hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
超高速分光法による半導体/溶液界面における光励起初期過程の解明

本研究は、酸化チタン粉末や電極における光励起初期過程を解析することによって、再結合の支配因子を明らかにすることをめざし、フェムト秒領域のパルスを発生させるレーザからの光を励起(ポンプ)・検出(プローブ)に用いるポンプープローブ法超高速分光の手法により半導体/溶液界面における光励起初期過程を分光学的に解析し、励起電子-正孔の再結合について定量的な分析を行うものである。まず、アナタース型とルチル型の結晶構造をそれぞれもつさまざまな酸化チタン粉末および板状酸化チタン試料を用いたフェムト秒過渡反射吸収分光法により光励起初期過程を追跡した。プローブ光波長を620nm、ポンプ光(励起光)を310nmとすると、きわめて速い(ほぼ検出限界)吸収の立ち上がりとその減衰が観測された。いずれの粉末状試料を用いる場合には減衰速度の違いはあるものの挙動はほぼ同じであり、速い二次減衰成分と遅い減衰成分の和で表されることがわかった。多結晶酸化チタン板でも同様であることから、多結晶試料では粉末と同じように微粒子ひとつひとつで光吸収とその減衰が起こると思われる。このような成果にもとづいて、さらに、励起(ポンプ)光波長を変化させて実験を行い、再結合挙動の違いを明らかにした。これまでに、励起光波長を変えて実験を行った例はなく、半導体光触媒反応の本質的な理解にきわめて重要であると考えられる。とくにバンドギャップ近傍の比較的小さなエネルギーで励起した場合にはバンドギャップ励起とは異なる挙動を示すことが明らかになった。これは、励起子生成によるものと思われる。半導体による光電極反応や、粉末系の光触媒反応における界面電子移動の素過程はサブピコピコ秒の非常に速い時間領域で進行することが知られており、近年超短パルスレーザーを用いた光励起電子と正孔の反応・再結合初期過程の追跡が行われている。しかしこれまでレーザーシステムの都合上、単一波長励起での測定しか行われていない。本研究では光励起電子と正孔の再結合初期過程をより詳細に検討するため、広範囲で波長変換可能なフェムト秒レーザーシステムを導入し、過渡吸収の励起波長依存性について検討した。試料として、アナタース型とルチル型の結晶構造をそれぞれもつ酸化チタン粉末(触媒学会参照触媒)を用いた。フェムト秒過渡反射吸収分光法は、再生増幅されたモードロック型チタンサファイアレーザーからのパルス光(パルス幅100fs、波長790nm、繰り返し周波数1kHz)をシードとする2台の波長可変レーザー(パルス幅100fs、波長300nm10μm、繰り返し周波数1kHz)をポンプ光、プローブ光発生用として用い、酸化チタン粉末へのポンプ光入射前後の反射率変化を記録した。プローブ光波長を620nmに固定し、ポンプ光(励起光)を短波長側から酸化チタンのバンドギャップ(アナタース:390nm、ルチル:410nm)近傍まで変化させ、過渡吸収を大気中で測定した結果、どちらの場合も、ポンプ光波長が長くなるにつれ全体の吸収が減少するとともに、ポンプ光入射直後に12ps程度の寿命の非常に短い成分が観測された。このような変化が観測される励起光波長は両試料において約20nmずれており、これはちょうど2つの酸化チタン結晶のバンドギャップの差に相当する。バンドギャップ近傍で励起した際に観測される初期の速い減衰成分をもたらす要因については現在検討中であるが、光励起電子-正孔の再結合ダイナミクスは酸化チタンの結晶構造に依存せず、選択する励起光波長によって大きく異なることが示唆された。半導体試料の光特性を正確に評価するためには、励起波長を適切に選ぶ必要があることが分かった。半導体による光電極反応や、粉末系の光触媒反応の界面電子移動過程はサブピコピコ秒の非常に短い時間領域で進行することが知られており、超短パルスレーザーを用いた光励起電子と正孔の反応・再結合初期過程の追跡が行われている。

しかしこれまでレーザーシステムの都合上、単一波長励起での測定しか行われていない。本研究では光励起電子と正孔の再結合初期過程をより詳細に検討するため、広範囲で波長変換可能なフェムト秒レーザーシステムを導入し、過度吸収の励起波長依存性について検討した。昨年度に引き続き飼料としてアナタース型とルチル型の結晶構造をそれぞれもつさまざまな酸化チタン粉末および板状酸化チタン試料を用いた。フェムト秒過渡反射吸収分光法は、再生増幅されたモードロック型チタンサファイアレーザーからのパルス光(パルス幅100fs、波長790nm、繰り返し周波数1kHz)をシードとする2台の波長可変レーザー(パルス幅100fs、波長300nm10μm、繰り返し周波数1kHz)をポンプ光、プローブ光発生用として用い、酸化チタン粉末へのポンプ光入射前後の反射率変化を記録した。プローブ光波長を620nm、ポンプ光(励起光)を310nmとすると、きわめて速い(ほぼ検出限界)吸収の立ち上がりとその減衰が観測された。いずれの粉末状試料を用いる場合には減衰速度の違いはあるものの挙動はほぼ同じであり、速い二次減衰成分と遅い減衰成分の和で表されることがわかった。多結晶酸化チタン板でも同様であることから、多結晶試料では粉末と同じように微粒子ひとつひとつで光吸収とその減衰が起こると思われる。一方、単結晶試料では素早い吸収の立ち上がりは観測されるものの、測定時間範囲(約200nm)内ではほとんど減衰は見られなかった。これは、全体に占める表面の割合が粉末や多結晶体とくらべて小さいために、結晶の欠陥部位が少なく、励起電子-正孔の再結合が遅いためと考えられる。本研究は、酸化チタン粉末や電極における光励起初期過程を解析することによって、再結合の支配因子を明らかにすることをめざし、フェムト秒領域のパルスを発生させるレーザからの光を励起(ポンプ)・検出(プローブ)に用いるポンプ-プローブ法超高速分光の手法により半導体/溶液界面における光励起初期過程を分光学的に解析し、励起電子-正孔の再結合について定量的な分析を行うものである。平成11年度までに、アナタース型とルチル型の結晶構造をそれぞれもつさまざまな酸化チタン粉末および板状酸化チタン試料を用いたフェムト秒過渡反射吸収分光法により光励起初期過程を追跡した。このような成果にもとづいて、本年度は、励起(ポンプ)光波長を変化させて実験を行い、再結合挙動の違いを明らかにした。これまでに、励起光波長を変えて実験を行った例はなく、半導体光触媒反応の本質的な理解にきわめて重要であると考えられる。とくにバンドギャップ近傍の比較的小さなエネルギーで励起した場合にはバンドギャップ励起とは異なる挙動を示すことが明らかになった。これは、励起子生成によるものと思われる。
膵臓消化酵素に見出した糖鎖結合活性の分泌と消化における意義

