hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
脂質機能の新展開-コレステロール共有結合タンパク質の構造・機能・修飾機構-

コレステロールで修飾されるタンパク質は、最近報告された中枢神経系の正常発生に必要なシグナル伝達タンパク質分子Sonic hedgehog(Shh)が知られているのみである。しかし、他の細胞系でもコレステロールで共有結合的に修飾されるタンパク質(少なくとも、分子量15kDa、17kDa、18kDaの3種の分子)が存在する事を本研究代表者は確認している。また、培養細胞で偶然観察された報告もある(Science,274,255-259,1996)。コレステロール修飾タンパク質の構造と機能についてはShhの機能でさえ充分には解明されておらず、未開拓の領域として残されていた。本研究代表者は、コレステロール生合成異常が胚子の中枢神経系の形成異常につながる事に注目してきた。その因果関係を明らかにする為、責任遺伝子と考えられる酵素のcDNAクローニングや構造解析を行ってきた。その過程でShhのC末端がコレステロールで共有結合的に修飾され、それによって正常な形態形成をONにするらしいという論文に出会った。データを詳細に見ると、Shh以外に通常の培養細胞にもコレステロールで修飾されるらしいタンパク質があった。本申請者自身も同様の事を確認している。本研究計画申請者はすでに分子量の異なる数種のコレステロール共有結合タンパク質-これを"コレステイン(Cholestein)"ファミリーと呼んでいる-を確認し、タンパク質の造を解析するために2次元電気泳動ゲルからの抽出を行った。そして脂質修飾分子としてのタンパク質部分の一次構造を一部決定し、データベースでの類似構造の検索を行っているが、既知データに符合するものは見つかっていない。コレステロールによって修飾されるタンパク質は、中枢神経系の正常発生に必要なシグナル伝達タンパク質分子、Sonic hedgehog(Shh)が知らされているのみである。しかし、他の細胞・組織でもコレステロールで共有結合的に修飾されるタンパク質が存在する事が本研究によって明らかにされた。コレステロール修飾タンパク質の構造と機能についてはShhの具体的な機能でさえ充分には解明されておらず、未開拓の領域として残されている。本研究は、構成的にコレステロールによって修飾されるタンパク質の構造と機能を解明する事を目的にしている。まず、培養細胞(CHO-K1、COS1、COS7)を用いて、コレステロール修飾タンパク質の検出を行った。セミコンフルエントにまで細胞を培養したあと、培養液中の血清を脱脂したものに変え、4-^<-14>Cコレステロールを加えて48時間培養したあと細胞を集め、PBSで洗浄後、SDS-PAGEを行った。細胞内の遊離コレステロールはブロモフェノールブルーよりも先に泳動され、また脂肪酸などによるエステル化コレステロールはブロモフェノールブルーと同じ位置に泳動されるので、15%アクリルアミド濃度のゲルで、10kDa以上のタンパク質とは分離できる。その結果、少なくとも15kDa、17kDa、18kDaの3種類のタンパク質がコレステロールで修飾されていることを確認した。これは、卵巣細胞や腎臓の細胞でも確認されたことから、普遍的・構成的に細胞に発現しているものと推定された。また、いずれのタンパク質も膜画分に存在している。現在、クローニングを目的とした部分一次構造決定のため、二次元展開ゲルからの抽出分離を試みている。
異文化を背景に持つ子どもたちのＤＶ被害に関する実態把握と支援プログラムの開発

本研究は、外国人母とともにドメスティック・バイオレンス(DV)による被害を受けた子どもなど、異文化を背景に持つ子どものDV被害の実態について考察したものである。DVからの直接的被害としては、DV加害者と被害者の両方から虐待を受ける危険性が高く、また、家庭環境から多大な影響を被ることが把握された。そして、直接的被害から生じる間接的被害としては、学業不振や、価値観およびアイデンティティのゆらぎ、母子関係の不安定化などが長期に渡って存続することが明らかとなった。そのため、子ども自身が多様な文化的背景に価値を見出せるようアイデンティティ確立を支える長期的支援体制の確立が不可欠であることを指摘した。DV防止法において被害者の国籍を問わない人権の尊が謳われているように、直接的なDV被害者である外国人女性(母親)については社会問題としての認識が広がり、状況も改善されつつある。しかしながら、同じくDVの影響を被りながら、外国人母とともにDV被害を受けた子どもたちに対しては十分な支援体制が確立されているとは言い難く、学校や支援団体などの各機関や関係者の個別的努力に委ねられているのが現状である。そこで、外国人女性のDV被害の特徴と有効な支援のあり方を検討し、DV被害は外国人女性のみならず、その子どもにまで波及していることを把握した。また、現実に提供される社会福祉支援は多様であり、その前提となる価値判断も、時代や社会、文化により変化を遂げることを指摘した。そして、問題の背景を理論的に考察するため、社会福祉を成立した結果から捉えるのではなく、成立する過程に着目し、利用主体と提供主体間でとり結ばれる関係から分析することにより、社会福祉の規定要因を考察した。さらに、これまでの研究成果を発展させ、利用主体と提供主体間で構築される関係の特徴から理念上の類別を行い、社会的価値判断によって社会福祉が規定されるだけではなく、異質な価値観によってもその判断が問い直され続けることを指摘した。そのため社会福祉における権利擁護とは、単に利用主体の権利を擁護するだけではなく、社会福祉が時代や社会に合わせて変化する契機となることを明示化した。近年の日本社会におけるドメスティック・バイオレンス(以下、DVと表記)被害の増加傾向に伴い、その影響は直接的なDVの加害者や被害者に留まらず、そのような家庭環境で育つ子どもたちにも波及していることが、これまでの研究によって把握されている。そして、日本で生活する外国人女性の子どもたちをはじめ、異文化を背景に持つ子どもたちの中には、特有の問題が生じており、深刻化していることも明らかとなっている。そこで平成25年度は、異文化を背景に持つ子どもたちのDV被害に対する支援体制の問題点を分析し、多様な文化的背景や家庭環境への配慮、および社会への働きかけを伴う長期的かつ包括的な支援プログラムの構築について検討した。さらに、現状の問題を明らかにし、学校や支援団体など関係者や各機関の個別的努力に委ねられていることが多い支援体制の実情を改善する必要性を明らかにした。ただし、長期に渡る多数の研究の蓄積がある直接的なDV被害者支援のためのソーシャルワーク研究とは異なり、異文化を背景にもつ子どもたちのDV被害に関するソーシャルワーク研究は先行研究が限られているため、幅広い領域で実践されているアプローチを渉猟し、理論的検討を進めた。具体的には、保健医療分野を中心に普及している行動変容理論等について考察を深めた。そして、これらの理論を社会福祉領域に取り入れることの有効性や可能性とともに限界についても明示した上で、先駆的な事例を参考にし、慎重かつ柔軟に取り入れ、実践に生かすことの重要性について指摘した。ドメスティック・バイオレンス(以下、DVと表記)の被害者とは一般的に配偶者間暴力の被害者をさす。しかし、平成17年に改正された児童虐待防止法にてDVの目撃が児童虐待にあたることが明記されたように、DVのある家庭で育つ子どもは心身に多大な影響を受けやすく、DVと児童虐待には密接な関係があることが明らかとなっている。そして近年、日本人男性と外国人女性との国際結婚が増加し、その子どもたちのDV被害が急増している。日本人父と外国人母との狭間で、子どもたちは長期に渡って特有の困難を抱える傾向があり、DVによる影響が深刻化している。このような中、DV防止法にて被害者の国籍を問わず人権を尊重するよう示されているように、直接的な被害者である外国人女性については問題への理解が広がり、状況が改善しつつある。一方で、同じくDVの影響を被りながらも、外国人母とともにDV被害を受けた子どもたちに対しては十分な支援体制が確立されているとは言い難く、学校や支援団体などの各機関や関係者の個別的努力に委ねられているのが現状である。そこで、(1)外国人母と共にDV被害を受けた子どもなど、異文化を背景に持つ子どものDV被害に関する実態を把握する。そして、問題の背景に対する分析を行うことにより、子どもたちの被害の実態を把握する。

