hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
英作文敷居レベルの実証検証とその教育的応用

日本人英語学習者の「国語作文力と英語作文力」、「英語力と英語作文力」との間には、それぞれ統計的に有意な相関関係があることが確認された。また、英語力が低い学生群の「国語作文力と英語作文力の相関係数」は低いが、英語力の高い学生群の「国語作文力と英語作文力の相関係数」は高いということも、確認された。この調査結果は、国語作文力が英語作文力の大きな影響要因となるためには、ある一定レベル(敷居レベル=閾値=threshold level)以上の英語力が必要であるということを示唆している。(1)TOEIC IP(国際ビジネスコミュニケーション協会)(2)国語作文テスト(課題「転職するかしないか」(説得文)自身の経歴の中で転職を好む人もいれば、同一職業にとどまることを選択する人もいます。それぞれの利点について論じてください。あなたはどちらを好みますか。あなたの選択した答えを説明する理由と例を挙げて、考えを述べてください。(下記英文訳)本研究において留意していることは、研究結果の一般的傾向をできるだけ高い信頼性で明らかにすることである。その実現のためにデータ収集で注意したことは、可能な限り多くの標本を得るということであった。両校の献身的な協力により約1,000人の被験者よりデータを入手することができた。平成19年度に実施した主なことは、防衛大学校・群馬工業高等専門学校で収集したデータの集計である。1.被験者氏名・学籍番号・専攻の入力2.国語作文のワード文書化3.英語作文のワード文書化4.国語作文の文字数・文数・1段落中の平均文数、国語作文得点のエクセルファイル化「採点の信頼性」の確認2名の現役国語教師(大学院国文科修了)に依頼した。2名の採点一致率を調査することにより、採点者間の信頼性を確認した。国語採点基準には「国語説明文評価表」(Miyuki Sasaki & Keiko Hirose著、Language Testing Vol.16, Number 4, 1999)を使用した。5.英語作文の単語数・文数・1段落中の平均文数、英語作文得点のエクセルファイル化「採点の信頼性」の確認6. TOEIC得点のエクセルファイル化次に、統計学の講習会に参加することによって得た知識と、アメリカ合衆国ソノマ大学で教鞭を執っているZachery Wong博士から教えていただいた計量データの扱い方に関する諸注意点を基に、基礎統計やデータ加工を行った。4に記載した「国語作文の文字数・文数」を調べる過程において、研究当初には予定していなかったものの、研究遂行上必要となった調査もここに付記しておく。「1段落中の平均文数(適正値3-7文)」に関する確認Microsoft Wordの機能の1つ、「読みやすさの評価」を利用することにより、データ化された作文の文字数・文数を瞬時に知ることができる。その「読みやすさの評価」内には、「1段落中の平均文数」という集計項目があり、「適正値3-7文」と記載されている。この適正値の根拠について調査した。国語作文力と英語作文力、英語力と英語作文力の間には、それぞれ有意な相関関係が認められた。これらの調査結果は、国際的に関心が持たれている第一言語作文力と第二言語作文力の関係、第二言語力と第二言語作文力の関係に関する学術的研究蓄積となると考えられる。この調査結果は、国語作文力が英語作文力の大きな影響要因となるためには、ある一定レベル(敷居レベル=閾値=threshold level)以上の英語力が必要であるということを示唆していると解釈できる。第一言語による作文力を第二言語の作文活動で発揮するためには、敷居レベル以上の第二言語力が必要であるという仮説(第二言語作文敷居説)検証は、現在発展途上段階にある。第一言語作文力の転移は、第二言語力の優れた学生において可能であると、本研究結果のみから結論付けることは困難と言わざるを得ない。本研究結果を一般化するためには、実験条件を更に厳しく統制した追試を行い、得られたデータを比較する必要がある。しかし本研究は、第一言語作文力と第二言語作文力の関係を調査している一連の研究、特に英語を第二言語とした二言語間の相関分析・敷居レベル分析には、十分貢献していると考えられる。
雇用モデルの多様化に対応した労働契約法と紛争処理システムの立法論的研究

本研究では、雇用モデルの多様化に対応して、労働条件設定システムおよび労働契約法が諸外国においてどのように変化しつつあるのかの比較法的検討を行うとともに、日本において多様な雇用モデルに対応できるような労働条件規範のあり方としての労働契約法と、実体法としての労働契約法と紛争処理システムがどのように連携すべきかについて、立法論をにらんだ検討を行った。まず、雇用モデルの多様化に対応した労働条件設定システムの展開については、労働条件設定システムと労働契約法の内容について、英米独仏を中心に各国の状況を概観し、大きな労働条件設定システムの中で労働契約法が諸外国においてどのように位置づけられているのかについても比較法的分析を行った。そこでは、伝統的な労働保護法とは区別して労働契約法を認識するドイツと、労働保護法と労働契約法を必ずしも明確に分離しない英仏などの相違も明らかとなった。そして、国家が刑事罰や行政監督によってその規範を担保しない協議の労働契約法については、その実効性を確保する仕組みとして労働紛争解決システムが重要であることも改めて確認できた。日本で参照されることの多いドイツとフランスについては、さらに労働契約法を考える場合に重要な手法となる法の設定する規範の柔軟化について深く検討した。とりわけ、集団的合意によって労働条件規範の柔軟化を図る場合の主体、柔軟化の対象事項、その限界等について比較法的分析を試みた。このような比較法的分析に基づいて、日本法についても雇用モデルの多様化に対応した労働条件設定システムの見直しの必要と、その場合の労働条件規範柔軟化の担い手について総論的検討を行った。ここでは、現行の過半数代表制度の法的な問題点を析出するとともに、新たな労働条件規制の担い手をどのように構築すべきかについて試論的検討を行った。また、比較法的検討を行う過程で、日本の状況について英文論文を執筆し、諸外国の比較法研究者との議論に供した。各論的検討では、労働契約法の内容となるべき各論点(労働契約、付随義務、労働者、採用、試用、解雇、労働条件変更、企業組織再編等)について検討を行った。三年計画プロジェクトの1年目として、(1)諸外国の労働契約法制の客観的把握と、(2)日本の労働契約法理に関する判例分析を課題とした。まず、(1)諸外国の労働契約法制の客観的把握については、ドイツ、フランス、イギリス、アメリカにおいて、労働契約を規律する制定法の分析を行った。ドイツでは刑事罰や行政監督によって履行確保を図る労働保護法と、そうした公法的権利実現措置を伴わない労働契約法の区別が明確に存在するが、そのほかの国では、そうした概念区分は明確には存在しない。しかし、当該労働契約内容に影響を与える制定法が国家によって履行確保がなされるのか、それとも当事者が訴訟等の紛争処理機関を利用することによってその権利実現を図ることが予定されているのか、という視点は、他の国でも有用なものと考えられる。そこで、そうした視点から、各国の労働法制に分析を加えつつある。また、公法的担保のない労働契約法の実効性を確保するためには、紛争処理システムとの連携、紛争処理の効率性が課題となる。そこで、各国の紛争処理システムの概要についても基礎的研究分析を行った。また、(2)日本の労働契約法理に関する判例分析については、多数の判例について一種のデータベースを作成しつつ、分析を進めている。特に、従来あまり検討の行われてこなかった民法の雇用契約に関する規定の強行性・任意性について検討を行うとともに、新たに構想する労働契約法の関係をどのように捉えるべきかについて、関連する裁判例を分析し、検討を深化させた。

