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ヌタウナギ(無顎類)の受精機構の解明

ヌタウナギ精子の先体反応誘起に成功し、先体突起を形成する無脊椎動物型先体反応であることを明らかにした(Develop.Growth Differ.,1999).先体胞開裂時の小胞形成、先体突起形成はこの種の系統的位量の点で注目され、時間を追った先体反応の詳細を観察している.高等脊椎動物精子先体胞開裂様式と似た、小胞を形成する先体胞開裂は米国産メクラウナギ精子にも共通していた.また米国産メクラウナギ精子先体部分にはアクチンが含まれていた(蛍光抗体法)。メクラウナギ精子先体突起形成に、無脊椎動物精子同様アクチン重合の関与する可能性が示唆された.精子形成過程観察を続け後期過程のデータを充実させた.精子運動性は他種魚類精子とも比較しつつ解析中である(一部J.Cell Science.1998).卵の卵門形成過程では多数の卵門細胞、卵門直下卵表の窪みと層状構造が著しい.卵門域構造を脊索動物中で比較検討し、ヌタウナギ卵形成末期の卵門域構造が魚類卵卵門域進化の一段階を示す可能性を示唆した(投稿中).卵門域eggcoat成分の脊策動物中における比較研究を開始した.成熟配偶子を得る効果的方法は研究続行中である.メクラウナギ類の卵、精子に関する基礎データを蓄積し、本研究は受精機構解明に迫る段階に来た.また配偶子構造のばか精子先体反応にもこの種の系統的位置を考察する鍵が潜んでいる可能性を示唆した.今後は、卵門域egg coatおよび精子先体の成分、機能、精子運動性、先体反応の詳細等を明らかにする、これまでに蓄積したデータと総合し、人工受精に適切な条件を考察して人工受精を成功させる、まだ知られていないこの種の受精、初期発生を明らかにする、それらの成果を脊策動物各種の場合と比較検討し、メクラウナギ類の系統学的位置、脊策動物の進化・系統を考察する、これが本研究の展開、計画である.ヌタウナギ精子の先体反応誘起に成功し、先体突起を形成する無脊椎動物型先体反応であることを明らかにした(Develop.Growth Differ.,1999).先体胞開裂時の小胞形成、先体突起形成はこの種の系統的位量の点で注目され、時間を追った先体反応の詳細を観察している.高等脊椎動物精子先体胞開裂様式と似た、小胞を形成する先体胞開裂は米国産メクラウナギ精子にも共通していた.また米国産メクラウナギ精子先体部分にはアクチンが含まれていた(蛍光抗体法)。メクラウナギ精子先体突起形成に、無脊椎動物精子同様アクチン重合の関与する可能性が示唆された.精子形成過程観察を続け後期過程のデータを充実させた.精子運動性は他種魚類精子とも比較しつつ解析中である(一部J.Cell Science.1998).卵の卵門形成過程では多数の卵門細胞、卵門直下卵表の窪みと層状構造が著しい.卵門域構造を脊索動物中で比較検討し、ヌタウナギ卵形成末期の卵門域構造が魚類卵卵門域進化の一段階を示す可能性を示唆した(投稿中).卵門域eggcoat成分の脊策動物中における比較研究を開始した.成熟配偶子を得る効果的方法は研究続行中である.メクラウナギ類の卵、精子に関する基礎データを蓄積し、本研究は受精機構解明に迫る段階に来た.また配偶子構造のばか精子先体反応にもこの種の系統的位置を考察する鍵が潜んでいる可能性を示唆した.今後は、卵門域egg coatおよび精子先体の成分、機能、精子運動性、先体反応の詳細等を明らかにする、これまでに蓄積したデータと総合し、人工受精に適切な条件を考察して人工受精を成功させる、まだ知られていないこの種の受精、初期発生を明らかにする、それらの成果を脊策動物各種の場合と比較検討し、メクラウナギ類の系統学的位置、脊策動物の進化・系統を考察する、これが本研究の展開、計画である.今年度は主として人工受精の基礎となる配偶子に関するデータを集めることに重点を置き、精子先体反応の誘起に成功するなどの成果が得られた。1)精子に関しては精子先体反応の誘起に成功した。メクラウナギ類の精子先体胞開裂時に先体突起が形成されることが世界に先駆けて示された。先体反応の誘起に成功したことは人工受精に向けての大きな前進と言える。また、脊索動物の中にあって、脊椎動物無顎類メクラウナギ類の先体反応が先体突起を形成することが明らかになったことは、進化、系統学上、たいへん興味深い。一方、精子の運動を数種の条件下でビデオテープに記録し、解析を進めている。2)卵に関しては、排卵後の卵における卵門下の微細構造を明らかにした。多数の卵門細胞が、より若い卵に較べて、互いに間隙をおくようになり、また、卵表には特殊な層状構造が存在した。卵門細胞とこの構造との間隙が大きくなっていた。産卵後の卵でも卵表の層状構造と考えられる構造が光学顕微鏡で観察された。ヌタウナギの卵門付近の構造は硬骨魚類とはかなり異なる可能性がある。この成果は国際シンポジウムで発表した。3)米国産メクラウナギEptatretus stoutiについても研究を開始した。精子運動の記録など、配偶子に関する初期的データを得つつある。この種でもE.burgeri

