hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
量子通信路の統計的推定理論

本研究の目的は,Hilbert空間H上の状態空間S(H)に作用する量子通信路Γ:S(H)→S(H)が,有限次元パラメタにより滑らかにパラメトライズされているという仮定のもとで,非可換統計学および量子情報幾何学の手法を用い,拡大通信路(id【cross product】Γ)^(【cross product】n)の量子状態空間S(H^(【cross product】2n))への埋め込み方法の最適化,および対応する量子統計的モデルに対する推定量の最適化理論およびその漸近論を研究することにある.本研究で得られた主な研究成果は以下の通りである.1.一般化Pauli型通信路,一般化amplitude-damping通信路,およびSU(d)通信路等の推定理論:標記の通信路の族は,いずれも量子情報理論の諸分野において標準的通信路として確立されたスタンダードな通信路のクラスである.本研究では,非可換統計学,量子情報幾何学,群の表現論等の方法に立脚し,さらにコンピュータを併用した実験数学的手法を駆使して,これら通信路に対する最適推定方法を完全に導出すると共に,その背景には,出力状態族のなす多様体の膨張・崩壊現象があることを明らかにした.2.局所不偏推定量に基づく適応的推定の漸近論:Holevoにより提唱された局所不偏推定量の概念は,推定すべき真のパラメタ値に依存して定まるため,実用的には意味がないという類いの主張をする研究者もいる.これに対しNagaokaは,最尤推定法と組み合わせた適応的推定の文脈では,十分意味のある推定量となっているであろうという予想を1987年に発表していたが,その証明は未解決であった.本研究では,マーチンゲール理論を用いて,局所不偏推定量に基づく適応的推定が強一致性および漸近有効性を有することを証明した.この結果はNagaokaの予想の肯定的な解決を与えるものである.本研究の目的は,Hilbert空間H上の状態空間S(H)に作用する量子通信路Γ:S(H)→S(H)が,有限次元パラメタにより滑らかにパラメトライズされているという仮定のもとで,非可換統計学および量子情報幾何学の手法を用い,拡大通信路(id【cross product】Γ)^(【cross product】n)の量子状態空間S(H^(【cross product】2n))への埋め込み方法の最適化,および対応する量子統計的モデルに対する推定量の最適化理論およびその漸近論を研究することにある.本研究で得られた主な研究成果は以下の通りである.1.一般化Pauli型通信路,一般化amplitude-damping通信路,およびSU(d)通信路等の推定理論:標記の通信路の族は,いずれも量子情報理論の諸分野において標準的通信路として確立されたスタンダードな通信路のクラスである.本研究では,非可換統計学,量子情報幾何学,群の表現論等の方法に立脚し,さらにコンピュータを併用した実験数学的手法を駆使して,これら通信路に対する最適推定方法を完全に導出すると共に,その背景には,出力状態族のなす多様体の膨張・崩壊現象があることを明らかにした.2.局所不偏推定量に基づく適応的推定の漸近論:Holevoにより提唱された局所不偏推定量の概念は,推定すべき真のパラメタ値に依存して定まるため,実用的には意味がないという類いの主張をする研究者もいる.これに対しNagaokaは,最尤推定法と組み合わせた適応的推定の文脈では,十分意味のある推定量となっているであろうという予想を1987年に発表していたが,その証明は未解決であった.本研究では,マーチンゲール理論を用いて,局所不偏推定量に基づく適応的推定が強一致性および漸近有効性を有することを証明した.この結果はNagaokaの予想の肯定的な解決を与えるものである.本研究の目的は,Hilbert空間H上の状態空間S(H)に作用する量子通信路Γ:S(H)→S(H)が,有限次元パラメタθによりΓ=Γ_θと滑らかにパラメトライズされているという仮定の下で,非可換統計学および量子情報幾何学の手法を用い,拡大通信路(id【cross product】Γ_θ)^<【cross product】n>の量子状態空間S(H^<【cross product】2n>)への埋め込み方法の最適化,および対応する量子統計的モデルに対する推定量の最適化理論およびその漸近論を研究することにある.本年度の主な研究成果は以下の通りである.(1)一般化Pauli通信路:S(C^2)上のPauli通信路は,量子情報理論の諸分野で一つの標準的通信路として確立された,物理的・工学的に重要な通信路のクラスである.この意味で,Pauli通信路の推定問題を研究することは,本研究の計画段階からの重要課題の一つであったが,本年度の研究において,S(C^2)上のPauli通信路のみならず,これをさらに一般化したS(C^d)上の一般化Pauli通信路の推定問題に対する完全な解決をみることができた.まず,拡大次数n=1に対しては,最大エンタングルド状態を入力とした時かつその時に限り出力状態族の量子Fisher計量が最大となる埋め込みが実現されること,および,モデルのパラメタが∇^mアファインである時かつその時に限り有効推定量が存在することを証明した.この定理の背景には,一般化Pauli通信路の集合が,上記埋め込みを介してd^2-1次元確率単体と情報幾何学的に同一視できるという事実が有効に機能している.

