hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
花成ホルモン研究モデルとしてのシソの開発研究

本研究の目的は、日長感受性の異なるシソの諸系統にそれぞれ早期発芽性を付与し、花成ホルモン研究のための遺伝学的モデル実験植物群を育成することにある。本年度は以下に述べる試験を行い、早期発芽性を有する長日系統の育種に成功した。1)昨年度の実験から、No.63系統(休眠要求性)×早期発芽系統由来のF_1植物が休眠要求性であり、早期発芽性が劣性形質であることが推定されたが、そのF_2種子を播種し、人工気象器内で生育させたところ、早期に発芽するものは殆ど見られなかった。このことから、早期発芽性は劣性形質であり、シソの発芽の休眠性には少なくとも2個以上の遺伝子が関与しているものと判断された。2)No.8系統より育種、固定された早期発芽系統(No.55945597系統)を薬用植物園の圃場で栽培し、それぞれ系統について大量増殖を図ると共に、特性を調査検討した。その結果、精油型はいずれもPP型(phenylpropanoidsを含む)で、果皮の薄い軟実系統で、No.8系統の性質を引き継いでいることが判った。また、日長感受性について調査したところ、No.5594およびNo.5595系統は完全な長日性を示し、6月に開花、7月に種子を収穫することが出来た。またNo.5596およびNo.5597系統はやや遅れて開花し、不完全な長日性で、種子の収穫期は9月であった。3)また、これらの実験とは別途に核酸レベルでの比較を行った。すなわち、日長感受性の異なる3系統群の葉についてそれぞれmRNAを抽出し、Northern blot法で花成時に特異的なRNAの検出を試みたが、成功しなかった。本研究の目的は、日長感受性の異なる諸系統にそれぞれ早期発芽性を付与し、世代交代を促進して、花成ホルモン研究のための遺伝学的モデル実験植物群を育成することにある。本年度は以下に述べる実験を行なった。実験1:早期発芽系統(No.8系統より選抜育種されたもの)と日長感受性の異なる、長日型(No.1866)、短日型(No.1,32,63など)、中間型(No.626)を苗床に播種、栽培温室で発芽させ、ついで長日条件(明:暗=16時間:8時間)下、人工気象器内で生育させた。本葉第2葉となった茎丈57cmの段階(播種後約30日)で、短日条件下(明:暗=8時間:16時間)に移し、花芽誘導を行った。その結果、約2週間後に花芽誘導が観察され、その後10日から20日間の間交配を行いF1種子を得た。実験2:収穫したF1種子を、a.収穫後早期(10日以内)に播種するもの、b.収穫後すぐに低温処理(5°C)をするもの、c.3ヵ月間低温(5°C)保存とにわけ、それぞれの早期発芽性と交配率とを検討した。その結果、aおよびbの条件下では早期に発芽するものは見られず、cの場合のみ発芽が見られた。またその場合の交配成功率もきわめて悪く、No.63×早期発芽系統由来のF1が1個体が得られたのみであった。ただし本F1植物については自家受精によりF2種子を得ることができた。以上の結果から、早期発芽性は休眠要求性に比べ劣性であると推察される。本年度の実験で、短日処理し誘導された花穂に着く花数が圃場のものとははるかに少数であったため、得られた種子の数も少なく、遺伝解析等の以降の実験を進めることが出来なかった。来年度はそれぞれの実験をスケールアップして個体数を増やし、また圃場での比較栽培実験を行なって当初の計画を完遂したいと考えている。
流体方程式の数値計算における境界条件の高精度化

流体方程式を高精度化に計算するうえで、固体の境界条件、あるいは流体間の変形する境界面をどのように扱うかという問題は重要である。本研究では(1)Level Set法を用いた三次元自由境界、(2)渦運動と音波の相互作用を調べる境界、(3)複雑な流れ場を解析するための計算、を取り上げ、それぞれの問題に対する計算スキームと境界条件の高精度化を検討し、次のような成果を得た。(1)液体中に気泡あるいは液滴が存在する場合の取り扱い方法として界面の位置、曲率などの量を容易に計算できるレベルセット法を取り上げ、三次元計算で異なる粘性比や、1:1000という大きな密度比の二流体を、精度よく計算できるコードの開発を行った。これを用いて、二気泡の合体、気泡の自由表面付近で崩壊過程、変形容器での界面の振動を解析した。(2)渦運動が局在している現象を渦度-ポテンシャル法による数値計算の方法を開発した。この中で、渦度集中領域、滑り球に近接した境界点でのポテンシャル値を積分により求めると高精度の計算ができ、渦音など流れ中の微少な変化に依存する現象を十分解析できることを、様々な流れにより示した。(3)外部からの音波の導入により境界層を制御する機構を、無反射境界条件を使い解析し、実験とほぼ一致する結果を得た。これの計算を基に、アニメーションなどの可視化により、異なる迎角について渦剥離に対する音の影響を解析した。(4)複雑な流れ解析のため、境界付近などに格子点が集中する不等間隔格子系に対する高精度高解像度の結合コンパクトスキームの開発を行い、より少ない格子点数で精度のよい計算ができることを示した。(5)熱塩対流や回転剪断流などを含む、様々な乱流の直接計算を実行し、理論との比較、モデルの検証などを行った。本年度は、計算領域、境界設定が比較的簡単な3種類の流れの数値的境界条件について、以下の研究を行った。●1.三次元二相流体の自由境界条件:液体中に気泡あるいは液滴が存在する場合の気泡界面の自由境界条件を検討し、Sussmanらが二次元気泡について提案しているLeveI Set法を三次元気泡周り流れに拡張した。三次元二相流体の場合、彼らの方法だけでは計算中の気泡の体積保存が不十分なため、過去に提案された3種類の方法を組み合わせることにより、気泡と周囲の流体の密度比、粘性比が大きい場合についても適用できる精度のよい数値計算方法を開発した。現在、これを用いて、より複雑な状態での計算を行い、検討を進めている。●2.外部からの微小入力音波の境界条件:外部から弱い音波を導入することにより、翼表面での剥離状態が変化する現象がある。この現象を数値的に捕らえるため、有限の計算領域境界に無反射境界条件を拡張して使用することで、音圧が基準圧の0.5%程度の音波を導入し、この現象を数値的に再現する事に成功した。今後、境界条件の高精度化等を計り、剥離に対する音波の影響を典型的なパラメータについて解析を行なう予定である。●3.結合コンパクトスキーム:二階の微分方程式と境界条件を同時に精度よく解くため、1998年Chuらによって発表された結合コンパクトスキームを用いて、二次元移流、二次元渦運動のテスト問題を解き、流体方程式に適用した場合の精度、安定性などを調査した。また、同じ空間点数を用いた、より高精度の結合コンパクトスキームへの拡張を行い、その有効性を検討している。昨年度につづき(1)Level Set

