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Ad-p53遺伝子治療併用粒子線治療に関する基礎的研究

過酸化チタンナノ粒子を用いた実験では、in vitroで、様々なROS反応試薬によるラジカルの同定を行いOHの可能性が高いことを確かめた。in vivoではナノ粒子と放射線との併用により高い抗腫瘍効果を示すことを確かめた。MGDGを用いた実験では、invitroでMGDGと放射線併用群において、放射線単独照射群と比較してapoptosisの増加を認めた。in vivoでも同様に抗腫瘍効果の増強が認められた。粒子線治療はその物理学的特性により、X線治療と比較して良好な線量分布を作成することができる。そのため少ない副作用で、通常の放射線治療では不可能ほどの高線量の照射が可能である。遺伝子治療を併用した粒子線治療を行うことで、高い抗腫瘍効果を保ちつつ、局所制御線量の低減が可能となり、正常組織障害を軽減することができると予想される。本研究の目的は、遺伝子治療併用粒子線治療の臨床応用への第一段階として、培養腫瘍細胞に対して、in vitroおよびin vivoでのアデノウイルス・ベクターを用いたp53遺伝子治療における遺伝子導入効率の確認、抗腫瘍効果の確認、粒子線治療との併用効果の確認などの基礎的研究を行うことである。H22年度はヒト膵癌細胞を用いて実験を行った。膵癌は、ジェムザール等新規抗癌剤の併用が適応されつつあるが、原発巣の制御を含めて更なる治療成績の向上が望まれている。ジェムシタビン単独、放射線照射単独、ジェムシタビン+放射線併用の3群に分けて実験を行った。ジェムシタビンの増殖抑制効果をMTT Assayで判定した。また放射線照射と併用療法の効果はColony forming assayで判定した。また、ヌードマウス皮下にMIAPaCa-2を移植し、上記3群での増殖抑制効果と生存率を比較した。アポトーシス関与はいずれの治療法でも5%以下と少ないことが分かった。LC3の定量、電子顕微鏡像での確認で、いずれの治療法においてもオートファジーが関与していることが分かった。ヌードマウスを用いた実験では、いずれの治療法でも腫瘍抑制効果が見られ、摘出した腫瘍には、LC3,Beclin-1の発現が確認された。今回の検討では膵癌の増殖抑制効果にはアポトーシスの関与が少ないことが判明し、新たな知見と考えられた。H23年度の研究では過酸化チタンナノ粒子を用いた放射線増感実験を行った。in vitroにおいて、様々なROS反応試薬によるラジカルの同定を行い、OHの可能性が高いことを確かめた。また、in vivoにおいてはヌードマウス大腿部に腫瘍細胞を移植し、ナノ粒子と放射線との併用により高い抗腫瘍効果を示すことを確かめた。ヌードマウスを用いた実験では、腫瘍抑制効果が見られ、摘出した腫瘍には、ナノ粒子の集積が確認された。またマウスの長期生存を確認し、臓器異常の無いことも確認でき、新たな知見と考えられた。H24年度の研究では、放射線抵抗性腫瘍に対する増感作用という観点からDNAポリメラーゼ分子種を選択的に阻害することが報告されているホウレンソウ由来の機能性糖脂質MGDG(monogalactosyl diacylglycerol)について、膵癌由来の癌細胞MIAPaCa2を用いて、in vivo, in vitroにおいてMGDGの放射線増感効果を検討を行った。その結果In vitroではMGDGと放射線併用群において、MGDG単独投与群、放射線単独照射群と比較して34倍近いapoptosisの増加を認め、in vivoではMGDGと放射線を併用することにより抗腫瘍効果の増強が認められた。MGDGは放射線と併用することによって、in vitro,in vivoの双方において放射線増感効果を示した。以上より、将来的にMGDGは有効な放射線増感剤となり得る可能性が示唆され、新たな知見と考えられた。

粒子線治療施設での遺伝子実験の申請・許可が遅れているため24年度が最終年度であるため、記入しない。放射線増感作用について、in vitro、in vivoで様々な実験を行い、その機序・効果について確認できた。アデノウイルスベクターを用いたP53遺伝子治療による放射線増感作用について引き続き、研究を遂行していく予定である。24年度が最終年度であるため、記入しない。
セルロース誘導体の高次構造がキラル分割の際のエナンチオ選択性に及ぼす影響

キラル分離相を形成する高分子材料としてセルローストリフェニルカルバメートを用い、このセルロース誘導体をシリカゲル上にコーティングする際の履歴効果が、結果として対掌体の分離にどのように影響するかを検討した。酢酸セルロースをコーティングする場合、用いる溶媒の違いによって、対掌体の溶出順序が異なるとする柴田らの報告(T.Shibata et al.Chromatographia,24,552-554(1987))を基にして、そうした挙動をさらに広範に把握することを目的として研究をおこなった。まず、セルローストリフェニルカルバメートをSchroederらの方法に従って合成し、これが既往の報告に掲載されている溶媒によって液晶を形成するかどうかを確認した。通常の1回の合成では、うまく行かず2回繰り返すことによりコレステリック液晶を与えるセルロース誘導体を得ることができた。誘導体の重合度が液晶形成に影響を与えていると考えられる(未確認)。コレステリック液晶の確認は偏光顕微鏡による光学組織の観察、UV、CDなどにより行った。メチルプロピルケトン、ジグリムなどの溶媒では、可視光の波長領域に選択反射が認められ、コレステリック液晶を形成していると確認した。得られたセルローストリフェニルカルバメートをメチルプロピルケトン(MPK)やジグリム(DIGLYME)の希薄溶液(10%)とし、粒径7μmの多孔性シリカゲル(平均孔径100nm)上に添加し、溶媒を溜去した。沸点の低いMPKの場合はドラフト中で、沸点の高いDIGLYMEの場合は減圧乾燥により、ともに1週間以上の時間を掛けて徐々に乾燥を行った。こうして調製された充填剤をステンレスカラムに充填して自作キラルカラムとし、HPLCによる光学分割能の評価に供した。MPKでコートした自作キラルカラムは、理論段数、分離係数ともに市販カラムに匹敵するものが得られた。他方、DIGLYMEはコーティング時の溶媒乾燥が困難なためか、分離性能が著しく低かった。この分離結果を基に対掌体の溶出順序を判断するのは難しいが、基本的には供試した化合物では溶出順序の違いは認められなかった、すなわちキラル分離相の履歴効果の影響は見出せなかった。供試するセルロース誘導体については、酢酸セルロース、セルロースフェニルカルバメートを基本に調製している段階である。セルロースエステルについては6位と2,3位を位置選択的にベンゾイル基、アセチル基で置換したセルロース誘導体の調製も進めているが、フェニルカルバメートについても同様に置換基の導入のされかたの異なる誘導体の調製を検討している。導入された置換基の分布については^1H-NMR、^<13>C-NMR等により確認する。液晶の評価に関しては、現在市販セルロースアセテートを用いてコレステリック液晶を与える溶媒を検討している。トリフルオロ酢酸やジクロロメタン、ジオキサン、アセトン、N, N-ジメチルアセトアミドやこれらの混合溶液などの濃厚溶液を調製し、偏光顕微鏡にて溶液の液晶性を確認中。また、螺旋のピッチ、掌性などを手持ちの分析装置で分析可能かどうか検討している。具体的には、各濃度の溶液を偏光顕微鏡、レーザー回折等による螺旋ピッチの測定、旋光計による掌性の決定などをする際のセルや治具などの製作を検討・準備している段階である。

