hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
自己組織化による動的微細構造表面を用いた海洋付着生物の接着制御

生き物の動的な性質に着目した場合、柔らかな表面では付着行動時に変形が生じる可能性が考えられる。その為、低弾性的素材を用いた基板上にて付着実験を行う。また付着生物のサイズと微細構造のサイズの関係について検討を行う為、フジツボ付着期幼生よりも一桁サイズが小さい付着珪藻を用いた付着実験を行う予定である。28年度が最終年度であるため、記入しない。
神経ペプチドPACAPによる神経障害に対する細胞死抑制・軸索伸張の分子制御機構

近年、脳虚血・脳梗塞モデル、脊髄損傷モデルといった神経障害モデル動物を用いた研究結果から、PACAPはその受容体分子に結合し、遅発性神経細胞死抑制作用や損傷した神経に対し軸索伸長作用を持ちその機能を回復することが明らかになっている。本研究では各種遺伝子ノックアウトマウス、阻害剤等を用い、PACAPの神経細胞死抑制作用、軸索伸長作用における分子機構の解明を目的とする研究を行う。当該年度は神経分化モデルとして広く使われるラット副腎褐色細胞腫細胞PC12細胞に種々な濃度のPACAPを添加し、軸索伸長時の分子機構の解析を行った。PACAP受容体にはPAC1受容体(-R)、VPAC1-R、そしてVPAC2-Rの3つの受容体が存在するが、まず、PACAP添加による軸索伸長にこれらのどの受容体が関与するかを各受容体遺伝子の発現および阻害剤を用いた実験で検討した。その結果、PACAPによるPC12細胞の軸索伸長にはPAC1-Rが関与することが明らかになった。また、これまでの結果から脊髄損傷モデルマウスにPACAP処置をした際に軸索伸長因子であるCRMP2遺伝子の発現上昇が損傷部位で認められたことから神経傷害時におけるPACAPの神経細胞死抑制作用、軸索伸長作用においてCRMP2が関与している可能性を強く示唆されている。そこで、PC12細胞においてPACAP添加により、CRMP2およびその関連タンパク質の変化を調べたところ、リン酸化CRMP2が減少し、そのリン酸化酵素であるGSK3βの不活性化が認められた。以上の結果から、PACAPのによるPC12細胞の軸索伸長には、PAC1-Rおよび、GSK3βの不活性化とそれに伴うリン酸化CRMP2の減少が関与していることが示唆された。当初、PACAP受容体であるPAC1-R, VPAC1-R, VPAC2-R遺伝子についてそれぞれノックアウトマウスの作製を行い、これらを用いて神経傷害モデルに対してPACAPが野生型マウスを用いた神経傷害モデルと比較して神経細胞死抑制・軸索伸長作用の効果に変化があるかを解析する計画であった。しかし、PAC1-R遺伝子ノックアウトマウスは作製できたが、VPAC1-R, VPAC2-R遺伝子ノックアウトマウスについては遅延しているため。作製したPAC1-R遺伝子ノックアウトマウスを用い脊髄損傷モデル、脳虚血モデルを作製する。これら神経傷害モデルに対してPACAPが野生型マウスを用いた神経傷害モデルと比較して神経細胞死抑制・軸索伸長作用の効果に変化があるかを解析し、動物個体レベルでPACAPの神経細胞死抑制作用、軸索伸長作用を解析する。また、PAC1-R遺伝子ノックアウトマウス脳から初代神経細胞を単離培養し、PACAPによる軸索伸長作用を野生型マウス由来神経細胞に対する作用と比較し、詳細な分子機構の解明を行う。さらに、またDNAアレイを行う実験系が立ち上がったので、これを用いより詳細なPACAPによる神経細胞死抑制あるいは神経再生・新生の実態を解明する予定である。下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド(Pituitary Adenylate Cyclase-Activating Polypeptide , PACAP)は主に神経組織で発現しており、生体内で多様な機能を担っている。これまでに得られた結果からPACAPの軸索伸長作用にはCRMP2遺伝子が関与している可能性が示唆されている。そこで、当該年度はPACAP添加により培養神経細胞が軸索伸長を促進する際のCRMP2タンパク質の発現量、およびリン酸化CRMP2タンパク質を定量した。また、CRMP2遺伝子に対するsiRNAをそれぞれ導入し、PACAPによる軸索伸長作用にCRMP2が関与しているかを検討するとともに各種阻害剤を用いてCRMP2をリン酸化するGSK3βなどリン酸化酵素活性についても併せて検討を行った。さらに上記実験と平行し、CRISPR/Cas9システムを用いて、PACAP受容体であるPAC1-R, VPAC1-R, VPAC2-R遺伝子についてそれぞれノックアウトマウス作製を開始した。

そこで、PC12細胞においてPACAP添加により、CRMP2およびその関連タンパク質の変化を調べたところ、リン酸化CRMP2が減少し、そのリン酸化酵素であるGSK3βの不活性化が認められた。以上の結果から、PACAPのによるPC12細胞の軸索伸長には、PAC1-Rおよび、GSK3βの不活性化とそれに伴うリン酸化CRMP2の減少が関与していることが示唆された。当初、PACAP受容体であるPAC1-R, VPAC1-R, VPAC2-R遺伝子についてそれぞれノックアウトマウスの作製を行い、これらを用いて神経傷害モデルに対してPACAPが野生型マウスを用いた神経傷害モデルと比較して神経細胞死抑制・軸索伸長作用の効果に変化があるかを解析する計画であった。しかし、PAC1-R遺伝子ノックアウトマウスは作製できたが、VPAC1-R, VPAC2-R遺伝子ノックアウトマウスについては遅延しているため。PACAP受容体遺伝子ノックアウトマウス作製を完了させ、これらを用い脊髄損傷モデル、脳虚血モデルを作製する。これら神経傷害モデルに対してPACAPが野生型マウスを用いた神経傷害モデルと比較して神経細胞死抑制・軸索伸長作用の効果に変化があるかを解析し、PACAPの作用においてどの受容体が関与しているかを明らかにする。また、各遺伝子ノックアウトマウス脳から初代神経細胞を単離培養し、PACAPによる軸索伸長作用を野生型マウス由来神経細胞に対する作用と比較する。作製したPAC1-R遺伝子ノックアウトマウスを用い脊髄損傷モデル、脳虚血モデルを作製する。これら神経傷害モデルに対してPACAPが野生型マウスを用いた神経傷害モデルと比較して神経細胞死抑制・軸索伸長作用の効果に変化があるかを解析し、動物個体レベルでPACAPの神経細胞死抑制作用、軸索伸長作用を解析する。また、PAC1-R遺伝子ノックアウトマウス脳から初代神経細胞を単離培養し、PACAPによる軸索伸長作用を野生型マウス由来神経細胞に対する作用と比較し、詳細な分子機構の解明を行う。さらに、またDNAアレイを行う実験系が立ち上がったので、これを用いより詳細なPACAPによる神経細胞死抑制あるいは神経再生・新生の実態を解明する予定である。当初購入を予定していた、実験動物の購入費が少なく済んだため。また学会参加費、旅費が不要であった。これらは次年度の遺伝子ノックアウトマウス作製の費用に充てる。これらは次年度の遺伝子ノックアウトマウス作製・維持の費用に充てる。
ペリサイトをターゲットとした腫瘍血管の正常化－膵癌の新規治療法開発に向けて－

