hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
核構造とRNA輸送の分子制御

細細胞の核内構造が転写を代表する核内反応の制御に関わる例が近年数々報告されている。本研究ではIGCの構成成分とRNA転写およびスプライシング、mRNA輸送に関わる機序と、核膜孔の細胞質フィラメント構成因子であるSUMO E3リガーゼRanBP2に焦点を当て、核膜孔におけるRNAの輸送と翻訳後修飾因子SUMOの役割を明らかにすることを目的として研究を推進し、以下の結果を得た。1.SUMO結合タンパク質の解析:大腸菌体内でSUMO化タンパク質を大量に合成するシステムを完成させた。酵母2ハイブリッド法によりSUMO化タンパク質結合因子STIPsを複数同定し、大腸菌システムによるリコンビナントSUMO化タンパク質を用いた解析を行った。STIP3はRNA結合タンパク質であり、SUMOがSTIP3との相互作用を介して核内RNAの動態制御に関わるというモデルを提案した。2.in situ SUMO化反応とRNAiによるSUMO化システムの解析:SUMO化反応と核内構造、および生体分子輸送の解析をセミインタクト細胞において解析する技術を確立した(in situ SUMo化反応系)。こうした新技術と、RNAi法を組み合わせることで、SUMO化システムとIGC、核膜孔の構築メカニズム、そして核膜孔におけるSUMO化およびRanBP2-E3活性生理的な意義を解析した。3.RanBP2のsiRNAによるノックダウン効果の解析:RanBP2のsiRNAにより,細胞内のRanBP2を約80%ほどノックダウンすることに成功した。RanBP2ノックダウン細胞において、ポリA-RNAの核内における蓄積をポリAのin situ hybridization反応を用いて観察したのと同時に、IGC核スペックルの構成因子の局在異常を免疫染色法により検出した。核膜孔タンパク質や核ラミナの構造には変化が見られなかったことから、この結果は、RanBP2の機能破綻が直接的にRNA輸送及び核構造の制御に関わることを示していると考えられた。1)細胞内におけるRNAの輸送や品質管理は、様々な生体分子、さらにそうした分子を翻訳後修飾する因子群が密接な関わりを持って制御している。ユビキチン様タンパク質SUMOは、イソペプイド結合することで、標的タンパク質の機能を変換する翻訳後修飾因子である。タンパク質間相互作用を調節することで、RNA輸送や分配、品質管理に関わるものと推定される。近年、SUMO-1がRanGAP1の修飾を介して核-細胞質輸送制御に関わること、あるいは複数のRNPがSUMO化されることなどが報告されている。今年度は、SUMO修飾系の制御機構の理解のために、SUMO修飾酵素群E1およびE2を、SUMOおよびその基質タンパク質と一緒に大腸菌体内で大量に発現させる系を確立した。この系で、SUMO化したリコンビナントRanGAP1,RanBP2,p53,PMLを大量に合成できるようになった。現在、未修飾とSUMO-1化修飾基質との生理的機能の違いを、生化学的あるいは構造学的なアプローチで解析している。2)Interchromatin Granule Cluster(IGC)はRNAの合成から細胞質への輸送までに関わる多くの因子を含む核内構造体で、転写とスプライシングの協調性を制御することに関わるの場と考えられている。転写とIGCとの時空間的な関係を調べるために、血清刺激によりc-fos遺伝子を誘導し、転写産物とその遺伝子座をそれぞれRNAとDNA FISHで同時に検出し、両者が共局在する転写の場を可視化した。IGCの免疫染色と組み合わせたところ、ほぼ全ての細胞でc-fos RNAがIGCと共局在した。c-fos遺伝子がIGCにおいて転写からRNAプロセッシング、核外輸送に至る複合体を形成する多くの段階を経ることが示唆された。一方、血清刺激でc-fos遺伝子の転写を誘導すると、PML蛋白質と転写因子Serum Response Factor(SRF)が複合体を形成し転写活性を制御すること、また、PMLボディーを形成できない細胞ではc-fos遺伝子の早期発現誘導ができないことから、PMLボディーがc-fos遺伝子の転写調節に関わることを示した。

RanBP2ノックダウン細胞において、ポリA-RNAの核内における蓄積をポリAのin situ hybridization反応を用いて観察したのと同時に、IGC核スペックルの構成因子の局在異常を免疫染色法により検出した。核膜孔タンパク質や核ラミナの構造には変化が見られなかったことから、この結果は、RanBP2の機能破綻が直接的にRNA輸送及び核構造の制御に関わることを示していると考えられた。
イネ葯発生時の冷温ストレスシグナル伝達に関与するMAPK経路の分子解析

本研究では先ず、OsMEK1と相互作用するMAPKを探索した。イネのMAPKの4つのサブグループに属する代表的なMAPKとOsMEK1の相互作用を酵母ツーハイブリッド法により検出したところ、Aサブグループに属するOsMPK3、OsMPK6とのみ相互作用が示された。2.OsMEK1はOsMPK3、OsMPK6をリン酸化する次に実際OxMEK1がOsMPK3およびOsMPK6をリン酸化するか否かについて検討した。自己リン酸化能を欠損体を構築したOsMPK3およびOsMPK6を調整し、OsMEK1によるリン酸化を試験管内で行ったところ、両OsMPKがリン酸化されOsMEK1の基質となっていることが判明した。更に、OsMEK1の構成的活性化変異体(OsMEK1DD)を作出したところ、OsMEK1DDはOsMPK3、OsMPK6のリン酸化能が著しく高まっていることが明らかとなったが両MAPKを活性化することも明らかにした。OsMEK1によるOsMPK3、OsMPK6のリン酸化が両タンパク質のMBPリン酸化活性を上昇させるか否かについて調べた。OsMEK1の共存によりOsMPK3、OsMPK6のMBPリン酸化活性が上昇し、それはOsMEK1DDを用いることで著しく高まることが示された。4.イネのチオレドキシンhはOsMPK3、OsMPK6の活性を負に調節するOsMPK3との相互作用を指標に酵母ツーハイブリッド法により単離されたチオレドキシンhを単離した。チオレドキシンhは、OsMPK3の基質とはならなかった。一方、チオレドキシンhはOsMPK3、OsMPK6の活性を著しく抑えることが示された。5.成果のまとめイネの低温ストレスシグナル伝達において機能するMAPK経路構成因子を明らかにし、チオレドキシンによる負の制御機構が判明した。イネの低温ストレス耐性のメカニズム解明に大きく貢献した。イネの冷温シグナル伝達に関わるMAPK経路構成するOsMAP1(MAPK)とOsMEK1(MAPKK)の相互作用を中心に本経路の分子解析を行った。まず,OsMEK1に対してアミノ酸置換を導入し,構成的活性型(OsMEK1DD)を作製した。組み換えタンパク質を精製し,in vitroでの活性調べたところ,OsMEK1はOsMAP1を基質としてリン酸化すること,その活性はOsMEK1DDにより数十倍以上高まることが明らかとなった。OsMEK1DDの存在下ではOsMAP1のMBP(ミエリン塩基性タンパク質)キナーゼ強力に活性化されることも明らかとなつた。OsMEK1DDにより本低温シグナルの活性化が期待されたので,OsMEK1DDを過剰発現する形質転換イネの作出を行った。現在TO植物を育成中である。OsMAP1のターゲットタンパク質を解析するため,シロイヌナズナでMAPK経路によりリン酸化されることが分かっているthioredoxinHに注目してOsMAP1との相互作用を解析した。酵母ツーハイブリッド法によりOsMAP1とthioredoxinHの相互作用が確認された.現在リン酸化の基質になりうるかどうかについて検討を行っている。更に,ThioredoxinHの冷温応答性を調べたところ,冷温によりmRNAの蓄積が認められたため,OsMAP1のターゲットとしての可能性が高いことが示唆された。
脳磁図と磁気刺激による軽度認知機能障害の臨床検査法の開発

