hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
神経損傷後のしびれはどのようにして発生するか?

末梢神経損傷によりひとたび低下した知覚はその後の回復過程において異常感覚を発生させることは多いが、その病態などについては不明な点が多い。特に顔面領域では知覚を支配しているのは三叉神経であり、構造的には脊髄領域と異なる点もあることから独自の研究が必要である。そこで、動物で三叉神経に神経損傷を生じさせて、形態学的にまたは行動学的に病態を検討した。(形態学的検討)マウスを出生直後にカプサイシンを注射してC線維由来の疼痛反応が欠損する動物を作製した。そして顔面領域からの痛覚の中継核である三叉神経脊髄路核尾側亜核において、いままでに異常知覚の発生に関与している可能性があると考えられるサブスタンスPを免疫組織学的に検討した。その結果、カプサイシンによる痛覚関連行動の欠如は同神経核における神経ペプチドの欠損によるのではなく、伝達物質である神経ペプチドの放出障害によるものである可能性が示された。(行動学的検討)マウスのオトガイ神経結紮モデルを作製した。手術直後上昇した知覚閾値は約1週間で急激に低下し、約2週間若干高い値で推移した後、約4週間後からさらに低下して、コントロールと同じ程度に回復した。これらはシャム手術群と明らかな違いを示している。さらに口唇部の知覚の回復がオトガイ孔直上の回復よりも遅い傾向を示すなど臨床との類似が認められた。したがって、本オトガイ神経損傷モデルは今後知覚回復を研究する動物モデルとなれる可能性がある。以上の結果より、今後はこの三叉神経損傷モデルにおいて神経ペプチドの変化を検討することが、「しびれ」などの異常感覚のメカニズムの研究に役立つ可能性があることが示唆された。神経損傷後に生じた「しびれ」の臨床的観察により、「しびれ」には2種類のものが存在し、それらは長期間の観察により異なる時間経過を取って推移することをすでにJournal of Oral and Maxillofacial Surgery,63(2005)298-303で発表した。これによると持続型の「しびれ」は自然消失する一方、誘発型の「しびれ」は長期間存続し、この誘発型の「しびれ」は無髄線維の損傷と深く関わっている可能性が高い。さらに支配領域への機械的刺激によりsmmation型またはafter sensation型などの異常感覚の発生を示すことから、この「しびれ」はwind up現象に非常に良く似ている。したがってサブスタンスPなどの神経ペプチドと神経損傷を調べることが神経損傷後の知覚の可塑的変化を調べるために必要である。そこではじめに三叉神経節または三叉神経脊髄路核におけるサブスタンスPの分布と、カプサイシンを投与した後のサブスタンスPの分布変化を調べた。その結果、出生直後に投与したカプサイシンは無髄神経刺激による三叉神経脊髄路核における疼痛関連反応を欠落させたことから、同核内の神経ペプチドは消失するものと考えられたが、実際は減少していないことが判明した。この反応欠如は神経ペプチドの放出機能不全によると推察された。一方、神経ペプチドであるCGRPはまた別の変化を示すことも明らかになってきた。これは同じ神経ペプチドであってもサブスタンスPとCGRPとは異なる反応を生じ、これらは別々に検討しなければならないことを示唆する。今後は特にサブスタンスPに関連した三叉神経脊髄路核における痛覚関連反応における可塑性変化を電気的にまた光学的に分析する予定である。マウスを用いて、神経損傷モデルを作成した。C57BL6雄性マウスを用いて、腹腔内に抱水クロラールを注射し、オトガイ神経を露出し、絹糸にて結紮を行い縫合閉創した。麻酔覚醒後から長期間触覚閾値の変化を経時的に測定した。触覚閾値は、フォンフレイフィラメントを左右の口唇、オトガイ孔部の計4箇所で測定し、グルーミングを引き起こす閾値を触覚閾値とした。測定は術後10週間行い、その変化を検討した。

この術後の触覚閾値には非常に特徴があり、またこれらの変化には一定の傾向も認められた。始めに触覚閾値は手術直後に急上昇した。この状態は術後1週間ほど高い状態で持続していた。その後は2週間日までに低下を始めて約40日まで比較的高い状態で維持されていた。その後触覚閾値は再び低下を初め、50日以降は健側とほとんど変わりがないことを示している。さらに術後1週間から2週間までに生じた高い閾値からの急激な変化ではオトガイ孔部分が始めに閾値が回復し、それに続いて口唇付近の閾値が低下を始める傾向があることがわかった。これらの現象は臨床的な神経損傷後に認められる知覚の治癒過程と類似していた。また、知覚閾値が急激に回復した後で2週間日から40日目までの変化は、神経損傷後の患者で知覚がほぼ回復したが、異常感覚が続いている状態に相応する可能性が示唆された。今後は今まで行ってきた中枢神経の光学的分析法、電気生理学的アプローチまたは免疫組織学的手法による神経ペプチド局在の時間的・空間的分析を行うことが必要と考えられた。
ヴィゴツキーの発達論を手がかりとした幼年期カリキュラムに関する基礎的研究

本研究では、ロシアの心理学者ヴィゴツキーの理論を手かがりとした、幼児期から児童期前期(本研究では以下、幼年期と標記)までのカリキュラムに関する理論的基礎を明らかにした。第一に、児童学文献など一次資料の読解から、ヴィゴツキーは「7歳の危機」のなかで、就学移行期を発達の契機としてとらえ、過渡期的なモメントとして位置づけていたことを明らかにした。第二に、ヴィゴツキーの危機のとらえ方、および、彼の最近接発達領域の概念をふまえるならば、就学期の子どもの困難1生と小学校への憧れを利用したカリキュラムの在り方が構想できることを明らかにした。第三に、上記の2点を踏まえ、小学校の文化的道具などを用いた「学校ごっこ」プログラムを実施することを提起した。本年度は,研究課題であるヴィゴツキーの一次資料を収集し,幼年期の発達に関して理論的に整理することを目的とし,以下の通り実施した。1,現在の幼年期カリキュラムにおいて,ヴィゴツキーがどのように位置づけられているのかを欧米圏のカリキュラムに焦点をあて先行研究を検討した。その成果は,日本教育方法学会第45回大会で"幼年期カリキュラムにおけるヴィゴツキーの位置づけに関する検討"と題して発表した。2, 2009年11月にロシア人文大学で開催されたヴィゴツキー記念国際会議第10回大会へ参加し,資料収集とヴィゴツキー研究者と意見交流を行ってきた。同大学にあるヴィゴツキー資料館およびモスクワ国立図書館で児童学に関する資料を収集してきた。現在,その資料をデジタル化し,整理している段階であるが,児童学資料のなかの「崩壊」いう概念に着目して整理したものを、教育学研究紀要第55巻に"ヴィゴツキー発達論における「崩壊」"と題して投稿し刊行された。本年度は,研究課題であるヴィゴツキーの一次資料の分析を行い,幼年期の発達とカリキュラムの基礎理論を構築した。本研究の成果としては次の点が挙げられる。第一に、ヴィゴツキーの発達理論を手がかりとして、幼年期の子どもたちは発達的な「危機」をむかえる年齢期であり、それを踏まえるならば、就学にともなう彼らの戸惑いや困惑を保育者や教師は理解すべきである。第二に、学校文化を取り入れた模倣やごっこ遊びなどの活動をカリキュラムに組込むことにより、安易な早期教育に陥るのではない就学準備の在り方を構想することができる。成果は以下の通りである。1,現在の幼年期カリキュラムにおいて,ヴィゴツキーがどのように位置づけられているのかをわが国と米国における受容形態を明らかにした。その成果は,日本教育学会第69回大会で"日本と米国におけるヴィゴツキーの受容に関する比較検討"と題して発表した。2,カリキュラムに関して、『子どもの教育原理』について保育・幼児教育(就学前)と小学校におけるカリキュラムの基礎理論について概説した文章を執筆した。3,幼年期カリキュラムに関して、基礎理論の成果発表の場として、平成23年3月に研究会を開催しその成果を発表した。また、保幼小連携に関連して調査研究を行い、その成果を中国四国教育学会第62回大会にて発表した。そして、現在、日本保育学会に本研究の成果を論文として投稿中である。
顎骨骨幹異形成症モデルマウスの構築

