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カズオ・イシグロ文学における職業・芸術の倫理的意義

本研究では、現代文学を代表する日系英国人作家カズオ・イシグロが生み出す小説世界を、モダニズムに始まる20世紀英文学における「英国性」の変遷の中に位置づけることを目指した。そこで「英国性」の発展のプロセスを詳細に分析すると共に、職業及び芸術を個人と国家の関係性の象徴と見なす作家独自のアプローチについて考察し、学会におけるシンポジウム発表及び学術論文の形で成果を得た。本研究は、現代文学を代表する日系英国人作家カズオ・イシグロが生み出す小説世界を、モダニズムに始まる20世紀英文学における「英国性」の変遷の中に位置づけ、国家的アイデンティティ及び個人的アイデンティティの表象と、その二つを結びつける役割を担う「芸術/職業」の倫理的意義について考察することを目的としている。19年度に実施した研究の中心は、イシグロの長編小説第5作『わたしたちが孤児だったころ』において、コスモポリタニズムから小英国主義への回帰という大戦間を舞台に、私立探偵という「英国的」職業がどのように脱神話化されているかというテーマで英語論文を執筆することにある。このために夏季休暇に大英図書館においてリサーチを行い、大戦間の文化資料等の収集に努めた。更に、本作構想にあたりイシグロが刺激を得たという1930年代の英国探偵小説について知識を深め、その代表的作家の一人であるドロシー・L・セイヤーズに関する研究を、日本ヴァージニア・ウルフ協会年次大会でのシンポジウム「National Cultureと(Step-)Daughterたち」において発表し、活発な意見交換を行った。大戦間の探偵小説については近年批評的関心が特に高まっており、イシグロが生み出した「信頼できない」名探偵に関する議論を発展させる上で、極めて有意義な研究であったと考えられる。こうした成果を踏まえ、現在完成段階に近づいている論文を20年度には発表し、まだ萌芽状態にあるイシグロ研究及びますます発展を続ける英国性に関する議論に貢献することを目指していく。本研究は、現代英文学の旗手とも言うべき日系人作家カズオ・イシグロが生み出す小説世界を、大英帝国崩壊に伴う20世紀における「英国性」の変遷の中で議論し、国家と個人の関係性、その狭間に位置する職業及び芸術の倫理的意義について検証することを目的としている。平成20年度に実施した研究においては、まずイシグロの多くの小説の舞台となっている戦間期英国社会に関する前年度からのリサーチを発展させ、『転回するモダン』(研究社)所収の論文「隠喩としてのインフルエンザ?」に纏め上げた。本論では、第一次世界大戦末期に世界を襲ったスパニッシュ・インフルエンザを巡る社会的・文化的言説の考察を通じて、正に最悪のタイミングで「グローバリゼーション」の脅威に直面した英国が、個人の身体と精神の統制を図ることで、国家的アイデンティティの保持を画策した過程について検証した。この論考によって、第一次世界大戦後の大英帝国の疲弊と衰退、その危機にあって再建を余儀なくされる「英国性」についての諸問題が明らかにされた。第二の研究としては、このように「英国性」が揺れ動いた戦間期を舞台としたイシグロの第5作長編小説『わたしたちが孤児だったころ』における、推理小説ジャンルのパロディ化をテーマとした英語論文を執筆した。戦間期に一大ブームを巻き起こした「名探偵」を主人公とする推理小説は、大戦によって精神的基盤を揺るがされた当時の英国民に、根絶し得る悪と、回復される安全という神話を提供する逃避文学とも解釈できるが、イシグロがこの「逃避」に倫理的意義の可能性を付与すべく採用した、テクストにリアリズムと非リアリズムの世界を混在させる手法について、本論では考察した。本論の出版によって、イシグロの小説世界の重層性についての議論が更に高まるものと期待される。
ジュニア期のスポーツ活動と防衛体力に関する研究

ジュニア期におけるスポーツ活勤と防衛体カの関係について検討するために,小学5年生の児童約700名を対象に,2ケ月間におけるかぜの罹患状況を調査した.調査は質問紙法により行った.調査項目は,感染症時によくみられる鼻水・鼻づまり,せき・たん,のどの痛み,腹痛・下痢,発熱,疲労感などとした.また,ウィルスとの接触確率を低くすること,保温を行うこと,不調の時には無理をしないことを指針としたかぜ予防ガイドラインを作成し,対象をかぜ予防ガイドラインを用いたかぜ予防対策実施群と対象群にわけ,かぜ症状の出現頻度,有症状日数,症状の平均持続日数などを比較した.あわせて,かぜ予防対策の実施状況も調査した.その結果,かぜ対策実施群および対象群において,鼻水・鼻づまり,せき・たん,のどの痛み,腹痛・下痢,発熱,疲労感などの出現頻度,有症状日数,症状の平均持続日数に有意な差は認められなかった.かぜ対策実施状況を両群で比較すると,その実施率にも差は認められなかった.しかし,実施率の高い児童ほど症状の出現頻度,有症状日数,症伏の平均持続日数は低い傾向が認められた.調査に用いた質問紙にかぜ対策実施状況の調査項目が含まれていた結果,両群ともかぜ対策の実施状況に差が生しなかったために,かぜの罹患状況に差が認められなかったと考えられる.かぜ症候群への対処法や予防策に関する経験的な知見について,医療の現場で小学児童の感染症の治療を行っている小児科医と感染症に関する専門的知識を有する内科医等からのアドバイスを得ながら,その妥当性と科学的根拠を検討し,ウィルスとの接触を避けること,ウィルスの活動性を減じる対策,環境への配慮,自己管理の大きく4項目からなるかぜ予防ガイドラインを作成した.このガイドラインをパンフレットとしてまとめ.調査対象の担任教諭および保穫者に配布し,ガイドラインの内容および使い方について教育した.また調査の実施方法について学校の担任教諭との協議を行なった.このような打ち合わせをもとに,茨城県水海道市の小学生56年生約800名を対象として,1年を通してかぜ症候群への罹患率が高いと考えられる冬季(2月)に上気道感染症時に観察される症状の有無について調査を行なった.調査は,学校担任教諭の指導下において,生徒自身が調査用紙に記入した.対象を2グループにわけ,1グループは作成したかぜ予防ガイドラインを対象に配布,教育し,ガイドライン中の対策の実施をチェックさせた.コントロールグループでは,ガイドラインの配布は行なわず,かぜ予防に関する啓蒙活動も日常行なっている程度のものとした.来年度は,この調査結果を整理・集計し,両グループにおける上気道感染症の罹患率を比較する.ジュニア期におけるスポーツ活勤と防衛体カの関係について検討するために,小学5年生の児童約700名を対象に,2ケ月間におけるかぜの罹患状況を調査した.調査は質問紙法により行った.調査項目は,感染症時によくみられる鼻水・鼻づまり,せき・たん,のどの痛み,腹痛・下痢,発熱,疲労感などとした.また,ウィルスとの接触確率を低くすること,保温を行うこと,不調の時には無理をしないことを指針としたかぜ予防ガイドラインを作成し,対象をかぜ予防ガイドラインを用いたかぜ予防対策実施群と対象群にわけ,かぜ症状の出現頻度,有症状日数,症状の平均持続日数などを比較した.あわせて,かぜ予防対策の実施状況も調査した.その結果,かぜ対策実施群および対象群において,鼻水・鼻づまり,せき・たん,のどの痛み,腹痛・下痢,発熱,疲労感などの出現頻度,有症状日数,症状の平均持続日数に有意な差は認められなかった.かぜ対策実施状況を両群で比較すると,その実施率にも差は認められなかった.しかし,実施率の高い児童ほど症状の出現頻度,有症状日数,症伏の平均持続日数は低い傾向が認められた.調査に用いた質問紙にかぜ対策実施状況の調査項目が含まれていた結果,両群ともかぜ対策の実施状況に差が生しなかったために,かぜの罹患状況に差が認められなかったと考えられる.
骨格形成を司る転写因子ネットワークの解析

