hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
熱音響機関のエントロピー生成と熱効率

一方,線形現象においても散逸や振動流による熱輸送等に起因したエントロピーが生成される.散逸や振動流による熱輸送を低減し,熱音響機関の熱効率を高めるためには,熱境界層に対して適切な流路径を有する蓄熱器を設定した上で,1蓄熱器において比音響インピーダンスが十分高い2蓄熱器において圧力流速間位相差がゼロの両方を満たす必要がある.ただし自励振動する熱音響機関内の音場は導波管長さや蓄熱器設置位置などの装置形状によって決定されるため,構築した装置において上述を満たせるとは限らない.そこで枝付きループ型熱音響機関を対象にループ内に「ばね,質量,ダンパー」からなる音場調整機構を設けることによって,蓄熱器位置で比音響インピーダンスと圧力流速間位相差を調整可能か数値計算によって検証した.ばね定数,質量,減衰定数を調整したところ,枝付きループ型熱音響機関の蓄熱器位置での圧力流速間位相差をゼロに近づけると同時に,高い比音響インピーダンスを保つことが出来た.また,この時の熱効率は音場調整機構がない場合と比べ向上した.また上述と並行して熱音響機関を対象に実験にて外力の強さと周波数を変化させた際のエントロピー生成を調査する目的から,音響ドライバーの構築を行った.昨年に続き,熱音響機関を対象として強制同期時のエントロピー生成の測定実験を行うことで,非同期から同期に遷移する際のエントロピー生成を検証しており,エントロピー生成という測度を用いた熱音響現象の理解は進んでいる.また熱音響機関の熱効率向上に関しても研究を進めており,枝付きループ型熱音響機関を対象にループ内に音場調整機構を設けることによって,蓄熱器位置で圧力流速間位相差をゼロに近づけると同時に,高い比音響インピーダンスを保つことができ,熱効率の向上が可能であることを計算にて確認した.細管の束(蓄熱器)の軸方向に閾値を超える急激な温度勾配を与えると,管壁と管内気体の間での相互作用により音波が励起し,熱流と音響パワーのエネルギ変換が行われる.この現象は音波を利用した熱機関と見なすことができ,熱音響機関と呼ばれる.熱音響機関のエネルギ変換は管内気体の圧力振動と流速振動の位相差に着目すると,定在波型と進行波型の2つのタイプに分類できる.定在波型のエネルギ変換は不可逆的な熱力学的サイクルによって行われ,熱効率は一般的に低い.一方で進行波型は「理想的」には等温可逆な熱力学的サイクルを実行可能な熱機関に分類することが出来る.ただし,現実の進行波型熱音響機関では,粘性散逸や振動流による熱拡散により,不可逆性が生じ,等温可逆的な熱力学的サイクルを実行することは難しい.不可逆性は熱効率の低下につながる場合が多いため、熱音響現象をエンジンとしての利用する際にも等温可逆的なエネルギ変換を実現することは重要である.一般に熱機関の可逆,不可逆性はエントロピー生成という測度によって評価することができる.上述したように,熱音響機関も熱流と音響パワーの相互変換を行う熱機関であるために,可逆,不可逆性の測度にエントロピー生成を用いることが可能である.本年度は進行波型熱音響機関を対象に規格化音響インピーダンスの絶対値並びに,熱境界層厚さに対する流路径の比を変更しながら蓄熱器におけるエントロピー生成並びにその際の熱効率を解析した.また上述と並行して定在波型熱音響機関を対象として強制同期時のエントロピー生成を観測した.外力の強さと周波数を変化させることで同期/非同期の境界領域にヒステリシスが存在することを確認した.ヒステリシスが存在する領域を対象に,蓄熱器におけるエントロピー生成を検証している.当初予定通り,進行波型熱音響機関の蓄熱器におけるエントロピー生成と熱効率を解析した.
メタボリックシンドロームに対する脂肪酸によるエピジェネティクス制御の解明