本計画ではジーンターゲティング法を用いて顎骨骨幹異形成症罹患者のGDD1/TMEM16E/Anoctamin5遺伝子でみられるミスセンス変異(C356R)を再現したマウス(顎骨骨幹異形成症モデルマウス)を作製し、顎骨骨幹異形成症の発生機構と変異型GDD1遺伝子産物の生体における機能について詳細な検討を行うことを目的とした。平成25年度は作製に成功した顎骨骨幹異形成症モデルマウスの繁殖、系統維持および解析を開始し、ホモ変異マウスの作製にも着手した。平成24年度より開始した本計画は、きわめて順調に実施され、初年度中に顎骨骨幹異形成症モデルマウスの作製工程をほぼ終えることができた。特に最も重要なES細胞相同組換え体を得る工程が早期に終了したことにより、次年度予算で計画したブラストシストインジェクションによるキメラマウス作製を予算前倒しにより滞りなく実施できたことは本研究費が基金であることの利点を生かせたものである。さらに平成24年度末にはCreトランスジェニックマウスと交配することによりノックインマウスを得ることができたため、平成25年度開始と共にノックインマウスの繁殖、系統維持、解析を開始したが、同年4月11日研究代表者の死亡により本研究計画は廃止となった。本計画ではジーンターゲティング法を用いて顎骨骨幹異形成症罹患者のGDD1/IMEM16E/Anoctamin5遺伝子でみられるアミノ酸変異(C356R)を再現したマウス(顎骨骨幹異形成症モデルマウス)を作製し、顎骨骨幹異形成症の発生機構と変異型IDD1遺伝子産物の生体における機能について詳細な検討を行うことを目的とした。平成24年度は、データベース上のマウスGDD1遺伝子全領域の塩基配列に基づき356番目のシステインをコードするエクソン周辺のゲノム制限酵素マップを作成し、変異型GDD1ノックインターゲティングベクターを設計したさらに、サザンプロットスクリーニングに用いるプローブ配列が、実際に野生型アリルを明瞭に検出できることを確認した後ターゲティングベクターの構築に成功した。作製したターゲティングベクターをマウスEs細胞に導入した結果ES細胞相同組換え体を得た、これにより、相同組換え体をブラストシストインジェクションすることが可能となりキメラマウスを作製するために25年度予算を前倒しすることを決定した。予算を前倒しすることにより、ES細胞相同組換え体が高度に寄与したキメラマウスを作製することに成功し、年度末にはCreトランスジェニックマウスと交配することによりノックインマウスを得ることが可能となった。(年度をまたぎこの工程を完了し顎骨骨幹異形成症モデルマウスの構築はほぼ完了している。)本計画ではジーンターゲティング法を用いて顎骨骨幹異形成症罹患者のGDD1/TMEM16E/Anoctamin5遺伝子でみられるミスセンス変異(C356R)を再現したマウス(顎骨骨幹異形成症モデルマウス)を作製し、顎骨骨幹異形成症の発生機構と変異型GDD1遺伝子産物の生体における機能について詳細な検討を行うことを目的とした。本研究計画では平成24年度-25年度の2年間で顎骨骨幹異型成症モデルマウスの構築を目的とした初年度の達成状況は計画以上の進展を見せ、予定していた研究を滞りなく進めるために予算の前倒し執行をするに至った。平成25度開始と共に顎骨骨幹異型成症モデルマウスの構築が完了することが確定していた。25年度一部予算の前倒し執行もって顎骨骨幹異型成症モデルマウスの構築をほぼ完了することが出来た
運動によるふるえの抑制に関与する介在ニュ-ロンの形態と機能

脊髄冷却によってハトの胸筋に引き起こされたふるえは、運動を開始すると反射的に抑制される。この抑制は下肢筋肉の電気刺激によっても引き起こされる。これまでの実験から下肢筋肉の一次求心性線維は第3胸随から第4腰髄にわたって終末し、胸筋運動ニュ-ロンは第1214頚髄に局在していることが分かっている。すなわち両者は空間的に全く重なり合っておらず、したがって両者間には未知のニュ-ロン(介在ニュ-ロン)が存在してと考えられる。本研究ではこの未知のニュ-ロンを組織学的に検索し、そのニュ-ロンの胸筋ふるえに対する役割を明らかにしようとするものである。胸筋に終末するニュ-ロンをWGAーHRPおよびWGAがもつ神経細胞間輸送とよばれる性質を利用して検索した結果、網様体外側部の小細胞網様体(Rpc)に胸筋運動ニュ-ロンに終末していると考えられるニュ-ロンが見つかった。そこでRpcを電気刺激してRpcの胸筋ふるえに対する役割を調べた。その結果、Rpcへの刺激強度が弱い場合、潜時約50msecで若干の胸筋ふるえの促進が見られたが、刺激強度が強い場合、潜時10msec以下でふるえの抑制が見られた。Rpcが位置する網様体外側部には種々の網様体脊髄路細胞や通過線維が存在するためRpcニュ-ロンの胸筋ふるえに対する役割を正確に特定することは因難であったが、これまでの実験で下肢筋肉を電気刺激して起こる胸筋ふるえの抑制潜時が15msec以下であったことから、胸筋のふるえの抑制にRpcニュ-ロンが関与していることが示唆された。しかし脊髄バトでも下肢筋肉の電気刺激で胸筋ふるえの抑制が起こることから脊髄内にも抑制性ニュ-ロンが存在していることが示唆されているが、本研究では脊髄内に陽性ニュ-ロが検出されなかった。なお下肢筋肉電気刺激によって生じた一次求心性入力は筋紡錘の一次終末で発生し、II群線維によって主に第4腰髄の第IV第V層に送り込まれていることも示唆された。長腓骨筋の1次求心性線維終末と胸筋の運動核との間に存在する介在ニューロンを組織学的に同定するためにHRPを用いて実験を開始したが、HRPを脊髄のある限られた部位に注入することが技術的に非常に困難であることが判明し、目的とする介在ニューロンのみを染め出すことが出来なかった。そこでHarrison(1984)やJankowska(1985)が発表したWGA-HRPのtransneuronal transportと呼ばれる性質を利用して胸筋の運動核に終末している介在ニューロンを染め出す方法を試みることにした。ただし、本実験ではJankowskaらの方法とは若干異なり、WGA-HRPの取り込みを促進するために介在ニューロンの活動性を高めるために行う電気刺激は特に行わなかった。その結果、目的の介在ニューロンと考えられる神経細胞が橋網様対外側部のNucleus reticularisparvocellularis(小細胞網様体)に見つかった。Jankowskaらの方法は再現性があまり良くなく評価は今一つではあるが、今回は見つかった橋網様体細胞は以下の二つの理由で胸筋の運動核に終末していると考えられる。

