hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ヘテロ接合性を考慮した次世代シークエンサ用ゲノムアセンブラ／遺伝子予測手法の開発

高ヘテロ接合性を持つ二倍体ゲノムのアセンブルはdebruijnグラフが複雑化するため極めて困難な課題であるが、非モデル生物ゲノムの配列決定への要求は極めて高い。そこで、contig作成時、scaffold作成時の双方でヘテロ接合性に起因したグラフ構造の単純化を図る事によりこの問題をクリアした新規Platanusアセンブラを開発した。Platanusアセンブラはシミュレーションデータ、実高ヘテロ接合性サンプルであるベネズエラ糞線虫データ双方に対して、既存アセンブラと比べて高い精度で長く繋がった結果を得る事に成功した。近年のシークエンス技術の進歩により、次世代シークエンサを用いた新規ゲノム解読が比較的容易に試みられるようになってきている。しかし成功を収めているのは、従来からのモデル生物や近交系が確立した生物に限定され、野生種など多くの生物のゲノム解読は、ヘテロ接合性の高さに起因しアセンブルがうまく行かず、行き詰まっているのが現状である。そこで、本研究ではヘテロ接合性の高いゲノムに適応したshort-read向けアセンブラ/および遺伝子予測パイプラインを開発することを第一の目的としている。本年度は、まずdebruijnグラフアルゴリズムを用いたshort-read向け新規denovoアセンブラを開発し、そのcontig作成ルーチンに、ヘテロ接合性に起因して生じるbubble構造を許容するアルゴリズムを組み込んだプロトタイプ版を完成させた。シミュレーションデータを用いたベンチマークでは、他の既存アセンブラよりもより繋がっている事が確認された。また、高ヘテロ接合性ゲノムでの実データによるベンチマークに用いる「正解」データを作成するためベネズエラ糞線虫ゲノムからFosmidクローンの作成を実施した。次年度以降実際のシークエンスに着手する予定である。一方遺伝子予測パイプラインの構築にも着手し、まずは真核生物遺伝子予測を汎用的に実施可能となる基本的なプログラムの実装を実施した。次年度以降RNA-seqデータ等の組み込みを図って行く予定である。本年度は、昨年度までに開発したde bruijnグラフアルゴリズムを用いたshort-read向け新規denovoアセンブラに対して改良を加え、よりよい統計結果と少ないミスアセンブルが得られるように改良を施した。今までは線虫をモデル生物として用い、線虫を実際にIllumina Hiseqでシークエンスしたデータに計算機上でヘテロサイトを導入してベンチマークを実施していた。今年度は実際の高ヘテロ接合性ゲノムであるベネズエラ糞線虫のゲノムを宮崎大学にて抽出、シークエンスしさらに「正解」データとしてベネズエラ糞線虫ゲノムFosmidクローンのシークエンスも実施し、これらをもとにベンチマークテストを繰り返し実施した。作成を実施した。一方遺伝子予測パイプラインの構築に関しては、上記開発したアルゴリズム(グラフ構造中に多分岐を許す)をRNA-seqに適用する事でのRNA-seqアセンブラの開発に着手した。これによりAlternative Spliceで生じる分岐への対応が可能になることが期待される。イルミナ社に代表されるショートリードタイプの次世代シークエンサから得られたデータからの新規ゲノム配列の決定には、主にde bruijnグラフに基づいたものが用いられており、世界中で数多くのプログラムが開発され使用されている。しかし、これらのプログラムではうまくアセンブルされない例も数多く報告されており、その代表的な例として、相同染色体間の配列が大きく異なる、高ヘテロ接合性ゲノムへの適応が挙げられる。本研究では、今までの研究で高ヘテロ接合性ゲノムであることが判明しており、ゲノムサイズが100Mb以下と小さいベネズエラ糞線虫を材料に選び、抽出したゲノムからIllumina HiseqによるシークエンスとFosmidを作成後、これらをシークエンスした双方のデータを用意し分析することで、高ヘテロ接合性ゲノムに対応したアセンブラの開発を実施した。開発されたアセンブラでは、de bruijnグラフ構築によるcontigアセンブルにおいて相同染色体の差異に起因して生成されるbubbleグラフ構造に対応するのみではなく、scaffold作成時にも比較的大きく異なった相同染色体由来のbubble, edge構造を許容し、そのcoverageを分析することで繰り返し配列に起因したbubbleとの区別を付けることで精度の高いアセンブルが実現されている。その精度はFosmid配列との比較によりベネズエラ糞線虫ゲノムでも確認されている。開発されたPlatanusアセンブラは広く一般に公開されており、世界中の研究者に利用されている。26年度が最終年度であるため、記入しない。ゲノム情報26年度が最終年度であるため、記入しない。第一の目標である高ヘテロ接合性ゲノム向けアセンブラのプロトタイプ版が完成していることから進捗はおおむね順調であると言える。

高ヘテロ接合性ゲノム向けアセンブラの開発は順調に進んでおり、ベンチマークにて他のツールよりも良い統計量を示していること、さらには遺伝子予測ツールに関してもプロトタイプ開発が終了していることなどから順調に推移していると考えられる。26年度が最終年度であるため、記入しない。今後は、本年度開発したプログラムをベースにさらによくアセンブルが可能となるように様々な改良を施して行くとともに、正解データの作成を図る事で精度の検証を行って行く予定である。遺伝子予測に関しても同様である。最終年度となる次年度では、今年度までに開発した高ヘテロ接合性ゲノム向けアセンブラをまとめ公開するとともに論文化を計る。また、本アルゴリズムを応用したRNA-seq用アセンブラも同様に公開と論文化を計り、さらにこのツールを遺伝子予測パイプラインの一部として組み込む事で、精度の高い遺伝子予測を実現する。開発したアセンブラの出力結果が正しいかを検証するために、fosmidクローンを作成シークエンスを実施する。そのための試薬代として主に使用する予定である。開発したゲノムアセンブラのベンチマーク用にシークエンスを行っているが、そのサンプルの準備に予定より時間を要したため、次年度に繰り越す事になった。また、同様の理由でそのデータ解析をするサーバの導入も次年度に先送りしたため。上記理由による繰り越し事案を実現するため、Miseqを用いたシークエンス費用および年度始めに解析サーバの導入を予定している。
甲殻類の脱皮抑制ホルモンの作用に関する生理・生化学的研究

