hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
都市に生きるサマの民族誌――生業と信仰をめぐる選択の過程

本研究では、平成23年度から4年間に渡り、フィリピンのミンダナオ島ダバオ市の文化的少数者サマ・バジャウ社会を事例に、生業と信仰をめぐる選択の過程について民族誌を作成することを目指した。しかし、実施期間中に災害など予測できなかった出来事が重なり、研究計画を変更せざるを得なかった。ただしこの間、文献調査、過去に収集した資料の整理、火災直後の現地調査の結果などに基づき、論文公刊と口頭報告を行った。また、ボストン大学CURA所長のロバート・ヘフナー教授をメンターに得て研究の枠組みが発展したため、「研究計画最終年度前年度の応募」を行い、平成26年度に採択となり、新しい研究課題として継続する見込みである。本研究では、フィリピンのミンダナオ島ダバオ市の文化的少数者であるサマ・バジャウ社会を事例に、貧困者は画一的に捉えられるべき救済対象者ではなく、価値観や文化に従った主体的選択により行動しているという基本仮説を立て、客観的指標、参与観察及びライフ・ストーリーによる民族誌の作成で検証する。これにより、経済生活と価値観の相互関係を動態的に検討するための方法論及びそれを具体的に示すデータセットを提供する。2年目の平成24年度は、過去の調査結果に基づいて調査地を代表する5つの家族の社会関係と資源獲得及び分配をみながら、都市における生活の再編を、生業、宗教、政治の3場面において、(1)過去に収集したデータの再確認、(2)最新のデータの捕捉を開始した。交付申請書では5つの家族について同時並行的に調査することを想定していたが、データセットの特殊性から、昨年度末の時点で1家族ごとに行う方法に変更した。ただし、調査地住み込みで調査しているため、ほかの家族についても随時、情報を収集中である。研究成果は、"Social Inequalityamong Sama-Bajau Migrants in Urban Settlements"という題目の英語論文で公刊した。2012年8月13日にはフィリピンのアテネオ・デ・マニラ大学フィリピン文化研究所で公開講義を行った。その折にスルー研究先駆者Gerry Lixhon先生の出席を得たことで、2013年度米国での報告準備につながった。当初の研究計画は、フィリピンのミンダナオ島ダバオ市の文化的少数者サマ・バジャウ社会を事例に、貧困者は画一的に捉えられるべき救済対象者ではなく、価値観や文化に従った主体的選択により行動しているという基本仮説を立て、複合的調査法により検証するものだった。これにより、経済生活と価値観の相互関係を動態的に検討するための方法論及びそれを具体的に示すデータセットを提供することを目指し、最終的に民族誌を英語と現地語で作成する予定であった。平成25年度夏に予定していた家族史調査のため、英語論文執筆及び講演・報告を通じてこの分野の欧米出身の先行研究者であるクリフォード・セイザー博士及びハリー・ニモ博士をそれぞれ米国の自宅に訪問、そこで口頭報告を行い(平成25年6月29日同年7月9日)、本研究の意義と独自性を確認できた。平行して、ダバオ市で調査対象の5家族を訪問し、過去の日本語著作の翻訳(英語・セブアノ語)の内容確認の準備をした。また、地域的文脈をよりよく理解するため、フィリピン再民主化過程に関する政治学の議論(とくに中間層と貧困層との接触領域を扱ったもの)を学び、二重公共圏を論じた著作の書評も執筆した。英語論文の準備としての自己の日本語論文の翻訳を進め、それを公表し(Harvard-Yenching InstitueのDissertation Writing Seminarに参加、及び日本の学術雑誌に投稿)、ハーバード大学で本研究テーマに関連するランチトーク(90分)をハーバード大学人類学部のテオドル・ベスター教授を討論者に迎えて行った。下記で「今後の研究推進方策」に記すように、この留学中に本研究課題について分析枠組みの発展をみたため、「研究計画最終年度前年度応募」に応募し、平成26年4月に採択されたため、本研究は平成25年度末をもって発展的に終了することとなった。初年度である平成23年度は、上記の概念的および分析的枠組を検討し、研究の方向性及びその独自性を確認するため、専門家から助言を受け、文献サーベイを行った。具体的には、1960年代70年代にサマについて先駆的な人類学的研究を行った2人の研究者、NimmoとSatherの文献を読み直し、60年代にサマを含むスールー海域の民族集団について研究をリードしたフィリピンのアテネオ・デ・マニラ大学の社会学・人類学研究者と議論した。

その結果、本研究の意義として、都市貧困層の生活について経済的側面と文化的側面の相互作用を見るという、いわば経済学と人類学を架橋する理論的貢献のほかに、海域世界を離脱したサマが都市において他民族集団に吸収されることなくサブ文化を形成している点を初めて実証する点で東南アジアの海民研究に対する貢献が期待できること、また、フィリピン地域研究としては、天然資源や文化資源が可視化でき、法律的保護や文化復興運動の対象となっているような「先住民」に対し、保護すべき、あるいは市場化可能な資源がないと外部者にみなされているがゆえに、たんに「貧困者」として扱われているような、見えにくい、周縁化されたマイノリティの生活の文化の側面に光をあてることで、フィリピン社会に対する理解を深めることが期待できると確認された。以上の結果をまとめ、次年度以降の研究につなげるため、調査地のサマの生業基盤が多様化しており、従来の村落研究のように均一集団として社会組織を考えるのとは別の方向の検討が必要であることを示すために一次資料分析による英語論文を1本まとめ(次年度刊行予定)、海外での発表準備を進めた。島嶼部東南アジアの経済と宗教現在までの達成度はおおむね順調に進展している。しかし交付申請書に付した内容に照らすと、平成24年度の目標と平成25年度の目標がややオーバーラップした形で進行している。平成24年度の目標で達成できなかったことは、1960年代にスールー諸島の海サマ人の陸上生活への移行について社会組織に注目しながら先駆的研究を行ったH.アルロ・ニモ博士をサンフランシスコに訪ね、調査について助言を受けることである。これができなかったのは、研究代表者本人が2013年8月末に入院手術をしたことと、同時にニモ博士を紹介してくださったアテネオ・デ・マニラ大学のリクソン先生が9月に急逝されたためである。このため、ニモ博士の訪問は平成25年の6月末7月初旬の日程で再調整した。なお、ニモ博士には会えていないものの、ニモ博士を指導したリクソン先生より思いがけずご指導いただけたことは交付書にも記載していない、予想外の幸運であったといえよう。逆に、上記による予定の変更を埋め合わせるために、平成25年度の目標でありながら、平成24年度に開始することとなったのは、家族史調査の実施である。具体的には3月に2週間ほどの住み込み調査を実施した。この折に、5つの家族のうち、所得水準の最も高いグループにとくに過去の調査のフィードバックや最新情報のアップデートを図った。同時に、5家族全てについて、口承文芸(創成神話/紀元神話)があるかどうかききとり調査を行った。このように、予期せぬ出来事から当初の予定どおり目標を必ずしも達成できたわけではないが、全体の研究計画からみればおおむね順調に進展しているといえる。また、ニモ博士への訪問が次年度となったことは、ある程度のフィールドワークを行った段階での中間報告となることを意味し、むしろ好ましいと判断している。交付申請書に記した通り、初年度(平成23年度)において、マニラでAteneo de Manila UniversityのDr. Wilfred F. Arceを訪問し、その助言のもとで文献調査を行い、サマ研究の最新の動向を把握した。また、この際、同大学のフィリピン文化研究所でほかのフィリピン研究者複数とも議論し、研究のもつ独自性を確認した。日本国内でも、東洋大学の長津一史准教授と学会発表及び研究会発表を共に行い、さらに京都大学東南アジア研究所の清水展教授からも研究指導を受け、研究の方向性の深化を図った。
支台歯形成イメージガイデッドシステムの開発

