hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
生理用品の流入による女性の身体観の変容：パプアニューギニアの事例から

本研究の対象であるメラネシアは、月経や出産という女性の身体の生理的現象を忌避する社会として広く知られている。本研究は、パプアニューギニアにおける生理用品(ナプキンのような西洋起源の月経処置の道具)の受容に焦点をあてて、女性の身体の歴史的経験を明らかにすることを目的とした。月経処置の道具の変遷について、基礎的な資料を収集した。それらの使用方法と月経期間の過ごし方から、月経小屋が存在した当時とナプキンが普及した現在の月経にまつわる慣行を比較した。ナプキンの使用によって女性は行動範囲を広げ、月経という身体の出来事は女性個人のものとなった。本研究は、パプアニューギニアにおける生理用品(ナプキンのような西洋起源の月経処置の道具)の受容を事例に、月経にまつわる慣行やその使用による身体観の変容を明らかにすることを目的としている。この目的を達成するため、本年度は、東セピック州マプリック地区ニャミクム村において予備調査を実施し、パプアニューギニア大学図書館ほか、マプリック地区で活動しているNGOなどで資料収集を行った。調査村では、20代から80代までの女性29名に、これまでに使用した月経処置の道具、使用の仕方、使用感、廃棄の仕方について聞き取りを行った。その結果、月経処置の道具は、1月経小屋のなかに敷いたヤシ科植物の仏炎苞(実を包むように成長する羽状の葉) →2布(仏炎苞の上に敷く) →3布(パンツをはいて固定する)、または生理用ナプキンというように変遷し、世代間で月経処置の経験が異なることが明らかになった。このうち、1の月経小屋はすでに現存しておらず(2006年までは確認できた)計測できなかった。月経小屋を使用した経験のある女性から、複数の月経中の女性が一緒に過ごすことがあったこと、直接仏縁苞に座るため肌がくっつくという不快感があったこと、月経中でも森へ行き薪集めなどを行なったこと、泉で頻繁に体を洗ったことなどを聞き取った。女性たちが次第に月経小屋を利用しなくなるのは、パンツとナプキンの普及を要因としており、これらの普及には、流通ルートの確保と学校での保健授業が関連していることも明らかになった。これまで、月経小屋にまつわる慣行は、その存在こそが知られていたが基礎的なデータの水準で存在していなかった。本年度のデータ収集は、そうしたデータの欠落を埋めるとともに、生理用品というモノの普及と、身体的な感覚、月経についての意識の関係を明らかにするのにつながるものである。本研究課題について、資料の精読による歴史人類学的研究と、参与観察による民族誌的研究を行った。人口840人の調査村において、10代から80代までの50人の女性に、月経処置の道具の変遷と処置法に関する調査を行った。研究成果を整理すると以下のようになる。生理用品を使用する慣行を生み出した近代医療や学校教育などの制度の導入は植民地時代に始まった。1960年代には医師・看護師による妊婦と乳幼児の健診が調査村でも始まり、月経小屋での出産が危険視され、月経処置は不衛生だとされたが、月経小屋を中心とする慣習は簡単には変わらなかった。生理用品が調査村で使用されるようになり月経小屋が数を減らしていくのは、都市部で生活し学校にも通学した経験のある女性の帰村と、生理用品の流通ルートが確保されたことによる。生理用品の普及以前、女性たちは、土間式の月経小屋のなかで、ヤシ科植物の仏炎苞(羽状の葉で、人間一人が座ることのできるほどの大きさ)を敷き、下半身には何も纏わずに座っていた。仏炎苞は経血を吸収せず、女性たちは座っていなければならなかった。当時は、集落の誰もが月経期間の女性を知ることができ、月経小屋は女性の性を可視化する装置として機能していた。月経処置の道具には、仏炎苞、布、パンツ、ナプキン、タンポンという変遷が認められた。なかでもナプキンの使用によって、女性たちは月経期間でも人前を歩くことができるようになった。月経期間の女性が不可視となり、月経という身体の出来事が女性個人のものとなった。本研究では、月経に対する忌避観の強い地域における生理用品の受容に関する具体的資料を収集することができた。身体に直接触れるモノの受容から身体観の変容を考え、対象社会の変容を女性の経験に即して描き直すことのできる資料となった。今後は、生理用品の流通とイメージ、月経に関する言説の消費に研究を展開させていきたい。今年度実施した予備調査において、生理用品の変遷を概ね把握した。その使用の仕方や使用感についても聞き取りを始めている。生理用品の普及については、流通ルートの確保と学校での保健教育が関連していることも把握できた。

こうした結果をふまえて、来年度の調査項目の見直しを進めているため、おおむね順調に進展していると考えている。25年度が最終年度であるため、記入しない。来年度も調査村で資料収集を行い、データの信頼性を高めるとともに、保健教育がパプアニューギニアの学校教育にいかに組み込まれたのかについて資料収集を行う予定である。そのため、来年度は、パプアニューギニア国立古文書館での資料収集に十分な時間を割きたいと考えている。収集した資料を分析し、口頭発表、論文という形で、結果を公表する。今年度の資料収集において問題となったのは、布やナプキンなどが流入する以前に月経処置の道具として使用されていたヤシ科植物の仏炎苞の収集である。植物の一部であり、収集には十分な乾燥と保存処理、保管場所の確保、許可申請などが必要であると考えられた。これについては所属研究機関の国立民族学博物館に相談し、収集の目途を立てたい。
再生医療のためのECM模倣ステントの開発

本研究は,情報処理解析手法と,実験的なペプチドアレイを用いた手法との融合による,新しい手法でデザインしたペプチドで,血管内の環境を模倣した,内皮化促進医療機器を開発するものである.具体的な方法は3ステップにて遂行した.1.ECM(細胞外マトリックス)構成タンパク質由来ペプチドのスクリーニング(情報処理的解析),2.ペプチドアレイを用いたアッセイ:細胞特異的接着&増殖実験(実験的手法),3.生体適合性マテリアルへの結合⇒動物実験評価1から,細胞外マトリックスであるコラーゲンIVに特徴的に存在する3残基ペプチド配列を,他のコラーゲンIVと比べる事により,907配列発見した.また,2から,内皮細胞に特異的な接着ペプチドを20種類ほど発見できた.3から,2で発見した内皮特異的接着ペプチドを人工血管に使用可能な素材であるPCLへ用いることにより,in vitro,in vivoでの評価を行った.in vitroでは,シート上で内皮特異性がみられ,in vivoにおいては,様々な生物学的検証(免疫染色,SEM写真,ウエスタンブロッティング)から,早期の内皮化が確認された.これにより,ペプチドアレイによる,生体材料のデザインの可能性が示唆され,今後も新たな生体材料の開発に貢献できるものと考えている.本研究は,情報処理解析手法と,実験的なペプチドアレイを用いた手法との融合による,新しい手法でデザインしたペプチドで,血管内の環境を模倣した,内皮化促進医療機器を開発するものである.具体的な方法は3ステップにて遂行した.1.ECM(細胞外マトリックス)構成タンパク質由来ペプチドのスクリーニング(情報処理的解析),2.ペプチドアレイを用いたアッセイ:細胞特異的接着&増殖実験(実験的手法),3.生体適合性マテリアルへの結合⇒動物実験評価1から,細胞外マトリックスであるコラーゲンIVに特徴的に存在する3残基ペプチド配列を,他のコラーゲンIVと比べる事により,907配列発見した.また,2から,内皮細胞に特異的な接着ペプチドを20種類ほど発見できた.3から,2で発見した内皮特異的接着ペプチドを人工血管に使用可能な素材であるPCLへ用いることにより,in vitro,in vivoでの評価を行った.in vitroでは,シート上で内皮特異性がみられ,in vivoにおいては,様々な生物学的検証(免疫染色,SEM写真,ウエスタンブロッティング)から,早期の内皮化が確認された.これにより,ペプチドアレイによる,生体材料のデザインの可能性が示唆され,今後も新たな生体材料の開発に貢献できるものと考えている.
化学修飾型基質を特異的に取り込むDNAメチル化酵素を用いたメチル基継承機構の研究

