hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
チタン合金のナノ構造制御によるインプラント周囲骨形成能の向上

本研究ではインプラント材料として使用される代表的なチタン合金の一つであるTi-6Al-4V表面上に濃アルカリ処理によりナノ構造(TNS)を形成し,ラット骨髄細胞の硬組織分化誘導について比較・検討を行った.SEM,SPMの観察ではナノメーターレベルのネットワーク構造が形成された.XPSの観察では深い酸化膜の層が形成されているのに加え,表層からはバナジウムの析出が見られなかった.濡れ性は実験群で低い接触角を示し,ラット骨髄細胞の初期接着および各種硬組織分化誘導に関するマーカーは高い値を示した.以上により,TNS析出チタン合金表面はオッセオインテグレーションの早期化に寄与できるものと示唆される.歯科治療におけるインプラント治療において良好な咬合状態を維持するには,埋入後の安定性が重要であり,そのためには早期のオッセオインテグレーションの獲得が必需である.我々は純チタン表面にナノシート構造を析出させ,骨分化誘導に有用であることを解明した.現在,インプラント材料には純チタンの他にTi-6Al-4V合金を代表とするチタン合金も多く存在する.そこで,チタン合金においても同様なナノ構造制御を行うことによって,細胞接着能および骨分化誘導能を向上した新規インプラント材料を作製し,臨床応用することを考えている.TNS析出チタン合金と未処理チタン合金をそれぞれ実験群と対照群とし,SDラットの骨髄細胞の初期接着能を比較したところ,培養1,3,6,24時間の全ての計測時間で実験群で高い初期接着能が認められた.ウシ血清アルブミンの吸着量においても実験群で高い接着能を示し,初期接着という観点においても高い値を示すことが明らかとなった.また,TNS析出条件の規定として濃度,温度の観点から比較したところ,10Mで9時間の水酸化ナトリウム水溶液への浸漬で高い硬組織分化誘導能および初期接着能を示す事が明らかとなった.本研究ではインプラント材料として使用される代表的なチタン合金の一つであるTi-6Al-4V表面上に濃アルカリ処理によりナノ構造(TNS)を形成し,ラット骨髄細胞の硬組織分化誘導について比較・検討を行った.SEM,SPMの観察ではナノメーターレベルのネットワーク構造が形成された.XPSの観察では深い酸化膜の層が形成されているのに加え,表層からはバナジウムの析出が見られなかった.濡れ性は実験群で低い接触角を示し,ラット骨髄細胞の初期接着および各種硬組織分化誘導に関するマーカーは高い値を示した.以上により,TNS析出チタン合金表面はオッセオインテグレーションの早期化に寄与できるものと示唆される.現在のインプラントフィクスチャーには純チタン以外に様々なチタン合金を主成分としたインプラントがある.今回開発された表面改質がチタン合金にも応用できれば,どのインプラント材料においてもオッセオインテグレーション期間を短縮することが可能となる.そこで,本研究ではインプラント材料として使用される代表的なチタン合金の一つであるTi-6Al-4V表面上にTNSを析出させ,骨髄細胞の分化発現について比較・検討を行った.実験材料としてナノシートを析出させた市販のTi-6Al-4V合金を使用し,対照群として#2000まで研磨した同材料を使用した.TNSの析出には,各試料を10 Mの水酸化ナトリウム水溶液に浸漬し,攪拌した状態で室温および大気圧条件下で24時間反応させた.反応後,試料を取り出し,イオン交換水にて導電率が5 μm以下になるまで洗浄を行った後,自然乾燥にてチタン金属表面にTNSを析出させた.次に,生後7週齢のSD系雄性ラットの両側大腿骨から骨髄間葉細胞を採取後,初代培養を確立しその3代目を実験に供した.次に,細胞を1穴あたり4×104個ずつ各試料上に播種し,培地に10 mM β-グリセロン酸ナトリウムと82 μg/mlアスコルビン酸,10 Mデキサメタゾン含有の分化誘導培地を用い培養後14,21日後のALP活性および28日後のオステオカルシンの産生量およびカルシウムの析出量を測定した.統計学的解析には,各測定値にStudentのt検定を用い,有意水準は5 %に設定した.14,21日後のALP活性,28日後のオステオカルシン産生量およびカルシウムの析出量は対照群と比較し,すべて実験群が有意に高かった.この結果から,チタン合金においても,純チタン金属と同様に,ナノレベルでの表面改質が骨髄細胞の硬組織への分化誘導の向上に有用であるという可能性が示唆された.われわれは室温での濃アルカリ水溶液中下で純チタン金属表面上にナノシート構造(TNS)が析出し,細胞の骨分化誘導能に影響することを報告した.今回のような表面制御がチタン合金にも応用できれば,どのインプラント材料においてもオッセオインテグレーション期間を短縮することが可能となる.そこで,本研究ではインプラント材料として使用される代表的なチタン合金の一つであるTi-6Al-4V表面上にTNSを形成し,骨髄細胞の硬組織分化誘導能について比較・検討を行った.実験群としてナノシートを析出させた市販のTi-6Al-4V合金を使用し,対照群として#2000まで研磨した同材料を使用した.SEM,SPMの観察では対照群で平坦な像が観察されるのに対し,実験群においてナノメーターレベルのネットワーク構造が形成された.XPSの観察では深い酸化膜の層が形成されているのに加え,表層からはバナジウムの析出が見られなかった.

濡れ性は実験群で低い接触角を示し,細胞接着数の比較では,全ての計測時間で実験群は対照群と比較して有意に高い値を示した.実験群においてウシ血清アルブミンの吸着量が有意に高い値を示し,すべての計測時間でALP活性,オステオカルシン産生量,カルシウム析出量,Runx2 mRNAの発現が有意に高い値を示した.以上の結果により,チタン合金においても,純チタン金属と同様に,ナノレベルでの表面改質が骨髄細胞の硬組織への分化誘導の向上に有用であるという可能性が示唆された.歯科補綴学チタン合金におけるTNS析出に成功し,ラットの骨髄細胞を利用したin vitro評価に関しては大方終了し,その結果をinternational journal of nanomedicineに投稿予定である.また,in vivo評価に利用する試料の作製に成功し,本年度補綴学会にて発表予定である.チタン合金におけるTNS構造の析出に成功し、ラットの骨髄細胞を利用したin vitro評価により、チタン合金においても硬組織分化誘導能の向上に寄与できる可能性の一端を示したため。また、TNS構造の分子間構造の解明にも務めており、Journal of Prosthetic Dentistryに投稿中である.in vivo評価に使用する試料は360°TNS構造の析出が必須であり,本年度にその作製に成功した.今後はこの試料を用い,in vivo評価について開始している.また,TNS構造の分子間構造についても引き続き検討予定である.24年度の研究結果をもとに、TNS構造の分子間構造の解明に努めるとともに、すでに報告を行っている純チタン金属表面に析出したTNS構造との細胞接着、硬組織分化誘導能の比較も行う.また、In vivo評価法の確立もスタートしており、年内にはその一端を報告予定である.in vivo計画に使用するスクリューピンへのTNS構造の付与に成功したのが当該年度末であり、本年度より各種試験に使用する試料を制作する費用が平成26年度に加算される。平成26年度はチタン合金スクリューへのTNSの付与を行い、in vivo評価を行うことを追記とする。24年度と同様、本研究費の大半は、細胞培養から解析にいたるまでの実験に関わる消耗品に費やされる。消耗品に関しては、必要性を吟味し、積算により算出した。研究施設に設置されている走査型電子顕微鏡、光学顕微鏡、万能試験機等を利用しできるだけ経費の節減に努めて研究を行う。
細胞膜コレステロールに依存するウイルス侵入機構の動態解析