本研究の第二段階にあたる17年度においては,(1)諸外国の労働契約法の客観的把握,(2)日本の労働契約法理に関する判例分析を継続するとともに,(3)内部労働市場において要請される契約法理と外部労働市場において要請される契約法理の相違の分析,(4)労働関係を規律する規範の抽出を試みた。(1)(2)の作業については,前年度からの作業の継続であるが,国家が刑事罰や行政監督を通じて履行確保を図る労働保護法と,当事者が紛争処理機関を利用してその権利実現を図る労働契約法という視角からの分析の可能性を探った。その結果,ドイツにおいては労働保護法と労働契約法が制定法単位に峻別されているが,フランス,イギリス,アメリカ等ではそのような明確な峻別はされていないこと,しかし,個別的労働関係法規をそのような観点から把握分析することは可能であることがほぼ明らかになったように思われる。また,雇用モデルの多様化に対応した労働条件設定枠組みとしての労働契約法について,比較法的観点からの検討を試み,その成果については,本研究の出張旅費を用いて参加した国際労働法社会保障法学会欧州地域会議(2005年9月,イタリア・ボローニャ)において関係研究者と討議を行い,また,国際労働法社会保障法学会アジア地域会議(2005年11月,台湾・台北)においては,当該問題をグローバル化との関係から論ずるセッションにおいてパネリストとして報告・ディスカッションを行った。こうした作業を通じて,(3)(4)の課題についても検討を深めた。本研究では、雇用モデルの多様化に対応して、労働条件設定システムおよび労働契約法が諸外国においてどのように変化しつつあるのかの比較法的検討を行った。比較法的分析に踏まえて、日本において多様な雇用モデルに対応できるような労働条件規範のあり方としての労働契約法と、実体法としての労働契約法と紛争処理システムがどのように連携すべきかについて、立法論をにらんだ検討を行った。まず、雇用モデルの多様化に対応した労働条件設定システムの展開については、労働条件設定システムと労働契約法の内容について、英米独仏を中心に各国の状況を概観し、大きな労働条件設定システムの中で労働契約法が諸外国においてどのように位置づけられているのかについても比較法的分析を行った。そこでは、伝統的な労働保護法とは区別して労働契約法を認識するドイツと、労働保護法と労働契約法を必ずしも明確に分離しない英仏などの相違も明らかとなった。そして、国家が刑事罰や行改監督によってその規範を担保しない労働契約法については、その実効性を確保する仕組みとして労働紛争解決システムが重要であることも改めて確認できた。日本で参照されることの多いドイツとフランスについては、さらに労働契約法を考える場合に重要な手法となる法規範の柔軟化について深く検討した。とりわけ、集団的合意によって労働条件規範の柔軟化を図る場合の主体、柔軟化の対象事項、その限界等について比較法的分析を試みた。
担持銀触媒上でのHC-SCRにおける表面ダイナミクス

ディーゼルエンジンから発生する窒素酸化物(NOx)の除去法開発の取り組みが世界的に行われている。炭化水素による触媒選択還元法は有望な方式であり、担持Ag触媒は最有力候補の一つである。我々はAg触媒の特徴的な挙動として、表面Agが反応場に応じて可逆的に凝集・分散し、その際に生じるAgクラスターが極めて高い触媒活性を示すことを明らかにしている。本研究では表面Agクラスターの表面ダイナミクスと触媒反応活性の関係を検討する。本年度は班内での共同研究を含めて次の成果を得ることができた。これまでAgクラスターはin-situ UV-Visのみで観察していたが、今回鳥取大学奥村先生との共同研究によりQXAFS(SPring-8)によるin-situダイナミクス解析を試みた。酸素含有条件を基本とし、水素の添加によるAg種の構造変化を観察したところ、可逆的にAg-O結合とAg-Ag結合の配位数が変化した。すなわちAg^+イオンと平均原子数4個のAgクラスターが可逆的に形成していることをQXAFSによって確かめることができた。[2.Agゼオライト上での反応中間体]In-situ FT/IRによりAgゼオライト上での反応機構の検討を行った。基本的にAg/Al_2O_3と同様にアセテートとナイトレートを経由してNOの窒素までの還元が進むが、新たな反応中間体としてCH_3NO_2を観察することが出来、後段のNCO種,NH3種を含む反応経路を明らかにすることができた。本年度は次の3つの課題を実施し、次のような成果を得ることができた。(1)Agクラスターのダイナミクス解析のため、in-situ UV-Visセル(日本分光との共同開発で既にVHR-630として市販)を短波長領域での分析に併せて改良し、反応類似条件下でのスペクトルを得ることに成功した。235nm付近に観察されるAgクラスターのバンドは温度の上昇に伴って減少した。Agクラスターの過渡応答による生成速度と分解速度の見積もりから、平衡状態でのAgクラスター量の変化を速度論的に説明することができた。(2)鳥取大学奥村先生との共同研究で、AgクラスターのQXAFS(SPring-8)によるダイナミクス解析を試みたところ、200°CにおいてAgクラスターの形成・分解過程を追うことができた。(3)第一原理計算によりAgクラスター形成機構を検討した。クラスター形成においてAgとヒドリドが結合したAg^+H^-が鍵になっていることが示唆された。
前立腺癌における再燃機序の解明:アンドロゲンレセプターと関連因子の解析

