hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
小型化抗体遺伝子導入による2次代謝活性成分の生合成制御に関する研究

小型化抗体遺伝子を植物へ導入することにより、抗体と2次代謝産物とのコンプレックスを生成し、系外へ除去されることにより2次代謝産物の生合成経路のキャパシティーが増大し、より多量の2次代謝産物を生産蓄積するというアイディアに基ずくものである。Agrobacteriumに組み換えるために、まず大腸菌でのscFVの発現系を構築した。抗forskolinMAb産生ハイブリドーマからmRNAを抽出し、逆転写によりcKNAを合成したVHとVLの可変部分に相補的なプライマーを用いてPCRを行いVH,VLを増幅した。VH,VLをペプチドリンカーにより連結しscFV遺伝子を構築する。このものをpET-28aベクターへ組み換えた。本ベクターを大腸菌BL21に形質転換し大量発現系を構築し、IPTGの添加によりscFVを発現させた。scFVはin clusionbodyとして発現するため尿素で可溶化し希釈法により巻き戻した後His-tagを用いたアフィニティーカラムにより精製を行うことによりscFVタンパクを得ることが出来た。本法によれば培地100nl当たり約6mgのscFVが得られる。現在までに抗forskolinMAb scFVとforskolinとのモデリングを行っている。現在scFV遺伝子を、Agrobacteriumに組み換え中で、今後forskolin含有Coleushorskohliiに組み換え植物体で発現させることによりforskolinの生合成をコントロールし、forskolin高含有株を作出すべく実験を進めている。薬用植物を大きく分類すると、活性成分を純粋に単離して医薬品とするものと漢方薬等の抽出エキスとして使用する群に分けられる。申請者は後者について植物細胞組織培養テクニックを駆使して生薬の基原植物の育種研究を行い、均質な品種やパソ-ゲンフリー品種の作出、さらに除草剤耐性遺伝子を挿入して除草剤耐性品種を育成してきた。本研究では従来の研究の延長線上にあって、活性成分リッチな品種の育成を目指し、活性成分に対するモノクローナル抗体遺伝子を植物に導入し2次代謝をコントロールするものである。各種活性成分リッチな品種の選抜用アッセイ法として阿片アルカロイドである、morphine,codeine,thebaine,アデニールシクラーゼを活性化し強心薬として市販されているforskolin,最近脳とマクロファージでレセプターが発見され神経免疫に関係していると目されている大麻成分、THCまた、ステロイドホルモンの原料となるsolasodene配糖体、solamargine等に対するモノクローナル抗体を作成し、ELISAによる超高感度定量法を確立してきた。さらにモノクローナル抗体遺伝子を小型化したシングルチェインFv(scFv)の作成を行った。抗forskolinモノクローナル抗体産生ハイブリドーマから全RNAを抽出しcDNAを合成後、VH、VLに特異的なプライマーを用いてPCRを行い、得られたVHとVLをリンカーで結合しscFvを作製する。さらにベクターpCANTAB5Eを用いて大腸菌に形質転換しクローニングを行った。現在scFvタンパクの確定とAgrobacteriumへの組み換え作業に進んでいる。申請者は後者について植物細胞組織培養テクニックを駆使して生薬の基原植物の育種研究を行い、均質な品種やパソーゲンフリー品種の育成を行ってきた。本研究では前者に関する研究として、活性成分リッチな品種の育成を目指し、活性成分に対するモノクローナル抗体遺伝子を植物に導入し2次代謝をコントロールするものである。各種活性成分リッチな品種の選抜アッセイ法として阿片アルカロイド、forskolin、大麻成分、また、ステロイドホルモンの原料となる、solamargine、甘草のglycyrrhizin、人参のginsenoside、柴胡のsaikosaponin等に対するモノクローナル抗体(MAb)を作成し、ELISAによる超高感度定量法を確立している。さらにMAb遺伝子を小型化したシングルチェインFv(scFv)の作成を行っている。この内forskolinとsolamargineに対するMAb産生ハイブリドーマからscFvの作製を行ってきた。抗forskolin.MAb産生ハイブリドーマから全RNAを抽出しcDNAを合成後、VH、VLに特異的なプライマーを用いてPCRを行い、得られたVHとVLをリンカーで結合しscFvを作製する。現在scFvタンパクの大量発現系を確立しAgrotacteriumへの組み換えforskolinを生産するcoleusforskohliiへの形質転換を行っている。なお、抗solamargineMAbscFvの全シークエンシングが終了し、その他のMAbについても同様にスタートしている段階である。

scFVはin clusionbodyとして発現するため尿素で可溶化し希釈法により巻き戻した後His-tagを用いたアフィニティーカラムにより精製を行うことによりscFVタンパクを得ることが出来た。本法によれば培地100nl当たり約6mgのscFVが得られる。現在までに抗forskolinMAb scFVとforskolinとのモデリングを行っている。現在scFV遺伝子を、Agrobacteriumに組み換え中で、今後forskolin含有Coleushorskohliiに組み換え植物体で発現させることによりforskolinの生合成をコントロールし、forskolin高含有株を作出すべく実験を進めている。
色素細胞の各種治療に対する細胞特性の変化

皮膚の色素増強を起こす病態として、全身性強皮症がある。申請者は以前この病態で血清中のbasic fibroblast growthfactor(bFGF)が増強していることを見いだした。bFGFはメラノサイトの増殖に促進的に作用するので、全身性強皮症における皮膚色素増強にはが関与している可能性もある。これに関連し、申請者は最近悪性腫瘍による強皮症類似病態において、全身性強皮症よりも高い血清中濃度について報告した。病変皮膚、原発の悪性腫瘍の一部でもbFGFの高発現が見いだされた。このbFGFは多くの皮膚疾患について関与が考えられる。申請者は皮膚型、および全身型の多発性動脈炎においてやはり血清bFGF濃度の上昇を報告した。やはり病変部の動脈周囲ではbFGFの発現も認められた。同様の手法を用いてより大型の血管の病変でも、bFGFやその他のサイトカインの発現を検討し、一部は発表済みである。色素脱失を来す尋常性白斑に対し、我々はnarrowband UVB療法を行っており、前後で皮膚生検を行いメラノサイト、表皮角化細胞におけるbFGFやその他のサイトカインの発現の変化を観察している。またメラノサイト特有の蛋白の発現も同時に観察中である。5S-cistenyl-dopa(5-S-CD)はメラノーマの血清マーカーとして知られている。我々は現在尋常性白斑、尋常性乾癬といったnarrowband UVB療法が有効である疾患で経時的に5-S-CDを計測し、発表した。またこの療法中に血清尿酸値の上昇も認められた。メラノサイトの検討については今後の課題となる。我々は現在尋常性白斑、尋常性乾癬といったnarrowband UVB療法が有効である疾患で経時的に5-S-CDを計測しており、興味深いデータを得ている。もう少し例を増やして投稿を予定している。

