hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
静脈麻酔薬が血管平滑筋のアンジオテンシンII受容体に及ぼす影響の検討

血管平滑筋細胞を静脈麻酔薬、主にプロポフォールを用いて、様々な濃度、時間で刺激した後、RNAを酸性グアニジウム-フェノール-クロロホルム法により抽出し、アンジオテンシンII1型受容体(AT1R)やカテコラミン受容体のmRNAレベルを、リアルタイムPCR法(ABIー7500使用)により解析したが、AT1Rは減少傾向にはあるものの、静脈麻酔薬による至適な刺激条件の検討に時間がかかり、また、新規実験立ち上げに伴う種々のコンタミネーション等により、平成23年度中に予定していたタンパク発現の検討(ウエスタンブロット)までは実施できていない。以上のことから、研究達成度はやや遅れていると判断した。ラットの血管平滑筋細胞をプロポフォールやミダゾラム等で刺激し、まずはマイクロアレイにてそのパスウェイをおおまかに理解した後に、それぞれのmRNAや蛋白発現量をリアルタイムPCR法やウエスタンブロットにて再確認する。ここで変化がみられればその発現量調節メカニズムを詳細に解析する。静脈麻酔薬によって引き起こされる低血圧の機序を詳細に解明することは、周術期の安定した麻酔を行うための足がかりとなるため、非常に意義がある。さらに、ARBの手術当日の内服に関してのエビデンスを提示することが出来ると考えられる。以上のことから、静脈麻酔薬がレニン・アンジオテンシン系に及ぼす影響を明らかにできれば、非常に特色のある研究になると思われる。*タンパク発現の検討*調節をうけたAT1Rが受容体として機能しているのかどうかを調べるAT1R調節の機能的影響を調べるためにアンジオテンシンIIによって誘発されるERKのリン酸化に対して、静脈麻酔薬によるAT1Rの調節が影響しているかどうかを検証する。*反応系における介在タンパクの存在の有無、またはmRNAの安定性に関すて検証する。VSMCをシクロヘキシミド(10μmol/l)で12時間処理し、蛋白合成を阻害するシクロヘキシミド存在下でも静脈麻酔薬はAT1R mRNAの発現に影響するかどうか、すなわち、静脈麻酔薬によるAT1Rの発現調節には新たなタンパク合成を必要とするかどうかについて検討する。また、アクチノマイシンDを用いた実験により静脈麻酔薬がAT1R mRNAの分解速度に影響を与えるかどうかを検討する。*AT1R遺伝子プロモーターのどこに作用しているのかを調べる。AT1R遺伝子プロモーターを制限酵素で切断した後、ルシフェラーゼ遺伝子に接続して5つのdeletion mutantを作成する3)。この変異体とLacZ遺伝子をDEAEデキストラン法によりVSMCに導入した後、プロポフォールで刺激する。静脈麻酔薬によるAT1R調節の原因となるDNA領域を特定するために、AT1R遺伝子のプロモーター活性をルシフェラーゼアッセイによって測定し、β-ガラクトシダーゼ活性によって標準化することで。必要に応じて、解析したDNA領域に結合するDNA結合タンパクを調べるために、静脈麻酔薬で刺激したVSMCから得られた核抽出物においてゲルシフトアッセイを行う。フェンタニル、チアミラールなど他の静脈麻酔薬及び吸入麻酔薬等でも同様の検討を順次行っていく。
全エクソーム解析を用いたPFAPA症候群疾患原因遺伝子の同定

PFAPAを呈する12家系、45検体について全エクソーム解析を施行した。まず遺伝性周期発熱の原因遺伝子である6遺伝子(MEFV, MVK, TNFRS1A, LPIN2, NOD2, ELANE)について病的変異の検索を行ったが、これらの遺伝子において疾患原因となりうる病的変異は認められなかった。次に各家系毎に候補変異の絞込みを行ったところ、常染色体優性遺伝形式を示す家系では2698個、孤発家系においては13個の候補遺伝子が絞り込まれた。そのなかで、疾患候補遺伝子と考えられる遺伝子の検索を行ったものの、複数家系において共通して変異が認められる遺伝子は同定できなかった。PFAPA症候群(periodic fever, aphtous stomatitis, pharyngitis, and adenitis syndrome)はアフタ性口内炎、咽頭/扁桃炎、頸部リンパ節炎を随伴症状とする周期性発熱発作を繰り返す自己炎症疾患であり、国内外で家族発症例の報告がみられることから、遺伝的要因の関与が示唆されているが、本疾患の原因遺伝子の同定には至っていない。本研究の目的は、PFAPA家系例について次世代シークエンサーを用いた全エクソーム解析を行い、原因遺伝子の単離・分子病態解明を行うことである。これまでに、12家系45検体を入手済みであり、全例においてエクソーム解析が終了している。エクソーム解析で得られたデータのリードカバレッジの平均は131、20×カバレッジの平均は91%であり、非常に良好なデータが得られている。本データをバイオインフォマティクスの手法を用いて塩基配列解析を行い、タンパクに影響を与える変異を予測し、疾患原因遺伝子変異の検索を行った。その結果、各家系において数万の遺伝子多型をコールされており、さらに遺伝形式や健常コントロールの配列情報をもとに絞込みをお粉たった結果、家系ごとに2438個の候補変異が絞り込まれており、数個の候補遺伝子が同定されている。しかし、現時点では疾患原因遺伝子を決定するには至っておらず、さらなる追加検体をもちいて再現性の確認と、疾患病態と遺伝子変異との関連について詳細な機能解析を施工する必要があると考えられる。PFAPA症候群(periodic fever, aphtous stomatitis, pharyngitis, and adenitis syndrome)はアフタ性口内炎、咽頭/扁桃炎、頸部リンパ節炎を随伴症状とする周期性発熱発作を繰り返す自己炎症疾患である。本研究では、PFAPA家系例について次世代シークエンサーを用いた全エクソーム解析を行い、原因遺伝子の単離・分子病態解明を行うことを目的としていた。まず我々は、PFAPA症候群をきたす患者およびその家族から血液試料の収集を行い、最終的に12家系、44検体の収集を行った。これらの検体からDNA抽出を行った後、全例につき全エクソーム解析を施行した。各家系において、予想される遺伝形式から候補遺伝子変異の絞込みを行い、その後複数家系において共通して変異がみられる遺伝子の検索を行った。まず、これまで先天性周期発熱の原因遺伝子としてすでに報告のある6遺伝子(MEFV, MVK, TNFRS1A, LPIN2, NOD2, ELANE)において病的変異の検索を行ったが、これらの遺伝子には疾患原因となりうる病的変異は認められなかった。このことは、本疾患が既存の周期発熱疾患とは異なる遺伝的要因によって引き起こされていることを示すものである。また新規候補遺伝子の検索においては、候補変異数は常染色体優性遺伝形式を示す家系においては2639個であり、孤発の罹患児がみられる家系においては05個であった。そのかなかで、疾患候補遺伝子と考えられる遺伝子の検索を行ったものの、複数家系において共通して変異が認められる遺伝子は同定できなかった。このことは、本疾患の遺伝的背景は多様な要因が関与している可能性を示唆するものであると考えられた。遺伝学平成25年度の目標としては、PFAPA家系の検体取集と全エクソーム解析による疾患原因遺伝子の絞り込みを施行する予定であった。現時点において、12家系45検体のサンプル収集とエクソーム解析が終了していることから、研究はおおむね順調に進展していると考えられる。今後はエクソーム解析の結果から同定された疾患原因遺伝子候補について、遺伝子機能の解明と疾患病態への関与のメカニズムを検討する予定である。ただし、現時点では複数の候補遺伝しが存在するため、真の原因遺伝子特定には至っていない。そこで、引き続き新規のPFAPA家系の収集を行い、さらに詳細な絞り込みを行っていく必要がある。実験試薬の購入延期による減額と平成25年度は国内外の学会出張に伴う旅費が生じなかったため。本年度は解析に要する追加試薬の購入を予定しおり、また研究成果発表のため国内外の学術集会に参加するための旅費を要する予定である。
喘息とCOPDのオーバーラップ症候群：分子生化学的アプローチによる病態生理の解明

