hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
敗血症におけるγグロブリン大量療法の有効性に関する検討

術後7日目の生存率は高用量群では73%でありコントロール群33%に比べて有意に改善したが(p=0.037),低用量群では生存率の改善は認めなかった.低用量群やコントロール群では術後4時間における血清HMGB1値が高値を示したが,高容量群では有意にその上昇が抑制されていた(p<0.05).また,高用量群では術後8時間におけるクレアチニンやBUNの上昇が他の2群に比し,有意に軽度であった(p<0.05).肺組織像の検討に関しては,コントロール群でみられた高度な肺の炎症性変化がガンマグロブリン投与群では軽微であった.高用量ガンマグロブリン製剤はラット敗血症モデルの生存率を有意に改善した.この生存率の改善は低用量群では認められないものであった.また,その機序として血清HMGB1値の抑制が関与していることが示唆された.術後7日目の生存率は高用量群では73%でありコントロール群33%に比べて有意に改善したが(p=0.037),低用量群では生存率の改善は認めなかった.低用量群やコントロール群では術後4時間における血清HMGB1値が高値を示したが,高容量群では有意にその上昇が抑制されていた(p<0.05).また,高用量群では術後8時間におけるクレアチニンやBUNの上昇が他の2群に比し,有意に軽度であった(p<0.05).肺組織像の検討に関しては,コントロール群でみられた高度な肺の炎症性変化がガンマグロブリン投与群では軽微であった.高用量ガンマグロブリン製剤はラット敗血症モデルの生存率を有意に改善した.この生存率の改善は低用量群では認められないものであった.また,その機序として血清HMGB1値の抑制が関与していることが示唆された.欧米ではガンマグロブリン療法は主にウィルス感染症などに対して用いられるlow-dose therapyとITPなどに対して用いられるhigh-dose therapyの2種類に分けられる.現在本邦で重症敗血症に対し認められている用量は海外におけるlow-dose therapyの用量に相当する.近年ガンマグロブリン製剤のhigh-dose therapyの持つ強力な抗炎症作用が敗血症に対しても有効である可能性が注目されているが,その効果に関していまだ一定の見解は得られていない.今回,我々はラットの盲腸結紮穿刺モデルを用いて高用量ガンマグロブリン製剤の有効性について検討した.術前にガンマグロブリン製剤をそれぞれ1500mg(高用量群),300mg(低用量群)あるいは等量の生理食塩水(コントロール群)を投与し生存率,HMGB1を含むサイトカイン値,各種臓器機能,肺組織像について検討した.術後7日目の生存率は高用量群では73%でありコントロール群33%に比べて有意に改善したが(p=0.037),低用量群では生存率の改善は認めなかった.低用量群やコントロール群では術後4時間における血清HMGB 1値が高値を示したが,高容量群では有意にその上昇が抑制されていた(p<0.05).また,高用量群では術後8時間におけるクレアチニンやBUNの上昇が他の2群に比し,有意に軽度であった(p<0.05).肺組織像の検討に関しては,コントロール群でみられた高度な肺の炎症性変化がガンマグロブリン投与群では軽微であった.高用量ガンマグロブリン製剤はラット敗血症モデルの生存率を有意に改善した.この生存率の改善は低用量群では認められないものであった.また,その機序として血清HMGB1値の抑制が関与していることが示唆された.欧米ではガンマグロブリン療法は主にウィルス感染症などに対して用いられるlow-dose therapyとITPなどに対して用いられるhigh-dose therapyの2種類に分けられる.現在本邦で重症敗血症に対し認められている用量は海外におけるlow-dose therapyの用量に相当する,近年ガンマグロブリン製剤のhigh-dose therapyの持つ強力な抗炎症作用が敗血症に対しても有効である可能性が注目されているが,その効果に関していまだ一定の見解は得られていない.本年度の研究では,我々はラットの盲腸結紮穿刺モデルを用いて高用量ガンマグロブリン製剤の有効性について検討した.術前にガンマグロブリン製剤をそれぞれ1500mg(高用量群),300mg(低用量群)あるいは等量の生理食塩水(コントロール群)を投与し生存率,HMGB1を含むサイトカイン値,各種臓器機能,肺組織像について検討した.術後7日目の生存率は高用量群では73%でありコントロール群33%に比べて有意に改善したが(p=0.037),低用量群では生存率の改善は認めなかった.低用量群やコントロール群では術後4時間における血清HMGB1値が高値を示したが,高容量群では有意にその上昇が抑制されていた(p<0.05).また,高用量群では術後8時間におけるクレアチニンやBUNの上昇が他の2群に比し,有意に軽度であった(p<0.05).肺組織像の検討に関しては,コントロール群でみられた高度な肺の炎症性変化がガンマグロブリン投与群では軽微であった.高用量ガンマグロブリン製剤はラット敗血症モデルの生存率を有意に改善した.この生存率の改善は低用量群では認められないものであった.また,その機序として血清HMGB1値の抑制が関与していることが示唆された.
ディジタルフィルタによる周波数歪み合成語音を用いた語音聴力検査の研究

PDP11/23電子計算機の制御のもとに音声合成装置DECtalkを駆動し、日本聴覚医学会制定の語音聴力検査用57式語表の全語音を合成した。次いでPDP11/73電子計算機の制御のもとにソフトウエアシステムILSを駆動し、その中のディジタルフィルタによって上記の合成語音に周波数歪みを加え、周波数歪み語音列を作成した。また67式語表についても同様の全語音を合成し、無歪みの一桁数字を用いて語音間隔を変化させ、この変化が語音聴力に及ぼす影響を検討した。これらの語音系列はすべて一旦ディジタルデ-タとして作成した後、ポ-タブルDATレコ-ダにディジタル記録し、D/A変換して語音聴力検査に利用した。対象は正常成人31名、内耳性難聴患者21名、伝音性難聴患者25名、老人性難聴患者20名、頭蓋内病変の存在が確定している後迷路性難聴患者9名であった。これらにつき純音聴力検査、従来の方法による語音聴力検査等を行った後、周波数歪み語音を含む合成語音聴力検査を行った。正常者においては、無歪合成母音の明瞭度は常に100%であったが、子音を含む音節の明瞭度は平均84%であり、肉声語音より冗長度が低いことが推察された。また周波数歪み合成母音では高域遮断周波数が3.3KHz以下になると明瞭度の低下がおこることが確認された。内耳性難聴症例では合成語音の明瞭度が平均73%であったが、正常者との差は有意でなかった。伝音性難聴患者における合成語音明瞭度は平均85%であり、各子音ごとに検討しても、正常者とほゞ同様であった。老人性難聴症例では、/k/,/t/,/h/,/s/群および/b/,/g/,/r/,/d/,/s/群の明瞭度が有意に低下しており、時間分解能の低下もみられた。頭蓋内病変群では、老人性難聴でみられた明瞭度の低下に加えて、/m/,/n/群の明瞭度が老人性難聴群よりも有意に低下していた。
ポリホスホセリンを用いたエナメル質再生に関する研究

