hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
大腸菌における染色体分配機構の分子生物学的研究

本研究の目標は,Fプラスミドや大腸菌染色体の分配の分子機構を明らかにすることである.先ず初めに種々の細胞学的技術を駆使して大腸菌の姉妹染色体を解析して,複製起点・複製終点・複製フォーク・MukBクラスター等の細胞周期における細胞内の規則正しい挙動を明らかにした.さらに,Fプラスミドの分配機構を免疫抗体法やFISH法で詳しく解析した実験結果に基づき,この分配機構はプラスミドにコードされたSopAとSopBタンパク質による"反応拡散系"であるという新説を提唱した.SopAは"アクチベーター"で,SopBは"インヒビター"であると考えられる.この反応拡散系では,SopAとSopBが互いに反応拡散する結果,SopBの細胞内局在化が起る.プラスミドのsopC領域がSopBに結合し,プラスミドDNA分子はそれぞれSopB濃度の高い複数の位置に局在することになる.一方,大腸菌の染色体分配は,SecA・SecY・AcpP・MukBなど少なくとも10種のタンパク質を含む"反応拡散系"であることを発見し,この系を"POC(positioning of chromosome)システム"と命名した。この系では,SecAが"アクチベーター"であり,SocYが"インヒビター"であると考えられる.POCシステムの"反応拡散系"では,これらのタンパク質が互いに反応拡散する結果,細胞内に局在し,それらのタンパク質と特異的に結合するDNA領域がタンパク質の濃度の高いところに位置することとなる.それによって細胞内のDNAの位置が決まり,細胞分裂に際し姉妹DNAは両娘細胞に規則正しく分配される.本研究の目標は,Fプラスミドや大腸菌染色体の分配の分子機構を明らかにすることである.先ず初めに種々の細胞学的技術を駆使して大腸菌の姉妹染色体を解析して,複製起点・複製終点・複製フォーク・MukBクラスター等の細胞周期における細胞内の規則正しい挙動を明らかにした.さらに,Fプラスミドの分配機構を免疫抗体法やFISH法で詳しく解析した実験結果に基づき,この分配機構はプラスミドにコードされたSopAとSopBタンパク質による"反応拡散系"であるという新説を提唱した.SopAは"アクチベーター"で,SopBは"インヒビター"であると考えられる.この反応拡散系では,SopAとSopBが互いに反応拡散する結果,SopBの細胞内局在化が起る.プラスミドのsopC領域がSopBに結合し,プラスミドDNA分子はそれぞれSopB濃度の高い複数の位置に局在することになる.一方,大腸菌の染色体分配は,SecA・SecY・AcpP・MukBなど少なくとも10種のタンパク質を含む"反応拡散系"であることを発見し,この系を"POC(positioning of chromosome)システム"と命名した。この系では,SecAが"アクチベーター"であり,SocYが"インヒビター"であると考えられる.POCシステムの"反応拡散系"では,これらのタンパク質が互いに反応拡散する結果,細胞内に局在し,それらのタンパク質と特異的に結合するDNA領域がタンパク質の濃度の高いところに位置することとなる.それによって細胞内のDNAの位置が決まり,細胞分裂に際し姉妹DNAは両娘細胞に規則正しく分配される.特異的なDNA分子が細胞内の特定のポジションに位置する分子機構のモデル系として、Fプラスミドの分配機構を解析した。免疫蛍光抗体法により、プラスミドがコードするプラスミドDNAの分配に必須なSopAとSopB蛋白質の細胞内分布を調べ、これらの蛋白質が螺旋状に細胞内に存在していることを明らかにした。SopB蛋白質は細胞の長軸に沿って、等間隔のフォーカスを形成しており、ミニFプラスミドDNA分子は主にそれぞれこのフーカス内に存在していることが、FISH法と免疫蛍光抗体法の同時解析によって明らかになった。SopAホモローグは細胞端から細胞端に振動する性質があることが知られている。これらの実験結果に基づき、我々はプラスミド分配の新しいモデルを提出した(Adachi, Hori and Hiraga,2006)。それはSopAとSopBが細胞内を細胞端から他の細胞端に振動しながら、次第に細胞の長軸上に等間隔のSopBのフォーカスを作り、プラスミドDNA分子はそれぞれこのフォーカス内に存在するというモデルである。このタンパク質の振動のメカニズムは、数学者アランM.チューリングが生物のパターン形成のために提案した「反応拡散システム」によるものと推測され、そのシミュレーションの結果は実験結果と良く一致した。このFプラスミドのタンパク質の振動と位置決定のモデルは、原理的にはシマウマやゼブラフィッシュの縞模様形成のモデルと同じもので、最もシンプルな生化学的手法で検証可能なパターン形成のモデル系である。染色体分配にも似た機構が含まれているに違いない。大腸菌のゲノムプロジェクトにおいて明らかになった蛋白一蛋白相互作用の巨大ネットワークの中に、我々は新たな生物学的な機能を持つ新しいシステムを最近発見し、「POCシステム」と命名した。この「POCシステム」に含まれる1群の蛋白質は全て、細胞内を振動する性質があり、細胞内にらせん状に分布する。このシステムに含まれるSecA蛋白質(膜蛋白質の内膜透過に関与)のATPase活性の阻害剤であるアジ化ナトリウムの添加によって、ただちにPOCシステムの他の蛋白質の振動が停止する。一方、アジ化ナトリウム耐性のsecA変異株では、振動は停止しない。このことから、これら1群の蛋白質の振動には、SacAのATPase活性が重要な働きをしていることが明らかになった。

現在までに「POCシステム」に含まれることが分かった蛋白質は、SecA・SecY・SecB(Secretory:膜蛋白質の内膜透過に関与)・AcpP(アシル基運搬蛋白質)・MukB(コンデンシン:DNAの濃縮)・MreB(アクチンホモログ)・SetB(糖の膜輸送)・SeqA(Sequestration:複製直後の半メチル化DNAに特異的に結合する蛋白質)である。これらの蛋白質の変異株は、DNAジャイレースの阻害剤であるノボビオシンに超感受性を示すことが分かった。さらに、secA・secY・acpP遺伝子の変異株では、姉妹染色体DNA分離が異常になるため、長い細胞の中に大きな核様体を持つPar^-の形質を示し、mukB変異株では、染色体DNAの細胞内位置が異常になるため、無核細胞を放出しMuk^-の形質を示すことが分かった。このことは、これらの蛋白質が本来の機能の他に、染色体DNAのオーガニゼーションや細胞内位置決定(positioning)にも関与していることを強く示唆している。したがって、我々はこれを「POC(positioning of chromosome)システム」と命名した。我々は、このPOCシステムにおける蛋白質の振動は「反応拡散系」によるものと推察している。「Fプラスミドの分配に関与する蛋白質(SopA・SopB)の振動は反応拡散系によるものである」という我々が先に提出した仮説(Adachi and Hiraga. J.Mol.Biol. 2006)と併せて比較研究中である。大腸菌のSecA・SecY・AcpPの条件致死変異株は、染色体分配が異常のときに現れるPar-形質を示すことを発見した。また野生型株にSecAのATPase活性の阻害剤である1mMアジ化ナトリウムを添加したときにもPar-形質を示した。また、この薬剤添加で、oriCコピーの細胞内位置が異常になる。これらのことは、大腸菌の染色体分配にSecA・SecY・AcpPタンパク質が関与していることを示している。さらに我々はGFPを結合させたSecA・SecY・AcpPタンパク質および他の7種のタンパク質(MukB・ParC・ParE・GyrA・GyrB・SeqA・SetB)が細胞内で強い蛍光焦点として存在し、その蛍光焦点は細胞内を動き回る性質があることをタイムラプス実験によって明らかにした。1mMアジ化ナトリウム添加によってSecAのATPase活性を阻害したときや、条件致死変異株を使ってSecA・SecY・AcpP活性を阻害したときには、これら一連のタンパク質の蛍光焦点の動きは見られなくなる。このことは、これらのタンパク質の蛍光焦点の動きには、SecA・SecY・AcpPの機能が必要であることを示している。さらにFRAP実験によって、SecA・SecY・AcpP活性を阻害するとSecAまたはSecYの拡散しない分を示している。さらにFRAP実験によって、SecA・SecY・AcpP活性を阻害するとSecAまたはSecYの拡散しない分画(bound form)の量が増加することを明らかにした。
気液相変化理論に基づくナノ・ミクロスケール乾燥モデルの構築と新規乾燥技術開発

