hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
びまん性軸索損傷モデルにおけるMSP遺伝子および蛋白発現についての分子生物学的解析

MSP(Myelencephalon-specific protease)は,ラット・ヒトの脳脊髄に多く含まれ,特にoligodendroglia, microglia,neuronに認められるセリンプロテアーゼの一種で,我々は凍結損傷のモデルを用いた動物実験で,1-3日して損傷直下の白質にMSPmRNAと蛋白陽性のoligodendrocyteが出現し,浮腫の伸展に応じて損傷遠隔部位の白質にまでも陽性細胞が出現することを確認した。またmRNAと蛋白の発現は同時に平行して変化していた。本研究では,MSPがoligodendrocyteの活性化,ミエリンの修復過程に関与していることをラットびまん性軸損傷モデルにおいて検討した。まずびまん性軸索損傷モデルをMarmarouのモデルを基に作製した。ラットの頭蓋骨を露出して正中線上に金属プレートを固定し,包水クロラール腹腔内投与によって全身麻酔を施したラットをウレタンマットの上にのせて450gのおもりを高さ1.5mより金属プレートをめざして落下させて作成した。経時的に屠殺して灌流固定を行い,脳スライド切片を作製した。またクローニングしたMSPcDNAの断片よりsenseおよびantisenseRNAプローブを作成した。抗MSP抗体を用いた免疫染色ではoligodendrocyteが染色されず抗体濃度を変化させるなどして試みたが,期待されるような結果を得られなかった。今一度recombinant MSPを作成し直してアミノ酸配列のシークエンスを行ったところ,MSPの配列ではなくexpression vector由来のものであることが明らかとなった。これらの作業に想定外の時間を費やし今回の研究期間内に目標まで到達することはできなかった。MSP(Myelencephalon-specific protease)は、ラット・ヒトの脳脊髄に多く含まれ、特にoligodendroglia, microglia, neuronに認められるセリンプロテアーゼの-種である。これまでの報告でミエリンの代謝に関与するとされている。我々は凍結損傷のモデルを用いた動物実験で、1-3日して損傷直下の白質MSPmRNAと蛋白陽性のoligodendrocyteが出現し、浮腫の伸展に応じて損傷遠隔部立の白質にまでも陽性細胞が出現することを確認した。また、mRNAと蛋白の発現は同時に平行して変化していたり(J Neurotrauma 22;501-510,2005)。本研究では、MSPがoligodendrocyteの活性化、ミエリンの修復過程に関与していることをラットびまん性軸索損傷モデルにおいて検討するものであり、本年度はクローニングしたMSPcDNAの断片よりsenseおよびantisenseRNAプロープの作製、またラットびまん性軸索損傷モデルの作製を行った。今後、in situ hybridization法・Western blottingによる分子生物学的解析を行い、脳損傷後のMSPの経時的変化、局在をmRNA・蛋白レベルから明らかにし、特にoligodendrocyte, neuron(axon)が損傷修復への関与を検討する予定である。
進行口腔癌に対する超選択的動注法のための新しい血流維持型血管内視鏡の開発

本研究の目的は進行口腔癌に対する超選択的動注法のための新しい血流維持型血管内視鏡を開発しすることである.FiberTech社製の3CCDイメージングシステム(FT-203F)に接続可能であり,イリゲーションとワーキングチャンネルを有する直径1.3mmの血流維持型血管内視鏡を開発したが,ファントム実験では作製した血管内視鏡の画質が十分ではなく,さらなる改善が必要と考えられた.口腔癌に対する超選択的動注化学放射線療法により咀嚼・嚥下・構音などの口腔機能を温存することが可能となってきたが,カテーテルが腫瘍栄養動脈に確実に留置されなければ十分な量の抗癌剤が腫瘍に到達せず良好な治療効果が得られないため,カテーテル留置率の向上が本法において極めて重要な課題である.そのため,目的とする腫瘍栄養動脈に確実にカテーテルを留置するための新しいアプローチの開発が求められる.本研究では進行口腔癌に対する超選択的動注法のための新しい血流維持型血管内視鏡を開発することである.まず,血流維持型血管内視鏡の設計・試作に着手した.分担研究者の愛知工科大学の板宮と共同で口腔癌に対する浅側頭動脈よりの超選択的動注法に適した血流維持型血管内視鏡の設計と試作を開始し,本研究で試作するのはFiberTech社製の3CCDイメージングシステムFT-203F(光源・プロセッサ装置)に接続可能な直径1.3mmの血流維持型血管内視鏡であり,以下のデザインや仕様とした(チャンネルは2つ:イリゲーション(ヘパリン生理食塩水注入用)とワーキング(ガイドワイヤー挿入用)).開発する血管内視鏡は石英系イメージガイド,セルフォレックレンズ,多成分ガラス製ライトガイド,チャンネルチューブからなる挿入部,チャンネル付きグリップ部およびイメージングシステム(光源・プロセッサ装置)に接続するリード部より構成した.まだ,プロトタイプの開発中であり,今後プロトタイプを完成させていく予定である.血流維持型内視鏡を開発しているが,現在はまだプロトタイプの開発中のため.口腔癌に対する超選択的動注化学放射線療法により咀嚼・嚥下・構音などの口腔機能を温存することが可能となってきたが,カテーテルが腫瘍栄養動脈に確実に留置しなければ十分な量の抗癌剤が腫瘍に到達せず,良好な治療効果が得られないため,カテーテル留置率の向上が本法においてきわめて重要な課題である.そのため,目的とする腫瘍栄養動脈に確実にカテーテルを留置するための新しいアプローチの開発が求められており,本研究では,進行口腔癌に対する超選択的動注法のための新しい血流維持型血管内視鏡を開発してきた.まず,血流維持型血管内視鏡を設計し,分担研究者の愛知工科大学の板宮と共同で浅側頭動脈よりの超選択的動注法に適した血流維持型血管内視鏡のプロトタイプの開発を行ってきた.試作しているのはFiberTech社製の3CCDイメージングシステムFT-203F(光源・プロセッサ装置)に接続可能な直径1.3mmの血流維持型血管内視鏡である,以下のデザインや仕様とした(チャンネルは2つ:イリゲーションチャンネル(ヘパリン生理食塩水注入用)とワーキングチャンネル(ガイドワイヤー挿入用)).開発する血流維持型血管内視鏡は石英系イメージガイド,セルフォレックレンズ,多成分ガラス製ライトガイド,チャンネルチューブからなる挿入部,チャンネル付きグリップおよびイメージングシステム(光源・プロセッサ装置)に接続するリード部より構成した.現在もプロトタイプの血管内視鏡を開発中である.血流維持型内視鏡を開発中であるが,現在はまだプロトタイプの開発中であるため.口腔癌に対する超選択的動注化学放射線療法により咀嚼・嚥下・構音などの口腔機能を温存することが可能となってきたが,カテーテルが腫瘍栄養動脈に確実に留置しなければ十分な量の抗癌剤が腫瘍に到達せず,良好な治療効果が得られないため,カテーテル留置率の向上が本法においてきわめて重要な課題である.そのため,目的とする腫瘍栄養動脈に確実にカテーテルを留置するための新しいアプローチの開発が求められており,本研究では,進行口腔癌に対する超選択的動注法のための新しい血流維持型血管内視鏡を開発してきた.まず,血流維持型血管内視鏡を設計し,分担研究者の愛知工科大学の板宮と共同で浅側頭動脈よりの超選択的動注法に適した血流維持型血管内視鏡のプロトタイプの開発を行ってきた.試作しているのはFiberTech社製の3CCDイメージングシステムFT-203F(光源・プロセッサ装置)に接続可能な直径1.3mmの血流維持型血管内視鏡である,以下のデザインや仕様とした(チャンネルは2つ:イリゲーションチャンネル(ヘパリン生理食塩水注入用)とワーキングチャンネル(ガイドワイヤー挿入用)).開発する血流維持型血管内視鏡は石英系イメージガイド,セルフォレックレンズ,多成分ガラス製ライトガイド,チャンネルチューブからなる挿入部,チャンネル付きグリップおよびイメージングシステム(光源・プロセッサ装置)に接続するリード部より構成した.プロトタイプの血管内視鏡を開発し,ファントムスタディを行った..本研究の目的は進行口腔癌に対する超選択的動注法のための新しい血流維持型血管内視鏡を開発しすることである.

