hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ライフステージを通しての吃音児者の実態に即した支援法の構築

アイオワ式吃音重症度評定尺度による初診時重症度は7(事例A)、4(事例B・C)、6(事例D)。(2)言語指導:遊戯的要素をとり入れて実施(平成17年度研究実績報告書)。(1)ゆっくり、ひき伸ばし気味の発話、(2)柔らかな起声・発話、(3)劇遊び(事例Dのみ)。(3)言語指導終了後に遊戯療法を実施。さらに、親面接を通して環境調整を実施。2.経過:支援は月1回程度のペースで実施。事例Dに対しては、音への過敏性などに配慮しながら指導。本支援を通して、事例B・Cは治癒、事例A・Dは重症度21に軽快した。3.考察:言語指導に焦点を当てた支援の効果が示唆された。III調査研究(1)女性吃音者21人を対象として上記調査を実施。差恥心がつよかった、吃音を隠そうとしたという回答が多くみられ、電話応対、発言・発表、人づき合い等における悩みや苦労について提示された。女性限定の支援は必要であるという回答が多かった。(2)成人吃音者51人を対象として上記調査を実施.学校教育期において、中学校で吃音重症度が高い傾向がみられた.教師に望まれる配慮・支援事項については、朗読、発言・発表、からかい、吃音の理解などで選択回答率が高かった.1目的ライフステージを通しての吃音児者の実態に即した支援法構築の一環として、(1)吃音幼児1例を対象とした事例研究、(2)調査研究として、高等教育機関における吃音のある学生に対する配慮・支援の要望、について検討を行った。2事例研究(1)方法:1)対象児:発吃2歳0ヵ月の3歳5ヵ月の女児。発話困難の意識あり。工夫、情緒性反応あり。アイオワ式吃音重症度評定尺度による初診時重症度4。2)言語指導:遊戯的要素をとり入れて実施(平成17・18年度研究実績報告書)。(1)ゆっくりとした発話、(2)柔らかな起声・発話。3)児童中心遊戯療法を言語指導の前後に実施。(2)経過:本指導は3週間に1回程度の頻度で実施。本指導を通して工夫、情緒性反応は消失、重症度21に軽快した。(3)考察:言語指導に焦点を当て、環境調整、遊戯療法を併用した本指導の効果が示唆された。3調査研究(1)対象者:上記調査について、大学、短期大学に在籍経験のある2030歳代の吃音者31人より主に複数回答方式で選択回答を得た。(2)結果:学校側に望まれる配慮・支援事項については、吃音の理解(58%)・情報提供(48%)、就職活動(45%)等で高かった。授業等に関連する項目では、発言・発表(32%)、音読(32%)、集団討論(23%)等で高かった。周囲の人との関係では、セルフヘルプグループ(52%)、吃音の専門家(36%)、心理の専門家(29%)、希望職種の人(26%)等で高かった。施設・設備については、学生相談室(29%)、就職支援室(26%)等で高かった。(3)考察:吃音および近接領域の専門家のいる学部・学科、学生相談室等が中心となり、具体的な配慮・支援方法の提示、情報提供や啓発、そのための環塊整備が求められる。
プロテオミクス解析による転写因子MafK制御ネットワークの解明

本研究の主題は、転写因子MafKによる標的遺伝子の転写抑制化から活性化への制御機構を理解することにある。そこで、MafKによる転写制御に関与する因子の同定を目指して、MafK複合体を精製し、メチオニンアデノシル基転移酵素(MATII)を同定した。本研究は、核内に局在するMATIIがMafK標的遺伝子であるヘムオキシゲナーゼ1(HO-1)の転写を抑制的に制御することや、ゲノム全体のDNAやヒストンH3K4ないしH3K9のメチル化修飾を包括的に制御していることを明らかにした。本研究の主題は、転写因子MafKによるBlimp-1遺伝子の転写抑制化から活性化への制御機構を理解することにある。そこで、私はMafKによる転写制御に関わる因子の同定を目指して、MafKを中心とした転写制御複合体の精製を試みた。まず、マウス形質細胞腫由来のX63/0細胞株にFLAGとHA、ヒスチジンタグを融合させたMafK蛋白質の発現細胞株を樹立した。この細胞から抗FLAG抗体とニッケルレジンの二段階アフィニティー精製法によって、MafK蛋白質複合体を精製し、その構成因子を質量分析法によって解析した。その結果、MafKとヘテロ二量体を形成する転写因子Bachlや、クロマチン構造に変化をもたらすFACTやKu、PARP1などが同定された。また、メチル基転移酵素の基質であるS-アデノシルメチオニン(SAM)の合成酵素、メチオニンアデノシル基転移酵素(MATII)も同定された。さらに、MATIIが細胞質分画だけでなくクロマチン分画にも存在することを、X63/0細胞株とマウス赤白血病由来のMEL細胞による分画抽出から明らかにした。そこで、MATIIが標的遺伝子のMaf認識配列(MARE)に存在しているのかどうかを確かめるために、MEL細胞を用いて抗MATII抗体によるクロマチン免疫沈降実験をおこなった。その結果、βグロビン遺伝子のプロモーター領域やDNaseI感受性領域(HS2)のMAREにMATIIが存在することを明らかにした。このことから、MafK蛋白質複合体は、MATIIとともに局所的にSAMを供給し、メチル基転移酵素によるヒストンやDNAなどのメチル化を促進する可能性がある。そこで、私はMafKによる転写制御に関わる因子の同定を目指して、MafK転写制御複合体の精製から、メチオニンアデノシル基転移酵素(MATII)を同定した。この因子がMafK蛋白質複合体の構成因子であることを証明するために、RNA干渉法を用いて、Hepa1c1c7細胞におけるMATIIの発現を減弱(ノックダウン)させた。その結果、MafKの標的遺伝子であるヘムオキシゲナーゼ(HO-1)の発現が増加し、酸化ストレス誘導による発現も増強した。また、MATIIによるHO-1遺伝子の転写制御に、その酵素活性が必要であるかどうかを確かめるために、MATIIの活性中心である134番目のアスパラギン酸の変異体(D134A)をHepa1c1c7細胞に過剰発現させた。その結果、MATIIをノックダウンさせた場合と同様に、酸化ストレス誘導によってHO-1の発現が増強した。このことから、HO-1遺伝子の転写抑制化には、MafK/Bach1のヘテロ二量体だけでなく、MATIIの酵素活性も必要であることが明らかになった。一方で、MATIIをノックダウンさせることによって、ヒストンH3K4ないしH3K9のメチル化がゲノム全体で包括的に減弱した。また、繰り返し配列やレトロトランスポゾンが含まれるヘテロクロマチン領域のDNAメチル化も減弱し、これらの領域由来の転写物が増加した。このことから、MATIIはゲノム全体のクロマチン構造に影響を及ぼす可能性が示唆された。
脳における痒みの神経伝達機構と伝達経路の解析

