hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
糖鎖に作用する機能未知グリコシダーゼの構造解析とオリゴ糖創出への応用

本研究では、真核生物の糖鎖に作用する酵素であるプロセシングα-グルコシダーゼIおよびIIと相同性を有する細菌由来の機能未知酵素を材料とした。大腸菌由来酵素YgjKについて、グリコシンターゼ化という手法を用いて糖を生成させることに成功し、Glc-α-1,2-Galという糖が生成したことから、このような構造を含む糖が基質であると考えられた。また、他にThermus属等由来の酵素についての研究を行った。本研究によって、糖質に作用する酵素のうち基質を入手することができないものについて、立体構造解析とグリコシンターゼ化の組み合わせにより、その基質を同定できることが示された。近年、真核生物の糖タンパク質糖鎖に作用する酵素と相同性を有する機能未知酵素が、細菌に存在することが明らかになった。本研究は、立体構造解析および変異酵素の解析の組み合わせにより、このような細菌の機能未知酵素の基質を同定し、応用につなげることを目的としている。本年度は以下の成果を得た。(1)プロセシングα-グルコシダーゼIと相同性を有する機能未知酵素である大腸菌YgjKについて、E727A変異酵素とグルコシルα-1,2-ガラクトース(Glc12Gal)の複合体構造(E727A-Glc12Gal)を詳細に解析した。E727A-Glc12Galと野生型とグルコースとの複合体の立体構造を比較すると、触媒ドメインの(α/α)6バレル構造が変化しており、それぞれクローズ型とオープン型という異なる構造をとることがわかった。以上のことからYgjKはGlc12Gal単位を認識し、induced-fitする加水分解酵素であることが示唆された。このような触媒ドメインの大きな構造変化は、類似する構造を有するグルコアミラーゼやトレハラーゼも含めた中で、初めての報告である。また、大腸菌YgjKの他に、Thermus thermophilus HB8由来の酵素について、リガンドとの複合体の結晶化を行った。(2)プロセシングα-グルコシダーゼIIと相同性を有する酵素については、酵素を精製し、性質の解析を行った。その結果、本酵素はα-グルコシダーゼと相同性を有するにもかかわらず、グルコースのみを構成糖とする糖には全く作用せず、活性は低いものの構成糖としてガラクトースを含む糖に作用することが分かった。(3)エンドマンノシダーゼと相同性を有する酵素について、Shewanella amazonensis由来酵素の性質の解析を、前年度に引き続き行った。本研究は、N結合型糖鎖を分解する酵素であるプロセシンググルコシダーゼIやプロセシンググルコシダーゼII等と相同性を有する機能未知酵素について、立体構造を決定することによりその機能を明らかにし、応用につなげようとするものである。以下、本年度の研究成果の概要を示す。1)プロセシンググルコシダーゼIと相同性を有する酵素について:これまで研究を行ってきた高度好熱菌Thermus thermophilus HB8由来の酵素TTHA0978は、グルコシル/マンノシルグリセリン酸を分解する酵素であることが判明した。グルコシル/マンノシルグリセリン酸は、好熱菌においてストレス応答の際の浸透圧の調節に働く物質、いわゆる適合溶質として知られている物質であり、ここでは本酵素をTt8gmghと略す。今回、Tt8gmghとグルコースとグリセリン酸の複合体の立体構造を決定したところ、活性中心付近のループの構造が大幅に動いていることが明らかとなった。また、Aspergillus niger由来のプロセシンググルコシダーゼI(AbPGI)について、3.4Å分解能ではあるが立体構造の解析に成功した。これまでに本研究で構造を決定した、大腸菌YgjK、Tt8gmgh、AbPGIを比較すると、サブサイトー1を構成するアミノ酸残基は各酵素の間で保存されていたが、サブサイト+1を構成する残基は、各酵素で異なることが分かった。2)プロセシンググルコシダーゼIIと相同性を有する酵素について:前年度に引き続きガラクトースを構成糖として含む糖に作用する酵素の研究を行い、精製法を確立した。また、プロセシンググルコシダーゼIIと相同性があり、特徴的な基質特異性を有する酵素であるイソマルトデキストラナーゼについて、その立体構造を決定した。細菌は、真核生物のようなタイプのN結合型糖鎖を、通常タンパク質に付加しない。しかしながら、近年、真核生物のN結合型糖鎖に作用するグリコシダーゼと相同性が認められるタンパク質の遺伝子が、細菌に存在することが明らかになっている。本研究は、このような細菌由来の機能未知グリコシダーゼを構造生物学の手法を用いて、その基質を明らかにし、応用につなげることを目的としている。本年度は、以下のとおりの成果を得た。

(1)プロセシングα-グルコシダーゼIと相同性を有する機能未知酵素:機能未知酵素である大腸菌YgjKの立体構造については、これまでの研究ですでに決定済みである。本年度は、変異酵素を用い、β-グルコシルフルオリドとガラクトースの混合物を基質とし糖の酵素合成を行った。生成物は薄層クロマトグラフィーで分取し、得られた糖と酵素の複合体のX線結晶構造解析を行った。その結果、分解能2.0Åでの立体構造決定に成功し、生成物はGal-α-1,2-Glcであると同定された。(2)プロセシングα-グルコシダーゼIIと相同性を有する機能未知酵素:細菌の一菌株より遺伝子を取得し、pETベクターを用いて大腸菌での発現系を構築した。酵素はNi-NTAカラムによるアフィニティークロマトグラフィーで精製し、電気泳動的に単一バンドになるまで精製することができた。(3)エンドマンノシダーゼと相同性を有する機能未知酵素:Shewanella amazonensis由来酵素の詳細な酵素化学的性質の解析を行い、Glc3Man3およびGlc1Man3を蛍光物質で修飾した糖を、加水分解することを明らかにした。近年のゲノム解析技術の進歩により、さまざまな生物のゲノムが判明し、多数の機能未知酵素の遺伝子の存在が明らかになった。この中から有用な酵素を見つけることができれば、新規な物質生産につながる。本研究では、基質が入手できないような酵素の解析法として、立体構造解析および変異酵素の解析の組み合わせにより機能未知酵素の基質を同定する方法の開発を目的としている。本研究により、大腸菌の機能未知酵素YgjKはグルコシルα-1,2-ガラクトース(Glc12Gal)という糖が結合したときのみ大きな構造変化を起こすことが判明し、Glc12Galが基質であることを明らかにした。この結果、機能未知酵素の基質の同定法として、本研究で行った方法が有用であることが実証された。また、本酵素は、Glc12Galに作用する酵素として初めての報告であるとともに、基質結合とともにこのような大きな構造変化が起こることについて、関連酵素を含めて初めての報告である。成果は、学会の一般発表の他、日本応用糖質科学会のシンポジウムで発表を行い、本研究に関する総説が応用糖質科学誌に受理されている。このことから現在までの達成度は概ね順調であると考えている。平成23年度は、プロセシングα-グルコシダーゼIと相同性を有する機能未知酵素である大腸菌YgjKについては、X線結晶構造解析を行い、生成した糖を同定することに成功した。これは糖加水分解酵素ファミリー63を用いたグリコシンターゼ化としては初めての例である。プロセシングα-グルコシダーゼIIと相同性を有する機能未知酵素については、大腸菌による生産および酵素の精製法を確立した。エンドマンノシダーゼと相同性を有する機能未知酵素については、酵素化学的性質を解析することができた。これらの成果は、論文や学会で発表を行っており、現在までの達成度は概ね順調であると考えている。
短冊切りとフィブリン糊貼付による新しいヒト卵巣組織凍結保存・移植法の開発

