hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
天然有機化合物の有効活用を目指した新規生物活性化合物探索法の開発とその応用

研究代表者は、天然物の鏡像構造を有する化合物群の効率的な探索を目指して、鏡像体タンパク質を用いた新規生物活性評価系の構築を行っている。平成28年度は、昨年度までに化合物アレイ法を用いたスクリーニングにより得られたGrb2のSH2ドメイン(以下Grb2-SH2)に対するヒット化合物群からの阻害剤探索と、新たな医薬品探索のための標的分子として細菌のアミノ酸代謝酵素の化学合成法の確立に向けた検討を実施した。まず、ELISAに用いるビオチン標識Grb2-SH2の両鏡像体について、3セグメントを用いた段階的なNCL反応による合成プロセスを確立した。この化学合成タンパク質を利用して、EGFR由来のリン酸化チロシンを含むペプチドとの競合阻害実験を実施した。望みの阻害活性を有する化合物は見いだされなかったものの、化学合成タンパク質を用いた化合物アレイ解析とELISAによる二段階の探索プロセスを確立したことで、SH2ドメインタンパク質が鏡像スクリーニングへ適応可能であることを明らかにした。細菌のアミノ酸代謝酵素は、複数のセグメントを用いたNCL反応による合成を検討した。合成検討の過程で、セグメントの難溶性に伴うHPLC精製の困難さの問題が生じたため、新規溶解性補助基を設計・合成し、難溶性セグメントに導入することで解決した。併せて構成ペプチド鎖に該当する全セグメント(計6種類)の合成を達成した。今後、各セグメントを用いた段階的なNCL反応と、全長ペプチド鎖構築後に補助基を脱保護することで全合成が可能であると期待される。28年度が最終年度であるため、記入しない。研究代表者は、天然物の鏡像構造を有する化合物群の効率的な探索を目指し、鏡像型タンパク質を用いた新規生物活性評価系を構築した。これまでに腫瘍の増殖に関与するタンパク質を標的としたスクリーニングを実施し、鏡像型タンパク質に対する選択的阻害剤として天然物誘導体を見出しており、本年度はその鏡像体の合成とそれら誘導体の構造活性相関研究を実施した。市販試薬を出発原料として目的の立体配置を有するユニットを合成した後、これらを順次カップリングさせることで、ヒットした天然物の鏡像体を得た。得られた鏡像体について天然型タンパク質との相互作用を評価したところ、天然物誘導体の鏡像型タンパク質に対する活性と同等の活性を有することが確認された。一方で、標的としたタンパク質の変異に起因する2種類の腫瘍細胞株用いた細胞増殖抑制試験を実施したものの、期待の増殖抑制活性は得られなかった。続いて、この鏡像体化合物の阻害活性に必要な構造要素に関する知見を得る目的で、そのクロマン骨格及びアルキル鎖上の立体化学、もしくはアルキル鎖の長さを変えた誘導体を設計し、前述の合成経路に倣って合成した。これら誘導体の阻害活性を評価したところ、アルキル鎖の長さと、四置換炭素の立体化学が標的タンパク質との相互作用に重要であることが示唆された。以上のように、天然型タンパク質に作用する天然物誘導体の鏡像体の活性が確認できたことから、本戦略の有用性を示すことができた。研究代表者は、天然物の鏡像構造を有する化合物群の効率的な探索を目指して、鏡像型タンパク質を用いた新規生物活性評価系の構築を行っている。平成27年度は、これまでに開発した探索手法の汎用性の実証を目的として、化学合成例がないGrb2のSH2ドメイン(以下Grb2-SH2)を標的とした研究を実施した。Grb2-SH2は、N末端セグメントとC末端セグメントを固相合成により合成後、Native Chemical Ligation(NCL)により各セグメントを結合し、脱硫反応に付すことにより調製した。化合物アレイ解析によるスクリーニングに用いる蛍光標識体は、N末端にリンカーを介して蛍光基を導入し、同様のNCLにより調製した。得られた化学合成タンパク質を用いて、化合物アレイを用いたスクリーニングを共同研究により実施した。その結果、天然有機化合物群からL-Grb2とD-Grb2に結合活性を有する化合物を同定した。二次評価に用いるビオチン標識Grb2-SH2は、2セグメントを用いた合成における収率の問題を解決するべく、3セグメントを用いた段階的なNCL反応により合成した。合成したビオチン標識Grb2-SH2は、Grb2の内因性リガンドであるErbB1ペプチドに対して濃度依存的な結合活性を示し、二次評価に利用できることを確認した。研究代表者は、天然物の仮想的な鏡像異性体ライブラリーから天然型タンパク質に活性を示す化合物を取得する探索法の汎用性の確認や探索プロセスに必要とされる要素技術の改善に向けて、これまでに化学合成例のないGrb2-SH2の化学合成を完了した。合成においては収率の低さをはじめとする複数の解決すべき課題があったが、セグメントの選択の工夫等により、収率よく目的のタンパク質を取得することに成功した。また、これらを用いたスクリーニングを実施し、複数のヒット化合物を取得した。以上のことから、当初の計画通りの研究が進展したと判断される。

まず、ELISAに用いるビオチン標識Grb2-SH2の両鏡像体について、3セグメントを用いた段階的なNCL反応による合成プロセスを確立した。この化学合成タンパク質を利用して、EGFR由来のリン酸化チロシンを含むペプチドとの競合阻害実験を実施した。望みの阻害活性を有する化合物は見いだされなかったものの、化学合成タンパク質を用いた化合物アレイ解析とELISAによる二段階の探索プロセスを確立したことで、SH2ドメインタンパク質が鏡像スクリーニングへ適応可能であることを明らかにした。細菌のアミノ酸代謝酵素は、複数のセグメントを用いたNCL反応による合成を検討した。合成検討の過程で、セグメントの難溶性に伴うHPLC精製の困難さの問題が生じたため、新規溶解性補助基を設計・合成し、難溶性セグメントに導入することで解決した。併せて構成ペプチド鎖に該当する全セグメント(計6種類)の合成を達成した。今後、各セグメントを用いた段階的なNCL反応と、全長ペプチド鎖構築後に補助基を脱保護することで全合成が可能であると期待される。鏡像型タンパク質に対する選択的阻害剤の鏡像異性体の合成を完了した。この化合物は天然型タンパク質に対して鏡像型タンパク質の場合と同等の阻害活性を示すことが確認され、スクリーニングプロセスの妥当性を実証できた。またこの誘導体を用いた構造活性相関研究を実施し、本化合物の阻害活性に必要な構造要素を明らかにすることができた。化合物アレイ法より獲得したヒット化合物群に対して、ビオチン標識Grb2-SH2を用いた二次探索を実施する。有望なヒット化合物が得られた場合は、その鏡像骨格の合成と抗腫瘍活性の評価を実施する。また鏡像体間の分子認識に関する更なる知見を得ることを目的に、酵素を標的タンパク質とした検討についても実施する。これまでに培ったタンパク質合成の技術をもとに、天然型と鏡像型の両方のタンパク質を取得し、これら分子を用いたスクリーニングから、天然物の立体構造に関する生物学的な有用性についてより詳細に考察する。28年度が最終年度であるため、記入しない。引き続き、細胞増殖を担いその機能亢進が腫瘍の増殖に関与するタンパク質に着目し、これらのタンパク質に共通なドメインを標的とする化合物探索を展開する。各種ドメインの合成においては、封入体タンパク質からのrefoldingが報告されている文献や結晶構造の知見を基に計画する。段階的な合成が困難な長鎖ペプチドのドメインに関しては、ライゲーションにより全長を合成することを検討し、必要に応じて脱硫反応を組み合わせる。また化合物アレイ法を用いたスクリーニングに必要な蛍光標識体についても同様の合成経路に基づき調製する。鏡像型タンパク質を用いたキラル天然物及びその誘導体の探索より、各種タンパク質選択的な新規阻害剤の同定を目指す。京都大学大学院薬学研究科医薬創成情報科学専攻ケモゲノミクス・薬品有機製造学28年度が最終年度であるため、記入しない。
新規スメクタイト層間化合物の構築と電子物性の研究

