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中国の政府間財政関係に関する調査研究-分税制以降の省レベル以下の行財政を中心に-

この現地調査をもとに、10月以降、資料の分析を本格的に始めた。今回の研究調査で明らかになったものは、およそ以下の通りであった。中国の政府間財政関係では、2002年以降は再集権化傾向を強めている。また、中国では省・県・郷鎮という3層制の地方財政体制と省・県という2層制の地方財政体制が併存しているが、国庫の単一口座制度の施行によって、郷鎮の財政部門の事務がなくなる郷鎮も見られるので、郷鎮の財政部門の撤廃が可能になってきており、実際にも、郷鎮財政を撤廃して省・県の2層制の地方財政体制が普及する動きを見せる地域もある。経費においては、上位の政府による下位の政府への統制が強くなり、各種の使途指定の補助金のみならず、公務員の給料支払いさえも銀行を通して集中するようになっている。他方、このような財政統制の強化政策は、現在進んでいる市場経済化にふさわしいかどうかという疑問が残っている。平成16年度の研究成果は、研究代表者張忠任の下記の論文に既に一部組み入れているほか、2005年5月に張忠任と研究分担者内藤二郎は、日本地方財政学会第13回大会において、共同報告を行う予定である。本研究プロジェクトでは、2005年8月末から、海外共同研究者である中国財政部・財政科学研究所副所長王朝才教授を通じて各地の財政局の協力を得て、十分な研究調査作業を行うことができた。具体的に調査を実施した地域は、上海市政府とその所属の閔行区財政局、福建省アモイ市財政局、広東省財政庁、広州市財政局及びその所属の海珠区財政局、深〓市財政局及びその所属の福田区財政局、湖北省武漢市財政局、安徽省財政庁、合肥市財政局及びその所属の瑶海区大興鎮財政所、江蘇省常州市財政局、金壇市財政局及び直渓鎮財政所であった。聞き取り調査のほかに、数多くの資料収集も行った。特に湖北省武漢市と安徽省合肥市で通常は入手困難な資料を手にいれることができた。2005年度の研究調査を通じて、中国の政府間財政関係への認識をさらに深めることができた。特に、湖北省と安徽省では、地級市の財政権を撤廃し省財政が直接県財政を管理するという事例を知り得た。江蘇省常州市では、県と郷鎮との間に財政請負制が事実上存在することが分かった。また、4層制の地域では、財源の上部集中現象が目立っており、末端政府の財政難が著しいことも分かった。2004年度の研究成果は、2005年5月の日本地方財政学会第13回大会において、張忠任と研究分担者・内藤二郎により、「再集権化を強める中国財政-その制度と実態-」と題して共同報告を行った(本稿は日本地方財政学会研究叢書第13号『地方財政運営の新機軸』に収録される予定)。また、『北東アジア研究』第10号(島根県立大学北東アジア地域センター)所収の論文「中国における地方行政改革と地方自治について-北京市石景山区魯谷の大社区改革を事例に-」の中にも組み入れられている。2005年度の研究成果は、2006年10月の日本財政学会第63回大会において、張忠任と研究分担者・内藤二郎により共同報告を行う予定である。本研究プロジェクトは、計画の通り順調に実施できてきている。2006年8月から、前後して研究代表者張忠任と研究分担者内藤二郎は、海外共同研究者である中国財政部・財政科学研究所副所長王朝才教授を通じて、同所の劉徳雄研究員に同伴してもらい、中国各地の財政庁・局の協力を得て、十分な研究調査作業を行うことができた。具体的に調査を実施したのは、寧夏回族自治区財政庁、陜西省財政庁及びその所属の延安市財政局、甘粛省財政庁及びその所属の天水市財政局、貴州省財政庁及びその所属の遵義市財政局、雲南省財政庁であった。寧夏回族自治区と甘粛省で貴重な資料も入手できた。2006年度の研究調査を通じて、中国の政府間財政関係への認識をさらに深めた。特に、貴州省と雲南省の調査を通じて、地級市財政体制の3つのモデル(省財政が直接県財政を管理するという「省管県」モデル、地級市が完全な財政自治権を持つ「市管県」モデル及び財政自治権が不完全な「省管市」モデル)を解明した。
海馬のてんかん発生に関わる神経ネットワークスケールの測定

てんかん発生に関わる神経ネットワークの空間的広がりと大きさを描出する新しい技術の基礎的知見を得ることを目標に研究を行った。光感受性遺伝子(チャネルロドプシン2)を用いた海馬の誘発てんかん発作モデルを用い、多点記録脳波を数理解析(Granger causality analysis)することで、海馬長軸方向の情報の流れ(information flow)がてんかん発作生成に重要であることを明らかにした。てんかん発生に関わる神経ネットワークの空間的広がりと大きさを描出する新しい技術について基礎的知見を得ることを目標に研究を行った。並行して行なっていた研究によって、より優れた海馬のてんかん発作モデルの創出にいたったため、そのモデルを使用して研究を進めた。光感受性遺伝子(チャネルロドプシン2)を導入した遺伝子改変ラットの海馬に、光ファイバーを介して間欠的な光刺激を与えることで高効率にてんかん発作を誘発できる。このてんかん発作モデルを用いて、てんかん発生に関わる神経ネットワークの解析を行った。1光刺激誘発発作の脳波解析:間欠的な光刺激によって海馬に誘発されるてんかん発作を、多点脳波によって記録した。数理解析(Granger causality analysis)を応用し、海馬の長軸方向への情報の流れ(information flow)が発作の生成に重要であることを明らかにした。つまり、てんかん発作開始時にはseptalからtemporal hippocampusへのcausalityが増すが、発作の終末に向けて同期性の増加とともに情報の流れが逆転することがわかった。この結果は、PLoS ONEに原著論文として発表した。2Mn増強MRIによる賦活域の検討: Mnが電位依存性Caチャネルによって神経細胞に取り込まれる特性を利用して、神経活動の賦活域を空間的に画像化する方法を用い、研究1で用いた海馬誘発てんかん発作モデルにおける賦活領域を計測した。視察的な画像評価において、刺激と反対側の海馬、同側の新皮質におよぶ広い範囲の賦活が確認できた。画像の統計学的処理を進め、てんかん発作活動の空間的なネットワークを定量的に評価する予定である。(1)光刺激誘発発作の脳波解析:間欠的な光刺激によって海馬に誘発されるてんかん発作を、多点脳波によって記録した。現在は、さらに両側海馬の脳波同時記録を行い、解析を進めているところである。(2)fMRIとの同時記録:先のモデルを用いることで、アーチファクトの少ないMRI記録が可能である。MRIの測定環境に光ファイバーと脳波電極を導入する方法について、モデルを作成しながら基礎的検討を行なっている。申請時とは異なるてんかんモデルを使用することになった。てんかん発作の誘発および発作時の生理学的現象を観察する点においては優れたモデルであり、海馬でのてんかん発作発生時に海馬長軸方向の神経ネットワークが重要な役割を果たすことを明らかにできた。一方で、MRI同時測定は技術的および人員的理由から着手が遅れている。現在、同時測定用の光ファイバーおよび電極の選択と基礎的検討を行っており、来年度には目標を達成できると考えている。光誘発による海馬てんかん発作について、fMRIの同時測定を行う。MRI測定については、ラットにおける測定経験が豊富な本学加齢医学研究所川島隆太研究室(住吉晃先生)に協力いただく方針である。てんかん発作発生過程のBOLD変化を測定し、てんかん発生に関わる神経ネットワークの広がりについて時間的変化を明らかにする。免疫組織学的検討も加えて、BOLDで検出された活動範囲との相関を求める。申請通り、実験用ラットの購入と免疫染色用抗体の購入に充てる。さらに、MRI同時測定用の光ファイバーおよび電極について追加の消耗品購入を予定している。
逆プロテオミクス研究を可能にする基盤技術の開発研究

