用する予定である。組織観察消耗品費と人件費をはじめ、計画的に使用する予定である。
強磁場内血球の特性計測と血流シミュレータ用数値解析モデルの開発

本研究は,一様強磁場下における赤血球懸濁液について,マイクロセンサを用いた赤血球の電気的特性と変形能計測技術,レーザを用いた蛍光温度計測技術,そして個々の赤血球に関する運動を高空間・時間分解能測定可能な計測装置を開発した.これらの装置を用いることで単一赤血球の磁気特性の計測が可能であり,その実験結果を用いて,生体内のシミュレータを指向した,強磁場条件下の3次元赤血球・流体連成解析モデルを開発した.本研究は,一様強磁場下における赤血球懸濁液について,マイクロセンサを用いた赤血球の電気的特性と変形能計測技術,レーザを用いた蛍光温度計測技術,そして個々の赤血球に関する運動を高空間・時間分解能測定可能な計測装置を開発した.これらの装置を用いることで単一赤血球の磁気特性の計測が可能であり,その実験結果を用いて,生体内のシミュレータを指向した,強磁場条件下の3次元赤血球・流体連成解析モデルを開発した.平成20年度は,強磁場内の赤血球を伴う流動特性と単一赤血球の変形能評価を行うための測定用マイクロ流路テストセクションを製作した.マイクロ流路は,PDMS製であり,SU-8を型としてソフトエッチング行程により製作した.一方,赤血球の電気特性と変形能特性を評価するために,幅5μm・厚さ200nmの白金薄膜電極をスパッタとリフトオフ法を用いてガラス基盤上に製膜し,電気センサを製作した.さらに流路に後向き・前向きステップを設けることで,赤血球の幅方向および高さ方向の位置制御が可能であることを示した.また,抵抗測定用の電極の両側にガード電極を設置し,電流密度分布のフリンジ成分を抑制することで,測定精度が向上させ,赤血球の通過に伴う抵抗値変化をS/N=2050の測定精度を持つマイクロセンサを完成させた.さらに,高速度カメラと顕微鏡による赤血球の可視化測定を行い,赤血球通過時の抵抗値の時間変化分布との同時測定を行うことで,磁場非印可時のマイクロ流路を用いた赤血球の変形能測定法の妥当性を検討した.実験では,ヒト赤血球を用い,正常赤血球およびグルタルアルデヒド処理を行った硬化赤血球について検討した.その結果,抵抗値の時間分布の半値幅と赤血球の形状(変形量)の間で相関が得られ,赤血球の抵抗値だけでなく,変形能評価が可能であることを示した.一方,数値シミュレーション用のコード開発として,流路内に存在する単一赤血球の2次元数値解析コードを製作し,マイクロポンプ内に赤血球が混入した場合について計算を行い,赤血球変形や並進・回転運動特性についての検討とコード妥当性の確認を行った.平成21年9月に磁場発生装置が納品され,実験装置の検証運転と測定装置の組み立てを行った後に,マイクロ流路内の赤血球の測定を開始した.測定系としてマイクロ電極を用いた電気的測定と高速度デジタルビデオカメラを用いた可視化測定装置を完成させた.前者のマイクロ流路とマイクロ電極から構成されるマイクロセンサでは,測定のS/N比向上を目的として細胞を含めた流路内の電極周りの電場について3次元数値解析を行い,流路と電極寸法,細胞の特性と形状が測定抵抗値に与える影響を明らかにした.解析結果からセンサの最適形状を求め,このセンサを用いてヒト赤血球について単一赤血球の電気特性と変形能特性の測定を行った.一方,可視化ではマイクロ流路内に懸濁した赤血球の磁気トルクによる配向現象などを測定し,磁場強度との関係を定量的に明らかにした.現在は,マイクロ流路内の流動場への影響の検討と,流体力との釣り合いによる異方磁化率の測定を開始している.数値シミュレーションでは,ばねネットワークモデルと有限要素法をそれぞれ用いた赤血球モデル,さらに境界埋込法を用いた流体との連成解析手法を導入した計算コードを完成させた.これらの赤血球モデルに赤血球全体の異方磁化率や細胞膜を構成するタンパク質等の各要素の異方磁化率を考慮した2種類の磁気トルクモデルの開発も行った.計算では,一様磁場中の赤血球の配向現象が求められ,上記の実験結果と定性的に一致した.今後は,実験と並行して計算を行うことで定量的な評価を行うとともに,他機関の研究協力者と連絡を取りながら,モデル開発を完成させる予定である.平成22年度は,これまで作成した膜の磁気特性,すなわち異方的磁化率による回転トルクを考慮した3次元赤血球・流体連成解析モデルの妥当性検証と現象解明を目的として,数値解析とマイクロ流路を用いた実験をともに行い,単一赤血球レベルにおいて配向運動の定量的比較を行った.実験では,購入した強磁場発生装置に高速度カメラと光学系を用いて,一様強磁場中におけるマイクロ流路内の赤血球の流体運動,レーザを用いた蛍光温度測定,そして個々の赤血球の高空間・時間分解能測定が可能な計測装置を開発した.この装置を用いて,磁場強度010テスラの一様磁場内の赤血球運動を測定し,同条件で数値解析を行って比較検討を行った.その結果,数値解析により赤血球がその両凹円盤面を磁場方向に並行となるように配向する現象を精度良く再現出来ることが分かった.さらに,それぞれの磁場強度において,運動の加速度や速度などの定量的な比較においても,実験と数値解析は良好な一致を示し,数値解析モデルの妥当性を示した.本モデルは,赤血球膜を構成する各要素に膜状の脂質二重層と膜透過タンパクの磁気特性を組み込んだものである.

