hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
金融市場モデルの実証的再検討と自由化後の金融政策

これら銀行行動について明らかになった多くの興味深い事実に基づいて、銀行行動の理論モデルの修正を行っており、平成7年度にはこれに基づいて最終的なモデルの実証研究を完結させる準備が整った。また、本年度は自由化後の金融政策を検討する前提として、銀行をとりまく制度的環境変化の影響と自由化後の銀行経営のあり方に関する研究を進め、多くの知見を得ることが出来た。また、自由化後の金融政策を考える上では金融システムの安定性維持の問題は密接な関わりを持っており、この問題にまで視野を広げて分析を行わない限り、現実に有効な金融政策に関する提言を得ることは出来ない。そこで、金融自由化と金融システムの安定性についての研究も進め、市場機能利用の意義とそのための環境整備に関しての報告をまとめ、今後の金融制度改革の方向性と問題点も明らかになった。更に、研究の最終年度である平成7年度において体系的に研究成果をまとめるために、これまでの知見の整理を行うと同時に、得られた成果や最近の諸外国での研究成果を取り入れた新たな理論的モデルの構築と改善を行い、より視野を拡大した分析フレームワークの中で全体の成果を統一的に位置づけるための見直し、次年度の研究のための準備を行った。平成7年度においては、これまでに蓄積されたデータベースに基づき、自由化後の金融制度のあり方、とりわけ金融市場のリスク増大に対応した社会的リスク負担システム構築の必要性、及び日本における土地担保付き貸出の役割の理論的・実証分析、金融市場の大きな変化に対応した金融政策のあり方についての研究を行い、併せて3年間の研究の総括・取りまとめを行った。その結果、金融制度のあり方としてはディスクロージャーを前提として、市場メカニズムを利用した監督体制や、経営難に陥った金融機関を問題をより悪化させない段階で早期に市場から混乱なく退出させることの出来る早期是正措置等の整備の必要性が明らかになった。また、リスクの複雑化、多様化、グローバル化に対応して、これまでの商業銀行によるリスク負担から、投資銀行業務を基礎として、社会的にリスクを分散して負担することの出来る金融システムへの移行の必要性が明らかになった。更に、金融政策に関しては、バブルの基本的原因も為替市場への介入に端を発していることなどから、市場メカニズムに介入せず、安定的な貨幣供給を行うことによって、将来の予見が容易な安定的経済環境を作り出すことを目的として運営されるべきであり、公衆が政策当局に過大な期待を抱かないような環境も重要な要因であることが明らかになった。全体的な取りまとめとしては、データベースの一般利用を可能とするマニュアルの作成、研究全体を踏まえた著書の出版準備などを行った。
ヒトの遺伝子マップと染色体のDNAセグメントマップの作成

我々は染色体ソ-ティングの技術に改良を加え、最近ポリアミン・ジギトニン処理法でヒト培養リンパ球(GM130B)から得た分裂中期染色体を、ヘキスト33258またはヨウ化プロピジウムで染色し、FACS 440セルソ-タ-を用いて合計18画分に分別できるようになった。さらに各染色体画分を直接ニトロセルロ-スフィルタ-に集め、ラベルしたDNAプロ-ブとのスポットブロットハイブリダイゼ-ションを組織的に行う技術も確立した。このようにソ-ティングした染色体と雑種細胞パネルのDNAを併用して、本年度は以下のヒト遺伝子をマッピングした。Calpain subunit1(CAPN1)/第11染色体、同subunit2(CAPN2)/第1染色体、同subunit関連遺伝子(CAPN3)/第15染色体、同subunit4(CAPN4)/第19染色体、Calpastatin(CAST)/第5染色体、水疱性類天疱瘡抗原蛋白遺伝子/第6染色体にマップした。ポリアミン・ジギトニン法でヒト培養リンパ球(GM130B)から得た分裂中期染色体をヘキスト33258で染色し, FACS440セルソーターを用いて15分画に分別できるようになった.すなわち,シングルレーザーを用いた場合の分離能のほぼ限界まで達成できた.また,ヒト×マウス雑種細胞からのヒト染色体の分離も成功している.さらに,セルソーターから分別されてくる各染色体画分をニトロセルロースフィルター上に直接回収し,アイソトープ標識したプローブとのハイブリダイゼーションを行なって,マッピングを迅速に行なう方法を確立した.このような染色体スポットブロット・ハイブリダイゼーション法を用いて,ミエロパーオキシダーゼ(MPO)を第17染色体に,インターロイキン4(IL4)を第5染色体に,インスリンレセプターと相同配列を持つ0.4kbDNAセグメント(INSRL)を7p13ーq22領域にマップした.さらに,ホスホリボシルピロリン酸シンテターゼ(PRPS)を構成する2個のサブユニットに対応する遺伝子, PRPS1とPRPS2,をそれぞれXq21ーqterおよびXpterーq21にマップしただけでなく, PRPS1に相同な配列をもつ遺伝子PRPSL1, PRPSL2を見出し,それぞれXp22ーqterおよび第9染色体にマップした.ポリアミン・ジギトニン処理法でヒト培養リンパ球(GM130B)から得た分裂中期染色体をヘキスト33258で染色し、FACS 440セルソーターを用いて15画分に分別できるようになった。分別されてセルソーターから滴下してくる各染色体画分を直接ニトロセルロースフィルターにスポット状に集め、ラベルしたDNAプローブとのハイブリダイゼーションを迅速に行えるようになった。このようにソーティングした染色体フィルターと雑種細胞パネルのDNAを併用して数種のヒト遺伝子をマッピングした。これらの遺伝子はMyelo-peroxidase(MPO)/第17染色体、Interleukin 4(IL4)/第5染色体、Phosphoribosylpyrophosphate synthetase(PRPS)の2個のサブユニットの遺伝子PRPS1/Xq21-qter、PRPS2/Xpter-q21、およびPRPS1の2個の相同遺伝子PRPS1L1/7p22-qter、PRPS1L2/第9染色体、Adenine nucleotide translocater(ANT)/第4染色体である。Ca^<2+>依存性のプロテアーゼ(カルパイン)のサブユニットに関して4つの遺伝子を異なる4つの染色体にマップできた。すなわちCANPL1/第11染色体、CANPL2/第1染色体、CANPL3/第15染色体、CANPS/第19染色体である。さらにプロテインキナーゼCの基質80K蛋白の遺伝子80KーIIを第19染色体にマップした。ポリアミン・ジギトニン処理法でヒト培養リンパ球(GM130B)から得た分裂中期染色体をヘキスト33258またはヨウ化プロピジウムで染色し、FACS 440セルソ-タ-を用いて18画分に分別できるようになった。分別されてセルソ-タ-から滴下してくる各染色体画分を直接ニトロセルロ-スフィルタ-にスポット状に集め、ラベルしたDNAプロ-ブとのハイブリダイゼ-ションを迅速に行うスポット・ブロット・ハイブリダイゼ-ション法を確立した。このようにソ-ティングした染色体フィルタ-と雑種細胞パネルのDNAを併用して13種のヒト遺伝子をマップした。すなわちPhosphoribosylpyro-phosphate synthetase(PRPS)の2個のサブユニット遺伝子PRPS1/Xq21-qter、PRPS2/Xpter-q21、およびPRPS1の2個の相同遺伝子PRPS1L1/7p22-qter、PRPS1L2/第9染色体、さらに、Adenine nucleotide translocater(ANT)/第4染色体、Ca^<2+>依存性のプロテア-ゼ(カルパイン)の4個のサブユニット遺伝子CANPL1/第11染色体、CANPL2/第1染色体、CANPL3/第15染色体、CANPS/第19染色体、またプロテインキナ-ゼCの基質となる80K蛋白の遺伝子80K-H/第19染色体、ATP synthase βサブユニット(ATPSB)の遺伝子/12p13ー