甲殻類の脱皮は,Y器官から分泌されるエクジステロイドにより誘導される.また,エクジステロイドの分泌は,眼柄内のX器官-サイナス腺系から分泌される脱皮抑制ホルモン(MIH; Molt-inhibiting hormone)により抑制的に調節されていることが平成13年度と14年度の研究結果より明らかになった.しかし,脱皮前期中盤にエクジステロイド分泌量が急激に増加することから考えると,Y器官がMIHによる抑制的な調節のみで制御されているとは考えにくい.そこで平成15年度は,Y器官の促進的調節について着目し研究を行った.まず,Y器官を促進する物質を検索するために、種々の神経節の抽出物を体外培養したY器官に作用させ,エクジステロイド分泌を測定した.その結果,脳の抽出物をY器官に作用させるとエクジステロイドの分泌が増加した.この結果は,脳内にY器官からのエクジステロイドの分泌を促進的に調節する因子が存在することを示唆している.また,脳抽出物は,脱皮前期前半から中盤のY器官にのみ特異的に作用した.この結果は,脱皮前期前半から中盤のエクジステロイド分泌量の増加には,脳からの促進的な調節が関与していることを示唆している.次に,Y器官促進因子がどのような物質かを調べた.Y器官促進因子が水溶性なのか脂溶性なのかを調べるために,脳抽出抑を水層と有機溶媒層に分配した.その結果,Y器官促進活性は水層にみられた.また,プロテアーゼで処理した脳抽出物をY器官に作用させてもエクジステロイド分泌促進活性はみられなかった.さらに,限外濾過によりY器官促進因子は分子量は3000以下,熱処理にも安定であるということも明らかにした.以上の結果から考察すると,Y器官促進因子は低分子のペプチド性物質である可能性が高い.現在,脳抽出物からY器官促進因子の精製を試みている.甲殻類において,Y器官からの脱皮ホルモン(エクジステロイド)の分泌は,眼柄内のX器官-サイナス腺系から分泌される脱皮抑制ホルモン(Molt-inhibiting hormone ; MIH)により抑制的に調節されているという仮説が,Y器官の培養実験や眼柄の除去実験の結果より提唱されている.しかし,脱皮周期に伴う体液中のMIH濃度の変動についてはどの甲殻類においても報告されておらず,生体内でMIHがエクジステロイドの分泌を調節しているかどうかは明らかでない.そこで,本年度は,昨年度に確立した二抗体サンドイッチ法による時間分解蛍光免疫測定法を用いて,脱皮周期に伴う体液中MIH濃度の変動について解析を行った.まず,脱皮間期(体液中のエクジステロイドレベルが低い時期)の個体から3時間ごとに体液を採取し,体液中MIH濃度の日周変化について調べたところ,MIHの濃度に変化はみられなかった.この結果は,脱皮間期にはMIHは連続的に分泌され,Y器官からのエクジステロイドの分泌を抑制していることを示唆しており,昨年度のMIHの投与実験の結果(平成13年度実績報告書参照)と矛盾しない.次に,脱皮周期に伴う体液中MIH濃度の変動について解析を行った,種々の脱皮ステージの個体から体液を採取し,MIH濃度を測定した.その結果,脱皮間期から脱皮前期(体液中のエクジステロイドレベルが高い時期)に移行するときに体液中のMIH濃度は低いレベルになっていた.この結果より,体液中MIH濃度の減少が脱皮間期から脱皮前期へと移行するときの引き金となっているということが示唆された.甲殻類の脱皮は,Y器官から分泌されるエクジステロイドにより誘導される.また,エクジステロイドの分泌は,眼柄内のX器官-サイナス腺系から分泌される脱皮抑制ホルモン(MIH; Molt-inhibiting hormone)により抑制的に調節されていることが平成13年度と14年度の研究結果より明らかになった.しかし,脱皮前期中盤にエクジステロイド分泌量が急激に増加することから考えると,Y器官がMIHによる抑制的な調節のみで制御されているとは考えにくい.そこで平成15年度は,Y器官の促進的調節について着目し研究を行った.まず,Y器官を促進する物質を検索するために、種々の神経節の抽出物を体外培養したY器官に作用させ,エクジステロイド分泌を測定した.その結果,脳の抽出物をY器官に作用させるとエクジステロイドの分泌が増加した.この結果は,脳内にY器官からのエクジステロイドの分泌を促進的に調節する因子が存在することを示唆している.また,脳抽出物は,脱皮前期前半から中盤のY器官にのみ特異的に作用した.この結果は,脱皮前期前半から中盤のエクジステロイド分泌量の増加には,脳からの促進的な調節が関与していることを示唆している.次に,Y器官促進因子がどのような物質かを調べた.Y器官促進因子が水溶性なのか脂溶性なのかを調べるために,脳抽出抑を水層と有機溶媒層に分配した.その結果,Y器官促進活性は水層にみられた.また,プロテアーゼで処理した脳抽出物をY器官に作用させてもエクジステロイド分泌促進活性はみられなかった.さらに,限外濾過によりY器官促進因子は分子量は3000以下,熱処理にも安定であるということも明らかにした.以上の結果から考察すると,Y器官促進因子は低分子のペプチド性物質である可能性が高い.現在,脳抽出物からY器官促進因子の精製を試みている.
癌の骨浸潤・骨破壊に対するマトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤の応用に関する研究

