hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
壁面と火炎の相互干渉機構の数値解析による解明とその実験的検証

特に,数値シミュレーションコードの高速化が遅れており,次年度以降,Xheon phi等の導入を視野に入れて開発を続ける予定である.次年度は最終年度であることから,これまでの結果に対する考察およびそれに基づき,不足していると考えらえるデータの追加取得を行う予定である.燃焼工学シミュレーションについては計算コードの高速化を引き続き行うとともに,より実験との比較を視野に入れたシミュレーションを実施する予定である.また,実験ではバーナの再設計を行うとともに,他の計測手法を導入することによりより多くの物理量に対する計測を試みる予定である.計算機や実験用消耗品の支出額が予定を下回ったため.数値シミュレーションコードの最適化作業が遅れており,計算機の購入を次年度としたため.主に,追加実験や数値解析,データ処理のための機器,次年度予定している論文の掲載料に使用予定である.計算機の購入を行う予定である.
Cyclooxygenaseの癌免疫における役割解析と分子制御による治療法の開発

大腸癌培養細胞株をヌードマウスやノックアウトマウスに移植し、腫瘍細胞やマクロファージや線維芽細胞に於けるcyclooxygenase-2活性の腫瘍増殖に及ぼす影響を明らかにし、腫瘍細胞-間質細胞相互作用について検討してきた。1.ヒト胃癌組織において、接する正常粘膜に比しCOX-2発現が増強しており、その発現の程度がリンパ節転移に関連していることを見いだした(Am J Gastroenterol 1999)。2.ヒト胃癌由来COX-2高発現培養細胞MKN45を用い、COX-2特異的阻害剤が腫瘍血管新生を阻害することにより、腫瘍の増大を抑制することを明らかにした(Lab Invest 1999)。4.ヒト胃粘膜において、H.pylori感染がCOX-2の発現を惹起すること、その局在がニトロチロシンと一致すること、さらにH.pylori除菌治療でCOX-2とニトロチロシンの発現は共に減弱することを明らかにし、胃癌の発症予防を考える上で、H.pylori除菌とは別にCOX阻害剤を考慮する必要性を示した(PG LT Ess FA 2001)。5.COX-2ノックアウトマウスに腫瘍を移植しても腫瘍は増大せず、間質細胞が産生分泌する血管新生因子や増殖因子産生がCOX-2活性で制御されていることが示された(J Clin Invest 2000)。以上より、COX-2阻害の抗腫瘍効果に関し、発癌予防・癌進展阻害の可能性の拡大を示唆する新たな知見が得られた。近年、食生活の欧米化に伴い、大腸癌の頻度が増えており、予防・進行抑制が課題となっている。疫学的検討から、非ステロイド系消炎鎮痛剤が大腸腫瘍の発生と進展の抑制に有効であることが明らかにされており、本剤の標的であるcyclooxygenase(COX)の大腸腫瘍の発生進展への関与が注目されている。腫瘍部には浸潤リンパ球の集積がみられるが、実際には腫瘍細胞の免疫監視機構からの回避のため抗腫瘍活性は十分ではなく、腫瘍免疫の発展に際してこの免疫制御機構の解明・抑制が重要となる。本検討は、COXが大腸粘膜の抗腫瘍免疫に及ぼす影響を、細胞障害性T細胞(CTL)、樹状細胞、マクロファージなどの免疫担当細胞の機能連関の面から検討することを目的としている。現在、主に近年開発が盛んなCOX-2特異的阻害剤のマクロファージ、抗原特異的細胞障害性T細胞(CTL)の抗腫瘍活性に及ぼす影響について検討した。マクロファージでは活性化に伴い、COX-2の発現が誘導されるが、COX-2特異的阻害剤により抗腫瘍活性はむしろ亢進した。そのメカニズムとして、COX-2阻害によりマクロファージにおいてiNOSの発現が高まることから、NOが抗腫瘍活性に関与する可能性が示唆される。CTLにCOX-2特異的阻害剤を作用させると、腫瘍抗原に反応性のインターフェロンγ産生は亢進するのに対し、抗腫瘍活性はアポトーシスが誘導され抑制された。現在、樹状細胞を含めたその他の免疫担当細胞の抗腫瘍活性に対するCOX-2特異的阻害剤の効果を検討し、より有効なstrategyの開発を検討中である。ヌードマウスにヒト大腸癌由来培養細胞を移植する系やマウス由来のColon38細胞を同系マウス、及び同系COXノックアウトマウスに移植する系を用い、腫瘍細胞や間質細胞におけるCOX-2活性の腫瘍血管新生や増殖因子産生に及ぼす影響を検討し、腫瘍細胞-間質細胞間相互作用について検討してきた。その結果、1.COX-2高発現ヒト胃癌培養細胞株のMKN45を用いた移植腫瘍系でCOX-2の特異的阻害剤が腫瘍血管新生を阻害することにより腫瘍の増大を抑制することを明らかにした(Lab Invest 1999)。2.ヒト胃癌組織においても隣接する正常粘膜に比べCOX-2の発現が増強しており、その発現の程度がリンパ節転移に関連していることを見いだした(Am J gastroenterol 1999)4.ヒト

胃粘膜を用いた検討で胃の発癌因子として注目されているH.pylori感染がCOX-2の発現を来すこと、その局在はニトロチロシンと一致すること、さらにH.pylori除菌治療でCOX-2とニトロチロシンの発現は共に減弱することを明らかにし、胃癌の発症予防を考える上で、H.pylori除菌とは別にCOX阻害剤を考慮する必要性を示した(PG LT Ess FA 2001)。5.COX-2ノックアウトマウスに腫瘍を移植しても腫瘍は増大せず、間質細胞が産生分泌する血管新生因子や増殖因子産生がCOX-2活性で制御されていることが示された(J Clin Invest 2000)。以上より、COX-2阻害の抗腫瘍効果に関し、発癌予防・癌進展阻害の可能性の拡大を示唆する新たな知見が得られた。
ＲＮＡ制御系によるｍＲＮＡ安定性と翻訳の時空間ファインチューニング