前立腺癌細胞において第2染色体にヘテロ接合性の喪失がみられ、手術単独症例より内分泌療法抵抗性癌死症例で高頻度であった。また、共通欠失領域を4カ所同定した。サイトカインのインターローイキン4(IL-4)は、血清において前立腺癌未治療患者より再燃癌で増加していることを証明した。また、前立腺癌培養細胞において、IL-4はIL-6と同様にアンドロゲンレセプターを非リガンド性に活性化することも報告した。神経内分泌分化に関連する血清クロモグラニンAやNSEがホルモン療法の予後因子として報告した。その他、現在まで判明した研究結果は以下の通りである。IL-10がアンドロゲンレセプターにおよぼす影響を検討した。この結果から内分泌療法抵抗性前立腺癌における再燃のメカニズムにおいてIL-10がIL-6、IL-4同様にアンドロゲンレセプターの非リガンド性の活性化に関与することが示唆された。2次元電気泳動による再燃前立腺癌患者における血清タンパクとアンドロゲンレセプターとの関連性の検討を行った。2次元電気泳動における同一患者における治療の経過による血清蛋白の変化の実験の結果、内分泌療法の治療経過中で血清における蛋白発現で増加している蛋白と減少している蛋白が判明した。以上の研究成果は一部論文として既に報告しており、主要なものは本稿に掲載した。本研究では、進行性前立腺癌の再燃におけるアンドロゲン抵抗性の分子生物学的メカニズムについてさまざまな方面から解析しえた。未治療前立腺癌・再燃性前立腺癌患者における、IL-6以外の数種類の血中サイトカイン値を測定した。健常人と比べて前立腺肥大症患者において血清IL-4値の上昇は認められなかった。血清IL-4値は治療前病期の比較において早期癌より進行癌のほうが高い傾向がみられた。燃前立腺癌患者のほうが血清IL-4値の上昇が有意に認められた。IL-4は再燃性前立腺癌において、前立腺癌の進展に関与することが示唆された。また、前立腺癌細胞にアンドロゲンレセプター(AR)を発現するベクターをトランスフェクションし、アンドロゲンやIL-4によって処理した。その結果、IL-6同様IL-4もARを非リガンド性に活性化した(研究発表)。次にインフォームドコンセントが得られた前立腺癌患者において各病期にある血清(未治療、内分泌療法にて制癌された状態、手術単独療法、再燃の初期、再燃の末期)が50例(100検体)ほど得られた。これら検体をもとに血清タンパクをプロテオーム解析に移る準備に入った。まず,どのようなタンパク質が前立腺癌の病期、治療前後で有意に変動しているかスクリーニングする予定である。研究発表の概略は以下の通りである。前立腺癌組織において第2染色体に高頻度の染色体欠失(LOH)を認めた。また、LOH解析を原発巣と転移巣におこなった結果、第2染色体に4ヵ所の共通欠失領域を発見し、これを報告した。転移性前立腺癌患者のアンドロゲンレセプター遺伝子CAG繰り返し構造においてその長さと治療前血清テストステロン値の相関をもとめ、治療における予後因子となることを報告した。前立腺癌における再燃機序の解明するため、前立腺癌治療におけるタンパク質の変化の解析を始めた。これまでインフォームドコンセントの得られた治療経過の異なる121検体の血清を複数名の当該疾患患者から採取し、以下の手順でタンパク質解析実験を行っている。(1)カラムを用いて血清から12種類のメジャータンパク質(アルブミンやIgG等12種類)を除去し、これらが取り除かれたタンパク質画分(以下スルー画分)を得る(2)スルー画分にプロテアーゼインヒビターを添加後溶液を限外ろ過膜を用いて濃縮し、尿素/チオ尿素系のバッファーを添加してトリブチルボスフィン及びアクリルアミドで還元、アルキル化を行い、その後アセトン沈殿によってタンパク質を抽出する(3)(2)の沈殿物を尿素/チオ尿素系のバッファーで溶解し、等電点範囲3.0-6.0, 4.0-7.0, 7.0-10.0の3種の等電点

電気泳動ストリップゲルを用いて等電点電気泳動を行う(4)(3)より得られたストリップゲルを用いてSDS電気泳動を行う(5)(4)より得られたSDS電気泳動ゲルをCoomassie Brilliant Blueを用いて染色する(6)染色されたタンパク質スポットを専用の解析ソフトを用いて検体間での比較解析を行い、異なる治療経過間でのタンパク質変化に関する情報を得る。今後、研究を重ね、研究発表・論文作成を目指す。研究発表の概略は以下の通りである。骨転移を有する再燃性前立腺癌患者5例に骨粗鬆症治療薬のビスフォスフォネート製剤を用い、抗腫瘍効果が得られるか検討した。患者の認容性は良好であり、大きな副作用は見られなかった。PSAは1例低下し、疼痛の悪化も認められなかった。前立腺癌の再燃には、骨転移の状態が予後に大きく影響するが、ビスフォスフォネート製剤は治療の選択肢になりうるといえた(発表論文)。1)IL-10がアンドロゲンレセプター(AR)におよぼす影響の検討IL-10のARとの関連について検討した。前立腺癌培養細胞にPSAプロモーターをトランスフェクションし、1)対照、2)R1881、3)IL-6、4)IL-10を添加し、培養した。R1881は、陽性コントロールとして対照の6倍反応がみられた。IL-6は対照の10倍の活性がみられた。IL-10はIL-6よりPSAプロモーターの活性が少ないものの(2倍)反応を示した。IL-10によりPSA活性がみられたことから、ARとの関連性を検討した。ARのN末端のみをトランスフェクションし、1)対照、2)R1881、3)IL-6、4)IL-10を添加し、培養した。培養細胞をルシフェラーゼアッセイを行なった。IL-10はIL-6(10倍)より活性が低いものの(3.5倍)、対象やR1881(それぞれ1倍)より活性が高いことが判明した。このことから、内分泌療法抵抗性前立腺癌における再燃のメカニズムにおいてIL-10がIL-6、IL-4同様にARの非リガンド性の活性化に関与することが示唆された。2)2次元電気泳動による再燃前立腺癌患者における血清タンパクとARとの関連性の検討前立腺癌内分泌療法の治療経過の異なる30例において2次元電気泳動によるタンパク質解析実験を行っている。実験のセッティング、基礎データはすでに得られており、データの一部はすでに学会にて報告済みである。2次元電気泳動における同一患者における治療の経過による血清蛋白の変化において蛋白発現で増加しているスポットと減少しているスポットが判明している。今後、これらの解析を行い、内分泌療法経過中において明らかな差を認めた発現蛋白については、ゲル上でその発現スポットを採取し詳細に検討するつもりである。
タングステン酸・有機高分子複合系の新規蓄積型光電エネルギー変換機能に関する研究

