hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
しまなみ海道開通に伴う島嶼部へのインパクトの諸相

本研究は、1999年5月に開通したしまなみ海道の地域インパクトの諸相を明らかにする目的で、開通に伴う島民の移動性を定量的に把握し、観光客のしまなみ海道を含む本四架橋3ルートの観光ルートとしての評価を明らかにし、さらには、まちづくりの一環として開通と同時に設立された「瀬戸内しまなみ大学」の活動と評価を行った。その結果、(1)しまなみ海道の開通は全体として島民の移動性を向上させたが逆に低下した地区も少なくないこと、(2)開通と同時に開設された高速バスは、片側クローズドドア方式のために期待ほどには島民の移動性を向上させていないこと、しかしこの方式を解除すれば移動性はかなり向上すること、(3)しまなみ海道の最大の観光価値は「橋と海と島がおりなす景観」であり、自歩道の存在がその価値をより高めていること、(4)本四架橋の3ルートの観光評価ではしまなみ海道が卓越した評価を有していること、その要因は島伝いのルートとも関係する島並の自然・景観、そして島の文化であること、(5)しまなみ大学は、「地域文化の発掘・再評価・創造」や「地域イメージの向上」に一定の役割を果たしていると地元自治体から評価されているが、大学の目的の一つである自治体間の連携の点では評価が低く、今後のしまなみ大学の運営に対する問題点の一つであること、等の諸点が明らかとなった。しまなみ海道沿線地域8自治体の観光による地域振興の比較分析を通して、地域振興の地域的差異、それを規定する要因、さらには観光振興の地域波及メカニズムの構造の解明を試みつつある。現時点までに明らかになったことは、同じしまなみ海道沿線地域でも観光振興への行政の対応には大きな違いがあることが明らかになった。この違いを規定する要因として、一つは観光産業以外の主要な地域産業の存在の有無が上げられる。すなわち、造船や海運などの主要な地域産業が存在する場合には新たなる観光産業の育成のニーズが低いが、主要な地域産業がない場合には逆に観光産業の育成に積極的である。さらに差異を規定する要因は、行政トップの観光に対する考え方とリーダーシップである。瀬戸田町の前町長のように観光産業の重要さと他産業への波及効果の大きさを把握しているリーダーが存在した自治体では、観光産業への熱心な取り組みが見られ自治体の主要産業に成長している。さらに差異を規定するのは外部の有用な人材の登用であり、吉海町では人材登用の顕著な効果が認められる。観光産業の育成は、住民の地域への誇り意識を醸成する効果も認められた。地域住民にアンケートを実施した結果、観光開発によるまちづくりで各種の賞を受賞している自治体ほど住民の誇り意識が高くなっていた。次年度は観光開発の地域への波及メカニズムを構造分析の手法などを用いて明らかにする予定である。
古高ドイツ語のValenz辞典作成の為の基礎的研究

古高ドイツ語ヴァレンツ辞典を作成するための現在までの作業実施経過報告.1.古高ドイツ語テキストの整理.古高ドイツ語時代(6ー11世紀)のテキスト中どのテキストが古高ドイツ語ヴァレンツ辞典作成の基礎資料となり得るかを調査し.その結果,ある程度文献学的研究の進んでいるテキストとして「オトフリ-トの福音書」,「タチア-ン」,「ノトカ-」,「イシド-ル」を選定した.2.用例の収集.これらの全テキストをコンピュ-タに入力,同時に古高ドイツ語に置いてどのテキストにでも出現可能な動詞を,Schutzeichelの「古高ドイツ語辞典」を使って選び出した.さらにコンピュ-タを用いて,選びだした動詞について全用例を収集(これは「オトフリ-トの福音書」と「タチア-ン」まで).3.ヴァレンツ理論による動詞の結合価分析.すなわち具体的に言うと,各動詞ごとに用例について,(1)一つ一つの動詞の例文に関して各文肢(Syntagma)に文を分解する.(2)一つの動詞がどのような文肢とよく結びつくか.文肢の頻度数を調査する事にによって,補足成文(頻度数がある程度高い文肢)と自由添加語(頻度数の低い文肢)を特定する.この作業を選定した動詞すべてに関して行なう.(3)ヴァレンツ辞書モデルの作成.補足成文が動詞の結合価(ヴァレンツ)であり,これを統語論的,意味論的に考察,記号によって分類し,各動詞ごとに辞書モデルとして記載する.以上の基礎的作業が本年は「オトフリ-トの福音書」及び「タチア-ン」の相当部分まで実施された.さらに今後,残りのテキストについても同相に上述作業を進めたい.古高ドイツ語ヴァレンツ辞典を作成するための現在までの作業実施経過報告.1.古高ドイツ語テキストの整理.古高ドイツ語時代(6ー11世紀)のテキスト中どのテキストが古高ドイツ語ヴァレンツ辞典作成の基礎資料となり得るかを調査し.その結果,ある程度文献学的研究の進んでいるテキストとして「オトフリ-トの福音書」,「タチア-ン」,「ノトカ-」,「イシド-ル」を選定した.2.用例の収集.これらの全テキストをコンピュ-タに入力,同時に古高ドイツ語に置いてどのテキストにでも出現可能な動詞を,Schutzeichelの「古高ドイツ語辞典」を使って選び出した.さらにコンピュ-タを用いて,選びだした動詞について全用例を収集(これは「オトフリ-トの福音書」と「タチア-ン」まで).3.ヴァレンツ理論による動詞の結合価分析.すなわち具体的に言うと,各動詞ごとに用例について,(1)一つ一つの動詞の例文に関して各文肢(Syntagma)に文を分解する.(2)一つの動詞がどのような文肢とよく結びつくか.文肢の頻度数を調査する事にによって,補足成文(頻度数がある程度高い文肢)と自由添加語(頻度数の低い文肢)を特定する.この作業を選定した動詞すべてに関して行なう.(3)ヴァレンツ辞書モデルの作成.補足成文が動詞の結合価(ヴァレンツ)であり,これを統語論的,意味論的に考察,記号によって分類し,各動詞ごとに辞書モデルとして記載する.以上の基礎的作業が本年は「オトフリ-トの福音書」及び「タチア-ン」の相当部分まで実施された.さらに今後,残りのテキストについても同相に上述作業を進めたい.
多成分モデル高分子網目の合成と特性評価