ポリA分解酵素Ccr4によるLRG1発現機構を調べた結果、対数増殖期でのLrg1タンパク質レベルは、野生型株とccr4Δ変異株で大きな変化がなかった。定常状態では、野生型株よりccr4Δ変異株でLrg1タンパク質レベルが高かった。ccr4Δpbp1Δ二重変異株では低下した。LRG1 mRNAのpolyA鎖の長さは、野生型株よりもccr4Δ変異株で長く、ccr4Δpbp1Δ二重変異株ではccr4Δ変異株よりも短くなっていた。以上の結果から、Ccr4とPbp1は、LRG1 mRNAのpolyA鎖の長さを調節することにより、定常状態でのLrg1タンパク質レベルを調節していることが明らかとなった。出芽酵母のポリA分解酵素であるCcr4は、低分子量Gタンパク質Rho1のGTPase-activating protein (GAP)をコードするLRG1 mRNAの発現を負に制御する。Rho1は細胞壁合成に関与しており、ccr4Δ二重変異株では、LRG1の発現が上昇する結果Rho1の活性が低下し、細胞壁の合成異常となり増殖遅延を示す。ccr4Δ変異株の増殖遅延は、LRG1遺伝子の欠損で抑圧される。また、ccr4Δ変異株の増殖遅延は、Poly(A)-binding protein (Pab1)-binding protein, Pbp1 (ヒトAtaxin-2の酵母オルソログ)をコードするPBP1の遺伝子欠損によっても抑圧される。しかしながら、PBP1遺伝子欠損によるccr4Δ変異抑圧の分子機構は不明であった。今回、Ccr4によるLRG1発現機構を調べた結果、対数増殖期でのLrg1タンパク質レベルは、野生型株とccr4Δ変異株で大きな変化がなかった。定常状態になると、野生型株ではLrg1タンパク質レベルが大きく低下したのに対し、ccr4Δ変異株では定常状態でもLrg1タンパク質は発現したままであった。ccr4Δpbp1Δ二重変異株では定常状態でLrg1タンパク質レベルが低下した。以上の結果から、Ccr4とPbp1は、LRG1 mRNAのpolyA鎖の長さを調節することにより、Lrg1タンパク質の発現レベルを調節していることが明らかとなった。本研究の目的は以下のとおりである。(1) RNA結合タンパク質Khd1とポリA鎖分解酵素Ccr4によるmRNA安定性と翻訳の調節機構について、細胞壁合成に関わるターゲットmRNA群の詳細な調節機構を明らかにする。ターゲットmRNAごとに異なる調節を、さまざまな周辺因子との遺伝学的相互作用から明らかにする。(2)細胞壁合成に関わるmRNA制御において、遺伝学的相互作用から、ヒトAtaxin2の酵母オルソログPbp1、デキャッピング酵素の周辺で働くDhh1, Pat1, Edc1、翻訳調節因子Caf20などさまざまな因子が関わることがわかってきた。これらの因子はターゲットmRNAも作用機構も未だ不明であるので、それについて明らかにする。(3)シグナル認識粒子サブユニットSec65はKhd1と結合し、細胞壁合成にも関わる。Sec65がmRNA安定性制御と翻訳制御の機構にどのように関わるかを明らかにする。(4)出芽部位のRho1を介した局所的な細胞壁合成、出芽の先端成長、細胞壁維持には、Khd1, Puf5, Ccr4, Pop2などさまざまなmRNA制御因子が関わる。Rho1の活性調節におけるRNA制御の全体像を明らかにする。このうち、(1), (2)について、Ccr4とPbp1による遺伝子発現調節機構が対数増殖期と定常状態で大きく異なることを見出し、Ccr4, Pbp1による遺伝子発現機構の新たな一面を見つけることができた。また、Ccr4とPbp1はLRG1 mRNAのpolyA鎖の長さを調節することにより、Lrg1タンパク質の発現レベルを調節していることを明らかにした。このように研究はおおむね順調に進行している。LRG1 mRNAのpolyA鎖の長さは、野生型株よりもccr4Δ変異株で長く、ccr4Δpbp

1Δ二重変異株ではccr4Δ変異株よりも短くなっていた。以上の結果から、Ccr4とPbp1は、LRG1 polyA鎖のpolyA鎖の長さを調節することにより、Lrg1タンパク質の発現レベルを調節していることが明らかとなった。デキャッピング酵素の周辺で働く因子のうち、Scd6がアルギニンメチルトランスフェラーゼHmt1によってメチル化され、メチル化がScd6のPボディへの局在に重要であることを示した。本研究の目的は以下のとおりである。(1) RNA結合タンパク質Khd1とポリA鎖分解酵素Ccr4によるmRNA安定性と翻訳の調節機構について、細胞壁合成に関わるターゲットmRNA群の詳細な調節機構を明らかにする。ターゲットmRNAごとに異なる調節を、さまざまな周辺因子との遺伝学的相互作用から明らかにする。(2)細胞壁合成に関わるmRNA制御において、遺伝学的相互作用から、ヒトAtaxin2の酵母オルソログPbp1、デキャッピング酵素の周辺で働くDhh1, Pat1, Edc1, Scd6、翻訳調節因子Caf20などさまざまな因子が関わることがわかってきた。これらの因子はターゲットmRNAも作用機構も未だ不明であるので、それについて明らかにする。(3)シグナル認識粒子サブユニットSec65はKhd1と結合し、細胞壁合成にも関わる。Sec65がmRNA安定性制御と翻訳制御の機構にどのように関わるかを明らかにする。(4)出芽部位のRho1を介した局所的な細胞壁合成、出芽の先端成長、細胞壁維持には、Khd1, Puf5, Ccr4, Pop2などさまざまなmRNA制御因子が関わる。Rho1の活性調節におけるRNA制御の全体像を明らかにする。このうち、(1), (2)について、Ccr4とPbp1による遺伝子発現調節機構が対数増殖期と定常状態で大きく異なることを見出した。また、Ccr4とPbp1はLRG1 mRNAのpolyA鎖の長さを調節することにより、Lrg1タンパク質の発現レベルを調節していることを明らかにした。Scd6がアルギニンメチルトランスフェラーゼHmt1によってメチル化され、メチル化がScd6のPボディへの局在に重要であることを示した。このように研究はおおむね順調に進行している。出芽酵母のポリA分解酵素であるCcr4は、低分子量Gタンパク質Rho1のGTPase-activating protein (GAP)をコードするLRG1 mRNAの発現を負に制御する。Rho1は細胞壁合成に関与しており、ccr4Δ変異株では、LRG1の発現が上昇する結果Rho1の活性が低下し、細胞壁の合成異常となり増殖遅延を示す。ccr4Δ変異株の増殖遅延は、LRG1遺伝子の欠損で抑圧される。また、ccr4Δ変異株の増殖遅延は、Poly(A)-binding protein (Pab1)-binding protein, Pbp1 (ヒトAtaxin-2の酵母オルソログ)をコードするPBP1の遺伝子欠損によっても抑圧される。
急性肝障害における脾臓の関与

