hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
中心体に依存しない微小管生成機構

細胞が中心体に依存せずに微小管を生成する機構についての理解を深めることを目標とした。主要成果は以下のとおりである。(1)動植物細胞の分裂期における中心体非依存的な微小管生成に必須の「オーグミン複合体」を糸状菌で同定し、オーグミンの進化的保存性を示した。(2)オーグミン複合体の必須サブユニットのノックアウトマウスを作出し、初期胚の分裂時、微小管形成中心をクラスター化することにオーグミンが必要であることを見出した。(3)ヒメツリガネゴケ細胞において、オーグミンにも中心体にも依存しない新たな微小管生成機構を見出した。微小管増幅因子・オーグミン複合体を、存在が想定されていなかった菌類で同定した。オーグミンは紡錘極体と紡錘体上に局在したが、これまで動植物での結果とは異なり、欠損させても微小管重合核形成因子・γチューブリンの局在には異常が生じなかった。この知見を基にオーグミン複合体の進化上の保存性と多様性を論じた論文をPLoSONE誌に発表した(Edzuka et al. 2014)。また、ヒメツリガネゴケにおいて、オーグミンに依存しない新規の微小管増幅機構を可視化することに成功した。この成果を含めたコケ細胞質微小管生成機構についての詳細な観察結果は、Plant Cell誌に発表された(Nakaoka et al. 2015)。微小管増幅因子・オーグミン複合体の哺乳類における生理的役割を明らかにするため、オーグミンの構成因子HAUS6 (Aug6/Dgt6)のノックアウトマウスを作成した。ノックアウトマウスは以下のような表現型を示した。(1)初期胚段階で致死となった。(2)初期胚発生の細胞分裂時にスピンドル形成に異常をきたした。(3)ノックアウトマウスでは、初期胚の細胞分裂時に現れる複数の微小管形成中心(microtubule organising centre; MTOC)のクラスター化がうまくいかなかった。(4)その結果、多極性のスピンドルが頻繁に認められ、染色体分配が異常となった。(5)中心体の数を人為的に増やした培養細胞においても、オーグミンをノックダウンすると上記のような表現型が現れた。(6)中心体を増やした培養細胞において、オーグミンを欠失させる以外の方法で微小管増幅を阻害したところ、オーグミン欠失と同様の表現型が現れた。以上の結果は、微小管増幅が3つ以上のMTOCを2つにまとめるのに必要であることを示唆している。微小管増幅の哺乳類生体内での機能を初めて明らかにしたこの研究成果はCell Reports誌に発表された(Watanabe et al. 2015)。当初の研究計画どおりマウス発生におけるオーグミンの機能を明らかにできたため。微小管形成、動態制御の機構についての分子細胞生物学的解析を多角的に進めた。まず、ショウジョウバエS2培養細胞の間期細胞質における微小管生成アッセイを立ち上げた。具体的には、(1)微小管及び微小管上で機能するショウジョウバエタンパク質を蛍光標識してあるS2細胞をカバーガラス状でspreadし、微小管の生成、重合・脱重合を可視化できる条件を作った。(2)細胞を氷冷し、細胞質の微小管を脱重合した。(3)細胞を室温に戻し、微小管が生成される様子を共焦点顕微鏡を用いてタイムラプス観察した。観察をはじめてまもなく、微小管結合タンパク質の点シグナルが数十観察され、そこから微小管が生える様子が認められた。このmicrotubule depolymerisation-regrowthアッセイにおいて微小管増幅因子である「オーグミン複合体」が関わっているか調べたが、今のところ、関わりを示唆するデータは得られていない。すなわち、オーグミンにも中心体にも依存しない、新たな微小管生成機構の存在が強く示唆された。これと並行して、オーグミン複合体の作用機序を解明するための分子生物学的実験も行った。オーグミンは微小管重合核形成因子である「γチューブリン複合体」と相互作用することが示唆されているが、具体的にどのサブユニット同士が結合するのかは明らかになっていない。いくつかの部分欠失断片を作成し、相互作用実験を試みたが、現在のところ、結合部位を1箇所に特定するには至っていない。オーグミン複合体の重要部位についての生化学的実験・研究を主体として推進する予定であった。しかし、当初の予想に反して、新たな重要部位の存在も示唆され、その解析も並行して行わなければならなくなった。2015年にヒメツリガネゴケ細胞質内で偶発的に微小管が生まれる様子の撮影に成功した(Nakaoka et al. Plant Cell. 2015)。約8割のケースでは、微小管重合核形成因子であるγチューブリンの局在化が認められたことから、γチューブリンに依存した微小管生成であることが強く示唆されたが、残りの2割のケースでは局在が認められず、γチューブリンに依存しない新規の微小管生成機構が存在することが示唆された。今年度、この未知の機構の解明に向けた実験を進め、以下の結果を得た。

・従来の細胞調整法では生きた細胞を顕微鏡視野に入れることが容易ではなかったが、微細流路を持つ細胞観察用の容器であるマイクロデバイス内での観察法を導入し、微小管生成イベントの検出頻度を飛躍的に高めることに成功した。具体的には、マイクロデバイス内では細胞は高い生存率を保ったままであり、かつ、従来法と同様の微小管動態が観察された(観察には斜光照明蛍光顕微鏡を用いた)。・γチューブリンに代わる因子の候補として微小管結合因子(モーターを含む)を予想した。これらの因子をRNA干渉法や遺伝子ノックアウトで機能阻害し、微小管の量を観察したところ、有力候補として動物でも保存された因子をひとつ得た。この因子のノックダウンにより、細胞内の微小管が劇的に減少した。以上、植物での中心体に依存しない微小管生成機構について、新たな知見をもたらすことを期待させる基盤を確立した。細胞が中心体に依存せずに微小管を生成する機構についての理解を深めることを目標とした。主要成果は以下のとおりである。(1)動植物細胞の分裂期における中心体非依存的な微小管生成に必須の「オーグミン複合体」を糸状菌で同定し、オーグミンの進化的保存性を示した。(2)オーグミン複合体の必須サブユニットのノックアウトマウスを作出し、初期胚の分裂時、微小管形成中心をクラスター化することにオーグミンが必要であることを見出した。(3)ヒメツリガネゴケ細胞において、オーグミンにも中心体にも依存しない新たな微小管生成機構を見出した。期待通りの成果を得、論文発表することができた。当初の予定どおり、動物、植物、菌類の系において微小管形成、動態制御の機構についての分子細胞生物学的解析を多角的に進める。オーグミン複合体の作用機序についての実験などを遂行する29年度が最終年度であるため、記入しない。細胞生物学27年度は当初の予定通り、哺乳類発生過程におけるオーグミンの機能解析を中心に研究を進める。消耗品にかかる費用を節約できたため未使用額が生じた消耗品にかかる費用を節約できたため未使用額が生じた29年度が最終年度であるため、記入しない。消耗品にかかる費用を節約できたため未使用額が生じた消耗品購入に使用予定消耗品購入に使用予定消耗品購入に使用予定
