hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
腎臓における細胞内糖鎖修飾の役割―生理的役割から糖尿病性腎症の病態形成まで―

慢性腎臓病(CKD)の進展因子として、腎局所における脂質代謝異常の役割が重要視されている。腎臓の近位尿細管は脂質代謝と特に関連が深く、その詳細な調節機構の解明は、腎症の発症・進展メカニズムの解明に寄与すると考えられる。その解明の足がかりとして、我々は脂質代謝が大きく変動する絶食時の応答に注目して検討を行った。絶食時には、脂肪細胞分解により生じた遊離脂肪酸が、アルブミンと結合した状態で近位尿細管細胞内へ急速に取り込まれ、一部が脂肪滴として細胞内に貯蔵される。近位尿細管における、絶食時の変化に対応するための調節機構は明らかでない。我々はこれに対応する機構として、細胞内栄養感知機構と言われているO-GlcNAc修飾に着目し、「O-GlcNAc修飾が近位尿細管における脂肪酸代謝調節に関与する」との仮説のもとに以下の検討を行った。近位尿細管特異的Ogt欠損マウス(PTEC Ogt-KOマウス)を作製し、表現型を検討した。PTEC Ogt-KOマウスは、絶食時に各種溶質の尿中排泄の増加、近位尿細管細胞のアポトーシス亢進、脂肪滴蓄積増加、ATP含量の減少が確認された。プロテオーム解析により、Carboxylesterase1(CES1)の発現低下と、その転写因子Farnesoid X Receptor(FXR)の活性低下が関与することを明らかにした。高脂肪食負荷時にも同様の尿細管障害の悪化を認めた。近位尿細管におけるO-GlcNAc修飾は、脂質代謝の恒常性を担っており、その異常が肥満糖尿病状態での腎障害にも寄与していることを明らかにした。細胞内蛋白に対する種々の翻訳後修飾は細胞の機能維持に不可欠であるが、ポドサイト機能制御における蛋白翻訳後修飾の役割には不明な点が多い。核内及び細胞内蛋白にN-アセチルグルコサミンが付加されるO-GlcNAc修飾の役割が解明されつつあるがポドサイトにおける役割は不明である。本研究ではO-GlcNAc修飾を制御するO-GlcNAc transferase (OGT)をポドサイト特異的に先天的に欠損するマウス(ポドサイト特異的OGTKOマウス)及びタモキシフェン誘導により後天的に欠損するマウス(タモキシフェン誘導性ポドサイト特異的OGTKOマウス)を作成しポドサイトにおけるO-GlcNAc修飾の役割を検討した。ポドサイト特異的OGTKOマウスは8週齢から尿蛋白が出現し、32週齢では高度尿蛋白を呈し、腎組織ではポドシンの発現量低下や点状化、電子顕微鏡における著しい足突起構造の破綻に代表されるポドサイト障害を示しポドサイト数の減少さえ認めた。一方、タモキシフェン誘導性ポドサイト特異的OGTKOマウスも尿蛋白を示したが、誘導32週での尿蛋白量はポドサイト特異的OGTKOマウスと比べて非常に少なくポドサイト障害の程度も軽微であった。以上よりO-GlcNAc修飾がポドサイト足突起構造及び機能に不可欠であることが明らかとなり、特に出生後のポドサイトの成熟に重要であることが示唆された。また、引き続き近位尿細管特異的OGTKOマウスを作製し現在機能解析を行っている。さらに糖鎖修飾を過剰に起こすためにOGA遺伝子の糸球体上皮細胞特異的欠損マウスならびに尿細管細胞特異的欠損マウスを作製開始する。初年度に予定したポドサイトにおけるOGTの機能解析は全て終了し論文公表までいたり、さらに尿細管細胞特異的な機能解析まで順調に進んでいる。本年度の研究では、近位尿細管細胞におけるタンパク翻訳後修飾O-GlcNAc修飾の近位尿細管細胞機能維持における役割を解明した。近位尿細管機能は脂肪酸分解を介したATP産生により維持されている。蛋白翻訳後修飾の一つO-GlcNAc修飾は細胞内栄養センサーとしての役割を持つが、近位尿細管での役割は不明である。本研究では、近位尿細管のATP産生制御におけるO-GlcNAc修飾の役割を検討した。近位尿細管特異的O-GlcNAc修飾欠損マウス(以下KOマウス)を作製し、野生型マウスと比較した。摂食時、KOマウスは有意な表現型を呈さなかったが、48時間絶食時には腎皮質ATP含量の低下を伴う、尿中アミノ酸、グルコース、各種イオン排泄の増加、アポトーシス亢進が確認された。絶食時のATP合成には、脂肪滴形成、脂肪酸分解、ミトコンドリアでの酸化的リン酸化が必要だが、KOマウス腎では、脂肪滴の巨大化、脂肪酸分解酵素の発現減少、ミトコンドリアの断片化といった、脂肪酸分解-ATP合成の全過程に障害が確認された。さらに、KOマウスから単離した培養尿細管細胞でもATP産生能の減弱が確認された。プロテオミクスを用い、脂肪酸代謝・ミトコンドリア機能調節因子に関するタンパク発現を検討した結果、ある転写因子によって制御される脂肪酸燃焼酵素群の発現がKOマウス腎で有意に減量していることが明らかとなった。本研究から、細胞ないタンパク質に対するO-GlcNAc修飾は近位尿細管における絶食時の脂肪酸代謝-ATP産生系に不可欠であることが明らかとなった。順調に進んでいる。

