hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
DOTAPコレステロールを用いた大腸癌の遺伝子治療及びターゲッティングの臨床応用

in vivoの実験においては、C3Hマウスのシンジェニック転移性肺癌モデルを用い、蛍光標識したDOTAPコレステロール・ルシフェラーゼプラスミド複合体を尾静脈より投与し、24時間後に肺組織を摘出し、蛍光顕微鏡にて肺組織ないでのDOTAPコレステロール取り込みおよび肺組織中のルシフェラーゼ活性を測定した。さらに、非担癌C3Hマウス、UV2237担癌C3Hマウスそれぞれより肺胞マクロファージを採取し、DOTAPコレステロール・ルシフェラーゼプラスミド複合体による遺伝子導入後の遺伝子発現の差を比較検討した。【結果】in vitroの実験では、ヒト腫瘍細胞株であるH1299、A549、H460及びマウスの腫瘍細胞株UV2237は正常細胞株であるMRC9、CCD16、NHBEおよび3T3と比べ導入遺伝子の発現が有意に高かった。また、単光標識したDOTAPコレステロール・ルシフェラーゼプラスミド複合体の細胞内での取り込みは腫瘍細胞で高く、サイトカラシンの投与により取り込みは抑制された。in vivoの実験においては、UV2237腫瘍細胞肺転移モデルマウスでは転移のないマウスと比べ尾静脈投与後、肺組織中においてのDOTAPコレステロール・ルシフェラーゼプラスミド複合体の細胞内への取り込み及び導入遺伝子の発現が有意に高く、特に転移性肺腫瘍部での取り込みおよび遺伝子発現が高かった。また、肺胞マクロファージへの遺伝子導入実験においては、担癌マウスより採取したマクロファージにおいてルシフェラーゼ遺伝子の発現が高かった。【考察】今回の実験においてDOTAPコレステロール・DNA複合体の経静脈的投与により正常細胞と比較して腫瘍細胞において導入遺伝子の遺伝子発現の上昇が認められたが、その要因の一つに腫瘍細胞によるDOTAPコレステロール・DNA複合体の細胞内への呑食能の増加が関与していることが明らかになった。
臍帯血移植の生着・拒絶に関与する移植片中および患者末梢血中CD8陽性T細胞の解析

同種造血幹細胞移植後の様々な免疫反応における、移植片中および移植後患者末梢血中CD8陽性T細胞の意義について解析した。(1)臍帯血移植後のナイーブCD8陽性T細胞の回復速度は、骨髄移植後のそれと同等であること、(2)臍帯血移植後の拒絶には、残存している患者由来CD8陽性T細胞が関与しうること、(3)HLA不適合移植後患者体内では、不適合HLA特異的CD8陽性T細胞による強い免疫応答が発生するが、そのHLAの発現量が低下もしくは消失した白血病細胞分画が増殖することで再発に至ること、を全て実際のヒト移植で確認した。本研究の目的は、臍帯血移植における拒絶などの同種免疫応答に関与する移植片中および患者末梢血中のT細胞の解析である。今年度の研究結果の要旨を以下にまとめる。骨髄移植後患者4名、臍帯血移植後患者6名から、移植後1、2、3、6、12ヶ月目に末梢血を採取し、全リンパ球、naive/central memory/effector memoryに細分化したCD4陽性細胞およびCD8陽性細胞、CD4陽性制御性T細胞、B細胞、NK細胞の各細胞数を経時的に測定した。それぞれの臨床経過との相関を検討したところ、1)全リンパ球、T細胞、B細胞、NK細胞は臍帯血移植後の方がやや回復が早く、これまでの報告と一致すること、2)naive CD4陽性細胞の回復は骨髄移植では6ヶ月以降と報告されているが、臍帯血移植後ではそれよりやや早いこと、3)naive CD8陽性細胞の回復速度は骨髄移植と同程度であること、4)CD4制御性T細胞は一貫して骨髄移植よりやや少ないこと、などが明らかになった。但し、骨髄移植例では移植後にステロイドの投与を受けた症例が多く含まれており、今後さらに症例を蓄積した上で再度解析を行う必要があると考えている。また、臍帯血移植を受けた患者の末梢血からT細胞クローンの分離にも成功した。今後、分離したそれぞれのクローンについて、フローサイトメトリーによる表面マーカーの評価、T細胞受容体可変領域の塩基配列を決定することによるクロナリティーの確認、それぞれの標的抗原の同定などを進めていく予定である。当大学で臍帯血移植を受け移植片拒絶に至ったの末梢血から、2つの細胞傷害性Tリンパ球クローンを分離した。フローサイトメトリー解析を行い、一方はCD3陽性/CD8陽性、もう一方はCD3陽性/CD4b陽性の細胞であることを確認した。また同じくフローサイトメトリー解析で、それぞれのクローンが使用しているT細胞受容体Vbの決定を試みたところ、後者はVb8を使用していることが判明したが、前者は決定できなかった。次に、EBウイルスを感作させた移植臍帯血由来のB細胞株と、同じくEBウイルスを感作させた移植前患者由来のB細胞株を標的細胞として、分離した2つのTリンパ球クローンによる細胞傷害性試験を行ったところ(Cr放出試験)、いずれも臍帯血由来細胞を傷害し、かつ移植前患者由来細胞を傷害しなかった。この結果は、これら2つのTリンパ球クローンが本患者の移植後拒絶に関与していた可能性を示唆するものであり興味深いと考えている。そこで、それらTリンパ球クローンが標的としている抗原の同定を試みることとした。具体的には、まずEBウイルスを感作させた第三者由来B細胞株を多数用いて、2つのクローンの細胞傷害活性を拘束するHLAの決定を開始した。候補となるHLAを可能な限り絞り込み、そのcDNA constructを作製してCOS細胞に遺伝子導入し、それぞれのTリンパ球を刺激しインターフェロンγ産生能を評価することで最終的に拘束HLAを決定したいと考えている。本研究では、移植後の生着や拒絶、および移植片対宿主病(GVHD)や移植片対白血病効果などの同種免疫応答に関与する移植片中もしくは患者末梢血中のT細胞について詳細な解析を行っている。今年度は、当大学でHLA不適合移植を受けた後に白血病再発を来たした患者末梢血から、その不適合HLA特異的な細胞傷害活性を呈するT細胞を分離、解析したので、その結果を報告する。患者はHLA1座(GVHD方向)不適合の母から骨髄移植を受けた後、制御不良なGVHDを合併していたにも関わらず再発した。この患者から文書による説明と同意を得た上で血液等の提供を受けた。移植後再発白血病細胞では、移植前白血病細胞と比べて不適合HLAの発現量が低下していた。一方、適合しているHLAの発現量は不変だった。移植後患者末梢血から複数のドナー由来T細胞クローンの分離に成功した。

