hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
電荷敏感型赤外検出器(CSIP)の量子効率に資するプラズモン効果の研究

さらに量子効率向上だけでなく,多色CSIPでのプラズモニックアンテナ構造による選択的光検出やアンテナバイアス電圧よる検出波長の制御等への展開を含む新たの可能性を探索できた.以上,設定した目標を達成できていることからおおむね順調に進展していると考えられる.平成30年度は、20μm以上の長波長側CSIPに拡大して下記のように研究を行った。20μm以上の長波長側CSIP設計のため、上部量子井戸の厚さとSiドーピング濃度、量子井戸の障壁高さなどを調節しながら、シミュレーションによりサブバンド間遷移確率を計算して、検出波長を20μm以上になるように設計した。Si基板上に設計した構造を分子ビームエピタキシャル法で成膜し、ナノギャップアンテナを持つCSIP素子を作製して光特性を評価した。分光特性の測定結果、検出波長が20.3μmから24.5μmまで設計された多くのCSIP素子が18.5μm付近でディップ構造をもつ二つのピーク(17.5μmと19.6μmもしくは17.5μmと20.5μm)が測定され、設計よりかなり短波長側にピークが移動及び、ビーク分離が見られた。これは短波長側にピークシフトを起こす量子井戸内のDepolarization効果以外に、18.5μm近傍にGaAsの2LOフォノン吸収による影響も考える必要が有ることが分かった。今後は,更なる量子効率向上を目指して,プラズモニックアンテナを持つCSIP上にドーム型キャビティーを配置しその効果を明らかにする.アンテナ最適化に関しては,大きい受光面積に有効なCross-hole arrayアンテナ構造を多色CSIPに適用し,シミュレーションによるアンテナ最適化と共に量子効率向上だけではなく検出波長のTuningへの展開を含む新たな可能性も探索する.そして受光面積が小さい場合に有効なナノギャップアンテナは,single photon counter用の小型CSIPに適用し,従来のCSIP感度上限よりも高い値を目指しながら,プラズモニック光カプラ効果の議論を深め,研究を推進していく.今後は,更なる量子効率向上を目指して,ドーム型キャビティーの配置を改善してそのキャビティー効果を明らかにする.加えて,プラズモニックアンテナ構造を長波長側(20 μm以上)CSIPまで拡大し最適化しながら、アンテナ効果及びキャビティー効果の議論を深め,研究を推進していく.平成28年度の研究成果で発表予定の国際会議(IRMMW 2017,メキシコ)が次年度にあり,その参加費・旅費を確保するために次年度使用額が発生した.また,single photon counter用CSIP評価に必要な精密計測機器等を追加で購入する可能性が生じたため次年度の予算として計上した.次年度目標である長波長側(20 μm以上)のCSIP研究では,新しいCSIPの作製・評価等が含まれているため、必要な消耗品,精密計測機器,長波長用光学部品の追加購入の可能性が生じるため次年度の予算として計上した.次年度では,新しい結晶成長に必要なGaAsウェハーや素子作製用消耗品を購入する予定である.また,作製したサンプルを評価するために長波長側用の分光に必要な光学部品等が必要となることから購入費用として使用する予定である.
産業レジティメーションのダイナミックスについてのマルチレベル・アプローチ

当研究の主な目的は、ネットワーク、会社、個人のレベルで、理論的・実証的に、産業のレジティメーションのダイナミクスを分析することである。本研究では、系列企業グループおよび多市場接触をネットワークレベルで、国際的合弁ベンチャーおよび事業展開経験を企業レベルで、起業家モチベーションを個人レベルで、といったさまざまなレベルで、レジティマシーのさまざまなソースに関する研究について出版し、プレゼンするに至った。研究結果は、国内および海外市場で成長し、生き残るために必要となるレジティマシー構築に関係する。本研究は計画通り進捗している。この研究の目的は、産業レジティメーションのダイナミクスを理論的、実証的に分析することである。レジティマシーは企業や産業の存続・成長にとって不可欠な要素であるため、レジティメーションの過程をより理解することが重要である。この課題を調査するため、本年は以下のような研究活動を行った。まず初めに、日本の製造業における外国企業が国際的な合併事業の利益をいかに効果的に活用できるかについての論文を執筆し、それら企業の成長や存続を分析することでレジティマシーを構築する手段とした。本論文は機関紙に提出し、現段階では3度目の査読が行われている。2番目には、日本の自動車部品業における企業の海外直接投資場所の選択に関する論文の理論部分と推測分析を執筆し、多様な市場競争がいかにしてレジティマシーを生み出し、各企業の競合未参入国への参入を促すかを明らかにした。このようなメカニズムが産業の国際化やレジティメーションを促進させるといえる。3番目に、日本のバイオ・グリーン産業における新事業に関するデータ収集を完了した。このデータ集は、開発の初期段階にある新事業に対するレジディメーション・バリアの解析に利用できるものである。また、提案のビジネス・プロセス・アウトソーシング産業ではなく、日本のバイオ・グリーン産業をさらなる研究の題材に選んだ理由は、その相対的な新しさと高まる重要性による。当研究は新規ベンチャーの存続と成長を促進するレジティメーションを構築するため、ネットワーク、企業、個人レベルで理論的実証的にレジティマシーのダイナミクスを分析することを主目的とする。まず、改訂した論文を査読付き雑誌Asian Business & Management Journalに発表した。これは成長と存続を分析することによってレジティマシーを構築する手段として日本の製造業における外資系企業が国際的な合弁事業の利益を効果的に強化できるか調査する。次に日本の自動車部品産業における企業の海外直接投資の立地選択に関する論文を執筆した。この中でマルチマーケット競争により会社にとってのレジティマシーが生じる可能性を示した。競合他社が参入していない国に参入できるかもしれない。本論文をThe Academy of International Business-South East USAで発表し、現在二回目の査読を受けている。第三に別の論文を書き終え、企業グループの提携(レジティマシー構築のための信頼できる方法)が日本の自動車部品産業における企業の国際化決定にどう影響するか調査した。これも現在二回目の査読を受けている。当論文では企業はレジティマシーと企業グループ提携で提供される他の資源の恩恵とを受ける可能性を示唆した。しかし現状維持のためにリスクを嫌い、リスクを伴うチャンスを探求することに駆り立てられない。この傾向がグローバル市場における日本の自動車部品産業の長期的な競争力に与える影響は今後の検討する必要がある。第四に今年執筆した別の論文で、起業家の動機が新規ベンチャーのレジティマシーと革新性にどう影響するか調査した。前述の論文の分析は企業やネットワークのレベルで行われているが、当論文は個人レベルで行う。日本の起業家をサンプルとして社会的な動機を持った起業家により設立されたベンチャーはより斬新であること、そしてこれらの事業は外部の資本所有者からではなく顧客や従業員からより高いレジティマシーを享受する、という仮説の裏づけを模索する。本論文は学会で発表し査読付き国際雑誌に投稿する。
ITAM受容体-CARD9経路による自己免疫病の発症・増悪機構の解明

