hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
肝細胞と膵細胞増殖に対する視床下部性調節機構

目的:私たちは視床下部腹内側核を破壊すると組織障害を伴わずに腹部臓器の細胞増殖が起こること、さらに視床下部腹内側核破壊ラットでは部分肝切除後の肝再生が促進されることを報告した。視床下部は腹内側核と外側野とで相反する機能を分担しているために、視床下部外側野と肝再生の関係を検討するのを主目的とした。また、視床下部腹内側核破壊時の膵増殖細胞の質的同定を目的とした。方法:1)70%部分肝切除ラットを用いて、肝切除前にあらかじめ視床下部外側野を破壊した群と偽破壊群に分け、経時的に肝DNA合成能、DNA量を測定した。さらに、外側野破壊の肝再生に及ぼす機構の解明のために各種迷走神経切除術(迷走神経幹切断、肝臓枝切断、膵臓枝切断)を用いて、機序の解明を行った。2)視床下部腹内側核破壊が膵細胞増殖に及ぼす効果を検討すると共に増殖細胞の質的診断のためにPCNAを用いたlabelling indexと膵ホルモン(インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン)抗体の二重免疫染色を行って、S期細胞の質的な同定を行った。成績:1)視床下部外側野破壊後に部分肝切除を行うと偽破壊群に比較して肝DNA合成の亢進とDNA量の増加を認めた。この効果は肝迷走神経切断術と肝交感神経切断術の両者を加えると完全に抑制された。2)視床下部腹内側核を破壊すると膵細胞のDNA合成は亢進した。PCNAを用いたlabellingindexでは膵外分泌細胞と内分泌細胞の両者が増殖すること、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン抗体との二重免疫染色ではインスリン産生細胞(B細胞)のみが増殖していた。結論:視床下部腹内側核だけでなく、視床下部外側野にも肝再生を調節する機構が存在することが判明した。さらに、視床下部腹内側核破壊により生ずる高インスリン血症は膵B細胞の増殖が主因であることが判明した。
両腕協調運動の制御・学習を支える脳内過程

ヒトは複数身体部位の運動を組み合わせて、多様な複合運動を構成する能力を備えている。我々はこれまでの片腕・両腕運動を対象とした研究により「素過程(各腕を動かす脳内過程)が組み合わされて、複合運動(両腕運動)が構成される」という、両腕運動研究が拠り所としていた常識的な概念が誤りであることを明らかにしてきた。この「両腕運動を構成する右腕(左腕)運動は、片腕運動としての右腕(左腕)運動とは異なっている」という新しい描像を研究の出発点として設定すると、両腕運動制御の問題は単なる「協調」の問題だけに留まらず、その一見非効率な構造の機能的意義、構造の脳内表象、構造が運動学習過程に及ぼす影響、など多様かつ本質的に重要な問題を含んでいることが分かる。ロボットアームを用いた心理物理的実験、脳機能イメージング、片麻痺患者の調査、数学的モデル構築などの方法を用いて、これらの問題を解決し、両腕運動が構成・制御される原理解明を目指す。我々は、これまでの研究結果(Nozaki et al., Nature Neurosci 2006)に基づき、腕の運動学習用の脳内過程(メモリ)が、もう一方の腕運動パターンに応じて切り替わることで柔軟な両腕協調運動が達成される、という仮説を提案した。この仮説の検証、メモリの脳内表象、メモリ更新規則の解明を目的として、本年度は以下の研究を実施した。1.両腕リーチング運動中に左腕のみに新奇な力場を課すという運動学習実験を実施した。学習後に左腕が発揮できる運動学習効果は、右腕運動方向が学習時の方向から離れるに従って徐々に減少した。2.右腕の動きに応じて左腕に力場が加わるように設定した新奇な力場環境に左腕は容易に適応できた。以上の結果から、腕運動学習用のメモリは反対側の運動パターンに応じて徐々に切り替わること、また、この切り替わり機構を備えているために、腕運動の制御過程はもう一方の腕運動を考慮に入れた運動指令を生成でき、結果として柔軟な両腕協誘運動が可能になっていることが示唆された。3.メモリの切り替わりの脳内表象を調べることを念頭に、fMRI内で使用可能な手首運動用のマニピュランダムを開発・製作したH21年度以降、この装置を用いて、片手・両手手首運動における運動学習中の脳機能イメージング実験を実施する予定である。腕の運動学習用の脳内過程が、反対側の腕運動に応じて切り替わることで柔軟な両腕運動が達成される、という仮説の検証、脳内過程の脳内表象、状態更新規則の解明を目的として以下の研究を実施した。1.エラークランプの実装:従来の運動学習効果を評価する方法は系の状態を乱してしまい、実験に要する試行数が莫大になるという欠点があった。この欠点を解消するため、手の軌道を直線上に拘束し、この拘束面に対して手が発揮した力を測定する「エラークランプ法」を我々の実験系に実装した。この方法により、最大で2試行に1回キャッチ試行を挟むことが可能になることを確認した。2.運動学習における反対側の腕運動の影響:エラークランプ方法を用いて、右腕運動の方向に応じて、左腕のメモリがどのように切り替わるかを網羅的(8方向)に調べた結果、右腕の運動方向が学習に使った方向から離れるに従って漸減するパターンが観察された。3,片腕運動と両腕運動の類似度:片腕リーチング運動で獲得した運動学習効果は、反対側の腕運動を加えたときにどの程度転移するか、エラークランプ法を用いて調べた。その結果、学習効果は右腕の運動方向(8方向)によらず一様に(60-70%)転移した。運動学習の観点からは、両腕を同・逆方向に動かすなどの両腕運動が特に片腕運動に似ているわけではなく、全て同様に異なっていることが示された。4.脳内表象の違い:昨年度開発した装置を用いて、片手・両手手首運動における運動学習中の脳機能イメージング実験を実施した。それぞれの運動学習に特異的な脳賦活部位を同定できた。5.片麻痺者の運動機能:片麻痺者3名のうち1名で、患側のリーチング運動が健側の運動を付け加えることで改善した。ただし、現状のマニピュランダムは剛性が低く、ハンドルも握りにくいため、患者のリーチング運動の測定には向いていないという欠陥も明らかになった。

