hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
スパイラル構造型ダメージレス固定砥粒工具の開発

著者らは、粗面ガラスの鏡面研磨のための変形可能な研磨層を有する新しい固定研磨工具を単一プロセスで提案している。研磨中、研磨層中の結合剤の変形は不均一砥粒の切れ刃の突出を滑らかにする。この層は、ガラスの梨地表面を切り取るためのΦ4-6μmのダイヤモンド粒子と、化学反応を促進して表面粗さを改善するためのΦ2μmのセリア粒子とを含む。研磨実験により、今回の新しい工具は、1回のプロセスで梨地面を表面粗さ4nmのRaで鏡面化できることを確認した。本研究の目的は、スクラッチで発現する硬脆材料の潜傷を防止するダメージレス固定砥粒工具の開発である。目的を達成するために、平成25年度は、1)導電性砥粒の凝集対策技術の開発、2)目詰まりに起因する気孔の充填方法の確立について検討した。その成果を以下に述べる。1)めっき浴に耐性のあるフッ素系の水溶性樹脂と導電性砥粒を混合し添加すれば、樹脂量6mL/300mLで凝集が僅かに緩和され、16mLで工具表面にほぼ均一な砥粒層が得られた。さらに、添加量を26mLにすると、析出量は減少に転じたが、砥粒は均一に分散し、砥粒層はポケットレスとなった。水溶性樹脂の添加量で、砥粒の析出状態を変えられることが分かった。砥粒の析出量は、めっき時間(3から5分に変化)で約1.5倍、電流密度(16から30A/dm2に変化)で約2倍となり、これらのファクターで調整できることを確認した。これにより、砥粒の凝集性は回避され、めっき条件で砥粒層の複層化が可能であることが分かった。2)複層化(分散化)した工具は、気孔やポケットが形成されているため、直接使用すると目詰まりを起こしてしまう。その対策として、1)で使用した水溶性樹脂を超音波と回転を付与して気孔部に充填(粘度120.2mPa.s)した。樹脂充填の最大の目的は、加工圧力の分散化による高精度加工である。この充填工具で純アルミの加工テストを行った結果、加工抵抗が3N前後で樹脂は剥離し、気孔が露出した。そこで、樹脂の粘度を38.8mPa.sに下げ、気孔部の底部まで充填させるようにした。加工後の砥粒層は、20N以上でも気孔部の樹脂は剥離せず、ほぼ平滑化された。今後は、この条件で工具の製造を行う。平成26年度は1)砥粒のバラツキを抑制するメディア砥粒の開発、2)メディア砥粒の複合めっき技術の確立、3)スパイラル構造の固定砥粒工具の製造と品質、4)加工面精度および工具の能率・寿命の評価について検討した。平成25年度の研究成果で導電性砥粒の分散化が可能となり、高砥粒率の複層化工具を製造した。この工具の気孔に水溶性樹脂を充填し純アルミを加工した結果、Ra7.8nmの高精度な面を達成した。しかし、この工具をガラス加工に適用しても、電着層の硬度や砥粒のバラツキの影響でクラックが発生する。砥粒のバラツキの影響を抑えるためにメディア粒子(シリコーン粒子、φ10-30um)に砥粒を埋め込んだメディア砥粒(弾性砥粒)を作製した。シリコーン以外のメディア粒子(アクリル系、ウレタン系)は、めっき液で溶出した。作製したメディア砥粒も導電性砥粒と同様にフッ素系の水溶性樹脂の添加で分散化でき、複層化が可能となった。そこで、φ5-12umのダイヤで製造したメディア砥粒工具の気孔部に、水溶性樹脂にダイヤ(φ4-6um)とセリア(φ2um)を混ぜ充填した。気孔の充填剤は、目詰まりの抑制と弾性による力の分散化およびケミカル作用の促進である。この工具で梨地面ガラスの加工を行った結果、一部ではあるがRa=4nm、Rt=31.4nmまで透明加工できることが分かった。しかし、弾性砥粒のメディア砥粒工具でも硬度やバラツキの大きいダイヤの切れ刃は、ガラスの母材よりも低硬度の水和層(工具と接触しているガラス表面の層で0.1um以下)を超えて深く切り込み、ガラスの延性領域を超えた。これを解決するために、今後は、電着層にセリアを使用したメディア砥粒(弾性砥粒)工具とNi粒子にセリアを電着したメディア砥粒工具を適用し梨地ガラスの全面鏡面加工を行う。スパイラル構造を基材としたメディア砥粒工具の開発を行ってきた。開発の目的は、ガラス等の脆性材料を機械研磨する際に問題になる砥粒径のバラツキによるスクラッチを抑える工具を開発し、機械研磨の代替加工につなげたい。そのために、バラツキのある砥粒に弾性を持たせたメディア砥粒の固定工具を開発した。一方でメディア砥粒の固定化は、電着層にランダムな有限の気孔が形成されるため、切屑の目詰まりが発生する。これもまた、スクラッチの原因となることから、電着時に得られた気孔は全て樹脂等の充填剤で埋める必要がある。この2点を考慮した気孔充填形メディア砥粒工具を提案し、粗面ガラスの鏡面加工を試みた。

