hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
トランスポゾンシステムを用いた医学・生物学研究ツールとしてのラットリソースの構築

本研究の目的は、Sleeping Beauty(SB)と呼ばれる哺乳類でも機能するトランスポゾンシステムをラットにおいて確立した成果を基に、網羅的にラットで挿入突然変異を惹起してリソースを構築するための基礎データを得ることである。結果的に、SBトランスポザーゼのトランスジェニックラット(tg)と転写単位トラップベクターのtgとの雄のダブルtgから産子を得て、3日齢でGFP陽性個体を選抜、離乳後に耳介からRNAを抽出し3'RACE法で挿入部位を同定するプロトコルが確立できた。マウスと比較して表現型の解析がしやすいラットにおいてnull mutationのリソースを構築することは、マウスでできなかったことをラットにより可能となり、広い範囲のバイオメディカルサイエンスの領域を活性化させることにつながる。ラットは、適度の大きさと豊富なゲノム情報を持つため、広範な医学.生物学領域で数多く使用される優れた実験動物である。そこで、トランスポゾンを用いて、1,500系統の挿入突然変異ラットを網羅的に作出し(最終目標)、その精液を保存して、医学・生物学研究ツールとしてのラットリソースの構築を図る。そこで、本年度においては、トランスポザーゼ遺伝子を持つトランスジェニックラットとトラッピングベクターを持つトランスジェニックラットを交配させて、ダブルトランスジェニックラットを作出、その雄1匹に対してSlc : Wistar/ST雌2匹を同居させて産子を得た。生まれた直後の新生児に対し、全身にGFPを発現する個体のスクリーニングを行った。さらに、GFP陽性個体が転写単位である遺伝子をトラップしているか否かを、GFPのプライマーを用いた3'RACE法とダイレクトシークエンスによって確認した。以上の結果、235匹のGFP陽性個体のうち、トラップされた配列を得たものが170匹分、163種類の配列のうち、既存遺伝子は58種類、既存遺伝子にアンチセンスに挿入されているものが41種類、既存の転写単位外にマッピングされるものは60種類、マッピングできなかったものが4種類であった。現在のところ、遺伝子ノックアウト動物として汎用されている実験動物種はマウスのみであるが、本研究が遂行されることにより、将来的には新薬開発に必須なラットにおいても遺伝子破壊ラットの整備が達成される、と期待される。sleeping beautyと呼ばれる哺乳類でも機能するトランスポゾンシステムをラットにおいて確立した成果を基に、網羅的にラットで挿入突然変異を惹起してリソースを構築するのが、本研究の最終目標である。さらに、トランスポゾンにloxP配列を含ませておき、MICERと同じ原理で、連続欠失突然変異ラット系統の作出も本研究の目的である。挿入突然変異および欠失突然変異の特徴は、基本的な突然変異型であるnull mutationを惹起できる点にある。本年度においては、欠失突然変異を作出する目的で、loxP配列を含んだトラッピングベクターのトランスジーンおよびsleeping beautyトランスポザーゼ遺伝子のトランスジーンの両方を保持したダブルトランスジェニックラットから1,296個体を作出した。さらに、GFP陽性個体を交配して産仔を作出した。現在、PCR法にて両方のトラッピングサイトをシスに持つ個体を選抜中であり、その基礎情報、ノウハウを蓄積している最中である。今後、Creリコンビナーゼトランスジェニックラットと交配することにより、実際に欠失突然変異が得られるか否かを検討したい。本年度は引き続き挿入突然変体を作出したことに加え、まずは国内大学との共同研究の形で分与を行い、挿入突然変体の詳細な表現型解析を実施した。すなわち、Netrin-4トラッピング系統を大阪大学の山本亘彦教授に送付して詳細に解析していただいた。北海道大学での通常の病理学的、病理組織学的検索や行動学的、繁殖学的解析では異常は観察されなかったにもかかわらず、大阪大学においてセロトニントランスポーター(5-HTT)抗体を用いた免疫染色を行ったところ、ノックアウトラットの体性感覚野におけるバレル構造の染色像が正常対照と比して減弱することが見出された。さらに、脳スライスの長期培養がマウスではきわめて困難であるがラットでは容易に行える利点を生かして、皮質と視床をin virto共培養したところ、ノーマルコントロールに比してノックアウトラットにおいては視床軸索の枝分かれ形成が減少していることが確認された。

プレリミナリーな表現型解析だけでは不十分な情報提供になる可能性があること、ラットの利点をアピールしてツールの利用を促進することは重要であること、を示す実例となった。
学校体育における水難防止教育プログラム構築に関する研究

本研究の目的は、水難事故の未然防止に資する学習プログラムを開発することであった。地域河川を利用した着衣泳を実施し、授業前後で学習効果測定を行った。その結果、河川環境(水温、水深、河床、流速)に対する認識は授業前後で明らかに変容した。河川に対する認識(楽しさ、危険性)は、授業後により楽しく、より危険である報告に変容した。地域河川を利用して着衣泳を実施することは、水難事故の多発する河川の危険性を認識させると共に、河川に対する認識をプラスの方向に変容させた。また、着衣泳の事前・事後指導に着目して水難事故の未然防止的な学習効果を得られる授業について検討した。本研究の目的は、学校体育下でのより効果的な水難防止学習プログラムを確立することである。本年度公表した研究成果は下記の通りであった。論文1教育現場と大学の共同による「地域河川を利用した水難防止学習」の授業計画作成過程、稲垣良介・岸俊行・野々垣邦彦、福井大学教育地域科学部附属総合実践センター紀要第38号、pp35-44、2014年2月掲載、論文2着衣泳における横泳ぎに関する検討ー泳速度・ストローク頻度・ストローク長の泳法間比較からー、稲垣良介、北陸体育学会紀要第50号、pp1-6、2014年3月掲載、論文3着衣泳が小学生の水難事故に対するリスク認識と対策実行認識に及ぼす影響ー救命胴衣を用いた授業を実践してー、稲垣良介・岸俊行、体育科教育学研究第30巻2号日本体育科、2014年7月発行予定(掲載決定)、論文4着衣泳授業に参加した中学生の地域河川に対する認識の変容、野外教育研究、2014年発行予定(掲載決定)、口頭発表1救命胴衣を用いた着衣泳が小学生の水難に対するリスク認識と対策実行認識に及ぼす影響、稲垣良介・岸俊行、日本体育学会第64回大会(立命館大学)、2013年9月、口頭発表(ポスター)2着衣泳に参加した中学生の地域河川に対する認識の変容、稲垣良介、日本野外教育学会第16回大会(京都教育大学)、2013年6月、口頭発表(ポスター)3水難防止に資する授業づくりの一過程-地域河川を利用した場合-、稲垣良介、福井大学教職大学院教師教育改革コラボレーション日本の教師改革のための福井会議2013ZoneD、2013年6月。上記のうち論文3は、水難事故の防止に資する着衣泳学習における「原因療法的」な効果を「事前、事後、遅延」の3時間点における「リスク認識」と「対策実行認識」について分析した。その結果、着衣泳の有効性と課題が明らかになった。本研究の目的は、学校体育下でのより効果的な水難防止学習プログラムを確立することをである。1小学生を対象とした着衣泳学習の指導項目に関する検討(福井大学教育地域科学部紀要2012年第3号に掲載)第一に、プールで行う一般的な着衣泳に救命胴衣を取り入れた授業に参加した児童の授業前後の調査から学習のねらいに対する達成度(理解度)を明らかにすること、第二に、より詳細に検討すべく、泳力、救命胴衣着用経験別に分析した。対象者は、平成23年7月15日に行われた着衣泳学習に参加したA小学校児童5・6年生87人であった。救命胴衣着用経験者は38人であり、着用未経験者は49人であった。救命胴衣を用いた着衣泳学習への参加により児童の学習のねらい(指導項目)に対する達成度(理解度)は意図する方向に変容した。救命胴衣を用いる授業は少ない。今後、着衣泳の指導項目の一つとして学校体育において積極的に取り入れられるように、教育関係者に対して啓発したり、用具の購入や貸出制度を整備したりすることが必要だろう。また、泳力・救命胴衣着用経験の有無による相違点について、特徴の見られる項目を見出した。これは、着衣泳学習における、児童の実態把握、指導方法、指導形態の工夫・改善が重要であることを示唆した。2「自然水での『泳ぎ』」を起点とする教材開発ー学校体育における水難防止プログラム構築に向けてー(福井大学大学院教育学研究科教育内容・教材開発研究会発刊報告書2012年に掲載)本報告は、なぜ「自然水での『泳ぎ』」なのか、また「自然水での『泳ぎ』」を学校体育授業で行う経緯について、児童生徒の水難に関する実態、我が国の水難事故の実態、現在行われる着衣泳学習の課題をまとめたものであった。本研究の目的は、水難事故を未然に防ぐ効果が期待できるより効果的な学習プログラムを開発することであった.