これまでに,我々はCD13がヒト線維芽細胞の主要ラフト成分であり,生細胞において抗体を用いて架橋するとカベオラへ移動する現象を見出した.CD13はヒトコロナウイルス-229E(HCoV-229E)のレセプターであることから,HCoV-229Eは抗CD13抗体と同様にCD13を架橋しカベオラへ移動する可能性,その後カベオラから細胞内へ侵入する可能性について検討した.HCov-229Eをヒト線維芽細胞に氷温にて結合させた後,すぐに固定するとウイルスは特定の局在を示さなかった.ウイルス結合後,37°C,3時間培養を継続すると,ウイルスはカベオリン-1と一致した局在を示した.37°C、3時間培養後の標本では、電顕観察により、ウイルスは高頻度でカベオラの開口部に認められた.膜コレステロールを枯渇させることで,ラフト,カベオラの機能を阻害した際のウイルス局在を追跡した.あらかじめ細胞にコレステロール結合試薬であるmethyl β-cyclodextrin(MeβCD)を作用させた場合,ウイルスとカベオリン-1の局在が一致する細胞数は有意に減少した.MeβCD処理後,コレステロールを付加すると,両者の局在が一致する細胞数は回復した.膜コレステロール枯渇処理がHCoV-229Eの細胞内エントリーに与える影響を検討した.ウイルスを細胞に吸着させ,37°C,3.5時間培養後,トリプシン処理にて細胞表面のウイルスを除き,細胞内のウイルス量をRT-PCR法を用いて定量した.MeβCDで前処置した細胞では,細胞内ウイルス量は減少した.MeβCD処理の後、コレステロール付加を行った細胞1では,細胞内ウイルス量は回復した.現在,カベオリン-1のドミナントネガティブ分子を発現した細胞株,siRNAをトランスフェクトした細胞株におけるHCoV-229Eエントリーについて検討中である.これまでに,我々はCD13がヒト線維芽細胞の主要ラフト成分であり,生細胞において抗体を用いて架橋するとカベオラへ移動する現象を見出した.CD13はヒトコロナウイルス-229E(HCoV-229E)のレセプターであることから,HCoV-229Eは抗CD13抗体と同様にCD13を架橋しカベオラへ移動する可能性,その後カベオラから細胞内へ侵入する可能性について検討した.HCov-229Eをヒト線維芽細胞に氷温にて結合させた後,すぐに固定するとウイルスは特定の局在を示さなかった.ウイルス結合後,37°C,3時間培養を継続すると,ウイルスはカベオリン-1と一致した局在を示した.37°C、3時間培養後の標本では、電顕観察により、ウイルスは高頻度でカベオラの開口部に認められた.膜コレステロールを枯渇させることで,ラフト,カベオラの機能を阻害した際のウイルス局在を追跡した.あらかじめ細胞にコレステロール結合試薬であるmethyl β-cyclodextrin(MeβCD)を作用させた場合,ウイルスとカベオリン-1の局在が一致する細胞数は有意に減少した.MeβCD処理後,コレステロールを付加すると,両者の局在が一致する細胞数は回復した.膜コレステロール枯渇処理がHCoV-229Eの細胞内エントリーに与える影響を検討した.ウイルスを細胞に吸着させ,37°C,3.5時間培養後,トリプシン処理にて細胞表面のウイルスを除き,細胞内のウイルス量をRT-PCR法を用いて定量した.MeβCDで前処置した細胞では,細胞内ウイルス量は減少した.MeβCD処理の後、コレステロール付加を行った細胞1では,細胞内ウイルス量は回復した.現在,カベオリン-1のドミナントネガティブ分子を発現した細胞株,siRNAをトランスフェクトした細胞株におけるHCoV-229Eエントリーについて検討中である.
知的障害者の地域生活援助システム構築のための基礎的研究-健康作りのためのスポーツ、身体活動などの余暇支援システムを中心に-

地域で自立的生活を送る知的障害者の生活実態と健康状況を把握するために、北海道、神奈川、九州におけるグループホーム利用者ならびにバックアップ施設を対象にアンケート調査ならびに聞き取り調査を実施した。その結果、多くはバックアップ施設等によって行われているプログラムや地域の行事に参加していた。しかしながら日常的に全身を使った身体活動・スポーツを行っているものは少なく、とりわけ休日には身体活動量が少ないことが伺われた。身体的な痛みの訴えと運動の関係を見たところ、腰痛を感じているものと運動を行っているものに関係が見られた。これは身体の痛みが運動の必要性の自覚を促しているものと考えられた。体脂肪率計を用いた調査では、女性において重度の肥満傾向を示す群がみられ、生活習慣病対策として身体活動プログラムへの参加を促すなど早急な対応が必要であることが明らかとなった。また季節変化では、夏季に比べ冬季では体脂肪率が増加する傾向にあることが示され、冬季間の身体活動プログラムの重要性が示された。重度肥満者に対し心拍数計ならびにアクティブトレーサーにより身体活動量を調査したところ、職場への通勤時などに心拍数の上昇などがみられるものの、その他の時間帯では極端に活動量が少ないことが示された。さらに実際に余暇活動に参加している障害者の意識や余暇活動への参加条件を明らかにすることを目的に、各種スポーツ大会参加者に対し、アンケートならびに聞き取り調査を行った結果、大会への参加をきっかけに、「日常的に練習を行うようになった」「生活に張りが出た」などの感想を持つものが多くみられた。反対に、指導者や練習会場への交通アクセス、環境・施設など障害者が参加しやすい条件を整えることが、重要であることが示された。その結果、多くはバックアップ施設等によって行われているプログラムや地域の行事に参加しているが、日常的には全身を使った身体活動への参加の機会は少なく、とりわけ休日には身体活動量が低下し肥満傾向を示すケースが多く見られた。体脂肪率計を用いた調査では、女性において重度の肥満傾向を示す群がみられ、身体活動プログラムへの参加などの早急な対応が必要であることが明らかとなった。また季節変化では、夏季に比べ冬季では体脂肪率も増加する傾向にあることが示され、冬季間の身体活動プログラムの重要性が示された。重度肥満者に対し心拍数計ならびにアクティブトレーサーにより身体活動量を調査したところ、職場やバックアップ施設への移動時に身体活動がみられるもののその他の時間帯では、極端に活動量が少ないことが示された。さらに実際に余暇活動に参加している障害者の意識や余暇活動への参加条件を明らかにすることを目的に、室内で行うことができる「障害者のスポーツチャンバラ大会」冬季間の身体活動として「障害者の歩くスキーの集い」参加者などに対し、アンケートならびに聞き取り調査を行った。その結果、これらの大会への参加をきっかけに、「日常的に練習を行うようになった」「生活に張りが出た」などの感想を持つものが多くみられた。反対に、指導者や練習会場へのアクセス、クロスカントリースキーではコースセッティングなど障害者が参加しやすい条件を整えることが、重要であることが示された。今後さらに調査対象を拡大するとともに、これらの資料や海外の情報をもとに、日本における余暇活動支援のシステムのあり方についてまとめて行く予定である。
アパタイト析出による歯根面知覚過敏症の治療法に関する研究

