hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
アンドロゲン依存性組織退縮に伴う初期発現遺伝子群の分子内分泌学的研究

アンドロゲン依存性組織の恒常性の分子機構を解明するためには、細胞増殖の分子機構と同時にアポトーシスの分子機構を明らかにする必要がある。本研究では、以下の3点に焦点を絞り研究を推進した。これらの研究には、ラット雄性副性器シオノギ癌をモデルシステムとして用いた。(1)アンドロゲン依存性組織の退縮初期段階における、がん遺伝子群を含むアンドロゲン応答性遺伝子群発現の検討。アポトーシスとの関連が示唆されるMycファミリーのパートナー、ラットMaxcDNAのクローニングに成功し、得られたcDNAをプローブとして、去勢ラット雄性副性器でMax mRNAのすみやかな発現誘導を観察した。(伊澤正郎、第66回日本内分泌学会学術総会、1993、Izawa Biopys Acta 1216,412,1993.)。一方、アポトーシスとの関連が示唆されているTRPM-2のAlfernative formのcDNAクローニングに成功した(第67回日本生化学会大会、大阪、1994、投稿中)。さらに、アンドロゲン応答性遺伝子群のmRNA Differential Displa法による同定を推進している。(2)ゲイムDNAのヌクレオソーム単位断片化の検討。アポトーシスの指標として用いられて来たGenomic DNAのヌクレオソーム単位断片化の高感度Assay法として、Genomic DNAをプローブとするHybridization Assay法を考案した。アンドロゲン応答性アポトーシス機構を有するシオノギ癌(SC115)由来細胞のクローニング。SC115の増殖進展過程でアンドロゲン応答性の異なる細胞群を示唆する結果が得られたことから、アンドロゲン応答性アポトーシス機構を指標として、SC115由来クローン化細胞の分離を試みた。その結果、ホルモン応答性の異なる3群のクローン化細胞を得た(第68回日本内分泌学会学術総会、1995)。これらの研究により、アンドロゲン依存性組織におけるアポトーシス機構を遺伝子発現レベルで解析する有用なプローブとモデルシステムが得られた。平成5年度の研究で、究極の目的であるアンドロゲン依存性組織の恒常性の分子機構の解明へ向けて、アンドロゲン依存性組織(ラット前立腺と精襄)退縮の分子機構解明の糸口を遺伝子発現のレベルで得る事を目標に、退縮初期段階における初期発現遺伝子群の概容を知ることを主目的に以下の2点に焦点を絞り研究してきた。(1)アンドロゲン依存性組織の退縮初期段階におけるがん遺伝子群発現の詳細な検討の1つの試みとして多様な生理作用との関連が示唆されているMycファミリーのパートナーであるラットMax cDNAのクローニングを試み、分離に成功した。そして、Max mRNAの去勢によるすみやかな誘導を観察した。これらの結果から、Maxをはじめとするがん遺伝子群発現の詳細と退縮過程との関連の検討が新たな研究課題となった。これらの研究は現在進行中であり、ラットMax cDNAに関する結果は既に報告した(伊沢正郎、第66回日本内分泌学会1993、Izawa,M.,1993,Biochem Biophys Acta 1216,492-494,1993)。(2)アポトーシスの指標として用いられて来たGenomic DNAのフラグメンテーションは、もっぱらエチヂウムブロマイド染色により観察されて来たが、アポトーシスの詳細なプロセスを検討するための指標とするには、DNAフラグメンテーションの分子機構の解明とともに、そのより感度の高いAssay法が必要であった。この目的のために、Genomic DNAをプローブとするHybridizationAssayを考案した。

この研究の過程でDNAフラグメントの性状の検討が新たな研究課題となった。このAssay法を用いて特定される退縮初期段階にある組織、細胞における発現変動を示す遺伝子群の検討は次年度の課題として残された。これらの研究は、発展的に現在進行中であり、次年度の研究課題として継続する予定である。平成6年度の研究では、アンドロゲン依存性組織退縮の分子機構を解明する糸口を、遺伝子発現のレベルで得る事を目標に以下の4点について、研究を推進した。(1)アンドロゲン依存性組織退縮とがん遺伝子群発現の関連の検討。(2)アポトーシスの指標の一つであるゲノムDNA断片化を、平成5年度の研究で開発した高感度Assay法により検討し、退縮初期過程を明確に特定する試み。(3)組織退縮初期過程に発現変動を示す遺伝子群のmRNA differential Display法による同定。(4)アンドロゲン依存性増殖を示すシオノギ癌(SC115)をモデルシステムとした、アポトーシス機構の解析解。(1)(2)(3)の研究では現在、継続推進中であり、Preliminaryではあるがアポトーシスとの密接な関連が示唆されているTRPM-2のAlferafive transcriptの同定(第67回、日本生化学会大会、投稿中)など興味ある結果が得られており、今後の発展が期待される。一方、(4)の研究では、癌の増殖進展過程へのアポトーシス機構の関与が示唆される結果が得られたことから(第67回日本内分泌学会学術総会、1994、投稿準備中)、アポトーシス機構を指標として新たなSC115クローン化細胞の分離を試み、アンドロゲン応答性の異なるアポトーシス機構を有するクローンの分離に成功した(第68回日本内分泌学会学術総会、1995、発表予定)。現在、これらのクローン化細胞を用いて(1)、(2)、(3)の研究を推進中である。これらの研究は、アンドロゲン依存性組織退縮の分子機構を遺伝子発現レベルで解析する興味ある手がかりを提供しており、発展的に推進中である。
片麻痺亜急性期の運動準備電位による脳の可塑性の研究

