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プロペプチドの分子内シャペロン機能の解明と新規生理活性ペプチドの創作

本研究は、ペプチドホルモンの前駆体蛋白質の立体構造形成の意義を明らかにすること、プロ領域の分子内シャペロン機能を有効利用することを目的として行われた。題材として腸管水分調節ホルモン(ウログアニリン)の前駆体プロウログアニリンを用い、その結晶構造の解明、変異体の立体構造形成反応を追跡した。その結果、分子進化における生理活性構造の形成と進化・保持に関する重要な知見を得ることができた。殆どのペプチドホルモンは、生体内で、前駆体タンパク質として産生し、その後、変換酵素により、生理活性ペプチドに成熟する。しかし、この時、切断されるプロ領域あるいは前駆体そのものの機能については全く研究が進んでいない。我々は、ペプチドホルモンの正しい生理活性構造の構築には、その前駆体蛋白質中のプロ領域が分子内シャペロンとして必須であることをウログアニリンについて証明した。そこで、プロ領域による生理活性構造の構築機構、即ち、分子内シャペロン機能の解明を目的とし、本研究を行っている。その手法として、(1)変異前駆体の立体構造形成および結晶構造について調査する。また、(2)前駆体中に存在するペプチドホルモンの立体構造が生理活性構造そのものに相関することから、プロ領域により捕獲されるペプチドの立体構造を指標とし、新規生理活性ペプチドのde novoデザインを行う。ペプチドホルモンのプロセッシングにおける前駆体蛋白質の立体構造形成の解明、およびプロ領域の分子内シャペロン機能を有効利用することを目的として、本年は、以下の点に焦点を絞り、研究を行った。1)プロウログアニリンの立体構造解析:前年度までに得られた結晶化条件を精密化し、結晶構造解析に適した結晶を得ることができた。その結晶について、Spring8の高輝度放射光により得た情報を元に、引き続き、構造解析の計算を行っている。野生型については、数回、回折収集を終了し、位相決定のため、重原子置換法を試みたが、位相決定には至らなかった。現在、分子置換法の適用を検討している。2)プロペプチドの分子内シャペロン機能を利用した新規生理活性ペプチドの創作:既に得られている2種類の新規生理活性ペプチドを組込んだ前駆体蛋白質を大腸菌から大量発現させ、結晶化を行ったが、良好な結晶は得られなかった。そこで、結晶促進剤の利用等、更なる検討が必要である。また、新たな生理活性ペプチドをデザインし、現在、その立体構造形成を検討している。3)他の前駆体蛋白質:前駆体蛋白質として、プロオピオメラノコルチンの発現系の構築、及び精製を行い、更に結晶化に成功した。既に、Spring8での回折実験を行い、現在、構造計算のための位相決定を行っている。本前駆体蛋白質は、ACTHやエンドルフィンなど様々なペプチドホルモンの前駆体であることから、医薬等、その構造決定の意義は大きい。1)プロウログアニリンの立体構造解析:前年度までに得られた結晶化条件を精密化し、得られた結晶について、Spring8の高輝度放射光により回折収集を行った。セレノメチオニン誘導体により位相決定し、野生型の立体構造を決定することができた。これは、ペプチドホルモン前駆体として始めての例であり、プロセッシングに限らず、分子内シャペロンおよび生理活性構造の進化について画期的な成果となった。現在、論文投稿を準備している。2)プロペプチドの分子内シャペロン機能を利用した新規生理活性ペプチドの創作:既に得られている2種類の新規生理活性ペプチドを組込んだ前駆体蛋白質を大腸菌から大量発現させ、結晶化条件を精密化した。いくつかの結晶が得られたため、現在、回折収集実験を行っている。Spring8での回折実験を行い、位相決定のためにセレノメチオニン誘導体を調製し、結晶化作業を行っている。本前駆体蛋白質は、ACTHやエンドルフィンなど様々なペプチドホルモンの前駆体であることから、医薬等への応用など、その構造決定の意義は大きい。また、pro-ANPについて、その前駆体を調製し、引き続き結晶化および立体構造形成の評価を行っている本研究は、ペプチドホルモンのプロセッシングにおける前駆体蛋白質の立体構造形成の意義を明らかにすること、およびプロ領域の分子内シャペロン機能を有効利用することを目的として行われた。山口(関西学院大学・理工学部)は連携研究者である。1)プロウログアニリンの立体構造解析(日高、山口)本年度、遂に、プロウログアニリンの精密化した最終立体構造を決定することができた。その立体構造を詳細に解析した結果、前駆体蛋白質の立体構造が進化の過程において、如何に成熟体の生理活性構造の構築に役割を果たしてきたのかを推測することができるようになった。その考察を基に、種々のプロウログアニリン変異体を作成し、その仮説の検証をおこなった。

現在、統括的に情報を収集し、最終結果を導くためのデータを収集しているところである。本成果は、これまで、省みられなかった前駆体の立体構造形成の重要性を主張するものであり、今後の生命科学の新分野を築くものである。また、現在、論文作成中である。2)プロ領域の分子内シャペロン機能を利用した新規生理活性ペプチドの構築と検索(日高)上記の研究成果と統合し、種々の前駆体を遺伝子組換えにより調製し、その立体構造形成と新規生理活性ペプチドの立体構造形成に対する分子内シャペロン機能の役割を検討した。本年度は、特に、その立体構造形成の中間体の意義を調べるため、反応中間体を分離精製し、その時点からの立体構造形成と生理活性構造の形成の相関を検討した。その結果、生理活性構造の形成には、ある一定のルートが存在することを明らかにした。本研究内容については、部分的に学術誌に発表した。本研究は、ペプチドホルモンのプロセッシングにおける前駆体蛋白質の立体構造形成の意義を明らかにすること、およびプロ領域の分子内シャペロン機能を有効利用することを目的として行われた。山口(関西学院大学・理工学部)は連携研究者である。1)プロウログアニリンの立体構造解析(日高、山口)昨年度決定したプロウログアニリンの立体構造を基に、プロ領域の分子内シャペロン機能発現に関与するプロ領域のアミノ酸残基を検索した。また、平行して、成熟体領域中、プロ領域との相互作用部位に着目し、その部位におけるプロ領域との相互作用の重要性について検討した。その結果、ウログアニリンの生理活性成熟化と前分子構造の熱力学的安定性に強い相関があることが解ってきた。また、逆に、分子進化を抑制する部位あるいは機構に関する情報を得ることができた。現在、この分子進化抑制機構がプロ領域の分子内シャペロン機能と密接な関係があると推測している。2)プロ領域の分子内シャペロン機能を利用した新規生理活性ペプチドの構築と検索(日高)プロウログアニリンの結晶構造解析に基づき、プロ領域と成熟体領域との相互作用様式を網羅的に解析した。その情報と併せ、これまでに得られた新規生理活性ペプチドあるいは人工ペプチドの立体構造形成がどのようにして制御されているのかを解析した。その結果、プロ領域の分子内シャペロン機能に連動していくつかの成熟体領域の水素結合が人工ペプチドの立体構造形成に関して重要な役割を果たしていることが分かった。現在、この局部構造の安定化及び不安定化が分子内シャペロン機能に及ぼす影響について、変異体を作成し、検討している。
血栓形成のポジティブおよびネガティブ制御機構の解析

