hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
タンパク質間相互作用解析に用いる新規プロテインチップの開発

本研究は、ダイヤモンド様炭素被膜処理基板(DLC基板)上に二次元電気泳動で分離されたタンパク質を電気泳動的に転写してプロテインチップを作製し、チップ上のタンパク質にタンパク質溶液を反応させた後、相互作用するタンパク質を質量分析装置で転写するハイスループットな方法を確立すること、また、確立された方法を用いて二次元電気泳動で分離されたダイズ種子胚軸タンパク質と相互作用するタンパク質を検出し、タンパク質間相互作用マップを作成することを目的とした。これまで電気泳動で分離されたタンパク質をDLC基板に転写する効率が同じタンパク質であっても異なることがあった。本年度、その原因を追究した。その結果、ブロッティング時の温度変化が効率の変動に関係があることがわかった。そこで、温度を厳密に制御できるブロッティング装置を設計・製作し、種々の温度で転写実験を行って安定的、かつ効率的にブロッティングを行うことができる温度条件を調べた。その結果、かなり高温(30°C)でブロッティングを行うと最も効率よくタンパク質を転写できることがわかった。一方、昨年度、ダイズ種子胚軸タンパク質を二次元電気泳動で分離し、約500のタンパク質を検出した。検出されたタンパク質のアミノ酸配列を質量分析装置によって分析し、アミノ酸配列から各タンパク質を同定した。これと種子子葉タンパク質の分析結果とを比較したところ、すべてではなく、特定の種子貯蔵タンパク質が胚軸と子葉の両方で発現していることがわかった。これらのタンパク質は、特別な機能を持っている可能性がある。そこで、DLC基板を用いてこれらのタンパク質と相互作用するタンパク質の検出を試みた。本研究は、ダイヤモンド様炭素被膜処理基板(DLC基板)上に二次元電気泳動で分離されたタンパク質を電気泳動的に転写してプロテインチップを作製し、チップ上のタンパク質にタンパク質溶液を反応させた後、相互作用するタンパク質を質量分析装置で転写するハイスループットな方法を確立すること、また、確立された方法を用いて二次元電気泳動で分離されたダイズ種子胚軸タンパク質と相互作用するタンパク質を検出し、タンパク質-タンパク質相互作用マップを作成することを目的とした。まず、DLC基板にCy3で標識したタンパク質を転写し、これにCy5で標識した抽出液中のタンパク質を種々の条件で反応させた。また、抽出したタンパク質をリシルエンドペプチダーゼによって消化し、得られたペプチドをCy5で標識して反応させた。この実験で、タンパク質にタンパク質を相互作用させることはできなかったが、ペプチドを反応させることができることがわかった。タンパク質-タンパク質、あるいはタンパク質-ペプチド相互作用を解析するためには、まず、二次元電気泳動で分離されたタンパク質を同定しておく必要がある。そこで、ダイズ胚軸タンパク質を二次元電気泳動で分離し、約500のタンパク質をクマシーブルー染色によって検出した。分離されたタンパク質をゲル中でリシルエンドペプチダーゼにより消化した後、エレクトロスプレーイオン化四重極飛行時間型質量分析装置によってアミノ酸配列を分析した。そして、アミノ酸配列から各タンパク質の同定を行った。DLC基板上のタンパク質が同定できたので、タンパク質に相互作用するペプチドを質量分析装置で同定すれば、相互作用するタンパク質とペプチド両方を同定できると考えられた。
画像処理・機械学習・1細胞オミックス技術の統合による細胞表現型定量解析技術の開発

近年、iPS細胞などの幹細胞を用いて、細胞の発生・分化や疾患発症機構の解析が精力的に行われている。しかし、培養下の細胞集団の状態は均一なものではなく、細胞分化や薬剤投与後の変動を計測する場合、細胞集団中の個々の細胞の変化を時系列に則して評価するべきであり、細胞集団全体をすりつぶして解析するマス解析では個々の細胞の応答性の違いは検出できない。一方、個々の細胞内での遺伝子レベルの変動を解析するシングルセルRNA-Seq (scRNA-Seq)などの手法では、個々の細胞の形態情報や組織中の位置情報などは捨て去られるため、細胞状態と遺伝子発現をリンクすることは不可能であった。そこで、本研究では通常の顕微鏡画像を元として、画像処理・機械学習を用いて、細胞集団中の各種細胞タイプ、細胞状態の検出を簡便に、かつ高精度で行う画像解析技術とscRNA解析を組み合わせ「細胞の表現型」を定量的に記述する技術の確立を行うことを目的とする。この技術をiPS細胞の形成過程の解析に適用し、ゲノム再プログラム化過程に関する詳細な知見を得ることを目指す。H30年度は、モデル実験として、CD34陽性ヒト臍帯血へ山中4因子を導入し、iPS細胞をつくる過程における細胞状態、細胞タイプの変化をタイムラプス撮影で記録し、この画像を用いて、画像処理・機械学習の手法を用いて、形成されたiPS細胞、iPS形成途上の細胞、iPS形成に至らず異なる方向に分化する細胞、それぞれの形態を類型化することを試みた。また、遺伝子導入後におけるゲノム再プログラム化の最初期過程における分子的変動を調査するために、遺伝子導入を行った後、2日目、3日目において、FACSによってシングルセルを単離し、RNA抽出、cDNA合成、シーケンス解析用のライブラリー作製までを行った。現在までに、ヒトiPS細胞の形成プロセスをモデル実験系として、機械学習を用いて、画像情報から細胞集団中の異なる細胞形態を示す細胞タイプの検出、定量を可能とする技術の確立を行っている。これまでに、ヒト臍帯血からのiPS細胞形成過程の静止画像を一日ごとに取得し、画像処理・畳み込み機械学習の手法で、一画像中の細胞の検出、異なる細胞分化状態にある細胞の分類とその定量を精度良く実施することに成功している。しかし、これらの静止画像からは、時系列変化を正確に推定することができない。そこで、インキュベーター型の顕微鏡内で約10日間にわたるiPS細胞形成を行うための条件検討を行った。その結果、一定の頻度でiPS細胞が形成されることが確認されたため、その過程のタイムラプス画像を取得し、これらの画像データをもとに上述の手法で、異なる形態(=異なる細胞分化状態)を持つ細胞の検出、判別、定量を行うための技術開発を実施しており、その時系列変動を示すことを試みている。ヒト臍帯血を用いたiPS細胞形成のプロトコールでは、山中4因子の遺伝子導入後、34日後に細胞が基質に付着し始める。本来浮遊性の血球細胞が付着するのは、遺伝子導入によるリプログラミングの結果と考えられるが、それ以前に恐らく細胞接着性の違いを産み出すための遺伝子発現の変動が起きていると予想されるが、その分子レベルの実態は全く不明である。そこで、このブラックボックスの解明のために、遺伝子導入後、未だ付着する以前の細胞をFACSで単離し、シングルセルRNA-Seq用のライブラリー作製のための処理を行った。これまで、約200細胞分のライブラリー作製が終了したので、次年度にこのライブラリーのシーケンス解析を実施する予定である。ヒト臍帯血をiPS作製に用いた場合、付着細胞に着目することにより、あらかじめリプログラミングを開始し、iPS細胞形成へと向かう細胞のみを追跡することが可能となる。そこで、タイムラプス撮影画像を解析することにより、iPS細胞はいつ出現するか、その前駆細胞はどのようなものか、あるいはiPS細胞に成り得ない細胞はどのようなものか、それぞれの細胞タイプ、細胞状態を検出、追跡、定量することにより、ヒトiPS細胞形成過程の詳細を明らかにする。それと並行して、各分類群に属する細胞内の遺伝子レベルの変化をscRNA-Seq解析によって調べ、画像解析の結果と組み合わせることにより、画像解析結果の補強、検証を行う。iPS細胞形成過程の細胞をFACSまたは用手的に単離し、scRNA-Seq解析を行ない、細胞集団を遺伝子発現データによってクラス分類し、それぞれのクラスの細胞分化軌跡を偽時間推定解析の手法で推定する。また、このクラス分けに貢献した遺伝子群を抽出し、それらの生物学的意義を追究する。これらのデータを総合することにより、ヒトiPS細胞形成過程(細胞のリプログラミング過程)の全貌を明らかにする。