口腔領域は周囲を骨に囲まれているという解剖学的特徴を持つことから悪性腫瘍の顎骨への浸潤・骨破壊はしばしば認められる.申請者は癌の骨内への浸潤増殖は破骨細胞性骨吸収に引き続いて起こることに着目し,破骨細胞を標的とした治療法を検討してきた.Matrix Metalloproteinase(MMPs)は癌の浸潤・転移を促進する重要な因子であるが,最近,破骨細胞の産生するMMP-9が破骨細胞性骨吸収に重要な役割を果たすことが明かとなった.本研究では,MMP-2,9を特異的に抑制する新規経口MMPs阻害剤(MMI-166)の骨代謝における薬理作用と腫瘍による骨浸潤・骨破壊に対する有効性について検討した.1.in vitroにおけるMMI-166の骨代謝系への影響1)MMI-166はマウス骨髄細胞の1α25(OH)_2D_3による破骨細胞形成には影響しなかった.2)象牙質片吸収系において,MMI-166は成熟破骨細胞の骨吸収活性に影響を与えなかった.2.in vitroにおけるMMI-166のMMPsへの影響骨代謝系の単位である骨芽細胞,破骨細胞,これらの共存培養に対してMMI-166を作用させ回収した培養上清をGelatin ZymogramでMMPs産生を検討したが,特に影響はなく,MMI-166のこれらの細胞のMMPs産生への直接的影響は無いことがわかった.3.in vivoにおけるMMI-166の腫瘍による骨浸潤・骨破壊に対する抑制効果の評価MMPsを発現しないヒト乳癌細胞株MDA-231とMMP-2を強く産生するヒトメラノーマ細胞株A375をヌードマウスの左心腔内注射し誘発した骨転移モデルに対するMMI-166の治療効果をX線学的,組織計測学的に検索した.X線学的に骨破壊抑制効果は認められたが,転移腫瘍の増殖抑制効果は比較的少なく,またMMPs産生の程度の異なる癌細胞株MDA-231とA375で治療効果に大きな差は無かった.このことから,MMPs阻害により骨破壊が抑制されるものの骨・骨髄での腫瘍進展に癌の産生するMMPsの影響は比較的少ないことが示唆された.口腔領域は周囲を骨に囲まれているという解剖学的特徴を持つことから悪性腫瘍の顎骨への浸潤・骨破壊はしばしば認められる.申請者は癌の骨内への浸潤増殖は破骨細胞性骨吸収に引き続いて起こることに着目し,破骨細胞を標的とした治療法を検討してきた.Matrix Metalloproteinase(MMPs)は癌の浸潤・転移を促進する重要な因子であるが,最近,破骨細胞の産生するMMP-9が破骨細胞性骨吸収に重要な役割を果たすことが明かとなった.本研究では,MMP-2,9を特異的に抑制する新規経口MMPs阻害剤(MMI-166)の骨代謝における薬理作用と腫瘍による骨浸潤・骨破壊に対する有効性について検討した.1.in vitroにおけるMMI-166の骨代謝系への影響1)MMI-166はマウス骨髄細胞の1α25(OH)_2D_3による破骨細胞形成には影響しなかった.2)象牙質片吸収系において,MMI-166は成熟破骨細胞の骨吸収活性に影響を与えなかった.2.in vitroにおけるMMI-166のMMPsへの影響骨代謝系の単位である骨芽細胞,破骨細胞,これらの共存培養に対してMMI-166を作用させ回収した培養上清をGelatin ZymogramでMMPs産生を検討したが,特に影響はなく,MMI-166のこれらの細胞のMMPs産生への直接的影響は無いことがわかった.3.in vivoにおけるMMI-166の腫瘍による骨浸潤・骨破壊に対する抑制効果の評価MMPsを発現しないヒト乳癌細胞株MDA-231とMMP-2を強く産生するヒトメラノーマ細胞株A375をヌードマウスの左心腔内注射し誘発した骨転移モデルに対するMMI-166の治療効果をX線学的,組織計測学的に検索した.X線学的に骨破壊抑制効果は認められたが,転移腫瘍の増殖抑制効果は比較的少なく,またMMPs産生の程度の異なる癌細胞株MDA-231とA375で治療効果に大きな差は無かった.このことから,MMPs阻害により骨破壊が抑制されるものの骨・骨髄での腫瘍進展に癌の産生するMMPsの影響は比較的少ないことが示唆された.口腔領域は周囲を骨に囲まれているという解剖学的特徴を持つことから悪性腫瘍の顎骨への浸潤・骨破壊はしばしば認められる.申請者は癌の骨内への浸潤増殖は破骨細胞性骨吸収に引き続いて起こることに着目し,破骨細胞を標的とした治療法を検討してきた.Matrix Metalloproteinase(MMPs)は癌の浸潤・転移を促進する重要な因子であるが,最近,破骨細胞の産生するMMPが破骨細胞性骨吸収に重要な役割を果たすことが明かとなった.これらのことはMMPの抑制は癌の骨破壊,骨内での腫瘍増殖を抑制することが期待できる.本研究では,MMP-2,9を特異的に抑制する新規経口MMPs阻害剤(MMI-116)の骨代謝における作用と腫瘍による骨浸潤・骨破壊に対する有用性を検討した.1.in vitroにおけるMMI-166の骨吸収抑制機序の解析

1)マウス骨髄細胞を1α25(OH)_2D_3存在下で培養する破骨細胞形成系に対しMMI-166は破骨細胞形成に影響を与えなかった.2)新生マウス頭蓋冠を1α25(OH)_2D_3存在下で器官培養し,培養液中のCa濃度を指標にMMI-166の骨吸収抑制活性を測定した.その結果,濃度依存性にCa濃度を抑制した.以上の結果より,MMI-166の破骨細胞形成への影響は無いものの骨吸収抑制効果を示唆するものであった.2.in vivoにおけるMMI-166の腫瘍による骨浸潤・骨破壊に対する抑制効果の評価MMPsを発現しないヒト乳癌細胞株MDA-231をヌードマウスの左心腔内注射し骨転移をモデルを作製した.MMI-166を細胞播種後より経口投与を行い骨転移巣における腫瘍増殖による骨浸潤・骨破壊をX線学的,組織計測学的に検索した.その結果,X線学的には腫瘍による骨破壊が抑制され治療的効果が認められたが,組織計測学的には腫瘍の抑制傾向は認められたものの統計的有意差は認められなかった.口腔領域は周囲を骨に囲まれているという解剖学的特徴を持つことから悪性腫瘍の顎骨への浸潤・骨破壊はしばしば認められる.申請者は癌の骨内への浸潤増殖は破骨細胞性骨吸収に引き続いて起こることに着目し,破骨細胞を標的とした治療法を検討してきた.Matrix Metalloproteinase(MMPs)は癌の浸潤・転移を促進する重要な因子であるが,最近,破骨細胞の産生するMMP-9が破骨細胞性骨吸収に重要な役割を果たすことが明かとなった.本研究では,MMP-2,9を特異的に抑制する新規経口MMPs阻害剤(MMI-166)の骨代謝における薬理作用と腫瘍による骨浸潤・骨破壊に対する有効性について検討した.1.in vitroにおけるMMI-166の成熟破骨細胞の骨吸収活性系への影響マウス骨髄細胞ならびに新生マウス頭蓋冠より単離した骨芽細胞様細胞をコラーゲンゲル上に1α25(OH)_2D_3存在下で培養し,多数の成熟破骨細胞を形成させた.コラゲナーゼを用いてこれらの破骨細胞を回収し,象牙質片上に播種し,成熟破骨細胞による象牙質片の吸収活性に対するMMI-166の影響を検討した.MMI-166は成熟破骨細胞の骨吸収活性に影響を与えなかった.骨代謝系の単位である骨芽細胞,破骨細胞,これらの共存培養に対してMMI-166を作用させ回収した培養上清をGelatin ZymogramでMMPs産生を検討したが,特に影響はなく,MMI-166のこれらの細胞のMMPs産生への直接的影響は無いことがわかった.3.in vitroにおけるMMI-166の腫瘍による骨浸潤・骨破壊に対する抑制効果の評価昨年度に行ったMMPsを発現しないヒト乳癌細胞株MDA-231をヌードマウスの左心腔内注射し誘発した骨転移モデルに対するMMI-166の治療効果の検討と同様の条件でMMP-2を強く産生するヒトメラノーマ細胞株A375に関しても同様の実験を行い,MMI-166の骨転移巣における腫瘍増殖による骨浸潤・骨破壊をX線学的,組織計測学的に検索した.心腔内注射法を用いた骨転移モデルにおいてX線学的に骨破壊抑制効果は認められたが,転移腫瘍の増殖抑制効果は比較的少なく,またMMPs産生の程度の異なる癌細胞株MDA-231とA375で治療効果に大きな差は無かった.このことから,MMPs阻害により骨破壊が抑制されるものの骨・骨髄での腫瘍進展に癌の産生するMMPsの影響は比較的少ないことが示唆された.
人工衛星触媒式スラスタ用耐熱合金の劣化機構の解析

