hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
炎症性腸疾患におけるマトリックスメタロプロテアーゼと潰瘍形成の関連

われわれはMMPが組織の破壊修復過程における重要な役割をもっていると考え、潰瘍性大腸炎における発現を検討した。免疫組織染色法を用いた検討でMMP・1,2,3,9については特徴的な染色傾向を認めないが、マトリライシンは高度な炎症所見を伴う潰瘍辺縁に強い発現を認め、潰瘍辺縁以外の上皮やリンパ球などの間質細胞には発現陰性の染色傾向を示した。また同病変でTIMP・1,2の発現は認められないことから、潰瘍辺縁部においてはマトリライシンが発現優勢であると考えられる。一方、中等度の炎症所見がある組織では、ほとんどが染色されず、RT・PCRでもマトリライシンの発現は認められない。以上より潰瘍性大腸炎におけるマトリライシンの発現は、潰瘍形成あるいは修復に働いていることが想定される。炎症性腸疾患における細胞外基質分解酵素マトリックスメタロプロテアーゼ(MMP)の発現と病態との関連に注目し検討を行った。炎症性疾患全般についてみると慢性関節リウマチにおいて滑膜細胞がMMPを生産していることが既に明らかとされている。一方、炎症性腸疾患におけるプロテアーゼの役割は、これまで一部のセリンプロテアーゼについて報告があるのみで詳細な検討はなされていないが、炎症性腸疾患において炎症に起因する潰瘍形成などの組織破壊が認められることは明らかであり、この組織破壊に何らかのプロテアーゼが作用していることが考えられる。免疫組織染色法を用いた検討でMMP-1,2,3,9については特徴的な染色傾向を認めないが、マトリライシンは高度な炎症所見を伴う潰瘍辺縁に強い発現を認め、潰瘍辺縁以外の上皮やリンパ球などの間質細胞には発現陰性の染色傾向を示した。また同病変でTIMP-1,2の発現は認められないことから、潰瘍辺縁部においてはマトリライシンが発現優勢であると考えられる。一方、中等度の炎症所見がある組織では、ほとんどが染色されず、RT-PCRでもマトリライシンの発現は認められない。マトリライシンの発現の認められる高度な炎症を伴った潰瘍辺縁の上皮細胞は、病理組織学的には再生像が強く、マトリライシンの発現と組織修復との関連が示唆された。
固体粒子のナノスケール構造・化学分析から挑む氷晶核メカニズムの解明

地球温暖化などの気候変動メカニズムの理解にとって、氷の粒(氷晶)からなる氷晶雲が不確定要素となっている。このため、高い氷晶核能を持つ粒子がどのような物理化学特性を持ち、どのようなメカニズムで氷を成長させるかの解明は大気科学における挑戦的な研究課題である。本研究では、申請者がこれまで蓄積してきた顕微鏡学的分析技術を組み合わせ、結晶構造、ナノスケールの化学分析を同一粒子に行う革新的な実験手法によって、この謎の解明に取り組む。
細胞が生成するトルクの新規測定手法を用いたキラルな細胞動態の解明

本研究の目的は、1細胞レベルのキラルな力学特性を定量的に明らかにし、キラルな細胞動態を力学的な観点から解明することである。そのために、本年度は、1細胞が生成するトルクの測定手法を確立することを目指した。具体的には、蛍光ビーズを分散させたゲルでできたマイクロウェルに1細胞を閉じ込め、ゲルの変形に伴う蛍光ビーズの変位から、細胞がマイクロウェルの内面に生成する力の場を算出することを計画した。計画を実施するために、まずはマイクロウェルを作成し、1細胞をマイクロウェルに閉じ込める手法を確立する必要があった。そこで、本年度は、UV硬化性樹脂を用いて、シリコン基板上にマイクロウェルのパターンを作成し、そのパターンをシリコン樹脂に転写することでマイクロウェルの作成を行った。このとき、マイクロウェルの内面のみを細胞接着のためのタンパク質フィブロネクチンで修飾し、それ以外の部分は細胞が接着しないようにする手法を用いて、細胞をマイクロウェルの中に特異的に閉じ込められるように工夫をした。フィブロネクチンを抗体染色することで、実際にマイクロウェルの内面に、特異的にフィブロネクチンが修飾されていることを確認した。続いて、このマイクロウェルに1細胞を閉じ込めることに成功した。以上のように、本年度は、マイクロウェルを作成し、1細胞をウェルの中に閉じ込める手法を確立した。今後は、シリコン樹脂に蛍光ビーズを分散させたマイクロウェルを作成し、キラルな細胞動態を示すことが報告されている細胞を閉じ込め、細胞のトルク測定を行っていく。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。
上衣繊毛ナノシステムの協調運動制御

1.上衣繊毛運動の極性獲得:上衣細胞繊毛の運動機能獲得過程と繊毛基部の分布の関係を明らかにするため、繊毛基部をGFPで標識したトランスジェニックマウスを用いてイメージングを行った。新鮮脳サンプルに対して細胞膜を色素により標識し、繊毛を可視化し高速度コンフォーカル顕微鏡にて撮影した。その結果、繊毛基部が成熟とともに分布変化し、それに伴って繊毛運動の極性と協調性が確立することが明らかになった。2.培養上衣細胞を用いた解析:培養下にて上衣細胞を高効率に分化させる方法を確立し、神経幹細胞からの上衣細胞の分化・成熟過程を解析した。その結果、分化から10日で成熟した繊毛を有する上衣細胞が生じることを見いだした。このことは、脳内では生後1週間までの間に上衣細胞が繊毛を成熟させることと類似しており、繊毛成熟過程を調べるための系として適していると考えられる。3.平面内細胞極性コア遺伝子群の関与:上衣細胞の極性を制御する因子の候補としてPCPコア遺伝子群の発現を調べた結果、膜蛋白質Strabismusl、エフェクター分子Dishevelled2、受容体蛋白質Frizzled3が上衣細胞の分化過程において、強く発現することを見いだした。これらの遺伝子産物の機能を調べるためにドミナントネガティブ型変異体およびshRNAを発現する高効率レンチウイルスを作成した。これらのウイルスを生後1日のマウス脳室内に注入し生後20日で上衣細胞の形態を調べたところ、対照群に比べて差はみられなかった。この結果は、これらの遺伝子群の機能阻害が繊毛の形成自体には影響を及ぼさず、極性形成に関与する可能性を示唆している。1.上衣細胞の極性形成過程の解析(1)走査型電子顕微鏡によって上衣細胞の分化過程における形態変化を観察し,上衣細胞は生後直後には繊毛を持たず,生後一週間の間に極性を示す繊毛を伸長させることを明らかにした。(2)繊毛基部およびゴルジ体マーカーによる脳室壁のホールマウント標本の染色を行い,繊毛の基部がまず上衣細胞表面全体に出現したのちに,前後極性を持つ分布へと変化することを見いだした。(3)繊毛の基部の分布の変化を生きた標本で観察するため,繊毛基部に局在する蛋白質Centrin2とGFPの融合蛋白質および細胞境界に局在するZO1とGFPの融合蛋白質を発現するDNAをエレクトロポレーションにより生後2日後の脳室壁に導入した。生後5日においてこれらの局在をタイムラプス撮影により観察し,繊毛基部が時間の経過とともに極性を獲得することを見いだした。2.平面細胞極性コア遺伝子群の関与の解析:上衣細胞の極性を制御する因子として平面細胞極性コア遺伝子群が挙げられる。我々はこの遺伝子群のうちStrabismusが上衣細胞の分化過程において発現することをin situ hybridization法により見いだした。さらに抗Strabismus抗体によってStrabismusの細胞内局在を観察したところ,上衣細胞内で前後極性のある局在を示すことがわかった。この結果は,Strabismusが上衣細胞の前後極性形成に関与する可能性を示唆している。
マルチスケール分析による嗅覚系神経回路の基本デザインの解明