(2)現状の支援体制の問題点を分析し、多様な文化的背景や家庭環境への配慮、および社会への働きかけを伴う長期的かつ包括的な支援プログラムを構築する、という2点を目的として研究を進めている。特に平成23年度は、(1)異文化を背景に持つ子どものDV被害とその支援に関する先行研究の把握と方法論の検討、および(2)母子生活支援施設とNPO団体にて母子支援に関する調査を中心に研究を遂行した。本研究は、(1)外国人母とともにDV被害を受けた子どもなど、異文化を背景に持つ子どものDV被害に関する実態を把握し、問題の背景について分析すること、(2)現状の支援体制の問題点を整理し、多様な文化的背景や家庭環境への配慮、および社会への働きかけを伴う長期的かつ包括的な支援プログラムを構築すること、という2点を目的としている。これまでの研究において、外国人女性が受けるDV被害には法的地位を利用した暴力や文化的暴力など、日本人の被害とは異なる特徴があり、外国人被害者の実情へ配慮した支援の提供が不可欠であることを明らかにした。さらに、その子どもたちの被害は多岐に渡り、深刻化や長期化が進展していることを把握した。そこで平成26年度は、このようなDV被害を受けた外国人女性とその子どもに特有な問題へ対応するため、多文化ソーシャルワークを活用し、多様な文化的・社会的背景への配慮を伴う支援提供のあり方について検討した。その結果、DV被害を受けた外国人女性やその子どもたちへの支援においては、生起した問題への局面的な対応のみならず、時間的経過の中で個別の状況を把握し、多様な文化的背景に肯定的な価値を見出せるようアイデンティティの確立を支え、生活再建へとつなげる長期的な視点が不可欠であることが明らかとなった。その意味において、多文化ソーシャルワークの活用によって多様な文化的・社会的背景への配慮を伴う支援を提供するとともに、関係機関が連携して多面的な支援体制を構築することが、急務の課題であると指摘した。国際社会福祉論、福祉社会学(1)異文化を背景に持つ子どものDV被害とその支援に関する先行研究の把握・方法論の検討DV対策に関するソーシャルワーク理論は、イギリスやアメリカ等を中心に発展した経緯があり、日本ではDV対策が実施されながらも、それが必ずしもソーシャルワークとして認識されておらず、外国人に関するソーシャルワーク研究も限られている。そのため、歴史や文化・社会的背景の異なる国々で発展した理論である点を考慮しつつ、海外の理論を本研究に援用する必要があることから、先行研究を渉猟し、異文化を背景に持つ子どもたちのDV被害に関する問題を検討した。(2)母子生活支援施設等での支援に関する聞き取り調査DV被害を受けた外国人母子を支援している母子生活支援施設においてこれまで実施した聞き取り調査の結果をもとに、子どもたちの被害と母子関係への影響を中心に検討し、被害の実態について分析した。(1)異文化を背景の持つ子どものDV被害とその支援に関する先行研究の把握
グラファイトカーボンと複合化したMg系プロチウム貯蔵材料の創製と特性

ボールミリングによる複合化効果は水素の放出過程においても顕著で、圧力型示差走査熱量計(DSC)を用い3MPaの水素で(Mg/G)_<BN>を水素化した後、0.1MPaの水素雰囲気で昇温して得られるDSC曲線より検討した。比較のために行ったMg単独のDSCでは707Kに吸熱ピークを示し、XRDとの比較よりこれはMgH_2の分解に対応していた。一方、(Mg/G)_<none>ではMg単独に比べてMgH_2の分解温度は低いものの(Mg/G)_<BN>のそれよりは高く、水素放出に対する反応性は先の水素化の結果と対応していた。ベンゼン(BN)を添加剤として用い、ミリング時間を4-40時間で変化させた(Mg/G)_<BN>試料について、3MPaの水素で水素化した後、0.1MPaの水素雰囲気下、昇温速度5K/minでDSCを測定した。比較のために行ったMg金属単独のDSCでは、707Kに吸熱ピークが現れ、XRDよりこれはMgH_2の分解に対応することがわかった。(Mg/G)_<BN>では、ミリング時間を延ばすとともにDSCピークの形、数、位置が著しく変化した。4時間ミリングした試料では664KにMgH_2分解のピークが一本見られるのに対して、10、20、30時間ミリングするとピークは低温側にシフトすると同時に2-3本に増加した。さらに40時間では612Kにほぼ一本のピークとして現れた。これらの吸熱ピークがそれぞれ何に基づくかを検討するため、同一の試料を用い同様に3MPaで水素化後、減圧下で昇温脱離(TPD)を行い脱離ガスをマススペクトルで調べた。脱離ガスは水素で、TPDとPSCの結果はよく対応し、DSCの吸熱ピークがすべて水素由来のものであることがわかった。
現代日本の都市表現文化におけるディアスポラと社会的排除の研究

