hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
分子複合体用結晶の実験室X腺光学系の開発と適用

実験室での生体高分子複合体用のX腺強度データ収集システムを構築した。本システムは、リガク(株)社製の回折計RAXIS-IVと微小焦点のX腺発生機FR-Cからなる。強2枚のイメージングプレートを用いて、度の読みとり時間は短縮するようになっている。X腺ビームはミラーで集光してある。本システムを用いて、蛋白質-DNA複合体、蛋白質-GTP複合体、蛋白質-蛋白質複合体のX腺強度データ収集と、それらの構造解析を行った。これらの複合体は、マウス由来の転写因子IRF-2とDNAとの複合体、分裂酵母由来の転写因子Pap1とDNAとの複合体、マウス脳海馬由来のセリンプロテアーゼNeuropsin、ヒト由来の低分子量G蛋白質RhoAとGTPγSの複合体、及びその標的蛋白質(蛋白質キナーゼ)であるPKNとの複合体、マウス由来の細胞膜-細胞骨格リンカー蛋白質radixinのFERMドメイン、及びそのドメインとIP3複合体とICAM-2複合体であり、それらの構造決定を通して、上記のデータ収集システムが有効であること示した。本年度は主に、超高輝度X線発生装置FR-CにセットアップしたsupperのミラーX線光学系を用いて、マウス由来の転写因子IRF-2のDNA結合ドメインとDNAオリゴマーとの複合体結晶と低分子量Gタンパク質RhOAとその標的タンパク質キナーゼPKNの結合ドメインとの複合体結晶の構造決定を行った。IRF-2/DNAの複合体は、既に重原子誘導体結晶を得ており、また、米国Mount Sinai医学校のAneel K.Aggarwalより供与されたIRF-1/DNA構造があるので、MIR-MRより位相決定し、構造を精密化する。予備的解析では、IRF-2は繰り返し配列にタンデムに結合しており、IRF-11DNA構造とは種々の点で異なることがわかった。この研究はEMBOJに投稿中である。RhoA/PKN複合体では、すでに我々が構造決定した活性型のRhOAの構造をもとに、分子置換法で構造決定した。PKNのRhoA結合ドメインは、反平行の2本のαヘリックスがcoiled-coil状に束になった構造をしており、我々はこの構造をACC-フィンガーと名付けた。ACC-フィンガーはRhoAのSwitch I、βストランドB2とB3、ならびにαヘリックスA5と主に水素結合により、認識されていた。また、結晶中では、もう一方のACC-フィンガーがSwitch II領域に結合していることも分かった。これはPKNが2つのドメインでと結合するという生化学的実験データと良く符合した。Yale製のミラーX線光学系の超強力度X線発生装置RU-300Hへのセットアップを行っているが、これについては、来年度にその性能評価をする。本年度は、先ず、超高輝度X線発生装置FR-CにセットアップしたSupperのミラーX線光学系を用いて、主に、分裂酵母由来のbZIP型転写因子Pap1のDNA結合ドメインとDNAオリゴマーとの複合体結晶の高分解能(2.0Å)データ収集と構造解析、及び低分子量Gタンパク質RhoAとその標的タンパク質キナーゼPKNの結合ドメインとの複合体結晶の分解能2.2Åデータ収集と構造解析を行った。いずれにおいても、構造解析に耐えうる良好のデータが得られた。また、それらの強度データを用いて構造決定に成功した。更に、前年度に超強力度X線発生装置RU-300HにセットアップしたYale製のミラーX線光学系を用いて、膜と細胞骨格のリンカータンパク質であるradixinの膜結合ドメインのデータ(分解能3.0Å)収集を試みた。この光学系でのデータも比較的良好であるが、前者には及ばないことがわかった。そこで、前者の光学系を用いて収集したデータを用いて構造解析を試みている。本年度は、超高輝度X線発生装置FR-CにセットアップしたSupperのミラーX線光学系を用いて、主に、ウシ由来の細胞膜と細胞骨格のリンカー蛋白質radixinのFERMドメインと膜成分PIP2の細胞質側のリン酸化部位IP3、及び細胞膜蛋白質である接着分子ICAM-2の細胞質ドメインとの複合体のX線強度データをそれぞれ収集して、構造解析を行った。これらのデータが構造解析に充分耐え得るものであることを確認した。

更に、前々年度に超強力度X線発生装置RU-300HにセットアップしたYale製のミラーX線光学系を用いて、X線強度データ収集を試みたが、この光学系でのデータも比較的良好であるが、前者には及ばないことがわかった。そこで、前者の光学系を用いて収集したデータを用いて構造決定した。また、巨大酵素複合体として、GTPCHI/GFRP複合体(360kDa)のデータ収集も試みたが、強度(輝度)不足で、充分なデータは得られなかった。これらのついては、SPring-8でのデータ収集が成功しいる。
感想戦に基づく、ゲームAI の強化法

