hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
骨伝導性と破骨細胞吸収性を併せ持つ高機能型ＧＢＲ複合膜の開発

生分解性高分子のポリ乳酸グリコール酸共重合体(PLGA)に低結晶性炭酸アパタイト(CO3Ap)と各種細胞成長因子を複合化することで、上皮細胞を遮断する機能だけでなく、骨芽細胞の増殖や分化を積極的に促し、最終的には骨リモデリングに調和し、生体内で分解吸収され完全に骨に置換されるGBR膜を開発した。さらに、細胞および実験動物を用いて、開発した材料の有用性を実証した。生分解性高分子のポリ乳酸グリコール酸共重合体(PLGA)に低結晶性炭酸アパタイト(CO3Ap)と各種細胞成長因子を複合化することで、上皮細胞を遮断する機能だけでなく、骨芽細胞の増殖や分化を積極的に促し、最終的には骨リモデリングに調和し、生体内で分解吸収され完全に骨に置換されるGBR膜を開発することである。平成24年度はFGF-2含有PLGA/ CO3Ap複合膜の破骨細胞吸収活性のインビトロ評価と骨芽細胞を用いたFGF-2含有PLGA/ CO3Ap複合膜のインビトロ評価を行った。まずFGF-2含有PLGA/ CO3Ap複合膜上に破骨細胞を播種し、一定期間培養し、その後、破骨細胞の吸収活性をセメント表面の吸収窩数および吸収窩面積より定量化した。また破骨細胞による吸収活性の評価と疑似ラッフルボーダー実験によるPLGA/ CO3Ap複合膜の溶解速度の結果から、FGF-2含有PLGA/ CO3Ap複合膜の溶解性が破骨細胞による吸収に及ぼす影響を検討した。その結果、FGF-2含有PLGA/ CO3Ap複合膜は破骨細胞吸収活性が高く、CO3Ap濃度に依存して高くなる傾向を示した。オステオカルシンなどから骨芽細胞の活性を評価し、FGF-2が骨芽細胞の活性化に及ぼす影響を検討した。その結果、FGF-2含有の複合膜において、優れた骨分化および増殖能を認め、さらにコラーゲン合成量やALP活性も経時的に高くなる傾向を示した。以上よりFGF-2含有PLGA/ CO3Ap複合膜はインビトロ実験においては骨芽細胞の増殖や分化を促し、生体内で分解吸収される優れた複合膜となりうる可能性が示唆された。FGF-2含有PLGA/ CO3Ap複合膜による骨組織修復能力の実験動物を用いた短期評価を行った。ラット脛骨に骨欠損を形成し、同骨欠損部をFGF-2含有PLGA/ CO3Ap複合膜で覆い固定した。コントロールとしては、FGF-2で修飾されていないPLGA/ CO3Ap複合膜設置群および膜を設置しない群とした。術後、経時的に当該部位を周囲組織と一塊にして摘出し、脱灰、非脱灰組織切片を作製し、組織学的にPLGA/ CO3Ap複合膜の生体親和性について検討した。また、骨伝導能および骨置換速度の評価と定量的に新生骨量について測定した。その結果、FGF-2含有PLGA/ CO3Ap複合膜群は両コントロール群と比較してどの観察期間においても骨形成が良好であった。また骨伝導能、骨置換速度においてもFGF-2含有PLGA/ CO3Ap複合膜は早期に優れた結果を示した。さらに,脱灰標本からFGF-2含有PLGA/ CO3Ap複合膜修飾の有無によるALP、オステオカルシン、BSP、オステオポンチンmRNAの発現量の違いをin situハイブリダイゼーション法にて検討した結果、FGF-2含有PLGA/ CO3Ap複合膜群はすべてのmRNAの発現量において高かった。続いてFGF-2含有PLGA/ CO3Ap複合膜による骨造生とインプラント植立実験を行った。ウサギ脛骨に骨欠損を作成後、純チタンインプラントを植立した。欠損部周囲の自家骨を採取し骨欠損部に骨造生を行い、その上にFGF-2含有PLGA/ CO3Ap複合膜を設置した。その後インプラント周囲の骨の状態について、経時的に非脱灰組織切片を作製後、組織学的検討を行った。その結果、FGF-2含有PLGA/ CO3Ap複合膜による骨造生した群はコントロール群と比較して、良好なオッセオインテグレーションを認め、新生骨量も有意に高かった。本研究の目的は生分解性高分子のポリ乳酸グリコール酸共重合体(PLGA)に低結晶性炭酸アパタイト(CO3Ap)と各種細胞成長因子を複合化することで、上皮細胞を遮断する機能だけでなく、骨芽細胞の増殖や分化を積極的に促し、最終的には骨リモデリングに調和し、生体内で分解吸収され完全に骨に置換されるGBR膜を開発することである。平成23年度は、GBR膜として機能するために必要な柔軟性を維持可能な範囲において、PLGAとCO3Apの複合化を行い、疑似ラッフルボーダー実験のデータに基づいて、PLGAとCO3Apの配合比等、膜組成の最適化を行った。また組成が最適化されたPLGA/CO3Ap複合膜に対しFGF-2の複合化を試み、FGF-2徐放量の経時変化を調べた。

PLGA/CO3Ap配合比の異なる複合膜を作製し、X線回折法と赤外分光法を用いて複合膜の結晶構造や炭酸含有量を検討した結果、特に構造、組成にはPLGAの添加の影響はみられず複合膜が作製することが可能であることが分かった。また、疑似ラッフルボーダー実験において、混合比1:1の複合膜が最も最適な結果となった。そのため。PLGA/CO3Ap配合比の1:1複合膜においてFGF-2の複合化を試み、FGF-2徐放量の経時変化を125IでラベルしたFGF-2を用いて、作製したPLGA/ CO3Ap複合膜を蒸留水(1mL)に浸漬し、経時的に蒸留水中のradioactivityをシンチレーションカウンターにて測定検討した。その結果、FGF-2の含有量に比例してFGF-2徐放量も多くなる傾向がみられた。交付申請に提出した計画内容と実施する年度どおりに研究が進んでおり、ほぼその結果についても予定どおりに達成されているため、今後もスムーズに研究計画に沿った実験が可能であるため。今後は、FGF-2含有PLGA/ CO3Ap複合膜による骨組織修復能力の実験動物を用いた短期評価とFGF-2含有PLGA/ CO3Ap複合膜による骨造生とインプラント植立実験を行う予定である。本研究(計画)に使用する機器、器材も所有し、動物実験を規則に準じて適切に行う施設もあるため、問題なく研究の推進が図れる体制である。今後は、FGF-2含有PLGA/CO3Ap複合膜について、骨芽細胞および破骨細胞を用いたインビトロ評価を行い、最終的には実験動物を用いて、組織適合性および骨形成能についての評価を行います。本研究(計画)に使用する基本物性実験・動物実験に関する機器もほとんど所有し、動物実験を規則に準じて適切に行う施設もあるため問題なく研究の推進が図れる体制である。次年度は、動物を用いた実験を行うため、研究費は試薬、実験動物(含エサ代)に使用する予定である。特に現在のところ、研究計画の変更などは考えておりません。次年度は、細胞および動物を用いた実験を行うため、研究費は主に試薬、ガラス器具、実験動物(含エサ代)に使用する予定である。
推論による未知語処理プロセスを通した語彙ネットワーク構築過程の検証

