hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
唾液タンパク由来ペプチド抗原に対する分泌型IgA抗体の歯周病細菌付着阻害能の検証

昨年度は、歯周病細菌Porphyromonas gingivalis線毛と特異結合するヒト唾液タンパクプロリンリッチプロテイン(PRP)上の結合部位に相当するペプチドprp21を作成後、DNA粘膜アジュバントとともにマウスに経鼻投与することにより、唾液中抗prp21抗体の誘導の検討を行ったところ、対照群と比較して有意な抗prp21IgA抗体価が認められた。今年度は、さらに唾液中抗prp21IgA抗体価を効率的に誘導させるため、キャリアタンパクKLHにペプチドprp21をコンジュゲートさせた多価ペプチド複合体を作成し、DNAアジュバントとともにマウスに経鼻投与後、唾液中抗prp21抗体価を測定した。ペプチドのコンジュゲートは、当初sulfo-SMCC法により行う予定であったが、専門業者により行われた。最終投与後7日目(day 28)において唾液を回収し、その唾液中のprp21抗原特異的SIgA抗体の抗体価をprp21特異的ELISA法により測定したところ、実験群では対照群と比較して、prp21抗原特異的SIgA抗体誘導の統計学的有意差は認められたが、KLHにコンジュゲートしていないペプチドprp21単独との差は認められなかった。またday 28のマウス顎下唾液腺、舌下腺、顎下唾液腺周囲に存在する顎下リンパ節、頸部リンパ節を摘出し、単核球細胞を調整後、prp21特異的IgA抗体産生細胞数をprp21特異的ELISPOT法により測定を行ったところ、それぞれ対照群と比較して実験群では有意な抗体産生細胞の誘導が認められたが、KLHにコンジュゲートしていないペプチドprp21のものとは、差は認められなかった。また、実験群マウスにおいて、prp21特異的IgA抗体産生細胞数が、顎下唾液腺、顎下リンパ節、頸部リンパ節より舌下腺において多く認められた。prp21特異的IgA抗体産生細胞数について、実験群マウスの顎下唾液腺だけでなく、舌下腺、顎下唾液腺周囲に存在する顎下リンパ節、頸部リンパ節について観察したところ、舌下腺における細胞数が顕著に多く認められた。また、概要には字数の関係で表記できなかったが、平成31年度の研究計画、すなわち歯周病細菌のペリクル実験モデルへの付着阻害実験についても一部行うことが出来た。最終年度である次年度は、prp21もしくはヒト唾液をを被覆したプレートを用い、唾液中に誘導されたprp21特異的IgA抗体が歯周病細菌の付着阻害効果の有無を検討する予定である。我々はまず、歯周病細菌Porphyromonas gingivalis線毛と特異結合するヒト唾液タンパクプロリンリッチプロテイン(PRP)上の結合部位に相当するアミノ酸配列ペプチドprp21の合成、作製を行ったが、精製の段階で収量が激減することから、専門業者に依頼する事とした。また並行して、DNAアジュバントとして使用するFlt3 ligandを発現するDNAプラスミド(pFL)を精製するために、pFLを保持する大腸菌を抗生物質により選択培養し、大量生成をプラスミド精製大型キットを用い行なった。CpGオリゴDNAの合成、作製については、当初の予定通り、専門業者に発注を行った。次にBALB/c(6週齢マウス♀)5匹を1グループとし、実験群および対照群に分け、実験群には、抗原であるペプチドprp21を50 μg、粘膜アジュバントとしてpFL 50 μg、CpG ODN 10 μg、対照群には、抗原としてのペプチドprp21のみを50 μg、週1回、4回連続経鼻投与を行った。最終投与後7日目(day 28)において唾液を回収し、その唾液中のprp21抗原特異的SIgA抗体の抗体価をprp21特異的ELISA法により測定したところ、実験群では、初回投与後から21日目(day 21)から抗体価が上昇したが、対照群では上昇が認められなかった。そして、対照群と実験群間に統計学的有意差が認められた。またday 28のマウス顎下唾液腺を摘出し、単核球細胞を調整後、prp21特異的IgA抗体産生細胞数をprp21特異的ELISPOT法により測定を行ったところ、対照群と比較して、実験群では有意にprp21特異的IgA抗体産生細胞数が上昇していた。さらにその後唾液中prp21特異的IgA抗体価について観察したところ、約半年にわたり抗体誘導が維持されていることが確認された。当初、自らペプチドprp21の合成および精製を行う予定であったが、精製の段階で行き詰まったため、専門業者に作製依頼の変更を早い段階で行ったことにより、次年度の研究ステップにスムーズに移行することが可能となった。

今年度は、さらに唾液中抗prp21IgA抗体価を効率的に誘導させるため、キャリアタンパクKLHにペプチドprp21をコンジュゲートさせた多価ペプチド複合体を作成し、DNAアジュバントとともにマウスに経鼻投与後、唾液中抗prp21抗体価を測定した。ペプチドのコンジュゲートは、当初sulfo-SMCC法により行う予定であったが、専門業者により行われた。最終投与後7日目(day 28)において唾液を回収し、その唾液中のprp21抗原特異的SIgA抗体の抗体価をprp21特異的ELISA法により測定したところ、実験群では対照群と比較して、prp21抗原特異的SIgA抗体誘導の統計学的有意差は認められたが、KLHにコンジュゲートしていないペプチドprp21単独との差は認められなかった。またday 28のマウス顎下唾液腺、舌下腺、顎下唾液腺周囲に存在する顎下リンパ節、頸部リンパ節を摘出し、単核球細胞を調整後、prp21特異的IgA抗体産生細胞数をprp21特異的ELISPOT法により測定を行ったところ、それぞれ対照群と比較して実験群では有意な抗体産生細胞の誘導が認められたが、KLHにコンジュゲートしていないペプチドprp21のものとは、差は認められなかった。また、実験群マウスにおいて、prp21特異的IgA抗体産生細胞数が、顎下唾液腺、顎下リンパ節、頸部リンパ節より舌下腺において多く認められた。prp21特異的IgA抗体産生細胞数について、実験群マウスの顎下唾液腺だけでなく、舌下腺、顎下唾液腺周囲に存在する顎下リンパ節、頸部リンパ節について観察したところ、舌下腺における細胞数が顕著に多く認められた。また、概要には字数の関係で表記できなかったが、平成31年度の研究計画、すなわち歯周病細菌のペリクル実験モデルへの付着阻害実験についても一部行うことが出来た。ペプチドprp21に対するSIgA抗体を唾液から大量に回収する。具体的には、200匹のマウスに同ワクチンを経鼻投与し、回収唾液から抗prp21抗体を精製する。マウスSIgA抗体の分泌成分(pIgR)に対する抗体を結合させたアフィニティカラム(CNBr-activated Sepharose 4)を作製し、抗prp21IgA抗体を精製する予定である。最終年度である次年度は、prp21もしくはヒト唾液をを被覆したプレートを用い、唾液中に誘導されたprp21特異的IgA抗体が歯周病細菌の付着阻害効果の有無を検討する予定である。試薬の調達が次年度に先送りになったため。
実験室光電子分光光源用高効率集光光学系の開発

