hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
地域に根差した木造住宅の長期耐用化支援方策に関する基礎的研究

本研究は、地域に根差した木造住宅を、安全かつ快適に長期間使い続けるための方策を探ることを目的としている。特に建物や居住者だけでなく、大工・職人、関連業者、設計者、行政など住宅の周囲を取り巻く主体との関わりをも視野に入れ調査・分析し、居住・所有時における木造住宅の長期耐用化支援方策を明らかにする。具体的には、民家や農家、町家などの伝統的木造住宅と、在来木造住宅とが共存する地域として、京都市地域と東広島地域を中心に事例を抽出し、両者の建物特性、居住履歴、居住者属性、ライフスタイル、住意識、維持管理行為、さらに大工・工務店や設計者、行政などの関わりなどについて、現地調査および関係者への聞き取り調査により比較・分析を行った。それらの結果、(1)子の転出、世代交代による建物相続時に建物の放置、老朽化、解体が発生しやすいこと(建物継承問題)、(2)伝統的木造住宅のデザイン・機能が相続者・後継者のライフスタイルにあわせた形で改変・更新されにくいこと(デザイン・技術問題)、密集市街地等で建物・敷地が小規模、長屋のように連棟形式である場合は特に困難であることが確認できた。また伝統的木造住宅を見直す動きがある一方で、(3)建物廃棄時期が不適切な維持管理・修繕行為、専門職による維持管理行為支援の低下、中古住宅・建材の保証・流通システムの未成熟さなどにより加速される場合も多々見られることも明らかになった。今後、木造建物の長期耐用化を図る上で、建物構造の安全性向上とともに、社会制度面での建物解体抑制支援(解体工事への課税、改修工事への経済的支援など)、健全な維持管理行為推進(定期的建物検査とその保証システム、経済的支援、中古住宅流通システム)とともに、現代的ライフスタイルに適したデザインや機能の開発支援、私的財産としてだけでなく社会的財産としての住宅の価値観の普及支援などの方策が考えられる。本年度は、既存研究および各種統計資料をレビューするとともに、京都、東広島を中心に民家、町家、在来木造住宅の類型化および抽出を行い、調査対象住宅を選定した。その後、建物特性、居住履歴、居住者属性、ライフスタイル、住意識、維持管理行為などについて、現地調査および聞き取り調査により分析を行った。既往研究・文献レビューでは、広島県、中国地域に分布する伝統的な民家、町家に関する関連文献・図書の収集を行った。また関係する研究者や実務経験者などに対する聞き取り調査を通じて、既往研究における論点、課題、研究手法等の整理を行った。また京都、東広島における木造住宅事例の類型化と抽出においては、既往研究や文献、現地観察などを通じて、建物特性、居住者特性の把握を試みるとともに、調査対象地域における民家、町家、および在来木造住宅の事例抽出を行うとともに、事例毎の建物特性、居住者・利用者属性、計画・設計プロセス、細部意匠・工法などの項目について、主に実務経験者への聞き取りを通じて情報の収集・整理を行い、居住プロセス、建物の改変、維持管理行為の基礎的資料を得た。さらに、これまで共同して調査活動を行ってきたNPOのメンバーと協働しながら、京都を中心に全国的に活動を行っているNPO法人古材バンクの会での研究メンバーとともに、これまでの調査経験を元に、木造建物の長期耐用化を実現する上での設計上、施工上の課題について検討を行うとともに、京都、中国地方における伝統的木造建物の再生事例の現地視察を行い、住宅生産システムおよび維持管理行為と、建物の長期利用の関係について基礎的資料を得た。
生成文法における統語構造のグラフ理論に基づく線状化に関する研究

生成文法理論の極小主義プログラムにおいて仮定されている素句構造から、言語理論から独立した数学・情報科学・計算機科学等の分野で確立されているグラフ理論を適用して線状的音形表現を得る方法を提案し、共有現象の分析に有効な多重支配構造にも適用可能であることを確認した。それには主要部移動を複数指定部への代入移動とし、音形表現は素句構造の終端記号としての主要部ではなく、その最大投射範疇ラベルの音形的線状化である。生成文法理論における言語表現としての線状的音韻形式は、グラフ理論的順序「木」とみなされる統語構造の終端記号にあたる形態列(単語列)から得られるものとして一般に仮定されてきたが、極小主義素形句構造理論では統語構造木の節点間には順序を仮定しておらず、いかに線状化されるかが問題となっていた。本研究課題の初年度である今年度は、素形句構造理論で仮定される二分木統語構造から、グラフ理論における巡回探索法を用いて線状的音韻形式を得る際に問題となる主要部付加構造を見直し、主要部移動は指定部への移動として移動先の一般化を行い、投射の継承性に着眼することにより、節点間の順序を仮定せずとも、非平面無順序二分木構造での巡回探索法による線状化が可能であることを究明した。上記の成果を基に、近年種々の言語現象の分析で提案されている多重支配構造に適用し、多重支配節点の巡回を適切に制御することにより、非平面無順序二分木構造での巡回探索法による線状化が適用可能であることも究明した。多重支配節点の巡回制御は、移動の顕在性に依存し、量化子・演算子移動に関しては類型論的に顕在性に差異があるが、無音の量化子・演算子の分岐構造を仮定することにより、類型論的に必要充分な記述が可能であることが解明された。これらの成果については、平成23年5月に南カリフォルニア大学で開催される平行領域に関するワークショップで口頭発表が決まっている。生成文法理論における言語表現としての線状的音韻形式は、グラフ理論的根付順序「本」とみなされる統語構造の終端記号にあたる形態から得られるものとして一般に仮定されてきたが、極小主義素形句構造理論では統語構造本の節点間には順序を仮定しておらず、いかに終端記号が音韻形式として線状化されるかが問題となっていた。本研究課題の二年目である今年度は、従来の根付順序「木」構造としての統語構造ではなく、近年、移動現象や共有省略現象等の種々の言語現象の分析に提案されている多重支配構造についての研究を行った。多重支配構造はグラフ理論的には根付無閉路有向グラフ(Rooted Directed Acyclic Graph : RDAG)であり、その終端記号(形態)から言語表現としての線状的音韻形式を得るには、多重支配されている節点を単独支配節点に刈込み、根付有向「木」に還元することにより、非平面無順序「木」でも深度優先探索による巡回走査法が適用可能であり、巡回走査アルゴリズム内に多重支配枝刈込みのアルゴリズムを組込むことが可能であることを究明した。この多重支配枝刈込みアルゴリズムはパラメータ化か可能であり、パラメータ値の設定は移動現象の顕在/潜在性の差異を具現化し、また省略現象における照応方向性と相補関係にある可能性が見えてきた。これは日本語のように調和的に主辞末尾で顕在的疑問詞移動が必須でない言語では、調和的に主辞先頭で顕在的疑問詞移動が必須である英語での右枝節点繰り上げ構文に構造的に対応する構文では前方省略が働いている可能性があることが判明した。これらの成果については、南カリフォルニア大学で開催された「平行領域に関するワークショップ」で口頭発表を行った。本研究の目的は、生成文法理論の極小主義プログラムにおいて問題となる、統語構造及びその線状化は、いかにあるべきかを学際的に究明することを全体構想とし、数学・情報科学・計算機科学等の分野で確立されているグラフ理論を用いて、言語理論に依存しない線状化方式を確立し、そのうえで問題となるグラフ理論的「木」と従来捉えられてきた統語構造を見直すことにあるが、最終年度となる平成24年度は、前年度までの成果を基に、グラフ理論での巡回探索アルゴリズムの理論的研究と、多重支配を許す統語構造の経験的・理論的研究を行った。

