hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
終末期がん患者の在宅医療システムの構築

17年度に実施した大分県下約1300ヶ所の医療機関(病・医院、訪問看護ステーション、調剤薬局)への終末期がん患者の在宅医療の現状に関する質問紙調査の分析から、終末期がん患者の訪問診療や訪問看護の実態や関心の程度、今後の課題が明らかになった。終末期がん患者の在宅医療に関する医療機関の情報のデータべース作成に当たっては、17年度以後のがん医療や在宅医療の大きな変化を踏まえ、追加調査を行い、インターネット対応のコンテンツとアクセス解析プログラムを作成した。また、冊子媒体として、「大分県内の終末期がん患者在宅医療対応機関一覧Vol.2」を作成した。1.17年度に実施した大分県下の約1300ヶ所の医療機関(診療所、在宅医療を行っている可能性がある入院医療機関、訪問看護ステーション、調剤薬局)に行った質問紙調査の分析結果:大分県内での終末期がん患者の訪問診療や訪問看護は、一部の地域を除いてどの地域でも提供されていたが、経験施設数は少なかった。訪問服薬指導を行っている薬局は非常に少なかった。終末期がん患者の在宅医療は、医師が一人しかいない医療機関で、(1)バックベッドは紹介先や患者頼り(2)訪問診療よりも往診や外来(3)自らの施設を母体とした訪問看護と連携(4)院内処方(5)医療機器は自施設で準備、という医療者個人の努力の範囲で行われ、複数の診療医との連携はほとんどなかった。今後の推進に向けての課題には、(1)急性期医療機関との連携不足による見切り発車的に在宅医療が始まる(2)終末期がん患者に対する病・医院や訪問看護の診療体制不足(3)在宅医療に関わる医療者の緩和ケアに関する知識や医療者同士の連携・意思疎通不足(5)終末期がん患者のニーズと家族への関わりなどの問題が挙げられていた。2.終末期がん患者の在宅医療に関する医療機関の情報公開についての調査調査内容:終末期がん患者の在宅医療への関心に関する調査、及び情報公開に関して、在宅医療を希望する患者・家族の問い合わせに応じる医療機関として、医療機関の基本情報や相談窓口の調査を、17年度に調査した約1300ヶ所の医療機関に行った。結果:問い合わせに応じる医療機関として350ヶ所からの回答を得た。このデータを、市町村単位の地域別に分類し、その中を病・医院、訪問看護、薬局別に分け、データベースを作成した。このデータベースは、まず、冊子として作成し、問い合わせに応じると解答した医療機関、急性期医療機関、県・保健所、市町村窓口、希望する一般市民に配布した。今後は広く情報公開するためのタッチパネル式機器に入力予定である。平成17年度の調査に基づく終末期がん患者の在宅医療機関の情報のデータベースの作成の目的に対して、平成19年4月から9月までの期間、17年度の調査データに基づくデータベースを作成していたが、研究内容・方法について再検討を行った結果、平成17年度以降のがん医療や在宅医療の変化に伴い、データベースには追加情報の調査が必要と考え、平成20年6月に追加調査を実施した。また、情報公開するための機器(タッチパネル式)に対応するコンテンツ、情報システムの検討、作成の目的に対して、当初、公開する情報はタッチパネル式の機器に対応するコンテンツを考えていたが、平成20年に大分大学と地域との教育・医療・福祉に関する情報提供システムが運用されることが9月に明らかになり、タッチパネル式1台よりもインターネット対応のコンテンツ作成が有効であることが明確になった。このような状況からインターネットに対応したHP用コンテンツ作成が妥当と考え、平成19年10月から17年度の調査内容で地図情報を含めて順次HP用のコンテンツとして作成し、平成20年6月の追加調査の内容を踏まえインターネット対応コンテンツとして、「じ・ま・え健康支援システム」を平成21年2月に構築した。平成21年4月よりネットワーク配信を行う予定である。平成19年4月から9月までの期間、17年度の調査データに基づくデータベースを作成していたが、研究内容・方法について再検討を行った結果、平成17年度以降のがん医療や在宅医療の変化に伴い、データベースには追加情報の調査が必要と考え、調査項目の検討・調査票の作成を行い、平成20年6月に追加調査を実施した。この追加調査に基づいて、平成21年2月インターネットに対応したHP用コンテンツを作成した。このコンテンツのインターネット配信にあたり、検索状況を把握するためのアクセス解析プログラムを作成した。平成21年度4月に配信予定である。これと並行して、インターネットに対応したHP用コンテンツを基に、冊子媒体として、「大分県内の終末期がん患者在宅医療対応機関一覧VOL.2」を作成し、大分県内の主要医療機関と冊子に掲載している医療機関に配布した。
残留性有機フッ素化合物の体内動態のモデル化と個体差に関する研究

環境汚染物質ペルフルオロオクタン酸(PFOA)はヒト体内に蓄積しやすい。成人の血清中濃度はPFOAより炭素鎖の長い化合物が急速な増加が認められた。動態パラメータを算出し、一般集団での曝露量を与えて、血中濃度シミュレーションを行った。動物実験ではリン脂質輸送分子MDR2の発現量とPFOA胆汁濃度が相関する。MDR1欠損マウスでは腎臓からのPFOA排出量が低下し、MDR1分子がPFOAの排出に関与することを示した。マイクロアレイの結果MDR1が誘導されていることが分かった。環境汚染物質として注目されているペルフルオロオクタンスルホン酸(PFOS)およびペルフルオロオクタン酸(PFOA)はヒト体内に蓄積しやすいことが知られている。PFOA・PFOSの食餌中濃度をヒト試料において測定することでヒト血清中半減期、また胆汁中PFOA・PFOSの再吸収による腸肝循環を検討し、他の動物との比較のための基礎を確立させる。食餌試料中PFOA・PFOSのLC-MS/MS分析を開発し、日本人におけるPFOA・PFOS曝露量の推定を行った。環境中濃度が低い地域での陰膳試料により得られた摂取量をもとに行った動態シミュレーションから血清濃度を推定したところ、食事により大半を推定でき、モデル自体の妥当性も高いと考えられた。排出経路について、これまで尿中にはほとんど排出されないことを明らかにしており、腎臓に発現するトランスポーターで再吸収系に関与するhOAT4を細胞系で発現し、PFOAの輸送に関与するかを検討した。hOAT4はPFOAの輸送活性を示し、腎臓での再吸収に関わっていると考えられた。この原因を知るために一般人口での曝露量と排出に関わるメカニズムの検討が必要であると考えた。PFOA・PFOSの曝露の違いを国際的に検討するため、韓国、ベトナムの成人女性の血清中PFOA・PFOS濃度を評価した。ベトナムではPFOAは極めて低値を示し、曝露量の違いが顕著であることが示唆された。現在、その他フッ素化脂肪酸を測定し、蓄積パターンの評価を開始した。またヒトでも胆汁中には比較的高濃度のPFOS・PFOAが含まれることから、腸肝循環の与える影響をシミュレーションモデルでの検討を開始した。動物実験において、ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体αの欠損マウスでPFOA投与を行ったところ、胆汁中PFOA濃度の低下が見られた。またリン脂質輸送分子MDR2の発現量が減少していたため、MDR2の関与が示唆された。野生型マウスでは投与量の増加に伴いMDR2は発現が上昇し、胆汁/肝臓濃度比も相関して高くなったことも認められた。しかし、血清中濃度の変化は野生型、欠損型で違いはなく、腎臓からの排出が高いことと、腸肝循環によって、野生型でも糞への排出は少なくなっていると考えられた。現在、MDR2のPFOA輸送メカニズムを検討するために、MDR2欠損マウスを用いて体内動態を検討している。PFOAに類似する多種の化合物の曝露を成人の血清中濃度を評価した。PFOAより炭素鎖の長い化合物が急速な増加が認められた。野生生物とともにヒトでも高蓄積性を示された。このような炭素鎖の違いによる物理化学的性質が影響していると考えられた。またヒトでのシミュレーションモデルを開発し、胆汁排泄率、腎クリアランスをもとに分布容積などの動態パラメーターを算出し、一般集団での曝露量を与えて、血中濃度の推定を行い、一致度の高い結果を得られた。動物実験において、リン脂質輸送分子MDR2の発現量とPFOA胆汁濃度が相関することが前年度に示されたため、MDR欠損マウスで動態を評価した。MDR1欠損マウスでは腎臓からのPFOA排出量が低下し、MDR1が尿細管上皮細胞に発現することからMDR1分子がPFOAの排出に関与することを示した。MDR2欠損マウスではPFOA尿中排出量は増加を示したが、MDR2は腎臓では発現しないことから、他の遺伝子発現が変化していることを考え、マイクロアレイで評価し、結果MDR1が誘導されていることが分かった。これらのことから、MDR1により腎臓からのPFOA排出が調節されていることが分かった。
アミノ酸光学異性体による新規癌代謝機構の解明