したがって,赤血球の運動や形に依らず適用可能な物理特性を模擬したモデルであり,高い汎用性を有することから,本実験の妥当性確認により,種々の応用展開が期待される段階に達したと考えられる.また,さらなる応用展開として,実験と数値解析の結果を一致させることで,赤血球全体ならびに膜状の各要素の異方的磁化率を求めることが可能である.本実験結果を用いた場合,異方的磁化率はΔχ_<RBc>=2.2×10^<-26>m^3となり,他の文献値と良好な一致を示した.このことから,マイクロ流路を用いることで単一赤血球の磁気特性の計測について可能性を示すことができた.
次世代生産・物流システムの構築と評価に関する研究

ジャストインタイム(JIT)生産方式は,多品種少量生産の状況下において,徹底的な無駄の排除によるコスト低減と高流動生産を実現した革新的な生産システムである.JIT生産システムの基本は,後工程引き取り,後補充生産方式,すなわち引っ張り方式であり,その情報伝達媒体としてかんばんが使用され,各工程でかんばん枚数を決めることによりシステムは自律分散的に機能する.他方,MRP(資材所要量計画)は,1960年代にIBMにより開発され,世界中に普及した生産方式であり,生産すべき製品の基準生産計画に基づき部品展開を行い,発注・生産指示により部品から完成品までを時間単位で管理する方式であり,押し込み方式である.また,OPT(最適化生産技法)は,1970年代にイスラエルで開発された生産方式であり,ボトルネック工程の利用率を最大化し,リ-ドタイム短縮,最適在庫水準の維持等の目標を達成する最適スケジュールを導くことを目標としており,MRP同様,押し込み方式である.本研究では,計算機・通信技術,生産技術の技術進歩を考慮し,次世代生産・物流システムを,JIT,MRP,OPTをはじめ,提案されている様々な未来型生産システムに基づいて構築し,その可能性を調査した.しかし,今日の激変する状況下において押し込み方式による生産システムでは,変化する環境に追従できず,次世代生産・物流システムとしては,各工程が自律分散的に機能する自律分散型生産・物流システムが有力となる.実際,1990年にMITは全世界の自動車生産システムを調査し,JIT生産システムに基づいて,リーン(lean)生産システムを提唱している.したがって,計算機・通信分野における技術革新を取り入れ,柔軟性,拡張性のある自律分散型システムとしてJIT生産システムを革新すれば,次世代生産・物流システムとしてあるべき未来形につながるものと期待される.ジャストインタイム(JIT)生産方式は,多品種少量生産の状況下において,徹底的な無駄の排除によるコスト低減と高流動生産を実現した革新的な生産システムである.JIT生産システムの基本は,後工程引き取り,後補充生産方式,すなわち引っ張り方式であり,その情報伝達媒体としてかんばんが使用され,各工程でかんばん枚数を決めることによりシステムは自律分散的に機能する.他方,MRP(資材所要量計画)は,1960年代にIBMにより開発され,世界中に普及した生産方式であり,生産すべき製品の基準生産計画に基づき部品展開を行い,発注・生産指示により部品から完成品までを時間単位で管理する方式であり,押し込み方式である.また,OPT(最適化生産技法)は,1970年代にイスラエルで開発された生産方式であり,ボトルネック工程の利用率を最大化し,リ-ドタイム短縮,最適在庫水準の維持等の目標を達成する最適スケジュールを導くことを目標としており,MRP同様,押し込み方式である.本研究では,計算機・通信技術,生産技術の技術進歩を考慮し,次世代生産・物流システムを,JIT,MRP,OPTをはじめ,提案されている様々な未来型生産システムに基づいて構築し,その可能性を調査した.しかし,今日の激変する状況下において押し込み方式による生産システムでは,変化する環境に追従できず,次世代生産・物流システムとしては,各工程が自律分散的に機能する自律分散型生産・物流システムが有力となる.実際,1990年にMITは全世界の自動車生産システムを調査し,JIT生産システムに基づいて,リーン(lean)生産システムを提唱している.したがって,計算機・通信分野における技術革新を取り入れ,柔軟性,拡張性のある自律分散型システムとしてJIT生産システムを革新すれば,次世代生産・物流システムとしてあるべき未来形につながるものと期待される.
DNA切断反応性を有するプロパルギルスルホン化合物の構造-活性相関

生体内で活性化されてアルキル化反応性を発現するとともに、特定のDNA塩基配列部位に特異的に作用してDNA鎖切断に導く新規プロパルギルスルホン化合物を分子設計および合成し、2年間の共同研究を実施して下記の成果を得た。(1)平成8年度に2回および平成9年度に3回、研究代表者または研究分担者が香港科学技術大学を訪問し、プロパルギルスルホン化合物の分子設計と合成、ならびに天然物を含めたDNA切断活性を有する化合物の構造特性と反応性について調査研究した。(2)平成8年度および平成9年度に各1回、研究分担者を招へいし、プロパルギルスルホン化合物の抗腫瘍活性発現機構および細胞毒性評価に関する研究動向について調査研究した。(3)シス-エンジイン型プロパルギルスルホン・モノプロパルギルスルホン・ビスプロパルギルスルホンを含む45種類の新規化合物を合成し、DNA鎖切断および細胞毒性について構造-活性相関を定量化した。また、1,5-ジイン化合物からアリル二重結合の移動を経てシス-エンジイン構造が発生することを見いだした。(4)一連のプロパルギルスルホン化合物について、DNA二重鎖に対するインターカレーション能とDNA一重鎖および二重鎖の切断量との関係を定量化し、2官能性のビスプロパルギル化合物よりもモノプロパルギル類縁化合物の方が一般にDNA二重鎖切断活性が大きいことを明らかにした。また、ナフタレンやアントラセンはDNA鎖へ挿入するが、挿入方向とアレン型活性部位の相対的な位置関係が切断活性を支配することを明らかにした。(5)プロパルギルスルホン化合物とグアノシンのモデル反応系において、2種類のグアノシン-プロパルギルスルホン付加体、および脱リボース構造をもつグアニン-プロパルギルスルホン付加体の生成を確認し、グアニン塩基部位のアルキル化によるDNA鎖切断反応機構を明らかにした。生体内で活性化されてアルキル化機能を発現するとともに、特定のDNA塩基配列部位に特異的に作用して鎖切断に導く新規プロパルギルスルホン化合物を分子設計および合成し、下記の研究を実施して作用機構を明らかにした。(1)研究分担者とその協力者1名を京都大学に招へいし、また関連研究を展開中の東京工業大学と東北大学を訪問する機会を設定することにより、プロパルギルスルホン化合物の抗腫瘍活性発現機構および細胞毒性評価に関する研究動向を調査した。この結果、共同研究の展開に有用な知見が集積された。(2)研究代表者が香港科学技術大学を訪問し、プロパルギルスルホン化合物の分子設計と合成、ならびに天然物を含めたDNA切断活性を有する化合物の構造特性と反応性に関する知見を集積した。(3)3種類のリ-ド化合物を設計し、大量合成ルートを確立するとともに、23種類の新規プロパルギルスルホン化合物を合成した。また、本研究の過程で1,5-ジイン化合物からアリル二重結合の移動を経てシス-エンジイン構造が発生することを初めて見いだした。(4)合成開発したプロパルギルスルホン化合物について、DNA鎖に対する認識機能および切断活性を評価し、2官能性のビスプロパルギル化合物よりもモノプロパルギル類縁化合物の方が一般にDNA二重鎖切断活性が大きいことを明らかにした。また、各種置換基として導入したプロパルギルスルホン化合物のDNA二重鎖切断活性序列から、ナフタレンやアントラセンがDNA二重鎖へ挿入するが、挿入方向とアレン型活性部位の相対的な位置関係が切断活性を支配することを明らかにした。