この技術をiPS細胞の形成過程の解析に適用し、ゲノム再プログラム化過程に関する詳細な知見を得ることを目指す。H30年度は、モデル実験として、CD34陽性ヒト臍帯血へ山中4因子を導入し、iPS細胞をつくる過程における細胞状態、細胞タイプの変化をタイムラプス撮影で記録し、この画像を用いて、画像処理・機械学習の手法を用いて、形成されたiPS細胞、iPS形成途上の細胞、iPS形成に至らず異なる方向に分化する細胞、それぞれの形態を類型化することを試みた。また、遺伝子導入後におけるゲノム再プログラム化の最初期過程における分子的変動を調査するために、遺伝子導入を行った後、2日目、3日目において、FACSによってシングルセルを単離し、RNA抽出、cDNA合成、シーケンス解析用のライブラリー作製までを行った。現在までに、ヒトiPS細胞の形成プロセスをモデル実験系として、機械学習を用いて、画像情報から細胞集団中の異なる細胞形態を示す細胞タイプの検出、定量を可能とする技術の確立を行っている。これまでに、ヒト臍帯血からのiPS細胞形成過程の静止画像を一日ごとに取得し、画像処理・畳み込み機械学習の手法で、一画像中の細胞の検出、異なる細胞分化状態にある細胞の分類とその定量を精度良く実施することに成功している。しかし、これらの静止画像からは、時系列変化を正確に推定することができない。そこで、インキュベーター型の顕微鏡内で約10日間にわたるiPS細胞形成を行うための条件検討を行った。その結果、一定の頻度でiPS細胞が形成されることが確認されたため、その過程のタイムラプス画像を取得し、これらの画像データをもとに上述の手法で、異なる形態(=異なる細胞分化状態)を持つ細胞の検出、判別、定量を行うための技術開発を実施しており、その時系列変動を示すことを試みている。ヒト臍帯血を用いたiPS細胞形成のプロトコールでは、山中4因子の遺伝子導入後、34日後に細胞が基質に付着し始める。本来浮遊性の血球細胞が付着するのは、遺伝子導入によるリプログラミングの結果と考えられるが、それ以前に恐らく細胞接着性の違いを産み出すための遺伝子発現の変動が起きていると予想されるが、その分子レベルの実態は全く不明である。そこで、このブラックボックスの解明のために、遺伝子導入後、未だ付着する以前の細胞をFACSで単離し、シングルセルRNA-Seq用のライブラリー作製のための処理を行った。これまで、約200細胞分のライブラリー作製が終了したので、次年度にこのライブラリーのシーケンス解析を実施する予定である。ヒト臍帯血をiPS作製に用いた場合、付着細胞に着目することにより、あらかじめリプログラミングを開始し、iPS細胞形成へと向かう細胞のみを追跡することが可能となる。そこで、タイムラプス撮影画像を解析することにより、iPS細胞はいつ出現するか、その前駆細胞はどのようなものか、あるいはiPS細胞に成り得ない細胞はどのようなものか、それぞれの細胞タイプ、細胞状態を検出、追跡、定量することにより、ヒトiPS細胞形成過程の詳細を明らかにする。それと並行して、各分類群に属する細胞内の遺伝子レベルの変化をscRNA
回転曲げ疲労試験における生体内埋め込み金属電極の摩耗および元素溶出特性

ステンレス鋼製生体刺激電極およびチタン製ワイヤーの回転曲げ疲労試験を310K、擬似体液中で行い、その疲労特性を明らかにした。1.ステンレス鋼製生体刺激電極(1)生体刺激用電極材料として開発されたFe-22Cr-10-Ni-6Mo-0.4Nオーステナイト系ステンレス鋼は、低曲げ応力領域において従来材であるSUS316Lよりも優れた疲労強度を示した。(2)1%乳酸溶液中における溶出イオン濃度は、ステンレス鋼組成とほぼ一致した。一方、Hanks溶液中では、疲労試験時間に関係なくイオン溶出は低濃度に抑制された。また、検出されるイオン濃度は、Ni>Cr>Feとなることを明らかにした。(3)疲労試験後にHanks溶液中における生成物として、棒状のβ-FeOOHの存在が確認された。β-FeOOH中にはCrが固溶していることがHanks溶液中における低いFeおよびCrイオン濃度の原因と考えられた。2.チタン製ワイヤー(1)当研究室で開発したβ型チタン合金(Ti-14Mo-3Nb-1.5Zr-0.080)を素材として作製した直径100mmの細線では、C.P.Tiよりも高い疲労強度が得られた。(2)市販の直径100μmのC.P.チタン細線の疲労強度は引張り強度の約3割に留まった。これは細線化プロセスにおいて形成された表面のクラックが疲労破壊の起点となったためと考えられる。(3)DLC(diamond like carbon)をコーティングした直径100μmのC.P.チタン細線では、疲労強度は引張り強度の7割程度となった。これらは、DLCコーティングプロセスの最適化によりチタン細線の疲労特性が向上する可能性のあることを示唆する。ステンレス鋼製生体刺激電極の回転曲げ疲労試験を310K、擬似体液であるHanks溶液中および1%乳酸溶液中で行い、疲労強度、疲労試験中のイオン溶出挙動および摩耗紛発生に関して以下の結果を得た。1.生体刺激用電極材料として開発されたFe-22Cr-10-Ni-6Mo-0.4Nオーステナイト系ステンレス鋼は、低曲げ応力領域において従来材であるSUS316Lよりも優れた疲労強度を示した。この優れた疲労特性は主に窒素添加の効果と考察した。2.1%乳酸溶液中においてはHanks溶液中よりも顕著な摩耗腐食に伴う擦過痕が観察された。3.1%乳酸溶液中における金属イオン溶出は、疲労試験時間に比例して増加した。これは、電極素線同士の摩擦によって電極表面における不動体皮膜の形成が阻害されるためと考えられた。いずれのステンレス鋼を用いた場合にも、溶出イオン濃度は、ステンレス鋼組成とほぼ一致した。4.疲労試験後にHanks溶液中における摩耗紛として、棒状のβ-FeOOH、および粒子状のα-FeOOHやγ-FeOOHの存在が確認された。β-FeOOHは塩素イオン存在下における腐食生成物との報告があり、Hanks溶液は塩素を含有することから従来の報告と一致する結果であった。β-FeOOH中にはCrが固溶していることがEDX分析からわかり、β-(FeCr)OOH形成がHanks溶液中における低いFeおよびCrイオン濃度の原因と考えられた。現在は、生体刺激電極の疲労特性に及ぼす活性酸素種H_2O_2の影響を明らかにするために、Hanks溶液+(100-1000mMH_2O_2)における回転曲げ疲労試験を行っている。