1.両腕運動学習における両腕運動方向の相互作用:昨年度、実験系に実装した「エラークランプ法」を用いて、一定の方向に両腕を動かしながら獲得した左腕の新奇力場への学習効果の、各腕運動方向を独立に変化させたときの(48パターン)汎化パターンを調べた。その結果、汎化関数が両腕運動方向の積の形で記述できることが明らかになった。2.両腕協調運動学習の数学的モデル:運動学習に関与するメモリ要素が両方の腕のキネマティクスを乗算的に統合していると仮定することにより、上記の実験結果が理論的に説明可能であることを示した。メモリ要素によるこのような乗算的統合は、任意の力学的環境を学習する上で有利であることをシミュレーションによって予測するとともに、その予測を実験によって実証した。3.脳内表象:手首運動用マニピュランダムを用いたfMRI実験を追加し、片腕・両腕運動に特異的な脳賦活部位を同定した。さらに、Dynamic Causal Modelingを適用することにより、両腕運動の場合特異的に、小脳から一次運動野へのフィードバックが有意に減弱することを見出した。4.動作を遂行する脳内神経ネットワーク冗長性の実証:左右二つのターゲットにリーチング動作を行う際に、逆向きの視覚回転変換をかけるという我々が考案した運動学習課題を用いることにより、被験者は主観的には異なった2つの運動を行なっていると信じているが、実際に実行された運動は同一であるという状況を作りだした。さらに、この同一の運動が、異なる運動計画によって実行されている場合に限り、相反する二つの力場に適応可能であることを明らかにした。この結果は、物理的に同一の運動が異なる脳内の神経リソースによって実行されていることを示した。
熱電素子を用いた変形制御機構の最適設計法の構築

構造物の熱変形の局所的な補正を行うことを目的として,熱電素子を用いた変形制御機構の最適設計を行うための方法論を構築した.熱伝導,電流,熱変形の支配方程式にもとづき,トポロジー最適化問題を定式化した.さらに感度解析の結果を元に開発した最適設計法をコンピュータプログラムとして実装し,方法論の有効性を確認した.構造物の熱変形の局所的な補正を行うことを目的として,熱電素子を用いた変形制御機構の最適設計を行うための方法論を構築した.熱伝導,電流,熱変形の支配方程式にもとづき,トポロジー最適化問題を定式化した.さらに感度解析の結果を元に開発した最適設計法をコンピュータプログラムとして実装し,方法論の有効性を確認した.工作機械に代表される位置決め機構を持つ機械製品では,駆動装置や加工点から発生する熱,あるいは,環境温度の変動が原因となって構造部材に熱変形が生じ,その結果,位置決め精度が悪化する問題がある.このような問題を,局所的な装置で解決するために,熱電素子を用いた構造変形制御システムの利用が有望である.そこで本研究では,高性能な構造変形制御システムを効率的に設計するための最適設計法の構築を行う.熱電素子を用いた変位制御機構を数値解析するためには,電気,熱,変位に関する連成問題を解く必要がある.このために,外部熱源によりある境界において熱が流入しているとき,熱電素子に通電したときの加熱及び冷却効果によってある境界における変位を抑制することを考える.そして電流の保存側,電気と熱のエネルギー保存側,熱弾性体の仮想仕事の原理の式に基づく3つの平衡方程式を解くことで,熱変位を求めることができる.熱変位を抑制する機構の最適設計を構築する予備的検討として,熱変形を積極的にアクチュエータとして利用するために熱変形を最大化を行う場合を考える.これには,トポロジー最適化問題の目的汎関数を,相互エネルギーに基づいて以下のように定式化し,この汎関数Fを最小化することで,大きな変位を持つアクチュエータの構造が得られることを確認できた.これに対し,本研究では逆に熱変形を最小化することが求められる.これに対して,変位を抑制するために,変位のノルムを最小化する検討を行った.工作機械に代表される位置決め機構を持つ機械製品では,駆動装置や加工点から発生する熱,あるいは,環境温度の変動が原因となって構造部材に熱変形が生じ,その結果,位置決め精度が悪化する問題がある.このような問題を,局所的な装置で解決するために,熱電素子を用いた構造変形制御システムの利用が有望である.そこで本研究では,高性能な構造変形制御システムを効率的に設計するための最適設計法の構築を行う.熱電素子を用いた変位制御機構を数値解析するためには,電気,熱,変位に関する連成問題を解く必要がある.このために,外部熱源によりある境界において熱が流入しているとき,熱電素子に通電したときの加熱及び冷却効果によってある境界における変位を抑制することを考える.そして電流の保存側,電気と熱のエネルギー保存側,熱弾性体の仮想仕事の原理の式に基づく3つの平衡方程式を解くことで,熱変位を求めることができる.本年度は,このような機構を設計するにあたり問題となってくる構造の応力の問題を検討した.本研究課題で扱っている設計問題に対して最適な構造が見つかっても,熱変形時に応力を許容値以下に抑えるような構造を最適解として導出する必要がある.そこで,応力を評価するための定式化の方法について検討を行った.構造の個々の部分の局所的な応力を最適化問題の中で評価すると計算負荷が非常に大きくなることから,大域的な評価指標を導入することが重要であることを確認した.前年度までの研究で,熱変形を局所的に補償するような構造物を設計するために,熱変形の最小化を行う場合について目的関数の定式化と応力の評価法についての基礎的な検討を行い,着目する点における変位を抑制するための方法論の枠組みを構築することができた.しかしながら,前年度までの方法は,目的関数の評価と感度解析において,熱変形部分のみを考慮した限定した方法となっていた.そこで,本年度では,熱電素子をも含めた系全体の挙動を考慮した方法とするために,これまでに構築してきた方法論を発展させるための検討を行った.そのために,熱電素子を用いた熱変形機構の解析と評価に用いる電流の保存側,電気と熱のエネルギー保存側,熱弾性体の仮想仕事の原理の式に基づく3つの平衡方程式の関係を見直し,感度解析の方法を修正した.そして,この新しい方法に基づいて数値実装を行い,例題を解くことで,新しい方法の有効性を確認することができた.さらに,熱変形を最小化することが目的である本手法を,逆に熱変形を積極的にアクチュエータとして利用するような構造物の最適設計場合に応用する方法についても再検討を行うこととし,大きな熱変形を得るための方法論の見直しを行った.この熱変形最大化の手法についても同様に数値実装を行い,これまでの局所的な評価法と比較して数倍から数十倍の変形を得られることが確認できた.最後に,熱変形の最小化だけでなく最大化したい場合も含めた総合的な熱変形構造物の最適設計法としてまとめをおこなった.最終目標を達成するための要素技術の開発は順調である.24年度が最終年度であるため、記入しない。ここまで得られた知見に基づき,本手法を統合的な方法としてまとめ上げる必要がある.24年度が最終年度であるため、記入しない。
全身麻酔薬が出血性ショック時および虚血再灌流時の糖代謝に及ぼす影響