qter、ATPSBの2個の相同遺伝子ATPSBL1/第2染色体、ATPSBL2/第17染色体である。我々は染色体ソ-ティングの技術に改良を加え、最近ポリアミン・ジギトニン処理法でヒト培養リンパ球(GM130B)から得た分裂中期染色体を、ヘキスト33258またはヨウ化プロピジウムで染色し、FACS 440セルソ-タ-を用いて合計18画分に分別できるようになった。さらに各染色体画分を直接ニトロセルロ-スフィルタ-に集め、ラベルしたDNAプロ-ブとのスポットブロットハイブリダイゼ-ションを組織的に行う技術も確立した。このようにソ-ティングした染色体と雑種細胞パネルのDNAを併用して、本年度は以下のヒト遺伝子をマッピングした。Calpain subunit1(CAPN1)/第11染色体、同subunit2(CAPN2)/第1染色体、同subunit関連遺伝子(CAPN3)/第15染色体、同subunit4(CAPN4)/第19染色体、Calpastatin(CAST)/第5染色体、水疱性類天疱瘡抗原蛋白遺伝子/第6染色体にマップした。
血管・脂肪組織由来新規分泌因子Favineの機能解析

肥満や糖尿病では動脈硬化が発症進展するが、その機序には依然不明な点が多い。研究代表者らは動脈硬化症に関わる新たな候補因子を探索し、血管より分泌される分泌因子Favine(fat/vessel-derived secretory protein)を同定し、本因子に着目した研究を行っている。本研究では、脂肪細胞と血管におけるFavineの作用のメカニズムを解明する。
明治期初等国語読本とリテラシ-形成メディアとしての子どもの読み物に関する研究

4年間にわたった本研究を通して、以下のような成果があがった。すなわち、明治期の子どもたちが何を読んできたのか、また、大人たちや文教当局は何を読ませようとしてきたのか、その具体的な様相を明らかにしたことである。また、そこから、急速な近代化の中で、在来の文化との激しい摩擦の中で生み出された様々な活字メディアを通して、子どもたちがどのようなリテラシーを身につけてきたのかを跡づけることもできた。(1)目的本研究は、教科書や児童読み物についてのさまざまな試みが模索され、また大きな転換点でもあった明治期の文化状況に光を当て、そこでの小学校教科書と児童読み物との相互交渉と断絶の様相を明らかにすることを目的としている。それは、教科書や児童読み物を通して作り上げられた、近代文化の展開の様相を視野に入れつつ、日本近代児童文学史や教科書史を書き換えることでもある。(2)方法文献資料の収集とその分析が中心となる。明治期の国語教科書類に大きな影響を与えたアメリカのリーダー類との比較分析、明治期の国語教科書(読本)の系統的な調査とその位置付け、さらには周辺の子ども文化との比較検討を通して、明治期の子どもはどのような知識獲得メディアを通してリテラシーを身につけ自己形成していったのかを、歴史的に探求する。本年度は、明治期初等国語読本と子ども読み物の状況を調査しその特徴を整理した。まず、明治初期の「子ども向け翻訳啓蒙書」として、従来は取り上げられてこなかった25冊を博捜し、それらを一覧表にした。総数では、33冊をランクアップすることができた。この調査は、2008年秋の日本児童文学学会で報告した。その多くがアメリカの英語読本に材を仰いでおり、中でもSargent's Standard Readerを種本としたものが最も多いことがわかった。そのうち深間内基の『啓蒙修身録』と松山棟庵の『サルゼント氏第三リイドル』には、本邦初訳のグリム童話が含まれていた。また前者にはアンデルセンの本邦初紹介作品もある。さらに、これら「子ども向け翻訳啓蒙書」には、アメリカのコウデリーの修身書から翻訳したものもいくつかある。明治初期には、子どもの読み物として「修身」的な内容を持つものが求められたからだと思われる。また、こうした子ども向けの翻訳・翻案作業が数多く行われた大きな要因に、福沢諭吉の直接の影響力が働いたことも指摘できる。一方、諭吉の影響とは別に、同様な訳業も各地で行われており、その中では、全文ひらがなによる鳥山拓の子ども向け啓蒙書の先駆的な仕事が、特筆すべきものである。これら「子ども向け翻訳啓蒙書」が果たした役割を、もとになったアメリカの読本や修身書などと比較して、その内容、文章・文体などの観点から検討した結果、これらの本が明治期の子ども読み物に占める位置は、これまで考えられてきた以上に大きいのではないかという結論を得た。平成21年度は、明治初期初等国語読本と子どもの読み物の状況を、国語教科書を中心として探っていった。中心になったのは、『小学読本』などの国語教科書をめぐる状況の調査と考察である。まず、明治10年代までの国語教科書とその様相について整理・考察をした。この時期の、国語教育、とりわけ国語教科書に関する研究には、山根安太郎、望月久貴、古田東朔などの仕事がある。これらを踏まえて、従来の研究では言及されてこなかった部面の調査と整理をした。その一部を、「第116回全国大学国語教育学会(秋田学会)」において、「明治初期国語教科書の検討-福沢諭吉・古川正雄・松川半山の仕事-」と題して、口頭で発表した。この作業の中で、明治初年には、翻訳啓蒙家や戯作画家などが、教科書あるいは類似の読み物を熱心に手がけていたことがわかり、その意味について考察することができた。次に、明治6年に刊行された最初の国語教科書というべき『小学読本』について、研究を進めた。その原本になったウィルソンリーダーとの比較については、様々な先行研究がある。これらを踏まえて、出典が不明だった第一巻の冒頭教材について、その典拠が外国の地理教科書であることを特定し、またそれが『小学読本』の冒頭に置かれたことの意味について考察した。冒頭教材という一教材についての研究だったが、それを通して明治初年には、欧化主義的な方向と国粋主義的な方向とが、互いにぶつかり合いながら展開していった様相が、教科書の教材編成や構成に表れていることを実証することができた。さらに、『小学読本』から派生した様々な『小学読本』類似の読本についても視野を広げ、そのうち『滋賀県管内小學読本』については、論考にまとめることができた。平成22年度は、明治中期初等国語読本と子どもの読み物の状況を、国語教科書を中心として探った。中心になったのは、明治期の教科書書肆の雄とも言うべき金港堂の国語教科書と、文部省の国語教科書をめぐる状況の調査と考察である。

