hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
結晶構造解析とタンパク質工学を基礎としたコレステロールの臨床検査用酵素の開発研究

本研究は、成人の健康指標とされているコレステロール値の測定に使用される、コレステロール酸化酵素を遺伝子工学、タンパク質工学、タンパク質結晶解析学、及び酵素生産の立場から研究している研究者が共同で、長期使用に耐えられる安定な酵素に改良することを目的とした。本年度は以下の研究成果が得られた。1。酵素タンパク質三次構造解析用ソフトの開発:コレステロール酸化酵素の分子構造の全部および一部を拡大して、パソコンで画像表示できるソフトを完成させた(平山)。2。試験管内変異による酵素の構造と機能の解明:FAD結合、期質結合領域、酵素の安定性に寄与しているアミノ酸を、上記で開発したコンピューターグラフィックにより予測し(平山)、これらアミノ酸の置換を部位特異的変異法により行った。(室岡、山下)。その結果、ステロール基質およびFADの結合部位に関与するアミノを明らかにした。基質との親和性の向上した変異酵素も得られた。3。酵素の耐熱性への改良:先に、放線菌の遺伝子を大腸菌で発現できるようにデザインし、大腸菌で大量発現させた(室岡、山下)。N末端部位を延長し、さらに変異をかけたところ、コレステロール酸化酵素は、熱に大幅に安定となったコレステロール酸化酵素に改良することに成功した。大腸菌で大量発現させることにも成功し、現在、この改良型酵素の工業生産に向けての開発が検討されている。4。コレステロール酸化酵素のX線構造解析用結晶の育成:コレステロール酸化酵素を高純度に精製し(曽我部)、この試料を用いて結晶化条件を検討し、現在、X線結晶解析用の結晶が育ってきている(平山)。4。このように、3年間で当初目的を達成し、100%以上の成果を上げることができた。1。2。(室岡、山下)。3。4。4。1。コレステロール酸化酵素のX線構造解析用結晶の育成:コレステロール酸化酵素を高純度に精製した(曽我部)。この試料を用いて結晶化条件を検討し、X線結晶解析用の結晶を育てている(平山)。2。酵素タンパク質三次構造解析用ソフトの開発:コレステロール酸化酵素の分子構造の一部を切り出して、Macintoshで画面表示できるソフトを開発した(平山)。3。タンパク質工学技術による放線菌酵素の大腸菌での高発現:放線菌の遺伝子を大腸菌で発現できるようにデザインし、大腸菌で発現させた(室岡、山下)。大腸菌で発現した、コレステロール酸化酵素は、基質特異性は放線菌と同じであったが、熱に安定となり、pHもアルカリ側で安定となっていた。大腸菌で作られた酵素は、アミノ末端側が長くなり、放線菌で発現した酵素より、耐熱性になっていることが解った。4。試験管内変異による酵素の構造と機能モデルの構築:ランダム変異および指定位置変異により、熱安定性および活性部位に関与するアミノ酸配列を決定した。FAD結合、基質結合領域、酵素の安定性に寄与しているアミノ酸を予測した(室岡、山下)。1。タンパク質工学技術による放線菌酵素の大腸菌での高発現:放線菌の遺伝子を大腸菌で発現できるようにデザインし、大腸菌で大量発現させた(室岡、山下)。

大腸菌で作られた酵素は、アミノ末端側が長くなり、放線菌で発現した酵素より、耐熱性になっていることが解った。現在この改良型酵素の工業生産に向けての開発が検討されている。2。試験管内変異による酵素の構造と機能モデルの構築:ランダム変異および指定位置変異により、熱安定性および活性部位に関与するアミノ酸配列を決定した。FAD結合、基質結合領域、酵素の安定性に寄与しているアミノ酸を予測し(平山)、これらアミノ酸の置換を行った。(室岡、山下)。3。コレステロール酸化酵素のX線構造解析用結晶の育成:コレステロール酸化酵素を高純度に精製した(曽我部)。この試料を用いて結晶化条件を検討し、X線結晶解析用の結晶を育てている(平山)。4。酵素タンパク質三次構造解析用ソフトの開発:コレステロール酸化酵素の分子構造の一部を切り出して、Macintoshで画面表示できるソフトを昨年開発したが、このものをさらに改良し、パソコンで解析できるようにした(平山)。本研究は、成人の健康指標とされているコレステロール値の測定に使用される、コレステロール酸化酵素を遺伝子工学、タンパク質工学、タンパク質結晶解析学、及び酵素生産の立場から研究している研究者が共同で、長期使用に耐えられる安定な酵素に改良することを目的とした。本年度は以下の研究成果が得られた。1。酵素タンパク質三次構造解析用ソフトの開発:コレステロール酸化酵素の分子構造の全部および一部を拡大して、パソコンで画面表示できるソフトを完成させた(平山)。2。試験管内変異による酵素の構造と機能の解明:FAD結合、基質結合領域、酵素の安定性に寄与しているアミノ酸を、上記で開発したコンピュタ-グラフィックにより予測し(平山)、これらアミノ酸の置換を部位特異的変異法により行った。(室岡、山下)。その結果、ステロール基質およびFADの結合部位に関与するアミノを明らかにした。基質との親和性の向上した変異酵素も得られた。3。酵素の耐熱性への改良:先に、放線菌の遺伝子を大腸菌で発現できるようにデザインし、大腸菌で大量発現させた(室岡、山下)。N末端部位を延長し、さらに変異をかけたところ、コレステロール酸化酵素は、熱に大幅に安定となったコレステロール酸化酵素に改良することに成功した。大腸菌で大量発現させることにも成功し、現在、この改良型酵素の工業生産に向けての開発が検討されている。4。コレステロール酸化酵素のX線構造解析用結晶の育成:コレステロール酸化酵素を高純度に精製し(曽我部)、この試料を用いて結晶化条件を検討し、現在、X線結晶解析用の結晶が育ってきている(平山)。このように、3年間で当初目的を達成し、100%以上の成果を上げることができた。
古文献に現れたアイヌ語方言の研究