極性構造をもつ新規リチウムナイオベート型化合物の合成と機能開拓

極性物質は、強誘電性、圧電性、非線形光学特性等の構造の非中心対称性に基づく機能を示し、強誘電体メモリー、電気を機械的エネルギーに変換(または逆変換)するのための圧電素子、光の波長変換機能をもつ非線形光学素子等に応用可能である。本研究では、極性物質の基礎を築くことを目的として、極性構造をもつリチウムナイオベート型化合物に着目し、物質探索と機能開拓に取組んだ。その中で、亜鉛チタン酸化物ZnTiO3をはじめ新規リチウムナイオベート型化合物の合成をおこない、結晶構造、極性等の物性を調べ、構成元素、構造、物性の関係を明らかにした。また、物質探索の過程でぺロブスカイト型構造をもつ新たな極性物質も見出した。当研究グループでは、LiNbO_3型酸化物が高圧下で安定化できることに着目し、LiNbO_3型酸化物の高圧合成と物性に関する研究を行ってきた。本研究ではこれまで得た知見を発展させ、(1)抗電場制御による分極の反転、(2)ペロブスカイトーLiNbO_3相境界を利用した高い外場応答性の実現、(3)マルチフェロイック等の新規機能開拓、(4)非線形光学特性の向上を目標とし、新規LiNbO_3型化合物の創製と機能開拓に取り組んでいる。24年度は、特に新規LiNbO_3型化合物の探索合成と高純度試料の合成を中心に行い、LiNbO_3型酸化物、酸化フッ化物、酸化窒化物および関連化合物の高圧合成と高圧での反応挙動の解析について検討を行った。LiNbO_3型酸化物については、新規な化合物の合成に成功し、現在、構造解析および物性測定を行っている。さらにベロブスカイト-LiNbO_3相境界の探索の過程で新たな極性構造をもつ酸化物を見出した。酸化フッ化物については、A^<2+>B<3+>O_2F組成を持つLiNbO_3型酸物化物の合成に取り組んだ。出発原料としてAF_2+B_2O_3、AO+BF_3+B_2O_3、AO+BOFの組み合わせについて検討したところ、AO+BOFの場合が最も反応性が高く、LiNbO_3型化合物の合成には至っていないものの、新規化合物の合成に成功した。またA^<2+>B^<5+>O_2N組成を持つLiNbO_3型酸窒化物についても、AO+BONを出発原料として用い、圧力、温度条件の最適化を行っている。当研究グループでは、LiNbO3型酸化物が高圧下で安定化できることに着目し、LiNbO3型化合物の高圧合成と物性に関する研究を行ってきた。本研究ではこれまで得た知見を発展させ、(1)抗電場制御による分極の反転、(2)ペロブスカイトーLiNbO3相境界を利用した高い外場応答性の実現、(3)マルチフェロイック等の新規機能開拓、(4)非線形光学特性の向上を目標とし、新規LiNbO3型化合物の創製と機能開拓に取り組んでいる。本年度は、昨年度に引き続き新規物質を含むさまざまなLN型酸化物、酸化フッ化物、酸化窒化物および関連化合物の高圧合成と高圧での反応および相変化挙動の解析を行い、得られた物質の構造解析と物性測定に取り組んだ。この中で新規LN型酸化物ZnTiO3の高圧合成に成功し、高圧下ではぺロブスカイト相で、減圧時にLN相へ転移することが実験および計算の両面から示唆された。LN型ZnTiO3はZnSnO3と比べるとその酸素八面体歪みが大きく、光第二高調波発生強度(SHG)は24倍であった。大きな歪みとそれに伴う高いSHG強度は、d0電子配置をもつTi4+の空のd軌道と酸素O 2p軌道の相互作用に基づく2次Jahn-Teller(SOJT)効果に起因することがわかった。また、上記(1)の抗電場制御と(2)のペロブスカイトーLiNbO3相境界を意識してCaTiO3-MnTiO3固溶系の合成を行う過程で見出したCaMnTi2O6は、極性空間群P42mcに属するAサイト鎖状秩序型二重ペロブスカイト構造という新規構造をもつこと、また電場による分極反転が観測され、強誘電性をもつことを明らかにした。そして、高温における構造解析、熱測定および誘電測定から、630 Kにおいて秩序無秩序型強誘電相転移が起こることを見出した。得られた結果から、SOJT効果とAサイト秩序が協奏的に作用し分極が生じているという新たな極性発現機構に基づいていることを明らかにした。さらにこの物質は10Kで反強磁性を示し、マルチフェロイック物質であることがわかった。

昨年度までに得られた知見を発展させ、(1)抗電場制御による分極の反転、(2)相境界を利用した高い外場応答性の実現、(3)マルチフェロイック等の新規機能開拓、(4)非線形光学特性の向上を目標とし、新規LiNbO3(LN)型化合物の創製と機能開拓に取り組んできた。昨年度見出したLN型酸化物ZnTiO3は、高圧下でぺロブスカイト相として安定に存在し減圧過程において生成していることが高圧下でのX線回折実験により明らかになった。また、(1)の抗電場制御と(2)の相境界の存在を意識して、高い抗電場をもつLN型LiTaO3にぺロブスカイト型CaMO3(M=Ti, Zr)を固溶することにより分極反転を目指した。その結果、Pb(Zr, Ti)O3に存在するようなモルフォトロピック相境界は見られず、分極反転および高い外場応答の実現は達成できなかったが、CaMO3(M=Ti, Zr)の固溶により絶縁性および誘電率の向上、相転移温度の低下が観測された。さらに、アニオンの複合化が構造や物性に与える影響を調べるためにLN型酸化窒化物の研究に取り組んだ。原料および合成条件を種種検討し、LN型酸化窒化物MnTaO2NおよびMn4Ta2O9との固溶体の高圧合成を行い、その相関係について調べた。その結果、圧力・温度条件により、陽イオン組成が異なるLN相が生成していることが明らかになった。また、昨年度見出した強誘電体CaMnTi2O6と同構造をもつ化合物について高圧合成による探索を行い、新規化合物を見出した。この化合物は、光第二高調波発生から反転中心をもたないことが確認された。これらの研究については現在も継続中である。そして、これまで得られた実験結果から、LN型化合物ABX3の極性は、LN型構造におけるAおよびBイオンの配列の幾何学とA-B間の陽イオン間反発に基づくこと、またTi4+、Nb5+、Ta5+等のd0電子をもつイオンを含む場合、二次ヤーンテラー効果によりその極性が強化されることが明らかになった。26年度が最終年度であるため、記入しない。無機固体化学26年度が最終年度であるため、記入しない。今年度は、LiNbO_3型化合物の探索合成を中心に研究を行った。その結果、新規LiNbO_3型酸化物の合成に成功し、さらにベロブスカイト-LiNbO_3相境界の探索の過程で新たな極性構造をもつ酸化物を見出した。酸化フッ化物については、LiNbO_3型化合物の合成には至っていないものの、新規化合物の合成には成功し、出発原料としてAO+BOFの組み合わせが最も反応性が高いことが明らかになった。以上のことからからおおむね順調に進展していると考えている。今年度は、昨年度に引き続きLiNbO3型化合物の探索合成を行うとともに得られた物質の構造および物性解明に取り組んだ。その結果、新規LiNbO3型酸化物ZnTiO3の合成に成功し、高圧における反応および相変化挙動について考察するとともに得られた物質の結晶構造や極性の発現機構を明らかにした。さらにぺロブスカイトーLiNbO3相境界の探索の過程で得られたCaMnTi2O6がAサイト鎖状秩序型二重ペロブスカイト構造をもつこと、また強誘電性を示すことを確認し、相転移挙動についても明らかにした。今後もLiNbO_3型化合物の探索合成について検討を継続するとともに、24年度に新たに見出されたLiNbO_3型化合物および関連化合物の構造解析および物性測定を行っていく予定である。今後もLiNbO3型化合物の探索合成、高圧における反応および相変化挙動の解析を継続し、これまで得られた知見をもとにLiNbO3型化合物における相変化、構造、極性、非線形