まず、金港堂の教科書を出版研究の側面から研究した稲岡勝の成果や、文部省の教科書政策を研究した掛本勲夫などの成果の上に立ち、金港堂や文部省がどのような意図で言語教科書を作製し、それがどのような内容構成になっているのかを分析した。金港堂関係では、久松義典の『小学読本』、日下部三之助の『小学読本』、それに新保磐次の『日本読本』などを検討し、それぞれの先進性とその特徴を考察した。金港堂の教科書が伝統的な日本の言語教育の方法を摂取しながら、大衆化路線を採用し、そのことによって多くの支持を得て、販売部数を伸ばしていったことが解明された。一方、文部省は森有礼文部大臣の構想の下、文部省に編輯局を置き、伊沢修二を中心として、西欧の言語教科書の編集理念に学んだ先進的な教科書を作りあげた。それが『読書入門』『尋常小学読本』である。その内容の分析とともに特徴のある教材についてその出典を探り、この教科書が当時のグローバルスタンダードに依拠していたことを実証した。だが、農村部の学童の就学のために実科的な「簡易科」を創設せざるを得ず、そのための『小学読本』も作製した。つまり、文部省は二系統の国語教科書を作製したのである。従来、この『小学読本』についてはほとんど研究されていなかったが、その全体像を把握して、それがどのような意味を持つのかについて考察することができた。さらに、明治検定期の代表的な国語教科書について資料を収集し、またそれが子ども読み物である「少年書類」とどのように関係するのかについて考察する準備が整った。本年度は、修身教育・副読本類と子ども読み物の研究を進めた。具体的には、修身教育の大きな流れを踏まえつつ、その周辺にあった「修身読み物」をリストアップし、子どもの読み物文化の一環としてそれを位置づけた。国立国会図書館の近代デジタルライブラリーで入手できる文献については、ほぼ関連文献の一覧表を作成し、それを分析した。また、「修身口授書」として教室で広範に使われた『修身説約』や、おそらくその校外版だと思われる種々の「修身読み物」類、あるいは草双紙屋で売られていたと考えられる「明治赤本」などと学校教育との関連を考察することもできた。そこでは、「修身口授」から始まった修身の授業が、いわば「ストーリーテーリング」と同じような現場性と問題を抱えていたという観点に立って、いくつかの「修身読み物」をとりあげて考察を進めた。また、それが教室でひとまとまりの話として語られたという事実に目を留めることによって、文字として書かれた「読み物」と音声表現との関係を、さまざまな位相から考えた。このように、本年度の研究では、明治初期から始まって、国定教科書が出現するまで、すなわち明治37年前後までの、修身教育と子ども読み物との関係を大筋で押さえることができた。4年間にわたった本研究を通しては、以下のような成果があがった。すなわち、明治期の子どもたちが何を読んできたのか、また、大人たちや文教当局は何を読ませようとしてきたのか、その具体的な様相を明らかにしたことである。また、そこから、急速な近代化の中で、在来の文化との激しい摩擦の中で生み出された様々な活字メディアを通して、子どもたちがどのようなリテラシーを身につけてきたのかを跡づけることもできた。
p53シトルリン化修飾の臨床的意義の検討