2000年代後半の日本の都市における,公共空間からの排除に抵抗するアーティストの活動を記録し,アートや表現と公共性をめぐる諸問題を議論した.また, 2011年以降の脱原発デモをはじめとするアクティヴィズムの映像記録を収集し,制作者との対話を通じて,公共的な表現とそのアーカイヴ化の方法をめぐる諸問題を検討した.いずれの場合にも,大学の内外を問わず,アーティスト,アクティヴィスト,研究者らが横断的かつ開放的に議論できるネットワーク的な場を構築した.2000年代後半の日本の都市における,公共空間からの排除に抵抗するアーティストの活動を記録し,アートや表現と公共性をめぐる諸問題を議論した.また, 2011年以降の脱原発デモをはじめとするアクティヴィズムの映像記録を収集し,制作者との対話を通じて,公共的な表現とそのアーカイヴ化の方法をめぐる諸問題を検討した.いずれの場合にも,大学の内外を問わず,アーティスト,アクティヴィスト,研究者らが横断的かつ開放的に議論できるネットワーク的な場を構築した.本研究は,日本の都市の路上(ストリート)をフィールドに,グローバルなディアスポラのモチーフが,ストリートの表現文化にどのように受容され,その表現文化をどのように変容させているかを探ると同時に,それらのディアスポラ的・周縁的なモチーフがつねにさらされている社会的排除の圧力や緊張が,この表現文化にどのような性格を与えているかを,主にフィールドワークとインタビューによって,具体的かつ実践的に調査し考察するものである.2009年度は,東京都渋谷区宮下公園の「ナイキパーク」化計画の問題を中心に,日本の都市空間における「公共性」をめぐる対立に焦点を絞って,宮下公園で活動するアーチストや表現者へのインタビューやフィールドワークを行った.「大学」と「路上」を結ぶ知の協働を生みだすべく,研究者,アーチスト,活動家らの連携からなる領域横断的な研究会「ストリート研究会」を組織し,研究体制の構築をはかるとともに,早稲田大学メディアシティズンシップ研究所,246表現者会議,みんなの宮下公園をナイキ公園化計画から守る会との協力関係のもと,早稲田大学と宮下公園(雨天により会場変更)の双方で,公開シンポジウムを開催した.こうした活動を通じて,社会的排除の緊張のもとに生成する表現文化の「現場」と,大学やメディアにおける知の生産の間の乖離を問題化する,批評的かつ実践的な視座を構築するとともに,さまざまな出自や文化的背景をもった人々の,横断的で異種混交的な出会いの場としての「公園」(=公共空間)の新しい意味づけと,「公共」(=行政とグローバル資本の提携)の名のもとに行われる社会的排除に抵抗する,新たな「公共性」の創出の論理が明らかになりつつある.本研究は,日本の都市の路上(ストリート)をフィールドに,グローバルなディアスポラのモチーフが,ストリートの表現文化にどのように受容され,その表現文化をどのように変容させているかを探ると同時に,それらのディアスポラ的・周縁的なモチーフがつねにさらされている社会的排除の圧力や緊張が,この表現文化にどのような性格を与えているかを,主にフィールドワークとインタビューによって,具体的かつ実践的に調査し考察するものである.2010年度は,東京都渋谷区立宮下公園のナイキ・ジャパン社による改修工事に反対するアーチストらの運動をとりあげ,公共空間の意味,メディアのあり方を含めた,公共性をめぐる議論を深める一年になった.主な活動は以下の通りである.1.「みんなの宮下公園をナイキ公園化計画から守る会」「宮下公園アーチスト・イン・レジデンス」をはじめとする,宮下公園での多様で創造的な活動への継続的な参与と調査.2.7月に駒澤大学で開催された「カルチュラル・タイフーン2010」への全面的な協力および,展示ブース出展.3.11月20日,27日に早稲田大学で,公共性をめぐる連続シンポジウムを開催.4.紙媒体,映像を含む宮下公園の活動のアーカイブ化の着手.その他の成果は,連携研究者によって随時論文や学会発表等にまとめられている.また研究遂行の母体である「ストリート研究会」を中心に,活発な人的交流と意見交換を通じて,アクチュアルで領域横断的な文化研究のネットワークを築いてきた.2009年度から本研究が集中的に取り組んできた,渋谷区宮下公園の「ナイキ化」に反対するアーチストの運動は,宮下公園改修工事の終了によってひとつのサイクルを終えた.2011年度の本研究は,東日本大震災および福島原発事故以降,日本の各地で盛んに行われるようになった脱原発デモや,また海外の「オキュパイ」運動などとも呼応しながら新たな表現形態を発展させてきたプレカリアートのアクティヴィズムに注目し,前年度までに引き続いてストリート研究会(代表:浜邦彦)を研究活動の場として,主に首都圏の脱原発にかかわるアクティヴィズムの映像記録や映像作品の政策に携わっている作家やアーティストの協力を得た.2011年3月4月,原発事故へのリアクションとしてもっとも早い時期に組織されたデモが,渋谷区宮下公園の「ナイキ化」に反対する活動と,高円寺「素人の乱」のネットワークによるものであったことは意義深い.その後も下北沢,杉並,国立といった,それぞれのローカリティをもった創発的な表現文化が世代を超えて浸透し,主にインターネットを介して共有され,触発し合ってきた.この「クラウド化するデモ」の政治学的な意義については,五野井郁夫『「デモ』とは何か-変貌する直接民主主義』(2012)が理論化した.ストリート研究会では,この間のフィールドワークを通じてアーチスト,活動家,ジャーナリスト,研究者らから大量の資料や映像記録の提供を受けており,これらの整理とアーカイブ化についての議論を重ねてきた.

研究成果のまとめとして,早稲田大学浜邦彦研究室に映像アーカイブを置き,試験的な運用を試みているが,本格的な運用のためには課題も多く(管理維持,肖像権や著作権の問題など),収集した資料の保管をもって一応の成果とするほかないのが現状である.
日韓の耐寒耐暑性からみた体質と衣文化の関係について