(1)関節リウマチの発症・増悪における役割の解明:CARD9経路の関節炎への関与を明らかにするため、IL-17依存性に関節炎を自然発症するIL-1Ra欠損マウスとCard9欠損マウスを交配し、得られたマウスの発症率、病態スコアをコントロールマウスと比較した結果、Card9-/-IL-1Ra-/-マウスとIL-1Ra-/-マウスの間で有意な病状の改善は認められなかった。(2)Card9欠損マウスは、DSS大腸炎が軽快する。解析の結果、Card9欠損マウス由来の粘膜固有層樹状細胞(DC)は、in vitroにおいて腸内細菌成分存在下で誘導されるTh17およびTh1の誘導能に不全があることが明らかになった。(3)我々はCard9-/-、Bcl10-/-、Syk-/-、DAP12-/-マウス由来のDCはCHS(contact hypersensitivity:アレルギー性接触皮膚炎モデル)の感作能が不全であることを見いだした。これは、ハプテンcontact sensitizer刺激によって産生されるIL-1βが、これらマウス由来のDCでは著しく減弱することによると考えられた。ハプテンによるIL-1β産生機構の解析の結果、DCにおけるNLRP3活性化能はDCのCHS感作能に必須であり、ハプテン刺激はDAP12-Sykの活性化を介してROSの産生とK+流出を引き起こし、これによりNALP3 inflammasomeを活性化する事を見いだした。一方で、Card9-Bcl10経路はハプテン刺激によるNF-κB活性化に必須であり、この不全によりPro-IL-1βの産生誘導が生じないことを見いだした。この研究により、ハプテンcontact sensitizerがDCを活性化し、T細胞を感作するメカニズムが明らかとなった。(1)関節リウマチの発症・増悪における役割の解明:1)CARD9欠損マウスではコラーゲン誘導関節炎が軽減し、これはコラーゲン特異的なTh17細胞が減少していることが原因と考えられた。2)Card9欠損HTLV-Tgマウスを作製し、関節炎の自然発症率をコントロールマウスと比べたが、Card9欠損の影響を認めることができなかった。3)CARD9欠損IL-1Ra欠損マウスは作成段階にある。(2)EAE発症における役割:CARD9欠損マウスではEAEの発症率および病理スコアが減少し、MOG特異的なTh17細胞分化の減少が見られた。(3)炎症性腸疾患における役割:CARD9欠損マウスでは粘膜固有層のTh17細胞の減少が見られ、DSS誘導腸炎、T細胞SCID移入腸炎誘導後の粘膜固有層および腸間膜リンパ節におけるTh17細胞の数も顕著に減少することが判った。また、Card9欠損マウスの粘膜固有層から単離した樹状細胞はTh17誘導能が低いことを見いだした。以上(1)(3)の検討から、CARD9シグナリングは腸管におけるTh17分化誘導に必要であり、従って炎症性腸疾患の誘導に重要であるのみならず、全身性のTh17が関わる自己免疫疾患の発症にも関与することが明らかとなった。(4)アレルギー性接触性皮膚炎における役割:CARD9欠損マウスはハプテン誘導性のアレルギー性接触性皮膚炎に耐性であり、これはハプテン刺激によるDAP12を介した樹状細胞(DC)の活性化にCARD9経路が重要であることが原因であると考えられた。CARD9およびDAP12を欠損するDCはOVAなどの蛋白抗原を提示してT細胞を活性化する能力に異常はないため、DAP12-Card9経路はcontact sensitizerの提示およびそれによるDCの成熟に特異的に働いていると考えられた。
有害化学物質の曝露評価としての遺伝子検査

DNAメチル化は有害化学物質の曝露指標として有用であるか検討した。DNAメチル化を網羅的に調べるため、散在性反復配列を標的遺伝子とした。始めに有害化学物質によるゲノムDNAのメチル化を調べるために重金属カドミウムをラットに長期間経口投与し,肝臓ゲノムDNAのID配列のメチル化を検出した。メチル化感受性制限酵素を用いた方法で解析した結果,CdによりDNAメチル化の割合が高くなった。次に,被験者(女性、30代)の血液から抽出したゲノムDNAのAlu配列のメチル化を検出した。メチル化配列特異的なプライマーを用いreal-timePCR法で解析し,DNAメチル化の割合と血中重金属濃度(Cd,Pb,Hg)と相関は認められなかったが,骨密度と相関が見られ,Alu配列のメチル化は骨代謝の指標の1つとして検討される。本研究は,有害化学物質の曝露指標として,DNAの塩基配列の変異によらない遺伝情報(エピジェネティクス)の1つであるDNAメチル化検出が有用であるかを検討した。また,網羅的にゲノムDNAのメチル化を検出するために散在性の反復配列を標的遺伝子とした。有害化学物質によるゲノムDNAのメチル化を調べるため,有害物質として重金属のカドミウムをラットに長期間経口投与し,肝臓のゲノムDNAのメチル化を検出し、CdによるDNAメチル化の割合を調べた。標的遺伝子はラットゲノムの反復配列であるIdentifier elements (ID配列)を用いた。DNAメチル化検出はメチル化感受性制限酵素を用い、real-timePCR法で解析した。CdによりDNAメチル化の割合が高くなった。この結果はCdによってゲノムDNAがメチル化される可能性が示された。次に, DNAメチル化検出が化学物質曝露評価の遺伝子検査として有用であるかを調べるため,ヒトの反復配列であるAlu配列のメチル化を検出し、更に血液中の重金属(Cd,Pb,Hg)を測定し、DNAメチル化の割合と血中重金属濃度とを比較・検討した。また,Cdは骨代謝に影響を与えるため,骨密度と比較・検討した。DNAメチル化検出はメチル化配列特異的なプライマーを用いreal-timePCR法で解析した。DNAメチル化の割合と血中重金属濃度(Cd,Pb,Hg)と相関は認められなかったが,骨密度と相関が見られ,Alu配列のメチル化は骨代謝の指標の1つとして検討される。生活・労働環境において,ヒトは様々な有害物質に曝される危険性がある。高濃度の場合は急性毒性を示し,低濃度の場合,症状は現れないが,遺伝子にダメージを与える物質であれば,何らか遺伝子レベルで変化を起こしている可能性がある。本研究は,低濃度の有害物質による健康への影響を評価する方法として,DNAの塩基配列の変異によらない遺伝情報(エピジェネティクス)の1つであるメチル化DNAの検出を行った。DNAのメチル化は,シトシンーグアニン(C G)配列のCにメチル基が付き,遺伝子の発現調節領域にある場合,その発現のON/OFFのスイッチとして働くことが知られている。がん細胞では,がん抑制遺伝子がDNAのメチル化により不活化される報告がある。従って,メチル化DNAを調べることは,化学物質による発がんや健康障害の評価に有用と考えられる。初年度は有害物質として重金属のカドミウム(Cd)をラットに長期間曝露させ,散在性反復配列であるID elementsのメチル化を調べた。ラットは20 mg Cd /kg/day,週6日5週間及び10週間経口投与し,対象として同様に蒸留水を投与した。投与終了後,各臓器を摘出し,各臓器のゲノムDNAを抽出した。メチル化DNAの検出は,抽出したゲノムDNAを制限酵素(EcoRI)で消化し,更にメチル化されると消化できない制限酵素(HhaI:認識配列GCGC)で消化を行い,リアルタイムPCR法でID elements(メチル化されたDNA)を増幅した。肝臓由来のゲノムDNAは,Cd曝露によりメチル化DNAが増加し,投与期間が長くなるとそのメチル化の割合も増加する傾向を確認した。また,そのメチル化DNAは,肝臓中のCd濃度やCdによって誘導されるメタロチオネインとの相関も確認した。従って,Cdは,ラット肝臓のゲノムDNAのメチル化に関与することが示唆された。ラット肝臓から抽出したゲノムDNAを用いたメチル化DNAの検出はおおむね順調に進展しているが,血液から抽出したゲノムDNAを用いたメチル化DNAの検出は安定した結果が得られていないため,やや遅れている。肝臓由来のゲノムDNAでは検出できているため,血液から精製したDNAに問題がある可能性があると考え,血液からゲノムDNAを抽出する方法を再検討する。ヒト血液から抽出したゲノムDNAを用いて,ヒト遺伝子の反復配列であるAluとLINE-

