hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
音の特徴による知覚的体制化とその相互作用の神経基盤に関する研究

知覚的体制化とは、時間的または空間的に連続した感覚刺激をある規則に従ってまとまりとして認識する能力のことである。本研究では、音列に知覚的体制化が生じることで音の知覚がどのように変化するかを、脳機能計測の手法を用いて調べた。周波数や音量のパターンによって音列に知覚的体制化が生じることで、音列中の音の欠落の検出がより早くできるようになり、欠落に対する聴覚野とその周辺の反応が大きくなることがわかった。これは体制化によって次の音に対する期待が強く生じるようになったことを示唆している。また、音楽経験者と非経験者では異なる脳部位の反応も見られ、音楽教育の影響も示唆された。平成25年度は、前年度に引き続いて周波数パターンによる音列の知覚的体制化が音列中の音の欠落知覚に与える影響について検討した。また、音楽経験がこの課題にどのような影響を与えるかの検討を加えた。実験では、3種類の高さの音を使って周波数パターンを繰り返す音列とランダムに提示する音列を作成し、それらの音列中にランダムに挿入される無音区間に対する脳活動を脳磁図で測定することで、周波数パターンによる知覚的体制化が音の欠落知覚に対してどのような影響を及ぼすのかを調べた。周波数パターンを繰り返す音列での欠落知覚の方が、ランダムな音列での欠落知覚よりも検出にかかる反応時間が短かった。また、欠落に伴う脳活動は聴覚野周辺を中心として生じ、ランダムな音列よりもパターンを繰り返す音列の方が大きな活動を示した。音楽経験者と非経験者との比較実験では、どちらも欠落に伴う脳活動が聴覚野周辺を中心として見られたが、経験者はより左半球優位な結果が見られた。この一連の実験に関しては複数の国内学会にて発表を行い、また海外雑誌への論文投稿を行った。またこの実験を踏まえて、計画していた特徴による知覚的体制化の交互作用に関する予備実験を行い、実験パラメータの検討を行った。平成24年度は、音の強弱とピッチによる知覚的体制化が聴覚野の活動に与える影響を主な目的とした。音の強弱による体制化の影響を調べた実験では、強弱2種類の音を使ってリズムパターンを繰り返す音列と2音をランダムに並べた音列を作り、ごくまれに音列の中にある無音区間に対する脳活動を脳磁図(MEG)を用いて測定することで、リズムパターンの有無が音の知覚に与える影響を調べた。音楽経験者と非経験者を対象として実験を行ったところ、どちらもランダムな音列での無音区間に対してより大きな脳活動を示した。脳のどこが活動したかを調べる信号源推定の手法を用いたところ、音楽経験者では右半球の下頭頂小葉に活動の発生源が見られた一方、非経験者では左半球の聴覚野に発生源が見られ、音楽経験によって音列におけるパターンの処理が異なる可能性を示唆する結果となった。この研究については10月にアメリカのニューオーリンズで行われたSociety for Neuroscienceにおいてポスター発表を行い、またこの4月に論文がEuropean Journal of Neuroscienceに採択された。ピッチによる体制化の影響を調べる実験では、音の強弱を用いた実験と同様にピッチパターンの繰り返しによる音列とランダムに並べた音列を作成し、予備実験および本実験を行った。結果についての分析を行う段階で当該年度が終了した。これらの実験を踏まえて計画していた3つ目の実験の準備についても、予備実験に進むことができた。本研究の骨子は、ピッチやリズムといった音の基本的な特徴によって音列に知覚的体制化が生じる事で、我々の音知覚の神経メカニズムがどのような影響を受けるのかを明らかにすることであった。本研究期間中には、1)リズムパターンあるいはピッチパターンによる音列の知覚的体制化が生じることで、音の欠落知覚にどのような影響が見られるか、2)音楽経験の有無によって音の欠落知覚における知覚的体制化の影響にどのような違いが見られるか、3)複数の特徴によって知覚的体制化が生じる場合に、音の欠落に対する相互作用が見られるか、に関する研究を脳磁図およびfMRIを用いて実施した。そして、1)音列中の音の欠落を検出する感度が向上すること、2)これらの知覚的体制化によって、音列中の音の欠落に対する聴覚野の反応が増加すること、3)音楽経験の有無によって左半球の聴覚野および右頭頂葉の反応が異なること、などが示され、知覚的体制化への聴覚野の関与が明らかになっただけでなく、音楽経験によって新たな脳部位の関与が加わることも明らかにした。これらの結果は、知覚的体制化によって次に聞こえるであろう音への期待が高まり、その期待と実際に聞こえる音とのマッチングに聴覚野および右頭頂葉などが関わることを示唆している。これらは2報の論文として刊行した。これらの研究は脳磁図を用いて行ったが、より空間解像度の高いfMRIを用いた実験を最終年度に行った。

この実験でもやはり知覚的体制化における聴覚野の関与を示すことができ、現在論文を投稿中である。最終年度は、この実験のほかに複数の学会にて本研究費で得られた成果についてのポスターおよび口頭発表を行った。認知神経科学当該年度においては、前年度の実験に被験者を加え、さらに音楽経験の効果を検討する事ができた。また学会でのポスターおよび口頭発表を行い、論文の投稿まで進む事ができた。fMRI設備の故障およびバージョンアップのためにfMRIを用いた研究を行う事ができなかったものの、これに関しては研究期間の延長を申請し、来年度の計画とした。当該年度においては、予定していた2つの本実験を終えることができた。1つは国際学会での発表および論文が採択される事となり、2つ目の実験についても特に問題なくデータ解析および論文作成へと進む事となった。またもう一つ計画していた予備実験についても取り組むことができ、当初の計画以上に順調に進展することができた。3年目においては、複数の特徴による知覚的体制化の交互作用についての実験を行う予定である。状況によってはfMRIを用いる実験の代わりに、脳磁図に加えて経頭蓋電気刺激(tDCS)など別の装置を用いた実験で検討を行う事も考えている。2年目においては、前年度に行った2つ目の本実験のデータ解析と論文作成をまず行う予定である。これらが終了次第3つ目の実験に進む予定だが、余裕があればこれらの結果を踏まえて新しい実験を行うことも考えている。平成25年度に計画していたMRI実験が、MRI機器の故障および新規導入によりほぼ半年間利用不可能となったので、実験被験者の謝金および機器使用料、また学会発表にかかる旅費などに未使用額が発生した。当初計画の実験を平成26年度に延期することとし、未使用額はその際の被験者謝金や機器使用料、および学会発表にかかる旅費などに充てることとする。2年目の研究費は主に実験の際の被験者への謝金および学会参加費に用いる予定である。また実験遂行に必要なソフトウェアおよびデータ保存メディアなどの購入にも用いる。
自動車エンジン用スクイズフィルムダンパ軸受の研究