本研究は、喘息とCOPDのオーバーラップ症候群の分子病態を解明することを目的とした。探索した炎症バイオマーカーの中で、末梢血好酸球数、呼気NO濃度、呼気凝縮液IP-10は喘息とオーバーラップ症候群で増加していた。呼気NO濃度がステロイド治療による気流制限およびCOPD assessment test(CAT)の改善を予測する有用なマーカーであることが確認された。中枢由来の呼気NOと末梢由来の呼気NOは同等の感度・特異度を有することが示された。また喘息を対象とした観察研究において、重度増悪の存在と呼気NO濃度の上昇が急速な気流制限の進行と関連することを見出した。喘息とCOPDのオーバーラップ症候群は診断が困難であり、増悪頻度が高く気流閉塞の進行が速く予後不良であるが、その病態生理は十分に解明されていない。本研究は、分子生化学的アプローチにより、オーバーラップ症候群の細胞および分子レベルでの炎症プロファイルを明らかにし、疾患特異性の高い炎症分子を同定することで分子機序に基づいた疾患のendotypeの解明を試みることを目的とした。本年度はステロイド未治療の喘息、COPD、オーバーラップ症候群を対象に横断的に症状、呼吸機能、QOL、中枢・末梢気道由来の呼気NO濃度を測定し、血液、呼気凝縮液を採取し、血清および呼気凝縮液中の炎症性分子の網羅的測定を開始した。今後は、吸入ステロイド薬の追加投与の前後で分子発現と症状、呼吸機能、QOLの変化を評価し、ステロイド反応性(感受性・抵抗性)と関連する分子を探索する。また今年度は、喘息における気流閉塞の急速な進行に関連する因子として高齢、増悪、呼気NO濃度高値を同定し、Respir Med誌に報告した。本研究でもオーバーラップ症候群の炎症プロファイルと長期的な増悪と気流閉塞進展との関連を検討する予定である。本研究は、分子生化学的アプローチにより、オーバーラップ症候群の細胞および分子レベルでの炎症プロファイルを明らかにし、疾患特異性の高い炎症分子を同定することで分子機序に基づいた疾患のエンドタイプの解明を試みることを目的とした。平成26年度はステロイド未治療の喘息、COPD、オーバーラップ症候群を対象に横断的に症状、呼吸機能、QOL、中枢・末梢気道由来の呼気NO濃度を測定し、血液、呼気凝縮液を採取し、血清および呼気凝縮液中の炎症性分子の網羅的測定を開始した。平成27年度より、吸入ステロイド薬の追加投与の前後で分子発現と症状、呼吸機能、QOLの変化を前向きに評価し、ステロイド反応性(感受性・抵抗性)と関連する分子を探索している。また、喘息を対象とした観察研究において、重度増悪の存在とステロイド治療に関わらず持続する呼気NO濃度の上昇が急速な気流制限の進行と関連することを見出し、JACI in pract誌およびAllergol int誌に報告した。当該研究でもオーバーラップ症候群の炎症プロファイルや増悪と気流閉塞進展との関連を検討する予定である。平成26年度は、60歳以上でステロイド未治療の喘息、COPD、オーバーラップ症候群を50症例登録し、全例でベースラインにおける症状、呼吸機能、QOLの評価および呼気NO濃度測定、呼気凝縮液の回収を終えた。また、平成27年度はステロイド介入後の検体採取について登録症例で進めて、呼気凝縮液中の分子解析を開始している。研究はおおむね順調に進捗していると考える。これまでの解析で、中枢および末梢気道由来の呼気NO濃度とステロイド反応性の関連性を見出している。初年度はステロイド未治療の喘息、COPD、オーバーラップ症候群を対象に横断的に症状、呼吸機能、QOL、中枢・末梢気道由来の呼気NO濃度を測定し、血液、呼気凝縮液を採取し、血清および呼気凝縮液中の炎症性分子の網羅的測定を開始した。次年度からは、吸入ステロイド薬の追加投与の前後で分子発現と症状、呼吸機能、QOLの変化を前向きに評価し、ステロイド反応性(感受性・抵抗性)と関連する分子の探索を行ってきた。探索した複数の炎症マーカーの中で、末梢血好酸球数、呼気NO濃度、呼気凝縮液IP-10はCOPDに比べて、喘息、オーバーラップ症候群で増加していた。COPDにおいては中枢および末梢気道由来の呼気NO濃度が吸入ステロイド追加投与による気流制限およびCOPD assessment test(CAT)の改善を予測する有用なバイオマーカーであることが確認された。中枢由来の呼気NOと末梢由来の呼気NOはステロイド反応性の予測において同等の感度・特異度を有することが示された。呼気NOの総排泄量に対しては気道におけるNOの産生と消費が影響するが、オーバーラップ症候群においては過剰に産生されているNOがステロイドの感受性を予測するバイオマーカーとして有用と考えられた。また喘息を対象とした観察研究において、重度増悪の存在とステロイド治療に関わらず持続する呼気NO濃度の上昇が急速な気流制限の進行と関連することを見出した。