具体的には、地域河川を利用した着衣泳学習プログラムと着衣泳の事前・事後指導のあり方を検討することであった.1)着衣泳学習の指導項目の検討:小学生を対象に、プールでの着衣泳を実施し、指導項目ごとに事前と事後の学習測定結果を分析した。紀要に掲載。2)地域河川を利用した着衣泳の指導計画作成:中学生を対象に、地域河川を利用した着衣泳学習の学習指導案を作成した。大学と中学校に消防署を加え、水難事故の未然防止を意図した内容で構成された。学内紀要に掲載。3)着衣泳の指導内容に関する検討:着衣泳の指導内容について、横泳ぎの可能性を検討するため、クロール、平泳ぎ、エレメンタリーバックストロークと比較検討した。論文(査読有)に掲載。4)着衣泳による未然防止的効果の検討:中学生を対象に救命胴衣を用いた着衣泳を実施し、リスク認識と対策実行認識の変容を3時間点で比較した。5)河川での実習の未然防止的効果の検討:中学生を対象に、地域河川を利用して着衣泳の授業を実施した。河川に対する認識や河川環境に対する認識を授業前後で比較した。6)着衣泳の事前・事後指導の導入効果の検討:着衣泳に加え、熟練教師による事前・事後指導を実施した。その結果、着衣泳だけを実施した場合に見られなかった学習効果が認められた。7)未熟練教師教師による着衣泳の事後指導の導入効果の検討:着衣泳に加えて未熟練教師が事後指導を実施した場合に、未然防止に資する学習効果が一定程度期待できることを明らかにした。身体教育学本研究は、水難事故を未然に防ぐ効果に着目し、学校体育下での「自然水における水辺活動」を取り入れたより効果的な学習プログラムを確立することが目的である。本年度は、原因療法的な視点から水難事故防止学習のあり方を検討し、論文にまとめることができた。また、地域河川を利用した着衣泳学習の具体的な授業展開を提案することができた。これらは概ね当初の計画通りであり、今後の研究に着実に寄与する。よって、現在までの達成度は、おおむね順調である。本研究は、水難事故を未然に防ぐ効果に着目し、学校体育下での「自然水における水辺活動」を取り入れたより効果的な学習プログラムを確立することが目的である。本年度は、1小学生を対象とした着衣泳学習の指導項目に関する検討(福井大学教育地域科学部紀要2012年第3号に掲載)、2「自然水での『泳ぎ』」を起点とする教材開発ー学校体育における水難防止プログラム構築に向けてー(福井大学大学院教育学研究科教育内容・教材開発研究会発刊報告書2012年に掲載)について報告を行った。他に、平成25年度の研究に関する事前の予備的な授業を複数行った(未報告)。これらは今後の研究に着実に寄与することから、現在までの達成度は、おおむね順調である。今後の研究の推進方策として、以下の点がある。1着衣泳学習の効果的なあり方を検討するため、実習だけでなく、どのような事前・事後の学習を十すすればより高い学習効果が得られるのか検討すること。2河川を用いた着衣泳学習の指導展開案を学校現場と共に作成・実施し、その効果を検討すること。今後の研究の推進方策として、3点がある。1小学生に対する着衣泳学習の効果的なあり方を検討するため、実習だけでなく、事前・事後の学習を充実させること。また、その効果を検証すること。
本邦上部白亜系の古地磁気層序・生層序の統合と国際対比

主要調査対象である北海道の上部白亜系蝦夷層群分布地域のうち,これまで未調査であった中央北海道中頓別地域の白亜系最上部層を中心に古地磁気試料を採取した.調査ルートは同地域の菊水川・ウツナイ川,およびそれらの支流沿いの3ルートである.これらの大部分は正帯磁を示し,ウツナイ川の一部の層準のみが逆帯磁を示す.これらの研究と並行して,南サハリン上部白亜系の古地磁気層序・大型化石層序の再検討を行い,蝦夷層群ばかりでなく北太平洋域上部白亜系の相互比較の基準となるような古地磁気模式層序を確立することができた.この模式層序と比較すると,中頓別地域の正帯磁は,Campanian階/Maastrichtian階境界のPolarity Chron 32nに対比できることが分かった.また,南サハリンの第三系を対象とした古地磁気学的研究により,サハリンから北海道に至る地域のテクトニクス史も明らかにすることができた.一方,ウツナイ川ルートから見いだされた厚い逆帯磁層は,Polarity Chron 32n前後の逆磁極期に相当する可能性も高いが,古第三紀以降の再磁化の可能性も否定できない.本調査地域の南に位置する古丹別地域の古第三系の大半が明瞭な逆帯磁を示すだけに,今後の更なる検討が必要である.北海道以外では、九州天草地域御所浦島に分布する白亜系御所浦層群の古地磁気・岩石磁気学的研究を進め,それらの安定磁化成分を担う磁性鉱物が,初生マグネタイト粒子から続成過程によって二次的に晶出した極細粒のヘマタイト粒子であることを明らかにした.さらに,御所浦層群および他地域の研究から,白亜紀後期以降の西南日本の古地磁気極移動曲線を確立することができた。平成10年度は、北海道中軸帯の羽幌地域と宗谷・音威子府地域の上部白亜系蝦夷層群を対象に試料採取と古地磁気測定を行った。宗谷・音威子府地域の調査ルートは主に同地域の菊水川およびその支流のルートで、前層厚は約400mである.測定の結果、最上部が逆帯磁、その直下が正帯磁、さらに下位が逆帯磁、その他の下位がすべて正帯磁であった.これらを標準古地磁気タイムスケールと比較対比することにより、上位から順に、Campanian階のChron32r.1r.C32r.1n,,C32r.2r、C33n-にそれぞれ対比できることが分かった.さらに既存の大型化石層序と比較すると、Sphenoceramus schmidti zoneがC32r.1r、Sphenoceramus orientalis zoneがC32r.1n、Polyptychoceras pseudogaultinum zone上部がC32r.2rに対比できる.一方、羽幌地域の古丹別川ルート羽幌川層群上中部層からは、白亜紀磁気静穏期Chron34の最後期(Santonian階最後期)から、Campanian階のChron33に対比できる正逆帯磁層準を見いだした。これらに相当する層準は南サハリンの上部白亜系にも存在するので、相互の対比により、これまで議論の多かった北西太平洋上部白亜系大型化石層序の年代対比が司能となった。特にS.schmidti zoneの時代範囲がCampania階後期のC32r.1r、すなわち絶対年代に換算して73.574Maであることが判明したことは特筆に値する。

