hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
骨肉腫に対する新規合成プラチナ錯体にカフェインを併用した化学療法の基礎的研究

新規に開発したプラチナ製剤にカフェインを併用した化学療法を骨肉腫細胞株に対して施行し,シスプラチン同様に抗腫瘍効果の増強を確認できた.また新規プラチナ製剤はDNA2本鎖断裂を引き起こすことを確認し,シスプラチン同様の作用機序が示唆された.一方でシスプラチン耐性株に対しても交叉耐性を示さなかったことからシスプラチン耐性といった臨床上の大きな問題にも対応できる可能性が示唆された.新規プラチナ製剤の骨肉腫に対する抗腫瘍効果を,骨肉腫細胞株を用いてin vitroで検証し,また,動物実験モデルを用いて抗腫瘍効果の評価をin vivoで行った.具体的には,骨肉腫細胞株(LM8、MG63、143B)を用いin vitroでの腫瘍抑制効果についてWST - 8 assayを用いて評価した。また,アポトーシスの誘導はDNA ladder、Annexin V/PIによるフローサイトメトリーにて評価した。In vivoにおける評価として,ヌードマウス(balb c nu/nu)の脛骨に143Bを移植したorthotopic modelを作成、各薬剤投与を行い抗腫瘍効果の評価を行った。我々の開発した新規プラチナ製剤はin vitroにおいて強く骨肉腫細胞株の増殖を抑制していた.また,ヌードマウスを用いたin vivoでの予備実験でも,これまでのシスプラチン製剤よりも強力に腫瘍の増殖を抑制することが確認できた.我々は,骨への組織特異性に優れた新規プラチナ製剤を独自に開発し,すでに特許を取得した.今後この新規プラチナ製剤を用いた骨肉腫化学療法を臨床応用へ繋げることを目指し,本研究を計画した.骨肉腫に対する化学療法は,1970年代にメトトレキセートとシスプラチンが導入されて,治療成績は向上したものの、その後有効な薬剤の開発は進まず治療成績は頭打ちとなっていた.我々はシスプラチンの作用増強効果のあるカフェインの基礎的研究を行い、1989年より悪性骨軟部腫瘍に対するカフェイン併用化学療法を臨床応用した。厚生労働省の高度先進医療の認定を受け、初診時に肺転移を有さない症例に対しては90%を超える5年生存率を実現している.しかしながら、肺転移を有する症例や再発例では治療が困難であり、さらなる治療効果を求め、新規プラチナ化合物の合成を行った.この化合物は骨親和性が高く、基礎実験では癌腫において,シスプラチンに比して高い抗腫瘍効果を確認しており,さらに安全性試験では,水溶性が高く腎障害が軽微であることをすでに明らかにしている.スプラチンの作用増強効果が報告されているキサンチン誘導体(カフェイン)を併用することで,新規合成プラチナ化合物の抗腫瘍効果を高め,骨肉腫の治療成績をさらに向上させることを動物実験により明らかとすることを目標とした.これまでにin vitroの研究により新規プラチナ製剤がアポトーシスを誘導することを確認しており,ヌードマウスを用いた予備実験により投与量の設定を行ってきた.昨年度はカフェインによる抗腫瘍効果の増強につき検討し,マウスを用いた本実験を計画した.また,シスプラチン耐性骨肉腫株に対する抗腫瘍効果を確認する目的でシスプラチン耐性骨肉腫株の樹立にむけた培養も計画した.新規に開発したプラチナ製剤にカフェインを併用した化学療法を骨肉腫細胞株に対して施行し,シスプラチン同様に抗腫瘍効果の増強を確認できた.また新規プラチナ製剤はDNA2本鎖断裂を引き起こすことを確認し,シスプラチン同様の作用機序が示唆された.一方でシスプラチン耐性株に対しても交叉耐性を示さなかったことからシスプラチン耐性といった臨床上の大きな問題にも対応できる可能性が示唆された.使用する新規抗がん剤であるリン酸基含有多核プラチナ錯体(=Ptn(IP6)2)について合成を行った。In vitroにおいて,新規合成リン酸基含有多核プラチナ錯体の感受性試験および,リン酸基含有多核プラチナ錯体+カフェインによる感受性増強試験を行い、新規合成リン酸基含有多核プラチナ錯体が骨肉腫細胞に対して、従来のCDDPよりも有効であることを96 wellのマイクロプレートリーダーを用いて細胞生存曲線を求めることで明らかとした。また、カフェインとの相乗効果についても、同様にWSTアッセイを行うことで明らかとした。またその効果が、骨肉腫細胞へアポトーシスを誘導するすることでもたらされていることも、フローサイトメトリーなどで確認することができた。これらのデータについては、癌の専門学会において発表を行った。骨への親和性に優れ,骨粗鬆症治療薬として用いられる「ビスホスホネート」をその化学構造式に含む3Ptと,プロテアソーム阻害作用を有する1Ptを用いました.通常骨肉腫細胞株,シスプラチン耐性骨肉腫細胞株を用いin vitroでの腫瘍抑制効果についてWST assayを用い評価し,カフェイン添加による効果増強を評価.アポトーシスの誘導はDNA ladder検出,フローサイトメトリーにて評価行いました.DNAとの相互作用についてはHistonH2AXのリン酸化を評価しました.In vivoではヌードマウスの脛骨に通常骨肉腫細胞株を移植したモデルマウスを用い抗腫瘍効果の評価を行いました.各骨肉腫細胞株において濃度依存性に腫瘍抑制効果が観察され、3Ptではシスプラチンを上回る抗腫瘍効果が得られました.カフェイン添加にて抗腫瘍効果は増強.薬剤作用後にはいずれもDNA ladderが検出され,FCMでは濃度依存性にアポトーシスを生じていることが明らかとなりました.シスプラチン耐性骨肉腫細胞株に対しても新規Pt製剤は通常株と同様に抗腫瘍効果を示しました.また各新規Pt製剤を作用させることでH2AXのリン酸化が観察されました.

