hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
占領下における教員資格制度改革に関する実証的研究

2年課程で2級普通免許状が取得できるならば、大学に4年間通うことができない学生も教諭になることができる。そして2年課程で2級免許状を得て卒業した後も、所定の単位をとれば1級免許状に上進可能である。2級免許状の制度は、主専攻(メジャー)・副専攻(マイナー)と連動させることによって、学生が大学で4年間学ぶ間に、一つの普通免許状だけでなく他校種あるいは他教科の2級普通免許状を取得することを可能とした。学生にとっては4年課程で学ぶことの利点がふえ、教員需要の面でも柔軟に対応できる。2年課程に対して不十分な教育プログラムであると批判する傾向が強いが、この点ではむしろ積極的に評価すべきである。教員免許制度は占領下にCIEの指示に基づいて大きく改められた。CIEの教師教育担当官のカーレーは、1主専攻(主免許状)と副専攻(副免)の導入、2各大学が免許状取得のための独自の科目を置けるようにすること、3広範囲の教科を甲教科として、教科専門科目の修得単位数を乙教科より多く設定すること、4仮免許状は有効期間を付して更新を可とすること、52年課程と小中学校の2級普通免許状をおくことを指示した。CIEのReport of Conference、Weekly Reportの検討により、占領下における教員養成、教員資格制度改革のプロセスのうち、従来日本側の資料では不明であった事項を明らかにすることができた。教育学教職科目の新増設と教育学の高度化に向けたCIEの取り組みを検討する。免許法・同法施行規則により、多くの教職科目が設定されたが、CIEのカーレーは当初からその種類と内容をあらかじめ構想していたことを明らかにする。また、CIEは4年制大学にふさわしい教育学教員の育成を行うことを目的に、IFEL(アイフェル、教育指導者講習、6週間または3か月の長期講習、米人講師)によるアメリカ教育学の普及や旧帝国大学への教育学部設置を行ったことを実証的に解明する。研究成果を本年秋の関連学会で発表予定である。交付申請書の「研究計画・方法」欄に平成25年度の研究計画として記載した以下の作業はほぼ予定通り行った。1GHQ/SCAP CIE Recordsの中から、本研究テーマに関わる主要文書を収集分析する。2占領下に文部省で師範教育課長・教職員養成課長をつとめた玖村敏雄の文書(山口県立図書館所蔵)を検討する。3日本側の第一次資料(国立教育政策研究所所蔵『戦後教育資料』、大学基準協会所蔵資料など)を検討する。4教師教育・教員養成・教員免許制度・戦後教育改革等に関する日米の関連論文・文献を複写して収集する。しかし、昨年度、教育委員会制度の改革が政府の具体的な政策課題となった。教育委員会制度には申請者の研究課題のひとつであり、また、申請者は日本教育行政学会の常任理事・研究推進委員長を10月まで務めていたため、教育委員会制度をめぐる学会の取り組みに時間を費やした。そこで、本研究に関する資料の検討が予定よりも若干遅れた。購入を希望する物品の金額が残額より高額であったため。平成26年度の作業として、第1に、これまでに収集した日米の文書を検討する。さらに関連資料の収集をすすめる。第2に、広島・東京文理科大学の改革や旧帝国大学における教育学部の設置事情を検討するために、関連の文献・資料を収集する。
高圧酸素による酸化ストレス誘導性蛋白質の強制発現による生体制御反応の研究

高気圧酸素暴露を行い、生体に保護作用のある有用な蛋白質を強制発現させることによって、治療時に想定可能な手術や感染、多臓器不全への移行などの際、あらかじめ発現させた蛋白の作用で生体へのダメージを抑えるとともに回復を早める効果を期待する。実験の結果、ヘモオキシゲナーゼ1の発現が腎臓や肝臓でみられ、生体に保護的に作用することがわかった。投薬をせずに高気圧酸素暴露で誘導性蛋白質の発現が可能となることから、臨床応用の為に、今後詳細な検討が必要と考えられた。誘導性一酸化窒素合成酵素(iNOS)の阻害剤の研究や虚血によるHeat Shock Protein(HSP)やヘムオキシゲナーゼ(HO-1)の誘導剤の研究がフリーラジカル及びストレス誘導タンパクの活性や抑制を目的に行われているが、生体への影響が大きく、未だ開発や臨床応用されていない。本研究は、高気圧下での酸素吸入により、酸化ストレス誘導性タンパク質を強制的に発現させ、その生体保護作用を利用して、想定される移植や感染などから積極的に主要臓器並びに生体の保護を図ることを目的としている。平成21年度に実施した研究の成果糖タンパク質リポポリサッカライド(LPS)を静脈内投与したラットにおいて、動物用小型チャンバーで高気圧酸素曝露を行い、血中エンドトキシン値の測定、肺、肝、腎などの主要臓器での組織学的検討並びに免疫組織化学的にヘムオキシゲナーゼ(HO-1)の発現を確認した。その結果、高気圧酸素は血中エンドトキシン値を低下させ、肺において多核白血球の肺胞への接着を減少させた。各臓器における免疫組織学的観察では、肺においては単球やマクロファージ、肝では、kupffer細胞、腎においては主に尿細管などがHO-1陽性となり、LPS投与、LPS+高気圧の両群で確認された。これらの結果から、高気圧酸素は単球およびマクロファージ等でのサイトカインのシグナル伝達や接着分子へ影響を及ぼす事が示唆され、高気圧酸素曝露により発現したHO-1の作用と関連した相互作用により有効な効果を発揮する可能性が考えられた。平成22年度に実施した研究の成果糖タンパク質リポポリサッカライド(LPS)を静脈内投与したラットにおいて、動物用小型チャンバーで高気圧酸素曝露を行い、血中エンドトキシン値の測定、肺、肝、腎などの主要臓器での組織学的検討並びに免疫組織化学的にヘムオキシゲナーゼ(HO-1)の発現を確認した。その結果、高気圧酸素は血中エンドトキシン値を低下させ、肝において壊死および炎症部分の縮小ならびにその部位への多核白血球の浸潤を減少させた。臓器における免疫組織学的観察では、肝では、kupffer細胞がHO-1陽性となり、対照群では陽性細胞はみられないものの、LPS投与、LPS+高気圧の両群で確認された。誘導性一酸化窒素合成酵素(iNOS)の阻害剤の研究や虚血によるHeat Shock Protein (HSP)の誘導剤の研究がプリーラジカル及びストレス誘導タンパクの活性や抑制を目的に行われているが、生体への影響が大きく、未だ開発や臨床応用されていない。平成23年度に実施した研究の成果NO donorであるL-arginineとNO inhibitorであるL-NAMEを腹腔内投与したddyマウスにおいて、動物用小型チャンバーで高気圧酸素曝露を行い、酸素中毒による痙攣発生時間の比較を行った。その結果、NO synthaseinhibitorであるL-NAME投与群での高気圧酸素曝露による痙攣発生時間は対照群とNO donorであるL-arginine投与群に比較して著しく延長した。これらの結果から、高気圧酸素曝露は、活性酸素種や活性窒素種およびその相互作用により、サイトカイン放出やシグナル伝達へ影響を及ぼす事が示唆された。酸化ストレス誘導性の蛋白類は高気圧酸素曝露により発現したこれらの活性酸素種や活性窒素種の各作用及び相互作用をトリガーとして、有効な効果を発揮する可能性が考えられた。