歯根面知覚過敏症の治療法については、種々の方法が臨床的に試みられているが、決定的に有効な方法は確立されていない。本研究では、開口象牙細管をアパタイトで封鎖する方法の開発を試みた。すなわち、アパタイトなどのリン酸カルシウム類は酸性溶液に対する溶解度は高いが、中性および塩基性領域の水溶液にはほとんど溶解しない性質を利用して、アパタイトを析出させる方法を考案した。アパタイト析出溶液としてリン酸カルシウムを含有した酸溶液(IM CaHPO_4・2H_2O、2M H_3PO_4)と、pHを上げるための後処理液として1N-NaOHを用いた。知覚過敏を想定して酸処理にて象牙細管を開口させた象牙質プレートにリン酸カルシウム処理液を綿球にて3分間塗布し、乾燥した後、後処理液を3分間塗布した。このプレートを走査型電子顕微鏡により観察した結果、象牙細管は処理表面では完全に封鎖されており、割断面では象牙質プレート表面より約10ミクロンの深さまで結晶性物質により封鎖されることが分かった。象牙細管内に析出した結晶性物質をX線微小分析により調べた結果、管間象牙質ではCa/P比は1.4であったのに対して結晶性物質では1.0と有為に低い値であった。この析出物の粉末を粉末X線回折により分析した結果、析出した結晶はリン酸カルシウム二水和物(CaHPO_4・2H_2O)であることが分かった。リン酸カルシウム二水和物は口腔内で唾液成分中のカルシウムを取り込むことによりアパタイトに相変化することから、本処理法により開口した象牙細管をアパタイトで表層のみならず深部にまで封鎖できる可能性が示唆された。
組織再生促進サイトカイン含有ナノファイバーを用いた新しい腱縫合糸の開発

本研究の目的は、生体吸収性合成ポリマー(PEG;polyethylene glycol)を用いてナノファイバー縫合糸のネットワーク内に、組織再生促進蛋白のーつである線維芽細胞増殖因子(FGF;Fibroblast Growth Factor)を含有させ、縫合糸そのものにDDS(Drug Delivery System)としての機能を持たせることで生物学的に断裂腱の再生・癒合を促すような新しい腱縫合糸の開発を行うことである。方法はウサギ腱損傷モデル(日本白色家兎、趾屈筋腱)を用い、PEG polymerに高濃度FGF溶液(500μg/ml)を混合し、ナノファイバー縫合糸に含浸させた。5-0ナイロン糸を用いてKessler法で断裂腱のcore sutureを行い、FGFを含有させたナノファイバー縫合糸を用いてperipheral sutureを行った(FGF群)。対照群としてはPEGのみを含有させたナノファイバー縫合糸を用いてperipheral sutureを行った(PEG群)。術後3週(3W-PEG群、3W-FGF群)、6週(6W-FGF群、6W-FGF群)で組織学的検討(HE染色)、力学試験(引っ張り強度)を行った。結果、腱縫合部の組織学的所見では、3W-FGF群、6W-FGF群でPEG群と比較し腱表層のepitenonの肥厚と細胞増殖の著明な増加を認めた。力学試験では、3W-FGF群(N=31.8±3.8)は3W-PEG群(N=24.3±3.4)に比較し有意に破断張力が増大した。6W-FGF群(N=52.5±3.5)と6W-PEG群(N=43.7±4.7)間ではFGF群のほうが破断張力の増大傾向は認めるものの有意差は認められなかった。ナノファイバーにFGFを含有させた群では、組織学的に腱修復の促進効果が得られており、力学的強度の早期回復が得られることがわかった。ポリ乳酸を原材料として、これを有機溶媒に溶かし、静電防止方法によりナノファイバーを作成した。ナノファイバー作成時にワイヤ状のコレクタ(捕集電極)を用いることで、棒状の繊維成型体を得、これを用いて撚り糸を作製した。作成した撚り糸を、ポリエチレングリコール(PEG)と腱組織再生促進サイトカインであるfibroblast growthfactor-2(FGF-2)を混和した溶液に浸し、陰圧をかけて糸の内部の気泡を除去し、撚り糸内にFGF-2混入PEGを含有させた。電子顕微鏡レベルでの、ナノファイバーの変化を観察し、そのファイバー径の肥大を確認し、より糸内にPEGが含有されていることを確認した。現在この組織再生促進サイトカインを含有したナノファイバーを用いて、ウサギの腱断裂モデルを作成中である。具体的には白兎の総踵骨腱を中央で切断し、右側を対照群とし、PEGのみを含有した糸で縫合した。左側はFGF-2混入PEGを含有させた糸を用いて腱縫合を行った。いずれも4-0ナイロン糸をcore sutnreとして用い、Kessler法で縫合した後に徐放糸にてKessler法および腱上縫合を行った。術後は両側ともギプス固定を行った。しかしながらこの方法では、縫合部でのギャップ形成を来す例が多く、適切な実験系が作製できないため、現在では一側肢のみを手術してギプスだけでなく、鋼線で関節固定を追加して行うなどの工夫をしながら実験モデルを作成中である。

本研究の目的は、生体吸収性合成ポリマー(PEG;polyethylene glycol)を用いてナノファイバー縫合糸のネットワーク内に、組織再生促進蛋白の一つである線維芽細胞増殖因子(FGF;Fibroblast Growth Factor)を含有させ、縫合糸そのものにDDS(Drug Delivery System)としての機能を持たせることで生物学的に断裂腱の再生・癒合を促すような新しい腱縫合糸の開発を行うことである。方法はウサギ腱損傷モデル(日本白色家兎、趾屈筋腱)を用い、PEG polymerに高濃度FGF溶液(500μg/ml)を混合し、ナノファイバー縫合糸に含浸させた。5-0ナイロン糸を用いてKessler法で断裂腱のcore sutureを行い、FGFを含有させたナノファイバー縫合糸を用いてperipheral sutureを行った(FGF群)。対照群としてはPEGのみを含有させたナノファイバー縫合糸を用いてperipheral sutureを行った(PEG群)。術後3週(3W-PEG群、3W-FGF群)、6週(6W-FGF群、6W-FGF群)で組織学的検討(HE染色)、力学試験(引っ張り強度)を行った。結果、腱縫合部の組織学的所見では、3W-FGF群、6W-FGF群でPEG群と比較し腱表層のepitenonの肥厚と細胞増殖の著明な増加を認めた。力学試験では、3W-FGF群(N=24.3±3.4)は3W-PEG群(N=31.8±3.8)に比較し有意に破断張力が増大した。6W-FGF群(N=43.7±4.7)と6W-PEG群(N=52.5±3.5)間ではFGF群のほうが破断張力の増大傾向は認めるものの有意差は認められなかった。ナノファイバーにFGFを含有させた群では、組織学的に腱修復の促進効果が得られており、力学的強度の早期回復が得られることがわかった。
脳卒中片麻痺上肢痙縮に対するボツリヌス療法と中枢性電気刺激の併用療法に関する研究