将棋や囲碁などのゲームではゲーム後にプレイヤ同士で「感想戦」と呼ばれるゲーム内容の検討を行い、実力向上に役立てる。ゲームAIにおいては、このような「感想戦」が行われることはない。本研究では人間が行う「感想戦」に着目し、複数のゲームAIによるゲームの検討とそれによる棋力向上を目的とした。本研究の主な成果の一つとして、あるゲームAIに他のゲームAIが助言を与える手法を提案し、それによる棋力向上を示したことが挙げられる。ゲームAI同士の感想戦の実現とそれによるAIの強化の実現に向けての研究を行っている。感想戦とは、ゲーム後にそのゲームの記録(棋譜)を振り返って検討を行うことで、プレイヤの棋力向上をことを目的としている。ゲームAIでは、過去のゲームの記録から機械学習によるパラメータ調整が行われているが、記録の検討、特にそのAI以外の思考を導入するものは余り研究が行われていない。本年度はAI同士の感想戦の実現のために、検討局面の発見、探索結果の解析、感想戦システムの開発について取り組んだ。従来のゲームAIに関する研究は単一のAIを使ったものが多く、2つ以上のAIによる探索や評価の取り扱いについては従来の手法が使えないことが多いという困難がある。検討局面の発見については、棋譜の指手について好手や悪手を発見する手法について取り組んだ。その研究過程において、AIの強さを棋譜の指手とAIの読筋や評価値から推測する手法についての発想を得たため、その研究を行った。AIによる評価値や読み筋を付加してその評価を行った例があるが、付加のためのコストが大きい。現在の将棋AIでは対戦時にその読筋や評価値を棋譜へと付加できるため、そのデータを使うこと付加コストなしでの処理が可能となる。ここでも、データを付加するAIが1体ではないため、従来手法はそのまま適用できないという問題があった。実際にそのデータで実験を行い、内容をまとめて国内の研究会において発表し、さらに発展させた内容を国際会議へと投稿する予定である。探索結果の解析や感想戦のシステムについては、プロトタイプとなるアイデアを実装し、実証実験のための準備を行っている。感想戦とは、ゲームプレイヤがゲーム終了後にそのゲームの記録(棋譜)を振り返り、どこで何をすべきであったかなどを意見交換しながら検討するもので、プレイヤの実力向上のために行われる。感想戦を行うことにより学習データの質が高まることや人間プレイヤとの感想戦への助けとなることが期待される。平成27年度の研究計画は「検討する局面の発見」、「ゲーム木探索の結果を解析する手法の開発」、「感想戦の結果からゲームAIを強化する手法の開発」「学習パラメータの拡張」であった。「検討する局面の発見」については、平成26年度の研究進捗から棋譜中の好手や悪手の発見手法を提案した。今年度はその研究から、ゲームAIの強さ推定という新しい研究へと発展させ、その成果を国際会議へ投稿・発表した。また、「ゲーム木探索の結果を解析する手法の開発」については、複数AIを利用した探索手法を開発し、その内容は国内研究会で発表した。その研究過程において、他のAIから助言を受けるAI、新しい並列探索という2つの方向の新しい研究テーマへの着想が得られた。現在は、助言を受けるAIとしての研究を進め、国際会議への投稿準備を進めている。「感想戦の結果からゲームAIを強化する手法の開発」や「学習パラメータの拡張」については、学習のために大規模なデータを用意する必要があり、当初の予定よりも大幅に時間がかかることが判明したため研究に遅れが生じている。計画の遅れはあるものの、新しい研究課題の発見とそれへの取り組みも行っているため、全体としてはおおむね順調であると考えている。感想戦によるゲームAI強化法についての研究では遅れがあるものの、これまでの研究から新しい研究テーマの発見とそれへの取り組みを行い成果を得ており、全体としてはおおむね順調であると考えている。一般に行われる学習では、棋譜の指手による学習が主であった。本研究では人間が行う「感想戦」のように、複数のゲームAIによるゲームの検討とそれによる棋力向上を目的とする。最終年度は、複数のAIによるゲームの検討する手法として、助言を活用するゲームAIについての研究を行った。あるゲームAIに、そのAI自身による指手の候補と他のゲームAIによる指手の候補とを比較検討させ、最終的な指手を決定する手法を提案した。従来は、単純な多数決や3-Hirn Systemと呼ばれる手法などがゲームでも提案されている。今回の手法が既存の単純多数決よりも有効であることを対戦などから示し、ゲームAIにおける助言の有効性を示した。この研究テーマは、助言による性能向上は人間とAIの協調と見ることができ、他の研究テーマとも横断することができた。研究期間全体としては、ゲーム内容の検討について研究を行い、その過程で棋譜の指手からプレイヤの強さを推測する研究を行った他、ゲームAIの評価関数の学習における教師データ生成のために複数プレイヤの利用についての研究を行い、上述の最終年度の研究を行った。本研究の目的は複数のゲームAIによる検討の有効性の調査とそれを用いたゲームAIの強化が目的であった。

感想戦から学習を行う実施計画とは異なる形であるが、助言を受けることでゲームAIとして強化する手法、すなわち複数のゲームAIによる検討とそれによる強化という目的を達成することが出来たといえる。将棋や囲碁などのゲームではゲーム後にプレイヤ同士で「感想戦」と呼ばれるゲーム内容の検討を行い、実力向上に役立てる。ゲームAIにおいては、このような「感想戦」が行われることはない。本研究では人間が行う「感想戦」に着目し、複数のゲームAIによるゲームの検討とそれによる棋力向上を目的とした。本研究の主な成果の一つとして、あるゲームAIに他のゲームAIが助言を与える手法を提案し、それによる棋力向上を示したことが挙げられる。遅れの原因は、提案手法の詳細についての発想が遅れたことである。現時点では、ゲーム木探索の結果の解析についてプロトタイプを実装中であり、実験と結果からの改良が必要ではあるが、概ね用意はできている。また感想戦のシステムについても、コンピュータ将棋で広く使われているプロトコルを利用して上記の実装を行っているため、そのプロトコルに対応するプログラム間での感想戦は容易に実現が可能となる。研究計画に従って研究を行う。また、平成26,27年度の研究過程で発見した課題にも取り組む。強化のために大規模なデータ生成が必要でその計算時間が課題となっている。研究目的に対して間接的なアプローチとなるが、既にあるデータを活用することで課題への対処することを考えている。ゲーム情報学基本的な推進方策に変更はない。達成度の項目で述べたように「ゲーム木探索の結果の解析」に起因した遅れがあるが、それ以降の部分は用意を行っているため、遅れは取り戻せるものだと考えている。また、検討局面の発見の副産物として、レーティングの推測についての研究を行った。これはゲームの内容と強さについての研究であり感想戦に関連がある。そのため、こちらも引き続き研究を行っていく予定である。申請時から予算が減少したこと、購入予定のワークステーションの価格が上がっていたため、ワークステーションなどの物品購入の計画を再検討する必要があった。それに加え、予算残高確認のため学会の旅費確定を待って物品購入を行ったため、購入時期が遅れ、次年度使用額が生じてしまった。生じてしまった次年度使用額については、予定していたワークステーションや書籍、ハードディスクなどの購入に使用する。
中世礼制史の再構築に向けた鎌倉幕府儀礼の基礎的研究

