hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
心不全の骨格筋代謝(酸素分圧・乳酸産生)に対する運動療法の効果

【目的】本研究は、1)心不全患者における運動時の骨格筋での酸素分圧-乳酸濃度の関係、2)心不全患者に対し強心薬を投与したときの骨格筋での酸素分圧-乳酸濃度関係の変化、3)心不全患者の骨格筋の酸素分圧-乳酸濃度関係に対する運動療法の効果、を明らかにすることを目的とした。【方法】運動負荷中の酸素分圧-乳酸濃度関係:心不全患者に対しエルゴメータを用いた運動負荷試験を行い、酸素摂取量の連続的な測定とともに、大腿静脈に留置したカテーテルから1分毎に採血し、酸素分圧、酸素飽和度、乳酸濃度等の測定を行った。強心薬投与:心疾患患者を対象に、ドブタミンを6μg/kg/minを投与した状態とドブタミンを投与しない状態で運動負荷試験を行った。運動療法:心不全患者を運動療法群と対照群に分け、運動負荷試験を運動療法(対照群では通常生活)前と2ヵ月後に行った。運動療法は各症例の最大酸素摂取量の60%に相当する強度の運動を1回15分、1日2回、週4日、2ヵ月間行うように指導した。【結果】骨格筋(大腿静脈)の酸素分圧は運動負荷の開始とともに徐々に低下し、負荷途中で最低値(Critical PO2)に到達した。大腿静脈血の乳酸濃度は酸素分圧がCritical PO2に到達した時点より増加し始めた。CriticalPO2に到達後は、その後の負荷の増量に関わらず酸素分圧はほぼ不変であった。ドブタミンの投与により、嫌気性代謝閾値(AT)は有意に改善し、Critical PO2も有意に増加した。運動療法群としてエントリーした6例のうち5例が運動療法を終了したが、5例とも最大運動能が改善し(54.4±14.5から72.6±24.9W)、うち4例においてはCritical PO2の上昇も認めた(17.0±3.6から18.1±2.9mmHg)。【結論】心疾患患者における強心薬の投与と運動療法は、運動筋の酸素分圧-乳酸濃度関係を右方にシフトさせ、酸素分圧の最低値(Critical PO2)を増加させることが明らかとなった。【目的】心疾患患者において、運動時の運動筋への血流(酸素供給)の程度と乳酸濃度上昇の因果関係については多くの説があり、未だ統一した見解は得られていない。本研究においては心疾患患者を対象に運動負荷試験を行い、骨格筋の酸素分圧と乳酸濃度の関係を詳細に検討し、またこれらの関係に強心薬(ドブタミン)の投与がどのような影響を及ぼすか検討を行った。【方法】心疾患患者10例(62±8歳)を対象に、自覚的最大負荷まで運動負荷試験を行った。運動負荷中は大腿静脈に留置したカテーテルから1分間に採血し、血液ガスと乳酸濃度の測定を行った。なお同一患者において約一時間の間隔を開けて、ドブタミンを6μg/kg/minを投与(静注)下状態においても運動負荷試験を行った。【結果】心拍数は安静時運動負荷中とも、ドブタミンの投与により有意に増加した。

両負荷試験とも大腿静脈血の酸素分圧は運動開始後速やかに低下し、ほぼ最低値(Critical PO2)に到達した後に乳酸濃度の増加が始まった。酸素分圧(X軸)と乳酸濃度(Y軸)の関係はドブタミンの投与に関わらず各症例で同様のL字型のパターンを示したが、Critical PO2はドブタミンの投与により20.5±2.0から21.9±2.4torrへ有意に増加した(p<0.01)。【結論】心疾患患者は運動負荷中に骨格筋での酸素分圧が徐々に低下し、最低値に到達後に初めて乳酸の産生が生じることが判明した。また心疾患患者に対する強心薬の投与は運動筋の酸素分圧-乳酸濃度関係を右方にシフトさせ、酸素分圧の最低値を増加させることが明らかとなった。次年度以降はさらに、心疾患患者に対する運動療法がこれらの骨格筋の酸素分圧-乳酸濃度関係にどのような影響を及ぼすかを検討する予定である。5【目的】本研究は、1)心不全患者における運動時の骨格筋での酸素分圧-乳酸濃度の関係、2)心不全患者に対し強心薬を投与したときの骨格筋での酸素分圧-乳酸濃度関係の変化、3)心不全患者の骨格筋の酸素分圧-乳酸濃度関係に対する運動療法の効果、を明らかにすることを目的とした。【方法】運動負荷中の酸素分圧-乳酸濃度関係:心不全患者に対しエルゴメータを用いた運動負荷試験を行い、酸素摂取量の連続的な測定とともに、大腿静脈に留置したカテーテルから1分毎に採血し、酸素分圧、酸素飽和度、乳酸濃度等の測定を行った。強心薬投与:心疾患患者を対象に、ドブタミンを6μg/kg/minを投与した状態とドブタミンを投与しない状態で運動負荷試験を行った。運動療法:心不全患者を運動療法群と対照群に分け、運動負荷試験を運動療法(対照群では通常生活)前と3ヵ月後に行った。運動療法は各症例の最大酸素摂取量の60%に相当する強度の運動を1回15分、1日2回、週4日、3ヵ月間行った。【結果】骨格筋(大腿静脈)の酸素分圧は運動負荷の開始とともに徐々に低下し、負荷途中で最低値(Critical PO2)に到達した。大腿静脈血の乳酸濃度は酸素分圧がCritical PO2に到達した時点より増加し始めた。Critical PO2に到達後は、その後の負荷の増量に関わらず酸素分圧はほぼ不変であった。ドブタミンの投与により、嫌気性代謝閾値(AT)は有意に改善し、Critical PO2も有意に増加した。運動療法によりAT等の運動能指標が改善した症例は、Critical PO2も上昇した。【結論】心不全患者における強心薬の投与と運動療法は、運動筋の酸素分圧-乳酸濃度関係を右方にシフトさせ、酸素分圧の最低値(Critical PO2)を増加させることが示された。次年度は運動療法の症例数を追加し、運動療法の骨格筋に及ぼす好影響について更に詳細に検討する予定である。【目的】本研究は、1)心不全患者における運動時の骨格筋での酸素分圧-乳酸濃度の関係、2)心不全患者に対し強心薬を投与したときの骨格筋での酸素分圧-乳酸濃度関係の変化、3)心不全患者の骨格筋の酸素分圧-乳酸濃度関係に対する運動療法の効果、を明らかにすることを目的とした。
自伝的記憶に含まれる感情が動機づけに及ぼす影響