このときの条件とキラルカラムの充填剤を得る際の、コーティング条件とを可能な限り近づけることにより、エナンチオ選択性のことなるキラルカラムを得る。セルロースアセテート(市販品)や重合度を変えて調製したセルローストリフェニルカルバメートを用い、コレステリック液晶を与える溶媒・濃度の組み合わせを中心に検討した。酢酸セルロースでは、トリフルオロ酢酸やジクロロ酢酸、ジクロロメタン、ジオキサン、アセトン、N,N-ジメチルアセトアミド及びこれらの混合溶液の濃厚溶液系で光学異方性を確認した。また、セルローストリフェニルカルバメートでも2-ブトキシエタノール、2-(2-ブトキシエトキシ)エタノール、1,2-ジメトキシニタン、2-(2-エトキシエトキシ)エタノール、ビス(2-メトキシエチル)エーテルなどの溶液で光学異方性を確認した。調製したセルロースリオトロピック液晶のコレステリック構造確認のため、偏光顕微鏡による液晶相の同定、紫外-可視分光光度計やレーザー回折を用いたコレステリック液晶の選択反射にもとづく螺旋ピッチの測定、掌性決定のためのORD測定などを試行しているが、現時点で選択反射の現象を確認していない。今後、液晶の相図を念頭に置きながら分子量や濃度の異なる系試料をつくり選択反射現象の確認を図る。コレステリック相を与える条件に限りなく近い形で、キラルカラム充填剤のコーティングを行い、エナンチオ選択性と掌性との関係を続けて検討する。場合により、液晶相の固定を図るため、架橋その他の処理の検討も行っていく。
正方晶HoCoGa_5型結晶構造に発現する特異な超伝導物質の探索

強相関重い電子系で見られる特異な超伝導は、f電子が遍歴か局在かの微妙な状態をとる場合に発現する。Sm化合物はf電子の局在性が強すぎるため、今までその研究対象ではなかった。本研究の目的は、Sm化合物でも特異な超伝導が発現するか否かを物質探索を通して明らかにすることである。目標を正方晶HoCoGa_5型結晶構造の物質群に絞った。この物質群では、CeTln_5(T : Co, Rh, Ir)やPuCoGa_5が特異な超伝導として報告されている。この系では、磁気揺らぎが重要な役割を担っていることは間違いないが、詳しい機構は未解決である。f電子数から、Sm化合物ではPuCoGa5に似た特異な超伝導が発現する可能性が期待される。ただし、f電子の局在性を弱める工夫が必要である。本研究では、f電子が遍歴側にシフトすると期待されるSmCoIn_5の単結晶育成を主な目標とした。フラックス法を用いてSmTIn_5(T : Co, Rh, Ir)の単結晶育成に成功した。SmCoIn_5では本研究で初めて単結晶育成に成功した。SmCoIn_5はこの3物質の中で最も反強磁性転移温度が低く、f電子の局在性が弱くなっていることが期待される。2005年春および秋の日本物理学会、2005年SCES国際会議に成果を公表した。現在、高圧下での研究を進めている。10GPa以下ではまだ磁気秩序が残っているが、転移温度が一番低いSmCoIn5では転移温度の低下する割合が最も大きいことを明らかにした。2005年夏のICMのサテライト会議で報告された。この物質群では、CeTIn_5(T : Co, Rh, Ir)やPuCoGa_5が特異な超伝導として報告されている。f電子数の類推から、Sm化合物ではPuCoGa_5に似た特異な超伝導が発現する可能性が期待される。特にf電子が遍歴側にシフトすると期待されるSmCoIn_5の単結晶育成を主な目標とした。本年度は、本研究の初年度であった。特に、いままでSmCoIn_5の単結晶の物性報告はなく、本研究で初めて育成に成功した。複数の転移が確認され、現在、研究が進行中である。2005年春の日本物理学会、2005年SCES国際会議に成果を公表する予定である。

目標を正方晶HoCoGa_5型結晶構造の物質群に絞った。この物質群では、CeTIn_5(T : Co, Rh, Ir)やPuCoGa_5が特異な超伝導として報告されている。この系では、磁気揺らぎが重要な役割を担っていることは間違いないが、詳しい機構は未解決である。f電子数から、Sm化合物ではPuCoGa_5に似た特異な超伝導が発現する可能性が期待される。ただし、f電子の局在性を弱める工夫が必要である。本研究では、f電子が遍歴側にシフトすると期待されるSmCoIn_5の単結晶育成を主な目標とした。フラックス法を用いてSmTIn_5(T : Co, Rh, Ir)の単結晶育成に成功した。SmCoIn_5では本研究で初めて単結晶育成に成功した。SmCoIn_5はこの3物質の中で最も反強磁性転移温度が低く、f電子の局在性が弱くなっていることが期待される。2005年春および秋の日本物理学会、2005年SCES国際会議に成果を公表した。現在、高圧下での研究を進めている。10GPa以下ではまだ磁気秩序が残っているが、転移温度が一番低いSmCoIn_5では転移温度の低下する割合が最も大きいことを明らかにした。2005年夏のICMのサテライト会議で報告予定である。
末梢血に存在するリンパ球前駆細胞の分裂増殖と造血微小環境に関する研究