探索した炎症バイオマーカーの中で、末梢血好酸球数、呼気NO濃度、呼気凝縮液IP-10は喘息とオーバーラップ症候群で増加していた。呼気NO濃度がステロイド治療による気流制限およびCOPD assessment test(CAT)の改善を予測する有用なマーカーであることが確認された。中枢由来の呼気NOと末梢由来の呼気NOは同等の感度・特異度を有することが示された。また喘息を対象とした観察研究において、重度増悪の存在と呼気NO濃度の上昇が急速な気流制限の進行と関連することを見出した。今年度は、60歳以上でステロイド未治療の喘息、COPD、オーバーラップ症候群を50症例登録し、全例でベースラインにおける症状、呼吸機能、QOLの評価および呼気NO濃度測定、呼気凝縮液の回収を終えた。また、ステロイド介入後の検体採取についても大半の症例で終了しており、研究はおおむね順調に進展していると考える。現在は呼気凝縮液中の分子解析を開始している。また呼気NO濃度とステロイド反応性の関連性を見出している。今後の研究計画として、経時的な呼吸機能や血液・呼気中の炎症分子の測定データと経年的な気流閉塞の進行や増悪についての関連性を検討し、炎症分子発現と疾患の長期予後との関連について前向きに解析する。オーバーラップ症候群の補助診断や管理の指標に有用なバイオマーカーの同定を目指す。呼吸器病学オーバーラップ症候群の頻度は高いが、本研究は60歳以上を対象とし、既治療例が多いため、横断研究における症例登録は平成26年度以降も継続して行う。今後の研究計画として、横断研究後も経時的に呼吸機能や血液・呼気の炎症分子を測定するとともに、経年的な気流閉塞の進行や増悪について23年間の長期的な観察を行い、炎症分子発現と疾患の長期予後との関連について前向きに検討する。オーバーラップ症候群の補助診断や管理の指標に有用なバイオマーカーの確立を目指す。所属研究機関の変更に伴い消耗物品の購入や研究成果発表が予定通りに遂行できなかったため次年度使用額が生じた。本年度は呼気凝縮液中の炎症分子測定用のmultiplex systemの機器整備を要したために、消耗物品としての分子測定キットの購入を待機したことにより次年度使用額が生じた。現在の研究機関において当該研究の遂行は可能である。データ解析を継続するとともに、学会発表と論文を通じて研究成果を発信する。標的とする分子測定キットは既に選定済みであり、速やかに購入し、分子の定量的測定を追加実施する予定である。
レーザー分光による反応性スパッタリング過程の研究

透明導電膜物性とその作成プロセス条件との関係を定量的に明らかにするために、インジウム・スズ酸化物(ITO)透明導電膜の反応性スパッタリグ過程における放電プラズマ中の粒子計測をレーザー分光(レーザー誘起蛍光法およびレーザー光脱離法)を用いて実施した。さらに、膜の電気抵抗率・透過率および成膜速度を定量計測し、プロセスプラズマ諸量と比較検討した。本研究で得られた結果の概要を以下に列挙する。1.DC反応性スパッタリング中で、ITOターゲットからスパッタされた中性In原子の空間密度分布が電子状態の違いにより異なることを、レーザー誘起蛍光計測により明らかにした。2.また、上記DC反応性スパッタリング中で、レーザー光脱離を利用して酸素負イオン密度の計測を行なった結果、酸素ガスの混合にともない酸素負イオンの生成が顕著になること、負イオン密度変化の様子はラングミュアープローブ計測から推定した負イオン密度変化と定性的に一致することを確認した。3.プレーナマグネトロンカソード(日電アネルバより提供)を用いて、実際の透明導電薄膜作成条件下(気体圧力数mTorr、放電電力密度0.11W/cm^<-2>)で反応性スパッタリング過程を調べた。その結果、(1)スパッタIn原子密度はターゲット表面の化学結合状態(これがスパッタ収量を決定する)で決まり、空間での衝突による反応は殆ど無視できること、(2)In原子のターゲットからの放出量は酸素ガス分圧により非常に大きく影響され、それに対応して、成膜されたITO薄膜の電気抵抗率および成膜速度も大きく変化すること、(3)本実験条件下では酸素分圧が10^<-5>Torr付近で良質のITO膜が再現性良く作成できること、(4)この最適酸素分圧はターゲット入射イオン束と酸素分子束がほぼバランスする領域であることを確認した。
画像補間のための確率モデルの実現に関する研究

これまで欠落領域の復元に用いてきたアルゴリズムを、画像の高解像度化、および類似画像検索のための画像の意味的特徴量の推定に応用を行った。まず、画像の高解像度化では、これまで提案を行ってきたカーネル主成分分析に基づいた失われた情報の推定法を応用し、既知の情報を低解像度画像における低周波成分、未知の情報を本来高解像度画像が有していたはずの高周波成分に置き換えることで、失われた高周波成分の推定を可能とした。近年の単一フレームによる超解像手法では、失われた高周波成分を推定するために、教師データとなる高解像度画像が必要となるのに対して、我々の研究では画像の異なる階層間での相関を用いることで、教師データを用いずに失われた高周波成分の推定が可能であり、非常に有効であることが確認された。さらに、我々は画像の高解像度化への応用だけでなく、復元や再構成とは異なる分野である類似画像検索への応用も試みた。一般に、対象となる画像に対して高精度に類似画像検索を行うためには、単純に画像特徴量間で距離を求めるのではなく、画像特徴量から意味的特徴量を推定し、それらの間で距離を求める手法が必要となる。我々はカーネル主成分分析を用いた画像の意味的特徴量の推定手法を提案し、与えられる画像の画像特徴量から意味的特徴量を高精度に推定することを可能とした。これにより、得られる意味的特徴量を用いることで、従来では困難であった画像内容に基づく類似画像検索を行うことが可能となった。このように、我々は復元・再構成の分野だけでなく、近年発展の著しい検索の分野への新たなアプローチの提案も行ってきた。テクスチャに特化した画像のモデル化を行うことで,欠落領域を高精度に復元する手法の提案を行った。まず、我々は位相回復手法の一つであるERアルゴリズムを用いた静止画像中に存在する消失テクスチャの高精度な再構成法を提案した。提案法では,類似したテクスチャのフーリエ振幅が類似した値であることに着目し,復元対象領域のフーリエ振幅に最も類似したテクスチャを含む領域を対象画像中から選択している.さらに,そのフーリエ振幅を用いて,消失テクスチャの再構成を行う.このとき,提案法では消失テクスチャのフーリエ振幅特性が未知でありながら,それと類似した特性を持つ領域を選択するため,ERアルゴリズムにより発生する誤差を観察する.また,ERアルゴリズムの繰り返し処理において用いられる拘束条件の更新を行うことで,テクスチャの再構成に適した手法の改良が導入されている.このようにして導出される提案法を用いれば,対象画像中の既知のテクスチャのみから消失テクスチャの高精度な復元が可能となった.次に、我々は上記手法の問題を解決する手法について提案を行った。提案法ではERアルゴリズムで用いられる拘束条件を,復元対象領域およびそのフーリエ振幅がそれぞれ対象画像中の複数の局所領域およびそれらのフーリエ振幅から生成される二つの部分空間内に存在するように設定する.これにより,復元対象領域において未知であるフーリエ振幅および位相の推定が可能となり,消失領域の再構成が可能となる.さらに,提案法では復元対象領域およびそのフーリエ振幅についてそれぞれ類似した局所領域とフーリエ振幅を選択し,これらを二つの部分空間の生成に用いている.これにより,得られる部分空間は復元対象領域に対して適応的に生成され,提案法では高精度な消失テクスチャの再構成が可能となった.従来より符号化により劣化した画像を復元するために適用されてきた凸射影法を用いることで、テクスチャに特化した欠落領域の高精度な再構成法を提案した。我々は、画像中に存在する様々なテクスチャをそれぞれモデル化するため、テクスチャを含む局所的な領域を高次元特徴空間において分類し、さらにそれぞれのクラスタについてテクスチャの特徴を表す、つまり最小二乗の規範において最良の近似を与える固有空間を生成する。さらに、凸射影法の拘束条件に対して得られた固有空間を導入し、欠落領域により消失したテクスチャの再構成を行う。このとき、再構成対象のテクスチャが、同一の種類のテクスチャを含むクラスタの固有空間により復元された場合、提案法では最良の近似を与えることが可能となり、高精度な推定結果を得ることが可能となる。ただし、対象のテクスチャには欠落した領域が存在するため、一般にテクスチャ間の距離を算出することは困難である。したがって、同一の種類のテクスチャを含むクラスタを決定することは困難であり、これが従来法における最も大きな課題となっていた。そこで、我々は凸射影法において収束する誤差が類似するテクスチャ程、低い値を示すことに注目し、これをテクスチャの距離として用いることで最適なクラスタを選択することを可能とした。したがって、提案法では対象のテクスチャをそれぞれ最適なクラスタにより再構成することが可能であるため、画像中に存在する全ての欠落領域を高精度に復元することが実現された。次に、我々は上記テクスチャの高精度な再構成法に加え、これまでに提案してきた輪郭線の高精度な再構成法を共に用いることで、テクスチャと輪郭線を同時に再構成可能なハイブリッド手法の提案を行った。提案法では、以前に我々が提案したマルコフ確率場モデルを用いた輪郭線の高精度な再構成法を、復元対象の画像に適用し、得られる結果を初期画像として、上記の凸射影法を用いたテクスチャの再構成を行う。これにより、復元対象となる領域が輪郭線を含むものであるか、またはテクスチャを含むものであるかを判定する必要がなく、誤判定による問題を生じずに復元を行うことが実現された。

