hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
新規摂食・エネルギー代謝調節ペプチドの機能解析および探策

本研究では、摂食・エネルギー代謝調節に強く関与している受容体FM-4/TGR-1(neuromedin U type-2 receptor : NMU2R)の内因性リガンドとして、ラット脳から36アミノ酸残基からなる新規ペプチドの単離・精製に成功した。本ペプチドは、視交叉上核(Suprachiasmatic nuclei)で特異的に発現していることからneuromedin S(NMS)と命名した。NMSのC末7アミノ酸残基はNMUと完全に一致するが、ラットへの脳室内投与によりNMSはNMUに比べ強力な摂食抑制作用を示した。ラット脳におけるNMS mRNA発現は、概日リズムを司るSCN腹側に限局しており、明暗条件下では明期にピークを有する発現リズムを示したが、恒常暗条件下では一定であった。また、NMSのラット脳室内投与により、非光同調型の概日リズムの位相変化を強力に引き起こした。以上の結果から、新規ペプチドNMSは摂食及び概日リズムの調節に関与していることが示唆された。また、摂食抑制ペプチドNMUのノックアウトマウスの機能解析により、内因性のNMUは、摂食調節のみならず痛覚刺激や環境変化に対する適応に深く関わっているペプチドであることが判明した。さらに、NMUは、哺乳動物だけでなく鳥類(ウズラ)にも存在し、摂食および体温調節に機能することを明らかにした。さらに、当研究室で発見した強力な摂食促進作用を有するペプチド:グレリンに関して、摂食関連情報を中枢に伝達する迷走神経求心路を介するグレリンとCCKの作用機構および相互作用について検討した。肥満症は、高血圧・心血管障害・糖尿病などの疾患を頻発させ、その治療と予防は医学的・社会的に大きな課題である。肥満症の分子レベルでの病態の解明は、近年急速に進んでいる分野であり、肥満症のみならずそれに起因する生活習慣病を総合的に治療する新しい治療法の開発につながるものと期待される。本研究は、摂食およびエネルギー代謝調節に関わると考えられるリガンドが不明な受容体(オーファン受容体)の内在性ペプチド性リガンドを同定し、その機能を解析することを目的とした。本年度は、従来より確立していたオーファン受容体安定発現細胞系を用いた細胞内Ca上昇を指標としたアッセイ系にて、ラット脳組織をスクリーニングした結果、既知のものとは異なる画分に2種類の活性を得ることが出来た。一つは、新規の物質と判断したが、反応物質が極めて微量だったため、最終精製までは至らなかったが、一つは、部分アミノ酸配列を決定でき、既知のペプチドとホモロジーは認めるが新規の生理活性ペプチドであることが判明した。この部分アミノ酸配列に基づき、本ペプチドをcodeするcDNAをESTデータベースおよびPCRを用いたクローニングにより決定し、ペプチド前駆体構造を明らかにした。さらに、定量的PCRを用いた遺伝子発現解析の結果、脳の視床下部領域に高発現していることが判明した。視床下部に発現しているペプチドは、神経内分泌・エネルギー代謝調節に強く関与することが示唆され、今後、ラットを用いエネルギー代謝・内分泌学的解析等を進め、その生理学的意義を明らかにしていく予定である。本研究は、摂食およびエネルギー代謝調節に関わるリガンドが不明な受容体(オーファン受容体)の内在性ペプチド性リガンドを同定し、その機能を解析することを目的とした。

NMSのC末7アミノ酸残基はNMUと完全に一致するが、ラットへの脳室内投与によりNMSはNMUに比べ強力な摂食抑制作用を示した。ラット脳におけるNMS mRNA発現は、概日リズムを司るSCN腹側に限局しており、明暗条件下では明期にピークを有する発現リズムを示したが、恒常暗条件下では一定であった。また、NMSのラット脳室内投与により、非光同調型の概日リズムの位相変化を強力に引き起こした。以上の結果から、新規ペプチドNMSは摂食及び概日リズムの調節に関与していることが示唆された。また、摂食抑制ペプチドNMUのノックアウトマウスの機能解析により、内因性のNMUは、摂食調節のみならず痛覚刺激や環境変化に対する適応に深く関わっているペプチドであることが判明した。さらに、NMUは、哺乳動物だけでなく鳥類(ウズラ)にも存在し、摂食および体温調節に機能することを明らかにした。
食品系および生体系膜モデル中の脂質分子のコンフォメーションと酸化的損傷

脂質を水中に分散した時の酸化安定性が、脂質分子の油水界面におけるコンフォメーションとどのように関連しているのかについて検討を加えた。まず、不飽和脂肪酸を含むトリグリセリドの界面での配向性を、界面圧測定、DSC,FT-IR等の手法を用いて詳しく解析した結果、不飽和脂肪酸は比較的ル-スな状態で界面上でパッキングされていることが明らかとなった。また、結晶性の界面吸着物質を加えることにより界面上での脂質分子の配向性が高まること、またその後の研究により、そのような変化に伴い脂肪酸が酸化を受けにくくなることが示唆された。次に、様々な脂肪酸エステルのエマルション中での酸化の受け易さを比較した結果、脂肪酸の種類というよりも、共存する乳化剤が大きな影響を与えていることが明らかとなった。すなわち、イオン性界面活性剤に比べて、陰イオン性界面活性剤を用いて乳化を行った場合の方が、酸化反応が顕著に抑制されることが示された。一方、タンパク質を乳化剤として用いた場合には、界面活性剤の場合とは異なった様式で酸化反応が進行する事が示された。以上の結果は、脂肪の水中での酸化されやすさは、脂質分子のコンフォメーションそのものより、脂質と界面吸着物質の相互作用によって決定されることを示唆している。そこで、リポキシゲナーゼを用いて、界面上における脂質分子と乳化剤の存在状態と相互作用について検討を加えた。その結果、タンパク質が界面上に存在しても、全ての脂質分子を束縛することは出来ず、束縛されなかった分子は、バルク中の場合と近似したコンフォメーションや移動度を持っていること、そのためリポキシゲナーゼ反応に容易に利用されることが明らかとなった。それに対し、界面活性剤は、界面全体にわたって脂質分子と相互作用し、脂質の酸化をより効率的に妨げていることが明らかとなった。水中分散系における不飽和脂肪酸の酸化反応の受け易さが、脂肪酸中2重結合の数と位置によってどのような影響を受けるのか、検討を行った。ω-3、ω-6、ω-9系列の幾つかの脂肪酸メチルエステルを標品として使用したが、市販品として入手しにくいミ-ド酸(20:3,ω-9)や8,11,14,17-cis-イコサテトラエン酸(20:4,ω-3)などのメチルエステルについては、これらの脂肪酸を高度に生産している微生物菌体を供給源として調製した。それぞれのメチルエステルと非イオン性の界面活性剤溶液より調製したエマルション中でラジカルを発生させ、数日間にわたって過酸化物価の上昇や脂肪酸の減少量を追跡した。その結果をα-リノレン酸(18:3,ω-3)とγ-リノレン酸(18:3,ω-6)のように、炭素鎖数や2重結合の数が同じで、2重結合の位置のみ異なっている脂肪酸のペア-について比較したところ、あまり顕著な差は認められなかった。すなわち、脂肪酸の2重結合の位置はエマルション系における脂質の酸化安定性とあまり関連していないという結果が得られた。これは、ω-3系列のα-リノレン酸に比べ、ω-6系列のγ-リノレン酸の方が水中分散系では酸化されやすかったという以前の報告と異なる結果であった。このような矛盾は実験に用いたエマルションの存在状態の違いによるものと考えられる。そこで、異なる条件下で調製したエマルションの初期の酸化反応を酸素消費量により追跡した結果、脂質の酸化の受け易さは乳化剤の種類や量、油滴の大きさなどによって変化することが示された。そこで、現在では、分散状態の影響をなるべく排除するため、それぞれのメチルエステルより脂肪酸を調製し、それを界面活性剤溶液でミセル状に分散させたものを用いて実験を行っている。