ホスホセリンをポリマーとしたポリホスホセリンやホスホセリンとアスパラギン酸の1対1の共重合体がアパタイトに吸着し、硬組織の形成を促進する。牛歯エナメル質表面に作用させた場合、ポリホスホセリンでは、硬組織形成が早く、エナメル質小窩裂溝入口を硬組織で塞いでしまうため、ホスホセリンとアスパラギン酸の共重合体にて、小窩裂溝内部の石灰化を促す割合を検討する必要がある。牛歯エナメル質表面を研磨したのち、ポリホスホセリンおよびホスホセリンとアスパラギン酸の1対1の共重合体(Copoly[Ser (P)^<50>Asp^<50>])水溶液中に1時間浸漬後、11時間第三リン酸カルシウム飽和溶液中に浸漬した。これを1クールとし、10クール繰り返し行った牛歯断面を走査型電子顕微鏡にて観察した。ポリホスホセリン水溶液および第三リン酸カルシウム飽和溶液に浸漬したグループと、純水および第三リン酸カルシウム飽和溶液中に浸漬したグループとでは、酸処理を行わなかったグループ、酸処理を行ったグループともにリン酸化ポリペプチドを作用させた表面に明らかな結晶成長を確認することができたが、牛歯断面の走査型電子顕微鏡にて観察したところ、ポリボスホセリン水溶液に作用させたグループでは、酸処理によってできたエナメル小柱間隙が埋まっておらず、表面のみに結晶ができていた。Copoly[Ser (P)^<50>Asp^<50>]水溶液に作用させたグループでは、エナメル小柱間隙内にも結晶の成長を確認することができた。ポリボスホセリン水溶液では、結晶成長が早くエナメル小柱間隙内に結晶ができる以前に、表層での結晶成長がおこり、エナメル小柱間隙内へのカルシウムイオンの供給を遮断してしまうことが考えられる。Copoly[Ser(P)^<50>Asp^<50>]水溶液では、表層での結晶成長がポリボスホセリンよりもゆっくりであるため、エナメル小柱間隙内ヘカルシウムイオンが供給され、間隙内にも結晶の成長が認められたと考えられる。合成リン酸化ポリペプチドであるポリホスホセリンおよびホスホセリンとアスパラギン酸の共重合体は、溶液中でアパタイトに吸着し、牛歯エナメル質表面にアパタイトの結晶成長を促進させることを報告してきた。今回は、ポリホスホセリンとホスホセリンとアスパラギン酸の1対1の共重合体を牛歯エナメル質表面に作用させ第三リン酸カルシウム飽和溶液中に浸漬し、硬組織の誘導形成を行った。共焦点レーザーラマン分光装置を用いて生成した硬組織の分析を行ったところ、リン酸カルシウムの結晶であることが再確認できた。共焦点レーザーラマン分光装置を用いた分析より、ポリホスホセリンおよびホスホセリンとアスパラギン酸の共重合体はエナメル質表面のカルシウムと吸着して牛歯エナメル質表面の性状を変化させ、カルシウムを誘導しリン酸カルシウム結晶を生成した後、ヒドロキシアパタイトに成長させると考えられた。ポリホスホセリンはホスホセリンとアスパラギン酸の1対1の共重合体と比較するとアパタイトとの吸着性がよく結晶成長が速いため、エッチングした場合、エッチングされたエナメル小柱間隙を結晶成長で埋めずに、カルシウム供給の多い表層の結晶成長が著しい。今後、アスパラギン酸の割合等を比較していく必要がある。ポリホスホセリンやホスホセリンとアスパラギン酸の共重合体は、現在使用されているコンポジットレジン材料にかわり、小窩裂溝填塞や齲蝕による微少な実質欠損の修復を行う可能性のある材料として期待できることがわかった。
高機能スピン制御材料の創製

本研究では、高スピン偏極特性、かつ低(ゼロ)磁気モーメント性を併せ持つ、高機能なスピン制御材料を創製、及び新規なデバイス機能を探求することを目的とした。(1)ハーフメタルの低磁気モーメント化:Fe系ホイスラー合金Fe_2(Cr_<1-x>M_x)Si(M=Ti,V)系バルク試料の実験により、Fe系ホイスラー合金は、従来に比較して1/2以下の低磁気モーメント性を持ち、擾乱耐性に優れたハーフメタルであることが明らかになった。(2)反強磁性ホイスラー合金の歪み効果:格子整合MgAl_2O_4基板を用い、Fe_2VSiのエピタキシャル薄膜歪みを精密制御により、反強磁性ネール温度T_Nの大幅(50%)なエンハンスを見出した。(3)反強磁性体のハーフメタル化:二重ペロブスカイトSrLaVMoO_6において、反強磁性状態と有限のスピン分極が共存することを初めて実証した。また、SrLaVMoO_6エピタキシャル薄膜の特性評価から、光電子分光によりハーフメタル電子構造の実験的証拠を得た。(4)ナノヘテロ構造を用いた検討:ナノヘテロ構造における界面ハーフメタル性の直接的検証方法として超伝導NbN接合法を開発した。この手法を、電気伝導スピン分極率P_σがハーフメタルと予測されているFe_4Nに適用して、精密定量化を実証した。本研究では、ハーフメタル磁性体に対して、そのハーフメタル性を規定するフェルミエネルギー(E_F)近傍の電子構造を維持したままで、電子構造を制御して飽和磁気モーメントを低減化させる材料制御手法を開拓することにより、高スピン偏極特性、かつ低(ゼロ)磁気モーメント性を併せ持つ、高機能なスピン制御材料を創製する。さらに、それらの材料で構成されるナノヘテロ構造を用いて、新規なデバイス機能を探求する。アップスピン電子のフェルミ面状態密度が大きく擾乱耐性に優れたFe系ホイスラー合金Fe_2(Cr_<1-x>M_x)Si (M=Ti, V)系において、磁気特性、スピン分極率Pに対する置換元素やその置換量依存性を調べた。その結果、V置換量x≦0.5の領域ではキュリー温度T_cを維持したまま磁気モーメントM_sが緩やかに低下するのに対し、V置換量x≧0.5の領域ではT_cとM_s共に急激に低下し、反強磁性的挙動を示すことを見出した。また、V置換の全領域において組成によらずスピン分極率Pがほぼ一定(0.6)で維持されることが明らかになった。また、二重ペロブスカイトSrLaVMoO_6に対して、バルクにおいて単相試料が得られる作製条件を見出した。その単相試料では、120Kで反強磁性転移が生じることを明らかにし、低温(4.2K)でのアンドレーエフ反射測定から、P=0.5という値を得た。これらのデータは、反強磁性状態でも有限のスピン分極を有することを示した初めての実験結果であり、ハーフメタル反強磁性体の実現の可能性を強く示唆するものである。本研究では、理論予測されているハーフメタル磁性体に対して、そのハーフメタル性を支配するフェルミエネルギー(E_F)近傍の電子構造を維持したままで、全電子構造を制御して飽和磁気モーメントを低減化させる材料設計手法を開拓することにより、高スピン偏極特性、かつ低(ゼロ)磁気モーメント性を併せ持つ、高機能なスピン制御材料を創製する。Fe系反弾磁性ホイスラー合金Fe_2VSiのエピタキシャル薄膜を用いて、基板との格子不整合歪みが磁気特性、電子構造に及ぼす影響を調べた。面内引張歪みを用いることにより、反強磁性ネール温度の大幅(50%)なエンハンスが生じることを初めて見出した。また、バンド計算に基づく理論的考察から、このエンハンス効果が、バンド・ヤーンテラー効果に伴うフェルミ面近傍における状態密度の変調によるものであることを明らかにした。