血管新生阻害薬は大腸癌、肺癌などで一定の効果をあげているが、膵癌では実用化されていない。本研究では血管を裏打ちし、血管の安定性に関わるペリサイト(周皮細胞)を標的とする新規治療の開発を目指した。我々の研究では膵癌組織でペリサイトは間質に広く存在していた。そこで、血管の脆弱性が膵癌の豊富な間質増生によってもたらされる可能性を考え、間質増生に中心的な役割を果たす膵星細胞に注目して研究を行った。膵癌切除組織の膵星細胞のCD51発現は予後と負の相関があり、膵星細胞のCD51抑制実験ではin vitroで膵星細胞の遊走、浸潤能は低下し、ヌードマウスへの膵癌細胞との共移植では腫瘍形成能が低下した。本研究の目的は、膵癌の治療抵抗性の一つである乏血性に注目し、腫瘍血管の機能異常を正常化することで薬剤到達率の向上を計り、治療の有効性を高めることである。本研究では腫瘍血管の構成要素の一つであるペリサイトに注目し、腫瘍血管における機能や血管新生時における役割を解析し、ペリサイトの正常化により血管の安定性を回復させることを目標としている。本年度はまず膵癌切除組織におけるペリサイトの形態・分布について、凍結切片を用いた蛍光染色により検討した。これまでに報告されているペリサイトのマーカーとしてNG2、PDGFRβなどがあるが、これらの免疫染色により膵癌組織における癌細胞の周囲の間質にペリサイトが広く分布していることが判明した。また、CD31を血管内皮細胞のマーカーとして上記マーカーとの2重染色を行うと、血管の分布とは無関係にペリサイトが分布していることも分かった。免疫染色におけるペリサイトの分布は、膵癌の豊富な間質、特に活性化した膵星細胞(PSCs)の分布と非常によく似ているため、PSCsとして膵癌切除組織から我々が樹立した間質の細胞集団の中に、ペリサイトマーカーを発現した群が存在していることを疑った。これを証明するため、フローサイトメトリーによりPSCsを解析し、ペリサイトマーカーであるNG2およびPDGFRβの2つの細胞表面抗原を指標としてPSCsにおける陽性率を検討した。その結果、膵癌組織由来のPSCsの中にはNG2、PDGRFβという表面抗原を有した細胞集団が存在することわかった。しかしながら、その陽性率は様々で、PSCsの由来や培養条件などに影響され、ダイナミックに発現が変化するということが判明した。本年度は、膵癌における血管の脆弱性が、膵癌の豊富な間質増生によってもたらされている可能性について、間質増生において中心的な役割を果たしている膵星細胞に焦点を絞り、間質増生の制御が血管の安定性向上に与える影響について検討を行った。膵癌の間質をターゲットとした間質制御については、ヒアルロン酸分解酵素やヘッジホッグ阻害剤などが有効であるとする報告がなされているが、未だ実臨床において実用化されていない。我々は、肝臓における線維化に肝星細胞のCD51が関与するとの報告を元に、膵星細胞におけるCD51制御が間質を抑制できるとの仮説を立て検証を行った。免疫組織化学染色では、膵癌組織において、CD51は間質に広く発現することを確認した。膵星細胞のCD51をRNA干渉によって発現抑制を行うと、膵星細胞の遊走および増殖能は低下した。さらに、CD51を抑制した膵星細胞においては、コラーゲンIやフィブロネクチンといった細胞外基質の産生が低下していることが確認できた。このことは、CD51が膵癌の間質制御において新たな標的となりうることを示し、血管の正常化にとって非常に意義のある結果である。本年度は膵星細胞におけるCD51の制御が間質増生を制御できるという仮説に基づき、昨年度に引き続き膵星細胞のCD51が膵癌の微小環境に与える影響について検証を行った。昨年までに膵癌組織において、CD51は間質に広く発現していることや、膵星細胞のCD51をRNA干渉によって発現抑制を行うと、膵星細胞の遊走および増殖能は低下し、さらに、CD51を抑制した膵星細胞においては、コラーゲンIやフィブロネクチンといった細胞外基質の産生が低下していることが確認できた。今年度はこれらの膵星細胞と膵癌細胞をヌードマウスの皮下に共移植することで、生体内でのCD51の役割を検討した。その結果、膵癌細胞とコントロールの膵星細胞を共移植した群と比較して、CD51を抑制した膵星細胞を共移植した群では腫瘍の増大、線維化及び癌細胞の増殖が抑制された。このことから、生体内でもCD51が膵癌の微小環境において膵癌の増大や線維化に促進的に働いている可能性が示唆された。

また、これらの結果をInternational Journal of Oncology誌に報告した。その他に、低酸素下で膵星細胞に誘導されるprocollagen-lysine, 2-oxoglutarate 5-dioxygenase 2 (PLOD2)が膵癌間質のリモデリングを促進することで膵癌の浸潤を促進することを明らかにし、Cancer Letters誌に報告した。血管新生阻害薬は大腸癌、肺癌などで一定の効果をあげているが、膵癌では実用化されていない。本研究では血管を裏打ちし、血管の安定性に関わるペリサイト(周皮細胞)を標的とする新規治療の開発を目指した。我々の研究では膵癌組織でペリサイトは間質に広く存在していた。そこで、血管の脆弱性が膵癌の豊富な間質増生によってもたらされる可能性を考え、間質増生に中心的な役割を果たす膵星細胞に注目して研究を行った。膵癌切除組織の膵星細胞のCD51発現は予後と負の相関があり、膵星細胞のCD51抑制実験ではin vitroで膵星細胞の遊走、浸潤能は低下し、ヌードマウスへの膵癌細胞との共移植では腫瘍形成能が低下した。本年度は、ペリサイトおよび腫瘍血管の周囲に存在する間質について、膵星細胞のCD51をターゲットとすることで制御できる可能性について示したが、実際にペリサイトおよび周囲血管への影響については、これから検討を加える予定である。さらに、正常血管構築を制御するペリサイトの因子についての検討が遅れている。医歯薬学まず、膵星細胞におけるCD51をターゲットとした膵癌間質の制御によるペリサイト(腫瘍血管)への影響について、マウスモデルを用いて検討するとともに、ペリサイト自体の血管構築正常化に向けた標的を明らかにし、治療への応用を検討する。当初の計画では、本年度は膵癌切除組織と正常膵組織からのペリサイトの単離とそれらの遺伝子発現の差異をマイクロアレイによって解析する予定であったが、現状では初代培養した膵癌間質細胞におけるペリサイトマーカーの発現解析にとどまっている。その理由として、ペリサイトマーカー発現の多様性があるためにセル・ソーティングが予想以上に困難であり、その培養条件の設定などをより厳密に検討する必要がでてきたことがある。ほぼ計画通りに使用できたが端数のみ残額が発生した。膵癌切除組織および正常膵からのペリサイトの単離を試み、その2群について、遺伝子発現の差異をマイクロアレイにより解析する。それと同時に、単離したペリサイトの機能解析も進め、血管内皮細胞との相互作用やチューブ形成におけるペリサイトの影響などを検討する予定である。さらに、マイクロアレイで同定した遺伝子をターゲットとしたノックダウンや強制発現実験を行い、血管の正常化に関与するタンパクを探索する。試薬類、抗体、リボ核酸干渉・遺伝子強制発現、実験用マウス、実験用ガラス器具、人件費、研究成果発表費、論文投稿料研究が当初の計画よりやや遅れているため。PCR用試薬、遺伝子導入用試薬、qRT-PCR試薬、ソート用モノクローナル抗体、Nucleofector用導入試薬、siRNA、shRNA/レトロウイルス作成キット、マウス等などの消耗品を経費として予定している。
EpiSC由来の幹細胞群を用いた、神経板の領域特異的な形成機構の研究