層状粘土鉱物であるスメクタイトと安定なラジカル種を形成することが知られている種々の芳香族アミンを用いて、新しい層間化合物を創製し新奇な無機-有機複合伝導体を開発することを目的として研究を行なった。この結果、スメクタイトの一種である合成サポナイト及びスメクタイトと同じ構造を持つが、より電荷密度の高い合成フッ化四ケイ素雲母を用いて、3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン、N,N,N',N'-テトラメチルベンジジン、N,N,N',N'-テトラメチルフェニレンジアミン、1,5-ジアミノナフタレンの層間化合物の合成を行い、それぞれの粘土層間でのラジカル生成に成功した。得られた試料の粉末X線回折測定により層間化合物の形成による層間距離の増加を調べた結果、アミノ位にメチル基が置換したアミンでは分子面が粘土層に平行になるように寝て層間に入るのに対し、メチル置換していないアミノ基を持つ2つのアミンでは分子面が粘土層に対して垂直に近い配列をとることが明らかとなった。さらにこれら2つのアミン(3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン及び1,5-ジアミノナフタレン)の層間化合物は比較的高い電気伝導性を示すことを明らかにした。この電気伝導性は共存する水分によってサポートされており、真空排気下ではほとんど伝導性を示さない。また、3,3',5,5'-テトラメチルベンジジンの層間化合物では直流電圧を印加した場合には速やかに分極が進み伝導度が減少するのに対し、1,5-ジアミノナフタレン化合物では直流測定でも伝導度の時間変化は見られなかった。この事実は前者が主にアンモニウムのプロトン移動によるイオン伝導が主な伝導機構であるのに対し、後者では電子伝導が電気伝導を担っていることを示唆する。平成10年度科学研究費補助金交付申請書に記載した「研究目的・研究実施計画」に従って研究を行い、以下の実績を得た。1.ホストとしてイオン交換容量の大きい合成フッ化四ケイ素雲母を、ゲストにはテトラメチルベンジジンを用いて、ホスト・ゲスト比が1:1及び1:2の層間化合物を合成した。特に1:1の化合物について、イオン交換法による試料合成時に、懸濁液を長時間攪拌した後に濾取したものは可逆的な吸湿性を示し、熱重量分析等の測定を行った結果、この化合物が多孔性であることが明らかとなった。この試料は、水を吸着させた状態では、室温で3G程度の極めて先鋭化されたESR吸収線を示し、分子間で高速な電子の移動が起こっていることを示唆している。2.上記項目1.で示した試料について、ESRスペクトルは低温になるに従って吸収線幅が広がり、120Kでは8.5G程度となった。これは、電子の移動速度が遅くなっていることを表しており,吸着した水の状態と何らかの関係があるものと思われる。そこで、さらに単純な系としてアルカリ金属イオンをはじめとする種々の陽イオンを層間に持つ粘土鉱物について、層間の吸着水の挙動を固体NMR法により明らかにした。3.室温で直流電気伝導度測定を行った結果、上記の水吸着1:1試料では測定開始直後の10^<-6>から1時間後の10^<-7>Sm^<-1>程度まで伝導度の値が連続的に変化した。この時間変化を示す成分はテトラメチルベンジジニウムのプロトン伝導を示しており、10^<-7>Sm^<-1>の定常値は電子による電気伝導を示唆している。1.前年度は合成フッ化

四ケイ素雲母をホストとして用い、3,3',5,5'-テトラメチルベンジジンとのホスト-ゲスト比の異なる様々な層間化合物を合成し、その電子物性を明らかにした。今年度はフッ化四ケイ素雲母よりも陽イオン交換容量の小さいサポナイトをホストに用いた系を合成し、その物性を調べた。この結果、フッ化四ケイ素雲母では1:1化合物にのみ見られた水の可逆的吸着がサポナイト系では1:3化合物でも観測され、細孔構造をとっていることを明らかにした。2.ゲストとしてN,N,N',N'-テトラメチルベンジジン、N,N,N',N'-テトラメチルフェニレンジアミン、および2,3,5,6-テトラメチルフェニレンジアミンを取り上げ、それぞれフッ化四ケイ素雲母およびサポナイトとの層間化合物を合成し、いずれの化合物も粘土層間でラジカル生成を起こすことを明らかにした。また、前述の3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン-サポナイトおよび前年度に合成したフッ化四ケイ素雲母化合物を合わせた粉末X線回折の結果から、N位にメチル基が置換したゲスト分子は常に粘土層に対して分子平面が平行になるような配列をとるが、N位に置換基を持たないものでは、あるホスト-ゲスト比の範囲内で粘土層に対して立ち上がった分子配列を取ることを明らかにした。4.フッ化四ケイ素雲母をホストとした場合には、生成する層間化合物は粉末状の沈殿物であり、配向試料を得ることは困難であったが、サポナイトを用いた場合には、ゲル状生成物が得られ、このゲルをガラス板などの平板上に展開、乾燥することで容易にフイルム状の試料を作製することができた。このことから、サポナイトをホストとして用いることにより伝導性薄膜の作製が有望であることが明らかとなった。1.合成フッ化四ケイ素雲母をホストとして用い、ゲストとして1,5-ジアミノナフタレンを用いた試料について合成を行った。合成された試料はほぼ黒色であり、電気伝導性を有する可能性が示唆された。この新規化合物について粉末を錠剤成型した試料を用い、直流電気伝導度測定を行った結果、室温で10^<-6>10^<-7>Sm^<-1>の伝導度を観測した。観測された伝導度は直流電流を通電しつづけても減少しないことから伝導性を担っているのはイオンではなく電子であることが明らかとなった。大まかな温度変化の測定からこの化合物の伝導性は半導体的な変化をすることが判明した。また、この試料を高温減圧下で放置すると伝導性を失い、大気中に放置することによりある程度伝導度が回復することが明らかとなった。これは、試料中の水分が電気伝導性に何らかの寄与をしているためであると考えられる。2.ここまでの試料合成は、すべて芳香族アミンの塩酸塩水溶液にスメクタイトおよびフッ化四ケイ素雲母を懸濁させることによるイオン交換法を用いたが、新たに、溶液を使用しない固相反応による合成を試みた。この結果、芳香族アミンの塩を用いた場合にはいずれのアミンでも層間化合物の形成を見なかったが、アミンのままで反応を行なったときには、1,5-ジアミノナフタレンとの層間化合物を得ることに成功した。さらにこの化合物をヨウ素とともに放置することにより、1.で述べたものと同様の電荷移動型の黒色化合物を得た。3.伝導性有機物として知られているBEDO-TTFについて2.と同様にフッ化四ケイ素雲母との固相反応を試み、層間化合物の合成に成功した。
擬二次元積層化合物における多重自由度と新奇物性探索