(5)プロパルギルスルホン化合物のDNA塩基へのアルキル化のモデル反応を行い、アレン中間体に1,8-ジアザビシクロー[5,4,0]-7-ウンデセンが付加する新反応を見いだし、DNA鎖切断がアルキル化機能で進行することを示した。生体内反応を経て活性化され、抗腫瘍活性を発現する新規プロドラッグの開発を目標として、生体内活性化のトリガー機能を担うと期待されるプロパルギル構造をもつ新規スルホン化合物を分子設計および合成し、下記の成果を得た。(1)研究分担者を香港科学技術大学に派遣し、DNA二重鎖への挿入機能の付与およびDNA鎖切断活性点の位置制御を目的とする新規プロパルギルスルホン化合物の分子設計と合成ルートについて研究調査した。(2)研究分担者を京都大学工学研究科に招へいし、プロパルギルスルホン化合物の抗腫瘍活性発現機構に関する研究結果について討論するとともに、関連研究の最新情報を収集した。(3)シス-エンジイン型プロパルギルスルホン・モノプロパルギルスルホン・ビスプロパルギルスルホンを含む45種類の新規化合物を合成し、構造一括性相関を定量化した。(4)一連のプロパルギルスルホン化合物について、DNA二重鎖に対するインターカレーション能を臭化エチジウムをプローブとする蛍光分光光度法を用いて評価し、デンシトメトリー法で定量したDNA一重鎖および二重鎖の切断量との関係を比較評価した。(5)研究分担者を香港科学技術大学に派遣し、プロパルギルスルホン化合物のインターカレーション能に及ばす構造因子に関する知見を報告し、併せて新規化合物の分子設計と合成について討論した。(6)プロパルギルスルホン化合物とグアノシンのモデル反応系において、2種類のグアノシン-プロパルギルスルホン付加体、および脱リボース構造をもつグアニン-プロパルギルスルホン付加体の生成を確認し、グアニンのアルキル化によるDNA鎖切断反応機構を明らかにした。(7)研究代表者が香港科学技術大学を訪問し、DNA鎖切断活性を有するプロパルギルスルホン化合物の構造-括性相関に関する検討と最新情報の収集、ならびに本共同研究の総括を行った。
アクリルアミドの作用機構および毒性予防に関する細胞生物学的研究

超高磁場磁気共鳴装置を用いて、生きたアクリルアミド中毒ラット(50mg/kg/日、8日腹腔内投与)脳について検討し、脳室、脳槽の拡大、大脳皮質の厚さの減少などを認めた。これにより、上記投与法によるアクリルアミド中毒ラットは、形態学的にも「脳症」モデルであることを確認した。これに先立ち、アクリルアミドと対照的に髄鞘を障害するヘキサクロロフェン投与ラットについて検討し、超高磁場磁気共鳴による脳の形態学的および"apparent diffusion coefficient"解析が非常に有効な方法であることを明らかにした。一方、アクリルアミドは、前初期遺伝子の1つであるc-Fosを脳内で発現させるという報告がある。これに関連して、強力なc-Fos誘導化学物質のペンチレンテトラゾールを投与して、マウス脳内のc-fos mRNAを測定、その増加とL-カルニチンによる抑制を明らかにした。次に、細胞レベルでのアクリルアミドなどの作用を検討するために、いくつかの細胞系を用いて、細胞毒性の評価と情報伝達系、特にMAPK(mitogen activated protein kinase)系に及ぼす影響を検討し、ある種の化学物質の毒性発現とMAPK活性化における細胞内Ca^<2+>の重要性などを明らかにした。以上にもとづき、ヒト神経芽細胞株SH-SY5Yを用いてアクリルアミド暴露の神経細胞への影響を検討した。その結果、アクリルアミド暴露48-72時間後、量依存的な有意な細胞生存率の低下を認めた。c-fos遺伝子の発現量には有意な増加を認めなかったが、c-jun遺伝子発現量には250、500μM暴露において有意な増加(それぞれ173.3±33.9%、250.3±26.0%(Mean±S.D))を認めた。しかし、活性化(リン酸化)されたERK、JNK、p38MAPK蛋白量、総(リン酸化+非リン酸化)MAPK蛋白量に変化は認めなかった。アクリルアミドは、ヒト・動物いずれでも中枢・末梢神経障害を引き起こしうる。特に末梢神経障害については、動物で明確な形態学的変化を惹起するため、実験的ニューロパチー作成にも広く利用されてきた。ただ、脳の形態学的変化については充分検討されていない。そこで、超高磁場磁気共鳴装置を用いて、生きたアクリルアミド中毒ラット(50mg/kg/日、8日腹腔内投与)について検討した。その結果、脳室、脳槽の拡大、大脳皮質の厚さの減少などを認めた。なお、この実験に先立ち、アクリルアミドと対照的に髄鞘を特異的に障害するヘキサクロロフェン投与ラットについて検討し、超高磁場磁気共鳴による脳の形態学的および"apparent diffusion coefficient"解析が非常に有効な方法であることを明らかにした。また、細胞レベルでのアクリルアミドの作用を検討するために、いくつかの細胞系を用いて、細胞毒性の評価と情報伝達系、特にMAPK(mitogen activated protein kinase)系に及ぼす影響を検討中である。これに関連して、ある種の化学物質の毒性発現とMAPK活性化における細胞内Ca^<2+>の重要性などを明らかにした。

