hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
日本、韓国、台湾のベンチャーキャピタルパフォーマンスの比較研究

日本・韓国・台湾のベンチャーキャピタルのパフォーマンスを比較研究した結果、日本の金融機関では理系出身者が投融資判断に関わることが少なかったがベンチャーキャピタルでは積極的に採用し、技術を持つ投資対象企業の株価の適正な形成に関与するようになった。理系研究者もMBAを取得し、文系・理系という分離したデイシプリンの在り方が改善されつつあるが、台湾と比較すると十分な展開がなされているとは言えない。台湾は80年代に、政府による積極的な海外留学者の帰国を図り、ポスト重化学工業化としてシリコンバレーで生じたハイテクベンチャー起業を台湾の新竹科学工業園区を中心に実現するための包括的な施策を実施し、IT産業分野で上場企業が増加し、世界的な企業を生み出すことに成功した。ベンチャーキャピタルは金融持株会社制度の発足に伴い、各金融グループの中に、ハイテク企業の上場等の金融サービスを提供する金融機関として位置付けられている。韓国については、97年のアジア通貨危機以来、ベンチャービジネス育成強化策が取られ、ITバブル期にベンチャービジネス、ベンチャーキャピタルともに発展し、バブル崩壊とともに沈滞期を迎えたが、回復を見せ、大手ベンチャーキャピタルは積極的な展開を行っている。台湾、韓国、日本ともに中国においても積極的なベンチャーキャピタルの活動を行っているが、欧米のベンチャーキャピタルはケイマン諸島などのオフショア金融センターを経由して積極的な投資行っており、ベンチャーキャピタルの活動が国際的なネットワークの下に展開されていることも明らかとなった。ベンチャーキャピタルが広い意味のプライベートエクイテイに包摂されつつあるが、東アジアにおいても技術とファイナンスの結合した固有の金融分野が確立しつつあり、今後も、発展してゆく可能性十分あるという結論を得た。日本・韓国・台湾のベンチャーキャピタルのパフォーマンスを比較研究するため、まず日本の代表的なベンチャーキャピタルとベンチャービジネスを訪問し、ヒアリングを行った。これまで日本の金融機関では理系出身者が投融資判断に関わることが少なかったのに反してベンチャーキャピタルで積極的に採用し、資金供給者の立場からも適正な株価形成を行うようになったことが分かった。また、ベンチャービジネスにも理系研究者がMBAを取得し、参加し始めるなど日本のこれまでの文系・理系という分離したディシプリンの在り方が改善されつつあることが明らかとなったことである。これに対し、治湾は80年代に政府による積極的な海外留学者の帰国を図り、シリコンバレーで生じたハイテクベンチャー起業を新竹科学工業園区で実現するための包括的な施策を取った結果、とくにIT産業分野で上場企業が増加し、しかも世界的に有数な企業にまで成長するケースが多かった。しかもこれらの企業に対しては同じくシリコンバレーでの経験を積んだベンチャーキャピタリストが積極的に関与し、ベンチャーキャピタルは金融持株会社制度の発足に伴い各金融グループの中に位置づけられ、台湾の各種金融サービスの一環として定着していることが明らかとなった。一方、韓国はITバブル期にベンチャービジネス、ベンチャーキャピタルともに発展し、バブル崩壊とともに沈滞期を迎えたが、ここ2、3年回復を見せ、大手ベンチャーキャピタルは積極的な展開を見せている。以上、日本、韓国、台湾のベンチャーキャピタルの比較からともにその役割が定着しつつあり、技術とファイナンスの結合した新たな分野が確立しつつあることが明らかとなった。また、ベンチャーキャピタルが広い意味のプライベートイクイテイーに包摂されつつあるが、ハイテク技術に対するファイナンス供給の固有の金融分野として存在し続けることが十分予想されるという結論を得た。以上の研究は研究代表者(伊東)と研究分担者(井村)、研究協力者(陳・柳)による現地調査によって得られた結果であり、この結果を次年度以降、研究論文、学会発表等で成果として発表する予定である。東アジアにおけるポスト重化学工業化としてのハイテク産業育成の手段の一つとしてベンチャーキャピタルがハイテクベンチャー乱企業とともに優遇支援されてきた。日本、韓国、台湾のベンチャーキピタルが産業政策、科学技術政策、そして金融システムに如何なる位置を占め、如何に先端産業育成に寄与してきたかを評価・分析することが本研究の目的であった。

この研究目的に従って、前年度は、日本、韓国、台湾における現地調査を行い、研究成果を論文として著したが、その過程で、台湾のベンチャー企業、ならびにベンチャーキャピタルが中国市場に積極的に展開していることが明らかとなった。同様に韓国のベンチャーキャピタルも広大な市場潜在力を持つ中国に積極展開していることから、本年度は、中国のベンチャー起業とベンチャーキャピタルの活動について、大連、北京での現地調査を行う一方、引き続き韓国における現地調査を行った。この結果、中国のベンチャーキャピタルは海外の投資ファンドの比率が高く、人民元の為替管理と投資規制を避けるためにオフショアファイナンスセンターを経由し、外国市場で公開上場を行い、海外の投資家に投資収益が還元される仕組みとなっていることか確認された。中国の地場ベンチャーキャピタルファンドはハイテク企業の技術評価能力は低く、投資行動も先進国のファンドとは異なり、投資行動の改善のためには政策的な支援が必要であり、条件が整えば、エンジェル投資家なども出現しており、豊富な投資機会のある中国のベンチャーキャピタルファンドの発展は十分期待できることが明らかとなった。以上のような各国の比較研究から韓国、台湾、中国においては先端産業のキャッチアップにベンチャーキャピタルは程度の差はあるが寄与してきたことが明らかとなり、金融サービスの範囲が拡大し、先端産業の発展に貢献してきたと結論できる。また、日本と比較してベンチャーキャピタルのハイテク企業の発展への寄与度は大きかったと言えよう。東アシア諸国に対して、比較の対象として注目を集めているインド、そしてフィリピンについても同様な目的での研究も行い、成果を発表した。本年度は昨年度の成果に本年度の現地調査の結果を加え、学会発表(研究代表者と研究分担者の指導の下での研究協力者(柳在廣))、学会セッションの司会とコメンテーター(研究分担者)と論文発表を行い、その成果を公表した。
新規脂肪細胞分泌蛋白アディポネクチンのインスリン抵抗性防御作用の解析