a.これまで我々の研究により明らかとなっていたPEGのみならず、PVA、セルロース等の他の高分子においても、フォトクロミズムの増感作用が見られる事が明らかとなった。また、高分子の添加により、着色濃度が増加する事の他に、他の成膜法により作成した酸化タングステン膜に無い可撓性のある膜を作成する事に成功した。b.従来、一見O-H基がフォトクロミズムを促進する原因である様に思われたが、本研究の後半において新たに見出された、1.フォトクロミズムが添加PEGの分子量に依存しない。2.O-H基を持つにも拘らずフォトクロミズムを促進しないもが存在する。という事実よりフォトクロミズム増感にはO-H基のみではなく、より普遍的により多くの物質存在する基によるフォトクロミズム増感機構が存在する事が、実験的のみならず、電気陰性度を基にした考察から示唆される事も明らかとなった。c.基材としての利用が考えられるいくつかのゲルの乾燥過程についての実験を行い、乾燥過程の様相は、ゲル中の溶媒とネットワークとの相互作用の変化によって大きな影響を受ける事を明らかにした。また、この乾燥試料が極めてガラス状態と近いものである事も様々の実験事実より明らかにした。この方法をさらに拡張して行く事により、完全に非加熱方式による高分子ガラス作成法が確立されれば、これまで熱分解しやすかった為に実現されなかった様々の新規な物性を持った物質が誕生する事が期待される。d.素子製作の際の基板材料として期待される幾つかの結晶材料の表面構造評価について、分域構造を原子間力顕微鏡(AFM)用いる事により評価可能である事を明らかにした。特に、TGSにおける強誘電性分域の特徴であるレンズ型構造を、この直接的な方式を用いて初めて観測する事に成功した。第1年目は、セル試作に備えた基礎物性を重点的に研究を行なって来た。まず、電極と溶液が接触する電気化学系のインピーダンスをRandlesの等価回路により実験データの解析から電気化学的な側面からは、以下のような事が明らかになった。溶液抵抗Rsolnを電気伝導率(L)へ換算したものは、時間の経過と共に減少していき、水溶液中ににおけるイオン数の減少や、ゲルネットワークが形成されることによりイオン移動度の制約されている事が明かとなった。このH^+の極限イオン導伝率と測定したpH値によってLを見積り、インピーダンス法で求まったLとの比較を行った結果、導伝率の減少は、水素イオンの減少に起因することも明かとなった。また、インピーダンス法で求めた電気伝導率の時間微分dL/dtの時間変化は、ティルティングテストによって決定されたゲル化時間(tg)付近まで急激に増加し、その後ある一定値へと漸近していく傾向がみられ、その前後におけるdL/dtの変化の違いは、初期のネットワークが全体につながっていく過程とゲル化時間以降においてネットワークが熟成していく過程という機構の違いによると考えられる。上に述べた結果は、物質探査の立場から非常に重要な示唆を与えている。フォトクロミズム矢エレクトロクロミズムの反応のためには、溶媒中の水素イオンの存在が不可欠である。上述の結果は、何も添加しないタングステン酸のゲル化ではフォトクロミズムやエレクトロクロミズムにとって重要な水素イオンが減少してくることを示している。PEG、PVA等の水溶性水溶性高分子は、半導体表面における光化学反応により生じたホールと反応する事により水素イオンを生じることが知られている。この事は、(当初相溶性・生成物のフォトクロミズム増感の観点のみからこれらの水溶性のものを用いる事を計画していたが、)水素イオンの補充という面から見ても予想以上に水溶性高分子を添加する事が重要である事を示している。

また、フォトクロミズムは、分子量で増感の度合いが大きく変化という予備的な知見も得ている。これまでの結果から現在までの段階では、添加物としては水溶性のしかも比較的分子量の小さいものが適当であろうという予測をしている。a.これまで我々の研究により明らかとなっていたPEGのみならず、PVA、セルロース等の他の高分子においても、フォトクロミズムの増感作用が見られる事が明らかとなった。また、高分子の添加により、着色濃度が増加する事の他に、他の成膜法により作成した酸化タングステン膜に無い可撓性のある膜を作成する事に成功した。b.従来、一見O-H基がフォトクロミズムを促進する原因である様に思われたが、本研究の後半において新たに見出された、1.フォトクロミズムが添加PEGの分子量に依存しない。という事実よりフォトクロミズム増感にはO-H基のみではなく、より普遍的により多くの物質存在する基によるフォトクロミズム増感機構が存在する事が、実験的のみならず、電気陰性度を基にした考察から示唆される事も明らかとなった。c.基材としての利用が考えられるいくつかのゲルの乾燥過程についての実験を行い、乾燥過程の様相は、ゲル中の溶媒とネットワークとの相互作用の変化によって大きな影響を受ける事を明らかにした。また、この乾燥試料が極めてガラス状態と近いものである事も様々の実験事実より明らかにした。この方法をさらに拡張して行く事により、完全に非加熱方式による高分子ガラス作成法が確立されれば、これまで熱分解しやすかった為に実現されなかった様々の新規な物性を持った物質が誕生する事が期待される。d.素子製作の際の基板材料として期待される幾つかの結晶材料の表面構造評価について、分域構造を原子間力顕微鏡(AFM)用いる事により評価可能である事を明らかにした。特に、TGSにおける強誘電性分域の特徴であるレンズ型構造を、この直接的な方式を用いて初めて観測する事に成功した。
植物細胞分化・分裂に関与するプラスチド機能の解析

プラスチド局在YFPタンパク質を用いてプラスチドを可視化した解析から、crl変異体においては胚、葉肉、気孔において葉緑体に分化していないプラスチドを含む細胞が存在することが明らかとなった。さらに、プラスチド局在YFPタンパク質を用いてもプラスチドが検出できない細胞が、crl変異体の胚、気孔、表皮に存在していた。プラスチドが検出できないcrl変異体胚細胞には、DAPI染色によって明らかなプラスチドDNAが検出されない細胞があった。プラスチドは植物の発生分化に必須の代謝産物を合成するオルガネラであるため、プラスチドが検出できない細胞が生じていることがcrl変異体が植物形態の異常を示す原因の一つである可能性が示唆された。PIN1タンパク質はオーキシンのefflux carrierタンパク質であり、オーキシンの極性輸送に重要であることが示されている。野生型胚の子葉表皮では細胞の頂端面に局在するPIN1-GFPタンパク質がcrl ftsZ1-1変異体においては側方面や基底面にも局在していた。PIN1-GFPの局在変化はcrl変異体においても見られた。また、オーキシンによって発現が誘導されるマーカー遺伝子DR5:GUSは、野生型成熟胚においては子葉と幼根の先端で強く発現している。これに対して、crl胚とcrl ftsZ1-1胚においては子葉先端におけるDR5:GUSの発現が検出できなかったり、子葉の縁おいて見られたりした。これよりcrlやcrl ftsZ1-1胚の形態が異常となる原因がオーキシンの極性輸送の変化である可能性が示唆された。葉緑体分裂に関与する遺伝子変異体ftsZ1-1,ftsZ2-1,ftsZ2-2とcrlとの二重突然変異体をそれぞれ作製し、植物の形態および細胞あたりの葉緑体数を解析した。その結果、すべての二重突然変異体において植物全体の形態、色素体分裂いずれにおいてもcrl単独変異体の表現型が亢進された。これからftsZ1-1,ftsZ2-1,ftsZ2-2がcrl変異のエンハンサーである事が明らかとなった。さらにcrl変異体、ftsZ1-1変異体およびcrl ftsZ1-1二重突然変異体の胚について詳細な解析を行ない以下の事を明らかにした。1,野生型シロイヌナズナの成熟胚はほぼすべての細胞が葉緑体に分化した色素体を含む。これに対してcrl変異体の胚は約30%の細胞が葉緑体に分化した色素体を持たない。さらに、約10%の細胞が我々の測定装置の検出限界以上に葉緑体局在型YFPタンパク質を取りこめる色素体を持たない。2,ftsZ1-1変異体の胚は約4%の細胞が分化した色素体を持たない。さらに、約1%の細胞が我々の測定装置の検出限界以上に葉緑体局在型YFPタンパク質を取りこめる色素体を持たない。3,crl ftsZ1-1二重突然変異体の胚は約55%の細胞が葉緑体に分化した色素体を持たない。4,crl ftsZ1-1二重突然変異体の胚は全体的な形態が異常となり茎頂分裂組織を含む領域が野生型の約2.5倍に拡大し、子葉原基の数が増加する。また、茎頂分裂組織を2つ持つ胚も生じる。以上の結果から、葉緑体分裂の阻害が色素体の葉緑体への分化阻害を胚において引き起こす事、および胚の形態形成不全を引き起こす事が明らかとなった。
脳のカルシウム/カルモデュリン/キナーゼ/キナーゼ・カスケード