FiberTech社製の3CCDイメージングシステム(FT-203F)に接続可能であり,イリゲーションとワーキングチャンネルを有する直径1.3mmの血流維持型血管内視鏡を開発したが,ファントム実験では作製した血管内視鏡の画質が十分ではなく,さらなる改善が必要と考えられた.血流維持型内視鏡のプロトタイプをまず開発し,その後ファントムスタディに進めていく.血流維持型内視鏡のプロトタイプをまず開発し,その後のファントムスタディに進めていく.口腔外科学内視鏡のプロトタイプの開発が遅れているため予定していた開発費を執行できなかったこと,および他の予定と重なってしまったため,予定していた国際学会への参加ができなかったため.内視鏡のプロトタイプの開発が遅れているため,予定していた開発費を執行できなかったこと,および予定していた学会への参加ができなかったため.本年度は情報収集のために国際学会への参加を行い,また内視鏡の開発スピードを上げて研究を確実に遂行していく予定である.内視鏡の開発を終えて,ファントムスタディを行い,内視鏡が実臨床に用いることができるかどうか評価を行う予定である.
スピン依存ファン・デル・ワールス密度汎関数の開発・応用と電子相関

ファン・デル・ワースル(vdW)力と磁気的相互作用が共存する系を第一原理的に解析する手法として、スピン依存ファン・デル・ワールス密度汎関数の開発・改良を行ってきた。vdW-DFを用いて磁性系を扱う手法としてvdW-DF-SGC法を提案してきた。磁性系でのvdW-DFに補正される項として、スピン依存勾配補正(SGC)を以前より提案していたが、SGCは酸素分子系のような反強磁性結合が系の安定性に大きく寄与している系において、その引力を弱める方向に働くことがこれまでの研究で判明していた。この点に関して、より詳細な解析を行うため、磁性体Ni(111)表面へのグラフェンの吸着についてvdW-DF-SGC法を用いた調査を行い、SGCの効果は特に反強磁性物質において重要である点が確認された。この点は、他のスピン系vdW-DF法svdW-DFを用いた理論計算によっても明らかにすることができた。更に、vdW-DF-SGC法とsvdW-DF法の関係についても、これまでの計算を通して、明確化することに成功している。本手法はvdW力や磁性起因の弱い相互作用の評価に着目しており、原子間距離が比較的大きくなるような構造にも興味が持たれる。自発的に原子・結晶構造に変位をもつ強誘電体と磁性体との界面において、分極方向を変える程度の外部電場の印加を行うことで原子の大きな変位が起こり、結果として界面間の原子間距離が比較的大きくなる可能性がある。モデル化されたPtCo/ZnO界面の理論的解析を行い、強誘電体と磁性体の界面において、非常に原子間距離の離れた界面構造が表われることが示唆された。この理論計算は、GGA計算を用いており、実際にvdW力の影響についても今後調査していく必要がある。28年度が最終年度であるため、記入しない。vdW力は幅広く使われている局所密度近似(LDA)/一般化勾配近似(GGA)では、その近似の粗さ故に考慮されていない。そこで非局所的相関エネルギー汎関数を用いたvdW-DF法を用いることで、非経験的にvdW力を見積もる。vdW-DF法はスピン状態を考慮せずに考案されたものであり、vdW-DF法を用いた磁性物質を含む系の解析は不可能である。しかしながら、磁性分子結晶に代表される、vdW力と磁気的相互作用が共存する系の高精度な第一原理的解析手法は、マテリアルデザインの観点からも強く望まれる。そこでvdW-DF法で磁性系を扱う手法として提案していたvdW-DF-SGC法をさらに改善することにより、計算手法の精度向上を図った。磁性系でのvdW-DFに補正される項として、スピン依存勾配補正(SGC)を以前より提案していたが、SGCは酸素分子系のような反強磁性結合がある系において、その引力を弱める方向に働くことがこれまでの研究で判明した。vdW-DF-SGCは電子密度の汎関数として相関エネルギーを計算する手法でありLDA/GGAと同様にバンドギャップの過小評価の問題は解決していない。バンドギャプの過小評価により、反強磁性状態の相互作用は全ての系において過大評価されてしまう。その点をSGCの効果によって補正するという視点から、汎関数の改良を行った。改良した手法は固体酸素α相の系において、強すぎる反強磁性状態の相互作用を弱め、より現実的な結晶構造を記述可能ということが判明した。vdW-DF-SGC法は、比較的容易に磁性系でのvdW-DF計算を行うことが可能であるが、応用計算例が少ないのが現状である。汎関数の性質を調査するためにも、様々な系への応用計算が望まれる。そこでvdW-DF-SGC法の応用計算として、従来手法では記述が不可能であった固体酸素の高圧相β相について計算を行った。その結果、α相と同様に従来手法より正確な結晶構造が計算されることが示された。しかしながら、α相の場合と同様に反強磁性相互作用が過大評価されてしまう問題が発生した。より高精度な計算を行うためには、その課題点を修正する必要があることが如実に示されたという点でも意味がある結果である。その問題についてSGC項を調節することで改善が可能であることが示すことができたが、固体酸素系の完全な記述には至らなかった。

