hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
膵β細胞の新規転写調節機構と機能性RNAの解析

高度に機能分化したインスリン産生膵β細胞における遺伝子発現調節機構を解明するために、ラット膵β細胞株INS-1D細胞から、Vector-capping法を用いて全長cDNAライブラリーを作成した。26,976クローンについて5'-側one passシークエンスを行い、データの品質チェック後6,042クラスターを得た。膵β細胞機能に関わるいくつかの遺伝子について、既報と大きく異なる転写開始点が同定され、転写因子結合予想配列や比較ゲノム学的見地から検討を行った。また明らかなORF (Open reading frame)をもたず、インスリン分泌に関与しうる、機能的なnon-coding RNA (ncRNA)も存在した。高度に機能分化したインスリン分泌臓器である膵β細胞の遺伝子発現調節機構の特徴を明らかにするために、ラット膵β細胞株INS-1D細胞(Dr Wollheim、及び関根信夫博士より供与)から、Vector-capping法を用いて完全長cDNAライブラリーを作成した。ランダムに拾った約2万クローンについて、5'-側one passシークエンスを行い、データベースサーチを行った。その結果、新規転写産物と思われるもののほか、既知遺伝子だが既報より500bp以上上流に転写開始点(TSS)が同定されたものも存在した。そのうちいくつかは、ヒト、マウスで報告されている転写開始点と一致したことから本来の転写開始点と思われるが、いくつかは新規のalternative TSSの可能性が考えられたので、その5'上流域1-3kbpを「新たな転写調節領域候補」として、in silico解析による転写調節エレメント抽出を行い、in vitroプロモーターアッセイによる機能解析の系を準備している。また前記で得られた新規クローンのうち、500bp以上のインサートをもちながら明らかなORF(open reading frame)を持たない「non-coding RNA(ncRNA)」候補に注目し、さらに系統的な解析を進めた。配列特異的なsiRNAを合成し、INS-1細胞へ導入してこのncRNA候補の発現を抑制するとグルコース反応性インスリン分泌に変化がみられたものもあった。この機能的ncRNA候補について、ノックダウンによる網羅的な遺伝子発現プロファイルへの影響を検討するとともに、内因性の発現調節機構などの解析を進めている。高度に機能分化したインスリン分泌臓器である膵β細胞は、きわめて特徴的な遺伝子発現調節機構を有することが知られており、その本体の解明は糖を中心とした代謝制御システムや、糖尿病の病態との関係からもきわめて重要である。我々は、ラット膵β細胞株INS-1D細胞(Dr Wollheim、及び関根信夫博士より供与)から、Vector-capping法を用いて世界に先駆けて完全長cDNAライブラリーを作成し、特異的な遺伝子発現調節機構を解析するとともに、新規転写産物、特にmRNA型の新規non-coding-RNA(ncRNA)と細胞機能との関連を検討した。ランダムに拾った約2万クローンについて、5'-側one passシークエンスを行い、新規クローン候補と思われるものについて、second Pass、third passのシークエンス解析を行った。さらに次世代シークエンサー(イルミナ社GAII x)を用いたRNA-Seqを開始しており、その結果との比較検討を開始した。膵β細胞の機能面から興味深い遺伝子のうち、既報と異なる転写開始点TSS (alternative TSS)が同定されたものについて、その5'上流域1-3kbpを「新たな転写調節領域候補」として、in silico解析による転写調節エレメント抽出を行ったのち、その機能、特に栄養素反応性の有無をin vitroプロモーターアッセイにより検討するためのコンストラクトを作成した。また500bp以上のインサートをもちながら明らかなORF (open reading frame)を持たないncRNA候補に注目し、配列特異的なsiRNAを作製してINS-1細胞へ導入した。グルコース反応性インスリン分泌に変化がみられ機能をもつと期待されたクローンについては、ノックダウンによる網羅的な遺伝子発現プロファイルへの影響をマイクロアレイにより検討した。膵β細胞における遺伝子発現調節機構の解明は、インスリンの産生・分泌による代謝制御システムや、糖尿病の病態の理解のためにきわめて重要である。我々は、ラット膵β細胞株INS-1D細胞(Dr Wollheim、及び関根信夫博士より供与)から、Vector capping法を用いて世界に先駆けて作成した完全長cDNAライブラリーを用いて、ランダムに拾った約2万クローンについて、5'-側one passシークエンスを行っている。膵β細胞の機能に深く関わる遺伝子のいくつかについて、既報と異なる転写開始点TSS(alternative TSS)が同定されたので、比較ゲノム学や転写因子の結合予想配列などの点からin silicoで考察を行い、転写調節エレメント候補の抽出を行った。また500bp以上のインサートをもちながら明らかなORF(open reading frame)を持たないnon-coding RNA(ncRNA)候補に注目し、配列特異的なsiRNAを作製してINS-1細胞へ導入したところ、いくつかのクローンでは、グルコース反応性インスリン分泌に変化がみられた。

これらのクローンについては、ノックダウンによる網羅的な遺伝子発現プロファイルへの影響を、マイクロアレイにより検討したところ、変動した遺伝子群は、インスリン分泌に関わる既報のパスウェイでは説明がつかないことから、新規機能的パスウェイの存在が示唆された。またこれらの変動遺伝子はノックダウンしたncRNAと配列上の相補性をもたず、センスーアンチセンス鎖による調節以外の機序が考えられた。さらに次世代シークエンサー(イルミナ社GAIIx)を用いたRNA-Seqデータとの比較統合解析を進めている。
IL-2受容体抗体を用いた免疫抑制剤の開発