脳磁図を用いて記憶機能の臨床検査法を開発する目的で、大脳皮質および海馬から記憶関連脳磁界反応を記録する方法を検討した。顔、文字、パターン、の画像呈示の5分後に既出と未出を混在させて呈示し、既出か否か答える課題を施行した。大脳皮質では下前頭葉と下頭頂小葉に反応が認められ、側方優位性が顔は右に、言語は左にそれぞれ認められた。海馬については、測定時間を長くすることで磁場変動を記録でき、側方性についても機能を反映した結果を示した。以上、大脳皮質および海馬における記憶関連の脳磁場変化が、定量的に計測可能であり、軽度認知障害の早期発見や、治療効果の判定に利用できる臨床検査法になりうると考えられた。目的は脳磁図を用いた記憶機能の臨床検査法の開発であり、初年度に行ったタスクの問題点を改良し平仮名3文字の呈示に加え、顔及び図形の呈示を用いたところ大脳皮質の記憶関連活動がより明瞭に記録することが可能になった。さらに解析方法を工夫することにより、皮質下の海馬の反応と考えられる活動も認められていて、脳磁計測により海馬活動が記録可能であることが示された。以上は正常被験者の記憶機能の評価を行うことを目的とした比較的難しいタスクにより計測したものであり、これまでに得られた結果をふまえ最終年度に向けて軽度認知障害を含む記憶機能の低下の場合にも対応可能なタスクを作成し、臨床応用に向けた検査法の確立を目指す。脳磁図を用いて記憶機能の臨床検査法を開発することを目的に、大脳皮質および海馬から記憶関連脳磁界反応を記録する方法を検討した。被験者の前の画面に、顔、文字、パターン、の画像を各50枚ずつ順に呈示し、5分後に既出と未出を半々に混ぜて呈示し、既出か否かボタン押しで答える課題時に脳磁界測定を行った。大脳皮質の磁界反応は、ベータ帯域や低ガンマ帯域の脱同期が下前頭葉と下頭頂小葉に認められ、側方優位性が顔は右に、言語は左にそれぞれ認められた。一方、海馬からの磁界反応については、海馬の位置が側頭葉の裏側に位置し頭皮から距離があるため磁場反応自体が弱いか測定限界以下の可能性も考えられたが、空間フィルターを用い、測定時間を1000ミリ秒と長くすることで海馬からの磁場変動を記録できた。さらに左右の海馬の各部位に仮想センサーをおいて磁場強度を推定すると、言語課題の際には左海馬の高域ガンマ活動、パターン画では右海馬のシータ領域の活動と高域ガンマ活動の両方が記録でき、側方性についても機能を反映した結果を示した。臨床で発症早期の認知症への応用をめざし、課題の難易度を検討した。検査直前に被験者に三語を口頭で覚えさせ、5分後より順に呈示した単語が覚えた言葉か否かを答えさせたところ、若年被験者に比し高齢被験者で海馬の脳磁界反応を認めた。下前頭葉あるいは下頭頂小葉を記憶課題提示の前に磁気刺激を行い、記憶時の脳活動変化も検討したが特に有意な変化は認めなかった。記憶機能に対する磁気刺激の改善効果は今後の検討課題と考えた。以上、今回行った記憶検査用の三種類の課題は、記憶時に活動する脳部位に課題に対応した機能局在を明らかにでき、大脳皮質及び海馬における脳磁場変化として定量的に計測が可能である。今後精度を上げることで臨床応用し軽度認知障害の早期発見や、治療効果の判定に利用できる臨床検査法になると考えられた。目的は脳磁図を用いた記憶機能の臨床検査法の開発であり、初年度は高次脳機能低下の患者でも可能なタスクの開発を行ってきたが、最適なタスクが開発できたとはまだ言えない状態である。言語記憶に関するタスクについては、11人の健常被験者で海馬の反応が得られており、今後一人ずつの測定で安定した反応が得られることを目指してタスクの改良を行っている段階である。従来大脳表面ではなく皮質下における神経活動は脳磁図で記録するのは困難であるとされてきたが、今回海馬での反応が得られたことで、見通しが立ってきていると考えている。非言語記憶については図形を用いたタスクを開発中であり、大脳の記憶関連領野である前頭葉や頭頂葉の反応が記録されるようになってきた。言語と非言語の両方の記憶機能を、海馬と大脳皮質のそれぞれの活動として簡便に定量的に測定できる方法を開発することは、高齢化に伴って増加している認知症の早期スクリーニングが容易になるという意義があり、臨床検査としての応用が期待されている。

初年度はタスクの作成を慎重に行ったため遅れがでていたが、当該年度は順調に測定を進めることができて、遅れを取り戻している。最終年度に向けて研究スピードをさらに加速したい。言語および非言語の記憶をする際の脳活動を脳磁図計測するのに最適のタスクを慎重に作成しているため、計画はやや遅れている。本研究の目的が臨床検査法の開発であるため、各個人で明瞭な定量化できる脳の反応を得る必要があり、拙速を避けて再現性のよい感度と特異性のよいものを開発したいと考えているためである。脳磁計で記憶機能を計測可能とするデータが得られてきたので、各個人ごとにデータをとり臨床検査となる測定方法とデータ解析方法を確立することを目指す。特に記憶機能が低下している場合でも測定か可能なタスクを作成し、臨床の場での利用範囲をより広くすることを検討する。満足できる記憶タスクを作成できればあとは、まず健常者について多数例で測定を行い、それぞれ個人の海馬の反応と大脳皮質の記憶関連領野の反応を定量化して基準値を作成する。その結果に基づき、臨床応用への道を目指したいと考えている。次年度使用額は2270円であり、ほぼ当初予定の計画に沿って使用し順調にこなしていると考えている。当初の研究計画に変更はなく予定通り研究を進めていくが、記憶に関する脳機能を感度よく賦活できるタスクを作成するところに時間をかけているため、当初予定していた国際学会発表は行わず、次年度以降に行う。遅れを取り戻すため、データ解析を手伝ってもらう人を謝金にて雇用する。なお脳磁図使用に関して発生する液体ヘリウム代は申請時は物品費として計上していたが、実際には医療設備使用料として「その他」という費目から移算処理されたため物品費が予定以上に残っている。次年度以降はこの点を改善したい。
一過性の運動によるストレス低減効果に関する心理生理学的研究