本研究は、鎌倉幕府の最も根幹的な儀礼である「椀飯」儀礼の基礎的研究を通じて武家儀礼研究に再考を促し、儀礼研究を自律的・独立的な学問分野=「中世礼制史」として再構築するための方法論を確立する目的で行われた。まず鎌倉幕府儀礼に関わる史料を収集し、続いて「椀飯」儀礼の起源・沿革・変遷過程などの基礎的考証・検討を行い、儀礼的意義や、そこに表現された当該期の思考様式・社会構造・政治的変動などを論証・解明・展望した。【研究目的】本研究は、鎌倉幕府の最も根幹的な儀礼の再検討から武家儀礼研究をやり直すことにより、歴史学の諸分野(政治史・社会経済史など)と比べて補助学問的に位置づけられていた儀礼研究を、自律的・独立的な学問分野=「中世礼制史」として再構築するための方法論を確立しようとするものである。【研究実施計画】上記目的に基づき、平成25年度は、作業A:鎌倉幕府の主要儀礼関係史料の網羅的調査・抽出・データベース化、作業B:未紹介資料の調査紹介を計画した。【成果】上記計画に基づき、本年度は作業Aを50%程度進捗させ、また作業Bとして2件の史料調査・紹介を行った。また作業Aを20%程度終えた段階で得られた知見を基に、2件の研究論文を公刊した。1件目は、新たな中世礼制史の取り得る方法論の試案を提示し、その手法が歴史像をどのように塗り替える可能性を持つかを論じたもの。2件目は、1件目の派生的問題として、儀礼・組織などの統率行為を意味する「管領」という単語の歴史的変遷・中世段階固有の特質を論じ、儀礼論の基礎研究の一部とすべく問題提起した副産物的成果である。また作業Bとして、2件の研究論文を公刊した。1件目は、慶應義塾図書館貴重書室が所蔵する鎌倉幕府御家人の家伝文書の原本調査を行い、活字化と基礎的考察を行ったもの。2件目は、昨年度に引き続き、朝廷の実務官僚でありながら室町幕府の儀礼運営に深く関与した廷臣広橋綱光の日記の翻刻をおこなったものである。【研究目的】本研究は、鎌倉幕府の最も根幹的な儀礼の再検討から武家儀礼研究をやり直すことにより、歴史学の諸分野(政治史、社会経済史など)と比べて補助学問的に位置づけられてきた儀礼研究を、自律的・独立的な学問分野=「中世礼制史」として再構築するための方法論を確立しようとするものである。【研究実施計画】上記目的に基づき、平成26年度は、以下の3つの作業を計画した。[作業A:鎌倉幕府の主要儀礼関係史料の網羅的調査・抽出・データベース化(平成25年度に50%程度進捗した作業)の完了][作業B:未紹介史料の調査紹介][作業C:作業Aの成果に基づく、鎌倉幕府儀礼の具体的な再検討・考察と学術論文化]【成果】上記計画に基づき、本年度は作業Aを概ね完了した(「概ね」とは、次年度以降に追加的情報が得られた場合には追加するが、現段階で調査・データベース化すべきと判断されているものは既に完了した、という意味)。また作業Bとして1件の史料調査・紹介を行った。また作業Aの完了に伴い、作業Cを開始した。作業Bとして公刊した論文は、昨年度に引き続き、朝廷の実務官僚でありながら幕府の儀礼運営に深く関与した廷臣広橋綱光の日記の翻刻を行ったものである。【研究成果】本研究は2段階に分かれる。〔段階1〕まず鎌倉幕府に関係する既知の記録・文書から網羅的に、また未知・未紹介の記録・文書の採訪・調査・紹介を通じて追加的に、幕府儀礼に関わる史料を収集し、データベース化した。〔段階2〕次に、抽出された史料群をもとに、個別儀礼ごと(椀飯・流鏑馬の順)に起源・沿革・変遷過程などの基礎的考証・検討を行い、儀礼的意義や、そこに発露した当該期の思考様式・社会構造・政治的変動などを論証・解明・展望し、論文・著書・学会発表などの形で公表する。本研究では前年度(平成26年度)までに上記の〔段階1〕を終え、〔段階2〕のうち、基礎史料として重要な古記録・古文書の調査成果を3件、「椀飯」儀礼の新たな歴史的意義を指摘した論文1件、関連論文1件を発表した。そして最終年度(平成27年度)においては、古記録の調査成果の発表を継続するとともに(1件)、椀飯儀礼の基礎的考察を軸として鎌倉幕府を取り巻く儀礼的環境の全体像を予察的に俯瞰した共著著書1件・学会発表(1件=招待講演)を発表した。以上により、本計画では、計画段階で可能なら開始すると予告していた「流鏑馬」研究については、論文・学会発表等の形で公表するには至らなかったものの(ただし調査には着手ずみ)、「椀飯」儀礼については、古い水準による研究を塗り替える、最新の拠るべき基礎研究が進展し、学界に一定の貢献を果たしたと考えられる。

本研究は、鎌倉幕府の最も根幹的な儀礼である「椀飯」儀礼の基礎的研究を通じて武家儀礼研究に再考を促し、儀礼研究を自律的・独立的な学問分野=「中世礼制史」として再構築するための方法論を確立する目的で行われた。まず鎌倉幕府儀礼に関わる史料を収集し、続いて「椀飯」儀礼の起源・沿革・変遷過程などの基礎的考証・検討を行い、儀礼的意義や、そこに表現された当該期の思考様式・社会構造・政治的変動などを論証・解明・展望した。平成26年度には、上記「研究実績の概要」に列挙した作業ACについて、以下の進捗を得た。作業A:当初計画の通りに概ね完了した。作業B:当初計画通りのペースで成果を公刊した。作業C:作業Aの進捗を踏まえ、データベース化された研究素材の整理・本格的分析と論文化が、当初計画通りに進んでいる。現段階で、その成果は4本の学術論文としてまとめる予定で執筆中であり、平成27年度(本計画の最終年度)中には投稿もしくは出版可能な形にまとまる見込みである。それらのうち、2本は当初計画で必ず遂行・完了するとしていた「椀飯」という儀礼の研究であり、その2本の完成により、当初計画通り、「椀飯」の基礎的研究が一通り完了する見込みである。また残りの2本は、当初計画において、上記「椀飯」の研究が順調に(あるいは予想より早く)進展した場合に、本計画で着手・進捗させる予定とした「流鏑馬」の研究である。現段階の進捗状況を鑑みるに、「椀飯」の研究は順調に計画通りの完成を見込めているため、「流鏑馬」の研究にも無事に着手し、予定通りに順調に進捗させることができている。日本中世史平成27年度は、上述の作業B(未紹介史料の調査紹介)を継続する。また並行して、作業A(鎌倉幕府の主要儀礼関係史料の網羅的調査・抽出・データベース化)の完了を踏まえ、平成26年度中に着手し順調に進捗しつつある作業C(作業Aの成果に基づく、鎌倉幕府儀礼の具体的な再検討・考察と学術論文化)をさらに進め、成果物として完成させる計画である。平成25年度に計画した[作業A:鎌倉幕府の主要儀礼関係史料の網羅的調査・抽出・データベース化]、[作業B:未紹介資料の調査紹介]のうち、作業Bについては当初計画通りのペースで成果を公刊した。しかし作業Aについては、史料収集を20%程度終えた段階で収集済み史料を点検し、いかなる史料のいかなる部分に出現が偏るかを大まかに分析した。これは、以後の史料収集作業において収集漏れを防止するため、特に留意しておくべき出現傾向を把握しておく目的で行った分析である。その予備的分析の結果、図らずも、中世武家礼制史のイメージを一新する傾向が見出され、今後の当該分野研究のために速やかに注意を促すべき事実(「椀飯」儀礼の主催者は儀礼の主役ではなく事務局長という裏方であった事実)が浮上したため、予察的考察として論文化すべきと判断した。これにより、当初は平成25年度中に予定されていなかったにもかかわらず、論文の形で研究成果を蓄積することとなった。平成26年度は、上述の作業B(未紹介史料の調査紹介)を継続するのと並行して、作業A(鎌倉幕府の主要儀礼関係史料の網羅的調査・抽出・データベース化)を完成させることを計画している。当初想定していた収集対象の100%を終えることを目標とし、前年度の予察的考察を踏まえ、収集データ全体を対照とした本格的分析を開始する。ただし、前年度の研究遂行過程において、データ収集が100%完了する以前に随時収集方針を再検討・洗練する必要があること、またその作業によって(経過報告的要素を含むものではあるものの)着実な研究の前進を形ある成果として発表可能であることが判明した。そこでその経験を踏まえ、データ収集の完遂率が100%に至ったか否かに必ずしもこだわることなく(もちろん最終的には計画通り本年度中の完遂を目指す)、随時研究成果を公表してゆく予定である。
薬剤誘導性遺伝子ノックアウト法を用いた細胞極性制御機構の解析