IL-2受容体α鎖、β鎖へのIL-2結合をそれぞれ阻害する抗Tac抗体(anti-Tac)、2R-B抗体(2R-B)を精製し、それに植物毒であるリシンのA鎖(RTA)を結合させ、その効果を調べた。anti-Tac-RTAは、α鎖を発現しているHut102等の細胞株の蛋白合成( ^3H-leucine incorporation)を最大90%阻害すると共に、その増殖を阻止する。一方、2R-B-RTAもβ鎖を発現しているYT2C2等の細胞株の蛋白合成を最大90%阻害すると共に、その増殖を阻止した。しかしながら、それぞれ、α鎖、β鎖を発現していない細胞株に対しては、増殖抑制効果は認められなかった。又、これらimmunotoxinの蛋白合成に対する効果は、NH_4Cl等の添加により増強(最大99%)した。次に、免疫抑制作用を検討する目的で、2R-B-RTAの混合リンパ球培養(MLC)、LAK細胞活性への効果を見た。MLCでのDNA合成は最大約80%阻害され、LAK細胞のDNA合成も約60%阻害したが、RTAの非特異的なDNA合成阻害も見られ、今後の臨床応用に関し問題となる可能性が考えられた。又、成人T細胞白血病(ATL)は、その白血病細胞が構成的にα鎖、β鎖を発現しているため、これらのimmunotoxinを用いた治療効果を検討する目的で、ATL患者末梢血単核球の蛋白合成に対する効果を見た。分離直後の細胞に対しては蛋白合成阻害は認めないが、数日間培養した細胞に対しては、anti-Tac-RTAは30-40%、2R-B-RTAは60%の蛋白合成阻害を認めた。このように、RTA結合IL-2受容体抗体は、少なくともinvitroの実験結果からは、免疫抑制剤として治療に用いうる可能性が十分にあると考えられた。ILー2受容体抗体のうち、α,β鎖へのILー2結合を阻害する抗Tac抗体,2RーB抗体を精製し、それに植物毒であるリシンA鎖(RA)を結合させ、その効果を調べた。まず、α鎖のみ,β鎖のみ,両鎖をそれぞれ発現しているMTー1,YT2C2,ED細胞株に加えて3日後の生細胞数で、その細胞傷害能を調べた。抗体単独では効果がないが、RA抗TacはMTー1,EDの,RA・2RーBはYT2C2とED細胞の増殖を著明に(対照の2030%)抑制する。次に、抗Tac抗体は、単独ではαβ鎖を発現している活性化T,B細胞に対し、ILー2の低濃度域でそのDNA合成を抑制する。これに対し、2RーB抗体は、β鎖のみを発現しているNK細胞のDNA合成は抑制できるが、α,β両鎖発現細胞では全く抑制できない。しかし、抗Tac抗体と共に加えると、ほぼ完全に抑制する。RA結合抗体は、それ単独で、α,β鎖発現細胞のDNA合成を著明に抑制し、混合リンパ球培養でのDNA合成も抑制する。以上の結果からは、抗Tac単独,両抗体併用,RA結合抗体が免疫抑制剤として使用しうる可能性があると考えられた。次に、生体投与時の副作用に関連して両鎖の発現分布を調べた。α鎖は非刺激CD4(+)T細胞の一部にのみ、β鎖は非刺激CD8(+)T細胞の一部,B細胞の一部、NK細胞に発現しており、選択的免疫抑制を計る際には注意すべき点と考えられた。また、細胞株を用いた検索では、線維芽細胞や神経芽腫,神経膠芽腫由来細胞株では発現がみられなかったが、一部の顆粒球系細胞株やK562などの比較的幼若な段階の血球細胞株には、α,β鎖発現の認められるものもあり、正常造血細胞に対する影響をさらに検討する必要がある。
脳波およびアンケート調査を用いた屋外空間における快適性評価に関する研究

本研究は、生理学的反応の一つである脳波を用いて、屋外空間における空間構成の違いによる心理的快適さの度合いを定量的に把握するものである。上記の目的を達成するため、特に平成30年度は、開放感・囲繞感の違いによる心理的快適さの度合いを定量的に把握するために、CG画像を用いて公園緑地における構成要素の物理特性である園路幅員、樹高、樹木間隔を変数とし、それぞれ8パタンのCG画像を作成して心理実験のサンプル画像とすることで脳波とアンケート調査による快適さの度合いの差について検証した。その結果、主に下記3点の結論が導かれた。1) CG画像を用いた脳波とアンケート結果の比較から、園路幅員の変化による脳波およびアンケート結果のリラックス度の挙動は一致する。また、園路幅員が狭いほど安静指数とともにリラックス度も低下することが確認された。2)植樹間隔の変化による脳波とアンケート結果によるリラックス度において不一致が生じた被験者は、従来の既存研究とは異なり、閉鎖的な緑地空間でリラックスする傾向が見られた。また、詳細なアンケートの結果と照合した場合、閉鎖的な緑地空間でリラックスした被験者は中学生までに住んでいたところ・育った環境に緑が少ない傾向があることが確認された。3)因子分析の結果、因子軸としては「心地よさ」と「開放感」が見出された。「心地よさ」軸は植樹間隔の影響を強く受け、「開放感」軸は樹高、園路幅員、植樹間隔に影響を受けることが分かった。また、開放感軸において顕著な値を示した画像は心地よさ軸において負の方向に評価され、心地よさ軸において正の方向に評価されている画像は開放感軸においては小さい値をとる傾向があることが確認された。平成29・30年度の実施計画に挙げられていた項目、公園等の緑地におけるリラックス効果に着目し、CG画像を用いた構成要素の物理特性の変化に基づく開放感・囲繞感の違い・心理的快適さの度合いについては、定量的に把握することができた。また、駅駅空間や公園等の緑地、街路空間といった現地における脳波観測およびアンケート調査の実験も一部完了しており、現在、その結果を分析するとともに研究成果として整理し、論文投稿に向けて最終の分析作業に入っている。加えて、駅駅空間や公園等の緑地、街路空間といった現地における脳波観測およびアンケート調査についても、既に静止画で動画による心理的イメージの違いを検証し、心理的快適さの度合いを定量的に把握する際の調査手法による違いがもたらす結果の差異についても検証作業を進めている。この成果については、本研究の最終年度に研究論文として結果を広く周知・公表するための準備を進めている。本研究では、上記の研究に着手し調査を進めるとともに、データ分析および研究成果の取り纏めに取り組んでいることから、進捗状況としてはおおむね順調に進展しているといえる。最終年度である本年度の実施計画は、駅駅空間や公園等の緑地、街路空間といった現地において、主にこれまで得られた研究成果である脳波観測およびアンケート調査の実験結果と被験者の属性との関連性、CG画像を用いた緑量や園路幅員等による心理的快適性評価の違い、そして被験者の育った環境や日常生活などといった属性による風景に対する心理的快適性の違いに関して本研究の成果として言及することであり、現在、その目標を達成するために分析作業を進めている。さらに、心理的快適性評価を計測する手法論として、風景のサンプルとして静止画および動画による違いを室内実験により明らかにするとともに、その再現性についても検証作業を進めている。本研究における最終年度は、これまでの成果である屋外空間における空間構成の違いによる心理的快適さの度合いを定量的に把握するため、現地における脳波およびアンケート調査による心理的快適性評価の差異、被験者の属性が結果に及ぼす影響、CG画像により定量的に風景の物理特性を調整した画像による心理的快適性評価を検証するとともに、静止画・動画を用いた脳波およびアンケート調査による比較検証実験についても実施し、これまでの成果を総括して、本研究の目的に応じた結論を導く予定である。本研究は、生理学的反応の一つである脳波を用いて、屋外空間における空間構成の違いによる心理的快適さの度合いを定量的に把握するとともに、従来の質問紙を用いたストレス評価SD法と比較し、空間の違いによる相違点を把握するものである。特に平成29年度は、従来公園等の緑地がリラックス効果を有することは一般的に認識されているなか、緑量の違いやその構成による心理的快適性を定量的に検証することを目的としている。平成29年度の実績として、まず屋外空間における空間構成の違いを把握するとともに、近景・中景・遠景域に領域を区分し、田や畑、樹木、森林といった緑地、市街地や海浜景観を望む風景などといった空間構成の違いや視対象の組み合わせパタンを実空間にて検証し、良好な景観を望むことができる視点場の抽出を行った。その研究成果は、平成29年度の論文として既に掲載されている。加えて、平成29年度は公園等の緑地におけるリラックス効果に着目し、CG画像を用いて、構成要素の物理特性に基づく開放感・囲繞感の違いによる心理的快適さの度合いを定量的に把握した。開放感・囲繞感の違いによる心理的快適さの度合いを定量的に把握するために、園路幅員、樹高、樹木間隔を変数とし8パタンのCG画像を作成した。そして脳波観測による心理分析とアンケート調査による結果の相違を対象空間毎に明らかにし、相違が生じた原因について被験者の性別や年代、生まれ育った環境、現在の日常生活の環境等を設問項目とするアンケート調査を実施することで、脳波観測による心理分析とアンケート調査による結果に相違の原因を検証している。