骨肉腫モデルマウスに対して1Ptはシスプラチンと同程度,3Ptはこれを上回る腫瘍抑制効果が得られました.我々の開発した新規Pt製剤はin vitroにおいて強い抗腫瘍効果を示し,シスプラチン耐性株に対しても交叉耐性を示しませんでした.H2AXリン酸化が証明され、シスプラチンと同様のDNA double strand brakeがその作用機序の一端であることが確認できました.3Ptはシスプラチンを上回る強い抗腫瘍効果を示しました.これは骨組織への選択的デリバリーに優れていることが寄与していると考えられました.骨軟部腫瘍これまで,新規開発シスプラチン製剤のIC50の決定,フローサイトメトリーによるアポトーシス導入の有無につき確認を行うことができた.動物実験についても,予備実験で従来のシスプラチン製剤よりも良好な抗腫瘍効果をin vivoにおいて確認することができた.計画通りおおむね順調に,研究は進展していると評価できる.in vitroにおいて,カフェインによる抗腫瘍効果の増強がシスプラチン同様に引き起こされていることを確認できた.in vivoのマウスに関する研究は骨肉腫モデルマウス作成効率が予定よりも低かったが,順調にマウス数を重ねている.シスプラチン耐性株作成は順調に進み,次年度,この細胞株を用いた研究を遂行できる見通しである.平成23年度に予定していたin vitroでの研究については、順調のデータを得ている。また、その作用がアポトーシスによりもたらされていることを明らかとした点は、従来の研究計画には当初なかった点であり、当初計画以上の成果であるといえる。また、これら研究成果について、癌の専門学会で発表を行えたもの大きな成果であるといえる。我々は実臨床において,シスプラチンの作用を増強するためにカフェインを併用した化学療法を施行しているが,カフェインがこの新規プラチナ製剤の抗腫瘍効果を高めることができるか,in vitroおよびin vivoで検討を行う予定である.また,この新規プラチナ製剤の作用機序につき,検討を予定している.作用機序の検討を行うことで,従来のシスプラチン製剤との交叉耐性の可能性についても検討を行う予定である.また,in vivoにおける抗腫瘍効果については,引き続き実験動物数を増やして検討を行うと同時に,蛍光タンパク導入細胞を用いたモデルを作成することで,骨肉腫細胞に対する作用を継時的に評価する予定である.in vivo実験を進め実験動物数を予定数まで行い検討するとともにin vitroではシスプラチン耐性骨肉腫細胞株を用い新規プラチナ製剤がシスプラチンとの交叉耐性を有するかどうかに関して検討を予定している.今後,in vivoの実験を行うことで、実際の生体内においても骨肉腫に対して、有効に作用するか確認を行う。また新規抗がん剤であるリン酸基含有多核プラチナ錯体(=Ptn(IP6)2)の作用機序につき、従来のCDDPとの相違点についてin vitroでの検討を行う予定である。
環境汚染物質の代謝に関与するチトクロームP-450IA1の新しい誘導機構

我々は、環境汚染物質を代謝活性化するチトクロームP-4501A1(CYP1A1)の、新しい誘導機構の存在を示唆する現象を明らかにするため、CYP1A1を誘導する物質オメプラゾール(OP)を用いて、ヒトとマウスの培養細胞における誘導性を比較したところ、ヒト培養細胞においては、明瞭なCYP1A1-mRNAの誘導が観察されたが、マウス培養細胞では、全く誘導されなかった。マウスのCyp1a1上流約1kbをCAT遺伝子と融合したDNAを、ヒト肝癌細胞HepG2にトランスフェクトしCAT活性を測定すると、OP処理によってダイオキシンと同程度にCAT活性が誘導された。次に、マウス肝癌細胞Hepa-1を親株として作製した変異株のうち、Ahレセプターを欠損したcl-19細胞に、ヒトAhレセプターを導入したところ、ダイオキシンではCYP1A1が誘導されるが、OPでは誘導されなかった。これらのことから、Ahレセプターの活性化には、直接リガンドを介したものと、何らかのシグナル伝達系を介した間接的な経路が存在し、そのうちのひとつの因子がヒトとマウスでOPに対する感受性が異なっているものと考えられた。そこで、このようなAhレセプターの活性化に関与している因子を探索するために、Ahレセプターと結合する蛋白質因子を、蛋白質-蛋白質相互作用を用いた方法により検討し、45kDa(p45)の蛋白質因子が結合することを示した。さらに、p45をマウス肝臓抽出液より精製し、トリプシン消化したp45の部分アミノ酸配列を決定した。この配列をもとに、オリゴヌクレオチドの配列を合成し、PCR法によるp45の遺伝子クローニングを進めている。
オリゴシランとポルフィリンを含むσ-π共役化合物の構築

本研究ではポルフィリンとオリゴシランを連結する手法を開発した.すなわち,メソ位に臭素基を有するポルフィリンと過剰量のα,ω-ジエチニルオリゴシランとの根岸カップリングを試みたところ,アセチレンをリンカーとしてポルフィリンとオリゴシランが連結された分子が,70%程度の収率で得られた.ここで得られる生成物は,ポルフィリン・オリゴシランの先に末端アセチレンを有しており,さらにメソ位に臭素基を有するポルフィリンとの薗頭カップリングを行うことで,二つのポルフィリンがオリゴシランを介して連結された化合物を合成することができた.この手法では,それぞれ異なる構造を有する二つのポルフィリンを連結することが可能である.また,密度汎関数計算により,今回合成された分子ではσ,π-共役系が効果的にのびていることが確認された.二段階目の薗頭カップリングにおいて,ポルフィリンの代わりにヨードベンズアルデヒドを用いることで,末端にアルデヒド基を有する分子の合成に成功した.この分子とN-メチルグリシン,[60]フラーレンの混合物をトルエン中加熱したところ,ポルフィリン・オリゴシラン・フラーレン連結分子が60%程度の収率で得られた.今回開発した手法は種々の構造を有するオリゴシランに対して適用可能であると考えられ,今後合成した化合物群の物理的性質を測定することでσ,π-共役系に関する新たな知見が得られるものと期待される.本研究ではポルフィリンとオリゴシランを連結する手法を開発した.すなわち,メソ位に臭素基を有するポルフィリンと過剰量のα,ω-ジエチニルオリゴシランとの根岸カップリングを試みたところ,アセチレンをリンカーとしてポルフィリンとオリゴシランが連結された分子が,70%程度の収率で得られた.ここで得られる生成物は,ポルフィリン・オリゴシランの先に末端アセチレンを有しており,さらにメソ位に臭素基を有するポルフィリンとの薗頭カップリングを行うことで,二つのポルフィリンがオリゴシランを介して連結された化合物を合成することができた.この手法では,それぞれ異なる構造を有する二つのポルフィリンを連結することが可能である.また,密度汎関数計算により,今回合成された分子ではσ,π-共役系が効果的にのびていることが確認された.二段階目の薗頭カップリングにおいて,ポルフィリンの代わりにヨードベンズアルデヒドを用いることで,末端にアルデヒド基を有する分子の合成に成功した.この分子とN-メチルグリシン,[60]フラーレンの混合物をトルエン中加熱したところ,ポルフィリン・オリゴシラン・フラーレン連結分子が60%程度の収率で得られた.今回開発した手法は種々の構造を有するオリゴシランに対して適用可能であると考えられ,今後合成した化合物群の物理的性質を測定することでσ,π-共役系に関する新たな知見が得られるものと期待される.
NMR用超高圧DAC装置の開発と圧力誘起分子性金属状態の研究