脳卒中片麻痺上肢痙縮に対するボツリヌス療法(BoNTA)は、脳卒中治療ガイドライン2015では、推奨レベルグレードAとしてエビデンスが確立され、日常診療で積極的に実施されている。しかし、効果持続期間が短く定期的な施注が必要であり、頻回の施注に伴う抗体産生のリスクや高額な薬剤費の問題がある。現在、BoNTAに併用することで効果増強や効果持続延長が得られるリハビリ治療は同定されていない。そのため、本研究では、脳卒中患者を対象に経頭蓋直流電気刺激(tDCS)治療群とSham(偽刺激)治療群の2群に振り分けた無作為化臨床試験を実施し、痙縮抑制効果増強および効果持続延長を治療条件の違いによって比較し、本併用療法が上記効果に及ぼす影響を短期的および長期的に検討する。あわせて、運動機能回復に関与するバイオマーカーである脳由来神経栄養因子(BDNF)血中濃度を測定し治療効果との関連を検討する。以上により、片麻痺上肢痙縮に対して、新しい本併用療法の効果を明らかとし、本法の臨床適用を確立することを目指す。当該年度においては、予備的研究を実施し、プロトコールの実行性及び有害事象を生じないことを確認するとともに、血液中のBDNF遺伝子多型を測定することに関して倫理審査を受審し承認を得た。また、対象となる慢性期脳卒中片麻痺患者をリクルートした。次年度以降は、研究計画に基づき、対象患者を無作為に2群(tDCS群とSham群)に割り付け、15セッションの治療介入を実施し、上肢機能の変化、血中BDNF濃度、BDNF遺伝子多型を測定し、追跡評価を行う予定である。遺伝子検査を含むプロトコールが確定し、倫理委員会の承認を得た。対象者のリクルートも順調に行われ、研究計画に沿って概ね実施できている。研究計画の変更はなく、実施上の問題はない。今後、研究計画通りに対象者を増やし、研究は順調に進むと考えられる。当該年度においては、予備試験やプロトコールの確定のための作業が中心となり、旅費や人件費・謝金等の支出が計画より少なかったこともあり、次年度使用額が生じた。次年度においては、研究実施にあたる人件費・謝金等の必要性が高まるため、その項目に次年度使用額を充当する予定である。
カルシウム動態から見た環境変動が陸域生態系に及ぼす影響の予測

本研究は、カルシウムが陸域生態系において供給(母材風化と降下)、溶脱、集積、流出などの過程を経て、その特性を規定する重要な機軸元素であると想定し、陸域生態系におけるカルシウム動態の様相を解明することを目的として行われた。10名の研究者が参加して、平成810年度の3年間にわたり研究を行った。データ収集及び解析のための現地調査は、北海道大学農学部附属天塩地方演習林、新潟県五泉市および東蒲原郡村松町に位置する菅名岳、長野県にある筑波大学川上演習林(一部は鹿児島県屋久島)、および京都府美山町にある京都大学農学部附属芦生演習林において行われた。その結果、以下の諸点が明らかとなった。すなわち、1)北海道北部の土壌は、Ca蓄積量が少なく、リター分解によるCa循環のほか、大気降下物がCaの重要な供給源になって森林生態系が成立していること。2)川上演習林及び屋久島における研究では、植物・土壌系のCa起源について、Sr同位体をトレーサーに用いた検証手法が有効であること。3)新潟県の冷温帯林においては、地形によって植生構造や土壌発達様式が変化し、それが林内を浸透通過する降水の化学性に影響を及ぼすこと、また季節によって林内通過水の性質が大きく変化すること。4)芦生演習林においては、地形的位置の違いが植生・土壌系の分化をもたらしているが、Caがそれを最も顕著に表していること。5)芦生演習林における落葉分解実験においては、落葉中のCa濃度初期値の大きなものは分解とともに濃度が低下、逆に初期値が小さなものは分解とともに濃度が増加し、最終的にはある一定値に漸近的に収束すること、等であった。平成8年10月に、本科学研究費補助金交付の通知を受け、急遽、研究実施体制を作り研究を開始した。本研究は、生態系内におけるカルシウム循環のパターンを解析し,それに基づいて生態系構成要素間の相互作用の関係を明らかにすることを目的としている。そのため、生物活動の最も活発な時期に野外調査を通して資料を収集し研究を行うのが望ましい。したがって平成8年度は主として現場の下見、機器の整備、文献研究、研究体制の整備等を主たる目的として研究を行った。平成8年11月に研究対象候補地の一つとして、長野県佐久郡川上村にある筑波大学川上演習林を訪ね、研究サイトとしての適応について検討を行った。機器の整備については、柳木製の炭素窒素自動分析装置(富山大学理学部)、日立製冷却遠心器(京都大学農学部)を購入した。また、平成9年1月23-24日にわたり、富山大学理学部において研究集会を開催、本研究に参加する研究者10名のうち9名が出席、研究内容について発表するとともに、平成9年度の研究計画について討議を行った。その結果、土地的環境条件の相違に伴う生態系の分化様式および既存データの利用という点から、京都大学芦生演習林が研究サイトとして適当であるとの結論に至った。また本研究の実施するにあたり最も留意すべき点は学際的連携で、異分野の研究者が可能な限り同一地域において共同作業的に研究を行う必要があるとが指摘された。平成9年3月6日-10日にかけて、代表者小島はカナダ、ブリテイッシュ・コロンビア大学林学部のクリンカ(K.Klinka)教授を訪ね、本研究についてのレビューを求めた。また同学部のキミンズ(H.P.Kimmins)教授には本研究の外部相談役(external adviser)としての協力を約束いただいた。平成9年度においては、芦生演習林を主たる研究フィールドとして、気象、水文、地質、地形、植生、土壌、土壌動物等の研究者が同じ時期同じ場所において、相互に交流しながら研究を実施する予定である。さらに、これらの解析結果を最終的には、生態系の包括的モデルにより統合することを目指している。本年度は、研究代表者小島を中心に研究分担者らが協力して野外調査を行った。