平成10年度に,これまで未調査であった中央北海道中頓別地域の白亜系最上部層を中心に古地磁気試料を採取した.調査ルートは同地域の菊水川・ウツナイ川,およびそれらの支流沿いの3ルートである.これらの大部分は正帯磁を示し,ウツナイ川の一部の層準のみが逆帯磁を示す.これらの研究と並行して,南サハリン上部白亜系の古地磁気層序・大型化石層序の再検討を行い,蝦夷層群ばかりでなく北太平洋域上部白亜系の相互比較を可能とする古地磁気模式層序を確立することができた.この模式層序と比較すると,中頓別地域の正帯磁は,Campanian階/Maastrichtian階境界のPolarity Chron32nに対比できる.一方,ウツナイ川ルートから見いだされた厚い逆帯磁層は,Polarity Chron32n前後の逆磁極期に相当する可能性も高いが,古第三紀以降の再磁化の可能性も否定できない.本調査地域の南に位置する古丹別地域の古第三系の大半が,同様の古地磁気偏角をもつ逆帯磁を示すだけに,今後の更なる検討が必要である.このほか,南サハリンから北海道に至る地域の新生代テクトニクスを明らかにするため,同地域の第三系堆積岩類を対象とした古地磁気学的研究も行った.その結果,後期中新世以降,同地域が鉛直軸の回りに3040度の時計回り運動を経たことが分かった.さらに,九州天草地域の白亜系,愛知県犬山地域の三畳系を対象とした研究により,西南日本の古地磁気極移動曲線を確立するとともに,異地性地塊の形成場所や衝突・付加過程を明らかにした.
覚醒剤乱用者の急死に関する法医学的研究

人のメタンフエタミン(MA)乱用者で、MAを注射直後に突然異常な精神病像を起し、急死する例が多くみられる。これら死体について、血液中および各臓器中のMA濃度を測定すると、いわゆるMAの過量投与による急性中毒死とはいえない結果が得られた。そこで、これら急死例での直接死因に疑問を抱き、ラットにMAを投与し、その体内分布および脳内ノルエピネフィリン(NE),ドーパミン(DA),セロトニン(5HT)濃度を調べ、MA投与後に認められるラットの諸症状との関係を検討した。MA投与後に急死したラットでは、その死亡直前に心拍数の異常な増加と体温の急激な上昇を認め、前者は脳内NEの変化と、後者は5HTの変化と関係があることが示唆された。また、MA投与後に認められるラットの各種異常行動は、ラット体内のMA濃度とは相関せず、むしろ脳内のNEやDAの変化と関係があることが証明された。特にラットにMAを慢性的に投与し、その後に一定の休薬期間をおくと、MAで急性中毒死したラットに比べて、脳内のカテコールアミン濃度に特徴ある変化が認められた。一方、人の常習飲酒者でMA乱用時において、異常精神病像の発現率が高いことが統計的にわかった。ラットでもエタノール嗜好性の高いものとそうでないものとにMAを投与すると、前者ではMA投与後のエタノール嗜好性に変化を来し、また、MA投与後のラットの異常行動発現率が両ラット間において差異が認められた。これは両ラット間における生来の脳内カテコールアミン濃度の差異に関係があるという結果が得られた。以上の結果から、人でのMA乱用者における各種の異常精神病像の出現および、それに引続いて起る急死の原因の一つに、MA投与の前後における脳内のカテコールアミン濃度の異常な変動が、心臓を始めとする体循環系に対して何らかの影響を及ぼすことが考えられる。
EBウイルス関連T/NK細胞増多症の細胞生存シグナルの解明と治療法の開発

1ピストン脱アセチル化酵素阻害剤(HDACI)によるEBウイルス(EBV)関連T/NK細胞増多症の治療の可能性:EBV関連T/NK細胞増多症ではEBVがT細胞またはNK細胞に感染しており、悪性リンパ腫の発症などを引き起こす。感染細胞は、抗原性の低い限られた蛋白質しか発現していないため、EBV特異的細胞傷害性T細胞(CTL)から逃避しうる。現在、T/NK細胞増多症の確立された治療法はない。HDACIは抗腫瘍活性をもつ薬剤で、EBV感染B細胞に対する細胞増殖抑制効果も報告されている。そこで、EBV関連T/NK細胞増多症の治療薬としてHDACIの可能性を検討した。HDACIとしてFR901228を用いた。EBV感染T/NK細胞株においてFR901228は濃度依存性に細胞増殖を抑制した。その効果はNK細胞株よりT細胞株の方が顕著であった。また、細胞周期停止およびカスパーゼ活性の上昇によるアポトーシスを誘導した。細胞周期関連蛋白質としてサイクリンD2、CDK4/6を、アポトーシス関連蛋白質としてBcl-xL、XIAP、cIAP2の発現を減少させた。これらの遺伝子の転写を制御する転写因子NF-kBおよびAP-1の恒常的活性化がEBV感染細胞株で認められ、FR901228により両転写因子の活性が抑制された。すなわち、これらの生存シグナルを抑制することでFR901228はEBV感染T/NK細胞株の増殖を抑制し、アポトーシスを誘導すると考えられた。さらに、FR901228はEBV感染T/NK細胞株のLMP1発現を誘導した。この結果から、生体内でのウイルス特異的CTLによる感染細胞傷害活性を増強する効果も期待できると考えられた。本研究からEBV関連T/NK細胞増多症に対する新規治療薬としてHDACIが有用であることが示唆された。2EBV感染によるIL-13遺伝子発現制御機構:IL-13は炎症性サイトカイン産生を抑制するTh2サイトカインであり、ホジキンリンパ腫細胞やHTLV-1感染T細胞において、IL-13の恒常的発現と発癌への関与が報告されている。そこで、EBV感染細胞株において検討したところ、IL-13の恒常的発現が確認された。EBV感染細胞株においてはIL-13レセプターの発現はなく、IL-13はパラクライン機構で作用すると考えられた。また、EBV感染やLMP1遺伝子の導入により、IL-13発現がNF-ATとAP-1活性化により誘導されることを明らかにした。IL-13は抗腫瘍免疫を抑制することが知られており、EBVによる発癌において感染細胞の生存維持に重要な役割を担っている可能性が示唆された。
高輝度真空紫外光を利用する分光科学の調査研究