標的蛋白質間相互作用を特異的に阻害するペプチド・蛋白質断片の効率的創製法の開発研究を行った。相互作用領域の精密同定法を確立し、同定された相互作用領域およびその改変体が、生体内において標的相互作用を競合阻害することを明らかにした。より力価の高い阻害ペプチドの創製を容易にするため、新たな相互作用レポーターを開発し、これを基盤とした相互作用蛋白質の定量的高速スクリーニング系を構築し、スクリーニングを実施した。【目的】相互作用蛋白質のゲノムスケール大規模解析(インタラクトーム解析)により蓄積した膨大な相互作用蛋白質の機能解析法、特に相互作用が担う生物学的機能の解析法を開発する。と同時に、創薬の標的として有望な相互作用を標的とし、標的相互作用を競合阻害する(アンタゴニストとなりうる)、高結合型ペプチド断片を取得するためのスクリーニング法を開発する。これらにより、遺伝学における逆遺伝学に相当する「逆プロテオミクス」ともいうべき研究分野の開拓を志向する。【達成状況】新規Y2Hレポーター遺伝子(糸状菌由来分泌型LacA)の開発と同レポーター遺伝子を用いた変異体ライブラリの定量的高速スクリーニング系を確立した。新規レポーター遺伝子の採用により、大規模変異体ライブラリー(10^6クローン)の高速定量的スクリーニングが安価・簡便に実施できるようになった(論文1)。これと平行して新規酵母キネトコア蛋白質複合体であるDam1複合体のサブユニット間相互作用ドメインの網羅的精密同定を行い、ドメイン発現によりDam1複合体の機能を特異的に阻害することを実験的に証明した(論文2)。同様の実験をオートファジー蛋白質に対して行い、ドメイン発現による相互作用阻害の様式や用量曲線などに関する知見を得た(論文投稿中)。スピンドルチェック蛋白質群の相互作用領域の同定、変異導入による高結合型変異体の取得を試み、ヒトMad2蛋白質に強固に結合する16アミノ酸残基からなるペプチド断片を加算的なスキャニング変異導入と上述の新規レポーターによる高速スクリーニングにより作出した(論文投稿準備中)。【達成状況】新規Y2Hレポーター遺伝子(糸状菌由来分泌型LacA)を用いた変異体ライブラリの定量的高速スクリーニング系を確立したことで、大規模変異体ライブラリー(10^6クローン)の高速定量的スクリーニングを実施できるようになった(前年度報告済)。新規酵母キネトコア蛋白質複合体であるDam1複合体のサブユニット間相互作用ドメインの網羅的精密同定を行い、ドメイン発現によりDam1複合体の機能を特異的に阻害することを実験的に証明した(論文1)。ヒトMad2蛋白質に強固に結合する16アミノ酸残基からなるペプチド断片を加算的なスキャニング変異導入と高速スクリーニングにより作出した(論文投稿準備中)。代謝調節蛋白質因子に結合する人工的なペプチド断片の作出を試み、ランダムペプチドライブラリーのスクリーニングを実施中である。同時に、創薬の標的として有望な相互作用を標的とし、標的相互作用を競合阻害する(アンタゴニストとなりうる)、高結合型ペプチド断片を取得するためのスクリーニング法を開発する。【達成状況】新規Y2Hレポーター遺伝子(糸状菌由来分泌型LacA)を用いた変異体ライブラリの定量的高速スクリーニング系を確立したことで、大規模変異体ライブラリー(10^6クローン)の高速定量的スクリーニングを実施できるようになった^1。ドメイン発現によりDam1複合体の機能を特異的に阻害することを実験的に証明した^2。ヒトMad2蛋白質に強固に結合する16アミノ酸残基からなるペプチド断片を加算的なスキャニング変異導入と高速スクリーニングにより作出し、in vitroの系で動力学的解析を試みた(論文投稿準備中)。代謝調節蛋白質に結合する人工的なペプチド断片の作出を試み、ランダムペプチドライブラリーのスクリーニングを前年度に引き続き実施中である。

さらに平成23年度は、得られた蛋白質断片の効率的生産系の開発を試み、難生産性蛋白質を効率的に菌体外発現できる組換え酵母発現誘導法を確立し、報告した^3。
環・加群と表現論に関する研究

本研究は、平成9年度からの継続研究2年目(最終年度)の研究である。平成10年度では、前年度からの研究を更に推し進め、一般有限擬フロベニウス環の性質・構造解明と、それに関連する問題解決のための研究を行った。その結果、1.日本数学会代数分科会(平成10年9月30日10月3日、於大阪大学)において、フォン・ノイマン正則環上の(一般)有限擬フロベニウス性の左右対称性の問題を肯定的に解決し、また正則でない場合、この対称性が成り立たないことを示す環を構成した。更に、3.「Quasi-Frobenius環の周辺の最近のトピックス」(平成10年7月、於山口);では、大城紀代市(山口大学理学部教授)氏との共同研究により、「入射的半準素環はアルチン的、即ち、準フロベニウス環になるか?」という長年の問題、いわゆる「Faith予想」の解決に関連する、局所半準素環の入射性の判定条件と、局所準フロベニウス環の具体的な一つの構成法について発表した。以上の研究を更に継続・発展させ、一般有限擬フロベニウス環、特にそのsingular因子の構造解明、更に「Faith予想」の解決に向けた研究を進めていく。本研究では、(一般)有限擬フロベニウス(FPF)環の性質・構造解明を進めた。特に、可換環及び(フォン・ノイマン)正則環上の(一般)FPF性に関して以下の結果を得た。1では、C.Faithによる可換FPF環の構造定理の精密化、一般化となる結果を得た。まず、「可換環上のFPF性は、商環の有限生成忠実部分加群の射影性に他ならない」ことを示し、これにより、可換FPF環の構造定理における有限生成忠実イデアルの射影性の条件を落とすことが出来ることを明らかにした。また、零化イデアルに関するある“simpleな"条件による可換FPF環の特徴付けを与え、更にそれが商環の部分環の整閉性、平坦性、及ぴ(Manisの)付値環と密接に関連していることを解明した。一方、正則(一般)FPF環の構造は、「商環の有限生成忠実部分加群が単元を含むアーベル正則環上の行列環の直積」で決定付けられているが、正則環上の(一般)FPF性の左右対称性の問題が未解決であった。2でこれを肯定的に示し、更に非正則の場合は左右非対称であることを明らかにする一つの環を構成した。以上の研究を更に継続・発展させ、一般FPF環、特にそのsingular因子の構造解明に向けた研究を進めていく計画である。
有機化学的手法を用いた分子間動的超分子認識機構の解明と医薬品開発への展開