Birzis & Hemingway(1956、1957)によると、ふるえの中枢内遠心路は後視床部から赤核を通り、橋・延髄網様体を経由して脊髄へ下降していると報告している。従って本実験で見つかった橋網様体細胞は彼らの報告とよく符号している。またこの橋網様体細胞は脊髄下行路の一つである網様体脊髄路の起始細胞の一つに属している。網様体脊髄路細胞は頚や体幹筋の運動核に強く投射していることが分かっているので、本実験で見つかった橋網様体細胞は胸筋の運動核に終末していると考えられる。この点を来年度以降、電気生理学的手法を用いて確かめていきたい。なお本実験では脊髄内に介在ニューロンらしいものが見つからなかったが、今後Jankowskaらの方法で再度実験を行っていきたい。昨年度行った実験で橋網様体外側部のN.reticularis parvocellularis(Rpc)にあるニュ-ロンは胸筋運動ニュ-ロンに終末していることが明らかになった。今年度は、Rpcを電気刺激すると胸筋のふるえにどのような変化が起こるかを調べた。Rpcに3V以下の電気刺激を加えるとふるえはわずかに促進された。しかし5V以上の電気刺激では10msec以下の潜時でふるえの抑制が始まり、約40msecで抑制は最大に達した。その後抑制は徐々に減弱していったが、刺激後約70msecから再び抑制が始まり60250msec間持続した後、約1秒間にわたってふるえの促進がみられた。このように胸筋のふるえに対するRpcの電気刺激の効果は複雑である。しかしRpc付近には網様体背髄路の起始細胞や通過線維が多数存在することを考えると、強い電気刺激を与えた場合Rpcのニュ-ロンだけではなく、他のニュ-ロンをも刺激してしまったことが考えられる。従って、来年度は橋網様体全域に局所の電気刺激を試み胸筋のふるえに対するRpcニュ-ロンの役割を明らかにしようと考えている。今年度はこの他に胸筋のふるえの抑制に関する一次求心性線維の特徴も調べた。長腓骨筋への電気刺激の強度を徐々に上げていくと背髄表面から記録される誘発電位にN1波が出現し、それに遅れてふるえの抑制が発現した。その後刺激強度を上げていくとN1波の振幅が増大し、抑制強度も増加した。N1波の開始潜時から一次求心性線維の伝導速度は約40m/sとなり、運動による胸筋のふるえの抑制にはAβ/II群線維が関与していることが示唆された。さらに電気刺激によって生じた求心性入力は主に第34腰髄の第IV層に送り込まれていることが明らかになった。胸筋のふるえの抑制に関与する背髄内の介在ニュ-ロンの組織学的標識は、Jankowskaの方法に従って介在ニュ-ロンの活動性を上昇させて実験を行ったが、WGAーHRPの取り込みは認められなかった。来年度は別の方法で解決にあたる予定である。脊髄冷却によってハトの胸筋に引き起こされたふるえは、運動を開始すると反射的に抑制される。この反射に関与する神経回路を明らかにする一環として、本年度はハトの胸筋運動ニュ-ロンに終末する介在ニュ-ロンをWGA(コムギ胚凝集素)がもつ神経細胞間輸送とよばれる性質を利用して検索した。神経細胞に取り込まれたWGAはABC法を用いて免疫組織化学的に検出した。その結果、WGA陽性の介在ニュ-ロンは左右両側の網様体外側部にある小細胞網様体(N.reticularisparvocellularis:Rpc)で見つかった。以前のWGAーHRPを用いた実験でもこの小細胞網様体
Web-LABの開発とこれを用いた理工学系概念の習得過程の解明及び教育の高度化

