hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
サブナノ領域の位相回復を実現する光子計数顕微映像法

1.光子計数イメージングカメラ(平成10年度申請設備備品)を用いることによって、非常に広いダイナッミックでフラウンホーファー回折像データを取得することに成功した。SiO_2透明薄膜を基板上に形成した極微弱位相格子の高次回折像部分を撮像し、これとNDフィルターで強度を減少させて別に撮像したゼロ次光部分を合成する方法で80,000以上のダイナミックレンジが、また、上記カメラの視野を横ずらししながら、隣接する回折スポットのグループごとに撮像していき、最後にそれらを合成する方法では、実効的なダイナミックレンジを11,000,000:1にまで高めることができた。現在のところナノメートルオーダーの位相感度が達成されたと推定されるが、今後、上記のダイナミックレンジをすべて有効に利用することによって、サブナノメートルのオーダーで物体の凹凸を正確に回復することが期待できる。2.冷却CCDによる従来の撮像法では1次回折光までを位相回復に利用していたため、回復できるのは物体周期構造の基本周期成分の情報にとどまっていたが、光子計数イメージングカメラのよって回折像の取り込み次数を7次まで拡大することができた。3.このうち3次回折光までを使って実際に位相回復することに成功した。7次光までのすべてを利用することによって、物体構造をさらに正確に回復されるものと期待できる。4.微弱位相の条件のもとで回折像が満たすべき数学的関係を利用して、解析的に物体位相を求める手法について考察した。この解を位相回復の初期推定に利用することでアルゴリズムの収束性の大幅な改善が期待できる。5.回折像を形成する光子数が少ない場合に、得られた離散的な光子計数データに対して最尤推定法を適用した。今後生体材料等に応用する場合には、このような光子数の制限された状況が多いものと想定される。これまでに検討した最尤推定法との比較を行いながら、引き続き有効なアルゴリズムを探る。1.光子計数イメージングシステムによる回折像の取込光子計数イメージングシステム(平成10年度申請設備備品)を用いて光波のフラウンホーファー回折像を撮像し、ワークステーション(現有設備)に取り込んだ。SiO_2透明薄膜を基板上に形成した極微弱位相格子の高次回折像部分を光子計数イメージングシステムで撮像した。この結果にNDフィルターで強度を減少させて別に撮像したゼロ次光部分を合成して回折像データとした。この方法で、80,000以上のダイナミックレンジが得られることを確認した。ワークステーションへのデータ取込は、フロッピーディスクによるデータ移動によっているが、今後、研究室内LANによるデータ転送を経て、最終的にはオンラインのデータ取込を行う予定である。2.光子計数データに基づく位相回復光子計数イメージングシステムで撮像した回折像データに対して位相回復アルゴリズムを適用し、アルゴリズムの収束性を調べた。位相回復アルゴリズムとして、HIO(Hybrid Input Output)法とER(ErrorReduction)法の組合せを用いた。現在のところ収束に至っていない。高次回折像部分とゼロ次光部分を合成する際の位置ずれがその原因の一つとして考えられ、解決法を検討している。3.位相回復データの前処理回折像に含まれる種々のノイズを低減する前処理が有効であることを冷却CCDで撮像したアナログデータに対して確認した。アナログデータに対して現在行っている、フレーム加算とウィーナー最適フィルターを光子計数イメージに適用してその有効性を調べるとともに、光子計数イメージに最適な処理について考察するのが今後の課題である。

1.光子計数イメージングシステムにより回折像の分割取込昨年度に引き続き、光子計数イメージングシステム(平成10年度設備備品)を用いて光波のフラウンホーファー回折像を広いダイナミックレンジで撮像する方法について検討した。SiO_2透明薄膜を基板上に形成した極微弱位相格子の高次回折像部分を光子計数イメージングシステムで撮像し、この結果にNDフィルターで強度を減少させて別に撮像したゼロ次光部分を合成して回折像データとした。この方法によって回折像撮像のダイナミックレンジを、1,000,000程度にまで向上でき、その結果、従来は3次までであった回折光の取り込みが、7次まで可能になった。2.光子計数データ取り込みのオンライン化データ収集・解析の効率を向上させるため、フロッピーディスクを媒体とするオフライン処理で行っていたワークステーションへの回折像データ取り込みを、まず研究室LANを介するデータ転送に改め、さらにオンラインのデータ取込が行えるようにした。3.光子計数データに基づく位相回復光子計数イメージングシステムの分割取り込みによって撮像した回折像データに対して位相回復アルゴリズムを適用した結果、HIO(Hybrid Input Output)法とER(Error Reduction)法の組合せを用いた反復型位相回復アルゴリズムが反復回数300程度で十分な収束がみられ、周期状の物体表面形状を再生することができた。再生像になお若干のノイズが残っている原因について、さらに検討している。4.顕微鏡観察試料への適用生物用の倒立顕微鏡(平成11年度申請設備備品)を用いて本方法を無染色の生物・生体試料のようなミクロな位相物体へ適用することの可能性について検討した。1.光子計数イメージングシステムによる位相回復法の確立光子計数イメージングシステム(平成10年度設備備品)を用いて光波のフラウンホーファー回折像を1,000,000程度の広いダイナミックレンジで撮像し、このデータから位相物体の周期状位相分布を再生することは、昨年度に成功していたが、再生像にはなお若干のノイズが残っていた。今年度は、この問題の検討を行い、NDフィルターで全体の強度を減少させて撮像した回折像と、ゼロ次回折成分をマスクで遮って撮像した回折像を合成する際の二つの画像の位置合わせ誤差と、回折像の飽和による像の歪みが主な原因であることを確認した。撮像条件の適正化と位置あわせの改善によって、回折像の強度分布をより正確に測定することができた。その結果、この回折像データから位相回復を行うアルゴリズムの収束性が向上し、位相差λ/30の物体の矩形の位相分布形状を、従来よりも正確に回復することに成功した。2.光子計数データ取り込みの完全オンライン化実験室で撮像した回折像データは、研究室内LANのデータ転送を利用してワークステーションに取り込んでいたが、今年度は、さらにデータ収集・解析の効率を向上させるため、ワークステーション側からの制御による完全オンラインでのデータ取込を可能にした。3.薄膜試料・生物試料への応用の検討SiO_2透明薄膜を基板上に形成した位相差λ/30のモデル位相物体を引き続き試料として用いているが、他の誘電体薄膜試料や生物組織試料などへの適用について検討を行った。
サーフェス誘導モータの開発研究