この結果は、反強磁性ホイスラー合金のスピントロニクス応用の可能性を広げるための重要な知見である。また、ハーフメタル反強磁性体の有力候補である二重ペロブスカイトSr_<2-x>La_xVMoO_6に対して、La置換量xを変えることによるキャリアドープ効果を調べ、完全ハーフメタル化のための電子構造制御への指針を明らかにした。合わせて、そのエピタキシャル薄膜の作製が可能であることを見出し、デバイス機能探索のためのナノヘテロ構造の作製検討を進めた。本研究では、高スピン偏極特性、かつ低(ゼロ)磁気モーメント性を併せ持つ、高機能なスピン制御材料を創製すること、並びにそれらの材料で構成される積層型ナノヘテロ構造を用いて新規なスピントロニクスデバイス機能を探求することを目的とした。まず、ハーフメタル反強磁性体の有力候補である二重ペロブスカイトSrLaVMoO_6エピタキシャル薄膜の作製とその物性解明を行った。価数変化が生じやすい二種類の遷移金属元素を含むため単相薄膜成長が困難なSrLaVMoO_6に対して、酸素分圧の精密制御と二段階成長により高品質なエピタキシャル薄膜を実現した。その(111)エピタキシャル成長薄膜の特性評価から、バルク試料より反強磁性ネール温度の大幅な向上を見出すとともに、光電子分光によりハーフメタル電子構造の証拠を得ることに初めて成功した。また、ナノヘテロ構造の界面ハーフメタル性の直接的検証方法として超伝導NbN接合法を開拓し、この方法を用いることにより界面での伝導機構(トンネル伝導とアンドレーエフ金属伝導)に依存した二種類のスピン分極率の定量化が可能なことを明らかにした。本研究は、従来理論予測に留まっていたハーフメタル反強磁性体の存在を実証するとともに、そのナノヘテロ構造の作製・評価手法の開拓を可能にした研究成果であり、ハーフメタル反強磁性体やその関連材料の今後の新たなスピントロニクス応用への可能性を広げるための重要な指針となる。
メタラリンヘテロ環を配位子とする金属錯体の合成と金属同士の協同的基質活性化反応

メタラリンヘテロ環は、環内に金属-リン共有結合を持ち、かつリン上にローンペアをもつ。このため、リン上にさらに金属フラグメントを結合させることができるので、2種の金属が互い接近したヘテロ2核錯体を構築することができる。このような、2種の金属が互いに接近した構造では、2つの金属による協同的な効果が期待できる。歪んだ環状配位子であるリン架橋[1]ferrocenophaneおよびnaphtho[1,8-b,c]phospheteをW(CO)_5に配位させ、これらのP-C結合に白金またはパラジウムフラグメントを挿入させた。これにより、期待したメタラリンヘテロ環が生成し、さらにこれが配位子として第2のメタルに配位したヘテロ2核錯体が合成できた。この錯体の2つのメタルにはさまれた空間は、非常に込み合っているため、配位子が脱離しやすくなっていた。また、2つのリンがヘテロ環に組み込まれた1,2-dihydro-1,2-diphenyl-naphtho[1,8-cd]-1,2-diphosphole(1)を合成し、これを架橋とした2核錯体(OC)_5M(μ-1)M(CO)_5(M=W(2a),Mo(2b),Cr(2c))を合成した。一方、2つの鉄がCp-PPh-Cpで結ばれた[1.1]ferrocenophaneを合成した。この錯体は、エーテル中でリン架橋[1]ferrocenophaneを光照射することで得た。この錯体には、synとantiの2つの構造異性体があり、syn体がanti体よりも熱力学的に安定であることが判った。syn体は、2座のキレート配位子としてはたらき、CoCl_2と四面体型の錯体を形成することをX線構造解析により確かめた。本研究では、新たな化合物群として、メタラリンヘテロ環を配位子としてもつ金属錯体を取り上げる。メタラリンヘテロ環とは、リンヘテロ環の一つの炭素が、遷移金属に置き換えられたものを指す。メタラリンヘテロ環のリン原子は種々の金属元素と安定な配位結合を形成できるのでこれを配位子とした錯体の合成法は、種々の組み合わせの複核錯体の合成へ応用可能なルートとして期待できる。本研究では、歪んだヘテロ小員環の解裂しやすいヘテロ原子-炭素結合へ、低原子価のメタルを酸化付加的に挿入させる方法に取り組んだ。§小員環のリンヘテロ環の構築1,8-ジリチオナフタレンとCl_2PNR_2(R=Et,^iPr,^nBu)とを反応させ、ナフタレンの1,8位がPNR_2で架橋された化合物を合成した。この生成物は、4員環のリンヘテロ環を持っており、リン周りの結合角が70°近くまで小さくなっている。このためリン上のσ*軌道のエネルギーレベルが低くπ酸性の強いリン配位子であり、金属の求核攻撃を受けやすくなっている。§金属挿入による5員環メタラリンヘテロ環の構築得られた、配位子のローンペアに金属フラグメント、S、BH_3、CH_3^+を結合させたものを合成し、それぞれに対して0価のパラジウムフラグメントを反応させた。単離した反応生成物の構造をX線解析で調べた結果、期待どおりP-C結合にパラジウムが挿入しており、ナフタレンの1,8位がPd-P結合で架橋されたメタラリンヘテロ環が構築されていることがわかった。

