hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
糖鎖プロセシング酵素と相同性を有する酵素の立体構造解析に基づく新規オリゴ糖の創出

Tt8MGHのアポ構造、生成物であるグルコースまたはグリセリン酸との複合体構造を1.67-2.10 Å分解能で決定し、Tt8MGHに特徴的な3つのループが基質認識に関与していることがわかった。3.細菌由来GH31機能未知酵素(PsGal31A)の大腸菌発現系の構築、組換え酵素の性質解析を行ったところ、GH31として初めてα-ガラクトシダーゼ活性を示す酵素であることがわかった。また、X線結晶構造解析によりPsGal31Aの立体構造を明らかにし、本酵素のユニークな基質特異性に関する知見を得た。以上の成果により、GH31およびGH63に属するユニークな基質特異性を有する加水分解酵素を新規なオリゴ糖合成酵素に変換するための基盤を確立した。26年度が最終年度であるため、記入しない。大腸菌由来機能未知酵素YgjKについては、オリゴ糖合成に加え、本酵素の機能に関する新たな知見を得ることができ、国際学術誌に論文として発表することができた。またAbPGIについては当初の計画通り、結晶化およびX線回折強度測定を行うまでに至っている。ゆえに、本研究はおおむね順調に進展していると考えている。今後は、Glcα-1,2-Galの収率向上を目的とし、昨年度行った立体構造解析から新たに明らかになった反応に里要なアミノ酸残基に変異を導入し、新たなグライコシンターゼ変異体の作製を行う。得られた変異体を用いて反応の定量的解析を行い、各反応効率の評価を行う。AbPGIは結晶の分解能向上を目的とし、結晶化条件のスクリーニングやX線回折強度測定の条件検討等を行う。また、YgjKグライコシンターゼより得られた知見をもとに、AbPGIのグライコシンターゼ化を行い、N結合型糖鎖の部分構造の合成を目指す。
細胞増殖制御における低分子量G蛋白質の機能と作用機構

低分子量G蛋白質Ras、Rhoは細胞増殖、細胞接着を制御するモレキュラースイッチとして働いている。本研究では、低分子量G蛋白質による細胞接着、細胞骨格の制御機構を解明し、癌細胞の転移機構を明らかにすることを試みた。私共は低分子量GTP結合蛋白質のRhoファミリーのうち、Rhoの標的蛋白質としてRho-kinase、myosin phosphataseの制御サブユニット(MBS)を見出している。私共は、Rho-kinaseがMBSをリン酸化してmyosin phosphataseの活性を抑制するとともに、myosin light chainそのものも直接リン酸化することを見出した。Rho-kinaseは、この二つのpathwayによりmyosin light chainのリン酸化レベルを上昇させ、その結果myosin ATPase活性を上昇させることを見出した。また、Rho-kinaseの新たな基質として細胞膜裏打ち骨格蛋白質のひとつであるERMファミリーを見出した。ERMは、MBSと直接結合して、複合体を形成することによりリン酸化されやすくなることも見出した。Cdc42とRac1の標的蛋白質IQGAP1が、細胞間接着部位に濃縮されcadherin・cateninと直接結合することを見出した。さらに、IQGAP1をoverexpressするとcadherin依存性の細胞間接着が抑制されることを見出した。このIQGAP1の作用は活性型Cdc42によりreverseされた。一方、私共はRasの新規標的蛋白質としてAF-6を同定し、AF-6が上皮細胞ではtight junctionに濃縮されることを見出している。AF-6はtight junctionのコンポーネントのひとつであるZO-1と直接結合することも見出した。これらの結果は、今まで不明であった細胞間接着の制御機構を分子レベルで解明することに大いなる寄与をするものと考えられる。すなわち、低分子量G蛋白質が関わると考えられている種々の病態の理解や治療法、診断法に応用されることが期待される。以上本年度の研究計画はほぼ達成することができたと考えている。低分子量G蛋白質のRasとRhoは細胞の増殖を制御しているが、その作用機構は不明であった。そこで、細胞増殖制御におけるRasとRhoの機能と作用機構を明らかにする目的で、RasとRhoの標的蛋白質の単離・同定を試みた。その結果、Rasの新規標的蛋白質としてAF-6とCanoeを同定した。AF-6とCanoeは共に細胞接着に関与するGLGFモチーフを持ち、細胞接着の制御に関与している可能性が高い。さらに、私共はPC12細胞ではAF-6は細胞間の接着部位に局在することを見出した。したがって、RasはAF-6を介して細胞の接着性を制御している可能性が高い。一方、Rhoの標的蛋白質としてプロテインキナーゼN(PKN)、新規プロテインキナーゼ(Rhoキナーゼ)、ミオシンフォスファターゼのミオシン結合サブユニット(MBS)を同定した。Rhoの下流にセレリン/スリオニンキナーゼとフォスファターゼが存在することが初めて明らかになった。また、Rhoがストレスファイバーの形成を促進することと、ストレスファイバーの形成にはミオシン軽鎖のリン酸化が重要であることがすでに報告されている。私共はRhoがRhoキナーゼを介してミオシンフォスターゼに作用することによりミオシン軽鎖のリン酸化を制御していることを明らかにした。これにより、Rhoによるストレスファイバーの形成機構が分子レベルで初めて明らかになった。私共はRasの新規標的蛋白質としてAF-6を、Rhoの標的蛋白質としてプロテインキナーゼN(PKN)、Rho-キナーゼ、ミオシンフォスファターゼのミオシン結合サブユニット(MBS)を,Rac/Cdc42の標的蛋白質としてIQGAPを同定した。AF-6は細胞膜裏打ち細胞骨格蛋白質に多く見出されるPDZドメインを有しており、実際に、細胞間接着装置であるtight junctionに濃縮されていた。また、AF-6はtight junction構成蛋白質のOccludinとZO-1に直接結合した。一方、私共はRhoキナーゼがミオシン軽鎖を直接リン酸化すると共に、MBSをリン酸化してミオシンフォスファターゼを不活性化し、ミオシン軽鎖のリン酸化レベルを上昇させることにより、アクチンとミオシンの結合を促進することを見出した。実際、活性型Rhoキナーゼを線維芽細胞に発現させるとアクチンストレスファイバーと接着斑(focal adhesion)が形成された。従って、RhoがRhoキナーゼを介してアクチン系細胞骨格と細胞基質間接着を制御している可能性が高い。他方、私共はRac/Cdc42とIQGAPが細胞間接着部位に局在しており、細胞間接着を制御することを明らかにした。また、IQGAPがカドヘリンやカテニンなどの接着分子に直接結合することも見出した。