本研究はマウス胚エピブラストより単離したepiblast stem cells (EpiSCs)を利用して、神経板の発生における転写制御ネットワークを明らかにすることを目的とする。マウス胚の神経板はE7.5以降、転写制御の異なるいくつかの領域に分かれて発生する。神経板の最前部(anterior forebrainの前駆体)は、Hesx1遺伝子の活性化で特徴付けられる。EpiSCの内在のWntシグナルをDkk1によって抑制すると、最前部神経板細胞を効率よく発生させることを明らかにした。また、Wntシグナルの抑制の効果がHesxlの5'エンハンサーを介してHesx1の発現を制御していることも示した。現在、開発したEpiscの神経板発生モデルを利用して、神経板を発生させる転写制御ネットワークを解析している。具体的にはOct3、Sox2、Otx2、Oct6、Zic2といった転写因子のEpiSCと神経板細胞における結合領域を、ビオチン化転写因子を用いた新しいChIP-seq法を用いて、網羅的に解析している。これまでに発表されたデータ、例えばLodato et al., 2013などのES細胞や神経系前駆細胞でのChIP-seqのデータと比較することで、ES細胞、EpiSCs、神経板細胞での転写因子の結合領域の違いを明らかにしつつある。(抄録なし)本研究は(1)EpiSCより由来する領域特異的な神経板細胞を樹立または単離する。(2)それらの幹細胞を用いて、領域特異的な神経板細胞を発生させる転写制御ネットワークを明らかにする。(3)培養細胞で明らかにした転写制御ネットワークを実際のマウス胚を用いて確認する。という3つの目的のもとで進めている。初年度は(1)について取り組んだ。EpiSCを神経系へと分化させる条件下(無血清培地よりEpiSCの維持に必要なActivinとFgfを取り除く)では神経板の様々な領域が混在した神経板細胞が分化していることを確認した。この混在状態より、Sox2遺伝子のエンハンサーN2を用いることで、前部神経板の発現プロファイルを反映した細胞集団を単離することができた。次にこの前部神経板に対応した神経板細胞を安定培養することを目指し、TetシステムとTol2トランスポゼースを利用した。時期・領域特異的なエンハンサーの活性を定常的に反映し、活性を持った細胞を選抜できるシステムを開発した。神経板の領域を考慮した細胞を単離し、安定培養するという試みは類を見ない。現在このシステムと時期・領域特異的なエンハンサーを利用し、前部神経板の単離、培養のための条件を検討している。前部神経板を単離するためのエンハンサーの候補として、Hesx1エンハンサーが挙げられる。このエンハンサーを効果的に利用するため、エンハンサーの特性について詳細に調べている。本研究は1.EpiSCより由来する領域特異的な神経板細胞を樹立または単離する。2.それらの幹細胞を用いて、領域特異的な神経板細胞を発生させる転写制御ネットワークを明らかにする。3.培養細胞で明らかにした転写制御ネットワークを実際のマウス胚を用いて確認する。という3つの課題を進めている。本年度は1と2について取り組んだ。最前部神経板は、Hesx1遺伝子の活性化で特徴付けられる。Hesx1の発現を制御するエンハンサーを活用して、最前部神経板状態で活性化されるレポーター遺伝子を開発した。最前部神経板ではWntシグナルが非常に低い状態にある。この状態を培養条件下で再現するために、WntシグナルのアンタゴニストであるDkk1を強制発現させて、EpiSC集団に内在するWntシグナルの効果を抑制した。その結果、最前部神経板に対応する神経板細胞をEpiSCから効率よく生み出す事ができた。このことは上記のレポーター遺伝子の活性化だけでなく、Hesx1のin situ hybridizationによっても確認した。これまでに、前部神経板、最前部神経板に対応した神経板細胞をEpiSCより効率よく発生させることができた。これらの細胞群を用いて、OCT3やOTX_2などの転写制御因子がゲノム上で結合する配列を網羅的に解析する。そのための予備実験として、ビオチン・ストレプトアビジンの特異的な結合を利用したChIP・PCRを行った。EpiSCでBLRP-OCT3(BLRP:ビオチンリガーゼ認識配列を付加したOCT3)を強制発現させた。BLRP-OCT3を強制発現させたEpiscを回収し、ChIP・PCRを行ったところ、OCT3結合配列を持つSox2のエンハンサーN2配列の特異的なバンドの増幅が見られた。

具体的にはOct3、Sox2、Otx2、Oct6、Zic2といった転写因子のEpiSCと神経板細胞における結合領域を、ビオチン化転写因子を用いた新しいChIP-seq法を用いて、網羅的に解析している。これまでに発表されたデータ、例えばLodato et al., 2013などのES細胞や神経系前駆細胞でのChIP-seqのデータと比較することで、ES細胞、EpiSCs、神経板細胞での転写因子の結合領域の違いを明らかにしつつある。領域特異性を持った神経板細胞を単離する目的で利用するエンハンサーの活性を効果的に反映させる条件検討を十分に行っているため。エンハンサーによって活性を強く持つ細胞状態や転写制御が異なる。前部神経板で活性を持つエンハンサーはいくつか知られているが、それらが活性を持つ条件を慎重に検討した。神経板細胞の領域を決めるエンハンサーの選定は本研究の要といっても良い。十分に時間をかける価値がある。神経板の領域特異性を反映した神経板細胞をEpiscより効率良く発生させる条件検討に多くの時間を要した。結果として前部神経板だけでなく、最前部神経板に対応した神経板細胞を効率よく発生させる条件を見つけることができた。これはWnt因子の抑制と神経板の領域化を結びつける新たな発見であり、多くの時間を要した価値があったと考える。本研究の推進方策に大幅な変更はない。神経系へと分化させる条件を工夫することによって、前部神経板特異的なエンハンサーの活性を培養細胞において効果的に反映させる方法を確立する。領域特異的な神経板細胞を単離することができれば、EpiSCと領域特異的な神経板細胞それぞれの状態をマイクロアレイなどで網羅的に遺伝子発現プロファイルを解析する予定だ。神経板の領域化に重要だと考えられている転写因子(例えばOCT3やOTX2)について、Episcより発生する前部神経板細胞、最前部神経板細胞を用いたChIP-seqを行う。これらの転写制御因子のゲノム上での結合領域の違いが神経板の領域化にどのような効果を及ぼすのかを明らかにしたい。(抄録なし)
肺ロイコトリエンD_4受容体の生化学的研究

