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NOカチオンを触媒として活用する有機合成反応の開発研究

NOカチオンは、有機合成反応おいてはこれまでに化学量論量の反応剤として用いられることがあっても、触媒種としての利用は極めて限られている化学種である。これらは金属を含まない非金属無機化合物であり、この化学種を有効な触媒種として活用することができれば、有害な廃棄物を伴わない活性触媒となることが期待でき、既存の金属触媒や有機触媒に取って代わるものになると考えられる。本年度の研究では、このNOカチオンを触媒として用いる、3-ピラゾリジノンとアルブヒドから調製されるアゾメチンイミンとオレフィンとの[3+2]付加環化反応の検討を重点的に行った。この[3+2]付加環化反応は、置換ピラゾリジン環を簡便に合成できる有効な手法であるが、これまでに電子求引性基を有するオレフィンが主に用いられている一方で、ビニルエーテル等の電子供与性置換基を有するオレフィンとの反応はこれまでに報告が無かった。そこで、このアゾメチンイミンとビニルエーテルとの反応の検討を行ったところ、1mol%のNOカチオン存在下目的の反応が円滑に進行し、高収率、高選択的に目的とする置換ピラゾリジン環化合物を基質一般性良く得ることができた。さらに、得られた生成物の変換反応の検討を行ったところ、この生成物のN,O-アセタール部位にルイス酸を作用させることによって、各種炭素求核剤を反応させ、新たな炭素骨格を導入することができた。また、この生成物のピラゾリジン環の窒素-窒素結合を還元的に切断することにより、大環状ジアミンへと導くことができた。さらにNOカチオンを触媒とするマンニッヒ型反応やアルドール反応、マイケル反応についても検討を行い、何れも良好な収率にて目的物を得ることができた。本研究結果はNOカチオンの触媒としての高い有用性を示す物であり、今後の環境に優しい有機合成の実現に大きく貢献すると考えている。合成反応を効率的に促進する化学触媒の開発は、有機合成化学上重要な研究課題の一つである。本研究では、NOカチオンを触媒として用いる様々な効率的有機合成反応の開発を目的として検討を行った。NOカチオン分子は、有機合成反応においては化学量論量の反応剤として用いられることがあっても、触媒種としての利用は極めて限られている。本年度の研究では、ニトロンとオレフィンとの[3+2]付加環化反応の検討を重点的に行った。ニトロンとオレフィンとの[3+2]付加環化反応は、置換イソオキサゾリジン環を簡便に合成できる有効な手法である。特に電子供与性置換基を有するオレフィンとの反応はこれまで金属Lewis酸触媒を用いて行われる例が殆どであり、他の触媒を用いた例は報告が少ない。そこでNOカチオンとしてNOPF_6を触媒量用いてニトロンとビニルエーテルとの[3+2]付加環化反応の検討を行ったところ、目的とするイソオキサゾリジン誘導体が高い収率で得られることが分かった。触媒量の低減化の検討を行ったところ、基質に対して0.001当量のNOカチオンを用いた時にも高い収率で目的物が得られた。また、様々な置換基を有するニトロンを用いた時にも高い収率をもって反応が進行進することを明らかにした。一方で、3-ピラゾリジノンとアルデヒドから調整されるアゾメチンイミンとビニルエーテルとの[3+2]付加環化反応が、ニトロンの時と同様にNOカオチンによって効率的に触媒され得ることを見いだした。この反応はピラゾリジン環を効率的に構築する有用な反応の一つであり、興味深いものである。

さらにNOカチオンを触媒とするマンニッヒ型反応やアルドール反応、マイケル反応についても検討を行い、何れも良好な収率にて目的物を得ることができた。本研究結果はNOカチオンの触媒としての高い有用性を示す物であり、今後の環境に優しい有機合成の実現に大きく貢献すると考えている。
ランダム行列理論を応用したレートレス符号化変調方式の創出

現在の無線通信では、通信路の環境に応じて符号化や変調方式を切り替える適応変調によって、伝送レートの調節を行っている。しかし、適応変調には、(i)符号化や変調方式の切り替え基準の設計は容易でない、(ii)切り替え失敗時に伝送レートの損失が大きい、という欠点がある。これらの適応変調の欠点を克服するレートレス伝送方式として、スパース重ね合わせ符号の研究を行った。スパース重ね合わせ符号では、辞書行列の設計が重要となる。現状で提案されている辞書行列は、辞書を独立なガウス乱数を使って構成するため、情報理論的な性能は優れているものの、辞書をメモリ上に保存することさえ困難で、実装は到底不可能であるという問題点がある。そのため、ランダムな辞書の構成と比較して性能劣化を最小限に抑制した上で、実装に適した代数構造を辞書に導入する必要がある。本年度は、スパース重ね合わせ符号の辞書行列として、標準ガウス行列、ハール直交行列、アダマール変換にランダムな置換を施した行列の三つを検討した。最初の二つがランダムな構成に対応し、最後の辞書行列は実装に適した代数構造を有する。近似的メッセージ伝播法(AMP)及び期待値伝播法(EP)に基づく反復推定法の性能評価を行った結果、AMPは標準ガウス行列を使用した場合のみ収束するという当初の予想に反して、いずれの行列を使用した場合にもAMPはEPとほぼ同等な性能を達成できることを数値実験により確認した。当初の想定よりも進捗がやや遅れた原因として、標準ガウス行列の場合以外にも、AMPはEPとほぼ同等な性能を達成できるという予想外の結果が得られた点が挙げられる。そのため、当初の計画ではAMPに見切りをつけてEPに研究を進める予定であったが、AMPをより深く研究する必要性が生じた。ただし、EPよりもAMPの方がレートレス化に適した復号法であるため、当初はEPに対して実施する予定であった内容をAMPに置き換えて実施することで、スパース重ね合わせ符号によるレートレス符号化変調方式を構築するという最終目的の達成には、大きな影響を与えないものと考えられる。EPに注目して研究を進めていく当初の方針を変更して、AMPに注目して研究を進める。特に、AMPの収束性に関する深い理解を得ることを目指す。現時点では、標準ガウス行列を使用した場合にAMPの収束性が保証されるという十分条件のみが知られている。平成30年度に得られた数値実験の結果からすると、これよりも緩い条件の下でもAMPの収束性を理論的に保障できる可能性がある。そこで、辞書行列をハール直交不変な行列に拡張してAMPの収束性の解析を行うことを目指す。ハール直交不変な行列は標準ガウス行列を含むより広いクラスの行列を表現できるという利点がある。
有病高齢者の嚥下を誘発する咽頭電気刺激条件の解明