また、高圧からの急速減圧ラットにおける脳の組織化学的な観察から虚血や白血球接着や血液脳関門の破綻等、脳微小血管において血管内皮細胞と血球間でのサイトカイン放出の関与が示唆された。これらの高圧酸素曝露に関連するフリーラジカル発生が細胞のシグナル伝達に及ぼす影響をさらに探求する為に、今後継続的な研究の必要性が認識された。
大規模崩壊地内の斜面下部に形成された堆積地の堆砂変動と砂礫流動に関する研究

本研究は、安倍川の源流部にある大谷崩を大規模崩壊地の1つとして取り上げ、そこでの土砂生産の様式や規模あるいは土石流の発生に関する降雨条件などを把握することを試みたものである。観測期間は1993年から1994年にかけての2年間であるが、この期間数回にわたり水圧センサーが流失したため、その都度再設置してようやく4例の土石流ハイドログラフを得ることに成功した。また土石流の流下実態を捉える目的で観測ビデオ装置も設置したが、電源トラブルや誤動作があり、そのものを撮影するには至らなかった。なお、1994年9月には予想を超える土石流の発生があり、水圧センサー、ビデオ観測装置の架台は流失している。したがって、得られた土石流のハイドログラフは4例でしかないが、これより次のような特徴が明らかとなった。すなわち、(1)土石流のハイドログラフは10分間雨量強度に敏感に急上昇し、降雨終了とともに急減水する。(2)土石流のピーク流量は10分間雨量。時間雨量に対し線形的な関係がみられる。(3)ピーク流量と総流出量との関係は対数表示で直線近似が成立するようである。一方、土石流の発生に関する降雨条件やピーク流量に関する定量的な関係をまとめると次のようである。(1)土石流は10分間雨量で約7mm、時間雨量で約12mmを超えるとほぼ間違いなく発生する。(2)土石流のピーク流量は213m^3/Sの範囲で、総出量は800080000m^3であった。(3)ピーク流量の大きさは、清水時のそれに比べ、約46倍に相当すると判断された。安倍川上流,大谷崩地内の「一の沢」を対象にインターバル機構を内蔵したビデオ観測装置と圧力式水位計を設置し,土石流の流下状況ならびにそのハイドログラフの把握を試みた.今年度は,観測機器の設置の遅れや不備等で特に土石流の流動現象を明確にとらえることはできなかったが,次年度は観測システムと手法を再検討し,砂礫の流動現象に関する観測結果を蓄積するとともに,その機構について考察したい.今年度得られた知見を要約すると次のようである.1.9月3日に発生した土石流について土石流の発生時のハイドログラフは10分間雨量強度に敏感に反応し,流出の遅れは10分程度しかない.この時の最大の10分間雨量は,15.5mmを記録したがこの直後に水圧センサーが流失した.2.観測期間内の雨量と土砂変動の対比9月3日に発生した土石流は,約2万m^3の規模であった.観測基準断面の変化量は約28m^2であり,浸食深は約3mにも達する箇所がみられた.本研究は、安倍川の源流部にある大谷崩を大規模崩壊地のひとつとして取り上げ、そこでの土砂生産の様式や規模あるいは土石流の発生に関する降雨条件などを把握することを試みたものである。なお、1994年9月には予想を超える土石流の発生があり、水圧センサー,ビデオ観測装置の架台は流失している。すなわち,(1)土石流のハイドログラフは10分間雨量強度に敏感に対応して急上昇し、降雨終了とともに急減水する。(2)

(3)土石流のピーク流量は10分間雨量と時間雨量に対して線形的な関係がみられ,ピーク流量と総流出量との関係は対数表示で直線近似が成立するようである。一方,土石流の発生に関する降雨条件やピーク流量に関する定量的な関係をまとめると次のようである。(1)土石流は10分間雨量にして約7mm,時間雨量で12mmを超えるとほぼ間違いなく発生している。(2)土石流のピーク流量は213m^3/Sの範囲で、総流出量は800080000m^3であった。(3)土石流のピーク流量は、清水時のそれに比べ約46倍に相当すると判断された。
レース展開の発展とその前衛的研究