平成15年度、Web-LABのプリプロトタイプを構築した。この試作システムは学習者1名に対して実験の遂行を可能とする、いわばWeb-LABの基本形の動作を確認する為のものであった。これに対し本年度はマルチプルアクセスを可能とするWeb-LABシステムの構築並びにHMI(Human machine interface)の高度化について研究を進め、実用に供し得るWeb-LABシステムの構築を行った。m人の学習者がn組の実験セットに同時アクセスする(但し、m>n)Web-LABシステムでは、有限数の実験セットをそれ以上の数の学習者で時分割利用することが不可欠となる。本研究ではWeb-LABサーバ上に実験セットをペリフェラルとするマルチタスク処理機構を搭載することとし、前年度試作システムに同処理機構を追加的に実装した。複数ユーザによる実験セットの時分割利用に加え、他ユーザサポート時における既計測データの転送機構を加えることによって、各学習者はあたかも自分が実験セットを占有しているかのような感覚で実験を遂行できる遠隔実験環境が構築できた。さらに実験の臨場感を高めるため、HMIの高度化についても研究を進めた。学習者端末上に表示された実験装置画像中の接続端子相互間をドラッグ&ドロップで接続することにより実験系配線が行え、その後の実験に移行できる、臨場感の高いHMIを構築することができた。これらの成果により、当初の理想形に近い極めて臨場感が高く、柔軟性に富んだ「Web-LAB」システムが構築できたと考えている。これらの検討結果をまとめ、平成16年9月、電子情報通信学会TM研究会(高山)、電気系四学会東海支部連合大会(名古屋)等において研究発表を行った。特に、TM研究会では、Webを利用した有限リソースのマルチプル制御について、多くの応用形態が考えられるという議論が巻き起こり、予想外の成果に結びつく可能性が示唆された。初年度となる平成14年度はWeb-LABの基本検討から開始した。システムに対する要求条件を明らかにした上でWeb-LABのシステム構成法の検討を行った。これに基づいてプリプロトタイプシステムを作成し、「電気回路II(過渡現象、四端子回路網等)」の講義において学内LANを介したデモンストレーションを行った。その結果、学生達から教科書とは全く異なる臨場感に富んだ、理解を助ける又興味深い講義となった旨の高い評価を得た。これらの検討を踏まえ、「情報工学実験」で行っている通信システム実験を対象に実用に供し得るWeb-LABシステム構成法を明らかにした。Webアプリケーションサーバを構築するためのソフトウェアプラットフォーム並びに通信システム実験に必要となる機材の調達は全て完了し、現在、システム構成法の検討結果に基づいて試作を進めている段階である。今期は更に、Web-LABの特徴を活かした教育法の有り方についての検討も推進した。即ち、Web-LABでは実験を行う学習者の操作履歴は全てシステム側で把握・蓄積することが可能であることから、この履歴情報を分析し、無効操作率等を定義することによって、学習者の理解度の推定、理解の過程の分析把握、学習者の評価、Web-LABシステム自体の評価などが定量的に行えることを明らかにした。これらの検討結果を纏めて、平成15年3月7日、電子情報通信学会教育工学研究会(徳島大学)にて報告し、インターネットを応用した新たな教育環境構築法であるということで、大変活発な議論を巻き起こした。なお、Web-LABシステムの研究は関連する幾つかのシステムの研究と併せ、本学の平成15年度4年次学生の卒業研究課題として、十分なる検討を推進していく予定である。平成15年度は前年度に進めた基礎検討結果をベースに、Web-LABシステムの具体的な構築を推進し、第一次試作システムを完成させた。本システムは本学、情報工学科

3年次の学生実験科目「通信方式」の内容をWeb-LABシステムとして採用したものであり、公衆電話網の構成、呼接続動作、信号方式等の実験をインターネットを介して、何処からでも可能とするものである。試作システムにより実験室に設置した実験系への制御、制御結果としての各種応答、解析結果等、一連の実験動作が遠隔から可能となることが明らかとなった。本研究は、平成15年度情報工学科卒業研究の一環として推進してきたが、研究に対する学生達の興味の深さは大きなものであった。平成15年度電気関係学会東海支部連合大会において、本研究を担当した学生による研究発表が行われた。この発表は好評を博し、一般企業からも生産ラインの制御技術への応用、遠隔監視制御系構築の基本技術になると言うことで大きな興味を引いた。Web-LABシステムの第一次試作により、幾つかの課題も明らかとなった。即ち、「通信方式」における代表的な信号方式であるDTMF信号の解析では、学生に高速フーリエ変換プログラムを書かせるステップが実際の実験では準備されているが、こうした課題をWeb-LABでどのように実装するか、実験者の操作履歴を蓄積し、この履歴から理解度、教育効果等を計ることしているが具体的な方法については今後の課題となっている。科学研究費補助金の助成を受けての研究は平成15年度までの2年間であるが、本研究については今後も最終的なシステム形態を模索しながら研究を続行することとしている。Web-LABシステムは科学研究費補助金助成のお陰で見事に立ち上がったと考えており、此処に深く感謝の意を表したい。
牛肉の熟成中におけるペプチド画分の特性およびその生成機序

食肉の熟成中に,CaイオンによってZ線の無定形物質が分解されたり,タンパク質はカルパインやカテプシンなどのプロテアーゼによって分解される。ペプチドは更に小さなペプチド,アミノ酸にまで分解され,風味が改善され,食味も向上する。本実験では,と畜後2日目のホルスタイン種のもも肉(半腱様筋:M.Semitendinosus)を用い,試料を一般的な保存形態である肉塊(ブロック肉)試料と,30mMクエン酸リン酸緩衝液でホモジナイズしたホモジネート肉試料,更に筋原線維を取り除いた筋漿画分試料の3つを調製した。これらを低温(4°C)で貯蔵(28日間)した時,ペプチド量やその成分がどのように変化するかについて検討した。ペプチド量については,ブロック肉とホモジネート肉試料の加熱可溶性ペプチド画分と2%TCA可溶性ペプチド画分は7日目まで急増し,14日目以降の増加は少し緩やかになった。しかしながら,筋漿画分試料は28日目まで一定の増加で,その値はブロック肉試料の値まで近づいた。ホモジネート肉試料と筋漿画分試料の違いは筋原線維タンパク質の存在の有無であり,熟成中にこれらの間には差が生じ,28日目にはその差は加熱可溶性のペプチドで約80mg,2%TCA可溶性ペプチドでは約90mgであった。このことは筋原線維タンパク質もプロテアーゼに対して感受性が高く,ペプチドとして可溶化することが推察された。SDS-PAGEによる結果から,ブロック肉試料の加熱可溶性ペプチドは分子量4万程度のタンパク質や1.7万のミオグロビンも含まれていた。この内,熟成中に増加するのは,分子量4.0,2.3,1.4,1.07,0.8,0.7,0,55および0.45万の成分が認められた。しかし,筋漿画分から由来するペプチドのバンドは2.3万以上の高分子のものは少なかった。また,ホモジネート肉試料では2.3,2.1,1.4,1.35および1.22万の成分が太く濃く現われた。2%TCA可溶性ペプチドはほとんどが0.8万以下の成分で,この外に0.7,0.55および0.45万の成分が主なものだった。Superdex peptide HR10/30カラムを用いた加熱可溶性ペプチドの分析では,ピークはRT-38,42,67,72,78,84,41,100および110の10ヶが観察された。分子量の大きなRT-38,42および67,また,分子量の小さなRT-100は3種類の試料でいづれも増加した。しかし,RT-78,84はすべての試料で減少した。2%TCA可溶性ペプチドのピークは,RT-67,72,78,100および110であった。以上のことから,生成するペプチドは筋漿画分由来のものが大きな割合を占めていた。食肉の熟成中に,CaイオンによってZ線の無定形物質が分解されたり,タンパク質はプロテアーゼによって分解される。本実験では,と畜後2日目のホルスタイン種のもも肉(半腱様筋:M.Semitendinosus)を用い,試料を一般的な保存形態である肉塊(ブロック肉)試料と,30mMクエン酸リン酸緩衝液でホモジナイズしたホモジネート肉試料,更に筋原線維を取り除いた筋漿画分保存資料の3つを調製した。これらを低温(4°C)で貯蔵(28日間)した時,ペプチドおよび遊離アミノ酸がどのように変化するかについて検討した。ペプチド量に関しては,ホモジネート肉保存の2%TCA可溶性画分が7日目から急増し,14日目にブロック肉保存がそれに続き,筋漿画分保存は穏やかな一定の増加であった。ホモジネート肉と筋漿画分の違いは筋原線維タンパク質の存在の有無であり,このことは筋原線維タンパク質の方がプロテアーゼに対して感受性の高いことが推察された。Superdex peptide HR10/30カラムを用いた低分子ペプチドの分析によって,ピークはRK-16,18,30,32,35,37,41,43および49の10ヶが観察された。RT-18はほとんどの試料で増加した。RT-35,37はすべての試料で減少し,2%TCA可溶性画分,加熱可溶性画分のいずれにおいてもホモジネート肉保存における減少が大きかった。ブロック肉保存において,RT-55のピークは熟成中に出現しなかった。熟成による総遊離アミノ酸量は,加熱,TCAのどちらの処理においても増加の傾向は類似していた。また加熱可溶性画分のG1n量は2%TCA可溶性画分のものに比べ多く,いずれもG1uを上回っていた。

