hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
12誘導心電図伝送システムが急性心筋梗塞診療に及ぼす影響に関する研究

導入前後でのAMI救急医療の変化に関する検討を発症から救急隊到着までの時間、病院までの搬送時間、来院から再灌流までの時間、来院時心不全合併率、Peak CPK値、Primary PCI施行率、院内死亡率といったパラメーターの変化をみることによって行う。2015年2016年のデータを用いて解析を行った結果、プレホスピタル12誘導心電図を施行された患者の特徴としてST上昇型心筋梗塞の割合が多いことや来院時に心不全合併例が多い傾向にあることが明らかになった。また、プレホスピタル12誘導開始後に救急隊現場到着から病院搬送までの時間は延長させずに、来院から再灌流までの時間の短縮を認めた。2017年度は2015年から2016年までのデータをもとにプレホスピタル12誘導心電図の開始後の救急医療体制の変化について解析を行うとともに2017年分のデータを追加するためのデータのクリーンアップを行っており、本年度に2015年2017年分のデータ解析を行うことが可能であると考えられるため。救急隊が急性心筋梗塞(AMI)患者のもとに到着した際に12誘導心電図を施行し医療機関に伝送する「プレホスピタル12誘導心電図」によって、来院から再灌流までの時間(Door to balloon time;D2BT)が短縮することが報告されており、宮城県においても2015年6月1日より大崎・仙南地域で導入されたが、本邦においてその効果を詳細に検討した研究はこれまでに認めないことから、本研究では宮城県内で発症した急性心筋梗塞のほぼ全例を35年以上前向き登録している「宮城県心筋梗塞対策協議会」のデータベースを用いて、プレホスピタル12誘導心電図の導入がAMI救急医療に及ぼす影響について検討した。2015年2017年のデータを用いて解析を行った結果、システム導入開始から経年的に伝送使用率の上昇を認めていた(2015年:23.1%、2016年:39.3%、2017年:52.1%)。プレホスピタル12誘導心電図施行患者は未施行例と比較して、ST上昇型心筋梗塞(STEMI)の割合が有意に多く(76.9% vs. 65.7%, P=0.03)、急性期再灌流療法であるPrimary PCI施行率が高い傾向であった(93.8% vs. 87.4%, P=0.06)が、院内死亡率には有意な差を認めなかった(7.7% vs. 8.0%, P=0.36)。また、年齢、性別、冠危険因子の罹患率に差は認めなかった。プレホスピタル12誘導心電図施行例は未施行例と比較して救急隊現場到着から病院搬送までの時間は延長させずに(34分vs. 35分, P=0.51)、D2BT短縮を認めていたが(101分vs. 118分, P=0.005)、STEMIと非STEMI症例に分けるとSTEMI症例でのみD2BTを認めた(STEMI:98分vs 115分、非STEMI:125分vs 126分)2016年5月以降の症例登録を重ねることでさらに詳細な解析を行っていく予定である。2015年2017年分の「宮城県心筋梗塞対策協議会」のデータベースを用いて、プレホスピタル12誘導心電図の開始後の救急医療体制の変化について、導入開始時時期と慢性期での変化も含めた解析を行う。参加学会が近隣開催のみであり、当初予定していたよりも旅費を削減することができたため。海外学会参加が予定よりも少なかったため。次年度は、海外学会および国内学会での発表を複数回予定しており、繰り越し分と併せて執行する予定である。国内および海外学会へ積極的に参加して研究発表を行う予定であり、繰り越し分と併せて執行をする。
遺伝子トラップ法によるメタボリックシンドローム心血管合併症に対する治療戦略の開発

申請者らは、レトロウイルスを用いた遺伝子トラップ法を応用して、脂肪細胞の分化に関わる遺伝子を明らかにするシステムを開発した。その結果、これまでに機能不明の遺伝子を含む、多くの候補遺伝子を同定した。セロトニン産生の律速酵素であるtryptophan hydroxylase 1(TPH1)が変異を受けた前駆脂肪細胞が脂肪細胞に分化せず、セロトニン2A受容体拮抗薬において、生理的な脂肪細胞分化が阻害されることを確認した。さらに、TPH1欠損マウスにおいて高脂肪食を負荷した際に、脂肪細胞分化が起こらず、既存の脂肪細胞が肥大するために、より大きな脂肪細胞が生じることを認めた(投稿中)。また、上記の遺伝子トラップ法においてTGF-βのシグナル伝達を抑制するTG-interactingfactor(TGIF)も脂肪細胞分化に必要であることを見いだした。TGF-βはSmad2,3の活性化により脂肪細胞分化を抑制するが、その一方で脂肪細胞から分泌されることが知られている。そこで、脂肪細胞分化に際しては、何らかの因子がTGF-βに拮抗的にはたらくことが推察されてきた。我々は、インスリン刺激によるAktのリン酸化がTGIF蛋白の安定性を起こすこと、さらに、PPAR-γアゴニストによって転写と翻訳の亢進によりTGIFの発現レベルが上昇することを見いだした。またインスリンによってTGIFのDNA結合能も上昇した。以上のことにより、インスリン、PPAR-γ刺激によってTGF-βのシグナル伝達を抑制することが、脂肪細胞の分化に重要であることを見いだした(J Lipid Res. 2008;49:1224-34.Epub 2008 Feb 28)。申請者らは、レトロウイルスを用いた遺伝子トラップ法を応用して、脂肪細胞の分化を指標に、その原因遺伝子を明らかにするシステムを開発した。その結果、機能不明の遺伝子を含む、多くの候補遺伝子を同定しつつある。セロトニン産生の律速酵素であるtryptophan hydroxylase 1(TPH1)が変異を受けた前駆脂肪細胞が脂肪細胞に分化せず、セロトニンの2A受容体拮抗薬において、生理的な脂肪細胞分化が阻害されることを確認した。さらに、TPH1欠損マウスにおいて高脂肪食を負荷した際に、脂肪細胞分化が起こらず、既存の脂肪細胞が肥大するために、より大きな脂肪細胞が生じることを認めた(投稿準備中)。また、上記の遺伝子トラップ法においてTGF-betaのシグナル伝達を抑制するTG-interactingfactor(TGIF)も脂肪細胞分化に必要であることを見いだした。TGF-betaはSmad2,3の活性化により脂肪細胞分化を抑制するが、その一方で脂肪細胞から分泌されることが知られている。そこで、脂肪細胞分化に際しては、何らかの因子がTGF-betaに拮抗的にはたらくことが推察されてきた。我々は、インスリン刺激によるAktのリン酸化がTGIF蛋白の安定性を起こすこと、さらに、PPAR-gammaアゴニストによって転写と翻訳の亢進によりTGIFの発現レベルが上昇することを見いだした。以上のことにより、インスリン、PPAR-gamma刺激によってTGF-betaのシグナル伝達を抑制することが、脂肪細胞の分化に重要であることを見いだした(投稿準備中)。また、肥満者、正常者において血漿エンケファリンの濃度測定を開始した。さらにインスリン抵抗性を惹起させる遺伝子としてFilamin、Thymosin-beta4、PDGS遺伝子を見いだした。