DAC-NMRの予備実験として、極微小NMR用受信コイル(外径300μm、高さ250μm、線径25μm)を作製し、非金属ガスケヅトの圧力空間内にコイルをセットして、常圧下で信号観測を試みた。試料には、NMR信号強度の大きな遷移金属化合物LiV_2O_4、有機化合物NDMAPなどを用いた。現在までに、強磁場下でNDMAPの水素(H)の信号観測に成功している。また、10GPa以上の圧力発生のためにはコイルをさらに小さくする必要があり、線径15μmの極微細銅線作製を入手して種々のNMRコイルを作製して予備実験を重ねている。線径が細いため加圧時の断線が頻発しており、試料空間内のコイルからいかにリード線を取り出すかが課題となっている。水素以外の種々の核に応用可能かどうかについても検証する必要があり、より広範囲の周波数、種々の試料でのNMR実験を行いたいと考えている。DAC-NMRの別のアプローチとして非金属ガスケット外にコイルを置く方式も検討中である。100GPa領域を念頭におく場合には、前段の方式では圧力発生に限界があるためである。問題は,試料充填率の著しい低下による、信号強度の著しい減少が予想される点にある。観測対象は限定されるが、この方式は将来のメガバール領域のNMR実験に道を開くものと考えている。DAC-NMRの予備実験として、極微小NMR用受信コイル(外径300μm、長さ250μm)を作製し、非金属ガスケットの圧力空間内にコイルをセットして、常圧下で信号観測を試みた。試料には、既知である遷移金属化合物LiV_2O_4、有機化合物NDMAPなどを用いた。しかしながら、10GPa以上の圧力発生のためには、さらにコイルを小さくする必要があり、その可能性を追求する予定である。また、水素以外の種々の核に応用可能かどうか検証する必要があり、より広範囲の周波数、種々の試料での予備実験を行う。
解像度非依存型動画像処理環境の開発と省電力プロセッシング

本研究では、通常の画像処理プログラミングで定義する必要のある画素という考え方を排除した新しいプログラミングパラダイムの提案を行った。その目的として以下の2点がある。(1)解像度非依存なプログラムとすることにより、解像度を実行中に変化させることを可能とする。従って、1フレームごとに解像度を変更することにより、計算必要量を動的に変動させることを可能とした。その結果他のプロセスによるCPU負荷が存在しても、1フレームを処理する際に十分な計算時間を確保することが可能となり、リアルタイムOSではない、通常OSでも疑似的なリアルタイム処理を実現した。(2)本来の認識処理に関係しない背景などの処理解像度を低下させることにより、計算必要量を減らすことが可能となり、結果的にCPUクロックを動的に制御することが可能となり、総電力量の低減を実現した。具体的には、まず動画像非依存型画像処理ライブラリRavioliを開発し、顔検出を含む種々の動画像アルゴリズムを実装し、記述の能力と処理速度の検討を行った。さらに、画像中の一部分を動的に選択し、その部分の解像度を変化させる解像度変更リフレクションモデルの検討も行うと同時に、解像度変更に対応した動画像ビューアの開発も行い、有効性を確認した。画像処理プログラムで広く重要視されている画素という考え方は、人間の脳内のパターン認識過程には存在しない。また人間は自分に危険がないときには、非常に雑な認識を行い、脳を休ませる一方、有用な場面(危険が近づくなど)で、脳をフル稼働させている。人間と計算機のパターン認識に於ける解像度の扱い方の違いへの疑問。この疑問が新しいプログラミングパラダイムへの着想の始まりである。この解像度を意識しないプログラミングパラダイムを画像処理に適用、以下の2種類のアプリケーションの適用について検討を行った。まず擬似実時間動画像処理環境およびストリーミングAPIの開発を行う。さらに、開発したストリーミングAPIを元に、動画像処理に於ける省電力プロセッシングアーキテクチャの提案も行う。18年度は以下の点について検討を行った。1.解像度非依存動画像処理用STLの仕様検討:既に提案されている2次元画像処理用のSTLの仕様を調査した後時間軸を加えた動画像処理に適したSTLの検討を行った。2.解像度非依存動画像処理記述言語の仕様検討:STLだけでは十分な動画像述能力を持った環境を提供することが困難であるため、C++言語を基本とした動画像処理への言語拡張を行った。
カルモデュリン依存性プロテインキナ-ゼIIの活性発現の調節

カルモデュリン依存性プロテインキナ-ゼII(キナ-ゼII)のαおよびβサブユニットのcDNAを培養細胞に導入し発現させ細胞内分布を調べ以下の結果を得た。(1)αとβサブユニットは,それぞれ単独でも酵素活性を示すこと,(2)両サブユニットの酵素学的性質は類似しているが,カルモデュリンに対する親和性と自己リン酸化したCa^<2+>非依存性酵素の安定性に差がみられた,(3)細胞内分布に違いがみられ,αサブユニットは細胞質と顆粒画分の両方に存在するが,βサブユニットは細胞質にほとんど存在せず,顆粒画分のみに存在する,(4)酵素が膜に結合することにより基質特異性が変化し,酵素活性の調節と細胞内での存在様式が密接に関係すると考えられる,(5)αとβサブユニットの構成比が細胞内分布と酵素活性の調節に重要であると考えられる。キナ-ゼIIの構造と機能の関係を明らかにするため酵素蛋白質を大量に得ることができるE.coliの発現系を用いて解析し以下の結果を得た。(1)E.coliの発現系によりαとβ両サブユニットは単独でも活性を示した。また簡単な操作で均一に精製された。(2)E.coliの酵素はラット脳のキナ-ゼIIと同様の酵素学的性質を示した。(3)キナ-ゼIIは触媒部位のみで十分な酵素活性を示した。(4)この活性はCa^<2+>とカルモデュリンに全く依存せず常に活性型であった,(5)カルモデュリン結合部位の欠失した変異酵素もCa^<2+>カルモデュリンに依存しないで酵素活性を示した。従ってカルモデュリン結合部位が明らかにされた,(6)自己リン酸化部位のThr286を他のアミノ酸に変異したものではCa^<2+>非依存性活性が出現しなかった。これらの結果からキナ-ゼIIの活性発現に関与する蛋白部分の構造が明らかとなった。キナ-ゼIIのcDNAを培養神経細胞に導入することに成功し,神経突起の伸展が促進される結果が得られており,キナ-ゼIIの作用との関係を解析している。
静電相互作用を利用した球状錯体内部へのアニオン集積とその反応