法を用いた三次元自由境界、(2)渦運動と音波の相互作用を調べる境界、(3)複雑な流れ場を解析するための計算、を取り上げ、それぞれの問題に対する計算スキームと境界条件の高精度化を検討し、次のような成果を得た。(1)レベルセット法により、異なる粘性比や、1:1000という大きな密度比の二流体間の界面を精度よく計算できる昨年開発した三次元計算用コードを用いて、気泡の自由表面付近で崩壊過程の解析や、変形する容器内に入れられた三種類の流体界面の振動解析を行った。(2)渦運動が局在している現象を過度-ポテンシャル法による数値計算の方法を開発した。この中で、過度集中領域、滑り球に近接した境界点でのポテンシャル値を積分により求めると高精度の計算ができ、渦音など流れ中の微少な変化に依存する現象を十分解析できることを示した。(3)外部からの音波の導入により境界層を制御する機構を、無反射境界を使い二次元翼について解析し、実験とほぼ一致する結果を得た。これの計算を基に、アニメーションなどの可視化により、異なる迎角についての渦剥離に対する音の影響を解析した。(4)複雑な流れの解析のため、境界付近などの格子点が集中する不等間隔格子系に対する高精度高解像度の結合コンパクトスキームの開発を行った。これにより、より少ない格子点数で精度のよい計算ができることを示した。
グリオーマの浸潤性・細胞周期からみたレトロウィルスベクターを用いた遺伝子療法

遺伝子導入効率を高める方法の開発を目的に次ぎの基礎実験を行った。1)神経膠腫の細胞周期(PCNA染色陽性率)と遺伝子導入効率が相関するか、細胞周期調節剤を用いて遺伝子導入効率を高めることが可能か。2)bystander effectにギャップ結合が関与しているか、関与しているとすればギャップ結合促進物質は自殺遺伝子療法の治療効果をあげるか。PCNA染色の結果から細胞増殖の盛んな腫瘍細胞でganciclovirの細胞障害性が強いと分かった。すなわち組換えウイルス感染率は増殖期細胞の割合に相関した。細胞周期に作用する物質Trichostatin Aについて検討した。Trichostatinを培養液から除去することにより同期したG0G1,G2M期細胞は細胞周期をS期に移行させることができこれに合わせて組換えレトロウイルス感染を行えばよいと分かった。このことから細胞周期調節剤の使用により治療効果を高めることができる可能性が示唆され、増殖性・細胞周期を考慮した治療計画が必要であると考えた。Bystander effectはヒト神経膠腫細胞とマウス由来のHSVtk陽性パッケージング細胞PG13との間においても認められた。免疫染色でヒト神経膠腫細胞におけるCx43は主として細胞質内に存在し、ウエスタンブロットでその存在は正常線維芽細胞に比べて少なかった。Lucifer yellow-fluorescent dye microinjectionでは隣接する細胞への蛍光色素の移行は少なかった。PG13は蛍光色素の移行を全く認めなかったにもかかわらずヒトグリオーマ細胞との間でbystander effectを示した。したがって細胞表面にCx43の発現が少ないグリオーマ細胞ではギャップ結合だけでbystander effectを充分説明できない結果であった。ギャップ結合作用をもつdexamethasone,β-caroteneは腫瘍細胞増殖抑制効果があるもののbystander effect促進作用を示さず自殺遺伝子療法への応用は今回の実験結果から有効性が期待できないと考えた。組替えウイルス産生細胞PG13pDGL-HSVtkcellの培養上清を使い、ヒトグリオーマ細胞に感染を行い遺伝子導入した。この際、ヒトグリオーマ細胞の増殖能、細胞周期と遺伝子導入効率が相関するかどうかin vitroでたしかめた。ヒトグリオーマ細胞の増殖能についてはdoubling time、細胞周期についてはPCNA,BrdU染色を調べた。Doubling timeの短い細胞で、またPCNA,BrdU染色率の高い細胞で遺伝子導入効率が高かった(第3回日本脳腫瘍カンファランス、1994年11月7日、那須)。Ganciclovirの細胞障害性はbystander effectによっても影響された(第7回脳と免疫研究会、1994年7月2日、宇都宮、第53回日本脳神経外科学会総会、1994年10月27日、徳島。Bystander effectにおけるギャップ結合については第2回脳腫瘍遺伝子治療懇話会において、1995年2月3日、佐賀県武雄)。以上から現時点における結論は以下の通りである。遺伝子導入効率は増殖能の高い腫瘍細胞で高い。細胞周期G1後期からS期に発現するPCNA、S期分画を示すBrdU染色陽性率に相関して遺伝子導入効率がよい。Ganciclovirの治療効果はbystander effectも関与している。今後in vivoについての結果、増殖能、細胞周期に影響を与える物質を作用させたときの結果を発表していく。浸潤悪性神経膠腫細胞に対して遺伝子治療が効果を発揮するためには2点について基礎的研究が必要なことが分った。第一は細胞周期のS期に遺伝子導入すること、第二にbystander effectを応用した遺伝子治療法である。第一については昨年度にヒトグリオーマ細胞の細胞周期と遺伝子導入効率が相関するかどうかin vitroで確かめ発表した。
消化器がん患者の栄養管理に関する看護支授プログラムの開発