嚥下誘発に関する動物実験の結果に基づき,摂食嚥下障害者(上手く食べられない,飲み込めない者)に対して安全に訓練を行う方法を開発するため,咽頭への微小電気刺激(pharyngeal electrical microstimulation: PEMS)が嚥下誘発するか,また加齢変化が影響するか検討した。健常若年成人と高齢者を対象とし,PEMSを実施した。飲み込みたくなった刺激強度を嚥下閾値(Dsw-Th)と定義した。その結果,高齢者群は若年群と比較してDsw-Thが有意に上昇した。人において若年者と高齢者はともにPEMSで嚥下誘発が可能であるが,加齢変化が刺激条件に影響を与えることが示された。健康成人、健康高齢者および有病高齢者の嚥下誘発に関わる咽頭領域の有効刺激条件を解析することを目的とした。中咽頭後壁を様々なパラメータの方形パルスで(刺激頻度: 10, 15, 20 Hz,刺激強度: 0.2-2.5 mA)電気刺激し、嚥下反射が誘発されるか検討した。刺激を感知した刺激強度を知覚閾値(Pe-Th)、飲み込みたくなった刺激強度を嚥下閾値(Dsw-Th)、痛みを感じた刺激強度を痛覚閾値(Pa-Th)と定義し、まず健康成人の性差ごとに刺激強度を解析した。その結果、Pe-Th、Dsw-ThおよびPa-Thはいずれも男女間で有意差はなく、飲み込みたくなる咽頭刺激条件は性差の影響をうけないことが示された。次に加齢による影響を検討したところ、以下の知見を得た。1Pe-Thは、加齢の影響を受けずに全ての者で認識された。2Dsw-Thは、若年者;10-15Hz、高齢者;15-20Hzで最も多く認識された。3Pa-Thは、20Hzでは若年者;100%,高齢者;30%が痛みを感じた。415Hzにおいて、高齢者は若年者と比較して、Dsw-Thが有意に高くなった。即ち高齢者においても嚥下誘発は可能であり、加齢により咽頭感覚閾値は高くなることが示された。一方、脳血管障害由来の仮性球麻痺患者の嚥下誘発に関わる咽頭領域の有効刺激条件は一定ではないことが推察される。Pe-Th、Dsw-Th、Pa-Thともに被験者によるばらつきを認めるため、さらに被験者を増やし基礎的データを取得する必要があると考える。経管栄養管理されている者の嚥下頻度は,健常者と比較して有意に低下し,唾液誤嚥などのリスクが高まると報告されている。そこで,日常的な随意嚥下の回数を増やす訓練は,唾液誤嚥のリスクを低減させる効果があると仮説を立てた。先行研究では,若年健常者(男性・女性),高齢健常者を対象とし,中咽頭後壁をさまざまなパラメータの方形パルス(刺激頻度10-20Hz,刺激強度0.2-2,5mA)で刺激したときの嚥下動態を観察した。刺激を感知する刺激強度を知覚閾値(Pe-Th),飲み込みたくなった刺激強度を嚥下閾値(DSw-Th),痛みを感じた刺激強度を痛覚閾値(Pa-Th)と定義し,性差,年齢によって相違があるか解析した。その結果,若年健常者では,周波数10-15Hz,刺激強度1.1-1.3mAで嚥下が誘発されやすいという結果を得た。またPe-Th,DSw-Th,Pa-Thはいずれも男女間で有意差はなく,嚥下誘発条件は性差の影響を受けないことが示された。次に加齢の影響を検討したところ,高齢健常者では周波数15Hz,刺激強度1.5-2.0mAで嚥下が誘発されやすいことが明らかとなった。高齢者の咽頭領域への微小電気刺激により,嚥下誘発が可能であるがDSw-Thは有意に高くなったため,加齢により嚥下誘発閾値は高くなることが示された。一方,有病高齢者の嚥下誘発に関わる咽頭領域の有効刺激条件の解析は,摂食嚥下障害に対する訓練法としての基礎的なデータとなることが期待される。急性期病院に入院中の患者を対象に健常者と同様の咽頭刺激を施行した場合,刺激を感知できる者にばらつきを認めた。Pe-Th,DSw-Th,Pa-Thはいずれも検知困難であり,刺激条件の再考を要した。有病者の場合,健常者と比較して試験に対する耐久性が低下しているため,試験時間を短縮するために刺激方法,条件を工夫する必要がある。今後さらに被験者を増やすため,被験者の選定条件,刺激方法を改良して検討を継続する。

人において若年者と高齢者はともにPEMSで嚥下誘発が可能であるが,加齢変化が刺激条件に影響を与えることが示された。嚥下誘発システム(咽頭刺激装置)や咽頭領域を描出する超音波診断装置(Toshiba社製、Powervision6000)などの研究環境に問題はないが、対象となる被験者の募集人数が計画よりも若干不足している状況である。また、飲み込みたくなる咽頭刺激条件は、健康成人では性差の影響をうけない、健康高齢者では感覚閾値が高くなるという過去の研究データに基づき、有病高齢者においても刺激条件を設定している。本研究では、設定した刺激条件で嚥下が誘発されない場合は、即時に咽頭刺激を中断し他のリハビリテーションに切り替えている。そのため、すべての被験者からデータを取得できない状況であり、解析に要するデータ収集がまだ十分でないと考える。医歯薬学脳血管疾患後遺症患者の病態は画一的でなく複雑であるため,全身的にまったく同じ状態の被験者を確保することは困難である。よって、本研究の被験者の選定条件を一部変更する。被験者は、脳血管障害発症からの期間・全身状態の安定度・誤嚥性肺炎の既往などを聴取し、同様の経過をたどった者とし、他疾患との重複、服薬状況が明らかに異なる者は除くとしていた。しかしながら、除外基準を一部緩和し、他疾患との重複については、他疾患により明らかな全身状態の変調をきたしている場合を除いては、疾患を別に有している場合でも被験者として含むこととする。さらにその選定条件で,脳血管障害由来の仮性球麻痺および球麻痺患者を募集することができれば,それらを2群に分け,それぞれの刺激条件を比較して解析する予定である。当該年度の国際学会参加を2学会予定していたが、研究の進捗やデータ解析の状況などから総合的に判断し、1学会のみの参加とした。そのため、国際学会参加のために計上していた旅費に差額が発生し、次年度使用額が生じた。次年度は、今年度と比較しより多くの研究被験者を募る予定である。今回生じた次年度使用額は、人件費および謝金に加えて計上し、使用する予定である。
中枢神経機能解析のためのニューロン電位活動の光学的多チャンネル三次元計測法の開発