それらは全て不適合HLA分子を標的とする細胞傷害活性を示した。保存細胞数に限りがあり一部のクローンの解析にとどまるが、少なくとも解析し得たクローンは、移植前白血病細胞を傷害したが移植後白血病細胞は傷害しなかった。この症例では、不適合HLA分子を認識するT細胞による免疫学的圧力からHLAを発現していない分画の白血病細胞がエスケープし、移植後再発に至ったと考えられる。ときに重症GVHDを発症しながら同時に白血病再発を来す症例を経験するが、今回の解析結果はこの再発メカニズムを説明しうるものと考えている。現在論文作成中である。
分娩期における助産診断可視化技法による次世代型トレーニング法の開発

助産師学生を対象に,分娩介助実習開始直後と実習終了時(分娩介助10例) ,OSCEリフレクション法を取り入れ,リアルタイムに学生の助産技術の映像を撮影し,評価者による反応を同期的に実施して,分娩期助産診断の到達度の明確化を行った。分娩介助開始直後では,基本的な助産診断とケアプランの立案は修得できていたが,状況に合わせたケアを判断・実施することは困難であった。しかし,評価表にない項目も多角的に観察して意見を出し合い,相互に学び,現実の自分を認識して自分の課題を明確にできていた。分娩介助終了時では,分娩時の救急や異常事例も状況に合わせたケアの判断・実施がほぼできていた。OSCE-Rの実施によって,学生は自分が経験できていない救急・異常事例においても,知識や技術を確実なものと発展させ,教員も学生の問題点を把握し,共有することができ,OSCE-R教育は有用であることが示唆された。本研究の目的は、分娩期の助産診断と助産技術を統合し、臨床実践能力を高めるために、OSCEリフレクション法の手法を取り入れ、学習コミュニケーションツールを用いてリアルタイムに学生の助産技術の映像を撮影し、学生・模擬患者・評価者の反応を同時的に撮影し比較することにより、客観的評価のポイントを明確化した視覚的評価に沿った教育プログラムを開発することである。本年度は、以下に示すように分娩期の助産診断に基づいた評価項目の作成とシナリオ作成を行い、それに基づいて1部OSCE-Rの実施を行った。1.分娩期の助産診断に基づいた評価項目の作成分娩期の経過診断(身体的側面)に基づいた産婦-助産学生の相互作用について評価できる項目を明確にし、精錬する。2.シナリオ作成分娩介助手順に基づき、分娩第一期、分娩第二期、分娩第三期の場面設定を行った。3. OSCE-Rの実施(機器の取り扱いの修練、評価項目・シナリオの精錬)助産専攻学生の分娩期実習に行く前(学内演習で分娩介助手順合格段階)、分娩介助5例終了後に、分娩手順の一場面を提示し、実施・録画を行い、分娩手順の自己評価、学生間評価、教師による評価を行い、評価項目の精錬を行った。1.シミュレーション助産教育の振り返りにPower Feedbackノートを使用した経験「目的」シミュレーション学習の振り返りにPFノートを使用してその振り返りの有用性を検討。「実施内容」:分娩後の女性と新生児の健康のアセスメントとケアにおいて、一連シミュレーション演習(ビデオ録画)後の振り返りにPFノートを使用し、「よい」「疑問」「注意」の3項目をビデオ撮影、クリッカーでマーキングし、再生して振り返りを行った。最後に学習モチベーションARCSスケールを用いて、1.5のlikert Scaleで評価した。「結果」学生の意見は利点と欠点に集約された。利点としては「マーキングされた注目すべきケアなど、その時点をわかるので記憶に残りやすい」「他の人の注目するポイントがわかる」「リアルタイムでマーキングするので、忘れることなく振り返りやすい」「全員の意見が盛り込まれる」であり、欠点は「他者のマーキングがわかるので、同調しやすい」「他者がマーキングしていないときにマーキングしにくい」であった。学習モチベーションARCSの平均値はA(Attention)4.4,R(Reference)3,9,C(Confidence)2.8,S(Satisfaction)4.2であった。「考察」自らの行為を振り返る省察的態度と自立的な学びを満ち部区自己学習を支援するのに有用である。「目的」:学生の分娩期の学習課題や到達度を明確化する。「方法」:対象はA大学4回生助産選択学生6名、実施時期-分娩介助を12例経験時と10例終了後の2回、状況設定は1回目-1.電話連絡後入院前、2.入院時分娩第1期、3.急産の助産介助、第2回目-1.児心音低下、2.分娩時出血、3.回旋異常である。各状況設定場面で、学生2名が助産診断とケアを展開、産婦役は修士課程の大学院生が演じた。評価は助産選択学生6名、大学院生3名、教員3名で行った。演習場面は学習支援ツール「パワーフィードバックノート」(内田洋行製)を用いて録画し、評価者となる学生はリアルタイムに評価や感想をクリッカーでマーキング(メタデータとして映像に付与)した。終了後に評価表(4段階評価)を記入し、録画映像を見ながらリフレクションを行った。

「結果・考察」:分娩介助経験が12例では、基本的な助産診断とケアプランの立案は習得できていたが、状況に合わせた判断・実施をすることはできていなかった。しかし、評価表にない学生の言動も多角的に観察して意見を出し合い、相互に学び、事故の課題を明確にできていた。分娩介助経験10例目では、産科救急・異常事例においても状況設定の診断及び状況に合わせたケアの判断・実施がほぼできており、学生は自分が経験できていない救急・異常事例についても、OSCE-Rを実施することによって、知識や技術を確実なものに発展させ、教員も学生の問題点をより詳細に把握し、共有することができた。目的:OSCE-R法を用いた実習前後の分娩期の助産診断技術分析と到達度の整合性の分析、分娩期の助産診断能力評価プログラムの作成。方法:平成23年度の方法論を踏襲。大学4回生助産選択学生6名と大学院1回生10名。実施時期は臨床での分娩介助実習を全学生が12例経験時と10例終了後時である。事例は第1回目:1電話連絡後入院前、2入院時分娩第1期、3急産の助産介助、第2回目:2児心音低下、2分娩時出血、3回旋異常である。平成24年度は産歴等のバリエーション、助産診断能力の難易度、評価基準、シナリオの調整をし、OSCE-Rが総合的な臨床能力を育成する手段となるように継続的に検討した。結果:分娩介助経験開始当初は基本的な助産診断とケアプランの立案は修得していたが、状況に合わせたケアの判断・実施は出来ていない。10例目では産科救急や異常事例の診断や状況に合わせたケアの判断実施がほぼできており、OSCE-Rによって年度が異なっても到達度の整合性が図られていた。目的:OSCE-R法による分娩直後の新生児ケア教育と能動的・効果的方略の構築。方法:大学院1回生10名に、実習前に分娩直後の母子の事例のOSCE-R法を実施。事例は1出生直後の母児のケア、2出生直後の児のフィジカルアセスメント、3胎便吸引症候群の児のケアなどである。結果:できるの評価は正常事例のケアやフィジカルアセスメントは95%以上で、異常事例では8590%。学習モチベーション評価は高値を示した。OSCE-R法は学生の主体的な学びの喚起,総合的臨床能力の向上,態度・倫理・安全管理の育成のための科学的な手段を提供し,産婦の豊かな分娩経験を支援する上で大いに貢献できる。教員に効果の高い授業方略とカリキュラム構築が期待できる。シナリオの内容についてはほぼ固まったが、精緻さをどの程度にするかが今後の課題である。24年度が最終年度であるため、記入しない。今後は、助産師学生の分娩期の助産診断の総合的判断力を育成するために、状況設定のシナリオと評価方法のさらなる検討を重ね、助産選択学生(4回生)と修士課程学生の学びの深さなどの違いにも視点を置き、シミュレーション教育を実施し、シナリオ及び評価方法を完成させる。
生体微小循環観察法を用いた肺腫瘍微小血管への抗腫瘍リンパ球付着特性に関する研究