メチル基の継承に関する解析を目的として、修飾型S-アデノシル-L-メチオニン(SAM)の化学合成とそれを特異的に取り込みメチル基の代わりにシトシンに導入するDNAメチル化酵素の創製を目的とした。分割型メチル化酵素の会合様式を詳細に解析するためにアフィニティー精製によって得られた酵素を用いたカイネティクス解析を行った。その結果、標的DNA配列の非存在下では分割型ドメイン間の相互作用は無く、それぞれの構造に関しても変化が起きていないことが明らかにされた。標的DNAが存在する場合は、各ドメインのDNA結合活性が上昇することから、会合に際して相互作用が存在することが示唆された。また、細胞内における標的配列特異的なDNAメチル化を行うために、数種類の標的に対して結合するジンクフィンガードメインを構築し、ゲノム遺伝子に対する結合も確認された。細胞内における酵素反応においては酵素の発現量も重要な要素になることが考えられた。そこで、コドン配列を最適化することによってメチル化酵素の細胞内発現量が向上することに成功した。本研究で得られた知見は細胞内におけるDNAメチル化パターンの維持に関する知見を得るために必要な技術要素として重要なものであると考えられる。本年度の研究において、分割型DNAメチル化酵素の会合様式に関するカイネティクス解析を詳細に行うために得た精製酵素を用いてCDスペクトルの測定を行った。各分割型ドメインのスペクトル、および混合した場合のスペクトルを比較したところ、C末端ドメイン(MeCD)およびN末端ドメイン(MeND)について、混合時のスペクトルは和を示していた。よって、混合時はそれぞれの分割型ドメインの構造的な変化は起きていないことが明らかになった。この測定条件では標的DNAが存在していないため、分割型DNAメチル化酵素が標的配列に結合したのちに会合をしてメチル化活性を発現するという予測に対する根拠の一つが得られたと考えられる。また、標的とするDNA配列の拡張を行うため、テロメア逆転写酵素のプロモーター配列、ASH1、ATF3各遺伝子のコーディング配列に対して結合するジンクフィンガーの構築を行った。分割型酵素のDNA結合ドメインとして、隣接する配列に結合する2個のジンクフィンガードメインが1対になる。それぞれの標的遺伝子に対して約20対のジンクフィンガードメインを構築し、その中から数ー数10 (nM)の高いDNA結合活性を有するジンクフィンガードメインを得ることに成功した。また、哺乳類細胞内において活性を有するメチル化酵素の構築を検討するため、ジンクフィンガードメインとDNAメチル化酵素M.HhaIの融合酵素を構築し、細胞内での発現に関する検討を行った。最初の段階では発現が見られなかったが、ファージ由来のメチル化酵素であるM.HhaIの遺伝子配列についてコドンの最適化を行ったところ、良好な発現が確認された。発現が最適化されたメチル化酵素ドメインを基に分割型メチル化酵素の構築を行うことで、細胞内において配列特異的なDNAメチル化を行うことが可能になり、メチル基の継承に関する知見につながると期待される。本年度の研究では、分割型メチル化酵素の会合様式を詳細に解析するために精製酵素を用いたカイネティクス解析を試みた。これまでに、C末端側ドメイン(MeCD)についてT7プロモーター発現系では発現が困難であたため、コールドショックプロモーターを有するプラスミドを用いてヒスチジンタグ融合タンパク質として発現を行った。その結果、可溶性画分に目的タンパク質を得ることができた。N末端側ドメイン(MeND)はMBP融合タンパク質として発現を行い、それぞれアフィニティー精製によって90%以上の純度で分割型メチル化酵素の各ドメインを得ることができた。また、DNA結合実験のコントロールとして各分割型ドメインに含まれているZFPを独立して発現・精製を行い、メチル化酵素との融合によるDNA結合への影響を確認することにした。DNA結合については標的配列を含むヘアピン型オリゴをプレートに吸着させ、ターゲットELISA法を用いて行った。その結果、MeND中のZFP(HS2)は48.4 nM、MeCD中のZFP(HS1)は67.5 nMというKd値を示し、十分なDNA結合親和性を有することが示された。次に同様の実験系を用いてMeNDおよびMeCDのDNA結合実験を行った。この結果、MeNDにおいてはKdが256 nMであり、ZFPのみと比較して5倍程度の親和性の低下が見られたものの、十分なDNA結合活性を有することが示された。

MeCDにおいてはKd値が10 uM以上であり、顕著なDNA結合性の低下が確認された。次に分割型ドメイン間の相互作用について標的DNA配列存在下で検討を行った。MBP融合タンパク質であるMeNDのDNA結合をELISA法によって検出する系内にMeCDが存在することでDNA結合親和性の上昇が確認された。このことから分割型メチル化酵素は標的DNAの存在下で効率的な会合をすることが示された。遺伝子に対して特異的に結合するDNAメチル化酵素の構築に関してはジンクフィンガードメインのデザインに関して、今年度はDNA結合における配列依存性についてデータの蓄積を行うことができた。従って、DNAメチル化酵素への応用も24年度以降スムーズに行えると考えている。メチル化酵素の酵素活性に関しては、分割型ドメインの会合に関する知見、分割型ドメインの分割部位によるDNAメチル化活性への影響などに関する知見を得ることができた。従って、24年度に酵素活性の最適化を行う際に有用となると期待している。S-アデノシル-L-メチオニンの誘導体合成については今年度取り組むことができなかった。しかし、共同研究などを通して、合成手法確立の方針などについては検討することができたため、24年度に目的とする化合物を速やかに得ることが可能であると考えている。分子進化法によるメチル化酵素活性の最適化に関しては、大腸菌をベースとした手法を用いる予定をしている。これについて用いるプラスミドベクターなどについて、条件を確定できたことは24年度においてこの手法に取り組む際に非常に有用になると考えられる。機能性タンパク質ドメインを分割型にすることによって会合する条件(融合した他のタンパク質ドメインの会合やDNA結合など)で機能を発現させる手法は細胞内の生命現象を理解するために利用されている。しかし、それらの研究においてピュアな系でそれぞれのドメインがどのような相互作用をしているか、また細胞内でみられる現象を反映しているか検討している例は少ない。今後さらに分割型ドメインの相互作用がどのような条件が重要になるか検討を行うことで、より活性の高いDNAメチル化酵素を創製することが可能になると期待されると同時に分割型機能性タンパク質のデザインにおいて有用な知見を与えると考えられる。分割型DNAメチル化酵素の標的DNA配列の作用においては1.各ドメイン(MeNDおよびMeCD)のDNAとの相互作用、2.分割型ドメイン間の相互作用による相互のDNA結合への相乗的効果、3.会合したDNAメチル化酵素ドメインのDNA配列との相互作用、の3点が主な要素であると考えられる。今年度の研究において、分割型ドメインが相互作用し、DNA結合親和性が増大していることを示すことができた。今回の実験系では標的DNA配列の存在下でのみドメイン間の相互作用を評価できる。
高齢者の寝たきり予防のための離床プログラムの開発に関する研究