被乾燥物を加熱昇温する温風乾燥や逆に冷却する凍結乾燥とは異なり,加熱や冷却のためのエネルギーを使わず,常温下で蒸発潜熱のみを供給することによって高品位で高効率な乾燥を可能とするマイクロ波常温乾燥技術を新たに開発し,その有効性を示した.同時に,被乾燥物内部に存在するマイクロチャンネル内における気液相変化と水分輸送を考慮し,海産物の場合には気液界面抵抗が無視でき,チャンネル内の粘性抵抗が支配的であることを明らかにした.一方,乾燥に係わる固体面上の液膜についてのナノスケールの輸送現象を明らかにするために,アルゴン分子を用いた非平衡分子動力学シミュレーションによる解析を行ない,チャンネル壁における付着水の濡れ挙動を検討した.この分子動力学解析により,固体面上の微細構造によって液体の濡れ挙動が変化し,接触角の変化によって液膜の蒸発挙動に変化が生じること,および接触角と表面粗さとの関係を示す相関式が得られた.また,液膜厚みが分子直径の46倍程度となると,固体壁の影響が現れ,蒸発速度は減少することを示した.さらには,滴状凝縮法によって気液界面の熱伝達率を測定し,その値から凝縮係数を評価することを行い,水の凝縮係数として0.50.6の値を得た.ただし,薄膜温度センサーによる微小液滴の成長過程の直接測定を行えば,凝縮係数の値が0.71.0に上昇する可能性があることがわかった.マイクロ波による水への選択的なエネルギー供給と減圧環境における蒸発温度の低下を特長として高品質,高速乾燥のための新たな提案(大気導入法,温度制御法)を行い,乾燥速度を温風乾燥に比べて約1/25に短縮することに成功した.被乾燥物を加熱昇温する温風乾燥や逆に冷却する凍結乾燥とは異なり,加熱や冷却のためのエネルギーを使わず,常温下で蒸発潜熱のみを供給することによって高品位で高効率な乾燥を可能とするマイクロ波常温乾燥技術を新たに開発し,その有効性を示した.同時に,被乾燥物内部に存在するマイクロチャンネル内における気液相変化と水分輸送を考慮し,海産物の場合には気液界面抵抗が無視でき,チャンネル内の粘性抵抗が支配的であることを明らかにした.一方,乾燥に係わる固体面上の液膜についてのナノスケールの輸送現象を明らかにするために,アルゴン分子を用いた非平衡分子動力学シミュレーションによる解析を行ない,チャンネル壁における付着水の濡れ挙動を検討した.この分子動力学解析により,固体面上の微細構造によって液体の濡れ挙動が変化し,接触角の変化によって液膜の蒸発挙動に変化が生じること,および接触角と表面粗さとの関係を示す相関式が得られた.また,液膜厚みが分子直径の46倍程度となると,固体壁の影響が現れ,蒸発速度は減少することを示した.さらには,滴状凝縮法によって気液界面の熱伝達率を測定し,その値から凝縮係数を評価することを行い,水の凝縮係数として0.50.6の値を得た.ただし,薄膜温度センサーによる微小液滴の成長過程の直接測定を行えば,凝縮係数の値が0.71.0に上昇する可能性があることがわかった.マイクロ波による水への選択的なエネルギー供給と減圧環境における蒸発温度の低下を特長として高品質,高速乾燥のための新たな提案(大気導入法,温度制御法)を行い,乾燥速度を温風乾燥に比べて約1/25に短縮することに成功した.温風乾燥や凍結乾燥が主流である現在の乾燥技術は,蒸発・昇華潜熱を加える以外に,常温からの昇温や冷却のための余分なエネルギーが必要である.本研究では,そのエネルギーを一切供給することなく,常温で蒸発潜熱のみを供給し,加熱による変質や変性,および凍結による損傷とは無関係に,高品位で高効率な乾燥を実現する新規技術を開発する.そのために,乾燥に係わる固体面上の三相界面におけるナノスケールの輸送現象を解明し,これまでに構築した気液相変化理論に基づく乾燥モデルを固相による気液界面構造の特徴を考慮できるように発展させ,被乾燥体に適した乾燥プロトコルを明確に示すことを検討する.今年度は,まず,親水性面上における液膜蒸発実験を実施し,親水処理したシリコンウェーハの表面に薄膜熱電対を製作して表面温度を直接測定し,レーザー干渉膜による液膜の計測を行い,その蒸発特性に及ぼす固体面の影響を把握した.次に,非平衡分子動力学シミュレーションによる三相界面の構造と輸送機構の解析を行い,固体面上には,加熱しても蒸発しない吸着層や,気液界面の抵抗が律則となって蒸発速度が低下するミクロ液膜が存在することを確認し,固体壁の影響であるdisjoining pressureを評価し,界面における分子の蒸発と凝縮,反射特性を把握した.さらには,マイクロ波減圧乾燥実験を実施し,ホタテ貝柱の乾燥特性の把握と乾燥試料の組織観察を行い,圧力,外気流量とマイクロ波照射に関する詳細な情報を得た.被乾燥物を加熱昇温する温風乾燥や逆に冷却する凍結乾燥とは異なり,加熱や冷却のためのエネルギーを一切使わず,常温下で蒸発潜熱のみを供給し,高品位で高効率な乾燥を可能とする新規乾燥技術を開発するための研究を行った.その方法として,マイクロ波常温乾燥技術を新たに開発し,その有効性を示した.すなわち,減圧環境下においてマイクロ波を間欠的に照射し,被乾燥物の温度制御を行なうことによって蒸発潜熱のみの供給が可能であり,高品位な乾燥を実現できることを示した.同時に,被乾燥物内部に存在するマイクロチャンネル内における気液相変化と水分輸送を考慮し,海産物の場合には気液界面抵抗が無視でき,チャンネル内の粘性抵抗が支配的であることを明らかにした.