申請者は皮膚型、および全身型の多発性動脈炎においてやはり血清bFGF濃度の上昇を報告した。やはり病変部の動脈周囲ではbFGFの発現も認められた。同様の手法を用いてより大型の血管の病変でも、bFGFやその他のサイトカインの発現を検討し、一部は発表済みである。色素脱失を来す尋常性白斑に対し、我々はnarrowband UVB療法を行っており、前後で皮膚生検を行いメラノサイト、表皮角化細胞におけるbFGFやその他のサイトカインの発現の変化を観察している。またメラノサイト特有の蛋白の発現も同時に観察中である。5S-cistenyl-dopa(5-S-CD)はメラノーマの血清マーカーとして知られている。我々は現在尋常性白斑、尋常性乾癬といったnarrowband UVB療法が有効である疾患で経時的に5-S-CDを計測しており、興味深いデータを得ている。もう少し例を増やして投稿を予定している。またこの療法中に興味深い血中の因子の変化も見られ、それぞれ平成18年度中に報告した。皮膚の色素増強を起こす病態として、全身性強皮症がある。申請者は以前この病態で血清中のbasic fibroblast growthfactor (bFGF)が増強していることを見いだした。bFGFはメラノサイトの増殖に促進的に作用するので、全身性強皮症における皮膚色素増強にはが関与している可能性もある。これに関連し、申請者は最近悪性腫瘍による強皮症類似病態において、全身性強皮症よりも高い血清中濃度について報告した。病変皮膚、原発の悪性腫瘍の一部でもbFGFの高発現が見いだされた。メラノサイトの検討については今後の課題となる。このbFGFは多くの皮膚疾患について関与が考えられる。我々は現在尋常性白斑、尋常性乾癬といったnarrowband UVB療法が有効である疾患で経時的に5-S-CDを計測しており、興味深いデータを得てそn結果を発表した。
腫瘍内圧とがん血管、リンパ管、細胞外マトリックスのメカノバイオロジー

マトリックス分解酵素で血管・リンパ管新生抑制作用を持つADAMTS1は、低酸素や血流等のメカニカルストレスでも発現誘導される。今回は腫瘍組織における腫瘍内圧変化によるADAMTS1の発現制御メカニズムを解析し腫瘍内圧との関連性を検討した。宿主由来のADAMTS1は、主に新生血管内皮細胞から発現されていることが明らかになった。腫瘍血管の脆弱性、希薄化、腫瘍内圧の変化に関与している可能性が示唆された。腫瘍組織内部の圧力(interstitial fluid pressure: IFP)は、未熟で透過性の亢進した血管と機能的でないリンパ管により容易に上昇する。IFP増大は、腫瘍血管・リンパ管を含む腫瘍組織および腫瘍を取り巻く細胞外マトリックスにも影響を及ぼしていると考えられる。今回、ヒト皮膚がん由来細胞A431を皮下移植した腫瘍内圧上昇モデルを用い、IFPが増大した腫瘍組織の増殖や血管新生・リンパ管新生にも関与すると考えられている細胞外マトリックス分解酵素特にADAMTS1の発現について検討した。また、ドレナージによりIFPを低下させた後の細胞外マトリックス分解酵素の発現についても検討した。ADAMTS1は血管新生のみならずリンパ管新生にも阻害効果を示すことが明らかになっているが、血流の強い血管において高い壁面せん断応力下で発現が増加することも報告されている。今回、IFPが増大した腫瘍組織では、がん細胞やがん間質内でADAMTS1が高発現していることが分かった。逆にIFPを低下させるとADAMTS1の発現は減少することも明らかになった。次に、in vitroでリンパ管内皮細胞に10 %の進展刺激をかけるとADAMTS1のmRNA発現量は約22.5倍に増加したが、リンパ管内皮細胞のマーカーであるリンパ管ヒアルロン酸レセプターLYVE-1の発現量は1/2から1/3に減少することが分かった。また、A431がん細胞に10%の進展刺激をかけるとリンパ管内皮細胞と同じようにADAMTS1のmRNA発現量が約2倍に増加することが分かった。本解析のため、ドイツより日本学術振興会外国人特別研究員(欧米短期)としてホフマン博士を派遣し、共同研究を実施した。腫瘍血管は、正常血管系とは大きく異なり、未熟で透過性が亢進し、血管壁の厚みも不規則で無秩序な走行をしている。そのため、腫瘍の組織間圧が高くなりやすい。さらに静脈系も伴っておらず、かつリンパ管も一般に小さく、そのルーメン内は高い腫瘍内圧によって維持できないため、機能できない。従って結果的に、がん組織の内圧(interstitial fluid pressure: IFP)は容易に上昇する。IFPの増大は、腫瘍血管・リンパ管を含む腫瘍組織および腫瘍を取り巻く細胞外マトリックスに影響を及ぼす。そこで我々は、血管・リンパ管の形成ががんの中でも不良で、容易にがん間質液が溜まりIFPが上昇しやすいヒト皮膚がん由来細胞A431と、高転移能を有し血管・リンパ管が比較的豊富なヒト乳がん細胞MDA-MB-231を用いて担がんマウスモデルを作製し、腫瘍組織の増殖や血管・リンパ管新生への関与が知られている細胞外マトリックス分解酵素であるADAMTS1の発現・局在の解析を続けて来た。A431はADAMTS1を高発現するがん細胞であるが、がん細胞のみならず宿主由来のがん間質にもADAMTS1を発現する細胞が認められ、IFPの増大に伴い発現が上昇することが分かった。一方、MDA-MB-231腫瘍組織では、ADAMTS1を発現している細胞は主にがん関連マクロファージ(Tumor-associated macrophage: TAM)であることが明らかになった。ADAMTS1は、がん組織周縁部のみならずがん組織内に浸潤しているTAMにも高発現していた。またリンパ管内皮細胞のマーカーであるリンパ管ヒアルロン酸レセプターLYVE-1陽性細胞の中にADAMTS1を発現している細胞やLYVE-1陽性TAMも認めら、それらは特にがん組織周縁部に確認されたことより、リンパ管新生とマクロファージ、ADAMTS1との関連性が示唆された。ドイツの日本学術振興会外国人特別研究員(欧米短期)であるホフマン博士との共同研究により、腫瘍内圧上昇モデルの解析も進み、また共培養細胞系での解析も開始した。腫瘍血管は正常血管と比較して未熟で、血管の壁細胞と血管内皮細胞との接着が疎であるため血管の透過性も亢進している。また血管壁の厚みも不規則で無秩序な走行をしており、腫瘍の組織間圧は高くなりやすい。さらに静脈系も伴っておらず、かつリンパ管も一般に小さくそのルーメン内は高い腫瘍内圧により機能できない。従って、がん組織の内圧(interstitial fluid pressure: IFP)は容易に上昇する。我々は、腫瘍組織の増殖や血管・リンパ管新生への関与が知られている細胞外マトリックス分解酵素であるADAMTS1の発現・局在の解析を行うことにより、腫瘍内圧とADAMTS1との関連性を検討してきた。がんの中でも血管・リンパ管の形成が不良で容易にがん間質液が溜まりIFPが上昇しやすいヒト皮膚がん細胞A431と、高転移能を有し血管・リンパ管が比較的豊富なヒト乳がん細胞MDA-MB-231を用いて担がんマウスモデルを作製してADAMTS1の免疫染色を行った。市販されている約10種類に及ぶ抗ADAMTS

