hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
改変型細胞融解性ウイルスを搭載する間葉系幹細胞を用いた難治性消化器癌の治療

現在遺伝子導入に利用されているアデノウイルスはタイプ5型であり、その細胞側の主な受容体はcoxsackie-adenovirus receptor (CAR)である。しかし、しばしば消化器癌では、このCAR分子の発現が低下しており、そのため同ウイルスによる遺伝子導入効率が低下している。一方タイプ35型ウイルスの主たる受容体はCD46分子であり、この分子は消化器癌において比較的高発現である。そこで、受容体結合部位であるウイルスのファイバー・ノブ領域をタイプ5型から35型に変換すれば、遺伝子導入効率が向上するはずである。そこで、タイプ35型の当該領域を有し、E1領域に外来性の遺伝子を挿入できるベクター系、ならびにウイルスの増殖に必須のEIAおよびE1B遺伝子の発現を、外来性の転写調節領域での制御を可能にするベクター系を構築した。実際にマーカー遺伝子を組み入れた改変型ウイルスを作製してみると、消化器癌においては、従来のタイプ5型ウイルスに比較してこのウイルスの遺伝子導入効率が優れていた。そこでこのベクター系を用いた細胞融解性ウイルスを搭載する間葉系幹細胞を使用して、抗腫瘍効果を検討するために、まずヒト間葉系幹細胞への遺伝子導入効率、ならびに当該細胞で作用するプロモーターの転写活性化能を検討した。その結果、タイプ5型ウイルスは全く間葉系幹細胞に感染しなかったが、タイプ35型改変型ウイルスの遺伝子導入効率は良好であった。また消化器癌で作用する腫瘍プロモーターのなかで、ミッドカインやサバインビンプロモーターの活性が間葉系幹細胞では低かったのに対し、cyclooxygenase-2プロモーターの活性は高く、当該プロモーターを用いた細胞融解性ウイルスを感染させた間葉系幹細胞は、ウイルスのデリバリーシステムとして有用であると考えられた。
エピソード記憶に関わる脳内機構の加齢変化と病的変化：脳機能画像法を用いた研究

本研究は、脳機能画像法(機能的磁気共鳴画像法、以下、fMRI)を用いて、健常高齢者と健常若齢者のエピソード記憶施行中の脳活動を計測し、両群の行動成績および脳活動を比較することで、その認知的・脳的基盤の加齢変化を検討することを目的としたものである。最終的には、正常な加齢と病的な加齢に伴う変化の違いを明らかにすることを目指した。これまで健常高齢者と健常高齢者の両方に用いることができる、エピソード記憶課題(出来事に付随する時間や場所などの文脈情報を問う記憶課題)の作成を試み、刺激の数、刺激の呈示時間や呈示回数などを変数として行動実験をおこなった。その結果、条件を満たす文脈記憶課題をおおむね完成することができた。また別の実験では、健常高齢者において、前期高齢者と後期高齢者の2群に分け、fMRIを用いて作業記憶課題実施中の脳活動を測定し、それを群間で比較することで、健常高齢者の中でも、さらに加齢に従って行動成績および脳内機構の変化が確認されるかについて検討した。その結果、1)後期高齢者では前期高齢者と比較して行動成績が低下すること、2)後期高齢者では前期高齢者と比較して前頭前野の活動が増加していること、を明らかにした。さらに後期高齢者において、前頭前野の活動の強さと行動成績の良さが正の相関を示したことから、この前頭前野の活動が作業記憶課題の遂行に補償的な役割を担っている可能性について考察した。本研究課題は、脳機能画像法(機能的磁気共鳴画像法、fMRI)を用いて、エピソード記憶に関わる脳内機構の加齢変化を検討し、最終的には、正常加齢と病的加齢による変化の違いを明らかにすることを目的とする。本年度は、健常高齢者(6579歳)および健常成人(2029歳)を対象とした脳機能画像研究の実施に向けて、エピソード記憶課題(出来事に付随する時間や場所などの文脈情報に関する記憶を問う課題)の作成をおこなった。具体的には、生物および無生物の写真からなる学習リストを2つ用意し、研究参加者に写真を1枚ずつ呈示して、2択のボタン押しにて生物/無生物判断を求めた(偶発学習課題)。同様の手続きがそれぞれの学習リストで実施され、2つのリストの間には休憩時間をはさんだ。その後の想起課題では、2種類の写真ペア(一方は学習した2枚の写真から構成されたペア、もう一方は学習していない2枚の写真から構成されたペア)を用意した。研究参加者には、呈示された写真ペアの両方が学習した写真であった場合にのみ、より最近に学習したものを選択するように求めた(時間情報の想起課題)。先に述べたように、健常高齢者と健常成人を対象とした研究となるため、前者では天井効果、後者では床効果の影響が想定された。したがって複数回の予備的な行動実験を実施し、いずれの効果の影響も排除できるように、刺激数、呈示回数・時間、また遅延時間などの実験条件に修正を加えつつ、適切なエピソード記憶課題の完成を目指した。また予備実験と並行して、研究への参加希望者のプーリング作業も開始した。次年度以降は、脳機能画像研究の実施へと段階を進め、データ収集に取りかかる予定である。本年度は、健常高齢者および健常成人を対象とした脳機能画像研究に用いる、妥当性の高いエピソード記憶課題の作成を目指して予備的な行動実験を実施した。当初の研究計画では本年度中に脳機能画像研究を開始させる予定であったが、実験条件の修正およびその確定に想定以上の時間を要したため、次年度に開始予定となった。本研究課題では、脳機能画像法(機能的磁気共鳴画像法、fMRI)を用いて、健常高齢者および健常若齢者のエピソード記憶課題施行中の脳活動を計測することにより、その脳内機構の加齢変化を検討することを目的とする。最終的には、正常加齢と病的加齢による脳内機構の変化の違いを明らかにすることを目指す。昨年度より、脳機能画像研究に用いる適切なエピソード記憶課題(出来事に付随する時間や場所などの文脈情報の記憶を問う課題)の作成を目指し、刺激種類、刺激数、遅延時間などの実験条件に変更を加えつつ、予備的な行動実験をおこなってきた。具体的に、時間情報を問う記憶課題では、参加者(健常高齢者(6579歳)および健常若齢者(2029歳))に物品の写真からなる学習リストを2つ、休憩時間をはさんで学習させ、後に2枚の写真を呈示してその時間順序の判断を求めた。また、場所情報を問う記憶課題では、参加者(健常高齢者(6579歳)および健常若齢者(2029歳))に、物品の写真を1枚、コンピュータ画面の左右どちらか一方に呈示して学習させ、後に1枚の写真を呈示してその場所の判断を求めた。上記2つの記憶課題について、予備的実験に妥当な人数までデータを収集し、適切な記憶課題の完成を目指した。研究への参加希望者の募集はすでに体制が整っている。次年度は、脳機能画像研究を速やかに開始できる研究体制を整え、データ収集およびその解析に着手する。健常高齢者および正常成人を対象とした脳機能画像研究に用いる予定であった、エピソード記憶課題の修正に時間を要した。全体の研究スケジュールとの兼ね合いもあり、脳機能画像研究が次年度開始となった。

