hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
慢性疼痛発症・維持機構としての脊髄グリア・血管・ニューロン相互連関の分子基盤

末梢神経障害後の難治性疼痛を示すモデル動物を用いて、その疼痛メカニズムに関する以下の成果を挙げることが出来た。1.末梢神経障害後の脊髄マイクログリアにおけるPGD2 synthase及びTXA2 synthaseの増加と疼痛メカニズムへの関与2.末梢神経障害後のマイクログリアにおけるP2Y12/13の下流のROCKシグナルの疼痛メカニズムへの関与3.末梢神経傷害後末梢組織で発現増加するArteminのTRPV1/TRPA1発現制御4.脂質メディエーター、ロイコトリエンの脊髄に対する影響の電気生理学的解析5.脊髄マイクログリアにおけるPGI2発現とその神経障害性疼痛における役割慢性疼痛特に神経障害性疼痛モデルの脊髄グリア細胞、血管内皮及びニューロンにおいて、1)障害を受けた末梢神経の脊髄終末部の血管内皮における各種プロスタノイドの各合成酵素の発現動態を詳細に検討する。2)ATP受容体P2Y12,13受容体の細胞内シグナル伝達系の解明、特に低分子G蛋白であるRhoの活性化を中心にその活性化動態を検討する。以上の2点につき、実験を中心的に進め、以下の途中経過の結果が得られている。1.ラットの末梢神経障害後に、脊髄マイクログリアにおいて、COX-1及びPGD2の合成酵素であるPGD2 synthase及びTXASの合成酵素であるTXA2 synthaseの増加が確認された。これはin situハイブリダイゼーション法及び二重標識法により得られた結果である。2.PGD2の受容体が脊髄ニューロンにおいて発現が明らかとなった。また、COX-1阻害剤やDP2の拮抗剤投与により、神経障害性疼痛の痛覚過敏行動が抑制された。これらの結果は、雑誌GLIAに発表した。3.末梢神経障害後のマイクログリアにおけるP2Y12/13の下流のシグナルについて精査した。特に細胞外ATPや末梢神経障害がP2Y12/13やROCK (Rho-associated coiled-coil-containing protein kinase)を介して、p38MAPKを活性化するか否かについて検討した。その結果、ROCK阻害剤はp38の活性化のみならず、2Me-SADP投与による痛覚過敏や脊髄マイクログリアの活性化を抑制することがわかった。興味深いことに、ROCK阻害剤は、末梢神経後のマイクログリアの増加を抑制することは出来なかった。以上の結果は他の結果と合わせて、外国一流雑誌に投稿し、現在Revise中である。慢性疼痛、特に神経障害性疼痛モデルの脊髄グリア細胞、血管内皮及びニューロンにおいて、1)障害を受けた末梢神経の脊髄終末部の血管内皮における各種プロスタノイドの各合成酵素の発現動態を詳細に検討する。以上の2点につき、実験を中心的に進め、以下の成果の発表や、途中経過の結果が得られている。1.昨年、GLIAに発表したCOX-1/PGD2系の合成酵素の脊髄ニューロンでの発現と神経障害性疼痛との関連に引き続き、COX-2とその下流の酵素発現と神経障害性疼痛の関連を精査している。その結果、ラットの末梢神経障害後に、脊髄内血管内皮においてCOX-2及びPGI2の合成酵素であるPGI2 synthaseの発現増加が観察された。また、PGI2の受容体が脊髄ニューロンにおいて発現していることを確認出来た。内皮細胞での発現増加を介在する分子として、脊髄マイクログリアで増加するTNFαが有力候補として見つかり、TNFα投与により末梢神経障害後で生じる種々の現象を再現することが出来た。現在、最終的な論文作成のための詰めの実験を施行中で、近々投稿予定である。2.末梢神経障害後のマイクログリアにおけるP2Y12/13の下流のシグナルについて精査した。以上の結果は他の結果と合わせて、外国一流雑誌であるGLIAに発表した。末梢神経障害後の難治性疼痛を示すモデル動物において、神経障害後の脊髄における血管内皮細胞/グリア細胞/ニューロンに活性化する因子を同定し、3者間の相互連関と神経障害性疼痛の関係を解明する。この1年間での成果は以下の通りである。1.脊髄マイクログリアにおけるPGI2発現とその神経障害性疼痛における役割:ラットの末梢神経障害後に、脊髄内血管内皮において、COX-2及びPGI2の合成酵素であるPGI2 synthaseの発現増加が観察された。

過去の論文のデータとの差異という最も大きな問題をクリアするために、コントロール実験や確認実験を繰り返してきた。データもまとまり、現在投稿直前である。2.脂質メディエーター、ロイコトリエンの脊髄に対する影響の電気生理学的解析:電気生理学的手法(パッチクランプ法)にて脊髄ニューロンに対するLTB4投与の影響を解析すると、神経障害性疼痛モデルの脊髄ニューロンのNMDA誘発内向き電流を有意に増加させることがわかった。この効果は受容体の拮抗剤で切れ、さらに細胞内のG蛋白を介していることも判った。これらの結果はMol Painに発表した。3.末梢神経傷害後発現増加するArteminの影響:末梢神経傷害後、皮膚のケラチノサイトでArtemin発現が増加し、それがDRGニューロンにおけるTRPV1/TRPA1の発現を制御していることを、種々のin vivo及びin vitro実験で証明した。末梢神経障害後の難治性疼痛を示すモデル動物を用いて、その疼痛メカニズムに関する以下の成果を挙げることが出来た。1.末梢神経障害後の脊髄マイクログリアにおけるPGD2 synthase及びTXA2 synthaseの増加と疼痛メカニズムへの関与2.末梢神経障害後のマイクログリアにおけるP2Y12/13の下流のROCKシグナルの疼痛メカニズムへの関与3.末梢神経傷害後末梢組織で発現増加するArteminのTRPV1/TRPA1発現制御4.脂質メディエーター、ロイコトリエンの脊髄に対する影響の電気生理学的解析5.脊髄マイクログリアにおけるPGI2発現とその神経障害性疼痛における役割本プロジェクトにより、COX-1の発現及びPGD2の発現を脊髄マイクログリアで証明し、難治性疼痛のメカニズムに関与していることを、昨年国際一流紙のGLIAに発表することが出来た。また現在進行中のプロジェクトも、COXー2発現とPGI2合成酵素の発現を、脊髄血管内皮で証明することが出来ており、脊髄グリア細胞と血管内皮及び脊髄ニューロンの3者間の相互関係を示すデータが揃いつつある。最終の実験を施行中であって投稿直前まで進捗しており、今年度中に発表できるように最大限の努力をする予定である。以上の状況により、おおむね順調に進展していると判断できる。27年度が最終年度であるため、記入しない。神経解剖学疼痛基礎研究最大の問題点は、現在投稿予定の成果の一部が、過去の他施設から発表されているデータと一致しない点である。特にその論文が世界的な超一流紙であるため、我々の成果を納得してもらうためには相当の苦労が予想される。繰り返し実験や複数の裏付け実験等を精密に繰り返して、論文を作成する予定である。既に第1の課題であるPGD2の合成酵素関係のデータは、GLIAに発表することが出来た。これはPGD2がC0X-1支配下にマイクログリアで調節されていることを示す貴重な結果となった。また、その継続部分であるPGIS関係も順調に実験が進んでいる。第2の課題であるマイクログリアにおけるROCK関係も順調にデータがでて、既に投稿し、レフリーのコメントを得て再実験を行っている状況である。
WR星の星風の観測によるGRB周辺環境の研究