カルシウム/カルモデュリン依存性タンパク質リン酸化酵素IV.(CaMキナーゼIV)をリン酸化して著明に活性化するCaMキナーゼIVキナーゼを精製し、精製した酵素をトリプシン消化して得たペプチドをHPLCで精製しその部分アミノ酸配列を決め、対応するオリゴヌクレオチドからPCRでプローブを作成し、そのプローブを用いてラットの脳のcDNAライブラリーからCaMキナーゼIVキナーゼのクローニングを行い、そのヌクレオチド配列を決めた。ヌクレオチド配列から推定された酵素のC末端部分のアミノ酸配列をもつペプチドを合成してウサギを免疫しCaMキナーゼIVキナーゼに対する特異抗体を調製した。こうして得たクローン化したCaMキナーゼIVキナーゼに対する特異抗体を用いて免疫組織化学的に酵素の脳内部位分布、細胞内分布を調べ、CaMキナーゼIVの分布と比較検討したところ、クローン化したCaMキナーゼIVキナーゼはCaMキナーゼIVと同様に脳内に広く分布しているが、CaMキナーゼIVが豊富に存在する小脳の顆粒細胞層には殆ど存在しないことが明らかになった。CaMキナーゼIVキナーゼの細胞内分布はCaMキナーゼIVと同様に細胞の核に限局して存在しており、CaMキナーゼIVキナーゼし神経細胞の核の中でCaMキナーゼIVをリン酸化して活性化する可能性が考えられた。CaMキナーゼIVキナーゼはin vitroの実験ではCaMキナーゼIVのみならずCaMキナーゼIをも著明に活性化するが、CaMキナーゼIが細胞の核には存在せず細胞質に分布するというこれまでの報告を考え併せると、我々が脳からクローン化したCaMキナーゼIVキナーゼはCaMキナーゼIVを活性化するための酵素である可能性が高いと思われる。またimmunotitrationの実験は小脳のCaMキナーゼIVキナーゼ活性の4分の1程度しか抗体と反応しないことを示しており、CaMキナーゼIVキナーゼが小脳の顆粒細胞層に殆ど存在しないという実験結果を併せて考えると、小脳には我々や米国のSoderlingらによってクローン化されたCaMキナーゼIVキナーゼとは異なるアイソフォームが存在する可能性が考えられる。
GDSLリパーゼによるピレスリン生合成の分子機構解明と昆虫抵抗性植物作出への応用

エステル構造をもつ殺虫性物質ピレスリンは、除虫菊の中で酸部とアルコール部とがGDSLリパーゼTcGLIPのはたらきにより連結されることにより生合成される。本研究では、本酵素の制御機構を解明するため、まずその触媒機構に必須のアミノ酸を大腸菌で発現させた組換え酵素を用いて同定し、結晶化に適した塩類溶液を明らかにした。また、低濃度で不可逆的に本酵素を阻害するホスホン酸エステル類を創出し、本酵素の遺伝子発現が傷害誘導的に生じる揮発性物質により促進されることを明らかにした。さらに、シロイヌナズナで本酵素遺伝子のホモログ遺伝子を破壊すると、防御遺伝子のプロモータ促進活性が低下することを見出した。除虫菊(Tanacetum cinerariifolium)は殺虫性物質ピレスリンを生合成し、昆虫による食害から身を守る。申請者はピレスリンのエステル結合の形成を触媒する酵素として除虫菊のGDSLリパーゼの一種(TcGLIPと命名)が関与することを発見したが、本酵素の触媒機構、調節因子および他の植物での関連酵素の役割については不明であった。そこでまず、X線結晶構造解析を目的としてTcGLIPの発現・精製条件について検討した。これまで本酵素は大腸菌BL21(DE3)pLysS株で発現させ、Amylose resinとMono Qカラムを用いて精製していたが、その方法では十分な酵素量を確保することが不可能であった。そこで、大腸菌株をOrigamiB(DE3)pLysSに変更したところ、本酵素の収量が飛躍的に向上した。また、TcGLIPを発現する際に融合させたマルトース結合タンパク質(MBP)は触媒作用に影響しないことも確認した。一方、TcGLIPに対する自殺基質タイプの阻害剤の合成を試みた。すなわち、benzyl carbamateを出発原料として用いて、ホルムアルデヒドを亜リン酸トリフェニルと縮合させることによってdiphenyl [(benzyloxycarbonyl)aminomethyl]phosphonateを合成し、接触水素添加によってベンジルオキシカルボニル基を除去後、亜硝酸ナトリウムによりジアゾ化し、銅触媒の存在下でカルベンを発生させ、2.5-dimethylhexa-2.4-dieneの二重結合への付加によりシクロプロパン環化し、ホスホン酸ジフェニルエステル型阻害剤を合成した。さらにTcGLIPの類縁酵素の植物普遍的な役割を解明するため、TcGLIPホモログ遺伝子を破壊したシロイヌナズナを作出した。それらは26年度の種々の実験に使用される。本研究では、ピレスリンのエステル結合形成反応を触媒するGDSLリパーゼ(TcGLIP)の触媒、基質認識および活性調節機構を理解するため、本酵素の結晶化に適した条件を探索するとともに、不可逆的阻害剤を合成した。また、本酵素のホモログ遺伝子を改変したシロイヌナズナ変異株を作成したので、以下にその概要を記す。大腸菌で発現させたマルトース結合タンパク質(MBP)::TcGLIP融合タンパク質をアミロースレジンと陰イオン交換カラムで精製したのち、これをプロテアーゼを処理することで酵素からMBPを除去した。さらに陰イオン交換カラムで精製することで、ゲルろ過で単分散を示すTcGLIPを得た。TcGLIPの結晶化条件を探索した結果、ポリエチレングリコールを含有する溶液で本酵素が結晶化することを見出した。TcGLIP阻害剤として菊酸構造をもつホスホン酸ジエステルを合成した。すなわちbenzyl carbamateから4段階で導いたジアゾ化合物から銅を触媒として用いてカルベンを発生させ、これを2,5-dimethylhexa-2.4-dieneに付加させることでホスホン酸ジフェニルエステルを得た。さらに本化合物の部分加水分解物をエタノール、シクロペンタノール、アレスロロンと反応させ、3種のヘテロジエステル型阻害剤を得た。ホスホン酸ジフェニルエステル類はTcGLIPを不可逆的に阻害した。植物の防御機構におけるTcGLIP類縁酵素の役割を理解するため、ホモログ遺伝子をノックアウト(KO)した形質転換シロイヌナズナを作出した。Plant defensin promoter::β-グルクロニダーゼレポーターを有するシロイヌナズナでのプロモーター活性に対する野生株とKO株の葉柄浸出液(PEX)の活性を比較し、特定の条件で野生株のPEXに比べてKO株のPEXが低い活性を示すことを明らかにした。除虫菊が産生する殺虫性物質ピレスリンは、その生合成の最終段階でGDSLリパーゼ(TcGLIP)の作用によりつくられる。その基質認識と触媒機構を解明するため、TcGLIPをマルトース結合蛋白質(MBP)との融合蛋白質として大腸菌で発現させ、MBPを除き、精製した。一方、p-nitrophenyl基を有するホスホン酸エステル類を合成し、それらのTcGLIP阻害活性を評価したところ、化合物はいずれも従来合成した阻害剤よりも高い阻害活性を示した。そこでTcGLIPに新規阻害剤を添加しインキュベートしたところ、酵素単独時には見られない形状をもつ結晶が生成した。分化状態の変化、あるいは傷害誘導的に除虫菊から生じるGreen Leaf Volatile等の揮発性物質(VOC)の受容に応じた除虫菊幼苗でのTcGLIP遺伝子の発現変動を調査した。その結果、TcGLIP遺伝子の発現は除虫菊が脱分化すると低下し、逆に傷害誘導的に生成するVOCを受容すると上昇することが明らかとなった。TcGLIP遺伝子のシロイヌナズナホモログは全身獲得抵抗性の誘導に寄与すると報告されている。