本実験では,と畜後2日目のホルスタイン種のもも肉(半腱様筋:M.Semitendinosus)を用い,試料を一般的な保存形態である肉塊(ブロック肉)試料と,30mMクエン酸リン酸緩衝液でホモジナイズしたホモジネート肉試料,更に筋原線維を取り除いた筋漿画分試料の3つを調製した。これらを低温(4°C)で貯蔵(28日間)した時,ペプチド量やその成分がどのように変化するかについて検討した。ペプチド量については,ブロック肉とホモジネート肉試料の加熱可溶性ペプチド画分と2%TCA可溶性ペプチド画分は7日目まで急増し,14日目以降の増加は少し緩やかになった。しかしながら,筋漿画分試料は28日目まで一定の増加で,その値はブロック肉試料の値まで近づいた。ホモジネート肉試料と筋漿画分試料の違いは筋原線維タンパク質の存在の有無であり,熟成中にこれらの間には差が生じ,28日目にはその差は加熱可溶性のペプチドで約80mg,2%TCA可溶性ペプチドでは約90mgであった。このことは筋原線維タンパク質もプロテアーゼに対して感受性が高く,ペプチドとして可溶化することが推察された。SDS-PAGEによる結果から,ブロック肉試料の加熱可溶性ペプチドは分子量4万程度のタンパク質や1.7万のミオグロビンも含まれていた。この内,熟成中に増加するのは,分子量4.0,2.3,1.4,1.07,0.8,0.7,0,55および0.45万の成分が認められた。しかし,筋漿画分から由来するペプチドのバンドは2.3万以上の高分子のものは少なかった。また,ホモジネート肉試料では2.3,2.1,1.4,1.35および1.22万の成分が太く濃く現われた。2%TCA可溶性ペプチドはほとんどが0.8万以下の成分で,この外に0.7,0.55および0.45万の成分が主なものだった。Superdex peptide HR10/30カラムを用いた加熱可溶性ペプチドの分析では,ピークはRT-38,42,67,72,78,84,41,100および110の10ヶが観察された。分子量の大きなRT-38,42および67,また,分子量の小さなRT-100は3種類の試料でいづれも増加した。しかし,RT-78,84はすべての試料で減少した。2%TCA可溶性ペプチドのピークは,RT-67,72,78,100および110であった。以上のことから,生成するペプチドは筋漿画分由来のものが大きな割合を占めていた。食肉の熟成中に,CaイオンによってZ線の無定形物質が分解されたり,タンパク質はカルパインやカテプシンなどのプロテアーゼによって分解される。ペプチドは更に小さなペプチド,アミノ酸にまで分解され,風味が改善され,食味も向上する。これらを低温(4°C)で貯蔵(28日間)した時,ぺプチド量やその成分がどのように変化するかについて検討した。ペプチド量については,ブロック肉とホモジネート肉試料の加熱可溶性ぺプチド画分と2%TCA可溶性ペプチド画分は7日目まで急増し,14日目以降の増加は少し緩やかになった。ホモジネート肉試料と筋漿画分試料の違いは筋原線維タンパク質の存在の有無であり,熟成中にこれらの間には差が生じ,28日目にはその差は加熱可溶性のぺプチドで約80mg,2%TCA可溶性ペプチドでは約90mgであった。
老人性難聴の発症機序の解明および予防法の開発に関する研究

ビタミンC合成のできないSMP30/GNL欠失マウスを用いた研究ではビタミンCの内耳での著明低下により有意に老人性難聴が悪化すること、ビタミンCを過剰に補っても老人性難聴の予防はできないことが判明した。ミトコンドリア内のCatalaseを過剰発現させると老人性難聴の発現は抑止された。また17種の活性酸素除去効果のあるサプリメントの検討ではαリポ酸、CoQ10、NACの3種類に抑制効果が見られた。これら老人性難聴の進行が抑制されたマウスの蝸牛ではBakの発現が有意に減少していた。Bak欠失マウスでは老人性難聴は抑制された。これらの結果から、蝸牛内に生じる活性酸素による慢性的障害がBakを介したアポトーシスを蝸牛内細胞に引き起こし、老人性難聴が生じることが示唆された。研究は大きく、遺伝子改変マウスを用いた実験と、サプリメント等食餌療法の効果を調べる実験に分かれる。解析は1)ABRを用いた機能解析、2)光顕・免疫染色による組織観察、3)DNA microarray、Quantitative PCR法による遺伝子解析を行った。まずビタミンC合成のできないSMP30/GNL欠失マウスを用い、ビタミンの欠乏が老人性難聴を進行させるか検討した。その結果、ビタミンCを与えないこのマウスでは蝸牛内、肝臓、血漿中のビタミンCが著明に低下し、ビタミンC投与群や野生型と比べて有意に老人性難聴が悪化し、ラセン神経節細胞も減少していた。次にCatalaseの過剰発現マウスにおいて加齢によるABR閾値上昇がC57BL6マウスに比べて抑えられることを見出した。さらに17種の活性酸素除去効果のあるサプリのC57BL6マウスにおける老人性難聴進行抑制効果を調べ、そのうち3種類に効果のあることを見出した。最後にBax欠失マウスでは加齢によるABR閾値上昇がC57BL6マウスと差がなく、Bak欠失マウスでは加齢によるABR閾値上昇がC57BL6マウスに比べて抑えられることを見出した。これらの結果から、蝸牛内に生じる活性酸素による慢性的障害からBakを介したアポトーシスが蝸牛内の細胞に生じ、老人性難聴が生じることが示唆された。研究は大きく、遺伝子改変マウスを用いた実験と、サプリメント等食餌療法の効果を調べる実験に分かれた。まずビタミンC合成のできないSMP30/GNL欠失マウスを用い、ビタミンCの欠乏による老人性難聴の影響を調べた。ビタミンCを与えないマウスでは蝸牛内、肝臓、血漿中のビタミンCが著明に低下し、ビタミンC投与群や野生型と比べて有意に老人性難聴が悪化し、ラセン神経節細胞も減少していた。一方ビタミンCを投与しても老人性難聴の予防はできなかった。次にミトコンドリア内のCatalase過剰発現マウスにおいて加齢によるABR閾値上昇がC57BL6マウスに比べて抑えられることを見出した。さらに17種の活性酸素除去効果のあるサプリのC57BL6マウスにおける老人性難聴進行抑制効果を調べ、そのうちαリポ酸、CoQ10、NACの3種類に効果のあることを見出した。Bax欠失マウスでは加齢によるABR閾値上昇がC57BL6マウスと差がなく、Bak欠失マウスでは加齢によるABR閾値上昇がC57BL6マウスに比べて抑えられることを見出した。最後に高脂肪食により老人性難聴が悪化するか、またそれが水素水やスタチンにより予防できるかに関して実験を開始した。研究は大きく、in vivoでの遺伝子改変マウスを用いた実験とサプリメント等食餌療法の効果を調べる実験、およびin vitroにおける蝸牛細胞培養実験により行った。解析は、ABRやDPOAEを用いた機能解析、光顕・免疫染色による組織観察、DNA microarray、定量的RT-PCR法による遺伝子解析などを用いた。