近年、成人脳でも、障害後機能分担の再構築が起こることがPETや磁気刺激による研究で示されている。このような脳の可塑性を運動準備電位と運動麻痺の回復の程度を指標に検討した。脳血管障害による片麻痺患者の亜急性期(発症から4-60日)に、指の随意的屈曲運動に先行する運動準備電位を記録した。また、運動準備電位検査時と発症6カ月後の筋力を6段階(0:完全麻痺、5:正常)に評価し、運動準備電位と麻痺の関係を検討した。その結果、1.正常側指運動では、運動準備電位の後期成分は、17名中12名で指と反対側の脳で大きく、指と同側の脳で大きいものはなかった。2.麻痺側指運動では、運動準備電位の後期成分は、17名中6名は指と反対側の脳で大きかったが、指と同側の脳で大きいものが5名あり、5名中4名は左片麻痺であった。3.脳の正中部の運動準備電位の早期成分は17名中5名で、後期成分は2名で麻痺側指運動の方が正常側指運動よりも大きく、4.麻痺の回復は、麻痺側指運動の運動準備電位が、同側の大脳皮質で反対側より大きかった例と正常側指運動の時よりも正中部で大きかった例で、その他の例と差はなかった。以上より、片麻痺の亜急性期に麻痺側指の随意運動で麻痺と同側の脳の運動準備電位が大きくなることが観察され、これは、脳障害により正常な脳の知覚運動野が活性化されるという脳の可塑性を神経生理学的に示したものと考えられた。しかし運動準備電位からみた脳の可塑性の有無は運動麻痺の回復に有意な影響を与えていなかった。今後運動麻痺の回復について詳しい評価が必要であろう。(Frackowiakら1991,Weillerら1992,Cohenら1991)。この脳の可塑性を片麻痺患者の運動準備電位と麻痺の回復を指標に検討した。脳血管障害による片麻痺患者の亜急性期に、患者の承諾を得て随意運動に先行する運動準備電位を記録した。正常側と麻痺側示指の屈曲運動を別々に行い、その際の運動準備電位を測定した。また、発症時、検査時、発症6ヶ月後の麻痺の程度を筋力検査で評価した。その結果、1.正常側運動の運動準備電位は17名中11名で指と反対側の脳で大きかった。2.麻痺側運動の運動準備電位は17名中5名で指と同側の脳で大きかった。3.正中部における運動準備電位は17名中5名で麻痺側指運動の方が正常側指運動よりも大きかった。4.麻痺側指運動の準備電位が、同側の大脳皮質で反対側より大きかった例と健側指運動の時よりも大きかった例の麻痺の回復は、通常例と差はなかった。以上より、麻痺例の随意運動では麻痺と同側の脳の運動準備電位が反対側よりも大きいことがしばしばあり、脳障害により麻痺指運動と同側の脳の知覚運動野が活性化されていることが示唆されたが、このことは必ずしも麻痺の回復に有意な影響をあたえているようにはみえなかった。しかし麻痺した指の運動に際して麻痺と同側脳の運動準備電位の活性化は、脳の可塑性の神経生理学的証拠であると考えられた。さらに、本研究では運動準備電位を指標に脳血管障害の亜急性期に脳の可塑性を示唆する所見をえた。

本年は運動準備電位の所見から正常脳が活性化されている場合に運動麻痺の回復がよいか否か検討した。そのために、脳血管障害による片麻痺患者の亜急性期に、指の随意的屈曲運動に先行する運動準備電位を記録した。また、運動準備電位検査時(発症から4-60日)と発症6カ月の筋力の程度を6段階(0:完全麻痺、5:正常)に評価した。その結果、1.麻痺側指運動では、運動準備電位の後期成分は、17名中6名は指と反対側の脳で大きかったが、指と同側の脳で大きいものが5名あり、5名中4名は左片麻痺であった。2.脳の正中部の運動準備電位の早期成分は17名中5名で、後期成分は2名で麻痺側指運動の方が正常側指運動よりも大きかった。3.発症6カ月後の筋力の改善は平均で0.8で、4.麻痺側指運動で運動準備電位が指と同側脳で大きかった5名中3名は、筋力の回復は0、1名は0.5、他の1名は1.5だった。5.麻痺側指運動の正中部での運動準備電位が、正常側指運動のものより大きかった5名中、2名は筋力の回復0、1名は1、2名は2であった。以上より、片麻痺の亜急性期の麻痺側指の運動準備電位からみた脳の可塑性の有無は運動麻痺の回復に有意な影響を与えていなかった。今後、運動麻痺の回復の詳しい評価による検討が必要であろう。
共分散行列の正実性を考慮した確率的同定問題に関する基礎的研究

本年度は,主に異常値が含まれる場合にも対応できるような確率的部分空間同定法を開発し,昨年度より複雑な場合の同定について考察を行った.具体的な研究成果は以下の4通りである.1)異常値が含まれる場合に対応できるシステム同定を考察した.具体的には,部分空間同定法の結果を初期値としてEMアルゴリズムによって推定値を改善する方法を考察し,システム制御情報学会論文誌に投稿した結果採用された(2005年5月号).また,異常値が含まれる場合の確率的部分空間同定法として,直交射影を繰り返す方法(査読のある国際学会CDC-ECC'05)とLeave-k-outによって異常値を検出する方法を開発した(査読のある学会SICE2005).2)これまで確率実現に基づいて提案した方法をまとめ,Automaticaに投稿した結果,2006年5月号に採用予定である.また,確率的部分空間同定法をまとめ提案法の利点を明らかにした(査読のある国際会議IFAC2005).3)これまでの知識を生かして閉ループ同定について考察を行った(査読のある国際学会IFAC2005).4)共分散行列の正実性に冠する研究結果を非正実な問題へと拡張して時期テーマとすべく,周波数データを用いて変数誤差モデルの同定に関する研究を行った.この予備的な研究は2006年3月下旬に開催される査読のある国際学会SYSID2006に投稿して,採用された.なお,3年間の科研費助成による本研究の成果を何件か海外発表したことにより,2006年9月にポルトガルで行われるControlo2006年の部分空間同定法のオーガナイズドセッションに招待された(投稿中).また,本研究の知識を生かした研究として,非線形性を含む場合や周波数領域のデータを使う研究を学生との共同の研究で行うことができた.本研究の目的は確率的部分空間同定法を確率実現の立場から見直し,有限個のデータに対して対応できる新たな確率的部分空間同定法のアルゴリズムを提案することにある.本年度は,ヒルベルト空間上のLQ分解に基づく新たな確率実現法を提案し,その結果に基づいて確率的部分空間同定法を提案した.具体的な研究成果は以下の通りである.1)無限個の時系列あるいは,無限個の正確な共分散行列が与えられる理想的な場合について考察し,Hilbert空間を導入してLQ分解に基づく新たな確率実現アルゴリズムを提案した.提案したアルゴリズムによって,定常リカッチ方程式を解くことなくイノベーション表現が得られる.この結果は査読のある国際学会SYSID2003で発表している.2)有限個の正確な共分散行列が与えられる理想的な場合について考察し,Hilbert空間上のLQ分解を用いて有限区間上の確率実現を求める新たなアルゴリズムを提案した.提案したアルゴリズムによって,非定常リカッチ方程式を解くことなく時変なイノベーション表現が得られる.この結果は査読のある国際学会ECC2003で発表している.3)上記の結果を有限個の時系列が与えられる場合へと適用し,リカッチ方程式を陽に用いない新たな確率的部分空間同定法を提案した.さらに数値シミュレーションを行ない,約1万個の時系列に対して良好な結果を得た。この結果は査読のある国際学会CDC2003で発表している.4,5)異常値が含まれる場合の部分空間同定法についても考察し,システム制御情報学会論文誌に投稿し掲載された.またEMアルゴリズムを用いて考察し,SSS2003の予稿集に採録された.安定性と最小位相性を保証する確率的部分空間同定法を考察し,精度の高いアルゴリズムを開発した.研究成果は以下の通りである.1.正確な共分散行列が有限個与えられる場合に対して,昨年度提案したブロックLQ分解に基づくアルゴリズムが最小位相なモデルを与えることを明らかにした.さらに,Lindquist and Picci (1996)による有限区間上の確率実現とMaciejowski (1996)による正準相関を用いた近似による確率実現が同じ実現であることも示し,これらの実現も最小位相モデルであることを示した.この結果を国際学会MTNS2004で発表した.2.CDC2003で提案した確率的部分空間同定法より,精度の良い推定値が得られる方法を考察した.さらに,最小位相なモデルを得るための確率的部分空間同定法のプロトタイプアルゴリズムを新たに開発したので,その中に精度良く計算する方法を盛り込んだ,この結果を国際学会SSS2004に投稿し,予稿集に採択された.3.有限個の時系列しか与えられない場合,昨年度CDC2003で提案したブロックLQ分解に基づくアルゴリズムでは,安定かつ最小位相モデルを与えないことが計算機による数値シミュレーションより明らかとなった.このためSSS04の結果を利用して,2本のリカッチ方程式を解いて,安定性と最小位相なモデルを得るための確率的部分空間同定法を開発した,国際学会IFAC2005に投稿した結果,採択されて2005年7月に発表予定となっている.4.外生入力が加わる場合のシステムに出力に異常値が含まれる場合に対して部分空間同定法を初期値とする精度が良いシステム同定法が得られた.システム制御情報学会論文誌に投稿したところ,掲載予定となっている.また、閉ループ同定に関してもシンプルな結果が得られ,国際学会IFAC2005に採択され発表予定である.本年度は,主に異常値が含まれる場合にも対応できるような確率的部分空間同定法を開発し,昨年度より複雑な場合の同定について考察を行った.具体的な研究成果は以下の4通りである.

