hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
プロトタイプカテゴリーをめぐる比較認知心理学的研究

プロトタイプカテゴリーの獲得過程を明らかにするために、主として以下の実験を行った。実験1:カテゴリー特性を四辺形の色とし、色がついた3つの四辺形からなる刺激を事例とするカテゴリーを構成した。その際、自然カテゴリーにみられる家族的類似性(カテゴリー内である程度の相関をもって生起する特性によって、多様な事例が類似性ネットワークで結びつけられる)と多型性(カテゴリーを定義する必要十分特性は存在しない)を満たすようにカテゴリーを構成した。ヒトはこのようなカテゴリーの獲得が困難で、新しい刺激に対しては学習期に獲得したルールに従って1・0的な反応を示し、プロトタイプ効果は得られなかった。一方、ハトは容易に学習し、顕著なプロトタイプ効果を示した。しかし、プロトタイプはそのカテゴリーで最も頻繁に出現した特性を最も多く含んでいたため、ハトが示したプロトタイプ効果は、これまでの研究と同様に事例学習や特性学習で説明できた。実験2:モーフィングによって画像合成して作成した訓練事例は、カテゴリー内で共通するある特定の顔Mを親として共有していた。つまり、AやBやCやDやそれらの50%合成画のそれぞれとMを合成して各カテゴリーの事例を作成した。このような2つのカテゴリーの弁別訓練の後、Mの合成率が0%から100%までの様々な合成画を用いて般化テストを行った。般化勾配は正カテゴリーのMの合成率に従って増加し、負カテゴリーのMの合成率に従って減少した。この結果は、カテゴリー内で共有される顔特性のカリカチュア効果に類似しており、事例学習モデルや特性学習モデルでは説明できなかった。ハトが示す優れたカテゴリー化は、多くの場合きわめて単純な事例学習や特性学習で説明できるが、カテゴリー構造によっては、カテゴリー内に共通する特性を抽出するような高次認知過程が介在することが示唆された。従来の比較認知心理学的なカテゴリー研究では、ハトのような動物も自然事物の写真をヒトと同様にカテゴリー化することがよく知られている。多くの自然事物のカテゴリーは、多様な事例がプロトタイプを中心として構造化されているといわれているが、ハトにおいてもヒトと同様のプロトタイプ効果が生じるか、また生じるならばそれはどのようなメカニズムにもとづいているのかを検討した。本年度の研究では、人の顔写真をMorphingによって合成した画像からなる人工的プロトタイプカテゴリーを用いた。まず、相互に類似していない2名の顔を、それぞれ刺激セット1と刺激セット2のプロトタイプ(M)とした。また、8名の男子大学生の顔を4名ずつランダムに2つのセットに分け、各セットの周辺事例A, B, C, Dとした。さらに、それらの50%合成画AB, BC, CD, AC, AD, BDも加えて、合計10種の周辺事例を用意した。各セットにおいて、Mとそれぞれの周辺事例を様々な割合で合成し、プロトタイプMを中心として10方向に拡散するカテゴリーを形成した。このカテゴリーでは、各事例のM合成率は、その事例の典型性に対応する客観的測度とみなすことができる。こうして作成された2つのカテゴリーにおけるM合成率50%の事例を用いて、go/no-go型のカテゴリー弁別訓練を行った。訓練完成の後、様々な合成率をもつ新奇刺激への般化テストを行ったところ、反応率はPositiveカテゴリーのM合成率の1次関数として変化し、明らかなプロトタイプ効果が生じた。また、M合成率0%の周辺事例にも、有意な弁別の転移が見られた。これらの結果は、ハトにおいてもプロトタイプ効果が生じ、少なくとも従来考えていたような単純な事例学習によっては説明できないことが明らかにされた。人の顔画像を合成し、人工的なプロトタイプ・カテゴリを作成した。典型性は、カテゴリの中心に位置するプロトタイプとして定義された顔の合成率で定義することができる。

前年度は、プロトタイプ合成率50%の多様な事例のカテゴリ弁別を訓練したところ、プロトタイプ効果が見られた。本年度は、そのメカニズムについて検討した。実験116年度の結果がピークシフト(頂点移動)と類似の現象か否かを、プロトタイプ合成率35%の事例を負の訓練刺激とする継時弁別後般化勾配と比較することによって検討した。いずれの般化勾配においても頂点はプロトタイプ合成率100%のプロトタイプに出現し、明らかなプロトタイプ効果が見出され、ピークシフト類似の現象ではないことが明らかになった。実験2新奇な顔とプロトタイプ顔を合成した様々な刺激でテストしたところ、プロトタイプを頂点とする般化勾配が得られ、新奇な顔特性に対しても柔軟にカテゴリー化が行われることが示された。実験3実験1や2で用いたカテゴリーと構造的に類似した人工カテゴリーを、9種の色からなる四辺形を用いて作成した。ハトはカテゴリー弁別を容易に学習し、新奇事例へは典型性(家族的類似性度)に対応した反応を示した。人の約半数はカテゴリー弁別の学習が困難であり、学習した人においても典型性(家族的類似性度)に従った新奇刺激への転移は見出されなかった。以上の実験でハトに見られたプロトタイプ効果は、事例+特性学習モデルによって良く説明できることが示された。昨年度および実験1と2の成果は、第9回ヨーロッパ心理学会招待シンポジウム(於:グラナダ、スペイン)にて発表した。実験3の成果は英語論文(題目:Discrimination of artificial categories structured by family resemblances)にまとめ外国雑誌に投稿した。人の顔画像をMorphingの方法を用いて合成し、人工的なカテゴリーを作成した。前年度までの研究によって、ハは、同一カテゴリー内の事例に共通すると同時に、対立するカテゴリー間で異なる顔特性を抽出し、それらの顔特性のMorphing合成率に従った般化勾配を示すことが明らかにされた。18年度は、このような顔カテゴリー内の成員間に機能的等価性が獲得されていたか否かを検討した。従来の研究で用いられてきた色や形や線分などの物理的な刺激とは異なり、本研究に用いたMorphingによって作成したカテゴリーでは、カテゴリー内のすべての成員の間にある程度の類似性が成立している。このようなカテゴリー内の成員間では、それらの間の類似性を介して機能的等価性が獲得され易いと考えた。機能的等価性の成立を確かめるための手法として、選択的逆転訓練の転移テストを行った。すなわち、カテゴリー訓練に用いた事例からごく少数の事例だけを選択して、その事例についてのみ反応を逆転する訓練を行い、その後にこの逆転が他の多様なすべての事例にも転移するか否かをみた。
金融機関のリストラクチャリングと金融リスク-ナロウバンク/コアバンク制導入の検討を中心に-