本研究ではさらに,任意の拡大次数nに対し,n=1の推定方式のiid拡張が統計学的に最適であることも証明した.(2)∇^e-自己平行量子通信路:量子情報理論で頻繁に用いられるdepolarizing通信路,bit flip通信路,phaseflip通信路,bit-phase flip通信路などの通信路は,S(C^2)上のPauli通信路の部分モデルとみなせるが,上述の最適化された埋め込みにより,これらはいずれも3次元確率単体P^3の∇^e-自己平行な統計多様体と同一視できることを証明した.また,この事実を(1)の結果と結び付けることにより,これらの通信路に対する最適推定方式も統一的に議論できることを明らかにした.さらに,S(C^d)上の一般化Pauli通信路の部分モデルの推定問題も研究し,一般次元depolarizing通信路を含む∇^e-自己平行量子通信路の概念を導入し,その推定理論を統一的に展開することに成功した.この結果は,良く知られた未解決問題の一つに対する完全な回答を与えるものである.本研究の目的は,Hilbert空間Η上の状態空間S(Η)に作用する量子通信路Γ:S(Η)→S(Η)が,有限次元パラメタθによりΓ=Γ_θと滑らかにパラメトライズされているという仮定の下で,非可換統計学および量子情報幾何学の手法を用い,拡大通信路(id【cross product】Γ_θ)^<【cross product】n>の量子状態空間S(Η^<【cross product】2n>)への埋め込み方法の最適化,および対応する量子統計的モデルに対する推定量の最適化理論およびその漸近論を研究することにある.本年度の主な研究成果は以下の通りである.(1)一般化amplitude-damping通信路:S(C^2)上のamplitude-damping通信路は,2つの緩和時定数が等しい場合のスピン緩和モデルであり,物理的・工学的に重要な通信路のクラスをなしている.本研究では,有限温度効果も取り入れるよう一般化したamplitude-damping通信路のパラメタ推定問題を研究し,数式処理を併用した実験数学的手法を駆使して,拡大次数n=1の場合の最適推定方法を完全に特徴付けた.(2)SU(2)通信路:昨年度の研究で明らかになった拡大次数n=1の場合の群軌道の膨張・崩壊現象を,任意の拡大次数nに一般化して研究を行った.ここではLie環su(2)の表現論およびCramer-Rao不等式の幾何の手法を駆使し,Cramer-Rao型下界がO(1/n^2)で減少すること,およびその背景には出力状態族のなす多様体の半径がO(n)で増大する現象があることを明らかにした.本研究の目的は,Hilbert空間H上の状態空間S(H)に作用する量子通信路Γ:S(H)→S(H)が,有限次元パラメタにより滑らかにパラメトライズされているという仮定のもとで,非可換統計学および量子情報幾何学の手法を用い,拡大通信路(id【cross product】Γ)^(【cross product】n)の量子状態空間S(H^(【cross product】2n))への埋め込み方法の最適化,および対応する量子統計的モデルに対する推定量の最適化理論およびその漸近論を研究することにある.本年度の主な研究成果は以下の通りである.1.局所不偏推定量に基づく適応的推定の漸近
日本住血吸虫の感染防御免疫機構の解析

住血吸虫症の知見はマウスや霊長類などの実験動物を用いた実験から得られているが、霊長類は高価なことや倫理的問題等から実験動物としては扱いにくいことや、マウスは小動物であることから住血吸虫の持続的な感染に耐えられないなど、住血吸虫症のモデルとしては不適当な部分も存在する。中国の浸淫地においては水牛、牛、家豚などが重要な日本住血吸虫の保有宿主となっており、コントロールの面も重要な対策である。ブタの免疫応答、臓器等についてヒトとの類似点も数多く報告されており、近年移植医療などの臓器提供動物として注目されている。特にミニブタは3ヶ月程で成熟し、従順であること、一年成豚でも体重は40kg程度と家豚と比較して扱いやすい。本研究はこのミニブタの実験動物としての日本住血吸虫感染感受性及び感染経過を観察し、実験モデルとしての可能性を検討する事を目的として行った。実験に用いたミニブタは日本においてゲッチンゲン系ミニブタとオーミニ系ミニブタを交配して確立した系統であるクラウン系ミニブタを用いた。2頭の生後6週の雄(体重、C1:3.0kg、C2:2.5kg)に中国大陸株の日本住血吸虫セルカリアを200隻経皮感染させその経過を観察した。感染後6週より糞便中に虫卵の排出をみとめた。8週目に便中の虫卵数はピークとなりその後徐々に減少傾向は示したものの感染25週後まで排出され続けた。超音波検査では門脈領域のエコーレベルの上昇を認め、日本住血吸虫に特異的といわれる肝小葉の末端には点状の斑紋を認め初期段階ではあるが、肝線維化傾向を示した。感染27週目に行ったパーフュージョンの結果、35匹(雄20、雌13、11ペア)が回収された。また、組織学的検査では、肝臓、脾臓、膵臓、mesenteric lymphnodes、小腸・肺の各組織に虫卵結節が存在することを認めた。この結果から実験動物モデルとして、ワクチントライアル、あるいは住血吸虫感染後の肝線維症モデルの開発等に応用が可能と考えられる。
AE支援による心持ち大断面材の割れ防止高温乾燥技術に関する基礎研究

心持ち柱材の乾燥においては、問題となっている表面割れ等のセンシング技術が確立されていない。実験的には木材乾燥においてAE法の利用が試みられているが、木材中のAE波は減衰が著しいため実大材での研究例は少なく、特に心持ち柱材の乾燥における検討例はない。ここで、心持ち柱材の表面割れは材面の板目中央で起こることが一般である。そこで、釘を打ち込むなどして傷をつけることにより、最初の割れ発生位置を特定できるとの仮定の下、実証を試みた。心持ち柱材の板目中央に釘を打ち込み、その釘のAEを乾燥過程で測定した。蒸煮中は、割れと関係なくAEの発生が見られた。その後の乾燥過程では、短時間のAE発生の増加が見られたものでは表面割れを生じていることから、表面割れをモニタリングできているものと考えられた。さらに、高温乾燥で問題となる内部割れについても、AE測定を試みた。心持ち柱材の内部割れは、髄から対角線状に発生していることが多い特徴があることから、材面の幅方向の端から3cmの位置に深く釘を打ち込み、その釘のAEを測定した。内部割れがでない蒸煮中では、表面割れの測定と同様、AEの発生が多く見られた。すなわち、蒸煮中のAEは割れとは別の因子によるものであることが、改めて確認された。その後の表層が急激に乾燥する初期の過程で乾燥温度に関係なくAEの増加が見られた。一般に内部は未だに高含水率で内部割れが生じないとされる期間であり、内部割れに起因してはいないものと思われる。表層部でのみ収縮が生じ、内層部とのせん断変形(ずれ)から釘に接する木材組織で、微視的な破壊が起こったものと推察される。内部割れが発生した条件については、蒸煮後1日経過以降に、比較的長期にわたりAE発生の増加が見られた。すなわち、内部割れは一度に短時間で発生するのではなく、乾燥中期以降、比較的長時間にわたり少しずつ伸展していくことが推測された。本年度は、スギ等心持ち大断面材の乾燥時に発生するAE(アコースティックエミッション)のモニタリングから割れの発生時期を事前に判断して乾燥条件を制御するためのシステムを構成するとともに、スギ正角材の従来型スケジュール(高湿条件から低湿条件へ変化)に適用した際のAE発生挙動と湿度制御について動作確認試験を行った。本システムは、乾燥状態の情報として被乾燥材の重量(含水率)およびAEカウントレートを採用した。すなわち、乾燥装置となる恒温恒湿装置上部の電子天秤に吊り下げた供試材の重量を計り、RS232Cでパーソナルコンピュータへ入力するとともに、AEセンサで感知した信号をAEテスタでカウント信号としてPIOインターフェイスを介して同様にパーソナルコンピュータへ連続的に取り込んだ。一方、コンピュータからはGP-IBインターフェイス、プロトコルコンバータを介して恒温恒湿装置の温度および相対湿度をコントロールできるようにシステムを作製した。このシステムを利用して森林総合研究所が提案した含水率スケジュールの平衡含水率に対応するように温度80°Cで相対湿度を自動的に変化させるとともに、AEのカウントレートが一定のしきい値を越えると相対湿度を下げないか、逆に上昇させる機能を付加している。今回の実験においては、AEカウントレートは含水率40%程度で極大値を示し、相対湿度の測定値よりも制御値が高い値となり、AEによる制御が効いていることが確認できた。さらに乾燥が進むと、AEの発生は少なくなり、相対湿度の制御値と測定値はほぼ同じ値で推移し、表面割れもなく乾燥が仕上がった。