1抗体を用い検討したが、特異性の面で十分に信頼できるものが得られなかったため、マウスADAMTS1 probeを用いたin situ hybridizationに切替えて解析を行った。A431腫瘍組織では、がんの辺縁部に強い発現を認め腫瘍間質の中でも主に血管内皮細胞あるいは壁細胞様の細胞からの発現が多く見られた。一方、MDA-MB231腫瘍組織では血管壁に加えて線維芽細胞様の細胞からも発現があることが分かった。ADAMTS1は主に腫瘍の間質に発現しており、腫瘍血管の脆弱性、希薄化に関与することで腫瘍内圧を上昇させる方向へ寄与していることが示唆された。さらに、ある種のがん組織においては線維化への関与が示唆されたことから、がん微小環境におけるADAMTS1の持つ複雑な役割が初めて示された。マトリックス分解酵素で血管・リンパ管新生抑制作用を持つADAMTS1は、低酸素や血流等のメカニカルストレスでも発現誘導される。今回は腫瘍組織における腫瘍内圧変化によるADAMTS1の発現制御メカニズムを解析し腫瘍内圧との関連性を検討した。宿主由来のADAMTS1は、主に新生血管内皮細胞から発現されていることが明らかになった。腫瘍血管の脆弱性、希薄化、腫瘍内圧の変化に関与している可能性が示唆された。ドイツの日本学術振興会外国人特別研究員(欧米短期)であるホフマン博士との共同研究により、腫瘍内圧上昇モデルの解析も進み、また培養細胞進展システムの系もすでに整い、解析が進んでいる。昨年度に引続き、腫瘍内圧とADAMTS1発現との関連性をより明らかにするため、A431腫瘍組織を用いて免疫染色等で解析するとともに、MDA-MB-231腫瘍組織ではLYVE-1陽性TAMやADAMTS1を発現している浸潤TAMやLYVE-1陽性細胞がVEGFCなどのリンパ管新生促進因子やMMP9なども発現し、リンパ管新生・がんの増殖・転移等に関与しているのかについて免疫染色等で検討する。またADAMTS1のsiRNAや抗ADAMTS1抗体を用いて、リンパ管新生に及ぼすADAMTS1の効果について同様に解析する。生化学昨年度に引き続き、マウス背部に移植した腫瘍片において内圧上昇と基底膜の破綻の関連を検討するため、IFPの変化で発現量が変化するADAMTS1マトリックス分解酵素に着目し、がん周囲のマトリックスによる圧負荷感受機構について、基底膜から細胞への情報伝達系、さらには血管新生・リンパ管新生への関連性から明らかにして行く。まず、培養細胞伸展システムを用いて、A431あるいはA549がん細胞に伸展刺激を加え、発現上昇が認められるADAMTS1の発現調節メカニズムの解明を行うために、メカノセンサーと考えられているintegrin beta1、イオンチャンネルやVE-カドヘリン、PECAM1(CD31)、LYVE-1などの接着因子、さらに、VEGFA、VEGFC、bFGF、PDGF-BBなどの増殖因子のmRNA、タンパク質発現変化、および活性変化、さらには免疫組織学的な局在の解析を行い、メカニカルストレスとADAMTS1の転写発現および活性制御機構の解明を行う。さらに、関連が示唆されるメカニカルストレス情報伝達関連分子のsiRNAやその阻害剤を用いて、培養細胞並びに担がんマウスモデル系で、腫瘍増殖およびがん血管新生・リンパ管新生への影響を検討する。
レンガ造り建造物遺跡の界面動電現象による現位置除塩法の研究

事前調査でレンガ造り構造物遺跡のうち東南アジア(タイ、カンボジア)に多くみられる(低温の)焼成レンガ遺跡では塩害による劣化が報告されているがその範囲・程度は、日干しレンガ遺跡建造物に比較して限定的であった。これは東南アジアでは雨季に乾季中にレンガに蓄積した塩分が洗脱されること、さらに降雨侵食対応した焼成レンガ(日干しレンガより塩分結晶成長による劣化を受けにくい)が用いられていることが報告されている。それに対し、乾燥・半乾燥地域(南西アジア北アフリカ)の遺跡では日干しレンガ(焼成していない)日干しレンガを使った遺跡構造物が多くみられ、その構造物基底部(地表面近く)で塩類集積による日干しレンガの劣化が報告されている。日干しレンガの塩害実験を行うために模擬日干しレンガの作成を行った。文献にある日干しレンガ材料の情報、土質(砂混じり粘土)、補強材料(スサ、麦わら)と現地の日干しレンガ作成過程の写真を参考に、日本家屋の土壁施工職人からアドバイスを得つつ、20×10×30cmの模擬日干しレンガ(乾燥密度1.5Mg/m3)を作成して電気浸透験の供試体とした。電気浸透による水分、塩分移動実験では電極に白金メッキしたラス電極を用いた。実験結果から塩分移動量と印加電圧、印加時間、電流の条件と水分、塩分移動量の関係を解析した。その結果、水分、塩分移動量と消費電力量に有意な相関関係を得ることができたが、当初予想した印加時間、印加電圧初期塩分量と水分、塩分移動量の間に有意な関係を見出すことはできなかった。また初期含水量の大小は水分、塩分の移動量に顕著な影響を与えるとの結果が得られたが、統計的に有意な関係を得るには至らなかった。以上の結果から、除塩に電気浸透を利用できる可能性を示し、除塩量の指標として消費電力量が有用であることを示した。しかし、初期水分量を大きくすることで移動量が大きくなることが指摘ができたものの、日干しレンガの含水量のコントロールと除塩の関係については十分な知見を得るに至らなかった。
網羅的遺伝子発現解析に基づく食道癌化学放射線療法の感受性予測法の開発

