hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
文脈依存的な意思決定を担う前帯状皮質から後頭頂葉皮質への領域間作用

予備的なデータについては解析を進め、すでにマウスの行動のアウトプット依存的に活動が変化する細胞を同定している。また、当初の予定にあったER-Creシステムを用いたChrimson遺伝子の時間選択的な発現制御についてだが、訓練に予想以上に時間がかかることが判明し、ウイルスのインジェクションから導入までに期間が空いてしまうため、十分な発現量が得られないことが判明した。このため、現在は学習成立後の個体にウイルスをインジェクションすることで発現誘導までの時間を最小限に抑えるように予定を変更している。すでに確立に成功している文脈依存的な行動課題は、そもそもマウスでは訓練が困難と考えられていた、ヒトやマカクザルを対象とした心理学的研究を適用したチャレンジングなものであり、そのような課題が効率よく、かつ再現性高く確立できたことそれ自体、大変学術的価値が高いといえる。さらに、行動課題の確立のための試行錯誤の過程で、いくつかの予想外の発見があり、現在それらの観察結果についても別の論文として成果をまとめるため、準備をしている。2光子顕微鏡を用いたデータ取得と解析についても予想以上に効率よく進んでいる。とりわけDeepLabCutを用いたトラッキングにより、従来以上に正確に瞳のトラッキングを行うことが可能になっただけでなく、姿勢などの視覚野の神経細胞の活動に影響を与えうる他の非視覚的要素の情報を同時に取得することが可能になったため、より詳細に神経活動データを分析することが可能になった。RNNを用いた神経集団活動のモデリングについてもLFADS(Pandarinath et al, 2018, Nat. Methods)などの強力な手法が発表されたこともあり、また所属研究室のインフラが整備され、GPUサーバーによるモデルの効率の良い訓練が可能になったため、当初の予定よりスムーズな遂行を予想している。当初の予定通り進める。とりわけ2019年度は訓練個体からの神経活動データの取得、及びその解析を主に進める。神経活動データを解析する際には、非視覚的な影響(例えばStringer et al, 2018, bioRxiv)などに注意し、一般化線形モデルなどを用いて純粋な認知的計算に相関する活動を抽出する。また、意思決定に関わる神経活動がposterior parietal cortex (PPC)のみならず他の視覚野で広く観察されているという最近の研究(Koay et al, 2019, bioRxiv; Minderer et al, 2019 Neuron)に留意し、PPC以外の神経回路(例えば一次視覚野)からも記録し、両者の類似点、及び違いを明らかにすることを試みる。行動データについても、逆相関法などの精神物理的解析を行う。また、マウスの行動はhistory依存的なバイアスを強く示すことが知られているが、それらの影響を定量するモデル(Roy et al, 2018, NeurIPS)を用いて行動をより詳細に分析し、神経活動との相関を明らかにすることを試みる。
日本の教員文化の特質と現段階-その社会学と社会史

首都圏の小中学校教師対象のアンケート調査を前年末に実施したが、その集計分析を今年度行い、教師文化がこの社会と学校の中で、いかなる意味で自律性をもち、また公共的なものとの通路を確保し得るのかを、最近のオートポイエシス理論を視点にして検討した。この成果は秋の学会で報告した。埼玉県の退職教員名簿からランダムにサンプリングして、千名余にアンケートを発送し、570名ほど回収した。その中からさらに35名を選んでインタビュー調査を行い、28名に会って話をきくことができた。ここからは戦中、戦後55年間の日本の教育制度、小・中学校の制度の変化の中で、教師たちが学校をどう体験し、どのように悩み、また支えられてきたのか、が浮かび上った。とくに、その世代的変化と時代的変化の重なりがあって、教師たちの世界がしだいにせばめられていく姿がそこに見えている。両調査の分析とも、まだ課題を残し、特にインタビュー調査の結果は十分検討し切れていないが、二つのアンケート調査結果について、この調査に協力してくれた人達とともに、報告冊子を作成した。日本教育史の中の教員文化の成立と展開について、資料収集を進めた。また、教員社会と教員文化の歴史と実態について、世代を区切った現・元の小・中教師のインタビューを、神奈川県・千葉県・福岡県・兵庫県で通算11名行った。その成果の一部は、論文として公表した。教員文化における日本的実態に関する教師アンケート調査は、東京、埼玉、神奈川、千葉の教職員名簿から、小・中教師1,558通を発送した。回収と集計・分析は年度を越えて行われる。また、次年度に行う予定の退職教員に対するアンケートとインタビューをめざして、各県の「退職教員名簿」を集めている。一連の研究作業は、その最終的成果を、次年度に持ち越しており、今年度内でのそれは、予備的なものとなっている。首都圏の小中学校教師対象のアンケート調査を前年末に実施したが、その集計分析を今年度行い、教師文化がこの社会と学校の中で、いかなる意味で自律性をもち、また公共的なものとの通路を確保し得るのかを、最近のオートポイエンス理論を視点にして検討した。
新たなコミュニティワークの理論および実践に関する研究一アメリカでの取り組みから