【目的】本研究は生体顕微鏡を用い、肺癌肺転移巣腫瘍微小血管の特性や抗腫瘍リンパ球の付着特性を明らかにすることによって、有効な癌免疫療法の開発を行うことを目的とする。【実験方法】(1)平成9年度は佐藤肺癌肺転移巣の成立過程と腫瘍微小血管の特性を検討した。腹水で継代している佐藤肺癌を用い、その10^6個を尾静脈より静注することにより肺転移巣を作成し、この腫瘍微小循環像を生体顕微鏡で経時的に観察した。(2)平成10年度は、成熟肺転移巣を用い、これに対する無治療群、化学単独療法群、免疫単独療法群、化学療法併用免疫療法群などの間で、生存率、生体腫瘍微小循環像、末梢血リンパ球像などの比較を行った。【実験成績】(1)尾静脈から静注された癌細胞は三つのスタイルで肺微小血管に停止した。91%は肺細動脈に押し込まれるように停止し、周囲血管壁から強いストレスを受けた。6%は肺細動脈に引っかかり、血流から強いストレスを受けた。3%は血漿に包まれる形で肺細動脈内に停止し、ストレスを回避することができた。3%のグループが生存できる可能性があった。生存した癌細胞は静注三日目より増殖を開始し、腫瘍微小血管の増加がこれに伴った。静注七日目には腫瘍細動脈、腫瘍毛細血管、腫瘍細静脈を備える成熟した肺転移巣へと成長した。これらの腫瘍微小血管にリンパ球は全く付着しなかった。(2)成熟肺転移巣に対し、生存率では無治療群が最も悪く、化学療法併用免疫療法群が最も良好であった。腫瘍微小血管の生体観察像では、化学療法併用免疫療法群のみに、腫瘍微小血管への抗腫瘍リンパ球の付着が見られた。末梢血リンパ球像では、化学療法併用免疫療法群で、単球、NK細胞、NKT細胞の増加が見られた。【結論】腫瘍微小血管は腫瘍細胞をマスクし、抗腫瘍リンパ球の抗腫瘍効果を妨げる。抗腫瘍リンパ球の作用を発揮させるためには、腫瘍微小血管を破壊し、腫瘍細胞を露出させたうえで、免疫療法を加える必要がある。(目的)本研究は、肺癌肺転移巣の形態学的特性と肺転移巣に対する抗腫瘍リンパ球の作用を微小循環レベルで生体観察することによって、免疫療法を中心にした新たな肺癌治療法を開発することを目的とする。(実験方法)平年9年度は主に肺転移巣の形態学的特性について研究を行った。生体腫瘍微小循環観察法については拙著(蛍光法を用いたラット肺微小循環の生体顕微鏡による観察。脈管学27:113-120,1987)をご覧いただきたい。1、ドンリュウラットに樹立された佐藤肺癌を腹腔に移植し、その癌性腹水より106個の癌細胞を取り出し尾静脈より静注し、静注された癌細胞が肺微小血管にどのように付着するかを観察した。2、肺微小血管に付着した癌細胞がどのように成長するかを、腫瘍微小血管との関連において観察した。(実験成績)1、癌細胞は次三つの形で肺微小血管に付着した:

(a)肺細動脈から肺毛細血管にかけて押し込まれるように付着(全体の約90%)する、(b)太い肺細動脈壁に引っかかるように付着(全体の約5%する、(c)周囲微小血管の微妙な圧バランスにより、肺細動脈末梢に軽く付着する。(a),(b)は癌細胞に大きなストレスがかかり、癌細胞は生存しにくいと思われた。(c)は癌の生存に良好であると思われた。2、癌細胞は癌付着3,4日後頃より成長しはじめた。この時期に一致して、転移巣周囲の腫瘍微小血管数が1,2日目の2-3倍に増加した。癌付着後約1週間で腫瘍細動脈と腫瘍細静脈を兼ね備えた成熟した転移巣ができあがった。これらの腫瘍微小血管には抗腫瘍リンパ球の付着が全く見られなかった。(結論)肺微小血管への癌細胞付着様式と癌細胞生存との間に密接な関係があるものと思われる。癌細胞付着後3,4日目より転移巣の増大が始まり、この増大に腫瘍微小血管の成長が対応していた。抗腫瘍リンパ球は腫瘍微小血管に全く付着しなかった。【目的】本研究は生体顕微鏡を用い、肺癌肺転移巣腫瘍微小血管の特性や抗腫瘍リンパ球の付着特性を明らかにすることによって、有効な癌免疫療法の開発を行うことを目的とする。【実験方法】(1)平成9年度は佐藤肺癌肺転移巣の成立過程と腫瘍微小血管の特性を検討した。腹水で継代している佐藤肺癌を用い、その10^6個を尾静脈より静注することにより肺転移巣を作成し、この腫瘍微小循環像を生体顕微鏡で経時的に観察した。(2)平成10年度は、成熟肺転移巣を用い、これに対する無治療群、化学療法単独群、免疫療法単独群、化学療法併用免疫療法群などの間で、生存率、生体腫瘍微小循環像、末梢血リンパ球像などの比較を行った。【実験成績】(1)尾静脈から静注された癌細胞は三つのスタイルで肺微小血管に停止した。91%は肺細動脈に押し込まれるように停止し、周囲血管壁から強いストレスを受けた。6%は肺細動脈に引っかかり、血流から強いストレスを受けた。3%は血漿に包まれる形で肺細動脈内に停止し、ストレスを回避することができた。3%のグループが生存できる可能性があった。生存した癌細胞は静注三日目より増殖を開始し、腫瘍微小血管の増加がこれに伴った。静注七日目には腫瘍細動脈、腫瘍毛細血管、腫瘍細静脈を備える成熟した肺転移巣へと成長した。これらの腫瘍微小血管にリンパ球は全く付着しなかった。(2)成熟肺転移巣に対し、生存率では無治療群が最も悪く、化学療法併用免疫療法群が最も良好であった。腫瘍微小血管の生体観察像では、化学療法併用免疫療法群のみに、腫瘍微小血管への抗腫瘍リンパ球の付着が見られた。末梢血リンパ球像では、化学療法併用免疫療法群で、単球、NK細胞、NKT細胞の増加が見られた。【結論】腫瘍微小血管は腫瘍細胞をマスクし、抗腫瘍リンパ球の抗腫瘍効果を妨げる。抗腫瘍リンパ球の作用を発揮させるためには、腫瘍微小血管を破壊し、腫瘍細胞を露出させたうえで、免疫療法を加える必要がある。
漫性肝炎を背景とする肝多段階発がん過程におけるDNAメチル化の変化