まずSirt3欠失マウスを作成し、カロリー制限が老人性難聴の進行に影響するか検討した。その結果、野生型では老人性難聴の進行が抑制されるのに対し、Sirt3欠失マウスでは抑制効果が無い事が判明した。またC57BU6マウスに高脂肪食を与え、通常食に比べ難聴が悪化するか検討した。高脂肪食群では体重は初期には著明に増加し、肥満傾向が明らかで、耐糖能も低下した。野生型に比べて老人性難聴も悪化傾向を示した。組織変化の詳細は検討中であるが、ラセン神経節細胞は減少傾向にあった。この動物に水素水を持続的に投与したが、明らかな老人性難聴の予防効果は得られなかった。一方、急性難聴モデルとしてモルモットに一過性の音響外傷を与えた場合、水素水の投与により、ABR閾値やDPOAE振幅の回復促進が得られ、酸化ストレスによる内耳障害に対する保護効果が確認できた。またp4マウスから採取した蝸牛培養ではパラコートによりBakの発現が有意に亢進するが、水素水はそれを抑制し、細胞死を減少することが判明した。
行列模型による超弦理論の非摂動的定式化の研究

超弦理論は素粒子の基本相互作用(重力・電磁気力・強い力・弱い力)を統一的に記述する理論として期待されているが、まだ完全な定式化がなされていない。本研究のメインテーマである「行列模型」とは、超弦理論のより完全な定式化(非摂動的定式化)を与えると予想されている模型である。本研究では行列模型の解析を行うことにより、行列模型が本当に超弦理論を実現しているのか、そして実現しているならばどのようにそれがなされているのかを明らかにする。特に本研究では、行列模型に自然に現れる「非可換幾何学」と呼ばれる新しい数学から、この問題にアプローチする。
壁面分布加熱による新機軸の流体制御手法の実証開発

本実験研究では,壁面の周期加熱を利用した低レイノルズ数内部流れの抵抗低減および駆動力の発生手法を確立すべく,その基礎性質を平面チャネル流れを対象に調べている.これは,特殊な表面加工や流路内へのデバイスの設置を必要としない特徴を持つ新機軸の流体制御手法である.特に前者については,実験で実現された壁面温度分布に基づいた詳細な数値解析(二次元ブジネスク近似モデル)も行い,実験結果との比較を通じて詳細な考察・検討を行った.その結果,壁面の周期加熱により,浮力による定在ロールが生成されることが確認されるとともに,ロールの大きさ,はく離・再付着位置,および流れ場の速度分布がいずれのレイノルズ数においても解析結果と極めて良く一致することが示され,壁面温度分布が抵抗低減に導くことが間接的に実証された.この成果は,Journal of Fluid Mechanicsに投稿され,2019年4月にアクセプトされた.後者については,実験モデルの設計・製作手法の再検討から開始した.これは,後者の現象が,前者よりも外乱に対し極めて敏感であることに依る.NCフライスによる壁面の精密加工と前者で確立した分布温度実現手法を組み合わせて慎重に実験を行ったところ,分布加熱を有する波状壁が水平流れを誘起し,その方向は温度分布の位相で制御できることが見出された.この成果は,1件の国内会議,1件の国際会議で発表され,現在論文投稿に向けて理論解析との比較を実施中である.壁面加熱による抵抗低減について,本課題実施前の予備実験(スモークによる流れの可視化)から定性的な一致は確認していたものの,工学的に見た場合,定量評価が欠かせない.ただし,本実験のレイノルズ数は20以下と小さく,そのような流れ場での抵抗変化(本実験では摩擦抵抗のみ)を直接計測で正しく評価することは難しい.そこで,本研究では,流れ場の速度分布計測を可能な限り精密に計測し,対応する圧力がポアッソン方程式を通じて一意に定まる低マッハ数流れの性質に基づいて,壁面分布加熱が確かに抵抗低減に導くことを実証した.これは計画の第一段階完了に対応する.次の段階である,壁面の波打との組み合わせによる水平流の駆動については,両側が大気開放された水平チャネルで検証する必要があり,外的要因(外乱,温度分布,壁面形状の仕上がり等)の影響を最小限に抑えることが強く求められた.実験装置の設計・製作はこうした点を慎重に考慮して行われ,12波長分の精密モデルを製作した.実験データの質に直結する外乱の回避法については,試行錯誤を繰り返しながら流れ場の観察を実施し,種々のレイリー数で再現性が確保できる実験法を確立した.スモークによる観察から,壁面加熱によって定在対流ロールとその間を縫って流れる水平流が駆動されることが確認され,流量はレイリー数とともに単調に増加することが確認された.また,加熱の位相を180°変えると水平流は強さは同じで向きが反転することが示された.以上のように,各課題において当初の予想を超えた慎重な取り扱いが求められたものの,一つずつ要因を検討・克服し,概ね計画していた内容が実施できた.2019年度以降は,前年度からの研究課題を継続し,分布加熱を有する波状壁面により駆動される流れ(Thermal Drift)について,理論解析との比較から詳細に検討する.これは,先に実施した抵抗低減研究と同様,研究協力者のFloryan教授(カナダ・ウエスタンオンタリオ大)と共同で実施する(稲澤が実験,Floryan教授が解析を担当).実験モデルの寸法,および温度分布データを解析の境界条件に適用し,流れ場のパターンと合計の流量がレイリー数とともにどのように変化するかを比較する.研究結果は,国内・国外の会議で発表予定である.以上の実施内容完了後に,流れ場の三次元性が制御効果に及ぼす影響を明らかにする実験に取り組む.これは,工学的に重要な内部流れはダクトあるいは円管であることに基づく.先行している理論解析も二次元チャネル流のみを対象としており,三次元性の効果は考慮していない.こうした三次元性の影響については,解析よりも実験の方がパラメータを容易に変化させることができる有利性をもつ.実験はチャネル側壁間隔を減らすことで容易に実行でき,まずは,チャネルから矩形ダクトに近づけた場合の流れの変化を,Super-Thermo-Hydrophobic EffectおよびThermal Driftにおいて,測定のスパン断面を異動させながら観察する.得られた結果を基に,矩形断面での有効性を明らかにするとともに,円管に対する適用の可能性についても検討する.本実験研究では,壁面の周期加熱を利用した低レイノルズ数内部流れの抵抗低減および駆動力の発生手法を確立すべく,その基礎性質を平面チャネル流れを対象に調べている.これは,特殊な表面加工や流路内へのデバイスの設置を必要としない特徴を持つ新機軸の流体制御手法である.特に前者については,実験で実現された壁面温度分布に基づいた詳細な数値解析(二次元ブジネスク近似モデル)も行い,実験結果との比較を通じて詳細な考察・検討を行った.その結果,壁面の周期加熱により,浮力による定在ロールが生成されることが確認されるとともに,ロールの大きさ,はく離・再付着位置,および流れ場の速度分布がいずれのレイノルズ数においても解析結果と極めて良く一致することが示され,壁面温度分布が抵抗低減に導くことが間接的に実証された.この成果は,Journal of Fluid Mechanicsに投稿され,2019年4月にアクセプトされた.後者については,実験モデルの設計・製作手法の再検討から開始した.