セボフルラン麻酔と比べてプロポフォール麻酔は好気的代謝条件および嫌気的代謝条件でのインスリン分泌を有意に増加させた。その機序として膵β細胞アデノシン三リン酸感受性カリウムチャネル(KATP-channel)に及ぼす影響の差が示唆された。また、セボフルラン麻酔下とプロポフォール麻酔下では、虚血再灌流時のインスリン分泌と感受性の変化に大きな差があり、プロポフォール麻酔下でのインスリン感受性に対するTNF-αの関与が示唆された。平成21年度はラット出血性ショックモデルを作成し、セボフルランとプロポフォールが出血性ショック時の糖代謝に及ぼす影響を検討した。ラットにセボフルラン麻酔下で出血性ショックを導入した場合、すべての個体(8匹)がショック導入後30分間生存し続けたのに対し、プロポフォール麻酔下ではショック導入後30分以内に8匹中4匹が死亡した。この間、セボフルラン麻酔下ラットの血糖値は、プロポフォール麻酔下ラットの血糖値と比較して有意に高値であった。出血性ショック時の糖代謝にセボフルランとプロポフォールが及ぼす影響の差を説明する機序を解明する目的に、出血性ショック導入前にKATPチャンネル阻害薬を用いた処置を行い、セボフルラン麻酔下およびプロポフォール麻酔下での糖代謝がどのように修飾されるかを検討したところ、KATPチャンネル阻害薬を用いた処置により、セボフルラン麻酔下での血糖値は有意に低下したが、プロポフォール麻酔下の血糖値は有意には変化しなかった。膵臓β細胞のKATPチャンネルが阻害されるとインスリンが分泌される。文献的には、セボフルランはKATPチャンネルを開口させるのに対し、プロポフォールはKATPチャンネルを阻害することが報告されている。このことから、上記の結果は出血性ショック時のインスリン分泌に対してセボフルランとプロポフォールが及ぼす影響の差を反映していると考察した。平成21年度の研究結果から、出血性ショック時の糖代謝に対しセボフルランとプロポフォールが及ぼす影響の差には、セボフルランとプロポフォールがインスリン分泌に及ぼす影響の差(糖利用への影響の差)が有意に関与している可能性が示唆された。平成22年度前半は、セボフルランとプロポフォールが出血性ショック時の糖代謝に及ぼす影響を引き続き検討した。セボフルラン麻酔下ではプロポフォール麻酔下と比較して、血糖値は有意に高値でありインスリン分泌量は有意に低かった。セボフルラン麻酔下とプロポフォール麻酔下の両条件において、KATPチャンネル阻害薬(グリベンクラミド)前処置は、血糖値を有意に低下させインスジン分泌を有意に増加させた。セボフルラン麻酔下とプロポフォール麻酔下の両条件において、KATPチャンネル開口薬(ニコランジル)前処置は糖代謝に有意な影響を及ぼさなかったが、プロポフォール麻酔下において出血性ショックに伴う心筋虚血の発生率を有意に低下させた。文献的には、セボフルランはKATPチャンネルを開口し、プロポフォールはKATPチャンネルを阻害すると報告されている。本研究結果は、セボフルランは膵β細胞KATPチャンネルを開口しインスリン分泌を抑制するのに対し、プロポフォールは膵β細胞KATPチャンネルを阻害しインスリン分泌を促進させることを示唆する。ただし、本研究で用いた用量では、プロポフォールのKATPチャンネルに対する影響は完全阻害ではなく部分的阻害であると考えられる。平成22年度後半は、セボフルランとプロポフォールが虚血再灌流時の糖代謝に及ぼす影響の検討を開始した。現段階では統計学的検討に必要なデータ数に満たないが、虚血再灌流時の糖代謝にセボフルランとプロポフォールが及ぼす影響は大きく異なる可能性が示唆されている。セボフルラン麻酔下に気管挿管・人工呼吸・動静脈路確保を行った後に、セボフルランによる麻酔維持を継続したラットとプロポフォールによる麻酔維持に変更したラットに群分けし、開腹手術を行って腹部大動脈遠位端を確保し、10分間の大動脈遮断の後に、再灌流を行った。大動脈遮断前の時点(好気的代謝条件下)において、セボフルラン麻酔群と比較してプロポフォール麻酔群では血糖値が有意に低く、血漿インスリン濃度が有意に高く、インスリン感受性の指標であるインスリン/ブドウ糖比が有意に高く、血漿TNF-α濃度が有意に高かったことから、プロポフォール麻酔はインスリン抵抗性を伴う高インスリン血症を惹起し、そのインスリン抵抗性にはTNF-αが関与していることが示唆された。セボフルラン麻酔下では虚血再灌流により血糖値には有意な変化が認められなかったが、インスリン分泌は再灌流直後に減少するが回復に転じ、インスリン感受性は再灌流直後に亢進するものの元のレベルに復し、経過中TNF-αはすべてのラットの血液中で検出できなかった。

プロポフォール麻酔下でも虚血再灌流により血糖値には有意な変化が認められなかったが、インスリン分泌は再灌流直後に増加するが、減少に転じ、インスリン感受性は再灌流直後に低下するが回復傾向に転じ、虚血前には血液中に高濃度で検出されたTNF-αは、再灌流後に減少してほとんどのラットで検出できなくなり、虚血再灌流に伴うインスリン感受性の変化と血漿TNF-α濃度の間に相関関係を認めた。以上により、セボフルランとプロポフォールが虚血再灌流時の糖代謝に及ぼす影響には大きな差があり、インスリン分泌・感受性の両方が関与していることが示唆された。本研究により、虚血再灌流を伴う手術の生体管理において、生体内エネルギー需給バランス維持および虚血再灌流障害防止を図る上での、代謝管理に関する重要な情報提供が可能になったと考える。
プローブ顕微鏡を用いた光半導体電極ナノ界面における電子移動反応制御

酸化チタンなどの半導体は,光半導体電極反応を利用して光エネルギー変換デバイスや光触媒などに利用可能であり,幅広く研究されている。光半導体電極反応のキーステップは,半導体界面における光吸収による電荷分離過程と,それに続く界面近傍の分子との電子移動反動である。このような反応のダイナミクスに関する研究は,これまではマクロスコピックな手法によるものが中心だった。本研究ではナノスケールの界面を作製し,微小領域での電子移動反応を解明することを目標としている。今年度は,電子線リソグラフィーにより酸化チタン単結晶表面にレジストパターンを形成し,このパターン上にこれまで行ってきた光電気化学の手法で白金を担持することにより,白金担持のメカニズムとその分解能について検討した。まず,レジストの円形パターンを形成しその中心付近に集光レーザー光を照射した場合,白金粒はレジストが付着している部分には現れず,その外側のレジストが付着していない部分に担持された。この白金形状およびサイズの解析から,光照射によって生じた伝導電子の拡散が白金担持に寄与していることが示唆された。また,レジスト膜に微細パターンを形成し,その周辺に一様に水銀ランプを照射した場合も,白金はレジストの付着していない部分にのみ担持された。すなわち,白金パターン形成の分解能は光の回折限界には制約されず,電子線リソグラフィーで作製するレジストパターンによって決定される。本研究では最小で40nm程度の分解能で白金パターンを担持することに成功した。
ハードウェア記述言語によるアナログ・デジタル融合知能処理LSI設計法に関する研究