含水ゲル膜内の水の特異的性質と溶質透過特性に関する研究

架橋剤としてグルタルアルデヒドを用い,架橋比0.0050.06の範囲でポリビニルアルコール(PVA)ゲル膜をキャスト法により作製した.含水PVAゲル膜の透過特性はCO_2とCH_4の混合ガスの透過特性を測定することにより評価した.架橋比が増すほど含水率が減少し,両ガスの透過速度も減少し,含水率の低下とともにCH_4に対するCO_2の選択性はやや増加する傾向があった.また,遅れ時間法で測定した膜中の水へのCO_2の溶解度は本実験条件では含水率が0.31の範囲で含水率によらす一定で純水に対する溶解度とほぼ等しく,PVAゲル中の水はCO_2の溶解度に関しては特異的な挙動を示さなかった.しかし,拡散係数は含水率の低下とともに著しく減少した.示差走査熱量計で測定した膜内の不凍水の比率は含水率の低下とともに増加した.PVAゲル膜の構造が架橋比,含水率によりどのように変化するかを,筑波のシンクロトロン放射光を用いた小角X線散乱実験による評価した.本装置は平成9年度は調整中であり,ようやく本年2月になってPVA膜試料の測定が可能になった.架橋比による散乱パターンの変化が観測されたが,その詳細な解析とガス透過特性の関連については目下検討中である.また,イオン性の含水ゲルとして,アクリル酸(AA)とビニルアルコール(VA)の共重合体ゲル膜を作製し,そのCO_2透過性,C_2H_4透過性を含水率,架橋方法との関連させて論じた.本ゲル膜は含水率が極めて高く,上述のPVAゲル膜より著しく高いガス透過性を示した.架橋剤としてグルタルアルデヒドを用い,架橋比0.0050.06の範囲でポリビニルアルコール(PVA)ゲル膜をキャスト法により作製した.含水PVAゲル膜の透過特性はCO_2とCH_4の混合ガスの透過特性を測定することにより評価した.架橋比が増すほど含水率が減少し,両ガスの透過速度も減少し,含水率の低下とともにCH_4に対するCO_2の選択性はやや増加する傾向があった.また,遅れ時間法で測定した膜中の水へのCO_2の溶解度は本実験条件では含水率が0.31の範囲で含水率によらす一定で純水に対する溶解度とほぼ等しく,PVAゲル中の水はCO_2の溶解度に関しては特異的な挙動を示さなかった.しかし,拡散係数は含水率の低下とともに著しく減少した.示差走査熱量計で測定した膜内の不凍水の比率は含水率の低下とともに増加した.PVAゲル膜の構造が架橋比,含水率によりどのように変化するかを,筑波のシンクロトロン放射光を用いた小角X線散乱実験による評価した.本装置は平成9年度は調整中であり,ようやく本年2月になってPVA膜試料の測定が可能になった.架橋比による散乱パターンの変化が観測されたが,その詳細な解析とガス透過特性の関連については目下検討中である.また,イオン性の含水ゲルとして,アクリル酸(AA)とビニルアルコール(VA)の共重合体ゲル膜を作製し,そのCO_2透過性,C_2H_4透過性を含水率,架橋方法との関連させて論じた.本ゲル膜は含水率が極めて高く,上述のPVAゲル膜より著しく高いガス透過性を示した.
臨床試験の効率化に向けた中央モニタリング手法の開発

2018年度は,訪問モニタリングの分類およびRisk-Based Monitoring(RBM)による中央モニタリングの設定を検討した.国内外におけるモニタリングおよびRBMに関する資料を調査し,実際のモニタリングと比較することにより,現状の状況および問題点などを検討した.訪問モニタリングを中央モニタリングに移行する場合,プロセス管理や臨床における評価法の統一など運用面を揃え,データ形式やデータベースのデータの持ち方など情報の視点から標準化などを行うことが必要であることが示唆された.標準化の検討には,医学研究の国際標準であるCDISC標準も考慮することにより,中央モニタリングを検討するための基盤が整備されると考えられる.CDISC標準の中でもデータ収集に関するCDASHを参考に,医療機関でのデータ収集法について検討を進めた.2018年度は,訪問モニタリングの分類およびRisk-Based Monitoring(RBM)による中央モニタリングの設定を計画した.中央モニタリング手法の開発および評価をするためには,プロセス管理や標準化が必要であったため,CDISC標準を参考に医療機関でのデータ収集法について検討を計画に加えたためやや遅れているとした.予定よりも進捗が遅れている部分については,2018年度の計画の一部を2019年度に移動することで対応する.具体的には、2019年度の計画は2018年度に分類したモニタリングにおけるデータの信頼性のリスク評価が主となっていたが,計画の若干の変更に伴いCDISC標準の考え方を考慮し,リスク評価およびプログラムの作成が可能となるため,計画通りに研究を推進可能な見込みである.2018年度は,訪問モニタリングの分類およびRisk-Based Monitoring(RBM)による中央モニタリングの設定を検討した.国内外におけるモニタリングおよびRBMに関する資料を調査し,実際のモニタリングと比較することにより,現状の状況および問題点などを検討した.訪問モニタリングを中央モニタリングに移行する場合,プロセス管理や臨床における評価法の統一など運用面を揃え,データ形式やデータベースのデータの持ち方など情報の視点から標準化などを行うことが必要であることが示唆された.標準化の検討には,医学研究の国際標準であるCDISC標準も考慮することにより,中央モニタリングを検討するための基盤が整備されると考えられる.CDISC標準の中でもデータ収集に関するCDASHを参考に,医療機関でのデータ収集法について検討を進めた.2018年度は,訪問モニタリングの分類およびRisk-Based Monitoring(RBM)による中央モニタリングの設定を計画した.中央モニタリング手法の開発および評価をするためには,プロセス管理や標準化が必要であったため,CDISC標準を参考に医療機関でのデータ収集法について検討を計画に加えたためやや遅れているとした.予定よりも進捗が遅れている部分については,2018年度の計画の一部を2019年度に移動することで対応する.具体的には、2019年度の計画は2018年度に分類したモニタリングにおけるデータの信頼性のリスク評価が主となっていたが,計画の若干の変更に伴いCDISC標準の考え方を考慮し,リスク評価およびプログラムの作成が可能となるため,計画通りに研究を推進可能な見込みである.分担研究者の離職のため,次年度使用額が生じた.次年度に学会発表が増える予定であるため,次年度使用額を設定した.