1.自動車エンジンのクランク主軸に作用する往復動荷重を想定して、ダンパ軸が直線的に変位する場合のスクイズフィルムダンパ軸受内の油膜圧力、油膜反力を求める式を導き、この式を用いて往復動荷重を受けるスクイズフィルムダンパ軸受の動特性を調べるシミュレーションプログラムを開発した。このシュミレーションプログラムにより、実機の自動車用エンジンにスクイズフィルムダンパ軸受が使用された場合のダンパ軸の変位挙動の予測が可能になった。2.スクイズフィルムダンパ内のダンパ軸に往復動荷重を加えられる実験装置を製作した。この実験装置は、スクイズフィルムダンパ内で発生する油膜反力に大きな影響を与えるダンパ軸とダンパ軸受間のすき間を、ダンパ軸の径を変えることによって設定可能にしてある。この実験装置を用いて実験を行い、往復動荷重に対するダンパ軸変位や軸受内油膜圧力を測定し、シミュレーション計算結果との比較を行った。その結果、シミュレーション計算結果が精度よくダンパ軸の変位挙動を予測できることを証明することができた。3.一般に油の粘性が低くなると無視できなくなる流体の慣性力の影響を調べるため、流体の慣性力の影響を含んだ形でのダンパ軸等の変位応答を求めることができるようシュミレーションプログラムの改良を行った。計算結果から本研究の実験条件の範囲では、流体慣性力の要素のうち変位加速度に比例する項の影響が無視できないことが分かった。この項を考慮することにより更に精度良くダンパ軸などの変位挙動を予測することが可能になった。本年度は、往復動荷重下でのスクイズフィルムダンパ軸受の動特性を調べるために、以下のことを行った。1.ダンパ軸が一方向にのみ変位する場合のスクイズフィルムダンパ軸受内の油膜圧力、油膜反力を求める式を導いた。2.1.で求めた油膜反力の式を用いて、往復動荷重を受けるスクイズフィルムダンパ軸受の動特性を調べるシミュレーションプログラムを開発した。3.スクイズフィルムダンパ軸受のダンパ軸に往復動荷重を加えられる実験装置を用意して実験を行い、往復動荷重に対するダンパ軸変位や油膜圧力などを計測した。4.該シミュレーションプログラムによる計算結果と実験結果との比較考察を行った。その結果、両者は定性的にほぼ一致しており、また、油膜圧力値に関しては定量的にも一致することが分かった。しかし、スクイズフィルムダンパ軸受内油膜厚さ変位量に関しては定量的な一致が見られなかった。この理由としては、用いた実験装置では、ダンパ軸のダンパ軸受に対する相対速度が小さいときに、理論計算で得られる値ほどの油膜反力が得られていないため、理論値よりも油膜厚さの変位量が大きくなってしまうのでないかということが考えられる。本年度は昨年に引き続き、往復動荷重が作用するスクイズフィルムダンパ軸受に関する以下の研究を行った。1.昨年度のシミュレーションプログラムを用い、実機の自動車用エンジンにスクイズフィルムダンパ軸受が使用された場合、ダンパ内で生じるであろうと予想される油膜反力を計算で求めた。また、その結果を利用し、ダンパ軸受内の油膜反力が、実機と同様な挙動を示すような実験が可能になるように実験装置を改良した。2.改良した実験装置を用い、実機で予想される油膜挙動を示す範囲の実験を行った。その際、多チャンネルデータ収集システムを用い、ダンパ軸変位や油膜圧力以外に軸受の変位や軸受に伝達された力などの測定も同時に行った。また、データ数の増加等のためデータ保存装置として大容量のハードディスク装置を使用した。実験により実機で想定される油膜特性を再現し、油膜特性のデータを得ることができた。3.スクイズフィルムダンパ軸受内の油膜反力に関してさらに考察を行い、昨年度のシミュレーションプログラムを流体慣性力の影響を考慮したものに改良し、高性能ワークステイション上で走らせ結果の計算データを収集した。

4.実験結果と改良したシミュレーションプログラムの結果から、実際には理論計算で導かれる油膜反力よりも大きな反力が生じている可能性があることが分かった。また、流体慣性力の影響も無視できないことがわかり、それについてはさらに研究を進める必要があることが分かった。
嚢胞腎発症を決定する繊毛から核へ移行する新規シグナル複合体の解析

一次繊毛は細胞表面から突出する細胞内小器官であるが、近年の解析により1000種以上もの蛋白が局在する事が明らかになってきた。Inv/Nphp2は内臓逆位とともに嚢胞腎を発症するinvマウスの責任遺伝子産物であり、ヒトにおいては、2型若年性ネフロン癆(NPHP2)の原因遺伝子でもある。本研究において、分子レベル、尿細管細胞内・ゼブラフィッシュ生体内において、Nphp2/Invは他の繊毛蛋白であるNphp9/Nek8と分子レベルで他の因子の介在なしに直接結合し、尿細管繊毛基部において正常な尿細管形態維持に協調的役割を担っていることを明らかにした。前年度までの成果をもとに、内臓逆位および嚢胞性腎疾患に関連する遺伝子産物Inv/NPHP2に存在するカルシウム結合部位であるIQドメインがInv/NPHP2蛋白局在制御およびゼブラフィッシュ個体での腎嚢胞形成に関与することを英文論文にまとめた(4月現在、未投稿)。IQドメインはカルモジュリン(CaM)が結合するドメインであり、繊毛/細胞内カルシウム濃度がInv/NPHP2局在を制御している可能性が強く示唆され、多発性嚢胞腎発症に深くかかわるPKD1/2遺伝子産物であるpkd1/2カルシウムイオンチャネル下流シグナル分子としてInv/NPHP2が細胞内へのカルシウムイオン流入後に繊毛各部位に移行し、結合パートナーを変え、繊毛の複雑なシグナル経路に関与している可能性が想定される点で、細胞生物学的に興味深い成果である。特に、PKDとNPHP疾患は尿細管拡張という良く似た表現型を示すが、これら経路の連絡点は明らかにされておらず、細胞内カルシウムイオン濃度の点からそのつながりを示唆した点で、病態学的にも重要な成果と言える。さらに、この成果をさらに発展させるために、繊毛センサーとして機能している内耳の球形嚢・卵形嚢に着目し、マウスからこの組織を顕微鏡下解剖で取得する系の構築を行った。文献検索から脱灰後の切片化・マイクロダイセクションが有効であると思われたが、実解剖の結果、顕微鏡下で直接上皮組織を取り出す方法を選択することとした。採取量はごく微量であるが、DNA解析等には用いることができると期待される。今後、この技術をさらに発展させ、繊毛内でのセンサー分子としてInvと相互作用する因子の同定につなげることが期待される。Invと相互作用する蛋白を抗体ライブラリーを用いスクリーニングを行ったところ、繊毛蛋白であるNek8 (セリン/スレオニンキナーゼ:基質未同定)がInv/Nphp2と結合することを見出した。Nek8の個体レベルでの機能を調べるために、Nek8の発現をアンチセンスオリゴのゼブラフィッシュ胚への注入により抑制したところ、嚢胞腎と内臓逆位が観察された。さらにInv/Nphp2とNek8のアンチセンスオリゴを同時添加すると、嚢胞腎の発症頻度・重篤度は相乗効果的に著しく増加した。これらの実験成果から、Inv/Nphp2とNek8が複合体として細胞内で機能し、腎嚢胞化に関与している可能性が想定された。臨床的に重要な点は、今回標的としたInvやNek8はヒトの小児嚢胞性腎疾患(若年性ネフロン癆:NPHP)の責任遺伝子であり(それぞれNPHP2, NPHP9)、これら分子の機能を明らかになったことにより、嚢胞腎という頻度の高い遺伝性疾患発症メカニズムの全貌解明に足がかりができた。細胞周期と繊毛形成の関係を解析する過程で、Inv/Nphp2がS期に一次繊毛から「核」へ局在変化することを発見した。S期は細胞分裂に先立ち繊毛が消失し始める時期であり、この時期に繊毛から核へ局在変化する蛋白は報告されていないため、この結果は繊毛から核へのシグナル伝達経路解明に大きな手がかりとなる。この局在変化が、importinによること、また、Inv/Nphp2内に新規の3つの核移行ドメインを見だした。この解析中にさまざまなInv/Nphp2の領域欠失蛋白の局在解析から、カルモジュリン(CaM)結合がInv/Nphp2の繊毛局在を制御していることも見出した。CaM結合が失われると、Invは基底小体(繊毛の根元)に集積、もしくは細胞質へ拡散するという別の発見につながった。繊毛タンパクの繊毛移行シグナルの解析はまだほとんど行われていないため、この成果はインパクトの高いものとなると思われる。2つの方向で研究を進める。1)Invに存在するIQドメインがInv蛋白局在制御およびゼブラフィッシュ個体での腎嚢胞形成に関与することを発見したが、より定量的にデータを取得する。IQドメインはカルモジュリン(CaM)が結合するドメインであり、繊毛/細胞内Ca2+濃度がInv局在を制御している可能性がある。