妊娠期から授乳期に母親が摂取する油脂由来の脂肪酸が、次世代における生活習慣病の発症に影響を及ぼす可能性があり、その仕組みを明らかにするため、母獣マウスを妊娠中から授乳期にわたり高脂肪ラード食および高脂肪魚油食で飼育し、仔マウスの肝臓を解析した。母獣マウスの食餌により仔マウスの脂肪燃焼に関与する遺伝子はDNAメチル化の変化を伴い発現量が大きく異なっていたことより、母獣マウスが摂取する油脂由来の脂肪酸は仔マウスの肝臓でメチル化を介して遺伝子発現を制御する可能性が考えられた。生活習慣病は環境因子と遺伝素因が複雑に相互作用することにより発症する代表的な多因子疾患であるが、環境因子である食事による脂質の過剰摂取は、肥満をはじめとするメタボリックシンドローム、さらに冠動脈疾患のリスクを増加させることが数多く報告されている。また現代の食生活は脂質摂取量の増加に加えて、調理が容易な肉類と加工食品や外食に多く含まれている飽和脂肪酸の摂取量が増加している一方で、魚離れは止まることなくEPAやDHAで代表されるn-3系脂肪酸の摂取量は減少しており、この傾向は子育て世代を含む若い世代において著しい。多くの疫学調査より胎内環境が成人期の健康状態や疾患リスクに関与することが示唆されているが、乳児期も未だ臓器可塑性が高く、母乳による栄養環境は、児の将来の健康状態や疾患リスクに影響を与える可能性がある。そこで本研究では妊娠・授乳期の母親の摂取する脂肪酸による、児の遺伝子発現のエピジェネティクス制御が成人期のメタボリックシンドロームの罹患感受性を決定するか否かを解明することを目指している。研究代表者らは母獣マウスを妊娠中から授乳期にわたり普通食、飽和脂肪酸に富むラード高脂肪食またはn-3系脂肪酸に富む魚油高脂肪食で飼育し、各食餌群における離乳前の仔マウスの肝臓での遺伝子発現を網羅的に解析した。その結果、母獣マウスの食餌により仔マウスの脂肪燃焼に関与する遺伝子の発現量が大きく異なっていた。この結果より妊娠期から授乳期に母獣マウスが摂取する油脂由来の脂肪酸が、仔マウスの肝臓での遺伝子発現を制御していることが示唆された。また仔マウスの遺伝子発現の変化が、エピジェネティクス修飾により制御されているのかを明らかにするためMIAMI法(Oncogene 25:3059-3064,2006)により、DNAメチル化状態を網羅的に解析中である。研究計画に基づき順調に進展しており、さらなる解析を進める。胎児期や乳児期の臓器可塑性が高い時期において、母乳は児の将来の健康状態や疾患リスクに影響を与える可能性があることより、本研究では妊娠・授乳期の母親の摂取する油脂由来の脂肪酸による、児の遺伝子発現のエピジェネティクス制御が成人期のメタボリックシンドロームの罹患感受性を決定するか否かを解明することを目指している。普通食、飽和脂肪酸に富むラード高脂肪食またはn-3系脂肪酸に富む魚油高脂肪食で飼育し、各食餌群における離乳前の仔マウスの肝臓での遺伝子発現を網羅的に解析した前年度の結果では、母獣マウスの摂取する油脂による仔マウスの遺伝子発現が異なり、特に魚油高脂肪食では脂肪燃焼に関与する遺伝子の発現量が有意に増加していた。そこで今年度は仔マウスにおいて発現が変化した遺伝子がエピジェネティクス修飾により制御されているのかを明らかにする目的で以下の実験を行った。網羅的なDNAメチル化解析を行うために肝臓よりDNAを抽出しMIAMI法(Oncogene 25:3059-3064, 2006)を用い検討するとともに、母乳中の脂肪酸組成を測定するため、胃内容物より脂質を抽出しガスクロマトグラフィー法で分析した。その結果、母乳中の脂肪酸の組成は、母獣が摂取した食餌に使用されている油脂の脂肪酸組成をほぼ反映していた。DNAメチル化については魚油高脂肪食群ではコントロール食群あるいはラード高脂肪食群と比較した場合、DNA脱メチル化されている遺伝子は共通しているものが多く、これらの多くは発現が増加していた脂肪燃焼に関与する遺伝子だった。したがって妊娠期から授乳期に母獣が摂取する油脂は母乳を介してエピゲノム状態を変化させる可能性が示唆された。研究計画に基づき、順調に進展している。今後、さらなる解析を進める。本研究は日本における若年層の食生活の欧米化による飽和脂肪酸の摂取量の増加と、これに伴うω3系多価不飽和脂肪酸(ω3PUFA)の摂取量の減少を背景にしている。胎内環境が成人期の健康状態に影響を及ぼすことが示唆されており、妊娠期から授乳期に母親が摂取する油脂由来の脂肪酸は、エピゲノムに影響を及ぼし成人期の疾患発症に関与する可能性がある。そこで母体の食事性脂肪酸の摂取が、児の肝臓におけるDNAメチル化によるエピゲノム制御に及ぼす分子メカニズムについて検討した。妊娠16日目より授乳期にわたり母獣マウスに、飽和脂肪酸に富む高脂肪ラード食、またはω3PUFAに富む高脂肪魚油食を摂餌させ、その産仔の乳仔期と成獣期における表現型と肝臓の遺伝子発現、DNAメチル化状態を網羅的に検討した。その結果、高脂肪ラード食に比べ高脂肪魚油食では、乳仔期の肝臓においてDNA脱メチル化を伴った遺伝子の発現が増加しており、特に脂肪酸β酸化に関与する遺伝子が多く認められた。分析により母乳中の脂肪酸は母獣が摂取する食餌性脂質に大きく影響を受けており、EPAやDHAなどのω3PUFAは高脂肪魚油食を摂取した場合のみに母乳に含まれていたことから、母獣の食餌に由来する母乳中のω3PUFAが栄養シグナルとして働き

DNA脱メチル化を誘導し遺伝子発現を増加させることが示唆された。さらにDNA脱メチル化を伴う発現増加した遺伝子のパスウェイ解析より、PPAR結合モチーフが検出されたことから、PPARを分子標的としたDNA脱メチル化による発現制御の可能性も示唆された。またこの乳仔期における脂肪酸β酸化関連遺伝子のDNA脱メチル化は成獣になっても維持されていた。食事由来の栄養素である脂肪酸が母乳中に分泌され、器官が未成熟な乳仔期において、特定の代謝経路におけるDNA脱メチル化をひきおこすことが明らかになったことは意義がある。妊娠期から授乳期に母親が摂取する油脂由来の脂肪酸が、次世代における生活習慣病の発症に影響を及ぼす可能性があり、その仕組みを明らかにするため、母獣マウスを妊娠中から授乳期にわたり高脂肪ラード食および高脂肪魚油食で飼育し、仔マウスの肝臓を解析した。母獣マウスの食餌により仔マウスの脂肪燃焼に関与する遺伝子はDNAメチル化の変化を伴い発現量が大きく異なっていたことより、母獣マウスが摂取する油脂由来の脂肪酸は仔マウスの肝臓でメチル化を介して遺伝子発現を制御する可能性が考えられた。研究計画に大きな変更はない。母獣の食餌組成中のn-3系脂肪酸および飽和脂肪酸によって発現が制御されると同定された仔の肝臓の遺伝子について、DNAメチル化状態と成獣期までDNAメチル化が維持されるのかについて解析を進める。DNAメチル化状態が変化した遺伝子が、どのように成獣期に発症するメタボリックシンドロームに対する罹患感受性に関与するか分子レベルの代謝調節メカニズムについて検討する。応用栄養学解剖を行う際に、効率の良い日程を調整する計画ができ、人件費を節約できたため。DNAメチル化に関する網羅的解析において、新規に購入する試薬などが生じなかったため。必要な物品の購入に充当する。DNAメチル化の網羅的な解析法に加え、バイサルファイト解析による特定の遺伝子におけるメチル化変化を検討していく必要があるため、シークエンスなどに使用する予定である。
脳萎縮補正を伴う脳血流SPECTデータベースによる定量的脳循環評価法の構築

