hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
相互作用情報と構造情報を統合した分子ネットワークの構築

これまでに、生体分子の構造空間(ストラクチュローム)の全体像を俯瞰するために、Protein Data Bank (PDB)に含まれている構造単位としてのchainをクラスター化しそれらの相互作用からネットワークとして体系化したツール、PDBnet、を開発してきた。本年度は、まずPDBnetに必要なデータを継続して更新した。蛋白質の構造・機能単位であるドメインだけでなく、ドメイン以外で相互作用や機能にかかわる非ドメインの情報も網羅的に収集した。構造情報を元にドメイン及び非ドメイン間の相互作用を解析し、ドメインレベルでのネットワーク構築を行った。これらの情報はPDBnetに統合し公開した。次に、生化学実験で得られた相互作用データを継続して収集し、構造情報に基づく相互作用ネットワークと統合した。生化学実験で得られたデータは信頼性の評価を行い、その情報を付加した。これらのデータはPDBnetに統合し公開した。一方、PDBnetの検索・可視化インターフェイスの改良をすすめた。このため、分子の構造、相互作用、ネットワークなどの情報に加え、分子の機能や疾病と関連する分子の情報を統合した。そして、これらの関係を視覚的に理解できるようにPDBnet検索や可視化のインターフェイスの機能強化を行った。PDBnetを用いた解析としては、構造、相互作用、物性とネットワーク間の関係についての系統的な解析や、非ドメインの機能的役割に関する解析などを行った。これらの結果、PDBnetが生体分子の構造、相互作用、物性、ネットワーク、機能の関係を解析する上で有効であることを示すことができた。当初の目標である、生体分子構造・相互作用・ネットワークデータベース/ツール「PDBnet」の構築とデータ更新、インターフェイスの改良をほぼ計画どおりに行うことができた。また、PDBnetはインターネット上に公開され、内外の研究者に利用されている。24年度が最終年度であるため、記入しない。生体分子の構造や相互作用の情報は急速に増大しているので、定期的にデータを更新する必要がある。また、インターネットを通して多くの研究者に利用されるので、検索や可視化のインターフェイスを常に改良する必要がある。今後とも、当該分野の進展や利用者の意見等を勘案して、PDBnetをより利用しやすいツールにし、新たな研究を促進するよう努力する。
近代ヨーロッパ境域権力の比較史研究：ロレーヌ=エ=バール公権の領邦君主権を事例に

本課題により,近世ロレーヌ=エ=バール公権の歴史的特質の一端が明らかになった。具体的には,バロワ地域にたいする統治実態の分析と独仏二大権力にたいして公権が展開した統治理念に関する分析から,封建的理論から脱した支配体系と統治理念の構築を積極的に試みるという公権の自律的側面が析出された。この結果,受動的で非自律的であるがゆえに固有の存立原理を内包する権力体であるとは理解されない傾向にあった近世ロレーヌ=エ=バール公権に関する従来の史的評価には,再考する余地があることを示すに至った。本研究は,初期近代のロレーヌ=エ=バール公権による「領邦君主権」の構築局面を,ヨーロッパの二大強権たるフランス王権および神聖ローマ帝権との関係において改めて捉え直そうとするものである。これにより,ロレーヌ=エ=バール公権の史的評価における「ネガティヴ」な偏りを相対化し,境域権力たるロレーヌ=エ=バール公権の歴史的特質にアプローチする。申請時の研究計画にのっとり,平成25年度は主として以下の作業に取り組んだ。1領邦君主権に関するわが国の研究状況をまずは把握すべく,先行研究の収集を行った。耐震工事によって所属大学の図書館利用が大幅に制限されていたことから,収集作業のほとんどを国立国会図書館にておこなった。211月中旬から12月中旬にかけての約1ヶ月,パリの国立文書館とナンシーのムルト=エ=モゼル県文書館において,史料の調査と収集をおこなった。パリには1週間ほど滞在し,フランス王権側が作成したロレーヌ関連の公文書にあたった。次いで,ナンシーに移動し,主として分類系列3F(ウィーン・コレクション)の調査に取り組んだ。結果,レオポルド1世期およびフランソワ3世期に徴収された人頭税,即位祝賀税などの税関連史料を入手することができた。また,ムルト=エ=モゼル県文書館での調査の合間にはナンシー市立図書館を訪問し,本研究にかかる刊行史料や,未公刊の学位論文を含むフランス本国の先行研究をできる限り収集した。帰国後は,以上の作業からえた資料の整理,読解,分析に集中し,本研究の予備的考察に該当する論文,および,研究計画の「基礎分析I」の成果に該当する論文をそれぞれまとめた。本研究の目的は,近代ロレーヌ=エ=バール公権(以下,ロレーヌ公権と略記)という独仏二大強権に挟まれた境域権力による領邦君主権の構築局面を,仏独(フランス王権,神聖ローマ帝権)双方との関係から改めて捉え直し,ロレーヌ公権の史的再評価を行うことである。平成26年度は諸般の事由によって計画通りに研究を進めることができなかったため,研究費の大半を翌年度10月まで繰り越して研究作業を再開させた。これにより,平成27年度にはロレーヌ地方のムルト=エ=モゼル県文書館やムーズ県文書館を訪問して,不足していた史料の収集をおこなうことができた。ここで収集した史料に関しては分析作業の途中で研究期間が終了してしまったものの,今後は順次,えられた研究成果を発表していく。他方,平成26年度には,前年度までの研究経過と今後の展望について口頭発表をおこなった。具体的には,ロレーヌ公権とフランス王権ないしはパリ高等法院の間でバロワ地域の統治をめぐって行われた論争をもとに,ロレーヌ公権が展開した領邦君主権の論理ついて考察したものである。また,平成27年度には,神聖ローマ帝権との関係も本格的に視野にいれた論考を発表した。この論考では,領邦君主権と関連する概念である「主権」や「領邦高権」に論及したドイツ史研究の成果を手がかりにして,ロレーヌ公権がもつ領邦君主権の歴史的特質に接近するためのより有効な方法論を模索した。くわえて,現在,ロレーヌをめぐってフランス王周辺とパリ高等法院がもつ利害の異同についても分析中である。これに関しては近いうちに論文としてまとめ,発表する予定である。27年度が最終年度であるため、記入しない。近世ヨーロッパ史日本とフランスにおける先行研究の収集はおおよそ順調にすすんだが,一次史料の収集状況をみると,訴訟(裁判)関連の史料がまだ不足している。それにしても,現時点で入手しえた資料から二本の論文を成果として提出することができた。現在もすでに,複数の研究発表を予定しており,つぎなる論文投稿の目処も徐々にたちつつある。さらには,平成25年度にえられた成果によって,今後の作業方針の焦点がより絞られてきたことから,全体として,本研究はおおむね順調に進展しているものと考える。平成25年度に引き続き,収集した資料の整理と分析をおこないつつ,今後は研究成果のアウトプットに比重を移していく。