進行食道癌に対する化学放射線療法(CRT)は耐術不能例,根治切除不能例に対する重要な治療オプションであるが,必ずしも高率に完全緩解が得られる訳ではないこと,毒性の強いプラチナ製剤を使用することなどから,治療前にその効果を予測することは重要である.本研究はより簡便かつ精度の高いCRTの効果予測因子の確立を目指し,CRTを施行する食道癌症例を対象として,治療前の生検検体の癌組織の遺伝子発現解析をマイクロアレイで行い,CRTへの感受性に関連する遺伝子,miRNAを抽出する試みである.本研究ではCRT応答性に関わるバイオマーカーを選択する目的で,抽出されたマーカーの中から少数の候補を絞り込み,実地臨床でも活用可能な感受性予測システムを構築することを目的とした.当該年度では食道癌病期II-IVa(UICC-TNM)のCRT対象患者の治療前腫瘍組織からtotal RNAを抽出し,1700種類の遺伝子を搭載したmiRNA検出用オリゴDNAプローブを用いて発現プロファイリングを行った.アレイから有効データの抽出を行い,標準化を行った後,Wilcoxon順位和検定を用いて治療奏効群と非奏効群の2群間の遺伝子発現量の差に対する統計的検定を行った.その後,FCが2群間で10倍となり,かつWilcoxon順位和検定でp<0.001となるプローブセットのみを抽出した.進行食道癌に対する化学放射線療法(CRT)は耐術不能例,根治切除不能例に対する重要な治療オプションであるが,必ずしも高率に完全緩解が得られる訳ではないこと,毒性の強いプラチナ製剤を使用することなどから,治療前にその効果を予測することは重要である.本研究はより簡便かつ精度の高いCRTの効果予測因子の確立を目指し,CRTを施行する食道癌症例を対象として,治療前の生検検体の癌組織の遺伝子発現解析をマイクロアレイで行い,CRTへの感受性に関連する遺伝子,miRNAを抽出する試みである.申請者らは既に胃癌に対しプラチナ製剤を含む化学療法を行った患者検体におけるDNA修復因子に着目し,検討行ったところ,新たな治療反応性予測因子としてDDB2を見出している(図3).本研究では更にCRT応答性に関わるバイオマーカーを選択する目的で,抽出されたマーカーの中から少数の候補を絞り込み,実地臨床でも活用可能な感受性予測システムを構築することを目的とした.当該年度では食道癌病期II-IV(UICC-TNM 7th ed)のCRT対象患者の治療前腫瘍組織からtotal RNAを抽出し,1700種類の遺伝子を搭載したmiRNA検出用オリゴDNAプローブを用いて発現プロファイリングを行う.アレイから有効データの抽出を行い,標準化を行った後,Wilcoxon順位和検定を用いて治療奏効群と非奏効群の2群間の遺伝子発現量の差に対する統計的検定を行う.その後,FCが2群間で10倍となり,かつWilcoxon順位和検定でp<0.001となるプローブセットのみを抽出した.医歯薬学当該年度50例集積予定であったが,保存検体不良や患者の検体利用拒否などの要因によりやや症例集積が遅れている.26年度は予定通りの症例集積を見込んでおり,研究計画に変更はない.
弾性ポリマー中の液滴アレイを用いた波長可変レーザの作製

蛍光色素を有機溶媒に溶かして直径100μm程度の液滴を形成しレーザを照射すると、蛍光が内部を周回して干渉し特定波長の光だけが観測される。液滴をエラストマー(弾性ポリマー)中に形成すると、液滴を保持しつつ変形させることが可能であり、形状変化によって発光の波長・方向・偏光状態などを制御することができる。インクジェット法を用いて液滴をエラストマー中に形成する技術を開発し、変形による発光特性の変化を調べた。弾性変形するポリシロキサンをマトリクスとして色素液滴を形成するためには、ポリシロキサン原液と混ざり合わない極性基をもつ溶媒が必要であることを予備実験で明らかにした。メタノールやエタノールなどのアルコールは、ポリシロキサンより屈折率が低く、光を液滴内に閉じ込めてウィスパリングギャラリーモードを励振することができないため、界面活性剤を溶媒として用いることにした。しかし、ロダミン6Gのメタノール溶液は粘度が高く、インクジェット装置から吐出することができなかった。そこで、この界面活性剤溶液をメタノールで20倍に薄めた溶液を吐出したところ、沸点の低いメタノールが吐出直後に気化してしまうため、ポリシロキサンゴムの表面には界面活性剤の液滴ができることが分かった。この界面活性剤の液滴は、ポリシロキサンゴムの表面上では扁平な楕円体状になっていたので、その上に硬化前のポリシロキサン原液を滴下したところ、表面張力によって自己形成的に球状の液滴へと変化した。原液に予め硬化剤を添加しておくと、そのまま硬化して、ゴム中に直径10120μmの色素液滴が形成された。このようにして作製した試料に、波長532nm、パルス幅5nsの緑色レーザ光を照射したところ、560620nmの波長帯で、ウィスパリングギャラリーモード発振による周期的な発光ピークが観測された。ポリシロキサンゴムを圧縮して変形させると、液滴も圧縮方向に縮み、垂直方向には伸びて楕円体になった。その結果、共振器長が変化して、発光ピークが短波長側あるいは長波長側へと移動するのが観測された。インクジェット法を用いて弾性ポリマー中で微小液滴を形成することに関し、前年度に確立した技術にもとづいて、液滴を1次元あるいは2次元的に配列させる方法を開発した。インクジェット法で吐出できる液滴は約80plであるが、ノズルから放出されてポリマー表面に着床するまでの間に溶媒のメタノールが蒸発して約4plになる。液滴内で光が周回するウィスパリングギャラリーモードによるレーザ発振を起こすためには、少なくとも30μm程度の直径(体積20plに相当)が必要と推定されるので、1ショットだけでは十分なサイズの液滴を形成することができなかった。したがって、モーター駆動のマイクロポジショナー上に置いたポリマーを連続的に移動させて周期的に液滴を吐出する方法は使えないことが分かった。そこで、一定距離進むごとに停止させて複数ショットの液体を同一の位置に吐出することにした。この方法によって、20100μm程度の液滴を50200μm程度の周期で1次元、2次元に配列させることができた。隣り合う液滴どうしを接触させると表面張力により一体化してしまうので、各液滴内を周回する光が相互作用を及ぼす程度まで接近させることが困難であった。そこで、ウィスパリングギャラリーモードの結合を調べるため、シリコーン樹脂をモールド成型して複数のリング状流路を形成し、そこに充填した色素溶液による発光を観測した。リングを直線的に配列させると直進光が誘導放出を起こすため、リングは円周上に配列させた。リングの数を増やすにつれて発光強度が増大し、スペクトル幅が狭くなる誘導放出現象が見られ、リング内を周回する光が互いに結合していることを確認できた。シリコーンゴム中に保持した液滴を変形させたときの発光特性の変化について実験を行った。初年度の実験で、シリコーンを1%程度圧縮して液滴をわずかに変化させたときには、ウィスパリングギャラリー(WG)モードの発光ピークが、長波長または短波長側にわずかに移動するのが見られた。しかし、シリコーンを10%以上変形させると、圧縮方向への発光が消失することが分かった。一方で、圧縮と垂直な方向では強い発振ピークが観測されたことから、楕円体に変形した液滴の場合、楕円形の断面よりも円形の断面の方がWGモード発振が起こりやすいことが示唆された。共鳴発光の指向性や偏光依存性についても実験を行った。液滴を上方(z方向)から光励起し、励起方向とは垂直な2つの方向(x方向とy方向)に出た発光を観測したところ、わずかに異なる波長帯で共振ピークが観測された。もしxy面でWGモードが発振しているとすれば両方向で同じ発光を観測していることになり、スペクトルが一致するはずであるが、そうならなかったことから、WGモードはxz面とyz面で発振していることが分かった。これは、励起光が入射する液滴の上部で強く発光が起こるためと考えられる。