本研究は、真空紫外放射物理学とそれに関連する分光科学および光源技術に関し、現在我国で展開されている研究内容を整理して見直し、今後推進すべき研究の方向を検討することを目的とした。併せて、1995年8月に東京で開催される第11回真空紫外放射物理学国際会議のため企画立案の作業を行うことも目的の一つとなっていた。この目的を実現するため、研究組織の全体会議を開催し、活動の基本方針を定めた上、三つの作業グループを編成し、各作業グループごとに研究調査活動を行った。作業グループは、光源に関するワーキンググループ、計測装置に関するワーキンググループ、研究テーマに関するワーキンググループの三種である。まず、全体的総括ではとくに、これまでに開催された真空紫外放射物理学国際会議で、放射光を用いる真空紫外、軟X線領域の分光科学のどのような新しい展開があったのかが調べられた。それを同時に、今後この分野の研究に如何なる好機が訪れるのかの見通しを行った。一方、今年8月に開催される国際会議の基本的様相を決定する招待講演や全体会議の内容について、その方向を決定する事ができ、それがプログラム委員会での議論に反映されることになった。それらは、高分解能吸収分光・発行実験、同時計数時間分解分光、偏光を利用する分光実験、原子の多電子励起状態解析、強相関電子系の電子状態研究、表面界面の電子物性、高エネルギー光領域における光化学研究、高輝度光源開発と自由電子レーザーの基礎研究が含まれている。
双極性障害におけるラモトリギンの有効血中濃度とその変動因子に関する研究

LTGは双極性障害において標準治療とされる薬剤の1つであり、治療ガイドラインにおいて大うつ病エピソードの治療および維持療法として、単剤および他剤との併用による使用が推奨されている。しかし、もう一つのLTGの適応疾患であるてんかんにおける治療濃度域は報告されているが、双極性障害におけるLTGの血中濃度と効果や副作用との関係については十分に研究されていない。本研究は,双極性障害患者におけるラモトリギン(LTG)の血中濃度を測定し、治療濃度域を明らかにするとともに、体格や併存疾患などLTGの血中濃度の変動因子についても調査することを目的とした。特に、UDP-グルクロン酸転移酵素(UGT)1A4、UGT2B7の遺伝子多型がLTGの血中濃度に変動因子として寄与したということもこれまでに報告されている。有効血中濃度とその変動因子を明らかにすることで、LTGの血中濃度の測定意義を明らかにし、患者への薬物療法への寄与を図る。本研究を実施するにあたり、遺伝子情報を取り扱うこととなるため、ヒトゲノム・遺伝子解析研究倫理審査委員会に研究計画書を提出し、現在ヒアリングの後の修正を実施している。臨床サンプルを用いた研究を実施するに当たり、市販血液を用いUGT1A4ならびにUGT2B7の遺伝子多型の解析法(RFLP法)の手技を確立した。また、検体のラモトリギン血中濃度の測定法としてHPLC法を用い適切な条件設定を確立した。今後、ヒトゲノム・遺伝子解析研究倫理審査委員会にて承認の後、患者からサンプルを入手し解析を実施していく予定である。
新規ＨＩＶ－１Ｎｅｆトランスジェニックマウスを用いたエイズ脳症発症機構の解析

ヒト免疫不全ウイルス1 (Human Immunodeficiency virus 1; HIV-1)のアクセサリー蛋白質Nefを発現するトランスジェニックマウス(Nef Tg)は、運動失調・後躯麻痺・てんかん様発作など重度の神経症状を示した。Nef Tgでは病理組織学的に脳および脊髄におけるアストロサイトの著明な増生、ミクログリアの増加・集簇、白質の空胞化、リンパ球浸潤など多彩な病変が観察された。また、Nef Tgの脳ではIP-10等複数のサイトカイン発現が増強していた。これらの病態はエイズ脳症の病態の一部と類似しており、NefがHIV-1による病理発生に重要な役割を持つことが示された。ヒト免疫不全ウイルス1 (Human Immunodeficiency virus 1; HIV-1)感染症では様々な神経障害が認められ、なかでも認知障害・運動障害を主徴とするエイズ脳症は高頻度に見られ重要な問題となっている。エイズ脳症の発症機序の詳細は不明であるが、神経組織の障害はウイルスの感染・増殖による直接的な侵襲だけではなく、ウイルスタンパク質に対する生体反応など間接的な障害が複合した多彩な病態であると言われている。HIV-1蛋白質のNefはCD4やMHC class Iの発現抑制、シグナル伝達分子との相互作用、アポトーシス誘導など多様な機能を持つ。さらに、エイズ脳症患者の脳から分離されるHIV-1のNefには特異的な変異があるという報告があり、Nefがエイズ脳症発症に何らかの役割を持つと考えられる。本研究ではこのNef蛋白質に着目し、Nefを脳で発現するトランスジェニックマウス(Nef Tg)を作製し解析を進めたところ、Nef Tgは運動失調・後躯麻痺・てんかん様発作など重度の神経症状を示した。また病理組織学的には脳および脊髄におけるアストロサイトの著明な増生、ミクログリアの増加・集簇、白質の空胞化、リンパ球浸潤など多彩な病変が観察された。本年度は、Nef Tgの脳におけるサイトカイン・ケモカイン発現についてアレイ解析を進めたところ、IP-10、Eotaxin、MCP-1、IL-17等複数の遺伝子発現が増強していることを明らかにした(各々野生型マウスの約5倍、5倍、3倍、7倍)。また、発現誘導型Nef Tgマウス(loxP Nef Tg)の作出を進めた。ヒト免疫不全ウイルス1 (Human Immunodeficiency virus 1; HIV-1)感染症では様々な神経障害が認められる。なかでも認知障害・運動障害を主徴とするエイズ脳症はエイズ患者の60%に見られるともいわれ、患者の社会生活に大きな障害をもたらす。エイズ脳症における神経組織の障害はウイルスの感染・増殖による直接的な障害だけではなく、ウイルス蛋白に対する生体の反応など間接的な障害が複合した多彩な病態であると提唱されている。エイズ脳症に関与することが示唆されているウイルス蛋白質のうちNefはCD4の発現抑制、MHC class Iの発現抑制、シグナル伝達分子との相互作用の他、アポトーシスの誘導など多様な機能を持つことが知られている。また、エイズ脳症患者の脳から分離されるウイルスのNefに特異的な変異があるという報告もあり、Nefはエイズ脳症発症の重要な鍵となると考えられる。本研究ではこのNefに注目し、ウイルスの感染・増殖という現象を伴わずにNefが単独で宿主細胞に影響して神経病原性を発揮するかを調べるため作製したNef発現トランスジェニックマウス(Nef Tg)について解析を進めたところ、進行性の運動失調、協調性失調、てんかん様発作など重篤な神経症状が認められ、病理組織学的には脳および脊髄におけるアストロサイトの著明な増生、ミクログリアの増加・集簇、白質の空胞化、リンパ球浸潤、神経細胞変性・細胞死といった多彩な病変が観察された。また、Nef Tgの脳ではIP-10等のケモカインの発現が増強していた。これらはエイズ脳症の病態と一致するものであり、Nefの発現がエイズ脳症の神経病理発生に重要な役割を持つことを示唆した。常時発現型のNef Tgマウスの詳細な行動解析・病理組織学的解析・Nef発現解析については概ね予定通り実施できた。また、次年度実施予定であったTgマウスで発現異常が認められる宿主遺伝子の探索にも着手することができ、複数のケモカインの発現増強が確認できた。