1.卵子および卵巣組織凍結卵子の生存率と形態学的評価から凍結卵巣組織の成型に最も適するスライサーとその使用方法の改良を重ねた結果、おおむね90%の生存率・正常形態維持率を確保できるスライサーを得ることができた。この条件下で、ガラス化急速凍結法に用いる凍結保護剤の混合比の検討を実施したが、前年度までの検討で得られた凍結保護剤を越える成績は得られず、ヒト卵巣組織の凍結には専用スライサーによる1mm厚薄層切片をエチレングリコールとジメチルスルフォキシドの等量混合液15%(v/v)に浸漬し、ガラス化急速凍結を行う方法が最適であると結論された。残念ながら、当初考案した短冊切り法では十分な成績が得られなかった。2.凍結保存卵子の生存率および発生能の評価法凍結保存卵子の発生能を評価するためには、ヒト精子との受精が必要であるが、今年度卵巣組織の提供を得ることができた患者が未婚者で受精研究について同意を得ることが困難であった。そこで、3前核のため廃棄となった体外受精卵子を用いて、卵子のゲノムDNAの評価と核形分析法の検討を実施した。これは、3前核(3PN)胚の少なくとも一部は形態学的正常な初期胚に発生すること、均一な胚で研究に必要な数の供給を受けることが可能なことなどによる。この結果、conventional IVFによる3前核胚とICSIによる3PN胚とでは、発生機転とその後の細胞分裂にともなう染色体構成の変化に明かが違いが生じていることが示され、FISHと新たに開発したDNA多型分析(rolling cycling amplification法によるDNA増幅とlight cycler法を組み合わせて実施)によって、凍結解凍ヒト受精卵の核型とDNA由来を分析できることが確認された。1.卵巣組織凍結法の検討凍結保護剤の浸漬に適する成型法として、専用スライサーによる薄切法(1mm厚)のと短冊切り法(3mm厚)とについて卵子・卵巣を行い形態学的に比較した結果、薄切法がより良好であることが明らかとなった。また、種々の凍結保護効果を検討した結果、エチレングリコールとジメチルスルフォキシドの等量混合液15%(v/v)が最も良好であることが明らかとなった。また、熱伝導速度が大きくなるようにガラス化保存容器を開発し、満足できる急速冷却の速度(20-80°C間において17,000°C/皿in)を得ることが可能であることを確認した。2.凍結保存卵巣組織内卵母細胞の生存率の検討同意の得られた患者から摘出されたヒト卵巣組織を用いて凍結融解を行い、卵子を回収して形態学的に判定した結果、開発したガラス化急速凍結法で88.5%(855個/954個)と緩慢凍結法の41。7%(342個/821個)より有意に高率で、非凍結の91.9%(329個/358個)にほぼ相当する生存卵子が回収できることを確認した。3.凍結卵子評価のためのゲノムDNA増幅・解析と核型分析法の検討卵子の全ゲノムをphi29 DNA polymeraseを用いるrollingcycling amplificationにより増幅し、LightCyclerを用いるreal time PCR法による増幅高率の評価と、DNA多型解析による増幅精度の評価とを行った。その結果、卵子1個のゲノムをRCA法により2時間で50倍に増加させることが出来た。アリル欠失もほとんど見られず増幅精度も高いと考えられた。また、染色体特異的DNAプローブを用いたFISH法について検討し、凍結保存卵子の染色体核型分析が可能であることを確認した。
無限次元空間上の確率解析

確率解析に現れる無限次元空間上のOU作用素の性質を研究した。これは有限次元空間においてディリクレ形式に対応して得られる生成作用素のスペクトルギャップの準古典極限の漸近挙動の研究の無限次元版である。特に、回転対称なリーマン多様体で曲率が負で大きな変動が無い場合、全空間の作用素のスペクトルギャップがやはり測地線におけるエネルギー関数の第2変分で決定されることを示した。また、確率過程に関する微分方程式、特にラフパスで駆動される微分方程式の性質を研究した。特に反射壁のWong-Zakai近似が真の解に収束すること、反射壁を持つ場合のラフパスで駆動される微分方程式の解の存在を証明した。(1)構成的場の量子論に現れるP(φ)_2ハミルトニアンのスペクトルの準古典極限下での漸近挙動(2)反射境界条件を持つ確率微分方程式の解のWong-Zakai近似について研究を行った。(1)は空間が区間の場合、および空間が実数全体で空間切断が入ったP(φ)_2ハミルトニアンについて(i)最小固有値の準古典極限の決定(h)ポテンシャル関数が対称・二重井戸型ポテンシャルの場合に,最小固有値とその上の第2固有値の差の指数減衰オーダーがポテンシャル関数のゼロ点間のAgmon距離以上であることの証明を行い、この論文は学術誌に掲載された。(2)について説明する。係数が十分な滑らかさを持つユークリッド空間上のブラウン運動で駆動されたStratonovich型確率微分方程式を考える。このブラウン運動を折れ線近似して得られるランダムな常微分方程式の解(Wong-Zakai近似)はもとの確率微分方程式の解に概収束することが知られている。ユークリッド空間の領域で定義された内向き法線方向への反射境界条件を持つ確率微分方程式を考える。この場合のWong-Zakai近似の収束については、(i)拡散係数が定数行列で領域が有界凸領域,(ii)拡散係数,ドリフト係数、領域の境界がC^2の場合に概収束することが知られていた。実際はLions-Sznitman,税所らの研究にあるようにもっと一般な領域(凸な角を持つような凸とは限らない領域)で強い解の存在が示されているが、この場合は2011年にEvans-Stroockにより弱収束が示されていただけであったが、Wong-Zakai近似解の連続関数の空間での概収束を示すことに成功し、論文を学術誌に投稿した。この研究は反射壁SDEの駆動過程の汎関数(例えばラフパス)としての研究で重要と思われる。今年度は(1)反射境界条件を持つ確率微分方程式の解のWong-Zakai近似(2)反射境界条件を持つrough differential equation(3)双曲型空間上のループ空間上のスペクトルギャップの準古典極限について研究を行った。(1)について説明する。ユークリッド空間の必ずしも滑らかとは限らない領域(論文では(A), (B), (C)と呼んでいる条件を満たしている領域)で定義された内向き法線方向への反射境界条件を持つ確率微分方程式に対して、Wong-Zakai近似解が真の解に強収束することを証明し、それをまとめた論文が2013年に学術誌に掲載された。さらに、領域に関するより弱い条件の下(領域が凸または領域が条件(A),(B)のみをみたす)で、確率収束することを示した。また、(2)において、ラフパスでドライブされた反射壁の方程式を定式化し解の評価を行った。一意性が成立するか、連続性定理が成立するかは今後の重要な課題である.(3)においては,まず,一般のリーマン多様体における最短測地線の近傍で定義されたディリクレラプラシアンの一般化された第2固有値の準古典極限をパスのエネルギー関数の最短測地線におけるヘッシアンを用いて,決定した。さらに,双曲空間におけるループ空間で定義されたOrnstein-Uhlenbeck作用素のスペクトルギャップの存在を示した。これは,Chen-Li-Wu(JFA, Vol.259, 2010)の結果の別証明である。我々の証明方法の利点は,自然にその方法と上記の証明方法とを合わせて,スペクトルギャップの準古典極限を決定することができることにある.今年度は(1)ラフパスで駆動されたある領域で定義される反射境界条件をもつ微分方程式の解の研究、(2)Poleを持ち回転対称なリーマン多様体で定義されたループ空間上のOrnstein-Uhlenbeck作用素のスペクトルギャップの漸近挙動の研究を行った。極めて不正則なパスで駆動された微分方程式の定式化にラフパスの概念が有効であるが、法線方向への反射などで解がある領域に閉じ込められる方程式の研究はSkorohod方程式を合わせて考えねばならず、従来の枠には入らない。この方程式を定式化しかつ解の評価を与えた。更に、ラフパスがgeometricであるときは、普遍的可測な解写像が存在することを示した。確率過程への応用を考えるとこれは重要な結果である。もちろん解の一意性、連続性定理が証明できればさらに望ましい。この解写像の分布の研究を継続中である。反射壁の微分方程式は過去の道に依存した方程式と見ることもできる。そのような観点からの研究も重要であろう。(2)の研究は、前年度に双曲型空間で行なっていた研究を回転対称な枠組みで拡張した研究である。この証明では、ループ空間上でのある対数ソボレフ不等式の成立が重要な役割を担う。