骨組織に特異的に発現する転写因子として研究代表者が同定した「オステリクス(Osterix; Osx)」は、転写因子「ランクス2 (Runx2/Cbfa1)」と共に骨芽細胞の分化制御に最も重要とされる必須転写因子であることが明らかにされてきたが、オステリクスが如何なる分子機構によって骨芽細胞の分化を促すのか、また如何なる機構によって骨格形成の発生プログラムに寄与するのか、その本質については十分に理解されてはいない。本研究計画は、ランクス2からオステリクスを経て下流遺伝子に至る、骨芽細胞分化を制御する転写因子カスケードの総体についての解明を目標として、まずオステリクスが直接転写を制御する遺伝子についての解明を進め、同時にオステリクスの転写活性を調節する分子メカニズムについての解明を目指した。これらの解析から、推定することのできたオステリクス関連経路で役割を果たす幾つかの遺伝子群の中から、Runx2, Cnot7, Schunurri-2, Cizについて遺伝子欠損マウスの骨組織および骨由来細胞を用いた解析をおこない、これらの分子が骨芽細胞において伝える細胞シグナルと骨形成への影響について多方面から研究を発展させた。また骨芽細胞における液性因子による活性化径路として骨形成性蛋白と副甲状腺ホルモンを介した径路に注目してその関与の機構の一部を明らかにした。さらに新たな側面として、転写因子JunD、Nfat、形態パターニングのシグナル分子PlexinD1、イオンチャネル分子TRPV4に加えて、レニンーアンギオテンシン系の関与の可能性についても検討をおこなった。本研究の成果は骨生物学の発展という側面から、関連臨床医学への応用の可能性を広げるものであり、そのような形での社会への貢献を期待する。ヒトの健康維持には、豊富な骨量を保ち、妥当な強度を示す健康な骨格を維持することが必要である。しかし、加齢、あるいは生理的状態からの逸脱に伴って骨量は減少して、骨は脆弱になる。従って、骨量の減少を予防して、減少した骨量を回復させる為に、骨代謝を担当する細胞群の機能制御メカニズムの解明が必要不可欠である。骨形成を担当する骨芽細胞が特異的な表現型を獲得するには、転写因子Runx2に加えて、いくつかの異なる転写因子が必要である。研究代表者は新規遺伝子Osterix(Osx)を単離、同定した。遺伝子改変マウスの解析から、Osxは遺伝学的にRunx2の下流で作用する、骨芽細胞分化と骨形成に必須な転写因子であることが判明した。Osx機能欠損マウスでは、Runx2を発現する細胞が骨形成予定域に存在するが、この細胞は骨芽細胞に分化せず、軟骨細胞の形質を発現した。従って、Runx2発現細胞は軟骨細胞にも分化しうる能力を持ち、骨芽細胞と軟骨細胞は共通の前駆細胞から分化すると考えられる。この仮説を検証する為に、Osx遺伝子の両端にloxPを導入した遺伝子改変マウスを作成した。このfloxed遺伝子改変マウスと軟骨細胞特異的にCreリコンビナーゼを発現するSox9-Creマウスを交配すると、その胎仔マウスは骨形成を示さないことから、骨芽細胞と軟骨細胞はSox9を発現する細胞集団の中から分化することが判明した。Osxが生後に進行する骨代謝を制御するか、否かを問うために、FK506投与マウスの表現型を解析した。FK506投与マウスでは、破骨細胞の活性が低下しているにもかかわらず骨量が減少した。このマウスの解析から、Osxは転写因子NFATc1との結合を介して生後のマウスの骨形成を制御すること、並びにFK506はこの結合を阻害することによって骨形成を制御することが判明した。

しかし、加齢、あるいは生理的状態からの逸脱に伴って骨量は減少して、骨は脆弱になる。従って、骨量の減少を予防して、減少した骨量を回復させる為に、骨代謝を担当する細胞群の機能制御メカニズムの解明が必要不可欠である。骨形成を担当する骨芽細胞が特異的な表現型を獲得するには、転写因子Runx2に加えて、いくつかの異なる転写因子が必要である。研究代表者は新規遺伝子Osterix(Osx)を単離、同定した。遺伝子改変マウスの解析から、Osxは遺伝学的にRunx2の下流で作用する、骨芽細胞分化と骨形成に必須な転写因子であることが判明した。Osxが生後に進行する骨代謝を制御するか、否かを問うために、FK506投与マウスの表現型を解析した。FK506投与マウスでは、破骨細胞の活性が低下しているにもかかわらず骨量が減少した。このマウスの解析から、Osxは転写因子NFATc1との結合を介して生後のマウスの骨形成を制御すること、並びにFK506はこの結合を阻害することによって骨形成を抑制することが判明した。OsxとNFATc1の結合は、Osx中央領域を介してなされたが、この領域はNFATc1非存在下では転写活性を持たない。NFATc1に依存しないOsxの転写活性化領域はNFATc1結合領域よりもさらにN-末端にある。そこで、このOsxの転写活性化領域との結合を介してOsxの活性を調節する転写調節因子の有無を検討した。In vitroでのOsx活性測定系を用いたスクリーニングの結果、3つのコファクターを同定した。これらの因子は、NFATc1に依存しないOsxの転写活性化領域に結合して、Osxの転写活性を相乗的に促進した。骨格形成を司る転写ネットワークとして、その下流の遺伝子は骨の形成に関わり特に骨芽細胞におけるその機能が明らかであることから、Runx2ならびにOsxとともに主要な機能を担うと推察される。この骨格形成における分子のネットワークの一部として、PlexinD1の意義を検討しその欠失によって骨格のパターニングの異常が起こることを見出した。この異常では、肋骨の形態異常や脊椎椎体の欠失変異更に椎体の軟骨の血管侵入の異常が観察され、本分子の骨格形成における意義が明らかとなった。更にOsxの制御分子の上流にあるBMPの機能についての解析を進め、BMPのターゲットを同時に修飾する分子としてSchnurri-2の意義を検索した。ノックアウトマウスによるこの検索によりSchnurri-2の欠失は、皮質骨ならびに海綿骨のいずれにおいても量の減少をもたらし、その遺伝子発現の検索からOsterixのレベルの低下が明らかとなった。骨の形成の全般的な低下は骨形成速度、骨芽細胞表面更には石灰化速度のいずれにおいても抑制として観察された。一方、破骨細胞の機能に対する抑制がノックアウトにおいて見られ、その抑制のレベルが骨芽細胞の抑制を上回ることから、海綿骨における骨量は増加することが観察された。以上の如く、骨格形成に関わる分子群の意義を明らかにし、またこれの一つの要因としてのOsterixの動きを解明した。
鋼構造立体骨組の設計レベルから崩壊に至るまでの終局耐震性能評価