生物の匂い識別機構を理解するために,カイコガの嗅覚一次中枢である触角葉の構成神経を対象として,マルチスケール分析を行った.まず,触角葉を構成する糸球体の再構成を行い,空間的位置情報から糸球体を個体間で同定する技術を確立した.つづいて投射神経の匂いに対する神経活動を糸球体に再構成することで,匂い情報が糸球体の時空間的な活動パターンによって表現されていることを示した.さらに局所介在神経の網羅的形態分析から,これらの特性が領域特異的に分枝する局所介在神経の動作によることを示唆した.生物の匂い識別機構を理解するために,カイコガの嗅覚一次中枢である触角葉の構成神経を対象として,マルチスケール分析を行った.まず,触角葉を構成する糸球体の再構成を行い,空間的位置情報から糸球体を個体間で同定する技術を確立した.つづいて投射神経の匂いに対する神経活動を糸球体に再構成することで,匂い情報が糸球体の時空間的な活動パターンによって表現されていることを示した.さらに局所介在神経の網羅的形態分析から,これらの特性が領域特異的に分枝する局所介在神経の動作によることを示唆した.生物の嗅覚情報処理機構の解明を目的に、本研究はカイコガー次嗅覚中枢である触角葉を構成する神経細胞を対象に以下の解析を行った。嗅受容細胞と触角葉糸球体との対応を明らかにするために、性フェロモン受容体遺伝子であるBmOR1またはBmOR3の上流領域をプロモータとしてGFPを発現する遺伝子組換えカイコガを作出した。BmOR1とBmOR3の発現細胞の軸索はそれぞれ、大糸球体のトロイドとキュムラスと呼ばれる異なるユニットに収束して投射しており、フェロモンの情報は糸球体への入力レベルから異なる領域で処理されることを示唆した。これらの嗅受容細胞の神経活動を計測するためにカルシウム感受性蛍光タンパク質GCaMPを発現する遺伝子組換え体の作出を行ったが、系統の確立にはいたらず、19年度以降に継続して行う予定である。並行して、触角葉からの出力神経である投射神経の解析を行った。細胞内記録法により神経活動を記録後、同じ細胞の分枝パターンを細胞内染色法により分析、再構成することで、単一投射神経の活動と糸球体構造を明確に対応付ける方法を確立した。この方法を用いて、匂いの情報が触角葉の時空間的な活動パターンにより表現されることを明らかにした。さらに、視認下電極刺入法により、局所介在神経の形態の同定を網羅的に行い、分枝領域の違いにより5タイプに分類されることを示した。視認下電極刺入法による生理応答の記録に数例成功したものの、局所介在神経の生理応答データ取得については十分な成果を得るにいたっておらず、19年度以降に継続して行う。本研究に関連して、昆虫の嗅覚情報処理機構を考察した総説、図書を計3編発表した(神崎、2006;櫻井ら、2006;関ら、2007)。また成果の一部は、日本比較生理生化学会、日本動物学会、アメリカ化学感覚学会、ヨーロッパ味と匂い学会等の国内外の学会の学術会議において報告した。生物の嗅,覚情報処理機構の解明を目的に,カイコガー次嗅覚中枢である触角葉を構成する神経細胞を対象に以下の解析を行った。触角葉における嗅覚受容細胞の匂い応答パターンを調べるために,昨年度の研究で作出した遺伝子組換え系統を改良し,性フェロモン受容細胞でカルシウム感受性蛍光タンパク質G-CaMPを発現する遺伝子組換え系統を作出した。この系統を用いて,触角をフェロモン刺激すると触角葉の大糸球体で濃度依存的なカルシウム濃度の上昇が起こることを示した。また単一感覚子記録法のセットアップを行い,予備実験として匂い刺激に対する受容細胞の電気的反応の計測に数例成功した。並行して,触角葉からの出力神経である投射神経の解析を進め,大糸球体へ分枝する投射神経の一部は,フェロモン単体で触角を刺激したときに比べ,植物の匂い成分とフェロモンの混合物で刺激したときにより強い反応を示すことを見出した。この反応の違いは受容細胞レベルで起こることが示唆され,これらの結果を原著論文として発表した(Namiki and Kanzaki,2008)。昨年度,分類した局所介在神経のタイプと機能との関係を明らかにするため,細胞内染色法と抑制性神経伝達物質であるGABAへの抗体を用いた2重染色実験を行い,多くの局所介在神経はGABA陽性であること,局所介在神経のタイプとGABAの分布に相関があること,を見出した。この結果を原著論文として発表した(Seki and Kanzaki, 2008)。上記に加えて,本研究の成果に関連して,原著論文を2編(lkeno, et. al., 2007; Yamagata, et. al., 2008),昆虫の嗅覚情報処理機構を考察した総説,図書を計5編発表した。また成果の一部は,日本比較生理生化学会,国際比較生理生化学会などの国内外の学会の学術会議において報告した生物の嗅覚情報処理機構の解明を目的に、カイコガー次嗅覚中枢である触角葉を構成する神経細胞を対象に以下の解析を行った。複数のオス個体の触角葉の共焦点顕微鏡像の3次元再構成を行い、糸球体の相対位置を調べることで、精密な糸球体地図を構築した(Kazawa et al.,2009)。

