hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
EMT-MET plasticityによる膵胆道癌進展機序の解明と個別化治療応用

原発巣でPrrx1b高発現によりEMTを起こした浸潤性膵癌細胞が原発巣を離れ、血管内へ侵入、循環、血管内から逸脱の過程を経て転移先に到着した後、Prrx1b発現低下、Prrx1a発現上昇により膵癌細胞のmesenchymalからEpithelialへのphenotypic switchが起こり、Metastatic colonizationが始まるといった一連の現象を確認した。Prrx1は癌細胞のEpithelial plasticityに関連している可能性があり、従来の細胞増殖にtargetをおいた治療に加え、今後の新しい治療法のtargetとなり得る可能性が示唆された。1) 3D cultureで形態的な特徴を解析すると、正常膵管細胞では大部分がSpheroid cystを形成、その後前癌細胞浸潤性膵癌細胞になるにつれSpindleshapeの細胞集塊の割合が増加し、肝転移細胞になると再びcystの割合が増加した。また、膵管細胞間の遺伝子発現ではPrrx1bは浸潤性膵癌細胞で最も高発現、Prrx1aは肝転移細胞で最も高発現であった。さらに、4313PanINcellと5143膵癌細胞にisoformを過剰発現させると、4313でPrrx1bはEMTを、5143でPrrx1aは癌細胞のMETを促進することを見出した。isoform特異的なsiRNAを用い、肝転移細胞のPrrx1aを抑制することによりSpindleshapeに、また浸潤性膵癌細胞のPrrx1bを抑制することによりSpheroid cystに形態が変化した。2) YFPが内因性にlabelingされているマウスの膵癌組織を用い、PRRX1AとPRRX1Bの発現をE-cadherinとN-cadherinとのco-stainingで局在や相関を蛍光免疫染色で確認した。両isoform特異的抗体を用いると、PRRX1Aは核と細胞質に発現を認め、その細胞がE-cadherinと共発現していること、一方、PRRX1Bは核に局在し、YFP発現を認める原発巣のcolonyから遊離した浸潤性癌細胞にN-cadherinと共に存在し、mesenchymalの特徴を有した膵癌細胞に発現していた。さらにヒトの膵原発巣と肝転移巣でのPRRX1A、PRRX1Bの発現を免疫染色で確認し、PRRX1Aは分化型にPRRX1Bは低分化型に有意に多く発現していることを見出した。さらに、マウス膵癌細胞とそれにPrrx1a、Prrx1bをそれぞれ過剰発現させた細胞でorthotopic transplantation、intra-portal vein injectionを行ったところ、PRRX1A過剰発現の腫瘍はE-cadherin高発現で、より分化度の高い傾向を認め、PRRX1B過剰細胞の腫瘍では浸潤傾向が強く、特に浸潤先進部の細胞でPRRX1B高発現、E-cadherin発現消失が認められた。さらにCTCs数がPRRX1B過剰発現腫瘍では最多で、逆にPRRX1A過剰発現腫瘍では有意に少なかった。昨年度の実績としては、当初の予定通り3D-cultureや機能解析等のin vitro実験,および膵癌mouse modelやヒトの膵癌組織のPRRX1A, PRRX1Bに対する免疫染色や、それらの膵臓からisolationされたマウスの細胞株を用いたin vivoの実験が十分に行えたと考えられる。現在の研究の進捗状況としては2つのisoformに対する下流因子候補蛋白についての絞り込みや、追加の免疫染色、および今年度、次年度に予定されている研究の準備が行われており、当初の計画以上に進展していると考えられる。今後、さらに今年度、次年度を通じ、研究を計画通り発展させていきたい。さらに免疫染色に関しては現在の症例数からさらに増やし、臨床での薬剤耐性との関連も検討していく予定である。さらに外部への情報、成果の発信については、現在までに少しずつ積み上げてきたデーターをまとめ、今年度も継続して学会報告を行っていく予定である。論文に関しては、まず第一報として、今年の2月にGenes and Developmentにpublishされた。今後も続報を投稿していく予定である。1ヒトHGF特異的中和抗体を用いたPrrx1b-Hgf axis制御による癌細胞浸潤および転移の抑制。2つのisoformに対するChIP sequence解析を行い、target moleculeをpick up、その中からPrrx1bに対する分子としてHgfを同定した。Prrx1b過剰発現細胞においてHgf発現は有意に上昇し、siRNAによるPrrx1b抑制細胞では著明に発現低下を認めた。siRNAにより癌細胞におけるPrrx1b発現をknockdownさせた後、recombinant HGFにてPrrx1bの機能をrescueできるかinvasion assayにて検証すると、浸潤能がrescueされた。ヒトHGF特異的中和抗体であるficlatuzumabを用い、preclinical studyとしてヒト膵癌細胞によるorthotopic transplantationを行うと、gemcitabineとficlatuzumabのcombination therapyにより有意に転移巣数が減少した。2 Cancer stemnessを有するPrrx1a-Mtdh相互関係が及ぼす転移形成能の解明。次に、Prrx1aのdownstream target因子であるMetadherin (MTDH)について、膵癌細胞における機能解析を行った。まずは、Prrx1a過剰発現膵癌細胞では有意に高いself-renewal capacityを有し、gemcitabineに対する抗癌剤抵抗性を示した。さらに、MTDHのin vitroでの機能解析をshRNA、siRNAを用いて行ったところ、MTDHをknockdownするとpancreatosphere formation assayにおいて有意にself-renewal capacityの低下を認めた。