なお、このAEの発生傾向は、従来測定されていた同乾燥温度条件の心持ち柱材幅方向表面応力に類似しており、AEが表面割れの危険性の推移を的確に示しているものと推察された。心持ち柱材の乾燥においては、問題となっている表面割れ等のセンシング技術が確立されていない。実験的には木材乾燥においてAE法の利用が試みられているが、木材中のAE波は減衰が著しいため実大材での研究例は少なく、特に心持ち柱材の乾燥における検討例はない。ここで、心持ち柱材の表面割れは材面の板目中央で起こることが一般である。そこで、釘を打ち込むなどして傷をつけることにより、最初の割れ発生位置を特定できるとの仮定の下、実証を試みた。心持ち柱材の板目中央に釘を打ち込み、その釘のAEを乾燥過程で測定した。蒸煮中は、割れと関係なくAEの発生が見られた。その後の乾燥過程では、短時間のAE発生の増加が見られたものでは表面割れを生じていることから、表面割れをモニタリングできているものと考えられた。さらに、高温乾燥で問題となる内部割れについても、AE測定を試みた。心持ち柱材の内部割れは、髄から対角線状に発生していることが多い特徴があることから、材面の幅方向の端から3cmの位置に深く釘を打ち込み、その釘のAEを測定した。内部割れがでない蒸煮中では、表面割れの測定と同様、AEの発生が多く見られた。すなわち、蒸煮中のAEは割れとは別の因子によるものであることが、改めて確認された。その後の表層が急激に乾燥する初期の過程で乾燥温度に関係なくAEの増加が見られた。一般に内部は未だに高含水率で内部割れが生じないとされる期間であり、内部割れに起因してはいないものと思われる。表層部でのみ収縮が生じ、内層部とのせん断変形(ずれ)から釘に接する木材組織で、微視的な破壊が起こったものと推察される。内部割れが発生した条件については、蒸煮後1日経過以降に、比較的長期にわたりAE発生の増加が見られた。すなわち、内部割れは一度に短時間で発生するのではなく、乾燥中期以降、比較的長時間にわたり少しずつ伸展していくことが推測された。
ストレス刺激伝達形におけるASK1ならびにASK2の解析

アポトーシスのシグナル伝達機構は、最終的な細胞死の実行機構としてのシステインプロテアーゼの解析を中心に研究が進められているが、アポトーシスの誘導シグナルについては不明な点が多い。われわれは、ASK1-MAPキナーゼ系の活性制御機構ならびにASK1誘導性アポトーシスの分子機構の解明を中心に研究を行なった。前年度までの研究成果からASK1活性制御機構の分子機構として、チオレドキシンならびにTRAF2がそれぞれASK1の活性抑制因子ならびに活性化因子として機能していることが明らかになっていた。本年度は両者の相対関係を検討した結果、TNF-TRAF2系によるASK1の活性化機構ではTRAF2とASK1の結合に先行してチオレドキシンの不活化ならびにASK1からの解離が誘導されることが明らかになった。また、ASK1によって誘導されるアポトーシスの過程では、ASK1によって活性化されたJNKによるBcl-2のリン酸化が重要な役割を果たしていることが明らかにされた。さらに構成的活性化型ASK1を用いた実験等により、細胞内でのASK1の活性化はアポトーシスのみならず、ASK1の活性化の程度に応じて細胞分化を誘導しうることが明らかになった。さらにASK1による細胞分化誘導は主にp38が活性化されることによるものであることが示唆された。われわれは本年度の研究成果として、TNFがASK1-MAPキナーゼ系の活性化に至る分子機構を明らかにした。またASK1が強く活性化されるとASK1-JNK系がBcl-2のリン酸化を介してアポトーシスを誘導するのに対し、ASK1-p38系は少なくとも一部の細胞で分化誘導に働くことが明らかになり、分化と死のシグナル伝達の連続性が示唆された。アポトーシスは、組織恒常性の維持に最も重要な細胞機能メカニズムのひとつである。本研究の大きな目的は、ASKl(Apoptosis Signal-regulating Kinase l)を介したアポトーシスシグナル伝達経路を明らかにすることにより、アポトーシスの細胞内分子機構解明に努めるものであり、本年度は特にASKl結合蛋白質によるASKl活性化機構の解析を進めた。(1) ASKl抑制性制御分子としてのチオレドキシンの同定:ASKl活性化の分子機構を明らかにする目的で、酵母two-hybridシステムを用いASKl結合タンパク質の解析を行ったところ、酸化還元(レドックス)タンパク質、チオレドキシン(T)がASKlのN末端に直接結合することを見いだし、チオレドキシンがASKlの特異的抑制因子として活性酸素種によるASKl活性化を介したアポトーシスにおける負の制御機構に寄与していることを明らかにした。(2) ASKl活性化制御分子としてのTRAF2の同定TNFのシグナル伝達分子であるTRAF2の直接的なエフェクター分子としてのASKlの可能性について検討を行なったところ、TRAF2はASKlに結合するとともにASKlを活性化し、TNFシグナル伝達におけるJNK pathwayにおいてTRAF2-ASKl経路がたいへん重要な位置を占めることが明らかにされた。(3) ASKl活性化制御分子としてのDaxxの同定:Fasからのシグナル伝達分子DaxxとASKlの関連性について検討したところ、DaxxはASKlに結合するとともにASKlを活性化し、Fasシグナル伝達におけるJNK pathwayにおいてDaxx-ASKl経路が生理的役割を持つことが明らかにされた。以上のように本年度はASKl活性制御分子メカニズムとしてひとつの抑制因子とふたつの活性化因子の同定に成功した。今後はこれらの分子機構を介したシグナル伝達が組織恒常性維持におけるアポトーシスにどのように関わっているかを生体内で明らかにする必要がある。