Rho-kinaseは、この二つのpathwayによりmyosin light chainのリン酸化レベルを上昇させ、その結果myosin ATPase活性を上昇させることを見出した。また、Rho-kinaseの新たな基質として細胞膜裏打ち骨格蛋白質のひとつであるERMファミリーを見出した。ERMは、MBSと直接結合して、複合体を形成することによりリン酸化されやすくなることも見出した。Cdc42とRac1の標的蛋白質IQGAP1が、細胞間接着部位に濃縮されcadherin・cateninと直接結合することを見出した。さらに、IQGAP1をoverexpressするとcadherin依存性の細胞間接着が抑制されることを見出した。このIQGAP1の作用は活性型Cdc42によりreverseされた。一方、私共はRasの新規標的蛋白質としてAF-6を同定し、AF-6が上皮細胞ではtight junctionに濃縮されることを見出している。AF-6はtight junctionのコンポーネントのひとつであるZO-1と直接結合することも見出した。これらの結果は、今まで不明であった細胞間接着の制御機構を分子レベルで解明することに大いなる寄与をするものと考えられる。すなわち、低分子量G蛋白質が関わると考えられている種々の病態の理解や治療法、診断法に応用されることが期待される。以上本年度の研究計画はほぼ達成することができたと考えている。
歯槽骨の吸収機構に関する実験薬理学的研究

歯槽骨吸収のメカニズムを解明する目的で、低カルシウム食飼育ラットにおける歯槽骨吸収実験、および単離破骨細胞を用いた実験を行い、以下の結果を得ることができた。1.ラットを低カルシウム食にて飼育すると、実験開始直後より歯槽骨に著しい骨吸収が起こり、実験20日目で約1/2の骨量が消失することが確かめられた。2.歯槽骨全体の骨吸収は進行するにもかかわらず、歯牙の周囲の固有歯槽骨には骨吸収が起こりにくいことが確かめられた。二つの所見から、咬合力を支えるために骨吸収に抵抗し、固有歯槽骨の形態を維持するメカニズムが存在する可能性が示唆された。3.低カルシウム食による歯槽骨吸収の発現効果は迅速かつ確実で再現性が高く、この実験系が歯槽骨吸収のメカニズムを解明するための実験モデルとして極めて有用であることが示唆された。4.ラットより破骨細胞を単離し、少なくとも24時間培養することが可能であった。5.単離破骨細胞は他の細胞に比べて高い酒石酸抵抗性酸性フォスファターゼ活性を示した。しかし、酵素活性は他の細胞にも認められることから、ラットにおいては、この酵素活性が単離破骨細胞のマーカーとなる可能性はないものと思われた。6.単離破骨細胞はその周囲に板状偽足や針状偽足を広げて、活発な運動を行いながら移動することが観察された。カルシトニンの作用によりこのような運動は抑制された。7.コラーゲンをコートしたdish上では単離破骨細胞の運動性は抑制されたことから、コラーゲン自体は骨吸収活性を抑制するように作用する可能性が示唆された。以上の結果より、歯槽骨吸収は歯牙の咬合力を支える歯槽骨の機能を維持しながら進行する特徴ある様式をもつことが明らかにされた。また単離破骨細胞を用いる検索により、骨吸収機構における破骨細胞の運動性の関与を解明できる可能性が示唆された。本年度は研究課題の初年度であり、今後の研究基盤を確立する意味で実験方法の検討を行った。まず本研究の根幹をなす低Ca食飼育による骨吸収の発現を再現性の高いものとするため、従来より知られていた低Ca食の組成と作成方法に改良を加えた。さらにpair fed法を用いて、ラットの成長発育に障害を起さない飼育を行うように改善を加えた。改良飼料,飼育法によりラットを代謝ケージにて飼育して予備的検索を行ったところ、低Ca食を与えた直後より、尿,糞中Ca量は急速に減少しほとんどCaの排泄が見られなくなった。血漿Ca値は低下したが、その程度は少なく、また同時にイオン化Ca値も低下した。血漿アルカリフォスファターゼ値は低Ca食群では増加傾向を示した。組織学的検索を非脱灰研磨切片により行なったところ、歯槽骨に著しい骨吸収像が観察された。特に海綿骨に著しい吸収が見られ、20日間低Ca食にて飼育したラットにおいては、海綿骨はほとんど消失し、切歯,臼歯の歯槽骨壁に一層の骨を残すだけとなった。しかし歯牙には吸収像は観察されず、歯牙が脱落するなどの著しい咬合状態の異常は認められなかった。したがって、歯槽骨の歯牙支持組織としての機能は、減弱している可能性はあるものの、依然として維持されているものと思われる。皮質骨も幅が狭くなるなどの著しい骨吸収像が認められたが、歯槽骨頂の高さや、外形などには著明な変化は観察されなかった。

以上のような基礎的検索により、低Ca食飼育ラットの歯槽骨においては脛骨などの他の骨組織とは違う特徴的な骨吸収が引き起こされることが明らかとなった。これは歯槽骨が歯牙の支持組織としての特殊な機能を持っているためであろうと考えられる。本年度の研究の結果、改良された低Ca食餌で飼育したラットにおける歯槽骨の骨吸収発現効果は確実で、且つ再現性も高く、骨吸収のメカニズムを解明するための実験モデルとして有用であることが確認された。本年度は前年度に確立した低Ca食飼育による実験的骨吸収モデルに関して詳細な検討を加え,同時に本年度入手した細胞形態記録装置を用いて,単離破骨細胞の動態に関して基礎的な検索を行った.1.低Ca食飼育ラットによる曽験的歯槽骨吸収の実験:低Ca食飼育ラットにおいて, Ca代謝に関するCa調節ホルモン(PTH,CT)の変動をRIAにて調べたところ,血液中のPTHレベルは低Ca食に切り換えた直後より急激に上昇した.飼育3日目をピークとして除々に低下し, 20日目には正常Ca食群と同レベルとなった. CTの血液中のレベルは実験期間内に変化は見られなかった. PTHの急激な上昇は,血中Caレベルを恒常的に維持しようとするCaホメオスタシス機構に基づくものと考えられる.一方,低Ca食飼育20日目までは骨吸収の進行にも拘らず,対照群とほぼ同程度の骨形成が行われていた.このような骨形成の仕形成の仕組みにより低Ca食飼育状態においても歯槽骨の外形は維持されているので,歯槽骨の歯芽支持組織としての機能は失われていないものと思われる.以上の結果から,低Ca食飼育状態における歯槽骨の変化は著しい骨吸収の増大によるものであり,また初期における骨吸収にはPTGの上昇が関与している可能性が示唆された.2.単離破骨細胞の動態に関する実験:破骨細胞は骨吸服を行う際に,活発な運動を行っていると思われる.ラット骨髄より破骨細胞を単離して培養ディッシュ上で経時的に動きをVTRに記録したところ,破骨細胞は細胞辺縁膜の波状運動や,伸展に伴って活発に移動していた.初歩的な段階ではあるが,以上の観察により破骨細胞が活発な運動を行い,骨吸収を行う可能性がin vitroの実験系で示された.本年度は研究の最終段階として、これまで行ってきた低Ca食飼育ラットによる実験的歯槽骨吸収モデルと単離破骨細胞のin vitroでの動態に関して、より詳細な検索を行うと同時に、得られた研究成果に関してまとめを行った。1.低Ca食飼育ラットによる実験的歯槽骨吸収の実験:低Ca食飼育ラットの歯槽骨の吸収の進行状態を、非脱灰研磨切片を用いて画像解析による形態計測にて詳細に解析したところ、歯槽骨量、平均骨幅(骨量/周囲長)は低Ca食飼育3日目より対照群より有意に減少し、その後経時的に低下した。骨吸収の進行にともない骨髄側の骨の複雑化と、骨髄腔の増加により内周長の増加が認められたが、外周囲長には変化が見られなかった。また顎骨外形に囲まれた面積、歯槽骨頂の高さにはほとんど変化がなく、歯槽骨全体の外形は対照群とほぼ同一であった。一方、骨吸収の進行と密接に関連する骨形成は、1日あたりの骨形成幅を指標として比べた場合、対照群と実験群との間に変化は認められなかった。破骨細胞数は実験開始直後より増加し、とくに皮質骨、海綿骨での増加が著しかった。しかし、切歯歯槽窩において破骨細胞数の変化は認められず、骨吸収も起こりにくいことが明らかにされた。この所見から、咬合力を支えるために骨吸収に抵抗し、固有歯槽骨の形態を維持するメカニズムが存在する可能性が示唆された。
性成熟疾患におけるエピジェネティック異常の検証