本研究では、種々の膵臓消化酵素、α-アミラーゼ、トリプシン、キモトリプシン、エラスターゼ、リパーゼ、ならびにリボヌクレアーゼに糖結合性を見出した。7種類の糖タンパク質を修飾して30種類のビオチン化糖タンパク質プローブを調製し、ウシおよびブタ膵臓トリプシン(BPT, PPT)ならびにウシ膵臓トリプシノーゲン(BPTG)との結合試験をトリプシン阻害剤存在下、ELISA法により行った。BPT, PPTは共通して糖タンパク質のN型糖鎖に対して高い結合性を示したが、BPTGはムチンなどのO型糖鎖に対してもよく結合した。表面プラズモン共鳴による相互作用解析から、ELISAでよく結合した糖タンパク質との親和定数(K_A)は、10^6-10^<10>M^<-1>の高い値を示し、トリプシンのフェツインに対するK_Aは脱N-グリコシル化により10^4M^<-1>まで低下し、ELISAでの結合性と相関する結果が得られた。一方、種々の糖-ビオチニルポリマー-プローブとのELISAから、各酵素で単糖レベルでの糖結合特異性の差も観測され、糖タンパク質結合性は、酵素の糖鎖配列に対する認識によることが示された。特異糖存在下では、トリプシンの人工基質に対する酵素活性が非競争的または不競争的に増強したことから、触媒部位とは異なる部位で糖と相互作用することが示唆された。各酵素の生体内糖鎖レセプターを解析するため、ブタ十二指腸の内腔から刷子縁画分を調製し、SDS-PAGEにより分画後、PVDF膜に転写し、標識した酵素と反応させた。それぞれの酵素について複数の陽性バンドが検出された。ゲル内消化とプロテオーム解析の方法により、レセプターの同定を進めている。この結果は、抗体による組織化学染色において、リパーゼ、α-アミラーゼは腸管内腔のレセプターに糖特異的に結合して存在するという観察とも一致した。これらの膵臓酵素の糖鎖結合部位と結合様式については、糖鎖結合予測プログラムによる予測と、X線結晶解析による実験的解明を進めている。7種類の糖タンパク質をビオチン標識後、様々なグリコシダーゼ処理により糖鎖修飾して30種類の糖タンパク質プローブを調製した。これら糖タンパク質プローブと、ウシおよびブタ膵臓トリプシン(BPT,PPT)ならびにウシ膵臓トリプシノーゲン(BPTG)との結合試験をトリプシン阻害剤存在下ELISA法により行った。膵トリプシンは、ウシ、ブタでほぼ共通して糖タンパク質のN型糖鎖に対して高い結合性を示した。一方、トリプシノーゲンはムチンなどのO型糖鎖に対してもよく結合した。表面プラズモン共鳴による相互作用解析から、ELISAでよく結合した糖タンパク質との親和定数(K_A)は、10^6-10^7M^<-1>の高い値を示し、トリプシンのフェツインに対するK_Aは脱N-グリコシル化により10^4M^<-1>まで低下し、ELISAでの結合性と相関する結果が得られた。一方、種々の糖-ビオチニルポリマー(BP)-プローブとのELISAによる結合分析から、各酵素で単糖レベルでの糖結合特異性も観測され、糖タンパク質結合性は、酵素タンパク質の糖鎖配列に対する認識によることが示された。

結合する糖質存在下では、トリプシンの人工基質に対する酵素活性が非競争的または不競争的に増強したことから、触媒部位とは異なる部位で糖と相互作用することにより、自己消化の抑制や基質結合の促進が誘導されるなど、酵素の構造を安定化する効果が考えられた。ブタ十二指腸から刷子縁膜を抽出し、小腸内のレセプターを探索した。刷子縁膜にはα2,6-結合したシアル酸を含む糖鎖や高マンノース型糖鎖が存在することが示され、ビオチニルPPTはこれらのうち複数の糖タンパク質バンドと結合した。刷子縁膜画分との結合によっても、酵素活性は増強することが示された。本研究では、糖質、タンパク質、脂質を分解する膵臓消化酵素、α-アミラーゼ、トリプシン、キモトリプシン、リパーゼに加えて、核酸分解酵素のリボヌクレアーゼ、エラスターゼも各酵素に固有の糖結合性を持つことを見出した。糖-BPプローブとのELISA結合実験によって、リボヌクレアーゼはα-Gal,α-Man6Pなどに対する高い結合性が見出されたが、デオキシリボヌクレアーゼには該当する糖結合活性がほとんど認められなかった。糖鎖修飾に差があるリボヌクレアーゼA, Bでは、糖結合性に差はみられなかった。エラスターゼはα-Manに対して非常に高い結合性を示したが、他の糖にはほとんど結合しなかった。これらの酵素と糖BPプローブとの結合親和性は、SPR測定によって10^<5-7> M^<-1>の親和定数(Ka)が示された。各酵素の生体内糖鎖レセプターを解析するため、ブタ十二指腸の内腔から刷子縁画分を、ならびにブタ膵臓からチモーゲン分泌顆粒を調製し、SDS-PAGEにより分画後、PVDF膜に転写し、標識した酵素と反応させレセプターを探索した。それぞれの酵素について複数の陽性バンドが検出された。ゲル内消化とプロテオーム解析の方法により、レセプターの同定を進めている。この結果は、抗体による組織化学染色において、リパーゼ、α-アミラーゼは内腔側上皮細胞表面(刷子縁)に結合して検出され、α-マンノースを含む緩衝液洗浄により刷子縁から酵素が遊離し、酵素は腸管内腔のレセプターに糖特異的に結合して存在するという観察とも一致した。すなわち、膵酵素に対する生体内糖鎖レセプターの存在が示された。本研究から、糖結合活性が多くの膵臓酵素に共通な性質である一方、デオキシリボヌクレアーゼのように糖結合性が非常に低い物もあるなど、酵素による糖結合特異性の異同が示された。これらの膵臓酵素の糖鎖結合部位と結合様式については、糖鎖結合予測プログラムによる予測と、X線結晶解析による実験的解明を進めている。
臍帯血由来間葉系幹細胞を用いた硝子軟骨形成の誘導