1 elementのメチル化DNAを検出し,メチル化DNAと重金属・骨密度等との関係を比較・検討する。これまでに,健康診断においてインフォームドコンセントを行い,承諾を得た被験者の血液,骨密度の測定,血中金属濃度の測定,アンケート調査などを行っている。骨密度は,健診時にAOS-100(ALOKA製)を用いて,踵骨の音響的骨評価値(ostero sono-assessment index:OSI)を測定した。また,血液中の重金属(Cd,Pb,Agなど)濃度は原子吸光度法で測定した。ヒトのゲノムDNAは承諾を得た被験者の血液から抽出する。メチル化DNAの検出は,ラットの実験と同様の方法で行い,調べる遺伝子は反復配列であるAluとLINE-1 elementを調べる。実験から得られたDNAのメチル化状態,骨密度,重金属( Cd,Pb,Agなど)濃度をそれぞれ比較し,相関を示すかどうかを調べ,DNAのメチル化が健康影響の評価として有用性があるかどうかを検討する。また,ラット血液から抽出したゲノムDNAのメチル化の検出が安定しないため,再検討する。初年度と同様の実験方法を用いるため,核酸抽出試薬,Real-time PCR用試薬類,器具(ピペット,チューブ・チップ等)が必要である。核酸抽出試薬は,被験者の血液からゲノムDNAを抽出するために必要である。Real-time PCR用試薬類は,抽出したDNAを制限酵素で消化し,その消化したDNAを鋳型としてPCRを行うために必要である。器具(ピペット,チューブ・チップ等)は核酸抽出やReal-time PCRを行うために必要である。また,初年度の未使用研究費はラット血液のゲノムDNAのメチル化の検出に使用する。
低出力レーザー照射の骨組織形成促進作用について

低出力レーザー照射による骨形成促進作用機序をin vitroの系で解明するために、ラット胎児calvariaから採取した骨芽細胞様細胞を培養し、低出力レーザー照射を行った。21日間培養しbone nodule(骨様結節)数の算定を行った結果、10分1回及び10分連続照射群で有意にnodule数が増大したので、培養期間中1回のみの照射を行ったところ、培養113日までの照射ではnodule数の有意な増加が認められ、さらにnodule平均面積は培養初期に照射するほど大きくなっていた。また14日目以後の照射では全く効果はなくなっていることより、レーザー照射は分化の進んだ細胞では効果が少なく、未分化な細胞の分化や増殖に促進的に作用し骨形成を増大させることが示唆された。collagen量やアルカリホスファターゼ(ALP)活性は10分間の連続照射群では、非照射群に比べ20-30%の増加が認められ、レーザー照射が細胞の機能を促進することも示唆された。またbone noduleのCa、Pについてエネルギー分散型X線マイクロアナライザーで検討したところ、Ca/P比は1.46と1.44と差がなかったが、密度はCa、Pともにレーザー群で著明に増大しており、レーザー照射がnoduleの石灰化を促進することが示唆された。10分間1回レーザー照射後のcollagen、ALPのmRNAの変化をRT-PCR法により検討したところ、照射群で200300bpで増幅されたcollagen cDNAと思われるバンドの発色はレーザー照射後24時間で対照群に比べ顕著に強く認められた。一方、ALP cDNAと思われるバンドも600bp付近に認められ、レーザー照射後24時間で顕著であった。以上より、レーザー照射は未分化な骨芽細胞様細胞の分化を促進していることが示唆され、レーザー光が細胞レベルに直接作用し機能や分化を促進している可能性が強く示唆された。Collagenase digestionにより得られたfetal rat carvarial osteoblastsを3週間培養中に低出力レーザー照射を1日10分毎日続けた実験では、培養6日目からbone noduleが形成され始めたが、対照群では10日目から形成され始めた。培養終了後のbone nodule数は3分1回のみの照射では効果がないが、6分、10分1回照射では最大35%増大し3、6、10分毎日照射群では最大55%増大し、この効果は照射量に依存していた(p<0.001 by ANOVA)。30分1回照射でも効果はあつたが10分照射より効果は少なかった。培養中の細胞数は10分毎日照射群で6、12日目で有意差(p<0.05)をもって増大したが3日目、18日目では差がなかった。アルカリホスファターゼ活性は3、6、12日目で有意差(p<0.02)をもって増大し、18日目で差はなくなっていた。コラーゲン量も12、18日目でレーザー群が有意差をもって増大した。レーザー照射によりbone nodule数が照射量に比例して最大55%まで増大しており、レーザー照射により骨芽細胞の分化が促進されることがわかった。さらに本培養法ではデキサメサゾンを添加しているにもかかわらず、レーザー照射により分化が促進されているため、デキサメサゾンの分化促進効果とは異なった系での分化促進効果であると考えられた。しかし、30分照射群のnodule数は10分照射群より低下しているため、bone neduleの形成を促進するための至適な照射量が存在し、過剰な照射は分化促進効果を低下させるものと思われた。