このことを考慮し、対数ソボレフ不等式が成立している有限次元空間での証明(これにより無限次元空間での証明の考え方がわかりやすくなる)も行った。ループ空間で対数ソボレフ不等式を証明するには熱核の対数微分の評価が必要になる。回転対称とは限らない負曲率の空間で同様なことが成立するはずなので、その証明にも取り組んでいるところである。技術的には、これ以外にループ空間上のある末尾確率の評価を新たに与える必要もある。この研究にも取り組みたい。今年度は、前年度に引き続き,(1)ユークリッド空間の領域で定義された反射境界条件のラフパスで駆動された微分方程式(rough differential equation)の解の性質の研究、(2)リーマン多様体上の基点付きループ空間上のOrnstein-Uhlenbeck作用素のスペクトルギャップの漸近挙動の研究、(3)1次元の非整数ブラウン運動で駆動される確率微分方程式の解の近似の漸近挙動、(4)経路依存の確率微分方程式の解のオイラー近似などの研究を行った。(1), (2)については、具体的には以下の通り。(1)この方程式の解は一意とは限らないが、普遍可測写像のバージョンが存在することを前年度に示した。境界が滑らかな時は、この解写像は滑らかなパスの所で連続であることを示した。これにより、ラフパスが非整数ブラウン運動などのときに、通常の確率微分方程式の場合と同様なサポート定理が成立することがわかる。領域の境界が滑らかでない場合、解の存在が示されている領域には、ある制限(境界での法線ベクトルがあまり動かない)という不自然な条件があるため、この縛りをなくすべく研究をしている。また、一意性についても考察を行っている。(2)回転対称な計量を持つリーマン多様体上のループ空間で定義されたOU作用素のスペクトルギャップの漸近挙動が測地線におけるエネルギー関数のヘッシアンで決定されることを示した研究である。内容的には前年度と変わりが無いが、大偏差原理を用いる部分の証明を改良した。回転対称とは限らない場合を含めるため、熱核の対数微分の評価も行っている。確率解析に現れる無限次元空間上のOU作用素の性質を研究した。これは有限次元空間においてディリクレ形式に対応して得られる生成作用素のスペクトルギャップの準古典極限の漸近挙動の研究の無限次元版である。特に、回転対称なリーマン多様体で曲率が負で大きな変動が無い場合、全空間の作用素のスペクトルギャップがやはり測地線におけるエネルギー関数の第2変分で決定されることを示した。また、確率過程に関する微分方程式、特にラフパスで駆動される微分方程式の性質を研究した。特に反射壁のWong-Zakai近似が真の解に収束すること、反射壁を持つ場合のラフパスで駆動される微分方程式の解の存在を証明した。反射壁の微分方程式の解写像のひとつとして普遍可測写像が取れることがわかったことでその法則を研究できることがわかったことは、将来の研究につながる意味のある成果である。スペクトルギャップの漸近挙動の研究もある程度一般の場合に示すことができ、負曲率一般の場合にできるかもしれないという期待がもてるようになった。27年度が最終年度であるため、記入しない。
軽度認知障害の原因疾患としての海馬硬化性認知症の臨床・分子病理学的研究