新たな複合積層化合物の発展を目指し、新規物質探索および物性研究を行った。遍歴磁性体Sr1-xCaxCo2P2系について強磁性量子臨界点のスピンダイナミクスを明らかにした。クラスター磁性体の開拓を行い、Re5.5価のLa3Re10において特異な相転移を見出いだした。また三角格子クラスター磁性体において、それぞれLi2InMo3O8の120度構造磁気秩序、Li2ScMo3O8のスピン液体状態、Nb3Cl8の面間の電荷不均化を見出した。さらに特異なCr4価をもつ1T-CrSe2の物性を明らかにした。これらの結果は積層化合物における新規物性のブレークスルーになりえると考えられる。新たな複合積層化合物の発展を目指し,いくつかの候補物質系について物性研究,および新規物質探索を行った.主な成果のひとつは中間原子価の化合物における新奇物性を目指し,La3Re2O10の物性を明らかにしたことである.La3Re2O10は形式価数5.5価のRe原子が二量体を形成しており,二量体間のd軌道の混成によりクラスター軌道を形成している.クラスター軌道の縮退は全て解けており,二量体内にd電子を3つ有しているので1つの不対電子が残っている.そのためRe2クラスターひとつあたりでS = 1/2の磁性を担っている.また金属クラスター磁性体は,「クラスター内の電荷自由度」をもっていると考えられる.巨視的にはスピンは局在しているが,微視的にはクラスター内のd電子の移動に対応した遍歴電子系の性質をもつため,クラスター内で電荷がいる場所が不確定になること,つまりクラスター内の電荷の揺らぎが存在する.そのためクラスター磁性体では,「クラスター内の電荷自由度」と他の自由度との結合に起因する新しい電子状態が発現することが期待される.こういった背景からLa3Re2O10の純良な粉末試料を合成し,帯磁率,比熱の詳細な温度変化を明らかにし,温度-磁場相図を作成した.またSrCo2P2とその周辺物質ついて遍歴強磁性量子臨界点近傍の物性研究を行った.以前の研究でSrCo2P2における強磁場磁化過程から60 Tでメタ磁性転移を発見している.本研究では,SrCo2P2およびSr1-xCaxCo2P2の多結晶試料の合成を行い,強磁場磁化過程を含む磁気的な性質を調べ系統的なスピンダイナミクスを明らかにした.新たな複合積層化合物の発展と機能性材料の開拓を目指し,いくつかの物質系について物性研究,および新規物質探索を行った.今年度の主な成果は,物質開拓として三角格子クラスター磁性体,Li2AMo3O8 (A=In,Sc)の物性を明らかにした.A=Inの合成報告はあるもののA=Scは新規化合物であり,系統的な物性を調べることによって,三角格子に特徴的な磁性を観測した.A=InはリチウムNMRから約15Kにおいて磁気秩序することを明らかにした.一方,A=Scは比熱測定から0.5Kまで磁気秩序せず,ハイゼンベルグスピン三角格子反強磁性体における基底状態である,スピン液体となっている可能性を見出した.比熱測定の結果から最低温において通常の金属における電子比熱のような比熱項があり,これはスピン流体のフェルミ面の存在を意味している.前年度報告したLa3Re2O10の特異な磁性とあわせてクラスター系に特徴的な新奇物性を発見した.またSrCo2P2とその周辺物質ついて遍歴強磁性量子臨界点近傍の物性研究を行った.以前の研究でSrCo2P2における強磁場磁化過程から60 Tでメタ磁性転移を発見している.今回,NMRを用いて遍歴磁性強磁性体LaCo2P2のスピンダイナミクスを明らかにした.その結果,層状化合物であるにも関わらずかなり等方的なスピン揺らぎを観測した.現在,Sr1-xCaxCo2P2系固溶体のNMR研究を行っており,異方的なスピン揺らぎがメタ磁性転移と強く関わっていることが分かってきている.これらは最終年度において系統的に明らかにする.本研究の目的は擬二次元積層化合物における多重自由度に関する新奇物性探索,およびその物性解明である.今年度物性研究を行ったLi2AMo3O8 (A=In,Sc)において,その内包されるクラスター磁性は,電荷の揺らぎとスピンの自由度が物質の電子状態を決定することに重要な役割を果たしていて,まさに研究目的と合致した物質である.つまり三角格子反強磁性体の理想的な基底状態であるスピン液体と,古典的な120度構造をもつ磁気秩序が,それらスピンと電荷の揺らぎの加減によって入れ替わる非常に興味深い物性を観測した.またSr1-xCaxCo2P2系の理解も深まってきて,真の量子臨界点が近傍にあることはNMRによって初めて解明された.これらの結果は本研究の主題である新奇物性を探索する上で非常に重要な知見であり,今後の深い理解の研究に順調に発展するものと思われる.

新たな複合積層化合物の発展と機能性材料の開拓を目指し,いくつかの物質系について物性研究,および新規物質探索を行った.前年度,物質開拓として三角格子クラスター磁性体,Li2AMo3O8 (A=In,Sc)の物性を明らかにしたことを発展させ,新たにNa3A2(MoO4)2Mo3O8 (A=In, Sc)の物性について明らかにした.この物質の前駆体Na2A2(MoO4)2Mo3O8 (A=In, Sc)はLi2AMo3O8 (A=In,Sc)と同様にMo3O8がクラスターを形成し,それらが三角格子上に並んでいる.しかし前駆体は不対電子を持たないことから強い磁性を持たないが,本研究では前駆体Na2A2(MoO4)2Mo3O8 (A=In, Sc)のナトリウム欠損をソフト化学的な手法で補完し,Na3A2(MoO4)2Mo3O8 (A=In, Sc)を合成し,Mo3O8にスピン1/2を持たせることに成功した。またこれらの物質は有限の反強磁性相互作用をもちながら0.5Kの低温まで磁気秩序しないことを明らかにした.このことは三角格子のスピンフラストレーションによるスピン液体状態を基底状態に持つことを示唆していて,本研究の目的である,積層化合物による新たな物性の発現の実現をみた.また本研究において継続的に研究を行っているSrCo2P2とその周辺物質ついて遍歴強磁性量子臨界点近傍の物性を明らかにした.以前の研究でSrCo2P2における強磁場磁化過程から60 Tでメタ磁性転移を発見している.今回,NMRを用いて遍歴磁性強磁性体LaCo2P2のスピンダイナミクスを明らかにした.またSr1-xCaxCo2P2系固溶体のNMR研究を行っており,異方的なスピン揺らぎがメタ磁性転移と強く関わっていることが明らかになった.新たな複合積層化合物の発展を目指し、新規物質探索および物性研究を行った。遍歴磁性体Sr1-xCaxCo2P2系について強磁性量子臨界点のスピンダイナミクスを明らかにした。クラスター磁性体の開拓を行い、Re5.5価のLa3Re10において特異な相転移を見出いだした。また三角格子クラスター磁性体において、それぞれLi2InMo3O8の120度構造磁気秩序、Li2ScMo3O8のスピン液体状態、Nb3Cl8の面間の電荷不均化を見出した。さらに特異なCr4価をもつ1T-CrSe2の物性を明らかにした。これらの結果は積層化合物における新規物性のブレークスルーになりえると考えられる。本研究の目的は擬二次元積層化合物における多重自由度に関する新奇物性探索,およびその物性解明である.今年度物性研究を行ったLa3Re2O10において,その内包されるクラスター磁性は,電荷の揺らぎとスピンの自由度が物質の電子状態を決定することに重要な役割を果たしていて,まさに研究目的と合致した物質である.実際,その温度-磁場相図に,2本の一次転移線と2本の二次転移線が合わさる非自明な多重臨界点が現れることを明らかにした.このような多重臨界点は,通常の二重臨界点や四重臨界点の場合のような,磁気相互作用や磁気異方性だけでは現れないため,クラスター内の電荷自由度などとのカップリングが存在していることが示唆される非常に興味深い現象である.またSr1-xCaxCo2P2系の量子臨界点がx=0.5付近にあることを明らかにした.同じぐらいの組成で一次相転移的に構造が変化するが,それは磁気量子臨界点を隠すだけで臨界点そのものではなく,真の量子臨界点が近傍にあることはNMRによって初めて解明された.
化学物質に対する生体反応の増悪因子,ことに蛋白摂取不足について