すなわち、Pkd1/2チャネル下流シグナル分子としてInvが機能し、Ca2+応答後に繊毛各部位に移行し、結合パートナーを変え、繊毛の複雑なシグナル経路に関与している可能性が想定される。しかしながら、この成果をさらに発展させるのは現状況では技術的に困難である。そこでさまざまな文献を参考にするとともに、IQドメインがInv蛋白局在制御およびゼブラフィッシュ個体での腎嚢胞形成に関与することまでを成果として論文にし発表する。2)一次繊毛が外界刺激感受のセンサーとして機能していることから、水流刺激(嚢胞腎の場合)以外の機械刺激入力系に対する応答メカニズム解析系構築にも取り組む。本年度より所属が変わり、新たに活用できる重力刺激付加装置(遠心機)がある。そこでこの刺激応答において、内耳(蝸牛や半規管)など他の繊毛細胞で、機械刺激で繊毛部から核へ移行する因子がないか検索する。腎嚢胞形成に関与する因子は、他の繊毛病にも関与するため、その可能性検討についても取り組みたい。前項推進方策1)公表する論文の英文校正、論文出版、学会参加を計画する。また、共著となる福井一博士(循環器病センター・研究員)との研究打ち合わせを計画する。前項推進方策2)マウス解剖、細胞培養関連費用、抗体・測定試薬などを消耗品として計上する。また、腎臓細胞で得られた成果の適用をさらに広げるため、腎臓以外で繊毛を有する細胞・組織の取得も目指すため、実体顕微鏡の取得も計画する。内耳の組織取得については、非常に難しい技術であるため、すでに摘出手術の経験のある杉山紀之博士(大阪医科大学・解剖学)に内耳組織解剖の手技指導を計画する。また、機械刺激や繊毛病関連の学会などへの参加を計画する。
口腔扁平上皮癌におけるεyndecan-1発現の免疫組織化学的検討

Syndecanは,膜貫通型プロテオグリカンで,種々のECM構成分子や増殖因子などと結合し,細胞-細胞間,細胞-細胞外基質の接着や情報伝達に関与するとされている.胃癌,食道癌,大腸癌などでsyndecan-1発現の低下と腫瘍の分化度や悪性度,予後との関連が報告されている.そこで,今回,口腔扁平上皮癌を対象にsyndecan-1の発現を免疫組織化学的に検討した.対照は56例の治療前生検材料で,ホルマリン固定・パラフィン包埋切片を用い,一次抗体として抗ヒトsyndecan-1モノクローナル抗体(DAKO)を使用し,Envision kit (DAKO)にて免疫染色を行った.対照は正常口腔粘膜上皮を用いた.syndecan-1の発現は正常口腔粘膜上皮では角化層を除く基底細胞層から有棘細胞層の細胞膜表面に強く認められたが基底細胞層では一部で減弱が認められた.口腔扁平上皮癌での発現を,(+),(±),(-)の3段階に分類して評価を行った.結果は(+);26例,(±);19例,(-);11例で,syndecan-1の発現とT分類,Stage分類とに関連は認められなかった.分化度(WHO)では中等度分化型で有意に発現の減弱を認めた(低分化型なし).浸潤様式(山本・小浜)との関連は認められなかった.リンパ節転移との関連では転移群で発現が減弱する傾向を認めた.Kaplan-Meier法による5年生存率では(-)群で有意に予後不良であった.以上の結果よりsyndecan-1の発現は口腔扁平上皮癌の分化度を反映し,また予後因子として有用である可能性が示唆された.Syndecanは,膜貫通型プロテオグリカンで,種々のECM構成分子や増殖因子などと結合し,細胞-細胞間,細胞-細胞外基質の接着や情報伝達に関与するとされている.胃癌,食道癌,大腸癌などでsyndecan-1発現の低下と腫瘍の分化度や悪性度,予後との関連が報告されている.そこで,今回,口腔扁平上皮癌を対象にsyndecan-1の発現を免疫組織化学的に検討した.対照は56例の治療前生検材料で,ホルマリン固定・パラフィン包埋切片を用い,一次抗体として抗ヒトsyndecan-1モノクローナル抗体(DAKO)を使用し,Envision kit (DAKO)にて免疫染色を行った.対照は正常口腔粘膜上皮を用いた.syndecan-1の発現は正常口腔粘膜上皮では角化層を除く基底細胞層から有棘細胞層の細胞膜表面に強く認められたが基底細胞層では一部で減弱が認められた.口腔扁平上皮癌での発現を,(+),(±),(-)の3段階に分類して評価を行った.結果は(+);26例,(±);19例,(-);11例で,syndecan-1の発現とT分類,Stage分類とに関連は認められなかった.分化度(WHO)では中等度分化型で有意に発現の減弱を認めた(低分化型なし).浸潤様式(山本・小浜)との関連は認められなかった.リンパ節転移との関連では転移群で発現が減弱する傾向を認めた.Kaplan-Meier法による5年生存率では(-)群で有意に予後不良であった.以上の結果よりsyndecan-1の発現は口腔扁平上皮癌の分化度を反映し,また予後因子として有用である可能性が示唆された.
固体状態において外部刺激応答特性を有する機能性超分子錯体の開発