本研究の目的は自伝的記憶がその中に含まれる感情を介して動機づけにどのような影響を与えるかを明らかにすることである。自伝的記憶の内容は何らかの具体的経験であり、その認知としての過去の具体的経験が今後の行動をどのように動機づけるかを検討しようとするものである。3つの調査的研究が実施された。研究1は女子大学生のスポーツについての自伝的記憶と動機づけが、続く研究2ではスポーツ振興会に所属して現在もスポーツに励む(動機づけの高い)人と特にそのような会に所属しない看護婦のスポーツについての自伝的記憶が比較された。さらに研究3では大学生を対象にして英語学習についての自伝的記憶と現在の英語学習への動機づけの関係が検討された。現在スポーツをしている社会人は学生時代以降の自伝的記憶が多かったが他の群では学生時代の自伝的記憶が多かった。また英語学習に関しては学校外の出来事に関する自伝的記憶が意外に多いことがわかった。いずれの研究でも自伝的記憶の内容は正の経験として成功経験、正の対人関係、フロー経験、負の経験として失敗経験、負の対人経験、怪我・危険な経験の6つに分類された。正の経験の多くが正の感情を、負の経験の多くが負の感情を伴っており、正の経験は現在のその行動の動機づけを高めていたが、負の経験は必ずしも動機づけを低減させているわけではなかった。初年度は計画どおり運動やスポーツに関する自伝的記憶に限定して、動機づけとの関係を検討した。具体的な方法としては大学生(女子)を対象にして、これまで運動やスポーツに関して強く印象に残っていることを10こ自由記述するという調査法を用いた。ただし、記述する際には、いつ、どこで、どんなスポーツに関して、どんなことがおき、それに対してどのような感情をいだいたのかが含まれるようにした。また、別に動機づけの指標としてどのようなスポーツをやってみたいと思うのか、逆にどのようなスポーツをやりたくないのかを尋ねたり、日頃、どの程度、実際にスポーツをしているのかを尋ねた。自由記述したものを整理するのに時間がかかり、現在はデータの一部をまとめたにすぎないが、以下のような結果がみいだされた。1.自伝的記憶の約3分の1は小学校時代のもので、約4分の1が中学時代のものである。2.全体的には学校の授業での記憶が多いが1番初めに思い出すのは運動会や体育祭での出来事である。3.思い出されるスポーツの種類で多いのはマラソンや水泳などである。4.自伝的記憶の内容はスポーツそのものができるようになったことや優勝したことが4分の1をしめるがスポーツをとおしての人間関係に関連したものも多い。5.生起した感情は正の感情の方が負の感情よりやや多いが大差はない。6.正の感情はそのスポーツの動機づけにつながっているが、負の感情を伴う自伝的記憶は一概に負の動機づけにつながるわけではない。昨年度は主にスポーツに関する自伝的記憶と感情および動機づけに関する調査を大学生と対象に実施した。その結果一部は昨秋の日本心理学会でポスター発表を行った。また、今年の夏にスエーデンのストックホルムで開かれる国際心理学会でも発表の予定である。スポーツの自伝的記憶の内容は競技での成功、失敗経験だけでなく、スポーツを通した正、負の人間関係の思い出、あるいは怪我の体験等が主なものであったが、その時の快・不快の感情が現在のスポーツの動機づけに反映していることが示された。本年度、新しく行った調査は2つあり、1つは昨年度と同様、スポーツの自伝的記憶に関するものである。しかし、今回は特に成人を対象として、日頃、市が主催するスポーツ教室等に参加している人と対照群として全く参加していない人に注目した。まだ、結果を整理していないので何とも言えないが、両群での自伝的記憶の内容はかなり異なるものと予想される。もう1つは領域をかえ、英語学習に関する自伝的記憶と感情、および動機づけとの関係を検討しようとする研究である。大学で英語をとっている学生300名ほどを対象にこれまでの英語学習に関する印象的に残っている記憶について記述させ、その内容と現在の英語学習への動機づけがどの程度予測しうるかをみようとしている。

特に今回はこれまでの動機づけの測定がやや粗雑であったので、それを修正し、多面的に動機づけを据えようとした。すべての研究で使用されている研究法は基本的には同じものでこれを「半構造化された自伝的記憶記述法」をよび、その考え方については2000年3月出版の小嶋秀夫・速水敏彦・本城秀次編「人間発達と心理学」(金子書房)でもふれた。しかし、現在のところ研究結果を論文としてジャーナルに載せたものはない。本研究の目的は自伝的記憶がその中に含まれる感情を介して動機づけにどのような影響を与えるかを明らかにすることである。自伝的記憶の内容は何らかの具体的経験であり、その認知としての過去の具体的経験が今後の行動をどのように動機づけるかを検討しようとするものである。3つの調査的研究が実施された。研究1は女子大学生のスポーツについての自伝的記憶と動機づけが、続く研究2ではスポーツ振興会に所属して現在もスポーツに励む(動機づけの高い)人と特にそのような会に所属しない看護婦のスポーツについての自伝的記憶が比較された。さらに研究3では大学生を対象にして英語学習についての自伝的記憶と現在の英語学習への動機づけの関係が検討された。現在スポーツをしている社会人は学生時代以降の自伝的記憶が多かったが他の群では学生時代の自伝的記憶が多かった。また英語学習に関しては学校外の出来事に関する自伝的記憶が意外に多いことがわかった。いずれの研究でも自伝的記憶の内容は正の経験として成功経験、正の対人関係、フロー経験、負の経験として失敗経験、負の対人経験、怪我・危険な経験の6つに分類された。正の経験の多くが正の感情を、負の経験の多くが負の感情を伴っており、正の経験は現在のその行動の動機づけを高めていたが、負の経験は必ずしも動機づけを低減させているわけではなかった。
腸管筋層における転写因子MITF isoformによるC-KIT発現調節

ヒト結腸におけるc-kitとMITFアイソフォームの発現をヒト結腸から抽出したトータルRNAを用いてRT-PCRを行い検討した。結腸においてはMITFアイソフォームであるMITF-AとMITF-H mRNAの発現は認められたが色素細胞特異的に発現しているMITF-M mRNAは検出されなかった。またc-kit mRNAの発現は認められた。ヒトc-kit遺伝子のプロモーターをルシフェラーゼ遺伝子の上流に組み込んだベクターとMITFアイソフォームの発現ベクターを作製し、c-kit遺伝子プロモーターに対するMITFアイソフォームの転写活性化能をヒト結腸癌由来のDLD-1、ヒト子宮頚癌由来のHeLa、黒色腫由来のHMV-IIを用いてtransient cotransfection assayを行い検討した。しかし、この系ではっきりとしたc-kit promoterに対する転写活性化能を検出し得なかった。続いて肥満細胞由来のHMC-Iを用いてtransient cotransfection assayを行い検討した結果、MITF-Aは少なくとも同プロモーターに対して転写活性化能を有する傾向が見られた。これまでの実験から少なくとも結腸において発現、機能しているアイソフォームはMITF-AもしくはMITF-Hであるという結果が得られた。また肥満細胞由来のHMC-1のみでしか確認できていないが、c-kit promoterに対してMITF-Aは転写活性化能を有していることが確認された。しかし、MITF-HにはAのような転写活性化能は確認できなかった。ヒト結腸におけるc-kitとMITFアイソフォームの発現をRT-PCRを用いて検討した。結腸においてはMITF-AとMITF-H mRNAの発現は見られたがMITF-M mRNAは検出できなかった。c-kit mRNAの発現は認められた。
性能可変オイルダンパーにより長周期巨大地震時の免震建物過大変位を抑制する技術開発