肝多段階発がん過程におけるDNAメチル化の変化をゲノム規模で評価するため、メチル化CpGアイランド増幅(MCA)法にBACアレイを用いた比較ゲノムハイブリダイゼーション法を連結したBAMCA法を導入した。本法には、国立がんセンター研究所と東京医科歯科大学難治疾患研究所稲澤譲治教授が共同で作成したMCG Cancer Array-800を用いた。大腸がん肝転移症例より得られた正常肝組織、B型あるいはC型肝炎ウイルス感染を伴う肝細胞がん症例より得られた慢性肝炎・肝硬変症を呈する非がん肝組織、ならびに肝細胞がん組織よりゲノムDNAを抽出し、はじめにメチル化感受性制限酵素つづいてメチル化非感受性制限酵素で処理し、メチル化DNA断片のみをPCR増幅ならびに蛍光標識した。年齢を概ね適合させた複数の大腸がん肝転移症例より得られた正常肝組織由来ゲノムDNAを混合して対照検体とし、ゲノム規模のDNAメチル化の状態を把握した。現在、機械学習法により、正常肝組織から肝細胞がん症例の非がん肝組織を区別でき、肝細胞がん組織においても保持されるようなDNAメチル化プロファイルの同定を試みている。さらに、長期経過観察後に肝細胞がんを発症したかどうかが確認されている慢性肝炎・肝硬変症患者の、肝細胞がん発症前の肝生検標本の蒐集に努めている。今後の解析により、着目するDNAメチル化プロファイルが、後に肝細胞がんを発症しなかった患者には認められず、肝細胞がんを発症した患者の慢性肝炎・肝硬変症の段階での生検検体にのみ検出されることが、バイサルファイトシークエンス法等で確認された場合、DNAメチル化診断ミニチップを作成するなどして、慢性肝炎・肝硬変症による経過観察患者における発がんリスク診断の実用化を目指したい。
在宅人工呼吸器装着ALS患者の困難と人生再構築支援ガイドライン作成への縦断的研究

本研究の目的は、研究代表者が平成17年度に実施した「人工呼吸器装着筋萎縮性側索硬化症(以下、ALSと略す)患者の生きる営みの支援に関する研究」の対象患者50名を対象に、困難と対処と人生再構築の過程と要因を縦断的に明らかにすることであり、方法は、ライフ・ライン・メソッド(縦軸:こころの状態、横軸:時間)を用いた質問票調査および半構造化面接調査を実施することである。初年度は、前半に、在宅人工呼吸器装着ALS患者の生きる営みに関連する国内外の文献レビュー、ならびに調査の実施準備(インタビューガイドの作成、研究代表者が所属する倫理審査委員会での研究計画書の承認)を行った。後半には、倫理審査委員会での承認が得られた後速やかに調査を開始した。対象の抽出は、平成17年度の対象患者50名のうち、できる限り属性・療養環境・当時の心理状況などが偏らないよう厳密に行い、順次依頼を行い、承諾が得られた場合のみ調査を実施した。初年度は、合計23名に調査の依頼を行い、2名が辞退したため、合計21名の患者を対象に調査を実施した。辞退の理由は、家族の判断と家族の病気であった。調査の結果、過去3年間のラインの推移と変動要因、現在の属性、療養生活状況、身体症状、Hope、心の支えである人、喜びや楽しみ、願いと社会への要望が具体的に明らかとなった。今後は、調査結果の分析、具体的にはインタビュー・データの質的分析および統計学的分析を進めるとともに、対象数を増やしていきたい。本研究の最終目的は、患者理解を深め、患者ニーズにみあった生きる営みに関する支援ガイドラインを作成することである。これまで、このような患者を対象とした研究がほとんど行われてこなかったなか、多くの問題や困難を抱えているこれらの患者を支援するための初めてのガイドラインの作成は社会的にも意義深くかつ重要性が高まっており、その作成が期待される。
DNA複製開始調節に関与するSld3-Sld7複合体の構造生物学的研究

本研究では、DNA複製開始複合体の中核となる活性型ヘリケースを細胞周期に連動して形成させる過程で不可欠な因子、出芽酵母由来の複製開始因子Sld3に着目した構造学的研究を進めている。活性型ヘリケースの必須構成因子であるCdc45の複製開始点への付加過程で不可欠となる「Sld3-Cdc45」複合体と、複製開始点から複製開始フォークを双方向へ正しく進行させるため、複製開始点にて2分子のヘリケース分子を同時に活性化させる仕組みと密接に関与すると想定されている「Sld3-Sld7複合体」とに着目し、それぞれにおいてSld3が果たす役割の解明に必要となる構造学的基盤を構築する事を目的とした。前年度は酵母Sld3とその脊椎動物における機能的ホモログTreslinに共通して保存された領域、Sld3/TreslinドメインがCdc45との結合に必要かつ充分である事を示すと共にその結晶構造を明らかとし、その結合における構造学的基盤を構築した(Itou et al. Structure 2014として発表)。本年度は、Sld3結合因子であるSld7が、そのN末側領域でSld3とヘテロ2量体を形成し、C末側領域でホモ2量体を形成する事を結晶構造解析法を用いて明らかとした。Sld7は出芽酵母とその近縁種のみに保存された因子であるが、本因子と類似の機能を持つ因子としてヒトにおいてMTBPが近年同定され、DNA複製開始反応でSld7が果たす機能の重要性と普遍性が示されつつある。今回得られた結晶構造から示されたSld3とSld7が形成する高次構造は、複製開始点上に向かい合う向きで結合した2分子のヘリケースコア分子にそれぞれCdc45、GINSをロードする上で合目的なものであり、その高次構造が複製開始点において2分子のヘリケースが同時に活性化される事を保証する機構の一つとして働く可能性を示した(Itou et al.論文投稿中)。26年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では、DNA複製複合体の中核となる活性型ヘリケースを細胞周期に連動して形成する過程で不可欠な因子である出芽酵母の複製開始因子Sld3に着目した構造生物学的解析を進めている。活性型ヘリケースの必須構成因子Cdc45の複製開始点への付加に不可欠な「Sld3-Cdc45複合体」、複製開始点から双方向へ正しく複製フォークを進行させるために複製開始点において2分子のヘリケースを同時に活性化させる仕組みと密接に関係すると想定されている「Sld3-Sld7複合体」に着目し、それぞれにおいてSld3が果たす役割の解明に必要な構造学的基盤を構築する事を目的としている。本年度は、酵母Sld3とその機能的ホモログである脊椎動物Treslinに共通して保存された領域(Sld3/Treslin domain)が、Cdc45との結合に必要かつ充分である事を見いだし、かつその結晶構造を明らかとした。立体構造に基づいて行った生化学、変異実験から得られた結果と併せて、Sld3-Cdc45複合体のモデルを提案した(Structure誌に論文を投稿。現在revision中)。活性型ヘリケースの必須構成因子Cdc45は、DNA上の複製開始点上に結合したヘリケースコア複合体にSld3との複合体として付加される事が知られていたが、そのメカニズムの一切はこれまで不明であった。我々はSld3のCdc45結合領域を同定し、その立体構造を明らかとした。

