hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
意思決定神経回路の可視化と操作

本計画は、脊椎動物で最も簡単な構造の脳を持つゼブラフィッシュの成魚の終脳を使って、意思決定に関わる神経細胞の活動を可視化し、意思決定の神経メカニズムを究明することが目的である。「逃げろルール」と「とどまれルール」の2つのルールが、終能外套部の2つの異なる神経細胞群の活動により別々に読み出されることを示した。腹側手綱核と,それに繋がる正中縫線核のセロトニン神経細胞が、条件刺激の提示に対して負の価値予測を反映していることを示した。さらに、ゼブラフィッシュ成魚で仮想現実空間システムを完成させて、視覚イメージの提示中に、成魚の全脳の神経活動を観察できるシステムの構築行った。1.神経細胞集団の振る舞いを個々の細胞レベルで観察する系の確立能動的回避学習の成立後に、条件刺激で活性化される終脳の細胞集団の振る舞いを、個々の細胞のレベルで観察するために、高速高感度ビデオカメラの代りに、2光子レーザー顕微鏡を用いて、外套部表面の個々の神経細胞の活動を、集団で記録する実験系を確立するための研究を行った。この結果、ゼブラフィッシュ成魚への任意の画像イメージの提示が、2光子レーザー顕微鏡による細胞の超高感度蛍光イメージ測定と、互いに干渉しないようにするために、画像提示と蛍光計測のタイミングを自由に制御できる実験系の確立に成功した。2.終脳の部位ごとの遺伝子操作のためのトランスジェニック系統の作成哺乳類の終脳の各部位に相当するゼブラフィッシュ終脳の各部位は、哺乳類と共通の分子を発現する。これらの分子のうちで、CaMKII,GAD67,Tac1遺伝子を含むBACクローンを単離し、大腸菌内遺伝子組み換えで遺伝子コード領域をGAL4-VP16に置換したクローンを使って、トランスジェニック・ゼブラフィッシュ系統の作成を行った。其の結果、終脳の興奮性神経細胞、抑制性神経細胞や、線条体の直接経路の神経細胞などで、独立に、任意の遺伝子の発現を制御するために、トランスジェニック系統を確立した。3.上記2.の研究で作成されたトランスジェニック系統を、GAL4-VP16の標的制御配列である、UASの下流に、カルシウム濃度依存的蛍光蛋白GCaMPの遺伝子を持つ別のトランスジェニック系統とを掛け合わせることによって、ゼブラフィッシュ終脳の様々な神経細胞の活動を可視化するための系統を作成した。本計画は、脊椎動物で、最も単純な構造の脳を持つゼブラフィッシュ成魚の終脳を使って、意思決定時の神経細胞の活動を可視化し、意思決定の神経メカニズムを究明することが目的である。平成24年度までの研究で、研究に必要なトランスジェニック系統を作製し、これらの系統の脳の神経活動を、2光子レーザー顕微鏡を使って観察出来るシステムを構築した。更に、世界で初めて、自由遊泳中のゼブラフィッシュの成魚の脳の神経活動を、オプトジェネティックスを用いて制御できる実験法を確立した。平成25年度は、腹側手綱核の神経細胞を、任意の条件の時のみにオプトジェネティックスを用いて興奮させることによって、その条件に対する忌避行動が誘起されることを示した。これ以前に得られた、腹側手綱核のみで特異的に破傷風毒素を発現するトランスジェニック系統では、古典的恐怖学習はできるが、能動的回避学習ができなくなるという結果と合わせて、腹側手綱核と、それに繋がる正中縫線核のセロトニン神経細胞は、条件刺激の提示に対して負の価値予測を反映して興奮し、能動的回避学習を可能とすることを明らかにした。また、作成されたトランスジェニックフィッシュを用いて、能動的回避学習の成立後に、条件刺激の提示に対して終脳のどの部分が興奮するかを、高感度高速撮影カメラを用いて観察することに成功し、複数の領域が順番に興奮することを発見した。更に、ゼブラフィッシュ終脳の神経活動を2光子型レーザー顕微鏡で観察するための改良を推し進め、計測中のゼブラフィッシュ成魚に仮想現実空間のイメージを提示するための装置を完成させた。本計画は、脊椎動物で最も簡単な構造の脳を持つゼブラフィッシュの成魚の終脳を使って、意思決定の神経細胞の活動を可視化し、意思決定の神経メカニズムを究明することが目的である。平成25年度までの研究で、研究に必要なトランスジェニック系統を作成し、これらの系統の脳の神経活動を,2光子レーザー顕微鏡を使って観察できるシステムを構築した。更に、世界で始めて、自由遊泳のゼブラフィッシュの成魚の脳の神経活動を、オプトジェネティックスを用いて制御できる実験法を確立した。これを使って、腹側の手綱核の神経細胞を,任意の条件の時のみにオプトジェネティックスを用いて興奮させることによって、その条件に対する忌避行動が誘起されることを示した。これ以前に得られた、腹側手綱核のみで特異的に破傷風毒素を発現するトランスジェニック系統では、古典的恐怖学習は出来るが、能動的回避学習が出来なくなるという結果と合わせて、腹側手綱核と,それに繋がる正中縫線核のセロトニン神経細胞は、条件刺激の提示に対して負の価値予測を反映して興奮し、能動的回避学習を可能とするという仮説を立てた。この仮説を更に検証するために、能動的回避学習の途中と成立後のゼブラフィッシュで、腹側手綱核神経細胞が、条件刺激の提示に対してどの様に反応するのかを調べた。これらの神経細胞が、負の価値予測をコードする場合に理論的に予測されるように、学習の途中では興奮頻度の上昇が見られ、学習成立後には、通常レベルに回帰するという振る舞いが見られた。