平成10年度も9年度に引き続き、青森、秋田、東京の所蔵機関で資料調査を行った。その結果、これまで研究がなされていない多くの江戸時代のアイヌ語資料を新たに見いだすことができた。特に、享和年間に岡儀三郎という人物によって作成された「蝦夷言」という資料は、アイヌ語彙数が多いことと年代が古い点で、特筆されるべきものである。さらに、これらの資料の言語学的な性格、資料的価値についての考察を行う過程で、年代の古いと思われる資料にはやはりアイヌ語の古い姿を示していると思われる特徴のあることが明らかとなった。すなわち、現代のアイヌ語ではアクセントの対立として記述されるべき特徴が、最古のアイヌ語文献と言われる「松前ノ言」も含めて、古い時代のアイヌ語文献では長母音であったことを示す表記のなされていることが明らかとなった。このことは、各資料をばらばらに研究していたのでは立証困難なものであり、本研究において江戸時代のアイヌ語文献を系統的に収集分類することによって初めて明らかになってきたものである。詳細は、さらに大量の資料を系統的に研究することによって補強しなければならないが、もしこのことが立証されればもう一つの重要な問題が明らかとなる。すなわち、もし古い時代のアイヌ語資料に長母音が極めて普通に確認されたとすれば、現代の諸方言に長母音の全く見られない原因は何かが問題となる。一つには勿論、言語変化が考えられるが、もう一つには近世以後の大規模なアイヌ語方言の交替、統合を仮定する必要があろう。すなわち、現在代表的なアイヌ語方言として知られている北海道西南部方言の分布は、比較的近年の拡大である可能性が出てくるのであり、この方言の出自を知る上で大きな問題を提供するものと言える。北海道立文書館、市立函館図書館、国立公文書館、天理大学付属天理図書館における本年度の調査の結果、江戸時代のアイヌ語資料として新たに多くのものを見いだすことができた。一例をあげれば、北海道立文書館では択捉島で実際に用いられたアイヌ語テキスト(申し渡し文)が見いだされたが、この地方の数少ない言語資料として貴重である。また、市立函館図書館では、数多くの非常にすぐれたアイヌ語の辞書の写本を見いだしたが、その中に、江戸時代のすぐれたアイヌ語辞書の一つとして有名な能登屋円吉の「蝦夷記」と形式、内容の点で密接な関係にあるものが含まれていることが判明した。「蝦夷記」は影印はあるものの原本は現在所在が不明であり、大正期にただ一種存在が確認されていた写本も紛失している今日、「蝦夷記」の成立を知る上で重要な手がかりとなる可能性がある。今後、両者の比較研究によって、この辞書の成立過程が明らかになることが期待できる。国立公文書館では江戸時代最大の蝦夷通辞として活躍した上原熊治郎の自筆稿本である「蝦夷語集」を調査したが、原本には翻刻や写真では知ることができなかった細かな訂正、書き入れが数多くみられ、校本の作成の必要と、これまで言われて来た以上にアイヌ語資料として非常に貴重なものであることが判明した。天理大学付属図書館では、アイヌ語最古の文献である「松前ノ言」を実施に調査し、その読み、解釈の点で、これまでの研究を訂正したり、不明の点を解明することに一部成功した。その成果の一部は論文として発表した。
麻酔薬による発達期脳障害と塩素イオン濃度の関係解明：徐放製剤による新規アプローチ

本研究の目的は以下の二つである。1薬の血中濃度を一定に保つことのできる最新の徐放化技術を応用し、麻酔薬が中枢神経に及ぼす形態学的影響に加え、機能への影響について検討する。2麻酔薬の主なターゲットであるGABA受容体に関連して、細胞内塩素イオン濃度が変化した遺伝子改変動物で薬の作用がどのように変化するのかを明らかにする。本研究により、乳幼児に対して安全に利用できる麻酔薬に関する重要な知見が得られることを期待して実験を行った。麻酔薬の皮下投与あるいは腹腔内投与による研究は多いが、薬の血中濃度を一定に保つことは難しく、低酸素による影響と薬そのものの作用を分離することが難しかった。薬剤の徐放化技術を用いて適切な濃度を設定できれば、この問題点をクリアできると考えた。また、研究の対象が幼若な動物であるので、薬の投与が頻回になるとそれによる侵襲も無視できなくなる。そこで、本研究ではin vivoで薬の血中濃度を長期間一定に保つための工夫として、徐放することが出来る麻酔薬の製剤を新たに開発することとした。麻酔薬としてプロポフォールを選択し、薬剤をパックする生体内分解材料としてポリ乳酸とグリコール酸を使用して徐放製剤の作成に取り組んだ。薬剤を動物に注射するためには徐放薬を粒子状にしなければならず、現段階では粒子状の製剤で安定的に生体内で薬の血中濃度を維持できるものを得るまでには至ることができなかった。麻酔薬は集中治療室で長期投与されるケースも多いが、患者にとって本当に安全だろうか?本研究では、薬の血中濃度を一定に保つことのできる最新の徐放化技術を応用し、麻酔薬が中枢神経に及ぼす形態学的影響に加え、機能への影響について検討する。さらに、麻酔薬の主なターゲットであるGABA受容体に関連して、細胞内塩素イオン濃度が変化した遺伝子改変動物で薬の作用がどのように変化するのかを明らかにする。本研究により、乳幼児に対して安全に利用できる麻酔薬に関する重要な知見が得られるほか、徐放剤の臨床応用も視野に入れている。今年度は、血中濃度を安定して保つことのできる麻酔薬の徐放製剤の開発に着手した。我々は実験中の薬の血中濃度の変動を極力小さくすることで、麻酔薬が呼吸・循環に与える影響を最小化できると考えている。そこで、1腹腔内あるいは皮下に単回投与するだけで血中濃度を1週間保てる製剤を開発すること、2作用時間が数時間から数日間に渡る様々な徐放特性を持った徐放粒子を作成し、目的別に単回投与で至適な作用時間が得られる薬剤を開発することを目指した。具体的には、ポリ乳酸とポリグリコール酸を使用し、その配合比率や各々の分子量を変化させることで麻酔薬プロポフォールを徐放化することのできる薬剤の開発である。現在のところ、様々な薬剤を作成してインビトロにおける徐放試験を繰り返し行っているが、期待するような結果は得られていない。実験に用いる麻酔薬の徐放製剤の開発が遅れているため。徐放製剤の開発が進まないと研究計画を遂行することが出来ないので、今後も徐放製剤の開発に注力していく。該当なし
プロトン共役電子移動を示す架橋型金属多核錯体の合成とその多重機能

生体膜中で起こっている電子移動とプロトン移動の共役系を人工的に作り出し、新しい機能性材料の探索を目的にして、本研究では電子移動とプロトン移動の共役系を有する金属錯体を固体表面上に構築し、その分子配列システム内での配位結合を通しての電子-プロトン移動共役の可能性を電気化学的あるいは伝導性などの点から検討しようと試みた。ブロンステッド酸の部位をもつ直線性のよい架橋三座配位子としてテトラ(ベンズイミダゾリル)ピリジンを新たに合成し、さらにこの配位子で架橋されたルテニウム錯体を合成した。Ru二核錯体においては架橋基のプロトン化・脱プロトン化により金属間相互作用が大きく変化することがわかった。また、分子内にプロトン参照電位を示すサイトをもつルテニウム二核錯体を合成することに成功した。この錯体の酸化電位のpH変化を調べると、ベンズイミダゾール基側のサイトは酸化電位はpHに依存して直線的に変化するのに対して,他方はpHに関らず一定となり、pH参照電位サイトを分子内にもつ分子であることがわかった。プロトン共役電子移動系をもつ錯体を自己組織化法(SAM)により金電極上に固定した新たな表面錯体系を合成した。アルカンチオール基をもつビス(2-ベンズイミダゾリル)ピリジン基を有するルテニウム錯体を合成し、金表面へのSAM膜とした。Ru(II/III)の酸化電位は溶液のpHに依存し、期待通り界面でもプロトン共役電子移動系として働くことがわかった。ボルタモグラムの形は、用いた錯体濃度および溶液のpHに大きく依存する。
ウィリアム・フォークナーのハリウッドでの著作と同時代作家との関連