その解明の足がかりとして、我々は脂質代謝が大きく変動する絶食時の応答に注目して検討を行った。絶食時には、脂肪細胞分解により生じた遊離脂肪酸が、アルブミンと結合した状態で近位尿細管細胞内へ急速に取り込まれ、一部が脂肪滴として細胞内に貯蔵される。近位尿細管における、絶食時の変化に対応するための調節機構は明らかでない。我々はこれに対応する機構として、細胞内栄養感知機構と言われているO-GlcNAc修飾に着目し、「O-GlcNAc修飾が近位尿細管における脂肪酸代謝調節に関与する」との仮説のもとに以下の検討を行った。近位尿細管特異的Ogt欠損マウス(PTEC Ogt-KOマウス)を作製し、表現型を検討した。PTEC Ogt-KOマウスは、絶食時に各種溶質の尿中排泄の増加、近位尿細管細胞のアポトーシス亢進、脂肪滴蓄積増加、ATP含量の減少が確認された。プロテオーム解析により、Carboxylesterase1(CES1)の発現低下と、その転写因子Farnesoid X Receptor(FXR)の活性低下が関与することを明らかにした。高脂肪食負荷時にも同様の尿細管障害の悪化を認めた。近位尿細管におけるO-GlcNAc修飾は、脂質代謝の恒常性を担っており、その異常が肥満糖尿病状態での腎障害にも寄与していることを明らかにした。先天的近位尿細管細胞特異的OGT欠損マウス、薬剤誘導性近位尿細管細胞特異的OGT欠損マウスを作製し、近位尿細管細胞におけるO-GlcNAc修飾のloss-of-functionが細胞機能や生命維持に及ぼす影響を検討する。既に先天的欠損マウスが12週齢以降に尿細管細胞における再吸収機能障害を呈する知見が得られている。特にこの点に関し、全ての再吸収機能に影響を及ぼしているのか、メガリン機能、各種分子(グルコース、リン、尿酸、アミノ酸、HCO3-)の中で特異的な機能障害を呈しているのかを解明していく。糖鎖修飾を過剰に起こすためにOGA遺伝子の糸球体上皮細胞特異的欠損マウスならびに尿細管細胞特異的欠損マウスを作製開始する。1遺伝子改変マウスからの単離細胞を用いたプロテオミクスによるO-GlcNAc修飾タンパクの同定。すでにプロテオミクスにより候補転写因子の同定に成功しており、今後、その転写因子のO-GlcNAc修飾の有無、その転写因子のO-GlcNAc修飾の有無が脂肪酸燃焼過程に及ぼす影響を検討する。2遺伝子改変マウスに糖尿病モデルを作製し、糖尿病状態における腎O-GlcNAc修飾の役割を検証する。近位尿細管特異的OGT欠損マウスに高脂肪食負荷、STZ誘導性糖尿病モデルを誘導し、糖尿病性腎症におけるO-GlcNAc修飾の役割を検証する。
比較ゲノム解析による進化・多様性のゲノム基盤の解明支援

本班は、特定領域研究「比較ゲノム解析による進化・多様性のゲノム基盤」で行う研究活動のうち、共通性が高く高度な経験を必要とするリソース整備、クローンスクリーニング、情報統計処理等を支援するために設置された支援班である。支援の成果として、ナメクジウオなどの重要種のゲノム解読の成功、新型シーケンサによる環境メタゲノム研究などがあげられる。本支援班の活動は、ゲノム科学の新たな展開を進めるための基盤形成と特定領域研究全体の進展に大きな寄与を果たした。比較ゲノム研究では、多様な生物種のゲノム構造情報や機能情報を効率的に収集・生産し、それらを有機的に結合させながら解析研究を進める必要がある。この中には、試料収集、各種のDNA・cDNAライブラリの整備、体系的なDNAマーカー類の整備、ゲノム全体を覆うクローンコンティグの整備、DNA・cDNAの配列決定、これらを統合した地図の作成など、統合的なゲノム情報を創出するために必要な共通性の高い活動を必要とする。しかし、これらに伴う作業は熟練と経験を要する専門的なものであり、通常の研究室の規模で実行することは不可能もしくは困難であると同時に非効率的である。そのため、本支援班では、研究材料の収集やライブラリの作成に十分な経験を持つ研究グループ、マーカー作成やスクリーニングに十分な経験を有するグループ、ゲノム情報の進化学的な処理に秀でたグループを組織し、各計画研究班ならびに公募研究班からの共通性の高い要望に対して支援業務を実施する。具体的には、計画の初年度であることから、当初計画を多少変更して支援用設備類の充実化をまず図った。また、研究支援の透明性を図るために研究支援委員会を設置し、班員からの支援要請について個別審査を実施後に支援の決定を行った。今年度分の支援としては、ゲノムライブラリ作成5件、完全長cDNAライブラリ作成7件、配列決定支援30件以上(12班分)、マイクロアレイ作製のほか、マイクロアレイ講習会(1回)を実施した。支援班であるため、研究活動は行っていない。比較ゲノム研究では、多様な生物種のゲノム構造情報や機能情報を比較解析し、それらを有機的に結合させることで研究が進展する。ゲノムを対象とした研究では、必要な試料の収集とリソース化、各種のゲノムDNAやcDNAライブラリの整備、高精度地図の作製、ライブラリスクリーニング、塩基配列決定等、各研究班に共通して必要だが特別な技術やシステムを必要とし、個別の研究班で対応するよりは領域全体として整備した方が効率的なものや、配列アセンブリ、比較配列解析、マイクロアレイ解析、統計解析のように、特別な知識や経験を有するエキスパートの支援を必要とするものがある。当班は、これら比較ゲノム研究の推進に必要で、しかも共通性の高い項目について研究支援を行うことを目的に活動する。また支援班である本班は、研究活動は実施しない。今年度の本班の活動は、支援対象をゲノム4領域全ての計画研究班、公募研究班とし、研究支援委員会への支援申し込みに基づいた審査のうえ、具体的な支援を実施した。その結果、今年度は19件の支援要請を受け、計3回の研究支援委員会で審査を行い(第1回8月初旬、第2回10月中旬、第3回11月下旬)、以下の支援を実施した。18件のBACライブラリ、フォスミドライブラリ、完全長cDNAライブラリを構築した。26件の入れる決定・解析支援を実施した。マイクロアレイ実験に関するコンサルティングと講習会(1回)を実施した。今年度の本班の活動は、前年度からの継続分に加え、今年度は新たに以下の支援を実施した。研究用リソース作成支援:ミヤコグサ、ヒメツリガネゴケ、クラミドモナスについて、複数条件下でcDNAライブラリを作成。Acytostelium粘菌の、BACライブラリ、フォスミドライブラリの作成。シーケンシングと配列解析支援(基盤ゲノム小原班、基盤ゲノム情報支援班、基盤ゲノム菅野班とも連携:Acytostelium属粘菌cDNAシーケンシング。Acytostelium粘菌のBAC&フォスミドクローンの末端配列解析。クジラBACコンティグの配列決定シクリッド嗅覚遺伝子を含むBACの配列決定。寄生性原虫cDNAの配列決定。パンコムギESTシーケンシング。また、今年度、新たに超並列型シーケンサ、レーザーダイセクション装置、定量PCR装置を導入し、稼働テストを行った。