その第一歩として,「基礎分析I」でえた成果を6月と7月に開催される学会で発表し,「基礎分析II」の成果は9月以降の学会で発表していく。不足資料を補完すべく夏にはふたたび渡欧するが,できるだけ短期間の滞在におさえる予定である。また,ここでえられる資料は,冬以降の「研究総括」にむけて早急に分析する必要があるだろう。
π共役系を有する大環状化合物の新規精密合成法の開拓

本年度は,昨年度合成した第1世代大環状化合物をテンプレートとして用いた,より大きな環サイズを有する第2世代大環状化合物の合成を行った.第1世代大環状化合物は,6個のベンジルアルコール側鎖を有しており,これが第2世代大環状化合物の骨格ユニットを取り付ける足場となる.この側鎖をメシル化した後,第2世代の骨格ユニットである,2,6位にフェニレンエチニレン2量体側鎖を有するフェノールを,Williamsonエーテル合成によって導入した.この2段階の反応によって,36%の収率で第2世代大環状化合物の前駆体を得ることに成功した.この前駆体の閉環は,擬希釈条件下において,大過剰量の銅塩を用いたGlaserカップリングにより行った.その結果,収率14%で第2世代大環状化合物を得ることに成功し,新規精密合成法を立証できた.得られた第2世代大環状化合物は,テンプレート部分も含めて分子量11636に達する,単一構造を有する巨大な化合物である.また,2重の環構造と,第1世代大環状化合物合成に用いたヘキサフェニルベンゼンテンプレートをコアに有しており,複数のπ共役系がアルキル鎖・エーテル鎖で隔離された,特徴的な構造を有している.このため,それぞれのπ共役系間でのエネルギーや電荷の移動が期待される.そこで,コアの最大吸収波長を励起波長として蛍光スペクトル測定を行ったところ,コアのテンプレート・第1世代の環骨格からの蛍光は微弱に観察されるのみであり,最も外側の第2世代の環骨格の蛍光が主として観察された.これは,π共役系間における蛍光エネルギー移動が起きていることを示唆する結果である.以上のように,大環状化合物をテンプレートとしてさらに大きな大環状化合物を得るという,新規精密合成法を実証することができ,また,合成した2重大環状化合物において,コアから外周部への放射状の蛍光エネルギー移動を見出すことができた.本研究は,大環状化合物の新しい精密合成法として,それ自身がテンプレートとなるような大環状化合物を設計・合成し,それを用いて順次環サイズの大きい大環状化合物を合成する方法の確立を最終目標としている.本年度は,計算化学を用いた共有結合性テンプレートの精密設計の実証と大環状テンプレートの合成を行った.テンプレートにはヘキサキス(4-カルボキシフェニル)ベンゼンを用い,アルキル鎖を介して2,6-ビス(4-エチニルフェニル)フェノールを主骨格とした大環状化合物部品を取り付けた.このとき,6つの反応点を1度に反応させる必要があるが,Williamsonエーテル合成を用いることで,高効率なテンプレートへの部品取り付けを達成した(収率88%),また,得られた分子の閉環反応では,分子内に12個あるアセチレンを,分子内でカップリングさせて6個のブタジインを形成させる必要があり,副反応が起こり難く,収率よくする進行する反応を選択する必要がある.そこで大過剰量の銅塩を用いたGlaserカップリングを,分子間反応を抑制するために擬希釈条件下で行った.その結果,収率18%で大環状化合物を得ることに成功した,この収率は大環状化合物を一段階で形成させた場合としては著しく高い値である.共有結合性テンプレートを用いる際に課題となる多点での反応は,反応や条件を適切に選択することにより効率よく進行することが確認できた.また,計算化学を用いた分子の精密設計も有効であることが実証された.次年度の目標である大環状分子自身をテンプレートとした大環状分子合成の確立にむけて基礎となる結果が得られたと考えられる.本年度は,昨年度合成した第1世代大環状化合物をテンプレートとして用いた,より大きな環サイズを有する第2世代大環状化合物の合成を行った.第1世代大環状化合物は,6個のベンジルアルコール側鎖を有しており,これが第2世代大環状化合物の骨格ユニットを取り付ける足場となる.この側鎖をメシル化した後,第2世代の骨格ユニットである,2,6位にフェニレンエチニレン2量体側鎖を有するフェノールを,Williamsonエーテル合成によって導入した.この2段階の反応によって,36%の収率で第2世代大環状化合物の前駆体を得ることに成功した.この前駆体の閉環は,擬希釈条件下において,大過剰量の銅塩を用いたGlaserカップリングにより行った.その結果,収率14%で第2世代大環状化合物を得ることに成功し,新規精密合成法を立証できた.得られた第2世代大環状化合物は,テンプレート部分も含めて分子量11636に達する,単一構造を有する巨大な化合物である.また,2重の環構造と,第1世代大環状化合物合成に用いたヘキサフェニルベンゼンテンプレートをコアに有しており,複数のπ共役系がアルキル鎖・エーテル鎖で隔離された,特徴的な構造を有している.このため,それぞれのπ共役系間でのエネルギーや電荷の移動が期待される.そこで,コアの最大吸収波長を励起波長として蛍光スペクトル測定を行ったところ,コアのテンプレート・第1世代の環骨格からの蛍光は微弱に観察されるのみであり,最も外側の第2世代の環骨格の蛍光が主として観察された.これは,π共役系間における蛍光エネルギー移動が起きていることを示唆する結果である.以上のように,大環状化合物をテンプレートとしてさらに大きな大環状化合物を得るという,新規精密合成法を実証することができ,また,合成した2重大環状化合物において,コアから外周部への放射状の蛍光エネルギー移動を見出すことができた.
フランス地方都市における都市化と社会政治空間―ローカルガバナンス・アプローチ