本研究では、Translin遺伝子欠損(TSN-KO)マウス末梢血中の白血球数が幼年期に激減していることに着目し、造血幹細胞の自己複製と前駆細胞への振り分けに必要な機構の解析をおこなった。この現象は、末梢血リンパ球の成熟が未分化な状態(B220-,IL-7R+,CD43+)で停止していることに因るものであった。実際、リンパ球前駆細胞に不可欠な転写因子、E2A, EBF, Pax-5のmRNAの末梢血中における発現は低下していた。従って、造血幹細胞や前駆細胞の極めて初期の段階でTranslin遺伝子が深く係わっていることを示唆している。TSN-KOマウスに認められるもう一つの異常は、加齢と共に骨髄の造血能が低下し、生後1年を経過すると骨髄の幼若骨髄系細胞が激減することである。さらに進行すると、骨髄の造血能は廃絶し、脾臓肥大を伴う髄外造血が観察された。この現象を明らかにするため、骨髄系細胞の分化に不可欠なPU.1遺伝子の発現をRT-PCR法で解析したが、活性に変化は認められなかった。しかし、basic helix-loop-helix(bHLH)型転写因子、E2Aとそれに特異的に結合する蛋白、TAL1の発現が低下していた。E2AとTAL1の複合体形成は、新たなDNA結合ドメインを形成し、骨髄系幹細胞から前駆細胞への振り分けに不可欠な遺伝子の発現を調節することを示唆している。さらに、この時期の骨髄では造血幹細胞(Lin- Sca-1+ c-kit+)が急激に増加していることも明らかとなった。以上の結果は、幼若リンパ系細胞や骨髄系細胞の分化成熟だけでなく、造血幹細胞の自己複製に不可欠な造血微小環境にもTranslin遺伝子が重要な役割を果たしていることを示唆している。造血幹細胞は概念的なものとして考えられていたが、その実体は単一の細胞ではなく、種々の分化段階にある細胞集団であると考えられている。しかし、その自己複製と前駆細胞への振り分けに必要な分裂機構の詳細は不明のまま残されている。我々は、Translin遺伝子欠損(TSN-KO)マウス末梢血中の白血球数が幼年期に激減していることに着目し、研究を行った。この現象はBリンパ球の減少によるもので、Tリンパ球には変化が認められなかった。また、脾臓や骨髄では変化が認められず、末梢血で最も顕著に観察される点が大きな特徴である。TSN-KOマウス末梢血中の大部分の細胞はB220^- CD43^+ IL-7R^+の表現型を示すことから、Bリンパ球の前駆細胞が未分化な状態で分裂を停止しているものと考えられる。骨髄における多能性幹細胞(HSC)は、リンパ系前駆細胞(CLP)に分化してT,B,NK細胞に振り分けられると考えられているが、同様の過程が幼年期の末梢血中でも進行していることを本研究結果は示唆している。当該年度は定量的RT-PCR法(Q-RT-PCR)を駆使してCLP細胞各分化段階におけるマーカー遺伝子の発現を詳細に検討した。その結果、Bリンパ球への分化を規定する転写因子Pax5やシグナルカスケード上流に位置するEBF遺伝子の発現が顕著に減少していた。さらにCLP細胞がBリンパ球に振り分けられる過程で最上流に位置するE2A遺伝子の発現も低下していた。一方、TSN-KO老齢マウス末梢血においても、幼若マウスと同様にCLP細胞の分化停止が認められる。さらに、骨髄における著明な造血機能障害、すなわち赤芽球系および幼若骨髄系細胞の減少が見られた。

従って、Translinは広範な造血細胞の分化初期過程で機能していることを示唆している。本研究では、Translin遺伝子欠損(TSN-KO)マウス末梢血中の白血球数が幼年期に激減していることに着目し、造血幹細胞の自己複製と前駆細胞への振り分けに必要な機構の解析をおこなった。この現象は、末梢血リンパ球の成熟が未分化な状態で停止していることに起因するもので、造血幹細胞や前駆細胞の極めて初期の段階でTranslin遺伝子が深く係わっていることを示唆している。平成17年度は、TSN-KOマウスに認められるもう一つの異常、すなわち、加齢と共に骨髄の造血能が低下して幼若骨髄系細胞が激減することを発見した。この現象を明らかにするため、骨髄系細胞の分化に不可欠なPU.1遺伝子のKOマウス骨髄における発現をRT-PCR法で解析したが、活性に変化は認められなかった。しかし、basic helix-loop-helix(bHLH)型転写因子、E2Aとそれに特異的に結合する蛋白、TAL1の発現が低下していた。E2AとTAL1の複合体形成は、新たなDNA結合ドメインを形成し、骨髄系幹細胞から前駆細胞への振り分けに不可欠な遺伝子の発現を調節することを示唆している。更に、この時期の骨髄では造血幹細胞(Lin-Sca-1+c-kit+)が急激に増加していることも明らかとなった。この現象の説明として骨髄細胞死に因る可能性が浮上したが、断片化したクロマチンDNAを末端標識法で検出するTUNEL法を用いた細胞化学的解析では差異が認められなかった。以上の結果は、幼若リンパ系細胞や骨髄系細胞の分化だけでなく、造血幹細胞の自己複製に不可欠な造血微小環境にもTranslin遺伝子が重要な役割を果たしていることを示唆している。
有機相中で光渦により捕捉した単一細胞を反応容器とする化学計測

本研究では,レーザートラッピングを利用した単一細胞分析のための新しい方法の開発を目指した。レーザートラッピング技術は分散媒体よりも高い屈折率をもつ物体の操作に有効である。しかしながら、水滴の屈折率は有機溶媒の屈折率よりも低いため、有機溶媒中で水滴を操作することは困難である。この問題を解決するために、ドーナツ型のビーム形状をもつ光渦を利用した。この光渦を利用した有機溶媒中での水滴の捕捉、操作、融合のための方法を開発した。水溶液中に分散させた油滴をレーザーにより捕捉し融合させるために、ふたつのレーザー光を顕微鏡に導入し、それぞれを独立に操作できるシステムを構築した。このシステムを用いて異なる二つの油滴を捕捉し、それらを融合させる方法について検討した。有機相として1-ブタノールとデカンの1:1混合溶媒を用い、これに種々の界面活性剤を添加して、マイクロエマルジョンを作製した。界面活性剤には陽イオン性の臭化セチルトリメチルアンモニウム(CTAB)、陰イオン性のドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、及び中性のポリエチレングリコール(PEG)を用いた。これらの界面活性剤を用いて作製したマイクロエマルジョンをレーザーで捕捉して接触させたところ、同種の界面活性剤から成るマイクロエマルジョンは融合することはできなかった。一方、CTABとPEGからなるマイクロエマルジョンは融合させることができた。このとき、融合前の各々の油滴の大きさと融合後の油滴の大きさは理論から予測される大きさと一致していることから、融合に成功したことを確認することができた。一方、二つの油滴溶液を捕捉した後に、溶液を水に入れ換えて融合を試みたところ、CTABとPEGの油滴を融合させることはできなかった。このことは、溶液中にPEGが存在するときには融合できるが、PEGが存在しない場合には融合できない可能性を示唆するものである。このような溶液内の界面活性剤が液滴の融合に影響を与える現象はこれまで報告されておらず、新しい知見を獲得することができた。水溶液中に分散させた油滴をレーザーにより捕捉し融合させる際の、界面活性剤の種類、並びに温度の影響について検討した。有機相として1-ブタノールとデカンの1:1混合溶媒を用い、これに陽イオン性の臭化セチルトリメチルアンモニウム(CTAB)、陰イオン性のドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、及び中性のポリエチレングリコール(PEG)を添加して、マイクロメートルレベルの油滴を作製した。レーザー捕捉によるこれらの油滴の融合を試みたが、いずれの油滴も融合には至らなかった。この原因は油滴の安定性に起因するものであると予想した。そこで、油滴の安定性を低下させるために、温度を上昇させて融合を試みたところ、PEGを用いて作製した油滴の融合に成功した。このことから、油滴を融合させるためには、水-油界面の安定性を低下させることが重要であることがわかった。一方、油相に分散させた水滴を捕捉するために、Z偏光素子を用いて光渦を発生させ、水滴の捕捉を行った。その結果、ドーナツ型のビームを発生させ、屈折率の大きな媒体中で水滴を捕捉することに成功したが、中心部の径が小さすぎるため、安定した捕捉が困難であった。具体的には、光強度の小さな中心部の径が捕捉する水滴よりも小さいため、外周部分の光と水滴に重なりが生じ、水滴をビームの進行方向に押す力が発生してしまうことがわかった。したがって、今後、ビーム径の最適化が必要であることが明らかとなった。これまでに,水溶液中に分散させた油滴をレーザーにより捕捉し融合させる際の温度の影響について検討し、温度を上昇させることで融合できることを示した。また、Z偏光素子を用いて光渦ビームを発生させ、油相に分散させた水滴を捕捉することに成功した。しかし、このとき、中心部の径が小さすぎるため、水滴をビームの進行方向に押す力が発生してしまい、安定した捕捉が困難であった。そこで今年度は流路の表面を疎水化し、疎水性表面に水滴を押し付けることで安定した捕捉を実現することを試みた。種々の疎水性コーティング剤を用いて流路表面を疎水化したところ、水滴に対して大きな接触角を与える表面処理を実現することができた。この流路内で水滴を光渦ビームの中心に捕捉し操作しようと試みたが、疎水性表面と水滴との反発力が小さく、表面に付着した水滴を移動させることは困難であった。これは水滴を作製する際の界面活性剤が水滴表面に疎水部を向けているためであると予想された。したがって、安定した水滴の捕捉、操作を実現するためには、界面活性剤を用いずに有機相内で水滴を作製し、これを捕捉、融合させる必要があると考えられた。この目的を達成するためには、水滴の作製、捕捉を実現できるマイクロ流体デバイスの設計と作製が必要であると考えられた。したがって、ポリジメチルシロキサンによるマイクロ流体デバイスの作製法について検討し、良好なデバイスを作製することに成功した。今後、液滴作製用の流路と液滴操作用の流路を備えたマイクロ流体デバイスを作製することで、有機相内での水滴や細胞の捕捉と融合が実現できるものと期待している。