脊髄や脳などの中枢における痒みの神経伝達機構は痛みに比べてほとんど明らかになっていない。本研究では脊髄におけるNMDA受容体のGluN2Bのリン酸化はヒスタミンやクロロキンなどの痒み伝達には重要であることを明らかにした。一方、セロトニンの痒み伝達はこれとは異なる機構により介されていた。このような異なる刺激による痒み伝達が脊髄においては異なる伝達経路を介しているのかを明らかにするためにテトラサイクリン発現誘導システムやIn-situと免疫染色の共染色を組み合わせた解析を行った。さらに、脳における痒み伝達経路を網羅的に探索するために慢性痒みモデルマウスを作製し、c-fosの発現解析を行った。痒みの研究はこれまで末梢組織を中心に行われており、脊髄や脳における痒みの伝達、制御機構はまだよく分かっていない。そこで、本研究では脊髄や脳における痒み特異的な伝達経路、伝達機構を明らかにすることを目的としている。初めに頬への痒み刺激が三叉神経脊髄路核においてどのように伝達、制御され脳へと出力されるのか、ノックアウトマウスを用いた遺伝学的、生化学的な解析を行った。NMDA受容体(NMDAR)のNR2Bサブユニットのリン酸化部位を消失させたノックインマウス(NR2B Y1472F-KI)では様々な痒み物質への応答が野生型に比べて大きく低下した。一方、痛みに対する応答は正常であった。このことからNR2Bのリン酸化は痒み特異的な神経伝達に重要であることを明らかになった。さらにこのNMDARの活性化は、痒み特異的な経路として報告されているGRP経路の上流で働くことを明らかにした。これらの研究成果を論文にまとめEuropean Journal of Neuroscienceに投稿した。次に、脳における痒みや痛みの伝達、制御領域を網羅的に解析するために、痒み刺激後の活動神経をc-fosやArc遺伝子の発現を指標とした全脳イメージング解析を進めている。arc-dVenusマウス、fos-tTA/fos-shEGFPマウスを入手し頬に痒み物質を投与した場合のシグナルを比較したところarc-dVenusの発現はfos-shEGFPマウスに比べて弱く発現細胞数も少なかった。そこでfos-tTA/fos-shEGFPマウスを用いて頬に痒み物質であるクロロキンや痛み物質であるカプサイシンを投与した後に固定して、脳サンプルを作製した。これらのサンプルを用いて大阪大学の橋本均先生との共同研究により全脳にわたる3Dイメージングを行っている。本研究は「脊髄における痒み特異的な神経伝達機構の解明」と「脳における痒み伝達経路の解明」の2つのテーマを明らかにすることを目的としている。脊髄における解析ではNMDARの活性化が痒み伝達に関わることを初めて明らかにし、さらに既知の痒み経路との関わりも明らかにすることで目標達成へ大きく前進することができた。今後は慢性的な痒みにおいて脊髄レベルで感作などの可塑的な変化が起こっているのか解析していく予定である。脳における解析ではfos-EGFPマウスを用いた痒みや痛み刺激後の脳サンプルの作製をを行った。今後、これらのサンプルを用いて3D全脳イメージングを行い、痒みと痛み伝達経路の違いを明らかにしていく予定である。NMDA受容体(NMDAR)のNR2Bサブユニットのリン酸化部位を消失させたノックインマウス(NR2B Y1472F-KI)において、ヒスタミンやクロロキンなど様々な痒み物質に対する掻破行動が野生型マウスに比べて大きく低下することを発見した。この原因を明らかにするために三叉神経脊髄路角におけるc-fosの発現解析を行ったところ、Y1472Fマウスでは野生型と比較してクロロキン刺激に対するc-fosの発現が大きく低下していることが明らかになった。さらに、大槽内への様々な作動薬、阻害剤の投与実験から多くの痒み伝達にはNR2Bのリン酸化が重要であり、NMDA受容体を介して痒み刺激が伝達されていることが示された。一方で、セロトニンや5-HT2セロトニンレセプタ-の作動薬であるα-メチルセロトニンに対する掻破行動は野生型とY1472F-KIでは優位な差が見られなかった。c-fosの発現解析においても、Y1472Fマウスは野生型差が見られず、また、NR2Bの選択的な阻害薬の大槽内投与は、セロトニンに対する掻破行動に変化をあたえなかった。このことからヒスタミンやクロロキンと異なり、セロトニンに対する痒み伝達においてNR2Bのリン酸化が重要ではないことが示唆された。三叉神経脊髄路角においてセロトニンはNMDA受容体を介さない別経路で伝達されていると推測される。痒みが脳においてどのように伝達され痛みと区別されているのかまだ分かっていない。このことを明らかにするために、マウスの毛剃りした左頬にビタミンD3のアナログ体であるMC903を塗布し、慢性的な痒みモデルの作製を行った。このマウスを用いて脳の連続切片を作製し、c-fosの発現解析を行った。痛み応答に関わる傍小脳脚核や体性感覚野、外側扁桃体などにおいて強いc-fosの発現が見られた。現在、痒みに特異的に応答する脳部位の探索を行っている。