これは,後者の現象が,前者よりも外乱に対し極めて敏感であることに依る.NCフライスによる壁面の精密加工と前者で確立した分布温度実現手法を組み合わせて慎重に実験を行ったところ,分布加熱を有する波状壁が水平流れを誘起し,その方向は温度分布の位相で制御できることが見出された.この成果は,1件の国内会議,1件の国際会議で発表され,現在論文投稿に向けて理論解析との比較を実施中である.壁面加熱による抵抗低減について,本課題実施前の予備実験(スモークによる流れの可視化)から定性的な一致は確認していたものの,工学的に見た場合,定量評価が欠かせない.ただし,本実験のレイノルズ数は20以下と小さく,そのような流れ場での抵抗変化(本実験では摩擦抵抗のみ)を直接計測で正しく評価することは難しい.そこで,本研究では,流れ場の速度分布計測を可能な限り精密に計測し,対応する圧力がポアッソン方程式を通じて一意に定まる低マッハ数流れの性質に基づいて,壁面分布加熱が確かに抵抗低減に導くことを実証した.これは計画の第一段階完了に対応する.次の段階である,壁面の波打との組み合わせによる水平流の駆動については,両側が大気開放された水平チャネルで検証する必要があり,外的要因(外乱,温度分布,壁面形状の仕上がり等)の影響を最小限に抑えることが強く求められた.実験装置の設計・製作はこうした点を慎重に考慮して行われ,12波長分の精密モデルを製作した.実験データの質に直結する外乱の回避法については,試行錯誤を繰り返しながら流れ場の観察を実施し,種々のレイリー数で再現性が確保できる実験法を確立した.スモークによる観察から,壁面加熱によって定在対流ロールとその間を縫って流れる水平流が駆動されることが確認され,流量はレイリー数とともに単調に増加することが確認された.また,加熱の位相を180°変えると水平流は強さは同じで向きが反転することが示された.以上のように,各課題において当初の予想を超えた慎重な取り扱いが求められたものの,一つずつ要因を検討・克服し,概ね計画していた内容が実施できた.2019年度以降は,前年度からの研究課題を継続し,分布加熱を有する波状壁面により駆動される流れ(Thermal Drift)について,理論解析との比較から詳細に検討する.これは,先に実施した抵抗低減研究と同様,研究協力者のFloryan教授(カナダ・ウエスタンオンタリオ大)と共同で実施する(稲澤が実験,Floryan教授が解析を担当).実験モデルの寸法,および温度分布データを解析の境界条件に適用し,流れ場のパターンと合計の流量がレイリー数とともにどのように変化するかを比較する.研究結果は,国内・国外の会議で発表予定である.以上の実施内容完了後に,流れ場の三次元性が制御効果に及ぼす影響を明らかにする実験に取り組む.これは,工学的に重要な内部流れはダクトあるいは円管であることに基づく.先行している理論解析も二次元チャネル流のみを対象としており,三次元性の効果は考慮していない.
心筋虚血及び再灌流時におけるストレス応答とストレス蛋白質

ストレス(熱ショック)応答は、主として転写レベルで調節されており、その転写調節は、主にプロモーター領域のHeat Shock Element(HSE)への熱ショック転写因子(Heat Shock Factor; HSF)の結合によるものである。虚血心におけるストレス蛋白質誘導のメカニズムを探るために、S-Dラットの摘出灌流心(Langendorff法)における、全虚血時(260分)及び虚血後再灌流時(1040分の全虚血後、再灌流1060分)のサンプルを採取し、HSFのHSEに対するDNA結合能の活性化をゲルシフト分析で調べた。更に、これらのサンプルの熱ショック蛋白質HSP70及びHSP90のmRNAレベルをノーザンブロットで調べた。全虚血のみでは、活性化は弱く、20分後には減衰し始めたが、その後再灌流を行うことにより活性化が増大した。更に、虚血再灌流を繰り返すことにより、強い活性化が得られた。抗HSF1,HSF2抗体を用いたゲルシフト分析により、高温ストレス時や虚血再灌流時に心臓で活性化されるHSFは、HSF1であることがわかった。ノーザンブロットで、HSP70及びHSP90のmRNAも虚血のみではほとんど誘導されなかったが、再灌流を行うことにより強く誘導された。また、再灌流時のmRNAレベルは、高温ストレス時に比し、HSP70では低かったのに対し、HSP90は明らかに高かった。虚血心においても、HSF1の活性が認められ、多くの高等動物細胞の他のストレス時と同様なストレス遺伝子の転写調節が行われており、虚血心では、特に虚血後再灌流がストレス応答の誘導に重要であることが明らかとなった。
ATPaseの活性ドメインの結晶化による構造解析