本研究の目的は、性成熟疾患(思春期遅発症・思春期早発症)におけるエピジェネティック異常の関与の検証である。2018年度は、主に思春期早発症とエピジェネティック異常の関連について検討した。近年、インプリンティング遺伝子であるMKRN3の機能喪失型変異が、思春期早発症を招くことが報告された。一方、アジア諸国思春期早発症患者での変異報告は少数である。また、MKRN3遺伝子のメチル化・コピー数の異常はこれまで同定されていない。そこで、アジア諸国思春期早発症患者におけるMKRN3遺伝子の変異・異常の関与の程度を明確にすることを目的に以下の検証を行った。1アジア諸国思春期早発症患者24例を対象に次世代シークエンサー(NGS)を用いてMKRN3遺伝子の変異スクリーニングを行った。220例を対象にパイロシークエンサーを用いてMKRN3遺伝子のメチル化解析を行った。321例を対象にreal-time PCRを用いてMKRN3遺伝子のコピー数解析を行った。解析の結果、24例中1例(4%)に疾患に関与するMKRN3遺伝子のフレームシフト変異(p.Glu229Argfs*3)を同定した。家族解析を行い、患者の父、父方祖母に患者と同一の変異を認めた。疾患に関与するMKRN3遺伝子のメチル化・コピー数の異常は同定されなかった。以上の結果より、アジア諸国思春期早発症患者におけるMKRN3遺伝子変異は稀であることが判明した。またMKRN3遺伝子変異の頻度にはアジア諸国と西洋諸国で差があることを明らかにした。思春期早発症患者の家系例解析において同定されている全てのMKRN3遺伝子変異は父由来であり、de novo変異はこれまで報告されていない。したがって、MKRN3異常の主体は、de novo変異の発生ではなく、父由来変異の伝達であることが見出された。2019年度は、思春期遅発症患者を対象に、ビーズアレイ法によるゲノムワイドメチル化異常解析を行い、疾患発症に関与するエピジェネティック異常を探索する。得られた患者集団のメチル化データをコントロールデータと比較し、疾患に特徴的なエピジェネティック異常領域を探索する。特徴的なエピジェネティック異常が同定された症例に関して、同異常と臨床症状との関連性を評価する。さらに、性成熟疾患患者を有する家系例において、家族検体が得られる場合、家族解析を行い、病因の解明につなげる。思春期早発症とエピジェネティック異常の関連について検討する際に使用した試薬等が比較的低予算で納めることができたので。思春期遅発症とエピジェネティック異常の関連について検討するためのメチル化試薬等に使用予定である。
知的財産法（学）の多元化・多層化現象の位相と包摂枠組の構築

本研究では、知的財産法の現代的課題(特許付与後のレビュー制度の拡充、文化コモンズと著作権、医薬関連特許と医薬品アクセス問題、反特許政策の意義と限界、職務著作の問題)について、(i)法プロセスに関与する主体の多元化、(ii)法システムの多層化と相互干渉、(iii)法的決定の多段階化と時間的広がり、(iv)法を捉える視点の多様化、という4つの観点から分析を行った。これにより、各問題を解決する上でどのような議論枠組みが必要なのかを明らかにした。本年度は、当初の予定どおり、1.付与後レビュー制度の拡充に関する研究に取り組むとともに、当初の予定を繰り上げて、3.文化コモンズと著作権に関する研究に取り組んだ。具体的には、1.として、わが国における特許異議申立て制度、無効審判制度について、(1)法プロセスに関与する主体の多元化、(2)法システムの多層化と相互干渉、(3)法的決定の多段階化と時間的広がり、という3つの観点から研究を行った。これにより、例えば特許異議申立て制度について、(1)特許の有効性判断の主体が特許庁の審判官から一般公衆にまで広がっていること(公衆審査としての色彩)、(2)米国や欧州の特許制度における付与後レビュー制度の拡充の動きが、わが国の平成26年特許法改正の推進力となるとともに、無効審判制度との併存という制度設計の在り方にも影響を与えていること、(3)特許の有効性判断をめぐる権限配分が事前審査から事後審査へとシフトしつつあることが明らかとなった。また、3.として、LinuxやWikipedia等の事例について、上記(1)や(4)法を捉える視点の多様化、という2つの観点から研究を行った。これにより、(1)Linux OSやWikipediaの記事といった知的成果物の創作主体が一個人ではなく一定のコミュニティであること、(4)これらの知的成果物には著作権という排他的独占権が発生するが、LinuxやWikipediaのコミュニティは、当該著作権をパブリック・ライセンスの枠組と組み合わせることで、知的成果物の自由かつ開放的な創作・利用環境を実現していること(「排他権」のパラドクス)が明らかとなった。本年度の研究は、知的財産法の現代的課題について(1)(4)の視点から分析することで、真に論じるべき問題の本質を明確化した点、その成果を論文として公表した点で、大きな意義を有するものと考える。本年度は,1医薬特許と医薬品アクセス問題、2反特許政策の意義と限界、3職務著作の各テーマを取り上げ、(i)法プロセスに関与する主体の多元化、(ii)法システムの多層化と相互干渉、(iii)法的決定の多段階化と時間的広がり、(iv)法を捉える視点の多様化という4つの観点から考察を行った。これにより、1について、(ii)TRIPS協定が加盟国の講じるべき最低保護水準を定めたことで、多国間フォーラムの場で途上国の医薬品アクセス問題が注目を集め、2001年のドーハ閣僚宣言の採択に至ったこと、その反動として米国主導の二国間FTAを通じたTRIPSプラス条項の流布を招いたこと、(iv)そうした中で、欧米の学説は、医薬品アクセス問題を人権や国際正義の問題として捉え、政治力学に埋没しない議論枠組みの構築に取り組むとともに、(i)NGO団体主導の解決策を模索していることが明らかになった。また、2に関し、(iv)オランダとスイスは19世紀後半に国内特許制度を廃止等したことで、短期間で先進工業諸国へのキャッチアップを達成しえたこと、(ii)しかし両国の産業発展は外国の特許技術の自由利用に立脚したものであったため、パリ条約の締結以降、他のパリ同盟国から倫理的非難が強まり、20世紀初頭には反特許政策の転換を余儀なくなされたことが明らかとなった。さらに、3について、(iv)法人等を著作者とするわが国の法制が、団体内で作成される著作物の作成責任を実際の作成者と団体のどちらが負うのかによって著作者を判断する考え方に立脚していること、(ii)この考え方はわが国の出版条例・版権条例に由来するものであり、著作物の現実の作成者のみを著作者とする大陸法系の考え方とは異なること、(i)(iii)両者の調整弁として、わが国の法制は著作物作成時に当事者が契約で規律を選択できるようにしていることが明らかになった。本研究の目的は、現代の知的財産法が抱える諸課題を前述した(1)(4)の4つの観点から分析し、その問題の本質・構造を明らかにした上で、課題の解決を図るというものである。この目的は、「研究実績の概要」で示したように、付与後レビュー制度の拡充および文化コモンズと著作権に関する本年度の研究によって、順調に達成できているものと考える。知的財産法本研究課題は、来年度(平成27年度)、2.医療関連特許の問題に関する研究とともに、4.デジタル著作物のオンライン流通と消尽の問題の研究に取り組む予定である。その際には、(2)法システムの多層化と相互干渉、(4)法を捉える視点の多様化、という2つの観点から問題の把握および分析を試みる予定である。そのため、