(1)同一個体ratでの門脈、大動脈血中TNF活性比較:右表の様に刺激1時間では、大動脈血中に比較して門脈血中のTNF活性が高く有意差を認めた。これは肝外より門脈を経て多くのTNFが肝臓へ集まる事を示している。(2)肝脾組織でのTNF-αmRNA発現比較:Northern blotは現在進行中で十分な結果はまだ出ていない。しかし、予備実験として行ったRT-PCRの結果では、刺激1時間では肝脾共に強いTNF-αmRNAの発現を示し以後漸減した。さらに肝での発現レベルの方が脾より低かった。(3)肝脾組織でのTNF-αmRNAin situ hybridization:肝では刺激1時間で類洞Kupffer細胞に極軽度発現が認められたのみだったが、脾では刺激0.5時間より辺縁帯部のマクロファージやリンパ鞘(T cell領域)のリンパ球に強い発現を認め3時間まで観察された。【まとめ】実験的急性肝障害早期には肝臓より脾臓のマクロファージやリンパ球より産生されるTNFが多く、脾静脈-門脈を介して肝臓へ影響を与えているものと考えられる。また、肝Kupffer細胞のTNF-αmRNA発現は意外に少なく、門脈血中の軽度のEndotoxinに常時曝露されているため刺激に対してTNF産生の抑制反応が起こっているものと考えられた。
多電荷金属クラスターの変形と分極

研究計画に基づき,以下の研究を行った。多電荷金属クラスターにおける,イオン芯変形と電子分極の効果を巨視的な液滴模型を用いて研究した。典型的なアルカリ金属クラスターであるNaクラスターを例にとって調べた。本年度は,多電荷金属クラスターが外部電場中にあるときに,エネルギーを極小化するクラスターの変形と電子の分極について調べた。外部電場としては,一価イオンによる電場を考え,イオンとクラスターの距離を変化させながら,各距離での平衡変形を求めた。クラスター変形は二通りを仮定した。一つは,クラスターとイオンを結ぶ軸を対称軸とする変形であり,もう一つはこれと垂直な軸を対称軸とする変形である。一般に,もとのクラスターの分裂度(静電エネルギーを表面エネルギーの二倍で除した量で,この量が1になると球形からの四重極変形に対して不安定となる)が大きいほど平衡変形での変形度が大きくなることなどを見出した。クラスター・イオン軸に垂直な軸を対称軸とする変形を考えたときは,イオンが近づくと分裂度が0.8を超えるような場合にクラスターが不安定化する(変形が大きくなるほどエネルギーが下がる)ことが見出された。これは,クラスターが2つのほぼ同じ大きさの破片に分裂する可能性を示している。さらに,クラスター表面の各点において静電反発力と表面張力の比を取ることで局所的な分裂度を定義し,電子分極とクラスター変形の効果をより詳細に調べた。時間依存密度汎関数法により,多価イオンが金属クラスターの近傍を通過して電子を剥ぎ取る過程を調べた。これを,半古典的な理論による結果と比較し,主要な様相が一致することを確認した。・多電荷金属クラスターにおける,イオン芯変形と電子分極の効果を巨視的な液滴模型を用いて研究した。親クラスターのサイズをn,電荷をqとしたとき,これをサイズm,電荷pとサイズn-m,電荷q-pのクラスターに分解したときの相互作用エネルギーを破片クラスター間の距離の関数として計算し,イオン芯変形も電子分極も考慮しない場合,電子分極のみを考慮した場合,イオン芯変形と電子分極の両方を考慮した場合について比較した。親クラスターの分裂度(fissility)が1を超えるような場合に,変形の効果が顕著となることを見出した。・このように荷電クラスターが2つの荷電クラスターに分かれる(分裂する)場合は,多くの場合,Na^+_3のようにサイズの小さいクラスターが放出される。親クラスターの分裂度が1に近いときには,この小クラスターが作る電場により,大きいクラスターに電子分極とイオン芯変形が生じる。これに対し,小クラスターの方のイオン芯変形はほとんど無視できる程度である。・さらに,大きい破片クラスターに,重心を結ぶ軸に垂直な軸の周りの軸対称変形を許した場合には,イオン芯変形の効果が著しく,親クラスターの分裂度が0.8程度でも,小クラスターの電場の効果により,大きい破片クラスターがさらに対称分裂するというようなより劇的な分裂が誘発される可能性を見出した。
リラキシン様蛋白で受精能獲得を誘起した豚精子のタンパクチロシンリン酸化機構の解明

本研究は科学研究費補助金(基盤研究(C))により種々の知見を得た。以下にその主要な成果を記す。ブタ精子へのリラキシン蛋白の暴露処理により、精子の生存率は平均77%ど高い割合を示し、クロロテトラサイクリン(CTC)法による精子の受精能獲得および先体反応の割合は、いずれも平均40%ときわめて高い誘起率を示したことから、リラキシン蛋白は高生存率かつ高効率でブタ精子の受精能獲得及び先体反応を誘起させる確証を得た。このようなリラキシン暴露処理精子においてタンパクチロシンキナーゼ(PTK)活性はインキュベーション時間の経過とともに上昇し、4時間後には10U/10^8 cllsときわめて高い値を示した。さらに、ウェスタンブロット法による解析から、暴露処理精子では約30kDaの位置に特異的なリン酸化タンパク質のバンドを見出すことができた。次に、約30kDaの付近に存在するリン酸化タンパク質の2次元電気泳動・プロテオーム解析の結果から、精子の受精能に関与する興味深いタンパク質である可能性が示唆され、基質分子の塩基配列決定に資する知見を得た。さらに、このリン酸化標的分子のcDNAクローンを鋳型として、pMALC2プラスミドに導入して発現ベクターを構築し、MBP(マルトース結合蛋白)との融合蛋白として発現さたることができた。この組換え体を抗原としてウサギに免疫し30kDaの基質分子のみを特異的に認識する抗体を得ることができた。この抗体を用いて光学顕微鏡レベルで精子のタンパクチロシンリン酸化部位を調べたところ、精子先体と中片部に局在していた。研究代表者によりブタ精液中で発見されたリラキシン様蛋白で受精能獲得を誘起したブタ精子におけるタンパクチロシンリン酸化の動態とその標的基質分子のプロテオーム解析に挑戦し、種々の知見を得た。1.タンパクチロシンキナーゼ(PTK)の動態とその標的となる基質分子の推移ブタ精巣より空気圧法で採取した精巣上体尾部精子を実験材料に用い、リラキシン様蛋白を150μg/mlの濃度で精子に4時間暴露処理させた。生存率は平均77%と高い割合を示し、クロロテトラサイクリン(CTC)法による精子の受精能獲得および先体反応の割合は、いずれも平均40%ときわめて高い誘起率を示し、150μg/mlのリラキシン様蛋白を4時間暴露処理したブタ精子では明らかに高効率で受精能獲得が誘起される確証が得られた。そのような暴露処理条件下の精子を用いてPTK活性を調べた結果、PTK活性はインキュベーション時間の経過とともに上昇し、暴露処理4時間では10U/10^8 cllsときわめて高い値を示した。一方、ウェスタンブロット法による解析から、暴露処理精子では約30kDaの位置に特異的なリン酸化タンパク質のバンドを見出すことができた。2.プロテオーム解析による基質分子の検索この約30kDaの付近に存在する特異的なリン酸化タンパク質をさらに2次元電気泳動・プロテオーム解析に供した。かなりの苦戦をともなったが、いくつかのスポットを見出すことが出来た。これらのスポットをかきとり、プロテオーム解析を行った結果、興味深いタンパク質である可能性が示唆された。この知見は次年度のPCRによる基質分子の塩基配列決定に資する知見であった。研究代表者によりブタ精液中で発見されたリラキシン蛋白である。今年度は,本蛋白により高生存率かつ高効率で受精能獲得を誘起したブタ精子におけるタンパクチロシンリン酸化標的基質分子の遺伝子工学的作製とその精子細胞内における局在について解析を行い,以下の知見を得た。1.リラキシン蛋白により高生存率かつ高効率で受精能獲得を誘起したブタ精子におけるタンパクチロシンリン酸化

