hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
保型形式の表現論的研究

議論の基礎となる原理は次の事実である;Sp(V_0)をp-進体上、又は、adele化して得られる局所コンパクト群Spの二重被覆群をSp^^とする。Sp^^のWeil表現をωとすると、Sp^^のユニタリ表現πに対してπ(〕SY.crosprd.〔)ωはSp_Jのユニタリ表現と見なせる。このとき、π→π(〕SY.crosprd.〔)ωはSp^^のユニタリ表現からSp_Jのユニタリ表現へのbijectionを与え、既約表現は既約表現に対応する。good prime pに対しては、対応π→π(〕SY.crosprd.〔)ωはSp^^のclass-1表現とSp_Jのclass-1表現とのbijectionを与えることが示される。これは、Sp^^のHecke作用素の環H_pとSp_JのHecke作用素の環H_<p,J>とのC-algebraとしての同型を与えるが、その同型写像をdouble cosetのcharacteristicfunction(それらがH_pとH_<p,J>のC-baisisを成す)の対応として具体的に書くことができる。以上のlocal theoryからadele化した群上でのglobal theoryが構成される。結果として、R=Q_∞上で与えた対応F→fがHecke作用素の作用と可換であることがわかる。表現論的手法を用いることにより、Eichler-Zagier-Ibukiyamaの対応の原理的基礎が明らかになり、他の多くの群の場合への一般化の明かな見通しが得られた。
超音波導入法を用いた内耳血管条への遺伝子導入

昨年度、in vitroでの超音波を用いた遺伝子導入法を確定し、今年度はin vivoでの検討を行った。当初マウスを用いて行う予定であったが、モルモットを用いて行うこととした。1.導入遺伝子の作成、遺伝子導入血管条に存在するカリウムチャンネルKCNJ10をコードするgerbilKCNJ10遺伝子のプラスミドベクターを作成。モルモットに麻酔を行った後、後頭部を固定し側頭骨を削開し内耳プロモントリーに直径1mmの開窓を行った。事前にKCNJ10プラスミドベクターをマイクロバブルに封入しておき、作成した小孔よりガラス毛細管を用いバブルを注入し、超音波発生装置を用いて超音波を照射した。小孔を側頭筋小切片を用いて閉鎖し、2472時間後に断頭し内耳を摘出した。2.導入遺伝子の確認GFPを添加したサンプルではは蛍光顕微鏡下にGFPの蛍光シグナルを確認した。また、FLAG添加したプラスミドを導入したサンプルでは免疫染色を行った後に光学顕微鏡下に観察した。結果は基底回転において蛍光および発色を確認できたが、当初の予想通り、血管条以外にも蓋膜にも導入されていた。これらの結果により、基底回転への遺伝子導入は可能であったが、apexまでいかに導入を行うかが今後の課題となった。初年度は培養内耳血管条への遺伝子導入を行い、その遺伝子導入法を確立することを目的として研究を進めた。当初はKCNJ10のプラスミドベクターを作成する予定であったが、その部分は次年度で行うこととし、gerbil prestin遺伝子ベクターを用いてin vitroで導入方法の検討を行った。1.遺伝子導入プラスミドベクターをマイクロバブルに封入し、マウスから摘出したコルチ器をマイクロバブル入りの培養液へ移した。そこへ超音波発生装置であるSonitron 2000(Rich Mar, Inora, OK, USA)から超音波を照射し、遺伝子を導入した。照射した組織は培養液中で2472時間CO2インキュベーター内で培養した。2.導入遺伝子の確認GFPを添加したプラスミドを導入したサンプルは蛍光顕微鏡下でGFPの蛍光シグナルを確認したが、細胞質、核にGFPの蛍光シグナルが認められた。遺伝子導入の確認のため、遺伝子導入したコルチ器組織からRNAを抽出し、特異的プライマーを用いてreverse transcription-PCRを行った。controlとしてマウス脳組織、遺伝子導入していないコルチ器、プラスミドDNAを用いた。結果は遺伝子導入したコルチ器から採取したcDNAとプラスミドDNAのバンドが一致し、脳組織、照射していないコルチ器からはバンドは認められなかった。これにより遺伝子導入が確認された。3.発現量の調整生理食塩水15μlとマイクロバブル10μlを混合する。超音波は0.5Wで30sec照射し、duty cycleは10%で行うことで、発現量が最適化された。
転写因子としての甲状腺ホルモン受容体による機能分化と細胞増殖調節の解析

1.ホルモン応答性増殖刺激因子遺伝子と受容体との関係NADPH依存性細胞質甲状腺ホルモン結分蛋白(CTBP)はホルモン応答性細胞増殖刺激因子の一つと考えられている。このCTBPは甲状腺ホルモンで誘導され、しかもこの誘導は甲状腺ホルモンによるCTBPの転写促進として実験的に証明された。そのためこのCTBP遺伝子には甲状腺ホルモン応答部位(TRE)が存在する可能性がある。本研究ではCTBP蛋白によりアミノ酸配列、およびこれに基づくヌクレオチド配列解明を行った。しかし、一部の構造解明はできたもののFull lengthの構造解析は不可能であった。従って受容体とこのCTBPとの直接的関係の存在を証明することは出来なかった。しかし、甲状腺ホルモンによるCTBPの増加は甲状腺ホルモン作用に対し抑制的に作用することが明かとなったため、この関係の解明は技術的には可能である。2.ヘテロ2量体によるホルモン応答性細胞増殖刺激因子遺伝子の発現甲状腺ホルモン受容体がホモ2量体を形成して作用を発現することはよく知られている。最近、他のリガンド、たとえばRA、ビタミンD3、によるテヘロ2量体は甲状腺ホルモンの作用に対し少なからぬ影響を及ぼすことが知られるようになった。われわれの研究でもこの事実を確認した。さらにホルモン応答性細胞増殖刺激因子遺伝子の発現にもこれらの機構が関与すると思われる実験結果を得ている。しかし、末だ、この刺激因子の構造が充分に解明されておらず、直接証明はまだ行われていない。しかし、このような刺激因子(細胞内)の発現がホルモンによって誘導されたことは、癌の発育、成長に関与すると考えられる因子の解明につながり、今後、さらにこの分野の研究の重要性が増すものと思われる。
ヒト培養細胞における複製開始機構の解析