そこで、ヒト神経芽細胞株SH-SY5Y細胞を用いて、アクリルアミドの細胞毒性、前初期遺伝子c-fos、c-jun発現及びMAPキナーゼ活性に及ぼす影響を検討した。まず、細胞毒性評価を血清入りDMEM/F12混合培地を用い、1×10^4個の細胞に対し、アクリルアミド濃度0、100、250、500μMで、24、48、72、96時間暴露後にWST-8アッセイにて行った。その結果、暴露24時間後では有意な生存率の低下は見られなかったが、48-72時間後、量依存的な生存率の低下が認められた。次に、1×10^5個の細胞を一晩のserum starvation後、新しいDMEM/F12培地に変えて37°Cでアクリルアミドを1時間暴露、総RNAをTrizol試薬を用いて分離し、RT-PCR法によってc-fos、c-jun遺伝子発現量を測定(G3PDH遺伝子発現量で補正)したところ、c-fos遺伝子発現量には有意な増加は認められなかったが、c-jun遺伝子発現量は250、500μM暴露において有意に増加した。一方、MAPキナーゼは、特異的抗体を用いてWestern blottingにて評価した。リン酸化されたERK(extracellular signal-regulated protein kinase)、JNK(c-Jun N-terminal kinase)、p38、および総(リン酸化+非リン酸化)MAPキナーゼ蛋白量いずれにも変化を認めなかった。
エンドウカルコン合成酵素遺伝子の病原菌シグナルによる発現制御機構

エリシターによりエンドウCHS遺伝子の転写誘導に必要なDNAシス領域を同定するために、まず、様々な長さのPSCHS1、PSCHS2遺伝子5 ́上流域をレポーター遺伝子であるクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)遺伝子に結合させてキメラ遺伝子を構築した。次に、これらのキメラ遺伝子をエンドウ培養細胞由来のプロトプラストにエレクトロポレーション法で導入して、一時的なCATの活性を測定した。この時エレクトロポレーション後にエリシター処理を行う区と行わない区を設けてエリシター処理による影響も解析した。その結果、PSCHS1では少なくとも-242から下流に、PSCHS2では-377から下流にエリシター応答性転写活性領域が存在することが明らかとなった。更にCaMVの35Sミニマルプロモーターを用いたgain of function実験からPSCHS1の-242から-181までの61塩基だけでエリシターに応答してレポーター遺伝子の発現を増高させることが明らかになった。次に、両遺伝子の転写制御に関わる核内タンパク質因子について、ゲルシフトアッセイ法により解析した。その結果、PSCHS1の-242から-181の61塩基の断片やPSCHS2の-347から-158までの189塩基の断片はエリシター処理エンドウ組織から調製された核タンパク質と強く結合して移動度の遅い複合体(LMC)を形成することが明らかとなった。LMCの形成は核タンパク質を予めアルカリフォスファターゼで前処理することによって阻害されたことから、LMCの形成にはリン酸化が必要であると考えられる。また、エリシターで転写が誘導されるエンドウのPSPAL1とPSPAL2のプロモーターにも同様なLMCを形成する領域が存在しており、それぞれのLMCの形成は互いにLMCを形成するDNA断片により競合することが明らかにされた。以上の結果から、エリシターによる防御遺伝子の転写誘導にはLMCを形成する共通因子が関与している可能性が示唆された。
コンピューター利用の対話形式の談話構造の特徴と第二言語習得への応用利点の検証