この場合には、脂質はナノサイズのレベルできわめて均一に分散されており、酸化反応のキネティクスの客観的な評価も可能となっている。昨年度の研究により、水中分散系における不飽和脂肪酸の酸化反応の受け易さが、脂質を分散するのに用いる乳化剤の種類によって変化する事が示された。その点について、今年度はさらに詳細な検討を加えた、その結果、陽イオン性、陰イオン性界面活性剤に比べて、非イオン性界面活性剤を用いて乳化を行った場合の方が、酸化反応が顕著に抑制されることが明らかとなった。一方、タンパク質を乳化剤として用いた場合には、界面活性剤の場合とは異なった反応様式で酸化反応が進行することが示された。また脂肪酸中の2重結合の位置と、その脂肪酸の酸化反応の受け易さとの間には明確な関連性は認められなかった。以上の結果、脂質の酸化のされやすさは、脂質分子自体のコンフォメーションというより、界面に存在するタンパク質や界面活性剤と脂質分子の相互作用によって決定されることが示唆された。そこで、リポキシゲナーゼを用いて、界面上におけるタンパク質、界面活性剤、脂質の存在状態と相互作用について検討を加えた。その結果、タンパク質は油水界面において2次元的なネットワーク構造を形成するが、リポキシゲナーゼはそのネットワーク中に存在するスペースより脂質分子を引き出し、反応に利用出来ることが明らかとなった。このことは、タンパク質が界面に吸着しても、全ての脂質分子を束縛することはできず、ネットワーク中のスペースに存在する脂質分子はパルク中の分子と同様のコンフォメーション、高い移動度を持っていることを示している。それに対し、界面活性剤が吸着している場合には、界面活性剤が自由に界面上を拡散してゆくため、脂質分子が全体にわたって束縛を受け、酸化反応を受けにくくなっていることが明らかとなった。
中東とソ連の都市問題とエスニシティの比較研究

この共同研究が目指したものは、中東とソ連における都市とエスニシティの在り方を比較検討しながら、近現代の急速な都市化にともなう環境、人間と社会との関係、個人と集団の社会意識の変容を総合的、多角的に解明しようとするところにあった。当該地域におけるエスニシティの多様性と連続性を考慮するとき、これは、集団間の反目、矛盾が先鋭で具体的な形をとって現われてくる都市という生活の場においてエスニシティの問題を検討することであり、またエスニシティ、民族、宗教問題を媒介変数としてトランスナショナルな視角から都市の在り方と変容を検討することでもあった。本共同研究の参加者は以上の問題意識を踏まえ、まず第1に、タシケント、モスクワ等のソ連の都市と、イスタンブ-ル、テヘラン、カイロ、エルサレム等の中東の都市において現地調査を行なった。これらの諸都市での調査においては現地人研究者の協力を得た上で、都市問題の現状とエスニシティを異にする住民相互間の衝突、反目の具体的事例をつぶさに観察した。また現地調査と平行して、現地人研究者との間で意見の交換を行ない、当該地域での研究状況の把握、現地人研究者との交流に努め、さらに必要な資料の収集にも当たった。第2に、ソ連、中東世界での都市化にともなうエスニシティ、民族、宗教問題を分析した。モスクワ国家による都市カザンへの支配の実態を検証し、また経済開発によるソ連中央アジアでの居住条件の変化と、エスニシティ・グル-プの変容についての相関関係を検討した。さらにイスラエルにおいては、ソ連からのユダヤ人移民にともなうユダヤ都市の拡大・拡散による、アラブ人とユダヤ人の文化接触の問題を取り上げた。次いで都市を基盤とした民族主義イデオロギ-の形成・展開の側面についても検討を加えた。トルコにおけるトルコ民族主義の展開過程とその周辺トルコ系地域への影響を、歴史的事実を踏まえつつ分析した。同時にソ連中央アジアにおける非ロシア系民族の間での民族意識の形成過程を検証し、イスラ-ムや、アルメニア正教、ギリシャ正教の復興が民族的アイデンティティに及ぼす影響を検討した。またアゼルバイジャンでの文学活動が民族意識の形成に与えた影響を分析した。これらの事例研究によって、中東とソ連における都市問題とエスニシティをめぐる問題の相関関係を明らかにし、また都市化にともなう社会意識の変容を解明することに努めた。第3に、経済と都市間ネットワ-クの側面から都市のエスニシティの問題を検討した。アレッポの都市経済におけるアルメニア人、クルド人の役割を検討した。またドイツへのトルコ人労働移民の問題を取り上げ、出稼ぎ者、帰還者双方が引き起こす都市問題が、二地域の関係の中で明らかにされた。さらにイラン諸都市とイスタンブ-ルの間の絨毯交易に従事していたアゼルバイジャン人に注目しながら、当該地域におけるエスニシティと都市経済、都市間の関係を把握した。アラビア半島諸都市における通商活動も取り上げ、アラブ世界の都市間通商ネットワ-クにおけるインド人、ペルシャ人の役割を分析した。次いでイランや中央アジアからのメッカ巡礼を分析することを通し、宗教的側面からも都市間ネットワ-クの検討を行なった。これらの研究により、当該地域における経済と宗教を軸とする都市間ネットワ-クとエスニシティの連続性を明らかにすることに努めた。第4に、総合的、多角的研究の必要性から都市とエスニシティ問題の持つ普遍的な性格に着目し、研究交流の空間的幅を広げ、中東、ソ連の現地研究者はもちろんのこと欧米諸国の研究者との間でも共同研究や比較研究を行なった。さらにストラスブ-ルにおいて日本とフランスの研究者を中心に、ソ連と中東の民族問題に関する国際シンポジウムを開催するなど、これまでの研究成果に基づいた研究者相互間の交流を推進した。この共同研究は、湾岸危機やソ連邦の解体など当該地域をめるぐる急激な変動の渦中に実施されたにもかかわらず、比較の手法を用い都市という場におけるエスニシティの問題を解明し、都市の在り方と変容を明らかにする上で大きな成果をあげることができたと確信している。