高等動物染色体の複製開始に必要なDNA上の情報を明らかにするために、我々はヒト染色体断片をクロ-ン化したライブラリ-からヒト細胞内でプラスミドとして自律複製する能力をもつもの(ARSプラスミド)を分離し解析することを試みた。1.5ープロモデオキシウリジン(BrdU)を用いた密度標識法によりARSプラスミドを選別した結果、10ー15kbの染色体断片を含む5種類のクロ-ンを分離した。分離したプラスミドを解析した結果、(1)ランダムな染色体断片を含むプラスミドよりも効率良く複製する(2)半保存的複製をする、(3)長期間のプラスミド保持を可能にする、(4)染色体に組み込まれた形ではなくプラスミドとして複製することから確かに自律複製能を有することが確認された。また細胞周期のS期に複製することからARSプラスミドの製複も染色体の複製と同様に細胞周期の制御を受けること、さらに1回の細胞周期中には同じプラスミド分子は2度目の複製を行わないように制御されていることも示唆された。2.ARSプラスミドから約300bp間隔でのdeletion株を系統的に分離しその複製能を解析した結果、クロ-ンした断片上にはプラスミドの複製に必要な領域が複数存在すると示唆され、それらの領域には出芽酵母でのARSコンセンサスや分裂酵母のARSに存在する配列によく似た塩基配列が頻繁に出現することも明らかとなった。以上の結果は、高等真核細胞染色体の複製開始点は、ある特定の塩基配列に依存して毎回そこから複製開始が起こるのではなく、ある頻度で開始を起こすような領域が多数あり、それらの密度が複製開始の頻繁に起こる領域とそうでない領域を区別しているのではないかと考えられる。
ラマンCT顕微鏡の開発と地球深部起源天然試料の圧力履歴探索

本研究では、point-to-pointの3次元ラマン顕微鏡により、地球深部起源の試料に蓄積された残留圧力を、ラマンスペクトルの微小な圧力シフトから可視化することを目指した。研究当初から技術的な問題となっていたことであるが、実験室の±0.5°C程度の微小な温度変化が、微小なラマンスペクトルの波数変動を観察する上では無視できない影響を及ぼす。この問題を解決するためには、実験室の温度を0.1°C以下の精度で制御する必要があるが、そのような高度な空調設備を整備することは現実的ではない。そこで、分光器に波長標準となるネオンランプの発行線を導入し、ラマンスペクトルとネオンの蛍光スペクトルを常に同時に観測し、分光器を逐次校正する機構を取り入れた。これまでラマン散乱光を取り入れていた光ファイバーを2分岐化し、一方にネオン光を導入し、両者の信号をCCDカメラ上に2本のアレイとして同時に検出するシステムを築きあげた。この機構により、ラマンスペクトルと同時にネオンランプの発行スペクトルを測定することが可能となった。本装置を用いることにより、ラマンスペクトルを波数安定度0.05cm-1で測定することが達成され、長時間に及ぶ3次元ラマンマッピングにおいても、高精度にラマンマッピングを測定することが可能となった。一連の技術的な開発により、ダイヤモンド中に含まれる異種鉱物の残留応力を独立に決定することができ、これらの鉱物の熱膨張率と圧縮率から、包有物がダイヤモンドに取り込まれた温度圧力条件を見積もることが原理的に可能となった。現実的に得られる値は、ダイヤモンド生成環境と比較して低い温度、圧力となっているが、今後より高い空間分解能で残留圧力を求めることで、より高精度な温度圧力環境の見積もりを今後展開されるであろう。本年度は、ダイヤモンド中の包有物周辺の応力分布を顕微ラマン分光法により3次元的にマッピングするための装置開発を行った。研究室に既存の顕微ラマン分光装置に、自動XYステージとフォーカス調整用のZ軸の制御機構を装着し、10ミクロンオーダーの包有物周辺のダイヤモンド結晶に蓄積している応力を3次元的にマッピング測定することが可能となった。実際に包有物周辺の応力をラマンスペクトルのシフトから検出するためには、0.1cm^<-1>かそれ以下の測定精度でラマンスペクトルの波数を決定する必要がある。我々のこれまでの研究によって、得られたラマンスペクトルに数値処理を行うこと0.1cm^<-1>の分解能でピーク位置を決定することができることが明らかになっているが、分解能が向上する反面、実験室における微小な温度変化が測定結果に無視できないノイズをもたらすことが明らかになった。この問題を解決するために、我々の分光システムに波長の内部標準としてネオンランプを取り入れ、実験室の0.5°C程度の微小な温度変化に応じて分光器が収縮することによって生じるデータ変動を完全に補正することに成功した。ここで開発した装置を用いて、ダイヤモンドに含まれる包有物周辺を対象に、3次元的なラマンマッピング測定を行った。その結果、包有物周辺の応力分布が3次元的に画像化され、ダイヤモンドの深さ起源に関する情報が得られつつある。来年度はX線CT画像データとの対比などを行う予定である。
肥満・糖尿病における免疫プロテアソームの役割の解明と治療法の開発