本研究課題では、脳機能画像法(機能的磁気共鳴画像法、fMRI)を用いて、健常高齢者および健常若齢者のエピソード記憶課題施行中の脳活動を計測し、両者を比較することで、その脳内機構の加齢変化を検討することを目的とする。最終的には、正常加齢と病的加齢による脳内機構の変化の違いを明らかにすることを目指す。これまで脳機能画像研究に用いるための最適なエピソード記憶課題、つまり出来事にまつわる時間や場所など文脈情報の記憶を問う課題の作成を目指し、予備的な行動実験をおこなってきた。本研究課題において、健常高齢者に対する床効果あるいは健常若齢者に対する天井効果の両方をクリアできる記憶課題の作成が必須である。刺激の数、呈示時間や呈示回数、学習から想起までの遅延時間などを変数として行動実験を繰り返した結果、健常高齢者および健常若齢者の両方に施行できる2つの記憶課題、つまり時間情報を問う記憶課題(学習リストAとBを学習させ、後に2刺激を呈示してその時間順序の判断を求める)、および、場所情報を問う記憶課題(刺激1枚をコンピュータ画面の左右どちらか一方に呈示して学習させ、後に刺激1枚を呈示してその左右の判断を求める)をおおむね完成することができた。研究参加者はこれまでの実績からすでに募集の体制が整っており、両方の年齢群とも確保に支障はない。次年度は、脳機能画像研究を開始し、データ収集およびその解析に着手する予定である。これまでの予備的な行動実験に基づき作成したエピソード記憶課題を用いて脳機能画像研究を開始予定であったが、研究代表者の研究施設の異動が重なったこともあり、開始が遅れている。本研究は、脳機能画像法(機能的磁気共鳴画像法、以下、fMRI)を用いて、健常高齢者と健常若齢者のエピソード記憶施行中の脳活動を計測し、両群の行動成績および脳活動を比較することで、その認知的・脳的基盤の加齢変化を検討することを目的としたものである。最終的には、正常な加齢と病的な加齢に伴う変化の違いを明らかにすることを目指した。これまで健常高齢者と健常高齢者の両方に用いることができる、エピソード記憶課題(出来事に付随する時間や場所などの文脈情報を問う記憶課題)の作成を試み、刺激の数、刺激の呈示時間や呈示回数などを変数として行動実験をおこなった。その結果、条件を満たす文脈記憶課題をおおむね完成することができた。また別の実験では、健常高齢者において、前期高齢者と後期高齢者の2群に分け、fMRIを用いて作業記憶課題実施中の脳活動を測定し、それを群間で比較することで、健常高齢者の中でも、さらに加齢に従って行動成績および脳内機構の変化が確認されるかについて検討した。その結果、1)後期高齢者では前期高齢者と比較して行動成績が低下すること、2)後期高齢者では前期高齢者と比較して前頭前野の活動が増加していること、を明らかにした。さらに後期高齢者において、前頭前野の活動の強さと行動成績の良さが正の相関を示したことから、この前頭前野の活動が作業記憶課題の遂行に補償的な役割を担っている可能性について考察した。本研究課題を推進する上で課題の一つとなるのは、研究参加者の確保である。健常高齢者および健常成人を対象とした脳機能画像研究については、本年度までで参加者募集の目処が立っているため、研究推進に問題は生じないものと思われる。次の研究段階として、健忘型軽度認知機能障害(aMCI)高齢者を対象として加える予定であるが、次年度中に参加基準を満たす参加者のリスト化を開始し、データ取得を円滑にできる体制を整える。また研究参加者群の追加に伴い、用いる記憶課題に再度修正が必要になるものと予想されるが、適切かつ迅速に対応する。
ニジマスインタ-フェロン遺伝子の特性と活性及びその応用

昨年度,ニジマス肝蔵より常法に従ってDNAを抽出し、XbaI断片約25KbのDNAをcharomid9ー28をベクタ-として、geromic DNA部分ライブラリ-を作製した。このライブラリ-より、大阪大学、谷口維紹教授より分与を受けたヒトインタ-フェロンβのcDNAをプロ-ブとして陽性シグナルを示すコロニ-を釣り上げた。ところが、この陽性シグナルを示したcharomid(RTINFβー1)からインサ-トXbaI断片を切り出し、種々の制限酵素で切断して後、ヒトインタ-フェロンBcDNAをプロ-ブとしてハイブリダイゼイションを行ったところ、プロ-ブDNAと相同性を示すバンドは検出できなかった。原因としてクロ-ニングのために使用したプロ-ブへのベクタ-pBR322の混入を疑い、精製度を高めたヒトインタ-フェロンβのプロ-ブと前に用いたものを用いて、RTINFβー1のインサ-ト及びベクタ-XbaI断片をサザンハイブリダイゼ-ションした。その結果、釣り出しに用いたプロ-ブにはわずかなPBR322断片の混入があり、これがCharomid9ー28とハイブリしたため、陽性シグナルを形成したことが明らかになった。また昨年度、ハイブリゼイションの最適条件として選んだ、4×SSC,60°Cオ-バ-ナイトハイブリダイゼ-ション、3×SSC,55°C、30分の洗浄条件では、為陽性シグナルを拾う確率が高いこともわかり、6×SSC,65°C,オ-バ-ナイトハイブリダイゼ-ション、15×SSC,65°C、15°Cの洗浄条件の方がよいことも明らかになった。現在、再度、ニジマスのgenomic DNAライブラリ-を作製し、新たに調製したプロ-ブを用いて陽性シグナル(RTINFPー2)の釣り対しに成功したので、制限酵素地図の作製を試み、釣り出したgeneの解析を急いでいる。
In vitro 翻訳系の調製によるミトコンドリアの暗号解読機構の研究