さらにイスラエルにおいては、ソ連からのユダヤ人移民にともなうユダヤ都市の拡大・拡散による、アラブ人とユダヤ人の文化接触の問題を取り上げた。次いで都市を基盤とした民族主義イデオロギ-の形成・展開の側面についても検討を加えた。トルコにおけるトルコ民族主義の展開過程とその周辺トルコ系地域への影響を、歴史的事実を踏まえつつ分析した。同時にソ連中央アジアにおける非ロシア系民族の間での民族意識の形成過程を検証し、イスラ-ムや、アルメニア正教、ギリシャ正教の復興が民族的アイデンティティに及ぼす影響を検討した。またアゼルバイジャンでの文学活動が民族意識の形成に与えた影響を分析した。これらの事例研究によって、中東とソ連における都市問題とエスニシティをめぐる問題の相関関係を明らかにし、また都市化にともなう社会意識の変容を解明することに努めた。第3に、経済と都市間ネットワ-クの側面から都市のエスニシティの問題を検討した。アレッポの都市経済におけるアルメニア人、クルド人の役割を検討した。またドイツへのトルコ人労働移民の問題を取り上げ、出稼ぎ者、帰還者双方が引き起こす都市問題が、二地域の関係の中で明らかにされた。さらにイラン諸都市とイスタンブ-ルの間の絨毯交易に従事していたアゼルバイジャン人に注目しながら、当該地域におけるエスニシティと都市経済、都市間の関係を把握した。アラビア半島諸都市における通商活動も取り上げ、アラブ世界の都市間通商ネットワ-クにおけるインド人、ペルシャ人の役割を分析した。次いでイランや中央アジアからのメッカ巡礼を分析することを通し、宗教的側面からも都市間ネットワ-クの検討を行なった。これらの研究により、当該地域における経済と宗教を軸とする都市間ネットワ-クとエスニシティの連続性を明らかにすることに努めた。第4に、総合的、多角的研究の必要性から都市とエスニシティ問題の持つ普遍的な性格に着目し、研究交流の空間的幅を広げ、中東、ソ連の現地研究者はもちろんのこと欧米諸国の研究者との間でも共同研究や比較研究を行なった。さらにストラスブ-ルにおいて日本とフランスの研究者を中心に、ソ連と中東の民族問題に関する国際シンポジウムを開催するなど、これまでの研究成果に基づいた研究者相互間の交流を推進した。この共同研究は、湾岸危機やソ連邦の解体など当該地域をめるぐる急激な変動の渦中に実施されたにもかかわらず、比較の手法を用い都市という場におけるエスニシティの問題を解明し、都市の在り方と変容を明らかにする上で大きな成果をあげることができたと確信している。この共同研究に携わる者の一致した認識は、近現代の社会を揺り動かす要因の一つである民族問題、エスニシティの問題を都市という「場」において総合問、多角的に比較検討しようというところにある。人びとの暮らしの場である都市こそもっとも先鋭なかたちで、反目、矛盾が具体的な姿をとって現われてくると思うからである。二年目に入った本研究は、以上のような問題意識にしたがって、ソ連のムスリム・トルコ系地域の都市と中東のそれとを連関させながら次の調査研究を実施した。
ＡＡＶベクターと人工ＧＰＣＲを用いたナルコレプシーの遺伝子治療法の開発

ナルコレプシーは強い眠気と情動性脱力発作(カタプレキシー)を主症状とする睡眠障害であり、その病態にオレキシン産生ニューロン(オレキシンニューロン)の変性・脱落が関わる。しかし、オレキシンニューロンがナルコレプシーを抑制するメカニズムは不明であった。本研究ではマウスにおいて、青斑核・ノルアドレナリンニューロンと背側逢線核・セロトニンニューロンがオレキシンニューロンの下流で働き、前者は強い眠気、後者はカタプレキシーを抑制することを明らかにした。また、これらのニューロンを人為的に活性化してナルコレプシーを抑制する方法を開発した。睡眠障害・ナルコレプシーは、オレキシン産生ニューロンの特異的な変性によって生じる。昨年度はナルコレプシー・モデルマウス(既知の二つのオレキシン受容体を両方欠損したOX1R-/-;OX2R-/-マウス)を用い、ナルコレプシーの二つの特徴、覚醒の分断化(睡眠発作に対応)とカタプレキシー(情動性脱力発作)について、オレキシンニューロンによる青班核ノルアドレナリン作動性ニューロンの活性化が前者を、背側逢線核セロトニン作動性ニューロンの活性化は後者を抑制することを示した。今年度はさらに、これらのニューロンを人為的に直接活性化することでナルコレプシーの症状を改善できるか検証した。DREADD (designer receptors exclusivelyactivated bya designer drug)と名付けられた変異型m3ムスカリン受容体(hM3Dq)は、生理的濃度の内在性リガンド・アセチルコリンでは活性化されず、合成化合物clozapine-N-oxide (CNO)の腹腔内投与によって活性化される。ナルコレプシーのモデルマウスであるオレキシンニューロン欠損マウスにおいてAAVベクターにより、青班核ノルアドレナリン作動性ニューロン、あるいは背側逢線核セロトニン作動性ニューロンに選択的にhM3Dqを発現させた。CNO投与により、前者の場合は覚醒持続時間が有意に増加し、後者の場合はカタプレキシーが抑制された。これらの結果は、昨年度に明らかにした事実をさらに裏付ける。さらに、予め有効性・安全性の高いことが保証されている薬剤のみをリガンドとする人工受容体を必要最小限のニューロンに遺伝子導入し、その薬剤を服用して当該ニューロンを活性化することで症状を抑えるとの、遺伝子治療法の新たなコンセプトに繋がるものである。我々は本研究計画において、ナルコレプシー・モデルマウス(既知の二つのオレキシン受容体を両方欠損したOX1R-/-;OX2R-/-マウス)を用い、ナルコレプシーの二つの特徴、覚醒の分断化(睡眠発作に対応)とカタプレキシー(情動性脱力発作)について、オレキシンニューロンによる青班核ノルアドレナリン作動性ニューロンの活性化が前者を、背側逢線核セロトニン作動性ニューロンの活性化は後者を抑制することを示した。また昨年度は、DREADD (designer receptors exclusively activated bya designer drug)を用いて、これらのニューロンを人為的に直接活性化することでも、ナルコレプシーの症状を改善できることを示した。今年度は、昨年度までに得られた結果をさらに信頼できるものにするために、実験数の追加、適切なコントロール実験等を行った。得られた結果は論文にまとめ、すでに受理されて公開された。さらに、青班核ノルアドレナリン作動性ニューロン、背側逢線核セロトニン作動性ニューロンの下流で睡眠・覚醒を調節する神経回路を明らかにするために、種々のウィルスベクターなどのツールを作製した。本研究により、オレキシンによる睡眠・覚醒スイッチ制御の詳しいメカニズムが明らかになった。ナルコレプシーのみならず,不眠症などさまざまな睡眠障害の対処に応用できると期待される。さらに、DREADDを用いてナルコレプシーを抑制できた結果は、予め有効性・安全性の高いことが保証されている薬剤のみをリガンドとする人工受容体を必要最小限のニューロンに遺伝子導入し、その薬剤を服用して当該ニューロンを活性化することで症状を抑えるとの、遺伝子治療法の新たなコンセプトに繋がるものである。本年度はマウスモデル(既知の二つのオレキシン受容体を両方欠損したOX1R-/-;OX2R-/-マウス)を用い、オレキシンニューロンにより活性化されるとナルコレプシー様症状を抑制できる脳領域・ニューロンの同定を試みた。組換えAAVベクターの局所感染を用いて、OX1R-/-;OX2R-/-マウスの様々な脳領域にオレキシン受容体発現をレスキューし、ナルコレプシーの二つの特徴、覚醒の分断化(睡眠発作に対応)とカタプレキシー(情動性脱力発作)が改善される領域を検索した。