今年度は現在までの設計や研究をベースとして,2007年に実施された実大4層鉄骨造建物の完全崩壊実験における倒壊挙動,及び耐震性能を詳細に分析した.現行の耐震設計に基づいて設計・施工された鉄骨造建物(以下試験体)に鷹取原波を入力したところ,1層における全ての柱脚と柱頭で耐力劣化が生じ,ほぼ一方向に大きく変形を生じた後,鉛直荷重支持能力を喪失して倒壊した.このことは現行の耐震設計に基づいて建築された中低層建物であっても,過大な地震動を受ける場合,特に幅厚比の大きな角形鋼管柱を用いた場合は全塑性耐力到達後に局部座屈による耐力劣化が早期に生じるため,建物が倒壊しやすいことを示す.試験体が層崩壊に至った大きな要因は二軸曲げと付加軸力を受けた柱耐力の低下,鋼材の歪硬化や床スラブの合成効果によって梁及びパネルの剛性が上昇したことであった.また試験体が倒壊に至るまでの過程をエネルギーの授受により検討し,倒壊に至らしめた支配的な要因はPΔ効果ではなく,塑性化の進行により試験体の周期が延びて長周期側の大きなエネルギーが入力され,更に塑性化の進行がもたらされたことであった.なお設計で想定する最大入力レベルである最大層間変形角1/50を生じた加振時に対する,倒壊時の崩壊メカニズムが移行した直後の全層のエネルギー吸収量の割合は1.62.0倍であり,この値は試験体が有する倒壊までの安全余裕度に相当する.完全崩壊実験の結果を受け,倒壊に関わる要因を検討した,まず,二方向入力を再現できるMSSモデルを用いた弾塑性応答解析を行い,入力波の種類や加振レベル,回数が変化しても倒壊時は一方向に変形が偏ることを確認した.今年度は現在までの設計や研究をベースとして,2007年に実施された実大4層鉄骨造建物の完全崩壊実験における倒壊挙動,及び耐震性能を詳細に分析した.現行の耐震設計に基づいて設計・施工された鉄骨造建物(以下試験体)に鷹取原波を入力したところ,1層における全ての柱脚と柱頭で耐力劣化が生じ,ほぼ一方向に大きく変形を生じた後,鉛直荷重支持能力を喪失して倒壊した.このことは現行の耐震設計に基づいて建築された中低層建物であっても,過大な地震動を受ける場合,特に幅厚比の大きな角形鋼管柱を用いた場合は全塑性耐力到達後に局部座屈による耐力劣化が早期に生じるため,建物が倒壊しやすいことを示す.試験体が層崩壊に至った大きな要因は二軸曲げと付加軸力を受けた柱耐力の低下,鋼材の歪硬化や床スラブの合成効果によって梁及びパネルの剛性が上昇したことであった.また試験体が倒壊に至るまでの過程をエネルギーの授受により検討し,倒壊に至らしめた支配的な要因はPΔ効果ではなく,塑性化の進行により試験体の周期が延びて長周期側の大きなエネルギーが入力され,更に塑性化の進行がもたらされたことであった.なお設計で想定する最大入力レベルである最大層間変形角1/50を生じた加振時に対する,倒壊時の崩壊メカニズムが移行した直後の全層のエネルギー吸収量の割合は1.62.0倍であり,この値は試験体が有する倒壊までの安全余裕度に相当する.完全崩壊実験の結果を受け,倒壊に関わる要因を検討した,まず,二方向入力を再現できるMSSモデルを用いた弾塑性応答解析を行い,入力波の種類や加振レベル,回数が変化しても倒壊時は一方向に変形が偏ることを確認した.
tmRNAによるトランス翻訳機構

tmRNAはtRNAとmRNAの両方の性質を持つユニークな低分子RNAで、トランス翻訳において中心的な役割を果たしている。饗場グループはこれまでにリボソームの停滞がmRNAの切断を誘起し生じたnonstop mRNAがトランス翻訳の標的になることが明らかにしてきた。今回、RFの活性または発現量の低下による終止コドンでのリボソームの停滞がmRNAの切断っを誘起し、したがってトランス翻訳の標的を産生することを発見した。また、アミノ酸飢餓条件下でmRNAの切断とトランス翻訳が起こることを明らかにした。さらに、セリン飢餓におけるmRNAの切断部位はserine codonに対応することを示した。すなわち、アミノ酸飢餓はリボソームの停滞を引き起こし、mRNAの切断を誘起すること、従って、tmRNAとリボソームによる品質管理機構は生理的ストレス条件下でも重要な役割を果たしていることが明らかになった。姫野は、精製した翻訳因子を組み合わせることによって、in vitroにおいてトランス翻訳系を開発し、この系を用いて、tmRNA結合タンパク質として知られるS1タンパク質がペプチド転移反応および最初のコドンの解読には必要ないことを明らかにした。また、Fe(II)-BABEを用いたヒドロキラジカルプロービングを行い、AサイトおよびPサイトに1分子ずつ、合計2分子のSmpBがリボソームに結合することを明らかにした。さらに、SmpBのC末端領域は、リボソーム上のmRNAの通り道にそって、Aサイトでは上流方向に位置することを明らかにした。これらの結果は「tRNA+mRNAを分子擬態するタンパク質」および「アミノ酸をコードするタンパク質」というこれまでにない概念を提唱するものである。平成14年度には次の結果を得た。1)大腸菌においてトランス翻訳に必須の因子SmpBは、細胞内でtmRNAと結合し、(1)その安定化に働く、(2)tmRNAのアミノ酸結合能を高める、(3)リボソームへの結合を助ける、という複数の機能をもつ事を明らかにした。(Hanawa-Suetugu et al.,2002)2)枯草菌tmRNAは大腸菌中でも正常にトランス翻訳反応を行うことを、その産物のマススペクトル解析を用いて明らかにし、両者の細胞中で同一のメカニズムでタグ合成が起きることを明らかにした。(Ito et al.,2002)。3)枯草菌においてトランス翻訳反応産物を検出する系を確立した。それにより、高温ストレス下ではより頻繁にトランス翻訳が起きることが確認された。また培養条件により反応の標的となるタンパク質の種類が変わることが判明、さらに高温と常温とで標的となるタンパク質の種類を数個づつ同定した。(Fujihara et al.,2002)。4)大腸菌suppressor株でトランス翻訳が高頻度で起こること、supC ssrA2重変異株では、細胞の生育が顕著に抑制されることを発見した。tmRNAの内在性標的の実体と翻訳のリードスルーに対応する品質管理システムとしてtmRNA系の役割を明らかにした。(Ueda etal.,2002)。5)ストレプトマイシンやカナマイシンなどの抗生物質が、trans-translationを広範に引き起こすこと、tmRNA系がこれらの抗生物質に対する細胞の抵抗性に寄与していることを見いだした。(Abo et al.,2002)。6)mRNA上の正常な終止コドン自体が、新生ペプチドのC末端のアミノ酸配列に依存してtrans-translationの標的になりうることを発見した。(Sunohara et al.,2002)トランス翻訳機構:tmRNAとトランス翻訳に対する各種抗生物質の作用をin vivoおよびin viro系で解析を行い、抗生物質のひとつParomomycinがtmRNAに直接結合すること、トランス翻訳においてタグ翻訳のフレームシフトを引き起こすことを明らかにした。トランス翻訳反応の生理的機能:トランス翻訳の反応産物を生産するtmRNA変異体を作成することにより、その検出が可能なin vivo系を枯草菌、大腸菌を用いて確立、トランス翻訳の標的タンパク質のいくつかを明らかにした。