母体に合併症のない症例より分娩時に両親の書類上の同意を得た後、臍帯血、胎盤血をヘパリン加採血した。検体は採取後24時間以内に処理を行った。前年度同様にPercoll(1.080g/ml)を用いた比重遠心法で単核球を分離した。分離した単核球をtype Icollagen coatedプラスティックディッシュに播種(1×10^6cells/cm^2)し20%ウシ胎児血清を含むDMEM培地を用いて培養を行った。また、採取し分離した単核球の一部に対してフローサイトメトリーを用い表面抗原の発現を調べた。検索した表面抗原はCD14,29,34,44,68,105である。培養により接着性細胞の存在と、コロニーの形成が観察された。接着性の細胞が出現した時点でbFGF(5ng/ml)を添加し細胞の増殖を促進した。線維芽細胞様の細胞が十分増殖した培養皿に対してdexamethasone,beta-glycerol phosphate,ascorbic acidを含む骨芽細胞分化誘導培地を加えて培養を継続した。分化誘導培地を加えることにより細胞形態は線維芽細胞様の形態から立方状の形態へと変化し、Von Kossa染色により細胞周囲のカルシウムの沈着を認めた。また同時に、多核巨細胞の存在も示された。フローサイトメトリーによる表面抗原の検索では、CD29,44,105の発現を高率に認めた。血球系幹細胞のマーカーであるCD34の発現も認められた。以上から臍帯血、及び胎盤血中には比重遠心法により分離されるプラスティック接着性の細胞が存在し、骨芽細胞分化誘導培地により骨芽細胞へと分化誘導可能な細胞が存在することが示された。表面抗原においても従来の報告による血球系細胞のマーカーだけではなく間葉系細胞のマーカーも高率に発現していた。以上を確認してから、ヌード・ラットの皮下に移植しin vivoでの骨組織の誘導を試みた。しかし、明らかな骨・軟骨組織は観察できなかった。そのため、フローサイトメトリーを用いたより詳細な表面抗原の調査と、より選択的な間葉系幹細胞の分離や培養条件の検索を行って、より分化能が高い細胞群の準備方法を続けて検討している。母体に合併症のない症例において分娩時に両親の同意を得た後、臍帯血をヘパリン加採血した。Percoll(1.080g/ml)を用いた比重遠心法で単核球を分離した。分離した単核球をプラスチックディッシュに播種(1×10^6 cells/cm^2>し20%ウシ胎児血清を含むダルベッコMEM培地を用いて培養を行った。培養によりプラスチック接着性細胞の存在と、コロニーの形成が観察された。経時的な細胞形態を観察すると線維芽細胞様のものと骨芽細胞様の細胞形態を持つ細胞が存在していた。また、採取、分離した単核球の表面抗原を調べた。今回は造血幹細胞のマーカーの一つであるCD34と間葉系幹細胞のマーカーの一つであるCD105の発現をフローサイトメトリーを用いて調べた。これにより、単離した細胞中には従来の報告どおり造血幹細胞の存在が示されたとともに、臍帯血中の間葉系幹細胞の存在の可能性が示された。以上のことから、臍帯血には比重遠心法により分離されるプラスチック接着性の細胞が存在し、またそれらの細胞が間葉系の細胞である可能性が示された。平成14年度はフローサイトメトリーを用いてより詳細に表面抗原を調べ、それらを利用して、より選択的に間葉系幹細胞の単離と遺伝子レベルでの細胞の観察を目指す。また、in vitroでの軟骨細胞への分化誘導と実験動物を用いてin vivoでの評価を行う予定である。尚、同じ細胞を用いて骨芽細胞への分化誘導も同時に行う予定である。分離した単核球をプラスチックディッシュに播種(1×10^6cells/cm^2)し20%ウシ胎児血清を含むダルベッコMEM培地を用いて培養を行った。さらに磁気ビーズ分離システムを用いてCD105陽性細胞を分離して培養を行った。これにより、単離した細胞中にはCD34陽性細胞、CD105陽性が存在すること、CD105陽性細胞を選択的に分離可能であることが分かった。以上のことから、臍帯血には間葉系幹細胞が存在すること、磁気ビーズ分離システムを用いて選択的に間葉系幹細胞を単離が可能であることが分かった。今後、詳細な遺伝子レベルでの細胞の観察をするとともに、in vivoでの軟骨細胞への分化誘導と実験動物を用いてin vitroでの評価を行う予定である。さらに、同じ細胞を用いて骨芽細胞への分化誘導も行う予定である。

母体に合併症のない症例より分娩時に両親の書類上の同意を得た後、臍帯血、胎盤血をヘパリン加採血した。検体は採取後24時間以内に処理を行った。前年度同様にPercoll(1.080g/ml)を用いた比重遠心法で単核球を分離した。分離した単核球をtype Icollagen coatedプラスティックディッシュに播種(1×10^6cells/cm^2)し20%ウシ胎児血清を含むDMEM培地を用いて培養を行った。また、採取し分離した単核球の一部に対してフローサイトメトリーを用い表面抗原の発現を調べた。検索した表面抗原はCD14,29,34,44,68,105である。培養により接着性細胞の存在と、コロニーの形成が観察された。接着性の細胞が出現した時点でbFGF(5ng/ml)を添加し細胞の増殖を促進した。線維芽細胞様の細胞が十分増殖した培養皿に対してdexamethasone,beta-glycerol phosphate,ascorbic acidを含む骨芽細胞分化誘導培地を加えて培養を継続した。分化誘導培地を加えることにより細胞形態は線維芽細胞様の形態から立方状の形態へと変化し、Von Kossa染色により細胞周囲のカルシウムの沈着を認めた。また同時に、多核巨細胞の存在も示された。フローサイトメトリーによる表面抗原の検索では、CD29,44,105の発現を高率に認めた。血球系幹細胞のマーカーであるCD34の発現も認められた。以上から臍帯血、及び胎盤血中には比重遠心法により分離されるプラスティック接着性の細胞が存在し、骨芽細胞分化誘導培地により骨芽細胞へと分化誘導可能な細胞が存在することが示された。表面抗原においても従来の報告による血球系細胞のマーカーだけではなく間葉系細胞のマーカーも高率に発現していた。以上を確認してから、ヌード・ラットの皮下に移植しin vivoでの骨組織の誘導を試みた。しかし、明らかな骨・軟骨組織は観察できなかった。そのため、フローサイトメトリーを用いたより詳細な表面抗原の調査と、より選択的な間葉系幹細胞の分離や培養条件の検索を行って、より分化能が高い細胞群の準備方法を続けて検討している。
滑膜肉腫を用いた神経堤幹細胞の分化方向決定機構の解明

滑膜肉腫切除組織13例及び培養細胞5株を用いた解析により以下の成果を得た。1)分化関連遺伝子の発現:特定の組織の分化形質に関連した遺伝子の発現をRT-PCR法により解析した。その結果、骨3/5例、軟骨4/5例、ニューロン5/5例、グリア3/5例、メラノサイト5/5例で何らかの関連遺伝子の発現が確認された。一方、脂肪及び血管内皮関連遺伝子の発現は確認されなかった。これらの遺伝子の発現は、切除組織を用いた解析においても確認できた。2)分化関連表現型の解析:同様に各組織細胞としての分化能に関連する表現型を解析した結果、骨1/5例、軟骨4/5例、ニューロン5/5例で陽性であった。脂肪及び血管内皮関連分化形質は確認されなかった。3)初代培養滑膜肉腫細胞を用いて、同様な実験を行い、細胞株と同様に骨、軟骨、ニューロン、グリアの分化形質を誘導することが確認された。4)神経系への分化形質をもつことから、誘導因子による増殖抑制効果を検討した。まずATRAによる処理では、5例全例において繊維肉腫あるいは大腸癌では抑制効果が認められない濃度において著しい抑制効果が検出された。造腫瘍能を有する1株を対象としたin vivoの実験においても、増殖抑制効果が認められた。またFGF2により分化誘導では、1/5例において、著明な抑制効果が示され、細胞にはアポトーシスが誘導された。FGF2により増殖が抑制された細胞株はin vivoにおいて明らかなnuclear palisadingを示す腫瘍を形成し、グリアとの強い関連性を示唆する結果が得られた。以上の結果より、滑膜肉腫が神経堤幹細胞に準じた多分化能を有することが判明し、特に神経分化能は、分化誘導療法の対象となりうるものであることを示唆する結果が得られた。
細胞膜分子を用いた特異的免疫抑制剤及び免疫賦活剤の開発