β-カルボリン骨格は生物活性天然物に広く存在する基本骨格であり、その効率的構築は天然物や医薬品合成分野において重要な課題の一つである。報告者は、最近開発した三成分インドール形成反応を用いれば、官能基化されたβ-カルボリン骨格がワンポットで効率的に構築できると考えた。検討の結果、N-(p-クロロベンゼンスルホニル)-2-エチニルアニリン、アルデヒド、及びN-メチルエタノールアミンを銅触媒存在下において反応させ、2-(アミノメチル)インドール形成後、t-BuOKを加えたところ、目的の置換β-カルボリン誘導体を効率的に得ることに成功した。一方、一価の銅塩(5mol%)を触媒として、マイクロ波照射中、N-メチル-2-エチニルアニリン、(HCHO)n、様々なN-アルキルグリシンや不斉中心を有するアミノ酸誘導体を用いてインドール誘導体形成後、メタンスルホン酸を加えさらに加熱すると、目的のβ-カルボリン化合物が効率的に得られることを示した。一方報告者は最近、四成分3-(アミノメチル)イソキノリン合成法を開発した。本法をさらに展開し、t-BuNH2の代わりに分子内に求核的官能基の有するアミンを用いればイソキノリニウムイオンに対して分子内求核攻撃が進行し、イソキノリン縮環型多環式骨格が形成されると考えた。検討の結果、酸素雰囲気下2-エチニルベンズアルデヒド、(HCHO)n、及び二級アミンを触媒量の塩化銅の存在下で反応させ、プロパルギルアミンの生成後、ジアミンを加えさらに反応させた。その結果カスケード環化、酸化反応を経て3-(アミノメチル)イソキノリン縮環型多環式化合物を高収率で得ることに成功した。本法は入手容易な各成分を用いた多様性指向型イソキノリン合成法として有用である。イソキノリン骨格は生物活性化合物や天然物に広く見られる基本構造である。特に3位にアミノメチル基を有するイソキノリンは重要な生物活性をもつ化合物に存在する。一方で、多成分反応や連続結合形成反応は、環境調和型反応として注目を集めている。これらの観点から、報告者は多成分カップリングによる3-(アミノメチル)イソキノリンの合成を検討した。まず、銅触媒存在下2-エチニルベンズアルデヒド、パラホルムアルデヒド、二級アミンを用いて、イソキノリン骨格に導入する窒素原子供与体の検討を行った。種々検討の結果、2,4,6-トリメチルベンジルアミンやt-ブチルアミンを用いた場合、高収率で目的のイソキノリンが得られた。原子効率の観点から、t-ブチルアミンを最適な窒素原子供与体として、以降の検討を行った。次に様々な二級アミン成分を用いて、反応の有用性を検討した。ジベンジルアミンを用いた場合、最初のマンニッヒ型カップリングが進行せずに原料回収に終わったが、より立体障害の大きいビス(1-フェニルエチル)アミンを用いた場合には高収率でイソキノリンが得られた。ピペリジン、ピロリジン、ジアリルアミンを用いた場合には、目的のイソキノリンが良好な収率で得られた。また芳香環に置換基のある2-エチニルベンズアルデヒドを用いて反応を行ったところ、4位、5位に電子吸引基であるフッ素が存在する場合、4位、5位にそれぞれメチル基とメトキシ基が存在する場合のいずれにおいても高収率で目的の3-(アミノメチル)イソキノリンが効率よく得られた。入手容易な化合物から構造的に複雑な化合物を高収率、温和な条件、簡便な作業により創出する新しい方法論の開発は非常に魅力的であると同時に挑戦的である。複数の触媒回転を同じ反応媒体で行うタンデム触媒は原子効率的観点から現在注目を集めている概念である。このような環境調和型化学合成を視野に入れて報告者は銅塩のタンデム触媒としての機能を期待し、銅塩の存在下エチニルアニリン誘導体、アルデヒド、オルトブロモベンジルアミン誘導体を用いたマンニッヒ型カップリング-インドール形成-N-アリール化によるインドール縮環型1,4-ジアゼピン骨格構築法の開発を行った。種々の条件の検討の結果、2.5mol%の一価のヨウ化銅の存在下N-メシル-2-エチニルアニリン、パラホルムアルデヒド、N-ブチル-(オルトブロモ)ベンジルアミンをジオキサン中マイクロ波照射下170°Cで反応させることによりインドール形成をTLC上で確認後、メシル基の脱保護試薬としてナトリウムメトキシドを加えさらにマイクロ波照射化170°Cでさらに反応させることにより目的のインドール縮環型1,4ジアゼピン化合物が高収率で得られた。この反応は様々なN-アルキル-(オルトブロモ)ベンジルアミンや電子供与性や吸引性の置換基が存在するエチニルアニリン誘導体にも適用可能であった。さらにブロモピリジンやブロモチオフェンを二級アミン成分として用いることにより、ピリジンやチオフェンが縮環した四環性化合物が得られた。これは銅触媒による三つの触媒回転と四つの結合を形成したワンポット反応の初めての例である。

検討の結果、N-(p-クロロベンゼンスルホニル)-2-エチニルアニリン、アルデヒド、及びN-メチルエタノールアミンを銅触媒存在下において反応させ、2-(アミノメチル)インドール形成後、t-BuOKを加えたところ、目的の置換β-カルボリン誘導体を効率的に得ることに成功した。一方、一価の銅塩(5mol%)を触媒として、マイクロ波照射中、N-メチル-2-エチニルアニリン、(HCHO)n、様々なN-アルキルグリシンや不斉中心を有するアミノ酸誘導体を用いてインドール誘導体形成後、メタンスルホン酸を加えさらに加熱すると、目的のβ-カルボリン化合物が効率的に得られることを示した。一方報告者は最近、四成分3-(アミノメチル)イソキノリン合成法を開発した。本法をさらに展開し、t-BuNH2の代わりに分子内に求核的官能基の有するアミンを用いればイソキノリニウムイオンに対して分子内求核攻撃が進行し、イソキノリン縮環型多環式骨格が形成されると考えた。検討の結果、酸素雰囲気下2-エチニルベンズアルデヒド、(HCHO)n、及び二級アミンを触媒量の塩化銅の存在下で反応させ、プロパルギルアミンの生成後、ジアミンを加えさらに反応させた。その結果カスケード環化、酸化反応を経て3-(アミノメチル)イソキノリン縮環型多環式化合物を高収率で得ることに成功した。本法は入手容易な各成分を用いた多様性指向型イソキノリン合成法として有用である。
β2ミクログロブリンのアミロイド線維形成反応の阻害

