hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
鋼部材に発生した疲労き裂のCFRP板による補修・補強

本研究では、炭素繊維強化プラスチック板(以下、CFRP板と記す)に着目し、平成14、15年度の2ヵ年に渡って、CFRP板を鋼部材に発生した疲労き裂の補修に用いることの可否について実験的に検討した。平成14年度は、CFRP板とストップホールを併用した場合を想定し、試験片中央に疲労き裂を想定したソーカットを設け、その先端にストップホールに相当するφ=4mmの円孔を明けた試験片を用いて検討した。ストップホールの両端までの長さaは25mmである。疲労試験の結果、無補強の場合は、作用応力範囲がΔσ=90MPa以下であれば、き裂の再発生を防ぐことが可能であったが、CFRP板の幅cとストップホールの両端までの長さaとの比c/a=0.4の場合はΔσ=100MPa、c/a=1.0の場合はΔσ=130MPaでも、き裂の再発生を防止することが可能であった。また、c/a=0.4であっても応力範囲が低いところでは寿命が急増しており、補修効果が顕著に現れていた。c/a=1.0の場合は、c/a=0.4の場合よりさらに高い応力範囲域でも補修効果が認められた。平成15年度は、CFRP板を単独で用いた場合を想定し、長さa=25mmの予き裂を有する試験片を用いて検討した。疲労試験の結果、CFRP板を単独で疲労き裂の補修に適用した場合、き裂の再発生を防止することはできなかったが、延命化には十分な効果があり、CFRP板の幅cとき裂長さaとの比c/aが大きいほうが補修効果は高くなった。しかし、c/a=0.4の場合でも応急処置としては十分実用性があると判断された。また、作用応力範囲の高い領域の方が、CFRP板の補修効果は大きかった。以上より、CFRP板は、単独で、あるいは、ストップホールと併用して疲労き裂の補修に適用できることが明らかとなり、CFRP板の実用化の可能性は高いと言える。近年、鋼構造物の溶接継手からの疲労き裂の発生が数多く報告されている。疲労き裂は放置すると進展し、鋼構造物の崩壊に至る可能性もあり、疲労き裂の進展を防止あるいは遅延するための補修および補強が重要である。本研究では、炭素繊維強化プラスチック板(以後、CFRP板と記す)に着目し、疲労き裂の補修に用いることの可否について実験的に検討する。平成14年度は、CFRP板とストップホールを併用することによる相乗効果を検討するために、試験片には中央に疲労き裂を想定したソーカットを設け、その先端にストップホールに相当するφ4mmの円孔を明けた。き裂部の全長aは25mmである。CFRP板の長さは100mmとし、CFRP板の幅cは10mm(a/c=2.5)と25mm(a/c=1.0)の2種類とした。これらの試験片と無補強試験片を用いて疲労試験を実施し、き裂の再発生の有無、強度などについて比較検討した。疲労試験の結果、無補強の場合は、作用応力範囲がΔσ=90MPa以下であれば、き裂の再発生を防ぐことが可能であったが、a/c=2.5の場合はΔσ=100MPa、a/c=1.0の場合はΔσ=130MPaでも、き裂の再発生を防止することが可能であった。

また、a/c=2.5であっても応力範囲が低いところでは寿命が急増しており、補修効果が顕著に現れていた。a/c=1.0の場合は、a/c=2.5よりさらに高い応力範囲域でも補修効果が認められた。なお、a/c=2.5とa/c=1.0のS-N線の傾きは同程度であった。以上より、CFRP板は疲労き裂の補修に適用できる可能性が高く、実用化の可能性が高いことが明らかとなった。次年度は、ストップホールを併用しない場合について検討したいと考えている。昨年度は、ストップホールと炭素繊維強化プラスチック板(以下、CFRP板と記す)を併用した疲労き裂の補修工法に関する研究を行い、この工法の実用性の高いことを明らかにした。本年度は、疲労き裂の補修にCFRP板を単独で用いることの可能性について実験的に検討した。本研究では、実際に鋼部材に発生した疲労き裂を対象とするため、幅100mmの試験片中央に長さ10mmのソーカットを設け、繰返し荷重を作用させ、ソーカットから疲労き裂を発生させた。ソーカットと疲労き裂の長さの合計が約25mmに進展した時に載荷を止め、これを無補修試験片(C-1シリーズ)とした。疲労き裂に補修材として貼付するCFRP板の長さは100mmとし、CFRP板の幅cは10mm(C-2シリーズ)と25mm(C-3シリーズ)の2種類とした。CFRP板の接着にはパテ状エポキシ樹脂接着剤を用いた。鋼板およびCFRP板の厚さは各々6mmと1.2mmである。実験の結果、以下の知見が得られた。1 CFRP板を単独で疲労き裂の補修に適用する場合、き裂の再発生を抑制することはできなかった。しかし、延命化には十分な効果があった。2き裂部に対してCFRP板の幅が大きいほうが補修効果は高くなった。しかし、CFRP板の幅とき裂長さとの比c/a=0.4の場合でも応急処置としては十分実用性があると判断された。3作用応力範囲の高い領域の方が、CFRP板の補修効果は大きかった。以上より、CFRP板は単独で疲労き裂の補修に用いても実用性が高いことがわかった。
乳癌組織周囲における脂肪細胞の挙動の解明と新規治療法の開発

癌組織やその周囲には癌細胞以外の細胞が存在し、癌細胞との相互作用により癌周囲の環境が形成され、癌の増殖、浸潤、転移に影響を与えていることがすでに分かっている。乳癌は周囲に脂肪組織が豊富に存在するため、癌周囲の環境に脂肪細胞の関与が予想される。しかし、生体内における乳癌組織周囲の脂肪細胞の動きや働きについてはこれまでに明らかにされていない。本研究では、脂肪細胞の運命を追跡することができるマウスで、乳癌モデルマウスを作成し、乳癌の増殖過程における脂肪細胞の動きや変化について明らかにすることで、新たな治療標的の発見や治療法の開発を行う。
アルツハイマー型痴呆脳におけるアシロイドP成分遺伝子発現の検討

アミロイドP成分(AP)遺伝子のエクソン部位の約300塩基をPCRで増幅しサブクローニング後,シークエンスを確認した上で,アンチセンスDNAを基にRNA polymeraseを用いてdigoxigeninでラベルしたRNAリボプローブを作製した。これにアルカリフォスファターゼで標識した抗digoxigenin抗体を免疫反応させ,発色をおこなった。この方法により5例のアルツハイマー型痴呆(AD)患者剖検脳と5例の正常対照剖検脳および肝組織のホリマリン固定切片においてnon-isotopic in situ hybridization(ISH)を行った。その結果,ADおよび正常対照剖検脳のいずれにおいても,アンチセンスプローブにより大脳皮質の第I層から第VI層にかけての錐体細胞を含む種々のタイプの神経細胞に広汎に反応が認められた。また,淡蒼球,被殼などの大脳基底核においても神経細胞に全般性に反応が認められた。AD検体においては,反応を示す神経細胞が減少していたが,このことはADでは全体の神経細胞が減少していることを反映していると考えられた。ADおよび正常対照剖検脳のいずれでも,神経膠細胞では反応はみられなかった。また,アンチセンスプローブによる反応は肝細胞においても認められ,その反応形態はいままでに報告されたものと同様であった。センスプローブではこれらの反応は認められなかった。これまでにAPについては肝細胞以外での産生は明らかではなかったが,今回の結果は神経細胞においてもAPが産生がされている可能性を示している。ADの老人斑や神経原線維変化の出現の過程に,神経細胞由来のAPがより密接に関与している可能性が示された。
風応答長期観測記録に基づく塔状構造物の動特性変動の定量化