本研究の目的は、実験室光電子分光用光源に広く用いられているHe放電管において、測定槽の超高真空を保ちつつ、超伝導ギャップ測定を高効率化するためのHeIα共鳴線の集光光学系を開発する事である。Snフィルターを導入することで、回折格子を用いることなくHeII共鳴線の強度を落とすことが可能になり、かつHeIα共鳴線の強度も維持することが出来る。Snフィルターの耐久性が課題であったが、Niサポートメッシュ付きのSnフィルターを導入することで、その課題を克服することが出来た。高エネルギー分解能光電子分光は物質の電子構造や超伝導体の超伝導ギャップを直接観測できる強力な実験手法であるが、精密な超伝導ギャップ測定には、より高い輝度とエネルギー安定性が必要である。エネルギー安定性の面では放射光よりも実験室光源である希ガス放電管の方が優れている。複数の共鳴線を単色化するにはこれまで回折格子が使われることが多く、また、測定試料の清浄表面を長時間維持するためには測定槽の真空度をより良く保つ必要があるが、真空紫外光であるHeIα用の高透過率光学窓は存在しないため、これまでは金属薄膜であるAlフィルターが使われてきた。しかしながら、回折格子の回折効率、集光性、Alフィルターの酸化による透過率低下など、欠点は多い。本研究の目的は、測定槽の超高真空を保ちつつ、超伝導ギャップ測定を高効率化するためのHeIα共鳴線の集光光学系を開発する事である。当該年度では、HeIα共鳴線の光子数を落とすことなく単色化し、かつ測定槽の超高真空を保つ方法として、100nm厚のSnフィルターを実装した。共鳴線のエネルギーは離散的であるため、回折格子を用いずにフィルターによって超高真空を保ちつつ単色化出来れば、全反射ミラーによって高効率に集光する事も出来る。しかしながら、100nm厚では十分な強度が得られず、フィルターの耐久性に問題があることがわかった。今後は、膜厚を大きくしたフィルターを検討するとともに、多層膜直入射集光ミラーの光学系の開発も検討していく。エネルギー安定性の面では放射光よりも実験室光源であるHeIα共鳴線が優れている。昨年度は、HeIα共鳴線の光子数を落とすことなく単色化し、かつ測定槽の超高真空を保つ方法として、100nm厚のSnフィルターを実装したが、十分な強度が得られずフィルターの耐久性に問題があることがわかった。当該等年度においては、膜厚を大きくしたフィルターや多層膜直入射集光ミラーの光学系の開発も検討したが、実装する事が出来なかった。今後は、十分な強度を持ったSnフィルターを実装する事に絞ってその方法を検討していく。回折格子を用いることなくHeIα共鳴線を単色化するためにSnフィルターを実装したが、強度不足により実用には耐えなかった。その後、膜厚の変更や異なる光学系を検討したが、実装することができなかったため。エネルギー安定性の面では放射光よりも実験室光源であるIα共鳴線が優れている。昨年度までは、HeIα共鳴線の光子数を落とすことなく単色化し、かつ測定槽の超高真空を保つ方法として、100nm厚のSnフィルターを実装したが、十分な強度が得られなかったため、耐久性のあるSnフィルターを実装する事が課題であった。最終年度である当該等年度においては、十分な強度を持ったSnフィルターの実装方法を検討した結果、Niメッシュサポート付きの100nm厚Snフィルターを導入することにした。これにより十分な耐久性が得られ、回折格子を使うことなくHeII共鳴線の強度を十分に落とし、かつ測定槽の超高真空を保つことが可能になり、本研究の目的を達成することができた。

Snフィルターを導入することで、回折格子を用いることなくHeII共鳴線の強度を落とすことが可能になり、かつHeIα共鳴線の強度も維持することが出来る。Snフィルターの耐久性が課題であったが、Niサポートメッシュ付きのSnフィルターを導入することで、その課題を克服することが出来た。回折格子を用いることなくHeIα共鳴線を単色化するためにSnフィルターを実装したが、強度不足により実用には耐えなかったため、膜厚の変更や異なる光学系を検討している。今後は十分な強度を持ったSnフィルターに絞って実装方法を検討し、実験室光電子分光光源の高効率化を行う。光電子分光まずはより膜厚の厚いSn自立膜フィルター、サポートメッシュ付のSnフィルター等の導入を検討していく。その後、多層膜直入入射グレーディッドミラーや斜入社全反射ミラー等を用いた光学系を検討し、実装する。回折格子を用いずに実験室光電子分光用光源のHeIα共鳴線を単色化するためにSnフィルターの実装を検討していたが、十分な強度を持たせることが出来なかった。その結果、本研究で予定していた集光光学系のための光学素子の開発が当初想定より遅れてしまったため。本研究の目的である集光光学系開発のために次年度使用が必要になった。次年度においては、十分な強度を持ったSnフィルターの実装方法を出来るだけ早急に検討し、その実装のために使用する計画とする。次年度使用額と併せて集光光学系開発に使用する。
X線導波路現象を利用したナノビーム集光素子開発と応用