抗体(Bence Jones Protein)の軽鎖はアミロイド病(AL-アミロイドーシス)の原因となることが知られていたが、その可変領域のみが線維形成部位として注目されてきた。しかし、定常領域(C_L)の立体構造がβ2mと似ていることに着目すると、C_Lも線維を形成する能力があると考えられる。本研究では、β2mで確立されている条件を用いてC_Lのアミロイド線維形成を試みた。用いた条件は、低濃度の界面活性剤(SDS)またはアルコール(TFE)存在下における超音波照射と、高塩濃度存在下における攪拌の2種類である。これらの条件下において、C_L単独でのアミロイド線維形成に成功した。また、同じ条件でβ2mの線維形成も行い、C_Lの結果と比較すると、線維の形成能や形状に違いが見られた。我々は各溶媒中における立体構造に違いに原因があると考え、円二色性分光法を用いて、両蛋白質の構造安定性と二次構造、三次構造を調べた。その結果より、C_Lの方が安定性が低いことがわかった。また、SDSまたはTFE存在下では、β2mの構造に変化はなかったが、C_Lの三次構造が変化していることがわかった。以上の点から、このような安定性や構造の変化が線維形成能に関連していると考えられる。他に、アミノ酸配列から予想されるβシートへの凝集特性なども踏まえて、配列と立体構造のアミロイド線維形成能に対する影響を考察していきたい。本研究では、アミロイド線維の阻害方法を模索するために、β2ミクログロブリン(β2-m)のジスルフィド(SS)結合に着目した。β2-mは長期血液透析患者に頻発する透析アミロイドーシスの原因となる蛋白質であり、SS結合を1つ持つ。このSS結合は天然状態やアミロイド線維においては蛋白質内部に埋もれて還元剤の影響を受けにくいが、変性剤などで構造が壊れた状態では容易に還元される。私は、線維形成過程における中間体を還元剤で攻撃すれば、SS結合が速やかに還元されてアミロイド線維の形成を阻害することが出来るのではないかと考えた。本研究では、中性条件(pH7.0)におけるβ2-mの線維形成に対する還元剤の阻害効果を中心的に調べた。実験には、これまでの研究によって確立されてきた3種類の条件(シードの添加、超音波照射、高塩濃度存在下での攪拌と加熱)を用いた。線維形成の有無の確認は、アミロイド線維に特異的に結合する蛍光色素チオフラビンT(ThT)の蛍光および電子顕微鏡、円二色性分光法(CD)を用いて行った。いずれの条件でも、還元剤存在下ではThT蛍光の上昇が抑えられ、CDからは線維とは異なる二次構造を示すスペクトルが得られた。反応後の溶液を電子顕微鏡で観察すると、アモルファスな凝集物のみが見られ、線維は観察されなかった。以上の結果より、in vitroにおけるβ2-mアミロイド線維形成に対する還元剤の阻害効果が確認され、還元剤は線維形成過程に存在するβ2-mの部分変性状態に有効に作用することがわかった。
ATL治療薬をめざしたHTLV-1プロテアーゼ阻害剤のデザイン

我々は,基質遷移状態に着目してそのミミックをデザインするという新しく理論的な方法を用いて高血圧治療薬として有望なレニン阻害剤,エイズ治療薬として有望なHIVプロテアーゼ阻害剤の合成に成功したので,この有用な方法を,HTLV-1プロテアーゼ阻害剤のデザインに応用し,基質のtransition-state analogと酵素の相互作用の解析から阻害剤を分子設計し,それに基づいてペプチドmimicを合成することにより,メカニズムの明確な抗ATL薬の開発をめざして以下の研究を行った.1.HTLV-1プロテアーゼの合成.HTLV-1プロテアーゼの合成は我々が開発した希釈メタンスルホン酸をalpha-アミノ保護基切断に使用する固相合成法で,現有のペプチド自動合成機により行なっている.また純度の高い酵素を得るため精製しやすいビオチン誘導体の合成も行っている.3.阻害剤の合成.基質遷移状態誘導体の概念に基づいたHTLV-1プロテアーゼ阻害剤の合成法を確立するため,同族のHTLV-1プロテアーゼ阻害剤の分子設計の方法論を確立した.すなわち,基質の切断部位の遷移状態ミミックとしてアロフェニルノルシタチンを導入した阻害剤キノスタチン-272を合成し,これが,高い酵素阻害活性と優れた抗ウイルス活性を持ち細胞毒性も低いことを示した.また光学異性体も各種合成し活性中心における立体構造の重要性も示した.この結果を基に,HTLV-1プロテアーゼに特徴的な基質の切断部位Leu-ProおよびLeu-Val(Pl-Pl′)のアミド結合をイソステリックなヒドロキシメチルカルボニル型[CHOH-CO-NH]に変換した遷移状態誘導体を合成した.我々は,基質遷移状態に着目してそのミミックをデザインするという新しく理論的な方法を用いて高血圧治療薬として有望なレニン阻害剤,エイズ治療薬として有望なHIVプロテアーゼ阻害剤の合成に成功したので,この有用な方法を,HTLV-1プロテアーゼ阻害剤のデザインに応用し,基質のtransition-state analogと酵素の相互作用の解析から阻害剤を分子設計し,それに基づいてペプチドmimicを合成することにより,メカニズムの明確な抗ATL薬の開発をめざして以下の研究を行った.1.HTLV-1プロテアーゼの合成.HTLV-1プロテアーゼの合成は我々が開発した希釈メタンスルホン酸をalpha-アミノ保護基切断に使用する固相合成法で,現有のペプチド自動合成機により行なっている.また純度の高い酵素を得るため精製しやすいビオチン誘導体の合成も行っている.3.阻害剤の合成.基質遷移状態誘導体の概念に基づいたHTLV-1プロテアーゼ阻害剤の合成法を確立するため,同族のHTLV-1プロテアーゼ阻害剤の分子設計の方法論を確立した.すなわち,基質の切断部位の遷移状態ミミックとしてアロフェニルノルシタチンを導入した阻害剤キノスタチン-272を合成し,これが,高い酵素阻害活性と優れた抗ウイルス活性を持ち細胞毒性も低いことを示した.また光学異性体も各種合成し活性中心における立体構造の重要性も示した.この結果を基に,HTLV-1プロテアーゼに特徴的な基質の切断部位Leu-ProおよびLeu-Val(Pl-Pl′)のアミド結合をイソステリックなヒドロキシメチルカルボニル型[CHOH-CO-NH]に変換した遷移状態誘導体を合成した.
ス-パ-・クラスタ-及び極超微粒子の質量分析法による直接観測