また、これらの発光を偏光子を通して観測したところ、x方向とy方向のどちらでも水平方向の偏光が強く、液滴径が大きいほど偏光による違いが大きくなることが分かった。水平方向の偏光は、xz面およびyz面を周回する光ではTEモードに相当することから、液滴中ではTEモードの方がTMモードよりも励振されやすいと推定される。液滴を配列させる方法については、新たに超音波トラップ法を開発し、シリコーン中に色素液滴を3次元配列させることに成功した。以上の結果を含め、3年間の研究期間で得られた成果をまとめ、論文投稿、学会発表などを行った。
GRIDによる天文学統合データ解析システムの研究・開発

近年発展が著しい情報学の研究成果と大量観測データを生み出す最新の望遠鏡技術の融合として構築を進めているJapanese Virtual Observatoryのプロトタイプ第1版が完成し,これを用いた数々のテストを実行した。プロトタイプではJVOを構成する連携データベースに透過的にアクセスするために新規に開発したJVO Query Language,仮想観測のワークフロー(プラン)を利用できる計算機資源によってダイナミックに変更できる機能などを組み込んだ。本年度のプロトタイプ構築の目的は,GRID技術を実際に用いこれまでに検討したデータベース連携などが可能であることを実証することにあった。プロトタイプ構築によって,GRID技術を活用することによってこれまで困難であった観測データ連携等が容易になることを実証できた。またデータベースを連携する際に必須となる検索言語(JVO Query Language)を新規に設計・実装した。言語はデータベースアクセスの標準言語であるSQLの上位互換となることを目指し,理論的な検討の結果,上位互換となることを確認できた。上に述べたプロトタイプにJVOQLを実装すると共に,JVOQLを標準SQLに分解するツールも実装することによって先に述べた連携データベースへのアクセスを可能にできた。これらの研究成果は,GRID関連の複数の国際学会における招待講演の結果非常に高い評価を受け,我が国のGRID関連活動を国際的に公表することができた。
欧米における自治体主導による都市再生と社会的包摂の比較研究

工業化からポスト工業化時代への移行は、中心市街地のアメニティ向上にむけた都市再生を促すとともに、空間的な社会的排除という問題を生起させる。本研究は、労働市場政策と住宅政策について、アメリカ、イギリス、ドイツ、オランダの比較検討から、都市における社会的排除への対応を類型化した。これにより日本の置かれている問題状況を明らかにし、社会的包摂を組み込んだあるべき都市再生のあり方を提示した。*今年度は、以下のような海外調査を実施した。2008年9月29日ベルリン市Mitte区は社会福祉局にHermann Heil氏を訪問、この区のWohngeld住宅扶助金の現状について、ベルリン市Mitte区社会福祉局住宅緊急対策専門相談室Hans Marien氏を訪問、この区の、住む場所を脅かされている人々に対する保護施策等について、9月30日ベルリン市ブルネン地区のマネージメント、Frau Grabner氏を訪問、社会的都市の現状と課題について、ベルリン州統合・労働・社会福祉省Schultke氏を訪問、ベルリン州におけるSLG IIの枠組みの中での居住費扶助について概要説明、10月1日ハンブルク州住宅・都市再開発・土地関係局住宅課Frank Hinrichsその他4名からIISLG導入後の住宅関係施策の現状について、同上、労働政策局にBou氏を訪問、ハルツ改革後の就労支援の現状と課題、10月2日ハンブルク州の地区町づくりマネージメントを行っている組織steg Hamburg mbHについてRuediger. Dohrendo氏から説明、ハンブルク州St. Pauli地区町づくりマネージメントについてRalf Starke氏からヒヤリング*今年度は、以下のように海外研究者を招聴し、国際セミナーを開催した。2009年2月7日李晶(上海華東師範大学)論題「大都市“農民工"の住宅問題と政策について」*今年度は、以下のような海外調査と研究者を招聘し、セミナーを開催した。10月26日*Dr. Korthals Altesからオランダの土地住宅問題についてヒヤリング*午後:デルフト市のジョブセンターを訪問、就労支援の実態についてヒヤリング10月27日*午前:Dr. Steve Wilkoxkから民間賃貸住宅、社会賃貸住宅のイギリス、オランダの比較についてレクチャーを受ける*午後:Dr. Marja Elsingaからオランダの社会住宅と住宅手当の最近の動向についてレクチャーを受ける10月29日*午前:オランダの就労政策、住宅政策についてDr.VroomanとDr. Kullbergからヒヤリング*午後田中書記官からオランダの社会保障についてレクチャーを受ける10月30日*Vestia住宅協会を訪問、副代表のYannsenから住宅協会の運営についてヒヤリング11月2日*Dr.Vincent Gruisからオランダの住宅協会の管理・運営についてヒヤリング2月22日Marja Elsinga教授(デルフト大学)を大阪に招聘、発表論題「オランダの社会住宅」2月23日同上、発表論題「オランダの住宅手当」2月24日同上、発表論題「オランダの社会住宅と住宅手当」*今年度の研究のねらいは、ドイツ、オランダにおける労働市場政策と住宅政策とに焦点をあて、大都市における社会的排除への対応を比較検討することにあった。とくに積極的労働市場政策と住宅手当との関連、さらに積極的労働市場政策を組み込んだ各国のワークフェア(雇用指向の社会政策)が、ウェルフェアの一環としての住宅手当に与えたインパクトを究明すべく、調査を行った。*具体的は、以下のような海外調査と研究者を招聘し、セミナーを開催した。9月28日、アムステルダム市のジョブセンターを訪問、若年者の就労支援についてヒヤリング。9月29日、アムステルダム大学、グローバル地理・行動学部にてDr.Sako Musterdから、アムステルダム市の都市再生と社会的排除についてレクチャーを受ける。9月30日、デルフト工科大学・建築環境研究所のDr. Marja Elsingaから、社会住宅と住宅手当の最近の動向についてレクチャーを受ける。10月1日、ロッテルダム市の住宅協会団地を数カ所、訪問。10月4日、ベルリン、フンボルト大学社会学部のDr. Hauzamanの自宅を訪問、ジェントリフィケーションについてレクチャーを受ける。10月5日、ベルリン市のジョブセンターを訪問、Dr. Bekkerから若年者の就労支援についてヒヤリング。2月22日、Dr. Stefan Kofner(チッタウ大学)を大阪に招聰、ドイツの労働市場と住宅手当についてレクチャーを受ける。2月23日、Dr. Stefan Kofner、その他の講師により、ドイツの住宅市場と住宅政策についてセミナーを開催。
スイッチング可能な光-分子強結合場のための蛍光性高分子の創製