本研究の目的は,学習意図の無い状況下で起こる英語語彙学習の認知プロセスを明らかにすることである。具体的には,日本人英語学習者の文脈内語彙学習に焦点を当て,推論による未知語処理を通して記憶される語彙情報が,どのようなプロセスを経て知識として体系化されるのかを明らかにする。本課題の最終年度となる平成27年度は,これまでの実験環境で得られた結果を教室環境で再現すること,および研究成果を博士論文としてまとめることを中心に研究を進めた。これまでの研究結果から,日本人英語学習者は単語と文脈の意味的類似度に基づいて未知語の意味を推論し,推論内容を心内に符号化していることが明らかになった。実験的な要因として使用した意味的類似度は,言語統計解析モデルの一つである潜在意味解析により規定されていた。そこで,英語リーディングのような言語活動に付随する語彙学習の効率を上げるための教材作成に向けて,潜在意味解析の応用可能性をさらに追及した。単語ー文脈の意味的類似度が文脈内語彙学習の成果を予測する要因になるのかを検証したところ,意味的類似度が高くなるほど未知語の意味・用法の付随的学習が促進され,その効果は意図的学習の場合よりも大きくなることが分かった。以上の結果は,付随的語彙学習の認知プロセスは,潜在意味解析理論が前提とする,言語学習の用法基盤モデルに従うことを示している。また,付随的語彙学習はテキスト理解に伴う記憶表象構築のプロセスと密接に関連していることが分かった。博士論文では結論部分で,英文テキストからの付随的語彙学習の効果を向上させるための教育的介入として,潜在意味解析を利用した教材開発,タスクを用いた読解指導の在り方,語彙知識の多面的な評価方法を提案している。27年度が最終年度であるため、記入しない。本研究の目的は,日本人英語学習者の文脈内語彙学習に焦点を当て,推論による未知語処理を通して記憶される語彙情報が,どのようなプロセスを経て知識として体系化されるのかを明らかにすることにある。1年目の研究となるH25年度は, (a)英文読解中に未知語推論が起こる条件, (b)文脈情報と未知語の意味的関連度が語彙習得に与える影響,および(c)推論された意味と単語の形式情報とが結合する過程を明らかにするための実証実験を行った。研究(a)では,日本人英語学習者は文脈の制約に敏感であり,未知語の意味を特定する手掛かりとなる文脈の位置に関わらず未知語推論を行っていることが明らかとなった。この結果は2つの追試でも再現され,文脈の制約が強い場合には未知語推論が行われること,および制約の強い文脈情報が目標語の後ろに位置する場合には推論の難しさが増すことが示された。研究(b)では,文脈情報と未知語の意味的関連度が語彙学習の成果を予測するのかを明らかにするため,潜在意味解析を応用した実験を行った。その結果,文脈との意味的関連度が低い目標語ほど,その意味・語法は学習されにくく,そのような阻害効果は文脈を用いた語彙学習を普段から行わない学習者に対して顕著に見られることが分かった。研究(c)では,日本語での記銘・英語での記銘・記銘指示なしという読解条件下で,未知語を含む英文を読解した後に語形情報の再認課題を行うことで,語形情報の記憶へのアクセス可能性を調べた。実験の結果,未知語の意味が理解されると語形情報へのアクセス可能性が低下するものの,学習者の目標言語である英語での記銘を行うことでアクセス可能性の低下を防ぐことができることが示唆された。平成26年度は,(a)未知語の意味が英文読解中の推論により特定され,推論された情報が心内に符号化されるかを明らかにするための事象関連電位実験,および(b)潜在意味解析により数値化された単語ー文脈間の意味的類似度が意図的な語彙学習の成果を予測するかの実証実験を行った。研究(a)では,未知語に対して惹起されるN400の性質を利用し,文脈情報に基づく推論により未知語の意味が特定されるかどうかを検討した。さらに,同じ未知語を(1)意味的に正しい形で使用されている文と(2)意味的に通じない形で使用されている文の中で再提示し,推論された情報が心内に符号化されているかどうかを検証した。実験の結果,日本人英語学習者は読解中であっても,手掛かりの多い文脈において未知語の意味を即座に推論できることが明らかとなった。さらに,推論された情報は心内にある程度符号化されており,別文脈への知識の適用が可能であることが示唆された。研究(b)では,目標語と文脈間の意味的類似度が異なる項目を複数用意し,日本人英語学習者に目標語の意味・用法を意図的に学習させた。実験の結果,文脈を上手く語彙学習に利用できない学習者であっても,単語ー文脈間の意味的類似度が高い場合には文脈情報を活用して目標語の意味・用法を学習できることを明らかにした。しかし,意味的類似度が低いと,文脈情報を利用できる学習者と比べて語彙学習の成果は著しく低下することが示された。研究計画通りの進捗が見られ,研究成果は学会発表や査読論文において一定の評価を得ている。

本研究の目的は,学習意図の無い状況下で起こる英語語彙学習の認知プロセスを明らかにすることである。具体的には,日本人英語学習者の文脈内語彙学習に焦点を当て,推論による未知語処理を通して記憶される語彙情報が,どのようなプロセスを経て知識として体系化されるのかを明らかにする。本課題の最終年度となる平成27年度は,これまでの実験環境で得られた結果を教室環境で再現すること,および研究成果を博士論文としてまとめることを中心に研究を進めた。これまでの研究結果から,日本人英語学習者は単語と文脈の意味的類似度に基づいて未知語の意味を推論し,推論内容を心内に符号化していることが明らかになった。実験的な要因として使用した意味的類似度は,言語統計解析モデルの一つである潜在意味解析により規定されていた。そこで,英語リーディングのような言語活動に付随する語彙学習の効率を上げるための教材作成に向けて,潜在意味解析の応用可能性をさらに追及した。単語ー文脈の意味的類似度が文脈内語彙学習の成果を予測する要因になるのかを検証したところ,意味的類似度が高くなるほど未知語の意味・用法の付随的学習が促進され,その効果は意図的学習の場合よりも大きくなることが分かった。以上の結果は,付随的語彙学習の認知プロセスは,潜在意味解析理論が前提とする,言語学習の用法基盤モデルに従うことを示している。また,付随的語彙学習はテキスト理解に伴う記憶表象構築のプロセスと密接に関連していることが分かった。博士論文では結論部分で,英文テキストからの付随的語彙学習の効果を向上させるための教育的介入として,潜在意味解析を利用した教材開発,タスクを用いた読解指導の在り方,語彙知識の多面的な評価方法を提案している。今後は本研究に関わる発展的課題に着手する。得られた成果については学会や論文投稿という形で発表し,外部機関による客観的な評価を確認しながら計画を進めていく。27年度が最終年度であるため、記入しない。研究計画通りの進捗が見られ,研究成果は学会発表や査読論文において一定の評価を得ている。今後は2年目の研究計画および発展的課題に着手する。
摂食抑制ホルモンNesfatin1の脂肪分化抑制機構の解明と肥満治療への応用