一方、本年度は、発現誘導型Nef Tgを新規に作出し、病理学的解析・行動解析を実施しエイズ脳症モデルとしての可能性を評価すると同時に、病態発現とNef発現との相関性を明らかにする予定であったが、1発現誘導型系統の作出に当初使用する予定だったDox誘導Tet-Onシステムでは非特異的な発現が発生することがあるため、タモキシフェン誘導Cre-loxPシステムを利用することにした、2このことにより発現誘導トランスジーンの入手や調整・発現誘導に必要な動物材料の入手に予定より時間がかかったため、新規系統の作出に遅れが生じた。1) H24年度に系統確立に至らなかった発現誘導型Nef Tgマウスの作製を継続する。すなわち、DNA組換え酵素Cre存在下でNefを発現するプラスミドから調整したloxP-PuroR-loxP-nef配列を含む遺伝子断片を持つloxP Nef Tgを作製し、これをタモキシフェン投与によってCreを発現するマウス(CreERマウス)と交配し、ダブルトランスジェニックマウス(loxP Nef/CreER Tg)を作出する。2) loxP Nef/CreER Tgにタモキシフェンを投与しNef発現を誘導して、行動解析・病理組織学的解析を行い、エイズ脳症の所見と詳細に比較検討し、疾患モデル動物としての可能性を評価する。3)本年度常時発現型Nef Tgで発現増加が確認されたケモカイン群に加え、アポトーシス関連分子、キナーゼ群を特に重点的に、遺伝子発現変動についてDNAマイクロアレイおよびユニバーサルプローブライブラリーセットを用いたリアルタイムPCRによって網羅的に解析する。発現異常が認められる遺伝子を同定した後は、その遺伝子の発現変動についてリアルタイムPCRによって解析する。4) Nef Tgの脳からNef発現アストロサイトを分離する。この培養上清が単球あるいはT細胞遊走活性を持つかを、ケモタキシスチャンバーを用いて解析する。また、この初代培養アストロサイトをマウス神経細胞と共培養し、神経細胞に及ぼす影響をタイムラプス顕微鏡で観察・評価する。5) Nefの発現を特異的に抑制するsiRNAを投与してNef発現を抑制すると病態が改善するか、行動解析・病理組織学的解析で確認する。前述のとおり、発現誘導型系統の作出に当初使用予定だったDox誘導Tet-Onシステムでは非特異的な発現が発生することがあるため、タモキシフェン誘導Cre-loxPシステムを利用することにした。そのため、本年度使用予定であった研究費の一部を、発現調整用のトランスジェニックマウス(CreERマウス)の購入費、loxP Nef TgとCreERマウスとのダブルトランスジェニックを作出するためのマウス購入費として、翌年度分の物品費と合わせて使用する計画である。
染色体形成機構とエピジェネティクス:ヒストン複合体解析からのアプローチ

我々はヒト培養細胞において世界で初めてクロマチン形成装置をヒストン複合体として精製することに成功した(Cell,2004)。16年度においては、クロマチン形成の分子基盤と、その戦略のバリエーションについて解析する目的で、出芽酵母および分裂酵母の系からヒストン複合体を精製し、以下の解析を行った。1)出芽酵母H3/H4複合体は、核輸送に関わるKap121や翻訳後修飾に関わるHat1/Hat2、ヒストンシャペロンAsf1を保持するが、ヒトの場合と異なりCAF-1やHirといった挿入因子が存在しないことが明らかとなった。この事実は、1種類のH3しか持たない酵母においては、Asf1がヒストンドナーとしてフリーのヒストンH3/H4と複合体を形成し、CAF1/Hirなどの挿入因子に受け渡すことが示唆される。2)H3/H4複合体と比較して、フリーのH2A/H2B複合体は非常に多く、ヒストン解離因子FACT(Spt16-Pob3)と結合していることから、遺伝子発現の多い酵母においてH2A/H2Bは非常にダイナミックに振る舞うことが示唆された。他のヒストンシャペロン因子等との相互作用を含め、クロマチン形成の全体像についてさらに解析する必要性がある。3)分裂酵母のH3/H4複合体は、ヒトや出芽酵母と大きく異なることが明らかとなった。これは分裂酵母ではG2期が長いことと関連がある可能性が高い。実際にG2/M進行制御に関わる因子なども含まれるため、ヒストン複合体解析から細胞周期制御などについて新たなメスが入ることが期待される。本研究において,申請者は世界で初めてクロマチン形成装置をヒストン複合体という形で単離することに成功し,ヒストン複合体の機能解析からクロマチン形成の分子機構について、以下に示す重要な知見が得られた。1)主要ヒストンであるH3.1および、そのバリアントH3.3をHeLa細胞の核抽出液よりエピトープタグにより精製したところ、10種以上のサブユニットからなる巨大なタンパク質複合体であった。両者ともH4を含むがH2A/H2Bを含まず,既知のヒストンシャペロン群も含まれることよりクロマチン形成装置であることが示唆された。2)ヒトH3.1とH3.3は5アミノ酸違うだけであり,それらのヒストン複合体中には共通の構成因子も多く存在するが,それぞれ異なるヒストンシャペロンを持つことが明らかとなった。クロマチンへの挿入がDNA合成に依存するH3.1複合体にはPCNAと相互作用するCAF-1 p150,p60が含まれるのに対し,依存しないH3.3複合体はHIRAを持つことが明らかとなり,さらに精製した複合体を用いた再構成実験によりそれぞれのヒストンシャペロンが挿入経路の決定因子であることを証明した。3)また,これらの複合体内にはH3.1/H3.3とH4を1分子ずつ持つことより、H3/H4が従来考えられてきた四量体ではなく,二量体を基本ユニットとしていることが示唆された。このことは,如何にしてエピジェネティック情報が次代に伝搬,維持されるのかという問題に対して、クロマチン情報の半保存的複製機構という新しい概念を提唱するものである。
中国雲南省及び福建省武夷山地の隠花植物相・菌類相に関する研究