(2)米国や欧州の議論動向を調査するために、海外出張が必要となる。また、(4)医療関連特許の問題を研究の自由、生命倫理、公序良俗の視点から分析したり、デジタル著作物のオンライン流通と消尽の問題を取引費用理論、消費者のアクセス権の視点から分析するために、これらの分野に関する和書・洋書の購入が必要となる。なお、本年度と来年度(平成27年度)とで取り組む研究の順序を一部入れ替えたが、これは当初の研究計画から予定され明記していたことである。
真核生物における小分子RNA作用機序の構造基盤の解明

Argonauteは、バクテリアから真核生物にまで全ての生物界に存在し、核酸の配列依存的なサイレンシング機構において必要不可欠なタンパク質である。これまでに多くの研究により、Argonaute-核酸複合体の構造的知見が得られてきた。しかしながら、Argonauteによるガイド鎖とターゲット鎖の認識メカニズムの詳細は、未だ不明のままである。本研究では、ガイド鎖をRNAとし、ターゲット鎖をDNAとするArgonauteタンパク質複合体をX線結晶構造解析により、明確に示すことに成功した。RNAサイレンシングは、約20塩基長の小分子RNAが関与する塩基配列特異的な遺伝子発現制御機構であり、種々の高次生命現象に関わる必要不可欠な生体メカニズムである。小分子RNAがトリガーとなる本機構は、新たな核酸創薬を担うシステムとして期待されているだけでなく、がん治療や再生医療の分野での応用利用が待ち望まれている。しかし、このメカニズムの詳細は不明な点が数多くあり、原子分解能レベルでの構造基盤解明が必要である。特に本研究では、この機構の中枢を担うタンパク質群による小分子RNAを介した“連続的な一連のメカニズムの詳細"をX線結晶構造解析を用いて解明する。RNAサイレンシング機構は、“小分子RNA"と“タンパク質"の協調的相互作用が非常に重要な生体システムである。また、その作用様式は、小分子RNA特有の結合・認識メカニズムを形成していると考えられる。本研究では、小分子RNA経路において機能の中枢を担うタンパク質による多段階からなる小分子RNA認識メカニズムの立体構造を決定することにより、一連の連続的な分子動態メカニズムを解明する予定である。研究手順は、まず1小分子RNA-タンパク質複合体の結晶化を行う。次に、2X線回折データの収集、3立体構造計算を行い、各々の複合体の立体構造を決定する。さらに、4生科学的実験により、一連の分子メカニズムの更なる理解を行なう予定である。当該年度では、「1小分子RNA-タンパク質複合体の結晶化」に力を入れて遂行してきた。これまでに、大量で且つ純度の高い蛋白質を得ることに成功している。また、小分子RNA-タンパク質複合体の結晶化スクリーニングを行なうことにより、結晶を得ることに成功している。現在は、「2X線回折データの収集」を行なうためのより質の良い結晶を得るために、様々な小分子RNAやタンパク質候補について調べている状況である。真核生物のRNAサイレンシングメカニズムは、約20塩基長の小分子RNAが関与する塩基配列特異的な遺伝子発現制御機構であり、数多くの高次生命現象に関わる必要不可欠な生体メカニズムである。小分子RNAがトリガーとなる本機構は、新たな核酸創薬を担うシステムとして期待されているだけではなく、がん治療や再生医療の分野での応用が待ち望まれている。しかし、このメカニズムの詳細は不明な点が数多くあり、原子分解能レベルでの構造基盤の解明が必要である。特に本研究では、この機構の中枢を担うタンパク質群による小分子RNAを介した「連続的な一連のメカニズムの詳細」についてX線結晶構造解析を用いて解明する。RNAサイレンシング機構は、小分子RNAとタンパク質の協調的相互作用が非常に重要な生体システムである。本研究では、小分子RNA作用機構において機能の中枢を担うタンパク質による多段階からなる小分子RNA認識メカニズムの立体構造を決定することにより、一連の連続的な分子動態メカニズムを解明する予定である。研究手順は、大まかに(1)小分子RNA-タンパク質複合体の結晶化、(2)X線回析データの収集、(3)立体構造計算(4)生化学的実験による構造モデルの検証を予定しており、平成25年度までに、(1)小分子RNA-タンパク質複合体の結晶化を完了しており、平成26年度では、(2)X線回析データの収集と(3)立体構造計算を完了することに成功した。現在は、(4)生化学的解析により、タンパク質複合体の分子動態メカニズムの詳細を解析中である。真核生物の細胞内に存在するRNAサイレンシング機構は、約20塩基長の小分子RNAが関与する塩基配列特異的な遺伝子発現制御機構であり、数多くの高次生命現象に関わる重要なメカニズムである。ガイド鎖と呼ばれる小分子RNAがトリガーとなる本機構は、遺伝子ノックダウンの手法として、バイオテクノロジー分野に広く応用されているだけではなく、ターゲット分子の選択性が非常に厳密であることから、新たな核酸創薬を担うシステムとして期待されており、ガン治療や再生医療研究分野における応用が待ち望まれている。これらの応用研究の発展には、本機構の詳細なメカニズムの解明が必要不可欠である。Argonauteタンパク質は、原核生物から高等生物まで広くゲノムにコードされており、多様なサイレンシング機構において中心的な役割を果たしている。一般的に、真核生物のArgonauteタンパク質は、ガイド鎖・ターゲット鎖が共にRNA分子であるが、光合成細菌ではターゲット鎖をDNAとする非常にユニークなArgonauteが機能している。平成26年度までに、光合成細菌のArgonauteタンパク質と核酸間の立体構造及び核酸の結合様式をX線結晶構造解析により明らかにした。本年度は、構造モデルを生化学的解析により検証し、Argonauteタンパク質と核酸の認識メカニズムの詳細の解明を行った。その結果、Argonauteタンパク質におけるアミノ酸の部位特異的変異導入実験によって、核酸の認識に重要なアミノ酸を特定することが出来た。さらに、核酸の変異(DNAもしくはRNA)による結合実験により、核酸の種類を識別するのに重要な構造的認識メカニズムを明らかにした。詳細は、研究成果報告書に記載する。