しかし、本遺伝子の破壊株は試験した植物病原菌に対して野生株と同程度の抵抗性を示した。一方、ディフェンシン遺伝子プロモーター::β-グルクロニダーゼ融合遺伝子を基盤とするレポーターシステムを用いて、野生株および遺伝子破壊株より採取した葉柄滲出液のレポーター誘導活性を精査したところ、破壊株ではレポーター誘導活性が低下する傾向が認められたが、活性の変動が大きいため本評価系の改良を進めている。さらに、TcGLIPならびにそのホモログの過剰発現コンストラクトを作成し、野生タバコ一過的発現系、ならびにシロイヌナズナ構成的発現系で組換え植物を作成した。現在、本組換え植物の代謝物および病害虫ストレス抵抗力の解析を進めている。エステル構造をもつ殺虫性物質ピレスリンは、除虫菊の中で酸部とアルコール部とがGDSLリパーゼTcGLIPのはたらきにより連結されることにより生合成される。本研究では、本酵素の制御機構を解明するため、まずその触媒機構に必須のアミノ酸を大腸菌で発現させた組換え酵素を用いて同定し、結晶化に適した塩類溶液を明らかにした。また、低濃度で不可逆的に本酵素を阻害するホスホン酸エステル類を創出し、本酵素の遺伝子発現が傷害誘導的に生じる揮発性物質により促進されることを明らかにした。さらに、シロイヌナズナで本酵素遺伝子のホモログ遺伝子を破壊すると、防御遺伝子のプロモータ促進活性が低下することを見出した。本研究の第一目標であるGDSLリパーゼTcGLIPの大腸菌での大量発現と短工程での高度精製にはめどがつき、精製した組換えTcGLIPは特定の条件で結晶化することも見出した。結晶化条件の最適化は課題として残るものの、TcGLIPのX線結晶構造の解明に向けて研究は着実に進展したと言える。しかし酵素の基質認識機構を理解するには、基質そのものあるいは別途合成するホスホン酸ジエステルタイプの阻害剤あるいは基質の部分構造と同じ構造をもつ類縁体との共結晶化が必須である。これらを達成するためには、研究速度を上げる必要がある。ホスホン酸ジエステルタイプのTcGLIP阻害剤については、当初の計画通り、合成ルートを確立した。平成27年度の構造最適化によって、これまでに合成した化合物よりもさらに高活性な阻害剤が創製され、TcGLIPとの共結晶化に適用されると期待される。モデル植物のシロイヌナズナには、TcGLIPに相同な酵素が存在する。これまでに、本酵素の遺伝子をノックアウトした変異株を作出した。野生株と本変異株との間で防御遺伝子の発現レベルならびに昆虫抵抗性を評価することで、当初の大目標であった植物の昆虫抵抗性機構におけるGDSLリパーゼの普遍的な役割を理解することができると期待される。以上の研究成果をもとに、研究はおおむね順調に進展していると評価した。27年度が最終年度であるため、記入しない。農薬科学、ケミカルバイオロジー、神経活性物質化学最終年度は、当初の計画通り、ピレスリン生合成に関わるGDSL
住民との協調に基づく地区環境計画の基礎となる環境マップの試作