その結果は現在論文投稿中であり、その成果は平成30年度の論文に掲載される予定である。平成29年度の実施計画に挙げられていた項目、公園等の緑地におけるリラックス効果に着目し、CG画像を用いた構成要素の物理特性に基づく開放感・囲繞感の違いによる心理的快適さの度合いを定量的に把握する作業は完了しており、既に論文投稿済みである。また、駅駅空間や公園等の緑地、街路空間といった現地における脳波観測およびアンケート調査の実験も一部終了しており、現在その結果・成果を整理しており、論文投稿に向けて分析作業に入っている。加えて、駅駅空間や公園等の緑地、街路空間といった現地における脳波観測およびアンケート調査についても既に実験に入っていることから、進捗状況としてはおおむね順調に進展しているといえる。本研究は、生理学的反応の一つである脳波を用いて、屋外空間における空間構成の違いによる心理的快適さの度合いを定量的に把握するものである。上記の目的を達成するため、特に平成30年度は、開放感・囲繞感の違いによる心理的快適さの度合いを定量的に把握するために、CG画像を用いて公園緑地における構成要素の物理特性である園路幅員、樹高、樹木間隔を変数とし、それぞれ8パタンのCG画像を作成して心理実験のサンプル画像とすることで脳波とアンケート調査による快適さの度合いの差について検証した。その結果、主に下記3点の結論が導かれた。1) CG画像を用いた脳波とアンケート結果の比較から、園路幅員の変化による脳波およびアンケート結果のリラックス度の挙動は一致する。また、園路幅員が狭いほど安静指数とともにリラックス度も低下することが確認された。2)植樹間隔の変化による脳波とアンケート結果によるリラックス度において不一致が生じた被験者は、従来の既存研究とは異なり、閉鎖的な緑地空間でリラックスする傾向が見られた。また、詳細なアンケートの結果と照合した場合、閉鎖的な緑地空間でリラックスした被験者は中学生までに住んでいたところ・育った環境に緑が少ない傾向があることが確認された。3)因子分析の結果、因子軸としては「心地よさ」と「開放感」が見出された。「心地よさ」軸は植樹間隔の影響を強く受け、「開放感」軸は樹高、園路幅員、植樹間隔に影響を受けることが分かった。また、開放感軸において顕著な値を示した画像は心地よさ軸において負の方向に評価され、心地よさ軸において正の方向に評価されている画像は開放感軸においては小さい値をとる傾向があることが確認された。平成29・30年度の実施計画に挙げられていた項目、公園等の緑地におけるリラックス効果に着目し、CG画像を用いた構成要素の物理特性の変化に基づく開放感・囲繞感の違い・心理的快適さの度合いについては、定量的に把握することができた。また、駅駅空間や公園等の緑地、街路空間といった現地における脳波観測およびアンケート調査の実験も一部完了しており、現在、その結果を分析するとともに研究成果として整理し、論文投稿に向けて最終の分析作業に入っている。
炎症性遺伝子発現におけるp38MAPキナーゼの役割

リポ多糖(LPS)やインターフェロンガンマー(IFNγ)は、マクロファージにおいてケモカインなどの炎症性遺伝子の発現を相乗的に誘導する。この遺伝子発現にはNF-κBやSTAT1などの転写因子が関与するが、この転写制御にLPSやIFNγによって活性化されるリン酸化酵素がどのような役割を持っているのかは十分には明らかにはされていない。本研究課題では、LPSとIFNγによって相乗的に誘導されるケモカイン遺伝子CXCL9の転写制御におけるp38MAPキナーゼ(p38MAPK)の役割を検討するため解析を行い以下の結果が得られた。1)p38MAPKが核内においてLPSによって誘導されるNF-κB依存性転写活性を制御しているのか検討するため、Gal4のDNA結合領域にNF-κB RelAの転写活性化領域を結合させた発現ベクターをマクロファージ様RAW264.7細胞にGal4の結合配列をもつレポーター遺伝子とともにトランスフェクションし、ルシフェラーゼ活性を測定した。その結果、LPS刺激により、RelA依存性の転写活性は増強し、その転写活性の増強はp38MAPKの阻害剤によって抑制された。2)p38MAPKがLPSとIFNγによって相乗的に誘導されるCXCL9遺伝子のプロモーター上でのエンハンソームの形成に関与しているのかクロマチン免疫沈降法を用いて検討した。その結果、LPSとIFNγとの共刺激によりSTAT1、RelAならびにRNAポリメラーゼIIのリクルートが相乗的に増強し、この増強作用はp38MAPKの阻害剤によって抑制された。3)LPS、IFNγ刺激で誘導されるSer727のリン酸化は、LPSとIFNγの共刺激で若干の相加的作用は認められたが遺伝子発現で認められるような相乗的な誘導効果は認められなかった4)p38MAPKの活性化剤としてanisomycinを用いIFNγによるCXCL9の発現誘導についてノーザンプロットにて検討したところLPSとIFNγで認められるような相乗的な発現は認めらなかった。これらの結果は、p38MAPKはSTAT1のSer727のリン酸化を誘導するが、STAT1のSer727のリン酸化の増強だけではCXCL9遺伝子の転写活性の増強は誘導されないことを示している。以上の結果から、p38MAPKは、LPS、IFNγによるNF-κBならびにSTAT1を介したCXCL9遺伝子の転写制御に関与し、そのメカニズムはCXCL9遺伝子プロモーター上でのエンハンソームの形成を介した相乗的な転写活性の誘導に関与していることが示唆された。リポ多糖(LPS)やインターフェロンガンマー(IFNγ)は、マクロファージ活性化因子としてケモカインなどの炎症性遺伝子の発現を誘導する。