アポトーシスのシグナル伝達機構は、最終的な細胞死の実行機構としてのシステインプロテアーゼの解析を中心に研究が進められているが、アポトーシスの誘導シグナルについては不明な点が多い。われわれは、ASK1-MAPキナーゼ系の活性制御機構ならびにASK1誘導性アポトーシスの分子機構の解明を中心に研究を行なった。前年度までの研究成果からASK1活性制御機構の分子機構として、チオレドキシンならびにTRAF2がそれぞれASK1の活性抑制因子ならびに活性化因子として機能していることが明らかになっていた。本年度は両者の相対関係を検討した結果、TNF-TRAF2系によるASK1の活性化機構ではTRAF2とASK1の結合に先行してチオレドキシンの不活化ならびにASK1からの解離が誘導されることが明らかになった。また、ASK1によって誘導されるアポトーシスの過程では、ASK1によって活性化されたJNKによるBcl-2のリン酸化が重要な役割を果たしていることが明らかにされた。さらに構成的活性化型ASK1を用いた実験等により、細胞内でのASK1の活性化はアポトーシスのみならず、ASK1の活性化の程度に応じて細胞分化を誘導しうることが明らかになった。さらにASK1による細胞分化誘導は主にp38が活性化されることによるものであることが示唆された。われわれは本年度の研究成果として、TNFがASK1-MAPキナーゼ系の活性化に至る分子機構を明らかにした。またASK1が強く活性化されるとASK1-JNK系がBcl-2のリン酸化を介してアポトーシスを誘導するのに対し、ASK1-p38系は少なくとも一部の細胞で分化誘導に働くことが明らかになり、分化と死のシグナル伝達の連続性が示唆された。
ゲノムインプリンティングにおいてＵＨＲＦ１が果たす役割の解明

ゲノムインプリンティングとは父母の配偶子形成過程でエピジェネティックな情報(DNAメチル化やヒストン修飾)がゲノムに刷り込まれ、受精後生涯を通して由来するゲノムにより遺伝子発現に差が出る現象であり、その異常はヒトの先天性異常の原因ともなる。本研究では、ゲノムインプリンティングの分子基盤の理解を深めるために、UHRF1というエピジェネティック制御因子がインプリンティングの確立・維持に果たす役割を調べた。その結果、UHRF1は卵子におけるインプリンティングの確立には関与しないが、着床前胚におけるインプリンティングの維持に重要な役割を果たしていることが明らかとなった。DNAメチル化は始原生殖細胞でリセットされ、成長期卵子においてDnmt3a/Dnmt3L複合体により性特異的なメチル化パターンが形成される。受精後、そのメチル化パターンはインプリンティング領域など一部の領域を除いて再びリセットされ、その後分化に伴い細胞系列特異的なメチル化パターンがDnmt3aおよびDnmt3bによって確立され、Dnmt1/Uhrf1複合体によって維持される。Uhrf1コンベンショナルノックアウトマウス胚は胎生10.5日頃に致死となるため、成長期卵子および初期胚におけるUhrf1のインプリンティングの確立および維持に果たす役割については調べられていなかった。そこで卵子特異的Uhrf1コンディショナルノックアウトマウス(♀)を作製し、野生型(♂)と交配したところ、母性Uhrf1ノックアウトマウス胚は胚盤胞期前後に致死となることがわかった。これは、母性Dnmt1ノックアウトマウス胚よりも重篤な表現型であり、Uhrf1がDnmt1の補助因子としての役割以外に重要な生理的機能を持つことを示唆している。この研究計画を書いた当初はUhrf1のインプリンティングに与える影響を調べることが第一目的であったが、予想以上に重篤な表現型であったため、Uhrf1が初期発生に与える影響の原因をインプリンティングに留まらず広範に調べることにした。Uhrf1ノックアウト卵子および母由来Uhrf1ノックアウトマウス初期胚の各種ヒストン修飾の免疫染色をおこなったが、顕著な異常は認められなかった。現在、完全成長卵子(FGO)の全ゲノムメチル化解析をおこなっているところで、プレリミナリーな結果だが、Uhrf1ノックアウト卵子では野生型卵子と比較してグローバルなメチル化も母由来にメチル化されるインプリンティング制御領域のメチル化も、10%程度低下しているという結果が得られている。このメチル化の低下は、in vivoでUhrf1がde novoメチル化に補助的な役割を果たしている可能性を示す初めてのデータである。ゲノムインプリンティング(以下インプリンティング)は父母の配偶子形成過程でエピジェネティックな「情報」が一旦消去された後、再度ゲノムに刷り込まれ、受精後生涯を通して由来するゲノムにより遺伝子発現に差が出る現象である。この現象の分子機構は特定ゲノム領域(ICR: imprinting control region)のDNAメチル化の相違に起因する場合が大半だが一部例外も存在し、ヒストン修飾の関与が示唆されている。Uhrf1はDNAメチル化の維持およびヒストン修飾の認識・付加に関与するエピジェネティック制御において重要なタンパク質であるが、複数のドメインを持ち、多くのタンパク質と複合体を形成するため、これまで知られていない生理的役割を果たしている可能性がある。私たちは生殖細胞特異的Uhrf1ノックアウトマウスを作製し、Uhrf1ノックアウト雌雄生殖細胞および初期胚の解析を通じてUhrf1がインプリンティングに果たす役割の解明を目指して研究を進めている。これまでに、私たちは生殖細胞特異的Uhrf1ノックアウトマウスを作製し、このようなマウスでは精子形成不全や初期発生に異常が起こることから、Uhrf1が精子形成および初期発生に重要であることを見出した。今後は、Uhrf1のノックアウトによって分子生物学的にどのような異常が生じているのかを検討し、Uhrf1の機能を詳細に調べる予定である。ゲノムインプリンティングとは父母の配偶子形成過程でエピジェネティックな情報がゲノムに刷り込まれ、受精後生涯を通して由来ゲノムにより遺伝子発現に差が出る現象である。この現象はインプリンティング制御領域(ICR)のDNAメチル化のアレル間の相違に起因する場合が大半だが、一部ヒストン修飾の関与も示唆されている。UHRF1はDNAメチル化の伝達およびヒストン修飾の認識・付加に関与するエピジェネティック制御において重要なタンパク質で、DNAのメチル化依存的及び非依存的なインプリンティングの両方に関与している可能性があった。そこで本研究では、UHRF1ノックアウト生殖細胞および着床前胚を用いて、UHRF1がインプリンティングに果たす役割の解明を目指してきた。初年度は、Uhrf1は胎盤におけるDNAメチル化非依存的なインプリンティングに関与しないことを明らかにした。