これまで生成文法理論による分析から経験的に提案されてきた多重支配統語構造は、グラフ理論的有向無閉路グラフ(Directed Acyclic Graph)と看做せるため、巡回探索アルゴリズムとして位相幾何学的ソート法(topological ordering)の適用可能性を検討したが、グラフ理論的には順序付けが一意には決定できず、経験的に個別言語に依存するパラメター化が必要であること、またパラメター化を規定すれば多重支配されている節点を単独支配節点に刈込み、根付有向「木」に還元することにより、非平面無順序「木」としての素句構造(Bare Phrase Structure)でも深度優先探索による巡回走査法が適用可能であり、パラメータ値の設定は移動現象の顕在/潜在性の差異を具現化し、また省略現象における照応方向性と相補関係にあり、日本語のように調和的に主辞末尾で顕在的疑問詞移動が必須でない言語では、調和的に主辞先頭で顕在的疑問詞移動が必須である英語での右枝節点繰り上げ構文に構造的に対応する構文では前方省略が働いている可能性があることを究明した。計画通り、多重支配構造の研究を進め、国際ワークショップでの発表に至った。24年度が最終年度であるため、記入しない。交付申請書に記載した通り、多重支配構造のアルゴリズムを位相幾何学的ソート法の観点から改良を試み、さらなる対象となる言語現象の精査を行う。
多機能化ビームラインの設計

世界の高エネルギー加速器施設にわが国より研究者を派遣し、ビームラインの多機能化推進計画の現状について資料を収集し、技術調査をおこなった。特にビームラインのスーパーサイクル運転、高速計算機制御、早い取り出しビーム用のビームライン要素の全般、及びそれを用いたニュートリノビームの発生、二次粒子蓄積リング等について重点的に技術調査した。特にマグネティックホーン並びに早いビーム用のモニター機器については、我国において建設途中(平成10年度末までに完成予定)である新型ニュートリノビームラインへの適用をも念頭において調査した。年度後半からは、わが国の現状に最も適した多機能化ビームラインの設計のまとめをおこなった。具体的には、(1)現在計画中のJHF加速器施設の50GeV陽子加速器(以下50GeV-PS)からの取り出しビームのためのビームライン並びに実験室を想定した。即ち、50GeV-PSにおける大強度陽子、偏極陽子、重イオンのスーパーサイクル加速と早い取り出しと遅い取り出しの一加速サイクル内での共存、早い取り出しビームによる反陽子ビームの生成と蓄積、冷却、減速といった一連の運転を可能にする加速器/ビームラインと実験室をシステムとして設計した。ニュートリノビームライン部分については上で述べたように、をおこなった。特にビーム強度モニター等については、今回調査した成果を生かした設計、試作がおこなわれ、実際に上記新型ニュートリノビームラインに設置した。なをこの新型ニュートリノビームラインは遅い取り出しビームラインとしても使用可能である。このような併用可能なビームラインは世界初であり、われわれの今回の調査が直ちに成果に結びついた好例である。今回の調査の目標は、世界の加速器施設における加速器・ビームラインのスーパーサイクル化を最終目標とする多機能化技術の最前線の状況を明らかにし、我国の加速器施設への具体的かつ最良の適用方法を検討し、最終的には具体的な多機能化ビームラインの設計を行う事である。この事は、今後の我国における加速器を用いた物理実験に非常に重要な貢献をなすと考えられ、また、加速器を用いた癌治療などの応用研究にとっても重要である。上記目的達成のため、世界の高エネルギー加速器施設にわが国より研究者を派遣し、多機能化推進計画の現状について資料を収集した。具体的には、まず偏極ビーム、電子ビーム、核ビーム及び大強度陽子ビームに関する個々の技術の調査を行い、継いでビームラインのスーパーサイクル運転、高速計算機制御、真空技術を含む早い取り出しビーム用のビームライン要素の全般、及びそれを用いたニュートリノビームの発生、二次粒子蓄積リング等について調査を行った。特にニュートリノビーム発生用のマグネティックホーンについて重点的に調査した。早い取り出しビーム用の特殊なビームモニターはサンプルを入手するとともに、必要に応じて国内でも試作し、わが国における唯一の高エネルギー加速器である高エネルギー物理学研究所の12GeV陽子シンクロトロン(以下KEK-PS)及び同ブ-スター・シンクロトロンからの取り出しビームラインに設置して試運転した。これらの資料をもとに、わが国の現状に最も適した真の多機能化ビームラインの、具体的な設計に着手する予定である。

具体的には、(1)現在計画中のJHF加速器施設の50GeV陽子加速器・(以下50GeV-PS)からの取り出しビームのためのビームライン並びに実験室を想定した。即ち、50GeV-PSにおける大強度陽子、偏極陽子、重イオンのスーパーサイクル加速と早い取り出しと遅い取り出しの一加速サイクル内での共存、早い取り出しビームによる反陽子ビームの生成と蓄積、冷却、減速といった一連の運転を可能にする加速器/ビームラインと実験室をシステムとして設計した。ニュートリノビームライン部分については上で述べたように、をおこなった。特にビーム強度モニター等については、今回調査した成果を生かした設計、試作がおこなわれ、実際に上記新型ニュートリノビームラインに設置した。なをこの新型ニュートリノビームラインは遅い取り出しビームラインとしても使用可能である。このような併用可能なビームラインは世界初であり、われわれの今回の調査が直ちに成果に結びついた好例である。
ヌクレオチド結合部位の動的構造の解析