わが国の金融機関は、金融環境の激しい変化のなかでリストラを図っているが、それは金融リスクの増大とリスク管理の失敗という大きな困難に直面している。本研究では、こうした状況下ですすむ日本版ビッグバンを視野に入れて、下記のような金融機関のリストラとリスク管理の検討と展望、さらに若干の提案を行った。(1)金融機関はリスク管理の技法と体制を充実し、リスク管理の徹底を図ると同時に、監督当局においてもディスクロージャーの充実、時価主義会計とリスク対応的な預金保険料の導入、自己資本規制の充実、破綻処理制度の整備などを推進する必要がある。(2)決済リスクの累積を回避するため、ネッティング、キャップ制などの仕組みや、中央銀行の最後の貸し手機能の改革などを引き続き検討していく必要がある。(3)上記のような対応を図ることと並んで、価格、金利、為替などの変動に対応するデリバティブなどの高度の金融取引が盛んになる中で、当局の金融検査・監督によるリスク管理の限界を認識し、金融の自由化・グローバル化・情報化と金融システムの安定性とが両立するような貨幣・銀行制度を考えることが必要となっている。そうした要請に応えるものとして、ナロウバンク、コアバンクの提案が注目さるべきである。(4)ナロウバンク構想などの実現のためには、シカゴプランの100%貨幣構想に学ぶべきものが多い。また、わが国の郵便貯金はその運用先が「安定資産」に限定されており、ナロウバンクの先取りという性格のものである。(5)いまや、金融持ち株会社組織の下で、安全資産への運用割合を徐々に高める方法でのナロウバンクの導入、郵貯の改革、弾力的資金供給可能なナロウバンク・コアバンクの構想などに取り組んでいくべき段階である。日本の金融機関は、金融の自由化・グローバル化・情報化といった金融環境の変化に対応してリストラを図っている最中であるが、それは大きな困難に遭遇している。すなわち金融リスク管理の失敗がそれであり、その結果、金融機関の経営危機や破綻が多発しているのみならず、金融システムそのものへの信任が揺らいでいる。システム・リスクのこれ以上の増大を阻止するには、なにが為されなければならないか。本研究では、まず情報開示の徹底によるモラル・ハザードの回避、オフ・バランス取引と時価評価の会計処理問題への対応、リスク対応的な預金保険料の導入、日本銀行の最後の貸し手機能の強化、決済システムにおけるリスク累積の回避、自己資本の充実と「含み益」算入の廃止などの改革が必要であることを確認した。これらの点では、米国のFDICIA法(1991年)や、BIS、IASC、IOSCOなど国際機関の対応が貴重な試みとして、参考になった。しかし、金融リスク管理にはより抜本的な対応が必要である。金融技術革新につれて業務分野規制が無意味となり、その結果、競争が激化し銀行にとって収益の保証はなくなっている。利潤を求めて銀行はよりリスクの大きい分野へ算出し、業務多様化を図るであろう。こうした環境の下で、通貨を金融リスクから遮断し決済システムの安定性を確保する仕組みとして、本研究ではナロウバンク/コアバンクの構想がますます重要性を増していることを確認した。その上で、リスク遮断をより確実なものとする仕組みとして、子会社方式と金融持ち株会社方式の比較検討を行い、金融持ち株会社方式の優位性を見いだした。しかし、その場合にも米国において法人分離主義と相互依存仮説の対立があり、またファイヤー・ウオールの効果をめぐる懐疑論がある。こうした問題をクリア-し得る構想として、ナロウバンク/コアバンクが新たな意義を主張しうるとの確信を強めている。日本の金融システムは、いわゆる不良債権問題にみられるようにシステム不安を抱えたままで金融リストラ、金融革新への取り組みは遅れ、いまや日本の金融業は欧米の金融業に大きく水をあけられている。橋本首相による96年11月の日本版金融ビックバンの提唱も、そのような危機意識の現れであると見ることができる。

日本の金融システムの再構築のために、大蔵省改革、金融持ち株会社導入、情報開示の強化、リスク管理の充実、金融機関破綻処理制度の整備などの提案の他に、ナロウバンクの提案がなされていることが注目される。すなわち政策構想フォーラムによる「純粋銀行」、高木仁氏の「信用創造付きナロウ・バンキング」の提案がそれである。また海外でも、ロンドン・エコノミストによるナロウバンク構想の支持表明、F.R.Edwardsによる「担保付き銀行(collateralized bank)の提案などが現在も相次いでいる。本研究では、内外のこうした新提案をフォローし、とくにナロウバンクをわが国へ導入する場合の問題点を意識しつつ、名古屋、高松、徳島、東京などの手形交換所や貯金事務センターを訪問した。その結果、ナロウバンクの決済コストは利用者から手数料として徴収すべきこと、電子マネーの普及および投資信託などのファンドの充実はナロウバンクの実現可能性を高めること、ナロウバンク制はナロウバンク以外の金融機関をベンチャー企業の育成に注力しやすくするという効果を持つことなどを、明らかにすることができた。さらに本研究では、金融持ち株会社解禁や日本版ビックバンの実施が待たれるという新しい環境の下で、伝統的銀行業務に特化したコアバンクがもっと注目されてよいことを主張している。その理由は、コアバンクが銀行システムのリスクを削減する効果を持つことに加えて、ブティック型金融機関として持ち株会社や巨大金融機関の競争相手となりうると期待できること、などである。
畿内政権成立前後における武装の復元的研究