本研究の目的は、心理的なストレス低減に及ぼす身体運動の効果を明かにするため、各人が快適と自覚する自己ペースのランニング(快適自己ペース走)を用いて、快、リラックス、満足感などのポジティブな感情の変化過程ならびに感情の変化を規定する要因の分析を行ったものである。快適自己ペースという運動強度は5060%V^^・o_2max強度に相当し、無酸素性作業閾値(AT:Anaerobic Threshold)が関与していることが明らかにされた。また、その再現性は再テスト間の相関係数によって、生理的、心理的変数で確認された。運動に伴うポジティブな感情は運動開始5分後の早い段階で有意な増加を示し、快感情、満足感、リラックス感には時間的変化のずれがみられた。つまり、快感情や満足感は運動直後に増加ピークを示すのに対し、リラックス感は回復期(30分後)に増加のピークがあることが明かにされ、感情の成分によって運動による影響のメカニズムが異なることが示唆された。また、運動によって増加したポジティブな感情は少なくとも60分間は持続し、運動後に気分の高揚や安定感が得られることが明かにされた。このポジティブな感情の増加が不安、緊張、抑うつ感などのネガティブ気分の減少・抑制をもたらし、心理的ストレスが改善されることが示唆された。さらには、快感情やリラックス感の増加に特性不安やタイプA行動パターンが関与し、不安特性の高い者やタイプA行動パターンを有する者に効果があることが明らかにされた。本研究を進める過程で、メンタルヘルスの状態を測定する尺度、つまり、「はつらつ型」「ゆうゆう型」「ふうふう型」「へとへと型」の4つのパターンに分類される精神的健康パターン診断検査(MHP:Mental Health Pattern)を作成した。本年度はストレス度を測定する「精神的健康パターン診断検査(SCL-7:Stress Check List)のさらなる改良を試みるとともに、一過性の運動による感情の変化を心理・生理学的見地から調べた。筆者らが開発したSCL-7尺度はストレス概念にQOL概念を導入し、「はつらつ型」「ゆうゆう型」「ふうふう型」「へとへと型」の4つの精神的健康パターンをみるものである。SCL-7尺度得点とストレッサーの認知的評価に影響すると思われるタイプA行動パターンと性格特性(Y-G)との関係を大学生を対象として分析した。その結果、冠状動脈心疾患の危険因子と考えられているタイプA行動パターンをとる者や情緒的に不安定な者ほどストレス度が高くなることが分かった。15分間の快適自己ペースによる一過性のトレッドミル走を行い、感情の変化と運動強度を調べた。運動後に快感情、満足感の有意な増加がみられ、回復期(30分後)においても運動前より有意に高いレベルを維持していた。リラックス感は運動直後より回復期の方がさらに増加することが分かった。これらのことから、運動によってなぜストレスが解消されるのか、その原因は運動後の気分の高揚感と関係し、気分が“ハイ"になることによって、ネガティブな感情が抑制されるためと推察された。また、快適自己ペース走の運動強度は、平均60%VO_2maxの中等度強の運動強度であることがわかった。生化学的分析から、カチュールアミン値、乳酸値は運動前に比べ、約2.1倍有意に増加していることがわかった。また、その運動強度を規定している心理的変数として、タイプA行動パターンや、積極的性格があげられ、積極的な者ほど運動強度は強くなることがわかった。本年度は我々が作成した「精神的健康パターン診断検査「SC^L-7:Stress Check List)による調査と、トレッドミルを用いた快適自己ペース走による感情の変化の心理・生理学的検討を行った。

SCL尺度を中学生から高齢者までを対象として調査し、性、年齢、運動実施との関連を調べた。その結果、性別では4つのパターン(はつうつ、ゆうゆう、ふうふう、へとへと型)間に相異はなかったが、高齢者、運動実施者ほど、「はつうつ型」が増加し、「へとへと型」が減少する傾向がみられた。「ゆうゆう型」「ふうふう型」には顕著な傾向はみられなかった。男子大学生を対象として快適自己ぺース走の再現性を主観的指標(RPE、感情)と客観的指標(%VO_2max、心拍数、乳酸値、カテコールアミン値)の観点から調べた。その結果、高い再現性が得られた。とくに、客観的指標における再現性が高かった。15分間の快適自己ペース走による感情の変化を運動中・運動後・回復期(90分間)について調べた。運動開始5分で既に感情の変化がみられ、快感情、リラックス感の増加と不安感の低下がみられた。運動後においては、快感情のピークは運動直後にあるのに対し、リラックス感は運動後30分の回復期にピークがみられた。その後、増加したポジティブな感情は減少するが、運動後90分でもまだベースライン(運動前)より有意に高いレベルにあり、気分の高揚の持続は少なくとも2時間はみられることが推察された。身体運動による心理的なストレス低減効果を明かにするため、快適と自覚する自己ペースという運動強度のランニング(快適自己ペース走)を用いて、快、リラックス、満足感などのポジティブな感情の変化過程ならびに感情の変化を規定する要因の分析を行った。快適自己ペースという運動強度は5060%Vo_2max強度に相当し、無酸素性作業閾値(AT:Anaerobic Threshold)が関与していることが明らかにされた。しかし、運動者の心理的特性つまり、積極的な特性や冠動脈疾患のリスクファクターの1つといわれるタイプA行動パターンを有する者は快適自己ペースの運動強度が高くなる傾向がみられた。ポジティブな感情は運動開始5分後には有意な増加を示し、快感情、満足感、リラックス感には時間的変化のずれがみられ、快感情や満足感は運動直後に増加ピークを示すのに対し、リラックス感は回復期(30分後)に増加のピークがあることが明かにされた。このことから、感情の成分によって運動による影響のメカニズムが異なることが示唆された。また、運動によって増加した感情は少なくとも60分間は持続し、気分の高揚や安定感が得られることが明かにされた。さらには、快感情やリラックス感の増加に特定不安やタイプA行動パターンが関与し、不安特性の高い者やタイプA行動パターンを有する者に効果があることが示唆された。本研究を進める過程でメンタルヘルスの状態を測定する尺度、つまり、「はつらつ型」「ゆうゆう型」「ふうふう型」「へとへと型」の4つのパターンに分類される精神的健康パターン診断検査(MHP:Memtal Health Pattern)を作成した。
リピドA類似体を用いたアジュバント組込みペプチドワクチンの開発研究