14年度は、(1)地区内に幹線道路の開通が予定されている戸建住宅団地地区(埼玉県菖蒲町)、(2)高架道路に隣接する集合住宅地区(さいたま市)、(3)地区内を外環道が通過する住宅地区(埼玉県川口市)の3地区を選定した。まず、全世帯を対象としたアンケート結果に基づき、実測項目を自治会と相談した。各地区とも車両交通による騒音レベルと二酸化窒素濃度(捕集カプセルを用いた短期暴露式簡易測定法による)を中心に実測した。すべての実測に自治会が参加したため、住民参加による実測手法を検討した。また、各地区で再度アンケートを実施し、それまでの一連の活動に対する認知度や住環境に対する意識向上効果の有無を調べた。一方、(2)の地区では熱・空気環境のシミュレーションを行った。これらの実測、アンケート、シミュレーションの結果から住環境マップを作成し、自治会との懇談会を開催して、住環境の実態とその改善について話し合った。各地区の住民はこうした一連の活動により住環境に対する意識が高まったと回答している。15年度は上記(2)地区のケーススタディを継続した。自治会とともに騒音レベル、二酸化窒素濃度、街灯照度を実測した。これに基づく自治会の話合いにおいて集合住宅中庭の街灯を照度の高い街灯に変更することが決定し、本研究が大きく進展した。一方、埼玉県草加市内の全自治会に送付したアンケートをもとに新規ケーススタディとして、(4)鉄道駅周辺商業地区、(5)外環道沿道住宅地区の2地区を選定した。両地区において自治会とともに騒音レベル、二酸化窒素濃度、街灯照度、交通量を実測し、住環境マップを作成した。同時に、活動を住民全員に伝える新聞を発行し住民への情報伝達をテストした。こうした活動に対する認知度や住環境に対する意識向上効果をアンケートで調べたところ顕著な効果があった。アンケートの実施に当たっては回答者の人権やプライバシー保護に十分留意した。2年にわたる計5地区のケーススタディ結果から住民参加による住環境改善活動を支援する方法を抽出整理し、研究の総括とした。地区スケール(500m平方程度のエリア)で捉える住環境は、住民が身近な環境を捉える基礎的単位である。本研究では、地域住民と共同で、地区スケールの住環境を対象とした実測、アンケート、シミュレーションを行って住環境マップを試作し、それを基に地区環境計画を作成する手法を検討する。これまでの研究成果の応用を強く志向する点、また、研究のプロセスに住民参加を促す点で先駆的な研究といえる。本年度は、(1)地区内に幹線道路の開通が予定されている戸建住宅団地地区(埼玉県菖蒲町)、(2)高架道路に隣接する集合住宅地区(さいたま市)、(3)地区内を外郭環状道路が通過する住宅地区(埼玉県川口市)の3地区を選定した。いずれの地区も自治会が住環境悪化を懸念しており、現状の住環境の実態を把握するため、住環境マップの作成を自発的に依頼してきた。そこで、それぞれの地区で全世帯を対象としてアンケートを実施し、住環境で不満に思う項目を調べた。次に、その結果に基づき、今後実測を行い住環境マップを作成する項目を自治会と相談した。各地区とも車両交通による騒音、大気汚染が大きな問題とされたため、騒音レベルと二酸化窒素濃度(捕集カプセルを用いた短期暴露式簡易測定法による)を中心に実測した。すべての実測に自治会が参加した。

また、各地区で再度アンケートを実施し、それまでの一連の活動に対する認知度や住環境に対する意識向上効果の有無を調べた。一方、(2)の地区では熱・空気環境のシミュレーションを行った。これらの住環境実測、住民意識アンケート、住環境シミュレーションの結果を視覚的に表現した住環境マップを作成した。地区ごとに自治会との懇談会を開催して、住環境の実態とその改善について話し合った。各地区の住民はこうした一連の活動により住環境に対する意識が高まったと回答している。今後は地区ごとに住民との話し合いを通じて「地区住環境計画」を作成し、それを実行に移すことで住環境改善に着手する。1.住環境改善活動の支援方法の比較表作成平成14年度に実施した3地区のケーススタディ結果をもとに、住民参加による実測、住環境マップ作成や懇談会開催など各ステップの実施方法の比較表を作成した。この表から実測調査を初めとして自治会による住環境改善活動を支援する方法を抽出整理した。2.ケーススタディ継続地区における実測調査とそれに基づく住環境改善の実践14年度に行った集合住宅LM地区におけるケーススタディの継続研究として、当地区の自治会とともに騒音レベル、二酸化窒素濃度、街灯照度を実測し、住環境マップを作成した。これに基づく自治会の話合いにおいて集合住宅の中庭に設置された街灯の照度不足が問題となり、自治会の費用負担でより照度の高い街灯に変更することが決定した。これに至るまでの住民の話合いのプロセスを詳細に記録した。3.新規ケーススタディ地区における実測調査と住民とのコミュニケーションの実践埼玉県草加市内の全自治会にアンケートを送付し、回答した自治会のうち住環境改善活動に意欲のある自治会を新規ケーススタディの対象とした。草加駅周辺商業地域の自治会と外環道沿道の自治会の2地区を選定した。両地区において自治会とともに騒音レベル、二酸化窒素濃度、街灯照度、交通量を実測し、住環境マップを作成した。同時に、実測調査などの活動を住民全員に伝えるため新聞を発行した。自治会と共同のこうした活動に対する認知度や住環境に対する意識向上効果をアンケートで調べたところ顕著な効果があった。なお、アンケートの実施に当たっては回答者の人権やプライバシー保護に十分留意した。4.研究の総括本年度の3地区におけるケーススタディ結果から住民参加による住環境改善活動を支援する方法を抽出整理した。特に住環境マップが住環境改善活動や将来の住環境計画づくりで果たす役割を抽出整理し、研究の総括とした。
心筋ネクサスのキネティクスと興奮伝導における役割に関する電気生理学的研究

1)細胞外高抵抗化の経過中のnexus conductanceの変化は、2つのtime constantをもつaexp(ーx/t_1)+b exp(ーx/t_2)の式で表わせ得ることを明かにした。これにより実験値にfitするa,bを決めることにより、目的とするx=0(細胞外高抵抗化前)のときのnexus conductanceを求め得た。3)これらから、Rjとθとの関係はθ=k_1+/√Rj (k_1=ー0.1034,k_2=9.1145,r=0.9923)で表されることを明らかにした。
超高速光クロスリンクを用いたゲノム操作法の開発