またセロトニン作動性ニューロン選択的、およびノルアドレナリン作動生ニューロン選択的にオレキシン受容体を発現するAAVベクターの開発にも取り組んだ。その結果、青班核ノルアドレナリン作動生ニューロンに選択的にオレキシン受容体発現をレスキューすると覚醒の分断化が有意に改善されたが、カタプレキシーの頻度には影響が見られないのに対し、背側逢線核セロトニン作動性ニューロン選択的にレスキューするとカタプレキシーがほぼ消失するが、覚醒の分断化は改善しないことを明らかにした。これは、オレキシンニューロンによる覚醒の分断化(覚醒からノンレム睡眠への異常な移行)とカタプレキシー(覚醒中にレム睡眠の特徴である脱力が病的に生じる)の抑制において、それぞれで異なる下流神経回路がオレキシンニューロンの機能を仲介していることを意味する。ナルコレプシー発症のメカニズムはもちろん、健常者の睡眠・覚醒調節機構を理解する上でも意義のあるものである。研究調書で記述した研究目的を、概ね達成できた。オレキシンニューロンの直接の下流でナルコレプシーを抑制する脳領域を特定しただけでなく、セロトニン作動性ニューロン選択的、ノルアドレナリン作動生ニューロン選択的にオレキシン受容体を発現するAAVベクターも既に開発し、両ニューロンタイプがそれぞれカタプレキシー、覚醒の分断化というナルコレプシー症状の異なる側面を抑制することを示した。これまでの研究で明らかになった、オレキシンニューロンにより直接制御され、睡眠・覚醒調節に重要な役割を果たす下流ニューロン、青班核ノルアドレナリン作動性ニューロン、背側逢線核セロトニン作動性ニューロンについて、さらにこれらのニューロンの下流で機能するニューロンの同定を試みる。今後は、人工GPCRをAAVベクターで導入し、上述した背側逢線核セロトニン作動性ニューロンや青班核ノルアドレナリン作動生ニューロンを人工リガンド投与によって人工的に活性化することでナルコレプシーが抑制されるかを検討し、人工受容体ー人工リガンドを用いた新たな遺伝子治療法の可能性について探る。該当なし今年度は予想以上に実験がスムーズに進んだため、想定していた様々な実験条件等を検討する必要がなくなり、次年度使用額が生じた。24年度に請求する研究費と併せ、実験計画を進めるための物品費・旅費等に使用する。
in-situ UV-Vis分光分析による超臨界水中での反応晶析機構の解明

高温高圧測定ダイヤモンドセルを作製し、それを用いて超臨界水中での反応場のin-situ測定を行なった。UV-visスペクトルの測定には、ファイバー方式のUV-vis検出器(V-570:日本分光(株))を用いた。実験試料は硝酸鉄水溶液および硝酸アルミニウム水溶液を用いた。それぞれの原料からαヘマタイト(Fe_2O_3)およびベ-マイト(ALOOH)微粒子が生成する。反応圧力は30MPa、反応温度は25, 100, 200, 300, 400°Cで行なった。実験手順は、まず各反応温度での蒸留水のみを流した場合の吸収スペクトルを測定する。次に反応溶液を流した時のスペクトルを測定し、これらの差を反応溶液のスペクトルとした。硝酸鉄系の場合、25°Cのときは、350nm近傍にピークを持つスペクトルが観察された。反応温度をあげていくと、ピークが高波長側へシフトしているのが観察された。100°Cでは400nm近傍で、400°Cでは620nm近傍となった。これらは、溶液の組成の変化(微粒子生成)および温度によるシフトであると考え、得られたスペクトルと反応溶液の組成について詳細な解析を進めている。今回の研究結果からin-situ UVスペクトル測定が定性的ではあるが、反応場での存在種の同定手法として有効であることが確認できた。
硫黄細菌の硫黄化合物分解活性の共生的従属栄養細菌により安定化

硫黄酸化細菌であるThiobacillus thioparusのチオシアン分解活性は従属栄養細菌が共存する事により促進されることが示されている。本研究では分解菌と共存菌との間に成立する共生関係を中心に研究を行った。1.共生関係の機構の解明:T.thioparusのチオシアン分解は初期濃度によって大きく影響を受け、20mM以上では培地中に残存した。しかし俊属栄養細菌の共存するN1 cultureでは50mMのチオシアン存在下でも完全分解を受ける事が明かとなった。T.thioparusの純粋培養にN1から単離されたC株を添加し混合培養を行うとチオシアン分解の阻害は見られず、T.thioparusのチオシアン分解がこの様な従属細菌の共存によって促進される事が明かとなった。T.thioparusをチオシアンで生育させると培地中には数種のアミノ酸の蓄積が見られ、特に分解が途中で停止した培養系では蓄積が4倍以上となった。一方、別の生育基質であるチオ硫酸塩を用いて培養した場合アミノ酸の蓄積は全く見られなかった。T.thioparusは絶対化学合成細菌であり有機物は生育にとって阻害的に働くので、本研究でみられたチオシアン分解の促進効果は従属栄養細菌がこれらの物質を除去することによってT.thioparusのチオシアン分解活性を維持する可能性が考えられた。2.共生関係が成立するための細菌集団の定量的解析:共生関係を成立させるための細菌の初期混合比率は分解菌1に対しC株が1/101の細胞数で存在するのが最適でありそれ以上では逆に阻害がみられた。本研究において申請した顕微鏡は計画通り購入されこれを用いた総菌数の計測とCFUに基づく結果を総合し混合培養系における各々の細菌数の動態を追う事が出来た。ポピュレーションバランスをさらに解析するために今後は蛍光抗体法やDNAプローブ法を導入し、活性汚泥中における特定微生物の挙動を明らかにする予定である。
核動態からみた廃用性筋萎縮後の荷重効果における加齢の影響