CD26分子は110kDaの膜糖蛋白で、CD4メモリーT細胞に選択的に発現され、N末端から2番目のプロリンのC末端側ペプチド結合を切る酵素であるdipeptidyl peptidase IV(DPPIV)活性を有している。またT細胞受容体からのシグナル伝達を補助する共刺激分子の一つで、T細胞活性化にも重要である。Adenosine deaminase(ADA)はCD26分子の結合蛋白であることを我々は既に報告している。T細胞共刺激には、CD26分子のインターナリゼーションやそれに引き続く蛋白のリン酸化が重要とされているが、CD26由来T細胞共刺激の機序を明らかにするため、CD26のADA以外のリガンドを探求することにした。CD26分子の結合蛋白として、我々はマンノース6リン酸/インスリン成長因子II受容体(M6P/IGFIIR)を同定し、CD26の糖鎖におけるマンノース6リン酸部位がCD26分子とM6P/IGFIIRとの結合に重要であることを明らかにした。さらにヒト末梢血T細胞において、T細胞活性化によりCD26分子はマンノース6リン酸化され、T細胞上のCD26分子は抗CD26抗体によるクロスリンクにより、CD26のキャップイングおよびインターナリゼーションを生じた。このCD26のインターナリゼーション及びCD26由来T細胞共刺激によるT細胞増殖はin vitroでのM6Pの添加により阻害されたが、G6Pやマンノース1リン酸添加では阻害されなかった。このようにCD26とM6P/IGFIIRの相互作用はCD26由来T細胞共刺激に重要な役割を果たしていることが明らかになった。CD26分子はメモリーT細胞の活性化や機能の鍵となる分子でDPPIV酵素活性を有し、この酵素はN末端から2番目のプロリンのC末端側ペプチドを切断することで知られているが、免疫に関与するDPPIVの基質は明らかでなかった。RANTES,MIP-1βなど多くのケモカインはN末端から2番目がプロリンであり、DPPIV酵素の基質となりうる。そこでCD26/DPPIVとケモカインの相互作用がリンパ球遊走及びHIV感染に及ぼす影響を検討した。野生型可溶性CD26(DPPIV+)の存在下でRANTESによるT細胞の遊走が増加した。しかし変異型可溶性CD26(mCD26)では遊走亢進は認められなかった。このようにCD26/DPPIVはRANTESによるT細胞の遊走を亢進させた。RANTESとsCD26を反応させ、アミノ酸配列を検討したところRANTESはN末端の2番目のプロリンのところで切断された。RANTESとCD26/DPPIVとの相互作用のM-tropicウイルス(SF162株)の細胞侵入における影響については、RANTESのみの場合と比較して抑制作用の変化は認められなかった。RANTES同様にSDF-1αとsCD26を反応させ、アミノ酸配列を検討したところ、N末端の2番目のプロリンのC末端側で切断された。この様にRANTES,SDF-1αともにDPPIVの基質であることが明らかになった。SDF-1αとCD26/DPPIVの相互作用がT-tropicウイルス(NL43株)感染における影響を検討した。SDF-1αによるHIVの細胞侵入の阻害はsCD26を添加することによりその阻害活性は失われた。さらにリンパ球遊走能の亢進作用も消失した。この様にCD26/DPPIVはin vivoにおいてHIV感染や炎症反応を制御する分子として重要であることが示唆された。

またT細胞受容体からのシグナル伝達を補助する共刺激分子の一つで、T細胞活性化にも重要である。Adenosine deaminase(ADA)はCD26分子の結合蛋白であることを我々は既に報告している。T細胞共刺激には、CD26分子のインターナリゼーションやそれに引き続く蛋白のリン酸化が重要とされているが、CD26由来T細胞共刺激の機序を明らかにするため、CD26のADA以外のリガンドを探求することにした。CD26分子の結合蛋白として、我々はマンノース6リン酸/インスリン成長因子II受容体(M6P/IGFIIR)を同定し、CD26の糖鎖におけるマンノース6リン酸部位がCD26分子とM6P/IGFIIRとの結合に重要であることを明らかにした。さらにヒト末梢血T細胞において、T細胞活性化によりCD26分子はマンノース6リン酸化され、T細胞上のCD26分子は抗CD26抗体によるクロスリンクにより、CD26のキャップイングおよびインターナリゼーションを生じた。このCD26のインターナリゼーション及びCD26由来T細胞共刺激によるT細胞増殖はin vitroでのM6Pの添加により阻害されたが、G6Pやマンノース1リン酸添加では阻害されなかった。このようにCD26とM6P/IGFIIRの相互作用はCD26由来T細胞共刺激に重要な役割を果たしていることが明らかになった。
メタボリックシンドローム介入標的としてのp38α作用機構