調査は、京都府北部にある京都大学農学部附属芦生演習林のおいて集中的に行われた。調査地域を地形的位置により、尾根部、中腹部、谷底部に区分し、合計40個所の調査区を設定した。各調査区において植物群落の構成を記録、毎木調査を行った。主要樹種立木の化学性を分析するため樹皮及び幹材のサンプルを採取した。また植物葉の化学性を分析するため、異なる立地を代表する植物15種を選び時期を違えて合計で650点の生葉サンプルを採取した。各調査区に1個の誌抗を掘り、土壌の発達を観察記録するとともに分析用サンプルを採取した。採取されたサンプルは合計200点となった。植物群落の記録から組成表を作成し調査区間及び立地型間の植生類似度を求めるとともに、各立地を代表する植生型を決定した。土壌に関しては、含水量、空隙量、三相構造などの物理生、またpH、電気伝導度、置換性陽イオン量(Ca,Mg,Na,K)、陽イオン交換容量、有機炭素量、全窒素量等の化学性を分析、それに基づいて塩基飽和度、C/N比を求めた。毎木調査の結果からha当たりの材積量を求めるとともに、材の化学分析結果から立木に蓄積された元素量を求めた。これらの分析の結果、植生・土壌系は明らかに尾根部、中腹部、谷底部という立地条件により分化していることが明らかとなった。また土壌、生葉の化学性、樹皮・幹材の化学性等に共通して、尾根部から谷底部にかけて同じ傾向を見せる要因としてカルシウムが認められた。すなわち、植物体(生葉、樹皮、幹材)及び土壌(有機質及び鉱質土壌)いずれにおいても、カルシウム量は尾根部で少なく谷底部において増加する傾向が認められた。これは、尾根部においては溶脱が進みカルシウムが失われるのに対し、谷底部では逆に周辺から供給されるカルシウムが集積するためと考えられた。このように、地形的位置の違いによるカルシウムの動態が本調査地において植生・土壌系分化の機軸要因として働いているこいとが明かとなった。平成10年1月、本研究参加者が愛媛大学農学部に集まり成果報告会を行った。平成10年度は、本研究の最終年度である。研究代表者小島を中心にして、研究分担者らが協力して野外調査、資料分析、集計を行い、本研究の成果報告書を作成した。分担者佐藤は、北海道大学農学部附属天塩地方演習林のある集水域においてカルシウムの収支を測定し、域外から空中飛散物として供給されるカルシウムの重要性を指摘した。分担者中田は、新潟県の山地において、地形的位置および季節の違いによる渓流水の化学性変化を分析し、渓流の水源域において化学性は季節変動が大きいこと、および水は酸性が強まることを明らかにした。分担者武田は、京都大学農学部附属芦生演習林において落葉の分解実験を継続し、分解進行に伴う分解葉の化学性の変化を分析した。小島は、平成9年度に引き続き、京都大学農学部附属芦生演習林における地形と植生および土壌特性について調査を行い、地形による植生の相違が土壌の化学性とくにカルシウム量と密接に関係していることを明らかにした。また主要樹種の幹材および樹皮の化学性においても地形的位置による違いが認められた。それらの分析値に基づいて、土壌、植物体、落葉、立木などに蓄積されている単位面積あたりのカルシウム量を算定した。
聴覚障害の補償・代行手段の有効性--音声認知能力の評価基準の国際的共通化--

音声の電気的な信号を内耳に植え込んだ電極を通して聴覚神経に伝える方式、あるいは音声を機械的な振動として皮膚の触覚から伝える方式の人工聴覚は、重度の聴覚障害者にも聴覚を活用する道を拓くもので、今後も飛躍的に性能が向上する可能性を秘めている。しかし、そのためには、各方式についての音声認知能力の詳細な評価実験のデータが必要になる。このような評価実験には、適切な被験者の長期にわたる総合的な観察をしなければならないために、限られた研究機関でしか、信頼できるデータが得られない。しかも、そのような貴重な評価実験が、異なる言語の音声によっているために、結果を相互に比較することができず、そのことが人工内耳の研究開発に致命的な障害になっている。本研究では、このような状態を打開するために、諸外国の人工内耳の研究開発に中心的な活動をしている研究者と共同して、異なる言語間の評価結果を相互に換算する方法を、聴覚での音声情報処理の特性の詳細な解析によって導き出して、評価基準を国際的に標準化する可能性を検討してきた結果、人工聴覚による音声認知能力の国際的評価基準を設定できる理論的な見通しが得られた。本研究の発足にあたって、平成3年6月に研究代表者・比企静雄がスウェーデン王國の王立工科大学に出張して、相手側対応研究グループの研究代表者・ア-ネリスベリと研究分担者のカ-ルエリクスペンスと会合して、研究計画の全体の調整の連絡と、聴覚補償手段の評価実験についての調査を行った。次に、平成3年8月にア-ネリスベリを招へいして、まず、熊本大学で、研究分担者の渡辺亮が役割分担として進めている聴覚代行のための音声処理法の検討について、詳細な調査を行った。そのうえで、カ-ルエリクスペンスとアメリカ合衆国の研究分担者のワシントン大学・A.メイナ-ドエングブレツオンも招へいして、東京で国内の研究分担者も参加して研究連絡会を開いた。ここでは、ア-ネリスベリの聴覚の補償・代行手段の全般の報告、カ-ルエリクスペンスとA.メイナ-ドエングブレツオンのそれぞれの方式の音声の触覚・視覚表示のスウェーデン語・英米語による評価実験の報告があり、日本語の音声の場合との対比について討議し、発足後数箇月の間の各役割分担の進捗状況を踏まえて、以後の共同研究を有効に進める方策について討議した。さらに、平成3年7月に研究分担者の大沼直紀がオーストラリアに出張し、研究分担者のメルボルン大学・ピ-タブラミが行っている聴覚神経の電気刺激方式の評価実験について、従来からの研究の経過を総合的に調査した。第2年度に移るにあたり、平成4年5月-6月に比企静雄が研究組織内の連絡・調整のためにスウェーデン王國およびオーストリアに出張し、王立工科大学・ア-ネリスベリ、カ-ルエリクスペンス、および同じく研究分担者のインスブルック大学・アウインS.ホフマイアと、それぞれの役割分担である聴覚の補償・代行手段の全般、聴覚代行のための音声処理法の検討、聴覚神経の電気刺激方法について、第1年度の研究成果を踏まえて第2年度の研究計画について打合せを行った。また、この期間にストックホイムで開催されたリハビリテーション技術の高度化に関するヨーロッパ会議、および、ヨーロッパ音声通信協会主催のワークショップ「障害者のための音声言語技術」で、多数の外国の研究者と本研究に関連した意見の交換をし、同時に、アメリカ合衆国の研究分担者のニューヨーク市立大学・ハリ-レヴィットとワシントン大学・A.メイナ-ドエングブレツオンとも、それぞれの役割分担の補聴器の多機能化と音声の触覚・視覚表示方法について、研究打合せをする機会をもった。平成5年3月には、比企静雄と研究協力者の高橋誠が、国外の研究分担者が開発した各種の補助手段の使用効果を調査するために、アメリカ合衆国に出張し、カリフォルニア州立大学ノースリッジ校の障害学生支援センターを中心にして、聴覚補償・代行機器の使用効果の評価資料の収集を行った。本研究は平成4年度で終了するので、研究成果の総括のための研究打合せの会合を、平成5年3月-4月に東京で開き、国外の研究分担者のスウェーデン王國・王立工科大学・ア-ネリスベリ,カ-ルエリクスペンスを招へいして、国内の研究分担者が参加して、各役割分担の研究成果の報告と討議を行う。さらに、国内の研究分担者の相互には、多くの機会に個別に研究連絡と討議を重ねてきた。本研究で提案する人工聴覚による音声認知能力の異なる言語間の評価結果を相互に換算する方法は、今後さらに、具体的な手順について、臨床的な側面も加えて検討を続ける必要がある。