本研究の目的は喘息等の病態の重要なメディエ-タ-であるロイコトリエン(LT)D_Δの肺の受容体の性質及び情報伝達機構を分子レベルで解明することであり、以下の二つの方法を用いた。モルモット肺の膜分画よりLTD_Δ受容体、同時に脾臓のLTB_Δ受容体をさまざまの界面活性化剤を用いて活性の可溶化を試みた結果、CHAPSを用いて効率よく活性型のまま可溶化に成功した。この可溶化蛋白はカラムクロマトにより部分精製され、受容体蛋白は分子量約7万の糖蛋白であることが判明した。また、百日咳毒素を用いてこの受容体が百日咳毒素感受性のGTP結合蛋白と連関していることが証明された(文献1、2)。しかし、可溶化された受溶体活性は不安定で受容体蛋白の単一蛋白としての精製には至らなかった。2)発現系を用いた受容体蛋白cDNAのクロ-ニングモルモット肺より抽出したmRNAより作成したcDNAをλベクタ-に組み込みcDNAライブラリ-を作成した。またアフリカツメガエル卵母細胞に肺のmRNAを注入しLTD_Δに反応するCa^<2+>依存性のCl電流をvoltage clamp法にて感知する電気生理的方法によるスクリ-ニングにより受容体蛋白をコ-ドしたcDNAのクロ-ニングを試みた。肺LTD_Δ受容体のクロ-ニングは当該年度中には成功せず、現在進行中である。しかし、同じcDNAライブラリ-を用いて、血小板活性化因子(PAF)の遺伝子クロ-ニングに成功し、その核酸、アミノ酸配列、hydropathicity profileなどから受容体蛋白の構造を明らかにした。また、COS細胞での受容体の発現にも成功している。(文献3)本研究の目的は喘息等の病態の重要なメディエ-タ-であるロイコトリエン(LT)D_Δの肺の受容体の性質及び情報伝達機構を分子レベルで解明することであり、以下の二つの方法を用いた。(文献3)ロイコトリエン(LT)D_4はいわゆるslow-reacting substance of anaphylaxis(SRS-A)として喘息その他の病態に於けるメディエイタ-として重要な役割を果たしている。その作用機能に関しては、肺由来の細胞膜にはLTD_4に特異的な高親和性の結合部位特異的受容体の存在知られている。本研究の目的は、今まで成功していない受容体蛋白の精製しその性質を明らかにすること、または受容体蛋白をコ-ドするcDNAの単離を行うことを目的にしている。(1)肺LTD_4受容体蛋白の生化学的追求モルモット肺の膜分画よりさまざまの界面活性化剤を用いて活性の可溶化を試みた結果、CHAPSを用いて効率よく活性型のまま可溶化に成功した。また、百日咳毒素を用いて解析により、この受容体が百日咳毒素感受性のGTP結合蛋白と連関していることが証明され、その情報伝達機構に関していくつかの新知見を得た(研究発表文献参照)。(2)発現系を用いた受容体蛋白cDNAのクロ-ニングモルモット肺より抽出したmRNAより作製したcDNAをλベクタ-に組み込みcDNAライブラリ-を作製した。アフリカツメガエル卵母細胞にライブラリ-より転写したmRNAを注入しLTD_4に反応するCa^<2+>依存性のCl電流をvoltage clamp法にて感知した。これから、この系を用いてスクリ-ニングを開始する予定である。以上、受容体蛋白の生化学的研究としては連関するGTP結合蛋白とその蛋白の性質について新知見を得た。しかし、可溶化受容体蛋白は不安定で現在のところカラムクロマトの連続的使用に耐えない。従って、第二の遺伝子工学的方法に重点をおいて研究を進めて行く予定である。

本研究の目的は喘息等の病態の重要なメディエ-タ-であるロイコトリエン(LT)D_4の肺の受容体の性質及び情報伝達機構を分子レベルで解明することであり、以下の二つの方法を用いた。1)肺LTD_4受容体蛋白の生化学的追求モルモット肺の膜分画よりLTD_4受容体、同様に脾臓のLTB_4受容体をさまざまの界面活性化剤を用いて活性の可溶化を試みた結果、CHAPSを用いて効率よく活性型のまま可溶化に成功した。この可溶化蛋白はカラムクロマトにより部分精製され、受容体蛋白は分子量約7万の糖蛋白であることが判明した。また、百日咳毒素を用いてこの受容体が百日咳毒素感受性のGTP結合蛋白と連関していることが証明された(文献1、2)。しかし、可溶化された受容体活性は不安定で受容体蛋白の単一蛋白としての精製には至らなかった。2)発現系を用いた受容体蛋白cDNAのクロ-ニングモルモット肺より抽出したmRNAより作成したcDNAをλベクタ-に組み込みcDNAライブラリ-を作成した。またアフリカツメガエル卵母細胞に肺のmRNAを注入しLTD_4に反応するCa^<2+>依存性のCl電流をvoltage clamp法にて感知する電気生理的方法によるスクリ-ニングにより受容体蛋白をコ-ドしたcDNAのクロ-ニングを試みた。肺LTD_4受容体のクロ-ニングは当該年度中には成功せず、現在進行中である。しかし、同じcDNAライブラリ-を用いて、血小板活性化因子(PAF)の遺伝子クロ-ニングに成功し、その核酸、アミノ酸配列、hydropathicity profileなどから受容体蛋白の構造を明らかにした。また、COS細胞での受容体の発現にも成功している。(文献3)
多中心プロトン移動を含むATP加水分解とその自由エネルギープロファイルの理論研究