血小板機能はポジティブおよびネガティブ機構により制御されている。本研究では、ポジティブ機構として、ADP受容体P2Y12、コラーゲン受容体であるGPVI、トロンボキサンA2受容体に関して、これら受容体の異常症患者の解析をおこなった。特にP2Y12はαIIbβ3の活性化維持機構に重要であることを明らかにした。一方、ネガティブ機構として細胞内蛋白であるαactininはαIIbβ3活性化に対しネガティブに制御していることを明らかにした。コラーゲンからのポジティブ機構として、血小板GPVIを介した血小板活性化が知られているが、本年度の成果として後天性GPVI欠損症に関し新たな病型を見出した。本研究にて解析した症例(12歳女児)はITPの発症とともに止血困難な鼻出血および紫斑が出現。血小板凝集にては、コラーゲン凝集能が特異的に低下していた。患者血小板ではGPVIが特異的に欠損していたが、患者血漿中には抗GPVI抗体は検出されなかった。またGPVIやFcRγの翻訳領域に遺伝子異常を認めなかった。患者血小板のPAIgGが増加していたため、血小板結合抗体をエーテルにて解離し解析すると、抗α_<IIb>β_3抗体に加えて抗GPVI抗体が検出された。本例を無治療にて経過観察していると、血小板数の回復とともにGPVIの発現の回復が観察され、後天性GPVI欠損症であることが明らかとなったが、GPVIの回復と共に血小板結合GPVI抗体の減少が観察され、GPVI欠損に抗体の関与が示唆された。GPVIはconvulxinにて刺激するとネガティブフィードバック機構によりshedding機構により血小板表面から消失する。本症例血小板ではGPVIのsheddingは観察されず、GPVIのinternalizationが欠損の主因と考えられた。ADP受容体P2Y_<12>のα_<IIb>β_3活性化維持機構、つまり非活性化抑制機構を解析するため、P2Y_<12>を恒常的に発現する巨核球細胞株CMK細胞(CMK-P2Y_<12>)を新たに樹立した。CMK-P2Y_<12>では、CMKとは異なりα_<IIb>β_3の活性化が維持され、P2Y_<12>がα_<IIb>β_3活性化の維持に必須であることが証明された。報告者は、これまでの研究成果として、ネガティブ機構に関してアディポネクチン、Semaphorin 3Aなどの蛋白を明らかにしてきた。本年度の成果として血小板凝集に必須であるGPIIb-IIIa活性化に関して、αアクチニンがその活性化をネガティブに制御していることを明らかにした。ヒト血小板をPAR1、PAR4-TRAPで刺激し、αIIbss3とαアクチニンの結合を共免疫沈降法で経時的に観察した。非活性化型αIIbss3とαアクチニンは共免沈された。PAR1-TRAPでαIIbss3を一過性に活性化させると、αアクチニンはαIIbss3から瞬時に離れ、刺激後20分で再結合した。PAR4-TRAPでαIIbss3を持続的に活性化させた時は、刺激後20分でも解離したままであった。このαアクチニンとαIIbss3の可逆的な結合には、αアクチニンのリン酸化が同調しており、SHP-1によって制御されていた。血小板無力症血小板では、αアクチニンのリン酸化様式は健常血小板と同じであり、P2Y12欠損血小板では、αアクチニンのリン酸化は健常血小板よりも早期に非活性化状態に回復した。さらにPAR1-TRAPにてαIIbss3を活性化しうる巨核球細胞株CMK細胞を用いた新規実験系を用いて、αアクチニンの強制発現およびshRNAを用いた発現抑制を行なった。その結果、αアクチニンの強制発現にてαIIbss3の活性化は抑制され、一方αアクチニンの発現抑制にてαIIbss3の活性化の亢進が誘導された。以上の結果より、インテグリン結合蛋白の1つであるαアクチニンnがインテグリンαIIbss3のinside-out signalに対し抑制的に作用することが明らかとなった。本年度の成果として血小板アゴニストとして重要なトロンボキサンA2(TXA2)の受容体異常症およびαIIbss3遺伝子異常に伴う先天性血小板減少症を新たに同定し、その分子機構の解析を行った。TXA2受容体異常症としては、現在まで2種類のミスセンス変異が報告されているのみであり、そのキャリアー(ヘテロ体)においても血小板機能異常を呈する。この機序として、ミスセンス変異がドミナントネガティブに受容体機能を抑制している可能性が指摘されていた。

報告者は、新たにc.167dupG遺伝子異常のヘテロ体を同定した。この遺伝子異常によりTXA2受容体は欠損する。事実、発端者は正常のTXA2受容体の発現が約50%に減少しているのみであるが、血小板機能の異常が観察されたため、ドミナントネガティブの作用は否定的である。受容体が50%に減少すると血小板機能異常が誘導される機序として、TXA2受容体の半減により血小板放出反応が傷害され、血小板からのADP放出の低下を来すことが一因であることが明らかになった。また、同じ遺伝子異常を有する父親には出血傾向はなく、TXA2受容体の半減のみでは出血症状を来さないことが示唆された。さらに本年度においてαIIbの細胞内領域におけるαIIb(G991C)を有する遺伝性血小板減少症を見いだした。血小板は大型で、血小板数は3万/μLに低下していた。293T細胞に発現させたαIIb(G991C)β3は恒常的に活性化されていた。報告者らは、すでにαIIb(R995W)が血小板減少を来すことを見出しており、これらの結果より、αIIbβ3の活性化異常が血小板数および形態異常に関与する可能性が示された。
1950年代の憲法論議ー地方ジャーナリズムを中心に