まず、画像の高解像度化では、これまで提案を行ってきたカーネル主成分分析に基づいた失われた情報の推定法を応用し、既知の情報を低解像度画像における低周波成分、未知の情報を本来高解像度画像が有していたはずの高周波成分に置き換えることで、失われた高周波成分の推定を可能とした。近年の単一フレームによる超解像手法では、失われた高周波成分を推定するために、教師データとなる高解像度画像が必要となるのに対して、我々の研究では画像の異なる階層間での相関を用いることで、教師データを用いずに失われた高周波成分の推定が可能であり、非常に有効であることが確認された。さらに、我々は画像の高解像度化への応用だけでなく、復元や再構成とは異なる分野である類似画像検索への応用も試みた。一般に、対象となる画像に対して高精度に類似画像検索を行うためには、単純に画像特徴量間で距離を求めるのではなく、画像特徴量から意味的特徴量を推定し、それらの間で距離を求める手法が必要となる。我々はカーネル主成分分析を用いた画像の意味的特徴量の推定手法を提案し、与えられる画像の画像特徴量から意味的特徴量を高精度に推定することを可能とした。これにより、得られる意味的特徴量を用いることで、従来では困難であった画像内容に基づく類似画像検索を行うことが可能となった。このように、我々は復元・再構成の分野だけでなく、近年発展の著しい検索の分野への新たなアプローチの提案も行ってきた。
超分子系での高次フラーレンフィルムの多価アニオン形成と新機能開発

本研究では、まず、C60多価アニオン生成の分子メカニズムを明確にし、これを基に、これまでまったく報告されていないフィルム系での高次フラーレンの多価アニオン形成に関する研究を行った。C60/脂質膜修飾電極を作成し、様々な電解質カチオン及びアニオンの存在下での電子移動反応を電気化学的手法、分光電気化学的手法、ならびに電気化学水晶振動子マイクロバランスを併用して解析することによりC60多価アニオン生成の分子メカニズムについて明らかにした。同様の手法を用いてC70脂質膜修飾電極についても解析し、C60,C70の電子移動特性の違いを明らかにした。フラーレンの多価アニオン形成は脂質カチオンの影響を受けること、酸化還元にカップリングして、20-60当量の水の出入りがあること、C70多価アニオンがミクロクリスタルに成長することなどが明らかとなった。高次フラーレンC84(あるいはC76)脂質膜修飾電極を作成し、電子移動特性を調べた。C84あるいはC76単独修飾電極では明確な電子移動は観測されない。これに対して、脂質膜修飾電極系ではC84,C76とも安定な多価アニオン生成が認められた。また、電子移動反応は脂質膜の荷電の影響を受け、カチオン膜では、還元電位の大きな正方向へのシフトが観測された。このことは、フラーレンアニオンと脂質カチオンとの強い静電的結合が存在すること、またこの強い相互作用が、安定なフラーレンアニオンの形成に関与していることが明らかとなった。
膜融合活性ポリペプチドを用いた融合性リポソームの創製と遺伝子送達システムへの応用

種々の両親媒性ポリペプチドや高分子で修飾することによって、機能性リポソームを開発した。グルタミン酸残基を含む両親媒性ポリペプチドを固定化したリポソームは、酸性条件下で融合性が高まるpH感受性リポソームであることが明らかになった。また、β-アラニン残基を結合したポリグリシドールで修飾したリポソームは、負電荷を持つ脂質膜と融合することがわかった。内部にクロラムフェニコールアセチル転移酵素の遺伝子を含むプラスミドを封入したβ-アラニン結合ポリグリシドール修飾リポソームによる動物細胞への遺伝子導入について調べた。その結果、高い融合性を示す膜組成のリポソームと処理した細胞からは、クロラムフェニコールアセチル転移酵素活性が見られ、内包されたプラスミドDNAが細胞内に導入されることがわかった。一方、サクシニル化ポリグリシドールで修飾したリポソームは、酸性条件で膜融合性となる。このリポソームはエンドサイトーシスで細胞に取り込まれると、酸性環境であるエンドソーム内で融合性となり、エンドソーム膜と融合することによって内包物を細胞質に移行させた。さらに、このリポソームをプラスミドDNA-カチオン性脂質コンプレックスと複合化することによって、細胞内にプラスミドDNAを効率よく導入する運搬体を得ることができた。さらに、温度感受性を示す両親媒性高分子ポリ(N-イソプロピルアクリルアミド)およびその共重合体で修飾したリポソームは内包物質や融合性を温度によって制御できることが明らかにされた。本研究で開発されたこれらの機能性リポソームは、細胞内に遺伝子を導入したり、あるいは部位選択的に生理活性物質を運搬する運搬体として有用であると考えられる。近年、分子生物学、分子遺伝学の発達に伴い、遺伝に関する多くの知識が集積され、遺伝の機構が分子レベルで明らかにされるようになってきた。また、ガンやエイズなどの疾病に対して、遺伝子治療が試みられつつある。遺伝子治療を治療技術として確立するためには、細胞に対する毒性が小さく、しかも目的遺伝子を効率よく細胞内に導入することが必要になる。本研究においては、膜融合によって細胞内に効率よく物質を移行させる膜融合性リポソームの開発を目的として、まずその最初のステップとして、膜融合性高分子であるポリエチレングリコール(PEG)と類似の主鎖構造をもち、側鎖にアミノ基を有するアミノプロピオニル化ポリグリシドールを合成し、この高分子で修飾したりポソームを逆相蒸発法によって調製した。このリポソームの融合性を共鳴エネルギー移動法で調べた結果、添加する高分子量を増やすと融合性は増大することが分かった。またリポソームの膜脂質にホスファチジルエタノールアミン(DOPE)を加えた場合にも、融合性は増加することが分かった。このリポソームによるCV-1細胞へのカルセインの運搬について調べた結果、より多くの高分子を添加した場合、またリポソーム膜脂質中にDOPEを加えた場合に、細胞内からより強い蛍光が観察された。またプラスミドDNAの細胞内への導入についても調べた。その結果、融合性がより高いリポソームを用いた場合ほど、細胞内におけるプラスミドDNAの発現効果がより高くなることが分かった。種々の両親媒性ポリペプチドや高分子を固定化したリポソームを調製し、その膜融合性について検討した。末端に長鎖アルキル基を結合した両親媒性ポリペプチドPoly(Glu-Aib-Leu-Aib)を合成し、このポリペプチドを固定化したリポソームの膜融合性について調べた結果、酸性条件下で融合性が増大することがわかった。一方、β-アラニンを結合した両親媒性高分子ポリグリシドールを固定化したリポソームは、その膜組成に依存してアニオン性リポソームに対して融合性を変化させることが示された。