近年、地域福祉の中心となるコミュニティワーカーは、高齢者サロンや小地域福祉活動などの活動に携わりながら近隣およびコミュニティの形成を進めているが、その実践に関してモデルを体系化することが求められている。本研究では、アメリカのWeil & Gamble(1995)が提示する8つのモデルに基づくアンケート調査からコミュニティワークの実態と課題に関して考察を行った。また、近年のアメリカにおけるコミュニティワークの動向についての現地調査を実施し、日本のコミュニティワークのあり方およびコミュニティワーカーに必要な知識やスキルについて検討した。さまざまな新しい問題の解決に向けてコミュニティワークを展開する上で、従来の社会福祉の枠組みを超えて農業、教育、住宅、都市計画などの分野と連携および協働、政策への働きかけなども焦点にあてた経済と生活の質の向上を目的とする社会開発的アプローチが必要であることを明らかにした。アメリカの社会福祉領域では福祉消減、民営化、個人責任論などが主流となり、その結果、社会的に不利な立場の人々への様々なサービスカットが一層進んでいる。このような状況を受けて、再びコミュニティに着目するインターベンションが注目されている。本研究は、アメリカのソーシャルワークにおけるコミュニティワーク(CW)の概念の展開および援助方法の現状と課題を検討し、日本の地域福祉の鍵となるコミュニティワークの体系化および実践モデルの構築へ貢献することを目的とする。本年度は、アメリカにおけるコミュニティワークの動向について、以下の調査・研究を実施した。(1)CWに関する先行研究に関するレビューをコミュニティ・プラクティス(CP)を中心に行い、その動向の整理に取り組んでいる。(2)米国コロラド州デンバー市のNPO(貧困者、母子世帯、移民、高齢者を対象)への現地調査(関係者への聞き取りと参与型調査)を実施した。在宅高齢者ケアとコミュニティワークとの関連についてデンバー大学のCox教授らと現行の福祉政策の特徴、コミュニティワークの展開、必要性について議論し、そのニーズが大きいにも関わらず政治的支持に欠け、資金確保が非常に厳しい状況であることが分かった。また、低所得コミュニティの女性を対象とするグラミン・アメリカの活動に関するデータ収集を行った。今年度の調査の一部は、『世界の社会福祉年鑑2009』「グラミン・アメリカ」としてまとめ、2009年12月に刊行した。他の調査結果は、関連学会誌へ投稿準備中である。今年度の調査から、アメリカのコミュニティワークの動向、必要性、実践における課題が明らかになった。その活動領域は、近隣の組織化から社会運動までと幅広くいくつかの研究はモデルを提示し、対象者も貧困者、母子世帯、移民、高齢者、ホームレス、元受刑者など包含している点は、日本の地域福祉とは大きく異なることが明らかになった。今年度(中間年)の研究実施計画はほぼ予定通り行うことができた。福岡県地域福祉活動職員連絡会主催の研修事業2010「コミュニティワーカー養成研修会」に講師として、約20名の地域福祉に携わっている社協職員を対象に、(1)コミュニティワーカーの役割を学ぶ-8つの領域、(2)事例研究(社会計画と機能的コミュニティの組織化)、(3)事例研究(近隣及びコミュニティの組織化とプログラム開発とコミュニティの連絡調整)、(4)まとめ-コミュニティワーカーに求められるもの、の内容を中心に研修会へ参加した。日本におけるコミュニティワーク(CW)の現状を把握するツールとしてM.ウェルの8つのCWモデルを分析の枠組みとし、参加者の活動内容を整理した。初回の研修で、参加者(19名)ヘコミュニティワークに関するアンケート調査(支援対象、必要なスキル、CWを推進する上で心掛けて行くこと)およびグループインタビューを実施した。アンケート調査から、CWの対象者は高齢者、障害者、子ども、当事者、近隣組織が多く、ワーカーが考える必要なスキルとして、調査・計画・評価、ネットワーキング、組織力、行動力、コミュニケーション、政治的技術などがあげられた。従来のサロン、小地域ネットワーク、地域活動計画、近隣・多様な小グループの組織化は実践されているものの、新たなニーズを抱えているホームレス、外国人、依存者、1人親世帯などへの実践および個別のニーズからCW実践へ展開されていない現状が浮き彫りになった。ウェルのモデルと参加者の活動内容を比較した結果、特に政治的・社会的運動の活動がほぼ存在しておらず、CWの活動範囲が政策への働きかけまで至っていない。その理由として、日本型CWにおいて政治的側面は馴染みの少ない活動であることがあげられるが、一方ではその必要性も確認された。また、グループインタビューでは、社協の組織的課題として、存在意義、コミュニティワークに対するサポート体制、組織内における情報交換、事例研究や研修会、行政との連携などの課題が明らかになった。研究事業の最終年度にあたる本年度は、本研究事業がテーマとしてきた「コミュニティプラクティス」と「エンパワーメント」に関する現状を把握する目的で先行研究のまとめを進めるとともに、国内外の研究者および実務者との情報交換・協議を行った。

2012年5月には、国際ソーシャルワーカー連盟(IFSW)前会長Dr.David Jonesと国際的な視点から研究テーマに関する議論を深める事ができた。8下旬から9月にかけてアメリカのコミュニティ・プラクティス(CP)の動向分析のためデンバー市において現地調査を行った。マイノリティの中でも同市のヒスパニック系住民の多くは貧困、失業、高校中退、薬物依存、ホームレス、母子世帯の増加などの社会問題に直面しており、問題解決のために政府・NPOが多種多様なプログラムを展開している。中でも、NPO MiCasaResource Centerは、ヒスパニック系低所得者を対象に生活、就労、教育、語学などの先駆的な取り組みを行っている。活動内容は、個人と家族への支援と伴に、ヒスパニック系地域への呼びかけ・働きかけ、雇用創出の機会、ケアネットワーク(子ども、高齢者、障害者など)、コミュニティ内外のビジネスの連携、他の黒人系やアジア系コミュニティとの連携、警察と地域防犯の連携などに焦点を当て、近年は特に新しいコミュニティ形成およびつながりを築くための活動を進めている。同時に、青少年を対象とするリーダーシップ育成、新たな領域(緑ビジネス)での就労訓練、議員および議会への働きかけなど生活と経済支援の多岐に及んでいる。地域の近隣やグループを組織化し、警察との連携を図りながら犯罪防止活動も進めている。また、貧困母子世帯を対象とするWork Optionfor Women (WOW)は、生活、教育、就労、家計管理、メンタルヘルスなどの個人・家族支援を通して、当事者のセルフヘルプワークへとつなげエンパワーメントを実践している。さらに、NPOが経営するカフェを基盤とし、幅広くWOWの活動やサポーター、ボランティアの働きかけなども活発に行っている。一方、日本では特に貧困、就労との関連から予防的なCPが求められることを確認した。
ケモカインからみた歯周炎病変局所浸潤リンパ球の組織破壊への関与に関する研究

歯周炎病変局所にはリンパ球をはじめとした様々な免疫担当細胞が認められ、歯周組織破壊に関与していると考えられている。特にリンパ球集積部では、歯周組織の構成細胞である歯肉線維芽細胞、歯肉上皮細胞、血管内皮細胞などが浸潤リンパ球との相互作用により様々な起炎物質を出し、歯周炎の進行に関与していることが示唆されている。また、近年Th1細胞が歯周組織破壊に関与していることも示唆されているが、歯周炎病変局所へのTh1細胞の浸潤機構は明らかとされていない。本研究ではTh1細胞浸潤に関与しているとされるTh1ケモカインであるCXCL16に着目し、その歯周炎組織での発現ならびに歯周組織構成細胞の一つである歯肉線維芽細胞にCXCL16産生能があるかどうかを明らかとするため研究を行った。その結果、歯周炎組織にはCXCL16発現が認められ、そのレセプターであるCXCR6発現細胞が多く浸潤していることが明らかとなった。また、歯肉線維芽細胞はIL-1β,TNF-αならびにIFN-γ刺激によりCXCL16を産生し、その産生にはMAPK,PI3KならびにNF-κBを介したシグナル伝達経路が関与している事が明らかとなった。これらのことより、歯周炎病変局所へのTh1細胞浸潤にCXCL16が関与している可能性が示唆された。歯周炎はプラーク中に含まれる歯周病原性細菌により惹起される慢性炎症性疾患でT細胞などの免疫担当細胞と線維芽細胞との複雑な相互作用によって病変が形成されているが報告されている。ケモカインはサイトカインの一種であり、炎症性細胞などの遊走、浸潤に関与していることが報告されている。その中の一つCXCL16はT細胞の遊走に関与していることが報告されているが、歯周炎での発現ならびにその役割については明らかとなっていない。本研究ではCXCL16ならびにそのレセプターであるCXCR6に着目し、歯周炎病変局所でのCXCL16およびCXCR6発現の解析、ならびに歯周組織の主な構成細胞の一つであるヒト歯肉線維芽細胞(HGF)のCXCL16産生の解析を行った。免疫組織化学的解析により歯周炎病変局所においてHGFはCXCL16を発現しており、同一部位にCXCR6陽性炎症性細胞が浸潤していることが明らかとなった。HGFのCXCL16産生は炎症性サイトカインであるIL-1beta,TNF-alphaならびにTh1関連サイトカインであるIFN-gammaにより濃度依存的に増強された。また、IL-1betaが誘導したCXCL16はTh2関連サイトカインであるIL-4ならびにIL-13により抑制された。さらに、シグナル伝達物質であるp3 MAPK, ERK, JNK, PI3KならびにNF-kappaBがHGFのCXCL16産生に関与していることが明らかとなった。これらの結果より、歯周炎組織中においてHGFのCXCL16産生は様々なサイトカインによりコントロールされていることが明らかとなった。また、CXCL16はT細胞浸潤に関連していることより、歯周炎病変局所において多くのサイトカインによってT細胞浸潤は調節されていることが示唆された。歯周炎はプラーク中に含まれる歯周病原性細菌により惹起される慢性炎症性疾患でT細胞などの免疫担当細胞と線維芽細胞との複雑な相互作用によって病変が形成されていることが報告されている。その中の一つCXCL10はTh1細胞の遊走に関与していることが報告されているが、歯周炎での発現ならびにその役割については明らかとなっていない。本研究ではCXCL 10に着目し、歯周組織の主な構成細胞の一つであるヒト歯肉線維芽細胞(HGF)のCXCL10産生に対する解析を行った。