メディア砥粒には、樹脂にセリアを埋め込んだタイプとNi粒子にセリアを電着した2種類が有効であるが、気孔の充填剤をサポートする電着層には、弾性より強度が求められることから、後者のNiとセリアのメディア砥粒を選定した。研磨抵抗12-14N、切込み量(1um/1回)、工具送り100um/sで繰り返し加工した結果、梨地面のガラスをすべて鏡面加工できた。工具送りを3um/sにすれば、粗さはさらに向上する(Ra4nm)。充填に使用したφ4-6umのダイヤで梨地面のトランケートが進行し、粗さの向上に伴って充填層は平滑化された。この平滑化に伴い、研磨抵抗は分散し、イオン交換水とセリア砥粒およびガラスの化学的作用が顕著になり、鏡面化できたと考える。本研究で提案した工具は、充填層の平滑化により不均一な砥粒(φ5-12um)でも均一化が可能となったこと。気孔の目詰まりを除去するために、ケミカル作用を発揮させる充填剤を使用すれば、粗面ガラスを鏡面化できること。また、Ni-セリアのメディア砥粒は、電着層および充填層のサポート剤として有効であることなどがあげられる。スパイラル構造を基材としたメディア砥粒工具の開発を行ってきた。この研究では、ガラス等の脆性材料を機械研磨する際に問題となる砥粒径のバラツキによるスクラッチを抑える工具を開発し、機械研磨の代替加工につなげたい。そのために、バラツキのある砥粒に弾性を持たせたメディア砥粒固定工具を提案した。一方でメディア砥粒の固定化は、電着層にランダムな有限の気孔が形成されるため、切屑の目詰まりが発生する。これもスクラッチの原因となるため、電着時に現れた気孔はすべて樹脂等の充填剤で埋める必要がある。この2点を考慮した気孔充填形メディア砥粒工具を提案し、粗面ガラスの鏡面加工を試みた。メディア砥粒には、樹脂に砥粒を埋め込んだタイプとNi粒子にセリアを電着した2種類が有効であるが、気孔の充填剤をサポートする電着層には、弾性より強度が求められることから、後者のNiとセリアのメディア砥粒を選定した。研磨抵抗12-14N、切込み量1um/1パス、工具送り100um/sで繰り返し加工した結果、梨地面をすべて鏡面化した。工具送りを3um/sでRa4nmが得られた。充填に使用したΦ4-6umのダイヤで梨地面がトランケートされ、粗さの向上に伴って充填層は平滑化される。平滑化に伴い、研磨抵抗は分散し、イオン交換水とセリア砥粒およびガラスの化学的作用が顕著になり、鏡面化できたと考える。提案した工具は、充填層の平滑化により不均一な砥粒(Φ5-12um)でも切れ刃の切込み量を一定にできる。気孔の目詰まりを除去するために、ケミカル作用を発揮させる充填剤を使用すれば、粗面ガラスを鏡面化できる。Ni-セリアのメディア砥粒は、電着層および充填層のサポート剤として有効であることを示した。著者らは、粗面ガラスの鏡面研磨のための変形可能な研磨層を有する新しい固定研磨工具を単一プロセスで提案している。研磨中、研磨層中の結合剤の変形は不均一砥粒の切れ刃の突出を滑らかにする。この層は、ガラスの梨地表面を切り取るためのΦ4-6μmのダイヤモンド粒子と、化学反応を促進して表面粗さを改善するためのΦ2μmのセリア粒子とを含む。研磨実験により、今回の新しい工具は、1回のプロセスで梨地面を表面粗さ4nmのRaで鏡面化できることを確認した。砥粒のバラツキの影響を抑制するメディア砥粒(弾性砥粒)を作成できたこと。また、メディア砥粒の複合めっきにおいてフッ素系の水溶性樹脂添加で分散めっきが可能となり、メディア砥粒(弾性砥粒)工具の複層化が可能となったこと。複層化した電着層には適度な気孔が創生されることで、樹脂等の充填が可能とり、加工抵抗が分散化できたこと。製造したメディア砥粒工具で梨地面のガラスの一部を透明加工できたこと等があげられる。メディア砥粒工具の研究成果を国外で発表する。
真核生物における染色体DNA複製の開始機構

真核生物の染色体DNAの複製開始は、サイクリン依存性キナーゼ活性(CDK)の低い時期に起こる複製開始点でのpre-Replicative Complex (pre-RC)の形成と、CDKの活性化とともに起こるDNA合成酵素の複製開始点への結合に分けることができる。本研究では、出芽酵母の両過程に必要な因子を精製し、それぞれの間での結合能を調べた。Pre-RCの形成は、6つのサブユニットからなるOrigin recognition complex (Orc)が複製開始点に結合し、その後ヘリケース活性を示すMcm複合体(Mcm27よりなる)が結合する。この反応にはCdc6とCdt1が必要である。我々は、Orc, Mcmを出芽酵母から、Cdc6,Cdt1を大腸菌発現細胞から精製し、相互作用を調べた。その結果、Cdc6及びCdt1がMcm, Orcに結合することが分かった。Cdt1とOrcの結合は、本研究により明らかになったものである。次に、DNA合成酵素の複製開始点への結合に必要なSld3,Cdc45を大腸菌から、Dpb11,Sld2を酵母から、GINS (Sld5,Psf1,Psf2,Psf3のサブユニットから成る)をバキュロウィルスによる昆虫細胞発現系から、精製した。複製の開始に伴って、Mcm, Cdc45,GINSの強固な複合体が形成することが報告されているが、この複合体形成においてSld3が重要な役割を果たしていることが分かった。即ち、Cdc45,GINS単独ではMcmに結合しないが、Sld3を加えると結合することが出来る。このことは、Sld3を介してまずCdc45,GINSがMcmに結合することを意味する。さらに、Dpb11がOrcと結合することも分かった。これは、合成酵素がどのように複製開始点にリクルートされるかの解明への糸口となるものである。出芽酵母では、CDK(Cyclin Dependent Kinase)活性の増加とともにpre-RC(pre-Replicative Complex)の形成した複製開始領域へは、GINS(Sld5,Psf1,Psf2,Psf3よりなる)、Dpb11,Sld2タンパク質が結合する。そしてin vivoでの相互作用解析から、これらタンパク質はPolεとともにSld3を介してpre-RCに結合すると考えられている。ざらに結合したタンパク質群のうち、Dpb11とSld2は複製開始領域へ結合したまま、複製フォークとともには移動しない。本研究では、複製開始領域への複製タンパク質の集合機構を分子のレベルで理解するため、まず複製に必要なタンパク質間の相互作用の解析を行う。そのため本年度は、複製開始領域に結合する出芽酵母のOrc複合体を昆虫細胞で発現させ,精製を行なった。Orcは6つのサブユニットからなるので、2つづつのサブユニットを1つのバキュロウィルスベクターにクローニングしたものを昆虫細胞に重感染し、1つのサブユニットに付けたHisタグにより最初の精製を行なった。続いて,Orc1,0rc6の抗体によるウェスタンブロッティングと複製開始領域を含むDNA断片への結合能を指標に精製を進めた。現在までに,少量ながら6つのサブユニットからなるOrc精製標品を得ることが出来たが,効率の良い精製は今後の課題である。精製したOrcと他の複製タンパク質間の相互作用解析も,順次進めてゆく予定である。真核生物の複製開始領域には、サイクリン依存性キナーゼ(CDK)活性の低いM期後期からG1期にpre-Replicative Complex(pre-RC)が形成し、CDK活性がG1期後期に増加すると多数の複製タンパク質がpre-RCに集合して、複製が開始する。pre-RCは、複製開始領域へ結合するOrc(Origin recognition complex : Orc16のサブユニットからなる)とMcm(Mcm16からなる)から形成されており、Mcmの複製開始領域へのローディングにはOrcとともにCdt1とCdc6が必要である。CDK活性に伴ってpre-RCに集合してくる複製因子群も、これらpre-RCの構成因子との相互作用により複製開始領域への集合が起こっていると考えられる。そのため、pre-RCの構成因子であるOrcをまず出芽酵母よりTAP(tandem affinity purification)法により精製した。Mcmも同様な方法により部分精製したところである。さらに、Cdt1及びCdc6に関しては大腸菌で発現させ、精製標品を得ている。これらと、CDK活性増加後に集合してくる因子との相互作用を調べ始めている(集合してくる因子の精製は、他のプロジェクトにより進行中)。その結果、Dpb11とOrcが結合するという予備的結果を得た。今後、この結合の詳細な解析や他の因子とpre-RC構成因子の相互作用について詳細な解析を進める予定である。