本研究は、現在の憲法改正論議の枠組みが形成された1950年代の憲法論議を、総発行部数の約半数を占める地方紙の論説を主対象として資料収集し、検討するものである。その成果の刊行は、『立命館大学人文科学研究所紀要』97号の特集「194050年代の日本の憲法と政治」と、全国の地方紙論説を500点に絞った資料集である、報告書『1950年代の憲法論議-地方紙を中心として』によって実現された。本研究は、1950年代とりわけ1952年4月末の講和独立から1956年12月の鳩山内閣退陣までの4年8ヶ月の期間における日本内外の憲法論議を、地方紙の論説記事を中心に全国的規模で博捜・検討することを目的としている。収集に当たっては最初に先行研究や全国紙の動向を参考としつつ、憲法問題がジャーナリズム上での争点として浮上した時期を把握し、注目すべきポイントの時期を定めて収集に当たった。その際特に国会での論争がきっかけとなってジャーナリズム上でも論争が展開することが多いので、国会の開会期間には注意を払った。本年度は研究の初年度であることから、各地のブロック紙・地方紙の論説を中心に基礎的資料の収集に努めることとした。この点では当初計画どおり、横浜の新聞ライブラリー所蔵の新聞と、国立国会図書館(東京館・関西館)所蔵の新聞を基本として資料収集を進めた。なお一部に、各県にしか所蔵されていない新聞の、当該県立図書館での資料収集も行っている。その結果『北海道新聞』『信濃毎日新聞』『中部日本新聞』『西日本新聞』などのブロック紙を始め、地方既存紙ではほぼ全国の全ての新聞の資料収集に着手することができた。すでに対象とする全期間の収集を終えた新聞も25紙を越え、憲法記念日論説など一部の収集も、『大阪新聞』始め20紙以上に及んだ。また新興紙も『福島民友新聞』など6紙の一部論説も収集することができた。さらに戦前の憲法論議との比較で、やはりジャーナリズム上の天皇機関説事件関係資料の発掘と収集を進めることができた。また共同研究者の小関素明は、日本史研究会の大会で主権論について報告し、報告内容を『日本史研究』に掲載した。本研究は、1950年代とりわけ1952年4月末の講和独立から1956年12月の鳩山内閣退陣までの4年8ヶ月の期間における日本内外の憲法論議を、主に地方紙の論説記事を中心に全国的規模で博捜・検討することを目的としている。本年度は、全国紙4紙を始め、『中国新聞』といったブロック紙、『東奥日報』など東北地方、『神奈川新聞』など関東地方、『徳島新聞』など中国四国地方、『南日本新聞』など九州地方の、各地方紙の論説を中心に基礎的資料の収集に努めることとした。その結果、ブロック紙の調査収集はほぼ完了し、地方既存紙ではほぼ全国の全ての地域の新聞の資料収集を進めることができた。すでに対象とする全期間の収集を終えた新聞も全国紙、ブロック紙、地方紙の既存紙で45紙を数え、新興紙・復興紙でも『室蘭民報』など17紙の論説を収集するに及んだ。本年度はこのように資料の調査収集に力点を置いたため、予算の執行において、当初予算の想定より旅費の支出の割合が増えることになったが、資料収集の点では大きな前進を見ることが出来た。本年度の研究成果としては、分担研究者の梶居佳宏が「50年代改憲論と新聞論説(1952-1957年)-中間報告-」を『立命館大学人文科学研究所紀要』96号に発表し、同じく分担研究者の福井純子が9月の集中研究会において「尾崎士郎の『天皇機関説』をめぐって」を口頭発表したことが挙げられる。現在の憲法改正論議の枠組みが一応形成されたのは1950年代のことである。本研究ではその50年代の憲法論議を、総発行部数の約半数を占める地方のジャーナリズムの論説を主対象として資料収集し、しかも国内だけでなく海外や沖縄からの視点を加えて広く検討するもので、憲法論議に新たな考える材料を提供するものである。本年度は科研の最終年度に当たるので、これまでの補充調査として、横浜新聞ライブラリー、国立国会図書館、県立図書館などに赴いて、過去二年間の調査から残された全国紙2紙地方紙十数紙の当該期間の憲法関係論説の資料の補充調査収集に努め、その資料整理を行った。その結果、講和・独立から鳩山内閣の終わりに至る期間の、憲法改正問題を主題とした膨大な地方紙論説が収集された。

その作業を踏まえて年度末に作成された資料集では、そのうち特徴のある論説500点を精選して掲載することが出来た。こうした中から、地方紙上では改憲論が護憲論を凌駕していた時期が、50年代のたいへん短い時期だったことが明らかになり、共同通信の配信論説の比重が高まっていることが分かった。また、イギリスの保守的な高級紙である『タイムズ』は改憲論支持だったが、駐日大使のデニングは、改憲論の持つ反動性に一抹の危惧を抱いていた様子であり、日本の憲法問題に関するイギリスの態度も一本化していないことが明らかになった。また、本研究会では憲法の主権論その他の分野で研究発表を行い、その成果は『立命館大学人文科学研究所紀要』97号の特集「194050年代の日本の憲法と政治」などに反映させることが出来た。そしてこれまでの研究成果と上記の地方紙論説の資料集をまとめて、報告書『1950年代の憲法論議-地方紙を中心として』を刊行することが出来た。
形状に沿った方向と積層方向に配向した炭素繊維で強化した光造形法の開発

光造形法で製作された構造物を炭素繊維で強化する製作方法を開発することを目的としている.本研究では炭素繊維で部品の一端から他端まで形状に沿って強化するとともに積層方向にも強化する.したがって短繊維による強化に比べて造形物の強度向上が期待できる.さらに,形状に沿った繊維で強化された構造物は,単一の方向にのみ強化された通常の繊維強化材料とは異なるので,新たな方式の繊維強化材料として学術的にも意義は大きい.光造形法で製作された構造物を炭素繊維で強化する製作方法を開発することを目的としている.本研究では炭素繊維で部品の一端から他端まで形状に沿って強化するとともに積層方向にも強化する.したがって短繊維による強化に比べて造形物の強度向上が期待できる.さらに,形状に沿った繊維で強化された構造物は,単一の方向にのみ強化された通常の繊維強化材料とは異なるので,新たな方式の繊維強化材料として学術的にも意義は大きい.
モダリテートから見た古高ドイツ語の接続法