高次元臨界現象を数学的に厳密に解析できる数少ない(モデルによっては殆ど唯一の)手段に「レース展開」がある.この強力な解析手法を発展させ, 2体相互作用係数が距離の冪で減衰する自己回避歩行や有向パーコレーションの2点関数の漸近挙動を精密に求めることに成功した.また, 2体相互作用係数の台が有限である臨界コンタクトプロセスを考え,時空間n点関数のスケーリング極限が超ブラウン運動標準測度のn-1多点関数に一致することを証明した.高次元臨界現象を数学的に厳密に解析できる数少ない(モデルによっては殆ど唯一の)手段に「レース展開」がある.この強力な解析手法を発展させ, 2体相互作用係数が距離の冪で減衰する自己回避歩行や有向パーコレーションの2点関数の漸近挙動を精密に求めることに成功した.また, 2体相互作用係数の台が有限である臨界コンタクトプロセスを考え,時空間n点関数のスケーリング極限が超ブラウン運動標準測度のn-1多点関数に一致することを証明した.(1)コンタクトフロヤスの超フラウン運動標準測度への収束について果樹園などの系における伝染病伝播をモデル化した「コンタクトプロセス」の臨界現象を研究.時空間n+1点相関関数の高次元スケーリング極限が,超ブラウン運動標準測度のn次モーメント測度に弱収束することをレース展開の手法で証明した.オランダのvan der Hofstad教授との共著論文がElectronic Journal of Probabilityに掲載されることが内定した.(2)長距離2体相互作用による臨界現象への影響について浸透過程を表わす代表的なモデルである「有向(ボンド)パーコレーション」の高次元臨界現象に対する長距離相互作用の影響を研究.このモデルは,コンタクトプロセスの離散時間版と考えることもできる.病気の伝染率に相当するボンドの占有確率が各ボンドの端点間距離の冪(=d+α,dは空間の次元,αは正のパラメター)でゆっくり減衰する場合,2点相関関数のスケーリング極限がα=2を境に「クロスオーバー」を起こすことを証明した.さらに,2点相関関数の空間依存性を詳しく調べ,特にα=2のとき,空間成分のモーメントの時間増大性に対数補正が掛かることを証明した.共にレース展開の手法を用いている.台湾のChen教授と共著論文を作成した.また,磁石のモデルであるイジング模型やパーコレーション,高分子鎖のモデルである自己回避歩行などの空間等方的な統計力学モデルの臨界現象に対する長距離2体相互作用の影響についても研究.これらのモデルの臨界2点相関関数の漸近評価について具体的な傍証が集まりつつあり,途中結果をパリの国際研究集会で発表した.Chen教授との共同研究が進行中である.(3)超臨界相パーコレーションのレース展開について従来の高次元臨界現象の研究は,専ら「低密度相」や「高温相」側から近付いたものであった.「高密度相」や「低温相」側から近付けない理由は単純ではないが,技術的な問題だけではないことが,九州大学の原教授との超臨界相パーコレーションに関する共同研究の中で明らかになってきた.レース展開や新しい相関不等式を開発すると共に,我々に欠落している超臨界相の描像を模索し始めた.1.コンタクトプロセスの超ブラウン運動標準測度への収束について果樹園などの系における伝染病伝播をモデル化した「コンタクトプロセス」の臨界現象を研究した.時空間n+1点相関関数の高次元スケーリング極限が,超ブラウン運動標準測度のn次モーメント測度に弱収束することをレース展開の手法で証明した.オランダのvan der Hofstad教授との共著論文がElectronic Journal of Probabilityに掲載された.2.長距離2体相互作用の導入による臨界現象への影響について臨界現象を示す様々な統計力学モデルを考え,それらを構成する2体相互作用係数が冪的に減衰する場合の影響を研究した.浸透過程を表わす代表的なモデルである「有向パーコレーション」や線形高分子の統計力学モデルである「自己回避歩行」の2点関数(例えば,自己回避歩行の2点関数は空間の異なる2点を繋ぐ「高分子」の母関数のこと)を考え,その回転半径の漸近挙動を高次元において詳しく調べた.台湾のChen教授との共著論文がThe Annals of Probabilityに掲載された.また,ランダム媒質を記述する「パーコレーション」や磁性体の統計力学モデルとして有名な「イジング模型」の2点関数(例えば,イジング模型の2点関数は空間の異なる2点に置かれたスピンたちの「そろい易さ」を表わす量のこと)を考え,相転移点直上における2点関数の漸近挙動をChen教授と共に研究している.途中経過を國立臺灣大學でのセミナーと京都大学での確率論シンポジウムで発表した.3.超臨界相パーコレーションのレース展開について現在のところ,レース展開の手法は高次元臨界現象を厳密に解析する殆ど唯一の手段となっている.しかし従来のレース展開では,「超臨界相」(パーコレーションでは「高密度相」,イジング模型では「低温相」に相当)側から近付いた臨界現象を「直接」解析することはできていない.九州大学の原隆教授と共に,レース展開の手法を超臨界相パーコレーションに適用する試みをしている.レース展開の解析に必要な新しい相関不等式を開発すると共に,我々に欠落している超臨界相の描像を模索している段階である.高次元における平均場臨界現象を数学的に厳密に証明することができる数少ない手法の一つが「レース展開」である.

我々はレース展開の適用範囲を広げるべく,平成23年度は以下3つの課題を中心的に研究し,より深い臨界現象の理解を獲得することを目指した.(1)長距離2体相互作用の導入による臨界現象への影響について.Fu-Jen Catholic UniversityのChen教授との共同研究.冪的に減衰する長距離2体相互作用を導入すると,その冪指数の値に依存して,臨界現象が「退化する」(すなわち「平均場的になる」)限界の次元が下がり,臨界2点関数のスケーリング極限も「ブラウン運動」から「安定過程」へと移行するだろうと予想されている.これを証明したい.現在までに相当の傍証が集まっていて,近い将来結実するものと考えている.(2)超臨界相パーコレーションのレース展開について.九州大学の原隆教授との共同研究.これまでのレース展開の手法では,「超臨界相」側から見た臨界現象を解析することができなかった.様々な技術的問題があることが分かってきたが,それらは全て,我々が未だに「真の超臨界相の描像」を獲得していないことに因るものと考えられる.これは非常に重要な問題で,現在も共同研究を継続中である.(3)ランダムな環境下の(有向)パーコレーションの臨界現象について.これまでのレース展開の手法は,並進対称性のある「均質な」時空間における臨界現象の解析には非常に強力であった.これを「ランダムな環境」にまで拡張したい.これは本質的に「二重のランダムネス」を扱う重要な問題である.我々は比較的扱い易い「ランダムな環境下での有向ポリマー」を最初の題材として選び,二重のランダムネスに付随する問題を勉強し始めた段階である.
光学活性金(I)錯体触媒を用いた脱水素シリル化による選択的合成法

光学活性化合物の効率のよい合成は重要な課題である。加えて最近では、資源の有効利用や廃棄物の低減につながる新しい合成反応の重要性が高まっている。本研究では、光学活性金(1)錯体触媒を用いた脱水素シリル化による速度論的光学分割という新しい手法で、光学活性化合物を効率よく合成し、かつ廃棄物が少ない方法の開発を検討した。その結果、光学活性金錯体触媒を用いたアルコールのヒドロシランによる脱水素シリル化反応において、不斉誘起が起こることを初めて明らかにした。まず予備的実験として、Xantphosタイプの配位子を数種類合成し、金(1)錯体を作成してその触媒活性の比較を行った。次に、各種光学活性ホスフィン配位子を用いて速度論的光学分割を検討した。金属ヒドリドは、合成反応剤や、触媒反応中間体としてよく知られており、様々な金属に対応する金属ヒドリドが合成されている。しかし、この触媒反応の重要な反応中間体として予想されていた金ヒドリド錯体はこれまで合成、単離された例がなく、その構造や性質については長らく未知であった。この金錯体触媒による光学活性化合物の合成研究を進展させていく中で、この脱水素シリル化反応において、金-ヒドリド錯体が反応中間体として実際に生じることを見いだし、このNMRスペクトル観察、Mass spectrometry測定を行い、構造解析に成功した。本研究は、金錯体の不斉合成への利用という応用面と、これまでに未知の化学種であった金ヒドリド錯体の合成という二つの成果を得た。今後、この二つを組み合わせることにより、光学活性金ヒドリド錯体の合成と、これを利用して高い不斉収率を与える触媒反応の開発への足がかりが得られた。1.光学活性金(I)錯体の合成と触媒的不斉脱水素シリル化反応への適用:剛直なバックボーンを持ち、かつ広い鋏角を与える光学活性配位子を合成し、これを用いて光学活性金(I)錯体を合成した。さらにこの金(I)錯体を用いて不斉点を持つ二級アルコールの脱水素シリル化による速度論的光学分割を試みたが、シリル化の反応速度は、以前報告しているXantphosを配位子とした反応系に比べて遅く、反応後得られたアルコールはほぼラセミ体であった。今回検討した光学活性配位子を用いた場合、今までの反応系では効率よく生成していると見られる反応活性種が、配位子の構造の違いのためにうまく生成していないのではないかと考えられる。2.金(I)ヒドリド錯体の生成とスペクトル的観測:上記の結果から、この反応を成功させるためには反応活性種の効率の良い発生と、構造解析が必須であると考え、Xantphos型配位子をもつ金錯体に用いてこれらを検討した。本反応で想定している反応活性種は金(I)ヒドリド錯体であるが、この錯体はこれまでに合成はおろか観測例もなかった。しかし、立体障害を導入したXantphos型配位子をもちいて、重クロロホルム中塩化金錯体に対してヒドロシランを作用させたところ、反応はほぼ定量的に進行して目的の金ヒドリド錯体が生成した。この錯体は、金二原子に対してヒドリド水素が一原子存在する二核錯体であり、その構造はESI-MassやNMR,計算化学的方法により確かめられた。また、この錯体を用いて脱水素シリル化反応を試みたところ、反応がスムーズに進行したため、この錯体が反応に重要な種であることが確認できた。これらの結果は光学活性金(I)触媒による脱水素シリル化を用いた選択的合成法の研究推進のために重要な知見を与える。