この転写活性化にはNF-κBやSTAT1などの転写因子が関与するが、この転写制御にLPSやIFNγによって活性化されるリン酸化酵素がどのような役割を果たしているのかは十分には明らかにはされていない。本研究課題では、LPSとIFNγによって相乗的に誘導されるケモカイン遺伝子CXCL9の転写制御におけるp38MAPキナーゼ(p38MAPK)の役割を検討するため以下の解析を行った。1)p38MAPKが核内においてLPSによって誘導されるNF-κB依存性転写活性を制御しているのか検討するため、Gal4のDNA結合領域にNF-κB RelAの転写活性化領域を結合させた発現ベクターを作製し、マクロファージ様RAW264.7細胞にGal4の結合配列をもつレポーター遺伝子とともにトランスフェクションし、ルシフェラーゼ活性を測定した。その結果、LPS刺激により、RelA依存性の転写活性は増強し、その転写活性の増強はp38MAPKの阻害剤によって抑制された。Gal4のDNA結合領域は、恒常的に核内に移行することから、LPS刺激により活性化したp38MAPKあるいはその下流の制御因子が核内でRelA依存性転写活性を増強している可能性が示唆された。2)p38MAPKがLPSとIFNγによって相乗的に誘導されるCXCL9遺伝子のプロモーター上でのエンハンソームの形成に関与しているのかクロマチン免疫沈降法を用いて検討した。その結果、LPSとIFNγとの共刺激によりSTAT1、RelAならびにコアクチベーターCBPのリクルートが相乗的に増強し、この増強作用はp38MAPKの阻害剤によって抑制された。この結果は、LPSとIFNγによるCXCL9遺伝子プロモーター上でのエンハンソームの形成に、p38MAPKが関与していることを示唆する。以上の結果より、p38MAPKは、LPS、IFNγによるNF-κBならびにSTAT1を介したCXCL9遺伝子の転写制御に関与し、核内におけるRelAの転写活性の制御、またCXCL9遺伝子プロモーター上でのエンハンソームの形成に関与していることが示唆された。一方、p38MAPKが直接CXCL9遺伝子のプロモーター上にリクルートされ、直接転写因子ののリン酸化に関与しているかについては十分な知見が得られなかった。マクロファージにおけるケモカインなど炎症性遺伝子の発現は、リポ多糖(LPS)やinterferon-γ(IFNγ)により増強され、この遺伝子発現にはLPS、IFNyによって活性化される転写因子NF-κBやSTAT1が関与している。本研究課題では、NF-κBやSTAT1によって誘導されるケモカイン遺伝子CXCL9の転写制御にP38MAPキナーゼがどのような役割を演じているのか明らかにする目的で解析を行ってきた。本年度の研究課題は、LPS、IFNγによって相乗的に誘導されるCXCL9遺伝子の発現におけるSTAT1のセリン残基(Ser727)のリン酸化の役割について解析を行った。従来よりマクロファージにおいてLPS、IFNγは、Ser727のリン酸化を増強することが知られおり、IFNyによって誘導されるSTAT1依存性の転写活性は、LPSとの共刺激により増強され、そのメカニズムにp38MAPKによるSer727の亢進が関係することが報告されている。
ゲノム刷込みに関連する哺乳類特異的遺伝子群の個体発生・系統発生における役割

現在の哺乳類の個体発生システムのなかで、哺乳類としての特徴を作り出すために機能した遺伝子をどのように同定するかという研究課題に対し、レトロトランスポゾンに由来するため哺乳類にのみ存在する遺伝子群を系統的に解析した。ノックアウトマウス作成による機能解析を行ない、これらの遺伝子が、哺乳類を特徴付ける胎生機構にかわかる胎盤形成、着床、妊娠継続等に関係する機能を有することを明らかにした。現在の哺乳類のもつ胎生という生殖様式やゲノムインプリンティングというエピジェネティクス機構などに代表される哺乳類に特徴的な個体発生システムは、生物進化上どのように形成されたのであろうか?本研究プロジェクトは、この系統発生学上の謎を、主として哺乳類ゲノムに保存される11個のsushi-ichiレトロトランスポゾン由来の遺伝子群の機能と起源の解析というゲノム科学的アプローチから解明することを目的としている。具体的な研究目標としては、1)レトロトランスポゾン由来の11個の遺伝子それぞれのノックアウトマウス解析による機能の解明、2)哺乳類を構成する3つのグループ(単孔類、有袋類、真獣類)における比較ゲノム解析、DNAメチル化解析およびゲノムインプリンティング解析による、これら遺伝子の起源およびゲノムインプリンティング機構の起源の解明3)レトロトランスポゾンから内在性遺伝子への遺伝子・タンパク質レベルでの進化の解明を考えている。これらのレトロトランスポゾン由来の遺伝子群の機能については、例えば、すでに明らかにしたようにPeg10やPeg11/Rtl1の胎盤形成・胎盤機能維持に関わる機能のように、何らかの哺乳類特異的な機能を想定している。胎盤の形成・維持に関しては、これに関係した遺伝子の獲得と胎生の起源の関係を明らかにしたい。また、この解析をとおして、胎盤以外の哺乳類特異的機能にも迫りたい。ゲノムインプリンティングやX染色体不活性化などの哺乳類特異的なエピジェネティック機構の起源は、「哺乳類がDNAメチル化をどのように利用してきたか」に大きく関係していると考えている。哺乳類のゲノムの半分がレトロトランスポゾン由来の配列の残骸で埋め尽くされているという事実とあわせて、このような観点からレトロトランスポゾン挿入とエピジェネティック機構の成立について考えてみたい。レトロトランスポゾン由来の遺伝子の産物が新しい機能をもつに至った、その経緯と現状を明らかにするため、遺伝子機能の解明に加えて、これらタンパク質の結晶化による構造解析からのアプローチも進めたいと考えている。哺乳類特異的レトロトランスポゾン由来の遺伝子であるPeg10が胎盤形成を通じて哺乳類の個体発生に必須の役割をはたすことを昨年度に発表した(Ono et al.Nat Genet 2006)。さらに、もう一つの同じレトロトランスポゾン由来の遺伝子Peg11/Rtl1についても機能解析を進めてきたが、Peg11/Rtl1が後期胎盤の機能維持に重要であり、この遺伝子の欠失および過剰発現はどちらも胎盤形態異常を伴う機能不全を引き起こすこと、また胎児期後期致死/新生児致死を引き起こす事を明らかにした(Sekita et al.投稿中)。Peg10とPeg11/Rtl1は同じレトロトランスポゾンに由来したと考えられ、どちらも哺乳類の個体発生に必須の機能をもつが、アミノ酸配列の違いから予想されるように機能的に異なった役割を果たしている。これらの結果は、哺乳類の進化という時間的に急速な変化にはレトロトランスポゾンの挿入とその内在遺伝子化という方法で様々な新機能が獲得されたことを示している。現在、これら2つの遺伝子と同じ由来を示すSirhファミリー遺伝子群についても、体系的なノックアウトマウス作成を開始し,また.Peg10に関してはタンパク質の機能解析と結晶化による構造決定を開始した。この哺乳類の胎生獲得に重要な機能を果たしたと考えられるPeg10が、生物進化上でいつ獲得されたのかを解析した。鳥類、両生類、魚類にはこの遺伝子は無く、哺乳類に特異的な遺伝子とこれまで考えられてきた。そこで、哺乳類を構成する3つのグループ(ヒトやマウスを含む真獣類、カンガルー・コアラ等の有袋類、カモノハシ・ハリモグラの単孔類)におけるゲノム比較解析を行い、その詳細な起源を決定した。有袋類にはアミノ酸配列が保存されたPEG10がゲノム上の位置も同じところに同定された。一方、単孔類にはこの遺伝子は存在しなかった。これにより単孔類と獣類が分岐した以降にPEG10のオリジナルなレトロトランスポゾンの挿入があり、その1匹の個体からすべての有袋類、真獣類が派生したという、哺乳類の進化の歴史が明らかとなった(Suzuki et al PLoSGenet in press)。また、有袋類のPEG10は真獣類同様に片親性発現をするインプリンティング遺伝子であり、真獣類でのインプリンティング制御に必須であるDNAメチル化の異なる領域(Differentially Methylated region : DMR)が存在していた。これは有袋類における初めてのDMRの発見であり、これによって真獣類と有袋類のゲノムインプリンティングが共通の機構から由来したことが明らかとなった。さらに有袋類ではPEG10のDMRだけがメチル化されているという事実は、DMRで制御されるゲノムインプリンティングがレトロトランスポゾンのDNAメチル化による抑制機構から生じた初めての実例であると考えられる。