以上全ての結果をまとめて、Neuron誌に発表した。さらに、ゼブラフィッシュ成魚で仮想現実空間システムを完成させて、視覚イメージの提示中に、成魚の全脳の神経活動を観察できるシステムの構築を進めた。平成27年度は以下の目的で研究を行った。ゼブラフィッシュを実験材料として、遺伝子操作技術を駆使して、神経活動の可視化や人為的操作を行うことで、基底核を中心として、行動プログラムの形成と読み出しに関わる神経回路の、動作様式を細胞レベルで可視化し、その動作特性を明らかにするために、以下の研究を行う。1)高速スキャン型共焦点レーザー顕微鏡、2光子レーザー顕微鏡を用い手、神経活動を可視化する。2)行動プログラムの形成と選択に関わる神経回路を、脳の部位ごとに操作するために、終脳の異なる部位ごとに、遺伝子操作を可能とするトランスジェニック・ゼブラフィッシュを作成する。3)上記観察システムと遺伝子発現制御システムを使うことによって、行動プログラムの形成と選択に関わる神経回路の動作特性を明らかにする。平成26年度までの研究で、ゼブラフィッシュ終脳の各種神経細胞を個別に標識するためのトランスジェニック系統の作成を終えた。平成27年度は、このシステムを利用して、活きたゼブラフィッシュの成魚が,能動的回避学習等の行動学習を行う過程や、学習が成立した後で、記憶を想起する過程で、どのような神経活動が見られるかを観察するための閉鎖ループ仮想現実空間システムを完成させた。本計画は、脊椎動物で最も簡単な構造の脳を持つゼブラフィッシュの成魚の終脳を使って、意思決定に関わる神経細胞の活動を可視化し、意思決定の神経メカニズムを究明することが目的である。「逃げろルール」と「とどまれルール」の2つのルールが、終能外套部の2つの異なる神経細胞群の活動により別々に読み出されることを示した。腹側手綱核と,それに繋がる正中縫線核のセロトニン神経細胞が、条件刺激の提示に対して負の価値予測を反映していることを示した。さらに、ゼブラフィッシュ成魚で仮想現実空間システムを完成させて、視覚イメージの提示中に、成魚の全脳の神経活動を観察できるシステムの構築行った。平成24年度までの研究で、哺乳類の終脳の各部位に相当するゼブラフィッシュ終脳の各部位の興奮性神経細胞の活動を観察するために、CaMKIIα、zbtb20の蛋白質転写領域をGal4-VP16で置換したBACクローンを持つトランスジェニック系統を作成した。さらに、Tg[vglut2:gal4-vp16]系統と掛け合わせることによって、ゼブラフィッシュ終脳の外套部の神経細胞のほぼすべての興奮性神経細胞での遺伝子発現を制御できるようになった。またTg[gad67:gal4-vp16]系統を作成し、抑制性神経細胞での遺伝子発現の制御を可能にした。さらに、神経細胞集団の振る舞いを個々の細胞レベルで観察する系の確立能動的回避学習の成立後に、条件刺激で活性化される終脳の細胞集団の振る舞いを、個々の細胞のレベルで観察するために、高速高感度ビデオカメラの代りに、2光子レーザー顕微鏡を用いて、外套部表面の個々の神経細胞の活動を、集団で記録する実験系の確立を目指した研究をおこなった。
屋内ギガビット無線LAN環境伝搬構造と伝送条件解明の研究

本研究では1Gb/s超屋内無線LAN構築を目的に電波伝搬,通信方式の両分野から検討を行い,以下の実績を得た。1.屋内無線LAN環境伝搬特性の測定とシミュレータの検討無線LAN環境伝搬特性の測定を既設チャネルサウンダに追加した到来方向測定機能と共に実施し,微細な電波伝搬特性と遅延波到来方向データを取得した。その結果,金属製建具を原因とする正規反射による遅延波と壁,家具などからの多くの弱い散乱波が観測された。また測定結果に基づく屋内無線LAN環境シミュレータの構築を進め,MIMO多重化による伝送速度向上を静的環境において確認できた。2.ギガビット伝送方式を実現する変復調方式の検討伝送品質推定法としてビタビ復号メトリック情報に基づく高精度かつ簡易な推定法を提案し、計算機シミュレーションにより有効性を確認した。この推定法による適応伝送速度通信方式として変調方式と周波数ダイバーシチブランチ数を変化させる2方式の検討を進めた。その結果,前者は所定の伝送品質で高い平均伝送速度を実現できたが,システム構成が複雑となった。これに対し,後者は性能的には劣るが,大幅なシステム簡略化を達成できた。次に多重波遅延時間差推定法として同相チャンネル成分ひずみ検出による高精度かつ簡易な推定法を提案検討し、これに基づくガードインターバル(GI)適応可変OFDM伝送方式を検討し,提案方式がGI長固定の従来方式に比べ、高い伝送品質と高い伝送効率を同時に実現できることが明らかとなった。更に,OFDMサブキャリア間の直交性を利用したMIMO-OFDM伝送方式を提案検討した。その結果,提案方式は従来の時空間符号化型と比べ、周波数利用効率が若干劣るが、同程度の伝送品質を達成できた。提案システムは伝送路推定や受信側の複雑な信号処理が不要なため,システムの複雑さと消費電力を大幅に減少できることが期待される。本年度の研究実績は以下の通りである。(1)屋内伝搬モデルの屋内無線LAN環境伝搬特性の測定と屋内無線LAN環境シミュレータの基礎検討既設の超高遅延時間分解能0.5ns(伝搬通路差15cmに相当)を有する遅延プロフィール測定装置(搬送波周波数7GHz)を用いて、屋内無線LAN環境における伝搬特性測定を実施し、各多重到来波の伝搬特性を解析した。基礎検討を実施している到来方向測定機能をほぼ完成させることができたが、測定精度に若干の問題があり継続的に検討している。しかし屋内伝搬構造の詳細な検討には十分であり、測定結果からは遅延発生原因が屋内の金属などの反射損失の少ない物体が主たるもので、レイトレースなどで予測されるほどの幾何光学的反射波はむしろ少なく、散乱波が非常に多く観測されることが明らかとなった。当初予定していた素波の性質はまだ十分に検討できていないが、今後検討する予定である。また、測定結果を基に屋内無線LAN環境シミュレータの基礎検討を進めている。(2)ギガビット伝送方式を実現する変復調方式の基礎検討これまで検討してきた適応伝送速度OFDM伝送方式について変調多値数と周波数ダイバシチブランチ数を伝送条件に対して適応に調整する方式、簡易な伝送路推定に基づきガードインターバルを変化させる方式、消費電力低減を狙った固定変調方式と符号合成周波数ダイバシチ組合せた方式などを検討した。また、符号合成方式を組合せることで伝送路推定を省略できるMIMO伝送方式を提案し、検討した。更にターボ符号を符号合成ダイバシチと組み合わせた方式の基礎検討を行った。これらの検討には今後(1)で構築する結果を基に実測伝送路特性を利用して検討したい。1.屋内無線LAN環境伝搬特性の測定とシミュレータの検討

本年度は無線LAN環境伝搬特性の測定結果を基に屋内遅延波到来方向データを取得し,屋内無線LAN環境シミュレータの構築を進めた。その結果,測定データから各遅延波をそれに基づく伝送シミュレーションを可能にすることができた。シミュレーションでは時空間符号化によるMIMO多重化の検討を行い,静的環境でも効果のあることを確認することができた。2.ギガビット伝送方式を実現する変復調方式の検討伝送品質の推定法としてビタビ復号のメトリック情報を活用した高精度かつ簡単な推定法を提案し、計算機シミュレーションによりその有効性を確認した。次にこの推定法による適応伝送速度通信方式として、変調方式適応と周波数ダイバシチブランチ数適応の二方式を検討し,前者の方が所定の伝送品質を達成しながら高い平均伝送速度を実現可能なこと,また後者はシステム構成が大幅に簡略化できることが明らかとなった。次にガードインターバル(GI)適応可変伝送方式の要である多重波遅延時間差の推定法として同相チャンネル成分ひずみ検出による高精度かつ簡単な推定法を提案し、この推定法に基づくGI適応可変OFDM伝送方式のシステム構成及び適応アルゴリズムを検討した。その結果、提案方式がGI長固定の従来方式と比べ、高い伝送品質と高い伝送効率を同時に実現できることを確認した。更に,OFDMサブキャリア間の直交性を利用するMIMO-OFDM伝送方式を提案し,計算機シミュレーションにより検討した。その結果,提案方式は従来の時空間符号化(STC)MIMO-OFDM伝送方式と比べ、周波数利用効率が若干劣るものの、同程度の伝送品質を達成できることが確認された。提案システムは伝送路推定や受信側の複雑な信号処理が不要なため,システムの複雑さと消費電力を大幅に減少できることが期待される。
運動介入による主観的睡眠評価と健康関連QOLに関する縦断的研究