アディポネクチンは私達が見出した脂肪細胞特異的な新規分子で、コラーゲン様の繊維状ドメインと補体様の球状ドメインからなる分泌蛋白である。私達はアディポネクチンが血管平滑筋細胞の増殖抑制や血管内皮細胞の接着分子発現抑制など血管機能に様々な影響を与えることを示し、脂肪細胞特異的発現を示すにもかかわらず、内臓脂肪蓄積時には血中濃度が低下していることを報告してきた。インスリン抵抗性は動脈硬化とともに内臓脂肪蓄積により招来される重要な病態である。本研究ではインスリン抵抗性における本分子の意義について検討した。2型糖尿病患者では肥満度に関わらずアディボネクチン血中濃度が低下しており、特に大血管症合併例で著しいが、非合併例でも低値を示した。2型糖尿病を高率に発症するPima Indianでは肥満度を合わせた白人に比し、血中アディポネクチン濃度が低下していた。血中アディポネクチン濃度はグルコースクランプ法で測定したインスリン感受性の程度と正相関し、インスリン感受性で補正するとPima Indianと白人における血中濃度の差は消失した。自然発症2型糖尿病モデル動物でも血中アディポネクチン濃度はインスリン感受性と正相関することが示され、さらにlongitudinal studyにより血中アディポネクチン濃度の低下はインスリン抵抗性発症に先行し、本分子の分泌不全がインスリン抵抗性発症の一因となる可能性を示した。またPPARgリガンドであるチアゾリジン誘導体が、脂肪細胞におけるアディポネクチン発現,分泌を促し、血中温度も増加させる作用を有することから、これが本剤のインスリン感受性増強作用の一要因である可能性が示された。以上よりアディポネクチンは抗動脈硬化作用とともにインスリン抵抗性防御作用をあわせ持つメタボリックシンドロームのキー分子であり、内臓脂肪蓄積時の本分子の分泌不全が動脈硬化、インスリン抵抗性の発症に深く関わっていることが考えられた。現代の我が国において糖尿病や動脈硬化疾患が急増している背景として、過栄養による体脂肪の過剰蓄積が存在する。体脂肪蓄積による糖尿病発症基盤にはインスリン作用不全すなわちインスリン抵抗性が考えられているが、発症の分子メカニズムは充分解明されていない。近年脂肪細胞分化を誘導するチアゾリジン誘導体がむしろインスリン抵抗性を改善し、逆に脂肪組織欠損マウスが強いインスリン抵抗性きたすことが明らかにされたことにより、脂肪細胞がインスリン抵抗性発症の中心に存在することが再認識されたが、これらの結果は単純に脂肪蓄積がインスリン抵抗性発症に関与するのではなく、より直接的にインスリン抵抗性に関わる分子を同定する必要性があることを示している。脂肪細胞は受動的にエネルギーを貯め込むだけではなく、個体の代謝に関わる様々な生理活性物質(アディポサイトカイン)を流血中に分泌する一種の内分泌細胞であることが明らかになってきた。この中には種々のインスリン抵抗性発症の候補分子が見出されてきているが、逆に本来脂肪細胞が分泌する物質が肥満や脂肪細胞分化不全で分泌不全がおこり、インスリン抵抗性発症に寄与している可能性も考えられる。アディポネクチンは私達が見出した脂肪細胞特異的な新規分子で肥満者では血中濃度が低下している。本研究ではインスリン抵抗性と本分子との関連を検討した。本年度の研究により、2型糖尿病患者では肥満度に関わらず本分子の血中濃度が低下していること(ATVB,2000)、2型糖尿病を高率に発症するPima Indeanで血中濃度が低下しており、クランプ法で測定したインスリン抵抗性の程度と関連していること(J Clin Endocrin Metab,2001)、自然発症2型糖尿病モデル動物でインスリン抵抗性発症に先行して血中濃度が低下すること(Diabetes,2001)を明らかにし報告した。

次年度はアディポネクチン高発現系を用いて、本分子のインスリン抵抗性防御作用について検討する予定である。アディポネクチンは私達が見出した脂肪細胞特異的な新規分子で、コラーゲン様の繊維状ドメインと補体様の球状ドメインからなる分泌蛋白である。私達はアディポネクチンが脂肪細胞特異的発現を示すにもかかわらず、内臓脂肪蓄積時には血中濃度が低下していること、血管平滑筋細胞増殖抑制や内皮における接着分子発現抑制などの抗動脈硬化作用を有することを報告してきた。インスリン抵抗性は動脈硬化とともに内臓脂肪蓄積により招来される重要な病態である。本研究ではインスリン抵抗性における本分子の意義について検討した。前年度研究では、2型糖尿病患者では肥満度に関わらず本分子の血中濃度が低下していることを報告したが(ATVB,2000)、本年度は2型糖尿病を高率に発症するPima Indianで血中濃度が低下しており、クランプ法で測定したインスリン抵抗性の程度と関連していること(J Clin Endocrin Metab,2001)、自然発症2型糖尿病モデル動物でも血中アディポネクチン濃度はインスリン感受性と相関することを示した(Dlabetes,2001a)。さらにlongitudinalstudyにより血中アディポネクチン濃度はインスリン抵抗性発症に先行して低下することを示し、本分子がインスリン抵抗性発症の一因となる可能性を示した。またPPARgリガンドであるチアゾリジン誘導体爪脂肪細胞におけるアディポネクチン発現、分泌を促し、血中濃度も増加させる作用を有することから、これが本剤のインスリン感受性増強作用の一因と考えられた(Diabetes,2001b, Diabetes Care,2001)。以上よりアディポネクチンは抗動脈硬化作用とともにインスリン抵抗性防御作用をあわせ持つメタボリックシンドロームのキー分子であり、内臓脂肪蓄積時の本分子の分泌不全が動脈硬化、インスリン抵抗性の発症に深く関わっていることが考えられた。
フィールド・エミッション(FE)X線管の試作