HGFはIL-1 beta, TNF-alphaならびにIFN-gamma刺激によりCXCL10産生が誘導された。また、TNF-alphaとIFN-gammaは相乗的にHGFからのCXCL10産生を増強した。一方、Th2サイトカインであるIL-4とIL-13はTNF-alphaあるいはIFN-gammaが誘導したCXCL10産生を抑制した。また、Th17サイトカインであるIL-17AおよびIL-22はIFN-gammaが誘導したCXCL10産生は増強したが、TNF-alphaが誘導したCXCL10産生は抑制した。さらに、regulatory T細胞が産生するIL-10はTNF-alphaあるいはIFN-gammaが誘導したCXCL10産生を抑制したが、TGF-beta 1はTNF-alphaが誘導したCXCL10産生は抑制したが、IFN-gammaが誘導したCXCL10産生は増強した。これらの結果より、HGFのCXCL10産生は様々なサイトカインによりコントロールされていることが明らかとなった。また、CXCL 10はTh1細胞浸潤に関連していることより、歯周炎病変局所において多くのサイトカインによってTh1細胞浸潤は調節されていることが示唆された。
現代アメリカ外交の「視座」形成過程をめぐる複合的研究

本年度は昨年度からの繰越金を使用し、米国から3名の研究者を招聘して国際シンポジウムを開催した。(そのうち1名の招聘には、共催科研費(B)「トランスナショナルな紐帯を保持する移民のホスト社会への編入=三つの最新事例(代表高橋均教授)からの資金を使わせていただいた)開催日、開催場所、概要は以下の通りである。開催日:2017年11月12日(日)、開催場所:東京大学駒場キャンパス上記シンポジウムの成果は、アメリカ太平洋地域研究センター発行の紀要『アメリカ太平洋研究』18号(2018.3)で公表した。本年度は昨年度からの繰越金も使用し、11月にアメリカから3名の研究者を招聘して(一部は他の科研費を使用)国際シンポジウム「アメリカは今歴史から政治へ」(公開)を開催した。また、このシンポジウムと合わせて、主として専門家や大学院生を対象とするセミナーも開催した。シンポジウムの成果は東京大学総合文化研究科アメリカ太平洋地域研究センター発行の『アメリカ太平洋研究』18号(2018年3月)563頁に掲載されている。なお、3名の招聘者のうち、マイケル・アダス教授については、健康上の理由により来日が中止されたが、事前にペーパーが提出されており、シンポジウム及びその後の成果発表においてもこの企画に全面的に参加してもらうことができた。本年度は最終年度にあたるため、研究代表者及び分担者は、学会報告や学会誌への投稿を通じての成果発表を中心とした活動を行う。基本的には各自が所属の学会での報告や論文成果発表を行う予定である。研究成果の報告を中心とした研究会を7月及び2019年12月の二回開くとともに、1011月には海外からの研究者を招聘し、公開セミナーを実施する。昨年度のシンポジウム、今年度のセミナーの内容などを踏まえ、成果公表に向けての話し合いも並行して進める予定である。「現代アメリカ外交の「視座」形成をめぐる複合的研究」初年次には、プロジェクトの視座、アプローチ、各自の研究テーマについての意見交換をするために研究会を二回、開催した。2016年7月18日には研究代表者の西崎文子が「プロジェクトにあたっての問題意識と背景」をテーマに、アメリカ外交をめぐる「視座」の多様性、その歴史的文脈、そして地域研究としてのアメリカ外交研究について報告をした。2016年12月26日には、研究分担者の古矢旬北海商科大学教授が「オバマ外交の8年ーアメリカ外交史の分水嶺?」とのテーマで報告をした。2016年の大統領選挙の衝撃から遡って、オバマ外交の歴史的背景、その達成と限界を振り返った上で、トランプ外交の持ちうる意味やその急進性を議論した。2016年秋に海外からの研究者を招聘してセミナーを開催する企画があったが、日程調整がうまくいかず、翌年度に繰り越すことを決定した。なお、2017年3月には、研究分担者の古矢旬教授が代表者であるプロジェクト「東アジアにおけるアメリカ認識の相克ー日中韓比較による総合的研究」が主催する「国際シンポジウム戦後世界秩序を振り返るー2017年から」を共催した。このシンポジウムでは酒井啓子教授(千葉大学)、ロブ・クルーズ教授(ユトレヒト大学)、デイヴィッド・ファーバー教授(カンザス大学)、ケネス・ルオフ教授(ポートランド州立大学)が招聘され、アメリカと中東との関係の変化の兆や、トランプ外交の持つグローバルな意味が議論され、西崎が討論者を務めた。今年度は二回の研究会を開催し、密接に関連するテーマでのシンポジウムを共催した。2016年がアメリカ大統領選挙の年でもあり、アメリカ外交・政治に対する関心が一般的にも高まったために、研究代表者及び分担者は各方面でプロジェクトと関連する研究報告などを行なっている。そのような動きに後押しされて、研究会及びシンポジウムでは濃密な議論が繰り広げられた。2016年秋に予定されていた海外からの研究者招聘は翌年度に繰り越しされたため、その点では計画が変更となったが、研究代表者や分担者による研究・調査活動は活発に行われており、それ以外ではおおむね順調に進展していると判断される。

