hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
深海由来の新奇セルロース分解菌が生産するセルラーゼの特異性を探る

得られた遺伝子を元に遺伝子組換え発現による酵素の大量取得を試みた。しかし一般的に用いられる大腸菌を用いたT7系の発現系では実験対象の全てが未発現もしくはインクルージョンボディを形成する事が明らかになり詳細な解析に至らなかった。しかし、コールドショック発現系を用いる事によりセルラーゼ活性を保持した可溶性タンパク質の発現に成功した。組換え酵素を粗精製した後にキャラクタリゼーションを実施した結果、低温で高い塩濃度中で最も高い活性が得られた事から、深海という環境を考えた場合において最もリーズナブルな性質がまず確認できたと考えている。当初の予定では既知の配列から相同性が認められるセルラーゼを予測して実験を行った場合、新規性の高い特異的なセルラーゼの発見そのものが困難なのではないかと考え、pUC18などを用いてショットガン法にてセルラーゼ発現株を取得しようと考えていた。しかし発現実験にてインクルージョンボディ形成が大きな問題となった事からこの方法は困難と予想され実施しなかった。酵素深海環境で進化したセルラーゼの特異的性質に関する基礎的知見を取得する事を引き続き研究目的とする。平成26年度に引き続き、組換え酵素の取得及び精製さらなるキャラクタリゼーションを実施する。これによって生化学的な特異的性質の一旦のさらなる解明を目指す。当初の計画では予備検討で明らかになった機能未知ながら結晶性セルロースと混合すると塩依存的にセルロース表明への親和性が示唆された配列をターゲットに部位特異的変異導入などを用いて結合に必要なアミノ酸の同定を目指す予定であった。しかしながらGE09株のセロビオハイドロラーゼのN末側にこれまでセルラーゼでは全く報告の無い機能ドメインを保持している可能性が、詳細な構造予測の結果から明らかになったことからこれをターゲットとする。具体的には各種の海洋性物質との相互作用の分析、部位特異的変異導入を用いての作用に必須なアミノ酸の同定を目指す。これによってより分子生物学的知見の取得を目指す。また複数の遺伝子について、酵素活性において重要な触媒ドメインのプロトンドナーであるアスパラギン酸残基の置換が認められた事からセルラーゼ活性を保持している可能性が低いという結果が得られた。しかし極めて新規性の高い触媒ドメインの構造である可能性も否定はできない。そこでこの酵素についても発現及び酵素活性の有無などの確認を行う。また仮にセルラーゼ活性が確認できた酵素については上述の実験と同様に部位特異的変異導入を用いて触媒残基の同定を目指す。新規性の高い特異的なセルラーゼの発見のために、pUC18などを用いてショットガン法にてセルラーゼ発現株を取得する計画であった。しかし研究結果から大腸菌発現系のインクルージョンボディ形成が大きな問題となった事からこの方法は困難と予想され実施しなかった。そのため組換え株の液体培養に必要と考えていた機器及び遺伝子試薬の一部に関して導入を見合わせた。さらに多量の酵素精製に利用予定であった機器も同様に見合わせた。またそれに伴い学会参加も1回だけとなり旅費等についても未使用額が生じた。セルラーゼ遺伝子の部位特異的変異導入後の組換え
ヘムプロピオン酸側鎖が関与するヘムタンパク質の高次構造形成と機能発現機序の解明

ヘムタンパク質は、補欠分子であるヘム(鉄ポルフィリン錯体)がタンパク質マトリクスと結合し、様々な機能を発現している生体分子である。このヘムは2本のプロピオン酸側鎖を有し、プロピオン酸側鎖はタンパク質のアミノ酸側鎖と水素結合ネットワークを形成している。今回、ヘムタンパク質の1つであるチトクロムP450camに着目し、そのプロピオン酸側鎖の酵素活性に対する役割の解明を行った。特に、片方のプロピオン酸(7位)と相互作用しているアミノ酸(Asp297)に着目し、変異体D297Lの挙動を検討した。この変異体は、活性が非常に低下し、resting state(休止状態)で存在する基質結合部位の水クラスターが、酵素外部に排出される過程が極めて遅いことを実験及び計算結果から明らかにした。したがって、Asp297は酵素内に存在する水排出は、このプロピオン酸-Asp297のネットワークが深く関与していることを主張するに至った。これまで、チトクロムP450camのカンファー水酸化の触媒反応において、最初のステップである水の排出機構については、殆ど言及されていなかったため、今回の研究成果は今後の酵素中での水の動的役割において、新たな知見を与えるものと期待される。さらに、チトクロムP450camだけでなく、代表的なヘムタンパク質であるHRP(西洋ワサビペルオキシダーゼ)についても、ヘムプロピオン酸側鎖の役割解明に着手した。こちらは、2本のプロピオン酸側鎖の片方が欠損した片足ヘムをアポ化したペルオキシダーゼに挿入した再構成タンパク質を調製し、その構造と活性の評価を行った。その結果、6位プロピオン酸は、タンパク質の中でヘムを安定化する重要な働きを示すこと、また活性の制御に役立っていることが明らかとなった。一般に、ヘムタンパグ質の補欠分子ヘムに結合する2本のプロピオン酸側鎖は、タンパク質へのヘム分子の固定の役割を演じていると見なされている。しかし、幾つかのヘムタンパク質の結晶構造を眺めてみると、活性部位に近接した箇所で、プロピオン酸側鎖は酵素機能に密接に関与したアミノ酸残基と相互作用しており、タンパク質機能そのものの制御に重要な役割を果たしている可能性がある。そこで今回、ヘムタンパク質内のヘムプロピオン酸側鎖の役割を明らかにするため、ヘム6位及び7位プロピオン酸側鎖を欠損した「片足ヘム」を多段階で合成した。次にアポ化したヘム酵素(チトクロムP450cam)に得られたヘムをそれぞれ挿入し、再構成体を調製した。この再構成タンパク質に関して十分な精製を行った後に、(1)構造的研究:結晶構造解析、^1HNMR測定、EPR測定、ラマン測定(2)物性的研究:ヘム鉄の酸化還元電位測定、基質の結合定数算出、タンパク質の安定性評価(3)反応的研究:生成物解析、電子移動速度(還元速度)評価に関する実験を実施した。その結果、ヘム7位欠損体を有するタンパク質の場合、基質結合部位に水分子が侵入し、d-camphorの結合定数が大きく低下し、触媒反応が劇的に減速した。以上の実験を通じ、特に7位プロピオン酸側鎖は、アミノ酸側鎖(Asp297,Arg299)と水素結合ネットワークを形成し、基質(d-camphor)の親和力を維持するために重要な役割を果たしていることが判明した。
Duchenne muscular dystrophyにおける知的障害の病態解明