本研究ではaPKCとDaam1の2種類の細胞極性関連遺伝子のコンディショナル・ノックアウトマウスを用いて、薬剤誘導下で遺伝子ノックアウトが可能な実験系を構築した。マウスの発生過程での表現型解析、上皮の初代培養系における解析を行い、aPKC-Daam1の遺伝学的な相互作用を検出した。さらにアフリカツメガエルを用いた遺伝子ノックダウン・レスキュー法を用いた解析によりaPKCの作用点がDaam1の下流であることを示唆する結果を得た。本研究では細胞極性関連遺伝子aPKCとDaam1の単独またはダブルでのコンディショナル・ノックアウトを、発生過程および初代組織培養下で行い、その表現型を解析することで組織構築の根幹をなす細胞極性制御機構の相互作用を解明する。本研究ではaPKC(1細胞)とDaam1(細胞集団)の2種類の細胞極性関連遺伝子のコンディショナル・ノックアウトマウスを用いて、マウスの初期発生過程での表現型解析、上皮の初代培養系における解析、を同時進行で行っている。本研究の目的のために、薬剤(タモキシフェン)誘導下で遺伝子ノックアウト出来る実験系を構築した。目的の遺伝子型の動物が作出され次第、順次実験のための掛け合わせを行い、得られた動物を用いて解析を行う。発生過程における表現型の解析は、妊娠させた雌にタモキシフェンを投与することにより遺伝子組み換えを勝発し、その効果を形態学的に解析する。また、成獣よマウスより上皮細胞を初代培養により採取し、培養下でタモキシフェンを添加することにより遺伝子組み換えを誘発し、細胞極性の有無を解析する。細胞極性異常の判定は、1.細胞分裂方向、2.核に対する中心体の位置、3.ゴルジ装置や線毛などの細胞内小器官の配置、4.細胞接着構造の配向性などを指標として行っている。また、本研究では形態学的な解析が中心となるが、遺伝学的な相互作用も同時に進行させる。本研究では細胞極性関連遺伝子aPKCとDaam1の単独またはダブルでのコンディショナル・ノックアウトを、発生過程および初代細胞培養下で行い、その表現型を解析することで組織構築の根幹をなす細胞極性制御機構の相互作用を解明する事を目的とした。本研究ではaPKC(1細胞)とDaam1(細胞集団)の2種類の細胞極性関連遺伝子のコンディショナル・ノックアウトマウスを用いて、マウスの発生過程での表現型解析、上皮の初代培養系における解析、を同時進行で行った。本研究の遂行のために、薬剤(タモキシフェン)誘導下で遺伝子ノックアウトが可能な実験系を構築した。目的の遺伝子型の動物が作出して掛け合わせを行い、得られたマウスを用いて解析を行った。発生過程における表現型の解析は、妊娠させた雌にタモキシフェンを投与することにより胎内で遺伝子組み換えを誘発し、その効果を形態学的に解析した。また、成獣マウスより上皮細胞を初代培養により採取し、培養下でタモキシフェンを添加することにより遺伝子組み換えを誘発し、細胞極性異常の有無を解析した。ウエスタンブロット法により両遺伝子産物が消失することを確認した上で、免疫蛍光染色により細胞接着構造の異常、核と極体の位置関係の異常、核と細胞内小器官との位置関係の異常の有無を検討した。また、本研究は形態学的な解析が中心であったが、遺伝学的な相互作用も同時に進行させ、実際に検出するに至った。さらに遺伝学的な相互作用の一般性を得る目的で、アフリカツメガエルを用いた遺伝子ノックダウン・レスキュー法を用いた解析も行った。
グレリン細胞性状・機能 の解析

すでに取得済みであるMGN3-1細胞(グレリン分泌細胞株)、MIN6細胞(膵β細胞株)、αTC細胞(膵α細胞株)でのマイクロアレイデータについて、脂肪酸輸送代謝関連遺伝子の解析を中心に行った。これまでに、我々は、膵β細胞では、グレリンおよびグレリン-O-acyltransferaseを導入しても、オクタン酸の添加なしにはアシル化グレリンの産生がほとんど起きないこと、グレリン細胞と膵β細胞との脂質代謝に差異がある可能性を見いだしてきた。MGN3-1細胞とMIN6細胞間での脂質代謝について、脂肪酸取込み、代謝等について検討を行ったところ、脂肪酸取込み、細胞内脂質の一部に差異があることを見いだした。両細胞の遺伝子発現プロファイルを比較検討したところ、脂質取込みに関連する遺伝子、またβ酸化に関連する遺伝子の一部の発現に差異があることを見いだした。このうち、MGN3-1細胞で発現が高かった脂質取込み関連遺伝子の一つを、siRNAにてノックダウンしたところ、MGN3-1細胞への脂質取込みは減弱した。受容体発現に関しては、発現量が低いことから、マイクロアレイによる解析は困難であったため、RNAseqを新たに行った。発現の高かった受容体に関して、グレリン生合成、分泌への影響について検討中である。一方、グレリンプロモーター支配下に蛍光蛋白を発現するトランスジェニックマウスに関しては、グレリン細胞における蛍光発現を確認し、セルソーターによる細胞単離にも成功しつつある。ただし、現状、グレリンmRNA発現を蛍光陽性細胞と、陰性細胞の間で比較した際に、数倍程度の差しか認められておらず、RNA回収量も限られており、今後、さらに系の安定化を図る必要がある。26年度が最終年度であるため、記入しない。すでに取得済みであるMGN3-1細胞(グレリン分泌細胞株)、MIN6細胞(膵β細胞株)、αTC細胞(膵α細胞株)でのマイクロアレイデータについて、脂肪酸輸送代謝関連遺伝子、転写因子の解析を中心に行った。これまでに、我々は、膵β細胞では、グレリンおよびグレリン-O-acyltransferaseを導入しても、オクタン酸の添加なしにはアシル化グレリンの産生がほとんど起きないことを見いだし、グレリン細胞と膵β細胞との脂質代謝に差異がある可能性を報告している(坂東、岩倉ら、Am Jour of Physiol End Met 2012)。現在、MGN3-1細胞とMIN6細胞間での脂質代謝について、脂肪酸取込み、代謝等について詳細な検討を進めつつあり、見いだされた脂質代謝の差異と遺伝子発現プロファイルの差異との関連を検討している。具体的には、MGN3-1細胞を用いて、発現に差異があった遺伝子を過剰発現もしくは発現抑制することで、特にグレリンのアシル化への影響を検討している。特に、遺伝子Xについては、MIN6細胞では、MGN3-1細胞の50倍の発現差異を認めており、現在、遺伝子導入によるグレリン産生への影響を検討している。また、逆にMGN3-1細胞で発現が高い遺伝子も見いだしており、siRNAによるノックダウンの影響も検討しつつある。また、細胞株でのデーターを確認するため、グレリン細胞の蛍光標識にも取り組み、グレリンプロモーター支配下に蛍光蛋白が発現するトランスジェニックマウスを作成している。今後、マウス胃より、セルソーターを用いてグレリン細胞の単離を行う予定である。これまでに得られた遺伝子プロファイルから、いくつかのグレリン細胞での脂質代謝に重要と思われる遺伝子を選択できており、またMGN3-1細胞とMIN6細胞との間での脂肪酸代謝の差異についてもいくつかの点で差があることを見いだしつつある。問題点として、MGN3-1細胞での遺伝子過剰発現実験、発現抑制実験を行っているが、現状では、十分な過剰発現や発現抑制が得られていないところがあり、この点は改善が必要である。