Anoikis assayにおいてはMTDH抑制細胞では有意にcolony形成数が減少した。今年度の実績としては、当初の予定通りヒトHGF特異的中和抗体を用いたin vitroおよびin vivoの機能解析や、MTDHのin vitro実験が十分に行えたと考えられる。現在の研究の進捗状況としてはおおむね順調に進展していると考えられる。今後、は最終年度となる今年度に研究結果をまとめあげる予定である。外部への情報、成果の発信について、論文では昨年2月にGenes and Developmentに第一報がpublishされ、その論文がNature Reviews CancerのHighlightarticleとして紹介された。第二報として現在投稿中(minor revision)である。来年度も継続して国内・国際学会での報告を行っていく予定である。今後も続報を投稿していく予定である。1)ヒトHGF特異的中和抗体を用いたPrrx1b-Hgf axis制御による癌細胞浸潤および転移の抑制。2つのisoformに対するChIP sequence解析を行い、Prrx1bに対する下流分子としてHgfを同定した。Prrx1b過剰発現細胞においてHgf発現は有意に上昇し、siRNAによるPrrx1b抑制細胞では著明に発現低下を認めた。siRNAにより癌細胞におけるPrrx1b発現をknockdownさせた後、recombinant HGFにてPrrx1bの浸潤能がrescueされた。ヒトHGF特異的中和抗体ficlatuzumabを用い、膵癌細胞によるorthotopic transplantationを行うと、gemcitabineとficlatuzumabのcombination therapyにより有意に転移巣数が減少した。(Genes and Dev 2016)2) Cancer stemnessを有するPrrx1a-Mtdh相互関係が及ぼす転移形成能の解明。次に、Prrx1aのdownstream target因子であるMetadherin (MTDH)について、in vitroでの機能解析を行うと、MTDHをknockdownするとpancreatosphere formation assayにおいて有意にself-renewal capacityの低下を認めた。Anoikis assayにおいてはMTDH抑制細胞では有意にcolony形成数が減少し、shRNAによるMTDH knockdown細胞をヌードマウスに膵臓および門脈に打つとcontrol細胞と比較し、有意に肝転移を減少させた。(Oncotarget 2017)
ＴＲＵＥ　ｇｅｎｅ　ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ法による頭頸部癌増殖抑制の試み

頭頸部癌は世界では年間50万人以上が罹患する.頭頸部癌の治療は手術,放射線治療,化学治療を複合的に組み合わせているが,予後に関しては、この20年で著しい改善は認められていない.その原因のひとつとして頭頸部癌の化学治療抵抗性が挙げられる,本研究の成果は治療成績向上が頭打ちの頭頸部癌治療において新治療法の開発へとつながる可能性を示している,化学療法併用放射線治療が頭頸部癌治療の重要なモダリティーとして確立した今日にあって,その治療効果を高める補助療法の整備は医療者サイドからも患者サイドからも強く望まれるものであり,低侵襲・低コスト・高効率の補助療法を供する可能性をも示しているTRUE gene silencing法を用いて,頭頸部癌細胞でcyclinD1の発現を抑える最適なsmall guide RNA (sgRNA)を見いだし,これらの癌細胞に対する効果を検討することを目的とした.ヒトcyclinD1のmRNAの二次構造からRNA前駆体様構造をとり得る部位6か所を選定し,各々の部位でHT, H, L型の3種類ずつのsgRNAをデザインした.デザインしたsgRNAはO-methyl化修飾したものを作成し,ヒト口腔扁平上皮癌細胞株であるHSC-2,HSC-3細胞を用い,以下の実験を行った.HSC-2細胞にHT型sgRNAのHT1-6をlipofectamin2000を用いトランスフェクション後,2日後にRNAを抽出し,リアルタイムPCRを用いてcyclin D1 mRNAのレベルを測定した.siRNAには及ばないもののHT1-6はいずれもcyclin D1 mRNAのレベルを低下させた.sgRNAはトランスフェクション試薬を用いなくても細胞内に取り込まれるため,HT1-6をトランスフェクション試薬を用いずに添加した.sgRNAはcyclinD1 mRNAレベルを低下させ、特にHT2とHT5の低下が大きく、cyclinD1のsilencingに効果的なsgRNAと考えられた.cyclinD1 mRNAのsilencingのタイムコースでは,トランスフェクション後24時間で20%程度にまで減少した.この減少はsgRNAの濃度に依存し200 nMで最も低下した。そこで,sgRNA,200 nM,24時間後の条件下でsgRNAのサブタイプHT, H, L型でcyclinD1 mRNAのサイレンシングを比較した.いずれも有意に減少し,sgRNAのsubtypeでの違いを認めなかった。次にタンパクレベルの検討を行い.48時間後のcyclinD1は,sgRNAによって減少することを確認した. cyclinD1はその下流で、CDKと結合しRBをリン酸化させることが知られており,事実HSC3細胞では,cyclinD1が過剰発現しpRBが高いレベルで発現している。sgRNAによって,cyclinD1のタンパクレベルが低下するとともに,pRBのレベルも低下した.頭頸部癌は世界では年間50万人以上が罹患する.頭頸部癌の治療は手術,放射線治療,化学治療を複合的に組み合わせているが,予後に関しては、この20年で著しい改善は認められていない.その原因のひとつとして頭頸部癌の化学治療抵抗性が挙げられる,本研究の成果は治療成績向上が頭打ちの頭頸部癌治療において新治療法の開発へとつながる可能性を示している,化学療法併用放射線治療が頭頸部癌治療の重要なモダリティーとして確立した今日にあって,その治療効果を高める補助療法の整備は医療者サイドからも患者サイドからも強く望まれるものであり,低侵襲・低コスト・高効率の補助療法を供する可能性をも示している頭頸部癌は世界では年間50万人以上が罹患し,日本では年間およそ1万人以上が罹患している.現在,頭頸部癌の治療としては手術,放射線治療,化学治療の3つがあり,これらを複合的に組み合わせて行われている.近年,各治療法の進歩が認められるものの,予後に関しては、この20年で著しい改善は認められていないのが現状である.その原因の一端として頭頸部癌の抗癌剤抵抗性が挙げられており,より効果の高い薬剤の開発が望まれている.これまでの研究から,一部の頭頸部癌細胞では,細胞周期の進行制御に関与するタンパク質であるサイクリンD1(CCND1)が過剰発現し,その過剰発現が予後不良因子であることが報告されている.このため,CCND1の発現を抑制することにより予後が改善され得る可能性も考えられ,CCND1を標的とした分子標的薬やRNA干渉等の研究が行われてきた.しかしながら,効果的な薬剤の開発が困難なため,これまで臨床への応用が進んでいないのが現状である.そこで本研究では,RNA干渉等に比較してより容易で低コストの遺伝子発現抑制法であるTRUE gene silencing法に着目した.本研究ではTRUE gene silencing法を用いCCND1を標的とした数種のsgRNAを設計し,頭頸部癌細胞培養系においてこれらの導入によるCCND1発現抑制および増殖抑制作用を調べるとともに,抗癌剤との併用による効果を明らかにすることを目的とした.頭頸部癌は世界では年間50万人以上が罹患し,日本では年間およそ1万人以上が罹患している.現在,頭頸部癌の治療としては手術,放射線治療,化学治療の3つがあり,これらを複合的に組み合わせている各治療法の進歩は認められるものの,予後に関しては、この20年で著しい改善は認められていない.