本研究は、高齢患者が治療を受ける過程で寝たきり状態に陥いるのを防止するための「離床プログラム」を開発することを目的としている。初年度は、「離床プログラム」の作成資料とするために、入院中の高齢患者を対象にして離床実態調査を実施した。4病院、94名の高齢患者を対象として、いつ、どのように離床がなされているか、また離床に際してどのような問題が発生しているのか、さらに離床を阻害している要因はなにかを調査した。その結果、退院時点で発症前の移動能力(自力歩行)に回復している群(63名)と低下している群(31名)とに分れた。離床時期は回復群が約8日、低下群は約14日であった。また、早期離床を阻害する要因として明らかになったものは、高齢、大腿骨骨折、脳血管障害、まひ、拘縮、痴呆、不穏の出現であった。次年度は、4病院で電動ベッドと手すり付ポ-タブルトイレを使用して高齢患者の離床に取組んだ。それらの設備が早期離床に一定の成果をあげるものの不穏対策などを含めた総合的な離床プログラムの必要性が示唆される結果を得た。2年間の研究により、離床プログラムを策定するうえで次のような示唆が得られた。(1)移動能力を低下させないための離床時期は臥床後、2週間を目途にすることが望ましい。(2)離床を阻害する要因のなかで不穏は看護の対応によって改善しうるものなので、身体抑制や薬物投与に頼らない対応を検討すべきである。それに基づいて、離床プログラムの概要を提示した。初年度に当たる本年は、実効ある「離床プログラム」開発するために、入院中の高齢患者を対象にして、離床実態調査を実施した。離床実態調査は、入院中の高齢者が急性期治療を受けている過程で、どのように離床がなされているのか、また離床に際してどのような問題が発生しているのか、さらに離床を阻害している要因はなにかを把握し、「離床プログラム」の作成資料とするものである。離床の過程は医師の指示による安静度とともに、排泄状態(カテール、おむつ、便尿器、トイレなど)と食事の状態を中心とした患者の生活機能の変化を把握した。離床の促進並びに阻害要因として、病状(バイタルサイン、検査値など)、医療処置、不穏症状の種別と有無、環境要因として、ベットの種類と高さ、トイレの位置や種類を病日を追って、4週間ないし退院日まで経過を記録した。さらに患者や家族の意欲・態度を調べた。調査対象とした病院は5ケ所あるが、実施時期が遅かったことと、経過を追う調査内容であるため、一部回収が遅れたために、データは解析中である。本研究の最終年度に当たり、前年度に実施した「離床実態調査」のデータ解析と電動ベッドと手すり付きポ-タブルトイレを使用して入院中の高齢者の早期離床に取組んだ。離床実態調査は、4病院、94名の高齢患者の結果が得られた。94名のうち、退院時点で発症前の移動能力(自力歩行)に回復している群が63名、低下している群が31名であった。臥床期間が長いことが移動能力の低下に影響していた。また、早期離床を阻害する要因として明らかになったものは、高齢、大腿骨骨折、脳血管障害、まひ・拘縮、痴呆、不穏の出現であった。4病院において電動ベッドと手すり付ポ-タブルトイレを使用して、高齢者の離床に取組んだ結果は、それらの設備が早期離床に一定の成果があることはわかったが、不穏対策などを含めた総合的な離床プログラムの必要性が示唆された。

2年間にわたる研究結果から離床プログラムを策定するうえで、次のような示唆を得た。(1)移動能力を低下させないための離床時期は臥床後、2週間を目途にすることが望ましい。(2)臨床を阻害する要因のなかで不穏は看護の対応によって改善しうるものなので、身体抑制や薬物投与に頼らない対応を検討すべきである。以上の結果に基づいて、治療を受けている高齢患者の離床プログラムの概要を提示した。
単一細胞の網羅的遺伝子発現プロファイルの統合解析による乳がん組織不均一性の解明

