hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
フッサールの時間意識の現象学を基礎とする、意識の一般構造の研究

2018年度の研究課題は、フッサールの時間意識の現象学の背景となっている、ブレンターノ学派やその他の心理学者の議論を把握することによって、フッサールによって暗黙裏に前提されている哲学的問題を明確に理解し、彼の議論をその問題設定の上に再構成することであった。具体的には、フッサールが明示的に参照しているブレンターノ、マイノング、ウィリアム・シュテルンの時間論を検討し、彼らが抱えていた問題とそれに対するフッサールの解決案を明確にした。ブレンターノについては、継起するものについての表象の可能性を問う彼の連続体論の枠組みを受け継ぎながら、フッサールは時間的継起を表象内容によって説明する内容説に代えて、統握作用の作用性格によって説明する統握説を唱え、また現在を刺激の因果的所産である点的瞬間としてしか認めないブレンターノの狭い規定から手を切ることで、継起的対象の知覚の可能性を開いたことを明らかにした。またマイノングとシュテルンについては、時間的対象についての知覚をめぐる彼らの論争を検討し、近接する過去を現在のうちに取りまとめることによって継起の知覚を説明するマイノングの説と大枠においては同型だが、意識作用それ自体も時間の中で継起しているとするシュテルンの説をも取り込む、両者の折衷説をフッサールがとっていることを明らかにした。これらの研究成果は、6月のNASEP (The North American Society for Early Phenomenology)の研究大会、11月の日本現象学会研究大会、2019年3月のフッサール研究会にて発表された。また、ヴントの実験心理学やフェヒナーの精神物理学とブレンターノとの関係を調査し、19世紀後半の議論の動向について大まかな見通しを得ることができた。その成果は9月の日本心理学会のシンポジウムにて発表された。ブレンターノ学派との関連性においてフッサールの時間意識の現象学を理解しなおすことが2018年度の目標であったが、その目標はおおむね達成されたと言える。不十分な点をあげれば、ブレンターノやマイノングの哲学の全体像の理解という点では、より明確にする必要を感じているが、その反面、当初は予定していなかった点として、第一に、当時の心理学のより大きな文脈の中での捉え直しができた点と、第二に、主に二年目に予定していたフッサール自身のテキストの読解が進んだ点とを考慮すれば、総じて予定通りと言える。具体的には、第一の点では以下のことを突き止めた。すなわち、ブレンターノとヴントやフェヒナーの関係について、ヴントがカントに反して心的なものに時間に加えて強度という第二の変数を認め、心理学を両者の関係を定式化する精密学と位置づけ、他方フェヒナーは感覚の強度と刺激の強度との関係を関数的に表現したが、この動向に対してブレンターノは反対でなくむしろより徹底した解釈を加え、心的なものの時間的連続と強度変化の関係の研究を独自に推し進めた。この問題はブレンターノにおいては断片的にしか見られないが、関連する問題が学派全体に広く共有されていると思われ、フッサールの時間論もこの動向に緩やかに位置づけられうる。第二の点では、1904/5年の時間講義と同時期の講義、フッサール全集24巻の『想像・像意識』講義、38巻の『知覚と注意』を通読でき、想像意識の細分化と知覚の拡張という、私が想定しているブレンターノからの離反について傍証をえた。この二点を考慮すれば、トータルではゴールに予定通り近づいていると言える。今年度は予定通り、フッサールの講義や研究草稿の読解に移りたい。具体的には、フッサールの1906年以降1911年頃までの時間論の発展についての研究を行う。この時期の時間草稿を読み直しながら、あわせて同時代の、1906/7年の講義『論理学および認識論入門』(全集24巻)、1907年の『現象学の理念』(2巻)、『物と空間』(16巻)などを通読し、時間論の発展との関連を探る。本研究の作業仮説は、1905年の時間講義が、1906/7年の講義で言及された、存在者の学としての形而上学の構想と関係づけられるべきであり、またこの形而上学の構想が、1907年の「物」と「空間」についての現象学とも関連しているはずだというものであるが、この二点をテキストの精査によって確認ないし修正し、フッサールが1904/5年に探求した継起的対象の知覚の議論からどのように発展したかを見る。なおこの時期、フッサールの時間論には、時間を構成する意識流の着想や統握ー内容図式の問題視が見られ、より完成形に近づいていくが、この議論との関連性を探る。これと並行して、以下の二点について引き続きブレンターノ学派の研究を進める。・ブレンターノの連続体論の研究。目下ブレンターノの議論は公刊著作『経験的見地からの心理学』と講義ノート『記述的心理学』に依拠しているが、フッサールが直接参照している議論は同時期の別の講義内容であり、この理論内実の確認のためにはオーストリア・グラーツのブレンターノ文庫にて未公刊テキストを見る必要がある。この調査を今年中に計画している。・エーレンフェルスの研究。継起的対象の表象ないし知覚についてのブレンターノとマイノングを研究する上で、重要な中継点をなすのが彼の有名な論文「ゲシュタルト質について」であるが、この論文について研究することでブレンターノ学派の動向の統一的な理解をめざす。

2018年度の研究課題は、フッサールの時間意識の現象学の背景となっている、ブレンターノ学派やその他の心理学者の議論を把握することによって、フッサールによって暗黙裏に前提されている哲学的問題を明確に理解し、彼の議論をその問題設定の上に再構成することであった。具体的には、フッサールが明示的に参照しているブレンターノ、マイノング、ウィリアム・シュテルンの時間論を検討し、彼らが抱えていた問題とそれに対するフッサールの解決案を明確にした。ブレンターノについては、継起するものについての表象の可能性を問う彼の連続体論の枠組みを受け継ぎながら、フッサールは時間的継起を表象内容によって説明する内容説に代えて、統握作用の作用性格によって説明する統握説を唱え、また現在を刺激の因果的所産である点的瞬間としてしか認めないブレンターノの狭い規定から手を切ることで、継起的対象の知覚の可能性を開いたことを明らかにした。またマイノングとシュテルンについては、時間的対象についての知覚をめぐる彼らの論争を検討し、近接する過去を現在のうちに取りまとめることによって継起の知覚を説明するマイノングの説と大枠においては同型だが、意識作用それ自体も時間の中で継起しているとするシュテルンの説をも取り込む、両者の折衷説をフッサールがとっていることを明らかにした。これらの研究成果は、6月のNASEP (The North American Society for Early Phenomenology)の研究大会、11月の日本現象学会研究大会、2019年3月のフッサール研究会にて発表された。また、ヴントの実験心理学やフェヒナーの精神物理学とブレンターノとの関係を調査し、19世紀後半の議論の動向について大まかな見通しを得ることができた。その成果は9月の日本心理学会のシンポジウムにて発表された。ブレンターノ学派との関連性においてフッサールの時間意識の現象学を理解しなおすことが2018年度の目標であったが、その目標はおおむね達成されたと言える。不十分な点をあげれば、ブレンターノやマイノングの哲学の全体像の理解という点では、より明確にする必要を感じているが、その反面、当初は予定していなかった点として、第一に、当時の心理学のより大きな文脈の中での捉え直しができた点と、第二に、主に二年目に予定していたフッサール自身のテキストの読解が進んだ点とを考慮すれば、総じて予定通りと言える。具体的には、第一の点では以下のことを突き止めた。すなわち、ブレンターノとヴントやフェヒナーの関係について、ヴントがカントに反して心的なものに時間に加えて強度という第二の変数を認め、心理学を両者の関係を定式化する精密学と位置づけ、他方フェヒナーは感覚の強度と刺激の強度との関係を関数的に表現したが、この動向に対してブレンターノは反対でなくむしろより徹底した解釈を加え、心的なものの時間的連続と強度変化の関係の研究を独自に推し進めた。この問題はブレンターノにおいては断片的にしか見られないが、関連する問題が学派全体に広く共有されていると思われ、フッサールの時間論もこの動向に緩やかに位置づけられうる。第二の点では、1904/5年の時間講義と同時期の講義、フッサール全集24巻の『想像・像意識』講義、38巻の『知覚と注意』を通読でき、想像意識の細分化と知覚の拡張という、私が想定しているブレンターノからの離反について傍証をえた。この二点を考慮すれば、トータルではゴールに予定通り近づいていると言える。今年度は予定通り、フッサールの講義や研究草稿の読解に移りたい。
性ホルモンモニタリングを基礎とした現実のPOPs汚染レベルにおける環境医学的研究