弥生時代終末から古墳時代前期を中心とした中部、近畿、中国地方の鉄鏃、銅鏃の出土地の集成、および編年上問題となるであろう武器、武具の実見をすすめ、鉄鏃と銅鏃の編年案の作成をおこなった。なかでも、研究の基幹をなす編年作成については、主要な型式の抽出を行い、編年上確認もしくは作図が必要と考えられた資料については、宮内庁所蔵の奈良県佐味田宝塚古墳、広陵町石黒山古墳、衛門戸丸塚古墳、大阪府津堂城山古墳鉄鏃、ヒエ塚古墳、ノムギ古墳出土鉄器、桜井茶臼山古墳鉄鏃、銅鏃、愛知県西上免遺跡出土銅鏃、岐阜県金ヶ崎遺跡銅鏃、朝日遺跡銅鏃、岡山県宮山墳墓出土鉄鏃、銅鏃、剣などについては,実測図を作成し、研究の基礎を固めた。その作業の中で、各主要型式の集成作業を進め、銅鏃の型式分布が極めて強い地域性をもつことを確認した。たとえば、奈良県は畿内政権成立時の政治的中心であることが墳墓のあり方から推測されるにもかかわらず、典型的な古墳時代前期銅鏃の型式とおもわれた定角式は、銅鏃編年の最終段階の佐味田宝塚古墳出土品のみで、大和からの出土は確認されていないこと、ホケノ山古墳に代表される腸抉柳葉式は、石黒山古墳をはじめ、伝中山出土品など大和の主流をなすが、その分布に偏りがあること、また、京都府では無茎の銅鏃が多いなど、畿内の周辺地域と比較しても強い地域性が認められた。また、弥生時代のおもに集落出土の銅鏃は、鎬をもつものの研ぎ出しは弱く、特に腸抉柳葉式もしくは長三角の鏃身をもつものの腸抉は、鋳型に鎬状の稜が掘り込まれているものの、鋳造後に鎬を強調するように研ぎ出させる例は確認できなかった。逆に言うと、中茎と鏃身の接合部の研磨から古墳時代の銅鏃の技法を抽出できそうである。鉄鏃についても、厚みをもった鏃身尻に明瞭な面を造り出し、鎬を意識した研ぎ出しの技法と短茎の鏃の大型化に古墳時代の鉄鏃製作技術を抽出できそうである。古墳時代前期を中心とした近畿、西日本の鉄鏃・銅鏃の出土例および実測図の集成とともに型式の集成を行い、データベース化を進めた。その過程で、特異な型式をもつ鹿児島県成川遺跡出土の鉄製武器類に注目し、この実測図を作成し、これをもとに論文集『古代近畿と物流の考古学』にて「古墳時代中期の武器・武具にみる交流の諸相と斉一性」を発表する。これは古墳文化の外縁地域における鉄器型式の認識と製作技術導入のずれに注目した考察で、外縁地域での自由な型式設定に対して他の前方後円墳造営地域の広い鉄器型式の斉一性のもつ特殊性を指摘した。また、畿内からの武器類の配布を認めつつも、武器型式の地域性を指摘することで鉄製甲冑類以外の鉄製武器・武具の地方生産の可能性を指摘した。また、武器の集成成果の一部を利用して、滋賀県立大学での第5回古代武器研究会において「日韓鉄鏃変遷にみる武器の解釈」という研究発表を行った。第一に、日韓両地域に非常に類似した鉄鏃型式が存在し、偶然の産物でないことを論証し、それを利用した両地域の相対年代観の整理を行なった。それを踏まえて第二に、日本出土鉄鏃および鉄製武器全般にわたる大陸との非常に密接な関係と、そのなかでの鉄製甲冑類に見出される特異性を指摘した。結論として、個々の型式組列の検討から、武器・武具の型式には少なからず儀仗的な側面があり、一連の型式変化は、必ずしも武器・武具の機能的発展が主導したものではなく、大陸からの新技術の導入と、それを用いた儀仗的な型式の選択という側面が少なからず認められるとする、従来とは異なる見解を発表した。これにより、古墳副葬品における武器・武具の実用性の評価を含めて、武装の実態に迫る研究の基礎を整えた。古墳時代前期を中心とした近畿、東日本の鉄鏃、銅鏃の出土地および実測図の集成を行った。その作業の中で、基礎となる型式の抽出作業を行ない、時間的な出土資料の整理を行なうために不可欠な編年作成に向けての準備をすすめた。その過程で、畿内政権成立に対応する古墳時代前期前半の資料について鉄鏃、銅鏃の実見を進めた。編年等で必要と判断された資料については、京都府椿井大塚山古墳、佐賀県西一本杉009号墳、福岡県津古生掛古墳、石塚山古墳出土資料など、型式の確認とともに、特に側面の観察に重点をおいて再実測を行い、編年の基本となる資料の作成を行なった。また、武器の集成成果の一部を利用した昨年度の古代武器研究会での口頭発表をもとにして、論文「日韓鉄鏃変遷にみる武器の解釈」を雑誌『古代武器研究Vol.5』にて発表した。主に古墳時代前期から中期にかけての鉄鏃の型式変化を整理し、機能性向上では説明がつかない一連の型式変化について解釈を行なった。

相対編年観を整理すると、短頸鏃、長頚鏃などの新型式の出現は対外的な変化に対応しており、それに伴う鉄鏃群の消長と変化は必ずしも機能の向上を志向していない。よって、鉄鏃型式は機能的側面と儀仗的な側面の2面性をもつと考えた。さらに武具(鉄製短甲)についても同様の視点から、軍事的必要性に変化がないにも関わらず後期に出土しない現象について、中期末の段階には少なからず儀仗的な側面が重視されていたこと、総生産量を不可知にする武装の公的管理の概念に対し、武具を制限して攻撃用の武器を規制していないという矛盾を指摘することで、鉄製短甲が中期を通して中下級の兵まで行き渡るような生産量でない可能性を示し、鉄製短甲保有に伴う儀仗的側面の存在を指摘した。これらにより、古墳に副葬される武器・武具の実用性の評価に視点をおいて当時の武装の実態に迫った。弥生時代終末から古墳時代前期を中心とした中部、近畿、中国地方の鉄鏃、銅鏃の出土地の集成、および編年上問題となるであろう武器、武具の実見をすすめ、鉄鏃と銅鏃の編年案の作成をおこなった。なかでも、研究の基幹をなす編年作成については、主要な型式の抽出を行い、編年上確認もしくは作図が必要と考えられた資料については、宮内庁所蔵の奈良県佐味田宝塚古墳、広陵町石黒山古墳、衛門戸丸塚古墳、大阪府津堂城山古墳鉄鏃、ヒエ塚古墳、ノムギ古墳出土鉄器、桜井茶臼山古墳鉄鏃、銅鏃、愛知県西上免遺跡出土銅鏃、岐阜県金ヶ崎遺跡銅鏃、朝日遺跡銅鏃、岡山県宮山墳墓出土鉄鏃、銅鏃、剣などについては,実測図を作成し、研究の基礎を固めた。その作業の中で、各主要型式の集成作業を進め、銅鏃の型式分布が極めて強い地域性をもつことを確認した。たとえば、奈良県は畿内政権成立時の政治的中心であることが墳墓のあり方から推測されるにもかかわらず、典型的な古墳時代前期銅鏃の型式とおもわれた定角式は、銅鏃編年の最終段階の佐味田宝塚古墳出土品のみで、大和からの出土は確認されていないこと、ホケノ山古墳に代表される腸抉柳葉式は、石黒山古墳をはじめ、伝中山出土品など大和の主流をなすが、その分布に偏りがあること、また、京都府では無茎の銅鏃が多いなど、畿内の周辺地域と比較しても強い地域性が認められた。また、弥生時代のおもに集落出土の銅鏃は、鎬をもつものの研ぎ出しは弱く、特に腸抉柳葉式もしくは長三角の鏃身をもつものの腸抉は、鋳型に鎬状の稜が掘り込まれているものの、鋳造後に鎬を強調するように研ぎ出させる例は確認できなかった。逆に言うと、中茎と鏃身の接合部の研磨から古墳時代の銅鏃の技法を抽出できそうである。鉄鏃についても、厚みをもった鏃身尻に明瞭な面を造り出し、鎬を意識した研ぎ出しの技法と短茎の鏃の大型化に古墳時代の鉄鏃製作技術を抽出できそうである。
細胞接着斑形成に着目した神経軸索再生法開発のための基礎研究