Cdt1とOrcの結合は、本研究により明らかになったものである。次に、DNA合成酵素の複製開始点への結合に必要なSld3,Cdc45を大腸菌から、Dpb11,Sld2を酵母から、GINS (Sld5,Psf1,Psf2,Psf3のサブユニットから成る)をバキュロウィルスによる昆虫細胞発現系から、精製した。複製の開始に伴って、Mcm, Cdc45,GINSの強固な複合体が形成することが報告されているが、この複合体形成においてSld3が重要な役割を果たしていることが分かった。即ち、Cdc45,GINS単独ではMcmに結合しないが、Sld3を加えると結合することが出来る。このことは、Sld3を介してまずCdc45,GINSがMcmに結合することを意味する。さらに、Dpb11がOrcと結合することも分かった。これは、合成酵素がどのように複製開始点にリクルートされるかの解明への糸口となるものである。
ナノ結晶分散金属ガラスの破壊挙動の分子動力学解析とそれに基づく高延性化指針の検討

金属ガラスは極めて高い降伏応力や特殊な機能特性を有するものの,マクロな延性が乏しいという欠点を有する.常温での金属ガラスの変形と破壊はせん断帯の生成と伝ぱによって支配されているため,その詳細を解明して対策を考えることが必要である.ここでは,まず,切欠きを含む平板にモードIIの変形を加えることで,切欠き底からせん断帯を伝ぱさせる大規模な分子動力学シミュレーションを実施し,せん断帯内部の温度と応力の時間変化を詳細に評価した.そして,分子動力学シミュレーションの結果に基づき,金属ガラス中のせん断帯を粘性流体を含むモードII型き裂としてモデル化することで,不安定伝ぱを生じる可能性のある限界せん断帯長さを計算した.そして,その結果から実験的に観察されているせん断帯の長さをうまく説明できることを示した.さらに,金属ガラスが示す圧縮下と引張下での延性の大きな違いを,それぞれの場合の限界せん断帯長さの違いから説明した.また,初年度に引き続き,ナノ結晶を含む材料中のせん断帯伝ぱ挙動に関する計算も実施し,せん断帯の伝ぱ抵抗をJ積分を用いて評価した.その結果,せん断帯の伝ぱ挙動を効率的に変化させるためには,せん断帯の幅に対して十分なサイズを有する結晶粒子が必要であることが明らかになった.本研究によって,金属ガラスの延性を向上させるためには,(1)限界せん断帯長さを長くすること,(2)せん断帯を捕捉する機構の導入が重要であることがわかった.(1)を達成するためには,不均質性によって低い応力レベルからせん断帯を生成させることが有効であり,(2)を達成するためには,適切なサイズの軟質介在物の導入が特に有効であると考えられる.金属ガラスは極めて高い降伏応力や特殊な機能特性を有するものの,引張り伸びが乏しいという欠点を有する.近年,金属ガラス相中に限られた範囲の粒径のナノ結晶粒子を適切な体積分率で分散させることで,延性特性が飛躍的に改善されることが示されている.しかしながら,高延性を発現する最適な粒径や体積分率が存在する原子構造論的な原因や,粒子分散による延性改善メカニズムの詳細は明らかにされていない.また,これまでに創製されている材料では組成が大きく異なるため,結晶体積分率/粒子径/界面強度等のそれぞれが,マクロな力学特性にどのような影響を与えているのか明らかにされていない.本研究では,異なる内部構造を有するナノ結晶分散金属ガラスの破壊挙動の分子動力学解析を実施し,ナノ結晶粒子のき裂進展挙動,特に靭性に与える影響を究明することで,高延性を有するナノメタルを開発するための明確な指針を与えることが目的である.本年度は,まず,これまでに開発を行なった並列分子動力学プログラムを用いて,平面的に広い準3次元金属ガラスモデル中の切欠き底からのせん断帯の伝ぱ挙動の解析を行なった.そして,せん断帯が伝ぱし始めると局所的な温度が急激に上昇して変形抵抗が低下するため,せん断帯が伝ぱし始めると停止しないことを示した.その後,ナノサイズの結晶粒子を挿入した材料に対して同様の解析を実施し,ナノ結晶粒子にせん断帯が衝突すると,停止,分岐,あるいは屈曲するため,直線的な伝ぱは生じなくなることを明らかにした.金属ガラスは極めて高い降伏応力や特殊な機能特性を有するものの,マクロな延性が乏しいという欠点を有する.常温での金属ガラスの変形と破壊はせん断帯の生成と伝ぱによって支配されているため,その詳細を解明して対策を考えることが必要である.ここでは,まず,切欠きを含む平板にモードIIの変形を加えることで,切欠き底からせん断帯を伝ぱさせる大規模な分子動力学シミュレーションを実施し,せん断帯内部の温度と応力の時間変化を詳細に評価した.そして,分子動力学シミュレーションの結果に基づき,金属ガラス中のせん断帯を粘性流体を含むモードII型き裂としてモデル化することで,不安定伝ぱを生じる可能性のある限界せん断帯長さを計算した.そして,その結果から実験的に観察されているせん断帯の長さをうまく説明できることを示した.さらに,金属ガラスが示す圧縮下と引張下での延性の大きな違いを,それぞれの場合の限界せん断帯長さの違いから説明した.また,初年度に引き続き,ナノ結晶を含む材料中のせん断帯伝ぱ挙動に関する計算も実施し,せん断帯の伝ぱ抵抗をJ積分を用いて評価した.その結果,せん断帯の伝ぱ挙動を効率的に変化させるためには,せん断帯の幅に対して十分なサイズを有する結晶粒子が必要であることが明らかになった.本研究によって,金属ガラスの延性を向上させるためには,(1)限界せん断帯長さを長くすること,(2)せん断帯を捕捉する機構の導入が重要であることがわかった.(1)を達成するためには,不均質性によって低い応力レベルからせん断帯を生成させることが有効であり,(2)を達成するためには,適切なサイズの軟質介在物の導入が特に有効であると考えられる.
病理組織学的手法を用いた関節拘縮の病態解明と理学療法学的治療の効果判定