得られた知見に基づく変異実験、生化学実験を行う事で、Sld3とCdc45との相互作用モデルを提案できるに至った(論文投稿中)。Cdc45のヘリケースコア複合体への付加は真核生物のDNA複製調節において必須かつ普遍的なイベントである。本成果は、その重要なプロセスについての理解を、分子構造に立脚した分子間相互作用のレベルでの理解へと推し進めた。得られている結合モデル実験的に証明するため、現在Sld3-Cdc45複合体の結晶化に向けた作業を進めており、大腸菌をホストとする系で目的複合体の大量調製プロトコルを確立している。今年度はその他、Sld3とSld7が形成する高次構造を明らかとするために、Sld3-Sld7ヘテロ2量体領域からなる複合体の大量調製プロトコルを確立した。また、Sld7のホモ2量体化ドメインを生化学的に同定し、そのタンパク質結晶を得る事にも成功している。これらのことから、研究全体として計画通りに進んでいると判断した。酵母からヒトまで真核生物に広く保存され、細胞周期に連動してDNA複製開始複合体を適切に構築する上でハブとして機能する事が示されているSld3に注目し、本因子が形成する複合体が持つ構造と機能の相関を明らかとする。真核DNA複製開始の調節機構については、これまで遺伝学的、生化学的手法が主として用いられ、必要となる因子の同定が進められてきた。本研究では、そこから更に立体構造に立脚した分子機構のレベルへと理解を深める事を目指している。前述の通り、Sld3のCdc45結合ドメインの他、Sld7の2量体化ドメインの同定と結晶化に成功しており、またSld3-Cdc45, Sld3-Sld7複合体についても、結晶化実験に向けたタンパク質複合体の大量調製系を構築済みである。既にタンパク質結晶を得ているSld7については、速やかにその結晶構造を明らかとし、他の複合体についても早期に結晶が得られる様、条件検討実験を進める予定である。立体構造から得られる情報を基に、適切な生化学的、遺伝学的解析を行う事で、研究目標の達成を図る計画である。
つぼみから開花に至る花弁成長機構の解明と切り花収穫後の開花制御

本研究の目的は、花弁肥大成長の仕組みを明らかにし、つぼみからの花弁の成長つまり開花現象を解明することにある。さらにそのメカニズムを制御し、切り花などのつぼみから開花に至る過程を人為的にコントロールすることを目標としている。バラ切り花の開花にはエクスパンシンやXTHが重要であることが、遺伝子やタンパク質の発現量変動を調べることで明らかとなった。また、XTH活性に対する阻害剤であるXG9という糖の効果について、比較的高濃度のXG9を切り花に処理すると花弁の成長を促進し、低濃度で処理すると逆に開花を阻害することが分かった。さらに、バラ切り花がつぼみから開花する際、一日のうちでも明期が始まった数時間しか花弁の成長が起こらず、それ以外の時間帯はほとんど成長していないことが明らかとなった。平成21年度はまず、シロイヌナズナの開花が遅延する変異体を用いて、花弁成長と相関が深い遺伝子の網羅的探索を試みた。しかし、変異体の形質が安定せず、目的の遺伝子を明らかにするのは時間が必要であると判断した。そこでシロイヌナズナを用いた網羅的遺伝子解析は次年度以降に行うこととし、本年度は当初の計画に従い、細胞壁のゆるみに関係する「エクスパンシン」と「XTH」の解析を進めることとした。まずトルコギキョウ花弁で発現するエクスパンシンとXTH mRNAを単離し、RNAi用のベクターに組み込み、アグロバクテリウム法によりトルコギキョウに遺伝子導入した。この組換えトルコギキョウでは、花弁特異的なエクスパンシンもしくはXTHのmRNA発現が抑えられている予定であり。現在栽培を続けている。今後開花に伴う花弁成長の変化を解析する予定である。また、エクスパンシンおよびXTHのリコンビナントタンパク質を大腸菌によって発現させ、精製を行った。これらリコンビナントタンパク質に対する抗体を用いて、次年度ではエクスパンシンやXTHの機能阻害実験などを試みる予定である。平成22年度は、シロイヌナズナ変異体を用いたエクスパンシンおよびエンド型キシログルカン転移酵素/加水分解酵素(XTH)遺伝子の発現解析を行い、モデル植物における開花と細胞壁関連酵素遺伝子との関係を調べた。しかし、前年に引き続きシロイヌナズナ変異体の形質の安定化に時間がかかっており、23年度も解析を続ける予定とした。また、大腸菌により発現させた細胞壁関連酵素(エクスパンシンおよびXTH)のリコンビナントタンパク質を抗原として、それぞれの酵素に対する抗体を作製した。その抗体を用いて、エクスパンシンおよびXTHのバラ切り花でのタンパク質量の変動、ならびにバラ切り花への抗体処理の影響を調査した。バラ切りバラへの抗体吸収実験は、切り花の切り口から処理することで、確実に花弁組織に到達することが確認でき、現在花弁成長への影響を繰り返し調査中である。一方、XTH活性に対する阻害剤としてXG9という糖を見出し、切り花に処理することで開花に対する阻害効果を調べた。その結果、XG9が花弁の成長を濃度依存的に阻害している事を明らかとし、その阻害メカニズムについて重要な知見を得ることができた。平成23年度は、まず昨年度までからの課題であったシロイヌナズナ変異体の発現形質の安定化を、T-DNA挿入遺伝子のホモ化を行うことで解決した。このホモ化したシロイヌナズナ変異体を用いてエクスパンシンおよびエンド型キシログルカン転移酵素/加水分解酵素(XTH)遺伝子の発現解析を行い、モデル植物における開花速度と細胞壁関連酵素遺伝子との関係を調べた。また、XTH活性に対する阻害剤であるXG9という糖の効果について、様々な品種のバラを用いて詳細に検証した。その結果、比較的高濃度のXG9を切り花に処理すると花弁の成長を促進し、低濃度で処理すると逆に開花を阻害することが分かった。この結果は、エンドウの実生を用いた実験報告と一致しており、バラ花弁の開花にともなう肥大成長も、エンドウ胚軸の伸長成長同様、外生的に与えたXG9により制御可能であることを示唆するものである。

さらに、本研究を通し、バラ切り花がつぼみから開花する際、一日のうちでも明期が始まった数時間しか花弁の成長が起こらず、それ以外の時間帯はほとんど成長していないことが明らかとなった。この成長リズムはこれまで研究を進めてきた細胞壁関連酵素の発現及び活性制御機構では解釈が困難であり、アクアポリンの制御などと言った細胞壁関連酵素以外の因子によって開花リズムがコントロールされている可能性が示唆された。これらの課題は、今後別の研究課題を立ち上げることで研究を継続して行く予定である。
薬物の血液胎盤関門輸送に及ぼすカルニチントランスポーターの関与