私はこれまでに、損傷した中枢神経組織で再生不全に陥った軸索を再現した培養系を用い、細胞接着班のダイナミクスを増加させることによって軸索再生が誘発されることを明らかにしてきた。本研究ではその機序として、プロテインキナーゼA、p21-activated kinaseおよびパキシリンの活性制御が関与することを明らかにした。本成果は、脊髄損傷等において軸索再生を誘発させるための新たな分子ターゲットを提唱するものである。脊髄損傷時に損傷部位に形成されるコンドロイチン硫酸プロテオグリカン(CSPG)濃度勾配に遭遇した軸索終末部(dystrophic endball)では、何らかの分子がこれを感知してプロテインキナーゼA(PKA)の活性化が生じ、この結果、細胞接着斑形成のダイナミクスが抑制され、軸索再生不全となる、という仮説を証明し、これを基に脊髄損傷治療法の確立を行うことが本研究課題の目的である。昨年度までに、p21-activated kinase (PAK)がpaxillinをリン酸化してCSPG濃度勾配上の軸索再生を促進することを明らかにした。PAKはPKAによってリン酸化されることによって不活性化されることが報告されている。以上のことから、dystrophic endballではPKAが活性化しているためPAKが不活性化し、paxillinのリン酸化が抑制されているのではないかと考えた。そこで本年度はdystrophic endballにおけるPKAの活性を検討した。PKA活性の指標となるリン酸化PKAに対する抗体を用いて免疫染色を行い、軸索終末部におけるPKAの活性を可視化した。まず均一なlaminin基質上で成体ラット由来後根神経節神経細胞を培養した後、アデニル酸シクラーゼ賦活薬forskolinを処置した結果、PKAのリン酸化が増加することが明らかになった。よって本手法でPKAの活性化を検出することが可能であることが示された。引き続きCSPG濃度勾配基質あるいはlaminin基質上で培養した神経細胞の軸索終末部におけるPKAの活性を評価した。CSPG濃度勾配上のdystrophic endballでは、laminin基質上の軸索終末部に比べてPKAのリン酸化が有意に増加した。以上、dystrophic endballにおいてPKAの活性が増加することを初めて明らかにした。脊髄損傷時に損傷部に形成されるコンドロイチン硫酸プロテオグリカン(CSPG)濃度勾配に遭遇した軸索終末部(dystrophic endball)では、何らかの分子がこれを感知してプロテインキナーゼA(PKA)の活性化が生じ、この結果、細胞接着班形成のダイナミクスが抑制され、軸索再生不全となる、という仮説を証明し、これを基に脊髄損傷治療法の確立を行うことが本研究課題の目的である。昨年度までに、p21-activated kinase(PAK)がpaxillinをリン酸化してCSPG濃度勾配上の軸索再生を促進することを明らかにした。また、PKAはPAKを不活性化されることが報告されており、昨年度までに久保山は、dystrophic endballではPKAが活性化していることを明らかにした。そこで本年度は、PKAの活性化機構の解明を目的とした検討を行った。CSPG濃度勾配下で培養した成体ラット後根神経節神経細胞に対して、cAMPのアンタゴニストRp-cAMPS、膜貫通型アデニル酸シクラーゼ阻害薬2',5'-dideoxyadenosine、細胞質型アデニル酸シクラーゼ阻害薬2-hydroxyestradiolを処置したが、いずれも濃度勾配を横切る軸索の長さは増加しなかった。またこれら阻害剤を処置した時、dystrophic endballにおけるPKAの活性は減少しなかった。一方、直接PKAの活性を阻害するKT5720およびmPKIを同様に処置したところ、PKAの活性は減少し、濃度勾配を横切る軸索の長さが増加した。以上のことから、CSPG濃度勾配上のdystrophic endballではPKAの活性が増加しているが、これはdystrophic endballでcAMPの濃度が増加しているためではなく、何らかの機構でPKAが直接活性化されていることが推測された。本研究成果では、CSPG濃度勾配下で再生不全に陥った軸索を再生させる機序として、PKA阻害によるPAK、paxillinを介した再生機序を明らかにした。本成果は、脊髄損傷治療薬の新たな分子ターゲットを提唱するものである。脊髄損傷時に損傷部位に形成されるコンドロイチン硫酸プロテオグリカン(CSPG)濃度勾配に遭遇した軸索終末部では、何らかの分子がこれを感知してプロテインキナーゼA(PKA)の活性化が生じ、この結果、細胞接着斑形成のダイナミクスが抑制され、軸索再生不全となる、という仮説を証明し、これを基に脊髄損傷治療法の確立を行うことが本研究課題の目的である。今年度は、細胞接着班の形成制御に関わるパキシリンの機能制御をすることが報告されているp21-activated kinase (PAK)が、本仮説に関与しているかどうかを明らかにすることを目的とした。まず、野生型あるいは、不活性化模倣、活性化模倣のPAKを作製し、それぞれ神経細胞に発現させ、CSPG濃度勾配上で培養した。

野生型あるいは不活性化模倣PAKを発現させた場合、CSPG濃度勾配を横切る軸索はほとんど存在しなかった。一方、活性化模倣PAKを発現させた場合CSPG濃度勾配を横切る軸索再生が増加した。次に、野生型PAKを発現する神経細胞にPKA阻害剤を処置した結果、CSPG濃度勾配を横切る軸索の長さが増加した。一方、不活性化模倣PAKを発現する神経細胞にPKA阻害剤を処置した場合CSPG濃度勾配を横切る軸索の長さは増加せず、PKA阻害による軸索再生作用が阻害されていた。これにより、PKA阻害によってPAKが活性化することがCSPG濃度勾配上の軸索再生に重要であることが明らかになった。以上のことから、CSPG濃度勾配上の軸索終末部ではPAKの活性が抑制されていることが推測され、PAKを活性化させることが軸索再生を誘発することに繋がることが示唆された。CSPG濃度勾配上で再生不全に陥った軸索終末部でPKAの活性が増加していることを初めて明らかにし、これまで不明な点が多かったCSPG濃度勾配の下流シグナルの一端を示すことができ、本年度の目標を達成できたため。細胞接着班の形成制御に重要な役割を果たすパキシリンの機能制御に、PAKが関与していることを明らかにし、軸索再生におけるPAK活性の重要性を明らかにすることができ、本年度の目標を達成できたため。CSPG濃度勾配に遭遇した軸索の終末部が、これを感知してPKAを活性化させ、細胞接着斑形成のターンオーバーを抑制し、軸索再生不全となる、という仮説を証明するため、さらなる細胞生物学的、分子生物学的検討を行う。特にPKAの活性化機構に着目した検討を行う。また、これより得られる結果を応用し、鍵となる分子の活性を制御することにより、脊髄損傷動物において軸索再生を誘発させることを目指す。本年度は予定通りに研究が進行したが、36,004円の残金が生じた。この残金は次年度に使用する。次年度の研究費の内、約98万円は細胞培養用試薬、組織化学実験用試薬、実験動物、顕微鏡関連消耗品、分子生物学実験用試薬などの消耗品に用いる予定である。また、学会参加のための旅費に約5万円用いる予定である。本研究を遂行するにあたって必要な設備機器類は全て利用できる環境にいるので、設備機器類に研究費を使う予定はない。次年度の研究費の内、約107万円は細胞培養用試薬、組織化学実験用試薬、実験動物、顕微鏡関連消耗品、分子生物学実験用試薬などの消耗品に用いる予定である。
現代ドイツにおける集合的記憶の形成と文学の機能