ラット膝関節拘縮モデルを用いて関節拘縮の病態を明らかにし,関節可動域運動を施行する事による効果判定を組織病理学的に観察する事を目的に研究を行った。関節の不動化により,関節後部関節包では膠原線維束の間隙が狭小化し,滑膜細胞の増生,線維芽細胞様の紡錐形細胞が膜様に増生し関節軟骨を覆っている像が観察された。不動期間中に関節可動域運動を施行する事によりこれらの変化は生じるものの軽度であり,関節可動域運動は関節構成体にも影響を及ぼす事が示唆された。本年度は,短期間から長期間にわたって関節不動化を行ったラット膝関節拘縮モデルを作成し,膝関節内の関節構成体やそれに関わる血管系,並びに神経系の組織がどのように変化しているのかを病理組織学的および免疫組織化学的に観察し,拘縮の病態像を明らかにする事を目的に研究を行った。ラット膝関節をギプスにより不動化したものでは,半月板周囲から関節腔に線維芽細胞と微少な毛細血管に富む膜様組織(肉芽様組織)が侵入しているのが観察され,また軟骨表面にも線維芽細胞からなる組織が増生しているのが観察された。これらは一部で癒着しているものも見られ,関節軟骨と癒着した部分では軟骨基質が失われ,軟骨細胞も観察されなかった。また,多糖類染色を行ったところ,軟骨表層では染色性が消失しており,軟骨基質の多糖類が産生されていない事を示していた。後部関節包は肥厚と線維の密生化を認めた。創外固定により屈曲位で不動化したものでは,ギプス固定のものより軽度ではあるが同様の所見が観察された。また,伸展位で不動化したものでは関節軟骨に対し荷重が掛かると考えられる部分で軟骨の菲薄化が観察された。どちらの群においても多糖類染色では軟骨が接する部分(荷重が常に掛かっていると考えられる部分)で染色性が消失しており,関節軟骨に何らかの変化が生じている事が示唆される。中枢神経麻痺による関節不動では,関節腔内への膜様組織(肉芽様組織)の侵入,後部関節包では線維の密生化が観察されたが,末梢神経損傷による関節不動では関節軟骨の変化は殆ど認められず,しかしながら後部関節包の肥厚/線維の密生化は生じていた。関節不動化による研究は散見されるが,実験の手法が様々であり,一致した見解は見られていない。今回,5種類の関節不動化を行ったが,様々な像を示している。これは拘縮の成因により病態,ひいては治療手技も考慮する必要が示唆される。本年度は,短期間から長期間にわたって関節不動化を施行し関節拘縮を作成したラットに対して関節可動域運動,物理療法(温熱療法など)の理学療法学的治療を行い,その結果関節構成体,神経組織にどのような変化(治療効果)が認められるかを病理組織学的に観察し,理学療法手技の効果を明らかにする事を目的に研究を行った。2週間の関節不動化により,ラットの膝関節伸展制限は平均77.2±7.4度,対照群では平均19.3±2.8度であった。拘縮を生じさせたラット膝関節に対し,バネ秤を用いて定量的に伸張を加え,関節可動域運動を施行した。この時,伸張する力は予備実験にて麻酔下で健常ラットの後肢を伸展させるのに必要なカ(1N)とした。可動域運動は実験期間中に創外固定を除去し3分間施行し施行後は再び創外固定を装着した。その結果,実験期間終了後の伸展制限は51.0±4.3度と固定群に対して改善が見られたが,対照群とはまだ差が見られた。関節構成体の病理組織学的検討では固定のみの群で滑膜組織・肉芽組織の増殖による軟骨の置換像と肉芽組織中に血管の走行とうっ血が観察されたが,運動を行った群では固定群と比較して線維芽細胞の増生は軽度であり,軟骨の置換像は観察されなかった。また,トルイジンブルー染色を行ったものでは,固定のみの群では軟骨基質中の多糖類産生がほぼされていない事が観察されたが,運動を行った群では表層のみで染色性が低下しているものの,大部分の軟骨で多糖類産生が保たれている事が観察された。関節包では両群に明らかな差は見られず,肥厚と線維の密生化が見られた。末梢神経損傷による関節不動モデルに対し今年度は創外固定による不動化を追加した。その結果,膝関節伸展制限は神経切断群で41±3.5度,神経切断・不動化群では48.8±6.2度であった。両群ではほぼ関節構成体に変化は見られず,関節構成体の変化に末梢神経が関与している可能性が示唆された。今年度は関節可動域運動が関節構成体に及ぼす影響について研究を行った。対象には9週齢のWistar系雄性ラット20匹を用いた。

ラットは8週で購入し1週間飼育環境に慣れさせた後に実験を開始した。ラットを無作為に治療群1(n=10),治療群2(n=10)の2群に分け,両群共に右膝関節を創外固定を用いて膝関節屈曲120度で不動化した。この時,股関節,足関節には制限がないことを確認した。ラットはケージ内を移動する事が可能であり,水と餌は自由に摂取する事が可能であった。両群共に不動化を行った次の日から全身麻酔下で膝関節に対しROM. Exを行った。ROM. Exの手法は始めの5秒間を膝関節屈曲位で保持し,次の5秒はバネばかりを使用して膝関節を約1Nで伸展し保持した。この時,治療群1は股関節屈曲0度,治療群2は股関節屈曲120度で運動を行った。この運動を3分間,週に6回施行した。実験期間は2週間とし,実験期間終了後,先行研究と同様に膝関節伸展制限の測定,標本作製を行い,画像撮影を行った。膝関節の伸展制限は,治療群1では平均50.2±4.3度,治療群2では平均48.2±2.4度であり,両群に有意差は見られなかった。今回の実験結果と先行研究で作製した固定群(平均77.3±7.4度)とは有意差を認め(p<0.05),今回施行した可動域運動が可動域制限を抑制した事が明らかとなった。組織病理学的検討では治療群の軟骨表層では膜様の組織は限局的に観察され,肉芽様組織の関節腔内への侵入もほとんど見られなかった。関節腔内に出血を生じたものが見られたが,これは可動域運動に伴う軟部組織の損傷によって生じた可能性が考えられた。今回の実験期間では,可動域制限の要因は筋によるものとする報告があるが,可動域運動を施行する事により筋に対する影響のみならず関節構成体の変化を抑制する可能性が示唆された。動物を使用した種々の後肢膝関節拘縮モデルの作製を確立し,当初の計画通りに関節可動域運動を施行して関節構成体の変化を観察する事が出来た。24年度が最終年度であるため、記入しない。膝関節不動化により坐骨神経周辺の神経周膜が密生化する事,また筋間脂肪・膝蓋下脂肪体の萎縮が観察され,神経周膜の変化,脂肪の萎縮に対する関節可動域運動の効果を関節構成体の変化と平行して観察する。また,短期(2週間)の実験により実験期間を長くしても変化が見られない可能性があるため,長期に渡る実験を行わずに短期(2週)の実験期間中での頻度について検討する事としたい。
ゼブラフィッシュ視神経再構築におけるＦａｃｔｏｒＸＩＩＩＡの関与とその作用機序