前年度のデータ分析から、平成18年度は、学習者間の対話を可能にするため日本語学習者を2人一組のペアにし、タスクベースの非共時性のコンピュータ媒介インターアクションに参加させ、オンライン(BBS)とオフライン(学習者間の口頭対話)両方のデータを収集した。更に、このようなオンラインとオフラインの両方が使い分けできる環境においてLREs(language Related Episodes)という言語的な部分に焦点があたっているメタ言語エピソードが、談話構造上どのような形で遂行されているか、また学習者個々人のLREsに基づいて作成されたポストテストを2週間後に行い、このようなLREsがどの程度、習得されたのかを分析した。本研究では、BBS活動中のオフライン時でのピアメタ言語エピソードに焦点を置き、社会文化アプローチの視点から、テキスト媒介でおこなうピア協働活動の重要性を見出した。今までのコンピュータ媒介コミュニケーションを利用した第二言語学習では注目されていなかったが、オフライン、つまり共時性のピア対話を導入することによって、非共時性のコミュニケーションでは不足していた累進的で偶発的なフィードバックが可能となることを示唆した。本研究で、コンピュータ媒介コミュニケーションを利用した学習のより効果的な導入方法を提示、またこの分野における研究でオフラインデータの分析の必要性を示唆することができた。インターネットの普及とともに、インターネット媒介のインターアクションと第二言語学習の研究がここ数年の間に、日本ではまだ少ないが欧米で急速に増加している。本研究では特に2000年以降の文献調査が重要となることから、今年度は欧米を中心に文献収集し、先行研究の結果をまとめた。また、パイロット実験として、日本語を第二言語とする留学生と日本語母語話者のインターネット掲示板BBSを行い、以前の研究で得たチャット及びメールのデータと比較した。先行研究結果及びパイロット実験から、以下の点及び調査方法が明確になった。1インターネットチャット(同時性)、インターネット掲示板BBS(非同時性)、電子メール(非同時性)、面と向かっての会話、コンピュータを使っての作文、という異なるインターアクションの種類別の特徴及び第二言語習得上の利点・非利点。2インターネット媒介のような新しい会話形態の中でできるコミュニティーを民俗学的なアプローチで調査し、このコミュニティー内で母語話者と非母語話者がタスク遂行・言語学習・意志の疎通に関してどのような役割遂行を行い、どのような関係を構築しているかを会話分析を用いて観察する。3 2のような民俗学的アプローチでは、研究の主旨である「言語クラスでオンラインインターアクションを応用する」点を考慮し、データは教室というコンテキストから切り離すべきではない。従って、(1)データは教室内で収集する。これにより研究結果はより実際の教室活動に適用しやすくなる。(2)チャットやメールのデータだけでなく、チャットやメール活動を行う時の言語学習クラス内での学習者、及び学習者間の行動もデータとして記録・収集する。(3)参加者のインサイダー的視点の重要性から参加者へのアンケート及びインタビューを実施し、分析する。以上の点を含めて、2005年度はデータ収集及び分析を行う予定である。平成17年度は、平成16年度のパイロット・スタディの結果から新たなデータ収集を行った。パイロット・スタディで収集した総合的なデータ分析から、インターネット上の学習者のインターアクションだけではなく、コンピュータを媒介としたインターアクションに参加しながら同時に行われる学習者間での口頭対話が第二言語習得上、重要な役割を行っていることが明らかになった。この結果をもとに、平成18年度は、学習者間の対話を可能にするため日本語学習者を2人一組のペアにし、タスクベースの非共時性のコンピュータ媒介インターアクションに参加させ、オンライン(BBS)とオフライン(学習者間の口頭対話)両方のデータを収集した。更に、このようなオンラインとオフラインの両方が使い分けできる環境においてLREs (language Related Episodes)という言語的な部分に焦点があたっているメタ言語エピソードが、談話構造上どのような形で遂行されているか、また学習者個々人のLREsに基づいて作成されたポストテストを2週間後に行い、このようなLREsがどの程度、習得されたのかを分析した。このデータ分析から、従来の口頭対話におけるメタ言語エピソードとは異なる特殊な談話構造とその第二言語習得上の利点が明らかになった。また、ポストテストでは、85%という高い正解率を得ることができ、この特殊なメタ言語エピソードと第二言語習得の関係が示唆された。また、参加学習者のインタビューとアンケートから、どのような要因がこのようなメタ言語エピソードの量や質に影響するのかについても検討した。

本研究で、コンピュータ媒介コミュニケーションを利用した学習のより効果的な導入方法を提示、またこの分野における研究でオフラインデータの分析の必要性を示唆することができた。
エネルギー移動を利用した発光波長変換法によるホモジニアス免疫診断システムの開発

本研究では,サンプル液に二次抗体とキメラ発光酵素さらに発光基質を添加し混合するだけで短時間に抗原濃度が測定できるホモジニアス免疫測定法を開発することを最終目標とし,エネルギー移動を利用した発光波長変換によるホモジニアス免疫測定法の原理実証を行なった.すなわち,抗体のFc部位に対する結合活性と発光活性を有するキメラ発光酵素で標識された二次抗体が,抗原-抗体反応により抗原を介して固相化抗体(一次抗体)のごく近傍に固定化される.その結果,キメラ発光酵素と固相化抗体も互いに接近する.この抗原-抗体反応による複合体生成に伴うキメラ酵素と固相化抗体の距離の変化を,数nm程度の距離の変化を感度良く反映する励起エネルギー移動現象を利用して検出しようと試みた.まず予め蛍光標識した固相化抗体のFc部分にキメラ発光酵素を直接結合させた場合には,蛍光性分子との距離が数nm以下となり,発光酵素から蛍光性分子への励起エネルギー移動が生じた.その結果,発光酵素固有の発光波長(λmax=450nm)から蛍光色素の蛍光波長(λmax=520nm)への発光波長の変換が観測された.また,蛍光標識固相化抗体の濃度の増加に従い,固相化抗体に結合するキメラ発光酵素量が増加し,その結果として蛍光色素に対する励起エネルギー移動量も増加した.すなわち,発光酵素から蛍光標識固相化抗体への励起エネルギー移動と発光波長の変換が実証された.またこの波長変化をマイクロプレート型ルミノメーターに短波長カットフィルターを付けて簡便に測定することに成功した.またより感度の高い測定を可能にするため,より抗体結合能の高いプロテインGとウミホタル発光酵素のキメラを新規に作製し,プロテインAを用いたキメラよりも約2倍の抗原検出感度を得ることに成功した.本研究では,サンプル液に二次抗体とキメラ発光酵素さらに発光基質を添加し混合するだけで短時間に抗原濃度が測定できるホモジニアス免疫測定法を開発することを最終目標とし,エネルギー移動を利用した発光波長変換によるホモジニアス免疫測定法の原理実証を行なった.すなわち,抗体のFc部位に対する結合活性と発光活性を有するキメラ発光酵素で標識された二次抗体が,抗原-抗体反応により抗原を介して固相化抗体(一次抗体)のごく近傍に固定化される.その結果,キメラ発光酵素と固相化抗体も互いに接近する.この抗原-抗体反応による複合体生成に伴うキメラ酵素と固相化抗体の距離の変化を,数nm程度の距離の変化を感度良く反映する励起エネルギー移動現象を利用して検出しようと試みた.まず予め蛍光標識した固相化抗体のFc部分にキメラ発光酵素を直接結合させた場合には,蛍光性分子との距離が数nm以下となり,発光酵素から蛍光性分子への励起エネルギー移動が生じた.その結果,発光酵素固有の発光波長(λmax=450nm)から蛍光色素の蛍光波長(λmax=520nm)への発光波長の変換が観測された.また,蛍光標識固相化抗体の濃度の増加に従い,固相化抗体に結合するキメラ発光酵素量が増加し,その結果として蛍光色素に対する励起エネルギー移動量も増加した.すなわち,発光酵素から蛍光標識固相化抗体への励起エネルギー移動と発光波長の変換が実証された.またこの波長変化をマイクロプレート型ルミノメーターに短波長カットフィルターを付けて簡便に測定することに成功した.またより感度の高い測定を可能にするため,より抗体結合能の高いプロテインGとウミホタル発光酵素のキメラを新規に作製し,プロテインAを用いたキメラよりも約2倍の抗原検出感度を得ることに成功した.本研究では、サンプル液に2次抗体とキメラ発光酵素さらに発光基質を添加し混合するだけで短時間に抗原濃度が測定できる、いわゆるホモジニアス免疫測定法を開発することを最終目標として、エネルギー移動を利用した発光波長変換によるホモジニアス免疫測定法の原理実証を行った。すなわち、抗体のFc部位に対する結合活性と発光活性を有するキメラ発光酵素で標識された2次抗体が、抗原-抗体反応により抗原を介して固定化不溶抗体(1次抗体)のごく近傍に固定化される。その結果、キメラ発光酵素と不溶抗体も互いに接近する。この抗原-抗体反応による複合体形成に伴うキメラ酵素と不溶抗体の距離の変化を、数nm程度の距離の変化を感度良く反映する励起エネルギー移動現象を利用して検出しようというものである。予め蛍光標識した不溶抗体のFc部位にキメラ発光酵素を直接結合させた場合には、蛍光性分子との距離が数nm以下となり、発光酵素から蛍光性分子への励起エネルギー移動が生じた。その結果、発光酵素固有の発光波長450nmから蛍光性分子固有の発光波長520nmへの発光波長の変換が観察された。また、蛍光標識化不溶抗体の濃度の増加に従い、不溶抗体に結合するキメラ発光酵素量が増加し、その結果として蛍光性分子に対する励起エネルギー移動量も増加し、蛍光性分子固有の発光強度も不溶抗体濃度依存的に増加した。このように、発光酵素から蛍光性分子への励起エネルギー移動と発光波長の変換が実証された。さらに、多サンプル発光測定システムを用い、短波長カットフィルターを付けた場合と付けない場合の発光強度比から励起エネルギー移動の割合を定量的に測定できること、本方式を用いれば、96穴マイクロプレートを利用して多サンプルを短時間に同時に測定することが可能な迅速で、簡便な臨床検査用ホモジニアス免疫測定システムを構築できることを明らかにした。

