hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
大都市「都心」地球の衰退と再生の関する比較社会学的研究

さまざまの意味での異質・多様性を許容して相互に折り合いなから共に築く洗練された新しい共同生活の規範・スタイルのコミュニティ定義と併せて,中心市街地に適合的な「ネットワーク型居体」との都心型居住形態についても明示された.大都市「都心」の衰退と再生は、都市化の成熟段階に見合う都市社会学研究上の大きなトピックスである。本研究では1960年代以降の東京都市圏の「都心」および外周のインナーシティ地域の変容過程を、コミュニティ再生の立場から調査研究することを目的とした。調査研究にあたっては、東京都心およびインナーシティの典型事例を、(1)欧米大都市、(2)東京圏以外の日本の大都市、とくに京都・大阪・神戸の関西三都、福岡の各典型事例との相互比較分析においてととりおこなった。〔I〕前年度において予備調査を実施済みの京都・大阪・神戸、とくに福岡の「都心」および外周のインナーシティ地域については、「都心居住の存在形態」「都心型コミュニティのモデル構成」の立場から典型事例を中心として精密調査を実施した。調査にあたっては、研究代表者を中心に徹底した現地ヒヤリングと資料荵集を手がけた。〔II〕以上の調査結果と相互比較するかたちで、やはり予備調査を実施済みの東京の「都心」および外周の典型事例(7地区)の精密調査の第2次作業と資料的整備を図った。〔III〕東京の「都心」と外周については、昭和63年度はとくに中央区「月島・佃」「明石町」地区、豊島区「東池袋4・5丁目(旧・日出町)地区をとりあげた。中央区の事例は大川端リバーシティ、聖路加国際病院を中心に中心市街地再開発事業が進行中でもあり、「都心居住」「都心型コミュニティ」の観点から動態的分析を追跡的におこなう格好の対象をなした。とくに明治初期の外国人居留地としての歴史的系譜を持つ「明石町」は、同様の構造の大阪市西区「川口・本田地区」との詳細な比較調査を試みた。「東池袋」については、アジア系外国人の急増地区でもあり、地域レベルの混住化を介してどのような洗練された独自の様相のインナーシティ型コミュニティに結ぶかを実態調査と分析を試みた。
緑茶成分エピガロカテキンガレートによる抗動脈硬化作用とがン細胞増殖抑制効果の検討

動脈硬化の発症あるいはその経過に深く関連する血管平滑筋細胞の増殖は、粥状動脈硬化巣(プラーク)の形成における重要な因子の一つである。PDGFはプラーク形成部位の活性化されたマクロファージ、平滑筋細胞、内皮細胞、あるいは血小板より産生放出され、血管平滑筋細胞の内膜への遊走、増殖を促進し、その結果内膜肥厚を引き起こし、動脈硬化症を引き起こすと考えられている。エピガロカテキンガレート(EGCG)は緑茶に含まれるポリフェノールで、近年、心臓疾患を引き起こす動脈硬化の発症の抑制や高血圧予防、体脂肪燃焼作用について効果があると研究されている。我々は培養ラット血管平滑筋細胞(A7r5 cell)をEGCG2時間前処理の条件下でPDGF刺激すると、PDGFによって誘導されるERK1/2、MEK1、AktがEGCG存在下では著しく減少し、PDGF-βレセプターのリン酸化は濃度依存的に減少すること、初期応答遺伝子c-fos,c-junの発現も抑制されることを明らかにした。従って、A7r5細胞株を用いEGCGによる細胞増殖抑制効果が、リガンド、受容体、または両者への作用によって引き起こされるかを分子レベルで明らかにすることを目的とし、1.EGCGのPDGF刺激によるERK1/2、MEK1のリン酸化に及ぼす効果、2.EGCGの増殖に関与する極初期遺伝子の発現に及ぼす効果、3.EGCGのPDGF刺激によ.るPDGFβ-受容体のリン酸化に及ぼす効果、4.EGCGのPDGF刺激によるAktのリン酸化に及ぼす効果、5.EGCGのPDGF刺激による細胞増殖に及ぼす効果について検討を行った。その結果、EGCGはPDGFシグナル伝達経路の鍵となる分子であるPDGFβ-受容体、ERK1/2、MEK1、Aktのリン酸化を有意に抑制し、さらに極初期遺伝子c-fos,c-junの発現を減少させ、細胞増殖を有意に抑制した。これらの結果は、EGCGが動脈硬化症の憎悪因子と考えられている血管平滑筋細胞の増殖を抑制する分子機構を明らかにし、動脈硬化やそれに基づく心血管疾患に対するEGCGの有用性を示すものである。
金属サブ波長格子を用いたＮＥＭＳ可変プラズモニックデバイスの開発

NEMSアクチュエータで変調可能な金属サブ波長格子を構成し、表面プラズモン(以下、SP)共鳴波長を電気信号で可変可能なアクティブプラズモンデバイス(以下、APD)を開発した。作製したAPDは、10 V以下のバイアス電圧で約60 nmの共鳴波長の可変化を可視光領域にて観測した。また、有限差分時間領域法を用いた数値計算より、本共鳴がSP共鳴であり、共鳴波長のシフトを定性的に明らかにした。さらに、Woodアノマリを用いた赤外光領域の共鳴波長の可変化の可能性を示した。これらのことから、単一試料・単一構造でSP共鳴波長を可変化可能なナノ光学制御技術を実現し、本技術を駆使した光学素子の開発に成功している。近年、LSI技術と大容量光伝送技術を融合させた光電子融合技術が提案されている。表面ブラズモン(Surface Plasmon : SP)は、光の回折限界以下の領域に光エネルギーを閉じ込めることから、光デバイスをCMOS回路と同サイズに小型化できる。研究代表者は、これまで微小領域中での表面プラズモンSPの光増強効果について、構造の観点から検討してきた。もし、SP共鳴波長を単一試料内で自由に可変することができれば、フィルタや導波路、変調器、センサ等多岐に渡る光デバイスへの応用が単一試料・単一構造で可能となり、更なる高集積化・高機能化が期待される。このようなSP共鳴波長は、構造に依存するため、構造を自由に可動できれば共鳴波長も連動して変化すると考えた。そこで、NEMSアクチュエータで金属サブ波長格子を構成し、SP共鳴波長を電気信号で可変可能なアクティブプラズモンデバイス(Active Plasmon Device : APD)の提案し、その開発を本研究の目的とした。平成24年度からの2年間で、APDの基本技術の確立を目指し、(i)APDの光学現象の解明と、構造の最適化、(ii)作製プロセスの検討と、APDの作製、(iii)評価光学系の構築、(iv)APDの光学特性評価、(v)APDを用いたフィルタや導波路、変調器、センサへの応用開発、を検討することとした。平成24年度は、(i)(v)のAPDの原理解明と構造の最適化を明らかにし、APDを用いた各要素技術を開発した。可視光から赤外光領域におけるSP共鳴及びWoodアノマリ共鳴は、サイズ依存による光学分布モードや構造依存による信号光強度、及びその共鳴波長の選択領域を明らかにした。また、本年度の研究業績より、学術論文6件、国内外の会議発表31件、受賞1件、特許2件、競争的外部資金獲得4件からも本研究の外部評価の高さが伺える。表面プラズモン(Surface Plasmon: SP)は、光の回折限界以下の領域に光エネルギーを閉じ込めることから、局所的に大きな電場増強効果を示し、センサの高感度化や光デバイスをCMOS回路と同サイズ程度に小型化する要素技術として注目されている。このようなSP共鳴波長を外部変調により単一試料で制御することができれば、更なる高集積化・高機能化を実現できると考えた。本研究では、NEMSアクチュエータで金属サブ波長格子を構成し、SP共鳴波長を電気信号で可変可能なアクティブプラズモンデバイス(Active Plasmon Device: APD)を提案し、開発した。また、構造に由来するWoodアノマリ共鳴波長の可変化も観測した。これらの知見を基に、「フィルタ」や「変調器」、「センサ」などの光電子集積回路の要素技術を確立した。また、「シャッタ」や「導波路」、「レンズ」としての更なる高集積化・高機能化が実現可能な要素技術を見出した。これらの応用デバイス例は、いずれも単一試料・単一構造で可能なため、次世代の光電子ナノ集積回路の基盤技術として期待される。一方、本技術の実用化には、共鳴波長の光強度・シフト量・Q値の向上を実現する『構造の改善』と、実デバイスの形状的動作による『実施例取得』が必要である。現在、構造色を採用した構造の改善を進めている。最後に、本年度の研究業績(本研究実施期間の総計)より、学術論文5(11)件、国内外の会議発表26(57)件、受賞1(2)件、特許1(3)件(現在、優先権主張準備中)、競争的外部資金獲得3(7)件からも本研究の外部評価の高さが伺える。平成24年度からの2年間に、APDの原理解明、構造の最適化とその開発を目的とし、(1)APDのSP共鳴波長シフトの解明、(2)数値計算によるAPD構造の最適化、(3)APDを用いたカラーフィルタの開発、(4)APDを用いた可変型SP導波路の開発、