また、細胞数も培養中期ではレーザー照射群で有意に増大しており、レーザーは細胞増殖にも促進的に働くことがわかった。アルカリホスファターゼ活性は初期からレーザー照射群で著明に増大しており、培養初期から分化促進効果が現れているものと思われた。現在オステオカルシンのRNAプローブを作製中であり、in situ hybridization法を用いてレーザー照射によるオステオカルシン遺伝子の変化についても検討する予定である。低出力レーザー照射による骨形成促進作用機序をin vitroの系で解明するために、ラット胎児calvariaから採取した骨芽細胞様細胞を培養し、低出力レーザー照射を行った。21日間培養しbone nodule(骨様結節)数の算定を行った結果、10分1回及び10分連続照射群で有意にnodule数が増大したので、培養期間中1回のみの照射を行ったところ、培養113日までの照射ではnodule数の有意な増加が認められ、さらにnodule平均面積は培養初期に照射するほど大きくなっていた。また14日目以後の照射では全く効果はなくなっていることより、レーザー照射は分化の進んだ細胞では効果が少なく、未分化な細胞の分化や増殖に促進的に作用し骨形成を増大させることが示唆された。collagen量やアルカリホスファターゼ(ALP)活性は10分間の連続照射群では、非照射群に比べ20-30%の増加が認められ、レーザー照射が細胞の機能を促進することも示唆された。またbone noduleのCa,Pについてエネルギー分散型X線マイクロアナライザーで検討したところ、Ca/P比は1.46と1.44と差がなかったが、密度はCa、Pともにレーザー群で著明に増大しており、レーザー照射がnoduleの石灰化を促進することが示唆された。10分間1回レーザー照射後のcollagen、ALPのmRNAの変化をRT-PCR法により検討したところ、照射群で200300bpで増幅されたcollagen cDNAと思われるバンドの発色はレーザー照射後24時間で対照群に比べ顕著に強く認められた。一方、ALP cDNAと思われるバンドも600bp付近に認められ、レーザー照射後24時間で顕著であった。以上より、レーザー照射は未分化な骨芽細胞様細胞の分化を促進していることが示唆され、レーザー光が細胞レベルに直接作用し機能や分化を促進している可能性が強く示唆された。
カリクレインにより血中で生成されるPGI_2産生促進ペプチドの分離同定と作用機構

プロスタサイクリン(PGI_2)は、血管内皮細胞が産生するアラキドン酸代謝物で、きわめて強い血小板凝集抑制作用をもっている。これまでの多くの研究から、PGI_2は内因性の動脈硬化予防因子であると考えられる。生体内におけるPGI_2の生成が如何なる機序で調節されているのかを知るために、血管内皮細胞の培養系を用いて検討を行った。ウシ頚動脈由来の内皮細胞を10%の仔胎児血清を含む培養液で培養した。この培養系にブラジキニンやヒスタミン、トロンビンなどを添加すると、血管内皮細胞が刺激され、ホスホリパーゼA_2の活性化、ついで細胞膜からアラキドン酸の遊離が起こり、その結果としてPGI_2産生が促進される。カリクレインは血中に存在するキニノーゲンに働いてブラジキニンを産生させる酵素であるが、薬剤として用いると末梢循環改善作用があるため、実際に臨床の場で用いられている。本研究において、カリクレインの培養系への添加が血管内皮細胞のPGI_2産生量を10倍以上にも高めることを見つけた。この効果は他の種類の細胞では見られず、血管内皮細胞に特有のものであった。また、カリクレインの本作用は一過性のものではなく、少なくとも24時間まで持続して認められた。カリクレインの本効果の発現には血清の存在が不可欠であることもわかった。さらに詳しく検討した結果、カリクレインが血清蛋白に働いて分子量10,000以下のペプチドを産生し、そのペプチドに血管内皮細胞のPGI_2産生促進作用のあることが判明した。HPLCによる分析の結果、このペプチドはプラジキニンやカリジン、サブスタンスP、Des、Argブラジキニンなど、既知のペプチドとは異なるものであることがわかった。目下、この未知のペプチドの構造決定を行っている。
神経堤細胞から血管平滑筋細胞への分化機構の解明

ET-1-/-マウスでは鰓弓における神経堤由来の大血管平滑筋・骨・軟骨などの間葉系組織に分化、形態形成異常を認めた。ET-1は上皮細胞に、ETA受容体は神経堤由来外胚葉性間葉細胞に発現が見られた。ET-1-/一胚の大血管平滑筋および鰓弓間充織ではdHAND,eHAND,goosecoidなどの転写因子の発現が低下消失しており、さらに大血管におけるneuropilin-1の発現が著減していた。dHAND-/-マウスにおいてneuropilin-1の発現が低下していること、neuropilin-1-/-マウスにおいても大血管形成に同様の異常をきたすことから、ET-1→dHAND→neuropilin-1のシグナル経路の存在が明らかになった。ET-1が神経堤細胞の分化に関与する分子機序を、第1鰓弓Meckel軟骨の形成を中心に解析した。軟骨分化に重要な転写因子Sox9の発現は、マウス胚の第1,2鰓弓で間葉凝集→Meckel軟骨形成に先立って限局的に認められたが、ET-1-/-胚とその鰓弓器官培養においては凝集パターンを作らず、Meckel軟骨形成も認められなかった。マイクロビーズによるET-1添加実験では、ET-1によってはSox9発現は誘導されず、ET-1はSox9自体の発現誘導よりもSox9陽性細胞の凝集に重要と考えられた。一方、正常胚とET-1-/-胚由来の鰓弓器官培養のいずれにおいてもFGF8添加によってSox9の発現が誘導された。鰓弓上皮におけるFGF8の発現パターンにも差はなかった。さらに、抗FGF8中和抗体処理により器官培養におけるSox9発現が阻害された。以上より、ET-1は神経堤細胞から血管平滑筋を含めた間葉系細胞への分化に、HAND,goosecoidなどの転写因子の活性化を介して関与する。血管平滑筋への分化と血管形成においては、ET-1→dHAND→neuropilin-1のシグナル経路が重要と考えられ、SemaphorinIIIやVEGF165との相互作用が今後注目される。さらに、神経堤細胞から軟骨への分化・形態形成においてはFGF8→Sox9のシグナル経路との協調作用が示唆されたET-1-/-マウスでは鰓弓における神経堤由来の大血管平滑筋・骨・軟骨などの間葉系組織に分化、形態形成異常を認めた。さらに、神経堤細胞から軟骨への分化・形態形成においてはFGF8→Sox9のシグナル経路との協調作用が示唆された
グラフェンナノポアデバイスの開発