昨年度まで私は、高度な機能を持つポリアニオン分子としてDNAに着目し、自己集合性錯体表面へのDNAの集積、および相補DNA鎖の認識を達成してきた。一方、真核細胞内でDNAは、カチオン性タンパク質であるヒストンに巻きついて多段階に折りたたまれ、その構造と転写活性を制御されている。精密構造を有する人工ポリカチオン性ナノ粒子を用いてDNAを折りたたむことができれば、DNAの転写活性の精密制御を期待できるが、そのような例は知られていない。本年度私は、24価の正電荷を有する自己集合性球状錯体表面をさらに24本のカチオン性ペプチドで修飾し、48価もの正電荷を高密度に有する分子性ナノ粒子として利用することで、DNAの構造制御を試みた。折れ曲がりの外側に正味1価の正電荷を有する6残基のペプチド(Ac-Arg-Lys-Leu-Pro-Asp-Ala-)を連結した二座配位子とPd(II)イオンから、表面に24本のペプチド鎖を有する球状錯体を定量的に得た。錯体の構造は各種NMRの解析により同定した。得られた錯体は、直径3.5nmの単一の球状骨格上に+1.25nm^<-2>という高い表面電荷密度を有し、効率的なDNAの折りたたみが期待できる。4363塩基対の環状DNAであるプラスミドpBR322の水溶液(0.75ng・μL^<-1>)に対し、得られた錯体の希釈水溶液を、電荷比1:0.9となるように加え、室温で10分間静置することで、DNAと錯体の複合体形成を行った。複合体溶液10μLをマイカ基板上に滴下し、乾燥させた後AFM観察したところ、剛直なDNA鎖にカチオン性錯体がランダムに結合している様子が見られた。錯体の当量を電荷比1:9まで増加させると、直径40-50nmの均一な粒子が多数観測された。この粒子はそれぞれ1分子のDNAを含むと考えられる。以上のことから、カチオン性球状錯体によってDNA分子が中間的な状態を経てコンパクトに折りたたまれることがわかった。このようなDNAの段階的折りたたみ挙動はヒストン類似の特異なものであることから、DNAはポリカチオン性の錯体表面に巻きつくことによって折りたたまれたものと考えられる。本年度私は、球状錯体内部への種々の機能性アニオンの包接、および多機能性アニオンであるDNAの球状錯体表面への集積を行った。蛍光を持つπ共役系分子は、会合状態を取ることで特異な分光学的性質を発現することが知られている。4価のアニオンであるピレンテトラスルホン酸イオンのカチオン性球状錯体内部への包接を行い、NMRによりピレン誘導体が球状錯体に包接されたことを明らかにした。カチオン性錯体への包接によって、ピレン誘導体がパラジウムイオンの近傍にトラップされ、蛍光が完全に消光されることがわかった。カチオン性錯体を用いることで、≠共役系分子の蛍光をON-OFF制御することができた。また、様々な触媒活性を持つ無機アニオン性クラスターであるポリオキソメタレートを包接することにも成功した。31P核を観測核とする拡散係数測定により、球状錯体内部に集積したカチオン性官能基の効果によってポリオキソメタレートが包接されていることを明らかにした。さらに私は、高度な機能を持つポリアニオンであるDNAの集積を検討した。DNAは生命の遺伝情報を司るとともに、相補的な二重鎖を形成する性質を持つことから、近年材料分野で注目されている。DNAを集積するための第一段階として、錯体表面へのオリゴヌクレオチドの集積を行った。折れ曲がりの外側にチミン1残基、および2残基からなるオリゴヌクレオチドを連結した配位子を合成し、パラジウムイオンと錯形成させることで、表面に24本のオリゴヌクレオチド鎖を集積した錯体を得ることに成功した。錯体の構造は、各種NMRおよびコールドスプレーイオン化質量分析によって行うことができた。今後、さらに長鎖のDNAを集積することで、相補的DNA鎖の認識など、多様な機能を持つ材料の創製に繋がると考えられる。私は昨年度より、高い機能性を有するアニオン性分子としてDNAに着目し、その集積化を行うことを考えて研究を立ち上げた。近年、金ナノ粒子の表面にDNAを修飾することで、相補的なDNA鎖の認識や結晶性材料の合成を行う研究が注目されているが、ナノ粒子の大きさや表面に修飾されるDNAの数を精密に制御できないという問題がある。厳密に構造制御されたナノ粒子の表面を定まった数のDNAで被覆できれば、その認識能を精密制御することができる。そこで私は、球状錯体の自己集合を利用すれば、一義的な骨格を持つナノ粒子の表面に決まった数のDNA鎖を集積することが可能になると考えた。折れ曲がり型配位子の外面にDNA鎖を連結し、パラジウム(II)イオンと錯形成させることにより、直径3.5nmの球状錯体表面を24本のDNA鎖で被覆できる。昨年度私は、表面に1塩基、2塩基のオリゴチミジンを24本集積した球状錯体の構築に成功している。今年度はまず、錯体表面でのさらに強い分子認識を目指し、3塩基のオリゴヌクレオチドを集積した球状錯体の構築を行った。

折れ曲がり配位子の外側にチミン3塩基からなるオリゴヌクレオチドを導入した配位子を合成し、パラジウム(II)イオンと錯形成させることで、目的の球状錯体を構築することができた。その構造は、1H NMRおよびDOSY NMR測定により明らかにした。これまでの成果により、表面に1-3塩基のオリゴチミジンを24本集積した球状錯体を得ることができた。そこで、得られた3種類の錯体を用いて、相補配列であるオリゴアデノシンの配列認識を試みた。チミン3塩基の錯体に対して、アデニン3塩基のトリヌクレオチドをDMSO:CHC13=2:1の条件下加えたところ、チミンとアデニンの間に水素結合対が形成されていることが1H NMRによる解析によってわかった。チミン1塩基、2塩基の場合にはこの条件では水素結合対の形成は見られなかったことから、オリゴヌクレオチドを伸長することによって配列認識能が向上したことがわかった。極性の低いDMSO:CHC13=4:1の条件下では、1塩基、2塩基の錯体においても弱いながら水素結合対の形成が見られた。さらにこの条件下、チミンに対するミスマッチ塩基であるシトシン、グアニンの誘導体をチミン1塩基の球状錯体に対してそれぞれ加えたところ、水素結合対の形成はほとんど見られなかった。したがって、この錯体は相補塩基を選択的に認識して水素結合を形成することが明らかになった。昨年度まで私は、高度な機能を持つポリアニオン分子としてDNAに着目し、自己集合性錯体表面へのDNAの集積、および相補DNA鎖の認識を達成してきた。一方、真核細胞内でDNAは、カチオン性タンパク質であるヒストンに巻きついて多段階に折りたたまれ、その構造と転写活性を制御されている。精密構造を有する人工ポリカチオン性ナノ粒子を用いてDNAを折りたたむことができれば、DNAの転写活性の精密制御を期待できるが、そのような例は知られていない。本年度私は、24価の正電荷を有する自己集合性球状錯体表面をさらに24本のカチオン性ペプチドで修飾し、48価もの正電荷を高密度に有する分子性ナノ粒子として利用することで、DNAの構造制御を試みた。折れ曲がりの外側に正味1価の正電荷を有する6残基のペプチド(Ac-Arg-Lys-Leu-Pro-Asp-Ala-)を連結した二座配位子とPd(II)イオンから、表面に24本のペプチド鎖を有する球状錯体を定量的に得た。錯体の構造は各種NMRの解析により同定した。得られた錯体は、直径3.5nmの単一の球状骨格上に+1.25nm^<-2>という高い表面電荷密度を有し、効率的なDNAの折りたたみが期待できる。4363塩基対の環状DNAであるプラスミドpBR322の水溶液(0.75ng・μL^<-1>)に対し、得られた錯体の希釈水溶液を、電荷比1:0.9となるように加え、室温で10分間静置することで、DNAと錯体の複合体形成を行った。複合体溶液10μLをマイカ基板上に滴下し、乾燥させた後AFM観察したところ、剛直なDNA鎖にカチオン性錯体がランダムに結合している様子が見られた。錯体の当量を電荷比1:9まで増加させると、直径40-50nmの均一な粒子が多数観測された。この粒子はそれぞれ1分子のDNAを含むと考えられる。以上のことから、カチオン性球状錯体によってDNA分子が中間的な状態を経てコンパクトに折りたたまれることがわかった。このようなDNAの段階的折りたたみ挙動はヒストン類似の特異なものであることから、DNAはポリカチオン性の錯体表面に巻きつくことによって折りたたまれたものと考えられる。
不確かな入出力データに基づくシステム同定に関する研究