アミノ酸にはL-アミノ酸とD-アミノ酸があり、ヒトを構成するアミノ酸は大部分がL-アミノ酸である。がん代謝におけるD-アミノ酸、あるいはD-アミノ酸代謝酵素の機能は明らかにされていない。本研究は、D-アミノ酸代謝に関わる酵素の発現の異常が、がんの活動能、代謝動態に及ぼす影響を解析し、新たな治療法および診断法の確立を図ることを目的としている。2018年度は、L-,D-セリンのラセミ化あるいはL-,D-セリンからピルビン酸を産生するSerine racemase (SRR)について、大腸癌、大腸腺腫、大腸腺腫内腺癌を用いて免疫組織化学染色を行い、隣接正常部位と比較して、大腸腺腫、腺癌と腫瘍が進展するに伴って、SRRの発現が上昇することを見いだしている。また、ヒト大腸癌細胞株を用いたin vitroの実験で、SRRの発現と細胞増殖能に正の相関が認められ、さらにSRR高発現ヒト大腸癌細胞株であるHCT116、DLD-1を用いて作製したSRR-knockout(KO)細胞は、in vitro、in vivoにおいて増殖能の低下を示すことを見いだしている。さらに、これらSRR -KO細胞では、ミトコンドリアの量が低下し、内在性の活性酸素が低下することによりAktのリン酸化が低下し増殖能が低下すること、またアポトーシス抵抗性が低下することを見いだしている。また、SRR-KO細胞ではピルビン酸とアセチルCoAが低下し、さらにヒストンのアセチル化が低下していることを見いだしている。また、SRR阻害作用を有するphenazine methosulfate(PMS)はin vitroでヒト大腸癌細胞株の増殖を抑制し、in vivoにおいても、ヌードマウスへの腹腔内投与によりヒト大腸癌細胞株のxenograftの増殖を抑制すること、さらに5-FUの抗腫瘍効果を増強することを見いだしている。本研究は、D-アミノ酸、あるいはD-アミノ酸代謝酵素が、がんの活動能、代謝動態に及ぼす影響を解析し、治療標的となり得る新規の腫瘍特異的な代謝経路を同定、その分子学的メカニズムを明らかにし、新たな治療法および診断法の確立を図ることを目的としている。これまでに、L-,D-セリンのラセミ化あるいはL-,D-セリンからピルビン酸を産生するSerine racemase (SRR)が大腸の腫瘍において、腺腫、腺癌と腫瘍が進行するに従って発現が上昇することを明らかにしている。また、SRRが腫瘍増殖に寄与する具体的なメカニズムとして、CRISPR/CAS9システムを用いたin vitroでの機能解析により、SRRがピルビン酸の産生、あるいはミトコンドリアの量の維持とそれによる内在性の活性酸素の量の維持により細胞増殖を促進することを明らかにすることが出来た。また、SRR阻害作用を有するphenazine methosulfate(PMS)が、in vitro, in vivoにおいて大腸癌細胞の増殖を抑制することを明らかにしている。さらに、PMSは既存の抗癌剤である5-FUの大腸癌細胞増殖抑制効果をin vitro, in vivoにおいて増強することを明らかにすることが出来た。以上の経過から、本研究はおおむね順調に進展しているといえる。今後は、SRRがミトコンドリアの量を維持する具体的なメカニズム、あるいはピルビン酸、アセチルCoAの量を維持する具体的な代謝経路の同定を行っていく。さらに、ヒトに存在するその他のDアミノ酸代謝酵素が腫瘍の増殖や浸潤、転移、代謝動態に寄与しているかどうかを同定していく。

これまでに、L-,D-セリンのラセミ化あるいはL-,D-セリンからピルビン酸を産生するSerine racemase (SRR)が大腸の腫瘍において、腺腫、腺癌と腫瘍が進行するに従って発現が上昇することを明らかにしている。また、SRRが腫瘍増殖に寄与する具体的なメカニズムとして、CRISPR/CAS9システムを用いたin vitroでの機能解析により、SRRがピルビン酸の産生、あるいはミトコンドリアの量の維持とそれによる内在性の活性酸素の量の維持により細胞増殖を促進することを明らかにすることが出来た。また、SRR阻害作用を有するphenazine methosulfate(PMS)が、in vitro, in vivoにおいて大腸癌細胞の増殖を抑制することを明らかにしている。さらに、PMSは既存の抗癌剤である5-FUの大腸癌細胞増殖抑制効果をin vitro, in vivoにおいて増強することを明らかにすることが出来た。以上の経過から、本研究はおおむね順調に進展しているといえる。今後は、SRRがミトコンドリアの量を維持する具体的なメカニズム、あるいはピルビン酸、アセチルCoAの量を維持する具体的な代謝経路の同定を行っていく。さらに、ヒトに存在するその他のDアミノ酸代謝酵素が腫瘍の増殖や浸潤、転移、代謝動態に寄与しているかどうかを同定していく。
感情労働の両価的特性とそれを促進する人事施策に関する体系的研究