同様に生殖サイクルがあるらしいことを掴んだ。1)昨年度世界で初めて明らかにした脊椎動物メクラウナギ類精子の先体反応(ヌタウナギ精子のsubacrosomal materialにははっきりした繊維構造が見られない;先体反応は、先体突起を形成するなど無脊椎動物に近い)について、今年度はまず、精子先端部での変化に注目して先体反応の微細構造をより詳しく調べ、先体突起形成を確信できた。先体反応に関してここまでの成果を論文にまとめた(投稿中)。繊維状構造の見られない先体からの突起形成では、無脊椎動物精子の場合アクチンの重合が起こっていることから、ヌタウネギの先体突起形成にも同様な機構が関与している可能性が高い。抗体を用いて免疫電顕法でのアクチンの存在解析を試みている。また、ヌタウナギ精子運動解析の比較生理学的見地から、より高等な魚類で精子運動機構の微細形態学的・生化学的研究を行った(論文印刷中)。2)卵に関しては、昨年度の排卵後の卵構造に関するデータをふまえて、幸運にも入手できた産出卵の動物極周辺、卵門直下の微細構造を調べ、比較検討した。これらの点については、排卵後体内にある卵のものと基本的には大きな違いを見いだせなかった。しかし、早産などの可能性もあり、受精可能な未成熟卵を得ての今後の観察が不可欠である。一方、卵殻は卵成熟に伴って固定・包理、薄切がたいへん困難になる。試料作製方法の検討も進めている。米国産メクラウナギ類Eptatretus stoutiの産出卵でも卵門周辺構造の解析を開始した。さらに、脊索動物の系統進化を配偶子の面から考えるうえから、高等脊椎動物、原索動物ホヤ等の卵黄膜に共通に存在する物質が、脊椎動物の中で最も原始的であると考えられているヌタウナギ卵にも存在する可能性があり。原索動物ナメクジウオ卵巣卵も用いて、免疫電顕法による解析を始めた。ヌタウナギは脊椎動物でありながら、精子先体反応は先体突起を形成する無脊椎動物型であることを論文発表した(Develop.Growth Differ.,1999)。先体反応の微細観察では特に二点がメクラウナギの系統進化を考察,する上で注目された。1)先体胞開裂に際し先体外膜は精子細胞膜と共に不規削な小胞をいくつも形成し(高等脊椎動物精子先体反応では多数の小胞が形成される)、2)先体突起は先体内膜に連続した膜に囲まれ、突起内容は反応前のsubactosomal materialに連続する(無脊椎動物精子ではsubacrosomal material中のFactinとGactinの重合で先体突起が形成される)。メクラウナギ精子の先体反応が完全に無脊椎動物型なのか、高等脊椎動物型の面も含むのかを明らかにするため、イオノマイシンにより先体反応を誘起し、時間を追って固定、し、actin束および小胞形成の存否に注意して先体反応の詳細を観察している.小胞形成は日本産、アメリカ産メクラウナギに共通していた.一方、蛍光抗体法で調べたところ、米国産Pacifichagfish精子の先体部分にactinが含まれていた.電顕観察では先体反応前のsubacrsomal materialに明らかな繊維構造は観察されなかったが、蛍光抗体法ではFactin存在の可能性も示された.メクラウナギ精子先体成分が無脊椎動物型で、先体突起形成にactinの関与する可能性が高い.精子形成過程については尾部後期形成過程の詳細な像を新たに得た.
国際語としての英語の音声理解及び内容理解に関する基礎的研究

最終年度である本年度は、日本人によって発音された英語のcomprehensibilityに影響を及ぼす要因を日本人英語側から見つけることを主な目標に実証研究を行った(本研究におけるcomprehensibilityとは、聞き手が主観的に評価した分かりやすさの度合いを意味する)。具体的には、日本人大学生複数によって吹き込まれた英語をアメリカ人大学生(英語を母語とするグループ)と香港中国人大学生(英語を第二言語とするグループ)に聞いてもらい、アクセント(訛り)、流暢さ、明瞭さのうち、聞き取りやすさに最も影響を及ぼすものはどれかを調査した。結果、最も影響力のある因子は、アメリカ人、香港中国人被験者ともに「明瞭さ」であることがわかった。多様な母語話者が含まれる国際コミュニケーションの現場では、訛りのない英語や流暢な英語よりも、明瞭な英語が重要であることを改めて示唆する結果が得られた。今後の研究展開として、日本人英語のcomprehensibility評価に影響力大であることが示唆された「明瞭な発音」とは具体的に何を指しているのか、という課題に取り組むことが不可欠であると思われる。このため、研究者グループは、英語母語話者(アメリカ人大学生)と英語に堪能な非母語話者(英語教育を専攻する韓国人大学生)を被験者として、日本人英語をディクテーションしてもらい、両被験者グループにとって聞き取り困難なノンネイティブ英語発音(子音、母音、ストレス、イントネーションを含む)を洗い出し、分析するという作業に着手した。来年度以降もこの課題に取り組む予定である。国際語としての英語の役割が増大しつつある昨今、教育現場では、従来のような日本人対英語母語話者という対話の枠組みはもはや現実的ではなく、言語モデルや指導内容を見直す時期にきていると思われる。本研究は、日本人対英語母語話者、日本人対非英語母語話者という2つの異なる枠組みを設けて、対話者相互の音声英語に対するintelligibility(音声理解度)及びcomprehensibility(内容理解度)に影響を及ぼす諸要因の探索と整理を主な目標とするものである。この理解度に影響する聞き手側要因としては慣れ、不安度、学習動機などを、一方、話し手側要因には、訛り、速さ、内容などを想定している。まず研究の手始めとして、非英語母語話者間のperceived comprehensibility(主観的内容理解度)と母語推測との関わりに焦点をあてて調査することにした。方法は、日本語を母語とする日本人大学生の英語、中国語を母語とする中国人留学生の英語を、日本人大学生と中国人留学生からなる2グループに聞かせて、perceived comprehensibilityを数字で評価させるとともに、話者の出身地を推測させるというものである。結果、日本人の聞き手グループの方が話者の出身地を正しく特定することができた。また、両グループともに、perceived comprehensibilityの評価が低い話者を、実際の出身地に関わらず、日本人であると判断する傾向がみられた。これらの結果から、日本人グループの方が、日本人の英語を聞き慣れていること、さらには自国民の英語発音を過小評価しがちであることが示唆された。本研究の目標は、国際語としての英語使用者である日本語母語話者の音声英語の理解について実証的に研究することである。研究2年目の本年度は、音声英語に対するintelligibility(音声理解度)に影響を及ぼす聞き手側要因の探索を目的として、2本の実証研究を行った。Intelligibilityの尺度としてはクローズ・ディクテーションを使用した。1つ目の研究は、英語母語話者であるアメリカ人及び非母語話者のホンコン出身中国人吹き込み者の英語を日本人大学生に聞かせ、英語変種に対する慣れ、不安度、英語力の自己評価のうちから、intelligibilityを最もよく説明する学習者要因を見つけ出すというものである。分析の結果、アメリカ英語及びホンコン英語のディクテーション・スコアを最もよく予測できたのは英語力の自己評価であった。また、ホンコン英語に関しては、多くの変種に対する慣れも影響を及ぼすであろうことが示唆された。2つ目は、上記と同様、日本人大学生にアメリカ英語及びホンコン英語をディクテーションしてもらい、そのスコアと英語学習動機との関連について調べるというものである。被験者の学習動機は、因子分析の結果、「外国人との交流」、「国際的職業へのあこがれ」、「英米文化指向」、「外国旅行と外国滞在」、「一般的必要性から」、「英米音楽を学ぶ」、「道具的動機づけ」の7つに大別された。これら学習動機のうち、「国際的職業へのあこがれ」が両英語のディクテーション・スコアを最もよく予測できる因子であることがわかった。一方、「一般的必要性」は高得点に結びつきにくい因子であった。多様な英語に対する聴解力を高めるためには、個人的目標を持ちながら学習することが重要であるものと思われる。