本研究では、このような状態を打開するために、諸外国の人工内耳の研究開発に中心的な活動をしている研究者と共同して、異なる言語間の評価結果を相互に換算する方法を、聴覚での音声情報処理の特性の詳細な解析によって導き出して、評価基準を国際的に標準化する可能性を検討してきた結果、人工聴覚による音声認知能力の国際的評価基準を設定できる理論的な見通しが得られた。本研究の発足にあたって、平成3年6月に研究代表者・比企静雄がスウェーデン王國の王立工科大学に出張して、相手側対応研究グループの研究代表者・ア-ネリスベリと研究分担者のカ-ルエリクスペンスと会合して、研究計画の全体の調整の連絡と、聴覚補償手段の評価実験についての調査を行った。次に、平成3年8月にア-ネリスベリを招へいして、まず、熊本大学で、研究分担者の渡辺亮が役割分担として進めている聴覚代行のための音声処理法の検討について、詳細な調査を行った。そのうえで、カ-ルエリクスペンスとアメリカ合衆国の研究分担者のワシントン大学・A.メイナ-ドエングブレツオンも招へいして、東京で国内の研究分担者も参加して研究連絡会を開いた。ここでは、ア-ネリスベリの聴覚の補償・代行手段の全般の報告、カ-ルエリクスペンスとA.メイナ-ドエングブレツオンのそれぞれの方式の音声の触覚・視覚表示のスウェーデン語・英米語による評価実験の報告があり、日本語の音声の場合との対比について討議し、発足後数箇月の間の各役割分担の進捗状況を踏まえて、以後の共同研究を有効に進める方策について討議した。さらに、平成3年7月に研究分担者の大沼直紀がオーストラリアに出張し、研究分担者のメルボルン大学・ピ-タブラミが行っている聴覚神経の電気刺激方式の評価実験について、従来からの研究の経過を総合的に調査した。第2年度に移るにあたり、平成4年5月-6月に比企静雄が研究組織内の連絡・調整のためにスウェーデン王國およびオーストリアに出張し、王立工科大学・ア-ネリスベリ、カ-ルエリクスペンス、および同じく研究分担者のインスブルック大学・アウインS.ホフマイアと、それぞれの役割分担である聴覚の補償・代行手段の全般、聴覚代行のための音声処理法の検討、聴覚神経の電気刺激方法について、第1年度の研究成果を踏まえて第2年度の研究計画について打合せを行った。また、この期間にストックホイムで開催されたリハビリテーション技術の高度化に関するヨーロッパ会議、および、ヨーロッパ音声通信協会主催のワークショップ「障害者のための音声言語技術」で、多数の外国の研究者と本研究に関連した意見の交換をし、同時に、アメリカ合衆国の研究分担者のニューヨーク市立大学・ハリ-レヴィットとワシントン大学・A.メイナ-ドエングブレツオンとも、それぞれの役割分担の補聴器の多機能化と音声の触覚・視覚表示方法について、研究打合せをする機会をもった。平成5年3月には、比企静雄と研究協力者の高橋誠が、国外の研究分担者が開発した各種の補助手段の使用効果を調査するために、アメリカ合衆国に出張し、カリフォルニア州立大学ノースリッジ校の障害学生支援センターを中心にして、聴覚補償・代行機器の使用効果の評価資料の収集を行った。本研究は平成4年度で終了するので、研究成果の総括のための研究打合せの会合を、平成5年3月-4月に東京で開き、国外の研究分担者のスウェーデン王國・王立工科大学・ア-ネリスベリ,カ-ルエリクスペンスを招へいして、国内の研究分担者が参加して、各役割分担の研究成果の報告と討議を行う。さらに、国内の研究分担者の相互には、多くの機会に個別に研究連絡と討議を重ねてきた。本研究で提案する人工聴覚による音声認知能力の異なる言語間の評価結果を相互に換算する方法は、今後さらに、具体的な手順について、臨床的な側面も加えて検討を続ける必要がある。
異方構造を有し高強度で高膨潤比を示すポリビニルアルコールゲルの新しい作製方法