アスベスト曝露が引き起こす腫瘍免疫の減衰と悪性中皮腫の発生

HTLV-1不死化T細胞株MT-2にアスベスト繊維の一種であるクリソタイルを低濃度長期曝露しクリソタイル耐性を獲得した細胞株を樹立することにより,アスベスト繊維曝露はCD4陽性T細胞のIFN-γ産生を抑制する一方で,IL-10,TGF-β1産生を促進することを示唆した。耐性株ではTh1型のT細胞に発現しており細胞遊走に関わるケモカインレセプターCXCR3の発現低下も生じており,アスベスト曝露による抗腫瘍免疫の減衰を推察できた。アスベスト曝露を起因とした悪性中皮腫は3050年の潜伏期間に腫瘍免疫が減衰し発症すると考えられ,本研究ではT細胞へのアスベスト曝露が誘導する免疫学的変化を検討することを目的としている。これまでにヒトポリクローナルリンパ球MT-2株(MT-20rg)を低濃度のアスベスト(chrysotile-B,10μg/ml)存在化で長期間(8ケ月以上)培養して樹立したアスベスト耐性亜株(MT-2Rst)は免疫機能を抑制する抗炎症性サイトカインIL-10の産生が促進するという結果を報告しているため,本年度の研究ではリンパ球の増殖抑制や癌の進展を促すもうひとつの抗炎症性サイトカインTGF-β1に注目し,アスベスト曝露によるサイトカイン産生変化を捉えることにした。はじめに健常人および悪性中皮腫症例の血漿中抗炎症性サイトカイン(IL-10,TGF-β1)をELISA法で測定した。またアスベスト曝露モデル細胞については,TGF-β1産生量の測定,FACSによるTGFβレセプターの発現解析,下流に存在するSmadの発現をリアルタイムRT-PCRおよびウエスタンブロッティング法によって解析した。TGF-β1刺激による細胞増殖についてはチミジンの取り込みで測定した。中皮腫症例血漿IL-10およびTGF-β1は健常人に比べて有意に高値であった。モデル細胞MT-2Rst亜株はTGFβ1を著しく産生しており,Smad3,Smad4の遺伝子発現が有意に低く,TGF-β1刺激に抵抗性であった。この結果から,MT-2Rst亜株はTGFレセプター/Smadを介したTGFβ1増殖抑制シグナリングが低下していると推察され,TGFβ1を産生している中皮腫担癌症例ではMT-2Rst亜株類似リンパ球が誘導されており腫瘍免疫の減衰が生じている可能性が示唆された。アスベスト曝露を起因とする悪性中皮腫発生過程にアスベスト曝露を受けた免疫担当細胞による腫瘍免疫低下が関与していることを実験的に解明することを目的とした。前年度に, HTLV-1不死化T細胞株MT-2(MT-2Org)にクリソタイルを低濃度(10μg/ml)長期(8ヶ月以上)曝露しクリソタイル耐性を獲得したMT-2Rst亜株は免疫抑制性サイトカインTGF-β1産生が促進しており, TGFレセプター/Smadを介するTGF-β1増殖抑制シグナリングが低下していること,並びに悪性中皮腫症例における血漿TGF-β1が高値であることを示した。そこで本年度は, TGF-β1により誘導され腫瘍免疫を抑制し腫瘍の増殖を促す制御性T細胞について,悪性中皮腫症例の末梢血単核球における割合をFACSにより測定した。その結果,健常人と比べて悪性中皮腫症例における末梢血CD4^+CD25^+Foxp3^+制御性T細胞数に有意差は認められなかった。またアスベスト曝露が誘導するTGF-β1産生促進機構を解明するために必要なMT-2RstのTGF-β1ノックダウン株をshRNA法により樹立できた。一方,アスベスト低濃度長期曝露により発現変動した遺伝子を同定するため, Mr-2OrgとMr-2Rsts(6株)を用いてDNAマイクロアレイ解析を行い, Mr-2Orgに対してMT-2Rstsで2倍以上有意に発現変動した遺伝子を162同定することができ, Patyway解析とNetwork解析の結果,抗腫瘍免疫低下を示すマーカー遺伝子としてTh1型T細胞に発現しているケモカインレセプターCXCR3発現低下を見出せた。本研究により検出されたTGF-β1とCXCR3は予防医学的にアスベスト関連疾患の抗腫瘍免疫を予測する早期診断マーカーとして応用が期待されるとともに,アスベスト曝露を介した発現調節機構を解明する重要性が益々高まった。
口腔癌に対するNF-κBを分子標的とした併用化学療法の開発

口腔癌細胞株B88細胞に対し、抗癌剤docetaxelとビタミンEのγ-tocotrienolを併用することによって、著明な抗腫瘍効果が認められた。本研究においてはNF-κBに着眼し、検討を行った。すなわち、docetaxelとγ-tocotrienolの併用により、NF-κB活性は抑制された。さらにNF-κBによって制御されるアポトーシス抑制タンパクの抑制、およびアポトーシス関連タンパクの発現を介してアポトーシスを誘導していると考えらえた。本研究で得られた知見を基に、新規癌化学療法の開発に向けて研究を継続したいと考える。本研究の目的は、抗癌剤docetaxelとビタミンEのγ-tocotrienolの併用療法が、ヒト口腔癌移植ヌードマウスに対する抗腫瘍効果を増強するか否かを、転写因子NF-κBとアポトーシス関連遺伝子の発現機構に基づいて明らかにすることである。本研究の成果は、口腔癌患者に対する癌化学療法による治療成績の向上に寄与するものた考えられる。docetaxelとγ-tocotrienolを併用することにより、in vitroにおいてヒト口腔癌細胞株B88細胞に対する抗腫瘍効果を増強するか否かの検討を行った。本研究の目的は、抗癌剤docetaxelとビタミンEのγ-トコトリエノールの併用療法が、ヒト口腔癌移植ヌードマウスに対する抗腫瘍効果を増強するか否かを、転写因子NF-κBとアポトーシス関連遺伝子の発現抑制機構に基づいて明らかにすることである。本研究結果の成果は、口腔癌患者に対する癌化学療法による治療成績の向上に寄与するものと考えられる。本年度は、in vivoにおいて、docetaxelとγ-トコトリエノールを併用することにより、ヒト口腔癌移植ヌードマウスに対する抗腫瘍効果を増強するか否かの検討を行った。1コントロール群、2docetaxel単独群、3γ-トコトリエノール単独群、4併用群の4群に分けて、腫瘍組織切片を作成、評価を行った。本研究成果は学会発表により報告を行った。平成27年度の研究実施計画に関しては、おおむね予定通りの進捗状況である。研究データの取得が、想定よりも早く終了したためと考えられる。docetaxelおよびγ-tocotrienolの併用することにより、口腔扁平上皮癌細胞株であるB88細胞に対する著しい殺細胞効果が生じるが、これはどのような分子メカニズムが働いて起こっているのか。