この点に関して、より詳細な解析を行うため、磁性体Ni(111)表面へのグラフェンの吸着についてvdW-DF-SGC法を用いた調査を行い、SGCの効果は特に反強磁性物質において重要である点が確認された。この点は、他のスピン系vdW-DF法svdW-DFを用いた理論計算によっても明らかにすることができた。更に、vdW-DF-SGC法とsvdW-DF法の関係についても、これまでの計算を通して、明確化することに成功している。本手法はvdW力や磁性起因の弱い相互作用の評価に着目しており、原子間距離が比較的大きくなるような構造にも興味が持たれる。自発的に原子・結晶構造に変位をもつ強誘電体と磁性体との界面において、分極方向を変える程度の外部電場の印加を行うことで原子の大きな変位が起こり、結果として界面間の原子間距離が比較的大きくなる可能性がある。モデル化されたPtCo/ZnO界面の理論的解析を行い、強誘電体と磁性体の界面において、非常に原子間距離の離れた界面構造が表われることが示唆された。この理論計算は、GGA計算を用いており、実際にvdW力の影響についても今後調査していく必要がある。これまでのvdW-DF-SGC法とsvdW-DF法の結果を通して、非局所相関項以外の項である交換エネルギー汎関数や電子相関効果の取り扱いにも問題があることが示唆された。そこでさらに高精度なDFT+U法、第一原理RPA法、多体電子論に基づくGW計算を用いることで、詳細な電子状態の解析を行い、問題点を明確にし、より高精度なスピン系でのvdW-DF手法を提案していく予定である。vdW相互作用は比較的小さなエネルギースケールに基づく相互作用であり、交換エネルギーや強い電子相関の影響もより精度よく扱うことで、全体としてより高精度な手法になる。GW計算等を使い高精度な電子状態を調査し、その電子状態を再現するように、交換エネルギー汎関数の改良や電子相関の効果をDFT+U法等により補正することで、高精度化の手法を研究する予定である。28年度が最終年度であるため、記入しない。
すべての前立腺肥大症が手術適応になり得るか否かの研究

前立腺肥大症の46人に対し、手術前に排尿時膀胱内圧尿流率同時測定を行い、その結果と手術後の尿流率の改善度を比較・検討した。図は全症例の最大尿流率時排尿筋圧(以下PQmax)と術後の最大尿流率の改善の程度との関係を示すグラフである。PQmaxは20cmH_2O150cmH_2Oであった。35例で手術後最大尿流率は改善したが、残り11例ではむしろ悪化していた。この2群の比較では改善群のPQmaxが平均66.7cmH_2Oであるのに対し、悪化群のPQmaxの平均は56.5cmH_2Oと低かった。また手術後最大尿量率が5ml/s以上悪化した症例が3例あった。この3例はいずれもPQmaxが52以下でかつ前立腺の切除量が11g以下の症例であった。以上より前立腺の肥大が軽度の症例では手術後排尿障害が悪化する場合があり、その手術適応の決定にあたっては排尿時膀胱内圧尿流率同時測定が有用であると思われた。
骨代謝におけるカルシウムシグナルを制御するイオンチャネルと骨免疫疾患との関連

本研究では、マウス前骨芽細胞(MC3T3-E1)において機能発現するイオンチャネルの分子同定とその生理機能の解析を目的として研究を行い、以下の点を明らかにした。1Ca2+活性化K+チャネルKCa3.1が機能発現し、Ca2+シグナル制御を介して細胞増殖を促進した。2ビタミンD刺激により誘導されるマウス前骨芽細胞の増殖抑制作用において、KCa3.1活性低下が一部寄与した。3ビタミンD刺激によるKCa3.1発現抑制メカニズムを検討したところ、AP-1およびHDAC2の活性低下が関与する可能性が示された。骨組織は骨形成と骨吸収による骨リモデリングにより恒常性を保っており、骨リモデリング破綻が骨免疫疾患の増悪に関与すると考えられている。骨と免疫系はサイトカインなどのシグナル系を共有し密接に関係している。これまで免疫細胞に対して様々なイオンチャネル研究が進められてきたが、骨免疫疾患における骨関連細胞を標的としたイオンチャネル研究は十分には行われていない。そこで応募者は、骨免疫疾患におけるイオンチャネル創薬を目的として、骨形成を担う骨芽細胞及び骨吸収を担う破骨細胞のイオンチャネルを介した細胞機能制御機構を検討した。今年度の実験結果より、マウス頭頂骨由来前骨芽細胞MC3T3-E1においてストア作動性Ca2+流入(SOCE)を介したCa2+流入が細胞増殖に寄与することが明らかとなった。さらに、MC3T3-E1に機能発現するCa2+活性化K+チャネルKCa3.1はSOCEの活性化に伴い活性化することで細胞膜を過分極させ細胞外からのCa2+流入を促進させることでCa2+シグナルの形成に寄与し、細胞増殖制御に関与することが明らかとなった。また、KCa3.1はMC3T3-E1の細胞周期のうちG1期に活性が亢進することにより、G1期からS期への細胞周期進行に寄与することが示されたことから、KCa3.1はG1-S期における細胞周期進行を促進することで前骨芽細胞の細胞増殖を制御する可能性が明らかとなった。さらに、本研究成果よりビタミンD刺激によるマウス前骨芽細胞の細胞増殖抑制作用に対して、KCa3.1の発現低下が一部関与する可能性が示唆されていることから、KCa3.1の生理的役割についてより詳細に検討する必要が考えられる。前骨芽細胞、骨芽細胞を含む骨芽細胞関連細胞の細胞増殖は骨形成において重要な役割を果たしていると考えられている。今回得られた結果は、KCa3.1チャネルが前骨芽細胞の細胞増殖を制御することで、骨の恒常性維持に寄与しうるという新たな知見を示すものである。しかしながら、MC3T3-E1に機能発現するSOCEを形成するCa2+透過チャネルの分子実体や細胞周期依存的なそれらイオンチャネル発現変化など検討すべき課題は山積しており、更なる検討が必要である。また、骨形成には、前骨芽細胞の骨芽細胞への分化が重要な要素であることから、前骨芽細胞の細胞増殖に加えて骨芽細胞分化に対する各種イオンチャネルの寄与に関しても検討を行う必要がある。現在、細胞分化に関しての検討も実施しており、分化に伴いKCa3.1チャネルの発現が減少する一方で、内向き整流性K+チャネルKir2.1の発現が上昇することを見出している。さらに、Kir2.1チャネルの阻害薬としてBa2+を添加することにより、骨芽細胞の分化の指標であるアルカリフォスファターゼALP活性が抑制されることからKir2.1チャネルが骨芽細胞分化に関与する可能性が考えられる。また、今年度の研究においては破骨細胞に関する検討は十分には行えておらず、骨芽細胞及び破骨細胞の両者を平行して行い、骨関連細胞におけるイオンチャネルの役割について包括的な検討を行いたい。本研究課題では、これまでに前骨芽細胞においてCa活性化KチャネルKCa3.1が機能発現し、Caシグナルの調節を介して細胞増殖を制御することを明らかにしてきた。KCa3.1の生理的役割をさらに検討するために、ビタミンD刺激において誘導される前骨芽細胞の細胞増殖抑制機構への寄与について検討した。動物個体へのビタミンD投与は、小腸上皮細胞におけるTRPV5/6の発現を上昇させ、小腸からのCa吸収を促進させることで骨量の増加をもたらすことが知られている。しかしながら、骨芽細胞特異的VDRノックアウトマウスを用いた検討及びマウス骨芽細胞を用いたin vitro研究では、骨量に対して負の制御因子として機能することが示唆されている。そこで、前骨芽細胞の細胞増殖に対するVDRアゴニストの細胞増殖に対する影響を検討するとともに、KCa3.1の寄与について検討した。その結果、VDRアゴニストであるcalciriolをマウス前骨芽細胞株MC3T3-E1の投与し、48時間培養後にKCa3.1発現を検討したところ、calcitriol投与細胞において有意にKCa3.1 mRNA及びタンパク発現が低下した。さらに、calcitriol処置による細胞増殖の低下に対して、KCa3.1活性の低下が関与するかを明らかにするために、KCaチャネル活性化薬DCEBIOを使用したところ、calcitriol誘導性細胞増殖の抑制が部分的に回復した。以上に結果から、MC3T3-E1に対するcalcitriol処置はKCa3.1の発現を低下させることで細胞増殖を部分的に抑制することが明らかになった。VDRアゴニストは、骨粗鬆症の治療薬に使用されるが骨芽細胞への直接作用は未だ不明な点が多い、そのため本研究成果がVDRアゴニストによる骨芽細胞の直接作用への理解につながることが期待される。