本国際学術共同研究は、動物ミトコンドリアにおける暗号変化(UGA;普遍暗号では終止暗号がトリプトファンに、AUA;イソロイシンがメチオニンの暗号に、AGA/AGG;アルギニンが殆どの無脊椎動物ではセリン、原索動物ではグリシン、脊椎動物では終止暗号に変化、など)の分子機構をin vitro翻訳系を構築して、解明する目的で始められた。このような研究は、ミトコンドリア(mt)からその細胞内量から見ても、生化学的な研究に十分な試料を調製することが大変困難なこと、翻訳に関わるタンパク性諸因子がかなり不安定で単離が困難なことなどが主な障害となって世界的にも殆ど手がつけられていなかった。我々は特異構造を持つmt・tRNA(殆どのmt・tRNAではL型立体構造形成に関わっているDループとTループ間の塩基対を欠いていたり、DループやTループが欠落したものも見つかっている)と変則暗号解読の因果関係を探る目的で、mt・tRNAの大量調製法を確立し、その構造と性質を調べていたが、翻訳系の構築に必要な活性のある因子の調製ができなかった。国外共同研究者であるSpremulliのグループは、活性あるmtリボソームと翻訳系諸因子の調製に成功していたが、mt・tRNAの単離ができなかった。このような状況においてお互いのグループで開発したシステムと技術を合体させることにより、mtのinvitro翻訳系を構築し、暗号変化の分子機構を解明するという目的で平成3年度から本研究がスタートした。研究はかなり順調に進んできたが、本格的な展開はこれからであり、やっとその基礎が固まったという現状である。以下に年度を追ってその成果を述べる。[平成3年度]1)tRNAの特定配列に相補的な合成DNAプローブを用いたハイブリダイゼーション法を開発し、mt・tRNAの0.2-0.5mgオーダーの調製が可能になった。2)UCN(N=A,U,G,C)のコドンに対応するウシmt・セリンtRNAを単離、精製し、それが従来の遺伝子から推定されていた配列から、実際の構造がずれていること、アンチコドン・ステムは一塩基対長く、アミノ酸ステムとDステムの間が一塩基しかない、異常な2次構造をとること、この構造は哺乳動物mtに共通であることを明らかにした。3)ウシ肝臓から活性のあるリボソーム、開始因子(IF-2)、伸長因子(EF-Tu/Ts、EF-G)、アミノアシル-tRNA合成酵素(ARS)の調製方法を確立し、それらの性質を検討した。[平成4年度]1)AGY(Y=U,C)のコドンに対応する、Dアームを欠くセリンtRNAのセリルtRNA合成酵素(SerRS)による認識部位を決定する目的で、このtRNA遺伝子からT7RNAポリメラーゼによる転写物を調製し、種々の塩基置換を導入したtRNA変異体のSerRSによるセリン受容能を測定した結果、アンチコドンは認識に無関係だが、Tループが重要であり、中でもよく保存されたループ中央のA44の置換が決定的であることが分かった。2)ウシ・mtでポリ(U)依存ポリ(フェニルアラニン)合成系を初めて構築し、大腸菌の系との構成成分の互換性を検討したところ、mtのPhe-tRNA^<Phe>は大腸菌のEF-TuとGTPとで3者複合体を形成するが、そこからリボソームA部位への転移過程が働かないことを明らかにした。3)ウシ・mtのメチオニンtRNAの塩基配列を再検討し、アンチコドンの一字目に、5-ホルミルシチジンという新規修飾塩基が存在することを明らかにした。4)ウシ・mtフェニルアラニンtRNAの修飾塩基を含む塩基配列を決定し、RNaseや化学試薬への感受性からその立体構造を推定したところ、Dループ、Tループ相互作用はないが、Dアームとバリアブルループ間の3次元的な塩基対形成によってL型に近い構造をとっていることを見出した。[平成5年度]1)ポリ(U)依存ポリ(Phe)合成系の効率化の条件を検討し、1mMスペルミン存在下で大腸菌の系の約1/2のレベルまで合成効率を上昇させることに成功した。2)AUAがメチオニンの暗号であることを証明するために、AUAを含む人工mRNAを用いて、AUAに依存したメチオニル-tRNAのリボソームへの結合、ポリペプチドへのメチオニンの取り込みを調べたが、現在までのところまだ肯定的な結果は得られていない。3)ウシmtからホルミルトランスフェラーゼを精製し、fMet-tRNAを作成し、EF-TuとIF-2の結合をMet-tRNAと比較したところ、fMet-tRNAはIF-2と、Met-tRNAはEF-Tuとそれぞれより高い親和性を示した。これは単一tRNAがホルミル化によって開始と伸長の両反応に使い分けられる可能性を支持するものである。

このような研究は、ミトコンドリア(mt)からその細胞内量から見ても、生化学的な研究に十分な試料を調製することが大変困難なこと、翻訳に関わるタンパク性諸因子がかなり不安定で単離が困難なことなどが主な障害となって世界的にも殆ど手がつけられていなかった。我々は特異構造を持つmt・tRNA(殆どのmt・tRNAではL型立体構造形成に関わっているDループとTループ間の塩基対を欠いていたり、DループやTループが欠落したものも見つかっている)と変則暗号解読の因果関係を探る目的で、mt・tRNAの大量調製法を確立し、その構造と性質を調べていたが、翻訳系の構築に必要な活性のある因子の調製ができなかった。国外共同研究者であるSpremulliのグループは、活性あるmtリボソームと翻訳系諸因子の調製に成功していたが、mt・tRNAの単離ができなかった。このような状況においてお互いのグループで開発したシステムと技術を合体させることにより、mtのinvitro翻訳系を構築し、暗号変化の分子機構を解明するという目的で平成3年度から本研究がスタートした。研究はかなり順調に進んできたが、本格的な展開はこれからであり、やっとその基礎が固まったという現状である。以下に年度を追ってその成果を述べる。[平成3年度]1)tRNAの特定配列に相補的な合成DNAプローブを用いたハイブリダイゼーション法を開発し、mt・tRNAの0.2-0.5mgオーダーの調製が可能になった。2)UCN(N=A,U,G,C)のコドンに対応するウシmt・セリンtRNAを単離、精製し、それが従来の遺伝子から推定されていた配列から、実際の構造がずれていること、アンチコドン・ステムは一塩基対長く、アミノ酸ステムとDステムの間が一塩基しかない、異常な2次構造をとること、この構造は哺乳動物mtに共通であることを明らかにした。3)ウシ肝臓から活性のあるリボソーム、開始因子(IF-2)、伸長因子(EF-Tu/Ts、EF-G)、アミノアシル-tRNA合成酵素(ARS)の調製方法を確立し、それらの性質を検討した。[平成4年度]1)AGY(Y=U,C)のコドンに対応する、Dアームを欠くセリンtRNAのセリルtRNA合成酵素(SerRS)による認識部位を決定する目的で、このtRNA遺伝子からT7RNAポリメラーゼによる転写物を調製し、種々の塩基置換を導入したtRNA変異体のSerRSによるセリン受容能を測定した結果、アンチコドンは認識に無関係だが、Tループが重要であり、中でもよく保存されたループ中央のA44の置換が決定的であることが分かった。2)ウシ・mtでポリ(U)依存ポリ(フェニルアラニン)合成系を初めて構築し、大腸菌の系との構成成分の互換性を検討したところ、mtのPhe-tRNA^<Phe>は大腸菌のEF-TuとGTPとで3者複合体を形成するが、そこからリボソームA部位への転移過程が働かないことを明らかにした。3)ウシ・mtのメチオニンtRNAの塩基配列を再検討し、アンチコドンの一字目に、5-ホルミルシチジンという新規修飾塩基が存在することを明らかにした。4)ウシ・mtフェニルアラニンtRNAの修飾塩基を含む塩基配列を決定し、RNaseや化学試薬への感受性からその立体構造を推定したところ、Dループ、Tループ相互作用はないが、Dアームとバリアブルループ間の3次元的な塩基対形成によってL型に近い構造をとっていることを見出した。[平成5年度]1)ポリ(U)依存ポリ(Phe)合成系の効率化の条件を検討し、1mMスペルミン存在下で大腸菌の系の約1/2のレベルまで合成効率を上昇させることに成功した。
認知症ワーキングケアラーのエンパワメントを高める教育支援プログラムの開発と検証