我が国において乳がんは女性で最も罹患数が高いがんであり、今後も患者数や死亡者数の増加が懸念されている。近年の研究により、正常幹細胞と同様に自己複製し、非対称性分裂により分化する特徴を持つ、がん幹細胞とよばれる少数の細胞集団が、腫瘍の発生や転移、再発の原因であると考えられている。本研究では、がん幹細胞を腫瘍細胞のヒエラルキーの頂点としたがん組織の多様性・可塑性の実態の解明を目的とする。具体的には、すでに収集済みの乳がん臨床検体2例(トリプルネガティブタイプ)について、我々が発見した新規乳がん幹細胞様細胞マーカーであるNeuropilin1 (NP1)が陽性の分画(乳がん幹細胞濃縮群)と陰性分画(コントロール群)をFlow cytometryにて各々分取し、Fluidigm C1 single cell-prepsystemにより単一細胞を回収した。回収した細胞より抽出したRNAからタグ付けした断片化cDNAライブラリーを作製し、次世代シーケンサーで解析した。結果、NP1陽性と陰性で分散が異なる遺伝子群についてNP1陽性群のほうに従来のがん幹細胞に関わる遺伝子群と神経軸索伸長に関与する遺伝子群が非常に濃縮することが明らかになった。NP1陽性細胞群の中から高発現している遺伝子を数個選び、qPCRを用いて発現を確認することにより、がん幹細胞の維持に関与すると予測される新規の分子標的候補を同定した。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では、乳がんを対象としてがん幹細胞をヒエラルキーの頂点としたがん組織の多様性、可塑性の実態の解明を目的とし、乳がん臨床検体を用いて1細胞レベルで網羅的な解析を行う。さらに、解析過程でがん幹細胞維持の鍵となる分子を同定し、がん幹細胞特異的に発現しているタンパク(がん幹細胞マーカー)や、がん治療薬の開発につながる分子標的を見出すことも視野に入れて研究を遂行している。採用1年目では、乳がん臨床検体から極少数しか存在しないがん幹細胞を多く取得する方法を検討した。共同研究先の東大医科学研究所にてすでに収集済みの乳がん臨床検体1例(ER-/Prg-/HER2-;トリプルネガティブ)を免疫不全マウスに移植しPDXを作製した。組織片移植約2ヶ月経過後にできた腫瘍から組織粉砕と酵素処理によりがん細胞を単離し、EGF、basic FGF、B27を含む無血清培地中で培養を行った。培養1週間後、100μm以上の細胞塊(スフェア)が複数観察されることを顕微鏡下で確認した。フィルター処理によりスフェアのみを取得し、酵素処理により細胞を分散した後、がん幹細胞マーカーをフローサイトメトリーにて解析した。その結果、接着細胞と比較して、スフェアの方ががん幹細胞様細胞が濃縮されることを確認した。以上の結果を踏まえて、今後は臨床検体のスフェア培養によりがん幹細胞を濃縮させた後、フローサイトメトリーにてがん幹細胞様細胞と非がん幹細胞に分けて1細胞解析を行い、RNAーseqによりがん幹細胞様細胞に特徴的な遺伝子発現を評価する予定である。これまでに生体外で細胞単離し培養することが困難な乳がん臨床検体でスフェアアッセイやマウスへ移植するpatient-derived xenograft(PDX)の系を立ち上げた。1細胞解析を行うための条件検討として腫瘍から取り出した細胞の内数%しか存在しないがん幹細胞をできるだけ多く確保する方法を確立や、生細胞のまま細胞を解析できる条件の検討に時間を要したが、おおむね順調に研究が進展したといえる。乳癌の中でも悪性度が高いとされているトリプルネガティブタイプについて、腫瘍細胞をシングルセルレベルで解析することにより、乳癌組織の不均一性を解明し、さらにはがん幹細胞性が維持される分子機構を明るみにすることを目的としている。乳癌臨床検体2検体について、免疫不全マウスに移植して再構築させた腫瘍を酵素分散し、スフェア培養後、我々が新規に見出したがん幹細胞マーカーの発現の有無により各々細胞分取した。Fluidigm C1を利用してシングルセルソーティングからcDNA合成までを行い、次世代シーケンサーによるRNAシーケンスを行った。RNAシーケンスおよびデータ解析については共同研究先とともに行った。がん幹細胞マーカー陽性、陰性の各分画のシングルセルにおける発現差異解析を行ったところ、がん幹細胞マーカー陽性と陰性で分散が異なる遺伝子群について、陽性群のほうに従来のCancer Stem Cell Signatureが非常に濃縮することが明らかになった。さらに陽性群の中でもcancer stem likeな分画とそうでないものが混在していることがわかった。したがって、がん幹細胞マーカー陽性細胞の中でもより幹細胞性が高い細胞がごく一部含まれており、それらが腫瘍組織内のヒエラルキーの頂点にいるのではないかと推測している。最終年度ではシングルセル解析結果をもとに、がん幹細胞維持に重要でかつ治療薬の標的となり得るような分子を見出すことを目標としている。予定していた乳がん臨床検体2例のXenograftモデル作製、Fluidigm C1によるシングルセルソーティングおよびcDNA合成、次世代シーケンサーによる解析まで修了した。最終年度でがん幹細胞維持に重要でかつ治療薬の標的となり得るような分子を見つけ解析する予定である。現段階で2年間の研究成果を基に論文を作成できる目処がついており、本研究はおおむね順調に進展しているといえる。

近年の研究により、正常幹細胞と同様に自己複製し、非対称性分裂により分化する特徴を持つ、がん幹細胞とよばれる少数の細胞集団が、腫瘍の発生や転移、再発の原因であると考えられている。本研究では、がん幹細胞を腫瘍細胞のヒエラルキーの頂点としたがん組織の多様性・可塑性の実態の解明を目的とする。具体的には、すでに収集済みの乳がん臨床検体2例(トリプルネガティブタイプ)について、我々が発見した新規乳がん幹細胞様細胞マーカーであるNeuropilin1 (NP1)が陽性の分画(乳がん幹細胞濃縮群)と陰性分画(コントロール群)をFlow cytometryにて各々分取し、Fluidigm C1 single cell-prepsystemにより単一細胞を回収した。回収した細胞より抽出したRNAからタグ付けした断片化cDNAライブラリーを作製し、次世代シーケンサーで解析した。結果、NP1陽性と陰性で分散が異なる遺伝子群についてNP1陽性群のほうに従来のがん幹細胞に関わる遺伝子群と神経軸索伸長に関与する遺伝子群が非常に濃縮することが明らかになった。NP1陽性細胞群の中から高発現している遺伝子を数個選び、qPCRを用いて発現を確認することにより、がん幹細胞の維持に関与すると予測される新規の分子標的候補を同定した。今後、国立がん研究センター研究所にてC1 single cell-prepsystem(Fluidigm)を用いた1細胞解析を行う予定にしている。予定では、C1にて96個の単一細胞を分離した後、逆転写、完全長cDNA合成、増幅まで行う。PicogreenによるcDNA濃度を測定後、酵素処理によるDNA断片化とシーケンスアダプター付加によるRNAライブラリーを作製する。磁気ビーズによりDNA精製を行い、Agilent 2100バイオアナライザにより生成したDNAの品質チェックを行う。サンプルは次世代シーケンサーを用いてRNAーseqを行う予定である。さらに、得られたデータの解析に取り組むのと並行して、上記と同様の手法を用いて別の検体(少なくとももう1検体)の解析も予定している。乳がん臨床検体2例についてシングルセル解析データをさらに分析し、乳がん幹細胞に対する新規の分子標的となり得るような分子を見出す。3年間で行った研究をまとめて、海外学術雑誌への投稿や学会発表を行う予定にしている。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
サルコイドーシスにおけるプロピオニバクテリア属の関与の解明とその診断法の開発