構築した地図を参照しながら、細胞内記録法により神経活動を記録後、同じ細胞の分枝パターンを細胞内染色法により分析、再構成することで、単一投射神経の活動と糸球体構造を明確に対応付ける方法を確立した。異なる匂い刺激に対する活動の比較から、匂い情報は糸球体の時空間的な活動パターンによって表現されていることを明らかにし、これらの結果を原著論文として発表した(Namiki andKanzaki,2008)。並行して、局所介在神経の匂い応答を単一神経および神経ネットワークレベルで調べるために、エレクトロポレーション法により神経細胞にカルシウム感受性色素を注入する技術を開発した。この方法を用いて、局所介在神経の応答は投射神経の応答より潜時が短い可能性を示唆する結果を得た(Fujiwaravet al.,inpress)。また、本研究期間内に触角葉の構成神経全体を対象にしたシミュレーションには至らなかったものの、これまでに得られた研究成果をもとにして、局所介在神経をモデルとして単一神経の入出力をシミュレーションする技術の開発に成功した。さらに、シミュレーションの妥当性を検証するために、光感受性イオンチャネルであるチャネルロドプシン2をフェロモン受容細胞で特異的に発現するカイコガを作出し、光照射の時間および強度依存的に神経活動を人為的に制御する系を確立した。上記に加えて、本研究の成果に関連して、原著論文を2編(Kazawa et al.,2008;Fukushima and Kanzaki,2009)、昆虫の嗅覚情報処理機構を考察した総説、図書を計5編発表した。また成果の一部は、日本比較生理生化学会、国際嗅覚味覚シンポジウムなどの国内外の学会の学術会議において報告した。
膜結合エストロゲン受容体の局在と構造の解明

1.膜結合エストロゲン受容体(M-ER)の局在の検索(免疫電顕)post-embedding法を用いた免疫電顕法によって、エストロゲン刺激、非刺激時のM-ERの局在をマウス子宮とMCF-7ヒト乳癌細胞において検索した。抗ERα陽性反応は子宮上皮のクロマチンに認められたが、エストロゲン投与における核内ERαの局在の変化は、特に認められなかった。細胞質、細胞膜上にも少数の金粒子が存在したが、一次抗体を作用させなかった対照群に比べて有意な差は認められなかった。MCF-7細胞では、陽性反応はクロマチンに認められ、少数の金粒子は細胞質および細胞膜に局在した。しかし細胞によって、核内、細胞質、細胞膜の金粒子の比率が大きく異なっていることが判明した。エストロゲン刺激15分後では、細胞膜の金粒子はやや増加している印象を受けた。現在、エストロゲン刺激前後の核内、細胞質、細胞膜の金粒子密度の定量化を行なっている。2.エストロゲン刺激時のERαのウエスタンブロット法による解析MCF-7細胞を10nMエストロゲンで刺激後、発現するERαをウエスタンブロット法で解析した。刺激後1時間以内では、65kDおよび37kDのバンドが抗ERα抗体と反応し、明らかなERα量の変化や、ERαの修飾、分解などは観察されなかった。3.エストロゲン刺激時のMAPKの活性化の解析ERK1,2の発現量はすべての試料でほぼ同じであったが、リン酸化されたERK1,2はエストロゲン刺激15および30分後に増加することが証明された。近年ホルモン作用後に短時間で起こる非ゲノミックな種々の現象が、膜結合エストロゲン受容体(M-ER)を介して引き起こされてしることが示唆されている。しかしM-ERの実体および局在は不明である。今年度は免疫電顕法を用いてその細胞内局在を検索した。同時に膜結合キナーゼである上皮成長因子受容体(EGFR)の共存の有無を検索した。去勢した成熟雌マウスに17β-estradiol(E2)を投与し、5分、10分、20分後に子宮を摘出した。ホルムアルデヒドで固定後、Lowicryl-K4Mに包埋し、超薄切片を作成した。2種類の抗ERα抗体を用いて、金コロイド標識抗体法でM-ERの検出を試みた。ERαは核の分散したクロマチン上に検出できたが、細胞膜上には反応は認められなかった。現在、陽性反応を得るために、固定法の改良と種々の緩衝液中での加熱による抗原の賦活化を試みている。同時に凍結超薄切片を用いた検出も試みている。2)EFGRの局在の証明マウス子宮においてEFGRの局在の検索を光顕、電顕レベルで検索した。EFGRは主として、上皮細胞の管腔側の細胞膜上に検出された。電顕で観察すると、カベオラと思われる部位に反応が認められた。現在カベオリン1との二重染色を試みている。3)現在、培養細胞(MCF-7人乳癌細胞株)を用いて、光顕、電顕レベルで同様な検索を行う準備をしている。近年、エストロゲン作用後に短時間で起こる種々の非ゲノミックな現象が、膜結合エストロゲン受容体(M-ER)を介して引き起こされていることが示唆されているが、M-ERの実体や局在は不明である。本研究では免疫電顕法を用いて、マウス子宮上皮細胞と培養細胞(MCF-7ヒト乳癌細胞)におけるM-ERの局在の検索を試みた。同時に膜結合キナーゼである上皮成長因子受容体(EGFR)との共存の有無を検索した。

去勢した成熟雌マウスに17β-estradiol (E2)を投与し、5分、10分、20分後に子宮を摘出した。組織は25mM塩化カルシウムを含むホルムアルデヒドで固定後、Lowicryl-K4M樹脂に包埋した。MCF-7はフェノールレッド不含培地で培養し、E2添加後、2分、5分、10分、15分後に同固定液で固定後、Lowicryl-K4Mに包埋した。超薄切片を作成し、2種類の抗エストロゲン受容体α(ERα)を1次抗体として用いて、金コロイド標識抗体法でM-ERを検出した。一部の切片はトリス塩酸緩衝液(pH9.0)中で加熱し、抗原の賦活化を行った。マウス子宮上皮では、陽性反応は核内の分散したクロマチン上に認められたが、細胞膜上は反応陰性であった。MCF-7細胞でのERαの局在は多様であり、核内の反応に加え一部の細胞では、細胞質や細胞膜に反応陽性が認められた。ERαの局在の多様性は、細胞周期の不均一性に基づいている可能性が示唆される。E2刺激による、ERαの細胞内移動は確認できなかった。2)EFGRの局在マウス子宮上皮とMCF-7において局在を免疫電顕法で検索した。EFGRは子宮上皮では管腔側の細胞膜上、MCF-7においても細胞膜上のカベオラと思われる部位に局在した。現在MCF-7細胞において、二重染色法を用いて、ERαとEFGRが共存するか否かを検索中である。
次世代モータ用電磁材料の超音波振動せん断技術に関する研究

