hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
コモンマーモセットで解き明かすブドウ球菌エンテロトキシン嘔吐メカニズム

3. 28年度に引き続きSEA変異体を作製しマーモセット腸管への結合性を確認するとともに、作製したSEA変異体のスーパー抗原活性を解析したところ、いずれの変異体もスーパー抗原活性を保持していた。このことは嘔吐活性とスーパー抗原活性が分離可能であることを示唆している。平成29年度に実施予定であった受容体の機能解析について、候補タンパク質がひとつ得られ、in vitroでの結合性の確認と機能解析も進んだため。またさらなる候補タンパクの探索にも取り組んでおり、現在ダイナビーズを用いて解析を行っている。また嘔吐シグナルの伝達機構について、細胞より上のレベルでは詳細が示されてきており、作動する神経の特定まであと一歩まで来ている。さらに嘔吐活性部位の探索も高効率に変異体の作製、スーパー抗原活性の測定、抗原性の確認および肥満細胞との結合性が確認できるようになり、結合部位の特定が加速している。本研究では、小型霊長類である顧問マーモセットを用いてブドウ球菌エンテロトキシン(SE)の嘔吐メカニズムの全容解明を目指し、SE受容体の探索と嘔吐シグナルの伝達機構、SEA内の嘔吐活性部位の同定を試みており、30年度は以下の研究を実施した。1.前年度に引き続き、SEAと高親和性を示す肥満細胞上の分子の検索を進めた。組織切片上において肥満細胞を各種酵素で処理したのちSEAとの相互作用を確認したところ、高親和性分子は糖タンパク質であることが示唆されたため、コモンマーモセット消化管から抽出したタンパク質から肥満細胞に存在する候補タンパク質のプルダウンを試みた。しかし、当該タンパク質の量がごく微量であるため分離には至らなかった。2.そこでコモンマーモセット消化管より細胞を分取し、肥満細胞のみを回収することを試みた。粘膜細胞を取り除き、粘膜下組織の細胞群よりセルソーターにより肥満細胞のみを分取することに成功した。この肥満細胞を用いてcDNAライブラリーを作製し、現在酵母ツーハイブリッドシステムにより、SEAと高親和性を示す糖タンパク質の同定を行っている。3.阻害剤を用いたin vivo, ex vivoでの実験により個体レベルの嘔吐メカニズムは明らかとなった。すなわち、SEAにより消化管肥満細胞が脱顆粒を起こし、放出されたヒスタミンが迷走神経を刺激することで嘔吐中枢へと伝わり、嘔吐反射を惹起する。また、この迷走神経での伝達にセロトニンも関与している。肥満細胞上のSEAと高親和性を示す分子の同定に難航している。本分子が同定されたのち、研究計画の最終段階に進むことができる。嘔吐シグナル伝達機構の解析実験が順調に進展しているため、この実験系を前倒しして実施ながら受容体の同定および活性部位の特定を進める。現在SEA受容体として複数のサイズの候補タンパク質があるが、肥満細胞上に存在するタンパク質を収集するために以下の実験を準備している。マーモセット腸管からコラゲナーゼ等を用いて細胞を分離し、セルソーターを用いて肥満細胞だけを分取し、この細胞を用いてタンパク質の解析やmRNAの解析を行う。
脳腫瘍特異的血管内皮成長因子(VEGF)の解析と血管新生阻害剤の治療応用

我々は、U373MG(神経膠芽腫細胞株)が小さなVEGFmRNA(1.0,0.8kb)を発現していることをNorthern blot analysisにて確認し、このU373MGから分離したmRNAをPrimer extension analysisのtemplateとして用いた。Primerとしては翻訳開始点から上流の三カ所に対応する21merのspecific primer三本(Pl:+1-+30,P2:-359--389,P3:-786--816)を合成し使用した。各々についてPrimer extension analysisを行ったところ、U373MGにおけるVEGFの転写開始点は翻訳開始点から-490bp上流に存在していた。従来の報告では転写開始点は-1.039kbとされているが下流にも転写開始点が存在することになる。この転写開始点からmRNAが転写されるとcoding regioinは保存されたまま小さなVEGFmRNAができることが判明した。VEGF遺伝子の5'non-coding regioinはGC sequenceが数多く存在する。このGC rich portionは他の成長因子(bFGF,TGFb)でも認められ、その機能としてはtranslational controlに関わっていると考えられてる。この結果から、ある種の腫瘍細胞では小さなVEGFmRNAを転写することで従来の大きさのVEGFmRNAからのVEGF蛋白の合成とは何らかの違いを生じている可能性が示された。今後我々は、このmRNAレベルと蛋白レベルの発現に関して解析を加えてゆく予定である。
重力波検出器の量子力学的検出限界に関する理論的研究

不確定性原理と測定の量子限界の関係に関する極めて厳密な考察を行ない,次の結果を得た。1.測定値の二乗平均平方根誤差を精度と定義し,非可換な物理量の同時測定の際の精度の積に関する不確定性関係をRobertsonの不確定性原理から証明した。2.一般の連続測定に対する標準量子限界が成立するための厳密な条件を得た。そのために,測定後の状態に由来する二乗平均平方根誤差を分解能と定義し、測定器が精度より良い分解能をもつとき,Robertsonの不確定性原理から標準量子限界が証明されることが示された。3.この証明のために,量子力学的測定の従来の誤差評価の不備を明らかにし,精度と分解能という2種の厳密な評価に基く推定理論の原理を確立した。4.従来の量子非破壊測定の理論では,QND観測量でない限り量子非破壊測定が不可能であると主張されていたが,これらの成果により,非QND観測量を分解能より精度が高い測定器で測定した場合に量子非破壊測定が可能であることが,理論的に明らかにされた。従って,干渉計型検出器に対しても,装置の原理的改良により量子非破壊測定を行ない得ることになり,今後の研究が期待される。5.従来から,加法的保存量と交換しない物理量は正確に測定できないことが厳密な証明なしに主張されてきた。これに対して,モデルの考察により,運動量の保存則にもかかわらず,位置の測定を運動量の測定と同程度の精度で行なえることを示した。また,この主張の完全に厳密な形の定量的限界をRobertsonの不確定性原理に帰着させて証明することに成功した。この結果は,特に,以前,柳瀬が求めた大ピン測定の限界に関する評価をも改良するものである。
土壌生態系の解剖学的解析ツールとしての人工土壌の開発