レトロトランスポゾンはジェネティックな意味でも、エピジェネティックな意味でも、哺乳類ゲノム機能に大きな影響を与えていた事が明らかに出来たと考えている。われわれが同定したインプリント遺伝子Peg10は哺乳類にのみ特異的に存在するレトロトランスポゾン由来の遺伝子であり、これが胎盤形成に必須の機構をもつことを報告してきた.本年度は、同じレトロトランスポゾンに由来するインプリント遺伝子であるPeg11/Rt11もまた、後期の胎盤機能において重要な機能を果たすことを報告した(Sekita, et. al. Nat Genet 2008)。Peg11/Rt11は胎盤の中心的な機能である母親と胎児の栄養・ガス交換を行なう胎児毛細血管の維持に必須の機能を果たし、この遺伝子の欠失は胎児毛細血管の異常による胎児期後期の成長遅延や致死を引き起こす。また、この遺伝子の過剰発現は胎児毛細血管拡張という異なる異常により、新生児致死の原因となる。また、ヒトPEG11/RTL1が染色体14番父親性・母親性2倍体の主要原因遺伝子であることを、国立成育医療センター緒方部長グループとの共同研究で明らかにした(Kagami and Sekita, et. al. Nat Genet 2008)。哺乳類の3グループ(卵生の単孔類、胎生の有袋類と真獣類)のPEG10領域のゲノム解析を行ない、この遺伝子が胎生哺乳類にのみに存在することを明らかにした。これは胎盤の起源にこの遺伝子が重要な寄与を果たしたことを意味している。また、有袋類におけるPEG10のインプリンティング解析から、この領域のインプリンティング制御の原因がレトロトランスポゾンの挿入であることを明らかにした(Suzuki, et. al. PLoS Genet 2007)。レトロトランスポゾンの哺乳類の進化への影響の解析のため、Peg10やPeg11/Rt11と共通のレトロトランスポゾン(sushi-ichiレトロトランスポゾン)に由来し、哺乳類特異的に存在する他の遺伝子についても、同様なノックアマウス解析による機能解析を進めている。哺乳類ゲノムに存在する11個のsushi-ichiレトロトランスポゾン由来の内在性遺伝子機能解析と起源を解明し、哺乳類の個体発生と系統発生の関係を解き明かすのが本プロジェクトの目的である。これまでPeg10が胎盤形成に必須の機能をもち、その欠失は初期胚致死を引き起こすこと、Peg11/Rt11は胎盤機能維持に必須であり、その欠失は胎児期後期/新生児期の致死性と成長不良を引き起こすことを見ていた。本プロジェクトによりPeg11/Rt11の過剰発現も新生児期致死となることを発見し、マウス染色体12番遠位部、ヒトの染色体14番の母親性・父親性2倍体の重篤な表現型の原因が、それぞれPeg11/Rt11欠失・過剰発現にあることを明らかにした(Nat Genet 2008a、2008b)。また、新規Sirh7遺伝子のノックアウトマウスに胎盤構造異常という別の表現型が見られる事が明らかになり(発表準備中)
プラントアクティベーターが標的とする植物因子群の同定と植物免疫制御機構の解明