本研究は、“多重電界陰極"(multiple field cathode,MFC)を電子源とする“X線カメラ"(XRC)システムの試作を目的としたものであり、計画年度内にすべての作業は完了した。本試作システムの基本構成は、1)XRC本体、2)電子源及び3)排気系であり、それぞれの概略は以下の通りである。1.)XRC本体XRCチャンバー外壁はステンレススチールから成り、7ケ所に内部との接続ならびに内部観察を用途とするポートが設けられている。チャンバーには、X線発生源であるアルミターゲット、電子ビーム収束レンズ(Glazerレンズ)、Glazerレンズ冷却システムが内蔵されている。2.)電子源部電子放射源であるFEエミッターは、主真空を破ることなく交換でき、またその位置は、マニピュレーターによって精密に調整される。エミッターから放出された電子は、いわゆる、“bipotential lens system"による収束後、Glazerレンズに入射する。3.)排気系装置の主排気は、2基のターボモレキュラーポンプ(排気速度:190l/sec)で行う。到達圧は、10^<-7>Torr台の後半である。なお、本研究で使用したMFCは、透過電子顕微鏡試料支持用のMoメッシュをハサミ切断した“meshemitter"(ME)である。このMEを電子源として、集積回路(IC)のX線像を得ることができた。このX線像は、市販の熱電子型X線カメラによって得られるものに比して、シャープに解像されている。電界電子によって得られた世界で始めてのX線像であることも踏まえれば、この成果は“画期的"というにふさわしい。唯一の誤算は、高圧ガイシとXRC本体の接続にゴム製のO-ringを使用しているため、XRC本体のベーキングができず、到達圧が10^<-7>Torr台に留まったことである。電界電子放射は、典型的な表面現象であり、電子源の作動特性を常に安定に保つには、超高真空(P【less than or equal】10^<-9>Tour)が不可欠である。“超高真空FE-X線カメラ"の開発がわれわれの次なる目標となる。X線“影"を映し出すことによって、検体の非破壊検査を行う“X線カメラ"(XRC)は、従来、一次放射線(電子)源に、大容積の加熱電源を必要とする熱電子源を用いるため、概して大型である上に、移動のできない“固定型"が大半を占める。近年、“ハイテク"産物の検査を目的とするコンパクトXRCへの関心が高まりつつあり、これに答え得る技術の開発が産・学に求められている。本研究は、このような社会的要請を考慮し、三菱重工(株)との共同研究として企画されたものである。具体的には、加熱電源を必要としないフィールド・エミッション(FE)源を一次放射線とする、コンパクトかつポ-タブルなXRCの開発を目的とし、平成8年度には、1)装置(FE Xray発生装置)の設計・製作及び、2)全体システムの組み立て・調整が計画されたが、これらは、平成9年1月をもって終了した。装置の主な仕用は以下の通りである。1)電子ビーム加速電圧80kV2)電子ビーム加速モード後段加速3)電子ビーム収束方式グレーザー方式4)到達真空度10^<-8>Pd

5)ターゲットアルミニウムX線“影"を映し出すことによって、検体の非破壊検査を行う“X線カメラ"(XRC)診断は、現代社会を支える基板技術である。本研究は、XRCのコンパクト化に不可欠な、冷電子エミッターを電子源とするフィールド・エミッション(FEX X線管の試作を目的として、企画されたものである。平成9年度に計画された研究は、1)FEX線管(平成8年度に試作)の線料特性評価、及び2)遮へい効果の点検である。具体的には、1070kVの電子加速電圧に対して発生X線量を測定し、X線量が実用領域に達するか否かを確認すること、ならびに、検出系へのX線侵入経路に各種厚みのAl板を置き、Al板の厚みとX線強度の関係を点検することである。結果の概要は以下の通りである。a)Ni-MFCからの発生X線量が電子加速電圧の増加と共に直線的に上昇し、70kVで実用水準を上回る0.9mSvに達する。b)全ての加速電圧に対して、検出X線量(I)とAl板厚み(t)がlog I=μt+I.(Io:t=0でのX線量)の関係を満たすことが確認された。以上は、ほぼ初期の目的に沿うものであるが、実験の初期過程で、高圧電源用碍子の耐圧が、不充分であり、その取り換えにかなりの日時を要したこと、高圧電源(≦80kV)が、安定性を欠き、修理の止むなきに至ったこと等の不都合が生じた。装置設計の不備によるものであり、反省材料としたい。本研究は、“多重電界陰極"(multiple field cathode,MFC)を電子源とする“X線カメラ"(XRC)システムの試作を目的としたものである。本システムの基本構成は、1)XRC本体、2)電子源及び3)排気系であり、それぞれの概略は以下の通りである。1. XRC本体XRCチャンバー外壁はステンレススチールから成り、7ヶ所に内部との接続ならびに内部観察を用途とするポートが設けられている。チャンバーには、X線発生源であるアルミターゲット、電子ビーム収束レンズ(Glazarレンズ)、Glazerレンズ冷却システムが内蔵されている。2.電子源部電子放射源であるFEエミッターは、主真空を破ることなく交換でき、またその位置は、マニビュレーターによって精密に調整される。エミッターから放出された電子は、いわゆる、“bipotential lens system"による収束後、Glazerレンズに入射する。3.排気系装置の主排気は、2基のターボモレキュラーポンプ(排気速度:1901/sec)で行う。到達圧は、10^<-7>Torr台の後半である。なお、本研究で使用したMFCは、透過電子顕微鏡試料支持用のMoメッシュをハサミ切断した“mesh emitter"(ME)である。このMEを電子源として、生物試料(煮干)の、見事なX線像を得ることができた。現在、この成果を国際的な学術に公表するための準備を進めているところである。
動物自然免疫の根幹をなす補体系の進化的起源

当研究は刺胞動物ネマトステラの補体系の構成、及びその遺伝子の発現部位を明らかにして、脊椎動物のものと比較することにより多細胞動物の共通祖先に存在したと考えられる原始補体系の全容を解明することをめざして行われた。公開された刺胞動物ネマトステラのゲノムデータから、ブラストサーチにより得られた部分配列を元にRACE-PCRを行い、2種の補体C3遺伝子・2種のB因子・1種のMASP遺伝子の完全長配列を決定し、RT-PCRにより発現を確認した。これまで刺胞動物からはC3のみが知られており、MASPは後口動物からのみ、B因子は後口動物とカブトガニから確認されていたのみであったので、この結果は複数の成分からなる補体系の起源の古さを大幅に更新したことになる。これらの遺伝子から推定されるアミノ酸配列を哺乳類の対応する補体系因子と比較すると、病原体のオプソニン化に必要なチオエステル結合部位など、補体系の活性に関わる重要なアミノ酸残基を大部分保持しており、哺乳類補体系因子と基本的に同様な生化学的性質を示す可能性の高いことが確認された。しかしながら、これらの遺伝子の発現部位はいずれも触手内胚葉に限定されており、主に肝臓で合成され血液中で感染防御に働く脊椎動物の補体系とはかなり異なる生理機能が推定された。また、円口類のヤツメウナギの肝臓のEST解析及び軟骨魚類サメ類のC3/C4/C5遺伝子の解析により、補体系は二胚葉動物と左右相称動物の分岐以前に比較的少数の成分からなる局所的な防御システムとして確立され、その後有顎脊椎動物の系列において遺伝子重複により成分を増やす事によって機能を拡大し、今日哺乳類に見るような複雑な全身性の生体防御システムに進化した事が明らかになった。公開された刺胞動物ネマトステラのゲノムデータから、ブラストサーチにより得られた部分配列を元にRACE-PCRを行い、補体C3・B因子・MASP遺伝子の完全長配列を決定し、RT-PCRにより発現を確認した。これらの遺伝子から推定されるアミノ酸配列を哺乳類の対応する補体系因子と比較すると、病原体のオプソニン化に必要なチオエステル結合部位など、補体系の活性に関わる重要なアミノ酸残基を全て保持しており、哺乳類補体系因子と基本的に同様な働きをしている可能性の高いことが確認された。また、分子系統解析の結果から、これらが最も進化的分岐の古い、原始的な補体系遺伝子であることが示された。さらに約10,000クローンのヤツメウナギ肝臓EST解析を行い、得られた補体系遺伝子配列に対して、分子系統解析およびヒト補体系遺伝子配列との相同性の比較を行った。その結果、ほ乳類で遺伝子重複とその後の機能分化により生じたと考えられるファミリーを形成する補体成分に対しては、祖先系と考えられる遺伝子のみが確認され、これらの遺伝子重複/機能分化は有顎脊椎動物の系統で円口類の分岐以降に生じたことが示唆された。また、軟骨魚類より分岐の古い動物から初めてI因子遺伝子を単離した。従って、顕著なドメイン構造を示す補体遺伝子のうち、C3・B因子・MASPファミリーは刺胞動物と二胚葉動物の分岐以前に、TCCファミリーは円口類の分岐以降・軟骨魚類の分岐以前に、I因子は尾索動物の分岐以降・円口類の分岐以前に起源をもつことが示唆された。補系の進化的な起源を明らかにする目的で,10億年以上前にヒトを含む二胚葉動物から分岐したとされる刺胞動物のイソギンチャクの補体系の構成をさらに精査し,遣伝子発現部位の特定を行った。