さらに、TPH1欠損マウスにおいて高脂肪食を負荷した際に、脂肪細胞分化が起こらず、既存の脂肪細胞が肥大するために、より大きな脂肪細胞が生じることを認めた(投稿中)。また、上記の遺伝子トラップ法においてTGF-betaのシグナル伝達を抑制するTG-interactingfactor(TGIF)も脂肪細胞分化に必要であることを見いだした。TGF-betaはSmad2,3の活性化により脂肪細胞分化を抑制するが、その一方で脂肪細胞から分泌されることが知られている。そこで、脂肪細胞分化に際しては、何らかの因子がTGF-betaに拮抗的にはたらくことが推察されてきた。我々は、インスリン刺激によるAktのリン酸化がTGIF蛋白の安定性を起こすこと、さらに、PPAR-gammaアゴニストによって転写と翻訳の亢進によりTGIFの発現レベルが上昇することを見いだした。またインスリンによってTGIFのDNA結合能も上昇した。以上のことにより、インスリン、PPAR-gamma刺激によってTGF-betaのシグナル伝達を抑制することが、脂肪細胞の分化に重要であることを見いだした(J Lipid Res 2008 in press)。
軟弾性体微細構造セルによる2次元圧力計測法の開発と展開

平成20年度には、2次元圧力計測を行うセンサー部分(圧力センサーセルマトリックスと呼ぶことにする.)の基礎開発を行い基礎的な計測方法を選定した.本年度は下記の成果が得られた。(1)比較的大型のセンサーマトリックスをもとにして、圧力の基本計測手法を確立した.昨年度に確認された圧力計測の精度(10Pa)、ならびに計測範囲(500Pa)を確認し時系列データを取得した.基板の材質をさらに調査し、最適な材料の選定を行った.(2)大型センサーマトリックスを用いた実験で、各セルの時系列データを取得し、これをヒルベルト変換することによって位相解析を行い,時系列データを得た。得られた時系列データに対して、時間応答、周波数応答に関して検討した。データのサンプリングは1000Hzで行い,解析し,十分な分解能を得た.(1)および(2)によって確認された計測法を噴流の計測に適応して,その実用性について検討した.計測結果は数値シミュレーションの結果と比較し,計測点において,ほぼ10%程度の精度で圧力が測定されていることが確認され,本手法の基礎手法が確立できた.本研究は,圧力の自在な2次元計測を可能にすることを目標とする.流体計測に関しては,速度,温度,圧力の計測に関して近年,多次元計測が展開されている,その中で近年,顕著な成果を上げた圧力の計測法としては,感圧塗料(PSP)の開発が記憶に新しい.PSPは,分子レベルでの光反応を利用した非常にユニークな手法であり,将来性のあるものと言えるが,現在では応答性とダイナミックレンジにおいてまだ多くの制約を余儀なくされている.本研究では,これを打開すべく,非常に単純な計測原理に基づき,ロバストな2次元圧力計測法を展開する,原理は,2次元にセル状に配列された軟弾性体の一つ一つの,圧力による面外方向変位をスペックル法により計測することで圧力を計測しようとするものである.平成20年度には、2次元圧力計測を行うセンサー部分(圧カセンサーセルマトリックスと呼ぶことにする.)の基礎開発を行った。ならびに、圧力を付加したときのセルマトリックスの表面の変位量の計測を行った。圧力センサーセルマトリックスの大きさを5mm×5mm程度として,その中に,5×5行列の圧力検知セルを形成した.得られた結果は、次の通りである。1)加えられた圧力に対して適切な変位が得られる軟弾性体を選択することで、圧力計測が可能であることが示された。2)面の法線方向変位量は、4μm程度が適切であり、また圧力セルの直径は0.5mm程度であれば、通常の方法によって計測が可能である。また。この範囲内で十分に干渉縞が生成されていることが観察された。データのサンプリングは1000Hzで行い,解析し,十分な分解能を得た.(1)および(2)によって確認された計測法を噴流の計測に適応して,その実用性について検討した.計測結果は数値シミュレーションの結果と比較し,計測点において,ほぼ10%程度の精度で圧力が測定されていることが確認され,本手法の基礎手法が確立できた.
哺乳類発生段階における心筋細胞の機能分化

1)過分極誘発内向き電流(I_f)チャネルの発達に伴う変化本実験では、胎生期マウス心室筋を用いた。過分極誘発内向き電流(I_f)チャネルをコードする遺伝子であるHCN遺伝子(HCN1-4)の発現について、リアルタイムPCR法で解析した。HCN遺伝子は、胎生9.5日齢は充分に発現していたが、胎生18日齢では発現量は減少する事が判明した。そのサブタイプ別の解析では、胎生9.5日齢ではHCN4が最も発現がよく次にHCN1であった。一方、胎生18日齢では、HCN2の発現が主であり、(I_f)チャネルは発達に伴うサブタイプの変化が見られた。病態心筋で観察される異常児童能は、このような過分極誘発内向き電流(I_f)チャネルが関わることも予想されるため、実際の病態心筋を使った解析が必要と考えられた。2)Ca^<2+>ハンドリング蛋白の発達に伴う変化9.5dpcから18dpcの発達段階で、RyR2、SERCA2、PLBのmRNA発現は、それぞれ8、3、15倍増加した。NCX1のmRNAは9.5dpcから十分な発現を認めるが、この発達段階では発現変化はなかった。成熟期でRyR2、SERCA2、PLBのmRNA発現はさらに増加したが(9.5dpcに対し21、18、33培)、NCX1は50%減少した。Ca^<2+>transientはCa^<2+>指示蛍光色素を用いて記録した。9.5dpcでSR阻害剤はCa^<2+>transientに影響を与えず、成熟期では消失させた。またCaチャネル阻害剤で、9.5dpcのCa^<2+>transientは消失した。本年度は以下の実験が行われた。1)細胞膜膜イオンチャネルの発生段階による機能分化の解析マウス胎生9.5日齢及び胎生18日齢の心室筋細胞にホールセルパッチクランプ法を施し、過分極誘発内向き電流(If)の記録解析を行い、発生段階による各電流の変化について検討した。胎生9.5日齢では-7.9pA/pF(-130mV)、胎生18日齢で-1.4pA/pFであり発達に伴う自動能の消失が示唆された。またβアドリレナン刺激による反応が胎生9.5日齢のIfで認められるが、その受容体の発達は未熟であることが判明した。PCR法を用いたmRNA解析では、HCN4が胎生9.5日齢心室筋のIfを狙う主要な発現遺伝子であることがわかった。2)細胞内Ca^<2+>濃度調節機構の機能分化の解析Ryanodine受容体、筋小胞体Ca^<2+>ポンプ、phospholamban,Na^+-Ca^<2+>交換機構蛋白のmRNA発現量を、種々の発達段階(マウス胎生9.5日齢・胎生18日齢・生後10週齢の心室筋細胞)で、定量PCR法により測定した。Westren blot法で蛋白質レベルの発現量の変化も解析した。機能的にはそれぞれの発達段階の単一心室筋細胞にCa^<2+>感受性蛍光色素fluo-3を負荷し、Caffeine,Ryanodine,Thapsigargin,Nisoldipine,KB-R7943による反応性について検討した。これらの結果、発達に伴い筋小胞体が成熟し、細胞内Ca^<2+>濃度調節機構に主要な役割を持つことが判明した。