現在それら標的タンパク質のトランス翻訳を受ける生理的意義とマススペクトル分析による翻訳の切り替え位置の解析等から、カタボライト抑制にこの機構が関与していることを明らかにした。一方、トランス翻訳が枯草菌の胞子形成に関与することを見つけ、その原因を追及したところ、胞子形成過程の後期におけるシグマK因子遺伝子の形成に関わるDNA再編成にtmRNAが必要であることが明らかになった。また、トランス翻訳が終止コドンを無くしたmRNA (non-stop mRNA)の分解に働くことを明らかにし、単に出来損なったタンパク質の分解(品質管理)ばかりでなく、mRNAの品質管理にも働くことを明らかにした。また、翻訳が滞ったリボソーム上のA-siteでmRNAの切断が起きる事を示した。トランス翻訳機構:tmRNAとトランス翻訳に対する各種抗生物質の作用をin vivoおよびin viro系で解析を行い、抗生物質のひとつParomomycinがtmRNAに直接結合すること、トランス翻訳においてタグ翻訳のフレームシフトを引き起こすことを明らかにした。また大腸菌と好熱菌の単離した成分のみによるin vitroトランス翻訳系を確立し、反応の各ステップのリボソーム複合体を精製した。これをもちいて構造解析を試みている。トランス翻訳反応の生理的機能:トランス翻訳の反応産物を生産するtmRNA変異体を作成することにより、その検出が可能なin vivo系を枯草菌、大腸菌を用いて確立、トランス翻訳の標的タンパク質のいくつかを明らかにした。また、トランス翻訳が終止コドンを無くしたmRNA(non-stop mRNA)の分解に働くことを明らかにし、単に出来損なったタンパク質の分解(品質管理)ばかりでなく、mRNAの品質管理にも働くことを明らかにした。バクテリアのtmRNAはtRNAとmRNAの両方の機能を持つユニークな低分子RNAで、トランス翻訳において中心的な役割を果たしている。トランス翻訳モデルは、モデル遺伝子の解析から提唱され、その機構のユニークさから多くの注目を浴びている。従来から連続するアルギニンのレアコドンで翻訳伸長中のリボソームが停滞した場合に、トランス翻訳が起こることが知られている。
学校づくりと地域づくりの好循環を生み出す「社会に開かれた教育課程」のあり方

本研究の目的は、「地域とともにある学校づくり」と「学校を核とした地域づくり」の好循環を生み出す「社会に開かれた教育課程」のあり方について考察することである。言い換えるなら、「社会に開かれた教育課程」の推進・実現は、「学校づくり」と「地域づくり」の好循環を生み出し、子どもと大人の学び合い・育ち合いにとって有効であるという「仮説」を文献研究や、数量的なアンケート調査、質的なインタビュー調査をもとに総合的に検証していく。その際、研究の視点として、「学校を核とした地域づくり」、“タテとヨコ"の「カリキュラム・マネジメント」、「ビジョンの共有」に着目して分析を進め、最終的には、「学校づくり」と「地域づくり」の好循環を生み出す「社会に開かれた教育課程」の望ましいあり方とそれを推進する方策について提言をおこなう。初年度にあたる平成30年度は、まず文献研究により、研究代表者を中心として「社会に開かれた教育課程」のあり方を理論的に探っていった。とくに、「学校を核とした地域づくり」、“タテとヨコ"の「カリキュラム・マネジメント」、「ビジョンの共有」といった研究視点の妥当性を確認し、その精緻化をはかった。さらに、研究代表者を総括に、研究分担者を定量分析リーダーとして、「社会に開かれた教育課程」に取り組む学校についての実態を把握するため、次年度に予定しているアンケート調査の枠組みや項目等についての検討もおこなった。当初の計画どおり、研究計画全体の基礎的な部分となる研究作業、すなわち各分担者が文献調査に基づき必要資料を順調に収集することができたことに加え、担当者それぞれが先行研究及び基本的な研究資料を分析することができたため。今後は、研究代表者を総括に、研究分担者を定量分析リーダーとしてアンケート調査を実施し、「社会に開かれた教育課程」に取り組む学校についての実態把握を行う。こうした実態の分析を通して、「社会に開かれた教育課程」の推進の現状や課題をつかみたい。量的なアンケート調査を実施するため
ミネラリゼーション異常症の新規メカニズムの解明

