hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
遺伝子改変マウスを用いた歯根形成・維持に関与する分子機構の解明

Scx、Msx2、Sost欠失マウスの表現系を前年度に引き続き解析した。樹立した全てのマウスラインは報告されている表現系を示すことが、新生仔マウスの骨格標本と成体マウス骨格のマイクロCTを用いた解析によって確認できた。これらのマウスの中では歯根や頭頚部形成の異常を含む新規の報告につながるような結果が、組織解析や多重免疫染色の結果得られている。これらのマウス系統とScxGFPレポーターマウスの交配を行なったが、ホモの欠失個体でGFP陽性の個体が得られていないために、欠失個体の歯根をレポーターによって可視化するに至ってない。この点に関しては、同じ部位の連続切片を一般組織染色し比較することで解決している。ScxGFPマウスの胎生線維芽細胞から樹立したScxGFP iPS細胞は、未分化多能性の確認が完了した後に、キメラ胚を作成し実際にiPS細胞がScxを発現する腱・靱帯原基の細胞に分化するとGFPを発現することを確認した。ScxGFP iPS細胞が腱・靱帯および歯根部を形成する細胞への分化誘導系の探索に有用であることが確認できた。そこで、ScxGFP iPS細胞由来の胚葉体由来の間葉系細胞や、iPS細胞から液性分子と低分子化合物を用いて直接分化誘導した間葉系前駆細胞を用いてGFPが発現するような培養条件を検討しており、いくつかの条件を見出している。多重免疫染色によって、分化誘導した細胞におけるGFPの発現と歯根形成に関与する分子の発現の重なりを検討した。さらにこの培養条件と合わせて、腱・靱帯および歯根形成に関与するような液性分子の機能も検討している。解析は継続中で申請内容も関連性があるために、日本学術振興会の特別研究員として研究者が引き続き次年度も継続する。これまでに、ゲノム編集技術であるTALENを用いてScleraxis (Scx)、Msx2、Sclerostin (Sost)それぞれの欠失変異を持つマウス系統Scx-TALEN、Msx2-TALEN、Sost-TALENを樹立した。各マウス系統のヘテロマウスは、野生型と比較し顕著な異常は示さずに成長し生殖可能であることを確認した。さらに、ヘテロマウスを交配しScx、Msx2、Sost遺伝子が欠失しているホモマウスを作成した。Scx欠失マウスは腱・靱帯の低形成のため運動機能障害を示し、Msx2の欠失マウスは被毛とエナメル質の低形成を示すことが確認できた。Sostが欠失するマウスも得られている。Scx-TALENマウスの骨格に関しては、2017年3月に論文報告したホモ個体においてScxが欠失するScxCreノックインマウスと同様に、ホモマウスにおいて腱・靱帯の骨への付着部が低形成になることを確認した。マイクロCT検査によってMsx2-TALENホモマウスにおいて、歯根以外にも骨格が低形成となることが確認できている。またScx、Msx2いずれのホモマウスでも歯根の低形成が確認できている。Msx2欠失マウスの歯根形成に関しては川本法により非脱灰凍結切片を作成し、免疫組織学的に血管走行や石灰化を解析し、野生型マウスとの差を見いだしている。また歯根の周囲には、Scxを発現しScxGFPトランスジェニックマウスにおいてGFP陽性となる細胞が存在する。未分化間葉系間質細胞からGFP陽性細胞への分化に影響を及ぼす条件を探索するために、ScxGFP-iPS細胞から直接的または胚様体を介してGFP陽性細胞に分化する誘導系を樹立した。解析のために必要なホモマウスを作出するために、ヘテロマウスによる交配を進めている。Scx、Msx2、Sostいずれの系統もホモマウスを得ることに成功しているが、Scx、Msx2欠失マウスは、運動機能や咀嚼機能が障害されているために、野生型やヘテロマウスと比較して誕生後も育成が難しく、当初の想定通り、解析のために必要な個体数を確保するために時間がかかっている。Sost-TALENマウスに関しては、ホモマウスの基本的な表現系を確認中である。試料作成を行いながらも、交配と個体確保を続けている。これまでの組織解析やマイクロCTによる解析の結果からも、すでに歯根や骨格形成において、興味深い表現系が確認できている。さらに遺伝子発現やタンパク質の局在を調べるために準備を進めている。また、象牙芽細胞や歯周靱帯などの歯根の周囲組織を蛍光タンパク質であるGFPの発現によって可視化するために、それぞれのマウスを歯周組織においてGFPを発現するScxGFPトランスジェニックマウスと交配している。Msx2-TALEN及びScx-TALENの2系統はScxGFPのトランスジーンを持つヘテロマウスが得られている。さらにホモマウスを作成するための交配を行っているが、Msx2-TALENの系統に関しては、ホモの個体が誕生せず個体を得ることが難航している状態である。マウスの交配や解析の進捗状況を総括すると、概ね当初の予定通りであると考えられる。

これらのマウス系統とScxGFPレポーターマウスの交配を行なったが、ホモの欠失個体でGFP陽性の個体が得られていないために、欠失個体の歯根をレポーターによって可視化するに至ってない。この点に関しては、同じ部位の連続切片を一般組織染色し比較することで解決している。ScxGFPマウスの胎生線維芽細胞から樹立したScxGFP iPS細胞は、未分化多能性の確認が完了した後に、キメラ胚を作成し実際にiPS細胞がScxを発現する腱・靱帯原基の細胞に分化するとGFPを発現することを確認した。ScxGFP iPS細胞が腱・靱帯および歯根部を形成する細胞への分化誘導系の探索に有用であることが確認できた。そこで、ScxGFP iPS細胞由来の胚葉体由来の間葉系細胞や、iPS細胞から液性分子と低分子化合物を用いて直接分化誘導した間葉系前駆細胞を用いてGFPが発現するような培養条件を検討しており、いくつかの条件を見出している。多重免疫染色によって、分化誘導した細胞におけるGFPの発現と歯根形成に関与する分子の発現の重なりを検討した。さらにこの培養条件と合わせて、腱・靱帯および歯根形成に関与するような液性分子の機能も検討している。解析は継続中で申請内容も関連性があるために、日本学術振興会の特別研究員として研究者が引き続き次年度も継続する。申請時の方針には大きな変更はないが、初年度の解析の結果や進行状況から、研究計画を修正する必要がある。Msx2やScxの単独の欠失マウスにおいて、これまでに報告のない興味深い表現系が明らかとなっているため、解析をより丁寧かつ詳細に進めていく必要があると考えられる。遺伝子の多重欠損マウスの作成と基本的な解析は進めていくが、これまでに得られた結果をもとに、さらにMsx2やScxの歯根形成においての機能解析を深めるための解析に集中し研究を進めることが必要である。また、マウスの交配と試料採取には当初の予定通り時間がかかっている。しかし、ScxGFPトランスジーンを持つことによって、歯周組織がGFPの発現によって可視化され、かつMsx2が欠失しているホモマウスは、交配を重ねているにも関わらず未だに1個体も得られていない。遺伝子改変アレルを多重に持つマウスが胎生致死となり誕生しないことはしばしば報告されている。本研究でもその可能性を考えて、抗体の使用など他の代わりの方法を用いて解析を進めていく準備を行っている。マウスの交配と試料採取に時間がかかっているために、解析に必要な経費がまだ消費できていない。次年度に解析が多くなるために、その経費として使用する予定である。
固体酸化物形燃料電池における固体/気体ヘテロ界面の反応機構解明と高機能化