金や銀などの金属ナノ粒子表面では、表面プラズモン共鳴による電場増強がおこるため、金属表面付近の分子のみに選択的に強い電場を与えることが知られている。本研究では、a)蛍光性分子を表面プラズモン共鳴による増強電場を用いて効率的に励起させる金属ナノ粒子の性質とb)熱刺激に応答して高分子鎖のコンホメーションを変化させる感熱応答性高分子の性質をあわせもつ機能性高分子を分子設計・合成し、蛍光性分子と金属ナノ粒子との相互作用可能な距離を熱刺激により可逆的に変更可能な光-分子強結合場の構築を目指す。平成22年度は、平成21年度に合成した蛍光性化合物を発光部位として用い、金ナノ粒子の捕捉ユニットとして3級アミノ基を有するユニットと温度に応答するアクリルアミド系ユニットとからなる三元共重合体を合成し、その感熱応答挙動について検討した。得られた三元共重合体を塩化金酸と室温で撹拌する事で7.1±0.8nmの金ナノ粒子を保持した感熱応答性高分子の合成に成功した。顕微鏡下における温度変化時の蛍光スペクトル観察の結果、金ナノ粒子を保持していない高分子に比べて金ナノ粒子を保持している高分子の方が高温領域における蛍光消光の割合が小さい事から、蛍光性分子と金属ナノ粒子との相互作用可能な距離を熱刺激で制御できる可能性が示唆された。平成21年度は、金ナノ粒子と相互作用可能な新規蛍光性分子として2,5-(ビスベンゾイミダゾール-2-イル)ピラジン誘導体およびピラゾール縮環キノキサリン誘導体を合成しそれらの分光学的特性を評価するとともに、蛍光性分子を連結した感熱応答性高分子であるポリ(N-イソプロピルアクリルアミド)(PNIPAM)の金ナノ粒子存在下における蛍光特性を検討し、以下の研究成果を得た。DMSO以外の有機溶媒に対する溶解性が低い2,5-(ビスベンゾイミダゾール-2-イル)ピラジンのベンゾイミダゾール環にアルキル基を導入して溶解性の向上を行った。いずれの誘導体もDMSO中で375nmに吸収極大を、440nmに蛍光極大をもつスペクトルを示し、その蛍光量子収率は0.80.9と高い値が維持された。ピラゾール縮環キノキサリン誘導体は470nmに吸収極大を、560nmに蛍光極大を持つスペクトルを示し、その蛍光量子収率は0.4であり、金ナノ粒子による消光およびプラズモン共鳴による蛍光増強を検討するのに有用な蛍光性分子である事を明らかにした。ピラゾール縮環キノキサリンを有するPNIPAMの熱相転移温度および蛍光強度には金ナノ粒子の影響は認められないものの、熱相転移後の蛍光団近傍がわずかに親水的となる事が明らかになった。
腫瘍血管内皮サイトカインレセプターの口腔癌の予後予測診断法への応用

口腔内は様々な炎症刺激に曝されることが多いことが知られている。実際,様々なケモカイン、炎症関連サイトカインの産生も亢進している。近年われわれは癌の血管においても炎症関連マーカーの発現が正常組織内の血管に比べて高いこと,その中でもPTX, PGE2、IL6などのサイトカインに加えて近年注目を集めているケモカインレセプターCXCR7が腫瘍血管内皮細胞の血管新生能維持に重要であることを見出した。そこで本研究においては口腔がんの腫瘍血管におけるCXCR7の発現と予後との比較を解析し,治療方針決定のためのバイオマーカーとしての有用性を探ることを目的とした。CXCR7はケモカインレセプターであるが,CXCL12の受容体として認識されてまだ日が浅いため、がんにおける機能に関しては未だ不明な点が多い。がんにおける炎症病態をとらえるためのバイオマーカーはいくつか報告されているが,血管に着目したものはほぼ皆無である。口腔がんの血管におけるCXCR7の発現に関してはこれまで全く報告されていない。当科ではほぼ定期的に口腔がんの手術が行われており、容易に入手できる口腔がん組織検体を用いて、CXCR7のがん細胞ならびに血管以外や間質細胞におけるCXCR7の発現の解析をした。腫瘍血管のCXCR7発現と各がん間質細胞との局在やその動員の程度などを組織学的に解析した。さらに各症例の臨床的因子とCXCR7発現の関連を統計学的に比較検討した。これまで、北海道大学病院口腔外科において口腔扁平上皮がんと診断された患者の病理パラフィン切片を用いてヒトのがん組織およびその周囲の非がん部の血管における発現を組織免疫染色により解析する.血管内皮細胞は抗CD34抗体を用いて識別し,さらにCXCR7に対する抗体を用いてシリアル切片を用いて血管との共局在の有無を解析してきた。なお,腫瘍血管におけるCXCR7の発現量の定量評価について法についても確立した。CD34により染色される血管の数が最も多い領域(hot spot)を5視野選びその視野における全血管数に対するCXCR7陽性血管数の割合により値を出すという手法が最適であるという結論に至った。CXCR7のがん細胞ならびに血管以外の間質細胞におけるCXCR7の発現の解析をおこなうにあたり、CXCR7の発現する血管以外の細胞を同定するために,がん細胞をAE1/AE3,がん関連線維芽細胞をαSMA, vimentin,さらにマクロファージとの関連をCD68に対する抗体を用いた免疫染色を行い,腫瘍血管のCXCR7発現と各がん間質細胞との局在やその動員の程度など組織学的に解析した。血管新生が豊富に起きている部位において炎症性細胞浸潤の増加と血管におけるCXCR7の発現増加が認められた。さらに、血管におけるCXCR7の発現のレベルと口腔がんの予後には負の相関があることが示唆された。今後は症例数をさらに増やして腫瘍血管におけるCXCR7の発現レベルとがんの転移や抗がん剤治療感受性、さらに腫瘍免疫細胞の動員の程度などについても検討を加えたい。なお、われわれはすでにCXCR7が腫瘍血管内皮においてその遊走能や管腔形成能をに関与していることをsiRNAならびに米国Chemocentrix社との共同研究により示している。今後は彼らが開発したさらにCXCR7の阻害剤CCX771を用いて抗腫瘍効果についても検証する予定である。口腔内は様々な炎症刺激に曝されており,炎症関連サイトカイン,ケモカインの産生が亢進している.このような環境下で発症・進展する口腔癌においても,炎症関連シグナル伝達は重要な役割を担っている.これまでわれわれは癌の血管内皮細胞もサイトカイン,ケモカインの発現が高いことを見出してきており,その中でもCXCR7が腫瘍血管新生に重要であることを見出してきた.本研究では,口腔癌の腫瘍血管ならびにがん細胞や間質細胞におけるCXCR7の発現を検討し,病態や予後との関連を解析して臨床的意義を明らかにし,バイオマーカーとしての可能性を検討する.平成29年度は,パラフィン切片におけるCXCR7の免疫染色条件を検討した.抗原賦活化方法,ブロッキング液,抗体濃度などの条件をふり,最適な染色条件を確立した.次にヒト口腔扁平上皮癌と診断された患者の手術摘出標本を用いて,CXCR7の免疫染色を行った.症例によってCXCR7発現パターンが異なることがわかってきた.腫瘍血管におけるCXCR7発現を検討するため,連続切片で血管内皮マーカーCD34の免疫染色を行い,血管を可視化した.腫瘍血管におけるCXCR7発現解析は,まずCD34で染色される血管数が多い領域(Hot spot)を各症例5視野程度選出し,全血管数をカウントする.次にその視野におけるCXCR7陽性血管数をカウントし,全血管に対するCXCR7陽性血管の割合を算出する方法で行った.当初の計画に沿って概ね研究は進んでいるため.パラフィン切片におけるCXCR7染色条件の検討ができ,実際にヒト口腔癌in vivo腫瘍血管におけるCXCR7の発現解析を行うことができた.口腔内は様々な炎症刺激に曝されることが多いことが知られている。