昨年度に引き続き、エロー県文書館において、公営住宅ラ・ペルゴラに関する資料のチェックおよび収集・分析を進めた。チェックするべき資料を一応すべてチェックしたと判断できる地点に至ったため、ラ・ペルゴラにおける都市問題の発生水準を評価した。その結果、境界を接する分譲団地であれ、先に分析の対象としたプティ・バールと比して、ラ・ベルゴラにおける都市問題の発生水準は大幅に低いことが明らかとなった。ついで「都市問題の生じにくさ」のメカニズムを明らかにすることを目指して、当該資料の分析を進めた。その結果、団地建物の形状や配置(空間構造)と住民コミュニティ(人的紐帯)の強弱のあいだには一定の関係があり、「閉ざされた空間構造、強い人的紐帯」あるいは「開かれた空間構造、弱い人的紐帯」の場合には都市問題が生じにくいことが明らかになった。逆に「閉ざされた空間構造、弱い人的紐帯」あるいは「開かれた空間構造、強い人的紐帯」の場合には、都市問題が生じる余地が生まれる。ラ・ペルゴラの場合、当初は「閉ざされた空間構造、強い人的紐帯」を特徴としていたが、1990年代初頭に再開発計画の対象となった際に一部建物が解体され、結果として「開かれた空間構造、弱い人的紐帯」を特徴とする団地に性格を変えた。この場合、いずれにしても「都市問題が生じにくい」メカニズムを保持しているということに変わりはない。これが、同団地と、近年まで「都市問題が生じやすい」特徴をもっていたプティ・バールの相違の源泉をなしている。ある地域における都市問題を分析する際には、「空間構造」と「人的紐帯」という二つの次元の関係を検討することが必要かつ有効である。■2015年度は、20世紀のモンペリエ(フランス南部)における社会政治空間の構造、人口移動のトレンド、および都市政策の展開について、先行研究のチェックや、統計資料や同時代定期刊行物の収集と分析、主要分析対象たるモンペリエ市文書館所蔵資料に対するアクセスの開始をつうじて、総体的に分析を開始する予定であった。■しかしながら、すでに国内に所蔵されている先行研究や統計資料をチェックし、モンペリエ市文書館におけるリサーチを開始した段階で、同館所蔵資料のうち本研究に直接関係する資料系列「W・現代」を収納する同館同時代部門の資料保管庫が、アスベスト対策のため2016年春に閉鎖されることが急遽決定された。閉鎖期間は3箇月と伝達されたが、フランスの場合、このような予定が守られることは絶望的に少ない。そのため、同資料系列に含まれる所蔵資料の閲覧・複写を最優先し、年間に2回・合計5週間同館でリサーチをおこなうことに予定を変更した。本年度の経費の使用がすべ海外旅費となっているのは、そのためである。■そのうえで、同館アーキヴィストであるピエール・ジュアン・ベルナール氏の助言を得つつ、モンペリエ市内の特定地区に空間的な対象を絞りこむことにより、限定された滞在期間のあいだにコーパス(一定のまとまりを持った資料群)を構築するべく努めることにした。具体的には、まず同市西部に位置するプティ・バール(Le Petit Bard)地区と、ついで西北部に広がるパイヤード(La Paillade)地区である。■両地区は1960年代に開発されるので、同年代から2010年代にかけての半世紀分について、同館所蔵資料系列「W」をチェックした。このうちプティ・バール地区については、ほぼコーパスを完成することができた。それをもとに、2016年6月末をメドとして論文を執筆する予定である。■当初は、2015年度は、研究のスタートとして、モンペリエ市の総体について、20世紀全般を対象として、社会政治空間の構造・人口移動のトレンド・都市政策の展開のあり方・変動・連関の総体に接近するという若干漠然とした課題を設定していたが、上記ベルナール氏のほか、モンペリエ市文書館諸部門責任者諸氏と意見を交換する過程で、特定地区に関するコーパスを構築することが重要であるという認識が得られた。■また、同館同時代部門資料保管庫の閉鎖という出来事が生じたが、同事態に対する対応として、上記コーパス作成を急ぎ、また、プティ・バール地区について、どうにかコーパスの作成を(完全に、とまではいえないが)完了することができた。これら全ては予期せぬ事態であったが、結果としては当初の計画を上回る進展がみられた。■さらに、プティ・バール地区の開発の歴史的な展開プロセスについては、論文として取りまとめ、同館が発行する学術誌『Bulletin Historique de la Ville de Montpellier』に掲載することを勧められた(締切は2016年6月末)。2016年3月からは、その準備として上記コーパスの分析を進めている。モンペリエ市(フランス、オクシタニ地域圏、エロー県)の北西部に位置するセヴェンヌ地区について、同地区に位置する民営集団団地「プティ・バール」と、同団地に隣接する県営団地「ペルゴラ」について、2000年代になって両者が都市再生計画(Projet de Renovation Urbaine)の対象となったことを念頭に置き、1960年代に両者が建設されてから今日に至るまでの歴史を明らかにする作業を遂行した。作業の遂行に際しては、モンペリエ市文書館に所蔵されている市役所資料、エロー県文書館に所蔵されている(ペルゴラを建設および維持管理してきた)エロー県低廉住宅公社資料を分析するという手法を用いた。

また、資料の分析に際しては、両団地が都市再生計画の対象となるまでに荒廃した原因を探求するべく、不動産市場メカニズムの機能、住民の集団的アイデンティティの特徴と強度、そして団地の管理運営に関わるガバナンスのありかたに着目した。実際には、プティ・バールにかかわる資料が大量にモンペリエ市文書館に保存されていることから、同団地関連資料の分析を優先した。具体的には、同団地について、環境改善計画事業の計画と実施断念(Operation Programmee de l'Amelioration de l'Habitat、1990年代)、および緊急救済計画の実施(Plan de sauvegarde、2000年代初頭)を経て都市再生計画が導入されたことから、これら三者の経緯と関係性を明らかにすることを最大の目的とした。プティ・バールについて、当初想定していた以上に大量かつ時系列的な資料がモンペリエ市文書館に残存していることが判明した。また、それら資料の閲覧にあたっては、同文書館から、規定(コータス)以上の量の資料の閲覧や、閲覧室ではなく資料保管庫近くのオフィスにおける資料閲覧など、各種の便宜が得られた。そのため、同団地の建設および管理維持については、ほぼ完全な資料収集が実現できた。そのうえで資料の分析を開始したところ、同団地が短期間のうちに荒廃したことの背景には、同団地が民営であるため、1980年代になって、管理担当者(syndic)を務めていた不動産業者によって市場メカニズムが導入され、各戸の所有者、居住者、管理担当者という三者のステイクホルダーの機能が分離し、管理運営ガバナンスが機能しなくなった、という歴史的な事情があることが明らかになった。以上の分析結果について、論文として取りまとめ、2016年末に『モンペリエ市歴史学報(Bulletin Historique de la Ville de Montpellier)』に発表することができた。ただし、不動産市場メカニズム、集団的アイデンティティ、管理運営ガバナンスの関係に関する上記知見はプティ・バール独自の事情かもしれないという可能性が残る。この点を明らかにするためには、比較アプローチの導入が必要である。このような観点から、ペルゴラの歴史的経緯に関する分析を開始した。モンペリエ市(フランス、オクシタニ地域圏、エロー県)の北西部に位置するセヴェンヌ地区に建設された県営団地「ペルゴラ(La Pergola)」について、隣接する民営団地「プティ・バール(Le Petit Bard)」との比較を念頭に置き、1960年代に建設されてから今日に至るまでの歴史を明らかにする作業を遂行した。また、資料の分析に際しては、不動産市場メカニズムの機能、住民の集団的アイデンティティの特徴と強度、そして団地の管理運営に関わるローカルなガバナンスのありかたに着目した。具体的には、プティ・バールに比して、ペルゴラではいわゆる「都市問題」の現れ方が低かったことが知られているが、その背景には、いちはやく1990年代はじめに大規模改修工事が施されたことがある。この点を重視し、同工事が実施されるに至った意思決定プロセス、同工事の実現を可能にしたエロー県低廉住宅公社の財務状況、そして同工事の空間的な特色を明らかにすることを、主要な目的とした。モンペリエでは、ペルゴラも含んで、市内の都市計画の計画と実施をおもに担うのは市役所であるが、同市役所の資料を所収する同市文書館は、2018年3月の時点で、依然として保管庫の閉鎖が続いている。同文書館
幹細胞の分化誘導のためのリアルタイム機械刺激応答評価マイクロデ バイスの構築