さらに、温度感受性高分子ポリ(N-イソプロピルアクリルアミド)で修飾したリポソームは、その転移温度付近において融合性が増大することが示された。クロラムフェニコールアセチル転移酵素の遺伝子を含むプラスミドを封入したβ-アラニン結合ポリグリシドールで修飾したリポソームによる動物細胞への遺伝子導入について調べた。その結果、高い膜融合性を示す膜組成のリポソームと処理した細胞からはクロラムフェニコールアセチル転移酵素活性が見られ、内包されたプラスミドDNAが細胞内に導入されることがわかった。一方、酸性条件下で膜融合性となるサクシニル化ポリグリシドール修飾リポソームをDNA-カチオン性脂質コンプレックスと複合化させたリポソームを用いて種々の動物細胞へのルシフェラーゼ遺伝子の導入を行ったところ、細胞内での遺伝子の発現はあまり見られなかったが、この複合体にトランスフェリンを結合した場合、細胞中にルシフェラーゼ活性が発現することがわかった。細胞表面のトランスフェリンレセプターとの特異的結合によって複合体が特異的に取り込まれたのち、エンドソーム膜と融合することによって遺伝子が、細胞質内に運搬されたものと考えられる。これらの結果から、本研究で調製したこれらの膜融合性リポソームは遺伝子運搬体として有用であることが示唆された。
遺伝子サイレンシングにおける新規スプライシング関連因子の機能解析

本研究ではモデル生物として分裂酵母を用い、欠損するとヘテロクロマチン領域内の遺伝子サイレンシングに異常が確認される新規スプライシング関連因子Dog1の機能解析を行うことで、スプライシング様因子がヘテロクロマチンにおいてサイレシングという機能を担う新たなメカニズムを明らかにすることを目的とする。本年度に行なった解析で、Δdog1+の脱サイレンシングが細胞周期依存的でS期に起きていることを新たに見いだした。更にDNA複製フォークの進行に欠損があることが予想される細胞周期変異体とdog1^+の二重変異体を作製すると、その脱サイレンシングの表現型が促進されることを発見した。これらの結果は、細胞周期S期における複製フォークの挙動が、Δdog1^+の脱サイレンシングに関与している可能性を示唆している。もしもDog1がスプライシング関連因子だとすると、遺伝子サイレンシングにおいて、複製フォークとスプライシング因子の間で未知のクロストークが行なわれることを意味していることになる。また脱サイレンシングとは全く別の表現型として、複製フォークを不安定化するHUへのΔrad3^+の高感受性が、dog1^+との二重欠損株において部分的に抑制されることを見出していた。今回新たに、1Δrad3^+Δdog1^+で複製チェックポイントが再活性化されている訳ではない2ゲノム上の複製起点の発火効率はΔdog1^+で大きく変化するわけではないという結果を得た。残る可能性としてdog1^+が欠損すると複製フォークが安定化するために、HUによる崩壊が起きにくくなることが考えられる。近年、出芽酵母において「転写されている遺伝子座位を核膜孔へ繋ぐ」機構の欠損株で同様の表現型が報告されており、Δdog1^+でも同じ欠損が起きている可能性が極めて高い。これが脱サイレンシングの一因になっていることも予想される。(抄録なし)本研究ではモデル生物として分裂酵母を用い、欠損するとヘテロクロマチン領域内における遺伝子サイレンシングに異常が確認される新規スプライシング関連因子Dog1の機能解析を行うことで、スプライシング様因子がヘテロクロマチンにおいてサイレンシングという機能を担う新たなメカニズムを明らかにすることを目的とする。本年度に行なった解析で申請者は、Δdog1+の脱サイレンシングとは別の表現型として、DNA複製フォークを介して二本鎖切断を誘起するHUやCPTといったDNA損傷剤に対するrad3+(ATR kinase)欠損株の高感受性が、Δdog1+との二重欠損株において部分的に抑制されることを見出した。HUは細胞内でDNA複製フォークの不安定化を引き起こす。解析の結果、dog1+が欠損すると複製フォークが安定化するために、HUによる崩壊が起きにくくなることを示唆ずる結果が得られている。近年、出芽酵母で「転写されている遺伝子座位を核膜孔へ繋ぐ」といった遺伝子発現に関わる機構の欠損株で同様の表現型が見られることが報告されており、Δdog1+でも同じ現象が起きている可能性が極めて高い。このことは、ユークロマチン上の遺伝子発現機構で機能する因子が、ヘテロクロマチンにおいては逆に遺伝子サイレンシングという機能を担うということを意味している。更にこの解析の過程で、Δdog1+cdc25-22二重変異体ではΔdog1+による脱サイレンシングの表現型が抑制されることを発見した。またΔdog1+cdc10-M17二重変異体では許容温度条件下で脱サイレンシングが起き、準許容温度下では抑制された。この結果は、Δdog1+による脱サイレンシングと細胞周期に何かしらの関係性があることを意味している。このような細胞周期と脱サイレンシングの関係を指摘した報告は未だ嘗てなく、全く新たな機構の解明に寄与する可能性がある。