ゲノム情報の解析,RT-PCR,5',3'RACEにより,ネマトステラには2種類のC3遺伝子,2種類のBf遣伝子,1種類のMASP遺伝子が存在する事,およびIf遣伝子,後期成分遺伝子は存在しないことが,ほぼ確立された。また,これら補体系遺伝子の発現部位をISHで検討したところ,いずれも内胚葉特異的な発現パターンを示し,ネマトステラの補体成分は胃体腔に分泌されて局所的な感染防御に働いている事が示唆された。少なくとも3種類の成分からなる補体系が刺胞動物に存在する事が確立されたことにより,補体系は真性多細胞動物の出現初期から複雑な反応系として存在し,真性多細胞動物の進化の過程を通じてその生体防御に重要な役割を果たしてきた事が示された。さらに,脊椎動物の進化の初期段階に生じたと思われる補体系の発展の様子を明らかにするために,従来から進めてきた無顎脊椎動物のヤツメウナギの肝臓EST解析をさらに追加し,また同様に血清中に存在し類似したプロテアーゼのカスケード反応を示す凝固系の遺伝子とあわせてヤツメウナギにおける網羅的解析を試みた。2007年に公表された米国産ヤツメウナギのドラフトゲノム情報も参考にして,補体系,凝固系遺伝子のほぼ全貌を明らかにする事ができたが,補体系の基本的な遺伝子セットは後期成分を除いて揃っていたのに対して,凝固系の遺伝子には多くの欠失が見られ,補体系の方が起源も古く,脊椎動物の初期段階での完成度も高く,両系の進化過程は全く異なることが明らかになった。
アマノリ細胞の赤腐れ病に対する生体防御反応の解明と抗病性品種の開発

1.赤腐れ病抵抗性細胞の分離・培養:養殖アマノリの赤腐れ病は藻菌類Pythium属の赤腐れ菌の寄生により生じ、ノリ養殖では最も被害の大きい病気である。感染により壊死したノリ葉体の組織中には、赤腐れ菌が侵入しない抵抗性の細胞が常に少数検出される。この細胞の持つ抵抗性因子を調査するために、抵抗性の細胞を分離後、1315°C、光強度120μE/m^2/s、12時間明期、12時間暗期、1/5PES海水で培養した。6ヶ月間培養後に得られた葉体の赤腐れ病抵抗性を測定したところ、養殖のスサビノリに比較して約2倍の抵抗性が認められた。2.赤腐れ病抵抗性因子の調査:細胞中の生体防御物質として考えられる細胞壁中の多糖類、糖タンパク質エクステンシン、細胞壁の硬さに関係するポルフィランの含量とポルフィラン中の3,6-アンヒドロ-L-ガラクトース量を分析し、抵抗性因子の解明を試みたところ、対照のスサビノリに比べていずれの成分も明らかに少なく、エクステンシンは存在しなかった。従って、抵抗性株の持つ抵抗性は藻体細胞壁の糖質含量が少ない方が強いことが判明した。3.抵抗性の持続性の調査:抵抗性株を2年間継代培養したところ、正常な葉体の形を保ちながら生育をし、実用品種としての正常な形態を有していた。一方、抵抗性については、アマノリ養殖場で赤腐れ病の最も発生・蔓延する環境条件下でも、スサビノリの3倍程度の抵抗性が維持されていた。以上、本研究成果はわが国の最も重要な養殖海藻であるアマノリの赤腐れ病について、抵抗性のメカニズムを解明し、抵抗性株の開発をするうえで貴重な手がかりを与えるものである。1赤腐れ病抵抗性細胞の分離・培養1998年12月5日に三重県鈴鹿市で赤腐れ病が発生した。養殖スサビノリの感染・壊死した組繊を顕微鏡観察し、菌糸の侵入していない抵抗性の細胞10数個をマイクロマニュピレータを用いて分離した。本細胞は現在、細胞数を増加させるために、ASP12-NTA培地中、16°C、明期10時間、暗期14時間、光強度10μE/m_2/sで通気培養中である。2抵抗性因子の調査現在、培養中の抵抗性細胞は、増殖が遅く、抵抗性因子の調査に使用するだけの量が得られていない。そこで、天然に生育し、比較的赤腐れ病に抵抗性が強いことが最近判明したマルバアマノリを、NPM培地を用い、19°C、120μE/m_2/s、11時間明期、13時間暗期で大量に室内培養し、その細胞壁成分を調査した。細胞壁中のマンナン・キシラン含量は2.5%、ポルフィランは12.7%、ポルフィラン中の3-6-アンヒドロ-L-ガラクトース量は13%、エクステンシンは存在しないことが判った。これらの値はスサビノリにおける値とほとんど差がなく、従って、マルバアマノリの赤腐れ病抵抗性は細胞壁成分によるものではなく、他の抵折性因子によるものと考えられた。本結果は、赤腐れ病抵抗性細胞の生体防御反応を解明する上で大いに役立つものと思われる。1.赤腫れ病抵抗性最近の分離及び抵抗性株の作製平成8年度に赤腫れ病感染により懐死したスサビノリ組織から、菌糸の進入していない抵抗性の細胞を顕微鏡下でマイクロマニュピレータを用いて分離したが、細胞の増殖が遅かったために、平成9年度も引き続き抵抗性細胞の分離を進めた。