多様な母語話者が含まれる国際コミュニケーションの現場では、訛りのない英語や流暢な英語よりも、明瞭な英語が重要であることを改めて示唆する結果が得られた。今後の研究展開として、日本人英語のcomprehensibility評価に影響力大であることが示唆された「明瞭な発音」とは具体的に何を指しているのか、という課題に取り組むことが不可欠であると思われる。このため、研究者グループは、英語母語話者(アメリカ人大学生)と英語に堪能な非母語話者(英語教育を専攻する韓国人大学生)を被験者として、日本人英語をディクテーションしてもらい、両被験者グループにとって聞き取り困難なノンネイティブ英語発音(子音、母音、ストレス、イントネーションを含む)を洗い出し、分析するという作業に着手した。来年度以降もこの課題に取り組む予定である。
水田を利用するトンボの越冬ステージからみた水稲箱苗施用剤耐性

2つの浸透移行性殺虫剤,フィプロニルとイミダクロプリドが水生生物,特に水田依存性トンボ2種であるアキアカネとシオカラトンボに及ぼす影響について,実験的水田を用いて調査した。両殺虫剤の水中濃度は時間と共に検出限界まで減少したものの,土壌中では両殺虫剤とも翌年でも残留が検出された。両殺虫剤ともアキアカネおよびシオカラトンボに影響するが,その影響の程度とパタンは両殺虫剤で異なっていた。茨城県つくば市近郊における水田地域において、水田利用性トンボの利用ハビタット調査をおこなった。コドラート法によるヤゴの調査は捕獲効率が極めて悪く、定性的な分布の確認ですら困難であることが判明したことから、定期的な羽化殻のカウントなどによる定量的調査がより有効と考えられた。なお、成虫の存在を調査地において確認したことから、付近に今回の研究対象の中心であるアキアカネ及びシオカラトンボが調査地付近において少なくとも産卵している可能性が高いと考えられたため、平成27年度も引き続き水田利用性トンボの発生状況を確認することで、これらの産卵の有効性を確認することが本研究において有効と考えられた。茨城県つくば市近郊における水田地域において、イミダクロプリド及びフィプロニルの水中濃度及び土壌中濃度を測定するため、水及び土壌サンプルを採集し分析をおこなった。その結果、今回得られたサンプルにおいて、水からはイミダクロプリド及びフィプロニルは検出されなかった。また、土壌においても、イミダクロプリド及びフィプロニルは極低濃度が検出されるに留まった。卵越冬型であるアキアカネ、及びナツアカネのメスを捕獲し、平成27年度におこなう急性毒性試験に用いるための卵を採集し、現在保存している。なお、これらの保存している卵の一部を用いて、温度条件を変化させることにより自然条件より早期の休眠打破を試みたが、急性毒性試験に耐えるだけの安定した打破条件を見つけることはできなかった。茨城県つくば市にある国立環境研究所構内の実験水田において、フィプロニル、イミダクロプリドの育苗箱施用剤の施用区、及び無処理区を設定し、定期的にトンボ類の発生状況(各種ヤゴ密度、成虫羽化殻数等)、物理環境測定(水温、pH、濁度、及び溶存酸素)、及び水中・土壌中農薬濃度の推移について調査をおこない、フィプロニル、及びイミダクロプリドの箱苗施用剤処理とトンボ類発生状況との間にみられる関係について重要な知見を得た。なお、調査地付近においてアキアカネ、及びシオカラトンボが生息し、使用した全ての実験水田に産卵していたことを、事前に確認している。また、茨城県つくば市近郊における水田地域において、平成26年度に引き続き水田利用性トンボの利用ハビタット調査を定期的におこない、ヤゴ見取り法、ヤゴすくい捕り法、及び羽化殻サンプリングにより、水田毎の発生トンボ相、及びそれぞれの種の大まかな発生量について把握した。また、調査水田の水および土壌を農薬濃度測定用サンプルとして採取した。加えて、周辺環境を含めたトンボ類成虫の見取り調査、及び捕獲調査を定期的におこない、調査水田に生息しうるトンボ相と調査水田に生息するヤゴ相との対応関係について解析した。茨城県つくば市近郊で採集したアキアカネ、及びシオカラトンボから採卵し、孵化した幼虫を用いて急性毒性試験の予備実験をおこない、急性毒性試験プロトコルの改良をおこなった。使用する農薬以外を統一した実験水田により、試験対象農薬がトンボ相に及ぼす影響のパタンについて、非常に明瞭な結果が得られたため。ただし、ヤゴの急性毒性試験方法にはまだ改善の余地がある。昨年度、茨城県つくば市にある国立環境研究所構内の実験水田にて実施したフィプロニル、およびイミダクロプリド施用によるアキアカネ、およびシオカラトンボへの影響についてさらなる解析を行い、結果報告論文執筆を開始した。なお、【現在までの進捗状況】で報告する通り、平成28年度に本研究課題を終了することが困難となり、また1年間の研究期間延長が許可されたため、当初平成28年度に実施予定であった内容のほとんどは、平成29年度に実施することになった。本研究課題は平成28年度を最終年度としていたが、平成28年度に2度異動したことに伴い、そのそれぞれにおいて研究体制の再構築に迫られ、当初の予定通りに本研究課題を完了することが困難となったため。なお、本事由を根拠として1年間の研究機関延長を申請し、許可されたため、平成28年度分の研究内容のほとんどを平成29年度に実施する運びとなった。茨城県つくば市にある国立環境研究所構内の実験水田において、殺虫剤成分であるフィプロニル、イミダクロプリドの育苗箱施用剤の施用区、及び無処理区を設定し、定期的にトンボ類を含む水田を利用する各種生物の発生状況(各種ヤゴ密度、成虫羽化殻数等)、物理環境測定(水温、pH、濁度、及び溶存酸素)、及び水中・土壌中農薬濃度の推移について調査をおこない、フィプロニル、及びイミダクロプリドの箱苗施用剤処理とトンボ類発生状況との間にみられる関係について重要な知見を得た。また、茨城県つくば市近郊における水田地域において、水田利用性トンボの利用ハビタット調査を定期的におこない、ヤゴ見取り法、ヤゴすくい捕り法、及び羽化殻サンプリングにより、水田毎の発生トンボ相、及びそれぞれの種の大まかな発生量について把握した。