一方,乾燥に係わる固体面上の液膜についてのナノスケールの輸送現象を明らかにするために,非平衡分子動力学シミュレーションによる解析を行ない,チャンネル壁における付着水の濡れ挙動を検討した.この分子動力学解析により,固体面上の微細構造によって液体の濡れ挙動が変化し,接触角の変化によって液膜の蒸発挙動に変化が生じること,および接触角と表面粗さとの関係を示す相関式が得られた.さらには,凝縮係数の実験測定を行なうための実験システムを構築した.当初は,液柱ジェットの蒸発実験を考えたが,計測の安定性を考慮した結果,滴状凝縮法によって気液界面の熱伝達率を測定し,その値から凝縮係数を評価することが最善であることがわかった.その実験システムが完成したことにより,精度良い凝縮係数の測定・評価が可能となった.温風乾燥や凍結乾燥が主流である現在の乾燥技術は、蒸発・昇華潜熱を加える以外に、常温からの昇温や冷却のための余分なエネルギーが必要である。本研究では、そのエネルギーを一切供給することなく、常温で蒸発潜熱のみを供給し、加熱による変質や変性、および凍結による損傷とは無関係に、高品位で高効率な乾燥を実現する新規技術を開発している。これに関連して、乾燥に係わる固体面上の三相界面におけるナノスケールの輸送現象を解明し、これまでに構築した気液相変化理論に基づく乾燥モデルを固相による気液界面構造の特徴を考慮できるように発展させ、被乾燥体に適した乾燥プロトゴルを明確に示すことを検討した。具体的には、親水性面上における液膜蒸発実験を実施し、親水処理したシリコンウェーハの表面に薄膜熱電対を製作して表面温度を直接測定し、レーザー干渉膜による液膜の計測を行い、その蒸発特性に及ぼす固体面の影響を把握した。次に、非平衡分子動力学シミュレーションによる三相界面の構造と輸送機構の解析を行い、固体面上には、加熱しても蒸発しない吸着層や、気液界面の抵抗が律則となって蒸発速度が低下するミクロ液膜が存在することを確認し、固体壁の影響であるdisjoining pressureを評価し、界面における分子の蒸発と凝縮、反射特性を把握した。さらには、マイクロ波減圧乾燥実験を実施し、食品の乾燥特性の把握と乾燥試料の組織観察を行い、圧力、外気流量とマイクロ波照射に関する詳細な情報を得るとともに、MRIによる内部水分分布の計測を行い、その特徴を示した。
分割同軸型高周波四重極線型加速器の加速試験

加速空胴の低電力試験に於て、4つの加速電極間に発生する電場(四重極電場)の対称性とビ-ム軸上の発生する電場の強さが摂動法を使って測定された。高周波四重極線型加速器ではこの電場の対称性は非常に重要であるが、測定の結果は対称性のずれが±0.6%以内という良い結果を示した。更に、ビ-ム軸上の電場分布の測定結果の解析から、ほぼ設計通りの電場分布が実現されている事が分った。周波数調整用にはピストン型の同調器を採用したが、予期した通りの性能を示した。低電力試験の後、最高出力100kw、最高デュ-ティ-10%の高周波増幅器を使って高電力試験を行った。その結果、実効時間(運転時間×デュ-ティ-)で150分の高周波コンディショニングで、荷電質量数比1/(30)のイオンを加速する為に必要な電極間電圧110kVを達成した。高電力高周波を加速空胴に供給する為に高周波結合器としてル-プ結合器を使用し、設計通りに電源と空胴との間の整合を取ることができた。高周波コンディショニングを通じて、マルチパクタリングレベルや、放電限界の測定も行われた。現在までに、デュ-ティ-4%までの運転を実現した。ビ-ム加速試験の為のテストスタンドの組立て(真空配管、静電レンズ、ビ-ムモニタ-、エネルギ-分析系、収束磁石等を含む)と並行して、荷電質量数比が1/(28)であるチッソ分子イオン源の製作が行われ、2860MHzの小型ECRによって、1keV/uのビ-ムを安定に引き出すことに成功した。テストスタンドでは数多くの電源、真空ポンプ、モニタ-等を制御しなければならないが、それらの制御系を完成し、1991年1月22日、チッソ分子イオンを1keV/uから45.4keV/uまで加速する事に成功した。現在、加速器の性能を示す諸量(エネルギ-、スペクトル、ビ-ムの伝送効率等)の精密測定の準備を進めている。線型加速器の本体である高周波キャビティ-(共振周波数25.5MHz、直径0.9m、長さ2.1m)は、平成元年10月に完成し、現在低電力試験を進めている。今まで得られた成果は、(1)共振周波数を設計計値である25.5MHzに調整することができた。(2)Q値は6100で、荷電数対質量数比が1/30のイオンを加速するために必要な高周波電力のピ-ク値は約70KWであることが確認できた。(3)電場分布は理想的なものに近い、等である。つまり、キャビティ-は当初期待していた性能を有していることがほぼ確認できた。高電力試験は、今年三月に高周波電源(ピ-ク出力100KW、デュ-ティ10%以上)が完成するのを待って行う。試験項目は、高電力運転時における共振周波数の制御、放電限界の確認、加熱による機械的歪みと電場分布にゆがみが出ない事の確認である。ビ-ム輸送系に関しては、加速器後方の部分について、設計が完了し、部品の製作を進めている。ビ-ム集束用の四重極電磁石ダブレットは、最大磁場勾配が1.25KG/cm、口径が5.8cm(半径)のものを制作中である。