本研究は、合成的手法の使用を最小限に抑え、性質の異なる2種類の構成分子を組み合わせることにより、固体状態で使用でき、「色(吸収及び発光)」による分子認識特性を有する機能性超分子ホストシステムの開発を目的としている。分子認識特性を有する超分子化合物の開発に当たり、軸不斉ビナフチル化合物に着目し、分子構造の変化による光学特性の変化について検討を行った。軸不斉ビナフチル化合物の分子構造内の二面体格を制御する目的で、2,2'-位を、長さの異なる置換基で結合したビナフチル架橋体である、リン酸架橋型ビナフチル化合物(R)-1,1'-binaphthyl-2,2'-diyl hydrogen phosphate及び、クラウンエーテル架橋型ビナフチル化合物(R)-2,2'-binaphthyl-4-crown-4、(R)-2,2'-binaphthyl-17,crown-5を用い、溶液中での光学特性について検討した。光学特性として、円偏光二色性(CD)スペクトル及び円偏光発光(CPL)スペクトルを測定した結果、それぞれCDのg-因子が約+1.6×10^<-3>,-6.9×10^<-5>,-1.5×10^<-4>、CPLのg-因子が約+2.1×10^<-3>,-2.3×10^<-4>,-4.1×10^<-4>と、同じ絶対配置を有する軸不斉ビナフチル化合物を用いているにも関わらず、リン酸架橋型とクラウンエーテル架橋型では、CD及びCPLの符号が反転する事を見出した。これら反転について検討するため、架橋部位を単純化したビナフチル化合物(R)-2,2'-dimethoxy-1,1'-binaphthylでCDの理論値をTD-DFT計算により二面体角-50°--120°の間で行った結果、二面体角が約-85°を境界にCDの符号が反転する事が明らかになり、CD及びCPLの符号の反転は、架橋部位の違いに起因した二面体角の違いに起因していると考えられる。本研究は、合成的手法の使用を最小限に抑え、性質の異なる2種類の構成分子を組み合わせることにより、固体状態で使用でき、気体状ターゲット分子に対して、「色(吸収及び発光)」による分子認識特性を有する機能性超分子ホストシステムの開発を目的としている。電荷移動(CT)ホスト錯体の生成を、電子ドナー分子としてイオン化ポテンシャルの異なる各種ビナフトール誘導体と、電子アクセプター分子として電子親和力の異なる各種benzoquinone誘導体を組み合わせ超分子・錯体化させることにより、開発を試みた。(rac)-10,10'-dihydroxy-9,9'-biphenanthrylを電子ドナー分子として、2,5-dimethyl-1,4-benzoquinoneを電子アクセプター分子として用い、それぞれをベンゼン溶液に溶解させその後、結晶化することによりCT錯体を得る事に成功した。得られたCT錯体は原料と、まったく異なる濃い紫色をしていた。分子構造について検討するため、単結晶X線結晶構造解析を行った結果、CT錯体は水素結合によるネットワーク構造を構築し、その間にできた空孔内にゲスト分子である、ベンゼン分子を包接していた。すなわち、CTホスト錯体の生成に成功した。次に電子親和力の異なる2-chloro-5-methyl-1,4-benzoquinoneを電子アクセプター分子として用い、同様の実験を行った。その結果CT錯体を得る事に成功した。分子構造について検討するため、単結晶X線結晶構造解析を行った結果、CT錯体は先ほどと同様、水素結合によるネットワーク構造を構築し、その間にできた空孔内にゲスト分子である、ベンゼン分子を包接していた。興味深いことに、いずれのCT錯体も結晶構造に大きな違いは見られなかったが、その色調に大きな違いが観測され、すなわち、電子アクセプター分子の電子親和力を変える事により、CT錯体の色調を制御することに成功した。光学特性として、円偏光二色性(CD)スペクトル及び円偏光発光(CPL)スペクトルを測定した結果、それぞれCDのg-因子が約+1.6×10^<-3>,-6.9×10^<-5>,-1.5×10^<-4>、CPLのg-因子が約+2.1×10^<-3>,-2.3×10^<-4>,-4.1×10^<-

4>と、同じ絶対配置を有する軸不斉ビナフチル化合物を用いているにも関わらず、リン酸架橋型とクラウンエーテル架橋型では、CD及びCPLの符号が反転する事を見出した。これら反転について検討するため、架橋部位を単純化したビナフチル化合物(R)-2,2'-dimethoxy-1,1'-binaphthylでCDの理論値をTD-DFT計算により二面体角-50°--120°の間で行った結果、二面体角が約-85°を境界にCDの符号が反転する事が明らかになり、CD及びCPLの符号の反転は、架橋部位の違いに起因した二面体角の違いに起因していると考えられる。
日本におけるオーガニックの停滞要因と日中韓におけるCSAの展開可能性