神経電位活動の光学的測定法は、中枢神経系のシステムレベルでの“機能"や“機能構築"の研究で新しい強力な実験手段とストラテジーとなってきている。ところが、この方法は、二次元計測に限られ、「三次元計測」が出来ないことが一つの大きな難点となており、それを克服するための新しい方法の開発が緊急性を要する重要問題になっていた。このような状況を背景にして、本研究は、「中枢神経系におけるニューロン活動を光学的シグナルとして三次元的に計測する方法を開発し、確立する」ことを目的として行われた。この研究を推進するに当たっては、これまでわれわれのグループで開発してきた「ニューロン電位活動の光学的多チャンネル二次元計測システム」をベースにして、「三次元計測法」をハードとソフトの両側面から検討し、その開発とその適用についての研究を進めた。(1)光学切片法の基本的手法の開発:原理的には光学顕微鏡による三次元画像法に準じる方法で、「形態画像の鮮明度」を「光学的シグナル」に置き換えて処理する。対象標本を光照軸(Z軸)に沿って移動させて焦点面をずらしながら光学切片を作る。各々の切片(焦点面)から光学シグナルを多エレメントフォトダイオードを用いて同時記録し、フォトダイオードに対応する二次元平面(x,y)とZ軸方向に沿って得られるシグナル系列をもとにして、ニューロン活動領域の三次元像を求める手法を開発した。これを主として脳幹に適用し、舌咽神経核、迷走神経核、三叉神経脊髄路核などに対応するニューロン活動領域の三次元像を再構成する方法を導いた。(2)共焦点レーザ走査蛍光顕微鏡を用いる方法:共焦点光学系では合焦点位置と光学的に共役な位置(共焦点面)にピンホールを置き、焦点面を移動させて、厚みのある組織標本を光学的にスライスすることにより、複数の焦点面からシグナル系列が得られる。この方法により、特に脳皮質の層構造に対応するニューロン活動の三次元像を再構成する方法の開発を手がけたが、まだ未完成であり、今後も続けて検討することになった。ニューロン電位活動の光学的多チャネル三次元計測法の開発のため、本年度は、特に、光学顕微鏡を用いた光学切片法に重点を置き研究を進めた。動物実験として、厚さ約1.5mmの鶏胚脳幹スライス標本をメロシアニン・ロ-ダニン系膜電位感受性色素NK2761で染色し、迷走神経および舌咽神経の電気刺激により誘発される脳幹内のニューロン活動を、光学的(吸光)シグナルとして最高1020ヶ所から同時記録をおこなった。光学系の焦点面を頭尾方向に200μmステップで移動させながらおこった一連の測定の結果をもとに、活動電位に由来するスパイク状のfast signalsとシナプス後電位に由来する時間経過の遅いslow signalsの空間的分布のマッピングをおこなった結果、焦点面の位置により、シグナルの空間分布のパターンは大きく変化することが明らかとなった。さらに、このパターンの変化を解析した結果、この変化は、脳幹内における両脳神経の運動性および知覚性の神経核の三次元的機能局在を反映していることが明らかとなった。上の結果は、同時に、光学顕微鏡を用いた光学切片法によるニューロン活動の3次元計測法の、中枢神経系の三次元的機能構築の解析における有効性を示している。この結果をもとに、現在、より精密な三次元解析をおこなうための理論的解析やデータ処理のアルゴリズムの確立とそれを実行するコンピュータソフトウエアの開発、および測定システムのハードウエアの改良を続けている。

ニューロン電位活動の光学的多チャネル三次元計測法の開発のため、本年度は、昨年度に引き続き、光学顕微鏡を用いた光学的切片法の改良に重点を置き、研究を進めた。実験動物として、孵卵69日の鶏胚を用いた。鶏胚から舌咽神経、迷走神経をつけたまま脳幹を切り出し、これらの脳神経をはさむような厚さ約1500μmのスライス標本を作製した。この標本をメロシアニン・ロ-ダニン系の膜電位感受性色素(NK2761)で染色し、顕微鏡のステージを上下させて色々な面に焦点を合わせ(光学的切片法)、各焦点面上で舌咽神経あるいは迷走神経刺激によって誘発される光学的シグナルを測定した。舌咽神経刺激によって誘発される光学的シグナルの大きさや出現領域は焦点面の深さによって変化し、それぞれ異なった深度にピークが存在することが明らかになった。また、迷走神経を刺激した場合にも同様の傾向が見られた。さらに、同一標本上で舌咽神経及び迷走神経を別々に刺激して光学的切片法によって得られたデータをもとに、機能的な意味での舌咽神経核、迷走神経背側運動核、孤束核の分布パターンの三次元的再構成を行った。その結果、発生初期の段階から、これらの神経核はそれぞれ異なった場所を中心として分布し、一部に重なった領域が存在することが明らかになった。また、舌咽神経と迷走神経の両方が投射する孤束核内においても、これらの投射領域は、この発生段階ですでに明確に区別されていることが示された。以上により、膜電位の光学的三次元計測法の1つの方法として、光学的切片法との組み合わせが有用であることを明らかにした。但し、この方法では、光学系の特性や光散乱などによるぼけの混入が避けられず、さらに良好な三次元像を得るために、真のシグナルサイズを求めるアルゴリズムを開発し、それを実行するためのプログラミングを行なう必要性が指摘された。ニューロン電位活動の光学的多チャネル三次現計測の性能向上化を行うとともに、前年度に引き続き、これまで開発してきた光学的切片法の改良とその適用について、研究を進めた。(1)実験動物として、先ず、孵卵69日の鶏胚を用いた。鷄胚から舌咽神経、迷走神経をつけたまま脳幹を摘出し、これらの脳神経をはさむような厚さ約1500μmのスライス標本を作製した。この標本をメロシアニン・ロ-ダニン系の膜電位感受性色素(NK2761)で染色し、顕微鏡のステージに固定し、これをステージととも上下させて色々な面に焦点を合わせ(光学的切片法)、各焦点面上で下咽神経あるいは迷走神経刺激によって誘発される光学的シグナルを多領域から同時記録した。(舌咽神経刺激や迷走神経刺激によって誘発される光学的シグナルの大きさや出現領域は焦点面の深さによって変化する。)このような測定をもとにして、舌咽神経核、迷走神経背側運動核、孤束核におけるニューロン活動パターンの三次元的再構成を行った。(2)同様の方法をさらに鶏胚の脊髄、ラット胚脳幹、成体ラット海馬のスライス標本に適用し、その方法を確立した。以上により、ニューロン活動の光学的多チャネル計測法と光学的切片法とを組合せることによって、電位活動の光学的三次元計測法を開発し、その適用を確立することができた。
腸管上皮に発現する新奇カプサイシン受容体の栄養科学的活用