(5)アクティブプラズモン変調器の開発、(6)APDを介したセンサの開発、を実施する。そこで、初年度は、(1)(3)のAPDの原理解明と構造の最適化を明らかにし、APDを用いたカラーフィルタの開発とした。この結果、可視光から近赤外光領域におけるSP共鳴は、サイズ依存による光学分布モードや構造依存による信号光強度、SP共鳴波長の違いを明らかにした。また、APDを用いたカラーフィルタは、可視光領域において、100nm程度のSP共鳴波長の可変化を実現した。一方で、(4)(6)におけるそれぞれのデバイス開発にも着手した。(4)については、本要素技術を採用した可変型ギャッププラズモン導波路の提案、及びその開発に成功した(特願2013-102667、2013年05月15日出願)。(5)及び(6)においても、数値計算における特定の可視及び通信波長帯域(1.55マイクロメートル)でのSPやWoodアノマリ共鳴を合致する構造(最適な金属の種類や金属膜厚、金属格子幅と金属間ギャップ幅)を検討し、決定した。また、検討した構造の作製と、可視光領域における電圧依存共鳴光学特性の可変化に成功した。現在、既存の透過型顕微分光光学系を拡張した透過及び反射型顕微分光光学系を構築しており、それぞれの実験検証に取り掛かっている((6)については、後述した)。さらに、当初の計画にない、(7)APDを用いたナノ光シャッタ素子としての新たな可能性も見出した。(6)の光センシングデバイスへの挑戦として、CO_2ガスセンサへの応用を検討した。同時に、ガス検知用センサの仕様調査、及び本技術に対する48社の企業評価(nanotech展を始めとする展示会への出展や企業への技術紹介を繰り返し、本技術の改善点調査)を行った。その結果、外部変調によるSP共鳴波長帯の可変化は、1台のセンサで、様々なガスを検知出来る画期的な技術であり、市場に与える影響は非常に大きいことが分かった。一方で、(1)信号光強度の向上や、(2)共鳴ピーク波長のシャープ化の2つが技術的な課題として集約された。現在、これらの課題についても解決しており、今後は実施例を取得する。最後に、本研究の客観的な外部評価も非常に高く位置付けており、ナノオプティクスやナノフォトニクスの主要な近接場光学における国際会議(NFO12、CLEO-PR&OECC/PS2013、APNFO2013)で3件の口頭発表として採択、1件(The Best Paper Award : Japan-India Bilateral Seminar on Supramolecular Nanomaterials for Energy Innovation)の受賞と、平成24年度知財活用促進ハイウェイ「大学特許価値向上支援」((独)科学技術振興機構)を始め、3件((公)高橋産業経済研究財団、(公)カシオ科学振興財団、(公)立石科学技術振興財団)の研究助成による外部資金獲得からもその様子が伺える。25年度が最終年度であるため、記入しない。開発したAPDの構造を最適な条件へと導くことで、可視光から赤外光領域における幅広い光学領域のSP共鳴波長やWoodアノマリ共鳴を可変化することを明らかにした。
メダカゲノム・EST情報と突然変異体を駆使した発生・再生システムの解明