Argonauteは、バクテリアから真核生物にまで全ての生物界に存在し、核酸の配列依存的なサイレンシング機構において必要不可欠なタンパク質である。これまでに多くの研究により、Argonaute-核酸複合体の構造的知見が得られてきた。しかしながら、Argonauteによるガイド鎖とターゲット鎖の認識メカニズムの詳細は、未だ不明のままである。本研究では、ガイド鎖をRNAとし、ターゲット鎖をDNAとするArgonauteタンパク質複合体をX線結晶構造解析により、明確に示すことに成功した。当該研究の大まかな手順は、(1)小分子RNA-タンパク質複合体を結晶化させ、(2)X線回析データの収集を行い、その後の(3)立体構造計算により複合体の立体構造を決定する。さらに(4)この示された立体構造モデルの情報を基に生化学的実験による分子動態メカニズムを明らかにしていく計画である。平成25年度までに様々なタンパク質と核酸の複合体の結晶化を行うことで、良質な結晶を得る複合体を見つけることに成功した。平成26年度では、この作成した結晶を用いて、X線回析データを取得し、構造計算を進めたが、既知構造データを用いた分子置換法では、この構造の位相を決定することは、出来なかった。そのため、セレノメチオニンで標識を行ったタンパク質を用いる方法で、位相の決定を行った。この位相決定実験では、高エネルギー加速器研究機構において、X線回析データを取得した。得られた解析データをもとに、立体構造を決定し、複合体構造の全貌を原子レベルの分解能で観察することに成功した。以上の結果より、上記(1)(3)を完了して、現在(4)を遂行中であることから、「おおむね順調に進展している」と評価する。構造生物学、分子生物学前述した研究手順(1)(4)のうち、平成25、26年度において(1)(3)を完了したことから、平成27年度は(4)を遂行していく予定である。平成26年度の研究で明らかになったタンパク質複合体の立体構造をもとに、様々な種類と長さの核酸との結合様式を調べる。さらに、タンパク質の核酸相互作用アミノ酸に着目して、変異体を作製し、各々の変異体タンパク質の核酸相互作用に関して解析を行なう予定である。当該研究の大まかな手順は、1小分子RNA-タンパク質複合体の結晶化を行う。次に、2X線回折データの収集、3立体構造計算を行い、各々の複合体の立体構造を決定する。さらに、4生科学的実験により、一連の分子メカニズムの更なる理解を行なう予定である。当該年度は、上記の1について完了し、現在2を遂行していることから、「おおむね順調に進展している。」と評価した。本研究の大まかな研究手順は、(1)小分子RNA-タンパク質複合体の結晶化、(2)X線回析データの収集、(3)立体構造計算
表面Ｘ線分光による燃料電池用白金合金ナノ粒子のｉｎ　ｓｉｔｕ解析と酸素還元活性

(1)燃料電池における高活性化の中核を担う酸素還元触媒について、in situ条件下の偏光XAFS法の測定を展開した。とくに、HOPG基板上にArc Plasma法によりPtナノ粒子とPtナノ合金粒子を展開した。HOPG基板を用いているため、Pt量は10^15個cm^-2と微量であり、高感度なXAFS測定が必要である。そこで、BCLA+BI-XAFS法という高感度XAFS測定法を開発して、適用した。その結果Pt-Ptの結合距離を精度良く決定することができた。特にPtCoNAuナノ粒子では高活性と高耐久性を示す。XAFS測定の結果、CoNをコアとし、その周辺にPtをシェルとしたコアシェル構造で存在し、そのPt-Ptの結合距離が2.74Aと通常のPt-Ptの結合距離より短くなっていることを見いだした。また、AuはPtの表面のステップサイトに有り、白金の溶解を防いでいることがわかり、失活防止の原因を解明した。(2)このBCLA+BI-XAFS法は高感度でXAFSを測定するだけでなく、Range Extended XAFS法が通常の装置でもできるところに特徴がある。元素番号が隣同士のPtとAuが共存すると互いに干渉し、XAFSを測定することができないが、BCLA+BI-XAFS法ではそれぞれの信号を分離することができ、干渉なく測定できるRange Extended XAFSが可能であることを見いだした。これにより、PtのXAFSを精度良く測定できた。(3)さらに、超高感度を実現するために特殊な電気化学測定XAFSセルを開発し、これまで全く測定ができていない10^14個cm^-2の測定にも成功した。以上の結果は1報の論文に発表し、現在2報を投稿中である。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。燃料電池の実用化のためには燃料電池触媒である白金量の低減と酸素還元活性の向上が必要である。近年PtとCo, Cu, Niなどの金属とからなるPt合金ナノ粒子触媒が用いられ、白金あたりの高活性化を達成しようという試みがなされている。しかし、その合金ナノ粒子の構造や電子状態についてはほとんどわかっていない。これは、電極として用いられるカーボンがアモルファス構造をしているためである。そこで、本研究では平坦な基板であるHOPG(Highly Oriented Pyrolytic Graphite)を用いて、PtCoナノ粒子をこの基板上に調製し、受入研究者が開発した表面X線分光法である超高感度偏光XAFS法や最新のSPMやXPSなどの表面科学的手法を駆使して、それらの合金ナノ粒子の構造や電子状態、基板との相互作用を解明して、その酸素還元活性要因を明らかにする。PtCoは高活性・高耐久性を持つ燃料電池触媒とされてきた。本研究では、高感度背面入射偏光XAFS法によりPtCoのグラファイト担体上における構造とそのポテンシャル依存性をしらべた。とくにPtCoはプラズマアーク法で調製した。この方法はナノオーダのPtおよびPt合金微粒子を得る手法である。その結果、PtとCoは、合金を作っていること、Coが電気化学反応中容易に析出することやNを同時に打ち込むことで、Coの析出が抑えられることを見出した。また、Pt-Ptの結合距離はCoとの合金化により0.270 nmと極端に短縮することが分かった。これが高活性化要因になっていることがこれまでの文献から予想される。さらに、Auとの合金効果についても検討を加える。現在、論文執筆に向けてさらに検討を進める。XAFSの解析法をマスターし、さらに解析法の開発を行う。また、アークプラズマ法でPtCoナノ粒子を調製し、これをHOPG基板に蒸着して、その構造とポテンシャル依存性を偏光XAFS法により測定した。さらに解析して、その構造や電位ポテンシャルによる構造変化等を明らかにした。この成果を国際会議で発表し、論文投稿を考えている。半年間ではあるが、ほぼ研究がまとまってきたことからこう判断した。ごく微量のPtナノ粒子の局所構造をとらえ、燃料電池の機構解明や寿命延長をはかるため、湾曲結晶ラウエ型分光器(BCLA分光器)と背面入射偏光XAFS法(BI-XAFS)を開発し、HOPG (Highly oriented pyrolytic graphite)上の10^13-10^14個/cm^2という低濃度のPt構造解析に成功した。(現在投稿中)東北大学の和田山教授らとともに、アークプラズマ銃をもちいて、Pt,PtCo, PtAuナノ粒子をHOPG表面に打ち込み、これらの微粒子の構造をin-situ条件下でのこれまで開発したBCLA+BI-XAFS法で測定を行った。その結果、PtおよびPtCoのナノ粒子とそのCoの分布状態を明らかにした。これにNを打ち込むことで、耐久性が増すがその際にN周辺の構造が全体の耐久性に対して与える影響もBCLA+BI-XAFS法で検討した。さらに、Auを塗布することで、寿命が延びるが,これは表面edgeなどにAuが乗ることで、さらにPtの溶出が抑えることができるためであることが分かった。(投稿準備中)この際にXAFSからの情報だけでなく、TEM, SEM, EDXなどの情報も重ねて解析に利用するフィルターリング法を開発し、精度高い解析結果を与えることができた。特に従来法の精度を一桁上げることに成功し、新たなXAFS解析法として期待される。(投稿準備中)