この問題を解決するために、ドーナツ型のビーム形状をもつ光渦を利用した。この光渦を利用した有機溶媒中での水滴の捕捉、操作、融合のための方法を開発した。油滴の融合に必要な条件を明らかにするとともに、油相に分散した水滴を捕捉するための光渦ビームの発生に成功し、水滴の捕捉にも成功している。分析化学油相内で水滴を安定に捕捉するためのビームの最適化を行うとともに、水滴内に細胞を閉じ込め、その中で化学反応を行うための実験に取り組む。また、実験の処理速度を向上させるために、マイクロチャンネルを作製し、その中での油滴や水滴の光操作について検討する。レーザートラッピングにより微小液滴を捕捉するためのシステムを構築し、油滴の捕捉と融合に成功している。油滴の融合の際に、溶液中に存在するPEGが重要な役割を果たしている可能性が示唆された。このような現象はこれまで報告されておらず、検討が必要である。したがって、今後は油滴融合に対するPEG濃度の影響について詳細に検討し、融合条件の確立を目指す。さらに有機溶媒中での生体細胞の捕捉にも取り組む。
春秋戦国秦漢時代の都市とその周辺

春秋戦国秦漢時代の膨大な都市関係資料をデータベース化し、加えて現地調査も実施して当該時代の都市とその周辺、都市と都市との関係について分析した。その結果、都市には周辺防衛強化型や相互連携型などいくつかの類型化が可能であり、当該時代の都市は地域と時代によって、軍事と経済の両面から多様な様態を取ることが明らかになった。地域の統合体である秦漢古代帝国のあり方ももこのような都市の側面から捉え直す必要がある。本年度は、研究の基礎となる春秋戦国秦漢時代の都市関係資料の収集と整理を集中的に行った。まず、これまで未収集の都市関係考古資料(考古学関係雑誌、報告書、貨幣など出土文字資料)を他大学の図書館や博物館において調査し収集した。これと平行して、これまで作成してきた手書きの都市遺跡カードを、本研究の目的に対応するように城趾内状況と城趾外状況に分けて再編成し、地図や写真、図面なども比較検討できるようにデータベースソフト・ファイルメーカーによってデータベース化を進めた。この作業を能率的に進めるため入力には研究補助者の協力を得た。これまでの作業によって、都市城外の考古調査は墓葬以外にあまり進んでいないことが明らかになってきたが、周辺の墓葬の副葬品からも都市の居住者や都市経済の問題を解明するための糸口が見えてきた。また、中国現地における都市遺跡調査と最新の調査情報の収集も行った。陝西師範大学の侯甬堅教授らの協力により、漢長安城、秦都咸陽、秦都櫟陽の遺跡についでとくに遺跡周辺について重点的に現状を調査した。現地の研究者や農民にもインタビューしたが、城内よりも城外周辺の状況把握はかなり困難であった。今後インタビューに工夫が必要と感じた。ただし、現地調査を行うことにより、考古学報告書によっては得られない、周辺の地理的状況も的確に得ることができ、研究の精度を高めることができることが確認できた。この他、『戦国策』、『史記』など文献史料を通読して関係資料をカード化し、都市周辺の情況把握に努めた。このような多角的な具体的アプローチにより、古代都市の立体的把握のための展望が開けてきた。本年度も、研究の基礎となる春秋戦国秦漢時代の都市関係資料の収集と整理を集中的に行い、データベースソフト・ファイルメーカーによってデータベース化を進めた。以上の資料収集の結果に基づいて、暫定的に都市遺跡分布図を改めて作成したが、周辺地域にあたる北京西北部でも都市発達が見られることが明らかになった。その要因を探るため、中国社会科学院歴史研究所王震中教授の協力のもとに、北京西北の〓鹿県、蔚県の都市遺跡の現地調査を行った。その結果、この地域の都市発達は趙国の北方進出と関係があり、北方民族との交易活動を考慮する必要が出てきた。すなわち戦国時代を中心とする都市発達は、中原地域内だけでなく、中原地域と周辺民族との交易活動にも注目し重層的に考えていく必要がある。またデータの蓄積によって、城郭都市と城外周辺とについても一定の知見を得ることができた。都市の城外には様々な遺構が確認できるが、そこから都市の多様性が浮かび上がってきた。政治的、宗教的都市や手工業製作場を有する経済的都市の他に、防御を強化した軍事的都市、運河や鉱山と関係のある特別な都市も確認できた。また、墓地や遺跡(農村集落)などの分布状況から、都市発達の背景も明らかになってきた。すなわち、中原地域では新石器時代以来の長期の居住地域における自生的な発展が見られるが、周辺地域では政治、軍事、経済的な進出にともなう都市建設が認められるのである。今後、都市あり方の多様性に注意しながら、都市発達を総合的に考えていく必要がある。本年度も、春秋戦国秦漢時代の都市関係資料の収集を継続的に行い、データベースソフト・ファイルメーカーによってデータベース化を進め、ほぼ予定どおり現時点での整理を終了した。本年度は計画の最終年度に当たるため、まず以上のデータベースに基づいて最新の都市遺跡分布図を作成した。山東省西部に都市密集地域が新たに確認されたが、これは河南中部の発展地域の延長として理解できる。ただし、山東中部の東西に伸びる都市発達の理由は課題として残った。次いで、データベースに基づいて、都市遺跡とその周辺の状況が明確になるような都市遺跡一覧表を都市発達地域を中心に省ごとに作成した。その結果、資料の豊富な国都を中心として、時代的、地域的に都市と周辺の関係に特色が見い出され、類型化が可能となった。春秋時代には黄河中流域の都市発達地域では都市住民を囲い込む外郭が見いだせない場合が多く、そのような外郭は戦国期になって経済の発展にともなって出現するようである。一方、春秋戦国期を通じて、周辺地域では巨大な軍事的外郭や、防御用都市を周囲に配置する例が見られる。このことは中心部における都市の密集発達と周辺部の都市の孤立性と対応していると考えられる。