トウガラシの辛み成分であるカプサイシンは、ヒト大腸癌由来の培養上皮細胞であるCaco-2細胞に作用し、そのタイトジャンクションを一時的に開放する作用を持つ。タイトジャンクションは、細胞間隙からの物質の透過吸収を制御しているため、腸管からの栄養吸収の制御剤としてカプサイシンを利用することが可能である。しかし、このカプサイシンによるタイトジャンクション開放のメカニズムは全くわかっていない。そこで、本研究では、Caco-2細胞に発現しているカプサイシン受容体をタイトジャンクション開放の開始点と考え、その構造機能解析とアッセイ系への活用を目的としている。今年度は、昨年度に引き続き、カプサイシン受容体のN末端細胞質領域にターゲットを絞り、その大量発現と精製を行い、核磁気共鳴(NMR)解析や結晶化などの構造解析を進めた。また、このN末端細胞質領域に含まれるアンキリンリピートドメインを固定化した樹脂を作製し、このドメインと相互作用するタンパク質や低分子化合物の単離・同定を検討している。一方、昨年度に引き続き、カプサイシン処理→カルシウムの流入→コフィリンの脱リン酸化→タイトジャンクションの開放という分子機構をより詳細に理解すべく、コフィリンのトランスフェクタントを用いた生理学的解析を行った。その結果、カプサイシン処理によってコフィリンの脱リン酸化が引き起こされ、更にタイトジャンクションタンパク質の分布やFアクチンの構造が変化することでタイトジャンクションが開放されることが明らかとなった。トウガラシの辛み成分であるカプサイシンは、中枢神経を刺激することで血行を良くしたり、消化酵素の活性を上げて脂肪や糖の消化を促進するなどの生理活性を持つ。また、最近、ヒト大腸癌由来の培養上皮細胞であるCaco-2細胞に作用し、そのタイトジャンクションを一時的に開放する作用を持つことが明らかにされた。タイトジャンクションは細胞間隙からの物質の透過吸収を制御しているため、腸管からの栄養吸収の制御剤としてカプサイシンを利用することが可能である。そこで、今年度は、タイトジャンクション開放の開始点と考えられるカプサイシン受容体の全長、またN末端およびC末端細胞質領域の大腸菌による発現系を構築したが、機能解析や構造解析に充分な量のタンパク質発現を得るには至らなかった。現在、発現系の再検討を行っている。また、Caco-2細胞のプロテオミクス解析を行い、タイトジャンクションの開放に関わる分子の同定を試みた。その結果、コフィリンと呼ばれるタンパク質の脱リン酸化がカプサイシン処理によって引き起こされることが明らかになった。更に、カプサイシン処理によりカルシウムの流入が誘起されるが、カルシウムキレート剤であるEGTAによってコフィリンの脱リン酸化が抑制されること、また、コフィリンの脱リン酸化とタイトジャンクションの開放に相関があることを見い出した。これらの結果は、カプサイシン処理→カルシウムの流入→コフィリンの脱リン酸化→タイトジャンクションの開放という流れがあることを示唆しており、カプサイシンによるタイトジャンクション開放の分子機構を理解する上で重要な知見である。タイトジャンクションに、細胞間隙からの物質の透過吸収を制御しているため、腸管からの栄養吸収の制御剤としてカプサイシンを利用することが可能である。今年度は、カプサイシン受容体のN末端細胞質領域にターゲットを絞り、その大腸菌による発現系の構築を種々検討した。その結果、可溶化したタンパク質を大量発現することに成功したが、構造解析が可能なデータはまだ得られていない。現在、効率良い精製と構造解析の条件検討を行っている。このN末端細胞質領域には、タンパク質間相互作用に関与するアンキリンリピートドメインが存在しているため、カプサイシン受容体の下流に存在するシグナル伝達タンパク質の同定も可能ではないかと考え、その検討も進めている。一方、昨年度に引き続き、カプサイシン処理→カルシウムの流入→コフィリンの脱リン酸化→タイトジャンクションの開放という分子機構をより詳細に解明すべく、その生化学的解析を行った。

その結果、カプサイシン処理によってコフィリンの脱リン酸化が引き起こされ、更にタイトジャンクションタンパク質の分布やFアクチンの構造が変化することでタイトジャンクションが開放されることが明らかとなった。
陸域生態系における放射性物質の循環過程の理解

森林と里山の生態系において、土壌、植物(樹木・草本)、哺乳類、昆虫、土壌微生物を主たる構成要素として、これらの要素間および要素内での放射性物質の動態の定量的把握とそのメカニズムの解明を行った。特に、落葉広葉樹林において地表の菌類が放射性Csを上方輸送してリター層に移行させることを明らかにした。また、ポプラなどのモデル植物を用いて放射性セシウムの挙動制御機構の解析を行った。生態系におけるさまざまな分析結果をもとに、各構成要素中の濃度を面積あたりの沈着量に対する比で表した面移行係数(Tag)を求め、系内での放射性セシウムの動態を図式化し、将来予測をおこなった。本研究では陸域生態系の中でも森林と里山の生態系に焦点を絞り、土壌、植物、昆虫、土壌生物を主たる構成要素として、これらの要素間および要素内での放射性Cs動態の定量的把握とそのメカニズムの解明を目的としている。土壌から樹木への経根吸収による移動については、スギ植栽実験で品種によって吸収能力が異なることが明らかになった。また、スギの葉における移行においては、転流を示すデータが得られており、表面吸収あるいは経根吸収された放射性Csが枝に滞留する可能性が示唆された。昆虫への移行については、ジョロウグモの観測により、クモ中の放射性Cs濃度は、周囲の放射線線量と関係あり、クモの体サイズとの関係は認められなかった。事故後の放射性Csのリター-Ao層-A層への移行については、高濃度汚染地のほうが顕著であり、リター中の濃度はかなり減少していることが明らかとなった。一方、土壌からリター層への移行については、広葉樹ウッドチップを用いた実験で、6か月で土壌表面の放射性Csの約6%をウッドチップに回収でき、微生物の働きによる土壌からリター層への動きが確認された。また、リターの分解過程における放射性Csの化学形態の変化について検討した結果、存在する放射性Cs全量に比べて、リターの分解に伴う放射性Csの植物可給態化は大きく影響しないこと、再吸収率は2030%であり、残りは土壌に捕捉されるか循環系外に逸脱している可能性が明らかとなった。植物における放射性Csのる吸収・輸送メカニズム解明の分子生物学的アプローチでは、疑似年間サイクル環境下でのポプラSKOR候補遺伝子(K輸送に関わる)の発現解析において、秋から冬にかけて発現量が増える傾向が認められ、K輸送の季節変化が遺伝子レベルで解析でき、セシウム輸送との関連性が示唆された。本研究では陸域生態系の中でも森林と里山の生態系(森林-農地)に焦点を絞り、土壌、植物(樹木・草本)、哺乳類、昆虫、土壌生物(土壌動物・微生物)を主たる構成要素として、これらの要素間および要素内での放射性物質の動態の定量的把握とそのメカニズムの解明を目的とする。対象とする森林は、福島県において占有面積の多いコナラを主体とする広葉樹林とスギ林とする。調査地は、放射性セシウムの沈着量のレベルの異なる3箇所を対象としている。2012年に植栽したスギ・コナラ苗木の葉中放射性セシウム濃度から、経根吸収が行われていることは明らかとなった。また、スギにおいて系統間による違いが確認された。スギとコナラにおいて、安定セシウムの表面塗布実験により、葉面だけでなく樹皮からも吸収されることを確認し、樹皮吸収されたセシウムは速やかに葉まで輸送されることが明らかとなった。また、森林リター中の植物可給態の放射性セシウムの層別分布では、落葉層の植物可給態がA0層に移行するとA0層の全量の0.1%程度が付加されることになった。放射性セシウム沈着量が多く、空間線量の高い地域で採集したジョロウグモほど放射性セシウム濃度が高く、食物連鎖を通じての放射性物質の移行がみられることが明らかとなった。シカにおける放射性セシウムの分布では、糞に多く含まれていることが明らかとなった。リターバッグ実験では、分解が進行するにつれて放射性セシウム濃度が10倍程度になることを発見した。イネを用いた現地調査からは同一の試験地で栽培しても品種間の差が大きく、セシウムの取り込みが遺伝的に制御されており、将来的にはセシウム低吸収イネの作出が可能であることが明らかとなった。草本植物ではマメ科のモデル植物であるミヤコグサを対象とし、木本植物では被災地で広く栽培されているスギ、さらにはゲノムが決定済みであるポプラについて解析を進めている。本研究では陸域生態系の中でも森林と里山の生態系(森林-農地)に焦点を絞り、土壌、植物(樹木・草本)、哺乳類、昆虫、土壌生物(土壌動物・微生物)を主たる構成要素として、これらの要素間および要素内での放射性物質の動態の定量的把握とそのメカニズムの解明を目的としている。対象とする森林は、コナラを主体とする広葉樹林とスギ林とする。樹木における放射性セシウムの吸収と移行については、スギ・コナラ苗木において経根吸収が行われていることは明らかとした。スギでは系統間による違いが確認された。スギとコナラにおいて、葉面だけでなく樹皮からも吸収されることを確認した。リターを介しての移行については、森林リター中の植物可給態放射性セシウムがA0層に移行するとA0層の全量の0.1%程度が付加されることが算出された。