加えて、周辺環境を含めたトンボ類成虫の見取り調査、及び捕獲調査を定期的におこない、調査水田に生息しうるトンボ相と調査水田に生息するヤゴ相との対応関係について確認した。加えて,トンボ孵化若虫における各種殺虫剤の急性毒性試験をおこなった。現在,上記内容についての解析を終え,結果報告論文を執筆しているところである。2つの浸透移行性殺虫剤,フィプロニルとイミダクロプリドが水生生物,特に水田依存性トンボ2種であるアキアカネとシオカラトンボに及ぼす影響について,実験的水田を用いて調査した。両殺虫剤の水中濃度は時間と共に検出限界まで減少したものの,土壌中では両殺虫剤とも翌年でも残留が検出された。両殺虫剤ともアキアカネおよびシオカラトンボに影響するが,その影響の程度とパタンは両殺虫剤で異なっていた。ヤゴの利用ハビタットを直接把握することを目的としたコドラート法が本研究において有効ではないことが判明したものの、本研究において調査地域のヤゴの分布パタンを確認する上で極めて重要である、調査地域に生息するトンボ相を成虫の見取り調査により把握することができた。また、イミダクロプリド及びフィプロニルの濃度測定についても、調査地域の水、及び土壌サンプルの採集と分析を順次おこなっている。急性毒性試験に用いるためのアキアカネ、及びナツアカネ卵の採集に成功し、現在試験に用いるため低温条件にて保存している。平成27年度におこなった水田利用性トンボ類ヤゴの利用ハビタット調査において、水田毎のヤゴ発生タイミングに違いは見られたものの、種相に明瞭な違いは検出されなかった。しかし、これを補う形で、平成27年度に行った実験水田調査により今回調査対象の農薬に関する明瞭なパタンを検出できた。平成28年度は平成26年から平成27年に得られた結果を元に、実験水田と実際の水田との間にある相違点を考慮しつつ、農薬の施用が越冬形態の異なるトンボ類に及ぼす影響について報告をまとめる。また、ヤゴの急性毒性試験方法を確立し、野外で検出される農薬濃度と毒性試験結果との比較により、調査対象農薬が水田利用性トンボ類に及ぼす時期などについて検討する。平成27年度に行った実験水田調査において、今回調査対象の農薬に関する明瞭なパタンを検出した。平成29年度はこれまでに得られた結果を元に、実験水田と実際の水田との間にある相違点を考慮しつつ、農薬の施用が越冬形態の異なるトンボ類に及ぼす影響について報告をまとめる。また、ヤゴの急性毒性試験の結果と野外で検出される農薬濃度との比較により、調査対象農薬が水田利用性トンボ類に及ぼす時期などについて検討する。群集生態学水田利用性トンボ類ヤゴの利用ハビタット調査において、コドラート法が有効ではないことが判明した。しかし、それに代わる調査方法として羽化殻カウントが有効と考えられたため、平成27年度以降は調査地域での定期的な羽化殻カウントをおこない、加えて成虫の見取り調査と産卵確認を合わせておこなうことで、成虫の産卵場所とヤゴの発生場所の対応関係を確認する。平成27年度以降も、平成26年度と同様に調査地域における水、及び土壌サンプル採集を継続し、イミダクロプリド、及びフィプロニルの濃度測定に供する。
冗長な文の改善に役立つ言語的特徴の機械的発見と作文支援