本研究の目的は、グラファイトの一原子層であるグラフェンを用いて、グラフェン極薄膜電極を有するナノポアデバイスを開発し、電界効果でグラフェン電極のフェルミ準位を変調することで、ナノポアを通過する一分子の単分子電気伝導機構を明らかにすることである。そのために、電極材料としてグラフェンを用いた面内型グラフェンナノポアデバイスについてその設計指針を確立するとともに、その設計指針を基にデバイスの作製に成功した。本研究の目的は、グラフェン極薄膜電極を用いたナノポアデバイスを開発し、電界効果でグラフェン電極のフェルミ準位を変調することで、ナノポアを通過する一分子の単分子電気伝導機構を明らかにすることである。具体的には、グラファイトの一原子層であるグラフェンを用いた極薄膜電極を有するグラフェンナノポアデバイスを作製する。これにより、従来の金電極では達成しえない高空間分解能のトンネル電流型ナノポアデバイスを開発し、一分子解像度の分子検出・識別を行う。更に、グラフェンの零ギャップ半導体という特性を利用し、従来の金属電極では実現不可能であった電界効果による電極のフェルミ準位の制御を行い、一分子がナノポアを通過する際に得られる単分子電気伝導の伝導機構を解明する。上記課題の達成のため、本年度は面内型グラフェンナノポアデバイスの開発を行った。まず、SiO2/グラフェン/SiO2のサンドイッチ構造を有する電界効果トランジスタ素子を作製した。ここで、上部SiO2層はグラフェンナノポア形成時のキャップ層となるとともに、グラフェンにナノスケール狭窄構造を導入するためのマスク層となる。そこで、第一原理計算によって計算したグラフェンの電子状態を考慮し、上部SiO2には90度狭窄構造を電子線リソグラフィーによって導入した。続いて、ドライエッチングによりグラフェンを90度狭窄構造に加工した後、狭窄グラフェンの電気破断を行った。その結果、狭窄グラフェンの電気伝導は5mA付近から徐々に減少しはじめ、次いで離散的な減少過程を経てゼロとなった。よって、グラフェン狭窄部の破断は、イオン化機構による狭小化とそれに続く切断現象として理解できる。更に、破断直前の量子化コンダクタンスは、ナノスケールでのグラフェンギャップ電極ーナノポア構造の形成を示唆しており、世界で初めて面内型グラフェンナノポアデバイス構造作製に成功したと言える。上記の目的達成のため、昨年度は、電極材料としてグラフェンを用いたグラフェンナノポアデバイスについて、その設計指針の確立とデバイスの試作を行った。本年度は、それらの結果をもとに作製したグラフェンナノポアデバイスの評価を行うとともに、グラフェン電極フェルミ準位の電界変調を実証した。昨年度の結果をもとに作製したデバイスは、90度狭窄構造を有する面内型グラフェンナノポアデバイスであり、グラフェンの狭窄ナノ構造は、電子線描画とスパッタリングによってグラフェン上面にパターン化したSiO2層をマスクとして、酸素プラズマによってグラフェンをエッチングすることによって形成した。上記のナノ加工によって、グラフェン電極には1.3×10^12(/cm2)のホールキャリアがドープされたことが、電界効果トランジスタ特性の評価によって明らかとなった。これは酸素プラズマ処理によるグラフェンのエッジ酸化による影響と考えられ、作製過程による酸化の影響下でも、電界効果による変調が可能であることを示すことに成功した。それとともに、コンダクタンストレースの測定から、このようなエッジ酸化状態にあっても量子化コンダクタンスを経たナノギャップーナノポア構造の形成が確認できた。以上の結果は、ナノポアによる一分子計測において、本研究における面内型グラフェンナノポアデバイスが大気中や或いは溶液中においても利用可能であることを示すものであり、生体分子の一分子計測まで含めた広い範囲に応用可能である事を示唆する非常に重要な知見である。昨年度は、当初研究計画に沿って面内型グラフェンナノポアデバイスの作製と評価を行った。作製したデバイスにおいては、狭窄グラフェン電極のキャリア密度が±3.8E12(/cm^2)の範囲で電界変調可能であることが確認できた。これは、電極フェルミ準位の電界制御下で単分子伝導を計測することにより伝導機構を解明するという本研究の目的達成のため、今後の計画を実施していく上で非常に重要な知見である。更に、グラフェンナノポアーナノギャップ電極構造作製のための狭窄グラフェン電気破断においては、炭素原子のイオン化機構に由来すると考えられる伝導度の漸進的な減少と、量子化伝導に帰属できる伝導度の離散的な減少がそれぞれ観測された。これらの結果をもとに、グラフェン電極を用いたグラフェンナノポアーナノギャップ電極構造の形成機構に迫る事ができた。

本年度は、上記の知見をもとに作製した面内型グラフェンナノポアデバイスを用い、単分子電気伝導計測に取り組む事が可能であり、本研究は当初計画のお通り、おおむね順調に進展しているものと言える。25年度が最終年度であるため、記入しない。今後は、開発した面内型グラフェンナノポアデバイスについて、電子顕微鏡観察やイオン伝導度の測定によってポアサイズ及びギャップサイズを定量的に評価していく。これによりデバイス構造の最適化を行い、単分子電気伝導測定に最適な面内型グラフェンナノポアデバイスの作製に取り組む。続いて、作製した面内型グラフェンナノポアデバイスを用いて、単分子電気伝導測定を行う。この時、グラフェン電極のフェルミ準位を電界変調させることにより、単分子コンダクタンスとそのゲート電圧依存性を明らかにし、単分子電気伝導機構の解明に取り組む。測定対象とする分子は、当初計画の通り、バイオデバイスへの展開も視野に入れたパイ共役分子を含む必須アミノ酸とする。
細胞競合による腫瘍成長制御機構の遺伝学的解析

本研究では、ショウジョウバエ上皮において癌抑制遺伝子変異クローンによって引き起こされる細胞競合をモデル系とし、細胞競合を介した上皮の腫瘍成長制御機構の遺伝学的解明を目指し、大規模な"細胞非自律的"遺伝学的スクリーニングの実施し、それにより同定された遺伝子群の解析を行った。癌抑制遺伝子クローンとして極性崩壊細胞(scribble変異細胞;以下scrib変異細胞)をショウジョウバエ成虫眼原基にモザイク状に誘導し、その周囲を取り囲む正常細胞にEMSを用いて変異を誘導し、scrib変異細胞クローンの大きさを評価することで、スクリーニングを行った。今回、我々はscrib変異細胞の排除を抑制する変具体(eld変異体)を4つ単離し、なかでも排除の抑制を強く起こすe/d-4について解析を進め、e/d-4の原因遺伝子をstranded at secopd (sas)と同定した。Sasは正常細胞の上端にのみ存在しており、細胞内ドメインを有さないタンパクであった。そのため、我々はSasがscrib,変異細胞に発現するタンパクのリガンドとして機能している可能性を考え、Sasレセフニタースクリーニングを行い、レセプター型脱リン酸化酵素であるPtp10Dを同定した。Ptp10Dはレセプター型チロシンキナーゼのキナーゼ活性を負に制御することで、その活性を抑制しているものと考えられた。またscrib勉変異細胞クローンを誘導して、Ptp10D抗体で染色して、その発現を評価すると、scrib変異細胞内で強くPtp10Dが発現していることがわかった。以上より、Sasはserib変異細胞上で発現するPtp10Dのリガンドとして機能することで、scrib変異細胞の排除に関与していることが明らかにした。現在、Sas-Ptp10Dのシグナル伝達経路について、Ptp10Dの器質の司定について解析を引き続き進めている。(抄録なし)本研究では、ショウジョウバエ上皮において癌抑制遺伝子変異クローンによって引き起こされる細胞競合をモデル系とし、細胞競合を介した上皮の腫瘍成長制御機構の遺伝学的解明を目指し、大規模な"細胞非自律的"遺伝学的スクリーニングの実施し、それにより同定された遺伝子群の解析を行った。(抄録なし)
腸管ホルモンによる腸内環境を標的とした新規代謝異常症治療法の開発