グレリン細胞の蛍光ラベルについては、トランスジェニックマウスを作成しており、セルソーターを用いた単離の準備を進めつつある。以上から、一部実験手技上の問題点が残るが、おおむね順調に進展していると考える。現在、問題となっているMGN3-1細胞への遺伝子導入効率が悪いという点に関しては、現在、リポフェクションに用いる試薬の変更、条件の最適化を行っている。今後、エレクトポレーションの利用、トランスポナーゼや、ウイルスベクターの利用など種々の方法による導入を検討する予定にしており、十分な導入効率が得られることを期待している。最終的には、安定した実験を行うため、トランスポナーゼシステム、あるいはレトロウイルス等を用いてstable cell lineの樹立を行う予定である。蛍光ラベルグレリン細胞の単離については、大学に新しいセルソーターが導入されており、これを用いることで高効率に細胞単離を行えるものと考えている。
Ａβオリゴマー化動態検出センサの構築

蛋白質異常化凝集・蓄積型疾患であるアルツハイマー病の早期簡易診断および病理変化の進展度評価ができるアミロイドβ(Aβ)オリゴマー化動態検出センサの構築を進めた。構成するセンサデバイス技術、バイオ技術として、I.Aβオリゴマー化動態検出センサの構築、II.センサ高感度化の研究、III.ELISA結果との比較、を研究対象として進めた。マイクロ流路を有するリポソームカンチレバーセンサから構成されるμTASチップを試作し、特にヒト血清中でのAβオリゴマー化に関連する同線維伸長動態を選択的に検出できた。またリポソーム脂質種の選定、低雑音化回路技術、基板温度制御技術により1 nM以下の高感度検出性が推定できた。本申請計画で構成したI.Aβオリゴマー化動態センサの構築、II.センサ高感度化、III.ELISA結果との比較、の3大項目中、主に前二者を進展できた。I.1)と2)オリゴマー検出脂質膜としては、Aβ分子モノマー段階で感度良く検出してしまう脂質種があったが、コレステロール添加(生体膜をより模擬)で線維伸長が活発になるオリゴマー段階を検出し得た。現時点でDMPC/コレステロールが最適であった。I.4)センサ動作では、被験者血液測定の病院認可を得るためにヒト血清中を用いたカンチレバーセンサでのAβオリゴマー化動態検出を上記I.1),2)での種々の脂質膜を用いて行い、ヒト血清中多数のタンパク質がリポソーム脂質膜と経時的相互作用変化をほぼ発現しないことから、Aβ線維伸長特有の動態変化を、上記選定したDMPC/コレステロールでヒト血清中においても検出できた。一方で並行して脂質膜修飾分子として糖鎖修飾リポソームの性能検討を行い、DPPCの蛍光測定では1桁以上の感度向上を確認した。II.センサ高感度化では、1)の上記センサ抵抗歪ゲージ出力の低雑音化を差動回路技術とデジタルフィルタ技術で約3 ppmまで低減できた。その結果、Aβ1 nMまでの低濃度測定が行えた。またセンサ動作時温度変化+/-0.1度以内の制御系を別途構成した。2)の動的検出PZT圧電センサでは、PZT薄膜が被測定バイオ溶液保持負荷を可能とするようなデバイス構造を検討し、溶液の流路供給と共に同薄膜を最上部/最下部にする2つの構造の設計に至った。III.ELISA結果との比較では、使用する合成オリゴマーの供給開発時間の点で分子内容が開示された市販Aβオリゴマーを選定した。上記センサ結果とは別に本Aβオリゴマーによる測定の比較を行う。集積デバイス工学
糖質吸収抑制食の中・長期間摂取と生活習慣病バイオマーカーの関連に関する介入研究

エネルギー、PFC比およびGIに配慮した低GI食を設計し、軽度過体重の健常勤労男性に5週間継続摂取させ、低GI食の継続摂取が生活習慣病関連指標に与える影響を検証した。介入後、介入群の体重、腹囲、BMIの減少(p<0.01)、血中HbA1c値の低下傾向が示され、血漿γ-GTP活性が有意に低下した(p<0.05)。このことから、低GI食の継続的な摂取により、内臓脂肪が減少し、耐糖能の改善および炎症の抑制が起こることが推察された。高Glycemic Index(GI)食品である白米を主食とする日本人の平均的な食事のGIは高く、食後高血糖、耐糖能異常予防の観点からGIを低減することが望ましい。本研究の目的は、メタボリックシンドロームおよびその予備軍の日本人における糖質吸収抑制食(低GI食)の継続摂取と糖代謝および慢性炎症状態の各指標との関連を、前向き介入試験により検証することである。健常な成人男性51名(BMI≧23)を年齢、BMIを対応させた上で無作為に介入群と対照群に割り付け、介入群には研究代表者らが開発した低GI冷凍惣菜を週に15食分ずつ宅配し、5週間継続摂取させた。対照群には通常の食事を自由に摂取させた。ベースラインおよび介入期間中に3日間の食事記録法による食事調査を行い、エネルギーおよび栄養素摂取量を算出した。介入期間の前後に身体計測および糖代謝、炎症等の関連指標の血液生化学検査を行った。2群間の比較にはWilcoxonの順位和検定、各群の介入前後の指標の比較には対応のあるt検定を行った。すべてのデータが得られた介入群22名、対照群17名を解析の対象とした。ベースライン時の年齢、体重、腹囲、BMI、アルコール摂取量に両群間の差はみられなかった。対照群では、介入期間に身体計測値および血液生化学指標の変動は認められなかった。一方、介入群では、5週間の低GI惣菜の摂取により体重、腹囲、BMIの有意な(p<0.01)減少、血中HbAlc値の低下傾向(p=0.083)が示された。また、血漿γ-GTP活性が有意に低下した(p<0.05)。血漿γ-GTP活性は、健常者における酸化傷害や炎症の指標、内臓脂肪面積と強く関連することが、最近の研究で明らかになっている。したがって、本研究では、低GI食の継続的な摂取により軽度肥満者の内臓脂肪が減少し、それに伴い耐糖能の改善あるいは炎症の抑制が起きたものと推察された。糖質の消化吸収制御によって、ヒトの糖代謝、脂質代謝および慢性炎症状態にも改善がみられることを、関連指標を用いて検討した報告はほとんどない。本研究の目的は、メタボリックシンドローム予備軍の日本人における糖質吸収抑制食(低GI食)の継続摂取と、糖代謝および慢性炎症状態の各指標との関連を検証することである。平成22年度および23年度の試験により、低GI食を5週間継続摂取した介入群(健常成人男性(BMI≧23)では、体重、腹囲、BMIの有意な(p<0.01)減少、血中HbA1c値の低下傾向、血漿γ-GTP活性の有意な低下(p<0.05)が示された。血漿γ-GTP活性は、健常者における酸化傷害や炎症の指標、内臓脂肪面積と強く関連することが明らかになっていることから、低GI食の継続的な摂取により軽度肥満者の内臓脂肪が減少し、それに伴い耐糖能の改善あるいは炎症の抑制が起きたものと推察された。平成23年度は上記に加え、低GI食調製の食品選択上、有効と考えられる食品中のレジスタントスターチ(RS)に着目し、米飯を主食とする食事において、RS摂取が食後血糖およびインスリン分泌に与える影響を、1日の変動で詳細に捉えることを目的にヒト試験を行った。健常成人9名を対象に、食事摂取基準とPFC比率に配慮した検査食を1日3食摂取させた。食事のみを対照群、食事直前にRS5g/食相当量のハイアミロースコーンスターチ原料の粉末を摂取する群をRS群とし、ランダムクロスオーバー試験を実施した。RS群では、昼食後30分以降の血糖値が緩やかに下降し、食後3060分後のインスリン分泌量が対照群に比べて低く、緩やかに下降した。RSの摂取は食事中の糖の消化吸収を遅延し、インスリン分泌を増大させることなく食後の血糖上昇を抑制することが示唆された。現在、インクレチン(GIR,GLP-1)分泌量についても測定中である。糖質の消化吸収制御によって、ヒトの糖代謝、脂質代謝および慢性炎症状態に改善がみられることを、関連指標を用いて検討した報告はほとんどない。