現在大きさの異なるPtAuナノ粒子の構造をこの新しく開発してBCLA+BI-XAFS測定法とフィルタリング解析法で解析し、その詳細な内部構造を得る研究を展開しつつある。こうした結果を国際会議や論文にまとめ公表する。当初、予定していたPtCoのナノ粒子製作は幸い、共同研究者が見つかったので、むしろ装置開発に注力した。これまで不可能であった10^13-10^14個/cm^2低担持の測定にも成功した。低担持量のサンプルに対しても測定ができるnode、容易に粒子径を調整することができるようになった。また、Pt,PtCoの精密な粒子の内部構造を決定できるような解析法も開発した。こうした成果は国際学会や論文で順次発表を開始しており、残された期間内で計画通りの成果を上げられると考えている。(1)燃料電池における高活性化の中核を担う酸素還元触媒について、in situ条件下の偏光XAFS法の測定を展開した。とくに、HOPG基板上にArc Plasma法によりPtナノ粒子とPtナノ合金粒子を展開した。HOPG基板を用いているため、Pt量は10^15個cm^-2と微量であり、高感度なXAFS測定が必要である。そこで、BCLA+BI-XAFS法という高感度XAFS測定法を開発して、適用した。その結果Pt-Ptの結合距離を精度良く決定することができた。特にPtCoNAuナノ粒子では高活性と高耐久性を示す。XAFS測定の結果、CoNをコアとし、その周辺にPtをシェルとしたコアシェル構造で存在し、そのPt-Ptの結合距離が2.74Aと通常のPt-Ptの結合距離より短くなっていることを見いだした。また、AuはPtの表面のステップサイトに有り、白金の溶解を防いでいることがわかり、失活防止の原因を解明した。(2)このBCLA+BI-XAFS法は高感度でXAFSを測定するだけでなく、Range Extended XAFS法が通常の装置でもできるところに特徴がある。元素番号が隣同士のPtとAuが共存すると互いに干渉し、XAFSを測定することができないが、BCLA+BI-XAFS法ではそれぞれの信号を分離することができ、干渉なく測定できるRange Extended XAFSが可能であることを見いだした。これにより、PtのXAFSを精度良く測定できた。(3)さらに、超高感度を実現するために特殊な電気化学測定XAFSセルを開発し、これまで全く測定ができていない10^14個cm^-2の測定にも成功した。以上の結果は1報の論文に発表し、現在2報を投稿中である。引き続き、様々な構造やモルフォロジーを持つPtCoナノ粒子を調製する。この時に、電気化学的方法、ゾルゲル法、その他の手法を検討する。また、現在、限られた放射光施設でしか測定することができない超高感度XAFS法をより汎用的な放射光施設でも測定できるように分光結晶と測定装置の改造を行う。こうすることで、マシンタイムを容易に確保し研究を加速するとともに、本手法の世界的に利用できるようにする。またAFM, XPS,超高感度
カルネキシン/カルレティキュリンのシャペロン分子機構と細胞分化における意義の解明