残留性有機汚染物質(POPs)による性ホルモンかく乱作用の実態をガスクロマトグラフ・質量分析計を駆使したリアルタイムモニターすることで成功した。その内容は、試験動物の血中ステロイドホルモン(17種;アンドロゲン4種、エストロゲン3種、プロゲスチン3種及びその代謝物7種)を検出下限値0.1pgでモニタリングすることで、生体の微弱なシグナルを高感度に確認することが可能とした。POPsによる内分泌かく乱作用を、血中性ホルモン濃度の測定により明らかにした。POPsを急性的に曝露させた雄性C57BL/6マウス(8週齢)による血中の17種の性ホルモン(アンドロゲン4種、エストロゲン3種、プロゲスチン3種)及びその代謝物(7種)のモニタリングを行った。2,3,7,8-TCDD、マイレックス(Mirex)、ペンタクロロベンゼン(PeCBz)、パーフルオロオクタンスルホン酸(PFOS)は、コントロール群と比較して血中性ホルモン濃度の変動が顕著であった。性ホルモンの合成は、コレステロールを原料としプロゲスチン→アンドロゲン→エストロゲンが主な経路である。この合成過程の各性ホルモン生成比をコントロールと比較したところ、TCDD、PeCBz及びPFOSはアンドロゲン/プロゲスチン比が0.20.6とプロゲスチンからのアンドロゲン合成が減少していることが判明した。しかし、アンドロゲン代謝物/アンドロステンジオン比を確認したところ、大きく増加していたことより、アンドロゲンの合成量が見かけ上、減少しているが、さらに下流のアンドロゲン代謝物への代謝が亢進していることが明らかとなった。デヒドロテストステロン比は顕著に減少していることや、エストロゲンへの生成比が増加していることから、これらPOPsによる雄の雌性化現象が示唆された。研究期間を通じて、種々の食品中に含まれるPOPsの汚染濃度が解明された。さらに現実の汚染レベルにおける動物への影響を評価したところ、食品汚染レベルでは顕著な内分泌攪乱作用が確認されなかったものの、高汚染レベルでの曝露の場合、動物実験において、内分泌攪乱作用を示した。この研究成果は、POPsの内分泌攪乱作用をリアルタイム的にモニタリングすることで攪乱メカニズムの解明への基礎的知見になると考えられる。また、現代社会において未解明な内分泌疾患と化学物質との因果関係を解明する一手段として重要な手法であると判断した。食品中のPOPs汚染濃度を明らかにするため、トータルダイエットスタディーにより食品の分析を行った。大阪府および京都府のスーパーマーケットから調査に使用する食品を購入した。その内容は、高脂肪含有食品を中心としたものであり、肉類、魚介類、油脂類、乳類(チーズ、牛乳)、野菜類、いも類である。今回、調査した食品群の中で、高濃度に検出されたのは肉類と魚介類であり、肉類の中で最も高濃度であったのがクジラ肉(Total POPs濃度として9600 pg/g湿重量)であった。次に、高濃度であった牛肉は、15001800 pg/g湿重量と豚や鶏肉と比較すると約618倍高濃度であった。一方、野菜類やいも類の汚染濃度は18170 pg/g湿重量と低濃度であった。これらの結果より、各食品群のPOPsによる汚染実態が部分的に解明された。今後、さらに調査対象食品群を広げ、食品汚染の全容を解明していく予定である。次に、POPsの内分泌攪乱作用の影響評価を行った。C57BL/6マウスに各POPs(2,3,7,8-TCDD、マイレックス、リンデン、クロルデン、ヘプタクロール、ヘキサクロロベンゼン、ペンタクロロベンゼン、DDT、PFOS、クロルデコン、アルドリン、ディルドリン、エンドリン)を経口投与し、2日後の間薬物代謝酵素誘導能と精子数観察を行った。その結果、CYP1Aを基質とするEROD活性が2,3,7,8-TCDD投与群でコントロールマウスに比べて20倍上昇した。さらに、CYP2BのBROD活性ではマイレックスが2,3,7,8-TCDDよりも強く酵素誘導を引き起こすことが明らかとなった。一方、精子数観察ではHxCBzとクロルデコンを除くほとんどのPOPsで精子数減少が確認され、精子形成に影響を与えることが明らかとなった。今後、慢性的にPOPsを摂取させ次世代への影響評価を行う予定である。平成23年度の研究計画は、大きく2つのテーマに沿って行われた。1つは食品試料中のPOPs汚染濃度を測定し、摂取量を推定すること。2つは、動物実験におけるPOPsの影響を肝臓の薬物代謝酵素誘導能および精子形成能を精子数計数により確認した。1つ目のテーマである食品中のPOPs分析は、トータルダイエットスタディーにより高脂肪含有食品(肉類、魚介類、油脂類、乳類(チーズ、牛乳)、野菜類、いも類)を中心として行われた。その汚染レベルは魚介類や肉類において高濃度になる傾向を示し、野菜類およびいも類では低濃度であった。