同じように化学物質の曝露を受けても健康を障害し易い人達がいる。こうした高感受性をもたらす因子について検討し、高感受性を制御し健康影響を防止することも必要である。そこで、今回は、蛋白摂取不足について検討した。1)蛋白摂取不足のベンゼン毒性に及ぼす影響:蛋白摂取レベルが軽度低下すると白血球数の減少が著しくなり、蛋白摂取レベルが著しく低下すると各種の健康影響パラメ-タ-が著しく悪化した。2)蛋白摂取不足のトリクロルエチレン毒性に及ぼす影響:軽度の蛋白摂取レベルの低下で腎尿細管細胞の細胞学的、生化学的機能異常が起り、蛋白摂取レベルが半減すると造血系の機能異常が起った。3)骨髄細胞を用いた蛋白摂取不足のベンゼン、トリクロルエチレン毒性に及ぼす影響の検討:蛋白レベルが著しく低下するとベンゼンの骨髄毒性が強く発現する可能性が十分にあると考えられた。トリクロロエチレンはベンゼンとは骨髄に対する作用機序が違うようであるが、蛋白摂取不足により骨髄毒性が高まる可能性があると考えられる。4)蛋白摂取不足のカドミウム毒性に及ぼす影響:蛋白摂取レベルが軽度低下すると腎細胞障害が、さらに低下すると肝細胞障害が強くなるなど、蛋白摂取レベルが低いほどカドミウムの毒性が強くなった。カドミウム毒性の毒性が急に強くなる蛋白摂取レベル(臨界値)は見いだせなかった。5)蛋白摂取不足の鉛毒性に及ぼす影響:蛋白摂取レベルが低くなるほど鉛による体重増加抑制、脂質代謝、血色素代謝の異常が強くなった。ことに、造血機能に対する影響は蛋白摂取レベルが低いほど早期にしかも強く発現しており、鉛毒性の蛋白摂取レベル臨界値は見いだせなかった。6)蛋白摂取不足の水銀毒性に及ぼす影響:蛋白摂取レベルが低いほど、水銀曝露により腎機能異常、脂質代謝異常が強く起こったが、水銀毒性の蛋白摂取レベル臨界値は見いだせなかった。1)蛋白摂取不足のカドミウム毒性に及ぼす影響:[実験計画]6週齢の雄ラット61匹を8群に分け、20(要求濃度)、15、10、7%(低蛋白症の起るより少し高い濃度)の蛋白と0、300μg/gのカドミウムを含む固形飼料を一日に15g、12週間、投与した。経時的に体重、尿検査を行なうとともに、12週目には屠殺し、血液、尿、臓器を用いて、生体影響指標について測定した。[実験結果](1)蛋白15%群では尿中GPT濃度が上昇した。(2)蛋白10%群では、腎重量の増加、血漿セルロプラスミンの著明な低下がみられた。(3)7%群では、体重の著明な減少が見られた。[考察]カドミウムの毒性は、蛋白レベルが低いほど、強かった。従って、カドミウム汚染地域住民やカドミウム作業者に対し、蛋白摂取が少なくならないよう生活指導することが必要と考えられた。[結論]カドミウムの毒性は、7%群では著しく、10%群では強く、15%群ではやヽ増強した。2)蛋白摂取不足のベンゼン毒性に及ぼす影響:[実験方法]蛋白を20%、15%、10%、7%の割合で含む固形飼料を毎日15g投与したラットを0、100、400ppmのベンゼンに一日に7時間、週6日の割合で12週間曝露したのち、60項目の生体指標を測定した。[実験結果]1)体重:100ppmベンゼン曝露で上昇したのち、400ppm曝露で蛋白10と7%群は低下した。2)腎重量:400ppmベンゼン曝露による増加は蛋白レベルの少ないほど著しかった。3)造血(赤血球)系:

ベンゼン曝露による貧血は15%群が最も著しかった。網状赤血球数は軽度に減少したが、蛋白レベルの低いほど少なかった。脾重量はベンゼン曝露によって量ー影響関係のある減少をしたが、蛋白レベルの低いほどその減少が著しかった。4)造血(白血球)系:ベンゼン曝露により白血球数は量ー影響関係のある減少をしたが、蛋白レベルによる違いはなかった。ベンゼン曝露によりリンパ球、胸腺重量が減少したが、蛋白レベルによる違いは認められなかった。「結論」蛋白摂取75%以下でベンゼンの健康影響は増強し、50%以下で著明に増強した。同じように化学物質の曝露を受けても健康を障害し易い人達がいる。こうした高感受性をもたらす因子について検討し、高感受性を制御し健康影響を防止することも必要である。そこで、今年度は、蛋白摂取不足による鉛毒性、水銀毒性の増強とin vitro研究による蛋白摂取不足による有機溶剤毒性の増強について検討した。1)骨随細胞を用いた蛋白摂取不足のベンゼン、トリクロルエチレン毒性に及ぼす影響の検討:蛋白を20または6%含む飼料で3週間飼育したラットの骨随細胞をベンゼンまたはトリクロルエチレンを加えた培養液で培養し、蛋白摂取不足によるベンゼン、トリクロルエチレンの造血毒性の増強を検討した。蛋白レベルが著しく低下するとベンゼンの骨随毒性が強く発現する可能性が十分あると考えられた。トレクロロエチレンはベンゼンとは骨随に対する作用機序が違うようであるが、蛋白摂取不足により骨随毒性が高まる可能性があると考えられた。2)蛋白摂取不足の鉛毒性に及ぼす影響:20、15、10または6%の蛋白を含む飼料を与えているウサギ31羽に0または1mgpb/kgの鉛を週3回、12週間静脈内投与しながら経時的に鉛による生体影響を測定した。蛋白摂取レベルが低くなるほど鉛による体重増加抑制、脂質代謝、血色代謝の異常が強くなった。ことに、造血機能に対する影響は蛋白摂取レベルが低いほど早期にしかも強く発現しており、鉛毒性の蛋白摂取レベル臨界値は見いだせなかった。3)蛋白摂取不足の水銀毒性に及ぼす影響:20、15、10または6%の蛋白を含む飼料を与えているウサギ29羽に0または1mgHg/kgの水銀を週3回、18週間皮下投与しながら経時的に水銀による生体影響を測定した。蛋白摂取レベルが低いほど、水銀曝露により腎機能異常、脂質代謝異常が強く起こったが、水銀毒性の蛋白摂取レベル臨界値は見いだせなかった。
弾性熱流体潤滑理論を応用したすべり軸受実用設計支援ツールの開発と実証試験