本研究の目的は、ハードウェア記述言語(HDL)を用いたアナログ・デジタル融合回路システムの設計法を確立し、これを動画像処理機能を実現する知能処理LSIの設計に適用することである.実施した研究内容を下記にまとめる.1.前年度に0.8μmCMOS技術で設計・試作したパルス幅変調(PWM)信号演算回路について、チップレベルの演算性能及び要素回路単位での動作特性を詳細に測定評価した.2.試作チップのレイアウトデータから寄生素子をLSI設計CADソフトを用いて抽出し、演算性能の劣化を回路シミュレーションにより評価した.3.PWM信号メモリ回路をアナログHDLで機能記述し、設計する回路の仕様を機能シミュレーションにより決定した.4.PWM信号演算回路を寄生素子を含めて最適化し、PWM信号メモリ回路を含めた0.8μmCMOSテストチップをフルカスタム方式で設計した.PWM信号演算回路では、時間軸上(パルス幅)に表現した多ビット情報の算術演算をスイッチト電流積分の方法に基づいて並列・低消費電力に実行する.試作した回路は、入力ベクトルと複数の参照ベクトルとのマンハッタン距離を演算し、その最小値を検出する.測定結果から、エネルギー効率1GOPS/Wで100MOPSの演算性能を有することが明らかになった.動画像圧縮処理の基本となるパターンマッチング処理を低消費電力かつ高速に実現できる.一方で、演算精度の実測値は初期設計値より低く、これが寄生素子の影響であることを回路シミュレーションにより明らかにした.アナログHDLを用いた機能シミュレーションにより、回路仕様を詳細設計に先立って明確にできる.本手法をPWM信号メモリ回路の開発に適用することで、設計期間を短縮できた.本年度設計したテストチップは現在試作中である.研究は継続しており、アナログ・デジタル融合回路アーキテクチャに基づく知能処理LSIの設計法をさらに追求する.本研究の目的は、ハードウェア記述言語(HDL)を用いたアナログ・デジタル融合回路システムの設計法を確立し、これを動画像処理機能を実現する知能処理LSIの設計に適用することである.実施した研究内容を下記にまとめる.1.前年度に0.8μmCMOS技術で設計・試作したパルス幅変調(PWM)信号演算回路について、チップレベルの演算性能及び要素回路単位での動作特性を詳細に測定評価した.2.試作チップのレイアウトデータから寄生素子をLSI設計CADソフトを用いて抽出し、演算性能の劣化を回路シミュレーションにより評価した.3.PWM信号メモリ回路をアナログHDLで機能記述し、設計する回路の仕様を機能シミュレーションにより決定した.4.PWM信号演算回路を寄生素子を含めて最適化し、PWM信号メモリ回路を含めた0.8μmCMOSテストチップをフルカスタム方式で設計した.PWM信号演算回路では、時間軸上(パルス幅)に表現した多ビット情報の算術演算をスイッチト電流積分の方法に基づいて並列・低消費電力に実行する.試作した回路は、入力ベクトルと複数の参照ベクトルとのマンハッタン距離を演算し、その最小値を検出する.測定結果から、エネルギー効率1GOPS/Wで100MOPSの演算性能を有することが明らかになった.動画像圧縮処理の基本となるパターンマッチング処理を低消費電力かつ高速に実現できる.一方で、演算精度の実測値は初期設計値より低く、これが寄生素子の影響であることを回路シミュレーションにより明らかにした.アナログHDLを用いた機能シミュレーションにより、回路仕様を詳細設計に先立って明確にできる.本手法をPWM信号メモリ回路の開発に適用することで、設計期間を短縮できた.本年度設計したテストチップは現在試作中である.研究は継続しており、アナログ・デジタル融合回路アーキテクチャに基づく知能処理LSIの設計法をさらに追求する.
時計遺伝子CLOCKの遺伝子多型と小児肥満の関連解析

小児肥満と時計遺伝子CLOCKの遺伝子多型との関連を調査する研究を行っている。小児肥満100-120症例を対象にCLOCK遺伝子の遺伝子多型(SNPs)を解析する。起床時刻、就眠時刻、睡眠時間、朝食の有無についてアンケート調査を行う。また。正常対照として京都府内の中学生についても(200-300例を想定)、遺伝子多型解析とアンケート調査を行う。小児肥満の集団についてはBMI、肥満度、腹囲、体脂肪率、血糖、血清インスリン、インスリン抵抗性指数(HOMA-R)、HbA1c、血清コレステロール、LDLコレステロール、HDLコレステロール、中性脂肪といった肥満関連パラメータと遺伝子多型の関連を解析する。遺伝子解析に当たっては研究対象者に対して研究の主旨について説明を行い、書面にて同意を取得する。京都府立医科大医学研究倫理委員会の審査承認を経て研究を行っている。小児肥満50例、正常対照85例について遺伝子解析を行った。CLOCK rs1801260 (3111T/C)について検討した結果、CアレルはTアレルに対して肥満のオッズ比0.57 [信頼区間(95%CI), 0.278-1.155; p=0.11]であった。CLOCK rs1801260が小児肥満に対する特別な危険因子とは言えなかったが、解析数が増加すればCLOCKrs1801260が小児肥満と関連する因子である可能性は否定できないと考えられた。Cアレルは肥満のリスクを軽減する働きがある可能性が推察された。現在まで、小児肥満50例、正常対照85例について遺伝子解析を行った。CLOCK遺伝子の多型(SNP)rs1801260 (3111T/C)について統計学的な検討を行った。Tアレルが野生型で、Cアレルがマイナーアレルと判明した。Cアレルの頻度(Minor Allele Frequency, MAF)は0.2であった。結果は、ジェノタイプCCはジェノタイプTT/TCの群に比べて肥満のオッズ比0.35[信頼区間(95%CI), 0.073-1.69; p=0.18]を示した。また、ジェノタイプCC/TCはTTに対して肥満のオッズ比0.635 [信頼区間(95%CI), 0.275-1.47; p=0.17]であった。また、CアレルはTアレルに対して肥満のオッズ比0.57 [信頼区間(95%CI), 0.278-1.155; p=0.11]であった。この結果からは、CLOCK rs1801260が小児肥満に対する特別な危険因子とは言えなかったが、解析数が増加すればCLOCKrs1801260が小児肥満と関連する因子である可能性は否定できないと考えられた。特にCアレルは肥満のリスクを軽減する働きがある可能性が推察された。CLOCK遺伝愛SNPsについては、s1801260 (3111T/C)以外にもrs3749474,rs1464490, rs4580704, rs486454などを設定し、リアルタイムPCRを用いたTaqman SNP genotyping assay (Thermo Scientific社製)にて解析する。生体リズムを司る遺伝子としてBMAL1遺伝子やPER1遺伝子が知られているため、それらのSNPsについても検討を加える予定としている。また。