本研究では、光学活性金(I)錯体触媒を用いた脱水素シリル化による速度論的光学分割という新しい手法で、光学活性化合物を効率よく合成し、かつ廃棄物が少ない方法の開発を検討した。その結果、光学活性金錯体触媒を用いたアルコールのヒドロシランによる脱水素シリル化反応において、不斉誘起が起こることを初めて明らかにした。金属ヒドリドは、合成反応剤や、触媒反応中間体としてよく知られており、様々な金属に対応する金属ヒドリドが合成されている。しかし、この触媒反応の重要な反応中間体として予想されていた金ヒドリド錯体はこれまで合成、単離された例がなく、その構造や性質については長らく未知であった。この金錯体触媒による光学活性化合物の合成研究を進展させていく中で、この脱水素シリル化反応において、金-ヒドリド錯体が反応中間体として実際に生じることを見いだし、このNMRスペクトル観察、Mass spectrometry測定を行い、構造解析に成功した。本研究は、金錯体の不斉合成への利用という応用面と、これまでに未知の化学種であった金ヒドリド錯体の合成という二つの成果を得た。今後、この二つを組み合わせることにより、光学活性金ヒドリド錯体の合成と、これを利用して高い不斉収率を与える触媒反応の開発への足がかりが得られた。
イネ融合葉突然変異体の解析による新規マスター調節遺伝子ネットワークの解明

本研究では、イネ融合葉突然変異体(abaxially fused leaf(abl)突然変異体)を解析することで、イネ茎頂分裂組織の発生に関わる未知のマスター調節遺伝子を開拓し、さらに、それらの間の相互関係を明らかにすることを目的としている。この目的が達成されたとき、人間は植物の発生、生長を自在にコントロールすることができることになる。これまで融合葉という突然変異体に着目してスクリーニングを継続しており、劣性のabl1、abl3および優性のAbl2について主に解析を行っている。原因遺伝子がLSMタンパク質をコードする劣性のabl1変異体については、LSMタンパク質がその分解を制御している遺伝子の種類を特定することを目指し、RNA-seq解析を行っている。今後データ解析を行う。形態観察の結果、融合葉の原因となる分裂組織が、分げつ芽となる分裂組織の早期生長のために形成されるものではなく、主茎の分裂組織から異所的に形成されるものであることが明らかになった。優性のAbl2変異体に関しては、原因遺伝子がサイトカイニンのリセプターをコードしていることを用いて、葉原基におけるサイトカイニンシグナルと新たに形成される分裂組織の関係性について考察した。劣性のabl3変異体には、新たなアリルが同定され、発芽直後の余分な分裂組織形成抑制において、この変異体の原因遺伝子が重要な役割を果たしていることが示唆された。今年度は、融合葉突然変異体の形態観察およびマッピングを主に行った。劣性のabl1突然変異体の形態観察では、abl1突然変異体の異常は融合葉出現以外に、葉序や葉身/葉鞘境界の形態などにも見られることが明らかになった。マッピングの結果、原因遺伝子の座乗染色体は第4染色体であり、領域もおおよそ500kbpまで狭まったが、その範囲にギャップも見つかり、実際の候補領域全体の距離はそれ以上である可能性が高いと考えられた。また、予定していたオーキシンの局在を調査するための形質転換体の作成と種子収穫は完了した。優性のABL2突然変異体の形態観察からは、ABL2遺伝子が胚発生中から機能していることが示唆された。ABL2突然変異体では、融合葉以外にイネの葉身および葉鞘に存在する一細胞性の毛の数が野生型に比べて増え、長さも長くなっていることも明らかになった。さらに、遺伝解析から、この変異体の低稔性が原因でこれまでは突然変異体の他殖が起こっていた可能性が高いと示唆され、開花時の袋かけによってその問題の克服を試みたところ、自殖種子や突然変異体ホモ株を得ることはできた。今後これらを用いた解析を行っていくことになる。また、原因遺伝子は第2染色体に座乗していることは明らかになった。領域としてはおよそ2Mbpが候補に挙がっている。この時点までのマッピング集団には自殖性の問題もあったため、今後はさらにマッピング集団を大きくするだけでなく、マッピングに使用する品種を変えたり、確実に自殖によって種子を収穫したりして実験を続ける必要がある。abl1については、原因遺伝子の座乗候補領域内にギャップが見られたこと、また、ABL2については、マッピング集団が完全に自殖によって作成されたものではなかったことが、遅れの理由である。本研究では、イネの融合葉突然変異体を解析することで未知のマスター調節遺伝子を世界に先駆けて開拓することを目的としている。マスター調節遺伝子の機能解明や相互関係の理解は、植物を自由自在に改変するために必須な知見の一つである。これまでに、主に2種類の融合葉突然変異体abaxially fused leaf (abl)1およびAbl2変異体が同定されており、平成28年度もこれらの解析を行った。劣性のabl1については、融合葉が形成される時期の茎頂分裂組織(SAM)付近の形態観察やSAM内の未分化細胞で発現する遺伝子を分子マーカーとして用いた解析を行ったところ、野生型では見られない位置に新たな分裂組織が形成されていることが明らかになった。abl1の原因遺伝子は、マッピングのみでは絞り切れなかったため、次世代シーケンサによる解析を行い、現在データ処理中である。優性のAbl2については、融合葉が形成される以前のSAMの幅が野生型より大きくなっていることを明らかにした。また、Abl2の原因遺伝子はポジショナルクローニングにより、ヒスチジンカイネースであることが示された。複数のアリルで同一遺伝子のエキソン内に点変異があることも確認された。さらに、平成28年度には、Abl2と表現型が非常によく似ているものの劣性の突然変異体を同定し、形態観察を行うことができた。つまり、葉分化に関わるマスター調節遺伝子の機能解析を行うための新たな材料が得られたことになる。今後は、この変異体の解析も同時進行で行っていくこととする。突然変異体原因遺伝子の同定は、2種類の突然変異体のうち1種類であり、やや進展が遅いものの、突然変異体の形態観察や新たな突然変異体の同定については順調あるいは予想以上に良い結果が得られている。