本年度は,昨年度までの成果をまとめ,すべり軸受設計にかかる高い人的・時間的コストを低減するための,設計支援ツールを開発した.当設計支援ツールは、数理計画法における最適化の概念を設計に応用し、流体潤滑理論と組み合わせたもので,設計問題をモデル化して設計仕様の望ましさをある一つの関数,すなわち目的関数で表し,目的関数の最大値あるいは最小値を与える設計解をコンピュータ援用で求めることによって,最も望ましい仕様を得ようというものである。本研究の実績を以下に示す.1.対象設計分野として,ティルティングパッドジャーナル軸受を例にとり,軸受幅径比,予圧係数など10項目の設計変数をリストアップした.2.設計変数の変化に対する軸受性能の挙動を詳しく調べた結果,当該設計分野には傾斜投影法と格子点法の長所を組み合わせた最適化手法が適していることを明らかにした.3.また,感度解析の結果,10項目の設計変数のうちパッド厚さなど2項目は軸受性能に及ぼす影響が小さいため定数として扱ってよいことを示した.4.以上の結果をふまえて,熱流体潤滑理論と,傾斜投影法と格子点法の合成解法に基づく最適設計ツールを開発した.5.上記最適設計ツールに,解析計算機能,軸受性能の挙動調査機能,感度解析機能を付加し,ティルティングパッドジャーナル軸受の総合的な設計支援ツールを実現した.6.上記設計ツールを用いた具体的な設計試行例から,得られた設計解の最適性を検証した。欲しい軸受性能を与えればそれが実現できる軸受の仕様を自動的に決定するすべり軸受設計支援ツールの基本仕様として、性能のうちのいくつかの項目については最適化が達成できるような最適化手法をツールに組込むことに決定した。これは従来の設計支援ツールでは、すべての性能についてそれぞれの限界値をクリアできればよしとする方式であったが、実用設計のニーズを調査した結果、特定の性能について可能な限り最大値あるいは最小値が達成できるような最適設計を可能にする設計支援ツールが要望されていることが判ったためである。今年度は、傾斜投影法を利用してしてこのようなニーズに応えることのできる設計支援ツールのプロトタイプをワークステーションを用いて開発することができた。解析部には、軸受の弾性変形計算、油膜動特性計算、新しい離散値化手法を組み込み、さらにはグラフィック機能を強化して、ツールの設計支援能力を大幅に高めることができた。また、設計対象の機械に合せて複数の軸受性能項目それぞれの優先度を設計者が自由に設定できるよう設計の柔軟性を高めることもできた。実証試験を行なうための実験装置の一部改造を行なった。潤滑油供給温度制御装置、軸受偏心測定装置、軸受表面温度測定装置、測定データ集録処理装置などに変更、改良を加え、それぞれに要求される機能が所定通りに達成できることを確認した。本年度は,昨年度までの成果をまとめ,すべり軸受設計にかかる高い人的・時間的コストを低減するための,設計支援ツールを開発した.当設計支援ツールは,数理計画法における最適化の概念を設計に応用し,流体潤滑理論と組み合わせたもので,設計問題をモデル化して設計仕様の望ましさをある一つの関数,すなわち目的関数で表し,目的関数の最大値あるいは最小値を与える設計解をコンピュータ援用で求めることによって,最も望ましい仕様を得ようというものである.本研究の実績を以下に示す.1.対象設計分野として,ティルティングパッドジャーナル軸受を例にとり,軸受幅径比,予圧係数など10項目の設計変数をリストアップした.2.設計変数の変化に対する軸受性能の挙動を詳しく調べた結果,当該設計分野には傾斜投影法と格子点法の長所を組み合わせた最適化手法が適していることを明らかにした.3.また,感度解析の結果,10項目の設計変数のうちパッド厚さなど2項目は軸受性能に及ぼす影響が小さいため定数として扱ってよいことを示した.4.以上の結果をふまえて,熱流体潤滑理論と,傾斜投影法と格子点法の合成解法に基づく最適設計ツールを開発した.5.上記最適設計ツールに,解析計算機能,軸受性能の挙動調査機能,感度解析機能を付加し,ティルティングパッドジャーナル軸受の総合的な設計支援ツールを実現した.
LHRHパルスジェネレーターとは異なる神経回路から成るサージジェネレーターの証明

電気生理学的,免疫組織化学的,分子生物学的手法を用いた本研究により,2つの異なったグループのLHRHニューロンが,それぞれ2つの異なったゴナドトロピンの分泌,つまり排卵性大量分泌とパルス状の分泌,に関与することを明らかにした。LHRHサージジェネレーターの神経回路視索前野領域に存在するLHRHニューロンは,エストロジェン受容要素としてのGABAニューロンとともにLHRHサージジェネレーターを構成し,視交叉上核からの時計情報の入力をうけている。エストロジェンは,mRNA転写調節を介したGABA合成酵素を増加させることによりGABAニューロンの活動に影響をおよぼし,それによりLHRHニューロンを抑制する。このGABAニューロンのLHRHニューロンに対する抑制は,何らかの機序により発情前期の午後に解除され,LHRHのサージ分泌,続いてゴナドトロピンのサージ分泌が惹起される。現在我々は,いかなる機序によりこのGABAのLHRHニューロンに対する抑制が解除されるのか,いかなるニューロンが視交叉上核よりサージジェネレーターへの時計情報を媒介するのかを検討している。LHRHパルスジェネレーターを構成する神経回路視床下部内側底部に存在するLHRHニューロンは,エストロジェンのネガティブフィードバック作用を仲介するオピオイドニューロンとともにパルスジェネレーターを構成する。現在我々は,いかにしてLHRHニューロンが同期して発火するのかの機序に焦点をあて研究を行っている。本年度の研究では、LHRHパルスジェネレーターとオピオイド神経およびLHRHサージジェネレーターとGABA神経の関わりを検討した。I.オピオイドとLHRHパルスジェネレーターの関係(1)卵巣摘除下にオピオイド受容体拮抗剤であるナロキソンを投与すると、血中LH濃度の増加とともに内側視索前野から視交叉上核周辺に存在するLHRH神経細胞の約10-20%にFos様蛋白が発現することが免疫組織化学より明らかと成った。これまでの研究と併せ、これらFos様蛋白を発現するLHRH神経がLHRHパルスジェネレーターを構成する可能性が示唆された。また、ノーザンによる解析から、誘導されたFos様蛋白はmRNAの発現量増加によることが示唆された。一方、c-jun mRNAやjun-B mRNAの発現量には変化がなく、また同時に免疫組織化学によってもLHRH神経と共存するc-jun様蛋白やjun-B様蛋白の発現は検出できなかった。(2)発情前期の午前にナロキソンを投与し、(1)の実験よりも広範囲の前脳領域について検討したところ、Fos様蛋白は視床下部基底部に存在するLHRH神経の約40%に認められた。内側視索前野領域での発現率は(1)の実験と同じく約10%であった。(1)発情前期の午前から正午にかけてGABA_A拮抗剤であるビククリンを投与すると、血中LH濃度のサージ様上昇とともに、内側視索前野周辺に存在するLHRH神経細胞の約40-50%にFos様蛋白の発現が認められた。発情前期午前の生理的食塩水投与対照群や非発情第一日のビククリン投与群でも、Fos様蛋白の発現は様々な脳内部位で認められたが、LHRH神経に共存するものほとんど認められなかった。以上から、オピオイド神経と関わりをもつLHRH神経、GABA神経と関わりをもつLHRH神経が異なる前脳部位に存在する可能性が示唆された。前年度の研究結果をもとにまず追加実験を行い(I)、次いで本年度の研究を行った(II)。I.オピオイドニューロンとLHRHパルスジェネレーターの関係前年度は、ナロキソン投与によりLHRHニューロンにFos様蛋白が発現することを明らかにしたが、今年度は、排卵阻止効果のある麻酔薬ペントバルビタール投与のそれらFos様蛋白発現に対する作用を検討した。その結果、ペントバルビタール前投与は、視床下部内側基底部に存在するLHRHニューロンのナロキソンによるFos発現に対して有意に増強することが明らかとなった。排卵後LHRH