得られた細胞をPES培地中、16°C、明期10時間暗期14時間、光強度10μE/m_2/sで静置培養を続けた結果、幼葉体になった。このものは活発に細胞分裂を繰り返し、6ヶ月後に成葉体を得ることができた。2.抵抗性の確認得られた抵抗性株と赤腫れ菌遊走子を接触培養し、感染率を著者の開発したモノクローナル抗体を用いて観察した。その結果、対称として用いた赤腫れ病抵抗性のマルバアマノリは10%の、赤腫れ病非抵抗性のスサビノリは90%の感染率であったが、抵抗性株は70%で赤腫れ病抵抗性に一定の改善が認められた。3.抵抗性因子の調査平成8年度に引き続き、抵抗性のアルバアマノリ、非抵抗性のスサビノリをNPM培地で19°C、120μE/m_2/s、11時間明期13時間暗期で室内培養し、最近壁多糖中の3,6-アンヒドロガラクトース料を調べた。アルバアマノリは0.0016g/g、スサビノリは0.03g/gであった。2年間にわたる調査の結果、マルバアマノリの赤腫れ病抵抗性は細胞壁成分によるものではないことが明らかになった。1.赤腐れ病抵抗性株における抵抗性因子の調査赤腐れ病抵抗性因子の調査のために、スサビノリの赤腐れ病に感染・壊死した組織から菌糸の侵入していない抵抗性の細胞を分離し、PES培地中で16°C、明期10時間暗期14時間、光強度120μE/m^2/sで培養して抵抗性株を作製した。凍結乾燥した抵抗性株から75%熱エタノール抽出により低分子化合物を抽出後、エチルエーテルで脱脂・脱色した。このものを35°Cで減圧濃縮して乾固し試料とした。別途スサビノリから抽出したポルフィラン、マンナン、キシランを基質として、ポルフィラン分解細菌、キシラン分解細菌、マンナン分解細菌の酵素反応に及ぼす影響を、還元糖の生成率を指標としてソモジー・ネルソン法で調べた。その結果、抵抗性株の細胞質抽出物は病原菌のポルフィラン、キシラン、マンナン分解反応を阻害せず、むしろ促進することが判った。2.抵抗性株の安定的供給の試み抵抗性株は赤腐れ菌に感染しない細胞から作製できるが、その作製方法は実験室規模のものでは比較的に簡単であるが、大量の抵抗性性株をこの方法では作製することは非常に能率が悪く、事実上不可能である。種々検討の結果、中性胞子の放出による抵抗性株の生産が最も適していると判断し、その方法を検討した。その結果、温度10°C、光強度100μE/m^2/s、8時間明期16時間暗期、培養液を1/5濃度のPES補強海水、培地交換は4日毎とした。本条件下で抵抗性株はさかんに中性胞子を放出し、放出された胞子は無数の幼葉体にすることができた。
機能性腸閉塞症の原因と病態に関する研究

神経提細胞は腸管神経系の発生に深く関与している。最近、神経提細胞から神経、グリア細胞および一部の平滑筋が分化することが明かとなり、神経提細胞の機能分化は、Hirschsprung病やその類縁疾患の発生原因を解明するうえで重要である。我々は複数の異なる神経マーカーを指標として、胎性10.5日から15.5日のWister系ラット胎仔の腸管を用いて、免疫組織学的手法で腸管における神経提細胞の系統分化を研究した。その結果、ret proto-oncogeneから合成されるc-Retは、腸管神経が神経として分化する以前にすでに腸管壁内に発現していた。口側腸管では、神経提細胞は一過性にTyroshine hydroxylaseを発現し、カテコールアミン陽性細胞を経て、神経細胞に分化した。肛門側結腸では、Tyroshine hydroxylaseは一過性に発現せず、腸管の口側と肛門側の神経因子の発現様式または発現の時間的因子は異なっていた。ラットの腸管における神経提細胞の腸管神経への分化は、胎生15.5日でほぼ完成した。一方、ret proto-oncogeneから細胞内で合成されるc-Retは、細胞表面に運ばれて、細胞分化に関するレセプターとして働く。Hirschsprung病では、ret proto-oncogeneに異常を認めることが多い。細胞外ドメインに異常を持ったc-Retは、細胞表面での発現が傷害され、その活性が落ちることが証明された。さらに、Hirschsprung病において、無神経節腸管の長い症例ほどこの細胞表面での発現が強く傷害されていることが示唆されていた。また、Hirschsprung病では無神経節腸管が運動性を失っていることが知られている。しかし、腸管の運動では、ペースメーカーとなる特殊平滑筋が、腸管運動の基本的リズムを形成していることが明らかとなった。
リン酸化H2AXを用いたヒト癌放射線感受性予測法の開発

放射線感受性予測法の開発目的で、放射線照射後のリン酸化H2AX蛍光免疫組織染色により検出されたDNA二重鎖切断数と細胞生存率との関係をin vitroで7種類のヒト悪性腫瘍株について求めた。全細胞株を対象にした場合、リン酸化H2AXフォーカス数と細胞生存率には弱い相関しか認められなかった。DNAプロイディでフォーカス数を補正し、さらにアポトーシス数で考慮すると、6細胞株では強い相関が得られた。ヒト線維肉腫由来細胞であるHT1080細胞を用いた。放射線照射後の細胞のリン酸化H2AXの蛍光免疫組織染色を行った。放射線照射後種々の時間経過後固定した細胞対象として、抗リン酸化H2AXモノクロナール抗体を1次抗体とし、さらに蛍光色素でラベルした2次抗体を用いて蛍光免疫組織染色を行った。蛍光免疫組織染色を行った標本はDAPIによりカウンターステイン後、蛍光顕微鏡を用いて観察し、1細胞あたりのリン酸化H2AXフォーカス数を測定した。形態的に見た場合、リン酸化H2AXフォーカスは核内に認められるとともに微小核内にも認められた。また、照射を行っていない細胞でもわずかながら認められた。まず、1細胞あたりのリン酸化H2AXフォーカス数を照射後経時的に求めた。4Gyを照射した場合、照射1時間ではフォーカス数14.1(SD 6.7)であったが、3時間および6時間後には18.4(SD 7.2)、18.2(SD 7.1)と増加した。24時間後には3.6(SD 3.1)まで減少した。次に照射24時間後のリン酸化H2AXフォーカス数と照射線量の関係を求めたところ、OGyでは1.0(SD 2.0)から3Gy 1.7(SD 1.7)、6Gy 5.2(SD 4.1)、9Gy 7.5(SD 5.5)と直線的に増加した。形態的には線量が多い方がフォーカスのサイズが大きい傾向を認めた。本年度で安定してリン酸化H2AXフォーカスが得られるようになったので、次年度は細胞の種類を変えながら、細胞生存率とフォーカス数の関連を求めていく。本年度ではin vitroでリン酸化H2AXの蛍光免疫組織染色により検出されたDNA二重鎖切断数とコロニー形成試験で求めた細胞生存率との関係をヒト悪性腫瘍株を用いて求めた。昨年度の結果から、細胞はplateau phaseのものを用い、照射24時間後に蛍光免疫組織染色およびコロニー形成試験を行った。使用した細胞は線維肉腫細胞HT1080細胞、食道扁平上皮癌細胞TE-9細胞、食道扁平上皮癌細胞KYSE150細胞である。各細胞のDNA Ploidyは、正常ヒトリンパ球を1とするとそれぞれ1.1、1.58、1.58である。使用したいずれの細胞株でも24時間後のリン酸化H2AXフォーカス数は線量依存性に増加した。リン酸化H2AXフォーカス数と細胞生存率との関係をみると、いずれも強い相関関係を認めた。しかしながら、直線の傾きが細胞毎に異なっているため、細胞が異なるとリン酸化H2AXフォーカス数からは細胞生存率は予測できないことが明らかになった。DNA量が多くなればリン酸化H2AXフォーカス数も増加すると考えられるので、それぞれの細胞のDNA Ploidyでフォーカス数を補正すると、各細胞での傾きの差が縮小し、全細胞株でフォーカス数と細胞生存率に極めて強い相関(R2=0.78)が認められた。この結果から、リン酸化H2AXフォーカス数をその細胞のDNA Ploidyで補正することで細胞生存率が予測できる可能性が示唆された。次年度はさらに細胞株の数を増やして上記可能性を確認し、本法による細胞生存率予測法の確立をめざす。本年度もin vitroでリン酸化H2AXの蛍光免疫組織染色により検出されたDNA二重鎖切断数とコロニー形成試験で求めた細胞生存率との関係をヒト悪性腫瘍株について求めた。昨年度と同様に細胞はplateau phaseのものを用い、照射24時間後に蛍光免疫組織染色およびコロニー形成試験を行った。使用した細胞は昨年度使用した線維肉腫細胞HT1080細胞、食道扁平上皮癌細胞TE-9細胞、食道扁平上皮癌細胞KYSE150細胞以外に、4種類の細胞(食道癌細胞KYSE30およびKYSE220、乳癌細胞HCC70およびZR75-1)を追加した。また、各細胞のDNAプロイディを測定した。使用したいずれの細胞株でも、リン酸化H2AXフォーカス数と細胞生存率に強い相関関係を認めた。しかしながら、全7種類の細胞を対象にして評価した場合、弱い相関関係しか認められず、リン酸化H2AXフォーカス数からは細胞生存率は予測できないことが明らかになった。DNAプロイディでフォーカス数を補正すると、5細胞株ではフォーカス数と細胞生存率に極めて強い相関を認めたが、2種類の細胞では大きく異なっていた。HT1080細胞はリン酸化