消化器がん患者の生存期間を通した栄養管理看護支援プログラム開発のため、食生活管理状況とQOLの関係を明らかにすることを目的として調査を行った。胃・大腸がんで手術を受けた成人期以降の患者86名を対象に、個別面接質問紙調査を行った。調査内容は、(1)患者の属性:術式・進行度・治療状況・栄養状態・消化器症状(2)QOL:SF-8・食生活に関するQOL(自作質問紙,Cronbach'α>0.7)(3)食生活管理状況(食事準備,術前との食事状況の変化,栄養状態を保つために行っている事)重回帰分析の結果、[栄養状態を保つための行動をとっている事][食事所要時間の変化]が食生活に関するQOLに影響し、食生活に関するQOLとPCS(身体的健康度サマリースコア・SF8)は相互に影響しあっていた。また、術後経過でみると、術後1年未満では[食事準備][食事回数の変化]が、術後13年未満では[食事摂取所要時間の変化]、術後3年以上では[食事摂取量の変化]が食生活に関するQOLに影響していた。そのため、プログラムには、食事の摂取方法だけでなく、食事準備など食事に関する日常生活行動や社会復帰等による生活の変化による食生活への影響についての項目も設けた。さらに、栄養状態を保つために行っている事の内容は、個々それぞれであることや体重の変化率やTPとの関連がなかったことから、そのような行動をとっているという認識が患者の自己効力を向上させ、QOLを高めていたことが考えられる。プログラム実施に向けて、患者が自ら自己の栄養管理に取り組んでいるという意識を持たせるような働きかけの重要性が示唆され、また、術後経過によってもQOLに影響する食生活管理状況の内容が異なっていたことから、患者は自己の食事摂取状況を術後経過期間と鑑みながら評価している事が考えられ、術後経過期間とともに食事摂取状況を把握し、患者と目標設定について十分話し合いながら、継続的に支援することの重要性が示唆された。本研究は、消化器がん患者の食生活を良好な状態に保ち、QOLの高い生活を送るために必要な栄養管理看護支援プログラムの開発を目的とし、今年度はプログラム作成のための基礎的研究を行った。1.先行研究による検討CINAHLによる検索の結果、がん看護分野における栄養管理や食生活に関連した文献は、総説も含め67件であり、主に、緩和ケアにおける栄養管理や手術,化学療法による副作用と栄養状態に関するものであった。MRAL.(2002)は、がん患者は治療の副作用により栄養状態が低下し、食生活の変更を顕著に認めていたことを報告している。支援プログラムの作成にあたり、症状の状況とどのように食生活が変化したかという食生活管理状況を明らかにし、QOLとの関連を検討する必要性が示唆された。2.食生活に関するQOLの尺度の検討研究者が胃がん術後患者を対象に実施した研究(2005)で作成した食生活に関するQOL尺度(3構成概念6下位尺度全22項目)をさらに精度を高く、使用しやすいものにするために再検討を行った。共通性が0.0に近い項目を省き、残りの項目で因子分析を行った結果、3構1成概念4下位尺度全15項目の尺度となり、いずれの下位尺度もCronbach' α>0.7であった。3.プログラム作成のための基礎的研究消化器がん手術後患者の食生活に関するQOLと食生活管理状況との関連を明らかにすることを目的とし、調査を行った。調査内容は、(1)QOL : SF-8,食生活に関するQOL(2)食生活管理状況:食事の準備,食行動の変化,消化器症状,栄養状態の把握状況とし、胃がん及び大腸がんと診断され、手術を受けた成人期以降の同意の得られた患者を対象に個別面接質問紙調査を実施、現在データ収集中である。今後、データを蓄積し、分析を行い、その結果をもとにプログラムの枠組みを作成、それに沿った内容で縦断的に面接調査を行い、QOL,食生活状況の変化と適応のプロセスを明らかにし、支援プログラムの内容を検討する予定である。

プログラム実施に向けて、患者が自ら自己の栄養管理に取り組んでいるという意識を持たせるような働きかけの重要性が示唆され、また、術後経過によってもQOLに影響する食生活管理状況の内容が異なっていたことから、患者は自己の食事摂取状況を術後経過期間と鑑みながら評価している事が考えられ、術後経過期間とともに食事摂取状況を把握し、患者と目標設定について十分話し合いながら、継続的に支援することの重要性が示唆された。
医療に対する患者の満足度-測定方法の標準化と影響要因の解明

【背景・目的】患者による医療の評価あるいは満足度の客観的評価を、医療・サービスの質の保障と向上に活用する重要性はますます高まっている。本研究は、患者満足度測定の方法論を開発し、その影響要因を解析することを目的とする。また、医療技術よりも思いやり・優しさを重視する患者群と、逆に思いやり・優しさよりも医療技術を重視する患者群とにおける医療満足度の関連要因の差異を比較・検討した。【対象および方法】調査期間中に合同調査参加病院(国公立33病院、民間43病院の合計76病院[平均病床数:484±256床])の対象基準を満たす全退院患者に自記式質問票を配布し回答率60%、5,814名より回答が得られた。調査項目は入院医療について総合評価、各領域における評価(健康の改善、医師・看護婦など病院スタッフのケアやコミュニケーション、説明、医療提供のシステム、入院生活の快適さ・利便性、病院の評判)、医療への期待・要望および患者属性である。質問票は高い妥当性と信頼性を持つにいたっている。【結果・考察】患者満足度は年齢が高い層ほど高くなる傾向を示し、男性患者では医師に対する評価や病院の評判、健康の改善等、医療の質に関連する要因が、女性患者では医療スタッフとの関係が満足度と有意に関連していた。「思いやり重視群」(n=479)「技術重視群」(n=1,698)においては、前者で医療の総合評価に関連する要因は患者への配慮や思いやりおよび療養環境を反映する項目が説明因子として特定された。「技術重視群」では、医師の技能への信頼、病院の評判、体のなおり具合など、医療の技能的側面、医療技術水準への信頼に関する項目が説明因子として特定された。期待・要望の差異により患者満足の影響因子が異なることが概念にとどまらず実証的に示され、医療・サービス改善の実践に際しても本知見は有意義と思われる。〈背景・目的〉医療サービスの質と効率の向上への社会的要請は益々高まっており、医療の受け手である患者の満足度はサービス評価の一つの重要な指標として位置づけられるようになってきている。本研究は、医療に対する患者の満足度について信頼性、妥当性、有用性の高い測定法を開発し、さらにそれを用いて、患者満足度の規定要因を解析することを目的とする。〈対象と方法〉調査対象は病院医療に対する患者および職員のアンケート調査研究に協力の得られた76病院で、所在地は北海道から沖縄までにおよぶ。50床未満から超1000床、国公立民間の設立主体の病院を含んでいる。中小病院を除く病院は臨床研修指定病院から無作為抽出した病院の内、参加承諾の取れたものである。入院医療に対する患者満足度調査票は過去5年間の調査を経て信頼性と妥当性を改善すべく改訂を重ね開発した。調査期間中の全退院患者を対象に配布し郵送にて回収した。その回収率は約6割であった。〈結果・考察〉綿密な内容分析と数回の調査・解析実績に基づく開発した患者満足度の調査票は、内容的妥当性、構成概念妥当性、因子的妥当性、内部整合性、再現性といった点で、十分に高い信頼性・妥当性を得ることができ、全国におよぶ種々のタイプの病院で利用可能性のあることが実証された。サブスケールのそれぞれは、病院間やグループ間の識別において、実質的でしかも統計的な有意差を呈した。サブスケール間の相関、総合評価の関連因子、などをみることがきた。

解析結果を各参加病院にフィードバックの後に第2回目のデータ収集を進めているが、今後、医療サービスの質のより実質的・客観的指標との関係から妥当性の検証や時間縦断的調査による因果関係の方向性の検証を進める必要がある。【背景・目的】患者による医療の評価あるいは満足度の客観的評価を、医療・サービスの質の保障と向上に活用する重要性はますます高まっている。本研究は、患者満足度測定の方法論を開発し、その影響要因を解析することを目的とする。また、医療技術よりも思いやり・優しさを重視する患者群と、逆に思いやり・優しさよりも医療技術を重視する患者群とにおける医療満足度の関連要因の差異を比較・検討した。【対象および方法】調査期間中に合同調査参加病院(国公立33病院、民間43病院の合計76病院[平均病床数:484±256床])の対象基準を満たす全退院患者に自記式質問票を配布し回答率60%、5,814名より回答が得られた。調査項目は入院医療について総合評価、各領域における評価(健康の改善、医師・看護婦など病院スタッフのケアやコミュニケーション、説明、医療提供のシステム、入院生活の快適さ・利便性、病院の評判)、医療への期待・要望および患者属性である。質問票は高い妥当性と信頼性を持つにいたっている。【結果・考察】患者満足度は年齢が高い層ほど高くなる傾向を示し、男性患者では医師に対する評価や病院の評判、健康の改善等、医療の質に関連する要因が、女性患者では医療スタッフとの関係が満足度と有意に関連していた。「思いやり重視群」(n=479)「技術重視群」(n=1,698)においては、前者で医療の総合評価に関連する要因は患者への配慮や思いやりおよび療養環境を反映する項目が説明因子として特定された。「技術重視群」では、医師の技能への信頼、病院の評判、体のなおり具合など、医療の技能的側面、医療技術水準への信頼に関する項目が説明因子として特定された。期待・要望の差異により患者満足の影響因子が異なることが概念にとどまらず実証的に示され、医療・サービス改善の実践に際しても本知見は有意義と思われる。
カボチャのアスコルビン酸酸化酵素遺伝子の組織特異的発現とその制御機構の解明