本研究では、MEMS技術を駆使して幹細胞の分化誘導を目指したリアルタイム機械刺激応答評価マイクロデバイスを構築した。まず、デバイスの設計や製作条件、プロセス条件などを確立し、提案したデバイスが製作可能であることを実証した。また、製作したデバイスの駆動特性を評価した。さらに、製作したデバイス上に実際に細胞を培養し、細胞に対して動的に機械刺激を与えた際の細胞の変形挙動や細胞内カルシウムイオン濃度の変化の様子をリアルタイムで観察した。また、刺激を受けた細胞の細胞内ひずみ分布をFEM解析により評価した。前年度の成果より、デバイス製作の歩留まりが悪い点と培養チャンバへの細胞の導入効率が悪い点が明らかになったため、これらの点の改善を試みた。具体的には、歩留りの悪さの原因は、PDMS構造体の各層を積層する際の接合不備であったため、接合前に酸素プラズマにより表面のクリーニングと活性化を行い、流路形状やガスケットの形状を設計変更し層間の接合面積を広くすることによって歩留りを改善した。また、導入効率に関しては、チャンバへの細胞導入時の流速を極力遅くすることと、細胞導入用マイクロ流路の幅を幅200μm、深さ50μmから幅400μm、深さ50μmに変更しチャンバ導入時の流速を遅くすることで改善できた。デバイスの改善後、実際に細胞を導入し、構築したデバイスの有効性と妥当性を検証した。細胞は骨芽細胞(MC3T3-E1)を使用した。まず、デバイスの生体適合性を調べるためにデバイス内に細胞を導入し24時間以上にわたって培養実験を行ったが、死滅することはなく生体適合性があることを実証した。次に、チャンバ内に導入した細胞に対して圧縮刺激を与え、その様子をリアルタイムかつその場で観察した。その結果、デバイスに圧力を印加するに従って細胞刺激用のダイアフラムが徐々にたわみ、たわんだダイアフラムによって細胞が直接徐々に押しつぶされていく様子を位相差観察することに成功した。さらに、刺激に対する細胞の応答を評価するために、細胞を蛍光染色し細胞内カルシウムイオン濃度の変化を観察した。その結果、細胞に刺激を与えた直後に細胞内カルシウムイオン濃度が急激に上昇する様子を捉えることに成功した。このように、本研究成果により、これまでに観察が困難であった、機械刺激中の細胞の形態変化の様子や刺激を受けた細胞の初期応答を評価することが可能となった。フォトリソグラフィとモールディングによって製作した自己接着性を持つPDMS構造体の積層により、細胞への圧縮刺激を動的に制御できるマイクロデバイスの構築に成功した。本デバイスは、ガラス基板とPDMS構造体の透明材料のみで構成されるため、光学顕微鏡を使って細胞をリアルタイムで観察することが可能である。製作したデバイスは、圧力導入ポート、ガスケット、幅200μm、深さ50μmの細胞導入用のマイクロ流路、深さ200μmの細胞培養チャンバ、培養チャンバの直上に製作された細胞に圧縮刺激を与えるための厚さ10μmのダイアフラムなどから構成される。圧力導入ポートより空気圧を導入し、ダイアフラムをたわませることによって、その薄膜で培養細胞に圧縮刺激を与えることができる。圧力を印加することによるダイアフラムの基礎的な変形特性を評価するために駆動実験を行った。ダイアフラムに印加する圧力を110kPaに徐々に変化させた際、ダイアフラムは約80180μmと圧力に応じて徐々に変形した。一方で、ダイアフラムの理論的な変形挙動を調べるためにFEM解析による構造解析を行った。この際、ダイアフラムのヤング率は3.2MPa、解析モデルは軸対象モデル、材料モデルは超弾性、をそれぞれ設定した。FEMでの解析結果と実験結果を比較したところ、誤差は24%未満でありグラフは同様の傾向を示した。これらの結果より、構築したデバイスは細胞への刺激を印加する空気圧によって制御でき、細胞に対して静的な刺激だけでなく動的な刺激を与えることが可能であることがわかった。さらに、当初の予定を繰り上げて製作したデバイス上での細胞培養実験を試みた結果、細胞はデバイス内でも培養可能であることが確認できたが、培養チャンバ内への細胞導入効率とチャンバ内の培養面への細胞接着が悪いことが判明した。この課題については次年度に検討する予定である。本年度の目標であった機械刺激応答評価マイクロデバイスの設計・試作・動作実験が完了した。また、当初の予定を繰り上げてデバイス上での細胞培養実験を実施しており、当初の予定より多少の進展はあるが、デバイス製作時の歩留りとチャンバ内への細胞導入効率が悪い点、チャンバ表面へ細胞が接着しにくい点など新たな課題も見つかっているため、達成度はおおむね順調であると言える。当初の計画通り、前半には、構築したデバイスの有効性と妥当性を検証するためにデバイス内での細胞培養実験と細胞刺激実験を行う。

既に得た結果から、デバイス製作の歩留りや培養チャンバ内への細胞導入効率、チャンバ表面への細胞接着が悪いことが判明しているため、まずはこれらを改善する。デバイス製作の歩留りに関しては、各層を積層する際に酸素プラズマにより表面のクリーニングと活性化を行う事により層間の強固な接合を試みる。また、細胞導入効率の向上に関しては、デバイスの再設計を行い、チャンバに導入された細胞がチャンバ外に流れ出て行かないような設計を考案する。そして、細胞接着を改善するために、チャンバ内を酸素プラズマによる洗浄と親水化やコラーゲンなどの細胞接着因子をコーティングすることなどを検討する。これらの改善を行いながら、随時、骨芽細胞への刺激実験を実施し、リアルタイムで観察することにより細胞の応答評価を行うことが可能であることを実証する。後半には、実際に間葉系幹細胞をデバイス内に培養し機械刺激を与えることにより、細胞の形態変化の挙動や細胞内カルシウムイオン濃度の変化を観察・評価し、機械刺激と分化挙動などの相関を求める。24年度の研究費は、研究を遂行する上で恒常的に必要な、ガラス基板やレジスト、表面処理剤、有機溶剤などの薬品、器具類などのデバイスの製作に必要な消耗品や、培地や血清などの細胞培養用薬品類、ディスポーサブル器具、細胞の応答や挙動を観察するための試薬類などの消耗品を購入する予定である。また、実験で必要な理化学器具も購入する。その他には、研究成果の発表や調査研究のための国内外への旅費や学会参加費、論文投稿料でも使用する。後半の細胞刺激実験では、多数の実験的検討が必要であるため、研究補助を行ってもらうための謝金を計上した。次年度に使用する予定の研究費は、交付当初、震災等の影響で予算が減額される可能性があったため、購入を予定していた圧力印加装置の購入を延期したことで生じた。この装置を使用せずデバイスの駆動実験を行う必要があったため、静水圧を利用した圧力印加法を考案し、手動ではあるが精度良く圧力を印加できることを確認した。現段階では、今後もこの方法で実験を進める予定である。一方で、圧力を印加し駆動実験を実施した際、デバイスの層間の接着力に不備があり、デバイス製作の歩留まりが悪いという不具合が発生した。このため、次年度に請求する予算と合わせて表面のクリーニングと活性化を行い、層間をより強固に接合するための酸素プラズマ装置を購入し上記の課題を克服する予定である。
伸展刺激感受性イオンチャネルの機能解析に基づく心筋症・心不全治療法の開発