本研究では、細胞内の化学・力学エネルギー変換で重要な役割を担うアデノシン三リン酸(ATP)分子の性質について、量子化学・統計力学に基づく理論的研究を行った。ATP分子は3つのリン酸基にエステルが付加したものであり、加水分解に伴う末端リン酸基の解離によって7--10kcal/mol程度の自由エネルギーを放出する。酵素や膜タンパク質は、放出された自由エネルギーを用いて触媒機能を発揮していると考えられている。本研究では、新学術領域の目的の一部として、特に溶液中での反応に焦点を当て、加水分解で生じる自由エネルギー変化の分子論的なメカニズムについて調べた。方法としては、反応に関与する分子を量子化学の方法で扱い、周りの水分子を経験的分子力場で扱うQM/MM法を用いた。特に、最近提案された平均場近似に基づく方法(溶質の波動関数を溶媒平均場の下で決定し、得られた平均波動関数を溶媒に埋め込む)を用いて、反応に伴う自由エネルギープロファイルを定量的に計算した。その結果、全自由エネルギーの変化は溶質分子内のエネルギー寄与(リン酸基間のクーロン反発)と、溶質--溶媒間の静電相互作用による安定化(溶媒和自由エネルギー)の大きなキャンセレーションによって生じていることが分かった。溶質分子内におけるクーロン反発は末端リン酸基を解離させる力として働くが、まわりの水分子はリン酸基の解離を抑制する方向の力を与えており、両者のつりあいが反応速度を決めていることになる。その結果、誘電率の低い溶媒(有機溶媒)では、溶媒和による反応の抑制効果が十分でなくなり、末端リン酸は非常に解離しやすい状態となることが分かる。これは、酵素中(低誘電率のタンパク環境)におけるATP加水分解を促進する物理的な原因の一つであると考えられる。ATP加水分解反応は生体分子のエネルギー伝達において中心的な役割を果たすにも関わらず、化学・力学エネルギー変換を含む総合的なエネルギー伝達の仕組みは未だに良く分かっていない。シミュレーションでこれを調べる方法としてはQM/MM法(量子化学計算と分子力場をハイブリッドに使う方法)等があるが、様々な理由によって計算の信頼性を得るのが難しい場合が多い。(ATPが大きな負電荷を持つこと、周りの溶媒やタンパク質とプロトンのやりとりをすること、ATP加水分解と共役するドメイン運動の時間スケールが一般に非常に長いことなど。)本研究では、まず溶液内のATP加水分解反応を対象として、QM/MM法に基づいて信頼性のある自由エネルギープロファイルを計算すること、および関与する複数の反応経路を自動的に洗い出す方法の開発を目的として研究を行った。平成21年度は、反応の始状態と終状態のみが分かっている時に、その両者をつなぐ最低エネルギー(または最低自由エネルギー)経路を状態チェインの方法で調べる研究を行った。その結果、水中メチルモノリン酸の加水分解ではassociativeなメカニズムとなるが、メチルピロリン酸やトリリン酸ではdissociativeなメカニズムとなった(触媒水は1個のみを仮定)。ただし、線形補間経路を初期経路として用いると、最適化された補間経路は初期経路に強く依存し、定性的に誤った結果になりうることが分かった。そこで、現在は初期経路になるべく依存しない自動的な経路探索の方法を調べている。さらに、ATPは大きい負電荷を持つため、溶媒やタンパク質の電子分極が自由エネルギー変化に対して定量的な影響を持つと考えられる。これを考慮するため、charge response kernelを用いたQM/MM自由エネルギー計算法の開発とテストを行った。
物性測定用液体ヘリウムレス希釈冷凍機の完全自動化システムの開発

本研究では、試作希釈冷凍機を用い、現在の開発中のリレー操作自動システムをコンピュータ制御の自動システムに置き換え、かつ、適切なプログラミング化により300KからmKまでの連続的温度設定が可能な希釈冷凍機の実現を目的とする。物性測定用としては、室温から数十mKまで連続的に温度設定を必要とするため、コンピュータ制御が不可欠であり、運転操作の自動化のためのコンピュータのプログラミング開発を行うことが本研究の目的である。運転の自動化シークエンスのコンピュータプログラミング化を行い、シークエンスと同様の運転が再現できることの確認であったが、これに関しては再現できることを確認した。冷却速度を自由に設定できることの確認においては、各温度域で必要なパワーが数桁も変わることから、複数の温度定点となる箇所に、それぞれ適切なパワーをもつヒーター抵抗を設置することが必要であることがわかった。実際のオペレーションに置いては、20mKから1K間は問題なく温度制御ができたものの、1Kから10Kおよび10Kから300Kの範囲では、それぞれ冷却速度の調整、および温度計の感度切換などが伴うため、一つの温度計だけの制御は難しく、プログラミングの開発も複雑になることが判明した。広範囲な温度制御を可能とするためには、単一の場所に設置した温度計での制御は困難で、最低2カ所に温度計とヒーターを設置し、適切なヒーターパワー配分による制御が必要となることが判明した。いずれにしても寒剤をいっさい用いないため、室温から連続的に温度制御はこのタイプの希釈冷凍機を用いることにより可能であることを明らかにできた。H19年度の当初計画では、現在開発中の運転の自動化シークエンスのコンピュータプログラミング化を行い、シークエンスと同様の運転が再現できることの確認であったが、これに関しては再現できることを確認した。冷却速度を自由に設定できることの確認においては、各温度域で必要なパワーが数桁も変わることから、ヒーターの適正抵抗に関する計算を行った結果、抵抗値を数段に切換するシステムを用意するか、もしくは抵抗は一つにしておいて、定電流源のハイパワー化を図るか2通りの方法を考えた結果、複数の温度定点となる箇所に、それぞれヒーターとなる抵抗を設置することが必要であることが新たにわかった。もう一つの課題であった振動の評価に関しては、パルス管冷凍機のバルブユニットの支持を別架台とし、希釈冷凍機とパルス管冷凍機間の熱リンクをさらに細い銅線に変えること、パルス管冷凍機のガスチューブのブロックによる固定などにより人が関知できる程度の振動の除去に成功した。
生体機能探索分子を用いたイノシトール3リン酸受容体のレーザー分子不活化