ただし、周辺部での特定地域の都市発達は軍事面だけでは説明できず、経済的要素も考慮しながら都市発達の多様な側面を考える必要がある。なお、最終年度に当たって、中国社会科学院歴史研究所の王震中教授、東北学院大学の谷口満教授を招聘して研究集会を開催し、研究計画の総括を行い将来の展望について検討した。上記の研究成果と研究集会提出論文は、本年度の科学研究費により194頁の研究成果報告書として印刷し刊行した。本報告書は、今後の古代都市の総合的研究に資するものと考える。
植物器官の代謝発現に関わる遺伝的プログラム

本研究は、植物器官に特有な代謝や細胞機能の発達や刺激に応答したその転換の過程を制御する遺伝的プログラムを明らかにすることを目的とした。中村は、貯蔵タンパク質遺伝子の糖による発現誘導にかかわる転写因子や糖誘導性CDPKを同定し、シロイヌナズナの糖応答性遺伝子発現が異常になった突然変異株を単離した。内藤は、メチオニンを過剰蓄積して種子タンパク質の発現に影響を与える突然変異株を単離し、メチオニン合成酵素遺伝子の5'-非翻訳領域中の変異により転写後のフィードバック制御が異常になることを見出した。島本はトランスポゾンを使ったイネの高効率突然変異誘発系を構築して多数の変異株を単離し、詳細な遺伝学的解析を進めた。大山はミトコンドリアに輸送されるtRNA遺伝子の構造と発現を明らかにした。飯は、S期特異的な転写制御を規定する転写因子複合体を解析した。服部は、ABA依存的にVp1と相互作用してDNAに結合する新規のbZIP因子を発見し、篠崎は、シロイヌナズナから乾燥ストレスで誘導され、乾燥に応答した遺伝子発現に関わるMYBとMYC因子を同定した。前島は液胞膜の水チャンネル分子の、また西村は、液胞タンパク質のプロセシング酵素の遺伝子を単離してそれらの発現パターンを詳細に解析し、それぞれが細胞伸長やプログラムされた細胞死と関わることを見出した。佐々木は、光抑制される低分子量Gタンパク質が伸長する茎や登塾種子で強く発現することから、液胞肥大による細胞伸長に関与すると推定した。岩崎は、イネの3量体型Gタンパク質遺伝子を詳細に解析し、その破壊変異株を同定することに成功した。植物体内を転流する糖のレベルによって種々の器官代謝機能に関わる遺伝子発現が調節されるが、糖応答性遺伝子の5'-上流域にTGGACGG配列よりなる糖応答性エレメントが同定され、この配列への核タンパク質の結合活性は組織の糖処理によって増加することが明らかになった(中村)。糖応答性遺伝子発現にはタンパク質のリン酸化・脱リン酸化、それにCa^<2+>-情報伝達系が関与し、組織への糖供与が細胞内Ca^<2+>濃度の増加をもたらすことが示され(中村)、根や葉での窒素同化に関わる遺伝子の硝酸シグナルによる誘導にもタンパク質のリン酸化・脱リン酸化反応やCa^<2+>情報伝達系が関与することが示唆された(杉山)。トランスジェニックイネにおけるヒストン遺伝子の分裂組織での発現はヘキサマーやG-boxモチーフによって規定され(島本)、これら配列に結合するbZIP型因子の間で複合体形成が起こることが示され、またG-box結合因子には潜在的な転与活性化領域があることが明らかになった(飯)。イネのbZIP型DNA結合因子cDNAの中の一つであるOSBZ8はABA応答性エレメントに特異的に結合するタンパク質をコードし、ABAによる誘導に先だって発現が誘導されることからABA誘導性遺伝子発現にかかわる転写制御因子であることが示唆された(服部)。タバコのnic1,nic2遺伝子はニコチン生合成系遺伝子群の根での発現を制御する遺伝子であることが示され(橋本)、シロイヌナズナのメチオニンを過剰蓄積するmto1-1変異株では母方遺伝子型によって種子貯蔵タンパク質遺伝子の発現が制御されることが明らかになり(内藤)、糖応答性遺伝子発現が抑制された変異株lsi1では葉の正常な成長が糖濃度依存的に異常になった(中村)。トランスジェニック植物において、細胞内アデニンヌクレオチドバランスを調節するアデニレートキナーゼの遺伝子発現レベルを人為的に操作すると成長に顕著な影響が現れた(内宮)。2種の糖応答性遺伝子に共通した糖応答性エレメントに結合しうるタンパク質のcDNAが単離され、その発現自体が糖によって誘導されることが示された(中村)。種子ABA応答性遺伝子のACGTG