我々の解析の結果、新規p53-PADI4経路の基質として、histoneH4R3及びLaminCR197,R198を同定した。またPadi4欠損マウスで放射線抵抗性を示すこと、PADI4が癌組織、癌細胞株で高頻度に機能喪失型の変異を認めることから、PADI4ががん抑制遺伝子であることが示唆された。平成22年度は、p53のシトルリン化部位についての解析を行った。まずin vitroでp53をシトルリン化させたサンプルについて質量分析を行った結果、複数のアルギニン残基がシトルリン化を受けることが明らかとなった。これらの部位について実際にシトルリン化を受けるかどうかを検討するため、p53の変異体を作成した。各変異の発現ベクターをp53欠損細胞株であるH1299細胞にPADI4発現ベクターとともに導入し、p53タンパク質のin vivoでのシトルリン化の有無を検討した。その結果、細胞内のCa濃度(10-7M)ではp53はシトルリン化を受けず、細胞外のCa濃度(10^<-37>M)でシトルリン化を受ける事が明らかとなった。これらの成果より、強いDNAダメージややp53の変異などでp53が異常に蓄積した細胞が細胞死を起こすことによって細胞の膜構造が破綻した結果、細胞外にPADI4と共に放出されてシトルリン化を受ける可能性が明らかとなった。またp53のシトルリン化に影響する遺伝因子を明らかにする目的で、食道癌症例700サンプルを用いて血清中p53抗体価の測定と、710万箇所のSNPタイピングを施行した。この結果を基に、p53の抗体価と関連する量的形質について検討を行った。その結果、p53のアミノ酸置換を伴うSNPを含め複数の遺伝子多型が血清p53抗体価と関連することが明らかとなった。今後これらの結果については別サンプルので再現性を検討を行う。また採血を複数回行っている症例については、手術や再発の前後、化学療法、放射線療法の有無とp53抗体価の変化について検討を行う予定である。平成23年度は、平成22年度に同定したp53のシトルリン化部位に対する抗体の作成を行った。計6カ所の候補領域に対して抗体を作成したが、残念ながらいずれの抗体でも内在性のシトルリン化p53は確認できなかった。細胞内レベルに相当する低Ca濃度(10-7M)ではp53はシトルリン化を受けず、細胞外レベルの高Ca濃度(10-3M)でシトルリン化を受けるというinvitroの解析結果も含めると、p53は生理的な条件では細胞内でシトルリン化修飾を受けないことが示唆された。また700例の解析で血清中p53抗体価と関連を示したHLA領域については、追加サンプルで検証を行ったが、p53の抗体価と関連する量的形質は同定できなかった。今後更に症例数を増やすと共に、担癌状態の患者に絞り込んで解析を進める予定である。これらの結果を元に、p53以外の生理的な条件でのシトルリン化の基質の探索を行った。その結果、NPM1以外にヒストンH4R3,LaminC R197,R198がシトルリン化修飾を受ける事を明らかとした。さらにこれらの分子のシトルリン化によってクロマチン構造が弛緩し、DNaseによる核の切断が起きやすくなる事を示した。また癌細胞株にてPADI4の遺伝子変異を探索した所、60細胞株中6細胞株でアミノ酸置換を伴う遺伝子変異が認められ、さらに内5細胞株では顕著に酵素活性の低下が認められた。またPADI4ノックアウトマウスの検討によって、胸腺組織においてもγ線照射後ヒストンH4R3のシトルリン化がPADI4依存的に認められ、またノックアウトマウスはアポトーシス抵抗性を示した。これらの結果より、PADI4が癌抑制遺伝子として機能し、DNAダメージ依存的なアポトーシス制御のメディエーターとして働くことが示された。平成24年度は、新規のPADI4の基質の探索を行った。候補分子を用いたin vitrocitrullination assayの結果、cyclinA2及びp27がシトルリン化修飾を受ける事を明らかとした。さらにこれらの分子のシトルリン化部位を同定し、特異的抗体の作成を行った。またマウス骨髄組織においては、cyclinA2のmRNA量は変化がないものの、タンパク量がノックアウトマウスにおいて野生型に比べて顕著に減少していた。以上の結果より、シトルリン化修飾がタンパク質の安定化に関わる可能性が示唆された。またProteome解析によって、網羅的な基質の探索を行った結果、hnRNPファミリーが顕著にシトルリン化を受けることが明らかとなった。現在シトルリン化部位の同定、抗体作成を進めている。また癌組織におけるPADI4の遺伝子変異を探索した所、ICGC等のデータベースに8箇所の変異が登録されていた。これらの変異について酵素活性に与える影響を検討した所、全てで酵素活性の低下が認められた。これらの結果より、PADI4が癌抑制遺伝子として機能し、さらに細胞周期やRNA splicingなどに重要な役割を担うことが示された。

一方、ノックアウトマウスでは、発癌に関して顕著なphenotypeが認められなかった。マウスPadi4はヒトPADI4に比べ酵素活性が弱く、この違いが弱い表現型として現れていと考えられた。当初予定の解析はほぼ終了した。生理的なp53のシトルリン化は今回作成した抗体では確認ができなかった。一方、p53以外の基質も並行して探索を行い、ヒストンH4及びLaminCがDNAダメージ依存的にシトルリン化修飾を受けることを明らかとした。またp53の抗体価と関連する遺伝因子は、追加サンプルの解析の結果再現性が確認できなかった。今後更なるサンプルの追加や、血清の採取時期を手術前のみとするなど適切なサンプルを用いた再解析が必要になると考えられる。24年度が最終年度であるため、記入しない。当初の解析対象であったP53は残念ながらシトルリン化を証明できなかったが、p53以外に複数の分子がシトルリン化を受けること、またシトルリン化修飾の発癌における意義が我々の解析で明らかとなった。今後さらなる基質を明らかとすることによって、PADI4の生理的な意義が解明できると考えている。我々はこれまで報告した以外に複数の新規シトルリン化標的を同定しており、今後はこれらについて抗体の作成と機能解析を進めていく。またPADI4の発現量に影響することが知られている遺伝子多型についても発癌リスクとの関係について解析予定である。これらの解析を通じてp53-PADI4を介したシグナルネットワークを更に解明していく予定である。
膜蛋白質の局在化に働くモチーフPDZドメインをもつ分子群ZO-1/ZO-2の解析

細胞間接着構造の形成には、多くの、膜タンパク質および細胞内タンパク質間の相互作用が必要である。この相互作用がどの様にしてオーガナイズされているのか明らかにすることは、発生過程における種々の細胞の挙動、また癌化・転移のプロセスなど細胞間接着が関わる様々な問題を解き明かすことにつながると思われる。近年、two-hybridsystemを含む種々の手法により、上皮細胞間の接着部位に局在する新規タンパク質も多数同定されてきた。特にtightjunctionについては、形態学的なtight junctionの特徴であるいわゆるstrand構造を形成する実体として、膜タンパク質クローディンが同定され、さらに、細胞内タンパク質としてPDZドメインをもつASIP,MAGI-1などが同定された。本年度、私は膜タンパク質クローディンとtight junctionに局在するPDZドメインを持つ膜裏打ちタンパク質ZO-1,ZO-2,ZO-3,ASIP,MAGI-1との相互作用について詳しい解析を行った。まず、マウス線維芽細胞L細胞に外来生にクローディンを発現させた細胞C1LにおいてZO-1,ASIPの局在を調べた。ZO-2,ZO-3,MAGI-1についてはC1L細胞に内在性に発現していなかったため、C1L細胞に外来性に発現させクローディンの分布と比較を行った。その結果、ZO-1,ZO-2,ZO-3はクローディンと一致した局在を示し、ASIP,MAGI-1は異なった分布パターンをとっていた。免疫沈降および組み換えタンパク質を用いたin vitroの結合実験から、クローディンのC末端2アミノ酸のモチーフYVにZO-1,ZO-2,ZO-3のPDZ1ドメインが直接結合することなどが明らかになった。ZO-1/ZO-2は細胞間の接着部位に存在する膜裏打ち蛋白質で、膜蛋白質を細胞膜の特定の領域に局在化させる働きを担っていると予想される。この予想を裏付ける根拠の一つとして、ZO-1/ZO-2がもつPDZ(PSD95,Dlg,ZO-1)ドメインと呼ばれる構造を有する分子群が存在し、その中の多くのものが上皮細胞や神経細胞などにおいて種々の膜蛋白質の細胞質領域に直接結合していることがあげられる。昨年度ZO-1を様々なドメインに分けて培養細胞へのトランスフェクション、in vitro結合実験などを行い、ZO-1のもつ特徴について解析した。本年度は、ZO-2について同様の解析を行い、ZO-2がZO-1と非常によく似た性質を示すことを明らかにした。すなわち、PDZドメインを含むN末側において膜蛋白質であるオクルディンに結合し、C末側でアクチンフィラメントと結合することによりオクルディンを細胞間接着装置のうちtight junction特異的に局在させることに関与していると予想された。こうした知見から、ZO-1とZO-2はお互いにredundantな分子であると考えられるが、各々が実際に生体内で果たしている機能をより直接的に解析するために、gene targetingによってZO-1およびZO-2を欠失したマウスの作製を試みた。現在生殖系列に入ったキメラマウス由来のヘテロ個体が誕生しており、今後ホモ個体を得てその表現系を解析していく予定である。
ヒト慢性肝疾患の進展機序における肥満細胞の役割について:特に血管作動性物質との相互作用に関する分子病理学的解析