ナフタレンの1,8位をP(N^iPr_2)で架橋した3価のリン化合物に対してS_8を反応させ5価のホスフィンスルフィドとした。これにPd(PPh_3)_4を反応させるとパラジウムがリン-ナフタレン結合に挿入しパラダサイクル構造をもつ錯体が得られた。この錯体は、5価のリンをもち、かつP-C-C-Cキレート骨格を持つので熱的に安定であると考えられ、Heck反応の触媒前駆体として期待できる。そこで、基質にstyreneとPhIを用いた単純なHeck反応を試みたところ、^1HNMRにより反応が進行することが確認できTONが約70000程度の比較的高い触媒活性を示した。一方、リン架橋[1]フェロセノファンのリン上にピリジンアーム(-2-CH_2C_5H_4N)導入したP-Nキレート配位子を合成し、これをW(CO)_4に配位させた錯体を合成した。このキレートの[1]フェロセノファン部には大きな立体歪みが存在するため、[1]フェロセノファンのP-Cp結合は開裂し易い。そこで、このタングステン錯体にPd(PMe_3)_2フラグメントを反応させるとP-Cp結合への挿入がおこり、スピロ型のホスフィド架橋構造をもつW-Pdヘテロ2核錯体が得られた。この2核錯体はW中心とPd中心の両方ともキレートにより架橋と結合しているので、架橋骨格が熱的に安定であった。さらに、2つのメタル中心が互いに近傍に位置するのでメタル上の配位子同士の立体反発が大きく、Pd上からPMe_3配位子が容易に脱離し、反応活性な空き配位座を生じることが判った。
ヒストン脱メチル化酵素を制御するmicroRNAを標的とした新規治療法の開発

EZH2と反対の酵素活性を持つヒストン脱メチル化酵素JMJD3を抑制するmicroRNA、miR186-5pを同定した。大腸癌細胞株においてmiR186-5pを強制発現させると、JMJD3の発現およびCDH1、VASH1、TFAP2Eといった大腸癌進展に重要な遺伝子の発現抑制を確認できた。大腸癌細胞株においてヒストンメチル化酵素EZH2の発現を抑制するとオキサリプラチン受性が増強することを確認した。1)JMJD3とmicroRNAに関する分子生物学的検討(a)大腸癌由来細胞株におけるJMJD3およびmicroRNAの発現状況の確認:JMJD3を標的とするmicroRNA候補としてmir286-5pをmicroRNAarrayを用いて同定した。JMJD3は大腸癌細胞株のcolo201およびcolo320で高発現である事を確認した。一方で、mir186-5pはcolo201では発現が低く、colo320では高発現である事を確認した。(b)大腸癌由来細胞株におけるJMJD3およびmicroRNAの機能解析:実際にmir186-5pがJMJD3を標的とするかを確認するために、大腸癌細胞へmir186-5pをトランスフェクションしJMJD3の発現を確認したところ、有意にJMJD3の発現が低下していた。またルシフェラーゼアッセイを用いて、186-5pが直接JMJD3に直接作用することを確認した。(2)大腸癌症例の臨床検体におけるJMJD3とmicroRNAに関する検討(a)大腸癌切除標本におけるJMJD3およびmicroRNAの発現状況の確認:これまでの実験でJMJD3は正常組織で高発現しており、癌で低発現である事が分かっている。そこでmir186-5pの発現を確認したところ、有意に癌で高発現である事が分かった。このmir186-5pとJMJD3の発現の逆相関性には統計学的有意差が認められた。(b)JMJD3およびmicroRNAの発現状況と予後との相関性の検討:われわれは既に大腸癌においてJMJD3低発現では予後不良である事を報告している。そこでmir186-5pの発現と予後との相関性を確認したところ、mir186-5p高発現では予後不良な傾向を示すものの、有意差は認められていない。今後症例数を増やす必要があると考えられる。概ね当初の計画通りに進行しており、特に問題ないと考えている。JMJD3およびmicroRNAの発現量と抗癌剤感受性との関連を、大腸癌細胞株を用いて検証する事を計画している。JMJD3と酵素活性として反対の作用を持つEZH2において、シスプラチン抵抗性と関連しているとの報告があることからJMJD3高発現細胞株は、抗癌剤シスプラチン感受性が高いことが考えられる。さらにmir186-5pを導入した場合のシスプラチン感受性を検討を行った。また、microRNAの結果から2種類のmiRを検出し、in vitroにてJMJD3を抑制するmiRとしてmiR186-5pを同定した。大腸癌細胞株においてmiR186-5pを強制発現させたところ、JMJD3の発現およびCDH1、VASH1、TFAP2Eといった大腸癌における重要な遺伝子の発現抑制を確認できた。熊本地震で研究室の復旧に時間を要したこともあり、当初予定よりはやや遅れている。が、早い段階で復旧することが出来たため、今後の研究推進に影響が出るほどではないと考える。JMJD3およびmicroRNAの発現量と抗癌剤感受性との関連を、大腸癌細胞株を用いて検証する事を計画した。さらにmir186-5pを導入した場合のシスプラチン感受性の検討を行った。さらにmir186-5pを導入した場合のシスプラチン感受性を検討する予定である。

今後の研究においては、大腸癌進展におけるmiR186-5pおよびCDH1、VASH1、TFAP2Eの機能解析および、ヒト臨床検体におけるmiR186-5p及びターゲット遺伝子の発現意義の確認を行い、同定したmicroRNAが現象へ与える影響をin vitroの実験を用いてさらに検証し、ヒト臨床検体におけるmiR186-5p及びターゲット遺伝子の発現意義の確認を行う。消化器癌、DNAメチル化、ヒストンメチル化医局保管の消耗品を使用することが出来たため。医局内保管の試薬等の使用ができたこと、また、当初予定より研究が遅れたため。次年度は、JMJD3およびmicroRNAの発現量と抗癌剤感受性との関連を、大腸癌細胞株を用いて検証する事を計画しており、検証にかかる細胞培養や各実験試薬、消耗品費に充てる。また、データ管理及び資料作成を補助してもらうための人件費、情報収集にかかる旅費に使用したいと考える。主に試薬等の消耗品購入費に充てる他、実験結果の集約、関係書類の整理、保管等の事務作業を手伝ってもらう事務補佐員の雇用経費に充てたいと考える。
磁気粉体を用いたセミアクティブオイルダンパの試作