結果は、ジェノタイプCCはジェノタイプTT/TCの群に比べて肥満のオッズ比0.35[信頼区間(95%CI), 0.073-1.69; p=0.18]を示した。また、ジェノタイプCC/TCはTTに対して肥満のオッズ比0.635 [信頼区間(95%CI), 0.275-1.47; p=0.17]であった。また、CアレルはTアレルに対して肥満のオッズ比0.57 [信頼区間(95%CI), 0.278-1.155; p=0.11]であった。この結果からは、CLOCK rs1801260が小児肥満に対する特別な危険因子とは言えなかったが、解析数が増加すればCLOCKrs1801260が小児肥満と関連する因子である可能性は否定できないと考えられた。特にCアレルは肥満のリスクを軽減する働きがある可能性が推察された。CLOCK遺伝愛SNPsについては、s1801260 (3111T/C)以外にもrs3749474,rs1464490, rs4580704, rs486454などを設定し、リアルタイムPCRを用いたTaqman SNP genotyping assay (Thermo Scientific社製)にて解析する。生体リズムを司る遺伝子としてBMAL1遺伝子やPER1遺伝子が知られているため、それらのSNPsについても検討を加える予定としている。平成30年度は研究参加者・解析のべ数が少なく、試薬の購入金額が少なかった。令和元年度は研究参加者を増やし、さらに調査する遺伝子の種類およびSNPsの数(種類)を増やす予定である。その理由により、Taqman蛍光プローベの購入金額やリアルタイムPCR試薬の購入金額が増加する。100-120万円また、特殊なホルモンなどの液性因子の測定も計画しているため、その測定費用も30ー40万円を見込んでいる。また、DNAや血清保存のための冷凍庫の購入も考慮している。その場合は40万円の見積もりである。
歯髄・根尖歯周組織再生療法におけるバイオガラス配合セメントの応用

本研究は,象牙質・歯髄複合体および根尖歯周組織再生療法を確立するという最終目標の達成に向け,生体医療材料の一種である「バイオガラス」を配合した歯科用セメント(NSY-222)の研究開発を行うことである.NSY-222は歯科用材料として適した物性を有しており,NSY-222に形成されたタグ様構造により良好な封鎖性が得られること,また除去することが可能であること,さらに,歯髄および根尖歯周組織へ生体親和性を有することが示唆された.また,NSY-222は石灰化組織誘導能も有することが示唆された.本研究は、象牙質・歯髄複合体および根尖歯周組織再生療法の確立にある最終目標の達成に向け、生体医療材料の一種である「バイオガラス」を配合した歯科用セメント(NSY-222)の研究開発を行うことである。当該年度では、このセメントを臨床応用していくために、物理学的特性、抗菌能、および生体親和性を有することを明らかにすることを第一の目的としている。今回、NSY-222の溶解率、エックス線造影性、NSY-222からの溶出物、および象牙質への封鎖性試験を検討し、物理学的特性を評価した。また、齲蝕の原因菌であるStreptococcus mutansに対する抗菌能を阻止円測定によって検討する。さらに、象牙芽細胞様細胞株、骨芽細胞様細胞株、歯根膜細胞株、およびNerve Growth Factor(NGF)により神経細胞へ分化する細胞株にNSY-222を作用させ、一定時間培養後、細胞の形態変化、および細胞増殖能に及ぼす影響を位相差顕微鏡観察およびトリパンブルー染色法を用いて生物学的な評価を行った。NSY-222の溶解率は2.0%、エックス線造影性はAl7.2 mmを示し、NSY-222からは継続的にカルシウム及びケイ素の溶出が認められた。そして、象牙細管内にHAp様結晶析出によるタグ様構造が形成され、高い象牙質への封鎖性が得られた。また、NSY-222に抗菌性は認められなかった。さらに、各種細胞に対してNSY-222を作用させたところ、細胞形態は通常の細胞形態と比較して、変化は認められず、細胞毒性も示さなかった。したがって、NSYー222は歯科用材料として適した物性を有しており、抗菌性は示さないものの細胞への毒性も示さないことがわかった。また、NSY-222の溶出成分より、各種細胞の分化誘導促進が示唆される。本研究は,象牙質・歯髄複合体および根尖歯周組織再生療法の確立にある最終目標の達成に向け,生体医療材料の一種である「バイオガラス」を配合した歯科用セメント(NSY-222)の研究開発を行うことである.当該年度では,前年度に引き続き,物理学的特性,および生体親和性を明らかにするとともに,象牙質形成に及ぼす影響をin vivoで検討することを目的としている.今回,根管充填材としての使用を想定して,NSY-222の象牙質への封鎖性,およびその除去性を検討した.さらに,骨芽細胞様細胞株,および歯根膜細胞株にNSY-222を作用させ,一定時間(1週間)培養後,細胞増殖・生存に及ぼす影響をトリパンブルー染色法で生物学的な評価を行った.また,覆髄材としての使用を想定して,in vivoでラット臼歯露髄部にNSY-222を貼布し,象牙質形成に及ぼす影響を病理組織学的に評価した.NSY-222を根管内に用いた場合,象牙細管内にHAp様結晶析出によるタグ様構造が形成され,高い根管封鎖性が得られるとともに,除去することが可能で,根尖孔穿通および再根管拡大形成も可能であった.さらに細胞へ及ぼす影響に関しては,トリパンブルー染色の結果から,NSY-222は細胞に為害性を与えないことが明らかとなった.また,in vivoにおいては,NSY-222の貼布下の露髄面に石灰化組織の形成が認められた.以上の結果より,NSY-222によって形成されたタグ様構造により良好な根管封鎖性が得られること,NSY-222は再歯内治療時に除去することが可能であること,さらに,根尖歯周組織へ生体親和性を有することが示唆された.また,NSY-222は石灰化組織誘導能も有することが示唆された.本研究は,象牙質・歯髄複合体および根尖歯周組織再生療法を確立するという最終目標の達成に向け,生体医療材料の一種である「バイオガラス」を配合した歯科用セメント(NSY-222)の研究開発を行うことである.NSY-222は歯科用材料として適した物性を有しており,NSY-222に形成されたタグ様構造により良好な封鎖性が得られること,また除去することが可能であること,さらに,歯髄および根尖歯周組織へ生体親和性を有することが示唆された.また,NSY-222は石灰化組織誘導能も有することが示唆された.申請した研究期間内に(1)NSY-222の物理学的特性の解析、(2)NSY-222の抗菌性及び生体適合性の解析、(3)組織創傷治癒・再生誘導を目的とした生体医療材料の開発の3点について解明することを目的としている。このうち(1)(2)の2点についてはおおよその結果がでているため、おおむね順調に進展していると判断できる。