炎症は肥満病態に関わっているが、未知の点が多い。免疫プロテアソームサブユニットの一つであるLMP7は免疫システムにおいて重要で、自己免疫疾患の病態に関与する。肥満に炎症が関わることから、LMP7欠損マウスを利用して、肥満におけるLMP7の役割について検討した。LMP7欠損により、高脂肪食による肥満・内臓・皮下脂肪の蓄積、脂肪組織での炎症が抑制され、耐糖能も改善された。LMP7欠損は脂肪細胞分化を抑制し、M2マクロファージマーカの発現を増強した。本研究により、血球系でも組織細胞でもLMP7が肥満病態に関与することが示唆された。免疫炎症反応は、肥満症や糖尿病の病態に関わることが解明されてきたが、詳細な機序はまだ不明である。本研究では、免疫プロテアソームという蛋白質分解酵素が、肥満・糖尿病などの炎症に関与しているのではないかという仮説の下、免疫プロテアソームを欠損したマウスを利用して、その役割を解明することを目的としている。平成26年度は、マウスの免疫プロテアソームのサブユニットの一つであるLMP7を欠損させると、抗炎症作用を介して、高脂肪食負荷による肥満に抵抗性を示し、耐糖能やインスリン感受性の改善がみられることなどを論文にまとめ、投稿中の段階に至った。また、免疫プロテアソームの別のサブユニットであるLMP2の欠損マウスについても同様の実験を行っているが、繁殖上の問題で時間がかかっている。糖尿病病態の慢性炎症への免疫プロテアソームの関与を検討するために、低用量ストレプトゾトシン投与モデルを利用して、その役割について解析を始めた。LMP7欠損マウスでは、ストレプトゾトシン投与による血糖値上昇が、炎症抑制により改善されるのではという予想に反して悪化することがわかった。悪化する原因として免疫細胞の早期浸潤が考えられたが、免疫染色やフローサイトメトリーによる解析でその仮説は当てはまらない知見を得ている。LMP7の選択的阻害剤を使用した細胞レベルでの研究を進めるために、ラ氏島細胞株MIN-6細胞の供与を受け、培養を始めた。本研究では、肥満・糖尿病の病態における免疫プロテアソームという蛋白質分解酵素の役割を解明することを目的としている。平成27年度は、マウスの免疫プロテアソームのサブユニットの一つであるLMP7の欠損が、高脂肪食による誘導される肥満や高血糖・高脂血症・耐糖能・インスリン抵抗性を改善し、脂肪組織での炎症反応を抑制することを論文(Scientific Reports, 5: 15883)に発表した。また、この内容を平成27年10月の肥満学会や平成28年4月の内分泌学会でも報告した。LMP2の欠損マウスについても同様の実験を行っているが、繁殖上の問題で時間がかかっている。LMP7欠損マウスでの脂肪細胞分化が抑制されることを見出したため、その続きとして、脂肪前駆細胞株3T3-L1細胞の脂肪細胞分化の系とLMP7の選択的阻害剤のONX-0914を利用し、脂肪細胞分化におけるLMP7の役割を解析している。脂肪細胞分化に関わる転写因子群の発現を測定し、LMP7阻害の効果を検討し、いくつかの候補を見出した。そして、LMP7の役割を分子機能的に解析するために、LMP7の高発現もしくは、ノックダウン、さらに変異型LMP7を発現するレンチウイルスを作製し始めた。現在、一部は作製済みである。今後は、これらのウイルスを使用し、より詳細な機構を解析する予定である。糖尿病病態の慢性炎症への免疫プロテアソームの関与を検討するために、低用量ストレプトゾトシン投与モデルを利用して、その役割について解析を始めたが、このモデルではLMP7欠損により糖尿病が悪化することがわかった。先に記載したレンチウイルスを利用して、LMP7を恒常的に発現しているラ氏島細胞株MIN-6細胞のLMP7をノックダウンしたり、さらには高発現させたりして、インスリン産生能などを検討し、LMP7の役割を解析する予定である。肥満モデルは論文が出て、さらにその発展の研究の脂肪細胞分化の研究に進めた。糖尿病モデルについて、予想外の結果ではあったが、レンチウイルスの系を利用して、その作用機序を検討し、血糖値制御のシステムの理解に役立てるつもりである。レンチウイルスの作製に少し時間がかかっている。平成28年度は、Scientific Reportsに発表した論文(免疫プロテアソームのサブユニットの一つであるLMP7の欠損が、高脂肪食による誘導される肥満や高血糖・高脂血症・耐糖能・インスリン抵抗性を改善し、脂肪組織での炎症反応を抑制する)を基盤に脂肪細胞の分化抑制と脂肪での炎症抑制という2点に集中して研究を進めた。また、日本内分泌学会と日本再生・炎症医学会において、上記論文発表内容を報告した。脂肪細胞分化の研究において、CRISPR/Cas9システムを利用して、免疫プロテアソームサブユニットのLMP7とLMP2のノックダウンさせた脂肪前駆細胞株3T3-L1細胞を作製し、脂肪細胞への分化誘導を行ったところ、どちらの細胞でも、その分化が抑制されることを見出した。また、変異型LMP7を発現する細胞も作製した。酵素活性がないLMP7と前駆体のままで成熟型に変換されないLMP7をそれぞれ発現する細胞株を作製したが、酵素活性のないLMP7を発現する3T3-L1細胞株で、脂肪細胞への分化が顕著に抑制された。

一方、LMP7あるいはLMP2を高発現する細胞株では脂肪細胞分化への影響がみられなかった。さらに、LMP7欠損や阻害によってPPARγの発現が抑制され、その機構について解析を進めている。脂肪組織での炎症反応抑制について、M2マクロファージの分化にLMP7欠損が影響するかどうかを検討した。骨髄由来のマクロファージを野生型とLMP7欠損マウスから作製し、IL-4でM2マクロファージに分化させたところ、LMP7欠損によりその分化が増強されることを遺伝子発現レベルと表面マーカーの発現で確認した。現在、M2マクロファージのIL-10の産生能について検討している。炎症は肥満病態に関わっているが、未知の点が多い。免疫プロテアソームサブユニットの一つであるLMP7は免疫システムにおいて重要で、自己免疫疾患の病態に関与する。肥満に炎症が関わることから、LMP7欠損マウスを利用して、肥満におけるLMP7の役割について検討した。LMP7欠損により、高脂肪食による肥満・内臓・皮下脂肪の蓄積、脂肪組織での炎症が抑制され、耐糖能も改善された。LMP7欠損は脂肪細胞分化を抑制し、M2マクロファージマーカの発現を増強した。本研究により、血球系でも組織細胞でもLMP7が肥満病態に関与することが示唆された。肥満モデルは投稿に至った。糖尿病モデルについて、予想外の結果ではあったが、その結果を利用して、その作用機序を血糖値制御のシステムの理解に役立てるつもりである。脂肪前駆細胞株3T3-L1、線維芽細胞株NIH-3T3細胞、ラ氏島細胞株MIN-6細胞を利用して、脂肪細胞分化やインスリン産生の機構におけるLMP7の役割を細胞レベルで解析する。以上のように内分泌・代謝における免疫プロテアソームの役割を引き続き解析する予定である。低用量ストレプトゾトシン投与の慢性炎症型糖尿病モデルにおいて、炎症及び炎症以外の免疫プロテアソームの役割を明らかにするため、骨髄移植モデルを利用する。ラ氏島細胞株MIN-6細胞を利用して、細胞レベルでの解析を進める。前回の繰り越し分をそのまま次の繰り越し分に回した。また、ELISAなどの一部の実験を節約して行うために、サンプルをある程度貯めてから一度に測定を行う計画にしたので、その分の費用も繰り越し分に回した。論文がアクセプトされるまで、投稿費用を繰り越し分に回した。論文投稿費用や試薬・ELISAキット購入に充てる投稿費用やELISAキット購入に充てる。
サンゴ骨格年輪による台風接近頻度の復元法の確立