本研究では、大規模塔状構造物の風応答観測を継続的に行い、気象条件に応じて変化する構造物の動特性変動を定量的に評価した。はじめに、風応答によって生じる微動を観測するための計測システムを構築し、長期連続観測を行った。同時に、気象庁より公開されている気温・風速・地震記録等のデータを収集した。続いて、風応答の観測記録を用いて、構造物の固有振動数と減衰定数を同定した。最後に、観測記録の分析結果と気象データを併用し、動特性の季節変動や経年変動の定量化を行った。本研究では、積雪寒冷地における塔状高層構造物の風応答長期連続観測を実施して、気象条件に応じた動特性の変動を定量化し、制振装置の設計・耐風設計・構造ヘルスモニタリングに資する新たな知見を得ることを目的とする。この目的に従い、昨年度に構築した風応答長期連続観測システムは安定的に稼働し、メンテナンス時以外一度も停止することなく、1年間にわたる振動データを連続収録した。また、年度の後半には建物内の無線LANおよび外部とのネット接続としてWiMAX回線を組み合わせて、遠隔地からの計測システムのモニタリングおよびデータ回収を可能とした。計測データの分析からは、構造物の水平方向の固有振動数が概ね0.5Hzであることと、構造物の固有振動数が夏季には低く冬季には高いこと、および年ごとに徐々に低くなっている傾向を抽出した。これは固有振動数と気温との相貫関係が強いことを示している。また、地震時の固有振動数も低下しており、固有振動数に振幅依存性があることも確認できた。ただし、いずれの変化も制振装置の効果を低減させるほどのものではなく、振動に対する人の知覚確率には影響しないレベルであった。一方、減衰定数については、固有振動数のような明確な変動傾向は見られなかった。以上の成果については、平成24年8月に韓国で開催された構造物の風応答に関する国際会議で発表した。来年度も計測を継続しデータを分析することで、ここで見出した動特性の変動の再現性について確認したい。この目的に従い、研究課題実施初年度に構築した風応答長期連続観測システムは3年間にわたり安定的に稼働し、メンテナンス時以外一度も停止することなく振動データを連続収録することができた。また、昨年度構築を試みたWiMAX回線による遠隔地からリモート操作も順調に稼働し、計測システムのモニタリングおよびデータ回収を行うことができた。昨年度までに把握した構造物の水平方向の固有振動数が概ね0.5Hzであることと、構造物の固有振動数が夏季には低く冬季には高いことを平成25年度も確認できた。しかし、固有振動数が年ごとに徐々に低くなっている傾向は、平成25年後半からほぼ一定に推移する傾向に転じたことは非常に興味深い。以上の長期間にわたる分析結果については、平成25年12月に香港で開催された工学と応用科学に関する国会会議で発表した。なお、本研究課題期間中に構築した風応答長期連続観測システムは課題終了後も同建物内で稼働させることが許可されたため、さらにデータを収集しデータ分析を継続することとなった。この目的に沿い、今年度は測定対象建物に振動測定システムを設置して、長期連続観測体制を確立した。計測システムは、微動観測用サーボ型速度計3台を建物内部壁面に取り付け、測定データを10分ごとのファイルに分割して24時間連続して取り込むものである。壁体内の電波状態が悪く通信が不可能なため、当初の計画にあった計測遠隔操作は行えなかった。しかし、無停電電源装置を設置することによって、設備点検時の停電でも計測システムは止まることなく、安定的に計測が継続されている。これまでに回収した計測データ分析からは、構造物の水平方向の固有振動数が概ね0.5Hzであること、日中は振動レベルが大きく夜間は小さいこと、夏は固有振動数が低くなり冬は高くなることなどの変動が確認できた。また、函館海洋気象台の気象観測データの自動取得システムを構築し、構造物の応答速度と風速との相関性についても確認することができた。一方、振動測定と並行して、対象構造物の理論モデルを作成した。対象構造物は制振装置を有しており、これを考慮した3質点の振動モデルを構築して、振動測定結果に基づいてチューニングを施した。計測システムはメンテナンス時以外一度も停止することなく、1年間の連続継続を行うことができた。

ただし、モニタリングシステムについては電波の状況により接続できないことがあるが、計測システムの稼働には問題ない。本研究では3年間の研究期間(平成2325年度)で、風応答長期連続観測の実施と観測記録の分析・評価を行う。初年度の平成23年度は、計測システムの構築と構造物の理論モデルの作成を予定しており、いずれも計画通り進展した。計測システムとモニタリングシステムが構築できたので、昨年度に引き続き振動測定データの蓄積を図る。また、現段階までに回収した測定データからは興味深い結果が得られており、データ分析プログラムの拡充によって多面的なデータ分析を行っていく。計測システムの安定稼働が確認できたので、まずは振動測定データの蓄積を図る。物品の購入はすべて終えたため、次年度はデータ回収とシステムメンテナンスに必要な旅費・謝金、遠隔地からのモニタリングのためのネット接続料、成果発表に必要な登録料・旅費が主要な使途である。初年度の平成23年度に計測システムの構築に必要な物品の購入は終えた。なお、現地でのデータ回収作業を1回省略したため未使用額が発生したが、これについては次年度すぐに現地に赴きデータ回収を実施する予定である。次年度はデータ回収に必要な旅費・謝金および成果発表に必要な登録料・旅費が主要な使途である。
航路標識用ブイの運動性能に関する研究