近年、メタボリックシンドロームの発症には炎症メカニズムの関与が必要であることが明らかにされつつある。炎症制御の中心的因子であるp38αの血管血球系ノックアウトマウスを作製することにより、炎症制御によるメタボリックシンドロームへの介入メカニズムを検討した。p38αの血管血球系ノックアウトマウスでは高脂肪食によるインスリン抵抗性および肥満が抑制されること、脂肪組織における炎症性サイトカインの発現が減少していること、脂肪組織へ浸潤する炎症性マクロファージが減少し、また炎症性マクロファージにおけるケモカインレセプターの発現が低下していることを明らかにした。このことから、p38αは脂肪細胞における慢性炎症を介してインスリン抵抗性を制御していることが示唆された。さらに、肝臓における脂質代謝制御遺伝子の発現が変化していたことから、血球細胞におけるp38αは肝における脂質代謝への影響を介して、肥満を制御している可能性が示唆された。Cre-loxPシステムを用いて血管血球系特異的p38αコンディショナルノックアウトマウス(p38α血管血球系cKOマウス)を作製した。p38α血管血球系cKOマウスでは、通常食では野生型との顕著な差は認められなかったが、高脂肪食投与時には、耐糖能試験およびインスリン抵抗性試験により、インスリン抵抗性が抑制され、また加えて体重増加および肥満が抑制されることを見いだした。この時、p38α血管血球系cKOマウスでは脂肪組織におけるTNAFα、IL-1、IL-6といった炎症性サイトカインの発現が減少していること、脂肪組織へ浸潤する炎症性マクロファージが減少し、また炎症性マクロファージにおけるケモカインレセプターの発現が低下していることを明らかにした。これらことから、p38αは脂肪細胞における慢性炎症を介してインスリン抵抗性を制御していることが示唆された。さらに、p38α血管血球系cKOマウスでは肝における脂肪酸結合因子FABPの発現が低下していたことから、血球細胞におけるp38αはなんらかの経路を介して肝における脂質代謝へ影響し、肥満を制御している可能性が示唆された。これらの研究結果は、血球細胞、おもにマクロファージにおけるp38αを介したシグナル伝達が、インスリン抵抗性および肥満という二つの経路を介して個体レベルの代謝を制御していることを示す、初めての知見である。p38αおよびその上下のシグナルを検討することで、インスリン抵抗性および肥満に対して新たな介入手段を提案するものである。われわれは作製した変異マウス(血管血球系特異的p38αノックアウトマウス)において、体重測定、耐糖能試験、インスリン抵抗性試験、血中遊離脂肪酸を測定した。この結果、高脂肪食投与時において変異マウスでは体重増加、空腹時高血糖、血中遊離脂肪酸の上昇が有意に抑制されていた。また耐糖能試験、インスリン抵抗性試験においても、変異マウスでは高脂肪食投与において顕著な耐糖能とインシュリン感受性を保つことがわかり、血管血球系特異的のp38αが高脂肪食による肥満とインスリン抵抗性の惹起に必要であることを明らかにした。また内臓脂肪組織に浸潤したマクロファージを分取し、フローサイトメトリーを用いて解析し、変異マウスではCD11c陽性の炎症性マクロファージの浸潤が抑制されていることを明らかにした。血球中の単球サブタイプに有意な差は認められなかったため、これはマクロファージの浸潤能の変化によるものと考えられる。脂肪組織、肝、および筋における代謝制御系の遺伝子発現を検討した結果、変異マウスの脂肪組織では高脂肪食投与によるIL1、IL6、TNFαなど炎症性サイトカインの発現が顕著に抑制されていることがわかった。アディポサイトカインであるアディポネクチンの発現は通常食、高脂肪食いずれの場合も変異マウスで増大しており、逆にPAI1は変異マウスで減少していた。これにより血球系による脂肪組織への作用が示唆された。肝においては、脂肪酸合成律速酵素および脂肪酸β酸化律速酵素の発現パターンが変異マウスでは変化しており、肝内部の血球系細胞が脂質代謝に影響を与えている可能性を示唆している。これらの成果は、p38αMAPKが個体レベルで肥満やインスリン抵抗性を制御しており、その効果は主に血管血球系において発揮されていることを世界に先駆けてしめすものであり、基礎研究および今後の治療方法開発において大きな意義を持つものである。研究計画はおおむね順調に実施されている。

変異マウス(血管血球系特異的p38αノックアウトマウス)における高脂肪食投与時の生理的データについては、体重、空腹時血糖、耐糖能、インスリン抵抗性、血中遊離脂肪酸を測定し、有意な変化を見いだした。呼吸商についても検討を行ったが、こちらでは顕著な差は認められなかった。脂肪組織への免疫細胞の浸潤に関しては、マウス脂肪組織からの浸潤細胞の分取と、フローサイトメトリーによる解析を行い、炎症性マクロファージの動態変化をみいだした。ソーティングによって分取した脂肪組織内炎症性マクロファージにおける遺伝子発現は現在解析中である。各臓器における遺伝子発現については、肝、筋、脂肪組織においてリアルタイムPCR法を用いて検討した。いずれの臓器においても、変異マウスでは炎症性サイトカインおよび代謝制御系の遺伝子発現が変化しており、血球系p38αが臓器の機能を制御していることを明らかにした。また、より遺伝子破壊の範囲が限定されるマクロファージ特異的p38αノックアウトマウスの作製を開始し、生存仔を得ることに成功した。現在実験用に繁殖中である。今後の方針としては、脂肪組織浸潤マクロファージのより詳細な機能、特に炎症性サイトカイン、ケモカインによるケモタキシス(走性)について検討を行う予定である。また野生型および変異マウスにおける炎症性マクロファージの遺伝子発現変化をより詳細に解析し、マーカーまたは創薬ターゲットとして利用可能な因子を探索する。これらの結果がまとまり次第、論文作成と投稿を行う。また現在解析中の血管血球系特異的p38αノックマウスにおいては、血管内皮細胞や多様な血球の影響が排除しきれないため、マクロファージ特異的p38αノックアウトマウスを作製し、高脂肪食投与による肥満および血糖制御への影響を検討する。研究費の主な使用対象は、実験動物の維持管理、遺伝子改変マウスのタイピングPCR試薬、フローサイトメトリー用試薬および抗体、ケモタキシスアッセイ用試薬、血糖測定用試薬、インスリン測定用ELISA試薬、リアルタイムPCR用酵素およびプライマー、サブトラクションアッセイ用試薬、組織切片分析用試薬、学会出張費、論文投稿料などの予定である。
網目状およびカゴ状炭素同素体の構造ユニットの合成

最近、フラーレンやナノチューブなどの新しいかたちの炭素同素体の発見に伴い、新しい構造ユニットからなる炭素同素体の合成が注目されている。本研究はこれらの内、特に網目状構造の構成ユニットであるヘキサエチニルベンゼンと、カゴ状構造の構成ユニットとみなせるペンタエチニルシクロペンタジエニド-金属錯体をとりあげ、それらの効率的合成法を開発することを目的として行ったものである。1.網目状炭素骨格を合成する際に一挙にアセチレン末端のカップリングを行うと、反応は規則的には進行しない。したがって、ある程度カップリングを段階的に行わせるために,アセチレン末端に異なる保護基を導入する必要がある。この観点から本研究では脱保護時の反応性が大きく異なる3種の保護基を有するヘキサエチニルベンゼン誘導体を合成した。すなわち、テトラハロシクロペンタジエノンアセタールに対して、二種のエチニル基を逐次導入したのち脱保護よりテトラエチニルシクロペンタジエノンとし、アセチレン誘導体との[4+2]付加と脱カルボニル化によりベンゼン骨格とした。最後に官能基変換することにより第三のエチニル基を導入し、目的の化合物を合成した。2.テトラエチニルシクロペンタジエノンからは光化学反応により、テトラエチニルシクロブタジエンやテトラエチニルテトラヘドランといった新しい炭素構造ユニットが合成できる可能性があるので、現在この点について検討している。3.カゴ状構造の合成については、テトラエチニルシクロペンタジエノンとエチニルアニオンとの反応により五つのエチニル基をもつシクリペンタジエノールの段階まで合成が完了した。しかし現在のところ、これからの金属錯体の合成には成功していない。
多機能タンパク質の機能性部位に着目した動的立体構造解析法の開拓