電気モータは,今後,輸送機器,各種産業機械あるいは福祉機器など,あらゆる分野の主要動力発生装置となるものと考えられる.この性能は,回転軸となるロータのコアおよびケース側となるステータの電磁特性により決まる.それらは,無方向性電磁鋼鈑およびアモルファス軟磁性合金の積層構造となっており,その製造にはプレスせん断加工法が用いられるが,電磁特性が劣化してしまうことが大きな問題となっている.本研究では,超音波振動せん断加工法により,切り口面精度の向上,塑性ひずみ低減などを期待する.その成果は,鉄損率低減,磁束密度維持などの電磁位特性に優れたコア,ステータの実現に寄与する.電気モータは,今後,輸送機器,各種産業機械あるいは福祉機器など,あらゆる分野の主要動力発生装置となるものと考えられる.この性能は,回転軸となるロータのコアおよびケース側となるステータの電磁特性により決まる.それらは,無方向性電磁鋼鈑およびアモルファス軟磁性合金の積層構造となっており,その製造にはプレスせん断加工法が用いられるが,電磁特性が劣化してしまうことが大きな問題となっている.本研究では,超音波振動せん断加工法により,切り口面精度の向上,塑性ひずみ低減などを期待する.その成果は,鉄損率低減,磁束密度維持などの電磁位特性に優れたコア,ステータの実現に寄与する.
離散時間可積分系と数値計算アルゴリズム

平成9年度には次の進展があった.まず,単振り子や非調和振動子などのセパラトリックスをもつ可積分力学系を広田差分法を用いて時間離散化した.離散系もまたセパラトリックスと離散版の保存量をもつが,セパラトリックスに対応する保存量の値は連続系の場合に完全に一致することが明らかとなった.また,1元の非線形方程式の反復解法であるSteffensen法を拡張して任意の収束次数をもつ反復解法を定式化した.新しい反復解法はHankel行列式の比を反復関数としている.εアルゴリズムの援用により計算量の増大を押さえることができ,Kepler方程式の解法では実際にsteffensen法より計算量が減少することを確かめた.平成10年度には次の進展があった.算術平均演算と幾何平均演算の組み合わせで定義される算術幾何平均のアルゴリズムが第1種完全楕円積分を保存量とする離散時間可積分系とみなせることを明らかにした.この発見を出発点に,まず,類似の算術調和平均のアルゴリズムを定式化し,幾何平均へ2次収束性する離散時間可積分系であることを示した.さらに,初期値を負とした算術調和平均のアルゴリズムがBernoulliシフトの力学系に共役な可解カオス系となることを証明した.また,算術調和平均のアルゴリズムの拡張を論じ,対称な正定値行列の空間(凸性をもつRiemann多様体)上で初期値の平方根行列に2次収束するアルゴリズムを発見した.平成9年度には次の進展があった.まず,単振り子や非調和振動子などのセパラトリックスをもつ可積分力学系を広田差分法を用いて時間離散化した.離散系もまたセパラトリックスと離散版の保存量をもつが,セパラトリックスに対応する保存量の値は連続系の場合に完全に一致することが明らかとなった.また,1元の非線形方程式の反復解法であるSteffensen法を拡張して任意の収束次数をもつ反復解法を定式化した.新しい反復解法はHankel行列式の比を反復関数としている.εアルゴリズムの援用により計算量の増大を押さえることができ,Kepler方程式の解法では実際にsteffensen法より計算量が減少することを確かめた.平成10年度には次の進展があった.算術平均演算と幾何平均演算の組み合わせで定義される算術幾何平均のアルゴリズムが第1種完全楕円積分を保存量とする離散時間可積分系とみなせることを明らかにした.この発見を出発点に,まず,類似の算術調和平均のアルゴリズムを定式化し,幾何平均へ2次収束性する離散時間可積分系であることを示した.さらに,初期値を負とした算術調和平均のアルゴリズムがBernoulliシフトの力学系に共役な可解カオス系となることを証明した.また,算術調和平均のアルゴリズムの拡張を論じ,対称な正定値行列の空間(凸性をもつRiemann多様体)上で初期値の平方根行列に2次収束するアルゴリズムを発見した.平成9年度は本科研費の援助のもとで合計21件の研究発表と研究打ち合わせ国内出張を行った.そのうち7件は研究代表者が企画した可積分系研究集会講演者への出張依頼である.また,分担者の一人の講演のための外国出張を援助した.さらに,代表者の教室に数値シミュレーション用計算機1台とプリンタを購入し,大学院学生によるプログラミング補助を得てアルゴリズムの数値実験を行った.以上の研究活動へのサポートを感謝する.この研究課題に関連して平成9年度には次の進展があった.まず,単振り子や非調和振動子などのセパラトリックスをもつ可積分力学系を広田差分法を用いて時間離散化した。離散系もまたセパラトリックスと離散版の保存量をもつが,セパラトリックスに対応する保存量の値は連続系の場合に完全に一致することがわかった.また,線形計画問題をRayleigh商の最小化問題ととらえ,可積分な勾配系の可積分な離散化による新しい内点法アルゴリズムの定式化を行った.拘束条件のない場合にはKarmarkar法より少ない計算量で最適解に収束する.この内点法の超離散極限,および関連する離散最適化問題が見いだされた.さらに,1元の非線形方程式の反復解法であるSteffensen法を拡張して任意の収束次数をもつ反復解法を定式化した.新しい反復解法はHankel行列式の比を反復関数としている.εアルゴリズムの援用により計算量の増大を押さえることができ,Kepler方程式の解法では実際にSteffensen法より計算量が減少することを確かめた.平成10年度は本科研費の援助のもとで合計14件の研究発表と研究打ち合わせ国内出張を行った.うち7件は研究代表者が企画した可積分系研究集会(平成10年7月京大数理解析研究所,同12月千里ライフサイエンスセンター)の講演者への出張依頼などである.また,研究代表者は研究レビューを受けるのための外国出張を1件行った.さらに,研究室に数値シミュレーション用計算機1台を購入し,大学院学生によるプログラミング補助を得てアルゴリズムの数値実験を行った.以上の研究活動へのサポートを感謝する.この研究課題に関連して平成10年度には次の進展があった.算術平均演算と幾何平均演算の組み合わせで定義される算術幾何平均のアルゴリズムが第1種完全楕円積分を保存量とする離散時間可積分系とみなせることを明らかにした.この発見を出発点に,まず,類似の算術調和平均のアルゴリズムを定式化し,幾何平均へ2次収束性する離散時間可積分系であることを示した.さらに,初期値を負とした算術調和平均のアルゴリズムがベルヌーイシフトの力学系に共役な可解カオス系となることを証明した.