平成56年度の現地調査で、まず、それぞれの調査地域の植生に関する観察資料と主要な植物の標本を収集することができた。各地域の植生を略記すると以下のとおりである。浙江省・江西省の自然保護地域の標高8001,800ネートルの地域の植生は多くはいわゆる照葉樹林で、マテバシイ、シイ、カシ類などが見られ、上部はツガやマツが優勢である。多くの山頂は森林限界より低いが食用草本の採取のために人為的な草地になっている。雲南省は南部の熱帯低地帯から北部の高山帯まで多様な植生が見られる。南部の西双版納地域は西部モンスーン気候下の熱帯・亜熱帯性の植生が見られる。二次林は浅い灌木林である。中部の標高2,0003,000メートルの地域の植生は二次林としてのマツ林、シイ林が多く、自然林は常緑のシイ、マテバシイ、Schima属の樹木などで構成される。北部の山岳地帯の標高2,5004,200メートルの地域は亜高山帯から高山帯の植生で、高山帯ではヤナギ類、イチゴ類や地をはうようなウバメガシの一種の密生が特徴的である。亜高山帯ではツガ、モミ、トウヒなどによって構成される森林や、カンバ類、カラマツなどで構成される森林が見られる。標高が下がるにつれ、マツ林、放牧用の草地が多くなる。このような植生下の隠花植物や菌類について、以下のような調査結果が得られた。1.シダ類:平成5年度の調査で中池が採集調査を行い、約500点の標本が採集された。この中には未記載の種が含まれ、目下研究中である。2.蘚苔類:平成6年度の調査で樋口が雲南省北部山地で約1,000点を採集した。その中には数種の新種が含まれる他、ヒマラヤナンジャモンジャゴケの胞子体が採集されたのが世界で2番目の記録である。3.地衣類:平成6年度の調査で原田が雲南省北部山地で採集調査した。その結果、アナイボゴケ科の2新種や中国新産種3種などが見出だされた。採集された標本点数は約1,800点に達する。4.菌類:中国政府の承認を得て日本に持ち帰った乾燥標本は3,500点に及ぶ。目下日本産の近縁菌類との関連などについて比較検究中である。中国では菌類の系統分類学的研究が立ち遅れているため、中国新産種は多数見出だされた。その中には、ヒラフスベ、サジタケ、サワフタギタケ、ミカワタケなどの従来日本特産種とされていた種が相当数含まれる。津田らによって採集された、イネごま葉枯病菌やイネイモチ病菌は中国側研究者との共同研究のもとで、目下RFLPs分析法などを用いて種同定基準作成実験を行っている。5.植生の研究に付随して採集された標本の中には、ユリ科のホトトギス属やガガイモ科の新種などが見出だされた。また、雲南省南部のショウガ科についてはインドシナとの関連が深いことが明らかになったが、タイ産の種とは異なる種があるようなので今後比較検討する予定である。6.中国に日本産分類群と近縁の分類群が分布する場合、それら詳細な比較は、科博で従来長期にわたって調査研究してきた日本列島の植物相・菌類相の成立を考察検証する上で極めて重要で、今後この研究を展開し、必要に応じて長江に沿って東中国から雲南省、さらにタイやミャンマーの調査も行う必要がある。本調査によってすでに明らかになった日本産分類群と近縁の分類群には、種子植物のドクダミ、タケニグサ、ヤブデマリ、ヤマホトトギス、シュロソウ群などがあり、これらには様々なレベルでの分化が認められた。菌類についても同様の例があり、Hypocrea schweinitzii群にみられる多様な種内変異と種分化の例、近縁であるが日本産は別種に分化しているH.cornea群の例などが明らかになった。これらの種子植物や菌類についてはDNAレベルでの分子系統学的解析に着手した段階である。なお、採集した標本は、大半は昆明植物研究所に保管され、その重複標本の大半は科博に保管されている。

北部の山岳地帯の標高2,5004,200メートルの地域は亜高山帯から高山帯の植生で、高山帯ではヤナギ類、イチゴ類や地をはうようなウバメガシの一種の密生が特徴的である。亜高山帯ではツガ、モミ、トウヒなどによって構成される森林や、カンバ類、カラマツなどで構成される森林が見られる。標高が下がるにつれ、マツ林、放牧用の草地が多くなる。このような植生下の隠花植物や菌類について、以下のような調査結果が得られた。1.シダ類:平成5年度の調査で中池が採集調査を行い、約500点の標本が採集された。この中には未記載の種が含まれ、目下研究中である。2.蘚苔類:平成6年度の調査で樋口が雲南省北部山地で約1,000点を採集した。その中には数種の新種が含まれる他、ヒマラヤナンジャモンジャゴケの胞子体が採集されたのが世界で2番目の記録である。3.地衣類:平成6年度の調査で原田が雲南省北部山地で採集調査した。その結果、アナイボゴケ科の2新種や中国新産種3種などが見出だされた。採集された標本点数は約1,800点に達する。4.菌類:中国政府の承認を得て日本に持ち帰った乾燥標本は3,500点に及ぶ。目下日本産の近縁菌類との関連などについて比較検究中である。中国では菌類の系統分類学的研究が立ち遅れているため、中国新産種は多数見出だされた。その中には、ヒラフスベ、サジタケ、サワフタギタケ、ミカワタケなどの従来日本特産種とされていた種が相当数含まれる。津田らによって採集された、イネごま葉枯病菌やイネイモチ病菌は中国側研究者との共同研究のもとで、目下RFLPs分析法などを用いて種同定基準作成実験を行っている。5.植生の研究に付随して採集された標本の中には、ユリ科のホトトギス属やガガイモ科の新種などが見出だされた。また、雲南省南部のショウガ科についてはインドシナとの関連が深いことが明らかになったが、タイ産の種とは異なる種があるようなので今後比較検討する予定である。6.中国に日本産分類群と近縁の分類群が分布する場合、それら詳細な比較は、科博で従来長期にわたって調査研究してきた日本列島の植物相・菌類相の成立を考察検証する上で極めて重要で、今後この研究を展開し、必要に応じて長江に沿って東中国から雲南省、さらにタイやミャンマーの調査も行う必要がある。本調査によってすでに明らかになった日本産分類群と近縁の分類群には、種子植物のドクダミ、タケニグサ、ヤブデマリ、ヤマホトトギス、シュロソウ群などがあり、これらには様々なレベルでの分化が認められた。菌類についても同様の例があり、Hypocrea schweinitzii群にみられる多様な種内変異と種分化の例、近縁であるが日本産は別種に分化しているH.cornea群の例などが明らかになった。これらの種子植物や菌類についてはDNAレベルでの分子系統学的解析に着手した段階である。なお、採集した標本は、大半は昆明植物研究所に保管され、その重複標本の大半は科博に保管されている。1993年に中国調査地域で採集した種子植物約2,500点,シダ植物約1,200点,菌類(植物病害菌を含む)約1,500点は,1994年2月に中国から科博に到着した。これらの標本を中心に研究を開始している。1.菌類.培養を必要とする資料標本は中国側共同研究者を日本に招へいしたときに持参して貰い,すでに分離培養を完了している。これらの中には、雲南省産ツノタケ属の新種をはじめ,相当数の新種が含まれている見込でこれからトリコデルマ時代の特徴やDNA分析による分類・系統学的研究を進める。また、作物病害菌の中には,イネ科植物のゴマハガレ病菌やバッカク菌が含まれ,これらの培養を用いてDNA分析による分類・系統学的研究を進めている。菌類については,日本と共通する種が中国東部に多く,武夷山地では近縁ではあるが別種に分化したもの,さらに雲南省では日本とは直接関連づけられない多様な種が,当初からの予想どおり確認され,その実体が明らかにできそうである。
数域半径による作用素環上の写像分解の研究