【方法と結果】3T3-L1細胞を用いた。ウエスタンブロットによると、Nucb2の発現は脂肪細胞へ分化するに従い減少した。3T3-L1細胞のconditional mediumとヒトの血漿中にNucb2が存在することをウエスタンブロットで確認し、血漿中には凡そ50nMの濃度で存在すると計算された。種々の濃度のGST-Nucb2を3T3-L1細胞の培養液中に、脂肪細胞への分化開始48時間前から、24時間または48時間ごとに添加し、分化開始後8日目にoil red染色で脂肪細胞への分化の程度を評価した。その結果、50nMで明らかな抑制効果を得た。RT-PCRにてPPARγ、adipsinのmRNA量を、ウエスタンブロットにて発現量を評価したところ、同様の結果を得た。Nucb2からはNesfatin-1が形成されるので、GST-Nesfatin-1、GST-ΔNesfatin-1[Nucb2からNesfatin-1部分を除いたもの]について同様の検討を行ったが、脂肪細胞への分化抑制作用は認められなかった。【考察】Nucb2には脂肪細胞への分化抑制作用が存在する。摂食抑制因子であるNesfatin(Nesfatin-1の前駆体)並びにNesfatin-1には脂肪分化抑制作用が存在すること、その際のNesfatinにおける主な生理作用部位はNesfatin-1であり他のNesfatin部分にはその作用が認められないこと、を新しく見出した。実験デザインは、GST融合蛋白として当研究室で作製したものを3T3L1培養細胞の培養液中に隔日で1日1回添加するものであった。種々の濃度で検討をした結果、150nMのNesfatin-1で約50%の脂肪分化抑制効果を認めた。しかし、連日投与にすると20nMの濃度でも明らかな抑制効果が確認出来たので、添加した蛋白はdegradationを受けていたと思われた。また、培養液中に添加された蛋白は、一部であるが細胞内へ取り込まれている可能性が明らかになりつつある。一方、Nesfatinは3T3L1細胞にも存在していることをreal time PCRとwesternblotとで確認したが、Nesfatin-1の存在はwesternblotでは確認出来ていない。Nesfatinは脂肪分化のステージが進むにつれてdownregulateされることも判明した。作用機序としては、Nesfatinがインスリン作用に拮抗してその効果を発揮している可能性を考えている。コンピューターソフトに依る解析では、NesfatinのY180(RHEEFKKYEMMKEHE)とY350(TEDELKEYESIIAIQ)がインスリン受容体により燐酸化を受け得るモチーフ内に存在するチロシン残基(Nesfatinはインスリン受容体の基質である可能性がある)であり、Y180が燐酸化されるとPI3キナーゼのp85 subunitのSH2 domainに対して結合部位を提供する可能性がある。実験結果は、Nesfatinはインス1リン刺激によりチロシン燐酸化を受けている可能性が大きいものであり、作用機序の解明へ向けて更に研究を進めている。2.細胞培養液中に添加したNesfatin-1は、細胞増殖を抑制することを見出した。具体的には、H1792腫瘍細胞にNesfatin-1 100nMを添加しcolony formation assayで評価したところ、明らかな抑制効果を確認した。脂肪細胞への分化誘導には、前駆細胞の細胞数も重要な因子なので、この細胞増殖抑制作用も、Nesfatin-1が脂肪細胞の分化を抑制する機序に関わっている可能性がある(新知見)。3.Nesfatin-1のELISAによる測定系を立ち上げた。そして、人の血中Nesfatin-1濃度とBMIの関係を調べたところ、有意な負の相関を認めた。Nesfatin-1は人の肥満・体脂肪量に深く関わっている可能性がわかってきた(新知見)。【方法と結果】3T3-L1細胞を用いて検討を行った。未分化な状態及び脂肪細胞へ分化した状態のいずれにおいてもNucleobindin-2が発現していることをウエスタンブロットで確認したが、脂肪細胞へ分化するとその発現量は分化前に比して減少していた。

次に、3T3-L1細胞のconditional mediumとヒトの血漿中にはNucleobindin-2が存在することをウエスタンブロットで確認したが、血漿中には凡そ50nMのNucleobindin-2が存在すると計算された。そこで、Nucleobindin-2の生理的な機能を検討する目的で、種々の濃度のGST-Nucleobindin-2を3T3-L1細胞の培養液中に、脂肪細胞への分化(Dexamethasone、インスリン、IBMXのカクテルを用いた)開始48時間前から、24時間または48時間ごとに添加し、分化開始後8日目にoil red染色で脂肪細胞への分化の程度を評価した。その結果(対照はGST添加群)、50nMで明らかな抑制効果を得た。RT-PCRにてPPARγ、adipsinのmRNA量を、ウエスタンプロットにて蛋白発現量を定量的に評価したところ、oil-red染色と同様の結果を得た。Nucleobindin-2からはNesfatin-1が形成されるので、GST-Nesfatin-1、GST-△Nesfatin-1[Nucleobindin-2からNesfatin-1部分を除いたもの]について同様の検討を行ったが、各々には脂肪細胞への分化抑制作用は認められなかったので、Nucleobindin-2が作用を発揮するためには、その全長が必要であることが明らかとなった。【考察】生体内に於けるNucleobindin-2の主たる産生部位は未解明だが、Nucleobindin-2には脂肪細胞への分化抑制作用が存在する事が示された。【本研究の意義】Nucleobindin-2はNesfatin-1の前駆物質であるが、Nucleobindin-2自体も分泌シグナルを有しており、本研究で示した様に培養液中や血漿中に存在している。既に、インスリン分泌への作用が報告されているが、本研究は新たな生理作用を報告するものである。現在、固有の受容体探索を行っており、脂肪分化の新たな機序解明、肥満の新規治療法の開発に向けて本研究は大きな可能性を含んでいると考えられる。
パイエル板組織内共生ネットワークを介した生体防御システムの構築