また,算術調和平均のアルゴリズムの拡張を論じ,対称な正定値行列の空間(凸性をもつリーマン多様体)上で初期値の平方根行列に2次収束するアルゴリズムを発見した.一方,離散可積分系のいわゆる超離散極限の操作によってMAX演算,算術平均,幾何平均などが相互に結ばれることがわかった.
血管新生依存度による消化器癌の個別化診断とこれに応じた遺伝子治療の創出

固形癌の増殖には血管新生が不可欠とされている。しかし、実際の臨床例においては血管新生が僅かであるにもかかわらず、旺盛な増殖能を有すると考えられる癌腫が存在する。言い換えれば、各々の癌の増殖機構における血管新生依存度は一様でないと考えられる。したがって、癌の増殖に対する有効な阻害戦略の構築には各々の癌の増殖機構を個別的に明らかにすることが重要である。本研究では癌の増殖においては血管新生による好気性代謝と同時に嫌気性解糖も大きく関与しているとの観点から、肝細胞癌および転移性肝癌の臨床サンプルを用いて血管新生因子VEGFと解糖系酵素のhekisokinase II(HK-II)のmRNA発現と腫瘍血管密度との相関を解析した。さらに両遺伝子が低酸素応答モチーフを有し、HIIF-1のコントロールを受けると推察されることからHIF-1αの発現と上述の両遺伝子発現との関連性についても検討した。その結果、肝細胞癌ではVEGFと腫瘍血管密度が弱いながらも相関を示したが、転移性肝癌では肝細胞癌に比べて血管密度は低くVEGFの発現も弱かったが、HK-IIの発現が著しかった。一方、肝細胞癌ではHK-IIの発現は群動脈塞栓療法を受けたサンプルにのみ認められた。HIF-1αの発現は腫瘍の壊死部近傍に多く観察され、HK-II、VEGFの発現と相関し、とくに転移性肝癌では肝細胞癌に比べてHIF-1αとHK-II発現の相関が高かった。このように癌腫によって、また同一組織型の癌においてもその酸素環境によりその増殖機構が血管新生或いは嫌気性解糖系に対する依存度を異にすることが明らかになった。この結果は癌に対する個別化治療を考えるうえで重要な知見である。癌の増殖におけるエネルギー獲得機構には血管新生を基盤とする好気性代謝と解糖系に依存する嫌気性代謝がある。したがって癌の増殖を抑えるには個別的に当該癌がどちらのエネルギー獲得機構に強く依存しているかを明らかにしなければならない。本研究では個々の癌について血管新生度を評価し、この結果と血管新生因子としてのVEGF,解糖系酵素としてのヘキソキナーゼII(HK-II)の発現度との相関を解析した。対象は肝細胞癌と転移性肝癌の外科切除標本とした。その結果、転移性肝癌は肝細胞癌に比べて有意に血管密度が低く、逆にHK-IIは転移性肝癌において有意に高く発現していた。この結果は転移性肝癌では少なくとも肝細胞癌に比べてそのエネルギー獲得には血管新生を介した好気性代謝よりも解糖系に依存していることを示唆する。肝細胞癌では血管新生度とVEGFは相関したが、肝動脈塞栓療法を受けた場合にはHK-IIの発現が著しく冗進する癌腫があることが示された固形癌の増殖には血管新生が不可欠とされている。本研究では癌の増殖においては血管新生による好気性代謝と同時に嫌気性解糖も大きく関与しているとの観点から、肝細胞癌および転移性肝癌の臨床サンプルを用いて血管新生因子VEGFと解糖系酵素のhekisokinase II (HK-II)のmRNA発現と腫瘍血管密度との相関を解析した。さらに両遺伝子が低酸素応答モチーフを有し、HIF-1のコントロールを受けると推察されることからHIF-1αの発現と上述の両遺伝子発現との関連性についても検討した。

その結果、肝細胞癌ではVEGFと腫瘍血管密度が弱いながらも相関を示したが、転移性肝癌では肝細胞癌に比べて血管密度は低くVEGFの発現も弱かったが、HK-IIの発現が著しかった。一方、肝細胞癌ではHK-IIの発現は肝動脈塞栓療法を受けたサンプルにのみ認められた。HIF-1αの発現は腫瘍の壊死部近傍に多く観察され、HK-II、VEGFの発現と相関し、とくに転移性肝癌では肝細胞癌に比べてHIF-IαとHK-II発現の相関が高かった。このように癌腫によって、また同一組織型の癌においてもその酸素環境によりその増殖機構が血管新生或いは嫌気性解糖系に対する依存度を異にすることが明らかになった。この結果は癌に対する個別化治療を考えるうえで重要な知見である。
大学物理教育におけるアクティブ・ラーニングを実現する授業デザイン

研究代表者が担当している授業(入門物理だけでなく,探究実験,さらに物理専門家養成を目的とする授業)において,物理教育研究(PER)で開発された様々な教授法や,ICTを効果的に導入することによって授業をデザインし,実践,評価を行う。また,AL型授業を行いつつ,カリキュラム上の授業の目標(学習内容の量)を維持するために反転授業を採用する。授業デザインの評価は,PERで開発された各種調査問題によるプレ・ポストテストを行う。
多孔性金属錯体の結晶表面工学による多重機能化