細胞生物学的研究のゴールの1つは生きている状態における分子の働きを生きているその場で明らかにすることである.このためには細胞をすりつぶさないで機能を調べることができれば多くの情報が得られると考えられる.本研究ではこの目的を達成するために有機化学を道具として用い,直接にIP_3受容体の細胞生物学的機能を解明しようと試みる.特に,生体機能探索分子をデザイン・合成し,イノシトール3リン酸(IP_3)受容体をレーザー分子不活化(CALI,Chromophore-assisted Laser Inactivation)することで,生きた状態での作用の解明を目的とする.方法としては,IP_3受容体に特異的に結合し,レーザー照射によりIP_3受容体の機能を瞬時にノックアウトする化合物を作成・応用する.この作成分子を用いて時間・場所を精密に制御した機能阻害を行い,生理学的条件下でのIP_3受容体の作用解析が可能となる.本年度は前年度の実験結果より得られたデータを有機化学的手法にフィードバックし,機能探索分子の最適化を行い,さらに生物学的評価を行った.現在までの研究結果では研究当初デザインされた化合物において,1位のリン酸基を保護することにより,IP_3の代謝酵素であるKinaseとPhosphataseへの特異性を低下させることに成功している.さらに,モルモットの平滑筋組織を用いてCa^<2+>放出能を測定した結果、これらの分子が弱いアゴニストであることが分かった.つづいて,モルモット冠動脈平滑筋組織の系でCALIを行った.低分子プローブを加え,パルスレーザーを3分間照射すると,照射前に比べて約60%のCa^<2+>放出が抑制された.一方,コントロールでは,変化が見られなかった.以上の実験から、低分子プローブを用いたCALIにより,IP_3受容体の機能を抑制できることが示された.低分子CALIが成功した例はこれがはじめてであり,生体分子の機能解明の手段として,非常に有用となることが期待される.本研究は生体機能探索分子をデザイン・合成し、イノシトール3リン酸(IP_3)受容体をレーザー分子不活化(CALI,Chromophore-assisted Laser Inactivation)することで、生きた状態での作用の解明を目的とする。方法としては、IP_3受容体に特異的に結合し、レーザー照射によりIP_3受容体の機能を瞬時にノックアウトする化合物を作成・応用する。この作成分子を用いて時間・場所を精密に制御した機能阻害を行い、生理学的条件下でのIP_3受容体の作用解析が可能となる。本年度は作成したCALI用IP_3類縁体を用いて生物における機能研究を行った。まず、作成した分子のIP_3受容体への親和性を調べた。IP_3受容体タンパクは、IP_3結合部位のプラスミドを用いて大腸菌を用いて発現させ作成した。作成したIP_3受容体を用い、表面プラスモン共鳴によって結合能を評価した。この結果、作成したマラカイトグリーンIP_3はK_d値が1nMと、現存する結合リガンドの中で最強であることがわかった。また、同様に作成したフルオレッセインIP_3もIP_3と同程度の強い親和性を示した(K_d200nM)。次に、単離組織としてモルモット平滑筋スキンドファイバーを用いて、IP_3類縁体のIP_3受容体からのCa^<2+>放出能を調べた。この結果、前述の量化合物ともIP_3に比べ弱いアゴニストであることが確認された。細胞生物学的研究のゴールの1つは生きている状態における分子の働きを生きているその場で明らかにすることである.このためには細胞をすりつぶさないで機能を調べることができれば多くの情報が得られると考えられる.本研究ではこの目的を達成するために有機化学を道具として用い,直接にIP_3受容体の細胞生物学的機能を解明しようと試みる.特に,生体機能探索分子をデザイン・合成し,イノシトール3リン酸(IP_3)受容体をレーザー分子不活化(CALI,Chromophore-assisted Laser Inactivation)することで,生きた状態での作用の解明を目的とする.方法としては,IP_3受容体に特異的に結合し,レーザー照射によりIP_3受容体の機能を瞬時にノックアウトする化合物を作成・応用する.この作成分子を用いて時間・場所を精密に制御した機能阻害を行い,生理学的条件下でのIP_3受容体の作用解析が可能となる.本年度は前年度の実験結果より得られたデータを有機化学的手法にフィードバックし,機能探索分子の最適化を行い,さらに生物学的評価を行った.現在までの研究結果では研究当初デザインされた化合物において,1位のリン酸基を保護することにより,IP_3の代謝酵素であるKinaseとPhosphataseへの特異性を低下させることに成功している.さらに,モルモットの平滑筋組織を用いてCa^<2+>放出能を測定した結果、これらの分子が弱いアゴニストであることが分かった.つづいて,モルモット冠動脈平滑筋組織の系でCALIを行った.低分子プローブを加え,パルスレーザーを3分間照射すると,照射前に比べて約60%のCa^<2+>放出が抑制された.一方,コントロールでは,変化が見られなかった.以上の実験から、低分子プローブを用いたCALIにより,IP_3受容体の機能を抑制できることが示された.低分子CALIが成功した例はこれがはじめてであり,生体分子の機能解明の手段として,非常に有用となることが期待される.
大腸菌100Sリボソームの構造と形成および解消機構の解明

大腸菌100Sリボソームの形成機構を明らかにするために、極低温電子顕微鏡を用いて100Sリボソームを観察した。その結果、100SリボソームはtRNAを含まない2つの70Sリボソームが30Sサブユニットを介して結合しており、この結合にリボソーム蛋白質S2,S3,S5が関与していることを明らかにした。これら蛋白質はmRNAのリボソーム結合に関与しており、これら蛋白質周辺の構造変化によって100SリボソームにmRNAが結合することを阻害しているのかも知れない。100Sリボソームの極低温(Cryo)電子顕微鏡による構造解析大阪大学難波研究室の協力を得てCryo電子顕微鏡による観察を開始した。しかし、電子顕微鏡観察用のサンプル調製によって100Sリボソームが解離してしまうことが明かとなった。そこで、グルタールアルデヒドで100Sリボソームを固定する方法を採用することにした。最近、この方法で観察されたリボソームの構造がX線結晶構造解析の結果とほぼ同じであることを示す論文が報告され、この方法は有用であると考えられる。この方法を適用した結果、100Sリボソームが左右非対称であることや、幾つか複数の構造を取り得ることが示唆された。現在、より多くのデータを収集して解像度の向上を目指すと共に、100Sリボソームの形成に関与する蛋白因子をリボソームに加えたときの変化をCryo電子顕微鏡で観測するために、蛋白因子を精製している。新規リボソーム結合蛋白質の探索これまでに発見した蛋白質以外にも定常期特異的にリボソームに結合している蛋白質が存在する可能性があり、これを探索した。その結果、機能未知のYqjDという蛋白質が定常期特異的に発現し、リボソームに結合することを見出した。YqjDは二次構造予測からtransmembrane motifを有しており、定常期においてリボソームを膜付近に局在化している可能性がある。現在、この蛋白質の機能を解析中である。100Sリボソームの極低温(Cryo)電子顕微鏡による構造解析大阪大学難波研究室の協力を得てCryo電子顕微鏡による100Sリボソームの観察を実施した。当初、電子顕微鏡観察用のサンプル調製によって100Sリボソームが解離してしまうという障害があったが、グルタールアルデヒドで100Sリボソームを固定する方法(GraFix)を採用することにより観察に成功した。その結果、(1)100Sリボソームは2つの70Sリボソームが2回回転対称で結合している、(2)100Sリボソーム中の70Sリボソームの結合様式(subunit間のbridging site)が、通常のものと異なる、(3)100Sリボソームは主にSmall subunitに存在するS2、S3、S5蛋白質を介して二量体化している、(4)100SリボソームにはtRNAが結合していない、(5)70Sリボソームでは存在しない領域に電子密度が観測される、などが明らかとなった。これらの結果は100Sリボソームの形成過程を考える上で非常に重要であり、今後の研究計画にも影響を与えるものである。例えば、従来の蛋白質合成過程から考えると、翻訳終了後のリボソームからtRNAを除去するのはInitiation factor3(IF3)であるが、昨年の研究結果として一度IF3がリボソームに結合すると100Sリボソームを形成する蛋白因子RMFは結合できないことを明らかにしている。従って、100SリボソームにtRNAが結合していないという事実を基に、従来のリボソームサイクルとは異なった過程を考えなければならない。そこで、今年度はRMF(あるいはHPF)が100Sリボソーム形成時にtRNAを除去する機能を有しているのかを調べることを予定している。また、現状の解像度ではRMFなどの蛋白質因子を可視化できなかったので、in vitroで70SリボソームにRMFなどの蛋白質因子を添加したときの構造を高解像度で観測し、蛋白質因子の結合位置や構造変化を明らかにする。100Sリボソームの極低温(Cryo)電子顕微鏡による構造解析大阪大学難波研究室の協力を得てCryo電子顕微鏡による大腸菌100Sリボソームの観察を実施した結果、70Sリボソームには存在しない領域に電子密度が観測された。そこで、この追加成分の同定を試みた。まず、対数増殖期の70Sリボソームに含まれる蛋白質を二次元電気泳動法で解析した。泳動には塩基性蛋白質の分離に優れたRFHR法を用いた。そして定常期において形成された100Sリボソームの蛋白質も解析し、対数期の70Sリボソームのものと比較した。その結果、複数の蛋白質スポットの変化が認められたが、その殆どは既知のものであり、追加成分の予想分子量の領域には変化がなかった。