L-605合金はその優れた高温強度および高温耐酸化性から人工衛星に搭載される一液触媒式スラスタの構成材料として使用されている。しかしながら、本合金をN_2およびNH_3の存在する高温環境中に暴露した場合には著しい劣化が生じることが問題となっている。本研究では、Nを含む環境中で熱処理したL-605合金のミクロ組織、力学的特性などを評価し、L-605合金の劣化機構の解明を試みた。N_2ガス雰囲気中で1173Kの温度で86.4ks以上の熱処理を施したL-605合金では硬くて脆いCr窒化物およびW炭化物の析出が認められた。また、L-605合金の力学的特性は熱処理時間の増加にともない低下した。これらの結果から、L-605合金の劣化にはCr窒化物だけでなくW炭化物が寄与していることを明らかにした。特殊環境下熱処理装置の雰囲気ガス調整部および冷却部に改良を行った。また、酸素の影響を極力少なくするために、雰囲気ガスの露点をモニタリングできるように改良を行った。改良した特殊環境下熱処理装置を用いてL-605合金に対してN_2、Arなどの種々の環境中で1073Kから1173Kの温度範囲で最長172.8ksの熱処理を施した。試料表層部に生成した窒化物層の厚さおよび硬さ、試料表層部の合金組成変化などの評価および窒化物の同定を行った。N_2ガス雰囲気中で1073Kの熱処理を施したL-605合金では、熱処理時間が増加しても試料表層部における合金組成に変化は認められなかった。一方、N_2ガス雰囲気中で1173Kの熱処理を施したL-605合金では、熱処理時間の増加にともない試料表層部のCr濃度が増加する傾向が認められた。また、Arガス雰囲気中で1173Kの熱処理を施したL-605合金においても試料表層部のCr濃度が熱処理時間の増加にともない増加する傾向が認められた。本研究によりArガス雰囲気中においてもN_2ガス雰囲気中と同様なCrの濃化が生じることが明らかになった。N_2ガス雰囲気中で1173K、172.8ksの熱処理を施したL-605合金試料の表層部に形成された窒化物はCr_2Nであり、その厚さおよび硬さはそれぞれ約10μmおよび約Hv340であった。L-605合金の実機燃焼試験により形成される窒化物層の厚さは本研究の熱処理とほぼ同じ試験時間で約50μmであるため、軌道上の暴露雰囲気を再現するためには熱処理雰囲気の圧力の影響についても検討する必要があることがわかった。また、いずれの雰囲気および熱処理温度においても、172.8ksの熱処理を施すことによりL-605合金の結晶粒径は約120μm以上に粗大化した。結晶粒粗大化および粒界析出物の形成もL-605合金の劣化に寄与していると考えられる。H20年度に改良を行った特殊環境下熱処理装置を用いてL-605合金に対して熱処理を行った.熱処理条件はN_2ガスおよびArガス雰囲気中にて1173Kの温度で最長保持時間345.6ksとした.熱処理後の試料のミクロ組織観察硬さ測定,引張特性を評価し,L-605合金の劣化におよぼすNの影響を検討した.N_2ガス雰囲気中で1173K,172.8ksの熱処理を施したL-605合金の表層部および試料内部の結晶粒界に化合物層および析出物の形成が認められた.SEMに付属のEDAX機能を用いてそれら化合物相および析出物の元素分析を行った結果,試料表層部ではCrを主体とする窒化物が形成されており,また試料内部の結晶粒界ではWを主体とする炭化物が形成されていることが明らかになった.いずれの析出物もマトリックスと比較して非常に硬くて脆いため,これら析出物の生成がL-605合金の劣化に寄与すると考えられる.熱処理前のL-605合金の0.2%耐力,引張強さ,破断伸びおよび断面減少率はそれぞれ466MPa,977MPa,50%および40%であった.一方,N_2ガス雰囲気中で1173K,345.6ksの熱処理を施したL-605合金の0.2%耐力,引張強さ,破断伸びおよび断面減少率はそれぞれ436MPa,848MPa,16.2%および15.3%であった.

また,Arガス雰囲気中で同様の熱処理を施した-605合金およびN_2ガス雰囲気中で1173K,345.6ksの熱処理後に窒化層を研磨により除去したL-605合金にの引張特性はN_2ガス雰囲気中で1173K,345.6ksの熱処理を施したL-605合金とほぼ同等であった.これらの結果から,L-605合金表面に形成される窒化物層の劣化への寄与は少ないと考えられる.L-605合金の劣化抑制にはPtおよび同族元素による被覆が有効である可能性が示唆された.H22年度はN_2ガス雰囲気中で熱処理したL-605のミクロ組織の同定,機械的特性評価などを行い劣化因子の詳細な検討を行った.また,L-605の代替材として使用が開始されているInconel 625についても同様の熱処理を施し,スラスタ材料としての信頼性評価を行った.なお,いずれの合金についても熱処理温度は1173Kとし,最長1036.8ksの熱処理を施した.L-605においては,N_2ガス雰囲気中で1173Kの熱処理を施すことにより破断伸びおよび断面減少率の著しい低下が認められた.1173Kで1036.8ksの熱処理を施したL-605の破断伸びおよび断面減少率は熱処理前のL-605のそれらの値の16%および22%までそれぞれ低下した.一方,同様の熱処理を施したInconel 625の破断伸びおよび断面減少率の値は熱処理前のInconel 625のそれらの値の84%および81%であり,Inconel 625においてはN_2ガス雰囲気中で長時間の熱処理を施しても比較的高い延性が維持されることが明らかになった.また,N_2ガス雰囲気中で長時間の熱処理を施したL-605ではCr窒化物とW炭化物の形成が認められたが,同様の熱処理を施したInconel 625ではこれらの析出物の形成は認められなかった.これらの結果から,L-605の劣化(脆化)には熱処理により形成されるCr窒化物とW炭化物が寄与していること,またこれらの析出物が形成されにくいInconel 625はL-605の代替材として高い信頼性を有することが明らかとなった.
内皮細胞由来血管平滑筋過分極因子の糖尿病病態における変化および酸化LDLの関与