昨年度、ステンレス鋼製生体刺激電極の回転曲げ疲労特性を310K、擬似体液であるHanks溶液中および1%乳酸溶液中で明らかにしたが、本年度はチタン材料製細線を用い、その回転曲げ疲労特性を検討し以下の結果を得た。1.市販の直径100μmのC.P.チタン細線では、1%乳酸中と蒸留水中において疲労強度に差異はなかった。しかしながら、回転曲げ疲労試験中におけるチタンイオン溶出量は1%乳酸中の方が多いことがわかった。いずれの溶液中においても、チタンイオンの溶出が確認されたことは、回転曲げに伴い不動態皮膜が破壊され、その再生が十分ではないことを示唆するものである。2.当研究室で開発したβ型チタン合金(Ti-14Mo-3Nb-1.5Zr-0.08O)を素材として作製した直径100μmの細線では、C.P.Tiよりも高い疲労強度が得られた。この原因は合金化に伴い、強度が向上したためと考えられる。3.チタン系材料の疲労強度は引張り強度の56割程度と考えられているが、市販の直径100μmのC.P.チタン細線では約3割に留まった。これは細線化プロセスにおいて形成された表面のクラックが疲労破壊の起点となったためと考えられる。4.DLC(diamond like carbon)をコーティングした直径100μmのC.P.チタン細線では、処理プロセスにおいて引張り強度が減少したため、疲労強度が未処理材よりも低下したものの疲労強度は引張り強度の7割程度となった。これらは、DLCコーティングプロセスの最適化によりチタン細線の疲労特性が向上する可能性のあることを示唆する。また、疲労試験中にDLCと基板のTi線の中間のCr相やWC相からのCrやWイオンの溶出が確認された。生体中へ応用する場合には、これらの中間コーティング相の選択も重要であることがわかった。
後期インド唯識思想におけるインド知識論及び中観思想との関連

本研究は,後期インド仏教思想史における重要な思想家Jnanasrimitra(ジュニャーナシュリーミトラ,10-11世紀頃)のサンスクリット語で書かれた著作『不二一元摘要論(Advaitabinduprakarana)』の校訂・内容分析を行い,後期インド唯識思想におけるインド知識論及び中観思想との関連を解明しようとするものである.平成16年度は,前年度までに完成済みの校訂テクスト及び和訳研究(将来的に出版・公表の予定)に基づき,Jnanasrimitraの唯識思想が中観思想及びインド後期知識論とどのように関連するかを明らかにし,インド唯識思想史・インド知識論における当該テクストの位置・意義を確定することに努めた.またその際,校正済みデータベースを研究補助手段として積極的に活用した.具体的な作業成果は,以下の3点である.a)Jnanasrimitraは唯識説(vijnanavada)を「顕現しつつあること(prakasamanatva)」と解釈するが,ヒンドゥー教諸派の後期知識論である誤認理論(khyativada)にも言及する.その際,特定の学派・著者名は挙げないが,anyathakhyati, asatkhyatiなど誤認理論における中心概念を取り上げて「顕現しつつあること」と対比させながら批判している事実を明らかにした.このことは,Jnanasrimitraの唯識説のインド知識論における位置づけを知る上で重要である.b)当該テクストには,Jnanasrimitraに先行するプラジュニャーカラグプタ(Prajnakaragupta,8世紀頃)の学説を中観説と同一視する記述がある.その根拠は,両者の認識論が「存在・非存在・存在かつ非存在・存在でも非存在でもない」という四つの選言肢を超越している点にあるようである.ただし,Prajnakaraguptaの著作のどの箇所が念頭に置かれているかという点については,未だ検討の余地がある.c)併せて,Jnanasrimitraに大きな影響を彼に及ぼしたDharmakirti(ダルマキールティ,6-7世紀頃)が,唯識説への一種の橋渡しとして用いる「外界存在推知説」について,インド諸注釈者の説を参照しながら分析した.(1)当該テクスト及び関連文献の写本マイクロフィルム(ゲッティンゲン大学図書館所蔵)を購入し(消耗品費),フィルムスキャナ(設備備品費)を用いてコンピュータに入力した後,それを活用して当該テクスト写本のローマ字転写を行い,テクスト校訂のための基礎資料を作成した.(2)必要な関連図書の整備を行った.(設備備品費)(3)従来誤入力の多かったジュニャーナシュリーミトラの著作データベースの校正作業を,関連分野専攻の学生に依頼し,研究環境の整備に努めた.(謝金)(4)国内外の学会・研究会に出席し,本研究に関連する主題について以下の研究発表を行うとともに,本研究の方向性などに関して他の研究者と意見交換を行った.(国内外旅費)(1)Jitari著Dharmadharmiviniscayaについて,韓・日共同印度学仏教学学術大会(於東国大学校,ソウル),2002.7.6.(2)Jnanasrimitraにおける存在性の概念について-反復を伴う知覚(abhyasavatpratyaksa)との関連をめぐって-,東京大学文学部印度哲学研究室第156回研究例会(於東京大学),2002.9.27.このうち(1)では本研究が主として扱うジュニャーナシュリーミトラと密接な思想的関連を持つと思われる人物であるジターリの著作について検討を行った.(2)ではジュニャーナシュリーミトラにおける存在性の概念について,また(3)では彼の知覚概念について考察した.両者ともに本研究の遂行に際して前もって検討が必要な問題であり,それをなしえたことは,今年度の最も大きな実績と見なすことができる.本年度の研究実績の概要は以下の通りである.(1)前年度に作成したテクスト校訂のための基礎資料に基づきつつ,テクスト校訂及び和訳註研究の作成を進めた.和訳註研究の作成に際して,特に今年度は,ジュニャーナシュリーミトラの他著,及び引用される他学派の著作との関係を同定することに勤めた.(2)必要な関連図書の整備を行った.(設備備品費)(3)従来誤入力の多かったジュニャーナシュリーミトラの著作データベースの校正作業を,関連分野専攻の学生に依頼し,研究環境の整備に努めた.(謝金)(4)国内外の学会・研究会に出席し,本研究に関連する主題について以下の研究発表を行うとともに,本研究の方向性などに関して他の研究者と意見交換を行った.(国内外旅費)本発表では,本研究計画における当該テクストでも主要なテーマとなる,ジュニャーナシュリーミトラにおける存在性の概念について考察した.ジュニャーナシュリーミトラにおける存在性は,一方では効果的作用の概念という側面を,他方では知における形象の顕現という側面を有している,と見なすことができる.この点は本研究の遂行に際して根幹をなす論点であり,それを明確なかたちで提示しえたことは,今年度の最も大きな実績と見なすことかできる.本研究は,後期インド仏教思想史における重要な思想家Jnanasrimitra(ジュニャーナシュリーミトラ,10-11世紀頃)のサンスクリット語で書かれた著作『不二一元摘要論(Advaitabinduprakarana)』の校訂・内容分析を行い,後期インド唯識思想におけるインド知識論及び中観思想との関連を解明しようとするものである.