Duchenne型筋ジストロフィー(以下DMD)は,dystrophin遺伝子変異による当該蛋白の欠損あるいは異常を原因とするX連鎖性劣性遺伝疾患で,筋症状に加え高頻度に知的障害を合併することが報告されているが,その発症のメカニズムは不明である。本研究は,DMDにおいて知的発達障害が生じるメカニズムの解明を目的とする。DMD症例を知的障害非合併群(IQ>85,n=4),高度知的障害合併群(IQ<40,n=2)に分類し,対照群を加え,病理解剖脳組織を用いて,神経病理学的,分子生物学的検索を行った。DMD脳,対照脳から前頭葉皮質の細胞膜画分あるいは細胞総蛋白を抽出,western blot analysisにより,dystrophin isoformであるDp71の発現解析を行った。知的障害高度群の一例において,Dp71の発現が細胞膜画分および細胞総蛋白で欠損,定量RT-PCRにより,Dp71mRNA発現低下(80%)を認めた。本例では,Dp71の塩基配列解析の結果,exon69にC端がstop codonとなる点突然変異が確認された(C1033T)。他例では,細胞膜画分,細胞総蛋白ともにDp71の中等度低下,Dp71mRNA発現低下(20%)を認めるとともに,β-dystroglycanの欠損,膜分画でのsyntrophinの高度減少が見られ,dystrophin-associated protein complex(DAPC)に異常がある可能性が示唆された。Dystrophin免疫蛍光染色では,対照群で,皮質神経細胞にdystrophin,β-dystroglycanの共発現が見られたが,知的障害高度群では,当該分子の発現は高度低下ないし欠損していた。知的障害非合併DMD群,対照群では,Dp71,Dp71mRNAの発現,DAPCに異常は見られなかった。DMDの知的障害発症機序には,Dp71に加え,DAPCの発現が重要であると考えられた。
分子認識と相分離を利用する易水容性分子の水溶液からの高効率分離回収法

当研究の目的は新規ホスト分子チアカリックスアレーン(TCA)の易水溶性分子に対する包接能を活用し,その高効率分離回収法の可能性を検討するところにある.前年度までに1.ゲスト分子の適用限界の調査,2.包接機構の解明を行った.本年度は3.TCAの分子修飾による包接能の高度化を検討した.3.TCAの分子修飾による包接能の高度化TCAは溶液中でコンホメーション変換運動をしており,これは易水溶性分子の包接能を弱めていると予想できる.そこで分子修飾を施し,コンホメーションの動的な揺らぎを制限することを企図した.まず,分子修飾としてTCAのフェノール性OHの一つをアルキル化し,OCH_2COOHとした.アルコールやケトン,ニトリルなど水溶性ゲストに対する包接能を調べた.TCAの場合より大きなゲスト分子に対して高い包接能を示したが,TCAモノカルボン酸はより小さなゲストに対し,高い包接能を示した.特にメタノールに対し10^2M^<-1>を越える大きな包接能を示した。これはモノアルキル化の結果,空孔の形状が制御され,あるいは空孔サイズが制限され,小分子の包接に適合したと考えた.一方大きなゲスト分子は生成したホストゲスト錯体において疎水的アルキル部位を空孔の外に露出するため,不安定となると考えた.一方,TCAの最大の特徴である,金属イオンとの錯形成能を利用し,TCAのフェノール部位を固定した.Cu(II),Cd(II)イオンのTCA錯体について易水溶性分子の包接能を評価した.その結果TCAに比べ,錯体は一桁程度の包接能の向上を示すことがわかった.これは統計的な効果を上回る包接能の向上であり,コンホメーション固定の効果と考えられる.以上から易水溶性分子のホスト設計の指針が得られ,これを塩析などの相転移と組み合わせれば,易水溶性分子の分離回収技術の開発につながると考えられる.当研究の目的は新規ホスト分子チアカリックスアレーン(TCA)の易水溶性分子に対する包接能を用い,その高効率分離回収法の可能性を検討するところにある.当年度は下記を検討した(1)易水溶性分子の適用限界の調査水溶液中でのTCAの包接および塩析を通して得られた塩析物を重水に溶解させ,TCAに対する易水溶性ゲスト分子の平均結合数nを調査した.アルコール(ジオールを含む),ケトン,エーテル(環状を含む),エステル,アルデヒド,アミン,ニトリル,ニトロ化合物,DMSO,DMFなど,検討したゲストの多くについて,n【approximately equal】1であることが分かつた.ホスト分子としてTCAと従来のメチレン鎖型カリックスアレーン(CA)を比較すると,全般にTCAの方が多くのゲストに対して優れた包接能を示していた.(2)包接・塩析機構の調査包接機構に関しては,エタノール包接錯体のX線結晶構造解析を行い,空孔内での疎水性相互作用と共に,ホストのスルホ基とゲストの極性基の間の極性相互作用が重要であることを明らかにした.たとえば,直鎖アルコールに対するTCAの包接能は以下の序列であり,上記の二つの相互作用が効果的に働くためにはアルキル鎖長が重要であることを示している.CH_3OHの例外的な挙動は,ゲストの水との親和性が大きいこと,および上述のように分子容から疎水性相互作用が効果的に働かないためと結論される.一方1,4-ジオキサンの塩析生成物は1:2(H/G)の組成であった.これについて結晶構造解析の結果,ゲスト分子がTCAの対イオンNa^+に配位していること,さらにTCAのOH基と水素結合していることを明らかにした.当研究の目的は新規ホスト分子チアカリックスアレーン(TCA)の易水溶性分子に対する包接能を活用し,その高効率分離回収法の可能性を検討するところにある.前年度までに1.ゲスト分子の適用限界の調査,2.包接機構の解明を行った.本年度は3.TCAの分子修飾による包接能の高度化を検討した.3.TCAの分子修飾による包接能の高度化TCAは溶液中でコンホメーション変換運動をしており,これは易水溶性分子の包接能を弱めていると予想できる.そこで分子修飾を施し,コンホメーションの動的な揺らぎを制限することを企図した.まず,分子修飾としてTCAのフェノール性OHの一つをアルキル化し,OCH_2COOHとした.アルコールやケトン,ニトリルなど水溶性ゲストに対する包接能を調べた.TCAの場合より大きなゲスト分子に対して高い包接能を示したが,TCAモノカルボン酸はより小さなゲストに対し,高い包接能を示した.特にメタノールに対し10^2M^<-1>を越える大きな包接能を示した。これはモノアルキル化の結果,空孔の形状が制御され,あるいは空孔サイズが制限され,小分子の包接に適合したと考えた.一方大きなゲスト分子は生成したホストゲスト錯体において疎水的アルキル部位を空孔の外に露出するため,不安定となると考えた.一方,TCAの最大の特徴である,金属イオンとの錯形成能を利用し,TCAのフェノール部位を固定した.Cu(II),Cd(II)イオンのTCA錯体について易水溶性分子の包接能を評価した.その結果TCAに比べ,錯体は一桁程度の包接能の向上を示すことがわかった.