骨のミネラリゼーション(石灰化)は、カルシウムと無機リン酸からなるヒドロキシアパタイト結晶が、コラーゲン線維に付着することで進行する。ミネラリゼーション異常症では、骨の力学的強度が低下する。チロシンキナーゼ型受容体EphAの遺伝子を欠損するマウスで起こるミネラリゼーション異常は、「基質小胞」の中でヒドロキシアパタイトの結晶が成長して、膜を突き破ってできる「石灰化球」の異常であることが示唆された。骨の石灰化は、カルシウム(Ca)と無機リン酸(Pi)からなるヒドロキシアパタイト結晶が、コラーゲン線維に付着することで進行する。申請者らは、チロシンキナーゼ型受容体EphA2を欠損するマウスでは石灰化が亢進していること、そのマウス頭蓋骨由来の骨芽細胞がin vitroにおける予備実験で「大きな基質小胞」を分泌することを観察した。頭蓋骨由来の骨芽細胞の初代培養系から「基質小胞」を超遠心法や、exosome精製法などで回収し、ナノ粒子解析装置(NanoSight)を用いて、野生型とEphA2欠損マウス由来の試料を比較解析した。脂質二重膜で完全に覆われている基質小胞では、有意なサイズの違いは検出されず、むしろヒドロキシアパタイト結晶が脂質二重膜を突き破って成長していると考えられる「石灰化球」の成長速度が、EphA2欠損細胞由来のサンプルでは速いことが示唆された。一方、3点曲げ試験では、EphA2欠損マウスの長管骨の骨強度が、野生型マウスに比べて高いことがわかった。さらに、マイクロCTを用いた新たな解析でも、成長板直下のミネラリゼーション亢進が裏付けられた。本研究では、リガンドephrinと受容体Ephの相互作用の解析から、ミネラリゼーション異常症の新規メカニズムを解明することを目指した。脂質二重膜で完全に覆われている基質小胞では、有意なサイズの違いは検出されず、むしろヒドロキシアパタイト結晶が脂質二重膜を突き破って成長していると考えられる「石灰化球」の成長速度が、Ep hA2欠損細胞由来のサンプルでは速いことが示唆された。ミネラリゼーションを定量化する方法として、放射光施設を利用したX線顕微鏡を用いた解析を行った。ミネラリゼーションの制御に関する骨細管周囲の脱ミネラリゼーションの根拠となる画像が取得された。また、副甲状腺ホルモン投与による成長板直下のミネラリゼーションの変化の可視化ができた。EphA2欠損マウスにおいて、イオンの輸送とミネラリゼーション異常の関連が示唆された。EphA2欠損マウスと野生型マウス由来の長管骨における遺伝子発現をマイクロアレイで比較したところ、特定の塩素イオンチャンネルの遺伝子発現が、EphA2欠損マウスで極めて有意に増加していた。これは、骨芽細胞の骨形成面をアルカリ化して、ミネラリゼーションを亢進させる要因になっている可能性があり、石灰化球のサイズを増大させていると考えて矛盾はない。そこで、分子メカニズムの方からのアプローチが可能になった。骨代謝学EphA2欠損マウスにおける長管骨の解析:EphA2欠損マウスで骨強度が有意に上昇していることが明らかになったので、骨形態の変化とミネラリゼーションの亢進の両面から、その原因を追究する。イオンチャネルの機能解析:ミネラリゼーション亢進の原因となっている可能性のある候補遺伝子が見出された。そのマウスのタンパク質を検出する抗体(現在、抗体の入手あるいは作製を目指している)を用いて、イオンチャネルがEphA2欠損マウス由来の骨芽細胞に高発現しているかどうかを確認した上で、骨芽細胞に強制発現してミネラリゼーション亢進を再現されるかどうかを検討する。
フィブロネクチン分子内の新しい機能部位(反接着配列)を認識する受容体の実体解明

フィブロネクチン分子内に見い出された反接着部位を認識する受容体を介した作用機構の究明を行い、以下のことが明らかになった。1)反接着機能部位を含むペプチドFNIII14はFAKを始めとする接着斑タンパクのチロシンリン酸化を抑制すると共に、チロシンリン酸化の過剰な上昇によるアポトーシスもブロックする。2)活性型β1インテグリンエピトープを認識するmAb AG89によるFACScanにより、ペプチドFNIII14はインテグリンを不活性型コンフォーメーションに変換する作用が有る。3)ペプチドFNIII14と特異的に結合する膜タンパク(p55)がFNIII14に応答する細胞の膜上に存在する。4)ペプチドFNIII14の反接着作用を受けない細胞株大腸癌細胞Colon26M3.1の膜上では、ビオチン化FNIII14によるアフィニティー標識によってp55が検出されず、p55の存在とFNIII14に対する反接着応答にはよい相関があることが証明された。5)p55を認識するmAbを調製し、これを用いたイムノアフィニティークロマトにより精製したp55のN末端アミノ酸配列の解析の結果、p55はN末端細胞外領城にIgVドメインを持つ膜タンパクであることが明らかになった。本研究を遂行している過程で、以下のことが明らかになった。1)反接着配列は血漿性フィブロネクチン分子についてはその高次構造内部に隠蔽されているが、ヘパリンとの相互作用やMMP-2による分解によって露出してくる。2)ペプチドFNIII14はラット肝星細胞の筋線維芽様への活性化を抑制することが明らかになり、肝線維化抑制作用を有する可能性が示された。3)ペプチドFNIII14はPDGF刺檄によるNIH/3T3細胞の増殖を抑制し、その時、細胞内MAPキナーぜカスケードの活性化を阻害していることが明らかになった。本ペプチドは、インテグリン機能そ低下させることにより、インテグリン関連シグナル全体に多大な影響を及ぼすことが証明された。次のことが明らかになった。1)フィブロネクチンの反接着部位を含むペプチドIII14-2には、細胞内のfocal adhesion kinaseを始めとする接着斑タンパクのチロシンリン酸化を低下させる作用がある。2)ペプチドIII14-2の反接着作用はコレラ毒素あるいはフォルスコリンやdibutylyl cAMPによってブロックされたが、PKA阻害剤によっては何等影響を受けなかった。以上の結果は、フィブロネクチンの反接着部位の作用が何等かの受容体を介した細胞内情報伝達系を介して作用を発現している、との我々の推測を更に指示するものである。そこで、この受容体のcDNAクローニングを容易にするため、受容体に対するモノクローナル抗体の作製を実施した。その結果、ビオチン化ペプチドIII14-2と特異的に結合する55-kDaの細胞膜タンパクを認識するモノクローナル抗体(3E12)の調整に成功した。現在、このモノクローナル抗体を用いて、反接着受容体のcDNAの発現クローニングを実施すべく準備を行っている。1)フィブロネクチン由来の活性ペプチドFNIII14に対して反接着応答を示さない細胞株を検索した。

その結果、ヒト大腸癌細胞Colon26M3.1のフィブロネクチンおよびビトロネクチンへの接着は、FNIII14によってほとんど影響を受けないことが示された。そこで、ビオチン化FNIII14を用いたアフィニティー標識法によりFNIII14受容体の検出を行ったところ、FNIII14応答性の細胞膜上に検出される55-kDaタンパク(p55)がColon26M3.1では検出されず、p55の存在とFNIII14に対する反接着応答にはよい相関があることが証明された。2)p55と結合するモノクローナル抗体を用いてp55の精製を実施し、アミノ末端領域にIgVドメインを持つタンパクであることが明らかになった。現在、cDNAクローニングを続行中である。3)受容体の実体解明を行っている過程で、ペプチドFNIII14はPDGF刺激によるNIH/3T3細胞の増殖を抑制し、その時、細胞内MAPキナーぜカスケードの活性化を阻害していることが明らかになった。本ペプチドは、インテグリン機能そ低下させることにより、インテグリン関連シグナル全体に多大な影響を及ぼすことが証明された。
食道癌におけるSUMO特異的プロテアーゼの意義と発現抑制による抗癌作用の解析