本研究は、日韓の民族服である和服と韓服(チョマチョゴリ)を両国の被験者それぞれに着衣させ、高温曝露中の生理的、心理的諸反応を比較することによって衣文化にともなう耐暑反応の違いを検討することを目的とした。被験者は、日本と韓国の健康な女子大学生各々6名で、身長、体重、体表面積、皮下脂肪厚にみられる身体的特徴はほぼ同じであった。使用した和服は浴衣、帯、下駄など、韓服はチョマ、チョゴリ、靴などで構成され、それぞれの全重量は1,232g,1,151gであった。また生地は和服が綿、韓服が絹であった。被験者は同国の2名ずつが1組となって和服か韓服のいずれかを着用し、前室26°C(RH50%)で30分安静後、35°C(RH50%)の高温環境へ立位に近い椅座位で90分間曝露された。測定項目は、直腸温、皮膚温(7点)、発汗率、心拍数、及び温冷感、快適感の主観評価であった。発汗率が和服では日韓両被験者でほぼ等しかったが、韓服においては日本人被験者の方が韓国人被験者よりも大きかった。平均皮膚温の上昇度は、和服で日本人被験者がより大きく、韓服では逆に韓国人被験者がやや大きい値を示した。直腸温の上昇度は、和服で日韓両被験者はほぼ等しく、韓服において韓国人被験者の方が小さかった。韓服では日本人被験者はより大きな発汗率を示したにもかかわらず直腸温の上昇度は大きくなることが示された。本研究は、日韓の民族服である和服と韓服(チョマチョゴリ)を両国の被験者それぞれに着衣させ、寒冷曝露中の生理的、心理的諸反応を比較することによって衣文化にともなう耐寒反応の違いを検討することを目的とした。使用した和服は着物、帯、草履など14点、韓服はチョマ、チョゴリ、靴など7点で構成され、それぞれの全重量は3200g,1295gであった。また生地はいずれも絹であった。被験者は同国の2名ずつが1組となって和服か韓服のいずれかを着用し、前室20°C(RH50%)で30分安静後、5°C(RH50%)の寒冷環境へ立位に近い椅座位で90分間曝露された。測定項目は、直腸温、皮膚温(7点)、酸素摂取量、心拍数、及び温冷感、快適感の主観評価であった直腸温及び平均皮膚温の各低下度は、和服と韓服のいずれにおいても韓国人の方が有意に大きく、その程度は和服より韓服において大きい傾向であった。しかしながら体重当たり酸素摂取量は、和服では韓国人が、韓服では日本人がそれぞれ有意に高い値を示し、いずれも被験者にとって異国の民族服が高い代謝反応を示す結果となった。全身的な温冷感については、いずれの民族服も寒冷曝露中で日韓の差はなかったが、20°Cの前室では和服では韓国人が、韓服では日本人がやや涼しいという主観を示した。
胸腺における自己反応性T細胞クローン選択的分化に関する研究

本共同研究では,自己免疫疾患の発生機序解明を主たる目的として胸腺内分化過程で自己反応性T細胞が選択分化或いは除去される現象を再現できる実験系モデルを作製する。具体的には,特定抗原を認識するT細胞クローンのみからなるT細胞抗原レセプター(TCR)トランスジェニックマウスを作製し,それら各分化段階の未熟T細胞の分化を誘導系を設定する。後者の系として日本側で分化誘導能をもつ胸腺ストローマ細胞株を昨年樹立した。抗原特異的TCRトランスジェニックマウス作製は米国の指導で両国で試み,それぞれ異なるTCRを使用したOVA特異的に反応するマウスを得た。1992年度にはそれらを発展させ,以下の結果を得た。I.作製したOVA特異的TCRトランスジェニックマウスはOVA抗原特異的反応性を示すT細胞からなる。OVAに濃度依存性に著明に反応して増殖したが,通常マウス脾細胞はいずれにも反応しなかった。さらにこの反応性の特異性をより正確に検討するため,MHCの1-A^d分子及び導入遺伝子TCRと結合するペプチドOVA-P1と,MHC-I-A^dとのみ結合してTCRは結合しないOVA-2を合成し,OVAの場合と同様に培養系に加えて増殖状態を調ベると,OVA-P1添加の場合のみTCRトランスジェニックマウスの脾細胞が増殖した。このOVAペプチド特異性はTCRを単離したT細胞クローンと同一である。つまり,導入遺伝子TCRを発現したOVA特異的T細胞が作製したトランスジェニックマウスの脾臓に優位に存在していることが示され。ほぼ目論みどおりのマウスが得られたと判断された(日本及び米国)。(2)in vivoに於ける反応:無感作のトランスジェニックマウス及び通常マウスのfootpadにアルミニュウムゲル沈殿OVAを皮下注射すると,24時間後トランスジェニックマウスにはfootpadに明らかな腫脹が観察された。OVA以外の抗原注射ではFootpadに腫脹は無かった。すなわち,T細胞により担われているアレルギー反応である遅延性型過敏症(DTH),通常では予め感作した状態にあるマウスに抗原を再度投度した場合,局所に生ずる現象であるが,トランンスジェニックマウスでは,感作なしで十分反応するクローンが存在することを示す(日本)。II.抗原に遭遇した未熟胸腺細胞の死滅(1)in vivo系:OVA-P1及びOVA-P2をTRCトラスジェニックマウスの腹腔に3日間投与し,flowcytometryで検索した。その結果,導入(自然死)により減少することが証明されている。すなわち,胸腺内で抗原と反応するT細胞は可溶性抗原の場合も死滅することが証明された。この可溶性抗原は胸腺外で産生される自己成分と反応するT細胞クローンの排除機序のモデルとなる(米国)。そこで,われわれはin vitroの系で死滅排除されるOVA反応性T細胞クローンの分化段階をさらに詳細に検索し,かつ将来死滅シグナルを誘導する分子を解明する目的で,昨年樹立した腺ストローマ細胞クローン(TNC-R3.1)とトランスジェニックマウスの胸腺細胞をOVA-P1或いはOVA-P2の存在下で培養した。その結果,OVA-P1との共培養にて,分化途上のCD4^+CD8^+細胞のみが減少した。すなわち,in vitroの系でも抗原と反応した未熟胸腺細胞が排除されることを明らかにした(日米共同)。(3)superantingenを用いたin vitro系:米国で作製した他抗原(H-2L^d)特異的TCRトランスジェニックマウスはsuperantigenであるstaphyrococcus enterotoxin B(SEB)に反応する。このマウス胸腺細胞をTNC-R3.1上でSEBと共に培養すると,通常可溶性抗原と同様にSEB特異的にCD4^+CD8^+細胞が減少した。この結果はTCR-αβによってMHC分子により提示された抗原でなく,TCR-βに結合した分子からのシグナルでも未熟胸腺細胞は死滅することが明らかとなった(日本)。以上の結果と昨年の結果から胸腺内で分化する過程でT細胸が自己抗原を認識した未熟T細胞が死滅除去される現象を再現するin vitroの良いモデルを作製することに成功した。今後は,それぞれ或いは共同研究を続けることによって,細胞死を誘導する分子及びシグナルを明らかにするべく研究を進める予定である。