戸建免震住宅を対象に、免震層変位に対応して減衰性能が変化する性能可変オイルダンパーを開発し、その性能確認実験を実施した。性能確認実験結果を受けて、戸建免震住宅に対する有効性を、振動実験と数値解析の両面から検討した。さらに、地震動の入力レベルごとに設計クライテリアを設定し、入力動のレベルごとの設計可能性を検討した。その結果、性能可変オイルダンパーを用いることで、複数の地震入力動に対して同時に、従来の減衰要素と比べて上部構造の加速度応答の上昇を抑制しつつ、免震層変位を低減することが可能であることを明らかにした。新たに考案して特許申請している性能可変オイルダンパーの縮小モデルを製作した。このダンパーを東北大学所有の振動台に取り付けて単体加振実験を行い、所定の変位に達すると小型シリンダーが作動してダンパーの減衰性能が大きくなることを確認した。また、さまざまなパラメータで加振して、性能可変前、後の減衰係数を明らかにするとともに、減衰特性が変化する折れ点のダンパー力の大きさが、小型シリンダーの変位に比例して変化することを示した。これらの結果を基にして性能可変ダンパーの解析モデルを作成した。続いて、1層鉄骨造免震試験体にこの可変ダンパーを設置した振動実験を行った。入力波として記録地震波を採用して実験を行った結果、性能可変させない通常のオイルダンパー設置時の免震層応答変位に対して、可変させた場合にはその値を大幅に抑制できることが分かった。また、可変した際に生じる上部構造物の応答加速度の上昇はそれほど大きくならないことも示した。さらに、単体加振実験に基づいて作成したモデルを用いてシミュレーション解析を行った結果、実験結果とのよい対応が見られ、解析手法の妥当性を明らかにした。さらに、木造免震住宅を想定して、過大応答を抑制するための可変オイルダンパーを設置した場合の地震応答解析を行い、上部建物の応答加速度をあまり上昇させないで、免震層の応答変位を抑制できる可能性を明らかにした。昨年度に引き続き、性能可変オイルダンパーを設置した転がり支承免震試験体を対象として、東北大学振動台による振動実験を再度実施し、性能可変オイルダンパーの一般的特性を評価した。また、旭化成と共同研究を行い、旭化成の技術研究所が製作したすべり支承免震試験体に東北大学の性能可変オイルダンパーを設置し、同技術研究所の振動台で加振実験を行った。その結果、戸建免震住宅でもっとも多く使用されているすべり支承免震建物に対しても、本ダンパーが有効であることを明らかにした。この結果について解析的検討も行い、その成果を日本建築学会東北大会に発表した。また、性能可変オイルダンパーは、免震建物を対象とした場合には、ダンパー長さが大きくなり、実際の戸建住宅に使用する場合に支障があるとの意見に対して、新たにユニフローダンパーを設計し、その試作品を製作した。このダンパーは、油圧室の長さを短くすることにより全長が短くなり、設置しやすくなるので、実用的であることが分かった。実際の戸建住宅への適用性については、設計で想定している中小地震、大地震レベルのほか、想定外の巨大地震に対して、それぞれ、加速度と変位についてクライテリアを定めて、それを満足できるシステムの設計を試みた。この際には、設計パラメータが多種類あるため、パラメトリックスタディに煩雑さが伴うため、最適設計手法を取り入れる試みを行った。その結果、短時間でよいパラメータ設定ができる可能性が明らかになった。来年度、この検討をさらに進め、実際の設計を支援できるツールにしたいと考えている。本研究では、設計で想定されている地震動を上回る巨大地震動や、長周期地震動を免震建物が受けた場合の、免震層の過大変位抑制を目的としている。本年度は、以下の2項目の研究内容を予定していたが、2項目ともに実施することができた。以下に項目別の研究成果を示す。1.すべり支承免震試験体による振動加振実験とその評価(動的実験)作成したすべり支承に、今回開発したユニフロー式性能可変オイルダンパーを設置し、振動台実験によってその特性及びダンパーの効果を検討した。また実験結果と事前のシミュレーション解析結果を比較検討し、解析モデルの妥当性およびその修正を試みた。その結果、シミュレーション解析結果は実験結果を非常に精度よく追跡することができることを明らかにした。また、すべり支承の挙動が非常に安定していること、性能可変オイルダンパーを設置することで、免震層の応答変位を効果的に低減できることを明らかにした。2.戸建免震住宅への適用性検討戸建免震住宅を想定して、過大応答抑制をめざした性能可変オイルダンパーを設置した場合の応答を地震応答解析で検討した。検討には、最適設計手法を利用して、上部建物の応答加速度の上昇を低減しつつ、免震層の応答変位の抑制効果を最大にできるダンパー性能を模索した。また、目標性能を地震動の入力レベルごとに設定し、それらすべてを満たす可能性について検討した。

その結果、従来の粘性系ダンパーでは設計条件を満たすことは不可能であること、本研究で提案した性能可変オイルダンパーでは、設計条件を満たすことが可能であること、を明らかにした。以上の研究成果から、性能可変オイルダンパーを用いることで、現行の免震建物設計の問題点である巨大地震時の免震層過大変形を抑制出来る可能性を明らかにした。
中耳真珠腫におけるマイクロバイオームの検討