これらの装置については平成20年度から一般支援に供する予定である。比較ゲノム研究では、多様な生物種のゲノム構造情報や機能情報を比較解析し、それらを有機的に結合させることで研究が進展する。ゲノムを対象とした研究では、必要な試料の収集とリソース化、各種のゲノムDNAやcDNAライブラリの整備、高精度地図の作製、ライブラリスクリーニング、塩基配列決定等、多研究班に共通して必要だが特別な技術やシステムを必要とし、個別の研究班で対応するよりは領域全体として整備した方が効率的なものや、配列アセンブリ、比較配列解析、マイクロアレイ解析、統計解析のように、特別な知識や経験を有するエキスパートの支援を必要とするものがある。当班は、これら比較ゲノム研究の推進に必要で、しかも共通性の高い項目について研究支援を行うことを白的に活動する。また支援班である本班は、研究活動は実施しない。今年度は新たに以下の支援を実施した。シーケンシング支援:全ゲノムを対象: 3件、BAC・フォスミド・cDNAクローン全長配列決定: 11件、BAC・フォスミドライブラリ末端配列決定: 1件、cDNAライブラリエンド配列決定: 6件、PCR産物を用いたゲノムリシーケンシング: 2件、GAIIによる支援(ゲノム・メタゲノム) : 6件、GAIIによる支援(トランスクリプト) : 2件、ライブラリ・リソース構築支援: BAC・フォスミドライブラリ作成: 4件、完全長cDNAライブラリ作成: 2件、マイクロアレイ技術支援: 1件比較ゲノム研究では、多様な生物種のゲノム構造情報や機能情報を比較解析し、それらを有機的に結合させることで研究が進展する。ゲノムを対象とした研究では、必要な試料の収集とリソース化、各種のゲノムDNAやcDNAライブラリの整備、高精度地図の作製、ライブラリスクリーニング、塩基配列決定等、各研究班に共通して必要だが特別な技術やシステムを必要とし、個別の研究班で対応するよりは領域全体として整備した方が効率的なものや、配列アセンブリ、比較配列解析、マイクロアレイ解析、統計解析のように、特別な知識や経験を有するエキスパートの支援を必要とするものがある。当班は、これら比較ゲノム研究の推進に必要で、しかも共通性の高い項目について研究支援を行うことを目的に活動する。今年度は従来から実施したcDNA解析支援、BACライブラリ等のゲノムリソース作成支援に加え、Illumina GAゲノムアナライザによる大規模シーケンシング支援依頼が増加したことが特徴である.応用ゲノム研究班からの依頼により、人個人ゲノムの大規模解読も開始した。支援実績は下記の通り。BACライブラリ構築、BACクローンシーケンシング:4件、新型シーケンサによる大規模シーケンシング:6件、その他(ライブラリ操作):1件
代数群上の保型形式とゼータ関数の研究

1.ユニタリ群のmetaplectic表現に関する研究局所体上のn次ユニタリ群上のmetaplectic表現を考察し、そのuniversalなsplittingを与えた。これは,特にテータ・リフトの研究において有用である。また、これの応用として、metaplectic表現の指標公式を与えた.2.3次ユニタリ群上の保型形式のフーリエ・ヤコビ展開の理論3次ユニタリ群上の保型形式のフーリエ・ヤコビ展開についての新谷の理論のアデール的再定式化を行い、Eisenstein級数、およびKudla liftと呼ばれる楕円モジュラー形式からのテータリフトに対して、そのフーリエ・ヤコビ展開を具体的に求めた。応用として,Kudla liftが消えないための新しい必要十分条件を得た。3の結果を用いて、一変数保型形式fから,テータ・リフトを介して構成される3次ユニタリ群上の保型形式Kudla liftのピーターソン内積に関するノルムが,本質的にはfの保型L関数の特殊値で記述されることを示した。この応用として,Kudla lifが消えないための(2で述べたものとは異なる)必要十分条件を得た。(以上、2-4は菅野孝史氏との共同研究である。)5.整数論サマースクールのサポート若手研究者の基礎知識向上および交流を目指して整数論サマースクールが行われている。これに対するサポートを行った。各年度のテーマは次の通りである。2001年度:「ゼータ関数」、2002年度:「概均質ベクトル空間」、2003年度:「岩澤理論」、2004年度:「基本群とGalois表現」。今年度は、テータリフトとそれに関連するmetaplectic表現について研究し、次の結果を得た。1、2次ユニタリ群上の正則保型形式fから3次ユニタリ群上の正則保型形式L(f)をテータ級数を介して構成するKudlaリフトについて研究した。特に、L(f)のフーリエ、ヤコビ展開を完全に決定した。各係数は本質的に、fの周期、テータ関数の周期およびHecke作用素に関する固有値で表される。その応用として、L(f)が消えないためのcriterionを得た。また、Kudlaリフトの正則性や、それがHecke作用素の作用に対してcompatibleであることの別証を得た。(金沢大、理・菅野孝史氏との共同研究)2、局所体上の般のユニタリ群のmetaplectic表現を詳細に研究し、特にそのmodel-independentなsplittingの明示公式および指標公式を得た。これは、1の証明で重要な役割を果たすものであるが、テータリフトの研究において今後も様々な応用があると思われる。今後は、今年度の研究をさらに深めるために、次のような研究計画を予定している。1、L(f)のノルムを計算して、L(f)が消えないための新しいcriterionを得る。そのために、(U(2,1),U(2,2))に対するSiegel-Weil公式を研究する。2、一般の3次ユニタリ群上の保型形式のフーリエ、ヤコビ展開に対する予想を研究する。また、今年度は、愛媛大・理・平野幹氏をプログラム責任者として、第9回整数論サマースクール「ゼータ関数」を開催し、本研究費から旅費の部や報告集の印刷費等を援助した。サマースクールは盛況で、若手研究者の知識を高めるとともに、研究者のあいだの交流をはかることができた。今年度は,3次ユニタリ群上のSiegel-Weil公式,およびそれの応用としてのテータリフトの内積公式を研究し,次の結果を得た。

2.1の結果を用いて,2次ユニタリ群上の正則保型形式fから3次ユニタリ群上の正則保型形式L(f)をテータ級数を介して構成するKudlaリフトの内積公式を計算し,それがfの保型L関数の特殊値で記述されるという結果を得た。応用として,Kudlaリフトが消えないための新しい規準を得た。今後は,今年度の研究結果をさらに深めるために,次のような研究計画を予定している。1.3次ユニタリ群上の一般の保型形式に対するFourier-Jacobi係数の絶対値の平方についてのWaldspurger型の公式の予想を確立し,証明を試みる。2.1の準備として,Kudlaリフトの場合のFourier-Jacobi係数の場合を考察するために,U(1)上の保型形式の周期とL関数の特殊値との関係を研究する。また,今年度は、近畿大学・理工学部・大野泰生氏をプログラム責任者として、第10回整数論サマースクール「概均質ベクトル空間」を開催し、本研究費から会議費,旅費の一部や報告集の印刷費等を援助した。サマースクールは大変盛況で、大学院生を含めた若手研究者の知識を高めるとともに、研究者のあいだの交流をはかることができた。今年度は,昨年度に引き続き,ユニタリ群上のSiegel-Weil公式,およびそれの応用としてのテータリフトの内積公式を研究し,次の結果を得た。2.1の結果を用いて,3次ユニタリ群上の正則保型形式Fから2次ユニタリ群上の正則保型形式L^*(F)をテータ級数を介して構成する随伴Kudlaリフトに対する内積公式がFの保型L関数の特殊値で記述されるという予想のもとに研究中である。応用として,随伴Kudlaリフトが消えないための新しい規準を得られると思われる。以上2点は,金沢大・理・菅野氏との共同研究である。3.四元数ユニタリ群上の保型形式の研究,特にテータリフトの研究のため,四元数ユニタリ群上のメタプレクティク表現を研究した。2.四元数ユニタリ群上のメタプレクティク表現の研究の応用として,楕円モジュラー形式から四元数ユニタリ群上の保型形式へのテータリフトを研究する。また,今年度は、島根大学・総合理工学部・尾崎学氏をプログラム責任者として、第11回整数論サマースクール「岩澤理論」を開催し、本研究費から会議費,旅費の一部や報告集の印刷費等を援助した。今年度は、昨年度に引き続いてユニタリ群上の保型形式の数論的研究を主なテーマとして研究を行った。内容は以下の通りである。1.前年度行ったKudla liftの内積公式に現れる1変数保型形式の周期を研究するため、dual reductive pair(U(1,1),U(1,1))に対応するテータリフトを調べ、Eichler commutation relationが成立することを示した。また、この場合のSiegel-Weil公式を研究することによって、テータリフトの内積公式を得た。応用として、1変数保型形式の周期(CM値)と保型L関数の特殊値のあいだの関係に関して、虚2次体の類数が1の場合に新しい知見を得た。
ATP合成酵素:サブユニットの複合体の回転を伴う反応機構