歯科臨床における支台歯形成の技術を効率良く習得するため,支台歯形成支援システムの開発を試みた.三次元力覚デバイスによる接触感覚を有した支台歯形成シミュレーションおよび位置測定装置を応用して形成をリアルタイムで視覚的に支援するシステムである.シミュレータおよび三次元データ(支台歯,タービン,形成用ポイント)と支台歯形成練習用ファントム,顎模型,位置測定装置により構成され,測定した顎模型と形成用タービンの位置情報をモニタ上の歯列とタービンにレジストレーションすることで,リアルタイムに形成時の支台歯,タービン位置,および削合による変形をモニタ上で確認できた.本研究は、歯科医療の技術教育とくに支台歯形成に着目し,三次元力覚デバイスによる接触感覚を有した支台歯形成シミュレーションおよび位置測定装置を応用した形成をリアルタイムで視覚的に支援するイメージガイデッドシステムを構築することを目的としている.これまでの成果ではリアルタイムかつ定量的な研削,支台歯形態の変形を行うことが可能な硬組織変形モデルを製作した.また,研削を行うタービンの動きをコンピュータ上で表現するシミュレータの開発を行ってきた.本年度は,試作したシミュレータで実際に支台歯形成を行ったことのある歯科医師に使用させ,形成時の感覚や形成量の程度,形成画面の使用感などについて調査を行い,シミュレータの改良を行った.シミュレータの改良として,三次元力覚デバイスにおける接触感覚や形成量の程度について段階的に調節が可能となるよう設定し,繰り返し形成を試みることで実際の支台歯形成により近似するよう調整した.また,シミュレータの作業画面に表示する形成モデルの回転を制限し,技術レベルによって形成時に表示できる範囲を決定できるよう設定した.これまで形成用モデルはSTLデータの入力が可能であり,変更が容易であったが,支台歯形成に使用する形成用のポイントについてはあらかじめ用意されたデータから選択できるように変更した.さらにコンピュータ上による支台歯形成では前後方向の認識が難しく,とくに隣在歯に接触しているかどうか判別しにくかった,そこで隣在歯の衝突判定を設定し,形成時に隣在歯に触れると隣在歯の色が変化することで容易に確認できるように改変した.歯科臨床における支台歯形成の技術を効率良く習得するため,支台歯形成支援システムの開発を試みた.三次元力覚デバイスによる接触感覚を有した支台歯形成シミュレーションおよび位置測定装置を応用して形成をリアルタイムで視覚的に支援するシステムである.シミュレータおよび三次元データ(支台歯,タービン,形成用ポイント)と支台歯形成練習用ファントム,顎模型,位置測定装置により構成され,測定した顎模型と形成用タービンの位置情報をモニタ上の歯列とタービンにレジストレーションすることで,リアルタイムに形成時の支台歯,タービン位置,および削合による変形をモニタ上で確認できた.本システムは三次元力覚デバイスによる接触感覚を有した教育用支台歯形成シミュレーションおよび形成を視覚的に支援するナビゲーションからなるシステムである.平成24年度は,支台歯形成に最適となる硬組織変形モデル方法を構築し,同時に本モデルを搭載したシミュレータを試作することによって,ナビゲーションシステムへの応用を検討した.支台歯形成ナビゲーションを行うにあたり,リアルタイムかつ定量的な研削変形を行うことが可能な硬組織変形モデル,およびタービンの動きを忠実にコンピュータ上で表現すシミュレータの開発を行う.まず,歯の解剖学的特性を考慮し研削時の衝突圧や摩擦状態などに応じた変形能を有する変形モデルが必要となる.そこで,三次元スキャナを用いて研削する歯のモデルをコンピュータに取り込みポリゴン形状の三次元VRモデルとした.次に,ポリゴン形状の内部をボクセルで充填し,境界球判定処理を用いてタービンモデルとの衝突計算を行う.このときタービンモデルは力覚提示デバイスを用いることで,研削時の衝突圧を力覚として変換して制御を行った.衝突判定が演算された場合,octreeアルゴリズムを用いて衝突ボクセルを研削していく.最終的に,ボクセルデータをポリゴン形状に再変換することによって研削処理を実現した.その結果,シミュレーション機能を有する硬組織変形モデルを構築し,シミュレータにより定量的な変形状態が表示された.さらにPhantomから研削時の衝突圧を得られ,実際の支台歯形成に近似した操作が可能となった.本研究は,歯科医療の技術教育とくに支台歯形成に着目し,三次元力覚デバイスによる接触感覚を有した支台歯形成シミュレーションおよび位置測定装置を応用して形成をリアルタイムで視覚的に支援するイメージガイデッドシステムを構築することを目標としている.これまでの成果ではリアルタイムかつ定量的な研削,支台歯形態の変形を行うことが可能な硬組織変形モデルを製作し,切削を行うタービンの動きをコンピュータ上で表現するシミュレータの開発,改良を行ってきた.これによりシミュレータは三次元力各デバイスによる接触感覚や形成量の程度などを実際の支台歯形成に可及的に近似するよう調整された.さらに,表示画面での隣在歯の衝突判定を設定することで,形成時の隣在歯への接触が色調の変化で確認できた.本年度は,シミュレータをイメージガイデッドシステムに搭載することで支台歯形成をリアルタイムに表示可能なシステムを構築した.シミュレータおよび三次元データ(支台歯,タービン,形成用ポイント)と支台歯形成練習用ファントム,顎模型,位置測定装置により構成される.三次元VRモデルの作製は三次元スキャナを用いて研削する支台歯モデルをコンピュータに取り込みポリゴン形状の三次元VRモデルとし,タービン,形成用ポイントは三次元CADソフトにて設計した.位置測定装置の光学式マーカーを下顎歯列およびタービンにジグを介して装着し,位置情報を得た.次に,シミュレータソフトの指示ツールを用いて個々のモデルの形態的特徴点をポイントし,VRデータとの座標系を一致させた.