本研究では、マウス前骨芽細胞(MC3T3-E1)において機能発現するイオンチャネルの分子同定とその生理機能の解析を目的として研究を行い、以下の点を明らかにした。1Ca2+活性化K+チャネルKCa3.1が機能発現し、Ca2+シグナル制御を介して細胞増殖を促進した。2ビタミンD刺激により誘導されるマウス前骨芽細胞の増殖抑制作用において、KCa3.1活性低下が一部寄与した。3ビタミンD刺激によるKCa3.1発現抑制メカニズムを検討したところ、AP-1およびHDAC2の活性低下が関与する可能性が示された。MC3T3-E1における細胞周期依存的なイオンチャネル活性を検討することで、細胞周期進行におけるイオンチャネル(特にKCa3.1)の寄与を明らかにする。細胞周期同調培養により各細胞周期におけるCa2+動態、静止膜電位、イオンチャネル発現を比較する。細胞増殖・分化の制御におけるCa2+シグナルの役割を明らかにするために、骨芽細胞が分泌するサイトカインや細胞間因子について検討する。特に骨芽細胞の産生するインスリン様成長因子(IGF)や線維芽細胞成長因子(FGF)の発現変化や各因子に対する感受性変化に関して検討する。細胞増殖制御に関わるKCa3.1及び細胞分化に関わるKir2.1の転写制御機構について、各種転写制御因子を検討してVDR刺激時におけるKCa3.1発現減少機構及び細胞分化におけるKir2.1発現亢進機構を明らかにする。また、破骨細胞に発現が報告されるものは、大コンダクタンス及び中コンダクタンスKCaチャネルである。これらKCaチャネルの破骨細胞における機能は充分に解明されていないことから、マウス骨髄細胞由来マクロファージ系細胞に対し、選択的阻害薬投与を行うことで破骨細胞分化に対する寄与を解明すると共に、破骨細胞におけるKCaチャネルを介した細胞内シグナル伝達機構に関してもパッチクランプ法、Ca2+イメージング、細胞膜電位測定、分子生物学的検討を行うことで多角的な検討を行う。成熟破骨細胞に対して、象牙質切片を用いたpitアッセイ、あるいは蛍光標識リン酸カルシウム固層化プレートを用いたリン酸カルシウム基質の吸収活性測定により、骨吸収能を測定する。KCaチャネル関連薬適用による骨吸収能の変化を検討することで、イオンチャネルを介した骨吸収メカニズムの解明を行う。薬理学当初予定していた実験計画で使用予定であった免疫化学実験関連試薬(主に各種抗体)ののうち一部の購入を次年度に先送りした。イオンチャネルの機能解析に予定以上の時間がかかり、イオンチャネル発現解析の一部を次年度におこなうように変更したため次年度使用額が生じた。次年度では、今年度購入しなかった各種抗体を購入するとともに、他の実験計画についても予定通り行う予定である。
限定合理的プレーヤーによる政策決定過程のゲーム理論的モデルの開発

本研究ではまず,政策立案過程で有権者の意向が反映されないのは何故かという視点から,政策決定過程を分析し,制度的障害や人間の限定的合理性など多数の要因からなる構造を明らかにした。しかし,こうした複雑な因果関係をそのまま反映するモデルは,操作不可能や,多様な可能性を指摘するだけという問題があり,実現性の高い政策提言を行うための理論的分析ツールを提供するという当初の目的は達成されない。従って現実的で操作性の高いモデルを目指して,まず,政策を立案できるのは官僚だけで,政党は官僚の作った政策案を受け入れるか拒否するかしか出来ない,という官僚,政党,有権者をプレーヤーとするゲーム理論モデルを開発した。しかしながら,昨今の行財政改革,教育改革など各種制度改革の実態をみると,改革志向の政治家が世論や専門家の意見を参考にしながら発案した政策(方針)に,既得権益を持つ,利益団体,官僚,族議員などが抵抗するという図式が見て取れる。そこで,最終的には,最近の経済学の理論的成果である,情報の経済学,比較制度分析,体制移行の経済学の成果を基に,上述した日本の制度改革の現実を反映させ,政治家の提案に始まるゲーム理論モデルを開発した。モデル分析から,改革のもたらす効率化の成果分配と,既得権益の大きさの関係や,不確実性や限定合理性の程度の重要性が明らかになった。しかし,このモデルはプロトタイプであり,それぞれに特徴を持つ個別の政策分野別での提言に貢献できるためには,官僚や政治家が官庁,政党などそれぞれの組織内で持つインセンティブを内生化した,個別分野のモデル化が必要かもしれない。また,有権者と政策決定過程の問題を考察するためには,有権者の属する各種組織,選挙制度,マスコミも明示的に考慮したモデルの検討が必要になってこよう。官僚、政党、有権者をプレーヤーとする、簡単な(しかし日本の政治過程の特徴をある程度反映した)ゲーム・モデルを開発した。このモデルでは、政策を立案できるのは官僚だけで、政党は官僚の作った政策案を受け入れるか拒否するかしか出来ない。政党が政策案を実施するかどうかの決定をし、実施した政策(あるいは新政策の不実施)の結果が明らかになった後、有権者が選挙で政権党か野党を選択する。それぞれのプレーヤーは、他のプレーヤーの(政策についての)選好については不完全な情報しか持っていないが、それに加えて有権者は、政策の効果についても他のプレーヤーより不確かな情報しか持ちあわせていない。このような設定でゲームの解を求めたところ、官僚の戦略的行動によって政党の選挙結果を左右する可能性があることや、有権者が間接的に官僚の意思決定に影響を及ぼせることが明らかになった。今後の主な課題は、現段階ではプレーヤーの限定合理性のモデル化が情報の不完備性の程度差を捉えるに留まっているのを、より現実的なものにすることと、官僚のインセンティブの内生化を図ることである。前者については、とくに有権者に注目して考察を進めている。有権者は原理的には政策決定過程のプリンシパルであるが、具体的な政策立案過程では主役にはなれない。そのような有権者の意向が反映されるということはどういうことかをモデル化の前に明確にしておく必要がある。後者については、官僚や研究者とのプリ・サーベイ的なインフォーマルな議論からモデル化の方向を模索している段階である。
界面・コロイド現象を利用した選択的可溶化と放出制御システムの構築

