hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
核スピンの精密制御を用いた原子の電気双極子モーメント探索

素粒子の崩壊において発見され、宇宙の物質・反物質非対称性の原因と考えられているCP対称性非保存の起源は現代物理学の未解明の謎である。このCP対称性を破る永久電気双極子モーメント(EDM)の探索に向け、希ガス元素129Xeの核スピン歳差周波数を超精密に測定する開発研究を行った。様々な変動要因の研究及び高感度磁力計の開発を行い、低周波核スピンメーザーの周波数安定度を向上させ、5×10-28ecmのEDM感度(45,000秒測定、電場強度E=10kV/cmを仮定)を達成した。今年度はスピン偏極した^<129>Xe原子核の低周波スピンメーザーを利用した電気双極子モーメント(EDM)探索実験のための装置開発・改善を行った。まずEDM実験において要のひとつとなる高感度磁力計に利用するためのRb原子の非線形磁気光学効果(NMOE)の観測を行い、その特性を調べた。Rb原子のD1吸収波長794.76nmで単一振動数発振するNMOE用プローブレーザーの構築、Rbガラスセル(φ20mm×20mm)の製作、そして1Gの磁場領域でのNMOE分散スペクトラムの観測を行った。Rb原子のプローブレーザー領域通過による1GのNMOE共鳴幅が観測され、そのレーザー波長依存性も調べた。より狭い幅のNMOE共鳴観測を行うための、スピン緩和抑制用パラフィンコーティングを内壁に施したRbセルの製作も行った。これを用いて来年度1μGの共鳴幅で高感度磁力計の運転を行う予定である。またメーザーの静磁場生成用定電流源として従来使用していたものは1°Cの温度変動に対して0.25μA程度の電流変動があったが、4.7°Cの変動に対して電流変動0.3μA以下の高安定電流源の設計・製作を行った。来年度はこれをメーザー実験に導入し、長期周波数安定度の向上を行う。その他、スピンメーザーの外部フィードバック機構に使用していたアナログ演算回路部分を、AD-DA変換を組み込んだCPUボードでデジタル演算させることで、回路の安定度・周波数依存性などの向上を行い、EDM実験に応用できる見込みがたった。昨年度に引き続きスピン偏極した^<129>Xe原子核の低周波核スピンメーザーを利用した電気双極子モーメント(EDM)探索実験のための装置開発を行った。磁場変動の高感度検出のためのRb磁力計の開発では、昨年度構築した非線形磁気光学効果(NMOE)の測定システムに、内壁をパラフィンでコーティングしたRbセルを導入した。このパラフィンコーティングはRb原子が内壁に衝突する際のデコヒーレンスを抑制することが知られており、狭い幅のNMOE分散スペクトラムの実現が可能になると期待される。コーティング無しのセルでは見られなかった幅3mG程度のNMOEスペクトラムがコーティングセルでは観測された。これは昨年度のコーティング無しのセルで見られた幅に比べて1/400狭いスペクトラムであり、ゼロ磁場近辺の高感度磁場測定を可能にする。まだ個別のセルによってスペクトラム幅にばらつきがあるので、現在コーティングプロセスを調査中である。また磁気シールド内残留磁場がNMOEスペクトルに及ぼす影響もシールド内3軸磁場補正コイルを用いて研究中である。またスピンメーザーのシステムには大強度ポンピングレーザーとして今まで使用していたアレイレーザーに代わり、ファイバー結合型の半導体レーザーを新たに導入した。これはXeガスを封入したガラスセルへの一様なレーザー照射を可能にし、Rb原子の偏極度分布の一様性を向上する目的である。まだこのシステムでの核スピン緩和時間や周波数安定度の向上は観測されていないが、詳細なデータ解析を行っているところである。その他、長期のメーザー周波数安定度向上に向けた静磁場用定電流源のフィードバック安定化にも着手した。昨年度まで開発研究を行ってきた^<129>Xe原子核の低周波核スピンメーザーに関して、電気双極子モーメント(EDM)探索実験に向けての改善を行った。一昨年度までに製作した高安定度のソレノイド電流源(変動10^<-6>)の導入により、短期(<10^4s)のメーザー周波数安定度は向上したが、長期(>10^4 s)の変動(40 ppm)は問題として残っていた。今年度は精密標準抵抗と高精度マルチメーターを通じたフィードバック系を導入して、この長期変動の抑制を行った。これにより1万秒を超えると100nA以上変動していた電流を、数日間に渡って10nA程度まで変動を抑制することができた。マルチメーターの精度を考慮する必要があるが、この改善により長期の変動を消せることができ、数千秒以内の周波数変動と1万秒以上の長期変動を分離した解析・検討をすることができるようになった。また昨年に引き続き、Rb原子の非線形磁気

光学回転(NMOR)を用いた高感度磁力計の開発を行った。本年度はスピンコヒーレンス緩和抑制のためのセル内壁パラフィンコーティング処理の方法やセルサイズ等が異なる複数のRbセルを用いた実験を系統的に行うことによって、磁力計の感度の検討・向上の試みを行った。現在NMORスペクトラム幅は0.5mG程度まで改善でき、スピンコヒーレンス時間は20-30msと見積もられ、既に現在所持している商用フラックスゲート磁力計の性能(12pT/√Hz)を上回っている。目標感度0,3fT/√Hzに到達するためのスペクトル幅1μGには到達していないが、磁気遮蔽系を最適化することで磁気ノイズおよび横方向残留磁場に関する問題点を克服できることが分かった。上記以外に電極付きセルの作製を行い、10kV/cmの電場印加のもとでのリーク電流が2pA程度であることを確認し、EDM感度10^<-27>ecm以下での実験準備が整った。
パーキンソン病とサーカディアンリズムに関する大規模調査