本研究の目的は、動脈硬化を促進する病態において増加しているlysophosphatidilcholine(LPC)の内皮細胞由来血管平滑筋過分極因子(EDHF)に対する影響を検討し、LPCの動脈硬化促進因子としての可能性およびそのメカニズムを検討することである。エーテル麻酔下に摘出したWistar ratの腸間膜動脈標本を作成し、膜電位変化を微小電極法により、また血管弛緩反応を張力トランスデューサーを用いて測定した。アセチルコリン(ACh)は、濃度依存性に、内皮細胞依存性に、血管平滑筋細胞の膜電位を過分極させた。例えば、ACh 10^<-6>Mは、膜電位を-16.4±0.4mV過分極させた。LPCはそれ自体では、膜電位変化を引き起こさなかったが、前投与により、AChの膜電位過分極反応を3μM以上で有意に抑制した(抑制率は、LPC 3μM;13%,5μM;52%,10μM;95%)。Pinacidilは、内皮細胞非依存性の血管平滑筋細胞の膜電位を過分極させたが、この過分極反応はLPCの前処置により影響を受けなかった。すなわち、LPCは、EDHFの過分極作用ではなく、EDHFの産生ないし放出を抑制し、AChによる膜電位過分極反応を抑制するものと推定された。AChは、indomethacin存在下に、phenylephrineで前収縮させた血管を内皮細胞依存性に弛緩させた。例えば、ACh 10^<-6>Mは血管を100%弛緩させた。さらに、NOの合成酵素阻害薬である、L-NNAで前処置すると、最大血管弛緩反応は、70%に減弱した。この弛緩反応は、EDHFによる弛緩反応であるが、これは、LPC10μMの前処置により、ほぼ完全に抑制された。以上より、LPCは、血管内皮細胞からのEDHF放出を抑制することにより、AChによる膜電位過分極反応および血管弛緩反応を抑制することが判明した。このLPCの作用は、LPCが増加する病態である糖尿病、高血圧症などにおける血管障害の原因の一つとして関与する可能性が示唆された。
肺筋線維芽細胞にHSP47siRNA特異的導入による肺線維症治療薬の開発

筋線維芽細胞でのHSP47の発現を特異的にブロックするために、VitaminAを用いたドラッグデリバリシステムを開発した。本ドラッグデリバリシステムを用いてHsP47siRNAを肺筋線維芽細胞に特異的に導入させ、肺線維症治療効果があるかどうか検討した。ラット肺線維症モデルに対してHSP47siRNAの投与により、肺線維化抑制効果を確認した。その線維化抑制メカニズムは、直接的なコラーゲン産生抑制だけではなく、サイトカイン産生抑制や筋線維芽細胞のアポトーシス誘導も関与していることを明らかにした。本研究の目的は、肺線維症で増加した肺筋線維芽細胞でのHSP47の発現を、アンチセンス法より少量で強力に遺伝子をノックダウンできるsiRNAを用いた遺伝子ノックアウト法を用いて抑制し、肺線維症動物モデルを用いて肺線維化抑制効果を確認することである。さらに、標的細胞である肺筋線維芽細胞の細胞特異性を利用し、特異的にsiRNAを導入するためのドラッグデリバリーシステムを確立することである。本年度は、ラットブレオマイシン肺線維症モデルを作成し、経静脈的にVitamin Aを混じたリポソームで封入したHSP47siRNAを投与した。投与3週間で、肺線維化は有意に抑制され、肺線維化抑制効果を確認できた。この効果はVitamin Aがあることで有意に作用し、肺筋線維芽細胞に特異的にHSP47siRNAが取り込まれたことが推測され、肺筋線維芽細胞にもVitaminAを取り込む細胞特異性があることが示唆された。また、肺胞洗浄液中の細胞数も有意に抑制された。HSP47の発現の抑制により、直接的もしくは間接的に肺の炎症をも抑制する作用があることも示唆された。来年度は、その線維化抑制、炎症抑制メカニズムのさらなる解明と、人への治療応用を考慮した上で、ある程度肺線維化が進行した時点でHSP47siRNAを投与した場合、肺線維化を改善もしくは進行を抑制させる作用があるかどうかを確認することを予定している。昨年度は、ラットブレオマイシン肺線維症モデルを作成し、経静脈的にVitaminAを混じたリポソームで封入したHSP47siRNAを投与し、肺線維化抑制効果を確認した。本年度は、その線維化抑制、炎症抑制メカニズムの検討を行った。ブレオマイシン投与2週間後よりHSP47siRNAを3週間投与した。投与により線維化の進行が抑制され、治療効果も確認できた。さらに本モデルでは、肺組織中のIL-1β、肺胞洗浄液中のTGF-β1の産生抑制が見られ、サイトカイン産生抑制も確認した。また、HSP47siRNA投与により、線維化病巣のアポトーシス細胞が増加しており、筋線維芽細胞のアポトーシス誘導も示唆された。以上の結果より、本ドラッグデリバリーシステムによるHSP47siRNA投与は、肺線維化抑制効果があり、そのメカニズムとして直接的なコラーゲン線維産生抑制だけではなく、サイトカイン産生抑制、筋線維芽細胞のアポトーシス誘導が関与していることが明らかとなった。
全身振動による流産発生機序に関する研究