モチーフに結合するbZIP因子のmRNAがタンパク質合成阻害下でもABAによって短時間のうちに誘導されることが明らかになり、同じくABA応答性遺伝子の転写制御因子であるVp1とin vivoで相互作用するタンパク質が検出された(服部)。シロイヌナズナから乾燥やABAによって誘導され、これら刺激応答性エレメントに結合するMYB因子cDNAが単離され、その結合活性はリン酸化によって失われること(篠崎)、ヒストン遺伝子の分裂組織での転写に関与するbZIP因子の一つが核内のCDPKと思われる活性によってリン酸化されることでDNA結合活性が調節されること(飯)が明らかになった。公募班員(杉田)によってタバコの核抽出液からRNA pol.IIによる忠実な転写開始を起こすin vitro転写系が開発された。糖応答性遺伝子発現にはCa2+-情報伝達系とタンパク質リン酸化が関与するが、タバコ葉の膜結合型カルシウム依存性プロテインキナーゼ(CDPK)が糖による誘導を受けることが明らかになり(中村)、窒素同化に関わる遺伝子の硝酸シグナルによる誘導にもリン酸化・脱リン酸化反応やCa2+情報伝達系が関与することが示唆された(杉山)。シロイヌナズナから単離された糖応答性遺伝子発現に関わる変異株lbalは葉の正常な成長にも異常が見られ、この表現型から新たな糖応答性変異株がT-DNAタツギングライブラリーから同定された(中村)。トウモロコシのAcとCsを組み合わせたイネの高頻度変異誘発系が開発され、開花時期や胚発生、病原菌抵抗性などに関する変異株が分離されて、原因遺伝子の単離へ向けた研究が順調に進んでいる(島本)。シロイヌナズナの遊離メチオニンを過剰蓄積するmto1-1変異株における変異の原因究明、およびそのもたらす生長生理への影響の解析が進んだ(内藤)。細胞周期特異的遺伝子発現に関わるタイプ1エレメントのOct配列への結合因子を解析し、B班の廣近班員が単離したLBP1がOct配列に結合することを見出した(飯・廣近(B))。シロイヌナズナから酵母のcdc5を相補するMYB因子を単離してDNA結合配列を同定し、分裂組織で強く発現していることを示した(篠崎)。ABA応答性にかかわる転写活性化因子であるトウモロコシのVp1とシロイヌナズナABI3の間で保存されたC末端領域と相同な配列を持つシロイヌナズナのVAL1/2を単離してそのVp1/ABI3ドメインにDNA結合活性を見出し、Vp1もDNA結合能を持つという新しい可能性を示し、Vp1と相互作用する新規タンパク質をTwo-Hybrid systemで同定した(服部)。シロイヌナズナ遺伝子の糖による発現誘導には、負の制御からの脱抑制が重要であることがシスエレメントの解析や突然変異株における発現の解析から示され、これら負の制御配列への結合活性を検出した。また、タバコ葉の糖で誘導される膜の自己リン酸化タンパク質を約千倍に部分精製し、細胞質膜に強固に結合した特異なカルシウム依存性プロテインキナーゼ(CDPK)であることを示した。(中村)。葉の光合成系遺伝子の転写を制御するサイトカイニンは、根に窒素シグナルを与えることで一過的に合成されるこすことを見出し、葉でサイトカイニンで誘導される遺伝子の一つがバクテリア二成分系のレシーバーと高い相同性をもつタンパク質をコードすることを見出した(杉山)。
日本の政府間人事関係の実証的研究

本研究が設定した課題は、日本の政府間において行われている人事交流を歴史的、制度的、比較的、および実態的に把握することにより、その特質と問題状況を探究することであった。したがって、研究は広範囲に及ぶため、ここでは本研究がもっとも力を入れた人事データベース作成についてもっぱら報告しておくことにしたい。この人事データベースは本研究の実証的部分の基礎をなすものである。その作成の基礎資料として地方財務協会が1972年から発行している『内政関係者名簿』を平成3年度版まですべて入手し、警察庁、厚生省、労働省、建設省、および自治省に昭和23年以降入省(庁)した者について、その氏名をまずすべて入力し、次いでその後在職した職名を年を追ってデータベースに入力していく作業を行った。対象となる資料がB5判で4000頁以上にも及ぶため、平成4年2月現在全部データを入力し終える段階にまでは到達してない。だが、とくに警察庁、自治省、および建設省について相当部分を入力できたことは大きな成果であった。つまり、このデータベースを様々なキーワードを用いて選択ないしソートすることにより、単に国地方間の人事交流の動態のみならず、日本の中央省庁の人事の動きがありありと把握できるからである。もちろん、運輸省や通産省という地方への出向人事が比較的多い省はカバーしていないという限界はあれ、例えば、「1984年の鹿児島県」をキーにすることで、その年の鹿児島県庁のどのポストがどの省庁の入省年次いくらの者によって占められていたのかを瞬時に明らかにすることができる。また、特定の個人のキャリアパスを表形式で一覧することにより、日本行政官僚制の人材育成(もしくは脱落)のパターンが抽出できるのである。今後、このデータベースに様々な属性--例えば、出身大学--を加えていくことにより、日本の人事行政の動態がより正確に闡明されることが期待される。
整閉イデアルの族の研究

本年度得られた主な成果は以下の通りである.・2次元の正則局所環において任意の整閉イデアルが有理数係数の整閉イデアルのmultiplier idealとして得られることをJ.Lipman氏との共同研究で示した.・後藤はI=Q : m(Qは局所環(A, m)のパラメーターイデアル)に関する等式I^2=QIの重要性に注目し,これが成り立つための条件,整閉性との関係などにおいて大変興味ある結果を得た.このように多くの興味深い結果を得たが,3次元以上における整閉イデアルの分解,整閉イデアルの列の挙動など多くの重要な問題が今後の課題として残っている.本年度は主に,状況の把握,特にすべてのイデアルの族であるHilbert Schemeの研究と,2次元有理特異点のgood idealsの族の研究を行った.イデアルの「大きさ」を知るための不変量として"Hilbert-Kunz重複度"の概念があり,大変神秘的な対象となっている.本研究では2次元有理特異点の整閉イデアルのHilbert-Kunz重複度を与える公式を特異点の解消と極大Cohen-Macaulay加群を結んでいるMcKay対応を用いて計算する公式を与えた.また,最近Ein,Lazarsfeldたちにより定義されたmultiplier idealとの対応も現在研究中で近いうちに何らかの結論が得られると期待される.2次元正則局所環の整閉イデアルについても整閉イデアルの積の一意分解の性質と整閉イデアルの鎖の性質との関連が研究代表者とS.S.Nohとの共同研究によって得られ,目下論文の準備中である.整閉イデアルの概念と関連して加群の整閉部分加群が定義され,研究が進んでいる.この概念と整閉イデアルの概念の関係,2次元正則局所環における整閉部分加群の特徴付けなどの課題が今後の問題である.本年度はMSRI, Berkeleyで"Commutative Algebra, Special Yearが開かれ,それに刺激されて大変有益であった.本研究で得られた結果は以下の通りである.・整閉イデアルの鎖について任意の包含関係をもつ2つの整閉イデアルの間に整閉イデアルのみから成る組成列が存在することを示した.また,固定された整閉イデアルに余長1で含まれる整閉イデアルの族がd-1次元の代数集合であることを示した.また,「イデアル全体の中で整閉イデアルの族はZariski閉集合か?という問いに反例を与えた.この結果はcontemporary math.(American Math, Soc)から出版予定である.・multiplier idealの研究は本研究と深く関係している.これについて3次元のトーリックの場合にsubadditivityの反例を得た.今後はGorensteinの場合を研究していく.・後藤は加群のRees環を研究し,Koszul複体のシジジー加群のRees環から新しい大変興味のある代数群の不変部分環を得た.このように多くの結果が得られ大変研究成果が上っている.本年度得られた主な成果は以下の通りである.・2次元の正則局所環において任意の整閉イデアルが有理数係数の整閉イデアルのmultiplier idealとして得られることをJ.Lipman氏との共同研究で示した.・後藤はI=Q : m(Qは局所環(A, m)のパラメーターイデアル)に関する等式I^2=QIの重要性に注目し,これが成り立つための条件,整閉性との関係などにおいて大変興味ある結果を得た.このように多くの興味深い結果を得たが,3次元以上における整閉イデアルの分解,整閉イデアルの列の挙動など多くの重要な問題が今後の課題として残っている.
グルココルチコイド作用発現におけるプロテインキナ-ゼCの役割