睡眠障害は、パーキンソン病の非運動症状のうちで最も頻度が高く、その有病割合は40ー60%とされている。これまで主観的睡眠の質を調査した先行研究から、中途覚醒や早期覚醒が多いとされている、客観的に睡眠の質を測定した報告は比較的乏しい。近年パーキンソン病患者において、体動を用いて睡眠を客観測定するアクチグラフィーの妥当性が示されたことから、本研究ではパーキンソン病の進行と客観測定した睡眠の質との関係を調べた。病期の進行に伴い、総睡眠時間の減少、睡眠効率の低下、中途覚醒時間の延長、睡眠の断片化、入眠潜時の短縮がみられた。晩期パーキンソン病では、早期と比べ就寝時刻・覚醒時刻が有意に早かった。本研究の目的は、PD患者(160人)を対象にサーカディアンリズム指標を測定し、コントロール健常者(既存コホート1000人)と比較することでPDがサーカディアンリズムに及ぼす影響を明らかにすることである。研究計画で予定されていた初年度目標のPD患者80人について以下の主要項目測定が完了した。PD臨床情報(Hoen-Yahrステージ・UPDRSスコア・1日ドーパミン換算量・罹患期間・認知機能)、虚血性心疾患、脳卒中、がんの既往、服薬内容、飲酒・喫煙歴、教育歴、世帯所得、シフトワーク歴、レム睡眠行動異常症、うつ症状、睡眠(PDSS)、疲労、アパシー、日中の眠気(エプワース眠気質問票)、睡眠の質(ピッツバーグ睡眠調査票)、クロノタイプ(朝型夜型質問票)、空腹時採血(血糖、HbA1c、中性脂肪、LDL/HDLコレステロール)、身体計測、アクチグラフ、環境照度、尿中メラトニン代謝産物濃度など。また、これらの測定データを整理した。倫理審査委員会の承認を得て測定を開始し、予定されていた80名のPD患者について主要項目測定が完了したため。研究協力者と研究プロトコル立案から共同で実施しており連携が取れている。研究計画で予定されていた本年度目標のPD患者80人について以下の主要項目測定が完了した。予定されていた80名のPD患者について主要項目測定が完了したため。本研究の目的は、パーキンソン病(PD)患者(160人)を対象に睡眠や生体リズム指標を測定し、コントロール健常者(既存コホート研究参加者1000人)と比較することでパーキンソン病が生体リズムに及ぼす影響を明らかにすることであるが、ほぼ当初の計画どおり実施することができた。平成29年度は、欠損値なく測定が完了したPD患者156名(平均71.3歳)と、奈良県在住の一般高齢者を対象とする前向きコホート研究(平城京スタディ)参加者のうち、PDの治療を受けていない1108名(平均71.9歳、)において、アクチグラフィを用いて客観測定した睡眠指標に関する横断解析を行った。一般対象者と比べて晩期PD患者(Hoehn Yahr分類34期)では、アクチグラフィで特定した入眠時刻が19.1分早く(P = 0.04)、覚醒時刻も43.5分早かった(P < 0.01)。一般対象者とHoehn Yahr分類1、2、3、4期のPD患者との間の比較から、総睡眠時間が300分未満の者の割合や、睡眠効率が70%未満の者の割合、中途覚醒時間90分以上の者の割合、睡眠の断片化指数が3以上の者が、病期の進行に伴い有意に高い傾向を認めた。一方入眠潜時が15分以上に延長している者の割合は、病期の進行とともに有意に少ない関連を認めた(P for trend = 0.01)。尿中メラトニン代謝物濃度は、1期の中央値12.1 ng/mg creを基準とすると、2、3、4期の濃度は、31.4%、108.3%、59.1%高かった。150名を超えるPD患者と1000人を超える一般対象者の睡眠を客観測定して比較した先行研究はなく、近年報告されたアクチグラフィによるPD患者の睡眠測定のための適切な身体活動閾値を用いた客観的睡眠と病期の進行との関連を示した点で、新規性が高い結果といえる。

近年パーキンソン病患者において、体動を用いて睡眠を客観測定するアクチグラフィーの妥当性が示されたことから、本研究ではパーキンソン病の進行と客観測定した睡眠の質との関係を調べた。病期の進行に伴い、総睡眠時間の減少、睡眠効率の低下、中途覚醒時間の延長、睡眠の断片化、入眠潜時の短縮がみられた。晩期パーキンソン病では、早期と比べ就寝時刻・覚醒時刻が有意に早かった。平成27年度に測定完了したPD患者80名に加え、新たにPD患者80名の研究参加の同意を得ている。その80名を平成28年度に前年度と同じ測定項目を測定し、全対象者160人のデータを整理する。平成27年度および平成28年度に測定完了したPD患者160名のデータを整理する。さらにコントロール健常者との比較分析を進める。脳神経内科学データ分析用機器の購入が遅れており、今年度残金を次年度に持ち越した。検体測定がやや遅れており、今年度残金を次年度に持ち越した。今年度にデータ分析用機器を購入するやや測定が遅れている尿中メラトニン代謝産物濃度などを測定する。国内外の学会に研究成果を発表する。
通級指導教室における早期からの教育相談

文献研究では、母子保健、福祉、療育、障害児教育における障害児の早期対応に関する制度や施策の変遷について各側面から整理した。これらをまとめていくことを通して、通級指導教室における早期からの教育相談は、母子保健制度や福祉制度のはざまを埋めていくものではないか、と考えられた。調査研究では、難聴・言語障害教育における幼児担当者の実態を全国規模の調査結果から考察した。難聴・言語障害の通級指導教室では、小学校の教師だけでなく、幼稚園教諭や保育士、専門員等の職種の職員が幼児の担当を行っていること、その幼児担当者の所属はおおよそ7つに分類できることなどが明らかになった。このようなことから、各地域ではその特性を生かして、幼児の対応の形態や方法を工夫している実態が明らかになった。事例研究では、研究協力者に協力を依頼し、北海道、静岡県袋井市、島根県における幼児対応の実態と指導事例を報告した。さらに茨城県のことばの教室が中心となり教育相談室を立ち上げた経緯、群馬県で学校外に設置されていることばの教室の設立経緯や幼児事例の実際についても報告した。これらの経緯は、今後、幼児の対応を行おうとしている地域の教室に参考になるものと考えられた。これらの研究結果を踏まえて、通級指導教室における早期からの教育相談の在り方について、地域の状況や幼児・保護者への対応について考察した。今後の課題として、保護者支援の視点から事例の収集、検討が必要性であることを述べた。通級指導教室担当者に行った早期療育システムに関するアンケート結果から、幼児を正規の指導対象児としている通級指導教室がどのように設置され、職員はどのように配置され、地域システムにおいてどのような役割をになっているかについて検討した。地域にはそれぞれ独自の早期療育システムがあり、障害乳幼児を対象にしている機関は医療、福祉、教育のいずれかであり、どの機関が主体となるかは地域によって大きく異なっていることがわかった。そこで研究協議会では、通級指導教室が地域の幼児の相談を行っている地域(北海道・群馬・島根)の教員に参加を求め、その実態についての報告をお願いした。北海道では、通級指導教室を組み込んだ早期療育システムがあり、その全体構成と成立までの経過、各機関の役割等についての報告があった。群馬県内の町のことばの教室としての通級指導教室が、教育相談を地域のシステムの中でどう位置付けられ、他機関といかに連携していくかについての報告があった。島根県の通級指導教室における幼児対応の実際について、全県調査した結果を報告した。市町村によって教室の設置状況や人員の配置、職種等は様々であり、それぞれの地域に応じた取り組みがなされていることが分かった。通級指導教室担当者に行った早期療育システムに関するアンケート結果では、幼児を指導している通級指導教室は、全体の65%であったが、そのうち幼児担当者が配置されている教室は、20%に満たない現状が分かった。このことは、小学校の教員が、地域や保護者の要請を受け、本務に支障のない範囲で幼児の相談に当たっている現状を示している。今年度は、幼児担当者が配置されている地域に対して、どのような職種で幼児の指導に当たっているのかの調査を開始した。また研究協議会では、地域に密接して活動している通級指導教室にその活動内容の報告を求めた。一つは通級指導教室に幼児担当の職員が配置され、幼児の相談を行っている地域(静岡)であり、もう一つは通級指導教室の教員が核になり「学校ぐるみ・町ぐるみの支援体勢作り」(茨城)を始めている教室である。静岡の通級指導教室における幼児を担当する職員からは、静岡県内の幼児教室の設置状況、担当職員の身分に関する現状や幼児の相談状況等について、報告があった。「学校ぐるみ・町ぐるみの支援体勢作り」の発端は、町の就学指導委員会で「ことばの教室」の教員が地域の早期療育システムを提案したことであり、さらに町の保健婦と交流しながら「早期療育研修会」に参加していったことであった。このことを皮切りにして学校ぐるみ・町ぐるみの支援体勢というネットワークの構築を実践中である報告があった。