アダルト哺乳類の中枢神経は一旦損傷を受けると不可逆的ダメージとなり、細胞はアポトーシスに陥り、やがて機能喪失に至る。ところが魚類中枢神経は、損傷後の軸索再生・修復が可能であり、機能も完全に回復する。ここでは、魚類視神経を実験的に損傷し、タンパク架橋酵素であるトランスグルタミネースファミリーの一つ、Factor XIII-A(FXIII-A)遺伝子の発現とその軸索再生への関与について検討した結果、FXIII-Aが視神経損傷後いち早く視神経および網膜で活性化され、創傷治癒・視神経軸索再生に深く関与することがわかった。ゼブラフィッシュを含む魚類の中枢神経軸索は、ダメージを受けると独自の再生機構が作動し、軸索の再生および機能の完全なる修復が可能である。本研究では、タンパク架橋酵素としての作用を有するトランスグルタミナーゼファミリーに属し、血液凝固因子の一つでもあるFactor XIIIが、視神経損傷後の魚類網膜中で軸索再生過程に発現が増加することを明らかにし、その機能について検索を行った。その結果、視神経をクラッシュ後約1時間後にはFactor XIIIの酵素活性ユニットであるAサブユニット(FXIII-A)遺伝子発現が視神経損傷局所において上昇することをin situ hybridizationで確認した。また、この損傷部位にはアストロサイトやマイクログリア細胞が集積し、これらの細胞にFactor XIIIの酵素活性ユニットであるAサブユニットの活性が認められた。一方網膜内では、視神経損傷後310日をピークにFXIII-A遺伝子発現の増加が網膜神経節細胞に認められ、タンパクレベルでもこの増加は確認できた。視神経再生過程におけるこれらの網膜および視神経局所におけるFXIII-Aの機能を解析するため、網膜組織を用いたFXIII-Aタンパク強制発現実験を行った。その結果、FXIII-Aタンパクは、再生初期の段階での神経突起出芽(sprouting)を促進する効果を有することが判明した。しかし、視神経損傷後数日経過した網膜を使用し、同様の実験を行った場合にはsprouting促進効果は得られなかった。これは網膜で既に内在性のFXIII-Aタンパクが充分発現しているためにsprouting効果がマスクされてしまうためと考えられた。魚類の中枢神経は、軸索が損傷を受けても自然の状態で再生関連分子が発現増加し、最終的には完全なる機能回復が可能である。本研究では、魚類の視神経を中枢神経再生モデルとして用い、視神経損傷後の視神経および網膜での修復過程において、発現増加の見られる血液凝固因子FactorXIII-Aサブユニット(FXIII-A)について、再生関連分子としての関連性も含め、その機能について検索を行った。視神経をクラッシュ後約1時間後には、視神経損傷局所においてFXIII-Aの発現が増加することをin situ hybridizationおよび免疫組織化学染色で確認した。この発現増加には、損傷部位に集積したアストロサイトやマイクログリア細胞が深く関与しており、これらの細胞が、視神経の損傷局所でのFXIII-A発現細胞として集積することを突きとめた。網膜組織を用いたExplant cultureへのFXIII-Aタンパク添加実験では、強制発現実験の結果と同様、再生軸索が突起を再形成する視神経再生の初期の過程で、神経突起の形成にFXIII-Aが重要な役割を果たすことが判明した。また、この効果はヒトFXIIIーAタンパクをマウス網膜神経節細胞由来の細胞株,RGC-5 cellへの添加実験でも確認することができた。魚類の中枢神経は、神経損傷後に完全なる軸索再生・修復が可能である。本研究では特にタンパク架橋酵素としての作用を有するTransglutaminase(TG)ファミリーに着目し、魚類視神経修復過程でのその動態について検索を行った。TGファミリー各タイプに特異的なFITC標識合成ペプチド基質を視神経損傷部位に反応させたところ、FactorXIIIの活性が他のTG1やTG2に先駆けて損傷後早期に発現上昇していることが判明した。視神経での、FactorXIII酵素活性レベルの上昇が遺伝子学な発現上昇にも裏打ちされるものであるかどうかを確認するため、視神経よりtotal RNAを抽出しこれによりcDNAを合成、シーケンス解析を行った。この際、ゼブラフィッシュは非常にサンプル採取量が少ないため、金魚を用いて視神経サンプルを調整し遺伝子解析を行った。この結果、金魚視神経に損傷後発現したFactorXIIIは744のアミノ酸からなるタンパクであり、FactorXIIIの酵素活性ユニットであるAサブユニット(Factor XIII-A)であることが推定された。mRNAレベルでのFactorXIII-Aの変動を視神経および網膜でのRT-PCR、in situ hybridizationで検索したところ、視神経損傷部位では1時間後から、網膜では損傷後3-7日をピークに発現が上昇することが確認された。タンパクレベルでのFactorXIII-Aの発現を検索した結果、FactorXIII-Aは84kDaのタンパクであり、発現の局在は網膜神経節細胞であることがわかった。

またmRNAレベルでの変動と同様、損傷後3-10日をピークに発現が上昇することが判明した。以上の結果より、魚類視神経損傷後のFactorXIII-Aの発現上昇が、視神経軸索再生過程において重要な役割を果たしていることが示唆された。哺乳類成体ではひとたび中枢神経軸索が損傷を受けると神経細胞はアポトーシスに陥り、最終的に機能不全に陥る。対照的に、魚類では中枢神経軸索再生が可能であり機能も完全に回復する。我々は魚類視神経の損傷後、網膜および視神経において発現が上昇する分子についてターゲットを絞り検索を進めてきたが、この中で血液凝固因子の一つであるFactor XIIIのAサブユニット(FXIII-A)が、再生関連分子の一つとして機能することが示された。FXIII-Aは、視神経損傷を受けた魚類の視神経局所および網膜神経節細胞で発現が上昇し、新たな神経突起形成を促し、さらにその再生軸索の再伸長を促進することが明らかとなった。そこで次に、今年度はFXIII-Aをさらにマウス視神経損傷モデルでどう作用するかを調べるため、リコンビナントタンパクを眼球内にインジェクションし、経過を観察した。その結果、哺乳類の損傷視神経に対しても、リコンビナントFXIII-Aタンパクを投与することによって、コントロール群に比較してFXIII-A投与群は視神経の再生が促進するという結果が得られた。神経化学今年度に目標にしていた、視神経再生過程におけるFactorXIII-Aの生理学的機能の解析については、網膜での発現は再生突起のsproutingに関与するという結果が得られ、目標はほぼクリアできたと考える。視神経損傷局所の発現については、創傷治癒という観点から、もう少し別の機能の可能性も考え、さらに検討をしたいと考える。魚類視神経の再生過程におけるFactorXIII-Aの生理学的機能を解析することにより、網膜でのFactorXIII-Aの発現は、網膜神経節細胞からの神経突起形成(sprouting)に重要な役割を果たすという結果が得られた。また、この神経突起形成促進作用は、ラット由来のRGC-5 cellを用いた培養細胞への添加実験においても同様の作用を有することを確認できた。さらに、視神経損傷局所に発現するFXIII-Aは、集積するグリア細胞から供給され、これは再生軸索の伸長に関与することが判明した。23年度に目標にしていた内容はほぼクリアできた。ただ、サンプルとしてゼブラフィッシュを用いる予定であったが、1尾あたりの視神経サンプルが非常に少なく、RNA抽出段階で困難を極めたため、シーケンス解析等を金魚に切り替えて実施した。
出芽酵母におけるゲノム工学技術の開発とゲノムエボリューション