標的基質分子の遺伝子工学的作製昨年の成果を基に,分子量30kDaのチロシンリン酸化標的基質分子のcDNAクローンを鋳型として,翻訳領域をPCRで増幅させた。増幅断片に塩基欠損や置換のないことを確認した後,pMALC2プラスミドに導入して発現ベクターを構築した。37°Cで培養し,培養液中へMBP(マルトース結合蛋白)との融合蛋白としてチロシンリン酸化分子を発現さ,アミロースカラムクロマトグラフィーで目的蛋白を分離し,さらに逆相HPLCで一本のシングルピークとして単離した。本蛋白の純度はSDS-PAGEでも一本のバンドとして認められ満足な結果を得た。2.タンパクチロシンリン酸化の標的分子の特異抗体作製と精子における局在解析上記で作製した標的基質分子の組換え体を抗原としてウサギに免疫しELISA法による抗体価を調べ,特異性をクタロニー法とWestern blot法で評価した。複数頭のウサギに免疫処理を施し,抗体作製にかなりの苦戦をしたが,最終的にリラキシン蛋白暴露処理精子の抽出液中の30kDaの基質分子のみを特異的に認識する抗体を得ることができた。この抗体を用いて光学顕微鏡レベルで精子のタンパクチロシンリン酸化部位を調べたところ,精子先体と中片部に局在していることを見出した。
高血圧ラットの血管弛緩作用に及ぼすアンギオテンシンIIの影響と揮発性麻酔薬の作用

(目的)高血圧の治療薬であるアンギオテンシンII受容体拮抗薬(A II A)の持続的投与により、揮発性麻酔薬使用下で治療抵抗性の低血圧が生じる現象について検討することである。(方法)血管平滑筋細胞内カルシウム濃度や細胞内酵素活性を測定することにより、vascular remodelingとAng IIによる血管反応性への影響および麻酔薬作用との関係を明らかにすることを計画した。(平成14年度)正常血圧ラットと高血圧ラットにおける揮発性麻酔薬に対する感受性に差が認められなかった。アンギオテンシンII (Ang II)投与による細胞内カルシウム濃度([Ca^<++>]i)増加が揮発性麻酔薬であるイソフルランにより濃度依存性に抑制された。(平成15年度)揮発性麻酔薬が細胞内microtuble networkに影響するかどうかについて検討することとした。まず、Ang IIによる血管収縮反応(細胞内機構)の中心的役割となるprotein kinase C (PKC)の酵素活性を測定するためにWestern blot法を用いた。その結果、ラット摘出大動脈における主要なPKC isozymeのうち、Ang II (10^<-7>-10^<-5>M)前処置によりノルアドレナリン(NA;10^<-5>M)の収縮が増強される現象は、PKCαの活性化によることを確認した。一方、揮発性麻酔薬であるセボフルラン(2MAC)は、Ang II前処置によるNAの収縮増強作用を抑制したが、[Ca^<++>]iは上昇しなかった。この現象に関しては次のように考えている。血管平滑筋細胞内のリン酸化酵素であるRho kinaseはミオシン軽鎖をリン酸化させ平滑筋収縮を増強する。Rho kinaseは収縮蛋白のCa^<++>感受性を増強させることにより、[Ca^<++>]i変化とは別の平滑筋収縮調節機構として働いている。Rho kinaseの活性化により血管平滑筋収縮が招来されるが、セボフルランはRho kinaseの細胞内から細胞膜分画へのtranslocationを抑制することにより血管収縮を減弱させることをWestern blot法を用いて証明した。したがって、セボフルランはPKC活性を抑制し、その結果として収縮蛋白におけるCa^<++>感受性を抑制することが示唆された。以上の知見から、揮発性麻酔薬は、血管平滑筋細胞内Ca^<++>濃度に影響を与えるだけでなく、PKCを始めとする蛋白リン酸化酵素の発現に影響を及ぼすことにより収縮蛋白Ca^<++>感受性を抑制し血管平滑筋を弛緩させる機序が考えられる。

平成14年度の本研究の実績報告臨床麻酔において最近問題となっているアンギオテンシンII受容体拮抗薬の長期服用患者における治療抵抗性の低血圧の機序について、動物モデルを用いてVascular-remodelingなど細胞内構築やsignal transductionの観点から検証することを目的とした。1.正常血圧ラット(Wistar rat)および高血圧ラット(SHR)において揮発性麻酔薬に対する感受性の差異を調べた結果、他の報告と同様、1MACの麻酔深度に必要なイソフルランの呼気中終末ガス濃度(Capnomac ; Datex Instrument)は種族間で有意差は認められなかった(Wistar rat v.s. SHR ; 1.20±0.1 v.s. 1.25±0.1)。この結果から、麻酔薬に対する感受性の種族間の差は本実験の結果にほとんど影響しないという前提が確認された。2.次に、今回の実験系において検討すべき薬剤が、細胞内シグナル伝達機構あるいは細胞内構造物の差のいずれに起因しているかどうかについて検討することとした。その結果、血管平滑筋におけるAngiotesin II receptor-mediated responseに関与する薬剤を予想できると考えた。当研究施設で培養している平滑筋細胞内のカルシウム動態をfluorescence method (CAF-110,JASCO Co, Ltd)を用いて調べた。アンギオテンシンII投与による細胞内カルシウム濃度増加が揮発性麻酔薬であるイソフルラン暴露により濃度依存性に抑制された。そして、これらの反応はnifedipine (Ca^<++> channel blocker 5×10^<-6>M)により影響を受けず、細胞外カルシウム濃度による影響受けなかったことを確認した。現在、イソフルランが細胞内microtublar networkに作用することで、アンギオテンシンIIによる細胞内カルシウム動態が影響されるかどうかについて検討中である。3.その結果次第で来年度の実験系の展開が決定される予定である。平成15年度の本研究の実績報告本研究の目的は、高血圧の治療薬であるアンギオテンシンII受容体拮抗薬(AIIA)の持続的投与により、揮発性麻酔薬使用下で治療抵抗性の低血圧が生じる現象について検討することである。今年度は、血管平滑筋細胞内カルシウム濃度や細胞内酵素活性を測定することにより、vascular remodelingとAng IIによる血管反応性への影響および麻酔薬作用との関係を明らかにすることを計画した。前年度は、正常血圧ラットと高血圧ラットにおける揮発性麻酔薬に対する感受性に差が認められなかった。アンギオテンシンII(Ang II)投与による細胞内カルシウム濃度([Ca^<++>]i)増加が揮発性麻酔薬であるイソフルランにより濃度依存性に抑制された。これらの知見により、揮発性麻酔薬が細胞内microtuble networkに影響するかどうかについて検討することとした。まず、Ang IIによる血管収縮反応(細胞内機構)の中心的役割となるprotein kinase C (PKC)の酵素活性を測定するためにWestern blot法を用いた。
顎位、頭位、全身姿勢の動的関連性:重心、気道、筋活動を媒介とする総合検査系の確立