2006年までに、メダカドラフトゲノム(2007)、および詳細なSNP地図、BACライブラリー等の情報が充実し、メダカ突然変異体から原因遺伝子同定の労力と時間は飛躍的に減少した。2005から2009年の間に、武田研究室および工藤研究室において、それぞれ9系統(肝臓、体軸形成、原腸形成、左右軸変異体、内耳形成)と15系統(心臓、血球、血管、椎骨、頭蓋・ヒレ骨形成、ヒレ形成変異体、ヒレ再生)の原因遺伝子を特定し、目標を達成した。武田研、工藤研が協力し、メダカゲノム情報を利用した変異体の原因遺伝子同定を行った。1.武田研ut016:心臓と肝臓の左右の配置がランダムになる変異体。ut-006はさらに多発性嚢胞腎を発症することも判明した。ポジショナルクローニングの結果、原因遺伝子はヒトでESTの報告があるだけの機能未知の遺伝子であった。ut016は繊毛形成に異常が起こり、その結果左右軸異常と多発性嚢胞腎を発症する変異体である。ut016がコードするタンパク質のN末領域は節足動物からヒトまで保存されており、繊毛形成に必須な新規遺伝子と考えられる。現在、その機能解析を進めている。aA-12(abecobe, abc):心臓と肝臓の左右の配置がランダムになる変異体。ポジショナルクローニングの結果、原因遺伝子が確定した。原因遺伝子は、解析が進んでいない、チャンネル様のタンパク質をコードする機能未知の遺伝子であった。2.工藤研心臓・血管、ヒレ形成、骨に関わるメダカ突然変異体からポジショナルクローニングにより6つの原因遺伝子のクローニングに成功している。その多くがそれぞれの器官形成に関して新規の遺伝子であり、新しいメカニズムの発見が期待される。特にヒレの伸張にかかわる遺伝子としてHoxb8が同定され、Hoxb8がWnt5aを制御することによりヒレを構成する細胞の移動がおこり、その結果ヒレの伸張と鰭条形成がもたされることが明らかになった。この結果はHoxb8による付属肢形成の分子メカニズムを示した初めての知見である。平成18年度では、武田研究室および工藤研究室で以下のような成果が得られた。武田研究室(1)昨年度クローニングに成功したメダカ左右軸異常変異体knt(ut016)の原因遺伝子の機能解析を行った。Kntは繊毛、鞭毛のダイニンアーム形成に必須な新規タンパク質であることが判明した。(2)肝臓の後期発生に異常を示すメダカ変異体aA7の原因遺伝子を同定することに成功した。aA7は鉄代謝に必須なABCトランスポーターをコードしていた。この変異体の肝臓は、いわゆる脂肪肝の表現型を示している。マイクロアレイによる解析により、aA7ホモ変異体と正常胚(孵化1-2日目)の肝臓で、鉄代謝に関係する多くの遺伝子の発現に差があることが判明した。(3)シミュレーションとゼブラフィッシュを用いた移植実験の相互検証により、分節時計は細胞を単位とする多数の小さな時計がノッチ・デルタを介して同調するという、いわゆるcoupled-oscillatorの性質を持っていることが判明した。また、同調の過程で細胞間の"遺伝子発現のばらつき"が最小化され、からだの中で正確に時が刻まれていることも判明した。工藤研究室心臓、血球、血管、骨、ヒレ形成、ヒレ再生に異常のあるメダカ突然変異体の中で、既に10種類の変異体の原因遺伝子を確定した。(1)ヒレ形成変異体ufiの原因遺伝子はHoxb8であり、魚における初めてのHox familyの変異体であった。(2)心筋形態異常を示す変異体sdcの原因遺伝子はfilamin Cであった。filamin Cは心筋・骨格筋の形成に機能する細胞内蛋白であり、アクチン重合を制御している。(3)椎骨異常の突然変異体の原因遺伝子は、体節形成の必須遺伝子、Notch1であった。また、解析の過程で、メダカにおいても骨リモデリングの存在が明らかになった。(4)血管形成において、器官形成の基盤となるメダカ血管発生のアトラスが完成し、メダカはゼブラフィッシュに比べて、哺乳類に近い血管発生様式を持つことが明らかになった。武田研究室と工藤研究室で得られた成果のうち、代表的なものは以下である。(1)メダカ左右軸異常変異体ktuの原因遺伝子の機能解析を行った。また、フライブルグ大学の研究者と共同で、繊毛病の約100家系をスクリーニングしたところ、2家系においてヒトKTU遺伝子に変異を見いだした。メダカ変異体の解析より、ヒト遺伝病の新規原因遺伝子を見つけることができた。

(2)肝臓の後期発生に異常を示すメダカ変異体aA7の原因遺伝子は鉄代謝に必須なABCトランスポーターであるabcb7をコードしていた。この変異体の肝臓は、いわゆる脂肪肝の表現型を示している。マイクロアレイによる解析により、aA7ホモ変異体と正常胚(孵化1-2日目)の肝臓で、鉄代謝に関係する多くの遺伝子の発現に差があることが判明した。実際abcb7はヒトの貧血性の遺伝病の原因遺伝子として報告がある。(3)メダカ骨発生様式を調べるために、硬節に特異的な発現を示すTwistトランスジェニックメダカ、骨芽細胞特異的な発現を示すオステオカルシントランスジェニックメダカを作成し、細胞の行方をトレースした結果、硬節由来の骨芽前駆細胞は脊索の石灰化を促し、脊索周囲の石灰化を亢進するとともに椎間板領域に収束し、骨芽前駆細胞を供給し続けることにより脊椎骨が成長することが明らかになった。(4)ゼブラフィッシュではメカニカルストレスに関連する筋間中隔の形成と筋繊維の発達に機能しているペリオスチンは、マウスにおいてコラーゲンのクロスリンクを制御することにより、コラーゲン繊維構造形成に寄与することが明らかになった。さらにマウス心筋梗塞モデルマウスでは、梗塞時の心筋再生を促すマトリックス形成に必要な繊維芽細胞の移動に、ペリオスチンはインテグリンを介して機能していることが明らかになった。メダカ変異体について2つの研究室で以下のような成果が得られた。武田研究室:(1)今年度は特に左右軸変異体ktuの解析が進み、その成果を論文発表した(Omran et al.,2008)。ktu変異体は繊毛の運動性が喪失するもので、研究の過程でヒト遺伝病である繊毛病の新しい原因遺伝子が判明した。(2)脂肪肝を発症する変異体nmkは、ABCトランスポーターの一つabcb7が原因遺伝子であった。マクロアレイを用いた発現解析の結果、肝臓で鉄と脂肪代謝関連の遺伝子の発現に異常を見いだした(Miyake et.al., 2008)。一方、体節の分化異常によりからだの外形(体型やヒレの形)が変化するメダカ自然突然変異体Daの解析も進めた。Daの原因領域はすでにZicl, 4遺伝子が存在する領域に絞り込まれていたが、ゲノム支援班の配列決定により、この領域に50Kb以上のDNA断片の挿入が存在することがわかった。DNA断片の挿入によりZic遺伝子の体節特異的エンハンサーの活性が落ちた可能性が高い。工藤研究室:(1)メダカ骨格異常変異体3種類の原因遺伝子はそれぞれwnt family,クロマチンリモデリング因子BRPF1、小胞体因子secDであり、脊索から椎骨形成、頭蓋骨からヒレ軌条形成について分子レベルで明らかになった。BRPF1についてはさらに同じクロマチンリモデリング因子ファミリーであるMozについてそのノックアウトマウスで調べたところ、メダカ変異体と同様の表現型が観察されるとともに、Hox遺伝子ファミリーの転写制御に関与することが明らかになった。以上からBRPF1・FMozの機能は脊椎動物共通であることが明らかになった(Hibiya et al., 2009)。繰越により本年度の実験は武田研究室だけで行われた。以下の2つの実験を実施した。1.ha変異体原因遺伝子の同定と機能解析:原因遺伝子は脂質合成に関与すると思われる新規遺伝子であった。
マイクロ波原子間力顕微鏡の開発及びナノ領域における電気的特性の定量評価