高齢者では加齢に伴う筋量の減少に加えて、疾病などで活動性が低下すると筋萎縮が急速に進行するとされている。高齢者の骨格筋の反応が若年者と異なるのであれば、不活動期間中の運動療法も高齢者により適した方法を検討する必要がある。本研究では不活動状態下で施行した荷重練習の効果について、加齢による反応の違いを骨格筋線維の核動態および組織化学的分析から検索した。方法は後肢懸垂モデルによる廃用性筋萎縮後のラットで荷重を施行した。3ケ月齢、7ケ月齢、14ケ月のラットで、それぞれ、a)懸垂群(懸垂飼育)、b)荷重群(懸垂飼育し、1週間後より1日1時間後肢を下ろして荷重)、c)対照群(通常飼育)の3つの実験群を設け、3週間の実験終了後に下肢筋を採取し、凍結切片を作成した。核動態に関して、筋線維の衛星細胞の増殖活動は3ケ月齢では対照群に比べて懸垂群、荷重群では減少しており7ケ月齢、14ケ月齢では減少した。アポトーシス核の検索では、加齢に伴い増加していたが荷重群と懸垂群との違いは明らかではなかった。筋線維横断面積(MCSA)の比較では、すべての月齢で対照群に比べて懸垂群、荷重群のMCSAは減少していた。荷重練習は8ケ月齢では比較的有効であり、3ケ月齢では懸垂群との間に違いは生じなかった。一方、14ケ月齢のTypeI線維において、荷重群のMCSAは懸垂群よりも若干低値であり、自重による荷重であってもその反応は月齢により異なっていた。本研究は理学療法の場で遭遇する、疾患の発症-安静臥床-廃用性筋萎縮の発生-安静の解除-立位練習(荷重)の施行という一連の流れを想定している。高齢者では加齢に伴う筋量の減少に加えて、疾患の発症などで活動性が低下すると筋萎縮が急速に進行するとされている。高齢者の骨格筋組織の反応が若年者と異なるのであれば、不活動期間中の運動療法も高齢者により適した方法を検討する必要がある。荷重は自重を利用した負荷であると同時に、言語的指示が理解されにくい症例に対してもセラピストによる介助、あるいは起立台など機械を利用して施行することが可能な利用範囲の広い治療手技である。しかし、廃用性筋萎縮の進行や荷重効果における加齢の影響に関して、メカニズムが十分明らかにされているとはいいがたい。本研究では積極的な自動運動が困難な状態下で施行される荷重効果について、筋線維の形態学的変化と加齢の影響を詳細に検索し、高齢者の筋機能低下予防や維持を考える根拠とするため計画した。具体的には、動物モデルを用いて廃用性筋萎縮後に荷重を施行し、加齢による反応の違いを核動態、荷重に伴う細胞の形態学的変化と組織化学的変化から検討することとした。本年度は3ヶ月齢と8ヶ月齢のラットで、それぞれ、a)懸垂群(常時懸垂飼育)、b)荷重群(懸垂飼育し、1週間後より1日1時間後肢を下ろして荷重)、c)コントロール群(通常飼育)の3つの実験群を設け、ヒラメ筋および長指伸筋の凍結固定切片を作成した。筋の核動態評価の一つとして行う筋衛星細胞増殖の測定はBrdU標識にて行うが、筋組織標識のための最適時間に関する報告は少なく、本年度は標識時間をいくつか設けて作成した標本切片の染色を行い、最適な標識時間を決定した。形態学的分析は作成した標本切片をATP染色し、筋線維横断面積を測定中である。高齢者では加齢に伴う筋量の減少に加えて,疾患の発症などで活動性が低下すると筋萎縮が急速に進行するとされている。高齢者の骨格筋組織の反応が若年者と異なるのであれば,不活動期間中の運動療法も高齢者により適した方法を検討する必要がある。

そこで,本研究では積極的な自動運動が困難な状態下で施行される荷重練習の効果について,加齢による反応の違いを骨格筋線維の核動態および形態学的分析から検索することとした。方法は後肢懸垂モデルによる廃用性筋萎縮後のラットで荷重を施行した。3ケ月齢,8ケ月齢,14ケ月のラットで,それぞれ,a)懸垂群(懸垂飼育し,実験期間中は荷重しない),b)荷重群(懸垂飼育し,1週間後より1日1時間後肢を下ろして荷重),c)対照群(通常飼育)の3つの実験群を設け,3週間の実験終了後に下肢筋を採取し,凍結切片を作成した。核動態に関して,筋線維の衛星細胞の増殖活動は3ケ月齢では対照群に比べて懸垂群,荷重群では減少しており,8ケ月齢,14ケ月齢では減少した。アポトーシス核の検索では,加齢に伴い増加していたが荷重群と懸垂群との違いは明らかではなかった。筋線維横断面積(MCSA)の比較では,すべての月齢で対照群に比べて懸垂群,荷重群のMCSAは減少していた。荷重練習は8ケ月齢では比較的有効であり,3ケ月齢では懸垂群との間に違いは生じなかった。一方,14ケ月齢のTypeI線維において,荷重群のMCSAは懸垂群よりも若干低値であり,自重による荷重であってもその反応は月齢により異なっていた。
中腎管細胞を用いた中腎管の再構築およびネフロン誘導能を有する尿管芽の作成