植物自身が持つ免疫力を高めることで病害を防除するプラントアクティベーター(PA)は次世代型の病害防除剤として注目されている。PAは病原体に直接作用せず、環境への負荷が小さい、耐性菌の発生リスクが低いといった特徴を有する。PAの開発には、殺菌性を指標とした開発手法が通用しないため、これまで効率的な選抜方法が存在しなかった。そこで、私たちが独自に開発した選抜法により、これまでに3万種以上の化合物を選抜した結果、植物の免疫力をアップする新規化合物を発見した。本剤を処理した植物は病原菌に対する抵抗力を発揮し、病原菌の感染を抑制した。本剤による環境低負荷型の農薬の開発が期待される。1標的遺伝子の破壊株および過剰発現株を用いた標的因子の機能解析前年度に取得および作製したモデル実験植物のアブラナ科植物シロイヌナズナの遺伝子破壊株および過剰発現株に、植物免疫を活性化する低分子化合物A1剤を処理し、アブラナ科植物に感染する病原糸状菌(カビ)のアブラナ科野菜類炭疽病菌を接種して防除価を検定した。その結果、A1剤とその類縁体はサリチル酸シグナル伝達経路に作用することが明らかになった。次いで、本剤の作用機作を明らかにするため、本剤をシロイヌナズナに処理し、サリチル酸シグナル伝達経路の有名なマーカー遺伝子であるPR-1とジャスモン酸/エチレンシグナル伝達経路の有名なマーカー遺伝子であるPDF1.2の発現プロファイルを詳細に解析した。その結果、処理初期には、PDF1.2遺伝子の速やかな発現誘導が認められ、次いでPDF1.2遺伝子の発現が低下するのと入れ替わりにPR-1遺伝子の強い発現誘導が認められた。また、他の防御応答遺伝子についても同様の傾向が認められた。これまでにサリチル酸防御応答とジャスモン酸防御応答は拮抗していることが報告されており、A1剤によるユニークな防御応答プロファイルの変化は非常に興味深く、今後も詳細に作用機作を解析する予定である。2植物免疫を活性化する低分子化合物に対する不感受性変異体の解析シロイヌナズナ変異体ライブラリーをスクリーニングした結果、数個の不感受性変異体が得られたが、後代で表現型が消失した。引き続きスクリーニングを行う予定である。1植物免疫を活性化する低分子化合物を処理したシロイヌナズナにおける構造-転写プロファイル相関解析による標的遺伝子の同定既に取得している低分子化合物A1およびその類縁体を用いて構造-転写プロファイル相関解析を実施し、標的遺伝子を探索した。シロイヌナズナの防御応答遺伝子群を活性化するA1剤はシロイヌナズナ生態型Col-0への前処理により、その後の炭疽病菌接種に対する病害防除効果を示した。A1剤の類縁化合物A2剤はA1剤と同等以上の炭疽病抑制効果示した。これに対して、類縁化合物A3剤は炭疽病抑制効果を示さなかった。このような病害防除効果(生物活性)の異なる類縁化合物をシロイヌナズナに処理して継時的にサンプリングした。次いで、それぞれのサンプルを用いてマイクロアレイ解析を実施することにより遺伝子発現プロファイルを取得した。低分子化合物処理による炭疽病抑制効果(生物活性データ)と各化合物処理した植物の遺伝子発現プロファイルとの相関解析を実施し、病害防除時特異的に発現または抑制する遺伝子群を絞り込み、これらをリスト化した。本成果によりこれら遺伝子群の特性が明らかになり、プラントアクティベーターの開発のための標準化システムの構築に資する。2標的遺伝子の破壊株および過剰発現株の作製1でリスト化した遺伝子群について、その特性を理解し、低分子化合物の処理による植物の防御応答シグナル伝達経路での作用機作を明らかにするため、ABRC(Arabidopsis Biological Resource Center)からこれら遺伝子の破壊株を取得し、自殖によりnull変異体を作製した。今後、これら変異体の特性を解析することで、植物の免疫機構が明らかになることが期待される。1標的遺伝子の破壊株および過剰発現株を用いた標的因子の機能解析前年度に引き続き、シロイヌナズナ野生株、遺伝子破壊株および過剰発現株に薬剤処理および炭疽病菌やその他の病原菌を接種し、病害感受度を検定した。マイクロアレイ解析により、A1剤は植物の病害防御応答において主要なサリチル酸シグナル伝達系に作用し、関連遺伝子の発現を強く誘導することを明らかにした。また、これら遺伝子は植物免疫の活性化のマーカー遺伝子としての利用が考えられ、新たなプラントアクティベーター開発のためのツールとして期待される。さらに、A1剤は植物の重要なシグナル物質と考えられている活性酸素種の発生を誘導した。2植物免疫を活性化する低分子化合物に対する不

感受性変異体の解析前年度に引き続き、変異体の原因遺伝子をマッピングするためのF1およびF2個体の取得を試み、A1剤に不感受性変異体を自殖し後代を得た。現在、後代の表現型を検定している。3シロイヌナズナ-Brassica rapa間比較ゲノム解析による標的因子の機能解析上述の課題のマイクロアレイ解析によって明らかになったA1剤処理により発現誘導する遺伝子群について、シロイヌナズナとB. rapa(ハクサイ)間の比較ゲノム解析を行った。B. rapaにおけるマイクロアレイ解析の結果から、A1剤はB. rapaにおいてもシロイヌナズナと同様にサリチル酸シグナル伝達系に作用することが示唆された。また、これら遺伝子群は、B. rapaにおける植物免疫の活性化のマーカー遺伝子としての利用が考えられ、新たなプラントアクティベーター開発のための評価ツールとして期待される。植物病理学これまでに報告されていない新規な低分子化合物を取得できた。また、従来と異なる作用機作の知見を発見できた。一方で、これら低分子化合物に対して不感受性のシロイヌナズナ変異体の取得が困難であった。独自に取得した植物免疫を活性化する数種類の低分子化合物のうち、1種の化合物について構造-転写プロファイル相関解析を実施した。本解析により特異的に発現が変動する遺伝子群を同定でき、計画通りに研究が進捗した。しかし、これら遺伝子群がどのように植物の防御応答に関わっているのかは未知数であり、今後は当該遺伝子を破壊した植物などによりその特性を解析する必要がある。また、未解析の化合物についても同様な解析を実施する予定である。取得した新規な低分子化合物の詳細な作用機作を明らかにするとともに、本剤を農作物(キュウリやアブラナ科作物など)に処理し、これら作物に感染する病原菌(炭疽病菌、斑葉細菌病菌、斑点細菌病菌など)を接種して防除効果を解析することで応用面での検討も行う。また、農作物における防御応答遺伝子の発現プロファイルを解析し、モデル実験植物の防御応答遺伝子と比較解析することにより、病害防御応答の普遍性を明らかにする。1植物免疫を活性化する低分子化合物を処理したシロイヌナズナにおける構造-転写プロファイル相関解析による標的遺伝子の同定:前年度に引き続き、複数の候補化合物について本解析を実施する。2標的遺伝子の破壊株および過剰発現株を用いた標的因子の機能解析:植物免疫を活性化する低分子化合物を処理したシロイヌナズナにおける構造-転写プロファイル相関解析の結果をもとに、さらに複数の化合物についてその類縁体および構造展開化合物を用いて構造-転写プロファイル相関解析を実施し、病害防除時特異的に発現または抑制する遺伝子群を取得する。24年度および25年度に取得した遺伝子群について、シロイヌナズナの遺伝子破壊株および過剰発現株をABRCから取得または独自に作製する。次いで、作製したシロイヌナズナの遺伝子破壊株および過剰発現株に炭疽病菌を接種し、病害感受度を検定する。表現型が変化した変異株の原因遺伝子は当該化合物処理により活性化する病害防御シグナル伝達ネットワークに関する因子と考えられる。さらに、プラントアクティベーター活性を有する既存剤(例:バイオンなど)の遺伝子発現プロファイルとの比較解析により、精度の高い解析を実施する。3植物免疫を活性化する低分子化合物に対する不
細胞内インスリンシグナルの分子制御機構とその異常