さらにこの反応性の特異性をより正確に検討するため,MHCの1-A^d分子及び導入遺伝子TCRと結合するペプチドOVA-P1と,MHC-I-A^dとのみ結合してTCRは結合しないOVA-2を合成し,OVAの場合と同様に培養系に加えて増殖状態を調ベると,OVA-P1添加の場合のみTCRトランスジェニックマウスの脾細胞が増殖した。このOVAペプチド特異性はTCRを単離したT細胞クローンと同一である。つまり,導入遺伝子TCRを発現したOVA特異的T細胞が作製したトランスジェニックマウスの脾臓に優位に存在していることが示され。ほぼ目論みどおりのマウスが得られたと判断された(日本及び米国)。(2)in vivoに於ける反応:無感作のトランスジェニックマウス及び通常マウスのfootpadにアルミニュウムゲル沈殿OVAを皮下注射すると,24時間後トランスジェニックマウスにはfootpadに明らかな腫脹が観察された。OVA以外の抗原注射ではFootpadに腫脹は無かった。すなわち,T細胞により担われているアレルギー反応である遅延性型過敏症(DTH),通常では予め感作した状態にあるマウスに抗原を再度投度した場合,局所に生ずる現象であるが,トランンスジェニックマウスでは,感作なしで十分反応するクローンが存在することを示す(日本)。II.抗原に遭遇した未熟胸腺細胞の死滅(1)in vivo系:OVA-P1及びOVA-P2をTRCトラスジェニックマウスの腹腔に3日間投与し,flowcytometryで検索した。その結果,導入(自然死)により減少することが証明されている。すなわち,胸腺内で抗原と反応するT細胞は可溶性抗原の場合も死滅することが証明された。この可溶性抗原は胸腺外で産生される自己成分と反応するT細胞クローンの排除機序のモデルとなる(米国)。そこで,われわれはin vitroの系で死滅排除されるOVA反応性T細胞クローンの分化段階をさらに詳細に検索し,かつ将来死滅シグナルを誘導する分子を解明する目的で,昨年樹立した腺ストローマ細胞クローン(TNC-R3.1)とトランスジェニックマウスの胸腺細胞をOVA-P1或いはOVA-P2の存在下で培養した。その結果,OVA-P1との共培養にて,分化途上のCD4^+CD8^+細胞のみが減少した。すなわち,in vitroの系でも抗原と反応した未熟胸腺細胞が排除されることを明らかにした(日米共同)。(3)superantingenを用いたin vitro系:米国で作製した他抗原(H-2L^d)特異的TCRトランスジェニックマウスはsuperantigenであるstaphyrococcus enterotoxin B(SEB)に反応する。このマウス胸腺細胞をTNC-R3.1上でSEBと共に培養すると,通常可溶性抗原と同様にSEB特異的にCD4^+CD8^+細胞が減少した。この結果はTCR-αβによってMHC分子により提示された抗原でなく,TCR-βに結合した分子からのシグナルでも未熟胸腺細胞は死滅することが明らかとなった(日本)。以上の結果と昨年の結果から胸腺内で分化する過程でT細胸が自己抗原を認識した未熟T細胞が死滅除去される現象を再現するin vitroの良いモデルを作製することに成功した。
運動ニューロン特異的遺伝子の探索

運動ニューロン特異的遺伝子を単離する目的で、マウス運動ニューロンと神経芽細胞腫とのハイブリッド細胞株NSC-19を用いてサブトラクションcDNAライブラリーを作成した。200クローンをスクリーニングして、3つのNSC-19に特異的に発現する遺伝子を単離した。ひとつはamyloidprecusor like protein1、他の2つは未知の遺伝子であった。新規の遺伝子のひとつは胎生期の中枢神経系に強く発現しており、全長クローニングを行った結果、thrombospondin type1 domainを有する新規の分泌型当蛋白で、thrombospondin(TSP)ファミリーのひとつであることが判明した。in situハイブリダイゼーションによる検討では、終脳の一部、中脳から脊髄の神経蓋板、趾芽などにシグナルが見られた。中枢神経系での発現は終脳も含めて神経管背側領域に強く限局しており、神経管背側での重要な役割を有することが予想された。TSP type1 domainを有する蛋白で特に中枢神経系と関連しているものはthrombospondinの他、F-spondin、SCO-spondin、UNC-5が知られている。TSP type1domainには細胞接着や神経突起の伸長などの機能が推定されており、この機能を通じて本遺伝子は神経管背側での器官形成や神経組織の発達に関与する可能性がある。運動ニューロンでの発現及び運動ニューロンとの相互作用についてはさらに解析を行う必要があると考えている。◇不死化運動ニューロンを用いたsubtractiorr cDNAlibraryの作成と、運動ニューロン特異的遺伝子のクローニング:不死化運動ニューロン(マウス運動ニューロン×neuroblasoma細胞株のハイブリッド細胞株)を用いて元のneuroblasoma細胞株との間でsubtraction cDNA libraryを作成した。ランダムに200クローンを選択してdefferential screeningをおこなったところ、発現量に明らかに差のある9クローンを得た。その内、3クローンにつきadultマウスの各機器を用いてノーザンブロット解析を行ったところ、1つは中枢神経系(大脳、小脳、脊髄)優位に発現しており、シークエンスの結果amyloid precursor like protein geneであった。他の2つはこの細胞のみに発現しており、adultのマウス組織(大脳、小脳、脊髄、心臓、肺、肝臓、腎臓)にも発現は見られなかった。シークエンスの結果はいずれも未知の遺伝子であり、不死化運動ニューロンが胎仔期のE12-E15の頃の運動ニューロンの由来であることより、運動ニューロンの発生分化に関係ある遺伝子の可能性があると考え、ノーザンブロットやin situ hybirdizationによりdevelopmetalな発現を検討している。この1つはhomology検索より、多くのreceptor geneや膜蛋白とのhomologyが見られ、何かのreceptor geneの可能性があり、平行して全長クローニングを行っている。また、残りの6クローンについてもシークエンスによる検討を行っているところである。◇Single cellでの解析:予備実験として、培養神経細胞を限界希釈して、そこから微小ガラス管を用いて数個(5個程度)の細胞からmRNAを抽出し、cDNAを合成を行なった。PCR用のtagをつけたアダプターをライゲーションした後、PCRを行ない電気泳動で確認したところ、きれいなDNAのsmearが得られることを確認した。今後の予定として、新生児ラットのmotor neruonをretrograde labellingにより標識してvibratome切片を作成し、その切片上で微小ガラス管を用いてmRNAの採取を行い、mRNA differential displayにより運動ニューロン特異的遺伝子を検討する。運動ニューロン特異的遺伝子を単離する目的で、マウス運動ニューロンと神経芽細胞腫のハイブリッド細胞株NSC-19を用いてサブトラクションcDNAライブラリーを作成した。新規の遺伝子のひとつは胎生期の中枢神経系に強く発現しており、全長クローニングを行った結果、thrombospondin type1 domainを有する新規の分泌型糖蛋白で、thrombospondin(TSP)ファミリーのひとつであることが判明した。

in situハイブリダイゼーションによる検討では、終脳の一部、中脳から脊髄の神経蓋板、趾芽などにシグナルが見られた。中枢神経系での発現は終脳も含めて神経管背側領域に強く限局しており、神経管背側での重要な役割を有することが予測された。TSP type1 domainを有する蛋白で特に中枢神経系と関連しているものはthrombospondinの他、F-spondin、SCO-spondin、UNC-5が知られている。TSP type1domainには細胞接着や神経突起の伸長などの機能が推定されており、この機能を通じて本遺伝子は神経管背側での器官形成や神経組織の発達に関与する可能性がある。運動ニューロンでの発現及び運動ニューロンとの相互作用についてはさらに解析を行う必要があると考えている。
胎児への愛着と絆を促進する「Mama’s Touch プログラム」の効果検証