最近の研究から、Low metalicityな環境で生まれたWolf-Rayet星がガンマ線バーストの前駆星の最有力候補として注目されている。ガンマ線バーストは超新星の爆発エネルギーが爆発前に撒き散らされたWoif-Rayet windに追いつくことで外部衝撃波を立て、残光としてX線等が放射されている可能性が考えられる。またそのスペクトルはその周りを囲うWolf-Rayef windによる吸収を受ける。したがって、ガンマ線バーストの前駆星の星風の解明が、ガンマ線バーストの理解を推し進める重要な因子になっている。我々は、はえ座θ型星のWC型の星風のアパンダンスを測定し、C/N(炭素/窒素)比が太陽組成を桁で超えることを見つけた。WC星を親星とするガンマ線バーストが発生した時には、この炭素と酸素の吸収を受けることが予想される。したがって、ガンマ線バーストの吸収構造を調べることで、その前駆星の起源が検証できることを観測的に立証した重要な観測結果であると考えている。また、この連星は周期19日の連星と思われていたが、我々の特性X線を用いたドップラー解析で周期130年以上の3番目の伴星が存在することがわかった。一例であるが、Wolf-Rayet星の連星率が高い可能性を支持する結果であり、我々が推進しているX線の分光観測がWolf-Rayet星の連星率の導出にも有効であることを示唆している。
リボソーム蛋白L7aを含む遺伝子クラスターの解析

リボソーム蛋白L7aを含む遺伝子のクラスター構造と機能を明らかにするために、鶏胚の遺伝子ライブラリーから単離されたクローンの解析を行った。このクローンは3.6kbpのL7a遺伝子を含んでいたが、その前後の断片をプローブにして得られた数個のcDNAクローンはL7a遺伝子の両側に位置する二つの遺伝子に由来していた。マウスの関連する領域との比較から、20kbpの範囲に少なくとも四個の遺伝子(CLG13、リボソーム蛋白L7a)が密なクラスターをとっていることが解かった。CLG1はL7a遺伝子の転写開始点から約550bp離れたところにその5'末端が向き合って存在していた。CLG2はL7a遺伝子の下流に反対向きに位置し、互いのポリ(A)付加部位間の距離は223bpであった。CLG3はL7aの更に下流にCLG2と向き合って存在し、互いの転写開始点は190bp以内の距離にあると思われた。データベースを利用した検索でCLG2とCLG3はマウスでの関連する遺伝子サーフ1とサーフ2に相同であることが解かったがその機能はしられていない。CLG1は分子量約9,000の酸性蛋白質(pl4.9)と予測されたが相同な蛋白は見つかっていない。これらの遺伝子いずれも5'上流配列にTATAboxをもたず、CpGに富むなどハウスキーピング遺伝子としての特徴をもっていた。一方、L7a遺伝子は-155から-75の間に強いプロモーター活性を持ち、その中のCTTCCGGの3回の繰り返し配列が核蛋白の結合部位であることが確認された。この結合配列は癌遺伝子産物Etsの認識配列としてよく知られているが隣接する遺伝子上流の調節領域にも存在していた。このことはクラスターを構成する各遺伝子が同じ癌遺伝子産物の転写調節を受けていることを示唆している。高等動物のリボソーム蛋白L7a遺伝子の周囲にはいくかの発現している遺伝子が密集して並んでいる。このようなクラスター構造は他に類を見ないものである。サーフと呼ばれるこの遺伝子群がどんな蛋白をコードし、このような集合構造がどんな機能的意義をもつのか、という興味でこの実験を進めている。すでに構造解析を終えている鶏のL7a遺伝子の前後約6Kbpの塩基配列を決定した。L7a遺伝子の下流にマウスのサーフ1及びサーフ2遺伝子のエクソンと相同する箇所が見いだされ、鶏でも同様な密なクラスターを形成していると思われる。同時にL7a遺伝子の下流及び上流の一部をプローブとして鶏cDNAライブラリーをスクリーニングし、得られた数個のクローンの塩基配列を現在解析中である。また、L7a遺伝子のプロモーター領域を解析すると、-134から-50bpの間にTTCCGGを共通配列とする4回の繰り返し配列が存在するが、これに類似の配列がマウスの隣接する遺伝子の転写調節領域にも見いだされる。L7aにおいてはこの領域は、LMH細胞に導入したCAT assayで強いプロモーター活性を示し、TTCCGG配列はフットプリント法、ゲルシフト法で、核蛋白との結合部位であることが確認された。この配列は、クラスターを構成する各遺伝子に共通な転写因子の結合部位であると考えている。UV-cross linking法の結果から主たる結合蛋白質は分子量約45,000と推定された。今後この因子の精製を進め、個々のサーフ遺伝子の転写活性にも及ぼす影響等を調べていきたい。マウスのリボソーム蛋白L7a遺伝子は他のいくつかの機能不明な遺伝子とクラスター構造をとっているが、このような集合構造をとることの意味についてはまったく解っていない。

我々はこれまでに鶏胚の遺伝子ライブラリーからL7a cDNAをプローブに約18Kbpのクローンを得、L7a遺伝子の前後、計約13Kbpの塩基配列を決定した。今回L7a遺伝子の上流及び下流の数百bpをプローブにcDNAクローニングを行い、L7a遺伝子の両側二つの遺伝子を同定した。その中の一つ、CLG1はL7a遺伝子の上流から約550bp離れたところにその5'末端が向き合って位置し、2つのエクソンから構成されていた。cDNAの全長は312bpでコードする蛋白は、分子量約9,000の酸性蛋白質(pI4.9)と予測されたが、データベース検索でも相同する蛋白は見つからなかった。CLG2はcDNAの5'末端が欠けてはいたがL7a遺伝子の3'末端から233bp離れてその3'末端があり、マウスでのクラスター構成遺伝子の1つであるサーフ1と高いホモロジーを示した。8つのエクソンから構成され、イントロンの挿入部位もマウスと一致していた。CLG3のcDNAの単離には未だ成功していないが、マウスのサーフ遺伝子クラスターとの比較により、その遺伝子の配列はサーフ2と相同であった。エクソン1から4までしか解析していないが、エクソンの保存性はかなり高くイントロンの挿入部位もマウスと同じであり、CLG2に向き合って190bp以内の距離にあると思われる。これらの結果から鶏のリボソーム蛋白L7aの前後には少なくとも3つの遺伝子が密接に並んでいた。これらの遺伝子はいずれも5'上流配列にTATA boxをもたず、CpGに富むなどハウスキーピング遺伝子としての特徴をもっていた。それらのコードする蛋白の機能は今のところまったく不明であるが、CLG2とCLG3はマウスのサーフ1とサーフ2に相同で、鳥類から哺乳類へとの長い進化の過程でもその遺伝子構造及び蛋白構造が高度に保存されていたことから細胞の基本的な構成成分と関わっている可能性を示唆している。現在、これらの発現の組織特異性及び成長段階での発現量の違いを調べている。
冷却原子気体における熱平衡化ダイナミクスの普遍性