中腎管は腎臓発生に不可欠な組織であり、中腎管細胞の維持・増幅と組織化は、腎臓再生研究の鍵となる。本研究では、様々な成長因子について中腎組織での発現と中腎管培養に対する効果を検証し、腎臓組織工学への利用の可能性を調べた。これまでの成果として、特にFGFの有用性を明らかにした。中腎組織に発現するFGF9が中腎管細胞の生存・増殖・分化応答能を支持することを突き止め、同細胞の培養維持にも効果的であることを見出した。中腎管は、後腎間葉からの成長因子GDNFに応答して尿管芽を形成し、腎臓発生をもたらす原基であり、中腎管細胞の能力をいかにして維持するかは、腎臓再生研究を進める上でも極めて重要な課題である。平成21年度は、研究実施計画に掲げたとおり、胎児組織およびその培養系の遺伝子発現解析を通して、中腎管維持に関わる因子の探索を行った。その結果、1)中腎管および中腎間葉にはFGF9が強く発現しており、その他のFGFは低発現であること、2)7つのFGFレセプターのうち、中腎管に主要に発現するは2b isoformであるが、FGF9に親和性が高いと考えられる1c、2c、4も発現していること、3)FGF9により培養中腎管のGDNFレセプターRet・GFRα1発現はupregulateされ、これはFGFレセプター阻害剤で顕著に抑制されること、4)FGF9は培養中腎管の細胞増殖を維持し、アポトーシスを抑制すること、5)FGF9は7日を超えて培養中腎管の成長を保ち、これをラット後腎間葉と共培養すると、中腎管は分枝成長しつつネフロンを誘導すること、6)FGF9は中腎間葉にも作用し、成長因子発現を変動させること、などが明らかになった。この研究により、FGF9シグナルが中腎管の維持に大きく関与していることが明らかとなり、また責任レセプターも絞り込まれてきた。生理的には、FGF9に対する中腎管・間葉双方の応答の均衡の上に中腎管の能力が維持されていると予想される。この機構の詳細を解明していくことにより、in vivoで行われている中腎管維持をin vitroでも再現できると考えられ、並行して進めている中腎管細胞培養系の構築、引いては細胞利用による腎臓組織再生にもつながるものと期待される。これらの成果は第9回日本再生医療学会総会で発表し、現在、論文準備中である。腎臓の組織再生には、発生メカニズムに基き、腎管系(中腎管や尿管芽)上皮細胞と後腎間葉細胞との相互作用による組織誘導を利用する方法が考えられる。中腎管の維持機構や成長因子に対する応答を解明することにより、腎臓再生への組織工学的応用が期待できる。平成22年度の研究では、中腎組織の成長因子とそのレセプターの遺伝子発現解析を進め、線維芽細胞増殖因子(FGF)については全22種を網羅した。特に組織工学に有用なCanonical FGF(15種)では、前年度報告したFGF9に加え、FGF18, FGF22が中腎管および周囲間葉に高発現していることが明らかになった。これらはFGF9のような中腎管培養維持効果を持たず、修飾的に働くと考えられる。FGF1とFGF7も中腎管培養を維持するが、発現量はFGF9に比べ有意に低い。FGFレセプター、MAPK経路、PI3K-Akt経路に対する各阻害剤の添加によりFGF9で培養した中腎管のRet・CyclinD1発現が有意に低下することからも、中腎管細胞の生存・増殖・GDNF応答能にはFGFレセプターシグナルが不可欠であると考えられる。Homone-like FGF(3種)は、レセプターKlothofamilyと共に発現は高くなかった。また、細胞内で働くIntracellular FGF(4種)のうち、FGF11, FGF12, FGF13の発現が高く、その意義も興味深い。その他、BMP, Wnt, EGF, IGF-I, SCFについてレセプターと共に中腎組織での発現を確認したが、中腎管培養を維持できるものは見つかっていない。中腎管細胞の初代培養は、FGF9添加により維持期間の延長が認められるものの、充分な細胞増幅には至らない。細胞間結合、細胞外マトリクスとの接着の変化による細胞死等の影響が考えられ、さらに検討を要する。(1)中腎管・周囲間葉に発現する因子の役割解明平成23年度の研究では、まず中腎組織に発現するFGFとそのレセプターについて、これまでの所見を踏まえ精査し、中腎管維持機構における役割を検証した。FGFに関しては、報告してきたFGF9とFGF18、FGF22は中腎管と間葉の双方に、FGF5は問葉に、FGF17は中腎管に発現することを確認した。これらの中ではFGF9のみが培養中腎管の成長を維持する。遺伝子発現解析から、FGF9は中腎管の生存・増殖・Ret発現を支持することが分かった。

培養中腎管に対するFGF9の作用は、これまで報告されていたFGF1とFGF7に類似しており、特に中腎管の長期培養を維持する点でFGF7にほぼ匹敵する。また、FGFレセプターに関しても中腎組織における発現パターンを明らかにした。レセプター活性化に関する報告と照らして、中腎管では2cと3bが主要にFGF9を受容している可能性が高い。一方で、間葉細胞もFGF9で活性化される2cレセプターを持つことから、FGF9は間葉細胞を介して中腎管のコンピテンスに何らかの働きを持つ可能性が考えられる。以上の結果を本課題研究の成果の一部として論文にまとめた(投稿中)。中腎管分化応答能の維持機構の一端が明らかになったことで、後腎間葉との相互作用による腎臓組織誘導に向けた前進であり、継続的な研究推進により腎臓組織再生への応用が期待できる。(2)中腎管細胞の培養と組織化中腎管細胞の初代培養にFGF9を添加し、培養期間の延長を図った。また、細胞間結合の変化によるアポトーシスを抑制する目的でBlebbistatin (myosinII阻害剤)を併用し、効果を検証した。これらの使用により、中腎管細胞の培養維持期間の改善が認められ、細胞増幅のための条件基盤が得られた。組織化については、中腎管初代培養細胞のシート状剥離の検討を進めている。
移植後拒絶反応時のレシピエント末梢血活性化T細胞内MAPK活性

BNラットをドナー、Lewisラットをレシピエントとしたラット腎移植モデルにおいて、免疫抑制剤(FK506)を投与した群(投与群)、投与しなかった群(非投与群)を作成した。それぞれの群において術後0、1、3、4、5日に移植臓器を病理組織学的に検討したところ、非投与群では術後徐々に急性拒絶反応の所見が得られるようになった。Fujita(Transplantation, vol64, No.6, September27,1997)の分類では術後3日目にgrade1、術後4日目にgrade2、術後5日目にgrade3(急性拒絶反応(T869)の完成)であった。それに対し投与群の病理組織学的検討ではgrade1に相当する若干の炎症細胞の浸潤を認めたが、それが進行しなかったことより、それらは手術操作によるものと考えられた。MAPK活性値は、非投与群において急性拒絶反応の病理組織学的所見が得られる術後3日目よりも早い、術後2日目から上昇していった(術後0日目、1日目、3日目と5日目との間で有意差を認める)。それに対し投与群のMAPK活性値は、術後徐々上昇していく傾向が認められたが各術後日数間に有意差を認めなかった。以上の結果から、臓器移植術後に起こる急性拒絶反応の診断法として移植臓器の生検に依らずに行えるMAPK活性の測定が有用であることが示唆された。しかし実際の臨床の場において、免疫抑制剤の投与量は血中トラフ値によって決められ、各個人で投与量が違う。今回はラットに投与した免疫抑制剤の血中トラフ値は測定しておらず、今回の結果をそのまま臨床に反映することはできないと考えられた。そのため、今後は血中トラフ値や移植臓器に関する血液生化学検査結果を求め、それらとの関連性を検討していくことが必要である、と考えられた。3種類のラット同所性肝移植モデル群(High responder群,Middle responder群,Low responder群)を作成し、術後免疫抑制剤非投与群、術後3日間のみ投与群、術後7日間投与群に分類した。免疫抑制剤はFK506を使用し、0.1mg/kg/dayを筋肉注射した。レシピエントのラットから移植後10日目に採血、および肝臓の摘出を行った。(1)抹消血のFK506濃度は、免疫抑制剤の投与期間が長くなれば高くなる傾向にあった。また、これは3種類のモデル間では差違を認めないようであった。(2)血清中のIFNγ濃度は、免疫抑制剤の投与期間が長くなれば低くなる傾向にあった。また、これはHigh responder群で高くなり、Low responder群で低くなる傾向にあった。IL2、IL4、IL10でも同じような傾向にあった。(3)摘出した肝臓の病理所見は、免疫抑制剤の投与期間が長くなれば急性拒絶の所見が弱く、少なくなる傾向にあった。また、これはHigh responder群で強く、多くなり、Low responder群で弱く、少なくなる傾向にあった。(4)T細胞内カルシウム濃度は、免疫抑制剤の投与期間とは関連を認めないようであった。また、これは3種類のモデル間でも同様であった。現在、上記モデルに於いてT細胞内のMAPK活性を測定しようと試みている。1.移植モデルの確立と拒絶反応時期の決定について実験手技の効率化のため移植モデルを肝臓から皮膚へと変更したため、DAラットをドナー、Lewisラットをレシピエントとする皮膚移植モデルの作成手技を確立し、さらに移植後4日目、5日目、6日目にそれぞれの移植片を採取したのちH.E染色し、拒絶反応が起こる時期を病理組織学的に検討した。移植後5日目には真皮が表皮より完全に分離していることより、この時期には病理組織学的に拒絶反応がを完成されていることがわかった。2.カルシウム濃度測定の準備について既知の濃度のカルシウム溶液にFura-2を添加し、ハロゲンランプを用いたニコン社製TE300蛍光顕微鏡、浜松ホートニクス社製顕微鏡用SITカメラC2400-08、画像解析装置Argus20を用いてカルシウム濃度の検量線を作成した。3.T細胞内カルシウム濃度の上昇についてレシピエントの脾臓を摘出し、ナイロンウールカラム法などを用いてリンパ球を、さらにTリンパ球を分離した。抗原提示細胞としてマクロファージを用いることにしたため、DAラットの脾臓より得られたリンパ球をLewisラットの腹腔内に散布し、4日後に腹腔内より抗原認識済みマクロファージを採取した。Fura-2を添加したレシピエントTリンパ球に抗原認識済みマクロファージを重層することでTリンパ球を活性化させ、上記装置を用いてTリンパ球内カルシウム濃度が上昇することを解した。また活性化される総Tリンパ球数は、移植後4日目から6日目にかけて増加していく傾向にある、と考えられる結果が出ている。4.今後の予定検体数を増やし統計学的解析を行う。その後、移植後4日目から6日目にかけてMAPKの活性酵素がどのように変化していくか、を解析していく予定である。