本研究の具体的課題は、1)有機農業・有機農産物普及の阻害要因、2)日中韓のCSAの展開プロセスの比較によるアジア的受容の可能性3)CSAと地域との関わりである。初年度は2)、3)を中心に韓国での事例調査を行い、現地の研究者・関係者とも議論を深めた。韓国には、典型的な形でのCSAは見られず、クロミと呼ばれる、欧米でのボックススキームに近似した形態での産消提携活動が存在している。その総数は全国に約80程度というのが関係者の認識である。本研究ではもっとも古くから活動している事例と、行政の施策で登場した最も新しい事例を含む5農場と消費者団体を調査し、有機農産物の取引の実態と生産者及び消費者の関係性、クロミに取り組む農家と地域との関わりについてそれぞれの実態を明らかにした。韓国におけるクロミとCSAとの同等性については、今後も考察を深める必要があるが、韓国では欧米とは異なる歴史的背景を共有しながら、その活動の理念において共通性を示していることが確認された。初年度で得られたクロミの有する機能、構造、背景についての調査結果は、次年度以降の調査対象国におけるCSA(的な取組)の調査で得られるであろうそれらと比較されることによって、アジアにおけるCSAモデルの受容(現地の主体適応)プロセスを明らかにする基礎となるものである。CSAと地域との関わりについては、地域の存続が経営体の成否に大きく影響する段階にある日本の農家経営において、CSAは、単に、農業経営体の経営手法の一選択肢ではなく、地域を外部と結び付ける有用な手段である。神奈川のなないろ畑農場と兵庫のビオ・クリエーターズを対象に、CSAの基本理念である「シェア」の実践における困難とその克服プロセスを明らかにした。これに基づいて、CSAのもう一つの重要なコンセプトであるCommunity形成の視点から明らかにする考察を継続している。1)については、オリパラに向けた短期的な情勢変化によって、普及の阻害要因が一時的に阻害されていることが考えられるため、データ収集と考察が滞っているが、2)、3)については予定通りの調査を進めることができ一定の結果が得られた。CSAは、有機農業を媒介として生産者と消費者をつなぐ方法であり、アジアにも普及しつつある。また、単なる生産者と消費者の協働モデルとしてだけでなく、農福連携、所得格差解消に向けた取り組みとしても、多様な展開を示しつつある。このことは韓国での調査で確認され、台湾、中国での実態比較が期待されるところである。一方で、その源流とされる日本のTEIKEI(産消提携)は、1970年代から活動を継続しながらも、国内での活動は縮小傾向にある。産消提携のみならず、日本の有機農業・有機農産物流通はOECD中最低レベルにあり、これには経済的要因だけでなく、生産・消費行動に対する社会的な制約がその背景として想定される。そのため、日本でのオーガニックの停滞要因を、欧米の市民社会を背景とするCSAおよび、中国・韓国での急速な展開を見せるCSAとの比較を通じて分析するという本研究の課題をさらに進めていくことは有用である。ただし、ベトナム、タイにもCSAが活動している可能性があり、現地調査以外の方法でそれらの情報を獲得することも模索中である。

1)については、オリパラに向けた短期的な情勢変化によって、普及の阻害要因が一時的に阻害されていることが考えられるため、データ収集と考察が滞っているが、2)、3)については予定通りの調査を進めることができ一定の結果が得られた。CSAは、有機農業を媒介として生産者と消費者をつなぐ方法であり、アジアにも普及しつつある。また、単なる生産者と消費者の協働モデルとしてだけでなく、農福連携、所得格差解消に向けた取り組みとしても、多様な展開を示しつつある。このことは韓国での調査で確認され、台湾、中国での実態比較が期待されるところである。一方で、その源流とされる日本のTEIKEI(産消提携)は、1970年代から活動を継続しながらも、国内での活動は縮小傾向にある。産消提携のみならず、日本の有機農業・有機農産物流通はOECD中最低レベルにあり、これには経済的要因だけでなく、生産・消費行動に対する社会的な制約がその背景として想定される。そのため、日本でのオーガニックの停滞要因を、欧米の市民社会を背景とするCSAおよび、中国・韓国での急速な展開を見せるCSAとの比較を通じて分析するという本研究の課題をさらに進めていくことは有用である。ただし、ベトナム、タイにもCSAが活動している可能性があり、現地調査以外の方法でそれらの情報を獲得することも模索中である。購入を予定したノートパソコンの型式がメーカーによって変更され、代替機の選定に時間がかかり、未発注となっているため。次年度には購入する予定である。
離島農村地域における新たな都市農村交流ビジネスの展開と地域内経済効果の計測

離島農村地域における新たな都市農村交流ビジネスとして注目される民泊事業は、農村地域に経済効果をはじめとする様々な効果を生み出しているだけでなく、民泊を体験した修学旅行生に対する教育効果も大きいことが明らかとなった。また、民泊の実施によって農作業体験や食材として野菜・果実の生産を増やした民家が多く、農業にもよい影響が現れている。ただし、安全性の確保や受入組織間の調整の必要性などの課題もみられる。本研究の目的は、沖縄県内における離島農村の取り組みに焦点を当て、宿泊体験学習の受入による都市農村交流ビジネスの実態と課題、その経済効果等を明らかにし、今後の展開方向について考察することである。初年度に当たる今年度は沖縄県伊江村において伊江島観光協会が受入窓口となって取り組んでいる民家体験泊を事例として、伊江村役場、伊江島観光協会、伊江島観光協会民泊部会に加入している民家、民宿等を対象としてヒアリング調査を実施し、その結果を分析した。成果の概要は次のとおりである。1.宿泊体験学習の受入による都市農村交流ビジネスの実態とその効果を明らかにした。伊江村における民泊事業の経済効果は直接効果だけで年間約3億円に達している.調査対象民家(64戸)の民泊による収入は1戸当たり144万円であり、貴重な収入源になっているだけでなく、民泊が様々な効果を生み出している。また、民泊の実施によって農業生産を縮小させた農家は少なく、逆に農作業体験や食材として野菜・果実の生産を増やした民家が多くみられるなど農業にもよい影響が現れているといえよう。2.伊江村における民家体験泊事業の成功要因を明らかにした。伊江村における成功要因として次の点が指摘できる。第1に、伊江島観光協会の役員が強力なリーダーシップを発揮するとともに、村、教育委員会、農協、漁協、商工会との協力体制を構築したことである。第2に、受入民家が人の命を預かっているという高い自覚をもつ一方で、あくまでも民泊は副業であるとの意識をもち、農業等の生業を主業としながら、無理のない範囲で取り組んでいることである。第3に、伊江島(村)はもともと修学旅行の人気が高い沖縄本島に近接しているなど立地条件がよいだけでなく、豊かな自然と多くの戦跡が残っており、さらに中等・高等教育機関がなく、若者の受入に鴛して村民が協力的であることも大きいと考えられる。本研究の目的は、離島農村における宿泊体験学習(修学旅行生の民泊)の受入による都市農村交流ビジネスの取り組みに焦点を当て、その実態と課題およびそれによる経済効果を明らかにし、今後の展開方向について考察することである。2年目に当たる本年度は、主に次の6点について調査研究を行った。第1に、2003年以降、毎年修学旅行で伊江島観光協会が主宰する「民家体験泊」を利用している東大阪市内O中学校の教員に対してヒアリング調査を実施し、「民家体験泊」の利用の契機、経過、評価等を明らかにした。第2に、統計データの分析および伊江村農林水産課、宮古島市農政課、農家15戸に対してヒアリング調査を行い、伊江村および宮古島市における産業および農業の構造と農家経済の実態を解明した。第3に、宮古島市観光課と宮古島市観光協会に対してヒアリング調査を実施し、宮古島市における観光産業の実態と観光客の入込状況を把握した。第4に、LLCぐすくベグリーンツーリズムさるかの会とその会員農家12戸、NPO法人いけま福祉支援センター等に対するヒアリング調査を実施し、宮古島市における宿泊体験学習の受入組織と受入農家の実態について明らかにした。第5に、宮古島および長崎県小値賀島における現地調査を実施し、離島における観光客の地域内支出と民泊事業の支出先別支出金額を解明するとともに、地域産業連関表作成のためのデータ収集を行った。第6に、鹿児島県南さつま市、NPO法人エコ・リンク・アソシエーション、鹿児島市役所、かごしまグリーン・ツーリズム協議会に対して都市農村交流ビジネスの取り組みに関するヒアリング調査を行い、離島農村地域との比較分析に必要な知見を得た。最終年度に当たる今年度は、伊江島観光協会民泊部会とぐすくべグリーンツーリズムさるかの会の事務局および会員に対する補足調査、新たに民泊を始めた宮古島観光協会および旅行業者へのヒアリング調査、修学旅行で伊江島を訪れ、民泊を行った広島県内の高校の教師へのヒアリング調査と生徒へのアンケート調査を実施し、それらの結果を分析するとともに、伊江村における民泊事業の地域内経済効果を計測した。離島農村における民泊活動は、農村地域に経済効果をはじめとする様々な効果を生むだけでなく、民泊を体験した修学旅行生に対する教育効果も大きいことが明らかとなった。また、沖縄県伊江村における民泊事業の地域内経済効果は以下のように推定された。