歯内治療学本研究の最終目標である象牙質・歯髄複合体および根尖歯周組織再生療法の確立の達成に向け、第二の目的であるNSY-222とFibroblast Growth Factor-2(FGF-2)やPlatelet-Rich Plasma(PRP)を徐放するゼラチンハイドロゲルを組み合わせ、組織の創傷治癒・再生を誘導する新たな生体医療材料の開発に取り組む。まず、FGF-2やPRPを徐放する供与ゼラチンハイドロゲルと別にバイオガラスを配合したゼラチンハイドロゲルを作製し、in vitroでの分解性試験や徐放試験などによりその物性を評価する。次に、in vivoの断髄モデルおよび根尖性歯周炎モデルにおいて、断髄部および根管内に充填する材料として、NSY-222およびゼゼラチンハイドロゲル、FGF-2、およびPRPを用い、(1)コントロール、(2)NSY-222単独、(3)NSY-222 + FGF-2含浸ゼラチンハイドロゲル、(4) NSY-222 + PRP含浸ゼラチンハイドロゲルを実験群とする。ヘマトキシリン-エオシン染色および免疫組織化学的手法を用いて象牙質形成や根尖部歯周組織形成量などを評価し、NSY-222、およびFGF-2、PRP含浸ゼラチンハイドロゲルの有効性を分析する。当該年度のin vitroの実験、特に、NSY-222の物理学的特性の解析を行う際に使用する消耗品の使用が想定より少なかったため、当該助成金が生じた。ハイドロゲルスキャフォールドの作製を行うことになったこと、動物実験を主におこなっていき実験群が多いことから、ハイドロゲルの作製するための材料費、in vitroで使用する試薬、プラスチック製品などの消耗品、および動物(ラット)、動物実験器具一式などに使用する。
ウェーブレット解析を用いた画像処理についての研究

本研究は、ウェーブレット解析を画像処理も効果的に応用する手法の構築を目的として始められた。1次元信号処理にウェーブレット解析が応用される場合と、2次元信号に応用する場合の違いは、時刻をどのように扱うかにある。従って、まず、2次元信号において時刻をどのように位置付けるかを考察した。その結果、2次元信号を異った複数の1次元信号の集まりと考えた。現在この考えのもとに、ウェーブレット解析を行なっている途中である。一方、上で述べた考え方から線形モデルの標準形と呼ばれるARMAX(Auto Regressive Moving Average Exogenous)モデルを同定する高速算法が導出できた。これは、3つの異った1次元信号の入出力関係を表すARMAXモデルのパラメータを高速に算出するものであり、異った1次元信号の集まりを、1つのモデルとして扱うという先に述べた発想から生まれたものである。
中国大陸における顎口虫症の病原虫の再検討

駒屋ら(1945)や大鶴・片桐(1958)の報告によると、長江流域の淡水魚には有棘顎口虫Gnathostoma spinigerum幼虫が高率に寄生していると記載されている。しかも同幼虫は主に魚類の内臓に寄生するとある。平成元年度は著者らは本報告を参考に長江流域の上海、鎮江、南京、九江、南昌とかなり広範囲に渡って、魚類の検索を行なった。上海地区ではさらに青浦、淀山湖、南涯、崑山の4ヶ所から魚類の採取を行なった。検索した魚類は計136尾でその大部分がカムルチ-と桂魚の2属2種であった。その結果、九江のカムルチー16尾の内臓から計15隻の顎口虫幼虫を得たが、その他の地区の同幼寄生率は低かった。特に上海地区のカムルチ-(56尾)からは1隻の幼虫しか得られず、その陽性率(2%)は著明に低かった。駒屋らの報告では上海市販のカムルチ-の陽性率は53%とあるので、同地区の同虫陽性率が低下したことが示唆された。得られた幼虫の大多数は魚類の内臓から得られた。虫体の大きさは著しく変化に富み、第3前期、第3後期、およびこの中間期の3種類が得られた。このことは前者の記載にない新知見である。回収虫体数計38隻中、18隻を光顕及びSEMレベルの検索に用い、他20隻はラットへ実験感染を行なった。虫体の形態を検討した結果、南京産カムルチ-から得られた1隻(体長4.8mm)は明らかに有棘顎口虫第3後期幼虫と思われたが、他の17隻は剛棘顎口虫(G.hipidum)第3前期および中間期幼虫と思われた。ラット2頭に実験感染を行なった20隻の幼虫はすべて中間期に属するものであった。感染約3ケ月後に同ラットを殺処分し、筋肉、内臓に分けて検索を行なった。その結果、幼虫はすべて筋肉部からのくみ得られ、被襄していた。回収虫体数は計17隻で、すべて第3後期幼虫(体長3.0ー3.9mm)に成長していた。同幼虫を光顕、SEMレベルで検索を行ない、同時に腸管のパラフィン切片標本を作製し、その形態を検討した結果、同虫体は剛棘顎口虫と思われた。このことは長江流域の魚類に寄生する顎口虫幼虫の大多数は剛棘顎口虫であることを示唆し、これは前者の記載にない新知見である。平成2年度はLin & Chen(1986)の報告で江蘇省洪沢湖畔の魚類および同地区の猫に有棘顎口虫幼・成虫が高率に寄生しているとの実見をもとに長江流域の鎮江を挟んで南北に位置する2つの大湖、洪沢湖畔と太湖畔の魚類を検索した。今後は本2地区に限定し、しかるに多種、多数の魚類を検索した。検索魚類は前記の如く12属12種の計553尾である。検査方法は前年度と同様、各鮮魚を筋肉、内臓別に分け、ズラス板圧平法および人工消化液法を用い、実体顕微鏡下で観察した。その結果、太湖のカムルチ-から3隻、太湖のタウナギから7隻、洪沢湖のタウナギから8隻の計18隻の幼虫がえられた。これらの幼虫は前年度と同様、第3前期のものおよび第3前・後期の中間期のものが多かった。虫体18隻のうち7隻を形態観察に用い、他11隻は2頭のラットに実験感染させた。現在、実験中である。Lin&Chen(1986)の記載では洪沢湖における顎口虫の陽性率が最も高いのはタウナギ(陽性率50%)で、タウナギ15尾から計1,169隻もの幼虫を得ている。今回の調査では彼等の結果と較べ、寄生率が著しく低かった。さらに彼等の報告では魚類に寄生していた幼虫はすべて有棘顎口虫第3後期幼虫と記載してあるが、今回の検索では剛棘顎口虫幼虫と思われた。結論として著者らが2年間に渡って中国東南部の魚類を調査した結果、長江流域に分布する顎口虫は現在では有棘顎口虫よりむしろ剛棘顎口虫である可能性が高いことが示唆された。近年、本邦において中国大陸から輸入されたドジョウの生食により多数の剛棘顎口虫症患者の発生を見た。輸入ドジョウを検索した結果、同魚に寄制する剛棘顎口虫幼虫は第3前期に近かった。このことは今回の著者らの結果を裏付けるものである。最近、中国湖南省において中国人の有棘顎口虫症患者の発生が報告された。本症例の感染原はドジョウであり、我々の研究結果から本病原虫が剛棘顎口虫である可能性が強く疑われる。また、近年になって、再び中国本土において顎口虫症患者の発生を認めたことは本研究の実施を大変意義あるものとした。今回、魚類から得られた虫体数が少なく、終宿主への実験感染ができなかった。さらに終宿主の1つである猫の野外調査でも成虫は全く得られなかった。従って、初めに計画した顎口虫成虫を用いての同虫の細胞遺伝学的検索および分子生物学的検索を実施することができなかった。今後、各種顎口虫成虫の生鮮標本が得られることがあれば、これらの検索は是非とも実施されるべき研究の一つであると考える。