短いペプチドは抗原性が低く、サブユニットワクチンとして使用することは困難である。ペプチドの低抗原性を改善する目的で、ペプチドと共有結合を介して縮合可能な糖脂質(リピドA類似体)を分子設計・合成を行い、アジュバント組込みワクチンへの応用研究を行った。得られた糖脂質を抗原ペプチドM2e(インフルエンザAウイルス膜タンパク質由来)と共有結合を介して結合させて、『糖脂質結合M2e』とした。糖脂質結合M2eのみでマウスを免疫した結果、抗M2e抗体がマウス血清中に確認された。本研究で合成した糖脂質のアジュバント組込みワクチンの開発ツールとしての有用性が示唆された。本研究は、様々な抗原ペプチドと簡易に結合可能な脂質部として、リピドA(Toll様受容体-4アゴニスト)を模倣した新規糖脂質の分子設計し、アジュバント組込みペプチドワクチン(build-in adjuvant vaccine)開発への応用・発展を目指した基盤研究である。昨年度の本研究費助成金実施状況報告書において、新たに分子設計した糖脂質の合成経路を確定し、固相合成法を用いた糖脂質と抗原ペプチドの縮合ならびに樹脂からの切り出しを検討している事を報告した。本年度実施した研究の成果は以下の通りである。(1)糖脂質の合成経路の確立:グルコサミンを出発原料とし、1位の水酸基をTBDMS基、2位のアミノ基をフタルイミド基、4,6位の水酸基をベンジリデンアセタールで保護した合成中間体を経由し、2位のアミノ基および3位の水酸基のアシル化を行った。2本の脂肪鎖を持った糖脂質中間体の脱保護後、生じた6位の水酸基に化学修飾を行い、リンカーを介してカルボキシル基を導入した糖脂質の安定的かつ良好な収率での合成経路を確立した。(2)抗原ペプチドとの縮合:Fmoc固相合成法によりWang-resin上に構築した抗原ペプチドのN末端に、汎用なペプチド縮合試薬を用いることで、分子設計した糖脂質とペプチド抗原との縮合が可能であることを確認した。(3)免疫学的評価:分子設計した糖脂質結合型抗原ペプチド単独投与でマウスを免疫した結果、マウス血清中に抗原特異的抗体が観測された。本研究で合成した糖脂質のアジュバント組込みワクチンの開発ツールとしての有用性が示唆され、新たなサブユニットワクチン開発研究の足掛かりとなる。本研究は、様々なペプチドエピトープと簡易に結合可能な脂質部として、免疫細胞を活性化させるToll様受容体-4のリガンド・リピドAを模倣した新規糖脂質を設計・合成し、ペプチドエピトープの弱抗原性を改善させたアジュバント組込みペプチドワクチン開発へ応用することを目的とした基盤研究である。出発原料グルコサミンの2位アミノ基をフタルイミド基で保護した。一旦、全ての水酸基をアセチル化した後、ベンジルアミンを用いて、1位アセチル基のみ選択的に除去した。1位水酸基をTBDMS基で保護した後、残り全て(3, 4, 6位)のアセチル基を除去した。4, 6位の水酸基をベンジリデンアセタールで保護した。無保護の3位水酸基に脂肪鎖を導入し、2位フタルイミド基を脱保護して得られたアミノ基にも同じ長さの脂肪鎖を導入した。2本の脂肪鎖を持った糖脂質中間体のベンジリデンアセタールを脱保護して、生じた6位水酸基にTs基を導入した。6位OTs基はKCNを用いて、シアノ化を行った後、カルボキシル基へと変換し、抗原ペプチドとの縮合に用いた。モデル抗原ペプチドとして用いる、インフルエンザAウイルスの膜上に存在する、M2タンパクの細胞外ドメイン(M2e: SLLTE VETPI RNWEG CRCND SSD)をFmoc固相合成法によりWang-resin上に構築した。N-末端のFmoc基を除去後、一部、樹脂からの切り出しおよび最終脱保護を行い、質量分析にて合成の確認を行った。6位カルボキシル基を有する糖脂質と抗原ペプチドとの縮合は樹脂上で試みた。DMSO/DCM混合溶媒中、COMUを用いた縮合反応後、樹脂からの切り出しおよび最終脱保護を行い、質量分析にて確認を行ったが、目的とする化合物は得られなかった。現在、糖脂質化合物を抗原ペプチドとの縮合方法の検討を行っている。アジュヴァントとして抗原ペプチドに組み込むために設計した6位カルボキシル基を有する糖脂質の合成の収率が低い。特に、最終工程であるニトリル基からカルボキシル基への加水分解反応で顕著あった。更に抗原ペプチドとの縮合が困難であった。おそらく、溶解性と立体障害により、固相上での反応性が低下しているモノと考えている。

抗原ペプチドとの縮合方法をアミド結合以外(アジドーアルキン[3+2]付加環化反応)も併せて検討している。現在所有している本研究合成中間体である6位にTs基を有する化合物を、NaN3で処理することにより、アジド基を有する糖脂質誘導体が容易に得た。一方、ペプチドのN-末端へのアルキン基の導入は行った。その後、アジドーアルキン[3+2]付加環化反応で選択的かつ効率良く糖脂質化合物を抗原ペプチドと縮合することが可能であると考えれれる。これにより、合成行程の少なくし、収率・低反応性による問題は大いに解消すると考えている。質量分析装置による分子量の確認およびRP-HPLC (C-4)を用いて分析・精製を行った後、当初予定していたマウスの免疫・抗体産生活性の評価とToll様受容体活性評価を実施する予定である。合成したワクチン候補化合物を生成するために使用するHPLC用のカラム(C-4)は1年目の予算で購入済みである。研究2年目に研究費140万円を計上しており、前年度繰越金約10万円と合わせて、ワクチン候補化合物の生物学的評価(in vivoおよびin viro)を実施するために使用する予定である。研究成果を発表するため、学会参加費(日本薬学会年会・横浜)およびそれに伴う旅費にも研究費を使用する予定である。
３Ｄエコーガイド下心拍動下手術器械の開発