本研究では,これまでによく知られてきた可溶化と従来の界面・コロイド現象を組み合わせて新たな付加価値を創り出すために,溶液中から目的物質のみを取り出す選択的可溶化,そして可溶化した物質を再び放出させる可逆的可溶化の技術を確立することを目的としている。これらの技術からリサイクルが可能で環境に配慮したシステムを構築でき,排水中の汚染物質の除去や香料の徐放性,医学・薬学分野における薬物送達システムへ応用できる。1年目は界面活性剤の疎水基に着目し,被可溶化物の溶解度の差を利用するために,疎水基に炭化水素をもつ界面活性剤と炭化フッ素をもつ界面活性剤の混合系で実験を行った。この混合系では被可溶化物を選択的に可溶化することができ,また界面活性剤の混合割合によって可溶化させた物質を再び取り出せることがわかった。2年目は両性界面活性剤を用いて,pH変化による選択的可溶化および可逆的可溶化を検討した。アミノ酸のように親水基に正電荷と負電荷の両方を有している両性界面活性剤はpHによって性質が変化する。表面張力測定を行った結果,特に強酸あるいは強塩基領域において臨界ミセル濃度が大きく変化することがわかった。それらの領域では可溶化量が大きく異なることがわかった。特に塩基性領域では可溶化量が著しく大きく,塩基性領域から酸性領域へpHを変化させると被可溶化物が取り出せることがわかった。また調査を進めていく中で,薬剤を運搬する1つの方法として粘土鉱物が研究されていることがわかった。粘土鉱物からの薬剤の徐放性は有用な性質であることから,本研究と関連して研究を進めていく。1年目は溶解度の差を利用した選択的可溶化と可逆的可溶化を確認でき,2年目はpH変化を利用した選択的可溶化と可逆的可溶化を確認できた。本研究の目的は選択的可溶化と可逆的可溶化の仕組みを確立することであり,これまでに2つの方法を確立できたことは目的の達成に寄与するものである。一方で定量的な議論を行うにはデータが不十分である。有色色素を用いた吸光度測定では定量化に限界があると考えられる。そこで無色の被可溶化物を用いること,そしてガスクロマトグラフィーを用いた分析を確立することを目的として,実験系を製作しているところである。具体的には揮発性の被可溶化物を用い,それらを回収して分析する方法である。当初想定していた実験系とは異なる方法を採用しているが,本研究の実験テーマを実施する上で必要な改善策と考えている。まずは可溶化量の定量化方法を検討する。被可溶化物に選んだ化合物の種類を問わずに測定できるようにすることで実験の幅が広がり,多種多様なデータを得ることができる。特に無色の被可溶化物を検出するために,ガスクロマトグラフィーを用いた測定方法の確立を目指す。そして1年目および2年目の結果をより定量的に議論するためのデータを取得する。また粘土鉱物に存在するナノチューブを利用した徐放性に関する研究に取り組む。当初の予定とは異なるが,その実用性とデータの重要性を鑑みて研究対象をシフトする。薬剤や香料を内包させた粘土鉱物ナノチューブの研究は少しずつ進められており,その徐放性について有用なデータが得られつつある。薬剤や香料を運搬する媒体として,これまで行ってきた界面活性剤ミセルを利用する「柔らかい」媒体と,粘土鉱物ナノチューブの「固い」媒体の結果を比較することは選択的可溶化と可逆的可溶化技術を確立する上で重要な役割を果たすと考えている。はじめに選択的可溶化を可能にするために,界面活性剤ミセルに対する被可溶化物の溶解度の差を利用した。炭化水素系化合物と炭化フッ素系化合物は水と油のように互いに混ざらない。そのため,疎水基に炭化水素をもつ界面活性剤と炭化フッ素をもつ界面活性剤の混合物を水中に添加すると,混合組成によって炭化水素系界面活性剤に富んだミセル,あるいは炭化フッ素系界面活性剤に富んだミセルのどちらかが形成される。前者には炭化水素系化合物を,後者には炭化フッ素系化合物を選択的に可溶化できる。また界面活性剤の混合組成を変化させることで炭化水素系界面活性剤に富んだミセルと炭化フッ素系界面活性剤に富んだミセルの間で起こる転移を利用すると,可逆的可溶化も可能になる。被可溶化物として炭化水素系赤色色素を用いて吸光度測定を行ったところ,炭化水素系界面活性剤に富んだミセルが存在する領域では溶液が赤く着色するのに対し,炭化フッ素系界面活性剤に富んだミセルが存在する領域では溶液がまったく着色しなかった。また炭化水素系界面活性剤ミセルに赤色色素を可溶化させたあとに炭化フッ素系界面活性剤を添加していくと,可溶化した色素が再び析出してくることがわかった。これらの結果から,選択的可溶化と可逆的可溶化のアイディアは実現可能であることが確認できた。