H2AXフォーカス数に比較して細胞生存率が低く、アポトーシスの寄与が示唆された。一方、KYSE30細胞では逆にリン酸化H2AXフォーカス数に比して細胞生存率が高く、アポトーシス以外の要因の存在が考えられた。この結果から、細胞生存率が予測するためにはリン酸化H2AXフォーカス数をその細胞のDNAプロイディで補正のみでは不十分で、他の要因を加味する必要性が示唆された。
鳥類多様性進化の発生研究基盤：ペンギンの水中飛翔を可能にする発生メカニズム

ペンギンの胚発生研究を可能とする実験基盤を構築した。ペンギン卵を胚操作できる状況を各種許可申請を得るなど制度的にも実質的にも作り出した上で、細胞系譜追跡実験など胚操作実験を行った。その結果、ペンギン前肢の第1指形成不全が発生段階27以降に生じること、この過程で細胞増殖の低下が見られること、過剰なbmp4遺伝子の発現が見られること、などが明らかとなった。風切羽形態の特殊性を明らかにするために、ニワトリ胚における風切羽発生について詳細な記述を行った。本研究計画によって、世界で唯一かつ初めての試みとしてペンギン胚の発生研究モデル化の基盤が構築できた。本研究は鳥類の中でとくに形態が特殊化したペンギンにおいて、鳥類で極めて保存性が高い共通派生形質である前肢の形態の変形を引き起こした発生メカニズムを明らかにすることを目的とする。1.ペンギン胚の発生段階表の作成本研究を行う上で前提となるペンギン受精卵の手配について、平成26年度においても引き続き平成東京動物園協会・葛西臨海水族園から継続して提供を受ける体制を整え、十分な受精卵を得ることができた。その結果、発生段階表を作成するための胚の固定標本の採集はほぼ終了し、現在発生段階表の作成と論文発表の準備を進めている。2.ペンギン胚肢芽の形態変化および骨組織の形態学的・組織学的データ分析平成26年度はペンギンの前肢の扁平な形状について特殊化の過程を調べるため、上記の発生段階表において形態の観察を行うとともに、Aggrecanのin situハイブリダイゼーションにより骨形成過程をニワトリ胚と比較した。また、前肢の第1指の形成不全の原因となる発生プログラムの解析のため、ペンギン胚前肢における細胞増殖(PHH3抗体)や細胞死(TUNEL法、ナイルブルー染色)の検出、また肢芽の前側の形態形成に関わると考えられるいくつかの遺伝子(HoxA11-13、Mkp3、sef、tskなど)の発現解析を行い、ニワトリ胚との比較を行った。さらに、これらの固定胚を用いた実験で得られた結果をさらに解析するため、生きた状態の胚を取り扱うことができるように関係する手続きを行い、平成27年度からは生きている胚に対する実験発生学的な手法による解析を行うことが可能となった。本年度はペンギンの胚発生研究を可能とする基盤のうち、これまで固定標本しか実験に用いることができなかった状況を改善し、ペンギン卵を胚操作できる状況を制度的にも実質的にも作り上げた。水族館との新しい共同研究を申請し、大学に譲受けの許可申請を行い、最終的に環境省にペンギン卵の輸送の申請を行うなどの制度的道筋をつけた。さらに、実際の輸送方法、ふ卵方法、卵の滅菌方法、卵殻の開け方や胚操作の方法などをひとつひとつクリアし、細胞系譜追跡実験など胚操作実験を可能とした。それらの実験の結果、ペンギン前肢(翼)の第1指形成不全が発生段階27以降に生じること、それには過剰な細胞死は伴わず細胞増殖の低下が見られること、過剰なbmp4遺伝子の発現が見られること、などを明らかにした。また、ニワトリとペンギンを比較するうえでさらに系統て駅に両者の中間に位置する動物種を比較に加えるため、キンカチョウ卵の入手を行い指形成について解析を行った。これらの内容について複数の学会発表を行った他、現在論文作成中である。また、鳥類および他の四足動物の指形成について比較研究を行う目的で、ニワトリおよびペンギン胚を比較対象として実験に用いた。そのなかで、AP2b遺伝子が指の指骨形状の形態形成に関与することを示し、また鳥類哺乳類との比較の中から両生類の一部の種が6番目の指をもつことを示した。これらを論文として発表した。平成26年度の研究実施計画は3次元形態解析を除きほぼ順調に遂行し成果を得ており、発生段階表については論文の作成に着手している。また、当初計画では困難と思われた生きた胚を用いた解析を行うため、ペンギン胚の運搬や動物実験計画について、綿密な計画のもとに手続きを行い、関係機関からの了承を得て、平成27年度から自らの研究室内においてペンギン胚を用いた実験を行う準備が整った。発生生物学本研究課題において、当初計画では予定していなかった生きた胚を実験操作できるようになったことから、今後は、実験発生学的な手法による解析に適した実験計画である、3.ペンギンの特徴を生み出す発生メカニズムの解析、に重点をおいて解析を進める。当初の計画どおり固定正常胚における細胞分裂、細胞増殖、細胞死、細胞形態などの細胞レベルの解析を進めるほか、FGF阻害剤などの薬剤添加やAER切除を行った実験胚における解析も行う。また、細胞標識により肢芽の間充織や上皮の発生系譜を解析し、ペンギン胚の扁平な形態や第1指の形成不全の原因となるメカニズムを解析する。また、これらの実験が順調に進捗した場合には、得られた成果から予想される原因遺伝子の機能解析(エレクトロポレーション法を用いた過剰発現、siRNAによる機能阻害など)を行う予定である。