インスリンの細胞内シグナルについて、その代謝作用は主にPI3-キナーゼを介して伝達されていることが明らかにされていたが、その下流のシグナルについては不明であった。そこで、我々はインスリンの代謝作用を検討するのに最適と考えられる3T3-Ll脂肪細胞に、アデノウィルスベクターを用いて各種変異蛋白質を発現する方法を用いて、PI3-キナーゼ下流のインスリンシグナルの解析を試みた。その結果、PI3-キナーゼの下流では、Akt(PKB)とatypical PKC(PKCλ,PKCζ)という少なくとも2種のセリン、スレオニンキナーゼが働いており、インスリンによる蛋白合成の促進作用は主にAktにより、糖輸送の促進作用は主にatypical PKCにより伝達されていることを見い出した。また、Aktとatypical PKCはPI3-キナーゼの下流で互いに独立に働いていることも明らかにした。また、PI3-キナーゼの下流で働くRacについては、インスリンの代謝作用の伝達には重要な働きはしていないという成績を得た。インスリンによる糖輸送の活性化は、糖輸送担体GLUT4を含む小胞が細胞内から細胞膜へトランスロケーションすることで生じる。この際の機序はほとんど不明であるが、我々はSNARE仮説の立場から、3T3-Ll脂肪細胞における小胞と細胞膜の融合について検討した。その結果、この細胞では小胞に存在するVAMP2と細胞膜に存在するsyntaxin4の結合が重要であり、syntaxin4はMunc18cが結合しており、この結合によりVAMP2とsyntaxin4の結合が抑制されていることを見い出した。Racインスリン作用における役割については、dominant negativeの働きを有するAsn^<17>Racをアデノウィルスベクターに組み込んで、3T3-L1脂肪細胞に感染させ、この蛋白を発現させ検討した。この細胞において各種のインスリン作用を測定した結果、dominant negative Racはインスリンによる膜ラッフリングの形成を阻害したが、インスリンによる糖輸送の活性化は阻害しなかった。従って、Racはインスリンによる糖輸送の活性化には関与していないと結論された。次にPI-3-キナーゼの下流に位置するセリン・スレオニンキナーゼであるAktについて検討した。Aktの活性化には2種類の機構が働いていることが想定されている。すなわち、PHドメインにPI(3,4)2燐酸が結合する活性化とAkt-キナーゼによるAktの燐酸化である。そこで我々は3種類の蛋白変異Aktを作製した。(1)AktのPHドメインのみ、(2)Aktのキナーゼ活性の消失した変異体(179番目のリジンをアルギニンに置換)(3)Aktの燐酸化部位である308番目のスレオニンをアラニンに同時に473番目のセリンをアラニンに置換した変異体、以上の3種の変異体をアデノウェルスベクターを用いて各種の細胞で発現した。インスリン作用がこれらの蛋白の発現でどのように変化するかは今後の検討課題である。更に同じくPI-キナーゼの下流に位置すると考えられているPKCλについても同様の検討を加えた。PKCλのキナーゼ欠損変異体を作製して、アデノウィルスベクターに組み込んだ。これによりこの変異PKCλを各種細胞で発現しうるようになった。細胞内インスリンシグナルの分子制御機構を明らかにするために、対象として3T3ーL1脂肪細胞を用いることとした。この細胞は、糖輸送に対するインスリンの効果が78倍認められるなど、インスリンの代謝効果を検討するには最適の細胞と考えられている。しかしながら、3T3ーL1線維芽細胞から培養細胞系で脂肪細胞に分化させる必要があり、従って外来遺伝子の発現が難しいという問題点があった。我々は、アデノウィルスベクターを用いればこの点を克服できることを見い出した。

そして、アデノウィルスベクターを用いてPI3ーキナーゼのdominant negative変異体を3T3ーL1脂肪細胞に発現すると、インスリンによる糖輸送の活性化などのインスリン作用が低下することを見い出した。すなわち、インスリンの糖輸送活性化作用は、PI3ーキナーゼを介して伝達されていると考えられた。次に、PIー3キナーゼの下流について検討した。我々はPI3ーキナーゼの下流で働くと想定されているAktに関し、各種変異体を作製してアデノウィルスベクターを用いて3T3ーL1脂肪細胞に発現したが、AktーAA(Aktの燐酸化部位である308番目のスレオニンと473番目のセリンをともにアラニンに変えた変異体)のみがインスリンによる内因性Aktの活性化を阻害した。しかしながら、AktーAAはインスリンによる糖輸送の活性化を阻害せず、Aktはインスリンによる糖輸送の活性化に必要ないと考えられた。我々は、PKCλについて、そのキナーゼ欠失型変異体がインスリンによる内因性PKCλの活性化を阻害すること、ならびにこの変異体がインスリンによる糖輸送の活性化を阻害することを見い出した。従って、インスリンによる糖輸送の活性化にはPKCλが必要と考えられた。
アジア太平洋地域の学生交流促進に向けた実証的研究－UMAPの活性化をめざして－

平成29年度の研究はNAFSA年次大会(アメリカ)、EAIE年次大会(スペイン)、第6回APEC高等教育協力会議(ロシア)、AIEC年次大会(オーストラリア)、CBIE(カナダ)、APAIE(シンガポール)などに出席し、UMAPを中心としたアジア太平洋地域における学生交流に関する発表を行うとともに、国際会議・大会に出席している政府関係者及び、大学関係者に対するヒアリングを行い、国の政策と大学の国際戦略の関係について分析を行った。その中でも、特に英語圏であるカナダとアメリカが、UMAPへの参加を表明するなど、学生交流に関する新たな関心と問題意識が生まれていることが確認できた。8月18、19日にはUMAP国際事務局を担当する東洋大学、留学生教育学会と連携し、カナダ、アメリカ、オーストラリアから学生交流に関する専門家を招聘し、国際フォーラムとワークショップを開催した。アジア太平洋諸国の大学がどのような大学間連携を模索しているか、というニーズ調査を推進するための意見交換をおこなった。また、オーストラリア、カナダ、米国など発足当初のUMAPには参加していた英語圏諸国から関係機関の代表に参加を得て、今後、これらの国からUMAPへの参加を得ていくための課題検証について意見交換をおこなった。本フォーラムとワークショップには国内外の大学教員、大学職員、政府関係者等の150人を超える参加を得られた。2月15日、19日、3月26日にUMAPタスクフォース会議を開催し、本科研メンバーと各国国内委員会の代表が意見交換を行った。その中で、UMAPに実際に係る専門家に対し行ったSWOT分析や、日本国内のUMAP参加大学、非参加大学に対するUMAPに関するアンケート調査の分析を行い、今後のUMAPプログラムの発展に寄与するいくつかのアクションプランが提言された。本科研を遂行するにあたって、3つの課題に対応して研究活動を遂行している。ユニット1では地域間学生交流のガバナンス・モデルの提案を目的に、各国のニーズ調査を中心に行った。具体的には(1)UMAPと他の大学間ネットワークの比較検証(2)調査表の作成(AND/ORインタビューのためのガイドライン作成)(3)重点国(オーストラリア、カナダ、ロシア等の調査)を中心に学生交流に関するニーズ分析を行った。ユニット2では学習成果・成績等の共通のプラットフォーム構築に向けた取り組みを行った。具体的には(1)UCTS(UMAP Credit Transfer Scheme)の基本概念の共有と意見交換(2)単位や成績の互換性を高めるための情報共有と意見交換ーシラバス、成績基準、学習成果分析(アセスメント)にかかわる共通理解の促進をおこなった。Eポートフォリオの構築及び、UMAPオンラインシステムと他の大学間ネットワークがもつオンラインシステムとの連携の可能性についても検証を加え、次年度以降に取り組みを継続する。ユニット3では地域学生交流ネットワークの交流枠組みの提案を目的として、実務者に対しヒアリングと将来への提言を行った。APAIE年次総会(2018年3月、シンガポール)では、各種の大学間ネットワークとUMAPの比較分析を行うセッションを主催し、研究者や実務家から意見を聴取することができたことは本年度の成果として意義深い。2018年度においては、カナダ、中国、アメリカをはじめとする主要国がUMAPに参加することが決定しており、UMAPの学生交流が活発化することが期待されている。こうした中で、科研メンバーもNAFSA、EAIE、APAIEなどの国際会議に参加し、主要国のUMAPの活用方針、参加形態などについても分析、調査をおこなっていく。また、以下の3つのユニットにおいて、それぞれ研究を推進し、地域間学生交流を促進する大学間連携ネットワーク発展の可能性について考察する。ユニット1では、各国における政府・大学間連携の分析を進める。29年度に実施したヒアリング結果について分析を進めるとともに、オーストラリア・ロシア・インド・インドネシア等におけるヒアリング調査を実施する。ユニット2では、国際通用性・質保障の共通課題の抽出を行う。特に、2018年9月から正式に運用を開始するUMAPオンラインシステムに歩調を合わせ、同システム上にUMAP参加学生向けEポートフォリオを設置するための開発準備をおこなう。ユニット3では、地域別学生交流ネットワークの連携の可能性を模索する。本年度はUMAP、AUN、AIMS、GMS-UCなどの関係者を集めた国際シンポジウムを開催し、複数の学生交流ネットワーク間の連携の可能性を検討する。