これは統計的な効果を上回る包接能の向上であり,コンホメーション固定の効果と考えられる.以上から易水溶性分子のホスト設計の指針が得られ,これを塩析などの相転移と組み合わせれば,易水溶性分子の分離回収技術の開発につながると考えられる.
超音波測定による長期臥床切迫早産妊婦の筋力の経時的な変化

20代女性の大腿四頭筋筋力と大腿四頭筋筋厚を測定した。2つの間には有意な相関が認められ、大腿四頭筋筋厚が若年女子の大腿四頭筋筋力の指標となりうることを確認した。次に、妊婦の大腿四頭筋筋厚を妊娠・出産後まで経時的に測定した。大腿四頭筋筋厚は妊娠28週から妊娠37週にかけて明らかに増加していたが、出産を機に急速に減少し、産後1ヶ月時点でも回復していなかった。最後に、切迫早産で入院した臥床妊婦の大腿四頭筋筋厚を経時的に測定した。切迫早産妊婦の大腿四頭筋筋厚は入院後に明らかに減少していた。臥床は妊婦の大腿四頭筋筋厚に影響することが示唆された。本研究の目的は、切迫早産妊婦及び正常妊婦の大腿四頭筋筋厚を超音波診断機器を用いて縦断的に測定し、妊娠中の安静臥床が妊婦の下肢筋力にどのように影響するかについて明らかにすることである。以上の研究目的を遂行するために、以下の手順で実施することとした。1.切迫早産妊婦の大腿四頭筋筋厚を縦断的(入院時、入院後は出産まで1回/週、出産1日、出産5日、出産1ケ月)に調査してデータを蓄積し、特徴を明らかにする2.正常妊婦の大腿四頭筋筋厚を縦断的(妊娠22週以降、出産入院時、出産1日、出産5日、出産1ケ月)に調査してデータを蓄積し、特徴を明らかにする。3.切迫早産妊婦の大腿四頭筋筋厚のデータと正常妊婦の大腿四頭筋筋厚のデータの比較から、妊娠中の安静臥床による下肢筋力の継時的な変化について明らかにする。平成25年度の実施計画は、上記1.及び2.について夫々約25名程度を対象に測定を実施することであった。実施前に、若年女性の大腿四頭筋筋厚が大腿四頭筋筋力を反映するかどうかについて予備調査を実施した。20代女性19名(健常肢34肢)を対象に実施した結果、大腿四頭筋筋厚と大腿四頭筋筋力の間に有意な正の相関(0.47、p<0.01)を認めた。倫理委員会承認後に妊婦を対象に事前調査を実施したが、測定時の体位の違いが(特に、妊娠末期のセミファラー位))が測定値にわずかながら誤差を生じさせることが明らかになった。測定体位について再検討し、妊娠中から産褥1ケ月まで一定の測定体位(30度のセミファラー体位)で実施することにした。現在、正常妊婦を対象に縦断的調査を開始している。本研究の目的は、切迫早産妊婦及び正常妊婦の大腿四頭筋筋厚(下肢筋力と相関があることから、下肢筋力を反映する指標の1つとされている)を超音波診断機器を用いて縦断的に測定し、妊娠中の安静臥床が妊婦の下肢筋力にどのように影響するかについて明らかにすることである。平成26年度の実施計画は、1切迫早産妊婦の大腿四頭筋筋厚を縦断的に測定する、2正常妊婦の大腿四頭筋筋厚を縦断的に測定する、ことであった。平成26年度は、正常妊婦38名について経時的に測定を行った。正常妊婦の大腿四頭筋筋厚は、妊娠28週では29.63mm、妊娠34週では31.48mm、妊娠37週では33.14mmと推移していた。これまで、妊娠中には妊婦の下肢筋力は低下すると考えられていたが、妊娠末期においては、妊娠経過に伴い大腿四頭筋筋厚は増加することが明らかになった。一方、正常褥婦の大腿四頭筋筋厚は、妊娠37週では32.24mm、産褥4日では31.71mm、産後1ヶ月では30.20mmと推移していた。正常妊婦においては、産褥1ヶ月の大腿四頭筋筋厚は経時的に減少することが明らかになった。当初の研究場所は「大学病院」であったが、正常妊産褥婦がほとんど存在しないことから、正常妊産褥婦の多い「市内の産科クリニック」に研究場所を変更して、まずは正常妊産褥婦の大腿四頭筋筋厚を測定した。現在は、研究場所を「大学病院」に戻し、切迫早産妊婦を対象に大腿四頭筋筋厚の縦断的調査を開始している。本研究の目的は、切迫早産妊婦及び正常妊婦の大腿四頭筋筋厚(下肢筋力を反映する指標)を超音波診断機器を用いて縦断的に測定し、妊娠中の安静臥床が妊婦の下肢筋力にどのように影響するかについて明らかにすることである。最終年度である平成27年度は、切迫早産で入院中の妊婦(安静臥床中)の大腿四頭筋筋厚(大腿直筋筋厚及び中間広筋筋厚)を超音波診断機器を用いて縦断的に測定した。その結果、入院日数(安静臥床日数)の経過に伴う右肢大腿直筋筋厚、右肢中間広筋筋厚及び左肢大腿直筋筋厚の有意な減少を認め、安静治療により廃用性筋委縮を生じていることが示唆された。【研究期間全体を通じて実施した研究の成果】初年度(平成25年度)は、高齢者の下肢筋力を反映する指標の1つである大腿四頭筋筋厚が若年女性においても下肢筋力を反映する指標になるかについて調査を実施した。