本研究では脊髄におけるNMDA受容体のGluN2Bのリン酸化はヒスタミンやクロロキンなどの痒み伝達には重要であることを明らかにした。一方、セロトニンの痒み伝達はこれとは異なる機構により介されていた。このような異なる刺激による痒み伝達が脊髄においては異なる伝達経路を介しているのかを明らかにするためにテトラサイクリン発現誘導システムやIn-situと免疫染色の共染色を組み合わせた解析を行った。さらに、脳における痒み伝達経路を網羅的に探索するために慢性痒みモデルマウスを作製し、c-fosの発現解析を行った。三叉神経脊髄路角におけるc-fos発現解析の結果、痒み刺激と痛み刺激では非常によく似た位置のニューロン群が活動していることが明らかになっている。脳においても痛みと痒みで近接した脳領域が活性化されることが予想される。そこで脊髄や脳における痒みと痛みの神経回路を区別するためにDREADD(Designer Receptors Exclusively Activated by Designer Drug)システムやジフテリア毒素受容体(DTR)を用いた人為的な神経活動操作を行い、痒みや痛みが変化するかを解析する。現在、TRE-hM4Diマウスを入手しfos-tTA/cfos-EGFPマウスとの掛け合わせを行っている。このマウスを用いて痒み刺激後にCNOを局所投与することによりc-fos発現細胞の活動を抑制することができる。そこで、痒みに応答する神経回路を抑制した場合に痛みへの応答が変化するか解析し、痒みと痛みを伝達する神経回路を区別する。さらにTREプロモーター下でDTRを発現するTRE-DTRマウスも作製中である。このマウスをジフテリア毒素を投与することによりc-fos発現細胞を特異的に破壊することが可能である。慢性的な痒みのモデルとしてビタミンDアナログであるMC-903を1週間頬に塗布し自発的な掻破行動を示すアトピーのモデルマウスを作製した。これらのマウスの三叉神経脊髄路角おいて痒み神経伝達の可塑的変化が起きているのかを明らかにするために、大層内にNMDAやGRPの痒み伝達物質を投与し、痒みの応答が変化しているかを解析する。脳における痒み伝達経路の解明に向けて、作製したfos-EGFPマウスの脳サンプルの全脳イメージングを進める。痒み伝達に関わる脳領域が明らかになれば、DREADDシステムやDTR発現により人為的にその領域の神経活動を抑制し、痒みや痛みへの応答が変化するか明らかにする。痒み実験動物飼育費や必要な試薬の購入費が実験の進行により変化したため当初の予定より少ない使用額となった。痒み伝達の解析において神経伝達物質やその阻害剤は高価であり本年度未使用分の助成金はその購入に用いる予定である。
生物の３Ｄ形態を構築するロジック

昨年度までの主な共用設備としては、レーザー顕微鏡、ライトシート顕微鏡、2台の3Dプリンター、3Dの計算ソフト、さらに29年度にX線マイクロCT装置(ブルカ製・スカイスキャン1172)を購入し、共用の機器として運用を開始した。この装置は一括購入すると2600万円するため、29年度から3年間で支払いを分割している。(本年度は2年目)設置場所は、大阪大学生命機能研究科の近藤研究室である。大阪大学の近藤研究室、松野研究室の研究に不可欠なものとなっており、平成30年度には、CTのデータを中心とした論文が3報発表された。運用は、近藤研究室内にオペレータを配置し、全班員の要求に答えられるようにシステムになっている。その他の総括班費の使途は、通常年度と同じく、全体を統括する事務員の給与、班会議、2回行う合宿費とそれに伴う旅費などである。班会議は、計画班員が2名所属する北海道内の会議施設で5月に行った。約150名の参加者があり、活発な議論が行われた。また、前年にUC Irvineで共同会議を行った際の、先方の責任者2名を加えることで、国際的な会になり、非常に好評であった。夏冬の合宿に関しては、引き続き、人数を絞り、淡路島で約40名を集めて行った。一人当たりの発表時間を2時間以上取れたことで、十分な議論がなされたと考える。班員間の共同研究の状況は非常に活発であり、総括班の活動は順調に推移しており、研究を後押ししている。計画班員のうち准教授2名(大澤、井上)が平成31年4月付で、それぞれ名古屋大学、京都大学の教授に就任しており、助教1名(秋山)も平成31年5月付で明治大学の准教授に昇進している。班員間の共同研究の状況は非常に活発であり、総括班の活動は順調に推移していると考えている。唯一、班のHPの機能充実が、当初の計画と比較して遅れていることを、調査官より指摘されており、その点を今後改善したいと考えている。残りの時間が少なくなってきているが、本研究費で支援された機器等は基本的にすべての班員間で共用できる状態を、今後も維持したいと考えているため、この作業は必須である。問題は、カスタムのシステムを構築する際の費用が1000万円単位でかかるうえに、その機能が果たして満足のいくものであるかどうかに確信が持てないことである。最近、非常に簡便にHPをつくれるサービスが出てきており、それをうまく活用することで、必要なものを安価で構築したいと考えている。最終年度は、大きな機器の購入はせず、総括班の活動はこれまでに構築したシステムの運用を中心に行っていく。CTスキャン購入費の支払いは平成31年度で終了するが、その後も大阪大学に置き、共用の設備として「旧」班員すべてが使える状況を維持する予定である。現時点で、班員間に非常にたくさんの共同研究が存在していることから、新学術による研究費が無くなった後でも研究組織としての存在を維持するメリットは大きい。HPはそのために不可欠のものであるため、業者に頼らずに、良いものを構築する必要があると考えている。ひとつの方策が、wixという非常に高機能なHPを簡便に作るサービスの利用であり、その使い勝手等を、大阪大学近藤研究室のHPをして、現在確認している状況である。半年使ってみた結果、特に、情報の更新が非常に楽であることから、班全体のHPシステムとして利用する方向で検討を進めている。27年度に行った主な事業は以下のとおりである。共通研究機器の購入*武田研究室は計画研究としてZeiss L1ライトシート顕微鏡を導入した。この顕微鏡で取得される画像の解析と、ここで開発される解析手法を班員と共有するため、画像解析用ワークステーションを購入した。これにより、数GB数TBにおよぶ画像データの処理が格段にスピードアップし、短時間のうちに組織に含まれる全細胞(最大数百個)の動態を数時間にわたって追跡することが可能となった。これらのデータを用い、班内の数理チームと共同して、特定の組織の3D形態形成をin silicoで再現することが可能となった。*秋山研究室で3Dプリンターと3D解析ソフトを購入した。この3Dプリンターは、班員すべてに公開されており、研究データの3Dプリントがオンラインでオーダーできるようになっている。*名古屋工業大(現名古屋大学)の松本研での超音波ステージの購入。この機材は胚などをレーザーで切断し、断面にかかっていた張力等を測定するものであり、既に複数の実験系グループによる依頼に応じている状況である。HPの作成*共通機材のオンライン予約や3Dプリント等の依頼、さらにデータ共有のためのストレージ機能など、班全体をあたかも一つの研究所として動かせるマルチ機能のHPの作成を目指した。すでに稼働しており、一定の機能は果たしている。班会議と合宿*本新学術班の特徴は、班会議のほかに、合宿と名づけた勉強会を行うことで、理論系と実験系のミックスを意図的に進めることである。27年度は、3月に京都で行った。総括班として最大の目的は、班員間の共同研究の促進、特に実験系と、数理工学系を融合させることにより、研究活動を効率よく行わせることであるが、現時点までのところ、総じてうまくいっている。共通機器に関しては、特に利用率が高いのが3Dプリンターであり、多くの研究グループが、北海道大学に依頼し、3Dサンプルの打ち出してもらっている。