平成16年度は,前年度までに完成済みの校訂テクスト及び和訳研究(将来的に出版・公表の予定)に基づき,Jnanasrimitraの唯識思想が中観思想及びインド後期知識論とどのように関連するかを明らかにし,インド唯識思想史・インド知識論における当該テクストの位置・意義を確定することに努めた.またその際,校正済みデータベースを研究補助手段として積極的に活用した.具体的な作業成果は,以下の3点である.a)Jnanasrimitraは唯識説(vijnanavada)を「顕現しつつあること(prakasamanatva)」と解釈するが,ヒンドゥー教諸派の後期知識論である誤認理論(khyativada)にも言及する.その際,特定の学派・著者名は挙げないが,anyathakhyati, asatkhyatiなど誤認理論における中心概念を取り上げて「顕現しつつあること」と対比させながら批判している事実を明らかにした.このことは,Jnanasrimitraの唯識説のインド知識論における位置づけを知る上で重要である.b)当該テクストには,Jnanasrimitraに先行するプラジュニャーカラグプタ(Prajnakaragupta,8世紀頃)の学説を中観説と同一視する記述がある.その根拠は,両者の認識論が「存在・非存在・存在かつ非存在・存在でも非存在でもない」という四つの選言肢を超越している点にあるようである.ただし,Prajnakaraguptaの著作のどの箇所が念頭に置かれているかという点については,未だ検討の余地がある.c)併せて,Jnanasrimitraに大きな影響を彼に及ぼしたDharmakirti(ダルマキールティ,6-7世紀頃)が,唯識説への一種の橋渡しとして用いる「外界存在推知説」について,インド諸注釈者の説を参照しながら分析した.
ナノ電気化学イメージングによる二次元電子系材料の触媒活性の可視化

グラフェンに代表される二次元材料は、原子レベルで平坦な構造を持ち特異な物性を示す。これらの材料は、当初、電子デバイス応用や基礎物性に関する研究に用いられていたが、近年では次世代エネルギー材料への応用も多くなされている。特に、貴金属材料から脱却し、高効率にエネルギー変換・蓄積を試みる研究は多く、水素の高効率な精製を期待した電極触媒反応などへの応用研究が盛んに行われている。しかし、これらの特異性が起こるメカニズムの解明には至っていない。その理由として、電気化学反応である電極触媒反応が、これらの材料の特異構造や領域による電子状態などに依存しているのにも関わらず、空間分解能のをもって評価することが困難であったからである。本研究では、この課題に電気化学顕微鏡の持つ電気化学反応を可視化技術である高分解能かつ反応領域を規定する計測技術:ナノ電気化学イメージングを用いて、これらの現象を解明することを目標としている。H30年度はグラフェンやSnS2、WS2など多様な二次元材料とそのエッジや層数などの構造の関係を水素発生反応を中心にメディエーターの酸化還元反応及び、酸素還元反応に関して研究を遂行した。その結果、二次元材料全般において電極触媒能がエッジ領域において高いことを見出し、また、構造的に類似する構造欠陥においても、同様の傾向が観測された。更に、グラフェンにおいてはそのエッジ領域において窒素やリンなどの元素種をドーパントとして導入することで高活性化を引き起こすことが電気化学イメージングから定量的に捉えることに成功した。グラフェンのエッジ及び構造欠陥における高い水素発生反応性をナノ電気化学イメージングにて定量的に評価可能となった。また、特定の元素をエッジ領域にドープすることでその反応性を向上させることが出来ることも見出すことが出来た。更に、他の二次元材料ではSnS2やWS2などの他の二次元材料にも展開することが可能となり、水素発生反応性を単層・二層を規定して評価することも可能となり層数による反応性もエッジ・ベーサルに分けて評価した。今後の研究方策として、他の二次元材料のみでなく、他の材料組み合わせや角度制御した二次元材料のヘテロ構造の研究にも展開していく。これらの研究を遂行することで、二次元電子系材料の高機能性のメカニズムのみならず、エッジ領域や構造欠陥を制御した最適な材料設計提案を構築できるような定量的な議論を進めていく。グラフェンなどに代表される二次元電子材料はその特異な物性からバルク特性を凌駕する。その特異性は電子素子への応用のみならず、エネルギー変換・蓄電デバイスへの応用が近年増しているが、それらの電気化学特性の分析評価法はバルク体を用いた平均的な特性評価に留まっている。本研究で用いたナノ電気化学イメージングは、通常の電気化学測定法と違い、高空間分解能を持ち電気化学測定が可能なナノ電気化学顕微鏡を用いて、電気化学反応に起因する電流応答を可視化するものである。この技術を用いて、二次元材料電子系、特に層状化合物を1原子厚まで剥離して得られた原子膜に応用した。例えば、グラフェンのエッジにおいてルテニウム錯体などのエディエータを用いた酸化還元反応特性が高く発現することを明らかにした。更に層数、アームチェア・ジグザグなどのエッジ構造、構造欠陥、しわなどを検討した結果、それぞれに反応性に違いを定量的に見出した。これらの反応性の違いは電子状態と酸化還元種の酸化還元電位との相関性に起因することを見出した。この知見を利用し、ナノ電気化学イメージングから得られた電流応答から、二次元材料におけるエッジ構造の違いや積層構造の違いを明確にすることにも成功した。これにより、積層構造が不明瞭であっても、エッジの反応性の有無から構造の特定も可能となった。また、ナノピペットの開口径の最適化や測定環境の整備により、空間分解能:50 nm(xy方向)、0.77 nm(z方向-反応電流応答による制御)、最小測定電流応答:0.2 pA程度、測定環境:グローブボックス内(H2O<0.1 ppm, O2< 0.1 ppm)測定を可能とした。グラフェンなどの二次元電子系材料の特異な電気化学特性の可視化に成功した。メディエータの酸化還元反応を利用したナノ電気化学イメージング結果から、材料構造による反応性の違いが明らかになった。また、グラフェン二層分のエッジ構造における高い電流応答を観察することにも成功した。それらの結果から、通常のエッジ構造のみならず、しわや層数が反応性に及ぼす影響も電流応答性として定量的に捉えた。二次元電子材料は、その理想的な二次元構造により、バルク特性では発現しない特異な物性を示す。その特異性を利用し、従来の電極触媒能を凌駕した材料の開発・研究が盛んに行われている。特にグラフェンに代表される原子膜をエネルギー材料として応用する試みは、レアアースフリーの電極触媒として期待されており、国際的にも研究競争の激しい分野である。本研究で用いたナノ電気化学イメージングは、50 nm程度の高空間分解能で材料の電気化学反応に起因した電流応答をその場観察することが可能である。これにより、既存の電気化学測定法と違い、空間分解能を持って評価することで二次元電子系材料の高反応性の律速要因の特定が可能となった。H29年度はグラフェン試料を準備し、水素発生反応や酸素還元反応などの電極触媒反応のナノ電気化学イメージングの取得に成功した。各測定は、グローブボックス内の雰囲気環境制御下にて反応系を制御することで、電極触媒能のその場観察の検証を行った。