近年、米国を中心として消化管や生殖器、皮膚組織などのmicrobiomeを検討し、疾患の発生や予防機序に応用する試みが行われている。中耳は気道粘膜の延長であり、中耳粘膜においても種々の細菌が棲み中耳炎の発症や遷延化に深く関わっていると考えられる。そこで手術時に得られた組織標本から中耳粘膜のmicrobiomeを真珠腫例、非真珠腫例との間で比較検討した。中耳真珠種と非真珠腫性中耳炎の患者の真珠種や中耳粘膜細菌コミュニティを比較した場合、両群で菌種の数に有意な差は認められなかったが、真珠種群において嫌気性菌が真珠種の形成に関わっているのではないかと推測された。近年、米国を中心として消化管や生殖器、皮膚組織などのマイクロバイオーム(microbiome、宿主に生存する微生物コミュニティの構成ゲノムの総称)を検討し、疾患の発生や予防機序に応用する試みが行われており、特に肥満や糖尿病などの代謝疾患で研究が進んでいる。中耳は気道粘膜の延長であり、中耳粘膜には種々の細菌が棲み中耳炎の発症や遷延化に深く関わっていると考えられる。ところが実際に培養できる微生物は10%以下であり、培養できない細菌が中耳炎の遷延化、中耳真珠腫の発症に影響を与えている可能性は大きい。しかしこれまでのところ中耳粘膜におけるmicrobiomeの検討は行われていない。本研究では手術時に得られた組織標本から中耳粘膜のmicrobiomeを真珠腫例、非真珠腫例との間で比較検討し、真珠腫に特異的なmicrobiomeを明らかにすることを目的とする。今年度は真珠腫10例、非真珠腫4例にから組織標本を採取した。真珠腫例では真珠腫上皮と表皮剝屑物、非真珠腫例では中耳粘膜および肉芽組織が検体となった。採取された組織表面の細胞を分離してDNAを精製し、PCR法を用いて細菌に特異的なPCR産物を得て、PCR産物をシーケンサーで解析して遺伝子の配列を決定し、データベースを用いて、真珠腫、非真珠腫例それぞれにおける細菌腫の同定を行なっている。今回の検討では、申請者らが行う手術時に得られた組織標本から中耳粘膜のmicrobiomeを真珠腫例、非真珠腫例との間で比較検討する。この結果、真珠腫例において特異的に発現するmicrobiomeが明らかとなる。今年度は真珠腫例5例、非真珠腫例4例から組織標本を採取した。現在、これらの組織をPCR法を用いて細菌特異的16s rRNAの増幅を行い、シーケンサーで解析して遺伝子の配列を決定し、データベースを用いて、真珠腫、非真珠腫例それぞれにおける細菌腫の同定を行なっている。近年、米国を中心として消化管や生殖器、皮膚組織などのマイクロバイオーム(microbiome、宿主に生存する微生物コミュニティの構成ゲノムの総称)を検討し、疾患の発生や予防機序に応用する試みが行われている。中でも肥満や糖尿病などの代謝疾患で研究が進んでいる。中耳は気道粘膜の延長であり、中耳粘膜には種々の細菌が棲んでいるためマイクロバイオームが中耳炎の遷延化や中耳真珠腫の発症に関連している可能性が高い。しかしこれまでの所、マイクロバイオームと真珠腫の発症についての関連を研究した報告はない。本研究では真珠腫症例から手術時に得られた真珠腫組織のマイクロバイオームを解析し、真珠腫症例と非真珠腫症例で比較検討することにより、真珠腫組織で特異的に発現するマイクロバイオームを検出することを目的とする。今年度は真珠腫症例、非真珠腫症例とも3症例から組織標本を採取した。真珠腫症例では真珠腫組織(真珠腫上皮とdebris)、非真珠腫症例では粘膜組織を検体とし組織表面の細胞を分離してDNAを精製し、PCR法を用いて細菌に特異的なPCR産物を得た。これをシーケンサーで解析して遺伝子配列を決定し、データベースを用いて真珠腫症例、非真珠腫症例それぞれにおける細菌腫の同定を行った。近年、米国を中心として消化管や生殖器、皮膚組織などのmicrobiome(宿主に生存する微生物コミュニティの構成ゲノムの総称)を検討し、疾患の発生や予防機序に応用する試みが行われており、特に肥満や糖尿病などの代謝疾患で研究が進んでいる。しかしこれまでのところ中耳粘膜におけるmicrobiomeの検討はほとんど行われていない。

本研究では手術時に得られた組織標本から中耳粘膜のmicrobiomeを真珠腫例、非真珠腫例との間で比較検討し、真珠腫に特異的なmicrobiomeを明らかにすることを目的とする。真珠腫30例、非真珠腫30例から組織を採取し、DNA精製を行い、細菌特異的遺伝子16s rRNAの存在を全例より確認した。シーケンサーにて解析、遺伝子配列の決定を行い、細菌種の同定を行っている。解析結果が膨大なため、真珠腫・非真珠腫におけるmicrobiomeの差異については今なお検討中である。近年、米国を中心として消化管や生殖器、皮膚組織などのmicrobiomeを検討し、疾患の発生や予防機序に応用する試みが行われている。中耳は気道粘膜の延長であり、中耳粘膜においても種々の細菌が棲み中耳炎の発症や遷延化に深く関わっていると考えられる。そこで手術時に得られた組織標本から中耳粘膜のmicrobiomeを真珠腫例、非真珠腫例との間で比較検討した。中耳真珠種と非真珠腫性中耳炎の患者の真珠種や中耳粘膜細菌コミュニティを比較した場合、両群で菌種の数に有意な差は認められなかったが、真珠種群において嫌気性菌が真珠種の形成に関わっているのではないかと推測された。検体によるデータのばらつきが大きく、現在までの症例数では真珠腫症例に特異的なマイクロバイオームの同定が行えていない。検体数が少ないことと真珠腫症例、非真珠腫症例とも手術時に組織を採取するため細菌感染例が含まれているためと考えられた。耳科学今年度は関連病院からの紹介で真珠腫症例の手術数が増加し、検体が多く確保できる予定である。組織採取については、感染例などでは消炎を行ってから手術を行うなどの改善を行う予定である。今回の検討では、申請者らが行う手術時に得られた組織標本から中耳粘膜のmicrobiomeを真珠腫例、非真珠腫例との間で比較検討することとした。真珠腫10例、非真珠腫4例にから組織標本を採取し、PCR法を用いて細菌特異的16s rRNAの増幅を行い、シーケンサーで解析して遺伝子の配列を決定し、データベースを用いて真珠腫、非真珠腫例それぞれにおける細菌種の同定を行っている。しかし検体によるデータのばらつきがまだ大きく、真珠腫例における特異的なパターンが検出されていない。真珠腫例において特異的に発現するmicrobiomeを明らかにすることが目的である。今年度は真珠腫例5例、非真珠腫例4例から組織標本を採取した。現在、これらの組織をPCR法を用いて細菌特異的16s rRNAの増幅を行い、シーケンサーで解析して遺伝子の配列を決定し、データベースを用いて、真珠腫、非真珠腫例それぞれにおける細菌腫の同定を行なっている。しかし検体によるばらつきが予想より大きく、まだ真珠腫例に特異的なパターンが検出されていない。検体組織数が少なく、PCR解析に伴う費用が見積もりより少なかったため。真珠腫手術例における検体組織摘出法の工夫が必要と考える。近年の光学医療機器の進歩により真珠腫の早期発見例が多く、大量の真珠腫塊が得られにくいという実情がある。
モザイク回折格子の試作研究