村内観光消費の1単位増加は、生産額ベースで1.00単位の直接効果と0.10単位の間接効果、0.30単位の誘発効果を伊江村内にもたらす。すなわち、生産額ベースの観光乗数は1.40である。産業の多様性に乏しい離島における結果と考えれば、この経済波及効果は大きいと言える。波及効果の特徴は、誘発効果が大きい点である。受入民家の所得率は非常に高く、民泊はきわめて労働集約的なビジネスである。労働集約的ビジネスであればあるほど、その売上の大きな部分が所得として地域内に歩留りし、消費に回る。そのため、誘発効果が大きくなるとともに、経済効果の地域外への漏出も小さくなるのである。以上の波及効果を考慮すれば、民泊体験型観光が伊江村内にもたらす経済効果は、生産額ベースで約8億円、所得ベースで約5億円と推定される。宿泊体験学習を行った修学旅行生に対するアンケート調査は実施できなかったが、次年度に予定していた体験型修学旅行を取り扱う旅行業者へのヒアリング調査が一部実施できたこと、他の調査研究についてはほぼ当初計画どおりとなっていることなどから、おおむね順調に進展していると評価した。24年度が最終年度であるため、記入しない。最終年度に当たる次年度は、今年度実施できなかった修学旅行生に対するアンケート調査を実施するとともに、体験型修学旅行を取り扱う旅行業者等に対するヒアリング調査や体験型修学旅行の受入による都市農村交流ビジネスの関係主体に対する補足調査等を行う。これらの結果とこれまでに収集したデータを分析し、研究成果の取りまとめを行う。
細胞内シグナルと代謝物リガンドによる核内受容体活性制御

細胞外シグナル分子は膜結合型受容体を介したシグナル伝達に加え、その細胞内代謝物がリガンドとして働くにより直接PPARγを制御している。申請者自身のこれらの研究結果から、「膜型受容体と核内受容体のクロストーク」の解明を目指した。細胞内シグナルと、リガンドによる作用を時間的・空間的に分離し定量化するために、最大6つの転写制御について時間的な制御を視覚化するシステムを開発した。細胞内リン酸化シグナルによる核内受容体PPARγの活性制御を解析し、PPARγ蛋白質の安定化の変化と細胞内局在変化という、代謝物リガンドとは別の次元での制御機構でPPARgの活性調節を行っていることを明らかにした。セロトニンは中枢・末梢の両方で作られているが、その合成酵素のサブタイプが異なる。炎症性腸疾患の患者において末梢セロトニン量が変化することが言われている。末梢セロトニンの合成、取り込み、分解に関わる因子群を薬理学的・遺伝学的操作をすると、肥満や骨密度の減少、心疾患が引き起こされる。これらの病態は一部のPPARγアゴニストで報告されている副作用と類似している。そこで本研究では以下の視点で研究を行っている。末梢セロトニンの作用についてセロトニン代謝物の関与を明らかにするために、セロトニン代謝の律速酵素であるモノアミンオキシダーゼ(MAO)とPPARγの連動を解析した。その結果、内在性にPPARgを発現するヒトマクロファージ様細胞THP1において、セロトニン投与によりPPARg標的遺伝子の発現上昇は、セロトニン取り込み阻害剤により消失した。従って末梢セロトニンはマクロファージに取り込まれた場合、MAOにより代謝されPPARgを活性化する事が明らかとなった。末梢セロトニンはセロトニン受容体を介したシグナル伝達も行う。細胞内シグナル伝達のなかでもセリン・スレオニンキナーゼによりリン酸化されたPPARgはPin1と結合し、ユビキチン依存性の蛋白質分解制御の阻害を受けることで安定化することがわかった。一方、リン酸化されていないPPARgやリン酸化を受けない様に点変異を導入したPPARgは非常に不安定であることがわかった。現在、リン酸化されていないPPARgを認識し、ユビキチンープロテアソーム系の誘導を介在する因子を探索中であろう。セロトニン細胞内代謝産物が、核内受容体PPARγのリガンドとして作用するということと、膜結合型受容体からのリン酸化シグナルがPPARγの転写活性を抑制するという発見に基づき、シグナル伝達による抑制と代謝物リガンドによる活性化の2重の制御の分子機構の解明を行った。膜結合型受容体からのシグナル伝達による転写調節とリガンドによる核内受容体の活性化視覚化するために、CFP/YFP/RFPの3色の蛍光タンパク質をポリシストロニックに発現するレポーター遺伝子を構築し、2色の組み合わせにより6種類のレポーター遺伝子(CC, YY, RR, CY, CR, YR)を作成することに成功した。これにより、6種類の異なるプロモーターの活性化キネティクスを同じ視野で観察することが出来るようになった。さらに、CFP/YFP/RFPに核移行シグナル、核外排出シグナルを付加することで、さらに多くのレポター遺伝子を同一視野で見分けることに成功した。細胞内におけるPPARγタンパク質の挙動を視覚化して、細胞内シグナル伝達による転写制御機構を解析した結果、リン酸化の有無による抑制と活性化の制御という申請時の予想とは異なり、抑制も活性化もリン酸化により引き起こされ、Pin1が作用すると抑制、SDP-1が作用すると活性化が引き起こされることがわかった。SDP-1による活性化機構を解析した結果、リン酸化により誘導されたポリユビキチン化されたPPARγタンパク質が、SDP-1依存性に核外排出抑制を受け、その結果核内に蓄積することが明らかとなった。したがって、リン酸化シグナルは直接PPARγの転写活性に連動するものではなく、共役する因子の組み合わせにより異なるということが明らかとなった。現在、これら共役因子の構造解析をすすめており、PPARγのリガンド非依存性の転写活性を制御する新しい創薬への展開が期待される。細胞外シグナル伝達物質であるセロトニンが細胞内に取り込まれる事により出来る代謝物が、核内受容体PPARgリガンドとして作用する。本研究では、細胞膜にある受容体からのシグナル伝達と核内受容体として作用する2重の制御の分子機構と疾患との関係を明らかにする事を目標としている。核内受容体PPARgを内在性に発現しているヒトマクロファージ様細胞THP-1細胞において、セロトニンを投与するとPPARg標的遺伝子であるFABP4の発現誘導が見られた。この誘導はセロトニンの細胞への取り込み阻害剤を同時に投与することにより消失したことから、セロトニン受容体を介した作用ではなく、細胞内に取り込まれた出来た代謝物がPPARgリガンドとして作用した結果であると考えられる。