ウィリアム・フォークナーは1920年代後半から1940年代前半まで映画脚本の執筆に携わっていたが、その動機は財政問題にあったため、この時期のシナリオ諸作品には、文化的・歴史的視点からのアプローチが欠けていた。しかし、フォークナーと同時期にハリウッドでシナリオ製作、あるいは、映画プロデュースに携わっていた、作家・映画監督などの動向を詳細に検討すると、当時のアメリカ政府による文化政策の影響が色濃く、フォークナーもその影響の範囲内での仕事を余儀なくされていた事実が浮かびあがる。本研究では、フォークナーがハリウッド時代、共に仕事をしたハワード・ホークス文書をユタ州ブリガム・ヤング大学図書館にて調査し、フォークナーとホークスのみならず、ガイ・エンドア、エイゼンシュテインらとの共通認識であったアメリカ海兵隊によるハイチ侵攻及びハイチからの撤退という歴史的事実が与えた映画界への影響の痕跡を探った。映画に携わった当時の映画人・作家は、表現のうえでも、思想のうえでも、アメリカの軍事行動に反発を示し、アメリカ政府がそれに対して検閲制度を強化していったが、そのような制限の中で、いかなる文学作品あるいは映画が生まれ、あるいは闇に葬られていったのかを検証した。ガイ・エンドアの『バブーク』はその好例でもあるが、エンドアとフォークナーが同時期にハリウッドで脚本制作に携わりつつ、全く異なるハイチ表象を選択した背景は、各々の思想的相違というよりは、ハイチに対するイメージの相違と考える。本研究では、ウィリアム・フォークナーが、1930年代から1940年代にかけて、断続的にカリフォルニア州ハリウッドでの映画製作に脚本家として関わっていた時代の足跡および関連作品、同時代作家などを広い文脈で捉えて、文学作品と社会状況、および大衆芸術からの影響関係を考察するものである。まず、基礎資料としては、すでに出版され、キャノンとして確定しているフォークナー文学のみならず、ブリガム・ヤング大学(アメリカ合衆国ユタ州)に所蔵されている、ハワード・ホークスに関わる文書を現地調査し、コピーライトに抵触するためゼロックス・コピーが禁じられている文書を一部筆写し、検討を加えた。そのひとつが、"Dreadful Hollow"である。その存在は、研究者には知られていたが、Bruce Kawinが精査し、研究書を出して以降、比較研究する機会がほとんど閉ざされていた。Bruce Kawin本人からの情報を元に、プリガム・ヤング大学の許可を受け、ハワード・ホークスが寄贈した文書類を調査した結果、"Dreadful Hollow"以外にも、ウィリナム・フォークナーが、ホークスと共に共同執筆したと考えられている"Sutter's Gold"のタイプスクリプトを、筆写し、その概要を入手することができた。"Dreadful Hollow"および"Sutter's Gold"には、カリブ海域諸国とアメリカ合衆国との政治的・社会的影響関係がはっきりと明示されているというよりは、恐怖、あるいは、暗黒の地、呪い、といった、カリブ海域にまつわるイメージが、増大され、誇張されて、投影されている。映画の脚本ではそうした場所の醸し出す雰囲気を利用することで、逆に、アメリカという政治組織体の抑圧された無意識に埋没したカリブ海域への真情が読みとれる。同時代作家にもカリプ海域に目を向けた作家が少なくなく、また、ホークスと共に、エイゼンシュテインも、カリブ、及びアメリカの人種差別問題に目を向けていたことを考え合わせると、1930年代のアメリカ文学が、単に、大恐慌の影響を受け、モダニズムを開花させた、というだけでは終わらないということが浮き彫りになる。今年度は、"Dreadful Hollow"及び"Sutter's Gold"へ呼応するカリブ海域との関連で、1930年代を彷佛とさせるフォークナーの短編、'A Rose for Emily'の文化的コンテキストを、人種との関わりから掘り下げて論じるところまで、研究を発展させた。来年度は、実際に、ハリウッドで、フォークナーと同時期に脚本に関わっていたGuy Endoreなどの著作にもあたる予定である。ウィリアム・フォークナーは1920年代後半から1940年代前半まで映画脚本の執筆に携わっていたが、その動機は財政問題にあったため、この時期のシナリオ諸作品には、文化的・歴史的視点かちのアプローチが欠けていた。

しかし、フォークナーと同時期にハリウッドでシナリオ製作、あるいは、映画プロデュースに携わっていた、作家・映画監督などの動向を詳細に検討すると、当時のアメリカ政府による文化政策の影響が色濃く、フォークナーもその影響の範囲内での仕事を余儀なくされていた事実が浮かびあがる。本研究では、フォークナーがハリウッド時代、共に仕事をしたハワード・ホークス文書をユタ州ブリガム・ヤング大学図書館にて調査し、フォークナーとホークスのみならず、ガイ・エンドア、エイゼンシュテインらとの共通認識であったアメリカ海兵隊によるハイチ侵攻及びハイチからの撤退という歴史的事実が与えた映画界への影響の痕跡を探った。映画に携わった当時の映画人・作家は、表現のうえでも、思想のうえでも、アメリカの軍事行動に反発を示し、アメリカ政府がそれに対して検閲制度を強化していったが、そのような制限の中で、いかなる文学作品あるいは映画が生まれ、あるいは闇に葬られていったのかを検証した。ガイ・エンドアの『バブーク』はその好例でもあるが、エンドアとフォークナーが同時期にハリウッドで脚本制作に携わりつつ、全く異なるハイチ表象を選択した背景は、各々の思想的相違というよりは、ハイチに対するイメージの相違と考える。
自閉性障害病因遺伝子変異がシナプス機能及び小胞体ストレスへ及ぼす影響の解析