X線導波路の特徴は、10100nmのサイズの干渉性の高いX線を発生することのできる微小X線源や、モノクロメーターのような分光器としての機能を有することである。ここではSi基板上に100nmのPMMAコア層をスピンコーティング法によって、さらにその上にスパッタ法によってSiクラッドを製膜した多層膜をX線導波路とした。計算機シミュレーションでは、効率よくX線を伝搬することのできるX線導波路の構造はエネルギーによって異なることを示しており、そのため、クラッド層の厚みは、020nmの範囲において2nmステップで段階的に変化させた。本実験では、X線管球から放射される特性X線を分光させる目的でSi/PMMA/Siに対し白色X線を入射させ、X線導波路現象の観測を行った。WLβ線を最も効率よく伝搬させるためのクラッド層の厚みは、シミュレーションによって10nmと算出されたため、その試料に対して入射角度を調整し、伝搬X線を観測した。伝搬X線の出射角度依存性を詳細に調べた結果。TE0、1、2、3モードの導波路現象が生じていることが確認された。出射角度0°付近で観測されるTEOモードのエネルギーは9.75keVであり、WLβ線と一致し強度が増強されていることが判明した。MoKα線に対しても同様に分光が行えることも示された。また、ペンタセン薄膜においても同様にX線導波路現象を観測した。伝搬X線のエネルギーから導き出される膜の構造(膜厚50m、密度1.35g/cm^3)は他の評価法のものと良い一致を示した。AFMでの形態観測によると、膜厚に対して非常に大きな凹凸が表面に存在していたが、本結果より、滑らかな界面を持つ薄膜だけでなく、粗い界面を持つ薄膜に対してもX線導波路現象が生じることが示された。導波路とは、光ファイバーなどに例えられるように、可視光などの電磁波を殆ど損失させることなく、伝播させることができる材料である。X線領域の光に対しては、炭素のような密度の低い物質(コア)を、金のような密度の高い物質(クラッド)で挟むことによって形成されるサンドウィッチ構造の多層膜によって実現されている。この、X線導波路の最大の特徴は、数十nmサイズのX線ビームが簡単に得られることであり、X線顕微鏡やコヒーレント散乱などの多彩な応用が期待されている。ここでは、まず、比較的均質な膜の作成やリソグラフィーなどによる加工の行いやすいSi/PMMA/Si多層膜に対して、X線導波路の設計を計算機シミュレーションを用いて行った。キャップ層であるSi及びコア層であるPMMAの膜厚や密度を変えながら、X線定在波線の強度の計算を行った。その結果、キャップ層のSiの膜厚が7nm、コア層のPMMAが100nmのときに最も強いX線定在波線が形成されることを見出した。この結果を基に、Siウエハー上にPMMAをスピンコーティング法によつて均質な膜を形成し、さらにその上にスパッタリング法により7nmの膜厚のSiキャップ層を形成させた。さらに、二次元導波路を作成するために、幅約100nmの溝を電子ビームリソグラフィーにより作成することとし、そのためのマスクの設計を行った。さらに、キャップ層の厚みの効果を調べるために、キャップ層の厚みを020nmに段階的にかえたものも作成した。
組織学的評価に基づくパーソナライズな耳介矯正装具の開発

本研究の目的は、折れ耳や埋没耳などの先天性耳介奇形を矯正するための安全で安心なパーソナライズな装具を開発することである。平成30年度は耳介部に強固な固定を行っても軟骨増生を阻害しない組織学的評価に基づいた素材の抽出を目標としていたが、動物実験を実施することができなかったため、平成31年度実施予定であった耳モデルの作製に着手した。既に石川県内にある人体のパーツモデルを手掛けている企業の方と面談し、健常人や耳介奇形の方のCT画像があればモデル作製して頂けることを確約した。また、モデル作製にあたり、工学的な視点からの意見を頂くために、富山県立大学工学部電子・情報工学科の唐山教授、大学院生の方々にご相談し、耳介矯正装具の作製や形状についての意見を頂いた。研究計画とは異なり、平成30年度に予定していた動物実験が行えなかったが、先に平成31年度予定であった耳介モデルの作製を進めることができた。また、実験結果を論文投稿することもできたことから本研究はおおむね順調に進展していると考える。今年度は平成30年度に実施予定であった耳介部に強固な固定を行っても軟骨増生を阻害しない組織学的評価に基づいた素材の抽出を行う予定である。既に本学動物実験委員会より実験許可がおりている。また、健常人および耳介形態奇形のある患者のCT画像を入手するため倫理審査委員会に申請する予定である。上記予定で研究を進め、平成31年度は安全な矯正装具の素材を明らかとすることと、耳介モデルの完成を目標に進める予定である。ほぼ予定通りに使用できた。余剰金は次年度動物実験に必要な消耗品費に当てる予定である。
外国人児童生徒の文化変容の実態からみる新たな教育支援

日本の公教育を受けた外国人児童生徒とその家族の体験や考え方を分析することにより日本の公教育と「移動」する子ども達の文化変容の関連性の実態を探る。このような文化変容に関し、肯定的に捉えて日本に現在も在住している者と様々な要因により帰国あるいは第三国に移動した者も含め、「帰国」した子どもたちの声も本研究に反映できるようにする。本研究の前提として、多文化教育理論に基づいた児童生徒のルーツとルートの関係性について吟味した上で彼らのアイデンティティの変容に着目する。子どもたちの文化変容について把握することで、文化適応のための支援を必要とする子どもたちの新たな支援のあり方を考え、政策・施策の構築を目指す。
デュルケム派宗教社会学研究の今日的展開-儀礼論の視角から-

デュルケム儀礼理論の宗教社会学的核は、儀礼の最終局面である集合的沸騰状況における、諸象徴を媒介とした聖なるものの顕現によって、社会的合一の観念が諸構成員に分有されるという点にある。ピカリングは、その集合的沸騰状況を、反復性と一回性の二類型に分類し、周期的に執行される祝祭的儀礼を前者によって、革命などの社会変動を後者によって説明する理論を提出した。またエルビュー=レジェは、「記憶」の概念によって、集合的沸騰がもたらす認知的、社会心理的な機能を摘出し、世俗化社会における宗教の私化に見られる聖なるものの回帰を説明している。それに対して、イザンベールは、民衆宗教における聖なるものの現代的な顕現が、道徳の社会的構成に影響を与えており、それが社会的統合への契機となっていることを指摘している。以上のように、今日のデュルケム派宗教社会学は、彼の儀礼理論を、「集合的沸騰」や「聖なるもの」の鍵概念としながら精緻化し、世俗化した現代社会における宗教性の社会的機能を、教団宗教だけではなく、個人的な宗教性や社会運動、民衆宗教にまで拡大する形で分析する視角を獲得している。実際、現代フランスの宗教状況の中で、民衆宗教としてのカトリシズム運動に関しては、ヨーロッパ統合に乗じた「キリスト教ヨーロッパ」建設をもくろむ教皇の巡行やそれに伴う聖地化、および民衆の巡礼やイベントへの参加という現象の分析において、キリスト教系の新宗教運動に関しては、新たな聖性の獲得という現象の分析において、またイスラームの運動に関しては、マグレブ諸国からの移民の「想像の共同体」の構築という現象の分析において、各研究者の理論は有効である。しかし、日系やインド・アメリカ系などの外来の新宗教運動に観察されるような、宗教の多元性や多文化主義、ニューエイジなどの新たな霊性の探究といった現象の分析視角は確立されておらず、これは今後の課題である。
ナノポーラスを制御したガス吸蔵材料の設計