カルネキシンとカルレティキュリン(CRT)はERに存在するCa2+結合性の分子シャペロンである。特にCRTはこれまでの報告から、分子シャペロン機能のみならず、遺伝子発現制御や細胞接着、細胞死などの分子機構にも関与することが明らかとなり、多機能分子としての役割が注目されている。平成14年度はCRTのCa2+代謝と細胞分化における新しい生理機能とその分子機構について、CRT遺伝子の導入を行った培養細胞系を用いた細胞分化モデルの解析を行った。カルレティキュリン高発現心筋芽細胞株を用いた細胞分化モデルの解析心筋細胞分化のモデルとして知られるラット心筋芽細胞株H9C2にマウスCRT遺伝子発現ベクターを導入し、CRT高発現細胞クローンを樹立した。これらのクローンを用いて、CRT高発現が心筋細胞分化を阻害し、細胞のアポトーシスを促進することを見いだした。CRT発現がどのような分子機構で細胞のアポトーシスを制御しているのかを解析した結果、以下のことが明らかとなった。1)CRT高発現細胞では、細胞生存シグナルであるPKB/Aktシグナルの分化条件下での抑制が観察された。2)CRT高発現細胞では、PKB/Aktを脱リン酸化するPP2Aの発現誘導が見られた。3)CRT高発現細胞では分化誘導条件下での細胞内遊離カルシウム濃度の上昇が見られた。一方、同様に細胞内遊離カルシウム濃度を上昇させるThapsigarginにより、PP2Aの転写レベルでの誘導が見られた。上記の結果から、CRT高発現細胞では細胞内カルシウム代謝が影響を受けることにより、細胞内遊離カルシウム濃度の上昇に伴うPP2A遺伝子の発現誘導が起こり、それによるPKB/Aktシグナルの抑制という分子機構によって、分化誘導条件下でアポトーシスが促進されるのではないかと考えられた。カルネキシン(CNX)とカルレティキュリン(CRT)はERに存在するCa^<2+>結合性の分子シャペロンである。CNX/CRTによるシャペロン作用や他のERシャペロンとの相互作用などについての詳しい分子機構はいまだ明らかではない。平成13年度は、CNXについて、他のERシャペロンであるGrp78/Bipとの協調機構を解析し、ERにおける糖タンパク質生合成の分子機構を明らかにした。具体的にはCNXのin vitroフォールディングアッセイ系を用いて、CNXとGrp78/Bipの協調機構の解析を行った。CNXは大腸菌で大量発現したものを精製、調整した。CNXの認識する基質は、Jack bean α-mannosidaseを用い、α-Mannosidaseを6M塩酸グアニジンで変性した後、希釈してタンパク質の凝集を誘導した。この系にCNXを添加して、その基質の凝集抑制能を測定することにより、シャペロン作用を評価した。また、同実験系に酵母由来の精製したGrp78/BipとHsp40のJドメインタンパク質を加えることにより、CNXとGrp78/Bipの協調作用を、HPLCによるゲルろ過、Dynamic Light Scattering、分子内蛍光の測定、電子顕微鏡(Negative staining)などにより解析した。解析の結果、以下のことが明かとなった。1)非糖タンパク質基質に対して、CNXとGrp78/Bipは同様のin vitroシャペロン活性を示した。2)一方、糖タンパク質基質に対して、CNXはGrp78/Bipに比べ、著しいタンパク凝集阻止活性をin vitroアッセイ系で示した。3)ATP依存性のin vitroタンパク質リフォールディングアッセイ系において、CNXとGrp78/Bipは協調的にタンパク質のリフォールディングを促進させることがわかった。
小児遷延性感染症の病原菌におけるバイオフィルム形成能の検討と新規関連遺伝子の同定

小児遷延性感染症を引き起こす病原菌の中で、下痢原性大腸菌である腸管凝集性大腸菌、中耳炎や下気道感染症のおもな原因であるインフルエンザ菌、病院感染症の原因となるMRSAに着目してバイオフィルム形成能と関連遺伝子を検討した。腸管凝集性大腸菌(EAEC)では、凝集抑制蛋自Aapの外膜排出蛋白AatAの構造・機能解析を行い、C末端の3非極性アミノ酸残基が機能発現に重要であることを明らかにした。またAatAのホモログである大腸菌異物排出ポンプTolCが、EAECの凝集・付着に関与していることを示し、病原性発現におけるTolCの新たな役割を明らかにした。さらに、病原プラスミドpAA2上のshf遺伝子が、強固なバイオフィルム形成に必要であることも明らかにした。nontypable H.inflyenzae(NTHi)臨床分離株の解析では、接着因子hifAとhia陽性株にはバイオフィルム形成株が多く、hifとhiaがバイオフィルム形成能と関連していることを明らかにした。また、反復性下気道感染症患者からの分離株は、急性患者からの分離株に比べてバイオフィルム形成株が強く、下気道感染症の遷延にバイオフィルムの関与が示唆された。MRSAの臨床分離株のバイオフィルム形成能は、感染症群が保菌群に比べて有意に高く、バイオフィルム形成能の強いMRSA株が院内感染の発症に関連していることが示唆された。バイオフィルム関連遺伝子の一つであるaccessory gene regulator(agr)型の検討では、2および3型が1型に比べてバイオフィルム形成能が強く、また2型の出現頻度は感染症群で有意に高く、agr型がバイオフィルム形成能に関連していると考えられた。本研究における病原機序の解明は、小児遷延性感染症の新たな治療法の開発に結びつく可能性を示した点で意義があったと考える。EAECの外膜表層に存在し,凝集した菌を散乱させる蛋白Aapが同定され,抗バイオフィルム因子として注目されている。我々は,このAapの分泌を促進するEAEC特異的ABCトランスポーター(Aat)と外膜排出蛋白(AatA)をクローニングしたが,AatAはその3次構造から,大腸菌の異物排出蛋白TolCのホモログと考えられる。今年度はAatAの構造・機能解析を行い,AatAのC末端1012番目の3非極性アミノ酸残基が,Aapを分泌するために重要であることを明らかにした。さらにEAECにおいてTolC遺伝子や未知遺伝子shfをノックアウトすることで,EAECバイオフィルム形成が著明に低下することを明らかにし,これら遺伝子群がバイオフィルム形成と関連していることが示唆された。NTHi108株の付着因子,線毛(hifA),付着蛋白HMW1/2,Hia, Hapとバイオフィルム形成能との関連を検討した。バイオフィルム形成能はマイクロタイタープレート法で定量化した。付着遺伝子保有頻度は,hifA 22.2%,hmw 48.1%, hia 55.6%,hap22.2%。hifAとhia陽性株には有意にバイオフィルム陽性株が多かった(p=0.025,0.036)。反復性下気道感染症患者由来株は強いバイオフィルム形成能を示した。3)MRSAのバイオフィルム形成能とagr型病院で分離されるMRSAのバイオフィルム形成能とquorum-sensing geneであるagrの遺伝子型を検討した。感染症患者由来株は保菌患者由来株に比べてagr2株が多く,有意にバイオフィルム形成能が強かった。