本研究はダンパの作動流体として磁性流体を使用し、これに磁界をかけることにより粘性減衰係数の値を制御し、複雑な機構を一切用いることなく電気的・磁気的に減衰力を連続に制御できるようなセミアクティブダンパを実現することを目的としている。研究内容は、流量と圧力差を様々な条件で計測する基礎実験、この基礎実験結果をもとに自動車用の可変ダンパの設計および試作、セミアクティブな防振懸架装置の制御方式を検討する理論研究の三つに大別できる。基礎実験では、磁極の形状、磁極間隔、コイル電流、ピストン速度を変化させ、磁性流体流速と減衰力発生部に生じる減衰力との関係を調べた。その結果、基本的には、減衰力発生部における流速が遅い(レイノルズ数が小さい)ほど同じ電流変化に対する減衰力の変化が大きいことがわかった。これは電流の変化によって磁性流体の粘性係数が変化するため、粘性抵抗の全抵抗に占める割合が高いほど減衰力の変化が大きくなるためと考えられる。可変ダンパの設計試作においては上記の特徴をいかに巧妙に実際のダンパに組み込むかが重要になる。実際に試作したものは減衰力発生部でダンパの外につけ、減衰力発生部に生じる流速を遅くし、また電磁石に生じる熱の悪影響も抑えるような形状にした。理論研究では、車両の懸架装置への応用を中心に理論計算シミュレーションを行った。ここでは防振のためにエネルギーを注入するアクティブな制御装置も含めて最適な制御方法の検討を行った。本研究はダンパの作動流体として磁性流体を使用し、これに磁界をかけることにより粘性減衰係数の値を制御し、複雑な機構を一切用いずに電気的・磁気的に減衰力を連続的に制御できるようなセミアクティブダンパを実現することを目的としている。本年度は、実際のダンパをモデルとした実験装置を設計・製作し、様々にパラメータを変えて実験を行い、またその結果をもとに実際にダンパを設計・製作し、その性能試験を行った。実験装置は減衰力発生部とこれに磁性流体を送り込む駆動部よりなる。減衰力発生部は非磁性体のハウジングに垂直方向の流路を通し、これに先端がくさび状の磁極を両側から水平に突き出して対向させている。磁極は先端形状の異なるものを3種用意した。また、磁極間隔(ギャップ)は磁極調整ねじにより自由に設定できる。このギャップはコイルとともに磁気回路を構成しており、コイル電流により磁界の強さが変化する。実験は、流量を設定後、油圧ユニットを駆動して磁性流体を減衰力発生部に送り込み、このときの減衰力発生部上下の圧力、ピストン速度およびコイル電流を測定する。測定値は、A/D変換後パーソナルコンピュータに取り込み処理した。磁極の形状、磁極間隔、コイル電流、ピストン速度を様々にかえて、磁性流体流速と減衰力発生部での減衰力との関係を調べた結果、減衰力変化について次のようなことがわかった。【◯!1】流路がなめらかになるような磁極形状ほど大きい。【◯!2】磁極間隔が大きいほど大きい。【◯!3】コイル電流が大きいほど大きい。【◯!4】ピストン速度が大きいほど小さくなる。したがって、減衰力が大きくなるにしたがい減衰力変化は小さくなる傾向があることがわかった。これらの結果をもとに自動車用のダンパを設計し試作品ができあがった。今後性能試験を行い制御方法を検討していく予定である。
頭蓋底外科のアプローチ法開発のための臨床解剖学的研究

1.頭蓋底の肉眼解剖頭蓋底の手術術式について屍体10体を用いて解剖学的検討を行った。Facial dismasking法やLe FortI型骨切り法など、顔面表面に皮切線を入れないあるいは顔面表面の皮切線が目立たないといった整容的に優れた手術を屍体を用いて行い、それによって得られる頭蓋底の展開の広さと到達できる深さについて、従来からの顔面に皮切線を大きく入れる術式と比較検討した。その結果、前者の顔面に皮切を入れない術式でも従来の術式と比較し同等の広い術野が確保でき、病変の摘出範囲も大きく変わらないことが分かった。これらの結果から、より侵襲が少なく整容的にも優れた多くの術式が臨床に用いられようになり、治療成績や術後のQOLの向上につなげていくことができた。2.外頭蓋底解剖の3次元再構築独自の手法による頭蓋底解剖の3次元構築は未完である。しかし頭蓋底手術に3次元画像を用いたナビゲーションシステムを臨床応用し、ナビゲーションシステムの応用範囲を拡大しその有用性をさらに高めた。さらにナビゲーションシステムを応用したシミュレーション手術法も開発した。3.頭蓋底手術における離断組織の血流温存頭蓋底へアプローチする際、骨や筋・筋膜など様々な組織を離断展開していく必要がある。それらの組織を有茎のまま血流を温存することにより、術後に一旦離断された組織の再建がより確実に行える。しかし血流がどの程度、またどの範囲まで温存できるかは明らかにされていない。これまで、離断された有茎組織の血流を測定しデータを集積してきた。今後これらのデータを解析することにより、有茎として組織を離断挙上する際のより確実な血流の温存法を検討していく。1.頭蓋底の肉眼解剖外頭蓋底は複雑に組み合わさった骨組織の間を多くの血管や神経が走行しているため、手術的アプローチが困難な場所である。そこで、臨床への向けて重要な情報を提供する目的で肉眼解剖によっていくつかのランドマークから深部の重要組織に向けての距離、角度を測定している。さらに外頭蓋底最深部に位置するため従来は外方からのアプローチが困難であった耳管、頸動脈管に対する頭蓋外からの浸襲の少ないアプローチ法を検討している。2.外頭蓋底解剖の3次元再構築頭蓋底手術のシュミレーションを行うために、様々な画像及び実際の解剖をもとに、コンピューター上で頭蓋底の重要な組織のマッピングを行い、3次元再構築を試みている。現在そのためのコンピューターソフトについて検討中である。3.頭蓋底手術における組織血流の測定頭蓋底へアプローチする際、多くの軟部組織、骨を切離し展開しなければならない。術後の機能や形態の維持のためにはそれらの組織の血流を保っておく必要がある。現在レーザー血流計を用いてそれらに切離された組織の血流を測定し、血流を温存しながらのアプローチ法を検討している。1.頭蓋底へのアプローチ法の検討頭蓋底及び顔面深部の臨床解剖学的検討から得られた知見及び様々な手術支援機器を利用して、頭蓋底・顔面深部に対する新しいアプローチ法を開発してきた。手術用ナビゲーションシステムの頭蓋底手術への応用、解剖学的研究によるLe Fort I型骨切り術の確立と頭蓋底手術への応用などがこれまでの成果であるが、今後さらに頭蓋底深部の解剖学的検討により耳管、頸動脈管周囲の手術法の確立を目指す。また、吸収性プレートを用いるなど発育を考慮した小児の頭蓋底手術についても症例を重ねて検討を行っている。