1)過分極誘発内向き電流(I_f)チャネルの発達に伴う変化本実験では、胎生期マウス心室筋を用いた。過分極誘発内向き電流(I_f)チャネルをコードする遺伝子であるHCN遺伝子(HCNl-4)の発現について、リアルタイムPCR法で解析した。HCN遺伝子は、胎生9.5日齢は充分に発現していたが、胎生18日齢では発現量は減少する事が判明した。そのサブタイプ別の解析では、胎生9.5日齢ではHCN4が最も発現がよく次にHCN1であった。一方、胎生18日齢ではHCN2の発現が主であり、I_fチャネルは発達に伴うサブタイプの変化が見られた。病態心筋で観察される異常自動能は、このような過分極誘発内向き電流(I_f)チャネルが関わることも予想されるため、実際の病態心筋を使った解析が必要と考えられた。2)Ca^<2+>ハンドリング蛋白の発達に伴う変化9.5dpcから18dpcの発達段階で、RyR2、SERCA2、PLBのmRNA発現は、それぞれ8、3、15倍増加した。NCX1のmRNAは9.5dpcから十分な発現を認めるが、この発達段階では発現変化はなかった。成熟期でRyR2、SERCA2、PLBのmRNA発現はさらに増加したが(9.5dpcに対し21、18、33倍)、NCX1は50%減少した。Ca^<2+>transientはCa^<2+>指示蛍光色素を用いて記録した。9.5dpcでSR阻害剤はCa^<2+>transientに影響を与えず、成熟期では消失させた。またCaチャネル阻害剤で、9.5dpcのCa^<2+>transientは消失した。
沖縄産海綿由来の抗腫瘍性物質マンザミンAの合成研究

Manzamine A(1)は沖縄の海綿から単離された強力な抗腫瘍作用を示すβーcarboline alkaloidである。この海洋産物の強い生物活性と特異な構造に着目し、申請者らは1つの全合成を企画し、その生物活性に関する研究を行なうこととした。本研究では重要中間体である三環性化合物(2)および四環性化合物(3)の合成を検討した。合成の重要な段階として、置換ピリジノン(4)とシロキシジエン(5)との超高圧Dielsーalder(DーA)反応を利用するpyrroloisoquinoline環(2)の合成法を確立した。さらに3の合成についても検討した。1)1、3ージ置換ジヒドロピリジノン(4)の合成;6とアミノアクリレ-ト(7a,R1=BOC,R2=Me)のMichael反応を行なったところ8が高収率で得られることがわかり8から種々の誘導体4の合成が可能となった。2)4と5の超高圧DーA反応による2の合成法の確立;超高圧DーA反応を活用して4aより三環性中間体2aの合成に成功している。3)光学活性azocine誘導体の合成;Azocine誘導体(4b)を合成しDanishefsky DieneとのDーA反応で光学活性なazocinopyrrolo isoquinolineを合成する目的でまず光学活性azocine(12)の合成を検討した。Lーserineより数行程で光学活性アルデヒド(9)を合成した。次に9をcarboxybutyltriphenylphosphonium bromideとWittig反応を行いcisーカルボン酸(10)に導いた。次に種々の反応条件を検討した結果、TFAで選択的に脱BOC化、TCFとの反応により分子内閉環がおこりazocine(11)が得られた。さらに11の脱アセトニド化、続くアセチル化によって12を得た。12と6との反応による4bの合成を検討中である。
コレシストキニン(CCK)とCCKレセプターの遺伝子発現、及び膵外分泌調節

1.小腸CCK-RPは現在、精製法を改良しながら、続行中である。2.膵由来CCK-RP(PSTI-61)とCCKとの相互関係は、膵管を結紮して血中CCKを増加させると、血中CCKは一貫して高値を示したが、CCKmRNAは漸増し、10日目に最大となって、28日目に基礎値に復した。PSTI-61mRNAは3日目に最大となり、以後低下した。一方CCK-A receptor mRNAは結紮後漸減し、7日目に最低となり、以後膵線房細胞の再生に伴って増加した。また膵液胆汁除去により血中CCK、CCKmRNA、PSTI-61mRNAが増加し、DDK拮抗剤の投与により、PSTI-61mRNAは減少したが、正常値よりは依然として高値を呈し、またCCK-analogueの投与によるPSTI-61mRNAの増加は、膵液胆汁による増加に、はるかに及ばなかった。よってCCK-RPmRNAの増減には血中CCK以外に他の要素が存在することが想像された。膵液胆汁外瘻作製のための手術操作により、膵は物理的に障害をうける。鋭敏に膵障害を反映するpancreatitis associated protein(PAP)mRNAの発現が消失する時期を確認してから、実験をおこなった。その結果、膵液胆汁の除外後1,2,4,24時間目の血中CCK,CCKおよびsecretin mRNAはいずれも上昇するが、PSTI-61mRNAは変動しなかった。つまり、PSTI-61mRNAの上昇は、膵障害を表すひとつの指標になる。3.CCKmRNA,CCK-A,B receptor mRNAレベルは、雄ラットでは、老齢群で低下したが、雌では変化しなかった。脳、小腸におけるCCK-A,B receporとCCK mRNAとの間には一定の相互関係はみられなかった。4.Afferent nerveを破壊した(覚醒)ラットを用いて、CCKの膵外分泌への効果を検討したが、むしろefferent nerveの関与の方が大きいと言う結果がえられた。脳室内ソマトスタチンは交感神経系を介して膵外分泌を抑制していた。コレシストキニン(CCK)は、消化管ホルモンとして、またneurotransmitterして生体内に広く分布する。しかしその合成と分泌に関する制御機構はおきらかでない部分が多い。本研究の第一の目標は小腸由来のCCK放出因子を精製すること、そのCCK放出因子のCCK分泌に対する作用機序を検討することであるが、まだ結論がでるにはいたっていない。第2には膵由来CCK分泌因子であるPSTIをもちい、遺伝子レベルで、CCKの合成分泌の制御機構との相互関係を検討することである。PSTI-61は炎症反応物質でもあるので,今回は膵障害の影響を除外するため、鋭敏に膵障害を反映するpancreatitis associated protein(PAP) mRNAの発現が消失する時期を確認してから,実験をおこなった。その結果、膵液胆汁の除外後1,2,4,24時間目の血中CCK,CCKおよびsecretin mRNAはいずれも上昇するが、PSTI-61 mRNAは変動しなかった。