これまで融合葉という突然変異体に着目してスクリーニングを継続しているが、その結果、再現性のある融合葉突然変異体が少なくとも7グループは同定された。その中で劣性のabl1、abl3および優性のAbl2について主に解析を行っている。劣性のabl1変異体については、原因遺伝子が明らかになり、mRNA代謝に関わるLSMタンパク質の1種をコードしていた。今後、LSMタンパク質がその分解を制御している遺伝子の種類を特定することを目指す。またabl1変異体は、ライフサイクルを通して複数の融合葉を分化する点で、Abl2およびabl3と異なる。融合葉が形成される時期の茎頂分裂組織の形状や遺伝子発現の点でもそれらの系統とは異なりユニークである可能性が高いので、今後詳細な解析を進める。優性のAbl2変異体および劣性のabl3変異体は、いずれもイネの発芽直後に形成される葉のみで融合葉が生じる系統である。いずれも遺伝子が単離されたので、遺伝子発現解析や二重変異体解析などを進めているところである。主に解析している3突然変異体の原因遺伝子がすべて明らかになり、その情報を用いた解析を行える状況になっている。本研究では、イネ融合葉突然変異体(abaxially fused leaf(abl)突然変異体)を解析することで、イネ茎頂分裂組織の発生に関わる未知のマスター調節遺伝子を開拓し、さらに、それらの間の相互関係を明らかにすることを目的としている。この目的が達成されたとき、人間は植物の発生、生長を自在にコントロールすることができることになる。これまで融合葉という突然変異体に着目してスクリーニングを継続しており、劣性のabl1、abl3および優性のAbl2について主に解析を行っている。原因遺伝子がLSMタンパク質をコードする劣性のabl1変異体については、LSMタンパク質がその分解を制御している遺伝子の種類を特定することを目指し、RNA-seq解析を行っている。今後データ解析を行う。形態観察の結果、融合葉の原因となる分裂組織が、分げつ芽となる分裂組織の早期生長のために形成されるものではなく、主茎の分裂組織から異所的に形成されるものであることが明らかになった。優性のAbl2変異体に関しては、原因遺伝子がサイトカイニンのリセプターをコードしていることを用いて、葉原基におけるサイトカイニンシグナルと新たに形成される分裂組織の関係性について考察した。劣性のabl3変異体には、新たなアリルが同定され、発芽直後の余分な分裂組織形成抑制において、この変異体の原因遺伝子が重要な役割を果たしていることが示唆された。マッピングについては、マッピング集団のサイズを大きくしたり、マッピング集団の種類を変えることで推進を図る。その他の形態観察や分子マーカーを用いた解析はこれまで通り継続して行う。未同定の突然変異体の原因遺伝子については同定を急ぎ、同定したものについては、発現解析を行う。また、突然変異体の分子マーカーによる解析を進め、突然変異体で融合葉が生じる原因について推定できるよう努力する。突然変異体の原因遺伝子の組織特異的発現解析や相補性検定、下流の遺伝子の特定、二重突然変異体の解析などを行って、葉の分化に関わる遺伝子カスケードを明らかにする。
物質と生命を光でつなぐ分子技術の開発

本研究は、これまでに申請者らが開発してきた「複雑分子系の理論化学」「複雑分子構造の精密有機合成」「複雑電子系の分光学」を結集・展開し、生命科学・物質科学を光でつなぐ次世代の分子技術・光技術を確立することを目標とする。特に、「近赤外光分子技術」「キラル光分子技術」「吸光・発光分子技術」を3つの柱に掲げ、これらに関する新しい理論の開発、新奇分子群の提案、有機合成手法の開拓、解析手法の開拓、イメージング技術、材料化学への応用などを指向した独創的な基礎学理的・基礎科学的を展開し、10年、20年後を見据えた研究シーズ/分子/概念の創出を目指している。医学・薬学・生物学の分野では、様々な実験や観察をしても決定的な解が得られず、未解決となっている重要課題も少なくない。材料科学・物質科学にもそのような問題は多く存在する。これは、「手に取り出せないもの」「目に見えないもの」が数多く存在することに他ならない生きた細胞の中や複雑分子系で起きている現象を正確に捉える(可視化する・理解する)技術が不足している。本研究の目的は、低分子有機化合物を道具に、光と理論を武器として新たな基礎科学を確立し、たとえば1個1個の生きた細胞の中で起こるさまざまな現象を、生きたまま(非破壊)リアルタイムで、将来的に時間的・空間的・立体電子的に可視化する分子技術の創出を目指している。一年目であった当該年度では、機能性色素である「オキサボロール」「N-アルキニルピリジン」の新規合成法を確立し、機能性分子としての可能性を示した。本研究の過程で、当初の計画にはなかった「プロペランの新規官能基化反応(JACS掲載)」「新規不斉触媒開発(Nature Commun.掲載)」「C-O/C-N結合を切断しながらポリマーを合成する新規重合法(Nature Commun.に掲載予定)」などの開発にも成功した。本研究では、申請者らがこれまで培ってきた有機合成化学・理論化学・分光学・元素化学を結集し、光と構造、物性の自在制御を目指す。特にこれまでに多くの知見を有するフタロシアニンやポルフィリン、ローダミン系の色素を中心に理論化学支援によるテーラーメード設計を行い、化合物の安定性を損なわないように、LUMO準位を下げることによって狭いHOMO-LUMOギャップを持つような分子を設計・合成する。さらに、周辺置換基、中心金属などを利用して物性(光電変換材料、近赤外蛍光色素など)に適した性質を付与すると同時に、新たな近赤外色素設計に向けて理論的・物理化学的なアプローチを試みる。芳香属性の起源などに着目しながら、経験と勘に頼っていた従来の合成化学的手法に加えて、積極的に量子化学計算を用いることで、特定の機能を持たせた機能性色素を合理的に設計する独自の分子設計法を開発することに挑んでいる。本年度の具体的な実施スケジュールとしては、さらなる機能性芳香族/反芳香族クロモフォアの設計と合成、分光スペクトル測定と量子化学計算による評価ならびに応用展開を行う予定である。