平成15年度には、平成14年度に引き続き、50歳台から70歳台の男女健常被験者のMRI脳形態画像及び、I-123 IMPを用いた定性的脳血流SPECT画像を得た。このうち60歳代の男女計6名からは、本研究で主に使用したSPECT撮像装置(MultiSPECT III、Siemens)とは異なる脳専用SPECT撮像装置(SPECT200H、日立メディコ)でも画像撮像を行った。総計35名分のデータを収集した。全例において、123I-IMP autoradiography法を用いて脳血流定量画像作成も行った。さらに、本課題で目的としている、I-123 IMPを用いた定量的脳血流SPECT画像のMRI脳形態画像を用いた萎縮補正を行うための基礎的検討として、過去に取得していた定性的脳血流SPECT画像とMRI脳形態画像とを併用して、形態的に見られる脳萎縮と脳血流SPECTで見られる加齢変化及び性差との関係を評価し、学術論文として英文誌に発表した。さらに、脳血流SPECT画像で観察される健常者における加齢に伴う脳血流低下が、MRI画像を用いた脳萎縮補正法により認められなくなることを示し、健常者における脳血流SPECT上の加齢変化は主に形態的な脳萎縮を反映すると考えられることを国際学会(2003年度欧州核医学会)にて発表した。これらの検討により定めた、MRI画像を用いた脳萎縮補正法を用いて、定性的及び定量的脳血流SPECT画像に脳萎縮補正処理を施し、臨床的に用いられている定量画像と、脳萎縮補正後の定量画像とを比較した。ここから、脳萎縮補正により算出される脳血流値が上昇し、従来ポジトロンCTを用いた報告で知られている値に近づくこと、及び、その上昇率に脳内で局所差があることを示した。平成14年度には、当施設にて行ったMRIを用いた脳画像データベース作成に関する研究に健常被験者として参加した近郊の住民の中で、頭部外傷や頭部の腫瘍、精神神経疾患などの既往が無く、MRI画像上、明らかな病的所見の認められない例を選択し、その中でランダムに本研究を紹介する書類を郵送、約半数の参加を得た。男女それぞれ、50歳台、60歳台、70歳台各々56名からデータを得、0.5テスラMRIを用いた全脳の形態画像および、I-123 IMPを用いた脳血流SPECT画像を得た。後者については、Table look-up法による定量値画像も算出した。これらの画像データを加齢医学研究所のワークステーション及びパーソナルコンピュータ上に移送し、データベースを構築中であるが、さらに十数例を加える予定としている。これらのデータを用いて、高齢者で多く見られる脳萎縮の、脳血流画像に与える影響を評価し、補正手法を開発するため、脳画像解析ソフトウェアであるSPM99でのMRI画像のsegmentationを用いて、灰白質の局所存在確率で表される脳萎縮と、脳血流SPECTで得られる局所脳血流量の変化との関係を検討している。脳血流SPECT画像の脳萎縮補正には、脳MRI画像と併せて画像処理を行うに当たって、多くの誤差を生じる要因があると思われるため、画像処理上のパラメーターを変えた複数の処理を行うことで、それらのパラメーターの脳萎縮補正に与える影響を評価し、より妥当な処理法を検討している。
非営利規制が医療機関の参入および機会主義的行動に及ぼす影響の理論的・実証的分析

現在、日本の医療機関では「剰余金を社員に分配する」ことが禁じられている(以下、非分配制約)。剰余金の分配を禁じる非分配制約が、医療の非営利性を担保する手段として用いられているのである。本研究では、非分配制約によって特徴付けられる非営利規制によって、医療機関の機会主義的行動を抑制できるのかどうかを、主に理論的な面から考察した。機会主義的行動としては、同じ価格のもとで質の低いサービスを提供するという医療機関のモラル・ハザードを想定している。以下、主な結論である。1.非営利の定義について「動機としての非営利」「制度としての非営利」の区別が必要である。そして、非営利規制によって実現できるのは後者の意味での非営利にすぎない。2.非営利規制では「動機としての非営利」を持つ医療機関だけに参入を限定できないことを前提とする。すると、非営利規制は医療機関の機会主義的行動を防ぐのに有効な手段であるとはいえない。日本の医療市場における非営利規制緩和をめぐる議論では、(1)規制緩和により医療機関の資金調達が容易になるというプラスの側面と(2)非営利規制がないと医療機関が機会主義的をとるようになるというマイナスの側面が指摘されてきた。(1)の点については、規制緩和により医療機関にとって資金調達の選択肢が増えるのであるから明らかにプラスである。ところが本研究の結果は、規制緩和によって(2)のようなマイナスが生じないことを示している。この意味で、本研究は非営利規制の緩和に肯定的である。しかしながら、医療機関の機会主義的行動を抑制することは医療政策上必要であり、今後は非営利規制とは無関係に、機会主義的行動を抑制する新たな手段を検討する必要があると考える。「医療の非営利性」は日本の医療供給体制の根本を成す大原則である。ところが、近年の規制緩和に関する議論では、この原則に変更を迫る「企業による病院経営」が検討されている。本年度の研究では、規制緩和の影響を分析するために、非営利規制の有無で何が変化するのか、そして、非営利規制は有効なのか、について理論的に検討した。はじめに、規制緩和の前後で変化するのは、剰余金を分配できるかどうか、すなわち非分配制約の有無であることを確認した。資金調達の手段なども変化するが、本質的に変化するのは非分配制約である。次に、規制緩和の議論に見うけられる混乱を整理する意味で、「法制度としての非営利」と「動機としての非営利」を区別することを提案した。規制緩和によって変化するのは、前者の「非営利」概念のみであり、規制緩和によって病院の動機まで変化するわけではない。最後に、非分配制約は病院のモラル・ハザードを防げるのか、という点についてモデル分析を行った。その結果、1)非分配制約規制は、品質プレミアムを抑えることで、低い価格でモラル・ハザードを防止する効果を持つ。しかしながら最終的には、2)非分配制約規制は最大限うまく機能したとしても、規制が無い場合と高々同程度の効果しかないことを示した。これらの成果をもとに、来年度は(イ)非営利規制は「営利動機」での参入を防ぐ効果があるのか、(ロ)現状の非営利規制のある状況下で、医療機関の行動は「非営利目的」と見なせるのか、などを実証的に検証する予定である。
社会性の障害の分子・神経・感覚要因を一元的に解明：ASDとADHDの超診断的評価

自閉スペクトラム症(ASD)と注意欠如・多動症(ADHD)は症状の重複を認め、二つの疾患が生物学的基盤・認知機能の面から異なるのか研究されている。実際に、申請者らはASD当事者とADHD当事者のASD症状の脳ー症状関係が共通しスペクトラムを形成していることを報告した。しかし、この研究では心理指標と白質の関係を調べたのみで、どのような分子レベルの異常に基づいて神経の異常が形成され、その神経の異常がどのような感覚・運動要因を介してASD症状を寄与しているかは検討できていない。そこで本研究では、これら多層の要因がASD症状を形成する連鎖を一元的に解析し、ASD当事者とADHD当事者で最適なASD症状の形成モデルを探求する。ASD当事者とADHD当事者のASD症状は形成過程から同質であるという仮説を検証し、診断ではなく病態に即した医療を提供するためのエビデンスの構築を目的とする。研究初年度は、リクルート経路の確立、スキャンパラメータの設定、データの予備的解析などのパイプラインの整備に時間が必要であった。しかし、3年間のリクルート目標数を3で割った数よりも多くの被験者をスキャンすることができた。一方で、最終年度はデータの最終的な解析、結果の解釈、論文作成、投稿などの作業が必要であり、最初の2年度で目標の8割程度のスキャンを行いたいと考えている。そのため、現時点では順調と言えるが、当初の計画を大きく上回るものではないと考えている。また、研究テーマと関連した論文を複数投稿することができた。これは当初は予定してなかったため計画を上回る内容である。しかし、依然として受理には至っていないことを踏まえると、計画を大きく上回るほどの成果とは言えない。このような理由で、現状は概ね計画は順調に進展していると考えている。今年度は被験者数を大きく伸ばしたいと考えている。また、当初の計画以上にデータリッチとして被験者数が予定数に達さなかった場合でも学術的に意義のあるデータの解釈ができるような体制づくりを目指す。それに際して、どのようなデータを増やすことが新規的かつ実質的か、どのような仮説が意義があるかの意見交換をするために国際学会で予備的データを紹介する。当初予定していた学会発表の旅費が科研費から支払わなかったことが主な原因である。実際に学会発表は計画通り2018年5月と6月に予定通り行ったが、宿泊の予約や飛行機の手配、抄録の投稿は2018年4月以前に行った。学会発表のためには他に手立てがなかったが、2018年4月より前に計画したため昭和大学研究支援課の内規により科研費から旅費が支払われなかった。なお、日本学術振興会には2018年4月以前に学会発表を計画することは科研費のルールに違反するものではないことを確認している。また、人件費を本年度は支払っていないことも次年度使用額に差が生じた原因である。これは外的資金を獲得し、被験者・研究協力者の謝金をそちらから支払ったためである。
圧電素子を用いた発電時における，素子相互が及ぼす発電特性への影響について