本年度は第一原理計算によりクラスレートハイドレートおよび有機金属構造体に関して研究を行った。以下に主要な結果について説明する。1)水素貯蔵材料中のゲスト-ゲスト間およびゲスト-ホスト間の相互作用の正確な記述ゲスト分子のホストへの影響とゲスト-ゲスト間相互作用を取り入れ、2種類のゲージと2種類のゲスト分子を扱うことのできるモデルを提案した。このモデルにより水素と水素-プロパンのハイドレートCS-II構造の相図を作成した。(JCP131(2009)244510)得られた結果は実験結果と良く一致していることを確認した。160-180bar、160K条件下のCS-II構造での水素貯蔵量は3.8wt%に達している。この系では昇温すると水素貯蔵量が減少することが欠点である。しかし、プロパンを少量入れたハイドレートでは貯蔵した水素分子を留められる可能性が示された。これらの結果はゲスト-ゲストの相互作用の理解こそが本質であり、水素ハイドレートの相図を求める計算には正確に算出する必要があることを示している。2)特定の有機構造体(MOF)を用いた薬剤分離鏡像異性的に完全にホモキラリなビルディングブロックを特定のMOFに入れた分子系のシミュレーションを行った。実験からの解析とともに、キラル合成、キラル触媒と同様に鏡像異性体の分離の可能性を探った。メチルフェニルスルホキシドPhSOCH3のS-とR-光学異性体をキラル性を持つMOFであるZn(bdc)(lac)(dnf)に入れた。吸着エネルギーの計算結果は、実験的に報告されているZn(II)テレフタル酸エステル乳酸塩を用いた対掌性の小さいスルホキシドのS-光学異性体の吸着エナンチオ選択性を支持するものであった。本研究で提案した計算方法により、ホストーゲスト間の相互作用がMOF構造の立体選択的な選択性の起源であることが明らかになった。MOF構造を用いた薬剤分離:有機金属系構造体(MOF)Zn_2(bdc)(l-lac)(dmf)を用いてS-とR-異性体のPhenylMethylSulphoxide(Ph-SO-Me)の吸着を調べた。第一原理計算はS-とR-異性体の吸着エネルギーの違いを見出した。S-異性体では吸着エネルギーは負の値(-1.568kcal/mol)であり、安定であることが分かった。一方、R-異性体では正の値(+6.835kcal/mol)であり、不安定であることからこのMOFには入らないことがわかった。電荷密度分布の詳細解析から、2つの異性体でのホスト-ゲスト間の相互作用と吸着サイトの違いが明らかになった。さらに、より長いリガンドの系(bdcの代わりにbpdcを用いた)で計算を行い、Ph-SO-Meよりも大きな体積を持つ薬剤における吸着能を調べた。計算結果は立体選択的分離用材料としてMOFを使うことができ、薬剤分離に活用できることを示していた。水素貯蔵材料中のゲスト-ゲストとゲスト-ホスト間の相互作用の正確な記述:水素貯蔵材料のゲスト-ゲストとゲスト-ホスト間の相互作用記述に必要なvan der Waalsの長距離力を、密度汎関数理論は再現出来ないことが知られている。そのため、より正確な計算方法が重要になる。本研究では水素クラスレートの構造最適化をMP2/6-31+G(d)レベルで行った。この計算にはCS-II構造のフラグメントを再現するために大きなクラスターを用いた。その結果、大きなケージには最大4個の水素分子が入るが、小さなケージには2個も入らないことが明らかになった。さらにヘルプガスの効果を電荷密度分布の解析から検討した。MOF構造を用いた薬剤分離:鏡像異性体の対掌性ビルディングブロックを用いた有機金属構造体metal-organic framework(MOF)系の詳細な理論解析を行った。生体活性を示す代表的な化合物・薬剤の重要な構成要素である、対掌性を持つ数種類のスルポキシドのテレフタル酸エステル乳酸塩ホモキラリティー高分子の吸着過程を調べた。吸着サイトと電荷密度分布の解析から、ホストーゲスト間の相互作用を評価した。bdc(terephthalate)からbpdc(4, 4'-biphenyldicarboxylate)までリガンド長を変えること、および、dmf(N, N'-dimethylformamide)の有無により、ポアのサイズを調整した。大きなポアを用いるとスルポキシドゲスト分子などの大きな分子を吸着できることを明らかにした。一方、dmf基を取り除いた系では弱い吸着になること、電荷分布解析からdmfとゲスト分子間の相互作用はファンデルワールス力よりも大きいことも判明した。計算したMOF構造は薬剤分離に利用可能であること、さらに、光学異性体の分離、キラル合成、触媒用材料としての可能性が示された。水素貯蔵材料のゲストーゲスト、ゲストの相互作用の正確な理論的記述: CS-II構造のハイドレートは水素を4.96%貯蔵することが知られているが、そのためには高圧が必要であり、実用化は現実的ではない。水素ハイドレートの安定化の方策の一つはTHFのような第2のゲスト分子を添加することである。しかし、この方法では吸蔵量が1%にまで落ちる。大きなケージを占有するTHFの代わりに小さいケージを占有し、ハイドレートを安定化させる分子の探索を高精度第一原理計算により行った。

1)水素貯蔵材料中のゲスト-ゲスト間およびゲスト-ホスト間の相互作用の正確な記述ゲスト分子のホストへの影響とゲスト-ゲスト間相互作用を取り入れ、2種類のゲージと2種類のゲスト分子を扱うことのできるモデルを提案した。このモデルにより水素と水素-プロパンのハイドレートCS-II構造の相図を作成した。(JCP131(2009)244510)得られた結果は実験結果と良く一致していることを確認した。160-180bar、160K条件下のCS-II構造での水素貯蔵量は3.8wt%に達している。この系では昇温すると水素貯蔵量が減少することが欠点である。しかし、プロパンを少量入れたハイドレートでは貯蔵した水素分子を留められる可能性が示された。これらの結果はゲスト-ゲストの相互作用の理解こそが本質であり、水素ハイドレートの相図を求める計算には正確に算出する必要があることを示している。2)特定の有機構造体(MOF)を用いた薬剤分離鏡像異性的に完全にホモキラリなビルディングブロックを特定のMOFに入れた分子系のシミュレーションを行った。実験からの解析とともに、キラル合成、キラル触媒と同様に鏡像異性体の分離の可能性を探った。メチルフェニルスルホキシドPhSOCH3のS-とR-光学異性体をキラル性を持つMOFであるZn(bdc)(lac)(dnf)に入れた。吸着エネルギーの計算結果は、実験的に報告されているZn(II)テレフタル酸エステル乳酸塩を用いた対掌性の小さいスルホキシドのS-光学異性体の吸着エナンチオ選択性を支持するものであった。本研究で提案した計算方法により、ホストーゲスト間の相互作用がMOF構造の立体選択的な選択性の起源であることが明らかになった。
HIV-1 の Rev タンパク質によるウイルス RNA 核外輸送複合体のリモデリング