本研究では,つぎに列挙する3種類のシステム同定法について検討した。(1)センサの静的な非線形性を制約条件とする非線形システム同定問題を「制約つき最適化問題」に帰着させる方法(2)センサ特性と対象システム全体を「区分的線形システム(Piece-wise affine system)」というハイブリッドシステムとみなして,ハイブリッドモデリング法を適用する方法(3)非線形システムの状態推定法として提案された「無香料カルマンフィルタ(Ullscented Kalman filter : UKF)」を非線形システム同定問題に適用できるように修正する方法そして,これらの不確かな入出カデータに基づくシステム同定法の性能を調べ,新たな改善点を探った。具体的には以下に列挙する結果が得られた。(1)提案した非線形システム同定法を,自動車エンジンの触媒システムの同定問題に適用し,ダイハツ工業から提供していただいた実験データを通して,その有効性を明らかにした。(2)ハイブリッドシステム同定法を自動車のドライバモデルの構築問題に適用し,その有効性を自動車のシミュレータを用いて検証した。また,ハードディスクのモデリング問題へもハイブリッド同定法を適用し,その性能評価を行った。(3)数値実験を通して,無香料カルマンフィルタの設定パラメータの選定法などについて検討した。(1)不確かな入出力データに基づくシステム同定に関する理論研究:非線形なセンサを有する非線形システムの同定問題に対して,以下に示す3つの方法の適用検討を行った。1.センサの静的な非線形特性を制約条件として,非線形システム同定問題を「制約つき最適化問題」に帰着させる方法2.センサ特性と対象システム全体を「区分的線形システム」というハイブリッドシステムと見なして,ハイブリッドシステムのモデリング法を適用する方法3.非線形システムの状態推定法として提案された無香料カルマンフィルタ(Unscented Kalman Filter:UKF)を非線形システム同定問題に適用できるように修正する方法(2)不確かな入出力データに基づくシステム同定法の実データへの適用:(1)で検討した不確かな入出力データに基づくシステム同定法の性能を調べ,また新たな改善点を探るために実データへの適用を行った。具体的な実データとして,従来から協力関係にあるダイハツ工業からエンジン制御に関する触媒データを提供してもらい,そのデータに対して(1)-1の制約つき最適化法を適用した。その結果,実データの場合,数値実験のような高精度な同定結果が得られないことが明らかになった。対象とした実システムにはセンサの非線形性と対象の非線形性の二つが存在したからである。この点については,次年度,検討を進める予定である。前年度,つぎに列挙する3つのシステム同定法について検討した。1.センサの静的な非線形性を制約条件として,非線形システム同定問題を「制約つき最適化問題」に帰着させる方法2.センサ特性と対象システム全体を「区分的線形システム」というハイブリッドシステムとみなして,ハイブリッドモデリング法を適用する方法3.非線形システムの状態推定法として提案された「無香料カルマンフィルタ」を非線形システム同定問題に適用できるように修正する方法本年度は,これらの不確かな入出力データに基づくシステム同定法の性能を調べ,また新たな改善点を探った。1.のアプローチでは,提案した非線形システムの同定法を,自動車のエンジンの触媒システムの同定問題に適用し,ダイハツ工業から提供していただいた実験データを用いて,その有効性を明らかにした。2.のハイブリッド同定法を自動車のドライバモデルの構築問題に適用し,その有効性を自動車のシミュレータを用いて検証した。3.の無香料カルマンフィルタについては,数値実験を通して,設定パラメータの選定法などについて検討した。
近世国文学資料のための解題目録を開発する研究

近世文学関係資料の解題は、例えば西鶴本とか馬琴読本等を例外として、多くの成果を見てはいない。対象が広範囲にわたること、関連分野が多様であることなどが、大きな理由であろう。今回、その解題目録を開発する研究に研究材料として用いた、実践女子大学図書館の旧近世文学研究室本は、授業時に使用し、雑な扱いを受けるとの想定のもとに集められた、いわゆる雑本の集積であって、各種の問題点を提供してくれた。その概略を示せば、第一に、雑本であり、無名な作であるからこそ、解題が必要である、ということである。大量かつ多種にわたる作品は、近世文学研究の専門家といえども実物に接する機会を得ることが少なく、熟知の範囲外であることは珍しくない。第二に、それゆえ、書誌解題の記述に終わるべからざること、である。従来の近世文学資料の目録は、書誌事項の略述で済まされることが多かった。識者よろしく賢察せよ、との態度である。しかし、第一に述べた理由、および、専門分化の進行に伴い、それでは目録の役目を果しにくいのが現状である。第三に、図影が長文の解説に優ること、である。とくに版本において問題になる改竄の実体、求版・覆刻の別など、一目瞭然であろう。本研究に基づき、次に行うべきは、調査の書誌カードを利用しての、目録化であろう。当該目録にあっては、書誌解題に作品解題を併せることが基本にしなる。ただし、いわゆる雑本にくだくだしい記述は、なじまない。参考文献の提出、あるいは『国書総目録』『古典文学辞典』等の参照ページを添えることによって、代替することが可能になろう。そして、これは図書館当局との交渉を必要とすることがらであるが、その公刊を期すことにしたい。ここに、あえて付言したいことがある。それは、調査の補助に携わった学生が、この集書に新鮮な感動を示したことである。近世文化の遺産が次代に継承される手ごたえを感じえたことは、望外の喜びであった。
高い抗凝血活性を発現する合成多糖を用いた抗血栓性材料の合成