本研究は、生活習慣病対策の戦略として睡眠に対する取組みに資することを目的に、青森県弘前市岩木地区に在住する一般住民を対象として、成人健診および運動教室(介入調査)を行った。その結果、睡眠状況と抑うつ傾向、QOL、肥満との関連が明らかとなった。また、運動習慣の改善は代謝機能、抑うつ傾向に影響し、運動が心身に良好な影響を及ぼすことが示唆された。本研究より、睡眠障害の予防と良好な睡眠習慣の獲得には精神的サポートが重要であり、継続的な運動は身体的・精神的健康の向上に寄与することが期待された。1.目的:本研究は,生活習慣病予防の主たる対象である地域住民に焦点を当て,身体活動の実践が主観的な睡眠の質と関連するという仮説のもと,運動習慣改善を意図した介入プロジェクト受講による主観的睡眠評価および健康関連QOLの縦断的変化を検討することである。平成21年度はこの目的に従って,地域住民(一般成人)を対象に,対象者の生活習慣(睡眠習慣),身体活動状況等の状況を把握することとし,以下の方法により調査を行った。なお,本研究は岩木健康増進プロジェクト(弘前大学医学部社会医学講座)と連携のもと実施した。2.方法(1)対象者:青森県弘前市岩木地区に在住する住民で,岩木健康増進プロジェクト成人健診に参加した一般成人約1000名である。(2)調査期間は平成21年5月下旬の10日間とした。(3)測定項目:(1)アンケートにより個人属性,生活習慣,抑うつの有無等を聞き取った。(2)身体組成値,(3)血液生化学検査,(4)各種身体機能検査である。本調査では,睡眠と年齢,肥満の関連について検討した。(4)結果:睡眠時間は加齢と共に,長くなる傾向があった。年代別では女性の20-30歳代,男性の40-50歳代において,6.0時間未満睡眠群と比較して6.0-7.9時間睡眠群,8.0時間以上睡眠群ではオッズ比が有意に低かった。睡眠の質では年代差を認め,20-30歳代では質の評価が低く,一方で加齢と共に,入眠障害や中途覚醒する割合が増加する傾向があった。3.介入活動:2.を受け,平成22年1月から,週1回の健康教室および月1回の栄養教室を実施している(6カ月の実施予定,参加者約60名)。上記健診結果をもとに,特に運動・栄養に関する介入活動を実施中である。これより,本研究の事前計画通りに,今後健診を実施すると共に,効果を検証し,この結果に基づいた運動・栄養に関する介入活動を継続検証する。平成22年度はこの目的に従って,地域住民(一般成人)を対象に,対象者の睡眠習慣を時間と質の観点からとらえ、睡眠障害と生活習慣の関連を把握することとし,以下の方法により調査を行った。(2)調査期間は平成22年5.月下旬の10日間とした。(3)測定項目:(1)アンケートにより生活習慣の聞き取りを行い、ピッツバーグ質問票(PSQI)により睡眠障害を判定した。本調査では,対象者を男女別に分類し,若年群,中年群,高齢群に区分した上で睡眠障害と生活習慣の関連について検討した。(4)結果:男女ともすべての年代において,睡眠障害と抑うつ度(CES-D得点)との間に正の相関を認め,睡眠が障害されているほど、抑うつ傾向が強かった。また、男性の中年群では睡眠障害とBMIとの間に正の相関を認めた。以上より睡眠障害の予防と良好な睡眠習慣獲得のためには直接的かつ包括的なメンタルヘルス対策が重要であり,これよりQOLの改善か可能であることが示された。3.介入活動:平成21年度(第1回目)は平成22年1月6月の期間で週1回の健康教室および月1回の栄養教室を実施しており(参加者約60名),平成22年度(第2回目)は,平成22年12月より前年度の内容に準じて実施している。2.の結果および上記健診結果をもとに,特に運動・栄養に関する介入活動を実施中である。次年度の健診において評価予定である。

1.目的:本研究は,生活習慣病予防の主たる対象である地域住民に焦点を当て,身体活動の実践が主観的な睡眠の質と関連するという仮説のもと運動習慣改善を意図した介入プロジェクト受講による主観的睡眠評価および健康関連QOLの縦断的変化を検討することである。平成23年度はこの目的に従って,成人健診および運動・栄養に関する介入活動より,以下の各種指標について調査,測定を行った。なお,本研究は岩木健康増進プロジェクト(弘前大学医学部社会医学講座)と連携のもと実施した。2.成人健診(1)方法・対象:青森県弘前市岩木地区に在住する住民で,岩木健康増進プロジェクト成人健診に参加した一般成人約1000名である。(2)調査期間:平成23年5月下旬の10日間とした。(3)測定項目:(1)アンケートによる生活習慣等の聞き取り調査(2)身体組成値,(3)血液生化学検査,(4)各種身体機能検査である。本調査では,対象者を男女別に分類し,若年群,中年群,高齢群に区分した。(4)結果:男女とも高齢群では睡眠時間が長く,若年群・中年群では睡眠の質を悪いと評価する者が多かった。睡眠障害と健康関連QOLにおいて,身体的健康度が良い者より悪い者では,睡眠障害のオッズ比が高かった。これは,精神的健康度においても同様の傾向を認めた,睡眠障害はQOLの低下に影響することが推測された。3.運動・栄養に関する介入活動(1)方法・対象:岩木地区に在住する住民約100名を対象とした。(2)実施期間:1回/週(2時間/1回)の健康実践教室を6カ月間とした。(3)測定項目:2.成人健診の内容に準じ教室前後の変化を検討した。(4)結果:運動教室後では運動習慣は増加,また,抑うつ傾向,身体組成値,脂質代謝は改善したが,喫煙・飲酒習慣,睡眠習慣,QOLでの変化は見られなかった。本研究の結果から、低頻度の運動介入は心身に良好な影響を及ぼすことが示唆された。これらが具体的な生活習慣の改善,QOLの向上につながるよう,今後は影響因子を多角的に検討する必要がある。
環境ストレスによるゲノム損傷の修復を制御する新たな分子機構の解明