本研究は,サンプル液に二次抗体とキメラ発光酵素さらに発光基質を添加し混合するだけで短時間に抗原濃度が測定できるホモジニアス免疫測定法を開発することを最終目標とし,エネルギー移動を利用した発光波長変換によるホモジニアス免疫測定法の原理実証を行なった.すなわち,抗体に対する結合活性と発光活性を有するキメラ発光酵素で標識された二次抗体が,抗原-抗体反応により抗原を介して固相化抗体(一次抗体)のごく近傍に固定化される.その結果,キメラ発光酵素と固相化抗体も互いに接近する.この抗原-抗体反応による複合体生成に伴うキメラ酵素と固相化抗体の距離の変化を,数nm程度の距離の変化を感度良く反映する励起エネルギー移動現象を利用して検出しようと試みた.まずより感度の高い免疫測定を可能にするため,より抗体結合能の高いプロテインGとウミホタル発光酵素のキメラを新規に作製し,プロテインAを用いたキメラよりも約2倍の抗原検出感度を得ることに成功した.興味深いことにプロテインGと発光酵素を直接結合させた場合には充分な抗体結合活性が得られず,間にプロテインAを介して結合させることにより高い抗体結合活性が得られた.次に昨年度の研究より,発光酵素と蛍光標識抗体をより近接させた方が効率よくエネルギー移動が起こることが示唆されたため,発光酵素のN末端側に抗原エピトープを遺伝子工学的に結合させ,これと蛍光色素標識特異的抗体との結合でエネルギー移動が観察されるかどうかを検討した.現在発現ベクター遺伝子の作製まで行なった段階である.これが確認されれば,ここに抗原あるいは末標識抗体を加えてエネルギー移動量が変化するかどうかを検討する.
相変態を利用した環境と省エネルギーのための新しい塑性加工法の均質化法による検討