本申請課題では,多孔性配位高分子を従来とは異なるアプローチによって機能化することである.1年目,2年目の成果と知見を踏まえ,基本骨格として柔軟性を有する二次元シート構造の多孔性配位高分子を採用し,界面活性剤を結晶表面に修飾することによって粒径を制御したナノメートルオーダーの粒子に着目した.X線解析を用いて格子定数を決定すると,粒径が小さい場合に結晶格子が大きくひずんでいることが明らかとなった.さらに重水素固体NMRの測定から,細孔壁を形成する有機配位子の運動状態が大きく変化していることも見いだした.今回用いた骨格では粒子を小さくすることで吸着等温線および吸着速度の変化が報告されており,この変化の原因が結晶格子のひずみと細孔壁の運動状態の変化によってもたらされているものと考えられる.つまり,粒径が小さい場合には表面修飾を行うことで,表面のみならず粒子全体に修飾の影響を与えることが可能であるとこを意味しており,従来の多孔性配位高分子のみならず,他の多孔性材料においてもこのような報告はなされておらず,これまでに無い新しい現象であると言える.多孔性配位高分子の一つの特徴として柔軟性が挙げられるが,今回用いた骨格も柔軟性を有しているため,粒系に応じたひずみと運動状態の変化をもたらしたものと考えられ,多孔性配位高分子と表面修飾という手法を用いることで達成できた成果である.今回の結果は,今後のガス分離や物質輸送等の機能発現および機能向上という観点からも,基礎的かつ非常に重要な知見を与えるものである.本研究の目的は、多孔性金属錯体における表面修飾による表面性質の変換・機能発現、及び新しい錯体化学の構築である。結晶表面に存在する化学種(置換基、金属イオン)に対し修飾分子との化学結合を形成することで表面性質の改質が行え、その表面性質の変換による機能変換及び多重機能化が行える。表面修飾のためには、表面に存在する化学種同定および表面状態の詳細な把握が必要であり、把握しやすい構造としてナフタレンジカルボン酸、亜鉛、及びピリジンによる層状構造の構築に成功した。また、同様にナフタレンジカルボン酸、亜鉛、及びルチジンによる類似構造の構築にも成功した。これら二つの構造はナフタレンジカルボン酸と亜鉛からなる2次元の層状構造に対して、ピラー配位子としてピリジンもしくはルチジンが配位した構造であり、3次元構造を有する結晶表面に対しても同様にピリジン環による配位結合の形成、つまり表面の修飾が可能であることが示唆された。さらに、ピリジンに対しメチル基を導入した構造であるルチジンでも同様の層状構造が得られたことから、ピリジン環に様々な置換基を導入したピリジン誘導体分子を修飾分子として導入することも可能であると考えられる。これは、望みの機能部位を有するピリジン環を、結晶表面に導入可能であるということを意味しており、今後の表面修飾における分子設計に非常に有用な成果が得られた。また単結晶構造解析が行えたことから、ピリジン環が一様に存在しているおり、配位結合による一様な修飾も可能であることが明らかとなった。本研究の目的は多孔性配位高分子の機能化を従来とは異なるアプローチによって機能化することである。昨年度は結晶表面の修飾可能性を示す新規化合物の合成に成功し、本年度は機能化に向けた表面における多孔性配位高分子の構成要素、特に有機配位子の運動状態の把握及び解析を行った。特に、ゲスト分子が細孔内に吸着されると骨格の運動状態が変化しゲスト分子は直接その運動の影響を受けるため、バルク状態のゲスト分子とは異なる状態へと変化すると考えられる。そのため、修飾を行った際には修飾分子と配位高分子の構成分子の運動の相関が機能発現及び機能制御に非常に重要になる。実際、ゲスト分子を細孔内へ導入することで、ゲスト分子が運動の障害になると考えられるにも関わらず運動性が増大するという特異な現象を見出すことに成功した。この原因としては多孔性配位高分子が構造柔軟性を有しており、ゲスト分子を吸着することで骨格の柔軟性に基づき構造変化し、運動可能部位の相対的位置が変化するため、ゲスト分子の存在下であっても運動性が増大するものと考えられる。以前にゲスト分子の導入によって運動性が低下するといったことは知られており、本研究によって運動性を増大させることにも成功したことで、運動性の増大及び減少の制御可能性を示すことができた。これは細孔内におけるゲスト分子の拡散制御など、従来のアプローチとは異なる新たな機能化への可能性と言え、表面を機能化することで今後の、ガス分離など応用へ向けた目的指向型の機能化へ展開するための知見が得られた。本申請課題では,多孔性配位高分子を従来とは異なるアプローチによって機能化することである.1年目,2年目の成果と知見を踏まえ,基本骨格として柔軟性を有する二次元シート構造の多孔性配位高分子を採用し,界面活性剤を結晶表面に修飾することによって粒径を制御したナノメートルオーダーの粒子に着目した.X線解析を用いて格子定数を決定すると,粒径が小さい場合に結晶格子が大きくひずんでいることが明らかとなった.

さらに重水素固体NMRの測定から,細孔壁を形成する有機配位子の運動状態が大きく変化していることも見いだした.今回用いた骨格では粒子を小さくすることで吸着等温線および吸着速度の変化が報告されており,この変化の原因が結晶格子のひずみと細孔壁の運動状態の変化によってもたらされているものと考えられる.つまり,粒径が小さい場合には表面修飾を行うことで,表面のみならず粒子全体に修飾の影響を与えることが可能であるとこを意味しており,従来の多孔性配位高分子のみならず,他の多孔性材料においてもこのような報告はなされておらず,これまでに無い新しい現象であると言える.多孔性配位高分子の一つの特徴として柔軟性が挙げられるが,今回用いた骨格も柔軟性を有しているため,粒系に応じたひずみと運動状態の変化をもたらしたものと考えられ,多孔性配位高分子と表面修飾という手法を用いることで達成できた成果である.今回の結果は,今後のガス分離や物質輸送等の機能発現および機能向上という観点からも,基礎的かつ非常に重要な知見を与えるものである.
トポロジカル量子相における光学応答の理論的研究

(1)多層グラフェンの光学応答について研究を行った。バンドの三角歪みの効果が光学応答に及ぼす効果について議論し、ファラデイ回転などによりこの効果を観測することが可能であると提案した。また3層グラフェンはゲート電場中でバレーホール状態が実現することを議論した。(2)クリフォード代数によるトポロジカル量子相の分類法を用いて、鏡映対称性のもとであらわれるトポロジカル結晶絶縁体の分類を行った。また、クリフォード代数による質量項の分類を応用し、弱いトポロジカル絶縁体の表面状態の安定性の議論も行った。近年物質の新たな相としてトポロジカルな側面が注目されている。古くは量子ホール効果がしられており、系の応答が波動関数のトポロジカルな性質により決まっている。グラフェンは2004年にGeimのグループにより発見され、低エネルギー励起が相対論的な準粒子になっており、トポロジカルなベリー位相を示すことがわかり、現在に至るまで実験、理論の両面から盛んに研究がなされている。また、トポロジカル絶縁体もスピン軌道相互作用のために非自明な波動関数の幾何学的接続から、バンドギャップ内で表面状態がディラックコーンをなす。トポロジカル絶縁体はスピントロニクス、量子コンピューティングにも応用可能な新しい材料として期待されている。量子ホール系に特徴的な低エネルギースケールのプローブであるテラヘルツ光の実験技術は、近年、長足の進歩をしているので、これらの系における光応答を議論することが現実的になってきた。そこで、本研究ではトポロジカル量子相における光応答を中心に理論的な研究をおこなっていく。これを踏まえ、本年度は以下のような研究を行った。(1)量子ホール系のac領域での伝導応答を、σxx- σxy two parameterscalingという方法をac応答に拡張して議論し、局在、非局在のダイナミクスを調べた。(2)2層および3層グラフェンの磁気光学応答を調べ、バンド構造の三角歪みの効果によりあらわれる、低エネルギーディラックコーンの応答が顕著に表れることを示した。(3)3層グラフェンに面直電場を印加すると、低エネルギーディラックコーンが誘起でき、現実的なバンド構造においてはバレーホール状態が実現することを示した。さらに電場によりtopological転移を引き起こすことが可能であることを提案した。1、鏡映対称性のある場合のトポロジカル絶縁体・超伝導体の分類我々はKitaevのクリフォード代数を用いた分類法を用いて、reflection symmetryなどの付加的な対称性がある場合において、トポロジカル絶縁体・超伝導体の分類をおこなった。付加的な対称性を系の対称性のなすクリフォード代数に付け加えることにより定式化し、以前Chiuらにより導かれていたreflection symmetryのある場合の分類を簡潔に再導出した。これにより、時間反転対称性とreflectionにより守られたSnTeのトポロジカル相やparticle-hole symmetryとreflectionにより守られた超伝導トポロジカル相についての系統的な理解を与えた。2、弱いトポロジカル絶縁体・超伝導体の表面状態の安定性弱いZ2トポロジカル絶縁体・超伝導体にあらわれる表面状態の安定性を議論した。一般のAltland-Zirnbauer symmetry classと次元にあらわれる弱いZ2トポロジカル絶縁体・超伝導体を考え、層間のdimerizationに対応した質量項により常に表面バンドにギャップを開けられることを示した。弱いZ2トポロジカル絶縁体・超伝導体の乱れた表面が平均して空間的に一様であれば、異なるdimerization patternに対応したZ2トポロジカル相の間の量子臨界点が存在するために、表面状態は局在しないことを見いだした。(1)グラフェン量子ホール系のac領域での伝導応答を、σxx- σxy twoparameter scalingという方法をac応答に拡張して議論し、局在、非局在のダイナミクスを調べた。今年度はさらに、(2)2層および3層グラフェンの磁気光学応答や、(3)3層グラフェンに面直電場を印加した系でのバレーホール状態、などについても議論した。(1)は当初24年度に予定していた研究内容で、すでに論文として出版されており、目標を達成したいえる。さらに(2)(3)の研究成果もあげることができたため、おおむね順調に研究が進展していると考えられる。25年度が最終年度であるため、記入しない。今後はこれまでグラフェンでえられた知見などをもとにして、トポロジカル絶縁体やトポロジカル超伝導体の物性についてさらに研究を進めていきたい。特に、(1)グラフェン、超伝導体接合系において発現するトポロジカル超伝導体のvortexcore stateやedge state、(2)近年盛んに議論されているtopological crystalline insulatorなどの統一的な理解、などが研究の方向性として考えられる。
転移腫瘍細胞の制癌剤耐性と標的臓器への接着の機序に関する研究