我々はこれまでに、グルココルチコイド(GC)ホルモン作用がプロテインキナ-ゼCのインヒビタ-のH-7で完全に抑制され、逆にジアシ-ルグリセリド、ホルボ-ルユステルなどのプロテインキナ-ゼCり活性化物質群によりGC作用が著明に増幅されることを明らかにしてきた。本年度の研究により、生体内における生理的プロテインキナ-ゼCの特異的インヒビタ-と考えられているスフィンゴシンによってもGC作用が著明に抑制されることが明らかとなった。しかもスフィンゴシンの抑制効果は110μMの濃度の範囲で、濃度依存性にGC作用を抑制し、細胞内でのGC作用の発現調節に関与していることが推定された。このように、生理的にはジアシ-ルグリセリドやスフィンゴシンによってそれぞれGC作用の増幅と抑制が細胞レベルで調節されている可能性が明らかとなった。さらにH-7やスフィンゴシンは、初代肝細胞培養系、肝切片組織培養系においてCytosol画分でのGCレセプタ-の活性化を抑制し、その結果GCレセプタ-は熱ショック蛋白のHSPー90と複合体を作ったままCytosol画分に不活性型として留まり、核への移行が抑制されることを明らかにしてきた。以上の結果を基にして、現在プロテインキナ-ゼCがGCレセプタ-やHSP+90を含む、いかなる蛋白のリン酸化を促進しその結果GCホルモン作用を増幅し、逆にH-7やスフィンゴシン等のプロテインキナ-ゼCの活性抑制剤がどのようにGC作用の発現を抑制するか、その作用機序を追求している。
西欧中世の『フィシオログス』写本―挿絵の展開と受容に関する美術史的研究

本研究は、西欧中世のキリスト教的博物譚『フィシオログス』(Physiologus)の伝統の流れを汲む写本群を取り上げ、その挿絵の成立と展開について、機能・受容という新たな視点を加え考察するものである。同書は古代アレキサンドリアで2世紀ごろ成立、古代末期以降西欧に伝播し、挿絵が豊富に付された写本が多数伝来するが、その挿絵の成立や展開に関する研究は未だ等閑な状態にある。また美術史上は同書の挿絵の意義として、キリスト教美術の図像典拠としての機能を認めてきた。しかし申請者は、同書の挿絵の諸相はそれに留まらず、神学や教育分野における多面的受容により生じた必然的帰結と考え、その重層的意義を明らかにする。
素子性能の向上に向けた「有機デバイス分光法」の確立

材料中の過渡的な電界変化を捉えることができる電界誘起光第2次高調波(EFISHG)測定を用いて有機半導体材料中におけるキャリア輸送を可視化することで、有機単結晶中で観測されるキャリア輸送の異方性や輸送機構の検討、有機トランジスタや有機ELなどにおけるデバイス動作の評価を行った。このEFISHG測定を中心として、各種分光学的手法を組み合わせることで、デバイス動作を系統的に評価する「有機デバイス分光法」として提案した。近年、活況を呈している有機デバイス分野において、デバイス動作時の状態を的確に捉える評価法の開発が早急に望まれている。本研究は、分子と電界・電荷との相互作用を評価する各種分光学的手法を用いて、基本的なデバイスパラメータ(キャリヤ密度、移動度など)を可視化した上で、系統的にデバイス動作を評価する「有機デバイス分光法」の確立を目的としている。本年度はまず、従来から用いているナノ秒波長可変レーザによるシステムに加え、現有するフェムト秒波長可変レーザシステムに時間分解顕微SHGイメージング測定系を導入した。極短パルスレーザの使用により、ナノ秒レーザと比較してサンプルへのダメージ閾値改善によるS/N比の向上が見込まれ、これまで観測できなかったような低電界領域や低電荷密度領域の現象を捉えることができる。具体的な成果としては、まず、単層の両極性トランジスタにおける電子・ホールの注入・輸送・再結合過程を時間分解SHG法によって観測した。有機ELにおいて発光までの過程を観測することは重要な意味を持つため、ここでは発光トランジスタ中のキャリア挙動を評価した。結果として、SHGから再結合位置を予想し、これが実際のEL発光位置がよく一致することを示すことができた。また、同じく両極性トランジスタとして2層構造のデバイスを選び、キャリアの輸送経路について検討した。実際には顕微CMS法を用いてC60とペンタセンの2層からなる半導体層を持つトランジスタを評価し、両極性動作におけるキャリアの輸送過程(ホールはペンタセン層を輸送され、電子はC60層を輸送される)をはじめて実験的に示すことができた。本年度は昨年度に引き続き、時間分解SHG法を用いた単層の両極性トランジスタにおける電子・ホールの注入・輸送・再結合過程の観測や、顕微CMS法による両極性動作におけるキャリアの輸送過程評価を継続して行うとともに、新たに配向した有機半導体薄膜における異方的なキャリア輸送の評価を試みた。特に、有機トランジスタでは依然として高移動度材料に関する研究が活発であり、例えば単結晶などの利用もしばしば検討される。このような材料では、キャリア輸送が異方的になるため、その異方性の評価が重要である。今回のような評価を目的として、トップ電極に円形電極を用い、配向した高分子半導体薄膜や単結晶薄膜におけるキャリア輸送の異方性を直接可視化することに成功した。また、プレフィリング法による有機FETチャネルのトラップ評価を試み、絶縁膜の違いによりプレフィリングに必要となる電圧が変化することが明らかとなった。これにより、絶縁膜の違いによるトラップ密度の違いや、またエネルギー的な深さに関する情報を得ることができた。一方で、有機ELにおいて膜厚方向の電界分布を評価するシステムを新たに導入し、微小な測定スポットをスキャンさせることで劣化状態などの面内分布を評価することができた。また、有機太陽電池による研究では、時間分解SHG測定により、バルクヘテロ太陽電池におけるn型およびp型層内部の電界の選択的な評価に成功した。本研究は、分子と電界・電荷との相互作用を評価する各種分光学的手法を用いて、基本的なデバイスパラメータを可視化した上で、系統的にデバイス動作を評価する「有機デバイス分光法」の確立を目的としている。本年度は昨年度に引き続き、時間分解SHG法を用いた配向した有機半導体薄膜における異方的なキャリア輸送の評価と、結晶性材料における輸送特性の温度依存性の評価を試みた。近年、新しいプロセスの開発などにより単結晶材料のデバイスへの応用が再度脚光を浴びているが、単結晶材料におけるキャリア輸送機構の研究は依然として重要な位置を占めている。EFISHG法の特徴として、キャリアの注入と輸送を分離して評価できるという点が挙げられる。有機トランジスタ構造において、注入障壁がある場合に移動度を評価する際には、その寄与を考慮した解析が必要となる。温度依存性の測定では、キャリアの注入と輸送を分離して評価できるというSHG法の特徴を活かし、注入の電位ドロップを考慮して移動度を計算することで、実効的な移動度の温度依存性のみを評価することに成功した。その上で、TIPSペンタセンの単結晶グレインにおける温度特性を解析すると、Marcus理論とよく一致することが分かった。