以上の結果より、食事経由のPOPs摂取量を部分的に解明することが出来た。2つ目には、動物を用いたin vivo試験において、POPs曝露による影響評価を行った。TCDDによるCYP1Aの誘導は広く知られているものの、その他のPOPsによるCYP誘導については皆無である。その結果、CYP1Aの誘導はTCDDで強く見られたが、その他のPOPsでは若干の誘導が確認されただけであった。一方、CYP2Bの誘導がマイレックスの投与により極めて強力に誘導することが明らかとなるとともに、その他のPOPsについてもCYP2Bを誘導することが判明した。さらに、ヘキサクロロベンゼンとクロルデコンを除くPOPsの曝露において、雄マウスで精巣上体における精子数が減少していることを明らかにした。このように2つのテーマとも当初計画していた内容で遂行できたことより、おおむね順調に進呈していると判断した。平成24年度は、3つの項目;(1)「性ホルモン分泌の影響」、(2)「酵素活性試験(薬物代謝酵素、ステロイド代謝・合成酵素)」および(3)「POPs標準物質の複合的な曝露による内分泌攪乱作用の影響評価」に焦点を絞り計画を遂行する。(1)の性ホルモンのモニタリングは、テストステロンなどのアンドロゲン(4種)とその代謝物(8種)、エストラジオールなどのエストロゲン(2種)とその代謝物(1種)およびその前駆物質であるプロゲステロンなどのプロゲスチン(3種)をモニター対象とする。性ホルモンの分析は、血清試料をC18カートリッジカラム及び酢酸エチルにより性ホルモンとその代謝物を抽出し、最終的にTMS誘導体化処理を行った後、HRGC-HRMSを用いて性ホルモンとその代謝物の同時一斉分析を行う。(2)の酵素活性試験では、酵素活性の変化をモニターし、内分泌への影響を確認する。また、前項の性ホルモンとの関連についても比較する。具体的にはCYP1A1、CYP1A2(EROD活性)、CYP2B(BROD活性)、ステロイド代謝型のCYP3A、ステロイド合成型のCYP17(17β-hydroxylase)及びCYP19(Aromatase)の活性試験を実施する。(3)のPOPs標準物質の複合的な曝露による内分泌攪乱作用の影響評価では、POPs標準品を複合的に曝露させたときの影響を調査する。POPsの組み合わせは、芳香族炭化水素レセプター(AhR)に活性のあるダイオキシン類とエストロゲンレセプター(ER)に活性のあるDDTあるいはアンドロゲンレセプター(AR)活性物質などを計画している。具体的には、AhR×ER、AhR×AR、AhR×抗ER、AhR×抗ARのように各レセプターへ活性作用を持つアゴニスト同士や抑制的に作用するアンタゴニストを組み合わせて影響評価を実施する。平成24年度は、動物実験が中心となることから、マウス(300匹)に300千円、解剖で得られた血液中の性ホルモンや臓器中のPOPs測定用にGCキャピラリーカラム(1本10万)を3本、質量分析計のフィラメントやチャンバー部分の消耗品代に200千円、薬品代に300千円を計上し、合計1100千円とする。さらに、国際学会発表のための出張旅費を200千円を計上し、合計1300千円とし平成24年度の研究費使用計画とする。
原発性胆汁性肝硬変の新規ウイルス感染の可能性とアネロウイルス属の疾患関連性の検討

NOD.c3c4マウス、PBCの患者血清よりRDV法にて未知のウイルス遺伝子の同定を試みる前に、慢性C型肝炎患者血清から、HCVの遺伝子を同様の方法で検出可能かどうか試みたが、困難なため、次世代シークエンサーを用いてウイルス遺伝子検出可能かどうか試みた。8583readsがリファレンスにmappingされた。約0.1%のreadがHCVゲノム由来であった。Coverageは99.8%、平均depthは69.5Xを示した。NS3領域では、アミノ酸塩基5カ所のvariantsを認めた。Rapid Genome Sequencing of RNA viruses (RDV法)にて、NOD.c3c4マウス、原発性胆汁性肝硬変(PBC)の患者血清から、未知のウイルス遺伝子を同定する前に、既知のC型肝炎ウイルスを血清から同定できるか試みたが、感度が低く、血清サンプルに用いるレベルには達しなかった。そのため、次世代シークエンサーを用いて、1.肝炎ウイルスの解析、2.PBC患者血清内のmicroRNAの発現プロファイルの解析から、病態解明にせまった。平成24年度は、2. PBC血清内の遊離microRNAを解析し、他のウイルス性肝炎と比較することで、ウイルス性疾患の可能性を模索した。結果として、191個のmicroRNAの発現量に有意差がつき、発現パターンをクラスタリングしてヒートマップを作成し、PBC群はCH-B、C、健常者群と明確にクラスターを異にした。さらに、解析をすすめ、miR-505-3pとmiR-197-3pは有意な発現量の低下が認められ、PBCの新たなるバイオマーカーになりうる可能性を示した。血清からRDV法で未知のウイルス遺伝子を検出するには、ウイルス由来のゲノムが微量であることや感度の観点から困難。RDA法は手技が煩雑になりやすく微量の検体からの抽出は困難なことより、次世代シークエンサーを用いた方法を施行中なため。RDV法より次世代シークエンサーを用いるほうが、新規や未知のウイルス遺伝子の検出が可能である。そのため、今後はこちらを使用する方法に変更し、解析していく予定である。研究費の使用計画は概ね、当初の予定どおりである。
酵母の接合因子情報伝達系におけるシャペロン蛋白の作用機構

REF1はHsp40ファミリーの一つであり、接合因子情報伝達系においてG蛋白質サブユニットGPA1の上流で作用すると考えられる。GPA1の上流で作用する蛋白質として接合因子受容体(STE2遺伝子によりコードされる)が知られており、その発現量の調節は、一つは、エンドサイトーシスまたそれにひき続く分解によって制御されている。よって、REF1が、受容体のエンドサイトーシスに関与することが考えられる。このことを調べるため、STE2遺伝子の発現が速やかにshut-offされるような融合遺伝子GAL-STE2のみを持つ細胞を構築した。GALプロモーターは、ガラクトース培地のみで誘導され、グルコース存在下でその発現は抑制される。REF1遺伝子の欠損は細胞増殖には影響しない。もし,REF1が、受容体のエンドサイトーシスに関与するなら、REF1欠損細胞においては、STE2遺伝子の発現が速やかにshut-offされた後も,STE2蛋白質(STE2p)が存在し続けることが予想される。以上の実験を行うことにより、REF1欠損細胞においては、STE2pが安定化されることが示されREF1のエンドサイトーシスへの関与が示唆された。
吸入酸素はMRI造影剤となりうるか-組織酸素代謝マーカーとしての役割