肥満症や2型糖尿病患者では腸内細菌叢に偏りが認められ、腸管内の短鎖脂肪酸や胆汁酸代謝の変化、腸管バリア機能の低下などが生じていると報告されている。さらにこれらの変化が、腸管ホルモン分泌の低下や高エンドトキシン血症による慢性炎症を引き起こし、宿主の耐糖能異常・肥満の原因となっていると考えられている。そこで我々は、エネルギー糖代謝異常症の治療に用いられている、腸管ホルモン製剤のこれらの因子への影響を検討したところ、同製剤は腸内細菌叢と腸管免疫細胞に作用し、エネルギー糖代謝異常症の改善に寄与している可能性が見いだされた。本所見は新たな肥満糖尿病の治療戦略の開発に繋がるものと考えられた。本研究では初年度に、マウスに高脂肪食を与え代謝異常症を誘導し、その治療としてGLP-1アナログを用いて治療を行い、代謝プロファイル、腸内細菌叢の解析および腸管免疫担当細胞の解析を行った。次に無菌マウスに同様の解析を行い、GLP-1アナログによる治療で認められた代謝異常症の改善の程度を比較した。雄性C57BL/6およびBalb/cマウス(4-6週令)に対し、通常食または高脂肪食を与え、それぞれに生理食塩水(対照)、またはGLP-1アナログを投与した。高脂肪食の投与により通常食に比較して体重の増加、血糖値の上昇、脂質プロフィルの悪化が認められ、GLP-1アナログの投与により体重、摂餌量は低下を認め、血糖値は低下、脂質プロファイルの改善が観察された。腸内細菌叢は高脂肪食の投与によりバクテロイデテス門の細菌の減少が認められた。GLP-1アナログの投与により同減少は低下の傾向が認められた。腸管免疫担当細胞の検討では、腸管マクロファージの表現型が高脂肪食の投与で特に変化が顕著であり、その変化の程度はGLP-1アナログの投与により低下の傾向が認められた。無菌マウスの検討では、高脂肪食の投与による体重の増加は有意に低下が認められ、GLP-1アナログ投与による体重の抑制効果も軽減していた。GLP-1アナログの投与による血糖値、脂質プロファイル、腸管免疫担当細胞に対する影響も無菌マウスでは軽減が認められた。本研究で初年度計画をしていた検討はほぼ完了をしている。無菌動物の維持・検討が来年度以降も引き続き重要な要素であり、初年度でも十分に時間を投じて管理を行った。初年度にC57BL/6およびBalb/cマウスに対して高脂肪食およびGLP-1アナログの投与を行い、高脂肪食によりエネルギー代謝指標の増悪が観察され、GLP-1アナログの投与によりエネルギー代謝指標の改善が確認された。腸内細菌叢に関しては、高脂肪食によりバクテロイデテス門の細菌の減少が認められ、GLP-1アナログの投与により腸内細菌科の細菌の増加が確認された。生来リンパ球を有さないCB17-scid/scidマウスおよび対照マウスに高脂肪食とGLP-1アナログの投与を行ったところ、両群ともに高脂肪食によりエネルギー代謝指標の増悪が、GLP-1アナログの投与によりそれらの指標の改善が確認された。腸内細菌叢は高脂肪食によりバクテロイデテス門の細菌の減少が認められ、GLP-1アナログの投与により腸内細菌科の細菌の増加が確認された。次に通常マウスの免疫担当細胞の各種分画を獲得し、GLP-1受容体の発現を確認した。GLP-1受容体はTリンパ球に発現が認められ、CD4陽性T細胞、CD8陽性T細胞ともに発現が認められた。さらにCD4陽性T細胞の刺激下でGLP-1アナログを投与したところ、容量依存性にCD4陽性T細胞のサイトカイン産生が抑制された。そこでBalb/cマウスに対してCD4陽性T細胞に対する抗体を投与して、エネルギー代謝異常症の発症を確認した。抗体の投与により、空腹時血糖値や血中インスリン値は低下を認め、また肝臓の脂肪含有量も低下を認められた。体重の減少は明らかではなかった。腸内細菌叢は対照群に比較して明らかな変化は認められなかった。当初の研究計画通り、インクレチン反応性の免疫担当細胞の同定・機能解析に至っており、おおむね順調に進展していると考えている。また初年度から引き続き、無菌飼育環境も維持継続している。本研究ではマウスに高脂肪食を与えエネルギー糖代謝異常症を誘導し、GLP-1アナログを用いて治療介入を行い、エネルギー糖代謝プロファイル、腸内細菌叢および腸管免疫細胞の解析を行った。また無菌マウスならびにscidマウスにおいても同様に介入を行い、GLP-1アナログによる治療で認められたエネルギー糖代謝への影響を比較した。免疫細胞の検討では、腸管免疫細胞の表現型が高脂肪食の投与で特に変化が顕著であり、その変化の程度はGLP-1アナログの投与により減弱傾向が認められた。