本研究の目的は、認知症ワーキングケアラーのエンパワメントを高める教育支援プログラムを構築することである。第1段階では、「ワーキングケアラーの学習ニーズ(学習課題)の抽出」を行い、第2段階では、「学習課題の特定と教育支援プログラムの作成」、第3段階では、「教育支援プログラムの実施と評価」を行う。平成30年度は、第1段階の調査を行った。働きながら認知症の人を介護している、または介護経験のある家族介護者の介護上の学習課題を明らかにすることを目的に、7名の家族介護者に半構成的質問によるインタビューを行った。そのうち、2名の対象者のデータを質的記述的に分析した。対象者の平均年齢は49.5歳で2名とも女性で、認知症の人の平均年齢は79.5歳で男性1名、女性1名だった。認知症の人との間柄は娘1名、義娘1名で、インタビュー平均時間は81分だった。認知症ワーキングケアラーの介護上の学習課題として、7つが見出された。働き盛り世代は家庭のみならず社会の担い手として活躍し、人生の最終段階に向けてその人らしい生活を構築する時期である。本研究で明らかになった7つの課題は、働き盛り世代が自己の価値を認識し、仕事と介護の両面で力を発揮させるための内容が示されたといえる。特に、他国に比べ家族への役割期待が強く、孤軍奮闘しがちな日本のワーキングケアラーの課題の特徴を示していることが示唆された。今後は、対象者数を増やし、多様な家族介護者にインタビューを行って学習課題を精選していくことが課題である。研究フィールドの協力をスムーズに得ることができ、対象者を確保することができた。2019年度は、引き続き家族介護者へインタビューを行って、課題の精錬化を行う。そして、第2段階であるプログラムの作成に向けて学習課題の特定を行う。予定よりも対象者の確保がスムーズに得られたことから、インタビューのための旅費を請求したため。
19世紀アメリカ禁酒小説/運動におけるジェンダーギャップの研究

前年度に引き続き、夏と春にアメリカ出張を行い、ニューヨーク公立図書館、コロンビア大学図書館等で資料調査および収集作業を行った。本年度は、女性禁酒物語作家の代表的存在であるメアリ・チェリスの作品を重点的に研究した。AT LION'S MOUTH(1872), THE WORKING MAN'S LOAF(1885), BENCHES WITH NEW PROPS(1891)など後期の作品の詳細な分析ができたことは大きい。また、関連して研究を進めている禁酒物語における離婚の主題を分析するうえで欠かせないテクストである、Julia M. Friend, THE CHESTER FAMILY, OR, THE CURSE OF THE DRUNKARD'S APPETITE(1869)屋、Charlotte S. Hilbourne, ALICEWATERS; OR, THESHADOWYVICTORY(1867)などが収集できたことも、今後の研究の進展に大いに貢献するものと思われる。その間のテクスト分析結果は学内の紀要に論文(原稿用紙約60枚)として発表した。内容は女性禁酒物語作家のひとりハリエット・ストウの文学全体を貫く「解放」の主題を、黒人解放、女性解放という、禁酒運動とともにアメリカ19世紀を彩った「解放」運動との関連において分析したものである。これまで進めてきた男性禁酒物語作家の作品を通して考察してきたジェンダー・バイアスを考えるうえで、一つの突破口となったと言うことができる。夏期の海外出張では、バンクーバーのブリッティッシュ・コロンビア大学、およびシアトルのワシントン大学にある図書館において資料調査・収集を行った。とくにT.S.ArthurとMary Chellisに関する、主としてマイクロフィルム化された貴重な資料を閲覧できたことは大きな成果である。たとえば、Larisa AsaeriによるChellisの論文やTEMPERANCE DOCTOR(1836)をはじめとするそれまで入手できなかった作品を閲覧あるいはコピーできたことは有意義であった。また、シアトルの古書店でMEMOIRS OF WATER DRINKER(1837)初版本を入手できたことも予想外の成果である。春にはニューヨークの公立図書館、コロンビア大学内の図書館において同様の資料調査・収集を行った。T.S.Arthurに加え、同時期を代表する禁酒小説家Lucius M.Sargentらの珍しいテクストを閲覧、コピーできたことが成果である。とりわけ、今後研究の中心になるはずの19世紀家庭経営論の資料として、ArthurのTHE ANGEL OF THE HOUSEHOLD(1856)、WOMAN'S TRIALS(1851)などは、Harriet B. Stoweの家庭論との対比研究をする際の貴重な資料となる。ニューヨーク滞在中にペンシルバニア大学英文学科教授デヴィッド・エスピー教授と意見交換する機会をもち、研究方針の妥当性を確認することができたことも大きい。現地での資料調査と同時に、入手した資料の分析も進行しており、その成果はすでに論文にまとめられ近々学術雑誌に発表する予定である。また、ニューヨークでのフィールドワークに基づいた経験をいかして文献に表れたニューヨークのイメージを論文の形でまとめ公表したことも本研究の副産物と言える。研究対象である禁酒物語はテクスト入手が困難で、アメリカ各地の図書館に点在する資料に直接あたるしかなく、拠点となる機関に直接赴きコピーをとるか、書物の保存状態によりコピー不可の場合は筆写やメモをとるしかなく、たびたびの出張が必要となる。その意味で、海外出張で資料調査を行ってこれたことは、研究のための基礎資料を得るうえで重要である。これまで相当数の文献が収集できたことは大きな達成と言える。また、それらの資料分析も進んでおり、禁酒物語におけるmanlinessをテーマとした論文はすでに完成しており、近々、学術雑誌に発表予定である。また、拠点機関であるニューヨーク公立図書館などでの調査のためしばしば滞在した経験を生かし、文献に表れたニューヨークのイメージを考究した論考を口頭発表および共著の形で公表できたことなど波及効果も大きい。禁酒物語関係の資料はおびただしく選択的に調査・収集しているが、時間の関係で調査できなかった重要文献についても所在の確認は進んでおり、次回の出張で入手する予定である。研究期間内での最大の成果をあげるための計画もすでに策定している。夏期の海外出張では、ニューヨーク公立図書館、コロンビア大学図書館において資料調査・収集を行った。禁酒物語をドラマ化したテクストに集中して調査を実施したが、Charles W. Babcock, A DRIFT: ATEMPERANCE DRAMA(1880), E.C. Whalen, UNDERTHESPELL(1890), T.P. Taylor, THEBOTTLE(1847)など貴重なテキストをちょうさすることができた。とりわけCarleton Potter, THE WHIRLPOOL: A NARRATIVE SHOWING THE EVIL OF TEMPERANCE(1852)はニューヨーク公立図書館アーカイヴに新たに収蔵されたもので、長く探し求めていた資料が入手できたことは大きい。春には旧知のテキサス大学歴史学教授カール・ジャクソン氏と再会し、禁酒運動、禁酒物語に関して広く情報交換をおこなうとともに、同教授によりテキサス大学所蔵の文献についての教示と稀覯書閲覧の斡旋をいただいた。その結果、オースティン校にあるCollectives and Deposit Library所蔵のマイクロフィルム閲覧ができたことは貴重である。Josia Allen's WifeやMary Chellisといった女流禁酒小説家の作品を閲覧および一部コピーできたし、これまで書物の形では入手できなかった匿名著者によるMY COUSIN MARY等の作品をマイクロフィルムで読めたことは大きな成果である。