本研究はナノテクノロジー発展の要求に応え、次世代材料・デバイスの開発・評価に不可欠な手段としてナノメートルレベルの微小領域における電気的特性を定量評価するマイクロ波原子間力顕微技術の開発を目的とする。マイクロ波顕微技術と原子間力顕微技術を融合する全く新しいシステムを確立することにより、原子間力顕微鏡の既存機能である表面形状計測と同時に、新たに材料表面の電気的特性分布を検出・画像化できるマイクロ波原子間力顕微技術を実現する。三年より以下の実績を得た。1.マイクロ波導波AFMプローブの設計マイクロ波の伝送特性と、AFMプローブの形状、寸法等各要素を考慮し、電磁波の伝送解析に基づき、マイクロ波を効率よく伝送できる導波線路を設計し、マイクロ波導波AFMプローブの最適な構造を決定した。2.ガリウム砒素AFMカンチレバーの作製マイクロ波導波路の基板として導波損失の少ないガリウム砒素を用い、微細加工プロセスにより、マイクロ波導波プローブの基本になるAFMカンチレバーを作製した。3.マイクロ波導波AFMプローブの完成スパッタリングによりガリウム砒素カンチレバーの上下表面に金属膜を蒸着させ、マイクロストリップライン構造の導波路を形成した。さらに集束イオンビーム加工技術を用いて、カンチレバー探針部の導波路を完成させ、マイクロ波導波AFMプローブを作製した。4.マイクロ波原子間力顕微鏡の構築開発したマイクロ波導波AFMプローブと原子間力顕微鏡及びネットワークアナライザを融合し、世界に先駆けたマイクロ波原子間力顕微鏡を構築した。AFMの既存機能である表面形状計測と同時に、新たに材料表面の電気的特姓分布の検出を実現した。5.電気的特性分布の検出及び定量評価導電率の異なるシリコンウェーハ試験片を用いて、マイクロ波の応答と試験片の導電率との関係から、定量評価モデルを構築し、微小領域における電気的特性の定量評価技術を確立した。本研究では、材料・デバイスの微小領域における電気的特性の定量評価を可能にする独自の発想に基づき、マイクロ波顕微技術と原子間力顕微技術を融合する全く新しいシステムの確立を図る。原子間力顕微鏡(AFM)の既存機能である表面形状計測と同時に、新たに材料表面の電気的特性分布を検出・画像化できるマイクロ波原子間力顕微技術を開発する。本年度は以下の実績を得た。1.マイクロ波導波AFMプローブの設計マイクロ波の伝送特性と、AFMプローブの形状、寸法等各要素を考慮し、電磁波の伝送解析に基づき、マイクロ波を効率よく伝送できる導波線路を設計した。さらに導波線路の材質、形状、寸法、使用周波数等に基づき、マイクロ波の伝送・検出ができるマイクロ波導波AFMプローブの最適な構造を決定した。2.ガリウム砒素AFMカンチレバーの作製マイクロ波導波路の基板として導波損失の少ないガリウム砒素を用い、微細加工プロセスにより、マイクロ波導波プローブの基本になるAFMのカンチレバーを作製した。さらに集束イオンビーム加工技術を用いて、カンチレバー探針部の導波路を完成させ、マイクロ波の伝送ができるAFMのカンチレバー、すなわちマイクロ波導波AFMプローブを作製した。4.マイクロ波導波AFMプローブの評価

原子間力顕微鏡を用いて、開発したマイクロ波AFMプローブの表面形状計測機能を調査し、プローブのバネ定数や検出分解能等について評価した。本研究はナノテクノロジー発展の要求に応え、次世代材料・デバイスの開発・評価に不可欠な手段としてナノメートルレベルの微小領域における電気的特性を定量評価するマイクロ波原子間力顕微技術の開発を目的とする。本研究では、材料・デバイスの微小領域における電気的特性の定量評価を可能にする独自の発想に基づき、マイクロ波顕微技術と原子間力顕微技術を融合する全く新しいシステムの確立を図る。原子間力顕微鏡(AFM)の既存機能である表面形状計測と同時に、新たに材料表面の電気的特性分布を検出・画像化できるマイクロ波原子間力顕微技術を開発する。本年度は、(II)マイクロ波原子間力顕微鏡の開発、なる研究を推進し、以下の実績を得た。1.マイクロ波原子間力顕微鏡の構築開発したマイクロ波導波AFMプローブと原子間力顕微鏡及びネットワークアナライザを融合し、世界に先駆けたマイクロ波原子間力顕微鏡を構築した。AFMの既存機能である表面形状計測と同時に、新たに材料表面の電気的特性分布の検出を実現した。2.マイクロ波導波AFMプローブの最適化開発したマイクロ波原子間力顕微鏡を用いて、マイクロ波の伝送、検出に関する各種検証実験を実施した。実験結果と理論を比較し、マイクロ波導波AFMプローブの形状、寸法等を改良し、マイクロ波導波AFMプローブの探針近傍の試料における近接場マイクロ波の振幅及び位相の変化の検出感度を向上させ、マイクロ波導波AFMプローブの最適化を行った。3.マイクロ波原子間力顕微鏡の最適化将来の実用化に向けて、マイクロ波の使用周波数の範囲を決定し、マイクロ波コンポネントを用いて、コンパクトな専用マイクロ波測定装置を構築した。原子間力顕微鏡の既存機能である表面形状計測と同時に、新たに材料表面の電気的特性分布を検出・画像化できるマイクロ波原子間力顕微技術を開発する。本年度は以下の実績を得た。1.プローブの接続部の最適化ナノ領域における電気的特性の定量評価の実現は、マイクロ波導波AFMプローブの探針近傍の近接場マイクロ波の高感度検出が必要不可欠である。この目的を達成するため、マイクロ波測定装置とマイクロ波導波AFMプローブの接続部の最適化を行い、理論及び実験解析により、接続部の最適な形状及び寸法を決定した。2.電気的特性分布の検出及び定量評価シリコンウェーハ試験片を用いて、材料の微小領域における電気的特性分布の高感度検出を実施した。導電率の異なるシリコンウェーハ試験片を用いて、マイクロ波の応答と試験片の導電率との関係から、定量評価モデルを構築し、微小領域における電気的特性の定量評価技術を確立した。
固体－流体混合系における物質輸送及び構造形成に潜む普遍的機構の解明