全身振動の暴露を受ける作業環境で働く妊娠中の女性労働者は、その全身振動により流産をはじめとする正常妊娠の障害が生じることが疫学的調査や症例検討により指摘されてはいるが、その発現機序についてはほとんど知られていない。そこで、全身振動による正常妊娠への障害を実験的に証明し、またその際生じる子宮血流量の減少がいかなる内分泌的機序によるかを明らかにするために、ラットに振動数8Hz、振動加速度10m/s^2の全身振動を90分間負荷した結果、全身振動暴露を施したラットでは暴露による子宮血流量の有意な減少を認めた。アンギオテンシンII(AII)前投与のラット子宮血流量は振動暴露を受けない群では増加を認めたが、振動暴露群ではその減少が観察された。コルチコステロンの値は振動負荷後に増加を認め、この増加はAII投与によってまったく影響を受けなかった。AII前投与の有無にかかわらず、対照群と全身振動暴露群の間にエストラジオールの有意な変化はなかった。全身振動負荷によるプロゲステロンの減少を認めたが、AII投与後には、全身振動の影響は認められなかった。AII投与の有無にかかわらず、振動群のプロスタグランジンE_2(PGE_2)は対照群に比べ減少を示した。プロスタグランジンF_2alphaについては、AII投与の有無にかかわらず、全身振動の影響が認められなかった。これらの結果から、全身振動によって子宮血流量が減少し、また妊娠黄体への機能障害を惹起するという正常妊娠への障害が実験的に証明された。この子宮血流量の減少は、主に全身振動の有する情動ストレスとして作用によるPGE_2への制御を介して生じると考えられた。
CAGリピートの伸長した新規遺伝子の脊髄小脳失調症への関与

我々が保有する検体のうちで未だ原因遺伝子が不明なものについて脊髄小脳失調症14型(SCA14)および同16型(SCA16)を検索した。SCA14はprotein kinase Cのγsubtype(γPKC)をコードするPRKCG遺伝子、SCA16はContactin 4(CNTN4)遺伝子が原因と報告されている。PRKCG遺伝子のエクソン4をスクリーニングしたところ、新たなC/Tミスセンス変異を同定した。本変異を有する症例の臨床症状は基本的には失調症状であるがてんかんをきたすものもあり、幅広いものであった。全体での本遺伝子の変異はこの1家系のみで認められ、日本におけるSCA14の占める割合は低いものと考えられた。CNTN4のc.4256C>T変異のスクリーニングでは同部位の変異を認める症例はなく、日本人においてはきわめて稀な変異・疾患であると考えられた。これまでの検討により家族歴のはっきりしたグループではSCA6の頻度が25.3%と最多で、次いでSCA3が23.1%、DRPLAが8.2%、SCA1が4.0%と続き、原因不明のものが34.8%であることを報告した。SCA6の原因遺伝子のCACNA1AのCAGリピートが伸長している家系を欧・南米・極東から収集し、ハプロタイプ解析を行った。中核となる疾患関連ハプロタイプはどの地域でも見出された。このコアハプロタイプは親が健常なde novo患者でも見出され、SCA6の病変座におけるCAGリピートの伸長しやすさの素因を共有していることが推測された。CAGリピートが伸長している候補遺伝子のスクリーニングではリピート数の分布はheterogeneityを有するものの、パターンは正常群と類似しており、かつリピートの伸長しているものは認めなかった。検体については今年度は38検体増加した。protein kinase Cのγsubtype(γPKC)をコードするPRKCG遺伝子変異は脊髄小脳失調症14型(SCA14)の原因として報告されている。我々が保有する検体のうちで未だ原因遺伝子が不明な検体は約3割を占めている。それらの検索として本遺伝子のエクソン4をスクリーニングしたところ、あらたなC/Tミスセンス変異を同定した。CAGリピートが伸長している候補遺伝子の一次スクリーニングは9つおこなった。このうち4つについてはpolymerase chain reaction(PCR)がまったく反応せず、プライマーの再設計が必要であることが判明した。1つについてはPCR反応が不十分であり、これについてもプライマーの再設計が必要であることが判明した。5つについては正常群で検討した結果、リピート数の分布はheterogeneityを有しており、脊髄小脳失調症群での検討が必要であると判断した。このうち3つについて脊髄小脳失調症群で検討したところ、リピート数の分布はheterogeneityを有するものの、パターンは正常群と類似しており、かつリピートの伸長しているものは認めなかった。検体は今年度59検体収集した。脊髄小脳失調症16型(SCA16)の原因遺伝子としてContactin4(CNTN4)が報告されたことを受けて、我々が保有する検体のうちで未だ原因遺伝子が不明な323検体(296家系)について検討した。CNTN4のc.4256C>Tの点変異が疾患と関係するとの報告に基づき、PCR-restriction fragment length polymorphismで解析した。保有検体のなかでは同部位の変異を認める症例はなく、日本人においてはきわめて稀な変異・疾患であると考えられた。

これまでの検討により家族歴のはっきりしたグループではSCA6が25.3%と最多で、次いでSCA3が23.1%、DRPLAが8.2%、SCA1が4.0%と続き、原因不明のものが34.8%であることを報告した。SCA6の原因遺伝子のCACNA1AのCAGリピートが伸長している家系を欧・南米・極東から収集し、ハプロタイプ解析を行った。中核となる疾患関連ハプロタイプはどの地域でも見出された。このコアハプロタイプは親が健常なde novo患者でも見出され、SCA6の病変座におけるCAGリピートの伸長しやすさの素因を共有していることが推測された。CAGリピートが伸長している候補遺伝子のスクリーニングでは脊髄小脳失調症群でリピート数の分布は正常群と類似しており、かつリピートの伸長しているものは認めなかった。
香道の「六国五味」にみる沈香のバリューチェーンの確立と課題