ヒューマンサービス施設に従事する対人援助業務人員(介護職員、看護師、その他)の職場定着ないしは離職行動を、感情労働(Emotion Work)の観点から分析することが本申請課題の骨子である。また感情労働には、リスク的側面以外の肯定的側面も理論的に想定されるので、その内容を明らかにした上で、それに寄与する人的資源管理施策のあり方も検討する。人的資源管理施策ー感情労働ーリテンションという一連の心理的作用機序を調整する、新たな要因の探索も必要である。本研究課題では、ポジティブ組織行動論から新しい知見(心理的資本)を援用し、施設人員の職場定着を巡る分析枠組みの精緻化・体系化を目指す。
母と子の相互行為分析から「育つこと」「育てられること」を捉えなおす

子育て支援センターにおける母子を取り巻くコミュニケーションの発見が2点あった。子どもの泣き出し状況をめぐる場面では、子の母親が他の母親やスタッフに対し、慎重に高度なコミュニケーションを行っていた。従来、気づかれていなかった当事者の戦略性が発見された。また、子どものジャンプ遊びの場面では、子の「あぶない」という発話を媒介としながら、遊びの場面を母子が協働して作り出していることが発見された。本年度は、本調査の年であり、現場でのビデオ撮影に成功した。そのデータを下に分析を行うこともできた。その後研究者や子育て現場の職員とのデータセッションも重ね、分析の精度を上げていった。以下、それらのデータから得られた成果を述べる。1つ目は、母と子の居場所つくりに関して。「事例」では、遊びの中で2歳2ヶ月の子が泣き出す「仲間はずれ」という状況が起こった。子どもの泣き出し状況に対する対応をめぐって、母親どおし、職員、子と母の相互行為分析から、母が一見トラブルにみえる現象をあえてトラブル視せず、高度なコミュニケーションをとっていることが確認できた。これらは、子育て現場の仲間づくりにも、有効なコミニュケーションであり、子育て現場での母子のゆるやかなつながりと居場所づくりの方略であるといえよう。2つ目は、母と子の遊びの中の相互行為について。「事例」では、2歳6ヶ月の子がジャンプ遊びの中で、『あぶない』という発話を繰り返した。これらから、何が読み取れるかについて探求を行った。母が、子の発言に対応して、手を高く上げたり、下に下げたりする様子が観察された。データセッションを積み重ねていく中で、子が母の言葉を先取りして使用していること、『あぶない』という言葉を吟味して使えるということをあらわしていること、などが分析できた。また、母と子だけの相互行為だけでなく、周りを取り囲む他の母や子ども、母親どおし、職員とのやり取り、子供同士というような幅広い中で、多様な相互行為が見て取れた。これらは、子育て支援センターでの母子の相互行為を理解することにもつながり、また支援する側にとっても、貴重な知見になることであろう。=研究対象=A地区のフィールドBにおいて、ビデオ撮影終了後においても、参与観察を行い、現場スタッフとデータセッションを行った。現場スタッフとのコミュニケーションも図れ、信頼を深めることができた。現場スタッフとデータセッションを行うことにより、分析を行う上で、有用な情報も得られた。子育て支援現場における支援の様子や、母子の普段の様子や、かかわり方についての情報提供及び情報交換がなされた。また、研究会においても、ビデオデータを基にしたデータセッションが行われた。活発な意見交換が行われ、分析の精度を上げることにつながった。=研究の成果=1子育て支援現場における居場所作りとしてなされている工夫を発見した。子供のトラブルである泣き出し状況について、泣いている子の母親が、子が泣いていることをあえてトラブル視せず、高度なコミュニケーションをとっていることが確認できた。2母と子のジャンプ遊び場面では、母と子だけでなく周りの母や子供やスタッフとの相互行為が見て取れた。3総じて、子育て支援現場において起きていることの多様さが判明した。子育て支援現場においては、母子の仲間づくりと居場所づくりが、ゆるやかなつながりの中で、行われており、それらは、子育て支援現場特有の特徴的なものである可能性が示された。ビデオ撮影を行うことにより、見過ごしてしまいそうな現象を捉えることができた。また、ビデオデータを繰り返し見ることが可能であるため、子育て支援現場の興味深い相互行為場面の発見につながった。3年計画の1年度目の研究として、学際的共同に関わる基盤整備、一部の本格調査、プラス若干の分析を行った。徳島大学でのビデオエスノグラフィー関連の調査及び、11月に行われた在宅ワークショップのデータセッションを繰り返し行った。データセッションは、ビデオ操作やビデオ分析や会話分析の習熟度や精度を上げるのに有効であった。データセッションの中で、発見があった。一見しただけでは、わからないような振る舞いや言葉の中に、ビデオを繰り返し見ることで、秩序だった行為が埋め込まれていることが理解できた。また、石川で2日間の合宿を行い、川島理恵氏、岡田光弘氏の招聘を行った。会話分析専門家との早い時期での合宿により、ビデオエスノグラフィーにおける分析技術を格段に洗練させることができた。例えば、「少年サッカー」の相互行為分析では、少年サッカーの選手に、指導者が、競技中に「お互いに声をかけあおう」という指導がなされていた。その行為が、どのような相互行為のもと行われ、それが、チームの中で、競技の中で、どのような意味をもってくるのかということや、子どもの性格や特徴を指導者が、指導の中にどのように取り入れているか、など、本研究を分析する上で、大変参考になる視点があった。本研究のフィールドは、石川県で子育て支援センターの協力が得られ、スタッフと数回のうち合わせや情報提供が得られた。母子の遊びの場面に数回の参与観察を行った。

参与観察の若干の分析を行ったが、子育て支援センターという場、職員、他の母子の存在が、母子の相互行為に影響を与える可能性のあることがわかった。多くの参与観察を行うことにより本調査のビデオ撮影を行う上での、多角的な視点を得ることができた。参与観察とビデオ撮影を7月に2日間行い、その後は、研究者のデータセッションと、子育て現場の職員ともデータセッションを行い、分析の精度をあげることができた。研究の目的は、子育て支援センターでの母子や職員、他の母子等の相互行為を観察し、そこから、「母と子の関係を捉えなおすこと」であるため、貴重な映像と参与観察からの新しい知見も得られており、研究が順調に進展しているといえるだろう。ビデオ操作やビデオ分析や会話分析の習熟度や精度を繰り返しのデータセッションであげることができた。これは、研究を遂行する上で、大変重要なことである。フイールドが確保でき、すでに複数回、母子の参与観察に入っている。ビデオ撮影を行う前に、参与観察が、十分なされていることが、研究の成功の鍵を握っているといえるであろう。参与観察で得られた情報や分析に基づいたビデオ撮影や分析が行われることが、母子の相互行為研究を行う上で重要であり、おおむね順調に進展している。子育て支援センターのスタッフとも、交流し、お互いの情報交換も進んでいる。研究分担者との打合せや研究会も複数回持ち、共通理解もできており、次年度の2年度目の調査に、大きく成果を出すための準備は滞りなく進んでいると言えるだろう。次年度(平成25年度)が最終年度であるため、ビデオ撮影を追加で平成25年の秋に行うことを予定している。昨年度のビデオ撮影の成功を参考にビデオ撮影のノウハウを駆使し、さらに新しい知見が得られるように撮影を行いたい。参与観察は、続けている。今年度は、音声状況のよいビデオ撮影を行うことができたので、次年度も撮影のタイミングや母子への配慮、母子の自然の姿を撮影できるように調査を行いたい。学会発表も、関西社会学会、関東社会学会を予定しており、学会誌への投稿も投稿先を現在検討中である。複数の学会誌に投稿を予定している。得られた知見を元に「子育て現場」、「看護教育」、「社会」にむけて情報発信をしていきたいと考えている。今後は、本調査をいかに、成功させるかが重要である。課題としては、子育て支援センターという場で、音声状態が良好なビデオ撮影に成功できるかどうか、にかかっている。そのためには、ビデオの配置や設置等に多くの配慮が必要になってくる。また、撮影のタイミングや母子への配慮、自然の姿の母子を撮影ができるように、撮影のシュミレーションを行うことが重要であると考えている。可能な限り、中間事例報告的なものになるが、学会発表も行うことにしたい。次年度は、複数回、学会発表に出向くための旅費とデータセッション分析の精度を上げるため、6月と7月に行われるEMCA研究会主催のビデオエスノグラフィーの研修会に参加する予定である。その旅費にも当てたいと考えている。
発がん性かび毒アフラトキシンB_1結合蛋白質の性質の解析