粒子の空気輸送メカニズムを解明するため,これまでに平均風速場の計算と個々の粒子計算を組み合わせた理論モデルを構築した.本年度は,既存成果の主要因特定のため詳細な物理量の解析1と2に加え,理論モデルの3次元乱流場への拡張3について,以下の通り実施した.11964年に提唱されたOwenの仮説を検証するため,粒子が飛散し始める臨界近傍における流体・粒子剪断応力の風速依存性について調べた.粒子輸送下で発生する粒子応力は,下降・上昇粒子の総運動量の差から算出される.その結果,流体と粒子応力の和は全ての風速条件で空間一様であったため,風速に対する粒子応力の変化が地表面応力特性の要因と特定された.さらに,粒子応力の風速依存性は,跳躍粒子の粒度分布変化によって説明されることを明らかにした.2跳躍粒子と地表面の衝突であるスプラッシュ過程を,既存の単一スプラッシュ実験に基づき再構築し,飛散粒径に応じた輸送形態の変化について調べた.その結果,粒子の運動形態は,粒径100 μmを境に跳躍から浮遊へ遷移し,既存の観測や実験結果と対応することを示した.さらに,スプラッシュ過程の再構築に伴う粒子運動の改善は,衝突速度に非依存した鉛直方向の反発係数によって生じたことを明らかにした.3風速場の空間不均一性による輸送の非定常ダイナミクスを理解するため,Large-Eddy Simulationによる乱流計算手法とスプラッシュ関数を用いた粒子計算手法を連成させた新たな粒子の乱流輸送モデルを開発した.そして,一定速度の壁面駆動による風速場の下,粒径100 μmの場合に生じる粒子の乱流輸送構造を調べた.その結果,主風向に沿った筋状の空間構造が,局所的に取り込まれた粒子によって形成された.さらに,この構造は時間的に輸送の発生と停止を繰り返す間欠性を示すことを明らかにした.28年度が最終年度であるため、記入しない。28年度が最終年度であるため、記入しない。本年度は、地形のパターン形成やダイナミクスに潜むメカニズムを議論する上で、最も基本的な要因である粒子輸送について調べた。特に、吹雪や砂嵐といった風生作用による堆積物輸送が示す時空間ダイナミクスを理解するため、流体近似計算手法と粉体計算手法を組み合わせた理論模型を構築し、以下の通り実施した。1風による粒子輸送吹雪や砂嵐などは、流体-粒子間の複雑な相互作用により発生及び発達する。そこで、吹雪のランダムフライトモデルを参考に、粒子運動の発生源である地表面近傍の輸送特性について調べた。その結果、粒子輸送は時間経過に応じて、発達段階・緩和過程・定常状態の3状態を示した。まず、浮遊粒子数は粒子と地表面との衝突によって急激に増加する。その後、空気抵抗を介した流体-粒子間の運動量交換により、風速の弱化と輸送量の減少が生じた。最終的に、粒子輸送の定常状態が実現された。そして、鉛直分布に関して、明瞭な転移高度が乱流揺らぎの指標である摩擦速度に確認され、粒子の平均高度で特徴付けられる事を示した。2粒子-粒子層間の衝突過程(共同研究として参加)粒子輸送下における粒子-粒子層間の衝突を直接測定することは、多数の粒子が同時に運動しているため非常に困難である。そこで、離散要素法を用いて衝突過程の統計的性質について調べた。特に、定常的な粒子輸送が形成された場合で、個々の衝突過程が独立であるか検証した。その結果、粒子層から放出する粒子の角度・速さ分布は、既存の実験結果と定性的に対応した(ただし、角度の浅い領域を除く)。つまり、定常的な粒子輸送は1粒子衝突の重ね合わせで再現できる事を明らかにした。吹雪や砂嵐に代表される粒子の空気輸送メカニズムを解明するため、これまでに流体計算と粉体計算を組み合わせた理論模型を構築した。本年度は、構築した理論モデルと先行研究の比較及びモデルの改良について、以下の通り実施した。1粒子輸送の発生と停止において、地表面摩擦速度は二種類の異なる臨界閾値(流体・衝突臨界)を示す。粒子輸送のヒステリシスは、これらの値の差により発生する。そこで、本モデルが風速変化に伴うヒステリシスを再現するか調べた。その結果、上空の摩擦速度が流体臨界(0.24m/s)より低い場合においても、粒子輸送は停止することなく維持された。さらに、衝突臨界(0.2075m/s)が粒子輸送速度から推定された。21964年に提唱されたOwenの仮説「平衡状態の地表面摩擦速度は衝突臨界と一致する」が、近年の数値計算や風洞実験によって検証されている。しかし、その性質は先行研究間で矛盾しており、未だ統一的な見解に至っていない。そこで、数値模型の立場から地表面摩擦速度の性質を調べ、各先行研究と比較した。本モデルによる地表面摩擦速度は、弱風領域で衝突臨界と一致し、中風領域で風速増加に伴い減少し、強風領域で増加に転じる。これら結果は、風速領域の順にOwen仮説、既存の数値モデル、風洞実験と対応する。3スプラッシュ過程は、粒子の取り込みや跳躍粒子の挙動を特徴付ける上で重要である。しかし、実験でスプラッシュ過程を捉えることは困難であり、本モデルは弱風で得られた実験結果を採用している。強風領域における粒子挙動を記述するため、単一スプラッシュ実験に基づきモデルを改良した。その結果、粒子の運動は、粒径に応じて次の変化を示した。

浮遊と跳躍の運動形態は30-60μmを境に切り替わり、跳躍による粒子高度は粗粒になるほど上昇する。本年度は、粒子の空気輸送のメカニズム解明に向け構築された理論モデルを用いて、理論や実験などの先行研究との緻密な比較検討を重ねた。そして、理論モデルの問題点を浮き彫りにしつつ、種々の改良が理論・実験的アプローチに基づき施された。先行研究との比較結果として、地表面摩擦速度に関する先行研究間の矛盾は風速領域の違いによって生じたと示唆する、新しい展開を提示した。また、スプラッシュ過程の改良についても、粒径効果を反映した粒子-地表面の衝突過程が導入された。そして、跳躍・浮遊粒子が高い位置まで舞い上がらないという、本モデルの問題点を克服した。今後、更なる厳密な検討が必要とされるが、既存研究との定量的な対応や粒子の空気輸送モデルの確立へ向けて、想定以上の結果が得られたと判断する。粒子の空気輸送メカニズムを解明するため,これまでに平均風速場の計算と個々の粒子計算を組み合わせた理論モデルを構築した.本年度は,既存成果の主要因特定のため詳細な物理量の解析1と2に加え,理論モデルの3次元乱流場への拡張3について,以下の通り実施した.11964年に提唱されたOwenの仮説を検証するため,粒子が飛散し始める臨界近傍における流体・粒子剪断応力の風速依存性について調べた.粒子輸送下で発生する粒子応力は,下降・上昇粒子の総運動量の差から算出される.その結果,流体と粒子応力の和は全ての風速条件で空間一様であったため,風速に対する粒子応力の変化が地表面応力特性の要因と特定された.さらに,粒子応力の風速依存性は,跳躍粒子の粒度分布変化によって説明されることを明らかにした.2跳躍粒子と地表面の衝突であるスプラッシュ過程を,既存の単一スプラッシュ実験に基づき再構築し,飛散粒径に応じた輸送形態の変化について調べた.その結果,粒子の運動形態は,粒径100 μmを境に跳躍から浮遊へ遷移し,既存の観測や実験結果と対応することを示した.さらに,スプラッシュ過程の再構築に伴う粒子運動の改善は,衝突速度に非依存した鉛直方向の反発係数によって生じたことを明らかにした.3風速場の空間不均一性による輸送の非定常ダイナミクスを理解するため,Large-Eddy Simulationによる乱流計算手法とスプラッシュ関数を用いた粒子計算手法を連成させた新たな粒子の乱流輸送モデルを開発した.そして,一定速度の壁面駆動による風速場の下,粒径100 μmの場合に生じる粒子の乱流輸送構造を調べた.その結果,主風向に沿った筋状の空間構造が,局所的に取り込まれた粒子によって形成された.さらに,この構造は時間的に輸送の発生と停止を繰り返す間欠性を示すことを明らかにした.本年度は、地形のパターン形成やダイナミクスに関して、最も基本的な要因と考えられる粒子輸送の計算手法を確立することが必須である。これまでに、先行研究として考案された流体・粒子計算手法に基づき、自由度の高い(設定条件などの変化が容易)モデルの構築を行った。加えて、モデルに内在する物理的特性が示されただけでなく、得られた結果が未だ風洞実験などと定量的に異なる事を明らかにした。以上の観点から、研究の基盤となる手法の構築により、研究目的の達成度は順調であると判断する。地表面摩擦速度の風速依存性について、本モデルの結果は先行研究と定量的に対応した。
マウスTL抗原を標的とした免疫療法モデルの開発