ATPase合成酵素(F型ATPase)は生体のエネルギー貨幣であるATPを合成するという極めて重要な役割を担っている。研究代表者らはF型ATPaseが化学反応とH^+輸送の共役に於いて、サブユニットの回転を伴う分子ナノモーターであることを、精製したF型ATPase、さらに大腸菌の膜に局在するF型ATPaseを用いて示した。特に工夫をした点は大腸菌より平面膜を調製し、F型ATPaseのF_0部分を用いてガラス面に固定する方法である。この系にATPを加えると反時計方向にαとβサブユニットよりなるα_3β_3部分が連続的に回転した。この結果はモーターの回転の機構、回転方向を決定する原理、回転とプロトンポンプ機能との共役機構を理解する上で極めて重要な知見である。F型ATPaseと構造的に類似しているプロトンポンプATPaseとして、液胞型ATPase(V型ATPase)が知られている。本研究では、酵母のV型ATPaseを膜内在V_0部分を介してガラス面に固定し、膜表在V_1部分にプローブを導入し、V型ATPaseもF型ATPaseと同様に分子ナノモーターであることを証明した。V型ATPaseはリソソーム、エンドソーム、シナプス小胞等のオルガネラの内部を、また、骨吸収窩、尿細管をはじめとする細胞外コンパートメントの内部を酸性にしている。すなわち、V型ATPaseが極めて興味深い多様性を持ち、多くの酸性環境を形成していることを明らかにした。さらに、局在性と生理的機能の多様性がサブユニットのイソフォームによって説明できることを示した。ATP合成酵素(F_0F_1)は、ミトコンドリア、葉緑体、細菌細胞膜に局在し、生物におけるほとんどのATPを合成している。最も基本的な大腸菌のATP合成酵素は8種のサブユニットからなりα_3β_3γδεがF1を、ab_2c_<1014>がF_0を形成している。本研究によって13年度には次のような成果が得られた。1)F_0F_1はab_2δα_3β_3部分が固定子γεc_<1014>が回転子を形成しているが、この回転は相村的なものである。すなわち固定子と回転子は取り替えることが出来る。2)逆反応すなわちF1部分をとりATPase反応を行わせ、回転を解析した。その結果βサブユニットのGlu-149Ser0-174にわたるドメインの反応に伴う構造変化に伴ってγサブユニットが回転することが部位特異的に変異を導入したF_1の解析によって明らかになった。3)V型ATPaseの固定子となりうるサブユニットEとGにイソフォームが存在することを明らかにした。V型ATPaseはF_0F_1と相同性があり、きわめてよく似ている。F_0とF_1に対応する部分はV_0とV_1とよばれている。GとEはV_1とV_0をつなぐ役割をしている。エネルギー貨幣であるATPを合成しているATPase合成酵素(F型ATPase)は生体に於いて極めて重要な役割を担っている。研究代表者らはF型ATPaseが分子ナノモーターであることを精製F型ATPaseを用いて実験的に示し、さらに大腸菌の膜を用いてF型ATPaseの回転を観察する系を確立した。特に工夫をした点は平面膜を調製する方法と、これをF型ATPaseのFo部分を用いてガラス面に固定する方法である。この系にATPを加えると時計方向に連続的にα,βサブユニットが回転した。これらの結果はモーターの回転の機構、回転方向を決定する原理、回転とプロトンポンプ機能との共役機構を理解する上できわめて重要な知見である。

研究代表者らはV型ATPaseとF型ATPaseがサブユニットの一次構造だけではなく、速度論的にも類似していることを示した。また、V型ATPaseが極めて興味深い多様性を持ち動物において多くの酸性環境を形成することを明らかにした。また局在性と生理的機能の多様性に関してはサブユニットイソフォームによって説明できることを明らかにした。さらに精製した酵母V型ATPaseをガラス面に固定し、Vo部分にプローブを導入し、V型ATPaseもF型ATPaseと同様に分子ナノモーターであることを実験的に証明した。プロトンポンプにはATP合成酵素と液胞型H^+-ATPaseが知られている。ATP合成酵素がH^+-ATPaseとしての逆反応を行うことが知られており、両者は似ている点も多い。研究代表者らは、ATP合成酵素の反応がサブユニットの回転機構と共役していることを示してきた。本研究では大腸菌形質膜断片を用いて、本来の膜内に局在するATP合成酵素の膜内在、aサブユニットと、および表在部分と内在部分よりなるサブユニット複合体γcサブユニットが相対的に回転することを実証した。すなわち膜からの可溶化精製という操作を行っていない標品を用い、ATP合成酵素のサブユニットの回転を実証した。また酵母の液胞型H^+-ATPaseにおいでも、cサブユニットを固定すると、同様にGサブユニットが相対的に回転することを実証した。液胞型H^+-ATPaseのサブユニット構造、生理機能、反応機構(ATP/H^+比など)はATP合成酵素とは異なるにも関らず、2つの酵素ともサブユニットの回転を伴って反応するという知見を得たことは大きな成果である。さらにマウスのV型H^+-ATPaseには回転軸および固定部分を形成するサブユニットに多数のイソフォームが存在することを示した。その中でも本年度、明らかにした肺と腎臓に異なるCサブユニットが存在すること、肺のラメラボディのV型H^+-ATPaseはC2-bを持つことを示したことはきわめて意義深い。
高塩分水浸透環境下における石灰・セメント改良土の長期的劣化特性に関する研究