1)異常値が含まれる場合に対応できるシステム同定を考察した.具体的には,部分空間同定法の結果を初期値としてEMアルゴリズムによって推定値を改善する方法を考察し,システム制御情報学会論文誌に投稿した結果採用された(2005年5月号).また,異常値が含まれる場合の確率的部分空間同定法として,直交射影を繰り返す方法(査読のある国際学会CDC-ECC'05)とLeave-k-outによって異常値を検出する方法を開発した(査読のある学会SICE2005).2)これまで確率実現に基づいて提案した方法をまとめ,Automaticaに投稿した結果,2006年5月号に採用予定である.また,確率的部分空間同定法をまとめ提案法の利点を明らかにした(査読のある国際会議IFAC2005).3)これまでの知識を生かして閉ループ同定について考察を行った(査読のある国際学会IFAC2005).4)共分散行列の正実性に冠する研究結果を非正実な問題へと拡張して時期テーマとすべく,周波数データを用いて変数誤差モデルの同定に関する研究を行った.この予備的な研究は2006年3月下旬に開催される査読のある国際学会SYSID2006に投稿して,採用された.なお,3年間の科研費助成による本研究の成果を何件か海外発表したことにより,2006年9月にポルトガルで行われるControlo2006年の部分空間同定法のオーガナイズドセッションに招待された(投稿中).また,本研究の知識を生かした研究として,非線形性を含む場合や周波数領域のデータを使う研究を学生との共同の研究で行うことができた.
先天性CMV感染症におけるSLITRK6（遺伝性難聴原因遺伝子）の役割について

先天性サイトメガロウイルス(CMV)感染は、神経・感覚器障害(精神発達遅滞や感音性難聴など)をはじめさまざまな臓器障害を引き起こすことが知られており、感染児のQOLに多大な影響をおよぼす。しかし、先天性CMV感染がどのようなメカニズムで神経・感覚器障害を引き起こすかについては不明な点が多い。我々はこれまでにヒト神経系培養細胞を用いたin vitroCMV感染モデルを構築・解析した結果、遺伝性難聴の原因遺伝子の一つであるSLITRK6の発現をCMVが抑制することを見出した。また、神経系細胞におけるSLITRK6発現変動の意義を明らかにするために、ヒト神経系培養細胞に対してSLITRK6発現ベクターあるいはSLITRK6 shRNA発現ベクターを導入し、SLITRK6発現を人為的に変動させた細胞を作出した。本年度は、これらの細胞について、神経系細胞の形態や生存率の違い、またこれらの細胞にCMVを実験的に感染させた場合の細胞障害性の程度など、CMVによる細胞障害性とSLITRK6発現レベルとの間に関連があるか検討を進めた。また、マウスサイトメガロウイルス(MCMV)をマウス脳に感染させると神経系障害や難聴を発症することが知られていることから、MCMVによる神経・感覚器障害とSLITRK6発現変動の関連を解析する目的で、マウス培養細胞を用いたMCMV感染系構築に向けた実験に着手した。これらの解析を進めることで、CMVによるSLITRK6発現抑制が神経系細胞の機能やCMV生活環に与える影響について明らかにする予定である。神経系細胞の機能やCMV生活環に対するSLITRK6発現変動の影響について解析を進めた。また、MCMVを用いたin vitro実験を行うための感染実験系構築に着手した。神経系細胞の機能およびCMV生活環に対して、SLITRK6の発現変動がどのような影響を及ぼすかについて引き続き解析を進める予定である。また、MCMVがマウスに引き起こす神経・感覚器障害のメカニズムにSLITRK6発現変動が関与するのかについても、実験系を確立し解析に着手する予定である。先天性サイトメガロウイルス(CMV)感染は、精神発達遅滞や感音性難聴などさまざまな神経・感覚器障害を引き起こし、感染児の予後に重大な影響をおよぼす場合がある。CMVが神経・感覚器障害を引き起こすメカニズムを明らかにする目的で、ヒト神経系細胞を用いたin vitro CMV感染モデルを解析し、これまでに1)遺伝性難聴の原因遺伝子として知られるSLITRK6の発現をCMVが抑制すること、2) CMVがコードするIE2がSLITRK6発現抑制に関与すること、を見出した。本年度は、CMV感染細胞におけるSLITRK6発現低下の意義を明らかにすることを目的として、ヒト神経系培養細胞に対してSLITRK6 shRNAあるいはSLITRK6発現ベクターを導入し、SLITRK6発現を特異的に抑制した細胞およびSLITRK6過剰発現細胞を作出した。これらの細胞を用いて、SLITRK6発現変動が神経系細胞の形態・増殖能・生存率などにどのような変化をもたらすのか、またこれらの細胞にCMVを実験的に感染させた後、CMV複製効率やCMVによる細胞障害性とSLITRK6発現レベルとの間に関連があるか検討を進めている。これらの解析により、神経系細胞におけるSLITRK6の機能、およびSLITRK6遺伝子産物の発現変動がCMV生活環に与える影響、さらにはCMVによるSLITRK6発現抑制が先天性CMV感染症における神経・感覚器障害とどのような関連性があるのかについて理解が深まると考えられる。CMV感染細胞におけるSLITRK6発現抑制の意義を明らかにする目的で、当初予定していた細胞の作出に取り組み、解析に着手した。