・研究の目的本研究は,並列接続された圧電素子で発電させる際,各素子が相互に及ぼす発電特性への影響について,ひずみゲージおよびひずみ計などを使って,調べることを目的としている.・研究の方法並列につないだ圧電素子の1つにひずみゲージをつけ,ゲージをつけていない素子(素子Aとする)に繰り返し応力を加えることにより(押した時LEDが点灯するように回路を組んである),ゲージをつけた(つまり応力を加えていない)圧電素子(素子Bとする)のひずみがどのように生じるかを,ひずみ計やオシロスコープなどを用いて時間的に観測し,素子の発電能力の影響を考察した.そのあと,素子B側にスイッチ付きの回路を予め組んでおき,短絡させた際に,素子Bに生じたひずみがどのようになるかを調べた.・研究結果上記の方法・手順で行った結果,ゲージが付いていない素子Aを押した後,押す力を緩めた時,他方の素子Bにひずみが生じた.そのひずみは,ひずみ計の出力値の正負から,素子が凹む形のひずみであることが分かった.なお,素子B側の回路を短絡させると素子Bに生じたひずみは解消された.そのようなひずみが生じるということは、仮に素子Bも使って発電させる場合に,素子Aの影響によって,素子Bの押し込み深さの余地が少なくなってしまうことを意味することがら,複数枚の素子を使って発電する際には各素子が互いに影響を及ぼすと考えられる.このようなひずみが生じる理由としては,押す力を緩めた際にLEDが点灯する極性とは逆の電圧が生じることが原因ではないかと考えられる.複数枚の圧電素子を使ってLEDを点灯させるような回路を組む場合は、ブリッジ整流回路等,回路の組み方に工夫が必要であろうと考える.・研究の目的本研究は,並列接続された圧電素子で発電させる際,各素子が相互に及ぼす発電特性への影響について,ひずみゲージおよびひずみ計などを使って,調べることを目的としている.・研究の方法並列につないだ圧電素子の1つにひずみゲージをつけ,ゲージをつけていない素子(素子Aとする)に繰り返し応力を加えることにより(押した時LEDが点灯するように回路を組んである),ゲージをつけた(つまり応力を加えていない)圧電素子(素子Bとする)のひずみがどのように生じるかを,ひずみ計やオシロスコープなどを用いて時間的に観測し,素子の発電能力の影響を考察した.そのあと,素子B側にスイッチ付きの回路を予め組んでおき,短絡させた際に,素子Bに生じたひずみがどのようになるかを調べた.・研究結果上記の方法・手順で行った結果,ゲージが付いていない素子Aを押した後,押す力を緩めた時,他方の素子Bにひずみが生じた.そのひずみは,ひずみ計の出力値の正負から,素子が凹む形のひずみであることが分かった.なお,素子B側の回路を短絡させると素子Bに生じたひずみは解消された.そのようなひずみが生じるということは、仮に素子Bも使って発電させる場合に,素子Aの影響によって,素子Bの押し込み深さの余地が少なくなってしまうことを意味することがら,複数枚の素子を使って発電する際には各素子が互いに影響を及ぼすと考えられる.このようなひずみが生じる理由としては,押す力を緩めた際にLEDが点灯する極性とは逆の電圧が生じることが原因ではないかと考えられる.複数枚の圧電素子を使ってLEDを点灯させるような回路を組む場合は、ブリッジ整流回路等,回路の組み方に工夫が必要であろうと考える.
動的モード分解に基づくHDR動画像生成技術の確立と応用

「動的モード分解法(DMD法)とスパースコーディングに基づき高効率で実用的な画像統合型HDRカメラ技術」とその応用の検討を行った。本年度は、フレーム毎に露光時間を変えて撮影した多重露光動画像からHDR動画像を生成するためにスパースコーディング及び凸最適化に基づく拡張DMD法の定式化を進め、実際に撮影した車載カメラ映像に適用し、その有効性を確認した。また、提案するスパースコーディング技術をスパースFIRフィルタ設計に応用し、既存手法を上回る高性能でよりスパースなフィルタの設計を実現した。平行して、車載カメラ撮影で問題となるガラス越しの撮影で生じる映り込みの除去や、HDR画像を低ダイナミックレンジディスプレイで表示するためのローカルトーンマッピングによる擬似エッジやハローアーティファクトの除去手法の開発を進めた。前者では、真の背景と映り込みの曖昧さを軽減するためにRGB画像に加えて距離情報(デプスマップ:D)を補足情報としたRGB-D画像を用いた新たな映り込み除去手法を提案した。後者では、画像平滑化の際に用いる「勾配の数と入力画像との類似度に基づく最小化問題」に入力画像に基づく新たな勾配制約を導入し、アーティファクトにロバストな勾配制約付き画像平滑化手法を提案した。さらに、夜間やトンネルなどの暗所撮影で問題となる高感度ノイズによる画質劣化を改善するために、混合ノイズにロバストな多重露光画像統合手法を提案した。本手法では、ランダムノイズに加えインパルスノイズを同時に除去することができる。当初の計画通り、設計フェーズ(平成30年度)「多重露光動画像のための拡張DMD法」のアルゴリズム開発に関しておおむね計画通りに進捗している。また、関連する成果に関しては、回路とシステムに関するトップカンファレンスであるIEEE ISCAS2018や同分野の難関国際学術論文誌であるIEEE Transactions on Circuits and Systems I: Regular Papersに掲載済みである。また、画像復元への応用に関する成果は、画像処理分野最大の国際会議であるIEEE ICIP2018に二件掲載済みである。平成30年度に定式化した拡張DMD法を多様なシーン(朝、昼、夜、市街、市内、晴天、曇天、雨天)に適用し、その復元精度を同時に撮影したHDR動画像と定性的/定量的に比較・評価することで、本手法の有効性を解析する。また、関連する既存手法との比較実験、及び高速化のための効率的な再構成アルゴリズムの検討を行い、提案技術の有効性と性能限界について明らかにする。
北海道南部における中世城館の基礎的研究