昨年度はUhrf1が卵子においてICRのメチル化の確立に一部関与している可能性を示すデータが得られ研究実績として報告したが、その後、次世代シーケンサーのバージョンアップに伴う機械トラブルに起因した見せかけの低下であることが判明し、Uhrf1は卵子におけるメチル化の確立に寄与しないことがわかった。最終年度である本年度は、着床前胚における広範な脱メチル化に抗してUhrf1がDnmt1と共にICRのメチル化を維持するかどうかについて調べた。野生型の胚盤胞期胚とUhrf1母方ノックアウト(Uhrf1ノックアウト卵子x野生型精子)胚盤胞期胚のメチローム解析をおこなったところ、Uhrf1母方ノックアウト胚盤胞期胚では、ICRのメチル化が数%まで減少していることがわかり、Uhrf1は着床前胚においてICRのメチル化維持に寄与していることがわかった(投稿準備中)。興味深いことに、Uhrf1母方ノックアウト胚盤胞期胚におけるメチル化の低下率はDnmt1母方ノックアウト胚盤胞期胚よりも顕著であり、現在この原因の究明を進めている。エピジェネティクス平成25年度は平成24年度に作製した卵子特異的Uhrf1ノックアウトマウスを用い、Uhrf1ノックアウト卵子と野生型の精子を受精させて得られた胚が胚盤胞期前後で胎生致死となることの原因を探った。なおこのシビアな表現型はインプリンティング領域のDNAメチル化異常だけでは説明がつかないものなので、インプリンティングの異常に着目しつつも、その他の要因も視野に入れて研究を進めている。Uhrf1ノックアウト完全成長卵子(FGO)は肉眼的には正常に見えるが、受精後早期に現れる発生異常の原因がFGOに既に蓄積されているのではないかと考え、FGOのヒストン修飾の状態とDNAメチル化の状態を調べている。これまでに各種ヒストン修飾抗体を用いてFGOの免疫染色をおこなったが、調べたヒストン修飾には顕著な異常は見つからなかった。現在、FGOのDNAメチル化について全ゲノムメチル化解析をおこなっている。プレリミナリーなデータだが、Uhrf1ノックアウト卵子では野生型卵子と比較してグローバルなメチル化も母由来にメチル化されるインプリンティング制御領域(ICR)のメチル化も10%程度低下していた。このメチル化の低下は、Uhrf1がDnmt3a/Dnmt3Lによるde novoメチル化に補助的な役割を果たしていることを示唆しており、in vivoでUhrf1が維持メチル化ばかりではなく、de novoメチル化に関与することを示した初めての知見となる。ただし、この結果からだけでは母由来Uhrf1コンディショナルノックアウトマウスが早期に胎生致死になるシビアな表現型の説明はつかず、根本的な原因をさらに追求している。また、当初計画にあった胎盤でD N Aメチル化非依存的にインプリンティングを受ける遺伝子の発現制御にUhrf1が関与するかどうかの検討も終了し、Uhrf1がノックアウトされた胎盤でもD N Aメチル化非依存的なインプリンティングは保たれていたので、この制御機構にUhrf1は関与しない事がわかった。
励起希ガス雰囲気中の半導体クラスター生成とその応用

1.希ガス励起状態と超微粒子の構造の相関ガスに導入した放電電流によってArガス原子を電子励起させた状態に設定し,この励起希ガス雰囲気中でGeの超微粒子を作製した.透過型電子顕微鏡による晶癖評価,結晶構造解析,ラマン分光によるフォノン構造評価などを行って,超微粒子の構造と希ガス励起状態との相関を見いだした.この成果は希ガス相の状態を変えることにより,生成する微粒子の構造をを制御できる可能性を示唆している.2.励起希ガス中蒸発法によるGeクラスター生成時の発光スペクトルルツボ周囲の微粒子形成場において,励起原子およびイオンの発光強度およびスペクトル(発光線の相対強度)の空間分解測定を行った.Ge原子の空間密度,Arガス温度,プラズマ中電子温度のなどの状態量をスペクトルから推定し,クラスター形成反応のダイナミクスについて考察した.3.希ガス中アーク放電法により作製されたカーボンナノチューブのラマン散乱カーボンナノチューブはガス冷却過程で形成される,極めて特異なナノ構造体であると考えられる.アーク放電法によって作製した直径の大きさの揃った単層カーボンナノチューブ(東北大粕谷教授より提供していただいた)のフォノン構造を,ラマン分光法とその理論解析の両面から調べた.ラマンスペクトルに観測される特異な構造は,フォノンおよび電子状態のナノチューブ周方向に生じる量子効果(zone-folding)とナノチューブの一次元性を反映した結果であることを示した.1.希ガス励起状態と超微粒子の構造の相関ガスに導入した放電電流によってArガス原子を電子励起させた状態に設定し,この励起希ガス雰囲気中でGeの超微粒子を作製した.透過型電子顕微鏡による晶癖評価,結晶構造解析,ラマン分光によるフォノン構造評価などを行って,超微粒子の構造と希ガス励起状態との相関を見いだした.この成果は希ガス相の状態を変えることにより,生成する微粒子の構造をを制御できる可能性を示唆している.2.励起希ガス中蒸発法によるGeクラスター生成時の発光スペクトルルツボ周囲の微粒子形成場において,励起原子およびイオンの発光強度およびスペクトル(発光線の相対強度)の空間分解測定を行った.Ge原子の空間密度,Arガス温度,プラズマ中電子温度のなどの状態量をスペクトルから推定し,クラスター形成反応のダイナミクスについて考察した.3.希ガス中アーク放電法により作製されたカーボンナノチューブのラマン散乱カーボンナノチューブはガス冷却過程で形成される,極めて特異なナノ構造体であると考えられる.アーク放電法によって作製した直径の大きさの揃った単層カーボンナノチューブ(東北大粕谷教授より提供していただいた)のフォノン構造を,ラマン分光法とその理論解析の両面から調べた.ラマンスペクトルに観測される特異な構造は,フォノンおよび電子状態のナノチューブ周方向に生じる量子効果(zone-folding)とナノチューブの一次元性を反映した結果であることを示した.本年度は以下の項目について研究を行った.1.クラスター作製装置従来のガス中蒸発装置に改良を加え,励起状態の希ガス原子雰囲気中でのクラスター作製装置を試作した.この装置は,希ガス励起用電極を装備している.この電極に十数V以上の電圧を印加することにより,微粒子の形成の行われるルツボ上の空間で,励起Ar電子を効率よく生成できることが確認できた.2.空間分解発光スペクトルの観測空間分解スペクトル測定および資料の評価のためのラマン分光を迅速に行うために,CCD検出器を新たに購入した.GeのArガス中蒸発を行いながら,ルツボの中心軸を含む面内で発光スペクトルを測定し,ルツボ周辺における励起Ar原子及び励起Ge原子密度の空間分布を求めた.●Geの発光は,Arの発光が生じる場合にのみ観測される.●Geの発光の分布はArに比して局在しており,ルツボ上約10mmより上では急速に減衰し,同時にGe_2が観測された.これらの結果より,Geは励起Ar原子との衝突により励起され,その後拡散過程で急速に冷却されると同時にGe dimerを形成するという,クラスター生成の初期過程に関する知見が得られた.3.ガス中蒸発(He中アーク放電)により生成されたカーボンナノチューブのラマン散乱炭素クラスターのラマン散乱を測定し,ナノチューブのフォノン状態における有限サイズ効果を見いだした.ガス中蒸発雰囲気中の励起Arが、クラスター生成過程においていかなる役割を果たし,生成した微粒子の構造や物性にどのような影響を及ぼすのか.それを調べるのが本年度の目的であった.そのため,発生スペクトルおよび質量分析のその場測定を行って,クラスター形成の初期過程の機構を解明しようと試みた.1.透過型電子顕微鏡によるGe超微粒子の粒径分布測定.基盤上に堆積したGe微粒子の粒径を電顕像から測定し,粒径分布ガス圧依存性の定量的評価をおこなった.Arガス圧14TorrでGe微粒子の平均粒径は210nmをとり,ほぼガウス分布にしたがっていることが確認された.この粒径分布には,励起Ar雰囲気中で作成した場合でも大きな変化は認められなかったが,基板上での微粒子の捕集量がこの場合には著しく低下した.基板と荷電微粒子とのクローン反発など,電極電位の印加に伴う作用と考えられるが,今後装置上の改善が要求される.2.空間分解発光スペクトルの観測および解析.Ge原子・イオンの励起が,励起Ar原子からのエネルギー遷移よるものであることが,種々のArガスの励起(グロー放電)の条件下での発光分光を行うことで明らかになった.