1.血液胎盤関門輸送機構評価系を用いた感染症治療薬の輸送機構(1)キノロン系抗菌薬pH5.5条件下において、大部分がカチオンとなるグレパフロキサシンは、カルニチンのNa^+依存的な取り込みに対してほとんど影響を与えなかった。一方、両性イオンの割合が60%以上となるpH7.4および8.5においては、カルニチンの取り込みを強く阻害した。(2)セフェム系抗生物質セファロリジンおよびセフピロムなどの4級窒素分子を有し両性イオンとなる薬物は、カルニチントランスポーターを介する輸送を競合的に阻害した。しかしながら、これらセフェム系抗生物質の輸送に関しては今回検討した基質濃度においてNa^+依存的な取り込み、すなわち、カルニチントランスポーターの関与について明確に評価することができなかった。今後、HPLCでの定量感度を上げることにより、これら薬物自体の輸送機構について明らかにすることが可能となる。2.カルバペネム系抗生物質とカルニチン輸送との関連カルニチンのNa^+依存的な取り込みは、カルバペネム系抗生物質であるパニペネム、ビアペネム、メロペネムによって何ら影響を受けなかった。一方、これらと構造、正および負の電荷距離が類似しているにもかかわらず、イミペネムにおいてはカルニチンのNa^+依存的な取り込みを有意に阻害した。これらの結果より、イミペネムにおいてはキノロン系抗菌薬、あるいはセフェム系抗生物質とほぼ同じメカニズムによりカルニチンの輸送を阻害することが示唆された。3.感染症治療薬の輸送機構とその評価これまでに検討した感染症治療薬自体の輸送機構およびカルニチン輸送に及ぼす影響は、正および負の電荷距離に関連していることが明らかとなった。今後、妊婦における薬物療法指針の構築に向けて、薬物の構造および荷電状態のみならず性ホルモンの影響について検討する予定である。1.血液胎盤関門輸送機構における評価系の確立ヒトトロホブラスト細胞由来BeWo細胞を用いた取り込み評価系を確立した。2.カルニチンの輸送特性カルニチンの取り込みはNa^+と共輸送され、そのstoichiometryは1:1であった。また、Na^+依存的な取り込みは濃度飽和性を示し、Km値は約6μMと算出された。3.感染症治療薬の輸送機構の解析レボフロキサシンの取り込みは、pHにより変化する両性イオンの割合と強い相関を示しpH7.0で最大となった。また、その取り込みは濃度飽和性を示し、かつ低温条件下および代謝阻害剤によって減少するにもかかわらずトランスポーターの関与については不明であった。4.カルニチンの輸送に対する感染症治療薬との関連(1)キノロン系抗菌薬カルニチンの取り込みに対するレボフロキサシンの阻害効果を検討した結果、pH7.4においてはカルニチンの取り込みを顕著に阻害した。また、レボフロキサシンの両性イオンの割合とその阻害効果には相関がみられた。しかしながら、その阻害様式は非競合型であり、カルニチンのNa^+非依存的な取り込みに対しても有意に阻害することが明らかとなった。(2)セフェム系抗生物質カルニチンの取り込みは、多くのセフェム系抗生物質の中でもセファロリジン、セフェピムおよびセフピロムなどの4級窒素分子を有し両性イオンとなる薬物により競合的に阻害された。しかしながら、4級窒素を有するにも関わらずジアニオンであるセフタジジムおよびセフスロジンによっては、全く影響を受けなかった。以上の結果より、生体内で両性イオンとして存在するキノロン系抗菌薬および4級窒素分子を有するセフェム系抗生物質は、カルニチンの取り込みに対して強く影響を与えることが認められた。さらに、その阻害様式の違いは両薬物における正および負電荷の距離に起因することが示唆された。
前立腺全摘除術後患者のためのセクシャリティ尺度の開発

前立腺全摘除術後患者におけるセクシュアリティー尺度の開発のために、がん患者のセクシュアリティーの全体像を把握する必要があった。まず,機能障害を持つがん患者に関する研究を概観し,直腸がん患者の機能障害に関する国内外における研究の動向と課題を検討した.更に,下部直腸切除術により生じた機能障害が,患者の生活に影響を及ぼしている内容を明らかにし,看護介入について示唆を得た.前立腺全摘除術後患者におけるセクシュアリティー尺度の開発のために、がん患者のセクシュアリティーの全体像を把握する必要があった。まず,機能障害を持つがん患者に関する研究を概観し,直腸がん患者の機能障害に関する国内外における研究の動向と課題を検討した.更に,下部直腸切除術により生じた機能障害が,患者の生活に影響を及ぼしている内容を明らかにし,看護介入について示唆を得た.過去10年間程度の前立腺がんに関する和・英文献を収集・精読し,近年のトレンドやその傾向を再認識した.有用な文献として,まずは,性機能障害に着目し,性機能障害が発生し得るがん(膀胱がん,精巣がんなど泌尿器系悪性腫瘍や大腸がんなどの骨盤内悪性腫瘍)や鬱病などの精神疾患による心因性の性機能障害についての文献を概観した.また,男性特有のがんだけでなく,乳がんや子宮がん等の女性特有の疾患を前提としたセクシュアリティに関する研究論文も概観した.以上より,前立腺がん患者のセクシュアリティに関する国内外における研究の動向と課題を明らかにするため,収集した文献を元に,研究デザイン,方法,内容の分析を行った.その結果,分析対象論文は,国内が8件,国外が11件であり,量的研究が47.4%,質的研究が42.1%,量質併用が10.5%を占めていた.研究デザインは,因子探索研究が最も多く,52.6%と半分以上を占めていた.研究時期は,治療後が61.9%と最も多く,治療中は1件(4.8%)のみであった.研究内容は,セクシュアリティを排尿機能などと並列で扱い,身体状態やQOLの一部として捉えて,研究対象としているものが半数以上であり,セクシュアリティを単独で対象としているものは3件(15.8%)であった.その他は,パートナーとの相互作用として捉えているもの等であった.以上の結果より,前立腺がん患者におけるセクシュアリティの研究は,国内外共に希薄であり,量質双方の充実が求められることが示唆された.また,セクシュアリティは,そのもの自体に身体的,心理社会的といった様々な問題が含有され,派生していくにも関わらず,多くの研究において,身体状態やQOLの一部として捉えられており,焦点化されている研究は少ないことが分かった.がん患者のセクシュアリティーの全体像を把握するために、機能障害を持つがん患者に関する研究を概観する必要があると考えた。そこで、まず直腸がん患者の機能障害に関する国内外における研究の動向と課題を検討した.内容は、以下の通りである。【目的】直腸がん患者は、がんの進行や治療によって機能障害が生じ、排便排尿障害や性機能障害、ボディイメージの障害といった幾多の問題と向き合わなくてはならない。直腸がん患者の機能障害に関する看護系論文を集約し、動向と課題を検討した。【方法】1992-2011年の間に国内外で学術誌に掲載された論文を対象とし、データベースは、国内は医学中央雑誌、Ciniiを、国外はPubMed、CINAHL/MEDLINEを用いた。検索用語は、国内は"直腸がん"、"(機能)障害"とし、看護、原著論文で制限をかけた。一方、国外は"rectal cancer"、"disorder"とし、EnglishとNursing Journalsで制限した。類似概念も検索し、オストメイトを対象とした論文は除外した。抽出した国内外双方の論文をハンドサーチし、研究方法、デザイン、研究時期、内容の分析を行った。【結果】分析対象論文は、国内が8件、国外が5件であり、量53,8%、質30.8%、量質併用15.4%であった。研究デザインは、因子探索研究と関連検証研究が最も多く、それぞれ30.8%であった。研究時期は、治療後が92.3%であり、7.7%は治療前後であった。研究内容は、障害内容や影響する事象に着目し分析した結果、"生活の実態・影響・対処"が46.2%と一番多く、次いで"排便障害評価尺度開発"、"排便障害に対する看護介入の効果"、"他部位がんとのQOL比較"が同数(15.4%)であり、"排便障害と自尊感情の関係"は1件(7.7%)のみであった。【考察】直腸がん患者の機能障害に関する研究は、20年間で20件に満たない状況であった。また、生活上の問題内容や排便障害に限定した内容が多くを占めていた。そこで、まずは機能障害を持つがん患者に関する研究を概観する必要があると考えた.前段階として直腸がん患者の機能障害に関する国内外における研究の動向と課題を検討し,その結果を踏まえ,下部直腸がんISR術後男性患者が,抱えている問題に対して如何なる反応をしているのかを明らかにした.【方法】対象:ISR術後1年経過した男性5名.方法:半