少子化・核家族化により、ワンオペ育児や孤育て、産後うつ病など日本の子育て環境は激変している。急速な少子化により、自身の子どもを持つまで日常生活の中で子どもとふれ合う機会がほとんどなくなってしまった現代、母となる女性に対し積極的な支援が必要である。本研究では、乳児と意図的にふれ合う「Mama's Touchプログラム」を実施し、その効果としての愛着ホルモンの増加、ストレスホルモンの減少、さらに胎児への愛着の増幅効果を検証するものである。
古代の技術によるモノづくりを通して思考力を育成する教材の開発

1.研究目的本研究では日本学術会議が出した提言「再び高等学校歴史教育の在り方について」(平成26年6月13日)内の「歴史基礎」の科目カリキュラム試案において示された「モノの交換や移動から思考させる問」に関連した教材の開発を試みた。とくに、生徒が製作体験することを教材の核に置き、古代エジプトのファイアンスを製作することとした。ファイアンスの製作体験が、生徒の思考力を育成する発問や生徒自身の探究の教材として有用であるかを検討し、「古代の技術によるモノづくり」を通して高等学校の歴史教育に求められる思考力を育成する教材の開発を目的とした。2.研究方法1研究は、参考となる授業例や古代の技術に関する文献・資料調査を実施し、白華技法によってファイアンス製作を行い、葬送に関連した人形の小像シャブティを製作の対象物とした。試作を繰り返して製作方法・手順を確定させ、生徒による製作体験を実施した。製作体験を通しながら、ファイアンスと高等学校世界史Bで扱う古代オリエントの内容とを結びつけた授業を展開し、生徒にはレポートや小論文を課題として課した。3.研究結果製作技術や製作物には関連した歴史的事象があり、ファイアンスの製作体験は単に技術を学ぶ機会としてではなく、十分に歴史教育へと展開ができる教材となった。製作体験は歴史的事象を単に知識としてではなく、体験的・実感的に学ぶことを可能とし、生徒の興味・関心を高めることにもつながった。今回の研究で製作したファイアンスは、製作時に工夫が必要であり、高校生が複数人で協働的に製作に取り組むのに適した教材であることも明らかとなった。製作体験にかける時間数や歴史的思考力を育む課題の内容設定の重要性も改めて確認されたが、高等学校の歴史教育の教材として「古代の技術によるモノづくり」は有用な教材となった。
組合せ問題を高速に解くための論理型言語の設計,実現及び応用

1.まず、Prologの拡張であるBeta-Prologの設計と実現を行なった.PrologにBoolean tableというバツクトラック可能なデータ構造を導入し,Boolean tableに対して,状態が真である組を選ぶ(select),状態をテストする(test),状態を更新する(up-date)及び状態が真である組を数える(count)などの述語を備えた.実際に,Beta-Prologのコンパイラを試作した.2.Beta-Prologを基本的なグラフ問題,制約充足問題,プラニング問題,TSP問題などへ応用した.結果として,これらの組合せ問題を全部状態遷移問題として定式化でき,Beta-PrologがPrologより遥かに有効であることが実証された.3.しかし,まだたくさんの問題が困難あるいは解決不能のままとなっている.例えば,108-queen問題の最初の解を求めるのに,10時間もかかってしまった.また,Deutshの四段層の配線問題は,一週間でも解けなかった.今後,コンパイラの最適化及び言語の並列化によって,さらに高速化を図る必要がある.1.まず、Prologの拡張であるBeta-Prologの設計と実現を行なった.PrologにBoolean tableというバツクトラック可能なデータ構造を導入し,Boolean tableに対して,状態が真である組を選ぶ(select),状態をテストする(test),状態を更新する(up-date)及び状態が真である組を数える(count)などの述語を備えた.実際に,Beta-Prologのコンパイラを試作した.2.Beta-Prologを基本的なグラフ問題,制約充足問題,プラニング問題,TSP問題などへ応用した.結果として,これらの組合せ問題を全部状態遷移問題として定式化でき,Beta-PrologがPrologより遥かに有効であることが実証された.3.しかし,まだたくさんの問題が困難あるいは解決不能のままとなっている.例えば,108-queen問題の最初の解を求めるのに,10時間もかかってしまった.また,Deutshの四段層の配線問題は,一週間でも解けなかった.今後,コンパイラの最適化及び言語の並列化によって,さらに高速化を図る必要がある.
抗原特異的抑制性T細胞を用いた実験的アレルギー性結膜炎抑制の試み

当初この研究は免疫学的な解析を行いやすいマウスモデルを用いる予定であったが、数回にわたって発症実験を行ったにも拘らず、実験的アレルギー性結膜炎発症モデルを確立できなかったため、代用としてBNラット用い、以下の4群を作成した。1)無処置ラットに抗原(OVA)の点眼のみを行った群:対照群2)抗原を強化免疫した後、同一抗原の点眼を行った群:結膜炎発症群3)抗原の免疫、点眼を行う前に、同一抗原を前房内投与した群:ACAID群4)抗原の免疫、点眼を行う前に、他抗原を前房内投与した群:他抗原群抗原の点眼のみでは結膜の変化は見られず(対照群)、抗原免疫後に同一抗原の点眼を行う事によって、実験的アレルギー性結膜炎の発症が誘導された(結膜炎発症群)。-組織学的解析よりまた、抗原免疫を行う前に同一抗原を前房内投与する事により、抗原特異的な遅延型過敏反応を抑制された(ACAID群、他抗原群)。-免疫学的解析よりしかし、ラット実験的アレルギー性結膜炎モデルの発症を抑制する上では、ACAIDにより誘導されるregulatoryT cellの有効性は証明できなかった(ACAID群)。抗原の違いによる発症程度の有意な差や傾向も認められず、抗体産生能の抑制もみられなかった。(ACAID群、他抗原群)-組織学的解析および免疫学的解析より眼における免疫寛容システム「Anterior chamber-associated immune deviation(ACAID)」は、角膜移植モデルの拒絶反応や自己免疫性ぶどう膜炎などのTh1依存性疾患の治療に主に応用されてきた。近年ACAIDを誘導したマウスでは、Th2依存性疾患であるアレルギー性気管支炎でも同様に抑制されることが明らかとなっている。これらの研究から、ACAIDシステムがTh2依存性疾患である難治性アレルギー性結膜炎の治療に応用可能かどうか、焦点を当てて検討を行った。まず今年度の研究目標としてACAIDモデルを作成し、ACAIDによる実験的アレルギー性結膜炎(Experimental allergic conjunctivitis ; EAC)の抑制効果を検討した。当初マウスによる実験系を想定していたが、B6マウスを用いた場合には卵白アルブミン(OVA)によるEACがうまく発症せず、ラットによる実験的アレルギー性結膜炎モデルに変更した。方法としてBNラットの前房内にOVA20μgを注入した群を作成し、同時に陽性コントロールとして結膜内にOVAを注入した群、0VA眼内非注入群を作成した。1週間後にOVAで皮下に強化免疫を行い、その1週間後に処置眼のOVA点眼を行い、同時に耳介にOVA10μgを注入して遅延型過敏反応を測定した。その後ラットを屠殺して眼球を摘出し、結膜における病理学的検索を行った。前房内にOVAを注入したACAID群では、OVAによる遅延型過敏反応が減弱し、陽性コントロール群に比べて結膜内の好酸球や好中球、リンパ球などの細胞浸潤が著明に減少していた。これらの実験結果よりラットEACモデルでは、ACAIDにより病変が抑制可能なことが証明された。今後、抗原特異的なregulatory Tcellにより病変が制御可能か検討する予定である。(ACAID群、他抗原群)-組織学的解析および免疫学的解析より
大規模映像資源のためのマルチモーダルセマンティックインデクシング