海馬硬化性認知症と診断される病態の解明のために、虚血によらないと考えられる海馬神経細胞の選択的脱落を検索した。小脳プルキンエ細胞の脱落を伴わず、海馬神経細胞が比較的選択的に脱落しているアルツハイマー病例を中心にポリクローナル非リン酸化TDP-43抗体などを用いた免疫組織学的検討を行い、封入体形成を伴わず、TDP-43の核染色性を喪失している神経細胞を観察した。核の染色性の低下は、神経原線維変化と関係なく、神経細胞の脱落の程度とも一定の傾向を呈さず、海馬硬化類似所見との関係も認められなかった。虚血やけいれんによらない海馬硬化変化の継続的な検討が必要である。アルツハイマー型認知症治療の重要な標的は軽度認知機能障害(MCI)であるが、MCIの全てがアルツハイマー型認知症に進展するわけではない。最近の臨床病理学的研究からは、嗜銀顆粒性認知症や海馬硬化性認知症などもMCIの重要な構成疾患として注目されてきているが、今回の検索対象である海馬硬化性認知症の病態はほとんど判明していない。海馬硬化性認知症の病態機序の解明のためには、症例を臨床病理学的に丹念に観察する必要がある。平成20年度には、まず、病理学的に海馬硬化所見を認める認知症剖検例の抽出を行ったが、過去の剖検例では純粋に海馬硬化のみを呈する症例がほとんどなかったため、アルツハイマー型認知症およびグアム島パーキンソン認知症で、小脳プルキンエ細胞の脱落を伴わず、海馬神経細胞が比較的選択的に脱落している症例を対象とした。病理学的検討としては、最近前頭側頭型認知症や筋萎縮性側索硬化症で注目されているTDP-43と、海馬神経細胞脱落の関係を検討した。中性緩衝ホルマリン弱固定ブロックから切片を切り出し、市販ポリクローナル非リン酸化TDP-43抗体を用いて免疫染色を行うと、正常細胞の核にはTDP-43染色性を認めるが、TDP-43陽性封入体を有する細胞の核内ではTDP-43染色性が消失している。本研究の対象症例において、この核の正常染色性が失われている海馬神経細胞を観察したところ、TDP-43陽性封入体を伴わない所見が認められた。この所見は、TDP-43が細胞内に蓄積する病態とは異なる機序によって海馬神経細胞死が起こる可能性を示唆するものである。これまでの検討で、純粋な海馬硬化性認知症は剖検例で検索することが困難であったため、平成21年度は、小脳プルキンエ細胞の脱落を伴わず、海馬神経細胞が比較的選択的に脱落している症例の検討を継続した。対象は研究代表者が連続剖検を検索している認知症専門病院におけるアルツハイマー型認知症(AD)と以前から研究対象として検索しているグアム島パーキンソン認知症(PDC)である。平成20年度に観察された所見(市販ポリクローナル非リン酸化TDP-43抗体を用いた免疫染色で、本来正常神経細胞は核の染色性が保たれているが、ADやPDCの海馬ではTDP-43陽性封入体を伴わずに、核の染色性が失われている)が、様々な程度で認められ、海馬神経細胞の脱落の程度や他の神経病理所見との相関の有無を検討した。現時点では、TDP-43核染色性の消失と有意な相関をみとめた所見・現象は認められていないが、引き続き検討を継続する。軽度認知機能障害(MCI)はアルツハイマー病の前駆状態として注目を集めているが、アルツハイマー病以外のMCIを構成する疾患である嗜銀顆粒性認知症や海馬硬化性認知症に関しては臨床病理学的に十分な検討が成されてはいない。特に海馬硬化性認知症の病態については本邦ではほとんど検討がなされていないため、本研究を行った。しかし、連続剖検シリーズにおいても、病理学的に診断される海馬硬化性認知症純粋例はほとんどないことから、昨年度までの検討同様、小脳プルキンエ細胞の脱落を伴わず、海馬神経細胞が比較的選択的に脱落しているアルツハイマー病例を中心に、グアム島パーキンソン認知症例も加えて以下の免疫組織学的検討を行った。

市販ポリクローナル非リン酸化TDP-43抗体を用いた免疫染色で、本来正常神経細胞は核の染色性が保たれているが、TDP-43陽性封入体を形成する疾患TDP-43 proteinopathyでは、封入体を形成した神経細胞の核の染色性は低下することが知られている。一方、今回検索に用いたアルツハイマー病の海馬などではTDP-43陽性封入体を伴わずに、本抗体による免疫染色で核の染色性が低下した神経細胞を認めた。TDP-43は本来、核に局在し、RNAなどと結合し、RNAの安定化や選択的スプライシング、転写調節などのプロセスに関与するタンパク質であることから、核染色性を喪失していることは、細胞死と何らかの関わりがある可能性があると考え、海馬神経細胞の脱落の程度や他の神経病理所見との相関の有無を検討した。しかし、脱落の程度と核の染色性の低下所見は必ずしも一定の傾向を呈さず、海馬硬化類似所見との関係は認められなかった。
英語による読み聞かせ型多読の脳科学的効果の検証

本研究の目的は, NIRS(近赤外線分光法)と視線追跡装置を用いて脳血流量の変化と視線の動向・注視の状況を測定し,そのデータを基に,小・中・高・大という発達・学習段階の異なる学習者を対象に,英語の絵本の「読み聞かせ」における効果について,脳科学的に検証することである。本研究では,聴覚野が存在する側頭部,視覚野が存在する後頭部も含めて測定する予定であったが,2017年度の被験対象者に対する事前調査により,当初予定していた実験を行うためには,NIRSのレンタル期間を延長せざるを得ず,予算を大幅に超えることが明らかになった。そのため,2018年度は,使用機器メーカーの変更,および先行研究のレビューをもとに測定部位の縮小を検討した。その結果,母国語での「読み聞かせ」におけるNIRSを用いた先行研究の多くが前頭前野の測定を行っていることから,母国語と外国語での「読み聞かせ」の比較検証を行うことができるという点からも,今回の研究では前頭前野に焦点を当てることとした。そして,時間的制約により十分な実験を行うことが出来ないことがないように,Spectratech OEG-16(スペクトラテック社製)を購入した。そして,Spectratech OEG-16の操作方法の習得と視線追跡装置TalkEye Liteとの同時計測方法・分析手法の開発を行った。また,「読み聞かせ」に関する先行研究は母国語を対象としたものが多く,外国語での「読み聞かせ」に関する脳科学的な先行研究はほとんど見当たらないため,前頭前野における脳血流の変化が英語による「読み聞かせ」の効果であるのかを検証するために,実験プロトコルの再構築および実験で使用する課題文の再選定を行った。以上により,申請当初の予定からは遅れが生じているが,2019年度にスムーズに実験を実施するために2018年度までに準備を行ってきた。2017年度・2018年度に,1先行研究のレビュー,2実験で使用する課題文の再選定,3実験参加者の募集や説明書の作成,4実験器具の購入と操作方法の習得,5実験プロトコルの再構築を行った。また,実験器具の購入が遅れたため,現在,倫理委員会へ承認の申請中である。1の先行研究のレビューについては,前頭前野のみの測定としたため,先行研究の範囲を第二言語および外国語を対象にしたものから,母国語を対象にしたものまで拡大し,再検討を行った。その結果,外国語での「読み聞かせ」における先行研究が見当たらないため,実験結果が本研究における外国語での読み聞かせの効果なのかを明らかにするためにも,日本語の読み聞かせと英語の読み聞かせの比較検証を実施すべきだと考え,5の実験プロトコルの再構築を行った。また,これに伴い,日本語と英語の2実験で使用する課題文の再選定を実施した。3の実験参加者の募集や説明書の作成は,2017年度にほぼ終了していたため,実験器具の変更に伴う説明や実験期間等に関する記述に関して加筆・修正を行い,倫理委員会に申請している。4の実験器具の購入と操作方法の習得は2018年度に行った。実験器具の変更に伴い,同時計測を行う視線追跡装置TalkEye Liteとの同期方法,分析手順を開発する必要が生じ,その開発も2018年度に実施した。以上のような状況から,2018年度までに実験を開始することが出来なかったため,当初の予定よりやや遅れていると判断した。しかし,予算内で実験機器をレンタルから購入に変更することができたため,当初の予定よりも実験に充てる時間を大幅に拡張することが可能となり,十分に遅れを取り戻すことができると考えている。2019年度は,1発達・学習段階の異なる小・中・高・大の被検者を対象に,日本語と英語の絵本の「読み聞かせ」を実施し,脳血流量の変化と視線の動向・注視の状況の比較検証を実施する。被験者は,各20名程度を予定しており,小・中・高・大で被検者数に大きなばらつきが生じないよう留意している。さらに,2019年度に予定していた2大学生を対象にした,「読み聞かせ」型多読指導法の実践を実施し,「聞き手」側だけでなく,「読み手」の脳血流の変化を検証する実験も同時並行実施する。ただし,NIRS機器は1台しかないため,本実験では,「読み手」側に焦点を当てて,測定することとする。実験で使用する課題文を被験者数は1020名を予定している。1の実験で得られたデータを解析し,(1)日本語と英語の絵本の「読み聞かせ」による脳血流量の変化の差異,(2)英語の絵本の「読み聞かせ」による発達・学習段階の異なる被検者間での脳血流量の変化の差異,(3)英語の絵本の「読み聞かせ」の効果について検証する。また,2の実験で得られたデータを解析し,(1)英語の絵本の「読み聞かせ」における「読み手」側の脳血流の変化について検証する。さらに,1と2の実験で使用する課題文を同一のものとすることにより,(2)「読み手」と「聞き手」の脳血流量の変化の差を分析し,「読み聞かせ」型英語多読指導法の効果について検証する。実験終了後は,速やかにデータ解析を行い,その結果については,2019年度中に学会で発表するとともに,論文投稿を行う予定である。