今年度は、本研究の最終年度にあたるため、文献研究、調査研究、事例研究の総括を行った。文献研究では、母子保健、福祉、療育、障害児教育における障害児の早期対応に関する制度や施策の変遷について各側面から整理した。これらをまとめていくことを通して、通級指導教室における早期からの教育相談は、母子保健制度や福祉制度のはざまを埋めていくものではないか、と考えられた。調査研究では、難聴・言語障害教育における幼児担当者の実態を全国規模の調査結果から考察した。難聴・言語障害の通級指導教室では、小学校の教師だけでなく、幼稚園教諭や保育士、専門員等の職種の職員が幼児の担当を行っていること、その幼児担当者の所属はおおよそ7つに分類できることなどが明らかになった。このようなことから、各地域ではその特性を生かして、幼児の対応の形態や方法を工夫している実態が明らかになった。事例研究では、研究協力者に協力を依頼し、幼児対応の実態と指導事例のまとめを行った。具体的には、研究協議会を開催し、北海道、静岡県、島根県での通級指導教室における幼児対応の現状と課題について協議した。さらに茨城県のことばの教室が中心となり教育相談室を立ち上げた経緯、群馬県で学校外に設置されていることばの教室の設立経緯や幼児事例の実際について協議した。これらの研究結果を踏まえて作成した研究報告書では、通級指導教室における早期からの教育相談の在り方について考察し、今後さらに保護者支援の視点から事例の収集、検討が必要性であることを述べた。
精神的ストレスが誘導する全身・腸管免疫システム変化における相互作用機序の解明

本研究では精神的ストレスに関連する脳領域の神経を人工的なリガンド-レセプターシステムDREADD法を用いて特異的に刺激することにより、全身および腸管免疫システムの変化が誘発されるかを検証し、中枢神経系と免疫システムの相互作用を明らかにする。具体的には以下3点の達成を目指す。(A)精神的ストレスに関連する脳領域の神経をDREADD法により特異的に刺激することで精神的ストレス症状を誘導するマウス実験系を確立する。(B) DREADD法による精神的ストレス誘導下(A)での免疫システムの変化を解析する。(C)誘導された免疫系の変化(B)が刺激脳領域または他の脳領域に及ぼす作用を解析する。
磁気ピンセットを用いた1分子操作による回転分子モーターの研究

本年は、本研究の最終年度であり、いくつかの具体的成果を上げることに成功した。全て、本研究で開発した磁気ピンセットを用いた研究である。まず、ADP阻害状態のF1モーターの回転子を、機械的に押すことによって活性化する現象の解明に成功した。これによって、F1モーターのADPに対する親和性が回転方向に沿って減少することを明らかにすることができた。この性質は、F1のモーターとしての性質を説明するだけでなく、逆反応であるATP合成をもうまく説明できる。すなわち、F1はモーターとして機能するときは、効率的にADPを解離しなくてはいけない。一方、合成酵素として機能するときは、溶液中から効率的にADPを結合しなくてはいけない。この二つの相反する性質は、本研究で明らかになったようにADPに対する親和性に強い角度依存性で説明がつく。また、1分子操作とマイクロ加工技術を組み合わせた実験によって、1分子のF1を逆回転させたときのATP合成効率の測定にも成功した。超微小の溶液空間にF1を閉じ込めて逆回転させることで、F1が合成したATP分子を濃縮することができる。合成されたATP量は、F1モーター自身の回転速度から見積もることができたい。この結果、εと呼ばれるこれまでさほど重要視されていなかったサブユニットが効率的な合成反応に重要であることが示された。(1)研究の目的本研究の目標は「1分子単位で分子モーターを操作してそのメカニズムを解明する」ことである。我々は、F1モーターというATPで駆動する世界最小の回転モーターが、ATPの化学エネルギーをどのようにして力学的な仕事に変換しているのかを研究している。本研究では、磁気ピンセットを改良し、「回転モーターの回転ポテンシャル測定」と「F1モーターの力学的活性化」に関する研究を行なっている。(2)結果H14年度は、これまでの磁気ピンセットを開発・改良して、ビデオ録画と同期しながら400pNnm程度までのトルクを任意の角度で発生する磁気ピンセットを作製した。「回転モーターの回転ポテンシャル測定」に関しては、静止トルクの絶対値測定に成功し、おおよそ3080pNnmであることを求めた。また、トルクが角度に依存して2倍程度変化することを明らかとした。また、「F1モーターの力学的活性化」に関しては、不活性化状態に陥り停止しているF1モーターを回転方向へ40°程押すとただちに活性化することを明らかとした。これを逆方向(ATP合成方向)に回しても活性化は起こらなかったが、ATP合成の基質であるADPとPi存在下では180°程度おすとこれも活性化することが明らかとなった。詳細を述べるスペースはここに無いが、これは我々の現在考えているF1モーターのメカニズムとも良く一致する。本研究では、磁気ピンセットを改良し、「F1モーターの回転ポテンシャル測定」「F1モーターの力学的活性化」「逆回転によるATP合成反応の検出」に関する研究を行なっている。(2)結果H15年度は、「F1モーターの回転ポテンシャル測定」ではトルクの角度依存性と、ヌクレオチドが結合していない状態でのポテンシャル測定を行った。「F1モーターの力学的活性化」では、力学的に分子に力を与えることでF1モーターに結合していたADPが解離することで活性化することを明らかにした。さらに、この「活性化反応」の活性化エネルギーが回転角度に比例して減少することを見出し、これを基に、回転角度がADPの親和性変化と強く共役していることを明らかにした。「逆回転によるATP合成反応の検出」では、検出のために不可欠な超微小空間の作成に成功し、この基本特性の確認と1分子生化学アッセイが現実に可能であることを実証した。さらに、この中でF1モーターの回転と磁気ピンセットによる操作も確認し、現在合成反応の1分子レベルでの検出に取り組んでいる。
Gillespie症候群の原因遺伝子同定と病態解明