気相の原子・分子クラスタ-の研究は、最近、急速な発展を遂げつつある。本研究では特に、質量数が数千万程度の大きなサイズのクラスタ-の観測をこころみた。ベンゼン、或いはフルオロベンゼンなどの有機分子クラスタ-、及びアンモニアやアルコ-ルなどの水素結合型クラスタ-を新熱膨張法で生成させた。サイズ数は、有機分子クラスタ-で50量体程度、水素結合型クラスタ-で100量体程度のものは容易に生成することが出来た。検出は、質量分析法の中でも質量分解能に優れ、またイオン透過率の良いリフレクトロン型の飛行時間(TOF)質量分析法を用いた。観測限界のサイズ数は、本実験システムでは主に次の2点にあることをつきとめた:(1)実際に、超音速クラスタ-分子線法で生成する気相クラスタ-には上限(サイズ教の)があること,(2)検出に用いたチャネルプレ-ト電子増倍管の検出率が、質量数23千を越えると急激に減少すること,の2点である。ポスト・アクセレレ-ション法と組み合せた、検出方法により、本実験では5,000程度の質量数のクラスタ-は、比較的容易にレ-ザ-2光子イオン化を用いて観測することに成功した。また、サイズ教が数十の分子クラスタ-の蒸発も観測することに成功した。これは、レ-ザ-による2光子イオン化後、1数μsの早期の蒸発過程と,数μs数100μsの間に起こる後期の蒸発過程に分けることが出来る。これらの蒸発過程では、共に、大きなサイズのクラスタ-程、蒸発し易いことが解明された。本研究を通じて、大きなサイズのクラスタ-検出に於ける間題点が明かにされた、と同時にその単分子蒸発過程が解明された。
相互行為における複様式的知覚と共感的反応の解明―会話分析と概念分析をとおして

2018年度は,昨年度収集したビデオデータを主に分析する作業を行なった.その成果の一部は,国際会話分析学会(招待講演および個人報告),「自己他者関係」シンポジウム」(招待講演),「相互行為における教授」ワークショップ,ヨーロッパ学習・教授学会(EARLI),日本現象学会等で,発表された.2018年度に得られた知見には,次のものが含まれる.1)これまでの会話分析研究において広い意味での「知識状態」が行為の構成にとって重要であることが指摘されていたのに対して,知覚に基づくか知識に基づくかにより,行為の構成が変わりうることが見出された.2)助産師が妊婦に対して触診で胎児の状態を示そうとするとき,触覚と視覚が具体的にどのように統合されるかは,そのときに何が行なわれているかに依存することが見出された.3)書道の教授の分析をとおして,視覚が複合感覚的であるだけではなく,(感官とは直接関係しない)どう書かれたか(行為)も視覚的に見て取られることが見出された.4)ギターのレッスンにおいて,音は,単に聴覚的現象であるだけではなく,指板上の視覚的位置,指板を抑える指の自己受容感覚を巻き込む現象として利用されることが見出された.5)保育士,保護者,子どもの三者間会話において,身体接触の生起とその場で進行している知識をめぐるやりとりとの間に連動性があることが確認された.6)相互行為において書くという視覚的行為は,発話という聴覚的行為と統合され,それによりそれぞれの意味が互いに彫琢されることが見出された.7)比喩表現をヴィトゲンシュタインのアスペクト概念(とくに概念的な構造的類似性)と関連付けるとともに,「嘆きのメロディを聴く」という知覚経験を,複様式的なアスペクトとして捉えなおした.(千葉大学大学院の荒野侑甫[前年度より]と鈴木南音の両名が研究協力者として加わった.)分析をかなり進めることができた.研究実績の概要でも述べたとおり,国内外の多くの学会で,研究成果を報告できた.研究代表者・分担者・協力者のワークショップを1回持つことができ,それをもとに,各自論文をまとめつつある.また,代表者・協力者は,分担者のヴィトゲンシュタインを読む授業にほぼ毎回参加し,議論を重ねることで,共通認識を高めることができた.研究発表欄の業績のほか,研究代表者はすでに2つの論文をまとめ,投稿した(現在,レビュー中もしくは修正中).2019年度は,引き続き,データの収集と分析を行なっていく予定である.これまでの知見を論文にまとめる作業も引き続き行なう.国際語用論学会,国際エスノメソドロジー・会話分析学会,アメリカ社会学会でも報告予定である(いずれも採択済み).とくに国際エスノメソドロジー・会話分析学会においては,研究代表者は,研究実績の概要における1)の知見を展開した報告予定している.視覚も知識も,いずれもパースペクティヴに依存する.このようなパースペクティヴィズムは,例えばニーチェのものが有名だが,しかし,視覚と知識は(ニーチェが想定するように)感情や意志に依存するというよりは,むしろ,現在どのような活動が行なわれているか,どのような活動の資源として動員されているかに依存するように見える.一方で,視覚と知識は,現在の活動に異なる貢献を行なうし,他方で,視覚は,身体の動きに相関的であるという点においてもパースペクティヴ依存的である.このような観点から,知覚・知識・活動の関係をさらに探究できればと考えている.2020年度は,最終年度になるため,データの収集よりも,分析と成果の発表に力を注ぐ予定である.共同研究者間でのワークショップを定期的に行ないながら,学会での研究発表を積極的にも行なうだけでなく,論文の投稿も積極的に行なう予定である.本年度は,主に,(1)教授(インストラクション)場面(何らかの「教える」「習う」という活動がなされている場面)においてデータを収集し,それにもとづき,(2)「見る」という概念の分析的整理を行なった.データ収集については,習字の教授(約15例),楽器演奏の教授(1例)に加えて,家族写真撮影の場面(2例)をビデオに収録した.家族写真撮影では,写真撮影者が家族に対して,ポーズの取り方,顔の表情など,様々な指図を行なう.その意味で,それも一つの教授場面と捉えることができる.いずれの場面においても,教授者の実演や指し示す方向などを,学習者は「正しく見る」ことが要求される.研究代表者は近年の研究で次のことを観察してきた.教授者の実演を正しく見るとは,学習者の自己受容感覚(自身の身体運動・位置の感覚)のアスペクトのもとで,教授者の身体運動を見ることにほかならない.本研究においては,この独特のアスペクト知覚を,次の2つの方向に拡張する可能性が見出された.(1)習字の教授においては,教授者のほうが,作品を学習者の自己受容感覚のアスペクトのもとで「見る」.筆を「硬く」持ってそのまま書くから,こうなる,というように.教授者は,作品を,教授という観点において「正しく見る」ことをこのようなアスペクト知覚として組織する.教授活動の相互行為的展開(教授者の評価と学習者の反応の配列)に応じて,書字の形状の評価と正しい書き方の教授をつなぐものとして,このような知覚が示される.(2)ギター演奏におけるコードの押さえ方の教授においては,学習者の学習上のトラブルに反応して,フレットと指の視覚的形状のみが切り離された形で,知覚の対象となる.