腸管には腸管免疫システムと呼ばれる精密な免疫システムが備えられており、中でもパイエル板は腸管免疫の制御における中核的な役割を担っている。最近ではその制御に腸内細菌が変わっていることが示されている。本研究においては、研究代表者が独自に見いだしたパイエル板組織内共生細菌であるAlcaligenesと、腸内細菌とパイエル板依存的に誘導される腸管IgA高産生細胞に関する知見を統合し、Alcaligenesを介した腸管での免疫制御について、生体と菌体の両面から解明することを目的に研究を遂行した。その結果、Alcaligenesの生菌が持つ機能と菌体成分であるLPSを介した免疫制御について明らかにした。腸管には粘膜免疫システムと呼ばれる精密かつダイナミックな免疫システムが備えられており、腸管組織における生体防御と恒常性維持を担っている。近年、腸内フローラを介した免疫制御の重要性が注目されており、宿主免疫システムの発達と制御、さらにはその破綻に伴う病態形成との関連が研究されている。我々はこれまでに腸管リンパ組織であるパイエル板の組織内部に共生する細菌としてAlcaligenesを同定し、リンパ組織内共生という新概念を提唱した。本事業ではAlcaligenesによる共生メカニズムと免疫学的作用を検証することを目的に研究を遂行している。本事業の初年度にあたる平成26年度は、Alcaligenesを単独で定着させたノトバイオートマウスを作製し、免疫学的機能を解析した。その結果、Alcaligenes定着ノトバイオートマウスではコントロールである大腸菌を定着させたノトバイオートマウスと比べ、炎症性腸疾患モデルにおける病態症状が軽度であることを明らかにした。またパイエル板組織内において標的となる樹状細胞との共培養系を確立し、AlcaligenesならびにAlcaligenes由来の菌体成分は大腸菌と比較して、in vitroとin vivoの両方において炎症反応を誘起する活性が低いことが明らかとなった。さらにAlcaligenesのゲノム情報をもとにしたインフォマティクス解析を開始し、Alcaligenesに特有の機能経路の候補を複数同定することに成功した。本年度は、Alcaligenesの宿主細胞になる樹状細胞に焦点を当てた研究を遂行したい。コントロールとして用いた大腸菌と異なり、Alcaligenesは樹状細胞の内部で長期生存できることが判明した。またAlcaligenesと共培養した樹状細胞からは、IL-10が産生されること、またその産生はAlcaligenesの生存依存的であることが明らかとなった。さらに動物モデルを用いた検討から、樹状細胞から産生されたIL-10は腸管でのバリア機能の維持と炎症抑制に重要であることが示された。これらのことからリンパ組織内共生細菌であるAlcaligenesの免疫学的意義について、樹状細胞を介した免疫制御と炎症抑制という観点からの知見を得ることができた。リンパ組織内共生細菌という独自の観点から、生体側と菌体側の両観点からの解析を進めており、それぞれの分子メカニズムに関する知見と生体レベルでの重要性を提示することが出来ている。我々はこれまでに腸管リンパ組織であるパイエル板の組織内部に共生する細菌としてアルカリゲネスを同定し、リンパ組織内共生という新概念を提唱した。本事業ではアルカリゲネスによる共生メカニズムと免疫学的作用を検証することを目的に研究を遂行している。本年度は、アルカリゲネスの主要菌体成分であるリポ多糖(LPS)に着目した研究を遂行した。その結果、アルカリゲネスのLPSは大腸菌LPSと同様、TLR4のリガンドとして機能するものの、その活性は著しく弱く、TLR4のweak agonistとして機能することが判明した。これらの機能を利用し、アジュバントとしての応用を検討したところ、アルカリゲネスLPSは過剰な炎症応答を誘導することなく、抗原特異的抗体産生を増強出来ることが判明した。これらの結果から、リンパ組織内共生細菌であるアルカリゲネスの共生を担う分子メカニズムの一端とその機能を応用したアジュバント開発に関し、LPSという観点からの知見を得ることができた。菌体成分の観点から、リンパ組織共生細菌であるアルカリゲネスの共生を担う分子基盤の解明と菌体成分を用いたアジュバントの開発につながる知見を得ることが出来た。よっておおむね順調に進展していると考える。本研究では、本研究グループが腸管リンパ組織共生細菌として同定したAlcaligenesに着目し、免疫細胞との相互作用を介した共生機構の解明を進めた。蛍光標識したAlcaligenesを用いパイエル板組織内での局在を観察したところ、Alcaligenesはパイエル板の樹状細胞に取り込まれていることが明らかになった。

この結果と相関し、樹状細胞を除去したマウスではAlcaligenesは認められなかった。そこでAlcaligenesと同じグラム陰性菌である大腸菌をコントロールにAlcaligenesの樹状細胞に対する作用について検討した。まずAlcaligenesの死菌体を樹状細胞に作用させた際に産生されるIL-6を測定した結果、死菌体の濃度依存的に樹状細胞からのIL-6の産生が認められたが、これらの量は大腸菌に比べると低い値であった。これらの結果から、Alcaligenesは菌体成分が樹状細胞の活性化に関与することが判明したので、菌体成分としてリポ多糖(LPS)に着目した。Alcaligenesから精製したLPSを樹状細胞に作用させたところ、濃度依存的に樹状細胞からのIL-6の産生が認められたが、死菌体の場合と同様、大腸菌由来LPSに比べると、その産生量は有意に低かった。またAlcaligenes、大腸菌共にLPSによるIL-6の産生はTLR4を欠損した樹状細胞においては認められなかったことから、Alcaligenes由来LPSはTLR4の弱いアゴニストとして機能していると考えられた。このように、Alcaligenes由来LPSはTLR4を介して免疫を活性化するものの、その強度は大腸菌に比べ微弱なものであることが明らかとなり、これがAlcaligenesがパイエル板組織内部において過剰な免疫応答を惹起することなく宿主免疫系を適度に活性化しつつ、共生できるメカニズムの一因となっていると考えられた。腸管には腸管免疫システムと呼ばれる精密な免疫システムが備えられており、中でもパイエル板は腸管免疫の制御における中核的な役割を担っている。最近ではその制御に腸内細菌が変わっていることが示されている。本研究においては、研究代表者が独自に見いだしたパイエル板組織内共生細菌であるAlcaligenesと、腸内細菌とパイエル板依存的に誘導される腸管IgA高産生細胞に関する知見を統合し、Alcaligenesを介した腸管での免疫制御について、生体と菌体の両面から解明することを目的に研究を遂行した。その結果、Alcaligenesの生菌が持つ機能と菌体成分であるLPSを介した免疫制御について明らかにした。本事業ではin vivo, in vitro, in silicoの各研究を開始することを本年度の計画としていたが、いずれの研究も当初の予定通り順調に立ち上げ、次年度につながる有益な情報を得ることができた。上記のように平成27年度についても当初の予定通り順調に計画を遂行できたことから、平成28年度の研究においても当初の予定通り研究を進めていく予定である。本年度の結果から、リンパ組織内共生細菌であるアルカリゲネスの共生を担う分子メカニズムの一端について、LPSという菌体成分からの知見を得ることが出来た。
ダイナミックMRIとコンパートメント解析による腫瘍血流機能画像の評価