カボチャ果実組織からゲノムDNAを抽出し、アスコルビン酸酸化酵素cDNAをプラ-ブとしたサザンブロットをおこなった結果、アスコルビン酸酸化酵素遺伝子のハプロイドゲノムあたりのコピ-数はシングルコピ-と推定した。アスコルビン酸酸化酵素cDNAをプロ-ブとしたノ-ザンブロット法によりカボチャ細胞におけるアスコルビン酸酸化酵素の種々の生産調節が転写レベルで制御されているのかどうかを調べた。カボチャ果実組織からのカルス化にともないアスコルビン酸酸化酵素活性およびタンパク質が急激に増大するが、ノ-ザンブロットの結果からアスコルビン酸酸化酵素mRNAもカルス化にともない増大することがわかった。ホルモンである2、4ーDをぬくとアスコルビン酸酸化酵素mRNAは増大しないこと、同じカボチャの分泌性酵素であるキチナ-ゼは2、4ーDあるなしにかかわらず増大することなどから、アスコルビン酸酸化酵素は2、4ーDにより酸導されるものと思われる。すなわち、アスコルビン酸酸化酵素遺伝子の転写がオ-キシンにより制御されている可能性が示された。一般に、アスコルビン酸酸化酵素はウリ科植物の果実組織に多量に発現する酵素とされていた。しかし、ノ-ザンブロットの結果から成長中の葉組織にも有意なアスコルビン酸酸化酵素mRNAが認められた。一方、カボチャ種子中にはアスコルビン酸酸化酵素mRNAは認められなかったが、吸水発茅にともなって、急激にアスコルビン酸酸化酵素mRNAが蓄積されていった。これらの結果から、アスコルビン酸酸化酵素の生産量が細胞の成長や増殖と相関しているように思われる。アスコルビン酸酸化酵素が細胞壁に局在する酵素であることから、アスコルビン酸酸化酵素が細胞壁の生長になんらかの関与をしているのかもしれない。現在、アスコルビン酸酸化酵素のゲノム遺伝子のクロ-ニングを試みており、今後、さらにアスコルビン酸酸化酵素伝子の発現調節の機構を遺伝子レベルで明らかにしていきたい。
エンドトキシン病態におけるIFN-γ誘導因子(IGIF)の役割に関する研究

本研究では、IL-18の生理活性を、特に、そのエンドトキシン病態における役割に焦点を当てて検討した。第一に、IL-18(IGIF)のノックアウトマウスを作製し、野生型マウスと比較検討した。その結果、IL-18ノックアウトマウスはエンドトキシン肝障害にはならないが、ショック死に至りやすかった。このことから、IL-18はエンドトキシン肝障害に必須であることが判明した。また、IL-18欠損マウスのリンパ球は、野生型のそれと同程度にTh2細胞へ分化したが、Th1への分化に異常があった。また、IL-18欠損マウスは野生型とほぼ同数のNK細胞を保有するが、そのNK活性は低下していた。このように、免疫系の分化にもIL-18が大きく貢献していることが判明した。第二に、種々の細胞におけるIL-18受容体の発現を検討したところ、NK細胞は恒常的にIL-18受容体を発現しているが、ナイーブなT細胞はIL-12刺激を受けることにより本受容体を発現する事が判明した。また、IL-18の細胞内伝達機構もMyd88欠損マウスを用いて明らかにした。また、IL-18受容体ノックアウトマウスはIL-18刺激にまったく応答しないことから、IL-18受容体が、IL-18の主要な受容体であることが判明した。第三に、IL-18の分泌にIL-1β転換酵素(ICE)が重要な働きを果たすことを、ICEノックアウトマウスを用いて証明した。第4にICEを多量に発現するICEトランスジェニックマウスが恒常的にIL-18を分泌することを明らかにした。このように、IL-18は、多様な臓器で多彩な機能を果たしていることを語り始めている。IGIF (interferon gamma-inducing factor)は、Tリンパ球からのインターフェロンγ産生を強力に誘導するサイトカインである点に着目して発見当初命名された名称であるが、多様な生理活性を有することが明らかになった現在では、インターロイキン18(IL-18)と称される。当該研究はIL-18がPropionibacterium acnes (P. acnes)とエンドトキシンによる肝細胞障害の発症にどの様に関わるかについて、分子レベルから個体レベルに至るまで、明らかにしようとするものである。平成9年度中に以下の項目が明らかになった。1.IL-18ノックアウトマウスの作製:型どおりIL-18を人為的に欠損したマウスを作製した。その結果、IL-18欠損マウスではP. acnesとエンドトキシンによる急性肝障害が観察されなかった。このことから、本肝障害にIL-18が必須であることが個体レベルで明らかになった。しかし、一方、致死性ショックはIL-18欠損マウスではむしろ強く生じることから、今後、エンドトキシンショックにIL-18がどの様な役割を果たしているのかを明らかにしていきたい。2.IL-18受容体はcDNAクローニングされ、IL-1受容体と相同性のある分子であることが判明した。現在、この分子を欠損したマウスを作成中である。3.既に報告しているように、IL-18は生理活性のない前駆体として産生された後にcaspase-1(ICE)によって切断されて初めて生物活性のある成熟型IL-18として分泌される。このcaspase-1欠損マウスもP. acnesとエンドトキシンによる肝障害に抵抗性であることが明らかになった。その結果、IL-18ノックアウト

マウスはエンドトキシン肝障害にはならないが、ショック死に至りやすかった。このことから、IL-18はエンドトキシン肝障害に必須であることが判明した。また、IL-18欠損マウスのリンパ球は、野生型のそれと同程度にTh2細胞へ分化したが、Th1への分化に異常があった。また、IL-18欠損マウスは野生型とほぼ同数のNK細胞を保有するが、そのNK活性は低下していた。このように、免疫系の分化にもIL-18が大きく貢献していることが判明した。第二に、種々の細胞におけるIL-18受容体の発現を検討したところ、NK細胞は恒常的にIL-18受容体を発現しているが、ナイーブなT細胞はIL-12刺激を受けることにより本受容体を発現する事が判明した。また、IL-18の細胞内伝達機構もMyd88欠損マウスを用いて明らかにした。また、IL-18受容体ノックアウトマウスはIL-18刺激にまったく応答しないことから、IL-18受容体が、IL-18の主要な受容体であることが判明した。第三に、IL-18の分泌にIL-1β転換酵素(ICE)が重要な働きを果たすことを、ICEノックアウトマウスを用いて証明した。第4にICEを多量に発現するICEトランスジェニックマウスが恒常的にIL-18を分泌することを明らかにした。このように、IL-18は、多様な臓器で多彩な機能を果たしていることを語り始めている。
新しいアデノウイルスベクターを用いた大腸癌肝転移に対する免疫遺伝子療法の確立