本研究は, 1980年代半ば以降顕著に観察されるようになったドイツにおける「記憶文化」と呼ばれる事象を,単に現象を追って確認するだけでなく,より広い射程から考察することを目指したものである。本研究期間内の三年間においては,第一に,「記憶」を論ずるにあたり前提となる考察を行ない,個人の記憶と集合的記憶,「死者の記憶」といった論点を整理した。また第二に,両大戦間期の思想・文化状況を第一次世界大戦の「戦後」と捉え,第二次世界大戦の「戦後」と併行して論じてゆく糸口を探った。また第三に,研究の前提となる資料を系統的に収集した。本研究は,過去20年ばかりのあいだドイツで盛んになっている<集合的記憶>をめぐる議論を,戦後の文学・芸術作品と社会との相関関係という観点から位置づけ検証することを目指している。研究の遂行は,1)理論的考察,2)具体例に即した考察,3)研究の前提となる資料収集,を三つの柱として進められている。1)理論的考察においては,まずは20世紀初頭からの思想史的文脈のなかで<記憶>の問題がどのように追究されてきたかを検討した。ニーチェ,フロイト,アルヴァクスらの所論を踏まえたうえで,とりわけヴァルター・ベンヤミンに即して考察を進めた。その過程でプルーストの<記憶>の捉え方なども参照しつつ,<想起>における主体的な行為という側面のみではなく,<思い起こさせられる>という使役的側面を理論的枠組みに組み込んでゆく構想,及び,<記憶>の隠喩的構造と換喩的構造,という対照性を手がかりに考察してゆく方向性などが獲得された。2)具体的作品に即した考察においては,本年度においては文学作品を扱うまでには到らなかったが,とりわけ1980年代末より社会的な現象として顕著に観察される,<警告碑Mahnmal>あるいは<カウンター・モニュメント>の数々をベルリン市に限定してではあったが実地に見学するとともに,それらの建設をめぐる諸議論について検討を重ねた。3)上記の研究遂行を支える資料収集においては,本年度は書籍として出版されている基礎的文献を理論面,実践面のふたつの系列において系統的に購入した。本研究の課題に関して本年度は,理論面においては,モーリス・アルヴァクス(Maurice Halbwachs)が両大戦間に構想した「集合的記憶」論-とりわけ"Les Cadressociaux de lamemoire","La memoire collective","La topographie legendaire des evangiles"の3著作-を検討し,その現代的意義を探った。これは以後の継続的に進められる研究の端緒をなすものになる。またアルヴァクスの構想と,同様に両大戦間期に独特な「回想」についての議論を行なったヴァルター・ベンヤミンの思想-とりわけ晩年の「歴史」概念-とを相関的・総合的に捉え,今後の1920年代,30年代における「記憶」構想形成を広範に検討する基礎研究とした。さらに,アルヴァクスとの関連で,彼の弟子でもあるスペイン出身のフランス語作家ホルヘ・センプルン(Jorge Semprun)の諸著作を,「ショアー以後」の「記憶」「歴史」記述の一例として検討した。現在のドイツにおいて「警告碑(Mahnmal)」等として具体的に設置されている諸インスタレーションについての検討は,とりわけクリスチャン・ボルタンスキーの「欠如した家(The Missing House)」及びグンター・デムニヒによる企画「蹟きの石(Stolpersteine)」について文献を系統的に収集し,その検討に着手した。その他の文献の収集も同時に進めた。ただし当初予定されていた現地での関係者に対する聞き取り調査は,職務のため海外出張が不可能となり実施されなかった。本年度は,2010年にヴァルター・ベンヤミン新全集の一巻として刊行された彼の遺稿「歴史の概念について(Uber den Begriff der Geschichte)」の再検討を第一の課題として,さまざまな異稿や草稿を含めて精読し,このテクストのベンヤミンの思想のなかでの位置づけを改めて確認するとともに,さらにそれを越えて,「第一次世界大戦後」という両大戦問期の思想に広く見いだされる特性を帯びたもののひとつとして確定する作業を進めた。つまりこれは,「死者の記憶」という言い回しによって敷衍できるものであって,その限りで第二次世界大戦後の思想の課題ともおおきく重なり合うものである。この見通しをさらに日本における「戦後」のディスクールに関連させた論文をすでにまとめてあるが,目下のところ投稿した雑誌は未刊行である。(掲載は決定されている。)それと同時に,前年までに引き続き,モーリス・アルヴァクスの「記憶」論を詳細に読解する作業を進めている。これは「集合的記憶」概念の成立を追うという概念史的な関心に由るものではなく,ベンヤミンの場合と同様に「第一次世界大戦後」の思想をより包括的に検討してゆくための準備作業になる。

そしてそのなかで,彼の「集合的記憶」概念も,「死者の記憶」という観点から検討してゆくことになる。また,これも継続されている「警告碑(Mahnmal)」についての検討は,資料の収集にとどまり,より具体的な作業を押し進めるまでにはいたっていない。
国際間移動を目的とした良質ヤギ胚作出法の開発に関する研究

本研究では、発情周期を回帰する18頭のシバヤギを使用した。超音波画像診断により少なくとも一つの黄体を確認した後、PGF2αのアナログ125μgを1回投与して発情を同期化した。雌ヤギは、雄と交配後0、7及び21日目にプロジェステロン測定用に採血した。実験群は、発情期に2回雄と交配し(グループI ; n=12)、対照群は交配を行わなかった(グループII ; n=6)。超音波画像診断は、経直腸あるいは腹壁から7.5あるいは5MHzのプローブを用いて、リアルタイムBモードで行った。雌ヤギは、PGF2α投与後、平均56.0±2.7時間後に発情を示した。本研究の結果から、血中プロジェステロン測定法による妊娠診断の確立は、妊娠21日において妊娠ヤギでは80%、非妊娠ヤギでは100%であった。胎胞は、平均妊娠20.2±0.6日齢に確認された。妊娠の進行に伴い胎胞は増大し、胎子は妊娠24.3±0.7日で確認された。胎盤節は、妊娠34.5±1.0日で小さな結節(0.7±0.2cm)として認められた。妊娠2ヶ月で頭蓋、胸郭および長骨などの骨格構造が確認された。長短の頭頂骨長、胸郭長、長骨長を胎齢の指標とすることが可能であった。超音波画像診断による妊娠60日における胎子数の確認率は91.7%であった。本研究の結果から、血中プロジェステロン測定法は、妊娠21日目で妊娠診断法としての使用可能であるが、超音波画像診断は、胎子の心拍を確認できることから、より有効な方法であろうと判定された。また、胎子の数と胎子の妊娠日齢の判断は、超音波診断によってのみ可能であることが確認された。
脂溶性ホルモンによるクロマチン構造変換の分子メカニズムの解析