本研究の目的は,英語による「読み聞かせ」の効果について,NIRSと視線追跡装置を用いて脳科学的見地から検証すること,さらに発達・学習段階に応じた英語絵本の「読み聞かせ」に関する指導法についての教育的示唆を得ることである。また,本研究の特色は,発達・学習段階の異なる小・中・高・大の被検者において,英語絵本の「読み聞かせ」効果を脳科学的に検証しようとしている点である。平成29年度は,1実験で用いる「読み聞かせ」用の絵本の選定,2倫理委員会への申請・同意書等の作成,3被検者の募集を行う予定であった。実際には,2・3は後述の理由で平成29年度中に完了することができなかったが,1については,以下の手順で選定を行った。まず,大学生対象の1年間の多読指導の実践の中で,大学生に人気が高かった絵本を20点選定した。その中から,小・中学生にも理解可能なものを10点にしぼり,ボランティアで行っている小学生対象の英語絵本の読み聞かせ会にて実際に読み聞かせを行い,実験用教材2点を厳選した。また,その際の小学生の反応から,未習語彙の多い小学生にとっては,絵のみで内容を理解することは難しいことが明らかになった。つまり,内容の補足説明を英語にて行ったり,同じ表現を繰り返すなど,実際の絵本に書かれれている文字情報以外の活動が小学生の内容理解度の向上には不可欠であることが示唆された。本実験では,発達・学習段階の異なるすべての被検者に対して同一教材を用いて「読み聞かせ」の効果を検証しようとしているため,内容が理解できない状態での「読み聞かせ」や反対に易しすぎる教材の「読み聞かせ」では,脳活性状態が正しく計測できないと考えられる。このような実践を踏まえ,平成29年度に英語学習歴の短い小・中学生に対する「読み聞かせ」方について検討し,実験方法の再検討を行った。1については,計画通りに教材の選定を行い,実験手順の検討を行うことができた。ただし,2・3については,計画よりやや遅れている状況である。というのも,NIRSのレンタル申請を行ったところ,大幅に予算を超えることが分かったからである。当初は聴覚野が存在する側頭部,視覚野が存在する後頭部もNIRSを用いて検証しようと考えており,実験期間を1カ月に設定していた。しかし,被験者の募集に先立ち,実験に参加可能な時期・時間帯を調査したところ,すべての被検者の実験を行うためには,2カ月3カ月の期間が必要であることが明らかになった。そのため,予算超過の可能性が生じた。そこで,現在,1使用機器のメーカー変更,2測定部位を前頭前野(ただしブローカ野を含む)のみに縮小,3被検者削減による期間の短縮を検討している。しかし,3は実験データの信頼性の問題が生じるため,1もしくは2で対応する予定である。2に関しては,測定分野を前頭前野に限った場合,「読み聞かせ」においては前頭連合野の活性は見られなかったとの報告もあるが,これらの先行研究は幼児を対象にしたもの,日本語による「読み聞かせ」を実施した時のものであるため,本研究のような英語での「読み聞かせ」や発達・学習状況の異なる被検者を対象にした実験でも同様の結果が得られるのかは検証に値すると考える。以上の理由から,使用機器を平成29年度中に決定することができなかったため,倫理委員会への申請書類を作成することができず,被験者の募集も行うことができなかったが,現在最終調整中であり,5月末までには機器の選定を終了できる見込みであるため,平成30年度以降の研究計画には大きな支障はなく,実験を実施できる予定である。
筋肉の脱神経性萎縮防止に関する実験的研究