○研究の目的北海道南部の拠点的中世城館について、その遺構配置・規模・構造を解明する。○研究の方法【調査対象】資料の蓄積が少なく、実態について不明な点の多い北斗市茂別館及び矢不来館とする。【調査手順】(1)先行研究精査、地籍図調査(2)矢不来館西側出入り口周辺測量調査(3)茂別館矢不来館間の道路跡現地調査(4)資料整理・報告○研究成果(1)地籍図調査により、茂別館と矢不来館をつなぐ道路跡と考えられる旧地名の存在が明らかとなり、さらに現地踏査によりその存在を確認した。(2)矢不来館西側出入り口周辺の測量調査により、精確な平面図・断面図を作成した。(3) (1)より、隣接して位置する茂別館と矢不来館の密接な関係の一端が実証された。(4) (2)より、これまで搦手と考えられてきた矢不来館跡西側が大規模かっ緻密な計算に基づき構築されていたことが判明し、矢不来館跡が海側(東側)ではなく内陸側(西側)を意識して構築された可能性が高まった。
Si(111)微斜面ステップ構造相転移の研究

Si(111)微斜面での7×7再構成に起因した、等間隔ステップ配置とステップバンチング構造間の相転移機構を調べた。正方格子のTSK(terrace step kink)モデルを用いて、モンテカルロシミュレ-ションを行なった。ステップ端でのボンド切断エネルギ-εとn×1表面再構成に伴うエネルギ-利得工を考慮し、温度Tでの平衡ステップ配置と平均ステップ間隔との相関を調べた。再構成温度Tcより高温側(I=0)では各テラス面は等価であるのに対し、Tcより低温側(I>0)では、微斜面は量子化された広いテラス面とステップバンチング領域より構成されている。以上の結果は、1992年春の物理学会で発表する予定である。現在、ステップ構造の微斜角依存性、温度依存性の解析中である。更に、より現実に即した系へとモデルの拡張を行なっている。
細胞内へのタンパク質トランスポートシステムの試作

経口接種されたボツリヌス毒素複合体は、構成する無毒のタンパク質(HA等)や神経毒素タンパク質(NTX)の巧妙な感染機構により、NTXの一部分を神経細胞内に注入して細胞機能を破壊し筋弛緩性麻痺を引き起こす。そこで、この機構を逆に利用すれば、有用タンパク質を目的細胞内に送達する新たなシステム(DDS)の創製につながるとの着想から、本研究では、まず、1,モデル注入体の試作、2, DDSが効率よく動作しているかの測定法の確立、3,より詳細な毒素感染機構の解明に取り組み、1ー3それぞれについてDDS創製の基盤となる成果をあげることが出来た。ボツリヌス神経毒素(NTX)は、複数の無毒のタンパク質と結合した巨大な複合体構造をしており、無毒成分は経口接種されたNTXの体内循環系への移行に重要な役割を果たしている。また、NTXも細胞質内で毒性を発揮するプロテアーゼドメイン(NTXLc)、標的神経細胞表面のレセプターに結合するドメイン、孔形成ドメイン(NTXHc)の三つからなり、NTXLcが他のドメインとS-S結合で繋がった二本鎖ポリペプチド構造をしている。無毒成分により体内循環系に移行したNTXは神経細胞表面のレセプターに結合し、エンドサイトーシスで細胞内に取り込まれた後、孔形成ドメインが構造変化を起こし、エンドソーム膜に孔を形成してプロテアーゼを細胞質内に注入して細胞機能を破壊する。そこで本研究では、この一連の毒素細胞内移行機能を応用して、毒素プロテアーゼの代わりに有用タンパク質を細胞質内に効率よく注入する細胞内へのタンパク質トランスポートシステムの試作を行い、新たなDDSの創製に向けチャレンジするものである。本年度は、昨年度に引き続きこのトランスポートシステムがうまく動作しているかを検証するためのTEVプロテアーゼ感受性FRETシステム構築の検討を行った。具体的には、GFP2とRFPのcDNA間に種々の長さのリンカーとTEVプロテアーゼ切断サイトを組み込んだ融合タンパク質を培養細胞に発現させ、細胞ホモジネートにTEVプロテアーゼを作用させて効率よくFRETが観察される融合タンパク質発現プラスミドを試作検討し、得られた最適融合タンパク質を恒常的に発現する細胞株の樹立を現在試みている。また、NTXを利用したDDSにおいてその改変NTXを体内に移行させるために改変NTXと無毒成分との複合体の形成が一つの重要なポイントであることから、複合体とNTXとの立体構造の解析も行った。その課程で、C型毒素複合体の無毒部分の立体構造を明らかにすることが出来たため、本研究の一つの成果として学会と論文で公表した。ボツリヌス神経毒素(NTX)は、細胞質内で毒性を発揮するプロテアーゼドメイン(NTXLc)、標的神経細胞表面のレセプターに結合するドメイン、孔形成ドメイン(NTXHc)の三つからなり、プロテアーゼドメインは他のドメインとジスルフィド結合で繋がった二本鎖ポリペプチド構造をしている。レセプターに結合したNTXは、エンドサイトーシスで細胞内に取り込まれた後、孔形成ドメインが構造変化を起こし、エンドソーム膜に孔を形成してプロテアーゼを細胞質内に注入して細胞機能を破壊する。そこで本研究では、この毒素細胞内移行機能を応用して、毒素プロテアーゼの代わりに有用タンパク質を細胞質内に効率よく注入する細胞内へのタンパク質トランスポートシステムの試作を行い、新たなドラッグデリバリーシステムの創製に向けチャレンジするものである。そこで、まずNTXHcにHisタグを付加したものを大腸菌で大量に発現させ、精製後神経系の培養細胞Nero2Aの培地に添加して、それらが細胞表面に結合しさらに細胞内に侵入することを確認した。現在は、このNTXHcのN末端側にTEVプロテアーゼがS-S結合を介して結合しているタンパク質の発現をデザインしている。一方、このトランスポートシステムがうまく動作しているかを簡便に検証するための方法として、TEVプロテアーゼ感受性のFRETシステムを神経細胞内に発現させる必要があり、こちらの方は蛍光色素タンパク質の組み合わせを種々検討した結果からGFP2とRFPの組み合わせとすることを決め、それらのcDNAの間にTEVプロテアーゼの基質となる配列を挿入した発現プラスミドを構築した。現在は、二つの蛍光色素間のアミノ酸の種類や数を調整して高いFRET効率が得られるような複合体の作製を検討している。本研究は、有用タンパク質をトランスポートするシステムの試作として、有用タンパク質のモデル物質TEVプロテアーゼを細胞内に注入する側のTEV-NTXHcタンパク質の構造設計と、細胞質内に注入されたTEVプロテアーゼを簡便に感度良く検出するFRETシステムの構築がまず初年度では重要な検討事項となっている。平成24年度はこれらのどちらの検討事項もほぼ当初の計画通りに進行しており、達成度は概して良いと言える状況である。