一方、有機太陽電池の劣化スポット解析に用いられているLBICとSHGを組み合わせることで、ミクロな劣化位置の特定と、その場所における電荷挙動解析が可能なシステムを構築した。現状では初期的なデータのみにであるが、LBIC測定で評価される低返還効率領域とSHGによる電界分布との対応が得られている。また、有機太陽電池におけるキャリアの初期過程を評価するために、ポンププローブ分光をベースとする過渡吸収測定システムとSHG評価システムを立ち上げた。26年度が最終年度であるため、記入しない。有機デバイス26年度が最終年度であるため、記入しない。当初の計画よりも早く光学系のセットアップが完了したため、実際の測定に移ることができた。そのため、予定をしていなかったデバイス構造を測定することができ、そこから両極性動作におけるキャリアの輸送過程評価という結果を得ることができた。測定用のレーザーを、従来のナノ秒レーザーとフェムト秒レーザーを併用したことで、測定のSN比が格段に向上に、これまで観測が困難であった現象を評価できるようになった。特に、高速アンプと組み合わせることで、時間分解能が向上し、結果として単結晶におけるキャリア輸送の評価が可能となった。現時点での、時間分解能は5 ns程度であり、高い移動度の材料にも対応可能である。また、単結晶を用いることで、例えばバンド計算などとの詳細な比較も可能となり、温度依存性などと組み合わせることで、キャリア輸送のメカニズムといった議論もできつつある。順調に計画が進んでいるため、新しい現象や、手法を常に取り入れながら今後の研究を進めていく予定である。特に、エネルギー的な側面からの評価として、これまで線形な光学プロセスであるCMSのみを用いていたが、今後非線形スペクトルなどに展開する予定である。これは、両方の光学スペクトルを組み合わせることで、相補的な情報を得られるだけでなく、時間分解評価も可能となる。また、単結晶におけるキャリア輸送の理論的予測を進め、実験との比較を行う予定でいる。一方、時間分解能が向上したことにより、今後無機材料に対する応用も視野に入れて進めていく予定である。
ヒアルロン酸を利用した転写促進機能を持つ生体適合性遺伝子デリバリーシステムの構築

ヒトへの臨床応用可能な、非ウィルス型遺伝子治療システムは、生体成分との副作用からの防御、上皮細胞の間隙を通ることのできるサイズ、標的細胞への取り込み、エンドソームからの脱出、核への移行、核内での効率よい転写等の問題を解決する必要がある。我々が開発したヒアルロン酸被覆三元複合体システムは、負の表面電荷や、カルボン酸の持つプロトンスポンジ効果、さらに結合緩和による転写活性化によって、これらの問題点を大きく改善した。さらにHMGタンパクを模倣して合成した両性イオン型のSpn-HAは、よりDNA複合体を弛緩し、高い非転写活性可能を持つことを報告した。これらのポリアニオン、両イオン型ポリマーとDNA/ポリカチオンとの位置的関係を簡単なモデルを用いてモンテカルロ法によるエネルギー計算で評価したところ、ポリアニオンはDNAとポリカチオンの外側に存在し、両イオン型ポリマーはDNAとポリカチオンの間に入り込むことが示された。そのためSpn-HAはDNA複合体をより弛緩させたのだと示唆される。このSpn-HAを添加したDNA複合体のゼータ電位は負に帯電し、マウスの腹腔に投与後、マウスの腹腔内で安定に分散するのが観察された。また、皮下に移植した腫瘍に局所投与したところ腫瘍細胞で非常に高い遺伝子発現を示した。さらに、第三成分のポリマーを加えたDNA/ポリカチォン複合体は、凍結乾燥しても遺伝子活性を維持できること見出した。これは、複合体が弛緩し、ポリアニオン及び両イオン型ポリマーが保護コロイド的に働いたためと考えられる。この凍結乾燥体は一ケ月以上4°Cで保存しても遺伝子発現効率は変わらなかった。また高希釈下で調製したDNAナノ粒子を、凍結乾燥した後少量の溶媒で再水和することで高濃度ナノ粒子分散液を得ることができた。これはマウスの尾静脈内に投与後、腫瘍細胞で非常に高い遺伝子発現を示した。非ウィルス型ベクターとしてDNAと静電的に結合するポリカチオンなどが多く研究されているが、これらのDNAとの複合体は生体成分と非特異的に相互作用することが問題となっている。さらにDNA/ポリカチオン複合体は強く凝縮しているために転写因子が近づけず、被転写効率が低いことが臨床に向けての障害となっている。我々は、DNA/ポリカチオン複合体をヒアルロン酸でコートし、複合体の表面電荷をマイナスにすることでこれらの相互作用を低減できることを見出した。またヒアルロン酸はそれ自体がリガンドとなって癌細胞に特異的に遺伝子導入できることを報告してきた。一方、細胞の核内ではクロマチンの高次構造を両性イオン型タンパクであるHMGタンパクが弛緩し転写因子の接近を容易にすることが報告されている。そこで、HMGタンパクに特有の両性イオン型構造を模倣して、ヒアルロン酸にスペルミンを付加させた両イオン型高分子(Spn-HA)を合成し、そのクロマチンやDNA複合体の被転写効率への影響を調べた。始めにこのような両イオン型高分子のDNA複合体に対する弛緩効果について調べてみた。Spn-HAを添加すると、DNA/Polycation複合体中の蛍光色素の発光強度がやや回復した。また蛍光の異方性比は低下し、Spn-HAがDNA複合体を弛緩させることが確認された。次に、Spn-HAのクロマチンに対する被転写効率改善効果についてE-Coli由来のRNA Polymeraseを用いて評価した。Spn-HAをマウス肝細胞より単離したクロマチンに添加すると、被転写効率は、クロマチン単独の場合と比べて約8倍向上した。クロマチンの代わりにDNA/Polycation複合体を用いた実験に於いても同様の効果が見られた。これらの結果からSpn-HAはDNA複合体を弛緩し、転写因子の接近を容易にして被転写効率を向上させることが確認された。

また高希釈下で調製したDNAナノ粒子を、凍結乾燥した後少量の溶媒で再水和することで高濃度ナノ粒子分散液を得ることができた。これはマウスの尾静脈内に投与後、腫瘍細胞で非常に高い遺伝子発現を示した。