アフラトキシンB_1(AFB_1)は現在知られている最も強力な肝発がん物質であり、強い肝急性毒性、肝細胞毒性を持つ。肝におけるその作用の発現には、ミクロソームのシトクロムP-450によって代謝活性化されたトキシンの生体高分子との結合が重要と考えられている。結合成分としてDNAに注目した研究は数多いが、蛋白質との結合様式に関しては知見が乏しいため、AFB_1の作用に蛋白質との結合が果たす役割は現在のところ不明であり、解明が待たれている。我々は今までに、AFB_1に高感受性のトリ胚初代培養肝細胞において(in vivo)細胞質の分子量25kDaの蛋白質が〔^3H〕AFB_1と特異的に結合すること、トリ胚肝臓のホモジネートより調製したpost-mitochondrial画分と〔^3H〕AFB_1をインキュベートすること(in vitro)によって分子量25kDaのものを含むいくつかの可溶性蛋白質が放射標識れることを見い出している。本研究は、AFB_1と蛋白質の結合がAFB_1の作用に果たす役割を解明することを目的に、分子量25kDaの蛋白質とAFB_1との結合様式について詳細に検討した。〔^3H〕AFB_1と蛋白質のin vitro結合は、トリ胚肝臓ミクロソーム画分の存在下では認められたが同画分の非存在下では認められず、in vitro結合がミクロソーム酵素系に依存した反応であることが明らかになった。また、トリ胚に加えて、トリ成鳥、ラット、ウサギ、マウス等、AFB_1に対する感受性の互いに異なる実験動物由来のin vitro系についても分子量25kDaの蛋白質とAFB_1との結合が認められ、その強さは、AFB_1の急性毒性に対する各動物種の感受性の高さによく対応していた。このことから、分子量25kDaの蛋白質がAFB_1の毒性の発現に何らかの役割を果たしている可能性が示唆された。
顎顔面形態に対する遺伝的影響と矯正治療の限界

研究対象として、矯正治療前・治療後・保定観察後の側貌頭部X線規格写真が揃っている治療患者98名とその血族両親196名を抽出した。資料としては咬合模型も用いた。次の相関分析をおこなった。1)側貌頭部X線規格写真から得られた11変数について(1)顔面頭蓋形態の変数では、矯正治療中にも術後観察期にも大きな変化はなかった。顔面頭蓋形態への矯正治療の影響は小さく、その個体が持つ骨格系の成長パタ-ンを維持していたと考えられる。(2)歯軸の傾斜を表す変数での変化は症例により様々で、叢生や上顎前突症例では上顎前歯、反対咬合では下顎前歯の変化が大きかった。術後観察期の変化(後戻り)が1020%認められた。上顎前歯歯軸は治療により自由に変化しても、術後観察期の変化は少ないが、下顎前歯歯軸は治療変化させることが難しいとの所見も得られた。2)家族内相関関係について矯正治療に伴い親子間の相関は高くなった。これは成長に伴い遺伝的形質が十分に発揮されるためとも、治療により術前の口腔環境が壊され、術後安定した状態との間にある程度家族性があるためとも考えられる。一方、歯軸傾斜角では遺伝的影響は小さい、即ち矯正治療が成立つ所であるし、軟組織の適応がなければ後戻りする所であると考えられる。3)咬合模型について。歯牙の捻転等の配列状態を接触点間のズレの大きさで見ると、治療変化が大きかった上顎前歯では後戻りも大きかったが下顎では小さかった。また歯列弓の近遠心的関係も、治療後には治療とは逆方向への変化が認められた。即ち後戻り現象が認められた。遺伝子影響を考えずして、むやみに歯牙ならびに顎顔面頭蓋に強制力を加えることは、必ずしも矯正治療とはならない。矯正診断においては、遺伝的影響を考慮した成長の予測が必要である。九州大学歯学部附属病院矯正科登録患者4000名から初診時年令10才以上で5年以上の経過資料がある患者62名(男20女42)を抽出した.その初回検査時(A),矯正治療終了時(B),保定観察後(C)並びにその両親の側貌頭部X線規格写真320枚を専門的に教育した者にトレースをさせた.矯正治療対象部位に関するデータを読み込ませ, 11変数と演算し患者の治療経過に伴なう変化と両親の観測値との関係を調べた.変数は, UN to polatal plane(PP),UN toMandibular plane(MP),PP to MP,UN to Facial plane(FP),PP to FP,切歯交又角,Upper 1(U1)to UN,U1 to PP,U1 to FP,Lower 1(L1)toMP,L1 to FPである.結果1.骨格系変数に関しては患者の術前(A)とその父母との間には有意な相関関係が認められた.しかし同変数で術後(B),成長終了後(C)ではやや低下.2.歯軸を含む変数では,術前には母との相関関係が強く,父とのそれは弱かったが,術後母との相関関係は弱くなり父とのそれと同程度になった.