本研究は、熱帯雨林産物の中でもアジアの社会や文化との関わりが深く、かつ市場価値の高い沈香に注目し、そのバリューチェーンがどのように確立されてきたのかを追究する。日本独特の遊芸であるところの香道では、沈香一片を大切に扱ってきた歴史がある。さらに、沈香の産地に由来する6つの種類と5つの味に分類する「六国五味」には、トレーサビリティへの関心を見てとることができる。フィールド調査結果から、今日原産地を国という単位で扱うのは適切ではなく、より厳密で詳細な産地情報に基づくトレーサビリティが求められているということができる。本研究は、熱帯雨林産物の中でも特に社会や文化との関わりが深く、かつ市場価値の高い沈香に注目して、そのバリューチェーンがどのように確立されてきたのかを追究する。香道では、「六国五味」と称して沈香の産出国や積出港に由来する6つの種類と5つの味の分類が行われてきた。6つの原産地はいったいどこを指しているのか。また、産地の範域はどのように変化し、広がってきたのか。沈香のバリューチェーンの形成過程の追究は、その高い経済価値だけでなく、相対的に公正なとり引きが行なわれてきたという点から、森林の持続的利用モデルへの含意が大きいと考えられる。1、10th Conference on Hunting and Gathering Societies (CHAGS10,リヴァプール大学、イギリス)にてポスター発表を行い、有益な意見交換ができた。また、大英帝国時代の貿易ルートに関する資料収集なども行った。3、インドのプーネ近郊のSasvadで「六国」に関する聞きとりを行った。またコーチンなどで香料貿易に関する資料収集を行った。4、国内の香木店での聞きとりを行った。香道では、「六国五味」といって、沈香の産出国や積出港に由来する6つの種類と5つの味の分類が行われてきた。等級の分類はだれがどのように行っているか。2.マレーシア、サラワク州のバラム河流域の沈香の仲買人に対して、聞きとり調査を行った。3.ミャンマーとラオスにおいて、沈香植林と沈香オイル生産の現状について企業等に聞きとりを行った。4.国内の香木店において聞きとりを行った。沈香と関連のある香道や仏教に関する史料を収集した。インドのアッサム州は沈香植林に関する研究とビジネスの最前線である。昨年度訪問したミャンマーやラオスの沈香オイルの生産企業もインド同州で技術研修を受けたり、情報収集を行ったりしていた。まず、インド環境省(環境森林気候変動省)傘下のアッサム州Jorhatにある熱帯林研究所(Rain Forest Research Institute)を訪問し、所内の植林地や実験室を視察し、情報収集を行った。次に、同州内のHojaiでは、Ajimal社の植林地を見学した。同社からほど近い8ヘクタールの植林地には約4万本、10ヘクタールの植林地には約4万5千本のマラッカ沈香(Aquilaria Malaccensis)が植栽されていた。さらに、大規模な植林地もあるとのことだった。この地で生産された沈香オイルは主に中東方面で利用されている。イギリスの大英図書館アジア・アフリカ資料室では、ヨーロッパと東南アジア、南アジア、日本を含む東アジアの香料関連の貿易史の資料を収集した。これまでの収集データをもとに、近刊の図書『狩猟採集民からみた地球環境史ー自然・隣人・文明との共生』において、東南アジア島嶼部における狩猟採集民と隣人との関係について論考をまとめた。同考では、林産物採集を含む狩猟採集という生業を営んできた人びとの社会関係について論じた。その手がかりとして、ボルネオ島の狩猟採集民をめぐり論争の的となったカール・ホフマンの問題提起から検討した。ホフマンの仮説は、狩猟採集民プーナン人(Punan)は農耕民社会から分離した人びとに由来し、アジアの交易ネットワークに組み込まれる形で林産物採集に特化して生き残ってきたというものである。この仮説は妥当なのか。仮説への反論を踏まえた上で、狩猟採集民はなぜ今日まで存続できたのかについて追究した。沈香の産地から小売段階までバリューチェーンの全体像に関する調査はおおむね計画通りに進展している。今後、入手した資料データの分析を深める。環境社会学研究計画に挙げた調査対象はおおむねカバーできたが、まだ情報が不確かな部分も残る。

再訪問して、残された課題を解明するとともに、研究成果を積極的に発信していく。研究計画に照らして、着実に成果を蓄積しつつある。おおむね順調だが、研究のさらなる進展には入手した資料データの読み込みが欠かせない。当初計画していた海外調査(大英帝国時代の貿易ルートに関する追加調査)を次年度に延期したため。今後、沈香産出国の過去の森林状態や輸出統計資料を調べる。関連の資料は植民地時代の宗主国であるイギリスにも多数存在することから、大英図書館のインド省資料にもあたる。マレーシアでは沈香の仲買人に聞きとりを行う。また、本研究成果を国際的な水準で発信していく。平成27年度中に、平成26年度の残額分による海外調査(大英帝国時代の貿易ルートに関する追加調査)を平行して実施し、その結果を総合的な分析につなげていく。
非生合成および生合成経路によるセルロース合成ならびにその生成機構に関する研究

セルロースは地球上に最も豊富に存在する人類にとってかけがえのない再生産される貴重な有機資源である。それは、古くから衣住において様々な形で用いられ、今後、21世紀のマテリアルサイエンスの中枢をなす高分子材料として注目されている。本研究の目的はセルロースの生成機構を、非合成経路と生合成経路との両面から日米間の国際協力を通して総合的に解明することである。1.高分解能電子顕微鏡による合成セルロースIIの形態観測酵素触媒重合の基質であるフッ化セロビオシルとセルラーゼ(オノヅカ)をアセトニトリル/緩衝液(5:1)中、銅グリッドに吸着させ、2%酢酸ウラニルでネガティブ染色して調製した試料を電子顕微鏡で観察した。t=0では、相分離の跡が観察されるのみであるが、t=30秒、t=60秒では、生成セルロースが相分離の境界から生長している様子が観察された。t=90秒の不定形セルロースは、長時間重合後(t=90分)の形態に類似している。90分後の生成物はセロビオヒドロラーゼ-金錯体により、強力にラベルされた。また、生成物の電子線回折(ED)により、生成セルロースはII型であることが明らかになった。2.高分解能電子顕微鏡による合成セルロースIの形態観測セルラーゼ(オノヅカ)はTrichoderma viride由来の粗酵素であり、数百のタンパク成分を含んでいる。これら成分の中から、合成セルロースの生成に関与している成分を分離・濃縮した結果、重合活性を持つ酵素はこの粗酵素の少量成分であることが分かった。部分精製画分(6本のバンドを含む)を触媒に用い、フッ化セロビオシルの重合を行い、同様に電子顕微鏡で生成物の形態観察を行った。その結果、合成セルロースの中に不定形のセルロースIIに混じって、長いフィブリルが少量観察された。このフィブリルは天然のセルロースIの形態に類似しており、セロビオヒドロラーゼ-金錯体とよく結合した。フィブリル状物質の比率を高めるために、各種反応条件、特に溶媒組成を様々に変えて検討した結果、アセトニトリル/緩衝液比を2:1にした場合が最適であることを見いだした。この条件では、フィブリル状物質の比率が高まり、5:1溶媒の場合よりも、太く長いフィブリル束が定常的に観察された。また、この試料での電子線回折図形は明確なセルロースIのパターンを示した。今回の試験管内での酵素触媒重合によりセルロースIが合成された理由は、酵素の精製により合成活性を持つ成分の濃度が高められたこと、相分離によりミセルが形成されることにより、合成サイトが局在化することによって、一方的にそろった多数のセルロース分子が高い密度で同時成長することが可能になったためと考えられる。以上の知見に基づいて、今後試験管内反応を利用して天然には存在しない分子量や結晶形態を持つ新しいセルロース材料を創出することが可能になるものと思われる。また、これらの結果は明確な反応によってセルロースが生成する過程を観察した初めての例である。今回の協同研究で得られた知見は、セルロースの人工の場での生成機構を生合成経路と比較しながら解明していく上で基礎的かつ重要なものであり、セルロース科学を含む高分子化学ならびに生物学に大きなインパクトを与えた。