SLITRK6の発現変動がおよぼす影響について、神経系細胞の機能およびCMV生活環の観点から解析を進める。また、CMVによるSLITRK6発現抑制に機序についても解析に着手する予定である。神経系細胞の機能およびCMV生活環に対して、SLITRK6の発現変動がどのような影響を及ぼすかについて引き続き解析を進める予定である。また、MCMVがマウスに引き起こす神経・感覚器障害のメカニズムにSLITRK6発現変動が関与するのかについても、実験系を確立し解析に着手する予定である。本年度は、ヒト神経系培養細胞に対してSLITRK6 shRNAあるいはSLITRK6発現ベクターを導入し、SLITRK6発現を特異的に抑制した細胞およびSLITRK6過剰発現細胞を作出した。これらの実験が予想より順調に進んだため試薬の消費が少なく、使用した研究費が計画を下回った。一方来年度は、これらの細胞を用いてSLITRK6発現変動が神経系細胞の形態・増殖能・生存率に与える影響や、CMV複製効率やCMVによる細胞障害に与える影響を検討する計画である。これらの実験には比較的高価な試薬を使用し、実験結果の整理のために人件費を必要とするため、本年度に未使用となった研究費を充てる計画である。本年度は、ヒト神経系培養細胞について形態や生存率の違いや、CMVを実験的に感染させた場合の細胞障害性の程度など、CMVによる細胞障害性とSLITRK6発現レベルとの間に関連があるか検討を進めた。これらの実験は当初の予定より少量の試薬で完了することができたため、使用した研究費が計画を下回った。一方来年度は、実験結果の整理のために人件費を必要とするため、本年度に未使用となった研究費を充てる計画である。
ゴルジ体形成に働くp97ATPase膜融合のユビキチン化による制御

ゴルジ体と小胞体は、共に細胞内蛋白質輸送に重要であるが、その形成維持の仕組みは大きく異なる。これら二つの小器官において共通して働く膜融合機構としてp97ATPase経路を申請者は発見しているが、その作用機序は細胞内小器官において幾つかの点で異なる。中でも、ゴルジ体のみにおいて細胞分裂期における再構成でユビキチン(Ub)化修飾が必要である。我々は先に、p97ATPaseによるゴルジ体形成に必須な脱Ub化酵素VCIP135に対して、活性化因子Wacを発見している。このVCIP135/Wac複合体に対する新規結合因子を探索している過程で、VCIP135に特異的に結合する新規因子(p40と仮に命名)を同定することに成功した。この因子は、VCIP135に結合するのみならず、p97にも結合し、VCIP135/p97複合体に結合すると考えられる。p40のリコンビナント蛋白質を調整して抗原とし、p40にたいする抗体を作成した。この抗体を用いてp40の細胞内局在を調べたところゴルジ体と小胞体に加えて、ミトコンドリアにも存在していた。このp40の発現を培養細胞でsiRNA法にて抑制すると、蛍光顕微鏡でゴルジ体が縮小する表現型が認められた。念のため、actin繊維の染色をしてみると、p40発現抑制細胞では核周りのactin繊維が減少していた。逆にp40を培養細胞で過剰発現させると、ゴルジは核近傍に存在するものの散る傾向があった。さらにactin染色では、ストレスファイバーの形成とそれに共局在するp40が認められた。また、作成した抗p40抗体と可溶化したゴルジ体膜を用いて、免疫沈降を行った結果、p40結合蛋白質としてactinが単離されてきた。以上の結果から、p97ATPaseによる膜融合と細胞骨格の形成が強く関係している可能性が示唆されてきた。本研究では、脱ユビキチン化酵素VCIP135に対する新規結合因子(p40と仮に命名)を同定することに成功した。このp40はゴルジ体の形成維持に働くのみならず、アクチン繊維の形成にも機能していることを示唆するデータが得られている。ゴルジ体におけるアクチン繊維の役割は全く不明であり、今後の展開が大きく期待される。現在、p40とVCIP135ならびにp97の結合領域の解析をしており、結合能を失った変異体を単離しようとしている。変異体が取れれば、それを用いてp40-VCIP135やp40-p97の結合の機能をin vivoで解析する。また、p40発現抑制細胞の電子顕微鏡観察をしていないので、それを早急に行う。加えて、p40結合蛋白質を単離して、ゴルジ体や小胞体に局在する機能、actin繊維に対する機能等をさらに検討するつもりである。ゴルジ体は細胞分裂期に一旦小胞化して終期に娘細胞で再構成されるのに対して、小胞体は細胞分裂期でもその構造が保たれる。中でも、ゴルジ体のみにおいて細胞分裂期における再構成でユビキチン(Ub)化修飾が必要であり、ゴルジ体形成の特異性との強い関連性が示唆される。本研究では、このWacに対する新規結合因子をYeast two-Hybrid法で探索していた結果、siah1aを同定することに成功した。このsiah1aはE3ユビキチンリガーゼであったが、その機能についてはよく分かっていない。さらに、そのリコンビナント蛋白質を大腸菌で発現・精製し、Wacとの結合を試験管内で確かめたところ、直接に結合することが確かめられた。このWacとの複合体は全く新規のものであった。現在は、リコンビナント蛋白質を抗原としてウサギに注射し、抗体を作成しているところである。抗体が得られれば、その細胞内局在はもとより、その機能についても検討するための重要なツールが得られることとなる。本研究では、Wacに対する新規結合因子をYeast two-Hybrid法で探索し、siah1aを同定することに成功した。このsiah1aはE3ユビキチンリガーゼであった。さらに、そのリコンビナント蛋白質を大腸菌で発現・精製し、Wacとの結合を試験管内で確かめたところ、直接に結合することが確かめられてもいる。これら二つの小器官おいて共通して働く膜融合機構としてp97ATPase経路を申請者は発見しているが、その作用機序は細胞内小器官において幾つかの点で異なる。