当初の予定では、初年度に表面形状の形(凹か凸か)について、超音波が斜めに入射しても描出できる条件をさらに追究するため、突出・陥凹のどちらがよいか、そのサイズはどうかということを検討することとし、試料(長方形の金属板)で平滑(対照)、半球状突出、半球状陥凹の試料を作成して水浸し、3Dエコーで走査しながら輝度変化を計測することとしていた。しかし、この条件に合う表面形状を見いだしても、実際に3Dエコーガイドで操作できなければ、検討自体が経費を浪費するだけになってしまう。そこで、まず確実に見える素材を、血液に触れ血栓を形成するという面は度外視して、検討することを優先し、それができることを確認した後に、当初初年度に予定していた試料作成を行うこととした。今年度は、以前の検討において3Dエコーで見えやすかった素材を含め、多くの素材を集め、それを3Dエコーで描出しながら角度を傾けて描出が不良にならないかを検討した上で、手術器械にそれを貼付して実際の操作を行い、その精度を検討することとした。当大学の先端医療学コースの学生(3年生)とともにこの検討を行っている関係で、なかなかスローペースの研究となったが、素材そのもの、それを細いビニルチューブの中に封入したものなどを準備して3Dエコーで描出した。その結果、数点適切な素材を選び出すことができ、それらを器械に貼付して3Dガイド下に操作する検討を始めたところである。これらの素材は、ホームセンターや100均ショップにあるものを集めたため、これまでのところ、素材の費用はほとんどかかっていない。上記の通り、先端医療学学生とともに研究を進めているため、ある程度彼らのペースに合わせる必要があること、また診療、教育でなかなか学生と時間を合わせることが容易でなかったこともあり、多少遅れが出ている。次年度は、研究に充てる時間が少し多めに取れそうなので、追上げていきたい。検討の順番は変更となったが、初年度の検討目的はおおむね達成できていると考える。次年度は、当初初年度に予定していた内容に踏み込んで検討を進めていきたい。前述したように、まず経費があまりかからないステップを初年度に先行して行うこととしたため、初年度の使用額が少なかった。次年度にこの経費を用いて試料の作製に当てたい。
遺伝子改変細胞・動物を用いたビタミンDとビタミンKの分子栄養学的骨形成作用の解析

ヒトでは、ビタミンD栄養状態の指標である血中25-Hydroxyvitamin D濃度が低値である程、骨粗鬆症の発症率が高くなることが疫学研究により明らかにされている。また、骨基質タンパク質のGla化を担い、骨質改善効果が報告されているビタミンKには、血中ビタミンK濃度と骨折率に負の相関性が認められている。しかし、ビタミンDとビタミンKの相互の影響に関しては不明な点も多い。本研究では、遺伝子欠損あるいは改変細胞・動物を用い、骨形成におけるビタミンDとビタミンKの相互作用の解析を行った。ビタミンKの作用については、骨芽細胞に対する作用を解析した。まず重水素標識ビタミンK同族体を合成し、これらが細胞内でメナキノン-4(MK-4)に変換されることを明らかにした。次いで、MK-4の側鎖構造に修飾を加えた誘導体を合成し、MK-4への変換活性およびsteriod and xenobiotic receptor(SXR)のリガンドとしての活性を評価した。その結果、側鎖の不飽和度やメチル基の有無により、MK-4への変換効率やSXRを介した作用が異なることが明らかとなった。また、骨芽細胞においてMK-4を生合成する酵素の探索を行い、ビタミンK同族体をMK-4へ変換する活性を有する酵素と予想される候補因子を見いだすことに成功した。ビタミンDの作用については、先天的に1α,25-D3欠乏となり、くる病症状を呈するビタミンD1位水酸化酵素(CYP27B1)遺伝子欠損マウス(CYP27B1-KO)を独自に作出し、これを用いてビタミンD誘導体による作用を解析した。CYP27B1-KOマウスを離乳後、すぐにビタミンD誘導体を投与し、6週間飼育後における骨の状態を解析した。その結果、ビタミンD誘導体を投与することにより、CYP27B1-KOマウスに出現する低Ca血症、骨形成異常や成長不全は完全に回復した。このことから、今回初めて内因的な1α,25-D3の影響なく、ビタミンD誘導体のみによる骨形成作用を解析することに成功した。本研究では、遺伝子欠損あるいは改変細胞・動物を用い、骨形成におけるビタミンDとビタミンKの相互作用の解析を行っている。まず、ビタミンKの種々の同族体を用いて、それらが細胞内で活性リガンドとしての作用を有するメナキノン-4(MK-4)に変換されるのかを検討した。その結果、すべての同族体が骨芽細胞内でMK-4に変換された。この変換は、マウスに安定同位体標識した各ビタミンK同族体を投与した場合にも認められ、骨中MK-4濃度が増加した。また、MK-4がsteriod and xenobiotic receptor (SXR)のリガンドとして細胞外基質タンパクの発現を促進することから、MK-4および新規ビタミンK誘導体のSXRを介した活性の評価系として、SXR応答配列(SXRE)を組み込んだluciferase reporter assayおよびSXR-GAL4 hybridluciferaseassayを構築した。

ビタミンDの作用については、骨芽細胞に対する石灰化促進作用を検討した。その結果、ビタミンDである1α, 25-D3の添加により石灰化が亢進すること、骨芽細胞においてビタミンD受容体(VDR)を欠損させるとさらに石灰化が亢進することがわかった。また、ビタミンD1位水酸化酵素(CYP27B1)を欠損させたマウス(CYP27B1-KO)を作出した。このマウスは、先天的に1α, 25-D3欠乏となり、くる病症状を呈した。このCYP27B1-KOに、骨粗鬆症治療薬として臨床応用の可能性があるビタミンD誘導体の投与を行うことにより、今後内因的な1α, 25-D3の影響なく、ビタミンD誘導体のみによる骨形成作用が解析可能となる。ヒトでは、ビタミンD栄養状態の指標である血中25-Hydroxyvitamin D濃度が低値である程、骨粗鬆症の発症率が高くなることが疫学研究により明らかにされている。また、骨基質タンパク質のGla化を担い、骨質改善効果が報告されているビタミンKには、血中ビタミンK濃度と骨折率に負の相関性が認められている。しかし、ビタミンDとビタミンKの相互の影響に関しては不明な点も多い。本研究では、遺伝子欠損あるいは改変細胞・動物を用い、骨形成におけるビタミンDとビタミンKの相互作用の解析を行った。ビタミンKの作用については、骨芽細胞に対する作用を解析した。昨年にビタミンK同族体が細胞内でメナキノン-4(MK-4)に変換されることを明らかにしたことから、MK-4の側鎖構造に修飾を加えた誘導体を合成し、MK-4への変換活性およびsteriod and xenobiotic receptor (SXR)のリガンドとしての活性を評価した。その結果、側鎖の不飽和度やメチル基の有無により、MK-4への変換効率やSXRを介した作用が異なることが明らかとなった。また、骨芽細胞においてMK-4を生合成する酵素の探索を行い、ビタミンK同族体をMK-4へ変換する活性を有する酵素と予想される候補因子を見いだすことに成功した。ビタミンDの作用については、昨年作出した先天的に1α,25-D_3欠乏となり、くる病症状を呈するビタミンD1位水酸化酵素(CYP27B1)遺伝子欠損マウス(CYP27B1-KO)を用いて、ビタミンD誘導体による作用を解析した。CYP27B1-KOマウスを離乳後、すぐにビタミンD誘導体を投与し、6週間飼育後における骨の状態を解析した。その結果、ビタミンD誘導体を投与することにより、CYP27B1-KOマウスに出現する低Ca血症、骨形成異常や成長不全は完全に回復した。このことから、今回初めて内因的な1α,25-D3の影響なく、ビタミンD誘導体のみによる骨形成作用を解析することに成功した。
屋外飛行のための飛行船の外乱適応型制御システムの最適化と実用化と屋外飛行実験