本研究は、冷却原子気体を舞台として孤立量子系の熱平衡化ダイナミクスの普遍性を明らかにすることを目的とする。具体的には、粗視化ダイナミクスを基軸に(1)周期外力場中のスピナーBose気体の緩和現象と(2)1成分Bose気体における乱流減衰を解析・数値的に研究する。研究(1)では、フロケエンジアリングの手法をスピナーBose気体に適用することで、有効ハミルトニアンを導出して、その緩和現象を理論的に調べる。研究(2)では、平均場方程式の数値計算とくりこみ群に基づく計算を行い、乱流減衰の普遍性を明らかにする。また、本研究(2)は国外の実験グループとの共同研究であり、得られた理論結果を実験と比較する。
T細胞活性化におけるTCRミクロクラスター形成とラフト動態の時空間制御の解析

獲得免疫を司るT細胞が抗原提示細胞によって活性化される時、接着面一面に形成されたT細胞受容体(TCR)ミクロクラスターが中央に集まり免疫シナプスと呼ばれる構造を作る。本研究は、飽和脂肪酸の集合体であるラフトの集積が分子の集合や免疫シナプス形成を促すという説に対して、ラフトの集積とされた現象はTCR等の細胞内取り込みに伴う細胞膜の集積であり、ラフトの役割はラフトに親和性を持つ分子の細胞膜への配置にあることを示した。T細胞は抗原提示細胞との接着面に免疫シナプスと呼ばれる構造を作ることから、免疫シナプスの形成こそが活性化であると予測されていた。しかし我々は、免疫シナプスが形成される数分前に接着面一面に形成されるTCRのミクロクラスターから活性化が始まっている事を明らかにした。本研究ではTCRミクロクラスター形成に関してラフトが果たす役割を明らかにする。従来受容体やシグナル分子を会合させるシグナル伝達の足場であるとされてきたラフトに関して、ラフトはクラスターを作らないとするデータも多く出されており真意の程はわからないのが現状である。T細胞にラベルしたTCRとラフトプローブを導入して、MHC分子と接着分子を含む脂質二重膜上に落とし、接着面にできるTCRクラスターとラフトを観察した。ラフトプローブとしてはコレラトキシン、ラフト局在分子LATやlckの細胞内部分を削った変異体を用いた。なお、計画段階でTCRのラベルに使用する予定だったmRFP, mCherry, KusabiraOrangeはいずれも細胞内ベジクルに蓄積してしまい本実験には不都合であり、別のラベル方法に変更する必要に迫られた。そこで細胞に蛍光リガンドを取り込ませるとHalo Tagをラベルした目的分子のみが染まるという新しい手法に挑み、本実験系への導入に成功した。Halo Tagの導入によって2種類の分子の動態を同時に追う事ができるようになり、データの質が格段に向上した。Halo tagでラベルしたTCRとラフトプローブを同一細胞内で同時に観察した所、いずれのプローブにもTCRクラスターの場所に集まる様子は見られなかった。この結果はラフト自身がクラスターを作るという定説を覆す、重要なデータである。今後はラフトプローブではなくラフト局在分子について実験を行い、分子のラフト局在が与える影響からラフトの意義を追究して行く。T細胞と抗原提示細胞の接着面に観察されるTCRの集積は免疫シナプスと呼ばれ、活性化の場であると予測されていた。従来シグナル伝達の足場を作るとされてきたラフトの会合、集積に関して、ラフトは集積しないとするデータも多く出されており真意の程はわからないのが現状である。昨年までに、HalotagでラベルしたTCRとラフトプローブを同一T細胞内に導入し、MHC分子と接着分子を含む脂質二重膜上に落としても、接着面にできるTCRクラスターの場所にラフトが集まる様子は見られない事を報告した。本年度は、抗原提示細胞とT細胞が接触しシナプスを作っている所を動画撮影する事に挑戦し成功した。この実験では接着面に対して垂直方向に観察したが、面白い事に免疫シナプス周辺でのラフトの動きはTCRと一致せず、ラフトの集積も認められなかった。この結果は、ラフトが集積して足場を作るのではない事を示す、より生理的で重要なデータであると思われる。しかし光学顕微鏡で観察できる程度の集積はなくても、もっと微小な環境での分子間相互作用が変化している可能性が残されている。そこで、分子レベルの距離を測る方法であるFRETを用いてラフトとTCRの距離を観察すべく蛍光プローブの作成及び探索を行い、FRETを起こすプローブを得るところまで進めた。また、ラフトの積極的な役割を解明するためラフト局在分子の変異体を用いての観察の準備も行った。T細胞と抗原提示細胞の接着面に観察されるT細胞受容体(TCR)の集積は免疫シナプスと呼ばれ、T細胞活性化に重要な構造である。近年、顕微鏡技術が免疫シナプス研究に駆使されより詳細な解析が進み、免疫シナプスが形成される数分前に接着面一面に形成されるTCRのミクロクラスターから活性化が始まっている事が明らかにされた。本研究はTCRミクロクラスター形成におけるラフトの役割の解明を目的とした。ラフト研究は、免疫シナプスヘのラフトの集積がシグナルの足場を作るとした従来の説に対してラフトは集積しないとするデータも出されるなど意見が分かれているが、本研究でシグナルの開始点であるTCRミクロクラスターにおけるラフトの役割を解明し議論に決着をつけたい。

昨年までに、TCRミクロクラスターにラフトが集まる様子は見られない事、免疫シナプス周辺でのラフトの動きはTCRと一致せずラフトの集積はTCRよりも遅れる事から、ラフトがクラスター形成に不必要である事を示した。今年度はFRETを用いて更に微小な環境でのラフトとTCRやLAT(ラフト局在、活性化に必須なアダプター分子)との相互作用を観察した所、TCRミクロクラスターでラフトとTCR、LATのFRET効率は下がる、つまりシグナル分子のクラスターでラフトはむしろ排除されている事が明らかになった。最後にラフトのポジティブな役割を求めラフト局在分子であるLAT様々な変異体について調べた所、ラフトに局在できないと細胞膜に出られないのでT細胞活性化を止めてしまうが、ラフトに局在しなくても細胞膜に配置できればクラスターを作り活性化を促す事ができた。以上のデータから、ラフトはクラスターの形成、維持に必要ないがラフト局在分子を細胞膜に配置する為に必要である事を証明し、論文にまとめた。
超対称性の低エネルギー拡大現象とそれを用いた超共形場理論の解明