3.家族内でUN to MP,UN to FPを用い患者術前(A)と父母の観察値より類似親・非類似親を選定し,親子の相関分析を行なった結果,骨格系変数では全ての段階で類似親と子の間では相関関係が非常に強く,非類似親とのそれは認められなかった.治療効果は骨格系まで及んでないことが〓えられる.歯軸系変数では類似親と子,非類似親と子の間で差を認めなかった.4.歯軸系変数では術後後戻り現象が認められ, (A)と(C)との間には0.80.9の強い相関関係が認められた.切歯交又角では治療移動量と後戻り量の間に-0.870の相関係数を認めた.しかし上下顎前歯の動態には差があり,下顎前歯は成長に伴なう方向に変化が認められたのに対し,上顎前歯は治療変化とは全く独自な後戻り現象を示した.本年度は、初年度に側貌頭部X線規格写真で分析を行った60名の矯正治療患者とその両親120名のうち、石膏咬合模型が治療前、治療終了時、予後観察後に揃っている44名と、正貌頭部X線規格写真が同様に揃っている56名のセファログラム280枚について分析を行った。1.咬合模型の分析矯正治療においては、第一大臼歯の咬合関係を正常な咬頭嵌合にし、他の部分の咬合調整を計る。治療前後における上下顎歯列弓の近遠心的関係の変化を見るたる、第一大臼歯の咬合関係の変化を計測した。だが小臼歯の抜歯症例ではこの変化量、即ち咬頭嵌合のズレの絶対値では問題があるので、近遠心的変化量の方向性についてx^2ー検定を行った。治療前後での第一大臼歯の咬頭嵌合のズレは、逆の方向に向かっていた(P<0.10)。叢生等により小臼歯を抜歯し歯の排列を行った症例では第一大臼歯は近心に移動したが、治療終了後装置を撤去すると遠心方向へ後戻りしたことを表していると考えられる。なお咬合平面内での歯牙の捻転等の後戻りに関しては写真撮影をし、較正後計測・分析中である。2.正貌頭部X線規格写真の分析正貌頭部X線規格写真上では矯正治療による側方歯群の変化を数量的に検討することは困難であるが、上下中切歯の歯軸の関係を数量化、矯正治療による変化を調べた。治療前後では顎顔面に対する歯軸の傾斜に線的関係を認められなかったが、治療終了時と数年間の予後観察後との間には統計的に有意な相関関係が認められた(P<0.01)。治療効果は、正貌観に限って言うと、ある程度維持されていることを示している。上下中切歯の歯軸の親子間における相関関係は、治療のどの時期をとっても認められなかった。歯軸や歯槽骨の領域は後天的、環境的影響が強い部位と考えられる。初年度に研究対象として得られた62症例に追加して、36症例を呼び出し資料を採取することができた。これら矯正治療患者98名について再度過去2年間に行ったのと同じ方法で分析した。1)側貌頭部X線規格写真から得られた11変数について(1)顔面頭蓋形態を表す変数では、矯正治療中あるいは術後観察期に平均値としては大きな変化は認められなかった。即ち顔面頭蓋形態は矯正治療の影響をあまり受けることはなく、その個体が持つ骨格系の成長パタ-ンを維持していたと考えられる。(2)歯軸の傾斜を表す変数では、矯正治療に伴う変化は症例により様々であった。叢生や上顎前突症例では上顎前歯、反対咬合症例では下顎前歯の変化が大きかった。術後観察期の変化すなわち矯正治療に伴う後戻りが1020%程度認められた。また上顎前歯の歯軸は治療によりかなり自由に変化しても、術後観察期の変化は少ないが、下顎前歯の歯軸は治療において変化させることが難しいとの所見も得られた。2)家族内相関関係について顔面頭蓋形態を表す変数でも歯軸の傾斜を表す変数でも、矯正治療が進むにつれて親子間の相関は高くなっていた。
線条体のGタンパク質共役型受容体に対する運動制御ペプチドの単離

いわゆるオーファン受容体ストラテジーにより線条体において作用するペプチドを単離するために、数百種のオーファンG蛋白質共役型受容体(GPCR)の中から線条体あるいは線条体に直接投射を持つ領域に分布するオーファンGPCRをin situハイブリダイゼーション法により形態学的にスクリーニングした.このデータを基に特異抗体を作製し免疫組織化学的による探索を行った.その結果、GPR6/3/C、GPR26、GPRJが線条体に分布することが明らかになった.GPR6/3/Cの免疫陽性染色は線条体においてパッチ・マトリックス様を示し、また線条体に関連する淡蒼球、側坐核、嗅結節、黒質、大脳皮質等にも認められた.GPR26は嗅結節、大脳皮質等にも分布した.GPRJは線条体においては特に外側部に斑状に分布した.これらのオーファンGPCRは従来のオーファン受容体ストラテジーにより細胞内情報伝達シグナルの変動を直接的に測定することは困難なため、次に、これらのオーファンGPCRは他の受容体とヘテロ複合体を形成した時にのみリガンドが結合するとの仮定に基づき、これらとヘテロ複合体を形成する受容体を探索するための形態学的手法の開発を試みた.その結果、いずれもグリアに発現し機能的にも共役する代謝型グルタミン酸受容体と水チャンネル受容体がヘテロ複合体を形成することをSDS処理凍結割断レプリカ免疫標識法により証明することができ、一般にオーファンGPCRのヘテロ複合受容体の探索にSDS処理凍結割断レプリカ免疫標識法が有効であることが示唆された.いわゆるオーファン受容体ストラテジーにより線条体において作用するペプチドを単離するために、数百種のオーファンG蛋白質共役型受容体(GPCR)の中から線条体あるいは線条体に直接投射を持つ領域に分布するオーファンGPCRをin situハイブリダイゼーション法により形態学的にスクリーニングした.このデータを基に特異抗体を作製し免疫組織化学的による探索を行った.その結果、GPR6/3/C、GPR26、GPRJが線条体に分布することが明らかになった.GPR6/3/Cの免疫陽性染色は線条体においてパッチ・マトリックス様を示し、また線条体に関連する淡蒼球、側坐核、嗅結節、黒質、大脳皮質等にも認められた.GPR26は嗅結節、大脳皮質等にも分布した.GPRJは線条体においては特に外側部に斑状に分布した.これらのオーファンGPCRは従来のオーファン受容体ストラテジーにより細胞内情報伝達シグナルの変動を直接的に測定することは困難なため、次に、これらのオーファンGPCRは他の受容体とヘテロ複合体を形成した時にのみリガンドが結合するとの仮定に基づき、これらとヘテロ複合体を形成する受容体を探索するための形態学的手法の開発を試みた.その結果、いずれもグリアに発現し機能的にも共役する代謝型グルタミン酸受容体と水チャンネル受容体がヘテロ複合体を形成することをSDS処理凍結割断レプリカ免疫標識法により証明することができ、一般にオーファンGPCRのヘテロ複合受容体の探索にSDS処理凍結割断レプリカ免疫標識法が有効であることが示唆された.線条体に局在するorphan G蛋白質共役型受容体(GPCR)に対するリガンドの単離により、大脳基底核の運動制御関連新分子の発見をはかるため、数百種のorphan GPCR中から線条体あるいは線条体に直接投射を持つ領域に局在するorphan GPCRを見出すべく、mRNAレベルではin situ hybridization法をタンパク質レベルでは免疫組織化学法を利用してその局在を形態学的に解析した.in situ hybridization法では既存orphan GPCRの塩基配列を基に設計したプローブでcDNAライブラリーまたはmRNAの一次逆転写産物をPCR増幅して作製したorphan GPCR非膜貫通部位数ヶ所をDNA鋳型として複数のジゴキシゲニン標識cRNAプローブをin vitro合成しこれにハイブリダイズするラット中枢神経系内のシグナルを組織切片をスライドガラスに固定せず浮遊切片のまま反応する独自の高感度かつ簡便な手法を活用して可視化した.当該部位に最も顕著なmRNA発現が認められるのはGPR6で、ORFの上流・下流の2種のプローブのいずれにおいても線条体、側坐核および嗅結節、視床下部腹内側核等に強い発現が、さらには黒質および視床下部背内側核等に中程度の発現が見られた.このGPR6に一次構造が最も類似したGPR3、GPRCのmRNA発現の脳内分布のパターンとGPR6のそれとの相異からGPR6とそのリガンドが大脳基底核の機能に特異的に関与する可能性が高いこと示唆された.続いてGPR6の大脳基底核、特に線条体での分布を免疫組織化学的に証明するため特異抗体の作製を試みたが、GPR6/3/Cのアミノ酸配列類似性は極めて高く、それぞれの特異抗体の作製は続行中である.現在のところGPR6は線条体の投射ニューロンに発現する可能性が高く、ここに発現するリガンド既知の受容体との相互作用をもとにGPR6のリガンドを精製する可能性が示唆された.いわゆるオーファン受容体ストラテジーにより線条体において作用するペプチドを単離するために、数百種のオーファンG蛋白質共役型受容体(GPCR)の中から線条体あるいは線条体に直接投射を持つ領域に分布するオーファンGPCRを形態学的に探索した.in situ hybridization法等のデータを基にさらに特異抗体を作製し免疫組織化学的な解析を行った.