熱帯低気圧が発達した台風は気象現象の中でも最も激しい擾乱の一つであり、もたらす自然災害は人間の生活に大きな影響を与えることから、台風の発生数やその規模と経路は重要な情報である。本研究では、過去の気候を高時間分解能で復元可能な地質試料であるサンゴ骨格年輪を用いた台風記録の復元法の開発と検証を目的としている。研究対象地域は、1年あたりの台風接近が国内でも多くさらに接近時の勢力が強い沖縄県八重山諸島のサンゴ礁(石西礁湖)であり、石西礁湖は国内最大規模のサンゴ礁である。サンゴの種類も多種多様で、年輪記録復元に適したハマサンゴ属の大型群体も生息する。平成30年度は、この石西礁湖において2回の現地調査をおこなった。阿部他(2017)の手法により、空中写真の画像解析から石西礁湖内のハマサンゴ属の現生群体の可能性がある物体の位置抽出を事前におこない、1回目の現地調査では約20地点において、現生ハマサンゴ群体が生息しているか、採取・分析に適した群体であるかどうかを調べた。このうち1群体を選び出し、2回目の調査において水中ボーリングによる骨格のコア試料の採取をおこなった。約230cmの長さのコア試料であり、本研究の分析に必要な少なくとも最近50年について明瞭な年輪を持つことが確認された。さらに、サンゴ試料の分析準備として昨年度からテスト実験により検討してきた、金属比(Sr/Ca比)のICP発光分光分析時の迅速多数測定を行うために、秤量過程を省略することが可能であることが示された。現在における台風などの豪雨と海洋環境の関係の解析については、観測記録から気象状況と降水量、水温、塩分の関係を調べ、同じ程度の降水量をもたらす台風と温帯低気圧を比較すると、どちらも海水温と塩分の低下が起こるが、台風の方がより長期間の影響を及ぼすことが示された。また、サンゴ骨格の同位体比と金属比の分析から水温と塩分の変化を読み取る際に必要な精度と時間分解能を明らかにすることができた。高時間分解能分析による水温・塩分の季節内変化の復元のために、沖縄県八重山諸島の石西礁湖において現地調査をおこない、気象記録との対比をおこなう現生ハマサンゴ骨格のコア試料を水中ボーリングによって採取した。次に、サンゴ骨格の分析環境、すなわち高時間分解能分析のための試料削り出し方法、酸素・炭素同位体分析と金属比(Sr/Ca比, Mg/Ca比)などの分析環境を整え、さらに最適な標準試料の検討やより迅速に分析を進めるための条件変更をおこなった。現在、骨格コア試料を3mm厚の薄板に切断したものをX線写真によって年輪解析を進め、水温復元指標である金属比(Sr/Ca比, Mg/Ca比)測定と塩分復元指標である酸素同位体分析のための、高時間分解能試料の削り出しを進めている。サンゴ骨格年輪の高時間分解能分析による水温・塩分の季節内変化の復元をおこなうため、X線による年輪(密度)バンド解析から年輪数と年輪幅を調べ、分析の解像度(時間分解能)を決定し、マイクロドリルにより試料を削り出す。削り出した試料の酸素同位体比を質量分析計で、金属濃度比(Sr/Ca比, Mg/Ca比)をICP発光分析計で測定する。測定は総合地球環境学研究所でおこなう。これらの結果から、石西礁湖における過去50年間の水温・塩分の季節変動を2週間以下の時間分解能で復元する。サンゴ骨格の酸素同位体比は形成時の水温と海水の酸素同位体比で決定され、金属濃度比(Sr/Ca比)は水温依存であるため、水温と海水の酸素同位体比変化が求まる。さらに、海水の酸素同位体比と高相関である塩分変化を推定できる次に、石西礁湖(石垣島)における気象観測記録とサンゴ骨格年輪記録の対比から、台風・大雨の復元可能性を検討する。過去の台風や豪雨などの気象イベントとサンゴ年輪分析による水温・塩分復元データを比較する。比較からサンゴ骨格年輪に記録された気象イベントの規模と特徴を解析し、サンゴ年輪データの変化から気象イベントを読み取る検出条件を決定する。さらに、この検出条件を用いて、一部の年代のサンゴ年輪データから台風などのイベントを復元し、実際の現象と比較から検出条件の検証をおこない、復元の精度について検討する。外部機関における機器利用で同位体・金属分析をおこなうため希望日程・期間での分析が難しい場合などには、X線写真による年輪解析から年輪の年代を先に決定できることから、現在の気象解析から推定された台風などの豪雨のシグナルが予想される年を優先して分析することにより、研究の推進を図る。研究対象地域は、1年あたりの台風接近が国内でも多くさらに接近時の勢力が強い沖縄県八重山諸島の石西礁湖である。平成29年度は、現在における台風と海洋環境の関係の解析と、サンゴ骨格年輪試料の水温復元指標である金属比(Sr/Ca比, Mg/Ca比)測定を迅速に進めるためのICP発光分光計の分析条件の検討を進めた。

台風によって変化する気象・海洋環境を調べるために、石垣島地方気象台の観測記録と環境省による石西礁湖モニタリング記録を用いて、気象現象と降水量、風速、海水温、塩分などの変化を解析した。その結果、同じ程度の降水量をもたらす台風と温帯低気圧を比較すると、どちらも海水温と塩分の低下が起こるが、台風の方がより長期間の影響を及ぼすことが示された。強風を伴う台風の方が表層海水の大きな混合をもたらすことが原因であると考えられる。台風などの多量の降水によって数時間スケールでは表層塩分の1, 2‰の大きな低下が起こるが、日平均データでは1‰以内、10日平均では0.5‰以内と変化程度が小さくなる。サンゴ骨格の同位体比を用いた塩分復元を行うには、時間分解能を上げ、0.5‰以内の変化を読み取ることが必要であることが示された。さらに、岐阜市内の観測から台風・低気圧・冬型の雨などの気象状況による同位体比の違いを調査した。サンゴ試料の分析準備として、金属比(Sr/Ca比)のICP発光分光分析時の最適標準試料の検討と、迅速に多数測定を行うための秤量過程の省略が可能か否かについて検討を繰り返し行った。現在における台風などの豪雨と海洋環境の関係の解析については、観測記録から気象状況と降水量、水温、塩分の関係を調べ、サンゴ骨格の同位体比と金属比の分析から水温と塩分の変化を読み取る際に必要な精度と時間分解能を明らかにすることができた。サンゴ骨格の分析環境、すなわち試料採集後の切断、高時間分解能分析のための試料削り出し、酸素・炭素同位体分析と金属比(Sr/Ca比, Mg/Ca比)などの分析環境を整えることができ、さらに最適な標準試料の検討やより迅速に分析を進めるための条件変更を進めた。初年度に石西礁湖において現地調査をおこない、気象記録との対比をおこなう現生のサンゴ骨格試料を採取する計画であったが、調査予定時期に現地の天候・海況が悪化し、年度内に試料採取をおこなうことができなかった。熱帯低気圧が発達した台風は気象現象の中でも最も激しい擾乱の一つであり、もたらす自然災害は人間の生活に大きな影響を与えることから、台風の発生数やその規模と経路は重要な情報である。本研究では、過去の気候を高時間分解能で復元可能な地質試料であるサンゴ骨格年輪を用いた台風記録の復元法の開発と検証を目的としている。研究対象地域は、1年あたりの台風接近が国内でも多くさらに接近時の勢力が強い沖縄県八重山諸島のサンゴ礁(石西礁湖)であり、石西礁湖は国内最大規模のサンゴ礁である。サンゴの種類も多種多様で、年輪記録復元に適したハマサンゴ属の大型群体も生息する。平成30年度は、この石西礁湖において2回の現地調査をおこなった。阿部他(2017)の手法により、空中写真の画像解析から石西礁湖内のハマサンゴ属の現生群体の可能性がある物体の位置抽出を事前におこない、1回目の現地調査では約20地点において、現生ハマサンゴ群体が生息しているか、採取・分析に適した群体であるかどうかを調べた。このうち1群体を選び出し、2回目の調査において水中ボーリングによる骨格のコア試料の採取をおこなった。約230cmの長さのコア試料であり、本研究の分析に必要な少なくとも最近50年について明瞭な年輪を持つことが確認された。さらに、サンゴ試料の分析準備として昨年度からテスト実験により検討してきた、金属比(Sr/Ca比)のICP発光分光分析時の迅速多数測定を行うために、秤量過程を省略することが可能であることが示された。
皮膚の老化における核膜タンパク質ラミンAの役割