天然多糖ヘパリンは血液中のアンチトロンビンIVと結合することによってその活性(抗凝血活性)を高める.ヘパリン類似物質であるヘパリノイドではいくつかの凝血因子と作用してて抗凝血活性を示す.その際に,ヘパリン中,あるいはヘパリノイド中の6位の硫酸エステル基が大きく寄与している.本研究では,ペントースのポリマーであるキシロフラナン(6位がない)に,マンノースの板をつけた硫酸化多糖を合成した.分枝反応の際,溶媒(クロロベンゼン)への溶解性が重要となってくるが, 2種の異なる保護基を有するモノマーの共重合によって解決した.すなわち, t-ブチルジメチルシリル化した1,4-無水キシロースとベンジル化した1,4-無水キシロースの共重合によって得られた(1→5)-α-キシロフラナンコポリマーを,フッ素イオンを用いてシリル基のみを選択的に脱保護した.部分脱保護されたコポリマーは22%のフリーの水酸基を有しクロロベンゼンに溶解したので,マンノースのオルソエステルと反応させて分枝反応を行った後,脱保護してマンノース分枝キシロフラナンを得た.さらにDMSO中のピペリジン硫酸により,主鎖の切断を極力おさえて硫酸化を行うと, 50unit/mgという高い抗凝血活性を有するヘパリノイドが得られた.直鎖状(分枝していない)硫酸化キシロフラナンの活性は28unit/mgであり,ヘキソース分枝が大きく影響していることが分かった.一方,合成によって得られた(1→6)-α-D-グルコピラナン誘導体の3位のみを選択的に脱保護し,マンノースを分枝させたマンノシル化合成デキストランは,硫酸化することによって100unit/mgという極めて高い活性を示した.この活性は今までに報告されたどのヘパリノイドよりも高いものである.このように,ヘキソースであるマンノースを分枝したポリサッカライドを硫酸化することによって,本研究の目的である高い抗凝血活性を有するヘパリノイドを合成した.天然多糖ヘパリンは血液中のアンチトロンビンIVと結合することによってその活性(抗凝血活性)を高める.ヘパリン類似物質であるヘパリノイドではいくつかの凝血因子と作用してて抗凝血活性を示す.その際に,ヘパリン中,あるいはヘパリノイド中の6位の硫酸エステル基が大きく寄与している.本研究では,ペントースのポリマーであるキシロフラナン(6位がない)に,マンノースの板をつけた硫酸化多糖を合成した.分枝反応の際,溶媒(クロロベンゼン)への溶解性が重要となってくるが, 2種の異なる保護基を有するモノマーの共重合によって解決した.すなわち, t-ブチルジメチルシリル化した1,4-無水キシロースとベンジル化した1,4-無水キシロースの共重合によって得られた(1→5)-α-キシロフラナンコポリマーを,フッ素イオンを用いてシリル基のみを選択的に脱保護した.部分脱保護されたコポリマーは22%のフリーの水酸基を有しクロロベンゼンに溶解したので,マンノースのオルソエステルと反応させて分枝反応を行った後,脱保護してマンノース分枝キシロフラナンを得た.さらにDMSO中のピペリジン硫酸により,主鎖の切断を極力おさえて硫酸化を行うと, 50unit/mgという高い抗凝血活性を有するヘパリノイドが得られた.直鎖状(分枝していない)硫酸化キシロフラナンの活性は28unit/mgであり,ヘキソース分枝が大きく影響していることが分かった.一方,合成によって得られた(1→6)-α-D-グルコピラナン誘導体の3位のみを選択的に脱保護し,マンノースを分枝させたマンノシル化合成デキストランは,硫酸化することによって100unit/mgという極めて高い活性を示した.この活性は今までに報告されたどのヘパリノイドよりも高いものである.このように,ヘキソースであるマンノースを分枝したポリサッカライドを硫酸化することによって,本研究の目的である高い抗凝血活性を有するヘパリノイドを合成した.
ＤＮＡ鋳型ナノワイヤを利用した血液検査デバイスの開発

DNAを金属被覆することでナノワイヤを形成する技術を確立し、その電気的特性を評価した。まず、ナノチャネル中の微小電極間に単分子DNAを伸長固定し、これを金属被覆することで単一ナノワイヤを形成した。次に、1本鎖DNAを金属被覆せずに、2本鎖DNAのみを特異的に金属被覆できることを実証した。さらに、部分的に金属被覆したDNAを利用してDNA分解酵素を測定する技術を構築した。そして、マイクロ流路中での毛細管力を利用して全血から血漿のみを迅速かつ簡便に抽出し、流路中でタンパク質を検出する技術を構築した。DNAを鋳型として金属ナノワイヤを形成する技術を確立し、その電気的特性を評価した。まず、ガラス基板上に間隔15μmだけ隔てて2つのAu薄膜電極を形成し、その上にPDMS製のマイクロ流路を構築した。蛍光色素Hoechst 33258によって長さ16μmのλDNAを標識し、その混合溶液を流路内に満たした。そして、電極間に1MHz、20Vの交流電圧を印加することで、λDNAを電界方向に伸長させるとともに電極上へ静電的に固定化し、これを蛍光観察により確認した。次に、ナフタレンジイミドの両末端に還元基を有するインターカレータを流路内に導入し、ナフタレンジイミドをDNAの2本鎖間に挿入して、還元基をDKA表面に配置した。最後に、銀イオンを含むトレンス試薬を導入することで、還元基によりDNA近傍の銀イオンを還元し、銀をDNA表面に析出させた。SEM観察により、電極間に直径50nm程度のナノワイヤが複数形成されていることを確認した。ナノワイヤの電流-電圧特性を計測したところ、それらが非線形な関係を有することが分かった。また、流路幅を変更することでナノワイヤの本数を変更し、本数と電気抵抗の関係を求めた。そして、交流インピーダンス法により複素インピーダンスプロットを描き、これからナノワイヤの等価回路を推定した。さらに、微量血液から血漿を抽出するために、1本の主流路(幅2mm×深さ100μm)の側面最上部から多数の側流路(幅5μm×深さ2μm)が分岐した構造のデバイスを製作した。主流路入口に血液10μLを滴下し、毛細管力により主流路内に血液を導入した。主流路内で重力により血球がわずかに沈降することで、即座に血漿が側流路内に導入された。これにより、無希釈の微量な全血から血漿のみを簡便かつ高速に抽出することが可能となった。本研究で用いるDNA鋳型ナノワイヤ形成法は、ナフタレンジイミドの両末端に還元基を有するインターカレータをDNAの2本鎖間に挿入することで還元基をDNAに沿って配列させ、その後にDNAの近傍で銀イオンを還元することでDNAを金属被覆するものである。したがって、本手法によれば、1本鎖DNAを金属被覆せずに、2本鎖DNAのみを特異的に金属被覆することができるはずである。これを実証するために、以下のようにして、同じ鎖長(約2μm)の1本鎖と2本鎖のDNAに対して金属被覆処理を行い、インピーダンス評価とAFM観察を行った。まず、ガラス基板上に1μmの間隔を持ったAu電極を作製し、マイクロ流路を用いてDNA溶液を電極間に導入し交流電圧を印加することで電極間にDNAを伸長固定した。そして、金属被覆処理を行った後に、1本鎖と2本鎖の処理前後の交流インピーダンスを評価した。その結果、いずれも処理前には大きな抵抗成分とコンデンサ成分が見られたが、処理後には1本鎖の特性に変化が無かったのに対して、2本鎖の場合にはコンデンサ成分が消失し、抵抗値が10000分の1に減少した。次に、予め還元剤と混合したDNA溶液をマイカ基板上にスピンコートすることで、メニスカス力を利用してDNAを基板上に伸長固定し、その後に銀イオンを含むトレンス試薬を滴下することで金属被覆処理を行った。処理前後の1本鎖と2本鎖の外径をAFMにより計測したところ、2本鎖では約2nmから2040nmに増大し、1本鎖では変化が見られなかった。さらに、DNA鋳型ナノワイヤの金属表面における局在表面プラズモン共鳴を血中タンパク質検出に応用することを想定して、マイクロ流路中に固定化した金ナノ粒子表面への抗体固定化法の最適化などを行い、実際にタンパク質の検出が可能であることを実験により示した。DNA鋳型ナノワイヤ1本の電気的特性を評価するために、ナノチャネル中の微小電極間に単分子DNAを伸長固定し、これを金属被覆することで単一ナノワイヤを形成した。まず、集束イオンビームを用いてシリコン基板上に幅500nmのナノチャネルを構築した後に、2つの金電極を間隔15μmで形成し、その上にPDMS製のマイクロ流路を配置した。