本研究は、最近癌との関連が指摘されているSUMO化修飾に着目し、その中でも基質(標的蛋白質)からのSUMO脱修飾に関与するSUMO特異的プロテアーゼの一つであるSUMO-specific protease 1(SENP1)の食道癌における意義を検証すること目的としている。本年度は以下の成果を認めた。1.牛胎児血清(FCS)濃度変化の食道癌培養細胞の増殖へ影響SENP-1発現の検討:抗Anti-SENP-1抗体(EPR3844 Abcam、PA5-11327 Invitrogen)を用いて、各種食道癌培養細胞(KYSE70(低分化型)、KYSE150(低分化型)、KYSE510(高分化型))において3種類のFCS濃度(10%、1%、0%)で10日間培養を行い、SENP-1蛋白の発現のウエスタンブロット分析を行った。すべての細胞がFCS濃度0%では増殖停止し、1%では僅かに増殖という結果であった。増殖の低下・停止に伴ってSENP-1の発現量が増加した。増殖低下・停止状態でのSENP-1発現量を細胞間で比較したところ、KYSE70が最も多く、次いでKYSE150、KYSE510の順であった。"僅かに増殖"と"増殖停止"の状態での発現量にはいずれの細胞も明確な差を認めなかった。2.上記条件下での食道癌培養細胞のポリユビキチン量の検討:SUMO修飾はユビキチン修飾と拮抗してタンパク質の安定化に働くことがあるため、細胞内のポリユビキチン量とSENP-1の発現量に相関があるか検討した。上記1の9試料の細胞内ポリユビキチンの総量をサンドイッチELISAで測定し、mgタンパクあたりの量を算出して比較した。その結果、KYSE70ではSENP-1量とポリユビキチン量が多少の相関する傾向を認めたが、他の2細胞には相関は認められず,SENP-1とユビキチン修飾の関係性は低い可能性がある。本年度の研究が当初の予定から遅れている理由は以下のものである。12018年4月に研究代表者が所属機関である東京慈恵会医科大学内で外科学講座から教育センターに異動したことから、机や物品の整理、研究室の移動等の引っ越し作業が発生したため、その間の研究活動が不能となった。2異動による業務内容の変更に伴い、研究分担者との研究協力体制の調整を行う必要があり、研究の遂行に遅延が発生した。以上の理由により科研費研究期間の延長申請をさせていただいています。本研究は、以下の予定をもって推進していく予定である。1.siRNAによるSENP-1遺伝子の発現阻害の検討食道癌細胞株にSENP-1遺伝子の発現阻害のために合成したsiRNAを導入する。SENP-1遺伝子発現阻害効果をノーザンブロティング、抗SENP-1抗体を用いたイムノブロットにて確認する。食道癌においてSENP-1遺伝子の発現阻害が抗癌作用をもたらすか抗増殖作用等の検討を行う。2.SENP-1発現の免疫組織学的検討食道癌手術患者の摘出標本のホルマリン固定、パラフィン包埋切片を用いて、SENP-1発現と臨床病理学的因子や予後との関連を検討し、SENP-1発現の食道癌における意義を検証する。本研究は、最近ユビキチン-プロテアソームシステムの中で癌との関連が指摘されているSUMO化修飾に着目し、その中でも基質(標的蛋白質)からのSUMO脱修飾に関与するSUMO特異的プロテアーゼの食道癌における意義を検証すること目的としている。本年度はその一つであるSUMO-specific protease 1(SENP1)の食道癌での発現を検討した。1.食道癌培養細胞での発現の検討市販の抗Anti-SENP-1抗体polyclonal antibodyab3657)を用いて、各種食道癌培養細胞(KYSE50、KYSE70等)、食道上皮培養細胞においてSENP-1蛋白の発現のウエスタンブロット分析を行っている。食道癌分化度別での発現、食道癌と正常食道上皮との発現の差などを比較検討している。なお食道癌におけるこれらの検討はいまだなされていない。2.食道癌手術症例での免疫組織化学的検討食道扁平上皮癌手術症例のホルマリン固定、パラフィン包埋切片を用いて抗Anti-SENP-1抗体を用いた免疫組織染色を行った。染色には市販の抗体であるAnti-SENP-1 antibody ab3657(abcam)、Anti-SENP-1 antibody ab3657(ab108981)、を用いて最も染色性の優れたものを検討している。現在までの染色結果としてSENP-1の発現は、主に細胞質に認められたが、染色強度が低く染色方法、条件設定をさらに検討している。適切な免疫組織染色の条件が決定したら、食道扁平上皮癌手術症例96例を対象として、摘出標本のホルマリン固定、パラフィン包埋切片を染色し、発現レベルと臨床病理学的因子や予後との関係について検討を行う予定である。SENP-1の食道癌患者での発現については、報告例はなく本研究がはじめての検討である。本年度の当初の予定からやや遅れていると判断した理由は以下のものである。・免疫組織化学染色の染色手法確立の遅れ当初文献上前立腺癌手術

患者のホルマリン固定、パラフィン包埋切片を用いて報告されていた手法を踏襲し、使用されたものと全く同一の抗Anti-SENP-1抗体、染色手順を用いて染色を行ったが、十分な染色性が確認されなかった。抗体がpolyclonal抗体であったことからロットナンバーの違いが染色性に影響している可能性が考えられた。そのためいくつかの異なった抗Anti-SENP-1抗体を購入し、染色手順、染色条件を含め検討を行った経緯があり、予定より若干の遅れが発生している。本研究は、最近癌との関連が指摘されているSUMO化修飾に着目し、その中でも基質(標的蛋白質)からのSUMO脱修飾に関与するSUMO特異的プロテアーゼの一つであるSUMO-specific protease 1(SENP1)の食道癌における意義を検証すること目的としている。本年度は以下の成果を認めた。1.食道癌培養細胞、正常ヒト食道上皮細胞での発現の検討:抗Anti-SENP-1抗体(EPR3844 Abcam、PA5-11327 Invitrogen)を用いて、各種食道癌培養細胞(KYSE50、KYSE70、KYSE150、KYSE170、KYSE510)と正常ヒト食道上皮細胞(HEsEpiC)においてSENP-1蛋白の発現のウエスタンブロット分析を行った。食道癌細胞は、いずれも正常食道上皮細胞に比べ、SENP-1発現が増加していた。食道癌では低分化型のKYSE70での発現が最も多く認められたがその他の癌細胞では分化度での発現に大きな差は認めなかった。2.牛胎児血清(FCS)濃度変化の食道癌培養細胞の増殖へ影響とSENP-1発現の検討:同様の各種食道癌培養細胞において3種類のFCS濃度(10%、1%、0.1%)で培養を行い10日後の増殖状態を検討した。KYSE50、KYSE150はFCS濃度0.1%で細胞死を認め、その他は増殖速度が低下した。細胞死しなかった細胞では、KYSE170ではFCS濃度が下がるほどSENP-1蛋白発現が増加する傾向が認められ、増殖因子とSENP-1との何らかの関連が示唆された。3.食道癌手術症例での免疫組織化学的検討:食道扁平上皮癌手術症例での抗Anti-SENP-1抗体を用いた免疫組織染色を行った。SENP-1の発現は、主に食道癌の細胞質に認められたが、染色強度は低かった。染色方法、条件設定をさらに検討している。本年度の当初の予定からやや遅れていると判断した理由は以下のものである。1.免疫組織化学染色の染色手法確立の遅れ:当初文献上前立腺癌手術患者のホルマリン固定、パラフィン包埋切片を用いて報告されていた手法を踏襲し、使用されたものと全く同一の抗Anti-SENP-1抗体、染色手順を用いて染色を行ったが、十分な染色性が確認されなかった。
高等植物における葉緑体RNAエディティングの分子機構の解明