ラミンA遺伝子変異による光老化(UV照射にによる細胞へのダメージ)と自然老化への影響について検討を行ったところ、ラミンA遺伝子変異を有する線維芽細胞はUVA照射や過酸化水素によるダメージ(アポトーシス)を受けやすい可能性が示唆された。Hutchinson-Gilford syndromeのラミン遺伝子変異をもつ細胞に対する治療的効果を持つ「ファルネシル転移酵素阻害薬」に対する影響を検討したが、Atypical Werner症候群のラミンA遺伝子変異を有する線維芽細胞に対する治療効果は得られなかった。本研究の目的は、Atypical Werner症候群(AWS)に特異的なラミンAの遺伝子変異が老化の病態にどのように関与するのかを明らかにし、治療薬の開発につなげることである。自験例のラミンA遺伝子変異を有する皮膚線維芽細胞と正常皮膚線維芽細胞を用いて解明する。まず、ラミンA遺伝子変異による光老化(UV照射にによる細胞へのダメージ)への影響について検討した。次に、ラミンA遺伝子変異による自然老化(酸化ストレス:過酸化水素による細胞へのダメージ)への影響についても検討を行った。その結果、ラミンA遺伝子変異を有する皮膚線維芽細胞では、光老化と自然老化の影響を受けやすいこととその機序を明らかにした。さらに、紫外線、酸化ストレスによる老化(ダメージ)に対するファルネシル転移酵素阻害薬の有効性について検討を行ったが、有効性は得られなかった。予定していた研究はほとんど遂行しており、現在、論文投稿中である。Atypical Werner症候群の原因遺伝子変異であるラミンA遺伝子変異による光老化(UV照射による細胞へのダメージ)への影響を検討した。UVA照射によって誘導されるアポトーシス数はラミンA遺伝子変異を有する患者由来細胞で亢進した。また、患者由来細胞では、UVA照射によるROS産生が健常由来細胞より増加していたため、Atypical Werner症候群由来線維芽細胞はUVA照射によるダメージ(アポトーシス)を受けやすい可能性が示唆された。光老化だけではなく、自然老化(加齢による皮膚老化)におけるラミンA遺伝子変異の影響を調べるために過酸化水素水刺激を用いた、酸化ストレスに対する細胞へのダメージ(アポトーシス)についてもFACSによる検討を行った。その結果、過酸化水素水刺激によって誘導されるアポトーシス数は患者由来細胞で亢進した。また、患者由来細胞では、過酸化水素水刺激によるROS産生が健常由来細胞より増加していた。これらの結果より、Atypical Werner症候群由来線維芽細胞は酸化ストレスによるダメージ(アポトーシス)を受けやすい可能性が示唆された。Atypical Werner症候群のラミン遺伝子変異を持つ細胞と正常細胞を用いて、紫外線、酸化ストレスによる細胞のダメージがファルネシル転移酵素阻害薬によって改善されるのかどうかを検討した。しかし、紫外線、酸化ストレスによるラミン遺伝子変異を持つ細胞へのダメージがファルネシル転移酵素阻害薬によって、さらに亢進するという結果になった。この結果より、ファルネシル転移酵素阻害薬は、Atypical Werner症候群の光老化及び生理的老化に対して有効な効果が得られない可能性が示唆された。これまに得た成果を発展させて、予定していた研究を遂行する。皮膚科学予定していた予算に基づき使用していたが、未使用の予算が生じたため。予定している研究を遂行するための物品の購入に使用する。
メチルフェニデートの精神依存形成機構に関する基礎的研究

以上、本研究の結果から、METHおよびMPD誘発dopamine遊離作用ならびにastrocyte活性化作用にPI3Kが関与することが明らかとなった。さらに、両薬物の作用には相違点が存在し、METHによる強力な薬理作用発現や神経細胞死誘発には5-HT神経系とdopamine神経系の相互作用が一部関与している可能性が示唆された。本研究では、ナルコレプシーや小児の注意欠陥・多動性障害の第一選択薬として繁用されるメチルフェフェニデートと、覚せい剤であるメタンフェタミンの相違を行動薬理学的に検討した。ラットにメタンフェタミンもしくはメチルフェニデートを投与したところ、側坐核内における細胞外ドパミン濃度の著明かつ有意な上昇およびドパミンの主要代謝物であるDOPACの細胞外濃度の有意な減少が認められた。また、側坐核内におけるメタンフェタミンおよびメチルフェニデート誘発ドパミン濃度の上昇は選択的phosphoinositide-3 kinase(PI3-K)阻害薬であるwortomanninの前処置によって有意に抑制された。このことから、メタンフェタミンおよびメチルフェニデート誘発ドパミン遊離促進作用にはPI3-Kが関与していることが示唆された。一方、マウスにメタンフェタミンを処置することにより、ドパミンと同様に側坐核内における細胞外セロトニン濃度の著明な上昇が認められた。しかしながら、メチルフェニデートを処置しても側坐核内の細胞外セロトニン濃度に変化は認められなかった。一般に、覚せい剤などの中枢興奮薬を動物に反復投与することにより、薬物に対する感受性の増強、すなわち逆耐性が形成されることが知られている。そこで、メチルフェニデートが逆耐性を形成するか否かを、マウスにおける自発運動促進作用を指標としたところ、メチルフェニデートの反復投与によって行動感作は引き起こされなかった。この結果より、メチルフェニデートは覚せい剤とは異なり逆耐性を形成しないことが明らかとなった。さらに、メタンフェタミン誘発報酬効果は休薬後2週間に渡り持続したが、メチルフェニデート誘発報酬効果は休薬後速やかに消失した。以上、本研究により、メタンフェタミンとメチルフェニデートでは依存形成機構が一部異なることが明らかになった。以上、本研究の結果から、METHおよびMPD誘発dopamine遊離作用ならびにastrocyte活性化作用にPI3-Kが関与することが明らかとなった。
天然タンパク質に匹敵する構造特異性を持つ人工タンパク質のデノボ設計