つまり、PSTI-61 mRNAの上昇は、膵障害を表すひとつの指標になると考えられた、次に、CCKは迷走神経afferent nerveを興奮させる作用のあることがわかっているので、この点をさらに確認するため、afferent nerveを破壊した(覚醒)ラットを用いて、膵外分泌の変化を検討した。結果はむしろefferent nerveの関与の方がおおきいと言う結果がえられた。Pancreatic PolypeptideやpeptideYYなどは膵腺房細胞にはreceptorが存在しないのにin vivoでは膵外分泌を抑制するが、これらは迷走神経efferent nerveを介して働くことが判明した。さらにCCKのレセプターはA,B2つのサブタイプがクローニングされているので、レセプターの遺伝子発現調節とCCK遺伝子発現調節との相互関係をしらべたところ、現在検討の途中であるが、レセプターのmRNAレベルとCCKmRNAとの間には相互関係はないと思われた。1.膵管結紮による膵実質萎縮状態での十二指腸内CCKmRNAの変動を検討するとともに、膵由来CCK-Releasing Peptide(CCK-RP)であるmonitor peptide(PSTI-61)の膵臓内での遺伝子発現とその制御機構を検討した。血中CCKの増加は、膵腺房細胞を肥大させる。しかし膵管を結紮してしまうと、血中CCKは上昇するが、膵実質は萎縮する。膵管結紮後28日間にわたって、膵内PSTI-61および十二指腸内CCKmRNAを測定、互いの関係と、さらに血中濃度との相関を検討した。結果は、血中CCKは一貫して高値を示したが、CCKmRNAは増加し、10日目に最大となって、28日目に基礎値に復した。組織内CCKはmRNAの増加にやや遅れて14日目に最大となった。PSTI-61mRNAは3日目に最大となり、以後低下した。2.膵液胆汁の小腸内の存否は十二指腸粘膜内CCKや血中CCK濃度に影響する。組織内ペプチドの濃度は合成と分泌のバランスで決定されるので、これらのmRNAレベルでの測定と同時に血中および組織内濃度を測定し、相互作用を検討した。結果は膵液胆汁除去により血中CCKは増加し、CCKmRNAは7日目に最大となった。一方PSTI-61mRNAは3日目に最大となった。CCK拮抗剤の投与により、PSTI-61mRNAは減少したが、正常値よりは高値を呈していた。またCCK-analogueの投与によってもPSTI-61mRNAは増加したが、膵液胆汁による増加にははるかに及ばなかった。CCKおよびCCK-RPmRNAの増減は血中CCKの増減により一部制御されているが、さらに他の要素が存在することが想像された。
ネオスポラ症における垂直感染メカニズムの蛍光発色原虫等を用いた網羅的解析

本研究では、まずNeospora caninumの蛍光発色原虫を作製することで本原虫を可視化し、ネオスポラ症の種々の実験を容易にした。垂直伝播の要因であるブラディゾイト(シスト)のマーカーとなり得るNcBAG1蛋白をコードする遺伝子を同定した。さらにブラディゾイト由来抗原の水平伝播モデルでの本蛋白の有用性を確認した。タキゾイト抗原およびブラディゾイト由来抗原の混合ワクチンは水平伝播において相乗効果を示したが、垂直伝播では効果は認められなかった。垂直伝播に関するホルモンの影響はこれまでのところその影響は確認できなかった。ネオスポラ症は、細胞内寄生原虫Neospora caninumの感染に起因する届出伝染病で、本症で問題となるのは終宿主の犬科動物と中間宿主の牛である。発症を起因する原虫ステージは中間宿主上のタキゾイトとブラディゾイトで、その伝播様式は垂直感染が主体となるが、本症に対する治療法および予防法は未確立のままである。本研究の目的は、本症予防ワクチンの開発を念頭に、タキゾイトーブラディゾイトのステージ特異的蛍光発色原虫を作製し、本症における水平感染後ならびに垂直感染時での原虫のステージ変換の動向ならびに誘因を特定し、妊娠時における対原虫免疫への基礎的知見の取得と、予防ワクチンの方向性の決定を行うことである。平成22年度には以下の研究を行った。(1)蛍光発色原虫の作製:N.caninum由来DHFR遺伝子によるピリメタミンを薬剤選択用マーカーとして、タキゾイトステージには緑色蛍光蛋白GFP遺伝子を、ブラディゾイトステージには赤色蛍光蛋白tdTomato遺伝子を用いてステージ特異的発色プラスミドを構築した。さらに本プラスミドをN.caninum Nc-1株に遺伝子導入しステージ特異的蛍光発色原虫の作出に成功した。(2)蛍光発色原虫のin vitroとin vivoでの検証:二重蛍光発色プラスミド導入原虫のタキゾイトをVero細胞に感染させ、培養液中にSNPを加えることでブラディゾイトへと分化誘導させた。SNP添加前の原虫は細胞の細胞質に緑色蛍光を発色して観察され、SNP添加後には赤色蛍光を発色する原虫の割合が増加し、SNPによるステージ変換がin vitroで確認された。次に本原虫タキゾイトをマウスの腹腔内に接種し、3週後に脳内の原虫を蛍光顕微鏡にて観察を行った。その結果、脳内には赤色発光するブラディゾイトのみが観察され、in vivo"においても原虫のステージ変換を確認することができた。平成23年度には以下の研究を行った。(1)水平感染を受けた親からの垂直感染マウスモデルの検討:妊娠-1,0,1,2週後にN.caninum 1.3×10^7/headの感染を受けたマウスからの妊娠率、産仔数、産仔からの原虫遺伝子の検出を試みたところ、妊娠-1>0>1=2週感染の順に垂直感染を起こしていることが判明した。(2)慢性感染からの垂直感染マウスモデルの検討:N.caninum感染(1×10^7/head)後1,3,6≦ヶ月のマウスからの産仔数、産仔からの原虫遺伝子の検出の検討を行った結果、6ヶ月≦のマウスが最も垂直感染を起こしたいたが、その間には有意な差は認められなかった。従って、本モデルにおける試験には感染後1ヶ月以上のマウスを用いるのがよいことが判明した。(3)N.caninum感染マウスにおける抗体価からみた妊娠の影響:各種タキゾイトおよびブラディゾイト由来抗原を用いたELISA法にてN.caninum感染後、妊娠、不妊娠、未交配マウスについて経時的(毎週)に採血を行い、これら複数の抗原に対する抗体の消長を網羅的に検討を行うべく、現在試験を継続中である.ネオスポラ症は、N. caninumの感染により、牛の死・流産ならびに子犬の神経・筋症状などを呈する疾病で、本症伝播で問題となるのは、1非妊娠時の原虫感染による宿主体内での増殖と分布、2妊娠時の原虫感染および妊娠等の刺激によるシスト内原虫の再活性による垂直伝播、である。