本研究では、冗長な文章の改善に役立つ技術を構築した。本課題は、日本語文章を対象とした。本課題はコミュニケーションの効率化に寄与する。手法としては機械学習を利用し、冗長な文の検出は約7、8割、冗長な文の修正は、「可能」「という」「すること」が原因となって冗長となった文において6割以上の正解率であった。文章レベルの冗長な表現を収集し、収集したデータを人手で分析し、文章レベルの冗長な表現における種々の特徴を明らかにした。一文内の冗長な表現の修正に関する支援技術を研究した。冗長な文を修正する方法として、パターンを用いた手法と機械学習を用いた手法を提案した。「可能」「という」「すること」が原因となって冗長となった文の修正の実験を行った。パターンを用いる手法と機械学習を用いる手法のいずれかが、最も頻度の高いものを出力とするベースライン手法よりも同等以上の正解率であった。パターンを用いる手法と機械学習を用いる手法のいずれかで6割以上の正解率で冗長な文を修正できた。修正後の表現のみの推定(修正前の表現の範囲を特定できなくてよい)では、パターンを用いる手法と機械学習を用いる手法のいずれかで7割以上の正解率を得た。以上により、「可能」「という」「すること」については、パターンを用いる手法と機械学習を用いる手法がある程度冗長な表現の修正に役立つことがわかった。しかし、実際の文書の推敲での冗長な文の修正ではもっと確実な手法を用いる必要がある場合も考えられる。そのため修正をするのではなく、修正箇所の検出を自動で行い、さらに検出した冗長箇所の修正候補を頻度の高い順に並べ、ユーザーに提示するという方式を検討した。この方式では、冗長な個所とその修正候補が提示されるため、文書作成者の修正作業の負担が軽減されると思われる。この方式で必要となるデータの構築も試みた。表現の順序、文体、表現など、冗長な文章の改善に資する文章処理技術の検討も行った。例えば、表現の変化の検出と考察を行った。また、文章の改善のため、文章における段落の順序を推定する研究を行った。二つの段落のうち、どちらの段落を先に記述すべきかの推定において、教師あり機械学習を利用した手法を提案し6割から8割の性能を得た。先に行った文の順序推定と、この段落の順序推定の比較も行い、順序推定において重要な事柄を分析できた。23年度および24年度に構築した文レベルの冗長性の検出・修正の研究の方法を段落・文書レベルのものに拡張し、文章レベルでの冗長な表現の検出に関する研究を行った。まず、文章レベルで冗長な文章とそれを修正したデータベースを作成した。そのデータベースのデータを分析し、典型的な3種類の分類を明らかにした。その3種類は、分類1「文単位の修正で十分なもの」、分類2「補足または説明をする文を先頭文にまとめる形で短く簡潔な文章に修正されるもの」、分類3「長い文を箇条書きにまとめる形で修正するもの」である。機械学習を用いる手法と、冗長度を用いる手法により冗長な文章を検出した。機械学習を用いた実験では機械学習の素性として「冗長度」を利用した際の正解率が最も高かった。機械学習を用いた手法の正解率(0.66)が、冗長度を用いる手法の正解率(0.65)と同程度の正解率であった。文章での実験で冗長度が役立ったので、文レベルでも冗長度が役立つかの実験を行った。1文における冗長な文において機械学習に冗長度を素性に追加したところ性能向上が見られた。冗長度を用いる手法が機械学習の手法より高い性能を出す場合があることが確認できた。これらのことにより冗長度が有用であるとわかった。例えば、表現の差異の検出と考察を行った。異表記においてどの表記をどういう文脈で用いやすいかの分析を行った。二つの段落のうち、どちらの段落を先に記述すべきかの推定において、教師あり機械学習を利用した手法について実験を追加した。一文内の冗長な表現の検出に関する支援技術を研究した。まず、大雑把に冗長な文を収集するために、文章の冗長度を定義した。簡単には、ある一定の語数における語の異なり数の逆数を、文章の冗長度(冗長性の度合い)と定義した。上記で定義した冗長度を計算し、冗長度の高いデータを収集した。収集したデータを人手で分析して、実際に冗長な文、冗長でない文を収集した。これを通じて、以下に示す、冗長性判定用データベースと冗長性修正文集合データベースを作成した。

冗長性判定用データベースには、冗長な文と冗長でない文が格納される。冗長性修正文集合データベースには冗長な文とそれを修正した文の対が格納される。次に、一文内の冗長な表現の検出に関する研究を行った。冗長性判定用データベースを教師データとして利用して、教師あり機械学習により、与えられた文が真に冗長であるか否かを自動判定する冗長性判定技術を構築した。その技術の性能評価を行った。種々の冗長な表現をまとめて教師あり機械学習で学習した場合は、冗長な表現の検出はF値0.5程度で行うことができた。冗長な表現を形成する理由となる表現ごとに機械学習で学習した場合は、冗長な表現の検出はF値0.70.8程度で行うことができた。高い性能で冗長な表現を検出できるという重要な意義のある事実を確認できた。機械学習にはSVMを用い、素性には文中に出現する単語や文字列を用いた。表現の順序、文体、表現など、冗長な文章の改善に資する文章処理技術の検討も行った。例えば、表現の変化の検出と考察を行った。また、文章の改善のため、文章における文の順序を推定する研究を行った。二つの文のうち、どちらの文を先に記述すべきかの推定において、教師あり機械学習を利用した手法を提案し7割から8割の性能を得た。これについても、高い性能で文の順序を推定できるという重要な意義のある事実を確認できた。本研究では、機械的な手法により冗長な文章の改善に役立つ言語的特徴を明らかにするとともに、その知見により冗長な文章の改善に役立つ支援技術を構築することを目的としている。本課題では、文レベルの問題から長い文章レベルの問題まで含めて、冗長な文章の改善に役立つ支援技術を構築する。本課題は、日本語文章を対象として研究を行う。本課題はコミュニケーションの効率化に寄与する。23年度は一文内の冗長な表現の検出に関する支援技術を研究した。冗長な文を検出する方法として、表現ごとに機械学習を用いる手法を提案した。冗長な表現を形成する理由となる表現ごとに機械学習で学習した場合、冗長な表現の検出はF値0.70.8程度で行うことができた。24年度は一文内の冗長な表現の修正に関する支援技術を研究した。冗長な文を修正する方法として、パターンを用いた手法と機械学習を用いた手法を提案した。「可能」「という」「すること」が原因となって冗長となった文の修正の実験を行った。パターンを用いる手法と機械学習を用いる手法のいずれかで6割以上の正解率で冗長な文を修正できた。25年度は文章レベルでの冗長な表現の検出に関する研究を行った。機械学習を用いる手法と冗長度を用いる手法などを提案した。これらの手法で6割以上の正解率で冗長な文章を検出できた。26年度は文章レベルの冗長な表現を冗長度などを用いて自動で収集し、収集したデータを人手で分析した。文章レベルの冗長な表現における種々の特徴を分析できた。自然言語処理本研究では、機械的な手法により冗長な文章の改善に役立つ言語的特徴を明らかにするとともに、その知見により冗長な文章の改善に役立つ支援技術を構築することを目的としている。
耳下腺での分泌と酵素誘導の比較研究

耳下腺の生理的特徴として次の2点があげられる。1.アミラーゼ分泌が蛋白燐酸化酵素Aの活性化剤であるイソプロテレノール(IPR)や蛋白燐酸化酵素Cを活性化するカルバコール(CC),ヌトキサミン,セロトニン,サブスタンスPで促進される。2.IPRによりポリアミン合成の律速酵素であるオルニチン脱炭酸酵素(ODC)の誘導をともなった細胞増殖がみられる。本研究では完全合成培地に浮べたレンズペーパー上で耳下腺explantを培養する系を用いて分泌と酵素誘導の関連を追求し、以下の結果をえた。1.アミラーゼ分泌を促進する上記薬物は全てODCを誘導し、かつその誘導能は分泌促進能を比例する。また、上皮成長因子はIPRによるDNA合成を増強するが、アミラーゼ分泌とODC誘導を増強しない。2.1価の金属イオン対するイオノフォアであるモネンジンやナイジエリンはIPRによるODC誘導を、また、ポリミキシンBはCCによるODC誘導を特異的に抑制する。しかし、分泌に対しては抑制効果を示さない。3.IPRは分子量20K,32K,34Kの耳下腺蛋白の燐酸化を促進する。これらのリン酸化はポリミキシンBでは影響をうけないが、モネンジンは20Kと32K蛋白の燐酸化を阻害する。4.CCは32Kと34K蛋白の燐酸化を促進する。このうち32Kの燐酸化のみがポリミキシンBで抑制される。なお、ポリミキシンBはIPR依存性蛋白燐酸化には影響を与えない。これらの結果は、耳下腺でのアミラーセ分泌とODC誘導は共に蛋白燐酸化酵素A及びCの活性化によりおこることを示している。この際、20Kと32K蛋白の燐酸化がODC誘導と、また、34K蛋白の燐酸化がアミラーゼ分泌と関連すると考えられる。
「脱農業化」する東南アジアに求められる熱帯農業理論の構築