(1)組み換え技術を用いて、TL抗原特異的エフェクターT細胞株を樹立すべく、TL特異的細胞傷害性T細胞(CTL)クローンからT細胞レセプター(TCR)遺伝子を、また抗TL抗体産生ハイブリドーマから抗体遺伝子の単離を行った。単離したTCRおよび抗体遺伝子が単鎖構造を取るような組み換え遺伝子を構築し、さらにシグナル伝達分子であるCD3ζ遺伝子の細胞内ドメインとタンデムに結合させたキメラ遺伝子を作成した。このうち、抗体キメラ分子については、活性化T細胞表面に発現できることを確認した。(2)C3HとB6マウスに化学発がん剤NBUを経口投与すると、C3HにおけるTL陽性腫瘍の発症時期がB6に比べて遅延した(統計学的には有為差は無い)。また、C3Hが同系のTL遺伝子導入マウス由来のTL陽性皮膚を拒絶するのに対し、B6では拒絶が見られなかった。In vivo抗TL活性の異なるC3HとB6を解析し、H-2K^b分子の発現により、TL特異的CTLの不活化が起こることを示唆した。また、TLテトラマー陽性細胞率および血清中の抗TL抗体活性はB6よりC3Hにおいて高く、in vivoの抗TL活性との相関が見られたが、(B6×C3H)F_1マウスをrecipientとして用いた各個体レベルでの検索では、これらin vitroの成績とin vivo抗TL活性とには明らかな一致が見られなかった。(1)マウスTL抗原陽性皮膚または樹状細胞を用いた免疫により、TL抗原陽性腫瘍に対する抗腫瘍活性の誘導が可能であることを示したが、同時に自己に対する反応性を惹起する危険性も示唆した。本結果により、免疫療法の際、抗原特異的および非特異的反応のモニターの必要性が示唆された。(2)TL抗原特異的細胞傷害性T細胞(CTL)エピトープはTAP非依存性であり、遺伝子導入により昆虫細胞に発現させたTL分子にも存在していることを示した。次いでTL抗原特異的CTL前駆細胞数を測定するために、昆虫細胞で作成したTL分子を用い、テトラマーを作成した。また、TLテトラマーを用い、TL特異的CTL集団をin vitroで濃縮可能であることを示した。(3)マウスNKT細胞が腫瘍細胞を傷害する時に、その認識に関わるレセプター分子の同定を試みた。サブトラクション法を用いることにより、NKT細胞特異的であるcDNA断片として、ESTマッチ38個、新規遺伝子16個を検出した。(4)ヒト末梢血中のNKT細胞を抗TCRV β11抗体、抗TCRV α24と磁気ビーズを用いて精製後、IL-2とαGalCerを用いて増殖させることにより、高い腫瘍細胞傷害活性を誘導できることを見出した。さらに、末梢血単核球より樹状細胞を培養し、NKT細胞を活性化できる条件も決定した。(1)昆虫細胞に遺伝子導入し、発現させたTL分子を用いてテトラマーを調製した。本TLテトラマーはTL抗原特異的細胞傷害性T細胞(CTL)をT細胞レセプター(TCR)/CD3依存性に染色し、本CTL群をin vitroで濃縮可能であることを示した。(2)本テトラマーを用いて各種正常組織由来のTリンパ球を染色した所、脾臓や末梢リンパ節由来のCD8陽性リンパ球はほとんど染色されなかったが、予想に反してCD8陽性の腸上皮間リンパ球(iIEL)と胸腺細胞が染色された。この染色はCD8分子依存性で、TCR/CD3非依存性であり、その反応機序として、(i)CD8との直接反応、または(ii)CD8とTLリガンド分子の共役反応の2つの可能性が示唆された。(3)TL抗原特異的CTL前駆細胞数をより正確に測定するために、CD8非結合性テトラマーの作成を試みた。CD8結合部位に変異を入れたTL分子(T3^b-A245V)を用い、テトラマーを作成し、その結果iIELや胸腺細胞とは反応しないTLテトラマーを得た。(1)大腸菌由来のリコンビナント蛋白であるT3^b-TLとβ_2Mを用いて、抗原物質を添加せずにTLテトラマーを作成した。本テトラマーがTL抗原特異的CTLと反応性を示すことより、これらCTLはTL分子と抗原物質により形成されるエピトープではなく、Framework自身を認識していることが示された。(2)バキュロウイルス発現系で産成した蛋白を用い調整したTLテトラマーを用い、各種正常組織由来のTリンパ球を染色すると、脾臓や末梢リンパ節由来のCD8陽性リンパ球は染色されなかったが、CD8陽性の腸上皮間リンパ球(iIEL)と胸腺細胞はCD8分子依存性に(しかしTCR/CD3非依存性に)染色された。その反応機序として、(i)iIELに発現するCD8ααホモ二量体はαβ型に比し、TL分子との結合性が強いこと、また、(ii)胸腺細胞に発現するCD8分子の糖鎖の付加状態が他のCD8分子と異なり、TL分子との結合性が強いこと、によると推定される。これらの影響を除外し、TL抗原特異的CTL前駆細胞数をより正確に測定するため、CD8に対する結合性を弱めたテトラマーの作成を試みた。CD8結合部位に変異を入れたTL分子(T3^b-A245V)を用い、テトラマーを作成したところ、CTLとは反応性を示し、一方iIELとは反応しなかった。

しかし、胸腺細胞との反応性は残存していた。(1)TL抗原特異的エフェクターT細胞を樹立すべく、3株のTL特異的細胞傷害性T細胞(CTL)からT細胞レセプター(TCR)遺伝子の単離を行い、また3株の抗TL抗体産生ハイブリドーマから抗体遺伝子の単離を行った。単離したTCRおよび抗体遺伝子が単鎖構造を取るような組み換え遺伝子を構築し、さらにシグナル伝達分子であるCD3 ζ遺伝子の細胞内ドメインとタンデムに結合させたキメラ遺伝子を作成した。これらキメラ遺伝子の発現は既に確認している。(2)H-2K^b promoterで全身にTL抗原を発現させた遺伝子導入マウス(C3H background)およびそのB6 congenic遺伝子導入マウス(両マウス系ともTL特異的なリンパ球は存在しないと予想される)に化学発がん剤であるN-buthyl-N-nitrosourea (NBU)を経口投与すると、リンパ腫の発症時期がbackgroundマウス系と比べ有為に早まった。本実験結果より、マウス生体内でTL特異的な免疫監視機構が働いている可能性が示唆された。(3)B細胞がCTLの誘導能において優れた抗原提示細胞であることを、マウス(in vivo)およびヒト(in vitro)の両系で示した。(1)組み換え技術を用いて、TL抗原特異的エフェクターT細胞株を樹立すべく、TL特異的細胞傷害性T細胞(CTL)クローンからT細胞レセプター(TCR)遺伝子を、また抗TL抗体産生ハイブリドーマから抗体遺伝子の単離を行った。単離したTCRおよび抗体遺伝子が単鎖構造を取るような組み換え遺伝子を構築し、さらにシグナル伝達分子であるCD3ζ遺伝子の細胞内ドメインとタンデムに結合させたキメラ遺伝子を作成した。このうち、抗体キメラ分子については、活性化T細胞表面に発現できることを確認した。(2)C3HとB6マウスに化学発がん剤NBUを経口投与すると、C3HにおけるTL陽性腫瘍の発症時期がB6に比べて遅延した(統計学的には有為差は無い)。また、C3Hが同系のTL遺伝子導入マウス由来のTL陽性皮膚を拒絶するのに対し、B6では拒絶が見られなかった。In vivo抗TL活性の異なるC3HとB6を解析し、H-2K^b分子の発現により、TL特異的CTLの不活化が起こることを示唆した。また、TLテトラマー陽性細胞率および血清中の抗TL抗体活性はB6よりC3Hにおいて高く、in vivoの抗TL活性との相関が見られたが、(B6×C3H)F_1マウスをrecipientとして用いた各個体レベルでの検索では、これらin vitroの成績とin vivo抗TL活性とには明らかな一致が見られなかった。
ヒトTNF遺伝子を導入したヒト線維芽細胞の抗腫瘍効果