マイクロ流路内にλDNA溶液を導入し、毛細管力により単分子DNAをナノチャネル中に進入させた。そして、電極間に1MHz、振幅10Vの交流電圧を印加することで、DNAを電界方向へ伸長させるとともに電極上へ静電的に固定化した。次に、ナフタレンジイミドの両末端に還元基を有するインターカレータを流路内に導入し、ナフタレンジイミドをDNAの2本鎖間に挿入して、還元基をDNA表面に配置した。最後に、銀イオンを含むトレンス試薬を導入することで、還元基によりDNA近傍の銀イオンを還元し、銀をDNA表面に析出させた。SEM観察により、ナノチャネル中に直径2040nm程度の単一の銀ナノワイヤが形成されており、ナノワイヤがバルク銀を数珠つなぎにした構造を成していることが分かった。そして、交流インピーダンス法により得られた複素インピーダンスプロットをもとに、ナノワイヤの等価回路を推定した。等価回路は、析出したバルク銀の抵抗約17Ωと、バルク間の接触抵抗と容量成分から成るRC並列回路との直列接続で表現された。さらに、マイクロ流路中の電極間に長さ2μmの1本鎖DNAと2本鎖DNAをそれぞれ別々に伸長固定し、同条件で還元基と銀イオンを導入して、2本鎖DNAのみが金属被覆されることを確認した。長さ2μmの1本鎖DNAの中央部に相補的なプライマーをハイブリダイゼーションさせることで1本鎖と2本鎖が複合したDNAを形成し、スピンコートを用いてマイカ基板上に伸長固定した。そして、両末端に還元基を有するナフタレンジイミドを2本鎖間に挿入し、還元基を2本鎖DNAの周囲のみに配列させた。次に、銀イオンを含むトレンス試薬を導入し、2本鎖DNA近傍の銀イオンを還元することで、銀を2本鎖DNAの表面のみに析出させ、DNAを部位特異的に金属被覆した。AFMによりこれを観察したところ、1本鎖部の外径は約1.5nmであり金属被覆操作後に大きな変化が見られなかったのに対して、2本鎖部は金属被覆操作後に約5nmまで太くなっていることが分かった。ガラス基板上に間隔1μmの1組の金電極を作製し、1本鎖/2本鎖DNA複合体を静電配向により電極間に伸長固定した。次に、上記の方法を用いて、DNAを部位特異的に金属被覆した。金属被覆前後の電極間のインピーダンスを周波数100Hz10MHzの範囲で計測し複素平面上にプロットしたところ、金属被覆によりDNAのインピーダンスが低下していることが分かった。電極間の等価回路を導出し、インピーダンス減少率を定量的に評価した。金属被覆DNAを用いて、心筋梗塞などの診断マーカであるDNA分解酵素(DNase)の測定を行った。マイクロ流路内の電極間に複数本のDNAを伸長固定した後にDNase溶液を導入し反応させると、1本鎖部が切断され電極から剥離し本数が減少する。これに伴う電極間のインピーダンスの増加率からDNase濃度を定量化できる。この時、DNAを部分的に金属被覆することで、切断前のインピーダンスが小さくなり切断前後のインピーダンス変化が大きくなるため、高感度化を期待できる。実際に、DNase濃度と電極間のインピーダンス増加率に正の相関があることを実証した。26年度が最終年度であるため、記入しない。バイオマイクロデバイス26年度が最終年度であるため、記入しない。交付申請書の研究実施計画に記載したDNA鋳型ナノワイヤの形成方法の構築、ナノワイヤの電気的特性評価、血漿抽出デバイスの構築など、全ての計画内容を実施し、当初目標としていた成果を得ることができたため。
家族ストレスと適応に関する研究-自然災害の場合-