これには、秋山研における人的な作業が必要になるが、その人件費を総括班費から支出できているため、問題は起きていない。また、秋山研では、他の実験系グループの研究員を集めての、3Dソフト講習会、実験に役立つ基礎数学講習会などを開いており、これも班員相互の交流に貢献している。松本研でも、多くのグループ用に特殊な実験装置を作成、データ取得協力を行っており、ほぼすべての研究グループが利用している状態である。このような良い状態を生んでいる理由は、そもそも、本新学術班の成り立ち自体が、研究を進める上での必要性から集まった研究者集団であったからであり、ある意味、当然ともいえる。今後、この状況を、公募班員すべてに広げていくことが重要であるが、そのためにも、もっとHPの充実と活用を広げていきたい。HPのカスタマイズは実のところ、機能を充実させようとすれば、それだけ費用がかさむので、今後は総括班費の残高との折り合いが重要になるが、研究室内にITのエキスパートを育てえるなどして、何とか対応したい。また、公募班員が参加することにより、合宿参加者が大人数になり、当初のような突っ込んだ議論がやりにくくなっていることも今後の課題となる。28年度の総括班では、既に、班としてのシステムの構築がほぼ終わっているために、既存の共有装置の維持管理が主なものになる。2機の3Dプリンターは、全班員の研究に有効に使用されている。28年度に、総括班費で購入した機器は、顕微鏡用の共焦点レーザーユニット(北海道大学:999万円)と、ズーム顕微鏡(基礎生物学研究所:299万円、原子間力顕微鏡の一部として購入)である。いずれも、他の資金で購入したパーツと組み合わせることで、購入金額の節約をしている。両装置とも、3D形態の計測に必須であり、共同利用が進んでいる。班会議は北大で、5月23,24日に行った。理論系と実験系の交流を目的とする夏、冬の合宿は、9月4,5,6日と、3月28、29日に、淡路島、琵琶湖で行った。いずれも、学生の旅費の補助を総括班費から支出している。これまで、合宿は主に比較的少人数で行ってきたが、2016年度は、公募班員からの希望が多かったために、冬の合宿では会場を変えた。非常に活発な議論が行われたが、参加者が多くなりすぎたため、プロジェクトごとの議論の時間が逆に短くなり、やや、食いたりない面もあった。この点の解消が、今後の課題として残された。北海道大学の秋山は、定期的に、数学と3Dソフトの講習会を行っており、そのための実費(交通費、宿泊費)の支援を行った。その他、HPの更新に約30万円を支出している。共同研究が非常に密に、しかも、多彩な組み合わせで行われており、総括班の目的は、順調に達成されていると考えている。実験チームと物理・理論チームの組み合わせは、丹羽(実験)ー秋山(理論)、武田(実験)ー秋山(理論)、松野(実験)ー秋山・松本(理論)、近藤(実験)ー秋山・井上・松本(理論)、上野(実験)ー井上・松本(理論)となっている。いずれの場合も、表面的な協力ではなく、理論系によるシミュレーションの予測が、実験のデザイン上、必要不可欠なものになっている、これからも、この関係が継続することが予測される。特に、近藤チームの、昆虫原基の折り畳みの展開の研究は、その傾向が強い。
イタリア・ルネサンス期の建設活動における職人組織の形成と発展に関する研究

中世の都市停滞期に喪失した建築家像が十五世紀に入ってアルベルテイの建築論の中で再び構策されていったが、同時に現在なおイタリア都市の性格を物質的に規定し続けている建築の文化的地平が都市機能充実の気運によって営まれた建設活動の中で培われた技術と職人組織とその建設法のシステム化によって支えられたことを明らかにした。初期ルネサンス建築を把握するには、建築家に対する作家論的な解釈ではなく、このような建設現場からの極小史的眼差しからの見据え直しこそが必要であった。ルネサンス期の都市化現象に通底した建設活動における組織編成の変容とその過程を射程することによって、ルネサンス期の建築文化の相貌を理解した。具体的な作業としては、十五世紀に建設されかつその建設記録が現在する建設事業、しかも相互に共通の職人が従事している可能性の高い建設現場を数箇所特定し、それぞれの記録に登場する職人の属性を整理した。職人個人の創意が尊重された初期ルネサンス期において、建築家単位あるいはその工房単位で、制作された建築の形態的特徴を把熟するのは困難であり、個人の職人をより流動的に多次元的に捉える必要があった。特に建築家ミケロッツォが中心に施工する中世的建設法とは異なった、現場での施工監理から解き放たれ、設計に尊心した近代的な建築家像とそのシステマテックな建設組織が浮き彫りになった。さらなるフィレンツェの都市規模の総合的分析による組織的建設法のメカニズムのモデル化には至らなかったが、他の工房の事例、他の都市の事例との比較検討を行なうことによって一般化し、職人組織の重層構造を解明するための基礎を構築できたと考える。
ヒドロゲナーゼの触媒反応機構と高効率プロトン伝達機構の構造基盤解明

本研究では,下記の研究を行う.(1)標準的[NiFe]ヒドロゲナーゼの中性子結晶解析で得られる核密度分布より,NiーFe活性部位における触媒反応のヒドリド結合中間体構造とプロトン経路を完全同定し,反応機構とそれを高効率化しているタンパク質内のプロトン機能「場」の役割を明らかにする.(2)種々の酸素耐性ヒドロゲナーゼの高精度X線結晶解析を基に,酸素耐性機構の一般則を提案する.(3)ラマン分光法による新規の触媒活性定量法を開発し,ヒドロゲナーゼ等ガス状分子を基質とするタンパク質機能の本質に迫る.本研究は、[NiFe]ヒドロゲナーゼの触媒する「水素分解・合成反応、水素ー重水素交換反応およびオルトーパラ核スピン変換反応」における反応機構と、タンパク質内高効率プロトン伝達機構解明のための構造基盤を高分解能中性子結晶解析やラマン分光法などにより確立し、新規酵素電極の開発やモデル化合物の設計に資することを目指すものである。本研究は、[NiFe]ヒドロゲナーゼの触媒する反応の詳細な解明にとどまらず、高効率プロトン移動を可能にするタンパク質機能場の一般的理解に繋がる可能性がある。本研究では,下記の研究を行う.(1)標準的[NiFe]ヒドロゲナーゼの中性子結晶解析で得られる核密度分布より,NiーFe活性部位における触媒反応のヒドリド結合中間体構造とプロトン経路を完全同定し,反応機構とそれを高効率化しているタンパク質内のプロトン機能「場」の役割を明らかにする.(2)種々の酸素耐性ヒドロゲナーゼの高精度X線結晶解析を基に,酸素耐性機構の一般則を提案する.(3)ラマン分光法による新規の触媒活性定量法を開発し,ヒドロゲナーゼ等ガス状分子を基質とするタンパク質機能の本質に迫る.
児童青年の感情障害に対する認知行動療法の統一プロトコルの実施可能性と有効性の検討