生体内の糖代謝において中心的な役割をもつUDP-グルコースの合成と分解に与るUDP-グルコース合成酵素酵素について、重原子同型置換法によるX線結晶構造解析を行い、ソルベントフラットニングによる電子密度の改良の後、モデルビルディングを終了した。その結果、本酵素サブユニットは、大小2個のドメインで形成されており、その一方は、左巻きβらせん構造という新規なホールディングモチーフをもつことが明らかになった。また、これまでにジャガイモ酵素について、種々の親和標識試薬を用いる研究を行って、活性部位に存在する複数のリジン残基の同定とそれらの空間的配置の推定を行ってきたが、これらのリジン残基は、いずれも活性部位と考えられる領域に存在することが判明した。現在、この結晶構造の精密化と、糖ヌクレオチド結合部位を構成するアミノ酸残基を置換した各種変異型酵素の結晶化を行っている。また、糖ヌクレオチド基質を結合した酵素の構造を解析するとともに、基質結合過程の構造変化をラウエ法による時分割測定により解析中である。一方、アデニル酸キナーゼはAMPをリン酸化してADPを合成する酵素で、これまでにニワトリ筋肉酵素のヌクレオチド結合部位にあるリジン残基やその周辺に存在する数種のアミノ酸残基の役割を明らかにしてきた。平成7年度では、本酵素と同じ反応様式をもつが、基質特異正の異なるUMP-CMPキナーゼを対象として、タンパク質工学的手法による基質特異性の改変を試みるとともに、ヌクレオチド結合領域の動的構造をアデニル酸キナーゼと比較しながら解析した。
上衣細胞の細胞周期再開始・運命決定制御による脊髄損傷修復促進技術の開発

上衣細胞の細胞周期再開始と脱分化にp73,p53が関与することを証明することができなかった。しかし、上衣細胞特異的p73ノックアウトマウスを活用し、p73によるシリア形成制御機構に関する研究を行った。p73ノックインマウスを用いて、p73の発現と、シリア形成の表現型を解析した。p73のノックインマウスは、translational poralityの異常を来しているが、これは胎児期のprimary cilium(一次繊毛)の形成の異常が成体にまで影響を及ぼしていると考えられたこと、また、条件特異的ノックアウトマウスの解析結果から、一次繊毛異常が水頭症発症にもっとも寄与していると考えられた。平成26年から27年にかけての計画では、ノックアウトマウスを使ったloss of function実験を第1に掲げた。FoxJ1CreERT2::R26R-tdTomatoマウスを導入し、floxマウスと交配し、p73fl/fl::FoxJ1CreERT2::R26R-tdTomatoマウスを作成した。まず、このトリプルトランスジェニックマウスが正しく働いていることを確かめるために、脊髄ではなく、より発現の高い脳室上衣細胞、脈絡叢における免疫染色法による発現を指標として、タモキシフェン投与による、p73の発現の低下を確認した。p73fl/fl::FoxJ1CreERT2マウスにタモキシフェンを投与したところ、上衣細胞層においてp73の発現低下が確認された。また、p73ノックアウトマウスは水頭症を発症することから、シリア維持機能が予想されていた。しかし、p73ノックアウトマウスにおけるシリアをen-face法により可視化したが、予想に反して、tdTomatoの発現が認められるFoxJ1陽性細胞における、p73のノックアウトによっても、シリアや、基底小体の形成には変化が認められず、上衣細胞におけるp73はシリアの維持や、基底小体の形成等を制御しないと言うことが確認された。次に、脊髄損傷を置き、p73のノックアウトの効果を検討したところ、初期検討においては、p73がないと、より増殖が促され、分化が促進する傾向にあった。このことから、p73は脊髄中心管の上衣細胞の細胞周期を負に制御する可能性が示唆された。本研究の目的は、「脊髄損傷時にグリア前駆細胞へ脱分化する、脊髄中心管上衣細胞の細胞周期再開始及び脱分化を制御する分子メカニズムを解明すること」である。a)脊髄損傷モデル動物における中心管上衣細胞の細胞周期再開始と、グリア前駆細胞への脱分化にTAp73が関与することを証明する。b)in vitroでの脊髄損傷による脱分化モデルを単離培養中心管上衣細胞を用いて確立し、脱分化シグナルを同定する。c)b)で同定したシグナル制御及び、TAp73分子の蛋白制御を介した脱分化促進剤を開発する、が具体的な目的であった。しかし、実験を進めるに従って、a)の脊髄損傷モデル動物における中心管上衣細胞の細胞周期再開始と脱分化に、p73、p53が関与することを証明することができなかった。そこで、p73のノックアウトマウスが水頭症を来すことから、全く同じ遺伝子改変マウスを用いて、p73によるシリア形成制御機構に関する研究を行ったところ、p73が胎児期の上衣細胞の一次繊毛形成異常を来すことを示唆するデータを得た。それが、発展して、現在論文が完成し、投稿準備中である。また、中枢神経の損傷回復に関する研究も行っており、グリア瘢痕に発現するCSPGのPTPシグマ受容体を介するシグナル伝達経路について検討を行い、新たなシグナル候補としてNME2を同定し、論文として報告した。研究の方向性は変わったが、論文の投稿準備中で有り、早期に論文発表ができる可能性が高い。本研究は、a)脊髄損傷モデル動物における中心管上衣細胞の細胞周期再開始と、グリア前駆細胞への脱分化にTAp73が関与することを証明する。c)b)で同定したシグナル制御及び、TAp73分子の蛋白制御を介した脱分化促進剤を開発するが具体的な目的であった。しかし、実験を進めるに従って、a)の脊髄損傷モデル動物における中心管上衣細胞の細胞周期再開始と脱分化にp73,p53が関与することを証明することができなかった。しかし、Frisen研究室との共同研究により作成した、上衣細胞特異的p73ノックアウトマウスを活用するため、p73のノックアウトマウスが水頭症を来すことから、p73によるシリア形成制御機構に関する研究を行った。新たに作成したp73ノックインマウスを用いて、p73の発現と、シリア形成の表現型を解析した。p73の発現は、成体においても上衣細胞にて発現が確認された。しかし、成体においてノックアウトしても、水頭症は来さず、シリアの形成にも異常は来さなかった。また、先行研究から、二次繊毛形成との関与が疑われたため、生直後にp73をノックアウトしたところ、これによっても水頭症は来さないものの、p73ノックインマウスで観察された中脳水道の狭窄を認めた。