サージ時にLHRHニューロン、に発現するFos様蛋白はこのペントバルビタール前投与により完全に抑制されることから、前年度の結果を併せ考え、(1)LHRHパルスジェネレーターとLHRHサージジェネレーターは、異なるLHRHニューロンは、異なるにより構成されること、(2)それぞれを構成するLHRHニューロンは、前者では主として視床下部内側基底部領域、後者では内視鏡視索前野領域に存在すること、(3)それぞれの神経回路には、前者ではオピオイドニューロン、後者ではGABAニューロンが関与すること、が明らかとなった。(1)逆転写PCR法により生後5日令の雌性ラットの視床下部にはGAD65mRNA、GAD67mRNAおよび胎生期特異的GAD67バリアントmRNAが存在することを確認した。(2)ノーザンブロットにより、GADmRNA発現におよぼすエストロジェンの効果を3日間検討した結果、内側視索前野領域および視床下部内側基底部領域で時間依存的にGAD67mRNAの発現量が増加することが明らかとなった。現在、LHRHサージジェネレーターのGABAニューロンとエストロジェンの関係の詳細を検討している。
南部九州における古墳文化の研究

昭和63年度科学研究費補助金一般研究C(課題番号63510225)による、熊本県水俣市北園遺跡の発掘調査成果は、人骨の発見など多大な成果を上げた。この成果をまとめる基礎作業は、墳墓、副葬遺物、人骨と多枝に渡り、2年を要してようやく報告書を刊行できるまでに到った。平成2年度科学研究費補助金一般研究C(課題番号02610189)の交付が、きわめて大きな支えとなった。まず、鹿児島県吉松町永山遺跡の出土資料の調査により、地下式板石積石室墓の年代の一点を知りえた。今後は、関係深い成川式土器の編年的研究を、更に進める必要があろう。八代海南部以南の古墳の踏査、資料の調査、および古墳の発掘調査への参加等で、重要な成果を上げることができた。最大の成果は、地下式板石積石室墓が消滅すると考えられる5世紀の中頃は、八代海より以南から薩摩半島にかけての地域に古墳がないこと、八代海以南に最大の影響力のある宇土半島の前方後円墳も築造されず、これらの動きが連動している可能性が高いこと。この大変動は、5世紀中頃に越ると考えられることから、継本朝の成立という、古墳時代の日本的規模の大変動に関係していることをも考慮せねばならない。地下式板石積石室墓を初めとした南部九州の古墳文化の研究は、南部九州という辺境の地という視野は最早捨て去らねばならず、日本全体の古墳文化の中で考えねばならないことが、より明らかになりつつあるといえる。
レキシコンに関する総合的研究