古高ドイツ語では、現代ドイツ語に比べ頻繁に副文において接続法が用いられる。この接続法は、これまで主文への従属の目印として、あるいは主文から副文への影響によると解釈されてきたが、この見解には議論の余地が残されている。特に後者の場合、なぜ本来は直説法であるはずの副文の定動詞が主文の影響によって接続法になるのか、解明されていない。そこで本研究は、副文におけるモダリテート(Modalitat)という観点からこの問題にアプローチすることを課題とした。そして具体的数値を示すことによって、この手法の限界と可能性に言及し、従来の解釈に異を唱えた。この接続法は、これまで主文への従属の目印として、あるいは主文の影響によって接続法が現れると解釈されてきたが、この見解には議論の余地が残されている。本研究の目的は、「ラテン語の影響」及び「モダリテート」(Modalitat)という二つの新しい視点から、この問題を解明することにある。本年度は先ず、830年頃フルダの修道院でラテン語から古高ドイツ語へと翻訳された作品『タツィアーン』を研究の対象とした。『タツィアーン』のラテン語テクストをよく調査してみると、直説法未来完了形か接続法完了形か、語形の上では全く判別できない動詞43例が確認された(例えばdixerit「言う」)。そこで、この43例が古高ドイツ語のテクストではどのような語形で翻訳されているかを検証し、ラテン語から古高ドイツ語へと翻訳される際、「ラテン語」や「モダリテート」の影響があるのか否かを考察することに主眼を置いた。2010年夏にはドイツへ赴きデュッセルドルフ大学やベルリン自由大学で文献や資料の収集を行った。その後9月に京都ドイツ語学研究会第72回例会で口頭発表し、研究成果の一部を発表した。発表後の質疑応答を踏まえ、研究内容をさらに修正・深化させ、その成果を『独逸文学』第55号へ投稿した。本年度の研究成果として、既述の43例においては、ラテン語から古高ドイツ語へと翻訳される際、ラテン語やモダリテートの影響はなく、時制、端的に言えば「時間関係」が大いに影響していると言える。本年度は『タツィアーン』のみを研究対象としたので、来年度は同じラテン語と古高ドイツ語の、いわゆる行間逐語訳の作品『イシドール』を研究対象とし、本年度得られた成果が『イシドール』にもあてはまるかどうかを検証したい。本年度は、古高ドイツ語ではなぜ本来は直説法であるはずの副文の定動詞が主文の影響によって接続法になるのか、言い換えば、この接続法は果たして主文の影響によるものなのか否かを解明することを課題とした。この課題を解決する為に、ラテン語・古高ドイツ語の対訳の作品『タツィアーン』'から、ラテン語では副文の定動詞が直説法であるにも拘らず、古高ドイツ語では接続法で訳されている事例を28例厳選し、これを考察の対象とした。本年度は手始めに主文が疑問文・否定文という事例に限定した。2011年7月に、沖縄外国文学会第26回大会で「モダリテートから見た古高ドイツ語の副文における接続法-主文が疑問文・否定文の場合-」と題して口頭発表し、研究成果の一部を発表した。その後、8月にはドイツへ赴き、デュッセルドルフ大学・ベルリン自由大学・レーゲンスブルク大学で文献収集を行った。これらの資料や学会発表後の質疑応答を踏まえ、研究内容をさらに修正・深化させ、その成果を『独逸文学』第56号へ投稿した。本年度の研究成果として以下の2点が明らかとなった。1)既述の28例においては、モダリテートという観点から見れば主文の影響ではなく、コンテクストの意味内容に合致した法として接続法が用いられている。2)言語史的観点からすれば、ゲルマン語は意志を表す接続法(Voluntativ)及び可能法(Potentialis)という二つの接続法を有していたが、「推量」「可能性」というモダリテートが表されていることから判断して、古高ドイツ語に現れた接続法は「可能法」と解釈できる。来年度は本年度の研究をさらに推し進め、主文が疑問文・否定文以外のケースにも本年度得られた成果があてはまるかどうかを検証したい。本年度は、昨年度に引き続き、古高ドイツ語ではなぜ本来は直説法であるはずの副文の定動詞が主文の影響によって接続法になるのかを解明することを課題とした。

この課題を解決する為に、ラテン語・古高ドイツ語の対訳の作品『タツィアーン』から、ラテン語では副文の定動詞が直説法であるにも拘らず、古高ドイツ語では接続法で訳されている事例を66例取り上げ、これを考察の対象とした。本年度は主文の定動詞が接続法・命令法という事例に限定した。さらに、この成果を昨年度の成果、つまり主文が疑問文・否定文の28例と統合した。両者の統合により、副文に影響を及ぼすとされる主文のファクターをすべて網羅したこととなる。2012年7月に、沖縄外国文学会第27回大会で「モダリテートから見た古高ドイツ語の副文における接続法(2) その限界と可能性ー」と題して口頭発表し、研究成果の一部を発表した。その後、8月にはドイツへ赴き、ケルン大学・レーゲンスブルク大学で文献収集を行った。レーゲンスブルク大学では、ティム-マーブレイ教授と面談し、専門的立場から助言を頂いた。これらの助言や資料、学会発表後の質疑応答を踏まえ、研究内容をさらに修正・深化させ、その成果をSouthern ReviewNo.27へ投稿した。本年度の研究成果として以下の2点を挙げることができる。1)94例中69例(73,4%)においては、モダリテートという観点から見れば主文の影響ではなく、コンテクストの意味内容に合致した法として接続法が用いられている。2)古高ドイツ語の副文において頻繁に現れる接続法を、モダリテートの観点からアプローチするこの手法の限界と可能性を、73,4%という具体的数値で以って示すことができた。モダリテートの観点から解明できなかった25例(26,6%)については、今後の課題としたい。当初の計画に変更はあるものの、古高ドイツ語の副文において接続法が頻繁に現れる現象を、従来の解釈とは異なり、モダリテートという新しい観点から解決の糸口を見出しつつあるから。24年度が最終年度であるため、記入しない。当初の研究計画では、『タツィアーン』以外にも『イシドール』や『オットフリート』を研究の対象とする予定であったが、予定を変更し、『タツィアーン』に焦点を絞って研究を進めることにしたい。これにより、研究内容をより深化させ、一定の成果が期待される。来年度(最終年度)は、1)主文のタイプと副文に現れる接続法との関係、2)どこまでモダリテートの観点から説明できるのか、その限界と可能性、3)それらの接続法が意志を表す接続法なのか、可能法なのかを解明し、本研究のまとめとしたい。
ランゲルハンス細胞のIL-12産生制御機構とその意義の解明

BALB/cマウスの表皮からpanning法で得た高純度のランゲルハンス細胞(LC)を用いて、naiveTh細胞からのTh1/Th2への誘導を解析した。LCは、TGF-βの存在下あるいは非存在下で、抗CD40抗体にて18時間刺激した。一方、OVA323-339-specificUTCR-transgenic BALB/c mice(OVA23-3)の脾臓よりMACS(positiveselection)にてCD4+CD62L^<high>Tcell(naiveT細胞)を単離し、処理したLCとOVA peptideの存在下でin vitroで共培養した。培養上清のELISAassayにて、24時間後のIL-2産生量はTGF-βの有無で変化なかったが、IL-12p40量は、TGF-β群で有意に多かった。さらに72時間後では、TGF-β添加群でIFN-γ産生量がより多く、またIL-4産生量はより少なく、naive Th細胞のeffector T細胞への分化がTh1系にシフトしたことがわかった。次に、こうして処理したLCをOVA peptideでパルスし、それをOVA323-339-specific TCR transgenic BALB/c miceの両側のfoot padに皮下注射した。5日後に、鼠径、膝窩リンパ節からリンパ節細胞のサスペンジョンを作成してOVA peptideの存在下で培養し、培養上清のサイトカインのレベルを測定した。ここでも、TGF-βを用いた群ではIFN-γ/IL-4の比がより大きくなり、Th1系へのシフトがin vivoでも証明できた。しかしながら、IL-2産生量が少ないため、分化した細胞の絶対数が少なかったことも想定された。この理由として、TGF-βでLCを処理することにより、LCの所属リンパ節への遊走が抑制された可能性が考えられた。今後、LCを用いて抗原特異的なTh1細胞をin vivoで効果的に誘導するためには、この問題を解決する必要がある。はじめにPanning法を用いて、BALB/cマウスの表皮から95%以上の高純度のランゲルハンス細胞(LC)を単離した。このLCを完全培地中で培養したところ、48時間後まで経時的なIL-12p40の産生がELISAで確認されたが、IFN-γあるいは抗CD40抗体によるCD40 ligationの刺激によってその産生が著明に亢進し、また両者の刺激は協調作用を示した。GM-CSFを同時に加えたところ、LCのIL-12p40産生は強力に抑制され、ELISAでみたp40の蛋白レベルのみならず、IL-12依存性の細胞株2D6の増殖によるバイオアッセイでも確認された。RT-PCRにより、IL-12p40の転写レベルでの抑制が示唆された。ケラチノサイトの培養上清も、刺激されたLCからのIL-12産生を抑制し、IL-1αのもとで培養したKCの上清ではさらに強い抑制をみた。この抑制はGM-CSFの中和抗体でブロックでき、IL-12産生の抑制がケラチノサイトの分泌するGM-CSFによることが示された。次に、LCがTGF-βの受容体を有することをRT-PCRで確認し、TGF-βが、LC表面のICAM-1分子とCD40分子の発現を有意に抑制することをFACSで示した。anti-CD40/IFN-γ刺激下でTGF-βを加えたところ、LCのIL-12p40産生をさらに亢進した。この作用は特にCD40ligationのもとで著明であり、p40蛋白レベルのみならずバイオアッセイでも確認できた。最後に、IL-12産生が、GM-CSFとTGF-βによりそれぞれ独立して調節され、両者のバランスがその最終的な産生量を決定することを示した。皮膚の微小環境に存在する両サイトカインが、Th1-Th2バランスに重要な役割を演ずることが示唆された。