20代女性を対象に行った調査で、大腿四頭筋筋力と大腿四頭筋筋厚間に有意な相関を認め、大腿四頭筋筋厚を若年女子の下肢筋力の指標にすることの妥当性を確認した。次年度(平成26年度)は、正常妊婦の大腿四頭筋筋厚を縦断的に測定し、大腿四頭筋筋厚が妊娠経過によってにどのように変化していくかについて明らかにした。正常妊婦の大腿四頭筋筋厚は、妊娠28週では29.63mm、妊娠34週では31.48mm、37週では33.14mmと推移しており、妊婦の大腿四頭筋筋厚は妊娠末期においては、妊娠経過に伴い増加することが明らかになった。最終年度(平成27年度)の結果を含めた一連の研究から、妊娠中の安静臥床が妊婦の下肢筋力に廃用性筋委縮を生じさせることを明らかにすることができた。20代女性の大腿四頭筋筋力と大腿四頭筋筋厚を測定した。2つの間には有意な相関が認められ、大腿四頭筋筋厚が若年女子の大腿四頭筋筋力の指標となりうることを確認した。次に、妊婦の大腿四頭筋筋厚を妊娠・出産後まで経時的に測定した。大腿四頭筋筋厚は妊娠28週から妊娠37週にかけて明らかに増加していたが、出産を機に急速に減少し、産後1ヶ月時点でも回復していなかった。最後に、切迫早産で入院した臥床妊婦の大腿四頭筋筋厚を経時的に測定した。切迫早産妊婦の大腿四頭筋筋厚は入院後に明らかに減少していた。臥床は妊婦の大腿四頭筋筋厚に影響することが示唆された。当初計画していた、大学内の研究施設(大学病院)の妊産褥婦には何らかの異常を合併している者が多く、対照群となる研究対象者(正常妊産褥婦)を確保することができなかった。そのため、研究場所を、正常妊産褥婦の多い市内の産科クリニックに変更した。2ケ所で同時に調査することは不可能であったため、平成26年度は研究対象者を正常妊産褥婦に絞り、調査を行った。このことが、現在までの達成が遅れている理由である。助産学・母性看護学研究分担者及び研究協力者は、超音波診断機器の測定技術につい十分に熟達している。研究場所である大学病院の研究協力者とさらに連携を深め、研究を推進していく。研究を開始するにあたり、先行文献について再度見直しを行ったところ、「若年女性では、大腿四頭筋筋厚の個人差が小さく測定の分布範囲が狭いために、大腿四頭筋筋厚と大腿四頭筋筋力とでは統計的に相関が出にくい」との報告を認めた。そこで、研究方法についての妥当性を確実にするために、研究開始前に、20代女性19名を対象に大腿四頭筋筋厚が大腿四頭筋筋力を反映するかどうかについての調査を実施した。調査の結果、大腿四頭筋筋厚が大腿四頭筋筋力の指標になることを確認することができたが、このため、研究開始が遅れてしまう結果となった。また、倫理委員会承認後に妊婦を対象にプレテストを実施した結果、測定時の体位の違いが(特に、妊娠末期のセミファラー位の角度のわずかな違い)が測定値に誤差を生じさせることが明らかになった。そのため、測定体位について再検討し、妊娠中から産褥1ケ月まで一定の測定体位(30度のセミファラー体位)で実施することにした。以上の2点が、現在までの達成度が遅れている理由である。そのため本来の対象者である切迫早産患者25名の調査を行うことができず、対象者数が少なくなってしまった。全体の対象者数が少なくなった分、謝金および人件費が減額となった。研究分担者及び研究協力者は、超音波診断機器の測定技術について十分な研修を受け、一致率はほぼ100%になっている。今年度は、研究場所である病院の研究協力者とさらに連携を深め、研究を推進していく。
火山地域における巨大地すべりと水蒸気爆発の発生要因・頻度・関連性

地質,年代測定,岩石学的調査により,火山地域での水蒸気爆発と地すべりの発生要因,頻度,関連性を明らかにした.水蒸気噴火と地すべりが相互に関連する場合としない場合があり,さらに,マグマ上昇と関連する場合もある.鳥海火山については,精査に基づき過去4500年間の発生頻度と巨大地すべりの関連性を明らかにした.蔵王火山については,1895-96年噴火の発生要因や短期間での噴火推移を明らかにした.(200字)地質,年代測定,岩石学的調査により,火山地域での水蒸気爆発と地すべりの発生要因,頻度,関連性を明らかにした.水蒸気噴火と地すべりが相互に関連する場合としない場合があり,さらに,マグマ上昇と関連する場合もある.鳥海火山については,精査に基づき過去4500年間の発生頻度と巨大地すべりの関連性を明らかにした.蔵王火山については,1895-96年噴火の発生要因や短期間での噴火推移を明らかにした.(200字)本研究では,水蒸気噴火と巨大地すべりの頻度・要因・関連性を明らかにするために,野外調査および室内分析を行っている.本年度は,本研究に関連する分析設備の設置(他の予算による)に重点をおきつつ,火山地質の基礎調査を主に行った.研究対象である東北の火山(八甲田,月山,白鷹,蔵王,鳥海,栗駒,乳頭高倉,恐山,安達太良山)等の噴火活動や地下現象の推移について,野外調査,室内分析,文献調査を基に調査し,一定の成果を挙げている.特に,鳥海山については,巨大地すべりと噴火の関連性が明らかになりつつある.そのため,22年度に集中調査を行う対象とする.また,巨大地すべりについては,その地質要因について,栗駒山を例に調査を行った.火山地域における巨大地すべり,水蒸気爆発の発生要因・頻度・関連性を明らかにするため,東北日本に分布するいくつかの活火山をフィールドとし,調査を行った.2010年度は,特に鳥海火山,蔵王火山に焦点絞って研究を行った.これらの火山については,水蒸気噴火の頻度と発生要因が明らかになった。水蒸気噴火の頻度はマグマ噴火よりも頻発し,火山活動としては高頻度現象であることが明らかとなった.これは,火山活動の中では低頻度現象である巨大地すべりとは対照的である.水蒸気噴火は火山直下の熱水系に由来することが多く,マグマ上昇が関与する事例とそうではない事例がある.巨大地すべりが引き金となる熱水系の破壊によっても水蒸気噴火が発生する当該年度およびそれまでの研究成果を総合的に判断すると,上記の結論が多くの火山に対して一般化できる.その結論は,査読付論文として受理されており,地質学雑誌に掲載予定である火山周辺で発生した巨大地すべりと水蒸気爆発について,その要囚,発生頻度,因果関係を,地質学・地形学・地球物質科学・年代測定といったアプローチによって明らかにし,今後の災害予測に役立つ知見を得ることが本研究の目的であった.当該年度は計画通り鳥海火山と蔵王火山について集中的に調査を行った.野外観察調査,年代測定(AMS),試料分析(粒度分析,SEM,EPMA)を行った.これにより鳥海山については水蒸気噴火の発生頻度,発生要因,巨大地すべりとの因果関係を明らかにし,その成果を公表した(論文2編と学会発表1件).蔵王火山については最新の水蒸気噴火の発生要因について明らかにし,現在国際誌へ論文一編を投稿中である.鳥海山では数十年に一度噴火が発生しており,その多くはマグマと熱水系由来物質を放出していることが明らかとなった.2500年前の巨大地すべり発生直後には,一時的に熱水系由来物質を放出する水蒸気噴火の頻度が上がったことが明らかとなった.蔵王火山では,明治28年に火口直下の熱水系由来物質を放出する水蒸気噴火が発生しており,地すべり等とは無関係に,マグマ貫入により噴火が生じている.当該年度が最終年度であり,期間内全体を通して次の知見が得られた.多くの水蒸気噴火は火山体内部の熱水系を起源としており,地すべりと関連してる場合と関連していない場合があり,いずれの場合もマグマ貫入を伴う場合と伴わない場合がある.この知見を学術論文として公開した.
脳虚血・還流後のアドレナリン、バゾプレッシンの脳保護効果