本研究の目的は、感情障害を抱える児童青年に幅広く適用可能な最先端の認知行動療法とされる統一プロトコル(Unified protocol: UP)を日本に導入し、その実施可能性、安全性、有効性を検討することであった。平成30年度は、引き続き国府台病院児童精神科と連携して、児童版UP(UP-C)の前後比較試験を進めた。これまでに介入を終えた13例に加えて、平成30年4月より4例に対して介入を開始し、平成30年10月までにすべての対象者の介入前、介入8週目、介入後、介入終了3か月後の評価を終え、データを収集した。最終的に、17例が登録となり、15例が治療を完遂した(脱落率12%)。重篤な有害事象は見られず、完遂者の出席率は親子ともに95%前後と非常に高く、プログラムに対する満足度も高かった。主要評価項目である臨床全般印象評価-重症度は、介入前から介入後にかけて有意に改善し(Hedges'g=1.04)、介入終了3か月後にかけても改善し続けていた。また、不安症状についても介入前から介入後、介入終了3か月後にかけて有意な改善が見られた。以上より、UP-Cは日本においても安全に実施可能であり、有効である可能性が示された。加えて、平成30年度は、原版のマニュアルの改訂に伴う日本版UP-Cの改訂を進めるとともに、青年版UP(UP-A)の翻訳を進めた。UP-Cの改訂はほぼ終えており、ワークブックおよびセラピストガイドの出版に向けた調整を行っている。UP-Aについてはワークブックの翻訳を終え、今後、セラピストガイドの翻訳を行う予定である。本研究の目的は,感情障害を抱える児童青年に幅広く有効な最先端の認知行動療法とされる統一プロトコル(Unified protocol: UP)を日本に導入し,その実施可能性,安全性,有効性を検討することである。初年度である平成27年度は,児童および青年に対するUP(児童版:UP-C,青年版:UP-A)の開発者であるEhrenreich博士より,治療マニュアルおよびワークブックの翻訳の許可を得て,翻訳作業を開始した。当初は,平成27年度中に両マニュアルおよびワークブックを翻訳し,日本版を作成する予定であったが,原版の改訂・出版作業が平成28年度にかけて行われることが判明し,その進捗に合わせて翻訳を進めているため,現在はUP-Cのマニュアルおよびワークブックの翻訳を終えた段階である。今後は,研究協力者と翻訳の見直しを行うとともに,日本の文化に合ったイラストや例に変更するなど修正を加えて,日本版を完成させる予定である。また,効果指標の選定にあたって,子どもの感情調整能力を測定する適切な尺度が日本には存在しなかったため,海外の尺度開発者と連絡をとり,翻訳の許可を得ている。翻訳作業と並行して,研究協力者を募って研究チームを発足した。週1回ミーティングを行い,プロトコルについての検討や進捗状況の報告等を行うとともに,月1回のリサーチミーティングで最新の知見の収集に努めている。また,子どもの精神疾患を専門とする国府台病院児童精神科と意見交換を行いつつ,前後比較試験が実施できる体制を整えている最中である。上記のように,当初は,平成27年度中にUP-AおよびUP-Cのマニュアルとワークブックを翻訳し,日本版を作成する予定であったが,原版の改訂・出版作業が平成28年度にかけて行われることが判明し,その進捗に合わせて翻訳を進めているため,翻訳作業がやや遅れている。そのため,研究全体がやや後ろ倒しになっている。本研究の目的は、感情障害を抱える児童に幅広く適用可能な最先端の認知行動療法とされる統一プロトコル(Unified protocol for Children: UP-C)を日本に導入し、その実施可能性、安全性、有効性を検討することである。平成28年度は、研究協力者とともにUP-CおよびUP-A(青年版UP)の開発者であるJill Ehrenreich-May博士が開催するワークショップに参加するとともに、マニュアルおよび臨床試験運用にあたってのコンサルテーションを受け、理解を深めた。こうしたコンサルテーションを受けて、初年度に翻訳を終えたマニュアルについて、研究協力者と翻訳の見直しを行った。その中で、日本の文化には合わない表現、イラスト、例が複数見られたため、開発者と相談の上、日本に適した内容に変更するなど修正を加え、日本版を完成させた。並行して、日本版が存在しなかったいくつかの効果指標について、原著者から許可を得てバックトランスレーション等の作業を行い、日本版を作成した。臨床試験の運用体制の整備としては、子どもの精神疾患を専門とする国府台病院児童精神科と複数回ミーティングを行って意見交換をしつつ、前後比較試験が実施できる体制を整えた。また、前後比較試験の研究プロトコルを作成して、国立研究開発法人国立精神・神経医療研究センター(承認番号:A2016-043)および国立研究開発法人国立国際医療研究センター(承認番号:NCGM-G-002148-00)の倫理委員会の承認を受け、3月より患者リクルートを開始した。昨年度報告の通り、研究計画の段階では、青年版のUP-Aも実施する予定であったが、UP-AおよびUP-Cの原版の改訂・出版作業の遅れに伴って翻訳作業が遅れていることと、2つの臨床試験を同時に実施する体制作りが困難であったことから、UP-Cの臨床試験の実施に専念しているため、全体として遅れている。本研究の目的は、感情障害を抱える児童青年に幅広く適用可能な最先端の認知行動療法とされる統一プロトコル(Unified protocol: UP)を日本に導入し、その実施可能性、安全性、有効性を検討することである。