Gillespie症候群(GS)は小脳失調、知的障害、無虹彩を特徴とする稀な疾患である。原因は不明であったが、私たちは日本人GS患者を集積し、全エキソーム解析を行い、原因遺伝子Aを同定した。同定された変異はすべてde novo変異であり、遺伝子AのC末端側に集積していた。C末端以外の場所の変異では小脳失調は起こすが、無虹彩は合併しない。そこで、私たちは遺伝子AのC末端には虹彩発生に関連するアイソフォームが存在するとの仮説を立て、マウスを用いた一連の実験を行った。その結果、遺伝子AのC末端に虹彩特異的転写産物を見いだし、仮説が正しいことを証明した。原因は不明であったが、私たちは日本人GS患者4名を集積し、全エクソーム解析を実施した。その結果、遺伝子AのC末端にde novo変異を4名全員に同定した。遺伝子AのC末端領域以外の変異はすでに他の小脳失調患者で報告されていたが、これらの患者では虹彩欠損は報告されていない。従って、遺伝子AのC末端領域は小脳での役割と独立して、虹彩発生に必須の役割を果たしていると考えられる。そこで、C末端蛋白の役割を解明することを目的として、C末端特異的抗体を作成し、マウスにおけるC末端蛋白の存在様式を検討した。ウェスタンブロットでは、眼特異的な短い蛋白の同定に成功した。免疫組織化学において、C末端蛋白は胎生期の前眼部に存在し、虹彩形成の主要な蛋白であるPAX6と一部共局在を示した。従って、C末端蛋白は虹彩発生に重要な役割を果たしていることが示された。完全長遺伝子Aはカルシウムチャネルをコードしている。そこで、同定された遺伝子変異をHEK293細胞に導入して、カルシウム動態について検討を行った。その結果、変異蛋白はカルシウム流入を軽度に障害することが示された。GS患者の遺伝子解析システムを構築するために、次世代シークエンサーであるIon PGMを用いた解析系を立ち上げた。臨床的にGSが疑われる患者の解析を行い、新たに1名に変異を同定した。この遺伝子診断システムは臨床的にGS診断に有用であることが示された。Gillespie症候群の分子遺伝学的診断を行うための解析系を構築した。原因遺伝子Aは大きくエクソン数が多いので、Ion PGMを用いた解析方法を構築した。この方法を用いてGillespie症候群疑い患者の解析を行い、新たに1例の診断を行った。私たちの研究室においては計5例の患者の遺伝学的診断を実施した。本解析系の確立はGillespie症候群の診断に大きな貢献をすることが期待できる成果である。Gillespie症候群の発症機構を解明するために、マウスを用いた実験を実施した。2014年度に原因遺伝子AのC末端にV5 tagを融合させたノックインマウスを作成し、2015年度はこれを用いた解析を行った。Gillespie症候群では小脳萎縮と虹彩欠損を特徴とする。遺伝子AのC末端以外での突然変異は小脳萎縮の原因となるが、虹彩の形成は正常である。そこで、私たちはC末端に虹彩発生に必須の虹彩特異的アイソフォームが存在するとの仮説を立て、その証明のための一連の実験を実施した。虹彩特異的な転写産物をClontech社のSMART-Seq v4 Ultra Lou Input RNA Kit for Sequencingを用いて同定した。その結果、虹彩特異的に発現する転写産物の転写開始点を明らかにした。プロモータ領域の各種フラグメントをクローニングし、転写活性を検討した。その結果、転写に必須の135bpの配列を同定した。この配列は虹彩発生に必須の転写因子であるPAX6とは結合せず、別の転写因子Bにより発現誘導されることを明らかにした。さらに翻訳開始点を同定した。これらの実験により虹彩形成に必須のアイソフォームの同定を行うことができた。遺伝子AのC末端に対する抗体を作成し、蛋白の発現について検討することができた。作成した抗体の特異性が不十分であったために、V5 tagをC末端に融合した遺伝子AをES細胞に発現させ、ノックインマウスの作成を行った。抗V5抗体を用いることで、特異的な信号を得ることができ、C末端蛋白の発現について検討することができた。C末端蛋白の発生的な意義については概ね情報を得ることができている。一方、CRISPR/Casシステムを用いたC末端特異的な遺伝子変異の導入実験については、目的の変異が導入されたマウスが未だに得られていない。この点については、コンストラクトの設計をやり直しているところである。