昨年度は肥満細胞キマーゼを組織アンジオテンシン産生系の一部と見なし、これを含めたアンジオテンシン系の肝硬変の病態への関与について明らかにすべく、主として免疫組織化学的検索にもとづいた研究に取り組んだ。その結果、肥満細胞キマーゼや組織アンジオテンシン系の発現亢進は、肝線維化の増悪や門脈圧亢進に関連していることを究明し得た。これらの所見は学会発表を通じた他研究者との意見交換により、その解釈に若干の変更が加えられ、再発表(次ページ、研究発表1)の予定であり、また雑誌へ投稿中である。本年度は肝硬変組織におけるエンドセリン系と肥満細胞キマーゼとの関連について、免疫組織化学、定量的PCR法およびELISA法などを駆使し、蛋白およびmRNAレベルで解析した。結果として、諸家の報告と同様、肝硬変組織中のエンドセリン1濃度は正常肝に比べ有意に上昇しており、病態への関与が示唆された。一方、その産生系酵素であるエンドセリン変換酵素をmRNAレベルで、また肥満細胞キマーゼを陽性細胞数で検討したところ、肝エンドセリン1濃度との明らかな相関は得られず、確認のための追加検討を進めている。さらに、受容体に関してmRNAレベルで検討したところ、肝硬変組織に発現しているのは2つのサブタイプ(AおよびB)のうち、主としてTypeB受容体であった。これも諸家報告するところと同じであるが、TypeB受容体を介したエンドセリン1の肝線維化や門脈圧亢進への関与は現在なお論争のポイントとなっており、所見の解釈には慎重を要すると考えられた。加えて肥満細胞キマーゼの産生するエンドセリン1(1-31)は肝組織に含まれるエンドセリン1全体の1/10程度であった。したがって、その肝病態への関与については大勢を左右するものとは考えにくい。以上を踏まえ、本テーマについては今後も解析を継続し、所見の意味するところが明らかとなった時点で発表することとした。肥満細胞キマーゼが慢性肝疾患の病期進展および線維化過程へおよぼす影響、殊に血管作動性物質の1つであるアンジオテンシンの作用を介したものに焦点を絞り、研究に取り掛かった。肥満細胞キマーゼは、炎症反応の制御やアンジオテンシンの活性化に関与することが知られている。アンジオテンシンは近年、肝線維化機序や門脈圧亢進に関与しうる因子として、エンドセリンなどとともに注目されており、肥満細胞はこれらの作用を介して、慢性肝疾患の病態に関与している可能性が考えられる。仮説の基盤となる、肥満細胞キマーゼおよび組織レニン・アンジオテンシン系の肝組織内での発現様態を、ヒト肝硬変患者肝組織を対象に検索した。免疫組織化学的にキマーゼ陽性細胞を検出し、その分布密度をモルフォメトリー技法の応用により算出した。組織レニン・アンジオテンシン系については、アンジオテンシン受容体の発現を、免疫組織化学、モルフォメトリーおよびポリメラーゼ連鎖反応を組み合わせ、蛋白およびmRNAレベルで解析した。その結果、肝硬変組織内ではキマーゼ陽性肥満細胞は正常肝に比べ有意に増加していることが明らかとなった(次頁、研究発表2,4)。アンジオテンシン受容体mRNA発現は硬変肝においても保たれ、またアンジオテンシン受容体を発現した血管は硬変肝において増加し、門脈圧との相関が認められた(研究発表1,3)。さらにアンジオテンシン受容体発現血管量はキマーゼ陽性肥満細胞数と正相関した(研究発表2,4)。以上の結果から、キマーゼにより活性化された過剰なアンジオテンシンは、慢性肝炎・肝硬変の病態下において、肝組織内に分布する血管や筋線維芽細胞に作用し、門脈圧亢進症や線維化促進に関与しうることが示唆された。来年度は検索対象をアンジオテンシンの組織濃度の測定やエンドセリン系の種々の項目にも拡げ、慢性肝疾患における肥満細胞キマーゼの役割について、その可能性をより深く検討していく予定である。

これも諸家報告するところと同じであるが、TypeB受容体を介したエンドセリン1の肝線維化や門脈圧亢進への関与は現在なお論争のポイントとなっており、所見の解釈には慎重を要すると考えられた。加えて肥満細胞キマーゼの産生するエンドセリン1(1-31)は肝組織に含まれるエンドセリン1全体の1/10程度であった。したがって、その肝病態への関与については大勢を左右するものとは考えにくい。以上を踏まえ、本テーマについては今後も解析を継続し、所見の意味するところが明らかとなった時点で発表することとした。
活性酸素共存下でのメイラード反応による新規変異原の生成と植物成分による生成抑制