これまでに収集してきた資料をもとに、男性性に対する二つの見方からまったく正反対の対応が示される禁酒物語の構造分析を勤務先の研究論集に論文として発表し、次の女性作家との対比でジェンダー論を展開する足掛かりを得ることができた。研究対象である禁酒物語はテクスト入手が困難で、アメリカ各地の図書館に散在する資料に直接あたるしかなく、拠点となる機関に直接赴き閲覧・コピーするか、書物の保存状態如何でコピー不可の場合は筆写やメモを取るしかなく、たびたびの出張が必要となる。その意味で、夏・春の休み期間にアメリカ出張で資料調査を継続的に行えたことは、研究のための基礎資料を整備するうえで重要である。これまで相当数の文献が収集できたことは大きな成果である。それらの資料の分析も同時進行で進めており、その成果は論文として公表されている。禁酒物語関連の資料は膨大で選択的に資料調査と収集を進めているが、時間等の関係で収集できなかったものについても所在の確認を進めており、今後の出張で入手する予定である。研究の成果をまとめた著書の刊行に向けての準備も8割方できているのが現状である。前年度に引き続き、夏と春にアメリカ出張を行い、ニューヨーク公立図書館、コロンビア大学、ハワイ大学図書館等で資料調査および収集を実施した。この分野の第一人者であるT.S.Arthurの文献調査はかなり進んでいるが、彼の編集による禁酒物語集THE TEMPERANCE GIFT(1854)の調査ができたことは大きい。今後力を入れるべく精力的にテクストを集めている女流禁酒物語作家についても、Mary Chellisを中心にテクストおよび関連資料を相当数収集できた。また、Alice Carey, THE ADOPTED DAUGHTER(1859)やNellie Grahame, THE GLASS OF WINE(1866)などテクスト入手が困難な作品に出合い、コピーもしくは現物を読みメモできたことも、今後の研究の基礎資料となる点で大きな収穫である。以上のように資料の蓄積を進めると同時に、テクスト等の分析についても研究を進めたが、今年度はとくにハリエット・ストウに焦点を定め、さまざまなジャンルにわたる主要作品を分析し、ストウ文学の背景にある思想を時代の流れのなかで考察した。その成果は24,000字程度の論文にまとめ、本年夏に発刊予定の紀要に投稿済みである。研究対象である禁酒物語はテクスト入手が困難で、アメリカ各地の図書館に散在する資料に直接あたるしかなく、拠点となる機関に赴き閲覧・コピーするか、筆写やメモをとるしかなく、たびたびの出張が必要である。今年度も夏と春の休みの期間にアメリカ出張を実施し、資料調査・収集を継続できたことは基礎資料の整備に役立ち、また相当数の資料が収集できたことは重要である。
人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）を用いた歯原性細胞分化誘導法の開発

歯胚は、その発生初期段階より歯原性上皮細胞と間葉細胞間の相互作用により形態制御されており、多くのシグナル分子群が関与していることが明らかとなっているが、エナメル芽細胞に関しては、その詳細な分化メカニズムが解明されておらず、人工的な分化誘導法もほとんど報告されていない。そこで本研究では、人工多能性幹細胞(iPS細胞)を用いて、歯原性上皮細胞、中でもエナメル芽細胞への分化誘導法の開発を進めてきた。これまでに、マウス由来iPS細胞をラット歯原性上皮細胞株SF2と共培養すると、一部のiPS細胞が上皮細胞マーカーであるp63やサイトケラチン14(CK14)、さらにエナメル芽細胞の細胞外基質蛋白であるアメロブラスチン(Ambn)やエナメリン(Enam)遺伝子を発現する細胞に分化誘導されたことが確認できた。この際、SF2が発現するAmbnやNT-4、BMP分子がiPS細胞からエナメル芽細胞への重要な分化誘導因子であること明らかにした。他の細胞の混入を最小限にするためSF2のconditioned medium(CM)を用いて培養した場合も同様に、免疫組織染色でNanog-GFP発現の低下したiPS細胞塊辺縁に、E-Cadherin陽性で上皮細胞様形態を示す細胞の局在が認められ、さらに、iPS細胞とSF2の共培養をCM下で行なった際には、iPS細胞塊辺縁でSF2と隣接する領域に強くAMBN陽性を示す細胞が確認された。また、CMの条件により、さらに効率的に歯原性上皮細胞へ誘導される可能性が示された。これにより、将来的なiPS細胞由来歯原性上皮細胞の獲得やエナメル芽細胞分化メカニズムの解析や、さらにはヒトiPS細胞由来の歯原性細胞を用いた人工歯胚再構築への応用などに繋がることが期待される。27年度が最終年度であるため、記入しない。歯の発生は、歯原性上皮細胞と神経堤由来間葉細胞間の相互作用により複雑に形態制御されており、BMPやFGF、Shhなどの多くのシグナル分子群が重要な役割を演じていることが明らかとなっている。しかしながら、歯のエナメル質を形成するエナメル芽細胞に関しては、その詳細な分化メカニズムが明らかとなっておらず、人工的な分化誘導法もほとんど報告されていない。そこで本研究は、人工多能性幹細胞(iPS細胞)を用いて、エナメル芽細胞が分泌する細胞外基質蛋白アメロブラスチン(AMBN)を指標に、歯原性上皮細胞への分化誘導法の開発を進めている。これまでに、マウス由来iPS細胞をラット歯原性上皮細胞株SF2と共培養すると、一部のiPS細胞をAMBN陽性細胞に分化誘導することが可能であり、SF2が発現するAmbnやNT-4がiPS細胞からエナメル芽細胞への分化過程において重要であることを明らかにしてきた。これにより、将来的なエナメル芽細胞分化メカニズムの解析や、iPS細胞由来歯原性細胞を用いた人工歯胚再構築への応用など、高純度で再生医療にも安全に使用できる細胞の獲得に繋がることが期待される。歯胚の発生は、歯原性上皮細胞と神経堤由来間葉細胞間の相互作用により複雑に形態制御されている。しかし、歯のエナメル質を形成するエナメル芽細胞に関しては、詳細な分化機序が解明されておらず、人工的な分化誘導技術がいまだ確立されていない。本研究では、人工多能性幹細胞(iPS細胞)を用いた歯原性上皮細胞またはエナメル芽細胞への分化誘導法の開発を進めている。これまで我々のグループは、歯原性上皮細胞からエナメル芽細胞への分化において、エナメル芽細胞が分泌する細胞外基質蛋白アメロブラスチン(AMBN)が重要であることを明らかにしている。本研究では、マウスiPS細胞とラット歯原性上皮細胞株SF2を共培養することで、共培養10日目にiPS細胞由来のp63、サイトケラチン14、Ambn、エナメリン(Enam)の発現が確認された。また共培養14日目の免疫組織染色で、上皮細胞様に分化したマウスiPS細胞集団の一部にAMBN陽性細胞の局在を認め、マウスiPS細胞をエナメル芽細胞へ分化誘導することに成功している。加えて、SF2が発現する神経栄養因子Neurotrophin-4(NT-4)やBMP分子も、Ambnを発現する歯原性上皮細胞への重要な分化誘導因子であることを明らかにしている。