遺伝子変異による遺伝子Aのカルシウムチャネルに与える影響については、十分な情報を得ることができ、この点については、予定通りに実験が進んでいると評価できる。C末端遺伝子とPAX6との相互作用については、種々の実験を行っている。免疫沈降などの手法では、蛋白どうしの結合は示されていない。一方、C末端蛋白はPAX6のプロモータ領域に結合するプレリミナリーなデータが得られており、C末端蛋白はトランスクリプションファクターとしてPAX6の発現を制御している可能性が考えられている。臨床的には、次世代シークエンサーを用いた遺伝子解析システムの構築を行うことができた。引き続き、症例の集積を進めることで、GSの遺伝型表現型連関について解析を進めることで、臨床診断の指針の作成の基盤を構築することができた。小児科遺伝子AのC末端にV5 tagを融合させた蛋白を発現するノックインマウスを用いたC末端蛋白の発生時間的、空間的発現について詳細に検討し、完成をさせる。本実験については、系の確立ができたので、着実な推進が期待できる。CRISPR/Casによる変異導入マウスの作成については、これまでのスクリーニングでは求める変異の導入が得られていないので、配列の設計を見直し、変異導入マウスを得るための実験を続ける。CRISPR/Casで変異導入が取れない場合は、コンベンショナルなノックインマウスの作成に切り替えることを検討する。C末端蛋白とPAX6との相互作用については、C末端蛋白のPAX6遺伝子調節領域との結合が示されているが、確定的ではない。そこで、PAX6のプロモータ領域を含むレポータープラスミドを調整し、C末端蛋白の結合部位の同定を予定している。臨床的には、本年度の研究にて樹立した次世代シークエンサーによる遺伝子解析系を用いて、GSの遺伝子診断を進める。特に、非典型的な症状を示す患者、即ち、虹彩欠損の存在しない小脳萎縮患者や小脳症状の存在しない虹彩欠損の患者を対象として遺伝子解析を行い、C末端蛋白の異常により発症する疾患の全体像を明らかにすることを目指す。更に、C末端蛋白の生物学的役割に基づく治療法開発のために、患者由来細胞株やモデルマウスを用いて、薬物スクリーニングの系の確立を行って行きたい。実験が効率的に進んだために、予定よりやや少ない消耗品で賄うことができたため。次年度使用額は57,341円とわずかであり、消耗品の購入に充当される予定である。
日中両国の初等・中等教育における漢字・漢文教育の比較研究

本研究は、日中両国の漢文教育について、教育理念、共通の教材の扱い方などを比較し、両者の違いを、教材、指導書の編纂、重点の置き方などに分けて分析し、日中両国の高等学校における漢文教育の共通点(教育理念の共通点、共通の教材の共通の扱い方など)と相違点(異なる選定基準と同一教材の異なる扱い方など)を明らかにした。本年度は、日本と中国の中学・高校の現行教科書の各教科の代表的な教材を収集したのをうけて、研究代表者、研究協力者の各自の研究のほかに、東京と京都で計三回、研究協力者との間で研究計画の打ち合わせと研究活動を行った(旅費執行)。具体的な作業としては、(1)明治以降日中両国の国語教育史対照年表の作成に着手したこと(李、田担当)。(2)日中両国の主な教科書における漢字の使用実態を調査した(菊地、李担当)。これによって、国語教育における漢字の字体、字数、意味との関連性などの問題が浮き彫りにされることが期待される。(3)中国の初等、中等教育のための漢文に関する教科書・指導書を収集し、その題材別の比較検討を行った。そして、中国における初等・高等教育の実態を把握する目的で平成21年度に予定している研究交流活動の交渉と資料収集のために、研究代表者が計二回中国の大連、長春に赴き、実地調査に基づいて、中国吉林省長春市第十一中学(高校)と東北師範大学付属中学をモデル校として選定した。それにともない、中国側の研究協力者として、夏光民(長春第十一中学国語科主任)、張彬、李林(同教師)、李頴(東北師範大学付属中学校長)、王江春(同国語科主任)を新たに加えた。21年度9月の研究交流活動についても基本合意しており、研究代表者、日本側の研究協力者(菊地隆雄・東京都小石川高校教諭、全国漢文教育学会常任理事)の両校の視察、授業参観、担当教員との座談会などを通じて、両校の実践的な取り組みを詳しく知るための準備が整った。本年度は当初から予定していた長春市第十一中学と東北師範大学付属中学での授業見学が、新型インフルエンザの影響で、現地入りした直後に学校閉鎖となり、実現できなかった。研究代表者李長波、研究協力者菊地隆雄氏、田洪宝氏は、中国滞在中、今後の研究について打ち合わせを行い、交流活動の難航にともなって、研究計画を立て直した。具体的には、日中両国の共通する教材の比較対象を決定し、漢文教材の全体的な比較については、『論語』、『孟子』をめぐる両国の教材の扱い方の相違を明らかにすることとし、同一教材の扱い方の違いについては、史伝・論説・散文・詩の各ジャンル別に、史伝:「鴻門の会」、「廉頗と藺相如」、論説:韓愈「師説」、散文:陶淵明「桃花源記」、詩:唐詩・杜甫「登高」、「春望」、李白「月下獨酌」、「望廬山瀑布」、王維「竹里館」、白居易「琵琶行」を比較した。交流活動の難航はあったものの、本年度は、中国の高等学校、中学国語の指導要綱(課程標準)の翻訳に着手したほか、代表者李長波は、平成21年8月30日開催された第1届漢日対比語言学研討会(第一回中日対照言語学研究フォーラム、於北京大学)において、「漢文訓読における誤読・誤釋・誤解-日本の高校国語教科書を例として-」)と題する研究発表を行いました。招待講演としては、研究代表者が鳥取県立図書館環日本海交流室の招きで、計三回にわたって、「漢字のタテヨコ・ウラオモテ」と題して、日本語、日本人にとって、漢字の持つ意味について講演を行った。研究協力者菊地隆雄氏は、中国に滞在中の資料収集をした(旅費執行)。本年度は、漢文教材の全体的な比較と両国の教材の扱い方の相違を明らかにすることができた。同一教材の扱い方の違いについては、史伝「鴻門の会」、「廉頗と藺相如」を比較研究した。他に、日中両国の高等学校、中学国語の新しい指導要綱の方針と具体的な方策を比較するための資料として、中国の高等学校、中学国語の指導要綱(課程標準)の翻訳を完了した(研究成果報告書に収録予定)。研究交流活動については、中国教育学会顧問張光瓔先生、中国教育学会教育体制研究分会副事務局長丁梁両氏の協力を得て、九月二十一日に、李・田・菊地一行が北京十一学校を訪問した。当日午前中、趙謙翔先生(北京十一学校顧問、漢文教育の第一人者)と研究交流集会(研究協力者菊地隆雄氏と対談を中心に展開)を開いた。同日午後、趙謙翔先生による「愛蓮説」(二コマ100分)の授業を見学し、その後若手教員を交えて座談会を開いた。(旅費執行)この交流活動への中国側の関心が高く、『中国多媒体教育学報』(中国教育部主管、北京:清華大学編集)から全交流日程にわたって同行取材を受けた。