1.エッシェル回折格子(20cm×10cm)2枚を組み合わせたモザイク回折格子制御台、及び、この性能を調べる焦点距離2mの分光光学系を試作した。2.固定した回折格子に対して、動く回折格子の必要とする制御精度は回転で0.1秒角以下、移動で0.1ミクロン以下と見積られたが、センサ-付ピエゾ素子と板ばね装置の組合せはこの条件を満たした。3.光源として赤レ-ザ-(6328AÅ)、緑レ-ザ-(5435AÅ)のような強力な単色光を用いれば、容易に2枚の回折格子の反射光の向きと位相を合わせられることが分った。順序としては、まずゼロ次光で回折格子の波長方向の回転と拜みを合わせ、次いで、回折光で回折格子の法線軸まわりの回転で向きを合わせ、最後に回折格子の移動で干渉像を得ることができる。4.上記3の手続では、レ-ザ-光の波長では位相が合うが、一般にはレ-ザ-波長から離れると共に位相がずれてくる。広い波長域で位相を合わせるためには、2枚の回折格子面が同一平面内になるようにせねばならぬ。白色光ハロゲン光源でゼロ次光を使った実験を行ったが、光源が暗いためよいデ-タが得られなかった。別の方法も何通りか考えられてはいるが、まだこれという調整法は見つかっていない。5.3の手続きで得られた干渉像がどの位の時間継続して見られるかをテレビカメラで録画した。実験は温度変動が1°C以内の部屋で行われたが、少くとも2時間は干渉像の変化が見られなかった。温度変化の影響を避けるため、制御台の材料としては低膨張鋳鉄、回折格子ブランクにはゼロデュアを使用してある。1、エッシェル回折格子(10cm×20cm)2枚をミルトン・ロイ社より購入し、飛騨夫文台にて性能調査を行った。詳しい調査は回折格子を分光器として組みこまなければできないことが分り行えなかったが、2枚の外観の詳細比較から両者が同じ母型からつくられた低膨張率材質ゼロデュアのレプリカであり、当実験に適したものであることを確認した。2、1989年にピエゾ素子と板ばねを組み合わせた1軸の微小回転制御台を試作し、これを用いた実験によってピエゾ素子がその時の測定系の感度<0.05>^^^<11>を上まわる制御能力を示すことが分っていた。この結果に基き、2枚の回折格子を並列制御する方式としてセンサ-付ピエゾ素子と板ばねの組み合せを採用することにした。また温度変化の影響を最小に押えるために新素材の低膨張鋳鉄を用いることにした。3、上記により制御台の仕様を決定し、設計試作を行った。4、試作機の制御性能をニコン大井製作所においてレ-ザ-を用いて調査した。観察光学系による詳しい調査は次年度であるが、レ-ザ-ビ-ムのふれからは<0.01>^^^<11>に近い制御能力が期待できた。5、モザイク回折格子の精密測定光学系として15cm中のダブレットレンズ(焦点距離2250mm)を用いた分光器系を採用することにし細部の仕様をつめている。また、輝線光源としては並列調節用として水銀放電管、位相調整用として2種類のHeーNeレ-ザ-を検討中である。1.前年度製作したモザイク回折格子制御台について、ピエゾ素子による制御性能をコリメ-タ-で調べ、0.1秒角,0.1ミクロンの制御性能があることを確かめた。また、エッシェル回折格子単体についても干渉計を用いて波面のひずみがλ/10程度であることを確認した。

2.焦点距離2mの分光光学系をつくり、モザイク回折格子の動作テストを行った。光源としてレ-ザ-光を用いた場合には、容易に、2枚の回折格子の反射方向と波面位相を合わせられることが分った。但し、レ-ザ-波長から離れて広い波長域で方向位相を合わせようとするとこれでは不十分で、種々の方法を試みたが研究期間の間には結論を得られなかった。3.レ-ザ-光で方向位相を合わせた状態がどの位続くか、ビデオカメラで録画した。実験は温度変動が1度以内の部屋で行われ、2時間までは2面の回折格子のつくる干渉像がくずれないことが観測された。4.広い波長域で2枚の回折格子反射光の方向位相を合わせるにはゼロ次光を使用するのが良いと考えられる。二つ方法があって、一つはレ-ザ-光で方向位相合せを行った後制御台を回転させて位相のくずれ方をみる、他は白色光々源を用い一枚の回折格子を前後させて干渉の強く現れるところを探すことである。現在やりかけている実験である。
蛋白脱リン酸化酵素阻害剤トートマイシンの作用機構に関する化学的研究

1)分子レベルでの研究を進める場合、トートマイシンの化学構造を正しく決定する事は最重要課題である。トートマイシンより得られるフラグメントの化学合成に成功して、不明であったトートマイシンの部分構造を確定した。2)トートマイシンから逆合成した3つのセグメントA、B、Cの立体選択的合成に成功した。無水マレイン酸骨格を有するセグメントAの合成はフランの光増感酸素酸化を用いることによって達成した。アミノ酸D-バリンを出発原料として、立体選択的四酸化オスミウム酸化反応を用いてセグメントBの有する3つの不斉中心を構築した。そしてジチアンアニオンとエポキシドとのカップリング反応を用いてセグメントBの合成を完了した。ピラノース糖を出発原料とし、コバルト錯体を用いた疑エナンチオ選択的ヘテロ共役付加反応を開発して、セグメントCの立体制御合成を行った。3)スルホンカルバニオンとエポキシドの反応、改良山口法を用いたエステル化反応によってセグメントA、B、Cをカップリングしてトートマイシンの有するすべての炭素骨格と不斉中心が揃った化合物を得た。無水マレイン酸部分の構築と脱保護を行い、トートマイシンの全合成を完了した。4)分子力場計算と超伝導核磁気共鳴装置による立体配座解析を行い、溶液中における立体化学を決定した。5)合成中間体を用いて、トートマイシンの誘導体を合成して、阻害活性の評価を行った。そして阻害活性発現に必要となる官能基を決定した。蛋白脱リン酸化酵素阻害剤トートマイシンから逆合成した3つのセグメントA、B、Cの立体選択的合成に成功した。Evansの不斉アルドール反応を改良して、合成ステップを従来法に比べて2段階短縮した。これによって、大量合成によるセグメントAの供給が可能となった。ピラノース糖を出発原料とし、コバルト錯体を用いた疑エナンチオ選択的ヘテロ共役付加反応を開発して、セグメントCの立体制御合成を完了した。またスルホンカルバニオンとエポキシドの反応、改良山口法を用いたエステル化反応によってセグメントA、B、Cをカップリングした。これによってトートマイシンの有するすべての炭素骨格と不斉中心が揃った化合物を得た。現在、最終段階である無水マレイン酸部分の構築と脱保護を検討中である。また平行して合成中間体を用いてトートマイシンの活性発現に必要と推定される合成誘導体を調製した。この化学合成品を用いて阻害活性の評価、分子力場計算と超伝導核磁気共鳴装置による立体配座解析を行い、活性発現機構の解明を目指している。2)トートマイシンから逆合成した3つのセグエントA、B、Cの立体選択的合成に成功した。アミノ酸D-バリンを出発原料として、立体選択液四酸化オスミウム酸化反応を用いてセグメントBの有する3つの不斉中心を構築した。ピラノース糖を出発原料とし、コバルト錯体を用いて疑エナンチオ選択的ヘテロ共役付加反応を開発して、セグメントCの立体制御合成を行った。3)スルオンカルバニオンとエポキシドの反応、改良山口法を用いたエステル化反応によってセグメントA、B、Cをカップリングしてトートマイシンの有するすべての炭素骨格と不斉中心が揃った化合物を得た。4)分離力場計算と超伝導核磁気共鳴装置による立体配座解析を行い、溶液中における立体化学を決定した。

5)合成中間体を用いて、トートマイシンの誘導体を合成して、阻害活性の評価を行った。そして阻害活性発現に必要となる官能基を決定した。
ユビキチンネオバイオロジー：拡大するタンパク質制御システム