大規模発電用の高効率発電デバイスとして注目されている固体酸化物形燃料電池は、空気極おける過電圧が大きく、その向上が望まれている。そこで、空気極反応機構の解明とその性能向上を目的とした。空気極材料として、電子・イオン混合導電性材料に焦点をあて、放射光を用いたその場計測X線吸収(XAS)手法を確立し、欠陥化学、電気化学、固体化学的観点から、作動条件下における、電極深さ方向の電子構造変化を評価した。その結果に基づき、混合導電性酸化物電極上での酸素還元反応機構の本質的解明と、それに基づく構造設計指針を導くことに成功した。大規模発電用の高効率発電デバイスとして注目されている固体酸化物形燃料電池においては、空気極おける過電圧が大きく、その向上が望まれている。そこで、空気極反応機構の解明を目的とした。空気極材料として、電子・イオン混合導電性材料であるLa1-xSrxCoO3-δ(LSC113)に焦点をあて、放射光を用いたその場計測X線吸収(XAS)手法を確立し、欠陥化学、電気化学、固体化学的観点から、作動条件下における、電極深さ方向の電子構造変化を評価した。その結果に基づき、混合導電性酸化物電極上での酸素還元反応機構の本質的解明と、それに基づく構造設計指針を導くことを最終的な目標とした。薄膜モデル電極を用いて、その場深さ分解XAS測定を行い、律速過程は酸素還元反応における電極表面反応であり、酸素ポテンシャルの大きなギャップが気相/空気極界面で発生していることがわかった。空気極表面ではポテンシャルギャップを駆動力として、バルクと異なる空間電荷層が存在している可能性があり、ペロブスカイト酸化物中のSr濃度、点欠陥量に応じて、酸素表面反応係数、酸素空孔拡散係数が劇的に変化している可能性がある。この現象を解明するためには電極反応中の空気極最表面(気相/空気極界面)の評価が必要となる。そこで、さらに表面敏感な評価が可能な、その場全反射XAS、蛍光X線分析(XRF)手法を適用した。これにより、電極最表面とバルクには、電子状態、組成分布に大きな違いがあることがわかった。具体的には電極最表面の領域でCoが極端に還元され、Srがenrichされていることが明らかとなった。以上のことよりLSC電極反応中において表面ではSrリッチなペロブスカイト相が生成していることが示され、これが界面のポテンシャルギャップの一因であると考えられる。大規模発電用の高効率発電デバイスとして注目されている固体酸化物形燃料電池(SOFC)の基礎研究を行った。SOFCにおいては、空気極おける過電圧が大きく、その向上が望まれている。その結果に基づき、混合導電性酸化物電極上での酸素還元反応機構の本質的解明と、それに基づく構造設計指針を確立した。その場全反射XAS、蛍光X線分析(XRF)手法を適用した結果、電極最表面とバルクには、電子状態、組成分布に大きな違いがあることがわかった。この知見を基に、層状ペロブスカイト構造をもつRuddlesden-Popper ((La0.5Sr0.5)2CoO4±δ)をLSC113電極に積層させることで電極活性を向上させ、Srリッチになる現象を抑制することに成功した。本研究は高性能SOFC空気極の設計に対する重要な知見を与えるものである。固体電気化学固体・気体界面を固体酸化物形燃料電池作動条件下にて測定するための方法論を確立し、モデル電極を用いた測定に適用させてた。得られた結果はこれまで見られなかった電圧印加時の界面構造を捉えた初めてのケースであり、予定通りの進展である。得られた界面情報から、反応を促進するための表面制御を行い、高性能固体/気体ヘテロ界面の設計を進める。電極表面での組成変化が律速要因であることから、LaSrCoO4等の異なる組成を有する極薄膜をPLD法にて被覆する。25年度で明らかにした律速過程の支配要因についての情報をベースにすることで、ヘテロ界面の基礎的な知見に沿った材料設計が可能となる。

これらの表面被覆した電極を用いて、ヘテロ界面の構造情報をその場X線測定で計測し、再度材料設計へフィードバックする。以上から、高性能固体/気体ヘテロ界面の構築を目指す。次年度に測定セル用部品を購入するために、物品費を削減したため。翌年度分の額を測定セル用部品の購入に充てる。
2光子イメージングと光操作による運動学習過程での大脳神経細胞の可塑性誘導機構解明