これを解明することは、新たな癌化学療法の開発への大きな足掛かりになり得ると考えられた。われわれは、NF-κB活性やNF-κBの活性化により制御されるアポトーシス関連遺伝子産物やアポトーシス抑制遺伝子産物に着眼し、解明を進めてきた。in vitroにおいては、B88細胞に対するdocetaxelおよびγ-tocotrienolのNF-κB活性への影響を検討し、これらの併用により、NF-κB活性が強く抑制されることを明らかにした。さらにNF-κBの活性化により制御されるアポトーシス関連遺伝子産物(Caspases、Apaf-1およびcytochrome c)の発現は増強され、一方でアポトーシス抑制遺伝子産物(Survivin、c-IAP1/2、XIAPおよびBcl-2)の発現は抑制されることを明らかにした。さらに、in vivoにおいてはB88細胞移植ヌードマウスを用いて、docetaxelとγ-tocotrienolの併用が腫瘍の増殖に及ぼす影響を検討した。その結果、それぞれ単独では腫瘍抑制効果の小さい濃度のdocetaxelとγ-tocotrienolを併用することにより、B88細胞移植ヌードマウスの腫瘍増殖が著明に抑制されることを明らかにした。平成26年度の研究実施計画に関しては、予定通りの進捗状況である。in vivoにおいて、さらなる研究、解析を進めたいと考えている。具体的には、ヌードマウス腫瘍の切片標本を作製し、アポトーシス関連タンパクの発現や、アポトーシス抑制タンパクの発現に関して、免疫組織学的染色の手法を用いて検討を行っていきたいと考えている。またデータの解析をすすめ、学会発表や論文作成に繋げたいと考えている。口腔外科学試薬、抗体等の購入が必要量より少なかったため、使用額が予定より少なくなった。物品費については、当初計画していたものよりも使用薬剤の使用量が少なくなったため、薬剤購入回数が計画よりも少なくなった。実験動物の購入、データ整理のためのパソコン購入および積極的な学会発表を行いたいと考えている。必要に応じ、試薬、薬剤、消耗品の購入を行いたいと考えている。また学会発表を積極的に行いたいと考えている。
植物病原菌の宿主侵入における表層認識と形態形成の制御機構

炭疽病菌は植物表層に特徴的な物理的シグナルの受容により侵入器官の付着器を形成することが示されてきた。本研究では炭疽病菌においてMOR経路が植物特異的シグナルとしてoctadecanalを受容して付着器分化を担うことを明らかにした。一方、環境受容因子PacCが付着器を介さない侵入様式のHTEモードと通常の侵入様式において病原性関連分泌タンパク質遺伝子の発現制御に関与することを明らかにした。また、RNAサイレンシングの病原性への関与を検討し、Dicer様遺伝子DCL2が病原性発現に必要であることを明らかにするとともに低分子RNAの解析を行い、DCL2依存的な低分子RNAを特定することに成功した。ウリ類炭疽病菌において分裂酵母tea1のホモログであるCoKEL2が宿主表面の非生物的シグナル受容を介した付着器形成に関与することから、植物特異的シグナル受容によって付着器を誘導する経路の存在が示唆されている。本年度の研究において植物特異的シグナル受容を介した付着器形成に関与する遺伝子の一つとして、出芽酵母の細胞極性成長などに関与するMORシグナル伝達経路の構成因子PAG1と相同性をもつCoPAG1を同定するとともに、恒常活性型NDRキナーゼの導入実験によりCoPAG1がMOR経路に関わることを確認した。出芽酵母においてPAG1は細胞の極性形成や細胞の分離および細胞壁の健全性などに関与するRAMネットワークの構成因子であることが報告されており、RAMネットワークの植物特異的シグナル受容系への関与を示唆する新知見である。また、病原菌の分子パターンに関する研究では細胞壁構成を制御するRNA結合制御因子SSDがCBK1キナーゼの制御下にある実験結果を得、結合RNAの精製をおこなった。一方、PacCの機能解析に関して、本年度は分泌タンパク質遺伝子の詳細な発現パターンを調査した結果、pacC破壊株が活物寄生段階において2つの病原性関連分泌タンパク質遺伝子NIS1とCoMC69を野生株よりも高いレベルで発現することを明らかにした。このことはPacCが分泌タンパク質遺伝子の発現制御に関わることを示している。また、DCL2が本菌の病原性発現に必要であることを前年度明らかにしたが、本年度は野生株、dcl1破壊株、dcl2破壊株、および、dcl1 dcl2二重破壊株についてその低分子RNAの網羅的解析をおこない、本菌ゲノム配列に完全一致する低分子RNA配列を約1300万(野生)、約600万(dcl1)、約1900万(dcl2)、約2300万(dcl1 dcl2)取得した。平成24年度の研究において植物特異的シグナル受容を介した付着器形成に関与する遺伝子を同定するために、CoKEL2の形態形成・病原性欠損二重変異株6菌株の変異遺伝子をゲノムシークエンスによって同定した。その結果、二重変異株kanl-9の変異遺伝子は出芽酵母PAG1(TAO3)と相同性があることを明らかにした。出芽酵母においてPA(71は細胞の極性形成や細胞の分離および細胞壁の健全性などに関与するRAMネットワークの構成因子であることが報告されており、RAMネットワークの植物特異的シグナル受容系への関与を示唆する新知見を得た。また、病原菌の分子パターンに関する研究では細胞壁構成を制御するRNA結合制御因子SSDがCBK1キナーゼの制御下にある実験結果を得、結合RNA分子種と細胞内局在性の解明を進めている。一方、Paccの機能解析に関しては、まず、pacO破壊株が形成する付着器が侵入菌糸形成能を失っていることが判明し、PacCがHTEモード選択に加えて、通常の侵入様式においても重要な機能を有することが判明した。興味深いことに、多面的な解析を通じて、pacO破壊株において、一部の病原性関連分泌タンパク質遺伝子の過剰発現が見出されている。また、ago1破壊株の病原性欠損とRNAサイレンシングのリンクを更に検討するために、Dicer様遺伝子の機能解析をおこなった。本菌には2種のDicer様遺伝子が存在し(DCL1,DCL2、と命名)、それぞれの破壊株を作出した結果、dc12破壊株は明確な病原性低下を示すことが判明し、RNAサイレンシングと病原性発現のリンクがさらに支持された。一方、RNAサイレンシングに機能するDicer様遺伝子DCL2が炭疽病菌の病原性に必須であり、胞子発芽および付着器侵入プロセスにおいて重要な役割を担っていることを見出した。また、Argonaute遺伝子AGO1の破壊株の表現型はDCL2破壊株の表現型と類似していた一方、AGO2破壊株は野生株と同等の表現型であった。