もっとも大きな変化が現れることを期待して選択した炭化水素系界面活性剤と炭化フッ素系界面活性剤の混合系は,被可溶化物が一方には可溶化するのに対し,もう一方にはまったく可溶化しないという予想通りの結果が得られた。そして混合組成を変えることで可溶化した物質が再び析出してくる現象を観察でき,本研究の目的である選択的可溶化と可逆的可溶化の実現可能性を確認できたことは評価できる。ただし現在のところは定性的な議論にとどまっており,定量的な議論を展開するために評価方法の検討を行っている。1つは時間変化について,可溶化した物質が再び析出してくるまでの時間が想定していた以上に長いことがわかったので,より正確に時間変化を測定するようにしている。もう1つは被可溶化物について,赤色色素以外の物質を使用することで選択的可溶化,可逆的可溶化に与える影響を検討することにしている。その際,有色色素であれば吸光度測定で定量化できるが,無色の化合物であれば困難となるため,ガスクロマトグラフィーを用いた定量化をめざしている。すでに測定を開始しているが,実験条件の設定など検討すべき課題は残っている。本研究では,これまでによく知られてきた可溶化と従来の界面・コロイド現象を組み合わせて新たな付加価値を創り出すために,溶液中から目的物質のみを取り出す選択的可溶化,そして可溶化した物質を再び放出させる可逆的可溶化の技術を確立することを目的としている。これらの技術からリサイクルが可能で環境に配慮したシステムを構築でき,排水中の汚染物質の除去や香料の徐放性,医学・薬学分野における薬物送達システムへ応用できる。1年目は界面活性剤の疎水基に着目し,被可溶化物の溶解度の差を利用するために,疎水基に炭化水素をもつ界面活性剤と炭化フッ素をもつ界面活性剤の混合系で実験を行った。この混合系では被可溶化物を選択的に可溶化することができ,また界面活性剤の混合割合によって可溶化させた物質を再び取り出せることがわかった。2年目は両性界面活性剤を用いて,pH変化による選択的可溶化および可逆的可溶化を検討した。アミノ酸のように親水基に正電荷と負電荷の両方を有している両性界面活性剤はpHによって性質が変化する。表面張力測定を行った結果,特に強酸あるいは強塩基領域において臨界ミセル濃度が大きく変化することがわかった。それらの領域では可溶化量が大きく異なることがわかった。特に塩基性領域では可溶化量が著しく大きく,塩基性領域から酸性領域へpHを変化させると被可溶化物が取り出せることがわかった。また調査を進めていく中で,薬剤を運搬する1つの方法として粘土鉱物が研究されていることがわかった。粘土鉱物からの薬剤の徐放性は有用な性質であることから,本研究と関連して研究を進めていく。1年目は溶解度の差を利用した選択的可溶化と可逆的可溶化を確認でき,2年目はpH変化を利用した選択的可溶化と可逆的可溶化を確認できた。本研究の目的は選択的可溶化と可逆的可溶化の仕組みを確立することであり,これまでに2つの方法を確立できたことは目的の達成に寄与するものである。一方で定量的な議論を行うにはデータが不十分である。有色色素を用いた吸光度測定では定量化に限界があると考えられる。そこで無色の被可溶化物を用いること,そしてガスクロマトグラフィーを用いた分析を確立することを目的として,実験系を製作しているところである。具体的には揮発性の被可溶化物を用い,それらを回収して分析する方法である。
表皮水疱症に対する遺伝子導入治療効果の客観的評価

non-Herlitz接合部型表皮水疱症レスキューマウスを詳細に解析し、遺伝子導入治療の客観的評価法を検討した。レスキューマウスに生じる臨床効果の差異は超微細構造学的構造変化と蛋白発現によっても確認することができた。これらの差異が生じる要因として遺伝子導入状態の違いを確認することができたが、この違いを明らかにするためには導入されたgenomic DNAを確認するだけでは不十分であった。臨床効果を分岐する遺伝子導入状態の分岐点を明らかにするためにはrealtime PCRによるmRNAの定量、Fluorescence in-situ Hybridization法による遺伝子導入部位の確認が必要である。本研究では研究代表者らが作成した、non-Herlitz接合部型表皮水庖症モデルマウスに正常ヒトXVII型コラーゲン遺伝子を導入したマウスを用いて遺伝子導入治療の客観的評価を行う。平成19年度研究計画に基づき、臨床効果から完全寛解群・不完全寛解群・non-Herlitz接合部型表皮水庖症発症群の3群に分類し、正常マウスを加えて4群の超微構造学的検索による発現タンパク機能の解析を実施した。透過電子顕微鏡を用いてヘミデスモゾーム構造の数・長さ・面積を計測し、臨床効果に伴ってヘミデスモゾーム構造に違いがあったが、完全寛解群においても正常マウスのヘミデスモゾーム構造との違いがあることも明らかになった。また、共焦点レーザー顕微鏡により抗ヒトXVII型コラーゲン抗体を用いて免疫組織科学的検索を施行し、蛍光強度による定量を行った。超微構造学的検索結果と同様に、臨床効果に伴い蛍光強度に違いがあることを明らかにした。さらに同じ抗体を用いた免疫電子顕微鏡法による金コロイド定量法を施行したが、金コロイド数による定量では統計学的に優位な差を見いだすことができなかった。これは定量可能な抗原性を保持した試料の作成に安定性を欠いたためと考えられ、引き続いて試料作成法を検討する必要がある。以上の結果は、遺伝子導入マウスの臨床効果と発現タンパク機能がほぼ合致するものと考えられたが、完全寛解の中でも差があり、特に正常マウスとの違いは、完全寛解と発現タンパク機能の完全復元が一致しないことを示唆している。すなわち平成20年度で遺伝子導入状態と発現タンパク機能の関係を検討することにより完全寛解を得るための遺伝子導入状態が明らかとなり、遺伝子導入治療の客観的評価を可能とすることが期待できる。平成20年度は、平成19年度に得られた超微細構造・免疫組織学的変化について分子生物学的解析を行って遺伝子導入状態と蛋白発現・蛋白機能の回復についての研究を行った。平成19年度に明らかとなった結果に従って、臨床症状・蛋白発現・超微構造変化によって以下に分類した。(1)完全寛解・蛋白発現正常・完全構造、(2)完全寛解・蛋白発現正常・不完全構造、(3)完全寛解・低蛋白発現・不完全構造、(4)不完全寛解・低蛋白発現・不完全構造、(5)XVII型コラーゲンKO、(6)wild type以上の6つに関して、それぞれ分子生物学的解析を行った。結果、(1)に関しては遺伝子発現も(6)と同様であり臨床・蛋白・構造・遺伝子が完全に回復したと確認した。(2)(3)(4)に関しては11RNA発現強度は(2)>(3)>(4)の順と考えられたが、結果は異なりそれぞれに有意差を見いだせなかった。続いて遺伝子導入状態の比較をin-situ hybridizationを用いたFISH法により解析を試みた。マウスの染色体はヒト染色体と異なり、形状が類似しているので比較が難しく、複雑な手技も伴って信頼性の高い結果は得られなかった。しかし、遺伝子導入状態は個数・部位ともに個体によって異なり遺伝子導入状態が不安定であることが推測された。これは我々が構築したCOL 17 rescue miceのバッククロスが不十分であり、遺伝子導入状態の不安定さが不完全寛解群を生じるものと思われた。これは極めて重要であり、遺伝子導入治療効果は我々が実施してきた検索を行い、FISH法にて遺伝子導入状態を明らかにすることで客観的評価を可能とし、構造や蛋白発現およびgenome DNAの確認だけでは不十分であると結論できる。
ランダムウォークの揺動理論のDLAモデルへの応用