日本語,中国語,英語,ドイツ語,フランス語などの東洋の2大言語及び西洋の3大言語の形態現象の分析とその他の言語事実の比較対照分析に基づく理論研究を行い,従来の理論の問題点をいくつか明らかにし,語彙論に関する研究を行った.その結果,主な成果として,次のような成果が得られた:(1)従来の語彙ならびに語形成理論の改良・修正・発展の可能性を検討し,成果を著書や論文として発表した.(2)音節に関する新理論を開発した.(3)言語に関するフラクタル理論を提唱した.(4)様々な言語のボイスを始めとする言語現象に関する新たな知見を明らかにし,それらを著書や論文の形で公開した.加えて,(5)本研究の延長として,「東西言語文化の類型論」特別プロジェクト研究を発足させた.レキシコンに関するデータベースの研究に関しては,語彙研究の知見に基づく,信頼に足る事実を体系的にまとめたレキシコン・データベースを作成する基礎研究を行い,主な成果としては,次のようなものが得られた:(6)逆配列日本語アクセント辞典を作成した.(7)形態論語彙目録を作成した.(8)語彙研究用英語データベースを作成した.レクシコンと関連分野のインターフェイスの研究としては,(a)語彙と統語論のインターフェイスに関する研究,(b)語彙と意味論のインターフェイスに関する研究,(c)語彙と音韻論のインターフェイスに関して,各分野のインターフェイスに関する知見の追求を行い,その成果の一端を『英文法への誘い』(1995)や『筑波大学東西言語文化の類型論特別プロジェクト研究研究報告書』I,Part I and II.(1998)などで発表した.日本語,中国語,英語,ドイツ語,フランス語などの東洋の2大言語及び西洋の3大言語の形態現象の分析とその他の言語事実の比較対照分析に基づく理論研究を行い,従来の理論の問題点をいくつか明らかにし,語彙論に関する研究を行った.その結果,主な成果として,次のような成果が得られた:(1)従来の語彙ならびに語形成理論の改良・修正・発展の可能性を検討し,成果を著書や論文として発表した.(2)音節に関する新理論を開発した.(3)言語に関するフラクタル理論を提唱した.(4)様々な言語のボイスを始めとする言語現象に関する新たな知見を明らかにし,それらを著書や論文の形で公開した.加えて,(5)本研究の延長として,「東西言語文化の類型論」特別プロジェクト研究を発足させた.レキシコンに関するデータベースの研究に関しては,語彙研究の知見に基づく,信頼に足る事実を体系的にまとめたレキシコン・データベースを作成する基礎研究を行い,主な成果としては,次のようなものが得られた:(6)逆配列日本語アクセント辞典を作成した.(7)形態論語彙目録を作成した.(8)語彙研究用英語データベースを作成した.レクシコンと関連分野のインターフェイスの研究としては,(a)語彙と統語論のインターフェイスに関する研究,(b)語彙と意味論のインターフェイスに関する研究,(c)語彙と音韻論のインターフェイスに関して,各分野のインターフェイスに関する知見の追求を行い,その成果の一端を『英文法への誘い』(1995)や『筑波大学東西言語文化の類型論特別プロジェクト研究研究報告書』I,Part I and II.(1998)などで発表した.(I)語彙論・語形成の理論研究:日本語,中国語,英語,ドイツ語,フランス語などの東洋の2大言語及び西洋の3大言語の形態現象の分析とその他の言語事実の分析に基づく理論研究を行い,従来の理論の問題点を明らかにし,語彙論に関する研究を行った.a.各言語の造語現象の体系的分析に基づく理論研究を行った.b.各言語の語彙概念構造とレキシコンを意味論的に関連づけ,その特徴の一端を明らかにした.c.従来の語彙ならびに語形成理論の改良・修正・発展の可能性を検討した.(II)5大言語のレキシコン・データベースの構築:語彙研究の知見に基づく,信頼に足る事実を体系的にまとめたレキシコン・データベースを作成する基礎研究を行った.作成しつつあるデータベースは,(a)日本語の体系的なレキシコン.データベース,(b)英語の体系的レキシコン・データベース,(c)中国語・ドイツ語・フランス語の体系的なレキシコン・データベースである.日本語,英語,ドイツ語,フランス語,中国語に関しては,各言語の比較対照研究により,語彙現象を精密に分析し,体系的なレキシコン・データベースに作成のための基本データベースの拡充に努めた.(III)レクシコンと関連分野のインターフェイスの研究:(a)語彙と統語論のインターフェイスに関する研究,(b)語彙と意味論のインターフェイスに関する研究,(c)語彙と音韻論のインターフェイスに関して,各分野のインターフェイスに関する知見の追求を行った.(I)語彙論・語形成の理論研究:日本語,中国語,英語,ドイツ語,フランス語などの東洋の2大言語及び西洋の3大言語の形態現象の分析とその他の言語事実の比較対照分析に基づく理論研究を引き続き行い,従来の理論の問題点を明らかにし,語彙論に関する研究を行った.a.各言語の統語現象及び造語現象の体系的分析に基づく理論研究を行った.b.各言語の語彙論概念構造とレキシコンを意味論的に関連づけ,その特徴の一端を明らかにした.c.従来の語彙ならびに語形成理論の改良・修正・発展の可能性を検討した.d.日英語の音韻現象の研究を行った.(II)5大言語のレキシコン・データベースの研究:語彙研究の知見に基づく,信頼に足る事実を体系的にまとめたレキシコン・データベースを作成する基礎研究を継続して行った.

日本語,英語,ドイツ語,フランス語,中国語に関しては,各言語の比較対照研究により,語彙現象を精密に分析し,体系的なレキシコン・データベースの作成のための基本データベースの拡充に努めた.(III)レクシコンと関連分野のインターフェイスの研究:(a)語彙と統語論のインターフェイスに関する研究,(b)語彙と意味論のインターフェイスに関する研究,(c)語彙と音韻論のインターフェイスに関して,各分野のインターフェイスに関する知見の追求を行った.(I)語彙論・語形成の理論研究:日本語,中国語,英語,ドイツ語,フランス語などの東洋の2大言語及び西洋の3大言語の形態現象の分析とその他の言語事実の比較対照分析に基づく理論研究を引き続き行い,従来の理論の問題点をいくつか明らかにし,語彙論に関する研究を行った.本研究の延長として,特別プロジェクト研究を発足させた.a.各言語の統語現象及び造語現象の体系的分析に基づく理論研究を行い,成果を発表した.b.各言語の語彙概念構造とレキシコンを意味論的に関連づけ,その特徴の一端を明らかにした.c.従来の語彙ならびに語形成理論の改良・修正・発展の可能性を検討し,成果を発表した.d.日英語の音韻現象の研究を行い,成果を発表した.(II)5大言語のレキシコン・データベースの研究:語彙研究の知見に基づく,信頼に足る事実を体系的にまとめたレキシコン・データベースを作成する基礎研究を継続して行った.日本語,英語,ドイツ語,フランス語,中国語に関しては,各言語の比較対照研究により,語彙現象を精密に分析し,体系的なレキシコン・データベースの作成のための基本データの拡充に努めた.(III)レクシコンと関連分野のインターフェイスの研究:(a)語彙と統語論のインターフェイスに関する研究,(b)語彙と意味論のインターフェイスに関する研究,(c)語彙と音韻論のインターフェイスに関して,各分野のインターフェイスに関する知見の追求を行った.日本語,中国語,英語,ドイツ語,フランス語などの東洋の2大言語及び西洋の3大言語の形態現象の分析とその他の言語事実の比較対照分析に基づく理論研究を行い,従来の理論の問題点をいくつか明らかにし,語彙論に関する研究を行った.その結果,主な成果として,次のような成果が得られた:(1)従来の語彙ならびに語形成理論の改良・修正・発展の可能性を検討し,成果を著書や論文として発表した.(2)音節に関する新理論を開発した.(3)言語に関するフラクタル理論を提唱した.(4)様々な言語のボイスを始めとする言語現象に関する新たな知見を明らかにし,それらを著書や論文の形で公開した.加えて,(5)本研究の延長として,「東西言語文化の類型論」特別プロジェクト研究を発足させた.レキシコンに関するデータベースの研究に関しては,語葉研究の知見に基づく,信頼に足る事実を体系的にまとめたレキシコン・データベースを作成する基礎研究を行い,主な成果としては,次のようなものが得られた:(6)逆配列日本語アクセント辞典を作成した.(7)形態論語彙目録を作成した.(8)語彙研究用英語データベースを作成した.
口蹄疫と類症鑑別が困難な反芻獣のパラポックスウイルス感染症の迅速診断法の開発