このことより、DCL2-AGO1経路が本菌の病原性発現において重要な役割を担っていることが示唆された。さらに野生株、DCL1破壊株、DCL2破壊株、DCL1 DCL2二重破壊株の胞子由来の低分子RNAのシークエンスについて解析した結果、DCL2依存的に低分子RNAが生成されると推定される47種の転写産物を同定した。26年度が最終年度であるため、記入しない。植物病理学26年度が最終年度であるため、記入しない。当初の研究計画に従って、植物特異的シグナル受容を介した付着器形成に関与する遺伝子を同定し、その機能解析を進めることができた。また、細胞壁構成を制御するRNA結合制御因子SSDの結合RNAの純化を行うことができた。また、PacCによる遺伝子発現制御を明らかにし、さらに野生株およびRNAサイレンシング変異株の低分子RNA配列の取得に成功した。当初の研究計画に従って、植物特異的シグナル受容を介した付着器形成に関与する遺伝子を同定することができた。また、細胞壁構成を制御するRNA結合制御因子SSDがCBKIキナーゼの制御下にあるという新規の実験結果を得ることができた。また、PacCの病原性機能を見出し、さらにRNAサイレンシングと病原性のリンクを明らかにできた。植物特異的シグナル受容を介した付着器形成に関与する鍵遺伝子CoPAG1の上流、下流にある遺伝子の同定を進め、シグナルカスケードの全貌を明らかにする。また、細胞壁構成を制御するRNA結合制御因子SSDの結合RNAの遺伝子配列情報を明らかにする。さらにPacCを起点とした侵入様式の選択および病原性発現の制御メカニズム解明に向けて研究を行う。また、取得した低分子RNAの情報解析およびそれに基づく分子生物学的解析を進め、RNAサイレンシングがどのように植物感染プロセスに関わるのかを明らかにする。また、細胞壁構成を制御するRNA結合制御因子SSDのCBK1キナーゼによる制御機構を細胞分子遺伝学的に明らかにする。さらにPacCを起点としてHTEモードの制御機構の分子メカニズム解明に向けて研究を行い、Dicer様遺伝子の解析によりサイレンシングと病原性の関係が明らかになったことから、病原性とリンクする低分子RNAおよびその標的RNAの探索・解析に着手していく。
歯胚形成におけるヒアルロン酸の発現と機能に関する研究

HA合成酵素(Has)のマウス歯胚発育過程における遺伝子発現パターンを検索した。Has2 mRNAは歯胚周囲の間葉組織, Has3 mRNAはエナメル器, HERS, Apical Bud等の上皮組織に特異的に発現が認められた。したがってHas3が歯胚の発育や構造維持に関与している可能性が示された。Has3の機能を抑制するために, siRNAを器官培養系に添加し構造変化を検索したところ,歯胚におけるHas3 mRNAの発現は4割ほど減少したが、組織学的観察では大きな変化は認められなかった。よって、Has3の歯胚発育に関する作用は他のHas分子などで代償される可能性が考えられた。2015年度はマウス歯胚発育過程におけるHA synthase (Has)1-3 mRNAの発現に関し、リアルタイムPCR法による定量解析と、in situ hybridization法による発現パターンの経時変化の解析を行った。その結果Has1 mRNAの発現はほとんど認められず、Has2 mRNAは歯胚周囲の間葉組織、Has3 mRNAはエナメル器とはじめとする上皮組織に特異的に発現が認められた。Has2 mRNAの発現は経時的に減少し、生後ではほとんど認められなかった。特にHas3 mRNAに関しては歯根形成を制御するヘルトビッヒ上皮鞘(HERS)およびstem cell nicheとして認識される切歯のapicalbudにも発現が認められた。またHA-binding proteinを用いた組織化学的手法により合成されたHAの存在部位の検索を行ったところ、上皮、間葉両者ともHERSやapical budをはじめとする様々な部位に陽性反応が認められた。その発現はHas2あるいはHas3遺伝子発現部位と共存する部位としない部位があることも明らかとなった。以上のことから各Has分子のうち特にHas3が歯胚発育、特に生後における歯根形成やapical budの構造維持に関与している可能性が明らかとなった。以上の結果は論文にまとめて投稿し、現在リバイスを行っているところである。またHA分解酵素のうちHyal-1, -2、HA受容体であるCD44、RAHMMの遺伝子発現の局在を、in situ hybridizationで検索も行ったが歯胚形成過程における強い遺伝子発現は認められなかった。マウス切歯、臼歯両者の歯胚発育過程におけるHas遺伝子の発現パターンの経時的変化がin situ hybridization法で明らかになり、論文にまとめてリバイス中である。器官培養の実験もすでに基本の系を確立させており、あとは必要な試薬を添加して解析をする段階となっている。以上のことから実験計画は概ね順調に進展していると判断した。2016年度は前年度までの結果を大学院生の学位論文としてまとめて雑誌に発表した(Morita T et al. Gene Expression Patterns21:28-40, 2016).内容はリアルタイムPCRの解析により、HA synthase (Has)1 mRNAは歯胚形成過程ではほとんど発現が認められず、Has2 mRNAは歯乳頭や歯胚周囲の間葉組織、Has3 mRNAはエナメル器の他歯根形成を制御するヘルトビッヒの上皮鞘(HERS )内、あるいは近年stem cell nicheとして認識されている切歯のapical bud内のtransit zoneに発現が認められた。また歯冠部の乳頭層にもHas3の発現が認められた。HA-binding proteinを用いた組織化学的検索により、HAは上皮、間葉両者やHERS, Apical bud等様々な部位に存在する事が分かった。以上のことからHas3分子のうち特にHas3が歯胚発育、特に生後における歯根形成やapical budの構造維持、さらに乳頭層でのミネラルの輸送等の機能に関係している可能性が明らかとなった。さらに本年度はこれらのHas3の機能を確認するために、胎齢16日のマウス歯胚を摘出し器官培養の系に移し、Has3に対するsiRNAを培地に添加しこの分子の歯胚発育に対する影響を検索した。その結果Has3 mRNAの発現は約50%低下し実験系が有効に機能している事がわかった。しかしながら歯胚の発育に関する顕著な形態異常は認められなかった。この事は他のHas分子(Has1, Has2)が代償的に働いている可能性もあり、更なる検討が必要な状況となっている。さらに器官培養の培地に2mMのβ-グリセロリン酸を添加する事で迅速に石灰化組織を誘導する系も確立した。