本研究の目的は、実用的な飛行船の自動航行制御システムを開発することである。具体的な主要研究成果の一つは、3次元空間に拡張された有用かつ実用的な運動制御問題を解き、風から受けるカをオンラインで推定し,風外乱を受けても任意の希望の地点にすばやくかつスムーズに移動し静止し、ある与えられた領域内にとどまり続ける実用的な適応制御系の設計法を導出したことである。飛行実験やシミュレーションにより成果の有用性を実証した。本研究の目的は実用的な飛行船の自動航行制御システムを開発し,無人飛行船を用いた飛行実験により有効性を実証することである.平成22年度の具体的な研究業績は以下のとおりである.1.テザー式小型飛行船による風の時系列データの取得と蓄積:屋外飛行のための飛行船の自動制御システムの設計やシミュレーションなどに行う際,実際の風の時系列データなどが必要である.そこで,風速・風向計や3軸ジャイロなどのセンサーを搭載し,無線LANにより各種データを地上にリアルタイムで無線送信できるテザー式の小型飛行船システムを用いて,屋外で風の時系列データや飛行船に与える影響などを測定し,データの蓄積を行った.2.外乱適応制御システムの設計:飛行船の動きなどのデータを用いて風から受ける力(風力)を推定・補正し,オンラインで制御器を自動調整することで,風外乱の状況下で船首をすばやく風に向け,同時に与えられた目標軌跡(直線経路や円軌道など)にすばやく追従し,ある与えられた領域内にとどまり続ける新しい適応コントローラを導出した.本研究のアイデアは,まず,モデルベース適応制御法を応用して風力をオンライン推定し,研究代表者の提案する座標変換法を応用することである.その結果,提案するコントローラは,風外乱を受けても,船首をすばやく風に向け,同時に与えられた目標軌跡への大域的漸近追従性を保証できるという,これまでにない優れた利点を有する.数値シミュレーションにより有効性を検証した.3.揺れなどを抑える飛行船制御システムの解析と設計:まず,揺れを抑える飛行船制御システムの検討に必要なパラメータ(飛行船の空力係数など)の同定を実験により取得した.その結果に基づき,プロペラを工夫した新しい飛行船システムを提案し,数値シミュレーションにより,プロペラの配置や位置などの解析と最適設計を行った.本研究の目的は実用的な飛行船の自動航行制御システムを開発し,無人飛行船を用いた飛行実験により有効性を実証することである.平成23年度の具体的な研究成果は以下のとおりである.1.テザー式小型飛行船による風の時系列データの取得と蓄積:屋外飛行のための飛行船の自動制御システムの設計やシミュレーションなどに行う際,実際の風の時系列データなどが必要である.前年度のシステムを改良し,3軸姿勢角センサー・GPS・風速・風向計などのセンサーを搭載し,無線LANにより各種データを地上にリアルタイムで無線送信できるテザー式の小型飛行船システムを製作した.屋外で風の時系列データや飛行船の運動データなどを測定し,データの蓄積・解析を行った.2.外乱適応制システムの設計:飛行船の動きなどのデータを用いて風から受ける力(風力)を推定・補正し,オンラインで制御器を自動調整することで,風外乱の状況下で船首をすばやく風に向け,同時に与えられた目標軌跡にすばやく追従し,ある与えられた領域内にとどまり続ける新しい適応コントローラを導出した.本年度は追従可能な目標軌跡のクラスを拡張し,制御系の安定性の保証を行なったことが新しい成果である.その結果,提案するコントローラは,風外乱を受けても,船首をすばやく風に向け,同時に与えられた目標軌跡への大域的漸近追従性とシステムの安定性を保証できるという,優れた利点を有する.数値シミュレーションにより有効性を検証した.3.揺れなど抑える飛行船制御システムの解析と設計:まず,揺れを抑える飛行船制御システムの検討に必要なパラメータ(飛行船の空力係数など)の同定を実験により取得した.その結果に基づき,プロペラを工夫した新しい飛行船システムを提案し,数値シミュレーションにより,プロペラの配置や位置などの解析と最適設計を行った.本研究の目的は実用的な飛行船の自動航行制御システムを開発し,無人飛行船を用いた飛行実験により有効性を実証することである.平成24年度の具体的な研究成果は以下のとおりである.1.飛行船自動制御システムの製作と基礎実験:平成23年度に得られた小型飛行船の運動データや制御則に基づき,自動制御装置を製作し,飛行実験により基礎データの取得と解析を行った.2.外乱適応制御システムの最適化と実用化:平成23年度に得られた成果を拡張し,つぎの(a)と(b)を同時に達成する実用的で最適なコントローラの設計法を導出した.(a)風外乱に対する過渡応答特性を最適化し,飛行船の動きなどのデータを用いて風から受ける力(風力)を推定・補正し,オンラインで制御器を自動調整することで,安定かつ任意の希望の地点にすばやく移動する最適コントローラ.(b)持続的な未知の風外乱が加わっても,ある与えられた領域内にとどまり続ける適応外乱抑制コントローラ.

平成23年度では,モデルベース適応制御法を応用して風力をオンライン推定し,研究代表者の提案する座標変換法を応用することで,風外乱の中で船首をすばやく風に向ける自然なアプローチ操船を達成するコントローラを導出したが,システム全体のロバスト性などに実用上の問題点を有していた.本年度はそれらの問題点を解決するコントローラを求めた.3.揺れを抑える飛行船制御システムの解析と設計:平成23年度に得られた成果を拡張し,テザー飛行船を用いて屋外での小型飛行船の運動テータの取得と解析を行い,同時に実験機に必要なパラメータの同定を行った.同定結果に基づきシステム設計を行い,風外乱に対する飛行船の揺れをできるだけ小さく抑える最適コントローラの設計法を与えた.4.シミュレーションおよび実験による有効性の検証:上記の成果を実機データに基づいたシミュレーションおよび実験により有効性を実証した.揺れを抑える飛行船制御システムの設計および屋外用の実験装置の製作に関しては,検討に必要なパラメータの同定実験が遅れたため,それらの作業は交付申請書のスケジュールに対して少し遅れている.一方,小型飛行船の運動データの取得と解析,および外乱適応制御システムの設計などの理論研究は,交付申請書の記載とほぼ同じで順調に進んでいるため,全体としてみると,おおむね順調に進展している.24年度が最終年度であるため、記入しない。上記の項目11に記載のとおり,風の時系列データの取得と解析,および外乱適応制御システムの設計などの理論研究は,交付申請書の記載とほぼ同じで順調に進んでいるが,揺れを抑える飛行船制御システムの設計および屋外用の実験装置の製作に関しては,少し遅れている.今回の課題では,外乱適応制御システムの設計は最重要の研究課題であり,性能評価用の屋内実験機はすでに製作済みであるため,平成24年度の前半では,まず屋内実験により制御性能の実証を行い,外乱適応制御システムの設計の研究を完了させる予定である.そして平成24年度後半では,揺れを抑える飛行船制御システムの設計および屋外用の実験装置の製作・屋外実験の作業を進めていく予定である.24年度が最終年度であるため、記入しない。
車載型らせんCTによる胸部検診のシステム構築に関する研究