これにより,測定した顎模型と形成用タービンの位置情報をモニタ上の歯列とタービンにレジストレーションすることで,リアルタイムに形成時の支台歯,タービン位置,および削合による変形をモニタ上で確認できた.クラウンブリッジ補綴学本年度までの予定であった、支台歯形成シミュレータおよびイメージガイデッドシステムの開発は,ほぼ完了している.支台歯形成シミュレータの改良により本研究でメインとなる支台歯形態の変形部分が完成したことから,実際のタービンの位置情報を加えることで,これらの情報により支台歯形成の変形を行わせることで,イメージガイデッドシステムの構築が完成する.本年度の目的としては支台歯形成シミュレーション・ナビゲーションシステムの構築である.大元である歯を形成するシミュレータの開発には着手し,ナビゲーションシステムへの適応は可能と思われる状態であるため,おおむね順調に進展していると考えている.しかし,よりリアルな研削感覚を付与したり,実際の形成の評価については今後解決していかなければならない問題である.しかし,当初計画していた支台歯型時の形成圧の計測はシミュレータの性質上,使用できないデータとなるため,形成時の摩擦や接触圧に対するデータはナビゲーションシステムに移行した後,実際の形成量とモニター上での形成量を比較することで実際の形成と近似しているかどうか検討を行う予定である.平成26年度は、これまで勧めてきたシミュレータの改良に,実際のタービンの位置情報を加えることで,支台歯形成イメージガイデッドシステムの構築を完成させる.研究計画においてはボランティアにシステムを使用させアンケート調査を行うことを予定していたが,システムの妥当性について検討を行うことが先決であると思われる.したがって実際に形成した支台歯形態と視覚支援に使用するコンピュータ上の支台歯形態との比較を行いながら,システムの精度を向上させていく予定である.本年度に開発したシミュレータの研削感覚や切削量などを実際の支台歯形成と近似させるよう調整を行う.さらにシミュレータ完成後,ナビゲーションシステムへ移行していくことで,高い教育効果が期待されるものと考える.また,支台歯形態の評価方法,評価項目を列挙し,システムの改善とともに行っていく.ナビゲーションシステムへ移行した後,ナビゲーションを行うメラミン歯の形成量とモニター上での形成量を比較することでシミュレータの形成量が適切かどうか検討を行う.さらに開発したシミュレーション・ナビゲーションシステムの応用として医局員での予備的検討開発した支台歯形成シミュレーション・ナビゲーションシステムを応用する.アンケートにより本システムの使用感,支台歯の具備すべき条件下での定量的評価を行い,システム構築へフィードバックすることでより効果的なシミュレーション・ナビゲーションシステムを目指す.
イネミトコンドリアATP合成酵素の分子形態と無機栄養素

1)イネを材料に使用することで計画したが、精製上の困難があり、テッポウユリを主な材料とすることにした。2)イネ、およびユリのミトコンドリアF_1-ATPaseを精製した。イネおよびユリとも同じ5種類のサブユニットから構成されていることが判明した。ユリの精製酵素を用いてF_1-ATPaseに対する抗体を調製した。またユリからF_0F_1-ATPaseを電気泳動的に均一に精製することに成功したが、そのサブユニット構成の解明が残されている。3)F_0F_1-ATPaseの精製中に、植物の部位によってSMP(亜ミトコンドリア粒子)のF_0F_1-ATPase活性が異なることを見いだした。ユリで詳細に検討し、花粉で活性が高く、球根で低いことなどF_0F_1-ATPase活性に器官特異性があることをはじめて見いだした。4)SMPのF_0F_1-ATPase活性の器官特異性は、F_0部とF_1部をそれぞれ調製し、再構成する方法で検討した。その結果器官特異的な活性はF_0部に起因すること、およびF_0が存在する膜のリン脂質の脂質組成も器官によって異なることを明らかにした。また器官特異的活性発現に関連すると思われるF_0F_1-ATPaseのインヒビターを単離することができた。このインヒビターは分子サイズが約16kDで活性の低い球根のSMPに多く存在した。器官特異的酵素活性を決めていると思われるこれら膜脂質の差やインヒビターの存在などを明らかにすることによって、植物F_0F_1-ATPaseの分子形態の特徴を探る新しい手がかりを与えることができた。5)イネ培養細胞を用いて、栄養ストレスがSMPのF_0F_1-ATPaseに与える影響を検討したところ、亜鉛欠乏とマンガン欠乏でF_0F_1-ATPase活性が著しく低下した。この原因としてF_0F_1-ATPaseそのものの酵素活性の低下とミトコンドリアの膜構造の破壊などが考えられるが、今後解決すべき課題である。イネ黄化幼苗のミトコンドリアから亜ミトコンドリア粒子(SMP)を経てF_1-ATPaseを精製し、電気泳動的に単一にした。分子量は約380,000であった。SDS電気泳動の結果、サブユニットはα,β,γ、δ、εの5種類が確認できたが、δ'は精製のロットによって出現することもあり今後の確認が必要である。ユリの花粉および球根からもF_1-ATPaseを単一に精製し、分子量は380,000、5種類のサブユニットからなり両単子葉植物からのF_1-ATPaseはよく似ていた。精製F_1-ATPaseはATP以外にもUTG,GTP,CTPなどをその基質としたが、ホスファターゼの基質であるpNPPは基質とはならなかった。また亜鉛イオンによって活性化されることを初めて見いだした。イネからは大量のF_1-ATPaseを調製することが困難であったので、ユリ球根から本酵素を調製し、抗体を作成した。また花粉からも本酵素を調製し、α、βサブユニットについて二次元電気泳動でその多様性を検討したところ、αサブユニットは花粉、球根いずれの場合も等電点の異なる2種類のペプチドが存在したが、βについては花粉で2種類、球根では1種類でありF_1-ATPaseの多様性が認められた。