ヒト免疫不全ウイルスの4-kbおよび9-kb RNAは、ウイルスタンパク質のRevを介してCRM1経路で核外へ輸送される。ところが、それらのRNAはキャップ構造を持つため、一般的なmRNAと同じTAP経路でも輸送される可能性が考えられた。それらのRNAの核外輸送においてTAP経路が利用されるかを、ウイルスRNAを発現する培養細胞で調べた結果、RevがTAPのRNA上へのリクルートを阻害することが示唆された。さらにRevが、TAPとRNAとのアダプターであるAlyとキャップに結合するCBCとの結合を阻害することを明らかにした。この活性により、TAP経路の誘導を抑制することが考えられた。核内で転写・スプライシングされるHIV-1の4kb-RNAと9kb-RNAの細胞質への輸送は、ウイルスタンパク質Revを介したCRM1経路で行われる。しかし、それとは異なるTAP経路も利用される可能性が考えられ、TAP経路も利用されるのか、あるいはTAP経路は抑制されるのかは不明であった。これまで申請者らは、RevがそれらのRNAの核外輸送においてTAP経路の利用を抑制することを示唆する結果を得ていた。本研究では「4kb-RNAと9kb-RNAの核外輸送においてRevがどのようにTAP経路の利用を抑制するのか」を明らかにすることを目的とする。初めに、RevによるTAP経路の抑制は、RevがTAPのRNA結合を阻害することによって行われると考え、TAPのRNA上へのリクルートを調べた。その結果、Revは4kb-RNAと9kb-RNAを模擬するモデルRNA上へのTAPのリクルートを阻害することがわかった。さらに、TAPとRNAとのアダプタータンパク質であるALYのRNA結合もRevによって阻害されることがわかった。ALYのRNA結合にはRNAのキャップ構造に結合するCBCとの相互作用が重要であることが知られていたため、次にRevとCBCとの相互作用を調べた。その結果、RevはCBCに直接結合することを見出した。したがって、RevがALYとCBCとの相互作用を競合的に阻害することによって、TAPのウイルスRNA上へのリクルートを阻害するというモデルが考えられた。これまでの結果を論文作成中である。また、本研究課題と関連して、mRNAにU snRNA輸送因子がリクルートされない分子機構を明らかにしたので、論文報告した(Science.2012 Mar 30;335(6076):1643-6)。核内で転写・スプライシングされるHIV-1の4kb-RNAの細胞質への輸送は、ウイルスタンパク質Revを介したCRM1経路で行われる。これまで申請者らは、Revが4kb-RNAの核外輸送においてTAP経路の利用を抑制することを示唆する結果を得ていた。本研究では「4kb-RNAの核外輸送においてRevがどのようにTAP経路の利用を抑制するのか」を明らかにすることを目的とする。平成23年度、ウイルス由来の4kb-RNA上へのTAPのリクルートを調べた目的で、HIV-1由来のDNAプラスミドをヒト培養細胞のHEK293Tにトランスフェクションし、4kb-RNAを模擬するRNAを発現させた。その細胞ライセートを用いてGSTタグを付加したTAPでプルダウンを行い、共沈降するRNAをRT-PCRによって解析した。その結果、TAPのウイルスRNA上へのリクルートがRevの発現によって抑制されることを見出した。さらに、TAPとRNAとのアダプタータンパク質であるALYのRNA上へのリクルートを調べる目的で、上述の細胞ライセートを用いてALYに対する抗体で免疫沈降実験を行った。その結果、ALYのウイルスRNA上へのリクルートもRevによって阻害された。ここまでの成果を国際学会で口頭発表を行った(RNA2011 16th annual meeting of the RNA Society)。また、本研究課題と関連して、mRNAにU snRNA輸送因子がリクルートされない分子機構を明らかにしたので、論文報告した(Science. 2012 Mar 30;335(6076):1643-6)。平成23年度の目的は、「HIV-1の4kb-RNAの核外輸送においてRevがどのようにTAP経路の利用を抑制するのか」であった。上述の通りHIV-1を発現する培養細胞を用いた結果、RevがTAPのウイルスRNA上へのリクルートを阻害することを示すことができ、おおむね計画通りに研究が進んだと言える。本研究課題の目的を一般化すれば、複数の輸送経路で核外輸送されうるRNAは、どのような機構でひとつの輸送経路に規定されるのか、ということである。この解析には、CRM1経路とTAP経路のふたつの輸送経路が同時に誘導されうるHIV-1の4kb-RNAが適している。したがって、本研究課題ではHIV-1の4kb-RNAの核外輸送に焦点を絞って解析を進めてきた。

しかし、複数の輸送経路が誘導されうるRNAは、HIV-1の4kb-RNAに限らず、一般的なmRNAについても当てはまる。mRNAは、その5'末端のキャップ構造にCBCが結合し、CBCがmRNA輸送因子をリクルートする。一方、別種のU snRNAにもキャップ構造があり、CBCが結合する。U snRNAの場合は、CBCがU snRNA輸送因子をリクルートする。つまり、mRNAにはU snRNA輸送因子もリクルートされうる。しかし申請者らは以前、mRNAにはU snRNA輸送因子はリクルートされないことを示した。ただしその分子機構は不明であったため、本研究課題で得られた知見や利用した手法も応用して解析を進めた。その結果、「RNA結合タンパク質hnRNP CがmRNAとU snRNAとを長さに従って識別し、mRNAに特異的に結合して、U snRNA輸送因子のリクルートを阻害する」ことを発見した。この成果はScience誌に発表することができ、本研究課題と関連するテーマに新たな知見を与えることができた。現在までは計画通りに研究が進んでいる。平成24年度では、計画していた「RevがTAPのHIV-1の4kb-RNA上へのリクルートを阻害する分子機構」を明らかにする。そのために、上述の通りALYの4kb-RNA上へのリクルートが阻害されていることから、RevによるALYリクルートの阻害機構について調べる。ALYのRNA上へのリクルートには重要な因子が存在する。ひとつはRNAヘリカーゼであるUAP56であり、もうひとつはRNAの5'端のキャップ構造に結合するCBCである。ALYがこれらと相互作用することが、RNA上へのリクルートに重要であることが知られているため、Revがこれらの相互作用を阻害するかを調べる。具体的には、CBC、UAP56、およびGSTタグの付加したALYをそれぞれ大腸菌で発現させ、精製する。まず、GST-ALYによってCBCやUAP56がプルダウンされる、つまりALYとCBCやUAP56とが結合することを確認する。次に、大腸菌で発現させ、精製したRevを用意し、Rev存在下でGST-ALYによってCBCやUAP56がプルダウンされなくなる、つまりRevがALYとCBCとの結合、ALYとUAP56との結合を阻害するかを調べる。以上の競合実験を示すことができれば次に、RevはALY、UAP56、CBCのどれに結合するかを調べる。以上のことを検証した後、これまでの成果を論文発表する予定である。当初は本研究課題では目的としていなかったが、新たな疑問として生じてきたのが、なぜRevは4kb-RNAの輸送においてTAP経路の利用を抑制するのかということである。この疑問に答えるため、ウイルスRNAの核外輸送を強制的にTAP経路にしたとき、ウイルスの増殖にとってどのような問題が生じるのかを観察していくことを検討している。
IL・1/TLRシグナルにおけるTAK1のダウンレギュレーションの解明