従って、セロトニンの代謝とPPARgの活性化は連動していることが明らかになった。一方、細胞膜上にある受容体により引き起こされる細胞内シグナル伝達、特にMAPキナーゼによりPPARgはリン酸化されることが知られている。PPARgのアミノ末端側に存在するリン酸化部位は肥満・糖尿病との関連性が既にマウスの分子遺伝学で示唆されている。このリン酸化部位に点変異を導入するとPPARgの活性は上昇することから、リン酸化はPPARg活性を負に制御していることがわかった。しかし、リン酸化修飾はプロリンイソメラーゼPin1を介して逆に蛋白質の安定化を引き起こしていることがわかった。従って、PPARgの活性は蛋白質量に相関するのではなくタンパク質の代謝回転に依存していると考えられる。これまで酵素などの蛋白質は、蛋白質量が上昇することで活性が上昇すると一般的に考えられてきた。しかし、核内受容体はDNA上での転写制御に際して、既に働いた蛋白質が新たに作られた蛋白質に入れ替わることが重要なのかもしれない。細胞内シグナルでリン酸化を受けたPPARgはユビキチン化の阻害を受け、安定性が増すことがわかった。しかし、蛋白質の量が増加するにもかかわらず、転写活性という点ではリン酸化は抑制性に働くことがわかった。この結果はこれまで知られている蛋白質安定性による活性制御機構と大きくメカニズムが異なることを意味する。そこで、蛋白質の代謝回転が活性に重要であるというモデルを立てて研究を行っている。その過程で、リン酸化されていないPPARgを認識し、ユビキチンープロテアソーム系へと誘導することで、転写活性を上げる因子の存在が想定された。そこで、現在この因子の同定を優先したため、申請時において進める予定になっていた、活性の視覚化、修飾の視覚化という技術開発が進んでいない。最終年度に技術開発という大きな課題を残してしまった。申請者は平成23年度に東北大学から近畿大学へ異動し、独立研究室を持つに至った。しかし3月11日の震災による研究機器のダメージと、引っ越しの遅延など多くの困難に直面した。被災した研究機器に関しては東北大学から移設したため、震災復興のサポートを得られれず、自前での修理とセットアップを余儀なくされた。赴任後も今年度は実験室のセットアップに多くの時間を取られてしまった。しかし、研究機器特に顕微鏡のセットアップに際して新しいシステムの導入をすることが出来た。平成24年度には活性の時間的・空間的変化の視覚化を目標としているため、導入した新しい顕微鏡システムが利用になった。当初の予定では機能連携を共発現で評価することを予定していたが、蛋白質の発現量と活性は核内受容体に関しては相関しないという事実を見いだしたため、若干軌道修正が必要になっている。しかし、次年度以降の活性評価システムへとつなげるという意味では、蛋白質の量ではなくその代謝回転をモニターするという新しい視野が開けたと評価している。申請時には東北大学に在籍していたため、所属研究室の研究機器を利用できたが、平成23年度から近畿大学で独立し、すべての研究を自分の研究室でセットアップする必要があった。
メゾ空間に拘束された高分子の相転移

本研究では、界面活性剤にAOT、球体の内部に水相、球体外部の分散相にイソオクタンを用い、水溶性高分子(ゼラチン、ポリエチレンオキサイド(PEO))を用いることにより高分子鎖を球体内に閉じ込めその時の高分子鎖とマイクロエマルション膜の挙動を研究した。我々はまず、高分子鎖(高分子鎖の回転半径(Rg)はドロプレットサイズとほぼ同じ)を閉じ込めることによるMEドロプレットの振る舞いについて調べた。MBドロプレット内に高分子鎖を閉じ込めていくと、ドロプレット一個あたりの平均高分子鎖数が一本程度までは球形を保っているが、その濃度を越えるとドロプレットは大きく変形を始め、球状からシリンダー状へとモルフォロジー転移をするものと考えられる。また、内包する高分子鎖が一本程度の領域では高分子鎖のフローリー半径をR_F、高分子を閉じ込める前のドロプレットサイズをR_O、閉じ込めた後のサイズをRとするとR/R_O(R_F/R)^<0.6>の関係が得られ、これは閉じ込められた高分子鎖のエントロピーロスと膜の弾性エネルギーのバランスから得られる理論的予言R/R_O(R_F/R)^<0.8>と非常によい一致を示した。次に、ドロプレット内部に閉じ込められた高分子鎖を観察するために重水素化AOTを合成し、膜からの散乱コントラストを消去することに成功した。得られた閉じ込められた高分子鎖からの散乱曲線はまだ予備的なもので今後検討することが必要な課題も多いが、希薄水溶液状態での高分子鎖の拡がりに比べ高分子鎖を膜内に閉じ込めた時のRgは大きく減少する結果が得られた。今後、重水素化AOTが作るMEの相挙動・高分子鎖との相互作用等解決すべき問題もあるが、最終目的であるメゾ空間に拘束された高分子鎖の相転移挙動を明らかにするべく研究を進めていく。
形質細胞様樹状細胞のエンドソーム時空間的制御に関与する新規分子の網羅的探索と同定