ゲノムDNAを対象とした化学的・酵素的操作法は遺伝子増幅、メチル化DNA解析、ゲノム編集などに応用されている。研究者はこれまでの研究において光応答性人工核酸である3-シアノビニルカルバゾール(CNVK)とシアノウラシル(CNU)を併用することで自己架橋を抑制し、今まで困難とされていた二本鎖DNAへの光架橋に成功している。しかし、自己架橋抑制の為にCNVKとCNUを併用しているものCNVKとCNU同士で全く光架橋しないわけではなく、プローブDNA同士の自己架橋が副反応として観察された。そこで、平成30年度はまずCNUに変わる新たな光架橋抑制分子の検討を行い、ゲノムDNAの光操作に必要と考えられる副反応(自己架橋)が抑えられたダブルストランドインベージョンDNA構築を行った。アザウラシル、ニトロインドール、塩基部分のないd-スペーサー、C3リンカースペーサーを用いて検討を行った結果、CNVKの架橋位置にC3リンカースペーサーをおいた際にCNUよりも光架橋抑制効果が高いことを見出した。また、副反応として観察されていた自己架橋反応を抑制することでmダブルストランドインベージョンDNA構築が70%という高収率で進行することも見出した。さらに、高次構造を持つ核酸(mRNA)に対し、超高速光架橋能を有するアンチセンス核酸を作用させる事で遺伝子発現を強力に抑制することにも成功した。ゲノムDNA自体はヒストンに巻き付くなど複雑な高次構造を形成していると考えられ、超高速光架橋反応のゲノム操作への有効性を確認することに成功した。本年度はゲノムDNAの光操作に向け、シアノウラシル(CNU)に変わる新たな光架橋抑制分子の検討を行い、ゲノムDNAの光操作に必要と考えられる副反応(自己架橋)を抑えたダブルストランドインベージョンDNA構築に成功した。さらに、高次構造を持つ核酸(mRNA)に対し、超高速光架橋能を有するアンチセンス核酸を作用させる事で遺伝子発現を強力に抑制することにも成功しており、同様に高次構造を有するゲノムを対象とした核酸類操作として超高速光架橋反応が有効であることをを確認した。以上のことから計画はおおむね順調に進行していると考えている。平成30年度に開発したCNVKより長波長でのDNAと光架橋可能なピラノカルバゾール(PyC)を含む光反応性塩基を用いて、光誘導DNAダブルストランドインベージョン(Photo-induced DNA Double-strand Invasion: pDDI)を行う。pDDI法による内在性の遺伝子発現制御を実証することを目的に、ガン細胞中で過剰発現しているガン原遺伝子の遺伝子発現制御に挑戦する。遺伝子DNAを標的とするアンチジーン核酸の標的遺伝子として多数の報告がある(Clin.Cancer Res., 2012,18,796)を参考に、N-myc遺伝子を標的とするpDDI-dsODN-Sを設計し、DNA自動合成機により合成する。ガン原遺伝子であるN-myc遺伝子を過剰発現しているヒト神経芽細胞腫細胞株(IMR-32)を準備し、リポフェクションによりpDDI-dsODN-Sを細胞内に導入する。適切な時間・波長の光照射の後、CO2インキュベーター内でインキュベーション(1日程度)し、市販のセルカウンティングキット(MTTアッセイ)を用いた生細胞率の測定、RT-qPCRによるN-myc mRNAの定量(内部標準:GAPDH or β-actin)から、N-myc遺伝子発現の光制御により細胞死が誘導されていることを証明する。また、N-myc遺伝子の発現抑制抑制によるアポトーシスの活性化(Mol. Cancer Ther., 2005, 4, 779)が報告されている。本系においてもこれを確認すべく、光照射後の細胞中に現れることが予想されるアポトーシスマーカー(Casp3/7活性の亢進、フォスファチジルイノシトールの細胞膜表面への提示(アネキシンV染色))の検出を試みる。いずれのマーカーも定量・染色キットが市販されていることから、これらを用い、効率的に研究を進める。研究者はこれまでの研究において光応答性人工核酸である3-シアノビニルカルバゾール(CNVK)を見出し、CNVKを含むオリゴDNAが相補鎖的1本鎖DNAもしくはRNAと数秒の光照射により光架橋することを報告していた。しかし、これまでは2本鎖DNAに対してCNVKを含むオリゴDNAの侵入が難しいため、ゲノムDNAの光操作は困難であった。そこで、平成29年度の実績として、まずゲノムDNAの光操作に必要と考えられるダブルストランドインベーションDNAの構築を行った。CNVKとシアノウリジン(CNU)を含む2本のオリゴDNAを用いることで、2本鎖DNAに対してダブルストランドインベーションDNAを構築できることを見出した。CNUプローブを導入することにより、2種類のオリゴDNA同士の自己架橋が抑制され、二本鎖DNAに対して光架橋しているものと考えられる。また、平成29年度には可視光域で操作可能な新規光架橋素子としてピラノカルバゾールヌクレオシドの開発に成功した。400 nmの光照射を10秒行なうことにより対象となるオリゴDNAと光架橋することを見出した。架橋体のNMR構造解析の結果、CNVKと同様に[2+2]光環化反応により標的ピリミジン塩基と光架橋していることを見出した。

ピラノカルバゾールヌクレオシドを用いることで、細胞毒性の弱い光波長で光架橋反応を誘起することが可能となった。その他、チミンダイマーの光修復を可能とする新規光増感剤の開発や反応性の異なる光架橋素子を用いることによりメチルシトシンを定量的に検出可能であることを実証した。本年度は細胞内でのゲノム操作に向け、新規光架橋素子の合成、およびその評価を行った。その結果、従来の紫外光よりも細胞への光毒性の低い可視光で操作可能な新規光架橋素子の開発に成功した。400 nmで数秒、450 nmでも数分の光照射で標的核酸と光架橋することを見出した。また、シアノビニルカルバゾール(CNVK)とシアノウリジン(CNU)を含む2本のオリゴDNAを用いることで、ゲノム操作に必要と考えられる2本鎖DNAに対してダブルストランドインベーションDNAを構築できることを見出した。以上のことから計画はおおむね順調に進行していると考えているゲノムDNAを対象とした化学的・酵素的操作法は遺伝子増幅、メチル化DNA解析、ゲノム編集などに応用されている。研究者はこれまでの研究において光応答性人工核酸である3-シアノビニルカルバゾール(CNVK)とシアノウラシル(CNU)を併用することで自己架橋を抑制し、今まで困難とされていた二本鎖DNAへの光架橋に成功している。しかし、自己架橋抑制の為にCNVKとCNUを併用しているものCNVKとCNU同士で全く光架橋しないわけではなく、プローブDNA同士の自己架橋が副反応として観察された。そこで、平成30年度はまずCNUに変わる新たな光架橋抑制分子の検討を行い、ゲノムDNAの光操作に必要と考えられる副反応(自己架橋)が抑えられたダブルストランドインベージョンDNA構築を行った。アザウラシル、ニトロインドール、塩基部分のないd-スペーサー、C3リンカースペーサーを用いて検討を行った結果、CNVKの架橋位置にC3リンカースペーサーをおいた際にCNUよりも光架橋抑制効果が高いことを見出した。また、副反応として観察されていた自己架橋反応を抑制することでmダブルストランドインベージョンDNA構築が70%という高収率で進行することも見出した。さらに、高次構造を持つ核酸(mRNA)に対し、超高速光架橋能を有するアンチセンス核酸を作用させる事で遺伝子発現を強力に抑制することにも成功した。ゲノムDNA自体はヒストンに巻き付くなど複雑な高次構造を形成していると考えられ、超高速光架橋反応のゲノム操作への有効性を確認することに成功した。本年度はゲノムDNAの光操作に向け、シアノウラシル(CNU)に変わる新たな光架橋抑制分子の検討を行い、ゲノムDNAの光操作に必要と考えられる副反応(自己架橋)を抑えたダブルストランドインベージョンDNA構築に成功した。さらに、高次構造を持つ核酸(mRNA)に対し、超高速光架橋能を有するアンチセンス核酸を作用させる事で遺伝子発現を強力に抑制することにも成功しており、同様に高次構造を有するゲノムを対象とした核酸類操作として超高速光架橋反応が有効であることをを確認した。以上のことから計画はおおむね順調に進行していると考えている。昨年度合成に成功した光架橋