拡張型心筋症・心不全では筋細胞変性により心臓のポンプ機能が著しく低下する。細胞骨格系蛋白質の異常に基づく筋変性では持続的な細胞内へのCa2+流入が細胞死の共通の危険因子となること、伸展刺激感受性イオンチャネル(TRPV2)が病態と密接に関与することを報告してきた。しかしながら、特異的阻害剤がないのが現状である。拡張型心筋症患者及びモデル動物ではTRPV2が心筋細胞形質膜に濃縮し、活性化していることを明らかにした。また特異的にTRPV2を抑制する方法を見出した。TRPV2を抑制すると心筋症モデル動物における心筋細胞内Ca2+濃度異常が是正され、心機能の悪化が防止され、延命効果が確認できた。拡張型心筋症、筋ジストロフィー症等の難治性疾患には決定的な治療法がなく、また虚血や高血圧などに起因する重症心不全を治癒する究極的な治療法はない。本研究では、これら筋変性疾患に共通する病態的特徴である持続的なCa2+濃度上昇に着目し、それを起こす有力な候補蛋白質、伸展刺激感受性イオンチャネル(TRPV2)の心筋における生理的、病態的意義を明確にするとともに、TRPV2が心疾患の有力な治療標的になることを確定することを目標としている。TRPV2の治療標的としての有効性を証明するためには、このチャネル活性を特異的に阻害したときに病態が改善するかどうか解明する必要があるが、現在のところTRPV2の特異的な阻害剤は開発されていない。今回は心筋症発症とTRPV2細胞膜発現との関係を明確にするためTRPV2の細胞膜発現を阻害する方法を検討し心筋症悪化への影響を検討した。TRPV2の細胞質ドメインを過剰発現させてドミナントネガティブ効果による細胞膜TRPV2濃縮の抑制を試みた。通常TRPV2が細胞膜に発現しているTRPV2ーHEK293細胞にTRPV2のドメインIを導入すると細胞内への移行が促進され、細胞膜TRPV2が減少した。それに伴いアゴニストの反応が減弱した。他方、ドメインIIの導入ではこのような効果が認められなかった。心筋症心筋モデルに心筋特異的にこのドメインIを導入すると心筋症発症時期の遅延、心機能低下の抑制、死亡日令の延長が観察された。以上の結果は心筋症、心不全など筋変性疾患において細胞膜で活性化しているTRPV2は病態発症及び悪化に重要であること、活性化TRPV2を細胞内へ移行させ不活化させることで病態が改善されることが明らかになった。拡張型心筋症、筋ジストロフィー症など筋変性疾患には決定的な治療法がなく、また虚血や高血圧などに起因する重症心不全を治癒療する究極的な治療法はない。本研究ではこれらの筋変性疾患に共通する病態的特徴である持続的なCa2+濃度に着目し、それを起こす有力な候補蛋白質、伸展刺激感受性イオンチャネルの心筋における生理的、病態的意義を明確にするとともに、このチャネルが心疾患の有力な治療標的になることを確定することを目標としている。治療標的としての有効性を証明するためには、このチャネル活性を特異的に阻害した時に病態が改善するかどうか解明する必要があるが、現在のところこのチャネルの特異的な阻害剤はない。今回はこのチャネルが、ヒト拡張型心筋症や心筋症動物モデルでは細胞内膜系から形質膜に移動し、濃縮、活性化されることを示した。TRPV2のN末端ドメインの発現によりTRPV2の形質膜移行が抑制され、心筋症モデル動物における心筋収縮能の低下が抑えられ、生存率が改善するることが示された。これらの成果はCardiovas.Res.(2013)において、Editorialに取り上げられた。拡張型心筋症等の難治性疾患、また虚血や高血圧などに起因する重症心不全を治癒する究極的な治療法はない。TRPV2の治療標的としての有効性を証明するためには、このチャネル活性を特異的に阻害したときに筋変性が改善するかどうか解明する必要があるが、現在のところTRPV2の特異的な阻害剤は開発されていない。今回、TRPV2特異的阻害抗体の作成を試み阻害抗体の検証、筋ジス、心筋症モデル動物を用いた評価をおこなった。TRPV2を細胞外から認識し阻害活性が確認された抗体は、類似TRPチャネルTRPV1、TRPC1などには反応しなかった。