本研究で研究代表者らは、精密重合により得られた直鎖状高分子の末端反応性基として環状オニウム塩を導入し、低分子あるいは高分子化合物中のカルボン酸アニオンとの反応により、イオン結合性高分子集合体を合成前駆体とする逐次的反応プロセス(Electrostatic Self-Assembly and Covalent Fixation)の開発に成功した。このシステムにおいては、イオン結合性高分子前駆体中の反応点がクーロン相互作用することにより局所的な末端基濃度を増大させることができ、適度な加熱処理で対アニオンの求核攻撃による環状オニウム塩の定量的な開環反応が生じ、イオン対を共有結合に変換できることを見出してきた。また、ポリテトラヒドロフランやポリスチレン、ポリエチレングリコールなど種々の主鎖セグメントに対し有効であることも明らかにした。加えて、海外研究分担者の招聘および日本側の研究代表者・分担者の派遣により、新たな反応性高分子(多分岐テレケリクスおよび内部官能性テレケリクス)の合成プロセスの開発にも成功した。これらの成果により、従来の高分子反応システムでは困難な定量的連結(および架橋)を達成し、星型および櫛形高分子などの分岐高分子や網目モデル高分子、さらにグラフト共重合体やネットワーク共重合体などの多成分分岐、網目共重合体の高効率的合成に成功した。さらにこの新規反応プロセスを発展させ、有機溶媒希釈下でのイオン結合性高分子前駆体の選択的自己組織化を利用して、多分岐状および網目状トポロジーとならび、次世代の材料開発における究極課題の一つである"分子デバイス"、"分子マシン"を実現するために必要不可欠であると考えられる、単環状および多環状構造を基礎とする種々の高分子トポロジーの一般的かつ高効率な構築法の開発にも成功した。本年度は多成分網目高分子の基本構造パラメーターである(1)架橋点の分岐数(2)分岐セグメントの種類、および(3)架橋点間の分岐セグメント長、を精密に制御したモデル高分子網目の合成を目的に、研究グループ間の人的交流を通して実験技術の共有化を図りつつ研究を進めた。本研究では、研究代表者らが開発した環状オニウム塩型テレケリックポリマーによる効率的な高分子カップリング反応を利用することでモデル高分子網目を構築する。分岐セグメントとなるテレケリックポリマーとして末端基にN-フェニルピロリジニウム塩(5員環アンモニウム塩)を有するポリエーテル(ポリテトラヒドロフラン)、およびキヌクリジニウム塩(6員双環アンモニウム塩)を有するポリスチレンの合成を行い、架橋点となる多価カルボン酸アニオンとの反応性について検討した。その結果、テレケリックポリマーの対アニオンとして導入したカルボキシレートは、室温で安定にイオン対を形成することが確認され、すべての架橋点での分岐セグメント数がそろったイオン結合性モデル網目が形成された。また、加熱処理によりカルポキシレートの求核攻撃によるアンモニウム塩の開環反応が進行し、イオン対が共有結合化されることがわかった。特にN-フェニルピロリジニウム塩基は、穏やかな加熱条件下でも高い開環反応性を有しており、テレケリックポリマーとトリ、テトラ、ヘキサカルボン酸アニオンとの反応により、定量的にポリテトラヒドロフランモデル網目高分子を与えることがわかった。これらの結果を基に、多成分系網目高分子の合成と特性評価について引き続き研究を進める。

また、ポリテトラヒドロフランやポリスチレン、ポリエチレングリコールなど種々の主鎖セグメントに対し有効であることも明らかにした。加えて、海外研究分担者の招聘および日本側の研究代表者・分担者の派遣により、新たな反応性高分子(多分岐テレケリクスおよび内部官能性テレケリクス)の合成プロセスの開発にも成功した。これらの成果により、従来の高分子反応システムでは困難な定量的連結(および架橋)を達成し、星型および櫛形高分子などの分岐高分子や網目モデル高分子、さらにグラフト共重合体やネットワーク共重合体などの多成分分岐、網目共重合体の高効率的合成に成功した。さらにこの新規反応プロセスを発展させ、有機溶媒希釈下でのイオン結合性高分子前駆体の選択的自己組織化を利用して、多分岐状および網目状トポロジーとならび、次世代の材料開発における究極課題の一つである"分子デバイス"、"分子マシン"を実現するために必要不可欠であると考えられる、単環状および多環状構造を基礎とする種々の高分子トポロジーの一般的かつ高効率な構築法の開発にも成功した。
遺伝子トラップによる胚幹細胞特異的な遺伝子の検索

1.マウス胚性腫瘍細胞株F9に、ネオマイシン耐性遺伝子を選択マーカーに持つプロモータートラップ用ベクターを導入して、宿主遺伝子の制御下に未分化特異的にネオマイシン遺伝子を発現する細胞株4種を確立した。この内の一つ、G19株を用いて、未分化細胞特異的な発現を示す遺伝子Zfp-57を単離した。2.Zfp-57遺伝子はサイズの異なる2種の転写産物を生じ、これらは分化誘導後短時間内に著明な減少を示した。また、2種のRNAに対するcDNAを単離して塩基配列構造を比較した結果、翻訳領域は両者で完全に一致しており、3'非翻訳領域の長さや塩基配列のみが異なっていた。Zfp-57 cDNAは421個のアミノ酸からなる、非常に塩基性の高い蛋白質をコードしており、複数個のzincfinger構造を有していた。3.成体マウス臓器におけるZfp-57遺伝子の発現は精巣でのみ認められ、マウス胎生期においては胎齢中期に特異的であった。4.Zfp-57蛋白質の細胞内局在を検討する為、合成ペプチドに対する坑体を作製した。これを用いて免疫染色を行なった結果、Zfp-57蛋白質は未分化F9細胞の核に認められ、分化誘導したF9細胞では検出されなかった。5.13日目のマウス胎児切片を用いて、胎生期における発現部位を検討した。その結果、副腎や神経節など、神経冠細胞由来の組織で特異的に発現が認められた。マウス胚性腫瘍細胞株F9の分化系とプロモータートラップ法を用いて、未分化細胞特異的な発現を示す遺伝子群の検索を行ない、これまでに4種を単離した。その内の一つ、G19遺伝子は“zincfinger"構造を有する新しいDNA結合蛋白質をコードしている可能性が示唆された。今年度は、G19蛋白質の機能を明らかにする目的で以下の実験を行なった。1)G19蛋白質をglutathione-S-transferaseとの融合蛋白質(GST-G19)として大腸菌内で発現させる系を確立した。アフィニティ精製したGST-G19蛋白質と結合配列検索用オリゴヌクレオチドを用いてDNA/蛋白質結合実験を行ない、G19蛋白質の結合標的配列を検索した。その結果、8塩基からなるコンセンサス配列が得られた。2)G19にはサイズの異なる3種のmRNA(1.8 kb, 3.2 kb, 5.0 kb)が存在するが、これらmRNAに対応するcDNAを単離し塩基配列構造を比較した結果、3′非翻訳領域の配列や長さに違いが見られたが、翻訳領域の構造は3者で完全に一致していた。3)G19蛋白質の機能を解明する為には、遺伝子の発現調節機構を明らかにすることも重要である。そこでまず、1.8 kb大のG19 mRNAに対するマウス染色体DNAを単離してその構造を決定した。マウスG19遺伝子は約8 kb大で、3個のイントロンと4個のエクソンより構成されていた。5′上流領域の配列はGCに富み、典型的なTATA boxやCAAT boxは認められなかった。4)G19蛋白質の細胞内局在を解析する為に、G19 cDNAの塩基配列から予想されたアミノ酸配列を基に合成ペプチドを作製し、これを用いてG19蛋白質に体する抗体を調製した。これまでに、マウスF9細胞の分化系とプロモータートラップ法を用いて、未分化細胞特異的な遺伝子Zfp-57を単離した。その遺伝子産物はDNA結合蛋白質としての構造的特徴を有しており、胚性腫瘍細胞の未分化状態維持に重要な役割を果たしている可能性が示唆された。そこで今年度は、Zfp-57蛋白質の機能を明らかにする為に以下の実験を行なった。