構成的面接を行い,面接時点で抱えている生活上の問題と,その問題に対する思いや行動について,自由に語ってもらった.面接内容から逐語録を作成し,質的帰納的に分析した.倫理的配慮:研究者所属機関の倫理委員会の承認と共に実施施設長の許可を得た.【結果】平均年齢61.2±10.2歳,術後から面接までの期間:平均17.2±3.9ヶ月.得られた55記録単位を分析データとした.ISR男性患者が抱える問題への認知と行動は,3カテゴリー「機能障害を悪しく思う」(記録単位数38:69.1%)「状態改善のために対処行動を起こす」(10:18.2%)「現状を認知する」(7:12.7%)が抽出され,サブカテゴリーは9個,コード35個であった.【考察】ISR術後男性患者は,直腸がん術後3大機能障害に悩まされて生活していた.しかし,機能障害により起こる様々な問題を否定的に捉える一方で,改善を試みている者もいた.よって,患者は機能障害を問題として捉えることができているため,対処行動を起こす環境を整えることで,ADL向上を図れる可能性があることが示唆された.今後は,排便排尿コントロールや生活上の工夫等,周術期から退院後を見越した継続的な介入を検討していく必要がある.前立腺がん患者のセクシュアリティーを検討する以前に、その他のがんにおける機能障害の実態を明らかにする必要性が出てきた。現時点では、直腸がん患者の機能障害について検討しているところである。24年度が最終年度であるため、記入しない。達成度でも述べたが、現時点では直腸がん患者の機能障害について検討している。今後は、その機能障害の実態を明らかにし、直腸がん患者が、いかに機能障害に適応していくかを明らかにしていく。その結果をもって、がん患者のセクシュアリティーを検討し、尺度開発に活かしていく。また、前立腺がん患者については、面接調査を開始し、抱えている問題状況を明らかにしていく。
体腔内コイルを用いたMRIによる直腸癌の壁内深達度の検討

食生活習慣の欧米化は、結果として、従来比較的少なかった大腸癌患者の増加をもたらした。その中でも直腸癌の頻度が高いのは周知の事実であり、その部位と壁内深達度は、術式や予後そして患者のquality of lifeまでも左右する。従来からの検査法としてはバリウムを用いた注腸検査と、大腸ファイバー検査などがあるが、壁内深達度診断はその形態から間接的に類推されるにすぎない。またCTやMRIも応用されてはいるが、壁外浸潤の有無の診断にとどまっている。今回、腫瘍摘出術が施行され、かつ術前にMRIが施行された直腸癌症例はおよそ50症例である。患者は腹臥位とし、経肛門的に300600ccの空気を注入し、body coilを用いて通常のMRIを撮像する。続いて、そのMRI画像及び注腸所見を参考に体腔内コイルを腫瘤部分の内腔に留置しMRIを撮像する。通常のMRIでは壁内の層構造は抽出されず、壁外浸潤の診断にとどまったが、体腔内コイルを併用することによって、その壁内層構造の描出が可能となり壁内深達度の診断が可能となった。しかしその手技は繁雑で、適切な位置(腫瘤内)に体腔内コイルを留置するには熟練を要し時間もかかる。また通常のMRIは全結腸を通じ検査可能であるが、体腔内コイルを用いた方法では自ずとその適応が直腸に限られ、その内腔も体腔内コイル以上の直径を持つことが要求される。したがって狭窄が強い症例や完全閉塞をきたしている症例では施行できず、全例に行うことは不可能であった。これら直腸癌に対するMRI画像については、平成5年度中、シンガポールで開催された国際放射線学会ICR'94(1994.1.24-29)にて展示発表した。今後さらに症例を重ね、その有用性を確立していくと共に、体腔内コイルに改良を加えることによって、その適応範囲を拡大し検査時間の短縮化も試みる予定である。
パーフルオロアルキル基の自己組織化による環境応答性ポリマーフィルムの創製