1.気管支肺胞洗浄細胞(BAL細胞)および血清の採取岡山大学医学部・歯学部附属病院呼吸器外来にて診断したサルコイドーシス(サ症)患者42例、非サ症患者30例に気管支鏡検を実施し、気管支肺胞洗浄細胞を採取するとともに血清の採取を行った。2.BAL細胞中のプロピオニバクテリア属ゲノムのリアルタイムPCR法による定量解析P.acnes及びP.granulosumの16 S ribosomalRNAに対する特異的プライマーとそれぞれのPCR増幅産物にハイブリダイズするように設計したTaqManプローブを用いて、リアルタイムPCR法によりBAL細胞中のゲノムの定量を行った。サ症42例のBAL細胞中のP.acnesゲノム量は対照肺疾患30例に比し有意に高値であった。一方P.granulosumはサ症患者と対照肺疾患の問でBAL細胞中ゲノム量の有意な差は認められなかった。サ症患者においてBAL細胞中のP.acnesゲノム量と血清ACE値とは有意の正の相関が認められ、BAL細胞中リンパ球比率とは有意の負の相関が認められた.P.acnesとサ症の関連が明らかとなり、BAL細胞中のP.acnes DNAの定量により診断が可能と考えられた.3.血清抗体価の測定1.気管支肺胞洗浄細胞(BAL細胞)および血清の採取岡山大学医学部・歯学部附属病院呼吸器外来にて診断したサルコイドーシス(サ症)患者42例、非サ症患者30例に気管支鏡検を実施し、気管支肺胞洗浄細胞を採取するとともに血清の採取を行った。サ症患者においてBAL細胞中のP.acnesゲノム量と血清ACE値とは有意の正の相関が認められ、BAL細胞中リンパ球比率とは有意の負の相関が認められた.P.acnesとサ症の関連が明らかとなり、BAL細胞中のP.acnes DNAの定量により診断が可能と考えられた.3.血清抗体価の測定1.気管支肺胞洗浄細胞(BAL細胞)および血清の採取岡山大学医学部附属病院呼吸器外来にて診断したサルコイドーシス(サ症)患者22例に気管支鏡検を実施し、気管支肺胞洗浄細胞を採取するとともに血清の採取を行った.2.BAL細胞中のプロピオニバクテリア属ゲノムのリアルタイムPCR法による定量解析1.気管支肺胞洗浄細胞(BAL細胞)および血清の採取岡山大学医学部附属病院呼吸器外来にて診断したサルコイドーシス(サ症)患者に気管支鏡検を実施し、気管支肺胞洗浄細胞を採取するとともに血清の採取を行い、症例の蓄積を行った。2.BAL細胞中のプロピオニバクテリア属ゲノムのリアルタイムPCR法による定量解析P.acnes及びP.granulosumの16 S ribosomalRNAの塩基配列より、P.acnesについてはアンプリコンサイズが182bp、P.granulosumについては102bpのForwardおよびReverseプライマーとそれぞれのPCR増幅産物にハイブリダイズするように設計したTaqManプローブを用いて、リアルタイムPCR法によりBAL細胞中のゲノムの定量を行った。P.acnesにつてはサ症27例のBAL細胞中ゲノム量は対照肺疾患15例に比し有意に高値であった。一方P.granulosumはサ症患者と対照肺疾患の間でBAL細胞中ゲノム量の有意な差は認められなかった。P.annes(ATCC 6919株)の培養菌体を超音波破砕とピリジン抽出を行い、2種のEIA用抗原液を作成した.これを用いて家兎を免疫して、抗P.acnes家兎血清を作製した。さらに作製した家兎血清をprotein AアフィニティーカラムでIgG分画を採取した。P.acnes菌体を超音波破砕にて作製した抗P.acnes家兎抗体を用いてのAntibody-capture EIA法確立のため、種々の被検血清希釈率、添加抗原濃度、添加家兎抗体濃度を組み合わせて検討したが、バックグランドが高く、本家兎抗体はEIAに不適と考えられた。ピリジン抽出した抗原液により作製した家兎抗体を用いて、EIA法の至適条件について検討中である。同時に抗P.acnes家兎抗体を用いない、whole bacterial EIA法による血清抗P.acnes抗体の検出法を確立し、これら2つの方法の比較を行っている。1.気管支肺胞洗浄細胞(BAL細胞)および血清の採取岡山大学医学部・歯学部附属病院呼吸器外来にて診断したサルコイドーシス(サ症)患者42例、非サ症患者30例雇気管支鏡検を実施し、気管支肺胞洗浄細胞を採取するとともに血清の採取を行った。2.BAL細胞中のプロピオニバクテリア属ゲノムのリアルタイムPCR法による定量解析P.acnes及びP.granulosumの16 S ribosomalRNAに対する特異的プライーマーとそれぞれのPGR増幅産物にハイブリダイズするように設計したTaqManプローブを用いて、リアルタイムPCR法によりBAL細胞中のゲノムの定量を行った。

一方P.granulosumはサ症患者と対照肺疾患の間でBAL細胞中ゲノム量の有意な差は認められなかった。サ症患者においてBAL細胞中のP.acnesゲノム量と血清ACE値とは有意の正の相関が認められ、BAL細胞中リンパ球比率とは有意の負の相関が認められた.P.acnesとサ症の関連が明らかとなり、BAL細胞中のP.acnes DNAの定量により診断が可能と考えられた.3.血清抗体価の測定
ヒトにおける抗パーキンソン氏病薬服用による尿中覚醒剤排泄と濫用との識別

抗パーキンソン病薬として、臨床使用開始が間近である「セレギリン」(塩酸デプレニル)を健常者に投与し、尿中に排泄される代謝物を分析した。代謝物として覚醒剤が排泄され、常用量(2-4錠)の服用で、一般的に覚醒剤濫用のスクリーニング試験に用いられるカットオッフ値である1μg/mlを越える値が全被験者から検出されることが判明した。このことは、覚醒剤の濫用とセレギリンの服用を識別する方法が必要となることを示す。分析方法において光学活性カラムを用いた光学分割分析を行うと、セレギリンの服用によってはL体の覚醒剤のみ検出され、覚醒剤乱用者からはD体のみ検出され、両者の識別は可能であった。セレギリンのみに由来するデスメチルセレギリンを検出することもセレギリン服用の証明となるが、排泄量が極めて低く検出可能時間が短く実務的とは言えなかった。また、アンフェタミン/メタンフェタミンの尿中比においても、かなりの相違が認められ、セレギリン服用では高く覚醒剤濫用では低い値であった。しかし、これには覚醒剤乱用者に少数ながら例外が存在し、確証とするには光学活性分析が不可欠であると結論した。
魚類単一筋線維の張力測定を基礎にした“あらい"の現象の解明に関する研究