本研究課題は平成24-28年度に推進した新学術領域研究「ユビキチンネオバイオロジー:拡大するタンパク質制御システム(ユビキチン制御)」の研究成果のとりまとめを目的とした。当該新学術領域ではユビキチン系が分解以外にも多様な様式でタンパク質機能を調節して多彩な生命現象の制御系として機能していることを明確とした。さらに、ユビキチン自身の翻訳後修飾(リン酸化・アセチル化)、や分岐ユビキチン鎖などの新たなユビキチン修飾を発見するなどの大きな功績があった。本研究課題ではそれらの成果のとりまとめを行った。1.領域終了シンポジウム:拡大するタンパク質5年間の研究期間中、当該新学術領域の班会議は日本のユビキチン研究の研究者を集結する研究発表会としての機能を果たしていた。本年度は班会議の代わりに平成30年1月18-20日に「ユビキチン研究会」を領域終了シンポジウムとして開催し、110名程度が参加した。2.ユビキチン研究情報窓口の維持:領域研究期間中は当該領域研究に参画した研究者が作製したユビキチン研究用の研究試料を領域内に限って共有していたが、領域終了後は研究コミュニティーに公開した。3.領域ホームページの維持:今後もユビキチン研究の意見交換の場として当該領域のホームページを維持するので、研究情報交換窓口、ユビキチン研究論文情報交換、ユビキチン研究会のアナウンスなどができるように同ホームページを改訂した。4.研究成果報告書:平成30年6月までに研究成果報告書を作成して、改訂した領域ホームページに記載する。29年度が最終年度であるため、記入しない。
過形成副甲状腺に対する遺伝子導入とアポトーシス誘導に関する分子生物学的研究

基礎的研究に有用な副甲状腺細胞のcell lineなどがないため、遺伝子導入を用いて標的遺伝子または遺伝子産物の過剰発現や発現の抑制による副甲状腺細胞の変化を検討する研究方法を確立するため、アデノウイルスをベクターとした遺伝子導入システムを開発した。さまざまな濃度のアデノウイルスを副甲状腺内に直接注入し、経時的に副甲状腺を摘出し、副甲状腺細胞におけるアデノウイルスの感染状況を検討することで、至適ウイルス濃度と効果を検討するための至適なタイミングを明らかにした。これらの結果をもとに、vitamin D receptor(VDR)およびCa-sensing receptor (CaSR)のcDNAを導入したアデノウイルスを副甲状腺細胞に感染させ、これらの遺伝子産物の副甲状腺細胞における発現量と機能の変化を検討した。なお、コントロールとしてLacZを導入したアデノウイルスを用いた。免疫組織化学的手法により、これらのウイルスが感染した副甲状腺では、これらの発現も著明に増加していることが確認された。また、前者ではビタミンDに、後者ではCaに対する副甲状腺の感受性の改善もみられ、導入した標的遺伝子または遺伝子産物の機能も確認された。さらに、これらの遺伝子を導入後、それぞれビタミンDまたはCaの投与後に副甲状腺細胞のアポトーシス誘導の変化について、TUNEL染色、DNA電気泳動、電子顕微鏡による形態学的評価により検討した。これらの治療を受けた副甲状腺では、TUNEL陽性副甲状腺細胞数が有意に高値であり、DNA電気泳動および電子顕微鏡的に副甲状腺細胞のapoptosis誘導が確認された。こうした変化はビタミンDやCaの投与量に依存して増加していた。本研究により、遺伝子導入を用いて標的遺伝子または遺伝子産物の過剰発現や発現の抑制による副甲状腺細胞の変化を検討する研究方法を確立することができた。さらに副甲状腺細胞の機能の調節に重要な役割を持つビタミンDやCaとアポトーシスの関係も明らかにすることができた。部分腎摘出術後、高リン(P)・低Ca食で8週間飼育したSDラットに対し、外科的に副甲状腺を剥離し、顕微鏡下にてVDR・CaSR・LacZを導入したアデノウィルスを副甲状腺内に直接注入した。24時間後に副甲状腺を摘出し、免疫組織学的VDRおよびCaSR染色、TUNEL染色、DNA電気泳動、電子顕微鏡による形態学的評価をした。注入前および副甲状腺摘出直前の血清Ca・P・intact-PTH値の変化を各遺伝子導入間で比較した。VDR遺伝子導入された副甲状腺では、VDR陽性副甲状腺細胞数がその他の遺伝子を導入された副甲状腺と比較して、有意に高値であった。CaSR遺伝子導入についても同様であった。また、VDRおよびCaSR遺伝子導入された副甲状腺では、LacZ遺伝子を導入した副甲状腺と比較してTUNEL陽性副甲状腺細胞数が有意に高値であり、DNA電気泳動および電子顕微鏡的に副甲状腺細胞のapoptosis誘導が確認された。さらに同一ラットに対し、一側ずつの異なる遺伝子を導入することにより、同様の結果を確認した。血清intact-PTH値はVDRおよびCaSR遺伝子を導入後、有意に低下した。アデノウィルスによるVDRおよびCaSR遺伝子導入は、副甲状腺細胞にこれらの蛋白を発現させ、vitamin DやCaに対する感受性の改善によるPTHの低下や副甲状腺細胞のapoptosisを誘導することが示唆された。
Bio-imaging without targets

ハイパースペクトルカメラと様々なイメージング技術を併用して、無染色の様々な生物標本から有用な情報を検出することを試みてきた。本年は特に無染色脳標本にこの技術を適用することにより、脳地図作成を再現性良くかつ簡便に行うことが可能であるかについて集中して検討を進め、大きく進展させることができた。ハイパースペクトルカメラを用いて、マウスおよびキンカチョウの無染色脳切片の透過光から、透過率スペクトルを取得した。ハイパースペクトルカメラは100以上に分光してスペクトルを取得でき、無染色脳切片から構造検出を行うための大規模データが得られる。また、この撮影は他の無染色手法と比較して高速であり(0.01 ms/pixel)、1000×1000 pixel画像を約10秒で取得できる。一方、ハイパースペクトルイメージングでは数百万pixel分のスペクトル解析が必要であり、そのデータ量は膨大である。そこでフェーザ解析を透過率スペクトルに適用した。この手法は、多重蛍光染色におけるスペクトル分離などにおいて、その有用性が示されている。これによりハイパースペクトルイメージにおける1 pixelが保持する透過率スペクトルを、その全波長帯域のスペクトル形状に基づいて、フェーザ平面上の一点に変換できる。無染色脳切片のハイパースペクトルイメージを取得し、それらを構成する全ての透過率スペクトルをフェーザ平面状にマッピングした。これにより解析するデータ量を60分の1以下に圧縮できた。その分布に対し混合ガウシアンモデルのフィッティングをし、フェーザ平面状に強度分布を作成後、脳切片を再画像化した。この画像は、脳切片の組成の差異を検出していた。統一規格のガウシアンモデルを、マウスおよびキンカチョウの脳切片全体を構成する約1億個の透過率スペクトル群に対して適用することで、脳切片全体のイメージングに成功した。
分子病態を非侵襲的に可視・数値化し、治療へ応用可能な新たな医療画像システムの開発

本研究では、磁気共鳴代謝イメージング装置(DNPーMRI装置)を用い、酸化ストレスやミトコンドリア機能異常が進行と共に変化する事が報告されているヒトおよびマウスのNASHモデルにおいて、生体内の酸化ストレスやミトコンドリア機能を非侵襲的に可視化し、NASHの病態を定量的に評価可能かどうかを明らかにすると共に、NAFLD/NASHの病態進行機序を解明する。
蛋白質の全電子計算手法を統合した高精度分子動力学シミュレーション法の開発