結果頭頚部領域で使用頻度の高いCDDPに対する高度耐性株を樹立した。またヌードマウスを用いてリンパ節転移細胞を樹立した。これらの細胞を用いて以下の結果を得た。1)biological markerに関して、耐性株で変化は認められなかった。リンパ節転移細胞では、CD44の消失が認められた。2)腫瘍細胞から産生されるサイトカインを測定した結果、GM-CSF、FGF、EGF、TGF、PDGF-ABについては、親株、耐性細胞、転移細胞で差を認めなかった。3)細胞培養上清中の可溶性ICAM-1については差を認めなかった。可溶性E-cadherinについては浸潤細胞で増加が認められた。4)浸潤能に関して、耐性株で増強が認められた。5)プロテアーゼ産生に関しては、MMP-2、MMP-3の産生は細胞間で差が認められなかった。以上の結果は癌細胞の制癌剤耐性化およびリンパ節転移に伴う細胞特性の変化を示すものと考えられた。
Fe-Ni-Mn系制振合金の交通機関への利用に関する試験研究

Fe-Ni-Mn制振合金の交通機関への利用に関する研究は、平成5年度科学研究費試験研究の対象として認められ、3年計画で開始された。初年度はレールとしての強度向上を目的とした温間加工や冷間加工の効果、制振性向上のための合金成分の調整、試作鋼の溶解修件と特性評価などの検討が行われた。平成6年度は大型試験溶解による製造上の問題点やインゴットの熱間鍛造性を調べたのち、大同特殊鋼に溶解、鍛造、熱処理を含む全長11mにおよぶ鍛造ブーム2本の製造を依頼し、これらを三井造船岡山製造所に移送してプラノボーラにより新幹線用60kgレールに削出した。実験線によるレール実験は平成7年2月7日に落重試験、同2月8日に走行実験が行われた。落重試験は衝撃荷重最大約30ton、加振力100kN以上に達し、一方モーターカ-走行実験では試験レール直前でエンジンを停止し、約20km/nrの低速走行による振動と直近騒音レベルの測定を行った。またインパルスハンマー試験については、レール締結時のほかフリービームによる実験も実施した。さらにコルゲーション(レール表面に生ずる波状摩耗)実験では、本合金の優れた特性が明らかになった。平成7年度は主として前年度走行実験のデータをもとに振動解析が行われ、その結果通常の60kg標準レールに比べて騒音レベルは5dBも低下することが確認された。これは当初目標を大幅に上回る結果であり、本試験研究の中核的成果として報告申し上げる次第である。これら成果の一部はすでに学会に発表ずみであるが、本格的な発表の時期は鉄道事業の公共性に配慮して慎重に検討中である。(I)制振性本合金の制振性はepsilon→gamma変態の中間の温度において著しく向上するが、この温度はNi量とMn量によって強く支配されるので、平成5年度の主要課題として本合金系における最適組成の追及を行った。両元素の比率を変えた16鋼種について実験を行った結果、下記の回帰式を得た。上式に従えば、変態温度区間を室温(25°C)付近まで下げるにはFe-6Ni-14Mnが適していると考えられる。事実この合金はFe-5Ni-15Mnより数倍も高い制振性を示したが、NiやMnがこれより僅かでも多くなると組織gamma(オーステナイト)単相となり、制振性は極端に悪化することが判明した。従って、鋼種としてはFe-5Ni-15Mnの方が実用的であるとの結論に達した。(II)機械的性質機械的性質についてはgamma量が多くなると耐力は下がる傾向にある。Fe-6Ni-14MnとFe-5Ni-15Mnについては適当な前処理によって超弾性特性の発現が認められた。またSiを添加すると形状記憶特性も現れることが判明した。(III)コルゲーション試験加振器により軌条輪と車輪の加速度応答を調べる。この応答曲線からハーフパワーポイント法で減衰比を求め、SUSなどの結果と比較したが、あまり差はみられなかった。(IV)耐磨耗性試験ピンオンディスク試験により耐磨耗性が調べられた。本合金は比較材料の鋳鉄などに比べても良好な耐磨耗性を有している。1レール製造と搬入・据付大同特殊鋼kk渋川工場において7トンの試料溶解を行い、四面鍛造機により156×187×10300mmのスラブインゴットに鍛伸後、第一熱処理船橋工場において800°C×6hr焼きなまし、強制空冷した。心配していた鍛造割れや熱処理に伴うひずみも発生せず、作業は極めて順調に進行し、11月中旬に三井造船玉野研究所に移送した。引きつずき、プラノミラーと大型プレーナによる切削加工を行い、新幹線用60kgレールに成形した。