自然免疫では特にinterleukin-1(IL-1)やTumor Necrosis Factor-α(TNFα)などの炎症性サイトカインの転写にNF-kBやAP-1が重要な役割を果たしている。これらのサイトカインは局所の炎症や全身の体温上昇など自然免疫において重要な役割を果たしている。またこれらの炎症性サイトカインの過剰な産生やシグナル抑制系の破綻は敗血症等の重篤な疾患を誘導する。TAK1は、これらのシグナル伝達に必須のセリンスレオニンキナーゼである。TAK1の活性化は刺激による一過性のものであり負に制御する機構が存在するはずであるがその機構はほとんど明らかになっていない。そこで本研究ではTamdem-Affinity-Purification(TAP)法によってTAK1をbeitにプロテオミクスからのアプローチを行い、TAK1のダウンレギュレーションに関与すると考えられる分子の探索を試みた。HeLa細胞にTAP-TAK1を過剰発現させ、未刺激時にはTAK1と結合せず、IL-1□刺激5分後に結合する分子群をLC/MSを用いて網羅的に探索を試みた。同定した分子群に関していくつか候補を絞ってクローニングを行い、293細胞に過剰発現させTAK1の活性によるNF-kBのレポーターアッセイを行った。その結果TAK1のダウンレギュレーションを担うと考えられる分子としてFBXW5を見出した。この遺伝子はF-ボックスを有するSCF複合体型E3ユビキチンリガーゼの一種であり、現在までに過剰発現の系の実験では、TAB2に会合しTAK1の活性化を負に制御していることを明らかとした。また上記分子は過剰発現の実験結果より、TAB1の分解を促進しその結果TAK1の活性を失うことが示唆された。さらにsiRNAを用いたノックダウンによってIL-1刺激によるTAK1のリン酸化が遷延することも明らかとなった。自然免疫では特にinterleukin-1(IL-1)やTumor Necrosis Factor-α(TNF α)などの炎症性サイトカインの転写にNF-kBやAP-1が重要な役割を果たしている。TAK1の活性化機構についてはアダプター分子TAB1,TAB2が既に報告されており、TAK1はこれらを介して上流のTRAF6と複合体を形成することで活性化されることが明らかとなっている。本研究では刺激によって活性化されたTAK1が再び不活性化の状態に戻るための分子機構を明らかにすることを目的とし、それに関与する分子の同定,細胞レベルでの機能解析,最終的には個体レベルでのTAK1の役割の解明を目指すことを目的とする。現在までにTamdem-Affinity-Purification(TAP)法によってTAK1をbeitにプロテオミクスからのアプローチを行いTAK1のダウンレギュレーションに関与すると考えられる分子の探索を試みた。HeLa細胞にTAP-TAK1を過剰発現させ、未刺激時にはTAK1と結合せず、IL-1β刺激5分後に結合する分子群をLC/MSを用いて網羅的に探索を試みた。その結果TAK1のダウンレギュレーションを担うと考えられる分子が見出された。そこで顕著にレポーターの下がったこの分子の詳細な機能を解析するために現在研究を進めているところである。この遺伝子はF-ボックスを有するSCF複合体型E3ユビキチンリガーゼの一種であり、現在までに過剰発現の系の実験のみではあるが、TAK1の活性化を負に制御していることを明らかとした。一方でTRAF6の分解には機能していないことが明らかとなった。今後過剰発現のみではなくsiRNAを用いたノックダウンによる検討や抗体を作成し内在の機能解析や特異性の確認を行う予定である。

同定した分子群に関していくつか候補を絞ってクローニングを行い、293細胞に過剰発現させTAK1の活性によるNF-kBのレポーターアッセイを行った。その結果TAK1のダウンレギュレーションを担うと考えられる分子としてFBXW5を見出した。この遺伝子はF-ボックスを有するSCF複合体型E3ユビキチンリガーゼの一種であり、現在までに過剰発現の系の実験では、TAB2に会合しTAK1の活性化を負に制御していることを明らかとした。また上記分子は過剰発現の実験結果より、TAB1の分解を促進しその結果TAK1の活性を失うことが示唆された。さらにsiRNAを用いたノックダウンによってIL-1刺激によるTAK1のリン酸化が遷延することも明らかとなった。
コムギおよびダイズ品質の圃場間・圃場内変動をもたらす要因の解析と可変量管理