2月15日、19日、3月26日にUMAPタスクフォース会議を開催し、本科研メンバーと各国国内委員会の代表が意見交換を行った。その中で、UMAPに実際に係る専門家に対し行ったSWOT分析や、日本国内のUMAP参加大学、非参加大学に対するUMAPに関するアンケート調査の分析を行い、今後のUMAPプログラムの発展に寄与するいくつかのアクションプランが提言された。本科研を遂行するにあたって、3つの課題に対応して研究活動を遂行している。ユニット1では地域間学生交流のガバナンス・モデルの提案を目的に、各国のニーズ調査を中心に行った。具体的には(1)UMAPと他の大学間ネットワークの比較検証(2)調査表の作成(AND/ORインタビューのためのガイドライン作成)(3)重点国(オーストラリア、カナダ、ロシア等の調査)を中心に学生交流に関するニーズ分析を行った。ユニット2では学習成果・成績等の共通のプラットフォーム構築に向けた取り組みを行った。具体的には(1)UCTS(UMAP Credit Transfer Scheme)の基本概念の共有と意見交換(2)単位や成績の互換性を高めるための情報共有と意見交換ーシラバス、成績基準、学習成果分析(アセスメント)にかかわる共通理解の促進をおこなった。Eポートフォリオの構築及び、UMAPオンラインシステムと他の大学間ネットワークがもつオンラインシステムとの連携の可能性についても検証を加え、次年度以降に取り組みを継続する。ユニット3では地域学生交流ネットワークの交流枠組みの提案を目的として、実務者に対しヒアリングと将来への提言を行った。APAIE年次総会(2018年3月、シンガポール)では、各種の大学間ネットワークとUMAPの比較分析を行うセッションを主催し、研究者や実務家から意見を聴取することができたことは本年度の成果として意義深い。2018年度においては、カナダ、中国、アメリカをはじめとする主要国がUMAPに参加することが決定しており、UMAPの学生交流が活発化することが期待されている。こうした中で、科研メンバーもNAFSA、EAIE、APAIEなどの国際会議に参加し、主要国のUMAPの活用方針、参加形態などについても分析、調査をおこなっていく。また、以下の3つのユニットにおいて、それぞれ研究を推進し、地域間学生交流を促進する大学間連携ネットワーク発展の可能性について考察する。ユニット1では、各国における政府・大学間連携の分析を進める。29年度に実施したヒアリング結果について分析を進めるとともに、オーストラリア・ロシア・インド・インドネシア等におけるヒアリング調査を実施する。ユニット2では、国際通用性・質保障の共通課題の抽出を行う。
重症男性不妊症/無精子症に対する新しい受精法-卵細胞質内spermatid核注入法

ウサギの円形精子細胞を卵細胞質内に注入することにより受精およびその後の胚の発育が認められる。しかし精巣機能障害よりの円形精子細胞の受精能についての検討はなっかった。ニュージーランドホワイトラビット5羽に対し左精索静脈瘤を作製し、精巣機能障害を作製した。このウサギからの円形精子細胞を使用し円形精子細胞核注入法を施行しその受精率、妊娠率などをコントロール群と比較検討した。その結果、分割胚の割合は精索静脈瘤23%に対しコントロール群82%、産仔数はそれぞれ0(0%)と6羽(9%)であった。このことより機能障害を有する精巣からの円形精子細胞も受精能および胚の発育が可能であることが示された。しかしながらその割合は正常な精巣由来の円形精子細胞を使用した場合に比較して有意に低値であった。以上より精巣機能障害は円形精子細胞の受精能を低下させることが示唆された。また円形精子細胞核注入法での受精、着床、妊娠率の向上のため、卵の活性化に機械的刺激だけでなく、これに電気刺激を併用し検討した。併用群と機械刺激単独群では卵活性化率は100%と85%、着床成功率は43%と23%、出産率は13%と1%であった。この結果より機械的刺激と電気刺激の併用は円形精子核注入法でよりよい結果を得るためには有用であると思われた。ウサギに実験的に精索静脈瘤を作製し、この精巣から分離したround spermatidを用いて卵細胞質内spermatid核注入を行う.8か月の成熟雄ウサギに於いて、左腎静脈と精巣静脈の交通枝の絞扼により左精索静脈瘤モデルを作製する.約5ヶ月後、精巣障害の発生を確認して精巣を摘出する.精巣組織をPBS中で細切してフィルター(45μm)で濾過してspermatidを分離する.Triton X-100を含むsucrose solution中で遠心分離しspermatid核を分離する.卵はFSH.hCGでウサギを過排卵処理しhCG投与後19時間で卵管より採卵する.顆粒膜細胞を除去した卵細胞に電気刺激を行い、micromanipulatorを用いてspermatid核を注入し培養する.得られた分割胚を偽妊娠雌ウサギに移植する.受精率、胚発生率、妊娠率を対照の正常spermatid核注入群と比較した.以下の結果を得た.(1)左精索静脈瘤は、精子だけでなく、round spermatidに対しても悪影響をおよぼし、受精率および妊娠率を低下させることが示唆された。(2)round spermatid核注入法は、正常のround spermatid注入に比べ、受精率も妊娠率も有意に高値であった.ウサギの円形精子細胞を卵細胞質内に注入することにより受精およびその後の胚の発育が認められる。しかし精巣機能障害よりの円形精子細胞の受精能についての検討はなかった。その結果、分割胚の割合は精索静脈群23%に対しコントロール群82%、産仔数はそれぞれ0(0%)と6羽(9%)であった。