磁気共鳴画像(MRI)を用いて、吸入酸素をトレーサーとして、吸気中の酸素濃度を変えたときの、組織磁化率効果と縦緩和時間の変化を測定することにより、非侵襲的に酸素代謝の情報を抽出することが可能であるかどうかを検討した。その結果、MRI縦緩和時間の変化を測定することにより非侵襲的に、動脈血や脳組織などの酸素分圧の変化を測定することが可能であると考えられた。また、組織磁化率効果の変化と組織脳血流量変化および呼気酸素分圧を同時に測定することにより組織酸素代謝量を推定できる可能性が示唆された。磁気共鳴画像(MRI)を用いて、吸入酸素をトレーサーとして、非侵襲的に人体各臓器の酸素代謝の異常の有無を検出する目的のため、今年度は、まずファントム実験を、次に正常ボランティア(主として脳)を対象にした実験を行った。ファントム実験では、生理食塩水とガドリニウム造影剤水溶液に酸素が溶解するときの縦緩和時間の変化を測定し、縦緩和率(R1)が、いずれも、およそ0.2/s/mM(02)で変化することを見いだした。予備的な実験では、動脈血においてもほぼ同様の変化率が得られ、溶媒が違っても酸素分子による緩和時間変化率はほぼ等しいのではないかと思われた。従って、緩和時間の変化を測定すれば、組織酸素濃度がどの程度変化したかを推定できるのではないかと考えられた。しかし、正常ボランティアを対象とした実験では、室内空気吸入時に比較して、大気圧50%濃度酸素吸入時において、脳R1の増加は0.001/sのオーダーであることが判明した。これにより、縦緩和時間の変化は臨床的に許容できる時間内で捉えることは困難であると考えられた。一方、同じ濃度の酸素吸入により、脳T2*強調画像の信号は1%程度増加することがわかった。従って、吸入酸素の影響を見る場合、臨床的には、T2*強調画像の信号変化を測定する方が良いことが分かった。また、高濃度酸素吸入時に、スピンラベル法で測定される脳血流量は10%程度減少することが見いだされた。また、我々の用いたスピンラベル法シーケンスにより血流量とT2*強調画像の信号変化を同時に測定できることがわかり、臨床的に有用と考えられた。さらに、血流と組織酸素代謝の関係をモデル化し、吸入酸素濃度を変化させた際に、毛細管内血液や組織の酸素濃度がどう変化するかをシミュレーションできるウエブページを作成し公開した。磁気共鳴画像(MRI)を用いて、吸入酸素をトレーサーとして、非侵襲的に人体各臓器の酸素代謝の異常の有無を検出する目的のため、今年度は、東北大学および秋田県立脳血管研究センター(秋田脳研)においても、正常ボランティアを対象にした実験を行った。秋田脳研では東北大学とは条件が違う環境・機器であり、まず正常ボランティアを対象にした検討と関係スタッフによる実施トレーニングが必要ということになり、臨床試験は2011年度に持ち越された。正常ボランティアを対象とした実験で、酸素吸入によるヒト脳の縦緩和率の増加は、白質領域:1.2±0.4×10^<-5>/s/mmHg(呼気酸素分圧)、灰白質領域:1.4±0.5×10^<-5>/s/mmHg、CSF領域:1.5±0.6×10^<-5>/s/mmHgであった。昨年度本研究で測定した動脈血緩和度(0.13/s/mM)を用いると、組織酸素濃度の増加は、白質領域:9.2±3.2×10^<-5>mM/mmHg(呼気酸素分圧)、灰白質領域:1.1±0.4×10^<-4>mM/mmHg、CSF領域:1.1±0.4×10^<-4>mM/mmHgとなることが判明した。一方、脳組織酸素供給モデルを考案し、シミュレーションをした結果、動脈血酸素分圧の変化による脳組織酸素分圧の変化率は、4×10^<-5>mM/mmHg程度となった。脳組織動脈血液量(2%として)を含めて考えると、測定された酸素分圧の変化率はやや大きめであるものの、モデル計算の結果と近い値となる。これにより、本研究で用いた手法により、MRIを用いて非侵襲的に、脳組織酸素分圧の変化を測定することが可能であると考えられた。腹部臓器でも検討を行い同様の結果を得たが、データのばらつきが大きく、生理的運動によるノイズを如何に低減するかが課題と考えられた。前年度の正常ボランティアを対象とした研究の成果(高濃度酸素吸入による組織緩和時間の変化と血液酸素濃度に依存したMRI信号変化[BOLD効果]、および血流量の変化を定量化し、これから酸素吸入による組織酸素代謝の変化を推定した)を国際・国内学会で公表した。また、論文も投稿中である。

今年度はさらに主幹脳動脈狭窄・閉塞疾患を対象に、PETにより得られる脳血流、血液量、酸素消費量と、酸素吸入MRIより得られるBOLD信号・血流の変化とを比較して、酸素代謝の異常の有無をMRIで検出することが可能であるかどうか知ることを目標とした。室内空気吸入時に対して高濃度酸素吸入負荷によるMRI信号強度(BOLD信号)と脳血流量の変化を測定し、MRI検査により得られた信号強度および血流量の変化とゴールドスタンダードであるPET検査の結果を比較し、主幹脳動脈狭窄・閉塞患者における低灌流状態における酸素摂取率の亢進について評価・検討した。これまでの結果を眺めると、高濃度酸素吸入による信号変化は小さいが、PETと比較することにより、酸素代謝・血流量とMRI信号強度の定量的関係が推定できそうである。これにより、MRIによる組織酸素代謝の定量が可能となると思われる。高濃度酸素吸入により、鼻咽頭腔の酸素濃度が増加すると、磁場不均一性が増加し、このためMRI信号強度が影響を受ける。この影響を補正する必要がある。すでにコンピュータシミュレーション用のソフトウェアを開発し、この影響を評価することが可能となっている。しかしながら、主幹脳動脈狭窄・閉塞患者で低灌流状態により酸素摂取率の著しく亢進した症例が少なく、まだ統計学的解析をするに至っていない。今年度は本事業としては最終年度ではあるが、今後さらに症例のリクルートを続けて研究を継続する方針である。
ソリッドコアフォトニックバンドギャップファイバの高度利用技術の開発に関する研究