哺乳類ヌクレオチド除去修復(NER)の損傷認識に関わるXPC、DDB2タンパク質の翻訳後修飾(ユビキチン化、SUMO化)に着目し、NERの時空間的制御に関わる新たな分子機構の解明を目指した。紫外線照射によって誘導されるXPCの可逆的なユビキチン化に関しては、脱ユビキチン化因子として同定されたプロテアソームサブユニットの発現抑制を行い、ユビキチン化XPCの蓄積が損傷部位へのXPCのリクルートを遅延させることを見出した。一方、XPCのSUMO化反応のin vitro再構成とSUMO化部位の同定を行い、非SUMO化変異XPCを安定発現する細胞において紫外線照射後のNER反応が遅延すること、またユビキチン化の誘導が減弱することを示した。特に後者は、XPCとDDB2との相互作用にSUMO化が関与している可能性を強く示唆した。さらにCRL4^<DDB2>ユビキチンリガーゼによるDDB2自己ユビキチン化の標的部位を明らかにするとともに、DDB2のユビキチン化が修飾部位によってタンパク質分解と損傷DNAからの解離という異なる機能を持つ可能性を見出した。ヌクレオチド除去修復(NER)の開始段階に必須であるDNA損傷認識因子XPCについて、我々が既に見出した翻訳後修飾(ユビキチン化、SUMO化)に着目し、それぞれの修飾を受けるリジン残基の特定、および修飾・脱修飾に関わる因子の同定を行う。決定された修飾部位に変異を導入したXPCの組換えタンパク質をバキュロウイルス系を用いて発現・精製し、生化学的な性状変化を解析するほか、これらの変異体を安定に発現する形質転換細胞株を単離して、細胞レベルでのNER活性、DNA損傷に伴うタンパク質の安定性や動態変化、およびチェックポイントや細胞死誘導に関わるシグナリングに対する変異の影響などを体系的に調べる。また、修飾部位を特異的に認識する抗体の作成やGFP再構成システムを構築することにより、それぞれの修飾の時空間的動態制御を観察するとともに、相互の機能的連関を明らかにする。さらに、修飾タンパク質と特異的に相互作用する因子を探索することにより、修飾が直接影響を与える細胞機能について分子レベルでの知見を得る。細胞の紫外線照射に伴って一過性に誘導されるXPCのポリユビキチン化の意義と脱ユビキチン化機構を詳しく解析する目的で、ヒト正常線維芽細胞を親株としてDDB2を安定に過剰発現することにより、XPCのユビキチン化の増強が見られる細胞株を樹立した。この細胞を用いて、PSMD14以外の脱ユビキチン化酵素がXPCの脱ユビキチン化に関わる可能性をsiRNAライブラリを用いて検討したが、単独でXPCの脱ユビキチン化を遅延させるものは特に見出されなかった。この細胞でPSMD14をノックダウンしたところ、紫外線非照射時においてもXPCのユビキチン化が低レベルながら観察され、また紫外線照射後のDDB2の分解が遅延することがわかった。一方、精製タンパク質を用いてXPCのSUMO化反応をin vitroで再構成することに成功した。XPCにはSUMO化コンセンサス配列に合致するリジン残基が複数か所存在するが、これらのリジンをさまざまな組み合わせでアルギニンに置換した変異XPCタンパク質をバキュロウイルス発現系を用いて発現・精製したものを、in vitro SUMO化反応系に加えて検討した。その結果、少なくともXPCのN末端近傍の3か所のリジン残基がSUMO化されうることが明らかになった。そこで内在性のXPCを発現していないXP4PASV細胞を親株として、この3か所のリジンをアルギニンに置換した3KR変異体を生理的レベルで安定に発現する細胞株を樹立した。野生型XPCを発現するコントロール細胞と比較して、この3KR変異体を発現する細胞株は紫外線感受性の点では特に異常を示さなかった。しかしながら、紫外線照射後の(6-4)光産物の修復速度を測定したところ、野生型XPCを発現する細胞に比べて有意な修復の遅延が認められた。この細胞におけるXPCのユビキチン化、および修復の異常について詳しい解析を進めている。昨年度までにin vitroSUMO化反応系を用い、XPCタンパク質の少なくとも3か所のリジン残基がSUMO化を受けることを明らかにし、これらのリジンをアルギニンで置換したXPC 3KR変異体を安定に発現するヒト細胞株を樹立した。

この細胞株に紫外線を照射したところユビキチン化によるバンドシフトが観察されたことから、ユビキチン化はSUMO化とは異なる部位で起こるものと考えられた。一方、XPCユビキチン化の経時変化を詳しく調べたところ、野生型XPCと比較して3KR変異体は紫外線照射後のユビキチン化のピークが遅れ、かつユビキチン化がより長く持続する傾向が認められた。それに対して、XPC 3KR変異体のN末端にSUMO-1を融合したタンパク質を安定発現する細胞株を作成したところ、ユビキチン化のパターンは野生型XPCと同様であったが、興味深いことに野生型XPCのN末端にSUMO-1を癒合すると紫外線照射後に出現するユビキチン化XPCの消朱は野生型よりもむしろ促進されるように見受けられた。すなわちXPCタンパク質におけるユビキチン化とSUMO化は修飾部位こそ異なるものの、SUMO化がユビキチン化(あるいは脱ユビキチン化)に対して何らかの制御機能を有することが示唆された。現在、野生型XPCとXPC 3KR変異体、およびそれぞれのSUMO-1融合体を安定発現する細胞株を用いて紫外線照射後のヌクレオチド除去修復活性、チェックポイントやアポトーシス誘導などの細胞応答の解析を進めると共に、SUMO化XPCと特異的に相互作用する因子の探索を開始している。これまでの研究で、19Sプロテアソーム・サブユニットの一つであるPSMD14が紫外線照射後のXPCの脱ユビキチン化に関わることが示唆された。そこでPSMD14の発現抑制が細胞のヌクレオチド除去修復(NER)活性や修復タンパク質の動態に及ぼす影響を詳細に解析した。その結果、特にDDB2を安定に過剰発現する細胞でPSMD14をノックダウンした上で紫外線を細胞全体に照射し、ユビキチン化XPCの蓄積を誘導した状態でさらに細胞核内に局所紫外線照射を行うと、XPCの損傷部位への集積に大幅な遅延が見られた。この結果は、紫外線損傷部位でUV-DDB E3リガーゼによってユビキチン化されたXPCが次の損傷認識に移行する際に脱ユビキチン化を必要とする可能性を示唆するものである。一方、細胞をプロテアソーム阻害剤で処理すると紫外線照射によるXPCユビキチン化の誘導が著しく減弱するという現象が見出された。この時、細胞内の遊離ユビキチンは必ずしも枯渇しておらず、プロテアソームの阻害がUV-DDB E3リガーゼの活性化に何らかの影響を与えていることが示唆された。さらに興味深いことに、プロテアソーム阻害剤処理によって紫外線照射後にDDB2がクロマチンに結合したまま解離せず、その結果(6-4)光産物の修復がDDB2の発現レベル依存的にブロックされることがわかった。我々は以前にin vitroの実験から、DDB2のユビキチン化によってUV-DDBが損傷DNA結合能を失うことを見出し、UV-DDBからXPCへの損傷の受け渡しがユビキチン化により促進される、というモデルを提唱した。今回得られた結果はこのモデルを強く支持するものであり、UV-DDBE3リガーゼの活性化機構とDDB2のユビキチン化部位の同定に関して現在解析を進めている。これまでにXPCタンパク質のSUMO化部位として3か所のリジン残基を同定し、それらをアルギニンに置換したXPC 3KR変異体を安定発現する細胞株を樹立したところ、野生型XPC発現株に比べて紫外線照射後の(6-4)光産物の修復に遅延が見られた。
食品の抗酸化活性を基準にした調理方法の評価と応用