また、運動量分析用磁石の電源として、300A、60Vのものを購入した。その他、ビ-ムモニタ-、真空チェンバ-類を順次設計、製作している。イオン源と加速器との間のビ-ム輸送系については、設計作業が始まったばかりで、詳細を詰める段階には至っていないが、集束用高圧電極のための電源(30KV)を購入し、タ-ボ分子ポンプ(1500l/秒)を発注した。計算機制御に関しては、CAMACフレ-ト、インタ-フェイス等を購入し、ハ-ドウェアを整備すると共に、ソフトウェアも制作しつつあり、例えば、ビ-ムエミッタンスの測定ができるようになった。加速空胴の低電力試験に於て、4つの加速電極間に発生する電場(四重極電場)の対称性とビ-ム軸上に発生する電場の強さが摂動法を使って測定された。高周波四重極線型加速器ではこの電場の対称性は非常に重要であるが、測定の結果は対称性のずれが±0.6%以内という良い結果を示した。更に、ビ-ム軸上の電場分布の測定結果の解析から、ほぼ設計通りの電場分布が実現されている事が分った。周波数周整用にはピストン型の同調器を採用したが、予期した通りの性能を示した。低電力試験の後、最高出力100kW、最高デュ-ティ-10%の高周波増幅器を使って高電力試験を行った。その結果、実効時間(運転時間×デュ-ティ-)で150分の高周波コンディショニングで、荷電質量数比1/30のイオンを加速する為に必要な電極間電圧110kVを達成した。高電力高周波を加速空胴に供給する為に高周波結合器としてル-プ結合器を使用し、設計通りに電源と空胴との間の整合を取ることができた。高周波コンディショニングを通じて、マルチパクタリングレベルや、放電限界の測定も行われた。現在までに、デュ-ティ-4%までの運転を実現した。ビ-ム加速試験の為のテストスタンドの組立て(真空配管、静電レンズ、ビ-ムモニタ-、エネルギ-分析系、収束磁石等を含む)と並行して、荷電質量数比が1/28であるチッソ分子イオン源の製作が行われ、2860MHzの小型ECRによって、1keV/uのビ-ムを安定に引き出すことに成功した。テストスタンドでは数多くの電源、真空ポンプ、モニタ-等を制御しなければならないが、それらの制御系を完成し、1991年1月22日、チッソ分子イオンを1keV/uから45.4keV/uまで加速する事に成功した。現在、加速器の性能を示す諸量(エネルギ-、スペクトル、ビ-ムの伝送効率等)の精密測定の準備を進めている。
解糖系酵素異常における赤芽球アポトーシスの責任遺伝子同定

赤血球型ピルビン酸キナーゼ(R-PK)異常症モデルマウス(Pk-1^<slc>)の病態解析で、脾臓において著明な赤芽球アポトーシスが観察された。Pk-1^<slc>から樹立したフレンド細胞株SLC3は継代中にアポトーシスを自然誘発する。低グルコース処理や2-デオキシグルコース(2DG)添加培養を用いて解糖系を阻害すると、R-PK遺伝子変異を持たない赤芽球にもアポトーシスが誘発され、さらに予めグルタチオン前駆体のN-アセチルシステインで前処置をしておくと、2DGによるアポトーシスが抑制された。SLC3に野生型R-PKを恒常的発現させたトランスフェクタントではSLC3に比してR-PK発現量依存性にROSの低下が認められた。これらの結果からR-PKは赤芽球細胞内ROSによって誘導されるアポトーシスを抑制する役割を果たしていると考えられた。Pk-1^<slc>に同定されるR-PK遺伝子変異はR-PKの基質結合部位近傍の単一アミノ酸置換Gly338Aspを来す。基質親和性の低下した変異タンパクに対して生理的濃度以上の基質ボスホエノールピルビン酸(PEP)を作用させることで解糖系を正常化し、細胞内酸化状態の改善やアポトーシスの軽減が認められるかどうかをin vitro培養系で検討した。SLC3の培養液中に5mMPEPを48時間添加培養すると、SLC3細胞内PEP濃度は約57倍に増加し、さらにR-PK反応の産物であるピルビン酸濃度は対照の約2倍に増加した。細胞内ROSはPEP添加濃度依存性に減少し、5mMPEPでは赤芽球アポトーシスは約1/2に減少した。以上より基質親和性の低下した変異酵素によって発症するPK異常症に対して、基質の大量補充が赤芽球細胞内ROSを減少し、細胞死を回避出来ることが明らかになった。赤血球型ピルビン酸キナーゼ(R-PK)遺伝子に変異を有する赤芽球系細胞株SLC3は継代中にアポトーシスを自然誘発する。低グルコースや2-デオキシグルコース(2DG)添加培養により解糖系を阻害すると、R-PK遺伝子変異を持たない赤芽球にもアポトーシスが誘発され、さらに予めグルタチオン前駆体のN-アセチルシステインで前処置をしておくと、2DGによるアポトーシスが抑制された。SLC3に野生型R-PKを恒常的発現させたトランスフェクタントでは、グルタチオンS-トランスフェラーゼやチオレドキシンのような抗酸化分子の遺伝子発現が低下することがGeneChip解析で明らかになった。また、細胞内活性酸素種(ROS)をDCFH-DA (2',7'-dichlorodihydrofluoresceindiacetate)を用いたフローサイトメトリーで定量したところ、SLC3に比してトランスフェクタントではR-PK発現量依存性にROSの低下が認められた。解糖系阻害によるアポトーシス誘発機序にp53が関与するかどうかを明らかにする目的で、以下の実験を行った。p53遺伝子破壊マウスと正常対照マウスから胎生16.5日の胎仔肝細胞(ほぼ9割が赤芽球細胞)を採取し、10%FCS、RPMI1640培地にて24時間培養した。24時間後のアポトーシス誘導率はAnnexinVによるフローサイトメトリーで定量した。

低グルコース培養による胎仔肝赤芽球のアポトーシス誘導率は、正常対照に比してp53遺伝子破壊マウスで有意に低く、このことから解糖系阻害による赤芽球アポトーシスの誘導にはp53の関与が示唆された。ピルビン酸キナーゼ(PK)異常症モデルマウス(Pk-1^<slc>)の病態解析で、脾臓において著明な赤芽球アポトーシスが観察される。今回、Pk-1^<slc>脾臓および骨髄から分離した単核球を用いて、造血細胞コロニー解析をおこなった。対照として60mg/kgフェニルヒドラジンを2日間皮下投与することにより急性溶血を誘導したCBA系マウス(PHZ)および無処置のCBA系マウス(CBA)を用いた。骨髄中の有核細胞数はPk-1^<slc>、PHZ共CBAとの有意差は無かった。脾臓内有核細胞数はPk-1^<slc>、PHZ共有意な増加を認めたが、Pk-1^<slc>でより著明であった。骨髄単核球を用いた造血細胞コロニー解析では、CBAに比してPk-1^<slc>、PHZ共CFU-Eの有意な増加を認めたがPk-1^<slc>とPHZとの間には差が無かった。一方、脾臓単核球の造血細胞コロニー解析では、Pk-1^<slc>においてCFU-E、BFU-E、CFU-GMおよびCFU-GEMMの増加が顕著で、CBAに比べて1030倍もの前駆細胞数を認めたが、PHZではCBAの数倍程度の増加であった。脾臓切片を用いたTUNELアッセイでは赤脾髄で著明なアポトーシス細胞の増加を認めるPk-1^<slc>と対照的にPHZにはTUNEL陽性アポトーシス細胞の増加は認められなかった。脾臓単核球から得たBFU-Eコロニー細胞を用いて、Annexin V-Ter119の二重染色によるtwo colorフローサイトメトリーを施行したところ、CBAではアポトーシス赤芽球が5.8%であったのに対し、Pk-1^<slc>では33.6%とアポトーシス赤芽球の著増が観察された。脾臓単核球中カスパーゼ3および8活性をTer119陽性細胞分画で比較検討したところ、PHZではCBAと有意差は無く、Pk-1^<slc>においてはカスパーゼ3および8共にCBAの4倍もの活性上昇を認めた。以上の結果から、マウス赤血球/肝臓型PK遺伝子(PKLR)の点突然変異は赤芽球の成熟過程で障害を来し、その一部はアポトーシスにより死に至ること、すなわち無効造血が生じていることが明らかになった。脾臓における髄外造血の亢進は赤芽球系のみならず、顆粒球・マクロファージ系にも認められるが、アポトーシスは赤芽球系に特異的であり、さらにPHZマウスでは脾臓内造血細胞コロニーの増加は軽度でカスパーゼ活性低下も有意では無かったことから、赤芽球成熟過程で赤血球型PKは抗アポトーシス作用を有していると結論した。
誘電泳動を利用したPCRフリーDNA診断技術の開発