平成30年度は、研究実施計画に沿って4次元N=1ラグランジアン理論の低エネルギー固定点を分類する研究を推進した。特に、低エネルギー固定点を持つ最も単純なラグランジアン理論である、N=1超対称SU(2)ゲージ理論において、その変形によって得られるすべての低エネルギー固定点を調べ、その特徴を明らかにした。また、その中に前年度に調べた超対称性が拡大するような固定点が含まれることを示した。この点に関して論文を発表した他、より一般的なゲージ理論の場合の研究を現在行なっている。上記のように既に発表した論文に加え準備段階の論文もいくつかあり、計画に沿った研究の成果が得られている。最終年度は、過去2年間で得た知識を元に、さらに発展する内容(ディフェクトや可積分系との関連)に関する研究を推進していく予定である。平成29年度は、研究実施計画に沿って超対称性が低エネルギーで拡大する4次元ラグランジアン理論の探索とその拡大条件、拡大理由の解明に焦点を当て研究を進めた。まず、超対称性が低エネルギーで拡大する条件について考察を行った。このラグランジアン理論はN=2理論の変形として得られることが知られており、後者の理論に関係する2次元カイラル代数のSugawara条件が低エネルギーでの超対称性の拡大と関係していることを、様々な場合でチェックした。多くの場合ではこの条件が満たされているが、満たされていても拡大が起きない場合もあり、全容の解明を行なっているところである。超対称性が拡大する理由の解明に関しては、特に低エネルギーでの真空構造をラグランジアン理論の観点から調べることにより、真空がクーロン相であることや、それを記述するSeiberg-Witten曲線等を導出することに成功した。これらの研究は超対称性の拡大現象の解明に欠かせないものであり、今後の研究においても有用となるものである。また、低エネルギーでE7型の対称性を持つN=2超共形場理論を固定点として持つような上記とは異なる模型を発見し、その超共形指数の計算に成功した。さらに、関連する研究として、4次元N=1 SU(2)ゲージ理論の可能な全ての変形に対する低エネルギー固定点を分類し調べた。これらには上記の超対称性が拡大する固定点もあるが、その多くはN=1超対称な固定点である。実際これまで知られていなかった新たな固定点が存在することを発見し、現在論文を準備段階である。また、N=1ゲージ理論の研究により新たな固定点の発見など思いがけない進展があることが明らかになりつつある。平成29年度に実施した研究をもとに、4次元ラグランジアン理論によるN=2超共形場理論の分類を行う。上記のSugawara条件は理論の物理量に対する条件であり、ある「許された」値の物理量の場合には超対称性の拡大現象が起こることを示していた。一方「許されない」値の場合は、超対称性が拡大しない、もしくは解析に矛盾が生じているはずであり、このことを利用して、N=2超共形場理論の分類を行う。これとは別に、N=1超対称ゲージ理論においてN=1対称性を保つ可能な限りの変形を考察し、そのもとでの固定点を調べる。これは29年度の研究をさらに発展させるものである。有効な使用方法がなかったため未使用とした。次年度の海外出張費用に追加して使用する予定である。
甲状腺ホルモン受容体βに特異的に結合するアクチベーターの同定

甲状腺ホルモン不応症発症の原因となる変異を持つ甲状腺ホルモン受容体(TR)β特異的アクチベーターの同定に向けた第一段階として、酵母Two-Hybridシステムを用いてT_3依存的にTRβに結合するタンパクをコードするcDNAのクローニングを試みた。【方法】全長ヒトTRβ1 cDNAをGAL4 DNA結合ドメインを持ったベクター(pGBKT7)に組み込み(TR/BDプラスミド)、これをBaitとして酵母Two-Hybridシステムによりヒト肝臓cDNAライブラリー(AD/cDNAライブラリー、Clonthech社製)をスクリーニングした。【結果】1)1次スクリーニングによって131個のクローンを得たが、2次スクリーニング後にT_3依存的に成育したクローンは91個で、これまでに74クローンの部分配列を決定した。しかし、11クローンは液体培地中で成育しなかったため、偽陽性と判断した。部分塩基配列を決定した74クローンは、データベース検索した結果、26種類に分類できた。2)上記26種類のうち、機能未知のクローンNo.60とNo.93について全長cDNAをクローニングした。No.60には3種類のmRNAが存在し、演繹されるアミノ酸配列からいずれも核内タンパクであり、DNA結合活性を持つ可能性がある.これら3種類の全長cDNAをクローニングした。No.93は1種類のみのcDNAをクローニングした.次に、クローニングしたcDNAがコードするタンパクが実際にTRと結合するかをin vitroで検討するために、TRをGST融合タンパクとして、クローン60,93のタンパクをHis tagとの融合タンパクとして発現させてpull-downアッセイを行う予定である。すでに、各々を大腸菌で発現させるためのベクターを構築した。(1)酵母形質転換体のスクリーニング:TR/BDプラスミドによって形質転換した酵母AH109株とAD/cDNAライブラリーによって形質転換されたY187株を接合させ、15μMT_3を含む選択培地(SD/-Ade,-His,-Leu,-Trp)へ播種し、30°Cにて3週間培養した(1次スクリーニング)。得られたコロニーをT_3含有および不含選択培地(SD/Ade,-His,-Leu,-Trp,+X-α-gal)に再度播種し、T_3依存的に成育するクローンのみを選抜した(2次スクリーニング)。(2)プラスミドDNAの単離と塩基配列決定:T_3含有選択培地でのみ成育した酵母コロニーからプラスミドDNAを単離した。AD/cDNAライブラリーインサートをPCR法で増幅し部分塩基配列を決定した。また、PCR産物が得られなかったクローンはプラスミドDNAを大腸菌へ導入してプラスミドを単離し、塩基配列を決定した。(3)データベース検索:得られた部分配列の情報を基に、ヒト完全長cDNAデータベースであるH-Invitationalデータベース(H-InvDB)を検索した。H-InvDBに登録されていない配列はGenBankを検索した。【結果】1次スクリーニングによって131個のクローンを得たが、2次スクリーニング後にT_3依存的に成育したクローン91個で、これまでに74クローンの部分配列を決定した。