EAECの外膜表層に存在するdispersin(Aap)の外膜排出ポンプAatAは、大腸菌の異物排出蛋白TolCのホモログである。TolCがAatAと同様にAapを分泌するかどうか、またEAECの病原性に関与しているかを検討する目的で、tolC欠損株とaatA・tolC両欠損株、さらにそのcomplemente株を作成した。Aap分泌能は、培養上清のAapをWestern blotで検討。付着試験は、24穴ポリスチレンプレートで培養後、浮遊細胞と底部の付着菌体を回収し,OD_<600>で定量化した。Transwell assayでは,透過膜を介して欠損株と野生株を共培養し相互作用を検討した。さらに走査電子顕微鏡で変異株の形状を観察した。その結果、tolC欠損株は、直接Aap分泌に影響を与えなかったが,tolC欠損株およびaatA・tolC欠損株ともに,培養中の凝集性が明らかに低下した。付着試験では,tolC欠損株の浮遊細胞数は野生株に比べて有意に多く,付着菌数は有意に少なかった。Complement株の凝集付着性は,野生株と同程度に回復した。Transwell assayでは,tolC欠損株の付着能低下が野生株との共培養で回復した。走査電顕では、変異株において線毛による菌の凝集の程度が低下していた。TolCはEAECの凝集付着を促進し,可溶性の凝集付着因子を外膜外へ排出し、線毛機能を修飾している可能性がある。TolCが凝集付着に関与するという報告はこれまでなく,EAECの病原性に関与する新たなTolCの役割が明らかになったと考えられる。腸管凝集性大腸菌042の病原プラスミド上のshf遺伝子の機能解析腸管凝集性大腸菌(enteroaggregative Escherichia coli,EAEC)は、持続感染に関与する厚いバイオフィルム形成を特徴とする。その病原プラスミド上の遺伝子群、shf,capU,virK(cap locus)の遺伝子ノックアウトを行い、機能解析を行った。マイクロタイタープレートアッセイとバイオフィルム形成能は、0.45%グルコース添加DMEMと24穴ポリスチレンプレートを用い、吸光度OD_<600>で定量化した。マイクロタイタープレートアッセイにおいて、沈降付着した菌体数は042野生株、shf,capU,virK欠損株ともに全て同程度であった。しかし、バイオフィルム形成能については、sbf欠損株(OD_<600>:0.230±0.007)が、042野生株(0.564±0.022)に比べて著明に低下していた。一方、capU欠損株、virK欠損株のバイオフィルム形成能は、042野生株と同等であった。shf遺伝子のコンプリメント株は、042野生株と同程度までバイオフィルム形成能を回復した。shf遺伝子の転写は、野生株に比べて転写因子aggR欠損株で著明に抑制された。一方、aggRコンプリメント株では、aggRの転写増強条件で、shf遺伝子の発現が明らかに増強した。以上の結果より、shf遺伝子がEAEC042株のバイオフィルム形成に重要であることが明らかになった。また、shf遺伝子がAggRに正に制御され、AggR regulonのひとつであることが明らかになった。
思春期における腸内細菌叢と抑うつ-周産期要因の影響-

本研究は、一般思春期児童における腸内細菌叢と抑うつ症状を調査し、帝王切開や母乳栄養などの周産期要因が腸内細菌叢を介して思春期児童の抑うつに影響を与えるという仮説を検証することが目的であった。一般思春期児童の糞便検体から腸内細菌叢を同定するための調査として、来所型調査を立ち上げ、一般思春期児童を研究施設に招いて糞便検体を持参してもらう形で、糞便検体を収集した。自宅で思春期児童が簡便に糞便を採取し保管・持参してもらうことを可能にするため、糞便採取キットの選定を行いった。ヒト糞便検体から正確な腸内細菌叢測定を行える解析業者を選定し、同社に依頼して検体解析を行った。また、主養育者に自記式質問紙(Child Behavior Checklist)を回答してもらう形式で、思春期児童の抑うつ症状を評価した。その結果、314名の思春期児童について腸内細菌叢を同定することができた。帝王切開の有無と思春期児童の腸内細菌叢の間には有意な関係がみられなかった。また、同集団において、母乳栄養期間は抑うつ症状と有意な関係を示さなかった。したがって、以降の解析に帝王切開の有無と母乳栄養期間は含めなかった。解析の結果、特定の腸内細菌叢の比率が高いことが、思春期児童の抑うつ症状の強さと関係していた。この関係は、性別、月齢などを調整しても有意であった。本研究は、一般思春期児童における腸内細菌叢と抑うつ症状を調査し、帝王切開や母乳栄養などの周産期要因が腸内細菌叢を介して思春期児童の抑うつに影響を与えるという仮説を検証することが目的である。平成28年度は3年計画の初年度にあたり、同年度の目標は、調査バッテリを構築して調査手法を確立し、少数名を対象としたプレ調査を行うことであった。自宅で思春期児童が簡便に糞便を採取し保管・持参してもらうことを可能にするため、糞便採取キットの選定を行った。また、ヒト糞便検体から正確な腸内細菌叢測定を行える解析業者を選定した。匿名での検体収集を可能にするため、IDシールを利用した調査キットを作成した。思春期児童が自分で検体採取を行えるよう、児童でも理解できるよう検体採取の手順を示した手順書を作成した。また、糞便採取時の児童の状況を調査するため、質問紙を作成した。評価項目には、糞便採取日時、糞便採取日の体温、糞便の性状、便秘の有無、下痢の有無、排便の頻度、使用中の薬剤・サプリメントなどを含めた。また、来所時には自記式質問紙を用いて児童の抑うつ症状等を評価した。プレ調査として、一般思春期児童を来所型調査にリクルートし、10名の児童から無事に糞便検体を回収した。計画した通りの保管、輸送等の手順を経て専門解析業者に配送し、回収した検体から腸内細菌叢の解析を行えることを確認した。当初の計画通り、調査バッテリの構築およびプレ調査の施行を終えることができた。平成29年度は3年計画の2年目にあたり、同年度の目標は、昨年度に確立した調査バッテリを用いて、100名程度を対象とした調査を行うことであった。一般思春期児童の糞便検体から腸内細菌叢を同定するための調査として、来所型調査を行った。一般思春期児童および主養育者に研究協力を依頼し、主養育者から同意を取得し、研究を進めた。自宅において児童が糞便採取キットを用いて糞便検体を採取し、それを研究施設に持参してもらった。糞便採取日時、糞便採取日の体温、糞便の性状、便秘の有無、下痢の有無、排便の頻度、使用中の薬剤・サプリメントなどの情報について、質問紙を用いて収集した。回収した糞便検体を専門解析業者に配送し、95検体の腸内細菌検体を解析した。当初の計画通り、約100名の児童を対象に腸内細菌の調査を終えることができた。

その結果、314名の思春期児童について腸内細菌叢を同定することができた。帝王切開の有無と思春期児童の腸内細菌叢の間には有意な関係がみられなかった。また、同集団において、母乳栄養期間は抑うつ症状と有意な関係を示さなかった。したがって、以降の解析に帝王切開の有無と母乳栄養期間は含めなかった。解析の結果、特定の腸内細菌叢の比率が高いことが、思春期児童の抑うつ症状の強さと関係していた。この関係は、性別、月齢などを調整しても有意であった。平成29年度は、平成28年度に行ったプレ調査を参考に、同様の手順で本調査を行う。計100名程度の思春期児童を来所型調査に招き、糞便検体の回収、腸内細菌叢の解析を進める。平成30年度は、平成29年度と同様の手順で調査を進め、さらに思春期児童の腸内細菌データ収集を進める。さらに、質問紙情報等を統合したデータセットを作成し、解析を進める。腸内細菌叢解析費用が予定よりも高額となった一方、謝金の支出を抑えることができ、結果として差額が生じた。平成29年度に行う約100名程度の思春期児童を対象とした来所型調査の本調査における腸内細菌叢解析費用に充てる予定である。