無菌マウスの検討では、高脂肪食の投与による体重の増加は有意に低下が認められ、GLP-1アナログ投与による体重の抑制効果も軽減していた。GLP-1アナログの投与による血糖値、脂質プロファイル、腸管免疫細胞に対する影響も、無菌マウスでは軽減が認められた。さらに成熟T細胞を有さないマウスにおいても、T細胞依存性にGLP-1アナログのエネルギー糖代謝異常改善効果は減弱傾向を認めた。以上の知見から、腸管ホルモンの標的の一部は腸内細菌・腸管免疫細胞であることが示唆された。肥満症や2型糖尿病患者では腸内細菌叢に偏りが認められ、腸管内の短鎖脂肪酸や胆汁酸代謝の変化、腸管バリア機能の低下などが生じていると報告されている。さらにこれらの変化が、腸管ホルモン分泌の低下や高エンドトキシン血症による慢性炎症を引き起こし、宿主の耐糖能異常・肥満の原因となっていると考えられている。そこで我々は、エネルギー糖代謝異常症の治療に用いられている、腸管ホルモン製剤のこれらの因子への影響を検討したところ、同製剤は腸内細菌叢と腸管免疫細胞に作用し、エネルギー糖代謝異常症の改善に寄与している可能性が見いだされた。本所見は新たな肥満糖尿病の治療戦略の開発に繋がるものと考えられた。初年度と同様の検討を、生来リンパ球を有さないCB17-scid/scidマウスおよび対照マウスに対し施行する。本検討から免疫担当細胞のGLP-1アナログのエネルギー代謝異常改善効果に対する意義を明らかとする。そのうえで、これまでの検討でGLP-1治療に重要と考えられた腸管免疫担当細胞に対する除去抗体を高脂肪食を与えた雄性C57BL/6マウスに投与し、体重、血糖値、脂質プロファイル、腸内細菌叢などを経時的に追跡し代謝異常の改善を確認する。またその腸管免疫担当細胞群を通常食群、高脂肪食群からソーティング抽出し、遺伝子発現を比較検討する。ただし想定していた免疫細胞群が、むしろ防御的に作用している可能性もありえるが、その場合は通常食マウスに同中和抗体を投与し、代謝指標の悪化を明確に示すことで免疫担当細胞の意義を明らかとする。上記の検討時には腸内細菌叢の変化も同時に行うが、無菌マウスに腸内細菌を移植することで、それらの腸内細菌が能動的にエネルギー代謝異常症の病態に関与している可能性の検討も進めて行く。昨年度と同様のプロトコールを用いて、リンパ球を有さないCB17-scid/scidマウス対しCD4陽性T細胞または非CD4陽性T細胞(negative selection群)を移植し、エネルギー代謝異常に対する影響を検討する。あわせて、腸内細菌叢への影響も遺伝学的タイピングを用いて検討する。またこれらの再構築したマウスに対してGLP-1アナログの投与を行い、エネルギー代謝異常改善に対する影響を明らかとする。本検討は、昨年度に検討されたCD4陽性T細胞に対する抗体投与実験の確認となるものであるが、抗体による検討よりもより明確にCD4陽性T細胞のエネルギー代謝異常への意義を明らかにできることが推測される。さらに無菌マウスにおいて腸管T細胞、末梢リンパ節T細胞、脾臓T細胞を採取し、それぞれのT細胞、特にCD4陽性
中学校の総合的な学習の時間を利用したストレスマネジメント教育

本研究は,主に以下の2つの研究から構成されている。研究1(第1部)は,総合的な学習の時間を利用して,中学校1年生を対象としてストレスマネジメント教育の一環と考えられるソーシャルスキル教育を実施した。その結果,(a)本研究で実施したソーシャルスキル教育による生徒のソーシャルスキルの変化は,下降群,低得点上昇群,高維持群および高得点上昇群の4つのタイプに分けることができ,対象生徒の45%の生徒はソーシャルスキルが上昇し,31%の生徒はそれを高く維持していた,(b)ソーシャルスキルが低い水準から向上した生徒は,孤独感が低減し,知覚された友人サポートが上昇するなどの主観的適応感が改善していた,(c)ソーシャルスキルのレベルは介入後3ヶ月にわたってある程度維持されていたこと,などが示唆された。研究2(第2部)では,中学2年生を対象としてより包括的なストレスマネジメント教育を実施した。その結果,(a)授業内容への興味・関心が高かった生徒はストレッサーに対して逃避・回避的な対処をあまり行わない,(b)今後も授業を受けたいと感じていたり,自己のストレスの理解度が高い生徒は教師からのサポートを高く知覚し,ストレッサーへのコントロール感が高いことなどが示された。しかしながら,今回実施したストレスマネジメント教育は,少なくとも本研究で用いた効果判定指標にほとんど影響を及ぼさなかった。今後学校においてストレスマネジメント教育を実践していく上で,ストレスマネジメント教育に対するニーズの問題,「予防教育」的観点からのプログラムの構築,効果判定上の問題などを再検討する必要性があるものと思われる。学校における,不登校,いじめ,暴力行為,非行等の問題の背景には,さまざまな問題が潜んでいると思われるが,児童生徒が日常の学校生活において経験するストレスに満ちた出来事にうまく対処できないために,心理的・身体的ストレス症状が高められ,不適応症状や問題行動が引き起こされている可能性がある。そのような問題を解決するための方法のひとつとして,円滑な人間関係の形成の仕方や,さまざまなトラブル解決するための方法を生徒に教え,ストレスを自ら作り出さないような,そしてストレスに適切に対処していけるような生徒を育てるストレスマネジメント教育を,学校教育の中に体系的に組み込んでいく必要がある。そこで,本研究では,公立中学校において,ストレスマネジメント教育を「総合的な学習の時間」の中に長期にわたって体系的に位置付けるための教育方法を開発することを主たる目的としている。本年度は,ストレスマネジメント教育の一環として,特に人間関係上のストレスに対処していくためのソーシャルスキル教育を,総合的な学習の時間(計18時間)を利用して実施し,生徒の社会性の向上に一定の効果があることを見出した。また,来年度以降,ソーシャルスキル教育を含めた総合的なストレスマネジメント教育を,総合的な学習の時間に導入し,実践していくための指導法を開発するために,他大学のストレス研究者と情報および意見の交換をし,具体的な指導プログラムを作成しているところである。本年度は,ストレスマネジメント教育のバリエーションを増やすことを目的として,公立中学校2年生1クラスを対象とし,その担任教諭と十分な意見交換を図りながら,下記のような内容から構成された合計9時間にわたる授業を実践し,その効果について検討した。(1)ストレスとは何か・学ぶことの意味(オリエンテーション)(2)心と身体の関連性の理解・リラクセーション法(筋弛緩法)の習得(3)ストレス状態(ストレス反応)の理解(4)ストレスを感じる出来事(ストレッサー)の理解(5)ストレスを感じさせる考え方(認知的評価)の理解(6)ストレスヘの対処方法(コーピング)の理解I:対処方法の存在と種類(7)ストレスヘの対処方法の理解II:対処方法の効果・選択(1)(8)ストレスヘの対処方法の理解II:対処方法の効果・選択(2)(9)ストレスマネジメントの実践(全体のまとめ)上記の授業実践を通して,より効果的な授業を行うための指導案および教材を開発するとともに,授業前後における生徒のストレスやストレス対処方法の変化に関するデータを収集し,現在そのデータを分析しているところである。