マルテンサイト変態の発生する材料においては、変態に伴って変態ひずみと呼ばれるせん断と体積膨張ひずみが生じる.また,この変態現象は温度に依存するため,熱膨張ひずみを考慮する必要がある.そこで,これらと弾粘塑性ひずみ速度の和から,各相における微視領域上の変態-熱弾粘塑性型構成式を導出した.変位速度の漸近展開形式を導出した構成式に導入し,均質化理論を適用することによって,特性変位関数を未知数とした微視系積分方程式,均質化定数を含む巨視系仮想仕事の原理式等の基礎方程式系を得た.同時に温度場も漸近展開によって表し,相変態によって発生する潜熱を考慮した微視領域における熱伝導方程式に対しても同様に均質化法を適用することによって,均質化理論に基づく基礎方程式を得た.これらを既に構築済みの有限要素法に基づいた数値シミュレーションシステムに組み込み,変態-熱-力学連成問題に適用可能な均質化法を用いた相変態発生材料用の数値解析システムを構築した.さらに,均一オーステナイト相内に楕円体形状を持ったマルテンサイト相をその中央部に配置した単位セルモデルを構築し,その単位セルが変態カイネティクスモデルに従って成長すると考え,移動境界問題として解析モデルを構築した.この解析システムを用いて,巨視的に平面ひずみ引張りを与えて数値シミュレーションを行った結果,これまでの有限要素法による数値シミュレーションと同じ傾向を示すと同時に,微視構造を忠実に表現可能なため精度のよい数値解が得られた.例えば,これまでのマルテンサイト相体積分率を内部変数とした有限要素法解析では,マルテンサイト相の配向性が表現不可能であったが,この数値シミュレーションシステムでは可能となる.マルテンサイト変態の発生する材料においては,変態に伴って変態ひずみと呼ばれるせん断と体積膨張ひずみが生じる.また,この変態現象は温度に依存するため,熱膨張ひずみを考慮する必要がある.そこで,これらと弾粘塑性ひずみ速度の和から,微視領域における変態-熱弾粘塑性型構成式を導出した.導出した構成式に均質化理論を適用し,巨視的構成式等の基礎方程式系を得る.さらに,相変態によって発生する潜熱を考慮した微視領域における熱伝導方程式に対しても同様に均質化法を適用し,基礎方程式を得た.これらを大変形,弾粘塑性体に対する均質化法に基づいて,既に構築済みの数値シミュレーションシステムに組み込み,変態-熱-力学連成問題に適用可能な均質化法を用いた相変態発生材料用の数値解析システムを構築した.さらに,均一オーステナイト相内に楕円体形状を持ったマルテンサイト相をその中央部に配置した単位セルモデルを用い,その単位セルが変態カイネティクスモデルに従って成長すると考え,移動境界問題として解析モデルを構築した.マルテンサイト変態の発生する材料においては、変態に伴って変態ひずみと呼ばれるせん断と体積膨張ひずみが生じる.また,この変態現象は温度に依存するため,熱膨張ひずみを考慮する必要がある.そこで,これらと弾粘塑性ひずみ速度の和から,各相における微視領域上の変態-熱弾粘塑性型構成式を導出した.変位速度の漸近展開形式を導出した構成式に導入し,均質化理論を適用することによって,特性変位関数を未知数とした微視系積分方程式,均質化定数を含む巨視系仮想仕事の原理式等の基礎方程式系を得た.同時に温度場も漸近展開によって表し,相変態によって発生する潜熱を考慮した微視領域における熱伝導方程式に対しても同様に均質化法を適用することによって,均質化理論に基づく基礎方程式を得た.これらを既に構築済みの有限要素法に基づいた数値シミュレーションシステムに組み込み,変態-熱-力学連成問題に適用可能な均質化法を用いた相変態発生材料用の数値解析システムを構築した.さらに,均一オーステナイト相内に楕円体形状を持ったマルテンサイト相をその中央部に配置した単位セルモデルを構築し,その単位セルが変態カイネティクスモデルに従って成長すると考え,移動境界問題として解析モデルを構築した.この解析システムを用いて,巨視的に平面ひずみ引張りを与えて数値シミュレーションを行った結果,これまでの有限要素法による数値シミュレーションと同じ傾向を示すと同時に,微視構造を忠実に表現可能なため精度のよい数値解が得られた.例えば,これまでのマルテンサイト相体積分率を内部変数とした有限要素法解析では,マルテンサイト相の配向性が表現不可能であったが,この数値シミュレーションシステムでは可能となる.
早期肝細胞癌の進展様式に関する病理学的検討

本年度の研究目的にそって早期肝細胞癌(肝癌)の進展様式ことに間貭浸潤について検討した. 123例の肝硬変あるいは肝線維症を基礎に発生した肝癌の剖検例を主体に再検討し,12層の肝細胞索即ち正索状型を呈する間貭内癌浸潤,いわゆるStreak patternの出現頻度をしらべた,対照としてこれら症例の非癌部組織,5の激症型肝炎,3例の結節性再生性過形成を〓んだ.streak patternは癌細胞索が平行に束状に間貭内に配列する典型的なものをgradeIIIとし,以下gradeI,II群と3群に分け,腫瘍径,組織学的分化度との相関をしらべた.streak patternの出現頻度は123結節中19結節(15%)であった.そのうち13結節は径3.0Cm以下の小肝癌であった.また大型結節に出現する場合には,主として高分型既ち正索状型を呈する一部において認められた.このようにstreak patternは小型・高分化型癌結節により高い出現率を示すことが明らかにされた.またgradeII,IIIは対照群にはみられず,はっきりとしたstreak patternが存在した場合には,結節の細胞異型が顕著でなくとも悪性であることがつよく示唆された.間貭内に含まれる癌細胞索の良・悪性の判定基準も大きな問題となる.これについては鍍銀染色を利用したreticulin frame(RF)の有無が決め手となる.いわゆるpiecemeal necrosisにおちいった肝細胞索は間貭内においても依然としてRFを有している.しかし癌細胞はしばしばRFを欠いている.ところが癌細胞が類洞構造を誘導すると更びRFに囲まれるようになる.現在これら間貭内へ侵入した癌細胞の増殖能,間貭破壊にかかわる因子,新生血管の特性などにつきなお検討が続けられている.本年度の研究目的にそって早期肝細胞癌(肝癌)の進展様式ことに間貭浸潤について検討した. 123例の肝硬変あるいは肝線維症を基礎に発生した肝癌の剖検例を主体に再検討し,12層の肝細胞索即ち正索状型を呈する間貭内癌浸潤,いわゆるStreak patternの出現頻度をしらべた,対照としてこれら症例の非癌部組織,5の激症型肝炎,3例の結節性再生性過形成を〓んだ.streak patternは癌細胞索が平行に束状に間貭内に配列する典型的なものをgradeIIIとし,以下gradeI,II群と3群に分け,腫瘍径,組織学的分化度との相関をしらべた.streak patternの出現頻度は123結節中19結節(15%)であった.そのうち13結節は径3.0Cm以下の小肝癌であった.また大型結節に出現する場合には,主として高分型既ち正索状型を呈する一部において認められた.このようにstreak patternは小型・高分化型癌結節により高い出現率を示すことが明らかにされた.またgradeII,IIIは対照群にはみられず,はっきりとしたstreak patternが存在した場合には,結節の細胞異型が顕著でなくとも悪性であることがつよく示唆された.間貭内に含まれる癌細胞索の良・悪性の判定基準も大きな問題となる.これについては鍍銀染色を利用したreticulin frame(RF)の有無が決め手となる.いわゆるpiecemeal necrosisにおちいった肝細胞索は間貭内においても依然としてRFを有している.しかし癌細胞はしばしばRFを欠いている.ところが癌細胞が類洞構造を誘導すると更びRFに囲まれるようになる.現在これら間貭内へ侵入した癌細胞の増殖能,間貭破壊にかかわる因子,新生血管の特性などにつきなお検討が続けられている.
アラキドン酸を有するリン脂質を認識するホスホリパーゼA_2の分画に関する研究