1)Zfp-57蛋白質に対するポリクローナル抗体を用いて免疫染色を行ない、この蛋白質未分化F9細胞における細胞内局在を検討した。その結果、Zfp-57蛋白質はF9細胞の核にのみ検出され、レチノイン酸で分化誘導したF9細胞では核、細胞質ともに認められなかった。2)マウス胎生期におけるZfp-57遺伝子の発現をノーザンブロット法により解析した。Zfp-57遺伝子は12日目までの胎児では弱くしか発現していないが、13日目の胎児では強い発現が認められ、これをピークに以後著明な減少を示した。3)Zfp-57遺伝子の発現が強く認められた13日目の胎児の凍結切片を作製し、免疫染色法により、Zfp-57蛋白質の発現部位を解析した。その結果、副腎、交感神経節、脊髄神経節、皮膚色素細胞、等の神経冠細胞由来の細胞に特徴的な局在を示した。さらに、16日目の胎児の副腎ではZfp-57蛋白質は消失して発現いるなど、Zfp-57遺伝子の発現の時期は神経冠が移動して上記組織が形成される時期とほぼ一致していた。
高感度炭素-13MR法による脳死患者の脳・肝機能同時評価システムの開発

1.独立した他核RFチャンネル2系統を臨床用MR画像装置へ導入し、これを画像装置で発生させる同期信号に連動させることで多重共鳴MR法を可能にした。この改良型装置では、元のハードウェアに改変を加えておらず、日常の臨床検査には支障をきたさない様に設計されている。2.上記の装置と自作した検出器により多量子遷移法を応用した^<13>C NMR信号の^1Hによる間接的高感度検出が実現し、人の体内における代謝過程が^<13>C-標識にて追跡できる様になった。^<13>C核に直結した^1H核による間接的検出ではスピン系が多量子遷移状態を経由する間に引き起こす緩和が信号強度に影響することが分かった。そこで、多量子遷移選択用磁場勾配パルスの波形および印加時間の最適化を計り、理論値に近い増強効果が得られた。また、不必要な水の^1H NMR信号や非標識炭素(^<12>C)に結合する^1H核の信号の抑制が臨床MR装置の限られた勾配磁場強度で達成でき、^<13>C標識の情報のみを選択的に取り出すことができた。3.投与された^<13>C標識グルコースの脳内集積や、その代謝産物であるグルタミン/グルタミン酸が^<13>C標識で追跡でき、脳代謝機能の非侵襲的解析が可能になった。4.^<13>C-標識グルコースのグリコーゲンとしての蓄積、および標識アラニンのグルタミン/グルタミン酸、ブドウ糖、グリコーゲンへの変換などが追跡でき、肝臓でのgluconeogenesisとglycogenesisが非侵襲的に評価できる様になった。これは肝臓の代謝を解析する有用な手段として利用できる。5.今後は本測定法の操作性の改良とともに信号の局所化精度の向上をはかり、脳死状態判定のための自動解析法の開発をも予定している。本年度はMR装置の開発と平行し、動物モデルを用いてMRによる脳微小循環代謝と肝代謝機能評価法を開発した。この方法により得られた結果をまとめると以下のようになる。1.小動物モデルによる脳内循環代謝(1)ラットに脳梗塞モデルを作成し、虚血解除後、拡散強調MR画像や高速撮像法により脳微小循環の局所的変化を追跡し、虚血負荷時間と血流が病態におよぼす効果を明らかにした。(2)ラット脳梗塞モデルにおいて^<31>P,^1H化学シフト画像、さらに^1H MRの形態画像を撮像し、クレアチンリン酸、アデノシン三リン酸、無機リン酸、及び乳酸のマッピングから脳内代謝物質と梗塞部位の病態との関連を明らかにした。2.ラット肝臓機能の標識としてのブドウ糖代謝ラット肝臓に阻血負荷を与え、血流再開後の肝機能をリン酸エネルギー代謝と^<13>C標識ブドウ糖の肝臓への取り込みをにより調べた。これによると、リン酸エネルギー代謝よりも、ブドウ糖の取り込みが鋭敏に肝機能を反映することが分かった。3.ヒト肝臓代謝の標識としてのMRによるブドウ糖負荷テスト健常人での^<13>標識ブドウ糖の肝臓への取り込みを^<13>C NMRにて直接計測した。本方法では数分程度の時間で追跡できたが、さらに時間分解能の向上を図るために^1Hによる^<13>Cの逆検出法を導入する必要性がある。本年度は昨年度構築したMR装置の改良と平行し、小動物の病態モデルを用いて^<13>C NMRによる肝代謝機能評価法を開発した。その結果をまとめると以下の様になる。1.二重共鳴機能を付備した臨床用MR画像装置の改良他