1.研究内容市販するカオリン土を採取して、物理特性及び化学成分を調べた。使われたカオリンの特性を下に示します:土粒子密度p_s=2.65、自然含水比w_n=0.5%、液性限界w_L=42.5%、塑性限界w_P=19.5%、シルト含有量45.8%、砂含有量54.2%。試料土の含水比を液性限界の2倍に調整して(w=85%)、セメント8%を添加して、高さ28cmの供試体を作製した。そして50kPaの圧密応力を掛けて、28日間アクリル浸透装置で養生した。圧密終了後、24cmの供試体を作成した。また、塩分濃度20g/Lの塩水を約35日間で供試体に浸透させた。通水応力が50kPaとした。浸透中に、50kPaの圧密応力を掛けた。また、浸透実験中、供試体底部からの浸出水について、塩分濃度、pH及び浸出水の容積を測定した。実験後、供試体をアクリルモールドから取り出し、厚さ4cm毎にカットして、各々に定体積一面せん断試験を行って、強度定数c及びφを求めた。浸透実験中、供試体底部からの浸出水の塩分濃度、pH及び浸出水の容積の変化を測定した。塩分濃度及びpHが時間の変化伴に下がったことが分かった。これは、浸透溶液中のNa+と供試体のCa2+がイオン交換した、供試体に形成した水和物(CSH)が溶解したと考えられる。また、実験室の停電などが浸出水の容積に影響したことが分かった。浸透実験後供試体の深度毎における含水比を測定した。供試体の深度毎において、含水比がほぼ均一的に分布することが分かった。また、供試体の0-4cm深度、4-8cm深度、12-16cm深度及び16-20cm深度において、一面せん断実験から、強度定数を求めた。これらの結果から、深度0-4cm及び4-8cmにおいて、強度定数c及びφがあまり変わらなかった。然し、12-16cm及び16-20cmにおいて、強度定数cが表部より急激に上がった。定数φも下がったことが分かった。これは、表部0-12cmまでにおいて、浸透水中のNa+と供試体のCa2+がイオン交換して、水和物(CSH)が溶解したと考えられる。今回の試験結果により、高塩分水浸透環境下供試体の劣化が12cmまで進行したと考えられる。
腫瘍細胞破壊の総合的研究―特に樹状細胞について

○樹状細胞は抗原提示細胞として免疫反応を起こす細胞である。臍滞血の中に種々の樹状細胞が存在している事が判明した。○すなわち臍帯血に含まれる樹状細胞は、GM-CSF、SCF、IL-3を添加して4週間にわたって培養すると、CD1a、CD11c、CD83、CDw123ともに増加が見られ、3.153.4%の範囲の増加、実数としては6.928.2x10^5/mlの増加が確認できた。○これらの結果から、臍帯血にはDendritic cellのprogenitorが含まれており、34週間後に最高となり、この頃の樹状細胞が骨髄系、単球系、リンパ球系のどの細胞由来であるのか、そうしてどの系の細胞が腫瘍の免疫療法により有効なのかは今後の問題である。そこで分娩後大部分は廃棄処分されていた臍帯血の細胞がどのような表面抗原を持っているのか検討した。66例の臍帯血細胞をFicoll conrayで処理しFlow Cytometryで測定すると,CD4 48.1%,CD8 19.6%,CD19 7.5%,CD34 2.9%,CD38 73.5%,CD83 1.5%であった。さらにDCを検出するための抗体を使うとCD1a 0.3%,CD11c 12.2%であった。γhIL-3を加えて培養した臍帯血細胞ではCD83,CD1aの二重染色で陽性率は平均3.9%、CD83,CD123では0.8%であった。臍帯血細胞にはCD34^+,CD1a^+,CD11c^+,CD83^+という細胞があり,抗原提示には重大な影響を与えているということになる。種々のサイトカインを使ってDCを増やすことを試みたが,現在のところ,まだ成功していない。頻度としては少ないが,DCの腫瘍局所への遊走能や腫瘍とDC,T細胞との相互関係などin vitroにおいてどのように行われたいるのか,今後の研究で明らかにしていきたい。CD1a^+0.20.3%、CD11c^+9.612.7%であったCBにγhIL-3を加えて3週間培養したところ、CD83^+/CD11c^+9.2%,CD83^+/CDw123^+0.2%であった。次に、T細胞、NK細胞、マクロファージをAutoMACSでネガティブフラクションをえて、その後AutoMACSでポシティブセレクションカラムにかけてDCをえて、フローサイトメーターで測定するとノイズが多く測定不可能であった。これはどういうことなのか検索中である。今後はGM-CSF、IL-4、TNFαを使用して、in vitroで増幅して用いる方法の検討が必要である。またFL3リガンドを投与すると樹状細胞の前駆細胞が増える事が知られており試みる予定である。更に免疫療法についてBalb/c、P3X63を用いて検討する。人臍帯血について、単核球を分離し3種のサイトカイン(γhGM-CSF,γhSCF,γhIL-6)を加え、1週間培養を行い、サイトフルオロメーターでリンパ球領域と単球領域に分けて解析を行った。新鮮血及び1週間培養後の臍帯血について、まず、リンパ球領域を培養前/後で見ると、CD4^+43.8%/45.6%, CD8^+33.3%/30.5%, CD19^+10.0%/2.4%, CD34^+1.4%/0.5%, CD38^+40.4%/40.6%, CD83^+5.0%/1.3%, CD1a^+0.8%/1.2%, CD11c^+16.9%/11.9%, CDw123^+7.2%/9.2%であり、新鮮臍帯血と1週間培養したものとの間では大差は認めなかった。即ち樹状細胞(DCs)はCD83^+,CD11c^+では新鮮血の方に多く、CD1a^+では培養細胞の方に多く認められた。しかしDCsを増やすサイトカインが何であるか、何種類のサイトカインが必要であるかなど、まだ確認できないところが多い。マウスを用いたDCsの確認と抗腫瘍効果発現の実験を行い、P388がDBA/2の体内で、あるいはP3×63がBalb/cの体内で破壊されていく過程を検討し、DCsが如何なる役目を持ち、腫瘍免疫において働いているのか実験する予定である。樹状細胞(DC)はT細胞に対して強力な抗原提示能を有する細胞である。

形態学的には特徴ある原形質突起を有し、大食細胞活性を持ち、MHC Class II並びに共刺激分子を持っている。未熟DCは小型で蛋白処理能力を有し、成熟DCは大型でT細胞刺激能が強い細胞といえる。次いで、増加したDCを使ってin vitroで腫瘍免疫を誘導する実験を行っているが、今のところ、未だ出来上がっていない。臍帯血の細胞は機能的には未熟であるのかもしれない。他方、マウスを用いた実験系でP388とDBA/2を使って腫瘍免疫を誘導しているが、P388の腫瘍抗原をいかに認識させるかが問題である、次年度もこれらの問題について研究を進める予定である。
都市環境改善と減災を目的とした人口減少下の緑地再配置計画に関する研究