従って、未知の追加成分が蛋白質である可能性は低いと考え、次にリボソームに結合しているRNAを調べた。蛋白質の解析と同様に調製した試料を、低分子RNAを分離できる核酸泳動法を用いて解析した。その結果、100Sリボソーム特異的に現れるRNAバンドの存在を確認した。現在、このRNAを解析中である。新規リボソーム結合蛋白質の探索定常期特異的にリボソームに結合することを発見したYqjDの性質を調べた。その結果、以下のことが明らかとなった。(1)yqjD遺伝子を欠損しても明確な形質変化は現れなかった、(2)yqjD遺伝子を大量に発現すると生育阻害が見られた、(3)膜結合モチーフをもつC末端ドメインを欠損しても生育阻害が見られたが、N末端ドメインを欠損すると生育阻害が見られなくなった。現在、YqjDのN末端がリボソームの活性に影響を与えると予想して、機能を調べている。
呼吸器感染症におけるデフェンシンの生体防御因子としての機能解析と分子生物学的研究

抗菌ペプチドであるhuman β-defensin-1(hBD-1)とhuman β-defensin-2(hBD-2)のヒト気道での遺伝子発現をRT-PCR法で解析し、肺組織と気管支肺胞洗浄液の細胞成分に両ぺプチドのmRNAを認めた。hBD-1とhBD-2にそれぞれ特異的な抗体を作成し、高感度の測定系を開発した。ヒト肺組織にはhBD-1は0.15±0.13fmol/mg、hBD-2は2.72±0.16fmol/mgの含量で存在した。正常人の気管支肺胞洗浄液(BALF)中には、hBD-1は39.4±23.4fmol/ml、hBD-2は0.09士0.06fmol/ml存在した。BALF中のhBD-2濃度は急性呼吸窮迫症候群、びまん性汎細気管支炎では14.5士6.5fmol/ml、15.0士9.4fmol/ml、特発性間質性肺炎では4.6±2.1fmol/mlと上昇していた。サルコイドーシスでは変動しなかった。BALF中のhBD-1濃度は急性呼吸窮迫症候群において211.5±48.4fmol/mlと上昇していたが、びまん性汎細気管支炎、特発性間質性肺炎、サルコイドーシスでは変動しなかった。またhBD-1、hBD-2ともに血漿中にも存在しており、細菌性肺炎において血漿hBD-1濃度は変動しなかったが、血漿hBD-2濃度は急性期に増加し、その治癒に伴い正常化した。光顕と電顕レベルでの免疫染色により、hBD-1、hBD-2はともに肺胞1型と2型細胞で産生されることを示した。βデフェンシンは気道に存在する抗菌ペプチドとして、生体防御に関与していることが示唆された。
親の学校参加に関する国際比較研究―学校と親のパートナーシップ関係形成を中心として―

本研究では、地方分権・規制緩和という大きな教育改革の流れの中で、諸外国における「親の学校参加」の在り方を、下記の4つの枠組みから分析比較し、日本における学校教育の質の改善のヒントを得ようとするものである。1.親の学校の意思決定への参加2.親の学校の教育活動への参加3.学校による親・家庭への支援4.親(団体)による学校への助成対象となった国は、アメリカ・イギリス・ドイツ・フランス・スウェーデンなどの欧米先進諸国のほか、アジア・太平洋地域の中国・韓国・マレーシア・オーストラリア・メキシコの計10カ国である。歴史社会文化的背景や経済の発展段階の異なる諸国であるが、親の学校参加、学校と親とのパートナーシップ形成は、教育問題の解決にとっての鍵であり、参加の機会がどの国においても開かれつつあることが明らかとなった。親の学校参加は子どもの心の安定、学力向上、社会的能力の発達にとって有効であり、親の生涯学習の機会となる事実も指摘された。なお、本報告書には、各国についての研究論文のほか、全体へのガイドと比較対照表、各国の関連文献目録などが含まれている。初年度(平成11年度)は、OECDによる親の学校参加に関する先行研究を検討し、調査の枠組みについて協議するとともに、各分担者の責任において各国の法令や事例を文献及びインターネット等を駆使して収集整理するなどの準備的な研究を進めた。当初計画では、年度内に、研究会を計2回、海外調査旅行を3カ国について実施する予定であったが、旅行の実施が諸般の事情から年度末に集中したため、(1)先行研究の検討研究会を計1回行った。調査枠組み、調査旅行実施に関する打ち合わせはインターネットならびに代表者の国内旅行(京都×2回)によって随時行った。(2)現地調査旅行は、韓国(2000年1月×1名)、ドイツ(2000年2月3月×1名)、アメリカ(2000年3月×3名)、オーストラリア(2000年3月×1名)の計4カ国について実施し、各国の政策動向、父母団体の動向、学校参加のモデル的事例についての情報収集を行い、それぞれ成果があった。平成12年度には、初年度の調査報告検討会と日本における学校参加の動向・課題についての研究会を開き、残りの地域(イギリス、フランス、北欧諸国、メキシコ、マレーシア、中国)についても現地調査を進め、中間資料集を編集刊行する。最終年度には1部の地域のフォローアップ現地調査と各地域に関する情報収集をひきつづき進め、最終報告書をまとめる予定である。1.平成12年度の研究活動内容(1)研究総会(計2回):第1回(6月):年間計画の確認。海外調査報告(アメリカ、ドイツ、韓国)。国内の学校評議会(員)設置状況についてのウェッブ調査報告。/第2回(12月):海外調査報告(マレーシア、メキシコ、中国)。国内調査計画の確認。中間資料集のとりまとめについて。(2)日本比較教育学会での発表:(7月)(アメリカ、韓国)(3)有志学習会:(7月11月にかけ、月1回程度参加に関する理論、諸外国のレポートを読む)(4)海外現地調査マレーシア(8月×1名)、メキシコ(9月×1名)、中国(11月×1名)。(5)国内調査岐阜県、新潟県小千谷市、神奈川県茅ヶ崎市×2名(1月)(6)中間報告書(資料集)の執筆・編集(1月3月)2.得られた知見と今後の計画研究目的である、親の学校参加に関する諸外国の理論、政策、実践から参考となる事例を収集・分析してわが国に適合した参加モデルを描く、点に則していうと、当初仮設した「決定参加モデル」「パートナーモデル」の双方が二項対立的に存在するのではないこと、また、参加を通しての親のエンパワーメントという側面もうかびあがってきた。最終年度には可能な範囲のフォローアップ現地調査をすすめながら、横断的比較とモデル提出への取り組みを行う予定である。1.平成13年度の研究活動内容(1)研究総会(計2回):第1回(7月):年間計画。海外調査報告(ドイツ、フランス)、国内調査報告。/第2回(12月):海外調査報告(メキシコ)。親の学校参加・国際比較の視点についての討論、最終報告書とりまとめ方針。