本年度の研究の主たる目的は,国立大学の附属中学校において,すべての学年を対象として,各学年のニーズに合わせ,過去2年間に行ってきたソーシャルスキル教育とストレスマネジメント教育を組み合わせた,いわば包括的な「心の健康教育」を総合的な学習の時間の中に体系的に位置付けるための教育方法を開発することである。附属中学校の教諭と共同で,1年生に対しては,人間関係の形成といじめの排除を中心としたプログラムを開発した。2年生に対しては,上手なコミュニケーションのあり方を中心としたプログラムを,3年生に対しては,受験ストレスへの対処法等を中心としたプログラムをそれぞれ開発した。授業は各学級担任教師が行い,それに対して本研究者が助言を行ったり,全体授業等で講話を行ったりした。全学年に生徒に対して,プログラムの実施前と実施後に,教育効果を判定するための調査を行った。その結果,学年によってその効果は異なっていたが,一部のストレス反応や孤独感の低減,一部のソーシャルスキルの改善,ストレッサーに対するコントロール可能性の評価を高める等の肯定的な効果が認められた。その一方で,ソーシャルサポートや一部のストレス反応,一部のソーシャルスキル等には期待したほどの効果は認められなかった。この結果に基づいて,さらに効果的な心の健康教育プログラムを構築する必要性のあることが示唆された。
細胞内タンパク質ターンオーバーの網羅的解析

細胞内に存在するタンパク質のターンオーバー(タンパク質の合成レート及び分解レート、mRNAの翻訳効率)を網羅的に測定する手法を構築した。この手法で大腸菌細胞中の1500種以上のタンパク質のターンオーバーを解析したところ、5%程度の例外を除いて、ほとんどのタンパク質はきわめて安定なことが分かった。嫌気条件から好気条件のように代謝酵素のレベルが大きく変わる場合でも、不要な酵素が分解されることなく存在し続けており、環境に応じたプロテオームの構成変化は合成量の変化によって主に行われていた。タンパク質、mRNAの量が時間によって変化しない定常状態でのタンパク質ターンオーバーの測定を可能にするため、ロイシンと炭素源の濃度を変えて連続培養の条件検討を行い、ロイシンを制限基質とした連続培養の系を確立した。非ラベルロイシン(Leu-NL)をフィードした培養からロイシン-5,5,5-d3(Leu-d3)に置き換えて培養を継続し、同位体の変化により定常状態が崩れていないことをDNAマイクロアレイによりmRNAレベルで確認した。確立した培養系を用い、フォード切り替え後にどれだけのタンパク質が置き換わったか(ターンオーバー)を調べるため、nanoLC-MS/MSによる網羅的なペプチドの解析を行い、Leu-NLとLeu-D3を含むペプチドの比を測定した。タンパク質毎に集計した結果、300-500種類程度のタンパク質のターンオーバーが測定可能であった。ほとんどのタンパク質は非常に安定で、数時間ではほとんど分解が見られなかったものの、半減期20-120分の早いターンオーバーを示すタンパク質も約50種類発見した。早い分解を受けることが既知のタンパク質も数種類含まれていたが、残りのほとんどは新たな発見である。一培養条件における実験だけで多数が発見されたので、今後条件の変更によってさらに多くを発見できると期待され、タンパク質ターンオーバーの機構と細胞内の役割について新しい知見が得られると考えている。次世代シーケンサーによって原核生物mRNAの絶対量を網羅的に測定するためのmRNA精製法の検討を行い、得られたmRNA量とemPAI法で得たタンパク質量の比較を行った。この結果より早いターンオーバーを示したタンパク質のうち、一部ではタンパク質/mRNAの比が非常に低いことも明らかになった。細胞の倍加時間3.5時間に保った定常状態の大腸菌を用い、研究計画での目標を超える1300種類以上のタンパク質についてターンオーバー速度のデータを得た。タンパク質全体として考えた場合、分解速度は合成速度の1/100以下に過ぎず、個々のタンパク質種を見た場合、半減期3.5時間以下のタンパク質は56種類(約4%)しか含まれていなかった。測定できたタンパク質は発現量が10分子/cell以下から1000分子/cell以上まで含まれており、少なくとも定常状態を保っている大腸菌においては、タンパク質分解は細胞内プロテオームを決定する大きな要因になっていない可能性が示唆された。環境条件の変化にともないプロテオームが再構成される過程でのタンパク質分解の役割を明らかにするため、個々のタンパク質種の分解、合成をそれぞれ測定する系を確立した。嫌気条件から好気条件への変化をモデルケースに解析を開始しており、今後他の環境変化についても解析を行う。大腸菌において不要タンパク質の分解する主要なプロテアーゼの一つClpPの基質特異性を決める因子(ClpA,ClpX,SmpB)の欠損株変異株を用いてターンオーバーの測定を行い、野生株での結果と比較して、これらの因子の存在下のみで早く分解されるタンパク質の同定を行った。ClpXについては、50あまりのタンパク質と結合することが報告されており、それらタンパク質の配列を元にClpXによって認識されるアミノ酸モチーフが提唱されている。我々の解析でもそれらほとんどのタンパク質のターンオーバーを測定できた。しかし、ClpX依存的に分解を受けていたのはそのうち16タンパク質に過ぎず、他の多くはClpX存在下でも非常に安定であった。この結果よりClpXとの結合が必ずしも分解に結びついていないか、他の付加的要因が必要な可能性もあると考えており、環境変化に伴うClpP依存の分解について今後解析を行う予定である。本課題の目的は、個々のタンパク質合成量、分解量を測定し、細胞中の各タンパク質ターンオーバーを明らかにして、細胞内タンパク質量の調節について網羅的な知見を得ることである。昨年度までに、大腸菌の定常増殖状態ではタンパク質分解はほとんど起きず、タンパク質ターンオーバーにはほとんど寄与していないことを明らかにした。本年度は1000以上のタンパク質のターンオーバーとそれらのmRNA翻訳効率の測定を行い、1、定常増殖状態において、mRNAの翻訳効率に差があり、その差がタンパク質の量の決定に分解よりも大きな寄与をしていること。2、環境変化によって定常増殖状態を外れた際には、条件によってタンパク質分解がターンオーバーに寄与するが、不要タンパク質を選択的に分解するような機構は全般的には大きな役割を持たないと考えられること。を示す研究成果を得た。

1、リボソームによってRNA分解酵素から保護されたmRNAと全mRNAを高性能シーケンサーにより定量、比較し、各mRNAの翻訳効率を網羅的に推定した。中心炭素代謝系55酵素とそのmRNAでは、リボソーム密度には最大で約5倍程度の差があり、解糖系遺伝子は他の経路よりも高密度であるなど、経路によって傾向があることが分かった。タンパク質量とそのmRNA量の関連についても、リボソーム密度を考慮することでより高い相関が得られ、タンパク質量の決定要因として分解速度よりも翻訳効率が重要なことが示された。2、嫌気的環境から好気的環境への変化、及び、栄養飢餓に伴うタンパク質ターンオーバーの解析を行った。いずれも多くのタンパク質の発現量変化をもたらし、条件によっては多量のタンパク質分解を伴うことが分かった。しかし、その場合でも不要タンパクの選択的な分解でなく、非選択的に多くのタンパク質を分解し、特定のタンパク質を合成することで環境適応が行われていると考えられた。