筋肉が神経再支配を受けるまでの待機期間に,別の神経による早期からの神経支配を与えることによって脱神経性萎縮を予防することができる(babysitter効果)かどうかを検討した。Wistar系ラットにおいて、左下肢で脛骨神経から分岐して腓腹筋外側頭に分布する神経枝を剥離露出し、切断、一群ではこれをただちに縫合(神経縫合群)、もう一群では同側より採取した腓腹神経(長さ1cm)を移植して縫合した(神経移植群)。同時に腓骨神経を切断し、その中枢端を腓腹筋外側頭に埋入した。右下肢は対称として腓骨神経の埋入操作のみを除いて同じ操作を行った。また別に、神経移植群と同じ操作を行った後、2ヶ月後開創し、埋入した腓骨神経を切断する群(神経移植一切断群)も作成した。各群(n=20)について、操作終了後6ヶ月を経て、腓腹筋外側頭に対し、組織学的、電気生理学的に検討を行った。その結果、神経縫合群では湿性重量比(対照側を100%として)116%、筋線維直径比108%、等尺性収縮力113%、神経移植群では湿性重量比125%、筋線維直径比107%、等尺性収縮力102%、神経移植切断群では湿性重量比112%、筋線維直径比105%、等尺性収縮力110%であった。すなわち,babysitter効果は神経縫合群で認められたが、本来の神経の再生が遅れる神経移植群では認められなかった。これにより、神経埋入操作を加えても本来の神経による神経再支配が遅延すると、筋収縮力は増加しない(すなわち、babysitter効果がない)ことが判明した。しかし、埋入した神経を途中で切断するという新たな操作を追加すると、やや弱いながら再びbabysitter効果が認められるようになった。これらの結果より、一時的に他の神経を筋肉内に埋入させ、脱神経性萎縮を防止することはある程度は可能であるということが示唆された。筋肉が再神経支配を受けるまでの間,別の神経による早期からの神経支配を与えることによって脱神経萎縮を予防できることができる(babyshitter効果)かどうかを検討した。Wistar系ラットを用い,以下の操作を行った。左下肢で脛骨神経から分岐して腓腹筋外側に分布する神経枝を剥離露出し,これを可及的に中枢まで分離して切断,一群ではこれを直ちに10-0ナイロンにて縫合(神経縫合群),もう一群では同側より採取した腓腹神経(1cm)を移植して縫合した(神経移植群)。内側頭への分枝は切断した。同時に腓腹神経を剥離露出し,切断後その中枢断端を腓腹筋外側頭に埋入固定した。右下肢は対照として腓骨神経の埋入操作のみを除いて同じ操作を行った。4ヵ月後開創し,両群を比較した。その結果、腓腹筋の湿性重量,筋線維の直径に関しては左右で有意の差を認めなかったが(湿性重量[左/右]:神経縫合群117%,神経移植群124%,筋線維直径[左/右]:神経縫合群115%,神経移植群108%),等尺性収縮力については,神経移植群では左右で差がなかったのに対し神経縫合群では左側(神経埋入側)で約13%の増加を認めた。

これにより,本来の神経からの再神経支配(neural neurotization)遅延すると,前処置としての神経埋入操作(direct neurotization)は,筋肉収縮を増加させない可能性(すなわちbabyshistter効果がない)が示された。現在,モデルとして神経移植群を作成しており,これに一定の期間を置いて埋入した神経の切断操作を加えることを予定している。次の段階として,埋入した神経からの神経支配を断つことによって,筋縮力に差が出るかどうかを検討する。筋肉が神経再支配を受けるまでの待機期間に,別の神経による早期からの神経支配を与えることによって脱神経萎縮を予防することができる(babyshitter効果)かどうかの検討を続けた.Wistar系ラットの左下肢で脛骨神経から分岐して腓腹筋外側に分布する神経枝を剥離し,これを可及的に中枢まで分離して切断,その断端間に腓腹神経(長さ約1cm)を移植して縫合した.同時に腓骨神経を剥離露出し,切断後その中枢断端を腓腹筋外側頭に埋入固定した.右下肢は対照として腓骨神経の埋入操作のみを除いて同じ操作を行なった.1カ月後,左下肢を開創し,埋入した腓骨神経を切断,再び閉創した.3カ月後,腓腹筋の湿性重量,筋線維の直径,等尺性収縮力を測定した.腓腹筋の湿性重量の比(左/右)103%,筋線維直径の比(左/右)は101%,等尺性収縮力の比(左/右)は98%と,いずれも有意の差を認めなかった.すなわち,神経移植により神経再支配が遅延すると,別の神経により一時的に神経再支配が成立していたにも関わらず,脱神経性萎縮を十分には予防できなかったことになる.しかし,いれには,(1)神経の埋入位置(2)埋入神経切離の時期などが大きく影響することが考えられるため,今後はこれらの設定を種々に変化させて予防効果の有無をみる必要がある.現在,埋入神経の切離時期を2週目,6週目,8週目と変化させたモデルを作成し,検討中である.筋肉が神経再支配を受けるまでの待機期間に,別の神経による早期からの神経支配を与えることによって脱神経萎縮を予防することができる(babysitter効果)かどうかの検討を続けた。Wistar系ラットの左下肢で脛骨神経から分岐して腓腹筋外側に分布する神経枝を剥離し,これを可及的に中枢まで分離して切断,その断端間に腓腹神経(長さ約1cm)を移植して縫合した.同時に腓骨神経を剥離露出し,切断後その中枢断端を腓腹筋外側頭に埋入固定した.右下肢は対照として腓骨神経の埋入操作のみを除いて同じ操作を行なった.2ヶ月後,左下肢を開創し,埋入した腓骨神経を切断,再び閉創した.3ヶ月後,腓腹筋の湿性重量,筋線維の直径,等尺性収縮力を測定したが、腓腹筋の平均湿性重量比(対照側を100%として)は103%,平均筋線維直径比(左/右)は101%,平均等尺度性収縮力比(左/右)は98%と,いずれも有意の差を認めなかった.しかし、6ヶ月後の評価では平均湿性重量比112%、平均筋線維直径比105%、平均等尺性収縮力110%と、軽度ながらbabysitter効果を認めた。すなわち、神経移植群では消失したbabysitter効果は、埋入した神経を途中で切断するという新たな操作を追加することにより、やや弱いながら再び認められるようになった。これらの結果より、一時的に他の神経を筋肉内に埋入させ、脱神経性萎縮を防止することはある程度は可能であるということが示唆された。
香川県金山産サヌカイト製石器の広域流通システムの復元と先史経済の特質の検討