イネーコムギーダイズを2年3作で作付ける田畑輪換田において、2007年から2010年播コムギおよびダイズを対象に、収量・品質の圃場内変動をもたらす要因を解析し、その要因の圃場内変動に応じて肥料や種子などの農業資材の投入量を変化させ圃場内の収量・品質の変動を是正する可変量管理の可能性を検討した。播種時土壌含水比の圃場内変動に応じて播種量を制御する可変量管理によって、場所ごとのコムギの穂数を是正することで圃場の収量・品質を是正し得るものと考えられた。この可変量管理は、収量の圃場内変動のうち是正できる可能性を有する変動の42.7%を是正できると判断された。集落営農での生産性向上のためには収量・品質の支配要因の変動に応じた栽培管理(Precision Crop Management ; PCM)が必要で、PCMのための管理戦略の開発が進められている。本研究では、品質・収量の向上と安定化が重要とされるコムギおよびダイズを対象に、集落営農における品質の圃場間・圃場内変動を是正するPCMのための管理戦略の設計と実証を行う。品質としてはタンパク含量(コムギ、ダイズ)および灰分(コムギ)を取り上げる。まず、集落営農において、コムギとダイズの品質の圃場間・圃場内変動を一次的に支配する生育特性や土壌特性を解明する。そして、この各特性が両作物の生長過程と収量を通して品質を規定する機構を解明し、PCMのための管理戦略を設計する。次に、管理戦略の実効性を、研究分担者が開発したGPSを搭載した可変量同時播種施肥機などを用いて検証する。イネ-コムギ-ダイズを2年3作で作付ける田畑輪換田において,コムギ収量と品質の圃場内変動をもたらす要因を解析し,その要因の圃場内変動に応じて肥料や種子などの農業資材の投入量を変化させ圃場内の収量および品質の変動を是正する可変量管理の可能性を検討した.収量変動に対して穂数の寄与が1穂整粒数および千粒重に比較して高く,収量を是正するには穂数を可変量管理の対象とするのが効率的と考えられた.そして播種量と出芽深度が苗立ち数を左右し,出芽深度および苗立ち数に影響される小穂分化期窒素保有量そして茎数が穂数を左右すると共に,播種時土壌含水比は出芽深度を左右することで穂数に強く影響していたと考えられた.これらの事から,播種時土壌含水比の圃場内変動に応じて出芽深度と播種量を制御する可変播種管理によって,場所ごとの穂数を是正することで圃場の平均収量を是正し得るものと考えられた.この可変量管理は,収量の圃場内変動のうち是正できる可能性を有する変動の42.7%を是正できると判断された.さらに,深播きと追肥の組み合わせによって,出穂期から成熟期における乾物増加量を大きくすることで出穂率が高くなり,穂数確保が容易になることが示唆された.一方,コムギ子実のタンパク含有率および灰分含有率は日本めん用コムギの品質評価の許容値を満たしていたが,処理区間に有意差が認められず,コムギ品質の圃場内変動に及ぼす変動要因を明らかにすることができなかった.(1)試験圃場における土壌理化学性(T-N, T-C,透水性および粒径組成など)などを10×10mメッシュで実測した。(2)耕起同時播種時の土壌水分、播種後の砕土率、出芽深度を10×10mメッシュで実測した。(3)苗立ち数と苗立ち時の地上部重・窒素保有量、コムギの小穂分化期と出穂期およびダイズ開花始期と着莢期の地上部重と窒素保有量をリモートセンシングにより10×10mメッシュで測定した。10圃場を測定対象の単位とするため、航空機画像はコストが高くなるので、生研センターと荏原が開発した携帯型リモートセンシングを使用した。(4)品質と収量の圃場別データを収集した。(5)コムギでは、パス解析により、播種時の土壌特性の影響を受ける苗立ち数(初期生育量)と出芽深度がその後の生育過程(生殖生長始期における地上部生育量)と収量を介して、品質を規定する機構を解明した。(6)ダイズでは、リモートセンシングにより推定した収穫指数と成熟期地上部乾物重を用いて収量を予測する重回帰モデルを作成した。

(7)小麦施肥播種機を用いて、あらかじめ設計された播種量と施肥量になるようにGPSで位置方位を検出しながら、可変量制御によって施肥播種作業を行った。品質・収量の向上と安定化が重要とされるコムギおよびダイズを対象に、集落営農における品質の圃場間・圃場内変動を是正するPCM(Precision Crop Management)のための管理戦略の設計と実証を行った。(1)コムギの耕起同時播種施肥時の土壌水分、播種後の土塊径、播種深度と出芽深度を実測し、苗立ち数、苗立ち時の地上部重・窒素保有量、小穂分化期と出穂期の地上部重と窒素保有量、収量・品質などをリモートセンシングと圃場調査等により測定した。(2)(1)の結果をもとに、パス解析により、前作作物の残効および播種時の土壌特性の影響を受ける苗立ち数(初期生育量)と出芽深度がその後の生育過程(生殖生長始期における地上部生育量)と収量を介して、コムギの品質を規定する機構を解明した。(3)ダイズの苗立ち数と苗立ち時の地上部重・窒素保有量、開花始期と着莢期の地上部重と窒素保有量、収量・品質などをリモートセンシングと圃場調査等により品種別に測定した。(4)(3)の結果から、窒素保有量でみたダイズの生育相と収量・品質との関係が解明されるとともに、収量・品質をリモートセンシングで予測できるダイズ形質が明らかとなった。(5)PCMの実行に不可欠な、コムギおよびダイズの可変量同時施肥播種を実施した。これらの可変量施肥播種では、事前に作成したマップに応じて播種深度、播種量および施肥量をGPS位置速度情報に基づいて適正に制御できた。(2)(1)の結果と過去3年間の結果をもとに、播種時の土壌特性の影響を受ける苗立ち数(初期生育量)と出芽深度がその後の生育過程(生殖生長始期における地上部生育量)と収量を介して、コムギの品質を規定する機構を解明した。(3)ダイズの苗立ち数と苗立ち時の地上部重・窒素保有量、開花始期と着莢期の地上部重と窒素保有量、収量・品質などをリモートセンシングと圃場調査等により土地利用別に測定した。(4)(3)の結果と前年の結果から、窒素保有量でみたダイズの生育相と収量・品質との関係が解明されるとともに、収量・品質をリモートセンシングで予測できるダイズ形質が明らかとなった。(5)PCMの実行に不可欠な、ダイズの可変量同時施肥播種を実施した。これらの可変量施肥播種では、事前に作成したマップに応じて播種量および施肥量をGPS位置速度情報に基づいて適正に制御できた。
耕畜連携をめざした環境保全型畜産システムの構築とその評価