本研究では,NMRを用いた多機能タンパク質の機能発現部位の動的構造解析法の開拓を行った.われわれが克服すべき問題点は,いかにして着目すべき部位からの情報を選択的に抽出できるか,そして溶液中でタンパク質が持つ動的構造を解析できるか,の2点であった.これに対する回答は,アミノ酸選択的安定同位体標識法の活用とNMR緩和時間の解析である.本研究により得られた結論をまとめる.抗ダンシルFvフラグメントを用いた研究1)主鎖アミド基由来のNMRシグナルの帰属は,2重標識法および連鎖帰属法を併用することにより効果的に確立できる.2)抗ダンシルFvフラグメントの抗原認識部位は,VHドメインに存在する超可変領域H1,H3およびN末端により形成されている.3)抗原認識に関与している残基は,Y96H,Y104H,F27HおよびV2Hである.4)抗原認識に伴う影響は,VHドメインからVLドメインに伝搬する.抗ダンシルFabフラグメントを用いた解析:分子量25KをもつFvフラグメントで確立された手法は,分子量50KFabフラグメントにも拡張できる.本研究では,NMRを用いた多機能タンパク質の機能発現部位の動的構造解析法の開拓を行った.われわれが克服すべき問題点は,いかにして着目すべき部位からの情報を選択的に抽出できるか,そして溶液中でタンパク質が持つ動的構造を解析できるか,の2点であった.これに対する回答は,アミノ酸選択的安定同位体標識法の活用とNMR緩和時間の解析である.本研究により得られた結論をまとめる.抗ダンシルFvフラグメントを用いた研究1)主鎖アミド基由来のNMRシグナルの帰属は,2重標識法および連鎖帰属法を併用することにより効果的に確立できる.2)抗ダンシルFvフラグメントの抗原認識部位は,VHドメインに存在する超可変領域H1,H3およびN末端により形成されている.3)抗原認識に関与している残基は,Y96H,Y104H,F27HおよびV2Hである.4)抗原認識に伴う影響は,VHドメインからVLドメインに伝搬する.抗ダンシルFabフラグメントを用いた解析:分子量25KをもつFvフラグメントで確立された手法は,分子量50KFabフラグメントにも拡張できる.1.試料の調製抗ダンシルモノクローナル抗体の抗原認識フラグメント(Fv:VH、VLの2個のドメインから構成される最小抗原認識フラグメント、Fabなど)の特定アミノ酸を^2D、^<13>C、^<15>N、で標識を行い、NMR測定用試料とした。2.NMR測定技術の開拓前述の試料を用い、HMQC-HOHAHA、HMQC-NOESY、および安定同位体フィルター法を用い、ラベルアミノ酸由来のピークを連鎖帰属法および2重標識法を用いて、Fvフラグメント中に存在するアミノ酸の80%を部位特異的に帰属した。得られた帰属に基づき、機能性ループの溶液中における主鎖の運動性を^<15>Nの緩和時間の測定から評価したところ抗原と直接相互作用を示した、H鎖CDR3は、抗原非存在下ではいくつかのコンフォメーションを取っていることが明らかになった。3.NMRスペクトロメーターの開発前項目の研究を行うに際して生じた装置上の問題点を解決するために、NMRスペクトロメーターの改造を行った。特に、^<15>Nの緩和時間の測定では、通常の装置では使用しないような高出力RFパルスを用いるため、この測定に耐えるパワーアンプおよび検出系の開発を行った。(1)抗ダンシルFvフラグメントの安定同位体標識および主鎖アミド基の帰属NMRを用いた原子レベルの解析を行うためにはNMRシグナルの部位特異的帰属が必須となる.13種類の^<15>N標識アミノ酸による安定同位体標識Fvフラグメント用いて,主鎖アミド基の帰属を行い,導入した安定同位体標識プローブのうちおよそ80%のアミノ酸残基に関しての帰属が完了した.帰属の戦略としては,^<15>N-^<13>C2重標識Fvフラグメントの^1H,^<13>C,^<15>N3重共鳴測定により帰属の起点を作り,3次元NMRにより得られた帰属をアミノ酸配列上,連鎖的に展開することが効果的であった.さらに,確立した主鎖アミド基の帰属をもとに,適当な安定同位体標識とパルステクニックを併用することで,芳香族アミノ酸側鎖シグナルまで帰属を展開することが可能になった。2)抗原認識に関与するFvフラグメントのアミノ酸残基の同定我々は,スピンラベル化抗原を用いた実験より,抗ダンシルFvフラグメントの抗原認識は,可変領域の存在するH1,H3ループとH鎖N末端に囲まれた領域で行われることを明らかにしてきた.さらに原子レベルでの解析を行うため,抗原(DNS-Lys)存在下でのNOE測定を行ったところ,DNS環プロトンシグナルとFvフラグメントにはいくつかの分子間NOEが観測された.さらにDNS-Lys側鎖からの分子間NOEを解析するために,Lys側鎖を^<13>Cで均一標識した抗原アナログを作成し,NOE測定を行った.1)項で得られた帰属を基に測定された分子間NOEを解析したところ,抗原結合部位において抗原から5A以内に存在するアミノ酸残基は,Y96H(H3),Y104H(H3),F27H(H1),V2Hであることが明らかとなった。

抗原結合部位には,両親媒性を有するTrp残基およびTyr残基が豊富に存在していることが知られている.そこで,Trp残基およびTyr残基の主鎖アミド窒素を^<15>N標識したFabフラグメントを用いて,抗原結合部位の同定を行った.主鎖アミド基に由来するNMRシグナルの部位特異的帰属は^<13>C-^<15>N二重標識法により行った.現在までに,二重標識可能な全てのシグナルの帰属を完了している.スピンラベル化抗原アナログであるNP-AmTEMPOを化学合成し,このアナログの添加実験により抗原結合部位の同定を行った.その結果N1G9の抗原結合部位には,H1ループに位置するW33,L3ループに位置するW91,W99が存在していることが明らかとなった.N1G9とC6のそれぞれのTyr残基およびTrp残基に対して同様のスピンラベル添加実験を行った結果,N1G9,C6いずれの場合にも,Y32(L1ループ),W91,Y92,W96(L3ループ),W33(H1ループ)およびH3ループの残基にシグナル強度の減少が観測された.したがって,N1G9およびC6の超可変ループには数多くのアミノ酸変異がおきているにもかかわらず,いずれの抗体においても抗原結合部位は,L1,L3,H1,H3ループで形成される領域であることが判明した.
数値解析理論を用いたハミルトニアンモンテカルロの高効率化と適用範囲の拡大