各種サイトカイン(IL-12,GMCSF)遺伝子を導入したp53導入アデノウイルスの作製に尽力している段階であるが、実験段階に使用できうる精度のベクターが現在のところ得られていない状況である.マウス大腸癌株(CT26)をマウスの脾に注入し脾静脈を介した肝転多モデルを作製、あらかじめ治療のため皮下に脾臓をつりあげておく.micrometastasisを起こしているとされる4-5日めに、コントロール群としてウィルス作製時に用いるVero細胞上清を,治療群として各種遺伝子変異型ウイルスを直接腫瘍内に注入する.4週後にsacrificeし,肝転移の度合いを評価する.現在in vivoでの手技的精度を一定化させるべく,このプロトコールを変異型ヘルペスウイルスG207にて繰り返しており,有意差はでないもののウイルス群で肝転移が抑制される傾向が認められている.また別に,腫瘍内でのウイルス発現,サイト力イン発現,免疫反応を検討するための各種免疫組織化学染色,アイソトープを川いたCTI活性の測定の精度を上げるための予備実験を積み重ねている段階である.各種サイトカイン(IL-12,GMCSF)遺伝子を導入したp53導入アデノウイルスの作製に尽力している段階であるが、実験段階に使用できうる精度のベクターが現在のところ得られていない状況である.マウス大腸癌株(CT26)をマウスの脾に注入し脾静脈を介した肝転多モデルを作製、あらかじめ治療のため皮下に脾臓をつりあげておく.micrometastasisを起こしているとされる4-5日めに、コントロール群としてウィルス作製時に用いるVero細胞上清を,治療群として各種遺伝子変異型ウイルスを直接腫瘍内に注入する.4週後にsacrificeし,肝転移の度合いを評価する.現在in vivoでの手技的精度を一定化させるべく,このプロトコールを変異型ヘルペスウイルスG207にて繰り返しており,有意差はでないもののウイルス群で肝転移が抑制される傾向が認められている.また別に,腫瘍内でのウイルス発現,サイト力イン発現,免疫反応を検討するための各種免疫組織化学染色,アイソトープを川いたCTI活性の測定の精度を上げるための予備実験を積み重ねている段階である.
量子極限におけるグラファイトの新奇振動現象の解明

グラファイトの擬量子極限(10-30 T)において磁場に周期的な電気伝導率の振動が2017年に発見され、注目されている。その振幅が量子化抵抗程度であることから量子現象由来である可能性が指摘されている。その起源として、結晶に積層欠陥による超格子が形成され、そのポテンシャル変調によって干渉効果が起こっている可能性が提唱されているが、直接的証拠はない。本研究では相対角度を制御した積層結晶を作製することで人工的に超格子を導入した試料を作製し、研究室レベルで行える小型のパルス磁場中での精密電気伝導測定と組み合わせることで、本現象の起源解明を行う。
デジタル化ナノチャネルに基づく単一細胞オミクス計測技術の確立

本研究では、単一細胞内のすべての生体分子を1分子単位かつハイスループットで計測すること可能な技術としてデジタル化ナノチャネル(DN)を提案し、DNのコンセプトを実現するための技術基盤を確立した。具体的には、まず、精密、高密度、安定的なDN構造を有するチップ作製の基盤技術を確立した。そして、DNによる1分子計測のための信号検出機構が確認できた。さらに、DN性能向上に関連するタンパク質非特異吸着の抑制やDNチップの再生などの基盤技術を確立した。以上から、DN技術は全く新しい細胞計測技術として更なる展開を大変期待できると考えられる。代表者がこれまで携わってきたナノチャネル技術と1分子計測技術に基づいて、単一細胞内のすべての生体分子を1分子単位かつハイスループットで計測することが可能な技術としてデジタル化ナノチャネル(DN)を提案するとともに、これに基づく全く新しい細胞計測技術の確立が本研究の目的である。平成26年度は、DN構造の作製条件の検討、DN構造を有するナノ流体チップの接合技術の開発、DN構造を用いた1分子検出のための自己組織化単分子膜の構築を行った。(1)DN構造を作製するには、電子ビームリソグラフィや、プラズマドライエッチング、蒸着、リフトオフなどの多段階ナノ加工プロセスを利用した。それぞれのプロセスのパラメーターの検討実験によって、超高精度(数字nm)の位置とサイズの制御ができる、高密度、安定的なDN構造の作製条件を明らかにした。その作製法は、特許として出願している(特願2014-101461号)。(2)DN構造にナノスケールの金構造がある。従来のガラスチップfusion接合は、1060°Cの接合温度が金の融点に近いので、DNチップの接合に利用できない。また、代表者が開発した室温接合は、フッ素ガスを使うため、金をエッチング・フッ素化する効果があり、DNチップの接合に適合した方法とは言えない。従って、DN構造を有するチップのダメージレス接合は課題であった。この課題に対して、酸素プラズマ処理などの複合プロセスを開発し、DNチップのダメージレス接合は低温600°Cで実現した。(3)提案したDN検出法では、自己組織化単分子膜(SAM)を利用して標的タンパク質捕獲用の抗体を固定する。作製したDNチップを用いてチップ内にSAMを形成させることで、高密度かつ高分解能を有するSAMのナノアレイの作製に成功した。この結果は、化学マイクロ・ナノシステム分野で最高峰の学術誌であるLab on a Chipに発表され、さらに裏表紙(Issue 9、2015)を飾った。代表者がこれまで培ってきたナノチャネル技術と1分子計測技術に基づいて、単一細胞内のすべての生体分子を1分子単位かつハイスループットで計測することが可能な技術としてデジタル化ナノチャネル(DN)を提案するとともに、これに基づく全く新しい細胞計測技術の確立が本研究の目的である。平成27年度は、DNのコンセプトを実現するため、抗体の高密度固定化、標識体検出範囲の確認、非特異吸着の抑制法の開発に取り組んだ。(1)標的タンパク質を高効率的に捕獲するために、DN内抗体の高密度アレイ化の流体制御、試薬濃度、反応時間などの条件だし実験を行い、それぞれの条件をおおまかに明らかにした。(2)高感度で1分子の信号を容易に検出するために、標識体を利用してDNによって標識体に由来するドット状の蛍光を、極微弱蛍光を検出できるEM-CCDカメラを用いて検出した。使用している標識体は適合していることを証明した。(3)DN内タンパク質非特異吸着抑制のため、生体膜の構成成分であるホスホリルコリン(PC)基を有するリン脂質モノマーの合成と評価を行った。定性評価と定量評価の両方から、合成したリン脂質モノマーは良好なタンパク質吸着抑制効果を有することがわかった。さらに、ナノスケールにおいて合成したリン脂質モノマーを用いたコーティング技術を試した。上記以外、現在のDNチップを用いた1分子検出のプロセスをさらにシンプルにするため、ナノ粒子を利用した新しいDN技術も探索した。平成27年度は、研究実績の概要で述べたように、抗体の高密度固定化、標識体検出範囲の確認、非特異吸着の抑制法の開発など当初に計画した項目を全部に取り組んで各項目の目標をほぼ実現した。また、現在のDNでは、1分子捕捉も1分子検出もナノチャネル内で行う仕組みとなっているため、反応ステップが多いというデメリットがある。これに対し、ナノ粒子よりナノチャネル外で1分子捕捉してナノチャネル内で1分子検出するという改良したDN技術の探索を始めているところである。従って、平成27年度は当初計画以上に進展していると言える。本研究の目的は、代表者がこれまで培ってきたナノチャネル技術と1分子計測技術に基づいて、単一細胞内のすべての生体分子を1分子単位かつハイスループットで計測することが可能な技術としてデジタル化ナノチャネル(DN)を提案するとともに、これに基づく全く新しい細胞計測技術の確立である。平成28年度は、DNのコンセプトの実現にあたり存在するいくつかの課題に取り組んだ。まずは、実験の効率化と検出精度の向上を目的として、1分子検出におけるダブルカウントや、その逆のカウント漏れを防ぐため、検出画面のサイズに基づいてDNの分子検出区域を区画し、さらに工夫した矢印を設計するなど、チップの構造的な改良を加え、観察しやすく、カウント精度を向上させたDNチップを作り出すことができた。そして、1分子検出率をさらに向上させるため、DN内の流体が静止できるような疎水性ゲーティングの構築を試した。一般的なナノチャネル内に作成した疎水性ゲーティングの性能を評価したところ、DNチップ内でも流体の制御ができると十分に期待される結果が得られた。