その原因のひとつとして頭頸部癌の化学治療抵抗性が挙げられる,一部の頭頸部癌細胞ではCyclin D1が過剰発現し,その過剰発現が予後不良因子であることが報告されているが、Cyclin D1は既知の細胞周期促進機能とは別に、DNA二重鎖切断時にRAD51/BRCA2との複合体を形成を介して相同組換えによるDNA修復に関与することが近年証明され、頭頸部癌の化学治療抵抗性の一因となる可能性がある。本研究においてわれわれは、Cyclin D1をターゲットとしたheptamer型sgRNAが頭頸部癌培養細胞で機能した結果として、タンパク質レベルでCyclin D1発現が抑制されていることを確認し、さらに増殖抑制効果を示すこと、および抗癌剤との併用効果を示すことを明らかにした.これらの成果は治療成績向上が頭打ちの頭頸部癌治療において新治療法の開発へとつながる可能性を示している,化学療法併用放射線治療が頭頸部癌治療の重要なモダリティーとして確立した今日にあって,その治療効果を高める補助療法の整備は医療者サイドからも患者サイドからも強く望まれるものであり,低侵襲・低コスト・高効率の補助療法を供する可能性をも示している耳鼻咽喉科・頭頸部外科TRUE gene silencing法を用いて,頭頸部癌細胞でcyclinD1の発現を抑える最適なsmall guide RNA (sgRNA)を見いだし,これらの癌細胞に対する効果を検討することを目的としており,順調に進展している.HSC-2およびHSC-3細胞いずれの細胞でも,CCND1 mRNA量は,siRNAの効果には及ばないものの各種sgRNAの導入によって20-70%のレベルに低下した.これらのsgRNAのCCND1発現抑制効果は,lipofectamineを用いないで培地に加えただけの場合でも認められた.設計したsgRNAの標的部位によって抑制効果には差があり,HT型では,HT-2, HT-5による抑制効果が大きかった.sgRNAのHT型,H型およびL型の違いはCCND1発現抑制活性には大きな差異は認められなかった.Western blotによる検討から,sgRNAの導入によってCCND1のタンパク質レベルも低下した.HSC-2およびHSC-3細胞いずれの細胞でも,抗癌剤であるCDDPを加え培養すると生細胞数が減少したが,同時に各種sgRNAを導入したところ生細胞数はCCDP単独時に比べ,さらに減少した.また,各種sgRNAの導入によって,細胞のCapase3/7活性が増加した.しかしながら,培養上清中のIFN-αはsgRNAの導入による誘導は認められなかった.これまでの研究から,新しい遺伝子発現制御法であるTRUE gene silencing法を用い,適切に設計されたsgRNAの導入によって,頭頸部癌細胞であるHSC-2およびHSC-3細胞においてCCND1の発現を抑制させ,生細胞数を減少させることが明らかになった.また,CCDPと併用することによって,癌細胞数をさらに減少させたことから,sgRNAは抗癌剤の感受性を増大させている可能性が考えられた.TRUE gene silencing法を用いて,頭頸部癌細胞でcyclinD1の発現を抑える最適なsmall guide RNA (sgRNA)を見いだし,これらの癌細胞に対する効果を検討することを目的として下記実験を追加する.1) sgRNAによるcyclinD1のサイレンシングによるapoptosisについて活性型のcaspase3/7をイメージングで検討する.
核融合大型ヘリカル装置における超短パルス反射計を用いたプラズマ密度分布測定の研究

本年度は、信号処理方法として使用しているSRA法の有効性について検討した。SRA法は低温プラズマへの適用例はあるが、高温プラズマへの適用は初めての試みであった。有効性を評価するため、有限差分時間領域法(FDTD)を用いたシミュレーションを行った。プログラムではLHDの磁場条件、プラズマの大きさや形状などを変えてシミュレーションすることにより、実験条件に近い状態でシミュレーションを実行することができる。まず、理想的な0-40GHzを含むパルスを使用してシミュレーションをすることによってSRA法の有効性を確認することができた。次に実験と同じ18-40GHzでシミュレーションを行った。この場合、信号の得られない0-18GHzに対応する密度領域は、解析するときに仮定を設けて取り入れる必要がある。これまでの仮定方法で再構成を行ったところ信号の得られない0-18GHzで誤差が生じていることが分かった。シミュレーションを通じて仮定領域の設定方法など解析プログラムを改善することによって正確な再構成プログラムの構築に成功した。Xモードの解析プログラムの作成を行った。Xモードでは磁場強度を考慮する必要があり、18-40GHzで計測を行う場合の予想される測定領域について計算した。磁場強度が1.5[T]以下の場合では、0モードで計測ができなかったさらに周辺部での計測が期待され、仮定領域を大幅に削減できることが分かった。Xモードでは再構成方法が0モードと異なり、新たに解析プログラムの構築を行った。数値計算によって解析プログラムの信頼性の評価を行ったところ、正確に再構成することができ、Xモード計測システムの構築ができた。
スウォーム法による原子トンネル反応の観測