SMPでは花粉のATPase活性が、球根のそれより10倍以上高かった。その原因を検討したところ、膜に貫入したF_0部分にあることを部分再構成F_0F_1-ATPaseなどを用いて明らかにした。要素欠乏細胞でのF1-ATPase活性については現在検討中であるが、幾つかの元素欠乏でATPase活性が見かけ上低下していたが、その詳細については検討中である。1)ミトコンドリアF_1-ATPaseをイネからも精製した。イネの場合もテッポウユリと同じく5種類(α,β,γ,δ,ε)のサブユニットから構成されていることが判明した。2)イネ培養細胞を用いて、栄養ストレスが亜ミトコンドリア粒子(SMP)のF_0F_1-ATPaseに与える影響を検討したところ、亜鉛とマンガン欠乏でF_0F_1-ATPase活性は著しく低下した。この原因としては、F_0F_1-ATPaseそのものの酵素活性の低下、あるいはミトコンドリアの膜構造の破壊などが考えられるが、今後解決すべき課題である。3)F_0F_1-ATPaseの解析中に、用いる植物材料によってSMPのF_0F_1-ATPase活性が異なることを見いだした。テッポウユリで詳細に検討したところ、花紛で活性が高く、球根で低いこと、また葉はその中間の値を示すことを明らかにした。4)SMPのF_0F_1-ATPase活性の器官特異性は、花紛と球根のF_0部とF_1部をそれぞれ調製し、再構成する方法で検討した。その結果、器官特異的な活性はF_0部に起因することがわかった。また器官特異的活性発現に関連すると思われるF_0F_1-ATPaseインヒビターを単離することができた。このインヒビターは分子サイズが約16kDで活性の低い球根のSMPに多く存在した。5)テッポウユリ花紛および球根からF_0F_1-ATPaseをほぼ単一に精製することに成功した。6)以上の結果、F_0F_1-ATPaseの器官特異的活性は膜を含むF_0部に起因することを明らかにし、今回新しく見いだしたインヒビターが活性調節の一翼を担っている可能性を示した。また数種の無機栄養ストレスによってF_0F_1-ATPase活性が著しく影響されることを示し、これら無機栄養元素とF_0F_1-ATPaseの新しい関連を示すことができた。
子宮内膜および胚におけるエストロゲン受容体サブタイプの機能解析

エストロゲン受容体(ER)はリガンド依存性転写因子であり、従来1分子種と考えられていたが、最近新たなER(ERβ)が見いだされた。そこで従来のER(ERα)とERβとの機能の相違を明らかにすることを目的として、生殖器官および胚における両者の局在と発現時期の解析を行った。まず、各々の特定のアミノ酸配列に対するポリクロナール抗体を作成し、ラットの生殖器官における局在を検討した。ウェスタンブロットにおいて、抗ERα抗体では卵巣と子宮に66kDaのバンドを、また抗ERβ抗体では卵巣、子宮および前立腺に55kDaのバンドを認めた。次にエストロゲン非存在下での両者の細胞内局在を免疫組織化学によって確認したところ、ERαは子宮内膜の腺および内腔上皮細胞の核に、ERβは腺上皮細胞の核だけに認められた。卵巣においては顆粒膜細胞の核が抗ERβ抗体で染色されたが、抗ERα抗体では特異的なシグナルを認めなかった。卵巣において、ERβはproestrous、metestrousとdiestrousに認められたが、estrousではほとんど認められなかった。以上よりラット子宮と卵巣において、ERαとERβの局在と発現時期には相違があることが明らかとなり、生殖器官における2つのレセプターの役割を理解するための手がかりとなると考えられた。さらに、初期胚発生における各ERの役割を理解するために、RT-PCRによってマウス卵細胞と着床前胚においてERαとERβ両方の発現を検討した。ERαmRNAは卵巣、顆粒膜細胞・卵細胞複合体、母細胞、2細胞期胚および4細胞期胚で発現していたが、8細胞期胚では一旦消失し、桑実胚と胚盤胞で再び発現した。ERβmRNAは桑実胚で発現していないことを除きERαと同様な発現パターンが認められた。また、エストロゲン応答性遺伝子であるefpの発現がERαとERβの発現パターンと同期していることが確認された。以上より初期胚発生においてはERサブタイプ間での大きな相違はなく、両者ともにエストロゲンの初期胚における何らかの作用を仲介していることが明らかとなった。本研究は胚および子宮内膜におけるエストロゲン受容体(ER)サブタイプ(α・β)の発現様式および機能解析を目的とする。第1に発現様式に関しては、胚の成熟の各段階においてエストロゲン受容体各サブタイプが現れる時期の解析、およびその後の発現量変化について調べ、第2に胚一子宮内膜間の相互作用におけるエストロゲン受容体サブタイプの機能の差について解析する研究計画に基づいて実験を行った。そこで、本年度は子宮、卵巣、卵および初期胚において各生殖周期におけるERα・β各々の発現を検討した。まず、エストロゲン受容体サブタイプの抗体を家兎を用いて作成した。このポリクローナル抗体を用いて、ラットの子宮および卵巣におけるERα・βの局在を免疫組織化学により分析したところ、ERαは子宮内膜上皮細胞および腺上皮細胞のいずれの細胞においても存在が確認されたのに対し、ERβは腺上皮細胞の核のみに存在していた。また、卵巣においては、顆粒膜細胞にERβの存在が確認されたが、ERαは認められなかった。さらに、顆粒膜細胞のERβはproestrous、metestrousおよびdiestrousにのみ認められ、estrousには認められなかった。次に、マウス受精卵および初期胚におけるERα・βの発現をRT-PCR法を用いて検討した。

その結果、ERα・β共に4細胞期まではおそらく母体由来のmRNAを保持しており、胚盤胞以後に胚由来のmRNAが発現されることが明らかとなった。以上のデータは、すでに論文発表ないし投稿を終えており、現在、胚-子宮内膜間の相互作用におけるエストロゲン受容体サブタイプの機能の差についての解析が進行中である。本研究は胚および子宮内膜におけるエストロゲン受容体(ER)サブタイプの発現様式および機能解析を目的とする。平成10年度には、胚の成熟の各段階においてER各サブタイプが現れる時期およびその後の発現量変化についての解析を行った結果、ERαおよびβは未受精卵から4細胞期まで発現が認められるものの8細胞期で消失し、胚盤胞に至って再発現することが明らかとなり、平成11年度にEndocrine Journalに発表した。平成11年度にはさらに、ラットの子宮および卵巣におけるER各サブタイプの局在の解析を行った。その結果、ERαは子宮内腔上皮および腺上皮に存在が確認されたのに対し、ERβは腺上皮のみに認められ、これらの結果もEndocrine Journalに発表した。すなわち、胚-子宮内膜においてER各サブタイプは時期や部位に応じて各々の発現量が異なり、それらの機能に差があることが推察されたため、以後、ER各サブタイプの機能と胚-子宮内膜間の相互作用との関連について研究を進めている。現在、10年度に作成した抗ERαおよび抗ERβ抗体を用いて胚-子宮内膜間の相互作用部位におけるERのサブタイプの発現様式を比較している。また、in vitroで胚-子宮内膜相互作用を研究する実験系の構築を目的として、子宮内膜細胞培養系の細胞にネオマイシン耐性遺伝子を発現するER各サブタイプの発現ベクターおよびドミナントネガティヴ体の発現ベクターを形質導入しネオマイシンでセレクトすることにより、それぞれのERサブタイプを強制発現している細胞株を作成中である。エストロゲン受容体(ER)はリガンド依存性転写因子であり、従来1分子種と考えられていたが、最近新たなER(ERβ)が見いだされた。そこで従来のER(ERα)とERβとの機能の相違を明らかにすることを目的として、生殖器官および胚における両者の局在と発現時期の解析を行った。まず、各々の特定のアミノ酸配列に対するポリクロナール抗体を作成し、ラットの生殖器官における局在を検討した。ウェスタンブロットにおいて、抗ERα抗体では卵巣と子宮に66kDaのバンドを、また抗ERβ抗体では卵巣、子宮および前立腺に55kDaのバンドを認めた。次にエストロゲン非存在下での両者の細胞内局在を免疫組織化学によって確認したところ、ERαは子宮内膜の腺および内腔上皮細胞の核に、ERβは腺上皮細胞の核だけに認められた。卵巣においては顆粒膜細胞の核が抗ERβ抗体で染色されたが、抗ERα抗体では特異的なシグナルを認めなかった。卵巣において、ERβはproestrous、metestrousとdiestrousに認められたが、estrousではほとんど認められなかった。以上よりラット子宮と卵巣において、ERαとERβの局在と発現時期には相違があることが明らかとなり、生殖器官における2つのレセプターの役割を理解するための手がかりとなると考えられた。
ナノメッシュ構造を利用した合金ナノ粒子の創製と耐熱性評価