平成29年度は、引き続き国府台病院児童精神科と連携して、児童版UP(UP-C)の前後比較試験を進めた。前年度末より開始した患者リクルートを続け、5月より、1クール目の介入を開始した。参加者は、児童とその保護者全8組であった。うち1組がドロップアウトとなったが、最後まで参加した7組については、介入前、介入8週目、介入後、介入終了3か月後のすべてのデータを収集した。11月より、2クール目の介入を開始した。参加者は、児童とその保護者全5組であり、ドロップアウトはなかった。全5組について、現在のところ、介入前、介入8週目、介入後のデータを取得済みである。3月より、3クール目のリクルートを開始しており、平成30年4月より介入を開始する予定である。登録目標症例数は、合計18例である。また、UP-Cおよび青年版UP(UP-A)ともに、原版のマニュアルの改訂が行われ、新たにワークブックおよびセラピストガイドが出版されたため、それに伴って、日本版UP-Cの改訂、およびUP-Aの翻訳を開始した。現在のところ、UP-Aのワークブックの下訳を終えており、今後、UP-C同様、日本の文化には合わない表現、イラスト、例については、日本に適した内容に変更するなど修正を加え、日本版を完成させる予定である。昨年度報告の通り、研究計画の段階では、UP-Aの臨床試験も実施する予定であったが、UP-AおよびUP-Cの原版の改訂・出版作業の遅れに伴って翻訳作業が遅れていることと、2つの臨床試験を同時に実施する体制作りが困難であることから、UP-Cの臨床試験の実施に専念しているため、全体として遅れている。本研究の目的は、感情障害を抱える児童青年に幅広く適用可能な最先端の認知行動療法とされる統一プロトコル(Unified protocol: UP)を日本に導入し、その実施可能性、安全性、有効性を検討することであった。平成30年度は、引き続き国府台病院児童精神科と連携して、児童版UP(UP-C)の前後比較試験を進めた。これまでに介入を終えた13例に加えて、平成30年4月より4例に対して介入を開始し、平成30年10月までにすべての対象者の介入前、介入8週目、介入後、介入終了3か月後の評価を終え、データを収集した。最終的に、17例が登録となり、15例が治療を完遂した(脱落率12%)。重篤な有害事象は見られず、完遂者の出席率は親子ともに95%前後と非常に高く、プログラムに対する満足度も高かった。主要評価項目である臨床全般印象評価-重症度は、介入前から介入後にかけて有意に改善し(Hedges'g=1.04)、介入終了3か月後にかけても改善し続けていた。また、不安症状についても介入前から介入後、介入終了3か月後にかけて有意な改善が見られた。以上より、UP-Cは日本においても安全に実施可能であり、有効である可能性が示された。加えて、平成30年度は、原版のマニュアルの改訂に伴う日本版UP-Cの改訂を進めるとともに、青年版UP(UP-A)の翻訳を進めた。UP-
統合失調症難治化の遺伝的要因の解明

抗精神病薬は統合失調症の薬物療法の根幹となる薬物であるが、その投与中に稀ながらも難治性の副作用として遅発性ジストニアが出現する。その性質上発症の予防が最も重要であるが、危険因子となる生物学的指標は未だ明らかではなく、遅発性ジストニアの予測不能性が問題となっている。抗精神病薬の錐体外路性副作用に対し、セロトニン受容体遮断が拮抗あるいは出現予防する可能性が知られている。そこで本研究では、セロトニン受容体である5-HT2Aあるいは5-HT2C受容体の遺伝子変異が遅発性ジストニアの生物学的指標となりうるか検討した。抗精神病薬投与中の遅発性ジストニアを発症した16名を対象とし、5-HT2A受容体の102T/C、His452Tryの2遺伝子多型と、5-HT2C受容体のCys23Ser遺伝子多型をpolymerase chain reaction法により検討した。なお、本件急は琉球大学医学部の倫理審査委員会の承認を得ている。102T/C、T/C、C/Cはそれぞれ7、7、2例であり、アレル頻度は102T 66%、102C 35%であった。全例がHis/His、Cys/Cys遺伝子型で、Tyr452やSer23は検出されなかった。症例数は少ないが、遅発性ジストニア群での102Tのアレル頻度は、日本人統合失調症患者で報告されている割合(102T 49%、102C 51%)よりも高い可能性があり、生物学的脆弱性に関与している可能性が示唆された。申請者らは、ドーパミンD2受容体遺伝子多型と抗精神病薬による統合失調症の臨床反応について系統的な研究を進めてきた。その結果、異なる遺伝子系を有する患者群間では、従来型抗精神病薬に対する治療反応性が明らかに異なることを報告した。すなわち,従来型抗精神病薬に対する治療反応者群と治療非反応者群が遺伝的に決定されている可能性が示唆された。更に、ある遺伝子型の組み合わせを保有する患者群では、他の群と比較し従来型抗精神病薬に対して著しく治療効果が不良であるという結果が得られた。そこで、今回は従来型抗精神病薬と比較し、1)錐体外路性副作用が少なく、2)陰性症状を改善し、3)難治例に効果が見られるといった従来型と比較し優れた治療効果を有する非定型抗精神病薬について、統合失調症での治療反応とドーパミンD2受容体遺伝子多型を中心とした神経伝達物質の受容体遺伝子多型との関連を検討すべく準備を進めている。現在、ドーパミンD2受容体遺伝子多型・ドーパミンD3受容体遺伝子多型・COMT遺伝子多型の同定が可能とした。また、その活性が遺伝的に規定されている薬物代謝酵素CYP2D6の変異遺伝子の同定も同時に行っており、これらの実験手法の効率化と精度の向上について検討を重ねている。非定型抗精神病薬は統合失調症の薬物用法の根幹となる薬物であるが、その投与中にcreatinine kinese(CPK)の上昇が約5%の頻度で出現する。本副作用が精神科の薬物療法に対する不信感そしてノンコンプライアンスに関与し、統合失調症の難治化に関与する可能性があると考えられる。CPK上昇の機序に非定型抗精神病薬のセロトニン(5-HT)受容体阻害作用による横紋筋の障害が想定されているが、5-HT受容体には遺伝子多型の存在が知られている。本研究では、非定型抗精神病薬投与後にCPK上昇をきたした症例を対象に、5-HT_<2A>受容体遺伝子多型を解析した。なお、薬物動態学的視点も加味し、cytochrome P4502D6(CYP2D6)の遺伝子多型も検索した。対象は非定型抗精神病薬投与中にCPK上昇をきたした統合失調症12例で、5-HT_<2A>受容体の102T/CおよびHis452Tyrの遺伝子多型とCYP2D6遺伝子多型を検索した。102T/T、102T/C、102C/Cはそれぞれ2例、6例、4例であり、102Tと102Cのアレル頻度はそれぞれ42%、58%であった。全例がHis/His遺伝子型であり、CYP2D6の代謝正常者であった。特定の遺伝子型あるいは変異遺伝子のoverpresentationは認められなかった。以上より、5-HT2A受容体の102T/CおよびHis452Tyrの遺伝子多型とCYP2D6の遺伝子多型は、非定型抗精神病薬によるCPK上昇に関与しないことが示唆された。

抗精神病薬投与中の遅発性ジストニアを発症した16名を対象とし、5-HT2A受容体の102T/C、His452Tryの2遺伝子多型と、5-HT2C受容体のCys23Ser遺伝子多型をpolymerase chain reaction法により検討した。なお、本件急は琉球大学医学部の倫理審査委員会の承認を得ている。102T/C、T/C、C/Cはそれぞれ7、7、2例であり、アレル頻度は102T 66%、102C 35%であった。全例がHis/His、Cys/Cys遺伝子型で、Tyr452やSer23は検出されなかった。症例数は少ないが、遅発性ジストニア群での102Tのアレル頻度は、日本人統合失調症患者で報告されている割合(102T 49%、102C 51%)よりも高い可能性があり、生物学的脆弱性に関与している可能性が示唆された。
非分割財市場の競争均衡の構造に関する研究と賃貸住宅・中古車市場への応用