ここでも、TGF-βを用いた群ではIFN-γ/IL-4の比がより大きくなり、Th1系へのシフトがin vivoでも証明できた。しかしながら、IL-2産生量が少ないため、分化した細胞の絶対数が少なかったことも想定された。この理由として、TGF-βでLCを処理することにより、LCの所属リンパ節への遊走が抑制された可能性が考えられた。今後、LCを用いて抗原特異的なTh1細胞をin vivoで効果的に誘導するためには、この問題を解決する必要がある。
アモルファス半導体における高速光応答特性の研究

本研究はカルコゲン系アモルファス半導体の基礎的物性の統一的理解を狙ったものであり、主に構造及び光物性の組成及び圧力の変化に対する実験的研究に基づいている。光物性の内でも、光誘起現象が集中的に研究されている。本研究の成果は二点に要約される。第一は、ミクロ構造、特に中距離秩序構造の実体が明らかになったことである。すなわち、アモルファス半導体の構造は共有結合平均配位数Zで規定され、Z【_!】2では一次元的な構造をとっているが、Zの増加と共に架橋してZ【_!】2.7で二次元的構造となり、Z【_!】4で三次元的網目構造をとると考えられる。この結論は、原子容,圧縮率,X線回折パターンなどの組成依存性などから導びかれた。勿論、より詳細に見ると、構造は製法の違いなどを反映する。例えば、1000°C付近から高速急冷された【As_2】【S_3】ガラスは、多くの等極性結合を含むことも明らかとなった。第二は光黒化現象に関するもので、これの機構が明確となり、又その大きさが定量的に推定できるようになった。従来から光黒化現象は光メモリーなどへの応用が期待され、その原因を明らかとすることが望まれていたが、本研究によってそのオリジンがカルコゲン原子の首ふり運動によることが定量的に明らかとなった。又上記の構造に関する研究に関連して、Z【_!】2.7の材料が最大の光黒化現象を示すことも明らかとなった。又強く集束された光によって、光黒化現象の大きさは従来から観測されている値の2倍にまで高められることも推定された。今後、第一と二の研究を発展させ、光構造変化と光黒化現象の関連を研究することによって、より一層の統一的理解を目ざす予定である。
サイトカインによって活性化される内皮細胞の一酸化窒素産生による猫条虫殺滅の検討

1.培養系の確立:脱血死させた正常マウスの肝臓をメッシュ上ですりつぶし、percollの不連続密度勾配法によって肝実質細胞を除去した。分離した細胞をendothelial mitogen(ECGF;Biochemical Technologies,Inc.)を添加した培養液で4-5日培養した。この細胞にリコンビナントマウスIFN-γあるいはリコンビナントマウスTFN-αおよびLPSを加え、NO産生を測定した。NOの測定にはGriess法を用いた。有意なNO産生の条件設定を検討中である。2.猫条虫卵のin vitroでの孵化・活性化:猫条虫卵を次亜塩素酸ナトリウムで処理し、パンクレアチンおよびウサギの胆汁を添加した培養液内で激しく攪拌しながら培養した。活性化の指標に鈎の運動性、虫体による分泌産物の有無および中性赤水溶液による染色性を用いた。中性赤は、幼虫の外膜(オンコスフェア膜)を通過しないため外膜を脱した虫体のみを染める。活性化した幼虫はしばらくの間、鈎を動かしているがそのうちにその動きを停止した。したがって、長時間培養する場合、虫体の生死判定はトリパンブルーによる色素排除試験あるいはMTT法による呼吸の有無判定を行った。活性化させてから24時間後の虫体の生存率は2時間後のそれに比して激減しており、長期培養系は難しいことが明らかとなった。短時間培養でのNO産生と虫体の生死判定について検討中である。3.in vitroの系は活性化虫体の確保のために多量の虫卵を要すること、虫体生死判定の困難さなどの問題を残している。抗マウスiNOSモノクローナル抗体を用いた免疫組織学的検索による肝臓内虫体周囲のiNOSの検出あるいはiNOS欠損マウスでの感染性の検討がより直接的かと思われる。
GM-CSF遺伝子発現型ヘルペスウイルスベクターを用いた大腸癌免疫遺伝子療法