光ファイバのクラッド領域に微細構造を有する微細構造光ファイバにはいくつかの種類が存在するが、本研究では、ソリッドコアフォトニックバンドギャップファイバの有する特異な光学特性に着目し、その複雑な構造パラメータと光学特性との関係を詳細に調査し、高度利用のための基盤技術を確立した。特に、コア径拡大と単一モード動作、および低曲げ損失特性の両立という観点から、複数のバンドギャップにおける光学特性を総合的に評価し、大コア径ファイバとしての最適な透過帯域(フォトニックバンドギャップの次数)を明らかにするとともに、ファイバ製造上の構造制御技術、およびファイバ使用時のコイル径等を考慮に入れたコア径拡大の理論的限界を特定した。光ファイバのクラッド領域にフォトニック結晶構造を有するフォトニック結晶ファイバは,その構造や導波原理の違いから,いくつかの種類に分類することができるが,本研究では,ソリッドコアフォトニックバンドギャップファイバ(ソリッドコアPBGF)と呼ばれる新しいタイプの光ファイバの有する特異な光学特性に着目し,その極限性能を明らかにするとともに,高度利用のための基盤技術を確立することにより,従来型光ファイバでは実現不可能なパッシブ光ファイバデバイス,さらには,従来の実現限界を超えたアクティブ光ファイバデバイスを開発することを目的として研究を進めた.平成22年度の研究では,有限要素法に基づくソリッドコアPBGFの高速シミュレーション技術を利用し,高屈折率散乱体の大きさ,屈折率,間隔やその数等,複雑な構造パラメータと光学特性との関係を明らかにした.具体的には,複数の透過帯域を有するソリッドコアPBGFにおいて,最も長波長側に存在する透過帯域である第一バンドを利用することの利点を示すとともに,バンドギャップ深さを最大化するための構造パラメータを明らかにした.また,クラッド領域に複数の共振器構造を導入することによりフォトニックバンドギャップ構造を制御可能であることを示し,コア径を拡大しつつ,単一モード特性と低曲げ損失特性を両立できるソリッドコアPBGFを提案した.さらに,大コア径ソリッドコアPBGFのファイバレーザ・増幅器への応用を想定し,ファイバを曲げて使用する条件下におけるコア径拡大の限界と,その最適構造パラメータを明らかにした.光ファイバのクラッド領域にフォトニック結晶構造を有するフォトニック結晶ファイバは,その構造や導波原理の違いから,いくつかの種類に分類することができるが,本研究では,ソリッドコアフォトニックバンドギャップファイバと呼ばれる新しいタイプの光ファイバの有する特異な光学特性に着目し,その極限性能を明らかにするとともに,高度利用のための基盤技術を確立することにより,従来型光ファイバでは実現不可能なパッシブ光ファイバデバイス,さらには,従来の実現限界を超えたアクティブ光ファイバデバイスを開発することを目的として研究を進めた.平成23年度の研究では,前年度までに得られた解析結果に基づき,大コア径単一モードソリッドコアフォトニックバンドギャップファイバのアクティブデバイスとしての最適構造を明らかにした.コア形状としては,通常の単位セル1個(周期構造の1つの単位)を欠陥領域(コア領域)としたソリッドコアフォトニックバンドギャップファイバのみならず,単位セル7個をコア領域とした7セルコア型ソリッドコアフォトニックバンドギャップファイバや,単位セル19個をコア領域とした19セルコア型ソリッドコアフォトニックバンドギャップファイバを対象とし,曲げ印加時の実効的単一モード動作条件を詳細に調査した.また,ソリッドコアフォトニックバンドギャップファイバには複数の透過帯域(フォトニックバンドギャップ)が存在するが,コア径拡大と単一モード動作,および低曲げ損失特性の両立という観点から,各バンドギャップにおける光学特性を総合的に評価し,大コア径ファイバとしての最適な透過帯域(フォトニックバンドギャップの次数)を明らかにするとともに,ファイバ製造上の構造制御技術,およびファイバ使用時のコイル径等を考慮に入れたコア径拡大の理論的限界を特定した.さらに,設計結果に基づき大コア径ソリッドコアフォトニックバンドギャップファイバを試作するとともに,従来型の大コア径ファイバとの比較を行い,ソリッドコアフォトニックバンドギャップファイバの優位性を実験的に実証した.
位置計測技術を応用してフル・ボディ・インタラクションを実現した環境問題学習ゲーム

本研究の目的は,複雑な自然現象・大きな時間的スケールの変化を体感できるデジタルゲームの開発を通して,科学性とエンタテイメント性を備えた身体性のある協調的学習支援環境としてのフル・ボディ・インタラクションの実現法を明らかにすることであった.成果は次の2点であった.(1)森林植生の遷移を体感できるデジタルゲームの開発を通して,画像認識と超音波による位置計測技術の応用に関する実現方を明らかにした.(2)六甲山をフィールドとした評価実験を実施し,里山の植生遷移・保全に関する学習者の興味関心の喚起と持続や理解進化など,フル・ボディ・インタラクションの学習支援効果を実証的に明らかにした.本研究の目的は,複雑な自然現象・大きな時間的スケールの変化を体感できるデジタルゲームの開発を通して,科学性とエンタテイメント性を備えた身体性のある協調的学習支援環境としてのフル・ボディ・インタラクションの実現法を明らかにすることであった.成果は次の2点であった.(1)森林植生の遷移を体感できるデジタルゲームの開発を通して,画像認識と超音波による位置計測技術の応用に関する実現方を明らかにした.(2)六甲山をフィールドとした評価実験を実施し,里山の植生遷移・保全に関する学習者の興味関心の喚起と持続や理解進化など,フル・ボディ・インタラクションの学習支援効果を実証的に明らかにした.本研究では,複雑な自然現象・大きな時間的スケールの変化を体感できるデジタルゲームを開発し,それを通して,学習者(子ども/大人)のための科学性とエンタテイメント性を備えた身体性のある協調的学習支援環境としてのフル・ボディ・インタラクション(Full-body interaction)の実現法(構成法)を明らかにする。平成23年度では,以下に示すように,ゲームのテスト・システムの開発と学習コンテンツ開発及び小規模の予備的な評価実験を実施した。(1)遠隔会議と対面の研究打ち合わせ会議を開催し,役割分担と研究計画を確認した。(2)国内外の先進的なシステム等の研究資料を収集した。(3)六甲山の森林植生に関する画像,テキストから構成された試作版デジタル・コンテンツの設計と開発を行った。(4)フル・ボディ・インタラクションのための基盤システムについて,学習者の位置に基づいたコンテンツ提供を可能にする基礎的な仕組みの開発に成功した。(5)上記(3)のコンテンツの評価のために,2011年10月に神戸市・六甲山のフィールドワークを伴う小学校6年生40名程度の小規模な予備的評価実験を実施した。平成25年度では,改良版ゲームのシステム開発と学習コンテンツ開発及び評価実験を実施した.従来通り,システム開発は,溝口博・杉本雅則,学習コンテンツ開発は,武田義明・楠房子が担当した.評価実験は,稲垣成哲・山口悦司が評価枠組みの策定,評価実験のデザインを検討した.論文化は全員で取り組んだ.全体の統括は,武田が行った.本年度の研究計画の概要は,次の通りであった.1研究打合せ会議:平成25年度上半期には,対面及び遠隔会議との研究打ち合わせ会議を開催し,研究組織における役割分担と研究計画を再確認した.2文献研究・データベース化:昨年度からの継続として,最新の知見を探索,蓄積するとともに,国内外の先進的なシステム等の研究資料の収集を行った.3学習コンテンツの開発:昨年度に開発したコンテンツの改良を試みた.4システムの設計と開発:昨年度に開発したフル・ボディ・インタラクション・システムを改良し,最大6名がプレイできるようにするとともに,学習コンテンツを結合させ,ゲームとして完成させた.5評価実験の設計と実施:評価実験については,神戸大学附属小学校の神山真一氏(神戸大学附属小学校教諭)が研究協力者として参画し,附属校との連携のもとに実施した.H25年度の上半期には,ゲームのみを使った実証実験,下半期には,六甲山のフィールドワークと統合した実証実験を実施した.6成果発表:研究成果については,海外では,CSEDU2013(ドイツ),IDC2013(アメリカ),ICCE2013(インドネシア),ACE2013(オランダ),ICST2013(ニュージーランド),国内では日本機械学会ロボティクス・メカトロニクス講演会で発表するとともに,Journal of Robotics and Mechatronicsに論文が掲載された.平成24年度では,本格的にゲームのシステム開発と学習コンテンツ開発及び評価実験を実施した.システム開発は,溝口博・杉本雅則,学習コンテンツ開発は,武田義明・楠房子が担当した.評価実験は,稲垣成哲・山口悦司が評価枠組みの策定,評価実験のデザインを検討した.全体の統括は,武田が行った.本年度の研究計画の概要は,次の通りであった.1研究打合せ会議:平成24年度上半期には,対面及び遠隔会議との研究打ち合わせ会議を開催し,研究組織における役割分担と研究計画を再確認した.2文献研究・データベース化:昨年度からの継続として、最新の知見を探索,蓄積するとともに,国内外の先進的なシステム等の研究資料の収集を行った.3学習コンテンツの開発:六甲山の森林植生に関する音声,映像,画像,テキストから構成されたデジタル・コンテンツの設計と開発に取り組んだ.4システムの設計と開発:フル・ボディ・インタラクション・システムについては,コンテンツとの結合試験を行い,ゲームシステムとして完成させた.5評価実験の設計と実施:評価実験については,神戸大学附属小学校の神山真一氏(神戸大学附属小学校教諭)が研究協力者として参画し,附属校との連携のもと実施した.H24年度の上半期には,ゲームのみを使った実証実験,下半期には,六甲山のフィールドワークと統合した実証実験を実施した.6成果発表:研究成果については,日本科学教育学会年会(東京理科大学),NOLTA2012(スペイン),ICCE2012(シンガポール)等で発表するとともに,論文化を試みた.