また、風切り羽の消失については、研究代表者らが発見した新規風切り羽マーカー遺伝子とそのエンハンサー解析がニワトリを用いて順調に進んでおり、それらの成果をペンギン胚へと適用、比較する。
近代化にともなうトンガ小児のイモ摂食の変化と健康度との関連に関する食生態学的研究

他国に類をみないトンガ成人の"健康な肥満"の成立と小児期からの健康や食事パタンとの関係を、食環境変化との対応で明らかにするために、首都コロフォウ地区(以下K)、離島ウイハ地区(以下U)及び移住先の一つニュ-ジ-ランドマヌカウ地区の0ー19歳904名、20歳以上383名の比較調査をおこなった。1.加齢と"健康な肥満"との関係(1)体格(身長・体重)からみた健康度は全般に良好で、WHO基準により低栄養が問題になる児はほとんどみられない。しかし、97パ-センタイル以上の過体重児が1ー5歳U7.0%、K10.8%、6ー18歳でU6.0%、K12.5%と著しく高率を示す。特にUよりKで、男児より女児で、10歳ごろから高率でかつ個人差が大きくなる。肥満指標のBMIにおいても同様の傾向がみられ、いわゆる肥満体型の児が多いことが確認された。(2)病態、生理機能からみた健康度は必ずしも良好ではなく、要治療児、要観察児を合わせてU13.0%、K9.5%である。しかし、その主な問題点はU、K共に皮膚疾患である。これらの結果から、過体重児が多い傾向は成人の"健康な肥満"の成長過程に位置づけてよいと考えられる。しかし、一方成人について特にKで高血圧や糖尿病等をともなう"病的な肥満"が増加していること及びHBV関連マ-カ-の保有者率が高いなどの衛生状態から、本対象児でみられる過体重傾向がこれらの予備的状態とみることもできる。(3)口腔からみた健康度は小学校高学年を例にすれば、う蝕、歯肉炎共にUよりKで多く、かつここ数年著しく増加している。加えて、歯と顎骨の不調和である不正咬合は成人15.3%に対し、高学年20.5%、低学年30.9%と低年齢でより高率を示し、この影響は幼児にも及び、乳歯咬合期における叢生や閉鎖型歯列がみられている。野外調査用筋電図記録法(本調査で開発)を用い測定した咀嚼機能量の低いことと、顎骨の発育不全の関連が密接であることが示された。2.加齢とイモを中心とする食事パタン、栄養との関係(1)イモを中心とした食事パタンの摂食者率は、UよりKで低い。離乳食にいもを食べる児U85.7%、K53.5%、日常的な摂食児は8ー12歳84.4%、K75.2%、12ー19歳U100.0%、K88.4%である。魚の日常的な摂食児率はさらに低く、8ー12歳U51.8%、K31.3%、12ー19歳U69.3%、K27.9%にすぎない。(2)エネルギ-摂取量は、平均値としてはFAOの南太平洋地区基準値に近似しているが、個人差が大きく、特にKで著しい。脂肪からの摂取率で差が著しいが、前項1に示した過体重との個人的な関係はみられない。各種栄養素摂取についてもUよりKが平均的には摂取率が高く、かつ個人差が大きくみられた。これらはイモを中心とする食事パタンからパンを中心とする食事パタンへの移行によるところが大きく、粗せんい量の低下等咀嚼機能量の変化を含めて口腔の健康度に直接的に関係していることが示唆された。3.キ-フ-ズを中心とした食環境の変化食料輸入量は1976年から1990年までに40%増加し、それにともなう対象地区内の輸入食物の流通量を示す食料品店数が、U1977年2店から、1991年6店、K1977年32店から1988年78店と増加している。一方、国内産物は、K町では賃労働化や土地不足などを背景として、1990年時点でほぼ完全に自給している世帯が、Uでは、イモ100%、魚60%に対し、Kではイモ60%、魚4%と著しく少ない。にもかかわらずイモの流通量は増加せず、魚の価格は高騰するなど入手条件が悪化している。以上、これらの結果からトンガ成人にみられる"健康な肥満"のくずれは、(1)小児期のイモを中心とする食事パタンからパンを中心とする食事パタンへの移行と密接な関係をもち進行していること、(2)病態や生理機能面より口腔面で、とりわけ不正咬合や歯肉炎を指標とする疾患で進行が著しいこと、(3)いずれも食環境の変化の著しいKが先行し、すでにUもそれらを追いかける形で進行していることが示唆された。