前年度は、航路標識用ブイの代表的なものとしてディスカスブイを取り上げ、流れの中におけるブイの静的つりあいや係留系の問題を扱ったことを受けて、今年度は円筒型のダンパーを有するディスカスブイの運動性能に関する研究を実施した。まず、ダンパー用のリングの部分模型を製作し、これによる流れの様子を観察した。その結果、ダンパーが放出する渦のパターンは、垂直平板が放出する渦に類似したものと、円柱が放出する渦パターンに類似したものとの2つが複雑に混ざり合わさったものになっており、これらのいずれの渦パターンが支配的になるかは、リングのアスペクト比(リング幅とリング直径の比)により異なり、その場合に働く粘性流体力も、2つのパターンに対応して定義されたKcに関係づけられることが分かった。次に、リング付きブイに働くブイに働く各種の流体力を計測し、1.波強制力は、ブイ本体に働くフルードクリロフ力と、リングに働く粘性流体力の線形重ね合わせで推定可能である。2.ブイが運動することによって受ける流体力はブイ本体に働くラディエーション力、リングに働く粘性流体力、支柱に働く粘性流体力の重ね合わせで推定することが可能で、これらの成分相互の流体力学的干渉は小さい。ことなどを明らかにし、流体力の推定を可能にした。さらに、係留系がスラック係留の場合には、カテナリー理論を用いた計算で実用上十分な精度で推定できるこどを確認した上で、ブイの運動を時間領域で計算するプログラムを開発し、ダンパーリングの幅の違いがブイの運動に及ぼす影響を調ベ、ダンパーリングの幅には最適ものがあることを明らかにした。本年度は、まず従来から航路標識用ブイとして用いられてきた各種のブイを伝、その形状やGM、KMなどによって分類し、ブイの基本的な特徴を調査した。その結果として、航路標識用のブイが備えるべき性能を明確にし、代表的なブイ形状も選定した。これまで行われてた研究内容は、次の3つに分類することができる。ブイの係留系に関する研究従来から係留系の初期設計段階では、その静的な特性計算には図表が使われてきたが、パ-ソナルコンピュ-タ-を使って、ブイの初期設計に必要な係留ラインの配置や長さなどを決定する簡易CADシステムを作成した。2.ブイ模型を使った系統試験航路標識用の典型的なブイ形状として、水面下の形状が円錐形状の本体と円板によるリングによって出来ているものを選び、そのリングの大きさと支柱の長さなどを系統的に変化させて、ブイが受ける波浪外力、粘性減衰力、付加質量力などの流体力を計測した。その結果、ブイの運動性能は、原理的に大型の海洋構造物に対するものと同じことを確認するとともに、これまでの知識と異なっているものは、リングの作用であるとの結論を得た。3.円板リングに働く流体力に関する研究円板リングに働く流体力を推定する手法を確立するために、円板リングの高さや直径を系統的に変化させた数種類の模型を作成し、定常流中および非定常流中で流れの観察を行った。その結果、円板リングの端部から発生する剥離渦とその挙動を詳細に観察、把握することができた。今後は、力の計測結果と比較、解析することによりブイの運動を推定する予定である。
双方向因果モデルの効用を再考する

本研究の目的は,共分散構造分析における双方向因果モデルに基づいて因果推論を行う際の,モデルの利用上の注意に関する具体的な知見を得ることである。この目的のために大きく分けて以下の2つの研究を行った。1:先行諸研究に示されたデータの再分析に基づく展望と理論的考察適用上の留意点をまとめるために,人工データに基づく理論的考察と先行諸研究の実データの再分析を行った。再分析したのは海外の学術誌及び文献から収集し,精選した代表的な5つのデータであった。先行諸データの再分析の際,双方向因果モデルを識別するための道具的変数の組み合わせを組織的に交換するという方法で一つのデータに対して50種類以上のモデルを適用し,結果の比較を行った。これらの結果から得られた主要な知見は以下の2点である。(1)内生変数が2,外生変数が2または3変数からなる構造方程式モデルの内生2変数に双方向の因果を仮定したモデルにも,統計的に適合が等しい「等価モデル」が存在し,等価モデル間の優劣の決定は統計的観点から行うことはできない。(2)同じデータであっても異なる道具的変数を設定すると2変数間の因果の方向に関する結果が逆転することもある。したがって道具的変数の設定には,統計的と言うよりも個別科学的な強い理論的根拠が必要である。2:調査研究データにおける適用以下の2種類の調査データへの適用を行い,個別科学的理論に照らして妥当な結果が得られた。(1)統計数理研究所の「日本人の国民性調査」第9回全国調査のデータについて,「生活に対する満足感」と「社会に対する満足感」に関する分析を行った結果,示唆された因果の方向は「生活に対する満足感」→「社会に対する満足」である。(2)育児中の母親に対する調査データについて,「育児満足感」と「自尊心」に関する分析を行った結果,示唆された因果の方向は「育児満足感」→「自尊心」の方向である。
新疾患概念「IgG4関連疾患」の病態解明に向けた自然免疫からの新戦略

本研究では自然免疫に重要な役割を果たす病原体センサーであるTLR7に注目し、huTLR7 Tgマウスを作製し、その表現型を検討した。その結果、huTLR7 TgはWTマウスと比較して臓器重量は有意な差は認めなかったが、唾液腺、膵臓、および肺におけるリンパ球浸潤と繊維化は有意に亢進していた。さらに、TLR7アゴニストによる刺激実験を行ったところ、huTLR7 TgマウスではIgG4-RDの好発部位である唾液腺と膵臓でリンパ球浸潤・線維化が亢進した。さらに、血清IgG1(ヒトのIgG4に相当)の上昇も認めることから、IgG4-RDモデルマウスへの応用が可能であることが示唆された。我々は以前から、IgG4関連疾患の代表的な病態であるIgG4関連涙腺・唾液腺炎(IgG4-DS)の病変局所に浸潤するT細胞サブセットを解析しており、Th2サイトカインがIgG4-DSの特異な病態形成に関わっていることを明らかにしてきた。本研究ではTh2細胞の活性化に関わるとされているIL-33に着目して検討を進めた。IgG4-DS、シェーグレン症候群患者、健常者の唾液腺組織を用いて比較検討を行なった。mRNAの発現を検討したところ、IgG4-DSではTh2サイトカインだけでなくIL-33とST2(IL-33受容体)の発現が対照群よりも有意に亢進しており、Th2サイトカインとIL-33の発現量の間には正の相関を認めた。免疫組織化学染色で検討すると、IL-33は対照群を含めて恒常的に導管上皮が陽性であったが、IgG4-DSでは胚中心周囲にも陽性細胞が認められた。IL-33陽性細胞が存在する胚中心周囲にはST2陽性細胞も認められ、いずれの細胞の分布もTh2細胞の浸潤部位と一致していた。IgG4-DSにおいてIL-33を発現する細胞の候補としてマクロファージ(M1+M2:CD68、M2:CD163)と樹状細胞(CD11c、CD123)を考え、それらの細胞の浸潤を検討したところ、IgG4-DSではいずれの陽性細胞も認められたものの、特にCD68陽性のM2マクロファージの胚中心周囲への浸潤が著明であった。さらに、二重蛍光免疫染色を行なったところ、IL-33陽性細胞はCD68およびCD163陽性細胞と局在がほぼ一致していた。また、IL-33陽性マクロファージが存在することはフローサイトメトリーによる検討でも確認できた。以上より、M2マクロファージがIL-33を介してTh2細胞を活性化し、IgG4-RDに特徴的なTh2依存性の病態形成において重要な役割を演じていることが示唆された。IL-33は主に上皮細胞、MΦ、樹状細胞(dendritic cell: DC)などが発現しており、受容体のST2は主にTh2細胞に発現している。Th2細胞はこのIL-33/ST2シグナルによって活性化され、Th2サイトカイン(IL-4、IL-13)を産生しているとされる。そこで本研究では、IgG4-DS患者7例、SS患者10例、健常者10例を対象とし、唾液腺におけるIL-33、ST2、IL-4、IL-13、IFN-γ、MΦ(CD68、CD163)、DC(CD11c、CD123)について検討を行った。その結果、IFN-γのmRNA発現量はSSで他の群より有意に発現が亢進していたが、それ以外の分子はIgG4-DSで他の群より有意に発現が亢進していた。さらにはIgG4-DSでは、IL-33とTh2サイトカイン(IL-4、IL-13)のmRNA発現量は正の相関を認めた。IL-33は全群で導管上皮細胞に認めたが、IgG4-DSのみeGC周囲にも散在性に認めた。蛍光二重染色ではIL-33はCD68、CD163と局在がほぼ一致しており、CD11cやCD123とはほとんど一致しなかった。これらの結果より、IgG4-DSの病変局所においては、M2 MΦが産生するIL-33がTh2優位な環境を形成し、病態形成に寄与していることが示唆された。IgG4関連疾患におけるIL-33産生細胞も同定され、現在その研究成果について論文作成中である。今年度は自然免疫に必須な病原体センサーであるToll様受容体(TLR)に注目し、IgG4関連疾患におけるTLRファミリーの発現と機能について検討を行った。IgG4関連疾患6例、唾石症3例、健常者3例の顎下腺においてDNAマイクロアレイを行い、自然免疫関連分子について網羅的解析を行った。さらに、TLRファミリーの中で発現亢進を認めたものについては、real-time PCR法および免疫組織化学染色法にてバリデーションを行った。最後に、TLRトランスジェニック(Tg)マウスを作製して各臓器の組織解析および血清IgG1(ヒトのIgG4に相当)値について検討を行った。その結果、DNAマイクロアレイおよびバリデーションでは、IgG4関連疾患はTLR7のみ有意な発現亢進を認め、M2マクロファージと局在が近似した。最近の報告では、TLR7アゴニストでマクロファージを刺激すると、Th2活性化因子であるIL-33が産生されることが示唆されていることから、TLRファミリーとIL-33との関連について検討を行ったところ、TLR7のみIL-33と正の相関を認めた。