楽器演奏は,本来,むしろ視覚,聴覚(音),自己受容感覚が統合された体験である.相互行為の展開に応じて,視覚のみに焦点化するアスペクト知覚が組織されるように見える.データ収集については,全部で,20例ほどの教授場面をビデオに収録することができた.それらの音声部分を書き起こし作業を行なっている.書き起こしは,現在,2分の1もしくは3分の2ほど完成している.また,研究代表者,研究分担者,研究協力者で小規模なデータ分析セッションを3回ほど持ち,分析的議論を重ねた.そのほか,他の研究者も招き,ヴィトゲンシュタインの「アスペクト」概念に関し議論する研究集会を(それぞれ4時間もしくは5時間ずつ)2回行なった.初回は,研究分担者である山田圭一が哲学の立場から,ヴィトゲンシュタインのテキストを詳細に読み解き,「端的に見ること」と「アスペクトを見ること」の違い,後者と「経験」との関係,絵画を見ることと「アスペクトを見ること」,「XをYとして見ること」と「XをYにおいて見ること(絵画の場合)」との関係などについて問題提起を行なった.2回目は,研究代表者の西阪が,ビデオ断片をいくつか具体的に検討しながら,相互行為研究のなかで,アスペクト知覚に関する分析課題はどのようなものでありうるかについて,問題提起を行なった.研究分担者山田圭一の大学院授業に西阪も毎週参加し,ヴィトゲンシュタインのテキストをともに読み,その理解を深めることができた.研究全般の強化のために,研究代表者のもとで会話分析研究に従事している荒野侑甫(千葉大学大学院生/日本学術振興会特別研究員)が,研究協力者として加わった.2018年度は,昨年度収集したビデオデータを主に分析する作業を行なった.その成果の一部は,国際会話分析学会(招待講演および個人報告),「自己他者関係」シンポジウム」(招待講演),「相互行為における教授」ワークショップ,ヨーロッパ学習・教授学会(EARLI),日本現象学会等で,発表された.2018年度に得られた知見には,次のものが含まれる.1)これまでの会話分析研究において広い意味での「知識状態」が行為の構成にとって重要であることが指摘されていたのに対して,知覚に基づくか知識に基づくかにより,行為の構成が変わりうることが見出された.2)助産師が妊婦に対して触診で胎児の状態を示そうとするとき,触覚と視覚が具体的にどのように統合されるかは,そのときに何が行なわれているかに依存することが見出された.3)書道の教授の分析をとおして,視覚が複合感覚的であるだけではなく,(感官とは直接関係しない)どう書かれたか(行為)も視覚的に見て取られることが見出された.4)ギターのレッスンにおいて,音は,単に聴覚的現象であるだけではなく,指板上の視覚的位置,指板を抑える指の自己受容感覚を巻き込む現象として利用されることが見出された.5)保育士,保護者,子どもの三者間会話において,身体接触の生起とその場で進行している知識をめぐるやりとりとの間に連動性があることが確認された.6)相互行為において書くという視覚的行為は,発話という聴覚的行為と統合され,それによりそれぞれの意味が互いに彫琢されることが見出された.7)比喩表現をヴィトゲンシュタインのアスペクト概念(とくに概念的な構造的類似性)と関連付けるとともに,「嘆きのメロディを聴く」という知覚経験を,複様式的なアスペクトとして捉えなおした.(千葉大学大学院の荒野侑甫[前年度より]と鈴木南音の両名が研究協力者として加わった.)分析をかなり進めることができた.研究実績の概要でも述べたとおり,国内外の多くの学会で,研究成果を報告できた.
電子線結晶構造解析によるギャップ結合チャネルのゲーティング機構の解明

ギャップ結合は隣接細胞間を直接連絡するチャネルで形成されている膜構造体であり、神経伝達や心臓の拍動、免疫系などの重要な生命現象に関わっている。ギャップ結合中に存在するギャップ結合チャネルは、コネキシン(Cx)と呼ばれる膜タンパク質の6量体から成るコネクソンが二つの細胞間で結合し、12量体となることで形成されており、細胞間をつなぐ役割を担っている。Cxの異常はヒトの多くの病気に関連していることが知られており、中でもCx32の点変異体T55A、Y65H、R75Qは、Charcot-Marie-Tooth(CMTX)病という遺伝性末梢神経障害を引き起こすことが報告されており、有効な治療法が求められている。しかしCx32は膜タンパク質であるが故の構造の不安定さから大量発現と精製が困難であり、CMTX病の詳細な発症機構は未解明のままである。そこで本研究では、CMTX病の発症機構の解明を目的とし、Cx32変異体の構造と機能に着目し解析を行った。変異残基T55、Y65、R75はいずれも第一細胞外ループ(El)か、その近傍に存在している。各残基に変異が入ることで、コネクソン自体は形成されるが、E1の構造変化により細胞間でコネクソン同士が結合できなくなったと考えられる。これよりギャップ結合チャネルが正常に機能するためには、コネクソンが細胞間で正しく結合することが必要であり、CMTX病患者ではその結合に異常があるということが示唆された。今後は電子線結晶構造解析などによりCx32変異体の構造をより詳細に解析し、変異タンパク質を特異的に阻害する薬剤を開発することで次世代の治療法が確立されると期待できる。現在すでにCx32の結晶化に着手しており、生体内でのギャップ結合チャネルのパッキングに近い状態であると推定される結晶の作製に成功している。細胞をつなぐチャネルであるギャップ結合を形成するコネキシンの研究を行っている。難聴の変異体を参考にして作製したコネキシン26M34A変異体の構造の解像度を上げることによって、ゲーティングに重要なプラグと名づけた部分が二段の構造をとっていること、その動きに影響を与えると思われる複雑な細胞質側の構造を解析した。さらに、コネキシン26と反対の電位依存性ゲーティングをするとされるコネキシン32ギャップ結合チャネルの立体構造を明らかにし、ギャップ結合の電位依存性ゲーティング及び化学的ゲーティングなどの複数のゲーティング機構を解明することを目標として研究を進めた。Hisタグを付加した野生型コネキシン32タンパク質を界面活性剤DDMで可溶化しニッケルアフィニティークロマトグラフィーにより精製し、脂質と混合してより良質な二次元結晶を作製するために様々な策を試みた。作製した二次元結晶は再現性が悪く、高分解能の情報を得られるものではなかった。その原因を追究する過程で、精製したタンパク質が、分解を受けていることが判明した。そのため分解を受けないような改変を加えた変異体を作製した。現在はその変異体を、従来野生型のタンパク質を発現、精製していた時と同様の方法で得ており、結晶化を行っている段階である。この変異体は、野生型と比較してタンパク質の安定性が向上しているため、再現性が高く安定して結晶が得られると思われる。変異残基T55、Y65、R75はいずれも第一細胞外ループ(E1)か、その近傍に存在している。