任意方向の直進や回転運動ができる二次元運動モータとして,サーフェス誘導モータについて検討した。本モータはトロイダルコアと各コイルに独立して電流供給が可能な電機子巻線からなる一次側と,導体板と裏張り鉄板からなる二次側とで構成される。一次側が円形であることに加えて,二次側の導体板や鉄板にも方向性がないために,原理的に任意位置で力の変動を生じない。本サーフェスモータについて以下のことを明らかにした。1.直進用として2つの巻線群をつくるための各コイルへの電流供給法において,全コイルを使用する方式は推力変換率の面では不利であるものの,発生力の大きさの点で最適である。また,左右巻線群の電流供給法としては,電流の空間分布が進行方向軸に対して,点対称になる場合が最大の発生力が得られる。2.三相インバータによる電流供給で進行方向を任意に設定できる方式として,巻線分割型サーフェス誘導モータを提案した。これは,本サーフェス誘導モータの構造的特徴を活かして,円形のトロイダルコアに配置された電機子巻線を複数の三相巻線群に等分割し,対角位置の巻線を直列結線して,巻線分割数の半分の三相インバータで電流供給する方式である。6分割型3インバータないし8分割型4インバータ方式が,実用性が高いことを明らかにした。3.円形の本モータの場合,巻線による移動磁界速度に対する進行方向の等価同期速度は0.88倍であることを明らかにした。直交する2台のリニア誘導モータを用いて二次元運動させる場合と比較すると,2台同時使用では発生力は本サーフェス誘導モータと同等以下であり,移動磁界速度に対する進行方向の等価同期速度は0.707倍となる。また,1台のみの使用では発生力が小さいなど,性能面での本モータの優位性を明らかにした。1.サーフェス誘導モータの電流供給法と推力,垂直力,トルク特性との関係について直進駆動時の推力,垂直力の測定ができ,また二次側の導体板や裏張り鉄板の材質や厚みが変更できる構造のサーフェス誘導モータ試験装置を本年度設備備品費で製作した。これを用いて以下のことを実証した。(1)直進用として2つの巻線群をつくるための各コイルへの電流供給法において,全コイルを使用する方式は推力変換率の面では不利であるものの,発生力の大きさの点では最適である。(2)左右巻線群の電流供給法としては,電流の空間分布が進行方向軸に対して,点対称になる場合が最大の発生力が得られ,軸対称のとき発生力は最小になる。また,進行方向軸は歯またはスロット中心いずれにおいてもほとんど差異のない発生力を得ることができる。(3)上記2種の電流供給法の差異は,トルク特性で比較的大きく見られるものの,推力および垂直力においてはそれぞれ6%,3%程度に留まる。2.サーフェス誘導モータの特性算定式の精度について(1)直交座標に変換して補正係数で円形の効果を考慮する二次元の電磁界解析法を開発しており,実測値との比較によってその妥当性を確認した。(2)内側オーバハング部の渦電流領域がトロイダルコアの内径に対して半分程度であれば,上記解析式の算定精度は保証され,その渦電流領域とポールピッチの関係を明らかにした。その結果,直径が小さい場合でもポールピッチが小さいと,円形である影響は軽微であることを明らかにした。研究代表者らは,任意方向の直進力と回転力を発生できる二次元駆動用モータとして,円形の一次側をもつサーフェス誘導モータを提案している。

直進力の発生には,進行方向軸に対して左右二組の巻線群に分けてそれぞれの巻線群で同一方向の移動磁界を作って行うが,本年度の研究では実用性を高めるために,駆動用に汎用のインバータを使用する方式について検討した。1.三相インバータによる電流供給で進行方向を任意に設定できる方式として,巻線分割型サーフェス誘導モータを提案した。これは,本サーフェス誘導モータの構造的特徴を活かして,円形のトロイダルコアに配置された電機子巻線を複数の三相巻線群に等分割し,対角位置の巻線を直列結線して,巻線分割数の半分の三相インバータで電流供給する方式である。2.本方式駆動用の試験装置として位相同期型の4出力インバータを製作した。これは通常の三相インバータを結合したもので,4個の出力は同一周波数で同一位相で供給し,かつ各インバータの電圧,電流はそれぞれ独立して調整するものである。本方式により簡単な半導体スイッチング制御電源を実現できた。3.対角位置にある一対の巻線に流す1台のインバータの電流のみを減少させることで,連続的な任意の方向角度で進行方向軸を決定できることを明らかにした。ここで,4分割型2インバータ方式で任意方向において推力を一定に保つためには,他のインバータの最大電流を1.4倍に増加することが必要であり,この場合,モータ自体やインバータの容量は2.0倍になる。一方,8分割型4インバータ方式では,一定推力駆動のための容量は約1.23倍で実現できることが確かめられた。4. 6分割型3インバータないし8分割型4インバータ方式が,実用性が高いことを明らかにした。研究代表者は,二次元運動モータとしてサーフェス誘導モータを提案している.本モータはトロイダルコアと各コイルに独立して電流供給が可能な電機子巻線からなる一次側と,導体板と裏張り鉄板からなる二次側とで構成される.円周上の任意の部分に自由な移動磁界を作れるために,任意方向の直進や回転運動ができる.円形の一次側に対して,二次側の導体板や鉄板には方向性がないために,原理的に任意位置で力の変動を生じない.昨年度までは,静止時の直進動作特性を調べてきたが,本年度は回転運動時と直進運動時の滑りおよび速度特性を実験と解析の両面から調べ,以下のことを明らかにした.1.円形のモータの場合,巻線による移動磁界速度に対する進行方向の等価同期速度は0.88倍であることを明らかした.2.直交する2台のリニア誘導モータを用いて二次元運動させる場合,2台同時使用では発生力は本サーフェス誘導モータと同等以下であり,移動磁界速度に対する進行方向の等価同期速度は0.707倍となる.また,1台のみの使用では発生力が小さいなど,性能面での本モータの優位性を明らかにした.なお,本サーフェス誘導モータはシート形二次導体板を使用するために,本試験機のように比較的小型の場合は等価エアギャップが大きくなり,効率は低いが,大型では等価エアギャップに対して長いポールビッチを採用できるために高性能化が期待できる.一方,小型の場合には低速での使用を前提としているために,効率はあまり問題にならないと考えられるが,本サーフェスモータでのより小型化のためには,先に示した巻線分割法による電流供給法では限界があるため,より簡便な電流供給法の提案が必要であると考えられる.
鼻性NK/T細胞リンパ腫におけるEBウイルス関連分子を標的とした診断治療法の開発