駒屋ら(1945)や大鶴・片桐(1958)の報告によると、長江流域の淡水魚には有棘顎口虫Gnathostoma spinigerum幼虫が高率に寄生していると記載されている。しかも同幼虫は主に魚類の内臓に寄生するとある。平成元年度は著者らは本報告を参考に長江流域の上海、鎮江、南京、九江、南昌とかなり広範囲に渡って、魚類の検索を行なった。上海地区ではさらに青浦、淀山湖、南涯、崑山の4ヶ所から魚類の採取を行なった。検索した魚類は計136尾でその大部分がカムルチ-と桂魚の2属2種であった。その結果、九江のカムルチー16尾の内臓から計15隻の顎口虫幼虫を得たが、その他の地区の同幼寄生率は低かった。特に上海地区のカムルチ-(56尾)からは1隻の幼虫しか得られず、その陽性率(2%)は著明に低かった。駒屋らの報告では上海市販のカムルチ-の陽性率は53%とあるので、同地区の同虫陽性率が低下したことが示唆された。得られた幼虫の大多数は魚類の内臓から得られた。虫体の大きさは著しく変化に富み、第3前期、第3後期、およびこの中間期の3種類が得られた。このことは前者の記載にない新知見である。回収虫体数計38隻中、18隻を光顕及びSEMレベルの検索に用い、他20隻はラットへ実験感染を行なった。虫体の形態を検討した結果、南京産カムルチ-から得られた1隻(体長4.8mm)は明らかに有棘顎口虫第3後期幼虫と思われたが、他の17隻は剛棘顎口虫(G.hipidum)第3前期および中間期幼虫と思われた。ラット2頭に実験感染を行なった20隻の幼虫はすべて中間期に属するものであった。感染約3ケ月後に同ラットを殺処分し、筋肉、内臓に分けて検索を行なった。その結果、幼虫はすべて筋肉部からのくみ得られ、被襄していた。回収虫体数は計17隻で、すべて第3後期幼虫(体長3.0ー3.9mm)に成長していた。同幼虫を光顕、SEMレベルで検索を行ない、同時に腸管のパラフィン切片標本を作製し、その形態を検討した結果、同虫体は剛棘顎口虫と思われた。このことは長江流域の魚類に寄生する顎口虫幼虫の大多数は剛棘顎口虫であることを示唆し、これは前者の記載にない新知見である。平成2年度はLin & Chen(1986)の報告で江蘇省洪沢湖畔の魚類および同地区の猫に有棘顎口虫幼・成虫が高率に寄生しているとの実見をもとに長江流域の鎮江を挟んで南北に位置する2つの大湖、洪沢湖畔と太湖畔の魚類を検索した。今後は本2地区に限定し、しかるに多種、多数の魚類を検索した。検索魚類は前記の如く12属12種の計553尾である。検査方法は前年度と同様、各鮮魚を筋肉、内臓別に分け、ズラス板圧平法および人工消化液法を用い、実体顕微鏡下で観察した。その結果、太湖のカムルチ-から3隻、太湖のタウナギから7隻、洪沢湖のタウナギから8隻の計18隻の幼虫がえられた。これらの幼虫は前年度と同様、第3前期のものおよび第3前・後期の中間期のものが多かった。虫体18隻のうち7隻を形態観察に用い、他11隻は2頭のラットに実験感染させた。現在、実験中である。Lin&Chen(1986)の記載では洪沢湖における顎口虫の陽性率が最も高いのはタウナギ(陽性率50%)で、タウナギ15尾から計1,169隻もの幼虫を得ている。今回の調査では彼等の結果と較べ、寄生率が著しく低かった。さらに彼等の報告では魚類に寄生していた幼虫はすべて有棘顎口虫第3後期幼虫と記載してあるが、今回の検索では剛棘顎口虫幼虫と思われた。結論として著者らが2年間に渡って中国東南部の魚類を調査した結果、長江流域に分布する顎口虫は現在では有棘顎口虫よりむしろ剛棘顎口虫である可能性が高いことが示唆された。近年、本邦において中国大陸から輸入されたドジョウの生食により多数の剛棘顎口虫症患者の発生を見た。輸入ドジョウを検索した結果、同魚に寄制する剛棘顎口虫幼虫は第3前期に近かった。
電子付着反応を利用した大気汚染物質の除去

1,コロナ放電反応器による硫黄化合物の除去コロナ放電によって生成した負イオンのアノード(正電極)での沈着を利用した気体除去装置によって,窒素一酸素混合気体中に微量存在する硫化メ長ル((CH_3)_2S),メチルメルカプタン(CH_3SH),硫化水素(H_2S),硫化カルボニル(CPS),二硫化炭素(CS_2),二酸化硫黄(SO_2)の除去率を測定した。硫化水素,二酸化硫黄,硫化メチル,メチルメルカプタンの除去において,酸素の存在により除去率は窒素中より格段に向上した。二硫化炭素の除去の場合、酸素共存下での除去率が窒素中より大きくなったが,酸素濃度とともに除去率が若干低下する結果が得られた。硫化カルボニルの除去においては,酸素濃度の最適値が存在することが判明した。酸素は硫黄化合物の除去に多様な影響を与えるが,これらの影響は硫黄化合物と酸素の負イオンの反応を考慮すれば説明可能である。2.酸素存在下での硫黄化合物の除去における反応副生成物の検討窒素からの硫黄化合物の除去の場合,反応副生成物は検出されないかまたは検出されてもトレース量であった。酸素共存下での硫黄化合物の除去に関しては,FPDガスクロとガスマスを併用して検討を加えた。二酸化硫黄,硫化メチル,硫化カルボニルの除去の場合,反応副生成物は検出されなかった。他方,メチルメルカプタンでは,二酸化硫黄と量的に無視小の硫化水素が生成し,二硫化炭素の除去においては,硫化カルボニルと二酸化硫黄が生成した。なお,放電電流を1mA以上にすれば、これらの副生成物は無視できることが判った。放電電流が高い場合,生成した副生成物も負イオンとなってアノードでの沈着によって除去されると考えられる。
合理的プロドラッグ創製を可能にするヒトCESインビトロ・インビボ試験系の構築