現在,Ar,Ge原子の発光強度空間分布から,励起原子やイオン等の空間密度や温度等の定量的評価を試み,Ar-Ge間のエネルギー遷移機構等の分析を行っている.3.質量分析による分子,イオン種の同定.本年度の設備備品として購入した四重極質量分析計を用いて,微粒子過程の気体の組成分析を試みた.これによりGeの2量体および3量体の分布密度を定量的に知ることができ,クラスター形成の初期過程がわかる.現時点ではガスの局所サンプリングに困難があり,ルツボ直上の活性領域での分析には成功していない.本研究では主に炭素C,シリコンSi,ゲルマニウムGeなどの4族元素について,ガス中蒸発法による半導体クラスターの生成過程と,生成したクラスターおよび超微粒子の構造・物性の評価を行った.(1)希ガス励起状態と超微粒子の構造の相関.ガスに導入した放電電流によってArガス原子を電子励起させた状態に設定し,この励起希ガス雰囲気中でGeの超微粒子を作製した.透過型電子顕微鏡による晶癖評価,結晶構造回析,ラマン分光によるフォノン構造評価などの方法を用いて,超微粒子の構造と希ガス励起状態との相関を調べた.(2)励起希ガス中蒸発法によるGeクラスター生成時の発光スペクトル.励起原子およびイオンの発光強度はAr,Geともにルツボの上12cmで最も大きく,そこから急激に強度が低下することが,発光スペクトルの空間分布測定から明らかになった.同時にスペクトル形状(発光線の相対強度)にも空間依存性が観測された.Ge原子の空間密度,Arガス温度,プラズマ中電子温度のなどの状態量をスペクトルから推定し,クラスター形成反応のダイナミクスについて考察した.(3)希ガス中アーク放電法により作製されたカーボンナノチューブのラマン散乱.アーク放電法によるカーボンナノチューブは,ガス冷却過程で形成されるナノ構造体の極めて特殊な場合としてとらえることができる.本研究では450800nmの励起光波長を用いて単層ナノチューブの共鳴ラマン散乱を測定し,ナノチューブの構造(チューブ半径やカイラリティ)と電子状態,さらにそれらの相互作用に関して考察した.ラマンスペクトルに観測される特異な構造は,フォノンおよび電子状態のナノチューブ周方向に生じる量子効果(zone-folding)とナノチューブの一次元性を反映した結果である.
種々の神経内分泌腫瘍の統合的な理解に向けたがん抑制遺伝子PHLDA3の機能解析

PHLDA3はAktの活性化を抑制し、肺と膵臓の神経内分泌腫瘍(NET)のがん抑制遺伝子として機能する。さらにPHLDA3遺伝子欠損マウスでは、膵ランゲルハンス島(膵島)の過形成など内分泌組織の異常が観察される事から、PHLDA3が様々な器官に生じるNETの抑制に重要であると考えられる。そこで本研究では、PHLDA3の消化管NETにおける重要性を調べる目的で、消化管NET検体を収集し、PHLDA3のLOHを調べた。また、膵NETに見られる、PHLDA3遺伝子欠損による膵島のアポトーシス耐性獲得が、膵島移植へ応用可能できることを明らかにした(PLOS ONE, 2017)。神経内分泌腫瘍(NET)は肺や内分泌器官、消化管などに生じる。我々はPHLDA3がAkt機能を抑制し、肺と膵臓のNETにおいてがん抑制遺伝子として機能することを明らかにした。これらのNETではPHLDA3が高頻度なヘテロ接合性の消失(LOH)を呈し、PHLDA3のLOHをもつ膵NETは予後不良であることがわかっている(Cell, 2009、PNAS, 2014)。また我々はPHLDA3欠損マウスにおいて、内分泌器官の異常を観察している。本研究ではヒトNETにおけるPHLDA3遺伝子異常の解析とPHLDA3欠損マウスに生じる異常の分析を行い、種々のNETの発症機構の解明を目指す。(1)ヒト消化管NET検体におけるPHLDA3遺伝子異常の探索:PHLDA3欠損マウスでは膵島の過形成と下垂体NETが観察されていることから、PHLDA3が全身に発生するヒトNETの重要ながん抑制遺伝子であることが推察される。そのため、これまでに調べた肺、膵臓に加え、ヒトNETの半数を占める消化管NET検体においてPHLDA3のLOHが起きていないかを調べる。平成27年度は検体の収集を行った。(2)PHLDA3欠損マウスに生じる異常の分析: PHLDA3欠損マウスでは膵島の過形成と下垂体NETが観察されている。一方でヒトNETは膵臓以外にも下垂体、肺、上皮小体、副腎、甲状腺、消化管、胸腺など、全身に発生する。平成27年度は、PHLDA3欠損マウスにおいてこれら器官の異常が起きていないか調べ器官の標本を作製した。ヒトNET検体の収集が順調に進んでいるため。また、マウスの観察についても順調に標本数を蓄積している。平成28年度は検体の収集およびLOH解析を行った。平成28年度は、PHLDA3欠損マウスにおいて一部の器官に異常を観察した。(3)種々のNETには共通の発症機構が存在するのではないかと考え、PHLDA3を起点として培養細胞を使用した分子機構の解析を開始した。ヒトNET検体の収集および解析が順調に進んでいるため。また、マウスの観察についても研究に資する所見を得たため。我々はPHLDA3が細胞膜脂質に結合することによってAkt機能を抑制し、肺と膵臓のNETにおいてがん抑制遺伝子として機能することを明らかにした。本研究ではPHLDA3遺伝子異常の解析を行い、種々のNETの発症機構の解明を目指した(結果1、2)。また、PHLDA3遺伝子が細胞の増殖、アポトーシスを抑制することから、膵島移植への応用を考え、実験を行った(結果3)。(結果)1.培養細胞におけるPHLDA3タンパク質の機能解析を行った。その結果、PHLDA3結合分子を見出し、Akt活性、細胞増殖への影響を確認した。