本年度はマウスモデルにおけるN. caninumタキゾイトおよびブラディゾイト由来抗原の1水平伝播および2垂直伝播に関する効果の検証を行った。タキゾイト由来抗原として組換え(r)NcSAG1、ブラディゾイト由来抗原としてrNcBAG1を供試し、各々単独および混合したものにTh1型免疫誘導性のO/W型オイルアジュバントを添加したものを免疫原とした。GSTタグ蛋白添加オイルアジュバントおよびPBS単独投与をそれぞれアジュバントおよび感染対照とした。1水平感染モデルの評価は抗体産生能は各種抗原を用いたELISA、防御評価は脳内蛍光発色原虫数の定量的PCRの測定値で行った。2垂直感染モデルの評価は各群マウスからの産仔数、仔マウス体内の蛍光発色原虫分布によって行った。1アジュバントおよび感染対照と比較して、タキゾイト由来抗原rNcSAG1とブラディゾイト由来抗原rNcBAG1の免疫は共に脳内原虫数を低下させた。さらにrNcSAG1とrNcBAG1を混合したものでは、それぞれ単独の場合に比べ、原虫数をより低下させ、相乗効果が確認された。2のモデルでは対照群に比べ、何れの試験群でも新生仔マウス数および仔マウスにおける体内原虫分布においても差を認めることができなかった。これらの結果は抗原特異的なTh1型は水平感染モデルでは有効であるが、体内免疫がTh2型に傾く妊娠免疫時にはTh1型誘導免疫は効果がないことを示唆された。本研究については(1)当初の計画以上に進展しているものと、(3)やや遅れている、ものがあり、(2)のおおむね順調に進展しているとした。(1)当初の計画以上に進展しているものは、ワクチン抗原の候補となる抗原の遺伝子クローニングならびに蛋白発現であり、有効な抗体調査の後には直ちにワクチン試験を行える状況になっている。(3)やや遅れているものは、妊娠中のホルモンによる妊娠免疫の検討であり、現在入手可能なマウスのホルモンを検索中であり、入手もしくは定量試験確定後、試験に入る予定である。24年度が最終年度であるため、記入しない。N.caninum感染マウスにおける抗体価からみた妊娠の影響の試験の結果から、ワクチン候補抗原を選択し、プロトタイプのワクチンを作製する。さらに慢性感染からの垂直感染マウスモデルの検討からN.caninumNc-1/VSC株(蛍光原虫)を感染させ、1ヶ月以上経過したマウスにワクチンを接種し、抗体が検出された後(約1ヶ月)、交配後、その産仔に対して産仔数、産仔からの原虫の可視化ならびにPCRによる原虫遺伝子を検出することで、ワクチンの効果を検証する。妊娠時におけるホルモン、ワクチン、原虫の感染によるTh1/Th2免疫のバランスを検証し、免疫状態の変化による妊娠の影響を検証する。
神経細胞成熟度と鉄動態感応性グルタミン酸シグナル入力の関連性に関する研究

異なる期間培養した大脳皮質由来神経細胞をCa^<2+>感受性蛍光指示薬に負荷したのち、NMDAに継続的に曝露したところ、培養日数にかかわらず少なくとも1時間は同程度の強さで蛍光強度が持続した。次に、5分間のNMDA刺激後、細胞を洗浄してから異なる時間静置し、再び同濃度のNMDA刺激を行った。その結果、1回目の刺激終了後、細胞を5分間静置した場合では、培養日数にかかわらず1回目のNMDA刺激時と同程度の蛍光強度上昇が、2回目の刺激時にも観察された。しかしながら、25分間静置した場合では、培養3日目の細胞では1回目のNMDA刺激と同程度の蛍光強度上昇が2回目の刺激時にも観察されたのに対して、培養9日目および15日目の細胞では2回目の刺激による蛍光強度上昇は、1回目の刺激時よりも著明に減弱された。さらに、1回目のNMDA刺激終了後、細胞を45分間静置した場合では、いずれの日数培養した細胞においても2回目の刺激時に見られる蛍光強度の上昇は、1回目の刺激時よりも顕著に減弱された。次に、培養9日目の細胞を用いて、NMDA刺激前後の細胞膜表面をビオチン標識してからNRサブユニット抗体を1次抗体とするウエスタンブロット解析を行った。その結果、ビオチン標識されたNR1、NR2AおよびNR2B抗体陽性蛋白質の発現量は、NMDA刺激前と比較してNMDA刺激終了直後では有意な変化は見られなかったが、NMDA刺激終了25分後および45分後では、細胞膜上のいずれのNRサブユニット発現量も有意に減少することが判明した。以上の結果より、大脳皮質由来初代培養神経細胞のインビトロ成熟に伴い、アゴニストが結合することによってではなくアゴニストが解離することによって開始されるNMDA受容体チャネルの細胞質内へのインターナライゼーションが亢進し、細胞膜表面上の受容体数減少に起因する脱感作が出現する可能性が示唆される。異なる期間間培養した大脳皮質由来神経細胞にCa^<2+>感受性蛍光指示薬を負荷したのち、5分間のNMPA刺激を一度行った。その後、細胞を洗浄してから異なる時間静置して、再び同濃度のNMDA刺激を行った。その結果、一回目の刺激終了後、細胞を5分間静置した場合では、いずれの期間培養した神経細胞においても、一回目のNMDA刺激時と同程度の蛍光強度堺が、二回目の刺激時にも観察された。しかしながら、25分間静置した場合では、培養3日目の細胞では一回目のNMDA刺激と同程度の蛍光強度上昇が二回目の刺激時にも観察されたのに対して、培養9日目および15日目の細胞では二回目の刺激による蛍光強度上昇は、一回目の刺激時よりも著明に減弱された。さらに、一回目のNMPA刺激終了後、45分間細胞を静置した場合では、いずれの細胞においても、二回目の刺激時に見られる蛍光強度の上昇は、一回目の刺激時よりも顕著に減弱された。そこで次に、細胞膜上のNMDA受容体数を検討するために、細胞膜表面をビオチン化したのち、ビオチン化標識された蛋白質を回収し、NR1抗体を一次抗体とするウエスタンブロット解析を行った。脱感作を生じやすい培養9日目の細胞にNMDAを適用し、刺激前、刺激終了直後、刺激終了25分後、および刺激終了45分後に、それぞれビオチン化標識されたNR1抗体陽性蛋白質の発現量を検討したところ、NMDA刺激前と比較してNMDA刺激終了直後では有意な変化は見られなかったが、NMDA刺激終了25分後およびNMDA刺激終了45分後では、ともに細胞膜上のNR1発現量は有意に減少することが判明した。以上の結果より、大脳皮質初代培養神経細胞のインビトロ成熟に伴い、NMDA受容体チャネルはインターナライゼーションに伴う細胞膜表面上の受容体数減少に起因する脱感作を受けやすくなる可能性が示唆される。