さらに、周辺置換基、中心金属などを利用して物性(光電変換材料、近赤外蛍光色素など)に適した性質を付与すると同時に、新たな近赤外色素設計に向けて理論的・物理化学的なアプローチを試みる。芳香属性の起源などに着目しながら、経験と勘に頼っていた従来の合成化学的手法に加えて、積極的に量子化学計算を用いることで、特定の機能を持たせた機能性色素を合理的に設計する独自の分子設計法を開発することに挑んでいる。本年度の具体的な実施スケジュールとしては、さらなる機能性芳香族/反芳香族クロモフォアの設計と合成、分光スペクトル測定と量子化学計算による評価ならびに応用展開を行う予定である。
細胞核内のアクチン・ミオシンファミリー間の協調によるクロマチン動態制御解析

遺伝子発現を後天的に制御するために、核内ではクロマチンの空間配置や動態が制御されている。これらの機構は細胞の発生や癌化などと関連性があることが示唆されておりその重要性が明らかになってきたが、分子機構はほとんど不明で詳細な分子メカニズムの解明が期待されている。代表者はアクチンファミリーのArp6とミオシンファミリーのNM1が協調してこのメカニズムに関与していると考え、研究を開始した。Arp6KOやノックダウンでNM1の局在に大きな変化は観察されなかったので、次に、Arp6とNM1の結合の変化を解析した。まずRNA Polymerase I(PolI)の転写を抗がん剤であるactinomycin Dによって停止させるとArp6とNM1の結合が減少することが示された。また、rDNAの転写抑制がおこるグルコース飢餓状態でも同様に結合が減少することが示唆された。rDNAの転写抑制時にArp6とNM1が核小体から抜けていることを考えると、rDNAの転写が抑制されるとArp6とNM1は解離し、核小体から消失するというモデルが考えられる。これまでの報告からNMIのATPase活性がPolIの転写活性を正に制御していることが見出されている(Ye J et al., 2008)。そこでATPを加えた状態でArp6とNM1の結合変化を観察すると、Arp6はATPの存在下では、NM1から解離することがわかった。従来、ミオシンファミリーのタンパク質は、それ自身が持つATPase活性によりエネルギーを得てモータータンパク質としてアクチン繊維と相互作用しながら機能している。このような背景と本研究により得られた結果より、Arp6がNM1のATPase活性を制御してrDNAの転写を調節していると考えられた。これまで核内のNMIがどのように制御されているかは、不明であったが本研究により、Arp6によるNM1の機能制御機構モデルを示せたことで有意義な結果を得られた。Arp6が構成因子として報告されている複合体にSRCAP複合体がある。クロマチンの空間配置にArp6がSRCAP複合体の機能に依存的、もしくは非依存的であるかを解析するためSRCAP複合体の機能を欠損した細胞で3D-FISHを行ったところクロマチンの空間配置はArp6依存的、非依存的な経路があることが示された。また核内のArp6の局在を解析した結果、核内では拡散もしくは点状に存在していることが明らかになった。現在NM1の核内局在を解析しており、Arp6の局在と比較し、両者が協調して機能している核内の位置を特定していく予定である。一方、核内でArp6がNM1の動態を、またその逆にNM1がArp6の動態をどのように制御するかをFRAP(消光後蛍光回復法)により用いて解析した。その結果NM1の存在量が減少することで、Arp6の核内での動きが早くなること、またArp6がNM1よりも早く核内を移動していることが示唆された。NM1の動態におけるArp6の影響について解析する。さらに核内に存在する他の核内Arp4,5,8についてNM1との結合を免疫沈降法により解析した結果、他の核内ArpはNM1に結合しておらず、核内に存在するArpの中でもArp6がNM1に特異的に結合していることが示された。今後はさらにArp6とNM1の複合体の核内における分子メカニズムをさらに詳細に解析していく予定である。前年度に引き続き、Arp6とNM1が協調して機能している可能性のある場所を探索した。その結果、ヒトHeLaでは、細胞核内小器官である核小体で両タンパク質が共局在していることが明らかになった。核小体においてNM1はribosomal DNAの転写に関与していることが報告されていたので、Arp6の関与が疑われた。Arp6はrDNAの転写を担うRNA polymerase Iと結合していることを確認した。また、抗がん剤であるactinomycin DによりRNA polymerase Iの転写を阻害すると、核小体におけるArp6の局在はRPA194と共に動くことから、Arp6がrDNAの転写に関与することが示唆された。我々が以前に作成したニワトリDT40、Arp6 KO細胞でrDNAの転写を調べたところWTと比較して若干の現象が確認された。我々はArp6が細胞ストレス時に、rDNAの転写を制御している可能性を考え、glucose飢餓状態におけるrDNAの転写を阻害している可能性を考え同様の実験を行った結果、glucose飢餓状態では、WTのrDNA転写は減少するのに対して、Arp6 KO細胞では減少しないことが明らかになった。

今後はArp6とNM1がrDNAの転写にどのように関与しているかを詳細に解析していく予定である。また、核小体は様々なストレスを感知する構造体であることが考えられており、Arp6-NM1が核小体に機能することで染色体の核内配置を制御している可能性についても研究を進めていく予定である。遺伝子発現を後天的に制御するために、核内ではクロマチンの空間配置や動態が制御されている。これらの機構は細胞の発生や癌化などと関連性があることが示唆されておりその重要性が明らかになってきたが、分子機構はほとんど不明で詳細な分子メカニズムの解明が期待されている。代表者はアクチンファミリーのArp6とミオシンファミリーのNM1が協調してこのメカニズムに関与していると考え、研究を開始した。Arp6KOやノックダウンでNM1の局在に大きな変化は観察されなかったので、次に、Arp6とNM1の結合の変化を解析した。まずRNA Polymerase I(PolI)の転写を抗がん剤であるactinomycin Dによって停止させるとArp6とNM1の結合が減少することが示された。また、rDNAの転写抑制がおこるグルコース飢餓状態でも同様に結合が減少することが示唆された。rDNAの転写抑制時にArp6とNM1が核小体から抜けていることを考えると、rDNAの転写が抑制されるとArp6とNM1は解離し、核小体から消失するというモデルが考えられる。これまでの報告からNMIのATPase活性がPolIの転写活性を正に制御していることが見出されている(Ye J et al., 2008)。そこでATPを加えた状態でArp6とNM1の結合変化を観察すると、Arp6はATPの存在下では、NM1から解離することがわかった。従来、ミオシンファミリーのタンパク質は、それ自身が持つATPase活性によりエネルギーを得てモータータンパク質としてアクチン繊維と相互作用しながら機能している。このような背景と本研究により得られた結果より、Arp6がNM1のATPase活性を制御してrDNAの転写を調節していると考えられた。これまで核内のNMIがどのように制御されているかは、不明であったが本研究により、Arp6によるNM1の機能制御機構モデルを示せたことで有意義な結果を得られた。震災の影響で多少の遅れは生じたものの、細胞内でのArp6,NM1の局在解析については有意義な結果が得られた。Arp6-NM1の複合体が機能していると思われる核小体とよばれる領域を同定でき、この結果をもとに、Arp6-NM1複合体の核小体での機能解析を進めることができた。また、これらの結果を学会等で発表することで高い評価を得ることができた。ヒトHeLa細胞でArp6およびNM1の遺伝子発現をノックダウンする系を作製する。Arp6に関してはSiRNAのオリゴで作製を試みたが、効率が良くなかったので、HeLa細胞を用いてstable knock down細胞を作製することで更なる解析を進める。また、NM1についても同様の解析を行うことで、両タンパク質が細胞核内でお互いがどのように影響を及ぼしているかについて解析していく。
成熟神経細胞の機能維持と老化を結ぶ転写抑制因子RP58の役割