バナッハ空間論において古典的な問題であるヒルベルト空間を経由する分解問題が、2つのヒルベルト空間を経由する分解問題として作用素環論の研究の中に現われ、数域半径が、新たな視点を与えることが、明確になってきた。この問題を作用素環論の研究に端を発した作用素空間の視点から捉え直すことを、目的とした。またPaulsenによって得られた『拡張した数域半径を用いた作用素分解問題』が、コンヌによる有限型因子の埋め込み問題と同値であることが示されたことにアイデアを得、上記の分解に現れる作用素が、与えられた作用素環の中の作用素として実現できるかが、鍵となることを突き止めた。さらに、自由群から生成されるC*-環からその双対への完全有界作用素の分解問題としてアプローチした。分解は可能であり、そこに現れる作用素が、自由群から生成されるC*-環の元として取り直すことが出来れば、コンヌによる有限型因子の埋め込み問題の解決も得られることを得た。しかしながら、現時点では、フォンノイマン環の元として取り直す段階に留まっている。C*-環における分解の困難さへのアプローチを模索しているのが現状である。今後取り直す元に着目する場合、分解に現れるヒルベルト空間の特徴(正確には、作用素空間的ヒルベルト空間の型)を、列ヒルベルト空間、行ヒルベルト空間さらにPisierによって導入されたOH等に取り換えて、分解に現れる作用素の特徴を吟味することが必要になってくる。併わせて、数域半径作用素空間のカテゴリーに中で、テンソル積に入るノルムの研究も必要となってくる。重要な課題が数多く現れた研究となった。ヒルベルト空間を経由する有界線形作用素の分解は、バナッハ空間論において古典的な問題である。2つのヒルベルト空間を経由する分解問題は、作用素環論の研究の中に現われ、数域半径が、深く関わっている。この問題を作用素環論の研究に端を発した作用素空間の視点から捉え直す。具体的には、ピジエによって導入された(2つの)作用素空間的ヒルベルト空間を経由する作用素の分解を目標の1つとする。まず、古典的な2つのヒルベルト空間を経由する分解においても未解決な部分があることから、バナッハ空間における分解の特長付けを中心にアプローチし、結果を得ている。さらに分解に現れる作用素のノルムの評価にも進展が得られている。また、ポールセンによって提出された『拡張した数域半径を用いた作用素分解問題』は、コンヌの有限型因子の埋め込み問題と同値であることから、上記アプローチは埋め込み問題の解決も視野に入れている。2つのヒルベルト空間を経由する作用素の分解を、ほぼ古典的なバナッハ空間における設定で解決しつつある。また、分解に現れる作用素のノルムもある程度コントロール出来ている。しかしながら、ノルムの評価が最適であるかどうか不明でもある。これを作用素空間的立場から見直すことも必要となっている。連続関数環からその双対空間への有界線形作用素の分解問題は、古典的なグロタンディークの不等式を用いて、ヒルベルト空間を経由する形で得られる。これを非可換な作用素環上で考察するとハーゲラップによる非可換グロタンディーク不等式が、強力な道具となり、やはりヒルベルト空間を経由した分解が可能になる。これらはいずれも1つのヒルベルト空間を経由する分解であるが、ノルムの代わりに数域半径を用いると、2つのヒルベルト空間を経由した分解を得る。ポールセンによって得られた『拡張した数域半径を用いた作用素分解問題』は、有限型因子の埋め込み問題と同値であることが示されたが、上記の分解に現れる作用素が、与えられた作用素環の中の作用素として実現できるかが、鍵となることを突き止めた。非可換グロタンディーク定数を以前ハーゲラップとの共著論文で決定したが、これは数域半径とノルムの差に現れる定数と一致している。伊藤-渚の導入した数域半径作用素空間とルアンの作用素空間の差異にも表れる定数である。作用素のノルムのままではコントロールすると、ヒルベルト空間は、1つしか現れず、数域半径に落とすと2つ出てくるが、その作用素は、あくまでB(H)の中でしか見つけられていない。ラドンニコディム微分に現れる作用素が、同じ役割を得る予想をたてているが、スタインスプリング型の表現に現れる作用素と同様、非可換グロタンディーク定数が、障害となっている。予想に現れる作用素をさらに取り直す方法を模索している。分解に現れる作用素をグロタンディーク定数を無視すれば、古典的なバナッハ空間の設定で解決している。ノルムの評価に関し困難が生じているが、数域半径ではコントロール出来た。作用素の作用素ノルムと数域半径ノルムの間にあらわれるラドンニコディム微分が鍵となることを突き止めている。