自閉性障害(ASD)病因遺伝子変異によるASD発症には、変異蛋白の機能喪失と、変異蛋白に誘導されるシナプス機能障害が関与すると考えられる。共通病態として変異による小胞体(ER)ストレス誘導とシナプス機能のアンバランスを想定した。CADM1含めASD病因遺伝子のERストレスへの影響の解析として、変異を持つ患者および患者家系内リンパ芽球に試薬でERストレス誘導後、ストレスマーカーの発現を解析した。変異を持つリンパ芽球はERストレス感受性が高い事を見出した。またCADM1変異ノックインマウス小脳で、抑制性ー興奮性シナプスバランスが不均衡であることを同定し、変異とシナプスバランスの関連性が示唆された。我々はCADM1、GPR37、GPR85等の遺伝子にASDの病因と考えられる変異を報告した。シナプス接着蛋白CADM1の解析では変異を導入した培養神経細胞で変異蛋白により小胞体ストレスが誘導され樹状突起の伸長が妨げられた。また、CADM1ノックアウトマウスの行動解析でASDの主症状を完全には再現できなかったことから、遺伝子変異によるシナプス蛋白のLoss of functionのみならず、遺伝子変異が誘導する小胞体ストレスがGain of functionとしてシナプス機能障害に関与すると推定し、以下の計画で研究を実施した。(1) ASD病因遺伝子変異が小胞体ストレス誘導へ与える影響の解析:ASD病因遺伝子変異を持つ患者リンパ芽球に、小胞体ストレス誘導試薬を添加し培養後、回収した細胞を用いて小胞体ストレスマーカーの発現を解析し、小胞体ストレス感受性を検出する方法を確立した。CADM1(Y251S)変異を持つ患者リンパ芽球で小胞体ストレス感受性解析を行った結果、遺伝子変異を持つリンパ芽球は持たないリンパ芽球と比較し、小胞体ストレス感受性が高かった。(2) ASD病因遺伝子がシナプス機能に与える影響の解析:ASD共通病態としてシナプス形成不全、シナプスバランスの乱れを想定し、CADM1、GPR37、GPR85の各病因遺伝子とシナプス形成、足場蛋白との結合の有無などの関連を改変マウス脳組織を用いて検討している。(3)新たなASD疾患関連遺伝子変異の同定:セクレチン受容体(SCTR)遺伝子でASD疾患関連変異を同定した。またアレーCGHを用いてCNV同定を行っている。【研究(1)】ASD病因遺伝子変異が小胞体ストレス誘導へ与える影響の解析:CADM1変異(H246N, Y251S)、GPR85変異(M152T)をもつASD患者およびその家系のリンパ芽球を用いて、家系内において変異の有無で小胞体ストレス感受性に違いがあることを検出した。(方法)リンパ芽球に小胞体ストレス誘導試薬(ツニカマイシン)を1μg/ml添加し、一定時間培養後、細胞を回収した。小胞体ストレスマーカーCHOPmRNA発現量の変化を、リアルタイムPCR定量し、変異を持つ患者リンパ芽球ではCHOPmRNA発現ピークが早期に現れ、小胞体ストレス感受性が高い事が示唆された。小胞体ストレス下でスプライシングを引き起こすXBP1mRNAのスプライシング産物の発現変化のRT-PCR法での解析、小胞体ストレス蛋白質GRP78発現のWestern blotでの解析でも、変異を持つ者のリンパ芽球で小胞体ストレス感受性が高いことを検出した。【研究(2)】ASD病因遺伝子がシナプス機能に与える影響の解析:ASD病因遺伝子ノックアウトマウスおよび変異ノックインマウスの解析。野生型Cadm1(WT)マウス及びCadm1(Y251S)変異ノックインマウス(ホモ)の小脳における興奮性・抑制性シナプス蛋白の発現を組織蛍光免疫染色およびWestern blottingにより比較した。抑制性シナプスマーカーGABBR2がWTと比較し、ホモマウスで強く発現しており、シナプスバランスが抑制性に傾いている事が示唆された。【研究(3)】新たなASD疾患関連遺伝子変異の解析:SCTR変異解析の結果、P90L、R2C、A245Tの変異を検出し、これらはコントロール群にはなく、ASD関連遺伝子変異の可能性が高い。

(3)新たなASD疾患関連遺伝子変異の同定:セクレチン受容体(SCTR)遺伝子でASD疾患関連変異を同定した。またアレーCGHを用いてCN V同定を行っている。(1)ASD病因遺伝子変異が小胞体ストレス誘導へ与える影響の解析:ASD患者から同定したSCTR遺伝子変異家系のリンパ芽球を用いて小胞体ストレス解析を行った。(2)ASD病因遺伝子がシナプス機能に与える影響の解析:シナプス機能と行動の関係の解析としてCadm1(Y251S)-KIマウスを用いた行動解析を行った。Cadm1ノックアウトマウスに見られなかった自閉性障害に特徴的な行動異常が見られ、自閉性障害モデルマウスと考える。(3)新たなASD疾患関連遺伝子変異の同定:ASD患者でaCGH解析を16年度は患者35名に実施した。NRXN等、既知の病因遺伝子を含む染色体の微小欠失・重複(CNV)も複数検出された。これまでの解析結果も含め、新たな候補遺伝子として、Chr 1q25.1のGPR52, RABGAP1L、Chr14q32.1のBDKRB1, BDKRB2、8p23.2のCSMD1、6p25.3のDUSP22、その他の遺伝子を抽出し解析している。いくつかの遺伝子で、ASDの病因である可能性が示唆されている。また、全エクソーム解析を8例に実施し、候補遺伝子が複数検出され、解析に着手した。我々はCADM1、GPR37、GPR85等の遺伝子にASDの病因と考えられる変異を報告した。シナプス接着蛋白CADM1の解析では変異を導入した培養神経細胞で変異蛋白により小胞体ストレスが誘導され樹状突起の伸長が妨げられた。また、CADM1ノックアウトマウスの行動解析でASDの主症状を完全には再現できなかったことから、遺伝子変異によるシナプス蛋白のLoss of functionのみならず、遺伝子変異が誘導する小胞体ストレスがGain of functionとしてシナプス機能障害に関与すると推定し、以下の計画で研究を実施した。(1) ASD病因遺伝子変異が小胞体ストレス誘導へ与える影響の解析:ASD病因遺伝子変異を持つ患者リンパ芽球に、小胞体ストレス誘導試薬を添加し培養後、回収した細胞を用いて小胞体ストレスマーカーの発現を解析し、小胞体ストレス感受性を検出する方法を確立した。CADM1(Y251S)変異を持つ患者リンパ芽球で小胞体ストレス感受性解析を行った結果、遺伝子変異を持つリンパ芽球は持たないリンパ芽球と比較し、小胞体ストレス感受性が高かった。(2) ASD病因遺伝子がシナプス機能に与える影響の解析:ASD共通病態としてシナプス形成不全、シナプスバランスの乱れを想定し、病因遺伝子CADM1とシナプス形成、足場蛋白との結合の有無などの関連を改変マウス脳組織を用いて解析し、CADM1変異マウス脳では、抑制性ー興奮性シナプスバランスが不均衡であることを同定した。
SH2ドメインを含む新規シグナル分子の遺伝子破壊による機能解析