RP58のナンセンセス変異が知的障害患者でみつかり、また、ヒト老齢前頭葉でRP58の発現が1/4に低下していることから、RP58の発現量は、脳機能に重要てあることが推察される。そこで、マウスを用いて検証した。RP58の発現抑制マウスを作製して、行動解析、組織解析を行った。その結果、RP58の発現を半減させる場合、脳形成異常は明確ではないが、行動異常がみられた。上流にStop配列を挿入し、発現を1/3にすると、脳形成異常も明らかとなり、より重篤な行動異常が見られた。従って、RP58の発現量が、行動と脳形成にきわめて重要であることが明らかになった。脳の機能はニューロンの成熟とその維持に大きく依存する。網羅的な解析から、ヒト前頭野において老化に伴い著明に発現が減少する遺伝子として転写抑制因子RP58が同定された(第3位、1/5に減少、Lu et al.,2004)。RP58の発現が半減するヘテロマウスを解析したところ若年時にすでに長期増強が低下し(未発表)、老化マウスと類似していた。従って、ニューロンの可塑性を含む成熟の維持にRP58の発現量が重要であると考えた。そこで、RP58の発現量を可逆的にコントロールできる改変マウスを新たに作製し、「R P 5 8の発現量がニューロンの成熟維持を制御し、その発現低下がニューロンの老化に伴うを機能不全を引き起こす」という仮説を検証する。本研究は、脳の老化を克服するための抜本的な分子メカニズムの解明を目指すものである。RP58ヘテロ欠損マウスでは個々のニューロンでRP58を半減させることはできるが、ヒトの老齢化をマウスで再現するには、半減ではなく1/5に減少させる必要がある。そこで、FASTシステム(Flexible Accelerated STOP TetO-knockin、Tanaka et al., 2009)を用いる。これまで、Stop-tetOコンストラクトのノックインマウスをRP58のATG上流で2種類作製した。ホモマウスを作製したところ、小脳失調様フェノタイプ師示した。これは、Stop配列によりRP58の転写産物が減少していることを推察させる。現在、Stop配列を除去するために、Floxマウスと交配中である。RP58の発現を制御するために、FASTシステムを用いている。現在STOP配列、TetOをRP58の上流に挿入した2つの系統を作製し(FASTV1, FASTV2)ている。そのホモマウスの組織解析を行い、とくに海馬歯状回の著しい形成不全を見出した。定量PCRを行い、FASTV1マウスではV1がほぼ0、V2通常通り、V3著明に減少していることを明らかにした。次に、Flipase発現マウスと交配し、STOP配列を除去し、現在、CamK2ーtTSと交配し、RP58の発現をドキシサイクリンで制御可能のマウスを作製中である。RP58のATG上流にFAST配列(Stop配列含有)を挿入して、そのマウスを交配して、FAST配列をホモにしたところ、RP58の転写量が1/3に減少した。離乳後、体重は1/3に減少し、死亡した。しかし、練り餌により、生存し、体重も正常の1/2程度まで回復した。ケージ内で明らかな多動を示し、上方を向いて手を揉むような異常行動をしめす個体も見られた。2ヶ月以降異常行動も減少した。しかし、興味深いことに、3ヶ月以降異常行動のほか、歩行障害が目立ちはじめた。従って、本マウスは、知的発達障害と加齢性脳障害を結ぶモデルマウスとして、有用であると考えられる。さらに、Stop配列を除き、TetO配列マウスにCamKIIーtTSマウスを交配することによってRP58の転写を抑制したところ、予備的実験により、オープンフィールドで多動、作業記憶低下傾向を示した。また、RP58の機能発現メカニズムを解明するためにRP58と結合する因子の同定を試みた。RP58の特異抗体を用いた免疫沈降実験では、MS解析によりDnmt3aは検出されず、代わりにCtBPなど多数の候補蛋白が同定された。Ctbp1は種々のクロマチンリモデリング酵素と結合することが知られている。従ってRP58の転写抑制活性がDnmt3aではなく、CtBP1を介して発現している可能性がある。今後、Ctbp1の結合予測部位を変異させたRP58で、大脳皮質放射状移動のレスキュウ実験により、RP58がCtbp1と結合することの重要性を検討する。

Floxマウスとの交配によるStop配列の除去が遅れているが、ホモマウスの作製により予想どおり小脳失調というRP58の発現減少を推察させるフェノタイプが見られていることから、おおむね順調に進展していると考えられる。CamK2-tTS保有、tetOホモマウスの表現型を組織学的、行動学的に解析する。RP58欠損の表現型がみられた場合、ドキシサイクリン含有食餌で飼育し、生後2ヶ月から、ドクシサイクリンを減少させ、RP58の発現減少の程度と、組織学的、行動学的に解析する。28年度が最終年度であるため、記入しない。神経科学今度、Floxマウスとの交配によりStop配列を除去し、CamKIIーtTSマウスと交配し、ドキシサイクリンの投与量を調節することで、RP58の発現量を自在にコントロールする。そして、行動解析と組織解析から、RP58の脳機能に果たす役割を明らかにする。遺伝子改変マウスの作成が予想より時間がかかったため、組織解析を次年度に回した。遺伝子改変マウスの組織学的解析び使用する。医学研神経細胞分化プロジェクトホームペイジ
開口分泌素過程の分子機構とその制御機構に関する研究