その結果、GPR6/3/C、GPR26、GPRJが線条体に分布することが明らかになった.GPR6/3/Cの免疫陽性染色は線条体においてパッチ・マトリックス様を示し、また線条体に関連する淡蒼球、側坐核、嗅結節、黒質、大脳皮質等にも認められた.GPR26は嗅結節、大脳皮質等にも分布した.GPRJは線条体においては特に外側部に斑状に分布した.探索したオーファンGPCRは従来のオーファン受容体ストラテジーにより細胞内情報伝達シグナルの変動を直接的に測定することは困難なため、次に、これらのオーファンGPCRは他の受容体とへテロ複合体を形成した時にのみリガンドが結合するとの仮定に基づき、これらとへテロ複合体を形成する受容体を探索するための形態学的手法の開発を試みた.その結果、SDS処理凍結割断レプリカ免疫標識法によりいずれもグリアに発現する受容体である代謝型グルタミン酸受容体と水チャンネル受容体がへテロ複合体を形成し機能的にも共役することが証明され、一般にオーファンGPCRのへテロ複合受容体の探索にSDS処理凍結割断レプリカ免疫標識法が有効であることが示唆された.
メタロチオネインのストレス系細胞内シグナル伝達調節機構

本年度はテトラサイクリン依存的メタロチオネイン(MT)発現系の構築とカドミウム、水銀、亜鉛の細胞死誘導機構の解析を行った。テトラサイクリン依存的MT発現細胞をRT-PCRを指標にクローニングしたところ、数クローンが単離された。しかしながら、MTの蛋白量を測定したところ、テトラサイクリンによりMTの蛋白質量の制御が行われていなかった。本系に関しては、今後、テトラサイクリン発現系および導入する細胞種の再選定を行う必要がある。カドミウム、水銀のアポトーシス誘導機構については去年度の結果を踏まえて、ミトコンドリア依存的経路に焦点を当てて解析を行った。カドミウムによるアポトーシス誘導経路における各種caspaseの関与を検討したところ、ミトコンドリア依存的経路のinitiator CaspaseであるCaspase-9が関与していることを見い出した。また、水銀によるアポトーシス誘導経路もカドミウム同様ミトコンドリアを介したcaspaseの活性化が関与している可能性が示唆された。カドミウムと水銀によるアポトーシス誘導におけるミトコンドリア依存的経路の上流の機構をmitogen actlvated protein kinase(MAPK)の一つであるp38MAPKに着目して検討したところ、p38MAPK特異的阻害劑によって水銀のアポトーシス誘導は抑制されたものの、カドミウムのアポトーシス誘導は抑制されなかった。この結果から、両重金属間でアポトーシス誘導においてミトコンドリアの上流の経路が異なる可能性が示唆された。また、細胞内遊離亜鉛とアポトーシス誘導の関連について検討を行ったところ、細胞内遊離亜鉛濃度がある一定濃度に達した時にp38MAPKの活性化に伴うcaspaseの活性化が生じアポトーシスが誘導される可能性が示唆された。この時の亜鉛濃度は生理的条件であることから、亜鉛は生理的状態においてアポトーシスの誘導を積極的に制御している可能性がある。今後は、MTとの関連を念頭にいれつつさらなる解析を進める予定である。カドミウムおよび腫瘍壊死因子(TNF-α)による細胞増殖阻害作用に対するメタロチオネイン(MT)の効果を、MT遺伝子欠失伊東細胞(MT-/-cell)および正常伊東細胞(MT+/+cell)を用いてMTTアッセイにより検討したところ、カドミウムに対する感受性はMT+/+cellの方が約10倍高い値を示した(IC50値:4.3μM(MT-/-),40μM(MT+/+))。一方、TNF-α処理ではMT+/+cellにおいて増殖阻害作用(50% of control)が観察される50ng/ml処理においてもMT-/-cellでは有意な増殖阻害作用は観察されなかった。そこで次に、カドミウムおよびTNF-α処理によりMT+/+、MT-/-両細胞間の増殖に差が観察された条件において細胞内シグナル伝達系の活性化を検討した。細胞増殖シグナルとしてERK1/2、細胞増殖停止シグナルとしてp38 MAP kinaseに着目して検討を行ったところ、いずれのシグナル系においてもカドミウムおよびTNF-α両刺激においてMT+/+cellとMT-/-cellの間に差は観察されなかった。そこで次に、カドミウムの細胞毒性発現機構に立ち返り検討を行った。ヒト前骨髄性白血病細胞HL-60を用いて解析を行った結果、カドミウムが直接ミトコンドリアからのチトクロームcの遊離を引き起こし、遊離に伴う各種カスペースの活性化が生じアポトーシスが誘導される可能性が示唆された(近藤ら掲載済み、近藤ら投稿中)。また、カドミウム毒性の発現に関与していると言われているユビキチンシステムを指標に検討したところ、MT-/-cellではMT+/+cellと比較してカドミウムによる細胞内蛋白質のユビキチン化が顕著に亢進しており、細胞増殖阻害作用の相違と相関があった。そこで今後これらの結果を指標にさらに検討を行う予定である。

また、細胞内遊離亜鉛とアポトーシス誘導の関連について検討を行ったところ、細胞内遊離亜鉛濃度がある一定濃度に達した時にp38MAPKの活性化に伴うcaspaseの活性化が生じアポトーシスが誘導される可能性が示唆された。この時の亜鉛濃度は生理的条件であることから、亜鉛は生理的状態においてアポトーシスの誘導を積極的に制御している可能性がある。今後は、MTとの関連を念頭にいれつつさらなる解析を進める予定である。
強い混成効効を示す充填スクッテルダイト化合物の純良単結晶育成と物性評価