BCR(B細胞抗原受容体)はB細胞上に発現しており、BCRを介して細胞内にシグナル伝達されることが、B細胞の活性化・分化に必須である。BCR刺激により最初に活性化されるPTKの内、Sykが重要な役割を担っていることが欠損B細胞、knock-out mouseの解析より明らかにされていた。従って、Sykのターゲット蛋白質の単離とその蛋白質のBCRシグナルにおける機能解析を目的として研究を行った。Sykによって、チロシンリン酸化される蛋白質(BLNK)を単離し、ノックアウトB細胞を樹立し解析した結果、BLNKはPLC-γ2,Racの活性化に必須であることが明らかになった。更に、PLC-γ2のSH2ドメインがリン酸化されたBLNKに直接結合すること、又、BtkもそのSH2ドメインを用いて、BLNKに結合し、BLNK/PLC-γ2/Btkの複合体が形成されることが、PLC-γ2活性化に必要であることを明らかにした。BCR刺激により最初に誘起される生化学反応は蛋白質のチロシン燐酸化であり、BCR刺激により活性化されるPTKの内、Sykが重要な役割を担っていることが欠損B細胞、knock-ou tmouseの解析より明らかにされていた。Sykによって、チロシンリン酸化される蛋白質(p80)を単離し、そのcDNAクローニング、ノックアウトB細胞を樹立した。p80の構造はアダプター分子SLP-76と30%の相同性を示し、N末から酸性領域・プロリン領域・SH2領域から構成されており、SLP-76がT細胞特異的なのに対し、B細胞特異的な発現を示した。ノックアウトB細胞のBCRシグナルの解析より、BLNKばPLC-γ2,Racの活性化に必須であることが明らかになった。
適応外医薬品へのアクセス改善を目的としたエビデンス評価システムの検証

本研究は、医薬品適応外使用のアクセス改善に必須である医薬品のエビデンス評価システムを構築することを目的として、日本の公知承認審査におけるエビデンスの選択から、承認の意志決定までの評価・判断基準の解析を行った。海外での承認は非常に重要ではあるが必須ではなく、むしろ世界標準的な教科書や診療ガイドラインにおける有効性・安全性の保証が常に必要とされる。さらに特定のカテゴリーの医薬品におけるエビデンスと承認等のアクセス確保に関する研究として、医薬品のコンパニオン診断薬およびCBRN対策医薬品のエビデンスと承認に関する研究を行った。本研究は、医薬品適応外使用のアクセス改善に必須であるエビデンス評価システムを日本で構築することを目的として、1日本の適応外使用要望のエビデンス・推奨度の検証、2日本の公知承認審査と米国コンペンディウムにおけるエビデンスの評価から、承認・推奨の意志決定までの評価・判断基準の解析、を行うことにしている。25年度は当初「適応外薬の要望」による2009年公募分285要望を対象に、DRUGDEXにおける評価(エビデンスに関する評価、推奨度など)、要望の基本属性(ATC分類、成人・小児の別など)、米国での承認状況、検討会における検討結果、日本で承認された場合のエビデンス、について調査、それぞれの関係を解析する予定であったが、多くの要望に対して日本での承認審査が進行している段階であったため、日本の承認状況が落ち着くまで、解析を延期した。代わりに25年度のエビデンスと承認等の意志決定までの判断基準解析を行う対象として、医薬品のコンパニオン診断に関するエビデンスと承認等に関する解析を行った。添付文書にBMによる診断の記載を取り入れる傾向は、米国が最も強く、英国、日本の順に続いていた。3ヶ国間の添付文書でのBM情報記載の差は、BMの種類、医薬品の対象疾患により違いがあるが、これらの差は、BM利用を支持するエビデンスの強さや、添付文書に記載することの実用性によって決まっていると推測できた。さらに解析手段としてテキストマイニングが利用できることを、添付文書安全性情報の解析により示すことができた。本研究は、医薬品適応外使用のアクセス改善に必須であるエビデンス評価システムを日本で構築することを目的として、1日本の適応外使用要望のエビデンス・推奨度の検証、2日本の公知承認審査と米国コンペンディウムにおけるエビデンスの選択から、承認・推奨の意志決定までの評価・判断基準の解析、を行うことにしている。24年度は日本の公知申請承認80品目を利用して、米国メディケアで使用している4種のコンペンディウムの特性検証を行い、25年度以降の研究で主に使用するコンペンディウムを選択することを目標に設定していた。まず各コンペンディウムの特性を明確にするために、検討対象とする公知申請承認80品目での、承認時に評価したエビデンス(評価している資料の種類・質、海外での承認状況など)の詳細調査と品目の属性(申請・承認年月日、審査期間、ATC(Anatomical Therapeutic Chemical)分類、成人・小児、希少疾病など)に基づく解析を行い、論文発表した(Clin Ther 2012; 34: 2104-16)。次に、この公知申請承認80品目を用いて、実際のコンペンディウムでの評価を調べ、今後の研究で主に使用するコンペンディウムの選択を行った。結果、収録医薬品数と評価されている効能・効果の多さ、最新情報のupdateの頻度、実際の調査の容易さなどから、DRUGDEXを今後主に使用するコンペンディウムとすることにした。さらに、DRUGDEXを用いた「適応外薬の要望」のうち2009年公募分285要望に対する予備調査を行い、25年度以降の解析に必要な収録医薬品数・評価効能効果数があることを確認した。26年度は当初から計画していた「適応外薬の要望」による2009年公募分285要望に関して、日本での承認状況を見守りつつ、DRUGDEXにおける評価(エビデンスに関する評価、有効性、推奨度)、要望の基本属性(ATC分類等)、海外での承認状況、日本で承認された場合のエビデンスについての調査を続けた。一方、25年度から引き続き、特定のカテゴリーの医薬品におけるエビデンスと承認等のアクセス確保に関する研究として、医薬品のコンパニオン診断に関するエビデンスと評価に関する研究を継続し、26年度は、コンパニオン体外診断薬の承認におけるエビデンス評価について研究した。体外診断用医薬品の承認としてみると日本の承認診断薬は限られており、医薬品が承認されていてもコンパニオン診断が利用できない状況にみえる。しかし日本の場合は、体外診断用医薬品としての承認がなくても、保険償還されているコンパニオン診断法が存在し、保険償還をアクセス可能と判断すると、有効性に関するコンパニオン診断は米国と同程度であることがわかった。