理論設計と実験を併用することで,構造特異性を持つタンパク質を人工的に設計することを目的とし,構造配列適合性関数の開発,新規設計手法の開発,および実験検証などを実施した.また点突然変異体の解析,安定性予測,フォールディングのシミュレーションや実験なども行い,得られた知見の設計への反映を試みた.新規構造配列適合性関数としてはラマチャンドランプロットを利用した局所構造関数を開発した.12種類の1部位構造コード(Single Site Conformational Code:SSCC)とアミノ酸配列について統計ポテンシャルを作成し,適合度の評価能を調べた.2種類のデコイを用いて調べた結果,DSSPで定義した局所構造を利用した関数よりも精度が高かった.新規設計手法の開発としては近縁タンパク質ペアの立体構造を利用した,機能転換を目指したデザインを行った.ミオグロビンの構造を利用し,汎用モデリングツールであるmodellarと3Dプロフィールを用い,フィコシアン配列をミオグロビン構造に適合しヘムと結合するよう10数個の置換を導入した.配列を実際に合成して構造特性などを実験的に調べたところ,そこそこのαヘリックス含量を示し,弱いながらヘムを結合した.この方法とは別に,フィコシアニンの構造にヘムが挿入されるような空間を開けるという方法で設計した配列は,良好な構造特異性とヘム結合能を示した.これまで継続して取り組んできた研究であるが,CROリプレッサのデノボ設計に関してはNMRでの立体構造決定に至り,成果を出版することができた.理論設計と実験を併用することで,構造特異性を持つタンパク質を人工的に設計することを目的とし,構造配列適合性関数の開発,新規設計手法の開発,および実験検証などを実施した.また点突然変異体の解析,安定性予測,フォールディングのシミュレーションや実験なども行い,得られた知見の設計への反映を試みた.新規構造配列適合性関数としてはラマチャンドランプロットを利用した局所構造関数を開発した.12種類の1部位構造コード(Single Site Conformational Code:SSCC)とアミノ酸配列について統計ポテンシャルを作成し,適合度の評価能を調べた.2種類のデコイを用いて調べた結果,DSSPで定義した局所構造を利用した関数よりも精度が高かった.新規設計手法の開発としては近縁タンパク質ペアの立体構造を利用した,機能転換を目指したデザインを行った.ミオグロビンの構造を利用し,汎用モデリングツールであるmodellarと3Dプロフィールを用い,フィコシアン配列をミオグロビン構造に適合しヘムと結合するよう10数個の置換を導入した.配列を実際に合成して構造特性などを実験的に調べたところ,そこそこのαヘリックス含量を示し,弱いながらヘムを結合した.この方法とは別に,フィコシアニンの構造にヘムが挿入されるような空間を開けるという方法で設計した配列は,良好な構造特異性とヘム結合能を示した.これまで継続して取り組んできた研究であるが,CROリプレッサのデノボ設計に関してはNMRでの立体構造決定に至り,成果を出版することができた.天然配列に匹敵するような構造特異性を持つタンパク質を設計するために,主に2つのアプローチを考えている.1つは側鎖のパッキング特異的が発揮されるようアミノ酸配列を選択することであり,具体的には側鎖エントロピーの計算値を陽に配列設計に取り込むことである.もう1つは,我々が今まで行ってきた設計方法ではではあまり重要視されていなかった,アミノ酸と主鎖構造の局所的相互作用関数をより高精度化することである.前者に対して後者のアプローチが比較的容易に思えること,および前者の計算が上手くできたとしても後者の関数を取り入れた総合的な判断から配列設計がなされるので,高精度の局所構造関数なくしては設計の成功はありえないと思えること,などから本年度は局所構造関数の開発に勢力を注いだ.まず,PDBから立体構造の代表セットを選択し,ラマチャンドランプロットを作成した.一方でDSSPを利用して二次構造のアサインメントを実行し,これとラマチャンドランプロットをつきあわせることにより,局所構造の分類を行った.例えばヘリックスの領域は,DSSPのH構造がドミナントな領域,G構造がドミナントな領域,その他,の3種類に分割した.結果として10ていどの局所構造に分割を行った.アミノ酸別に10構造の分布を計算し,比較を行った.分布をベクトルとみなして階層的クラスタリングを実行し,アミノ酸のデンドログラムを作成した.得られたデンドログラムは概ねアミノ酸の側鎖の物性や二次構造傾向性を反映しており,ヘリックス/ストランド/コイルの3分割で書いたデンドログラムよりも整合的に思われた.これら10分割を3残基,5残基,7残基などのフラグメントに適用することで高精度な局所関数の開発を行う予定である.昨年度に引き続き,コンピュータを利用した理論設計で利用する局所構造の関数の精密化をおこなった.昨年度はタンパク質の立体構造データベースを利用して,主鎖二面角について大規模な統計調査を実行し,ラマチャンドランプロットから(φ,ψ)の領域を10程度に分割した.今年度は分割した領域についてアミノ酸配列とそれがのる構造との適合具合を評価する関数を実際に作成し,その出来を評価した.関数を作成する場合,Sipplが提案した変喚式がよく利用されるが,ここではそれには従わず,ベイズ統計で利用される式を採用した(Sipplの形式とは構造と配列の統計を利用する箇所が異なっている).実際に分割した領域についてアミノ酸別にスコア表を作成し,それを利用して天然タンパク質の立体構造を擬似的に作成した構造群(デコイ)から天然の立体構造が選択できるかを調べた.

その結果,二面角を天然構造から変化させて作成したデコイ(4state_reduced)についてはほんとどの場合において天然構造の選択に成功した.他のデコイセットではあまり良い成績は得られなかったが,それはアミノ酸間相互作用関数など本来利用すべき関数をまだ組み込んでいないからだと思われる.4state_reducedで良い結果が得られたことから本研究で作成した関数は局所構造の天然構造らしさを反映したものであると考えられる.今後は隣り合った部位同士の相関などをふくめて関数を精密化することで,より高い精度が得られるかを検証する.理論設計としては,以下の2つの試みを行った.1つは引き続き実施している局所構造関数の作成である.ラマチャンドランプロットを利用して定義した,局所構造を表現する12種類の1部位構造コード(Singl Site Conformational Code : SSCC)とアミノ酸配列について統計ポテンシャルを作成し,適合度の評価能を調べた.2種類のデコイを用いて調べた結果,1アミノ酸と1部位についての適合を評価する関数と,隣り合った,もしくは近隣にある(アミノ酸,1部位)ペア同士を評価する関数,ともに良好な結果を得た.特に1アミノ酸と1部位を評価する関数では,DSSPで定義した局所構造を利用した関数よりも精度が高かった.もう1つは近縁のタンパク質ペアの立体構造を利用した,機能転換を目指したデザインである.具体的にはミオグロビンの構造を利用し,ヘムに結合するフィコシアニン配列の設計を行った.汎用モデリングツールであるmodellarと3Dプロフィールを用い,フィコシアン配列をミオグロビン構造に適合するよう10数個の置換を導入した.この配列を実際に合成して構造特性などを実験的に調べたところ,設計した配列は水溶性に問題があり測定が困難であったが,設計配列の1置換体はそこそこのαヘリックス含量を示し弱いながらヘムを結合した.この方法とは別に,フィコシアニンの構造にヘムが挿入されるような空間を開けるという方法で設計した配列は,良好な構造特異性とヘム結合能を示した。
母乳中生理活性物質のヒト消化管粘膜上皮の増殖、分化に及ぼす生理作用-特にラクトフェリンのCaco-2細胞に対する作用-