以上の結果より、大脳皮質由来初代培養神経細胞のインビトロ成熟に伴い、アゴニストが結合することによってではなくアゴニストが解離することによって開始されるNMDA受容体チャネルの細胞質内へのインターナライゼーションが亢進し、細胞膜表面上の受容体数減少に起因する脱感作が出現する可能性が示唆される。
器官再生を惹起するROSシグナルの解明

生物の器官再生において、活性酸素(ROS)が重要な役割を担っていることが注目されている。しかしながら、その作用機序は未だ不明である。これまでに得た知見から、申請者は「ROSが大規模なエピジェネティクス修飾の変化を誘導し、器官再生を惹起する」という仮説を立てた。申請者が得意とするオミックス解析やゲノム編集技術を駆使して、器官再生におけるROSシグナルの重要性とエピジェネティクス修飾へと変換される一連の作用機序を解明することが本申請課題の目的である。本研究課題では、高い器官再生能力を持ち、超高効率のゲノム編集が可能であるイベリアトゲイモリをモデルとして用いる。本研究から得られる成果は、発生・再生生物学におけるROSの新たな生物学的意義の発見につながる。くわえて、現在注目度の高い再生医学分野において、器官再生に関する重要な知見をもたらすことが期待できる。本年度は四肢再生芽におけるプロテオミクス解析およびトランスクリプトミクス解析を行い、ROSシグナルの下流において四肢再生の鍵となる候補因子を同定するためのオミックスデータの蓄積を集中して行なった。さらには、先進ゲノム支援の協力の下、PacBioシークエンサーを用いた完全長cDNA解読も進行中である。また、イベリアトゲイモリのゲノム編集技術の開発を行い、超高効率ノックアウトを基盤にした迅速な遺伝子機能解析システムの確立に成功した。本年度に得られた成果は二本の国際学術誌にて発表した。これら得られた知見や技術は研究コミュニティーにおいても大きな成果となっており、当初の期待以上の波及効果があった。本年度はイベリアトゲイモリの分子生物学的および逆遺伝学的研究基盤の整備に努めたため、ROSに関する研究が少々遅れ気味となった。しかしながら、得られた成果は本申請課題の遂行を加速させるだけでなく、研究コミュニティーにとっても重要な知見や技術となることが十分期待できる。進捗状況で述べたように、本年度の成果によりイベリアトゲイモリの分子生物学的および逆遺伝学的研究基盤の整備が十分整いつつある。得られた知見と技術を十分に活用することにより、本申請課題は確実に遂行されることが期待できる。次年度はROSが器官再生を惹起するメカニズムの実体に迫れるように努力したい。雇用している研究補助員の勤務日数が予定よりも少なくなったため、記載している差額が生じた。この差額は次年度の消耗品購入に充てる等、有効に使用したい。
筋ジストロフィーにおける自閉傾向のアセスメントと臨床心理学的援助

本研究は、ジストロフィンの異常と自閉傾向の関連を研究した。ジストロフィン異常症者(56名、平均年齢12.9歳)が研究に参加した。自閉傾向はPARS-SFとSRSで測定された。18名の患者(32.1%)がPARS-SFの幼児期評価で、11名(19.6%)が現在評定で自閉傾向を示した。エクソン30-44で19.6%、45-55で20%がASD傾向が見られた。エクソン30より上流では見られなかった。ジストロフィン蛋白に異常を持つ筋ジストロフィーにおいては、よく知られている筋障害だけでなく、最近では脳内に存在するジストロフィン・アイソフォームの影響による、中枢神経系の障害(CNS障害)が注目されている。そこで本研究では,筋ジストロフィー患者において、CNS障害の表現型としての自閉的傾向(PDD傾向)が、一般群と比較し高いのかどうか検討することになった。以上の結果から、筋ジストロフィー患児・者においては、一般群では10,000人に520人と推定される有病率(DSM-IV-TR)と比較し,著しく高い出現率であることが明らかとなった。このような高い出現率は、筋ジストロフィーのCNS障害と関連すると推定される。今後、神経心理学的な検査や医学的・生物学的精査も行い、関連性を明確化する必要があると考えられる。デュシェンヌ型をはじめとする筋ジストロフィーでは、認知機能の低下や対人関係の困難さがあると指摘されている。このような問題は、運動機能の低下や長期にわたる療養生活など、限定された生活経験の影響が大きいとこれまでは考えられてきた。しかし、近年ジストロフィンタンパク質の異常が、筋だけでなく中枢神経系にもあり、彼らの示す自閉的傾向のひとつの要因ではないかと考えられるようになってきた。本研究では、56名のジストロフィン異常者(主としてデュシェンヌ型筋ジストロフィー)を対象に、自閉的傾向を測定する尺度(PARS-SF)を実施し、ジストロフィン遺伝子の突然変異の位置との関係を分析した。PARS-SFにおいては、ピーク時評定で32.1%、現在評定で19.6%が自閉傾向を示した。一般群と比較して筋ジストロフィーでは自閉的傾向が高いことが確認された。ジストロフィン遺伝子の突然変異の位置との関係については、エクソン33-44で29%が、エクソン45-55で20%が、PARS-SFのピーク時評定、現在評定、共にカットオフポイントを越えていた。エクソン1-30でカットオフポイントを越えた者はいなかった。以上の結果から、筋ジストロフィーの自閉的傾向とジストロフィン遺伝子の突然変異の位置は、関連性があることが示唆された。筋ジストロフィー患者への心理的支援に関しては、共同研究を行っている国立病院機構刀根山病院において、隔月でケースカンファレンスを実施しており、医師、看護師、臨床心理士を含めた多職種で検討を行っている。現時点での本研究の限界は、単一施設からの研究協力者であり、何らかのバイアスがかかっている可能性が有る。また、調査対象者数が十分でなく、今後増やす必要があると思われる。筋ジストロフィーとは、筋肉が萎縮し呼吸不全や心不全を起こし、死に至る進行性の疾患である。しかし、医療技術の進歩により、生命予後は改善されてきているが、その分、療養期間が長期化し、療養生活には様々な困難がある。本研究ではそれらの困難さの一つとして、彼らの有する対人関係の困難さに注目し、自閉傾向の視点からの調査を行った。自閉傾向を測定するPARS-SFを実施したところ、20%から30%に自閉傾向が見られた。また、同じく自閉傾向を測定するSRSを実施したところ、30%程度に自閉傾向が見られた。これらの結果から、一般では1%とされる自閉スペクトラム症(ASD)が、筋ジストロフィー患者ではより高い頻度で合併する可能性が示唆された。先行研究では、デュシェンヌ型筋ジストロフィーにおいて、30%程度に知的障害があることが知られており、その原因の一つとして、脳内のジストロフィン蛋白質異常の関与が疑われている。そして、ジストロフィン遺伝子の3′側の変異ほど、多種類のジストロフィンのアイソフォームに影響を与え、知的障害が重篤化するのではないかと考えられている。同様の問題が、筋ジストロフィー患者の自閉傾向にも当てはまるとすれば、ジストロフィン遺伝子の変異の位置により、彼らの示す自閉傾向の出現頻度に違いが想定される。そこで遺伝子変異の位置により、Dp427のみ異常を有する群とその他の群を比較したところ、その他の群の方がSRS-SF及びSRSのコミュニケーションでの得点が高値であった。以上の結果から、筋ジストロフィーでは自閉傾向が合併しやすいこと、脳内におけるジストロフィン蛋白異常の影響が示唆された。しかし、本研究では環境因の検討が十分でなく、継続的研究が必要とされる。今後、このような彼らの特性を考慮した介助や心理的支援が望まれる。