交流集会の成功を受けて、座談会、対談内容についての報道(文字、映像つき)は、急遽、平成22年12に発行する『中国多媒体教育学報』第6期に掲載することとなった。(研究成果報告書に収録予定)九月二十二日、一行は北京師範大学附属実験中学を訪問し、若手教員による古文の授業を見学した後、古文担当の先生方と座談会を開き、研究交流をしたほか、今後の研究交流についても意見交換を行った。(旅費執行)代表者李長波、研究協力者田洪宝氏、研究協力者菊地隆雄氏は、中国滞在中資料収集をした。
ＳＥＩＱｏＬ－ＤＷによる経時的変化を用いた若年性神経難病患者のＱＯＬに関する研究

本研究の目的は、若年性パーキンソン病のQOLについて、経時的にSEIQoL-DWを調査して、患者の主観的QOLの特徴について明らかにすることである。複数回実施した48名のデータから、前年度に比し値が下降したケースでは、1自分自身の喪失体験、2家族の問題、3家族間の関係の悪化、が下降の主な原因であった。上昇したケースでは、1一度失ったものの回復、2代わる何かを得る、3考えの枠組みの変容、が上昇の主な原因であった。患者は病状の進行と共に様々な喪失体験を経験するのは仕方ないが、その体験から何かを得たり、考え方の枠組みを変更したりすれば、必ずしも主観的QOLは下がることないことが示唆された。本研究の目的は、若年性神経難病患者(特に若年性パーキンソン病)のQOLについて、SEIQoL-DWを中心にその特徴を明らかにすることである。SEIQoL-DWについては、対象者の発症時平均年齢は33.98±9.42歳であった。SEIQoL-DWは6年間で51名に実施した。6回の実施者が8名(48回)5回の実施者が11名(55回)、4回の実施者が11名(44回)、3回の実施者が10名(30回)、2回の実施者が1名(2回)、1回のみの実施者が10名(10回)である。全189回の平均値は68.64±18.62であった。2年以上で複数回実施した41名(179回)のデータから、インデックス値の変動が比較的小さいケースのキューの内容の変化とその値について分析した結果、前年度と比較してキューの内容の一部が大きく変更されたケースとそうではないケースに二分された。特に前者においては、一見、値の変動が小さいケースであっても、大切なものを失っていたり、その一方で、失ったものに代わる何かを得ていたり、考え方を変容していたりなど、非常に大きな転換期を迎えていたケースが存在することがわかった。MASAC-PD31については、1発症年齢とMASAC-PD31の全体得点及び各得点との間に有意な差はみられなかった。一方、罹患年数とMASAC-PD31の全体得点及び各得点との間でも、ほとんどの項目で有意な差はみられなかった。ただし、運動症状得点の中で、ジスキネジア、及び起床時の状態について、p=0.015で17年未満の群よりも17年以上の群で得点が高く、この部分のみ有意な差がみられた。2SEIQoL-DW得点が増加した群、減少した群と、MASAC-PD31の全体得点及び各得点との間に、有意な差はみられなかった。なお、UUISについては、今年度から取り始めたところで分析は今後の課題である。本研究は、若年性神経難病患者(特に若年性パーキンソン病)の生活の質(Quality of Life:QOL)について、数年間経時的に“SEIQoL-DW"を実施することにより明らかになった変化の様相とその意味について分析し、若年性神経難病患者のQOLの特徴について明らかにすると共に、患者のQOLの向上に寄与する方策を検討することを目的とする。若年性の神経難病患者(特に若年性パーキンソン病)は慢性進行性であるが、進行はゆっくりである。その長いスパンの中で患者の生活やQOLがどう変化し、何が原因でQOLが変化するのかを見極めるには、できるだけ長い期間の継続観察・測定が必要である。そこで本研究では、(1)5年の期間を使い、事前のアンケート調査と患者のライフヒストリー聴取を基礎として“SEIQoL-DW"を一人あたり1年に1度ずつ測定する。(2)その値と内容の変動について、研究者と患者自身との対話、およびMASAC-PD31(パーキンソン病疾患特異的尺度)などとの比較により考察する。以上の計画に基づき、本年度は計画3年目であり、引き続き、主に若年性パーキンソン病の対象者に対して“SEIQoL-DW"を行った。今年度は新規の対象者も含めて43名に実施した。また同時に同じ対象者にMASAC-PD31も聴取した。なお、本科研の前の科研からも継続している対象者には、“SEIQoL-DW"をすでに最大8年継続しているので、QOLの変化の原因については、ある程度明らかになりつつある対象者もいるが、まだ研究全体では途中段階である。さらに、何が原因・きっかけでQOLの値が変動したかを検討する。多くのケースのSEIQoL-DWを毎年経時的に分析していくことと、ナラティブを同時に聴取していくことによって上記のことを考察していく過程の中で、QOLを向上させるための具体的な方策について検討する。同時に、長いスパンでSEIQoL-DWを実施するという中で、この方法論の新たな意義についても明らかにする。そこで本研究では、(1)5年の期間を使い、事前のアンケート調査と患者のライフヒストリー聴取を基礎として"SEIQoL-DW"を一人あたり1年に1度ずつ測定する。