口蹄疫と類症鑑別が困難なパラポックスウイルス感染症を迅速に診断するため、パラポックスウイルスに特異的なLAMP法を2種類デザインした。一つは、牛丘疹性口炎ウイルスを100コピー/反応あれば検出できるLAMP法、もう一つは、5種類のパラポックスウイルスをすべて検出できるLAMP法である。また、野外での診断を可能にするため、電源を必要としないコードレス恒温維持装置を製作した。以上より、パラポックスウイルス感染症を野外で迅速に遺伝子診断することが可能となった。口蹄疫との類症鑑別が困難なパラポックスウイルス(PPV)感染症について、農場内だけで完結する新たな迅速診断法を開発することを目的とする。PPV感染症には、牛の丘疹性口炎、偽牛痘、羊や山羊、アカシカ、ニホンカモシカの伝染性膿疱性皮膚炎、ヒトの搾乳者結節、などが含まれる。これらの原因となるPPVとして、牛丘疹性口炎ウイルス(BPSV)、偽牛痘ウイルス(PCPV)、伝染性膿疱性皮膚炎ウイルス(ORFV)、アカシカパラポックスウイルス(PVNZ)、が知られている。本年度は、従来のPCR法に代わるLAMP法を用いて、これらのPPVすべてに利用可能な新たな遺伝子診断法確立を検討した。具体的には、1時間以内でのPPV遺伝子検出を目指し、LAMP法用プライマーをデザインした。それぞれのPPV感染細胞のDNAを用いて検出感度を検討し、PVNZの検出感度が低いが、1時間以内に4種類のPPVすべてを検出する系を確立した。検出感度の向上を目指し、現在さらに反応条件を検討している。そのほか、PPV感染症の中で最も口蹄疫との鑑別が困難なことが多い牛丘疹性口炎の遺伝子診断に焦点を絞り、BPSV検出に最適なLAMP法を検討した。具体的には、BPSVのエンベロープ遺伝子をクローニング後、希釈列を作成し、BPSV遺伝子検出感度が高い反応温度条件を探索した。BPSV遺伝子として10^3コピーまで検出可能な条件が得られたが、現在さらに感度の向上を目指し、反応条件を検討している。本研究は、口蹄疫との類症鑑別が困難なパラポックスウイルス感染症について、新たな迅速診断法を開発することを目的とする。パラポックスウイルス感染症には、牛の丘疹性口炎、偽牛痘、羊や山羊、アカシカ、ニホンカモシカの伝染性膿疱性皮膚炎、ヒトの搾乳者結節、などが含まれ、5種類の原因ウイルスが知られている。いずれもヒトにも感染し皮膚に発痘するため、人獣共通感染症の原因となる。本年度は、前年度に標準ウイルスを用いて開発した2種類のパラポックスウイルス検出用LAMP法(牛丘疹性口炎原因ウイルスの迅速診断に特化した高感度LAMP法と、パラポックスウイルス属すべての検出を目的とした共通LAMP法)について、実際に野外分離ウイルス株、発症部位から抽出したDNAで診断に利用出来るか検討した。開発した2種類のLAMP法により、国内で分離された7株の牛丘疹性口炎ウイルスすべてを1時間以内に検出することができた。しかし、国内発症牛の病変部から抽出したDNA10検体を用いて検討したところ、それぞれのLAMP法で検出できない検体があり、開発したLAMP法は野外での診断に用いることができないと判断した。そこで、LAMP法用のプライマーを再度デザインし直した。新しく改良したプライマーを用いたLAMP法により、すべての検体からウイルス遺伝子を検出することに成功した。実際に農場で、LAMP法を用いてパラポックスウイルス感染症の診断を可能にするため、持ち運びできる遺伝子増幅反応用ヒートブロックを製作した。電源のない放牧場でも利用可能にするため、ヒートブロックを設定温度まで上昇させたあと、保温により温度を維持する装置を目指したが、温度を一定に維持することができなかった。そこで、小型バッテリーを搭載させたコードレスヒートブロックを製作した。小型軽量で1時間以上温度を一定に保つことができたことから、オンサイトでの遺伝子診断の実用化が期待できると思われた。本研究は、口蹄疫との類症鑑別が困難なパラポックスウイルス感染症について、農場内だけで完結する新たな迅速診断法を開発することを目的とする。パラポックスウイルス感染症には、牛の丘疹性口炎と偽牛痘、羊や山羊、アカシカ及びニホンカモシカの伝染性膿疱性皮膚炎、ヒトの搾乳者結節などが含まれる。これらの原因として、牛丘疹性口炎ウイルス、偽牛痘ウイルス、オーフウイルス、アカシカパラポックスウイルスの4種類のウイルスが知られており、それぞれ皮膚に赤色丘疹、結節、びらん、痂皮を形成する病態が共通している。またアザラシパラポックスウイルスも新しいパラポックスウイルスの候補となっており、5種類すべてが人獣共通感染症となる。本年度は、従来の遺伝子診断法であるPCR法に代わり、LAMP法を用いた新たな遺伝子診断法確立を検討した。

遺伝子増幅の標的とした、牛丘疹性口炎ウイルスのエンベロープ領域をプラスミドにクローニングし、希釈列を作成、LAMP法の検出感度を検討し、2種類のLAMP法の開発に成功した。1)牛丘疹性口炎(BPS)ウイルスの検出感度が高いBPS診断用BPS-LAMPは、65°C1時間の条件で100コピーまで検出することができた。PCRでは判定までに約2時間半かかることから診断時間の大幅な短縮に成功した。牛丘疹性口炎の原因となることが知られている3種類のパラポックスウイルスはすべて検出することができた。しかし、それ以外の2種類のパラポックスウイルスを検出することはできなかった。2)パラポックスウイルス(PPV)すべてを共通して検出可能なPPV-LAMPは、BPS-LAMPと比べ、同じ反応条件で検出感度は劣るが、5種類すべてのウイルスが検出可能であり、ヒトと動物のPPV感染症の診断法として有用であることが示唆された。本研究は、口蹄疫との類症鑑別が困難なパラポックスウイルス感染症について、新たな迅速診断法を開発することを目的とする。パラポックスウイルス感染症には、牛の丘疹性口炎、偽牛痘、羊や山羊、アカシカ、ニホンカモシカの伝染性膿疱性皮膚炎、ヒトの搾乳者結節、などが含まれ、5種類の原因ウイルスが知られている。いずれもヒトに感染し皮膚に発痘するため、人獣共通感染症の原因となる。本年度は、前年度に新たに開発したパラポックスウイルス属共通LAMP法と、携帯型コードレス恒温維持装置が、実際に野外での診断に利用できるか検討した。農場内で電気を使わずに、口腔スワブ材料からDNAを抽出する方法として、PURE法を検討した。牛の唾液に牛丘疹性口炎ウイルスを添加、希釈し、DNAを抽出、LAMP法により増幅したところ、唾液(スワブ)1mL中に約300TCID50のウイルス量が存在すれば検出できる感度だった。新しく開発したLAMPプライマーと携帯型コードレス恒温維持装置による遺伝子増幅により、パラポックスウイルス属に属す5種類のウイルスそれぞれの標準株、牛由来野外分離株7株、羊由来野外分離株6株、牛病変部DNA10検体、すべてを1時間以内に検出することができ、その有用性が証明出来た。また、野外での目視判定を容易にするため、羊由来株6株を用いて、目視判定用の検出試薬3種類を比較した。いずれの検出試薬も同程度に判定が容易だったことから、LAMP法を実験室ですでに利用している場合、常温で保存したい場合、安価に検査した場合、それぞれのニーズごとに使い分けられることを明らかにした。これらの成果は、オンサイトでのパラポックスウイルス感染症の診断に大きく貢献するものと思われる。26年度が最終年度であるため、記入しない。獣医感染症学26年度が最終年度であるため、記入しない。4種類のPPV遺伝子を検出できるLAMP法が確立直前まで達しており、計画通りである。開発したLAMP法は、野外の臨床材料を用いると一部検出できないことが判明したことから、再度プライマーをデザインし直し、あらためて条件検討の必要があったため。しかし、診断法の実用化に向けて恒温維持装置の製作に成功したことから、最終的には目的を達成できる見込みである。実験室内で利用可能な、4種類のパラポックスウイルス属共通LAMP法と牛丘疹性口炎ウイルス高感度検出用LAMP法を確立できた。岐阜大学応用生物科学部共同獣医学科食品環境衛生学研究室ホームページ