生体適合性を有するポリビニルアルコールゲルの医用材料としての実用化を目指し、従来のゲル化方法(繰返し凍結・解凍法(FT法)、キャストドライ法(CD法))を基礎から見直すとともに、新しいプロセスを導入して高機能化を目指した。すなわち、一方向凍結法により繊維配向したFTゲルの作製方法を確立し、積層法による多層構造CDゲルの異方的な膨潤特性と面方向の強度ならびに面に垂直方向の圧縮強度特性を明らかにした。擬一次元もしくは擬二次元の異方構造をもつゲル網目の微視構造を膨潤比ならびに力学強度の測定結果と比較して、異方性を有し高い膨潤比と力学強度を併せ持つハイドロゲルの作製技術の基礎を構築した。汎用のポリビニルアルコール(PVA)を用いて、従来のゲル化方法(キャストドライ(CD)法、凍結解凍(FT)法)を用い、作製条件を大きく変化させ物性との関係を検討した。(1) CDゲルおよびFTゲルの作製:汎用のPVA粉末(平均重合度1700、ケン化度9899 mol%:クラレ製、Cat. No. PVA117)を90°C以上で湯煎により純水に溶解して15wt%PVA水溶液を作製した。この水溶液をポリスチレンシャーレに適量流し入れ、重量が一定になるまで乾燥させ試料を作製した。CDゲルの作製条件として、乾燥時の温度(8°Cから80°C)と湿度(40%RHから80%RH)を制御し、FTゲルの作製条件として、凍結・解凍時の温度(ー17°Cからー50°C)、各温度での保持時間(1時間から72時間)を制御し、様々な試料を作製した。(2)膨潤比と引張り強度の測定:室温において一定重量比の純水中に24時間静置し、平衡膨潤に達したゲルの重量(Wt)を測定した。その後、膨潤させたゲルを60°Cで24時間以上乾燥させ、このときの乾燥重量(Wd)を測定し、重量膨潤比(Wt/ Wd)を算出した。また、平衡膨潤に達したゲルをダンベルカッターによりJIS K-6251-3規格の試験片を切り出した。汎用の引張り試験機を用いて、試料が破断するまで単軸引張り試験を室温、大気中または水中で行なった。ビデオカメラで標点間の伸びを撮影してひずみを算出し、応力ーひずみ曲線を得た。(3)ゲルの網目構造解析:X線回折(XRD)装置とフーリエ変換型赤外(FT-IR)分光光度計を用いて網目の構造解析を行ない、微結晶の大きさ・数・分布を見積った。乾燥を途中で中断した各試料の網目の構造解析を行い、ゲル化時間と微結晶の形成過程の相関を詳細に検討した。さらに、示差走査熱量測定装置(DSC)を用いてゲル中の微結晶の結晶化度を評価した。キャストドライ(CD)法では、低温で高湿度で乾燥させると結晶化度が上昇することが明らかになった。凍結解凍(FT)法では、-20°Cで24時間の凍結、4°Cで12時間以上の解凍により、結晶化度が上昇した。一方で、温度、湿度の制御には様々な要因が影響を与えるため、実際の試料の環境制御には様々な制約があることが分かり、このことは次年度以降、引き続き注意深く最適化をはかることが必要であることを認識した。汎用のポリビニルアルコール(PVA)を用いて、一方向凍結法ならびに積層法による微結晶の集合状態の制御技術を確立するために、前年度作製方法を詳細に検討した凍結・解凍(FT)ゲルとキャストドライ(FT)ゲルを用いて、以下の実験を行なった。(1)一方向凍結法による繊維配向FTゲルの作製:<一方向凍結FTゲルの作製>PVA水溶液をシート状の型に入れて、室温から徐々に所定温度(ー28°C)の冷媒に、型を端から一定速度で浸漬してPVA水溶液全体が冷媒に浸漬した後、所定温度(+4°C)で静置した。この凍結・解凍の操作を45回繰り返した。冷媒に浸漬する速度を0.01mm/sから0. 1mm/sの範囲の範囲の一定速度で制御した。(2)積層法による多層ゲルの作製:<CD-FT積層ゲルの作製>前年度検討した凍結・解凍時の温度ならびに保持時間の最適値を用いてFTゲルを作製した。PVA溶液をポリスチレン製のシャーレにキャストして所定時間の経過後に、このFTゲルを乗せて、さらにFT層の上に第3層としてPVA水溶液をキャストした後、この3層ゲルを温度・湿度制御の下で乾燥させた。<CD-CD積層ゲルの作製>前年度検討した温度・湿度制御されたCDゲルを多数作製し、一定量のPVA水溶液をCDゲルシートの間に挟むことにより、一度の乾燥で多層化ゲルを作製した。<一方向凍結FT積層ゲルの作製>上記の一方向凍結法による一方向に配向された一方向凍結FTゲルシートを多数作成し、配向の向きを90度回転して一定量のPVA水溶液と交互に積層して、一方向凍結FT積層ゲルを作製した。(3)ゲルの物性の測定:膨潤比は、試料を十分の量の純水に浸漬し、平衡膨潤に達するまで静置し、重量から計算し、単軸引張り試験、剥離強度の測定、単軸圧縮試験、引き裂き試験により力学特性を評価した。剥離強度は、新規購入した角度可変剥離治具を使用して評価した。

一方向凍結FTゲルの配向方向の強度は等方FTゲルと比較して大きく増大し、膨潤比も大きくなった。その効果は、ゲルの浸漬速度に大きく依存することが分かった。一方、積層ゲルについては、積層面の強度を向上させるための作製方法は明らかになったが、一方向凍結FT積層ゲルの高膨潤・高強度化の実現には至っていない。生体適合性を有する結晶性ポリマーであるポリビニルアルコール(PVA)のゲル化方法として、繰り返し凍結・解凍法(FT法)とキャストドライ法(CD法)が知られている。いずれのゲル(FTゲル・CDゲルと略す)も他のハイドロゲルと比べて膨潤比が大きくかつ強度も高いが、医学や工学への実用化のレベルには達していない。そこで本研究では、従来の作製方法を基礎から見直すとともに、新しいプロセスを導入して、高い膨潤度と力学強度を併せ持つハイドロゲルの作製技術の基礎を構築することを目的とした。以下の実績を上げることができた。(1) FT法における凍結温度ならびに凍結時間を変化させて、それぞれの最適条件を明らかにした。CD法では、乾燥温度と乾燥湿度を厳密に制御して、それぞれの最適条件を明らかにした。それぞれのゲルの作製条件が、微結晶の大きさ・数・分布に与える効果を明確にし、膨潤比(膨潤重量/乾燥重量)と力学強度(引張り、圧縮、引き裂き)との相関が明らかになった。(2)一方向凍結法により繊維配向したFTゲルの作製方法を確立し、膨潤比と1次元配向方向の強度を詳細に検討した。一方向への凍結速度は、温度のみならずゲルの形状にも依存するため、円管状または薄板状ゲルの作製を試み、その直径または厚さ依存性を明確にした。(3)積層法により多層構造を持つCDゲルの作製を試み、その膨潤比と引張り・圧縮強度を調べた。乾燥時に形成される擬2次元界面により、異方的な膨潤特性が現れ、面方向の強度と圧縮強度が増加することが明らかになった。(4)擬一次元もしくは擬二次元の異方構造をもつゲル網目の微視構造、すなわち微結晶の大きさ・数・分布をXRD、FT-IR、DSC測定により解析し、力学強度と膨潤比の測定結果と比較して、高強度・高膨潤比を有するハイドロゲルの作製方法を確立することができた。生体適合性を有するポリビニルアルコールゲルの医用材料としての実用化を目指し、従来のゲル化方法(繰返し凍結・解凍法(FT法)、キャストドライ法(CD法))を基礎から見直すとともに、新しいプロセスを導入して高機能化を目指した。すなわち、一方向凍結法により繊維配向したFTゲルの作製方法を確立し、積層法による多層構造CDゲルの異方的な膨潤特性と面方向の強度ならびに面に垂直方向の圧縮強度特性を明らかにした。擬一次元もしくは擬二次元の異方構造をもつゲル網目の微視構造を膨潤比ならびに力学強度の測定結果と比較して、異方性を有し高い膨潤比と力学強度を併せ持つハイドロゲルの作製技術の基礎を構築した。キャストドライ(CD)法、凍結解凍(FT)法はすでに確立したPVAのゲル化方法でありながら、条件を大きく変化させると物性が大きく異なることが予想されていた。実際、そのような結果が得られたが、「乾燥」「凍結」は試料の表面から始まるために、試料サイズや使用する容器の物性(熱容量や熱伝導特性)によっても変化することが分かり、当初予想していた作製条件を固定しても、必ずしも同じ結果が得られないことも明らかになった。したがって、今後は同一形状・容量の試料を使用することにした。昨年度までの結果から、従来のFT法、CD法単独の方法で作製した物理架橋PVAゲルの高膨潤・高強度という観点からの作製方法の最適化、ならびに擬一次元もしくは擬二次元の異方構造を有するゲルの作製方法がほぼ確立できた。
ヒト骨肉腫発生過程へのrasシグナル伝達系の関与