そこで、ヒト(hu)TLR7 Tgマウスを作製して同週齢の野生型マウスと比較検討したところ、huTLR7 TgマウスのみIgG4関連疾患の好発部位である顎下腺と膵臓でリンパ球浸潤と線維化の亢進を認めた。さらに、TLR7アゴニスト(R848)で刺激したhuTLR7 Tgマウスは血清IgG1値が刺激前と比べ有意に増加した。これらの結果から、TLR7による刺激が病変局所のM2マクロファージを活性化してIL-33の産生を促進させることで、IgG4関連疾患に特徴的なTh2優位な病態を形成していることが示唆された。また、huTLR7 Tgマウスは世界初のIgG4関連疾患モデルマウスになり得る可能性が示唆された。IgG4関連疾患ではTLR7の発現が亢進しており、TLR7トランジェニックマウスではIgG4関連疾患の臨床所見と類似していることを見出した。本研究の最終目的である世界初のIgG4関連疾患モデルマウスの確立に向けて、研究は順調に進展している。【目的】IgG4関連疾患(IgG4-RD)におけるIgG4クラススイッチにはIL-4やIL-10などのTh2サイトカインが重要な役割を果たしていると考えられているが、最近ではヘルパーT細胞などの獲得免疫だけではなく、自然免疫(特にToll様受容体(TLR))もIgG4-RDの病態形成に関与していることが示唆されている。そこで本研究では、IgG4-RDの唾液腺病変で発現亢進を認めたTLR7に注目し、ヒトTLR7トランスジェニック(huTLR7 Tg)マウスを作製し、その表現型を検討した。【方法】huTLR7 Tgと野生型(WT)マウスの各臓器(顎下腺、膵臓、腎臓、肺、肝臓)における重量、病理所見(リンパ球浸潤、繊維化)について評価した。さらに、TLR7アゴニスト(R848)による刺激実験を行い、WTマウスとの比較検討を行った。【結果】huTLR7 TgはWTマウスと比較して、臓器重量は有意な差は認めなかったが、唾液腺、膵臓、および肺におけるリンパ球浸潤と繊維化は有意に亢進していた。さらに、片耳にR848を4週間塗布して刺激実験を行ったところ、huTLR7 Tgマウスでは唾液腺と膵臓で、WTマウスでは肝臓と腎臓でリンパ球浸潤・線維化が亢進した。また、Tgマウスでは血清IgG1値(ヒトのIgG4に相当)が上昇したのに対し、WTマウスでは血清IgG2a値(ヒトのIgG1に相当)が上昇した。【結論】huTLR7マウスはIgG4-RDの好発部位に類似した病理所見を認め、血清IgG1(ヒトのIgG4に相当)の上昇も認めることから、IgG4-RDモデルマウスへの応用が可能であることが示唆された。本研究では自然免疫に重要な役割を果たす病原体センサーであるTLR7に注目し、huTLR7 Tgマウスを作製し、その表現型を検討した。その結果、huTLR7 TgはWTマウスと比較して臓器重量は有意な差は認めなかったが、唾液腺、膵臓、および肺におけるリンパ球浸潤と繊維化は有意に亢進していた。さらに、TLR7アゴニストによる刺激実験を行ったところ、huTLR7 TgマウスではIgG4-RDの好発部位である唾液腺と膵臓でリンパ球浸潤・線維化が亢進した。さらに、血清IgG1(ヒトのIgG4に相当)の上昇も認めることから、IgG4-RDモデルマウスへの応用が可能であることが示唆された。本研究の研究成果はClinical Immnologyをはじめ、数報の論文が今年度に出版された。今年度の研究成果は、次年度以降の研究に繋がるものと考えられる。
キャピラリーガス比例計数管を用いたcDNAマイクロアレイ解析装置の研究開発

「生物にはどのような遺伝子があるのか」については、ゲノムプロジェクトとして世界的に行われてきた。今後は、これら遺伝子が「いつ、どこで、どれだけ発現しているか」を調べることが疾病の診断や予防法の開発、環境問題対策の研究開発を飛躍的に進歩させる手段として期待されている。特に、この「ポストゲノム研究」で中心となるのは,遺伝病の克服,多因子病の治療や予防,一遺伝子多型(SNPs)を解析して個人差を知りその人の体質にあった薬を創り出す「ゲノム創薬」といった医療分野である。cDNAマイクロアレイはそのためのツールとしてもっとも注目されている技術である。そこで、本研究では、キャピラリープレートガス比例計数管(CGPC)をCCDカメラや光電子増倍管を用いたcDNAマイクロアレイスキャナーと比較して100倍の感度と高速処理系および幅広いダイナミックレンジを持つcDNAマイクロアレイ解析用光検出器として応用するための実用化に向けた開発研究を行った。具体的には、CGPCの封入ガスとしてアルゴン、メタン、TMAのペニングガスを用いて22keVのX線入射時の発光像を観察しCGPCの基礎評価試験を行った。X線イベント1発1発の飛跡像を明瞭に捕らえることができ、その飛跡分布がX線の無偏光を反映した等方分布であることを確かめた。本研究結果は、Nucl. Instr. and Meth.に論文が受理されている。また、本装置を高輝度光科学研究センター(SPring-8)および高エネルギー加速器機構のフォトンファクトリー施設に設置して、エネルギーの異なるX線を直径約400μmφにコリメートして入射させ本検出器の位置に対する感度の一様性およびダイナミックレンジの測定を行った。これらX線を用いたCGPCの特性試験からcDNAマイクロアレイスキャナーとしての性能を評価した。
ＫｃｓＡカリウムチャネルｐＨ依存性ゲーティングダイナミクスの一分子構造機能解析