しかし、97パ-センタイル以上の過体重児が1ー5歳U7.0%、K10.8%、6ー18歳でU6.0%、K12.5%と著しく高率を示す。特にUよりKで、男児より女児で、10歳ごろから高率でかつ個人差が大きくなる。肥満指標のBMIにおいても同様の傾向がみられ、いわゆる肥満体型の児が多いことが確認された。(2)病態、生理機能からみた健康度は必ずしも良好ではなく、要治療児、要観察児を合わせてU13.0%、K9.5%である。しかし、その主な問題点はU、K共に皮膚疾患である。これらの結果から、過体重児が多い傾向は成人の"健康な肥満"の成長過程に位置づけてよいと考えられる。しかし、一方成人について特にKで高血圧や糖尿病等をともなう"病的な肥満"が増加していること及びHBV関連マ-カ-の保有者率が高いなどの衛生状態から、本対象児でみられる過体重傾向がこれらの予備的状態とみることもできる。(3)口腔からみた健康度は小学校高学年を例にすれば、う蝕、歯肉炎共にUよりKで多く、かつここ数年著しく増加している。加えて、歯と顎骨の不調和である不正咬合は成人15.3%に対し、高学年20.5%、低学年30.9%と低年齢でより高率を示し、この影響は幼児にも及び、乳歯咬合期における叢生や閉鎖型歯列がみられている。野外調査用筋電図記録法(本調査で開発)を用い測定した咀嚼機能量の低いことと、顎骨の発育不全の関連が密接であることが示された。2.加齢とイモを中心とする食事パタン、栄養との関係(1)イモを中心とした食事パタンの摂食者率は、UよりKで低い。離乳食にいもを食べる児U85.7%、K53.5%、日常的な摂食児は8ー12歳84.4%、K75.2%、12ー19歳U100.0%、K88.4%である。魚の日常的な摂食児率はさらに低く、8ー12歳U51.8%、K31.3%、12ー19歳U69.3%、K27.9%にすぎない。(2)エネルギ-摂取量は、平均値としてはFAOの南太平洋地区基準値に近似しているが、個人差が大きく、特にKで著しい。脂肪からの摂取率で差が著しいが、前項1に示した過体重との個人的な関係はみられない。各種栄養素摂取についてもUよりKが平均的には摂取率が高く、かつ個人差が大きくみられた。これらはイモを中心とする食事パタンからパンを中心とする食事パタンへの移行によるところが大きく、粗せんい量の低下等咀嚼機能量の変化を含めて口腔の健康度に直接的に関係していることが示唆された。3.キ-フ-ズを中心とした食環境の変化食料輸入量は1976年から1990年までに40%増加し、それにともなう対象地区内の輸入食物の流通量を示す食料品店数が、U1977年2店から、1991年6店、K1977年32店から1988年78店と増加している。一方、国内産物は、K町では賃労働化や土地不足などを背景として、1990年時点でほぼ完全に自給している世帯が、Uでは、イモ100%、魚60%に対し、Kではイモ60%、魚4%と著しく少ない。にもかかわらずイモの流通量は増加せず、魚の価格は高騰するなど入手条件が悪化している。以上、これらの結果からトンガ成人にみられる"健康な肥満"のくずれは、(1)小児期のイモを中心とする食事パタンからパンを中心とする食事パタンへの移行と密接な関係をもち進行していること、(2)病態や生理機能面より口腔面で、とりわけ不正咬合や歯肉炎を指標とする疾患で進行が著しいこと、(3)いずれも食環境の変化の著しいKが先行し、すでにUもそれらを追いかける形で進行していることが示唆された。トンガ王国における1988年から1990年にかけての小児やその家族の健康状態の変化は、首都地区だけでなく離島地区においてもかなり進行し、食事パタンの変化への適応がうまくできていないことが主に次の点から明らかとなった。数値は離島地区の値、( )内は首都地区の値。1.口腔からみた健康度:小学6年生を例にすれば、う蝕2度以上の者が1988年12.5%から1990年42.1%(首都地区では58.2%→51.0%)、歯肉炎2度以上の者が同じく18.7%→47.4%(20.4%→58.5%)、不正咬合の者が37.5%ー42.1%(49.0%→49.1%)といずれも高率を占め、かつ増加傾向にある。
トロンボモジュリンの多機能性解析と移植における治療戦略の開発

血管内皮細胞に存在し、凝固系のレギュレーターであるトロンボモジュリン(TM)を用いた移植医療においての治療戦略は、i)敗血症DICの治療薬としてもちいられている可溶性リコンビナントTMの投与とii)TMを血管内皮細胞に膜型に強発現させる2つの方法が考えられる。研究結果より、第一に可溶性hTMの投与は、APCの産生を高め、トロンビンの産生を制御し、過剰なトロンビン産生が予想される、移植直後の虚血再灌流傷害などハイリスクな状況において有用な抗凝固作用が期待されると思われる。一方膜型hTMは、血管内皮細胞膜状での炎症因子を直接抑制する抗炎症効果が期待され、グラフトの長期生着に必要な因子と思われた。【目的】臓器移植では、移植後のグラフトに対する傷害(虚血再灌流傷害、急性・慢性拒絶反応など)を抑制し、いかに長期生着を実現するかが課題となっている。私どもは,補体、凝固、炎症反応がグラフト傷害を憎悪させることに着目し、従来の免疫抑制療法とは異なる視点からグラフト保護を目的とした新しい治療法の開発をめざす。敗血症DICの治療薬として用いられているトロンボモジュリンは、凝固系の生理的調整因子として血管内皮細胞膜に存在し、抗補体、抗炎症作用を併せ持つことが報告されている。移植医療において,トロンボモジュリンの多機能性が臓器移植後のグラフトに対する傷害に有効であるかを評価する。【結果】APCの産生上昇、トロンビン産生の抑制は、S-hTMが有意な効果を認めたが、血管内皮細胞膜上の外因性凝固反応のイニシエーターであるpig TF,また血管内皮細胞の炎症因子であるE-selectinの発現抑制は、MB-hTMが有意な効果を認めた。【結論・考察】S-hTMの投与は、過剰なthrombin産生が予想される、移植直後の再灌流傷害などハイリスクな状況において有用な抗凝固作用が期待される。一方MB-hTMは、血管内皮細胞膜状での抗炎症効果が期待され、グラフトの長期生着に必要な因子と思われる。臓器移植では、移植後のグラフトに対する傷害(虚血再灌流傷害、急性・慢性拒絶反応など)を抑制し、いかに長期生着を実現するかが課題となっている。研究の歴史を繙くと、有効な保存液の開発、カルシニューリン阻害剤によるT細胞制御により、飛躍的に移植成績は向上し、近年では抗体関連型拒絶反応抑制のためのB細胞制御が注目されている。私たちは、補体、凝固、炎症反応が、グラフト傷害を増悪させることに着目し、従来の免疫抑制療法(免疫担当細胞の制御)とは異なる視点からグラフト保護を目的とした新しい治療法の開発をめざす。敗血症DICの治療薬として用いられているトロンボモジュリンは、凝固系の生理的な調整因子として血管内皮細胞膜に存在し、抗補体、抗炎症作用を持つ可能性が示唆されている。本研究では、トロンボモジュリンの特性を分子レベルで解析し、細胞膜発現レベルを調節する因子を見出す。異種移植用に開発したトロンボモジュリン発現クローンブタを用い、その多機能性が臓器移植後の様々な局面で有効であるか評価し、グラフト機能廃絶を阻止し長期生着を可能にする治療戦略を探索する。研究目的臓器移植では、移植後のグラフトに対する傷害(虚血再灌流傷害、急性・慢性拒絶反応など)を抑制し、いかに長期生着を実現するかが課題となっている。平成27年度は、主に異種移植のモデルであるブターヒヒ腎移植モデルによるhTMの凝固抑制効果を確認するためにヒト型トロンボモジュリン(hTM)が導入されたブタ(Galノックアウト、補体制御因子導入)の腎臓をヒヒに移植実験をし、hTM導入により移植臓器を長期生着に導くか確認する予定だったが、成果としてGTKO/hDAF/hTM pig作成に関して、Flow cytometryのsortingシステムによる、GTKO pigより採取したfibroblastにhDAF,hTMが高発現する細胞株の作成までは行うことができたが、核移植によるGTKO/hDAF/hTM pigの誕生にまで至らず、ブターヒヒ腎移植実験を行うことができなかった。