ヒト間葉系幹細胞(BioWhittaker社)にレトロウイルスベクターを用いてBmi1遺伝子、テロメラーゼ遺伝子を導入し不死化した細胞株hMSC-Bmi1-hTを得た。この細胞は培養系で骨、軟骨、脂肪細胞への分化誘導に反応する多分化能を有し間葉系幹細胞の性質を保持していたが、細胞培養系において接触阻害を示し、造腫瘍性は示さなかった。この細胞を骨肉腫の前駆細胞と想定し、細胞に活性化H-ras遺伝子を導入し形質転換を試みた。導入した細胞hMSC-Bmi1-hT/rasは低血清培地下で旺盛な増殖能を示し、免疫不全動物の皮下、骨内で腫瘍を形成し最終的には宿主個体を死に至らした。このことから導入細胞は造腫瘍性、悪性形質を獲得したと考えられた。これによりrasシグナルが間葉系細胞の癌化、悪性形質転換に関与している事が示唆されたが、形成された腫瘍は骨肉腫の組織像の特徴である骨・類骨の形成を示さず未分化肉腫の組織像を呈した。次に不死化間葉系幹細胞を培養系で骨分化に誘導した後、同様にrasによる形質転換を行った。造腫瘍性は獲得したがやはり形成された腫瘍内に骨基質の形成は認められず、また腫瘍から得られた細胞株のいずれにおいても骨分化形質に特徴的な遺伝子発現は認められなかった。以上の研究からヒト骨肉腫類似の性質を持つ細胞への形質転換は再現できなかったが、癌腫におけるのと同様、間葉系幹細胞から肉腫への造腫瘍性、悪性形質の獲得にもrasシグナルが関与している事が示された。ヒト骨肉腫腫瘍組織におけるDDM23(RGL3)遺伝子の発現レベルを定量的RT-PCR法を用いて計測した。正常ヒト骨芽細胞に比較して24例中8サンプルでDDM23の発現量が5倍以上に増加しており、ヒト骨肉腫発生過程にDDM23が関与している可能性が示唆された。次にレトロウイルスベクターpBabe-puroに、われわれがクローニングしたヒトDDM23遺伝子(hDDM23)を挿入し、そのC末端はmyc epitopeおよび6×His epitopeを用いて標識した。ヒトテロメラーゼ遺伝子hTERTおよびヒトパピローマウイルス16型E6,E7遺伝子を導入して不死化したヒト間葉系幹細胞(MSC-E6/7-hTERT)に、このpBabe-puro-hDDM23およびネガティブコントロールとしてpBabe-puroを感染させ、puromycin投与下に2週間培養することでhDDM23を発現するpolyclonalな不死化MSC(MSC-hDDM23)を作成した。導入したhDDM23の発現は抗myc抗体および抗His tag抗体を用いてWestern blotting法にて確認した。この細胞のin vitroでのコロニー形成能を評価するためにcolony formation assayを行ったが、MSC-hDDM23とMSC-EVの間に明らかな差は認められなかった。また細胞の移動能を評価するためtranswell migration assay,基底膜浸潤能を評価するMatrigel inavasion assayにてもMSC-hDDM23とMSC-EVの間に有意な差は認められなかった。現在この細胞をヌードマウスに移植し造腫瘍性を評価しているが、4週間経過した現時点では腫瘍形成は認めていない。この細胞を骨肉腫の前駆細胞と想定し、細胞に活性化H-

ras遺伝子を導入し形質転換を試みた。導入した細胞hMSC-Bmi1-hT/rasは低血清培地下で旺盛な増殖能を示し、免疫不全動物の皮下、骨内で腫瘍を形成し最終的には宿主個体を死に至らした。このことから導入細胞は造腫瘍性、悪性形質を獲得したと考えられた。これによりrasシグナルが間葉系細胞の癌化、悪性形質転換に関与している事が示唆されたが、形成された腫瘍は骨肉腫の組織像の特徴である骨・類骨の形成を示さず未分化肉腫の組織像を呈した。次に不死化間葉系幹細胞を培養系で骨分化に誘導した後、同様にrasによる形質転換を行った。造腫瘍性は獲得したがやはり形成された腫瘍内に骨基質の形成は認められず、また腫瘍から得られた細胞株のいずれにおいても骨分化形質に特徴的な遺伝子発現は認められなかった。以上の研究からヒト骨肉腫類似の性質を持つ細胞への形質転換は再現できなかったが、癌腫におけるのと同様、間葉系幹細胞から肉腫への造腫瘍性、悪性形質の獲得にもrasシグナルが関与している事が示された。
酵素間の相同性に基づくセリン・スレオニン脱リン酸化酵素選択的阻害剤の設計

免疫抑制剤の開発を目的として、セリン/スレオニンプロテインホスファターゼ(PP2B)の選択的阻害剤の開発研究を行った。これまでPP2Bを直接阻害する化合物は知られていないため、標的酵素と相同性の高い酵素群を選びその阻害剤の中からリード化合物を探索する、いわば酵素間の相同性に基づいたリード化合物の探索を行った。その結果、標的酵素PP2BのサブタイプであるPP1はPP2Bと比較し、触媒部位におけるアミノ酸配列の相同性が高く、またX線構造解析によりその三次構造も良く保存されていることが分かった。そこでPP1およびPP2Aの特異的阻害剤であるカンタリジンをリード化合物として選び出し、分子計算モジュールInsight IIを用い、ノルカンタリジンとPP2Bとの結合シュミレーション計算を行った。その結果、ノルカンタリジンの5位に疎水性官能基を導入することでPP2Bに特徴的な疎水性アミノ酸部位と優位に相互作用することが出来ることが予測された。実際、このように分子設計したカンタリジン誘導体を合成し、PP1,PP2A,PP2Bそれぞれにに対する阻害活性試験を行ったところ、予想通り、5位に疎水性官能基を導入することでPP2Bに対し親和性が向上した。特に、1,5-2置換カンタリジン誘導体はサブタイプ選択性を完全に逆転させPP1およびPP2Aを全く阻害せず、目的とするPP2Bを選択的にすることを見いだした。
チロシナ-ゼ陰性型白皮症の原因であるチロシナ-ゼ遺伝子の異常についての研究

先天性白皮症のうち、チロシナ-ゼ(以下Taseと略す)陰性型において、染色体TaseDNAの塩基配列の変異により色素細胞内に活性のない不完全なTaseが作られ、それが病因となることを我々は世界に先駆けて発表した。今までに我々が日本人の患者3人において見い出した異常は次ぎの2種類である。(2)Tase遺伝子のcodingregionの312番目の塩基GがAに置換し、そのためTaseの59番目のアミノ酸がアルギニンからグルタミンに変換を示すpoint mutation(J Biol Chem 265:17792,1991)。今回、前3人の患者とは全く血縁のない患者2名(症例4、5)について、新たに検索を開始した。患者のリンパ球をEBウィルスによりトランスフォ-ムして株化した細胞を増殖し、染色体DNAを抽出した。このDNAを用いてPCR法により症例4の患者のTase遺伝子を増幅し、制限酵素断片長多型性の検討を行ったところ、症例4においては一つは(2)のpoint mutationが、もう一つは(1)でもない(2)でもない"第3の異常"を持つヘテロ接合体であることが明らかとなった。現在その"第3の異常"が具体的にどの様なDNA塩基配列の異常を持つものであるか、症例5の患者とともに検索中である。