Fujita(Transplantation, vol64, No.6, September27,1997)の分類では術後3日目にgrade1、術後4日目にgrade2、術後5日目にgrade3(急性拒絶反応(T869)の完成)であった。それに対し投与群の病理組織学的検討ではgrade1に相当する若干の炎症細胞の浸潤を認めたが、それが進行しなかったことより、それらは手術操作によるものと考えられた。MAPK活性値は、非投与群において急性拒絶反応の病理組織学的所見が得られる術後3日目よりも早い、術後2日目から上昇していった(術後0日目、1日目、3日目と5日目との間で有意差を認める)。それに対し投与群のMAPK活性値は、術後徐々上昇していく傾向が認められたが各術後日数間に有意差を認めなかった。以上の結果から、臓器移植術後に起こる急性拒絶反応の診断法として移植臓器の生検に依らずに行えるMAPK活性の測定が有用であることが示唆された。しかし実際の臨床の場において、免疫抑制剤の投与量は血中トラフ値によって決められ、各個人で投与量が違う。今回はラットに投与した免疫抑制剤の血中トラフ値は測定しておらず、今回の結果をそのまま臨床に反映することはできないと考えられた。そのため、今後は血中トラフ値や移植臓器に関する血液生化学検査結果を求め、それらとの関連性を検討していくことが必要である、と考えられた。
神経障害痛に対するLactate Dehydrogenase阻害の鎮痛効果

本研究は、神経のエネルギー基質の供給となるアストロサイト-ニューロン乳酸代謝経路(ANLS)に着目し、神経障害性疼痛の発現維持の解明を目的とした。抗てんかん薬であるStiripentolは、ANLSの乳酸脱水素酵素(LDH)を阻害することによりてんかんを制御していることが知られている。申請者らは、L5神経切断(L5SNT)により神経障害性疼痛を惹起させたマウスを用いて、Stiripentolの神経障害性疼痛に対する鎮痛効果および神経障害性疼痛に対するANLSの関係を検証した。疼痛評価として、von Freyフィラメントを用いた機械的刺激およびplanter testを用いた熱刺激による行動学的評価を行い、神経障害性疼痛によって活性化する脊髄後角のアストロサイトの形態変化を抗GFAP染色を用いて免疫書式学的に評価した。(研究実施概要)1) StiripentolがLDH阻害によって用量依存性に鎮痛効果があることを行動学的評価により明らかにした。しかし、免疫組織学的評価では、stiripentolはL5SNTモデルマウスの脊髄後角においてアストロサイトの活性を抑制しなかった。2)ANLSが神経障害性疼痛に関与していることを明らかにした。3)一般的に神経障害性疼痛に対して臨床使用されている他の抗てんかん薬とStiripentolの作用機序の違いを検証した。研究実績に記載した通り、研究目的であるStiripentolの神経障害性疼痛に対する鎮痛効果および神経障害性疼痛のANLSとの関係を行動学的に評価し、検証することができた。また、免疫組織学的評価に関して、Stiripentolによる脊髄後角のアストロサイトの活性を評価した。現在、論文を投稿中である。現在結果をまとめ上げ、論文を投稿中である。追加実験など適宜行う予定をしている。疼痛評価として、von Freyフィラメントを用いた行動学的評価を行い、神経障害性疼痛によって活性化する脊髄後角のアストロサイトの形態変化を抗GFAP染色を用いた免疫染色により評価した。(研究実施概要)1) StiripentolがLDH阻害によって鎮痛効果があることを行動学的評価により明らかにした。しかし、免疫組織学的評価では、L5SNTモデルマウスの脊髄後角においてアストロサイトの活性を抑制しなかった。しかし、結果をさらに裏付けるために、アストロサイトの活性評価方法を見直すことが課題として挙げられた。1)アストロサイトの評価として、脊髄後角の採取時間を再度検討し、免疫染色を行う。2)脊髄後角また、アストロサイトの活性評価方法として、形態的変化でなく、アストロサイト活性時に発現する蛋白などの機能的な側面から評価する方法を検討する。以上を検討し、今回の成果を雑誌論文および学会で発表予定をしている。

研究が予想よりも円滑に遂行され、実験動物や消耗品の購入に計画していたほどの費用を要する必要がなかった。また、参加予定をしていた学会に参加することができなかった。その他の印刷に必要としていた経費が少額であったため、請求する必要がなかった。次年度使用額は、研究成果論文作成費用および追加実験の費用に充てる予定である。研究が予想よりも円滑に遂行され、計画していたほどの費用を要する必要がなかった。また、論文投稿および修正に時間を要しており、今後追加実験や論文投稿費用に充てる予定である。
生体組織の凍結保存において細胞の配向と細胞同士の接触状態が生存率に与える影響