金山のサヌカイト原産地遺跡の発掘調査で旧石器時代から弥生時代中期までの石器生産活動を明らかにした。金山での石器生産活動と消費地での石器生産活動の比較から、岡山県、香川県以遠の遠隔地への流通に専業集団を復元し、瀬戸内海の海運とともに金山産サヌカイト製石器の広域分布の要因とした。金山産サヌカイトの蛍光X線回折による成分分析を行い、東西南北4地域で区分されることを明らかにした。これによって、金山の各地域と消費地の石器生産活動の結び付きをより詳細に跡付けることができる。(1)金山サヌカイト原産地遺跡の発掘調査(2)出土遺物の整理分析(1)考古学的分析b遺跡構造の分析(2)岩石学的分析b力学的性質の解析金山のサヌカイト原産地遺跡の発掘調査で旧石器時代から弥生時代中期までの石器生産活動を明らかにした。平成18年度の調査研究の目標は、初年度として石器石材のサヌカイトの産出地である金山全域及び周辺遺跡における石器製作に関係する遺物の分布調査と予備的発掘調査(発掘調査地点の設定と遺物の採集)を行うことであった。調査研究の結果、地表にしかも多量に露出しているサヌカイトから地域的に粗密はあるが中腹から山麓のほほ全域に石器製作に関わる活動痕跡が認められた。その活動は総じて原石からの石器石材の製作(石核の製作)と石核からの石器素材の製作(素材剥片の製作)が主体となっており、成品までの製作は稀であった。しかし、地域によってその技術に特徴が見出せた。また肉眼観察ではあるが、北半分と南半分で原石の質に差異が認められた。そこで、次年度の発掘調査箇所として東部、西部、南部、北部の各1箇所に2m四方のグリッドを設け、本年度は表面に露出している遺物を採集し、その石器生産技術を精査した。東地区は縄文時代系(洗谷式)が主で弥生系(金山式)が従、北地区から西地区は弥生系が主で縄文系は僅かに認められる程度であった。南地区では縄文系と旧石器系(瀬戸内技法、縦長剥片剥離技法)が混在した。本年度の調査研究における技術形態学的部門の成果は、1)消費地での石器生産の分析からすでに知られていた石器生産技術の第一工程を原産地で確認したこと2)金山の地域間で技術の異同があること3)金山で旧石器の生産が始めて確認されたこと以上の3点に総括された。また岩石学部門での成果は、旧石器時代の石器製作技術が始めて確認された南部のグリッドで採集した原石30点の蛍光X線成分分析を行ったところ、金山産サヌカイトの既知の成分とは異なる結果を得た事であった。これは従来の成分分析研究によると、旧石器時代の消費地遺跡では金山産サヌカイト製石器はないとする知見に変更を予測させる重要なデータである。平成19年度の調査研究の目標は、18年度の金山の分布調査で選定された東地点で石器製造に関して、時代的変遷を跡づける層位データを収集することに求められた。東1地点の3m四方の発掘調査坑では土壌の形成は極めて低調で土層は認められず地表下3mまで掘り下げたが、サヌカイトの層にわずかに粒子の細かい土が混じる状態であった。沢状地形に大量のサヌカイトが断絶無く流れ込み、窪みを埋めたものと判断される。地表を形成する50cmの石群層には、盛んな石器製作活動と弥生時代の石器素材の製作技法である〔金山技法〕が認められ、多量のかつ風化を殆ど被っていない大型のサヌカイト原石が伴うのに対し、それ以下の石群層には低調な石器製作活動と縄文時代後半の石器素材製作技法である〔洗谷技法〕が認められ、多量の小型の摩耗の進んだサヌカイト原石が伴っていた。階段状に掘り下げたため調査深度は3mを限界とした。そのレベルでは旧石器時代の堆積には至らなかった。このような東1地点の堆積状態から、金山全域の石器製造の大勢を想定することが可能となった。現地表の状態は弥生時代に近いこと、金山の南部を除いて現地表を形成するサヌカイト群には海抜100mから上方、山頂直下で弥生時代の石器素材の製造技術が顕著であることから、旧石器時代は南部を中心に成品の段階に至る石器製造が行われ、縄文時代になると、主に中腹以下で石器素材の段階までの石器製造、弥生時代になると、中腹以上を主に、ほぼ全域で石器素材の段階までの石器製造が行われたとみられる。東1地点のサヌカイトの蛍光X線分析を行った。その結果、微量元素の成分比が同高度の南地区のものと同じで、同じ東地区で高度を下げたところのものとは異なることが判明した。高度によって成分の異なることを明らかにしたことは重要な成果である。消費地のサヌカイトで検証すると、金山のサヌカイト採集集団が特定できるからである。

平成20年度の調査研究の目標は、平成18年度の金山の分布調査の結果選定された5つ(東1・東2・北1・西・南)の発掘調査地点のうち東2と北1の2地点の発掘調査を行い、各地点の石器製造に関して、その時代的変遷を跡づける層位データを収集することに求められた。東2地点に2m四方の発掘調査区を設けた。調査地点は急傾斜を呈しており、調査深度は上方端部で2m、下方端部で1mに至った。地層は地表から第5層まで6層に分かれたが、第4層まではサヌカイト原石、石核、剥片、石器半製品等のサヌカイトで形成される石群の層で、山の傾斜に従いながらも、傾斜面上の通常の堆積と異なって、上方に厚く、下方に薄い堆積をみせる。ところが最下層の第5層は土を主体とする地層で、そこに上層の石群層と同じ構成のサヌカイトと土器片が含まれるが、堆積は山の傾斜に逆行する。この変則的な層の堆積状況は、金山の急斜面に対し、緩やかに斜め下方にオープンカットされた跡への堆積を想定すると理解しやすい。発掘調査地点は、サヌカイト採掘坑の中に位置していることになる。金山での最初の採掘坑の検出である。その時期は、調査は坑の床に達していないので確定はできないが、出土遺物から弥生時代の可能性が高い。北1地点に2m四方の発掘調査区を設けた。50cmの深度まで地表から第2層までの3層に分かれたが転石ではない大きなサヌカイト原石群が検出された。石器石材生産地点と密接に係る原石分布状態を示す重要なデータである。東2地点、北1地点のサヌカイト原石、山頂南部の原石、山頂南西下方サヌカイト露頭の蛍光X線分析を行った。1年度から3年度までの分析で、金山サヌカイトは西・北群と東・南群に2分される可能性が高くなった。この結果を消費地の金山サヌカイトで検証すると、石材生産・流通集団の展開を跡付けられる。平成21年度の研究目標は、研究最終年度として、原産地遺跡金山に予定した発掘調査の完了と『研究成果報告書』の作成とした。発掘調査は4地点に設定したが、北1、東1、南1各地点共に有史前に形成されたサヌカイト原石、安山岩を含む安山岩風化土の基盤層を検出して終了した。東1地点は調査可能深度3mをもって既に19年度に終了した。この調査によって、金山の基本層序と石器生産活動の変遷がはじめて明かとなった。地表形成石層で弥生時代中期の石核・大型剥片の生産、中間層上部石層群で弥生時代前期・縄文時代晩期の石核と、それに加えて東部に限っては打製石斧の生産、中間層下部土層群で縄文時代前半の石核・剥片・石器の生産、南部に限って旧石器時代の石核・剥片・石器の生産が確認されたのである。また、出土したサヌカイト原石の蛍光X線成分分析によって、金山サヌカイトは東西で2分される事を確定した。この金山での石器生産活動と消費地での石器生産活動を地較して、金山産サヌカイトの広域流通システムを復元し、先史経済の特質に言及したものを研究成果報告書にまとめた。中四国の地域社会の展開が比較的明かな縄文時代後期において、金山産サヌカイトの石器生産と流通の展開には津島・岡大遺跡群タイプと帝釈峡遺跡群タイプがあり、前者では地域社会の派遣メンバー、後者では専業集団が各地域社会に金山産サヌカイト製石器石材を搬入し、ついで分配によって地域社会メンバーに行き渡ったとした。金山から50km圏内に前者、圏外に後者のシステムが働いたが、後者のシステムを集団間の分配と位置付け得ることに先史経済の物質を求め、同システムと産出規模、瀬戸内海の海運が金山産サヌカイトの広域流通の要因であることに始めて言及したものである。
光格子中のボース気体における超流動の崩壊