核RFチャンネルを導入し二重共鳴法が可能となった臨床画像用MR装置に^<13>C,^<31>P核用(16-25MHz)バンド・パス、並びに、高性能^1H核用(63MHz)バンド・ストップ(110dB)フィルターを製作し付加した。この結果信号検出中にも他核の照射が可能になり、^1H,^<13>Cをデカップリングしたスペクトルが得られる用になった。八の字形^1H用コイルと円形^<13>C用コイルを持つ^<13>C-^1H二重同調MR信号検出器を自作、これを用いて^1Hデカップリング、及び、核からのオーバーハウザ-効果により^<13>C NMR信号の大幅な増強が得られ、人体の^<13>C NMRスペクトルが測定できる様になった。^<13>C NMR信号の^1H核による間接的検出では多量子遷移を経た核スピンの緩和が一般に予想されていた値よりも速いことを見いだした。そこで、多量子選択用勾配パルスの印加時間を最適化することにより、信号強度の増加率が今まで報告されていた^1H核の10倍程度から約30倍に到達し、理論値に近い効果が得られる様になった。3.^<13>C-標識アラニンを用いたラット肝代謝の解析アラニンにおける標識^<13>Cは肝臓内のグルタミン/グルタミン酸、ブドウ糖、グリコーゲンに取り込まれる。この標識の移動から、アラニンを基質にする肝臓でのgluconeogenesisとglycogenesisがATPのレベルに支配されていることが分かり、肝臓の代謝を解析する有用な手段として利用できる様になった。本年度は昨年度までに構築してきた人体用他核多重共鳴MR装置をさらに改良し、^<13>C NMR信号検出の高感度化を達成した。さらに、2テスラNMR装置を用いて実験的に作成した小動物の病態モデルにて体内における^<13>C-NMR標識移動の解析から新しい脳・肝代謝機能評価法を開発した。その結果は以下の様になる。1.多重共鳴機能を付備した臨床用MR画像装置の改良改良中の臨床画像用MR装置に他核RFチャンネルを2系統導入し既存装置の1系統と合わせて三重共鳴MR法が可能となった。さらに雑音除去のために種々のフィルターを追加し、^1H,^<31>P、^<13>Cを含む多くの核種の照射が可能になり、同種核、及び、他核種間でデカップリングや飽和移動の計測が実現した。^<13>C NMR信号の^1H核による間接的検出では多量子遷移を経由したスピン系が1量子状態で検出されるまでの過程で起きる緩和を考慮することにより、^<13>Cの情報を持つ信号の著しい増強が認められた。すなわち、多量子選択用磁場勾配パスルの波形と印加時間を最適化することにより信号強度がさらに増加し、理論値に近い増強効果が得られた。ラット肝臓では、リン酸エネルギー代謝よりもグルコースの取り込みが肝機能を反映すること、そして、アラニンを基質とする肝臓でのgluconeogenesisとglycogenesisがアデノシン三リン酸のレベルに支配されていることが分かり、肝臓の代謝を解析する有用な手段として利用できる様になった。
口腔癌の顎骨浸潤に対する血管新生阻害剤TNP-470の応用に関する研究

口腔領域は周囲を骨に囲まれているという解剖学的特徴を持つことから悪性腫瘍の顎骨への浸潤・骨破壊はしばしば認められる.本研究では,血管新生阻害剤フマギリン誘導体TNP-470の骨代謝における作用と腫瘍の顎骨浸潤に対する有用性を検討した.1. in vitroにおけるTNP-470の骨吸収抑制機序の解析(1)マウス骨髄細胞を1α25(OH)2D3存在下で培養する破骨細胞様細胞形成系に対しTNP-470は著明に破骨細胞様細胞形成を抑制した.(2)頭蓋冠を1α25(OH)2D3存在下で培養し,培養液中のCa濃度を指標にTNP-470の骨吸収抑制活性を測定した.その結果,濃度依存性にCa濃度を抑制した.(3) TNP-470は破骨細胞ならびに骨芽細胞様細胞に対し細胞障害性(LDH,CPK活性)を認めなかった.2. in vivoにおけるTNP-470の骨吸収抑制効果の評価(1) IL-1をマウスの頭蓋冠周囲に注射し骨吸収を誘発し,TNP-470の影響を組織学的に検討した.対照群では破骨細胞の活発な骨吸収像と髄膜側に反応性骨形成を認めたが,TNP-470投与群では破骨細胞は消失し骨吸収は抑制された.(2) IL-1βとPTHrPの持続投与により作製された高カルシウム血症マウスへのTNP-470皮下注射は濃度依存性に血清Ca値を改善した.(3)ヒト口腔扁平上皮癌細胞株HSC-3をヌードマウスの左心室注射し作製された顎骨転移モデルに対しTNP-470皮下注射は顎骨での転移腫瘍の骨浸潤・骨破壊を抑制した.以上の結果から,TNP-470は,本来の血管新生阻害作用のみならず優れた破骨細胞性骨吸収抑制作用を有し,腫瘍の顎骨浸潤・骨破壊を制御するのみならず高カルシウム血症の改善など,腫瘍に関連する骨代謝治療への応用への可能性が示唆された.口腔領域は周囲を骨に囲まれているという解剖学的特徴を持つことから悪性腫瘍の顎骨への浸潤・骨破壊はしばしば認められる.本研究では,血管新生阻害剤フマギリン誘導体TNP-470の骨代謝における作用と腫瘍の顎骨浸潤に対する有用性を検討した.1. in vitroにおけるTNP-470の骨吸収抑制機序の解析(1)マウス骨髄細胞を1α25(OH)2D3存在下で培養する破骨細胞様細胞形成系に対しTNP-470は著明に破骨細胞様細胞形成を抑制した.(2)頭蓋冠を1α25(OH)2D3存在下で培養し,培養液中のCa濃度を指標にTNP-470の骨吸収抑制活性を測定した.その結果,濃度依存性にCa濃度を抑制した.(3) TNP-470は破骨細胞ならびに骨芽細胞様細胞に対し細胞障害性(LDH,CPK活性)を認めなかった.2. in vivoにおけるTNP-470の骨吸収抑制効果の評価(1) IL-1をマウスの頭蓋冠周囲に注射し骨吸収を誘発し,TNP-470の影響を組織学的に検討した.対照群では破骨細胞の活発な骨吸収像と髄膜側に反応性骨形成を認めたが,TNP-470投与群では破骨細胞は消失し骨吸収は抑制された.(2) IL-1βとPTHrPの持続投与により作製された高カルシウム血症マウスへのTNP-470皮下注射は濃度依存性に血清Ca値を改善した.(3)ヒト口腔扁平上皮癌細胞株HSC-3をヌードマウスの左心室注射し作製された顎骨転移モデルに対しTNP-470皮下注射は顎骨での転移腫瘍の骨浸潤・骨破壊を抑制した.以上の結果から,TNP-470は,本来の血管新生阻害作用のみならず優れた破骨細胞性骨吸収抑制作用を有し,腫瘍の顎骨浸潤・骨破壊を制御するのみならず高カルシウム血症の改善など,腫瘍に関連する骨代謝治療への応用への可能性が示唆された.口腔領域は周囲を骨に囲まれているという解剖学的特徴を持つことから悪性腫瘍の顎骨への浸潤・骨破壊はしばしば認められ,顎骨浸潤の予防あるいは浸潤した癌細胞の顎骨での増殖を制御することは臨床上極めて重要である.本研究では,骨内に浸潤増殖した腫瘍に対するTNP-470の有用性を検討するためTNP-470の破骨細胞性骨吸収の抑制機序の解析を行った.1.in vitroにおけるTNP-470の骨吸収抑制機序の解析C57マウス骨髄細胞培養系を用いTNP-470の破骨細胞形成に及ぼす影響を検討した.骨髄細胞を1a25D3存在下で培養し破骨細胞様細胞を誘導した.これにTNP-470を添加すると,血管新生阻害作用を示す10-3ng/ml以上で著明に破骨細胞様細胞の形成を抑制した.一方,MC3T3-G2/PA6と脾細胞を1a25D3存在下で培養した破骨細胞形成系ではTNP-470は影響を与えなかった.骨髄細胞には血管内皮細胞が含まれており,TNP-470の血管新生阻害作用を介した破骨細胞形成抑制作用が示唆された.2.in vivoにおけるTNP-470の骨吸収抑制効果の評価