pH依存性カリウムチャネルであるKcsAのゲーティング構造変化を捉えるために回折X線追跡法のハードウェアの面からを改良し、毎秒5000フレームの高速記録が可能になった。従来の定常状態でのDXT測定では観察されるねじれの向きとゲーティングの関係が分からなかった。pHジャンプすることにより、たとえば酸性ジャンプであれば開遷移だけが捉えられる。このようなアイデアで実験を行うためのpHジャンプ系を確立し、ゲーティングの過渡的応答を高解像度で捉えることに成功した。またpH依存性のゲーティング開口過程に際し、膜に埋め込まれた状態のチャネルが長軸方向の長さを短縮することを原子間力顕微鏡により明らかにした。本年度はDXT(Diffracted X-ray Tracking)法におけるpHジャンプ実験の確立とデータ収集を行い、データ解析のためのプログラム開発を行った。caged化合物を使用することにより中性pHからpH4まで効率よく溶液pHをジャンプし、それにより閉構造からゲートが開き始める過程を追跡することができた。とくに注目したのはpHジャンプから大きく構造変化をはじめるまでの時間経過、およびその期間に何がおこっているか、という点である。これらの現象を定量的に解析するための方法を現在検討中である。これと並行して単一チャネル電流によるpH変化におけるゲーティング特性の実験と解析を行った。従来のpHジャンプの実験では巨視的電流しか報告されておらず、単一チャネルでのゲーティング変化を詳細に捉えられていない。私達は定常条件ではあるが、詳細なpH依存性ゲーティング変化を単一チャネルレベルで実験を進めた。この測定は長時間記録であるため脂質平面膜に単一のチャネルしか存在しないことが証明でき、真に単一チャネルのゲーティング特性を測定していることになる。予想していなかったゲーティングの効果を発見することができた。一方、酸性pHでの開状態におけるボア開口部の構造についての実験データを原子間力顕微鏡により得ることができ、さらに分子動力学法により開構造を求めた。これらの結果と単一チャネル結果との対応を付けることができた。チャネルの機能を分子レベルで明らかにする上で結晶構造は重要な情報を提供してきたが、いくつかの問題点もあらわになってきた。たとえば可溶化蛋白質であることに伴う問題である。私達はKcsAカリウムチャネルを膜に埋め込まれた状態で、AFMによる構造解析を行い、結晶構造との比較を詳細に検討した。その結果、閉状態の構造は結晶構造と大きな差はなかった。一方、開構造に関してはAFMで末端部まで構造を辿ることができ、構造揺らぎと機能的なチャネル電流揺らぎを対応させることができた。またチャネルの活性化ゲートのゲーティングには膜脂質との相互作用が不可欠であることを明らかにし、さらに脂質の分子種を認識する脂質センサーを特定することができた。これはチャネルN末端のM0ヘリックス構造であり、膜脂質と相互作用するために膜界面上で回転運動をすることを初めて明らかにした。これに加えてAFMではチャネルが膜上で集合・離散することを捉えた。可逆的な集合・離散はチャネルのゲート状態に依存するという発見をした。本年度はDXT法におけるpHジャンプ実験法を完成させ、データ収集を行った。同時にデータ解析のためのプログラム開発を行い、すべての実験データを解析中である。中性pHからpH4程度まで効率よく溶液pHをジャンプし、それにより閉構造から開き始める過程を追跡することができた。とくに注目したのはpHジャンプから大きく構造変化をはじめるまでの時間経過、およびその期間におこっている揺らぎである。これと並行して単一チャネル電流によるpH変化におけるゲーティング特性の実験法を新たに開発し、短時間でしかも繰り返し何度でもジャンプできるシステムをほぼ完成させることができた。これと並行してpH変化における単一チャネルでのゲーティング変化を詳細に捉えた。この測定では長時間記録であるため脂質平面膜に単一のチャネルしか存在しないことが証明でき、真に単一チャネルのゲーティング特性を測定していることになる。さらに活性化ゲートが膜内葉脂質成分により制御されることを発見し、その分子機構が全く新しいものであることを解明することができた。ゲート構造の変化について論文をすでに発表し、さらに新しいpHジャンプ法の関する論文を準備中である。放射光施設の実験時間確保など、さまざまな制約はあるが、SPring-8だけでなく、ESRFなどで十分な実験時間を確保すべく最大限の努力を行っている。一分子測定として他の方法で新しい情報が得られ、多様な結果を統合し、ダイナミック像を得る状況に近づきつつある。25年度が最終年度であるため、記入しない。高輝度放射光施設SPring-8の使用するビームラインの調整が極めて困難であり、また自前で様々な装置を導入する必要があった。またデータの信号雑音比が低いので、回折点を捉え追跡することが難しく、データ解析に膨大な時間を費やすことになった。

一方、1分子機能測定法に関しては予想をはるかに超える方法と成果を得ることができ、数報を出版することができた。研究計画は現在の状況を維持すればよく、変更はない。解析プログラムが完成しつつあり、これを使って現在までの膨大なデータを解析する。25年度が最終年度であるため、記入しない。現在までの研究の方向性は正しいと判断でき、この方針で最後の年度の研究を進めたい。回折点追跡データを様々な観点から解析し構造変化様式の特徴を抽出する。これらの解析の完成を待って速やかに論文作成に移りたい。平行して進める機能解析などの結果は順次論文発表を進めたい。
新しいホスホリパーゼC分子種PLCεの活性制御機構と生体内機能の解析