昨年度までに実験に使用する温度可変型液体ヘリウム冷却式極低温移動管質量分析計の開発,ならびに極低温ヘリウム気体圧力測定方法の再検討はほぼ終了した.今年度は質量分析計としての装置の特性を調べることを念頭において更に予備実験を進めた.具体的には,液体ヘリウムによって4.3Kあるいは2.0Kに冷却した極低温ヘリウム気体の中に二価のクリプトン・イオンKr^<2+>を入射し,このときに生成したイオンの質量スペクトルの測定を行った.これまでに一価のイオンを用いた場合には,イオンを凝集核として10個程度のヘリウム原子が結合したヘリウムクラスターイオンの生成が観測されている.電荷を持つイオンと中性ヘリウム原子の間に働く引力的相互作用である分極力はイオンの価数の二乗に比例するので,イオンを二価にすると引力ポテンシャルが一価の場合の4倍になる筈であり,より多くのヘリウム原子が結合した(サイズの大きな)クラスターの生成が期待できる.測定に先立って,効率を上げるために質量スペクトル測定をパーソナルコンピュータによって制御できるようにシステムを改良し,測定用プログラムの開発を行った.この改良によって,以前の測定方法より5倍以上の測定時間の短縮および信頼性の向上が可能となった.実験結果から二価クラスターイオンでは,一価の場合と同じヘリウム数n=12に特異的な安定性が見られるとともに,一価では観測されなかったn=40程度の非常に大きなクラスターが生成することが判明した.この大きなクラスターに関しては特異的な安定性が顕著ではないが,イオンを中心に置いた正二十面体の頂点と面の中心にヘリウム原子が並んだ場合に相当するn=32が魔法数である徴候が観測されている.残念ながら,本研究の最終的な目標である原子トンネル反応の直接的な観測には至らなかったが,極低温において以前より遥かに大きなヘリウムクラスターの生成に成功した.今後はクラスターイオンの生成機構を解明し,そこにトンネル効果が隠れている可能性についても検討していく予定である.本研究では実験装置として極低温移動管質量分析計が必要である.この装置は液体ヘリウムによって希薄な気体を満たした容器(移動管)を冷却し,その容器の中にイオンを入射して気体分子との反応を観測するものである.装置の開発は数年前より始められており,外形は既にほぼ完成していた.本年度当初,装置の特性を調べるために予備実験としてヘリウム気体中のイオン移動速度の測定を行ったところ,予想もしていなかった新たな問題点が判明した.この装置では極低温気体の圧力を測定するために真空槽の外部にキャパシタンス・マノメータ(以後,CMと略す)を置き,移動管とCMを細いパイプで連結して使用している.CMは318Kに保たれているため,極低温に冷却された移動管とは温度が大きく異なる.このためCMの示す圧力と実際の移動管内部の圧力は異なってしまう.我々は,この熱遷移効果による圧力差を補正する方法として,Takaishi-Sensuiによって提案された経験的な補正公式を用いてきた.補正方法の妥当性はイオン移動度の圧力依存性から判断することができる.圧力補正が適切であれば移動度は圧力には依存しない筈である.ところが,今回の測定の結果では20mTorr以下の低圧において顕著な圧力依存が観測されてしまった.この問題を解決するため,様々な圧力による測定,さらに連結パイプの径を変えた測定を行い,新たな圧力補正式を求めた.その結果,移動管内の絶対圧力を1%程度の誤差で求めることが可能となった.本研究の目的である原子トンネル反応の観測のためには移動管内の圧力の絶対値を正確に測定することは極めて重要である.その意味でも今年度の内に圧力補正の問題を発見し,これを解決する方法を見いだすことができたのは大きな成果と言える.昨年度までに実験に使用する温度可変型液体ヘリウム冷却式極低温移動管質量分析計の開発,ならびに極低温ヘリウム気体圧力測定方法の再検討はほぼ終了した.今年度は質量分析計としての装置の特性を調べることを念頭において更に予備実験を進めた.具体的には,液体ヘリウムによって4.3Kあるいは2.0Kに冷却した極低温ヘリウム気体の中に二価のクリプトン・イオンKr^<2+>を入射し,このときに生成したイオンの質量スペクトルの測定を行った.これまでに一価のイオンを用いた場合には,イオンを凝集核として10個程度のヘリウム原子が結合したヘリウムクラスターイオンの生成が観測されている.電荷を持つイオンと中性ヘリウム原子の間に働く引力的相互作用である分極力はイオンの価数の二乗に比例するので,イオンを二価にすると引力ポテンシャルが一価の場合の4倍になる筈であり,より多くのヘリウム原子が結合した(サイズの大きな)クラスターの生成が期待できる.測定に先立って,効率を上げるために質量スペクトル測定をパーソナルコンピュータによって制御できるようにシステムを改良し,測定用プログラムの開発を行った.この改良によって,以前の測定方法より5倍以上の測定時間の短縮および信頼性の向上が可能となった.実験結果から二価クラスターイオンでは,一価の場合と同じヘリウム数n=12に特異的な安定性が見られるとともに,一価では観測されなかったn=40程度の非常に大きなクラスターが生成することが判明した.この大きなクラスターに関しては特異的な安定性が顕著ではないが,イオンを中心に置いた正二十面体の頂点と面の中心にヘリウム原子が並んだ場合に相当するn=32が魔法数である徴候が観測されている.残念ながら,本研究の最終的な目標である原子トンネル反応の直接的な観測には至らなかったが,極低温において以前より遥かに大きなヘリウムクラスターの生成に成功した.
分子・生態情報に基づく東南・東アジアにおけるハダニ類の分布拡大プロセスの解析

ハダニ類は、かつては化学薬剤を多用するいわゆる先進国に多発する害虫であったが、最近では東南アジアなどでも被害が顕著になり、また農産物の国際的な流通により、分布域が拡大する傾向がある。本研究では、東・東南アジアに分布拡大が見られる2種のハダニ(ナミハダニとカンザワハダニ)を対象に、休眠性という適応的な生態情報とCOI塩基配列という分子情報を用い、2種間および種内の地域個体群間の変異を調べ、分布拡大のプロセス、系統分化などを調べた。わが国のナミハダニの休眠性には地理的勾配がみられ、変異が大きく、南に下がるにつれて休眠率が低くなり、暖地の個体群ではきわめて休眠性が弱いことが知られる。東・東南アジアにおける本種の発生は局地的であったが、いずれの地域でも、わが国暖地と同様に休眠性がきわめて弱かった。本種は地中海地域を起源とし、その後、世界中に短期間に一気に分布拡大したとされる。本研究におけるCOI遺伝子配列の解析からもこのことが確認され、日本、台湾、韓国、タイなどの個体群はすべて同じクレードに含まれていた。一方、わが国のカンザワハダニの休眠性は、鹿児島以北の個体群はいずれも90%以上の休眠率を示した。しかし沖縄個体群は休眠性がきわめて弱く、また台湾の個体群では休眠率に大きなばらつきが見られた。タイ北部高地の個体群の休眠性は弱かったが、逆に熱帯域のマニラ近辺、東ジャワの個体群はいずれも高い休眠性を示した。このように、本種の休眠率の変異は緯度との関連では説明できなかった。休眠性が除去されるに十分な時間が経過したにもかかわらず、休眠性が依然として維持されており、本種の休眠性が必ずしも自然選択の対象とはなっていないことが示唆された。COI塩基配列から、本州以南の個体群はいずれもCOIハプロタイプの多型が貧弱で、わが国南部の個体群と塩基配列にはほとんど違いがなかった。このことから、本種が東南アジアなどに分布を拡大したのは比較的最近であると考えられた。一方、北海道北部の個体群には多様なハプロタイプが確認されたことから、本種の起源は北方にあり、そこを基点に南に分布拡大したと推察される。主としてナミハダニとカンザワハダニの日本、台湾、ベトナム、インドネシア、タイなどの個体群について、発生生態と休眠性を調べ、またCOI遺伝子の塩基配列を比較した。1)カンザワハダニについては、日本の個体群では鹿児島以北のものはほぼ完全な休眠性であったが、沖縄諸島の個体群は休眠性が極めて低かった。台湾の個体群は休眠性の変異に富み、また沖縄よりも南に位置するにもかかわらず、休眠性は沖縄個体群よりも高かった。タイの個体群は北部産でも休眠性が極めて低かった。ベトナム個体群は温度による休眠発現への効果が大きく、休眠性の強さは日本や台湾と、タイとの中間に位置した。一方、ジャワ島の個体群は熱帯産であるにもかかわらず、休眠性が高かった。