他の細胞の混入を最小限にするためSF2のconditioned medium(CM)を用いて培養した場合も同様に、免疫組織染色でNanog-GFP発現の低下したiPS細胞塊辺縁に、E-Cadherin陽性で上皮細胞様形態を示す細胞の局在が認められ、さらに、iPS細胞とSF2の共培養をCM下で行なった際には、iPS細胞塊辺縁でSF2と隣接する領域に強くAMBN陽性を示す細胞が確認された。また、CMの条件により、さらに効率的に歯原性上皮細胞へ誘導される可能性が示された。これにより、将来的なiPS細胞由来歯原性上皮細胞の獲得やエナメル芽細胞分化メカニズムの解析や、さらにはヒトiPS細胞由来の歯原性細胞を用いた人工歯胚再構築への応用などに繋がることが期待される。平成26年度は、iPS細胞を歯原性上皮細胞、あるいはアメロブラスチン(AMBN)を発現するエナメル芽細胞へ効率的かつ高純度に分化誘導するため、SF2の培養上清中のsoluble factorの解析と培養方法の検討を行っている。リアルタイムRCR解析により、SF2はコンフルエント培養後にAmbnとEnam、続くアメロジェニン(Amel)の発現上昇を示しており、現在SF2培養上清中のタンパクも確認中である。また、iPS細胞を初期段階で上皮細胞へ誘導し、効果的にエナメル芽細胞へ分化誘導するための方法も検討している。これらの成果をもとに、SF2のCM培養によるiPS細胞から歯原性上皮細胞への分化誘導効率の上昇に繋がれば、iPS細胞由来歯原性上皮細胞の獲得やエナメル芽細胞分化メカニズムの解析、将来的な人工歯胚再構築への応用が期待され、着実に本研究計画のステップを実現していることから概ね順調に進展しているものと判断した。27年度が最終年度であるため、記入しない。SF2のCM培養によるiPS細胞から歯原性上皮細胞への分化誘導効率化を目標に研究を行う。その際に、ハイドロキシアパタイトの前駆物質として知られる人工合成リン酸オクタカルシウム(OCP)コンパウンドを用いて、3次元培養とカルシウムイオン供給を行いながら、さらに効率的かつ他の細胞混入を最小限にしたiPS細胞からAMBNを発現する歯原性上皮細胞への分化誘導法の開発を行う予定である。また現在、マウスiPS細胞をヒトiPS細胞に替えて同様にSF2との共培養およびCM培養を行っており、今後、上皮細胞マーカーやAmbnやEnam、Amelなどのエナメル芽細胞分化マーカーの発現をRT-PCR解析する予定である。ラット歯原性上皮細胞株SF2の培養条件によっては、歯原性上皮細胞として安定した状態を培養維持しながらiPS細胞と共培養し分化誘導することが難しいが、CM培養にて分化誘導する条件検討を行うことで改善を図っている。CM培養で分化誘導効率が低下しないよう、当初の研究計画通り、培養上清やエナメル芽細胞への分化過程における発現遺伝子を網羅的に探索することで、エナメル芽細胞への分化誘導に必要な因子の同定を行いながら、iPS細胞の効率的な分化誘導を試みる。また、iPS細胞を分化誘導する際に、3次元培養やカルシウム供給を目的として人工合成リン酸オクタカルシウム(OCP)を用いて、iPS細胞から歯原性上皮細胞への分化誘導効率を検討する。
多重極限環境における層状遷移金属化合物の量子臨界現象

本研究では,磁気ゆらぎが強いと考えられる層状遷移金属化合物において,ナノスケールで物質・構造制御を行い,超伝導等の新奇量子臨界現象を示す層状遷移金属化合物を開発することを目的とした.その結果,擬一次元磁性体Y_5Re_2O_<12>について,合成およびYサイトへの元素置換を行ない,その電磁気特性を評価することで,多重極限環境における構造と物性の関連を詳細に研究した.擬一次元磁性体への圧力印加は,結晶構造の三次元性を高め,電子の遍歴性を増大させることにより,系の電磁気特性を著しく変化させる効果を有することが明らかになった.本研究では,磁気ゆらぎが強いと考えられる層状遷移金属化合物において,ナノスケールで物質・構造制御を行い,超伝導等の新奇量子臨界現象を示す層状遷移金属化合物を開発することを目的とした.その結果,擬一次元磁性体Y_5Re_2O_<12>について,合成およびYサイトへの元素置換を行ない,その電磁気特性を評価することで,多重極限環境における構造と物性の関連を詳細に研究した.擬一次元磁性体への圧力印加は,結晶構造の三次元性を高め,電子の遍歴性を増大させることにより,系の電磁気特性を著しく変化させる効果を有することが明らかになった.本研究では、まず磁気ゆらぎが強いと考えられる層状遷移金属化合物において、層間に種々の原子・分子を導入し、ナノスケールで物質・構造制御を行い、超伝導等の新奇量子臨界現象を示す層状遷移金属化合物を開発することを目的とした。層状三角格子を有するLi-Ti(v)-S系では,常圧において合成することができないことが知られているVS_2について,石英管封入法を用いてTiを酸素ゲッターとして入れ,V_5S_8相とLi_2Sを用いて,前駆体としてLi_<0.8>VS_2を合成し,物性を評価した.さらに,臭素アセトニトリル溶液,ヨウ素アセトニトリル溶液を用いて化学的にLiを脱離させることに成功した.磁化率測定の結果,低温で長距離磁気秩序を示すV_5S_8相と異なり,いずれのLi-V-S系化合物も低温まで磁気秩序を示さなかった.さらに電気抵抗率測定の結果,Li組成xが欠損するにつれて,電気抵抗率の絶対値が増大した.以上の結果から,Li_<0.8>VS_2は遍歴電子系であり通常の金属的な振舞いを示す一方,χの減少によって系の局在性が強まるとともに,スピンフラストレーションの影響が大きく現れると考えられる.また、金属絶縁体転移をともなうブロンズ関連化合物(Na-Ti-O系など)について,錯体重合法による合成方法を確立し,固相反応法で合成した試料と比較した.この錯体重合法で得られた試料について,Naのコンテントを制御することによる磁気的電気的特性変化を評価した.特に,高温X線回折の結果より,χ=0.2およびχ=0.23において500550K付近でα軸長の異常発散が見られ,過去に報告されているCDWがα軸方向に存在していることを示唆している.さらにこの異常発散の見られる温度と,高温での磁化率測定での極大の見られる温度がほぼ一致していることから,α軸方向のCDWが磁気転移温度に関係していると考えられる.したがって,層間距離やキャリアー濃度などを変化させることによってCDWへの転移温度を下げることができれば超伝導が発現することが予想される.本年度は擬一次元磁性体Y_5Re_2O_<12>について,合成およびYサイトへの元素置換を行ない,その電磁気特性を評価することで,多重極限環境における構造と物性の関連を詳細に研究した.擬一次元磁性体Y_5Re_2O_<12>はその構造中に[ReO_4]_n鎖と,磁性鎖から独立した二次元Y_5O_4四面体骨格を持ち,ab平面においてRe鎖がY_5O_4四面体骨格によって分離された構造を有する.磁化率はS=1/2の一次元反強磁性ハイゼンベルグモデル(Bonner-Fisher (BF)モデル)に適合する.Luを置換した化合物Y_<5-x>Lu_xRe_2O_<12>において,x=0.04.0で単一相が得られ,この際,格子が収縮することによりRe磁性鎖に対して化学的な圧力が生じたと考えられる.また,磁化率は全組成の試料において一次元磁性体に特徴的なブロードなピークを示した.フィッティングの結果,スピン間の相互作用の大きさを示すJ/k_Bの値がxの増加にともなって減少したことから,格子が加圧され,結晶構造が変化することにより,隣接スピン間に働く相互作用が減少することが明らかになった.さらに,格子を物理的に加圧しながら磁化率を測定したところ,鎖内の原子間距離が減少することによってスピン間相互作用が増大する一方で,磁性鎖間の距離が減少することによって系の三次元性が増大し,一次元的な磁気秩序が低下することが明らかになった.