本研究では、光格子中のBose気体において量子揺らぎが超流動の崩壊に及ぼす影響を詳細に調べることを目的としている。二年度目である本年は「一次元リング状光格子中のBose気体における永久流の崩壊」という興味深い現象に関して、共同研究者のAnatoli Polkovnikov(Boston Universityに所属)と共に、巨視的量子トンネル効果による超流動流のダイナミクスを以下のように詳細に調べた。巨視的量子トンネル効果の研究において、トンネル確率を計算する理論手法としてインスタントン法が広く利用されている。しかしながら、この手法が巨視的量子トンネル現象におけるトンネル確率をどれほど精密に予言できるかは明確にはわかっていなかった。というのも、多体系のシュレーディンガー方程式の時間発展を厳密に計算することが一般的に困難であるため、インスタントン法と厳密解の比較がなされてこなかったためである。そこで本研究では、インスタントン法が巨視的量子トンネル効果のトンネル確率を定量的に記述できることを数値的厳密計算との比較により確証した。TEBD法でリング状Bose-Hubbard模型のダイナミクスを厳密に計算し、超流動流が巨視的量子トンネル効果によって二つの異なる巻き数をもつ巨視的可峻別な状態間をコヒーレントに振動しうることを示した。この振動から抽出したトンネル確率をインスタントン法の結果と比較し、系の実効的なプランク定数が十分に小さいときにはインスタントン法の誤差が10%以下になることを明らかにした。また、TEBD法による超流動流の巨視的量子トンネル効果の実時間ダイナミクスを直接的にシミュレーションすることで、二つの巨視的可峻別な状態間の振動に伴って凝縮体波動関数の位相が局所的に2πだけ変わるという「phase slip」が起こっていることを見出した。本研究では、光格子中の一次元ボース気体の輸送現象を研究した。一次元ボース気体は、磁気トラップに閉じ込められたボース凝縮体に対して非常に強い光格子を二方向(y方向とz方向)に印加することでつくられる。近年の実験では、軸方向(x方向)にも光格子を加えて、このような一次元ボース気体の輸送特性が調べられている。なかでも、NISTの実験グループは一次元ボース気体の二重極振動が光格子の深さに依存してどのように変化するのかを調べ、a)格子が低いときでも二重極振動の減衰が顕著であること、b)格子を深くしていくにつれてボース気体の運動が減衰振動から過減衰に転移することを報告した。一次元性からくる非常に強い量子揺らぎのため、これらの実験結果は平均場理論の結果と全く一致せず、量子揺らの効果を考慮した理論研究が必要とされていた。そこで我々は、Time-evolving block decimation法をボース・ハバード模型に適用することでこの一次元ボース気体の二重極振動をシミュレーションした。この手法では、一次元格子系のダイナミクスを厳密に極めて近い制度で記述できる。重心運動の減衰率を光格子の深さの関数として計算し、実験結果と定量的な一致を得た。我々は、過減衰への転移が起こるのは強い量子揺らぎによって超流動流の崩壊が早められているためだということを明らかにした。
網羅的エピジェネティクス解析による脳腫瘍幹細胞特異的な遺伝子発現調節機構の解明

幹細胞研究の進展に伴って、脳腫瘍幹細胞(brain cancer stem cell ; BCSC)の存在が証明され、抗癌剤や放射線治療に抵抗性の細胞であるため、重要な治療標的として解析が急速に進められている。しかし、現在まで確立されたBCSC分離・精製法がないため、BCSCの分子制御機構の詳細は不明であり、またBCSC特異分子の発見には至っていない。そこで、第一に様々なグリオーマ組織からBCSCを分離してその性状解析を行った。その結果、グリオーマ腫瘍検体から、長期培養可能なBCSC細胞株を3種類樹立することに成功し、in vitroでのスフェア形成能、自己増殖能、および多分化能を有すること、さらに免疫不全マウス脳内に細胞移植後の腫瘍形成能を検証した。つぎに、メチル化感受性制限酵素を用いたRLGS(Restriction Landmark Genomic Scanning)解析により同定されたHOXD9遺伝子が、グリオーマにおいてプロモーター領域が高頻度にメチル化されていることを検証した。また発現解析の結果、HOXD9遺伝子は正常脳組織や正常神経幹細胞おいてほとんど発現が見られず、一方BCSCにおいて高発現していた。さらに、HOXD9遺伝子の機能解析を行った結果、HOXD9はBCSCの増殖に関与し、siRNAを用いて遺伝子発現をノックダウンすることによりBCSCを細胞死へ誘導することが明らかになった。現在、HOXD9遺伝子の発現選択性(正常脳組織で発現せずBCSCで高発現していること)を利用して、HOXD9遺伝子プロモーターを組み込んだ蛍光遺伝子発現ベクターユニットを作成中であり、今後は、このベクターを利用した新たなBCSCの精製法の開発、新規BCSC抗原の同定を進める予定であり、BCSCを標的とした治療法の開発を目指す。幹細胞研究の進展に伴って、脳腫瘍幹細胞(brain cancer stem cell; BCSC)の存在が証明され、抗癌剤や放射線治療に抵抗性の細胞であるため、重要な治療標的として解析が急速に進められている。そこで、本年度は、BCSC特異的遺伝子の単離同定とその発現調節機構の解明を目指して、第一に様々なグリオーマ細胞株およびグリオーマ組織からBCSCを分離してその性状解析を行った。その結果、グリオーマ細胞株(SK-G-1)のHoechst33342排出能の高いSide Population (SP)分画からBCSC細胞を分離し(論文投稿中)、また、グリオーマ患者の腫瘍検体から長期培養可能なBCSC細胞株の樹立に成功した。これらの細胞が、in vitroで神経幹細胞培養条件におけるスフェア形成能、自己増殖能、および多分化能を有すること、さらに免疫不全マウス(NOD-SCIDマウス)脳内に細胞移植後の腫瘍形成能を検証した。第二に、BCSC特異的遺伝子を単離・同定するため、メチル化感受性制限酵素を用いたRLGS (Restriction Landmark Genomic Scanning)法を行なった。その結果、染色体DNAのプロモーター領域に存在するCpGアイランドが、正常脳組織と比較して、グリオーマにおいて高頻度にメチル化されているBCSC関連遺伝子を同定した。
健診受診者の背景・主観的行動と、生活習慣病に係る客観的検査値との関係の経年的分析

健康診断や人間ドックは重要な予防医学的アプローチであり、疾病の早期発見・早期治療はもとより、疾病罹患前の健康管理においても有効な手段である。特に、生活習慣病は有病率が高いため、抑制できた場合の恩恵が大きく、個人はもとより、行政の立場からも将来の医療・介護に係る負担を軽減させることが期待される。本研究は、経年的な生活習慣の変化と検査値をはじめとする生理的状態の変化の関連について検討し、受診者個人あるいはその属性グループに応じた効果的な保健指導のあり方に対する有用なエビデンスを提供することを目指すものである。