そこで本研究においては口腔がんの腫瘍血管におけるCXCR7の発現と予後との比較を解析し,治療方針決定のためのバイオマーカーとしての有用性を探ることを目的とした。CXCR7はケモカインレセプターであるが,CXCL12の受容体として認識されてまだ日が浅いため、がんにおける機能に関しては未だ不明な点が多い。がんにおける炎症病態をとらえるためのバイオマーカーはいくつか報告されているが,血管に着目したものはほぼ皆無である。口腔がんの血管におけるCXCR7の発現に関してはこれまで全く報告されていない。当科ではほぼ定期的に口腔がんの手術が行われており、容易に入手できる口腔がん組織検体を用いて、CXCR7のがん細胞ならびに血管以外や間質細胞におけるCXCR7の発現の解析をした。腫瘍血管のCXCR7発現と各がん間質細胞との局在やその動員の程度などを組織学的に解析した。さらに各症例の臨床的因子とCXCR7発現の関連を統計学的に比較検討した。これまで、北海道大学病院口腔外科において口腔扁平上皮がんと診断された患者の病理パラフィン切片を用いてヒトのがん組織およびその周囲の非がん部の血管における発現を組織免疫染色により解析する.血管内皮細胞は抗CD34抗体を用いて識別し,さらにCXCR7に対する抗体を用いてシリアル切片を用いて血管との共局在の有無を解析してきた。なお,腫瘍血管におけるCXCR7の発現量の定量評価について法についても確立した。CD34により染色される血管の数が最も多い領域(hot spot)を5視野選びその視野における全血管数に対するCXCR7陽性血管数の割合により値を出すという手法が最適であるという結論に至った。CXCR7のがん細胞ならびに血管以外の間質細胞におけるCXCR7の発現の解析をおこなうにあたり、CXCR7の発現する血管以外の細胞を同定するために,がん細胞をAE1/AE3,がん関連線維芽細胞をαSMA, vimentin,さらにマクロファージとの関連をCD68に対する抗体を用いた免疫染色を行い,腫瘍血管のCXCR7発現と各がん間質細胞との局在やその動員の程度など組織学的に解析した。血管新生が豊富に起きている部位において炎症性細胞浸潤の増加と血管におけるCXCR7の発現増加が認められた。さらに、血管におけるCXCR7の発現のレベルと口腔がんの予後には負の相関があることが示唆された。今後,腫瘍血管におけるCXCR7発現と非癌部正常血管におけるCXCR7の発現を比較する.さらに腫瘍血管におけるCXCR7発現と臨床病理学的因子との関連を統計学的に検討する.血管以外の間質細胞や癌細胞におけるCXCR7発現についても同様に解析し,その臨床的意義を検討する.CXCR7発現と臨床病理学的因子との関連が見出されれば,バイオマーカーとしての有用性の可能性が高い.さらに担癌マウスモデルを用いて,CXCR7の阻害を検討し,治療標的としての可能性を検討する.今後は症例数をさらに増やして腫瘍血管におけるCXCR7の発現レベルとがんの転移や抗がん剤治療感受性、さらに腫瘍免疫細胞の動員の程度などについても検討を加えたい。なお、われわれはすでにCXCR7が腫瘍血管内皮においてその遊走能や管腔形成能をに関与していることをsiRNA
超短パルスレーザー誘起断熱励起過程による次世代半導体ナノ表面の非熱的改質プロセス

本研究では、従来の熱的なプロセスが抱える上述のような技術課題に対するブレークスルーを探ることを目的とし、新材料系におけるナノヘテロ構造形成にも整合したナノ表面改質技術の確立を目指し、特に、超短パルスレーザー照射による低温再結晶化過程の解明ならびにSiナノ表面改質特性の解明に主眼を置いて研究を進めてきた。まず、ドーパント注入層の断面TEM観察を行ったところ、Geイオンの高濃度注入により非晶質化した深さ約10nmまでの領域は、それよりも深い領域での格子と整合した固相エピ成長に類する状態で、表面まで再結晶化し、シート抵抗もas implantedでの高抵抗の状態から低抵抗まで活性化させることが可能であることを示している。また、本実験では、パルス幅が短いほど、より活性化の度合いが高いことを示しており、本研究でのドーパント活性化プロセスが、パルス幅すなわち励起される周波数領域(パルス幅の逆数)に依存したプロセスであることを示唆している。さらに、Applied Materials Inc.が発表している1ms程度のdwell timeでのレーザー加熱によるドーパント活性化に関する実験データ(S.B.Felch等,Nucl.Instr. and Meth.in Phys.Res.B237(2005)35.)と比較を行ったところ、1ms程度の長時間のレーザー加熱アニールでは、B注入ドーズが1x10^<15>cm^<-2>におけるシート抵抗は本研究での実験結果と同等であるが、B注入ドーズを2x10^<15>cm^<-2>まで増加した領域では飽和しており、本研究での結果の方がより低抵抗化が可能となっている。今後、これまでの研究成果をさらに発展させて、ドーパント領域の更なる低抵抗化と新奇材料への適用を目指した研究を進めていく計画である。本研究では、従来の熱的なプロセスが抱える技術課題に対しブレークスルーをもたらす技術の開発を目的とし、これまでの研究成果をさらに発展させて、ポストスケーリング技術(新材料系におけるナノヘテロ構造形成)に整合したナノ表面改質技術の確立を目指し以下の研究を行った。まず、ドーパントに対するアニール特性の差異を調べるため、Si(100)基板にBイオンを注入した試料とBF2イオンを注入した試料について、超短パルスレーザーを室温で照射後のシート抵抗を測定した。Bイオンを注入した試料では、超短パルスレーザー照射により、室温でも低抵抗まで活性化させることが可能であることを示している。一方、BF2イオンを注入して作製した試料では超短パルスレーザーを照射しても高抵抗のままであり、照射するレーザーのフルーエンスが高い領域に入ってくるとむしろ抵抗が上昇した。これらの結果は、イオン注入により非晶質化した層へのレーザー照射により、非晶質相の結晶化は可能であるものの、室温での低温プロセスであるが故に、通常の熱的なアニールプロセスではフッ素原子の増速拡散によりBF2イオンを注入した領域からフッ素原子は深い領域に拡散して問題とならないのに対し、本課題で研究している超短パルスレーザー照射によるナノ表面処理プロセスでは、レーザー照射領域での再結晶化過程ににおいてフッ素原子の増速拡散を顕著に生じる程度まで高温になっていないために、フッ素原子が高濃度に残留し、低抵抗化を妨げている可能性を示唆している。このことは、本研究でのプロセスが室温での低温プロセスであり、さらに熱的な拡散を抑制可能であることを示しているものと考えている。
冠攣縮性狭心症動物モデルを用いた冠攣縮の成因と治療に対する分子生物学的アプローチ