一方,電気抵抗率は,系内に存在する電子のもつ高い局在性の影響を受け,全組成において非常に大きな絶対値を示したが,Lu置換によってバンドの重なりが大きくなることにより伝導性が増大する傾向が観察された.以上の結果より,擬一次元磁性体への圧力印加は,結晶構造の三次元性を高め,電子の遍歴性を増大させることにより,系の電磁気特性を著しく変化させる効果を有することが明らかになった.
交錯する＜集団歌唱＞とその意義－現代モンゴルの日常的歌謡実践をめぐる人類学的研究

本研究ではモンゴルの婚姻儀礼の宴における<集団歌唱>について調査してきたが、本年度はそれに加え日常生活における祝詞も視野に入れ、言語運用の社会的な在り方と<集団歌唱>とを関連付けて調査を行った。現地の人々のなかでは、伝統的民俗歌謡が消滅しつつあるという認識が共有されているが、彼らは現代的な大衆歌謡をその代替歌謡として宴を遂行している。しかし現代のモンゴルでは、大衆歌謡のなかでもいくつかの歴史的名曲はすでに古典的歌謡と考えられており、いわば「本物」の宴の歌となりつつあることが明らかになった。宴やそこで歌われる歌のモードが大きく二つに分けられることも新たに明らかになった。モンゴルの儀礼的酒宴には、盛大に終わりホストとゲストが別れたあとで、双方の親族が「潰れる」まで自由に飲み歌う、宴の第2のモードが存在する。こうした宴は形式に則った正式な宴よりもはるかに多様な様態で実践されており、それぞれが代替不可能なものとして存在する。これらの点は、非伝統的なものであるがゆえに先行研究において看過されてきたが、現代のモンゴルにおける<集団歌唱>を考えるうえで重要である。報告者は、こうした宴の歌の現代的な状況についてホヴド大学主催の国際学会において報告した。また、牧民家庭に滞在し、訪れた客との挨拶や、日々の会話の内容などを観察した。季節の挨拶を交わす人々はときどきの状況に合わせて挨拶の仕方を変化させる。形式通りの挨拶では家畜や牧草地が良い状態であることを寿ぐものだが、本調査では、そこで「悪い」とか「良くない」という状況を打ち明ける場を複数確認した。報告者は今後も言語コミュニケーションにおける形式の適用/非適用のあり方とその境界について調査を続けながら、社会的営為としての<集団歌唱>の理念や原理を探究する。27年度が最終年度であるため、記入しない。本研究の目的は、モンゴルの宴の場において人々が揃ってひとつの歌を歌う行為である<集団歌唱>を例に、社会的営為としての現代的歌謡実践のあり方を明らかにすることである。そのために、本年度は約11か月のフィールドワークを行い、主に結婚式の宴の歌について、(1)資料収集と聞き取り調査、(2)参与観察を実施した。(1)においては、<集団歌唱>する歌群が伝統的に歌われていた民謡から大衆的な流行歌謡へと完全に移行しつつあり、儀礼の諸段階において歌うタイミングや歌を先導する役割等、地域や民俗ごとに定まっていた様々な規範も曖昧になっていることが分かった。(2)においては、各々がふさわしいと思う大衆歌謡を好きなときに歌い出し、参加者がそれに続いて唱和するような状況も生じており、先のような規範の揺らぎが明白であることを認める一方で、現代の<集団歌唱>は、伝統的な形式性が薄れているが故に、「歌う」行為が宴の場に良い意味を与える(寿ぐ)という、声の力をむき出しにし得るという知見を得た。今後は、この点に基づいて更に調査を行う。さらに、モンゴルの人々は、日常生活において、儀礼的に飾り立てた言葉を用いたり、過度に情報を隠したりすることによって、その場に言外の意味を与えていることも明らかになった。報告者は、このような言語コミュニケーションのあり方もまた、モンゴルにおける声の文化のひとつであり、<集団歌唱>を中心とした歌謡実践の背後にある何らかの原理と相関すると考える。今後は日常的言語コミュニケーションも視野に入れた調査研究を行う予定である。本年度計画していた、現代の歌謡実践の全体像を把握するための資料収集および聞き取り調査はおおむね順調に進展した。

特に、夏期には複数の地域、民俗の結婚式に参加し、参与観察および聞き取り調査を行ったことにより、今後の調査研究に有益となる豊富かつ多様な資料を得ることができた。冬期には、日照時間の短さや悪天候により多くの世帯を訪ねての聞き取り調査は滞ったが、その分日常的な社会生活を観察し、有意義な知見を得ることができた。27年度が最終年度であるため、記入しない。本年度は、<集団歌唱>を中心とした歌謡実践に的を絞った聞き取り調査を行い、その実態の把握に努めた。本研究は、そうした歌謡実践が伝統的歌文化であるのみならず、現代の社会生活と密接に関わっている社会的営為であるという視座に基づいている。今後は、本年度までの調査を継続しながら、現地の人々の社会関係にも重点を置いた調査研究を行う。
新興クリプトコックス・ガッティ感染症における高病原性機序の解析