これまでの結果から、カンザワハダニの休眠性は必ずしも緯度が低くなるにっれて低くなるとは限らず、東南アジアの個体群はさまざまな地域由来の侵入個体群から成り立ち、休眠性に自然選択が働かずに、侵入元の休眠性が維持されていることが示唆された。2)一方、カンザワハダニのCOI遺伝子配列については、地理的距離と遺伝的距離の相関は検出されず、地理的変異の指標として本遺伝子を用いることが適当かどうか検討する必要がある。ただ、これまでの結果から類推して本種の起源は東南アジアではないことが予想された。3)ナミハダニについては、南日本・台湾から東南アジアにかけていずれも休眠性が極めて低く、同様の休眠性をもつことが明らかとなった。4)ナミハダニのCOI遺伝子配列はいずれの地域でもほぼ同じであり、すべて一つのクレードにまとまり、日本などから一気にアジア全域にかけて短期間に分布が拡大したと考えられた。1)昨年度までに行った実験室内における休眠誘起実験から、台湾のカンザワハダニの休眠性には個体群間に遺伝的な変異が大きく、また亜熱帯であるにもかかわらず休眠性の強い個体群も存在することが示された。そこで、2004及び2005年、休眠期にあたる12月に台湾中西部の南投縣の茶園及びキャッサバ園に発生する個体群について、令構成及び雌成虫の休眠状態を現地で調べた。その結果、実験室内での誘起実験から得られる休眠率と野外での休眠発現率には相関が見られた。ただ、遺伝的には高い休眠性を有していても、野外での休眠発現率はかなり低く、冬期でもすべてのステージが存在し、発育・増殖が継続していた。2)2004年にベトナム・ハノイおよび2005年に中国山東省周辺の農業生態系から採集したTetranychus属ハダニを、ミトコンドリアCOI遺伝子の塩基配列を用いたDNAバーコード法によって同定し、種構成を調べた。その結果、両地からナミハダニ、イシイナミハダニ、カンザワハダニなどが認められ、ハノイ周辺からはカンザワハダニが、山東省からはイシイナミハダニが最も多くを占めていた。ベトナムで採集されたカンザワハダニの塩基配列を調べたところ、その変異はきわめて小さく、また分子系統樹から、ベトナムへの本種の侵入は比較的最近であることが示唆された。本年度は、これまでにアジア各地で採集・保存したカンザワハダニの標本に加えて、北海道北部で新たに採集した標本を含め、ミトコンドリアCOI塩基配列を用いたDNAバーコードによって種の確認を行い、さらに分子系統樹を構築した。その結果、日本、韓国、台湾の23系統から14のハプロタイプが検出され、それらをもとに系統樹を作成すると、わが国本州以南の個体群は、台湾・韓国の個体群とあわせて遺伝的にきわめて均質であることが判明した。タイやベトナム北部の個体群でもこれらの個体群と明瞭な差は認められなかった。このように、韓国、台湾、ベトナムなどを含む東・東南アジアの個体群から得られたCOIのハプロタイプは多型が貧弱で、わが国南部に分布する個体群と塩基配列の違いはわずかしかなかった。ただ、インドネシアジャワ島の5個体群、計46個体の塩基配列にはまったく変異が検出されず単一系統を形成していたが、この塩基配列は、わが国を含めた上記の地域の個体群においてこれまで知られたものとは異なり、インドネシアにはかなり以前に小数個体が侵入して分布拡大したと考えられた。一方、北海道北部から採集した13個体群、計118個体からは13のハプロタイプが検出され、1個体群から複数のハプロタイプが検出された個体群が9つあり、この地域のカンザワハダニの遺伝的多様性が大きいことが明らかになった。これらの結果から、カンザワハダニの起源地は北方にあり、そこを基点に南方に分布を拡大していったと推察された。
幼若感作マウスにおける気道リモデリングの進展寄与因子の解明と薬物による制御の検討

乳児喘息モデルマウスを確立し、そのアレルギー性気道炎症の特徴を解析した。即ち、幼若BALB/Cマウス(新生仔:日齢3)および成熟マウス(8週齢)に、少量(10μg)または大量(1000μg)の卵白アルブミン(OVA)を週1回ごと計3回腹腔内投与して感作した。次いでOVA溶液を6日間連日吸入チャレンジし、最終チャレンジの2日後に気道過敏性を測定した。マウスを麻酔後、採血したのち、気管支肺胞洗浄液(BALF)を採取した。また、感作後のinterleukin-4(IL-4)とinterferonγ(IFN-γ)値を検討するため、各群の一部の動物では最終チャレンジの24時間後に、BALFを採取した。更に気道の組織学的評価を行なった。その結果、BALF中のIL-4は幼若・成熟マウスともに少量感作群で著明に増加し、大量感作群では幼若マウスのみ軽度増加した。逆にBALF中のIFN-γは幼若・成熟マウスともに少量感作群で低下した。OVA特異的血中IgE抗体価の上昇は成熟マウス少量感作群>幼若マウス少量感作群≒成熟マウス大量感作群>幼若マウス大量感作群の順であった。気道過敏性は幼若・成熟マウスとも同等に亢進していた。BALF中好酸球数の増加は成熟マウス少量感作群≒幼若マウス少量感作群>成熟マウス大量感作群の順であり、幼若マウス大量感作群では有意であったが極めて軽微な増加であった。気道への炎症細胞浸潤の程度は成熟マウス少量感作群>成熟マウス大量感作群>幼若マウス少量感作群>幼若マウス大量感作群の順であった。一方、気道上皮の杯細胞化は4群間で同等であり、むしろ幼若マウスの方が著明であった。以上から、幼若マウスでは抗原刺激に対し、Th2優位の反応を示すが、IgE産生能や好酸球性炎症は成熟動物に比べ軽微と思われた。一方、気道過敏性の成立や気道上皮の杯細胞化は幼若と成熟マウスで差がなかった。これらのことがヒトにあてはまるなら、乳幼児の喘息では粘液過分泌がアレルギー性炎症において重要な因子である可能性が示唆された。【目的】小児喘息の自然寛解現象(アウトグロー)のメカニズムは不明であるが、小児ではアレルギー性気道炎症の進展が最終的に治癒に向かいやすいためかもしれない。我々は、異なる成熟段階のマウスのアレルギー性気道炎症の進展の差異を検討するため、慢性アレルギーモデルマウスを作成する予定である。今年度は卵白アルブミン(OA)にて感作した異なる週齢のマウスの急性の気道炎症像を比較した。【方法】幼若(日齢3)および成熟(8週齢)