本課題では,凍結組織の細胞密度上昇に伴う配向と接触状態の違いが解凍後の生存率に与える影響を調べることを目的とし,(1)生体組織を模した非配向単層培養細胞の凍結保存後の蛍光画像の生死分布状態を調べ,(2)単層細胞の配向制御を確立し凍結方向を変えて試料を凍結させ生存率を求め,(3)懸濁細胞の緩速凍結時の密集に伴う接触と生存率の関係を調べ,(4)急速冷却された人工組織の熱物性値による細胞内の凍結保存状態の評価を行なった.全ての実験にヒト皮膚繊維芽細胞を用いた.(1)と(2)では,溝加工カバースリップ上で2日間単層培養(0.25×10^5cells/cm^2)したものを配向制御試料(傾斜で凍結方向を可変),培養皿上で培養したものを非配向試料とした.試料を4-80°C,0.110°C/minで凍結させ-185°C以下で保持後解凍し,Calcein-AMとDAPIの蛍光2重染色画像から細胞の2次元生死分布と生存率を調べた.(3)では,上と同冷却条件で懸濁細胞(10^6cells/cm^3)を高分子物質で制動隔離(有無)し凍結し,解凍後に生存率を求めた.(4)では,コラーゲンスポンジ(φ20×1mm)中で細胞を2日間培養(10^6,10^7cells/cm^3)した試料を30700°C/minで凍結した場合の細胞内の有効温度伝導率を推定し解凍後生存率と比べた,その結果,(1)より,凍結保存後の非配向細胞に死細胞の局所集中が見られた.(2)より,単層細胞の配向制御を確立し,配向よりも凍結方向の違いの方が凍結保存後の生存率に影響を与えることが分かった.(3)より,緩速凍結中の細胞の密集に伴う接触による生存率低下が明らかとなった.(4)より,人工組織の急速凍結では細胞内凍結による生存率低下に細胞密度は関与しないことが示唆された.以上より生体組織の緩速冷却による凍結保存において細胞同士の接触機会の増加が解凍後の生存率低下につながることが示唆された.本課題では,凍結組織の細胞密度上昇に伴う配向と接触状態の違いが解凍後の生存率に与える影響を調べることを目的とし,(1)生体組織を模した非配向単層培養細胞の凍結保存後の蛍光画像の生死分布状態を調べ,(2)単層細胞の配向制御を確立し凍結方向を変えて試料を凍結させ生存率を求め,(3)懸濁細胞の緩速凍結時の密集に伴う接触と生存率の関係を調べ,(4)急速冷却された人工組織の熱物性値による細胞内の凍結保存状態の評価を行なった.全ての実験にヒト皮膚繊維芽細胞を用いた.(1)と(2)では,溝加工カバースリップ上で2日間単層培養(0.25×10^5cells/cm^2)したものを配向制御試料(傾斜で凍結方向を可変),培養皿上で培養したものを非配向試料とした.試料を4-80°C,0.110°C/minで凍結させ-185°C以下で保持後解凍し,Calcein-AMとDAPIの蛍光2重染色画像から細胞の2次元生死分布と生存率を調べた.(3)では,上と同冷却条件で懸濁細胞(10^6cells/cm^3)を高分子物質で制動隔離(有無)し凍結し,解凍後に生存率を求めた.(4)では,コラーゲンスポンジ(φ20×1mm)中で細胞を2日間培養(10^6,10^7cells/cm^3)した試料を30700°C/minで凍結した場合の細胞内の有効温度伝導率を推定し解凍後生存率と比べた,その結果,(1)より,凍結保存後の非配向細胞に死細胞の局所集中が見られた.(2)より,単層細胞の配向制御を確立し,配向よりも凍結方向の違いの方が凍結保存後の生存率に影響を与えることが分かった.(3)より,緩速凍結中の細胞の密集に伴う接触による生存率低下が明らかとなった.(4)より,人工組織の急速凍結では細胞内凍結による生存率低下に細胞密度は関与しないことが示唆された.以上より生体組織の緩速冷却による凍結保存において細胞同士の接触機会の増加が解凍後の生存率低下につながることが示唆された.凍結組織の細胞密度上昇に伴う配向と接触状態の違いが生存率に与える影響を調べることを目的とし,本年度は凍結実験に耐えうる単層培養細胞の配向制御技術の確立,凍結単層培養細胞の蛍光画像解析による2次元生存分布と細胞生存率の測定法の確立,熱物性値による凍結人工組織の凍結保存状態の評価の3点を遂行した.単層細胞の配向制御のため,カバーガラス(松浪24×24×0.7mm)に研磨紙で溝加工しコラーゲン(新田ゼラチンType I-C)を塗布し滅菌し,その上でヒト皮膚繊維芽細胞(Cell Systems Fb Cells)を2日間培養したものを用意した.解凍後の生存状態検討のために非配向制御の単層細胞(細胞密度:0.25×10^5cells/cm^2)も培養皿に用意した.

次に,試料を凍結させ(冷却速度:0.110°C/min,凍結保護物質:10%ジメチルスルホキシド),解凍後に蛍光染色し(同仁化学Calcein AM, DAPI),蛍光倒立顕微鏡(ニコンTE300 DEF-S),CCDカメラ(浜松ホトニクスORCA-ER),画像処理解析システム(ソリューションシステムズ:購入設備)を介しパソコンに画像を取り込み細胞の生存状態を観測した.更に,皮膚繊維芽細胞をコラーゲンスポンジ中(高研CS-100, φ20×1mm)で人工組織化した試料(10^6, 10^7cells/cm^3)を急速冷却(30700°C/min,35%プロピレングリコール)した場合の液体窒素中の細胞内の有効温度伝導率を推定し生存率とつきあわせた.結果として,単層細胞の配向制御は確立したが凍結後の生存率が低く,非配向細胞を用いた凍結保存後の蛍光画像から生存率測定が可能となり死細胞の局所的集中が見られ,人工組織の急速冷却での凍結保存状態は細胞密度の上昇に伴い細胞内凍結を起こし易く生存率が低いことが示唆された.細胞の配向と細胞密度上昇に伴う接触状態の違いが凍結解凍過程において細胞に与える影響を明確にすることを目的とし,本年度は,第1に配向制御された単層培養細胞を各方向から凍結させ解凍後の蛍光画像解析により生存率を求め,第2に懸濁細胞の凍結時の密集に伴う接触が解凍後の生存率に与える影響を調べた.ヒト皮膚繊維芽細胞(Cell Systems Fb Cells)を継代培養したものを実験に用いた.カバースリップ(松浪24x24×0.7mm)に磨紙(#1000)で一方向に溝加工し滅菌後,細胞を播種し2日間その上で単層培養(細胞密度:5×105cells/cm2)したものを配向制御試料とした.試料に傾斜をつけることで凍結方向を可変出来る実験系を実現した.凍結保護物質として10%ジメチルスルポキシドを用い,4-80°Cの範囲で0.110°C/minの冷却速度で凍結させ-185°C以下で保持した直後に解凍した.その後試料を蛍光染色[同仁化学Calce量n AM(生細胞),DAPI(死細胞)]し,蛍光倒立顕微鏡(ニコンTE300DEF-S),デジタルCCDカメラ(浜松ホトニクスORCAER),画像処理・解析システム(前年度購入)を介しパーソナルコンピュータに蛍光と位相差画像を取り込み,細胞の2次元的生存分布状態と生存率を求めた.更に,上と同冷却条件において懸濁細胞(初期細胞密度:106cens/cm3)を高分子ピアルロン酸の粘性で制動隔離し凍結し,解凍後にトリパンブルー染色法により生存率を求めた.結果として,配向制御試料の凍結実験より,細胞の配向よりも凍結方向や基質の違いによる細胞周りの氷晶形成状態の相違の方が生存率に影響を与えることが示唆された.そして,懸濁細胞の凍結実験より,緩速冷却条件で凍結中の細胞の密集に伴う接触により生存率が低下することが明らかとなった.