1.頭頚部および全身姿勢検査系の開発と導入下顎骨の位置を含めた顎顔面骨格形態、頭位、全身姿勢の関連性を検討することを目的に、ビデオカメラを用いた頭頚部ならびに体幹部、およびモアレトポグラフィーを用いた経時的な背中の形態変化の同時記録を行う統合検査系を開発した。この開発に当たり、撮影時に生じる誤差と、ビデオ画像上に生じる機械的誤差の検討を行った結果これらの誤差はきわめて小さく無視できるものであった(口腔病学会誌第62巻3号P.441-450)。さらに上記の検査系にSliding gauge法を加え、脊椎の形態と顎顔面骨格形態との形態的関連性を調査し多変量解析の手法を用いて検討を行った結果、正面姿勢については、左右の肩の傾きおよびそれに対する首の傾きと、下顎の左右の偏位との間に有意な相関を認めた。また側面の姿勢においては脊椎の湾曲の度合いと、下顎の前後的位置および咬合状態との間に有意な相関を認め(第54回日本矯正歯科学会大会1995、第6回日本顎変形症学会1996)、本検査系への導入の意義が認められた。2.鼻咽腔通気抵抗検査法の導入現有する鼻咽腔通気計度(MPR-2200,日本光電工業)を上記検査系に導入した。計測法としてはマスクアンテリオール法が安定した結果が得られることがわかり、さらに.鼻咽腔通気抵抗値と姿勢形態が顎顔面骨格形態に対して有意な関連性があることを認め(54回日本矯正歯科学会大会1995)、本検査系への導入の意義が認められた。3.重心動揺検査法の導入経時的に5分間の測定が可能となるように改良を加えた平行機能解析装置(ECG-1010,共和電業)と、足底圧分布計測法(稲葉ゴム製圧力分布計測装置イナストマーPXH128)を上記検査系へ導入した。1頭頚部および、全身姿勢検査系の開発下顎骨の位置を含めた顎顔面骨格形態、頭位、全身姿勢の関連性を検討することを目的に、ビデオカメラを用いて頭頚部並びに体幹部の同時記録を行う統合検査系を開発した。同時に撮影時に生じる誤差、並びにビデオ画像上に生じる機械的な計測誤差の検討を行った結果、これらの誤差はきわめて小さく無視できるものであった。加えて、モアレトポグラフィーを導入し経時的な背中の形態変化の計測法を開発した(口腔病学会誌第63巻3号P.441-450)。更に、Sliding gauge法を導入して、脊椎の形態と顎顔面骨格形態との間に形態的な関連性に検討を加え、有意な相関を認めた(第54回日本矯正歯科学会大会1995)。2鼻咽腔通気抵抗検査法の導入現有する鼻咽腔通気度計(MPR-2200,日本光電工業)を上記検査系へ導入した。計測法としてはマスクアンテリオール法が、安定した結果が得られることがわかった。更に、鼻咽腔通気抵抗と姿勢形態が顎顔面骨格形態に対しどのように関連性を有するかの検討を行なった結果、有意な関連性を認めた(第54回日本矯正歯科学会大会1995)。3重心動揺検査法の導入平衡機能解析装置(ECG-1010D,共和電業)に改良を加え、経時的に5分間の測定が可能となるようにし、上記全身姿勢検査系にこれを加えて検討を行っている。更に、足底圧分布計測法(稲葉ゴム製圧力分布計測装置イナストマーPXH128)を開発し上記統合検査系への導入をはかり、現在データの集収中である。この経緯は、平成8年第6回日本顎変形症学会にて発表を行う予定である。

1.頭頚部および全身姿勢検査系の導入昨年度の本研究により、下顎位を含めた顎顔面骨格形態、頭位、全身姿勢の関連性を検討することを目的に開発された統合検査系を用いデータの収集を行い、多変量解析の手法を用いて検討を行った。その結果、正面姿勢においては、左右の肩の傾きおよびそれに対する首の肩きと、下顎の左右の偏位との間に有意な関連性を認めた。また側面の姿勢においては脊椎の彎曲の度合いと、下顎の前後的位置および咬合状態との間に有意な関連性を認めた(第6回日本顎変形症学会1996)。2.鼻咽喉通気抵抗検査法の導入現有する鼻咽喉通気度計(MPR-2200,日本光電工業)を上記検査系に導入しデータの収集を行っている。これと平行して、これまでとらえることのできなかった下咽頭部の通気度の計測を可能とし、現在データの収集中である。3.重心動揺検査法の導入経時的に5分間の測定が可能となるように改良を加えた平衡機能解析装置(ECG-1010,共和電業)を上記検査係へ導入し、顎顔面骨格形態および全身姿勢との関係を生理学的背景および力学的背景から検討を行っているこの結果は今後発表を行う予定である。。
ネズミギス目魚類の分子系統と形態進化