負の誘電泳動力の変化をDNA修飾ビーズの運動軌跡の変化として検出可能とするマイクロ流路デバイスを考案・試作し、DNA修飾ビーズの運動軌跡の変化を観察した。その結果、ビーズ1個あたりのDNA修飾量が1000個以上の場合、DNA修飾ビーズの運動軌跡に明確な変化が現れた。この現象を利用して、粒子個数を蛍光画像観察で定量化する手法を考案し、その有効性を確認した。同手法では、DNA修飾条件100 DNA/particleの検出が可能であることを示した。当初目標としたPCRフリーは実現できなかったものの、従来の微粒子誘電泳動を用いた検出法と比較して約100倍の高感検出を達成した。・多層誘電体球モデルを用いてDNA修飾をビーズ表面層の誘電特性変化として表現し、DNA修飾量によってマイクロビーズに作用する負の誘電泳動力がどのように変化するかを理論的に定量解析した。その結果、ビーズ1個あたりのDNA修飾量が1000個以上であれば、負の誘電泳動力の変化が顕著になることがわかった。・負の誘電泳動力の変化をDNA修飾ビーズの運動軌跡の変化として観察可能とするマイクロ流路デバイスを考案した。同デバイスでは、DNA修飾ビーズに作用する負の誘電泳動力と粘性力のバランスによって同ビーズの運動軌跡が変化する。・上記のデバイスの有効性を検討するため、DNA修飾ビーズの運動軌跡を数値シミュレーションにより検討した。その結果、負の誘電泳動力の低下により、DNA修飾ビーズの運動軌跡が変化することが定量的に確認された。・考案したマイクロ流路デバイスを試作し、DNA修飾ビーズの運動軌跡の変化を観察した。即ち、DNA修飾を施していないビーズには大きな負の誘電泳動力が作用するため、その運動軌跡はマイクロ電極のギャップに沿って大きく変化した。これに対し、DNA修飾ビーズでは負の誘電泳動力の影響が相対的に低下するため運動軌跡の変化が小さくなった。この現象を利用すれば、粒子個数を蛍光画像観察などで定量化することで、DNAを定量的に検出できるものと考えられる。・確認されたDNA検出感度は、従来の正の誘電泳動を用いる方法に比べ、約100倍の高感度化に相当する。計画立案時に提案した原理を用いて、我々のグループが従来提案してきた方法に比べ、約100倍の感度でDNAを検出することに成功した。ただし、最終的な目的としている「PCRフリー」のレベルにはまだ到達しておらず、今後更なる高感度化に向けた検討が必要である。PCR法は病原性細菌やウイルスの検出法のひとつであり、対象のDNAを特異的に増幅することができる。通常、PCRによるDNA増幅の有無はゲル電気泳動によって確認されるが、この作業は煩雑で数時間を要する。そこで、研究代表者らのグループはDNA修飾微粒子の正の誘電泳動を用いたDNA検出法を考案した。微粒子に働く誘電泳動力を負から正に変化させるために微粒子1個当たり約100000個のDNAを結合させる必要がある。本研究の目的は、微粒子誘電泳動を用いたDNA検出法の高感度化である。負の誘電泳動であってもDNA結合量に伴って誘電泳動力が連続的に変化していることに着目し、負の誘電泳動力のわずかな変化を検出するマイクロ流体デバイスを考案した。これにより、究極的にはPCR増幅を必要としないDNA検出法の実現を目指した。本年度得られた主な研究成果は以下の通りである。・昨年度開発した負の誘電泳動力の変化をDNA修飾ビーズの運動軌跡の変化として観察可能とするマイクロ流路デバイスに蛍光観察光学装置を組み合わせ、更にDNA修飾ビーズに蛍光ビーズを用いることで、ビーズ運動軌跡の変化を定量的に検出可能なシステムを新たに構築した。・同デバイスを用いて、DNA修飾ビーズの運動軌跡の変化を定量化した。蛍光微粒子数が多いほどパルスが重畳されてパルスのピーク値が増加することがわかった。したがって、測定時間内に現れたパルスのピーク値の総和が蛍光微粒子数に依存すると考えられる。そこで、修飾条件ごとにピーク値の総和を算出したところDNA修飾量100DNA/particleの検出が可能であり、正の誘電泳動を用いる従来の手法と比較して約100倍の高感度化を達成した。・負の誘電泳動力の変化によるDNA修飾ビーズの運動軌跡の変化を定量検出するため、蛍光画像観察などの手法を導入する。・更なる高感度化のため、進行波誘電泳動を応用した新たな検出原理を提案しその有効性を確認する。静電気工学今年度は既存の設備を有効利用して研究を実施することができたため、物品費の支出が当初の予算よりも少額となったため。
新規テラヘルツ高分解能測定によるリン酸亜鉛微細構造の検出