出芽酵母を対象に、一度の形質転換操作で染色体の任意領域に重複あるいは欠失を導入できる方法を用いて、ゲノワイドに200 kb毎の染色体部分重複および部分欠失を導入し、任意領域の部分異数性が表現型に与える影響を解析した。その結果、特定の染色体領域の部分重複や部分欠失が産業上重要となるエタノールや高温、酸ストレス耐性の向上につながることを見出した。本研究の成果は、ゲノム工学技術を用いた新たな微生物育種法の確立につながることから、発酵産業の発展に貢献すると期待される。本研究では、産業上重要な微生物である出芽酵母を材料にして、独自に開発したゲノム工学技術を駆使し、細胞の多様な特性を生み出す原動力となる染色体の部分重複および部分欠失をシステマティックに導入し、染色体の部分異数性と細胞特性の関連を解析することを目的とした。染色体の部分重複実験については、使用していた親株に異常が見られたことから、昨年度までに構築した部分重複株についても新たに構築し直し、第1番ー7番および第10番ー16番染色体の部分重複を行った。新たに、第1番染色体[1bpー100kb]の重複は硫酸ストレス耐性を付与し、第3番染色体[1bpー160kb]と[160kbー315kb]の重複はエタノールおよび硫酸ストレス耐性を付与することを見出した。部分重複染色体の安定性を調べたところ、非常に安定に保持されることが分かった。染色体の部分欠失実験については、欠失予定領域がミニ染色体化された1倍体細胞を構築し、野生型株との2倍体形成後、ミニ染色体の脱落によって部分欠失株を構築するという方法に切り替え、第8番、13番、14番、15番、16番染色体の部分欠失を行った。第14番染色体[600kbー800kb]の部分欠失により、高温耐性とエタノール耐性を付与することが明らかとなった。一方、1倍体細胞における非必須遺伝子領域の欠失実験からは、第4番染色体[1bpー30kb]、[1470kbー1490kb]および[1500kbー1530kb]の欠失が高温や乳酸耐性を付与することも明らかとなった。酵母のエタノールや酸、高温ストレス耐性化は、発酵生産の高効率化に重要となる。「ゲノムの特定領域の部分重複・部分欠失による細胞機能の飛躍的な改良」という本研究の成果は、新たな微生物育種法の確立につながることから、真核細胞のゲノムの機能解明に資するだけでなく、発酵産業の発展にも貢献すると期待される。本研究では、独自に開発したゲノム工学技術を用いて、細胞の多様な特性を生み出す原動力となる染色体の部分重複および部分欠失をゲノムワイドにシステマティックに誘導し、染色体の部分異数性と細胞特性の関連を解析することを目的とした。染色体の部分重複実験については、染色体部分重複技術を確立し、第2番、4番、7番、8番、10番、13番、14番、15番、16番染色体の約200 kb毎の重複についてそれぞれ終了した。染色体の部分異数性が付与するさまざまな細胞特性について調べたところ、第13番染色体[200 kb - 400kb]の重複はエタノールストレス耐性を示すことを見出した。第16番染色体[1 bp - 200kb]、[600 kb - 800kb]および[800 kb - 948 kb]の重複は硫酸ストレス耐性を示すことを見出した。第15番染色体[1 bp - 200kb]の重複は高温ストレス耐性を誘導した。一方、染色体の部分欠失実験については、直接欠失法では二倍体細胞において偽陽性が多く出現し部分欠失株構築のスピードを著しく低下させたことから、バックアッププランである染色体分断技術による欠失領域のミニ染色体化とミニ染色体の脱落による部分欠失構築法に切り替え、第9番、15番、16番染色体に約200 kb毎の欠失を導入した株をそれぞれ構築した。一倍体細胞を用いた欠失実験からは、データベースからは予想できない新たな合成致死や機能重複のある遺伝子群の探索と解析を可能とするデータを得た。酵母のエタノールや酸、高温ストレス耐性化は循環型社会を目指したバイオマスからの基幹化合物の生産の効率化に重要となることから、本研究からゲノム工学的アプローチによるこれまでにない新たな微生物育種法が確立できれば、バイオによる循環型社会の構築を一層進展させると期待される。染色体の部分重複法については首尾よく確立できたが、部分欠失法では、部分欠失の候補株は多数得られるものの、二倍体細胞を使用していることから、当初は導入した欠失誘導用断片のターゲティング効率が低下し偽陽性が予想以上に多数出現した。

そのため、構築が少し遅れたが、バックアッププランとして用意しておいた染色体の分断技術による欠失領域のミニ染色体化とその後のミニ染色体の脱落による部分欠失構築法に切り替えることにより効率よく構築できている。細胞特性の解析からは特定の形質に正の効果をもたらす領域の同定も順調に進んでいることから、次年度中に遅れを取り戻することができると考えている。次年度は、部分重複・欠失株の構築と酵母の生育や産業的に重要な形質である高温ストレス耐性、低温ストレス耐性、高浸透圧・高糖濃度ストレス耐性、酸ストレス耐性やエタノール生産性などを引き続き網羅的に評価する予定である。そして、産業的に有用な上記の形質に正の効果をもたらすと同定された領域を組み合わせその相乗効果についての検討を進め、ゲノム工学的アプローチによるこれまでにない新たな微生物育種法の確立を目指す。また、染色体の部分重複・欠失による細胞特性変化の因果関係をゲノム工学的手法や分子生物学的手法を用いて解析する予定である。次年度使用額が3,767円生じたが、これは、研究を進めていく上で必要に応じて研究費を執行したため当初の見込み額と執行額は異なったが、研究計画に変更はなく、前年度の研究費も含め、当初予定通りの計画を進めていく。次年度は、上記した研究の進展のために必要な理科学機器、PCRによる重複・欠失誘導断片調製のためのオリゴヌクレオチドプライマー、PCR複製酵素やエタノール測定試薬などを購入する予定である。
高機能化微生物を利用した木質バイオリファイナリー技術の構築