今回,選択的複製能力を有する変異型単純ヘルペスウイルス1型(以下G207)を腫瘍内投与し,腫瘍特異的な免疫を誘導させ,微小肝転移を抑制するin situ腫瘍ワクチン療法を検討した。BALB/cマウス由来大腸癌株CT26を用い3種類の肝転移モデル,i)腫瘍細胞を脾被膜下に注入する経脾肝転移モデル,ii)腫瘍片を盲腸に縫着した同所性移植肝転移モデル,iii)皮下腫瘍を同時作製した経脾肝転移モデルを作製し,G207をi)脾腫瘍内,ii)盲腸腫瘍内,iii)皮下腫瘍内,にそれぞれ投与し肝転移状況(肝転移個数)を評価した。また経脾肝転移モデルにおいてヌードマウスを用い肝転移の状況を比較した。この結果,全ての大腸癌肝転移モデルにおいてG207投与に有意な肝転移抑制を認めた。(経脾注肝転移モデル:治療群0.8±1.4個,コントロール群7.1±2.9個p<0.01,同所性移植肝転移モデル:治療群0.9±1.7個,コントロール群6.3±2.9個p<0.05,経脾肝転移+皮下腫瘍モデル:治療群2.5±3.0個,コントロール群6.4±2.5個p<0.05)。しかし,ヌードマウスではG207投与による肝転移の抑制は認めなかった(治療群12.6±4.8個,コントロール群15.9±3.5個p=0.213)。同所性移植肝転移モデルにおいて脾細胞を用いたCTL assayでは,G207投与群に腫瘍特異的なCTLの誘導を認めた。以上より,G207単独使用でin vivo大腸癌肝転移モデルに対し有意な肝転移抑制効果および腫瘍特異的な抗腫瘍免疫反応の誘導が認められ,その抑制にはT細胞が深く関与していることが示唆された。現在,Lipofection法によりGM-CSF遺伝子導入された培養細胞の上清中のGM-CSF値をELISA法にて測定を行い検討している。今回,選択的複製能力を有する変異型単純ヘルペスウイルス1型(以下G207)を腫瘍内投与し,腫瘍特異的な免疫を誘導させ,微小肝転移を抑制するin situ腫瘍ワクチン療法をマウス大腸癌肝転移モデルを用いて検討した。(方法)BALB/cマウス由来大腸癌株CT26を用い3種類の肝転移モデル,i)腫瘍細胞を脾被膜下に注入する経脾肝転移モデル,ii)腫瘍片を盲腸に縫着した同所性移植肝転移モデル,iii)皮下腫瘍を同時作製した経脾肝転移モデルを作製し,G207をi)脾腫瘍内,ii)盲腸腫瘍内,iii)皮下腫瘍内,にそれぞれ投与し肝転移状況(肝移転個数)を評価した。(結果)経脾肝転移モデルでは,G207投与群に有意な肝転移個数の減少を認めた。(G207投与群:平均転移個数0.8±1.4個。コントロール群:平均転移個数7.1±2.9個。P<0.001)。同所性移植肝転移モデルでは,肝転移個数は抑制される傾向が認められた。(G207:0.1±0.4個。コントロール:3.4±3.6個。P=0.062)。皮下腫瘍同時作製経脾肝転移モデルでは,有意な肝転移個数の減少を認めた(G207:2.5±3.0個。コントロール:6.4±2.5個。P<0.05)。ヌードマウスを用いた経脾肝転移モデルでは,肝転移個数に有意差を認めなかった(G207:12.6±4.8個。コントロール:15.9±3.5個)。以上より,in situ腫瘍ワクチン療法による肝転移抑制効果を認めた。(結語)変異型ヘルペスウイルスを用いたin situ腫瘍ワクチン療法は,大腸癌肝転移転移を抑制する有効な治療と考えられ,その抑制にはT細胞が深く関与していることが示唆された。

しかし,ヌードマウスではG207投与による肝転移の抑制は認めなかった(治療群12.6±4.8個,コントロール群15.9±3.5個p=0.213)。同所性移植肝転移モデルにおいて脾細胞を用いたCTL assayでは,G207投与群に腫瘍特異的なCTLの誘導を認めた。以上より,G207単独使用でin vivo大腸癌肝転移モデルに対し有意な肝転移抑制効果および腫瘍特異的な抗腫瘍免疫反応の誘導が認められ,その抑制にはT細胞が深く関与していることが示唆された。現在,Lipofection法によりGM-CSF遺伝子導入された培養細胞の上清中のGM-CSF値をELISA法にて測定を行い検討している。
中枢神経系における神経細胞社会の構築機構

大脳皮質神経細胞の移動過程に注目し、まずは辺縁帯直下で移動終了過程にある細胞に強く発現する遺伝子を多数同定した。また、いくつかの分子について層形成や細胞動態における機能を見いだした。さらに、脳室帯で誕生した神経細胞と脳室下帯/中間帯で誕生した神経細胞とでは移動プロファイルが全く異なることを見いだした。前者は、脳室下帯とオーバーラップする部位で一時的に長時間滞留することを発見し、多極性細胞蓄積帯と命名した。大脳皮質の神経細胞は、多くが脳室面近くで誕生し、辺縁帯直下へと移動した後、誕生時期をほぼ共通にする細胞同士が集合して、脳表面に平行な6層からなる多層構造(皮質板)を形成する。我々は、独自開発した移動神経細胞の可視化法によって、脳室面近くで誕生した神経細胞がその後どのような挙動をとるかを観察した。その結果、多極性移動と命名した新たな細胞移動様式を見いだした。すなわち、脳室面で誕生した神経細胞の多くが、実は移動開始後に多極性に形態変化し、「脳室下帯」と呼ばれる脳室帯直上の部位で多くの細い突起をさかんに出し入れする特徴的な運動をすることがわかった。それらはその後、中間帯で再度双極性に形態変化し、放射状線維に沿って脳表面近くの辺縁帯直下へと向かう(ロコモーション)。辺縁帯直下で移動を終えつつある細胞は、核形態がヘテロクロマチン様からユークロマチン様に変化するとともに、同じ時期に誕生し個別に移動してきた細胞同士が再び凝集して新たな細胞間の関係を構築していくこと、それまで移動に使っていた先導突起を変化させて著明な樹状突起を分化成熟させること等様々な現象を一斉に示すことを見いだした。これらの事実は、辺縁帯直下で何らかのシグナルにより活発な転写が開始され、皮質形成において重要な一連の現象が開始される可能性を強く示唆する。しかしながら、その実態・機構は全く不明である。そこで本研究では、大脳皮質神経細胞の移動過程のうち「脳室下帯」と辺縁帯直下の二カ所に特に注目し、移動神経細胞に対していかなる制御が行われるのかを明らかにすることを目指す。発生期大脳皮質の興奮性神経細胞の移動終了部位である辺縁帯直下では、移動停止の他、樹状突起形成、細胞凝集による層構造形成等の様々な重要なイベントが起こるが、その分子的制御機構については知見が乏しい。そこで本研究では、皮質形成時に辺縁帯直下で起こる一連のイベントを制御する分子群の候補として、辺縁帯直下において優位に強く発現する遺伝子群の同定を行なった。その結果、マウス胎生16.5日目と18.5日目の両方の時期で共通して辺縁帯直下に強く発現する遺伝子を多数同定し、発現様式によってそれらを分類した。次に、細胞移動終了のイベントが辺縁帯直下に限らず様々な皮質板部位で起こることが知られている複数の突然変異マウスでそれら遺伝子の発現を検討した。その結果、得られた遺伝子群は確かに細胞移動終了に関連したイベントに関わっていることが示唆された。さらに、上記のうち移動細胞側での発現様式が明瞭な28個の遺伝子についてIPA(Ingenuity Pathways Analysis)を用いた解析を行なった結果、これらはカルシウムを中心としたネットワークで有意に強く関連づけられることがわかった。また、予想通り樹状突起の形成を制御する分子も多数検出され、その一部はカルシウムによる制御が知られているものであった。また、辺縁帯から分泌され層形成を制御することが知られているリーリン分子によってカルシウムシグナルが増強される分子も同定された。以上の結果から、辺縁帯直下の神経細胞では、これらのシグナル経路が顕著に動いていることが示唆された。マウス発生期の大脳皮質脳室面で分裂を終えて誕生したニューロンのほとんど(少なくとも9割以上)が、脳室帯直上で多極性移動ニューロンとして丸一日滞留することを、in vivoにおける定量的解析で証明した。脳室帯直上の部位は、従来分裂細胞(神経前駆細胞)が高密度に局在する部位として認識され、またその意味で定義付けされた「脳室下帯」という名称で呼ばれてきたが、本研究により、その部位の多くの細胞は、実は分裂を終えて長時間滞留中の多極性移動ニューロンであることを見いだした。そこで、その脳室帯直上の部位を多極性細胞蓄積帯(multipolar cell accumulation zone ; MAZ)と命名して報告した。また、それらが将来大脳皮質浅層の錐体ニューロンに分化することも示した。また、滑脳症を含む重篤な脳奇形と関連することで注目されているArxの大脳皮質発生における機能を解析した。その結果、脳室帯における神経前駆細胞の分裂からの離脱と、皮質板への放射状細胞移動の双方を制御していることが示唆された。また、多極性細胞蓄積帯における移動細胞の形態にも影響し、その結果として細胞移動の速度の制御にも関わっていることが見いだされた。