12月下旬にはすべての作業を終了し、JR総研日野土木実験所に搬送して、外観と加工精度のチェックを行い、設置を完了した。実体から採取した試験片の制振性は、今までの小規模試料よりかえって特性が優れていた。レール試験は平成7年2月7日に落重試験、同2月8日に走行実験が行われ、トラブルもなく、無事終了した。解析結果がまとまるのは本年5月末の予定である。2コルゲーション試験12t×160φの円盤試料を焼きなまし材と5%加工材について作製し、すべりを与えながらコルゲーション実験を行った。比較材は200回転において激しいコルゲーションを発生したが制振試料は何れの場合も5000回転後でもコルゲーションを発生せず、極めて優れていることが実証された。3制振性能の向上研究本年度後半になって、5%加工後500°C×3hr焼きなまして更に3%加工すると制振性がかなり向上し、この処理を23回繰り返すと制振性向上に極めて有効なことが判明した。これをトレーニング法と名ずけたが、残念ながらレール走行試験には間に合わなかった。平成7年2月7日,JR総研日野土木実験所における制振合金レールおよび新幹線用60Kg標準レールに対する各種試験の結果を基に、データ解析が行われた。また、これと平行してコルゲーション試験と制振性向上実験が継続して行われた。1制振合金レールの振動騒音試験結果とその解析モーターカ-走行試験は、できるだけ車両側の騒音が影響しないように試験レール直前でエンジンを停止させ、約20km/hrの低速走行によるデータ収録を行った。走行回数は20回以上とした。輪軸落下試験は落下高さを2060mmとしたので、衝撃荷重は最大約30tonに達した。実走行では約3ton程度である。加振力は100kN以上を目標とし、落下回数は10回以上とした。インパルスハンマー試験については、加振力を増すために2ポンドのハンマーも合わせて用いた。また、実験はレール締結時のみならず、フリービームによる実験も実施した。上記データの解析結果によれば、制振合金レールの特性は予想以上に優れており、60kg標準レールに比べて騒音レベルは5db程度低下するものと考えられる。2コルゲーション(液状摩耗)については、縦すべりと横すべりを同時に与えることのできる装置を開発し、実験を行った。軟鋼が1000回転でコルゲーションを発生する条件下で、制振合金は6000回転でも発生しなかった。3制振特性と熱処理条件の関係を調べた結果、200°Cから室温までの間を急冷することによって、特性が大幅に改善されることがわかった。また、本合金に形状記憶特性のあることが見いだされた。
血管由来の細胞外因子による神経幹細胞の制御

Tsukushi KOマウスでは、側脳室下帯領域における神経幹細胞の制御が乱れていました。また、Tsukushi KOマウスでは側脳室拡張が観察されますが、神経特異的なcreマウスや血管特異的なcreマウスを用いたトランスジェニックマウスでは、側脳室の拡張がレスキューされました。さらに、Cre-loxPシステムを用いてTsukushi遺伝子の欠損を行い、血管周皮細胞特異的なマウスを用いた場合には、側脳室の拡張が誘導されましたが、血管内皮細胞特異的なマウスを用いた場合では誘導されませんでした。これらの結果は、Tsukushiが中枢神経系の幹細胞ニッチ制御に関与していることを示唆するものです。(1)神経幹細胞の維持に関わる血管性ニッチの分子基盤私たちは血管に発現するTsukushiの脳神経幹細胞ニッチに対する機能解析を行うために、血管系におけるTsukushiのgain-of function loss-of-function機能解析の準備を進めている。TsukushiコンディショナルノックアウトマウスとTie2-Creマウスを掛け合わせることにより血管内で、MS22-Creマウスと掛け合わせることによりmural cellsで、Tsukushiを強制発現や機能消失させることができ。脳室の上衣細胞に発現するTsukushiの機能を調べるために、Sox2-Creマウスとの掛け合わせも進行中である(2)血管-神経間に介在する基底膜の役割に注目した両組織間クロストークの制御機構血管-神経間に介在し、かつ脳内で特徴的な基底膜構造をもつ"neurovascular unit"や"フラクトン"構造体におけるTsukushiの局在様式を解析する。Tsukushiを効率的に分泌するコンストラクトを作製し、充分量のTsukushi蛋白質を得ることができた。Tsukushi蛋白質を抗原として、現在ラットを用いたモノクローナル抗体を作製中である。また、基底膜構造を構成するコラーゲンやラミニンとそ相互作用も検討中である。私たちのグループは、細胞外領域においてシグナル伝達経路間の情報を仲介する因子であるTsukushiの機能解析を行っている。Tsukushiが動物種を超えて網膜幹・前駆細胞が局在する領域(トリやカエルでは毛様体辺縁部、ヒトやマウスでは毛様体と呼ばれている)に発現し、その増殖をWntシグナル阻害因子として制御することを報告した(Ohta et al.,PNAS 2011)。マウスの成体脳において、Tsukushiは神経幹細胞が局在する成体側脳室下帯や海馬・歯状回において強く発現している。様々なマーカー分子を用いた免疫染色法やBrdU取り込み実験により、Tsukushi遺伝子欠損マウス(Tsukushi遺伝子のエキソン領域をLac-Zと入れ替え)では野生型マウスと比べて、神経幹細胞と神経前駆細胞の増殖が亢進していた。この結果はFACSを用いた解析でも再現されたことから、Tsukushiが神経幹・前駆細胞の増殖を制御していることが証明された。さらに、成体TsukushiヘテロマウスのLac-Z染色により、Tsukushiは毛の幹細胞が局在するバルジ領域と毛乳頭と呼ばれる領域に発現していることが明らかになった(Niimori et al.,revised)。これらの解析結果から、Tsukushiは外胚葉由来の幹細胞の未分化性維持に関わるニッチ分子として、細胞外領域においてシグナル伝達を調節するシグナル仲介因子であることが示唆された。成体マウスの側脳室下帯に存在する神経幹細胞が正しく維持されるためには、近傍血管に由来する成分(血管性ニッチ)が重要な働きをもつ。血管性ニッチは、液性因子や細胞外マトリクスから構成されると考えられ、WntやBMPシグナルの関与が示唆されているが、その分子実体は未解明のままであった。本申請では、神経幹細胞の維持に関わる血管性ニッチの分子基盤の解明を目的とした。今までの研究結果から、1) Tsukushiは脳室の上衣細胞や血管に発現している、2)生後10日目前後のTsukushi KOマウスでは野生型マウスと比べ脳が小さく、側脳室が拡張し、神経幹細胞や神経前駆細胞の制御が乱れることが明らかになっていた。25年度は、Tsukushiタンパク質を神経系または血管系特異的なCreマウスを用いて過剰発現させると、側脳室の拡張がレスキューされるか検討した。まず、全身でTsukushiタンパク質を過剰発現するCAGGS-Creマウスを用いた場合、側脳室の拡張はレスキューされたが、約1ヶ月でマウスは死んだ。この結果は、過剰なTsukushiタンパク質はマウスにとって有害であることを示唆するものである。