前年度の三宅島阿古地区の調査に続いて、平成元年7月に長野県王滝村における昭和59年の地震の被災世帯の一斉調査を実施した。これは昭和59年に松岡英子が実施した第一次調査の反復という側面を有すると同時に、三宅島調査と極力項目を重ね合わせることによって、両地域の比較が可能となるように工夫されたものである。その結果、第一次調査を完了した264世帯のうち、227世帯について面接と留置きの双方からなる調査票が回収され、第一次調査の結果と接合した長期反復調査のデ-タセットを作成することができた。三宅島との比較でみると、王滝村の地震災害では、村外者を含め20数名の死亡者がでたことが大きな違いである。これは復元不能な損傷を当該家族に与える打撃であった。こうした世帯について事例的な分析を実施中であるが、危機の深刻化およびそこからの回復過程については、家族によって大きな開きのあることが分かる。災害による家族員の喪失にとどまらず、その後にも困難な課題が累積されたケ-スで回復の遅れと不適応がみられ、他方、結婚による息子の妻の加入、それに続く孫の誕生といったプラスの変化を経た家族では急速な再適応が認められる。また住宅については、三宅島のような大量埋設ではなかったので、住宅再建、移転、借金返済、コミュニティの再編といった困難は最小限に押えられた。しかし、応急修理で居住継続した世帯も多いため、住生活の質は低下したまま残り、問題が先送りされた面もある。三宅島についても若干の補充聞きとり等を実施して、報告書をとりまとめるべく、目下両地区のデ-タの解析を続行中である。1.本研究は地震(王滝村)と火山噴火(三宅島)という大きな自然災害を受けた地域の家族について、既に被災後1年余りたった時点で実施した調査を踏まえて、さらにその後の長期的な回復・適応過程を捉えようとする所に特色がある。ただし両地区での前回調査は共に家族ストレス論としての問題関心をもってはいたが、全く別個に行なわれたものであった。今回両地域の再調査を行なうに当たって、それぞれ前回調査とのつながりをどう保つかが課題となるが、合わせて地域性(山村と離島)と災害の種類(地震と火山噴火)を異にする二つの対象地域を比較する視点をどのように具体化するかについて検討する研究会を続けた。またそのために、前回調査のデータの再加工などの作業も組み込まれた。2.王滝村については主に信州大学のグループが担当したが、現地の状況と学生調査員の動員態勢の都合から大量調査は次年度にまわすこととし、前回調査のデータの再分析を踏まえて、夏以降数回にわたって比較的、少数例についてインテンシブな聴きとり調査を行ない、合計70ケースほどのデータを収集した。被災後4年間の生活再建過程は、全体としては順調であるものの、一部になお大きな困難をきたしているケースが認められた。3.三宅島については都立大をはじめ在京グループが主に担当し、前回調査以来協力関係にある東京都精神医学総合研究所のチームに合流する形で調査体制が組まれた。現地は噴火直後から政治問題化した空港(米軍機訓練場)問題が争点となる村長選挙の年に当たったため、調査時期を予定より遅らせて実施せざるをえなかった。その結果、昭和58年の噴火災害を経験した全世帯を対象としたうち330ケースほどのデータを得ることができた(回収率8割)。目下データをコンピュータ集計に掛けるための準備作業中である。
軟骨および骨形成における低分子量Gタンパク質、Rhoファミリーの役割

低分子量Gタンパク質の一つRacのconstitutively active体(L61Rac)を遺伝子導入したトランスジェニック(Tg)マウスを作製し、Racの活性化が骨代謝環境に与える影響について検討した。その結果、L61Rac Tgマウスでは幼若化した骨芽細胞の増加と類骨に異常が認められ、骨量が減少していた。よって、Racの活性化は骨芽細胞の成熟を抑制する可能性が示唆された。これまでに骨芽細胞のRhoファミリー分子(Rac、Cdc42, RhoA)機能を抑制することにより、細胞分化・骨形成機能に多大な影響を及ぼすことを明らかにしてきた。本研究では、Rhoファミリー分手の機能亢進による軟膏、骨芽細胞分化、それぞれの機能への影響を検討することを目的としている。本年度は、Racを骨芽細胞内で特異的に発現するトランスジェニックマウス(tgマウス)を作製し、Rhoファミリー機能亢進、特にRacの機能亢進よる細胞分化・骨形成機能への影響を検討した。骨塩量・密度の測定p-QCT骨密度測定装置を用いた大腿骨の形態単的変化の解析では、野生型(wt)マウスに比べ、tgマウスで有意に骨密度の減少が認められた。この骨密度の減少は海綿骨および皮質骨両方の減少によるものであった。本傾向は骨形態計測においても同様に認められた。骨芽細胞分化マーカーの解析骨芽細胞の分布および分化状態をべるために、in situハイブリダイゼーション法、ノザンハイブリッド法を用いて検討した。その結果、tgマウスとwtマウスで骨芽細胞の骨内での分布には変化はないが、tgマウスで明らかに骨芽細胞の分化が抑制されていた。発現マーカーのmRNA発現量はオステオポンチンの発現量がtgマウスでwtマウスに比べ亢進していた。これまで、そして本検討結果より、骨芽細胞でRac分子の機能亢進、低下いずれにおいでも、骨量の低下を誘導することが示唆された。しかしながら、骨形態がらみた表現系は明らかに異なっており、今後さらに検討を要する。骨形成関連細胞のRhoファミリー分子による破骨細胞の細胞分化・骨吸収作用への影響:Type1コラーゲンプロモーターを用いて、Rhoファミリー分子の一つであるRac1を骨芽細胞特異的に強発現させたトランスジェニックマウス(CA Rac Tgマウス)の破骨細胞機能への影響を検討するため、RANKLとOPGのmRNA発現量をRT-PCR法にて測定した。その結果、野生型マウスに比べ、RANKLの上昇とOPGの低下傾向が認められた。しかしながら、個体間のばらつきが大きく有意差を認めなかった.次年度、再度検討を行う。生体内における骨芽細胞の走化性への影響:骨芽細胞においてRacが走化性機能ヘ与える影響を検討するため、細胞の集積と走化性が必要とされる条件として、CA Rac Tgマウスに骨折術を施し、骨折治癒能への影響を検討した。その結果、野生型マウスに比べ、CA Rac Tgマウスでは、明らかに骨の融合が遅延しており、Rac機能の上昇が細胞走化性の低下と骨形成に影響を与えることが示唆された。軟骨形成におけるRhoファミリーの役割:軟骨細胞ATDC5にRhoファミリー(Rac1、Cdc42、RhoA)それぞれのconstitutively active体およびdominant negative体を遺伝子導入し、それぞれの遺伝子が安定発現する細胞を作成した。次年度これらを利用し細胞分化能、軟骨形成能について検討を行う。細胞分化能について:軟骨分化能に対するRhoファミリーの役割を検討するため、軟骨分化マーカーとして知られているType IIコラーゲン、Type Xコラーゲンの発現について、ノザンブロット法を用いて検討した。その結果、mock体に比べ、全てのdn体では両コラーゲンの発現が亢進していた。その中で特にdo-Rac1で強い発現が認められた。一方でca体では変化は認められなかった。軟骨形成について:軟骨形成能について検討するため、各安定発現細胞のプロテオグリカン生成量について測定を行った。その結果、mock体に比べ、全てのdn体で有意にプロテオグリカン量の上昇が認められた。特にdo-Rac1が最も上昇を示した。また、ca体では有意な差は認められなかった。研究代表者は、これまでに骨芽細胞のRhoファミリーの役割について検討し、in vitro条件下、Rhoファミリーの活性化が骨形成に対し変化を認めず、不活性化が促進的に作用することを示してきた。今回の結果により、軟骨細胞においてもin vitro条件下では同様の結果が得られることが示唆された。