本研究は高病原性のクリプトコックス・ガッティに対する防御免疫機能を明らかにすることを目的として行った。研究期間内に、厚い莢膜を持つ高病原性株は樹状細胞による認識を回避することを示した。また、ニワトリ由来のovalubumin(OVA)遺伝子を、バイオリスティック法を用いることで種々のクリプトコックス株に導入することに成功した。OVA発現クリプトコックス株とOVAを認識するT細胞受容体を発現するトランスジェニックマウスを用いることで、クリプトコックスに対する防御免疫の詳細を解析する新規の系が構築された1999年にカナダのバンクーバー島でアウトブレイクを起こしたCryptococcus gattiiは、免疫機能が正常な宿主においても中枢神経系へ播種感染を起こし、感染宿主はクリプトコッコーマと呼ばれる腫瘤病変を呈する。C. neoformansによるクリプトコックス症の研究から、ヘルパーT細胞(Th)サブセットのバランスが病態形成において重要であることが示唆されてきたが、ある異種抗原に反応して活性化・増殖するT細胞は極めて少ないため、詳細は不明であった。この問題は、ほとんどのT細胞が特定の抗原に対して反応するように設計されたトランスジェニックマウスを用いることにより解決することができると考えた。本研究では、マウスにとって異種であるニワトリ卵白アルブミン(ovalbumin: OVA)を発現するクリプトコックスを作製し、OVAに反応するT細胞受容体トランスジェニックマウスに感染させる系を構築すること、この系を用いてクリプトコックスの高病原性とThサブセットのバランスとの関係を明らかにすることを目的とした。平成25年度は前年度に作製したOVA発現プラスミドを3株のC. gattiiと4株のC. neoformansに導入した。厚い莢膜と硬い細胞壁を持つクリプトコックスへの遺伝子導入はエレクトロポレーション法ではうまくいかなかったが、千葉大学真菌医学研究センターとの共同研究で、DNAを付着させた金属球をヘリウムガスで菌体に打ち込むバイオリスティック法を用いることにより成功した。また、OVA反応性T細胞受容体トランスジェニックマウスOT-IIを入手し、繁殖を進めた。研究期間内に感染実験に到達することができなかったが、期間終了後も継続して研究を進め、早期に結果を出したい。OVA発現クリプトコックス株とOVAを認識するT細胞受容体を発現するトランスジェニックマウスを用いることで、クリプトコックスに対する防御免疫の詳細を解析する新規の系が構築された1999年にカナダのバンクーバーでアウトブレイクを起こしたCryptococcus gattiiは免疫正常者においても中枢神経系へ播種性感染を起こし、クリプトコッコーマと呼ばれる腫瘤病変を起こすことが明らかになっている。クリプトコックス感染症の病態形成において、ヘルパーT(Th)細胞サブセットのバランスが重要であることから、異なるクリプトコックス株によるTh細胞サブセットの分化の違いを明らかにすることを目的とした。ある異種抗原に反応して活性化・増殖するT細胞の割合は極めて小さいので、Th細胞サブセットの動態を明確に解析することが難しい。そこで、ニワトリ卵白アルブミンであるovalbumin (OVA)を発現するクリプトコックスを作製した後、OVAを認識するT細胞受容体トランスジェニックマウスに感染させ、解析を行う。平成24年度は、高病原性のC. gattiiバンクーバーアウトブレイク株(R265:遺伝子型VGIIa)、もともとオーストラリア、東南アジアなどの限られた地域で呼吸器・中枢神経感染症を起こすC.gattii株の中国分離株(CH8:遺伝子型VGI)、さらに世界的に分布するC. neofomansのうちこれまで保有していなかった株(H99:血清型A)を入手した。これらの株の生菌はマウス骨髄由来樹状細胞を活性化したが、死菌は活性化しないことから、樹状細胞の活性化は病原体関連分子パターン(PAMPs)のみで起こっているのではないことが明らかになった。一方、クリプトコックスでOVAを発現させるためのクリプトコックスphospholypase B(PLB)プロモーター含有ベクター、OVA遺伝子、クリプトコックス選択薬剤nouseothricin(NAT)を入手し、PLBプロモーター下にOVA遺伝子を挿入したプラスミドを構築した。平成24年度中に本研究に必要なC. gattiiの代表的な遺伝子型を持つ株およびC. neoformansの未所持株、さらにOVA発現プラスミドを作製し、クリプトコックスに導入するために必要なプラスミドやクリプトコックス選択薬剤を入手した。クリプトコックス株の入手時期が遅かったので、in vivo感染実験はH25年度に行うこととし、H25年度に予定していたOVA発現プラスミドの構築をH24年度中に行った。クリプトコックス各株の収集とOVA発現プラスミドの構築が完了しているので、これらを用いてOVA発現クリプトコックス各株を樹立する。クリプトコックス各株およびOVA発現クリプトコックス各株をOVA特異的受容体トランスジェニックマウスに感染させ、自然免疫応答性および獲得免疫応答性について解析する。特に後者ではTh細胞サブセットへの分化や細胞傷害性T(Tc)細胞の活性化を中心に、感染後の肺やリンパ節における各種免疫細胞の推移やサイトカイン・ケモカインの産生などの質的変化を経時的に解析する。

得られた結果をもとに、感染モデルマウスにおけるC. gattiiの病原性を評価し、C. neoformansと比較する。また、熱帯・亜熱帯地域で以前から発生していたVGIタイプのC. gattiiと1999年以来北米太平洋沿岸地域でアウトブレイクを起こしているVGIIaのクリプトコッコーマの形成や免疫応答性に特に注目して比較し、高病原性と免疫応答性との関連についての詳細な検討を行う。次年度使用額は、今年度の研究を効率的に推進したことに伴い発生した未使用額であり、平成25年度請求額とあわせ、平成25年度の研究遂行に使用する予定である。
クワへの簡便な遺伝子導入系の確立

本研究は、アグロバクテリウムと発芽種子との共存培養系による方法および接木による遺伝子導入系による方法をもちいてクワにおける簡便な遺伝子導入系の確立を目的とした。接木による遺伝子導入の可能性を検討するため、まず適した諸形質を持つ材料の選定を行うこととした。日本におけるクワ品種の形態的変異に加え遺伝子変異を調べるためにRAPD分析を行い、品種評価分類を試みた。その結果、従来の分類法では形態やタンパク質成分と系統群との関係がみられず、また本研究の葉の全タンパク質の分析でも系統性は認められなかったが、PCRによるDNA分子多型により3つのクワ品種群、ヤマグワ系、ログワ系、カラヤマグワ系に対応する群が認められた。こうしたことにより、形態形質マーカーとDNA分子マーカーの利用可能性が確認された(本間慎)。これをもとに、接木により作成されたと言われている品種のDNA多型分析を行った。「魯桑」に「十文字」を反復接木して育成された「利桑」を調べたところ、育成品種に穂木品種と台木品種とのDNA断片が認められるなどの結果が得られた。さらに、実際に「剣持」に「国桑13号」を接木し、穂木「国桑13号」に認められた(平田豊)。こうしたことにより、従来より、木本植物で用いられている、接木でも、遺伝的変異の誘導や導入が可能と考えられるので今後さらに、詳細な研究が期待される。また、木本植物の遺伝子導入系のモデルとして、クワを再評価し、利用できる可能性も示された。