コイ筋肉に関して、死後硬直による張力と浸漬液からのカルシウムイオンの浸透による張力の関係を調べた。安静即殺区の魚肉でもストレス区の魚肉でも、魚肉を魚体から切り取って成形する際に損傷した筋肉表面に存在する筋内膜の一部を通って浸透したカルシウムイオンによって第1ピーク張力が発生した。筋肉内部の筋内膜は安静即殺区の魚肉では脆弱化していなかったので、浸漬液中のカルシウムイオンは筋肉内部へは浸透できなかった。その結果、死後硬直による張力発生と外因性のカルシウムイオンによる張力発生は二つの独立した現象として区別できた。ストレス区の魚肉では筋肉内部の筋内膜の構造が脆弱化していたので、カルシウムイオンは筋肉内部へ浸透できた。その結果、死後硬直による張力発生と外因性のカルシウムイオンによる張力発生は重なった現象として検出された。浸透圧を増加させると、筋肉表層は外因性のカルシウムイオンの浸透量の増加によって強く収縮し、大きな第1ピーク張カを発生したので、外因性のカルシウムイオンは筋肉内部へ浸透できなくなった。その結果、死後硬直による張力発生と外因性のカルシウムイオンによる張力発生が区別できるようになった。“あらい"は浸漬液中のカルシウムイオンが魚肉中に浸透し、魚肉中に残存しているATPと相互作用してミオシンフィラメントとアクチンフィラメントの滑り込みによる強縮を起こし魚肉が収縮する現象である。浸漬液中の水はカルシウムイオンの浸透を促す役割を担うことの他に、水自体の浸透によっても張力を発生していることが判明し、カルシウムイオンと水の浸透の影響を定量的に分けて“あらい"におけるそれぞれの影響の程度を議論することができた。コイのグリセリン筋単一筋繊維を作製し、弛緩液中から硬直液中に移すと23mg程度の張力が発生し、収縮液(ATP 5mM)中に移すと50mg程度の張力が発生した。収縮液(ATP 0.3mM)のCa^<2+>濃度を10^<-7>Mから10^<-6>Mに増加すると発生張力が13mgから20mgに増大した。あらいという調理法の原理を解明するため、安静即殺した時と即殺直前にストレスを与えた時のコイ筋肉を波中に浸漬して、等尺性張力の経時変化を調べた。生理的塩溶液に浸漬した場合、ストレスを与えたコイの方が安静即殺より張力ピークの出現が35時間早く,ATPも35時間早く消失した。Caの浸透の影響を調べるため生理的塩溶液にCaを加えると、程度は弱いがCaが浸透し、安静即殺では6分後に15g、ストレスでは4分後に7gの張力ピークが出現した。純水の浸透の影響を綱べるため蒸留水に浸漬すると、水の浸透により安静即殺では2時間後に6g、ストレスでは30分後に4gの張力shoulderが出現した。水とCaの浸透の影響を鋼べるため蒸留水にCaを加えると、水の浸透に影響されてCaの急激な浸透により安静即殺では25分後に58g、ストレスでは15分後に42gの張力ピークが出現した。蒸留水にCaを加えてCaと水を浸透させるた場合は、生理的塩溶液にCaを加えてCaのみを浸透させた場合より、張力ピークの大きさが安静即殺では4倍、ストレスでは6倍に増大した。ストレスはATPの減少が既に進んでいるため,Caのみの浸透による張力ピークの大きさは安静即殺の50%、Caと水の浸透による張力ピークの大きさは安静即殺の75%であった。あらいは浸漬液中のCaが魚肉中に浸透し、魚肉中に残存しているATPと相互件用してミオシンフィラメントとアクチンフィラメントの滑り込みによる強縮を起こし魚肉が収縮する現象であることが判明した。詳細は現在実験中である。

コイ筋肉を浸漬液に浸し、水とカルシウムイオンの浸透の影響を調べた。カルシウムイオンを含む浸漬液と含まない浸漬液を準備し、カルシウムイオンの浸透の条件を変えるため、浸漬液中の生理的塩溶液の体積分率を段階的に下げて実験を行った。外液からのカルシウムイオン浸透の影響は、安静即殺区では主に瞬間的な張力発生に表れた。外液からの水の浸透の影響は、安静即殺区では死後硬直時の張力の大きさを増大した。安静即殺区では硬直張力は緩慢に発生し最大値が8g程度で小さく、発生時間、張力値に関して浸漬液の違いによる変化は認められなかった。安静即殺区では、浸漬液がカルシウムイオンを含む場合、塩溶液の体積分率を減らし浸透圧を増すにつれ、瞬間的な張力および硬直時の張力が増大した。コイ筋肉を浸漬液中でホモジナイズし、各種浸漬液に透析して筋繊維の構造変化を調べた。カルシウムイオンを含む純水中および塩溶液中でホモジナイズすると筋繊維の断片化が起こり、前者では筋繊維の膨潤も認められた。カルシウムイオンを含まない純水中でホモジナイズすると筋繊維は膨潤したが、束になっているものは膨潤しなかった。カルシウムイオンを含まない塩溶液中でホモジナイズし、カルシウムイオンを含まない純粋に透析すると膨潤は更に顕著になった。カルシウムイオンを含む純粋に投透析した筋繊維は、カルシウムイオンを含む塩溶液に透析したものより幾分太くなったが、共にカルシウムイオンを含まない純水に透析した場合のような顕著な膨潤は起こらなかった。“あらい"は浸漬液中のカルシウムイオンが魚肉中に浸透し、魚肉中に残存しているATPと相互作用してミオシンフィラメントとアクチンフィラメントの滑り込みによる強縮を起こし魚肉が収縮する現象である。浸漬液中の水はカルシウムイオンの浸透を促す役割を担うことの他に、水自体の浸透によっても張力を発生していることが判明し、カルシウムイオンと水の浸透の影響を定量的に分けて"あらい"におけるそれぞれの影響の程度を議論することができた。ストレス区のコイ筋肉を浸漬液に浸し、水とカルシウムイオンの浸透の影響を調べた。第2ピーク張力は、対照の安静即殺区の筋肉では、浸漬液中の生理的塩溶液の体積分率を段階的に下げるにつれて増大したが、硬直張力の大きさは、カルシウムイオンを含む種々の体積分率の浸漬液に浸した筋肉ではほぼ一定で、カルシウムイオンを含まない種々の体積分率の浸漬液に浸した筋肉の硬直張力とほぼ同じ値であった。ストレス区の筋肉では、10mM塩化カルシウムを含む浸漬液中の生理的塩溶液の体積分率を段階的に下げても第2ピーク張力の大きさについての明らかな傾向は認められなかったが、硬直張力の大きさは、生理的塩溶液の体積分率を段階的に下げるにつれて減少し、10mM塩化カルシウム水溶液に浸した筋肉の硬直張力の大きさは、カルシウムイオンを含まない種々の体積分率の浸漬液に浸した筋肉の硬直張力とほぼ同じ値になった。ストレス区の魚肉では筋肉内部の筋内膜の構造が脆弱化していたので、カルシウムイオンは筋肉内部へ浸透できた。その結果、死後硬直による張力発生と外因性のカルシウムイオンによる張力発生は重なった現象として検出された。浸透圧を増加させると、筋肉表層は外因性のカルシウムイオンの浸透量の増加によって強く収縮し、大きな第1ピーク張力を発生したので、外因性のカルシウムイオンは筋肉内部へ浸透できなくなった。その結果、死後硬直による張力発生と外因性のカルシウムイオンによる張力発生が区別できるようになった。
難治性ホジキンリンパ腫の臨床病理学的解析