まずアデノ随伴ウイルスの逆行性感染様式を利用して、マウス一次運動野第5層の神経細胞の中で、線条体に投射している皮質-線条体投射神経細胞、もしくは脊髄に投射している皮質-脊髄投射神経細胞のみに蛍光カルシウムセンサーを遺伝子発現させた。次に、これらの投射経路特異的に蛍光カルシウムセンサーを遺伝子発現させたマウスに、2週間、自発的なレバー引き課題をおこなわせ、2光子カルシウムイメージングによって、神経活動を計測した。解析の結果、投射経路によって、運動学習で、発火頻度が上昇する神経細胞の集団が異なることを明らかにした。大脳新皮質は、哺乳類のみに存在する大脳の表面を覆う領域で、多くの認知機能に関わる。6層構造からなる大脳新皮質は、各層の神経細胞が異なる入出力を持ち、記憶や学習が関与する認知課題を行う際には、様々な領域とネットワークを形成し、情報処理を行っている。運動技能は、繰り返し練習して身につけた動作で、運動学習が重要な役割を果たす。学習は段階的に進行し、初期は動きが未熟でぎこちないが、練習により行動の正確さや速度が増し、後期に運動は自動化される。これまでの研究では、in vivo 2光子カルシウムイメージングで、げっ歯類の運動野の浅層第2/3層および深層第5層の神経細胞の活動を解析し、運動学習によって、第2/3層よりも第5層の神経細胞の方が、運動課題実行時、発火頻度が上昇する(課題関連細胞になる)ことを明らかにした。本研究では、アデノ随伴ウイルスが順行性だけでなく逆行性にも感染する様式を利用した遺伝子導入法を用いて、運動野第5層の神経細胞の中で、反対側の線条体に投射している皮質-線条体投射神経細胞、もしくは脊髄に投射している皮質-脊髄投射神経細胞のみに蛍光カルシウムセンサーのGCaMPを発現させ、それらの神経細胞の活動を観察する系を立ち上げた。具体的には、左脳運動野に「アデノ随伴ウイルスセロタイプ9(AAV9)-human synapsin 1プロモーター-LoxP-stop-LoxP-GCaMP」を注入し細胞体から順行性に感染させ、さらに、右脳線条体、もしくは脊髄に「AAV9-CMVプロモーター-Cre」を注入し、運動野から線条体、もしくは脊髄に投射している神経細胞の軸索末端から、逆行性に感染させた。本年度は、運動学習課題として、飲水制限したマウスに700ミリ秒以上レバーを引くと報酬(水)が出る課題を毎日1時間、14日間連続で行わせた。その際に、アデノ随伴ウイルスが順行性だけでなく逆行性にも感染する様式を利用した遺伝子導入法を用いて、運動野第5層の神経細胞の中で、反対側の線条体に投射している皮質-線条体投射神経細胞、もしくは脊髄に投射している皮質-脊髄投射神経細胞のみに蛍光カルシウムセンサーを発現させた動物を用いて、運動学習課題実行時のin vivo2光子カルシウムイメージングを行った。平成27年度は、投射経路特異的に蛍光カルシウムセンサーを発現させた系を用いて、運動学習課題実行時のイメージングを行った。従って、本研究は順調に進行している。これまでの研究では、運動学習課題として、飲水制限したマウスに700ミリ秒以上レバーを引くと報酬(水)が出る課題を毎日1時間、14日間連続で行わせた。本年度は、取得したイメージングデータを解析し、学習に伴い、皮質-線条体投射

神経細胞では、学習初期に運動情報量が低い細胞が、学習初期に高い細胞を追い越して高くなるのに対し、皮質-脊髄投射神経細胞では、学習初期に運動情報量が高い細胞が、さらに高くなる傾向を明らかにした。まずアデノ随伴ウイルスの逆行性感染様式を利用して、マウス一次運動野第5層の神経細胞の中で、線条体に投射している皮質-線条体投射神経細胞、もしくは脊髄に投射している皮質-脊髄投射神経細胞のみに蛍光カルシウムセンサーを遺伝子発現させた。次に、これらの投射経路特異的に蛍光カルシウムセンサーを遺伝子発現させたマウスに、2週間、自発的なレバー引き課題をおこなわせ、2光子カルシウムイメージングによって、神経活動を計測した。解析の結果、投射経路によって、運動学習で、発火頻度が上昇する神経細胞の集団が異なることを明らかにした。平成26年度は、投射経路特異的に蛍光カルシウムセンサーのGCaMPを発現させる系を立ち上げた。従って、本研究は順調に進行している。取得した実験データを解析し、投射経路によって、運動学習過程における神経活動の発火パターンの変化に違いがあるかどうかを明らかにする。神経科学今後、運動野第5層の神経細胞の中で、反対側の線条体に投射している皮質-線条体投射神経細胞と、脊髄に投射している皮質-脊髄投射神経細胞で、運動学習過程で神経活動の発火パターンの変化に違いがあるのかどうかを明らかにする。
eRF3ファミリーGタンパク質によるmRNA品質管理機構の解明

研究代表者はこれまで、正常なmRNAの分解が終止コドン上での翻訳終結と共役して開始されること、またG蛋白質eRF3がその制御において中心的な役割をはたしていることを証明した。本研究においては、終止コドンをもたない異常なmRNAを分解する品質管理機構(ノンストップ型mRNA分解:NSD)がヒトにおいても存在し、eRF3と相同なG蛋白質Hbs1とエキソソームがそのメカニズムにおいて不可欠な役割をはたしていることを証明した。異常なmRNAを分解なるmRNS品質管理機構として知られるナンセンス型mRNA分解(NMD)、ノンストップ型mRNA分解(NSD)、リボソーム停滞型mRNA分解(NGD)についてその分子機構を解明することを目的として解析を行い以下の知見を得た。(1)リボソーム停滞型mRNA分解(NGD)NGDの第1段階はエンドヌクレアーゼであるDom34によるmRNAの分子内切断であると考えられていたが、昨年度Roy Parkerらのグループによって完全に否定された。研究代表者らは、Dom34を運搬するG蛋白質であるHBS1と結合する因子としてGAPDHを同定しているが、酵母オーソログであるTdh3の破壊株を作成しNGDを解析したところ、NGDに明らかな異常が観察され、エンドヌクレアーゼの実体がGAPDHである可能性が示された。(2)ナンセンス変異型mRNA分解(NMD)(3)ノンストップ型mRNAの分解(NSD):βグロビンのレポーター遺伝子を用いたノンストップ型mRNAの発現系を用いてヒトにおけるノンストップmRNA分解の特性を明らかにした。研究代表者は、mRNAが翻訳終結と共役して分解される」という正常なmRNAの分解開始の普遍的分子機構を解明した。そのなかで、G蛋白質である翻訳終結因子eRF3がその制御において中心的な役割をはたしていることを証明した。一方で、(1)ナンセンス変異型mRNA分解(NMD)、(2)ノンストップ型mRNA分解(NSD)、(3)リボソーム停滞型mRNA分解(NGD)という異常なmRNAを分解する品質管理が知られているが、その分子機構の詳細については不明な点が多い。本研究においては、研究代表者らが独自に解明した正常なmRNAの分解開始機構の研究成果とその過程で用いた独自の研究手法を応用することにより、いまだ解明の進んでいない異常なmRNAの分解機構(品質管理機構)を解明し、mRNA分解全般に共通する普遍的分子機構を解明することを目的としている。本年度はとくにNSDのメカニズムについて解析を行った。NSDの研究は酵母において研究が先行して行われ、Ski7が分解に中心的役割をはたしていることが明らかにされている。一方で、哺乳類にはSki7のオーソログは存在せず、NSD自体が哺乳類において機能しないとする論文も出されている。研究代表者らは、Ski7がeRF3ファミリーに属するG蛋白質であることに着目し、同じファミリーに属するHBS1が哺乳類におけるNSDに関わる可能性について検討を行ってきた。その結果、HBS1のドミナントネガティブ変異体やノックダウンにより、NSDが正常に機能しないことを明らかにした。また、HBS1がSki複合体やエキソソームと結合することを見出し、哺乳類においても酵母と同様なノンストップmRNAを認識し分解するmRNA品質管理機構が存在することを証明した。昨年度に引き続き、本年度においても主にノンストップ型mRNAの分解機構(NSD)について解析をおこなった。昨年度までに終止コドンを除いたルシフェラーゼをmRNAレポーターとして、HBS1がNSDに必要であることを明らかにしてきたが、本年度は、HBS1と複合体を形成するDom34、および、エキソソームの構成因子であるRrp6、Dis3、Rrp40、さらにエキソソームと複合体を形成するSki2/Ski2Lについても解析をおこない、これらの因子の欠損によりNSDに異常をきたすことから、これら因子群がNSDに必要な因子であることを明らかにした。