BALB/Cマウスに、少量(10μg)または大量(1000μg)のOAを週1回ごと計3回腹腔内投与して感作し、2.5%OA溶液を6日間連日吸入チャレンジした。最終チャレンジ2日後にメサコリン(MCh)を吸入させ、enhanced pause(penh)を測定し気道過敏性を評価した。その指標として、penhが前値の200%を越えたMCh濃度を気道感受性とし、MCh最終濃度におけるpenhの絶対値を気道反応性とした。過敏性測定後、血中OA特異IgE、IgG2抗体価、気管支肺胞洗浄液(BALF)中好酸球数、気道組織像(炎症細胞浸潤の程度、粘液分泌細胞増加の程度をスコア化)を検討した。【結果】OA特異IgE抗体価の上昇は成熟マウス少量投与群>幼若マウス少量投与群≒成熟マウス大量投与群≫幼若マウス大量投与群の順であった。IgG2抗体価は成熟マウス大量投与群でのみ上昇を認めた。BALF中好酸球数の増加は成熟マウス少量投与群≒幼若マウス少量投与群>成熟マウス大量投与群の順であり、幼若マウス大量投与群では有意であったが極めて軽微な増加であった。気道過敏性は4群とも亢進し、気道感受性の亢進は成熟マウス少量投与群>幼若マウス少量投与群≒成熟マウス大量投与群>幼若マウス大量投与群の順であったが気道反応性の亢進は成熟マウスでは少量投与群>大量投与群なのに対して幼若マウスでは少量投与群と大量投与群は同等であった。炎症細胞浸潤の程度は成熟マウス少量投与群>成熟マウス大量投与群>幼若マウス少量投与群>幼若マウス大量投与群の順であったが、粘液分泌細胞数は4群とも同等に増加していた。【結論】血中IgE抗体価やBALF中好酸球数の増加の程度と気道過敏性の発現状態あるいは粘液分泌細胞増加の程度とは幼若マウスと成熟マウス間で異なった関係がみられ、アレルギー性気道炎症の進展は個体の成熟段階に影響を受ける可能性を示唆するものと思われた。アレルギー性気道炎症におけるサイトカインの役割の、年齢による差異を検討するため、幼若マウスの喘息モデルの確立を行なった。即ち、幼若BALB/Cマウス(新生仔:日齢3)および成熟マウス(8週齢)に、少量(10μg)または大量(1000μg)の卵白アルブミン(OVA)を週1回ごと計3同腹腔内投与して感作した。次いで2.5%OVA溶液を6日間連日吸入チャレンジし、最終チャレンジの2日後に気道過敏性を測定した。マウスを麻酔後、OVA特異IgE、IgG2抗体価を測定するため採血したのち、気管支肺胞洗浄液(BALF)を採取し、総細胞数、好酸球増多を評価した。また、各群の一部の動物では感作後のサイトカインバランスを検討するため最終チャレンジの24時間後に、BALF中のinterleukin-4(IL-4)とinterferon γ(IFN-γ)を測定した。更に気道の炎症細胞浸潤の程度と気道上皮の杯細胞化を組織学的に評価した。その結果、BALF中のIL-4は幼若・成熟マウスともに少量感作群で著明に増加し、大量感作群では幼若マウスのみ軽度増加した。逆にBALF中のIFN-γは幼若・成熟マウスともに少量感作群で低下した。OVA特異IgE抗体価の上昇は成熟マウス少量感作群>幼若マウス少量感作群≒成熟マウス大量感作群)幼若マウス大量感作群の順であった。IgG2抗体価は成熟マウス大量感作群でのみ上昇を認めた。気道過敏性は幼若・成熟マウスとも同等に亢進し、亢進の程度は両群ともに少量感作群の方が、大量感作群より著明であった。BALF中好酸球数の増加は成熟マウス少量感作群≒幼若マウス少量感作群>成熟マウス大量感作群の順であり、幼若マウス大量感作群では有意であったが極めて軽微な増加であった。
神経伝達物質の放出過程を阻害する生理活性物質の探索とその作用の解析

一次検索系としてPC12細胞からのノルエピネフリン(NE)放出阻害を指標とし、カビ2200株、放線菌3600株の培養抽出液の検索を行った。続いて二次検索系としてCa^<2+>イオノフォアであるイオノマイシン(1mM)存在下に同様の実験を行った。再現性よく阻害活性が認められたものについて、さらにATPの放出阻害についても検討した。その結果、カビからの2サンプル(LF11039、LF10512)、および放線菌からの2サンプル(LS8877、LS9940)に顕著な阻害活性を見出した。これについてさらに三次検索系として好中球からのβ-グルクロニダーゼ放出に対する作用を調べた。その結果LF11039、LF10512、LS9940はいずれも強い阻害活性を示したが、LS8877は阻害よりもむしろ若干促進するという結果を得た。このことから、前三者は調節性分泌に共通する過程(おそらく膜融合過程)の阻害剤であるが、LS8877は神経伝達物質の放出に特異的な阻害剤であることが示唆された。またアクリジンオレンジを用いて酸性オルガネラに対する作用を調べた結果、候補物質はいずれも阻害活性を示さず、分泌阻害剤であるコンカナマイシン類とは作用が異なることがわかった。さらに候補物質の毒性をPC12細胞を用いて調べたところ、いずれもNE放出を阻害する濃度で増殖の抑制はみられなかった。この結果は候補物質が調節性分泌に特異的な機構を標的としていることを示唆する。次に各活性物質の精製を行った。比較的活性の強いLF11039株を大量培養し、菌体から80%アセトン抽出、酢酸エチル転溶後2回のシリカゲルカラムクロマトグラフィーを行い、約19mgの淡黄色の結晶を得た。本物質は230、252、320、370nmの各波長に吸収極大を示し、またFAB-MSスペクトル解析の結果分子量が390であることが解った。^1H-および^<13>C-NMR解析から1516個の炭素のシグナルが認められ、それらがいずれもSP^2炭素であることが示唆された。LF10512、LS8877、LS9940についても精製を試みている。以上いずれの物質も最終的な構造決定には至っていないことから、引き続き精製・機器分析を行い、活性物質の本体を明らかにしたい。
脊椎骨折及び骨量減少の予防に関する長期前向き研究―一般住民を対象とした栄養、運動、環境、遺伝要因の検討―