エクソン30-44で19.6%、45-55で20%がASD傾向が見られた。エクソン30より上流では見られなかった。当初の研究計画に近い研究結果は出ているが、現時点での限界で記載したような問題があり、可能な限り対処する予定である。また、英文の論文原稿がほぼ完成しているが、まだ専門誌にアクセプトされておらず、論文の修正をしているところである。臨床心理学できる限り研究協力者を増やし、関連する情報を収集していく予定である。筋ジストロフィーにおいて、SRSおよびPARSを用い、彼らのPDD傾向の高さを示すことができた。したがって研究はほぼ順調に遂行されていると思われる。しかし,当初予定していた対象者数をやや下回り、現在の協力施設「国立病院機構刀根山病院」での評価可能な対象者の上限に近いと考えられる。また、神経心理学的な検査結果や医学的データは現在収集中である。旅費と謝金の執行額が予定を下回った。学会の開催場所が浜松であり、旅費が東京計算より下回ったため。謝金については、遺伝生物学関係の専門家を招へいする予定であったが、先方の都合で実施できなかった。他の国立病院機構の筋ジストロフィー病棟を有する病院にも働きかけ、データ数を増やすとともに、神経心理学的検査や医学的データもさらに収集し、PDD傾向に影響を与える要因を明らかにする予定である。データ数を増やすため、2015年度は心理テスターを雇用し、2014年度執行できなかった分を執行する予定である。また、専門家の助言も予定しており、謝金として執行することになる。
網膜視細胞発生における転写調節機構の解析

マウスCrxの発現は網膜視細胞の発生パターンと時空間的に一致することが明らかとなっている。申請者らはCrxのプロモーター解析より、Crxの視細胞特異的発現を誘導する14bpの配列(CUE配列)をCrx遺伝子上流近傍より同定した。CUE配列のみを欠損しているプロモーターを用いてトランスジェニックマウスを作製したところ、網膜視細胞および松果体でのLacZの発現が消失したことから、CUE配列はCrx発現に必要な配列であることを明らかにした。Crxはotd/Otxホメオボックス遺伝子ファミリーに属する転写因子であり、変異マウスの解析結果から視細胞分化を決定づける因子であると考えられている。申請者らは以前Crxの発現がOtx2により制御されていることを明らかにした。Otx2の発現は中枢神経系に広範囲であるにもかかわらず、Crxの発現は視細胞、松果体に限局している。CUE配列を変異させたCrx変異プロモーターの下流にLacZレポーター遺伝子を組み込んだトランスジェニックマウスを解析した結果、完全なCrxプロモーターによる制御下ではLacZの発現が網膜視細胞および松果体に限局しているのに対し、CUE配列変異プロモーターでは網膜視細胞および松果体でのLacZの発現が消失したことから、CUE配列はCrx発現に必要な配列であることを示唆する結果を得た。しかしながら、欠損させる配列の長さに依存しlacZの発現パターンに違いが見られるトランスジェニックマウスラインが存在し、最終的にこれが変異挿入配列に依存することを突き止めたので、再確認のためのトランスジェニックマウスラインを作成した。今後解析を行う予定である。CUE配列を変異させたCrx変異プロモーターの下流にLacZレポーター遺伝子を組み込んだトランスジェニックマウスを解析した結果、完全なCrxプロモーターによる制御下ではLacZの発現が網膜視細胞および松果体に限局しているのに対し、CUE配列領域が変異しているプロモーターの下流でレポーター遺伝子が発現するようなトランスジェニックマウスでは視細胞以外に発現がみられた。そこでCUE配列のみを欠損しているプロモーターを用いてトランスジェニックマウスを作製したところ、網膜視細胞および松果体でのLacZの発現が消失したことから、CUE配列はCrx発現に必要な配列であることを示唆する結果を得た。今後は新規Yeast One Hybrid法により結合する因子についての解析を行う予定である。今後は新規Yeast One Hybrid法により結合する因子についての解析および、CUE配列に結合する網膜中のタンパク質の同定を行っている。
線虫C.エレガンスでの細胞内電位記録法の確立