動物・昆虫を介しての放射性セシウムの移行については、食物連鎖を通じての放射性物質の移行がみられることが明らかとなった。シカにおける放射性セシウムの分布は、糞に多く含まれていることが明らかとなった。また、土壌生物による放射性セシウムの移行においては、リターバッグ実験の結果、分解が進行するにつれて放射性セシウム濃度が増加することを見出し、カビバイオマスとの関連性を確認した。農地における放射性セシウムの移行では、イネでは品種間の差が大きく、セシウムの取り込みが遺伝的に制御されていることが明らかとなった。また玄米中に含まれる放射性セシウム量はカリウムと窒素の施肥法によって制御できることを見出した。モデル植物であるミヤコグサを用いた研究では、セシウム吸収に関わる遺伝子のQTL解析から、現在までに3つの候補領域を得ており、その中にはカリウムの輸送体などセシウム輸送への関与が期待される遺伝子が複数含まれていることをみいだした。本研究では、陸域生態系の中でも森林と里山の生態系に焦点を絞り、樹木、土壌、土壌生物、哺乳類、昆虫を主たる構成要素として、これらの要素間および要素内での放射性物質の動態の定量的把握とそのメカニズムの解明を目的としている。昨年度までいくつかのサイトを対象に行ってきた各パーツに関する研究を、異なる植生が隣接する同じサイト(福島県川俣町世戸八山)で試料採取を行うことにより、全体のモデル構築・検証のためにデータの集積を続けている。各移行過程の研究成果としては、まず樹皮からのセシウム吸収過程について、スギ・アカマツ・コナラでその違いを確認した。その結果、スギがもっとも樹皮吸収しやすいことが明らかとなった。またスギ木部にはいったセシウムは、時間経過とともに心材に移行していく傾向が示された。根からの吸収においては、コシアブラで菌根菌の関与を示す結果が得られている。リターとしての地面への供給は、コナラやブナでは季節変動があり、外的要因(大気からの付着等)が原因のひとつとして考えられた。また落葉中の放射性セシウムの化学形態としては、落葉広葉樹の葉のほうが可給態の割合いが高いことが明らかとなった。地表面のリター層/鉱質土壌層の間では、主に糸状菌の菌糸による吸収・移行があり、そのメカニズムを利用した土壌からの放射性セシウム除染の試行では、チップを土壌表面に敷設することにより、2年で6-18%の放射性セシウムをチップに移行させることができた。また、落ち葉かきによる除染が行われた地点でのモニタリングでは、除染効果は4-5ヶ月後には消失しており、むしろ空間線量が上がっていることも見出された。このことから、森林における落ち葉かきという除染方法の有効性は否定された。ForestLandモデルの日本版の作成を進めており、最終年度にはある程度の予測精度でのモデルが構築できる予定である。研究計画において示していた最終目標である放射性セシウムの森林生態系におけるモデル化が順調に進んでいる。最終年度では、ほぼ目標達成が可能であると思われる。また、世戸八山で集中調査を行ったことで、これまで複数箇所で行っていた個々のプロセス研究を同じ環境でみることができ、科学的な説得力が出てきたものと考える。本研究では陸域生態系の中でも森林と里山の生態系(森林-農地)に焦点を絞り、土壌、植物(樹木・草本)、哺乳類、昆虫、土壌生物(土壌動物・微生物)を主たる構成要素として、これらの要素間および要素内での放射性物質の動態の定量的把握とそのメカニズムの解明を目的とした。土壌および樹木に沈着した放射性物質の吸収・蓄積・輸送メカニズムを解明し、定量的な評価を行った。
QUESTにおける非誘導電流生成と自発電流駆動のための高速電子の役割の解明と制御

本研究の目的は核融合発電の定常的運転のために、非誘導プラズマ電流(Ip)駆動法であるEC波入射のみを用い、捕捉粒子の閉じ込めに有利な球状トカマク装置の利点を生かした高自発電流運転とその定常化の基礎を確立することである。特に、衝突緩和時間が長く閉じ込められやすい高速捕捉電子に注目し、それらが放射する硬X線のエネルギースペクトル・空間分布を計測することで、高速電子のエネルギーと密度の変化を調べ、高自発電流駆動に最適な条件を見出すことを目標としている。全lp中の自発電流の駆動率は、プラズマの圧力と閉じ込め磁場(Bp)の圧力の比に比例する。その比はポロイダルベータβpと呼ばれ、これを大きくするような条件を見つけることが高自発電流駆動のため必要である。そのため最終年度である平成24年度は前年度に設置したシステムを用い、高速電子の捕捉条件を変化させることで、このβpがどのように変化するのかを調べた。昨年度はIp立ち上げから閉じた磁力線構造形成過程を調べたのに対して、本年度は、数秒間以上定常維持され平衡状態となった閉じた磁力線構造中の高速捕捉電子閉じ込めとβpの関係についてしらべた。具体的には、高速捕捉粒子の閉じ込め条件が磁場構造の湾曲度によって変わることを利用し、その湾曲度(トロイダル磁場ミラー比;M)を増加させ、さらに印加する垂直磁場(Bz)を増加させた。このような高Mと高Bz条件でのIp駆動は過去の研究や他装置と比して新規な試みである。その結果、M=2の場合(通常1.2程度)、同じ閉じ込め磁場強度(同程度のIp)において高速電子の温度が10倍増加していることを確認した。磁気解析によりポロイダルベータは3.7まで増加し、高βp化に伴うインボードヌル磁場配位も確認された。硬X線計測により見積もったβpの値(3)は磁気解析の値とよく一致し、一方で低速電子の担うβp(0.2)が十分低いことにより、Mの増加に伴うβpの増加は、高速捕捉粒子の閉じ込めが優位なことにより温度が上昇しプラズマ圧力が上昇したことに起因すると考える。23年度は、トカマクにおける非誘導方式によるプラズマ電流(I_p)駆動に対する自発電流と高速電子の役割を調べるため、奨励金にて多視線での硬X線(HX)計測系の整備を行った。それらを用い自発電流駆動のためのポロイダルベータ(β_p;プラズマの圧力平均に対するポロイダル磁場の圧力)を高速捕捉粒子の捕捉条件を変化させることで調べた。また奨励金により、実験で得られた結果をPlasma Conference 2011にて発表した。具体的内容:計測系の整備として、幅広いエネルギー領域のHXを検出するために高エネルギー領域に適したCsI(<3MeV)半導体検出器とその波形増幅器等を設置した。またHXの空間分布が得られるよう、検出器を回転駆動できるシステムを奨励金にて整備した。それらと既設の垂直方向計測を併せて以下の実験で放射HXを計測した。実験では、捕捉粒子の閉じ込め条件を複数の磁場のミラー比(磁力線上のトロイダル磁場勾配)のもとでI_pと外部垂直磁場(B_z)の関係及びHXによるプラズマ加熱を調べることでミラー比によるβ_pの違いを調べた。その結果弱ミラー比(1.2)の場合に比べ強ミラー比(2)の場合はHXのエネルギー、フラックス、非等方性は増加したことから、プラズマの温度が上昇していることが分かった。特に垂直方向からの放射は弱ミラー比の場合に比べ強ミラー比の場合でエネルギー5倍、フラックス400倍に増加した。このことからミラートラップされた電子が増加したと推測される。またI_pのB_zに対する関係は、弱ミラー比の場合よりも強ミラー比の場合で任意のI_pの平衡に必要なB_zが大きいことが分かった。このことは強ミラー比の場合の方がプラズマが加熱されているために弱磁場側に移動し、平衡を保つのに必要なB_zがより多く必要であるからだと考えられる。同等のI_pでは電子密度は両者ともあまり変わらず、形状因子の効果以上に平衡関係が異なるため、温度が高い強ミラー配位の方がβ_pが大きいと考える。意義・重要性;本研究により球状トカマクでの高β_pなI_p立ち上げがミラー比に依存し、それは高速な捕捉粒子の増加に起因することが示された。これは将来の核融合炉の定常運転に貢献すると考えられる。