アドレナリンとバゾプレッシンは心肺停止時に使用することが推奨されていた。この研究の目的は、アドレナリンとバゾプレッシンが正常な脳血管に与える影響と、脳虚血再灌流後の脳血管に与える影響を調べることである。アドレナリンとバゾプレッシンは正常な脳血管に与える影響を認めなかった。アドレナリンはバゾプレッシンとコントロールと比較し、脳虚血再灌流後の脳血管収縮に拮抗する作用を認めた。本研究の目的は、心肺蘇生時に使用されるアドレナリン、バソプレッシンが、心肺蘇生後再灌流時の脳血流や蘇生後の脳組織にどのような作用をおよぼしているか調べることである。蘇生後に類似した脳虚血・再灌流を行ったニホンシロウサギに対して、吸入麻酔または静脈麻酔下でアドレナリンまたはバゾプレッシンが脳血管径、脳血流量などに与える影響をcranial window法を用いて検討していく。今年度は、静脈麻酔下でアドレナリンまたはバゾプレッシンが正常脳血管に直接与える影響を調べた。また、静脈麻酔下で、アドレナリンまたはバゾプレッシンが脳虚血・再灌流後の脳血管に対し直接与える影響を調べた。正常脳血管に対して、10-9, 10-7,10-5, 10-4 mol/Lのアドレナリン、または10-11, 10-9, 10-7, 10-6 mol/Lのバゾプレッシンをcranial window内に投与した。アドレナリン、バゾプレッシンともに、いずれの濃度においても脳血管径に対して有位な影響を与えなかった。次に脳虚血・再灌流後の脳に対して、10-5 mol/Lのアドレナリン、または10-7 mol/Lのバゾプレッシン、またはコントロールとして脳灌流液をcranial window内に投与した。バゾプレッシンはコントロールと比較して脳血管径に与える影響を認めなかった。アドレナリンはコントロールと比較して、脳虚血・再灌流後の脳血管の収縮に対して拮抗する作用を認めた。本研究の目的は、心肺蘇生時に使用されるアドレナリン、バゾプレッシンが心肺蘇生後再灌流時の脳虚血や脳組織にどのような影響を及ぼしているのかを調べることである。蘇生後に類似した脳虚血・再灌流を行ったニホンシロウサギに対してアドレナリンまたはバゾプレッシンが脳血管径、脳血流量などに与える影響をcranial window法を用いて検討している。平成25年度、脳虚血再灌流後の脳に対してアドレナリン、バゾプレッシン、脳灌流液(コントロール)をcranial window内に投与した。バゾプレッシンはコントロールに比べ脳血管径に与える影響を認めなかったが、アドレナリンはコントロールに比べ虚血再灌流後の脳血管収縮に対して拮抗する作用を認めた。このアドレナリン投与による血管収縮による作用がα1、α2、β1、β2どの作用によるものなのか不明である。H26年度、これを解明するための追加実験を行った。β1拮抗薬であるlandiololは脳脊髄保護作用があることが報告されていることからcranial window内にlandiololとアドレナリンを併用投与とアドレナリン単独投与で比較検討した。landiololとアドレナリン併用投与群はアドレナリン群と比較し、脳虚血再灌流後の血管収縮に拮抗する作用を認めた。アドレナリンは脳虚血再灌流後の血管収縮に拮抗する作用を認めた。これは、アドレナリンのα1、α2、β1、β2どの作用によるものなのか不明である。当初の実験に加え、アドレナリンの持つβ1作用を調べるための追加実験をlandiololを用いて行ったため、実験の進行が遅れている。さらにlandiololが脳虚血再灌流後の血管収縮にどのように作用するか調べたため、実験の進行が遅れている。本研究の目的は、心肺蘇生時に使用されるアドレナリン、またはバゾプレッシンが心肺蘇生後再灌流時の脳虚血にどのような影響を及ぼしているのかを調べることである。蘇生後に類似した脳虚血再灌流を行ったニホンシロウサギに対し、アドレナリンまたはバゾプレッシンが脳血管径、脳血流量などに与える影響をcranial window法を用いて検討した。平成25年度、脳虚血再灌流後の脳に対して、アドレナリン、バゾプレッシン、脳灌流液(コントロール)をcranial window内に投与した。バゾプレッシンはコントロールに比べ有意差を認めなかった。アドレナリンはコントロールに比べ虚血再灌流後の脳血管収縮に対し拮抗する作用を認めた。アドレナリンの血管収縮に拮抗する作用が、α1、α2、β1、β2のどの作用によるものか不明である。H26年度はこれを解明するための追加実験を行った。β1拮抗薬であるlandiololは脳脊髄保護作用があることが報告されていることから、cranial window内にlandiololとアドレナリン併用投与と、アドレナリン単独投与で比較検討した。landiololとアドレナリン併用投与は、アドレナリン単独投与と比較し血再灌流後の脳血管収縮に対して拮抗する作用を認めた。H27年度はlandiololが脳虚血再灌流後の血管与える影響を調べるため、landiololを脳虚血後のcranial window内に投与した。landiololはコントロールに比べ脳虚血再灌流後の脳血管収縮に対して拮抗する作用を認めた。

H28年度はH25年度に行ったアドレナリン、バゾプレッシン、脳灌流液(コントロール)が脳虚血後の脳血管に与える影響を行ったが、一群あたりの標本数が少なく論文か困難と考え追加実験を行った。1群あたり7匹となり統計を行った結果、H25年度と同様の実験結果を得た。アドレナリンとバゾプレッシンは心肺停止時に使用することが推奨されていた。この研究の目的は、アドレナリンとバゾプレッシンが正常な脳血管に与える影響と、脳虚血再灌流後の脳血管に与える影響を調べることである。アドレナリンとバゾプレッシンは正常な脳血管に与える影響を認めなかった。アドレナリンはバゾプレッシンとコントロールと比較し、脳虚血再灌流後の脳血管収縮に拮抗する作用を認めた。アドレナリンは脳虚血再灌流後の血管収縮に拮抗する作用を認めた。これは、アドレナリンのα1、α2、β1、β2どの作用によるものなのか不明であり、これを解明するための追加実験を行っていく。おおむね当初の計画通り実験は遂行できている。当初購入予定であったモニターは、故障もなく使用できる状況であったため購入を見送った。そのほかは当初の予定通り、実験にかかる消耗品などを購入した。引き続き、ニホンシロウサギの購入や、必要な薬剤物品の購入に充てる。本年度は吸入麻酔下でバゾプレッシンまたは、アドレナリンをcranialwindowに投与し脳血管に与える影響を調べる予定である。来年度は、バゾプレッシンまたは、アドレナリンを静脈内投与し脳血管に与える影響を調べる予定である。古くなったモニターの一部故障していたため購入を検討したが、部品を交換することで使用できるようになったため、昨年度は購入を見送った。モニターの購入や、脳組織染色を行うための物品、そのほか必要な物品の購入に充てる。
細胞外タンパク質品質管理システムの実証と研究基盤創出