RNAエディティングとはゲノムDNAの配列がRNAレベルで編集(エディティング)される現象である。タバコの葉緑体ゲノムは約16万塩基対の大きさがあり、これまでC→U変換型のエディティング部位が34カ所同定されている。これらのエディティング部位周辺には共通の配列や構造が見つからず、これらのCがどのようにして認識されているのかが大きな謎とされてきた。本研究課題では、in vitro RNAエディティング系を用いて葉緑体におけるRNAエディティングの分子機構の解析を進めてきた。その結果、psbE遺伝子のmRNAではエディティング部位の上流-15から-6(エディティングされるCを+1)の領域に56kDaのトランス因子(p56)が、また、petB mRNAでは-20から-6までの配列に70kDaのトランス因子(p70)が、それぞれ配列特異的に結合することが明らかになった。つまり、個々のエディティング部位はそれぞれ特異的なタンパク質によって認識されていることが強く示唆された。ついで、p56をモデルに、エディティング部位とトランス因子の相互作用を、様々な塩基置換やUVクロスリンク法などを用いて詳しく解析した。その結果、p56とエディティング部位との直接の結合がpsbE mRNAのエディティング反応に必須であることが明らかになった。これらの結果から、部位特異的因子によるエディティング部位認識機構を世界で初めて示した。それは、トランス因子はまず上流シス配列に強く結合し、その一部を標的のCに近付け、接触すればエディティング反応が進行する、というものである。一つのタンパク質が2段階でエディティング部位を認識するこの機構は、他のRNAエディティングにはない、葉緑体独自のものである。さらに、エディティング部位が部位特異的因子に直接認識されることから、一つのタンパク質が部位決定とC→U変換反応の両方を行う可能性が示唆された。RNAエディティングとは、ゲノムDNAの塩基配列が転写された後RNA上で変わる現象のことで、高等植物では葉緑体ゲノム(約15万塩基対)あたりおよそ30カ所のC塩基がRNAエディティングをうけ、転写後にUに変換される。しかし、エディティング部位の周辺には共通の塩基配列や構造が見られないことから、特定のC塩基がどのようにして認識されでいるのかが大きな謎とされてきた。本研究では、タバコ葉緑体抽出液を用いたin vitro RNAエディティング系を用いて、葉緑体遺伝子psbEとpetBのRNAエディティング部位認識機構を解析した。その結果、psbE mRNAではエディティングされるCの前方15から6ヌクレオチド、またpetB mRNAでは20から6ヌクレオチドの領域がトランス因子結合配列と同定された。さらに、その配列の中央にRI標識を入れたmRNAを基質として用いたUVクロスリンク実験から、トランス因子結合配列にpsbE mRNAでは56kDa、petB mRNAでは70kDaのタンパク質がそれぞれ配列特異的に結合していることが明らかになった。このことから、葉緑体のエディティング部位はそれぞれ部位特異的なタンパク質によって認識されている、ということが示された。さらに、エディティング部位に特異的に標識を入れたmRNAを基質として用いたUVクロスリンク実験から、上記の部位特異的因子がエディティング部位上流の配列だけではなく、エディティング部位とも直接結合していることを明らかにした。この結合は上流配列との結合に比べると弱いが、mRNA基質への変異実験からエディティング活性との相関が見いだされ、反応に必須であることを示した。以上の結果より、部位特異的因子はまずエディティング部位の数ヌクレオチド上流に配列特異的に結合し、それを足場としてエディティング部位近傍の配列を認識する、というRNAエディティングの基本メカニズムが明らかになった。
骨芽細胞分の分化およびメカニカルストレス応答性におけるAMPKの役割