リグノセルロース資源からのバイオ燃料生産を目的とし、環境低負荷型のバイオリファイナリーツールとしての新たな生物的処理法の開発を目指した。白色腐朽菌であるPhanerochaete sordida YK-624株の分子育種を試み、高活性リグニン分解菌を作出した。さらに、白色腐朽菌によるエタノール発酵菌のスクリーニングを試み、Phlebia sp. MG-60株が選抜され、脱リグニン、糖化、発酵をワンポットで可能なプロセスを提案した。(1)糖化前処理工程用微生物の作成高活性リグニン分解菌Phanerochaetesordida YK-624株リグニン分解時に特異的に発現しているタンパク質のプロテオーム解析を行ったところ、分子量35kDa・pI6.4のタンパク質の高発現を観察した。本タンパク質の同定を試みたところ、アルコールデヒドロゲナーゼであることが示唆された。また広葉樹未晒クラフトパルプ残留リグニン分解時に特異的に発現しているタンパク質のプロテオーム解析を行ったところ、主にリグニン分解酵素の産生が認められた。一方、これらと同時に本菌由来5-アミノレブリン酸シンターゼ、1,4-ベンゾキノンリダクターゼ遺伝子の取得にも成功した。木材腐朽菌キチリメンタケの形質転換系の構築を試み、プロトプラスト生成後、PEG法により形質転換が可能であることが示唆された。(2)酵素糖化工程用多糖分解酵素の開発日本の代表的な針葉樹であるスギ・ヒノキ腐朽材より得た糸状菌株のスクリーニングを行い、セルロース分解能の高い菌株の単離を行った。針葉樹腐朽材より採取した試料を、唯一の炭素源としてスギ木粉を含んだ選択培地上に接種し、生育した菌の単離を行った。さらに、得られた菌株を針葉樹クラフトパルプ上に接種し、一定期間培養後、パルプ重量減少率を測定し、既知の木材腐朽菌ならびにセルラーゼ高産生菌であるTrichoderma reesei数株と比較することで、より高い重量減少率を示す菌株を選抜した。その結果、針葉樹パルプ重量減少率の高い菌株を複数取得し、T. reeseiよりもCMCアーゼ活性の高い菌株を複数選抜した。(3)未探索の遺伝子資源から新規多糖分解酵素群をスクリーニングするために、自然環境より二つの試料を採取し環境ゲノムを抽出し、これを用いてメタゲノムライブラリを構築した。今後多糖分解酵素のスクリーニングに供する。(1)糖化前処理工程用微生物の作成高活性リグニン分解菌Phanerochaetesordida YK-624株をベースとして、5-アミノレブリン酸シンターゼ(ALAS)遺伝子恒常発現のマンガンペルオキシダーゼ(MnP)生産に及ぼす影響について検討したところ、ALAS遺伝子恒常発現株ではMnP産生量が増加することが判明した。また、木材腐朽時に高発現しているalcohol dehydrogenase遺伝子プロモーターを用いて、MnPを木材腐朽時に高発現する菌を作出し、そのリグニン分解特性を評価したところ、得られた形質転換株全てにおいてリグニン分解能の向上が認められ、特にリグニン分解選択性が飛躍的に向上することが判明した。(2)酵素糖化工程用多糖分解酵素の開発21年度にセルロース高分解性糸状菌として選抜されたPestalotiopsis属およびArthrinium属菌より粗酵素液を調製し各種酵素活性を測定した.その結果,Trichoderma reeseiよりもタンパク質量あたりのFPase活性が高いことが示され,高機能なセルラーゼを産生していることが示唆された.また,培養基質としてアビセルではなくスギ木粉を用いた場合に、Arthrinium属菌はより高いFPase活性産生能を示すことが見出された.(3)メタゲノムライブラリー土壌中微生物の環境DNAより作成したメタゲノムライブラリよりも、セルロースなどを用いて短期間の集積培養を行った培養系より得た環境DNAを用いてライブラリを構築する事により、より高効率に多糖分解酵素が獲得できることを見出した。結晶性セルロースあるいはパルプを用いた集積培養系から、少なくともセルラーゼを4種、キシラナーゼを2種獲得できた。(1)糖化前処理工程用微生物の作成高活性リグニン分解菌Phanerochaete Sordida YK-624株をベースとして、5-アミノレブリシ酸シンターゼ遺伝子高発現株を作出し、そのマンガンペルオキシダーゼ(MnP)産生能を調査したところ、野生株と比較して約3倍のMnP産生能を示す遺伝子導入株の取得に成功した。さらに、MnPがリグニンを分解する際、基質として必要となる過酸化水素を生産する酵素であるglyoxal oxidaseの遺伝子を高発現する株を作出し、本株のリグニン分解特性を調査したところ、野生株より優れたリグニン分解特性を示すことが判明した。(2)褐色腐朽菌キチリメンタケKU-70株は、難腐朽性バイオマスであるスギ材を速やかに分解する優れた特性を持つが、高分子リグニン分解能は有していない。

そこで本菌に高分子リグニン分解能を持たせることを目的として、KU-70株における遺伝子導入系を新たに構築した。効率良く遺伝子導入を行うにあたって重要な要素となるプロトプラスト調製法、遺伝子導入マーカー選択法等を種々検討した結果、ハイグロマイシン耐性遺伝子をマーカーとして容易に任意の遺伝子を導入可能な系を構築した。本遺伝子導入系を用いて白色腐朽菌由来の高分子リグニン分解酵素(YK-Lips)ゲノムDNAを導入した結果、本遺伝子がmRNAとして異種発現していることを確認した。(3)セルロースを直接発酵できる白色腐朽菌としてPhlehia sp.MG-60を選抜し、リグニンを含むリグノセルロース原料(広葉樹未晒クラフトパルプ、針葉樹未晒クラフトパルプ、新聞紙)から酵素添加なしに直接エタノールを生成することを示した。ヘキソース(グルコース,マンノース,ガラクトース,フルクトース)を発酵基質としたとき,いずれの糖もPhlebia sp.MG-60により効率よくエタノールに変換された(それぞれ理論収率の86.9,79.0,79.5,78.2%の収率),酵母で発酵が困難なキシロースを発酵基質とした場合には、理論収率の65.0%のエタノールが生産された,白色腐朽菌による脱リグニン前処理と組み合わせることで、脱リグニン同時糖化発酵が可能であることが示された。(4)九州大学内の土壌を採取し、土壌から直接あるいは結晶性セルロースを炭素源とした集積培養系よりメタゲノムライブラリーを作成し、スギに対して高い活性を有するセルラーゼの獲得を試みた。少なくとも4種の新規一次配列をもつセルラーゼ遺伝子を獲得した。これらの内二つのセルラーゼは結晶性セルロースに対して活性を示し、脱脂スギ木粉に対してもセルラーゼ活性を示した。
蝸牛神経切断後の再生に関する研究

1)蝸牛神経切断の解剖学的特性を理解するため、モルモット灌流固定し、頭蓋骨を摘出し、脱灰固定ののち、脳の連続切片を作成した。またモルモットを用いて開頭による蝸牛神経切断を確実に行う方法を確立した。手術はケタミン・ザイラジン投与下に清潔操作で行い、術後死をかなり軽減できた。2)蝸牛神経を切断し、1ヶ月後、3ヶ月後に灌流固定ののち、蝸牛神経および内耳の組織検索を行った。コントロールでは神経断端は瘢痕組織になり、再生の所見はほとんどなかった。内耳感覚上皮の変性が著しく、またラセン神経節も広範に変性していた。神経賦活因子を投与したところ、ラセン神経節の変性は若干軽減傾向が見られたが、内耳感覚上皮の障害は不変であった。現在このデータ処理を終え、論文にまとめている。3)蝸牛神経切断後に神経縫合し、頭蓋内に浸透圧ポンプを用いて神経賦活因子を投与したが、コントロールに比べ、断端部に有意な再生所見の亢進は得られなかった。4)本研究の関連項目として、細胞増殖を検討する手技を内耳で確立し、論文にまとめた。また遺伝子導入の新たな手技の開発・副作用の予防も論文にまとめた。脳幹インプラントにおける画像診断の共同研究を放射線科と開始し、新たな画像診断手技を開発した。この手技をまず人工内耳患者に応用し、その有効性を論文に報告した。1)蝸牛有毛細胞の経時的な障害の程度を評価するため、中耳内にゲンタマイシンを投与して数日おきに断頭し、surface preparationで有毛細胞のカウントを行い、またパラフィン切片によるアポトーシス細胞のカウントを行った。この結果細胞障害は10日後には確立し、アポトーシスは2,3日後がピークとなることが判明した。2)Math1を組み込んだアデノウィルスベクターを内耳障害を作成したモルモット蝸牛内に投与し、支持細胞から有毛細胞に変化するか調べた。その結果、一部の支持細胞が有毛細胞に変化し、聴毛もきれいに再生することが判明した。さらにこの細胞に向かって求心性神経線維が伸びていくことも明らかとなった。有毛細胞障害後の支持細胞からの有毛細胞への変化を促すため、浸透圧ポンプで各種神経賦活因子を投与し、その影響を評価している状態である。また神経繊維の増殖についても、観察期間をより延長して、最終的に新たなシナプス結合ができるか検討中である。3)エタクリン酸およびカナマイシン投与による高度有毛細胞障害をモルモットおよびラットで作成し、その後BrdUを連続投与し、蝸牛内の細胞分裂の状態を調べた。モルモットでは5日目においてすでにらせん靭帯および蝸牛神経周囲において分裂細胞が増え、10日目にはより顕著になった。またラットの10日目の変化はモルモットより顕著であった。しかしいずれの動物においてもコルチ器内に新しい分裂は生じないことが判明した。
培養神経細胞を用いた学習・記憶機能をもつバイオチップ開発の基礎的研究