昨年度はIp立ち上げから閉じた磁力線構造形成過程を調べたのに対して、本年度は、数秒間以上定常維持され平衡状態となった閉じた磁力線構造中の高速捕捉電子閉じ込めとβpの関係についてしらべた。具体的には、高速捕捉粒子の閉じ込め条件が磁場構造の湾曲度によって変わることを利用し、その湾曲度(トロイダル磁場ミラー比;M)を増加させ、さらに印加する垂直磁場(Bz)を増加させた。このような高Mと高Bz条件でのIp駆動は過去の研究や他装置と比して新規な試みである。その結果、M=2の場合(通常1.2程度)、同じ閉じ込め磁場強度(同程度のIp)において高速電子の温度が10倍増加していることを確認した。磁気解析によりポロイダルベータは3.7まで増加し、高βp化に伴うインボードヌル磁場配位も確認された。硬X線計測により見積もったβpの値(3)は磁気解析の値とよく一致し、一方で低速電子の担うβp(0.2)が十分低いことにより、Mの増加に伴うβpの増加は、高速捕捉粒子の閉じ込めが優位なことにより温度が上昇しプラズマ圧力が上昇したことに起因すると考える。23年度研究計画は1.多視線硬X線計測系、それらの駆動システムの整備、2.EC波を用いた高自発電流定常運転の基礎の確立であった。1に関しては終了できた。2番は複数の磁場のミラー比を増加させる実験と印加する垂直磁場を変化する実験を組合すことで、ミラー比によってプラズマの中心温度が変化すること、自発電流の基となる高速捕捉電子・β_pが変化する事を多視線X線計測により実証した。しかし高速電子の電流への定量的評価には至っていないため、上記のような区分を行った。既に整備した多視線計測のシステムと駆動システムを用いて、分布関数の同定を行う実験を計画してえる。これは高速捕捉電子が電流を駆動していることを定量的に示すために必須である。実験では硬X線強度とエネルギーの空間分布を計測。そのデータと分布関数をパラメータとして数値計算した結果を比較し、差が最小となる分布関数を求める。23年度中に数値計算コードを確立したので、24年度では分布関数同定のための計測を行う。但しここで研究を遂行する上での問題点が判明しており、23年度の硬X線空間分布計測により、複数の視程では装置内の2か所のリミター(突起物)からの制動放射が、プラズマからの放射を計測できないほど大きいことが分かった。そのため、リミターが視線内に存在しない垂直方向からの空間分布計測を対応策として講じる。
神経細胞樹状突起におけるカルシウム動態

細胞内Ca^<2+>放出チャンネルである1型イノシトール3リン酸受容体(IP3R1)は小脳プルキンエ細胞に豊富に発現している。細胞内Ca^<2+>濃度の増加はプルキンエ細胞でのシナプス可塑性である長期抑圧現象(LTD)に必須であることは知られていたが、IP3R1がLTDに必須であることを、IP3R1の阻害抗体とIP3R1ノックアウトマウスを用いて示した。生後変性、脱落していく、1型小脳脊髄変性症(SCA1)モデルマウスのプルキンエ細胞においてIP3R1の発現量は減少しているが、シナプス刺激によるCa^<2+>放出はむしろ活性化していた。これらの知見は、プルキンエ細胞樹状突起でのCa^<2+>動態は複雑な時間・空間的特性をもって細胞内メカニズムを制御していることを示唆している。プルキンエ細胞樹状突起のCa^<2+>動態をさらに詳細に検討した。平行線維を50Hz、38発刺激するとCa^<2+>の流入と細胞内からの放出が二相性に見られた。刺激回数を増加するとCa^<2+>上昇は一相性となり、持続時間は刺激回数に比例し、50発刺激では持続時間は68秒、濃度は200μMに達した。IP3R1欠損マウスおよびIP3受容体阻害剤を用いて、この大きなCa^<2+>上昇はほとんどがCa^<2+>流入によることを示し、AMPA受容体阻害剤やCa^<2+>チャンネル阻害剤を用いNa^+とCa^<2+>の濃度変化を測定した結果、P型Ca^<2+>チャンネルがその主役であることが明らかとなった。プルキンエ細胞のAMPA受容体はCa^<2+>を通さないことが分子生物学的研究から示唆されているが、ここでは機能的に示すことができた。刺激回数を増加するとCa^<2+>上昇は一相性となり、持続時間は刺激回数に比例し、50発刺激では持続時間は68秒、濃度は200mMに達した。IP3R1欠損マウスおよびIP3受容体阻害剤を用いて、この大きなCa^<2+>上昇はほとんどがCa^<2+>流入によることを示し、AMPA受容体阻害剤やCa^<2+>チャンネル阻害剤を用いNa^+とCa^

<2+>の濃度変化を測定した結果、P型Ca^<2+>チャンネルがその主役であることが明らかとなった。プルキンエ細胞のAMPA受容体はCa^<2+>を通さないことが分子生物学的研究から示唆されているが、ここでは機能的に示すことができた。
非対称積層薄膜間に形成した多点水素結合接合の動的制御