申請者らは、和歌山県一山村において1989年に40-79歳からなる全住民を対象としてコホートを設定し、既往歴、食生活、運動習慣、飲酒喫煙状況など130項目からなるベースライン調査をおこない、総合的健康管理を行ってきた。この集団から40-70歳代の男女各年代50人、計400人をランダムに選び、Dual energy X-ray absorptiometry (DXA ; Lunar DPX)を用いて腰椎L2-4、大腿骨近位部の骨密度を測定し、その後3、7、10年目に再度骨密度を測定した。10年間の腰椎L2-4骨密度の変化率は、男性では40歳代から順に1.7%、5.5%、0.1%、-1.6%、女性では40歳代から順に-8.7%、-8.4%、-4.8%、-4.8%となった。一方大腿骨頚部の骨密度変化率をみると、男性40歳代から順に-2.6%、-1.3%、-7.5%、-11.7%となり、女性は-5.3%、-5.4%、-5.0%、-11.6%となった。次に初回3年目の調査で骨密度の低下率が大きいものから1/3をfast bone loser、その他を正常群と定義し、骨密度変化率を比較してみると、まず男性の3-7年後における腰椎骨密度変化率はfast群では0.67%/yrとなり、正常群の0.32%/yrと比べむしろ増加していた(P=0.14).7-10年後の骨密度変化率はfast群0.13%/yr、正常群0.09%/yrとなり、両群の間で差は見られなかった(P=0.90)。女性においては3-7年後における腰椎骨密度変化率はfast群では-0.18%/yrとなり、正常群の-0.71%/yrと比べ低下率の鈍化が見られた(P=0.06)。7-10年後の骨密度変化率はfast群-0.65%/yr、正常群-0.87%/yrとなり、両群の間で差は見られなかった(P=0.57)。次にこの二群において骨密度そのものの推移を比較すると、女性では、7年後の腰椎骨密度はfast群0.84g/cm2、正常群0.95g/cm2(P<0.01)、10年後はfast群0.83g/cm2、正常群0.95g/cm2となり(P<0.001)、fast群の方が有意に低かった。男性でも腰椎骨密度はfast群の方が有意に低かった(P<0.001)。この差は年齢、初回骨密度を調整した後も認められた。即ち男女ともfast bone loserにおいては骨量の低下速度はいずれ鈍化するが、腰椎の骨量は正常群に比べて低いまま持続することがわかった。

次にこの二群において骨密度そのものの推移を比較すると、女性では、7年後の腰椎骨密度はfast群0.84g/cm2、正常群0.95g/cm2(P<0.01)、10年後はfast群0.83g/cm2、正常群0.95g/cm2となり(P<0.001)、fast群の方が有意に低かった。男性でも腰椎骨密度はfast群の方が有意に低かった(P<0.001)。この差は年齢、初回骨密度を調整した後も認められた。即ち男女ともfast bone loserにおいては骨量の低下速度はいずれ鈍化するが、腰椎の骨量は正常群に比べて低いまま持続することがわかった。申請者らは、和歌山県一山村において1989年に40-79歳からなる全住民を対象としてコホートを設定し、既往歴、食生活、運動習慣、飲酒喫煙状況など130項目からなるベースライン調査をおこない、総合的健康管理を行ってきた。その後、この集団から40-70歳代の男女各年代50人、計400人をランダムに選び、骨粗鬆症予防検診としてDual energy X-ray absorptiometry(DXA ; Lunar DPX)を用いて腰椎L2-4、大腿骨近位部(大腿骨頚部、Ward三角、大転子)の骨密度を測定した。今回、骨密度の経年変化を把握し、骨量変化に影響を及ぼす要因を明らかにすることを目的として、10年目の骨密度追跡調査として、同じDXAを用い、同対象者に対して、再度腰椎L2-4、大腿骨近位部の骨密度を測定し、変化率を求め、これを測定部位間、各世代間において比較した。初回調査時における対象400人のうち、10年目の調査に参加したのは299人(男性137人、女性162人:参加率74.8%)であった。10年間の密度変化率を性、年代別にみると、腰椎骨密度は男性ではほとんど低下していないが、女性ではすべての年代で低下し、特に40-50歳代に大きな骨密度低下を認めることがわかった。一方大腿骨頚部においては、男女とも骨密度は低下し、特に高齢群である70歳代の骨密度低下率が極めて大きいことから、骨密度の低下の割合は、部位により異なることが明らかになった。次に10年前と今回において同世代の骨密度を比較した。世代間の格差をみると、腰椎、大腿骨近位部ともに、男性では60歳代に、女性では50歳代に有意な世代間格差を認めた。その後、この集団から40-70歳代の男女各年代50人、計400人をランダムに選び、骨粗鬆症予防検診としてDual energy X-ray absorptiometry (DXA ; Lunar DPX)を用いて腰椎L2-4、大腿骨近位部(大腿骨頚部、Ward三角、大転子)の骨密度を測定し、その後3、7、10年目に再度骨密度を測定した。今回は、10年間の骨密度変化とADLの変化の関連について検討した。ADLの項目は、European Vertebral Osteoporosis Study (EVOS)で用いられている問診票を日本語に翻訳した10項目について、対象者に「問題なくできる」「少し難しいが一人でできる」「介助が必要、もしくはできない」の中からどれがあてはまるかについて回答を得た。ADLの項目ごとに骨密度変化率を比較したところ、男性の腰椎骨密度では、どの項目でも有意な差はみられなかったが、大腿骨頚部骨密度の変化率では、1時間座るの項目で、「介助が必要、もしくはできない」と答えた群が-17.4%となり、「問題なくできる」-5.3%、「少し難しいが一人でできる」-3.6%よりも、低下率が有意に大きかった(P<0.05)。一方女性では、100M走るの項目で、「介助が必要、もしくはできない」と答えた群の大腿骨頚部骨密度変化率は-9.6%となり、「問題なくできる」-5.1%、「少し難しいが一人でできる」-6.2%よりも低下率が大きい傾向にあったが有意ではなかった(P<0.08)。さらに、ADLの低下と骨密度変化の関係をみると、男性の腰椎骨密度変化率ではADLの変化と有意な関連は得られなかったが、大腿骨頚部では、髪を洗うの項目で、ADLが低下した群の骨密度変化率が-28.6%、不変の群が4.7%となり、ADL低下群の骨密度低下率が大きかった(P<0.001)。
培養中枢神経細胞における神経成長因子受容体の発現に関する分子生物学的研究