本年度は、大規模映像資源に対するマルチモーダルなセマンティックインデクシングシステムの構築に向けて、前年度までに作成したシステムの高速化を行う手法を開発した。セマンティックインデクシングとは、映像の中から物体やイベントなど、意味を持った対象を自動的に検出し、映像の意味的分類を行うことである。セマンティックインデクシングは、意味に基づいた高度な映像検索への応用が期待される研究課題であり、画像、音声、言語に基づいたマルチモーダルな手法の開発が必要とされている。さらに、大規模なデータの処理に向けて、高速な特徴抽出アルゴリズムが不可欠である。そこで、本年度は、Neighbor-to-Neighbor (NTN)探索という高速化手法を新たに開発した。NTN探索は、ベクトル量子化や混合ガウス分布に関する確率計算を高速化する手法であり、入力となる特徴量の中から類似したものを探索し、類似度に応じて計算を省略することで高速化を実現する。PASCAL VOCデータセットにおける評価実験では、これまでに作成した混合ガウス分布を用いたセマンティックインデクシングシステムにNTN探索を導入することで、検出精度を高く保った状態で、89.3%の計算量削減を実現した。また、映像解析に関する国際的ワークショップであるTRECVIDのセマンティックインデクシングタスクにおける評価実験では、6種類の画像・音響特徴量とこれまでに開発した手法を統合して用いることで、映像検出精度がタスク参加18機関中第3位となり、精度・計算量の両観点から、我々の手法の有用性が確認された。(抄録なし)本年度は、大規模映像資源に対するマルチモーダルなセマンティックインデクシングシステムの構築に向けて、画像と音響を組み合わせた検出手法の高性能化と高速化を行った。そこで、本年度は、従来の混合ガウス分布を用いた検出手法に6種類の画像・音響特徴量を組み合わせた手法を提案し、映像検出の精度向上を図った。具体的には、SIFT特徴量をはじめとした5つの画像特徴から画像モデルを、MFCC特徴量から音響モデルを構築して、マルチモーダルな検出手法を実現した。さらに、従来手法は多大な計算コストを要していたため、木構造混合ガウス分布を用いた高速化手法を提案した。映像解析に関する国際的ワークショップであるTRECVIDのセマンティックインデクシングタスクにおける評価実験では、映像検出精度がタスク参加28機関中第一位となった。他機関の手法の多くは画像特徴のみを用いていたため、我々のマルチモーダルな手法の有用性が確認された。また、木構造混合ガウス分布を用いた高速化手法により、映像検出精度の劣化なしに、従来の約4倍の速度で映像検出が可能となった。本年度は、大規模映像資源に対するマルチモーダルなセマンティックインデクシングシステムの構築に向けて、画像モデルと音響モデルの高性能化を行った。本年度は、q-混合ガウス分布という確率モデルを新たに導入し、昨年度に作成した画像モデルと音響モデルの高性能化を行った。さらに,音声認識における言語モデルを映像認識に応用する基礎的段階として,ビデオショット間の関係を考慮した検出手法の開発を行った。具体的には、複数のビデオショット間で共有される事前スコア(ビデオクリップスコア)を定義し、物体やイベントなどの再出現を捉えやすいモデルを構築した。映像解析に関する国際的ワークショップであるTRECVIDのセマンティックインデクシングタスクにおける評価実験では、6種類の画像・音響特徴量と本年度に開発した手法を用いることで、映像検出精度がタスク参加15機関中第一位となり、我々のマルチモーダルな手法の有用性が確認された。また、ビデオショット間の関係を考慮することは、様々な物体やイベントに効果があり、総合的な映像検出精度が大きく向上することが確認できた。

また、映像解析に関する国際的ワークショップであるTRECVIDのセマンティックインデクシングタスクにおける評価実験では、6種類の画像・音響特徴量とこれまでに開発した手法を統合して用いることで、映像検出精度がタスク参加18機関中第3位となり、精度・計算量の両観点から、我々の手法の有用性が確認された。画像特徴と音響特徴を用いたマルチモーダルな手法を提案し、映像検出精度の向上が確認されたため、研究はおおむね順調に進展していると考えられる。画像・音響モデルを用いたマルチモーダルな手法の高精度化およびビデオショット間のモデル化に成功し、映像検出精度の向上が確認されたため、研究はおおむね順調に進展していると考えられる。本年度で画像モデルと音響モデルの高性能化を行った結果、今後の課題として、物体の位置情報に基づいた画像モデルの構築と言語モデルの構築の2つが必要であることが分かった。前者は特に映像中の物体(飛行機や車など)の検出に必要なものであり、現在の画像モデルを物体位置検出に発展させる方向で研究を行う。後者は映像に付与されているメタデータを解析し、そこから新たな言語モデルを構築し、現在の手法と組み合わせることで映像検出精度の向上を図る。今後の課題として、物体の位置関係を考慮した言語モデルの開発が挙げられる。具体的には、映像中の飛行機や車などといった物体の時間・空間的位置関係を表すモデルを構築する。モデルの開発にはPASCAL VOCデータベースなどで公開されている物体の位置情報付き画像データを利用する。(抄録なし)
組換えアルブミン-プロトヘム錯体から成る酸素輸送合成ヘム蛋白質の創製