2.頭蓋底手術における離断組織の血流温存頭蓋底へのアプローチする際、様々な組織を離断していくが、有茎として血流を温存することにより術後離断組織の再建がより確実に行える。現在、組織の血流を測定しながら頭蓋底手術を進め、血流のより温存された離断法を検討している。3.外頭蓋雇解剖の3次元再構築頭蓋底手術のシュミレーションを行うために、コンピューター上での3次元再構築を試みている。1.頭蓋底の肉眼解剖頭蓋底の手術術式について屍体10体を用いて解剖学的検討を行った。Facial dismasking法やLe Fort I型骨切り法など、顔面表面に皮切線を入れないあるいは顔面表面の皮切線が目立たないといった整容的に優れた術式を用いた手術によって得られる頭蓋底の到達範囲について、顔面に皮切線を大きく入れる従来の術式のそれと比較した。その結果において、前者は従来の術式に比べほぼ同等の広い術野が確保でき、病変の摘出範囲も大きく変わらないことが分かった。これらの結果、より侵襲が少なく整容的にも優れた様々な術式が臨床に用いられ、治療成績や術後のQOLの向上につながっている。2.外頭蓋底解剖の3次元再構築.独自の手法による頭蓋底解剖3次元構築は未完である。しかし頭蓋底手術に3次元画像を用いたナビゲーションシステムを臨床応用し、ナビゲーションシステムの応用範囲を拡大しその有用性をさらに高めた。さらにナビゲーションシステムを応用したシミュレーション手術法も開発した。3.頭蓋底手術における離断組織の血流温存頭蓋底へアプローチする際、骨や筋・筋膜など様々な組織を離断展開していくが、それらの組織を有茎弁として血流を温存することにより、術後に一旦離断された組織の再建がより確実に行える。しかし血流がどの程度、またどの範囲まで温存できるかは明らかにされていない。これまで、離断された有茎組織の血流を測定しデータを集積してきた。今後これらのデータを解析することにより、有茎として組織を離断挙上する際のより確実な血流の温存法を検討していく。
ウェブ会議を取り入れた発信型の指導が英語スピーキング力に与える影響

研究の目標は、日本人英語学習者に対するウェブ会議の活用の有効性を検証することである。擬似実験的に大学の既製の2クラスを活用した。実験群は毎週1回ウェブ会議で外国在住の英語話者と討論やロールプレイ活動を体験した。ウェブ会議のための事前タスクとして毎週授業の中で話題に関する討論、発表、ロールプレイ演習を行った。比較群もロールプレイの代わりに授業内外でシャドーイングを行った。事前・事後のスピーキングテストの結果、期間と処遇に有意な交互作用があり実験群の伸びが顕著だった。産出言語分析の結果からは流暢さと複雑さに有意な交互作用があり、実験群に顕著な伸びが見られた。ウェブ会議の有効性が明らかになった。本研究の目標は、日本人が英語を話せるようになるにはどのような指導法が有効かを明らかにすることである。具体的には、英語学習者である日本人大学生16名に、オンラインによるウェブ会議(ビデオ会議)を定期的かつ継続的に体験してもらった(毎週1回、年間18回)。フィリピン在住の英語教師と日本人学習者ペアが英語によるディスカッションを行うことで、英語スピーキング力、英語習熟度、ウェブ会議の使用感、国際的志向性にどのような変化が起こるかを見た。ウェブ会議における英語による討論の準備のための授業では、日本人同士で討論したり、英語表現の確認を行ったり、プレゼンテーションを行ったりした。このような授業とウェブ会議のタスクサイクルを年間を通して繰り返した。結果として、スピーキング力では、語数における量的な流ちょうさと、1文中の語数に基づく複雑さに伸長がみられた。しかし、正確さにおいては有意な変化は見られなかった。リスニングとリーディングによって操作化した習熟度においても有意な伸長が見られた。とりわけリスニングにおいて伸びが著しかった。ウェブ会議の使用感においては、「難易感」において有意な変化が見られた。具体的には、「回数を重ねるごとに緊張感が減った」、「回数を重ねるごとに言いたいことが言えるようになった」、「思ったより話せた」などの感覚が増した。また、「ウェブ会議の使用は英語スピーキング力向上に効果的」という意識も高まった。英語を話せたという達成感を示す項目群においても有意な伸びが見られた。国際的志向性においては、「国際的な職業・活動への関心」項目群において有意な伸長が見られた。総合的に見て、ウェブ会議における英語話者との討論を軸にした発信型の指導は、英語力や心理的側面に肯定的な影響を及ぼすことが明らかになった。1年目の効果測定の手法に妥当性と客観性を加えるため、英検IBA標準テスト(リスニング、リーディング、語彙)、ウェブ会議による対話型スピーキング測定テスト(IELTS式)、モノローグによるスピーキングテスト・エッセイライティングテスト(TOEFL式)を加えた。実践期間途中における個別インタビューも実施した。さらに、指導内容において、ウェブ会議に向けての準備段階での活用やウェブ会議中に学習者が発話する機会を最大限に増やすため、共同研究者間で協力して実践的スピーキング力を高めるためのロールプレイ型タスクを約20レッスンにわたり制作した。このようなウェブ会議を用いたタスクベースの対話演習を、3つの大学において1年間展開したこと、1大学において対照群を設けた計画を実施した。比較群では、ウェブ会議の代わりにライティングを実施し、ウェブ会議を含む処遇との効果の異なりを比較できるようにした。本年度行った取り組みとして、音声評価のための音声情報の整理(音声ファイル編集)とTOEFL式スピーキングテストのデータ(140件分)を協力者間で評価しあい、評価の信頼性を高める努力をした。このようなスピーキングテスト(モノローグ)の処理過程を通して得られた結果は、前期終了時ウェブ群・比較群ともに有意な伸びを示したが後期においてはウェブ群だけが有意な伸長を見せた。そのほか、標準テストにおいては両群ともに有意な伸びを示したが、実験群の伸びの方が著しかった。WTC(コミュニケーション意欲)指標や国際的志向性に関しては年間を通じて有意な変化が見られなかったが、個人差が大きく見られたため、今後独立変数として活用し、スピーキング力の変化との交互作用等の検証を行いたい。モノローグのみによるTOEFL式とダイアローグによるIELTS式の2種類のスピーキングテスト音声データを匿名で評価しやすくするために加工すること、また、それらを評価しあい調整することに多くの時間を費やした。その結果、ダイアローグ形式のテストデータの再評価作業(テスト実施者以外の評価者による)や他の収集済みデータの処理が終わっていない。発話データの文字言語への書き起こしも行いたいがあまり進んでいない。2年目に3大学において実施したウェブ会議を用いたロールプレイタスクの効果を精査するために、前期中のプリ、ポストテスト(TOEFL型モノローグ評価)の結果を比較したところ、3大学ともに1%水準で有意な伸びが観察された。また、A大学に設けた比較群(ウェブ会議の代わりにシャドーイング練習)も3大学と同様に伸びを示したが、A大学ウェブ会議群と交互作用を確認したところ非有意であった。この結果から半期程度では必ずしもウェブ会議の効果が高いとは言い切れないため、A大学における実験群と比較群を対象に通年20回を処遇期間としてモノローグテストの評価における交互作用を確認したところ、有意と認められ実験群の伸びが有意だった。IELTS型ダイアローグテストも通年期間で有意な伸びが認められた。言語分析の結果から、流ちょうさ、複雑さの指標において交互作用が有意で実験群に伸びが見られた。