今年度は以下に示す内容を実施し、都市環境図作成に伴う「都市環境生態系図」の作成に関わる「生物生息環境の維持と形成を意図した公開空地における利用者評価に関する研究」をすすめた。[研究背景・目的]日本の大都市中心部では、公開空地に緑化指導を施すことで、都市全域の緑化面積の増加を図っており、近年では、緑の機能を用いた「人間にとって快適な空間の確保」と併せて「生物生息環境の維持と形成」が都市中心部の公開空地で実施されている。これまで、「生物生息環境の維持と形成」を意図した植栽計画は、景観面の制約や維持管理の難しさから、人間が日常的に利用するレクリエーション空間とは分けて計画されてきた。しかし、都市中心部のような比較的限られたエリアにおいて、両空間を分けて計画した場合、それぞれが有する面積の小規模化が予想される。そのため「生物生息環境の維持と形成」を行いつつ、「人間にとって快適な空間の確保」をするためには、どのような緑地空間を計画すればよいかを明らかにする必要があると考えられる。そこで本研究では、「生物生息環境の維持と形成」を目標に植栽計画が行われた公開空地を対象に、利用者評価を把握し、今後の都市中心部における緑地計画のあり方について検討することを目的とした。[結果]アークヒルズ仙石山森タワーを対象に、まずは実施されたアンケート調査結果を用いて、「生物生息環境の維持と形成」を意図して計画された日常的なレクリエーション空間としての緑地の利用者評価を把握した。次に居住者インタビュー調査を実施し、その結果とアンケート調査結果を併せて、利用者が緑地空間をどのように評価し、なぜそのように考えるのかを考察した。さらに利用実態調査を実施し、その実態と利用者評価との関連を明らかにした。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。今年度は以下に示す内容を実施し、都市環境図作成に伴う「都市環境気候図」「都市環境生態系図」の作成をすすめた。1「都市環境気候図」の実用化を目標としたヒアリング調査実施に関わる情報収集地方自治体の環境・都市計画関連業務を支援するための都市環境気候地図のあり方を明らかにするための第一歩として、来年度行うヒアリング調査に向けた情報収集を行った。対象は広島市とし、まずは環境・都市計画関連業務を行っている課及びその業務内容を調査した(企画総務局:「企画調整部政策企画課、総合計画係」、環境局:「環境政策課、環境政策係」「温暖化対策」「環境保全課、環境管理係」、都市整備局:「都市計画課、都市計画係」「都市機能調整部都市再開発担当」「緑化推進部緑政課、企画管理係」「緑化推進部緑政課、花と緑の施設係」「緑化推進部公園整備課」「住宅部住宅政策課、計画係」、下水道局:河川防災課)。2「都市環境生態系図」作成に関わる「公開空地における利用者アンケート調査実施」に伴う事前準備今年度は主に都市生態系保全の観点からどのようなゾーンを優先的に緑化すべきかを示す、「都市環境生態系図」作成を最終目的とし、それを見据えた研究課題「東京都心部の公開空地における物的特性と利用者評価の関連に関する研究ー東京都心部の公開空地における利用者アンケート調査ー」に伴う事前準備を行った。具体的には、1「人間にとって快適な空間の確保」と「生物の生息環境の維持と形成」を意図した植栽計画がなされた東京都23区内の公開空地の調査、2公開空地設計者に対する公開空地内植栽計画の意図に関するヒアリング調査、3ヒアリング調査結果を用いた利用者インタビュー調査及びアンケート調査設計等を行った。研究計画書に示した本年度の目的である「都市環境気候図」、「都市環境生態系図」の作成に関わる情報収集を行ったが、一部行っていない調査があるため、「(2)おおむね順調に進展している。」を選択した。

さらに利用実態調査を実施し、その実態と利用者評価との関連を明らかにした。主に29年度の成果をベースに、「都市環境気候図」、「都市環境生態系図」の作成を行う。さらに平成30年度は主に「都市環境水図(水環境)」の作成を行う。以下にその手順を示す。1環境要素(水)に関連する基礎的な資料収集、及び現地調査を行い、GISデータベース化を行う。2水環境分野の文献を収集・整理し、水環境に関する都市環境改善機能、減災機能を整理する。3Arc Hydro、及びHEC-HMSを用いた水文解析を行い「水資源ネットワーク」の把握、及び地図化を行う。41、2、3の結果を用いて、各基礎情報から水環境に関する機能評価を行い「環境機能評価図(水環境)」を作成する。54の結果を用いて、水環境に関する機能評価別のゾーニングを行い、「都市環境水図」を作成する。63、5の結果を用いて、水環境の観点から優先的に緑化すべきゾーンを抽出する。7国内外の学会(日本建築学会、日本都市計画学会等)や論文集を通じて6までの成果を公表する。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。
樹状細胞療法の反応例の解析に基づく腫瘍血管標的療法の検討

悪性黒色腫に対する樹状細胞療法で反応した症例を解析した結果、治療反応症例にのみ炭酸脱水酵素(carbonic anhydrase II : CAII)に対する抗体が上昇していた。またCAIIは腫瘍血管内皮に特異的に染色された。これらの事実から本研究の目的は、(1)樹状細胞療法の反応例における腫瘍血管を破綻させる抗体の検索、(2)腫瘍血管内皮様に分化させたhUVECを抗原とした腫瘍免疫療法の確立とした。(1)についてメラノーマ腫瘍cDNAライブラリーを作製し、蛋白を発現させ、患者血清を用いたスクリーニング行った。(2)の腫瘍免疫療法については動物実験を行いその効果を確認した。第IV期悪性黒色腫患者10名と遠隔転移を伴う甲状腺癌患者6名に対し,腫瘍溶解液を抗原とする樹状細胞療法(第1相臨床研究)行った。悪性黒色腫でmixed responseを示した2例では,多数の転移巣の壊死とそれに続く腫瘍の縮小あるいは消失が認められた。検索の結果,悪性黒色腫の治療反応症例にのみ,治療後に炭酸脱水酵素(carbonic anhydraseII:CAII)に対する抗体が上昇していることが明らかとなった。CAIIの局在を調べたところ,腫瘍血管内皮に特異的に染色され,正常血管内皮には認められなかった。これらの事実から本研究の目的は,(1)樹状細胞療法の反応例における腫瘍血管を破綻させる抗体の検索,(2)腫瘍血管内皮様に分化させたhuVECを抗原とした腫瘍免疫療法の確立とした。まずメラノーマ腫瘍cDNAライブラリーを作製した。腫瘍組織の一方向性のcDNA合成を行い,ZAP Express XRにcDNAを挿入し,一方向性ライブラリーを作製した。各プール3-4万個の独立クローンを含むようにプール化し,amplificationを行った。メラノーマ腫瘍由来のライブラリーを3種類作製してスクリーニングを行った。次に患者血清を用いたスクリーニング行った。しかし平成19年度には陽性クローンは得られていない。平成20年度以降も引き続き行う予定であるが,CAIIなどのポジティブコントロールを置いて検討する。第IV期悪性黒色腫患者10名と遠隔転移を伴う甲状腺癌患者6名に対し、腫瘍溶解液を抗原とする樹状細胞療法(第I相臨床研究)行った。悪性黒色腫でmixed responseを示した2例では、多数の転移巣の壊死とそれに続く腫瘍の縮小あるいは消失が認められた。検索の結果、悪性黒色の治療反応症例にのみ、治療後に炭酸脱水酵素(carbonic anhydrase II:CAII)に対する抗体が上昇していることが明らかとなった。CAIIの局在を調べたところ、腫瘍血管内皮に特異的に染色され、正常血管内皮には認められなかった。(1)についてメラノーマ腫瘍cDNAライブラリーを作製した。腫瘍組織の一方向性のcDNA合成を行い、ZAP Express XRにcDNAを挿入し、一方向性ライブラリーを作製した。各プール3ー4万個の独立クローンを含むようにプール化し、amplificationを行った。しかし平成20年度には陽性クローンは得られていない。論文を投稿し受理された第IV期悪性黒色腫患者10名と遠隔転移を伴う甲状腺癌患者6名に対し、腫瘍溶解液を抗原とする樹状細胞療法(第I相臨床研究)行った。検索の結果、悪性黒色腫の治療反応症例にのみ、治療後に炭酸脱水酵素(carbonic anhydrase II: CAII)に対する抗体が上昇していることが明らかとなった。各プール3-4万個の独立クローンを含むようにプール化し、amplificationを行った。陽性クローンが得られるかの検討を行った。(2)の腫瘍免疫療法については動物実験に関する論文が刊行された。
電解質溶液における排除体積効果の理論的研究ーホフマイスター系列の解明に向けてー