一方、p73のノックインマウスは、translational poralityの異常を来しているが、これは胎児期のprimary cilium(一次繊毛)の形成の異常が成体にまで影響を及ぼしていると考えられたこと、また、条件特異的ノックアウトマウスの解析結果から、一次繊毛異常が水頭症発症にもっとも寄与していると考えられた。これらのことを論文にまとめ、投稿し、reviewをうけ、revisionを投稿するに至った。研究の方向性は変わったが、論文を投稿し、リバイス実験を行った。早期に論文発表できる。本研究は、a)脊髄損傷モデル動物における中心管上衣細胞の細胞周期再開始と、グリア前駆細胞への脱分化にTAp73が関与することを証明する。b)in vitroでの脊髄損傷による脱分化モデルを単離培養中心管上衣細胞を用いて確立し、脱分化シグナルを同定する。c)b)で同定したシグナル制御及び、TAp73分子の蛋白制御を介した脱分化促進剤を開発することが具体的な目的であった。しかし、実験を進めるに従って、a)の脊髄損傷モデル動物における中心管上衣細胞の細胞周期再開始と脱分化にp73,p53が関与することを証明することができなかった。しかし、Frisen研究室との共同研究により作成した、上衣細胞特異的p73ノックアウトマウスを活用するため、p73のノックアウトマウスが水頭症を来すことから、p73によるシリア形成制御機構に関する研究を行った。新たに作成したp73ノックインマウスを用いて、p73の発現と、シリア形成の表現型を解析した。p73の発現は、成体においても上衣細胞にて発現が確認された。しかし、成体においてノックアウトしても、水頭症は来さず、シリアの形成にも異常は来さなかった。また、先行研究から、二次繊毛形成との関与が疑われたため、生直後にp73をノックアウトしたところ、これによっても水頭症は来さないものの、p73ノックインマウスで観察された中脳水道の狭窄を認めた。これらの成果を論文にまとめScientific Reportsに掲載された。上衣細胞の細胞周期再開始と脱分化にp73,p53が関与することを証明することができなかった。しかし、上衣細胞特異的p73ノックアウトマウスを活用し、p73によるシリア形成制御機構に関する研究を行った。p73ノックインマウスを用いて、p73の発現と、シリア形成の表現型を解析した。p73のノックインマウスは、translational poralityの異常を来しているが、これは胎児期のprimary cilium(一次繊毛)の形成の異常が成体にまで影響を及ぼしていると考えられたこと、また、条件特異的ノックアウトマウスの解析結果から、一次繊毛異常が水頭症発症にもっとも寄与していると考えられた。p73の上衣細胞特異的ノックアウトマウスの作成が完成したことから、脊髄損傷モデルにおける検討を開始した。実験成果が得られていることから、概ね順調に進展していると考えられる。方向性を転換し、p73によるシリア形成における分子機構を解明する。今後は、p73による一次繊毛形成制御機構を解明していきたいと考えている。
Ｃ型インフルエンザウイルスの出芽部位budozoneは脂質ラフト以外の形質膜か？

C型インフルエンザウイルスの出芽部位budozoneを明らかにすることが本研究の目標である。今までの成績から、出芽領域は形質膜の脂質ラフト以外の領域であることが示唆されている。これが真実であれば、新規のエンベロープウイルスの出芽部位を提唱することになる。そこでウイルス様粒子(VLP)産生細胞を解析することとした。CM2を大量に発現するVLP産生細胞(293T細胞)からは、野生型VLPと同様の形態をもつVLPが産生されていることを確認した。今年度(最終年度)では、VLP産生細胞を可溶化および不溶化成分に分画し、それぞれに含まれるウイルスタンパクを検出した。その結果、HEFとCM2の膜タンパク質の大部分はともに可溶化成分に回収された。膜タンパク質以外のタンパク(NP, M1, NS1, NS2)は、両方の成分に回収された。これらの結果は、VLPの出芽部位は脂質ラフト以外の領域であること、大量のCM2の発現によってもHEFの分布(すなわち出芽領域)に変化はなかったことを示唆している。このように、C型インフルエンザウイルスの出芽部位budozoneは、形質膜の脂質ラフト以外の領域であることを示唆する成績が得られた。今後は感染細胞を用いてその分子機構について明らかにすることが課題である。A型インフルエンザウイルスの主たる出芽部位は細胞膜(形質膜)表面の脂質ラフトlipid raftである。これに対し、代表研究者の村木靖は2007年、同じオルソミクソウイルス科に属するもののC型インフルエンザウイルスは主に脂質ラフト以外の領域の形質膜から出芽することを提唱した。しかしその詳細は不明であった。今般、C型インフルエンザウイルスM遺伝子の890位にA(アデニン)→C(シトシン)の変異をもつ組換えウイルス(MーA890C)を作製した。この変異はスプライシングのbranching pointを破壊するため、M遺伝子のスプライシングの効率が低下していた。結果としてMーA890C感染細胞においては、少量のM1タンパクと大量のCM2タンパクが発現した。そこで本研究では、MーA890C感染細胞とMーA890C粒子を詳細に解析し、MーA890Cの出芽部位が脂質ラフト以外の領域の形質膜である証拠をつかむこととした。本研究によってC型インフルエンザウイルスの出芽部位が脂質ラフト以外の領域の形質膜であることが明らかにされれば、エンベロープウイルスの第3の出芽様式を提唱することになる。MーA890C感染細胞に発現する大量のCM2タンパクは、低濃度の界面活性剤存在下での膜浮遊解析で脂質ラフトに親和性を示さなかった。すなわちCM2は、脂質ラフト以外の領域のマーカーとして利用できることが明らかになった。本実験ではヒト悪性黒色腫由来の培養細胞であるHMV-II細胞を用いた。A型およびC型ウイルスの両者ともに良好に増殖することのできる細胞株である。しかしながら、理由は不明であるがHMV-II細胞はM-beta-CDに感受性が強く、添加後早期に形態変化を起こし、同細胞を用いての実験は不可能と判断せざるを得なかった。C型インフルエンザウイルス(C型ウイルス)の出芽部位を明らかにすることが本研究の目標である。C型ウイルスの主な出芽部位は、A型インフルエンザウイルスとは異なり、形質膜表面の脂質ラフトlipid raftでない領域であることを明らかにする。そのために変異ウイルスや変異ウイルス様粒子(VLP)を作製し、それらの粒子と感染細胞を解析する。平成28年度は、C型ウイルスと脂質ラフトとの関連性の有無を明らかにするために、脂質ラフトの形成を阻害した培養細胞を用いたウイルス感染実験を予定した(脂質ラフト形成阻害剤methyl-beta-cyclodextrinで処理した細胞にウイルスを感染させ、その細胞から産生される子ウイルス粒子やウイルス増殖能の解析)。しかし予想以上に阻害剤に対する細胞の感受性が高かったため、感染実験を行うことができなかった。一方、予備実験の成績から、C型ウイルスの第2の膜タンパク質であるCM2を大量に含有する変異ウイルスの解析が有用であることが示唆されていた。そこで本年度は、CM2を大量に発現する培養細胞から産生されるVLPを解析した。予想通り、このVLPには大量のCM2を含有すること、また電子顕微鏡観察によりその形態は野生型と同様の繊維状を示すことが明らかとなった。これらのことからCM2を大量に発現する培養細胞はVLPの出芽部位の解析に有用であると考えられ、次年度の研究に用いることとした。C型インフルエンザウイルス(C型ウイルス)の出芽部位を明らかにするために、C型ウイルスの第2の膜タンパク質であるCM2を大量に含有する変異ウイルスおよび変異ウイルス様粒子(VLP)を作製し、解析した。ヒト胎児腎臓細胞由来の293T細胞に、GFP-vRNAを発現するPolIプラスミドDNA、および9種類のウイルスタンパク(PB2、PB1、P3、HEF、NP、M1、CM2、NS1、NS2)を発現するプラスミドDNAを同時にトランスフェクションした。CM2を大量に含有する変異VLPを作製するために、野生型VLPの作製に必要なCM2蛋白発現プラスミドの30倍量のプラスミドDNAをトランスフェクションした。トランスフェクション72時間後の培養上清と培養細胞を解析した。トランスフェクションしたプラスミド量にほぼ比例した量のCM2タンパクが、細胞内およびVLPに検出された。