形質細胞様樹状細胞(pDC)は,核酸に反応してI型インターフェロン(IFN)を迅速かつ大量に産生する免疫細胞であり,病原体由来の核酸に反応してI型IFNを産生した場合は生体防御に重要な役割を果たす一方で,自己細胞由来の核酸に異常に反応した場合は全身性エリテマトーデスや尋常性乾癬などの免疫疾患の病態形成に関与する。本研究では我々が樹立したヒトpDCの細胞株を用い,二重レポーターシステムによってエンドソームの活性化動態を可視化することによりpDCのI型IFN産生メカニズムを明らかにすることを目的に研究を行った。pDCの核酸受容体であるToll様受容体9(Toll-like receptor 9: TLR9)の下流には,IRF7経路とNF-κB経路の異なる2つのシグナル経路が存在し,IRF7経路が活性化した場合にはI型IFNが産生され,NF-κB経路が活性化した場合は炎症性サイトカインの産生,共刺激分子の発現増強が誘導される.これらのうち,生体防御・臨床病態への関わりからするとI型IFN産生につながるIRF7経路の活性化が注目される.本研究計画においては,pDCのIRF7経路の活性化に特異的に関わる分子を網羅的に探索し,同定することを目的に,我々が独自に樹立したヒト芽球性pDC腫瘍由来の細胞株に,2つの異なる蛍光蛋白(EGFPおよびDsRed)をレポーター遺伝子とするNF-κBおよびIRF7のレポーターシステムを二重に導入し,レトロウイルス挿入変異により遺伝子変異を導入したのち,TLR9シグナル経路の活性化様式の異なるクローンをレポーター遺伝子の発現の差を指標にセルソーターにて分離し,各クローンの遺伝子変異を解析することによってpDCのI型IFN産生に必須である分子を同定することを計画している.平成24年度は,EGFPをレポーター遺伝子とするNF-κBレポーターシステムをヒトpDC細胞株に安定導入することに成功し,現在,DsRedをレポーター遺伝子とするIRF7レポーターシステムの作製を行っている.形質細胞様樹状細胞(plasmacytoid dendritic cell: pDC)は,I型インターフェロン(interferon: IFN)を迅速かつ極めて大量に産生する細胞であり,病原体由来の核酸に反応して生体防御に重要な役割を果たす一方で,自己細胞由来の核酸に反応して全身性エリテマトーデスなどの自己免疫疾患の病態形成に関与する。本プロジェクトではpDCの高レベルのI型IFN産生能の基盤となる分子メカニズムの解明を目指した。我々は芽球性pDC腫瘍患者から高レベルのI型IFN産生能を保持したヒトpDC細胞株を独自に樹立することに成功した。形質細胞様樹状細胞によるI型IFN産生はToll様受容体9(Toll-like receptor 9: TLR9)シグナルの下流で起こる。TLR9シグナル経路の下流にはIRF7経路とNF-kB経路の2つのシグナル経路が存在し,大量のI型IFN産生にはIRF7経路の活性化が決定的に重要である。このIRF7経路の活性化に特異的に関与する分子を網羅的に探索し同定することを目的に,我々は,ヒトpDC細胞株にNF-kBおよびIRF7のレポーターシステムを二重に導入することを計画した。これまでNF-kBレポーターシステムをヒトpDC細胞株に安定導入することに成功した。さらにIRF7レポーターシステムの構築を目指し,試行錯誤を繰り返し行ったが,後の実験に有用なIRF7のレポーターシステムを構築することに期間内には成功しなかった。以上のような状況から研究計画を変更し,I型IFN産生能に差のあるヒトpDC株のサブクローンを樹立し,DNAマイクロアレイにてパスウェイ解析を行い,サブクローン間で差のあるTLR9シグナルの同定を行った。また,ゲノムワイドのDNAメチル化解析も併用した。今後,これらの解析で得られたデータを元に候補遺伝子を絞り込み,各分子の機能的な解析を行っていく予定である。I型インターフェロンは哺乳類の生体防御において必須の役割を果たしているサイトカインである。ヒト形質細胞様樹状細胞(plasmacytoid dendritic cell: pDC)は,このI型インターフェロンを極めて大量に産生する特別な能力を持っている。我々はpDCがなぜこのような高レベルのI型インターフェロン産生能を持っているのかを明らかにするため,その分子メカニズムを解析するべく研究を進めている。ヒトpDCは,ヒト末梢血白血球中に占める割合が0.5%前後と非常に少なく,解析に必要な数の細胞を入手するのが困難であることが,シグナル伝達機構を含む,pDCの細胞内分子動態の解析において足かせとなってきた。我々はこの状況を打破するため,pDC白血病患者の白血病細胞よりI型インターフェロン高産生性のpDC細胞株を樹立した。

形質細胞様樹状細胞白血病由来の細胞株はこれまでにもいくつか樹立されているが,いずれもI型インターフェロン産生能が低く,白血病化あるいは細胞株樹立の過程でpDCの特殊なI型インターフェロン産生機構を構成している分子に何らかの異常を来していることが想定される。我々が樹立したpDC細胞株は大量のI型インターフェロンを産生することから,pDCの正常なI型インターフェロン産生機構を保持しており,pDCにおけるI型インターフェロン産生機構の解析に適している。ただし,この細胞株は継代培養を続けると高レベルのインターフェロン産生能を徐々に失って行くことから培養方法の工夫が必要である。さまざまな培養条件を試した結果,ストローマ細胞株との共培養で高レベルのI型インターフェロン産生能が回復することが分かった。今後,この培養条件で培養した細胞を用い,pDCのエンドソーム時空間的制御に関与する新規分子の同定を主たる目的としてI型インターフェロン産生機構の解析を進めていく予定である。ヒトpDC細胞株への導入を目的としている二重レポーターシステムのうち,これまで,NF-κBのレポーターシステムは作製に成功し,さらに,これを安定発現するヒトpDC細胞株の樹立が完了している.次に,このヒトpDC細胞株にIRF7のレポーターシステムを安定導入する予定で,現在,IRF7のレポーターシステムの作製に取り組んでいる.I型IFNの発現誘導に関わる転写因子にはIRF3とIRF7の2つがあり,両転写因子の結合配列には相同性がある.我々はIRF7に特異性が高いレポーターシステムを作製するため,IRF3では活性化されず,IRF7のみよって活性化されると報告されているIFN-A7遺伝子のプロモーター領域(Mol Cell Biol 20:6342, 2000)をクローニングし,DsRedの発現ベクターに組み込んだ.しかし,この発現ベクターを活性化IRF7の存在下に遺伝子導入してもDsRedが発現せず,IFN-A7遺伝子のプロモーター領域に加え,他のエンハンサーなどを加える必要が考えられる.現在,エンハンサーを加えたIRF7レポーターシステムを作製し,その機能を検証しているところである.このようにIRF7レポーターシステムの作製について試行錯誤を繰り返している状態であり,その段階で計画が足踏みをし,研究計画の遂行に遅延を生じている.当初の予定では,我々が樹立したI型インターフェロン高産生性pDC細胞株にIRF7,NF-κBのレポーターシステムを二重に導入し,その細胞株を用いてpDCのI型インターフェロン産生に関与する新規分子の探索を行う予定であった。しかし,残念なことに,我々のpDC細胞株は継代培養の過程でI型インターフェロン産生能を徐々に喪失し,我々の目的には適さないことになってしまった。形質細胞様樹状細胞由来の細胞株は,他にもいくつか樹立されているが,いずれもI型インターフェロン産生能が低く,I型インターフェロン産生機構の解析に適しているとは言いがたい。このように我々が樹立したpDC細胞株の代替となる細胞株も存在しないため,当初の研究計画を予定通りに進めることが非常に困難になった。以上のような事情から研究計画の遂行が遅れてしまっている。まずは本研究計画の推進に必須となるIRF7レポーターシステムを可及的速やかに何とか作製する.現在試みているエンハンサーの追加にても,DsRedの誘導が起こらない場合は,IFN-A7