歯胚発育におけるHas遺伝子の発現パターンを検索する事で、特にHas3の重要性が明らかとなった。この結果は大学院生の学位論文として発表する事が出来た。また歯胚の器官培養の系にsiRNAを添加する実験系で、Has3の発現低下を誘導することが出来た。ヒアルロン酸およびその合成酵素であるHas3の歯胚形成に関する生化学的、分子生物学的意義についてはまだ明らかになっていないが、Has1やHas2の遺伝子発現を同時に低下させる等の実験でそれらを明らかにできる可能性がある。また器官培養の系で石灰化組織を迅速に石灰化させる系を確立した。ヒアルロン酸(HA)の歯胚形成への役割を明らかにすることを目的に、まずHA合成酵素(HAS)および分解酵素のマウス歯胚の発育過程における遺伝子発現パターンを検索した。その結果Has1mRNAの発現はほとんど認められす、Has2mRNAは歯胚周囲の間葉組織、Has3mRNAはエナメル器をはじめとする上皮組織に特異的に認められた。

生後組織ではHas2 mRNAの発現はほとんど認められなくなったが、Has3mRNAに関しては歯根形成を制御するヘルトビッヒ上皮鞘(HERS)およびstem cell nicheとして認識されている切歯のapicalbudにも発現が認められた。HA-binding proteinを用いた組織化学的手法により合成されたHAの存在部位の検索を行ったところ、上皮、間葉両者ともHERSやapicalbudをはじめとする様々な場所に陽性反応が認められた。HA分解酵素の遺伝子発現は強い反応が認められなかった。以上のことからHas分子のうち特にHas3が歯胚発育、特に生後における歯根形成やapical budの構造維持に関与している可能性が示された。次に胎齢16日齢のマウス臼歯を摘出して器官培養の系に移し、Has3の機能をノックダウンするためにsiRNAを終濃度200nMで培地中に添加し、7日間培養後歯胚の構造変化を検索した。その結果歯胚におけるHas3 mRNAノックダウンの効果はコントロールと比較して、4割ほど下方制御された。実体顕微鏡で歯胚全体の大きさを観察したところ、実験群は対照群と比較して全体的に小さい傾向を示した。しかしながら、組織学的観察においては内エナメル上皮や象牙芽細胞の形態に関して、実験群は対照群と比較して大きな変化は認められなかった。以上のことからHas3の歯胚発育に関する作用は他のHas分子などで代償される可能性が考えられた。HA合成酵素(Has)のマウス歯胚発育過程における遺伝子発現パターンを検索した。Has2 mRNAは歯胚周囲の間葉組織, Has3 mRNAはエナメル器, HERS, Apical Bud等の上皮組織に特異的に発現が認められた。したがってHas3が歯胚の発育や構造維持に関与している可能性が示された。Has3の機能を抑制するために, siRNAを器官培養系に添加し構造変化を検索したところ,歯胚におけるHas3 mRNAの発現は4割ほど減少したが、組織学的観察では大きな変化は認められなかった。よって、Has3の歯胚発育に関する作用は他のHas分子などで代償される可能性が考えられた。本年度は器官培養の系にHA合成阻害薬4-メチルウンベリフェロン(MU)を添加するか、各Has遺伝子のアンチセンスオリゴあるいはsiRNAを添加して歯胚形態形成への影響を検索する予定となっている。さらに歯胚全体あるいは上皮と間葉を分離後3H-グルコサミンを培地に添加する事でmetabolic labelingを行い、合成されたHA量を定量するとともに分子量の測定、分解酵素による分解産物の構造解析も行う予定である。さらに歯胚の器官培養系で石灰化組織を誘導する系の開発にも取り組み、石灰化に対するHA合成の影響も検索する予定である。本年度は器官培養の系にヒアルロン酸(HA)合成阻害薬4-メチルウンベリフェロン(MU)の添加実験、あるいはHas 1,2,3に対するsiRNAを同時に培地に添加する実験等でHA合成を阻害し、ヒアルロン酸の歯胚形成に関する機能をさらに明らかにする予定となっている。
バイオ還元システムを基盤とする有用物質生産プロセスの開発

本研究では、還元型補酵素(NAD(P)H)要求性の酵素反応を利用する物質生産プロセスとして確立した「バイオ還元システム」を技術基盤とした有用物質生産プロセスの開発を進め、本システムのさらなる展開を目指した。特に、炭素二重結合不斉水素化酵素および新規バイヤービリガーモノオキシゲナーゼの探索と解析を進めた。1.炭素二重結合不斉水素化酵素の探索と解析:これまでの検討で見出した2種の新規な旧黄色酵素は同じ立体選択性を示すものの基質特異性において異なっているが、アミノ酸1次構造では40%以上の相同性を示すことから、その要因を解明することで基質特異性の改変を試みた。構造解析の結果、2種の酵素で特定のアミノ酸残基の違いが判明し、そのアミノ酸残基の置換を試みている。また、フォレノールの不斉水素化反応の探索において、見出した旧黄色酵素と逆の立体選択性を示す菌株からの酵素単離およびその解析を進め、旧黄色酵素とは異なる立体選択性を示す酵素の取得を試みた。2.新規バイヤービリガーモノオキシゲナーゼ(BVMO)の探索と解析:BVMOによる環状ケトン化合物からのラクトン類の生産に関して検討を行った。難分解性環境汚染物質であるフルオレンの微生物分解に関する報告があり、その中でBVMOが大きな役割を果たしていることが明らかとなっている。そこで、フルオレンおよび類縁化合物の分解代謝微生物の取得を行い、BVMO活性の探索を行った。BVMO高活性菌株数株から酵素単離およびその解析を進めたが、BVMO酵素の取得には至らなかった。そこで、フルオレン代謝経路の下流に存在すると考えられるラクトン環加水分解酵素の精製および遺伝子クローニングを進め、遺伝子レベルからのBVMO酵素の取得を目指した。現在ラクトン化加水分解酵素の酵素精製に成功している。1.炭素二重結合不斉水素化酵素の探索と解析:これまでの検討で見出した2種の新規な旧黄色酵素(炭素二重結合不斉水素添加酵素)は同じ立体選択性を示す一方で、基質特異性において異なっている。そこで、両者の構造比較を行い、それに基づいた部位特異的変異を検討した。その結果、基質特異性が変化した変異酵素を得ることに成功した。また、フォレノールの不斉水素化反応の探索において見出した旧黄色酵素と逆の立体選択性を示す菌株から、触媒酵素の単離を試みた。現在、部分精製酵素の取得に成功しており、さらなる精製と遺伝子クローニングを進めている。2.新規バイヤービリガーモノオキシゲナーゼ(BVWO)の探索と解析:BVWOによる環状ケトン化合物からのラクトン類の生産に関して検討を行った。