コバルト60ガンマー線照射で不死化した脱瘍性をもたないヒト線維芽細胞にTNF-αを導入し,TNF-αを産生する細胞のクローンを取得した.この細胞を培養した培地(Conditioned medium:CM)を,ヒト由来の肺癌(A549),卵巣癌(PA-1),肝癌(HLE,HLF,JHH-7),試験管内で癌化したヒト線維芽細胞(KMST-6/RAS)の培養培地に終濃度10%添加すると,これらの細胞の増殖を45-92%抑制した.この細胞増殖抑制作用はCMの濃度依存性であった.また,この細胞増殖抑制作用は細胞の産生ずるTNF-αであることを,抗TNF-α抗体で証明した.一方,ヒト由来の正常線維芽細胞(KMS-6),子宮癌(HeLa),肝癌(PLC/PLF/5,JI-II-I-l,HuH-6,HepG2)などの細胞の増殖は抑制しなかった.したがって,TNF-α産生細胞は約50%のヒト腫瘍の増殖を抑えることが分かった.このTNF-α産生細胞を,臨床的に応用できるかどうかを検討するために,この細胞をスフエロイド培養し,そのスフエロイドをアガロース,カルボキシメチール-レルローズでカプセル化した.このカプセル化TNF細胞は培地に1カ月間にわたってTNFを産生した.我々はより強いヒトTNF-α発現ベクターを得るために、強力なプロモーター活性を持つSRαプロモーターの下流にヒトTNF-α遺伝子をつないだ発現ベクターpCDL81/TNFを作成した。pCDL81/TNFをヒト線維芽細胞株(KMST-6)に導入し、ヒトTNF-α発現細胞(KMST-6/TNF)を樹立した。この細胞の培養上清はin vitroで形質転換したKMST-6/RASやKMST-6T細胞、肝癌、奇形腫、肺癌などのヒト癌由来の細胞株の増殖を抑制したが正常線維芽細胞の増殖は抑制しなかった。また、得られた培養上清には10-60JRU/mlのTNF-αを含み、その増殖抑制活性はTNF-αの中和抗体で中和される。KMST-6/TNFの培養上清のKMST-6/RASに対する細胞増殖抑制活性は抗酸化剤Butylated hydroxyanisoleによって阻害されたので活性酸素が関与していると考えられる。また、1%の酸素濃度の培養条件でも増殖抑制効果が十分維持されていた。これらの結果から、TNF-α産生ヒト線維芽細胞の培養上清はin vitroで癌細胞に対し強い増殖抑制効果を示し、一方正常細胞の増殖に影響を与えず生理的な酸素濃度でも十分効果を示すことが明らかになった。今後、我々が考案している線維芽細胞にTNF-α遺伝子を導入し、この線維芽細胞の由来した元の個体に戻し移植する癌治療プロトコールの有効性が期待できるので、ヌードマウスなどを用いたin vivoの実験を進める予定である。コバルト60ガンマー線照射で不死化した脱瘍性をもたないヒト線維芽細胞にTNF-αを導入し,TNF-αを産生する細胞のクローンを取得した.この細胞を培養した培地(Conditioned medium:CM)を,ヒト由来の肺癌(A549),卵巣癌(PA-1),肝癌(HLE,HLF,JHH-7),試験管内で癌化したヒト線維芽細胞(KMST-6/RAS)の培養培地に終濃度10%添加すると,これらの細胞の増殖を45-92%抑制した.この細胞増殖抑制作用はCMの濃度依存性であった.また,この細胞増殖抑制作用は細胞の産生ずるTNF-αであることを,抗TNF-α抗体で証明した.一方,ヒト由来の正常線維芽細胞(KMS-6),子宮癌(HeLa),肝癌(PLC/PLF/5,JI-II-I-l,HuH-6,HepG2)などの細胞の増殖は抑制しなかった.したがって,TNF-α産生細胞は約50%のヒト腫瘍の増殖を抑えることが分かった.このTNF-α産生細胞を,臨床的に応用できるかどうかを検討するために,この細胞をスフエロイド培養し,そのスフエロイドをアガロース,カルボキシメチール-レルローズでカプセル化した.このカプセル化TNF細胞は培地に1カ月間にわたってTNFを産生した.
葉のガス交換の直接計測によるイネ光合成QTLの同定手法の開発

葉の光合成能力に関わる遺伝要因の解明は作物生産性の向上のために重要であるが、従来のQTL解析手法とガス交換測定手法には網羅性と迅速性に欠点があり、研究の進展を妨げる要因となっていた。そこで本研究では、QTL検出の新手法である網羅性と迅速性の高いゲノムワイド関連解析と、申請者らが最近開発した新型迅速光合成測定装置を組み合わせることによって、イネ光合成能力の自然変異に関わる原因遺伝子の同定を目指す。本研究成果によって、光合成の自然変異遺伝子の解明が大きく進むと期待される。
配偶子間の接着における糖鎖の役割

オビダクチンの精子に対する結合能は蛍光染色法により確認された。精子をビオチン化したオビダクチンおよびFITCアビジンを用いて反応させたところacrosome capに特異的蛍光が観察されたが、先体反応を起こした精子とは反応しなかったため、オビダクチン結合性分子は精子の先体上に存在すると推定された。Scatchard analysisにより精子とオビダクチンの結合定数は、精子数10^7個の時2.26nMであり総結合分子数は34.2fmoleであった。一方、卵透明帯とオビダクチンの結合では、Scachard plotでは直線性を与えずHill plotで直線性であったため透明帯との結合にはallostericな影響があると推察された。透明帯をendo- -galactosidaseで処理するとオビダクチンとの結合性が消失した。酵素処理前および後の透明帯の形態を走査電顕で調べたところ、大きな形態上の変化は観察されなかったので、透明帯上の糖鎖がオビダクチンとの結合に関与していると推定された。単糖のオビダクチンとの結合に対する影響を調べたところ、200mMグルコース、ガラクトース、N-アセチルグルコサミン、および100mMシアル酸では結合への影響は見られなかったが、200mMのN-アセチルガラクトサミンでは結合が約250%へと増加した。この結合増加の機序はまだ不明であるが、オビダクチンと透明帯の反応に糖鎖が関与することを示唆していると考えられた。
HDAC阻害剤による癌細胞での老化誘導と癌抑制遺伝子の再発現