土壌は、鉱物・イオンなどの無機物、植物遺体・腐植などの有機物、微生物を含む生物から構成される複雑系である。本研究では、「土壌とは何か?」という問いに答えるためのツールとして人工土壌の開発を行なった。水田土壌の各土壌構成要素を抽出し、それを再構成することで作成した人工土壌の嫌気的有機物分解活性を測定し、各種構成要素の影響を解析した。その結果、腐植物質が人工土壌の活性を大きく左右することが明らかとなった。最終的にもとの土壌に匹敵する人工土壌の開発に成功し、今後様々な土壌機能の解析に利用できる人工土壌の「レシピ」を確立できた。土壌は、有機物、無機物、生物から構成される複雑系であり、自然状態の土壌を用いた場合、各構成要素が土壌の生化学反応や微生物活動などの土壌機能に与える影響・役割を個別に解析することは極めて困難である。本研究では、要素還元主義的アプローチに基づいて人工土壌の開発を行う。土壌の各構成要素を抽出あるいは調整した後に、様々な組み合わせでそれらを再統合し、代表的な土壌の生化学反応、微生物活性を再現できる土壌を構築する。人工土壌の開発を通じて土壌構成要素が土壌の生化学的機能に果たす役割を明らかにするとともに、人工土壌を用いた研究アプローチの可能性と限界を提示する。1年目である本年度は、黄色土水田の作土から、植物遺体、土壌フミン酸、フルボ酸、土壌鉱物の分画と解析を行なった。また、無機陽イオン、陰イオンを抽出・定量を行い、人工土壌の構成表を作成した。土壌鉱物の分画に必要な湿式分解の過程で失われる無機陽イオンは、イオウを除いて土壌全体の1%未満であった。また損失したイオウの大部分は植物遺体および腐植物質に含まれており、それらを還元することで補充できることが明らかとなった。一方、ブレンダーによる分散処理によって回収された土壌微生物は、もともとの土壌に生息する微生物の0.1%未満であることが示された。また、DGGE解析の結果から回収された土壌微生物の群集構造も元の土壌とは異なっており、土壌粒子に強く結合した微生物を定量的に回収するのは極めて困難であった。そこで、土壌微生物以外の構成要素を合わせた人工土壌に、微生物源として全体の0.1%となるように土壌懸濁液を加え、稲わら粉末を加えて嫌気的に培養した。その結果、人工土壌は同様の条件で培養したオリジナル土壌の80%程度の二酸化炭素発生を再現することができたが、メタンの生成はオリジナル土壌の50%以下にとどまった。1年目に土壌構成要素の解析結果を元に作成した人工土壌は、同様の条件で培養したオリジナル土壌の80%程度の二酸化炭素発生を再現することができたが、メタンの生成はオリジナル土壌の50%以下にとどまった。同じ人工土壌を一旦風乾後再度培養すると微生物活性の著しい上昇が認められ、当初作成した人工土壌が潜在的な活性を有することが明らかとなった。各土壌構成要素の影響を検討したところ、腐植物質(フルボ酸・フミン酸)が微生物活性を低く抑えていることが示唆された。腐植物質の調製法を改良し、調製した腐植物質を土壌に添加後一定時間の後に微生物源(土壌懸濁液)を接種し培養することで、二酸化炭素発生、メタン生成ともにオリジナル土壌に匹敵する活性が認められた。このことから腐植物質の性状と土壌での存在状態が微生物活性に重要な影響を与えることが示唆された。培養後の土壌の真正細菌群集をPCR-DGGE法で解析したところ、人工土壌は元の土壌より単純な群集構造を持つこと、腐植物質が人工土壌の細菌群集の多様性に寄与している可能性があることが示された。2年目に確立したオリジナル土壌に匹敵するメタン生成活性を示した人工土壌に形成された微生物群集構造を、16SrRNA遺伝子をターゲットにしたアンプリコンシークエンスによって解析した。α多様性はオリジナル土壌に比べて著しく低く、メタン生成機能を果たすために必要となる微生物はすべての土壌微生物のうちのわずかなメンバーで構成されうることが示された。また、腐植物質の有無によって、鉄還元菌やメタン生成古細菌の存在比および構成比が異なっており、人工土壌の環境に応じて異なる微生物群がメタン生成という同一の機能を果たすことが示された。

土壌構成要素が人工土壌の微生物活性に及ぼす影響をさらに詳細に検討した。微生物源として用いる土壌は、前培養を経なくとも十分な機能を有することが明らかとなり、安定的な微生物源の確保が可能となった。腐植物質のうち、フルボ酸が特に微生物活性に大きな影響を与えており、調整の際のpHが重要な要因であることが明らかとなった。フルボ酸の低pHは微生物に直接影響する可能性と人工土壌に含まれるアルミニウムの可溶化による間接的な影響が想定された。また、人工土壌に粘土(モンモリロナイト)を添加することで有機物分解活性は著しく抑制された。土壌は、鉱物・イオンなどの無機物、植物遺体・腐植などの有機物、微生物を含む生物から構成される複雑系である。本研究では、「土壌とは何か?」という問いに答えるためのツールとして人工土壌の開発を行なった。水田土壌の各土壌構成要素を抽出し、それを再構成することで作成した人工土壌の嫌気的有機物分解活性を測定し、各種構成要素の影響を解析した。その結果、腐植物質が人工土壌の活性を大きく左右することが明らかとなった。最終的にもとの土壌に匹敵する人工土壌の開発に成功し、今後様々な土壌機能の解析に利用できる人工土壌の「レシピ」を確立できた。2年目となる本年度は、人工土壌の微生物活性が低い要因として腐植物質の影響が明らかになり、微生物活性を向上させるための腐植物質の調製法や添加方法が確立できた。また、炭酸ガス発生、メタン生成ともにもともとの土壌に匹敵する土壌の作成に成功し、人工土壌の開発にとって有益な情報を得ることが出来た。一方で、年度当初予定した、特徴の異なる土壌間での土壌構成要素の影響に関する比較解析や、微生物群集の詳細な解析を進めるまでには至らなかった。土壌微生物学昨年度までの結果から、腐植物質の有無やその添加方法によって人工土壌中の微生物の活性と細菌群集が変化することが明らかとなった。本年度は安定同位体標識した植物体試料を用いて腐植添加が土壌の有機物分解に及ぼす直接的、間接的影響を明確化するとともに、微生物群集の詳細な解析を進め、土壌構成要素としての腐植物質の影響を明らかにする。加えて、他の構成要素の影響についても同様の解析を進める。また、水田において特徴的かつ重要なメタンの動態のうち、メタン酸化反応に焦点をあて、メタン酸化細菌の水田土壌における生態解明のための人工土壌の有用性を検証する。当初計画では初年度は土壌の分析と各要素の分離、分画が達成目標であったが、最終的に有機物の嫌気的な分解活性を測定することができ、炭酸ガス発生という点ではもともとの土壌に匹敵する人工土壌が作成できたことで、今後の更なる進展が期待される。一方で、供試した土壌は1種類だけであったので、特徴の異なる土壌について今後検討を進める必要がある。昨年度までに計画していた安定同位体標識化合物を用いた培養実験や次世代シークエンサーを用いた微生物群集の詳細な解析を遂行するに至らなかった。本研究の推進にあたり、初年度において最も律速となったのが、土壌腐植(フミン酸、フルボ酸)の抽出、精製であった。そのため、培養に供試できた人工土壌は20g以下であり、今後土壌腐植を大量に抽出することで、土壌構成要素の影響を解析するための条件を整えていく。
話し言葉コーパスに基づく言語変異現象の定量的分析