これまで哺乳類においてはNSDは存在しないと考えられてきたが、NSDのメカニズムは存在しており、Hbs1-Dom34とそれに結合するエキソソーム-Ski複合体によって担われていることを証明することができた。一方、ノンストップmRNAから翻訳されてできた異常な蛋白質を分解する機構としてLtnをユビキチンリガーゼとするプロテアソームによる分解系が酵母で報告されているが、哺乳類においてもLtnのオーソログであるListerinが分解にはたらくことも明らかにした。研究代表者は、正常なmRNAの分解開始の普遍的分子機構を解明した。そのなかで、G蛋白質である翻訳終結因子eRF3がその制御において中心的な役割をはたしていることを証明した。一方で、ノンストップ型mRNA分解(NSD)、リボソーム停滞型mRNA分解(NGD)という異常なmRNAを分解する品質管理が知られているが、その分子機構の詳細については不明な点が多い。本研究においては、研究代表者らが独自に解明した正常なmRNAの分解開始機構の研究成果とその過程で用いた独自の研究手法を応用することにより、いまだ解明の進んでいない異常なmRNAの分解機構(品質管理機構)を解明し、mRNA分解全般に共通する普遍的分子機構を解明することを目的としている。本年度は、本基盤研究の最終年度にあたるため、ノンストップ型mRNAの分解機構(NSD)について研究の総括をおこなった。ヒトにおいてはこれまで、NSDのメカニズムは存在しないとされてきたが、本研究においては、ノンストップ型mRNAが正常なmRNAに比べ不安定であり、積極的に分解されていることを証明した。また、NSDは翻訳に依存しておこり、翻訳終結因子eRF3ファミリーに属するHbs1とその結合パートナーであるDom34が必須な役割をはたしていることを証明した。酵母においてはエキソソーム-SKI複合体が分解に必要であるが、ヒトにおいてもエキソソームの構成因子であるDis3とSKI複合体の構成因子であるSki2/Mtr4ヘリカーゼが分解に必要であり、Hbs1-Dom34がこれらの因子と複合体を形成していることを明らかにした。以上の研究成果は、ヒトにおいてもNSDのメカニズムが存在し、ノンストップ型mRNA上で停滞したリボソームにHbs1-Dom34がエキソソーム-SKI複合体をリクルートすることでmRNAを積極的に分解していることを強く示唆している。本研究で取り上げた3つの課題のうち、特にNSDの研究に進展がみられたため、NSDを重点的におこなった結果、NGDおよびNMDの解析が遅れている。24年度が最終年度であるため、記入しない。上述の通り、NSDについては当初予定通りその分子機構の解明に成功したことから、今後はNGD、NMDについて重点的に解析を行なう。
シクロデキストリン化学の新展開-水系から非極性溶媒系での分子認識へ

本研究では、非極性溶媒中で高度な分子認識能を示す革新的シクロデキストリン(CD)ホスト分子の開発とそれを用いた汚染オイル中からの有害物質の高効率除去を目的としている。本年度は、非極性溶媒中で高度な分子認識能を示すCDホスト分子の開発を目的として、種々のCD誘導体を設計・合成し、それらの非極性溶媒中での分子認識能を検討した。CDホスト分子に、6-O-tert-ブチルジメチルシリル化β-CDや6-O-トリイソプロピルシリル化β-CDといった6位修飾β-CDを用いた時、非極性溶媒中のハロゲン化ベンゼンとの顕著な包接錯体形成が認められた。特に、これらのCDホスト分子は2置換以上のハロゲン化ベンゼンと安定な包接錯体を形成することがわかった。また、用いる非極性溶媒の種類により、これらのCDホスト分子のゲスト選択性が変化することがわかった。例えば、ベンゼン中では1,2-ジクロロベンゼンよりも1,3-ジクロロベンゼンに対し高い包接選択性を示したのに対し、シクロヘキサン中ではそれらに対する包接選択性が逆転した。一方、1,2,4-トリクロロベンゼンに対しては、CD空孔内への包接モードの違いにより、ベンゼン中とシクロヘキサン中とで1オーダー異なる会合定数が観測された。これらのCDホスト分子は、非極性溶媒中の臭素化ベンゼンならびにヨウ素化ベンゼンに対しても顕著な包接能を示し、特に1,2-ジブロモベンゼンに対し高い包接能(会合定数>2500M^<-1>)を示すことが明らかとなった。さらに、これらのCDホスト分子は、非極性溶媒中でピレンやナフタレンといった多環式芳香族化合物とも包接錯体を形成し、用いる溶媒によって包接錯体の構造が劇的に変化することが分かった。
在宅型心臓リハビリテーションを促進するWEBコンテンツの作成と評価