このVCIP135/wac複合体に対する新規結合因子を探索している過程で、VCIP135に特異的に結合する新規因子(p40と仮に命名)を同定することに成功した。この因子は、VCIP135に結合するのみならず、p97にも結合し、VCIP135/p97複合体に結合すると考えられる。p40のリコンビナント蛋白質を調製して抗原とし、p40に対する抗体を作成した。この抗体を用いてp40の細胞内局在を調べたところ、ゴルジ体と小胞体に加えて、ミトコンドリアにも存在していた。このp40の発現を培養細胞でsiRNA法にて抑制すると、蛍光顕微鏡でゴルジ体が縮小する表現型が認められた。念のため、actin繊維の染色をしてみると、p40発現抑制細胞では核周りのactin繊維が減少していた。逆にp40を培養細胞で過剰発現させると、ゴルジは核近傍に存在するものの散る傾向があった。さらにactin染色では、ストレスファイバーの形成とそれに共局在するp40が認められた。本研究では、脱ユビキチン化酵素VCIP135に対する新規結合因子(p40と仮に命名)を同定することに成功した。このp40はゴルジ体の形成維持に働くのみならず、アクチン繊維の形成にも機能していることを示唆するデータが得られている。ゴルジ体におけるアクチン繊維の役割は全く不明であり、今後の展開が大きく期待される。ゴルジ体と小胞体は、共に細胞内蛋白質輸送に重要であるが、その形成維持の仕組みは大きく異なる。これら二つの小器官において共通して働く膜融合機構としてp97ATPase経路を申請者は発見しているが、その作用機序は細胞内小器官において幾つかの点で異なる。中でも、ゴルジ体のみにおいて細胞分裂期における再構成でユビキチン(Ub)化修飾が必要である。我々は先に、p97ATPaseによるゴルジ体形成に必須な脱Ub化酵素VCIP135に対して、活性化因子Wacを発見している。このVCIP135/Wac複合体に対する新規結合因子を探索している過程で、VCIP135に特異的に結合する新規因子(p40と仮に命名)を同定することに成功した。p40のリコンビナント蛋白質を調整して抗原とし、p40にたいする抗体を作成した。この抗体を用いてp40の細胞内局在を調べたところゴルジ体と小胞体に加えて、ミトコンドリアにも存在していた。また、作成した抗p40抗体と可溶化したゴルジ体膜を用いて、免疫沈降を行った結果、p40結合蛋白質としてactinが単離されてきた。以上の結果から、p97ATPaseによる膜融合と細胞骨格の形成が強く関係している可能性が示唆されてきた。
律蔵関連文献の総合研究

本研究では、世界各地に現存する「律蔵(=古代インドの仏教教団の実状を伝える文献)関連文献」の全体像を浮き彫りにし、どこに、どのような形で、いかなる言語の文献が現存するのかについて調査を行った。その結果、収集可能な資料は複写も含めてほぼすべてを集めることができた。同時に、それらの文献に関する整理分類を行い、過去の研究成果を踏まえながらSenteを用いて「律蔵関連文献データベース」の基礎となる<暫定版>を作成した。平成18年度は、律蔵研究の基礎となる原典類の現存状況を調査し、その全体像を正確に把握する作業を行った。具体的には、湯山明によって作成された<湯山目録>ならびに、徳田明本編『律宗文献目録』をガイドラインとしながら、申請者自身の先行研究である「律蔵関係写本研究の現状」に付加すべき資料の現存状況などを調査した。さらに、現存状況が確認された資料のうち入手可能な資料についてはそれを収集し、不可能な資料については、写本から作成された「テキスト」や「刊本」などをこれに準ずるものとして位置付け、資料の存在を確認できるような整理を行った。また、将来的な公開を前提としたデータベース化に向けて、それに相応しい形式や、将来におけるデータの大幅な追加・修正、隣接分野とのネットワーク化なども考慮し、その基本的構造の検討を行った。その過程で「研究者等による検索への対応」「文字コードの問題」「データベースの柔軟性」など多くの課題が再確認され、律蔵研究や教団史研究に関心を有するすべての研究者にとって有益な<総合目録>作成に向けて、今後解決していかなければならない多数の問題点が浮き彫りとなった。これらの問題点に関しては、本研究課題の海外研究協力者の一人である、ドイツ・ミュンヘン大学教授Christoph・Kleine氏を招聘し、世界的に利用可能なデータベース構築に向けていかなる形式を採用し、どのような方法をとるべきかについて意見交換を行い、基本的な方向性を確立することができた。次年度は、その方向性に従って、具体的な作業を継続させていく予定である。平成19年度は、律蔵研究の基礎となる原典類の現存状況を調査し、その全体像を正確に把握する作業を前年度に引き続いて行った。具体的には、湯山明によって作成された<湯山目録>ならびに、徳田明本編『律宗文献目録』をガイドラインとしながら、申請者自身の先行研究である「律蔵関係写本研究の現状」に付加すべき資料の現存状況などの調査を継続した。さらに、現存状況が確認された資料のうち入手可能な資料についてはそれを収集し、不可能な資料については、写本から作成された「テキスト」や「刊本」などをこれに準ずるものとして位置付け、資料の存在を確認できるような整理に取り組んだ。また、データベース化に向けて、将来的な公開を前提として、それに相応しい形式や、将来におけるデータの大幅な追加、修正、隣接分野とのネットワーク化なども考慮し、その基本的構造の検討を行った。特に本年度はカナダ・マクマスター大学のShayne Clarke氏を招聘し,昨年度に検討した<総合目録>作成に向けての全体構想に関して、律蔵研究の特殊性を踏まえた上で、どのようなソフトを利用し、いかなる形式・フォーマットでデータベース構築に取り組むべきかについて意見交換を行った。その結果、基本的な方向性については前年度の枠組みで進めることが確認された。あわせて具体的な作業の進め方についても検討を行い、Third Street Softwareが提供しているSenteを作業用のソフトとして採用し、収集したデータについては、当面は13種類の項目に従ってデータを入力していくこととなった。次年度は、具体的にこの入力作業を行い、データベースの基礎部分の構築を進めていく予定である。平成20年度は、律蔵研究の基礎となる原典類の現存状況に関する調査を継続し、その全体像を正確に把握する作業を前年度に引き続いて行った。さらに、現存状況が確認された資料のうち入手可能な資料についてはそれらを収集し、不可能な資料については、写本から作成された「テキスト」や「刊本」などをこれに準ずるものとして位置付け、資料の存在を確認できるような整理に取り組んだ。また、データベース化に向けて、昨年度、将来的な公開を前提として、それに相応しい形式や、将来におけるデータの大幅な追加、修正、隣接分野とのネットワーク化なども考慮し、その基本的構造の検討を行った結果、Third Street Softwareが提供しているSenteを作業用のソフトとして採用することを決定した。これに基づき、本年度は具体的な調査結果や資料整理の結果をSenteに入力し、データベースの基礎の構築を行った。収集したデータについては、当初の予定通り、一つの律関連資料に対して、13種類の項目を設定し、これを逐次入力していく作業を進めた。その結果、ガイドラインの一つである、徳田明本編『律宗文献目録』に集録された<第一次文献類