部分塩基配列を決定した74クローンは、データベース検索した結果、26種類に分類できた。甲状腺ホルモン不応症発症の原因となる変異を持つ甲状腺ホルモン受容体(TR)β特異的アクチベーターの同定に向けた第一段階として、酵母Two-Hybridシステムを用いてT_3依存的にTRβに結合するタンパクをコードするcDNAのクローニングを試みた。16年度中の研究により、酵母内でT3依存的にTRβと結合するタンパクをコードするcDNAを26種類クローニングした.17年度はこれらのうち、タンパクの機能が未だ不明な2種類のcDNAに焦点を絞り研究を進めた.【方法】1)昨年と同様に、全長ヒトTRβ1cDNAをBaitとして酵母Two-Hybridシステムによりヒト肝臓cDNAライブラリー(AD/cDNAライブラリー、Clonthech社製)を、改めてスクリーニングした。2)17年度はこれらのうち、タンパクの機能が未だ不明な2種類のcDNAに焦点を絞り(1)全長cDNAのクローニング、(2)Pull-downアッセイのためのベクターの構築を行った。【結果】1)さらに20種類のcDNAをクローニングしたが、これらの中には前回のスクリーニングによってクローニングしたものとオーバーラップがあった.2)(1)全長cDNAのクローニングクローンNo.60には3種類のmRNAが存在し、演繹されるアミノ酸配列からいずれも核内タンパクであり、DNA結合活性を持つ可能性がある.これら3種類の全長cDNAをクローニングした。クローンNo.93は1種類のみのcDNAをクローニングした.クローニングしたcDNAがコードするタンパクが実際にTRと結合するかをin vitroで検討するために、TRをGST融合タンパクとして、クローン60,93のタンパクをHis tagとの融合タンパクとして発現させてpull-downアッセイを行う予定である。本年度はその準備として、各々を大腸菌で発現させるためのベクターを構築した。
電極酸化により生成する硝酸ラジカルを用いた炭素電極表面の構造規制

硝酸イオン(NO3-)の電極酸性化により生成する硝酸ラジカル(NO3・)を用いて、グラファイト電極や、炭酸繊維電極の表面酸化を行うことにより炭素電極表面上に高効率で酸素官能基および、窒素官能基を導入できることを見出した。この方法は、等方性炭素繊維、PAN系炭素繊維、および、グラファイト等に広範に適用可能であることが明らかになった。また。この方法は、炭素繊維電極の表面改質、特に、親水性炭素繊維の有効な作成法として極めて有効であり、酸化処理した炭素繊維を用いた複合プラスチック材料は未処理の炭素繊維を用いた場合と比べ約1,5倍の強度を示すことが明らかになった。さらに、炭素繊維上の官能基の反応性を利用して、炭素繊維電極の表面を化学的に修飾することも可能であることが明らかになった。これらの官能基により修飾した修飾炭素電極は、反応性に大きな違いがあり、たとえば、水酸基で修飾した電極を用いてベンゾフェノンの還元カップリングを行った結果生成物のd,1体の比率が未修飾の電極を用いた場合の約倍になり、電極表面の水酸基の効果が顕著に現われることを見出した。また、水酸基を立体的に嵩高いエステル基で修飾すると、カップリング生成物の比率が顕著に減少し、単純還元体であるアルコールの比率が増加することが明らかになった。さらに、光学活性なシトロネリックアシッドで修飾した電極ではd,1体の比率が顕著に変化することも分かった。また。
浸透圧による膜タンパク質間相互作用を制御する機構の解明

浸透圧応答を制御する出芽酵母HOGMAPキナーゼ(MAPK)経路の上流に存在する、浸透圧センサーHkr1を介したSHO1支経路の活性化には、4回膜貫通タンパク質Sho1と1回膜貫通タンパク質Opy2との膜貫通(TM)領域間結合およびHkr1細胞内領域の機能が必要であることを明らかにした。Opy2細胞外システイン・リッチ(CR)領域がHkr1/Msb2との結合に必要であった。浸透圧応答を制御する出芽酵母HOG MAPキナーゼ(MAPK)経路の上流にはSLN1支経路とSHO1支経路と呼ばれる2つの独立した経路が存在する。SHO1支経路を介したHog1 MAPKの活性化には、機能が重複した浸透圧センサーHkr1とMsb2、Pbs2 MAPKKに結合する4回膜貫通蛋白質Sho1、足場蛋白質Ste50とSte11 MAPKKKとの複合体に結合する1回膜貫通蛋白質Opy2が必要である。今回、Hog1活性化におけるSho1とOpy2との特異的相互作用の役割を調べた。活性化型Ste11-Q301Pを発現させた場合にのみHog1の活性化を引き起こすOpy2変異株を探索した結果、Opy2-A104V変異体の単離に成功した。GSTプルダウンアッセイの結果、Sho1はOpy2-WTとは弱くしか結合しないが、Opy2-A104Vとは強く結合することがわかった。Opy2-A104VのTM領域内に系統的な変異を導入したところ、Sho1との結合レベルが低下するものがいくつか見つかり、そのようなOpy2変異体はHog1の活性化を引き起こせなかった。Sho1 TM領域内に系統的な変異導入すると、Opy2-A104Vとの結合レベルが低下するものがいくつか見つかり、そのようなSho1変異体はHog1の活性化を引き起こせなかった。Opy2-A104V高発現によるHog1の活性化には、Hkr1とMsb2のうち、Hkr1のみが必要であった。さらに、細胞内領域の一部を欠失したHkr1変異体では、Opy2-A104VによるHog1の活性化があまり起こらなかった。これらの結果から、SHO1支経路のうち、Hkr1に依存したHog1の活性化には、Opy2とSho1とのTM間結合およびHkr1細胞内領域の機能が必要であると考えられる。浸透圧応答を制御する出芽酵母HOG MAPキナーゼ経路の上流に存在するSHO1経路の活性化には1回膜貫通型膜蛋白質Opy2と4回膜貫通型膜蛋白質Sho1とが必須である。Opy2とSho1との結合に関する共沈実験を行った。まずOpy2とSho1の膜貫通領域(TM)内のアミノ酸を系統的に別のアミノ酸に置換した変異体をそれぞれ作成し、Opy2とSho1との結合に影響を与えるアミノ酸の特定を行った。その結果、Opy2 TM内の3つのアミノ酸(I100, V101, Y113)に変異を導入すると、Opy2とSho1との結合レベルが低下することがわかった。Sho1 TM4内の2つのアミノ酸(A127, L131)に変異を導入すると、Opy2とSho1との結合レベルが低下することがわかった。次にOpy2とSho1との結合レベル低下とHOG (SHO1)経路活性化との関係を8xCRE-lacZレポーターアッセイによって定量的に調べた。その結果、Opy2 I100に変異を導入した変異体やSho1 A127あるいはSho1 L131に変異を導入した変異体を用いると、高浸透圧ストレスによるHOG (SHO1)経路活性化レベルが低下することがわかった。また、細胞内C末領域の一部を欠失させた1回膜貫通型浸透圧センサー膜蛋白質hkr1変異体とI100に変異を導入したopy2変異体とを共発現させると、高浸透圧ストレスによるHOG (SHO1)経路活性化レベルが著しく低下することがわかった。これらの結果から、3つの膜蛋白質Hkr1, Opy2, Sho1のTM間や細胞内領域間での相互作用がHOG (SHO1)経路活性化に深く関わっていると考えられる。出芽酵母における浸透圧応答を制御するHOG MAPKカスケードの上流に存在するSHO1経路の活性化機構において、高浸透圧ストレスによって浸透圧変化を感知するセンサーを含めた4つの膜蛋白質Msb2, Hkr1, Sho1, Opy2がどのように相互作用して細胞内にシグナルを伝えるのかを理解することを大きな研究課題として掲げている。研究が先行しているOpy2とSho1との相互作用を制御する機構について、今年度1年間を通じて行った研究の結果、Opy2とSho1との結合に影響を与える膜貫通領域内のアミノ酸の特定に成功し、またOpy2とSho1との結合がHOG(SHO1)経路活性化に必要であることを明らかにすることができ、目標達成に向けて前進していると思われる。