酸化バナジウムナノメッシュ表面上において、2種類の元素からなる合金ナノ粒子が作製できること、また、ナノ粒子の平均組成や大きさや数密度が制御可能であることもわかった。一方で、酸化バナジウムナノメッシュの耐熱性に問題があり、ナノ粒子の耐熱性評価に適していないことが明らかとなった。酸化バナジウムナノメッシュにかわる材料として、スズからなるナノメッシュ格子の創製研究と酸化セリウムからなるナノメッシュの作製と構造解析研究を行った。その結果、Ag(111)表面上においてスズが二次元のハニカム格子を形成すること、Rh(111)表面上において酸化セリウム超薄膜がテンプレート構造を形成することを明らかにした。平成26年度は、合金ナノ粒子創製のための超高真空対応型試料準備チェンバーを設計製作し、性能確認を行った。4種類の金属蒸着源を試料準備チェンバーに取り付けることが可能となり、本研究課題の遂行に向けて大きく前進した。次に、Pd(111)表面上の酸化バナジウムナノメッシュを再現性良く作製する実験条件を明らかにした。また、ナノ粒子作製に向けて白金、ルテニウム、パラジウムの蒸着条件を明らかにした。白金ナノ粒子が想定通り作製されることを確認し、現在、ルテニウム、パラジウムについてもナノ粒子が形成されるかどうかについて実験を行っている。実験はおおむね順調であり、今後は成果発表も随時行っていく予定である。従来のトップダウン加工技術であるリソグラフィー技術は、微細加工精度の限界が近づいている。一方で、リソグラフィー技術による微細加工は、大量生産に対して大きな課題がある。それゆえ、近年、ボトムアップ法による新しい加工技術が注目されている。固体表面上における結晶成長の制御は、大きさの制御が可能になりつつあるため注目されているが、ナノ粒子の空間配列制御は難しい課題として残されている。最近、固体表面上のナノメッシュ構造をテンプレートとして利用することにより、大きさのそろった金属ナノ粒子を高密度で規則的に創製できることがわかってきた。平成27年度は、Pd(111)表面上に作製した酸化バナジウムナノメッシュにパラジウム、ルテニウム、金、銀、銅、ニッケル,白金の7種類の金属を蒸着した。現在、どのような合金ナノ粒子が形成可能であるか調べているところである。蒸着初期においても、銅やニッケルはナノメッシュエッジにてクラスターを形成し、ナノドット内へ収まることはなかった。金、銀、白金、パラジウム、ビスマスは、逆にナノメッシュエッジに吸着してクラスターを形成することなく、ナノドット内におさまり、ナノドットのみを形成した。なお、金原子が隣接するナノドットに浸入すると酸化バナジウムナノメッシュが破壊することが判明した。実験は、おおむね順調であり、今後は成果発表も随時行っていく予定である。本研究課題と深く関連し、平行して取り組んでいる酸化亜鉛超薄膜および酸化セリウム超薄膜の作製と構造解析の研究において、投稿論文が二報受理されている。Pd(111)表面上に作製する酸化バナジウムナノメッシュが一時期再現性良く作製されなくなり、時間を要した。原因は、真空チェンバーの真空度の質がポンプ性能の劣化により、以前より悪くなったためであることが判明した。これに伴い、酸化バナジウムナノメッシュが水分あるいは水素分子に対して、化学的に安定ではないことが明らかとなった。今後は、真空度をより良い条件で実験を行うとともに、新たなナノメッシュの開発にも取り組む。本研究課題と深く関連し、平行して取り組んでいる酸化亜鉛超薄膜および酸化セリウム超薄膜の作製の研究も順調に進んでいる。Pd(111)表面上に作製した酸化バナジウムナノメッシュにパラジウム、ルテニウム、金、銀、銅、ニッケル,白金の7種類の金属を蒸着した。銅やニッケルは蒸着初期においてもナノメッシュエッジにてクラスターを形成し、ナノドット内へ収まることはなかった。平成28年度は、2種類の元素からなる合金ナノ粒子が作製できること、また、ナノ粒子の平均組成や大きさや数密度が制御可能であることもわかってきた。一方で、酸化バナジウムナノメッシュの構造安定性が高くなく、超高真空環境下においても残留ガスと反応し、崩壊することも明らかとなった。そこで、酸化バナジウムナノメッシュにかわる材料として、スズからなるナノメッシュ格子の創製研究と酸化セリウムからなるナノメッシュの作製と構造解析研究を行った。Ag(111)表面上において、スズからなるナノメッシュ格子が形成されることがわかった。また、Rh(111)表面上において、酸化バナジウムナノメッシュ原子層膜がナノメッシュ構造を形成することがわかった。