当初の計画に従って、研究期間の前半ではデータの整備をおこなった。具体的には以下のデータを新規に生成した。また既存のデータのエラー修正も実施した。1.『日本語話し言葉コーパス』コア部分(約44万語)について、韻律情報その他をアクセント句単位に再編成した韻律研究用XMLデータを設計し、作成した(担当:菊池)。2.『日本語話し言葉コーパス』の異なり語(約4万語)に対して、和語、漢語、外来語等の語種情報を付与した(小椋)。3.『日本語話し言葉コーパス』からガ行鼻濁音を含みうる語を文脈とともに切り出した鼻濁音研究用データベースを作成した(前川・日比谷)。4.『日本語話し言葉コーパス』全体(約752万語)を対照として、語形の変異現象を包括的に記録した語形変異研究用RDBを整備した(前川)。これらのデータを利用して、『日本語話し言葉コーパス』に記録された各種の言語変異現象の研究を実施した。具体的には以下の現象を分析した。1.母音の無声化(前川・菊池)2.母音の非語彙的延長(伝)3.助詞の撥音化(小磯)4.ガ行鼻濁音(日比谷)5.語形変異(前川)6.アクセント句末イントネーションのうち上昇調の変異(前川・菊池)7.文末の文体的特徴(小椋)研究成果は国際学会を含む各種学会で報告した他、3年分の成果をまとめた報告書(252頁)を刊行した当初の計画に従って、研究期間の前半ではデータの整備をおこなった。1.母音の無声化(前川・菊池)2.母音の非語彙的延長(伝)3.助詞の撥音化(小磯)4.ガ行鼻濁音(日比谷)5.語形変異(前川)6.アクセント句末イントネーションのうち上昇調の変異(前川・菊池)7.文末の文体的特徴(小椋)研究成果は国際学会を含む各種学会で報告した他、3年分の成果をまとめた報告書(252頁)を刊行した当初の予定どおり、本年度は主として研究方データの整備を実施した。また、これと並行して一部予備的なデータ解析を実施した。データ整備の内訳を以下に示す。1)『日本語話し言葉コーパス』短単位形態論データのRDB(リレーショナル・データベース)化(752万語分)。2)『日本語話し言葉コーパス』発音形に(W)タグが付されたケースを解析し、RDBによる検索を可能とした(45万語分)。3)韻律研究用XMLデータの派生(160講演分)。4)短単位に対する語種(和語、漢語、外来語など)データ(17500語分)5)ガ行鼻濁音データの聞き取り(30万語分)。6)MSExcel環境での音声再生ソフト開発。予備的データ解析は、上記1),2),5)について行い、その一部を論文として公開した。平成16年度に実施した『日本語話し言葉コーパス』から変異現象研究用の各種データを派生させる作業を継続するとともに、派生させた研究用データを用いて変異現象の分析をすすめた。今年度の代表的成果としては、現代日本語の話し言葉における語形変異の全体像を把握するための研究が挙げられる。これは『日本語話し言葉コーパス』の短単位752万語全体を対象とした語形変異の調査であり、従来の各種国語辞典では(発音アクセント辞典の類を含めても)きわめて不十分にしか提供されてこなかった日本語の語形のゆれに関する調査として画期的な性格をもつものである。調査の結果は、1)自発的な講演ほど語形の変異率が高いが、変異率は朗読音声でもゼロとはならないこと、2)コーパスに含まれる語形変異の77%は変異率が高く同時に頻度も高い語彙20項目程度によってもたらされていること、3)多くの変異形が存在する語形であっても、頻度の高い変異形を上位から3語まで示せば変異の少なくとも90%以上、多くの場合に99%以上がカバーされることなどを確認した。さらに変異率の高い数十語について変異の言語的ないし社会的要因に関する個別的分析も実施した。この調査研究の成果は、平成17年夏に英国バーミンガム大学で開催されたコーパス言語学の国際学会(Corpus Linguistics Conference)にて口頭発表した。その他にも種々の変異現象を個別に分析した結果を各種学会で口頭発表しているが、紹介は省略する。

本研究の目的は大規模な自発音声コーパスである『日本語話し言葉コーパス』を用いて、そこに記録されている大量かつ多様な言語変異減少を多角的かつ定量的に研究することであった。メンバーの役割分担は以下のとおりであった。前川研究の総括、音声、語彙、韻律レベルの変異の分析小磯助詞の擬音化の分析小椋語種データの生成と分析菊池韻律研究用XMLデータの生成と分析伝母音の非語彙的延長の分析日比谷ガ行鼻音データの分析研究の前半ではデータ整備作業を実施した。小椋は語種構成の変動を研究するために、『日本語話し言葉コーパス』に対して語種(和語、漢語、外来語など)情報を付与する作業を実施した。菊池は韻律現象(イントネーションなど)研究用に特化した新しいXML文書を設計し、生成した。前川は『日本語話し言葉コーパス』に記録されたすべての語彙を対象とした語形変化の全体像を把握するために、『日本語話し言葉コーパス』の全短単位データについて語形のゆれの有無とその特徴を記述したデータベースを生成した。後半では『日本語話し言葉コーパス』と新規に生成したデータを用いて実際に言語変異現象を解析した。従来の研究でとりあげられてきた言語変異現象の大部分は音声・音韻もしくは語形の変異であったが、本研究では、CSJの特徴を活かして韻律現象の変異もとりあげた。韻律現象のうち語彙アクセントは従来から研究対象となってきているが、イントネーションがとりあげられたことは稀である。またいわゆる非流暢性(disfluency)に属する現象、すなわち母音の非語彙的な引き伸ばしやフィラーの変異が研究されることは、少なくとも日本語においては従来稀であった。
ゲノム情報解析によるエイズ病態制御因子の解明