今年度に得られた実験結果はさらなる研究に向けての弾みとなり、現在、4回膜貫通型Sho1のTM内のアミノ酸と1回膜貫通型Opy2 TM内のアミノ酸をそれぞれ系統的にシステインに置換した変異体を作成し、in vitroおよびin vivoにおけるOpy2とSho1とのクロスリンク実験を行う準備を進めている。in vitroおよびin vivoにおけるOpy2とSho1とのクロスリンク実験を進めることによって、浸透圧ストレスによるHOG (SHO1)経路活性化機構のうち、Opy2とSho1との相互作用を制御する機構が明らかになるものと考えられる。浸透圧ストレスによるOpy2とSho1との相互作用を制御する機構を明らかにする上で、昨年度はOpy2とSho1との結合に関する実験は限定的であった。今年度は、昨年度得られた実験結果をもとに大きく発展させたOpy2とSho1との結合実験を進める予定であり、その分使用する研究費が多くなることが予想される。今年度予定しているクロスリンク実験では、まず1回膜貫通型膜蛋白質Opy2の膜貫通領域(TM)内のアミノ酸と4回膜貫通型膜蛋白質Sho1のTM1内からTM4内までのアミノ酸をシステインに置換した変異体をそれぞれ作成する。これらのシステイン変異体を用いて、in vitroおよびin vivoにおけるOpy2とSho1とのクロスリンク実験を行い、クロスリンクするOpy2システイン変異体とSho1システイン変異体との組み合わせを探す。その際、用いるOpy2コンストラクトとSho1コンストラクト、クロスリンカー試薬の種類、使用濃度、反応時間など、クロスリンク実験を最適に進めるための実験条件にも十分な時間を割く予定である。同じ研究室では、Sho1がどのような構造をとっているのかを明らかにする実験が進められており、Sho1構造から得られる情報とクロスリンク実験結果から得られる情報とを合わせることによって、Opy2とSho1とがどのTMを介してどのように結合しているか、また高浸透圧ストレスによるOpy2とSho1との動的結合などが明らかになるものと考えられる。Opy2とSho1との結合が明らかになれば、浸透圧センサー膜蛋白質Hkr1とMsb2がOpy2-Sho1複合体にどのように関わるかのさらなる発展的研究が計画でき、最終的に4つの膜蛋白質が関わる細胞膜上で起こる現象への理解に繋がるものと考えられる。次年度の研究計画に沿って進める実験では、クロスリンカー試薬、ウエスタンブロットに用いるHA抗体やMyc抗体、器具類、チューブ、チップ類などが必要である。酵母を用いた分子生物学的、分子遺伝学的実験では、酵母の液体培養および寒天プレート上での培養が必須であり、このために培地調整用の大量の試薬、培養チューブ、培養フラスコ、プレート用シャーレなどが必要である。システイン変異体の作成をはじめ、様々なプラスミドの構築が本研究では欠かせないが、こうしたプラスミド構築に各種試薬(プラスミド調整キットなどを含む)、酵素類、オリゴDNA(PCR用、シークエンス用)が必要である。これらの消耗品の購入に研究費を使用する予定である。
ラジカル反応プロセスの触媒化研究

研究代表者らは、水溶媒中で光触媒を用いるラジカル反応を基盤として、連続的に炭素ー炭素結合を形成する方法を開発した。水溶性光触媒としてのルテニウム触媒やローダミンの有効性は、可視光照射下での水溶媒中ラジカル付加ー閉環ー補足反応により確認された。励起状態のローダミンからの電子移動は、ローダミンの蛍光スペクトルの消光により調べた。クマリン色素を吸着させた酸化チタン光触媒を用いれば、紫外線でしか応答しない酸化チタンを可視光領域で働かせることができた。現在、“ラジカル種"は、有機合成分野において注目を集めている化学種であるが、その発生には化学量論量以上の試薬を用いるなど、環境への負荷も大きく、有機合成への利用という観点から解決すべき問題が多く残されている。本年度は、ラジカル反応の“触媒化"を達成する目的で、「酸化的ラジカルプロセス」と「還元的ラジカルプロセス」を同一反応系内で共存させる反応の開発を試みた。具体的には、酸化剤としても還元剤としても働く“光触媒"と“光エネルギー"を活用して、新しい「酸化ー還元融合型触媒サイクル」の開発を行った。不均一系光触媒であるTiO2を用いた研究では、芳香族ケトン類の還元やアルコール類の酸化をモデル反応として、TiO2を染料(dye)で修飾した可視光応答型TiO2触媒系の開発を行った。いくつかの染料とTiO2の組み合わせを検討し、可視光応答型TiO2触媒の耐久性などを評価した。また、均一系触媒である遷移金属光触媒(Ru触媒)を用いた研究では、可視光(LEDランプ)照射による励起種の発生を利用し、触媒的なパーフルオロラジカルの発生を検討した。さらに、発生したパーフルオロラジカルを用いたラジカル付加ー閉環反応を行った。本研究では、Ru触媒が水に可溶である点に注目し、水溶媒中での触媒的なラジカル反応の開発につなげた。本年度は、昨年度に続き、ラジカル反応の“触媒化"を達成する目的で、酸化剤としても還元剤としても働く“光触媒"を活用した新規ラジカル触媒反応の開発と解析を行った。不均一系光触媒であるTiO2を用いた研究では、昨年に続き、TiO2を染料(dye)で修飾した可視光応答型TiO2触媒の研究に取り組み、フルオレセンを担持したTiO2が芳香族ケトン類の還元やアルコール類の酸化に有効であることを見出した。さらに、私たちが開発した「TiO2を用いたアセトフェンオン類の還元反応」の反応解析を行った。また、均一系触媒である遷移金属光触媒(Ru触媒)を用いた研究では、昨年に続き、可視光照射による励起種の発生を利用して、触媒的なパーフルオロラジカルの発生と連続反応への応用研究を展開した。また、新たに、有機染料系化合物と可視光を用いた触媒的ラジカル反応の開発研究や低毒性酸化剤として働く鉄触媒を用いたラジカル反応の開発研究にも着手した。ラジカル種の発生には化学量論量以上の試薬を用いるなど、環境への負荷も大きく、有機合成に利用するには解決すべき問題が残されている。そこで、ラジカル種の発生に、酸化剤としても還元剤としても働く光触媒を活用して、ラジカル反応プロセスを触媒化することを目指した。はじめに、遷移金属光触媒であるルテニウム光触媒を用いた方法を検討し、触媒的なパーフルオロラジカルの発生により始まるカスケード反応を開発した。さらに、光触媒から発生する化学種や反応中間体の酸化還元電位などを比較して触媒サイクルを解明し、その成果を論文として発表した。次に、有機染料系化合物であるローダミンを用いた方法を検討し、カスケード型ラジカル反応に利用できることを確認した。さらに、ローダミンの蛍光スペクトルの消光実験を行ったところ、ヨウ化パーフルオロアルキルを添加した場合に消光が確認された。これらの実験から、考えられる二つの触媒サイクルのうち、ローダミンの励起種が還元剤として働く触媒サイクルが主経路であることを解明し、その成果を論文として発表した。また、不均一系光触媒である酸化チタンを用いた研究では、クマリン系色素を担持した可視光応答型酸化チタンを開発し、アセトフェンオン類の還元反応に応用し、その成果を論文として発表した。さらに、研究を重ねる過程で、酸化チタンには、炭素ーフッ素結合を還元的に切断する場合があることを見出し、切断反応が起こる基質の検討や反応速度解析などを行った。TiO2を用いた研究は、おおむね計画通りに進行し、いくつかの染料(dye)とTiO2の組み合わせを検討し、可視光応答型TiO2触媒の耐久性などを評価した。