27年度は、初年度から引き続き、特定のカテゴリーの医薬品におけるエビデンスと承認等のアクセス確保に関する研究として、医薬品のコンパニオン診断に関するエビデンスと評価に関する研究を継続し、コンパニオン体外診断薬(CDx)が医薬品の有効性に関連する場合と安全性に関する場合のそれぞれにおいて、CDxとCDxを必要とする医薬品の承認におけるエビデンス評価について研究した。一方、新たにCBRN(Chemical, Biological, Radiological, Nuclear)対策医薬品のエビデンスと承認に関する研究を行った。CBRN対策医薬品は、その性質からヒト対象の前向き介入臨床試験により有効性を確認することができないため、各国が様々な制度を導入し、エビデンスの評価とアクセス確保(承認、計画的な備蓄)を行っている。米国が世界で最も対策が進んでいる国であるが、日本も2001年以降、CBRN対策医薬品に関するエビデンス評価と承認が進み、現時点で日本と米国の承認されているCBRN対策医薬品の種類とその承認の元になったエビデンスの多くは同じであった。一部、米国のみで承認されているCBRN対策医薬品は米国独自のAnimal Ruleにより、エビデンス評価、承認されていた。研究期間全体の成果として,適応外使用医薬品のエビデンス評価では、通常の承認審査で要求される前向きの介入試験による評価だけでなく、使用実態を踏まえた観察・疫学研究による成果が大きく貢献していることが明らかとなった。本研究は、医薬品適応外使用のアクセス改善に必須である医薬品のエビデンス評価システムを構築することを目的として、日本の公知承認審査におけるエビデンスの選択から、承認の意志決定までの評価・判断基準の解析を行った。海外での承認は非常に重要ではあるが必須ではなく、むしろ世界標準的な教科書や診療ガイドラインにおける有効性・安全性の保証が常に必要とされる。さらに特定のカテゴリーの医薬品におけるエビデンスと承認等のアクセス確保に関する研究として、医薬品のコンパニオン診断薬およびCBRN対策医薬品のエビデンスと承認に関する研究を行った。25年度から開始した、特定のカテゴリーの医薬品におけるエビデンスと承認等のアクセス確保に関する研究が順調に進行し、特にコンパニオン診断薬とそれを用いる医薬品の開発、承認におけるエビデンス評価に関する研究が進展しているため。医薬品評価科学特定のカテゴリーの医薬品におけるエビデンスと承認等のアクセス確保に関する研究として、新たにCBRN対策医薬品のエビデンスと承認に関する研究を行っているので、その成果をまとめる。引き続き、コンパニオン診断に関するエビデンス評価に関する研究も進行する。さらに調査を継続してきた「適応外薬の要望」の285要望に関する解析をまとめる。当初25年度に予定していた「適応外薬の要望」のうち2009年公募分285要望を利用したDRUGDEXにおける評価、要望の基本属性、米国での承認状況、検討会における検討結果、日本で承認された場合はそのエビデンス、それぞれの関係の解析は延期することとなったが、代わりに医薬品添付文書におけるコンパニオン診断の記載状況と、医薬品でのコンパニオン診断利用を支持するエビデンスとの関係を示唆する研究結果が得られた。
「ただ乗り」の神経行動学的検討

「ただ乗り」とは、利益(報酬)を探索し獲得するためのコストを他者に支払わせ、自らは横取りするという方略である。主に社会科学・経済学の観点から検討されてきたが、生物学・行動生態学においても、「生産者-略奪者ジレンマ」という枠組みで論じられている。自らコストを支払って餌を発見する「生産者」が多い集団において、各個体は略奪者に転じた方が利得を増やせる。しかしながら生産者の比率が下がると、ただ乗りできる報酬の総量も減る。結果として、生産者と略奪者とが一定割合で共存することが、進化的に安定な戦略となる。本研究は、動物としてのヒトという行動生態学的な観点からただ乗り問題を捉え直し、「リソース競合のある生産者-略奪者ジレンマ」という行動生態学的な枠組みをヒトの行動に適用することで、より普遍性のある形でただ乗り行動を理解できると考えた。作業仮説は、「リスク回避的な人ほど略奪者になりやすい」である。生産者は、見つかるかどうか分からない報酬を、コストを払って探索しなければならない。他方、略奪者は既に見つかった報酬にただ乗りするので、報酬の量は生産者が獲得した分だけ少なくなるが、報酬獲得のコストは少なくて済む。したがって生産者になるか略奪者になるかの選択は、「リスクのある大報酬かリスクのない小報酬か」の選択とパラレルではないかと考えた。今年度は、2017年度までに実施した「社会採餌ゲーム」プロトタイプの行動実験データに対して、新たに状態空間モデルを適用した。各被験者がただ乗り(略奪)行動の出現確率を潜在パラメータp_scrounge (0≦p≦1)として持ち、p_scroungeがローカルレベルモデルに基づいて時間とともに推移するものと仮定した。推定されたp_scroungeとリスク感受性関連指標との関連を調べた。p_scroungeとリスク感受性(Eckel & Grossman (2002)の質問紙に基づく)との関連性は認められなかった。他方、予備的な検討過程で(状態空間モデリングに拠らず)求めた「生産しやすさ」の指標は、EGでリスク回避的な人ほど高い傾向が認められた。すなわち作業仮説からの予想とは逆に、リスク回避的な人ほど生産者として振る舞っていた。このような結果になった理由として、「ただ乗り傾向」と「生産傾向」とが必ずしも一次元上に存在しない可能性を考えることができる。これまでに検討したモデルでは、生産行動の出現確率p_produceがp_scroungeと同一次元にあるものと仮定し(すなわちp_produce = 1-p_scroungeである)、明示的に組み込まなかった。p_scroungeと「生産しやすさ」とは負に相関するもののばらつきが認められ、別の行動次元として検討すべきである可能性がある。提案モデルは、概ねどのデータセットにおいても収束するという点においてある程度妥当だと考えられる。しかしながら上記の問題点の他にも、ゲーム対戦相手との相互作用など、重要だと考えられるものの現行モデルには組み込めていない変数がある。また行動を詳しく分析する過程で、2名のプレイヤーがともに「ただ乗り」しようとして報酬探索をやめてしまうなど、報酬を増やすというゲームの目的からすると一見不合理な行動が生じていることが分かった。興味深い知見ではあるものの、当初想定していなかった行動パターンが様々に存在するため、単純な「生産かただ乗りか」の二分法で行動を分類することが困難だと分かった。第一に状態空間モデルの改善が挙げられる。対戦相手との相互作用を積極的に盛り込むとともに、「生産」とも「ただ乗り」とも判断しがたい行動パターンがみられたとしても、ロバストに「ただ乗り」の潜在パラメータを推定できるモデルを検討する。第二に行動分類手法の改善・自動化が挙げられる。第三に、ゲーム課題そのものの修正・改善が必要である。現在のタスクは生態学的な妥当性を重視した結果、過剰に複雑になっている恐れがある。プレイヤーの行動が「ただ乗り」傾向および対戦相手の行動のみならず、空間探索能力や時間認知などにも大きく影響されると考えられる。そこで現在、生態学的な妥当性はある程度確保しつつも、「ただ乗り傾向」をより適切に抽出できる実験パラダイムを改めて開発中である。報酬探索に係る意志決定においてノルアドレナリン系の活動が重要であるという知見(Aston-Jones & Cohen 2005)を踏まえ、ノルアドレナリン系活動指標の一つである瞳孔径など、生理指標測定と組み合わせることも検討している。