本研究はゲノム多型解析などゲノム情報解析技術を用いて、HIV-1感染感受性やエイズ病態進行等の個人差を決定する宿主因子を解明し、エイズ制御のための新たな治療標的を見出すとともに、個人差に対応した緻密で適切な予後診断および治療指針の策定を目指す。現在までにHIV-1感染者ならびに非感染者のゲノム多型を検討し、以下の知見を得た。1.HIV-1の主要なコレセプターCCR5のアジア人特異的欠失変異893(-)を持つCCR5は、粗面小胞体から先への細胞表面への輸送効率良く進行せず、HIV-1感染効率が低下することを見出した。2.CCR2の64番目のアミノ酸がバリンからイソロイシンに置換した多型CCR2641のホモ接合がHIV-1に繰り返し暴露されながらも感染を免れているアジアの人々の中に濃縮されていること、64番目がイソロイシンに置換したCCR2のスプライスバリアントの一つCCR2A 64Iは、バリンのものより細胞内での安定性が向上し、HIV-1の主要なコレセプターCCR5の細胞表面発現を阻害することにより感染抵抗性に寄与すること、を見出した。3.IL-4はCCR5の発現を低下させる。IL-4の転写を上昇させるプロモーター内の多型IL-4-5897がフランス人HIV-1感染者集団においてエイズ発症の遅延と相関すること、欧米人とはIL-4-5897の頻度が大きく異なるタイにおいてもこの多型がHIV-1感染者の未治療期間における死亡率を低下させること、を見出した。4.CCR5の生理的リガンドRANTES(CCL5)はCCR5に結合してHIV-1の細胞侵入を阻害する。RANTESのプロモーター部の多型RANTES-28は、RANTESの転写量を上昇させる。この多型がタイにおいてやはりHIV-1感染者の未治療期間における死亡率を低下させることを見出した。欧米人では、ケモカインレセプターCCR2Bの64番目のアミノ酸がバリン(V)からイソロイシン(I)に置換した多型CCR2B 64Iが、約10%の頻度で認められる(ホモ接合体の頻度は1%)。これらの地域のコホート研究においては、この多型を持つHIV-1感染者ではAIDS発症が遅延することが報告されている。また、HIV-1感染者と非感染者で比較するとこの多型の頻度には差がないことから、この多型はCCR5delta32とは異なり、HIV-1感染成立には影響しないと考えられていた。我々は、日本人HIV-1感染者423名と非感染者288名のCCR2 64Iの頻度を検討した。その結果、感染者ではこの多型のホモ接合体の頻度は6.6%であるのに対し非感染者では11.8%に達し、感染者においてはこの多型のホモ接合体の頻度が有意に少ないことが明らかになった。従って、アジア人ではCCR2B 64Iのホモ接合体がHIV-1感染抵抗性とも関連する可能性が考えられる。CCR2B 64Iは、上記の疫学的研究からエイズ病態に影響することは明らかだが、その分子機構は明らかではない。CCR2Bの64番目のアミノ酸をVからIに置換してもHIV-1コレセプター活性もケモカインレセプター活性も変化しない。我々はCCR2遺伝子からalternative splicingによって産生され、C末端の細胞質内領域のみCCR2Bと異なり、主に細胞質に局在するCCR2Aに着目した。CCR2Aを発現させたところ、VのCCR2AよりIのCCR2Aの方が細胞内でより安定であった。

CCR5と共発現させたところどちらのCCR2AもCCR5とヘテロオリゴマーを形成したが、IのCCR2Aの方がVのCCR2AよりもCCR5の細胞表面発現を強く阻害した。従って、VからIに置換すると細胞質内でCCR2Aの安定性が増し、細胞表面に向かおうとするCCR5との間でヘテロオリゴマーが形成されてCCR5の細胞表面発現が低下するものと考えられる。HIV-1は宿主域が狭く人以外に感染する動物はチンパンジーのみで、アフリカミドリザル等の旧世界ザルには感染しない。従って感染予防ワクチンの有効性を実験的に検定することが大変難しく、ワクチン開発の大きな障害となっている。HIV-1はレセプターCD4とコレセプターCCR5あるいはCXCR4が存在しても旧世界サルの細胞には感染できず、水疱性口内炎ウイルスの外被膜糖蛋白質(VSV-G)を用いて細胞侵入をさせてもそれ以降の過程が効率良く進行しない。旧世界サルの細胞にはHIV-1の細胞侵入直後の過程を阻害する因子が少量存在するものと考えられている。そこで旧世界ザルの細胞に存在するHIV-1感染抵抗性因子の同定を試みた。旧世界ザルよりもさらにヒトから遠いハムスター由来TK-TS13細胞にVSV-Gを用いてHIV-1を感染させた場合には阻害は観察されず、少なくともウイルス遺伝子の発現までは進行する。そこで、アフリカミドリザル細胞の全ゲノムDNAを、チミジンキナーゼ活性陰性のTK-TS13細胞に導入し、その後チミジンキナーゼ遺伝子を発現するHIV-1をVSV-Gで感染させ、BudR存在下で感染を免れた細胞を選別した。そして、生き残った細胞株にGFPを発現するHIV-1(HIV-1/GFP)をVSV-Gで感染させ、感染抵抗性を獲得したか否かを検討した。その結果、一部のBudR耐性細胞ではHIV-1/GFPの感染効率も低下していた。旧世界サル細胞をサイクロスポリンAで処理するとHIV-1感染感受性が回復することが最近報告されたが、今回得られたHIV-1/GFP感染感受性の低下した細胞をサイクロスポリンAで処理すると、旧世界ザル細胞と同様に、HIV-1/GFPの感染感受性が回復した。以上の結果から、サル細胞の持つHIV-1感染抵抗性をDNAトランスフェクションによりハムスターの細胞に付与できたことが示唆された。本研究は、網羅的なゲノム多型解析(ゲノムワイドスキャン)により、HIV-1感染感受性やエイズ発症の個人差に関わる宿主因子を解明し、HIV-1感染阻止ならびにエイズ発症阻止のための新たな治療標的を見い出し、個人差に対応した緻密で適切な予後診断および治療指針の策定を目指す。本年度は約100名のHIV-1感染者についてDNAチップを利用したゲノムワイドスキャンを行ってHIV感染症との関わりが明らかなものからHIV感染症との関連が全く不明なものまで一万箇所以上の一塩基多型を網羅的に検討し、病態進行速度と関連する可能性の高い10個の候補遺伝子多型を見出した。現在、より多数のHIV-1感染者集団においてこれら候補遺伝子多型と病態進行速度との間に相関が認められるか否かの検討を行っている。一方、HIV-1はアフリカミドリザル、カニクイザル、アカゲザル等の旧世界サルには感染せず、ワクチン開発の上で大きな障害になっている。アカゲザル、カニクイザルにはSIVmacが感染できるが、アフリカミドリザルにはHIV-1のみならずSIVmacも感染できない。
環状多鎖型界面活性剤の開発と乳化型液膜輸送への応用