また、交互作用非有意ながら正確さ指標にも実験群に顕著な伸びが見られた。これらのことからウェブ会議を用いた実践は通年程度の期間を経て着実な効果が認められることがわかった。この傾向を裏付けるため、3年目に外部基準テストACTFL OPIcを用いて、ウェブ会議を施した学習者の通年の変化を見たところ有意な伸びが認めれられた。このことから、外部基準による客観的な指標においてもスピーキングが伸びることが判明した。更に副次的な効果として、2年目に採取した英検IBAと3年目に実施したVELCテストの結果からリスニング、リーディング力への効果、2年目に実施したTOEFL式ライティングテストの結果から実験群に有意とする効果が見られた。これらの結果から、ウェブ会議を用いたロールプレイタスクを含む発信型の指導は、スピーキングを軸として英語の4技能の全体的な向上をもたらす可能性をもつ指導法であることが示唆された。研究の目標は、日本人英語学習者に対するウェブ会議の活用の有効性を検証することである。擬似実験的に大学の既製の2クラスを活用した。実験群は毎週1回ウェブ会議で外国在住の英語話者と討論やロールプレイ活動を体験した。ウェブ会議のための事前タスクとして毎週授業の中で話題に関する討論、発表、ロールプレイ演習を行った。比較群もロールプレイの代わりに授業内外でシャドーイングを行った。事前・事後のスピーキングテストの結果、期間と処遇に有意な交互作用があり実験群の伸びが顕著だった。産出言語分析の結果からは流暢さと複雑さに有意な交互作用があり、実験群に顕著な伸びが見られた。ウェブ会議の有効性が明らかになった。年度当初は「英語が話せる」力の定義と構造の解明を目的に、(1)コミュニケーション分析と言語分析の融合的指標を視野に入れたウェブ会議における対話を客観的に分析する方法の研究と開発、(2)対話によるコミュニケーションに焦点を当てたスピーキングテストと習熟度構成要素、コミュニケーションへの意欲指標との関係を探るとしていたが、(1)については、文献研究の結果、コミュニケーション分析には様々な観点が存在し、どの観点を活用するか未定である。また、実際のコミュニケーション分析に至っていないので、2年目に持ち越す課題となっている。(2)については、オンラインによるウェブ会議の実施計画作成と実行に多くのエネルギーを費やしたり、指導開始期、中期、終期のデータ収集と分析にかなりの労力を要することが分かったため、各データを独立した形で分析するにとどまった。今後、予定通りデータの構成素間の関係をさぐる。ダイアローグ形式のテストデータの再評価作業(テスト実施者以外の評価者による)や他の収集済みデータの処理を行う。また、学習者の発話力に変化をもたらす可能性のあるウェブ会議の中で行われたタスクベースのコミュニケーション活動分析、および産出言語分析について進める。ライティングの評価や使用言語分析にも着手する。WTCや習熟度テストの結果を独立変数として、学習者への指導の影響を個別に探るような量的、質的両面からの混合的な研究に着手する。
ESCRT小胞輸送蛋白複合体によるレトロウイルス感染増殖制御

HIV-IGag蛋白はキャプシド構成分子であり、単独で発現させるとウイルス様粒子(VLP)を形成し、それ自身が出芽(budding)する。小胞輸送蛋白複合体(ESCRT)の上流に位置する輸送蛋白HrsがEGF受容体等の分解制御に関わること、同じくESCRTに含まれるTsg101(ESCRT-I)である及びVps4がHIVの出芽に重要であることが報告された。Gagはユビキチン化修飾を受けることが知られており、これまで詳細不明であった「ユビキチン化されたGagの認識・輸送機構」の存在も想定された。Hrsはユビキチン結合ドメイン(UIM)を持つほか、エンドソーム上にTsg101をリクルートする機能があることから、Gagの認識・輸送にHrsが関与する仮説を立て、Gagの細胞内輸送及び分解に果たすHrsの役割を検討した。siRNAを用いHrsをノックダウンしたHeLa細胞にHIV-I gagを遺伝子導入し、細胞内のGag蛋白量及び培養上清中のVLPをウエスタンブロッティング、ELISA法にて検討した。その結果、Hrsノックダウンにより、細胞内のGag蛋白量が顕著に増加し、培養上清中のVLP量も有意に増加した。ライソソーム阻害剤存在下で細胞内Gagの分解を調べたところ、Hrsノックダウン細胞と同様に分解が抑制された。共焦点顕微鏡下で、GagとCD63の共局在がみられたが、HrsノックダウンによってGagとCD63の共局在が顕著に増加した。一方、Hrsノックダウン時に蓄積するGagはSNARE蛋白のうちSTX6およびSTX8によって有意に蓄積が解除された。以上の結果から、1)Gag蛋白はライソソームで分解されること、2)分解にHrsが必須であること、3)SNAREによってGagがライソソーム分解に誘導されることがわかった。小胞輸送蛋白質複合体(ESCRT)の上流に位置する輸送蛋白HrsがEGF受容体等の分解制御に関わること、同じくESCRTに含まれるTsg101(ESCRT-I)である及びVps4がHIVの出芽に重要であることが報告された。Gagはユビキチン化修飾を受けることが知られており、これまで詳細不明であった「ユビキチン化されたGagの認識輸送機構」の存在も想定される。siRNAを用いHrsをノックダウンしたHeLa細胞にHIV-I gagを遺伝子導入し、細胞内のGag蛋白量及び培養上清中のVLP量をウエスタンブロッティング、ELISA法にて検討した。共焦点顕微鏡下で、GagとCD63(後期エンドソーム)の共局在がみられたが、HrsノックダウンによってGagとCD63の共局在が顕著に増加した。以上の結果から、1)Gag蛋白はライソソームで分解されること、2)分解にHrsが必須であること、がわかった。
2次元球面の力学系の組合せ構造とフラクタル構造