本研究の目的は、メタボリックシンドローム予備軍の日本人における糖質吸収抑制食(低GI食)の継続摂取と、糖代謝および慢性炎症状態の各指標との関連を検証することである。平成22・23年度の試験により、低GI食を5週間継続摂取した軽度肥満者(BMI≧23)の成人男性において、体重、腹囲、BMIの有意な(p<0.01)減少、血中HbA1c値の低下傾向、血漿γ-GTP活性の有意な低下(p<0.05)が示された。血漿γ-GTP活性は、健常者における酸化傷害や炎症の指標、内臓脂肪面積との強い関連が明らかにされており、低GI食の継続摂取による軽度肥満者の内臓脂肪の減少と耐糖能の改善あるいは炎症の抑制が起きたものと推察した。平成24年度は、高GIと低GIのモデルメニューを調製し、両者における食後の血糖値、インスリン濃度、インクレチン濃度および中性脂肪値の変動の違いを明らかにし、低GI食が糖代謝に与える影響の機序を検討した。すでに検証済みの食品の調理後GIデータをもとに、一定の栄養比率で複合食の高GI食、低GI食を調製した。一般健常学生に両者をクロスオーバーで単回摂取させ、食後3時間までの血糖値、インスリン濃度、中性脂肪値およびインクレチン濃度を測定した。低GI食は、高GI食に比べて明らかに食後の血糖値上昇を抑制し、インスリンの初期分泌を抑制した。一方、GIP、GLP-1の分泌量には影響していなかった。これらのことより、一定のPFC比率であり、不溶性および水溶性食物繊維や有機酸による胃排出速度の遅延効果、腸管における消化吸収の遅延効果を利用した低GI食の摂取は、GIP、GLP-1の分泌に関与せずに、インスリンを節約しながら血糖値を下げることが示された。低GI食の機序を検討する上で必要と考えられた、レジスタントスターチと日常食の同時摂取が血糖、インスリン、インクレチンの日内変動に及ぼす影響を調べるヒト試験を組み入れたため、当初23年度中に実施予定であった、低GI食、高GI食の単回摂取による血糖、インスリン、インクレチン値の比較試験が24年度にずれ込んだ。24年度が最終年度であるため、記入しない。平成24年度は、同意の得られた被験者に対して、栄養比率を一定とし、GIの異なる食品を用いて調製した低GI食1種類と高GI食1種類についての単回摂取試験を、1週間のウォッシュアウト期間をはさんでクロスオーバーで行う。検査食摂取前および摂取後30、60、90、120、180分の計6回、各3mlを肘静脈より採血し、得られた血液サンプルについて、血糖、インスリンおよびインクレチン(GIP、GLP-1)を、測定用キットを用いて測定する。GIの異なる食事の摂取とインスリン分泌を促進する消化管ホルモンであるインクレチン(GLP-1,GIP)分泌量との関係を明らかにし、低GI食の効果をヒトのインスリン感受性に及ぼす影響のメカニズムから裏付けることを試みる。
連続体理論による大量アミノ酸配列に対する物理知識情報処理

ゲノム計画から得られるデータは多様な側面を持っている。アミノ酸配列のデータに限っても進化的な側面、機能的な側面、構造的な側面と多岐にわたる。これに応じて、データ処理も様々な手法を取り入れる必要がある。私達は、これまで物理学的な考え方(「分子に働く力によって、タンパク質の立体構造が形成される」ということ)にこだわって、アミノ酸配列データの情報処理法を工夫し、主として膜タンパク質の解析を行ってきた。その結果、分子間相互作用のあり方を正しく理論に取り込み、二次構造を連続体とみなす単純化を行うと、二次構造も三次構造も現実的な時間で予測が可能であることが分かってきた。「ゲノムサイエンス」では大量のアミノ酸配列が産み出されるが、それを現実的な時間内で解析するには、連続体の枠組みで計算していくことが最も適切であると私達は考えている。本研究では、構造形成のもっとも基本的な段階として、アミノ酸配列から膜タンパク質への分岐を高精度に予測できる方法を開発した。そして、このシステムを一般に利用可能な形にするためにWWW上のシステムとして構築した。
広葉樹材の繊維組織の構造に基づく材質分類の研究