1ホスホリパーゼCε(PLCε)遺伝子ノックアウトマウスを作製し、半月弁(大動脈弁と肺動脈弁)における顕著な逆流と軽度の狭窄による容量付加に起因する心室拡張という表現型を見いだした。この病因である先天性半月弁形成異常の発生機構を解析した。胎児発生過程の組織学的解析により、ノックアウトマウスの半月弁に見られる弁葉の肥厚と形態異常は、半月弁形成後期のリモデリング期における細胞増殖の亢進によると結論した。上皮増殖因子(EGF)受容体の活性低下変異マウスやヘパリン結合性EGFノックアウトマウスの表現型との類似性から、PLCεがEGF受容体下流でRasのエフェクターとして半月弁細胞の増殖抑制に関わると推測した。実際、半月弁細胞の増殖を誘導する骨形成因子受容体下流のシグナル分子Smad1/5/8の燐酸化がノックアウトマウスでは亢進しており、この結果は上記仮説を支持した。2 DMBAをイニシエータ、ホルボールエステルTPAをプロモータとする二段階皮膚化学発癌系を用い、PLCεがras癌遺伝子依存性の良性腫瘍の発生とその悪性化に重要な役割を持つことを示した。これを多数のPLCεノックアウトマウスを用いて完全に証明すると共に、PLCεの作用機構を解析した。ノックアウトマウスでは、TPA刺激により誘発される皮膚基底層細胞の増殖と上皮の肥厚が野生マウスに比べて著明に抑制されていた。この結果は、PLCεがTPA下流のシグナル伝達に重要な役割を有することを示唆した。3モデル生物線虫においてPLCε遺伝子を破壊し、貯精嚢括約筋の収縮異常に起因する不妊の表現型を得た。4 PLCγ結合部位欠損PDGF受容体を発現したBaF3細胞を用いて、PDGF依存性のPLCε活性化によるカルシウム濃度上昇を蛍光指示薬で測定する系を確立し、PHドメインとRAドメインの重要性を示した。1ホスホリパーゼCε(PLCε)遺伝子ノックアウトマウスでは、生後4週齢の時点で心臓が野生マウスに比べて著明に大きく、Mモード心エコー図により心室内径の増加が見られ心室拡張であることがわかった。ドップラー心エコー図と心カテーテル法により、大動脈弁に中等度の狭窄並びに顕著な逆流が認められ、左心室拡張は大動脈弁逆流による容量負荷によると結論された。肺動脈弁も同様であった。ノックアウトマウスの半月弁には、著明な弁葉の肥厚と形態異常が見られた。この表現型は、上皮細胞増殖因子(EGF)受容体の活性低下変異マウスやヘパリン結合性EGFノックアウトマウスの表現型と酷似しており、PLCεがEGF受容体下流でRasのエフェクターとして半月弁形成に関わっていることが示唆された。2 ra3癌遺伝子依存性の発癌におけるPLCεの役割を個体レベルで解析するため、PLCεノックアウトマウスを用いて、化学発癌剤DMBAをイニシエータ、ホルボールエステルTPAをプロモータとした二段階皮膚化学発癌実験を行なった。その結果、ノックアウトマウスでは、野生マウスに比べパピローマの発生時期が著明に遅延し、発生個数が約4分の1に減少した。更に、扁平上皮癌へのプログレッションが全く起こらなかった。発生した腫瘍では全てH-ras遺伝子に活性型変異が見られた。この結果は、PLCεがras依存性の発癌に重要な役割を持つことを示した。3 PLCεのRasとRap1との結合による細胞内空間

特異的調節機構を解明するため、RasとRap1が各々細胞膜とゴルジ装置という異なった細胞内局在を示す機構を一部解明した。両者のアミノ酸番号85-89の5残基の交換により細胞内局在が逆転する事を発見し、この小領域が局在特異性の決定に必要十分であることを示した。1昨年度の本研究で、ホスホリパーゼCε(PLCε)遺伝子ノックアウトマウスが、半月弁(大動脈弁と肺動脈弁)における顕著な逆流と軽度の狭窄による容量付加に起因する心室拡張を発症することを示した。この病因である先天性半月弁形成異常の発生機構を解析した。胎児発生過程の組織学的解析により、ノックアウトマウスの半月弁に見られる弁葉の肥厚と形態異常は、半月弁形成後期のリモデリング期における細胞増殖の亢進によると結論した。上皮増殖因子(EGF)受容体の活性低下変異マウスやヘパリン結合性EGFノックアウトマウスの表現型との類似性から、PLCεがEGF受容体下流でRasのエフェクターとして半月弁細胞の増殖抑制に関わると推測した。実際、半月弁細胞の増殖を誘導する骨形成因子(BMP)受容体下流のシグナル分子Smad1/5/8の燐酸化がノックアウトマウスでは亢進しており、この結果は上記仮説を支持した。2昨年度に、DMBAをイニシエータ、ホルボールエステルTPAをプロモータとする二段階皮膚化学発癌系を用い、PLCεがras癌遺伝子依存性の良性腫瘍の発生とその悪性化に重要な役割を持つことを示した。これを多数のPLCεノックアウトマウスを用いて完全に証明すると共に、PLCεの作用機構を解析した。ノックアウトマウスでは、TPA刺激により誘発される皮膚基底層細胞の増殖と上皮の肥厚が野生マウスに比べて著明に抑制されていた。この結果は、PLCεがTPA下流のシグナル伝達に重要な役割を有することを示唆した。3モデル生物線虫においてPLCε遺伝子を破壊し、貯精嚢括約筋の収縮異常に起因する不妊の表現型を得た。4 PLCγ結合部位欠損PDGF受容体を発現したBaF3細胞を用いて、PDGF依存性のPLCε活性化によるカルシウム濃度上昇を蛍光指示薬で測定する系を確立し、PHドメインとRAドメインの重要性を示した。
非グルコース環状オリゴ糖合成の新戦略の開拓とその分子認識