引き続き研究代表者と研究分担者がそれぞれの研究テーマに沿って、資料調査、学会報告、論文執筆を進めていくほか、年に2回程度の研究会を開催し、「アメリカ外交の「視座」形成過程」についての意見交換を行う。翌年度には、今年度招聘が叶わなかったために実現できなかった国際セミナーの代わりに、23名の海外からの招聘者を含むやや大規模な国際シンポジウムの開催を企画している。そのための準備作業は今年度のうちに行い、日程調整、テーマの絞り込み、全体の構成については概要が固まっている。また、シンポジウムに合わせて、本プロジェクトのメンバーを含む数名の報告者による専門家セミナーも開催する予定である。シンポジウムやセミナーでの研究成果はアメリカ太平洋地域研究センターの発行する「アメリカ太平洋研究」などに発表する予定である。本年度は最終年度にあたるため、研究代表者及び分担者は、学会報告や学会誌への投稿を通じての成果発表を中心とした活動を行う。基本的には各自が所属の学会での報告や論文成果発表を行う予定である。研究成果の報告を中心とした研究会を7月及び2019年12月の二回開くとともに、1011月には海外からの研究者を招聘し、公開セミナーを実施する。昨年度のシンポジウム、今年度のセミナーの内容などを踏まえ、成果公表に向けての話し合いも並行して進める予定である。
アメリカの対沖繩軍政の総合的研究(続)

本研究の目的は、日本占領研究の不可分な一部たるべき沖繩占領について米国政府および米軍政府、琉球列島米国民政府関係の文書・資料を収集するとともに、沖繩統治に直接・間接に関与した人々の証言を通して沖繩占領の実態を体系的かつ総合的に明らかにし、それを日本(本土)占領研究の中に正当に位置づけることにある。この目的を達成するため昭和62年より3か年にわたり米本国において現地調査を行った。昭和62年度は、ワシントンを中心にボストン、ニュ-ヨ-ク、サンフランシスコ等で調査を行った。主な収獲を上げれば、ボストンではケネディ大統領記念図書館で1960年代初期の大統領特別補佐官カ-ル・ケイセンを団長とする沖繩調査団による「ケイセン報告書」を収集したこと、さらにライシャワ-元駐日大使とインタビュ-ができたこと等である。さらに、ワシントンの米国立公文書館では、対日講和条約関係文書並びに1950年代に米国務省と国防総省間においてなされた沖繩返還論議に関する資料を大量に入手できた。また、ホノルルでは、現地で発刊されている邦字新聞、英字新聞から沖繩関係記事を収集するとともに、ハワイ大学図書館では「ホ-レ-文庫」蔵の沖繩関係文書を収集した。昭和63年度の調査は、前年度調査で新たに資料の所在が確認された米陸軍大学図書館において、事前に複写機器の持込み許可を得て強力な資料収集を行った。同図書館には、琉球列島米国民政府の元高等弁務官たちの沖繩統治に関する貴重な証言資料が保存されており、これを収集するとともに、同校卒業生(陸軍将官級)の沖繩に関わる卒業論文ー沖繩の核問題に言及したものを含むーを入手できた。さらに、ニュ-ヨ-ク、サンフランシスコ、ホノルル市等では、その土地で発刊されている新聞社を訪問し、つとめて沖繩関係新聞記事の収集を行った。一方ワシントンでは、元米国民政府渉外局長を長年勤めたエドワ-ド・E・フライマス氏を訪問、多くの未公開資料を収集することができた。平成元年度は、予算の都合から研究代表者のみの現地派遣となったが、従来にもまして定点観測ともいうべき最重要資料の調査、および資料収集にあたった。国立公文書館をはじめ米海軍図書館にも赴き、各省庁間での沖繩問題論議、さらに政策決定過程に関わる重要な資料を入手できた。こうした成果と並行して同年9月には、那覇市において全国の占領研究者を集め沖繩占領研究会を開催した。同研究会は、今後の日本占領研究のあり方に大きな問題を投げかけることにもなり、本土マスコミでも広く全国に報じられた。第一次、同二次現地調査を終了したが、これからは本格的な収集資料の分析にあたるとともに、関係研究者とも協議して今後の全般的な研究の総括に入っていくつもりである。近い将来研究代表者、同分担者の研究成果を集大成して、可能な限り和英両文で本にして研究者の参考に供する計画である。

同研究会は、今後の日本占領研究のあり方に大きな問題を投げかけることにもなり、本土マスコミでも広く全国に報じられた。第一次、同二次現地調査を終了したが、これからは本格的な収集資料の分析にあたるとともに、関係研究者とも協議して今後の全般的な研究の総括に入っていくつもりである。近い将来研究代表者、同分担者の研究成果を集大成して、可能な限り和英両文で本にして研究者の参考に供する計画である。
難治性腫瘍性疾患に対する新規検査法の開発

『難治性造血器悪性腫瘍・固形腫瘍における新規共通増殖機構の解明とそれをターゲットとした新規検査法の開発』を深化・実用化するために(1)(2)を通じた研究・開発を行う。(1)難治性腫瘍の新規予後因子の探索とそれを利用した新規検査法の開発A:急性骨髄性白血病の新規予後因子探索;AML-05登録患者検体を用いて、網羅的遺伝子解析を遂行中であり、t(8;21)及びMLL転座型AMLにおいて、新規遺伝子変異を見出し、変異遺伝子の機能解析を遂行中である。t(8;21)細胞株を用いて、in vitro及びin vivoにおける細胞死誘導機序を解析し、CDK4/6阻害剤によるin vitro及びin vivoにおける抗腫瘍効果を検討する。B:難治性腫瘍予後不良因子をターゲットとした新規遺伝子スイッチ法の開発;CML、MLL-AML細胞株を用いたPI-Pライブラリー(SAHA、Chb-conjugated)スクリーニングを施行し、IC50が1μM以下のHITsを取得する。野生型マウスを使用したHITsの簡易毒性試験(10mg/kg・週1回投与)を実施し、毒性の低いHITsのValidationを実施する。(2)新規検査技術の開発A:Xeno-Graft Banking新規マウス生体内ヒト腫瘍細胞増幅技術;JCCG再発ALL観察研究登録中の患者検体をNOGマウスを用いて増幅、保存中である。B:フローサイトメーターによる白血病微小残存病変の検出;JCCGAML臨床試験(AML-D11)の患者検体を用いて、三重大学とともに、微小残存病変を解析し、MRD陽性例は予後不良であることを見出し、今年のアメリカ血液学会で発表予定である。C:レーザーマイクロダイセクション法の開発;JCCG再発AML観察研究登録患者の再発時検体のG-CSFRtypeIV発現量解析を中央診断施設として解析中である。1.急性骨髄性白血病の新規予後因子探索;AML-05余剰検体を用いた網羅的遺伝子解析を、順調に遂行している。また、再発AML観察研究も開始しており、登録症例の検体も用いて解析中である。単なる新規予後因子探索に留まらず、機能解析をin vitro及びin vivoで遂行し、t(8;21)細胞株におけるCDK4/6阻害剤投与で抗腫瘍効果を得た。3.Xeno-Graft Banking新規マウス生体内ヒト腫瘍細胞増幅技術;JCCG再発ALL観察研究登録患者検体を用いたNOGマウスでの増幅を順調に遂行中であり、増幅前の検体と増幅後検体の網羅的遺伝子解析を予定している。5.レーザーマイクロダイセクション(LMD)法の開発;登録開始となったJCCG再発AML観察研究登録検体から、白血病細胞のみを抽出し、G-CSFR typeIV発現量をJCCG中央診断施設として解析している。1.急性骨髄性白血病の新規予後因子探索;AML-05余剰検体を用いた網羅的遺伝子解析を継続するとともに、新規予後因子探索に留まらず、機能解析をin vitro及びin vivoで遂行する。既存の抗がん剤のみならず、スーパーコンピューターを用いた新規薬剤の開発も目指す。2.難治性腫瘍予後不良因子をターゲットとした新規遺伝子スイッチ法の開発;HITsの6塩基配列より、ターゲット転写因子Xを同定するために、MLL-AML細胞(MV4-11)へのHIT投与後のMicroarrayを施行し、最も変動の大きなPathway抽出を行い、転写因子Xを確定する。転写因子XのConditional KD、O/Eにてその評価を行う。3.Xeno-Graft Banking新規マウス生体内ヒト腫瘍細胞増幅技術;JCCG再発ALL観察研究登録患者検体を用いたNOGマウスでの増幅を順調に遂行中であり、増幅前の検体と増幅後検体の網羅的遺伝子解析終了後は、新規開発された薬剤の薬効効果も検討予定である。5.レーザーマイクロダイセクション(LMD)法の開発;すでに既知の遺伝子変異解析が終了しているAML-05保存細胞を用いて、LMD法を用いて、白血病細胞のみを抽出し、新たな遺伝子変異が同定できるかどうかを検討する。同様の検討は、再発AML観察研究や、AML-12登録症例においても遂行し、初発時から予後不良因子が同定できれば、小児AML患者の予後改善に貢献できることが期待できる。