ユークロマチン上の普遍的な遺伝子発現におけるDog1^+複合体の機能解析の手がかりとして、dog1^+欠損によって複製フォークが安定化することを示唆する結果を得ることには成功しつつあるが、その実験に時間を割かれてしまい、当初の予定であったDog1複合体精製が殆ど進んでいない。しかし反面その実験過程において、当初予想していなかったΔdog1^+に見られる脱サイレンシングと細胞周期の関係性を見出したことは、今後ヘテロクロマチンにおけるDog1複合体の機能を解析していくのに非常に有力な知見となったと考えている。(1)まず来年度は上記の遅れを取り戻すべく複合体精製実験から取り組むことが必須である。(2)Δdog1^1による複製フォーク安定化という結果を、ユークロマチン上の遺伝子発現機構におけるΔdog1^1の影響へと変換する:出芽酵母において一部の遺伝子発現機構因子の欠損株で複製フォークの安定化が報告されており、Δdog1^1においても同様に、その転写装置への影響が結果として複製装置に反映されていると考えられる。よって安定化が十分に検証された後にはその結果を手がかかりに転写装置への影響を検討し、これを元に予備的な結果を得た後はChlP-seq等を用いてゲノムワイドな解析を行なう。(3)細胞周期と脱サイレンシングの関連性を解析し、ヘテロクロマチンにおいてDog1複合体が担う新規の機構を明らかにする。(抄録なし)
RNA結合蛋白を介した上皮間葉転換制御による抗癌剤耐性克服療法の開発

上皮間葉転換(EMT)は癌細胞の浸潤能亢進などに関連している。本研究では、RNA結合蛋白であるRBM5がEMTを介して抗癌剤感受性に与える影響を検討した。癌細胞においてRBM5をノックダウンさせるとEMT転写因子Snailの発現量が増加した。一方でRBM5を発現誘導するとSnailの発現量は減少した。5FU耐性癌細胞ではRBM5の発現量は減少しSnailの発現量は亢進していた。またRBM5をノックダウンさせると5FU感受性を低下させ、RBM5を発現誘導すると5FUに対する感受性を亢進させた。これらよりRBM5はSnailの発現制御を介して薬剤感受性に影響を与えていることが示唆された。消化器癌は造血器腫瘍や生殖器癌に比較して化学療法の奏効率は低く、多剤併用による強力な化学療法を行っても、進行癌においては未だに予後不良である。癌化学療法の問題点の一つに、治療により薬剤耐性細胞が出現し、再増殖を来すことがあげられる。そのため抗癌剤への感受性や耐性に関する分子機構の解明は、非常に重要な課題である。近年、上皮細胞が間葉系細胞に形態変化する現象である上皮間葉転換(Epithelial-Mesenchymal Transition:EMT)が、癌細胞の浸潤能亢進、抗癌剤耐性獲得などに関連していることが報告されているが、その機序は未だに不明な点が多い。遺伝情報の発現は、DNAから蛋白質までの様々な段階で複雑に制御されている。RNA結合蛋白質は、mRNAのスプライシング、核外輸送、細胞質内局在、安定性及び翻訳効率の調節などの転写後遺伝子発現調節において重要な働きをしている。申請者らはRNA結合蛋白RBM5が、癌抑制遺伝子p53の転写活性を亢進させることを報告した。さらに各種の癌細胞、癌組織においてRBM5の発現が低下していることを見出した。また、RBM5は癌細胞に対して、5-FUなどの各種抗癌剤の感受性を高めることも見出した。現在、RBM5の発現量により変動するRBM5下流遺伝子群の解析およびRBM5結合遺伝子を網羅的に解析し、その中から抗癌剤耐性に関与すると思われる遺伝子を抽出し、癌細胞内での機能解を行っている。今後は、これまでの研究を発展させ、抗癌剤投与中の癌細胞において、RBM5に直接結合する新規のEMT制御遺伝子を探索し、抗癌剤感受性あるいは耐性に与える影響を検討し、EMTを制御することにより抗癌剤耐性克服する治療法への応用を目指していく予定である。そのため抗癌剤への感受性や耐性に関する分子機構の解明は非常に重要である。近年、上皮細胞が間葉系細胞に形態変化する現象である上皮間葉転換(Epithelial-Mesenchymal Transition:EMT)が、癌細胞の浸潤能亢進、抗癌剤耐性獲得などに関連していることが報告されているが、その機序は不明な点が多い。RNA結合蛋白質(RBP)は、mRNAのスプライシング、核外輸送、細胞質内局在、安定性及び翻訳効率の調節などの転写後遺伝子発現調節において重要な働きをしている。また、RBM5は癌細胞に対して、5-FUなどの各種抗癌剤の感受性を高めることも解明した。現在、RBM5の発現量により変動するRBM5下流遺伝子群の解析およびRBM5結合遺伝子を網羅的に解析し、癌細胞内での機能解析が進行中である。これまでに、抗癌剤投与中の癌細胞において、RBM5が発現により変動するEMT制御遺伝子を網羅的に解析を行った。その中で新規のEMT制御遺伝子あるいは抗癌剤感耐性制御遺伝子有望なものを詳細に検討し、抗癌剤耐性克服への応用を目指していく予定である。

さらに各種の癌細胞、癌組織においてRBM5の発現が低下していることを見出した。またRBM5は癌細胞に対して、5-FUなどの各種抗癌剤の感受性を高めることも解明した。RBM5の発現量により変動するRBM5下流遺伝子群の解析およびRBM5結合遺伝子を網羅的に解析し、癌細胞内での機能解析を行った。これまでに、抗癌剤投与中の癌細胞において、RBM5が発現により変動するEMT制御遺伝子を網羅的に解析を行った。その中でEMTとの関連の報告の無い新規のEMT制御遺伝子あるいは抗癌剤感耐性制御遺伝子有望なものを詳細に検討し、抗癌剤耐性克服への応用を目指し研究を発展させている。上皮間葉転換(EMT)は癌細胞の浸潤能亢進などに関連している。本研究では、RNA結合蛋白であるRBM5がEMTを介して抗癌剤感受性に与える影響を検討した。癌細胞においてRBM5をノックダウンさせるとEMT転写因子Snailの発現量が増加した。一方でRBM5を発現誘導するとSnailの発現量は減少した。5FU耐性癌細胞ではRBM5の発現量は減少しSnailの発現量は亢進していた。またRBM5をノックダウンさせると5FU感受性を低下させ、RBM5を発現誘導すると5FUに対する感受性を亢進させた。これらよりRBM5はSnailの発現制御を介して薬剤感受性に影響を与えていることが示唆された。RBM5に結合するmRNAをRNA-結合タンパク質免疫沈降法を実施し、胃癌細胞からRBM5に特異的に結合するmRNAを回収している。しかしながらRBM5に結合しているRNAは非常に微量であり、mRNAそのものが不安定であり、定量・定性の検討が非常に困難であり、再現性の検討を慎重に行っている。またマイクロアレイによって拾い上げた幾つかの候補遺伝子が、1つの胃癌細胞株に特異的なものか、他の消化器癌細胞にも機能している普遍的なのかの見極めは簡単ではない。また一方で、これらの候補遺伝子がRBM5に特異的に作用しているのかを慎重に検討している。癌細胞において、EMTが抗癌剤による抗腫瘍効果に与える影響は、抗癌剤により様々であり、いくつかの抗癌剤に絞る必要性があることが判明した。また癌細胞の種類によっても影響度は様々であるため、普遍的な抗癌剤耐性機序に関わる分子の拾い上げは、予想以上に複雑であった。またEMTそのものが、複雑な機序で制御されており、EMT誘導因子、阻害因子の影響も単純ではないため、結果の解釈に時間を要している。いくつかの候補遺伝子は、RBM5によりその発現制御を受けていることが判明してきているが、RBM5による直接的な制御の可能性と、他の分子を介した間接的な制御の可能性もあり、その評価は単純ではないことが分かってきた。今後はこれらの未解決部分を一つ一つ解析していきたい。消化器内科現在は抗癌剤の中から消化器癌に頻用される、代表的な抗癌剤として5-FUおよびCDDPに絞り込み、胃癌細胞内における抗癌剤耐性機序の検討を行っている。また抗癌剤に対する特異性を検討するために、抗癌剤の投与時間依存性、投与量依存性を示す変動遺伝子に候補を絞り込み、細胞生物学的な検討を行っていく予定である。現在、データマイニングのアルゴリズムを改善させ、複数回のマイクロアレイに共通する変動遺伝子の抽出をさらに厳格に絞り込んでいる。
19世紀半ばから戦間期にかけてのアメリカ合衆国プロテスタントの比較宗教的探究