生体薄膜や細胞一層レベルの薄膜の構造と物性を分光学的に詳しく調べることは,生物学的にもまた分光分析化学的にも大きな挑戦課題である。本研究では,これまで構造異方性の解析の難しかった要因を,入射光電場と官能基の遷移モーメントの相互作用だけに着目してきたことにあると考え,従来の考え方とはまったく異なる解析法を考案した。従来の光学定数に代わる概念として,Kimらの振動子モデルによる誘電関数を利用し,膜面内と面外の両方の関数をこれで表現することを考えた。そして,薄膜を非金属基板上で異なる二つ以上の入射角で反射法によりスペクトル測定し,その複数のスペクトルを同時に説明しうる関数になるよう,パラメータの最適化を行う方法とした。これにより,従来わからなかったα-炭素の配向角など,詳細な分子情報が得られるようになった。一方,分子認識を積極的に使った薄膜の作成も行った。これは,蛋白の一種であるヒスチジンの金属イオン認識機構を真似た人工的な薄膜を,コンビナトリアル表面化学と言うコンセプトで実現させることを狙ったものである。三種の鎖長の異なるアミド結合を持つ分子を合成し,その混合膜が金属イオンをどのように認識するかを調べた。その結果,Zn^<2+>とCu^<2+>を明確に識別できることがわかった。この際の分子配向変化を,赤外分光法で詳細に明らかにすることにも成功し,擬似生体分子の開発に新たな道を与えることができた。また,主成分分析法をスペクトル解析に新しく導入し,空間分解能を超えた新しい分析手法の開発も行い,固液界面の水の特異的構造をはじめて振動スペクトルで捉えることに成功した。これらの成果はJ. Phys. Chem. Bに2報,Chem. Eur. Jに1報公表した。これ以外にも,時間分解スペクトルに含まれる化学信号と他の要因とを識別する新たな分析手法の開発にも成功し,これは現在Appl. Spectrosc.に印刷中である。これらの成果に対し,日本分光学会論文賞と日本分析化学会奨励賞を受賞することができた。
舌骨の位置調節に関わる新しい神経メカニズムの解明

本研究では、副交感神経系がオトガイ舌骨筋を支配する確証を得ることを目的とし、以下の検討を行った。免疫組織学的検討:実験にはWister系ラットを用い、塩酸ケタミンの腹腔内投与を行い、ラットを仰臥位に固定し、手術用顕微鏡下にてオトガイ舌骨筋を剖出した。オトガイ舌骨筋とオトガイ舌骨筋枝を一塊として摘出し、Zanboni固定液に浸漬後、30%蔗糖-リン酸緩衝液に2448時間浸漬した。O.T.C compoundに包埋し、急速凍結を行った後、クライオスタッドにて厚さ30μmの凍結横断切片を作製した。シランコートスライドガラスに貼付し、前処理の後、一次抗体としてVIP抗体(副交感神経標識用)、抗S100タンパク抗体(神経筋接合部標識用)の両者を用い一連の免疫組織化学染色を施した。光学顕微鏡で観察した結果、副交感神経の節後ニューロンの終末とオトガイ舌骨筋線維による神経筋接合部の形成を示唆する所見が得られた。電子顕微鏡学的検討:免疫組織学的検討と同様にオトガイ舌骨筋とオトガイ舌骨筋を一塊として摘出し、摘出したオトガイ舌骨筋を4%パラホルムアルデヒド-0.5%グルタールアルデヒド-0.1Mリン酸緩衝液-0.2%CaCl2に24時間浸漬固定後、マイクロスライサーにて連続切片を作製した。一次抗体としてVIP抗体、抗S100タンパク抗体の両者を用いた一連の免疫組織化学染色を行った。1%オスミウム酸-0.1Mリン酸緩衝液で30分間固定を行い、上昇エタノール系列とプロピレンオキサイドで脱水後、エポン樹脂に包埋重合し、ウルトラミクロトームで超薄切片を作製した。電子顕微鏡にてオトガイ舌骨筋の神経筋接合部の詳細について検索したが、光学顕微鏡レベルで認められた副交感神経の節後ニューロンの終末とオトガイ舌骨筋線維による神経筋接合部は数が少ないため超微細構造の観察に苦慮している。これまでの我々の成果よりオトガイ舌骨筋に関する一連の研究を行い、オトガイ舌骨筋は舌下神経本幹を経由する体性神経系と頸神経ワナを経由する副交感神経系によって二重神経支配されていることを明らかにした。その結果として、この副交感神経系によってオトガイ舌骨筋の伸張が調節されることにより舌骨の制御が行われている可能性が示唆された(Exp.Brain.Res.2003)。本研究では、副交感神経がオトガイ舌骨筋を支配する確証を得ることを目的とし電気生理学的検討を行った。<電気生理学的検討>実験にはWister系ラットを用いた。塩酸ケタミンの腹腔内投与を行い、保温パッド上でラットを仰臥位に固定し下顎前歯を利用してクランプによって下顎を固定した。手術用顕微鏡下で下顎骨内側から鎖骨に至る皮膚切開を加え、舌下神経本幹と頸神経ワナ、オトガイ舌骨筋、オトガイ舌骨筋枝を明示し、頸神経ワナと舌下神経本幹からオトガイ舌骨筋を一塊として摘出し、酸素飽和人工脊髄液(NaCl 120mM,MgSO_4 2.0mM,KCl 3.0mM,NaH_2PO_4 125mM,MaHCO_3 26.0mM,CaCl_2 1.0mM,glucose 20.0mM)を環流したrecording chamber内に固定し、オトガイ舌骨筋に微小ガラス管を刺入し筋放電を導出し、副交感神経節後ニューロンの神経放電と筋放電との同期を証明するためrecording chamber内に以下の薬剤をそれぞれbath applicationし解析を行った。結果、各薬剤投与後に神経放電の現象傾向が認められた。現在、神経放電の発現頻度について解析中である。

1%オスミウム酸-0.1Mリン酸緩衝液で30分間固定を行い、上昇エタノール系列とプロピレンオキサイドで脱水後、エポン樹脂に包埋重合し、ウルトラミクロトームで超薄切片を作製した。電子顕微鏡にてオトガイ舌骨筋の神経筋接合部の詳細について検索したが、光学顕微鏡レベルで認められた副交感神経の節後ニューロンの終末とオトガイ舌骨筋線維による神経筋接合部は数が少ないため超微細構造の観察に苦慮している。
子宮平滑筋肉腫の早期診断と効果的治療法の確立を目指したOMICS解析