(2)新規検査技術の開発A:Xeno-Graft Banking新規マウス生体内ヒト腫瘍細胞増幅技術;JCCG再発ALL観察研究登録中の患者検体をNOGマウスを用いて増幅、保存中である。B:フローサイトメーターによる白血病微小残存病変の検出;JCCGAML臨床試験(AML-D11)の患者検体を用いて、三重大学とともに、微小残存病変を解析し、MRD陽性例は予後不良であることを見出し、今年のアメリカ血液学会で発表予定である。C:レーザーマイクロダイセクション法の開発;JCCG再発AML観察研究登録患者の再発時検体のG-CSFRtypeIV発現量解析を中央診断施設として解析中である。1.急性骨髄性白血病の新規予後因子探索;AML-05余剰検体を用いた網羅的遺伝子解析を、順調に遂行している。また、再発AML観察研究も開始しており、登録症例の検体も用いて解析中である。単なる新規予後因子探索に留まらず、機能解析をin vitro及びin vivoで遂行し、t(8;21)細胞株におけるCDK4/6阻害剤投与で抗腫瘍効果を得た。3.Xeno-Graft Banking新規マウス生体内ヒト腫瘍細胞増幅技術;JCCG再発ALL観察研究登録患者検体を用いたNOGマウスでの増幅を順調に遂行中であり、増幅前の検体と増幅後検体の網羅的遺伝子解析を予定している。5.レーザーマイクロダイセクション(LMD)法の開発;登録開始となったJCCG再発AML観察研究登録検体から、白血病細胞のみを抽出し、G-CSFR typeIV発現量をJCCG中央診断施設として解析している。1.急性骨髄性白血病の新規予後因子探索;AML-05余剰検体を用いた網羅的遺伝子解析を継続するとともに、新規予後因子探索に留まらず、機能解析をin vitro及びin vivoで遂行する。既存の抗がん剤のみならず、スーパーコンピューターを用いた新規薬剤の開発も目指す。2.難治性腫瘍予後不良因子をターゲットとした新規遺伝子スイッチ法の開発;HITsの6塩基配列より、ターゲット転写因子Xを同定するために、MLL-AML細胞(MV4-11)へのHIT投与後のMicroarrayを施行し、最も変動の大きなPathway抽出を行い、転写因子Xを確定する。転写因子XのConditional KD、O/Eにてその評価を行う。3.Xeno-Graft Banking新規マウス生体内ヒト腫瘍細胞増幅技術;JCCG再発ALL観察研究登録患者検体を用いたNOGマウスでの増幅を順調に遂行中であり、増幅前の検体と増幅後検体の網羅的遺伝子解析終了後は、新規開発された薬剤の薬効効果も検討予定である。5.レーザーマイクロダイセクション(LMD)法の開発;すでに既知の遺伝子変異解析が終了しているAML-05保存細胞を用いて、LMD法を用いて、白血病細胞のみを抽出し、新たな遺伝子変異が同定できるかどうかを検討する。
中枢神経損傷後の軸索誘導のメカニズム

軸索誘導のfine tuningのメカニズムの解明のために、小脳の神経細胞をin vitroで培養し、ニューロトロフィンで刺激し、この時に発現変化をみせる遺伝子をDNAマイクロアレイを用いてスクリーニングした。その結果100を超える遺伝子が発現上昇をしていた。この中からFine tuningの鍵を握ると考えられる遺伝子の候補を絞り込んだ結果、10の有力候補遺伝子について、その後の解析を進めた。さらに軸索の伸展をin vitroで評価するシステムとして培養皿に再生阻害因子をストライプ状に配置させる手法を開発した。有力候補遺伝子を神経細胞に過剰発現させ、MAG、Nogoなどの再生阻害蛋白に対する、神経細胞の反応の変化について解析した。その結果、Rho GTPaseの活性を制御する蛋白であるChimaerinが、軸索の反応性を有意に変化させることが明らかになり、この蛋白の機能について解析を進めていくことにした。Chimaerinを過剰発現させると、神経細胞はMAGあるいはNogoに対する反応性を失い、軸索伸展は促進された。従ってChimaerinはin vivoにおいても再生誘導に働くことが期待される。また突起伸展のメカニズムの解明とその再生治療への応用というテーマに関しては、脊髄損傷後に損傷周囲組織に発現する遺伝子を網羅的に解析し、再生阻害に関わると考えられるGPIアンカー型蛋白RGMを単離した。この蛋白は軸索の再生を著明に抑制し、既知の再生阻害蛋白よりも強力である。RGMを中和抗体で抑制すると、ラット脊髄損傷後の軸索再生が促進され、運動機能も改善した。以上よりRGMが最も重要な軸索伸長阻害因子であることが示唆された。遺伝子を機能によって分類し、発現パターンについての既知の報告を参考資料にし、Fine tuningの鍵を握ると考えられる遺伝子の候補を絞り込んでいった。その結果、10の有力候補遺伝子について、その後の解析を進めることに決定した。さらに軸索の伸展をin vitroで評価するシステムとして、培養皿に再生阻害因子をストライプ状に配置させる手法を開発した。この方法により、軸索誘導蛋白に対する成長円錐の反応を経時的に追跡することが可能になる。有力候補遺伝子を神経細胞に過剰発現させ、MAG、Nogoなどの再生阻害蛋白に対する、神経細胞の反応が変化するかについて解析した。その結果、Rho GTPaseの活性を制御する蛋白が、軸索の反応性を有意に変化させることが明かになり、この蛋白の機能について、今後解析を進めていくことにした。また突起伸展のメカニズムの解明とその再生治療への応用というテーマに関しては、脊髄損傷後に損傷周囲組織に発現する遺伝子を網羅的に解析し、再生阻害に関わると考えられる候補であるGPIアンカー型蛋白を単離した。この蛋白は軸索の再生を著明に阻止し、既知の再生阻害蛋白よりも強力なものである可能性がある。現在この蛋白の機能解析を行っている。