骨吸収刺激因子IL-1をマウスの頭蓋冠周囲に注射し骨吸収を誘発し,TNP-470の影響を組織学的に検討した。IL-1単独処理群では,多数の破骨細胞が骨髄内腔に認められ活発な破骨細胞性骨吸収と髄膜側に反応性骨形成を認め,骨代謝回転が促進した.一方,IL-1処理群にTNP-470を投与すると破骨細胞は消失しその骨吸収は著明に抑制された.以上の結果より,TNP-470には破骨細胞の形成抑制による骨吸収抑制作用があることが明らかになった.現在,破骨細胞性骨吸収の抑制機序の解析をさらに検討中である.癌の顎骨浸潤の予防あるいは浸潤した癌細胞の顎骨での増殖を制御することは臨床上極めて重要な課題である.報告者は血管新生阻害剤フマギリン誘導体TNP-470に血管新生阻害作用のみならず破骨細胞形成抑制作用を有することを初めて明らかにしている.本年度は骨内に浸潤増殖した腫瘍に対するTNP-470の破骨細胞性骨吸収抑制機序の解析並びに高カルシウム血症マウス,骨浸潤モデルを作成しその臨床的有用性を検討した.1. in vitroにおけるTNP-470の骨吸収抑制機序の解析ICRマウスの頭蓋冠を器官培養し,1α25(OH)_2D_3で骨吸収を惹起させ培養液中に遊離したCa濃度を指標に,TNP-470の骨吸収抑制効果を検討した.その結果10^<-5>ng/mlという極めて低濃度からCa濃度を濃度依存性に抑制した.2. in vivoの高カルシウム血症マウスに対するTNP-470の効果ICRマウスにIL-1β並びにPTHrPを投与し高カルシウム血症モデルを作製し,血管新生抑制効果を示す12.5mg/kg/mouseのTNP-470皮下注射での骨吸収抑制効果の評価したが濃度依存性に高カルシウム血症を改善した.3.ヒト口腔扁平上皮癌細胞株HSC-3を4週齢のヌードマウスの左心室に心腔内注射することにより顎骨転移を引き起こす骨転移モデルを作成した.TNP-470(50mg/kg/mouse)を週3回皮下注射し,顎骨での腫瘍の骨浸潤・骨破壊をエックス線学的,組織学的に検索し,その効果を画像解析プログラムにて定量的に分析した.TNP-470は明らかに骨破壊を抑制し,抗腫瘍効果を認めた.以上の結果から,血管新生阻害剤フマギリン誘導体TNP-470は,本来の血管新生阻害作用を介した抗腫瘍効果のみならず優れた破骨細胞性骨吸収抑制効果を有し,腫瘍の骨浸潤・骨破壊の治療的効果のみならず高カルシウム血症の改善など,腫瘍に関連する骨代謝治療剤の臨床応用への可能性が示唆された.
自律航法型環境測定ロボットの開発

研究目的:最近,環境汚染と地球温暖化が,生物をはじめ様々なものに悪影響を及ぼしている.環境汚染には,大気汚染,海洋汚染,河川汚染などがあり,直接的あるいは間接的に種の存続に関わるような重大な問題にもなっている.また温暖化も地球規模の環境変化をもたらしている.こうしたことから,海洋などにおける有害な物質や微生物の調査・研究が,日本はもとより世界各地で行われている.そこで本研究は,このような調査を容易にかつ効率的にするための方法として,環境測定を行う自律航法型ロボットの開発を行った。研究方法:自律航法ロボットに必要な要素技術の調査・研究を行うとともに,これらを統合してロボットを製作した。以下にロボットに組込んだ主な要素技術および製作項目を示す。2.USBメモリをマイコン外部記憶装置として拡張。3.GPSデータをUSBメモリに保存,また必要に応じて読出して参照。4.モータドライバ回路の設計・製作。5.環境測定装置として濁度センサを製作。6.LCD表示装置の製作。7.航行アルゴリズムの設計と自律航行プログラムの作成。研究成果:ロボットにより河川・湖や海の沿岸域において環境測定を行うことを可能にした.具体的には,ロボットがGPS情報を用いて自律的に移動し,設定した場所において水質測定を行い,そのデータを保存したり,あらかじめ設定した場所に帰還させたりすることを可能にした。通常では,船やボートを用意してサンプル採集を行うところが,このように無人で行えるので,省資源の観点からも有効である。
細菌の病原性を修飾するストレスとストレス蛋白質

本研究は病原細菌がどのような状況にあるとき病原因子を産生するかについて分子生物学的に解析し、宿主に寄生した病原細菌の病原因子産生を選択的に抑制する方法を開発することを目的とした。研究の対象材料としては未解決の問題を多く含むグラム陽性球菌・桿菌を選び、外界刺激から遺伝子発現までの菌体内の応答機構を解析した。ブドウ球菌は46Cの熱ショックに応答して熱ショック蛋白質(HSP60群、HSP70群など)を産生しることを発見し、その蛋白分子と特異的な遺伝子構造を解明した。熱応答は遺伝子の転写レベルで行われており、それには遺伝子群の特異的なバリンドローム構造が関与していることが解かりさらにその特異的構造に結合する蛋白分子があることが判明した。それが転写因子であると推察されるが、ブドウ球菌の転写因子は、大腸菌や枯草菌のように特異的熱ショック応答転写因子が検出されず、ユニバーサルな転写因子が熱ショック調節に関与しているらしい。HSPsの蛋白性状その特異機能については順次明かになりつつある。アルカリショック(pH12)に応答する蛋白分子(ASP23)を同定し、その分子機構も明かにした。ウエルシュ菌の菌体外毒素・酵素(フォスフォリパーゼ、パ-フリンゴリジン、コラゲナーゼ、ヘモアグルチニンなど)の産生をグローバルに調節する遺伝子(virR/S系)を同定し、その作用機構を解析した。それぞれの毒素遺伝子は独自の転写開始点を持つとともに共通のシストロンとしての開始点もあり、VirR/S系の調節は込み入ったしかし整然とした機構で調節されていることが判明した。毒素関連遺伝子の遺伝子配列(染色体地図)を解析したところpfoR、pfoA、arcA, B, C、pbg(b-ガラクトシダーゼ)などの順で配列していることがわかった。さらに、virR/S系の発現を調節している遺伝子が同定され、その蛋白分子は菌体外に分泌され、他の菌体のvirR/S系の発現をも調節する因子であり、菌体間の情報伝達物質として極めて重要な機能を果していることが推察された。2種類のグラム陽性菌のストレス応答機構と病原因子産生調節機構が解かり、これをさらに検証・普遍化することにより、病原細菌のストレス(外来刺激)による病原因子産生の調節・制御機構が明かとなり、抗菌作用物質に関する新しい概念が確立できると確信する。黄色ブドウ球菌とウェルシュ菌の病原因子産生にストレスがどのような影響を与えるかを解析している。黄色ブドウ球菌では培養温度を37°Cから42°Cへ移し、熱ストレスを負荷すると10種類以上の蛋白が多量に産生されてくる。そのいくつかはアミノ酸分析の結果熱ショック蛋白であることがわかったので、その内、hsp60とhsp70の遺伝子(オペロン)をクローン化し構造を決定した。hsp60はHSP10とHSP60の2種類の蛋白をコードしており、hsp70はHSP37、HSP20、HSP70、HSP40、HSP35の5種類をコードしていた。