H23年度において,学習者の位置に基づいたコンテンツ提供を可能にする基礎的なシステムの開発に成功し,H24年度には,本システムと映像・画像コンテンツを結合した実証実験を行う見通しが立ったため。また,成果についても,審査付き国際会議を中心に複数件の発表を行うことができたため。25年度が最終年度であるため、記入しない。交付申請書に記載した研究目的については,H24年度については順調に達成されている.開発・実験も順調であり,成果も論文3編,学会発表2編と一定程度のものが蓄積されているからである.H24年度には,H23年度の成果を踏まえて,開発するゲームのプロトタイプを完成させ,予備的な実証実験を行い,問題点の整理,ゲームの改良・改善を実施する予定である。H25年度には,改良版のゲームについて,科学系博物館等の協力を得て,比較的長期の実証実験を行い,その有効性を検討する予定である。成果については,継続的に国内外の学会発表,論文化を試みるものとする。平成25年度も当初の予定通り,研究打合せ会議,文献研究・データベース化,学習コンテンツの開発,システムの設計と開発,評価実験の設計と実施,成果発表を実施する.
乳癌幹細胞を標的とした薬物療法効果判定システムの構築

今回の研究では乳癌原発巣、および転移巣や微小転移巣としての骨髄での乳癌幹細胞の採取とそれを用いた感受性試験の構築を目的とした。先ず我々は理論的裏付けのため、原発巣における乳癌幹細胞性の確認を免疫染色による抗ALDH1抗体を用いて行い、原発巣-リンパ節転移巣の違いを検証した。幹細胞性は原発巣より転移リンパ節で高頻度に観察されることが判明、原発-転移巣間でどのような因子が発現の増強がみられるかを検討したところ、EMT(Epithelial-Mesenchymal transition)に関連するTWISTやSNAILといった因子が原発、及びリンパ節転移巣で特異的に発現していることが観察された。そこで乳癌原発巣とくにEMTの1つの発現型と予想された脈管侵襲陽性症例に絞って幹細胞性とEMT(Epithelial-Mesenchymal transition)に関連する種々の因子(TWIST, SNAIL, Vimentin、E-cadherin、β-catenin、)を免疫染色で検討、これらALDH1とEMT関連因子が腫瘍の中心より辺縁で高発現していること、それらの症例が予後不良であることが判明した。EMTの本質は間質化による細胞移動能の亢進ではあるが、同時に間質化により分化型上皮に感受性が高い従来の殺細胞性抗癌剤に対する感受性の変化とも考えられる点で、当初の目的である抗癌剤の効果判定システムの緒に着いたといえた。これらはいくつかの国内学会で発表され、1編の投稿論文もすでにReviseの段階にある。乳癌幹細胞(BCSC)の機能は本研究の趣旨である薬剤感受性で最重要であるが、先ずは免疫染色を中心とした実験系の確立を兼ねてその各組織内でのALDH1での同定(分布、割合)、さらにBCSCにEMT等の現象が生じている場合Stemnessの変化、薬剤感受性が変化していることが予想され今後の研究の影響を及ぼすと考えられた。原発巣、転移陽性センチネルリンパ節でのALDH1の発現を免疫染色で検証したが、原発巣、センチネルリンパ節での発現頻度、強度、発現部位(上皮・間質)は多様で、臨床病理学的因子との比較ではER陰性、Ki67低発現と相関が見られ諸家の論文と同様の傾向であった。さらに研究を進め、センチネルリンパ節ではALDH1の発現は原発と異なる発現形式を示す場合が見られ、これは腫瘍の物理的移動だけでなく能動的移動とそれに伴う腫瘍の生物学的発現型の変化を示す可能性が示唆されたことから、EMTが生じていると仮定し代表的markerであるTWISTの発現を連続切片上で染色し、ALDH1陽性細胞群に近接してTWIST陽性細胞が存在することが判明した。これは未報告の発見でありEMT自体が薬剤耐性の1因で有る可能性は否定できず、乳癌の能動的転移の機序の解明と共に非常に重要な発見であったことから、The 7^<th> International Sentinel Node Society MeetingのPlenary sessionで発表する機会を得た。その後転移と腫瘍の生物学的変化を多重免疫染色で検証する実験を重ねている。今後薬物療法後の同一患者の骨髄内DTC、循環血中CTCと原発、リンパ節転移巣での各マーカーの発現を検証する基盤は形成されたと判断している。乳癌の原発巣と微小転移巣の代表である骨髄転移の細胞から乳癌幹細胞を分離し治療前後の機能や発現型の変化から投与した薬剤への感受性を検討する研究テーマであったため、(1)原発腫瘍での乳癌幹細胞マーカーの発現、EMT関連蛋白の発現を免染で検討した。引き続き原発-転移巣で環境により薬剤感受性が異なるのではないかという仮説から、(2)転移巣とくに転移の初期段階と考えられるセンチネルリンパ節の微小転移(直径<2mm)での幹細胞マーカー、EMT関連蛋白の発現を検証した。