本研究の目的は、心疾患をもつ成人の退院後のセルフマネジメントを促進するため、多角的効果が期待される在宅型心臓リハビリテーションを、Webコンテンツを用いて運用しその評価を行うことである。退院後心臓リハビリテーションを特に実施していない患者を対象に、セルフマネジメントに関する実態調査を実施した。ヒアリング及び統計的調査結果から、全体の70%程が退院後1ヶ月以内に社会復帰し、退院後は運動習慣の改善などが見られることが明らかになった。しかし、心臓リハビリテーションの必要性は感じていないことも示唆された。3か月後には、生活上の行動に関する認知と健康関連行動の関連は強く、療養生活をマネジメントする機能が高くなることが考えられた。さらに、セルフマネジメントに影響を与える阻害・促進因子として、「EF」、「社会的支援」、「抑うつ傾向」、「勤務年数」が作用することが明らかになった。これらの成果を基にWebページ「狭心症・心筋梗塞の方のための情報・交流サイト」を作成し運用した。ユーザーが関心をもつ喫煙や飲酒などの嗜好品、食事、生活リズム、運動習慣など、心臓病に深く関わる健康関連行動に関する調査概要を記した。療養生活や心臓リハビリテーションに関する知識や情報については、添付ファイルで閲覧できるようにした。また、Web上で体験談を収集できるようコンテンツを作成した。コンテンツに対する反応はまだ十分でないため、今後もコンテンツを随時改変し、URLについて広く周知できるように広報についての対策が課題である。本研究の目的は、心疾患をもつ成人の退院後のセルフマネジメントを促進するため、身体的側面のみならず、多角的効果が期待される在宅型心臓リハビリテーションを、Webコンテンツを用いて運用しその評価を行うことである。(1)平成21年度は、包括的心臓リハビリテーション実施状況に関する調査を実施した。調査は、A県内で循環器(心臓)内科および心臓外科を有する総合病院または循環器専門病院施設(平成21年1月現在)を対象に、郵送調査を実施した。質問紙の内容は、急性期、回復期、維持期の心臓リハの実施状況・心臓リハに関わる職種と業務内容・心臓リハ指導士の認定を受けている職種・現在行っている心臓リハの問題点に関して、多項選択を中心とした回答形式の質問紙とした。また、これ以外の循環器科、心臓外科を標榜している埼玉県内の医療施設を対象に、心リハ実施状況、心リハに関する要望などを、同じく質問紙を用いて郵送調査を実施した。現在調査を続行中、平成22年度内に結果を総括する。(2)心リハが退院後も必要と考えられる心筋梗塞、狭心症、慢性心不全患者を対象にした心リハに関するヒアリングを実施した。まだ調査協力者が少ないため、今後協力者の募集と調査を継続する。質問内容は、心リハに関する認識、退院後の運動、栄養等の日常生活状況、医療者や同病者に相談したい事項、再入院や手術などの心疾患に関連するイベントの有無、およびインターネットの利用状況に関する質問項目による非構成的面接法を用いる予定である。(1)平成22年度は、心リハが退院後も必要と考えられる心筋梗塞、狭心症患者を対象にした心リハに関するヒアリングを実施した。まだ調査協力者が少ないため、協力者の募集と調査を継続する。質問内容は、心リハに関する認識、退院後の運動、栄養等の日常生活状況、医療者や同病者に相談したい事項、再入院や手術などの心疾患に関連するイベントの有無などに関する構成的面接法を用いる。(2)これまでの研究成果および心臓リビリテーションに関する情報を、インターネットに公開するためのWebページ「狭心症・心筋梗塞の方のための情報・交流サイト」を作成した。今後は、開設した心臓リハビリテーション患者を対象にしたWebページを介して、調査結果の概要などを情報公開し、アクセス状況などの反応をみて修正を行う。また、Web利用者の患者体験を収集し、文字情報や画像情報などで情報を公開し、患者の情報共有スペースの作成とその効果について検討していく予定である。

現在、公開に受けてレイアウト等の最終的な調整をしている。URLは、調査に協力をしていただいた患者や施設を中心に配布し、広く周知できるようにしていく予定である。在宅での心臓リハビリテーションプログラムについては現在作成中のためまだ未公開である。本研究の目的は、心疾患をもつ成人の退院後のセルフマネジメントを促進するため、多角的効果が期待される在宅型心臓リハビリテーションを、Webコンテンツを用いて運用しその評価を行うことである。平成23年度は、これまでの研究成果および心臓リビリテーションに関する情報を、インターネットに公開するためのWebページ「狭心症・心筋梗塞の方のための情報・交流サイト」を作成し運用した。壮年期の虚血性心疾患患者を対象にした調査結果から、ユーザーが関心をもつと考えられた喫煙や飲酒、塩分や脂質の摂取状況といった食事内容に関すること、食事時間や睡眠時間などの生活リズムに関すること、運動習慣の継続などの心臓病に深く関わる健康関連行動に関する調査の概要を記した。より詳細な内容について知りたいというニーズがあったので、研究論文にアクセスできるようにリンクを張った。また、概要掲載にあっては、なるべく簡易な用語を使用し、リンクや添付については「こちら」などの指示語だけでなく、具体的な内容もわかるように修正を行った。療養生活や心臓リハビリテーションに関する知識や情報については、研究者が整理をして添付ファイルの形で閲覧できるように作成した。他の患者体験について知りたいというニーズがあったので、Web上での体験談を収集できるようコンテンツを作成した。これに関する反応はまだ十分でないため、今後の患者側からの情報の蓄積が必要と考える。今後もコンテンツを随時改変し、URLについて広く周知できるように広報についての対策が課題である。
道教内丹学の形成と展開についての語彙および図像論的研究

本研究の目的は、まず後漢の魏伯陽『周易参同契』、北宋の張伯端『悟真篇』、唐末五代の『霊宝畢法』『鍾呂伝道集』『入薬鏡』などの内丹学の資料をコンピューターに打ち込み、内丹学の教説の発展を構造的に把握する点にある。これらの資料の打ち込みはすべて完了し、語彙解釈の基準としては清朝・仇兆鼇の『古本周易参同契集注』を基本として『周易参同契』を解釈した。ついで『鍾呂伝道集』を検討し、かなりの部分の日本語訳を蓄積した。この作業では、相関連する『霊宝畢法』『入薬鏡』の解釈も並行して行なった。ついで唐末北宋以來の内丹学は金代にいたって大きく様変わりしたが、その新しい宗教である全真教の基本書籍を数点コンピューターに打ち込んで解釈することが目的である。そこで譚長真『水雲集』、劉長生『仙楽集』『黄帝陰符経註』『黄庭内景経註』『無為清静長生真人至真語録』『長生劉真人語録』、丘長春『〓渓集』『大丹直指』『長春丘真人寄西州道友書』、王玉陽『雲光集』、〓廣寧『太古集』など、いわゆる「七真」と呼ばれる、全真教開祖王重陽の弟子たちの著作を打ち込み、それらに見られる内丹語彙の展開状況について検討した。次ぎに『遵生八箋』『性命圭旨』『大丹直指』などの図を収集分析し、内丹の修行との関連を把握することを目標としたが、残念ながら時間的な余裕があまり無く、十分な検討ができなかった。ただし『大丹直指』と『太古集』中の図については、その解説文を併せて分析した。その他『秘書集成』中の若干の資料について、系統、特色そのほかの要項を抽出してカード化した。これらの成果は、一部はすでに発表し、その他のものもいずれさまざまな形で発表する予定である。本年度は主に道教内丹関係の主要著作をコンピューターに打ち込む作業を行なった。まず、もっとも基本的な資料である後漢の魏伯陽『周易参同契』を打ち込み、次いで北宋の趙伯端(趙紫陽)『悟真篇』を打ち込んだ。さらに全真教の基本経典にもなっている唐末から五代にかけての『鐘呂伝道集』『霊宝畢法』『入薬鏡』を打ち込んだ。そのため、コンピューターそのほか若干の設備を整え、打ち込み作業は研究室補助員のアルバイトを使って行なった。打ち込んだ資料については、まず『周易参同契』の読解を行なった。それまでのさまざまな注を集めた清朝・仇兆鼇の『古本周易参同契集注』に基づいて、一通り解約した。ただし、資料がすこぶる難解なため、本年度としては重要な語彙を抽出してしっかりした概念規定を行なう段階にまでは至っていない。ついで『鐘呂伝道集』を検討し、かなりの部分の日本語訳を蓄積した。この作業では、相関連する『霊宝畢法』『入薬鏡』の解釈も平行して行なった。また中国でのこの方面の研究状況を把握するため、九七年正月に北京に出張し清華大学などで情報交換を行なった。さらに全真教関係に資料である『大丹直指』や『雲光集』などを打ち込み内丹語彙の展開状況を検討する基礎資料の準備に取りかかった。