テラヘルツ波は室温程度の弱いエネルギーを有するため、物質の形態に関係する結晶性についての評価が可能であると期待されているが、ほとんど解明されていない。そこで本研究ではリン酸亜鉛を対象とし、独自のテラヘルツ分析装置を用いて、異なる水和構造におけるテラヘルツスペクトルを測定し、テラヘルツスペクトルと結晶形態の相関を議論した。さらに鋼板表面における非破壊検査技術としての可能性を示した。実用材料表面について化成処理皮膜の状態及びその分布を解析する手法が求められている。テラヘルツ波は室温程度の弱いエネルギーを有するため、物質の形態に関係する結晶性についての評価が可能であると期待されているが、テラヘルツ物性は最近ようやくデータベースとしてのスペクトルが測定されはじめたにすぎず、ほとんど解明されていない。そこで本研究ではリン酸亜鉛を対象とし、高分解能テラヘルツ分析装置を用いて、結晶サイズや水和構造が異なる状態のテラヘルツスペクトルを測定する。結晶形態のマクロな違いや水和物形成におけるテラヘルツスペクトルの変化からリン酸亜鉛の微細構造を検出し、鋼板表面におけるその状態・分布を電気化学測定と合わせて議論することを目的としている。4つの水和水を含む4水塩を加熱することにより、100度で2水和水、190度で3水和水、約250度で4水和水を失い無水塩となることが知られており、平成24年度は4水塩の状態から真空中で加熱し無水塩へと変化するときのそれぞれの状態におけるテラヘルツスペクトルを室温にて測定した。さらにテラヘルツスペクトルの理解を進めるために、比較的安定に水和物を調製できる硫酸カリウムアルミニウムについても測定した。テラヘルツスペクトル測定と同時に、各種顕微鏡により結晶形態を観察するほか、X線回折パターンの測定やラマン分光測定を行い、分子軌道計算によるテラヘルツスペクトルの解析とあわせて同一の試料に対する系統的な理解を進めた。本研究で行う「マクロな結晶形態や水和物形成におけるテラヘルツスペクトルの変化を知る」ことは水和物を含む微細構造に着目してテラヘルツスペクトルを理解するという学術的に重要なものであり、分子振動のスペクトル解析に用いられることが多い重水素化による吸収ピークのシフトによる議論とは異なる創造的な研究といえる。最終年度である25年度は水和構造が異なる金属塩のテラヘルツスペクトルにおいて、リン酸亜鉛について得られている結晶構造および水和構造とテラヘルツスペクトルの相関をもとに構造の分布を議論した。腐食試験後の溶融亜鉛めっき鋼板に対して、室温ならびに加熱セルを用いたテラヘルツ反射スペクトル測定を行った。結果として、測定温度により吸光度が減少する吸収ピークや、中心周波数が変化する吸収ピークがあることが確認された。それらの原因としては、腐食生成物の水和構造が変化することだけでなく、加熱により別の化合物に変化することも考えられる。平成23年度はリン酸亜鉛粉末試料の作製とテラヘルツスペクトル測定を行った。結晶のサイズや形態が異なる粉末状態のリン酸亜鉛を作製するプロセスを検討した。ウェットプロセスだけでなく赤外線加熱炉を用いることにより、水和数が異なる種々のリン酸亜鉛を作製することが可能となった。現有するテラヘルツ分析装置を用いて、リン酸亜鉛の各種水和物のテラヘルツスペクトルの変化を測定した。さらにそれらの試料に対して電子顕微鏡や光学顕微鏡などによる形状観察、X線回折測定による構造評価、赤外・ラマン分光などの分析を合わせて行った。リン酸亜鉛結晶の化成処理皮膜として必要とされる緻密さや均一性に着目して、テラヘルツスペクトル・イメージングのデータを系統的に解析するために、テラヘルツスペクトルのリン酸亜鉛・水和数による変化を分子軌道計算により議論した。

本研究はリン酸亜鉛を対象として、顕微鏡観察をはじめX線回折測定や赤外・ラマン分光など従来からの各種分析とともに次に挙げる実験を行い、テラヘルツスペクトルについて結晶形態や水和構造との関係を明らかにし、化成処理皮膜に必要とされる結晶の緻密さと均一性について議論するものである。(1)異なる製法・条件によるリン酸亜鉛粉末試料の作製とテラヘルツスペクトル測定(2)加熱乾燥セルの導入と水和水脱離プロセスにおけるテラヘルツスペクトルの測定(3)鋼板表面におけるリン酸亜鉛被膜のテラヘルツ分光イメージング測定と電気化学測定平成24年度までに(1)ならびに(2)についてはほぼ終了し、(3)については既存の計測器も含め、電気化学測定が可能なシステムを構築している。平成25年度はテラヘルツスペクトルの理解を深め、リン酸亜鉛の結晶形態や水和物形成の状態・分布と電気化学特性の相関が議論できる状況であり、おおむね順調に進展しているといえる。本研究はリン酸亜鉛を対象として、顕微鏡観察をはじめXRDや赤外・ラマン分光など各種分析とともに下記の実験を行い、テラヘルツスペクトルについて結晶形態や水和構造との関係を明らかにし、化成処理皮膜に必要とされる結晶の緻密さと均一性について議論するものである。(1)異なる製法・条件によるリン酸亜鉛粉末試料の作製とテラヘルツスペクトル測定(2)加熱乾燥セルの導入と水和水脱離プロセスにおけるテラヘルツスペクトルの測定(3)鋼板表面におけるリン酸亜鉛被膜のテラヘルツ分光イメージング測定と電気化学測定平成23年度に(1)及び(2)について実施でき、平成24、25年度においてはテラヘルツスペクトルの解釈にあわせて、(3)を進める状況にあり、おおむね順調に進展しているといえる。平成25年度は最終年度であり、昨年度に構築したシステムを用いて電気化学測定をリン酸亜鉛をめっきした鋼板に対して行う。リン酸亜鉛の結晶形態や水和物形成の状態や分布について、テラヘルツスペクトル・イメージング像をはじめ、電気化学特性ならびに各種分析結果を合わせて議論する。リン酸亜鉛のほか、硫酸カリウムアルミニウムも合わせて行っている分子軌道計算の精度を高め、水和構造を基盤として明らかになるテラヘルツスペクトルの解釈をもとに、鋼板の耐食特性についてテラヘルツによる非接触分析測定技術を展開する。平成24年度はまず電気化学測定ができるシステムを構築する。リン酸亜鉛めっきした鋼板を対象として、リン酸亜鉛の析出条件とテラヘルツスペクトルと電気化学測定を進めていく。リン酸亜鉛めっき鋼板の腐食挙動を把握するため、アノードおよびカソード分極曲線の電気化学測定を行う。リン酸亜鉛皮膜のテラヘルツスペクトル・イメージングと耐食性の相関について議論していく。なお、皮膜の厚さは数マイクロメートルであるため、リン酸亜鉛めっきのテラヘルツスペクトルが良い精度で測定できない場合は高感度測定法を検討する。さらに、テラヘルツスペクトルを解釈するために、他の無機水和物を対象とするテラヘルツスペクトル測定及び解析を行う。レーザ装置におけるランプなどの消耗品、損傷を受けやすいミラーや波長板などの光学部品を購入し、テラヘルツスペクトルならびにイメージング測定が可能な研究環境を引き続き整備していく。
仰臥位片肺換気時の低酸素血症と肺血管内皮機能障害