鼻性NK/T細胞リンパ腫細胞株をNOGマウスに皮下移植したXenograftモデルを樹立した。形成された腫瘍はEBERが強陽性であった。さらに、鼻性NK/T細胞リンパ腫患者組織と血清中でそれぞれPD-L1とsoluble PD-L1の高発現、高値を認め予後との相関が確認された。鼻性NK/T細胞リンパ腫患者における血清中のEBウイルスマイクロRNA(EBV-miRNA)発現を解析し、バイオマーカーとしての有用性を検討したところ、miR-BART2-5pが鼻性NK/T細胞リンパ腫の診断、予後予測において有用なバイオマーカーになりうる可能性が示唆された。1.ケモカインアレイ解析の結果鼻性NK/T細胞リンパ腫細胞株にTARC,MDCの高発現を認めた。TARC,MDCのレセプターであるCCR4が本疾患細胞に高発現していることも認めた。さらに抗CCR4抗体を用いて細胞傷害活性試験を行ったところ、抗CCR4抗体が本疾患細胞に対してADCC活性を有することを見出した。2.c-MetとそのリガンドであるHGFが鼻性NK/T細胞リンパ腫細胞株や患者組織、患者血清で発現しており、HGFはオートクライン機構によって細胞増殖を助長した。複数のHLA-DRに結合可能なc-Metエピトープを複数同定し、これらのエピトープペプチドは鼻性NK/T細胞リンパ腫細胞を直接殺傷するc-Met特異的CD4ヘルパーT細胞を誘導した。3.鼻性NK/T細胞リンパ腫細胞株および臨床検体においてmiR-15aが発現低下していることを確認した。鼻性NK/T細胞リンパ腫細胞株にmiR-15aを強制発現させることで細胞周期の進行が抑制され、細胞増殖が低下することを認めた。また、同細胞株ではmiR-15aの標的遺伝子であるMYB、cyclin D1が高発現しており、miR-15aの導入によりその発源は抑制されることを認めた。患者夜毎の関連を検討したところ、miR-15a低発現群で有意に予後不良であった。4.鼻性NK/Tリンパ腫のマウスモデルを樹立し、形成された腫瘍を摘出して組織学的検索を行ったところ、多形性に富んだ大小不同の腫瘍細胞で構成されており、形態学的に鼻性NK/T細胞リンパ腫患者組織に一致する所見であった。さらにEBERが強陽性であり、NOGマウスに移植してもEBウイルス感染が持続していることが確認された。研究計画における昨年度の目標は、ほぼ達成されていると考えられる。鼻性NK/T細胞リンパ腫細胞株をNOGマウスに皮下移植したXenograftモデルを樹立し、形成された腫瘍を摘出して組織学的検索を行ったところ、多形性に富んだ大小不同の腫瘍細胞で構成されており、形態学的に鼻性NK/T細胞リンパ腫患者組織に一致する所見であった。また、EBERが強陽性であり、本疾患細胞株をNOGマウスに移植してもEBウイルス感染が持続していることが確認された。鼻性NK/T細胞リンパ腫細胞株をNOGマウスに皮下移植したXenograftモデルを樹立し、異種移植モデルの作製に成功した。腫瘍を摘出して組織学的検索を行ったところ多形性に富んだ大小不同の腫瘍細胞で形成されており、形態学的に鼻性NK/T細胞リンパ腫患者組織に一致する所見であった。鼻性NK/T細胞リンパ腫細胞株と実際の患者検体においてPD-L1が高発現していることを発見した。さらに患者血清において可溶性PD-L1が健常人よりも有意に多く存在することを発見し、その発現量と予後不良に関して正の相関が存在することが確認された。さらに鼻性NK/T細胞リンパ腫細胞株をNOGマウスに皮下移植したXenograftモデルにおいても、血清中の可溶性PD-L1がコントロール群よりも有意に多いことが確認された。鼻性NK/T細胞リンパ腫細胞株においてsurvivinが高発現していることを過去に本研究グループにおいて確認しているため、survivinの阻害薬であるterameprocolとmithramycin AをXenograftモデルに投与し、腫瘍増殖抑制効果が得られることを確認した。平成27年に行った研究の継続と、平成28年度の研究計画に沿って研究を進行していく。平成28年に行った研究の継続と、平成29年度の研究計画に沿って研究を進行していく。29年度が最終年度であるため、記入しない。
脂肪酸組成バランスとストレス誘導因子Sestrinによる肺気腫化・線維化の解明

ELovl6は脂肪酸鎖長を延長する酵素で、細胞内での脂肪酸の動態を制御する重要な因子である。このことは、Elovl6活性の亢進または低下によって、細胞内の脂肪酸組成のバランスが変化すると、飽和脂肪酸あるいは一価不飽和脂肪酸による過剰な反応さらには細胞障害を引き起こし、疾患の進展に深く関わっていると考えられる。したがって、肺胞上皮での飽和脂肪酸と不飽和脂肪酸のバランスが肺線維症および肺気腫の発症、進展機序に重要であると考えられる。申請者らは肺におけるElovl6の発現および病態意義について検討を行った。その結果、Elovl6はII型肺胞上皮細胞に発現が認められ、Elovl6欠損マウスにブレオマイシンで肺線維症モデルを作成したところ、野生型マウスと比較して著明な肺線維症の増悪を認めた。さらに、大変興味深いことに、Elovl6欠損マウスでは間質の線維化だけでなく、肺胞の破壊による気腫性変化も伴っていた。そこで、野生型マウスに対して、マウス用喫煙曝露装置により2ヶ月および6ヶ月間、喫煙曝露を行うことで、肺気腫モデルマウスを作成し、このマウスにおけるElovl6の発現と脂肪酸組成について検討を行った。免疫組織化学染色の結果から、喫煙曝露2ヶ月の標本では、II型肺胞上皮細胞におけるElovl6の明らかな発現増加が認められたが、喫煙曝露6ヶ月の標本では、2ヶ月の標本と比較すると発現は減少し、喫煙無処置の標本とほぼ同等のElovl6の発現レベルであった。6ヶ月喫煙曝露させたElovl6欠損マウスで肺気腫病変が増悪したことから、その機序を明らかにするため、野生型マウスとElovl6欠損マウスをRNAシークエンスにより、遺伝子発現の網羅的スクリーニングを行った。野生型マウスとElovl6欠損マウスに喫煙曝露し、RNAシークエンスにより、遺伝子発現の網羅的スクリーニングを行い、病態に重要な遺伝子群を検討する。野生型マウスに対してElovl6欠損マウスで発現が著明に増加している上位40位までの遺伝子で、Serpina1a, Serpina1b, Serpina1c, Serpina1d, Serpina1eという遺伝子が、非喫煙、喫煙曝露のいずれにおいても、Elovl6欠損マウスで著明に発現が増加していることが明らかになった。SerpinA1はα1-アンチトリプシンと呼ばれ、α1-アンチトリプシン欠損症は遺伝性の肺気腫を引き起こす唯一の疾患として知られる。α1-アンチトリプシンは主に肝臓で産生されるため、肺でのSerpinの発現と病態との関連を明らかにするためにはElovl6の発現をII型肺胞上皮特異的に欠損したコンディショナルノックアウトマウスの作成が欠かせない。このコンディショナルノックアウトマウスを作製するため、SP-C promotor-Cre rtTAトランスジェニックマウス(Cincinnati小児病院, Jeffrey A.Whitsett教授より譲渡)と、Elovl6 floxマウス(筑波大学,島野仁教授より譲渡)を交配して、ドキシサイクリン誘導型のII型肺胞上皮細胞特異的Elovl6欠損マウスElovl6を作製し、現在、繁殖中である。コンディショナルノックマウスの作製にあたって、自然受精が成功せず、人工授精による繁殖を開始した。また、肝臓特異的Elovl6欠損マウスを筑波大学より譲渡して頂き、本学で繁殖する必要もある。さらに喫煙モデルマウスの作製に6ヶ月を要する。従って、本研究の主要課題である遺伝子改変動物による実験が当初の計画より遅延しているため、研究費の使用も一部、平成31年度に繰り越しとなっている。1) II型肺胞上皮特異的にElovl6発現を欠損したコンディショナルノックアウトマウスを用いて、肺でのSestrinの発現局在/AMPK活性/mTOR活性と脂肪酸分画、酸化還元状態および病態との関係を比較検討する。ドキシサイクリン誘導型のII型肺胞上皮細胞特異的Elovl6欠損マウスとマウスとコントロール動物に長期喫煙曝露により肺気腫モデルと肺線維症モデルを作製し、肺組織中の遊離脂肪酸分画とリン脂質量、Elovl6、SP-CおよびSestrin1,2,3の発現と、肺気腫や肺線維症のマーカーとなる遺伝子群を定量する。さらに、Sestrinによって制御され、蛋白合成に需要なPI3K/Akt/mTOR経路と細胞周期、細胞老化に重要なAMPK/p53/p21経路を遺伝子発現を測定する。2) II型肺胞上皮特異的にElovl6発現を欠損したコンディショナルノックアウトマウスおよび肝臓特異的Elovl6欠損マウスを用いて、肝臓でのα1-アンチトリプシン発現、産生とElovl6発現および肺気腫進展への関与を明らかにする。今後は肝臓特異的Elovl6欠損マウスと、II型肺胞細胞特異的Elovl6欠損マウスで、肺気腫病変に差が認められるかを検討する必要があると考える。そこで、肝臓特異的Elovl6欠損マウスと、II型肺胞細胞特異的Elovl6欠損マウスに喫煙曝露を施し、α1-アンチトリプシン濃度,好中球エラスターゼ活性と病変の重症度との関連を解析する。次に、α1-アンチトリプシンの発現や活性を規定する責任脂質の同定を行うために、Elovl6欠損マウスの肝臓から脂質を抽出し、リピドミクス解析を行う。