ミトコンドリアゲノムデータに基づきネズミギス目と周辺魚類の分子系統解析を行い,その結果を論文としてまとめ投稿した.ネズミギス類は陸上最大の淡水魚群である骨鰾類の基部を形成する魚群で,条鰭類の海水から淡水への進入の鍵を握る一群である.さらに形態的にも特異なグループとして知られ,近年の解析からシラスの親として知られるニシン類の根幹にも位置する可能性が指摘されており,ネズミギス目の系統解明は特殊な仔魚形態の進化の道筋にも大きな示唆を与える.ネズミギス目には34種の魚類が含まれているが,これまでに7種の魚類を採集しミトコンドリアゲノムデータを決定した.既存のカライワシ類,ニシン類,骨鰾類などの下位真骨類と正真骨類のデータを合わせ合計38種のミトコンドリアゲノムデータを用いて予備的な解析を行った.38種から得られたミトコンドリアゲノム全長配列(ND6遺伝子と調節領域を除く)を,5区分(1st,2nd, and 3rdコドンポジション;tRNA遺伝子;rRNA遺伝子)し,タンパク質領域の形質の取り扱が異なる3つのデータセット1)3rdコドンポジション無し(9957ポジション);2)3rd cコドンポジション有り(13,461ポジション);3)アミノ酸配列(6453ポジション),を作成して,ベイズ法,最尤法,最節約法を用いて系統解析を行った.その結果,ネズミギス目はOtophysiの姉妹群となり,その外側にニシン類が分岐することが示唆され,形態データに基づく研究で支持されてきた伝統的な仮説を再現した.本研究で得られた結果は,骨鰾類がシクリッド類など他の二次的淡水魚と異なり,4億年を超える昔から淡水域に生息し続けていたことを示唆した.ミトコンドリアゲノムデータに基づきネズミギス目と周辺魚類の分子系統解析を行い,その結果を論文としてまとめ投稿した.ネズミギス類は陸上最大の淡水魚群である骨鰾類の基部を形成する魚群で,条鰭類の海水から淡水への進入の鍵を握る一群である.さらに形態的にも特異なグループとして知られ,近年の解析からシラスの親として知られるニシン類の根幹にも位置する可能性が指摘されており,ネズミギス目の系統解明は特殊な仔魚形態の進化の道筋にも大きな示唆を与える.ネズミギス目には34種の魚類が含まれているが,これまでに7種の魚類を採集しミトコンドリアゲノムデータを決定した.既存のカライワシ類,ニシン類,骨鰾類などの下位真骨類と正真骨類のデータを合わせ合計38種のミトコンドリアゲノムデータを用いて予備的な解析を行った.38種から得られたミトコンドリアゲノム全長配列(ND6遺伝子と調節領域を除く)を,5区分(1st,2nd, and 3rdコドンポジション;tRNA遺伝子;rRNA遺伝子)し,タンパク質領域の形質の取り扱が異なる3つのデータセット1)3rdコドンポジション無し(9957ポジション);2)3rd cコドンポジション有り(13,461ポジション);3)アミノ酸配列(6453ポジション),を作成して,ベイズ法,最尤法,最節約法を用いて系統解析を行った.その結果,ネズミギス目はOtophysiの姉妹群となり,その外側にニシン類が分岐することが示唆され,形態データに基づく研究で支持されてきた伝統的な仮説を再現した.本研究で得られた結果は,骨鰾類がシクリッド類など他の二次的淡水魚と異なり,4億年を超える昔から淡水域に生息し続けていたことを示唆した.
カーボン超微粒子の高速衝撃における硬質非晶質炭素膜の潤滑性保護膜効果

1.直流高電圧を印加した真空中の平行平板電極間で、カーボン超微粒子(200【A!°】径)の静電界による帯電、凝集状態からの分離、加速という一連の高エネルギ化プロセスとその機械的な高パワー密度衝撃とに基づき、常温基板(陰極)上に硬質の非晶質半動体炭素膜を効率的(800【A!°】/mn)に作製する方法を開発した。2.作製膜の内部構造は、低抗率とその温度特性およびこれらの熱処理に伴なう変化、ならびに硬さの測定結果より、固体間の高速衝撃効果を受けて炭素原子の4配位結合状態と高密度な格子欠陥(ダングリングボンド)とを内在する非晶質構造に変化したものと評価される。3.潤滑性保護膜への適用を想定し、硬質炭素膜の潤滑機構と摩耗開始条件とを明確にすることを主目的とする同一軌道上すべり摩擦実験を各種雰囲気・摩擦条件下で実施した結果、(1)大気中では、摩擦係数が表面吸着分子の被覆率によって一義的に規定されるという典型的な境界潤滑特性が認められ、関与する吸着種は物理吸着した水分子(吸着熱36KJ/mel)とみられる。(2)プラズマ法・ダイヤモンド状炭素膜での知見と同様の極低摩擦状態(摩擦係数;0.02前後)が確認された。この状態は、分子の吸着と摩擦作用による脱離とが低い被覆率で平衡を保つような摩擦条件で成り立つ。(3)上記の平衡条件が成り立たない摩擦状況(高速,高負荷,低湿度)では、低摩擦状態を経て微上摩耗粉の排出が開始し、異質な界面状態になることで摩擦係数は漸増する。これらの結果は、水分子が炭素膜本来の潤滑性能を阻害する因子として働く一方で、活性な表面欠陥にターミネータ(終端子)として結合することで摩耗の開始を遅らせる役目をも兼ねていることを示唆している。
中世寺社縁起絵の総合的研究