また、1分子検出精度を向上させるため、昨年度に設計、合成したMPC-Siを用いてDNにおけるタンパク質非特異吸着の抑制効果について評価したところ、MPC-SiコーティングはDN内で優れたタンパク質非特異吸着能力を有することが示された。これらの取り組みによりDNの1分子検出の能力が向上させた。以上を踏まえ、DN技術は全く新しい細胞計測技術として更なる展開を大変期待できると考えられる。本研究では、単一細胞内のすべての生体分子を1分子単位かつハイスループットで計測すること可能な技術としてデジタル化ナノチャネル(DN)を提案し、DNのコンセプトを実現するための技術基盤を確立した。具体的には、まず、精密、高密度、安定的なDN構造を有するチップ作製の基盤技術を確立した。そして、DNによる1分子計測のための信号検出機構が確認できた。さらに、DN性能向上に関連するタンパク質非特異吸着の抑制やDNチップの再生などの基盤技術を確立した。以上から、DN技術は全く新しい細胞計測技術として更なる展開を大変期待できると考えられる。平成26年度は、若干の方針変更はあったものの、研究実績の概要で述べたように、DNチップ作製のために必要かつ不可欠である条件を明らかにするとともに、DNチップを用いて1分子計測のfirst stepであるSAMのナノアレイの形成に成功しており、当初の目的はほぼ達成した。また、当初の計画の推進により、タンパク質非特異吸着がDNに基づく高感度1分子検出に大きな支障になることが新たに明らかとなった。この新たな重要課題を解決するため、以前に代表者が培ってきたマイクロスケールでの非特異吸着抑制の経験を活用し、ナノチャネルの極めて小さい空間に適合する、タンパク質非特異吸着の抑制ができるリン脂質モノマーの分子設計、合成、及び評価も始めているところである。従って、平成26年度は当初計画以上に進展していると言える。平成28年度は、DNのコンセプトの実現にあたり存在する下記の課題を取り組む。(1)1分子検出におけるダブルカウントや、その逆のカウント漏れを防ぐため、チップの構造的な改良を加え、観察しやすいチップを作り出すことによって実験の効率化と検出精度の向上を目指す。(2)1分子検出率をさらに向上させるため、DN内の流体が静止できるようなバルブの構築や、高性能な分析ツールの導入、またはDNチップの構造、試薬濃度、反応時間、反応温度など、DN構造内でシトクロムcを捕獲する為の最適条件を更に検討する。(3)1分子検出精度を向上させるため、昨年度に合成したMPC-Siを用いてDNにおけるタンパク質非特異吸着の抑制効果にいて評価する。(4)余裕がある場合、QDを用いる検出法に適合したDNチップの再生法を開発する。DNを含むナノ流体デバイスを用いた研究開発の効率面・経済面を促進する。28年度が最終年度であるため、記入しない。ナノ化学システム、分析化学、バイオマテリアル
キラルナノ界面の構築を目指した含ホウ素自己組織体の創製と不斉触媒反応への応用