酸化バナジウムナノメッシュにかわる材料として、スズからなるナノメッシュ格子の創製研究と酸化セリウムからなるナノメッシュの作製と構造解析研究を行った。その結果、Ag(111)表面上においてスズが二次元のハニカム格子を形成すること、Rh(111)表面上において酸化セリウム超薄膜がテンプレート構造を形成することを明らかにした。本研究課題を効率よく遂行するために、当初計画にはなかった合金ナノ粒子創製のための超高真空対応型試料準備チェンバーを設計製作し、必要十分な性能を有していることを確認した。また、次に、Pd(111)表面上の酸化バナジウムナノメッシュを再現性良く作製する実験条件を明らかにし、また、ナノ粒子作製に向けて白金、ルテニウム、パラジウムの蒸着条件を明らかにした。一方で、ルテニウム、パラジウムについてもナノ粒子が形成されるかどうかがまだ判明しておらず、トータルでは概ね順調に進展していると思われる。酸化バナジウムナノメッシュの作製、合金ナノ粒子の創製、分析と一連の実験を、真空度をより良い条件で実験を行うとともに、新たなナノメッシュの開発にも取り組む。表面界面制御工学<合金ナノ粒子の創製>今年度は、ルテニウム、白金あるいはパラジウムを複数種蒸着することにより、合金ナノ粒子を創製し、その組成や構造を明らかにする。ここで、蒸着する金属の順番や蒸着する金属原子の量、さらには蒸着時のナノメッシュ基板の温度について、様々な条件で作製する。<合金ナノ粒子の構造評価> LEED法によりナノメッシュの結晶周期性が維持されているかを確認し、STM法により蒸着した2種類の金属の空間分布や合金ナノ粒子の形成の有無を明らかにする。さらに、XPS法により蒸着した金属の化学結合状態を調べることにより、合金ナノ粒子の化学結合状態に関する知見得る。一様な合金ナノ粒子が作製されたことが確認された後、蒸着した元素の原子数密度と合金ナノ粒子の種類とその個数から、ナノ粒子当たりの構成原子数や組成比を評価する。<計算機シミュレーション>合金ナノ粒子の構造モデルは、上述の第一原理計算により決定するが、さらに、得られた構造モデルのSTMシミュレーション像と実験から得られるSTM像の比較から、構造モデルの妥当性を評価する。合金ナノ粒子の電子状態(バンド構造)の評価は、第一原理計算により行う。<耐熱性の評価>作製した合金ナノ粒子およびナノメッシュの熱的安定性を明らかにするために、800°C以下の様々な温度で試料を加熱し、合金ナノ粒子およびナノメッシュの熱的安定性を上述したSTM-LEED-XPS法による複合分析により明らかにする。予算の都合上、ワークステーションの購入は断念することとなったが、既存のワークステーションのマシンタイムを本研究課題に優先的に割り当てることにより、当初の計画課題を遂行する予定である。
大脳皮質眼球運動関連領域のオブジェクト内連続サッカード運動課題中の神経活動

サルにサッカード課題を訓練して、前頭眼野(FEF)、補足眼野(SEF)、を含む前頭葉を広く皮質内微小刺激と細胞活動の記録によりマップピングをした。その結果、FEF SEF以外にも運動前野腹側部(PMv)と背側部(PMd)にもサッカードを皮質内微小刺激により誘発できる部位を見出した。PMvには、固視点の位置の影響を受ける上肢の運動関連活動を示す細胞も有り、その活動は、外部基準点としての固視点または、複合図形内の相対位置に依存している可能性が示唆された。次いで、連続サッカードを同時に左右のFEFに刺入した電極によるペア皮質内微小刺激の効果から、刺激効果は従来考えられている眼位に依存しない固定サッカードでも、またゴール収斂型でもなく、固視の基準点からみたあるターゲット位置に現在の限位から収斂した。この場合、ターゲットの基準点は任意に決められる事から、融通性のある座標表現であり、オブジェクト座標にも対応しうると想定された。さらに連続的なサッカードのときには、基準点を新しい位置に更新する事が重要であると考えられるが、この機構を調べる目的で、FEFとLIPを比較検討した。すると、随意的なサッカードの場合、基準点はダイナミックにその位置を元の固視点から、新たな固視点に更新されることが明らかになったが、LIPでその基準点の更新が早い事が判明した。結論としてサッカードに関しても、上肢の運動関連領域と同様に、多数の大脳皮質領野が制御している。これらの領域は、オブジェクト内連続サッカードにおいては、基準点の定めかた、サッカードのターゲットの基準参照型の空間表現、基準点のサッカード時の更新に関わり、このような座標表現は、認知的なサッカード運動の制御に役立つものと考えられる。本研究では、まず神経生理学的方法(特に皮質内微小刺激法)をもちいて、大脳皮質のFEF、SEFと其の近傍の運動前野を探索した。その結果、運動前野の一部にサッカードを誘発出来る部位が存在する事が判明した。また運動前野の一部には、眼位の影響をうける運動関連活動をしめす細胞が存在した。一方で、FET、SEFにおいては、固視課題と、遅延サッカード課題の課題の課題遂行中の皮質内微小刺激(ICMS)の効果が異なっている事が判明した。すなわち、SEFでは課題遅延期間中では、準備中のサッカードのターゲットへ向かうサッカードが誘発されFEFでは、固視期間と同様のサッカードが誘発された。さらに、固視期間に、左右のFEFを連続的にICMSで刺激すると、2つのサッカードが誘発されたが、その2番目のサッカードの方向、大きさは、サッカードベクトルがFEFに表現されているという従来のベクトル説では説明のできず、新しい解釈が必要である事が示唆された。このペア刺激のFEFの応答性は、特にダブルまたはそれ以上の連続サッカードの実行に於ける、FEFの機能的役割を考える上で重要であり、連続サッカードの制御機構は単独のサッカードの制御にない新しい側面があると考えられる。眼球運動の大脳皮質関連領野は複数の領野が分散的に機能連関しているという事をさらに検討していく必要がある。大脳皮質には、サッカード制御に関連する領野が複数あり、中でも前頭眼野FEF、補足眼野SEF、頭頂葉LIP野がよく知られている。しかしこの三者の機能的差異は不明な点が多い。サッカードに関わる三領野の差を調べる目的で、固視課題、遅延サッカード課題、上肢到達課題をサルに訓練した。さらに其の課題遂行中に各部位を細胞活動記録用電極を使って皮質内微小刺激を行った。刺激効果に関して、LIPとFEFに関して、興味深い差が見られた。

刺激誘発のサッカードは、基準となる点があり、そこからのベクトルとして表現されるが、随意的サッカードの前後では、其の基準点が元の固視点から新しい固視点に更新される。これは、FEF、LIP両方で見られたが、其のタイミングに差が見られた。すなわち、LIPはFEFに比較して、基準点のアップデートが早く行われた。この事は、視覚応答に関して、受容野がサッカ-ドに先行して移動するとする以前に報告と共に考えると、受容野の場合も、誘発サッカ-ドの場合も、其の基準点がどこに位置しているかは、課題の中でダイナミックに調節されている事が明らかになった。このような基準点座標におけるサッカ-ド制御機構は、従来知られた、固定ベクトルやゴ-ル収斂型サッカードの表現と違い、オブジェクト内連続サッカード運動課題中において、重要な機能的意義がある事が示唆された。大脳皮質には、サッカード運動の制御に関係する部位として前頭眼野(frontal eye field:FFF)以外に、補足眼野(Supplementary eye field:SEF)が知られる。しかし、オブジェクト等の連続サッカードには頭頂連合野など、空間認知の機構と密接な関係があると考えられるので、頭頂葉特にLIPと前頭眼野とサッカードの制御に関し比較した。用いた方法は、遅延サッカード課題を訓練した動物から、細胞活動と微小皮質内刺激法を用いて調べた。かつ以前の研究から、大脳皮質のサッカード運動の表現には方向大きさのベクトルとしてのパラメータ以外にも、現在の眼位とは異なる基準点からのターゲットの相対的な位置としての表現の可能性を見出している。この基準点はサッカードにより更新され,いわばremappingされるが、頭頂葉LTPが前頭眼野より早く更新される事を見出した。これは連続サッカードを行う場合に頭頂葉が関与するとする考え方を指示するものである。
子どもにおける超越的存在イメージに関する発達および臨床心理学的研究-小学生から大学生まで