脂溶性ホルモンであるエストロゲンは、エストロゲン標的組織の細胞内に存在するエストロゲンレセプターに結合する。エストロゲンの結合してエストロゲンレセプター(ER)は、DNA上の特異的な配列に結合し、標的遺伝子の転写を制御することにより、様々な生理作用を現わす。ERの転写制御には、リガンド依存的に結合する一群の蛋白質複合体が必須であることが知られている。これらは、転写を活性化する転写活性化因子複合体と転写を抑制する転写抑制因子複合体に分けられる。われわれは、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ融合ER蛋白質を用いたカラムを作製し、新規ER結合蛋白質複合体を精製した。質量分析による同定により、この蛋白質複合体はTRRAP, GCN5,TAFなどを含み、TRRAPを介して、エストロゲンの結合したERに結合することが明らかとなった。In vitro転写系において、この蛋白質複合体は、ERの転写活性を促進することから、転写活性化因子複合体として機能するものと考えられた。TRRAPのアンチセンスmRNAはERの転写活性を著しく阻害することから、この複合体がERの転写活性化において重要な役割を担っているものと考えられた。さらに、乳がん由来の細胞株であるMCF7に、このアンチセンスRNAを恒常的に発現させたところ、エストロゲン依存的な乳がん細胞増殖が顕著に抑制された。この抑制はER結合領域を持つが複合体を形成しないTRRAPドミナントネガティブ体を細胞内に導入した場合にも観察されることから、TRRAP/GCN5複合体はエストロゲン依存的な乳がんの増殖に関与している可能性が示された。今後さらに解析を進めることにより、エストロゲン依存的な乳がんの増殖機構が明らかになり、新たな抗がん剤の開発に結びつくのではないかと期待している。低分子脂溶性物質をリガンドとするリガンド誘導性転写因子である核内レセプターは、リガンド未結合時にはN-CoR/SMRTなどを含むヒストン脱アセチル化酵素複合体と結合することにより転写活性を抑制し、またリガンド結合時にはp300/p160蛋白質といったヒストンアセチル化酵素と結合することにより転写を活性化することが明らかとなっている。DNAはヒストン蛋白質と相互作用し、クロマチンと呼ばれるよりコンパクトな構造体を形成して核内に存在している。これらヒストンアセチル化、脱アセチル化酵素複合体はヒストンを修飾することによりクロマチン構造を変換することによって転写を制御しているものと考えられる。われわれは、新規ヒストン修飾蛋白質複合体を検索するため、核内レセプターファミリーに属するエストロゲンレセプター(ER)を用いてカラムを作製し、HeLa細胞核抽出液よりリガンド依存的にERに結合する蛋白質複合体を精製した。精製した蛋白質をSDS-PAGEにて分離しプロテアーゼを用いて分解した後、質量分析機にてペプチドの質量を決定しデータベースと比較することにより同定した。その結果、基本転写に関与すると考えられていたヒストンアセチル化複合体であるGCN5/TRRAP複合体がリガンド依存的にERに結合することが明らかとなった。免疫共沈降実験から、この複合体は細胞内においてもERと結合することが示された。TRRAP/GCN5を細胞内に発現させたところ、ERの転写活性を促進することが明らかとなった。また、TRRAPのアンチセンスRNAはERの転写活性を抑制すること、さらに乳癌由来の細胞株であるMCF7にアンチセンスRNAを導入したところ、エストロゲン依存的な細胞増殖を強く抑制した。これらの結果から、われわれは、TRRAP/GCN5がヒストンのアセチル化を介してERの転写を制御しているものと考え解析を進めている。

エストロゲンの結合してエストロゲンレセプター(ER)は、DNA上の特異的な配列に結合し、標的遺伝子の転写を制御することにより、様々な生理作用を現わす。ERの転写制御には、リガンド依存的に結合する一群の蛋白質複合体が必須であることが知られている。これらは、転写を活性化する転写活性化因子複合体と転写を抑制する転写抑制因子複台体に分けられる。われわれは、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ融合ER蛋白質を用いたカラムを作製し、新規R結合蛋白質複合体を精製した。質量分析による同定により、この蛋白質複合体はTRRAP, GCN5, TAFなどを含み、TRRAPを介して、エストロゲンの結合したERに結合することが明らかとなった。In vitro転写系において、この蛋白質複合体は、ERの転写活性を促進することから、転写活性化因子複合体として機能するものと考えられた。TRRAPのアンチセンスmRNAはERの転写活性を著しく阻害することから、この複合体がERの転写活性化において垂要な役割を担っているものと考えられた。さらに、乳がん由来の細胞株であるMCF7に、このアンチセンスRNAを恒常的に発現させたところ、エストロゲン依存的な乳がん細胞増殖が顕著に抑制された。この抑制はER結合領域を持つが複合体を形成しないTRRAPドミナントネガティブ体を細胞内に導入した場合にも観察されることから、TRRAP/GCN5複合体はエストロゲン依存的な乳がんの増殖に関与している可能性が示された。今後さらに解析を進めることにより、エストロゲン依存的な乳がんの増殖機構が明らかになり、新たな抗がん剤の開発に結びつくのではないかと期待している。
AAA型ATPaseに隠されたオルガネラアダプターの分子基盤