乳化型液膜による物質輸送は分離速度が速いため工業化が有望視されている。多鎖型の機能性界面活性剤は,機械的強度の強い乳化液膜(W/O/W型の乳化液)を形成し,輸送のキャリアーとしても機能することが期待された。そこで,レゾルシン系カリックス[4]アレン,コンプレキサン類,大環状ポリミンに,34本のアルキル鎖を導入した環状多鎖型の機能性界面活性剤を合成し,Cs^+,Cu^<2+>,あるいはアニオン種の乳化型液膜輸送へ応用した。環状4本アルキル鎖のレゾルシン系カリックス[4]アレンは,レゾルシノールに長鎖脂肪族のアルデヒトを作用させて合成した。直鎖状および環状多鎖型コンプレキサンは,エチレンジアミン,ジエチレントリアミン,あるいはシクラム(1,4,8,11-テトラアザシクロテトラデカン)に,2-ブロモドデカン酸を反応させ,また環状多鎖型ポリミンは,シクラムにハロゲン化アルカンを作用させて合成した。これら34本鎖の環状多鎖型界面活性剤はトルエンに対して乳化能を示し,安定なW/O/W型の乳化液膜になった。環状4本アルキル鎖のカリックス[4]アレンによりCs^+の輸送を試みたところ,アルキル鎖長C_6では単独・少量でも811分/回の割合でターンオーバーして,外部水相中のCs^+を内部水相へ連続的に輸送することができた。多鎖型コンプレキサンによる輸送でも,23鎖型にすることにより安定なW/O/W乳化液膜が長時間安定に保たれ,Cu^<2+>を712分/回の割合で連続輸送することができた。また,環状多鎖型ポリアミンは,ピクリン酸,Br^-などアニオン種の乳化型液膜輸送剤として機能した。多鎖型の機能性界面活性剤は,機械的強度の強い乳化液膜(W_1/O/W_2型の乳化液)を形成し,輸送のキャリアーとしても機能することが期待される。そこで,レゾルシン系カリックス[4]アレンあるいはコンプレキサン類に34本のアルキル鎖を導入した環状多鎖型の機能性界面活性剤を開発し,Cs^+Cu^<2+>の乳化型液膜輸送へ応用した。環状4本アルキル鎖のレゾルジン系カリックス[4]アレン1は,レゾルシノールにアルキル鎖長C_1,C_5,C_7,C_<11>の脂肪族アルデヒトを作用させて合成した。2本のアルキル鎖を持ったジアミノジカルボン酸(コンプレキサン)2は,エチレンジアミンに2倍モルの2-ブロモドデカン酸を反応させ,また3本アルキル鎖のコンプレキサン3は,ジエチレントリアミンに2倍モルの2-ブロモドデカン酸と等モルの1-ブロモドデカンを反応させて合成した。なお,環状4本鎖のコンプレキサンは,シクラム(1,4,8,11-テトラアザシクロテトラデカン)に4倍モルの2-ブロモドデカン酸を反応させて現在合成中である。1,2,3はトルエンに対してW/O型の乳化能を示し,34本鎖では特に安定な乳化型液膜になった。Cs^+輸送を1により試みたところ,アルキル鎖長C_1,C_7,C_<11>では連続輸送を示さなかったが,鎖長C_5の1は少量でもターンオーバーして外水相のCs^+を内水相に連続的に輸送した。

Cs^+輸送の成果は,エマルション・サスペンションに関する特別討論会,2B14(1994.7.21,日本化学会講堂)で発表し,現在論文を投稿中である。多鎖型コンプレキサンによるCu^<2+>の輸送では,2で調製した液膜が破壊しやすいのに対して,3本鎖の3で調製した液膜は長時間安定に保たれ,Cu^<2+>を連続的に輸送することができた。この成果は日本化学会第69春季年会,2P53(1995.3.27,京都)で発表する。乳化型液膜による物質輸送は分離速度が速いが,安定な液膜の開発が工業化への条件になる。多鎖型の機能性界面活性剤は,機械的強度の強い乳化液膜(W/O/W型の乳化液)を形成し、輸送のキャリアーとしても機能することが期待される。昨年度のレゾルシン系カリックス[4]アレンによるCs^+の乳化型液膜輸送へ応用に続いて,今年度はコンプレキサン類と大環状ポリミンに24本のアルキル鎖を導入して,Cu^<2+>あるいはアニオン種の乳化型液膜輸送への応用を中心に検討した。直鎖状および環状多鎖型コンプレキサンは,エチレンジアミン,ジエチレントリアミン,あるいはシクラム(1、4,8,11-テトラアザシクロテトラデカン)に,2-ブロモドデカン酸を反応させ,また環状多鎖型ポリミンは,シクラムにハロゲン化アルカンを作用させて合成した。これら24本鎖の環状多鎖型界面活性剤はトルエンに対して乳化能を示し,安定なW/O/W型の乳化液膜になった。多鎖型コンプレキサンによる輸送では,金属イオンにCu^<2+>を用いた。コンプレキサン系でも,アルキル鎖長16以上の2鎖型あるいは3鎖型にすることにより単独・少量の使用で安定なW/O/W乳化液膜が得られ,外部水相中のCu^<2+>を712分/回の割合で内部水相へ連続輸送することができた。また,環状および直鎖状多鎖型ポリアミンは,ピクリン酸,Br^-などアニオン種の乳化型液膜輸送剤として機能した。
in vitro 全茎切断およびフェノール代謝制御による植物の再分化促進