骨芽細胞分化過程において、AMP-activated protein kinase(AMPK)のリン酸化レベルの低下が見られた。AMPK活性化剤metformin刺激により、基質石灰化の抑制,骨基質特異的タンパク質およびRunx2遺伝子発現レベルの低下,さらにALP活性の低下が認められた。活性型AMPK発現誘導によっても、基質石灰化が抑制された。骨折治療に応用されている低周波超音波(LIPUS)刺激を骨芽細胞に与えた結果、AMPKリン酸化レベルが低下した。LIPUSによるAMPKリン酸化の抑制が骨芽細胞分化を促進する可能性が考えられた。メカニカルストレスは骨組織における重要な代謝調節因子であるが、その分子メカニズムは不明な点が多い。AMP-activated protein kinase(AMPK)はαβγのヘテロ3量体から成るセリン-スレオニンキナーゼの一種であり、一般的に細胞内エネルギー恒常性や極性等の重要な調節因子として知られている。これまでの研究で、マウス骨芽細胞株であるMC3T3-E1細胞およびマウス初代骨芽細胞の分化過程において、AMPK活性が低下することを確認した。また、AMPK活性化剤によりAMPKの活性を維持させるとRUNX2および骨芽細胞分化マーカーの発現が低下し、骨芽細胞の分化が著明に抑制されることが分かった。そこで、メカニカルストレスによるAMPK活性の誘導と骨芽細胞分化シグナルとの関連を明らかにするために、骨芽細胞に低周波超音波(LIPUS)刺激を加えた。LIPUSは骨折治療に応用されており、骨形成を促進して治療期間を短縮させる効果があることが知られている。LIPUS刺激(30mW/cm2, 20分間)により、MC3T3-E1細胞においてAMPK活性の低下が認められた。この結果から、LIPUS刺激がAMPK活性を低下させることにより、骨芽細胞の分化を促進する可能性が考えられた。LIPUS刺激による、骨芽細胞におけるRUNX2や骨芽細胞分化マーカー発現の変化は研究途中であるが、明確な結果が得られておらず、継続して調べていく予定である。また、AMPKノックアウトマウスや、AMPK活性化剤をマウスに投与した際のvivoにおける骨形成の評価も行う予定である。これまでの研究で、骨芽細胞におけるメカニカルストレス応答遺伝子としてAMPキナーゼ(AMPK)を同定し、マウス骨芽細胞株であるMC3T3-E1細胞の分化過程においてAMPK活性が低下することを確認した。そこで、メカニカルストレスによるAMPK活性の誘導と骨芽細胞分化シグナルとの関連を明らかにするために、MC3T3-E1細胞に低周波超音波(LIPUS)刺激を与えたところ、AMPK活性の低下が認められた。このことは、LIPUS刺激によるAMPK脱リン酸化の誘導が骨芽細胞分化に重要な意義を持つ可能性を示している。研究成果は、日本補綴学会九州支部会にて発表した。今後はLIPUSと細胞内分化伝達シグナルにおけるAMPK活性の相互関係について、より詳細な解析を行っていく予定である。なお、本年度の研究実施計画に基づき、骨芽細胞分化シグナル伝達におけるAMPKの意義を明らかにするためconstitutively active AMPKの発現誘導を行う計画であったが、AMPK発現ベクターの骨芽細胞へのトランスフェクションが成功していない。これについても継続して行う予定である。本年度はconstitutively active AMPKの発現誘導を行い、骨芽細胞分化シグナル伝達におけるAMPKの役割を解析する予定であったが、作製したAMPK発現ベクターのトランスフェクションが成功しておらず、計画より遅れているため。骨芽細胞におけるメカニカルストレス応答性遺伝子の網羅的解析により、AMPKを含む複数の遺伝子を同定した。AMPKの骨芽細胞における機能は不明な点が多いため、本研究を始めるに至った。AMPK活性が骨芽細胞分化に影響を与えることを明らかにしたが、分化シグナル伝達における役割を次年度は解析する予定である。また、骨芽細胞のメカニカルストレス応答性におけるAMPKの意義解析も進めていく予定である。次年度は、MC3T3-E1細胞においてconstitutively active AMPKを発現誘導させ、骨分化関連転写因子および骨形成マーカー遺伝子の発現レベルの変化をリアルタイムPCRやノーザンブロット法により定量し、骨芽細胞分化シグナルにおけるAMPKの意義を解析する。また、constitutively active AMPKを発現誘導させたMC3T3-E1細胞に対しLIPUS刺激を与え、同様に骨分化関連転写因子および骨形成マーカー遺伝子の発現レベルの変化を解析し、骨芽細胞のメカニカルストレス応答シグナルにおけるAMPKの意義を明らかにする。研究費は、これらの実験に必要な細胞培養培地,試薬,プラスチック容器の他、研究成果を発表するための旅費として使用する予定である。
生徒の探究心を数学的活動へと昇華させる数学教育のキャリア教育的意義についての研究

中学生の数学の授業を通して、例えば数の規則性や高次関数、形の美しい公式や定理などに興味を持つ生徒はいる。しかし、通常の学習課程の中で、自分の興味を数学的活動へと転化させ、自分で探究する機会はほとんどない。もし数学を探究することができる学習ツールが与えられ、自由に数学的対象を探究する機会があれば、生徒は数学を自ら探究することに価値を感じ、その経験は生徒自身のキャリアとなっていくのではないだろうか。このような課題意識の下、本研究では「テクノロジーを使って数学を探究しよう」(全14時間の選択学習)を実践した。この講座を選択した2,3年生の生徒14名は、各自で数学的探究課題を設定し、コンピュータソフトウェアを使って自分なりに探究し、その探究成果を簡単なレポートにまとめた。この実践を通し、自分で決めた課題を自分なりに研究することに対して前向きに取り組み、学習の終わりに「またやってみたい」という感想を持つ生徒の姿が見られた。ある程度数学に対して興味を持っている生徒は、時間と環境が与えられることによって、自分の力で探究的な数学的活動を行うことが、実践で確かめられた。そして、知識が足りず十分な探究はできなくても、数学に対する興味が膨らみ、もっと研究したいと考えるようになることが分かった。数学教育のキャリア教育的意義を考えたとき、少なくとも数学に対して探究心を持った生徒に対し、その探究心をもとに数学的活動をさせることは意義深いことであり、そういう機会を学校教育の中で作っていくことが必要である。本研究の今後の課題は、もともと数学をそれほど好きではない生徒がどのように変容するかを検証するため、もっと多くの生徒に同じような実践を行い、データを元にその効果を示し、生徒が自由に数学を探究する授業をカリキュラムに取り入れる提案を行うことである。
アラニンアミノ基転移酵素の基質特異性の解析

アミノ基転移酵素群では、アスパラギン酸アミノ基転移酵素(AspAT)の研究が最も進んでおり、結晶構造の解析や部位特異的突然変異体の研究により、基質特異性を規定している酵素構造と触媒反応機構との関係が明らかになりつつある。しかし、他のほ乳類アミノ基転移酵素の基質特異性と酵素構造との相関は、立体構造解析の進捗の遅さもあり解明が進んでいない。ここでは、1)ヒトアラニンアミノ基転移酵素(AlaAT)の微生物での発現系の構築、2)推定される基質結合部位を中心とした変異型酵素の作成と機能解析、3)さらにはAlaATの厳密な基質特異性を規定している構造要因を特定し、他のアミノ基転移酵素のそれと比較検討することにより、多くのアミノ基転移酵素群に共通するジカルボン酸に対する選択性と、その共通性と相反する個々のアミノ基転移酵素に固有の基質特異性を担う構造要因に関して解析することを目的とする研究を開始し、以下の成果を得た。大腸菌および酵母における発現系を構築したが、当初の目的、酵素の結晶化および機能解析に十分量の蛋白量が得られなかったことから、ベクター系の変更ならびに発現菌培養条件等を検討し、活性を有する酵素タンパクの生産を試みた。同時に5'末端側塩基配列の変更やプロモータの変更を行ったが、期待した発現量の増大ならびに活性酵素を得ることができなかった。再度、ベクターに組み込まれたDNA配列の正確性を検討した。その結果、数カ所の配列の訂正を行い、発現ベクターへの組み込みを行った。AlaATアミノ酸配列を他のアミノ基転移酵素の配列と比較し、基質認識部位を想定することができた。1.ヒトAlaATをコードするcDNAの欠失していたアミノ基末端側3残基分を、昨年度明らかにした遺伝子構造を参考に作成したプライマーを用いたPCR法により補完し、完全長cDNAを得た。2.大腸菌pETベクターに上記のcDNAを組み込み、IPTG存在化での発現効率を検討した。3.酵母菌を発現宿主とする発現系(ADHプロモーター)を構築したが、期待した発現レベルが観察されなかったことから、染色体組み込み形ベクターを利用するための検討を開始した。4. 5'末端側塩基配列を、AT/GC比や発現宿主のコドン利用率を考慮し、アミノ酸配列を変更しない範囲で発現効率を高める配列に変更する実験を開始した。