考えられる責任脂質を培養肝細胞に添加し、α1-アンチトリプシンの発現や、培養上清中のα1-アンチトリプシン濃度を測定するとともに、発現制御メカニズムを解析する。ELovl6は脂肪酸鎖長を延長する酵素で、細胞内での脂肪酸の動態を制御する重要な因子である。このことは、Elovl6活性の亢進または低下によって、細胞内の脂肪酸組成のバランスが変化すると、飽和脂肪酸あるいは一価不飽和脂肪酸による過剰な反応さらには細胞障害を引き起こし、疾患の進展に深く関わっていると考えられる。したがって、肺胞上皮での飽和脂肪酸と不飽和脂肪酸のバランスが肺線維症および肺気腫の発症、進展機序に重要であると考えられる。申請者らは肺におけるElovl6の発現および病態意義について検討を行った。その結果、Elovl6はII型肺胞上皮細胞に発現が認められ、Elovl6欠損マウスにブレオマイシンで肺線維症モデルを作成したところ、野生型マウスと比較して著明な肺線維症の増悪を認めた。さらに、大変興味深いことに、Elovl6欠損マウスでは間質の線維化だけでなく、肺胞の破壊による気腫性変化も伴っていた。そこで、野生型マウスに対して、マウス用喫煙曝露装置により2ヶ月および6ヶ月間、喫煙曝露を行うことで、肺気腫モデルマウスを作成し、このマウスにおけるElovl6の発現と脂肪酸組成について検討を行った。免疫組織化学染色の結果から、喫煙曝露2ヶ月の標本では、II型肺胞上皮細胞におけるElovl6の明らかな発現増加が認められたが、喫煙曝露6ヶ月の標本では、2ヶ月の標本と比較すると発現は減少し、喫煙無処置の標本とほぼ同等のElovl6の発現レベルであった。また、培養血管平滑筋細胞でのElovl6発現を枯渇させると、p53, p21の発現誘導およびmTORの発現低下を介した増殖能の著明な抑制とともに、活性酸素種(ROS)の産生増加、ストレス誘導因子Sestrin1,2の発現増加およびAMPKの活性化が認められた。一方、Sestrin3の発現は低下していた。1)肺気腫および肺線維症の病態モデル動物を作製し、肺でのSestrinの発現局在/AMPK活性/mTOR活性と脂肪酸分画、酸化還元状態および病態との関係を比較検討する。喫煙2ヶ月モデルでは肺から抽出した蛋白のSestrin1,2および3の発現がいずれも低下していた。また、喫煙6ヶ月モデルでもSestrin1,2および3の発現が低下し、Elovl6ノックアウトマウスでは喫煙モデルと同様にSestrin1,2および3の発現が低下、さらに、Elovl6ノックアウトマウスに6ヶ月の喫煙を行うと、Sestrin1,2および3の発現は著明に低下していた。一方、p-AMPKは喫煙マウスで上昇が認められた。2)呼吸器疾患患者のSestrin発現とElovl6活性、脂肪酸分画、酸化還元状態を測定する。肺気腫患者の血清ではSCD1活性が低下し、肺線維症患者の血清では、逆にSCD1活性が上昇していた、Elovl6活性は両群間では差が認められなかった。現在、疾患の重症度とElovl6活性、SCD1活性および脂肪酸分画との関連を検討中である。Elovl6の発現をII型肺胞上皮特異的に欠損したコンディショナルノックアウトマウスを作製するため、SP-C promotor-Cre rtTAトランスジェニックマウスと、Elovl6 flox
The effect of explicit instruction on the listening comprehension of learners from a mora-timed L1 background

学生へのアンケート及び質的調査によると、学生が英語学習において成果を上げるには、音韻的障害こそが克服すべき課題だということがわかってきたのである。ただ、この発見の信憑性を高めるには、経験に基づく証拠が必要だ。だが、データ収集はいささか難しい。これを打開するために次の段階として私が考えたのは、様々な異なる言語のネイティブスピーカーにとって既知である単語の聴解力を比較できるような、ウェブサイトを立ち上げてみようということである。私は、音節リズムの言語及びモーラリズムの言語の話者は、既知の単語を理解する能力においては強勢リズムの言語の話者よりも点数が低く出るのではないかと思っている。
新規高効率理論創薬システムの構築と抗インフルエンザ薬などへの応用