神経成長因子(NGF)作用の分子機構を明らかにする目的で、まず第一段階として、NGFレセプタ-の発現調節を解析し、その発現量を変動させる要因を検索した。モデルニュ-ロンであるラット副腎髄質クロマフィン細胞腫由来のPC12h細胞を用いて、NGFレセプタ-のmRNAをRNAブロット法で、また蛋白質自体をモノクロ-ナル抗体を用いたELISA法を解析した。PC12h細胞をコラ-ゲンコ-トしたディッシュ上に培養し、NGFを添加(最終濃度50ng/ml)すると、24日で神経繊維を伸長し始め、PC12h細胞はニュ-ロン様に分化し始める。この過程でNGFレセプタ-の発現量の変動をまず解析した。PC12h細胞は、NGFの添加前も、既にレセプタ-を発現している。我々の解析によれば、NGFレセプタ-の発現はNGF添加による分化誘導の影響を受けず、変動しないことが分かった。むしろ、PC12h細胞の細胞密度を上げるとNGFレセプタ-の発現量が顕著に増加した。この結果は、細胞間の接着がNGFレセプタ-の発現を促進している可能性を示している。一方、我々の研究室で新たに分離したPC12h細胞の亜株でNGFに対する応答の早いPC12hーR細胞では、NGFレセプタ-の発現が高まっていることを見いだしている。PC12h細胞では、NGFレセプタ-の発現はNGF添加による分化誘導の影響を受けず、むしろ細胞密度に依存することが分かった。細胞密度を上げると、NGF添加の有無に関わらず、NGFレセプタ-の発現量が増加するので細胞間接着がNGFレセプタ-の発現を促進している可能性がある。PC12hーR細胞では、NGFレセプタ-の発現量が高くこのことがNGFに対する応答の早さの原因となっていると考えられる。今後、初代培養中枢ニュ-ロンでも解析を進める予定である。
情動表出についての認識の発達：幼児期３年間の縦断的研究

本研究では、幼児期3年間において、情動の経験と表出についての認識がどのように発達していくのかについて、4歳時点からインタビューを実施し、その1年後、2年後を追い、発達的変化を検討した。その結果、喜びの経験については4歳時点で既に認識されているが、悲しみと怒りの経験と表出についての認識は5歳時点以降となり、特に、怒りについての認識は遅れることが見出された。また、怒り表出の機能について語ることの内容とその変化のあり方には、多様性のあることが見出された。そこから、怒りの表出についての認識の成長の仕方には、多様な経路のあることが示唆された。2011年度の研究結果(2012年度から開始する「3年間を追う縦断的研究」の、実質的なパイロットスタディであって、4歳児・5歳児・6歳児を対象として、横断的にデータを収集)に基づき、2012年度から開始する縦断研究では、4歳児に対しては、各情動の経験について尋ねることを中心に調査を実施するように計画を修正することとした。2012年度は、具体的には、4歳児を対象として、自由遊び場面の参与観察(週1回)と、1対1のインタビュー(年度末に1回)を行った。インタビューでは、対象児自身および「園のお友だち」について、うれしい、悲しい、怒ったという感情経験の有無を尋ねた。その結果、全体としては、うれしい経験については、ほぼ8割の子どもたちが自他共にあると応えたが、悲しい経験については、あるとした子どもたちは半数に満たず、怒った経験については、あるとしたのは、1/3に満たなかった。特に、自身が怒った経験があるとした子どもは2割に満たなかった。自他のポジティブな感情に比して、ネガティブな感情の経験は捉えられにくい、あるいは語られにくいことが推測される。一方、個々にみていくと、全部の感情経験を自他共にあると応えた子どもが13%、逆に全部ないと応えた子どもが6%、自他共にうれしい経験のみあるとした子どもが26%、自身よりも他者の方が各種の感情経験をよくしていると応えた子どもが32%、逆のパターンで応えた子どもは13%などとなった。そこから、「自他共にうれしい経験のみあるとの応え方」と、「自身よりも他者の方が各種の感情経験をしているとの応え方」が代表的なものであることがうかがえるとともに、自他の感情経験についての捉え方・語り方には、広範な多様性のあることが示唆された。前年度には、4歳児に、園生活における自身の情動経験と友だちの情動経験について尋ね、自身の場合と他者の場合とは異なるのかどうか、また、それについてはどのような個人差があるのかについて、検討した。当該年度では、その4歳児達の1年後を追い、5歳となった子ども達に、情動経験および情動表出の機能についての認識を尋ね、その変化と多様性を検討した。その結果、全体としては、うれしい経験については約9割の子どもたちが自他共にあると応えたが、悲しい経験についてはあるとした子どもたちは6割に満たず、怒った経験についてはあるとしたのは1/3に過ぎなかった。特に、自身が怒った経験があるとした子どもは1/4に過ぎなかった。1年後の年中組(5歳)時点になっても、自他のポジティブな情動に比して、ネガティブな情動の経験は捉えられにくい、あるいは語られにくいことが窺える。また、それらには多様な個人差があり、4歳から5歳にかけて、語られる情動経験の種類は全般的には増えるものの、自他の情動経験についての捉え方・語り方には、依然として広範な多様性のあることが示唆される。一方、情動表出の機能については、多くの子どもたちが何らかの認識を語ることが多かった。その認識内容には、多様な個人差が見られた。26年度にはさらに、その子ども達の6歳時点を追い、就学前期3年間の変化を検討することとする。平成23年度は、幼児期における情動表出についての認識の発達について、幼児期3年間の変化について、横断的にデータ収集を行い、幼児期3年間の変化の平均的な全体像を描出することを目的として取り組んだ。具体的には、年少組児(4歳)・年中組児(5歳)・年長組児(6歳)を対象としてインタビューを実施し、喜び・悲しみ・怒りの各情動の経験およびその先行事象ならびに各情動の表出の機能について尋ねた。その結果、各情動の経験の有無とその先行事象については、個人差と各情動による違いはあるものの4歳児であってもある程度語ることが可能であったが、情動表出の機能については、4歳児は語ることが困難なことが見出された。5歳児と6歳児は、個人差と各情動による違いはあるものの、情動経験の有無とその先行事象のみならず、情動表出の機能についても語ることが可能であった。