(2)海外現地調査ドイツ(6-7月×1名)、メキシコ(9月×1名)、中国(1月×1名)。(3)日本教育学会、課題研究シンポに参加し、国内の学校参加関係者との交流(8月)。(4)UNESOO-NIER国際セミナー「教育におけるパートナーシップ」の組織と参加(9-10月)。(5)国内調査滋賀県、福岡市、岐阜県内の事例について行う(随時)。(6)最終報告書の執筆、編集(1月3月)。2.得られた知見諸外国の親の学校参加については、「決定参加モデル」「パートナーモデル」の双方が二項対立的に存在するのではなく、両者のどちらに重点があるかはその国・地域の発展情況による違いがある。決定参加機関である学校会議(審議会、評議会、理事会、運営委員会)の運営の仕方にも多様性がみられ、ドイツでは、教師の仕事に親や地域住民が関与しないかわりに、決定において親ばかりか生徒までが投票権を持つ国から、フランスなどのように親団体が地方の教育政策決定参加をする事例までみられた。また以上とは対照的にアメリカのように「教師としての親」の学習・訓練を通して家庭と地域の資質を高める、とされる場合もあった。また、開発途上のアジア・ラテンアメリカの諸国では親の参加自体がまだ新しい経験として上から奨励される段階にあり、政府・教師が与える教育から「教育への参加」の文化形成への転換が徐々にはかられようとしていることも明らかとなった。教師・学校がその専門性をよりよく担保しながら、親とのパートナーシップを築くことは、子どもの学習権・発達権の保障にとって必要なことで、参加を通して親のエンパワーメント、ケァがますます重要となっていることが確認でき、これらは我国における参加のあり方のみなおしに直結できるものである。
TrkBのリン酸化;側坐核における薬物依存習慣化の分子スイッチの機序解明と治療法

神経活動依存性のタンパク質翻訳に関わる分子、TrkBおよびribosomal protein S6(rpS6)のリン酸化は、神経可塑性や学習記憶に関与する。我々はラット側坐核において、TrkBの記憶の統合と獲得にそれぞれ特異的に関与するリン酸化部位、ならびにrpS6でmTOR依存性および非依存性に活性化される2つのリン酸化部位に注目し、対照群と慢性コカイン投与群で、急性コカイン後にそれぞれ異なった活性化が起きることを確認した。動物のコカイン依存行動を正常化するN-アセチルシスティンは、TrkB-mTOR系のリン酸化に影響しなかった。研究の目的;慢性コカイン投与動物の側坐核TrkBの2つのリン酸化部位、Y516とY817の側坐核内シグナル伝達系における機能的意義を調べる。結果;(1)Y516とY817の特異的阻害システムの確立;初年度は、Y516とY817をそれぞれ特異的に阻害する細胞膜透過性TATペプチドを設計・合成し、in vivoでの予備実験を開始した。次年度は、ペプチドの至適濃度が決まり次第、行動実験を開始する。(2)慢性コカイン投与動物の側坐核神経可塑性を回復させるN-アセチルシステイン(NAC)が、Y516とY817のリン酸化に及ぼす影響についての検証;初年度は、NACの効果はTrkBを介したタンパク質合成系に影響することによって発現する、と仮説を立て、NACのY516とY817のリン酸化レベルに対する影響を慢性コカイン投与動物で検証した。その結果、NACはY516とY817のいずれのリン酸化レベルにも影響を与えなかった。また、TrkBの下流でタンパク質合成の活性の指標となるmTORや、ribosomal protein S6のリン酸化レベルもNACの影響を受けなかった。一方、NACの前処置の結果、多くのシナプスタンパク質(actin,PSD-95,NA2A,SAP102,GluR2,gephyrinなど)の総量が有意に減少し、NACの効果は、タンパク質合成系への影響ではなく、分解系の促進による可能性が高まった。更に、この分解系への効果は、グルタミン酸非依存性であると確認した。そこで、次年度は、タンパク質合成系への影響は、グルタミン酸以外の要因、例えばドーパミンやBDNFそのものによると仮説を修正し、対照動物で側坐核のドーパミントーンやBDNFを恒常的に遮断し、Y516とY817のリン酸化レベルがどのように変化するか、検討を予定している。薬物依存の習慣化は、依存難治化の最大の要因の一つである。習慣化した行動の出力は、腹側線条体(側坐核)の機能に比べ、背外側線条体の機能が優位となったときに促進される。慢性的にコカインを投与された動物の側坐核では、脳由来神経栄養因子の受容体であるTrkBにおいて、新規の学習・記憶内容の統合に必要なリン酸化が、対照群に比べ著しく低下している。この事実は側坐核の可塑性が低下し、背外側線条体-側坐核間の回路間均衡が、背外側線条体側に傾いている可能性を示唆する。本研究では側坐核TrkBリン酸化の機能的意義を解明し、慢性コカイン投与動物の側坐核TrkBリン酸化を正常化することで、依存行動の治療を目指す。本研究グループは、慢性にコカインを投与したラットの側坐核にLTPを誘導した際、TrkBのリン酸化部位のうち、Shcが結合するチロシン残基516(以下、Y516)でのリン酸化が、対照群に比べ有意に抑制されていることを確認した。一方、phospholipase C γ(PLCγ)が結合するチロシン残基817(同、Y817)のリン酸化は、対照群では殆ど誘導されないのに対し、慢性コカイン群では、LTP誘導以前から2倍以上の亢進を示した。最近の恐怖記憶課題を用いたラット扁桃体での研究から、Y817のリン酸化は記憶の獲得(=一時的な保持)に、一方、Y516のリン酸化は記憶の統合(=長期的な記憶貯蔵)に重要と推測されている(Musumeci et al, J.Neurosci,2009;上表)。本研究グループのこれまでの検討から、慢性コカイン投与後の側坐核では、LTPの早期相は亢進しているものの、後期相は成立していないことが確認されており(Toda et al.J.Neurosci,2009)、今回観察されたTrkBリン酸化のパターンと極めてよく符号する。そこで本研究では、以下のような作業仮説を立て、これを実験的に証明する;(1)慢性コカイン投与の結果、側坐核TrkBにおいて、Y817のリン酸化が促進するが、Y516のリン酸化は抑制される。