寺社縁起・祖師伝を大画面に描いた中世の掛幅絵を中心対象とし、原本の調査、物語の現地調査を重ね、相対的に研究が手薄となっているこの分野の基礎資料を蓄積するとともに、周辺の仏教説話画・絵巻・垂迹画などとの関係も分析して、関連する専門分野の横断的な議論を深めた。特に、原本調査等にもとづく図柄の読み取りを反映させたトレース図を作成し、展示や出版にも活用した。また海外の日本研究者とともに国際シンポジウムを開催して、作品の魅力を発信することに努めた。平成19年度は、八回の研究会(延13名の研究報告)、四回の調査を行い、また学習院大学人文学研究所とパリ第七大学、INALCO共催の日仏国際シンポジウムLes croyances etles arts dansle Japon medieval(中世日本の信仰と芸術文化)で阿部泰郎と佐野みどりがそれぞれ「宗教図像テクスト複合としての聖徳太子絵伝」「中世掛幅縁起絵のマトリックス」研究報告を行った。また、学習院大学人文科学研究所共同プロジェクト「中世掛幅縁起絵の総合研究」と共同で「聖徳太子絵伝(飯田市美術博物館)」、「誓願寺縁起絵」、「観興寺縁起絵」「石清水八幡宮曼茶羅(大倉集古館)」「清園寺縁起絵」のトレース図制作を行った。研究スタッフやゲストを招いての、これら研究会や調査での活発な意見交換は、作品の熟覧調査による図様細部の確認を経ての個別作品研究と文学および思想史での宗教文化研究をすり合わせ、縁起絵に表象された宗教的世界観の個別的な解析、絵画、彫刻や寺社建築、芸能および宗教儀礼など視覚表象と文学テクストが形成する複合的な中世信仰の様態への考察を深めることとなった。なお、本年度の研究対象となった作例・事象は、「釈迦八相涅槃図(開善寺)」「聖徳太子絵伝(飯田市美術博物館)」「同(旧満性寺本)」「箱根権現縁起絵巻」「親鸞聖人絵伝」「法然上人絵伝」「善光寺如来絵伝」「法華経曼茶羅(本法寺)」「源誓上人絵伝」「桑実寺縁起絵巻」「清園寺縁起絵」「道智上人夢想記(金光寺『仏説目連救母経』紙背)」「春日権現験記絵」「志賀海神社の祭祀」「北野社の託宣」『聖法輪蔵』『善光寺如来伝私考』などである。これら研究の果実は、次年度、次々年度の作品研究の進展とあわせ、平成21年度末に研究報告としてまとめる予定である。平成20年度は、調査と研究会を中心に活動を進め、前年度に引き続き国際シンポジウムを行った。調査に関しては、作品に関する新知見を得ると同時に、データの集積をすすめた。前年度分とあわせ、作品調査のデータは、所蔵機関等のご許可がいただけるものに関して、順次公開を目指し、画像データの整理を行っている。中世寺社縁起および周辺の中世絵画や中世文学の研究に、これら作品の詳細なデータの開示は大いに寄与することになるだろう。また研究会では、メンバーの研究発表のほかに、国内外から研究者を招きし、中世の信仰と造形に関する新たな研究成果をご披露いただいた。とりわけ海外で開催したワークショップ、シンポジウムによって、中世寺社縁起絵研究の知名度もあげている。様々な土俵に立つ研究者との交流によって、文学・歴史・造形史・思想史などそれぞれの分野に蓄積した知見や論点を共有しつつあり、それがまた新たな研究の視座を切り開くことともなっている。聖徳太子絵伝に関する研究の一端は、飯田市美術博物館・特別展示「伊那谷の仏教絵画-聖徳太子絵伝と真宗の宝を集めて-」(2008年9月6日10月5日)を同館と共催し、シンポジウム「中世説話画研究の可能性-真宗絵伝を中心に-」も行った。(基調講演・米倉迪夫「中世高僧伝絵を読む」、報告・藤原重雄「飯田市美術博物館蔵「聖徳太子絵伝」トレース図作成について」鴈野佳世子氏(東京藝術大学大学院)「源誓上人絵伝の想定復元模写について」なお、平成21年3月24日、25日米国メロポリタン美術館で行った国際シンポジウム「中世日本の基層文化--信仰と芸術--」の発表者(海外研究者、連携研究者の発表タイトルも付す)は以下の通りである。:佐野みどり、ケヴィン・カー「Figuring Korea and Japan in Fourteenth-century Kyushu (14世紀<九州絵巻>にみる韓国と日本の表象)」メラニー・トレーデ「The Life and Afterlives of Hachiman Painting」、阿部泰郎、渡邊雅子「壁画から掛幅へ--山西省金時代壁画(仏伝図)を中心にして」、土谷真紀「釈迦堂縁起絵巻の構造」、シネード・キヨー「メトロポリタン美術館蔵「拾遺古徳伝絵」の断簡と画中画」、阿部美香「異界巡歴譚の宗教的背景とその図像化」、藤原重雄、小平美香「女性神職の祭祀

形態に見られる神信仰」島田健太郎「中世の聖徳太子信仰」エステル・リジェリー・ボエール「源氏絵に見る信仰の形」平成21年度も基本的に前年度の方針を継承し、調査と研究会を中心に活動を進め、飯田市美術館本聖徳太子絵伝を研究対象の中核作品として、根津美術館本善光寺如来縁起絵、メトロポリタン美術館本聖徳太子絵伝、静嘉堂文庫美術館本聖徳太子絵伝などの検討を行った。その成果は、学習院大学史料館に於いて展覧会「掛幅縁起絵研究の現在-模写・トレース・復元-」(2009年12月8日12日)と、シンポジウム(2009年12月12日、学習院大学、報告者8名)において集約的に開示し、少なからぬ観覧者を得た。なお、この展示用に作成した解説パネルの一部は現在、飯田市美術博物館のロビー展示としても利用されている。また、3年間の研究報告から、18編の論考を集め、佐野みどり・新川哲雄・藤原重雄編『中世絵画のマトリックス』(青簡舎、全449頁、2010年9月)を刊行した。収録論文は、掲載順に以下の通りである。佐野みどり「中世掛幅縁起絵序説』、阿部泰郎「宗教図像テクスト複合としての聖徳太子絵伝」、織田顕行「飯田市美術博物館「聖徳太子絵伝について」、藤原重雄「掛幅本鞍馬寺縁起絵の絵画史的位置」、原口志津子「本法寺法華経曼茶羅にみる掛幅説話絵の論理」、池田美弥子「蜜月生まれの絵画-掛幅縁起絵の構造から」、新川哲雄「『一遍聖絵』の語る『聖』」、メラニー・トレーデ「永享五年八幡縁起絵巻の生涯とその余生」、加藤みち子「温泉寺縁起の思想的背景」、林東洋「『古語類要集』にみる十種神宝図について」、小平美香「中世における「子良」の諸相」、米倉迪夫「描かれた明石-法然上人伝法絵と一遍聖絵」、丸山陽子「『伊勢新名所絵歌合の邸宅図と和歌』、阿部美香「二所三島の社頭図-中世霊地図像の展開」、高岸輝「清水寺縁起絵巻の空間と国土」、土谷真紀「「鞍馬蓋寺縁起絵巻」における縁起と景観」、上野友愛「洛外名所絵から洛中洛外図屏風へ」、茨木恵美「滋賀県立近代美術館蔵「近江名所図屏風」の景観イメージ」以上のごとく、中世掛幅縁起絵とその周辺を思想史、文学、中世史、美術史など諸分野からの多彩に立論した本書の刊行は、研究グループの分野横断的構成の有効性を示すものでもある。
転写超複合体による植物の細胞周期制御とその作用メカニズム