常圧フラックス法と高圧合成により充填スクッテルダイト純良結晶の合成を行い,領域内外研究グループに供給して共同研究を行った。同時に進めた,グループ内での研究を以下に例示する。(1)常圧合成されたPrFe_4Sb_(12)の磁気特性の矛盾する報告の原因の解明を目指し,Prサイトの充填率が高い試料を合成して強磁性的な転移が消滅することを示した。(1)その機構を解明するため,中性子非弾性散乱実験により,高充填率試料の結晶場基底状態がバルク測定と矛盾しないΓ_1であることを示した。(2)更に,Yb系,Nd系に拡張し,磁気的特性への顕著な希土類サイ充填率依存を確認し,PrOe_4Sb_(12)の超伝導2段転移の原因としての充填率効果の検証を進めている。(2)As系の本質的な物性評価のために,高温高圧下での長時間合成を行い,Rfe_4As_(12)(R=La,Ce,Pr)の純良結晶の合成に成功した(LaFe_4As_(12)の残留抵抗比は,これまでと比較し格段に大きな64である)。この純良結晶での物性測定により,約5K以下で弱い遍歴電子強磁性を示すことを見出し,より高い"電子状態密度"を持つ常磁性体LaFe4Sb12と対比して不思議な,この強磁性機構を説明する提案を行った。(3)中性子回折実験により,CeOs_4Sb_(12)の約1K以下の秩序相において,弱いSDW的な反強磁性を確認したが,比熱などのバルク測定による相図と矛盾して磁場1T以上で消滅する。また,報告者により異なる高磁場相図の矛盾を解決すべく,単結晶での比熱測定を行い,大きな異方性を明らかにし,更に,転移温度以上で4f電子の磁気的揺らぎを示唆する顕著な臨界発散的な依存性を見出した。その揺らぎは,この物質で見出されてきた,種々の物性にあらわれた異常な振る舞いへの,磁気的な揺らぎによることを示唆している。本研究班責務として、充填スクッテルダイト純良単結晶をフラックス法により育成し領域内・領域外研究グループに供給し、各種条件化でNMR、磁化、超音波、熱伝導度等の共同研究が進められた。通常フラックス法で不可能な構成要素での単結晶育成をめざし高圧合成炉H16年2月に導入、調整・条件調査をほぼ終了し、試料育成が開始される。本研究班が主体となって進めた実験結果の主要な例について報告する。1.PrFe_4P_<12>、PrRu_4P_<12>の非磁性秩序状態の解明のため、磁場下中性子散乱測定を行い、前者についてq=<100>に対応する超格子反射を確認し、反強四重極秩序であることを示した。更に、偏極中性子回析を行い、秩序変数がO_2^0型の四重極モーメントである証拠を得た。後者についても、原子変移が410倍大きな超格子反射を確認した。両物質の高温相での中性子非弾性散乱測定において、スペクトル幅の広い準弾性散乱を関することにより、他の測定から類推されていた、Pr化合物としては特異な強いcf-混成効果を確認した。2.物性測定に耐えるSmOs_4Sb_<12>の純良単結晶育成に初めて成功し、磁場中比熱を測定した。電子比熱係数は磁場に鈍感で0.80J/K^2mol.であり、極めて重い電子状態が確認された。3.比熱及び熱伝導測定から示唆された、PrOs_4Sb_<12>の多重超伝導相の可能性を検証するため、磁束流抵抗測定を行い、これまで報告のない2段階ピーク効果を発見し、更に超伝導高温相でのピン止め力の磁場角度依存に熱伝導測定と同じ4回対称性を見出した。4.μS R測定:PrOs_4Sb_<12>と参照物質LaOs_4Sb_<12>の超伝導相無磁場μS R測定の系統的な比較を行い、超伝導相で明白な内場の発生を確認した。これは、Sr_2RuO_4に次ぎ、金属系としては始めての時間反転対称性のやぶれを伴う超伝導体の発見となった。本研究班の責務として、充填スクッテルダイト純良単結晶のフラックス法による育成と領域内・外研究グループへの供給は、国内で35以上、国外で7つの、NMR、磁化、超音波、熱伝導度など多岐にわたる測定手法をもつグループに対して行い、共同研究が進められている。また、通常フラックス法では育成が困難な構成要素について、高圧合成炉をH16年2月に導入し、試料育成を進めている。以下に、本研究班が主体となって進めた実験結果の主要な例について報告する。1.現時点でこの物質系で最も重要な問題の一つが、PrOs_4Sb_<12>の超伝導の機構の解明である。特にクーパー対の引力の起源が、超伝導相に隣接する反強四重極秩序相(AFQ)の存在からから期待される、四重極揺らぎによるのか否かが注目される。そのため、中性子散乱実験により、低エネルギー磁気励起の観測を行い、励起が波数ベクトル=[100]{

AFQ相の変調ベクトルと同じ}の近傍でソフト化すること、そのエネルギーと幅の超伝導転移温度近傍の振る舞いから、四重極揺らぎと超伝導状態の強い相関を明らかにした。2.一方、PrRu_4P_<12>の示す金属-非金属転移の機構を理解するためにも、またPr-系スクッテルダイト全体の理解のためにも、c-f混成効果の寄与、結晶場スキームの知見が必要なため、中性子非弾性散乱測定の温度依存測定を行った。その結果、(1)転移温度以下では格子歪みに伴う二つの非等価なPrサイトに対応する明白な結晶場励起が見えること、(2)そのエネルギーが大きく温度依存すること、(3)転移温度異常で線幅が急増すること、など極めて特異で重大な情報が得られた。本研究班の責務として、充填スクッテルダイト純良単結晶のフラックス法による育成を行い、領域内外・国内外の多岐にわたる測定手法を持つ50以上の研究グループに供給し、共同研究を進めた。同時に、通常フラックス法では育成が困難な構成要素について、高圧合成による結晶育成と純良化を進めた。以下に、本研究班が主体となって進めた実験結果の主要な例について報告する。1.SmOs_4Sb_<12>単結晶の育成に初めて成功し、Sm系化合物としては最も重い電子系であること、しかもその電子質量は磁場に非常に鈍感であることを見出した。これは、質量増強の機構がこれまでのf電子系とは全く異なることを示唆しており、機構解明のため多くの研究者との共同研究が進められている2.PrOs_4Sb_<12>のフラックスフロー抵抗の磁場依存性測定を行い二段の極小を見出した。これまでの超伝導体で報告されている、磁化のピーク効果と関連した一段の極小とは異なり、この物質の特殊性を反映している。3.PrFe_4P_<12>、PrRu_4P_<12>のフェルミ面は波数ベクトル[100]のネスティング条件を満たしており、温度低下に伴い、異なった特性の金属-非金属(半金属)を示す。二つの相の相関を調べるためPr(Fe_xRu_<1-x>)_4P_<12>を育成して物性測定を行なった結果、両相とも微少な置換により急激に抑制されることを明らかにした。4.PrFe_4Sb_<12>は、PrOs_4Sb_<12>、PrFe_4P_<12>という二つの典型物質の振舞いの理解を進める上で重要な物質である。高圧合成法によりPrイオンの充填率が実験誤差内で100%の結晶育成に初めて成功し、これまでの不完全充填試料(フェリ磁性的基底状態)とは異なり、常磁性基底状態を持ち、物性への3dバンドの影響が大きいことを確かめた。充填スクッテルダイト純良単結晶のフラックス法による育成を行い、領域内外・国内外の多岐にわたる測定手法を持っ研究グループに供給し、共同研究を進めた。同時に、通常フラックス法では育成が困難で、希土類サイトの充填が不完全になる、Sb-、As-系について、高圧合成による結晶育成と純良化を進め、グループ内で以下のような測定を進めた。1.中性子散乱実験:PrFe_4p_<12>およびそのLa置換形について、非磁性秩序相の転移温度上下で、磁気励起スペクトル測定を進め、新たな解析によりΓ_1型の秩序パラメーターである可能性を示した。更に、重要な議論の対象となっているラトリングの寄与が大きいとされているPrRu_4Sb_<12>、PrOs_4Sb_<12>について、非弾性散乱測定を行い、低エネルギーフォノンに異常なソフト化を観測した。解析の結果、主にPrイオンの大きな振幅のカゴ内振動によることを示した。2.PrFe_4P_<12>の圧力誘起絶縁相のミクロスコピックな解明:
生理的環境及び炎症性肺疾患病態下における肺内幹細胞動態とそのホーミング機序の解明