ホジキンリンパ腫(CHL)は化学療法に奏功し、高い完全貫解率を示すことで知られるが、難治性症例は存在する。本研究の目的は以下の難治性ホジキンリンパ腫の臨床病理学的特徴を明らかにすることであった。(1)細胞傷害性分子(CM)陽性CHLは、CM陰性CHLと比較し有意に予後不良を示した。(2)EBV陰性例と比較し予後不良との報告があるEBV陽性CHLは、高齢発症例が多く、CD20陽性例が多い特徴を示した。その点からも加齢性EBV関連リンパ増殖異常症との鑑別を要する。(3)高齢発症CHL、特に結節硬化型ホジキンリンパ腫(NSCHL)は、若年発症NSCHLと比較し予後不良を示した。ホジキンリンパ腫(cHL)は、単核および多核の巨細胞を示した腫瘍細胞が反応性細胞を背景に出現することを特徴とし、その特異な形態を示す腫瘍細胞は濾胞中心B細胞由来であるとされている。また欧米データによると化学療法に奏功し高い完全貫解率を示すことで知られるが、標準治療の反応性の悪いものは存在し、その例としてTマーカー陽性のホジキンリンパ腫、またEBV陽性ホジキンリンパ腫の存在が挙げられる。今回の研究はそれらの難治性ホジキンリンパ腫の特徴をまず臨床病理学的に検討することにある。細胞傷害性分子(CM)陽性cHLはCM陰性cHLと比較し、病理形態学的にはほとんど相違を認めないもの、PAX5というB細胞マーカー(本来cHLでは陽性となる)が陰性になるなど、B細胞由来の確証を得られないものであり、また臨床的にCM陰性cHLと比較し有意に予後不良を示した。これらの症例の由来細胞の同定を進めており、その方法としてマイクロダイジェクション法を用いたDNA抽出法を施行したが、採取されるDNA量が少なく、またIgHおよびTCRγの再構成を見つけることはできなかった。したがって、DNAを抽出する方法として他の方法を検討中である。それはMACS(Magnetic Cell Sorting and Separation of Biomolecules)を利用しCD30陽性細胞の分離する方法であり、まずパラフィン切片から細胞を分離し、その細胞にCD30の発現が保持されていることを免疫染色にて確認した上で、上記MACSを使用し磁気ビーズに反応するCD30+細胞を選択的に回収する。ホジキン細胞がCD30陽性であることから、CD30+richな分画のゲノムDNAを抽出キットで分離抽出することにより、特異的にそのDNAを抽出することが可能となる。ホジキンリンパ腫(cHL)は、単核および多核巨細胞の腫瘍細胞が反応性細胞を背景に出現することを特徴とし、その腫瘍細胞は濾胞中心B細胞由来であるとされている。また化学療法に奏功し高い完全貫解率を示すことで知られるが、標準治療法に対し治療反応性の悪いものは存在し、その例としてTマーカー陽性のホジキンリンパ腫、またEBV陽性ホジキンリンパ腫の存在が挙げられる。今回の研究は難治性ホジキンリンパ腫の特徴をまず臨床病理学的に検討することにある。細胞傷害性分子(CM)陽性cHLはCM陰性cHLと比較し、病理形態学的にはほとんど相違を認めないもの、PAX5というB細胞マーカー(本来cHLでは陽性となる)が陰性になり、また臨床的にCM陰性cHLと比較し有意に予後不良を示した。当検討は、米国血液学会(ASH:ニューオーリンズ)においてポスター発表を行ない、現在論文化中である。また、これらの難治症例の由来細胞の同定を検討中である。マイクロダイジェクション法を用いたDNA抽出法でのIgHおよびTCR_γのクロナリティー検索は難渋し、DNA抽出の他の方法を検討中である。そのひとつとしてMACS(Magnetic Cell Sorting and Separation of Biomolecules)を利用しCD30陽性細胞の分離する方法がある。まずパラフィン切片から細胞を分離し、その細胞にCD30の発現が保持されていることを免疫染色にて確認した上で、上記MACSを使用し磁気ビーズに反応するCD30+細胞を選択的に回収する。CD30+richな分画のゲノムDNAを抽出キット(QIAGEN DNA extraction kitなど)で分離抽出する。貴重症例であり検体がホルマリン固定パラフィン切片上でのみであるため、上記方法によりホジキン細胞由来のDNAの抽出を検討中である。また、EBV陽性ホジキンリンパ腫に関しては、2009年Blood誌にその臨床病理学的検討を掲載し、また血液腫瘍科において紙面発表を行った。当検討は2010年病理学会学術奨励賞を受賞した。

ホジキンリンパ腫(CHL)は、単核および多核の巨細胞を示した腫瘍細胞が反応性細胞を背景に出現することを特徴とし、その特異な形態を示す腫瘍細胞は濾胞中心B細胞由来であるとされている。また欧米データによると化学療法に奏功し高い完全貫解率を示すことで知られるが、標準治療法に対し治療反応性の悪いものは存在し、その例としてTマーカー陽性のホジキンリンパ腫、またEBV陽性ホジキンリンパ腫の存在が挙げられる。今回の研究はそれらの難治性ホジキンリンパ腫の特徴をまず臨床病理学的に検討することである。細胞傷害性分子(CM)陽性CHI.)はCM陰性CHLと比較し、病理形態学的にはほとんど相違を認めないもの、PAX5というB細胞マーカー(本来CHLでは陽性となる)が陰性になるなど、B細胞由来の確証を得られないものであり、また臨床的にCM陰性CHLと比較し有意に予後不良を示した。また、これらの難治症例の由来細胞の同定を、マイクロダイジェクション法を用いたDNA抽出法を施行したものの、IgHおよびTCRγの再構成を認めなかった。当検討に関しては現在雑誌投稿中である。また治療抵抗性ホジキンリンパ腫として、高齢者発症の結節硬化型ホジキンリンパ腫に着目した臨床病理学的検討を行った。結節硬化型ホジキンリンパ腫は若年者発症で予後良好のホジキンリンパ腫として知られるものであるが、高齢者発症例に関しては予後不良を示す。高齢者発症の結節硬化型ホジキンリンパ腫の臨床病理学的検討を進めたところ、これらはEBV陽性症例、Tおよび細胞障害性分子陽性症例の比率が高く、これらの症例を除外すると、若年症例との予後の有意差は認められなかった。当検討に関しては、国際ホジキンシンポジウム(ISHL2010)および米国血液学会(ASH2010)で発表した。
フラーレンをアクセプターに用いた連結系の光励起電子移動