本研究はハミルトニアンモンテカルロという,確率分布にしたがう乱数を発生させるアルゴリズムの改良と応用範囲の拡大を目的としている.ハミルトニアンモンテカルロは,統計学・機械学習分野において大規模・複雑なベイズモデルの事後分布の計算に利用され,高次元のベイズモデルの実用化のために有用であるとして近年普及が進んだ手法である.平成30年度はハミルトニアンモンテカルロアルゴリズムの改良のために,アルゴリズム内の数値積分に関するパラメータを実行中に適応的に変化させる手法に関する研究を行い,学会発表を行った.ハミルトニアンモンテカルロの性能はパラメータに大きく影響されるのでそのチューニングが重要であり,これまではアルゴリズム実行前に事前のチューニングがなされてきた.本研究は実行中にパラメータを適応的に変化させることでさらに詳細なパラメータの調整を可能にするという面で有用である.数値実験によって,本研究が提案した手法では発生させたサンプル間の相関が下がり,より効率的なサンプリングが行えることを確認した.また,統計学の諸問題へのハミルトニアンモンテカルロの応用,特に統計モデルのパラメータ空間の幾何的な情報を用いるハミルトニアンモンテカルロの応用先を探る中で,多変量解析の分野で統計モデルの幾何構造を調べる研究を行った.そこから派生したテーマとして,因子分析モデルの幾何構造を利用した事前分布および最尤推定の手法を提案し,学会発表を行った.さらに,因子分析モデルを含む曲指数型分布族と呼ばれるクラスの統計モデルの幾何構造についての理解を深め,それを利用した新しいクラスの推定量を提案した.この結果について現在論文を執筆中である.数値解析技術を用いたハミルトニアンモンテカルロの改良について一定の成果をあげた.また,ハミルトニアンモンテカルロの応用先を探る中で,多変量解析の分野で想定外の成果をあげたため,概ね順調であると判断する.来年度は,因子分析モデルに対する事前分布の構成や最尤推定に関する本年度の成果について追実験や論文執筆等のとりまとめを行った上で,新たな研究を行う予定である.当初の予定では新たな力学系を用いた乱数発生法も検討する予定であったが,派生テーマである多変量解析の幾何構造の研究は急務であると考えるためこのテーマを発展させる予定である.また,因子分析を含む多変量解析の分野でのハミルトニアンモンテカルロの応用を検討する.本研究はハミルトニアンモンテカルロという,確率分布にしたがう乱数を発生させるアルゴリズムの改良と応用範囲の拡大を目的としている.ハミルトニアンモンテカルロは,統計学・機械学習分野において大規模・複雑なベイズモデルの事後分布の計算に利用され,高次元のベイズモデルの実用化のために有用であるとして近年普及が進んだ手法である.平成30年度はハミルトニアンモンテカルロアルゴリズムの改良のために,アルゴリズム内の数値積分に関するパラメータを実行中に適応的に変化させる手法に関する研究を行い,学会発表を行った.ハミルトニアンモンテカルロの性能はパラメータに大きく影響されるのでそのチューニングが重要であり,これまではアルゴリズム実行前に事前のチューニングがなされてきた.本研究は実行中にパラメータを適応的に変化させることでさらに詳細なパラメータの調整を可能にするという面で有用である.数値実験によって,本研究が提案した手法では発生させたサンプル間の相関が下がり,より効率的なサンプリングが行えることを確認した.また,統計学の諸問題へのハミルトニアンモンテカルロの応用,特に統計モデルのパラメータ空間の幾何的な情報を用いるハミルトニアンモンテカルロの応用先を探る中で,多変量解析の分野で統計モデルの幾何構造を調べる研究を行った.そこから派生したテーマとして,因子分析モデルの幾何構造を利用した事前分布および最尤推定の手法を提案し,学会発表を行った.さらに,因子分析モデルを含む曲指数型分布族と呼ばれるクラスの統計モデルの幾何構造についての理解を深め,それを利用した新しいクラスの推定量を提案した.この結果について現在論文を執筆中である.数値解析技術を用いたハミルトニアンモンテカルロの改良について一定の成果をあげた.また,ハミルトニアンモンテカルロの応用先を探る中で,多変量解析の分野で想定外の成果をあげたため,概ね順調であると判断する.来年度は,因子分析モデルに対する事前分布の構成や最尤推定に関する本年度の成果について追実験や論文執筆等のとりまとめを行った上で,新たな研究を行う予定である.当初の予定では新たな力学系を用いた乱数発生法も検討する予定であったが,派生テーマである多変量解析の幾何構造の研究は急務であると考えるためこのテーマを発展させる予定である.また,因子分析を含む多変量解析の分野でのハミルトニアンモンテカルロの応用を検討する.
鳥類に広く適用できる性判別プローブの開発と希少種の繁殖等への利用

(1)深胸類鳥類種の性判別プローブの開発:1997年に研究代表者らが見いだし、報告した[A.Ogawa et al.Chromosome Res.5 : 93-101(1997)]ニワトリのW染色体(雌特有の性染色体)長腕中部に存在するEE0.6非反復配列は進化上の保存性が高く、広く鳥類種のW染色体上に存在する。このことに着目し、微量の血液由来のDNAに対するPCRによる性判別法の開発を行なった。その後、EE0.6の関連配列がZ染色体(雌雄共通の性染色体)上にも存在し、種によってはW、Z上のEE0.6関連配列の塩基配列類似性が比較的高い場合もあり、必ずしもニワトリで設定したPCR条件が全ての種に適用出来ないことが分かってきた。そこで、ニワトリとニホンコウノトリのW、Z染色体上のEE0.6関連配列をそれぞれクローニング、塩基配列決定して、それぞれについてPCRプライマー配列を設定した。これらのプライマーを組み合わせることにより、これまでに8目18種の深胸類鳥類種の性判別が確実に行なえるようになった。(2)走鳥類の性判別:ダチョウ、エミュなどの走鳥類は形態的に識別できる性染色体をもたず、性染色体の同定や起源については謎であった。本研究でニワトリW染色体上のEE0.6配列、Z染色体上の2つの遺伝子IREBP,ZOV3の関連配列がダチョウ、エミュに存在することが分かり、それぞれのゲノムクローンを取得、塩基配列を決定した結果、ニワトリの配列と相同性が高いことが分かった。これらの配列をプローブとして雌雄のダチョウ、エミュ、ヒクイドリの染色体に対して蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)を行なった結果、いずれも同じ1対の染色体上に局在し、ダチョウとヒクイドリの雌では、片方の染色体でIREBP遺伝子が欠失していることが示され、深胸類、走鳥類の性染色体が同一起源であること、ダチョウ・ヒクイドリではW染色体の形態分化がわずかに生じていることが明らかになった。したがって、ダチョウ、ヒクイドリではFISHにより、IREBP遺伝子が1本の染色体上に存在(雌)するか2本の染色体上に存在(雄)するかを調べれば雌雄判別が可能であることが分かった。(3)希少種の繁殖等への応用:特別天然記念物で種の絶滅に瀕しているニホンコウノトリとトキの幼鳥の血液または羽の根端細胞由来のDNAに対して、ニホンコウノトリのEE0.6配列のプライマーを用いてPCRを行うことにより、確実に性判別を行うことができ、繁殖計画に役立てることができた[Y.Itoh et al. Genes Genet. Syst. 72 : 51-56(1997), K.Murata et al. Jpn. J. Ornithol46 : 157-162(1998)]。