本研究では、冠攣縮性狭心症動物モデルであるヒトR257H亜型PLC-delta 1血管平滑筋特異的過剰発現マウス(PLC-TGマウス)を用いて、カルシウム拮抗薬による冠攣縮抑制効果の機序を明らかにした。さらにAキナーゼアンカータンパク(A-kinase anchoring proteins, AKAP)の冠攣縮における役割を初めて明らかにした。本研究は冠攣縮性狭心症の新しい機序解明のみならず、難治性冠攣縮性狭心症の治療法の開発という点においても十分に意義深いと考えられる。1変異型Phospholipase C(PLC)を血管平滑筋に過剰発現させたtransgenic mouse(PLC-TG)を用いて、経静脈的エルゴノビン(50mg/kg)投与により誘発された冠攣縮が、カルシウム拮抗薬(ジルチアゼム60 mg/kg/日、経口投与14日間)により抑制されるかどうかを、体表面心電図による心電図変化(心拍数やST-T変化、房室ブロック)により検討した。さらにカルシウム拮抗薬による降圧の影響を除外するため、他の降圧薬(利尿薬トリクロルメチアジド1 mg/kg/日、経口投与14日間)を用いて同様の実験を行った。その結果ジルチアゼム投与では冠攣縮が抑制されたが、トリクロルメチアジドでは抑制されなかった。またこの結果は降圧効果とは無関係であった。2PLC活性を亢進させる物質であるp122蛋白を血管平滑筋に過剰発現させたtransgenic mouse(p122-TG)を作成し、免疫染色にてこのことを確認した。さらに頚静脈的エルゴノビン投与により体表面心電図にてST上昇が観察され、冠攣縮が誘発された。p122TGマウスの心臓ならびに大動脈を速やかに摘出し、ランゲンドルフ灌流装置にて実験を行った。p122TGマウスではエルゴノビンを投与後の圧センサーにて冠動脈灌流圧の上昇を認め、冠攣縮が誘発されたと考えられた。1細胞内カルシウムの動態ならびに血管トーヌスに関与しているAKAP79/150蛋白の冠攣縮への関与を検討した。AKAP79/150ノックアウト(AKAP-KO)マウスをPLC-TGマウスと交配し、PLC-delta 1血管過剰発現AKAP-KOマウス(PLC-AKAP-KOマウス)を作成した。PLC-TGマウスではエルゴノビン投与により冠攣縮が誘発されたが、PLC-TG/AKAP150KOマウスでも冠攣縮は抑制されなかった。PLC-TGマウスとPLC-TG/AKAP150KOマウスの大動脈より、Explant法にて血管平滑筋を初代培養(primary culture)し、アセチルコリン刺激に対する細胞内遊離カルシウムイオンの反応性についてfura-2を用いて分光蛍光光度計にて測定した。PLC-TGマウスより得られた血管平滑筋ではアセチルコリン刺激により細胞内遊離カルシウムイオンの上昇を認めたが、PLC-TG/AKAP150KOマウスより得られた血管平滑筋では細胞内遊離カルシウムイオンの上昇は野生型と同程度であった。以上から、PLC-TG/AKAP150KOマウスでは、細胞内遊離カルシウムイオンの過度の上昇を認めないにも関わらず、冠攣縮が誘発され、現在この機序を検討中である。2PLC活性を亢進させる物質であるp122蛋白を血管平滑筋に過剰発現させたトランスジェニックマウス(p122TGマウス)を作製し、マウス冠動脈の免疫染色によりp122蛋白の過剰発現を確認した。エルゴメトリン投与により体表面心電図でST上昇が観察され、冠攣縮が誘発された。p122TGマウスの大動脈平滑筋のPLC活性は野生型と比較し高値であった。ランゲンドルフ潅流実験では、p122TGマウスにおいてエルゴノビン投与後に冠潅流圧の上昇を認めた。ミクロフィルではp122TGマウスにおいて、冠動脈の攣縮を認めた。以上から、p122蛋白は冠攣縮を引き起こすことが示唆された。交付申請書に記載された平成27年度の研究計画がおおむね実行され、冠攣縮における細胞内カルシウムシグナル伝達機構の解明に向けて、非常に興味深い結果が得られており、上記区分(2)に該当すると思われる。1PLC活性を亢進させる物質であるp122蛋白を血管平滑筋に過剰発現させたトランスジェニックマウス(p122TGマウス)を作製し、このマウスが冠攣縮性狭心症の動物疾患モデルとして有用であることを報告した(PLoS One 2015)。p122TGマウスの大動脈よりExplant法にて血管平滑筋を初代培養し、アセチルコリン刺激に対する細胞内遊離カルシウムイオンの反応性をfura-2を用いて測定したところ、アセチルコリン濃度依存性に細胞内カルシウム濃度が上昇した。エルゴノビン投与による冠攣縮は、カルシウム拮抗薬であるジルチアゼム投与により抑制された。さらに、p122TGマウスの大動脈平滑筋細胞を用いた実験では、ジルチアゼム濃度依存性に細胞内カルシウム濃度上昇が抑制された(2017日本循環器学会学術集会発表)。以上から、p122蛋白過剰発現が関与した冠攣縮の抑制には、ジルチアゼムが有効である可能性が示唆された。2細胞内