水とn-プロパノールの混合溶媒からα-シクロ(2,3-エポキシマンニン)の結晶化を行い,X線構造解析に成功した.n-プロパノールがα-シクロ(2,3-エポキシマンニン)の空洞に包接され,その水酸基が空洞の親水性部位(6-OH側)に,そのn-プロピル基が空洞内部に位置していた.この構造は,昨年報告したエタノールとの包接錯体とは正反対のものである.即ち,後者の場合は,空洞に包摂されたエタノールは,その水酸基を空洞の疎水性部位(エポキシ側)に位置し,包接錯体が二量体となってエタノール水酸基同士の水素結形成を可能にしている.この構造上の相異は,アルコールのメチレン基一個の有無によってもたらされるものであり,空洞がそれを精密に認識できることを意味する.β-CDの構成単位糖であるグルコース1個をアルトロースに変換したaltro-β-CDがゲスト分子をその空洞に取り込むとき,空洞形を変化させることを発見した.即ち,altro-β-CDはH-NMRの解析から1Cと^oS_2コンホーマーがほぼ2/1の比率で速い平衡状態にあるものと推定されたが,これがアダマンタンカルボン酸ナトリウムを取り込むと主に^oS_2コンホメーションをとるようになった.球状のアダマンタン部分を取り込むためにこのようなコンホメーション変化が誘起されたものである.これはホストの基質誘起コンホメーション変化を設計できることを示唆する点で興味深い.さらに,altro-β-CDが平板な形状をしたゲスト分子をその空洞に取り込むとき,アルトロース部分が1Cコンホメーションを取り空洞の形をゲスト分子に合わせる結果,ゲスト分子の自由回転が著しく阻害されることを発見した.またCDの構成単位グルコース複数個を位置特定的にマンノースあるいはアルトロースに高収率で変換し,変形環構造を持つ新規環状オリゴ糖を合成した.γ-シクロデキストリン(以下CDと略)を原料として,その一級水酸基を全てシリル基で保護した後,水素化ナトリウムで2級水酸基を活性化し次いで塩化ベンゼンスルホニルを反応させO-2のスルホニル化とエポキシ化を一挙に行い,二級水酸基側をすべてマンノエポキシドに変換した.この後シリル基を脱保護しγ-シクロ(2,3-エポキシマンニン)を得,これを水で煮沸するという簡単な操作(申請者らの発見した方法)でγ-シクロアルトリンを高収率(γ-CDから37%),短工程(計4工程)で合成した.γ-シクロアルトリンの結晶化を行い,X線結晶解析(独ダルムシュタット工科大の研究協力者所有の装置使用)を試みたが,結晶格子上の問題で不成功に終わった.さらにNMRスペクトルによって溶液中の構造解析を行った.室温では,β-及びγ-シクロアルトリンの構成糖であるアルトロ-ス(α-アノマー)は^1C_4,,^4C_1,^0S_2のコンフォメ-ションの速い平衡状態にあって単一の糖の様相を示していたが,-60°Cでは前者が依然として速い平衡状態にあるのに対し,後者は少なくとも二つのコンフォメーションに分裂する気配が濃厚であった.しかしそれ以上低温にする実験は機器の限度を超えるため断念した.α-シクロ(2,3-エポキシマンニン)の結晶化,X線構造解析に成功した.結晶作成に使用した溶媒エチルアルコールが,空洞に包摂され,水酸基が空洞の疎水性部位(エポキシ側)に位置し,それが二量体となってエチルアルコールの水酸基同士が水素結合をしている興味深い構造であった.この結果は,非グルコース環状オリゴ糖がゲスト分子を包摂する最初の直接的証明である.水とn-プロパノールの混合溶媒からα-シクロ(2,3-エポキシマンニン)の結晶化を行い,X線構造解析に成功した.n-プロパノールがα-シクロ(2,3-エポキシマンニン)の空洞に包接され,その水酸基が空洞の親水性部位(6-OH側)に,そのn-プロピル基が空洞内部に位置していた.この構造は,昨年報告したエタノールとの包接錯体とは正反対のものである.即ち,後者の場合は,空洞に包摂されたエタノールは,その水酸基を空洞の疎水性部位(エポキシ側)に位置し,包接錯体が二量体となってエタノール水酸基同士の水素結形成を可能にしている.この構造上の相異は,アルコールのメチレン基一個の有無によってもたらされるものであり,空洞がそれを精密に認識できることを意味する.β-CDの構成単位糖であるグルコース1個をアルトロースに変換したaltro-β-CDがゲスト分子をその空洞に取り込むとき,空洞形を変化させることを発見した.即ち,altro-β-CDはH-NMRの解析から1Cと^oS_2コンホーマーがほぼ2/1の比率で速い平衡状態にあるものと推定されたが,これがアダマンタンカルボン酸ナトリウムを取り込むと主に^oS_2コンホメーションをとるようになった.球状のアダマンタン部分を取り込むためにこのようなコンホメーション変化が誘起されたものである.これはホストの基質誘起コンホメーション変化を設計できることを示唆する点で興味深い.さらに,altro-β-CDが平板な形状をしたゲスト分子をその空洞に取り込むとき,アルトロース部分が1Cコンホメーションを取り空洞の形をゲスト分子に合わせる結果,ゲスト分子の自由回転が著しく阻害されることを発見した.またCDの構成単位
食品由来の脂質代謝改善因子の新規スクリーニング及びその機能評価

申請研究では、以下の1.、2.の2つの新規の知見を発見した。1.(1)抗動脈硬化因子に焦点を当てた研究では、アポリポタンパク質A-I(ApoA-I)遺伝子発現に対するポリフェノールの影響を検討した。その結果、大豆ゲニステインがヒト肝臓由来培養細胞(HepG2)において、動脈硬化を抑制するApoA-I及びそのmRNAレベルを上昇させた。(2)ラットの動物実験でも、ゲニステイン、ヘスペレチンの摂取は血清アポリポタンパク質A-Iレベル及びその肝臓mRNAレベルを上昇させることを発見した。2.コレステロール(CHOL)吸収抑制因子に焦点を当てた研究では、我々の開発したリン脂質結合大豆ペプチド(ペプシンペプチド及びスミチームペプチド)について、血清CHOL低下作用を有する特定保健用食品に認定されている大豆ペプシンペプチド、キトサン(食物繊維)のCHOL代謝改善作用について比較検討した。(1)ラットの動物実験では、キトサンは体重増加量の顕著な減少を招いた。リン脂質結合大豆ペプチド、大豆ペプシンペプチド及びキトサンは、カゼインと比較して血清・肝臓CHOLが有意に低下した。リン脂質結合大豆ペプチドは最も血清・肝臓CHOLが低下した。(2)in vitroでのCaco-2培養細胞でのCHOL吸収試験では、リン脂質結合大豆ペプチドはCHOL吸収をカゼイントリプシンペプチドと比較して有意に低下させた。以上の結果から、リン脂質結合大豆ペプチドは、特定保健用食品としてすでに認定されている大豆ペプシンペプチドやキトサンよりも優れたCHOL代謝改善作用を発現することを初めて明らかにした。大豆イソフラボンや赤ワインに含まれるアントシアニンやカテキンなどを含めた、ポリフェノールと呼ばれる一群の抗動脈硬化作用は、学術研究発表だけではなく、マスコミなどでも最近頻繁に紹介され、社会的にも高い関心を集めている。そこで、このポリフェノールの抗動脈硬化作用に注目した。しかし、既報の論文の詳細を検討した結果、この抗動脈硬化作用そのものは、実は、Cu^<2+>などを用いた、in vitroでの抗酸化能を検討した成積のみから推定されたものであることが判明した。したがって、抗動脈硬化作用の評価系として不十分であり、さらに新規の評価系が切望されている。そこで、申請研究では、抗動脈硬化作用の新規評価法により、ポリフェノールを評価した。この評価法の特色は、動脈硬化を抑制するアポリポタンパク質A-1(apoA-1)遺伝子プロモーターを利用した遺伝子転写活性評価法である。研究代表者がボストン大学留学により、習得したものであり、関連した成果も、動脈硬化の研究では、国際的に評価の極めて高い雑誌に掲載された(Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.(1998)in press)。apoA-1は、種々の食品成分の摂取により大きく変動することが知られている。しかし、ポリフェノールが、apoA-1に対して影響するという報告は、大豆イソフラボンについてのみ極わずかに報告されているにすぎない。おおよそ4000種類と言われるポリフェノールについての解析は、予想に反して極めて遅れている。そこでapoA-1遺伝子の転写活性に対する大豆イソフラボンをこの新規評価法で評価した。すでに、未発表ながら、驚くべきことに、大豆イソフラボン(ゲニステイン、ダイゼイン)が、ヒトの肝臓の培養細胞において、動脈硬化を抑制するapoA-1のレベルを上昇させるとともに、その遺伝子を活性化させることを発見した。したがって、その他の種々のポリフェノールにも大いに活性が期待できる。これまで、大豆イソフラボンの影響を中心に検討したが,ワイン(ブドウ)成分(アントシアニン、レスベラトロール、カテキン、エピカテキン)、イチョウ成分(ギンコライド、ケンフェロール、ケルセチン)、柑橘類成分(ナリンジン、ヘスペリジン)なども今後検討する方針である。近年、ライフスタイルの変化や食生活の欧米化に伴って、ガン、動脈硬化、高血圧といった生活習慣病が増加している。動脈硬化の原因として高コレステロール血症の関与が指摘されている。