その結果、エッジ構造における電極触媒能が高いことが視覚的かつ定量的に評価することが可能となった。また、他の二次元電子系材料、特に層状化合物を原子膜化した超薄膜に関しても検証を行った。その結果、グラフェンと比較すると、エッジ構造による電極触媒反応が必ずしも高い反応性を示すものでもないことを明らかにした。その他にも絶縁性を示す原子膜でも層数に依存し、触媒能が顕著にみられるなどナノ電気化学イメージングの可視化技術により材料の特異な電極触媒反応の検証が可能となってきた。H29年度はナノ電気化学イメージング技術を用いて、電極触媒反応をその場観察で計測することに成功した。特に測定雰囲気を制御し、水素発生反応や酸素還元反応などを切り分けて評価することが可能となった。また、その他の材料への応用も可能となり、二次元電子系材料の電気化学反応における特異性の分析が可能となりつつある。グラフェンに代表される二次元材料は、原子レベルで平坦な構造を持ち特異な物性を示す。これらの材料は、当初、電子デバイス応用や基礎物性に関する研究に用いられていたが、近年では次世代エネルギー材料への応用も多くなされている。特に、貴金属材料から脱却し、高効率にエネルギー変換・蓄積を試みる研究は多く、水素の高効率な精製を期待した電極触媒反応などへの応用研究が盛んに行われている。しかし、これらの特異性が起こるメカニズムの解明には至っていない。その理由として、電気化学反応である電極触媒反応が、これらの材料の特異構造や領域による電子状態などに依存しているのにも関わらず、空間分解能のをもって評価することが困難であったからである。本研究では、この課題に電気化学顕微鏡の持つ電気化学反応を可視化技術である高分解能かつ反応領域を規定する計測技術:ナノ電気化学イメージングを用いて、これらの現象を解明することを目標としている。H30年度はグラフェンやSnS2、WS2など多様な二次元材料とそのエッジや層数などの構造の関係を水素発生反応を中心にメディエーターの酸化還元反応及び、酸素還元反応に関して研究を遂行した。その結果、二次元材料全般において電極触媒能がエッジ領域において高いことを見出し、また、構造的に類似する構造欠陥においても、同様の傾向が観測された。更に、グラフェンにおいてはそのエッジ領域において窒素やリンなどの元素種をドーパントとして導入することで高活性化を引き起こすことが電気化学イメージングから定量的に捉えることに成功した。グラフェンのエッジ及び構造欠陥における高い水素発生反応性をナノ電気化学イメージングにて定量的に評価可能となった。また、特定の元素をエッジ領域にドープすることでその反応性を向上させることが出来ることも見出すことが出来た。更に、他の二次元材料ではSnS2やWS2などの他の二次元材料にも展開することが可能となり、水素発生反応性を単層・二層を規定して評価することも可能となり層数による反応性もエッジ・ベーサルに分けて評価した。二次元電子系材料の電極触媒反応のナノ電気イメージングを行うために、測定雰囲気の制御や他の材料の評価につなげる予定である。特にグラフェンの水素発生反応や酸素還元反応などの電極触媒能に関しては、燃料電池用の次世代電極としても期待されており、これらの反応系の検証を行う。
筋増強可能な筋骨格型ヒューマノイドの感覚運動系の自律的発達システムの構成法