本年度の研究作業はほぼ以上の通りであり、基礎研究があまり為されていないこの分野の研究としては、ほとんどの時間を基礎資料の整備に費やさざるを得なかった。今後の作業としては、さらに膨大な存する基本資料の打ち込みと、それを整理して語彙を抽出し、その展開を位置づけること、『遵生八箋』『性命圭旨』『大丹直指』そのほかに付けられている多くの図の収集とその整理がある。本年度も引き続いて道教内丹関係の主要著作をコンピューターに打ち込む作業を行なった。唐末北宋以來の内丹学の展開は金代にいたって大きく様変わりしたが、本年度はその新しい宗教である全真教の基本典籍を数点コンピューターに打ち込んだ。丘長春の『大丹直指』と王玉陽『雲光集』はすでに打ち込んであるので、譚長真『水雲集』のほか、劉長生『仙楽集』『黄帝陰符経註』『黄庭内景経註』『無為清静長生真人至真語録』『長生劉真人語録』、丘長春『長春丘真人寄西州道友書』などを打ち込んだ。それと同時に、これら多くの典籍に見られる内丹語彙の展開状況について若干の検討を行なった。譚長真、劉長生、丘長春、王玉陽は他の二名とあわせて全真教開祖王重陽の弟子であり、一番弟子の馬丹陽を含め、七真と呼ばれ、後世の中国文化に大きな影響を与えた。ところが例えば「中国」という言葉は重陽や丹陽は使わず、長生が多用し、長春がやや使う。内丹学の特殊用語については、それほどのはっきりした特徴はないが、使用語彙の分布にはやはり若干の偏向がある。それらについては、まだ散発的に検討している段階で、整理はしていないが、いずれ整理して気功などとの関係もあきらかにしたい。また、『秘書集成』中の諸資料について、系統、特色そのほかの要項を抽出してカード化する試みも若干行なった。さらに、中国でのこの方面の研究状況を把握するため、九七年十月に北京に出張し、北京外国語大学などで情報交換を行なった。本年度の研究作業はぼ以上の通りである。今後の作業としては、図の収集とその整理がある。本研究の骨子は、後漢の魏伯陽『周易参同契』、北宋の趙伯端『悟真篇』、唐末五代の『霊宝畢法』『鍾呂伝道集』『入薬鏡』などの内丹学の基本的資料を打ち込み、その重要語彙を抽出して概念規定を行なうこと、語彙解釈の基準として清朝・仇兆鼇の『古本周易参同契集注』に基づいて『周易参同契』を解釈すること、譚長真『水雲集』、劉長生『仙楽集』『黄帝陰符経註』『黄庭内景経註』『無為清静長生真人至真語録』『長生劉真人語録』、丘長春『大丹直指』『長春丘真人寄西州道友書』など、いわゆる「七真」と呼ばれる、全真教開祖王重陽の弟子たちの著作を打ち込み、それらに見られる内丹語彙の展開状況について検討をすること、『遵生八箋』『性命圭旨』『大丹直指』などの図を収集分析し、内丹の修行との関連を把握すること、などである。資料の打ち込みはほぼ予定通り行ない、本年はさらに七真の一人、廣寧の『太古集』を打ち込み、整理した。さらに引き続いて『秘書集成』中の諸資料について、系統、特色そのほかの要項を抽出してカード化した。図像関係では、『大丹直指』および『太古集』中の図について、その解説文を併せて分析した。ただし『遵生八箋』『性命圭旨』など、道教内丹学では重要な資料となる書籍の図については、残念ながら時間的な余裕が無く、検討できなかった。本年は特に全眞教関係の資料の分析に注力し、各資料の間での語彙使用状況の特色などについて分析したが、その成果は、いずれ、さまざまな形で発表する予定である。
男児外性器異常発症に関与する環境因子と遺伝因子の複合的作用についての研究