本研究の目的は、東南アジアの生業・農業の現代的変化を分析する枠組み(熱帯農業理論)を構築し、「脱農業化」が農村生業と農業技術に与える影響を解明することである。具体的には、様々な生態環境下で非農業部門の相対的重要度が増した農村で現地調査を実施し、農業体系・技術の変化を明らかにする。特に干ばつや洪水などの自然のハザードへの対処機能(熱帯農業に共通する特徴)に着目して、生態環境の異なる調査対象地(群)の生業・農業動態を可視化および比較分析する枠組みを構築する。これを用いて現代東南アジアの「脱農業化」のメカニズムの解明を目指す。計画初年度の2019年度は、東南アジアの代表的な生態区分(デルタ部・平原部・山地部・島嶼部)のうち、特に平原部に焦点をあてた。ミャンマー中央乾燥平原の農村部で、研究代表者と分担者らによる合同調査を実施し、農村生業と農業技術の現代的変化について住民らに対する聞き取り調査をおこなった。その結果、同平原内では強い乾燥という自然のハザードに対して作物生産が安定化するような農業システムがある一方で、同平原内で最も乾燥した地域の天水畑作村では強烈な乾燥条件のもとでは作物生産への生計依存度を低める(作物生産の安定性確保を放棄する)対応も存在することが確認された。将来的に安定した生産と収益を期待した永年性作物への投資も一部でおこなわれていた。自然・社会経済条件から農業に不適である状況下では、収入源としてよりも、社会的理由や個人の嗜好に依拠した農業の存続が示唆された。また、同平原内の天水畑作以外の農業システム(大河川の氾濫原を利用した農業システム)の不安定要因も明らかになった。合同調査を通じて、自然のハザードへの対応と脱農業化(ひとつの生業コンポーネントとして農業を分析する)の両視点から今後の研究計画を進めることと、生態区間連携に試行的に着目することが確認された。2018年度はデルタ部と平原部の両生態区分での合同フィールド調査を予定していたが、調査期間と調査地域間の移動をふまえた効率性を考慮して、平原部のみに集中した合同調査を実施することとした。デルタ部の調査は研究計画4年目以降に必要に応じて再企画する。計画2年目(2019年度)には研究対象地域のうち島嶼部(インドネシア・マルク州アンボン島を予定)を主対象として、研究代表者と分担者による合同フィールド調査をおこなう。この合同調査では、同地域における農業体系や生業変化、ハザード被害現象について共同で調査した上で、地域固有の文脈や研究対象地域間の質的な相違についての検討をすすめる。具体的には同地域の在来アグロフォレストリー体系の現代的な変化に着目する予定である。また、各研究対象地域での個別の現地調査をすすめていく。さらに、国内研究会や合同調査を通じて研究組織内での情報共有と理解深化を高め、各対象地域での調査手法と獲得データの標準化や複数事例を統合する総合考察をスムーズにおこなうための基盤を整備していく。

この合同調査では、同地域における農業体系や生業変化、ハザード被害現象について共同で調査した上で、地域固有の文脈や研究対象地域間の質的な相違についての検討をすすめる。具体的には同地域の在来アグロフォレストリー体系の現代的な変化に着目する予定である。また、各研究対象地域での個別の現地調査をすすめていく。さらに、国内研究会や合同調査を通じて研究組織内での情報共有と理解深化を高め、各対象地域での調査手法と獲得データの標準化や複数事例を統合する総合考察をスムーズにおこなうための基盤を整備していく。
平面内極性の制御分子DAAM1による細胞間接着F-アクチンの制御機構の解析