一次元非粘性バーガース方程式に、ホワイトノイズの初期条件を正の半直線上で与え、負の半直線上にはマイナス無限大を与えた系を研究し、質量流の性質を統計的に記述した。遥動理論の二次元ランダムウォークへの種々の拡張を行った。二次元ランダムウォークが半無限直線へ初めて到達する時刻・場所をふくむ詳細情報に関する確率分布の裾野の漸近評価を得た。二次元ブラウン運動でも半直線への初到達時刻の詳細情報に関する漸近評価を得た。二次元ランダムウォークの場合と同じ特徴的な定積分を導出したが、その出現に到る過程はまったく異なっていた。片側の跳躍のみを持つレヴィ過程が初めて出発点を下回るときの値の確率分布を研究した。1.今年度中に学術雑誌に掲載された内容。一次元非粘性バーガース方程式に、ホワイトノイズの初期条件を正の半直線上で与え、負の半直線上にはマイナス無限大を与えた系を研究した。これは、真空に向かって放出・拡散する完全非弾性粒子のモデルになっている。本研究では、遠方まで到達した粒子の総質量を、重複対数のオーダーで表すことができた。初期条件がホワイトノイズの原始関数の場合も研究し、質量流の長時間漸近挙動に関する重複対数の法則を得た。さらに精密化して、質量流の下流関数と上流関数の特徴づけを得た。2.今年度中に学術雑誌に投稿した内容。一次元ランダムウォークの正の半直線への初到達時刻についての遥動理論(Sparre Andersenの定理)に関連して、二次元確率過程への種々の拡張を行った。これより、二次元ランダムウォークの半無限直線への初到達時刻に対する恒等式を得た。この研究は、二次元DLAモデルに関連して、クラスタに付着するまでの経過時間・付着箇所のきわめて簡単な場合を考えることが動機である。拡張された遥動理論の応用として解析し、三変数の漸近評価を得た。また、その定理で重要な役割を果たす興味深い定積分を見つけた。3.投稿準備中の内容。上記2.の項目の研究を拡張し、二次元ブラウン運動でも半直線への初到達時刻に対する三変数の漸近評価を得た。2.と同じ定積分を導出したが、その出現に至る過程はまったく異なっていた。1.今年度中に学術雑誌に投稿した内容。一次元ランダムウォークの正の半直線への初到達時刻についての遥動理論(Sparre Andersen定理)を拡張・応用して、二次元ランダムウォークの半無限直線への初到達時刻・付看箇所を含む三変数の漸近評価は、本研究で既に得ていた。これを論文にまとめたものは、再投稿した。この研究を拡張し、連続時間の類似した性質を持つ確率過程、すなわち二次元ブラウン運動でも、半直線への初到達時刻に関連する三変数の漸近評価を得た。手法はランダムウォークの場合とは全く異なるものであり、本研究が始まるよりまえの、研究代表者の研究結果を組み合わせて使うものであった。さらに、ランダムウォークの結果に出現した、公式集にも載っていない興味深い定積分が、ブラウン運動の場合でも出現したが、その出現に到る過程はまったく異なっていた。2.投稿準備中の内容。一次元ランダムウォークのうち、負の向きには大きな跳躍を持つが、正の向きには1ずつしか跳ばないものは、リスク理論の興味から、これまでに多くの研究がある。そこで得られている恒等式のひとつに、初めて出発点を下回るときの値の確率分布が、跳躍を特徴付けるレヴィ測度ではなく、レヴィ測度の裾野つまり積分を密度とするものであることが挙げられる。この食い違いに着目し、連続時間の場合に拡張を試みた。「片側の跳躍のみを持つレヴィ過程」として知られる分野の結果を応用して、類似の結果を得たが、もちろん手法はランダムウォークの場合とは全く異なるものである。さらに、当該恒等式の本質が、「exit system」として知られる、より一般のマルコフ過程について成り立つ原理であることにも気づき、研究結果をまとめるに際しては、この見地に立って作業中である。これらの拡張された定理がふくむ情報は、ランダムウォークの第一成分の最大値や、最大値に初めて到達した時刻、最後に到達した時刻、さらには、それらの時点でのランダムウォークの第二成分の値などである。これを利用して、二次元ランダムウオークが半無限直線へ初めて到達する時刻・場所をふくむ詳細情報に関する確率分布の裾野の漸近評価を得た。平面内の半無限直線へのランダムウオークの到達は、DLAクラスタのうち、針状に突き出た部分への付着を理想化したものに相当する。2.投稿中の内容。

上記の研究を拡張し、連続時間の類似した性質を持つ確率過程、すなわち二次元ブラウン運動でも、半直線への初到達時刻・場所をふくむ情報に関連する漸近評価を得た。ランダムウォークの定理では半直線の反対側での滞在回数を扱っていたが、ブラウン運動では半直線の反対側での局所時間を扱っている。手法はランダムウォークの場合とは全く異なるものであり、レヴィ過程に対する二次元揺動理論・3変数ラプス変換に対するレゾルベント方程式・Frullani積分を組合わせて利用した。さらに、ランダムウオークの結果に出現した、公式集にも載っていない興味深い定積分が、ブラウン運動の場合でも出現したが、その出現に到る過程はまったく異なっていた。
アルカリフォスファテース遺伝子導入による培養歯髄細胞の硬組織形成能

1、アルカリフォスファテース発現量と硬組織形成能に関する検討抜去したヒト健全歯の歯髄組織から遊走した歯髄細胞を継代培養した。アルカリフォスファテース活性を測定したところ、検出限界程度の低活性値を示した。そこで、アルカリフォスファテース高発現性のヒト骨肉腫細胞株(NOS-1)を入手し、硬組織形成能の比較検討を行なった。培地にグリセロリン酸カルシウムを添加し硬組織形成誘導を行なったところ、NOS-1のみに細胞の層状化がみられ石灰化組織を観察できた。アルカリフォスファテースの発現量は硬組織形成能に大きく影響することが明らかとなった。2、アルカリフォスファテース遺伝子のクローニングとベクター作製NOS-1細胞を破砕後、オリゴdTカラムによりmRNAを抽出した。また、データベース登録配列をもとに臓器非特異型のアルカリフォスファテースに対するPCRプライマーを設計しRT-PCRを行ない、アルカリフォスファテース遺伝子のクローニングに成功した。またこの遺伝子断片を発現ベクター(pEGFP-N1)に挿入し、グリーンフルオレッセントプロテイン(GFP)とアルカリフォスファテースの融合融蛋白質をを発現可能なベクターを作製した。3、培養歯髄細胞の形質転換遺伝子の導入効率がよく、in vivoへも応用可能なエレクトロポーレーション法の可能性を検討した。歯髄細胞を培養皿でほぼコンフルエントになるまで培養し、皿電極にてエレクトロポーレーションを行った。GFPの発現にて遺伝子の導入を確認し、ネオマイシン耐性の形質転換細胞を選択した。現在、形質転換細胞の硬組織形成能については確認中である。本研究から、細胞移植という、直接覆髄、生活断髄後の修復被蓋象牙質形成に関して新しい概念にもとづく治療法に発展させることの可能性が示唆された。本年度は、以下の3点について実験を行い、基礎的データを得た。1,培養歯髄細胞の継代による変化に関する検討:継代50代を越えた歯髄細胞(RPC-K細胞)のアルカリフォスファテースの活性を測定したところ、培養14日目をピークに減少した。また、そのピーク値は、継代10代までの早期のものと比較するとはるかに低い値を示し、長期間の培養により著しく活性が低下した状態となっていることが明らかとなった。2,アルカリフォスファテース遺伝子のクローニング:RPC-K細胞よりmRNAを抽出後、オリゴdTプライマーによりcDNAを調製した。また、データベース登録配列をもとに、PCRプライマーを設計し、期待される約1500bpのDNA断片を得た。この断片の塩基配列の確認を行うとともに、発現ベクター(pEGFP-N1)に挿入する予定である。3,遺伝子導入システムの確立:予備実験として、遺伝子の導入効率がよく、in vivoへも応用可能なエレクトロポーレーション法の可能性を検討した。RPC-K細胞を培養皿でほぼコンフルエントになるまで培養し、今回はポジティブコントロールとしてpEGFP-N1を添加した後、皿電極にてエレクトロポーレーションを行った。pEGFP-N1は、ネオマイシン(G-418)耐性遺伝子をもち、グリーンフルオレッセントプロテイン(GFP)と目的の遺伝子を融合蛋白質として発現させることが可能である。エレクトロポーレーション2日後にGFPの発現を蛍光顕微鏡で観察した。トリプシン-EDTAで細胞を剥離した後1:20の割合で細胞を播種した。1216時間後、G-418を培地に400mg/mlの割合で添加し、細胞のセレクションを行った。4日毎に培地を交換し、約1週間後GFP発現細胞のクローニングを行うことが可能となった。
植物乳酸菌 174A 株が産生する新奇バクテリオシンの作用機序と自己耐性機構の解明