他方、略奪者は既に見つかった報酬にただ乗りするので、報酬の量は生産者が獲得した分だけ少なくなるが、報酬獲得のコストは少なくて済む。したがって生産者になるか略奪者になるかの選択は、「リスクのある大報酬かリスクのない小報酬か」の選択とパラレルではないかと考えた。今年度は、2017年度までに実施した「社会採餌ゲーム」プロトタイプの行動実験データに対して、新たに状態空間モデルを適用した。各被験者がただ乗り(略奪)行動の出現確率を潜在パラメータp_scrounge (0≦p≦1)として持ち、p_scroungeがローカルレベルモデルに基づいて時間とともに推移するものと仮定した。推定されたp_scroungeとリスク感受性関連指標との関連を調べた。p_scroungeとリスク感受性(Eckel & Grossman (2002)の質問紙に基づく)との関連性は認められなかった。他方、予備的な検討過程で(状態空間モデリングに拠らず)求めた「生産しやすさ」の指標は、EGでリスク回避的な人ほど高い傾向が認められた。すなわち作業仮説からの予想とは逆に、リスク回避的な人ほど生産者として振る舞っていた。このような結果になった理由として、「ただ乗り傾向」と「生産傾向」とが必ずしも一次元上に存在しない可能性を考えることができる。これまでに検討したモデルでは、生産行動の出現確率p_produceがp_scroungeと同一次元にあるものと仮定し(すなわちp_produce = 1-p_scroungeである)、明示的に組み込まなかった。p_scroungeと「生産しやすさ」とは負に相関するもののばらつきが認められ、別の行動次元として検討すべきである可能性がある。提案モデルは、概ねどのデータセットにおいても収束するという点においてある程度妥当だと考えられる。しかしながら上記の問題点の他にも、ゲーム対戦相手との相互作用など、重要だと考えられるものの現行モデルには組み込めていない変数がある。また行動を詳しく分析する過程で、2名のプレイヤーがともに「ただ乗り」しようとして報酬探索をやめてしまうなど、報酬を増やすというゲームの目的からすると一見不合理な行動が生じていることが分かった。興味深い知見ではあるものの、当初想定していなかった行動パターンが様々に存在するため、単純な「生産かただ乗りか」の二分法で行動を分類することが困難だと分かった。第一に状態空間モデルの改善が挙げられる。対戦相手との相互作用を積極的に盛り込むとともに、「生産」とも「ただ乗り」とも判断しがたい行動パターンがみられたとしても、ロバストに「ただ乗り」の潜在パラメータを推定できるモデルを検討する。第二に行動分類手法の改善・自動化が挙げられる。第三に、ゲーム課題そのものの修正・改善が必要である。現在のタスクは生態学的な妥当性を重視した結果、過剰に複雑になっている恐れがある。プレイヤーの行動が「ただ乗り」傾向および対戦相手の行動のみならず、空間探索能力や時間認知などにも大きく影響されると考えられる。そこで現在、生態学的な妥当性はある程度確保しつつも、「ただ乗り傾向」をより適切に抽出できる実験パラダイムを改めて開発中である。
SHG光計測による瞬時大変形した赤血球の膜損傷の可視化と損傷度の定量

SHG(Second Harmonic Generation)は細胞膜の構造変化を反映する.細胞膜にダメージが加われば,細胞膜の構造は変化するはずであるため,細胞膜のダメージを定量化できるはずである.本研究では,細胞膜に与えるダメージとSHG光強度との関係の定量化を目指している.細胞膜のダメージの可視化を目指し,まずはSHG観察によって細胞膜に沿った円環状の画像が取得できるかを確認した.観察対象を赤血球としSHG観察したところ,円環状のシグナルを得ることはできなかった.そこで,SHG専用色素Ap3を用いることで,細胞膜のSHG観察を可能にしようと考え,Ap3で染色した赤血球をSHG観察した.その結果,円環状のSHGシグナルは得られたものの,それが細胞膜であるかは不明であったため,サイズが大きいPASM(ブタ胸大動脈由来平滑筋細胞)に切り替えて,Ap3で染色して観察した.しかしながら,泡の発生や細胞が瀕死の状態となってしまったため,生細胞では細胞膜の観察ができなかった.そこで,細胞を固定してAp3染色の条件の最適化を試みたが,様々な条件を試しても細胞膜を観察することはできなかったため,観察方法を一から見直した.具体的には観察を落射観察から透過観察に変更し,検出フィルターの波長幅を狭くした.その条件でPASMの細胞膜を観察したところ,わずかに細胞膜を観察できたが,環状のシグナルは得られなかった.これは,PASMの細胞高さが小さいことが原因であり,細胞膜の観察にはある程度の細胞高さが必要だと考えた.その仮説のもと,細胞高さが大きいニワトリの赤血球を観察したところ,ニワトリの赤血球で環状に細胞膜を観察することができた.すなわち,昨年度の成果としては,ニワトリの赤血球において,細胞膜のSHG観察を行える染色条件ならびに観察条件の同定が行えたことである.赤血球膜をSHG光にて可視化する条件および方法を決定した。これにより2年目以降に予定している細胞膜を損傷した場合でのSHG光変化を調べることが可能になる。今年度の最終目標は細胞膜に与えるダメージ量とSHG光強度との関係の定量化である.それにはまず,細胞膜にダメージが加わると細胞膜から発せられるSHG光は減光するのかを確認する.その確認には,細胞膜に確実にダメージを与える必要がある.その方法として,浸透圧による膜破壊,エレクトロポレーションなどが考えられる.浸透圧によって膜破壊を発生させた場合,細胞膜のどの部分に損傷が起こったのか不明である.SHG観察可能な細胞膜の箇所は,光軸方向と垂直に配向するリン脂質にあたる部分のみであるという報告がある(Mizuguchi et al, 2018) .よって,細胞膜の狙った箇所に確実にダメージを与える方法が必要である.エレクトロポレーションは(電気穿孔法)は,細胞に電気パルスを与えることで一時的に小さな孔を生じさせる方法である.特にエレクトロポレーションにおいては電気パルスの陽極側に大きなダメージが加わることが報告されている(Moen et al, 2014)ため,細胞膜の狙った箇所に確実にダメージを与えることができる.この方法によって,細胞膜にダメージが加わるとSHG光が減光することを確認する.次に,細胞膜に機械的なダメージを与える方法を検討する.前述したように,最終目標は細胞膜に与えるダメージ量とSHG光強度との関係の定量化であるため,与えるダメージも定量可能な量でなければならない.例としてひずみがあるが,細胞の引張試験は現実的には非常に困難である.このように,直径10 μm以下の細胞に機械的なダメージを与えることは困難であるため,その方法を検討しなければならない.最終的には,細胞膜に機械的なダメージを与えた上で,SHG観察し,細胞膜に与えるダメージ量とSHG光強度との関係を定量化する.SHG(Second Harmonic Generation)は細胞膜の構造変化を反映する.細胞膜にダメージが加われば,細胞膜の構造は変化するはずであるため,細胞膜のダメージを定量化できるはずである.本研究では,細胞膜に与えるダメージとSHG光強度との関係の定量化を目指している.細胞膜のダメージの可視化を目指し,まずはSHG観察によって細胞膜に沿った円環状の画像が取得できるかを確認した.観察対象を赤血球としSHG観察したところ,円環状のシグナルを得ることはできなかった.そこで,SHG専用色素Ap3を用いることで,細胞膜のSHG観察を可能にしようと考え,Ap3で染色した赤血球をSHG観察した.その結果,円環状のSHGシグナルは得られたものの,それが細胞膜であるかは不明であったため,サイズが大きいPASM(ブタ胸大動脈由来平滑筋細胞)に切り替えて,Ap3で染色して観察した.しかしながら,泡の発生や細胞が瀕死の状態となってしまったため,生細胞では細胞膜の観察ができなかった.そこで,細胞を固定してAp3染色の条件の最適化を試みたが,様々な条件を試しても細胞膜を観察することはできなかったため,観察方法を一から見直した.具体的には観察を落射観察から透過観察に変更し,検出フィルターの波長幅を狭くした.その条件でPASMの細胞膜を観察したところ,わずかに細胞膜を観察できたが,環状のシグナルは得られなかった.これは,PASMの細胞高さが小さいことが原因であり,細胞膜の観察にはある程度の細胞高さが必要だと考えた.