>についてのデータ入力が完了した。従って、当初の目的である<律蔵関連文献類に関する総合的なデータベース>の完成に向けて合、今後さらに<第二次文献類>の入力、並びに<湯山目録>を用いての補完作業を進めることが必要である。
農商務省と文部省に分けられた近代日本における漁業者養成制度の構造的特質

中等程度の水産教育機関で展開した近代日本の漁業者養成は、農商務省と文部省によって担われた。農商務省管轄の府県水産講習所では、正系の学校とされなかったことによる柔軟な教育課程と、研究・試験機能の内包を特徴とする組織で実際の生産活動を担う人材を多く養成した。文部省管轄の水産学校は、中学校や高等女学校とならぶ中等教育機関として、教育内容や水準もそれらとの整合性が求められた。また、水産学校には、専門学校への接続および判任官への無試験任用などの特典が付与されたことで、公吏となる者や大手水産に関わる者が養成された。すなわち、近代における漁業者養成制度は、管轄官庁や得られる学歴資格により構造化されたことが明らかとなった。本研究は、生産構造の変容に対応することが難しいという、日本の漁業者養成システムの形成過程を表出させる目的で実施される。その方法は、農商務省と文部省に分けられたわが国の漁業者養成制度の展開過程に注目し、なぜ2系統での養成形態が温存されたのかや、系統ごとの養成形態にみられる特質を明らかにする歴史研究の方法を採る。本年度は、かかる方法での研究を実施するため、明治期における水産教育の成立情況に関する基礎的資料の蒐集に力点をおいた調査研究活動を展開した。本研究が対象とする分野は、先行研究もほとんど皆無であり、通史などに記載されている事項ですら、事実であるかを確認する必要がある。本研究において、事実であるかの判断(事実認定)は、もっぱら県報でくだすこととしている。しかしながら、県報の保存状態は都道府県によってまちまちであり、本研究においても、青森県などでその確認が困難であった。県報を蒐集できなかった地域では、同窓会誌などの学校関係資料の蒐集に努めた。こうした資料蒐集や事実認定における段階は、十分な時間をかける必要がある。丁寧な一次資料の蒐集なくしては、その後の分析に小さくない瑕疵をもたらす。結果的に、分析は次年度に持ち越すこととしたため、本年度は資料蒐集が活動の中軸となった。ただし、既存の資料と併せることで成果発表も実施した。すなわち、全国地方教育史学会シンポジウムでの報告であり、当該学会の機関誌での発表である。次年度は、新たな調査による資料蒐集と、蓄積された資料の分析を通して、成果の蓄積を図ることを予定している。本年度における主要な作業は、府県水産講習所ならびに水産学校の当時の存立意義や特質に接近するため、未発見の『学校一覧』や同窓会誌などの資料蒐集とその資料から明らかとなる卒業生の動向などの分析につとめることであった。さらに、水産教育機関の展開背景にある水産教育政策の影響を把握するため、政策立案担当者(農商務省官吏など)や、水産教育制度構築に圧力団体として影響力を発揮した大日本水産会の役割にも注目した分析をおこなうことであった。分析の結果、わが国の水産教育機関の成立が他の職業教育に比して遅れた背景には、水産行政制度の遅れから官僚養成機構としての水産教育機関の成立が強く要求されなかったこと、漁船の動力化などを推し進める産業資本の流入が遅れたことなどが指摘できた。展開過程における水産教育機関の役割も、沿岸漁業の振興ではなく、官公吏養成や水産資本の発達に貢献する姿勢が色濃くでていた。とりわけ、水産学校は、中学校や高等女学校とならぶ中等教育機関に位置づけられており、教育内容や水準もそれらとの整合性が求められた。さらに、専検指定や将校配属の特典もあり、社会的位置づけが明確であったため、福井県立小浜水産学校では、明治後期の明治38年でさえ、在籍者103名のうち、士族階級が17.5%を占めた。卒業後は、官公吏となる者や水産資本に身を投じる者はいても、沿岸漁業に参入する者は限られた。つまり、本年度の研究からは、水産教育機関が自らの存立意義を官公吏養成や資本制漁業への人材供給に求めることで階層移動を後押しした実相と、沿岸漁業への貢献が、学ぶ者、教える者の双方にとって強い動機とはなり得なかったことが明らかとなった。これらの成果は、朝倉書房の『郷土史大系3』に掲載されることになった。最終年度となる本年度は、水産教育機関が漁業資本などの実社会へ人材を送り出す機能の分析をおこない、水産教育機関を卒業して、技師や船舶職員などの専門性の高い職に就いた者のキャリア構築の過程を捉えることで、水産教育システムと漁業経済システムの交錯を立体的に把握することを目指した。その結果、文部省管轄下にあった水産学校の性格として次のことが明らかとなった。すなわち水産学校は、実業学校として中学校や高等女学校とならぶ中等教育機関に位置づけられており、教育内容や水準も当然ながらそれらとの整合性が求められた。

このため専門学校への接続および判任文官への無試験任用を可能とした「専検指定」や、陸軍幹部候補生への志願資格が得られる現役将校配属の特典が付与された。特典によって、社会的位置づけが明確にされていたため、福井県立小浜水産学校では、明治後期の1905(明治38)年でさえ、在籍者103名のうち、士族階級が17.5%を占めた。卒業後は、官公吏となる者や水産資本に身を投じる者はいても、沿岸漁業に参入する者は限られた。この結果に、これまでの研究で明らかとなった官立および府県水産講習所の機能に関する研究成果をあわせると、近代日本の水産教育機関は、水産補習学校や一部の事例を除いて、沿岸漁業への貢献という側面を強化する方向に展開することはなかったことが確認された。すなわち、官立水産講習所は、水産学校と同じように官公吏需要や水産資本拡大への対応に軸足を置いていたし、これらに比べれば沿岸漁業層の傍らにあった府県水産講習所でさえ、大正期から昭和初期にかけて、威信や特典を求め、水産学校への改組や昇格を望むようになった。この時代、学校に通うには経済的余裕はもちろん、階層移動への期待が動機として必要であった。水産教育機関も、自らの存立意義を官公吏養成や資本制漁業への人材供給に求めることで階層移動を後押しした。はたして、近代日本の水産教育の展開過程からは、沿岸漁業への貢献が、学ぶ者、教える者の双方にとってその強い動機とはなり得なかったことが明らかとなった。
病原酵母のマイトファジーが病原性に及ぼす影響