上皮細胞の細胞間接着は頂端部接着複合体と接着側面部により構成されているが、接着側面部の制御機構についてはこれまで明らかでなかった。我々は、forminファミリーのアクチン重合制御分子DAAM1が接着側面部に分布し、DAAM1ノックダウンにより接着側面部の運動性亢進、細胞層の異常形成、および3次元培養体からの細胞の逸脱が起こることを見出した。またこの接着側面部の運動性亢進には、Rac-WAVE2複合体-Arp2/3複合体が関与することも見出した。従って、接着側面部には元来WAVE2複合体に依存した運動性があるが、DAAM1がこれに競合的に作用することにより、接着構造が安定化されると考えられた。上皮細胞の細胞間接着(AJ)に局在するF-アクチンは、細胞層の運動や変形に重要であるが、その制御機構は完全には明らかでない。我々は、神経管形成時において、神経上皮細胞層AJのF-アクチンが極性収縮する際に、forminの一種であるDAAM1が関与することを見出した。さらにDAAM1は種々の培養上皮細胞でAJに分布が認められたものの、その役割については未解明であった。そこでDAAM1による上皮細胞AJのF-アクチン制御の可能性について検討を行った。まずDAAM1のAJへの局在機構について検討した結果、N末端領域で分布することが分かった。またDAAM1のN末端領域の免疫沈降物のMS解析を行ったところ、種々の分子との相互作用が確認された。その中に含まれるAJ分子のひとつをノックダウンすると、DAAM1のAJ分布が減少したことから、DAAM1の分布への関与が示唆された。次に、DAAM1が上皮細胞AJのF-アクチンおよびAJ分子に与える影響について検討した。その結果、DAAM1をノックダウンした細胞でAJのF-アクチンが減少傾向を示し、また一部のAJではF-アクチンが大きな構造変化を起こしていた。また、AJ分子のひとつについて分布を調べたところ、apicalへの分布が減少し、lateralへの分布が増えることが分かった。さらにDAAM1ノックダウン細胞において、Ca2+スイッチにより細胞間接着を再形成させたところ、接着形成自体にはほとんど影響しなかったものの、接着形成後のAJにおいてF-アクチンおよび上記AJ分子の分布が変化したことから、細胞間接着の維持に関与することが示唆された。培養乳腺上皮細胞においてDAAM1の分布を詳細に調べたところ、AJの側面に分布していることが分かった。DAAM1をノックダウンすると、AJ側面におけるF-アクチン分布が減少し、AJ側面における細胞間接着分子の分布も変化した。またライブイメージングを行ったところ、DAAM1のノックダウンにより、AJ分子の動態が不安定になることも明らかとなった。さらに、AJ側面においてDAAM1を活性化するための上流シグナル経路も明らかにした。また、DAAM1の生理的意義を明らかにするため、トランスウェルを用いた長期培養の際の細胞層形成について調べたところ、DAAM1のノックダウンにより細胞層の形態に異常をきたすことが分かった。以上の結果から、DAAM1は上皮細胞のAJ側面におけるF-アクチンの制御を介して、上皮細胞層の細胞間接着構造を安定化することが示唆された。上皮細胞の細胞間接着はアクチン骨格により裏打ちされている。接着部アクチンのうち、頂端部アクチンについては接着部位の張力維持や収縮に重要であることが知られている。一方、側面部アクチンの役割については、これまでほとんど報告されていなかった。我々は、神経管形成に関与するforminファミリー分子DAAM1が、培養乳腺上皮細胞において接着側面部に分布していること、またDAAM1のノックダウンを行うと側面部F-アクチンが減少するとともに、側面部E-カドヘリンの分布が基底側に広がること、さらにその際に接着側面部が活発に動くことを見出した。これらの現象は、DAAM1のアクチン重合活性に依存していた。そこで、DAAM1ノックダウン細胞をトランスウェルで長期間培養したところ、細胞層の形成が異常になることが分かった。また、コラーゲンゲル上で培養してライブイメージングを行ったところ、DAAM1ノックダウン細胞は接着側面部から頻繁に突起を出していた。さらにこの突起形成は、隣接した細胞が野生型の場合には促進されることも分かった。これらの現象を引き起こすメカニズムを調べたところ、ラメリポディアの動態に関与することが知られるWAVE2複合体およびlammelipodinが接着側面部に分布しており、これらの分子のノックダウンまたはRac1活性の阻害により、DAAM1ノックダウン時の接着側面部の動きが抑制されることが分かった。従ってDAAM1は、上皮細胞の接着側面部におけるF-アクチン重合を介して、Rac1-WAVE2複合体-lamellipodinにより引き起こされる接着側面部の細胞膜の動きを制御することで、細胞間接着を安定化することが示唆された。交付申請書に記載した実施計画をほぼ予定通り行い、おおむね期待通りの成果を得ることができた。

我々はこれまでに、forminファミリーのアクチン重合分子DAAM1が、乳腺上皮細胞において接着側面部に分布すること、DAAM1のノックダウンにより側面部F-アクチンが特異的に減少し、かつ接着側面部の動きが活発化することを見出した。これらの現象は、DAAM1のアクチン重合活性に依存していた。また、DAAM1ノックダウン細胞を長期間培養すると細胞層の形成が異常になり、コラーゲンゲル上で培養すると接着側面部から頻繁に突起を出す様子が観察された。そこでメカニズムを調べたところ、ラメリポディア形成に関与するWAVE2複合体およびlamellipodinが接着側面部に分布し、これらの分子のノックダウンまたはRac1活性の阻害によりDAAM1ノックダウン時の接着側面部の動きが抑制されることが分かった。今年度は、上記結果を補強するための追加実験を行った。まず、DAAM1がE-カドヘリンの細胞内部分と相互作用し、E-カドヘリンを介して細胞間接着に分布することを示した。また、細胞をマトリゲル中で3次元培養すると、コントロールでは細胞同士が緊密に接着した球状のスフェロイドが形成されたのに対し、DAAM1ノックダウン細胞では細胞間の接着がゆるく、かつ細胞がスフェロイドの底部からマトリゲル中に逸脱する様子が頻繁に観察された。さらに、DAAM1ノックダウン時の接着側面部の動きに関与するRac-WAVE2の下流分子であるArp2/3も機能していることを見出した。以上の結果から、DAAM1は上皮細胞の接着側面部に分布してアクチン重合を促進し、Rac1-WAVE2複合体-Arp2/3およびlamellipodinを介した接着側面部の動きを抑制することで、細胞間接着を安定化していると考えられた。この研究結果を学術論文にまとめて投稿し、受理された。上皮細胞の細胞間接着は頂端部接着複合体と接着側面部により構成されているが、接着側面部の制御機構についてはこれまで明らかでなかった。我々は、forminファミリーのアクチン重合制御分子DAAM1が接着側面部に分布し、DAAM1ノックダウンにより接着側面部の運動性亢進、細胞層の異常形成、および3次元培養体からの細胞の逸脱が起こることを見出した。またこの接着側面部の運動性亢進には、Rac-WAVE2複合体-Arp2/3複合体が関与することも見出した。従って、接着側面部には元来WAVE2複合体に依存した運動性があるが、DAAM1がこれに競合的に作用することにより、接着構造が安定化されると考えられた。交付申請書に記載した実施計画をほぼ予定通り行い、おおむね期待通りの成果を得ることができた。本研究成果については論文にまとめて学術雑誌に投稿し、現在リバイスのための追加実験を行っている。また、学会に参加し、本研究成果について報告する予定である。細胞生物学平成26年度の研究成果に基づき、その発展を図る。例えば、長期培養の際のDAAM1ノックダウンの影響について、各種マーカーを用いてより詳細に記述する。また、本研究結果をまとめ、学術誌に投稿する。
救急外来トリアージ基準確立のための情報収集システム構築に関する研究