しかしCx32は膜タンパク質であるが故の構造の不安定さから大量発現と精製が困難であり、CMTX病の詳細な発症機構は未解明のままである。そこで本研究では、CMTX病の発症機構の解明を目的とし、Cx32変異体の構造と機能に着目し解析を行った。変異残基T55、Y65、R75はいずれも第一細胞外ループ(El)か、その近傍に存在している。各残基に変異が入ることで、コネクソン自体は形成されるが、E1の構造変化により細胞間でコネクソン同士が結合できなくなったと考えられる。これよりギャップ結合チャネルが正常に機能するためには、コネクソンが細胞間で正しく結合することが必要であり、CMTX病患者ではその結合に異常があるということが示唆された。今後は電子線結晶構造解析などによりCx32変異体の構造をより詳細に解析し、変異タンパク質を特異的に阻害する薬剤を開発することで次世代の治療法が確立されると期待できる。現在すでにCx32の結晶化に着手しており、生体内でのギャップ結合チャネルのパッキングに近い状態であると推定される結晶の作製に成功している。CMTX病の発症機構の解明という目的について、研究計画通り、分子レベルで発症機構を合理的に説明できる結果を得ることができた。従って研究の目的の達成度については、おおむね順調に進展しているという判断を下した。今後さらに高分解能構造解析に適した結晶化条件の検討を進め、ギャップ結合チャネルのゲーティング機構についても議論する予定である。
シアノ錯体界面を通じての電圧誘起物質移動とそれを用いた新機能の開拓

本研究の目的は、「シアノ錯体界面を通じての電圧誘起物質移動とそれを用いた新機能の開拓」の研究分野を開拓することである。平成23年度は、平成22年度に引き続き、電圧誘起物質移動の機構解明の手掛かりを得るために、下記の内容について測定を行った。1.まず、シアノ錯体接合素子の接触抵抗成分を差し引くために、Na_xCo[Fe(CN)_6]_<0.90>・2.9H_2O(NCF90)、Na_xNi[Fe(CN)_6]_<0.68>・5.1H_2O(NNF68)の二種類の薄膜について、バルク抵抗率の膜厚依存性を測定し、ITO電極とシアノ錯体薄膜の接触抵抗を決定した。2.次に、シアノ錯体接合素子の複素インピーダンスの周波数特性を測定し、この素子は、RC等価回路で再現できることを見出した。3.これまでの研究では、素子に流れる電流応答を通じて、間接的に物質移動を計測しており、より直接的に物質移動を計測するため、NCF90膜とNNF68膜を接合した素子において、電子移動と物質移動のダイナミクスの温度依存性について同時測定を行った。その結果、温度上昇に伴い、電流応答、物質移動の応答ともに速くなり、また、物質移動量が増加することが明らかとなった。4.また、これまでの研究により、接合界面において水分子層が形成されることが示唆されていたが、この水分子層の役割を明らかにするために、(1)大気中で作成された素子と(2)乾燥下で作成された素子、の電子移動ダイナミクスと物質移動ダイナミクスを測定し、比較した。その結果、乾燥下で作成した素子は抵抗体となることがわかった。このことから、この素子の界面間の物質移動には、電子絶縁層としての水分子層が重要であることが示唆された。平成22年度では、電圧誘起物質移動の機構解明の手掛かりを得るために、下記の内容について測定を行った。1.シアノ錯体薄膜間のイオン移動の機構解明を理解するためには、シアノ錯体薄膜の持つ電気特性を理解する必要がある。そこで、Na_xCo[Fe(CN)_6]_<0.90>2.9H_2O(NCF90)、Na_xCo[Fe(CN)_6]_<0.71>3.8H_2O(NCF71)、Na_xNi[Fe(CN)_6]_<0.68>5.1H_2O(NNF68)の三種類のシアノ錯体薄膜の電気特性の測定を行った。その結果、シアノ錯体薄膜は抵抗体であることがわかった。2.上記3種類の膜は、SEM観察および、X線回折パターンの測定により、NCF90膜は弱い(111)配向を示し断面方向に結晶粒が大きく成長し、NCF71膜は(111)配向した結晶粒が成長することがわかった。また、NNF68膜は断面方向に結晶粒は観察されない膜である。膜構造と物質移動の関係を明らかとするために、膜構造の異なるシアノ錯体薄膜を用いて、それぞれの膜のホモ接合全固体素子を作成し、その電気特性を測定した。その結果、結晶性の良いNCF90、NCF71膜で作成した素子では速い電流応答が誘起されるが、結晶性の悪いNNF68膜で作成した素子では、遅い電流応答が観測された。このことから、シアノ錯体薄膜を利用した素子において速い応答速度を得るためには、結晶性の良い試料を選択する必要があることが示唆された。
がん関連糖鎖と免疫細胞の相互作用によるがん微小環境調節機構の解明