1.PKCによるプライミング調節機構PKCの活性化は、ATP依存性プライミング効率を増大させる。プライミングの活性化に関わるPKCの分子種は、αおよびβであること、その分子機構においては、活性化されたPKCα,βが形質膜近傍に移行し、その受容蛋白質RACK1との結合を介してF-アクチンと結合する事が重要であることを明らかにした。開口分泌におけるPKC活性化の効果を、アンペロメトリー法により解析を行った結果、PKCが放出可能な状態への顆粒の供給を調節し、また分泌顆粒の開口過程も調節している可能性が示唆された。第三に、分泌顆粒運動の実画像解析から、顆粒供給過程において、0.030.6μm/sの速度で移動する顆粒運動をPKCが調節しており、この速度で行われる運動が供給にとって重要な役割を果たす運動である、という可能性が考えられた。2.プライミング機構と細胞骨格系蛋白質の関連高カリウム刺激後には素速く動く顆粒が全顆粒のうち約25%あり、これら素速く動く顆粒はアクチン-ミオシン相互作用によって放出部位へ移動、供給されていることが示唆された。この機構は、アンペロメトリー法により解析したスパイクの出現頻度によっても明らかとなった。3.SNARE複合体調節の分子機構ほかVAMP-2-C端ドメインへのカルモヂュリン及びリン脂質の結合が、Ca^<2+>依存性開口分泌に必須であること、シンタキシン1AとCaMキナーゼIIの、Ca2+/ATP依存性結合が、同じくSNARE複合体の形成の調節因子として生理的にも重要な役割を担う事を明らかにした。以上のように、我々が現在進めている解析法は、開口分泌の時空的調節機構の研究に大変有効な手段である事が示唆された。1)PKCによるプライミングの増強には、活性化されたPKCα、またはβが形質膜近傍へ移行し,受容蛋白RACK1と結合することが必須であることを明らかにした。また、RACK1は形質膜直下のF-アクチンと結合しており、アクチンを脱重合するとRACK1は形質膜直下から消失しPKCのプライミング増強作用も消失した。2)分泌顆粒供給過程における細胞骨格系の役割を解析するために、蛍光ラベルした分泌顆粒運動の実画像解析を行った。高カリウム刺激後運動解析から素速く動く顆粒が分泌顆粒のうち約25%あり、これら素速く動く顆粒はアクチンーミオシン相互作用によって放出部位へ移動、供給されていることが示唆された。3)単一細胞からの開口分泌をカーボンファイバー電極を用いて電気化学的に記録解析した。シナプトタグミン(Syt)に結合して開口を抑制的に調節することが示唆されているイノシトール-6-リン酸を細胞内に微量注入をすると、自発性の開口頻度ならびに脱分極刺激に対する応答の開口頻度が顕著に抑制された。これに対して、Sytに結合活性のないイノシトール-6-硫酸は全く阻害作用を持たず、阻害作用の特異性と同時に、生理的条件下でこのクランプ機構が働く可能性が明らかとなった。電気化学検出系の記録頻度的条件下でこのクランプ機構が働く可能性が明らかとなった。電気化学検出系の記録頻度を2KHzで作動させると、個々の開口現象の立ち上がり時間、持続時間などキネティクスの詳細な解析が可能であった。4)ウシ副腎髄質細胞に存在する分子量の異なる3種のラフト蛋白を認識する抗体を作製し、免疫組織化学を行った。3種のうち38KDaの分子量を持つラフト蛋白が形質膜直下に局在し、他の蛋白は細胞質に広く分布する事が明らかになったが、高透過性細胞からの開口分泌にはいずれの抗体も影響を与えず、機能については今後の解析が必要である。

1)微小炭素繊維電極アンペロメトリー法により、1個のクロマフィン細胞からの開口分泌頻度に対するPKC活性化の影響を調べた。高カリウムによる5分間持続刺激に対する開口分泌応答では、開口頻度が有意に増加し、特に刺激開始後2・5分における頻度の増加が顕著であったことから、PKC活性化が分泌顆粒供給を促進していることが示された。また、顆粒を蛍光標識して高カリウム刺激後の運動を実画像解析すると、PKC活性化によって中速(0.03・0.06μm/min)で移動する顆粒の割合が顕著に増加したことから、中速での顆粒運動が供給に関わり、PKCの調節下にあることが示唆された。2)アクチン-ミオシン系が関わると考えられる分泌顆粒の運動について、可視的測定解析を進めた結果、高カリウム刺激後2・10分間の顆粒の運動は、無刺激細胞に比較して極めて活発であり、移動距離にして無刺激細胞の6倍移動していることが明らかになった。また、無刺激下においても低頻度の自発性開口像が観察された。3)副腎クロム親和細胞由来の分泌顆粒画分よりラフトを調製し、主要成分のタンパク質を固定し、これらがH+- ATPase complexであることを見い出した。また、脳由来シナプス小胞膜ラフトにおいてもこのcomplexが存在することを見い出した。すなわち分泌顆粒の成熟にラフトが大きく関与することが見い出された。細胞骨格と分泌過程・メンブレンサイクリングとの関わりを解析する目的で、脳由来ラフトに存在するチューブリン結合因子を解析し、SCG10と呼ばれるチューブリン結合因子の局在を見い出した。アクチン系の解析においては、低分子量Gタンパクのうち、Rac1が神経細胞ラフトに局在することを見い出した。1)微小炭素繊維電極アンペロメトリー法により、高カリウム刺激で引き起こされる個々のクロマフィン顆粒の開口キネティクスに対するPKC活性化の影響を調べた。TPA処理によって、シングルイヴェントのRise timeならびにMiddle widthが増大した。PKC阻害によりその効果は消失したことから、PKC活性化は個々の分泌顆粒の開口速度を調節することが明らかとなった。同様にして、アクチン-ミオシン相互作用ならびにアクチン細胞骨格が開口速度の調節に関わることが明らかとなった。2)分泌顆粒の可視的測定解析を進めた結果、これまで活発な顆粒運動が観察された位置よりも焦点を形質膜方向に近づけると、開口分泌を示すと考えられる蛍光強度の増大が観察された。高カリウム刺激による開口像の中に、いわゆるCompound exocytosis(多顆粒開口分泌)を示すと考えられる持続性の蛍光強度変化が観察された。走査型電子顕微鏡による細胞内の微細構造観察から、複数の顆粒鎖と形質膜の融合像が得られ、クロマフィン細胞においてCompound exocytosisが行なわれる事が明らかになった。この成果は、世界初の分泌顆粒の走査電顕像であり、またCompound exocytosisの走査電顕像である。3)神経細胞のシナプス小胞とプレシナプス膜に局在するタンパク質NAP-22は、PC12細胞にも発現している。NAP-22の脂質結合能を解析するためC末よりの欠損体を大腸菌で発現させ、リポソームとの結合を解析した。脂質結合にはN端のミリスチル化が必須であること、フォスファチジルコリン存在下でコレステロールやフォスファチジルエタノールアミンが存在すると膜結合能を持つことを見い出した。