1.マウス、ラットの炎症性肺疾患モデルにおける、肺局所幹細胞マーカーの発現、及び幹細胞のホーミングに関連するメディエータの解析:1)マウス塩酸吸入急性肺損傷モデル:種々の濃度、量の塩酸を経気道的に噴霧し、肺の病理組織所見を経時的に観察したところ、0.5N塩酸投与群で再現性よく肺水腫が認められ、同濃度が本研究の至適濃度と判断された。次に、正常、急性肺損傷時の局所幹細胞動態解析を、主にMusashi-1をマーカーとして行った。その結果、肺傷害の惹起後、経時的に肺気管支領域を中心としたMusashi-1陽性細胞の増加を認めた。Musashi-1は元々神経領域の幹細胞マーカーとして見いだされたが、その後他臓器の上皮幹細胞にも発現していることが確認されており、肺上皮細胞傷害後の組織修復・再生に局所幹細胞が関与していることを示唆する所見と考えた。2)ラット放射線肺臓炎/肺線維症モデル:MDC、TARCの肺局所産生充進を確認し、その幹細胞集積、活性化への関与の検討を開始した。3)マウス熱傷後敗血症性急性肺損傷モデル:熱傷前負荷群で細菌内毒素投与後の肺組織中MDC、TARC値が有意に高値をとったため、現在CCR4拮抗薬の影響を検討中である。2.マウスを用いた、肺の多能性幹細胞、sidepopulation(SP)細胞分離技術の確立と、同法を用いたin vivo肺SP細胞定量:肺組織からのSP細胞の分離技術を確立するため、肺スライスの方法、使用する組織融解酵素(コラゲネース、ジェラチネース)の選定と至適濃度、処理時間、などを変えて、幹細胞収率が最も高い分離条件を探索した。SP細胞の収率は0,050.8%と非常に少なく、かつばらついていたため、正常時と肺傷害時のSP細胞数の変化を本解析法で明らかにできなかったが、上記(1)と同様肺における幹細胞の存在を明らかにすることができた。1.マウス、ラットの炎症性肺疾患モデルにおける、肺局所幹細胞マーカーの発現、及び幹細胞のホーミングに関連するメディエータ特にケモカインと、MMP等の解析:(1)マウス塩酸吸入急性肺損傷モデル:本年度は、モデルを確立するため、種々の濃度、量の塩酸を経気道的に留置、または噴霧し、肺の病理組織所見を経時的に観察することで、至適塩酸濃度、量を検討した。また、正常肺における組織幹細胞の有無を調べるため、他臓器の組織で幹細胞マーカーとされる複数の抗体で染色したところ、複数の陽性マーカーを見いだしたため、現在サイトケラチンなど細胞特異的マーカーとの二重染色を行い、陽性細胞の種類を同定中である。(2)ラット放射線肺臓炎/肺線維症モデル:ラット肺へ放射線を照射後、経時的病理像、ハイドロキシプロリン含有量を指標とした線維化の進展を観察した。さらに(1)と同様の手法により幹細胞マーカーによる染色を開始した。(3)マウス熱傷後敗血症性急性肺損傷モデル:マウスに約30%のIII度熱傷を作成、711日後に細菌内毒素を投与し、急性肺損傷を惹起する系において、熱傷前負荷による予後の不良化を再確認した。また熱傷前負荷群では、細菌内毒素投与後の肺組織中ケモカインMDC, TARC値が有意に高値をとることを見いだし、現在追加実験にて確認中である。

今後これらケモカインに対する拮抗薬の投与も計画している。2.マウスを用いた、肺及び骨髄からの多能性幹細胞、sidepopulation (SP)細胞分離技術の確立と、同細胞のフェノタイプ、特にケモカイン受容体発現の解析:初年度は、肺組織からのSP細胞の分離技術を確立するため、肺スライスの方法、使用するcollagenase等酵素の選定と至適濃度、処理時間、などを検討し、全肺細胞中0.3%程度のSP細胞を得ることに成功した。(1)マウス炎症性肺疾患モデルにおける、肺局所幹細胞マーカーの発現、及び幹細胞のホーミングに関連するメディエータの解析:マウス塩酸吸入急性肺損傷モデルを用いて、昨年に引き続き、正常、急性肺損傷時の局所幹細胞動態解析を、主にMusashi-1をマーカーとして行った。その結果、肺傷害の惹起後、経時的に肺気管支領域を中心としたMusashi-1陽性細胞の増加を認めた。Musashi-1は元々神経領域の幹細胞マーカーとして見いだされたが、その後他臓器の上皮幹細胞にも発現していることが確認されており、肺上皮細胞傷害後の組織修復・再生に局所幹細胞が関与していることを示唆する所見と考えた。今後Musashi-1発現抑制などの手法を用いた局所幹細胞枯渇が肺損傷後の組織修復・再生へ与える影響を検討予定である。(2)マウスを用いた、肺及び骨髄からの多能性幹細胞、Side Population (SP)細胞分離技術の確立と、同法を用いたin vivo肺SP細胞定量:SP細胞の分離法を色々と工夫し、さらに収率の良い分離条件を探索した。全肺組織を様々な濃度の組織融解酵素(コラゲネース、ジェラチネース)を加えて種々の時間インキュベートし、その後ホモジェネートして得られた細胞から、高性能セルソータを用いてHoechst 33258色素高排出能を有するSP細胞の分離を行った。SP細胞の収率は0.050.8%と非常に少なく、かつばらついていたため、正常時と肺傷害時のSP細胞数の変化を本解析法で明らかにすることはできなかったが、上記(1)と同様肺における幹細胞の存在を明らかにすることができた。今後同細胞の由来を明らかにするため、骨髄幹細胞枯渇後の肺SP細胞を解析予定である。