組織培養法は、植物研究や育種に有効な技術であるが、多くの植物種において未確立または不安定である。そこで、効率的で安定的な新しい組織培養法として試験管の中の植物を子葉の下で切断するin vitro全茎切断法を開発した。窒素欠乏条件で育成した植物体を全茎切断し、褐変を抑制する物質(AOPP)を含む培地に移植すると、更に増殖効率が高くなることが分かった。これらの成果は、多くの植物種の組織培養において再分化を効率的で安定的なものにする可能性を示している。遺伝子組み換えは、地球の温暖化や飢餓に対処できる技術として、世界的に導入が進んでいる。しかし、モデル植物や一部の植物を除くと効率的な再分化法がなくて困っているのも現状である。当研究では、煩雑な植物成長調節剤の組み合わせが不要な再分化法である全茎切断法の組織培養への応用と、フェノール代謝阻害物質AOPPの培地への添加を行って再分化効率を向上させようとした。その結果、トマトでは、in vitro全茎切断によってリーフディスク法よりも高い再分化効率が得られた(未発表)。また、in vivoでは、全茎切断した茎切断面を暗黒処理すると、フェノール代謝が抑制されて再分化が促進されることが分かった(下記の2011年論文)。そこで、in vitro全茎切断法とAOPPの培地への添加を組み合わせたところ、再分化効率が更に向上することも明らかになった(未発表)。一方フウランでは、培地へのAOPP添加が褐変を抑制して再分化効率を向上させた(下記の2010年論文)。植物の遺伝子組み換えは、組織培養による再分化系の確立が大前提であるにも係わらず、多くの植物種において未確立または不安定である。そこで、圃場レベルで不定芽形成効果の高いことが証明されている全茎切断法(すべての茎頂の切除により茎切断面に不定芽を形成させる。)と切断面の褐変抑制に有効なAOPP(L-2-アミノオキシ-3-フェニルプロピオン酸)処理を組織培養に適用して安定的で高い効率の再分化系を開発する。23年度は、トマトのin vitro全茎切断においてAOPP処理による不定芽形成の促進効果を調べた。その結果0.01mMのAOPPを培地に加えると、増殖および不定下形成の効率が上がることが明らかになった。ナスでは、従来の胚軸培養とin vivo全茎切断のシュート形成効率を比較した。不定芽形成数は、胚軸培養で3.1個に対して、in vivo全茎切断では10.3個、シュート形成数は、胚軸培養で2.4本に対して、in vitro全茎切断では8.1本となり、増殖効率が著しく改善された。さらに胚軸培養において、培地のAOPP濃度を0.01mMにすると、対照(0mM)の2.3倍の増殖効率になることが明らかになった。一方、組織培養による不定芽形成が極めて困難なソバについては、24年度の実験計画を前倒しで実施した。胚軸の切断位置、暗黒(褐変物質濃度低下)、低窒素(サイトカイニン濃度上昇)、AOPP(フェノール代謝抑制)、硝酸銀処理(エチレン生成防止)などの処理を試みたが、全ての処理でカルスおよび不定芽形成促進効果は認められなかった。植物の遺伝子組み換えは、組織培養による再分化系の確立が前提であるにもかかわらず、多くの植物種において未確立または不安定である。そこで、圃場のトマトでは全茎切断(すべての茎頂の切除)により茎切断面に不定芽が多数形成されることに着目し、これらの組織培養への適用法を検討した。ナス4品種を用い、in vitro全茎切断(下胚軸で切断)おける再分化の品種比較を行った。その結果、`紫水'、`千両二号'および`黒曜'の不定芽形成率は100%だったのに対し、`庄屋大長'では80%だった。切断6週後におけるシュート形成数は`紫水'が最も多く、続いて`千両二号'、`黒陽'そして`庄屋大長'となり、それぞれ8.1、7.6、5.8および3.4本であった。シュートの発根率は、全品種で100%であった。したがって、in vitro全茎切断は、再分化率に品種間差異があるものの、採取したシュートは全て発根することが明らかになった。根におけるサイトカイニンの生合成は、土壌中の窒素が十分であると制御される(Takeiら,2002)ので、培地の窒素欠乏によって不定芽形成を促進できるか検討した。MS培地(以後、N充分培地)と窒素成分のみ47%に減少させたMS培地(以後,N欠乏培地)にナス`紫水'を無菌播種し、3週間後に全茎切断して両培地に移植した。不定芽形成数は、N欠乏→N

充分区が最も多く、1個体当たり20.5個、続いてN充分→N充分区、N欠乏→N欠乏区、N充分→N欠乏区の順となり、それぞれ13.7,8.4,0個であった。1 cmに達したシュートは、N欠乏→N充分区で最も多く、形成時期も2週間早かった。カボチャでは、全茎切断による不定芽形成は認められなかったが、N欠乏→N充分によって不定芽が形成が(20%)された。したがって、全茎切断前の窒素欠乏処理は不定芽形成を促進することが明らかになった。研究室に所属する学生の多くがこの研究課題を実施しており、エフォートの割合が高いことにより、ほぼ予定通り進行している。24年度が最終年度であるため、記入しない。ナスのin vivo全茎切断におけるAOPP添加の効果を明らかにするとともに、全茎切断による不定芽形成促進のメカニズムを解明する。前倒しで研究を実施したソバは、効果が全く認められなかったので、その場合の当初計画通りに、研究対象を全茎切断による不定芽促進がやや困難なウリ科植物やかなり困難なピーマンに変更し、解明した不定芽促進メカニズムの応用を試みる。
関節軟骨組織の発生・再生機序における転写因子KLF4の機能解明

本研究は、変形性膝関節症(OA)の臨床トランスクリプトームデータをもとに抽出されたKLF4の機能と治療標的分子としての可能性について検討することを目的としている。申請時までにKLFファミリーの中でKLF4において強い軟骨基質発現調節機能が認められること、軟骨の分化に伴いKLF4の発現が上昇すること、OA変化に伴いKLF4の発現が減少することを明らかにしていた。初年度はコンディショナルKOマウスの作成と軟骨組織をもちいたRNAシーケンス解析を行い、KLF4が標的とする軟骨基質遺伝子の発現低下を確認した。また、NET-CAGEシーケンスにより、KLF4が標的遺伝子のプロモーターならびにエンハンサーと思われる領域に結合することを明らかにした。2年目には、コンディショナルTGマウスを作成し、OA変化を生じさせた後にタモキシフェン(Tmx)による治療を試みた。組織学的解析により、Tmx投与群でOARSIスコアの低下が認められ、KLF4が治療分子として有望であることが明らかになった。ノックアウトマウスでの解析、NET-CAGEを用いた解析、トランスジェニックマウスを用いたDMMモデルでの解析など、当初の計画どおり進んでいる。NET-CAGEの結果から、エンハンサーへの新規の結合が認められなかったため、3C解析については見送ることとした。トランスジェニックマウスを用いたKLF4によるOA組織の治癒について丁寧に検証する。同実験の結果をもって、KLF4の機能解明実験は概ね終了するため、論文化を進める予定である。本研究では、変形性関節症(OA)において変性した軟骨を治療するための標的分子として転写因子KLF4に着目し、その機能を明らかにすることを目的にしている。研究開始に先立ち実施したスクリーニングにより、1) OA軟骨組織ではKLF4の発現が失われること、2)正常な軟骨の発生に伴い、KLF4の発現が上昇すること、3)KLF4の発現は軟骨基質遺伝子の発現を上昇させることの3点を発見した。本年度には、KLF4による転写調節の機序および標的遺伝子を明らかにする目的でCAGE-sequenceを行い、KLF4によって活性化されるプロモーター、エンハンサーを複数見出した。Col2A1、Aggrecanなどは推定エンハンサー領域においても活性化を示すシグナルが見られたことから、KLF4による新たな転写活性化メカニズムの提案に結びつく可能性がある。また、生体内におけるKLF4の機能を明らかにするため、コンディショナルノックアウトマウスの解析とCol2A1-Cre/GFP→KLF4ERトランスジェニックマウスの作成を行った。コンディショナルノックアウトマウスの軟骨組織では一部の軟骨基質遺伝子に発現量の低下が認められ、in vitro実験の結果と一致した。トランスジェニックマウスについても現在、作成と解析を進めている。トランスジェニックマウスがうまく作動しないなど問題はあるが、代替の実験も準備中であり、当初目的は達成可能であると考えている。引き続きin vitroでの機能解析を進める。また、ノックアウトマウスの解析も進め、CAGE-seqの結果と照らし合わせKlf4の標的遺伝子を網羅的に明らかにしていく。トランスジェニックマウスについては再作成を計画しているが、平行してウイルスやRNAトランスフェクションなど代替手段も検討を進める予定である。当該研究は3カ年で実施する事業であり、特に2年目、3年目には多くの分析を実施するためその費用として計上している。当該研究は3カ年で実施する事案であり、3年目に多くの分析を実施する予定のためその費用として計上している。
中枢神経による心臓メモリーの修飾とそのメカニズムの解明