阻害抗体はヒト心筋症のモデル動物筋細胞の細胞内Ca2+代謝異常およびストレッチ刺激に伴う筋変性を抑制した。心エコーで病態改善効果を調べたところコントロール抗体投与群に比し、阻害抗体投与群は左心室内径収縮率が上昇し心機能の有意な改善が認められた。同時に心筋変性のマーカーである血中心筋トロポニンI量および心筋組織切片染色により評価した線維化占有率の有意な減少が確認された。以上の結果より、この阻害抗体がTRPV2を特異的に阻害する実験ツールとして、また筋変性疾患治療への適用が可能な抗体医薬の開発に非常に有用であることが示唆された。心筋症・筋変性の進展において細胞膜TRPV2の活性化が非常に重要であることが明らかになったが、心筋特異的TRPV2KOマウスの作成が遅れていてTRPV2の生理的意義の解析がまだできていない。TRPV2特異的阻害抗体をモノクローナル化しin vivoでの応用を試みることは成功し、筋変性におけるTRPV2の病態的重要性は明らかになったが、TRPV2のノックアウト(KO)マウス作成・解析にてこずっており生理的意義の解明がやや遅れている。心筋症心筋モデルに心筋特異的にTRPV2の細胞質ドメインIを導入すると心筋症発症時期の遅延、心機能低下の抑制、死亡日令の延長など病態が改善された。この細胞質ドメインIの詳細と細胞内への移行のメカニズムは不明である。分子メカニズム解明のためこのドメインの最小単位、特異性を同定するとともに相互作用蛋白質を同定する。またTRPV2の心筋における生理的役割を解明するため心筋特異的TRPV2KOマウスおよびチャネル機能を失ったTRPV2変異体マウスの心筋生理機能をコントロールマウス心機能と比較検討する。TRPV2の生理的機能を明らかにするためTRPV2の膜局在化機構及び伸展刺激感受性機構を調べるとともにKOマウスの作成・解析も進める。TRPV2は4量体を作ること、刺激により細胞膜へ局在変化すること、細胞骨格系異常の心筋症心筋では常に膜に存在することがわかったが、それらの詳細なメカニズムは全くわかっていない。チャネルのさまざまな変異体を用いて4量体形成および膜局在化に対するチャネルの寄与部位を調べる。ドミナントネガティブ体となりうるTRPV2の部位を探しその部位のTATペプチドをTRPV2発現細胞、病態心筋細胞、病態動物に適用し、4量体形成および膜局在化への影響を調べる。またチャネルポア領域に変異をいれたHAタグ標識したドミナントネガティブ体または膜局在化を阻害する部位を心筋に過剰発現させたマウスのストレス刺激(アドリアマイシン、フェニレフリン、大動脈狭窄等)に対する心筋の適応を検討する。結合蛋白質の探索はtwo-hybrid法プロテオーム的手法も導入する。現在作成中のTRPV2-KOマウスの生理的心機能評価の解析を行いTRPV2の生理機能を明らかにする。心臓に負荷をかけたとき(アドリアマイシン、大動脈狭窄、虚血再還流)の病態進展度をコントロールマウスと比べる。また単離心筋細胞を用いた細胞内カルシウム濃度解析の比較検討も行う。端数による残額が生じている。25年度は、最終年度であるため今まで明らかにしてきたことを論文などにして発表する。発表するために現在の研究の弱点である細胞を用いた分子メカニズムに関しての基礎的研究を集中的に行う。
赤外光を用いた新しい人工内耳の研究

現在わが国には補聴器でも言葉の聞き取りが困難な高度難聴者が約15万人存在している。高度難聴者に対する唯一の聴覚獲得法として人工内耳があげられる。しかし、従来の人工内耳の装用には手術を要するため、感染症のリスクや高額な治療費が問題となっている。本研究では赤外光を用いた神経刺激手法による非侵襲型人工内耳の開発を推し進めている。本年度はスナネズミを対象とし、赤外光刺激が音知覚の生成に有効であるかが主なテーマとなった。スナネズミには音を聞き分ける能力が備わっている。その際に外部から受けた刺激を脳内の神経活動レベルでそれらを分けることが知られている。これはミスマッチ反応と呼ばれ、脳の高次の部位が役割を担っている。様々な照射パターンで内耳を赤外光刺激することでミスマッチ反応が起こるのか、またはそれらが弁別可能かを検証した。研究の成果としてミスマッチ反応の発生が確認された。これは赤外光刺激が音情報として脳内で処理されていることを示している。また、サイレンのように音を一定の周期で提示することで、その周期と同じ音の高さを知覚することが分かっている。同様に極短時間の赤外光の照射を繰り返し行うことで、脳内で音の高低が弁別されていることが分かった。これらの成果は赤外光刺激が音知覚を再建できることを示唆している。また、音の高さといった音の情報を作り出すことができ、より難聴者の生活の質を向上する一助となり得る可能性があると考えられる。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。
半導体Cu配線形成に用いるめっき添加剤のメカニズム

穴埋めめっきの促進効果と抑制メカニズムについて検討した1.促進効果(1)ビア底のみに電極を有するパターン電極を用い検討した。Cl^-+PEG+JGBに対してCl^-+PEG+JGB+SPSでは電流密度が増加する。アスペクト比を増加させるとビア底電極の電流密度が増大する。(2)また狭い開口寸法のパターン電極ほど電流密度が増大した。そのパターン電極上に析出しためっき断面の観察を行った。促進効果を示す狭い開口寸法でも断面形状は曲率を示さない。この結果はT.Moffatらのモデルに矛盾する。(3)そのため、フリーな促進錯体がパターン電極底部に滞留することにより促進効果を示していると考えている。2.抑制効果(1)抑制効果を示すPEG分子について検討した。粒状結晶分析部分はEFAUGERの0元素のピーク強度が他の部分と比較して強い。PEG分子はOを含有する高分子であり、二次電子像での粒状結晶はPEG分子である。(2)あらかじめCuめっきしたQCM基板をPEGとCl^-を添加したCuめっき溶液に浸漬すると、時間の経過に伴い周波数偏差が増加した。200秒浸漬後では、Cuめっき表面には直径数10mmの微細なPEG分子を観察した。1000秒浸漬後では、より多数の直径数10mmの微細なPEG分子を観察した。(3)PEGとCl^-を添加したCuめっき溶液では電流値は時間に関わらず低電流密度の43mA/cm^2で一定値となった。SPSを1PPm添加すると、電流密度が著しく増加した。SPSは電流密度を増加させる促進効果がある。SPS添加前のCuめっき表面には直径数10mmのPEG分子が多数存在した。一方、SPSを添加した後の3000秒と5400秒では、PEG分子が観察されなかった。さらにCuめっき結晶は100mmと微細化した。添加剤SPSは吸着したPEG分子を排除する効果と、Cuめっきを微細化する効果がある。*半導体を積層実装する技術に三次元実装技術がある。三次元実装にはシリコン基板に貫通電極を形成しその貫通電極に高アスペクトの穴埋めめっきをする。本科研テーマの応用として、本高アスペクト穴埋めめっきに着手し、2.5時間の高速で穴埋めめっきを達成した。1.ビア底のみに電極を有するパターン電極を用い、促進効果について検討した。パターン電極ではCl^-+PEG+JGBに対してCl^-+PEG+JGB+SPSでは電流密度が増加する。SPS添加剤濃度の増加とともに電流密度が増加する。さらにアスペクト比を増加させるとビア底電極の電流密度が増大する。ダマシンめっき電極でのめっき時間を変化させ断面観察した。めっき初期ではビア底部のめっき膜厚は薄いが、電解時間の増大に伴い加速的に増大する。電解に伴いSPSはより活性な一量体(促進物質)に分解する。その一量体がビア底部に蓄積されていき、電解にともないビア