Sodium Butyrate(NaB)は食物繊維の腸内消化過程で産生され、ヒストン脱アセチル化(HDAC)阻害作用を有する。我々は様々な癌細胞においてNaBが誘導するGO/G1期停止と細胞老化誘導は異なる分子機構により制御されることを明らかにした。NaBが誘導するGO/G1期停止はpRb依存性に制御されていた。一方pRb蛋白が不活化されているHPV陽性子宮頚癌をNaBで処理するとGO/G1期停止と共にG2/M期への細胞の集積を認めた。さらに細胞老化も顕著に誘導されていた。このため本研究ではマイクロアレイ法を用い(A)NaBにより発現変化する遺伝子群の同定、(B)p21依存性に細胞老化誘導に機能する分子の同定を行った。NaB処理により、子宮体癌及び卵巣癌細胞における細胞周期関連蛋白(サイクリンA、サイクリンB1、cdc2など)の発現は抑制された。一方、細胞外マトリックス及びそのリセプターはNaBに反応し、顕著に発現を亢進した。特にファイブロネクチン1、PAI-1、MMP-1、MMP-2、MMP3及びMMP10の発現は顕著に誘導された。NaBによる遺伝子発現変化プロファイルをp21強制発現型(Chang et a1 2000)と比較すると、発現抑制あるいは亢進する遺伝子群は概ね共通であった。細胞外マトリックス及びそのリセプター発現はヒト老化に関連する様々な病態で亢進するため、pRb非依存性p21-細胞外マトリックス伝達路の存在が示唆された。今後、本シグナル伝達の同定及び分子機構について解析する予定である。
相同的組み換え蛋白質を用いた新しい核内ゲノムマッピング法の開発

従来、ゲノムDNA上の特定配列を細胞内で標識するためには、激しい処理で二本鎖DNAを解離させる必要があり、細胞構造のダメージが大きかった。本研究では相同的組換え蛋白質を用いて、蛍光標識したDNA配列を温和な条件でゲノムDNA上にターゲットさせることを試みた。組換え蛋白質である大腸菌RecA蛋白質・真核生物XRad51蛋白質と固定した培養細胞を用い、特定のゲノムDNA配列のターゲッティングをおこなったが、非特異的な結合が多く、ゲノムDNA上の特定配列を細胞内で効率的に標識することはできなかった。一方、これに代わる手段として、特定のDNA配列を認識できる蛍光ポリアミド化合物を合成し、固定した細胞のゲノム上のテロメア配列の効率的な標識に成功した。核内におけるゲノムDNAの配置が遺伝子め転写に関わることが示唆されており、近年、核内でゲノムを3次元的にマッピングする技法の需要が高まってきている。核内でのゲノムのマッピングする技術は現在のところfluorescence in situ hybridization (FISH)によるところが大きいが、FISHでは核に対して塩酸処理、プロテアーゼ処理などの多くのプロセスを要することから正確な核内の立体構造を保持できているかということが懸念される。そこで、なるべく生細胞に近い条件で核内のゲノムをマッピングする手法を開発することが本研究の目的である。申請者は大腸菌の相同的組み換え蛋白質、RecAが一本鎖DNAにフィラメント状に結合し相同DNAと正確に結合する性質を有していることを利用し、検出したいゲノム配列のプローブを蛍光色素Cy3でラベルし、組み換え蛋白質との複合体を形成させることにより核内ゲノムのマッピングできるかどうかを検討した。プローブにはFISHで一般的に用いられているテロメアリピート配列を用いた。ヒト子宮頸部癌細胞(HeLa細胞)をカバーガラス上で培養し、1%ホルムアルデヒド固定、0.5% Triton X-100による透過処理の後、作製したRecA-プローブ複合体存在下で37°Cで10分間インキュベートすることによりプローブのテロメアへのハイブリダイゼーションを試みた。しかしながら、この手法では核内で数個の明るい輝点が検出されたもののバックグラウンドが高くテロメアシグナルの認識が困難であった。現在、相同性組み換え蛋白質を大腸菌由来のRecAからアフリカツメガエル由来のRad51に変更することでプローブのゲノムDANへのターゲッティング効率を向上させることでテロメアシグナルの検出を改善できるかどうかを検証している段階である。核内におけるゲノムDNAの配置が遺伝子の転写に関わることが示唆されており、近年、核内でゲノムを3次元的にマッピングする技法の需要が高まってきている。核内でのゲノムのマッピングする技術は現在のところfluorescence in situ hybridization(FISH)によるところが大きいが、FISHでは核に対して塩酸処理、プロテアーゼ処理などの多くのプロセスを要することから正確な核内の立体構造を保持できているかということが懸念される。当該年度では、相同的組み換え蛋白質を用いて、50塩基程度のプローブで核内マッピング可能なシステムの開発をおこなった。昨年度の研究で、申請者は大腸菌の相同的組み換え蛋白質RecAを用いていたが、RecAを用いたゲノムマッピングではバックグラウンドのシグナルが高くなるという問題が生じた。そのため、当該年度では、アフリカツメガエルのホモログ蛋白質Rad51を用いることでプローブのターゲッティングを向上させることを試みた。用いるDNAプローブも、テロメアリピート配列に加えてαサテライト配列を蛍光色素Cy3でラベルし、組み換え蛋白質との複合体を形成させることにより核内ゲノムをマッピングできるかどうかを検討した。その結果、Rad51にHisタグを付加したもの、およびタグを付加していないものについて大量発現系を構築し、Rad51の精製蛋白質を得ることに成功した。しかしながら、相同的組み換え蛋白質をRecAからRad51に変更してマッピングを行った場合にも、非特異的なプローブの結合が依然高い頻度で発生するため、ターゲットとする領域を明確に検出することができなかった。そこで、現在、プローブにN-メチルピロール・N-メチルイミダゾールポリアミドを用いることでターゲッティング効率を向上させることの検討を行っているところである。

そこで、なるべく生細胞に近い条件で核内のゲノムをマッピングする手法を開発することが本研究の目的である。23年度までの試みにおいて、相同的組換え蛋白質RecA、Rad51を大量に調製し、マッピングを行った。ターゲットはテロメア領域、セントロメア領域を用いた。しかしながら、非特異的なプローブの結合が依然高い頻度で発生するため、ターゲットとする領域を明確に検出することができなかった。この問題に対し、当初の方針を変更し、プローブにN-メチルピロール・N-メチルイミダゾールポリアミドを用いることにした。N-メチルピロール・N-メチルイミダゾールポリアミドは、DNA二重らせん構造のマイナーグルーブに塩基配列特異的に結合する人工DNA分子である。これらのポリアミド類はDNAの各塩基対と特異的な水素結合を介して結合するので、ピロール・イミダゾールの配列を変えることにより配列認識能を制御することができると期待できる。実際、京都大学杉山教授と共同で、テロメア配列にターゲットできるポリアミドを合成し、ヒト細胞のテロメア配列にターゲットできることを示した。当該研究を遂行するために必須である相同性組み換え蛋白質、アフリカツメガエルRad51の大量発現系を構築し、精製蛋白質を得ることに成功したため。24年度が最終年度であるため、記入しない。Rad51を用いたゲノムマッピングでは非特異的シグナルが検出されるという問題が生じた。この問題に対し、プローブにN-メチルピロール・N-メチルイミダゾールポリアミドを用いることでターゲッティング効率を向上させることを検討する。これらのポリアミド類はPNAの各塩基対と特異的な水素結合を介して結合するので、ピロール・イミダゾールの配列を換えることにより配列認識能を制御することができると期待できる。