光反応性基とアミノ基を同時に有する種々の末端官能基化ポリマーを合成し,その鎖末端アミノ基とC8F17COOHとのイオン結合を形成した.C8F17基の表面濃度挙動によって,ポリマーフィルム最表面にはイオン結合性アミノ基が濃縮した.その後,UV照射による光反応性基の光二量化反応を引き起こすことで,フィルム表面にこれらの官能基を固定した.最後に,メタノール処理によりC8F17基を定量的に除去することで,アミノ基が濃縮したフィルム表面を形成した.光反応性基としてクマリン基を用いた場合,その可逆的な光二量化と開裂反応を利用することで,表面における分子運動性制御の可能性を見出した.昨年度成功したシンナモイル基に加え,同じく光応答性を示す官能基であるクマリン基を含む新規末端官能基化ポリマーを合成した。すでに報告した通り,シンナモイル基の光二量化反応を利用することで,フィルム表面の固定化反応が進行し,撥水・撥油性が向上することが明らかとなっている。ただし,このシンナモイル基の反応は非可逆的であるため,フィルムを固定化する場合において効果的である。一方,本年度研究対象としたクマリン基は,波長の異なるUV光を照射することで,二量化反応(365 nm)と開裂反応(254 nm)を可逆的に起こすことが知られている。そこで,クマリン基の特性を活かして,フィルム表面の分子運動性を制御することが出来れば,照射UV光の波長変化(外部環境変化)に応答した機能性表面が構築できると考えた。鎖末端にクマリン基を有する官能基化ポリマーは,昨年度報告した1,1-ジフェニルエチエレン(DPE)誘導体を用いた精密合成法により合成した。DPE誘導体の特異な反応性により,クマリン基の導入数(今回は両末端に2個ずつ計4個)は厳密に規制されている。得られた末端官能基化ポリマーを製膜し,撥水・撥油性を指標に,クマリン基の可逆的な光二量化反応に伴うフィルム表面の外部環境変化応答性(光応答性)について検討した。まず,SECカーブの形状変化より,UV(365 nm)照射による二量化反応は20分間で約30%まで進行し,60分間でほぼ飽和することが示された。つぎにフィルム表面の接触角測定より,照射するUV光の波長を365 nm,254 nm,再び365 nmへと順次変化させると,撥水・撥油性が追随し,動的に変化することが観察された。したがって,クマリン基の可逆的な光反応性を利用した,外部環境変化に応答する機能性フィルムの構築に成功した。光反応性基とアミノ基を同時に有する種々の末端官能基化ポリマーを合成し,その鎖末端アミノ基とC8F17COOHとのイオン結合を形成した.C8F17基の表面濃度挙動によって,ポリマーフィルム最表面にはイオン結合性アミノ基が濃縮した.その後,UV照射による光反応性基の光二量化反応を引き起こすことで,フィルム表面にこれらの官能基を固定した.最後に,メタノール処理によりC8F17基を定量的に除去することで,アミノ基が濃縮したフィルム表面を形成した.光反応性基としてクマリン基を用いた場合,その可逆的な光二量化と開裂反応を利用することで,表面における分子運動性制御の可能性を見出した.本年度は,種々の末端官能基化ポリマーの精密合成の第一段階として,光架橋性を示すシンナモイル基と表面自己組織化のトリガーとなるパーフルオロアルキル(Rf)基を同時に鎖末端に有するポリスチレンの合成を試みた.合成したポリマーはすべて新規化合物であり,高分子合成の面で新しい.本研究の最大の特徴は,1,1-ジフェニルエチエレン(DPE)誘導体の分子設計を工夫することで望みの官能基を任意の数,ポリマー鎖末端へ導入できることである.ここで種類の相異なる官能基,すなわちシンナモイル基とRf基を同時に有するDPE誘導体を新たに分子設計することで,目的の官能基化ポリマーを得ることを考えた.異種の官能基が同時に導入されたDPE誘導体の合成例は極めて少ないが,新規DPE化合物合成の面から,その合成に成功したことは意義がある.もう一つは,得られポリマーを用いた外部環境応答性フィルムの構築である.Rf基の表面濃縮と自己組織化を確認した後,UV光照射による表面構造の変化を定量的に議論した.上記で得られたシンナモイル基とRf基を同時に含むポリスチレンを製膜し,シンナモイル基の光架橋性を利用したフィルム表面の固定化を行った.固定化反応後のポリマーをサイズ排除クロマトグラフ(SEC)を用いて分析することで,UV光(360nm)の照射時間に対するシンナモイル基の光二量化反応が数時間かけて進行することを明らかとした.また,反応によってRf基が表面に固定され,撥水撥油性が向上することをX-ray Photoelectron Spectroscopyと接触角計から確かめた.以上の結果より,本年度は官能基化ポリマーの新規合成を行うとともに,外部環境変化(UV照射)に応答し表面特性を向上させる高機能性フィルムの創製に成功した.先行研究において,ポリマー鎖末端にイオン結合によって導入されたイオン結合性パーフルオロアルキル(Rf)基が,通常のRf基と同様にフィルム表面に濃縮すること,さらに温和な条件でイオン結合を解離させRf基を表面から除去可能であることを見出してきた.

また昨年度,UV光照射により二量化反応を起こす官能基として知られるクマリン基やシンナモイル基を含むポリマーを用いることで,鎖末端に導入されたRf基をフィルム表面に固定化出来ることを示した.本年度は,これら2つの手法を組み合わせることで,アミノ基が濃縮したフィルム表面の形成を目的とし,鎖末端にシンナモイル基とジメチルアミノ基を同時に有するポリスチレン(PS-cin-NR2)を合成した.さらに,Rf-COOHとの反応によりイオン結合性Rf基が導入されたポリマー(PS-cin-NR2Rf)を調製した.PS-cin-NR2は,スチレンのリビングアニオン重合とエンドキャッピング反応,そして4段階の官能基変換反応を経ることで精密合成に成功した.次にPS-cin-NR2Rfを調製し,フィルム表面の構造解析を行った.フィルムは高い撥水性を示し,Rf基とイオン結合しているジメチルアミノ基,そしてシンナモイル基が表面に濃縮されていることが示された.このフィルムにUV光を照射したところ,接触角は上昇し,撥油性が向上した.これはフィルム最表面におけるシンナモイル基の光二量化により,Rf基が固定化されたためである.さらに,メタノールで処理することで,イオン結合が解離しRf基が除去され,目的とするジメチルアミノ基が表面に濃縮したフィルム表面の形成に成功した.高分子合成化学本年度は,可逆的な光反応性を示すクマリン基を鎖末端に有するポリマーの精密合成に成功した.さらに,クマリン基の特性を活かし,得られたポリマーフィルムに波長の異なるUV光を照射することで,表面の分子運動性を変化させ,撥水・撥油性を制御することに成功した。昨年度示した,シンナモイル基の光架橋性を利用したフィルム表面の撥水・撥油性の向上に加え,本年度は新たに,外部環境変化に応答した機能性フィルムの開発に成功した。以上より,本研究の進展は当初の計画どおり順調である.本年度は,光架橋性を示すシンナモイル基と表面自己組織化のトリガーとなるパーフルオロアルキル(Rf)基を同時に鎖末端に有するポリスチレンの合成に成功した.本研究の目的の一つである,種々の末端官能基化ポリマーの精密合成の第一段階として確実な成果が得られた.さらに,得られたシンナモイル基とRf基を同時に含むポリスチレンを製膜し,シンナモイル基のUV照射による光架橋性を利用したフィルム表面の固定化によって,Rf基が表面に固定されフィルム表面の撥水撥油性が向上することを確かめた.末端官能基化ポリマーの合成に加え,外部環境変化(UV照射)に応答し,表面特性を向上させる高機能性フィルムの創製に成功したことから,本研究の進展は当初の計画以上に順調である.刺激応答性の官能基が導入された末端官能基化ポリマーの合成と,これらを用いた外部環境変化に応答する機能性フィルムの構築を推し進める。これまでのシンナモイル基,クマリン基に加え,アゾ基を有するポリマーの合成とフィルム表面の構造解析を行う。これらの研究を通じて,光応答性を示す機能性フィルムの開発を推進する。一方,新たな刺激応答性の官能基として,pH応答性を示す第四級アンモニウム塩の導入を試みる。具体的には,ポリマー鎖末端に第三級アミノ基を導入した後,これをパーフルオロアルキルカルボン酸と反応させることで,第四級化(イオン結合の形成)を行う。イオン結合は,中性条件では安定であるが,pHによって解離することが知られている。そこで,pH変化をトリガーとして,イオン結合で導入されたパーフルオロカルボン酸をフィルム表面で選択的に除去することができれば,極性基であるアミノ基が表面濃縮した,高機能化ポリマーフィルムが生成することが期待される。