細胞外タンパク質分解経路の分子メカニズムを解き明かすため、関連する細胞外シャペロン、基質、受容体がどのような結合様式によって選択的分解を発揮するのか調べる。また細胞外タンパク質として分解される基質の指向性を、特に疎水性度に着目して、基質選択性の範囲を同定して、細胞外不良タンパク質の選別方法を解き明かす。これらの研究を進めることで細胞外、つまり血液内のタンパク質品質管理システムの研究基盤の確立を狙う。
軌道自由度をもつ遷移金属磁性体のバルク敏感光電子分光

多軌道の電子が伝導を担う以下の化合物: (i)磁性形状記憶合金材料Ni2MnGa、(ii)高いネール点を示す反強磁性体の候補材料MnRh、(iii)ハーフメタル候補材料CrO2、(iv)反強磁性相と空間相分離を示す鉄系超伝導体KxFe2-ySe2、(v)スピン軌道相互作用の顕著な新規層状超伝導体La(O,F)BiS2に対して、電子状態を直接観測できる光電子分光を用い、その物性のメカニズムをバルク電子状態から理解する研究を行った。光電子分光法を用いた遷移金属磁性体の電子状態研究として、以下を行った。1.装置改良:マニピュレータに直接搭載する真空中劈開用ブレードつき基板を作成した。マニピュレータ先端部の設計を行った。熱輻射シールドの設計、作成を行った。コイルによる外部磁場印加前後における装置内部の(残留)磁化測定と分解能への影響を確認し、磁場印加による悪影響がないことを確認した。2. Ni基ホイスラー合金の偏光制御硬X線光電子分光:SPring-8 BL-19LXUにおいて、Ni_2_MnGa試料に対して、Ni s電子あるいはd電子を強く観測する2通りの偏光を励起光とした光電子分光測定を行った。その結果、構造相転移の前後で、両偏光を用いたスペクトルがフェルミ準位近傍の同様なエネルギーにおいて変化していることを見出した。また、表面敏感な測定で報告されている構造相転移の前駆現象的振る舞いは、バルク敏感な本測定では観測されなかった。3. Ni基ホイスラー合金の第一原理計算および実験との比較:Ni_2_MnGaに対してバンド計算を行い、各電子軌道の部分状態密度を求めた。2の実験結果との比較の結果、両者はフェルミ準位上の強度を除いて定性的のみならず定量的に良い一致を示した。この計算結果を基に実験結果の解釈を行い、Ni基ホイスラー合金における構造相転移の起源について議論した論文を投稿中である。4. MnRhの光電子分光:反強磁性転移・マルテンサイト変態を示すMnRhに対して、SPring-8 BL-19LXUにおいて光電子分光測定を行った。その結果、相転移の前後で電子状態の変化を観測し、低温相においてフェルミ準位近傍の電子状態が擬ギャップ的振る舞いを示すことを見出した。バンド計算との比較を行い、相転移が電子状態のエネルギー利得という観点で定性的に理解できると議論した。光電子分光法を用いて、多軌道の電子が伝導を担う系の物性を電子状態から理解することを目的として、以下の化合物における電子状態の研究を行った。Ni2MnGaでは前年度得た実験結果をもとに、局在的なNi 3d電子と遍歴的なs,p電子との混成について第一原理計算との対応から議論した。その結果、Ni 3d電子は立方晶で軌道縮退しているeg電子の存在確率が高い方向に位置する最近接Ni 4s電子と強く混成し、構造相転移に伴う混成強度の変化が軌道縮退を解いて系を安定化していると結論した。この結果について、論文を作成中である。また、関連物質Co2NbSnやNi2Mn1+xSb1-xの光電子分光において、Ni2MnGa同様の電子状態の構造相転移に伴う変化を観測した。スピネル化合物の入手が困難と判明したため、以下のp,d電子系化合物の研究を行った。CrO2は、Cr 3d電子が100%スピン偏極を示す候補材料である。バルク敏感なスピン分解光電子分光を行い、CrO2由来のバンドにおいて少数スピン状態のエネルギーギャップの存在と100%近いスピン偏極、およびその昇温における変化を観測した。この結果について、共著者の一人として論文を発表した。KxFe2-ySe2は他の鉄系超伝導体と異なるフェルミ面のトポロジーを持つ電子構造が報告され、スピン・軌道ゆらぎからの解釈に困難を与えている。特定の軌道をより強く観測することのできる偏光依存光電子分光を行い、他の鉄系超伝導体と同様の電子構造の兆候を観測した。この結果について、共著者の一人として論文を投稿した。LaOBiS2は銅酸化物や鉄系超伝導体と同様の層状構造をもつ新規超伝導体である。最適ドープ近傍の電子構造について、Biのスピン軌道相互作用の影響が顕著なこと、第一原理計算の予測とよく対応していることなどを見出し、論文発表を行った。光電子固体物性ホイスラー化合物の電子状態研究は、測定を行い、実験結果について論文を投稿している。スピネル化合物は、測定のためのブレードつき基板を作成し終えた段階にあり、測定はまだ実施できていない。

一方、当初考えていた上記2物質の他に、同様に磁気・構造相転移を示す系としてMn基2元系合金の電子状態研究を行っている。1.測定環境:所属の異動を行った。所属研究室では、以前所属の研究室にあったXe, He放電管に加え、Ne, Ar放電管とスピン分解分析器を有し、また放射光源としてHiSOR BL-5を使用可能である。これらの光源・装置を用いてバルク敏感性や偏光を考慮した実験を行う。2.装置改良:作成したブレードつき基板の真空中における動作確認、特に稼働による脱ガスの影響を調べ、試料測定を行う。3.試料測定:ホイスラー化合物については、代表例のNi_2_MnGaの電子状態を行ったので、部分置換系や他の化学式を持つ試料との電子状態比較を行う。また、昨年度議論したs電子およびd電子の構造相転移に対する寄与の他に、p電子の寄与について計算を含めた検討を行う。スピネル化合物は、角度積分光電子分光実験から行っていく。Mn二元系化合物は、組成比を変化させた際の電子状態の影響を考慮し、実験と計算の対応を調べる。基金として使用する消耗品の購入に充てる
パラメトリックエックス線、テラヘルツコヒーレント放射光を用いた悪性腫瘍の画像診断