本年度は、ヒト消化管上皮細胞株であるCaco-2細胞を購入し、細胞培養を開始した。まず、培養条件の再検討を行い、必要最低限の胎仔ウシ血清濃度を決定し(10%)、継代培養の確立を達成した。その後、ラクトフェリンのCaco-2細胞に与える影響の検討を開始した。最初に、その基礎データとなるCaco-2細胞の血清加培養液および無血清培養液下における増殖曲線の作成を行った。そして、これとラクトフェリンを添加した際の状態を比較し、鉄飽和型のラクトフェリンが、細胞増殖に対し、軽度促進的に働くが、一方、鉄不飽和型のラクトフェリンは抑制的に作用すること、そしてこの変化が一定濃度までは容量依存的であることを確認した。次の段階として、Caco-2細胞の増殖過程における形態学的な変化を明らかにするため、経時的に、光学顕微鏡による観察を行った。そして、未分化な状態では、Caco-2細胞の細胞質が扁平であるが、増殖、分化が進行するにつれて、立方円柱上皮様に変化することを確認した。以上のデータを基礎として、現在、ラクトフェリン添加によりCaco-2細胞に何らかの形態学的変化が生じるか否かについて、光顕、電顕レベルにて検討中である。さらに、今後は、鉄不飽和型のラクトフェリンにより細胞増殖が抑制される点について、鉄不飽和型ラクトフェリンがCaco-2細胞に対してnecrosisを起こすのか、apoptosisを誘導するのかについて電顕での観察を行うとともに、DNAの断裂が生じるか否かを蛍光色素を用いる方法によって明らかにすべく準備を進めている。
複合免疫療法に向けた各種抗がん剤の免疫抑制解除効果の検証とバイオマーカー探索研究

平成30年度は、前年度から探索的に得られた結果に基づいて、悪性黒色腫などの他の癌腫においても、免疫抑制解除作用が期待できる薬剤と免疫療法をおこなった患者における解析を進めた。次年度も免疫モニタリング解析を進め、各種解析結果と奏効割合、無増悪生存期間、全生存期間等との関連を検証し免疫系因子におけるバイオマーカーの検索を行っていく。研究は概ね予定通りすすんでおり、投稿中の骨軟部腫瘍を対象とした解析結果の論文に続き、他のコホートでの解析結果についても順次論文化を進めていく予定である。各薬剤を投与された各癌種のコホートにおいて検体収集が予定通りすすんでいる。また、免疫応答解析の系についてもすでにバリデーションがついており解析系として安定している。よって、計画はおおむね順調に進展していると考えられるため。平成31年度も同様に症例の収集を行い、各コホートから、順次免疫モニタリングを進め、解析結果と奏効割合や無増悪生存機関との関連を検証し免疫系因子でのバイオマーカー検索を行う。また、各種薬剤ごとに経時的に免疫モニタリングすることにより、薬剤ごとに各種免疫因子の動きを解析して、どのような患者で免疫抑制細胞が減少し、エフェクター細胞が増加・活性化しているかを検証することにより、将来的に免疫療法と組み合わせるのに適切な薬剤を選択する根拠を求めていく。平成29年度はすでに検体収集がすすんでいる術前、術後治療を実施された骨軟部腫瘍患者における解析を中心にすすめ、治療前のmonocytic MDSCの数量、および、T細胞の副刺激シグナルに関わる分子の発現割合が予後との相関することを見出した。本研究成果については、現在論文作成中で2018年5月中に論文として提出予定である。その他の癌種(悪性黒色腫、胃癌等)についても、免疫抑制解除作用が期待できる薬剤と免疫療法をおこなった患者での検体収集が順調に進み、一部解析も始めており、研究は概ね予定通りすすんでいる。次年度以降も同様に症例の収集を行い、患者検体の揃ったコホートから、順次免疫モニタリングを行い、解析結果と奏功割合、無増悪生存期間、全生存期間等との関連を検証し免疫系因子におけるバイオマーカーの検索を行っていく。平成30年度も同様に症例の収集を行い、患者検体の揃ったコホートから、順次免疫モニタリングを行い、解析結果と奏功割合や無増悪生存機関との関連を検証し免疫系因子でのバイオマーカー検索を行う。平成31年度には、これまでに得られたバイオマーカー候補分子と全生存機関との関連を検証する。来年度以降も継続して研究をおこなうため、今年度の予算の残金を次年度に繰り越して使用させていただくことにした。当初予定していた実験の一部について、必要試薬が国内に在庫切れで海外からの取り寄せが必要であったため期限内に購入が間に合わず、次年度に行うことにしたため。
新奇体性幹細胞標識抗体Ａ３の生物学的特性と毛の発生・病態における機能的役割の解明