まず、モデルタンパク質TEVを細胞質内に注入するTEV-NTXHcの設計に於いて、TEVのC末端側にボツリヌス毒素NTXLcの当該部分を適当な長さで挿入した種々のフュージョンタンパク質を大腸菌で発現させて、オリジナルのNTXHcと同様にS-S結合がかかっているものを選び出し、大量に調整する。また、TEVプロテアーゼの細胞注入量を感度良く検出するFRETシステムの構築に於いては、二つの蛍光色素間のアミノ酸の種類や数を調整して高いFRET効率が得られる複合体を検討し、最適のFRETシステムをパーマネントに発現するNeuro2A細胞株を樹立する。そして、当初の計画通りH25年度中にモデルタンパク質TEVプロテアーゼを培養細胞の細胞質に挿入するシステムの試作の完成を目指す。物品費:実験、測定に必要な蛍光顕微鏡、蛍光分光光度計等の設備、細胞培養設備等は整っているため、研究費のほとんどを細胞培養に必要な消耗品や培地、遺伝子操作用の試薬や消耗品に使用する予定である。旅費:成果を学会で発表するための旅費を計上している。人件費・謝金:細胞の培養に於いては、常時幾つもの種類の細胞を維持していく必要があるため、細胞培養を手伝ってもらう研究補助者への謝金を支払う予定である。その他:研究成果の発表のための費用を計上している。
外来性グルタミン酸受容体遺伝子の導入によるパーキンソン病の治療の開発

[目的]パーキンソン病の諸症状に対する、視床下核(STN)の高頻度電気刺激術の作用機序については解明されていない。パーキンソン病の症状は、STNやその興奮性入力を受ける大脳基底核の出力核の過剰な活動に起因すると考えられている。そこで本研究において、STNの高頻度電気刺激に対する大脳基底核の出力核の応答について脳スライス標本を用いて解析した。[方法]生後23週齢のラットを用い、視床下核と黒質網様部(SNr)を含む傍矢状断の脳スライス標本を作成した。STNのトレイン電気刺激(0.1ms duration、<100μA,5 train、50200Hz)に対するSNrの細胞の応答をホールセル・パッチクランプ法を用いて記録した。[結果]Nakanishiらの報告をもとにして、電気生理学的にSNrのGABAニューロンの同定を行った。Action potentialのdurationが比較的短く(およそ1ms)、10Hz以上の自発発火活動を示し、depolarizing current pulseによって更に高頻度の発火活動が誘発されspike accommodationしない、またhyperpolarizing current pulseによってh電流が見られない、以上の性質を持つものをGABAニューロン(n=45)と判定した。次にSTNの単発電気刺激に対するSNrニューロンの応答をvoltage clamp法で記録し、刺激後に早期のEPSC(excitatory postsynaptic current)とそれに続くIPSC(inhibitory postsynaptic current)の2つの成分がoverlappingしていることを確認した。これをもとにEPSCとIPSCのpeakにおける電流-電圧曲線をプロットすると、それぞれの反転電位がおよそ0mV、-60mVであることから、グルタミン酸電流、GABAA電流であることが推測された。更に、視床下核の電気刺激後に見られるIPSPの成分がGABAA受容体の拮抗薬の投与によって消失し、IPSPはGABAA電流であることを確認した。STNの5連発電気刺激に対するSNrニューロンの応答を、currnt clamp法で記録した。刺激頻度が高くなるにつれて、特に130Hz以上の高頻度刺激で、action potentialが追随することが出来なくなり、かつover shootまでの閾値に達しないでEPSPに留まる様になった(Fig.2)。更に、GABAA受容体の拮抗薬の投与によって、action potentialが高頻度刺激に対して追随するようになった。[結諭]STNの連続刺激は、大脳基底核の出力核の応答を刺激頻度依存性に抑制する。STN-SNrシナプスは興奮性投射であるため、STNの連続刺激は他の抑制性機序を積極的に作用させることによって効果を発現することが示唆された。
脳画像との対応による脳障害者の認知機能評価システムの開発

脳損傷者の認知機能障害を簡易に評価するものとして、本邦ではHDS-RやMMSEが一般的に知らている。このような簡易検査は、特に、高齢者の認知機能障害の有無と程度の評価を目的としており、認知症の鑑別に非常に有効であるとされている。本報告書では、さらに、脳障害者の認知機能評価を簡に評価することを目的としたバッテリーで評価することの必要性のもとに心理検査を開発した。本研究で開発した神経心理検査バッテリーは,従来心理学領域でよく知られている心理検査を用いてバッテリーを構成し、広汎な脳領域に起因する認知障害と、病巣性に起因する認知障害の様相を明らかにしようとした。脳障害者の認知機能障害そのものの評価が重要であると同様に、脳障害者の現在の認知の様相を素早く理解することの重要さのもとで心理検査を開発した。一般に、検査者は認知障害そのものの評価に検査目的をもつが、障害を含む、現状での認知機能全体の様相を知ることも、障害者の今を生きる、そのことを支援することの重要さを考えたとき、障害者の全体的な認知様相の理解がさらに重要になってくる。本検査の開発の第2の目的は、現在の神経科学の成果を取り入れて、心理検査の評価と解釈を行なうためにMRI、SPECT等の脳画像を積極的に導入することであった。今までの認知機能検査は、脳の構造的、機能的に障害と無関係に、心理学的概念のもとに作成された。しかし、invivoの状態で脳の活動をみることができるようになってきたことから、心理検査による評価と脳画像との対応関係の評価を試みた。本研究の主たる目的は、脳障害にある患者の認知障害の質と程度をpsychometric心理検査を通して、認知心理学モデルとの神経科学の知見をもとに再考することにある。そのため下位目的を2つ設定した。第1の目的は、脳障害者に国際的に認知された神経心理検査を実施し、その検査結果に基づく認知障害を脳画像と関係で再考することである。現在以下の観点から検討中である。脳損傷者や健常成人に実施してきた琉大式簡易神経心理学査バッテリー(RBNB)の下位検査間の成績をもとに、以下の観点から検討中である。1.RBNBの実施についての吟味2.RBNBの下位検査の妥当性と信頼性について3.RBNBによる、記憶機能障害の評価について4.RBNBによる、前頭葉機能障害の評価について5.RBNBによる検査結果の量的評価と質的評価の併用の検討6.RBNBによる脳機能の局在性と全体性機能低下の評価の吟味7.RBNBとさらなる検査項目の導入について8.RBNBと他の簡易検査(長谷川式やMMSE)との関連性9.RBNBの痴呆検査としての妥当性と有効性についての吟味10.RBNBの高齢者の認知機能評価の有用性について第2の目的は、実験心理学的psychometric検査の導入を行うことで、現在、従来のpsychometric検査からヒントを得た実験的なpsychometric検査の導入を考案中である。1.RBNBの実施についての吟味2.RBNBの下位検査の妥当性と信頼性について3.RBNBによる、記憶機能障害の評価について4.RBNBによる、前頭葉機能障害の評価について5.RBNBによる検査結果の量的評価と質的評価の併用の検討6.RBNBによる脳機能の局在性と全体性機能低下の評価の吟味