Sai (2014)が考察対象としたモデルの賃貸住宅市場への応用であるKaneko-Ito-Osawa (2006)において、最大競争均衡(理論)家賃ベクトルの代理解である“差分家賃ベクトル"を用いた比較静学分析が行なわれた。しかし現実の市場が実際にどの均衡家賃を達成しているかどうか未知であるため、最大理論家賃を代表家賃として用いることの妥当性に議論の余地がある。このことはKaneko等の論文中においても指摘されていたが、関連する研究はなされていない。この点に基づき、本年度ではKaneko等の差分家賃ベクトルの最大・最小値間の差がどの程度であるか、またどのような形状・特徴をもつかを研究した。得られた結果として、最大・最小差分家賃の差を特徴づける2つの定理を導いた。これらの結果はKaneko等で疑問となっていた“最大理論家賃を用いることの妥当性"に一つの答えを与えるものである。すなわち、東京などの大きな都市圏を考察対象にする場合において、導いた定理より理論価格の差分はほとんど0に等しいとみなすことができ、最大・最小のどちらを用いても比較静学の結果は同様となる。また主定理の応用として、家計数が十分多く所得分布が密な賃貸住宅市場における差分家賃ベクトルの収束定理を導いた。本結果は所属大学(筑波大学システム情報工学研究科)のDiscussion Paperとしてまとめた。また今後、国際学術誌へ投稿予定である。注記として、本年度で得られた諸定理は本プロジェクト昨年度の研究結果(Sai(2014),定理3.1)に基づき得られた。26年度が最終年度であるため、記入しない。本プロジェクトにおける研究目的は以下の2つであった:1:所得効果を許す非分割財市場における競争均衡集合の具体的構造を明らかにすることにより、消費者にとって特に支出の割合が大きい住宅・車市場の市場均衡分析を容易にする。2:研究1で得た知見をもとに,現実の住宅市場・中古車市場の応用分析を理論・実証の2つのアプローチで行う。本年度の主な研究は1であった。具体的内容は以下である:Kaneko (1982)の一般化割当て市場モデルの競争均衡の構造が明らかにされた。そこでは各財について競争均衡価格と配分は、同時に複数存在しないことが明らかとなった。この結果の応用として、市場参加者が多数存在するときの均衡価格の一意性が示された。さらに、消費者が1単位以上の非分割財を消費可能な非分割財市場においても先の性質が成立しうるかが示された。結果として消費者の財選択に所得効果がない場合に先の性質は拡張されるが、所得効果を許す場合には性質は拡張されないだけでなく、競争均衡そのものが存在しないケースがあることが示された。これらは当該分野で知られていない結果であり、新規性がある研究と言える。また諸結果は非分割財市場モデルを様々な現実市場に応用する際に役立つものである。並行して、研究2を以下の内容で行った:現実の東京都市圏近郊の住宅価格データを採取し、住宅価格の特徴を調査した。その結果、東京郊外(八王子・立川など)と東京中心地付近(中野・三鷹)それぞれの価格分布に関して、占有面積の上昇率に対する価格の上昇率が、東京中心付近の方がより大きいという特徴的な性質が明らかになった。この性質を理論面から考察するために、研究1のモデルに更なる仮定を設けて、単一中心都市を持つような住宅市場に置いて理論価格が上記のような特徴的性質を持つための十分条件は何かを考察した。(この研究は今後も継続予定である)Sai (2014)が考察対象としたモデルの賃貸住宅市場への応用であるKaneko-Ito-Osawa (2006)において、最大競争均衡(理論)家賃ベクトルの代理解である“差分家賃ベクトル"を用いた比較静学分析が行なわれた。

当該研究1に関して、著名な国際誌に掲載が決定し、その後の応用分析2についても一定の成果を見込める為引き続き研究1の理論モデルに基づいた応用研究を行う予定である。応用対象の市場として住宅・中古車市場を想定していたが、後者はデータの採取・精査等に関して困難なことが予想されるため、前者の住宅市場を焦点とした研究とする。
日本の昔話研究に関する総合的研究

現在、子供の置かれた環境の大きな変化によって、児童文学の中の昔話研究は曲がり角にきており、また、農山漁村の変質に伴って、民俗学的研究の中の昔話研究も変化を余儀なくされている。しかし、そうした変革期であるからこそ、100年あまりに及ぶ研究について見通しを立てておく必要である。それを明らかにすることができれば、現在の状況が生まれた背景をわかるだけでなく、今後どのように受け継がれてゆくべきかという展望を見いだすための契機になるにちがいない。そう考えてこの総合的研究を立案してみた。ところが、実際に取り組みはじめてみると、テーマが大きすぎたので、ここ数年、集中的に調査を進めている佐々木喜善と柳田国男、そして、遠野の状況について明らかになってきたところからまとめることにした。報告書は、「佐々木喜善の昔話」「「昔話」の成立へ」「柳田国男の昔話研究」「語り部教室講演録」の4章からなる。どちらかと言えば、民俗学的研究の分析が主になったが、児童文学的研究に見える童話や民話との緊張関係を追究してある。本研究は,日本の昔話研究に関する総合的研究をテーマに今年度については,明治期・大正期の昔話研究を対象として研究を行った。特に,柳田邦男を中心とした民俗学における昔話研究については,遠野の佐々木喜善との関係を通して,その見通しを立てることができた。現在,刊行中の『柳田邦男全集』の解題にもその成果を導入し,基礎的な研究を進めているところである。佐々木喜善については,日本昔話学会で研究発表を行うことができるようにお願いしてある。一方,児童文学における昔話研究は,これまでその流れを見通すような研究がないので,なかなか進まない状況にある。現在、巌谷小波,石井研堂,蘆谷蘆村,坪田譲治の資料について収集と整理を進めている。この分野は昭和後期(戦後)になると,出版物も増えて複雑な様相を呈してくるので,そこまで広げることは考えず,昭和前期までに限定して,二つの流れとその交流を押さえることにしぼり込みたいと考えている。しかし、そうした変革期であるからこそ、100年あまりに及ぶ研究について見通しを立てておく必要がある。それを明らかにすることができれば、現在の状況が生まれた背景がわかるだけでなく、今後どのように受け継がれてゆくべきかという展望を見いだすための契機になるにちがいない。報告書は、「佐々木喜善の昔話集」「「昔話」の成立へ」「柳田国男の昔話研究」「語り部教室講演録」の4章からなる。
新たなゲノム創薬手法による新規2型糖尿病治療標的の同定