結果として1)原発巣ではIntrinsic subtype毎にかなり多様な乳癌幹細胞マーカーの発現状態であること、2)腫瘍径での検討では小腫瘍でリンパ節転移を伴う腫瘍でより幹細胞マーカーおよびEMTマーカーの発現が高い3)微小転移であるセンチネルリンパ節の腫瘍での乳癌幹細胞マーカーの発現は原発巣での発現よりも高い傾向であること、同陽性部位の細胞にEMTマーカーであるTWIST蛋白の発現が高いことが判明した。これは原発巣の乳癌幹細胞がEMTを介しリンパ節に能動的に転移するプロセスを観察している可能性、あるいは転移のプロセスの初期で幹細胞性が向上し、結果微小転移で多く観察された事を示唆する。この後手術検体の生標本での酵素処理による細胞レベルでの検証の基礎となるデータが得られた。今後は骨髄腫瘍細胞の採取、管理方法、各種マーカを検出し、特に術前化学療法患者実施患者での原発巣、骨髄腫瘍細胞での残存腫瘍における発現マーカーのプロファイルの違いから、補助化学療法による微小転移巣の絶滅の機序を検討する。乳癌手術検体において乳癌幹細胞(BCSC)マーカーALDH1を用い腫瘍内のBCSCの局在を免疫染色で検討、腫瘍辺縁での発現の増強を認めた。さらに同部位での浸潤細胞におけるがん幹細胞性とEMTを介した浸潤能の関連を観察するためEMTマーカー(E-cadherin,Vimentin、β-catenin,Snail、Twist)による免疫染色を実施、腫瘍辺縁での発現増強、および一部BSCSマーカーとの2重陽性も認められた。さらに500例の乳癌症例の中から30%が、ly(リンパ管浸潤)陽性でリンパ節転移陰性、36%がly陰性でもリンパ節転移陽性で有ることを見い出し、単純にlyの発現がリンパ節転移陽性となる物理的減少では無いことを想定、がん幹細胞性の獲得やEMT因子の発現が重要な意義を持つと過程、そこで乳癌の転移の初期段階、あるいはEMT発現型の典型としてD2-40抗体によるリンパ管染色を行い、ly(リンパ管浸潤)細胞でのALDH1およびEMTマーカーの発現を検討した。その結果ly症例においてはより顕著にALDH1陽性BCSCとEMTマーカー陽性細胞が特に腫瘍辺縁に発現していることが解り、さらにリンパ管内の腫瘍細胞に何れかの因子が発現しておりことを同定、乳癌細胞の転移の初期段階にがん幹細胞性の強化、EMTによる癌細胞のMigration,Invasion能の亢進の1つの機序である可能性をを見い出した。この結果は現在英論文として投稿、校正中である。原発巣での幹細胞マーカーの検証は免疫染色中心に大きく進歩したが骨髄生検の検証において当初予定していた会社(ベリデックス社)が業務縮小したため、採取後短時間で検査が必要な環境が実現できなかった。24年度が最終年度であるため、記入しない。当初免疫染色のみで幹細胞マーカーやEMTマーカーを検出する予定であったが、ベリデックス社のCELL SEARCHへの外注が困難であることから、今後はRT-PCR法でのmRNAの発現の検証で代替する予定である。このことは不安定で発現時間の短い癌幹細胞マーカーやEMTマーカーを適宜検出可能であること、また連続関数での定量が可能、検出系も汎用性があることが予想される。
卵巣癌における上皮間葉移行の新規分子機構の解析

卵巣癌は婦人科癌の中では最も生存率が低い。その理由の一つは、診断時においてはすでに腹空内に浸潤し、他の臓器に転移していることが多いためである。卵巣癌が浸潤転移し、抗がん剤耐性を獲得する過程において、上皮間葉移行という現象が深く関与していることが知られている。上皮間葉移行(Epithelial to mesenchymal transition; EMT)とは上皮細胞が癌化する過程において、上皮細胞様の形質を失い、間葉系細胞様の形質を獲得する現象のことである。上皮細胞には細胞間接着に関わるE-cadherinと呼ばれる膜貫通型タンパク質が発現しているが、EMTが誘導されるとE-cadherinの発現は低下し、間葉系のマーカーであるN-cadherin、vimentinなどの遺伝子が誘導されてくる。申請者らは卵巣癌におけるEMTを制御する因子が新たな卵巣癌治療の標的分子となると考え、卵巣癌のEMTを誘導するあらたな因子の同定をおこなってきた。その過程において、ALX1という遺伝子が卵巣癌のEMTの誘導、浸潤の亢進に深く関与していることを見出した。ALX1は卵巣癌、また悪性度の高い卵巣癌で発現が亢進していた。ALX1がどのようにしてEMTを制御しているかけんとうしたところ、Snailと呼ばれるEMT誘導因子の発現がALX1により亢進することが分かった。Snailは様々な癌で悪性化に関与している。Snailの発現を抑制すると、ALX1を発現しても癌の浸潤、EMTは誘導されなかった。これらの結果より、ALX1はSnailの発現を介して、卵巣癌の悪性化を促進していると考えられる。我々はALX1という遺伝子が卵巣癌の組織でその発現が亢進していることを見出した。そこで卵巣癌細胞であるSKOV3にALX1に対するsiRNAを導入し、その変化を観察した。すると、細胞の形態が顕著に変わることを発見した。詳しく解析した結果、ALX1の発現を抑制することにより、SKOV3細胞は上皮細胞のマーカー遺伝子であるE-cadherinを強く発現するようになっていた。逆にALX1をSKOV3細胞に過剰発現すると、E-cadherinの発現が顕著に抑制された。さらに他の上皮細胞にALX1を導入したところ、同様にE-cadherinの発現が抑制され、細胞の形態が顕著に変化した。この結果は、ALX1が細胞の形態変化に重要な働きをしていると考えられる。さらにALX1が癌細胞の悪性に関与しているか検討した。ALX1は癌細胞の増殖、細胞死に対する耐性、浸潤に深く関与していることが明らかとなった。ALX1がどのようにしてこのような形態変化を誘導するのか、その分子メカニズムの解明を試みた。その結果、Snailという転写因子の発現がALX1により制御されていることが明らかとなった。ALX1の発現を抑制するとSnailの発現が低下し、逆にALX1を過剰発現するとSnailの発現が亢進した。ALX1がSnailのプロモーター活性を制御することをルシフェラーゼアッセイにて確認した。以上の結果、ALX1はSnailの発現を介し、細胞の形態、癌細胞の悪性化を制御していると考えられる。目的に掲げたことは(A)ALX1の抗体作成、(B)ALX1の細胞内局在の確認、(C)ALX1がEMTを制御することを明らかにする、(D)ALX1がSnailの転写を制御する、である。これらのうち、(B)、(C)、(D)は達成した。しかしながら、(A)は達成できなかった。