本研究では、創薬ターゲットとなるタンパク質の高精度全電子計算が可能なフラグメント分子軌道(FMO)法を基盤とした、薬剤候補化合物とターゲットタンパク質のヴァーチャルスクリーニングのための『新規高効率理論的創薬システム』の構築を目指した。さらにその応用として、抗インフルエンザ薬をはじめ、抗ヒトパラインフルエンザ治療薬、抗デングウイルス薬、さらには作用分離された免疫疾患治療薬などへの適用を行った。本年度は、活性発現のメカニズム解析より一段踏み込んで、実際の創薬に向けた実用計算の第一フェーズと位置付けた。従来までのインフルエンザウイルスの表面糖タンパク質ヘマグルチニン(HA)以外に、実際の抗インフルエンザ薬のターゲットタンパク質であるノイラミニダーゼ(NA)などに計算対象を拡大した。タミフル耐性の原因となる変異について理論的に解析し、新規薬剤開発に向けた新たな指針を探索した。さらに、肥満などに付随する生活習慣病治療薬のターゲットとして、近年、大きな注目を集めているペルオキシゾーム増殖応答性受容体-Y(PPAR-Y)も対象として取り上げた。このPPAR-Yは当初、オーファン受容体として同定され、この受容体のLBPが他の受容体のLBPに比べてそのサイズ(1400Å^3)がはるかに大きく、従来の方法に基づいたstructure based drug design(SBDD)によるアプローチだけでは、実際の創薬は困難であると考えられていた。そこで、本申請研究では、対象リガンド化合物だけではなく、リガンド結合に伴うLBP部分の構造最適化計算を実行し、結合状態をab initioレベルで再評価した。さらに、開発途上の各種新規薬剤候補化合物に対しても同様な解析を行って、より高活性な新規化合物の分子設計を試みた。実際のLBP内の構造最適化においては、諸熊らのONIOM法によって蓄積された最新理論化学のノウハウに基づいて、典型的な候補化合物からデータを収集して、効率化を図った。本年度は、昨年度までの活性発現のメカニズム解析および第一段階の実用計算を基盤として、実際の合成開発を行う候補化合物を絞り込み、その最終的な最適化ステップと位置付けた。まず、最近問題となっているタミフル耐性を獲得したインフルエンザ変異株にも有効な新規治療薬を分子設計するとともに、薬剤耐性を獲得したウイルスの自発変異の原因を解析した。また、重篤な副作用が問題となっているペルオキシゾーム増殖応答性受容体-Y(PPAR-Y)アゴニストに変わる新規候補化合物として、PPARsのすべてのサブタイプに対して高活性を有するパンアゴニストの開発を目指した。リガンド結合に伴う誘導適合効果を考慮した理論的相互作用解析から、各サブタイプに有効な相互作用の原因を特定し、新規なスーパーパンアゴニストの設計に成功した。現在、それらの合成およびアッセイの実行を検討している。さらには、骨粗しょう症やカルシウム代謝異常に対するターゲットであるビタミンD受容体(VDR)に対する世界初の作用分離型モジュレータの設計・開発に成功し、このモジュレータ化合物について、現在、特許申請中である。この新規モジュレータは、VDRパーシャルアゴニスト活性を有するだけでなく、アンタゴニスト活性をも有する極めて興味深い化合物で、組織選択的VDRモジュレーターとして機能して、高カルシウム血症を誘導せずにその他の作用を誘導できるため、今後、実際の創薬化に期待がかかる。また、方法論的にも、本年度は、汎用プログラムとのインターフェースを開発し、種々のリガンド結合に伴う誘導適合効果を考慮したLBD全体の最適化計算が可能な高速最適化法を開発した。本年度は、本申請研究の最終年度として、昨年度まで実行してきた理論的手法の整備構築フェースに引き続いて、実際の新規薬物の設計開発に向けたとりまとめの年次と位置付けた。特に、今まで取り扱っていた対象系に加えて、地球規模で進行する温暖化に伴い世界中で流行するウイルス感染症のうち、化学療法剤およびワクチンの開発が遅れているウイルス感染症として、ヒトパラインフルエンザおよびデングウイルスを取り上げた。リレンザやタミフルなどのインフルエンザに有効な薬剤が効かないとされるパラインフルエンザに対して、プロパルギル置換基の先端にヘテロ芳香環を導入した新規薬物候補化合物が、ターゲットサイトのアミノ酸残基と安定な水素結合ならびに有効なCH一π相互作用をし、従来までのシアリダーゼ阻害薬が主にイオン性相互作用によりその有効性を発揮したのに対して、異なる阻害活性発現機構を有することを明らかにした。ヒトパラインフルエンザ1型および3型の両者に対して最高活性を有する化合物を基に、さらなる高活性を狙った化合物を理論的に設計し、現在、合成開発中であり、今後の活性測定が待たれる。さらに、現在まで治療薬が全くないデングウイルスに対しても、従来までの空間充填型創薬とは全く異なる視点による理論的創薬指針に基づき、低分子で最高活性を有するスルホニル基を導入した単糖誘導体が、ターゲットウイルスの表面膜タンパク質にどのように作用するのかを理論的に明らかすることができた。また実際の実験室レベルにおいても、簡便に本申請手法に基づいたde novoシミュレーションが実行可能となるように、汎用プログラムとのインターフェースを整備し、リガンドだけでなく複合体全体のモデリング・理論計算ができるようにした。
半正定値計画問題に対する高精度計算アルゴリズムの開発