1.『サラダにおける食品中の抗酸化活性の相互作用と調味料の効果』(1)研究目的「トマトと一緒にキュウリを摂取すると、キュウリのもつ酵素によって、トマトに含まれるアスコルビン酸が減少する」という情報が取りあげられることがあるが、接触状態の違いによる抗酸化活性の低下や、ドレッシングなどの調味料により、抗酸化活性の低下が抑制されるか否かを検討し、アスコルビン酸量を定量することでその仮説が正しいかを証明する。(2)研究方法抗酸化活性の測定には、DPPHを用いたラジカル消去活性測定法を用いて行った。アスコルビン酸量の測定には、インドフェノール法とヒドラジン法を併用して行った。(3)研究成果トマトとキュウリのホモジネートを混合することでトマトの抗酸化活性は低下し、アスコルビン酸量の低下が見られた。このことから、アスコルビン酸の減少が抗酸化活性の低下原因と考えられる。食酢に30分浸けたキュウリを用いると、トマトの抗酸化活性の低下は抑制された。カットしたキュウリと接触させたトマトの抗酸化活性もほとんど低下しなかった。これらの結果から、サラダとして盛りつけた状態では酵素の影響はほとんどなく、さらにドレッシングを使用することは、トマトのアスコルビン酸の保持に効果的と考えられる。2.『調理におけるリンゴのもつ抗酸化活性の変化』(1)研究目的リンゴによく用いられる加熱処理や食塩水処理など、様々な調理方法に着目し、これらがどの程度のリンゴの持つ抗酸化活性に影響を与えているかを調べる。(2)研究方法テーマIに同じ(3)研究成果蒸すことで活性は保持されると同時に褐変しなくなった。冷凍すると活性は保持されるが褐変は解凍とともに進行した。食塩水で処理すると褐変は抑えられたが、抗酸化活性が低下し、浸けた食塩水からはアスコルビン酸が検出された。しかし、なにも処理をせず放置したリンゴが抗酸化活性の低下が最も大きかった。
ミオシン少数分子間の動態を可視化する１分子計測法に基づく協同性の検証

本研究課題では,骨格筋ミオシン分子間力発生の協同性を検証するために,長さ1ミクロン程度のミオシンフィラメント上におけるミオシン2-3分子の動態を直接捉える計測に挑戦してきた.特にミオシンフィラメント片側半分の約400nm程度に位置するミオシン2-3分子の動態を個別に捉えるためには,回折限界内の分子の運動をとらえる必要がある.そこで,東京大学上田正仁教授のグループが開発された超解像イメージング法を用いて,回折限界内の約200nm程度の間隔に位置するミオシン2-3分子の動態を個別に抽出することを試みた.これらの分子は制御軽鎖にビオチンタグを入れてあるため,アビジン化量子ドットで標識することが可能であり、1点にみえる元の蛍光輝点が超解像イメージング法により2-3粒子の輝点に分離され,各ミオシン分子の動態を個別に検出できるようになった.このような超解像技術を用いて,1秒間に100フレームという高周波数で回折限界内の数分子をとらえた事例はなく,非常に注目度が高い将来性のある手法を確立出来たと感じている.我々の実験では,レーザーを絞り40ミクロン四方の範囲において高光密度で量子ドットを励起するため,取り得る限界のフォトン数にて量子ドットの蛍光像をEM-CCDカメラに撮ることが可能であり,100フレーム/秒の高速撮影でも3nmの精度での計測が可能となった.実験結果を解析すると,アクチンとの相互作用前には各ミオシン変位間の相関は殆どないが,アクチンと相互作用が始まると時折相関が非常に高くなることが確認され,各分子の動きが同調してくる傾向が示唆された.またこれまでは全く測られたことの無い,アクチンと相互作用時のミオシン頭部のゆらぎ範囲も見えて来た.今後はATP濃度や負荷を与えるなど外部環境変化を変えて各分子動態の変化を評価していく予定だが、そのベースとなる実験系の構築に成功した.27年度が最終年度であるため、記入しない。27年度が最終年度であるため、記入しない。本研究の目的は,タンパク質が集合体を形成するに際して,1分子の機能が集合体においてどのように拡張され,集合体の機能発現に繋がっているのかを検討するため,骨格筋ミオシン集合体をつかった実験系を構築し,ミオシン分子間における協同的な現象を可視化することである.本研究では,分子集合体の複数の分子を同時に可視化する顕微鏡技術を用いて,分子間の協同性を直接検証する画期的な実験を遂行していく.本年度では,大きく分けて2つの点にフォーカスした.1)アビジン化した金コロイドや量子ドットが非特異的に結合しないガラス基板処理の検討.2)蛍光分光顕微鏡を用いた実験方法の最適化.ガラス基板の表面処理に関しては,ガラス面をプラズマ処理し親水性を高め,そこにカゼイン(0.5-1.0 mg/ml)と界面活性剤体Pluronic F127 (1%)を混合したブロッキング溶液を入れることで,アビジンのガラス基板への非特異的吸着を劇的に軽減することに成功した.一方,蛍光分光顕微鏡においては,理研QBiCの市村垂生研究員の開発された顕微鏡を使用して,ミオシンフィラメント上の複数分子を蛍光波長の異なる量子ドットで標識し,各分子の挙動を同時に測ることに成功した.またアクチンの蛍光像も同時に観察する必要があり,アクチンフィラメントはローダミンで標識し,一方ミオシンは量子ドット525,565,585で標識することが最適であった.実験では,通常の蛍光像では回折限界内にあるため識別できない蛍光像2点(ミオシン2分子)を分光することで,分離して解析することができ,アクチンとの相互作用時における各々の変位を計測することに成功した.今後は,この実験系で計測を繰り返し,市村博士との共同研究の元,光ピンセットなどを組み込んで,より本研究に適した顕微鏡システムに構築していく予定である.本研究課題では,骨格筋ミオシン分子間力発生の協同性を検証するために,長さ1ミクロン程度のミオシンフィラメント上におけるミオシン2-3分子の動態を直接捉える計測に挑戦してきた.特にミオシンフィラメント片側半分の約400nm程度に位置するミオシン2-3分子の動態を個別に捉えるためには,回折限界内の分子の運動をとらえる必要がある.そこで,東京大学上田正仁教授のグループが開発された超解像イメージング法を用いて,回折限界内の約200nm程度の間隔に位置するミオシン2-3分子の動態を個別に抽出することを試みた.これらの分子は制御軽鎖にビオチンタグを入れてあるため,アビジン化量子ドットで標識することが可能であり、1点にみえる元の蛍光輝点が超解像イメージング法により2-3粒子の輝点に分離され,各ミオシン分子の動態を個別に検出できるようになった.このような超解像技術を用いて,1秒間に100フレームという高周波数で回折限界内の数分子をとらえた事例はなく,非常に注目度が高い将来性のある手法を確立出来たと感じている.