新しいエックス線であるパラメトリックエックス線、テラヘルツコヒーレント放射光および赤外自由電子レーザーの複合光源を用いた悪性腫瘍の画像診断への基礎的な研究を行なうことである。
転写因子AP-2による卵巣癌の抗癌剤耐性克服メカニズム及び遺伝子治療への展開

AP-2αを強制発現させた卵巣癌細胞株SKOV3においてタキソール・カルボプラチン・シスプラチン・ドキソルビシン・5FUへの感受性がそれぞれ1.262.05倍に亢進していた。その機序として薬剤耐性受容体の発現変化の有無を検討した。ABCB1、ABCC1、ABCC2、ABCG2各受容体についてrealtime RT-PCRを行ったところ、AP-2α強制発現株において各受容体発現は0.92倍、1.09倍、1.12倍、0.89倍、1.21倍であり、有意な変化を示さなかった。また、SKOV3親株とmock株、AP-2α強制発現株においてp53のリン酸化につきWestern blottingにて検討したところ、AP-2α強制発現株においてリン酸化の亢進を認めた。実験動物を用いたAP-2α遺伝子導入卵巣癌細胞株の病態と抗癌剤感受性・AP-2α遺伝子導入細胞と親株をヌードマウスの大腿部皮下に接種し、生じる皮下腫瘍の大きさを経時的に計測した。接種3週後における腫瘍サイズは親株において平均80.5mm^3であったのに対しAP-2遺伝子導入細胞においては平均48.6mm^3であった。また、マウスの腹腔内にtaxo1を200μg投与した場合の腫瘍サイズは前者にて平均54.4mm^3であったのに対し後者では8.lmm^3と著明な増殖抑制効果を得た。これらより、AP-2α遺伝子導入によりin vivoにおいても腫瘍増殖抑制効果を、かつtaxolに対する感受性亢進効果を確認した。AP-2αを強制発現させた卵巣癌細胞株において増殖能が20%の低下を示したことからAP-2αが細胞周期に何らかの影響を及ぼしていることが考えられる。この機構を検討するため、SKOV3親株とmock株、AP-2α強制発現株をそれぞれ10%FCS入りメディウムと10%FCSにタキソールを加えたメディウムにて24時問培養後flow cytometerを用いて細胞周期につき比較検討を行った。その結果、AP-2α強制発現株においてアポトーシス細胞が増加してみられ、この傾向はタキソール負荷群で顕著であった。AP-2αを強制発現させた卵巣癌細胞株においては抗癌剤に対する感受性が変化することが予想される。これを増殖能の変化としてMTS assayを行い、各種薬剤において増殖が50%抑制される濃度(IC50)を求めた。抗癌剤として卵巣癌治療に頻用されているタキソール・カルボプラチン・シスプラチンを、さらにドキソルビシン・5FUについて検討した。その結果、それぞれのIC50はmock株とAP-2α強制発現株においてタキソール:7.75→6.09nM、シスプラチン:7,52→4.72μM、パラプラチン:11.1→6.91μM、5FU:14.1→6.61nM、ドキソルビシン:70.3→34.2nMへと低下し、抗癌剤感受性が亢進することが示された。(1)卵巣癌細胞における転写因子AP-2β・AP-2γの機能に関する検討AP-2 familyに属する他の転写因子AP-2β・AP-2γについてAP-2αと同様に癌の増殖・浸潤を抑制する可能性がある。これを検討するため、卵巣癌細胞株SKOV3にAP-2β・AP-2γ遺伝子発現ベクターを導入しようと試みた。しかしながらAP-2αのようには遺伝子の過剰発現は観察されなかった。(2)子宮体癌症例の臨床検体における転写因子AP-2α実際の子宮体癌症例において、免疫組織染色によりAP-2αの発現の頻度・強度を調べ組織型・病期進行度・grade・予後との関連につき検討した。検体は子宮体癌39症例で、組織型はすべて類内膜腺癌でありgrade1が15症例、grade2が11症例、grade3が13症例であった。これらパラフィンブロック標本を脱パラ後、95°C15分間の加熱にて抗原賦活化し抗AP-2α抗体を一次抗体として免疫組織染色を行った。その標本におけるAP-2αの発現の程度を03まで4段階にスコア化して評価した。結果、grade1症例においてはスコア0:0例(0%)、スコア1:5例(33%)、スコア2:5例(33%)、スコア3:5例(33%)で平均スコア2.0、grade2症例においてはスコア0:1例(9%)、スコア1:6例(54%)、スコア2:4例(36%)、スコア3:0例(0%)で平均スコア1.27、grade3症例においてはスコア0:2例(15%)、スコア1:6例(46%)、スコア2:3例(23%)、スコア3:2例(15%)で平均スコア1.38であった。有意差は得られなかったが、gradeの低い症例のほうがAP-2α発現の高い傾向が得られた。ABCB1、ABCC1、ABCC2、ABCG

2各受容体についてrealtime RT-PCRを行ったところ、AP-2α強制発現株において各受容体発現は0.92倍、1.09倍、1.12倍、0.89倍、1.21倍であり、有意な変化を示さなかった。また、SKOV3親株とmock株、AP-2α強制発現株においてp53のリン酸化につきWestern blottingにて検討したところ、AP-2α強制発現株においてリン酸化の亢進を認めた。実験動物を用いたAP-2α遺伝子導入卵巣癌細胞株の病態と抗癌剤感受性・AP-2α遺伝子導入細胞と親株をヌードマウスの大腿部皮下に接種し、生じる皮下腫瘍の大きさを経時的に計測した。接種3週後における腫瘍サイズは親株において平均80.5mm^3であったのに対しAP-2遺伝子導入細胞においては平均48.6mm^3であった。また、マウスの腹腔内にtaxo1を200μg投与した場合の腫瘍サイズは前者にて平均54.4mm^3であったのに対し後者では8.lmm^3と著明な増殖抑制効果を得た。これらより、AP-2α遺伝子導入によりin vivoにおいても腫瘍増殖抑制効果を、かつtaxolに対する感受性亢進効果を確認した。
壁細胞特異的Ｎｏｔｃｈ３による虚血性血管新生メカニズムの解明