本研究の目的はゲノムワイド関連解析(GWAS)の成果を活用した新しいゲノム創薬手法を用いて同定された新規2型糖尿病治療薬候補(KIF11阻害薬、GSK3B阻害薬, AP-1阻害薬)を2型糖尿病モデルマウスに投与し、これらの薬剤のin vivoでの耐糖能改善効果を検証するものである。2018年度は2017年度に引き続き上記の新規2型糖尿病治療薬候補の1つであるKIF11阻害薬の糖代謝改善効果に関する検討を行った。非肥満マウス(C57BL/6Jマウス)および肥満2型糖尿病モデルマウス(db/dbマウス)にKIF11阻害薬を投与し、耐糖能およびインスリン感受性に及ぼす効果を評価した。通常飼育下でのC57BL/6Jマウスのグルコース負荷試験およびインスリン負荷試験の結果からKIF11阻害薬投与は通常飼育の正常マウスの耐糖能には影響を及ぼさないと考えられた。一方、KIF11阻害薬を投与したdb/dbマウスの耐糖能は改善する傾向が観察され、インスリン感受性は有意に改善していた。肥満モデルマウスにおけるKIF11阻害薬のインスリン感受性改善効果の分子機序を解明するため、インスリンの標的臓器の1つである肝臓に着目し、マイクロアレイを用いて肝組織における網羅的な遺伝子発現解析を行った。その結果、KIF11阻害薬投与による有意な発現変動を示す355個の遺伝子が同定された。現在はマイクロアレイデータを用いたパスウェイ解析およびGene Set Enrichment Analysis(GSEA)を行うことでKIF11阻害薬の耐糖能改善効果の詳細な分子機序の解明を進めている。2018年度はマウスモデルを用いたKIF11阻害薬の耐糖能改善効果の検討を重点的に行い、非肥満および肥満モデルマウスを用いた検証が実施された。その結果、肥満マウスにおける耐糖能改善効果が示され、さらに摘出臓器を用いた網羅的な遺伝子発現解析による詳細な分子機序の解明にも着手している。以上のことからKIF11阻害薬の検討については順調に進展していると考える。GSK3B阻害薬, AP-1阻害薬を用いた検討が遅れているが、KIF11阻害薬に耐糖能改善効果が観察されたことにより、分子機序の解析を優先させたことが理由である。よって、本研究課題の進捗はおおむね順調であると判断した。KIF11阻害剤投与による耐糖能改善効果については、非肥満マウスモデルを用いた検討は十分に行われたが、肥満モデルマウス(db/dbマウス)における効果については解析するマウスの数を増やして検証を行う必要がある。また、マイクロアレイ解析の結果を元に詳細なKIF11阻害剤による耐糖能改善効果の詳細な分子機構の解明を進める。また、GSK3B阻害薬およびAP-1阻害薬のマウスへの投与を行いこれらの薬剤の糖代謝改善効果の検討を行う。

また、マイクロアレイ解析の結果を元に詳細なKIF11阻害剤による耐糖能改善効果の詳細な分子機構の解明を進める。また、GSK3B阻害薬およびAP-1阻害薬のマウスへの投与を行いこれらの薬剤の糖代謝改善効果の検討を行う。(理由)2017年度は動物実験計画が当初の予定よりやや遅れたため、当初計画していたマウスの購入および試薬購入のための物品費の一部を2018年度に繰り越すこととなった。2018年度はほぼ当初の予定どおりの使用額であったため、2017年分の未使用額に相当する額を2019年度に繰り越すこととなった。(使用計画)次年度使用額および2019年度予定所用額を合算した額を、2019年度の研究計画遂行のために使用する予定である。
藍藻における概日リズムの分子機構の解明

これまでの研究において、藍色細菌の概日リズムを制御する生物時計の中核機能を担う時計タンパク質KaiA, KaiB, KaiCとその時計機能を微調整する時計関連タンパク質Pex, SasAを明らかにしてきた。しかしながら、これらタンパク質の生化学的活性と立体構造は未解明であった。本研究計画においては、これら時計タンパク質及び時計関連タンパク質の構造と機能とを解析し、以下のことを解明した。1.KaiCはATP存在下で可逆的に6量体リング構造を形成する。これは電子顕微鏡解析と単粒子解析に基づく成果である(国内共同研究の成果である)。2.KaiAはKaiCと結合して、KaiCのリン酸化を促進する。3.昆虫や哺乳動物では生物時計タンパク質として機能し、高等植物では生物時計への光入力系の光受容体として機能するCryのホモログが藍色細菌にも存在する。この藍色細菌CryのX線結晶構造を解明した(アメリカの研究者との国際共同研究の成果である)。また、これらタンパク質の結晶化とX線結晶構造解析を進めている。KaiBとPexで結晶が得られており、現在X線結晶構造解析を精力的に進めている。本研究は、藍藻に存在する概日リズムの分子モデルの中で、Pexタンパク質の機能を追求することを目的としている。本年度はまずタンパク質研究の準備として、Pexタンパク質の大量発現と精製を行った。Pexタンパク質を大量に得るために、Glutathione-S-transferase(GST)をN末端側につけた融合タンパク質として大腸菌体内で大量に発現する条件を見つけた。大腸菌細胞破砕液からグルタチオンカラムを用いてGST融合Pexタンパク質を精製し、さらに特異的プロテアーゼを用いてGSTタグから切り離して純粋なPexタンパク質を得ることに成功した。また、藍藻内の微量タンパク質を検出するために、Pexのポリクローナル抗体を作製した。抗体は、アミノ酸配列から抗原性の高い配列を推定し、この配列に相当する合成ペプチドをウサギに免役して抗Pex抗血清を得た。この抗血清からProteinAアフィニティーカラムを用いてIgG画分を精製した。次にPexの機能を推定するために、DNA結合活性が見られるかどうかを検討した。藍藻の時計遺伝子にはkaiA、kaiB、kaiCがあることが知られているが、PexはこのうちkaiA発現を調節することが明らかになったため、kaiAORFの上流領域DNAと精製Pexタンパク質が結合するかどうかをゲルシフトアッセイを用いて調べたところ、PexはkaiA上流領域DNAに結合した。Pexによって制御をうけない領域のDNAには結合しなかった。今後はin vivoでもPexタンパク質がkaiAの発現を直接調節しているのか検討する予定である。