我々の実験では,レーザーを絞り40ミクロン四方の範囲において高光密度で量子ドットを励起するため,取り得る限界のフォトン数にて量子ドットの蛍光像をEM-CCDカメラに撮ることが可能であり,100フレーム/秒の高速撮影でも3nmの精度での計測が可能となった.実験結果を解析すると,アクチンとの相互作用前には各ミオシン変位間の相関は殆どないが,アクチンと相互作用が始まると時折相関が非常に高くなることが確認され,各分子の動きが同調してくる傾向が示唆された.またこれまでは全く測られたことの無い,アクチンと相互作用時のミオシン頭部のゆらぎ範囲も見えて来た.今後はATP濃度や負荷を与えるなど外部環境変化を変えて各分子動態の変化を評価していく予定だが、そのベースとなる実験系の構築に成功した.初年度では,当初,金コロイドを標識したミオシン頭部のダイナミクスを高時間分解能で観察し,さらに並進方向だけでなく,回転方向も把握するために,ナノロッドを結合させた実験系を構築していく予定であった.しかし,金コロイドのガラス基板に対する非特異的な結合が著しく,計画を変更せざる得ない状況となった.結果的に,非特異的な結合を削減する表面処理方法を決定できたことは大きな前進であるが,当初の計画とは随分変更となった.その一方で,次年度に行う予定であった分光顕微鏡を用いた実験の方が進展し,ほぼ実験条件が決定した.ただし,現在は東京から大阪のQBiCに出向いて実験しているため,実験回数が少なく十分なデータを取れないのが難点である.また,計測中は分光像しか確認できないため,実際にどのような相互作用が起きているのか把握することができず,データの理解が困難であり,解析がそれほど進められていない.こうした問題が,データ解析を遅延させた.27年度が最終年度であるため、記入しない。分光顕微鏡に関しては,実験方法は決定したが,本研究に適した装置により最適化していく必要が有る.ミオシン分子間の協同性については負荷依存性を検討することが重要であり,そのためには分光顕微鏡に光ピンセットを組み込む必要がある.さらに,分光像とともに実像を同時にモニタリングする必要があり,そうした光学系をシステムに組み込んでいく必要が有る.こうした点を踏まえて,今年度は分光顕微鏡を申請者のもつ顕微鏡に組み込んで,実験を繰り返していく.また,ガラス基板の表面処理法も最適化されたので,金コロイドによる実験を再開していく.まずは,ミオシンに標識した金コロイドが非特異的にガラス面に結合していないか確認するため,アクチンとATP非存在下で硬く結合させ,アクチンにビーズをつけて光ピンセットで引っ張り,アクチンの動きと相関して,ミオシン頭部の金コロイドが変位するか確認していく.こうした検証実験での確認の後,金コロイドの実験を再開していく.27年度が最終年度であるため、記入しない。
定言命法の体系とその実現のための技術的仮言命法の創出に関する研究

イマヌエル・カントの晩年の実践哲学体系書である『人倫の形而上学』を、《定言命法の体系》として読み解いていった。《批判倫理学》における「定言命法」理解とは異なり、『人倫の形而上学』においてはそこに含まれる法義務や徳義務がいずれも定言命法と呼びうるものであり、それらが体系的全体を成していることを明らかにした。さらにカント自身は明言しなかったものの、定言命法だけでは人間の行為・実践を導くことができず、定言命法を現実世界において実現するため技術的仮言命法が必要であることを明らかにした。哲学カフェといった思想運動を、そのような具体的な仮言命法のひとつとみなして福島の地で実践し、その有効性を検討した。研究目的のうちの『道徳形而上学』を「定言命法の体系」として読み解いていくという部分に関しては、「徳の定言命法の体系」ならびに「全体の結論」にあたる部分を執筆し、博士論文指導教員に当たる法政大学の牧野英二教授のもとで指導を受けた。この部分は当初の予定より若干進行が遅れているので、まとめ終えるにはいたらなかったが、次年度においてまとめきるためにはどのような手立てが必要かということも含めて、内容ならびに研究の進め方に関してきめ細かい指導を受けることができた。その指導にもとづき、すでに執筆を終えていた「90年代におけるカントの自律概念」の部分について手直しをした上で、学内の紀要論文として発表した。また、カントの法・政治哲学に関する研究書としてひじょうに高い評価を受けているケアスティングの『自由の秩序』の翻訳(共訳)を終え、ミネルヴァ書房から刊行することができた。研究目的の後半部分、定言命法を実現するための技術的仮言命法を現実の社会の中で開発していくという部分に関しては、当初の計画では次年度から「てつがくカフェ」を福島で開催する予定であったが、こちらは前倒しですでに前年度からプロジェクトを開始することができており、今年度も引き続き月に1回のペースで「てつがくカフェ@ふくしま」を開催し続けることができた。本年度は「本deてつがくカフェ」に加えて「シネマdeてつがくカフェ」という新しい形態も始めることができた。また3月10日には「てつがくカフェ@ふくしま特別編3」として、原発問題を扱って多くの一般市民と対話の場を設定することができた。研究目的のうちの『人倫の形而上学』を「定言命法の体系」として読み解いていくという部分に関しては、博士論文指導教員に当たる法政大学の牧野英二教授のもとで指導を受けながら、全体の構成について詰めていった。全体構成に関する当初の計画を若干修正したり、訳語の選定の変更や、既発表論文をどのように手直しして繋げていくかなど、細かい最終調整の段階に入っている。また、前年度に執筆した「《徳の定言命法》の体系」の部分について手直しをした上で、学内の紀要論文として発表した。研究目的の後半部分、定言命法を実現するための技術的仮言命法を現実の社会の中で開発していくという部分に関しては、初年度より継続的に月1回のペースで「てつがくカフェ@ふくしま」を開催し続けている。本年度は、地域の文化発信スペースとして名高い映画館「フォーラム福島」と提携して「シネマdeてつがくカフェ」を開催することができた。映画『ハンナ・アーレント』を題材とした「シネマdeてつがくカフェ」には100名近くの参加者が集い、これまでになく大きなムーブメントとなった。また静岡で「てつがくカフェ@しぞか」を立ちあげようとしていた人々に招かれ設立記念講演を行った。また、3月15日には「てつがくカフェ@ふくしま特別編4」として、原発問題を扱って多くの一般市民と対話の場を設定することができた。また、参加者への聞き取り調査なども開始した。さらに研究目的の後半部分に関しては「てつがくカフェ」という社会的実践ばかりでなく、理論的研究も進めることができた。日本カント協会の公開シンポジウム「カントと日本国憲法」において、「日本国憲法における定言命法と仮言命法」と題する提題発表を行い、カント研究者や憲法学者と議論を交わすことができた。A「定言命法の体系」に関する研究について後述するように平成23年度はBの研究が想定以上に進展してしまったため、文献収集はそれほど行えなかった。しかしながら、法政大学牧野英二教授の指導を受けたり、また日本倫理学会の共同討議の場で、カント倫理学のエッセンスについて報告する機会を得て、カント専門家以外の多くの哲学・倫理学研究者から「定言命法の体系」という構想に対して意見を賜ることができた。