この内HSP20はE.coliのGrpEに、HSP40はDnaJにHSP70はDnaK相当であったがHSP37とHSP35はE.coliには認められず、新しい遺伝子であった。またHSP37はGram陽性菌に相同性の高い構造があり、Gram陽性菌に共通的に保存されている構造であるらしいことが推察された。HSP35はブドウ球菌に特異的な構造であった。これらの熱ショック蛋白の遺伝子のオペレーター構造は特徴的なパリンドローム構造を持ち、これらがどのような特性があるのか検討している。ウェルシュ菌の溶血毒素の産生は2分子情報伝達系により調節されていることを発見した。それに関与する遺伝子virRのクローン化に成功し、塩基配列を決定し構造の特性を解析した。さらにこれを調節する因子、virSをクローン化している。virRが他の毒素の産生をも制御していることは各種の変異を分離し、コンプリメンテイション法により確認しているが、さらに他の因子が関与していることがわかってきた。これらの毒素がいかに病原性と関わり、何がストレスとして作用してその発現を調節しているか、遺伝子・蛋白レベルで解析している。黄色ブドウ球菌の熱応答蛋白質、HSP60グループとHSP70グループのオペロン構造を明らかにした。それぞれのオペロンのプロモーター上流には特異的なパリンドローム構造がある。その機能を、点変異を組み込み解析したところ、大腸菌内では影響を受けないが、黄色ブドウ球菌では、変異により発現の抑制を受ける傾向がみられた。σ因子を調べたところ、黄色ブドウ球菌には大腸菌と類似したσ^<32>は遺伝子解析では検出されず、熱ショック特異的な転写因子は検出できなかった。引き続きアリンドローム構造の活性特性を調べている。HSP70の新しい蛋白分子Orf35を精製し、特異性の高い抗体を得た。これを用い熱ショックでこの蛋白が発現誘導されていることが確認され、また、グラム陰性菌ではこれに類する分子はないことが確認できた。この蛋白の機能について検索中である。アルカリストレスで誘導される新しい蛋白も同定された。分子量23Kで膜蛋白様のアミノ酸配列であり、大腸菌のコリン輸送蛋白と類似性が高い。アルカリショックで転写レベルで活性化を受けており、酸や熱などでは誘導されないことから、何らかの抗アルカリ作用を有するものと推察される。またアルカリショックで栄養条件に対応する遺伝子agrも抑制されるので、これが病原因子産生に関与している可能性もある。ウェルシュ菌では、菌体外毒素・酵素の産生をグローバルに調節する遺伝子pfoR-A virR-Sを同定しており、その構造と機能の解析が進んでいる。θ毒素の遺伝子下流にはβガラクトシダーゼの遺伝子が存在することが確認され、クローン化した。発現はθ毒素とは別に調節されており、今後毒素遺伝子発現の対照といて有用であり、また、それ自体の発現の意義を検討している。ブドウ球菌のストレス応答の分子機構とウエルシュ菌の病原因子産生の調節機構のについて解析した。ブドウ球菌は46Cの熱ショックに応答して熱ショック蛋白質(HSP60群、HSP70群など)を産生し自己を熱による変性から防御する。その応答は明かに遺伝子の転写レベルで行われており、それぞれの遺伝子群の特異的なパリンドローム構造が関与していることが解った。さらにその特異的構造に結合する蛋白分子があり、それが転写因子である可能性がある。
生体鉱物の特性を生かした地下水・土壌汚染修復技術の新展開

原位置地下水浄化技術である透過型浄化壁のカラム試験において、嫌気性菌である硫酸還元菌やセレン還元菌の寄与を確認した。カラム解体後の試料のSEM-EDXによる直接分析から硫酸は硫化物となっていることが示唆され、処理前後の水のイオウ同位体比分析から、σ^<34>Sの減少を確認したことにより、硫酸還元微生物による影響があると判断した。この反応にともなって地下水中のヒ酸や鉄以外の重金属イオンが硫化鉄とともに共沈する効果がある。また、硫酸還元菌が硫酸還元反応をおこなう際に、炭素源が分解され、アルカリ度を上昇させる。その結果、重炭酸イオンが天然水に普遍的に存在するCa^<2+>,Mg^<2+>イオンと反応し炭酸塩が析出し、これらと地下水中汚染物質であるヒ酸イオンが共沈することもカラム解体後の試料のSEM-EDXによる直接分析から推定できた。このとき、ヒ酸イオンは単体ヒ素やヒ化物とはならず、ヒ酸あるいは亜ヒ酸の状態で透過型浄化壁の活性物質の表面に不動化されることをX線光電子分光法(XPS)により確認した。一方セレン還元菌によるセレン酸の不動化では、セレン酸や亜セレン酸ではなく、単体セレンとなって不動化されることをX線光電子分光法(XPS)およびラマン分光法により確認した。好気性菌であるが準表層環境で機能するマンガン酸化菌がもたらすマンガン酸化生体鉱物については形態や化学状態に化学的酸化物にはない特徴があり、それに起因した他の重金属濃集挙動(選択性、酸化還元反応、収着サイト)あることがわかった。この生体鉱物に対する重金属イオン収着選択性については工学的応用の可能性を見出した。環境浄化に有用な生体鉱物を合成すると期待される3種のマンガン酸化真菌を単離し、形態観察およびDNA遺伝子解析にもとついた系統樹を作成し、分類学的位置づけを明らかにした。形態的特徴からは、3種とも不完全菌群に属すると考えられるが、ITS-5.8srDNA遺伝子解析によると3種のうち2種は不完全菌群、1種は担子菌群に属すると考えられる。それぞれの菌によるマンガン酸化特性について、最適条件の決定、マンガン濃度耐性などを明らかにした。3種のうちの2種の菌のマンガン酸化反応の至適pH、従来報告されているマンガン真菌のものよりもやや酸性側にあった。通常、マンガン酸化真菌によるマンガン酸化反応は進行に伴いpHが低下していくため、このことは高濃度マンガンを処理する上では有利な性質であるといえる。また、より酸性側に至適pHを有する菌につき、酸化可能なマンガンイオンの上限濃度を調べたところ、240ppmでも十分な速度で酸化を起こすことがわかった。この濃度はこれまで報告されているマンガン酸化真菌による酸化可能な上限濃度の記録を更新する値であり、鉱山廃水などの高濃度処理への応用にとってはきわめて有利な性質であるといえる。上記の菌により合成された生体鉱物の分光学的特性、形態特性、粉体物性について検討したところ、多孔性に富み、4nmに特化した細孔分布をもつ粉粒体であることがわかった。このようなメソポア構造はきわめて珍しく、環境浄化材料への応用が期待される。昨年度、マンガンを含む廃水を処理し続けている人工湿地より単離したマンガン酸化真菌のうちの一種であるPicea glauca sp.様真菌は、およそ400ppmのMn(II)イオンを酸化することが可能であった。ただし、それには、適切なpH制御,有機炭素源の種類と濃度を与えることが必要であった。最適条件を制御することにより、生物合成によって大量のマンガン酸化物を得ることが可能となった。