この条件では、フィブリル状物質の比率が高まり、5:1溶媒の場合よりも、太く長いフィブリル束が定常的に観察された。また、この試料での電子線回折図形は明確なセルロースIのパターンを示した。今回の試験管内での酵素触媒重合によりセルロースIが合成された理由は、酵素の精製により合成活性を持つ成分の濃度が高められたこと、相分離によりミセルが形成されることにより、合成サイトが局在化することによって、一方的にそろった多数のセルロース分子が高い密度で同時成長することが可能になったためと考えられる。以上の知見に基づいて、今後試験管内反応を利用して天然には存在しない分子量や結晶形態を持つ新しいセルロース材料を創出することが可能になるものと思われる。また、これらの結果は明確な反応によってセルロースが生成する過程を観察した初めての例である。今回の協同研究で得られた知見は、セルロースの人工の場での生成機構を生合成経路と比較しながら解明していく上で基礎的かつ重要なものであり、セルロース科学を含む高分子化学ならびに生物学に大きなインパクトを与えた。セルロースは地球上に最も豊富に存在する人類にとってかけがえのない再生産される貴重な有機資源である。本研究の目的はセルロースの生成機構を、非生合成経路と生合成経路との両面から日米間の国際協力を通して総合的に解明することにある。1.酵素触媒重合モノマー、フッ化β-D-セロビオシルの合成セロビオースオクタアセタートを出発原料とし、プロモ化、フッ素化、アセチル基の除去を行うことにより、モノマーであるフッ化β-D-セロビオシルを大量合成した。2.セルラーゼによるフッ化β-D-セロビオシルの重合条件の最適化フッ化β-D-セロビオシルのセルラーゼ触媒による重合条件を詳細に検討した。その結果、重合を有機溶媒-水系で行う、目的とする重合反応が効率よく進行し、合成セルロースが収率良く得られることが分かった。3.合成セルロースの形態観察研究分担者がブラウン研究室(テキサス大学オースチン校)に約2週間滞在し、フッ化β-D-セロビオシルの-酵素触媒重合によるセルロース合成を光学顕微鏡下で試みた。その結果、合成セルロースが反応開始から30分以内に球晶を形成することを明らかにした。また、合成セルロースの初期過程を電子顕微鏡で観察したところ、反応開始から30秒以内に合成セルロースと触媒セルラーゼの複合体の生成を確認した。これらは、明確な反応によってセルロースが生成する過程を観察した初めての例である。ブラウン教授は、約2週間日本に滞在し、高分子化学的手法に関する資料収集を行うとともに、盛岡で開かれた第41回高分子討諭会に出席し、特別講演を行うことにより、セルロース生合成に関して多くの研究者に有益な情報をもたらした。
新規免疫原を用いたプリオン病ワクチンおよび免疫学的治療法開発のための基盤構築

プリオン病はヒトや動物にみられる致死性且つ難治性の中枢神経変性疾患である。有効な治療法は無く、ワクチンや治療法の開発が望まれている。本研究は、新たなプリオンワクチンあるいは免疫学的治療法開発に繋がる基礎的知見を得ることを目的とし、正常型あるいは試験管内増幅法により作成した異常型プリオン蛋白を用いてマウスにおける免疫反応について調査した。得られた結果から、これらのプリオン蛋白はワクチンおよび治療法開発への礎となり得る有用なツールとなることが示唆された。本研究は、試験管内増幅法(QUIC法)を用いて異常型リコンビナントプリオンタンパク(rPrP-res)を作成し、それを免疫原としてマウスにおける免疫反応を調査することを主要な目的としている。そこで今年度では、まず各種動物(マウス・ハムスター・ウシ・ヒト)rPrPの精製を行った。次にマウスrPrP(rmoPrP)を用いて、QUIC法におけるrmoPrP-resの作成および作成後の保存条件の検討を行った。その結果、0.1M(0.5M)塩酸グアニジン存在下で、48時間以上振とう(1500rmp)した場合にrPrP-resの生成効率が最も高かった。また振とう時における反応液の容量は、容器容量の1/3以下で行った場合に生成効率が高かった。rmoPrP-res作成後の保存方法については、凍結融解あるいは塩酸グアニジンの存在によりrmoPrP-resが次第に消失したことから、PBSを用いて透析置換後、冷蔵(4°C)での保存が適していた。これらのrmoPrP-res作成および保存条件は、他動物種のrPrPを用いた場合とは異なり、それぞれについて条件の検討が必要であることも明らかとなった。現在rmoPrP-resを大量に作成しマウスへ免疫することにより、その免疫反応の調査を試みようとしている。一方、rmoPrP-resを用いた場合免疫寛容により反応が見られない場合も考えられることから、ウシrPrP(rboPrP)を用いた検討も考えている。本研究は、試験管内増幅法(QUIC法)を用いて異常型リコンビナントプリオンタンパク(rPrP-res)を作成し、これを免疫原としてマウスにおける免疫反応を調査することで、新たなプリオンワクチンあるいは治療法開発へ繋げることを目的としている。今年度では、抗PrP抗体産生誘導に着目した。まず、作成したrmoPrP-resをBALB/cマウスに投与し、免疫寛容機構を克服できるか検討した結果、若干ではあるが特異的IgG価の上昇を検出した。更に、rmoPrP-res投与により誘導されるIgG抗体について調査するため、PrP欠損マウスを用いrmoPrP-resを投与した。その結果、有意なIgG価の上昇が検出された。産生されたIgGは、rPrPとrPrP-resの両方あるいはrPrPを主に認識するか、マウス個体によって異なっていた。またこの抗血清は、抗プリオンエピトープ領域を含むアミノ酸90-109、131-154および219-231のペプチドのいずれとも強く反応しなかった。IgGサブクラスは、主にIgG1およびIgG2b価が高く、rPrP-resを認識するIgGは、主にIgG2bであった。一方、我々の予想に反し、BALB/cマウスにrmoPrPを投与した結果、有意な特異抗体産生が認められ、これらの抗体は、rmoPrP-resを強く認識しなかったが、上記3種のペプチドと反応を示し、ワクチンへの応用の可能性が示唆された。今後、IgGサブクラスあるいは認識エピトープの相違について異常型プリナン増殖への影響について検討する必要が考えられた。これらの結果は、効率の良いプリオンワクチンおよび治療法の開発に途を開く礎となるものである。