本研究は繊維組織の特徴から広葉樹材の材質分類を行うことを指向した。繊維は広葉樹材の基礎組織であり、広葉樹材の材質は繊維組織の組織・構造上の特徴に強く依存すると考えられる。繊維の組織・構造的特徴の指標として、繊維の直径、壁厚、繊維壁率、繊維長、フィブリル傾角をとりあげ、その測定法、変動性を研究した。これらの指標は材質評価・分類に用いられる。1)繊維の横断面寸法の測定には、20μm厚さの横断面切片をヘマトキシリン・サフラニン2重染色して用いた。顕微鏡条件を定め、CCDカメラを通して顕微鏡像を画像解析装置(PIAS-Iおよび【II】)に入力し、二値化した繊維内こう像について計測した。2)繊維内こうのフェレ径(放射方向、接線方向)、内こう面積、同面積率から、壁厚、放射径、接線径を推定することができた。この方法を数種の広葉樹(典型的な樹種)に適用し、その変動性を調べた。これらを繊維の横断面の形態を示す指標値とすることができる。3)内こう面積率から繊維の細胞壁率(繊維壁率)を算出し、その変動性を上記樹種で調べた。細胞壁率は材の密度と関連する指標であり、壁率による繊維組織の階級区分が考えられる。これは針葉樹材の早材・晩材の区分とも共通する階級・区分となる。4)繊維長は解繊試料を投影器で測定した。繊維長は髄からの年数とともに増大し、1520年後は変化の少ない成熟材となる。成熟材の繊維長は重要な指標となる。また、別にパルプ繊維長の評価方法を検討した。5)繊維壁の【S_2】層のフィブリル傾角は走査電子顕微鏡像で測定した。フィプリル傾角は髄からの年数とともに減少し、繊維長と同様に1520年以後に安定する傾向を示した。しかし、変動は針葉樹材に比べて小さく、材質区分では比較的均質とすることができる。
カルシアるつぼによるチタン合金の溶解・鋳込に関する研究

1.研究目的チタン合金は溶融温度が高く、その溶湯は活性に富むために,るつぼ溶解は一般的に困難とされ,まだ実用化の段階にまで至っていない。本研究は,高純度カルシアるつぼを用いてチタン合金を溶解する際に問題となるるつぼの耐侵蝕性,鋳込特性,耐水和性などを調べ、カルシアるつぼの実用化に関する基礎的資料を得ることを目的とした。2.研究方法カルシアるつぼは,純度99.9%で見掛け気孔率の異なる3種の焼結品(18%,56%,<1%)と電融クリンカーを材料とした電融品(18%)ならびにCaCl_2を含む純度92.7%の焼結品の計5種類である。Ti-6Al-4V合金を入れ,高周波誘導眞空炉を用ひ,眞空およびAr雰囲気で溶解した。冷却後切断し,溶融チタン合金のビッカース硬度,チタン合金とカルシアるつぼ界面のSEM観察,EPMA分析を行なった。別にカルシアるつぼの室内および飽和水蒸気圧下での耐水和実験を実施した。3.研究結果(1)溶融まで6時間以上の時間をかけたにも抱らず,電融品を除き,溶融温度附近においてるつぼ下部に割れが発生する確率が高かった。バックアップ材の使用やるつぼ寸法の再検討などを要すると思われる。(2)見掛け気孔率の大きいカルシアるつぼほど界面附近にTi溶湯の浸入が認められるが,いずれの場合も通常の使用には充分耐えられる。(3)溶融Ti合金への酸素汚染は殆んど無視できる程度であった。(4)カルシアるつぼの耐水和性は,見掛け気孔率が小さい程向上する。同じ見掛け気孔率の場合には,電融クリンカー製品の方が耐水和性に優れている。また使用後のるつぼは耐水和性が一段と向上するが,CaCl_2含有るつぼではそのような傾向はみられなかった。1.溶解、鋳込実験高純度カルシアるつぼ(CaD99%以上)を使用し,高周波誘導炉で,TiおよびTiAl合金の溶解は可能で、るつぼの耐熱性,耐久性,Tiとの反応性において充分使用に耐える実績が得られた。2.カルシアるつぼに関する試験(1).カルシアるつぼ/チタン界面のEPMA観察によると、るつぼの気孔へのチタンの局部的浸入が認められ,その程度は気孔率が大きいほど,また溶解時間が長いほど顕著であるが,るつぼ組織への均等な浸食ではなく,溶融チタンのカルシアに対する濡れ性の低いことがわかった。(2)高純度カルシアるつぼは真空包装を厳密にすれば約1年後でも使用可能であり,使用るつぼも眞空デシケ-タ-中で23ケ月の保存がきくが,空気中に放置すれば10日以内で水和により使用不可能となる。3.溶融チタン金属に関する試験(1)溶融チタン中への酸素濃度の変化はEPMA分析では有意差が認められない程度であったが,ビッカ-ス硬度を測定すると,界面附近で700HVを示し,中央部にゆくに従い減少し,500μmの距離においては350HVを示した。したがってチタン中への酸素の拡散が考えられるが、これがカルシアとの反応によるものか,雰囲気(約10^<-3>Torr)中の酸素によるものかは現在調査中である。(2)高純度カルシアるつぼでは,酸素以外に他の成分の汚染は胎んど無視できる。
人工心臓開発のための袋状ソフトアクチュエータ実現に向けた基礎特性評価

人工心臓などの人工臓器開発のための基礎研究として,導電性高分子による袋状ソフトアクチュエータの実現を目指した.具体的には,立体構造配置による面状ソフトアクチュエータの駆動メカニズム解明とその変形の広範囲化と面状ソフトアクチュエータを発展した袋状ソフトアクチュエータの創製とポンプへの応用を目指した.その結果,以下のことが明らかになった.1.導電性高分子・ポリピロール(PPy)をモノマーとし,指示電解質にドデシルベンゼンスルホン酸(DBS)とテトラブチルアンモニウムトリスホロメタンスルホイミド(TBATFSI)を用いたバイモルフ構造(立体構造造配置)のソフトアクチュエータ(PPy.DBS/PPy.TFSl)の変形量が大きく,また,これをLiTFSI溶液中で駆動させた場合に最も大きな変形を行い,さらには,長時間の駆動も可能となり高耐久性も確認できた.しかしながら,このバイモルフ構造間にスペーサーとして他層を挿入した場合の変形量は小さい.2.電解重合の基盤電極に曲面形状を用いることにより,開閉運動するソフトアクチュエータとして機能する.3.面状のソフトアクチュエータ(PPy.DBS/PPy.TFSl)を駆動源としたマイクロポンプを構築した結果,最大42.4[μ1/min]の振動体積が得られた.また,開閉運動するソフトアクチュエータを駆動源とした場合には,2.228.3[μ1/min]の振動体積が得られた.広範囲な変形が可能な面状のアクチュエータへの発展と実用化技術を目指した袋状のソフトアクチュエータの創製,また,袋状ソフトアクチュエータの収縮運動によるポンプ(流体輸送システム)への応用とその性能評価を行う.本年度は,立体構造配置による面状ソフトアクチュエータの駆動メカニズム解明とその変形の広範囲化を目指し,以下のことを明らかにした.1.アニオン駆動層とカチオン駆動層の接合されたバイモルフ構造の導電性高分子ソフトアクチュエータを向かい合わせて設置することにより,広範囲に開閉運動するソフトアクチュエータが作製可能となる.2.内側にカチオン駆動層,外側にアニオン駆動層を接合したバイモルフ層のアクチュエータを向かい合わせに設置することにより,顕著な開閉運動が実現可能となる.カチオン駆動層とアニオン駆動層の比が2:1の場合にアクチュエータの開閉運動は最も大きくなる.酸化時には,内側のカチオン駆動層が収縮し,外側のアニオン駆動層が膨潤するために2枚のアクチュエータは外側に膨らむように変形する.一方,還元時には,内側のカチオン駆動層が膨潤し,外側のアニオン駆動層が収縮するために2枚のアクチュエータは内側に変形する.そのため,2枚のアクチュエータは初期状態に戻る.3.アクチュエータにスリットを入れることにより,開閉運動はさらに大きくなり,またアクチュエータが閉じる際に最も大きな力を発生させることが可能である.人工心臓などの人工臓器開発のための基礎研究として,導電性高分子による袋状ソフトアクチュエータの実現を目指した.具体的には,立体構造配置による面状ソフトアクチュエータの駆動メカニズム解明とその変形の広範囲化と面状ソフトアクチュエータを発展した袋状ソフトアクチュエータの創製とポンプへの応用を目指した.その結果,以下のことが明らかになった.1.導電性高分子・ポリピロール(PPy)をモノマーとし,指示電解質にドデシルベンゼンスルホン酸(DBS)とテトラブチルアンモニウムトリスホロメタンスルホイミド(TBATFSI)を用いたバイモルフ構造(立体構造造配置)のソフトアクチュエータ(PPy.DBS/PPy.TFSl)の変形量が大きく,また,これをLiTFSI溶液中で駆動させた場合に最も大きな変形を行い,さらには,長時間の駆動も可能となり高耐久性も確認できた.しかしながら,このバイモルフ構造間にスペーサーとして他層を挿入した場合の変形量は小さい.2.電解重合の基盤電極に曲面形状を用いることにより,開閉運動するソフトアクチュエータとして機能する.3.面状のソフトアクチュエータ(PPy.DBS/PPy.TFSl)を駆動源としたマイクロポンプを構築した結果,最大42.4[μ1/min]の振動体積が得られた.また,開閉運動するソフトアクチュエータを駆動源とした場合には,2.228.3[μ1/min]の振動体積が得られた.
スインゴシン1-リン酸受容体のクローニングと連関G蛋白質の解析