その結果、フルオレセンなどの染料を担持したTiO2が比較的良好な耐久性を示すことが分かり、それらの成果を論文として発表した。また、TiO2を用いたアセトフェンオン類の還元反応をモデル反応として、TiO2触媒ラジカルプロセスの反応速度解析を行い、反応メカニズムを考察し、その成果を論文として発表した。遷移金属光触媒(Ru触媒)を用いた研究も、おおむね計画通りに進行し、触媒的なパーフルオロラジカルの発生を足掛かりとしたラジカル付加ー環化ー補足反応の開発に成功した。さらに、本反応は、アミン非存在化でも進行することや他のラジカル種の発生にも利用できることを見出した。新たに開始した有機染料系化合物を光触媒として活用する研究においても、Rhodamine Bが、水溶媒中で触媒的にパーフルオロラジカルを発生することを見出した。また、鉄触媒を用いたラジカル反応の開発研究でも、鉄触媒とNCSを組み合わせることにより連続反応に利用できることを見出した。有機化学不均一系光触媒を用いた研究では、これからも、有機合成反応に利用できる可視光応答型TiO2触媒の開発研究を進めていく。特に、クマリン系色素を担持したTiO2に焦点をあてて、触媒の活性と耐久性などを調べていく計画である。均一系光触媒を用いた研究では、研究の中心を遷移金属光触媒(Ru触媒)から有機染料系化合物(Rhodamine B)に移し、より環境に優しい光触媒の研究を進める。具体的には、Rhodamine Bを可視光応答型光触媒として活用し、触媒的ラジカル反応の開発を行いとともに、その電子移動過程の解析を行う。Rhodamine Bを用いる反応には、「二つの触媒サイクル」が考えられるため、どちらの触媒サイクルがより重要なサイクルであるかを調べていく。TiO2を用いた研究では、計画通りに、染料(dye)で修飾した可視光応答型TiO2触媒系の開発を行った。いくつかの染料との組み合わせを検討したが、触媒の耐久性などに問題が残るため、次年度以降も、より耐久性が高いと考えられる染料との組み合わせを検討していく必要がある。無修飾のTiO2の活性化にはUV照射を必要とするため、可視光で活性化する染料修飾TiO2の開発は意義深く、芳香族ケトン類の還元のような有機反応に利用できた点は大きな進歩と言える。また、遷移金属光触媒(Ru触媒)を用いた研究では、計画通りに、触媒的なパーフルオロラジカルの発生に成功し、触媒的なラジカル酸化ー還元反応系を開発できた。最も注目すべき成果は、水溶媒中でも目的のラジカル反応が進行する点であり、環境に調和した反応の開発研究に展開できた。計画に従い、適切な執行を行った結果、少額の次年度使用額が発生した。TiO2を用いた研究では、有機合成反応に利用できる可視光応答型TiO2触媒系の開発を進めていく。TiO2と組み合わせる染料としては、より耐久性が高い考えられる染料との組み合わせを検討する。具体的には、官能基を持たない染料の方が、高い耐久性を有すると考えられるため、染料の構造に着目しながら検討を進めて行く。遷移金属光触媒(Ru触媒)を用いた研究では、反応の詳細な検討と反応機構解析を行う。本反応には、励起種(dye*)が酸化剤あるいは還元剤として働く「二つの触媒サイクル」が考えられるため、その二つの触媒サイクルの可能性を検討していく。特に、ラジカル種、試薬、スカベンジャーの酸化還元電位などを調べ、主要な触媒サイクルを解明する。平成27年度において、新たな研究に必要な物品などの経費に充てる予定である。
心停止ドナーからの心臓移植に関する実験的検討

本研究では主に来院時心停止を想定した心停止ドナーからの心移植モデルを用い移植前にグラフトの機能を評価し得るか否かについて検討を行った。【方法】13頭の雑種成犬の大腿動脈から瀉血し心停止として60分間室温で放置した後心臓を体外に摘出し、Langenndorff回路に類似した潅流装置に設置しsubstrate-enriched warm blood cardioplegia(WBCP)で潅流した。WBCPに続いて30分間血液を用いたLangendorff潅流を行った後、冠潅流を離脱し80mmHgの後負荷に対し駆出可能か否かを検討した。この後同所性に心移植を行い移植後の心機能を評価した。【結果】潅流装置内での再潅流後冠潅流を離脱し80mmHgの後負荷に対し駆出したものは13例中4例であった。これらの4例は移植後ドーパミンを中止しても良好な血行動態(収縮期圧>80mmHg、平均左房圧10mmHg)を維持した。またこれらの心臓は移植後も心停止前と同等の収縮性を維持していた。一方他の9例中6例は体外循環を離脱し得たが、いずれもドーパミン離脱後に良好な血行動態を維持し得なかった。【結論】失血による心停止後1時間を経過した心臓でも潅流装置を用いた再潅流法を用いることにより移植可能なものがあることが示された。更にこの潅流装置を用い80mmHgの後負荷に対し駆出し得たグラフトは移植後も良好な血行動態を維持した。本法は移植前に移植後の心機能を予測するのに有効な方法と考えられた。日本においても脳死ドナーからの心移植が行われるようになったが、海外と同様にドナー不足の問題をかかえるようになることは必至と思われる。近年注目されている心停止ドナーの中でも来院時心停止患者は大きなドナープールとなることが期待されるが、移植前の心機能を評価できないことが最大の問題点とされてきた。今回得られた結果は心停止ドナーからの移植の実現に大きく貢献するものと思われる。(目的)本実験の目的は失血による心停止後60分を経過したドナーを心臓移植に利用する場合、移植に先立って心臓を再潅流する方法でどの程度心機能を回復させ得るかを検討することである。(対象と方法)7頭の雑種成犬の大腿動脈から瀉血し心停止としたのち心臓を60分間体内にて室温(25°C)で放置した。実験群(n=7)では心停止から60分後に心臓を摘出してLangendorff回路に類似した潅流装置に設置し、ハイドロキシラヂカルスカベンジャーであるEPCとウロキナーゼを含むsubstrate-enriched warm blood cardioplegia (WBCP)にて再潅流を行った。45分間の血液潅流をおこなった後UW液中に保存した。コントロール群(n=6)ではSt.Thomas液で心停止とした直後に心臓を摘出しUW液中に保存した。両群とも同所性に心移植を行い心機能評価を行った。