平成25年度の結果を踏まえ、平成26年度には、変異Notch3トランスジェニックマウスの大動脈、髄膜血管、腎血管などの血管でもF/Gアクチン比を測定した。すると、大動脈よりも細動脈などの小血管で野生型と変異型に有意差がみられることがわかった。これは、CADASILが脳小血管病であることと整合性がある。そこで、マウスの脳から血管平滑筋初代培養細胞(CVSMC)を採取し、Notch3変異が血管平滑筋機能におよぼす影響を調べた。CVSMCを正常酸素圧および低酸素圧下で培養したところ、野生型と比べて変異型ではHIF1αの増加が優位に低下していた。また、この低酸素培養によりG-, F-actin比やα-Tubulinなどの細胞骨格タンパク量も変化することがわかり、以前western blottingの結果解析でα-Tubulinを補正に使用していたのは間違いであったことがわかった。そこで、今回の結果と前回の結果を再解析したところ、CVSMCでもiPS細胞由来平滑筋細胞でも、変異型の方が虚血侵襲によるHIF1αの増加が少なかった。つまり、CADASILの血管平滑筋は虚血に関する反応性が悪い可能性が示唆された。これは、iPS細胞由来平滑筋細胞を低酸素で3日間培養した時にCADASILで細胞死が優位に増加していたこととも整合性がある。ところが、Cultrex Directed In Vivo Angiogenesis AssayによりVEGFによる血管新生能を評価すると、野生型よりもむしろ変異型でより血管新生が亢進しているという結果が得られた。変異型マウスの脳梗塞モデルでより脳梗塞が悪化するという従来のデータとは相反する結果である。ただし、新生血管の構成細胞を詳しく調べたところ、変異マウスの新生血管ではPDGFRβの量が少ない、つまり壁細胞が少ない可能性が示唆されている。26年度が最終年度であるため、記入しない。Notchは隣接細胞同士のシグナル伝達により分化、遊走、細胞死など幅広い細胞機能を制御する細胞膜受容体である。1-4のホモローグのうち、Notch3は血管壁細胞(平滑筋・ペリサイト)に特異的に発現しており、その遺伝子変異により全身性の血管障害を伴う脳小血管疾患(CADASIL)を発症することが知られている。近年、NOTCH3の欠損または変異により血管新生の障害が起きている可能性が示唆されている。そこで、本研究では壁細胞の機能と動態に着目して、Notch3が虚血および低酸素条件下での血管新生を制御する機序を解明することを目的とした。H24年度は、計画を変更して京都大学iPS研究所・井上研究室にて3人のCADASIL患者から採取した繊維芽細胞からiPS細胞の樹立を行った。樹立したiPS細胞の核型に異常はなく、テラトーマの形成も確認された。以後、NOTCH3変異が確認されたCADASIL患者2名由来のiPS細胞4クローンと、Control iPS細胞各4クローンの血管内皮細胞と血管壁細胞への詳細な分化条件の検討を行った後、細胞のPhenotypeの評価に移った。これまでのところ、血管壁細胞の収縮能力と虚血応答性に有意差が認められており、さらに詳細な解析を行っている。また、iPS細胞実験に加えてNOTCH3トランスジェニック(Tg)マウスの実験も並行して実施した。6ヵ月齢および9ヵ月齢の野生型、変異型(C455R)NOTCH3 Tgマウスを用いて下肢虚血モデルを作成し、血管新生能を経時的な血流測定により評価した。今後、採取した組織の染色・タンパク質定量などにより血管密度・血管新生関連タンパク質の変化を定量し、NOTCH3変異による血管新生への影響を検討していく。近年、Notch3の欠損または変異により血管新生の障害が起きている可能性が示唆されている。平成25年度は、まず初代培養細胞を使用して血管平滑筋細胞の至適培養条件の設定とNotch3のノックダウン実験を行った。Notch3 siRNAを導入後に正常酸素圧および低酸素圧下で培養したところ、Notch3ノックダウン細胞ではHIF1αの増加が優位に低下していた。この結果と比較するため、前年度に樹立したCADASIL患者由来iPS細胞から分化させた血管壁細胞で同様の実験を行ったところ、Notch3ノックダウン細胞の結果とは対照的に、CADASIL壁細胞では正常コントロールと比べてHIF1αの誘導が過剰に起こることが示唆された。HIF1αは細胞の虚血抵抗性に関係する分子であるが、同時に低酸素状態でのアポトーシスにも関わっていることが知られている(Greijer AE, J Clin Pathol. 2004)。これらの結果から、CADASILの病態発生メカニズムがLoss of functionではなくGain of toxic functionである可能性が高くなった。

すると、大動脈よりも細動脈などの小血管で野生型と変異型に有意差がみられることがわかった。これは、CADASILが脳小血管病であることと整合性がある。そこで、マウスの脳から血管平滑筋初代培養細胞(CVSMC)を採取し、Notch3変異が血管平滑筋機能におよぼす影響を調べた。CVSMCを正常酸素圧および低酸素圧下で培養したところ、野生型と比べて変異型ではHIF1αの増加が優位に低下していた。また、この低酸素培養によりG-, F-actin比やα-Tubulinなどの細胞骨格タンパク量も変化することがわかり、以前western blottingの結果解析でα-Tubulinを補正に使用していたのは間違いであったことがわかった。そこで、今回の結果と前回の結果を再解析したところ、CVSMCでもiPS細胞由来平滑筋細胞でも、変異型の方が虚血侵襲によるHIF1αの増加が少なかった。つまり、CADASILの血管平滑筋は虚血に関する反応性が悪い可能性が示唆された。これは、iPS細胞由来平滑筋細胞を低酸素で3日間培養した時にCADASILで細胞死が優位に増加していたこととも整合性がある。ところが、Cultrex Directed In Vivo Angiogenesis AssayによりVEGFによる血管新生能を評価すると、野生型よりもむしろ変異型でより血管新生が亢進しているという結果が得られた。変異型マウスの脳梗塞モデルでより脳梗塞が悪化するという従来のデータとは相反する結果である。ただし、新生血管の構成細胞を詳しく調べたところ、変異マウスの新生血管ではPDGFRβの量が少ない、つまり壁細胞が少ない可能性が示唆されている。26年度が最終年度であるため、記入しない。計画を変更し、H26年に予定していたiPs細胞樹立と機能評価を先に行った。4名のCADASIL患者からiPs細胞を樹立して内皮細胞と壁細胞へ分化し、それぞれのマーカー蛋白質の発現が確認された。現在、大まかな機能解析を行っているところである。京都大学とのiPS細胞のMaterial transfer agreement締結に時間がかかったため、予定していたiPS細胞を使用した実験は平成26年度に持ち越されることになった。新たに国立循環器病研究センターでトランスジェニックマウスを交配しつつ、ips細胞の実験を継続して行う。ips細胞実験の比較対象群として、購入したヒト大動脈平滑筋初代培養細胞にsiRNAによるNOTCH3ノックダウンやNOTCH3遺伝子導入による過剰発現を行って、CADASILの病態発生機序の解明を図る。CADASIL患者由来のiPS細胞から壁細胞を誘導し、トランスジェニックマウスおよび初代培養細胞から得られた結果がiPS細胞由来壁細胞でも再現されるのか確認を行う。また、その知見を基に治療法の開発を試みる。