底部のめっき成長を促進する。2.ビア底のみに電極を有するパターン電極を用い、促進効果について検討した。パターン電極幅を減少させるとビア底電極の電流密度が増大する。1と同様な活性な一量体(促進物質)の効果を確認した。3.SPS添加剤濃度の増加とともに、分極曲線上の電流密度が増加する。この電流密度の増大は、銅めっき表面上に吸着したPEG分子の減少によることを高分解能走査型電子顕微鏡で確認した。4.半導体のCu配線はサブミクロントレンチ中に形成する。このCu配線形成の際、トレンチ上部が盛り上がりハンプが発生する。このハンプ発生は添加剤中のレベラーであるJGBに原因することを確かめた。5.半導体を積層実装する技術に三次元実装技術がある。三次元実装にはシリコン基板に貫通電極を形成しその貫通電極に高アスペクトの穴埋めめっきをする。本科研テーマの応用として、本高アスペクト穴埋めめっきに着手・開発中である。穴埋めめっきの促進効果と抑制効果とについて検討した促進効果1.ビア底のみに電極を有するパターン電極を用い、促進効果について検討した。促進剤であるSPSを添加すると、狭い開口寸法のパターン電極ほどテイブ電極の電流密度が増大した。そのパターン電極上に析出しためっき断面の観察を行った。促進効果を示す狭い開口寸法でも断面形状は曲率を示さない。この結果はT.Moffatらのモデルに矛盾する。2.そのため、フリーな促進錯体がパターン電極底部に滞留することにより促進効果を示していると考えている。抑制効果3.抑制効果を示すPEG分子について検討した。粒状結晶分析部分はEFAUGERの0元素のピーク強度が他の部分と比較して強い。PEG分子はOを含有する高分子であり、二次電子像での粒状結晶はPEG分子である。4.あらかじめCuめっきしたQCM基板をPEGとCl^-を添加したCuめっき溶液に浸漬すると、時間の経過に伴い周波数偏差が増加した。200秒浸漬後では、Cuめっき表面には直径数10mmの微細なPEG分子を観察した。1000秒浸漬後では、より多数の直径数10mmの微細なPEG分子を観察した。5.PEGとCl^-を添加したCuめっき溶液では電流値は時間に関わらず低電流密度の4.3mA/cm^2で一定値となった。SPSを1ppm添加すると、電流密度が著しく増加した。SPSは電流密度を増加させる促進効果がある。SPS添加前のCuめっき表面には直径数10mmのPEG分子が多数存在した。一方、SPSを添加した後の3000秒と5400秒では、PEG分子が観察されなかった。さらにCuめっき結晶は100mmと微細化した。添加剤SPSは吸着したPEG分子を排除する効果と、Cuめっきを微細化する効果がある。半導体を積層実装する技術に三次元実装技術がある。本科研テーマの応用として、本高アスペクト穴埋めめっきに着手し、2.5時間の高速で穴埋めめっきを達成した。
表面波の有限波長トモグラフィー法を用いた3次元上部マントル異方性構造の研究

本研究では,研究代表者がこれまで開発を進めてきた表面波の有限波長トモグラフィー法を,異方性媒体の場合にまで拡張し,高分解能な上部マントル内部の3次元異方的不均質構造を復元することを目的としている.今年度は,高密度な広帯域地震観測網が展開されている北西太平洋地域の地震波形データに対して独自のトモグラフィー手法を適用し,この地域直下の上部マントルの方位異方性分布の復元を行った.同時に,比較的観測点密度が低く,これまでトモグラフィーモデルの分解能に限界のあった北海道北部(苫前町)に,新たな広帯域地震観測点を設置し連続観測も行った.これまで進めてきた地震波解析により,北西太平洋地域を通過するレイリー波の位相速度データを十分収集することができたので,これらを用いて,日本列島及びその周辺域を含む北西太平洋の位相速度分布及び方位異方性分布の復元を行った.この結果,周期約100秒以下の基本モードレイリー波位相速度(深さ約150km以浅のS波速度構造に相当)の方位異方性分布が,GPS観測から判明しているユーラシアプレート東縁部の運動方向と整合的であることや,北海道北西部のユーラシアプレート及び北米プレートの境界を境にして方位異方性の方向が急激に変化すること等が分かった.これらの観測事実は,ユーラシアプレート東縁部の移動方向に沿った流れ場がその直下の上部マントル内部に存在することや,二つのプレートの境界直下において水平流の向きが大きく変化していること等を示唆しており,本地域のプレート運動史を探る上で重要な結果を示すものといえる.この成果は,日本地震学会秋季大会(名古屋)において発表を行い,現在,国際学術誌に投稿すべく準備中である.さらに,本研究とも密接に関連する,表面波による海洋域(フィリピン海,南太平洋)の上部マントルの3次元S波速度構造に関する共同研究の成果を国際誌に2編発表した.本研究では,研究代表者自身がこれまで開発を進めてきた表面波の有限波長トモグラフィー法をさらに発展させることで,異方性媒体の場合にも適用できるように手法を拡張し,上部マントル内部の高分解能な3次元異方性分布の復元を目指している.特に近年,広帯域地震観測網の発展が著しい西太平洋地域の地震波形データに対して新手法を適用し,この地域下の上部マントル内部のダイナミクスを明らかにすることを目的としている.2年計画の1年目である今年度は,まずレイリー波及びラブ波のマルチモードの位相速度から,上部マントル内部の偏向異方性の3次元分布を復元するための解析プログラムの作成を行うと同時に,データ収集及び解析を行った.また,現段階ですでに十分な数のレイリー波及びラブ波の位相速度データが集められたオーストラリアとその周辺地域に対して,SV波及びSH波の3次元速度構造の復元を行い,新しい高分解能な3次元S波偏向異方性モデルを作成した.これにより,大陸リソスフェアの直下において明瞭なSH波の高速異常の存在が示され,またサンゴ海の海洋プレート直下でも顕著なSH波の高速異常が確認された.これらの結果は,年間約7cmの高速度で移動しているオーストラリアプレート直下における大規模な水平流の存在を示唆している.この成果は,日本地震学会秋季大会(札幌),及び,チリ・サンチャゴにおける国際地震学・地球内部物理学協会(IASPEI)総会において口頭発表を行い,現在,国際学術誌に投稿すべく準備中である.また,オーストラリア大陸の表面波トモグラフィーモデルから推定される上部マントル内部の3次元温度分布に関する共同研究の成果を,国際誌に発表した.さらに,本研究とも密接に関連する表面波の有限波長トモグラフィー法の新しい理論に関する論文を国際誌に発表した.本研究では,研究代表者がこれまで開発を進めてきた表面波の有限波長トモグラフィー法を,異方性媒体の場合にまで拡張し,高分解能な上部マントル内部の3次元異方的不均質構造を復元することを目的としている.今年度は,高密度な広帯域地震観測網が展開されている北西太平洋地域の地震波形データに対して独自のトモグラフィー手法を適用し,この地域直下の上部マントルの方位異方性分布の復元を行った.同時に,比較的観測点密度が低く,これまでトモグラフィーモデルの分解能に限界のあった北海道北部(苫前町)に,新たな広帯域地震観測点を設置し連続観測も行った.これまで進めてきた地震波解析により,北西太平洋地域を通過するレイリー波の位相速度データを十分収集することができたので,これらを用いて,日本列島及びその周辺域を含む北西太平洋の位相速度分布及び方位異方性分布の復元を行った.この結果,周期約100秒以下の基本モードレイリー波位相速度(深さ約150km以浅のS波速度構造に相当)の方位異方性分布が,GPS観測から判明しているユーラシアプレート東縁部の運動方向と整合的であることや,北海道北西部のユーラシアプレート及び北米プレートの境界を境にして方位異方性の方向が急激に変化すること等が分かった.これらの観測事実は,ユーラシアプレート東縁部の移動方向に沿った流れ場がその直下の上部マントル内部に存在することや,二つのプレートの境界直下において水平流の向きが大きく変化していること等を示唆しており,本地域のプレート運動史を探る上で重要な結果を示すものといえる.この成果は,日本地震学会秋季大会(名古屋)において発表を行い,現在,国際学術誌に投稿すべく準備中である.さらに,本研究とも密接に関連する,表面波による海洋域(フィリピン海,南太平洋)の上部マントルの3次元S波速度構造に関する共同研究の成果を国際誌に2編発表した.
RFLP subtraction法による精神分裂病の原因遺伝子座の連鎖解析