本研究の課題である電解質溶液の性質解明のためには、(1)イオンおよび溶媒の排除体積効果、(2)イオンの電荷に起因する水和効果(電縮効果)、を理解することが不可欠である。まず(1)を理解するため、電荷を持たない疎水性溶質のを2成分溶媒に入れた溶液の性質を理論的に調べた。具体的には、Mansoori-Carnahan-Starling-Leland(MCSL)による多成分剛体球系をほぼ厳密に記述するモデルを用いて、溶媒和自由エネルギー、密度揺らぎ、Kirkwood-Buff(KB)積分、第2ビリアル係数、そして相挙動(液ー液、気ー液)などを調べた。水のような溶媒では溶媒分子間引力も重要であるため、(MCSL)モデルに加えてvan der Waals型の引力相互作用も取り入れた。パラメタ設定は、溶質が溶媒第1成分よりも第2成分に溶けやすい、すなわち溶媒第2成分の組成比を大きくしていくにつれて溶媒和自由エネルギーが小さくなっていくようにした。結果、次のようなことがわかった。(1)溶質サイズが大きくなるにつれて溶質ー溶質間のKB積分が大きくなる、すなわち溶質ー溶質間引力(直接相互作用+溶媒誘起相互作用)が強くなる、(2)モデルに依存しない一般的結果として、溶質ー溶質間のKB積分を溶媒組成の関数として見ると中間組成で極大をもつ。これは溶媒組成ゆらぎと溶質との結合に起因する。(3)溶媒が全ての組成で混ざり合う場合であっても、溶質を増やしていくことによって相転移が起こりうる(溶質誘起相転移)。相転移は同じパラメタであっても液ー液、気ー液の両方が起こりうるが、液ー液のほうが界面張力が小さいことが多いため核生成はおこりやすい。研究実績の概要欄で述べたように、排除体積効果を調べた研究はすでに論文として出版されている。また、イオンの水和効果を調べた研究については現在論文を執筆中であり、おおむね順調に進展しているといえる。ここまでの研究で溶液における排除体積効果に対する知見がえられており、論文も出版されている。また、塩水溶液におけるイオンの水和効果に関する研究も進展しており、イオンの活量係数、浸透圧係数、部分体積などの実験を合理的に説明できるようになった。これについては現在論文を執筆中であり、近々投稿する予定である。このモデルは、様々な状況に適用可能なものであるので、今後は、(1)イオンの界面吸着や(2)動力学的性質に関する研究を進める予定である。(1)についてはコンピュータを用いて溶媒やイオンの分布を求めて界面張力や界面へのイオン吸着などの熱力学量を計算し、実験データとの比較を行う。(2)については主として解析的な計算を行い、電気伝導度や粘性係数の導出をして実験との比較を行う予定である。

(2)については主として解析的な計算を行い、電気伝導度や粘性係数の導出をして実験との比較を行う予定である。本年度は解析的な理論を主として研究を行い、計算機の使用はそれほど多くなかったため、2台の購入にとどめた。来年度は計算機の使用が増えることが想定されており、1台追加で購入することを予定している。
Gタンパク質共役受容体シグナル異常を基盤とする疾患とその制御法の探求

1Ca感知受容体に対する機能選択的な自己抗体の作用機構/構造解析と、後天性低Ca尿性高Ca血症に対する特異的治療法の検討2V2受容体変異体の機能解析と腎性尿崩症の新しい治療戦略の検討3心不全・肥満症の治療戦略としてのβ1,2,3受容体に対するarrestin-biasの検証とその作用機構の解明1Ca感知受容体に対する機能選択的な自己抗体の作用機構/構造解析と、後天性低Ca尿性高Ca血症に対する特異的治療法の検討2V2受容体変異体の機能解析と腎性尿崩症の新しい治療戦略の検討3心不全・肥満症の治療戦略としてのβ1,2,3受容体に対するarrestin-biasの検証とその作用機構の解明
骨芽細胞におけるＲＡＮＫＬ逆シグナル経路とＷｎｔシグナル経路のクロストーク解析