さらに、大脳基底核原基に由来する抑制性ニューロンの脳表面に平行な向きの移動も制御していることを示唆する結果を得た。ただし、抑制性ニューロンの運命決定には関わっていない可能性が高いと考えられた。マウス発生期大脳皮質の神経細胞の誕生及びその後の動態を可視化して観察することにより、脳室帯で誕生した細胞と脳室下帯/中間帯で誕生した細胞とでは移動プロファイルが全く異なることを見いだした。すなわち、前者は脳室帯で最終分裂を終えて神経細胞として誕生した後、脳室帯内で10時間以上にわたって留まり、その後に脳室帯直上(多極性細胞蓄積帯multipolar cell accumulation zone, MAZ)に移動して、「多極性移動」と命名した特徴的な運動をしながら約1日停滞した(slowly exiting population, SEPと命名)。一方後者は、脳室帯から細胞体トランスロケーションと呼ばれる様式で素早く脳室下帯または中間帯深部に移動し、その後にさらに分裂を行った(rapidly exiting population, REPと命名)。すなわち、REPはbasalprogenitorsと呼ばれる神経前駆細胞を含み神経細胞を産生するが、一部にグリア前駆細胞も含むと考えられた。GFP発現ベクター等の脳室面への遺伝子導入によって脳室面の細胞をラベルしたところ、同時にラベルされたREPはSEPよりも早く脳室下帯/中間帯に移動したが、それらはその後その部位に留まった。一方SEPは、MAZを脱出後、脳室下帯/中間帯に停留中のREPを追い越して先に皮質板に進入し、辺縁帯直下に到達した。それにより、神経細胞としての誕生時期に依存した“インサイド-アウト"様式の各皮質層への細胞配置が保証されることがわかった。さらに、皮質第IV層の神経細胞に注目し、脳室下帯/MAZに停留中及び移動終了後に強く発現する分子の皮質発生・発達期における機能を明らかにした。
植物資源より、新たなガン抑制シーズ分子の探索研究

1.化合物の単離と構造決定以下の植物について成分検索を行い記載の骨格の新化合物を単離・構造を決定した。(1)オトギリソウ科植物Garcinia fusca(新キサントン類8種)、Garcinia assigu(新ポリプレニル化ベンゾフェノン類2種)、Calophyllum brasiliense(新クマリン類3種)(2)マメ科植物Dalbergia cultrata, D.nigrescens,D.olibari(新シンナミルフェノール類5種、イソフラボノイド2種)、Milletia taiwaniana(新イソフラボノイド5種)、(3)ミカン科植物Glycosmis arborea(新カルバゾールアルカロイド3種)、Orixa japonica(新キノロンアルカロイド4種)、Murraya exotica(新二量体クマリン類2種)(4)トウダイグサ科植物Croton jatrophoides(新テルペノイド2種)2.生物活性試験下記に示す種類の生物活性試験を行い、結果を報告した。(1)発がんプロモーション抑制活性試験・・ベンゾフェノン類、シンナミルフェノール類、クマリン類、アクリドンアルカロイド類、カルバゾールアルカロイド類、フェニルプロパノイド類、フィトキノイド類(2)マウス皮膚2段階発がん抑制活性試験・・アクリドンアルカロイド類、イソフラボノイド類(3)抗酸化活性試験・・ベンゾフェノン類(4)NO産生抑制活性試験・・キノロン類、キノリン類(5)白血球細胞成長抑制活性試験・・・4位置換クマリン類以上のように、本プロジェクトにおいて、多数の新化合物を単離・構造決定すると共に、既知化合物も含め生物活性試験を行い強い活性を示す化合物の存在を明らかにし、医薬品シーズ分子としての可能性を示した。1.先に,我々はオトギリソウ科Garcinia属植物から,多数のキサントン類と共に,高等植物からは最初の例としてデプシドン骨格を持つ化合物を単離・構造決定し,報告した。今回,タイで採集したG.fuscaおよびパプアニューギニアで採集したG.assguの樹皮について成分検索を行ない,単離した化合物について発がんプロモーション抑制活性試験(TPAによるEBV早期抗原誘導抑制活性試験)および抗酸化活性試験(DPPHラジカル消去活性試験)を実施した。(1)G.fuscaからは,新しいキサントン8種を単離,fuscaxanthone AHと命名し,構造決定した。これらの化合物は,いずれもプレニル基,ゲラニル基,あるいはこれらに由来するピラン環構造を持っている。これらに対する発がんプロモーション抑制活性試験の結果では,特に強い活性を示すものはなかった。(2)G.assiguからは,2種の新しいポリプレニル化ベンゾフェノン類を単離,構造決定した。同時に単離した既知構造のベンゾフェノン類4種と共に発がんプロモーション抑制活性試験および抗酸化活性試験を実施した結果,共の特に強い活性は認められなかった。2.ミカン科植物から単離した17種のアクリドンアルカロイドについて,発がんプロモーション抑制活性試験を実施した結果,atalaphyllinine, severifoline, glycocitrine-IIなどに強い活性を認めた。また,マウス皮膚2段階発がん抑制活性試験の結果でも強い活性が認められ,これらは発がんプロモーション抑制試薬として有用であることを認めた。(A)新化合物の単離と構造研究:1)オトギリソウ科植物Calophyllum brasilienseの樹皮の成分検索を行い、3種の新しいクマリン類(brasimarins A, B, Cと命名)を単離し、2次元NMR(HMBC)法などにより構造を決定した。これらは、4位にフェニル基またはプロピル基をもつクマリンである。2)マメ科植物