平成9年11月から平成10年1月末にかけ,千葉県のT町およびC村の2地区で車載型らせんCTによる胸部1次検診を施行した.T地区では,従来の結核住民検診・肺癌検診と同様,検診機関-役場-病院のネットワークにより精密検査までを行い,C地区では従来のネットワークの中で大学病院呼吸器内科医および地元基幹病院の呼吸器専門医が主体となって精検を施行した.受検者は,T地区782名(男333,女449),C地区765名(男463,女302)であり,CT読影での要精検数(要精検率)は各々33名(4.2%),40名(5.6%)であった.肺癌はT地区で1名,C地区で5名発見され,T地区の1名,C地区の3名が肺切除術を受けた.C地区では要精検例全例が最終検査を終え,良性腫瘍,炎症痕,炎症性疾患などの診断が下されたが,T地区では6名で最終情報が得られなかった.すなわち,検診の精度を上げるには検診システムのネットワークをさらに綿密にする必要があることが示された.これらの検診の経験から,らせんCTによる検診でのCT読影所見記載用紙を作成することができた.われわれはその後の読影でその用紙を使用してきたが特に支障はなかった.この検診でのCT画像読影は,CRTにてシネモードで行ってきたが,経年集団の読影では過年度画像との比較読影が必要になる.われわれは.NTTヒューマンインターフェイスと共同でCRT上での比較読影装置の開発を思考してきたが,そのソフトが完成し,平成10年後半のC地区でのらせんCT検診の読影で試用してみた.これは,従来の読影コンソール(日立DC-1)の画像データを書式変換してパソコンへインストールし,CRT上に当該年度と過年度の両画像をシネモードで見られるようにしたものである.今回の試用経験では極めて有用で,今後のCT読影の精度向上に役立つものと確信した.平成9年11月から平成10年1月末にかけ,千葉県のT町およびC村の2地区で車載型らせんCTによる胸部1次検診を施行した.T地区では,従来の結核住民検診・肺癌検診と同様,検診機関-役場-病院のネットワークにより精密検査までを行い,C地区では従来のネットワークの中で大学病院呼吸器内科医および地元基幹病院の呼吸器専門医が主体となって精検を施行した.受検者は,T地区782名(男333,女449),C地区765名(男463,女302)であり,CT読影での要精検数(要精検率)は各々33名(4.2%),40名(5.6%)であった.肺癌はT地区で1名,C地区で5名発見され,T地区の1名,C地区の3名が肺切除術を受けた.C地区では要精検例全例が最終検査を終え,良性腫瘍,炎症痕,炎症性疾患などの診断が下されたが,T地区では6名で最終情報が得られなかった.すなわち,検診の精度を上げるには検診システムのネットワークをさらに綿密にする必要があることが示された.これらの検診の経験から,らせんCTによる検診でのCT読影所見記載用紙を作成することができた.われわれはその後の読影でその用紙を使用してきたが特に支障はなかった.この検診でのCT画像読影は,CRTにてシネモードで行ってきたが,経年集団の読影では過年度画像との比較読影が必要になる.われわれは.NTTヒューマンインターフェイスと共同でCRT上での比較読影装置の開発を思考してきたが,そのソフトが完成し,平成10年後半のC地区でのらせんCT検診の読影で試用してみた.これは,従来の読影コンソール(日立DC-1)の画像データを書式変換してパソコンへインストールし,CRT上に当該年度と過年度の両画像をシネモードで見られるようにしたものである.今回の試用経験では極めて有用で,今後のCT読影の精度向上に役立つものと確信した.平成9年9月よりいくつかの検診対象候補地区の役場と交渉を開始し、千葉県安房郡富浦町と千葉県長生郡長生村の2町村で車載型らせんCTによる胸部一次検診の実施を計画した。10月に役場等と最終的な打ち合わせを行い,11月から平成10年1月末までの間に延べ28日間CT撮影を行った。なお,読影所見用紙はまず昨年度までに二次検診に用いていたものを踏襲し,読影方法に応じてそれを改善していくことにした。これまで経過およびその成果は以下のとおりである。(1)両町村とも50歳以上人口は約3.000人であり、らせんCT検診希望者は共に約800人,そして実際に受診した者は富浦町782人,長生村765人であった。(2)受け付けから撮影終了までに混乱・苦情はなく,初めてCT検診を受診する者が殆どであったが集団検診として成り立つと考えられた。(3)CTは車内のCRTで読影できるが、その読影結果は,車内ではよほどの異常がなければ被験者に伝えないようにし,MOにて持ち帰った画像データを保健管理センターまたは結核予防会千葉県支部内のCRTにてダブルチェックする方式をとった。さらに2名の読影医の両方またはいずれか1人が異常ありとした症例の画像は後日読影医全員(10名)で合同判定をすることにした。なお、判定基準は従来の肺癌検診で用いられているものを本検診ように改変した。

(4)E判定すなわち肺癌の疑いとされた率は富浦町で2.9%,長生村で5.6%であった。E判定に該当した受験者には役場からその旨を報告していただいた。医療機関での精密検査は進行中である。平成9年11月から平成10年1月末にかけ,千葉県のT町およびC村の2地区で車載型らせんCTによる胸部1次検診を施行した.T地区では,従来の結核住民検診・肺癌検診と同様,検診機関-役場-病院のネットワークにより精密検査までを行い,C地区では従来のネットワークの中で大学病院呼吸器内科医および地元基幹病院の呼吸器専門医が主体となって精検を,施行した.受検者は,T地区782名(男333,女449),C地区765名(男463,女302)であり,CT読影での要精検数(要精検率)は各々33名(4.2%),40名(5.6%)であった.肺癌はT地区で1名,C地区で5名発見され,T地区の1名,C地区の3名が肺切除術を受けた.C地区では要精検例全例が最終検査を終え,良性腫瘍,炎症痕,炎症性疾患などの診断が下されたが,T地区では6名で最終情報が得られなかった.すなわち,検診の精度を上げるには検診システムのネットワークをさらに綿密にする必要があることが示された.これらの検診の経験から,らせんCTによる検診でのCT読影所見記載用紙を作成することができた.われわれはその後の読影でその用紙を使用してきたが特に支障はなかった.この検診でのCT画像読影は,CRTにてシネモードで行ってきたが,経年集団の読影では過年度画像との比較読影が必要になる.われわれは,NTTヒューマンインターフェイスと共同でCRT上での比較読影装置の開発を思考してきたが,そのソフトが完成し,平成10年後半のC地区でのらせんCT検診の読影で試用してみた.これは,従来の読影コンソール(日立DC-1)の画像データを書式変換してパソコンへインストールし,CRT上に当該年度と過年度の両画像をシネモードで見られるようにしたものである.今回の試用経験では極めて有用で,今後のCT読影の精度向上に役立つものと確信した.
深層学習モデル間の演算体系確立と大規模分散学習への応用