7.RBNBとさらなる検査項目の導入について8.RBNBと他の簡易検査(長谷川式やMMSE)との関連性9.RBNBの痴呆検査としての妥当性と有効性についての吟味10. RBNBの高齢者の認知機能評価の有用性について第2の目的は、実験心理学的psychometric検査の導入を行うことで、現在、従来のpsychometric検査からヒントを得た実験的なpsychometric検査の導入を考案中である
高等植物の受精における自己・非自己の認識機構

自家不和合性は、雌しべが自己と非自己の花粉を認識し非自己花粉でのみ受精する性質である。本研究の目的は、バラ科ニホンナシを対象に、配偶体型自家不和合性に関与している雌しべ側・花粉側因子を同定し、自家不和合性の分子機構を明らかにすることである。平成12年から14年までの3年間で、雌しべ側因子であるS3-RNaseの1.5Å分解能の立体構造をX線結晶構造解析により明らかにした。この立体構造より、花粉側因子との認識に関与している領域を推定することができた。近年、花粉特異的に発現しているF-box遺伝子がS遺伝子座に発見され、花粉側因子である可能性が強く示唆されている。しかし、F-boxタンパク質がS-RNaseと相互作用する直接的な証拠はなく、F-boxタンパク質が関与するユビキチン・プロテアソーム系が配偶体型自家不和合性の本質である証拠も未だ示されていない。そこで、精製したS-RNaseを用いたハンギングドロップ法により再現性よく花粉管伸長阻害が起こるin vitro実験系を構築した。次に、この実験系を用いて花粉管伸長阻害時に特異的に発現しているタンパク質およびS-RNaseの構造変化を解析した。その結果、花粉管伸長阻害時に特異的に発現している13種類のタンパク質が検出されたが、F-boxタンパク質は検出されなかった。上記の実験において花粉管内に取り込まれたS-RNaseは何らかの修飾を受け、複数のS-RNaseスポットとして二次元電気泳動ゲル上に検出された。また、S-RNase添加から12時間後には花粉管内に取り込まれたS-RNaseがすべて分解されていた。さらに、S-RNaseの代わりにRNase T2やRNase Aを添加しても、S-RNaseに見られるようなRNase自身の分解は観察されなかった。以上の結果は、S-RNaseを積極的に修飾・分解するシステムが花粉管内に存在していることを示唆している。最近、LuuらがNatureに発表した論文によりインヒビター説が有力になったが、シグナル伝達に基づくレセプター説である可能性も残されているため、広範な視点から花粉側S遺伝子産物の探索を行った。花粉(管)の細胞質可溶性蛋白質、膜蛋白質に対して、S-RNaseをリガンドとしたアフィニティークロマトグラフィーを行い、S-RNaseと特異的に結合する3種類の花粉管膜蛋白質(M.W.約70kD)を検出した。これらの蛋白質は、RNase T_2とは相互作用せず、花粉と比べて花粉管の細胞膜画分により多く発現していた。これらの蛋白質を2次元電気泳動で精製し、トリプシンによるin gel消化後、ペプチド・マスフィンガープリントを作製し、データベースで検索したところ、3種類ともレセプター型プロテインキナーゼとの相同性が示唆された。現在、MS/MSシーケンシングによりこれらの蛋白質の内部アミノ酸配列の決定を試みている。内部アミノ酸配列の情報が得られれば、PCRにより遺伝子を増幅し、塩基配列から予測されるアミノ酸配列がS遺伝子型特異的であるかを調べる。また、S-RNaseに対する結合もS遺伝子型特異的であるかを慎重に検討している。さらに、表面プラスモン共鳴を原理にしたIAsysにより、in vitroでの花粉管伸長時に花粉管から培地に分泌される成分にもS-

RNaseと結合する因子(M.W.約15kD)が存在することを見い出し、アフィニティークロマトグラフィーにより精製した。現在、この因子と自家不和合性との関連性を検討している。花粉(管)の細胞質可溶性蛋白質、膜蛋白質に対して、S-RNaseをリガンドとしたアフィニティークロマトグラフィーを行い、S-RNaseと特異的に結合する花粉管膜蛋白質(M. W.約70kD)を検出した。この蛋白質を2次元電気泳動で精製し、トリプシンによるin gel消化後、Q-TOF MSによりMS/MSシーケンシングを行ったところ、ヒトケラチンと一致し、クロマトグラフィーの操作段階で混入した不純物であると判明した。再度S-RNaseをリガンドとしたアフィニティークロマトグラフィーを試みたが、S-RNaseと特異的に結合する蛋白質は花粉(管)可溶性画分、膜画分のいずれにも検出されなかった。これは、S-RNaseを直接樹脂に結合させたため、樹脂との立体障害で花粉側因子がS-RNaseと結合できなかったためと考え、S-RNaseをその糖鎖(立体構造上、糖鎖は予想される認識部位から離れている)でレクチンカラムに結合させ、花粉(管)蛋白質抽出液に対してアフィニティークロマトグラフィーを行なっている。さらに、S-RNaseのC末端領域(立体構造上、C末端領域も予想される認識部位から離れている)のペプチドで免疫したポリクローナル抗体を用いた共免疫沈降法によりS-RNaseと特異的に結合する花粉側因子の検出も試みている。また、表面プラスモン共鳴を原理にしたIAsysにより、in vitroでの花粉管伸長時に花粉管から培地に分泌される成分にもS-RNaseと結合する因子(M. W.約15kD)が存在することを見い出したが、アミノ酸組成分析、糖組成分析の結果、この因子は蛋白質ではなく、主に中性糖からできている多糖類である可能性が非常に高いことが判明した。しかし、S-RNaseとの結合にS遺伝子型特異的はなく、自他認識に関与する花粉側因子とは考えにくい。自家不和合性は、雌しべが自己と非自己の花粉を認識し非自己花粉でのみ受精する性質である。この性質は1遺伝子座の複対立遺伝子(S遺伝子)により支配され、雌しべと花粉でそれぞれ特異的に発現する蛋白質(S蛋白質)の分子間相互作用により雌しべ・花粉間の自他認識が行われると考えられている。配偶体型自家不和合性を示すナス科やバラ科植物ではRnase T2型のリボヌクレアーゼが雌しべ側S蛋白質(S-RNase)であると実証されていたが、近年、花粉特異的に発現しているF-box遺伝子がS遣伝子座に発見され、花粉側S蛋白質である可能性が強く示唆されている。しかし、F-box蛋白質がS-RNaseと相互作用する直接的な証拠はなく、F-box蛋白質が関与するユビキチン・プロテアソーム系が配偶体型自家不和合性の本質である証拠も未だ示されていない。そこで平成14年度の本研究では、バラ科ニホンナシを研究対象に、S-RNaseおよびF-box蛋白質の細胞内動態の解析から配偶体型自家不和合性の分子機構の解明を目指した。まず、精製したS-
シークリッドを用いた硬組織形態形成に関わる遺伝子の同定・-下顎骨形態形成遺伝子の解明を中心として-