(3)希少種の繁殖等への応用:特別天然記念物で種の絶滅に瀕しているニホンコウノトリとトキの幼鳥の血液または羽の根端細胞由来のDNAに対して、ニホンコウノトリのEE0.6配列のプライマーを用いてPCRを行うことにより、確実に性判別を行うことができ、繁殖計画に役立てることができた[Y.Itoh et al. Genes Genet. Syst. 72 : 51-56(1997), K.Murata et al. Jpn. J. Ornithol46 : 157-162(1998)]。研究代表者らはニワトリW染色体特異的な反復配列XhoI,EcoRIファミリーを見いだし、これらのゲノムクローンをプローブとして、DNA・DNAハイブリダイゼーションまたはPCRによりGallus属(ニワトリ、野鶏)の初期胚の性判別を行ってきた。しかし、これらのプローブ配列は属特異的であるため、広く深胸類鳥類のDNAレベルの性判別に利用できるプローブの開発を目指した。雌ニワトリの中期染色体標本に対してレーザーマイクロビーム照射を行い、一本のW染色体のみを残して焼却し、このW染色体DNAをランダムPCRで増幅してラムダファージベクターを利用したW染色体特異的ゲノムライブラリーを作製した。このライブラリーからW染色体上のXhoI,EcoRIファミリードメインの中間に位置する約25kbの非反復配列をクローニングした。さらにこの領域中のEE0.6(0.6kb Eco RI断片)配列が多くの鳥類種でW染色体上に保存されていることが分かり、この配列を鳥類性判別のユニバーサルプローブとして利用できるか検討した。その過程で、EE0.6関連配列がZ染色体上にも存在し、W、Z上の配列の相同性が種によって異なることが分かった。EE0.6をプローブとして17目34種の雌雄DNAに対するサザンブロットハイブリダイゼーションを行った結果、雌特有のバンドのみが検出される種と雌特有のバンドの他に雌雄共通のバンドでシグナル強度が雄2:雌1となるバンド(Z染色体由来)が検出される種に分かれた。雌特有のバンドは常に認められることから、鳥類性判別へ広い応用の可能性が示唆された。ニホンコウノトリではW、Z染色体上のEE0.6関連配列をクローニングし、塩基配列を比較して、両者を識別できるPCRプライマーを設定することにより、羽一本由来のDNAを用いて確実にPCR法による性判別が行えるようになった。1997年にニワトリの雌特有の性染色体であるW染色体の長腕中部に位置する偽遺伝子様のEE0.6配列をクローニングし[A.Ogawa et al.Chromosome Res.,5:93-101(1997)],その相同配列をニホンコウノトリからもクローニングした[Y.Itoh et al.,Genes Genet.Syst.72:51-56(1997)]。EE0.6配列は鳥類種を通じて高く保存されている。また、EE0.6配列と類似の配列はZ染色体上にも存在するが、W、Z上の配列はかなり異なるので、適当なプライマーセットを用いることにより、PCRでW、Z上の配列を異なったサイズの増幅断片(W;300bp.Z;580bp)として得られるため、性判別に利用することができる[K.Murata et al.,Jap.J.Ornithol.,46:157-162(1998)]。本年度はニホンコウノトリのW,Z上のEE0.6配列をそれぞれ特異的に増幅できるPCR法をキングペンギン、マカロニペンギン、ヒゲペンギン、フンボルトペンギン、アビの血液から調製したDNAに適用していずれも明確に性判別することが出来た。この結果は同様の方法により、ニホンコウノトリと近縁のトキ幼鳥の性判別も行えることを示唆するものである。
超高電界ダイヤモンド光電素子の開発とその高出力THz光源への応用

気相合成法(CVD)を用いた薄膜ダイヤモンドは大面積化が可能なこと、不純物制御が可能なこと、様々な電極構造をとりえることなどの利点があり、電気光学素子や高速デバイスとして期待されている。しかし、その多結晶性からの粒界のキャリヤーの動特性に対する影響が大きく、この詳細な物理を明らかにし、制御、膜質の改善を行うことが望まれていた。本研究では光伝導素子を構成させた超短パルスレーザー照射による電気パルス波形の観測、紫外ポンププローブ計測によるキャリヤー密度の時間発展の観測を行い、以下のような新しい知見を得た。1.粒径の減少によりその粒界内のキャリヤー寿命、移動度は減少するが0.110μmの粒径試料ではその依存性はγ=80ps(d/10μm)^<0.177>、μ=30cm^2/Vs(d/10μm)^<0.43>になることが明らかになった。2.粒界内でキャリヤー寿命は大きく変化しており、また、5.0eV程度の紫外光照射ではトラップ準*の影響がキャリヤー寿命に大きな影響が出ることが分かった。3.粒界影響による低移動度はダイヤモンドの持つ高い絶縁破壊強度により高電界印加させることでフォノン相互作用による飽和ドリフト速度まで増加させることが可能で影響は設計により低減させることが可能である。また、これらCVDダイヤモンドの基礎特性が得られたことから光電動素子型の高出力THz光源の設計を行った。この際の最も重要な点は大面積化にともなう高電界印加可能な電極設計、出力THz光の空間コヒーレンス制御にある。THz光源でのダイヤモンドの優位性を確認するために実際に数千のギャップを2インチウエハ上に製作し、2ピコ秒の深紫外レーザーを用いて出力実験を行った。照射レーザーのバイナリーマスクによるコヒーレント制御性、電界の2乗スケーリング、波形の測定などが行われ、10mm^2の有効出射面積でこれまでのGaAsで達成された出力密度を越えるTHz波の発生に世界で初めて成功した。さらに高電界印加時の電流特性の評価から2インチウエハ前面に拡張することで出力強度としても最高値を得られることが明らかになった。高出力THz光源としてのダイヤモンド光伝導素子を評価するため、超短パルスレーザー照射時のキャリヤ-生成・消滅過程、加速過程を測定するシステムを確立し、実際のCVDダイヤモンド薄膜で計測を行った。ダイヤモンドの高いバンドギャップエネルギーに合わせてポンプ光は400nm、250nmの2種類を用意し、光伝導特性の励起波長依存も評価でき、また、空間・時間分解能はそれぞれによるそれぞれ5μm、250fsを達成した。このシステムによる測定で以下のことが明らかになった。1.CVDダイヤモンド内のキャリアー寿命には12ピコ秒の短いものと数十ピコの長いものがあった。その励起波長依存性から、これらは吸収領域の差や励起されたキャリヤ-のバンド構造における位置の差であると考えられた。また、この短い寿命を積極的に利用したギャップ内粒径のみを小さく制御する新しい素子設計が提案された。これにより、1kV、1psパルス発生が可能となりTHz以外の応用にも大きな貢献となった。