B「技術的仮言命法の創出」に関する研究についてこちらに関しては、はじめのうちは各地の哲学カフェ等の視察に費やし、4年間の研究期間のうち後半2年間に重点的に取り組む予定にしていたが、前年度末に発生した東日本大震災ならびに福島第一原発事故を承けて、「てつがくカフェ@ふくしま」を早急に立ち上げる必要が生じ、平成23年5月22日に第1回「てつがくカフェ@ふくしま」を開催することができた。その後、ほぼ月1回のペースで開催することができ、平成23年10月22日と平成24年3月10日には、法政大学サステイナビリティ研究教育機構の協賛を得て、「特別編」と題して、震災と原発事故をテーマに大々的に開催することができた。通常の「てつがくカフェ」には常時20名前後、「特別編」のときには50名前後の参加者を得て、一般市民が自分の頭で考え、互いに意見を開陳し、相互に傾聴しあうという貴重な場を提供することができた。その試みは全国紙や地方紙、ラジオ等でたびたび取り上げられ、その宣伝効果により参加者は全国各地から集まってくるようになった。研究目的のうちの『人倫の形而上学』を「定言命法の体系」として読み解いていくという部分に関しては、博士論文指導教員に当たる法政大学の牧野英二教授のもとで指導を受けながら、全体の構成や細かい表現の修正、注や参考文献一覧の作成など、実際に提出する最終段階の原稿を作成していった。また第9章にあたる「《法の定言命法》の体系」の部分について手直しをした上で、学内紀要論文に投稿した。最終段階において内容の修正を余儀なくされたので、残念ながら年度内に完成・提出することは叶わなかったが、次年度早々に提出する方向で仕上げにかかっている。研究目的の後半部分、定言命法を実現するための技術的仮言命法を現実の社会の中で開発していくという部分に関しては、初年度より継続的に月1回のペースで「てつがくカフェ@ふくしま」を開催し続けており、前年度から始まった、地域の文化発信拠点「フォーラム福島」と提携しての「シネマdeてつがくカフェ」も今年度は4回開催することができ、それぞれ多くの参加者を集めることができた。これらの活動は全国紙や地方紙で何度も取り上げられている。毎年3月に行っている「てつがくカフェ@ふくしま特別編」も第5回を迎え、「フォーラム福島」で映画『小さき声のカノンー選択する人々』を上映し、鎌仲ひとみ監督も迎えて100名近い参加者とともに原発事故問題に関して哲学的対話を展開した。こうした活動について、高千穂大学連続講義の中で「民主主義の危機と哲学的対話の試み」と題する発表をし、その現代的・社会的意義を分析した。さらに研究目的の後半部分に関して、前年度に公開シンポジウムで発表した「日本国憲法における定言命法と仮言命法」を日本カント協会の学会誌に掲載した。倫理学研究目的の前半部分と後半部分に分け、当初の計画では最初の2年間で前半部分を終了し、後半部分に関しては最初の2年間は準備期間と位置づけ、後半の2年でそちらを本格的に始動させる予定であった。ところが、思いの外に、後半部分が研究期間の最初期からフル稼働し始めてしまい、それは予想外の成果であったが、その分前半部分の研究の進行が遅れてしまうことになった。研究目的の達成度として考えるならば、前半部分は50%、後半部分は80%ということになるだろうか。全体を平均してみるならば65%くらいの達成度であり、4年間という研究期間のうちの半分を終えたところとしては、当初の計画よりも順調に進んでいると言えよう。
ビオチントランスポーターのキャラクタリゼーション

ビオチンは生物の生育に欠かすことのできない物質(ビタミン)で、脂肪酸の合成などにおいて重要な役割を果たしている。その細胞内での作用の仕組みは近年かなり良く分かってきたが、食餌等から取り入れたビオチンがどのようにして細胞内へ到着するかについてはあまり良く分かっていなかった。他のビタミン等と同様に、ビオチンの細胞内への輸送には、特有のトランスポーターが介在することが知られていたが、その実体は殆ど不明であった。私どもはo461といして知られていた大腸菌の仮想的な膜タンパク質の遺伝子を破壊することによって細胞内へのビオチンの取り込みが顕著に減少することから、このものが大腸菌のビオチントランスポーターの遺伝子をコードすることを突き止めた。そこで酵母やヒトなどの真核生物のビオチントランスポーターの同定にも取り組んだが、研究が進行中に外国のグループによって先に報告されてしまった。興味深いことに、大腸菌と酵母のビオチントランスポーターのアミノ酸配列に必ずしも高い相同性はなく、また哺乳類のトランスポーターはビオチンの他にリポ酸やパントテン酸も輸送する多機能のものであった。一方、細胞内へ取り込まれたビオチンの働きについても精力的に研究を進めた。ビオチンはアセチル-CoAカルボキシラーゼやピルビン酸カルボキシラーゼなどの補酵素として重炭酸の固定に重要な働きをしている。これらの酵素は複数の機能ドメインをもつ複雑な構造の酵素であるが、各ドメインの役割およびビオチンの働きを解明するために、触媒機能に不可欠と推測される残基の部位特異的変位を行ったり、当該ドメインを酵素間で入れ替えたキメラ型の酵素を作製し、性質を調べた。これらの研究によって、ビオチンの機能と働きを一層良く理解できるようになった。ビオチンは生体内でカルボキシル化、カルボキシル基転移および脱炭酸に関与する補酵素である。ビタミンを合成できない高等真核生物では、食餌から取り込んだビオチンの細胞内への取り込みは死活問題である。ビオチンの輸送に関わるのが、ビオチントランスポーターである。ビオチンを合成できる微生物にもビオチントランスポーターが存在して、古くからかなり研究がなされているが、依然としてその実体は不明であった。大腸菌の場合、染色体上で86分付近に存在するbioP遺伝子がビオチントランスポーターと言われてきたが、正確な同定はなされていなかった。そこでまず、その同定を目指した。86分付近に存在する遺伝子の中で、機能が不明で、疎水性が高く、既知のトランスポーターにアミノ酸配列が類似していることを指標に調べた結果、o461が最も可能性の高い候補となった。それを確かめるために、この遺伝子を破壊し、ビオチン輸送能がどう変化するかを調べた。常法に従って作製した破壊株のビオチン輸送能は野生株の半分くらいに落ちていたが、予想した程大きな減少ではなかった。この原因を現在探求中である。酵母のビオチントランスポーターについても、その実体は皆目分かっていない。0461が大腸菌のビオチントランスポーターであるとして、アミノ酸配列の相同性から、酵母のビオチントランスポーターの可能性がある遺伝子をいくつか選び、遂一それらを破壊し、ビオチンの輸送能がどのような影響を受けるかを調べている。また、高等動物のビオチントランスポーターのモデルとして、線虫のビオチントランスポーターの研究にも着手した。ビオチンは生物の成育に欠かすことのできない物質(ビタミン)で、脂肪酸の合成などにおいて重要な役割を果たしている。その細胞内での作用の仕組みは近年かなり良く分かってきたが、食餌等から取り入れたビオチンがどのようにして細胞内は到達するかについてはあまり良く分かっていなかった。他のビタミン等と同様に、ビオチンの細胞内への輸送には、特有のトランスポーターが介在することが知られていたが、その実態は殆ど不明であった。