本研究は還元糖とアミノ酸をクレアチニンとともに0.2Mリン酸緩衝溶液(pH7.4)に1:2:2のモル比で溶解し、主として37°Cの生理的条件下で反応させ、生成する変異原物質をブルーコットンに吸着後、2%アンモニア-メタノール混液で溶出し、Ames試験を行った。変異原性陽性画分についてLC-MS分析を行い、化学構造を解析した。また、それら変異原の生成に対する酸素や金属イオン、植物成分の影響とともに、動物体内での生成の可能性について検討した。(1)グルコース、フェールアラニン、クレアチニンまたはグルコース、グリシン、クレアチニンからなる混合液を生理的条件下(pH7.4、37°C)で静置したところ、前者より2-amino-1-methyl-6-phenylimidazo[4,5-b]pyridine (PhIP)を、後者より2-amino-3,8-dimethylimidazo[4,5-f]guinoxaline (MeIQx)を変異原性物質として同定した。両変異・発がん物質は加熱ハンバーグや焼魚から分離されているが、生理的条件下でその生成を初めて明らかにした。(2)グルコース、グリシン、クレアチニンの反応液の変異原性は鉄イオンの添加により上昇し、溶存酸素濃度とは逆相関を示した。茶カテキンの添加により変異原性は低下した。3成分をマウスに投与し^<32>P-ポストラベル法で検討したが、2週間ではDNA付加体を検出することはできなかった。(3)グルコース、クレアチニンの混合物に、メチオニン、プロリン、トレオニンをそれぞれ添加して生理的条件下で反応させた場合、グリシンやフェニルアラニンを用いた場合と比較して強い変異原の生成を認めた。化学構造を解析中である。初年度はD-グルコースに各種アミノ酸を加え、pH7.4のリン酸緩衝液中、37°Cで反応させたところ、反応液は次第に褐変し、蛍光強度が増加した。各反応系にクレアチニンを添加したところ、12ヶ月後にS.typhimurium TA98、+S9mixで強い変異原性を示す物質の存在を確認した。また、Fe^<2+>、Fe^<2+>の添加により反応が著しく上昇した。グルコース-グリシン-クレアチニンの反応液より2-amino-3,4-dimethylaminoimidazo[4,5-f]quinoxaline(MeIQx)を、またグルコース-フェニルアラニン-クレアチニンの反応液より2-1-amino-methy1-6-phenylimidazo[4,5,6]pyridine(PhIP)を分離した。両化合物はいずれも魚類や獣肉の焼け焦げ変異のがん原物質であるが、37°C、pH7.4という生理的条件下で生成することを初めて明らかにした。さらにアミノ酸としてL-プロリン、L-スレオニン、β-アラニン、L-メチオニンを用いた反応液も強い変異原性を示したことから、活性酸素(02-、・OH、NO、ONOO-)の存在下、非存在下での変異原の検索を行っている。このことは極めて緩和な反応条件下でも変異原が生成することを意味しており、生体内とともに環境中でこれら変異原が容易に生成する可能性が示唆された。現在、各種茶葉抽出物を用いて変異原生成に対する抑制効果についても検討しており、その成果を期待している。魚肉や獣肉の加熱過程で生成するヘテロサイクリックアミン(HCA)は、変異原性・がん原性を有する。それらの中のいくつかのHCAが、還元糖、アミノ酸、クレアチニンより生成することが明らかにされてきた。

我々はin vitroで、且つ、生理的条件(37°C、pH7.4)において、グルコースとフェニルアラニン、クレアチニンのメイラード反応により、2-amino-1methyl-6-phenylimidazo[4,5-b]pyridine(PhIP)が、グルコースとグリシン、クレアチニンのメイラード反応により、2-amino-3,8-dimethylimidazo[4,5-f]guinoxalim(MeIQx)が生成することを明らかにした。この結果は、人の生体内においてもHCAが生成する可能性を示唆するものであった。そこで、同じモデル系におけるHCA生成量と生体内の変動因子の関連を調べるために、S. typhimurium TA98を用いてAmes試験を行い、さらにLC/MSによる定量を試みた。グルコース、グリシン、クレアチニンの系では、溶存酸素濃度が上昇すると変異原性が低下する傾向を示した。一方、鉄イオンの添加により変異原性が上昇し、MeIQxの生成量と変異原性の間に正の相関がみられたことから、メイラード反応が促進されたものと推察した。しかし、グルコース、フェニルアラニン、クレアチニンの系では、PhIPの生成量と変異原性との間に相関がみられず、同時に別の副反応が進行しているものと考えた。グルコース、クレアチニンの系にメチオニンやプロリンを添加してメイラード反応を行ったところ、さらに高い変異原性が認められたので、現在、それらの化学構造を解析している。なお、各反応系に緑茶抽出物またはカテキン類を添加したところ、PhIP, MeIQx等の変異原性物質の生成が有意に抑制することを明らかにした。これらの実験結果は生理的条件下で進行する変異・発がん物質の生成が食品成分で阻害されることを示しており、今後、動物実験なヒトにおいて、それらの現象が観察できるか否かを検討することは、日本人の死因の第一位を占めるがん予防の面からも極めて重要であると考えている。
機械学習支援によるプラズマ表面反応解析原理の確立