本研究課題の目的は、バイオインフォマティクス分野の二つの主要な計算手法である蛋白質の分子動力学(MD)シミュレーションと蛋白質の非経験的全電子状態計算とを融合することによって、従来のMDシミュレーションの精度を高めることであった。具体的には、研究分担者が開発に加わっていた蛋白質の全電子状態計算プログラムProteinDFと、研究代表者が単独で開発したMDシミュレーションプログラムCOSMOS90とを統合することによって、蛋白質の全電子状態計算をMDシミュレーションの数千ステップ毎に行うことを目指していた。本研究課題の目的を達成するために、まず、蛋白質の原子電荷を精度よく決定するための新たな計算手法を開発した。低分子の原子電荷の計算において、すでに、mulliken電荷よりもESP電荷が優れていることが示されていた。しかし、蛋白質のような巨大な分子については、ESP電荷を計算することが困難である。なぜなら、蛋白質に埋もれているアミノ酸残基については、ESP電荷を決定するための分子表面を作り出すことが困難だからである。そこで、我々は、分子を幾つかの部分(フラグメントと呼ぶ)に分け、フラグメントを構成する局在化軌道(LO)からESP電荷を求める方法を考案した。我々の方法によって、蛋白質の部分構造であるα-helixとβ-sheetのESP原子電荷が精度よく計算できることを確認した。水中の小ペプチド(グリシン12残基)について、実際に、ProteinDFによるESP原子電荷の計算とそれを使ったCOSMOS90によるMDシミュレーションを行うことに成功した。ここで、12残基グリシンの電子状態計算を行う際に、周囲の水分子を外部点電荷として取り入れた。我々の方法を水中の蛋白質について適用することは、原理的に可能である。しかし、実用化するためには、LO計算のアルゴリズムを現在のO(N^4)から少なくともO(N^2)に高速化する必要がある。これが、実用化のための今後の課題として残った。本研究課題では、バイオインフォマティクス分野の二つの主要な計算手法である蛋白質の分子動力学(MD)シミュレーションと蛋白質の非経験的全電子状態計算とを融合することによって、従来のMDシミュレーションの精度を高めることである。具体的には、蛋白質の全電子状態計算にはプログラムProteinDF(研究分担者が開発に携わった)を、そしてMDシミュレーションにはプログラムCOSMOS90(研究代表者が開発した)を使用し、両プログラムを融合することによって、蛋白質の全電子状態計算をMDシミュレーションの数千ステップ毎に行う。当初の計画では、第一段階でCOSMOS90とProteinDFとの統合モジュールの開発を、第二段階でProteinDFによる原子電荷計算モジュールの開発を行う計画であった。しかし、第二段階の新しい試み(局在化軌道による原子電荷の計算)が成功するか否かによって、研究計画全体が達成できるか否かが決まるために、まず、第二段階の研究に着手することにした。ProteinDFの開発を現在推進している佐藤ら二名(東大生産研)を、本研究課題の旅費を使って弘前大学に招き、本研究課題の代表者と分担者とを交えた四名による議論を行った。更に、佐藤らの協力を得て、ProteinDFを弘前大学のPCクラスタ(8ノード)に移植し、正常に動作させることができた。ProteinDFを用いて小ペプチド(グリシン12残基)の非経験的全電子状態計算を行って、ペプチドの一部のアミノ酸の原子電荷を決定するために、まず、アミノ酸毎の局在化軌道をProteinDFによって作り出した。この局在化軌道からアミノ酸毎の電子密度分布を得た。この電子密度分布が周囲に作り出す静電ポテンシャルを再現するようにESP電荷をMerz-Kollman-Singh(MKS)法により求めることに成功した。

現在、ESP電荷の計算精度の詳細な検討を行っている。本研究課題の目的は、バイオインフォマティクス分野の二つの主要な計算手法である蛋白質の分子動力学(MD)シミュレーションと蛋白質の非経験的全電子状態計算とを融合することによって、従来のMDシミュレーションの精度を高めることであった。具体的には、研究分担者が開発に加わっていた蛋白質の全電子状態計算プログラムProteinDFと、研究代表者が単独で開発したMDシミュレーションプログラムCOSMOS90とを統合することによって、蛋白質の全電子状態計算をMDシミュレーションの数千ステップ毎に行うことを目指していた。平成18年度においては、まず、平成17年度に開発した局在化軌道に基づいたESP原子電荷を求める方法(ESPLOと呼ぶ)を、蛋白質の部分構造であるα-helixとβ-sheetに適用して、ESP原子電荷が精度よく計算できることを確認した。我々は、α-helixとβ-sheetとを、それぞれ幾つかの部分(フラグメントと呼ぶ)に分け、フラグメントを構成する局在化軌道(LO)からESP電荷を求めた。この方法を蛋白質に適用するときには、同様に蛋白質を幾つかのフラグメントに分割して、ESP電荷を求めることが可能である。したがって、蛋白質の原子電荷をより正確に求めるための方法を、具体的に提示したことになる。ただし、大きな蛋白質に実用化するためには、LO計算のアルゴリズムを現在の0(N^4)から少なくとも0(N^2)に高速化する必要がある。これは、今後の課題である。次に、水中の小ペプチド(グリシン12残基)について、実際に、ProteinDFによるESP原子電荷の計算とそれを使ったCOSMOS90によるMDシミュレーションを行うことに成功した。ここで、12残基グリシンの電子状態計算を行う際に、周囲の水分子を外部点電荷として取り入れた。この方法を水中の蛋白質について適用することは、原理的に可能である。これらの計算手順は、まだ完全には自動化されていない。完全自動化と高速化が今後の課題として残った。
環境汚染物質の発癌性に関する研究