また電子顕微鏡観察では、野生型VLPと同様に繊維状VLPが観察され、しかもVLPの表面にはHEFに特徴的なhexagonal arrangementが保たれていた。このように本研究の目標の達成のためにはVLP作製系は有用であると考えられた。C型インフルエンザウイルスの出芽部位budozoneを明らかにすることが本研究の目標である。今までの成績から、出芽領域は形質膜の脂質ラフト以外の領域であることが示唆されている。これが真実であれば、新規のエンベロープウイルスの出芽部位を提唱することになる。そこでウイルス様粒子(VLP)産生細胞を解析することとした。CM2を大量に発現するVLP産生細胞(293T細胞)からは、野生型VLPと同様の形態をもつVLPが産生されていることを確認した。今年度(最終年度)では、VLP産生細胞を可溶化および不溶化成分に分画し、それぞれに含まれるウイルスタンパクを検出した。その結果、HEFとCM2の膜タンパク質の大部分はともに可溶化成分に回収された。膜タンパク質以外のタンパク(NP, M1, NS1, NS2)は、両方の成分に回収された。これらの結果は、VLPの出芽部位は脂質ラフト以外の領域であること、大量のCM2の発現によってもHEFの分布(すなわち出芽領域)に変化はなかったことを示唆している。このように、C型インフルエンザウイルスの出芽部位budozoneは、形質膜の脂質ラフト以外の領域であることを示唆する成績が得られた。今後は感染細胞を用いてその分子機構について明らかにすることが課題である。そこでC型インフルエンザウイルスが増殖可能な細胞株(MDCK、LLC-MK2、CV-1細胞など)を用いた実験を計画している。これらの細胞を種々の濃度のM-beta-CD存在下で培養し、その生存を確認後、ウイルス感染実験を予定している。しかしながらHMV-II細胞に比し、これらの細胞におけるC型インフルエンザウイルスの増殖能は低いことが示されている。解析に充分なウイルス増殖能が得られない場合、出芽部位の同定実験は困難と予想される。そこで、下記のようにウイルス様粒子virus-like particle (VLP)作製系を用いた実験を計画している。M遺伝子のスプライシング効率が低下したウイルス感染細胞では、CM2が大量に発現する。これを模した細胞を用いる。すなわち大量のCM2発現プラスミドを各種ウイルス蛋白発現プラスミドと共に293T細胞にトランスフェクションする。この細胞からはCM2を大量に取り込んだVLPが産生される(データ未発表)。そこで産生されるVLPおよびVLP産生細胞を解析することで、C型ウイルスの出芽部位を推定することとする。平成29年度で得られた知見は、CM2は出芽部位の「マーカー」として有用であることを示す。平成30年度は、VLP産生細胞を可溶性分画と非可溶性分画に分け、それぞれに存在するウイルスタンパクを解析する。またCM2を大量に含有する変異ウイルスとその感染細胞を解析する。このウイルスの感染細胞では、M1タンパクの発現量は野生型よりも低下しCM2の発現量は野生型の10倍以上に増加していることは確認している。
脊椎動物初期発生におけるCaMキナーゼカスケードの分子解析

CaMキナーゼホスファターゼ(CaMKP)とその核局在型アイソフォームであるCaMIKP-Nは多機能性CaMキナーゼ(CaMKs)群を特異的に不活性化する酵素であるが、生体内においてどのような働きをしているかは不明であった。そこで脊椎動物のモデルとしてゼブラフィッシュを用いて、初期胚においてCaMKPとCaMKP-Nの遺伝子発現を抑制しその影響を調べた結果、奇形を生じ、この異常はCaMKPまたはCaMKPNの発現量の低下に伴うCaMKs活性の上昇が原因として考えられた。CaMKP社Nは核に局在するCaMKIVの活性調節に関与していると考えられため、ゼブラフィッシュCaMKIV(zCaMKIV)の機能を明らかにすることにした。zCaMKIVの一次構造はラットCaMKIV(rCaMKIV)と比較してC末端領域が大きく欠損していることを見出した。そこで、このC末端領域欠損の影響を調べるため、rCaMKIVとzCaMKIVの性質を比較した。その結果、両者で活性化機構と細胞内局在に大きな違いはみられなかったが、基質特異性に差がみられた。本研究によりCaMKIVのC末端領域が基質特異性に影響を与えることを明らかにした。また、ゼブラフィッシュ脳における内在性CaMKP-Nを解析した結果、その融部に核移行シグナル配列を含むC末端領域が分解を受けていることを見出した。この分解断片の細胞内局在を調べたところ、核ではなく細胞質に局在することが明らかとなった。さらにCaMKP社NはC末端の分解に伴い活性化されることが判明した。このCaMKP-Nの分解はプロテアソーム阻害剤で処理することにより抑制された。以上の結果から内在性のCaMKP社Nはプロテアソームによる分解に伴い活性化され、さらに核から細胞質に移行することにより細胞質に局在するCaMKsの活性を負に調節していることが示唆された。核局在型CaMキナーゼホスファターゼ(CaMKP-N)は多機能性CaMキナーゼ(CaMKs)群を特異的に不活性化する酵素で、生体内ではCaMKP-Nと同様に核に存在するCaMKIVを標的にしていると考えられている。ゼブラフィッシュ胚においてCaMKP-Nの遺伝子発現を抑制すると奇形の胚が出現し、この異常はCaMKP-Nの発現量の低下に伴うCaMKIV活性の上昇が原因として考えられた。そこで、本研究ではゼブラフィッシュにおけるCaMKIVの機能を明らかにすることを目的とした。ゼブラフィッシュCaMKIV(zCaMKIV)の一次構造は哺乳類のCaMKIVと比較してC末端領域が大きく欠損していることを見出した。そこで、このC末端領域欠損の影響を調べるため、ラットCaMKIV(rCaMKIV)とzCaMKIVの性質を比較した。このことから、zCaMKIVは哺乳類のCaMKIVとは違ったタンパク質のリン酸化を制御していることが示唆された。また、脳における内在性CaMKP-Nを解析した結果、その一部に核移行シグナル配列を含むC末端領域が分解を受けていることを見出した。このCaMKP-Nの分解断片は細胞質のCaMKIを脱リン酸化することが判明した。以上の結果から、生体内においてCaMKP-Nは細胞質に局在するCaMKを不活性化する役割も担う可能性が考えられた。このため、ゼブラフィッシュ胚におけるCaMKP-Nの発現抑制による異常はCaMKIV以外のCaMKsも関与していることが示唆された。