本年度は最終年度に当たり,感覚運動系の自律的発達システムの研究を行い,感覚系・運動系の性能を飛躍的に向上した感覚運動系の発達研究プラットフォームとして筋骨格型ヒューマノイド「小次郎」の開発を完了し,感覚情報に基づく足踏み動作,立ち上がり動作,視覚追跡動作,分布多次元触覚情報に基づく寝返りなどの感覚運動を実現した.1.センサ・アクチュエータ性能を飛躍的に向上した筋骨格型ヒューマノイド小次郎温度制御によるアクチュエータ出力制御法や高再現性高信頼性のセンサ構成法などの研究により,これまでに研究代表者らが開発してきた腱駆動ロボットの性能を飛躍的に向上した,感覚運動系の発達研究のプラットフォームとして利用できる筋骨格ヒューマノイド「小次郎」を開発した.2.感覚運動系の発達法研究多種多数のセンサ情報をリアルタイムに運動情報に反映する感覚に密に結合した運動実現法を示した.実世界繰り返し実験に耐えるプラットフォーム小次郎の完成により,足首部六軸力センサ・各筋張力・電流センサ・関節角度推定センサなどの情報に基づく反射的足踏み行動を実現した.3.外界内界センサの統合に基づく感覚運動系の学習適応連続的学習が可能なR学習により,外界センサとしての視覚情報と各種内界センサに基づく運動指令の自律的発達法が可能な手法を示した.また,ニューラルネットワークと遺伝的アルゴリズムによる,感覚運動系の学習適応の枠組みを示し,分布多次元触覚を内蔵したウレタンの柔軟外装を持つヒューマノイドの寝返り行動の実現法を示した.初年度の本年度は、人間の身体構造に学んだ筋骨格型ヒューマノイド「小太郎」を開発し、筋増強可能システム構築、感覚運動情報収集システム構築、シミュレーション環境構築などを行い、本研究課題の基礎を固めた。1)筋骨格型ヒューマノイド「小太郎」の開発超多自由度・可変柔軟性・脊椎・筋骨格型などの特徴を有し、張力センサ内蔵の筋約100本・多種多数のセンサ(カラー二眼、ステレオ聴覚、筋の張力センサ・温度センサ・電流センサ、分布触覚、肉質触覚、関節角度)を搭載している。非線形の非常に高いシステムで、現在は人間による試行錯誤により行動デモを行うことができるレベルであるが、感覚運動系の自律発達システムが必要不可欠なプラットフォームである。2)筋増強可能システムの構築電気モータとプーリを組み合わせて、追加や配置変更が容易な筋ユニットを設計・製作した。張力センサを内蔵し力制御が可能である。筋追加による下半身の増強試験などを行い、筋増強可能であることを確認した。3)感覚運動情報収集システムの構築「小太郎」の全身の約100のアクチュエータ、数百のセンサ情報を、リアルタイムで記憶するシステムを構築した。来年度以降に感覚運動系の自律獲得の研究を進めるベースとなる。4)筋骨格ヒューマノイドのためのシミュレーション環境の構築実機を動かすシステムと同じインタフェースで、筋指令・張力などのセンサ情報収集が可能な、シミュレーション環境を構築した。力の入れ方を探索するなどの、学習・探索に有効である。本年度は計画の二年目であり、感覚運動系の自己獲得に関する研究、筋骨格型ヒューマノイドの運動性能向上に関する研究などを行った。また、実世界で継続的に実験を行い、データ収集が可能になるように、耐故障性を向上し、アクチュエータの出力を向上した、次期版筋骨格ヒューマノイドの設計と製作を進めている。○多自由度多感覚系のロボットの並列自律反応系の構成法に関する研究多種多数のセンサを備え、アクチュエータ数の多いロボットのビヘイビアを構成するための手段として、複数の自律反応要素のプログラムが、非同期並列的に同時に走ることにより、その総和としてのヒューマノイドの行動の複雑性・多様性が向上し、知的な振る舞いを示すことができるようなシステム構成法を提案した。さらにそれを実装し、複数の多自由度多感覚ヒューマノイドにおける実験を通して、その有効性を示した。○感覚運動系の自己獲得に関する研究運動中の感覚情報の変化をモニターし、それに応じて運動系を調節することで、感覚に応じた運動指令を自律的に修正することができるようなシステムの研究を行った。筋骨格型ヒューマノイド小太郎によるクランク動作を例として取り上げ、手先・腕・肘・肩の感覚情報を監視し、どのような感覚情報のときに筋指令を送ればクランクがスムーズに回転するかを、試行錯誤的に獲得する方法を明らかにした。○筋骨格型ヒューマノイドの運動性能向上に関する研究さらに継続的な実験が可能なロバスト性と、這い這い・寝返り・屈伸・歩行などが可能な筋骨格型ヒューマノイドを目指して、大出力のモータを使用したヒューマノイド小次郎の設計と製作を進めた。現在下半身及び骨盤・背骨下部の第...次版が完成し、屈伸動作に成功した。本年度は最終年度に当たり,感覚運動系の自律的発達システムの研究を行い,感覚系・運動系の性能を飛躍的に向上した感覚運動系の発達研究プラットフォームとして筋骨格型ヒューマノイド「小次郎」の開発を完了し,感覚情報に基づく足踏み動作,立ち上がり動作,視覚追跡動作,分布多次元触覚情報に基づく寝返りなどの感覚運動を実現した.1.センサ・アクチュエータ性能を飛躍的に向上した筋骨格型ヒューマノイド小次郎温度制御によるアクチュエータ出力制御法や高再現性高信頼性のセンサ構成法などの研究により,これまでに研究代表者らが開発してきた腱駆動ロボットの性能を飛躍的に向上した,感覚運動系の発達研究のプラットフォームとして利用できる筋骨格ヒューマノイド「小次郎」を開発した.2.感覚運動系の発達法研究多種多数のセンサ情報をリアルタイムに運動情報に反映する感覚に密に結合した運動実現法を示した.

実世界繰り返し実験に耐えるプラットフォーム小次郎の完成により,足首部六軸力センサ・各筋張力・電流センサ・関節角度推定センサなどの情報に基づく反射的足踏み行動を実現した.3.外界内界センサの統合に基づく感覚運動系の学習適応連続的学習が可能なR学習により,外界センサとしての視覚情報と各種内界センサに基づく運動指令の自律的発達法が可能な手法を示した.また,ニューラルネットワークと遺伝的アルゴリズムによる,感覚運動系の学習適応の枠組みを示し,分布多次元触覚を内蔵したウレタンの柔軟外装を持つヒューマノイドの寝返り行動の実現法を示した.
減数分裂におけるリン脂質の役割

クローニングした分裂酵母のホスファチジルイノシトール3キナーゼ遺伝子を用いて遺伝子破壊株を作成した。その表現形を注意深く検討したところ、パン酵母において報告されている表現型(高塩濃度に感受性、高温に感受性など)の他に接合能、胞子形成能が極端に低下していることがわかった。そこで、その原因を追求するため、細胞周期に異常があるかを検討した。ホスファチジルイノシトール3キナーゼ遺伝子破壊株と野性株をYPD培地で生育させた後、SPO培地に移し替えた。フローサイトメトリーによるDNA含量の検討の結果、栄養源飢餓のため野生株ではG1期に静止したが、破壊株ではこれが起こらなかったことがわかった。また、野生株では生存率が高いのに比べ、野生株ではG1期に静止できないため死滅していくこともわかった。このことが接合不能、胞子形成不能の原因と考えられる。さらに検討を進めるために、ホスファチジルイノシトール3キナーゼ遺伝子破壊株の各種表現型に対するsuppressor変異株の取得を試みた。最も明瞭な表現型である高カリウムイオン感受性、胞子形成不能、接合不能について検討した結果、高カリウムイオンに対する挙動、接合能について表現型の回復した株を数種取得できた。高カリウムイオン耐性株には温度感受性が回復するなど各種ストレスに対する感受性も回復した株が存在したが、胞子形成能、接合能も回復した株はなかった。また、接合能の回復した株の中には胞子形成能も回復した株はあったが、上記のストレスに対する感受性の回復したものはなかった。したがって、ホスファチジルイノシトール3キナーゼの下流はストレス感受性に関する遺伝子系統と胞子形成・接合に関する遺伝子系統の二つに分れていると考えられた。
運動ニューロンの生存・維持に関わる分子の作用機序の解明と疾病との関連

神経細胞は発生の初期に過剰に産生され、分化の過程で約半数が死に至る。このような運動ニューロン自然細胞死に関わる分子、さらには成熟運動ニューロンの分化生存維持に関わる分子を同定し作用機序を解明していくことは、運動ニューロン病を始めとする種々の神経変性疾患発症機構の解明および治療法の開発に結びつくと考える。ニワトリ胚脊髄では、孵卵後4日から10日目の間に、運動ニューロンの自然細胞死がおこり、残った未分化である細胞群が劇的な変化を起こし、神経系としての機能を獲得することが知られている。この期間のニワトリ胚脊髄神経細胞の生存および分化に関与する遺伝子のスクリーニングを行い、新規細胞増殖因子(spinal cord-derived growth factor)を始めとする、数種の興味深い遺伝子を単離した。これらの遺伝子の発現パターンについては、northern blotting法、in situ hybridization法で解析した。さらに、いくつかの遺伝子の相同遺伝子について、マウス脳からのneurosphereを用いた機能解析を行っている。また、私達は、ニワトリの自然細胞死が起こる胚期の運動ニューロン初代培養系に対し生存活性を示す物質を骨格筋から分離精製したが、得られた物質は、タンパクではなく7SL-RNAのニワトリ相同遺伝子であることがわかった。in situ hybridizationの結果は、7SL-RNAは運動ニューロン自然細胞死に関与している可能性を強く示唆するものであった。そこで、7SL-RNAの機能を個体レベルで解析するために、エレクトロポレーション法を用いたin ovo RNA interference法を確立し、検討を行っているが、7SL-RNAのRNAiによるノックダウンにより、細胞死が誘導されることがわかってきている。同様の方法を用いて、これまでクローニングしてきた遺伝子に機能解析も行う準備をしている。
断層と断層内プロセス