本研究では、エステル型プロドラッグの開発に有用なヒトCESモデルの開発を目的とした。CES1 mRNAに対するRNAiおよびCES2遺伝子の導入により、Caco-2細胞からCES2/CES1A1KD-Caco2を作製した。本細胞はCES1活性を欠失し、CES2活性を保持しており、さらに単層膜形成能も認められた。したがって、CES2/CES1A1KD-Caco2はヒト小腸型CES分子種機能プロファイルを有しており、エステル型プロドラッグ吸収評価に有用な細胞であると考えられる。本研究では、エステル型プロドラッグの開発に有用なin vivoおよびin vitroヒトCESモデルの開発を目的としている。本年度では、in vitroヒトCESモデルの開発を中心に進めた。ノックアウトするCES1遺伝子には、CES1A1、1A3、1A1variantが存在する。そこでまず親細胞であるCaco2細胞のCES1分子種発現プロファイルをRT-PCRにより解析したところ、Caco-2細胞では主にCES1A1が発現していることが明らかとなった。また、ノックアウト効率を最大限上昇させ、かつ優れた消化管細胞機能を有するホスト細胞を得るため、複数のCaco-2細胞クローンを分取した。これらのうち、#24において単層膜形成が確認され、claudin-4、claudin-7およびoccludinの発現が認められたことから、本クローンをノックアウトのホスト細胞とした。ノックアウトについては、CES1A1遺伝子を標的としたzincfinger necleaseを導入し、Caco2よりも遺伝子導入効率・相同組み換え効率の高いヒト肝がん細胞を用いてその機能検証をおこなっている。また、作製したCES1ノックアウトCaco-2細胞にCES2遺伝子を導入するため、CES2 cDNAのクローニングをおこなった。さらにCES1機能とCES2機能の分別解析を可能とする実験系の確立もおこなった。一方、in vivoヒトCESモデルの構築について、研究協力者はより高効率な遺伝子クラスターの導入を可能とするTALEN/CRISPERの導入を進めている。この最新技術を用いることにより、in vivoヒトCESモデル動物の構築が飛躍的に促進されることが期待される。まず、遺伝子導入効率・相同組み換え効率の高いヒト肝がんFLC7細胞を用い、CES1-ZFNの効果検証をおこなった。その結果、一般的なリポフェクション方法ではCES1-ZFNの効果発現に至らなかったものの、その方法最適化をおこなうことにより、FLC7細胞のCES1A1遺伝子を破壊することが可能であることを明らかとした。そこで、同様の手法を用いてCaco2細胞へのCES1-ZFN導入を進めた。これまでにFLC7細胞で用いたリポフェクション条件、およびCaco2細胞に最適とされるリポフェクション条件・試薬、セルソーティングによる導入細胞分取等種々の条件をおこなったが、Caco2細胞におけるCES1A1遺伝子破壊は認められていない。そこで、現在はアデノウイルス・レトロウイルスによるCES1-ZFN導入を進めている段階である。一方、short-hairpin RNAを用い、CES1A1遺伝子破壊Caco2細胞の擬似細胞としてCES1A1ノックダウンCaco2細胞を構築した。また、モデルプロドラッグとして種々の鎖長を有するアトロバスタチンエステル体ライブラリーを構築した。これらを用いることによりプロドラッグ透過性とCES発現プロファイルの関連解析の予備検討をおこなうことが可能であり、次年度早々に取り掛かる予定としている。昨年度までにCES1A1遺伝子破壊Caco2細胞の擬似細胞としてCES1A1ノックダウンCaco2細胞(CES1A1KD-Caco2)を構築した。本細胞のCES活性を解析したところ、CES1A1の活性はほぼ失われており、CES1A1ノックアウトで期待される結果と実質同等であった。そこで、本年度はこのCES1A1KD-Caco2にCES2遺伝子を導入し、ヒト型CES小腸モデル細胞を構築することに取り組んだ。まず、レトロウイルスを用いてCES2 cDNAを導入し、複数のクローンを作成した。これらを用いてCES2特異的機能であるフルオレセインジアセテート加水分解活性を測定し、最も高い活性を有するクローンを同定した(CES2/CES1A1KD-Caco2)。本細胞の経細胞電気抵抗値を測定したところ1200Ω・cm2であり、親細胞であるCaco2細胞と同等の値が得られた。また、細胞間結合タンパク質であるオクルディンの細胞膜局在も認められた。これらの結果より、CES2/CES1A1KD-Caco2はバリア機能を有する単層膜形成能を保持していることが明らかとなった。さらにCES2/CES1A1KD-Caco2において、P糖タンパク質およびbreast cancer resistance proteinのmRNA発現も親細胞であるCaco2細胞と同様に認められたことから、薬物排泄能も保持されていると考えられた。一方で、CESの基質となるアトロバスタチンエステル体およびフェキソフェナジンエステル体を合成した。現在、これらを用いてCES2/CES1A1KD-Caco2の薬物透過性試験における有用性解析を進めている。

本細胞はCES1活性を欠失し、CES2活性を保持しており、さらに単層膜形成能も認められた。したがって、CES2/CES1A1KD-Caco2はヒト小腸型CES分子種機能プロファイルを有しており、エステル型プロドラッグ吸収評価に有用な細胞であると考えられる。27年度が最終年度であるため、記入しない。薬学アデノウイルス・レトロウイルスによるCES1-ZFN導入を進めるとともに、種々の鎖長を有するアトロバスタチンエステル体ライブラリーをモデルプロドラッグとして、プロドラッグ透過性とCES発現プロファイルの関連解析をおこなう。in vivo系については実験手法をかえ比較的サイズの小さいCESのKOマウスの作成から進める。平成25年度は主にin vitroヒトCESモデル構築に向けた検討を進め、予想される複数の実験上困難な点について(ホスト細胞の選択・遺伝子導入最適化・CES1/CES2機能の分別解析等)、種々の検討と検証を要したものの、目処をつけることができた。効率的なヒトモデル動物作成のための新規遺伝子改変技術導入にも順調な進展が認められている。また、研究進捗状況確認および対応のための協議も複数回おこなってきており、研究者間の連携も取れている。したがって、目立った研究業績には至っていないものの平成26年度・平成27年度へと進むにつれ、研究の加速度的な進展が期待できると考えている。以上のことから、現在までの達成度を(2)おおむね順調に進展していると判断している。平成26年度の主な推進方策は、前年度までに決定したホストCaco2細胞に、最適化した条件を用いてCES1A1ノックアウト用zinc finger nucleaseを導入することによりCES1ノックアウトCaco2細胞(CES1-KO/Caco2)を完成させることである。CES1-KO/Caco2のCES1およびCES2機能は、前年度までに確立した分別解析手法を用いて検討をおこなう。また、消化管上皮細胞としての機能については、密着結合タンパク質発現解析、経上皮細胞電気抵抗値計測やマンニトール透過性試験、トランスポーター機能解析などを用いて検討をおこなう予定であるが、これら手技については既に確立済みである。これと並行して、CES1-KO/Caco2にCES2 cDNAを導入して、ヒトin vivo小腸に匹敵するCES2の発現を目指す。さらに、この細胞とヒト肝CES2発現細胞(CES1ノックアウト検証用に使用)を用いて、エステル型プロドラッグ活性化における小腸・肝CES2の役割の差異を明らかとする。一方、in vivoヒトCESモデル構築については、新たな遺伝子改変技術に応じてまずはCes遺伝子クラスターのノックアウトマウスの作製から取り掛かる。