本年度は、昨年の問題関心であった、アメリカ合衆国における複数の宗教の並存という状況をさらに考察するため、カトリックからプロテスタントへの改宗という問題に取り組んだ。19世紀のアメリカ合衆国において、カトリックは人数の上でも、文化的にも少数派の地位にあったが、プロテスタントのアメリカ人の中からは、あえてカトリックへの改宗を選択する者も存在していた。改宗者の手記を読みながら、彼らの改宗の動機やその意味について考察を行うことによって、当時の状況をよりよく理解することに努めた。改宗は英語ではconversionであるが、これは改宗という意味のみならず、回心という訳語が充てられる場合もある。むしろ、アメリカ合衆国の宗教史においてはプロテスタントの家庭に生れた人物が、しばしば青年期に宗教体験を経ることによって、プロテスタント信仰をより深く受け入れていく、回心の意味でのconversionがもっぱら注目されてきた。conversionはこうした広い意味を持つ言葉なのである。また、これまで「宗教学」と「アメリカ宗教史」の研究を並行して行ってきたが、研究対象に対する両者の方法論や研究史、前提とされる理論はかなり異なっている。合衆国の研究者の中には両者の長所を生かしつつ著述を行う者も存在するが、多くの研究者がどちらかの伝統に則った研究を行っている状況である。本年度は今後の研究の方向性を見据えるため、研究のヒストリオグラフィを参照しながら両者の特徴と差異に注目し、非公式のものながら研究発表を行った本研究はアメリカ合衆国に対する宗教、特にプロテスタンティズムの影響を歴史的に探求しようとしたものである。特に19世紀後半から20世紀初頭にかけて、世俗的価値規範が力を増しつつあった時代のキリスト教の社会的活動への関わりに焦点を当てている。本年度は、ディーコネスと呼ばれた女性たちに注目することで、キリスト教社会改革運動の草の根的な発展に対する研究を深めた。キリスト教徒による「社会的」な活動は、明確に「宗教的」な動機に支えられることによって開始されていたこと、その視覚は隣人愛という極めて狭いものであったことを読み取ることができるが、同時に、こうした活動はアメリカ合衆国全体の革新主義の流れの中に位置していることも明らかである。宗教学的に述べれば、これは世俗的な用語と価値観によって支配されるようになるアメリカ合衆国社会の転換点にあって、宗教の実践者たちが巧みに自らの宗教を時代に即したものに組み替えて行った過程とみなすこともできる。なお、女性の運動に注目したことにより、女性と男性という、19世紀にあっては現在以上に、截然と分かたれた社会的集団に対して、宗教が持った意義と役割の差異を、きわめて明確に浮き彫りにすることができた。アメリカ合衆国の枠組み内の宗教を問うのが本研究の目的ではあるが、人間社会や集団は国家の境界を越えて活動するという認識は、近年のアメリカ研究ではますます重視されている。本年度は、実践者自身が国家という枠組みをあまり意識しない・ローカルな運動に着目したが、このローカル性が他の地理的概念的広がりを持ったより大きな文脈にどのように位置づけられていくのかと言う点が、今後の課題となるだろう。その中では特に教会対国家の衝突という、ヨーロッパにおける長い歴史を持った問題を、教会と国家の分離によって一応のところ解決した合衆国の性格が必然的に重要性を帯びるだろう。本年度は19世紀後半のアメリカ合衆国の宗教状況を、多宗教の並存という視点から理解することに努めた。そのため、研究対象をそれまでのプロテスタントから合衆国の他の宗教集団に広げ、主流のアメリカ文化べの適応、もしくは軋轢に目を向けることになった。研究の焦点として選択したのは、1893年、シカゴ万博に付随して開催された万国宗教会議である。この会議は欧米の宗教指導者のみならず、いわゆるアジアの宗教者を招聘し、アメリカ合衆国における多宗教状況が一層の広がりを示した画期的事件として取り上げられる。また会議は合衆国のプロテスタント指導者を中心に開催されたが、カトリック教徒やユダヤ教徒も包含された。多様な宗教集団が近代のもたらす変化への対応に苦慮していたこの時代に、世界の宗教者を集め、宗教間の協調をうち出した万国宗教会議はいかなる意味を持ったのだろうか。会議が一過性の影響力しか持たなかったことはしばしば指摘されるが、大会記録から見出されるのは、プロテスタントの指導者たちの予定した宗教間の調和とキリスト教の優越性の主張よりもむしろ、多様な宗教伝統固有の論理やアイデンティティの根強さであった。とりわけそれは万国宗教会議と前後して開催された、各宗教、宗派ごとの会議と対照させたときにより一層明らかになる。「宗教一般」を語ることと、「個別の宗教」について語ることは両立不可能ではないが、そこには常に齟齬や緊張が孕まれた、なお、宗教間の協力は、その「社会的」な活動、すなわち神学や儀礼と関わらない、人類の福祉への貢献において実現されるという期待は会議においてもしばしば示されていた。しかしその場合には「宗教」と「人道主義」との境界が曖昧になり、宗教自体の存立基盤が脅かされかねない。近代「世俗」社会における宗教の役割という現代にまで通じる問題は、この時代に既に投げかけられていたのである。

改宗は英語ではconversionであるが、これは改宗という意味のみならず、回心という訳語が充てられる場合もある。むしろ、アメリカ合衆国の宗教史においてはプロテスタントの家庭に生れた人物が、しばしば青年期に宗教体験を経ることによって、プロテスタント信仰をより深く受け入れていく、回心の意味でのconversionがもっぱら注目されてきた。conversionはこうした広い意味を持つ言葉なのである。また、これまで「宗教学」と「アメリカ宗教史」の研究を並行して行ってきたが、研究対象に対する両者の方法論や研究史、前提とされる理論はかなり異なっている。合衆国の研究者の中には両者の長所を生かしつつ著述を行う者も存在するが、多くの研究者がどちらかの伝統に則った研究を行っている状況である。本年度は今後の研究の方向性を見据えるため、研究のヒストリオグラフィを参照しながら両者の特徴と差異に注目し、非公式のものながら研究発表を行った
第一原理計算に基づくミルフィーユ構造のフォノン物性の解明