以上の結果から内在性のCaMKP社Nはプロテアソームによる分解に伴い活性化され、さらに核から細胞質に移行することにより細胞質に局在するCaMKsの活性を負に調節していることが示唆された。
オプトジェネティクスを用いた神経回路構築におけるPACAP遺伝子の役割

PACAP欠損マウスにおいて、精神行動異常とスパイン形態異常を見出し、PACAPシグナルが精神疾患と強く相関しシナプス病態に関与することを示唆した。PACAPによりmiR-132が発現上昇し、その標的分子でスパイン形成への関与が報告されているp250GAP mRNAおよびタンパク質の減少が認められた。また、PACAPにより、5-HT2A受容体の細胞内局在化が生じることを見出した。PACAPシグナルのうち、おもにPAC1のPKCを介するシグナル系が5HT2A受容体の制御に関ることも示唆された。本研究は、神経回路構築や高次脳機能に重要な樹状突起スパインにおけるPACAP役割の解析をおこない、精神疾患発症・病態メカニズムの解明することを目的とする。24年度は研究実施計画に基づき、主に以下の成果を得た。PACAPにより生じる5-HT2A受容体のインターナリゼーションは、PACAPと70%以上の相同性を持つVIPでは、有意な変化を示さなかった。また、他の5-HT受容体である5-HT1A、5-HT2C受容体を解析した結果、PACAPシグナルは各受容体の内部局在割合に有意な変化を示さなかった。さらに、PACAPシグナルのうち、おもにPAC1のPKCを介するシグナル系が5HT2A受容体の制御に関ることも示唆された。以上の検討から、PACAP-PAC1による特異的な5HT2A受容体の動態制御は、5-HT機能制御の可能性と新規創薬ターゲットとしての有用性を示すものと考えられる。(B)PACAPによるスパイン形態・シグナル伝達の解析初代培養神経細胞におけるPACAP投与により、培養21日目でのスパインの数および体積の増加が認められる。スパイン形成促進作用の分子機構解析として、神経機能や神経細胞の形態調節に関わる5種類のmicroRNAに着目し、PACAPによる発現変動を解析した。結果、PACAPによりmiR-132のみ発現上昇が認められ、その標的分子であり、スパイン形成に関わることが報告されているp250GAP mRNAおよびタンパク質の減少が認められた。今後、PACAPシグナルを起点とした脳領域特異的なスパイン形成異常に関わる分子機構を詳細に解析することにより、精神疾患の発症機構の解明、PACAPシグナルを標的とした新規創薬候補分子の同定に繋がることが期待される。本研究は、統合失調症などの精神疾患の脆弱因子であるPACAP (pituitary adenylate cyclase activating polypeptide)欠損マウスや細胞内イメージング法を用いることにより、神経回路構築や高次脳機能に重要である樹状突起スパインにおけるPACAPの役割の解析をおこない、精神疾患発症・病態メカニズムの解明することを目的とする。23年度は研究実施計画に基づき、主に以下の成果を得た。(A) PACAP欠損マウスにおけるセロトニン2A受容体(5-HT2AR)亢進に関する分子メカニズム解析5-HT2A作動薬によりPACAP欠損マウスにて過感受性が見られる大脳皮質や他の脳部位において5-HT2A発現量を検討したところ、有意な発現量の変化は認められなかった。しかし、5-HT2ARはGPCRであるため、細胞膜上での局在に変動が見られる可能性があることから、5-HT2ARのHalo-tag融合蛋白質を作製し、細胞膜非透過型蛍光リガンドを用いて、細胞膜上での動態をHEK293細胞にて検討した。その結果、PACAP投与により5-HT2ARの細胞膜上から細胞内への移動がおこるインターナリゼーションが生じることが明らかになった。この現象は、クラスAのGPCRであるRhodpsinでは生じないことから、PACAPシグナルが5HT2ARに直接的に関与する可能性が示され、精神疾患発症におけるPACAPの役割の解明にむけた重要な成果であると考えられる。(B)FRETイメージングを用いたスパイン形態・シグナル伝達の解析FRETイメージングに用いるPSD-95等のコンストラクト作製が完了した。さらに、HEK293細胞での発現解析では、融合蛋白質付加による生理的機能に影響が出ていないことが確認出来た。現在、初代海馬神経細胞への遺伝子導入を試みている。本年度は、樹状突起スパイン上で細胞内イメージングやシグナル伝達解析をおこなうためのステップとして、(A) Halo-tagシステム(B)FRETイメージングの2つの系を立ち上げることが出来たことより、おおむね順調に進展していると考えられる。特に、Halo-tagシステムは、タンパク質相互作用解析から細胞内イメージング解析へと幅広い解析をするための最適なツールであり、このシステムを用いて、PACAP刺激による5-HT2ARのインターナリゼーションを捉えることが出来たのは大変有意義であると考えられる。5-HT2ARは、精神疾患との関連が深く、樹状突起スパイン上での発現が認められ、スパインの一過的な肥大へも影響することが知られている。