Chimaerinを過剰発現させると、神経細胞はMAGあるいはNogoに対する反応性を失い、軸索伸展は促進された。従ってChimaerinはin vivoにおいても再生誘導に働くことが期待される。また突起伸展のメカニズムの解明とその再生治療への応用というテーマに関しては、脊髄損傷後に損傷周囲組織に発現する遺伝子を網羅的に解析し、再生阻害に関わると考えられるGPIアンカー型蛋白RGMを単離した。この蛋白は軸索の再生を著明に抑制し、既知の再生阻害蛋白よりも強力である。RGMを中和抗体で抑制すると、脊髄損傷後の軸索再生が促進された。従ってRGMは再生治療のターゲット分子として有望である。軸索誘導のfine tuningのメカニズムの解明のために、小脳の神経細胞をin vitroで培養し、ニューロトロフィンで刺激し、この時に発現変化をみせる遺伝子をDNAマイクロアレイを用いてスクリーニングした。その結果100を超える遺伝子が発現上昇をしていた。この中からFine tuningの鍵を握ると考えられる遺伝子の候補を絞り込んだ結果、10の有力候補遺伝子について、その後の解析を進めた。さらに軸索の伸展をin vitroで評価するシステムとして培養皿に再生阻害因子をストライプ状に配置させる手法を開発した。有力候補遺伝子を神経細胞に過剰発現させ、MAG、Nogoなどの再生阻害蛋白に対する、神経細胞の反応の変化について解析した。その結果、Rho GTPaseの活性を制御する蛋白であるChimaerinが、軸索の反応性を有意に変化させることが明らかになり、この蛋白の機能について解析を進めていくことにした。RGMを中和抗体で抑制すると、ラット脊髄損傷後の軸索再生が促進され、運動機能も改善した。以上よりRGMが最も重要な軸索伸長阻害因子であることが示唆された。
ロジウムカルボキシレートを鍵活性種としたｓｐ３　Ｃ－Ｈ結合官能基化反応の開発

前年度の報告で述べた通り、筆者は種々の検討の結果、当初の研究目的であった「カチオン性ロジウム錯体触媒を用いて、ロジウムカルボキシレートを鍵活性種としたsp3 C-H結合官能基化反応の開発」は困難であるという結論に至り、これに代替する研究テーマとしてエナミドを用いた不斉[2+2+2]付加環化反応を研究し、カチオン性ロジウム錯体触媒存在下、1,6-エンインとエナミドの分子間不斉[2+2+2]付加環化反応が進行し、カルボニル基で保護されたキラルアミンが得られることを見出した。本年度は、この前年度の研究成果をまとめてAngew. Chem. Int. Ed.誌に投稿した。さらに、より有用な反応への展開としてN-ホモプロパルギルエナミドを用いた[2+2+2]付加環化反応を着想した。本反応によって多様な置換基をもつテトラヒドロインドール骨格をエナンチオ選択的に構築することができればインドールアルカロイドとして報告されている数多くの生理活性物質の新規合成法を確立できると考えたためである。検討の結果、2-ブロモエチルアミン臭化水素酸塩のスルホニル化、光延反応、脱ハロゲン化水素反応を行うことで、N-ホモプロパルギルスルホニルエナミドの合成に成功し、続いて本化合物と末端アルキンとの分子間不斉[2+2+2]付加環化反応が高い位置およびエナンチオ選択的に進行することを見出した。また、得られたテトラヒドロインドールを、[4+2]付加環化反応と引き続く還元によってジオールへと変換した。以上のように筆者は、N-ホモプロパルギルエナミドを用いた不斉[2+2+2]付加環化反応と引き続く官能基変換によって不斉ヘキサヒドロインドール骨格をもつジオールを位置、ジアステレオ、エナンチオ選択的に合成することに成功した。このジオールはインドールアルカロイドの一つである(ー)-クリニンの合成中間体として考えられる。28年度が最終年度であるため、記入しない。まず、既に報告している1,6-エンインの不斉環化異性化反応を1,6-イノンの反応に展開することで2-アルキリデン6-オキサビシクロ[3.1.0]ヘキサン化合物の不斉合成を試みた。しかし、目的の反応は進行しなかった。次に、1,6-エンインにカチオン性ロジウム錯体及び安息香酸触媒を作用させることで2-アルキリデンビシクロ[3.1.0]ヘキサン化合物と3-アルキリデン-1-シクロヘキセン化合物への並行速度論的光学分割を試みた。しかし、アリル位に第3級不斉炭素をもつ1,6-エンインを合成し、カチオン性ロジウム錯体及び安息香酸触媒を作用させたところ目的の3-アルキリデン-1-シクロヘキセン化合物は低収率で得られたものの、2-アルキリデンビシクロ[3.1.0]ヘキサン化合物は全く得られなかった。以上の結果から、本研究計画で想定していたsp3 C-H結合官能基化反応が進行しないことが示唆された。そこで、sp3 C-H結合官能基化反応ではなく付加環化反応を用いて、含中心不斉環状骨格を合成することとした。2つのアルケンを含んだ分子間[2+2+2]付加環化反応はこれまでに4例報告されているが、いずれも電子不足でキレート配位が可能なαβ不飽和カルボニル化合物を用いていた。そこで私は本反応において、アルケンの電子密度と配位性のどちらか、又はその両方のいずれが鍵となるのかを明らかにすべく、キレート配位が可能な電子豊富アルケンであるエナミドを用いた反応を検討した。検討の結果、1,6-エンインとエナミドとの反応が室温で進行し、目的のビシクロ化合物が高い立体選択性で得られた。以上のことから、本反応に対するアルケンの電子密度の寄与が小さいことを明らかにした。次いで、本反応を応用してポロサジエノンの不斉全合成を達成した。ポロサジエノンの不斉全合成は本研究が初めてのものである。当初想定していた、2-アルキリデン6-オキサビシクロ[3.1.0]ヘキサン化合物の不斉合成やアリル位に不斉3級炭素をもつ1,6-エンインを用いた並行速度論的光学分割を行うsp3 C-H結合官能基化反応の開発においては、迅速に基質合成を行い詳細な検討を行うことができた。結果、目的の反応は進行しなかったが、カチオン性ロジウム錯体に対する深い知見を得ることができ、次なる研究テーマの考案に繋がった。新たに考案した付加環化反応では、電子不足な不飽和結合が高い活性を示すという従来の知見に反し、アルケンの電子状態に関わらず、配位性官能基の有無のみに起因して反応が進行するという、大変重要な知見を得ることができた。また、反応開発を利用した不斉全合成をも達成しており、有機合成上重要な反応を生み出すことができた。以上の点から、当初予定していたsp3 C-H結合官能基化反応反応開発は達成できなかったものの、新たに考案した分子間不斉付加環化反応に対して充分な研究成果を見出したものと考えている。