平成5年度は、幼児における超越的存在イメージについて、さまざまな超越的存在を図版にしたものを使用して調査を行った。そこで得られた結果から、超越的存在イメージについての感じ方が「自我境界」という概念によって捉え得る事を示した。平成6年度は、子どもにおける超越的存在イメージについて、子どもにおける「心の支え」イメージと関係付けて調査研究を行った。調査対象は一般家庭の子どもと養護施設の子どもとした。一般家庭における子どもに関してはその発達傾向について、また養護施設における子どもに関しては、一般家庭の子どもとの共通点と相違について、検討を行った。さらに養護施設の子どもに関しては被調査対象者の人数が少ないことと、一人一人の事情がきわめて個別的かつ複雑でもあるため、事例研究をあわせて行った。一般的家庭の子どものだいたいの発達傾向として、男子は心の支えを、年少の頃は家族に求め、次第に「自分」や、「友人」に分化していく。女子は年少の頃は男子と同じく、「家族」が心の支えとして選択され、次第に「友人」を選択する傾向が増えてくることが示唆された。それに対して養護施設では、まず回答自体が一般家庭とかなり質を異にすることが明らかとなった。その具体的な現れとしては、回答の選択肢には存在しない「心の支えはない」という答えが少ないながらも存在したこと、および一応選択肢の中の一つを選びながらも今一つその対象にコミットしていない感が強く、あいまいな印象を与える回答が少なからず存在したことなどである。さらに事例研究によって、突っこんだ考察を行った。見えない存在についての調査、つまり心の支えとなっているものは何かの調査で、その発達的様相と自我境界に関して、男子と女子の間に有意な差がみられた。男子については、小3のころは、「家族」および「家族」に端を発していると思われる「自分」を心の支えにしている。発達に伴い、その傾向とあいまって、「友人」の比重がましていく。又見えない存在について、「神仏」より「霊」、その意味として、「肯定的」より「中立・否定」の反応が増えている。このことは、「神仏」のイメージは家族からの自立を志向する際の葛藤あるいは緊張関係をその背後に推測できる。一方、女子においては、小3のこと「家族」が圧倒的に心の支えとして選ばれ、その傾向は徐々に弱まり「友人」が増加していく。男子と異なり、中3の一時期「自分」が増すのみで、その他は、あまり大きな割合を占めない。このことから、男子においては、男からの自立が、自己を親とは別の存在として作りあげていく傾向が強いのに対して、女子の場合は(相対的ではあるが)親との関係は比較的友好に保ちながら、友人関係の中で、自分の位置づけを確かなものにする方向へと移行していくものと考えられる。平成6年度は、子どもにおける超越的存在イメージについて、子どもにおける「心の支え」イメージと関係付けて調査研究を行なった。一般家庭における子どもに関してはその発達傾向について、また養護施設における子どもに関しては、一般家庭の子どもとの共通点と相違について、検討を行なった。さらに養護施設の子どもに関しては被調査対象者の人数が少ないことと、一人一人の事情がきわめて個別的かつ複雑でもあるため、事例研究を合わせて行なった。「心の支え」というやや漠然としていて、しかもさまざまな状況や深さの次元があり得る調査内容であるため、調査手続きは、一般家庭の子どもに対しても養護施設の子どもに対しても、被験者一人に対して調査者が一人で聞き取る個別面接法を採用した。さらに場合によっては、質問項目を補ったり修正したりして、質問内容を被験者が的確に理解し、調査目的に合った意味のある回答が得られるように工夫を行なった。一般的家庭の子どものだいたいの発達傾向として、男子は心の支えを、年小の頃は家庭に求め、次第に「自分」や「友人」に分化していく。女子は年小の頃は男子と同じく、「家族」が心の支えとして選択され、次第に「友人」を選択する傾向が増えてくることが示唆された。

それに対して養護施設では、まず回答自体が一般家庭とかなり質を異にすることが明らかとなった。その具体的な現れとしては、回答の選択肢には存在しない「心の支えはない」という答えが少ないながらも存在したこと、および一応選択肢の中の一つを選びながらも今一つその対象にコミットしていない感が強く、あいまいな印象を与える回答が少なからず存在したことなどである。さらに事例研究によって、突っ込んだ考察を行なった。
全身性エリテマトーデスにおけるCD154発現異常に関与する遺伝子配列の解析

CD154は、主にCD4陽性T細胞上に発現する糖蛋白であり、B細胞上のCD40を介して抗体産生を誘導する。CD154の発現は一過性であり、これは抗原特異的な抗体産生を制御する上で重要な分子機構である。全身性エリテマトーデス(SLE)では抗2本鎖DNA抗体をはじめとする様々な自己抗体が認められるが、SLE患者リンパ球においてCD154は恒常的に発現し、自己抗体産生などの病態に深く関与していると考えられている。本研究では、SLEにおけるCD154発現異常は、CD154mRNA量が増加しているだけでなく、健常人に比べCD154mRNAがより安定化していることを見い出し、その原因を検索するため、以下の検討を行った。SLE40例,健常人28例の末梢血からCD4陽性T細胞を分離しPMA+ionomycin刺激後mRNAを抽出し、CD154安定化に関与していると考えられるCD154 3'UTR部位をRT-PCR法にて増幅し、direct sequence法を用いて同部位の塩基配列を解析した。SLEに塩基配列の異常は認められなかった。同部位にはCA repeatが存在しrepeat数には個人差が認められたが、疾患との明らかな関連は認められなかった。また、5'UTR部位の塩基配列も検索した範囲内ではSLEでの異常は認められなかった。このことから、CD154mRNAの安定化は遺伝子配列異常によるものではなく、他の原因があると考えられた。次に、SLE患者CD4陽性T細胞を4日間培養すると刺激後のCD154mRNAの安定化は認められなくなったことから、CD154mRNAの安定化は可逆的であり、生体内では何らかの因子が安定化に関与していると考えられた。本研究は、この安定化を規定する血漿中の因子の同定に方向転換され、現在解析をすすめている。全身性エリテマトーデス(SLE)患者と同性同年齢の健常人を対象とし検討をおこなった.1.末梢血CD4陽性T細胞において、SLEの病態に強く関与していると考えらているCD154の発現をRT-PCR法にて検索した.SLEでは未刺激でCD154の発現が認められるのに対し、コントロール群ではCD154発現は認められなかった.2.CD4陽性T細胞のPMA+ionomycin刺激後におけるCD154の発現は、蛋白レべル、mRNAレベルともSLE患者では健常人に比べ長時間持続した.4.SLE35例,コントロール28例の末梢血から採取したリンパ球に刺激を加えmRNAを抽出し、cDNAとした。それを鋳型として、CD154安定化に関与していると考えられるCD154 3'UTR部位をPCR法にて増幅し、direct sequence法を用い、同部位の塩基配列を解析中である。現在まで明らかな塩基配列の異常は認めていない。同部位にはCA repeatが存在しrepeat数には個人差が認められるが、今のところ疾患との関連は不明である。5.今後はさらに症例数を増やし、CD154 5'UTR部位についても検討する。また、CD154はX染色体上に存在するため、CD154 destabilizing elementsの塩基配列について、SLE家系での発症例、未発症例についての検索を行う。検索の結果、認められた塩基配列異常を有するCD154 mutant遺伝子を培養細胞に遺伝子導入し、wild typeと比較する事により、実際のmRNAのstabilizationに対する影響について検討する。
α-シヌクレイン分解酵素ニューロシンの細胞内プロテアーゼ特性とその制御因子の検討