PACAP欠損マウスでは5-HT2A過感受性がみられること、ドパミンD2・5-HT2R拮抗薬であり非定型型精神病薬でもあるリスペリドンは、PACAP欠損マウスに見られる精神行動異常を改善することなどから、PACAPと5-HT2ARとは何らかの関係があることが考えられていたが、今回初めて直接的な関与を示すことができた。この成果から、本研究の目的である細胞内イメージングを用いた樹状突起スパインにおけるPACAPの役割を解析することは、精神疾患の病態メカニズム解析に非常に重要であると考えられる。(A) PACAP欠損マウスにおけるセロトニン2A受容体(5-HT2AR)亢進に関する分子メカニズム解析Halo-tagシステムを用いて、引き続き5-HT2ARとPACAP特異的受容体であるPAC1との受容体間相互作用の解析をおこなう。PACAPによる5-HT2ARのインターナリゼーションのみならず、抗精神病薬投与時における5ーHT2ARおよびPAC1の細胞内局在の変動なども明らかにすることにより、精神疾患の病態メカニズムにおけるPACAPの役割を解明していく。(B)FRETイメージングを用いたスパイン形態・シグナル伝達の解析初代海馬神経細胞への遺伝子導入系を確立し、樹状突起スパイン形態やFRETによる可視化を試みる。初代海馬神経細胞への一過的な遺伝子導入は、非常に効率が悪く、また、通常のアデノウイルスでは神経細胞へは導入され難い。神戸大学の白井康仁教授により作製され、提供していただいたNSE-tTA/tOP-GFPを用いたスパイン形態イメージングをおこなうことだけにとどまらず、スパイン形成に関わるPSD-95や遺伝子発現抑制などをレンチウイルスやエレクトロポレーションを用いて導入することにより、蛍光顕微鏡およびタイムラプスにて、スパイン形態の経時的変化、成熟過程での局在変化、FRET変化に伴うシグナル伝達の解析をおこなう。また、PACAP投与によるスパイン数増加に関わるmiRNAなどのエピジェネティクスな変化の解析も行う。24年度の研究費については以下の使用計画を予定している。Halo-tagシステムを用いたPACAPと5-HT2A受容体相互作用を検討するため、細胞膜透過型・非透過型蛍光リガンドの購入、タンパク質間相互作用のためのhalo-tagプルダウンアッセイ用試薬の購入をおこなう。スパイン形態やシグナル伝達の解析をおこなうために、初代海馬神経細胞採取用の妊娠マウスやスライドチャンバーの購入、レンチウイルスやエレクトロポレーション用の試薬や消耗品の購入を行う。
多点衛星観測データ解析に基づいた磁気嵐時環電流の発達と消失に関する研究

地球磁気圏のプラズマは、太陽風と電離圏の2つの供給源を持つ。これまで観測的には、0+やHe++などの重イオンの成分比を用いることで、この2つの供給源の寄与が研究されてきた。その結果、大きな磁気嵐時には、電離圏起源である0+イオンの環電流への寄与が、劇的に増加することが指摘されている。一方、もう1つの源である太陽風からプラズマシートへのプラズマ供給については、最近の研究から、北向きの惑星間空間磁場(IMF)が長く続いた後に磁気嵐が起こる場合に、低緯度境界層(LLBL)から侵入した高密度の太陽風プラズマが、環電流発達に寄与する可能性が指摘されている。本研究では、環電流への電離圏および太陽風起源プラズマの供給過程を調べるため、プラズマ輸送を考える上で鍵となる、磁気圏子午面観測データ(FAST衛星)、および、プラズマシート観測データ(GEOTAIL衛星)について統計解析用データベースを整備し、以下の課題について重点的に研究を行った。1.FAST衛星データを用いて環電流イオンのイオン種別の変動を調べた結果、磁気嵐時の内部磁気圏への0+イオンの供給には、太陽風動圧の変動が重要な役割を果たしていることが明らかとなった。2.更に、特徴的な分布関数形状(バンド構造)に着目し統計解析を行った結果、磁気嵐時主相には電離圏から内部磁気圏への0+イオンの直接供給が増加することが明らかとなった。3.FAST衛星によってサブストーム時に観測された広いエネルギーでの電子降下を調べた結果、この電子降下が異なる高度で加速された2つの成分から形成されていることが明らかとなった。4.北向きIMF時の太陽風侵入についてGEOTAIL衛星観測データと数値実験結果の比較を行った結果、KH不安定などによるLLBLでの乱流的な物質輸送が、濃いプラズマシート形成に重要な役割を果たしている可能性が示された。これまで、観測的には、O+やHe++などの重イオンの成分比を用いることで、この2つの供給源の寄与が研究されてきた。その結果、大きな磁気嵐時には、電離圏起源であるO+イオンのリングカレントへの寄与が、劇的に増加することが指摘されている。一方、もう1つの源である太陽風からプラズマシートへのプラズマ供給については、最近の研究から、北向きの惑星間空間磁場(IMF)が長く続いた後に磁気嵐が起こる場合に、低緯度境界層(LLBL)から侵入した高密度の太陽風プラズマが、リングカレント発達に寄与する可能性が指摘されている。本研究では今年度、統計解析用に、極域から中低緯度までの低高度磁気圏(極軌道)、磁気圏尾部赤道面、および内部磁気圏外縁部(静止軌道)という内部磁気圏へのプラズマ輸送を考える上で鍵となる、(A)磁気圏子午面観測データ(FAST衛星)、(B)プラズマシート観測データ(GEOTAIL衛星)、(C)静止軌道衛星データ(主にLos Alamos衛星群)の3つの衛星観測データセットのうち、特に(A)と(B)を整備し、以下の課題について重点的に研究を行った。1.低高度極軌道衛星データ(データセットA)を用いて環電流イオンのイオン種別の変動を調べた結果、磁気嵐時の内部磁気圏へのO+イオンの供給には、太陽風動圧の変動が重要な役割を果たしていることが明らかとなった。2.低高度極軌道衛星(A)によってサブストーム時に観測された広いエネルギーでの電子降下を調べた結果、この電子降下が異なる高度で加速された2つの成分から形成されていることが明らかとなった。3.プラズマシートでの観測データ(BおよびC)と数値実験結果の比較を行った結果、KH不安定などによるLLBLでの乱流的な物質輸送が、濃いプラズマシート形成に重要な役割を果たしている可能性が示された。4.北向き

IMF時の太陽風侵入についてGEOTAIL衛星観測データと数値実験結果の比較を行った結果、KH不安定などによるLLBLでの乱流的な物質輸送が、濃いプラズマシート形成に重要な役割を果たしている可能性が示された。
クラウドサービスを多重化した信頼度の高いe-Learning環境構築に関する研究