われわれが得た成果は以下の項目である。1今回はLC/MSMS法を用いて、正常新生児の臍帯血におけるfrontdoor pathway・backdoorpathway両方の一斉分析を行った。胎児期から新生児期にかけての男性ホルモン産生経路を中心としたステロイドプロファイルを明らかにした。胎児期から新生児期における男性ホルモン産生機序はいまだ不明な点が多く、性分化研究における重要な結果である。2これまでに集積した日本人男児・成人男性、性分化異常症症例の末梢血DNAを使用し、ESR1遺伝子のイントロン内微小欠失頻度を解析し、この欠失がエストロゲン効果の感受性亢進を招くことを明らかとした。平成25年度は、以下の項目を行った。1正常新生児の外性器の状態を評価を行った。本項目は、帝王切開症例のみに限定せず、浜松医科大学にて出生した男児新生児に関して、可能な限り外性器の評価および肛門性器間距離の測定と記録を行った。肛門性器間距離は胎内での抗男性ホルモン作用の指標として重要である。平成25年間にて160症例のデータ集積が可能となった。2予定帝王切開にて出生するケースのリクルート状況は、若干の進行の遅延がある。現時点で25症例のリクルート状況である。方法としては、浜松医科大学医学部付属病院において妊娠が判明した妊婦ならびに出生した児を対象とし、インフォームドコンセントを取得した後、母体の尿・臍帯血・胎盤をサンプリングする計画であるが、インフォームドコンセントを取得するタイミングの不一致、児の胎内での状態の変化による予定帝王切開のスケジュールの変更、研究参加への同意の取得困難、などの理由により、リクルート数としては不十分である状況である。3母体尿の環境ホルモンレベルの測定は、取得した検体に関しては解析を進めている。すでに研究協力者(国立環境研究所曽根秀子先生)における確立したアッセイ系を使用するため、問題ない。1正常新生児について、外陰部の計測を行った。正常分娩および帝王切開にて出生した児について、平成25年から継続して計測を継続した。平成25年から26年まででトータル180例のデータを集めることができた。2予定帝王切開症例を対象としたリクルートを行った。出産のために入院してきた母(と父)に対して研究の概要を説明し、同意をえた。同意がえられない例も数例あったが、概ね順調にリクルートできた。予定帝王切開の直前の日程変更、児の産後合併症などもあり、十分満足できるサンプル数には達しなかったので、平成27年度も引き続きリクルートを継続していく。採取したサンプルは、母尿、母血液、臍帯血、臍帯、胎盤、児の尿である。3臍帯血を用いて、新生児期のステロイド一斉分析をLC/MSMS法にて行った。通常のアンドロゲン産生経路(frontdoor pathway)由来のアンドロゲンおよび、17-OHPから5α-17-hydroxy pregnanolone、androsteroneを経て、testosteroneを介さずにdihydrotestosteroneを産生する新たなアンドロゲン産生経路(backdoor pathway)の両方の経路に関与するステロイドを含めて解析した。これまで、新生児期における詳細なステロイド一斉分析は行われておらず、重要な結果である。1当院周産母子センターにて出生した新生児にたいして、外陰部の計測を行った。正常分娩および帝王切開で出生し、性の分化異常も含めて合併症がない症例に限って行った。平成25年から計測を開始し、継続した結果、現時点までで約250症例のデータを集めることができた。2母体尿、母体血液、臍帯血、臍帯、児の尿をサンプリングするために、予定帝王切開症例に対してリクルートを行った。出産のために入院をしてきた母(および父)に対して、研究概要を説明し、同意を得た。サンプル数は50例である。3臍帯血を用いて、新生児期におけるステロイド(frontdoor pathwayとbackdoor pathway)の一斉分析を行った。もっとも精度のよいLC/MSMS法を測定法として選択した。通常のアンドロゲン産生経路をfrontdoor pathway(testosteroneから強力な男性ホルモンであるdihydrotestosteroneを産生する)と呼ぶが、胎児期やある一定の病的な状態では17-OHPから5αー17-hydroxypregnanolone, androsteroneを経て、testosteroneを介さずにdihydrotestosteroneを産生する経路であるbackdoor pathwayが性分化研究において重要である。これまで、臍帯血におけるfrontdoor pathway・backdoor pathwayの一斉分析のデータはなく、今回のデータは極めて重要である。4環境化学物質に関する一斉分析を依頼中である。5エストロゲン受容体遺伝子、ダイオキシン需要t外遺伝子のハプロタイプ、エストロゲン遺伝子の微小欠失につき解析中である。1正常新生児の外性器のデータを増やす必要がある。

2予定帝王切開症例のリクルートは十分とは言えない、さらに追加する必要がある。3環境ホルモンレベルの解析は進行中であるが、外性器の計測値との解析がまだできていない。4臍帯、胎盤の分子遺伝学的解析が遅れている。平成27年度には性分化に関与する遺伝子の解析を進める必要がある。5母採血、臍帯血に関する環境ホルモンに関する感受性遺伝子の解析が遅れている。平成27年度に行っていく。新生児学先天奇形症候群1予定帝王切開症例のリクルートを行う。100症例を目標とする。2母尿中環境ホルモンレベルとアウトカムとしての児表現系(外性器)との相関を解析する。3臍帯、胎盤の分子遺伝学的解析を至急おこなう。4母採血、臍帯血に関する環境ホルモンに関する感受性遺伝子、具体的にはERαに存在する微小欠失の解析を行う。5これらのデータに関して、統計学的解析を行う。サンプル採取の進捗がやや遅れている。サンプルは母体尿、臍帯血、胎盤である。対象は浜松医科大学産婦人科にて予定帝王切開にて出産する妊婦および出生した新生児。平成25年度で25名のリクルートあり。遅延している理由として、1研究への参加同意を取得するために、対象妊婦に研究概要を説明することが必須であるが、研究概要説明担当医師のスケジュールと妊婦健診のスケジュールとの不一致があり、すべての対象妊婦をリクルート出来なかったこと2児の胎内での状態の変化により、予定帝王切開のスケジュールが変更になったケースがあったこと3研究参加に同意いただけないケースがあったこと、が上げられる。新生児の表現系として重要である肛門性器間距離に関しては、すべての出生新生児(帝王切開によらない)に関してデータ取得できたため、今後の乳児健診によるフォローアップによるデータを加えて解析が可能である。1分子遺伝学的解析が遅れたため、消耗品として計上していた物品の使用が遅れた。2実験助手が、他の予算により雇用されたため、謝金などによる費用が発生しなかった。3環境科学ホルモンの解析は現在依頼中であり、使用額に含まれなかった。1リクルート数を増やす工夫をする。研究参加同意取得説明を積極的に行う。院内でのポスターなどにおける周知を徹底し、対象妊婦の理解を得られるように努力する。2すでに採取しているサンプルの解析に着手する。外性器異常と関連するエストロゲン受容体遺伝子、アンドロゲン産生経路関連遺伝子、ダイオキシン代謝関連遺伝子の遺伝子多型やハプロタイプの解析を行う。3胎盤におけるインスリン様成長因子タイプ2(Insuline-like growth factor 2;IGF2)に代表されるインプリンティング遺伝子群が、胎児の成長の制御に強く関与していることが知られている。
アレルギー性鼻炎に対するIgE・ケモカイン産生を抑制する遺伝子治療の確立