本研究では、術前診断における子宮平滑筋腫との鑑別が困難で、悪性度が高く治療方針に苦慮する子宮平滑筋肉腫および類縁疾患を解析対象としました。染色体構造解析、DNAメチル化解析、遺伝子発現解析等により構成されるOMICS解析から子宮平滑筋肉腫に特異的なバイオマーカーの抽出を試み、早期診断と効果的治療法に帰結させることを本研究の目的とし推進してきました。早期診断および標的治療に有用なバイオマーカーを抽出し子宮平滑筋肉腫の治療成績を向上させると伴に、本研究手法をさらに発展させ他悪性腫瘍の早期診断・治療成績向上に帰結させることを究極の目的として進捗させています。「現在までの進捗状況」に詳述しますが、研究開始2年目である平成30年度では(1)子宮平滑筋肉腫の検体を用いたOMICS解析と(2)子宮平滑筋肉腫の特異的バイオマーカー検索につき進捗させました。(1)は子宮平滑筋正常細胞から悪性細胞に至る悪性化の経路について解析を行う目的で施行しています。(2)は(1)で得られたデータの中で、次世代シークエンサーによるRNAseq解析で正常子宮筋層・平滑筋腫と平滑筋肉腫での発現が有意に異なる分子を選別しました。正常子宮筋層・平滑筋腫での発現が平滑筋肉腫に比し有意に高値である12分子、平滑筋肉腫での発現が正常子宮筋層・平滑筋腫に比し有意に高値である8分子を選別しました。これらの分子のタンパク発現については、別途免疫組織染色により解析中です。平成30年度には、研究進捗に基づき医学誌・学会等で成果の発表を行ってきました。(1)子宮平滑筋肉腫の検体を用いたOMICS解析:子宮平滑筋正常細胞から悪性細胞に至る悪性化の経路について解析を行う目的で、子宮平滑筋肉腫の検体から抽出したRNAからRNAシークエンス用のライブラリーを作製し、次世代シークエンサーで網羅的解析を施行しました。得られた遺伝子発現情報とDNAメチル化情報を比較し、最終的には各組織型に特異的なmolecular signatureを同定する作業を行っています。これらの分子生物学的解析によって得られたデータを用いて、腫瘍の臨床病理因子・予後との相関について統計学的解析を行う予定です。この解析により得られる各腫瘍のmolecular signatureは細胞生物学的特性に関して理解可能となるのみならず、細胞同定による検査法や標的治療法の確立へ帰結することが期待できます。(2)子宮平滑筋肉腫の特異的バイオマーカー検索:以前、正常子宮筋層・平滑筋腫・平滑筋肉腫:各3症例と平滑筋肉腫細胞株:3種を使用して網羅的アレイを用いた遺伝子発現解析を行いました。平滑筋肉腫での発現が正常子宮筋層・平滑筋腫に比し有意に高値である群には細胞周期関連分子が、逆に平滑筋肉腫で低発現である群には細胞接着分子が含まれることを報告しました(Miyata T, Sonoda K etal. Sarcoma 412068, 2015)。今回は平滑筋肉腫症例サンプルを更に9症例増やして次世代シークエンサーによるRNAseq解析で正常子宮筋層・平滑筋腫と平滑筋肉腫での発現が有意に異なる分子を選別しました。正常子宮筋層・平滑筋腫での発現が平滑筋肉腫に比し有意に高値である12分子、平滑筋肉腫での発現が正常子宮筋層・平滑筋腫に比し有意に高値である8分子のタンパク発現については、免疫組織染色により解析中です。(1)候補分子の発現を人為的に変化させた際の細胞特性の解析:molecular signature解析により得られた細胞特性を表現するバイオマーカーの発現を人為的に変化させた細胞株(強制発現またはRNA干渉による発現ノックダウン)を用いた発現分子プロファイルの変化、細胞増殖、細胞遊走能・浸潤能等に関してin vitro解析を行います。また、これらの細胞株をヌードマウス皮下等に移植しin vivo造腫瘍能を解析します。(2)候補分子による診断能の検証:前述したように、子宮平滑筋肉腫は平滑筋腫との術前における鑑別は極めて困難です。本研究で得られた特異的バイオマーカーの発現について、細胞診・組織診検体を用いて解析を行います。さらに、本研究では末梢血細胞も検体として解析を行います。検出法としては、樹脂マイクロ流体チップを用いて細胞を分離・回収した後のpolymerase chain reaction(PCR)法、特異的抗体での細胞染色およびflow cytometry解析等が考慮されます。(3)候補分子をターゲットとした標的治療の構築:特異的バイオマーカーをターゲットとした分子標的治療法としては、複数が候補として考慮されます。即ち、1特異的抗体の作製、2化合物アレイを使用したsmall substance同定、3RNA干渉による発現ノックダウン等が考慮されます。RNA干渉システム使用時には効率良い組織デリバリーおよび発現システムの開発を併せ試みます。

「現在までの進捗状況」に詳述しますが、研究開始初年度である平成29年度では(1)子宮平滑筋肉腫の検体を用いたOMICS解析と(2)子宮平滑筋肉腫におけるRCAS1発現解析につき進捗させました。(1)は子宮平滑筋正常細胞から悪性細胞に至る悪性化の経路について解析を行う目的で施行しています。(2)は研究代表者がこれまで従事してきた研究内容を発展させるものです。RCAS1は子宮体癌(内膜癌)症例の年齢・進行期・筋層浸潤・腹腔内細胞診陽性と有意な相関を認め、多変量解析ではRCAS1発現は転移および頸部間質浸潤と共に全生存期間に関する独立した予後因子でした。同じ子宮体部から発生する悪性腫瘍である平滑筋肉腫についても、RCAS1発現と臨床的意義につき解析を行いました。平成29年度には、研究進捗に基づき医学誌・学会等で成果の発表を行ってきました。(1)子宮平滑筋肉腫の検体を用いたOMICS解析:子宮平滑筋正常細胞から悪性細胞に至る悪性化の経路について解析を行う目的で、子宮平滑筋肉腫の検体から抽出したRNAからRNAシークエンス用のライブラリーを作製し、次世代シークエンサーで網羅的解析を施行しました。得られた遺伝子発現情報とDNAメチル化情報を比較し、最終的には各組織型に特異的なmolecular signatureを同定する作業を行っています。これらの分子生物学的解析によって得られたデータを用いて、腫瘍の臨床病理因子・予後との相関について統計学的解析を行う予定です。この解析により得られる各腫瘍のmolecular signatureは細胞生物学的特性に関して理解可能となるのみならず、細胞同定による検査法や標的治療法の確立へ帰結することが期待できます。(2)子宮平滑筋肉腫におけるRCAS1発現解析:腫瘍の悪性度を規定する複数の臨床病理因子と相関し、15種類の悪性腫瘍の予後因子であることが報告されているRCAS1の発現解析について免疫組織染色を使用しました。10症例(conventional:6症例、myxoid:2症例、epithelioid:2症例)による解析では、発現なし:2症例、低発現:2症例、高発現:6症例であり、RCAS1は腫瘍細胞の胞体内に顆粒状に染色されました。経過観察期間中央値:19ヶ月(1284ヶ月)にて、RCAS1発現なしおよび低発現群では4症例全てが生存していましたが、高発現群では6症例中2例が腫瘍死していました。本研究では、術前診断における子宮平滑筋腫との鑑別が困難で、悪性度が高く治療方針に苦慮する子宮平滑筋肉腫および類縁疾患を解析対象としました。染色体構造解析、DNAメチル化解析、遺伝子発現解析等により構成されるOMICS解析から子宮平滑筋肉腫に特異的なバイオマーカーの抽出を試み、早期診断と効果的治療法に帰結させることを本研究の目的とし推進してきました。早期診断および標的治療に有用なバイオマーカーを抽出し子宮平滑筋肉腫の治療成績を向上させると伴に、本研究手法をさらに発展させ他悪性腫瘍の早期診断・治療成績向上に帰結させることを究極の目的として進捗させています。