本研究では,e-Learningサービスに必要なサーバに,所属機関の外部で「クラウドサービス」として提供されているアプリケーションサーバを利用することで,高信頼度かつコストを抑えた形態でe-Learning環境を構築すること目的とした.今回の研究において信頼度を高めるための具体的目標として,一部のサーバが停止してもサービスを提供できる「サービス稼働率の向上」,同時に多数のアクセスがあった場合でも対応できる「レスポンスタイムの短縮」の2つを定義して取り組んだ.「サービス稼働率の向上」を実現する方法として,所属機関外のクラウドサービス上に構築したe-Learningサービスと,所属先のサーバ上に構築したe-Learningサービスを同時に運用する方式を採用した.これらにより,どれかのサーバが停止した場合でも,他のサーバに切り替えることで,e-Learningサービスを提供できる.ただし複数のサーバを同時に運用する場合,一般的に運用管理コストが増大するが,本研究では全てのサーバのアプリケーション実行環境を同一にし,管理用コンピュータ上の統合開発環境で一括して管理する仕組みを構築したため,プログラム更新や学習データ管理にかかるコストの増加を抑えることができた.また「レスポンスタイムの短縮」を実現する方法として,利用者のパソコンからe-Learningサーバに対する負荷を分散する装置を導入する方式を取った.そのために,従来は高価なロードバランサ機器を導入する必要があるが,本研究では安価なネットワークスイッチとノートパソコン上に構築したネームサーバを用いて,低コストでロードバランサ機能を実現した.これにより,学生が自己学習に利用する場合のほかに,演習や実験などで一斉にアクセスする場合においても,利用に支障がないレスポンスタイムが確保できるシステムを構築できた.本研究では,e-Learningサービスに必要なサーバに,所属機関の外部で「クラウドサービス」として提供されているアプリケーションサーバを利用することで,高信頼度かつコストを抑えた形態でe-Learning環境を構築すること目的とした.今回の研究において信頼度を高めるための具体的目標として,一部のサーバが停止してもサービスを提供できる「サービス稼働率の向上」,同時に多数のアクセスがあった場合でも対応できる「レスポンスタイムの短縮」の2つを定義して取り組んだ.「サービス稼働率の向上」を実現する方法として,所属機関外のクラウドサービス上に構築したe-Learningサービスと,所属先のサーバ上に構築したe-Learningサービスを同時に運用する方式を採用した.これらにより,どれかのサーバが停止した場合でも,他のサーバに切り替えることで,e-Learningサービスを提供できる.ただし複数のサーバを同時に運用する場合,一般的に運用管理コストが増大するが,本研究では全てのサーバのアプリケーション実行環境を同一にし,管理用コンピュータ上の統合開発環境で一括して管理する仕組みを構築したため,プログラム更新や学習データ管理にかかるコストの増加を抑えることができた.また「レスポンスタイムの短縮」を実現する方法として,利用者のパソコンからe-Learningサーバに対する負荷を分散する装置を導入する方式を取った.そのために,従来は高価なロードバランサ機器を導入する必要があるが,本研究では安価なネットワークスイッチとノートパソコン上に構築したネームサーバを用いて,低コストでロードバランサ機能を実現した.これにより,学生が自己学習に利用する場合のほかに,演習や実験などで一斉にアクセスする場合においても,利用に支障がないレスポンスタイムが確保できるシステムを構築できた.
東南アジア熱帯林における樹木根系を介した土壌の炭素蓄積と放出メカニズムの解明

マレーシア、サラワク州のランビルヒルズ国立公園において、(1)細根の生産量と枯死量の評価、(2)細根の成長と枯死の変動要因、(3)細根の成長や枯死と土壌圏の炭素動態との関わり、を検討した。その結果、細根生産量は生態系総生産量の10%程度であること、粗根に比べると、細根の方が、分解が遅いことが明らかとなった。また土壌からのCO2フラックスの変動は細菌による枯死根分解と強い関係があると予想された。細根の成長量と枯死量の変動は、平均降水量との間に正の相関が、平均気温との間に負の相関がみられ、環境要因の変動に対応してしていると予想された。本研究では、樹木根系が熱帯林土壌の炭素動態に直接的・間接的に与えるインパクトに着目し、熱帯林における土壌圏の炭素貯留と炭素放出における根系の役割を評価することを目的としている。ここでは、未だ熱帯での適用例が報告されていない新しい調査法を用いた細根のターンオーバーの推定し、これまで熱帯ではブラックボックスとされてきた土壌呼吸の変動に対する根と菌根の役割を明らかにするため、(1)細根の成長と枯死が土壌への炭素貯留量にもたらす影響、(2)土壌呼吸における根系及び菌根の役割、の2種類の実験を実施する。実験は、申請者らが2002年から炭素循環の調査を続けてきたマレーシア、サラワク州にあるLambir Hills国立公園の4haクレーンサイトで行う。本年度は、同試験地において3つの実験プロットの設置し、以下の準備作業を行った。1.課題(1)と(2)において、土壌中の細根の根系動態の制御とそれに伴う土壌呼吸変化を測定するため、6種の改良型イングロースコアを作成し、試験地に埋設した。埋設したコアは、埋設2か月後、6か月後、12か月後の3回に分けて取り出し、中の根系増加量、根系分解量を測定したところ、新規根系の順調な増加と、根系リターの分解が確認された。また、コアの上には土壌呼吸カラーを設置し、根系の増加と分解に伴う土壌呼吸量の変化を得た。2.課題(1)に関して、根系動態を継時的に測定するためのCCDスキャナ法の測定器具を作成し、試験地に設置した。3.課題(2)に関して、土壌呼吸の連続測定を行うための自動開閉型チャンバーの開発を行った。本年度は、同試験地において3つの実験プロットの設置し、以下の作業を行った。1.課題(1)と(2)において、1年目に土壌中の細根の根系動態の制御とそれに伴う土壌呼吸変化を測定するため、6種の改良型イングロースコアを作成し、試験地に埋設した。今年度は、1年目に引き続き、埋設12か月後と24カ月後の2回に分けてコアを取り出し、中の根系増加量、根系分解量を測定した。また、実験(1)に関連し、1年目に埋設したCCDスキャナボックスにスキャナを定期的に差し込み、土壌の中のスキャン画像を取得した。さらに画像の取得に加えて画像解析方法について、主導抽出マニュアルを開発した。2.実験(2)について、実験(1)で埋設した各コアの上部で土壌呼吸を測定した。さらに土壌呼吸の連続測定を行うために開発した自動開閉型チャンバーの試運転を行った。今年度は、昨年度取り出したコアから得られた根系増加量、根系分解量のデータを解析し、同林分の根系動態量を評価した。