魚類の硬組織形成に関与する遺伝子を同定するために、スズキ目(Perciformes)カワスズメ科(Cichlidaeシクリッド)ハプロクロミス類の頭部から抽出したRNAを用いてcDNAライブラリーを作製した。EST (Expressed Sequence Tag)シークエンス・データから硬組織形成に関与すると思われる遺伝子を選び出したところ、哺乳類のdentin sialoprotein (DSP)および哺乳類・爬虫類のdentinmatrixprotein(DMP1)の遺伝子にホモロジーを示す遺伝子が1つ見つかった。DSP遺伝子とDMP1遺伝子は、共通の祖先遺伝子から進化した遺伝子であると想像されている。DMP1のアミノ酸組成の特徴は、酸性アミノ酸の割合とセリンの割合が高いことである。シクリッドで見つかった遺伝子は、酸性アミノ酸が29%を占めていたが、これは他の動物で知られているのと同等に非常に高い割合であった。哺乳類ではヒト29%・オポッサム27%、鳥類ではニワトリ30%、爬虫類ではカイマン26%である。セリンの割合はシクリッドで見つかった遺伝子では12%、他の網の平均は約20%である。現在わかっている哺乳類、鳥類、爬虫類のDMP1 exon 6部分のアミノ酸配列と、シクリッドで見つかった遺伝子のアミノ酸配列の同等部分の配列を比較したところ、315アミノ酸中107アミノ酸が同一であった。すべての種に共通に保存されている領域においても、シクリッドで見つかった遺伝子のアミノ酸配列は、よく保存されていた。シクリッドで見つかった遺伝子は、Blast Xで、ゼブラフィッシュのstarmakerともホモロジーを示した。starmakerは、ゼブラフィッシュにおいては耳石の形態形成に強く関与していて、dentin sialoprotein (DSP)のホモローグと考えられている。しかしながら、ゼブラフィッシュのstarmakerとシクリッドで見つかった遺伝子は、dot plotで比べてみると相同性は無かったので、シクリッドで見つかった遺伝子はstarmakerではない。シクリッドで見つかった遺伝子は、DMP1の特徴を持ち、dentin sialoproteinとホモロジーがあることから、DMP1とDSPのホモローグであると考えられる。シークエンス・データを順次解析したところ、硬組織形成に関与すると思われる以下の遺伝子10個が見いだされた。
受精時の多精拒否におけるTPC3チャネルの役割の解明

Two-Pore Na+ Channelファミリー3(TPC3)は膜電位依存性Na+チャネルの一種である。TPC3は卵母細胞に発現しており、特に表層顆粒と形質膜への局在が認められる。表層顆粒は受精時に形質膜と融合し、多精拒否に重要な受精膜の形成に寄与する。TPC3は、ノックダウンにより受精膜の形成異常が起こるなど受精への関わりが示唆されるものの、その生理的役割はよくわかっていない。我々は、電気生理学的解析によりTPC3がホスホイノシチドとプロテインキナーゼC(PKC)により制御されていることを見出した。特に、PKCは受精時に活性が亢進することから、TPC3のPKC依存的な制御が受精に重要であることが示唆される。我々は、ツメガエル卵母細胞を用いた二電極膜電位固定法によりTPC3電流を測定し、これまでに以下のような結果を得た。(1)ツメガエル卵母細胞に強制発現させたTPC3電流の、PKC活性化による影響を詳細に解析した。PKCの活性化剤であるPMAで処理しながらTPC3電流の変化を測定したところ、PMAによりTPC3電流は一過的に増大し、その後緩やかに減弱していく現象を見出した。PKCによる電流の増強が一過的であるということは、TPC3が受精時の特定のタイミングでのみ作用することが重要であることを示していると考えられる。(2)強制発現させたTPC3の電流測定により、TPC3がpH感受性を持つことを見出した。形質膜に発現させたTPC3に対して、細胞外側溶液のpHを変化させたところ、低pHでTPC3が著しく阻害されることがわかった。表層顆粒内腔は低pHに保たれているとされており、局在場所に依存したTPC3の活性制御機構の存在が示唆される。電気生理学的解析による上記の2点の結果は、ともに仮説を支持するものと考えられる。特に、pH感受性の発見からは、受精時にTPC3が表層顆粒から形質膜に移行するに伴い活性が変化する可能性が示唆される。このように、TPC3が受精に重要であるという仮説、および研究の方向性は妥当であると考えられ、研究計画のとおり次年度も解析を進めていく。特に、蛍光免疫染色などの細胞生物学的手法を用いた解析も行い、多面的に仮説を検証する予定である。PKC非感受性の変異体を探索し、どのような分子メカニズムによりTPC3の活性が制御されているかを確かめる。また、卵母細胞に内在するTPC3をノックダウンし、内在性のTPC3電流が強制発現の場合と同様の振る舞いをするかを確認する。さらに、蛍光免疫染色などの細胞生物学的手法を用いて、活性や局在の変化といった電流測定によって得られた知見を異なる実験手法によって補強することを狙う。

本年度は、電気生理学的手法を用いた実験によりpH感受性などの興味深い観察結果が得られたため、この点に注力した結果、細胞生物学的解析に必要な試薬などの購入費が抑えられた。次年度は、本年度と同様に分子生物学的・電気生理学的実験に必要な基本的な試薬・消耗品に加え、細胞生物学的実験に必要な蛍光試薬や細胞固定・処理試薬の購入費用が必要となる予定である。