肺など、胸腔内の手術では片肺による換気が必要になることがある。片肺換気の問題点として、低酸素血症があり、これは体位の影響も受ける。今回はじめに、片肺換気を始める前にその低酸素血症を予測できるか、呼気に含まれる二酸化炭素に着目して行った。二酸化炭素の排泄は肺血流に影響され、一方片肺換気時の低酸素血症も左右肺の血流分布に依存する。片肺換気を始める前の両肺換気時の左右肺二酸化炭素分圧差が片肺換気時の動脈血酸素分圧低下の予測因子の一つとなることが分かった。今回、呼気含有CO2総量測定装置(コズモフラス8100)を一台購入し、以前より所有していたものに加え2台で左右気管支それぞれの呼気終末二酸化炭素分圧、換気量、二酸化炭素排泄量、死腔量を同時に測定できるようにした。肺外科手術症例を対象として、全身麻酔下に気管支ダブルルーメンチューブで挿管し、仰臥位両肺換気時、側臥位両肺換気時、側臥位片肺換気にして5分おきに30分まで、それぞれ左右気管チューブ呼気終末二酸化炭素等圧、換気量、二酸化炭素総排泄量、死腔量の測定を開始した。仰臥位から仰臥位すると、上位肺では換気量の増加(279mLから322mLへ)が、下位肺では換気量の低下(284mLから254mLへ)と呼気終末二酸化炭素分圧の上昇(33mmHgから36mmHgへ)を認めた。さらに、側臥位片肺換気を行うと、PF比は徐々に低下を認め、15分後にはほぼプラトーとなった。また、側臥位両肺換気時の左右二酸化炭素分圧の差は側臥位片肺換気時の最低Pa02と有意な相関を認めた(r=0.82,p<0.01)。しかし、二酸化炭素排泄量に関しては換気量の影響を受け解析が困難であった。従って、左右気管支の換気量をそれぞれ独立して調節するために人工呼吸器(サーボ900C)を2台用意し、かつ連動して動作するように整備した。さらに、換気量の影響を取り除くため、左右気管支換気量を一定にし、現在計測を開始している。今までのところ、仰臥位から側臥位に体位変換して有意な差がでているのは下位肺の二酸化炭素分圧のみ(41mmHgから44mmHg)である。今後症例を重ねて、引き続き検討する予定である。平成20年度はまず、19年度に測定したデータを基に解析し、考察と論文作成を行った。肺外科手術症例を対象に全身麻酔下に気管支ダブルルーメンチューブを挿管し、左右肺それぞれの呼気終末二酸化炭素分圧、換気量、二酸化炭素排泄量、死腔量を両肺換気仰臥位時、側臥位時にそれぞれ測定を行った。仰臥位から側臥位への体位変換により、上位肺では換気量の増加(279から322mLへ)、呼気終末二酸化炭素分圧の減少(33から29mmHgへ)、下位肺では換気量の減少(284から254mLへ)、呼気終末二酸化炭素分圧の増加(33から36mmHgへ)がみられ、また、側臥位両肺換気時の左右肺呼気終末二酸化炭素分圧の差が、側臥位片肺換気15分後の酸素分圧と相関した(r=0.698 ; P<0.01)。側臥位両肺換気時の呼気終末二酸化炭素分圧の差は、片胆換気を開始する前に低酸素血症を予測できる因子の一つとして、測定が簡便であり有用と考えられる。以上の結果をJournal of Anesthesiaに投稿し受理された(平成21年度掲載予定)。その後、測定の際の体位変換による換気量変化の影響を取り除くため、人工呼吸器(サーボ900C)を2台用意し、同期させながら左右肺を独立して一定の換気量で換気できるように整備し、同じく肺外科手術症例を対象に同項目の測定を行った。現在のところ10症例で仰臥位から側臥位への体位変換により、呼気終末二酸化炭素分圧は上位肺では有意な変化がなく、下位肺では有意な上昇(40か44mmHg)を認めた。側臥位両肺換気時の左右肺呼気終末二酸化炭素分圧の差は片肺換気時の酸素分圧と相関関係を現在の所認めていない。今後、経食道超音波法による左右肺静脈血流速度の測定を含め症例を重ねてさらなる検討が必要である。
視床下部ホルモン含有神経の線維伸展のメカニズム:軸索誘導物質の検索

本研究課題は、視床下部における神経線維の伸展のメカニズムを追究し、同時に想定されている神経線維誘導物質の同定を目指して行ったものである。目的を達成するため、標的組織である正中隆起を構築する細胞の同定から始め、脳軟膜の重要性を明らかにし、未知の因子の単離同定を目指して現在も研究を続けている。その、経過を概要する。最初、標的組織には無数の神経線維、アストログリア、マイクログリア、血管由来の細胞、軟膜由来の細胞に加えて、POMC神経細胞体が分布していることを明らかにした。次に、発生過程や下垂体摘除におけるこれらの細胞の変動を解析し、線維の伸展と関連するものは脳軟膜と血管系であることを突き止めた。更に、下垂体摘除により誘導される神経線維の再生現象を解析し、線維の伸展には脳の軟膜細胞が重要であることを明かにした。そこで、軟膜細胞の大量培養系を確立し、条件培養液中に強い神経栄養活性を見い出した。この活性はFGFの神経細胞に対する効果とは明らかに異なっていた。この因子を検討した結果、主成分としてIGF-IIとIGFBP-2が検出され、同時にIGF-IIの活性発現に必須の極く微量の蛋白因子(+α)の存在が明らかとなった。一方、軟膜細胞の生産分泌する蛋白成分を分析し、軟膜が生理的に重要な蛋白因子(例えば、β-trace蛋白など)を多数産生していることを確認できた。本研究課題を通して、軟膜は従来考えられてきた機能を遥に越えた高度な機能を司っていることが明らかとなった。視床下部の神経(GRHやTRH、SRIF並びにvasopressin)の線維伸展のメカニズムを追究する為、本年度はその標的組織(正中隆起)を構成する細胞各種の同定を行った。正中隆起の初期細胞培養を行い、個々の細胞の同定は特異的な抗体を用いた免疫細胞化学法にて行った。その結果、新生仔期の正中隆起の構成細胞は視床下部とは著しく異なり、アストログリア細胞ではstellate型が多い事、オリゴデンドログリア細胞は殆ど存在しないこと。また、fibroblast並びに血管内皮細胞が多量に存在することが明らかとなった。更に、従来神経細胞体がMEに存在していることは疑念視されていたが、相当数のPOMC神経細胞体が存在し、しかも胎生14日以前に発現する事も明らかとなった(Neuroendocrinology in press)。次に、標的器官を切除した場合の当該神経線維の挙動を明らかにする為に、下垂体の摘出を行いvasopressin神経線維に与える影響を検討した。vasopressin神経は正中隆起の外層の更に外層すなわち基底層に新しい終末集団を形成した。しかし、正中隆起のアストログリア細胞やPOMC神経細胞体の分布や形状は影響されないし、SRIF神経線維やTRH線維も変化しない事が判明した。更に、視床下部神経の発育よりもアストログリアの発現が遅れることも明らかとなった。以上の実験成績は、基底組織すなわち下垂体門脈系もしくは脳軟膜の重要性を示唆している。現在、正中隆起に多い軟膜細胞並びに血管内皮細胞を多量に培養し、その培養液中に分子量約50Kで当該神経の生存率を高める因子の存在が確認され、単離・精製を行っている。視床下部ホルモン含有神経の線維伸展に,正中隆起部の外層の更に外側,即ち結合組織・基底層が重要であることが平成3年度の研究により明らかにされている.本年度は,この結合組織・基底層の構築細胞である脳軟膜細胞に焦点をあてた研究を行ない,以下の新しい知見が得られた.1.脳軟膜(新生児から採取)を第三脳室の基底部,すなわち正中隆起の表層に移植すると,下垂体摘除(終末切離)により新しく再生されるvasopressin神経線維が多量に移植片に進入する.