この生体鉱物は均質なナノポア構造をもつため、重金属イオンの吸着特性を検討した。生体合成マンガン酸化物へのCo^<2+>イオンの吸着特性を化学合成マンガン酸化物と比較したところ、前者が66mmol-Co/l mol forsolid Mn以上であるのに対して、後者が28mmol-Co/l mol forsolid Mnであり、生体鉱物はきわめて高いコバルト吸着容量を持っていることがわかった。またXPSにより、両者の鉱物表面を分析したところ、吸着後のCo^<2+>イオンの被覆率は、化学合成マンガン酸化物のほうが大きく、化学合成マンガン酸化物へのコバルト吸着量が生体鉱物よりも小さいことと整合していなかった。これは、前者には細孔の奥深くまでコバルトイオンが捉えられ、生体鉱物の細孔分布が小さい孔径に片寄っていることを裏付ける結果と考察される。生体鉱物へCo^<2+>イオンを吸着させる過程では、Mn^<2+>イオンが溶出する傾向が見られたが、Mn^<2+>イオンの溶出は、Co^<2+>イオンの吸着とは必ずしも連動せず、生体鉱物の低結晶性と多孔性に基づき、不安定なマンガンが水溶液中に放出したためと考えられる。重金属除去剤としてこの生体鉱物を用いるには、合成後の洗浄方法を工夫する必要がある。マンガン酸化真菌の単離株であるParaconiothyrium sp.様真菌により合成したマンガン酸化物は、低結晶性でありながら、birrnesite(Na_4Mn(III)_6Mn(IV)_8O_<27>・9H_2O, JCPDS 23-1046)に近く、構造中にMn(III)およびMn(IV)を含む。また、化学合成によるマンガン酸化物は完全なMnO_2であり、構造中のMnにはMn(IV)しかもたない。Co(II)の収着実験ではどちらの酸化物表面でもCo(III)として酸化されたものとして検出され、酸化還元反応をともなった収着であることはあきらかであった。Co(II)収着過程においてはMn(II)の溶出がみられた。化学合成酸化物からは、イオン交換型のMn(II)の脱離のみであったが、とくに生体鉱物からは、イオン交換型のMn(II)の脱離のみならず、Mn(III), Mn(IV)を電子受容体とした酸化還元反応によるMn(II)の脱離がみられた。Mn(II)溶出量の経時変化から、Mn(IV)を優先的に電子受容体としながら、次第にMn(III)も電子受容体として利用していく変遷の傾向が認められた。生体鉱物の表面には不規則な結晶構造中の空隙が存在し、重金属イオンはそのようなサイトに吸着されやすいと考えられる。そのあと、Co(II)の場合には、隣接するMn(III)およびMn(IV)と酸化還元反応を起こす。Co(II)が酸化されて、Co(III)を生成するときにMn(IV)が電子受容体として使われれば、Mn(III)-OOHとして、なお固相表面にとどまっているが、Mn(III)が電子受容体として使われ出すと、Mn(II)を溶液中に放出する。このようなことは、化学合成酸化物ではみられない点で、マンガン酸化生体鉱物の特徴といえる。原位置地下水浄化技術である透過型浄化壁のカラム試験において、嫌気性菌である硫酸還元菌やセレン還元菌の寄与を確認した。カラム解体後の試料のSEM-EDXによる直接分析から硫酸は硫化物となっていることが示唆され、処理前後の水のイオウ同位体比分析から、σ^<34>Sの減少を確認したことにより、硫酸還元微生物による影響があると判断した。
カルシウムシグナル異常による外胚葉異形成症発症メカニズムの分子基盤