(2)その値と内容の変動について、研究者と患者自身との対話、およびSF-36(or 8)やMASAC-PD31(パーキンソン病疾患特異的尺度)などとの比較により考察する。また、(3)若年性パーキンソン病以外の若年性神経難病患者、および同じパーキンソン病でも高齢患者との"SEIQoL-DW"の比較も必要である。今年度は、38名の対象者(若年性パーキンソン病患者)に直接面接し、SEIQoL-DW、およびMASAC-PD31を実施した。本研究は、若年性神経難病患者(特に若年性パーキンソン病)の生活の質(Quality of Life:QOL)について、数年間経時的に“SEIQoL-DW"を実施することにより明らかになった変化の様相とその意味について分析し、若年性神経難病患者のQOLの特徴について明らかにすると共に、患者のQOLの向上に寄与する方策を検討することを目的とする。若年性の神経難病患者(特に若年性パーキンソン病)は慢性進行性であるが、進行はゆっくりである。その長いスパンの中で患者の生活やQOLがどう変化し、何が原因でQOLが変化するのかを見極めるには、できるだけ長い期間の継続観察・測定が必要である。そこで本研究では、(1)5年の期間を使い、事前のアンケート調査と患者のライフヒストリー聴取を基礎として“SEIQoL-DW"を一人あたり1年に1度ずつ測定する。(2)その値と内容の変動について、研究者と患者自身との対話、およびMASAC-PD31(パーキンソン病疾患特異的尺度)などとの比較により考察する。以上の計画に基づき、本年度は計画4年目であり、引き続き、若年性パーキンソン病患者に対して“SEIQoL-DW"を実施した。今年度は新たな対象者も含めて45名に実施した。また同じ対象者に対して、MASAC-PD31も聴取した。なお、本研究の前の科研研究から継続している対象者には、“SEIQoL-DW"をすでに最大9年実施しているので、QOLの変化の原因については、ほぼ明らかになっている対象者もいるが、まだMASAC-PD31などとの比較は行っておらず、研究全体としては途中段階である。59名に実施したSEIQoL-DW全364回の平均値は63.3±18.6であった。全1820個のキューの種類を分析した結果、若年層に特化したキューとしては、「仕事関連」「恋人・婚約者」「子育て関連」等があった。2年以上で複数回実施した48名のデータから、インデックス値の変動の原因を分析した。前年度に比し値が下降したケースでは、1自分自身の喪失体験、2家族の問題、3家族間の関係の悪化、が主な原因として挙がり、上昇したケースでは、1一度失ったものの回復、2代わる何かを得る、3考えの枠組みの変容、が主な原因であった。次にMASAC-PD31を5回以上聴取した36名220回分の調査について分析を行った。まずMASACを構成する運動症状(on/off時の各得点)、非運動症状および総得点とSEIQoLの間には相関はなかった。
児童や前期高齢者に向けた整理整頓教育プログラムの開発と健康影響への効果評価

国内外の既存文献から、整理整頓教育の動向を明らかにする。その上で、我が国の生涯学習としての「整理整頓教育」に関する実態調査を行う。次に整理整頓が苦手な児童、高齢者、ADHD者等にインタビュー調査を行い、整理整頓を阻害する要因を明らかにする。合わせて、対象者を支援する様々な職種に支援上の留意点を調査した後、挑戦的萌芽研究で開発した教育介入プログラムを改良する。改良の視点は多世代汎用型・ユニバーサルデザインの整理整頓教育プログラムである。次に、そのプログラムを用いて介入を行い、健康影響への効果を測定する。得られた結果を取りまとめ、成果の発表を行う。
分子電線への応用を目指した非共有結合型π共役高分子組織体の構築

p-フェニレンジアミンと2-フルフラール(Fur-CHO)および2-ピリジンカルボキシァルデヒド(Py-CHO)との縮合反応により、Fur-CH=N-C_6H_4-N=CH-Py:D-π-A(D:ドナー,A:アクセプター)型のπ共役ゲスト分子を合成した。このD-π-A型π共役ゲスト分子のN,N-ジメチルホルムアミド溶液とγ-シクロデキストリン(γ-CD)水溶液を混合撹拌することにより、沈殿物としてπ共役高分子組織体(1)が得られた。1の粉末Xさ線回折パターンでは、γ-CDがカラム状に配列した場合に特徴的なピークが観測された。また、1のγ-CDの空孔内にゲスト分子が包接したことにより、γ-CDの歪みが解消されて対称性が高まったことが固状態の13C NMR測定により明らかになった。さらに、1の示差走査熱量分析曲線が、ゲスト分子とγ-CDの物理的混合物と大きく異なったことからも、1ではゲスト分子がγ-CDの空孔内に包接していることか確認できた。1の吸収スペクトルは、ゲスト分子のそれよりも長波長に観測されたことから、γ-CD空孔内でのゲスト分子同士の相互作用により、π共役系が拡大していることがわかった。また、サイクリックボルタンメトリー測定から、1中のゲスト分子は、γ-CDに包接していないゲスト分子よりも、低電位で電気化学的酸化反応を受けた。この結果は、1ではπ共役系が拡大していることと対応している。p-フェニレンジアミンと2倍モルの2-フルフラール(Fur-CHO)あるいは2-ピリジンカルボキシアルデヒド(Py-CHO)との縮合反応により、それぞれFur-CH=N-C_6H_4-N=CH-Fur : D-π-D (D:ドナー)型とPy-CH=N-C_6H_4-N=CH-Py : A-π-A (A:アクセプター)型のπ共役ゲスト分子を合成した。これらのD-π-D、A-π-A型π共役ゲスト分子のN, N-ジメチルホルムアミド溶液とγ-シクロデキストリン(γ-CD)水溶液を混合撹拝することにより、沈殿物としてπ共役高分子組織体(1)が得られた。^1H NMR測定により、1はD-π-D、A-π-Aとγ-CDをほぼ1:1:1から成る組成をもつ組織体であることが分かった。また、粉末X線回折、固体状態での^<13>C NMR、示差走査熱量分析測定により、1のゲスト分子がγ-CDの空孔内に包接していることを確認した。さらに、1の吸収スペクトルは、ゲスト分子のそれよりも長波長に観測されたことから、π共役系が拡大していることがわかった。p-フェニレンジアミンと2-フルフラール(Fur-CHO)および2-ピリジンカルボキシアルデヒド(Py-CHO)との縮合反応により、Fur-CH=N-C_6H_4-N=CH-Py:D-π-A(D:ドナー,A:アクセプター)型のπ共役ゲスト分子を合成した。1の粉末X線回折パターンでは、γ-CDがカラム状に配列した場合に特徴的なピークが観測された。また、1のγ-CDの空孔内にゲスト分子が包接したことにより、γ-CDの歪みが解消されて対称性が高まったことが固体状態の13C NMR測定により明らかになった。

さらに、1の示差走査熱量分析曲線が、ゲスト分子とγ-CDの物理的混合物と大きく異なったことからも、1ではゲスト分子がγ-CDの空孔内に包接していることが確認できた。1の吸収スペクトルは、ゲスト分子のそれよりも長波長に観測されたことから、γ-CD空孔内でのゲスト分子同士の相互作用により、π共役系が拡大していることがわかった。また、サイクリックボルタンメトリー測定から、1中のゲスト分子は、γ-CDに包接していないゲスト分子よりも、低電位で電気化学的酸化反応を受けた。この結果は、1ではπ共役系が拡大していることと対応している。
神経芽腫における血管新生の役割とその制御に関する基礎的研究