このことから、コレステロール(以下CHOL)低下作用を示す新しい食品や食品成分に関心と期待が高まっている。そこで本研究では、我々の発見した成分の詳細な評価も含め、広範な食品成分から迅速かつ微量で脂質代謝改善因子をスクリーニングする新規の研究手法を導入し、新しい脂質代謝改善因子(CHOL吸収抑制因子、抗動脈硬化因子など)を発見し、その発見因子について、in vivoやin vitroで評価したい。今年度は、CHOL吸収抑制因子に焦点を当てて、我々の開発したリン脂質結合大豆ペプチド(ペプシンペプチド及びスミチームペプチド)について、血清CHOL低下作用を有する特定保健用食品に認定されている大豆ペプシンペプチド、キトサン(食物繊維)のCHOL代謝改善作用について比較検討した。(1)ラットでの動物実験では、キトサンは体重増加量の顕著な減少を招いた。リン脂質結合大豆ペプチド、大豆ペプシンペプチド、及びキトサンは、カゼインと比較して血清・肝臓CHOLは有意に低下した。リン脂質結合大豆ペプチドは最も血清・肝臓CHOLが低下した。(2)in vivoでの放射性CHOLを用いたCHOL吸収試験や、in vitroでのCaco-2培養細胞でのCHOL吸収試験では、リン脂質結合大豆ペプチドはCHOL吸収をカゼイントリプシンペプチドと比較して有意に低下させた。以上の結果から、リン脂質結合大豆ペプチドは、特定保健用食品としてすでに認定されている大豆ペプシンペプチドやキトサンよりも優れたCHOL代謝改善作用を発現することを初めて明らかにした。
プラスチド局在型イソプレノイド系二次代謝の制御と生理的役割

初年度に単離したSfN8DT-1遺伝子を導入した形質転換酵母を用いて、植物エストロジェン活性を有する8_--d_-imethylallyln_-aringenin(8DN)の微生物生産を試みた。酵母培地中にナリンゲニンを添加し培養後、酵母及び培地を別々に回収・抽出した。LC/MS分析の結果、酵母菌体からは8DNは検出されず、培地中から8DNが検出された。この結果より、酵母内在性のDMAPPをプレニルドナーとして添加基質のナリンゲニンがSfN8DT-1によりプレニル化され、生産された8DNは培地中に放出されていることを示した。次に、クララからSfN8DT-1とは基質特異性の異なるプレニル化酵素遺伝子の取得を試みた。クララ培養細胞から新たに単離した9種のフラボノイドプレニル化酵素候補遺伝子を酵母にて発現させ組換え酵素を調製し、酵素活性測定を行ったところ、SfN8DT-1とは基質特異性の異なる酵素をコードするcDNAを二種類見出した。一つ目は、カルコン骨格を有するisoliquiritigeninをプレニル化する活性を有していた。二つ目は、イソフラボン骨格を有するgenisteinにジメチルアリル基を転移する活性を有していたことから、g_-enistein 6_--d_-imethylallylt_-ransferase(SfG6DT)と命名した。SfG6DTは5位に水酸基を有するイソフラボン骨格を特異的に基質にし、他のフラボノイド骨格を持つものは一切基質にならないことが分かった。異なるフラボノイド骨格を基質にする二種類のプレニル化酵素遺伝子、SfN8DT-1とSfG6DTのキメラ酵素(計10種類)を作成し、フラボノイド基質認識機構の解明を目指した。キメラ酵素の酵素活性測定より、アミノ酸一次配列上でフラボノイド基質を決定する部位が、5番目の膜貫通α-ヘリックス領域にあることが示唆された。今後、他の植物種からも類似遺伝子が単離され、遺伝子配列とその酵素機能の情報が蓄積することで、基質認識機構の更なる解明が進むことが期待される。クララ培養細胞由来ESTクローン約10,000個中から、Mg^<2+>依存型プレニルトランスフェラーゼにおける保存モチーフ6種のいずれかを有するクローン200個を選出した。それらをそれぞれ酵母で発現させ、その膜画分を用いてナリンゲニンとDMAPPを基質として酵素活性のスクリーニングを行ったところ、ナリンゲニンに1つのdimethylallyl基を転移する活性を示すものが1クローン得られた。このcDNAをnaringenin 8-dimethylallyltransferase(SfN8DT)と命名した。SfN8DTは、全長1,495bpで410個のアミノ酸をコードしていた。ウェブ上のプログラム予測(TMHMM)から、本タンパク質は9回の膜貫通ドメインを有することが示唆され、生体キノンの生合成に関与する膜結合型プレニルトランスフェラーゼと類似の分子であることが分かった。組換えSfN8DTを用いて基質特異性を調べたところ、本酵素はナリンゲニン以外にはフラバノン骨格を有するヘスペレチンのみをプレニル化し、フラボン、イソフラボン等は基質としなかった。また、クララ培養細胞の主成分であるプレニルフラボノイドSFGの直前の基質であるleachianone Gや、フェノールカルボン酸であるホモゲンチジン酸もSfN8DTの基質とはならなかった。一方、プレニルドナーとしては、DMAPPのみに高い特異性を示すことが分かった。組換えSfN8DTのK_m、至適温度、至適pH、二価カチオン要求性を調べた。ナリンゲニンに対するK_mは55μM、DMAPPに対するK_mは108μM、至適温度は70°C、至適pHは9-11であった。これらは至適温度を除き、クララ培養細胞の膜画分を用いたnativeな酵素において報告されている値と一致した。今後は、SfN8D7の発現解析やタンパク質の局在、生成物の蓄積部位を調べる予定である。本年度は、1年目に単離したSfN8DTの分子生物学的解析を行った。Sf8DTの発現解析を行ったところ、クララ植物体において、SfN8DTは根の形成層より外側の組織で特異的に発現していることが分かった。またHPLC分析より、プレニルフラボノイドは根の形成層より外側の組織のみに蓄積し、Sf8DTの発現の見られない内側の組織や地上部では蓄積が見られないことが分かった。これらの結果から、クララにおけるプレニルフラボノイドの生合成は根の形成層より外側の組織のみで行われ、そのままそこに蓄積されることが明らかとなった。次に、SfN8DTの細胞内局在をGFP融合タンパク質を用いて調べた。SfN8DTとGFPの融合タンパク質は、プラスチド局在のタンパク質、イソプレン合成酵素と同様のドット状の局在を示した。このことから、細胞分画によるnativeなN8DT酵素活性の局在と一致し、SfN8DTの細胞内局在はプラスチドであることが示された。さらにシロイヌナズナにSfN8DTを高発現させ、プレニルフラボノイドの含量を測定した。その結果、形質転換体において、8-dimethylallyl kaempferol(8DK)が生成していることが確認された。