(結果)コントロール群は全例体外循環を離脱し、移植後左室Emaxは心停止前に対し90.2±7.1%まで回復した。一方実験群では移植後Emaxは心停止前に対し68.7±7.7%までしか回復せず、また7例中1例は体外循環を離脱できなかった。(考察、結論)本実験により失血による心停止後60分を経過したドナー心でも、移植に先立って再潅流を行うことによって移植可能であることが示された。しかし健常な心臓と比べるとその機能は不十分であり、更に良好な心機能を保持するための再潅流法や保存法のが必要であると考えられた。本研究では心臓移植ドナープールの拡大のため、心停止ドナーからの心移植モデルにてその方法を検討している。用いたモデルは、雑種成犬を脱血死させたものでheparinを含む心停止前の投薬、いわゆるpretreatimentは行っていない。前年度の研究により、脱血死より60分間放置したgraftの中にも、体外に摘出したgraftをLangenndorff回路を順じた血液灌流装置にてradicat scavengerであるEPCを含むsubstrate-enriched warm blood cardioplegia(WBCP)を用い慎重に再灌流させることにより、移植後も移植前とほぼ同等の心収縮力を示すgraftが存在することが示された。本年度では同様のモデルを用い、保存・移植する前にgraftの機能を評価する試みを行った。この実験では、上記の血液灌流装置にて再灌流し自己心拍を回復したgraftに、回路内で徐々に前負荷を与えることにより心拍出を誘導し心機能評価を行った。この後、心停止液にて心停止とし保存・移植を行い、移植後の心機能評価を行った。この結果血液灌流装置内で80mmHgの後負荷に抗して拍出する心収縮力をもつgraftは、保存・移植後もcatecholamineの補助なしで体外循環から離脱し、移植後の心機能評価でも移植前値(心停止前)とほぼ同等の心収縮力を有していることが明らかになった。このモデルではgraftに対し2回の再灌流が必要となるがWBCPによる慎重な再灌流、EPCの添加により心筋虚血再灌流障害は軽度に抑えられたものと考えられた。本研究のモデルはDead on arrivalを想定したものであるが、移植前にgraftの心機能が評価可能であるということは臨床上大きな利点となりうると思われる。
トウモロコシの内生ジベレリンに関する生理化学的研究

1.トウモロコシ「交7号」を栽培し、未熟種子を採取し、内生ジベレリンについて機器分析による同定を試みた。その結果、すでに同定されているジベレリンの他に、前年度はイムノアッセイで存在が示唆されていたGA_4,GA_<19>をCG/SIMによって確実に同定した。2.純系の材料として、矮性型d_1と正常型トウモロコシを用い、絹糸が現れた時期に人工授粉し、未熟期から糊熟期に至る期間、1週間ごとに4回にわたって種子を採取した。対象とするジベレリンとして、生合成経路が異なり、かつ生理的役割が異なる可能性がある17-OHジベレリン(GA_1、GA_<20>)と、17-Hジベレリン(GA_4、GA_9)を選び、イムノアッセイで分析した。その結果、それらのジベレリンの量的変動についての知見が得られるとともに、矮性型と正常型におけるジベレリンの種類、レベルともに大きな差異はないことが明らかとなった。3.正常型トウモロコシの未熟種子を、胚と胚乳に分離し、それぞれに含まれるジベレリンをイムノアッセイで分析した。その結果、活性型ジベレリンと考えられるGA_1は、胚の方により高濃度に含まれること、またGA_1の前駆体であるGA_<20>は、胚乳により高濃度に含まれることが示された。4.トウモロコシ特有の雌しべ(絹糸)を採取し、内生ジベレリンの検索を行った。イムノアッセイによる分析の結果、GA_1、GA_3、GA_4が検出された。これらのうちで、GA_3が高等植物で検出されるのはまれであり、とくにイネ科植物ではほとんど例を見ない。そこで、確認のためGA/MSを行い、その存在を証明した。しかし、コンタミネーションの可能性を否定するための実験が必要であり、現在追試験中である。5.矮性型と正常型のisogenic lineを作出するため、前年度につづいて、d1とd5を対象とし、それぞれ正常型のF3、F2を得た。トウモロコシの未熟種子の内生ジベレリンについては,すでにGA_9,およびGA_<20>をGC/MSにより同定しているが,今年度はそれらの前駆体として生合成経路上に位置するジベレリンの検索を行った.材料となるトウモロコシとしてハイブリットの「交7号」を圃場にて栽培し,授粉から8, 9日後の種子767gを採取した.常法通り酢酸エチル可溶分画を得たのち, HPLCで分画・精製を行い, GC/MSによる同定,およびGC/SIMによる定量を試みた.定量分析の内部標準物質として,重水素化したGA1, GA4, GA20を用い,定量分析用の未熟種子を抽出するさいに試料中に混入した.内生量が少ないためGC/MSによる分析が不可能なジベレリンについては,イムノアッセイによる分析を行った.その結果, C-13位に水酸基を有するジベレリンの生合成経路上にあるものとして, GA_<53>, GA_<44>, GA_<20>, GA_1, GA_<17>, GA_<29>がGC/MSにより同定された. GA_<19>はイムノアッセイにより同定された.主要ジベレリンであるGA1, GA_<20>の含量は,それぞれ0.10ng, 1.6ngであった.C-13位に水酸基を持たない系統のものとして, GA_<24>, GA_9, GA_<34>がGC/MSにより,またGA_4がイムノアッセイにより同定された.以上の結果から,トウモロコシの種子には, C-13水酸化,および非水酸化の2系統のジベレリン生合成経路が働いていることが確認された.トウモロコシにおける茎の伸長にはC-13位に水酸基を持つジベレリンが関与することが明らかにされているが,種子においては, C-13位に水酸基を持たないジベレリンが何らかの役割を果たしているものと推定される.今後は,受精後の時間的経過に従って,トウモロコシの雌穂,ならびに種子中のジベレリンの生合成がいかなる変化を示すかを追究する予定である.また,絹糸(雌しべ)中のジベレリンについての検索も行うことも計画している.1.トウモロコシ「交7号」を栽培し、未熟種子を採取し、内生ジベレリンについて機器分析による同定を試みた。