PCBの口腔組織におよぼす影響について,発癌という観点から病理組織学的,生化学的および分子生物学的に検討を行った.唾液腺組織においては,PCBを大量に投与した場合は,急性毒性として組織学的変化が認められ.生化学的にはライソゾーム系酵素の関与が認められた.少量投与した場合には,アポトーシスの関与が認められた.同じ唾液腺組織でもその影響については.耳下腺および顎下腺では若干の相違が認められ,耳下腺の方が強く影響が出る傾向が認められた.耳下腺におけるアポトーシス関連酵素については,PCB投与群において,Bel-2およびBaxの関与が示唆された.PCBの骨芽細胞および破骨細胞におよぼす影響を調べた研究では,PCB低濃度では,細胞増殖能は影響されないものの,骨芽細胞においては,ALPおよびPGE2の活性の増加が認められた.PCBにより骨芽細胞から破骨細胞が誘導されさらにその破骨細胞にPCBが作用して骨吸収が進んでいく可能性が示唆された.また,Bisphenol AとPCBを作用した実験では,さらに,オステオポンチンへの影響が認められた.これらの結果から癌細胞の顎骨浸潤への影響も示唆された.最後に,口腔扁平上皮癌細胞株におよぼすPCBの影響について検討した.口腔扁平上皮癌細胞は使用したすべての細胞株において,PCB低濃度で増殖傾向を示し,PCB高濃度で増殖抑制傾向を示した.P53とp53R2に関する検討結果では,癌化した細胞については,PCBの作用とそれらの発現については相関性が認められなかった.PCBの口腔組織におよぼす影響について,発癌という観点から病理組織学的,生化学的および分子生物学的に検討を行った.唾液腺組織においては,PCBを大量に投与した場合は,急性毒性として組織学的変化が認められ.生化学的にはライソゾーム系酵素の関与が認められた.少量投与した場合には,アポトーシスの関与が認められた.同じ唾液腺組織でもその影響については.耳下腺および顎下腺では若干の相違が認められ,耳下腺の方が強く影響が出る傾向が認められた.耳下腺におけるアポトーシス関連酵素については,PCB投与群において,Bel-2およびBaxの関与が示唆された.PCBの骨芽細胞および破骨細胞におよぼす影響を調べた研究では,PCB低濃度では,細胞増殖能は影響されないものの,骨芽細胞においては,ALPおよびPGE2の活性の増加が認められた.PCBにより骨芽細胞から破骨細胞が誘導されさらにその破骨細胞にPCBが作用して骨吸収が進んでいく可能性が示唆された.また,Bisphenol AとPCBを作用した実験では,さらに,オステオポンチンへの影響が認められた.これらの結果から癌細胞の顎骨浸潤への影響も示唆された.最後に,口腔扁平上皮癌細胞株におよぼすPCBの影響について検討した.口腔扁平上皮癌細胞は使用したすべての細胞株において,PCB低濃度で増殖傾向を示し,PCB高濃度で増殖抑制傾向を示した.P53とp53R2に関する検討結果では,癌化した細胞については,PCBの作用とそれらの発現については相関性が認められなかった.実験動物としてddyマウスを用いた.環境汚染物質としては,PCB,PCDF,PCDDを使用し,マウスに腹腔投与する.投与後1日,4日,7日,2週,3週,4週,8週,12週,16週に屠殺する.対照群は溶媒のみを投与し,同様の実験系で経日的にに屠殺した.各郡のマウスを潅流固定し,舌,頬粘膜,歯肉および皮膚を切除し,光顕用と電顕用の資料を作製した.(1)光顕観察:組織をパラフィン包埋し,薄切後,HE染色を施し,光顕観察を行った.舌および頬粘膜において投与後一週以降の郡で,空砲変性および軽度の炎症所見がみられた.(2)増殖因子に関する免疫組織化学:パラフィン切片あるいは凍結切片を用いて,PCNA,Ki-67のモノクロナール抗体を用いて免疫組織化学染色を行った.これらの染色においては,対照群と比較して有意な差はみられなかった。(3)アポトーシスに関して,baxおよびbcl-2に関する免疫組織化学,およびTUNEL法による形態学的検討を行った.舌および頬粘膜において,投与後1週以降の実験群では,アポトーシスが誘導されている可能性が示唆された.(4)癌関連遺伝子としてp53およびp21の免疫組織化学染色を行った.p53に関しては,経日的に陽性細胞の増加が認められた.p21は,対照群と実験群で有意差が認められなかった.(5)電顕観察:通法に従い樹脂包理切片を作製し,酢酸ウランおよびクエン酸鉛の二重染色を施し観察した.投与後1週の実験群で,核濃縮やミトコンドリアの異常を示す個体が多く認められた.ddyマウスに,環境汚染物質として,PCB,PCDF腹腔投与し,舌,頬粘膜および皮膚にDMBAを塗布し,投与後一定期間ごとに経日的に屠殺した.対照群は溶媒のみを投与し,同様に経日的に屠殺した.形態学的解析として各群のマウスを潅流固定し,舌,頬粘膜,皮膚を切除し,光顕用と電顕用の資料を作製した.浸漬固定を24時間行い,光顕観察のため組織をパラフィン包埋後薄切し,HE染色をを行った.増殖因子に関する免疫組織

化学としてパラフィン切片用いて,PCNA,Ki-67のモノクロナール抗体を用いて免疫染色を行った.アポトーシスに関しては,TUNEL法を行った.癌関連遺伝子の免疫組織化学検討としては,p53,MDM2のモノクロナール抗体を用いて検討した.さらにその関連として,HPV16およびHPV18のプローブを用いてその局在を検討し,p53との関連を認めた.p53の変異部位を確認するために,新鮮標本を用いてDNAを抽出し,エクソン5-9のプローブを用いてPCR-SSCP法を行い,銀染色した.その結果,免疫組織化学で確認できたものよりさらに多くの変異が認められた.電顕資料から樹脂包埋切片を作製し,酢酸ウランおよびクエン酸鉛の二重染色を施し観察し,アポトーシスの確認を行った.生化学的解析として,舌,頬粘膜,皮膚を切除し組織をホモジナイズした.それを遠心して,その上清を用いて,LDHの活性を測定した.さらに,プロテアーゼとしてカテプシンB,H,L,Dを各々測定した.LDHの有意な上昇と,カテプシンBおよびDの有意な上昇を認めた.本年度は培養系細胞を用いた実験を行った。培養細胞としては、マウス歯肉由来線維芽細胞、MC3T3E1細胞、ヒト歯肉由来線維芽細胞を用いた。環境汚染物質としてはPCBおよびBisphenolAを用いて、単独および複合で各濃度の細胞におよぼす影響をMTTassayで調べた.毒性は濃度依存性であったが,特に複合で用いた場合毒性が強度であった。細胞増殖に影響を及ぼさない濃度で、p53変異をPCR-SSCP法で検討した結果、複合で用いたグループに強く異常バンドが発現した。異常バンドは数種類のexonに認められたが、特にexon8に多くの異常がみられる傾向が認められた。また、免疫組織化学的検討を行った結果、p53、bcl-2、mdm2の発現において単独で用いたグループに比較して複合で用いたグループに強い陽性所見が認められた。アポトーシス関連酵素の測定結果では、単独群でも複合群でも低濃度で酵素活性の上昇が認められたが、特に複合群でDNAエンドヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ、プロテインキナーゼC、アデニレートシクラーゼの活性値が他の群に比較して有意に高い値を示していた。尚、今回用いた細胞3種類の間の差は、ヒト歯肉由来線維芽細胞、MC3T3E1細胞、マウス歯肉由来線維芽細胞の順に強く反応が認められた。今回の結果から、これからの環境汚染物質が発ガンと何らかのかかわりを持つ可能性があることが示唆された。本年度の研究は,環境汚染物質の口腔粘膜における発癌性を調べることを目的とした.前年度までの実験でPCB等の有機塩素化合物の投与により口腔組織に影響を及ぼすことを動物実験および細胞培養実験を行ったので,本年度は,培養系での実験をさらに発展させることを目的として実験を行った.環境汚染物質としては入手可能であったKC400を用いた.培養細胞として,マウス線維芽細胞,血管内皮細胞等を用いて各々の細胞株に各種濃度のKC400を加えMTT試薬を用いてその増殖能をELISA法にて測定した.細胞の種類によってKC400感受性の相違が認められた.毒性試験と同様の濃度のKC400を細胞に作用させ,PCR-SSCP法によりp53の検討を行い,変異型p53の出現を有する細胞を検索した.その結果KC400に対する感受性の高い細胞に変異型p53が出現する傾向が認められた.一方,p53の野生型と変異型のわかっている癌細胞培養株において各種濃度のKC400を作用させたが,増殖能とp53変異との聞に相関性は認められなかった.p53のターゲット遺伝子であるp53R2に関しても検討を行った.すなわち,RT-PCR法によりp53R2mRNAの発現を検索しp