本研究の目的は,深層学習で得られるモデル間の「演算」を可能とする体系の構築である.データベース構築に利用されている関係代数の演算をモデル空間に導入することで,大量の計算機で独立に学習されたモデルの事後的統合を可能とすることを目指す.これにより,現存の小・中規模計算資源を有効活用できる分散学習の方法論を開拓する.この研究は,人工知能を用いた画像・映像認識システムを高精度化することに役立つものであり,近未来社会での活用が期待される.本研究の目的は,深層学習で得られるモデル間の「演算」を可能とする体系の構築である.データベース構築に利用されている関係代数の演算をモデル空間に導入することで,大量の計算機で独立に学習されたモデルの事後的統合を可能とすることを目指す.これにより,現存の小・中規模計算資源を有効活用できる分散学習の方法論を開拓する.この研究は,人工知能を用いた画像・映像認識システムを高精度化することに役立つものであり,近未来社会での活用が期待される.
チベット空気シャワーアレーによるKnee領域の宇宙線全粒子強度の研究

昨年度に、現有ワークステーションの増強をおこない、実験データと直接比較できる観測条件を込みにした空気シャワーのシミュレーションによって、データー解析の方法を検討した。今年度は、データ解析方法のつめを行い、蓄積したデータの解析を行った。1)地上高度での同種の観測では、空気シャワーの頻度が組成比に強く依存し、また空気シャワーの発達の変動が大きいため、空気シャワー・サイズから10^<15>eV領域の一次宇宙線の全強度スペクトルを求めることが原理的に不可能であること、2)羊八井高度では、天頂角約25度以下という制限内で、^*10^<14>-10^<17>eV領域の一次宇宙線がつくる空気シャワーのサイズが組成によらずほぼ等しく、エネルギーのみによって決まること、およびその発達の変動が小さく、一次宇宙線のエネルギーがほぼ20%の誤差で決定できることなどを明らかにし、200万イベントの解析を終了して、3×10^<14>eVから2×10^<16>eVまでの一次宇宙線全粒子微分強度j(E_0)について以下の結果を得た。なお、スペクトルはこの間で徐々に変化しており、j(E_0)=6.7×10^<-22>(m^<-2>sec^<-1>sr^<-1>eV^<-1>)at E_0=10^<15.25>eVである。これまで地上観測等で得られていた3×10^<15>eV付近での急激な折れ曲がりは観測バイアスが原因である。得られたスペクトルは100TeVまでの直接観測結果のなめらかな延長上にある。現有ワークステーションの増強によって、実験データと直接比較できる観測条件を込みにした空気シャワーのシミュレーションを行ない、1)一次宇宙線を、組成によらず100%捉えられるエネルギー領域の選定方法の確立、2)対象とするエネルギー領域全体に共通な有効面積の選定方法およびイベント選択基準の選定方法の確立、3)直接観測量からの一次宇宙線エネルギーを推定する方法の確立、4)一次宇宙線の組成比による、エネルギー決定誤差の推定、を行なってきた。すでに部分の実験データを上記で確立した方法に基づき解析し、knee領域のエネルギースペクトルのプレリミナリな結果を得ており、国際会議で報告した。上記の研究から、1)地上高度での同種の観測では、空気シャワーの頻度が組成比に強く依存し、また空気シャワーの発達の変動が大きいため、空気シャワー・サイズから10^<15>eV領域の一次宇宙線の全強度スペクトルを求めることが原理的に不可能であること、2)羊八井高度では、天頂角約25度以下という制限内で、^*10^<14>-10^<17>eV領域の一次宇宙線がつくる空気シャワーのサイズが組成によらずほぼ等しく、エネルギーのみによって決まること、およびその発達の変動が小さく、一次宇宙線のエネルギーがほぼ20%の誤差で決定できること、などの知見を得ている。1)地上高度での同種の観測では、空気シャワーの頻度が組成比に強く依存し、また空気シャワーの発達の変動が大きいため、空気シャワー・サイズから10^<15>eV領域の一次宇宙線の全強度スペクトルを求めることが原理的に不可能であること、2)羊八井高度では、天頂角約25度以下という制限内で、^*

10^<14>-10^<17>eV領域の一次宇宙線がつくる空気シャワーのサイズが組成によらずほぼ等しく、エネルギーのみによって決まること、およびその発達の変動が小さく、一次宇宙線のエネルギーがほぼ20%の誤差で決定できることなどを明らかにし、200万イベントの解析を終了して、3×10^<14>eVから2×10^<16>eVまでの一次宇宙線全粒子微分強度j(E_0)について以下の結果を得た。なお、スペクトルはこの間で徐々に変化しており、j(E_0)=6.7×10^<-22>(m^<-2>sec^<-1>sr^<-1>eV^<-1>)atE_0=10^<15.25>eVである。これまで地上観測等で得られていた3×10^<15>eV付近での急激な折れ曲がりは観測バイアスが原因である。得られたスペクトルは100TeVまでの直接観測結果のなめらかな延長上にある。
内耳有毛細胞のアポトーシスにおけるカスパーゼ動態の定量的・経時的解析

強大音やアミノグリコシド系抗生剤によって誘導される内耳有毛細胞のアポトーシスの防御実験の予備実験として、強大音暴露による内耳のcaspase cascadeの活性化の実験モデルの作成を試みた。実験対象はPreyer's reflex正常なfemale pigmented guinea pig。誘導刺激として4kHz octave band 120dB SPLのtone burstに5時間暴露した。音響暴露前、暴露直後、暴露6時間後、1日後、3日後、7日後にgninea pigを断頭後、蝸牛を採取し、deep freezer中に生標本として保存した。免疫染色用には同じ時系列で4%パラホルムアルデヒドをintracardial perfusion後、断頭して内耳骨胞を採取し、さらに固定液に2日間浸透後、2週間奪灰し、パラフィンに包埋し薄切した。caspase assayでは各時系列でcaspase3、caspase8、caspase9の活性を蛍光分光計で測定した。免疫染色では各時系列でcleaved caspase3、single strand DNA染色を行った。結果としては免疫染色では、これまで施行した染色条件では7日後に血管条に上記2つの抗体の染色性が陽性を認めたが有毛細胞の陽性は認められなかった。背景染色も強く統計学的に有意とは言えなかったためさらに様々な条件を工夫し、背景染色を抑制する試みが必要であり、その操作中である。caspase assayではどの時点を通じても蛍光強度に有意差が認められなかった、これは、内耳骨胞内にある骨髄細胞からのcaspase活性のアーチファクトにより、有毛細胞の微細な蛍光が隠されてしまうためと推測された。現在アーチファクトの抑制、他に実験系に最適な動物種としてラットやアレチネズミも候補に挙げ検討中である。