ジュリア集合がカントール集合になる場合に、そのコーディングの重複度がとりうる値について調べた。次数dの有理関数で、1対1の幾何学的コーディングがある場合、幾何学的コーディングの重複度はつねにdのベキであり、さらにある条件をみたすときは、任意のdのベキに対しそれが重複度になるような幾何学的コーディングがあることを示した。また、ジュリア集合への1対1の幾何学的コーディングが存在しないが、2回合成についてはそのようなものが存在する有理関数の例を発見した。今年度は、主に情報収集と予備的な計算を行った。物品費は、ほとんどを書籍の購入にあてた。研究目的である、球面の分岐被覆の力学系における、組合せ構造を調べるため、まだよくわかっていなかった、幾何が双曲的となる有理関数について、そのジュリア集合のコーディング空間(geometric coding treeより定まるコーディング全体として定義される)がどのような構造を持つかを調べていった。これまでの研究で、ユークリッド幾何的な有理関数については、普遍被覆をとるとユークリッド空間上の相似写像に持ち上がるので、コーディング空間の構造が計算できることがわかっている。まずは、双曲幾何的な有理関数の中で最も簡単と思われる、次数2で、ジュリア集合がカントール集合となるものを計算の対象とした。考察の末、その素なコーディングの重複度全体の集合は、{1,2}であると予想した。被覆空間のとりかたを工夫することにより、新しい証明の手法を見出したが、最終的な結論までは未到達である。もし、これが正しいとすると、双曲幾何的な有理関数に関しては、重複度の集合が決定できる初めての例であり、意義深い。また、情報収集の過程で、複素ベクトル場の分岐を調べることの、フラクタル構造の研究における重要性に気づいた。この方面の研究はまだ多くはなく、本研究に組み入れる価値があると思われる。その他に、自己相似集合の研究として、どんなときに開集合条件が満たされるか考察を行った。研究の目的のひとつである、球面の分岐被覆の組合せ構造について、双曲的な幾何を持つ有理関数でコーディング空間を決定できるようなものを見つけることを、実施計画の中であげていた。この問題に関し、ジュリア集合が完全不連結になる2次多項式についての研究を進めた。コーディング空間の決定までは至らないが、コーディングの重複度は必ず2のベキになることを証明した。その証明法は以下のようである。まずこの多項式力学系についての「被約基本群」の構造を調べた。コーディングが全単射になるものを固定する(これを「座標の原点」のようなものとみなす)と、コーディングを選ぶことと、被約基本群の元を選ぶことに対応がつく。この対応を使って、各コーディングを記号力学系から自分自身への連続な半共役写像と考えることができる。この連続な半共役の重複度は、「遷移行列の分解」からなる行列代数の階数として計算ができることがわかる。あとは、遷移行列の構造を組合せ的に調べることにより、証明が完了する。双曲的な幾何を持つ有理関数の力学系で、コーディング空間全体について非自明な結果はこれが初めてのものであり、その意義は大きいと考える。また、一般論でなく、具体的な力学系に対する結果であることも、重要でありコーディング空間の構造の数学的豊富さを示すものである。この手法は、ある程度のクラスの有理関数にも適用できるはずであり、今後の発展が期待される。この問題に関し、ジュリア集合が完全不連結(すなわち、カントール集合)になる双曲的な有理関数についての研究を進めた。昨年度は、次数が2の場合について、幾何学的コーディングの重複度は必ず2のベキになることがわかったが、今年度はもう少し一般的なものについて考察を行い、次のようなことがわかった。1.次数dが何であっても、ジュリア集合への幾何学的コーディングで1対1のものがあれば、任意の幾何学的コーディングの重複度はdのベキになる。2.さらに、クリティカル・オービットが退化していない場合は、任意のdのベキにたいして、それを重複度にもつ幾何学的コーディングが存在する。3.ジュリア集合がカントール集合になるための十分条件として、安定な不動点を含むファトゥ成分にすべてのクリティカル・ポイントが属することというものが知られているが、この条件をみたしていても、1対1の幾何学的コーディングがあるとは限らない。この場合、幾何学的ではない1対1コーディングは持つし、適当回の合成については1対1幾何学的コーディングを持つ。最も簡単なクラスと思われる、ジュリア集合がカントール集合になるものについてでも、これほど豊富な構造を持つことがわかったことは意義が大きい。
赤痢菌の感染細胞内における病原性遺伝子発現検出系の開発

赤痢菌が病原性を発揮するまでには大きく分けて(i)ヒト腸管に到達した雨が上皮細胞に食作用を誘発し細胞内へ侵入し,(ii)エンドサイトゾーム膜を破り細胞内へ脱出し,(iii)細胞内を増殖しつつ拡散し,(iv)隣接細胞へ再侵入する段階がある。これらの各感染段階に対して,赤痢菌はそれぞれに必要な病原性因子を備えており,それらの発現を必要な場に応じて巧妙に調節していると考えられている。このことから本菌の宿主細胞内に於ける遺伝子発現の変化を知ることは,菌の感染機構を把握するためには不可欠であるが,現在まで本菌の感染細胞内遺伝子発現を検知,測定する実験系は皆無に等しく,この方面の知見は全くなかった。そこで本研究では、細胞内でのビルレンス関連遺伝子群の発現様式,およびその調節機構を明らかにすることを究極の目的として,上述のビルレンス遺伝子の感染細胞内発現様式を測定する系の開発を企図した。この目的の為本研究ではまず標的遺伝子の転写段階での発現レベルを簡便に検出できるプロモーターアッセイベクターを作成し、本システムが感染細胞内に存在する10^3-10^5個の菌数でも検出,測定しうるか検討を行った。具体的には、プロモーター活性の検出には,ルシフェラーゼ遺伝子(lux)をレポーター遺伝子に選び,本遺伝子の上流に様々なDNA断片を挿入できるようにマルチクローニングサイトを有するDNA片を結合させ,さらに融合遺伝子を安定に保持できるよう遺伝子下流に転写終結配列を含むDNA片と配置した。次に,作成した融合遺伝子の系が感染細胞内に存在する菌の遺伝子発現検出に有効かどうかを見るため,赤痢菌の細胞内拡散に必須の遺伝子virGのプロモーター領域を含むDNA断片を用いて融合遺伝子を作成した。これを赤痢菌にプラスミド状態で移入し,上皮細胞へ感染後,経時的に融合遺伝子を持つ菌を回収し,菌抽出液を調製し,酵素活性を測定した。この結果ルシフェラーゼ活性を指標に測定したvirG遺伝子プロモーター活性は,赤痢菌が宿主上皮細胞内へ侵入後30分-1時間に於てピークを示し,隣接細胞へ移行期には減少した。virGプロモーター活性のピークは,本菌が上皮細胞内に於て宿主細胞骨格系線繊を菌体の一極に凝集し,細胞内を活発に拡散する時期と一致していた。従って本システムは標的ビルレンス遺伝子の各感染過程に於ける発現調節を解析する手段として有効であることが示唆された。今回融合遺伝子は多コピーベクター上にある状態で開いたが,今後該遺伝子の本来の部位に於いて測定しうる系を開発したい。