ヒト血清アルブミンのヘムポケット内部にヒスチジン(His)を導入した組換えアルブミン(rHSA)を合成し、鉄プロトポルフィリンIX[プロトヘム:heme]を軸配位により固定、従来に類例のない酸素輸送合成ヘム蛋白質[組換えアルブミン-プロトヘム(rHSA-heme)錯体]を創製することを目的とする。酸素配位平衡を制御できる人工ヘムポケットの分子環境構造を明確にしたい。初年度は、組換えアルブミン(rHSA)の発現とrHSA-heme錯体の調製および酸素結合反応の解析を実施し、ヘム近傍分子環境が酸素結合に与える影響を明らかにした。第二年次は、酸素配位座側に遠位塩基を導入することにより、hemeの酸素親和性を18倍増大させることに成功した。さらにhemeを亜鉛プロトポルフィリン(ZnPP)に変換すると、得られたrHSA-ZnPP錯体が、水の光還元反応系における有効な増感剤として作用することも見出した。第三年次は、ヘムポケット構造の最適化を進め、最終的にヒトHbやヒト赤血球と同じ酸素親和性を有するrHSA-heme錯体を創製した。本来補欠分子族すらもたない単純蛋白質のアルブミンに酸素結合能を付与することに成功した成果は、ヘモグロビンを全く必要としない完全合成系人工酸素運搬体の開発に大きな突破口を開くものであり、社会福祉に与える波及効果と意義はきわめて大きい。本研究内容は、研究報文17報、総説・図書3件として公開され、国内外から多くの注目を集めている。本研究は、ヒト血清アルブミンのヘムポケット内部にヒスチジンを変異導入した組換えアルブミンを合成し、プロトヘム誘導体を軸配位により固定、従来に類例のない酸素輸送合成ヘム蛋白質(アルブミン-プロトヘム錯体)を創製することを目的とする。初年度は、計画に沿った展開を実施し、予想以上の成果を得ることができた。(1)近位塩基(ヒスチジン)を導入した組換えアルブミンを発現、プロトヘムを配位結合させることにより、新しい合成ヘム蛋白質を構築、(2)酸素結合定数(酸素親和度)、酸素結合解離速度定数、酸素錯体安定度をパラメーターとして酸素結合能を評価、ヘモグロビンやミオグロビンと比較した。(3)酸素配位座近傍のアミノ酸も変換し、安定酸素錯体を形成できる条件を解明。(5)得られたアルブミン-プロトヘム錯体のX線結晶構造解析のため、単結晶作成に着手した。(1)組換えアルブミンの発現とプロトヘム錯体の調製ヘムポケット内部にヒスチジンを有する組換えアルブミン(3種)を合成。得られた組換えアルブミンにプロトヘムを結合させ、組換えアルブミン-ヘム錯体を得た。(2)組換えアルブミン-プロトヘムの酸素結合能酸素結合定数、酸素結合解離速度定数を高速反応計測システム(設備備品として設置)を用いて測定、酸素輸送ヘム蛋白質としての機能を評価した。酸素親和度はミオグロビンに比べて低く、これは大きな解離速度定数に起因する。(3)ヘムポケット構造と酸素結合能の相関酸素配位座近傍にあるTyr-161を疎水性アミノ酸残基に変換することが、安定酸素錯体の生成条件であることを見出した。(4)組換えアルブミン-プロトヘムの単結晶作成アルブミン-プロトヘム錯体の結晶構造を決定するため、Prof.S.Curry(海外協力研究者)の協力を得た。協議・共同実験は小松が短期滞在して実施した。

第二年次も、計画に沿った展開を実施し、以下に示す成果を得た。(1)ヘムポケット内部に変異導入したヒスチジン(近位塩基)が中心鉄に軸配位することを実証し、得られた組換えアルブミン-プロトヘム錯体が酸素を吸脱着できることを明確にしたので、さらに二重変異を加えることにより酸素錯体の安定度向上を図った。(2)他方、磁気円偏光二色性(MCD)スペクトル測定から、ヘム鉄の配位数、価数、スピン状態を詳細に解析した。(1)近位塩基と遠位塩基の二重変異安定酸素錯体の生成には、酸素配位座側に存在する遠位塩基の役割が重要である。分子シミュレーションからロイシン185を特定し、そこへ塩基性アミノ酸(アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン)を変異導入した(小松)。可視吸収スペクトル、レーザーフラッシュホトリシスを用いて、プロトヘム錯体の酸素結合反応を解析した結果、アスパラギンを導入した系の酸素親和性が最も高いことを見出した。その効果をさらに明確にするため、Prof.Stephen Curry(海外研究協力者)とともに単結晶調製を開始した(小松)。(2)配位酸素の電荷分極構造酸素配位座近傍アミノ酸の修飾が配位酸素の電荷分極構造にどのような影響を与えるのかを明らかにするため、MCDスペクトルを測定、中心鉄の配位数、価数、スピン状態を解析した(小松、黄)。185位にヒスチジン、グルタミンを導入すると、ヘム鉄は鉄(II)6配位低スピン錯体を形成、アスパラギンの場合は鉄(II)5配位高スピン錯体となる。本研究は、ヒト血清アルブミンのヘムポケット内部にヒスチジンを導入した組換えアルブミンを合成し、プロトヘム誘導体を軸配位により固定、従来に類例のない酸素輸送合成ヘム蛋白質(アルブミンプロトヘム錯体)を創製することを目的とする。第三年次も計画に沿った展開を実施し、予想を上回る成果を得た。(1)三重変異体の合成と評価安定酸素錯体の生成には、軸塩基配位子としての近位ヒスチジンはもちろん、酸素配位座側に存在するアミノ酸残基の役割がきわめて重要である。ロイシン185の位置ヘアスパラギンを変異導入すると、酸素親和性が増大することを見出したので、本年度はさらにロイシン182、アルギニン186の位置ヘヒスチジン、ロイシン、フェニルアラニンを導入した三重変異体を合成した。アルブミン・プロトヘム錯体を調製後、酸素結合パラメータを算出、186位への疎水性アミノ酸の導入が、酸素親和度を適度に下げることを明らかにした(小松、中川)。また、組換えアルブミンプロトヘムの単結晶を作成し、Prof.S.Curry(海外研究協力者)とともにX線結晶構造解析を実施(小松)。(2)まとめ三年間に得られた結果を総合し、アルブミンのヘムポケット(サブドメインIB)内アミノ酸置換により、本来酸素結合能はもちろん、補欠分子(ヘム)すら持たない単純蛋白質のアルブミンに、ヘモグロビンの酸素運搬能を付与する方法論を確立することができた(小松)。(3)アルブミン・亜鉛プロトポルフィリンを光増感剤とする水の還元反応これまでに得られた成果をさらに拡張し、鉄プロトポルフィリンを亜鉛プロトポルフィリンへ変換、得られたアルブミン'亜鉛プロトポルフィリン錯体の光励起状態を解析するとともに、これが水の光還元反応に有効な増感剤として作用することを見出した(小松)ユニークな水素発生システムとして、海外メディアに紹介された。