近年、悪性腫瘍の発育、浸潤、転移に腫瘍血管新生(angiogenesis)の関与が注目されている。生体内では血流、血管透過性、間質密度などもangiogenesisに関与していると考えられるが、これらのダイナミックな現象をin vivoで評価する方法はまだ確立されていない。我々は、本研究にて、MRI用造影剤Gd-DTPA静注後のダイナミックデータのモデル解析から、血管新生により増加した腫瘍血流をin vivoで画像化し評価できる可能性を示した。ダイナミックMRIは3D IR-FFE(TR/TE/TI=7.7/3.9/280ms、FA=10)を用い、Gd-DTPAをボーラス静注後、約2分間のダイナミックデータ収集を行った。腫瘍部近傍の動脈から入力関数を求め、コンパートメント解析ならびにデコンボルーション解析を用いて、ピクセル毎に組織血流を算出し、最終的に腫瘍部および周囲健常部を含む血流機能画像を作成した。悪性腫瘍では治療前後での比較検討も行った。腫瘍血流量(mL/100mL/min)は、疾患により大きく異なり、腫瘍内部の血流分布は不均一で、早期濃染される高血流部から徐々に造影される低血流部まで造影パターンも様々であった。従来の形態画像では捉えられない腫瘍内部の血流不均一性が明瞭化し、腫瘍辺縁部で血管新生(angiogenesis)を反映した高血流が示された。治療前後の検討では、通常の造影MRI画像では治療効果判定が困難な症例においても、治療後に腫瘍内の血流分布や血流量の変化がみられ、病理学的検討が行われた症例においては、最終治療効果をよく反映していた。今後、各種の血管新生阻害剤による治療の新たな展開も予想され、治療効果の評価や転移、予後の推測にも将来応用が期待される。MRI用造影剤(ガドリニウム)急速静注下に高速撮像法を用いてダイナミックデータ収集を行い、腫瘍血流の定量的測定を行った。初年度は、骨軟部腫瘍を対象に検討を行い、治療例では治療前後での比較検討も行った。腫瘍血流量(mL/100mL/min)は、疾患により大きく異なり、最小は脂肪腫の2.72+/-1.57から、最大は転移性骨腫瘍の191.19+/-89.56まで広く分布した。血流機能画像上、通常の造影画像では捉えられない腫瘍内部の血流不均一性が明瞭化し、腫瘍辺縁部で血管新生(angiogenesis)を反映した高血流が示された。一方、腫瘍周囲正常組織の血流量は、別に求めた健常者の値(平均11.10+/-2.68)とほぼ同等の値を示し、本法の良好な再現性が示された。治療前後で、形態画像上で変化が捉えにくい症例においても、治療後に腫瘍血流の低下が確認された。手術後の病理学的検討が行われた症例においては、最終治療効果をよく反映していた。以上、初年度においては、骨軟部疾患を対象として、ダイナミックMRIによる腫瘍血流機能画像の有効性を示すことに成功した。ここまでに得られた研究成果の一部は、日本医学放射線学会、日本磁気共鳴医学会、北米放射線学会、世界磁気共鳴医学会などで発表ならびに発表予定であり、現在、成果を論文にまとめているところである。平成15年度は、さらに症例を追加(対象症例も骨軟部腫瘍以外にも拡大)し、治療効果判定や最終治療効果の病理学的検討との対比を進めていく予定である。

また、放射線治療計画を含めた包括的治療計画や予後予測にも応用し、検討を加えて行く予定である。近年、悪性腫瘍の発育、浸潤、転移に腫瘍血管新生(angiogenesis)の関与が注目されている。生体内では血流、血管透過性、間質密度などもangiogenesisに関与していると考えられるが、これらのダイナミックな現象をin vivoで評価する方法はまだ確立されていない。我々は、本研究にて、MRI用造影剤Gd-DTPA静注後のダイナミックデータのモデル解析から、血管新生により増加した腫瘍血流をin vivoで画像化し評価できる可能性を示した。ダイナミックMRIは3D IR-FFE (TR/TE/TI=7.7/3.9/280ms、FA=10)を用い、Gd-DTPAをボーラス静注後、約2分間のダイナミックデータ収集を行った。腫瘍部近傍の動脈から入力関数を求め、コンパートメント解析ならびにデコンボルーション解析を用いて、ピクセル毎に組織血流を算出、最終的に腫瘍部および周囲健常部を含む血流機能画像を作成した。悪性腫瘍では治療前後での比較検討も行った。腫瘍血流量(mL/100mL/min)は疾患により大きく異なり、腫瘍内部の血流分布は不均一で、早期濃染される高血流部から徐々に造影される低血流部まで造影パターンも様々であった。従来の形態画像では捉えられない腫瘍内部の血流不均一性が明瞭化し、腫瘍辺縁部で血管新生(angiogenesis)を反映した高血流が示された。治療前後の検討では、通常の造影MRI画像では治療効果判定が困難な症例においても、治療後に腫瘍内の血流分布や血流量の変化がみられ、病理学的検討が行われた症例においては、最終治療効果をよく反映していた。今後、各種の血管新生阻害剤による治療の新たな展開も予想され、治療効果の評価や転移、予後の推測にも将来応用が期待される。
鼠径周辺部痛症候群の危険因子と発生メカニズムの解明-股関節機能に着目して-