悪条件な半正定値計画問題に対して高精度な解を求めるために,悪条件性を取り除く前処理アルゴリズムの提案・開発を行った.悪条件な半正定値計画問題とは,その問題とその双対問題が実行可能内点解を持たない半正定値計画問題である.具体的な成果は, (1)悪条件な半正定値計画問題に対して良条件な半正定値計画問題,つまり,実行可能内点解を持つ等価な半正定値計画問題を半正定値計画問題を生成する前処理の提案,(2)いくつかの応用問題から派生する半正定値計画問題に対して,悪条件になる原因の追及, (3)特に多項式最適化問題に対して,良条件な半正定値計画問題を生成する手法の提案をした.悪条件な半正定値計画問題に対して高精度な解を求めるために,悪条件性を取り除く前処理アルゴリズムの提案・開発を行った.悪条件な半正定値計画問題とは,その問題とその双対問題が実行可能内点解を持たない半正定値計画問題である.具体的な成果は, (1)悪条件な半正定値計画問題に対して良条件な半正定値計画問題,つまり,実行可能内点解を持つ等価な半正定値計画問題を半正定値計画問題を生成する前処理の提案,(2)いくつかの応用問題から派生する半正定値計画問題に対して,悪条件になる原因の追及, (3)特に多項式最適化問題に対して,良条件な半正定値計画問題を生成する手法の提案をした.半正定値計画問題(以下,SDP)に対する面的縮小法は,2つの凸集合の交わりを求める問題として定式化できる.その定式化された問題はSDPと見なすこともできるが,その場合,元のSDPよりも計算が難しい.本研究では,SDPとして扱うのではなく,凸射影アルゴリズムを適用することで計算の難しさを回避することを考えた.今年度は,以下の研究を行った:(1)様々なSDPに対して適用できるようなアルゴリズムを開発・実装.(2)特定の最適化問題から派生するSDPに対して面的縮小法を適用して,数値的困難が生じないSDPを構築・計算.(1)に関しては,様々な実験をところSDPによっては凸射影アルゴリズムの収束が遅い,または収束しないケースが見られた.これに関しては,さらに凸射影アルゴリズムの改良が必要であると同時に,既存研究の調査を十分に行うべきである.(2)に関しては,グラフ等分割問題,二次割当問題や0-1変数を持つ非凸二次最適化問題等の組合せ最適化問題から生じるSDPに対しては,これらのSDPが持つ特有の性質を利用することで簡単に面的縮小を適用することができた.さらに,面的縮小を施したSDPを解くことで数値的安定かつ高速に解け,また元のSDPが有している疎性を保つ様にSDPを変形しなければ,数値的安定かつ高速には解けないこともわかった.次の3点について重点的に研究を行った.[1]制約式を持つ多項式最適化問題から得られる二乗和多項式問題に対して,ロバストな面的縮小法を提案した.また,数値実験を行いその有効性を確認した.これにより,二乗和多項式問題に対する面的縮小法は確立したことになる.(電気通信大学村松教授との共同研究)[2]Doubly Non-Negative optimizationに対するロバストな面的縮小法を提案した.数値実験を行ったところ,得られる解の精度が少し改善される程度であった.これは提案手法が不完全であることに起因する.この不完全な部分の対応が今後の課題である.(東京工業大学中田准教授,田中さんとの共同研究)[3]Lasserreの半正定値計画緩和を最適化のアプローチから理解することで,より小さい緩和問題を構成する手法を提案した.考えたが非常にシンプルで疎性を持つ場合や対称錐上の多項式最適化問題への拡張も容易にできた.また,数値実験でもその有効性が実証できた.(電気通信大学村松教授,Waterloo大学Tuncel教授との共同研究)また,多項式最適化問題を解くソフトウェアSparsePOPの開発も継続している.特に,組合せ最適化問題に生じる構造を利用することで,得られる半正定値計画緩和問題を小さくできる手法を組み合わせた.さらに,東京工業大学山下助教と共同でwindows binaryを作成し配布している.これにより,windows上でも容易にSparsePOPを実行できるようになった.今年度は主に, H∞制御問題から生じる半正定値計画問題に対して議論した.一般にH∞制御問題から生じる半正定値計画問題(SemiDefinite Programming problem, SDP)は高精度に求解することが難しい,ということが知られている.この原因がSDPまたはSDPの双対問題が実行可能内点解を持たないからではないか,と予想した.その予想のもとで, "では,実行可能内点解を持たないSDPが生じるのはなぜか",という疑問に答えるべく本研究を推進した.この予想は,面的縮小法を利用することで調べることができる.その結果,元のH∞制御問題が以下の性質を持っている際には,得られるSDPまたはその双対問題が実行可能内点解を持たないことが分かった.(1)可安定でない,または可検出でない.(2)不変零点に関するランク条件を満たさない.(1)が言っていることは,元の制御対象が工学的に意味をなさない,つまり設計の段階で取り除かれるべき条件で,こういった制御問題は不自然である,ということである.一方, (2)は興味深い条件である.というのも, H∞制御問題は代数的Riccati等式を解くことで求解できることが以前から知られていた.

90年代からSDPが飛躍的に研究される様になり,現在ではSDPを利用することが一般的である.(2)の式は,この代数的Riccati等式が解を持つための条件に酷似している.これらより,元の制御対象が工学的に不自然であれば得られるSDPが実行可能内点解を持たず高精度な求解が難しい,ということが分かった.一方で,たとえ工学的に自然であってもSDPの求解が困難である場合が多々あるためこれだけが本質ではない,と考えている.次の3点について重点的に研究を行った.[1]Doubly Non-Negative optimizationに対するよりロバストな面的縮小法を提案した.去年度提案した手法よりもより精度の高い解を得ることに成功している.これは,得られる半正定値計画問題の半正定値性だけでなく非負性を組み合わせることで実現できた. (東京工業大学中田准教授,田中さんとの共同研究)[2]多項式最適化問題に対する半正定値計画緩和を利用して,確率点過程で現れるalpha-determinantに関する予想に挑戦した.Alpha-determinantとは行列式を拡張した関数であり,この予想は任意のサイズの半正定値行列に対して, alpha-determinantが非負の値をとるであろう,というものである.この予想を多項式最適化問題の枠組みでとらえた.ここで, Lasserreの半正定値緩和ではなく,より強い定式化を提案し,行列サイズN=3,4,5,6まではこの予想が正しいことを確認した.この定式化においても面的縮小法の考え方を利用している. (九州大学白井教授, IBM基礎研究所恐神さんとの共同研究)[3]半正定値計画問題の低ランク解を見つける実用的なアルゴリズムの開発を行った.低ランク解は半正定値計画問題を用いる様々な分野で必要とされている技術であり,発見的手法がいくつか提案されている.しかしながら今回の滞在で開発したアルゴリズムは一般の半正定値計画問題に適用可能であり,他の既存手法とはこの点で異なっている.今後は実装を行い,数値実験から提案手法の正当性を主張していきたい. (Waterloo大学Tuncel教授との共同研究)制約式を持つ多項式最適化問題から得られる二乗和多項式問題に対するロバストな面的縮小法を提案することができた.これにより,二乗和多項式問題に対する面的縮小法が確立されたため.25年度が最終年度であるため、記入しない。特定の半正定値計画問題に対して面的縮小法を適用し効率の良い計算を実現できたが,一般の半正定値計画問題または対称錐上の線形計画問題に対する面的縮小法の実装やソフトウェア化は進んでいない.これは,面的縮小法が誤差に敏感で何らかの構造を利用して解析解を求めてそれを使わないと,実現できないからである.双線形行列不等式問題等は,制約式を持つ多項式最適化問題から得られる二乗和多項式問題に対するロバストな面的縮小法が有効であることが予想される.今後は数値実験をする予定である.また,モーメント問題から得られる半正定値計画緩和問題においても,面的縮小法に有用な構造を持っている場合が多い.こういった場合のロバストな面的縮小法を提案する予定である.25年度が最終年度であるため、記入しない。
Li誘起による半導体ZnOの強誘電性発現と電子材料の可能性