本研究の目的は、「断層」をキーワードに,地震と地震予知・地球内物質大循環・廃棄物処分問題など,学問的にも社会的にも重要性の高い問題に焦点をあてながら,断層と断層内プロセスを総合的・学際的に研究することである.2年間の研究期間に以下のような成果を得た.(1)精密イオンポリシャー(米国ガタン社製,691型)を導入して,透過型電子顕微鏡による変形微細組織の観察を組織的に進める体制を整えた,(2)断層と深部断層岩のカタログ作り:断層に関する膨大な文献を整理し,断層をみる統一した視点を確立して,様々なテクトニクス場で形成された断層の特徴と多様性を把握するためには,断層のカタログを作る必要がある.本研究では,3つの断層を選んでカタログの雛形を作成した.3年後を目処にカタログを出版する体制を整えた.(3)リソスフェアの強度断面の決定と新しい断層モデルの提唱:高温二軸試験機を用いて,地温勾配と同様に温度を圧力に比例して増加させて,リソスフェアを横断する形で岩塩剪断帯の強度断面を初めて決定した.実験結果は既存のどの断層モデルとも異なる.実験結果に基づいて新しい断層モデルを提唱した.(4)高速摩擦の性質に基づいて地震の2段階発生論を提唱した.この説は,既存の断層の構成則に基づいて予想される地震の震源核が不安定になって断層が加速すると,高速領域にはいってvelocity strrengtheningのバリアによって断層の加速が抑えられ,断層がこのバリアを乗り越えた時に地震の発生に至るというものである.地震の第2種空白域がこのモデルによって説明できる可能性がある.本総合研究の目的は,『断層』をキーワードに,地震と地震予知・地球内物質大循環・廃棄物処分問題(放射性廃棄物に限らない)など,学問的にも社会的にも重要性の高い問題に焦点をあてながら,断層と断層内プロセスを総合的・学際的に研究することである。本年度は,以下の点において次年度に向けて有益な体制を整えることができた。(1)透過型電子顕微鏡用の試料作成装置の導入:本科研費補助金を用いて最新式の精密イオンポリシャー(米国ガタン社製,691型)を導入することができ,透過型電子顕微鏡(科学研究費補助金(一般A,代表者:嶋本利彦)を用いて購入)による変形微細組織の観察を組織的に進める体制が整った。これによって来年度以降,総研参加者による変形微細組織の観察が容易になった。(2)地震研究所に設置されている高温二軸変形試験機と高速摩擦試験機の調整を進め,断層モデルと地震性断層運動時の断層内プロセスに関する非常に新しい成果が得られた。変形試験機を総研参加者の利用に供する体制も整った。(3)甚大な被害をだした兵庫県南部地震以降,地震予知に関する学際的な研究の必要性が一層認識されるようになった。本総研では,当初計画をさらに拡張し,電磁気的及び地球化学的な地震の前兆現象の発現機構をも含める形で総合研究を進めることにした。本年度は,そのための拡大された研究の枠組みを作り直し,組織作りも始めることができた。本研究の目的は、「断層」をキーワードに,地震と地震予知・地球内物質大循環・廃棄物処分問題など,学問的にも社会的にも重要性の高い問題に焦点をあてながら,断層と断層内プロセスを総合的・学際的に研究することである.2年間の研究期間に以下のような成果を得た.(1)精密イオンポリシャー(米国ガタン社製,691型)を導入して,透過型電子顕微鏡による変形微細組織の観察を組織的に進める体制を整えた,(2)断層と深部断層岩のカタログ作り:断層に関する膨大な文献を整理し,断層をみる統一した視点を確立して,様々なテクトニクス場で形成された断層の特徴と多様性を把握するためには,断層のカタログを作る必要がある.本研究では,3つの断層を選んでカタログの雛形を作成した.3年後を目処にカタログを出版する体制を整えた.(3)リソスフェアの強度断面の決定と新しい断層モデルの提唱:高温二軸試験機を用いて,地温勾配と同様に温度を圧力に比例して増加させて,リソスフェアを横断する形で岩塩剪断帯の強度断面を初めて決定した.実験結果は既存のどの断層モデルとも異なる.実験結果に基づいて新しい断層モデルを提唱した.(4)高速摩擦の性質に基づいて地震の2段階発生論を提唱した.この説は,既存の断層の構成則に基づいて予想される地震の震源核が不安定になって断層が加速すると,高速領域にはいってvelocity strrengtheningのバリアによって断層の加速が抑えられ,断層がこのバリアを乗り越えた時に地震の発生に至るというものである.地震の第2種空白域がこのモデルによって説明できる可能性がある.本研究の目的は,「断層」をキーワードに,地震と地震予知・地球内物質大循環・廃棄物処分問題など,学問的にも社会的にも重要性の高い問題に焦点をあてながら,断層と断層内プロセスを総合的・学際的に研究することである.2年間の研究期間に以下のような成果を得た。(1)精密イオンポリシャー(米国ガタン社製,691型)を導入して,透過型電子顕微鏡による変形微細組織の観察を組織的に進める体制を整えた.(2)断層と深部断層岩のカタログ作り:断層に関する膨大な文献を整理し,断層をみる統一した視点を確立して,様々なテクトニクス場で形成された断層の特徴と多様性を把握するためには,断層のカタログを作る必要がある.

本研究では,3つの断層を選んでカタログの雛形を作成した.3年後を目処にカタログを出版する体制を整えた.(3)リソスフェアの強度断面の決定と新しい断層モデルの提唱:高温二軸試験機を用いて,地温勾配と同様に温度を圧力に比例して増加させて,リソスフェアを横断する形で岩塩剪断帯の強度断面を初めて決定した.実験結果は既存のどの断層モデルとも異なる.実験結果に基づいて新しい断層モデルを提唱した.(3)高速摩擦の性質に基づいて地震の2段階発生論を提唱した.この説は,既存の断層の構成則に基づいて予想される地震の震源核が不安定になって断層が加速すると,高速領域にはいってvelocity strrengtheningのバリアによって断層の加速が抑えられ,断層がこのバリアを乗り越えた時に地震の発生に至るというものである.地震の第2種空白域がこのモデルによって説明できる可能性がある.
色素細胞の分化調節機構の解明