半導体デバイス製造工程に使われるプラズマプロセス技術は、デバイスの超微細化を主導し、巨大産業と結びついている。現在、半導体デバイスの微細化が極限にまで進み、原子レベルの構造加工が研究対象となる中、ある特性を持つ薄膜やプロセスを実現にするには、どの基板材料を用いて、どのようなプラズマ条件が必要か、という問題に対する回答を与える必要がある。この問題に回答する人工知能(AI)開発の第一歩が、本研究課題であり、具体的には、プラズマ表面相互作用研究分野において、機械学習を用いて、数値シミュレーションや実験から得られた大量のデータを処理することにより、まだ研究のなされていない物質とプラズマの組み合わせに対するプラズマ表面相互作用を予測する技術を確立し、その予測手法に学術的基礎を与えることを本研究の目的とする。本年度は、プラズマを用いた微細加工において、プラズマと基板との相互作用を理解するために重要なパラメータであるスパッタ率の予測手法を開発した。すなわち、本研究では、機械学習を用いて既知のスパッタ率データから予測モデルを作成し、これら新規プロセス開発の効率化を行った。予測モデルの作成には、ノンパラメトリック回帰であるGaussian process regressionを用いた。スパッタ率のデータセットは文献から収集し、基板原子の質量、原子番号、融点と、照射イオン種の質量、原子番号、照射エネルギー等を記述子として回帰を行った。前提となる知識などを入れずデータのみから予測モデルを作成したにもかかわらず、実験値と予測はよく一致しており、高い精度の予測モデルを作成した。当初の計画では、物理スパッタリング・イールドの経験則を記述したYamamura-Tawaraの公式[Y. Yamamura and H. Tawara: Atomic Data and Nuclear Data Tables 62, 149-253 (1996)]を、同公式を基に作成した大量のイールド値にノイズを重畳した人工のイールド・データを作成し、そのノンパラメトリック回帰から、Yamamura-Tawaraの公式を再発見することにより、機械学習の手法を確立することを目的とした。本年度の研究では、早いうちにその作業を終え、過去に実験的に求められた多量のイールドデータから直接、幅広い基板物質および入射イオン種、入射イオンエネルギーに対して、機械学習によりイールドを予測する手法を確立した。また、本研究において、ベイズ推計により、Yamamura-Tawaraの経験則に用いられる各種パラメータの物理的意義を明らかにすることが可能となった。こうした結果を踏まえ、現在までの進捗状況に対して、上記の判断を下した。これまでの研究で、大量のデータからスパッタリング率を予測する手法を確立したが、今後は、その物理機構をより詳細に理解するため、系を記述する各種の記述子の相対的重要性を、より系統的な解析により、定量的に評価する。具体的には、基板を構成する原子および入射イオンの質量や原子半径、基板を構成する原子の結合エネルギーに関係する物理量(表面結合エネルギー、融点、沸点等)、イオン入射エネルギー等、関連すると考えられる多数の記述子の相対的重要度を評価する。また、原子間ポテンシャルエネルギーの特徴量を記述子としたとき、このポテンシャル関数と、この原子で構成される物質表面のスパッタリング・イールド(エッチング率)の関係を分子動力学シミュレーションにより求め、データベースを作成する。この結果と、上述した記述子群の関係を明らかにすることにより、スパッタリング現象・エッチング表面反応の物理機構を明らかにする。

また、本研究において、ベイズ推計により、Yamamura-Tawaraの経験則に用いられる各種パラメータの物理的意義を明らかにすることが可能となった。こうした結果を踏まえ、現在までの進捗状況に対して、上記の判断を下した。これまでの研究で、大量のデータからスパッタリング率を予測する手法を確立したが、今後は、その物理機構をより詳細に理解するため、系を記述する各種の記述子の相対的重要性を、より系統的な解析により、定量的に評価する。具体的には、基板を構成する原子および入射イオンの質量や原子半径、基板を構成する原子の結合エネルギーに関係する物理量(表面結合エネルギー、融点、沸点等)、イオン入射エネルギー等、関連すると考えられる多数の記述子の相対的重要度を評価する。また、原子間ポテンシャルエネルギーの特徴量を記述子としたとき、このポテンシャル関数と、この原子で構成される物質表面のスパッタリング・イールド(エッチング率)の関係を分子動力学シミュレーションにより求め、データベースを作成する。この結果と、上述した記述子群の関係を明らかにすることにより、スパッタリング現象・エッチング表面反応の物理機構を明らかにする。
C型肝炎における肝傷害機序:抗原提示細胞の宿主防御免疫機構における役割

C型慢性肝炎での持続感染の原因として樹状細胞機能低下によるHCV抗原特異的T細胞間のpriming状態の異常がないかどうかを検討した。C型慢性肝炎患者の末梢血からGM-CSFとIL-4で培養することにより、樹状細胞を誘導し、組み替えHCV蛋白抗原(core,NS3)およびpeptide抗原特異的ヘルパーT細胞増殖反応を誘導した。この増殖反応は非感染者よりは有意に増強していたが、他のPPD抗原などの反応はむしろ低下していた。樹状細胞によりHCV特異的に誘導された増殖T細胞では、peptideをパルスした標的細胞に対するCTL活性が認められたが、増殖応答の弱い抗原刺激に対してはCTL活性は認められず、上清中にIL-4活性の増強が認められた。このことは、樹状細胞の刺激でTh1型T細胞のみならず、Th2型T細胞が誘導される可能性があり、慢性肝炎患者間で抗原の種類やHLAのtypingに一定の見解は得られなかった。可能性としては、このようなTh2型T細胞がより有意に反応する状態が、HCV抗原の少なくとも一部分に対しては存在しており、それが持続感染の原因になっている可能性が示唆された。また、peptide抗原を用いたときと違って、crudeの組み替え蛋白を抗原として用いたときには、樹状細胞のみでは反応が弱く食作用のあるマクロファージによるprocessingが樹状細胞による抗原提示において必須であり、この行程が抗原特異的クローンの性質を左右する可能性も考えられた。C型肝炎は多くは持続感染の形で慢性に経過し、治癒することは困難とされる。しかしながら、急性肝炎で治癒する例やウイルス量が多いにもかかわらず肝傷害の軽微な患者がいるなど、疾患における免疫応答の違いはこの病態を明らかに修飾していると思われる。この理由を解明するためにC型慢性肝炎患者の末梢血リンパ球の抗原提示機能につき検討した。抗原提示細胞のうち職業的抗原提示細胞といわねる樹状細胞は分離直後にはわずかの比率しか含まれていないがin vitroでサイトカインで刺激することにより増殖及ぴ培養可能とされている。今回我々は末梢血リンパ球分画からプラスチック付着細胞と非付着細胞分画に分け、それぞれをサイトカイン(GM-CSFとIL-4)で刺激して得られるHCV抗原の抗原提示能の増強につき検討した。C型慢性肝炎患者末梢血リンパ球でのHCV抗原特異的増殖反応はGM-CSF添加により活性化された樹状細胞により増強されたが、この反応はIL-4添加で抑制された。未感作の健常人末梢血リンパ球でも同様に活性化された樹状細胞がHCV特異的応答を誘導することができたが、これはIL-4添加でむしろ反応が増強される傾向にあった。以上よりC型慢性肝炎で感作されているリンパ球とin vitroで1次的に感作されたリンパ球ではサイトカインに対する応答が異なることより誘導されている細胞分画に違いがあることが示唆された。現在、樹状細胞表面マーカーの一っのCD83抗原に対する組み替え抗原を作成中であり、さらにその抗体を用いた抗原提示細胞の亜分画化により詳細な機能解析を行う予定である。vitroで誘導されてくる細胞であり、生理的にはかなり低い頻度でしか存在しない。この誘導されたDCとpeptide抗原を用いて、未感作のヒトneive T細胞からin vitroでmemory T細胞が誘導できる可能性がmelanoma抗原などの系で示されている。今回、DCによるHCV抗原提示での抗原processing機能を調べるために、HCVの組替え蛋白抗原(coreおよびNS3)およびHCVcore peptideを浸透圧によりDCにendogenicに発現させたもの、およびパルスしたDCにより未感作の健常人T細胞を感作できるかどうか、またすでに感作されたT細胞を増殖刺激しうるかどうかを試験した。その結果健常人10人のneive T細胞からin vitroでHCV抗原特異的T細胞クローンを誘導することはできなかったが、自己のDCに強く反応して分裂増殖するautologous MLR反応性T細胞が誘導された。