優れた機械的特性を示すLPSO構造型Mg合金は,ミクロなミルフィーユ構造の特徴から熱的特性を担うフォノンが強い相互作用を受けると考えられ,その固有のフォノン特性を明らかにすることはミルフィーユ構造の理解を深化させる.本研究では,電子状態からエネルギーや各原子に働く力を解析する第一原理計算を用いて,LPSO構造Mg合金に対する高精度なフォノン解析を行い,有限温度でのLPSO構造の安定性や熱的特性を明らかにする.優れた機械的特性を示すLPSO構造型Mg合金は,ミクロなミルフィーユ構造の特徴から熱的特性を担うフォノンが強い相互作用を受けると考えられ,その固有のフォノン特性を明らかにすることはミルフィーユ構造の理解を深化させる.本研究では,電子状態からエネルギーや各原子に働く力を解析する第一原理計算を用いて,LPSO構造Mg合金に対する高精度なフォノン解析を行い,有限温度でのLPSO構造の安定性や熱的特性を明らかにする.
日米共同研究によるIgG4関連疾患の国際的疾患概念の構築と新規診断法への展開

平成30年度の研究は、日米のIgG4関連疾患(IgG4-RD)の免疫学的差異について、以下の研究を行った。1)IgG4-RD患者の唾液腺における免疫細胞(ヘルパーT(Th)細胞やマクロファージ)の検索当科および米国のRagon研究所で収集したIgG4-RD患者の唾液腺を用いて、自然免疫の中心的役割を担うマクロファージとCD4陽性細胞(Th細胞)の発現と局在について検討を行った。その結果、日米ともにIgG4-RD患者の唾液腺では、シェーグレン症候群(SS)や慢性唾液腺炎(CS)患者に比べて、マクロファージではM2マクロファージ(CD163陽性細胞)が優位に浸潤していた。さらに、DNAマクロアレイおよびバリデーションにて発現上昇を認める自然免疫関連分子を検索したところ、TLR7が候補分子として抽出された。唾液腺病変におけるTLR7の発現細胞を二重蛍光染色法にて確認すると、IgG4-RD患者のみM2マクロファージとほぼ発現が一致していた。また、多重蛍光染色より免疫細胞の構成比を測定する最新の技術であるTissueFAXSTMで解析した結果、Th細胞では濾胞性T細胞(CD4+IL-4+BATF+CXCR5+細胞)およびCD陽性細胞傷害性T細胞(CD4+GZMA+TGF-β+細胞)が優位に浸潤しており、特異的な免疫細胞の浸潤パターンがIgG4-RDの唾液腺に認められた。日米間での明らかな免疫学的な差異は認めなかったが、これらの濾胞性T細胞とCD陽性細胞傷害性T細胞は、患者の血清IgG4値と正の相関を示し。IgG4-RDの病態形成に深く関与していることが示唆された。免疫学的検討にてマクロファージおよびTh細胞ともにIgG4-RDに特徴的な細胞を同定できた。IgG4-RDの診断にはキャッスルマン病や悪性腫瘍を慎重に鑑別・除外する必要がある。それは、単に「血清IgG4高値」や「病変へのIgG4陽性細胞の著明な浸潤」だけでは、鑑別疾患にも同様の現症を呈することがあるためである。また、確定診断には「包括的診断基準」と「臓器特異的診断基準」の2つの診断基準を用いないといけないため、煩雑で時間を要するのが現状である。そのため、本研究で抽出した日米共通の疾患感受性分子とその発現細胞を検索することにより、迅速で簡便な診断方法の確立に繋がることが予想される。しかし実際にIgG4-RDの診断に応用できるか否かを検証するには少なくとも数百例が必要であるが、当科を含めた本研究の共同施設のみでこの症例数を集めることは不可能である。そのため、厚労省難治性疾患克服疾患事業「IgG4関連疾患の診断基準並びに治療指針の確立を目指した研究」班に依頼して、研究班で収集した臨床データおよび組織を利用し、新規分子の検索が診断に有用か検証する予定である。平成29年度はまず臨床的データの収集・解析を中心に以下の研究を行った。1)日米のIgG4関連疾患(IgG4-RD)患者の罹患臓器および血液採取と臨床データの収集アメリカ合衆国ボストンのRagon研究所(ハーバード大学、マサチューセッツ工科大学、マサチューセッツ総合病院(MGH)の共同出資施設)に赴き、MGHに受診したIgG4-RD患者の臨床データ(現病歴、既往歴、現症、画像所見、病理所見、血液データ)を収集した。さらに、九州大学病院(日本)に受診した患者についても同様に臨床データを収集した(総数:108例)。2)日米のIgG4-RD患者の臨床データの比較検討最近のIgG4-RDの臨床論文で、本邦と欧米で臨床所見に差異があることが指摘されている。

特にキャッスルマン病との鑑別が困難なため、収集した患者に鑑別疾患が含まれていないかをIgG4-RDと鑑別疾患(キャッスルマン病や悪性リンパ腫)の病理の第一人者である岡山大学病態検査学の佐藤教授(研究分担者)により検証した。その結果、日米での平均年齢、男女比、罹患臓器数、病変局所のIgG4陽性細胞数、血清IgG4値、アレルギー疾患の有無には差異はないものの、血清CRP値が米国の症例でやや高値であった。その大きな要因は米国の症例で数例キャッスルマン病が含まれていることが考えられため、研究分担者の佐藤教授に病理診断を依頼した。その結果、キャッスルマン病と新たに診断された患者を除外すると、今回の検討では明らかな臨床的人種差は認められなかった。目標の症例数を収集できている。IgG4-RDの診断にはキャッスルマン病や悪性腫瘍を慎重に鑑別・除外する必要がある。それは、単に「血清IgG4高値」や「病変へのIgG4陽性細胞の著明な浸潤」だけでは、鑑別疾患にも同様の現症を呈することがあるためである。また、確定診断には「包括的診断基準」と「臓器特異的診断基準」の2つの診断基準を用いないといけないため、煩雑で時間を要するのが現状である。そのため、本研究で抽出した日米共通の疾患感受性分子とその発現細胞を検索することにより、迅速で簡便な診断方法の確立に繋がることが予想される。しかし実際にIgG4-RDの診断に応用できるか否かを検証するには少なくとも数百例が必要であるが、当科を含めた本研究の共同施設のみでこの症例数を集めることは不可能である。そのため、厚労省難治性疾患克服疾患事業「IgG4関連疾患の診断基準並びに治療指針の確立を目指した研究」班に依頼して、研究班で収集した臨床データおよび組織を利用し、新規分子の検索が診断に有用か検証する予定である。来年度以降の研究では、IgG4-RDの臨床的差異だけではなく、免疫学的に差異がないかを検討し、最終的には日米共通疾患関連分子を同定する。