本研究では、ストア作動性カルシウム(Ca2+)流入(SOCE)が外胚葉異形成症(ED)の発症に関与する分子メカニズムを解明し、毛髪の再生、歯の石灰化や唾液腺分泌の機能回復を目指した知識の蓄積に貢献するストア作動性Ca2+流入の上皮細胞における分子基盤を解明することを目的としている。昨年度までは、SOCE関連分子(STIM1/2遺伝子)を上皮特異的に欠損させたマウスの歯の表現型解析を実施してきたが、今年度は、毛の表現型解析、および唾液腺の表現型解析を行うことでSOCEの異常が、上皮間葉相互作用に影響あたえるという仮説を検証し既存EDとの表現形とシグナル伝達の違いを明らかにすることを当初の目標とした。まず毛の表現型解析として、毛伸長の速さ、毛の性質を野生型と変異型とで肉眼的、組織学的に比較を行ったが、明確な差が認められなかったため、今年度は唾液腺の表現型解析を主に行うこととした。唾液腺の表現型解析の結果、i)唾液腺組織構造の解析を行ったが、野生型と比較して、上皮特異的STIM遺伝子欠損マウスにおける明確な構造の違いは確認できなかったことから、上皮間葉相互作用に影響を与える可能性は低いと判断した。ii)マウスから唾液採取により唾液分泌量・組成変化の有無を解析をおこなったところ、上皮特異的STIM遺伝子欠損マウスにおいて、ピロカルピン刺激時の唾液分泌量が減少しており、唾液の組成について特に塩化物イオン濃度に有意な変化が見られた。iii)Ca2+応答と唾液分泌機能の変化の関係について、水チャネルのアクアポリン5等の局在や塩化物イオンチャネルの発現を免疫組織化学染色やreal time PCRで確認したところ、有意な差が見られなかった。以上のことから、SOCEの異常は、唾液腺の塩化物イオンを制御する機構に影響を及ぼし唾液分泌量を減少させる可能性が示唆された。昨年度までは、当初の計画以上に進展していたが、今年度実験動物飼養保管施設での感染事故による影響から、実験に用いるマウスの微生物学的クリーニングが必要となり、研究の進捗に影響が生じた。結果として、研究課題全体の進捗状況は、やや遅れている状態となった。今年度実施を見送った毛の表現型解析を継続するとともに、当初の交付申請書とおり、今後は毛包、歯胚、唾液腺器官培養系におけるCa2+流入のリアルタイム蛍光イメージ解析を実施する計画である。野生型および変異マウスから、組織を実体顕微鏡下にて取り出し、Ca2+の蛍光指示薬(Fura-2等)を負荷後、蛍光強度を指標として九州大学歯学研究院所有の多光子共焦点レーザー顕微鏡下で、器官(細胞)内のCa2+濃度変化のリアルタイムイメージ画像を得る。また、Ca2+流入関連レセプターの局在とその変化について、蛍光融合タンパクを強制発現させた細胞培養系あるいは器官培養系でイメージ解析することで、マウスにおいて見られる表現型変化がどのようにもたらされたか、分子レベルで可視化する。外胚葉異形成症(ED)は、歯、毛髪、汗腺、あるいは唾液腺の形成・機能異常を引き起こし、QOLの著しい低下を引き起こすばかりでなく時に生命に関わる疾患である。近年、その疾患の発現に、細胞の「ストア作動性カルシウム(Ca2+)流入(SOCE)」というメカニズムが関与している可能性が示された。そこで本研究では、SOCEがEDの発症に関与する分子メカニズムを解明することを目的とする。これにより、毛髪の再生、歯の石灰化や唾液腺分泌の機能回復を目指した、歯科医療の基盤的知識の蓄積に貢献し、ストア作動性Ca2+流入の上皮細胞における分子基盤を解明する。今年度は、エナメル芽細胞を含む上皮において特異的にStim1・Stim2遺伝子欠損させたマウスを作出し(K14Cre- Stim1・Stim2 flox)、STIMファミリー間で補償メカニズムが働かないように工夫し表現型解析を行った。まず、野生型と変異型マウス歯より得た歯の組織切片、マイクロCT、SEM像を撮影し、エナメル質の厚みおよび石灰化度を定量的・定性的に評価した。8週齢のStim1およびStim1/2変異マウスの歯では肉眼的に顕著な咬耗が認められ、マイクロCT解析ではエナメル質の石灰化度が有意に低下し、SEMではエナメル小柱の性質が変化していた。さらに、エナメル質のCalcein蛍光標識ラベリング法およびGBHA染色により、エナメル芽細胞の成熟期に見られる周期的な形態変化が変異マウスで変化していることがわかった。これらの結果から、SOCEの異常は、エナメル基質の成熟および成熟期エナメル芽細胞の周期的形態変化に影響を与え、低石灰化型エナメル質形成不全をもたらすことが示唆された。当初予定していた歯の表現型解析の大部分を終えることができ、その成果を論文として国際雑誌に投稿し受理されたため。

まず毛の表現型解析として、毛伸長の速さ、毛の性質を野生型と変異型とで肉眼的、組織学的に比較を行ったが、明確な差が認められなかったため、今年度は唾液腺の表現型解析を主に行うこととした。唾液腺の表現型解析の結果、i)唾液腺組織構造の解析を行ったが、野生型と比較して、上皮特異的STIM遺伝子欠損マウスにおける明確な構造の違いは確認できなかったことから、上皮間葉相互作用に影響を与える可能性は低いと判断した。ii)マウスから唾液採取により唾液分泌量・組成変化の有無を解析をおこなったところ、上皮特異的STIM遺伝子欠損マウスにおいて、ピロカルピン刺激時の唾液分泌量が減少しており、唾液の組成について特に塩化物イオン濃度に有意な変化が見られた。iii)Ca2+応答と唾液分泌機能の変化の関係について、水チャネルのアクアポリン5等の局在や塩化物イオンチャネルの発現を免疫組織化学染色やreal time PCRで確認したところ、有意な差が見られなかった。以上のことから、SOCEの異常は、唾液腺の塩化物イオンを制御する機構に影響を及ぼし唾液分泌量を減少させる可能性が示唆された。昨年度までは、当初の計画以上に進展していたが、今年度実験動物飼養保管施設での感染事故による影響から、実験に用いるマウスの微生物学的クリーニングが必要となり、研究の進捗に影響が生じた。結果として、研究課題全体の進捗状況は、やや遅れている状態となった。交付申請書通り、平成30年度は上皮特異的STIM遺伝子欠損マウスの解析として、毛の表現型解析、および唾液腺の表現型解析を行うことでストア作動性Ca2+流入の異常が、上皮間葉相互作用に影響あたえるという仮説を検証し既存EDとの表現形とシグナル伝達の違いを明らかにする。また、細胞間接着がCa2+流入に従い変化し細胞機能に影響を与えるという残りの仮説も検証する。具体的には、毛の表現型解析として、i)毛髪伸長の速さ、毛の性質を野生型と変異型とで肉眼的、組織学的に比較ii)毛周期と毛包幹細胞・色素幹細胞の運命との関連についてBrdUを用い組織学的に観察iii)毛胞組織における細胞間接着に関連するアドヘレンス・ジャンクションやGap junctionの形成、Tight junctionの形成を免疫組織化学法で確認する予定である。また、唾液腺の表現型解析として、i)唾液腺組織構造の解析後、唾液分泌量・組成変化の有無をマウスから唾液採取により解析ii)Ca2+応答と唾液分泌機能の変化の関係について、水チャネルのアクアポリン5等の局在や細胞間接着分子の発現を免疫組織化学染色やWestern blottingで確認して考察する予定である。今年度実施を見送った毛の表現型解析を継続するとともに、当初の交付申請書とおり、今後は毛包、歯胚、唾液腺器官培養系におけるCa2+流入のリアルタイム蛍光イメージ解析を実施する計画である。野生型および変異マウスから、組織を実体顕微鏡下にて取り出し、Ca2+の蛍光指示薬(Fura-2等)を負荷後、蛍光強度を指標として九州大学歯学研究院所有の多光子共焦点レーザー顕微鏡下で、器官(細胞)内のCa2+濃度変化のリアルタイムイメージ画像を得る。