Sialyl-Tn (sTn)糖鎖抗原の発現は腫瘍に特異的に発現し、予後の不良や転移と相関する事は知られているが、そのメカニズムは分かっていない。がん細胞移植マウスモデルを用いた検討より、sTn糖鎖抗原の発現は、腫瘍内部のHIF-1発現領域に一致し、さらにsTn糖鎖抗原発現領域には、マクロファージやT細胞が浸潤していた。また、sTn糖鎖抗原高発現細胞は単球との接着が亢進しており、この接着亢進にはインテグリン上のsTn糖鎖抗原が関与している事が分かった。以上の結果より、sTn糖鎖抗原は、マクロファージとの相互作用を亢進させる事により腫瘍免疫に関与している可能性が示唆された。今年度の研究では、がん細胞ー免疫細胞との相互作用となるため、今年度はC57BL/6マウス由来肺癌細胞株(Lewis lung carcinoma (LLC)細胞)を用いC57BL/6マウスに移植した同種移植モデルの作製、解析を中心に行なった。LLC細胞をC57BL/6マウス皮下に投与したところ、皮下に固形腫瘍が観察された。その固形腫瘍の中心部は、hypoxia inducible factor (HIF)-1陽性領域となり、一致してsialyl-Tn (sTn)糖鎖抗原の発現も認められた。sTn糖鎖抗原発現領域の免疫細胞の分布を検討したところ、特異的なマクロファージやCD4陽性のT細胞の浸潤が認められた。次に、ST6GalNacI (ST6)を高発現させたLCC細胞を作製したところ、sTn糖鎖抗原をもった蛋白の亢進がみられた。そこで、このsTn糖鎖抗原高発現細胞(LLC(ST6)細胞)をC57BL/6マウス皮下に移植したところ、移植後2週間目では、LLC(mock)細胞移植群に比べて、その皮下腫瘍体積は約半分程度であった。しかしながら、肺へのLLC細胞の浸潤は、LLC(ST6)細胞移植群では皮下に投与し3週間目で認められたが、LLC(mock)細胞移植群ではほとんど認められなかった。また、LLC(ST6)細胞を皮下に投与した肺組織では、がん免疫を抑制する事によりがん微小環境に影響を与える事が知られている、Foxp3陽性T細胞の浸潤も認められた。以上の結果より、sTn糖鎖抗原を発現は、がん関連免疫細胞(腫瘍随伴マクロファージ、CD4陽性のT細胞)の特異的な浸潤を促し、さらにその転移能においても影響を与える事が示唆された。今年度は、silyl-Tn (sTn)糖鎖抗原発現がん細胞ーマクロファージを介したがん微小環境形成ーがん転移分子メカニズムを解明するため、sTn糖鎖抗原を発現しているタンパクに着目し検討をおこなった。がん細胞上でsTn糖鎖抗原を発現しているタンパクを同定するため、sTn糖鎖抗原発現肺がん細胞株(H157(sTn(+))の細胞可溶化画分を抗sTn抗体で免疫沈降後SDSページを行なったところ、高分子量のところに3本のメジャーなバンドが認められた。次にこの3本のバンドについてウェスタンブロットで確認したところ、インテグリン、ムチン、CD44であった。インテグリンは白血球ーがん細胞との相互作用に関わる事が知られている事から、sTn(+)/α2インテグリン欠損株(H157(sTn(+)/α2(-))を作製した。H157(sTn(+))株と単球細胞株(THP-1)を共培養すると、THP-1から免疫調節サイトカインであるIL-8, IL-10, TNF-αの産生がH157(vector)に比べ亢進していたが、H157(sTn(+)/α2(-))株との共培養ではその亢進がH157(vector)と同程度にまで低下した。次に、がん細胞と単球との細胞間相互作用に細胞間の接着の亢進が関与しているか、H157(sTn(+))上でTHP-1をローリングさせ解析を行なった。すると、H157(sTn(+))上での白血球のローリング速度は、H157(vector)と比べ優位な低下が認められたが、ST6高発現α2インテグリン欠損株(H157(sTn(+) /α2Integrin(-))では認められなかった。以上の結果より、がん細胞のα2インテグリン上へのsTn糖鎖抗原の発現は、マクロファージや単球との接着能を亢進させ、さらに単球に腫瘍随伴マクロファージ様の変化を与えている事が示唆された。Sialyl-Tn糖鎖抗原を持つタンパクの1つにがん幹細胞マーカーであるCD44が検出されたため、今年度はまず、CD44の機能に着目し検討を行った。ヒト肺がん細胞株(H157)細胞フローサイトメーターを使用検討より、sialyl-Tn糖鎖抗原高発現H157細胞では、mockH157細胞に比べ細胞表面のCD44の発現が亢進していた。最近、CD44のスプライスバリアント(CD44v)がシスチントランスポーターを安定化させグルタチオン合成を亢進させる事が報告されている。

そこで、CD44vの発現を検討したが、mock、sialyl-Tn糖鎖抗原高発現H157細胞ともに、CD44vの発現に影響は認められなかった。また、還元型、酸化型グルタチオンの細胞内の量もsialyl-Tn糖鎖抗原高発現H157細胞はmockと同程度であった。次に、酸化ストレスに対する耐性をみるため過酸化水素付加実験をおこなった。sialyl-Tn高発現H157細胞は、mockに比べ優位に過酸化水素に対する耐性が亢進していた。そこで、最近がん細胞の酸化ストレスに対する耐性には、Nrf2の恒常的な発現が関与する事が報告されている。そこで、核内のNrf2の蓄積について検討したところ、sialyl-Tn糖鎖抗原高発現H157細胞はmockに比べてNrf2の核内での蓄積が亢進し、さらにその下流にあるheme oxygenase(HO)-1の発現も亢進していた。以上の結果より、sialyl-Tn糖鎖抗原は、がん幹細胞マーカーであるCD44上に発現しその細胞表面での発現を亢進させていた。また、sialyl-Tn高発現H157細胞は、Nrf2-HO-1の発現を亢進させる事により酸化ストレスに対する耐性を獲得していることが示唆された。Sialyl-Tn (sTn)糖鎖抗原の発現は腫瘍に特異的に発現し、予後の不良や転移と相関する事は知られているが、そのメカニズムは分かっていない。がん細胞移植マウスモデルを用いた検討より、sTn糖鎖抗原の発現は、腫瘍内部のHIF-1発現領域に一致し、さらにsTn糖鎖抗原発現領域には、マクロファージやT細胞が浸潤していた。また、sTn糖鎖抗原高発現細胞は単球との接着が亢進しており、この接着亢進にはインテグリン上のsTn糖鎖抗原が関与している事が分かった。以上の結果より、sTn糖鎖抗原は、マクロファージとの相互作用を亢進させる事により腫瘍免疫に関与している可能性が示唆された。sTn糖鎖抗原を発現しているタンパクの同定、及びTHP-1細胞の活性化に関わっているsTnを発現したタンパクの同定を行なう事ができた。その結果、欠損株を用いた機能解析まですすめる事ができた。細胞生物学次年度の研究では、sTn糖鎖抗原が発現することによるがん細胞自身へ及ぼす影響について検討を行う。sTn糖鎖抗原が発現していた分子の中で、CD44に着目しその機能から解析を行う。CD44はがん幹細胞のマーカーでもあること、また最近CD44のバリアントアイソフォームがシスチンのトランスポーターとなり、酸化ストレスに対する耐性を獲得する事が報告されている。そこで、まずsTn糖鎖抗原のCD44への発現が分子そのものの発現に影響を与えるか、細胞表面、細胞内に分けてFACS,ウェスタンブロットで確認を行なう。また、CD44のバリアントアイソフォームがシスチンのトランスポーターとなり、酸化ストレスに対する耐性を獲得する事が報告されている事から、CD44のバリアントアイソフォームを確認し、さらに酸化ストレスを引き起こす薬物に対する耐性について検討を行う。in vivoでのC57BL/6マウスを用いた同種移植(皮下移植)ー肺転移を立ち上げることができた。その系を用いsTn糖鎖抗原が、がん微小環境に与える影響について免疫細胞の分布を中心に検討を行った。その結果、sTn糖鎖抗原が、マクロファージだけではなく、T細胞の表現型にも影響を与える事が確認できた。次年度の研究では、LLC細胞、ヒト肺癌細胞株H157細胞、ヒト乳癌細胞株で樹立したsTn糖鎖抗原高発現細胞を用い、sTn糖鎖抗原をもったタンパク質の同定と、さらに免疫細胞と会合する分子の同定を行なう。具体的には、sTn糖鎖抗原をもった蛋白については、sTn糖鎖抗原高発現がん細胞の膜分画を可溶化して、抗sTn抗体を用い免疫沈降を行い、SDSページを行ない検討する。