II-VI族半導体ZnOのZnをLiで一部置換すると強誘電性を示すことを発見し、そのメカニズムの解明を試みた。ZnOは電子系が主因の新しいタイプの強誘電性である可能性が大きい。この系が強誘電性研究に適しているのは、構造が簡単であること、Li添加により抵抗が急激に増加し、高抵抗になる点にある。次ぎのような、基本的な誘電特性、小さい格子系の変化を明らかにした。(1) Znを3d電子を持たないLiで世換すると、強誘電性が誘起される。(2) SPS法で作製したセラミックスでは、転移点が470Kまで上昇した。Tc-χ相図を得た。(3) ZnO単結晶Li雰囲気中で処理した場谷、セラミックスと同様な異常がみられる。(4) ZnOは相転移に伴う構造変化が小さく、空間群も変化しない。(5)電子系のわずかな変化が相転移を誘起しうることを現象論的に示した。酸化亜鉛は機能性酸化物として、最近広く注目を浴びている。半導体材料との整合性も良いことから、デバイスに組み込む強誘電体薄膜材料としても展開が期待される。また、In,Alドープにより高伝導度の透明電極材料になること、青色レーザーが発振可能なこと等の興味ある特性を示す。光ICなどの発光部、機能部、電極部などが一つの基礎材料で構成可能となる。また、p型のドーピングに成功すれば、透明太陽電池が可能になる。ガラス窓で被われたオフィスビルの電力源にもなりうるなど可能性にみちた次世代の夢の電子材料である。II-VI族半導体ZnOのZnをLiで一部置換すると強誘電性を示すことを発見し、そのメカニズムの解明と基礎特性を調べ、電子材料としての可能性を検討している。(1)Liと同様のサイズ効果が期待されるMgドープの効果を調べた。Liと同じく強誘電性が見られるが、10%ドープでは強誘電相転移点は低下する。実用に耐える温度を確保するには30%以上のドープが必要である。(2)ZnOは相転移に伴う構造変化が小さく、空間群も変化しない。Liは3d電子を持たないことから、Zn-O結合電子状態の変化に起因する新しいタイプの強誘電性である可能性が高いことを指摘した。また、電子系のわずかな変化が相転移を誘起しうることを現象論的に示した。(3)同じII-VI族強誘電半導体CdTe:Zn、CdTe=Mnの比熱測定を行い、この系の類似点、相違点の検討した。現在、セラミックス作製法の検討による高転移点化の検討、単結晶の育成を検討している。Tc-χ相図を得た。
48Caの2重ベータ崩壊の研究

ニュートリノのマヨラナ性を検証すべく、^<48>Caのニュートリノ放出を伴わない二重ベータ崩壊を探索する装置、CANDLES III(U.G.)の建設を神岡地下実験施設にて行った。大阪大学(地上)に建設したプロトタイプ装置を用いて性能評価を行い、特にバックグラウンドの低減・エネルギー分解能の向上に関して、要求される性能が得られることを示した。また、将来のさらなる感度向上につながる^<48>Caの低コストの同位体濃縮研究にも着手し、わずかではあるが、実験室レベルでの濃縮に成功した。ニュートリノを放出しない2重ベータ(Oνββ)崩壊の観測は、ニュートリノが粒子と反粒子を結ぶマヨラナ質量を持つ事を示し、宇宙が粒子だけの(反粒子のない)世界になったことを説明する鍵となっている。本研究では2重ベータ崩壊核の中で最高のQ値(4.27MeV)を持ち、BGの最も少ない^<48>Caの2重ベータ崩壊を研究するためにCANDLES-III検出器を建設して、現在世界最高感度を達成している^<76>Geの実験に追いつき追い越す事を目標としている。本年は1.CaF2結晶を購入し、バックグランドを測定し予定の性能が達成されていることを確認した。2.PMTを購入し、性能を確認した。3.検出器の特性を検証するため、地上の阪大理学部の原子核実験施設に直径2.8m高さ2.6mのタンクを建設し、PMTをインストールした。理学部では消防法の問題があるので、タンク内は水とし、中心に1kリットルのオイルのベッセルを設置し、結晶はそこに入る。4.結晶を入れるまえにPMTからの信号を確認した。5.本実験用に新設計したPMTが長期的な対腐食性に問題があることが判明し、メーカーと相談して対策を立て、手直しを行った。手直しは年度中に間に合った。来年度後半に地下実験室に装置を設置して、観測に入る予定は崩さずに済みそうである。2005年9月16日20日の日程で日米セミナーを開催した。報告書はをご覧頂きたい。岸本とK.Lesko氏(米国の新しい地下実験施設の代表)が共同で主宰し、シーソー機構の創造者である柳田氏の基調講演と米国の中心計画であるMajorana projectが紹介される中、本CANDLES計画も紹介し、他の計画に比較して実際の問題点を既に克服済であることを印象付けることができた。2重ベータ崩壊の検証はニュートリノの質量の直接測定という以上にレプトン数の破れを確認できる点に意義が大きく、宇宙がなぜ物質だけの世界になっているかを検証する最も重要な実験になる。本研究では48Caの2重β崩壊の研究のためCaF2シンチレーターを中心検出器とするCANDLES検出器を建設している。本年行ったことは1.2層構造で発光効率を最適化した液体シンチレーターを周りに配置したCaF2シンチレーターを約100個作成。2.CaF2シンチレーターを液体シンチレーターに入れる容器を製作し、強度と漏れに対する耐久試験を行った。4.現在地上で装置の建設がほぼ終了した。5.液体シンチレーターのベッセルに結晶を設置し、PMTを設置してテストを行った。6.オイルの漏れとPMTへの浸水が発生したので対策を施した。7.現在ひとつひとつの結晶からの信号を確認しながら全体の動作テストに入っている。8.神岡地下の実験室に設置して実験するための準備を行った。地上での測定で問題点を出し切り、地上での限界まで計測した上で、地下実験室の装置を建設する。尚東大宇宙線研が神岡地下に掘削中の実験室のスケジュールの調整に伴い、昨年度繰り越していた液体シンチレータータンクと水タンクの製作を完了させた。本研究計画で推進している2重ベーダ崩壊の検証は、レプトン数の破れの検証を意味し、宇宙がなぜ物質だけの世界になっているかを物理法則で説明するとき最も重要な実験になる。本研究ではCaF_2シンチレーターを中心検出器とするCANDLES検出器を用いて^<48>Caの2重ベーダ崩壊の研究を進めている。本年度に以下の事項を行った。1.理学研究科付属原子核実験施設内にタンクを設置し、昨年までに製作した結晶・PMT・液体シンチレーター容器を全てインストールして動作テストに入った。尚結晶は56個を用いている。2.初期不良の問題が幾つか出たが、解決した。3.地上での実際の測定を始めた。4.トリガー条件をFPGAを用いた回路で最適化した。更に研究は必要であるが、基本的な条件を押さえること出来た。5.バックグランドの原因をほぼ特定した。但し、一部更に研究が必要な部分が残されている。6.新しく掘削された実験室Dの工事完了に伴い、東京大学宇宙線研究所神岡宇宙素粒子研究施設内での実験室整備に関し、SUSタンクを運搬、設置作業を完了。『安全衛生関連設備も含め』

大阪大学2重ベータ崩壊実験室としての整備を行った。7.同位体濃縮についてクラウン・エーテルを用いる方法の研究を東工大の研究グループと協力して進め、濃縮か確実に出来る様になった。但し、現在得られている分離係数は大量生産にたいしてはもう少し研究が必要である。
触媒反応への応用に向けた単分子ラマン顕微分光法の開拓

NOxの無害化などに代表される,不均一系触媒反応を研究するための手法として,単分子レベルの空間分解能を有し,表面に吸着した分子の吸着状態を1分子ずつ調べることができる顕微分光法が望まれている。しかし現状,そのような分光法は確立されているとはいえない。近年,走査トンネル顕微鏡(STM)とラマン分光を組み合わせた探針増強ラマン分光(TERS)によって,色素分子などの有機分子の単一振動分光が可能となってきた。本研究では,そのTERSを一酸化炭素(CO)や一酸化窒素(NO)へと拡張し,触媒反応において本質的である小分子の単一振動分光法を開拓する。
幹細胞を融合したオーダーメード型人工神経の開発