その仮説のもと,細胞高さが大きいニワトリの赤血球を観察したところ,ニワトリの赤血球で環状に細胞膜を観察することができた.すなわち,昨年度の成果としては,ニワトリの赤血球において,細胞膜のSHG観察を行える染色条件ならびに観察条件の同定が行えたことである.赤血球膜をSHG光にて可視化する条件および方法を決定した。これにより2年目以降に予定している細胞膜を損傷した場合でのSHG光変化を調べることが可能になる。今年度の最終目標は細胞膜に与えるダメージ量とSHG光強度との関係の定量化である.それにはまず,細胞膜にダメージが加わると細胞膜から発せられるSHG光は減光するのかを確認する.その確認には,細胞膜に確実にダメージを与える必要がある.その方法として,浸透圧による膜破壊,エレクトロポレーションなどが考えられる.浸透圧によって膜破壊を発生させた場合,細胞膜のどの部分に損傷が起こったのか不明である.SHG観察可能な細胞膜の箇所は,光軸方向と垂直に配向するリン脂質にあたる部分のみであるという報告がある(Mizuguchi et al, 2018) .よって,細胞膜の狙った箇所に確実にダメージを与える方法が必要である.エレクトロポレーションは(電気穿孔法)は,細胞に電気パルスを与えることで一時的に小さな孔を生じさせる方法である.特にエレクトロポレーションにおいては電気パルスの陽極側に大きなダメージが加わることが報告されている(Moen et al, 2014)ため,細胞膜の狙った箇所に確実にダメージを与えることができる.この方法によって,細胞膜にダメージが加わるとSHG光が減光することを確認する.次に,細胞膜に機械的なダメージを与える方法を検討する.前述したように,最終目標は細胞膜に与えるダメージ量とSHG光強度との関係の定量化であるため,与えるダメージも定量可能な量でなければならない.例としてひずみがあるが,細胞の引張試験は現実的には非常に困難である.このように,直径10 μm以下の細胞に機械的なダメージを与えることは困難であるため,その方法を検討しなければならない.最終的には,細胞膜に機械的なダメージを与えた上で,SHG観察し,細胞膜に与えるダメージ量とSHG光強度との関係を定量化する.昨年度は、実験条件の選定に時間がかかってしまったため、消耗品代が残ってしまった。成果に記したように、実験条件は決定できたため、今年度は昨年度予定していた実験も含めて行っていく予定である。
校内研究改善のための授業検討会分析ツールの開発

1本研究の背景、目的本研究では、校内研修の運営者が自校の授業検討会の実態を把握し、その改善につなげるためのツールを開発・評価する。具体的には授業検討会の話し合いがどのように行われているかを可視化するシートである。本研究では、著者が以前に開発した「発言分析シート2010AB」を試験的に利用し、評価したうえで「発言分析シート2016AB」を開発し現場で校内研修の運営者に対しての「マニュアル」をコンパクトにまとめ、ウエブサイトで公開をする。2本研究の方法筆者が作成した「発言分析シート2010AB」をいくつかの学校で使用してもらい、シートの効果と課題を明確にする。STEP2発言分析シート2016ABの試作・評価1STEP1で明らかになった課題と、先行研究の知見を踏まえて「発言分析シート2016AB」試作する。2いくつかの学校の授業検討会に「試作版発言分析シート2016AB」を使用してもらい、評価を得る。その際にいくつかの授業検討会には実際に参加し、筆者が発言シートを使用して分析する。3評価作業と並行して、アメリカの小学校の授業研究会に参加し、授業検討会についての情報収集を図る。STEP3発言分析シート2016ABの完成と公開1市内の教員グループミーティングを実施し、それに基づいて、完成版を試作する。2「発言分析シート2016AB(試作)」の成果と課題を明確にし、「発言分析シート2016AB」を完成する。3インターネット上に「発言分析シート2016AB」を公開するとともに、使用した感想や意見を得てよりよいものに改善していく1本研究の背景、目的本研究では、校内研修の運営者が自校の授業検討会の実態を把握し、その改善につなげるためのツールを開発・評価する。1市内の教員グループミーティングを実施し、それに基づいて、完成版を試作する。3インターネット上に「発言分析シート2016AB」を公開するとともに、使用した感想や意見を得てよりよいものに改善していく
アーベル多様体の有理点のなす郡についての研究

代数函数体上定義された1次元アーベル多様体である楕円曲線、及びその特殊化として得られる準楕円曲線を主に研究した。ネロンの極小モデル理論により、これらの曲線の有理点の研究を、それぞれ代数閉体上定義された楕円曲面、及び準楕円曲面上定義されるのファイブレーションの切断を研究することに帰着させ、曲面上の交点理論やその上に定義されたファイブレーションの退化理論などにより次の結果を得た。(1)標数2、及び3の体上定義された単有理準楕円曲面のモ-デル・ヴェイユ郡、ネロン・セベリ郡、準楕円ファイブレーションの退化、及び曲面、切断の定義方程式などの決定。(2)正標数の代数閉体上定義された楕円曲面で、特に射影直線上のファイブレーション構造を持ち、切断のなす郡(モ-デル・ヴェイユ郡)が有限郡となる場合のモ-デル・ヴェイユ郡、退化の様子、及び曲面、切断の定義方程式などの決定。上記(2)の曲面は超特異曲面と呼ばれる正標数特有の曲面であり、非常に興味の持たれる対象であり、中でもK3曲面の場合、上記性質、即ちモ-デル・ヴェイユ郡が有限となる場合をほぼ決定できた。その結果、これらは有理曲面で上記の性質を持つものからのフロベニウス基底拡大で得られるという顕著な性質を持つことがわかり、一般の超特異曲面に対しても類似の性質が成り立つことを予想する根拠となる。これら事実は大変興味深く、標数0の場合に進んでいる多くの研究との関連から、今後更に発展させたい。