α-シヌクレインの分解活性を有するニューロシンの酵素学的特性および活性に影響を与える因子を培養細胞を用いて検討した。ニューロシンは細胞内では主として小胞体に局在し、培養上清中に分泌された。細胞外に分泌されたニューロシンには、セリンプロテアーゼ活性が認められ、α-シヌクレイン分解活性を有していた。一方で細胞内に存在するニューロシンには酵素活性は認められなかった。ニューロシンは主として細部外プロテアーゼとしてα-シヌクレインの分解に関与している可能性が高いと考えられた。今年度は、α-synucleinの分解活性を有するセリンプロテアーゼであるneurosinの細胞内局在および細胞内での動態を、neurosinおよびα-synucleinを発現させた培養細胞系を用いて検討した。方法は、Pre-pro-neurosin、そのEGFPとの融合蛋白質、α-synucleinの発現ベクターを構築し、HEK293T細胞にトランスフェクトして、細胞内局在部位を検討した。また、抗neurosin抗体および抗α-synuclein抗体によるウエスタンブロッティングで細胞内および培養上清中の蛋白発現を検討し、セリンプロテアーゼの合成基質ペプチドを用いて培養上清中のセリンプロテアーゼ活性を検討した。さらに、pre-pro-neurosinとα-synucleinをHEK293T細胞に共発現させて、細胞内でのα-synucleinプロセッシングを検討した。結果として、1)neurosinおよびEGFP融合neurosinともに細胞内に検出され、かつ細胞外にも分泌されていた。2)neurosin発現細胞の培養上清中にはプロテアーゼ活性が検出された。また、3)細胞内では、neurosinは小胞体マーカーと局在性が一致していた。さらに、4)α-synucleinおよびneurosinを共発現した細胞内では、両者の発現を確認したが、α-synucleinの分解産物は検出できなかった。培養細胞に発現させたneurosinは小胞体に存在し、細胞外に分泌され、培養上清中でセリンプロテアーゼ活性を有していることから、neurosinは細胞外セリンプロテアーゼとして機能している可能性が考えられた。昨年度に続いて、α-シヌクレイン分解活性を有するニューロシンの細胞内局在および細胞内での動態を、ニューロシンおよびα-シヌクレインを発現させた培養細胞系を用いて検討した。昨年度の検討で、ニューロシン-EGFPをトランスフェクトしたHEK293T細胞ではニューロシンが小胞体に局在するという結果を得たが、GFPの結合による蛋白分解系への非生理的なsortingの可能性も考えられた。今年度はニューロシンのみを発現させたHEK293T細胞で、抗ニューロシン抗体とER、ミトコンドリア、ライソゾームなどの各種細胞内オルガネラ・マーカーとの局在を詳細に検討した。その結果、ニューロシンはERマーカーと局在性が一致していたが、ミトコンドリアマーカーとは局在が一致せず、ライソソームマーカーとは一部で局在性の一致が認められた。また、ニューロシン発現細胞の細胞抽出液および無血清培養上清のウエスタンブロッティングでは、細胞抽出液中には全長ニューロシンに加えて、糖鎖修飾を受けたと考えられるニューロシンが検出された。培養上清中では後者のみが検出された。以上からは、GFPを結合させていないニューロシン発現細胞においても、ニューロシンは細胞内では主としてERに局在し、分泌経路で糖鎖修飾を受けて細胞外に分泌されることが確認された。また、昨年度に行ったセリンプロテアーゼの合成基質ペプチドに対する細胞外ニューロシンの酵素活性の検討を、より詳細に行う目的で、細胞内(細胞抽出液)および細胞外(培養上清)に存在するニューロシンの合成基質ペプチド分解活性を定量的に検討した。その結果、細胞内ニューロシンにはペプチド分解活性が認められなかったが、細胞外ニューロシンにはセリンプロテアーゼ活性が確認された。以上は、ニューロシンは細胞外セリンプロテアーゼとして機能しているという我々の仮説を支持する結果であった。昨年度までの検討で、α-シヌクレイン分解活性を有するニューロシンが主として分泌経路によって細胞外に分泌されることを示した。さらに平成21年度には、細胞抽出液および培養上清に存在するニューロシンの、合成セリンプロテアーゼ基質ペプチド(Boc-Gln-Ala-Arg-MCA)に対する分解活性を定量的に検討し、細胞外ニューロシンにはペプチド分解活性があったが、細胞内ニューロシンには分解活性が無いことを示した。平成22年度は、ニューロシンの細胞内(細胞抽出液)および細胞外(培養上清)でのα-シヌクレイン分解活性を、これまでと同様にニューロシンを発現させた培養細胞で検討するとともに、新たにpre-pro-ニューロシンおよびα-シヌクレイン発現ベクターをHEK293T細胞にトランスフェクトしてニューロシンとα-シヌクレインを共発現させた培養細胞系を作成し、この培養細胞系を用いてニューロシンの細胞内におけるα-シヌクレイン分解活性を検討した。

まず、このような共発現細胞系においても細胞抽出液中にはα-シヌクレインの分解産物は検出できず、細胞内のニューロシンはα-シヌクレイン分解活性を有していなかった。一方、ニューロシン発現細胞の培養上清中に分泌された細胞外ニューロシンについては、培養上清にリコンビナントα-シヌクレインを添加し、一定時間ごとに一部を回収して上清中のα-シヌクレインの経時的変化をウエスタンブロッティングで検討した。その結果、培養上清中のα-シヌクレインは経時的に減少し、細胞外に分泌されたニューロシンはα-シヌクレイン分解活性を有していた。以上からは、ニューロシンは主として分泌経路により細胞外に分泌され、細胞外セリンプロテアーゼとして細胞外でのα-シヌクレインの分解・代謝に関与していると考えられた。