線維芽細胞におけるRANTES・Eotaxinの産生とシグナルの関係を調べた。その結果、線維芽細胞におけるSykの発現とLPS刺激によるRANTESの産生が、正比例することを見出し、SykアンチセンスオリゴにてLPS刺激によるRANTESの産生は抑制され、Sykの発現ベクターによってSykを過剰発現させるとRANTESの産生は亢進した。さらにRANTES産生には、JNK1とp38のリン酸かシグナルが重要であり、ERKの系は関連が少なかった。Sykの下流にあるRasの検討からは、RANTES産生と増殖経路は異なり、PI3-kinaseを活性化する系が最もRANTES産生を亢進させ、増殖はERKの系が関与していた。鼻粘膜由来線維芽細胞におけるToll-like receptor(TLR)発現を調べると、TLR7、TLR8、TLR10以外のTLRは発現していた。TLR3に結合するウイルス由来のdouble strand RNA(dsRNA)に注目した。dsRNAにて線維芽細胞を刺激すると大量のRANTES産生を認めた。そしてその産生はIFNγの添加にて有意に亢進したが、IL-4を添加しても軽度のRANTES産生亢進を認めるのみであった。一方、dsRNAにてEotaxin産生は認めらないが、IL-4とdsRNAの併用で有意な産生亢進認め、ウイルス感染によって一時期症状の増悪の可能性を示唆した。さらに鼻線維芽細胞におけるCCR3の発現を検討すると、RANTES処理にてCCR3の発現が亢進するとともに、RANTES刺激による鼻線維芽細胞自身の増殖亢進を認め、オートクライン的相乗効果があることが判明した。また、IgE産生においてCD45がJNKを介してIgEへのクラススイッチを制御していることを証明した。IgEプロモーターとGFPによる組み換えベクターによるクラススイッチの定量システムにて、IgEへのクラススイッチ転写活性を調べたところ、DNAの構造修飾などの何らかの機序がIL-4の刺激以外に必要であることを証明した。さらに、ヒトIgE-IgGキメラ蛋白を作成し、IL-4とCD40によるIgEクラススイッチを抑制させた。IgEとRANTES/Eotaxinなどの強い好酸球遊走活性を有するケモカインは、アレルギー性鼻炎の発症機序において双壁的役割を担っている。本年は、アレルギー性鼻炎患者の鼻粘膜や鼻茸より線維芽細胞を樹立し、ケモカイン産生に及ぼす影響を検討した。sykは非受容体型チロシンキナーゼであるが、我々は血球系の細胞以外の鼻線維芽細胞にも存在することを見つけた。そして、鼻線維芽細胞内のsyk発現量とLPSにて刺激した際のRANTES産生が正比例関係であることを見いだした。sykに対するアンチセンス処理でRANTES産生は低下し、非活性型変異体発現ベクターを導入してもRANTES産生が起こらなかった。一方、野生型syk発現ベクターを導入すると有意にRANTES産生が誘導された。RANTES産生は、IL-1βとTNFαのいずれの刺激でも起こるが、syk発現との関連を検討した。

その結果sykは、IL-1βリセプターに結合するTRAF6にassociateし、IL-1βの刺激はLPS刺激同様アンチセンス処理でRANTES産生抑制、野生型syk発現ベクター導入で冗進を認め、免疫沈降においてもsykとTRAF6の関連を証明できた。しかし、TNFαの刺激はsyk発現と関連を認めなかった。つまり、syKはTRAF6との間でシグナルのやりとりを行うが、TRAF2との間では行わないことがわかった。線維芽細胞は、好酸球が持つCCR3も細胞膜上に発現していることを見つけ、そのリガンド山であるRANTESの刺激によって、細胞増殖が促進することがわかった。この現象は、アレルギー性鼻炎患者からの線維芽細胞のみの特徴であった。さらにRANTESの刺激によって、好中球遊走因子であるIL-8の産生も冗進することがわかり、オートクラインによるアレルギー炎症の複雑さを示唆した。アレルギー性鼻炎の新しい治療法開発を最終目標として、好酸球遊走能が強いケモカインであるRANTES/Eotaxinの産生に注目し、その産生シグナルについて検討した。アレルギー性鼻炎患者の下鼻甲介粘膜由来線維芽細胞を検討材料として用い、シグナル伝達であるSyk、Rasについてケモカイン産生への関与を調べた。RANTESは、IL-1βやTNFαの刺激によって産生されるが、SykはIL-1βの刺激においてTRAF6にassociateしてRANTESに関与していることが、Sykの発現ベクターおよびSykのアンチセンスの実験から判明した。一方、TNFαの刺激においては、Sykは関与しないが判明した。このことから、Sykの制御による線維芽細胞のRANTES産生制御は不可能と断定した。Eotaxinは、IL-4の刺激にて線維芽細胞から産生されるが、Sykは関与しなかった。次にSykの下流にあるとされるRasについて調べた。Ras変異常時活性型発現ベクターを用いて、遺伝子導入し検討した。その結果、PI3 kinaseを主に活性化するRas12V40CにてRANTES産生がもっとも敵ることが判った。Ral-CDC/Rasの系を活性化するRas12V37Gでは、RANTES産生低かったが、線維芽細胞の増殖を最も促した。すなわち、RANTES産生のシグナルと増殖のシグナルは異なることが判明した。Eotaxin産生においては、Ras変異常時活性型発現ベクターでの遺伝子導入にてもその産生には、全く影響を認めなかった。アレルギー性鼻炎は、サイトカインパターンがTh2型にシフトしている。それをTh1型に戻すため、自然免疫を活性化させる受容体Toll-like receptor(TLR)を介した治療法を検討した。TLRは10種類存在するが、まず材料とした鼻粘膜由来線維芽細胞においてTLRの発現を調べると、TLR7、TLR8、TLR10以外のTLRは発現していた。そこでTLR3に結合するウイルス由来のdouble strand RNA(dsRNA)に注目して、遺伝子治療に使用できないかさらに検討した。アレルギー性鼻炎患者においては、ウイルス感染によって一時期症状の増悪を認めることもあるが、逆にウイルス感染後症状が消失することもある。dsRNAにて線維芽細胞を刺激するとRANTES産生を認めた。
胃壁細胞におけるプロトンポンプの転写機構とクロライドイオン輸送の解析

本年度の研究行なった。具体的には以下の示す。融合タンパク質を用いた因子の検索:GATA-GT1、GATA-GT2と直接的に相互作用するタンパク質を調べるために、HA(ヘマグルチニン)タグを付けたGATA-GT1またはGATA-GT2との融合タンパク質を大腸菌で大量に調製した。そのれら融合タンパク質をプローブとして、胃粘膜組織より調製したcDNAライブラリーの発現系を用いて、相互作用するタンパク質の分離を行なっている。現在までに、複数の陽性クローンを分離できた。さらに、この方法によって分離されたクローンの塩基配列の決定を進めるとともに、ノーザンブロットなどを用いて得たクローンを選別していく予定である。2、胃におけるクロライドイオンの輸送とそのチャンネルの同定胃のクロライドチャンネルを同定するために、アフリカツメガエルの卵を用いた発現クローニングを行なった。胃粘膜より調製したcDNAをアフリカツメガエルの卵に打ち込み、クロライドイオンの透過を電気生理学的に測定したが、現在までにこの方法により、特異的なクローンは得られていない。今後は、胃粘膜のcDNAの再調製と測定感度について再度検討しなおし、チャンネルを同定を進めていく予定である。