本研究では、キラルナノ構造体の機能創出を目的に、ボロン酸を基軸とした階層的自己組織化を経て得られる単分散性ボロネート粒子の不斉触媒用担体利用や不斉分子ユニットとして酒石酸を連結した凝集誘起発光型ボロネート分子系の合成を検討した。具体的には、N-ホルミル-L-バリン誘導体にボロン酸グラフト基を結合した新規化合物を合成して、ボロネート粒子に吸着させた。得られた複合体をトリクロロシラン共存下ケチミン類の還元反応に適用したところ、不斉触媒機能を発現した。一方、凝集誘起発光型光学活性ボロネート酒石酸は、キラルジアミン類や天然のシンコナアルカロイド類の添加に対してエナンチオ選択的発光挙動を発現した。ボロン酸の動的共有結合性を用いた階層的自己組織化により単分散性粒子が得られ,不均一触媒の担体として機能することを見出している。今年度,不斉水素化反応に適用することを念頭に,ペンタエリスリトールと1,4-ジベンゼンボロン酸との逐次的脱水縮合から組み上がるボロネート粒子の表面にPdを担持させた(Pd-BP)。そのPd-BPと不斉修飾剤としてシンコニジン(CD)を共存させ,α-フェニル桂皮酸(α-PCA)の不斉水素化反応を実施した。その結果,(S)-2,3-ジフェニルプロピオン酸が優先的に得られたことに対して,擬鏡像異性体であるシンコニン(CN)を添加した場合,その鏡像異性体である(R)-2,3-ジフェニルプロピオン酸が主生成物して得られることがわかった。一方,ボロン酸エステルを基軸とする新規キラル機能分子系の提案は,本研究課題に寄与する。そこで,凝集誘起発光特性をもつテトラフェニルエチレンのジボロン酸誘導体を合成し,そこにキラルな酒石酸を共存させたところ,ボロン酸エステル型動的共有結合を介するb分子会合系が形成した。興味あることに,キラリティーをもつシクロヘキサンジアミンに対して,エナンチオ選択的な蛍光応答を示した。酒石酸のカルボン酸部位とシクロヘキサンジアミンとの酸・塩基反応が相互作用点であると考察されるが,シクロヘキサンジアミンの分子不斉に基づく僅かな凝集挙動の違いが蛍光強度の差に反映したものと思われる。階層的自己組織化から誘導されるボロネート単分散粒子は,種々の貴金属の担持を可能にし,それらナノ金属の性質と協働した触媒活性を発現させる。今年度,そのナノ金属担持ボロネート粒子に不斉修飾剤を共存させたところ,α-フェニル桂皮酸の水素化反応に対して不斉反応を導くことができた。しかしながら,生成物のエナンチオ選択性は最大32%eeに留まっており,改良が望まれる。含ホウ素分子系を用いた階層的自己組織化により単分散性粒子が得られる。今年度は、キラルナノ界面をもつ粒子の不斉固体触媒としての応用と関連キラル分子系の機能開発をおこなった。1)キラル分子をグラフトさせたボロネートマイクロ粒子の調製と不斉反応への適用ジボロン酸と多価アルコールとの逐次的脱水縮合反応は核形成-成長反応を誘導し、単分散粒子が生成される。その表面修飾性を勘案した新規な不斉固体触媒の調製を目指して、N-ホルミル-L-バリンのボロン酸誘導体を新規に合成した。その不斉補助剤は当該単分散性粒子にグラフトされ、キラルナノ界面をもつ粒子を得た。その特性評価として、トリクロロシランをヒドリド源とする4-メトキシ-N-(1-フェニルエチリデン)アニリンの還元反応に適用したところ、不斉触媒粒子としての活性を示した。生成物のエナンチマー過剰率の改善が望まれるものの再利用特性が見出され、固体触媒としての性質をもつことがわかった。2)凝集誘起発光(AIE)特性をもつキラル分子系の構築と蛍光不斉認識含ホウ素キラル分子系の基礎研究を併せておこなった。ジボロン酸型テトラフェニルエチレンは酒石酸とボロネートエステル化を経てキラル分子系を形成する。そこに、光学活性なシクロヘキサンジアミンと共存させたところ、その鏡像異性体関係を反映した蛍光性不斉認識を発現した。その機構解明に向けた調査は、シクロヘキサンジアミン添加後の凝集速度にエナンチオ依存性があることを突き止めた。この現象と凝集誘起発光特性との組み合わせは新しいキラルセンサーの提案に結びつくので、単結晶X線構造解析を含む更なる調査と関連分子系の調製を進めている。固体触媒は分離精製の容易さや再利用特性に優れているものの、不斉触媒反応のように基質と触媒分子との間で厳密な相互作用が要求される反応系では、均一系触媒と比べて不斉選択性が低い。事実、今年度実施したN-ホルミル-L-バリン修飾型ボロネート粒子では、生成物のエナンチオマー過剰率が最大で74%であった。この値を90%台に高める努力が必要となった。動的共有結合は自己修復性を持ち、熱力学的に有利な分子系を導くツールとして超分子化学分野で検討されている。本研究では、ボロン酸を基軸に階層的自己組織化から得られる単分散性ボロネート粒子の不斉触媒用担体利用や不斉分子ユニットとして酒石酸を連結した凝集誘起発光型ボロネート分子系の合成を通じて、キラルナノ構造体の機能創出を検討した。以下にその概要を示す。また、含ホウ素分子の機能開拓を通じて、基礎的知見を集積した。

1)ボロネート粒子の界面機能化に基づく不斉触媒の調製:ベンゼン-1,4-ジボロン酸とペンタエリスリトールとの逐次的ボロネートエステル化反応から得た単分散性粒子の界面には、構成ポリマー末端のアルコール水酸基が存在する。そこで、不斉補助剤であるN-ホルミル-L-バリンにボロン酸グラフト基を結合した新規化合物を合成したところ、粒子界面に化学吸着させることに成功した。次にそのキラル界面型粒子を固体触媒に適用する目的で、トリクロロシラン存在下、ケチミン類の還元反応に適用した。その結果、(S)体の目的物が優先的に得られ、不斉触媒担体としての有意性が示された。2)ボロネート酒石酸を用いたキラルナノスケール会合体の形成と機能化:キラル分子系の会合構造をコントロールして、ナノスケールにおけるキラル反応場の機能化研究をおこなった。酒石酸エナンチオマー体はボロン酸と結合可能なジオール部位を持ち、一方、二つのカルボン酸部位は水素結合を通じてキラルなネットワーク構造体の形成を導く。われわれは、ジ(ボロン酸)導入型テトラフェニルエチレンとキラル酒石酸を反応させることでボロネート分子系を合成した。そこへ、キラルジアミン類を添加したところ、会合化挙動を経てエナンチオ選択的発光挙動がおこることがわかった。本研究では、キラルナノ構造体の機能創出を目的に、ボロン酸を基軸とした階層的自己組織化を経て得られる単分散性ボロネート粒子の不斉触媒用担体利用や不斉分子ユニットとして酒石酸を連結した凝集誘起発光型ボロネート分子系の合成を検討した。具体的には、N-ホルミル-L-バリン誘導体にボロン酸グラフト基を結合した新規化合物を合成して、ボロネート粒子に吸着させた。得られた複合体をトリクロロシラン共存下ケチミン類の還元反応に適用したところ、不斉触媒機能を発現した。一方、凝集誘起発光型光学活性ボロネート酒石酸は、キラルジアミン類や天然のシンコナアルカロイド類の添加に対してエナンチオ選択的発光挙動を発現した。当該ボロネート粒子の表面が機能性分子のグラフト化に活性であるという特色を利用して,不斉修飾剤を直接粒子界面に化学結合させる試みをおこなっている。不斉補助剤をグラフトさせる担体粒子の形状をチューニングする。これは、界面における不斉補助剤の密度を変化させることができるので、界面の効果と生成物のエナンチオマー過剰率との関係が調査できる。また、N-ホルミル-L-バリン誘導体を用いた系以外に金属錯体系固体触媒の調製を計画している。29年度が最終年度であるため、記入しない。有機化学29年度が最終年度であるため、記入しない。
疫学解析と自然発症型モデル動物解析の融合による閉塞性肺疾患の包括的理解と創薬研究