このような再生神経線維の進入はいかなる脳組織片(大脳皮質など)を同部位に移植しても起こらない.この事実は脳軟膜の線維伸展における特殊性と重要性を示めしており,極めて興味深い.2.生後1-2日目のラットから脳軟膜由来初代培養細胞系を確立し,その条件培養液を得た.この培養液中に,in vitroでvasopressin神経の線維伸展や生存率を著しく高める因子の存在がすることが明かとなった.また,脳軟膜細胞の培養液はvasopresin神経に限らず,小脳や大脳皮質の細胞の生存率も高める.3.大脳皮質の神経の生存率を高める因子を単離・同定しようと試みているが,現在のところ以下の点が明かとなっている.活性因子はゲルクロマトでは30-50Kの位置に溶出されてくる.熱に弱く,酸処理には耐性がある.ヘパリンに親和性があり,同カラムで部分精製が出来る.HPLCカラムによる分離・精製ではその活性は著しく減弱するが活性は残る.精製の中途ではあるが,SDSページにより32K,18K,16Kや7Kなどのメインバンド蛋白が活性因子と関連していると思われる.今後,これらの蛋白成分のアミノ酸配列などを解析すると同時に最終的な単離精製品を得る必要がある.視床下部ホルモン含有神経の線維伸展に,正中隆起部の外層の更に外側,即ち結合組織・基底層が重要であることを平成3年度の研究により明らかにしている.4年度は,この結合組織・基底層の構築細胞でもある脳軟膜細胞に焦点をあてた研究を行ない,脳軟膜細胞の培養液中に強い神経栄養因子活性が存在することを見い出している。本年度はこの神経の生存率を高める因子の単離・同定、並びに培養液中に存在する主要な蛋白成分の単離精製を試み以下の点が明らかになった。1、脳軟膜細胞の培養液中に存在する神経栄養因子はIGF様の作用を示す。2、培養液には主要蛋白質として、7KD,16KD,18KD,27KD,32KD並びに38KDの成分がSDSページにより確認される。それぞれの蛋白成分を精製し、N-末端アミノ酸配列を解析し、ホモロジー検索をしたところ7KDはIGF-IIとdes 1-IGF-IIであることが判明した。更に、32KD蛋白はIGF結合蛋白質(IGFBP-2)であり、16KDと18KDはIGFBP-2の分解産物であることが判明した。これらの成績から、脳軟膜細胞の産生する神経栄養因子活性はIGF-II/IGFBP-2複合体であることが想定される(投稿中)。3.次に27KD蛋白のアミノ酸配列を解析し、β-trace protein(プロスタグランジンD合成酵素)であることを見い出した。現在のところ、β-trace proteinは脳脊髄液中に多量に存在していることは判っているがその生理作用は不明である。本研究により産生部位は脳軟膜であることが示唆され、生理作用の解明の糸口が得られたと考えている。抗体を作製し、免疫組織化学によりβ-trace proteinが脳軟膜に多量に存在することも確認している(投稿中)。以上の知見により脳軟膜の知られていない生理作用が明かとなった。現在、同定された主要産生蛋白と視床下部神経の軸策誘導との関連を解析している。
エピジェネティクス制御に関わるセレノプロテイン含有タンパク質複合体の同定

必須微量元素であるセレンは、エピジェネティック制御に影響を及ぼすとの発見を契機に、我々は、核内に局在する唯一のセレン含有プロテインSelHに注目した。SelHノックダウンマウスES細胞(SelH-KDES細胞)の解析により、SelHはES細胞の多分化能に関わるエピジェネティック因子として、DNAのメチル化とヒストン修飾に関与することが分かった。現在進行中のSelH含有タンパク質複合体の同定は、今後、SelHのエピジェネティクス制御機構解明に大きく貢献すると期待する。申請者は、挑戦的萌芽研究「セレノプロテインによるエピジェネティック制御」により、セレン(Se)含有タンパク質の一種、セレノプロテインH (SelH)が、ES細胞において、特定遺伝子領域(標的)のDNAメチル化状況やヒストン修飾に影響を与えていることを発見した。抗酸化酵素としての作用のみが注目されてきたセレノプロテインが、エピジェネティック制御機能を有することを初めて示した。この成果を基盤に、本研究では、生化学的展開を試み、独自に作製された抗SelH特異抗体を用いて、SelH標的ゲノム領域における集積タンパク質群、すなわち、SelH含有エピジェネティック制御複合体の同定を試みる計画である。本年度は、すでに作製してある抗SelH特異抗体を用いて、免疫沈降(IP)を行い、SelH標的ゲノム領域に集積しているタンパク質群(SelH複合体)の濃縮を試みた。ES細胞から調整したクロマチン画分を抗SelH特異抗体に供することに加えて、さらに効率のよい濃縮をめざして、SelH強制発現細胞株より調整したクロマチン画分を用いたIPも行った。非特異的な沈降を完全に避けることは困難であるため、SelHノックダウン細胞株を、非特異的な沈降に対するネガティブコントロールとして用いた。また、申請者が確立したGSTをタグとして有するGST-SelH組換えタンパク質の発現系を用いて精製した組換えGST-SelHに対して、マウスES細胞より調整したクロマチン画分、あるいは、核画分を過剰に供し、組換えGST-SelHに結合するタンパク質群を回収する方法も試みた。SelH含有エピジェネティック制御複合体の濃縮の過程については、概ね順調に遂行している。今後は濃縮した複合体の分離同定を速やかに遂行する予定である。当初の計画においては、今年度内に、抗体や組換えタンパク質を駆使して、SelH含有エピジェネティック制御複合体の濃縮実現し、さらに、各種電気泳動によって、タンパク質複合体の分離を行う予定であった。当研究課題は、追加内定という形で採択され、開始したため、当初の計画全体を遂行するには、時間に限りがあったというのが実際である。研究実績の概要に記したように、複合体の濃縮の検討については概ね順調であったが、分離についての条件検討は、まだ開始できていないのが現状である。すでに作製してある抗SelH特異抗体を用いて、免疫沈降(IP)を行い、SelH標的ゲノム領域に集積しているタンパク質群(SelH複合体)の濃縮を試みた。また、申請者が確立したGSTをタグとして有するGST-SelH組換えタンパク質の発現系を用いて精製した組換えGST-SelHに対して、マウスES細胞より調整したクロマチン画分、あるいは、核画分を過剰に供し、組換えGST-SelHに結合するタンパク質群を回収した。以上の方法によって、濃縮したSelH含有エピジェネティック制御複合体を用いて、SDSーPAGE、また等電点2次元電気泳動による分離、および、エピジェネテッィク制御因子に対する抗体を用いた検出も試みた。当初の計画においては、今年度内に、SelH複合体の同定を行う予定であったが、実状は、SDS-PAGEあるいは2次元電気泳動による分離までしか至らなかった。追加内定という形で採択され、半年以上の遅れをもって研究計画の実施を開始したため、その遅れを今年度中もまだ補うことができなかったというのが実際である。最終年度はさらに加速した計画遂行に向けて最大限努力する。この成果に基づいて、本研究では、生化学的展開を試み、独自に作製された抗SelH特異抗体を用いて、SelH標的ゲノム領域における集積タンパク質群、すなわち、SelH含有エピジェネティック制御複合体の同定を試みる計画をした。