1.パッチクランプ法を用いた検討現在,ラットおよびウサギ脳のスライス切片を作成し,海馬のCA1領域からneuronを単離し,その電気生理学的性質を検討中である。特に心臓メモリーに関与していると考えられる化学伝達物質に対する反応性を重点的に検討している。2.生体位心を用いた検討生体位心の電気現象(心電図および単相性活動電位)および血行動態(動脈圧および左室内圧)をモニタリングしながら,中枢神経を電気的および薬理的に刺激する方法を確立した。すなわち家兎の開頭,脳定位固定を電気生理学検査時に併せて行い,種々の部位から電気刺激を加え,心臓電気現象および血行動態に与える効果を検討している。また,心臓メモリーに関与していると考えられる化学伝達物質の脳室内投与が可能となったため,現在これらの薬剤の脳室内投与の効果を検討中である。さらに,これらの方法によって中枢神経を刺激した動物の,心臓のイオンチャネルおよびその情報伝達系に関与する蛋白の遺伝子レベルでの変化を,ノーザンブロット法により定量評価している。以上,1.2.の検討より,心臓メモリーと中枢神経の関連が明らかになりつつある。1.平成10年度は家兎において、頸部を露出させ自律神経を刺激する方法を確立した。これは自律神経系の刺激が、心臓にどのような影響を及ぼすかを解析するために必須の技術である。特に頸部の迷走神経刺激と、交感神経星状神経節刺激が実現可能なモデルを作成できないと実験が出来ない。刺激は原則として電気刺激を用いた。その結果、セシウム誘発性の心室性不整脈を自律神経が修飾する事を明らかに出来た。即ち交感神経星状神経節刺激を5時間行った場合と2時間ではその効果は異なり、5時間刺激ではセシウムによる心室頻拍の誘発効果が減弱していた。しかし2時間刺激では減弱は認めなかった。これは一種のメモリー効果と考えられる。2.中枢神経系の中でも海馬は記憶、情動を制御する部位として知られている。上記研究課題を推進するために、単離した海馬ニューロンを用いパッチクランプ法にて循環動態への関与を検討する方法の確立を目指している。中枢神経系で、海馬の神経細胞を単離してその電気現象を解明する為に、現在ラットで海馬の神経細胞の細胞単離方法を確立しつつある。具体的には生後2週齢のWister-king ratをpentobarbital 40mg/kg腹腔内投与にて麻酔後断頭し、脳を頭蓋内より摘出後microslicerにて400μmの脳薄切片を作成する。脳薄切片は標準細胞外液にて60分間preincubate後、pronase(1mg/6ml)に31°Cにて20-30分間incubationを行う。酵素処理後標準細胞外液にてwashoutを行い、脳薄切片より海馬のCA1領域をmicro-punch outし顕微鏡下にmicroPasteur pipetteにて機械的にneuronの単離を行う。neuronがculturedishに接着後CA1 neuronの形態学的特徴を満たすpyramidal neuronを実験に供している。この神経細胞の電気現象を現在検討中であるが、今後この方法を兎に応用する事により、兎の海馬の神経細胞の電気的活動を検討する。併せて、頸部自律神経刺激下あるいは中枢神経刺激下に心臓の電気的活動を同時に記録し、cardiac memoryと中枢神経系との関連を検討する予定である。
有機トランジスターにおける有機/電極界面制御による新機能の発現

有機半導体デバイスにおいて,金属電極と有機半導体の接合界面の構造および電子状態は,デバイス特性に極めて重要な影響を与える。本研究では,金属/分子接続界面におけるキャリア注入特性に注目し、界面の制御手法の確立と新しい素子の開発を目的とする。具体的には(1)金属電極表面の構造、凹凸を制御し、キャリア注入特性との関連を明らかにし、(2)正孔・電子の注入バランスを制御して、高輝度発光型トランジスターの実現を目指す。さらに(3)スピンの注入の可能性を探り,スピントロニクスデバイスへの発展を探る,ことを目的とした。発光トランジスターに関しては,単分子層の非常に薄い膜をチャンネルとする有機トランジスターからの発光を確認し,キャリアの注入効率との関係を明らかにした。さらに,金属電極への電流注入によるプラズモンの励起とそのエネルギー移動に基づく有機分子からの発光を確認した。プラズモンの励起を利用することにより,チャンネル内に挿入した金属線や金属微粒子からの発光が観察され,新しい発光トランジスターとしての可能性を示した。有機材料へのスピン注入においては,ハーフメタル酸化物を電極、とし,有機材料を挟む構造を作製することによりスピンバルブ特性を確認した。酸化物の作製条件を最適化することにより,原子レベルで平坦な表面を作製し,スピンバルブ特性における有機層の膜厚依存性を議論することを可能にした。有機材料が厚い場合には,有機材料のP型およびN型特性を反映するスピンバルブ特性が得られることを見出した。今年度は,単分子層でチャンネルを形成する発光性有機電界効果トランジスターを作製した。有機材料としては,セクシチオフェンを用いた。適切な条件で真空蒸着すると,この有機分子は層状に成長することを原子間力顕微鏡によって確認した。電極としては,ソース電極に金を用い,ドレイン電極にアルミニウムを用いた。有機薄膜中に,ソース電極から正孔が注入され,ドレインから電子が注入されて,キャリアの再結合によりドレイン近傍での発光を観察した。薄膜の膜厚を増やすと,発光スペクトルのピーク位置がシフトし,その結果から,再結合位置とメカニズムに関して考察を行うことが可能となった。また,P型材料の上に発光体を層状に成長することにより,キャリア輸送能力の低い有機材料においても,発光強度が増強されることを見出した。エネルギー異動による発光ではなく,P型薄膜層が,正孔を発光体の近傍まで輸送することによる効率の向上によると考えられた。さらに,シリコンを電極とするトランジスターの作製も行った。SOI(silicon on insulator)を基板として,異方性エッチングにより電極を作製した。電極表面には,有機分子を化学反応により固定化し,ペンタセンなどの有機半導体を蒸着してトランジスター特性を測定した。シリコン電極に直接有機分子を蒸着したデバイスに比べ,シリコン表面を有機分子で被覆すると,注入特性が改善されることが見出された。
脊髄内歩行リズム神経回路網の発生機構の解析