AMPKを活性化するMetforminが,既存のCOPDモデルマウス(Elastase誘導モデル)の肺病態を保護するという報告がなされたが,Elastase誘導モデルは急性モデルであり,また顕著な粘液貯留を認めないという欠点を有する.本研究では,閉塞性肺疾患の発症や病態進行に関わる因子の探索と標的化を企図し,本研究室で確立した粘液貯留を呈する新規の慢性COPDモデルマウス(βENaC-Tgマウス)を用い,Elastase誘導モデルとの生化学的・組織学的指標による病態比較及びMetformin投与による肺病態への影響について検討を行った.βENaC-TgマウスとElastase誘導モデルマウスの肺気腫病態の詳細な評価を実施するため,マウス肺全体画像を用いた新規の画像診断パラメーター(面積・周囲長・(長径+短径)/2・フェレ径)を計測した(BZ-Analyzer, Keyence).さらに,Q-RT-PCR法にてCOPDの主徴である炎症・老化に関わる遺伝子発現を解析した.最後に,βENaC-Tgマウスに対するMetformin (5 mg/mL,4週間,自由飲水)の効果について,組織学的・呼吸力学的解析を実施した.その結果,まず,βENaC-Tg及びElastase投与マウスの両モデルで,肺気腫の一般的な指標である平均肺胞径(MLI)及び画像診断に基づいた各種肺気腫パラメーターの有意かつ同程度の上昇が認められた.一方,得られたデータの変動係数解析(ばらつきの指標)から,βENaC-Tgマウスは,広範かつ均等な肺気腫病態を呈すること,さらには,生化学的解析により,炎症・老化関連遺伝子の安定した発現上昇を認めることが明らかになった.最後に,Metforminの持続的投与は,βENaC-Tgマウスの肺気腫病態及び呼吸機能の低下を改善させることが明らかになった.当初予定通り,閉塞性肺疾患の発症や病態進行に関わる因子の探索と標的化を企図し,Metforminの有用性について,明らかにすることに成功した.今後も閉塞性肺疾患の発症や病態進行に関わる因子の探索と標的化を企図し,本研究室で開発したβENaC-Tgマウスと,疫学解析に着眼し,さらなる因子の探索を試みていく予定である.本研究では,閉塞性肺疾患の発症や病態進行に関わるPulmo-modulatory因子を抽出し,ここで見出した因子に関して,その治療標的としての妥当性について,多方面から解析した.まず,本研究では,COPDモデルマウス肺組織で発現変動する遺伝子群の中から,亜鉛の細胞内輸送を担うZrt-Irt -like Protein 2 (ZIP2)に着目し,種々の検討を行った.その結果,ヒト閉塞性肺疾患モデル気道上皮細胞(ENaC過剰発現細胞,cystic fibrosis患者由来細胞)では,ZIP2遺伝子のintron 1がexonに変化した,新規アイソフォーム(ΔC-ZIP2)が高発現することを見出した.一方,閉塞性肺疾患気道上皮細胞では,正常型ZIP2遺伝子の発現は減少し,結果として,正常型ZIP2タンパク質発現量および細胞内への亜鉛取り込み能が低下すること,さらには,気道上皮細胞内の亜鉛濃度の減少は,閉塞性肺疾患時に特徴的な遺伝子発現変化を一部模擬することが明らかになった.また,ヒトΔC-ZIP2に類似した不完全型アイソフォームZIP2の発現上昇は,C57BL/6-βENaC-Tgマウスの気道上皮組織においても認められ,ZIP2発現異常の肺疾患病態における普遍性が示された.さらに,尿酸に関する研究も解析した.その結果,疫学解析において、通常加齢に伴い呼吸機能が低下するが,尿酸平均値が6 mg/dl以上の70歳以上の女性は,4 mg/dl以下の群と比べFEV1 %値が有意に高いことが示された.さらに,2種類の尿酸値上昇COPDマウスモデルを用いた検討結果から,尿酸値の上昇は, COPD雌マウスにおいてのみ,呼吸機能および肺気腫病変を改善することが示された.当初予定通り,閉塞性肺疾患における亜鉛および亜鉛トランスポーターの役割について明らかにした.また,女性・雌マウスにおける尿酸と病態時の呼吸機能の関係性についても,明らかにすることに成功した.AMPKを活性化するMetforminが,既存のCOPDモデルマウス(Elastase誘導モデル)の肺病態を保護するという報告がなされたが,Elastase誘導モデルは急性モデルであり,また顕著な粘液貯留を認めないという欠点を有する.本研究では,閉塞性肺疾患の発症や病態進行に関わる因子の探索と標的化を企図し,本研究室で確立した粘液貯留を呈する新規の慢性COPDモデルマウス(βENaC-Tgマウス)を用い,Elastase誘導モデルとの生化学的・組織学的指標による病態比較及びMetformin投与による肺病態への影響について検討を行った.βENaC-TgマウスとElastase誘導モデルマウスの肺気腫病態の詳細な評価を実施するため,マウス肺全体画像を用いた新規の画像診断パラメーター(面積・周囲長・(長径+短径)/2・フェレ径)を計測した(BZ-Analyzer, Keyence).さらに,Q-RT-PCR法にてCOPDの主徴である炎症・老化に関わる遺伝子発現を解析した.最後に,βENaC-Tgマウスに対するMetformin (5 mg/mL,4週間,自由飲水)の効果について,組織学的・呼吸力学的解析を実施した.

その結果,まず,βENaC-Tg及びElastase投与マウスの両モデルで,肺気腫の一般的な指標である平均肺胞径(MLI)及び画像診断に基づいた各種肺気腫パラメーターの有意かつ同程度の上昇が認められた.一方,得られたデータの変動係数解析(ばらつきの指標)から,βENaC-Tgマウスは,広範かつ均等な肺気腫病態を呈すること,さらには,生化学的解析により,炎症・老化関連遺伝子の安定した発現上昇を認めることが明らかになった.最後に,Metforminの持続的投与は,βENaC-Tgマウスの肺気腫病態及び呼吸機能の低下を改善させることが明らかになった.当初予定通り,閉塞性肺疾患の発症や病態進行に関わる因子の探索と標的化を企図し,Metforminの有用性について,明らかにすることに成功した.本研究の結果より,閉塞性肺疾患時には,ΔC-ZIP2/正常型ZIP2の発現比が増加し,その結果生じた気道上皮の細胞内亜鉛濃度の低下が肺病態形成に重要であることが示された.尿酸値と生理的・病態生理的呼吸機能低下の関係性には性差が存在し、女性における血中尿酸値高値が,加齢に伴う呼吸機能低下の抑制とCOPD病態進行抑制に関わることを示唆するものであった.また,本研究は,過去の疫学研究において因果関係が不明瞭であったCOPD病態時における血中尿酸値と呼吸機能の関係性を実験的に示した.特に,これまで多くの疾患において尿酸による負の側面(尿酸結晶生成,酸化ストレス誘発など)が注目を浴びているが,本研究は,疫学及び実験動物を用いた前向き試験を駆使し,女性の呼吸機能の維持における尿酸の正の側面を初めて明らかにするものである.今後,亜鉛,尿酸の側面から,呼吸器疾患の病態形成の詳細なメカニズムについて種々の方法で明らかにするとともに,他のpulmo-modulatory因子の抽出も試みる予定である.今後も閉塞性肺疾患の発症や病態進行に関わる因子の探索と標的化を企図し,本研究室で開発したβENaC-Tgマウスと,疫学解析に着眼し,さらなる因子の探索を試みていく予定である.