一方、C型慢性肝炎の患者では抗原をパルスしたDCを用いてHCV特異的に反応するラインが誘導できたが、これはおそらくin vivoで広がっているクローンをin vitroで誘導したと考えられ、T細胞側の抗原に対して潜在的に存在するクローンサイズが重要であることが示唆された。また、このラインはHLA-DRの一致する患者のDCでも抗原特異的に反応することが確認された。したがって、in vitroでneiveT細胞を感作させるには、より誘導されやすいHCVのpeptide抗原をHLAに連鎖した形で見つけ出し、その上でDCにより抗原提示させることが重要であると考えられた。また、抗原の提示の際にprocessingを分担するマクロファージとの役割分担が示唆された。現在はHLA class I拘束性の、従来報告されたCTLを誘導できるHCV peptideを用いてのCTLの誘導についてDCを用いて解析中である。C型慢性肝炎での持続感染の原因として樹状細胞機能低下によるHCV抗原特異的T細胞間のpriming状態の異常がないかどうかを検討した。C型慢性肝炎患者の末梢血からGM-CSFとIL-4で培養することにより、樹状細胞を誘導し、組み替えHCV蛋白抗原(core,NS3)およびpeptide抗原特異的ヘルパーT細胞増殖反応を誘導した。この増殖反応は非感染者よりは有意に増強していたが、他のPPD抗原などの反応はむしろ低下していた。樹状細胞によりHCV特異的に誘導された増殖T細胞では、peptideをパルスした標的細胞に対するCTL活性が認められたが、増殖応答の弱い抗原刺激に対してはCTL活性は認められず、上清中にIL-4活性の増強が認められた。このことは、樹状細胞の刺激でTh1型T細胞のみならず、Th2型T細胞が誘導される可能性があり、慢性肝炎患者間で抗原の種類やHLAのtypingに一定の見解は得られなかった。可能性としては、このようなTh2型T細胞がより有意に反応する状態が、HCV抗原の少なくとも一部分に対しては存在しており、それが持続感染の原因になっている可能性が示唆された。また、peptide抗原を用いたときと違って、crudeの組み替え蛋白を抗原として用いたときには、樹状細胞のみでは反応が弱く食作用のあるマクロファージによるprocessingが樹状細胞による抗原提示において必須であり、この行程が抗原特異的クローンの性質を左右する可能性も考えられた。
バイオセーフティのための生物地理情報の融合

近年、SARSの発生や現行のH5NI型トリインフルエンザの流行が世界中の注目を集め、その結果、感染症の流行が人間の健康に及ぼす脅威についての認識が高まっている。感染症から社会を守るには、監視や対策に携わる専門家ができるだけ早い段階で意思決定ができるよう、支援ツールを提供する必要がある。当グループは、Web上のニュースソースを利用した感染症の監視と追跡に焦点をおき、テキストマイニング技術を用いてニュース記事内の重要な箇所を特定する手法について研究している。この若手(A)のプロジェクトでは、世界で実際に発生している感染症の動的な側面を理解するのに不可欠な、「地名」の意味について研究を行った。このプロジェクトの成果物は以下の通りである。1.知識ソースの構築。(1)英語、タイ語、ベトナム語、日本語のニュース記事各500件の用語アノテーションおよび関連性アノテーション(2)世界の国名や行政区分など、地名の地理的な分類。2.テキストマイニングシステムへの、地名を理解するためのアルゴリズムの統合。3.Google mapを利用したGlobalHealth Monitor(生物地理情報インターフェース)の開発。現時点で、アメリカやアジア太平洋地域から、一ケ月あたり3000のユーザが訪問している。生物地理情報インターフェースでは、感染症がWeb上で報告された直後から、ユーザが社会的・地理的な文脈に沿った形で発生状況を閲覧することができる。また、情報を病名、日付の範囲、症状や文書のタイプなどによって絞り込むことや、リンクをたどって学術論文や外部のオントロジーなど、より深い知識を提供しているソースに移動することも可能である。また、Google Earthのユーザの向けのデータストリームも提供している。感染症に対して適切な対応を行うには、疾病発生状況の全体な把握が不可欠である。そのためには、言語により伝えられるニュースなどの情報と、生物地理マップの形で提供される視覚的な地理的・社会的情報との統合が必要であるが、これに関する研究はほとんどなされていない。そこで本研究では、テキストマイニングによりWeb上の言語情報から獲得した感染症発生イベントとその要約を、Google Earth上で表示できるプラグインモジュールを開発する。これは医療関係者による感染拡大の予測や、異常事態の検知をサポートする。本年度は、現在開発中のテキストマイニングシステムを基盤として、以下の点に焦点を置いて研究開発を行った。1.知識リソースの構築:(a)500のニューステキストに対して、重要な用語と関連性のアノテーションを行った。言語は英語、日本語、タイ語、ベトナム語の4ヶ国語で、テキストマイニングシステムのトレーニングに用いられる。(b)世界全体の国名、地方名などの地名の分類を行い、アジア太平洋地域の5つの国(ベトナム、中国、韓国、日本、タイ)に関しては主要な都市名もカバーした。(c)ケンブリッジ大学のグループと共同で、感染症監視に関わる情報を含む文から述語項構造フレームへのマッピングを行うパターンのセットを開発した。2.地理オントロジー情報の統合:現在、発表されたニュース記事について、疾病と場所の統計を計算するため、地理オントロジーを使用している。プロトタイプシステムでは、時間軸上での出現頻度がプロットされるため、異常事態の発生を示唆するような動向を監視することができる。更に、このシステムではユーザがGoogle map上で場所を表示したり、Google newsで疾病名と地名のペアを使って記事検索をすることができる。現在、疫学の専門家からフィードバックを得ている。