2年間にわたって実施された本研究の結果、少なくとも次の諸点を明らかにした。1.S1P受容体のクローニング:我々がS1P受容体遺伝子候補クローン解析している途中で、endothelial differentiation gene-1(Edg-1)、Edg-3、Edg-5と呼ばれるorphan受容体がS1P受容体であることが他のグループより報告された。しかしながら、これら受容体の発現量と細胞応答が一致しない場合も見受けられたことから、我々は他のS1P受容体の存在を予測しその候補遺伝子を探索した。その結果、新たにEdg-6がS1P受容体であることを証明した。2.S1P受容体に連関するG蛋白質-情報伝達系の解析:Edg-1、Edg-3、Edg-5、Edg-6各受容体を同程度に発現するCHO(Chinese hamster ovary)細胞を調製し、これら受容体のS1Pに対する結合親和性、連関するG蛋白質-情報伝達系の解析を行った。その結果、以下の知見を得た。(1)受容体発現細胞と標識S1Pとの結合実験より、最大結合数もほぼ同程度で、いずれの受容体もS1Pとの親和性も同程度であることが判明した。(2)PLC/Ca^<2+>系の活性化作用、アデニル酸シクラーゼ促進、抑制応答、細胞移動を指標にSlP作用を調べたところ、たとえば、PLC/Ca^<2+>系の活性化はEdg-3>Edg-5>Edg-1>Edg-6発現細胞の順でS1P作用が発現したが、細胞移動能に対してはEdg3=Edg-1であり、Edg-5、Edg-6発現細胞ではS1P作用は観察されないなど、それぞれの受容体サブタイプはやや選択的にシグナル伝達系を刺激することが判明した。スフィンゴシン1-リン酸(S1P)受容体は現在までのところ3種(Edg-1、Edg-3、Edg-5/AGR16/H218)報告されている。我々はS1P受全体応答(ホスホリパーゼC/カルシウム系)が細胞の増殖/分化状態で変化することを見出してきた。そこで、S1P受容体サブタイプめシグナル伝達系の解析と細胞の増殖/分化状態で変化する受容体サブタイプの同定を試みた。末分化HL60白血病細胞をdbcAMP、レチノイ酸、ビタミンD3などの分化誘導剤で処理するとS1PによるホスホリパーゼC/カルシウム系応答が減弱する。未分化HL60白血病細胞にはS1P受容本サブタイプ(Edg-1、Edg-3、Edg-5)のなかではEdg-3mRNAのみがノーザンブロットで検出されるが、分化誘導剤処理ではこの発現が著名に減弱する。したがって、Edg-3がHL60細胞の増殖/分化状態で変化する受容体サブタイプと考えられた。そこで、3種のS1P受容体-(Edg-1、Edg-3、Edg-5)遺伝子をCHO細胞に導入し、受容体過剰発現細胞を調製し、S1PのホスホリパーゼC/カルシウム系の活性化作用の程度を比較するとEdg-3が最も強く、Edg-5、Edg-1の順であることが判明し、Edg-3が実際にホスホリパーゼC/カノレシウム系の活性化を導くことが示唆された。一方、Edg-5は胎児脳、肝臓でその発現が高いが、成熟動物の脳、肝臓では低く、Edg-3と同様、細胞増殖の盛んな、分化途中の細胞では高いのに対し、Edg-1は逆で成熟動物の脳の方が胎児脳よりその発現が高い。このようにS1P受容体はいずれもその発現が細胞の増殖/分化状態で変化する調節性の遺伝子であることが示唆される。

スフィンゴシン1-リン酸(S1P)受容体として3種(Edg-1、Edg-3、Edg-5)が既に報告されていたが、今回、我々は新たにオーファン受容体であったEdg-6に対してもS1Pが特異的リガンドであることを証明した。我々はこのようにS1P受容体が複数存在する理由を調べる研究プロジェクトの一貫として、これらの受容体をCHO細胞に強制発現し、受容体サブタイプとシグナル伝達系との関連を調べた。その結果、以下の知見を得た。(1)受容体発現細胞と標識S1Pとの結合実験より、最大結合数もほぼ同程度で、いずれの受容体もS1Pとの親和性は約1030nMであることが判明した。(2)ホスホリパーゼC/カルシウム系の活性化作用、アデニル酸シクラーゼ促進、抑制応答、細胞移動を指標にS1P作用を調べたところ、たとえば、ホスホリパーゼC/カルシウム系活性化はEdg-3>Edg-5>Edg-1>Edg-6発現細胞の順でS1P作用が発現したが、細胞移動能に対してはEdg-3=Edg-1であり、Edg-5、Edg-6発現細胞ではS1P作用は観察されないなど、それぞれの受容体サブタイプはやや選択的にシグナル伝達系を刺激することが判明した。