RANKL逆シグナル経路は、Runx2の活性化をトリガーすることで骨芽細胞の初期分化を加速し、カップリングを媒介するシグナル機構の一部を構成する可能性を、申請者らが新規に見出した。一方、Wntシグナル経路は骨芽細胞の分化過程における重要性が示唆されているものの、Wnt分子およびFzd分子の多様性も相俟って、その全体像は未だ明らかとはなっていない。そこで本研究においては、生理的な骨芽細胞分化の各段階において、骨芽細胞の分化制御に特に関与するWnt-Fzdの組み合わせを、網羅的なアッセイを行って同定し、その後、RANKL逆シグナルとどのようにクロストークして、骨芽細胞の分化過程全体を制御しているのか、その全体像の解明を目標としている。前年度までの検討によって、CMVプロモーター転写活性がWntシグナル経路によって大きく影響を受けることが判明したため、適切なプロモータをスクリーニングし、UbCプロモータとイントロン配列を組み合わせたコンストラクトに変更した。新規コンストラクトでWnt下流経路の網羅的活性化パターンを再取得した。Ca2+経路とcAMP経路の活性化は基本的に逆相関し、Fzdに対してGiの共役が示唆されたが、Fzd8に関しては相関から外れており共役するGタンパク質が異なると推定された。またshRNAを用いた遺伝子ノックダウン手法を用いて、RANKL逆シグナル経路とのクロストーク解析を進めたが、遺伝子発現抑制の効果が弱い、あるいは他の分子種による代償反応などで、変化がマスクされるケースが散見されたため、Cas9-CRISPRの手法を用いてFzd1-10全ての遺伝子を同時に破壊した細胞株の取得を行なった。今後、樹立した細胞株を用いてRANKL逆シグナル経路とWn-Fzdシグナル経路のクロストークの詳細な解明を行うと共に、in vivoレベルでの解析も進める予定である。Fzdには基本的にGiが共役する一方でFzd8のみ異なるGタンパク質が共役する可能性がある、など複数の新規知見が得られており、またクロストーク解析をより高精細に実施するためのツールも整った。前年度からの検討を継続し、RANKL逆シグナル経路とWn-Fzdシグナル経路のクロストークの詳細な解明を目指す。また、Wnt分子に対する中和抗体の取得を継続すると共に、Wntに対する中和に利用するためのバックアップとして、FzdのN末端側のCRDを抗体IgG1 Fcドメインとの融合タンパク質としたコンストラクトを作成する。中和分子が取得でき次第、RANKL逆シグナルを抑制したRANKL P29A変異マウスおよび野生型同腹仔に対する投与実験を行なって骨表現型を解析し、生体レベルで両シグナル経路のクロストークを解析する。RANKL逆シグナル経路は、Runx2の活性化をトリガーすることで骨芽細胞の初期分化を加速し、カップリング媒介に関与することを、申請者らが新規に見出した。一方、Wntシグナル経路は、骨芽細胞分化過程における重要性が示されているものの、その全体像は明らかとはなっていない。そこで本研究においては、生理的な骨芽細胞分化の各段階において骨芽細胞分化を制御しているWnt-Fzdの組み合わせを、網羅的なアッセイを行って同定し、その後、RANKL逆シグナルとどのようにクロストークして、骨芽細胞の分化過程全体を制御しているのか、その全体像の解明を目標としている。初年度である平成28年度は、RANKL逆シグナル経路とのクロストーク解析を行う前段階として、骨芽細胞の各分化段階において、Wntシグナル経路の網羅的評価を行なった。マウス骨芽細胞様培養細胞株MC3T3-E1細胞を用い、384wellプレートに播種して必要期間の前培養を行い、各分化段階に達したMC3T3-E1細胞を用い、Wnt 19種(+Mock 1種)×Fzd 10種(+Mock 1種)×共受容体4種(+Mock 1種)×分化段階3種、総計3,300パターンの組み合わせに関して、アデノウィルス混合液を培地中に添加し、添加72hr時点で、TCF/LEF応答配列(古典的経路)、AP-1応答配列(PCP経路)、NFAT応答配列(Ca経路)、cAMP応答配列(PKA経路)の活性化をそれぞれ評価した。また、骨芽細胞分化指標の測定を行った。現在得られた結果を統合し、骨芽細胞分化に主要な影響を与えるシグナル分子及びシグナル経路の抽出を行なっている。Wntシグナル経路の下流シグナル経路の活性化パターンに関する包括的評価が終了し、概ね計画通りに検討が進捗しているRANKL逆シグナル経路は、Runx2の活性化をトリガーすることで骨芽細胞の初期分化を加速し、カップリングを媒介するシグナル機構の一部を構成する可能性を、申請者らが新規に見出した。平成29年度はまず、前年度に行った網羅的なシグナル経路の活性化パターンの解析に基づいて検討を進めた。

その結果、骨芽細胞分化に影響を与えるシグナル経路に関する解析を進め、骨芽細胞の初期分化過程においては、βカテニン経路の活性化が主要な役割を果たすことが示唆され、逆に骨芽細胞の後期分化過程においてはPCP経路の活性化が主要な役割を果たすことが示唆された。一方で、遺伝子導入に汎用されるCMVプロモータに関して、Wntシグナル経路の活性化パターンに依存して、大幅に転写活性に影響が生じることが明らかになったため、より正確な評価結果を得るため、各Wnt関連遺伝子の発現プロモータを影響の少ないプロモータを、スクリーニングによって同定し、関連する全てのアデノウィルスを再構築した。さらに、全ての組み合わせに関してシグナル経路の活性化プロファイルの再取得を完了した。今後、新規のプロファイルの結果も踏まえて、RANKL逆シグナル経路とのクロストーク解析を実施していく。骨芽細胞の初期分化過程を主にβカテニン経路の活性化が、後期分化過程を主にPCP経路の活性化が制御していることが示唆され、RANKL逆シグナル経路とのクロストーク解析を行うための基盤が得られたため。RANKL逆シグナル経路は、Runx2の活性化をトリガーすることで骨芽細胞の初期分化を加速し、カップリングを媒介するシグナル機構の一部を構成する可能性を、申請者らが新規に見出した。一方、Wntシグナル経路は骨芽細胞の分化過程における重要性が示唆されているものの、Wnt分子およびFzd分子の多様性も相俟って、その全体像は未だ明らかとはなっていない。そこで本研究においては、生理的な骨芽細胞分化の各段階において、骨芽細胞の分化制御に特に関与するWnt-Fzdの組み合わせを、網羅的なアッセイを行って同定し、その後、RANKL逆シグナルとどのようにクロストークして、骨芽細胞の分化過程全体を制御しているのか、その全体像の解明を目標としている。前年度までの検討によって、CMVプロモーター転写活性がWntシグナル経路によって大きく影響を受けることが判明したため、適切なプロモータをスクリーニングし、UbCプロモータとイントロン配列を組み合わせたコンストラクトに変更した。新規コンストラクトでWnt下流経路の網羅的活性化パターンを再取得した。Ca2+経路とcAMP経路の活性化は基本的に逆相関し、Fzdに対してGiの共役が示唆されたが、Fzd8に関しては相関から外れており共役するGタンパク質が異なると推定された。またshRNAを用いた遺伝子ノックダウン手法を用いて、RANKL逆シグナル経路とのクロストーク解析を進めたが、遺伝子発現抑制の効果が弱い、あるいは他の分子種による代償反応などで、変化がマスクされるケースが散見されたため、Cas9-CRISPRの手法を用いてFzd1-10全ての遺伝子を同時に破壊した細胞株の取得を行なった。今後、樹立した細胞株を用いてRANKL逆シグナル経路とWn-Fzdシグナル経路のクロストークの詳細な解明を行うと共に、in vivoレベルでの解析も進める予定である。Fzdには基本的にGiが共役する一方でFzd8のみ異なるGタンパク質が共役する可能性がある、など複数の新規知見が得られており、またクロストーク解析をより高精細に実施するためのツールも整った。実際の骨芽細胞においては、内因性の遺伝子発現レベルは遺伝子間で大きく異なっており、また分化段階特異的に発現の変動が生じるケースもある。