前年度の報告で述べた通り、筆者は種々の検討の結果、当初の研究目的であった「カチオン性ロジウム錯体触媒を用いて、ロジウムカルボキシレートを鍵活性種としたsp3 C-H結合官能基化反応の開発」は困難であるという結論に至り、これに代替する研究テーマとしてエナミドを用いた不斉[2+2+2]付加環化反応を研究し、カチオン性ロジウム錯体触媒存在下、1,6-エンインとエナミドの分子間不斉[2+2+2]付加環化反応が進行し、カルボニル基で保護されたキラルアミンが得られることを見出した。本年度は、この前年度の研究成果をまとめてAngew. Chem. Int. Ed.誌に投稿した。さらに、より有用な反応への展開としてN-ホモプロパルギルエナミドを用いた[2+2+2]付加環化反応を着想した。本反応によって多様な置換基をもつテトラヒドロインドール骨格をエナンチオ選択的に構築することができればインドールアルカロイドとして報告されている数多くの生理活性物質の新規合成法を確立できると考えたためである。検討の結果、2-ブロモエチルアミン臭化水素酸塩のスルホニル化、光延反応、脱ハロゲン化水素反応を行うことで、N-ホモプロパルギルスルホニルエナミドの合成に成功し、続いて本化合物と末端アルキンとの分子間不斉[2+2+2]付加環化反応が高い位置およびエナンチオ選択的に進行することを見出した。また、得られたテトラヒドロインドールを、[4+2]付加環化反応と引き続く還元によってジオールへと変換した。以上のように筆者は、N-ホモプロパルギルエナミドを用いた不斉[2+2+2]付加環化反応と引き続く官能基変換によって不斉ヘキサヒドロインドール骨格をもつジオールを位置、ジアステレオ、エナンチオ選択的に合成することに成功した。このジオールはインドールアルカロイドの一つである(ー)-クリニンの合成中間体として考えられる。これまでに得られた、エンインとエナミドとの分子間不斉[2+2+2]付加環化反応に対する研究結果を学術論文にまとめ、投稿する。また、当初予定していたアリル位に不斉3級炭素をもつ1,6-エンインを用いた並行速度論的光学分割反応に代わって、ホモアリル位に不斉炭素をもつ1,6-エンインを用いて並行速度論的光学分割反応を試みる。しかし、本反応は非常に達成が難しい、新規性の高い反応であり、目的の反応が進行するかどうかは未知数である。そこで、目的の反応が進行しなかった場合は、1,6-エンインと不斉アリルアルコールを用いた分子間不斉[2+2+2]付加環化反応による並行速度論的光学分割反応の達成に挑戦する。この反応はアリルアルコールという安価な出発原料を用いて光学活性なアルコールを合成できる有用な反応である。既に私は、アリルアルコールのヒドロキシ基が配向性官能基として作用して、高い立体選択性で6員環化合物を合成できるという知見を得ており、本反応開発は実現性の高い研究計画である。28年度が最終年度であるため、記入しない。東京工業大学物質理工学院応用化学系田中健研究室
着床前胚における分泌型プロサポシン産生細胞の同定と細胞内動態の解明

プロサポシンは、リソソームに向かい脂質代謝に関係するサポシンA,B,C,Dの前駆体蛋白質としての機能を有する型(リソソーム型プロサポシン)と、細胞膜に向かい神経栄養因子として細胞外に分泌される型(分泌型プロサポシン)が存在する。本研究では、雌性生殖器・初期発生胚における分泌型プロサポシン産生細胞を同定し、さらにプロサポシン受容体の発現性と局在を明らかにした。プロサポシンは、リソソームに向かい脂質代謝に関係するサポシンA、B、C、Dの前駆体蛋白質としての機能を有する型(リソソーム型プロサポシン)と、細胞膜に向かい神経栄養因子として細胞外に分泌される型(分泌型プロサポシン)が存在する。雌性生殖器系では卵巣においてプロサポシンが存在する事が判明しているが、卵巣以外の雌性生殖器においては依然不明のままである。申請者らの予備実験により、卵管上皮・子宮上皮においてもプロサポシンの存在が明らかとなったので、着床前胚に注目し本年度は以下の結果を得た。新規に作製したプロサポシン特異抗体を用いて、着床前胚におけるプロサポシン含有細胞の検討を行った。Western blotting法を用いた着床前胚におけるプロサポシン蛋白の検討結果から、プロサポシン蛋白は着床前胚においても存在し、その含有量は発生のステージが進むにつれて増加する傾向にあった。初期胚を回収し、ポリエステルワックスに包埋後、連続切片を作製し、プロサポシン特異抗体を用いて免疫組織化学を行い、プロサポシン蛋白の初期胚における分布について検討を行った。初期胚においてプロサポシン蛋白は、一様に分布していた。胚盤胞期の胚については、検索に耐えうる良好な切片を得るための固定時間および包埋条件の設定に時間を要し、プロサポシン含有細胞の同定が完了していない。そのために、in situ hybridization法を用いた分泌型プロサポシン産生細胞の同定は未だ完了していない。当該年度は、1前年度に引き続きラット雌性生殖器(卵巣・卵管・子宮)におけるプロサポシン(PS)含有・産生細胞の解析、2新たにPS受容体蛋白質であるGPR37、GPR37L1に対する特異抗体を作製し、ラット雌性生殖器における発現状況について検索を行い、3受精卵における蛍光標識合成ペプチド(Fluorescein Aminohexyl合成ペプチド;FAM標識合成ペプチド)を用いた分泌型PSの動態解明のための条件設定を行った。1雌性生殖器におけるPS含有・産生細胞の分布は、子宮においては性周期によって差が認められたが、卵管においては差が認められず、卵管内は高PS状態が維持されていることが解った。卵巣においては、卵胞の発達に伴いPS産生細胞が変化する事が解った。2PS受容体蛋白質(GPR37、GPR37L1)のラット雌性生殖器における発現状況は、PS産生細胞の分布とシンクロしていることが解った。しかし、GPR37とGPR37L1では発現様式が異なっており、さらなる精査を必要とするので、現在解析を進めている。3FAM標識合成ペプチドを受精卵に投与してその動態の観察を目指しているが、取り込み能が安定しないので、培養条件、受精卵の品質について検討を行っている。当該年度は、引き続き週齢毎のラット雌性生殖器(卵巣・卵管・子宮)におけるプロサポシン(PS)含有・産生細胞の解析を行った。前年度までの解析によりPS受容体蛋白質であるGPR37とGPR37L1では発現様式が異なっており、さらなる精査を行うために、前年度に作成したものとは異なる部位を認識するGPR37L1に対する特異抗体を新たに作製し、ラット雌性生殖器における発現状況について検索を行うと共に、mRNAの発現についても解析を行った。さらに、当初の計画通り受精卵における蛍光標識合成ペプチド(Fluorescein Aminohexyl合成ペプチド;FAM標識合成ペプチド)を用いた分泌型PSの動態解明のための条件設定を行った。他の雌性生殖器が性周期の影響下にある中で、卵管内は性周期に左右されることなく、高PS状態が維持されており、老齢ラットにおいても同様であることが明らかとなった。新たに作製したGPR37L1の抗体、およびin situ hybridizationのプローブを用いて解析したところ、やはり発現様式が異なっているという結果を得た。ラット受精卵においても同様に発現様式が異なっていた。FAM標識合成ペプチドを受精卵に投与してその動態の観察を目指したが、取り込み能が受精卵の品質に大きく影響を受けており、さらなる改善が必要である事が判明した。以上より、雌性生殖器分泌されるPS・受容体蛋白は、卵管以外においては性周期の支配下にあり、初期発生においても分泌型PSを利用していることが明らかとなった。雌性生殖器におけるプロサポシン(PS)含有・産生細胞の解明、および交付決定後に明らかとなったPS受容体蛋白質(GPR37、GPR37L1)について解析を行った。GPR37とGPR37L1の発現様式の違いを明らかにすることは出来なかったことと、FAM標識合成ペプチドの動態解析について、安定した結果を得られていないので、やや遅れているとした。解剖学