肺マクロファージのザイモザンによるアラキドン酸の遊離はカルモデュリン阻害剤により特異的に抑制された。カルモデュリン阻害剤はアラキドン酸の遊離を完全に抑制する濃度においても、オレイン酸等他の脂肪酸の放出を阻害しなかった。阻害剤はザイモザンによるコリン型、イノシトール型リン脂質からのアラキドン酸の放出を阻害する事から、ホスホリパーゼA_2の反応を阻害する事が明らかとなった。ザイモザンによるアラキドン酸遊離には外界のカルシウムが不可欠であった。一方、カルシウムキレート剤であるEGTA免罪下においても、オレイン酸、リノー酸の放出は阻害されなかった。これらの結果はザイモザン刺激に伴う、マクロファージよりの脂肪酸遊離にはカルシュウムに依存する反応と非依存の反応があり、依存する反応はアラキドン酸に選択性がある事を示唆している。肺マクロファージの全ホスホリパーゼA_2活性の約70%は上清画分に存在していた。上清画分を用い、ホスホリパーゼA_2の基質特異性を検討した所、コリン型リン脂質よりのアラキドン酸の水解反応はカルシュウム添加により有意に増加したが、オレイン酸、リノール酸を有するコリン型リン脂質の水解はカルシュウムの有無に影響されなかった。この結果は、マクロファージの細胞上清画分にアラキドン酸を認識するカルシュウム依存的ホスホリパーゼA_2が存在する事を明らかにする為、ホスホリパーゼA_2の分画を試みた。疏水からむ、DEAE-セルロースカラム、ゲルロ過により、ホスホリパーゼAの比活性は約500倍に上昇したが、アラキドン酸を認識するホスホリパーゼA_2を分画するにいたらなかった。しかしながら、本研究において、肺マクロファージにアラキドン酸を認識するホスホリパーゼの存在が、細胞、酵素レベルで確かめられた。本年度の研究の目的はウサギ肺クマロファージのホスホリパーゼに関し,細胞内での本酵素の局在性,基質特異性について基礎的な検討を行なう事にあった.その結果,次の点を明らかにする事が出来た.1.ホスホリパーゼAの細胞内分布肺マクロファージを超遠心法でミトコンドリア+リソゾーム画分,ミクロゾーム画分,細胞質画分に分け,ホスホリパーゼAの活性を測定した所,いずれの画分とも活性が認められた.一般的に哺乳類のホスホリパーゼAは膜結合酵素としても知られているが,肺マクロファージではホスホリパーゼの70%は細胞質画分に存在しており,細胞膜から遊離した形で存在している事が分った.細胞質にはホスホリパーゼAの他,イノシトール型リン脂質を特異的に水解するホスホリパーゼC,及びリゾホスホリパーゼの存在が確認された.ホスホリパーゼAの至適PHは9であり, Ca^<2+>によって活性の上昇が見られた.2.基質特異性細胞質に存在するホスホリパーゼAはコリン型,エタノールアミン型,イノシトール型のいずれのリン脂質をも水解した.脂肪鎖の異なる1-16:0-2-(^<14>C)20_〓4GPC及び1-16:0-2-(^<14>C)-18:1GPCを用い,基質特異性を検討した. Ca^<2+>の非存在下では顕著な水解の相違は見られないが, Ca^<2+>を添加すると20:4の水解は18:1に比較し,著しく上昇する事が明らかとなった.

各リン脂質分子種の物理化学的性質に基づく相違を除外する為, 16:0-^<14>C-18:1 GPCを混合したリポソームを基質として,同様な検討を行なった.複数の基質を含むアッセイ系においても,単独の基質を用いた場合と同様, Ca^<2+>添加によるリン脂質からの20:4の優先的な水解が見られた.この結果は,細胞刺激→Ca^<2+>流入→20:4の遊離と言った活性化機構でのホスホリパーゼAの役割を知る上で重要な知見を提供出来るものと考えられる.肺マクロファージを用い、オプソニン化ザイモザンによる各脂肪酸の放出へのカルモデュリン阻害剤、外界カルシュウムの影響について検討した。各脂肪酸の定量は9ーアンスリルジアゾメタンにより脂肪酸を螢光標識した後、高速液体クロマトグラフィーにより分離し行なった。カルモデュリン阻害剤であるWー7、トリフルオペラチンはオレイン酸等の他の脂肪酸の遊離を妨げる事なく、濃度依存的にアラキドン酸の放出を特異的に阻害した。ホスホリパーゼA_2の阻害剤として知られているPーブロモフェナシルブロマイド、メパクリンはいずれの脂肪酸の遊離をも阻害した所から、カルモデュリン阻害剤はアラキドン酸を選択的に水解する経路を抑制している事が明らかとなった。放射制アラキドン酸で標識した肺マクロファージを調製し、各リン脂質よりの放射性アラキドン酸の放出へのカルモデュリン阻害剤の、影響について検討した。Wー7、トリフルオペラチンはともにコリン型、イノシトール型リン脂質よりのアラキドン酸の放出を著明に抑制した。この事は肺マクロファージでのザイモザンによるホスホリパーゼA_2の活性化反応にカルモデュリン阻害剤が抑制的に働らいている事を示唆している。ザイモザン刺激によるマクロファージよりのアラキドン酸の放出に細胞外カルシュウムは必須であった。一方、オレイン酸、リノール酸の遊離は、外界カルシュウムの有無に影響されない事が明らかとなった。以上の結果より、肺マクロファージにはカルシュウム依存又さらにカルモデュリンに依存するホスホリパーゼA_2が存在しており、このホスホリパーゼは細胞活性化に伴い、活性化されアラキドン酸を選択的に水解している事が示唆された。