AAA-ATPaseは、細菌からヒトまで広く保存されているタンパク質ファミリーであり、ATP加水分解エネルギーを利用して、タンパク質のunfoldや複合体の解離を行う。その分子中央部分に、AAAドメインを一つ有するI型と2つ有するII型に大別される。また、19SプロテアソームのようにN末端部分にドメインを持たないもの、PEX1のように更に長い(500残基)配列を有するものなどがあり,ドメイン解剖学的研究が必須であった.そこで,まずタンパク質ドメイン発現系を効率よく作成する方法論(PRESAT-vector法)を確立した。それを用いてII型酵素ペルオキシソーム因子PEX1のN末端から新規のドメインを発見し,結晶構造解析に成功した。驚くべきことに、14%という低い配列相同性ながらその構造は他の膜融合装置のそれに酷似していた。また,エンドソームに局在するI型酵素Vps4と,類縁の微小管切断因子katanin p60のN末端から,ドメインを単離し立体構造決定を行った.前者のドメイン(MIT)の分子表面には,標的となるESCRT-III複合体の結合部位と考えられる特徴的な溝が存在していた.後者はドメイン直後にコイルドコイル領域が存在するため,解析可能な試料を得るにはコイルドコイル配列の改変技術が不可欠であった.さらにN末端ドメインをもたないプロテアソームについては,基質認識を行うシャトル因子と呼ばれる別のタンパク質が介在しているが,そのうちの一つDsk2についてUBAドメインとユビキチン複合体の構造決定を行った.また19Sプロテアソームによる基質認識機構について、K48linkポリUb鎖のみを基質とし、K63linkは基質としないという特異性を解明するため、両者の動的性質の違いをNMRにより比較した。解析を行った5例のうち2例に,脂質結合活性があることを見出した.AAA-ATPaseは、細菌からヒトまで広く保存されているタンパク質ファミリーであり、ATP加水分解エネルギーを利用して、タンパク質のunfoldや複合体の解離を行う。解析を行った5例のうち2例に,脂質結合活性があることを見出した.AAA-ATPase(ATPases associated with diverse cellular activities)は、真正細菌からヒトに至るまで普遍的に存在しているタンパク質ファミリーであり、その分子の中央部分に、非常によく保存された約200アミノ酸残基からなるATPaseドメイン(AAA domein)を有することを特徴とする。これらの分子は、ATP加水分解エネルギーを利用して、タンパク質のunfoldや複合体の解離を行う点が共通していると考えられる。更にAAA-ATPaseはこのAAA-domainを一つ有するType Iと2つ有するType IIに大別される。また、19Sプロテアソーム(制御サブユニット)のように、N末端部分にほとんど配列が見られないもの、NSFなどのようにN末端に250残基程度の配列を有するもの、PEX1のように更に長い(500残基)配列を有するものなどがある。研究代表者らはAAA-ATPaseのN末端部分に存在する、各分子固有の配列を解析し、そこから構造決定可能な新規タンパク質ドメインを単離する、いわゆるドメイン解剖学の戦略をとり、構造と機能の解明を行った。そのために、まず短いタンパク質ドメインの発現系を効率よく作成する方法論(PRESAT-vector法)を確立した。それを用いてペルオキシソーム生合成に関わる因子PEX1のN末端機能未知配列から新規のドメインを発見した。さらにそのドメインの結晶構造解析に成功した。驚くべきことに、11%程度という低い配列相同性ながらその構造は他の膜融合装置に酷似していた。また19Sプロテアソームによる基質認識機構について、K48linkポリUb鎖のみを基質とし、K63linkは基質としないという特異性を解明するため、両者の立体構造をNMRにより比較して、その分子認識機構の違いを解明した。

AAA-ATPase(ATPases associated with diverse cellular activities)は、細菌からヒトまで広く保存されているタンパク質ファミリーであり、その分子中央部分に、約200アミノ酸残基からなるAAA-ATPaseドメインを有することを特徴とする。これらの分子は、ATP加水分解エネルギーを利用して、タンパク質のunfoldや複合体の解離を行う点が共通していると考えられる。AAA-ATPaseはこのAAA-domainを一つ有するType Iと2つ有するType IIに大別される。また、プロテアソーム19SサブユニットのようにN末端部分にドメインを持たないもの、NSFなどのようにN末端に250残基程度の配列を有するもの、PEX1のように更に長い(500残基)配列を有するものなどがある。研究代表者らはAAA-ATPaseのN末端部分に存在する、各分子固有の配列を解析し、そこから構造決定可能な新規タンパク質ドメインを単離した.具体的には,チューブリンを切断するAAA酵素katanin p60サブユニットと,核内でリボソーム複合体のアセンブリに関与するNVL2から,新規のN末端ドメインを単離し,発現精製の後NMR解析を行った.両者とも核となるドメインの直後にコイルドコイル領域が存在し,その部分の配列をデザインし欠失変異を導入することで,はじめて立体構造解析可能な試料を得ることができた.現在両者のドメインについて,立体構造決定の精密化の途上であり,基本フォールドが明らかになった.合わせてモデルとなるコイルドコイルの分子設計に関しても構造学的知見を得た.また,katanin p60類縁のType I酵素Vps4のN末端から,構造未知のMITドメインを単離し,その立体構造決定を行った.MITドメインには,標的となるESCRT-III複合体の結合部位と考えられる,分子表面の特徴的な溝が存在することが明らかになった.さらにN末端ドメインをもたないプロテアソームについては,基質認識を行うシャトル因子と呼ばれる別のタンパク質が介在しているが,そのうちの一つDsk2についてUBAドメインとユビキチン複合体の構造決定を行った.
肺炎球菌と赤血球間の相互作用の解明