今後は、研究期間に収集したPHLDA3欠損マウスの異常が認められた内分泌器官において、見出した分子の機能的関与を調べる。2. PHLDA1に類似の構造を持つPHLDA1遺伝子の解析を行った。PHLDA1のAkt活性、細胞増殖への影響、ドメイン構造の解析、細胞膜脂質に対する結合性について調べた。結果は論文にまとめ、投稿中である。3. PHLDA3遺伝子の欠損は、膵島細胞をアポトーシス耐性にする(PNAS, 2014)。このことから、PHLDA3遺伝子の欠損が膵島移植に役立つのではないかと考えて実験を行った。膵島細胞を死滅させた糖尿病モデルマウスにPHLDA3欠損膵島を移植したところ、膵島が効率よく定着し、機能した(PLOS ONE, 2017)。PHLDA3はAktの活性化を抑制し、肺と膵臓の神経内分泌腫瘍(NET)のがん抑制遺伝子として機能する。さらにPHLDA3遺伝子欠損マウスでは、膵ランゲルハンス島(膵島)の過形成など内分泌組織の異常が観察される事から、PHLDA3が様々な器官に生じるNETの抑制に重要であると考えられる。そこで本研究では、PHLDA3の消化管NETにおける重要性を調べる目的で、消化管NET検体を収集し、PHLDA3のLOHを調べた。また、膵NETに見られる、PHLDA3遺伝子欠損による膵島のアポトーシス耐性獲得が、膵島移植へ応用可能できることを明らかにした(PLOS ONE, 2017)。(1)ヒト消化管NET検体におけるPHLDA3遺伝子異常の探索:検体の収集およびLOH解析を行う。(2)PHLDA3欠損マウスに生じる異常の分析:PHLDA3欠損マウスにおいて全身の内分泌器官の異常が起きていないか調べる。さらに本年度は検体の収集に加え、組織像の解析を行う。複数のヒトNETにおいてPHLDA3が重要ながん抑制遺伝子であるという証拠が得られたこと、PHLDA3欠損マウスが複数のNETを発症したことから、種々のNETには共通の発症機構が存在するのではないかと考え、PHLDA3を起点として培養細胞を使用した分子機構の解析を開始する。分子腫瘍学予算内訳を計画した当初より安く試薬を購入できたため。当初計画していたより物品を安く購入でき、旅費もかからなかったため。解析を目的に、主に物品費、旅費、人件費に使用する。
次世代南極点ニュートリノ望遠鏡を実現する４π高感度チェレンコフ光検出器の開発

宇宙ニュートリノ観測は高エネルギー宇宙線起源の解明に向けて有力なツールである。しかし、現在の観測頻度は世界最大1ギガトン検出器体積を持つニュートリノ検出器、IceCubeをもってしても30事象/年と限定的である。観測頻度を格段に向上させるため次世代のニュートリノ望遠鏡では8ギガトンにも及ぶ超巨大な検出器体積を狙うが、実現に向けては従来の検出器技術では費用と性能の両面で難しい。そこで本研究では、安価に有効感度面積を稼ぐことのできる波長変換ファイバを利用した新しい方式の氷中チェレンコフ光検出器を開発する。期間内に南極点深氷河に埋設可能な技術実証プロトタイプ機の完成を目指す。
シャペロニンを介した新生蛋白質の構造形成機構

巨大なポリペプチドが正しい立体構造を形成するときに、立体構造形成を介添えする蛋白質(シャペロン蛋白質)群が関与する。大腸菌Escherichia coliに存在するGroELはシャペロニンと呼ばれる原核生物のシャペロン蛋白質で、真核生物のHSP60と相同的な蛋白質である。GroESはコシャペロニンとも呼ばれ、GroELと共に機能する分子シャペロンの1つである。ATPの加水分解とポリペプチドの高次構造の形成が行われるこのフォールディング機構をシャペロニン・サイクルとよび、多くのモデルが示されている。本課題は、GroELの蛋白質介添え機構を解明するために、GroELの構造を溶液散乱法で検討した。中性子溶液散乱法は中性子が、重水素と軽水素で異なる散乱を起こすので、軽水素蛋白質と重水素化蛋白質の複合体解析を行うのに有用である。重水素化したGroEL、GroESとロダネーゼにより、組み合わせを変えてこれらの3元複合体を形成し、中性子散乱を測定した。散乱パターンに変化がみられており、現在モデリングを行っている。原核生物のシャペロニンGroELは、コシャペロニンGroESとともに機能する分子シャペロンの1つで、in vitroおよびin vivoで蛋白質の高次構造形成を促進する役割を持つ。シャペロニンの仲介するプロテイン・フォールディングの機構は未だ明確ではない。中性子散乱は軽水素と重水素の散乱が異なるので、軽水素化タンパク質と重水素化タンパク質の複合体の解析に有用である。そこで、変性蛋白質とシャペロニンGroELから成る複合体のフォールディング中間体を解析するために、重水素化蛋白質の作製を試みた。重水素下中で、大腸菌の成長と蛋白質合成は非常に難しい。私は以下の点を改良した。1)M9グルコース最小培地にNZ amine、ビタミン類、鉄、銅、マグネシウム、マンガン、コバルトの各塩を加えた。2)核酸を大腸菌の成長のために培地に添加した。3)グルコース濃度を3%にした。大腸菌の増殖は、M9グルコース培地のみの時よりもおおむね2倍程度の菌量を得ることができた。シャペロニンGroELの場合、SDS電気泳動でわずかながら分子量の位置が高分子量側にシフトしていた。GroEL、GroESおよび基質になるポリペプチドの重水素化蛋白質をこの培地で作製した。同様に軽水のGroEL、GroESおよび基質になるポリペプチドの各蛋自質も作製した。次年度、これらの蛋白質を組み合わせて、重水素化蛋白質-軽水素化蛋白質の複合体を中性子散乱で測定する。
日本人潰瘍性大腸炎感受性遺伝子SLC26A3の遺伝子多型機能解析