1-インダノン-ラクトン化活性を示した土壌分離菌Rhodococcus sp.より、1-インダノンモノオキシゲナーゼの単離・精製を試みたが、不安定であり精製できなかった。1-インダノンは3,4-ジヒドロクマリン(3,4-DC)へのラクトン化後、加水分解され代謝されると予想される。そこで、本菌より3,4-DC加水分解酵素の単離と遺伝子クローニングを行い、遺伝子レベルから1-インダノンモノオキシゲナーゼの取得を試みた。3.炭素二重結合不斉水素化酵素およびBVMOのライブラリー化と補酵素再生系酵素遺伝子との共発現:新規な炭素二重結合不斉水素化酵素およびBVWOに関して、遺伝子の取得を試みているが、現在までにクローニングに至っていない。遺伝子クローニングをさらに進め、ライブラリー化と補酵素再生系酵素遺伝子の共発現大腸菌の育種を目指す。1.炭素二重結合不斉水素化酵素および新規バイヤービリガーモノオキシゲナーゼ(BVMO)の解析:基質特異性の異なる2種の旧黄色酵素について、部位特異的変異による基質特異性の改変を行った。これらの改変酵素を用いた酵素化学的解析と光学活性化合物生産への応用に関する検討を行い、基質特異性の異なる変異酵素を見出した。また、フルオレンおよび類縁化合物の分解代謝微生物として単離した菌株から、BVMOとリンクすると思われるラクトン環加水分解酵素の単離を行った。本ラクトン環加水分解酵素の解析を行うとともに遺伝子クローニングに成功し、周辺にBVMO遺伝子類似遺伝子が存在することを見出した。2.炭素二重結合不斉水素化酵素のライブラリー化と補酵素再生系酵素遺伝子との共発現:改変して得られた旧黄色酵素等の炭素二重結合不斉水素化酵素の変異酵素遺伝子ライブラリーを作成するとともに、補酵素再生系酵素(グルコース脱水素酵素)遺伝子との共発現大腸菌の育種を行い、「バイオ還元システム」を利用した物質生産の基盤を構築した。3.触媒ライブラリーを用いた有用物質生産の検討:補酵素再生系酵素遺伝子との共発現を行った触媒ライブラリーを用いて、各種不飽和化合物の変換を試みた。また、これらの酵素ライブラリーを用いる反応を組み合わせて用いることにより、より複雑な化合物(特に、キラル中心を複数有する化合物)の生産に関しても検討を行った。
低ｐＨ環境を可視化する蛍光プローブの開発と生体イメージングへの応用

関節リウマチなどの骨疾患原因細胞である破骨細胞の生体蛍光イメージングを行うために、骨吸収時に形成される低pH環境を可視化する蛍光プローブの開発を行った。ビスホスフォネート構造と光誘起電子移動により、蛍光プローブの生体内デリバリーとpH応答性の蛍光ON/OFF制御を行った。さらに、蛍光プローブに電子求引基を導入することで光安定性を向上させ、破骨細胞活性の長時間イメージングを達成した。また、プローブ構造を改良することで、蛍光波長の長波長化にも成功した。前年度までに開発したpH感受性蛍光プローブ「BAp-E」は、光安定性が低く、二光子励起顕微鏡を用いた長時間イメージングには適用できないことが、研究の過程で明らかとなった。そこで、プローブ構造の再設計を行い、より光安定性の優れた蛍光プローブの開発を行った。具体的には、まず、BAp-Eの光退色の原因を究明すべく、試験管内のプローブ溶液に対して光照射を行い、蛍光強度変化を観察した。その結果、BAp-Eの光安定性は、一般的に光退色し易いことが知られているフルオレセインよりも低いことが明らかとなった。この光照射による蛍光退色は、溶液中の溶存酸素を取り除くことにより著しく改善されることがわかった。したがって、光照射によって生じる一重項酸素が光退色の主な原因であると考えた。そこで、一重項酸素への反応性を低下させることで、プローブの安定性を向上させることを狙った。また、プローブ母骨格の構造改変により電子状態が変化してしまうため、量子化学計算を用いて構造探索を行い、プローブのpH応答性を最適化した。開発した改良型プローブをマウスに投与し、二光子励起顕微鏡を用いて、マウス頭頂骨内で活動する破骨細胞のイメージングを実施した。プローブの光安定性が向上したため、2時間以上に渡る経時的観察が可能であった。さらに、本プローブを用いることで、破骨細胞が骨吸収を開始する瞬間を捉える事に成功した。以上の知見を生かし、プローブの蛍光波長の長波長化にも取り組んだ。その結果、BAp-Eに比べ約50 nmの長波長化に成功した。さらに、試験管内にてプローブの光安定性を評価した結果、長時間イメージングに十分耐えられるだけの光安定性を有していることが明らかとなった。我々の体を支える骨組織では、破骨細胞による骨吸収と骨芽細胞による骨形成のサイクルが繰り返され、骨強度や形状が保たれている。破骨細胞による過剰な骨吸収は、関節リウマチや骨粗しょう症などの骨疾患を引き起こすことが知られているため、その細胞機能の解明は急務である。破骨細胞の機能をリアルタイムに可視化するためには、高感度かつ空間分解能の高い蛍光イメージング法が有力である。しかしながら、破骨細胞活性を検出する既存の手法は、酵素認識による蛍光回復を利用していることから、特異性が低く不可逆なシステムであることが問題であった。本研究では、上記の問題点を解決するために、破骨細胞が骨吸収時に形成する低pH領域に着目し、可逆的なpH変化を蛍光シグナルとして読み出すための蛍光プローブの開発を行った。我々はこれまでに、ボロン-ジピロメテン(BODIPY)色素を母骨格とするpH感受性蛍光プローブとしてBAp-Eを開発し、マウス体内で骨吸収を行う破骨細胞のイメージングに成功している。このBAp-Eを用いることで、生体内において成熟破骨細胞には(1)骨吸収をしていない休止期の細胞と(2)活発に骨吸収をしている細胞の2種類が存在することを明らかにした。これらの細胞の存在を視覚的に捕えることは既存のプローブでは困難であり、本プローブは破骨細胞機能解明において有力なツールであると言える。更に、破骨細胞の活性変化がリアルタイムに評価できることから、破骨細胞が関連する骨疾患の治療薬開発に対して重要な手法であると考えられる。本研究において開発したpH感受性蛍光プローブが、マウス体内における破骨細胞活性の検出に利用可能であることを示した。それだけに留まらず、成熟破骨細胞の休止期と活動期という2種類の存在を示したことは、非常に意義のある研究であると言える。破骨細胞機能の解明に向け、細胞活性の経時的な観察を達成する。さらに、動物個体内でのイメージングに使いやすくするため、蛍光プローブの蛍光波長をより長波長領域へと伸長する。研究遂行にあたり、必要に応じて物品の購入等を行ったため、当初予定していた見込み金額と執行金額に差が生じてしまった。しかし、研究計画自体には変更はなく、前年度の研究費も併せて、申請時の計画通りに研究を進めていく。