病原真菌Candida glabrataの宿主体内での生育(病原性)において、ミトコンドリア選択的オートファジー(マイトファジー)が果たす役割を明らかにすることを目的に研究を行った。本年度は、(1)C. glabrataにおけるマイトファジー検出法の確立、(2)C. glabrataにおけるマイトファジー関連遺伝子ATG32の発現量とマイトファジーが誘導される条件の同定を試みた。(1)大阪大学生命機能研究科岡本准教授より分与していただいたプラスミドを用い、ジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)にGFPを付加したタンパク質をミトコンドリアに高発現するC. glabrata株を作製した。この株を親株とし、マイトファジーおよびオートファジーに必須であると考えられているATG遺伝子の破壊株を作製した。これらのC. glabrata株を用い、出芽酵母で報告されている抗GFP抗体を用いたウエスタンブロットにより、マイトファジー活性を検出する実験を行い、検出に成功した。(2)宿主臓器内においてマイトファジー関連遺伝子ATG32の発現量が増加することをすでに明らかにしていたため、宿主体内において菌が遭遇しうるストレス条件でスクリーニングを行ったところ、鉄欠乏条件においてATG32の発現量が著名に増加し、マイトファジーも活性化することが明らかになった。宿主体内、特に血液中ではトランスフェリンなどの鉄キレートタンパク質の働きにより、菌が利用することのできる遊離鉄濃度は非常に低く保たれている。そのため、病原真菌にとって鉄欠乏に適応することは病原性を発揮するために不可欠であると考えられている。マイトファジーによるミトコンドリア分解が鉄欠乏での生育に何らかの役割を果たしていることが示唆され、C. glabrataの病原性についての新たな知見が得られた。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。
デバイス駆動メカニズムに基づく高性能n型有機半導体の創出と普遍的設計指針の確立

研究の全体構想は、機能性材料を指向した新規π共役分子を開発することである。とりわけ応募者はエレクトロニクス材料への応用を目指している。この構想の一環として、本研究では電子輸送型(n型)の有機電界効果トランジスタ(OFET)、有機薄膜型太陽電池(OPV)材料の開発を目的とする。研究の方向性として、デバイス駆動メカニズムをもとに、電子構造と分子構造を精密設計した新規n型共役分子の系統的な開発を行う。さらに、創出したπ共役分子の構造ー基礎物性ー薄膜物性ーデバイス特性の相関を明らかとする。最終年度の今年度はn型OFET, OPVに向けた分子開発を実施した。FETに関してはベンゼン縮環を導入して安定化させ、かつフッ素原子導入で最低空軌道を低下させた分子を開発し、その構造を明らかにした。具体的にはベンゼン縮環導入によりキノイド構造の寄与が大きく増加することが明らかとなった。これを反映して、FET特性からキノイド構造が性能に及ぼす影響を考察した。n型OPV材料に関しては、新規な電子受容性部位としてフッ素化ナフトビスチアジアゾールを世界に先駆けて開発に成功し、これを導入したπ共役分子でフラーレン誘導体に匹敵する特性の発現を観測した。さらに、分子構造から性能向上に向けた知見を得ることができた。また、このフッ素化ナフトビスチアジゾールはn型OPVのみならず、n型FET, p型OPVの電子受容性部位としても機能する予備的知見も得た。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。本研究の全体構想は、機能性材料を指向した新規π共役分子を開発することである。研究の方向性として、デバイス駆動メカニズムをもとに、電子構造と分子構造を精密設計した新規n型π共役分子の系統的な開発を行なう。今年度はn型OFET, OPVの両方の分子開発を実施した。FETに関しての設計指針は、熱力学的・速度論的安定性を向上させるため、縮環構造や架橋構造の電子受容性ユニットを積極的に活かすことで、低いLUMOレベルと密な分子配列を満たす可溶性分子と定めた。これに向けてキノイド構造を鍵とする新規な電子受容性π共役分子の開発を系統的に行った。OPVに関しての設計指針は、ドナー-アクセプタ型p型材料と適合させるため、分子のLUMOレベル、混合薄膜での電子移動能、および、p型材料との混和性を精密に調節した直鎖構造・3次元構造と定めた。これに向けて新規な電子受容性部位を開発するとともに、新規π共役分子の設計と合成も行った。これら創出した分子の基礎物性評価として、電子吸収スペクトル測定、蛍光スペクトル測定、サイクリックボルタンメトリー測定を行った。本研究は、機能性材料を指向した新規π共役分子を開発することである。この構想の一環として、本研究ではn型のOFET、OPV材料の開発を目的とする。この目的に対して、今年度は計画していた標的分子の合成を達成できている状況であるため。研究の全体構想は機能性材料を指向した新規π共役分子を開発することである。とりわけ応募者は有機エレクトロニクス材料への応用を目指している。この応用に向けて、本研究では電子輸送型(n型)の有機電界効果トランジスタ(OFET)、有機薄膜型太陽電池(OPV)材料の開発に注力している。本研究の方向性としてはデバイス駆動メカニズムをもとに、分子構造と電子構造を精密設計した新規n型共役分子の系統的な開発を行っている。さらに、創成したπ共役分子の分子構造-基礎物性-薄膜物性-デバイス特性の相関を明らかとする。

今年度も昨年度に引き続き、n型OFET, OPVに向けた分子開発を実施した。FETに関してはキノイド構造分子に対して、ベンゼン縮環を導入してビラジカル性の寄与を減らすことを目的とした分子開発を行った。得られた分子に関してNMR測定において、ベンゼン縮環の導入によってビラジカル性の寄与が減少していることが明らかとなった。さらに、温度可変のトランジスタ測定の結果、ベンゼン縮環の導入により、電流のオンオフ比の温度依存が減少する傾向が観測された。OPVに関してはフッ素置換を導入したカルボニル縮環型アクセプターユニットの開発に成功した。このユニットの機能を明らかとするため、ドナーアクセプター型構造のポリマーを開発した。このポリマーはアモルファス特性を示すにも関わらず、9%を超える高い光電変換特性を示した。トランジスタ、有機薄膜太陽電池ともに分子開発が順調に進捗しているため。今年度合成した分子に関して基礎物性評価と半導体特性評価を実施する。さらにこの知見をもとに、第二世代の分子開発へと展開する。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。引き続き、分子構造に特徴のある半導体開発を継続することで、デバイス駆動メカニズム解明を検討する予定である平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
生物発光を利用した重症筋無力症関連自己抗体の包括的測定法の確立