研究代表者は以前の研究で、歩行運動様リズムを形成する脊髄内神経回路網に関して、GABAおよびグリシンを介した興奮性のシナプス入力がその発達期に一過性に見られることを示した。このような胎生期の脊髄におけるGABAおよびグリシンの興奮性は、細胞内Clイオンを細胞外に汲み出すK^+-Cl^- cotransporter isoform 2 (KCC2)の発現が発生初期の細胞では少ないために起こることが知られている。本研究では、発達期のGABAおよびグリシンによる興奮性を抑え、神経回路の形成におけるこれら興奮性応答の役割を明らかにすることを目的に、分子生物学的手法を用いて脊髄内ニューロンにおけるKCC2の発現レベルを変更し、発達期の神経ニューロンにおける影響を調べた。歩行運動の神経回路網が形成される時期のマウス胎児の脊髄中心管に、KCC2遺伝子を組み込んだGFP発現プラスミドベクターを子宮外から微少ガラス管を用いて注入し、エレクトロポレーションによって、分裂過程にある脊髄ニューロンにKCC2遺伝子を導入した。遺伝子導入の2日後に脊髄を摘出し、免疫染色を行ったところ、GFPを発現している細胞でKCC2の発現も同時に見られた。さらに、このようにKCC2を強制発現させたニューロンにおいて、グラミシジン穿孔パッチクランプレコーディングを行ったところ、KCC2を強制発現させたニューロンでは、GFPのみを発現させたニューロンに比べて、GABA投与時の反転電位が30mV過分極側にシフトしていた。これらのKCC2を強制的に発現させたニューロンとGFPのみを発現させたニューロンについて、細胞体の大きさ、細胞体から出ている神経突起の数および長さを比較したところ、いずれの値にも有意な差は見られなかった。そこで、脊髄ニューロンの中でも限局した細胞にのみKCC2を発現させることでより詳細な比較をするために、運動ニューロン特異的な転写因子であるHb9の下流にKCC2を醜置するプラスミドの作成を行った。本研究では、発達期のGABAおよびグリシンによる興奮性を抑え、神経回路の形成におけるこれら興奮性応答の役割を明らかにすることを目的に、分子生物学的手法を用いて脊髄内ニューロンにおけるKCC2の発現レベルを変更する手法を確立した。さらに、このようにKCC2を強制発現させたニューロンにおいて、KCC2が機能的に正常に働いているかどうかを調べるため、グラミシジン穿孔パッチクランプレコーディングを行った。その結果、KCC2を強制発現させたニューロンでは、GFPのみを発現させたニューロンに比べて、GABA投与時の反転電位が30mV過分極側にシフトしていた。これらの結果から、エレクトロポレーションによってKCC2遺伝子を導入することによって、発達過程にある脊髄ニューロンにKCC2を強制的に発現させ、そのニューロンのGABAやグリシンに対する応答を変化させることができることが示唆された。

そこで、脊髄ニューロンの中でも限局した細胞にのみKCC2を発現させることでより詳細な比較をするために、運動ニューロン特異的な転写因子であるHb9の下流にKCC2を醜置するプラスミドの作成を行った。
ヘパリン結合性上皮細胞成長因子(HB-EGF)を用いた急性尿細管性腎不全

急性尿細管性腎不全(ATRF)からの回復とその後の尿細管再構築作用に対するheparin-bindingepidermal growthfactor-like growthfactor (HB-EGF)の役割を検討した。soluble formであるmature HB-EGFは、シスプラチンにより誘導したマウスATRFに対し、recombinant HB-EGFのATRF発症後の治療的、発症前の予防的投与により、臨床血液学的、組織学的に軽減を認めた。すなわち、有意な尿素窒素やクレアチニンの抑制と尿細管上皮の脱落や壊死の軽減化が観察された。その機序として、BrdUrd uptake assayにより、障害された尿細管上皮細胞のDNA合成の促進作用が推察された。一方、mature HB-EGFの前駆体である膜結合型HB-EGF (proHB-EGF)は、ランダムに増殖した尿細管上皮細胞を、管腔構造へとリアレンジメントさせる組織構築因子として機能することが、proHB-EGF発現ラット尿細管上皮細胞(NRK)を用いた検討により明らかとなった。また、proHB-EGF発現NRKにより形成された尿細管類似構造は、apical surfaceにmicrovilliを有し、basolateralsurfaceは、平滑な面を配列する管腔構造特有の構造を呈し、かつ水チャンネルの一つであるaquaporin 2の発現を示したことから、集合管としての性質を持つことが明らかとなった。以上の成績から、HB-EGFは、mature HB-EGFによる尿細管上皮の細胞増殖刺激の促進と膜結合型HB-EGF (proHB-EGF)による形態再構築作用という2つの異なった機能によりATRFからの尿細管機能の回復に関与していることが示唆された。すなわち、以上のHB-EGFの役割は、今後の人工ネフロンの開発や尿細管障害時の尿細管機能の回復と組織再構築に対する将来の臨床応用が可能と考えられた。抗腫瘍剤であるシスプラチンの投与により、マウスに急性尿細管性腎不全(ATRF)を発症させると、正常腎組織では認められないHB-EGFの発現が、主として遠位尿細管に観察される。また、正常ラット尿細管上皮細胞由来のNRK52E細胞にrecombinant(r)・soluble(s)HB-EGFを添加すると、[3H]-thymidineの取り込みが促進され、高度なDNAの生合成が生じる。これらの成績から、HB-EGFはATRFによる尿細管障害の修復に関与する成長因子である可能性が推察される。そこで、まず我々は、シスプラチン誘導型マウスATRFモデルに対するsoluble HB-EGFの治療的および予防的効果について検討した。ATRFモデルは、BALB/cマウスに15mg/kgのシスプラチンを腹腔内投与することにより作成した。このモデルでは、シスプラチン投与後約48-72時間で、著明なATRFを発症する。予防的効果の検討は、シスプラチン投与前30分、投与後6、12、24、36、48時間に250ug/kgのrhs-HB-EGFを尾静脈より静注した。対照群は生食を同様に静注した。両群で経時的に血清BUN、クレアチニンおよび腎組織の変化について検討した。BALB/cマウスにrhs-HB-EGFを静注し、腎組織への移行の程度を検討したところ、静注後1分でHB-EGFの濃度は腎組織1g当たり290ngとピークを示し、15分後には1ng以下となり30分後には検出感度以下となり、明らかな腎組織への移行が確認された。