Dalbergia cultrata, D.nlgrescensおよびD.olivariの樹皮より5種の新しいシンナミルフェノール類(dalberatins AEと命名)、および2種の新しいイソフラボノイド(olibergins A, Bと命名)を単離し構造を証明した。(B)シンナミルフェノールおよび4置換クマリン類の発がんプロモーション抑制活性:シンナミルフェノール類は、いずれも、古くから発がんプロモーション抑制効果があるとされている化合物β-carotene(IC_<50>=400)よりも、はるかに強い活性を示し、特にカテコール(1,2-dihydroxyphenyl)構造を持つdalberatin Eの強い活性が注目された。○ミカン科Murraya属植物から新しい二量体クマリンの単離石垣島で採集したミカン科植物Murraya exoticaの葉部より、2種の新しいビクマリンmurradimerin A,murramarin Bを単離・構造決定した。このうちmurramarin Bはオルトエステル結合で2個のクマリン骨格が結合したものである。この結合様式はフロクマリン二量体についてのみ知られていたものであり、単純クマリン二量体の結合様式としては最初の例である。○ミカン科Glycosmis属植物から新しいカルバゾールアルカロイドの単離ミカン科Glycosmis属植物は、生合成的にはアントラニル酸から誘導されるアルカロイド類を豊富に含む植物として知られている。今回、バングラデッシュで採集したミカン科植物Glycosmis arboreaの枝部より新しいカルバゾールアルカロイド3種glybomine ACを単離構造決定した。この内、glybomine Aは2、5位に酸素官能基を持つカルバゾールアルカロイドとして最初のものである。また、この植物から単離したアルカロイド類(carbazoles,furoquinolines,acridone,quinazoline)9種について発がんプロモーション抑制活性試験を実施した結果、いずれも、基準としたβ-caroteneと同等の活性を示した。○マメ科ドクフジから5種の新しいイソフラボノイドの単離と発がんプロモーション抑制活性ドクフジMilletia taiwaniana Hayataは台湾原産の植物でその乾燥根は「魚藤根」と呼ばれ、Derris属植物デリス根と同様ロテノン類を含み魚毒として用いられてきた。今回、本邦産植物の枝部について成分検索を行い5種の新しいイソフラボノイドmillewanin AEを単離・構造決定するとともに、同時に主成分である既知のイソフラボノイドauriculasinについてマウス皮膚2段階発がん抑制試験を実施した結果、コントロール群に比べて、顕著に腫瘍発生を押さえることを認めた。
運動疲労時における中枢制御機構の解明

脳磁図、心電図計測、および心理行動学的評価手法を用い、運動疲労時の中枢神経系における制御機構を解明することを目的に、健常な成人を対象として本研究を実施した。ラマチャンドランのミラーボックスを用いた行動学的および脳機能イメージング手法により、運動疲労時、脳において反対側感覚運動野の活動を制限する、抑制系システムの存在を科学的に証明した。加えて、前頭前野が、両側感覚運動野の賦活に関わることも明らかにし、運動疲労時の中枢神経系における動作制御機構の統合的解明に向けた貴重な知見が得られた。運動疲労時の中枢神経系における制御機構の解明を目的として研究を実施した。本年度は、運動疲労負荷課題の基礎的検討及び運動疲労負荷課題遂行時の磁場応答の基礎的検討を行った。1.運動疲労負荷課題の基礎的検討:運動疲労負荷課題の確立には疲労そのもの、疲労の認知、および疲労感を分離可能な課題の確立が必須である。ミラーボックスを用いると、疲労側上肢を非疲労側上肢と、あるいは疲労側上肢を非疲労側上肢と認識させることが可能であった。これらの原理を使って、ハンドグリップを用いた60回の運動疲労負荷後、疲労側上肢の握力の低下は減弱、非疲労側上肢は低下傾向を認めた。このことは、運動疲労において、運動野より上流の抑制システムの存在を示唆しており、従来の定説であった脊髄レベルでの制御を覆す、新しい知見が得られた。これらの行動学的な結果をベースに、脳磁図を用いて、運動疲労時の中枢神経系における制御機構を解明すべく歩みを進めることが可能となった。2.運動疲労負荷課題遂行時の磁場応答の基礎的検討:運動負荷課題遂行時の基礎的検討として、脳磁図を用いた試験を予備的に実施した。運動疲労負荷課題遂行前後のハンドグリップと脳磁図の間のコーヒレンス解析を行ったところ、疲労により、その値が上昇することが明らかとなった。これは、過去の知見とも一致しており、試験・解析の信頼性・妥当性を確認できたとともに、左右反転を用いた来年度からの実験の下準備が全て整ったこととなる。脳磁図等を用い、運動疲労時の中枢神経系における制御機構を解明することを目的に、健常な成人を対象として本研究を実施した。実験は、疲労負荷試験、反転疲労負荷試験、休息試験の3つから構成され、モニターを用いて左右反転するものとしないもの、及び、疲労を負荷しない、3回の実験を、3クロスオーバーデザインで実施した。被験者には、予告音を手掛かりに、音声キューに合わせ、音声キューの間利き手でボールを握ることをイメージするよう指示した。疲労負荷は、被験者は脳磁図用ベッド上に座ってもらって実施した。実験中、脳磁図、心電図、握りセンサーによる計測を行った。なお、本研究は、大阪市立大学医学部倫理委員会の承認を既に得ており、本研究の遂行に当たってはプライバシーに充分配慮し、実施時、医師が付き添った。利き手を握る際の反対側及び同側の脳半球の運動野にあらわれた脱同期の強さをそれぞれについて解析を行った。疲労負荷の前後での脱同期の強さには差が認められなかった。しかしながら、疲労や休息前後での脱同期の強度の差を休息試験と疲労負荷試験、休息試験と反転疲労負荷試験で比較したところ、反対側の脳半球の運動野において、統計学的に有意な差は認めなかったものの、疲労負荷試験では反転疲労負荷試験よりも減弱の程度が著しかった(-0.45±0.64vs-0.03±0.34nAm(mean±SD))。疲労負荷前後のボールを握るイメージをした時の脱同期の強度を、定量化同期脱同期解析を用いて検討したところ、左右反転の有無で、大脳のイメージした手と反対側の運動野において、顕著な違いを認め、疲労時における視覚フィードバックの運動野に対する影響についての重要な知見が得られた。今後、コヒーレンスを始めとした解析を進めるとともに、再現性を含め、最終年度において更なる検討を進めて行く。実験は、疲労負荷課題、その前後の疲労評価課題から構成される。疲労評価課題時、被験者には、予告音を手掛かりに音声キューに合わせ、音声キューの間利き手でボールを握ることをイメージするよう指示した。疲労負荷は、被験者は脳磁図用ベッド上に座ってもらい、利き手で最大把握を音声キューについていけなくなるまで行った。実験中、脳磁図、心電図計測、および、心理行動学的評価を行った。利き手を握る際の反対側及び同側の脳半球の感覚運動野にあらわれた脱同期の強さをそれぞれについて解析を行った。

疲労負荷の前後で、反対側感覚運動野の脱同期の強さは減少する一方、同側感覚運動野の脱同期の強さは増加した。加えて、前頭前野領域で、疲労負荷による賦活も明らかになった。前頭前野領域における脱同期の強さと対側及び同側の脳半球の感覚運動野にあらわれた脱同期の強さの相関を検討したところ、前頭前野領域の賦活の程度は、両側の感覚運動野の賦活の程度と正の相関を認めた。以上より、前頭前野領域は、運動疲労時におけるパフォーマンスの維持に重要な役割を有していることが明らかとなった。昨年度のミラーボックスを用いた研究、本年度の研究ともに、論文投稿中であり、さらに、総まとめとしての総説論文も作成し、英文校正の準備を進めている。