本年度は、十分な情報を得られる家系の集積と、その家系の構成者からの血液検体の収集、およびそれに際して必要となる大学内倫理委員会における当研究に対する承認を得ることが主に行われた。当初予定されていた精神分裂病の大家系は、残念ながら検体が採取できず、代わりに中小の精神分裂病家系が集められた。これまでのところ、発端者10例以上の血液検体が収集され、DNAが抽出されているが、保因者などの家族を含めて採取できた家系は4家系にとどまっている。検体の採取に関しては、横浜市大医学部倫理委員会において承認された形式の書類を用いて研究の主旨を十分説明した上で行われた。これと平行してPFLP subtraction法に関しての予備的な実験を行った。ある一家系における発端者一名のDNAを制限酵素Eco RIで消化し、これにリンカー・オリゴヌクレオチドを結合させる。正常同胞者2名のDNAについても同様の操作を行なうが、この際リンカー・オリゴヌクレオチドにあらかじめビオチン標識をしておく。双方のDNAをPCR法を用いて増幅するが、正常者については大過量のDNA断片を作成する。次に両者をハイブリダイズさせ、マグネティックビ-ドを用いて標識されている正常者DNA断片及びそれにハイブリダイズしている発端者DNAを差し引く。この操作により残ったDNA断片は発端者特異的なものを含むことになる。この操作を複数回繰り返し、残ったDNA断片をプールした。さらに数多くの正常者DNAを差し引いていくことにより、疾患特異的なDNA断片すなわちRFLPマーカーを抽出していくのだが、現在充分な数の正常者を含む検体がないため、予備的な解析にとどまっている。今後、さらに家系内の検体を増やしてより特異性に高いマーカーを抽出していく予定である。
血管内皮細胞の障害部位に、血流条件下で形成される血小板血栓の形成メカニズム

血管内皮細胞の機能的、器質的障害部位における血小板血栓の形成メカニズムを検討した。血管内皮細胞が剥離し、内皮下のマトリックスが血流に曝露されると、血液中の血小板は流動状態下でマトリックスとの相互作用の過程で活性化され血小板血栓を形成した。マトリックスとの相互作用における活性化には血小板膜糖蛋白GP Ibαとvon Willebrand因子、GP VIとコラーゲンの相互作用が必須の役割を果たした。活性化した血小板から放出されるADPによるADP受容体刺激も、活性化と血栓形成に関与した。ステントの存在により血流が乱されると、血栓性はさらに亢進した。培養血管内皮細胞をトロンビン、サイトカインで刺激すると、内皮細胞の表面にP-selectinなどの接着蛋白が発現するものの、血液中の血小板との相互作用は見られなかった。刺激を受けた内皮細胞が分泌放出する組織因子は、凝固系の活性化と血小板血栓形成の増強効果を有したものの、それ自体が直接流動状態下で血小板を粘着させる効果はないことを確認した。われわれの開発した高速共焦点顕微鏡によるイメージングシステムは、血管内皮細胞障害部位におげる血栓形成メカニズムの解明に有用であった。コラーゲンを固相化したガラス板の上に、任意の壁ずり速度の条件で血液を灌流するflow chamberシステムを用いて、血管内皮細胞の損傷部位に血液を灌流するモデルを作成した。メパクリンにより、血小板および白血球の濃染顆粒を蛍光標識した。レーザー共焦点顕微鏡を用いて、コラーゲンと血小板の相互作用、血小板血栓の3次元的形成過程、血小板と白血球の相互作用を各々分離してイメージングすることを可能とした。コラーゲン上に、狭窄した小動脈に相当する高いずり速度(1,500s^<-1>)の条件で血液を灌流したところ、血小板血栓が形成され、時間経過とともに、血管内腔の方向に向かって山のような形状で3次元的に成長した。高ずり速度下では、血小板と白血球の相互作用は明らかにならなかった。モノクローン抗体を用いた検討により、血小板血栓の3次元的成長にはフィブリノーゲンなどの血漿リガンドと血小板膜糖蛋白GP IIb/IIIaの相互作用のみではなくて、von Willebrand因子と血小板膜糖蛋白GP Ibαの相互作用が必須であることが示された。低ずり速度(100s^<-1>)の条件では、コラーゲン上に血小板が接着し、血小板上に白血球がrolllingすることを確認した。レーザー共焦点顕微鏡を用いることにより、血小板とコラーゲンの相互作用、血小板と白血球の相互作用を別個の相として描出することが可能となった。モノクローン抗体を用いた検討により、血小板上に発現したP-selectinが白血球と血小板の相互作用に必須の役割を果たしていることが示唆された。血管内皮細胞をトロンビンで刺激したのち、被刺激内皮細胞上に、蛍光標識した血小板と自血球を含む全血を灌流した。当初の予想に反して、刺激を受けた血管内皮細胞上にも血小板の接着は流動状態下では全く見られなかった。一方、白血球系細胞は内皮細胞とtransientに相互作用して、被刺激血管内皮細胞上をrollingした。モノクローン抗体を用いた検討により、白血球と被刺激血管内皮細胞の相互作用は内皮細胞上に刺激により発現したP-selectinによることが示された。マトリックス上の血小板血栓の形成に影響を与える因子として組織因子に着目した。組織因子は被刺激血管内皮細胞上に発現することが知られる。組織因子を単独で固相化した場合には、血液を灌流しても血小板の組織因子表面への接着は認められなかった。この結果は、被刺激血管内皮細胞上が組織因子を表面に発現しても、血小板が直接接着することはできないことを説明した。コラーゲンを固相化した表面上に毎液を灌流した場合と比較して、コラーゲンと組織因子を同時に固相化した場合には、同一灌流時闘後により大きな血小板血栓が形成された。

流動状態下で血小板血栓が形成されるためには、コラーゲン、Von Willebrand因子などのマトリックスの存在が必須であること、組織因子、トロンビンなどはマトリックス上の血柱形成を促進する刺激とはなっても、それら自身で血小板の粘着を仲介することはできないことが示された。これら血栓形成の定量的評価において、われわれの開発した高速レーザー共焦点顕微鏡によるイメージング法が有用であった。