光合成細菌の反応中心での電荷分離機構を明らかにするために、メソ、メソ連結ポルフィリンを多段階電子移動モデルに組み込んだフェロセン・メソ、メソ連結亜鉛ポルフィリンダイマー・フラーレン連結系を初めて合成した。この連結系ではポルフィリン多量化による可視光領域での光捕集能の改善も期待できる。時間分解過渡吸収分光法により、亜鉛ポルフィリンダイマーの励起1重項からフラーレンへの電子移動、引き続いてフェロセンから亜鉛ポルフィリンダイマーラジカルカオチンへと電荷が連続的にシフトし、最終電荷分離状態であるフェロセニウムカオチンとフラーレンラジカルアニオンが生成することがわかった。詳細な分光学的解析からフラーレンラジカルアニオンからフェロセニウムカオチンへの分子間電子移動よりも、段階的逆電子移動が優先することが明らかになった。すなわち、再配列エネルギーが小さなために基底状態への逆電子移動が遅くなりすぎるため、多段階逆電子移動が起こることがわかった。また、ポルフィリン・フラーレン連結系において、スペーサーの短い相互作用の大きな系を系統的に合成し、そのフェムトおよびピコ秒時間分解過渡吸収分光を行った。その結果、光励起電子移動により電荷分離状態が生成するが、その前駆体としてエキサイプレックスが生成することがわかった。さらにポルフィリン・フラーレン連結系をITO電極上に化学修飾した光電変換系を初めて構築し、フラーレンによる光電変換特性の向上を見い出した。光合成細菌の反応中心では多段階電子移動で生じた最終電荷分離状態の量子収率がほぼ100%であり、しかも寿命が秒レベルであるために、後続の化学反応を円滑に行うことができる。そこで、この様な長寿命の電荷分離状態の実現を目指して、フェロセン・亜鉛ポルフィリン・フリーベースポルフィリン・フラーレン連結系を合成した。時間分解過度吸収分光法により、亜鉛ポルフィリンの励起1重項からフリーベースポルフィリンへのエネルギー移動がまず起こり、さらにフリーベースポルフィリンの励起1重項からフラーレンへの電子移動、引き続いて亜鉛ポルフィリンからフリーベースポルフィリンラジカルカチオン、フェロセンから亜鉛ポルフィリンラジカルカチオンへと電荷が連続的にシフトし、最終電荷分離状態であるフェロセンニウムカチオンとフラーレンラジカルアニオンが生成することがわかった。しかしながら、溶液中では電荷分離状態の寿命があまりに長過ぎるために、分子間電子移動が優先して、分子内逆電子移動過程が観測できないことを明らかになった。そこで分子間電子移動を抑制するために、低温マトリックス中光照射下に、電子スピン共鳴分光法によりラジカルイオン対を追跡した。その結果、フラーレンラジカルアニオンからフェロセニウムカチオンへの分子内電子移動過程を観測することに成功した。その寿命は最長で0.38秒となり、これまでに報告された分子内電荷分離寿命としてはもっとも長く、かつ光合成の電荷分離寿命に匹敵する値となった。しかしながら、入力されたエネルギーに対して、保持されるエネルギーは約40%と満足のいくものでない。この問題点を明らかにするために、メソ、メソ連結ポルフィリンを多段階電子移動モデルに組み込んだフェロセン・メソ、メソ連結亜鉛ポルフィリンダイマー・フラーレン連結系を初めて合成した。この連結系ではメソ、メソ連結亜鉛ポルフィリンダイマーによる可視光領域での光捕集能の改善も期待できる。時間分解過渡吸収分光法により、亜鉛ポルフィリンダイマの励起1重項からフラーレンへの電子移動、引き続いてフェロセンから亜鉛ポルフィリンダイマーラジカルカチオンへと電荷が連続的にシフトし、最終電荷分離状態であるフェロセニウムカチオンとフラーレンラジカルアニオンが生成することがわかった。詳細な分光学的解析からフラーレンラジカルアニオンからフェロセニウムカチオンへの分子間電子移動よりも、段階的逆電子移動が優先することが明らかになった。すなわち天然系では一見無駄に思えるエネルギー損失を生じているが、そのことによって副反応を抑制ていることがわかった。
虚血性網膜疾患の移植による治療の試み

虚血性網膜疾患の代表として糖尿病網膜症が代表的でよく知られているが、加齢黄斑変性も最近局所に低酸素領域が存在することが疑われている。臨床的にもインドシアニングリーン造影検査にて脈絡膜血流の遅延で低酸素状態が疑われる症例が存在する。さらに我々は加齢黄斑変性をはじめさまざまな眼内増殖疾患の増殖膜に発現するサイトカイン遺伝子の変化を確認してきた。血管内皮細胞増殖因子(VEGF)などは、加齢黄斑変性症の増殖膜などに有意に増加していることが判明したが、今回in vitroの実験でも低酸素でVEGF遺伝子の発現が強まることを確認した。それ以外にも各種増殖膜に脳由来神経成長因子(BDNF)など様々のサイトカインが多数発現していることが判明した。一方網膜虚血の実験より網膜内層とくに神経節細胞やアマクリン細胞は初期に障害される代表的な細胞として知られる。BDNFなどは神経節細胞やアマクリン細胞の保護効果があることが予測されたため、BDNFcDNAを虹彩色素上皮細胞(IPE)に導入しBDNF遺伝子ならびに、その蛋白質の発現がコントロールよりも有意に多く発現している細胞を利用して虚血による網膜細胞の障害に保護効果があるかどうかを確認してきた。また、in vivoではこの遺伝子導入細胞は視細胞外節の貧食能を強調することも判明した。実際にこれらの研究の一部は当教室で施行してきている加齢黄斑変性の自己虹彩色素上皮細胞移植にも利用された。今回の研究は虚血性疾患が対象であったが、以前も報告しているように移植につきまとう拒絶反応が、採取のしやすい自己IPEの利用により改善されること以外に、さまざまな眼疾患の遺伝子治療を将来めざす場合の重要なステップにもなる可能性があると考えられた。虚血性網膜疾患の治療はさまざま試みられているが、いまだに有効な治療方法がないといえる。我々はこれまで虚血性疾患の代表である糖尿病網膜症をはじめさまざまな眼内増殖疾患の硝子体のアミノ酸代謝や、酵素反応の変化、さらに眼内の増殖膜に発現するサイトカイン遺伝子の変化を確認してきた。血管内皮細胞増殖因子(VEGF)などは、加齢黄斑変性の増殖膜などに有意に増加していることが判明したが、それ以外に各種増殖膜に脳由来神経成長因子(BDNF)など様々のサイトカインが多数発現していることが判明した。また、網膜虚血の実験よりBDNFなどが神経節細胞やアマクリン細胞の保護効果があることが予測されたため、BDNFcDNAを虹彩色素上皮細胞(IPE)に導入しBDNFの発現を高めた状態でこのIPEが他の細胞を虚血より保護する効果があるかどうかを確認した。細胞への導入にはリボフェクション法を利用した。ベクターのジェネティシンを利用して導入細胞を選択し、遺伝子内に安定に導入された細胞を選択した。この方法で選択された細胞は継代培養を重ねても、BDNF遺伝子発現ならびに蛋白の発現に差がなく、コントロールよりも有意に多く発現していた。この細胞を培養し、ラット網膜より採取したアマクリン細胞とともに培養するとBDNF遺伝子導入をしていない培養細胞よりアマクリン細胞の細胞死が有意に抑制されることも判明した。さらに、遺伝子導入細胞をラット網膜下に移植後、虚血を作成した実験においては、遺伝子導入した細胞の移植が網膜内層の保護効果が強い傾向が見られた。移植には常に拒絶反応がつきものであるが、今回の実験に利用したIPEの目的は最終的に自己の細胞を利用して拒絶反応を抑制しようというもので、我々がこれまで加齢黄斑変性の治療に対して、実際に最近臨床応用まできたものである。したがって、将来遺伝子治療をめざす場合の重要なステップにもなっている。