動物では、複数の転写因子を含む転写超複合体によって、細胞周期特異的な遺伝子の発現が制御されることが報告されている。一方で、植物における制御の仕組みはよくわかっていなかった。本研究では、シロイヌナズナの遺伝子の中から動物の転写超複合体に含まれる因子と相同性のあるものを探索し、その突然変異体の表現型観察や網羅的な遺伝子発現解析を行った。その結果、植物においても転写超複合体の存在が示され、細胞周期に関する遺伝子の発現を統合的に制御する仕組みの一端が明らかとなった。シロイヌナズナには,ヒトのDREAM complexを構成するLIN9と類似性の高いタンパク質をコードする遺伝子が3個存在するが(ALY13),それらの機能はわかっていなかった.そこで今年度は,このALYの機能を明らかにすることに重点をおいて研究を行った.それぞれの単独変異体を入手して表現型を調べたところ,野生型と違いは見られなかった.ALYは機能が重複していると考えられたため,単独変異体の交配による三重変異体の作出を試みた.しかし配偶体致死により得ることができなかったため,二重変異体の解析を行った.その結果,種子や幼植物体の巨大化や胚発生の異常など,抑制型R1R2R3-Mybの変異体とよく似た表現型が見られた.特にaly1 aly2二重変異体では,分裂パターンの異常な胚や,発達の停止した胚珠が高頻度に出現することがわかった.今年度の研究から,ALYは特に初期胚の発達に重要な役割を果たしているという新たな知見が得られた.続いてaly1 aly2二重変異体の幼植物体を用いて,RNA-seqによる網羅的な遺伝子発現解析を行った.その結果,発現が上昇していた遺伝子の中に,E2FのターゲットであるG1/S期遺伝子とR1R2R3-MybのターゲットであるG2/M期遺伝子が多く含まれることがわかった.これは,ALYがMyb-E2F超複合体の一員として,細胞周期関連遺伝子を負に制御している可能性を示すものと考えられた.シロイヌナズナにはE2Fをコードする遺伝子が6個存在し,E2FAC,E2FDFの2つのグループに分けられるが,多重変異体の解析はほとんど行われていなかった.そこで今年度は,それぞれのグループの三重変異体を作出して解析を行った.その結果,e2fa e2fb e2fc三重変異体の生育は正常であったが,e2fd e2fee2ff三重変異体は植物体が小さくなるなどの異常を示すことがわかった.今年度の研究計画のうち,DREAM complex構成因子の植物ホモログの解析については,ALYに関する研究に順調な進展が見られた.多重変異体を作出し,その表現型解析やトランスクリプトーム解析の結果から,ALYの機能について新たな知見が得られた.一方でMyb-E2F超複合体の構成因子の同定については,研究の前提となる事実に疑問が生じ,まずはそれを確認するための実験を優先して行った.活性化型のE2FとされていたE2FAとE2FBの二重変異体のRNA-seq解析を行ったところ,発現量が増加した遺伝子にE2FのターゲットであるG1/S期遺伝子が多く含まれていた.一方で抑制型のE2FとされていたE2FCの変異体では,G1/S期遺伝子の変動がほとんど見られなかった.これらの結果は,これまでに報告されていたE2Fの機能と矛盾し,残りの3個のE2F(E2FDF)を含めて機能の冗長性について再検証する必要があるとの結論に至った.そこで今年度は,E2Fの多重変異体の作出と解析を優先して進めたため,今年度に計画していた共免疫沈降などの実験をほとんど進めることができなかった.以上のことから,全体的な進捗状況として「やや遅れている」とした.シロイヌナズナには、細胞周期を制御する転写因子複合体である動物のDREAM complexの構成因子であるE2Fのオルソログが6個存在し、E2FACとE2FDFの2つのグループに分けられる。今年度はE2FAの機能を完全に欠失した変異体を用いて、多重変異体の解析を行った。その結果、e2fa e2fb二重変異体は胚性致死の表現型を示すことがわかった。その原因は、雄性配偶体で起こる雄原細胞の分裂が阻害され、本来2つできる精細胞が1つしかできず重複受精に失敗することにあった。従ってE2FAとE2FBは細胞分裂に必須であり、その機能には冗長性があることが遺伝学的にも明らかとなった。一方で、e2fd e2fee2ff三重変異体は植物体が小さくなるものの、致死とはならないことを昨年度に報告した。今年度は三重変異体の幼植物体を用いて、RNA-seqによる網羅的な遺伝子発現解析を行った。その結果、発現が上昇していた遺伝子の中に、E2FのターゲットであるG1/S期遺伝子が多く含まれることがわかった。これはe2fa e2fc二重変異体でも同様であったことから、シロイヌナズナにおけるE2Fの主要な機能は、G1/期遺伝子の抑制であることが示された。今年度は、ヒトのDREAM complexを構成するLIN9のオルソログと推定されるALYの解析も進めた。GUSレポーターを用いてALY1とALY2のプロモーター解析を行ったところ、どちらも幼植物体の全体で発現し、発現のパターンは細胞周期特異的でないことが明らかとなった。

また前年度に行ったaly1 aly2二重変異体のRNA-seqの結果を詳細に調べたところ、G1/S期遺伝子の変動がe2fa e2fc二重変異体と非常に似ていることがわかった。従って、ALYはE2Fと協働して多くのG1/S期遺伝子を制御していると考えられた。動物では、複数の転写因子を含む転写超複合体によって、細胞周期特異的な遺伝子の発現が制御されることが報告されている。一方で、植物における制御の仕組みはよくわかっていなかった。本研究では、シロイヌナズナの遺伝子の中から動物の転写超複合体に含まれる因子と相同性のあるものを探索し、その突然変異体の表現型観察や網羅的な遺伝子発現解析を行った。その結果、植物においても転写超複合体の存在が示され、細胞周期に関する遺伝子の発現を統合的に制御する仕組みの一端が明らかとなった。研究計画のうち,DREAM complex構成因子の植物ホモログの解析については,ALYについての研究を引き続き行う.ALYの変異体とR1R2R3-MybまたはE2Fの変異体を交配し,aly mybまたはaly e2f多重変異体を作出する.多重変異体の表現型観察やトランスクリプトーム解析を行い,それぞれの単独変異体で見られる表現型と比較することによって,ALYとR1R2R3-MybやE2Fとの関連を遺伝学的に明らかにする.またALYの三重変異は配偶体致死を引き起こすことがわかったが,遺伝子導入によって三重変異体の個体を取得し,その表現型を調べる.具体的には,DNA配列の部位特異的組換えを誘導するCre/loxPシステムを二重変異体に導入し,受精後の個体発生が進んでから残りの遺伝子を欠損させるといった方法を考えている.Myb-E2F超複合体の構成因子の同定については,まず前年度に作出したe2fの三重変異体(e2fa e2fbe2fcおよびe2fd e2fee2ff)のトランスクリプトーム解析を行う.E2FのターゲットであるG1/S期遺伝子の発現にどのような変動が見られるかを調べ,E2Fの機能やその冗長性を明らかにする.続いて,前年度に計画していた共免疫沈降と質量分析の実験を進める.E2Fの機能がはっきりとしなかった場合は,実験の対象を活性化型と抑制型の機能がわかっているR1R2R3-Mybに絞り込む.その後に計画していたChIP-seq解析については,最低でも一つのサンプルでは行えるように実験を進める.植物分子遺伝学