線虫C.エレガンスではあまり電気生理学的な研究がなされていない。頭部全体から記録する咽頭全図やパッチクランプの実験が2.3あるのみである。そこで無傷の線虫での細胞内電位記録を試みた。線虫の体表近くには6個のタッチ感覚細胞が存在するが、その中の後半部のマイルドな触刺激に応じるPLM細胞からの膜電位記録を試みた。未開の分野なので実験をするにあたりいろいろと問題がでてきた。虫を動かないようにどのようにして固定するか?触刺激のしかたや触刺激を電位記録と同時にどのようにして記録するか等。固定に関しては外科用ボンドでうまくいった。デジタル信号とアナログ信号を同時に記録するには、AD変換器の未使用領域をうまく利用して、同時に記録できるようにAD変換器を改造した。タッチ感覚細胞からの細胞内記録の結果、静止膜電位は最大で-50から-60mVの電位が見られた。しかし普通は-20から-40mV位であった。マニピュレーターを操作して体の後半部をマイルドに刺激すると、刺激に呼応して10mV以上の刺激の間中続く大きな脱分極性の反応が記録できた。PLM細胞に電極を刺した状態で、前半部をタッチすると殆ど反応がないか、もしくは逆転したすなわち過分極のごく小さな反応が見られた。現在はタッチ刺激に反応できないmutantの線虫のタッチ感覚細胞にGFPを組み込み、mutantでの実験の準備をしているところである。線虫C.elegansで電気生理ができるようになることは、C.elegans研究者の長年の夢であり、たくさんの研究者が試みたにもかかわらず、まだほとんど成功していない。もっとも、最近patch clampが試みられ、1,2の成功例が見られるようになった。しかし微小電極による細胞内記録は成功していない。私の今回の目的はその細胞内記録である。この1年間、細胞内記録に挑戦してきた。いくつかの問題点があり、現在それを少しずつ克服しているところである。まず第一に、生きたままどのようにして固定するかという事であったが、いろいろ試み、糊づけするという方法で何とか目的を達成できそうである。次は目指すタッチ感覚細胞を同定する事である。タッチ細胞をGFPでラベルした線虫をわけて頂いたが、20年も前の蛍光顕微鏡ではGFPの蛍光がほとんど見えず、現在、他の方法で細胞が同定できないかと模索しているところである。そして細胞内に電極を刺して記録する事であるが、めくら刺しで-50-60mV位の静止電位を確認できたので細胞の同定ができれば細胞内記録は可能と思える。さらに刺激の方法等が以前の実験とはまったく異なるので、今までのカエル神経筋での終板電位の記録の時の方法がそのままでは使えず、AD変換器の改造と、そのための新しいプログラムを作成中である。
膵内分泌細胞間のクロストークを介した恒常性維持のメカニズムの解明

膵臓は、消化液を分泌する外分泌細胞とホルモンを分泌する内分泌細胞、そして膵液を十二指腸へと運ぶ膵管からなる。この内分泌細胞で最も研究されているのβ細胞である。β細胞は、血糖値を下げるインスリンを分泌するため、その機能不全は血糖値の上昇を促し、最終的には糖尿病を発症する。申請者は膵臓の内分泌細胞の一つであるPP細胞に着目して研究を行なっている。PP細胞とは、摂食抑制ホルモンであるPP分泌する細胞で、その機能はほとんど分かっていない。そこで申請者はPP細胞の生理的作用を明らかにする目的でPP細胞の数が変化するモデル動物の探索を行なった。その結果、グルカゴン遺伝子欠損マウス(GCGgfp/gfp)でPP細胞が増加することを見出した。GCGgfp/gfpは、グルカゴン遺伝子にコードされるグルカゴンを含む全てのホルモン産生が欠損している。このマウスでは他のグルカゴン作用不全マウスと同様に膵α細胞の過形成が起こるが知られている(Hayashi, Y. et al., Mol. Endocrinol., 2009. )。我々は、GCGgfp/gfpの膵臓の切片を用いて、PPを特異的に認識する抗体で免疫組織染色による観察を行った。その結果、2つのことを発見した。一つ目は先述のようにPP細胞が過形成していた。PP細胞は、膵内分泌細胞全体の数%程しか存在しない細胞であるが、このGCGgfp/gfpでは膵島の37.9%の細胞がPP陽性細胞であった。もう一つはPP-グルカゴン、PP-グルカゴン-ソマトスタチンなど複数のホルモンが発現する多重ホルモン産生細胞が多数存在した。野生型を用いた観察では、多重ホルモン産生細胞はほとんど出現しない。そこで現在申請者は、GCGgfp/gfpにおいて認められたPP細胞の過形成および多重ホルモン産生細胞の発現誘導のメカニズムの解明を行なっている。グルカゴン遺伝子は、プログルカゴンタンパク質をコードしている。このプログルカゴンにより様々なホルモンが産生される。その一例がグルカゴン、GLP-1、GLP-2、グリセンチン、オキシトモデュリンである。そのため、GCGgfp/gfpでは、これら全てのホルモンが欠損してため、今回、見出したPP細胞の過形成および多重ホルモン産生細胞の出現がどのホルモンの欠損によるものかは不明である。そこで、まず、本研究ではどのホルモンの欠損に由来するものかを明らかにするために検討を開始した。最初のターゲットとして、グルカゴンを選択した。グルカゴンの作用ついては多くの研究がなされ、特にグルカゴン作用不全によりα細胞の過形成が誘導されることはよく知られている。グルカゴンは肝臓に作用し、アミノ酸の異化を促進する。そのため肝臓でのグルカゴン作用が欠損すると、アミノ酸の異化が抑制され、血液中のアミノ酸が上昇する。この上昇したアミノ酸がシグナルとなり、α細胞でmTORが活性化され、細胞増殖が加速し、その結果α細胞が過形成する。PP細胞も同様のメカニズムで過形成するのか否か検討を行なった。検討には、グルカゴン受容体のFloxマウスを作出した。その後、全身性にグルカゴン作用を抑制するためにCAG-Creマウスとこのグルカゴン受容体のFloxマウスを交配した。GCG-Flox:GCG-Creマウスでは、PP細胞の過形成が認められた。この結果はグルカゴン作用不全によりPP細胞の過形成が誘導されることを示唆するものである。次に肝臓でのグルカゴン作用不全がPP細胞の過形成を誘導するか否か検討した。その結果、肝臓での作用不全では、PP細胞の過形成が誘導されないことが示唆された。今後は、どこの組織でのグルカゴン作用不全がPP細胞の過形成を誘導するのかを明らかにしてゆく。これまでの研究の結果、GCGgfp/gfpで観察されたPP細胞の過形成はグルカゴンの欠損によるものであることが示唆されたが、グルカゴン作用不全によって引き起こされるα細胞の過形成とは違うメカニズムで起き得ることが考えられる。すなわち、肝臓でのグルカゴン作用不全が血中のアミノ酸上昇を促し、それによりα細胞が過増殖するのというメカニズムとは異なり、PP細胞は独自の増殖機構により過形成が誘導されると予想される。そこで、どこの組織のグルカゴン作用不全がPP細胞の過形成を誘導するのかを明らかにすることとした。現在、申請はPP細胞でのグルカゴン作用不全がPP細胞の過形成を誘導するのではないかと仮定し検討の準備を行なっている。具体的には、PP細胞で特異的にしかも誘導的にグルカゴン受容体の発現を抑制させるマウスを作製中である。またこのマウスはlineageをおうことができるようレポーター遺伝子を導入している。このマウスが完成し次第、PP細胞でのグルカゴン作用とPP細胞の過形成に関連が見られるかどうか明らかにしたい。