1.小眼球症関連転写因子(MITF)はチロシナーゼとチロシナーゼ関連関連タンパク1(TRP-1)遺伝子のプロモーター機能を活性化するが、TRP-2遺伝子プロモーターに対しては影響を及ぼさなかった。一方、C末端領域を欠くMITFはチロシナーゼプロモーターの活性化能を失うが、TRP-2プロモーターを著明に活性化した。よって、同領域はMITFの機能を制御すると推定される。そこで、MITFのC末端領域と相互作用する因子をイ-ストTwo Hybrid法にて探索した結果、複数の新規cDNAを単離した。2.3種の新規MITFアイソフォームを発見し、A、B、H型と命名した。次いで、既知のMITFがメラノサイトとメラノーマのみで発現されていることを明らかにし、M型と命名した。これらのアイソフォームのN末領域は互いに異なっているが、C末領域はすべてに共通である。A型とH型MITFのRNAは種々の培養細胞・組織で発現しているのに対し、B型mRNAの発現はメラノサイトと網膜色素上皮細胞(RPE)では検出できなかった。さらに、マウス胎児脳切片を用いたin situハイブリダイゼーションにより、A型あるいはH型がRPEで多く発現していることを明らかにした。A型はM型と同様にチロシナーゼとTRP-1遺伝子のプロモーター機能を活性化するが、TRP-2プロモーターに対しては影響を及ぼさなかった。一方、B型とH型は上記プロモーター活性には有意な影響を及ぼさなかった。よって、A型がRPEにおけるメラニン生成を制御すると考えられる。(論文投稿中)。3.転写抑制因子としてラットで発見されていたTFECのヒトアイソフォーム(TFECL)をcDNAクローニングにより同定した。ラットニューロフィブロミンの完全長cDNAのクローニングにより、全アミノ酸配列を明らかにした。(論文投稿中)。1.小眼球症関連転写因子(MITF)はチロナーゼ関連タンパク1 (TRF-1)遺伝子のプロモーター機能を活性化するが、TRF-2遺伝子プロモーターに対しては有意な影響を及ぼさなかった。2.種々の領域を欠失させたMITFの変異体の機能解析の結果、C末端領域を欠くMITFはチロシナーゼ遺伝子プロモーターの活性化能を失うが、TRF-2遺伝子プロモーターを著明に活性化した。従って、MITFのC末端は標的遺伝子の選択に関与することが示唆される。3.cDNAクローニングにより、MITFにはプロモーター領域とN末端が異なるアイソフォームが存在することが示唆された。MITF遺伝子の色素細胞特異的転写調節機構を解析するために、MITF遺伝子の未知のプロモーター領域を含むコスミドクローンを単離し、現在解析中である。4.MITFアイソフォームを探索する過程で、転写抑制因子としてラットで発見されていたTFECのアイソフォーム(TFECL)をcDNAクローニングにより同定した。さらに、TFECLが転写活性化機能を持つことを明らかにした。なお、TFECLには、ラットTFECでは欠落している転写活性化ドメインが存在すると考えられる。5.ヒトチロシナーゼ遺伝子の5'上流領域には、それぞれ1コピーのCATGTGモチーフを含む3つの抑制領域が存在する。各制御領域の同モチーフに塩基置換を導入し、転写活性及びMITFによる活性化への影響を解析することにより、メラノサイト特異的転写への各制御領域の関与の程度を明らかにした。6.脳脈絡細胞由来のがん細胞よりアドレノメデュリンが分泌されることを見いだした。アドレノメデュリンは血管拡張性の降圧ペプチドであり、神経堤由来の褐色細胞腫での発現が高い。

7.ラットニューロフィブロミンの完全長cDNAのクローニングにより、全アミノ酸配列を明らかにした。色素細胞はメラノサイトと網膜色素上皮細胞(RPE)から成り、メラニン生成という特異な形質を有する。即知の小眼球症関連転写因子(MITF)がメラノサイトとメラノーマのみで発現されていることを明らかにし、同MITFをメラノサイト(M)型アイソフォームと命名した。次いで、cDNAクローニングにより、N末端が異なる3種の新規MITFアイソフォームを発見し、A、B、H型アイソフォームと命名した。以上の4つのアイソフォームのN末端領域は互いに異なっているが、C末端領域はすべてに共通である。A型とH型MITFのmRNAは調べたすべての培養細胞・組織で発現しているのに対し、B型MITF mRNAの発現はメラノサイト、メラノーマ、RPE,胎盤では検出できなかった。さらに、マウス胎児より採取した脳切片を用いたin situハイブリダイゼーションにより、A型あるいはH型アイソフォームがRPEに分化する細胞層で多く発現していた。一時的発現実験では、A型MITFはM型と同様にチロシナーゼとチロシナーゼ関連タンパク1(TRP-1)遺伝子のプロモーター機能を活性化するが、TRP-2遺伝子とM型MITFプロモーター活性に対しては有意な影響を及ぼさなかった。一方、B型とH型MITFは転写因子として機能することが示唆されるが、上記遺伝子プロモーター活性には有意な影響を及ぼさなかった。以上の結果により、A型MITFがRPEにおけるメラニン生成を制御すると考えられる。M型MITFはTRP2遺伝子には作用しないが、そのC末端領域を人為的に欠失されるとTRP2遺伝子のプロモーター機能を活性化する。よって、同領域はMITFの機能を仰制的に制御すると推定される。そこで、TRP2遺伝子の転写制御因子を同定するために、MITFのC末端領域と相互作用する因子をイ-ストTwo Hybrid法にて探索した結果、複数の新規cDNAを単離した。
麻痺性貝毒により毒化した養殖カキの減毒と有効利用に関する研究

広島湾では平成4年春に初めて麻痺性貝毒による養殖カキ等二枚貝の大規模な毒化が発生し、大きな産業的な被害を出した。毒化は規模は低いがその後2年続いており、毒化カキの利用等の対策の確立が望まれている。そこで本研究では毒化カキの食品としての有効利用を図るため、現行の加工処理による減毒試験及び、生きている二枚貝の有毒プランクトン投与等による毒化と減毒過程の毒性と毒組成の推移を調べ、以下の結果を得た。1)毒化したカキ(30MU/g)を原料にして燻製油漬け缶詰と水煮缶詰を製造したところ、残存毒性は全て2.5MU/g未満で規制値を越えるものはなかった。オイスターソースでは原料の毒性90%が消失し、製品では不検出となった。乾燥カキでは規制値以上の毒性が残存した。加熱条件を十分考慮すれば、缶詰とオイスターソース製造では利用が可能と考えられた。2)無毒のアサリとカキに有毒プランクトンの培養細胞を10日間投与したところ、両者とも毒化は進行したが、毒の蓄積率は低く、毒性は前者で4.6MU/g、後者は1-4MU/gと毒化の程度は低かった。次に養殖イタヤガイ中腸腺の毒性の変化を毎月追跡した。毒性の最高値は5月上旬の45MU/gで、その時期は有毒プランクトン出現の時期と一致していた。その後の毒性の低下は緩慢で、アサリ、カキ等の剥き身の毒性が約1か月で不検出になるのに対し、半年後の翌年2月でも、マウス致死毒性が残存した。イタヤガイは中腸腺が大きく容易に得られ、かつ毒性が高いので、毒化の初期検知の指標として有効と判断された。また二枚貝の毒組成は有毒プランクトンのそれとは異なり、いずれも高毒成分のGTX群が主であった。