3cm以上の末梢神経欠損に対しては自家神経グラフト(ANG)移植が唯一の治療法であるが、ドナー神経の犠牲、採取できる神経量の限界、レシピエントとの形状のミスマッチなどの欠点を有する。本研究ではANGの代替えと成り得るオーダーメード可能なハイブリッド型人工神経の開発を目指した。薬剤処理によって無細胞化した同種ラット末梢神経へ脂肪組織由来間葉系幹細胞から分化誘導して得られた自家シュワン細胞様細胞を付加することでハイブリッド型人工神経を作製した。神経欠損への移植後、付加した細胞の大部分はレシピエント神経由来のシュワン細胞に置き換わるものの、細胞付加により機能回復速度の促進を認めた。本年度はラット自家dASCと同種無細胞化神経グラフトの親和性検討を重点的に行った。1)ラットdASCおよびラット坐骨神経由来シュワン細胞の初代培養・・全ての細胞に蛍光タンパクGFPを発現するラット[LEW-Tg(CAG-EGFP)1Ys]の皮下脂肪組織を採取し、コラゲナーゼ処理、遠心分離によりASCを得た。第2継代目において、これまで申請者らが用いてきた手法、すなわちGGF-2をはじめとする増殖因子添加によりdASCへの分化誘導を行った。コントロール細胞としてGFPラット坐骨神経由来のシュワン細胞の初代培養も行った。(2)同種異型無細胞化神経グラフトの作成・・SDラットより坐骨神経を採取し、過去にワシントン大学形成外科により報告されているプロトコールにより神経グラフトの無細胞化を行った。無細胞化処理後、切片を作成し観察したところ、僅かに生存しているnativeシュワン細胞が確認されるグラフトを認めた。これを解決すべく無細胞化処理時間を長めに設定するなど修正を加える必要があると考えられた。(3)dASCの同種異型無細胞化神経グラフトへの移植・・マイクロシリンジによる注入によりdASCを神経グラフトへ移植した後、一定期間in vitroにて培養を行った。その後グラフト内GFP陽性細胞の観察を行ったが、生存率に関してはグラフト間でその値にばらつきが見られた。1箇所より大量に注入した群においてはその生存率が低い傾向が見られたため、数箇所に分けて移植する必要があることが示唆された。次年度はグラフト無細胞化法、細胞移植法の最適化を継続して行い、その後実際に動物モデルをを用いてその有用性を検討していく予定である。本年度は昨年度においていくつかの課題が残っていた神経グラフトの無細胞化法、および細胞移植法の最適化を引き続き行った。(1)同種異型無細胞化神経グラフトの作製・・昨年度のプロトコールよりも無細胞化処理時間を各段階で長めに設定することを試みた。その結果、処理完了後におけるグラフト内生存細胞をほぼ0とすることができた。(2)dASCの同種異型無細胞化神経グラフトへの移植・・1箇所から大量の細胞を移植すると移植細胞の生存率が著しく低下するため、複数の箇所からマイクロシリンジを用いて少量ずつ細胞移植を行った。その後培養液内にて培養を行った。その結果、昨年度の移植法に比べて2週間後におけるグラフト内生存細胞数が増加した。これら結果を踏まえ、ラット坐骨神経において神経欠損モデルを作製し、dASCを付加した無細胞化神経グラフトの移植を行った。モデルとしては以下の2つを作製した。すなわち、1脛骨神経・総腓骨神経分岐前のレベルの神経欠損に対して1本のdASC付加無細胞化神経グラフトで再建するモデル、2脛骨神経・総腓骨神経分岐部における神経欠損をY字型のdASC付加無細胞化神経グラフトで再建するモデルをそれぞれ作製した。対照群として自家神経グラフトで再建した群と、細胞を付加しない無細胞化神経グラフトで再建した群をそれぞれ作製した。今後長期フォローアップを行い、足跡分析による運動機能回復評価、および遠位再生神経の形態組織学的評価を行っていく予定である。本年度は昨年度に最適化を行った幹細胞付加無細胞化神経グラフトを用いて動物モデルの作製・解析を行った。近交系ラットの総腓骨神経に5mmの欠損を加え、1cmの神経グラフトを移植するモデルを全3群作製した。すなわち、(1)同種神経グラフトを移植した群(コントロール群)、(2)無細胞化神経グラフトのみを移植した群、(3)幹細胞付加無細胞化神経グラフトを移植した群をそれぞれ作製した。術後経時的な足跡分析による運動機能回復測定を行い、その後20週のフォロー期間の後、移植神経・遠位再生神経の形態組織学的評価、および免疫染色による評価を行っている。また筋電図による再生神経・筋肉の評価、腓腹筋重量測定も行っている。移植神経の組織学的評価では、幹細胞付加無細胞化グラフト内におけるシュワン細胞のほとんどはレシピエント神経由来のシュワン細胞であり、長期的な付加幹細胞の生存は認めなかった。再生神経、および機能回復の評価についてはまだ最終的な結果は得られていないものの、幹細胞付加による回復速度促進効果を認めている。今後解析を進めていき、最終的な機能回復の程度を各群間で比較・検討していく予定である。

薬剤処理によって無細胞化した同種ラット末梢神経へ脂肪組織由来間葉系幹細胞から分化誘導して得られた自家シュワン細胞様細胞を付加することでハイブリッド型人工神経を作製した。神経欠損への移植後、付加した細胞の大部分はレシピエント神経由来のシュワン細胞に置き換わるものの、細胞付加により機能回復速度の促進を認めた。神経グラフトの無細胞化および移植法の設定を行い、動物モデルの作製を開始していることから、概ね順調に進行しているものと考える。再建外科今後は現在作製している長期フォローアップ動物モデルの運動機能解析、遠位再生神経の組織形態学的評価、および移植神経グラフトの免疫染色を含めた評価を順次行っていく予定である。GFPラットより必要な細胞の調達に成功した。神経グラフトの無細胞化処理法、細胞移植法に関してはさらに試行錯誤による修正が必要であるものの、概ね順調に進行しているものと考える。本年度購入予定であった抗体などの消耗品の一部は、研究進行状況や消費期限の関係上、次年度の予算として計上することとした。今年度はグラフトの処理法、細胞移植法の修正が終了次第、前年度で作成した各細胞を用いて実際の末梢神経損傷動物モデル作成を行う。そのモデルに関して機能的回復の経時的評価及び移植グラフトの形態学的評価を行っていく予定である。繰り越した予算に関しては抗体などの消耗品予算に充てる計画である。今年度予算はほぼ使用したが、僅かに生じた残高に関しては消耗品の使用期限もあることから次年度予算として計上することとした。繰り越した予算に関しては培養液等の消耗品予算に充てる計画である。