肺炎球菌による感染症が、敗血症などの侵襲性の病態に進展する過程においては、菌が定着したのちに血管内へと移行し、血液中で宿主の免疫機構を回避して増殖する必要がある。しかし、肺炎球菌の血液中における動態や、病態の重症化機構については不明な部分が多い。最終年度である本年度は,初年度および前年度に得られた成果に基づき、赤血球の添加による肺炎球菌の宿主免疫回避機構への影響と,同菌の赤血球侵入機構について検討した.肺炎球菌について、菌体表層タンパクを細胞壁に架橋する役割を持つSortase Aの欠失株、溶血毒素であるPlyの欠失株、自己融解酵素であるLytAの欠失株をそれぞれ作製し、赤血球への侵入能を比較した。さらに、リピッドラフト形成阻害剤,アクチン重合阻害剤存在下における肺炎球菌の赤血球侵入能を比較した。侵入試験の結果,野生株と比較してΔlyM株は3倍以上侵入率が増加し、ΔsrtA株は39%まで侵入率が低下した。一方、Δply株については有意差は認められなかった。リピッドラフト形成阻害剤、アクチン重合阻害剤存在下では約50%まで侵入率が低下した。これらの結果から、肺炎球菌の赤血球侵入機構に、菌体表層タンパクとリピッドラフトならびにアクチンリモデリングが重要な役割をはたすことが示唆された。また、赤血球存在下における好中球ならびにH_2O_2の殺菌能の変化は、肺炎レンサ球菌を好中球またはH_2O_2と反応させた後、血液寒天培地上に播種し、生育コロニー数を計測することで決定した。補体非働化ヒト血清を加えた好中球殺菌試験では、肺炎球菌の菌数に差は認められなかったが、新鮮ヒト血清添加時には、培養3時間後に赤血球添加群が赤血球非添加時と比較して生存菌数が3倍以上に増加した。また、H_2O_2による殺菌能は赤血球の添加により80%以上抑制された。以上の結果から、肺炎球菌は赤血球に侵入し、宿主の免疫機構や抗生物質による殺菌を回避する可能性が示された。肺炎球菌は市中肺炎の主たる原因菌であり,敗血症患者から最も高頻度に分離されるグラム陽性菌のひとつである.肺炎球菌による重症肺炎患者の血液培養検体において,肺炎球菌と赤血球が結合している像が多数認められる.このことから肺炎球菌と赤血球の相互作用は,感染の成立過程で重要な役割を果たしている可能性が考えられる.そこで本研究では,肺炎球菌と赤血球の相互作用について分子生物学的な解析を行った.まず,ヒト末梢血またはヒト赤血球と肺炎球菌を混和し,走査型電子顕微鏡ならびに共焦点蛍光レーザー顕微鏡にて観察を行った.これらの顕微鏡観察から,肺炎球菌が赤血球に付着ならびに侵入している像が得られた.さらに,肺炎球菌と赤血球を混和し,細胞外の菌を抗生物質にて除去した後に菌数を算定することで赤血球に侵入する割合を算出した.侵入試験から,菌の莢膜の有無にかかわらず約1%の肺炎球菌が赤血球内に侵入することが示された.つぎに,肺炎球菌の菌体表層タンパクを電気泳動にて展開し,リガンドブロット法を用いてビオチン標識した赤血球の表層タンパクと結合する分子を検索した.結合を示す肺炎球菌のタンパクバンドを質量分析装置により解析したところ,DnaK, FusA, Enolaseと同定された.得られた配列情報を基に作製した組換えタンパクを蛍光色素にて標識し,赤血球と反応させ,フローサイトメーターにて液相における生細胞への結合能を測定した.その結果,DnaK, FusA, Enolaseは濃度依存的に生きた赤血球表層に結合することが示された.以上の結果から,肺炎球菌は複数の表層タンパクにより赤血球に結合し,侵入することが示唆された.肺炎球菌は、グラム陽性菌において黄色ブドウ球菌と並んでもっとも敗血症を起こしやすい菌の一つである。肺炎球菌による感染症が敗血症などの侵襲性の病態に進展する過程においては,菌が定着したのちに血管内へと移行し,宿主の免疫機構を回避して増殖する必要がある.本研究では,肺炎球菌と赤血球の相互作用について着目し、分子生物学的な解析を行った.今年度は,初年度に得られた成果をもとに、赤血球側の肺炎球菌結合分子の同定、ならびに赤血球の存在が菌の増殖に及ぼす影響の検討を行った.赤血球の膜タンパクを電気泳動にて展開し,リガンドブロット法を用いてビオチン標識した肺炎球菌の表層タンパク,DnaK,FusA,Enolaseと結合する分子を検索した.結合を示す赤血球のタンパクバンドを質量分析装置により解析したところ,Band3,α-spectrin,β-spectrin,β-actinが同定された.また、鉄イオンキレート剤の存在下、または非存在下において、赤血球と肺炎球菌または黄色ブドウ球菌を混和した後、血液寒天培地上に播種し生育コロニー数を計測した。その結果、鉄イオンキレート剤存在下では黄色ブドウ球菌の増殖は有意に阻害されたのに対し、肺炎球菌の菌数は培養6時間後には170倍以上増加した。次に、各種酸化ストレス阻害剤による赤血球存在下の肺炎球菌菌数の変化を計測した。

一酸化窒素合成阻害剤は菌数に変化を及ぼさなかったが、鉄イオンキレート剤、フリーラジカルスカベンジャー、またはスーパーオキシドディスムターゼ様活性物質存在下では培養2時間後の菌数が10倍以上増加した。これらの結果から、黄色ブドウ球菌は増殖に鉄イオンを必要とするのに対し、肺炎球菌は、増殖に鉄イオンを必要とせず、赤血球の鉄イオンが産生する活性酸素によって増殖が阻害されることが示唆された。肺炎球菌による感染症が、敗血症などの侵襲性の病態に進展する過程においては、菌が定着したのちに血管内へと移行し、血液中で宿主の免疫機構を回避して増殖する必要がある。しかし、肺炎球菌の血液中における動態や、病態の重症化機構については不明な部分が多い。最終年度である本年度は,初年度および前年度に得られた成果に基づき、赤血球の添加による肺炎球菌の宿主免疫回避機構への影響と,同菌の赤血球侵入機構について検討した.肺炎球菌について、菌体表層タンパクを細胞壁に架橋する役割を持つSortase Aの欠失株、溶血毒素であるPlyの欠失株、自己融解酵素であるLytAの欠失株をそれぞれ作製し、赤血球への侵入能を比較した。さらに、リピッドラフト形成阻害剤,アクチン重合阻害剤存在下における肺炎球菌の赤血球侵入能を比較した。侵入試験の結果,野生株と比較してΔlyM株は3倍以上侵入率が増加し、ΔsrtA株は39%まで侵入率が低下した。一方、Δply株については有意差は認められなかった。リピッドラフト形成阻害剤、アクチン重合阻害剤存在下では約50%まで侵入率が低下した。これらの結果から、肺炎球菌の赤血球侵入機構に、菌体表層タンパクとリピッドラフトならびにアクチンリモデリングが重要な役割をはたすことが示唆された。また、赤血球存在下における好中球ならびにH_2O_2の殺菌能の変化は、肺炎レンサ球菌を好中球またはH_2O_2と反応させた後、血液寒天培地上に播種し、生育コロニー数を計測することで決定した。補体非働化ヒト血清を加えた好中球殺菌試験では、肺炎球菌の菌数に差は認められなかったが、新鮮ヒト血清添加時には、培養3時間後に赤血球添加群が赤血球非添加時と比較して生存菌数が3倍以上に増加した。また、H_2O_2による殺菌能は赤血球の添加により80%以上抑制された。以上の結果から、肺炎球菌は赤血球に侵入し、宿主の免疫機構や抗生物質による殺菌を回避する可能性が示された。赤血球存在下における菌の生育について、当初の予想と異なる結果が得られたため、一部研究計画を変更しその機構の解析を行った。そのため、当初の計画と異なる進行を見せている点はあるが、全体を通して計画にそって研究が進行していると考える。基本的に年次計画にそって研究を遂行する。一部変更点として、肺炎球菌の赤血球侵入機構のさらなる解析を行う。具体的には、グラム陽性菌のタンパクを菌体表層に架橋する働きを持つSortaseA,肺炎球菌の溶血毒素であるPneumolysin,自己融解酵素LytAの遺伝子欠失株をそれぞれ作製し、赤血球侵入機構への関与を、野生株ならびに各遺伝子欠失株の侵入率を比較することで解析する。さらに、リピッドラフト形成阻害剤,アクチン重合阻害剤で赤血球を処理し、肺炎球菌の侵入率を比較する。