私どもはo461として知られていた大腸菌の仮想的な膜タンパク質の遺伝子を破壊することによって細胞内へのビオチンの取り込みが顕著に減少することから、このものが大腸菌のビオチントランスポーターの遺伝子をコードすることを突き止めた。そこで酵母やヒトなどの真核生物のビオチントランスポーターの同定にも取り組んだが、研究が進行中に外国のグループによって先に報告されてしまった。興味深いことに、大腸菌と酵母のビオチントランスポーターのアミノ酸配列に必ずしも高い相同性はなく、また哺乳類のトランスポーターはビオチンの他にリポ酸やパントテン酸も輸送する多機能のものであった。一方、細胞内へ取り込まれたビオチンの働きについても精力的に研究を進めた。ビオチンはアセチル-CoAカルボキシラーゼやピルビン酸カルボキシラーゼなどの補酵素として重炭素の固定に重要な働きをしている。これらの酵素は複数の機能ドメインをもつ複雑な構造の酵素であるが、各ドメインの役割およびビオチンの働きを解明するために、触媒機能に不可欠と推測される残基の部位特異的変異を行ったり、当該ドメインを酵素間で入れ替えたキメラ型の酵素を作製し、性質を調べた。これらの研究によって、ビオチンの機能と働きを一層良く理解できるようになった。
熱流体解析による補助循環システムの血液適合性評価法の提案

血液ポンプの血液適合性は血流に依存することから,ポンプ内血流に注目したポンプ設計がなされているが,ここでは,より実使用条件に近い計算および実験流体力学解析に基づく血液適合性評価方法について検討した.心室内の血流に注目し,特定の脱血管開口部形状,挿入深度および角度の組み合わせにより,心室内腔面の洗い流し効果が向上することを示した.また,部分補助下の血流解析を行い,心駆出率,ポンプ接続方式およびポンプ特性による心室内血流の変化を明らかにした.さらに,溶血試験の結果を左右する,使用血液の品質を検査する方法として,血球脆弱性を簡便に評価する方法について検討し,その妥当性を確認した.本研究では,補助循環システムの血液適合性評価に向けて,実使用環境を想定した血流動態解析および血球損傷度を評価する新たな方法について検討した.心室内血流解析:計算機上に左心室内腔形状をモデルリングし,連続流補助循環装置による拍出補助下の心室内血流の数値解析を行い,脱血管配置が血流動態に与える影響を調べた.脱血管を内壁にほぼ平行に配置したとき,心室内壁に沿う流れが誘起され,脱血管の挿入基部付近を含む領域の洗い流し効果向上が期待されることが示された.また,計算手法の改善として,重合メッシュの使用について検討した.心室内腔モデル(流体領域)と脱血管モデル(固体領域)とを別個にメッシュ生成した後に,両メッシュを重ね合わせ,固体領域内に含まれる流体を静止させるように生成項を付加して流体解析を行ったところ,従来の心室・脱血管統合モデルを用いた解析と同様の結果が得られ,解析方法の妥当性が確認された.これにより,脱血管形状の変更,挿入方向,深度の変更の度毎のメッシュ生成が不要となり,大幅な省力化が達成される.血球損傷度評価法:これまでの溶血試験法では,膜破断による血球崩壊のみを扱っており,崩壊前の損傷赤血球を評価対象としていない.また,動物血を使用しているため,試験結果がその血液の初期性状に依存してしまう.そこで,血球の性状,損傷度を光学的に簡便に評価する方法について検討した.極微量の血液を生理食塩水で希釈した試料に同量の蒸留水を加えて浸透圧溶血を引き起こし,このときの試料溶液の光透過率を連続計測した.せん断負荷の有無および試験用血液の保存状態により,透過率変化の時定数に明確な差異が認められたことから,本手法による血球損傷度評価の可能性が示された.補助人工心臓血液ポンプの開発においては,血液適合性の向上を目指して設計がなされる.最近では,設計段階において数値流体解析の使用が進められているが,ポンプ内部に限定した解析がほとんどである.本研究課題では,ポンプ上流の脱血管および心室を含め,実使用環境に近い条件を想定した解析方法について検討し,その中でいくつかの知見を得た.左室内腔形状を計算機上でモデリングし,連続流ポンプによる完全補助状態における左室内血流を数値解析した.また,同一形状の透明シリコーン製流路を作製し,計算と同条件の実験を行い,粒子画像流速測定法により流速分布を測定し,両者の比較から数値解析の結果の妥当性を確認した.脱血用カテーテルの先端形状,挿入深度,挿入角度による左室内血流パターンおよび壁せん断応力分布の変化を調べ,特に,挿入方向を前壁に平行にした場合および複数の側面孔を脱血管先端付近に設けた場合に,低壁せん断応力領域が有意に減少し,壁面洗い流し効果の向上が期待されることを示した.また,計算手法の改善として,心室内腔モデルと脱血管モデルについて別々に生成したメッシュを重ね合わせて計算する重合メッシュ法の適用について検討し,計算モデル構築における省力化を図れることを確認した.さらに,一般的な心尖部脱血型に加え,カテーテル型,大動脈弁位置設置型の3種類の脱血方式を想定した左室・脱血管統合モデルを用意し,心室壁の運動を考慮した部分補助下の左室内血流解析を行った.心尖部脱血型およびカテーテル型については,左室駆出率が低い(15%)場合,および使用するポンプの特性よっては,大動脈弁が開放せず,大動脈弁付近に血流鬱滞領域が形成されることがわかった.以上のような,連続流血液ポンプによる拍出補助下の左室内血流解析と血液損傷モデルの組合せを,補助人工心臓血液ポンプ設計プロセスの一つとして提案する.血液ポンプの血液適合性は血流に依存することから,ポンプ内血流に注目したポンプ設計がなされているが,ここでは,より実使用条件に近い計算および実験流体力学解析に基づく血液適合性評価方法について検討した.心室内の血流に注目し,特定の脱血管開口部形状,挿入深度および角度の組み合わせにより,心室内腔面の洗い流し効果が向上することを示した.また,部分補助下の血流解析を行い,心駆出率,ポンプ接続方式およびポンプ特性による心室内血流の変化を明らかにした.さらに,溶血試験の結果を左右する,使用血液の品質を検査する方法として,血球脆弱性を簡便に評価する方法について検討し,その妥当性を確認した.心室内血流解析:血液ポンプの血液適合性は血流の状態に依存することが知られており、これまでポンプ内部の流れに注目した研究がなされている。植込型の補助人工心臓として使用される血液ポンプについては、周辺管路とともに心室内での血栓形成抑制についても考慮する必要があると考え、ここでは、補助人工心臓血液ポンプによる心拍出補助下での心室内血流動態を、数値流体解析及び流れの可視化実験の両手法により調べた。