抗体の作成を2度試みたが、作成することが不可能であった。そのため、中止をすることにした。4つの項目のうち3つを完全に達成し、さらにALX1が癌細胞の悪性化に関与していることを明らかにしている。達成できなかったものもあるが、当初の目的以上に達成した部分もあり、おおむね順調に研究は進んでいると考えられる。ALX1の発現を抑制した癌細胞を作成し、動物実験をおこなう。ALX1に対するshRNAベクターを作成する。そして卵巣癌由来の細胞であるSKOV3、ES-2細胞にshRNAをレトロウイルスを用いて導入し、発現を抑制する。コントロールとして、ルシフェラーゼに対するshRNAを発現した癌細胞を作成する。shRNAの導入によりALX1の発現が抑制されたか確認し、EMTの逆の変化、METが誘導されたか検討する。また、癌の悪性化が抑制されたかin vitroの実験系を用いて確認する。次にこれらの細胞をマウスに移植し、その増殖を検討する。マウスの大腿の皮下に移植し、癌細胞の大きさを計測する。また、マウスの腹空内に移植し、癌細胞の増殖を調べる。ALX1が抗がん剤の耐性獲得に関与するか検討する。コントロール細胞、ALX1 shRNAを発現した細胞に異なる濃度の抗がん剤をin vitroの系で加え、それによる増殖抑制効果を検討する。また、細胞死が促進するか明らかにする。次にこれらの癌細胞をマウスに移植し、抗がん剤を投与する。そしてALX1の発現が抗がん剤に対する耐性獲得に関与しているか明らかにする。ALX1を過剰発現した細胞を用いて、同様な研究をおこなう。以下に掲げる品目に関し、経費を使用する予定である。動物実験のためのマウス。細胞培養関連試、器具。組み換えDNA実験に用いる酵素、DNAプライマー。
小胞体経路の蛋白質選別輸送の分子機構

1.リソソ-ム膜に存在する分子量85Kの糖蛋白質(LGP85)のcDNAを分離し、蛋白の一次構造を決定した。LGP85はN末端のシグナルペプチド部分とC末端附近の疎水性部分で膜にアンカ-され、C末端の21アミノ酸残基部分がサイトゾル側に露呈していると推定された。リソソ-ムへの選別輸送シグナルは、C末端の21アミノ酸部分に存在すると考えられるので、今後はこの部分の機能を明らかにする。2.合成ぺプチドと大腸菌で発現させ精製したミトコンドリア前駆体蛋白質を用いて、ミトコンドリアへの前駆体蛋白質の輸入に関与する細胞質因子を検討し、ラット肝の細胞質から蛋白質因子を精製し、前駆体蛋白質の輸入の関与を明らかにした。3.エンドサイトーシス過程に対するキナ-ゼ活性阻害剤スタウロスポリンの効果を研究し、アシアロ糖蛋白質の肝実質細胞への取り込みにおいて、その取り込みはほとんど影響をうけないが、エンドソ-ムとリソソ-ムの融合過程を阻害することを明らかにした。4.ミクロソ-ム型アルデヒド脱水素酵素(mALDH)のcDNAをクロ-ニングし、蛋白の一次構造を決定し、mALDHのC末端に疎水性配列が存在することを見出した。mALDHは遊離リボソ-ムで合成されるが、合成後、この配列によって小胞体膜に組み込まれることを推定した。5.酵母小胞体ーゴルジ体間輸送の無細胞系を改良し、小胞体よりの輸送小胞の形成を定量できる系を確立した。この系を用いた解析の結果、Sar/pによるGTPの分解は、輸送小胞の形成以後に必要であることが明らかになった。6.オ-トファゴソ-ムの形成過程を形態学的に解析し、標的オルガネラを取り囲む分離膜は小胞体に由来すること、取り囲んだオルガネラと分離膜の間には微細線維状の構造があること、形成初期のオ-トファゴソ-ム膜の内容は、リソソ-ムの性質をもっていないことを明らかにした。
TP53遺伝子機能解析データベースを利用した抗癌剤感受性予測システムの開発

申請者を含む研究チームが既に作成したp53ミスセンス変異ライブラリー(KatoS,OtsukaKら、PNAS100,8424-8429,2003)には、1塩基置換により生じうる全ての1アミノ酸置換型変異p53(2314種類)が網羅されている。今回、申請者はこのライブラリーを用いてTP53cDNA上にミスセンス変異を持つp53発現プラスミドを約1000種類抽出した。このプラスミドのTP53cDNAのコドン72はプロリン(P)である。このプラスミドからTP53cDNA断片をPCR法により増幅し、コドン72がアルギニン(R)であるp53発現ベクターとともに出芽酵母内に導入し、相同組換え法によりコドン72がRに置換された変異p53発現ベクターを構築した。また酵母内にはWAF1遺伝子由来のp53結合配列を持つEGFPレポータープラスミドも導入されており、その発現を測定することにより転写活性化能を定量的に評価できるシステムとなっている。960種類の変異p53発現ベクターの構築を試みたが、実際に作成できたものは886種類(=92.3%)であった。コドン72がRである変異p53とPである変異p53とでその転写活性化能を定量的に比較した。結果、886変異体のうち、コドン72がRである場合とPである場合に、転写活性化能の有意差(p<0.001)を認めた変異体は10種類あった。その他の大多数のp53ミスセンス変異体においてはその転写活性化能はコドン72の遺伝子多型に大きな影響を受けなかった。今回得られた結果は、TP53にある変異が生じた場合にのみ、p53の転写活性化能が遺伝子多型により影響を受けることを実験的に示しており、コドン72遺伝子多型についての重要な知見である。今後。プラスミド構築時のPCRエラーの頻度を解析し、更に精度の高いデータに仕上げて発表する予定である。申請者を含む研究チームが既に作成したp53ミスセンス変異ライブラリー(Kato S, Otsuka Kら、PNAS 100,8424-8429,2003)には、1塩基置換により生じうる全ての1アミノ酸置換型変異p53(2314種類)が網羅されている。今回、申請者はこのライブラリーを用いてTP53 cDNA上にミスセンス変異を持つp53発現プラスミドを約1000種類抽出した。このプラスミドのTP53 cDNAのコドン72はプロリン(P)である。このプラスミドからTP53 cDNA断片をPCR法により増幅し、コドン72がアルギニン(R)であるp53発現ベクターとともに出芽酵母内に導入し、相同組換え法により変異p53発現ベクターをin vivoで構築し、結果978種類の変異p53発現ベクターを作成した。構築したp53発現ベクターにおけるTP53 cDNAのコドン72はPからRに置換されている。また、酵母内にはWAF1遺伝子由来のp53結合配列を持つEGFPレポータープラスミドも導入されており、その発現を測定することにより転写活性化能を定量的に評価できるシステムとなっている。コドン72遺伝子多型が変異p53の転写活性化能に影響を及ぼすか、コドン72がRである変異p53とPである変異p53とでその転写活性化能を定量的に比較した。結果、978変異体のうち、コドン72がRである場合とPである場合に、転写活性化能の有意差(p<0.001)を認めた変異体は11種類であり、その他の大多数のp53ミスセンス変異体においてはその転写活性化能はコドン72の遺伝子多型に大きな影響を受けなかった。

その他の大多数のp53ミスセンス変異体においてはその転写活性化能はコドン72の遺伝子多型に大きな影響を受けなかった。今回得られた結果は、TP53にある変異が生じた場合にのみ、p53の転写活性化能が遺伝子多型により影響を受けることを実験的に示しており、コドン72遺伝子多型についての重要な知見である。今後。プラスミド構築時のPCRエラーの頻度を解析し、更に精度の高いデータに仕上げて発表する予定である。