我々は,従来法とは異なるカイアシルシフェラーゼ免疫沈降法(GLIP法)を利用した重症筋無力症自己抗体測定法の開発を計画した.MuSK抗体測定については従来法と同様の結果が得られたが、AChR抗体測定は十分に検出感度がすぐれているとは言えなかった。これと並行し、cell based assayによる高感度抗AChR抗体、MuSK抗体測定法にも着手し,Oxford大学の協力のもと測定環境が整った.従来,抗AChR抗体の検出にはradioimmunoprecipitation assay (RIA)法が汎用されてきたが,最近RIA法の検出感度を上回るcell-based assay (CBA)が注目されている.高感度抗AChR抗体測定法により全身型seronegative MGの約70%がaffinityの低い抗AChR抗体をもつことが示された. CBAの場合は,検査結果の定量性という点で困難さを包含しており,我々は,従来法とは異なるカイアシルシフェラーゼ免疫沈降法(GLIP法)による抗AChR抗体測定法の開発を計画した.ヒト筋肉型ニコチン性AChRを構成する5つのサブユニット(α1, β1,γ,ε,δ)cDNAとカイアシルシフェラーゼ(GL)cDNAを制限酵素部位により連結(アミノ末端側に各サブユニットcDNAを,カルボキシル末端側にGL cDNAを配置)し,各AChRサブユニットに関するリポーターの作製を行った.さらに,作製したリポーターcDNAを哺乳動物細胞遺伝子発現ベクター(pcDNA3.1)に組込んだ. AChRサブユニット特異的リポーター発現ベクターをヒト細胞株・293Fに遺伝子導入し,その発現を生化学的に確認するとともに,GL活性の確認も行った.各AChRサブユニットに対する既製抗体を入手し,各リポーターを使用したGLIPを実施し,GLIP法が成立する確認作業に取り組んだ.我々は,従来法とは異なるカイアシルシフェラーゼ免疫沈降法(GLIP法)を利用した重症筋無力症自己抗体測定法の開発を計画した.MuSK抗体測定については従来法と同様の結果が得られたが、AChR抗体測定は十分に検出感度がすぐれているとは言えなかった。これと並行し、cell based assayによる高感度抗AChR抗体、MuSK抗体測定法にも着手し,Oxford大学の協力のもと測定環境が整った.重症筋無力症(MG)は自己抗体がその発症の引き金を引くと目される自己免疫疾患の一つであり,その自己抗体の検査結果はMGの診断と診療において重要な位置を占める.全身型MGのおよそ8割強の患者,さらに,眼筋型MGのおよそ半数の患者の血清中には抗アセチルコリン受容体(AChR)抗体が認められ,抗AChR抗体型MGとも称される.当該研究代表者の白石は,これまでに,抗筋特異的受容体型チロシンキナーゼ(MuSK)抗体型MGの分子病態についての研究に携わってきた.「従来,抗AChR抗体の検出にはradioimmunoprecipitation assay (RIA)法が汎用されてきた.最近では,RIA法の検出感度を上回るcell-based assay (CBA)が注目されている.しかしながら,RIA法の場合は放射性同位元素を使用するため,検査担当者にとっては身体的・心理的負担が大きい.一方,CBAの場合は,検査結果の定量性という点で困難さを包含している.このような状況において,我々は,従来法とは異なる新しい抗AChR抗体検査法の開発を計画した.その検査原理には,当院の樋口らが開発したカイアシルシフェラーゼ免疫沈降法(GLIP法)を採用する.GLIP法は上述したRIA法やCBA法の問題点を解決する可能性があり,本研究は抗AChR抗体検査技術の更なる向上につながるものと期待している.我々は,従来法とは異なるカイアシルシフェラーゼ免疫沈降法(GLIP法)による抗AChR抗体測定法の開発を計画した.各AChRサブユニットに関するリポーターの作製を行った.次にAChRサブユニット特異的リポーター発現ベクターをヒト細胞株・293Fに遺伝子導入し,その発現を生化学的に確認するとともに,GL活性の確認を行った.各AChRサブユニットに対する既製抗体を入手し,各リポーターを使用したGLIPを実施し,GLIP法が成立する確認作業に取り組んだ.しかしながら、十分に検出感度がすぐれているとは言えなかった。この結果は第112回日本内科学会講演会で発表した。神経内科学各AChRサブユニットに対する既製抗体を入手し,各リポーターを使用したGLIPを実施した.現時点で十分に検出感度がすぐれているとは言えず,検証作業を行っている.これと並行し, cell based assayによる高感度抗AChR抗体測定法に着手した.方法は,1HEK293細胞にAChRα,β,δ,εサブユニットとラプシンをtransfectionし,細胞表面にAChRを高密度に発現させる.2患者血清を加え,ホルマリンで固定後,二次抗体(Goat anti-human IgG Alexa Fluor568)を加える3蛍光顕微鏡で評価を行う.13の準備は整い,assayを開始する.今年度は,カイアシルシフェラーゼ免疫沈降法(GLIP法)を原理とした新しい抗アセチルコリン受容体(AChR)抗体検出法の開発に着手した.GLIP法では,抗体の標的となる抗原分子の全長とカイアシルシフェラーゼ(分泌シグナルを除く)を融合させた「リポーター」の作製が必要である。そこで,まず,ヒト筋肉型ニコチン性AChRを構成する5つのサブユニット(α1, β1,γ,ε,δ)に関するヒトcDNAクローンのクローニングを行った.

次に,それぞれのヒトAChRサブユニットcDNAとカイアシルシフェラーゼ(GL)cDNAを制限酵素部位により連結(アミノ末端側に各サブユニットcDNAを,カルボキシル末端側にGL cDNAを配置)し,各AChRサブユニットに関するリポーターの作製を行った.さらに,作製したリポーターcDNAを哺乳動物細胞遺伝子発現ベクター(pcDNA3.1)に組込んだ.こうして完成した5種類のAChRサブユニット特異的リポーター発現ベクターをヒト細胞株・293Fに遺伝子導入し,その発現を生化学的に確認するとともに,GL活性の確認も行った.このリポーター作の完成が確認されたことで,抗AChR抗体のGLIPを実施する準備が整った.まず,各AChRサブユニットに対する既製抗体を入手し,各リポーターを使用したGLIPを実施し,GLIP法が成立することを確認する.この確認が済次第,実際のMG患者血清を対象としたGLIPを実施し,従来法と比較した上で,その検出感度や特異性などの詳細な検討を行う.MG血清を保存・管理するためのフリーザーを購入予定である.