潰瘍性大腸炎の発症には遺伝的素因が関与していることが疫学的研究から明らかになっている。2009年に行ったゲノムワイド相関解析によって、いくつかの日本人潰瘍性大腸炎の感受性遺伝子が新たに報告された。しかし、ゲノムワイド相関解析では相関を示す遺伝子多型を決められた多型セットから抽出するだけであり、実際に相関を示している多型がその多型とは限らない。また、その多型が疾患と相関するかどうかをみているだけであり、疾患の病態や病型、治療反応性などとの関連は不明である。本研究では、その中の一つであるSLC26A3遺伝子について、その相関がどのようなものであるかを明らかにし、感受性を示すメカニズムを探ることを目的とした。遺伝子解析をより詳細に行うため、SLC26A3遺伝子の上流にあるrs2108225について、臨床データや他の感受性遺伝子の遺伝子型とともに検討を行った。対象は東北大学病院を受診した潰瘍性大腸炎患者260人と、健常人ボランティア654人とし、まず各群での対立遺伝子頻度の違いについてカイ二乗検定で検討を行った。その結果、対立遺伝子Cの頻度が、患者群で69.6%、健常人群で64.1%であり、有意に患者群で頻度が多いことが確認された。(p値0.0262,オッズ比1.28)。また、他の感受性遺伝子候補との関連を見るため、これまでに報告したNKX2.3遺伝子、HLA-B*52遺伝子について、それぞれのリスクキャリアとそれ以外に分けて相関解析を行った。その結果、NKX2.3遺伝子については、NKX2.3遺伝子リスクキャリアのみにおいてSLC26A3が相関を示した(p=0.00472,オッズ比=1.44)。また、HLA-B*52については、B*52キャリアと非キャリアでSLC26A3対立遺伝子頻度が有意に異なり(p=0.0212)、B*52キャリアでは相関を示さず、非キャリアでのみ相関を示した(p=0.00167,オッズ比=1.69)。このことから、SLC26A3は、他の感受性遺伝子との相互作用がある可能性が示唆された。
組換え蛍光標識法による天疱瘡抗原のバイオイメージング法の開発

本年度は、表皮角化細胞間接着に重要なデスモソームの構成蛋白であるデスモグレイン(Dsg)3、ならびにデスモソームを裏打ちする中間径線維の一つであるケラチン14(K14)に、それぞれ蛍光蛋白質を融合した発現ベクターを複数作成した。そして作成した発現ベクターを培養角化細胞株に遺伝子導入して、発現蛋白の細胞内における局在を観察した。角化細胞に対する遺伝子導入効率に優れたK5プロモータの下流に、マウスDsg3全長およびGFPのcDNAをタンデムに挿入した発現ベクターを作成した。作成した発現ベクターをPam212培養マウス角化細胞株に遺伝子導入したところ、Dsg3-GFP融合蛋白が角化細胞同士の接着面において点状に発現する像が認められた。またK5プロモータの下流に、DsRedおよびhuman K14のcDNAを挿入した発現ベクターを作成してPam212細胞に遺伝子導入したところ、DsRed-hK14融合蛋白が細胞質において網状の構築を示した。さらにDsg3-GFPおよびDsRed-hK14の発現ベクターをPam212細胞にco-transfectionしたところ、同一細胞において膜表面に発現したDsg3-GFPが、DsRed-hK14により裏打ちされる像が観察された。以上の結果より、今回作成したcDNAは、培養生細胞におけるデスモソーム関連蛋白の細胞内局在の経時的変化を解析する上で有用なツールとなると考えられた。今後は作成したcDNAを用いて、アデノウイルス発現系を用いた蛍光融合蛋白の培養角化細胞における発現解析、ならびにmDsg3-GFPならびにDsRed-hK14を表皮基底細胞に発現したdouble transgenic mouseの作成を試みる予定である。
大脳皮質における層特異的な神経結合の形成機構の研究

大脳皮質から他の能部位への遠心性神経結合では、特定の皮質層に属するニューロンが対応する標的部位へ軸索を投射することが知られている。この皮質遠心性結合の形成機構を解明するために、大脳皮質視覚野から上丘への軸索投射(5層の細胞が上丘へ軸索を伸展させる)に焦点を当てorganotypic cocultureを用いて解析した。大脳皮質切片、上丘組織片を新生、胎生期のラットから切り出し両組織片を共培養した。培養約1週間後に蛍光色素DiIを皮質の浅層部あるいは深層部に置いて標識される軸索の投射パターンを調べた。DiIを浅層に注入した場合、多くの軸索は皮質の最下層に到達したが、上丘組織片内にはほとんど侵入していなかった。一方、DiIを深層部に注入した場合は、一部の軸索が上丘内で伸展していることが観察された。次に浅層からの軸索が上丘に侵入しない要因を調べるために、上丘を一端ホルマリン固定ならびに熱処理を加えた後、生きた皮質組織片と共に培養した。皮質の浅層にDiIを置いてその軸索の伸長パターンを観察すると、ホルマリン固定、熱処理を加えた上丘片には多数の標識された軸索が伸展していることがわかった。さらに、この処理した上丘に軸索を投射するニューロンの層分布をDiIの逆行性標識により調べた。生きた上丘と皮質の共培養では標識された細胞が5層に局在するのに対して、処理した上丘と皮質の共培養ではその分布はかなり広がったものになった。これらの結果は、固定、熱処理を受けた上丘に対しては皮質2/3層からの軸索が伸長できるようになることを示すものと考えられる。従って、上丘には2/3層ニューロンの軸索伸長にとっては排斥的な因子が存在するが、固定、熱処理によってそれが失活したと考えられる。さらにこの因子は5層ニューロンの軸索伸展には効果が無いことから、かなりの選択性を有する軸索伸長排斥物質であると考えられる。