連想学習の神経的基礎を明らかにする目的で、これまでウミウシを用いて光と回転で条件づけし、その神経系の変化を明らかにしてきた。本補助金による研究課題は、これまで明らかにしてきた知見を基礎として、ウミウシの神経細胞を単離、培養し、その後人為的操作により、神経細胞相互に機能的回路を形成させ、そこでの学習・記憶様式を工学的に応用しようとするものであった。条件づけ学習(連合学習)は視覚系と前庭系の間の感覚受容器相互の神経干渉によるもので、これには種々のタンパク質キナーゼがGTP結合タンパク質のリン酸化を促進し、イオンチャンネル活動を修飾することが明らかになっている。従って学習・記憶の基礎としては、対象とする神経細胞の種類に関わらず、神経細胞の作る回路において、細胞膜タンパクのリン酸化を調節すれば,そこでの情報処理様式が変わるはずである。このような構想のもとで研究を進めた。当初in-vivoでの学習と同様に視細胞と有毛細胞を近接培養することを計画したが,特に有毛細胞は単離後、軸索の伸張は観察されなかった。このような理由から,対象を中枢神経系の細胞に変更し,その近接培養を行い以下の諸点が明らかになった。(1)ウミウシ神経細胞は無脊椎動物の神経培養で広く用いられているL-15(リボヴィツ液)を基本として,神経接着因子ラミニンを添加すると34日で軸索は50μm程度伸張すること,(2)近接培養した細胞相互には,シナプスが形成され機能的連絡ができること。ここで形成されるシナプスの生理的意義は未検討である,(3)細胞軸索の成長方向を制御するため,培養基板に深さ2μmの溝を徴細加工すると,軸索はこの溝に沿って伸張することから有用性を確認した。従って(2)で形成されたシナプスの性質があらかじめ判っていれば,想定される情報処理の形式から特定のパターンで溝を作っておけば有用な神経回路を設計することも可能である。生物の情報処理様式を利用するバイオコンピュ-タを構成するためには神経系で行なわれている情報処理アルゴリズムを従来型の計算機にインプリメントする方法と、演算装置、記憶装置をより生物的に構成する方法がある。本研究では後者の立場に立って代表者が長年研究を進めてきたウミウシ神経細胞を単離、培養し、人為的に神経回路を構成することによって神経系の情報処理様式を直接利用することをめざしている。ウミウシは光刺激を条件刺激として重力刺激を無条件刺激として古典的条件づけができることから連想学習・記憶のモデル動物として多くの研究がある。学習獲得による行動の変容は感覚受容器、中枢神経系、筋肉という経路で伝えられたが、最初に認められる著明な変化は一種の視細胞であるB型視細胞において観察され、これは感覚受容器相互(視細胞と有毛細胞)の情報干渉によって生じる。本研究では光と重力による連想学習系を培養細胞を用いて再構築することを目的として平成3年度には最適な培養条件を検討した。これまで本研究で用いるウミウシ神経系は単離培養されたことがなかったため、多くの神経培養が行なわれている同じ軟体動物動物のアメフラシ、カタツムリの研究結果を参考にした。培養溶液は神経細胞の成長に必要な種々のアミノ酸を含むリボヴィッツ液(L15)を基本として神経突起の発芽を促進する蛋白質であるコンカナバリンA、神経成長因子ラミニンを含む液溶中において神経細胞の成長が最も著しかった。ただ、この際当初ねらった視細胞、有毛細胞の成長は中枢神経細胞の成長に比べ悪かった。

これは従来いわれているように視細胞、有毛細胞等の感覚受容器は中枢神経細胞より分化が進んでいるためと考えられることから、今後弱齢の動物から摘出した細胞を培養する必要があると思われる。連想学習の神経的基礎を明らかにする目的で,これまでウミウシを用いて光と回転で条件づけし,その神経系の変化を明らかにしてきた.本補助金による研究課題は,これまで明らかにしてきた知見を基礎として,ウミウシの神経細胞を単離,培養し,その後人為的操作により,神経細胞相互に機能的回路を形成させ,そこでの学習・記憶様式を工学的に応用しようとするものであった.条件づけ学習(連合学習)は視覚系と前庭系の間の感覚受容器相互の神経千渉によるもので,これには種々のタンパク質キナーゼがGTP結合タンパク質のリン酸化を促進し,イオンチャンネル活動を修飾することが明らかになっている.従って学習・記憶の基礎としては,対象とする神経細胞の種類に関わらず,神経細胞の作る回路において,細胞膜タンパクのリン酸化を調節すれば,そこでの情報処理様式が変わるはずである。このような構想のもとで研究を進めた.当初in-vivoでの学習と同様に視細胞と有毛細胞を近接培養することを計画したが,特に有毛細胞は単離後,軸索の伸張は観察されなかった.このような理由から,対象を中枢神経系の細胞に変更し,その近接培養を行い以下の諸点が明らかになった.(1)ウミウシ神経細胞は無脊椎動物の神経培養で広く用いられているL-15(リボヴィツ液)を基本として,神経接着因子ラミニンを添加すると34日で軸索は50μm程度伸張すること,(2)近接培養した細胞相互には,シナプスが形成され機能的連絡ができること.ここで形成されるシナプスの生理的意義は未検討である,(3)細胞軸索の成長方向を制御するため,培養基板に深さ2μmの溝を微細加工すると,軸索はこの溝に沿って伸張することから有用性を確認した.従って(2)で形成されたシナプスの性質があらかじめ判っていれば,想定される情報処理の形式から特定のパターンで溝を作っておけば有用な神経回路を設計することも可能である.