伊予柑から分離された乳酸菌Lactobacillusbrevis174Aによって産生されるbrevicin 174Aは、174A-βおよび174A-γの2つのペプチドから成る、class IIbに分類されるバクテリオシンである。本研究では、brevicin 174Aに感受性を示す乳酸菌株の膜抽出画分より、本バクテリオシンと相互作用する膜タンパク質を見出すことに成功した。植物乳酸菌174Aは、それぞれ単独でも活性を示すが、混合使用によって飛躍的に活性の上昇する、2種類のバクテリオシンbrevicin 174A-βおよび174A-γを産生する。本研究では、本バクテリオシンが如何なる作用によって抗菌活性を示すか、そして本株が如何にして自己防護しているのかを明らかにすることを目的としている。本年度は、バクテリオシンからのアプローチによる実験を中心として進めた。精製済みのbrevicin両ペプチドを用い、乳酸菌や食中毒菌を含む種々の被検菌に対して、その抗菌スペクトルを解析した結果、多くの菌株において、単独使用時では活性を示さない場合でも、混合時には活性を示すようになった。ちなみに、産生株であるLb.brevis 174Aの感受性変異株においては、brevicin 174A-β単独使用時と比べ、200倍以上の活性の上昇が確認された。一方、抗体を調製するに十分な量のペプチドが得られず、作用点に対する解析については進めることは出来なかった。現在継続して実験中である。加えて、生合成遺伝子クラスター中に含まれるバクテリオシン様のペプチドであるBreFについて、合成ペプチドを用いてバイオアッセイを行ったところ、抗菌活性は確認されなかった。また、brevicin両ペプチドと混合した場合にも、活性の増加効果は確認されなかった。後述する遺伝子破壊株の取得により、耐性や生合成への影響を今後評価する予定である。今後必要となる遺伝子破壊株構築実験のため、本株における新たな薬剤耐性マーカーを検討した結果、E.coli由来のクロラムフェニコール耐性遺伝子(クロラムフェニコールアセチル化酵素)が、一般的に同薬剤に対して感受性である乳酸菌に対し、薬剤耐性を付与することが確認できた。現在、breFを含めたクラスター内の遺伝子破壊株の構築を進めている段階である。本年度は、バクテリオシンに対する自己耐性因子であるBreE(申請時OrfE)と呼称)を中心としたアプローチを試みた。BreEは4回膜貫通ドメインを有すると予測されるタンパク質であり,予備実験の結果から可溶性画分への発現性が弱いことがわかったため,trigger factorとの融合タンパク質としての発現・精製系を構築した。しかしながら,可溶化タグを切り離したBreEの精製・可溶化条件については未だ検討中であり,継続して実験中である。一方,新たなアプローチとして,以前構築した乳酸菌-大腸菌シャトルベクターpLES003を基に,新たに乳酸菌におけるタンパク質高発現用のシャトルベクターを構築し,His-tag付のBreEを174A株中で発現させ、耐性を付与することのできた菌株の膜画分より,免疫沈降法によらず,His-tgaへのアフィニティーを利用することでBreEと親和性を示すタンパク質を抽出,特定する方法を試みた。ベクターの構築はほぼ終了しており,現在は導入株の構築を進めている段階である。加えて,遺伝子破壊株構築のため,種々の条件検討を行ったが,174A株が保有するプラスミド上の生合成遺伝子クラスターをdouble crossover法によって直接破壊することは困難であると結論付けた。そこで,まず生合成遺伝子クラスター全体をシャトルベクター上に構築したものを用意し,その後で必要な変異を導入することを試みた。しかし,部分的なクラスターは構築できるものの,クラスター全体を含むプラスミドが,中間宿主である大腸菌を用いた場合には全く取得できなかった。現在,乳酸菌株へ直接導入することによる構築実験を行っている。また,breEと共に転写され,breEの転写を制御すると考えられていたBreDについて,プロモーターアッセイの結果,breEの転写を正に制御する可能性が新たに示された。本年度は、バクテリオシンであるBreB、およびそのimmunity protein (自己耐性因子)であるBreEの標的分子の決定を目的として実験を進めた。まず、far-western法による解析を試みた。BreBに対して感受性を示す菌株のうち、遺伝子操作の比較的行い易いLb.plantarum IFO 3070株を対象とし、構築したBreE発現シャトルベクターを導入し、BreE発現株(BreB耐性)を作製した。BreE発現株および3070株(非導入株)の膜タンパク質を抽出し、baitタンパク質としてBreBを、そして検出用の抗体として抗BreB抗体を用いて条件検討を重ねたが、相互作用すると考えられるタンパク質を検出することはできなかった。続いて、抗体との共免疫沈降法により、溶液状態でBreBおよびBreEと相互作用するタンパク質を検出することを試みた。しかしながら、本方法によっても、特異的に作用するタンパク質を見出すことはできなかった。

抗体を調製する為に十分な量のバクテリオシンおよびBreEの準備が計画通り進まず,律速となっている。ただし,並行して乳酸菌株内でタグ付きタンパク質を発現させる実験も進めている。24年度が最終年度であるため、記入しない。抗体調製については,試料タンパク質の十分な量の精製が非常に困難な為,高発現するtrigger factorタグ付きのまま抗体調製が可能と言われる,モルモットを用いた系への変更を計画している。また,免疫沈降法に限らず,活性に影響を及ぼさないレベルでのタグを付与したタンパク質を乳酸菌株中において発現させ,そのタグによるアフィニティーを利用した実験系も並行することとした。乳酸菌における遺伝子操作に関しては,今年度において条件検討を繰り返した結果,制限修飾系による排除機構が強力に働いている可能性も考えられたため,damやdcmの欠損株であるE.coli ET12567株やHST04株の利用,PCRによるベクター構築,また制限修飾系の弱い類縁菌を経由した導入法などを新しく検討している。