本課題では、耕畜連携をめざした環境保全型畜産システムの構築の可能性について、個体レベル、農家レベル、地域レベルの3水準から、学際的視野で検討を加えた。その結果、個体レベルでは、糞尿由来の窒素やリンなど環境負荷栄養素の排泄量の低減、生産性を向上、農家レベルでは畜舎の生糞尿や堆肥化過程での揮散アンモニアや窒素化合物の低減、効率的な堆肥や化学肥料の施肥、農家内での栄養素の内部循環の促進、また地域レベルでは耕畜連携の強化と堆肥の広域流通の確立が重要であることが示された。本プロジェクトでは、家畜サイドと耕種作物サイド、また個体レベル、農家(農場)レベルおよび地域レベルから窒素とリン、カリウムの循環を検討した。家畜の個体レベルの検討としては、ホルスタイン種雌牛50頭(乾乳牛34頭および泌乳牛16頭)を用いた出納試験の結果から、尿中窒素排泄量の上昇に伴って血漿中尿素窒素濃度が上昇することを明らかにした。また、農場レベルでは農学研究科附属牧場の肉用牛の繁殖・肥育一貫経営における窒素、リン、カリウムのフローについて定量的に把握するため、附属牧場において飼料給与量、牧草生産量および牧草地への堆肥投入量などについて計測した。その結果、牧草生産部門の窒素ロスは1267.8Nkg/年であり、牧場全体の窒素ロス6621.3Nkg/年と比べると1/5程度であり、附属牧場では草地以外において、窒素が多く失われている可能性が示唆された。耕種作物サイドでは、本研究では、耕起移植区と不耕起直播区に堆肥区(堆肥1t+窒素8kg/10a)、化学肥料区窒素(8kg/10a)、無施肥区を設け、生育収量、窒素吸収量および地下への窒素流亡を調査した結果、耕起移植区では堆化区の収量、乾物重、窒素保有量が化学肥料区に比較して高くなるが、不耕起直播区では堆化区の収量、乾物重、窒素保有量が化学肥料区に比較して低くなることが示された。また、水抽出液を用いてコマツナの発芽テストを行なった結果、コマツナの生育量は与えた窒素の種類に限らず、窒素が硝酸アンモニウムであれ、家畜糞堆肥であれ、どの畜種であれ、窒素含有率と指数関数的な関係にあることが分かった。最後に地域レベルの研究としては、堆肥生産と耕畜連携の取り組みの現状と課題の把握を目的とした予備的な実地調査として、愛媛県の畜産農家、島根県の畜産農家、および栃木県内の堆肥センターと行政機関に対してヒアリング調査を実施した。本研究は、畜産、耕種および両者をつなぐ研究の3部門に分かれるが、畜産の研究としては、京大附属牧場で飼養している繁殖雌牛計24頭の血漿および尿中の尿素態窒素、尿酸態窒素、クレアチニン含量並びに尿中窒素含量を測定した結果、尿中窒素含量の約83.5%が尿素態窒素で構成され、血漿中尿素態窒素濃度から尿中への窒素排泄量および尿素態窒素排泄量を推定できることが認められた。さらに、肉用繁殖雌牛と肥育牛、乳用牛のいずれにも適用できる糞尿による窒素排泄量を予測する経験式を開発し、また飼養標準を利用して窒素排泄量を予測する理論モデルを構築した。また、肉用牛の繁殖・肥育一貫経営における窒素、リン、カリウムのフローを定量的に把握した結果、フローは元素により様相が異なり、その循環量はカリウム>窒素>リンの順であることが明らかになった。一方、耕種の研究としては、牛糞堆肥の施用が、不耕起直播水田における縦浸透による硝酸態窒素の溶脱量を増加させること、牛糞堆肥に硫安を窒素成分で等量混合することで、湛水条件下における牛糞堆肥からの不安定な窒素発現を改善できることを明らかにした。また、家畜糞を原料とする堆肥の適正な施用量を知るため、堆肥を化学分析して得られた各種形態の窒素含有量と、その堆肥を用いて栽培したコマツナの窒素吸収量との回帰式を作り、堆肥窒素の利用率を算出した結果、30点の家畜糞堆肥に含まれる速効性窒素は全窒素の12%で、化学肥料の75%に対して約16%であることが示された。両者をつなぐ研究としては、安愚楽共済牧場の傘下の肉用牛経営に対するアンケート結果を用い、当該経営の経営意識や意向が家畜排泄物の処理実態に与える影響について、繁殖・肥育の飼養形態、地域等に注目して定量的に解明した。また、畜産農家での畜産と耕種農業(飼料畑等)を連携した窒素・リン収支を計算するアプリケーションを作成した。

本研究は、畜産、耕種および両者をつなぐ研究の3部門に分かれるが、畜産の研究としては、牛からの尿中窒素排泄量を低減するために、黒毛和種繁殖雌牛24頭の血液と尿並びにホルスタイン種乾乳牛および泌乳牛の42回の出納試験のデータを用いて、血漿中尿素態窒素から尿中窒素排泄量を推定する方法を検討した。その結果、肉用雌牛の尿中窒素含量と尿中尿素態窒素含量に強い正の相関が認められ、また泌乳牛の血漿尿素態窒素濃度の増加率は乳中への窒素排泄量によって影響されることが推察された。一方、耕種の研究としては、メタン発酵消化液の連用水田土壌中での分解されにくい有機態窒素の蓄積量は,分解されやすい有機態窒素に比較して小さいが,分解されにくい有機態窒素は後者に比較して水稲の幼穂分化期以降に多く無機化するために水稲の穎花生産に及ぼす影響は大きかったことを明らかにした.両者をつなぐ研究としては、2005、2006年度の調査による窒素、リン、カリウムの循環データをもとに、循環指標を用いた元素の循環性の評価および算出結果の不確実性分析を行い、その結果、窒素、リン、カリウムフロー量に大きな変動は見られなかったこと、およびフロー量のばらつきはとくに系内のフロー量に含まれる堆肥やサイレージのデータのばらつきが大きいことに起因していると考えられた。また、石川、滋賀、島根、香川、大分、熊本の6県を対象に、肉用牛経営に対するアンケート調査を実施し、当該経営の経営意識や意向が家畜排泄物の処理実態に与える影響について、繁殖・肥育の飼養形態、地域等に注目して定量的に解明した。その結果、基本的に地域性が存在しているが、飼養形態、経営類型によって家畜排泄物への意識・意向が異なることが明らかとなった。本年度も個体レベル、農家レベルおよび耕種作物のサイドから研究を実施した。まず、個体レベルに関しては、肉牛からの窒素およびカリウム排泄量を低減するために、黒毛和種繁殖雌牛12頭および黒毛和種肥育雌牛12頭の尿並びに給与飼料を採取し、繁殖牛と肥育牛の窒素およびカリウム排泄量の実態を調査した。その結果、繁殖牛と肥育牛の尿中窒素含量には差違が認められなかったものの、尿中カリウム含量は繁殖牛が肥育牛よりも高かったことから、肉用繁殖牛でもカリウムの過剰摂取に注意することが必要と推察された。農家レベルでは、肉用牛の繁殖・肥育一貫経営牧場における窒素、リン、カリウムのフローについて定量的に把握することを目的とした。同牧場において濃厚飼料,粗飼料、糞尿、敷料および堆肥などを定期的に採取して約180点のサンプルを収集するとともに、飼料給与量、牧草生産量および牧草地への堆肥投入量を計測した。その結果、システム全体の元素の生産物/投入比は平均で窒素、リン、カリウムについてそれぞれ0.08、0.07、0.01であった。また、循環指標で表わすと、窒素、リン、カリウムでそれぞれ0.19,0.17,0.49であった。最後に、耕種作物のサイドから、メタン発酵消化液の水田への施用の効果について検討した。その結果、メタン発酵消化液を混和した土壌では、土壌培養初期に窒素の有機化が、それ以降で窒素の無機化がおこり、土壌への消化液の施用量を増加させると有機化と無機化の傾向が顕著となった。メタン発酵消化液を施用した水田では、化学肥料に比較して生育期間の短い早生品種では窒素吸収量が不足し、生育期間の長い中・晩生品種では窒素吸収量が同等か増加した。これらのことから、メタン発酵消化液は化学肥料の代替として使用できるが、消化液を施用した水田からの窒素の無機化に対応した水稲品種や作型の選定が重要であると考えられた。