大学サッカー選手を対象にフィジカル測定を実施した。測定項目として、形態計測、下肢関節可動域(股関節内旋・外旋、足関節背屈)、下肢筋タイトネステスト(下肢伸展挙上)、下肢筋力(股関節外転・内転)、アライメント、バランス能力、機能評価とした。その後、各選手の傷害発生状況を調査しており、鼠径周辺部痛が発生の有無により群分けを行い、フィジカル測定の各結果を群間で比較し、鼠径周辺部痛に関与する可能性のある因子を抽出する予定である。男子大学サッカー選手に対してキック動作の三次元動作解析を行った。キック動作としてインステップキック、インサイドキック、インフロントキックを実施した。各キック動作による関節運動の違いを比較した。今年度中に発生した鼠径周辺部痛者の人数が少なかった。そのため来年度も同様の測定を継続して鼠径周辺部痛者のキック動作の解析を行い、対象者数を増やした状況で対照群とコントロール群の比較から、鼠径周辺部痛者のキックの特徴を検討する。また、今回、下肢関節に加え骨盤、体幹の動作解析を実施したが、妥当性と信頼性について再検討する必要が生じた。同様の対象者に対して、切り返し動作の三次元動作解析を行った。しかしながら先行研究で指摘されている通り、あらかじめ切り返し方向が決められた状況での切り返し動作では競技動作とは異なる可能性がある。そのため、来年度の研究では切り返し地点の直前に切り返す方向を指示する反応課題による切り返し動作を行い、より競技動作に近い状況での解析を行い、鼠径周辺部痛者の特徴を明らかにする。本研究では三次元動作解析によりキック動作と切り返し動作の解析を行っている。今年度より三次元動作解析室を一新し、新規の三次元動作解析装置を用いて実施しているが、機器の安定的な動作に手間取っており動作解析に遅れが生じた。また、三次元解析で使用しているモデルの再検討が必要となり時間を要している。今後は、三次元動作解析対象者数を増やし、キック動作および切り返し動作での鼠径周辺部痛者の特徴を明らかにする。問題点として骨盤と体幹のモデルの再構築が必要であり、早急に行う。前向き研究結果から鼠径周辺部の危険因子となる動作を抽出し、フィジカル測定との関係を明らかにすることで、鼠径周辺部痛に対する予防プログラム、リハビリテーションの提案につなげたい。また、フィジカル測定から危険因子を明らかにすることでスポーツ現場でできる簡単な評価方法の提案につなげたい。また、本実験はサッカー選手を中心に行っているが、他の競技種目の競技特有動作の動作解析を鼠径周辺部痛の既往の有無で検討していきたいと考えている。股関節内転筋等の筋硬度(スティフネス)とグロインペインの発生との関連性を調査していくため、男子大学サッカー選手を対象として股関節内転筋を含む下肢筋・体幹筋(長内転筋、大腿直筋、ハムストリングス、下腿三頭筋、腹直筋)の筋スティフネスの計測を行った。筋硬度は安静時と伸長位で計測を行い、筋間の特徴を検討するとともに、伸長による筋硬度変化の検討も行った。筋間の比較では安静時の筋スティフネスが筋により異なること、伸長によるスティフネスの増大も異なること、筋スティフネスは左右差があることが明らかとなった。同時に男子大学サッカー選手のグロインペインの発生率や発生の特徴を検討するために同サッカー選手の傷害調査を開始している。今後、これらのデータからグロインペインの発生の有無と筋硬度の特徴に関連が認められるか検討する。また、グロインペインの発生には身体的特徴や動作の特徴、フィジカルフィットネスとの関連が認められるか調査するため、姿勢や足部アライメント、下肢の関節可動域、筋のタイトネス、股関節筋力、ジャンプ能力、これまでに報告されている一般的な動作スクリーニングテストおよびサッカーに特化した動作スクリーニングテストを実施した。これらの項目については今後、グロインペインの発生との関連を調査してく予定である。上記の項目は前向き研究により行っているため、次年度以降に傷害の発生と筋スティフネスや各測定項目との関連を報告する予定である。各種項目の測定人数が比較的多いため、日程調整が困難となり測定実施がずれ込んだ。動作解析を検討していたが、実験機器の調整が必要となったため今年度に実施できず、次年度に実施することとした。本研究ではサッカー選手を対象として鼠径周辺部痛既往群とコントロール群のキック動作の解析を骨盤部の動き(前傾/後傾、側方傾斜、回旋)に着目して行った。キック動作はサッカーで多く用いられる3種類(インサイドキック、インステップキック、インフロントキック)とした。キック間の違いとして骨盤の前傾角度はインステップキックで最も大きかった。骨盤の側方傾斜はインフロントキックで変位量が最も大きかった。骨盤の回旋についてインフロントキックにおいて軸足方向の回旋が大きかった。インステップキックは骨盤の動きが他のキック動作と比較して小さかった。これらのことから骨盤の動きはキックで違いがあることが明らかになった。鼠径周辺部痛既往群とコントロール群の比較では既往群ではインステップキックにおいて動作全域において骨盤が後傾している傾向を示した。また既往群では非軸足方向への回旋が小さく、テイクバック時の骨盤回旋が小さく、骨盤の回旋が不十分である可能性が示された。これらのことから既往群はコントロール群と骨盤の運動がことなること、特に回旋が小さいことが明らかになり、これらが股関節など他の関節の代償動作が生じている可能性が示唆された。

その他に、グロインペインの疫学調査を継続するとともに、アライメント、関節可動域、柔軟性、股関節筋力、ファンクショナルテストを実施した。今後、各種テスト結果と疫学調査の関連を検討するとともに、キック動作とグロインペインとの関連性も調査する。三次元動作解析の不具合が生じ、改善に時間を要したこと、解析方法の再検討により動作解析の研究に遅延が生じている。大学サッカー選手を対象にフィジカル測定を実施した。測定項目として、形態計測、下肢関節可動域(股関節内旋・外旋、足関節背屈)、下肢筋タイトネステスト(下肢伸展挙上)、下肢筋力(股関節外転・内転)、アライメント、バランス能力、機能評価とした。その後、各選手の傷害発生状況を調査しており、鼠径周辺部痛が発生の有無により群分けを行い、フィジカル測定の各結果を群間で比較し、鼠径周辺部痛に関与する可能性のある因子を抽出する予定である。男子大学サッカー選手に対してキック動作の三次元動作解析を行った。キック動作としてインステップキック、インサイドキック、インフロントキックを実施した。各キック動作による関節運動の違いを比較した。今年度中に発生した鼠径周辺部痛者の人数が少なかった。そのため来年度も同様の測定を継続して鼠径周辺部痛者のキック動作の解析を行い、対象者数を増やした状況で対照群とコントロール群の比較から、鼠径周辺部痛者のキックの特徴を検討する。また、今回、下肢関節に加え骨盤、体幹の動作解析を実施したが、妥当性と信頼性について再検討する必要が生じた。同様の対象者に対して、切り返し動作の三次元動作解析を行った。しかしながら先行研究で指摘されている通り、あらかじめ切り返し方向が決められた状況での切り返し動作では競技動作とは異なる可能性がある。そのため、来年度の研究では切り返し地点の直前に切り返す方向を指示する反応課題による切り返し動作を行い、より競技動作に近い状況での解析を行い、鼠径周辺部痛者の特徴を明らかにする。本研究では三次元動作解析によりキック動作と切り返し動作の解析を行っている。今年度より三次元動作解析室を一新し、新規の三次元動作解析装置を用いて実施しているが、機器の安定的な動作に手間取っており動作解析に遅れが生じた。また、三次元解析で使用しているモデルの再検討が必要となり時間を要している。今後の方策として、今年度実施できなかったグロインペインの誘発要因として考えられるキック動作と切り返し動作の三次元動作解析を行い、グロインペイン既往群と非既往群を比較することでリスクファクターを検討する。また、今年度実施している傷害調査を継続し最終的にはグロインペイン発生者と非発生者で今年度の各種測定項目の比較を行い、グロインペインの誘因となりうる項目を抽出していく予定である。疫学調査の対象者に対して、キック動作および切り返し動作の三次元動作解析を進める。疫学調査の結果から、グロインペイン・鼠経周辺部痛発症者の有無によりキック動作および切り返し動作に違いがないか、特に骨盤の動作に着目して検討する。対象者の身体機能(関節可動域、柔軟性、股関節筋力、ファンクショナルテスト)により発症に違いがないか検討し、発症リスクとなり得る因子を抽出する。
脂肪酸代謝蛋白の発現からみたヒト癌細胞の生物学的特性