悪性腫瘍は血管新生による腫瘍の増殖に関わる血管新生因子を分泌していると考えられている。そして,これまで様々な血管新生因子が,多くの悪性腫瘍の増殖,転移に関与していることが明らかになってきた。そこで我々は神経芽腫の増殖・進展においてどんな血管新生因子が関与しているのか,また,それによってどんな因子が神経芽腫に対する抗血管新生療法のターゲットを検索することを目的として、以下の研究を行った。初めに、神経芽腫組織におけるVEGF-Aの発現について、ノーザンブロット法を用いて検討し、神経芽腫においてVEGF-Aが発現していることを確認した。次に神経芽腫の生物学的特性と血管新生因子の発現量の関係について詳しく検討することにした。病期の異なる神経芽腫の切除腫瘍28検体(Stage1,2,3,4がそれぞれ3,8,8,9例)において、4つの血管新生因子,VEGF-A, VEGF-C, bFGF, PD-ECGF/TPの神経芽腫腫瘍組織における発現について定量RT-PCR法を用いて検討した。その結果、bFGF, PD, ECGF/TPの神経芽腫腫瘍における発現はStage,年齢,原発部位,MYCN遺伝子のコピー数,リンパ節転移の有無による差は認められなかった。VEGF-Cの発現はStageによる差はなく,また,リンパ節転移の程度にも関係なく発現していたが,MYCN遺伝子の増幅症例に発現が高いことが示唆された。VEGF-AはStage-1の症例で他のStageに比べ統計学的に有意に高発現が観察された。本研究において、神経芽腫におけるVEGF-Aの発現はStage4症例で有意に高発現していることが判明した。VEGF-Aは神経芽腫のdisseminationに関与しており,進行神経芽腫の抗血管新生疲法のターゲットになりうる可能性が示唆された。平成12年度は神経芽腫の腫瘍検体をもちいて神経芽腫の増殖に血管新生がどのように関わっているかを研究した。血管新生に関与する因子の神経芽腫の腫瘍組織における発現についての検討神経芽腫には比較的悪性度の低いものから、悪性度の高いものまで様々な腫瘍が存在することが知られている。そのため、まず、病理組織やStageなどから様々な28例の腫瘍検体を収集した。それらの腫瘍からRNAを抽出し、PCR (polymerase chain reaction)法を用いて、血管新生因子の発現について検索した。血管新生因子として、これまでに多くの癌でその発現が腫瘍の増殖と関わっていることが示唆されている、VEGF (vascular endotherial growth factor)-A、VEGF-C、bFGF (basic fibroblast growth factor)およびThymidine phsphorylaseの4つを選んで、神経芽腫における発現について検索した。その結果、これらの因子が神経芽腫でも発現していることが示された。現在、定量PCR法によって各腫瘍における発現量の差を解析し、神経芽腫の増殖、進行との関係について統計学的手法を用いて検討しているところである。今後は、神経芽腫においてどの因子が最も重要であり、また、それを制御することが治療上の意味があるのかを検討し、新しい治療法の開発を目指してゆく予定である。そこで我々は神経芽腫の増殖,進展においてどんな血管新生因子が関与しているのか,また,それによってどんな因子が神経芽腫に対する抗血管新生療法のターゲットを検索することを目的として、以下の研究を行った。初めに、神経芽腫組織におけるVEGF-Aの発現について、ノーザンプロット法を用いて検討し、神経芽腫においてVEGF-Aが発現していることを確認した。

次に神経芽腫の生物学的特性と血管新生因子の発現量の関係について詳しく検討することにした。病期の異なる神経芽腫の切除腫瘍28検体(Stage1,2,3,4がそれぞれ3,8,8,9例)において、4つの血管新生因子,VEGF-A,VEGF-C,bFGF,PD-ECGF/TPの神経芽腫腫瘍組織における発現について定量RT-PCR法を用いて検討した。その結果、bFGF,PD-ECGF/TPの神経芽腫腫瘍における発現はStage,年齢,原発部位,MYCN遺伝子のコピー数,リンパ節転移の有無による差は認められなかった。VEGF-Cの発現はStageによる差はなく,また,リンパ節転移の程度にも関係なく発現していたが,MYCN遺伝子の増幅症例に発現が高いことが示唆された。VEGF-AはStage4の症例で他のStageに比べ統計学的に有意に高発現が観察された。本研究において、神経芽腫におけるVEGF-Aの発現はStage4症例で有意に高発現していることが判明した。VEGF-Aは神経芽腫のdisseminationに関与しており,進行神経芽腫の抗血管新生療法のターゲットになりうる可能性が示唆された。
ヒトパピローマウイルスを安定に複製するヒト表皮細胞株の樹立と抗ウイルス剤の検索

ヒトパピローマウイルス(HPV)は、種特異性、組織特異性のきわめて高いウイルスであり、HPVを培養細胞内で増殖させる実用的な系は未だ完成しておらず、その生活環には不明な点が多い。そこで、自然宿主であるヒト表皮細胞中で、HPV DNAの複製が安定に維持される細胞株を樹立することを本研究の目的とした。まず、レトロウイルスベクターにHPV16型のE7遺伝子とネオマイシン耐性遺伝子の両遺伝子を導入したものをヒト表皮細胞に感染させ、G-418存在下で選択して目的の遺伝子が導入された細胞株を得た。この細胞株は、半年以上に渡って培養が可能であり、しかもカルシウム存在下で正常ヒト表皮細胞と同様に分化することなどから不死化はしたものの正常ヒト表皮細胞に近い機能を保持しているものと思われた。次に、HPV47型のE2遺伝子の一部をブラストサイジンS(bsr)耐性遺伝子に入れ換えたものを大腸菌プラスミドDNAの一部として増殖させ、プラスミドベクターの部分を取り除いた後、HPV DNAを自己連結させ閉環状DNAを得た。HPV自身の複製にはE1およびE2蛋白が効率よく発現することが必要なので、HPV47型のE1やE2遺伝子を発現するプラスミドを作製し、これらと前記の自己連結させ閉環状HPV DNAをリポゾームを用いて上記の不死化したヒト表皮細胞株に同時に導入し、これらの細胞をbsr存在下で培養を続けた。上記の閉環状DNAが安定に数十個以上複製した細胞は、bsr遺伝子の発現が、bsr耐性を獲得するに十分となり、bsr耐性株として分離されることが期待される。しかし、目的の細胞株が得られなかったので、現在E1,E2遺伝子をより効率よく発現するプラスミドを作製しそれらの導入したヒト表皮細胞株を得つつある。今後、これらの細胞株にあらためて、前記の自己連結させ閉環状HPV DNAをリポゾームを用いて導入する予定である。