分解は可能であり、そこに現れる作用素が、自由群から生成されるC*-環の元として取り直すことが出来れば、コンヌによる有限型因子の埋め込み問題の解決も得られることを得た。しかしながら、現時点では、フォンノイマン環の元として取り直す段階に留まっている。C*-環における分解の困難さへのアプローチを模索しているのが現状である。今後取り直す元に着目する場合、分解に現れるヒルベルト空間の特徴(正確には、作用素空間的ヒルベルト空間の型)を、列ヒルベルト空間、行ヒルベルト空間さらにPisierによって導入されたOH等に取り換えて、分解に現れる作用素の特徴を吟味することが必要になってくる。併わせて、数域半径作用素空間のカテゴリーに中で、テンソル積に入るノルムの研究も必要となってくる。重要な課題が数多く現れた研究となった。ヒルベルト空間を作用素空間的ヒルベルト空間に取り換え、さらに有界作用素を完全有界作用素に置き換えた設定で当初の問題に接近する。一旦、作用素空間内で得られた結果は、古典的なバナッハ空間での設定に(ある意味で)翻訳することができることから、バナッハ空間の量子化である作用素空間を積極的に考察する。そして、国内での研究会に参加し、発表を行い意見交換や情報交換を行う。また、国際研究集会にも参加し、研究を推進する。有界線形作用素のヒルベルト空間を経由する分解を、作用素空間的ヒルベルト空間を経由する完全有界作用素の分解としてとらえ直すことが、不完全である。そこで、作用素空間的ヒルベルト空間を列ヒルベルト空間もしくは行ヒルベルト空間に換え、さらに補間理論を用いてアプローチを試みる。科研費の採択が、平成28年10月に入ってからであったため、平成28年度前半予定の研究会等に参加できなかったため。当初、平成29年度計画では、作用素環の国内研究集会に出席予定であったが、都合で参加できなかった。次年度使用額と今年度の助成金と合わせて、作用素環の研究集会のみならず、関連する作用素の研究会にも参加する計画をしている。積極的に国内外の関連する研究集会に出席する。
破骨細胞形成におけるその前駆細胞と骨芽細胞の細胞間相互作用の解析

試験管内で破骨細胞の形成を検索できるマウス骨芽細胞と脾細胞の共存培養系を用い、破骨細胞の形成過程とその形成を支持する骨芽細胞の役割について検索し、以下の結果を得た。1.破骨細胞を誘導する骨芽細胞の役割骨芽細胞由来の破骨細胞誘導因子の発現を詳しく解析したが、その因子は可溶性ではなく骨芽細胞膜上に発現されていることが示唆された。また、その発現は骨吸収因子により、厳格に調節されていることが明らかにされた。2.大理石骨病マウスの破骨細胞形成障害のメカニズムの解析骨芽細胞と脾細胞の共存培養系を用い、大理石骨病op/opマウスとoc/ocマウスの骨吸収障害のメカニズムを解析した。op/opマウスにおける骨吸収不全の原因は骨芽細胞の産生するM-CSFの欠如に起因すること、一方、oc/ocマウスの大理石骨病は破骨細胞前駆細胞の欠損に起因することが明らかとなった。3.破骨細胞形成におけるM-SCFの役割の解析op/opマウスを用い破骨細胞形成におけるM-CSFの役割を解析したところM-CSFは破骨細胞前駆細胞の増殖のみならず、破骨細胞への分化過程にも重要な役割を果たしていることが示された。4.破骨細胞におけるp60^<c-src>の発現c-src遺伝子を破壊したトランスジェニックマウスの解析より、p60^<c-src>が骨吸収に重要な役割を果たしていることが示唆されている。破骨細胞形成系を用いp60^<c-src>の発現を検討したところ、破骨細胞はその分化に伴い大量のp60^<c-src>を発現することが明らかになった。また、その細胞内局在を検討したところ、波状縁とその周囲の小胞に局在することが示されp60^<c-src>が波状縁の形成に関与することが示唆された。1.破骨細胞形成におけるマクロファ-ジコロニ-剌激因子(MーCSF)の役割破骨細胞形成系をその前駆細胞の増殖過程と分化過程に分離し、破骨細胞形成におけるMーCSFの役割を検討した。(1)各種造血因子で支持されたマウス骨髄細胞のメチルセルロ-ス培養よりコロニ-を集め、更に骨芽細胞と共存培養しコロニ-に含まれる破骨細胞前駆細胞数を比較した。MーCSFで支持されたコロニ-が最も多くの前駆細胞を有しており、MーCSFは破骨細胞前駆細胞の増殖因子であることが示唆された。(2)骨芽細胞と脾細胞の6日間の共存培養系において、後半2日間のみ1α,25(OH)_2D_3を添加しても破骨細胞は形成される。この期間にDNA合成の阻害剤を添加し、細胞増殖を完全に抑制しても破骨細胞の分化は促進された。一方、この期間にMーCSF抗体あるいはMーCSFレセプタ-に対する抗体を添加すると破骨細胞の分化は完全に抑制された。即ち、MーCSFは破骨細胞前駆細胞の増殖のみならず、分化過程に重要な役割を果たしていることが明かとなった。2.破骨細胞前駆細胞から破骨細胞への分化過程の解析破骨細胞の分化過程を、各種のマ-カ-の発現を調べることより検索した。破骨細胞形成系として骨芽細胞と脾細胞の共存培養系を、破骨細胞の分化マ-カ-として酒石酸抵抗性酸ホスファタ-ゼ(TRAP),

carbonic anhydraseII,csrc,液胞型プロトンATPase,ビトロネクチンレセプタ-,カルシトニンレセプタ-の発現を検索した。共存培養系で形成された破骨細胞はここに列挙したマ-カ-が全て強力に発現していることが示された。これらのマ-カ-の発現を経時的に観察すると、興味あることに全てのマ-カ-が同時期には発現されることが認められた。また、invitroで形成された破骨細胞は骨切片上で、10時間以内に吸収窩を形成することができた。骨芽細胞が調節する破骨細胞の分化過程において、全ての機能を有した破骨細胞への分化が一時期に完了することが示唆された。1.大理石骨病マウスの破骨細胞形成障害のメカニズムの解析大理石骨病(op/op)マウスにおける骨吸収不全の原因は、骨芽細胞の産生するM-CSFの欠如によるものであることを前年度に明らかにしたが、同様の手法を用いoc/ocマウスの骨吸収障害を解析した。oc/ocマウスの骨芽細胞と正常マウスの脾細胞を共存培養すると、骨吸収能を有する破骨細胞が形成された。一方、oc/ocマウスの脾細胞と正常骨芽細胞の共存培養系において、酒石酸抵抗性酸ホスファターゼやカルシトニンレセプターを有する破骨細胞様多核細胞は形成されたが、それらに骨吸収活性は認められなかった。以上の知見より、oc/ocマウスの骨吸収障害は破骨細胞前駆細胞の欠損に起因することが明らかとなった。2.破骨細胞形成におけるM-CSFの役割の解析骨芽細胞が産生するM-CSFは破骨細胞の形成に必須の因子であるが、どの様に調節しているか明らかではない。op/opマウスを用い破骨細胞形成におけるM-CSFの役割を解析したところ、M-CSFは破骨細胞前駆細胞の増殖のみならず、破骨細胞への分化過程にも重要な役割を果していることが示された。3.破骨細胞におけるp60^<c-src>の発現c-src遺伝子を人為的に破壊したトランスジェニックマウスに大理石骨病が発症することが示され、破骨細胞の骨吸収機能の発現にその遺伝子産物p60^<c-src>が重要な役割を果たしていることが示唆されている。そこで破骨細胞形成系を用いp60^<c-src>の発現を検討したところ、破骨細胞は極めて大量にp60^<c-src>を発現していること、また破骨細胞の分化に伴いp60^<c-src>が発現することが明らかになった。更に、その細胞内局在を検討したところ、p60^<c-src>は破骨細胞の波状縁とその周囲の小胞に局在することが示された。