1.ヒト正常細胞では脂肪酸合成酵素(FAS)はホルモン感受性細胞(乳腺、前立腺、子宮内膜、卵巣黄体、など)、脂質代謝の活発な細胞(皮脂腺、脂肪組織、II型肺胞上皮など)および胎児で増殖の盛んな細胞に発現していた。2.各種ヒト癌における(FAS)の発現(1)ヒト癌(軟部組織肉腫を含む)では1131例中838例(74%)にFASの発現が認められた。高頻度にFASの発現を示す癌は乳癌(243/243),食道癌(85/88),膀胱癌(55/64),肝癌(39/47)であり、胃癌(270/434),肺癌(127/200)は中等度の頻度、軟部組織肉腫(20/64)は低頻度であった。(2)生存率との相関FASの発現の高い群で生存率の不良な癌は乳癌、膀胱癌および軟部組織肉腫であった。その他の癌(食道・胃・肺・肝)ではFASの発現と予後との間に一定の相関性は認められなかった。3.乳癌株MCF-7はエストロゲン、プロゲステロン刺激によりFAS-mRNAの発現が亢進した。つまり女性ホルモンは転写レベルでFASの発現を上昇させた。エストロゲンの効果はタモキシフェンにより阻害された。4.胃癌株8種では、FASの発現と脂肪酸代謝に関わる蛋白・酵素(β-酸化、リン脂質合成ならびに蛋白質のアシル化)の発現は非常に高い関連性を示した。5.FASの特異的阻害剤セルレニン処理によりFAS産生株である胃癌株Takigawaの増殖は著名に抑制された。同時に脂肪酸代謝関連蛋白・酵素の発現は大部分有意に低下した。以上、ヒト癌でFASは高頻度に発現していること、FASの発現はホルモンのコントロールをうけることならびにFASの発現と脂肪酸代謝系は密に関連していることが確認された。また、胎児および一部の癌では、細胞の増殖とFASの発現がおおむね関連性をもつことが明らかにされた。1.各種ヒトがんについて脂肪酸合成酵素の発現と臨床病理学的因子との相関性について調べた。1)乳癌(n=243)では6割の症例が高発現、4割の症例が低発現であった。2)多変量解析により、エストロゲン・プロゲステロンレセプター陽性とFAS高発現が相関していた。エストロゲンレセプター陽性乳癌でFAS高発現例は有意に再発し易いことが分かった。3)膀胱癌(n=59)ではFAS高発現群は低発現に比べ有意に生存率が低い。また、Ki-67抗原とFAS高発現群はKi-67抗原とFAS低発現群に比べ有意に生存率が低い。(p<0.009)4)胃癌(n=200)では60%にFASの発現が認められ、分化度の高い例にFASの出現が有意に高率であった。5)肝癌(n=47)では80%に陽性であったが予後との相関は認められなかった。6)肺癌・脳腫瘍については検討中。2.ヒト胃癌株におけるFAS蛋白の発現3.結腸癌株C-1のFAS特異的阻害剤による増殖抑制C-

1株はFASを産生しているがここの細胞をセルレニン(10μg/ml)で処理すると安全に増殖が抑制される。細胞死のメカニズムとして形態学的にアポトーシスも一部に観察される。しかし、細胞内ATP濃度の急激な低下が細胞死と関連するのではないかという予備的な知見が得られた。1.ヒト正常細胞では脂肪酸合成酵素(FAS)は主にホルモン感受性細胞(乳腺、前立腺など)・脂質代謝の活発な細胞(皮脂腺、脂肪組織、II型肺上皮など)および胎児で増殖の盛んな細胞に発現している。2.各種ヒト癌における(FAS)の発現肺癌(n=200)では127/200(64%)、胃癌(n=434)では270/434例(62%),乳癌(n=243)では全例(但し高発現は145例),食道癌(n=88)では85/88例(97%)、軟部肉腫(n=64)では20/64例(31%)にFASの発現が認められた。FASの高発現が生存率と有意に相関したのは乳癌と軟部肉腫のみであった。3.乳癌株MCF-7のFAS-mRNAはエストロゲンあるいはプロゲステロン処理により速やかに増加した。エストロゲンの効果はタモキシフェンにより阻害された。4.胃癌株8種のFAS-mRNAの発現と脂肪酸代謝に関わる蛋白・酵素(アシルCoA結合蛋白;アシルCoA脱水素酵素→β酸化系;リソリン酸アシル転移酵素→リン脂質合成系;N-ミリストイルアシル転移酵素-2→蛋白質アシル化)のmRNAの発現は非常に高い関連性を示した。5.FASの特異的阻害剤セルレニンでFAS陽性胃癌株Takigawaを処理すると、胃癌株の細胞の増殖は抑制され、脂肪酸代謝関連蛋白・酵素の発現は大部分低下した。以上のようにFASは細胞の脂肪酸代謝・ホルモン感受性と関連が深く、また脂肪酸代謝系と密接に連動して発現していることが確認された。また、FASはおおむね細胞の増殖能(胎児および癌)と関連性をもって発現することが明らかにされた。
GPIアンカー型蛋白質（CD24）のラフト形成と化学療法抵抗性のメカニズム解析