A3はラット悪性線維性組織球種(MFH)の株化細胞を抗原として作製された抗体であり、ラットの体性幹細胞を認識することが明らかとされている。本研究ではラットの毛包形成および皮膚創傷治癒におけるA3標識細胞の機能と役割を解明することを目的とし、組織学的および分子生物学的解析を行った。A3標識細胞は、毛包の発生期および毛周期において、毛包上皮幹細胞が存在するとされるバルジ付近と、間葉系幹細胞を含む毛包結合織鞘に発現し、皮膚創傷治癒では、これらに加えて被蓋化上皮で発現が観察され、発現範囲および発現数が増大した。さらに、A3標識細胞の特性を調べるため、全身におけるA3標識細胞の分布を観察したところ、体性幹細胞の存在するとされる部位に一致した。これらのことから、A3は、毛包形成および皮膚創傷治癒に関与する未分化上皮および未分化間葉細胞のいずれも標識し、既存の幹細胞抗体とは異なる細胞を標識する、新たな抗体であることが示された。また、A3のエピトープ解析を目的として分子生物学的解析を行った。A3の抗原(A3抗原)を高発現する株化細胞であるMT-9細胞をサンプルとして用い、Native PAGEおよびWestern Blotting法によって抗原を分離したところ、高分子領域に幅広く拡散した単一のバンドが得られ、糖を染色するPAS染色に陽性を示した。また、N型糖鎖消化試験、糖鎖解析、MT-9細胞に対する糖鎖合成阻害試験、抗ケラタン硫酸抗体による免疫沈降およびWestern Blotting法により、A3抗原はヒト人工多能性幹細胞に発現する、硫酸化度の低いケラタン硫酸と類似する可能性が示唆された。糖鎖は細胞の情報伝達に関与し、個体発生において重要な役割を担っているとされる。本研究により、低硫酸化ケラタン硫酸を発現する細胞がラットの毛包形成および皮膚創傷治癒に関与する可能性が示唆された。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。【実績内容】1成体の成長期毛包で,毛乳頭と隣接し,内根鞘もしくは毛幹に分化する上皮細胞がA3抗体に標識された.また,成長期の毛乳頭の間葉系細胞も一部弱陽性を示した.2ラット骨髄のA3標識細胞は,幹細胞マーカーCD90標識細胞と,隣接して発現していた.また他の幹細胞マーカーCD73とは連続切片において同部位で発現が観察された.血管マーカーRECA-1とは,大部分で共発現がみられたが,一致しない部分が少数認められた.3口腔から前胃の上皮細胞,胎盤構成細胞(一部の羊膜と連続する細胞・迷路層の血管内皮細胞・胎盤を支える部位の子宮内膜の一部の間質細胞),子宮間質,膣上皮においてA3標識細胞の発現が認められた.4悪性線維性組織球腫(MFH)由来細胞株MT-9をラットに移植した腫瘍組織を用いて,Western Blotting,二次元電気泳動及びLCMSによってA3タンパク同定を試みた.その結果、腫瘍組織のA3タンパクの分子量は,正常組織とは異なる大きさであった.【意義】1間葉系細胞とシグナル相互作用し,分化傾向を示す上皮細胞が,A3によって標識される可能性が示唆された.2骨髄のほとんどのA3標識細胞は血管内皮であることが分かった.血管内皮がA3に標識される意義および血管内皮以外の,骨髄A3標識細胞の特性については今後さらに詳細に調べる.⇒血管内皮の新たな特性の解明,および血管周囲の多能性幹細胞(Pericyte)の特性解明につながる.3全身の重層扁平上皮(特に口腔から前胃)において,基底細胞直上に存在する1層から2層の細胞がA3に標識された.これは,毛包成長期において細胞の分化の程度が高いのと同様に,口腔から前胃までの上皮はターンオーバーが高く,A3の特徴である,やや分化過程にある細胞を認識する可能性を支持する結果であった.4正常組織と腫瘍組織で,A3抗体が異なるタンパクを認識する,もしくはA3タンパクが異なったタンパク複合体を形成している可能性が示唆された.【内容】研究実施計画1:A3タンパクの質量分析のために,長瀬無アルブミンラット(NAR)の肺およびMT-9誘発腫瘍(F344ラットにMT-9細胞を移植した腫瘍塊)から抽出したタンパクについて,A3抗体を用いて免疫沈降法を行った.そこで得られたサンプルを用いウエスタンブロッティング(WB)・ゲル銀染色を行ったところ,特異的バンドを検出した.このタンパクに対し,現在質量分析を実施中である.また,A3タンパクの機能解明を目的として,MT-9誘発腫瘍および毛包における,A3タンパクの細胞内局在を明らかにするために免疫電顕法による解析を行っている.研究実施計画2:MT-9培養細胞からタンパクを抽出し,WBを行った.再現性のあるバンド検出のために,現在条件検討中である.研究実施計画3:胎齢15日のF344ラットの胎子および胎盤を採取し,詳細な形態学的解析を試みた(正常な成体F344およびNARではA3標識細胞の発現に差異がないことを確認している).研究実施計画4:F344ラットの食道上皮および骨髄組織を用い,フローサイトメトリー法によるA3標識細胞分離を試み,現在条件検討中である.【意義・重要性】研究実施計画

1:A3のアミノ酸配列および細胞内局在が明らかとなればラット生体内でのA3認識タンパクの機能解明につながる.またリコンビナント抗体を作製することによって,他種動物におけるA3タンパクの類似性/相違性を明らかとすることができる.研究実施計画2:MT-9の腫瘍化の特性を明らかとすることができる.研究実施計画3:代謝物質・ガス交換に特化した組織である胎盤と,分化段階の細胞から構成される胎子でのA3標識細胞発現を解析することにより,その細胞特性を詳細に解析できる.研究実施計画4:生体由来A3標識細胞の培養条件を変えたり,その発現に係る遺伝子を解析することによってA3標識細胞の機能特性を明らかとすることができる.A3タンパクのアミノ酸配列を決定する実験が遅れている.これは,毛包組織におけるA3タンパクの機能を解明する試みであるが,免疫沈降法,二次元電気泳動,WB及びゲル染色において再現性のある結果を得ることができなかった.この原因は,組織におけるA3タンパク発現量が少ないこと,もしくは抽出タンパクに対する抗体の低反応性が考えられた.そのため,組織あたりのA3タンパク発現が豊富なMT-9誘発腫瘍とアルブミンの関与が無いNARの肺を材料とし,上記の実験を行ったところ,A3タンパクの単一のバンド(100 kDa付近)の検出に成功した.現在ゲルからA3タンパクを抽出し,質量分析を実施中である.またMT-9細胞を用いて,A3発現の調節因子を明らかにする実験では,再現性のある結果を得るためにWBの条件を再度検討中である.その他の試験はおおむね順調に進んでいる.A3はラット悪性線維性組織球種(MFH)の株化細胞を抗原として作製された抗体であり、ラットの体性幹細胞を認識することが明らかとされている。本研究ではラットの毛包形成および皮膚創傷治癒におけるA3標識細胞の機能と役割を解明することを目的とし、組織学的および分子生物学的解析を行った。A3標識細胞は、毛包の発生期および毛周期において、毛包上皮幹細胞が存在するとされるバルジ付近と、間葉系幹細胞を含む毛包結合織鞘に発現し、皮膚創傷治癒では、これらに加えて被蓋化上皮で発現が観察され、発現範囲および発現数が増大した。さらに、A3標識細胞の特性を調べるため、全身におけるA3標識細胞の分布を観察したところ、体性幹細胞の存在するとされる部位に一致した。これらのことから、A3は、毛包形成および皮膚創傷治癒に関与する未分化上皮および未分化間葉細胞のいずれも標識し、既存の幹細胞抗体とは異なる細胞を標識する、新たな抗体であることが示された。また、A3のエピトープ解析を目的として分子生物学的解析を行った。A3の抗原(A3抗原)を高発現する株化細胞であるMT-9細胞をサンプルとして用い、Native PAGEおよびWestern Blotting法によって抗原を分離したところ、高分子領域に幅広く拡散した単一のバンドが得られ、糖を染色するPAS染色に陽性を示した。また、N型糖鎖消化試験、糖鎖解析、MT-9細胞に対する糖鎖合成阻害試験、抗ケラタン硫酸抗体による免疫沈降およびWestern Blotting法により、A3抗原はヒト人工多能性幹細胞に発現する、硫酸化度の低いケラタン硫酸と類似する可能性が示唆された。糖鎖は細胞の情報伝達に関与し、個体発生において重要な役割を担っているとされる。本研究により、低硫酸化ケラタン硫酸を発現する細胞がラットの毛包形成および皮膚創傷治癒に関与する可能性が示唆された。