今後は、プロサポシン(PS)受容体蛋白質であるGPR37とGPR37L1のラット雌性生殖器における発現様式について解析を進めるとともに、蛍光標識合成ペプチド(Fluorescein Aminohexyl合成ペプチド;FAM標識合成ペプチド)を用いた分泌型PSの動態解明のための条件設定を行い、安定して分泌型PSの動態解析を行っていく。さらに、プロサポシン発現ベクターをトランスフェクションし、プロサポシン濃度の変化が胚発生に与える影響について解析を行う。新規に作製したプロサポシン特異抗体を用いて、初期胚におけるプロサポシン含有細胞の同定を終えたが、胚盤胞期の胚については良好な組織像を得るための条件設定は終了したものの、未だ完了していない。また、in situ hybridization法を用いた分泌型プロサポシン産生細胞の同定も完了していないため。発注予定であった抗体作製に手間取り、当該年度で受け取ることが出来なかったため。胚盤胞期のプロサポシン含有細胞の同定を完了し、さらに、in situ hybridization法を用いて分泌型プロサポシン産生細胞の同定を行う。プロサポシン産生細胞の同定後、培養初期胚にFAM結合合成ペプチドを投与し、プロサポシンの初期胚での動態について検索を行う。次年度において抗体を購入し、使用する。今年度は胚盤胞期の胚について解析を進める事が出来なかったので、その後に予定していたin situ hybridization法を用いた分泌型プロサポシン産生細胞の解析を行う事が出来ず、RI試薬が購入出来なかったために次年度使用額が生じた。現在、胚盤胞期におけるプロサポシン含有細胞の解析を進めており、RI試薬を用いた検索に入るので、本年度中に使用する予定である。
レチノイド関連核内受容体の化学制御剤の創製

遺伝子発現に関わる因子には、低分子化合物により活性化されてはじめて特異的応答遺伝子の発現を制御する核内受容体群が存在し、リガンド依存的に細胞の分化、増殖、形態形成、代謝、ホメオスタシスなどの重要な生理作用を厳密に制御している。近年、種々の核内受容体の機能が癌、骨粗鬆症、リューマチ、糖尿病、肥満など様々な疾患の発症と治療に関与していることが明らかに成りつつある。本研究ではレチノイド受容体RAR、RXRを標的として新規骨格を有するリガンド分子の創製を行った。特に、既存のリガンド構造の一部に含酸素もしくは含窒素複素環の導入を試みた。まず、前骨髄球性白血病に有効性が示されている合成レチノイドAm80をリード化合物として、その疎水性部位にアルキル置換ピラン環の導入を試みた。レチノイド構造の疎水性部位は、受容体の活性化に必須なヘリックス12のフォールディングに直接的に関わる重要な構造要素である。2,6-di (tert-bytyl)pyrane環を持つ安息香酸誘導体をデザインし、合成した。本化合物については細胞分化誘導作用および核内受容体活性化能を検討する予定である。ついで、Am80のカルボキシル基がいわゆる生物学的等価性基では大体できないことに着目し、安息香酸部位の代替構造としてベンゾフロキサンを導入した化合物を設計、合成した。合成した化合物のうち、芳香族アミド骨格を持つ化合物Bf580がヒト白血病細胞HL-60の分化誘導作用を発揮した。その作用はAm80ほど強いものではなかったが、ベンゾフロキサンが安息香酸部位の代替構造として有用であることを示した。
骨髄異形成症候群における単一細胞を用いた癌遺伝子および癌抑制遺伝子変異の証明

N-ras遺伝子の異常および第5染色体短腕の欠失がすでに確認されていた骨髄異形成症候群(MDS)患者の骨髄組織より分離した単一細胞のそれぞれについて、primer-extemsion preamplification法およびnested PCR法を施行して各遺伝子のDNA断片を増幅した。増幅されたN-ras遺伝子のexon 1の領域を含むDNA断片をSSCP解析法にかけることにより、本遺伝子の点突然変異は単一細胞からでも検出しうることが示された。同一症例において、解析し得た範囲の細胞については、芽球および形質細胞に同一の変異が検出され、MDSにおいては悪性クローン由来のリンパ系細胞をもつ症例もあることが示唆された。また、N-ras遺伝子の変異が検出された細胞についてAPC遺伝子の3′側のuntranslatedregionにあるSsp Iの多形性部位を含むDNA断片を増幅し、制御酵素断片長多型性を用いた解析を施行した。その結果、N-ras遺伝子の変異が存在する細胞でも、APC遺伝子のヘテロ接合性の喪失は認められないことが明らかとなった。すなわち、MDSに高頻度に認められる第5染色体短腕欠失の切断点はAPC遺伝子の不活化よりは癌遺伝であるN-ras遺伝子の活性化の方がより深く関与していることが示唆された。現在、さらにp53遺伝子やRb遺伝子等の癌抑制遺伝子、IRF-1遺伝子等の第5染色体長腕上に遺伝子座をもち造血に関与すると考えられている遺伝子についても、解析を検討中である。