近年癌細胞の浸潤・転移過程において上皮間葉形態転換(Epithelial-Mesenchymal Transition: EMT)が注目されているが、このEMT現象が子宮内膜癌において重要な予後因子となる事を報告した。またEMTを起こす細胞は強い自己複製能と腫瘍形成能を有し薬剤に耐性を示すことが明らかとなりつつあるが、我々はEMTの有用な表面マーカーとして、乳癌、膵臓癌で癌幹細胞のマーカーとしても注目されているCD24に着目した。CD24は分子量35-45KDaのグリコシルホスファチジルイノシトール(GPI)アンカー型シアロ糖タンパクで、細胞表面に存在しさまざまな癌種で過剰発現が予後悪化因子であると報告されている。我々は子宮内膜癌においてCD24高発現が組織型や分化度、予後と有意に相関する事や、EMTを介した浸潤・転移と相関していることを明らかにした。さらにCD24はGPIアンカー型タンパク質であるが、GPIアンカー型蛋白質は細胞膜の外側に存在するため、このような蛋白質がどのような役割を担っているのかは長らく不明であった。近年の研究からGPIアンカー型蛋白質にリガンドが結合するとオンデマンドで細胞膜上にlipid raftが形成され、このraftに細胞質内のシグナル分子がリクルートされる事が徐々に明らかとなってきている。我々は、CD24がlipid raftを形成すること、そしてそこへpMETがリクルートすることにより細胞内へシグナルを伝達することを見出した。pMETがリクルートされるとAKtやERKのリン酸化が引き起こされ、これが化学療法抵抗性の原因の一つになっていることをつきとめた。婦人科癌の中でも白金製剤抵抗性卵巣癌やtype2子宮内膜癌(類内膜腺癌G3や漿液性腺癌、明細胞腺癌など)は予後が著しく悪いが、その原因として癌の浸潤・転移能の高さや化学療法抵抗性がある。我々は従来より婦人科癌の浸潤・転移の制御や化学療法抵抗性癌の治療に向けた研究に注目してきた。卵巣癌において、生存シグナルであるERK経路とAkt経路およびその下流の転写因子Nuclear Factor κB (NFκB)が白金製剤の耐性に関わる重要な分子であることを明らかにし、さらにAktの活性化が重要な予後因子である事を臨床病理学的にも確かめ、白金製剤の耐性化に関与するAktおよびERK両経路をブロックすると、卵巣癌の白金製剤への耐性性が解除され感受性が高まることにより転移病巣や再発病巣での治療効果が上がることを明らかにしてきた。また我々は子宮内膜癌においてCD24高発現が組織型や分化度、予後と有意に相関する事や、EMTを介した浸潤・転移と相関していることを明らかにしてきた。しかしながらCD24発現と化学療法抵抗性や癌幹細胞との関連を示唆する報告はみられるもののその機序は全く不明である。このシグナルには我々が研究してきた癌の増殖・生存にかかわるIGF-1/PI3K/Aktシグナルなどが報告されており、これらの機構を解明する事は癌の生物学的特性を解明する事につながる。我々はFACS sorting systemを用いて子宮内膜癌細胞株(hec1A、hec108)をCD24陽性細胞と陰性細胞へと分離することに成功しているが、CD24陽性細胞は陰性細胞と比較して生存や増殖シグナルに必要なMET、Akt、ERKのリン酸化が見られる事を見出した。おおむね計画通りの実験が遂行できている。近年癌細胞の浸潤・転移過程において上皮間葉形態転換(Epithelial-Mesenchymal Transition)が注目されているが、このEMT現象が子宮内膜癌において重要な予後因子となる事を報告した。またEMTを起こす細胞は強い自己複製能と腫瘍形成能を有し薬剤に耐性を示すことが明らかとなりつつあるが、我々はEMTの有用な表面マーカーとして、乳癌、膵臓癌で癌幹細胞のマーカーとしても注目されているCD24に着目してきた。我々は、GPIアンカー型蛋白質の一つであるCD24発現が癌の浸潤・転移やEMT(上皮間葉転換)現象、化学療法抵抗性と強く相関している事を見出した。特に卵巣癌において、CD24がAkt経路、ERK経路を通じてEMT(上皮間葉転換)現象を制御し、浸潤、転移に深くかかわっている可能性を見出し報告した。GPIアンカー型蛋白質はラフト形成を通してシグナルを細胞内へ伝達している事が徐々に明らかなとなっているがその機序は未だに不明である。そこで今後はGPIアンカー型蛋白質(CD24)のラフト形成とそこでリクルートされる細胞内シグナル分子を同定し化学療法抵抗性のメカニズムの一旦を明らかにしていきたいと考えている。我々は子宮内膜癌、卵巣癌においてCD24がEMT現象を介して浸潤、転移に深くかかわっている事を見出した。またCD24高発現群は予後不良であり化学療法抵抗性である事を示した。ここまでは当初の予定通り計画が進んでいる。今後は化学療法抵抗性にGPIアンカー型タンパク質がどのようにかかわっているのかを明らかにしたい。

またEMTを起こす細胞は強い自己複製能と腫瘍形成能を有し薬剤に耐性を示すことが明らかとなりつつあるが、我々はEMTの有用な表面マーカーとして、乳癌、膵臓癌で癌幹細胞のマーカーとしても注目されているCD24に着目した。CD24は分子量35-45KDaのグリコシルホスファチジルイノシトール(GPI)アンカー型シアロ糖タンパクで、細胞表面に存在しさまざまな癌種で過剰発現が予後悪化因子であると報告されている。我々は子宮内膜癌においてCD24高発現が組織型や分化度、予後と有意に相関する事や、EMTを介した浸潤・転移と相関していることを明らかにした。さらにCD24はGPIアンカー型タンパク質であるが、GPIアンカー型蛋白質は細胞膜の外側に存在するため、このような蛋白質がどのような役割を担っているのかは長らく不明であった。近年の研究からGPIアンカー型蛋白質にリガンドが結合するとオンデマンドで細胞膜上にlipid raftが形成され、このraftに細胞質内のシグナル分子がリクルートされる事が徐々に明らかとなってきている。我々は、CD24がlipid raftを形成すること、そしてそこへpMETがリクルートすることにより細胞内へシグナルを伝達することを見出した。pMETがリクルートされるとAKtやERKのリン酸化が引き起こされ、これが化学療法抵抗性の原因の一つになっていることをつきとめた。子宮内膜癌細胞株・卵巣癌細胞株へCD24の遺伝子導入を行い、検討した薬剤耐性因子やMETシグナル、Akt、ERKに変化が見られるかどうかを検討する。さらにsiRNAで抑制されるかを確認する。またCD24で分離した細胞をNOD/SCIDマウスへ皮下移植し、両群間でのシスプラチン投与による化学療法の効果の差を解析する。GPIアンカー型蛋白質であるCD24で、lipid raft形成能を評価するべくsucrose gradient assayを行う。特にpMETのリクルートメントについての評価を行いCD24とMETシグナルとの関連性を明らかにする。GPIアンカーは細胞膜に存在する蛋白質(例:CD24)を細胞膜の正しい位置につなぎとめる碇の役割を果たす蛋白質である。近年の研究からGPIアンカー型蛋白質にリガンドが結合するとオンデマンドで細胞膜上にlipid raftが形成され、このraftに細胞質内のシグナル分子がリクルートされる事が徐々に明らかとなってきた。このlipid raftには特定の脂質のみならず様々な蛋白質(Gタンパク質、プロテインキナーゼ、イオンチャネルなど)が集積する事が報告されており細胞外からの刺激を細胞内へ伝えるシグナル伝達の場として機能している事が推察される。そこでGPIアンカー型蛋白質であるCD24のlipid raft形成と、そこでリクルートされる細胞内シグナル分子を同定し、化学療法抵抗性のメカニズムの一旦を解明したいと考えている。