ATPaseの活性部位領域の結晶化を試みるため、活性部位領域のペプチドをコードするDNAを大腸菌の発現系に導入し大腸菌内に大量発現させて精製した。その研究成果の概要は次のとおりである。(1)シビレエイNa,K-ATPaseαサブユニットの活性部位領域をコードするDNAを得るためにNa,K-ATPaseαサブユニットの遺伝子クローンから約1.3kbpのDNA断片を得た。この断片をマルトース結合蛋白質(MBP)との融合蛋白質を発現するベクター(pMAL-c2)に挿入し、プラスミドDNA(pMAL/AS-7)を構築した。(2)構築したプラスミドを大腸菌に形質転換し、遺伝子産物を発現させたところ、pMAL/AS7プラスミドの発現産物である融合蛋白質は分子量、約90kDaタンパク質としてプロテアーゼ欠失株である大腸菌PR745で大量に発現した。発現した融合蛋白質は、その大腸菌の溶解物中では封入体を形成し不溶物であった。そこで、その封入体を6Mウレアで可溶化した後、アミロースアフィニテイーカラムにかけ、大量に精製した。また、アミノ酸配列-Ile-Glu-Gly-Argを認識するプロテアーゼ(ファクターXa)によりその融合蛋白質を切断後、SDS-PAGEにより分析したところ、約42kDaのMBPと約50kDaの活性部位領域蛋白質について等量の蛋白質のバンドが得られなかった。この結果から、ファクターXaは非特異的にも活性部位領域蛋白質を切断し、低分子のペプチドに消化しているものと思わせる。この切断効率の低さにより、大量精製後の活性部位領域蛋白質のみの回収が容易ではないことが予想される。(3)精製した融合蛋白質に対し、二次構造の解析のためにCDスペクトルの測定を行なったところ,208nmと222nmにαヘリックスに特有なピークが得られた。このことから、得られた融合蛋白質について二次構造が保たれていることが推測される。現在、ATPの結合能があるかどうか調べるためにTNP-ATPを用いた差スペクトルの測定を検討中である。融合蛋白質の切断条件や変性を伴わない可溶化条件も検討している。
アメーバ共培養法で検出したレジオネラの遺伝子型と棲息環境との関連性解析

アメーバ共培養法を用いて、環境水中のレジオネラ汚染実態の解明を試みた。環境水120試料のうち、アメーバ共培養法とリアルタイムPCR法により91試料(75.8%)が陽性であった。アメーバ共培養法で検出したL.pneumophilaについては、遺伝子型と棲息環境との関連性について解析を行うためにSBT法を試みたが、遺伝子型を特定することができなかった。アメーバ共培養法を行うことにより、17試料(14.2%)で10倍以上の菌数増加が確認され、レジオネラ培養不能菌種を検出した。本研究により、通常の培養法では検出できないが、生存しているレジオネラが環境水中に高率で生息していることが明らかとなった。育児休暇の取得に伴い研究中断したため、H25年度の研究実績はなし。レジオネラ症を防止するためには、感染源となる環境水中のレジオネラの棲息状況を正確に把握し、患者発生時には感染源を迅速に特定することが公衆衛生上重要である。レジオネラは、生存しているが人工培地で培養できない状態(VNC : viable but non-culturable)になる細菌であること、また、宿主アメーバ内で増殖するが人工培地では検出することができない菌種が存在することが報告されている。そのため、培養法で検出可能なレジオネラだけでなく、これら培養不能レジオネラの棲息状況も把握しておく必要があるが、培養不能レジオネラを含めた分布実態は十分に明らかになっていない。我々はこれまでに、従来の培養法ではレジオネラ不検出の浴槽水から、アメーバ共培養法を用いてVNC状態を含むレジオネラを高率に検出してきた。本研究では、種々の環境水を対象にアメーバ共培養法を用いてレジオネラ汚染分布実態を明らかにし、レジオネラ症の最も多い原因菌種であるL.pneumophilaについては、遺伝子型と棲息環境との関連性について解析を行うことを目的とする。環境水試料は、レジオネラ症の感染源となり得る浴槽水、冷却塔水に加え、水道原水として取水を行っている河川水を対象とした。環境水試料及びアメーバ共培養後の環境水試料は、PCR法及びリアルタイムPCR法等によりレジオネラ検出を行っている。L.pneumophilaを用いたSequence-Baced Typing(SBT法)による遺伝子型別手法の確立を行うために、保有しているL.pneumophila株を用いて検討を行っている。本研究では、レジオネラ症の感染源となりうる種々の環境水を対象にアメーバ共培養法を用いてレジオネラ汚染分布実態を明らかにし、レジオネラ症の最も多い原因菌種であるL.pneumophilaについては、遺伝子型と棲息環境との関連性について解析を行うことを目的とする。H26年度は、これまでに対象としていた冷却塔水や河川水に加え、噴水や人工池などの水景水を対象に加え、計60試料を採取した。これら環境水試料及びアメーバ共培養後の環境水試料は、PCR法等によりレジオネラの検出を行っている。検出されたL.pneumophilaについては、これまでに検討したSequence-Baced Typing(SBT法)による遺伝子型別手法を用いて解析を進めている。レジオネラ防止対策を行うためには、培養法で検出可能なレジオネラだけでなく、VBNC状態や培養不能菌種を含めた培養不能レジオネラの棲息状況も把握しておく必要があるが、これらレジオネラを含めた分布実態は十分に明らかになっていない。本研究では、レジオネラ症の感染源となりうる種々の環境水を対象に、アメーバ共培養法を用いてレジオネラ汚染分布実態を明らかにし、レジオネラ症の最も多い原因菌であるL. pneumophilaについては、遺伝子型と生息環境の関連性について解析を行うことを目的とする。H27年までに、冷却塔や河川水などの環境水試料90試料を採取した。これら環境水試料およびアメーバ共培養法後の環境水試料は、PCR法等によりレジオネラの検出を行っている。検出されたL. pneumophilaについては、Sequence Based Typing (SBT法)による遺伝子型別手法を用いて解析を進めている。種々の環境水からレジオネラの検出を試みているが、当初予測していたより検出率が低いため、試料数を増やして採取を行っている。試料採取を優先しているため、遺伝子解析がやや遅れているが、全体としてはおおむね順調に進展していると考えている。レジオネラがアメーバ内で増殖することを利用したアメーバ共培養法を用いて、環境水汚染実態の解明を試みた。環境水は、レジオネラ症の感染源となりうる冷却塔水、水景水に加え、水道原水として取水している河川水を対象とした。アメーバ共培養法は、Acanthamoeba castelanii ATCC30234株を用いて、これまでに浴槽水試料を対象としたレジオネラ検出で用いた培養条件により実施した。環境水120試料(冷却塔34試料、水景水31試料、河川水55試料)のうち、培養法では3試料からレジオネラを検出した。環境水およびアメーバ共培養後の環境水試料について、いずれかの試料がレジオネラ陽性となったのは、PCR法は73試料(60.8%)、リアルタイムPCR法は95試料(79.2%)であった。L.pneumophilaを検出するためにmip遺伝子を標的とするPCR法を実施した結果、アメーバ共培養法後の3試料が陽性であった。