多くの地域において増え続ける救急患者に対して「緊急に治療が必要な患者を、適切な時間内で、的確に診断治療」できる安全な社会基盤を確立するために、救急外来において普遍的に使用できる標準化された患者トリアージシステムを確立し、システムを用いた救急患者のトリアージ結果を一元化して集積するために看護師向けの教育コースを開発し提供するとともに、地域においてトリアージ結果のデータ収集ができる体制を構築した多くの地域において増え続ける救急患者に対して「緊急に治療が必要な患者を、適切な時間内で、的確に診断治療」できる安全な社会基盤を確立するために、救急外来において普遍的に使用できる標準化された患者トリアージシステムを確立し、システムを用いた救急患者のトリアージ結果を一元化して集積するために看護師向けの教育コースを開発し提供するとともに、地域においてトリアージ結果のデータ収集ができる体制を構築した本研究は、(1)救急外来における標準化された患者トリアージシステムを確立し、(2)トリアージ結果を一元化して集積するためのデータベースを構築する、(3)データベースに集積された情報を客観的に分析し評価を行って結果をフィードバックすることで「科学的根拠を持つERトリアージシステムの構築を図る」ことを目的としている。平成21年度の研究成果としては1、共同研究者であるカナダAlberta大学のBullard教授と協力し、カナダ救急医学会が作成した標準的なERトリアージシステムであるCTAS:Canadian Triage and Acuity Scaleを参考とした日本版のERトリアージシステム(JTASプロトタイプ)を開発し出版・公開した。本システムは標準的なPC上で運用可能なプログラムであり、トレーニングを受けた看護師が受診患者の症状を選択することで患者のトリアージレベルが決定されるよう配慮されている。2、我々がこれまで取り組んできたシミュレーション教育のノウハウを生かして、ERトリアージシステムの実際の臨床現場での使用方法について講習を行った。看護師、医師、救急救命士を対象として8時間の講習を行い適切にERトリアージが行われるような教育体制を確立した。3、これらの取り組みの経過に関して世界救急医学会、ヨーロッパ救急医学会において発表し、本研究の今後の方向性について世界各国の研究者と意見交換・討議を行った。これらの研究成果を踏まえて、今後はトリアージ結果を迅速且つ簡便に入力し集積することが可能となるデータベースシステムの構築を進めていくことを予定している。本研究は、(1)救急外来における標準化された患者トリアージシステムを確立し、(2)トリアージ結果を一元化して集積するためのデータベースを構築する、(3)データベースに集積された情報を客観的に分析し評価を行って結果をフィードバックすることで「科学的根拠を持つERトリアージシステムの構築を図る」ことを目的としている。平成23年度の研究成果としては1、共同研究者であるカナダAlberta大学のBullard教授と協力し、カナダ救急医学会が作成した標準的なERトリアージシステムであるCTAS: Canadian Triage and Acuity Scaleを参考とした日本版のERトリアージシステム(JTAS)を開尭し、救急外来においてタブレットPCを用いて救急受診患者の緊急度を的確に判定できるシステムを構築した。本研究は、1救急外来における標準化された患者トリアージシステムを確立し、2トリアージ結果を一元化して集積するためのデータベースを構築する、3データベースに集積された情報を客観的に分析し評価を行って結果をフィードバックすることで「科学的根拠を持つERトリアージシステムの構築を図る」ことを目的としている。平成24年度の研究成果としては1、JTASトリアージシステムを用いた救急外来におけるトリアージを富山県内の二次救急病院において実践できるように体制整備・教育を行った。2、実際の救急医療現場でのトリアージ結果を集積することで、緊急度判定の有用性につき検討できるようにした。3、これらの取り組みの経過に関して日本救急医学会、世界救急医学会において発表し、本研究の今後の方向性について世界各国の研究者と意見交換・討議を行った。これらの研究成果を踏まえて、今後はデータベースシステムの情報を生かしてより的確な救急外来トリアージが行われるような医療体制整備を進めていくことを予定している。基本となるERトリアージシステムであるJTASの開発は終了し、それを用いた救急外来での患者トリアージ方法の実際に関する講習会も順調に開催され、今後実際のデータ収集が進んでいくものと思われる。24年度が最終年度であるため、記入しない。富山県内の二次救急医療機関にJTASシステムを提供し救急外来における患者トリアージ結果をデータベース上に集積して解析し分析することでトリアージシステムの改善を図り、救急外来におけるトリアージの患者安全に及ぼす影響について科学的に分析検討するための基礎資料とする。
細胞内蛋白質結晶化反応を用いた構造解析手法の開拓

X線結晶構造解析の目覚しい進歩により、従来不可能と考えられてきたマイクロ微小結晶からの構造決定が次々と報告されている。これらの成果は、精製された大量の蛋白質と、良質な結晶を得るための長い時間が必要とされてきた結晶作成の常識を劇的に変えつつある。本研究では、迅速結晶構造解析に向けた革新的な結晶化手法の確立として、細胞内で鋳型となる細孔を蛋白質の結晶化により作成し、構造解析の目的となる蛋白質を同じ細胞内で同時に発現させ、鋳型蛋白質結晶の細孔へ規則正しく集積し、複合結晶の構造解析を目指した。その結果、タンパク質を挿入可能な内部空間を形成し、さらに目的タンパク質をその内部に挿入することにも成功した。昆虫の多角体病ウイルスは、昆虫細胞感染後に多角体とよばれる結晶性蛋白質を産生する。この多角体は、自己集積反応により細胞内に1-5 μmの結晶を形成する(図3a, 3b)。多角体結晶の本来の役割は、多角体病ウイルスの保護である。野生型の多角体結晶は結晶全体積のわずか19%の細孔空間しか持たないために、広範囲なpH、温度、有機溶媒、乾燥、凍結に対し安定に結晶を保持できる。この性質を利用し、細孔を有する鋳型蛋白質結晶を形成した。多角体結晶を鋳型とし、目的の蛋白質を規則正しく集積するためには、内部空間の拡張が必要となる。野生型の結晶構造からは、多角体単量体が結晶中で三量体構造を形成し、構造単位となって結晶が構築されていることがわかる。つまり、三量体同士が相互作用する部位のアミノ酸置換あるいは、フラグメント欠損を緻密に設計し、細孔空間を広げることが可能である。具体的には、高く結晶中の分子間相互作用に大きな影響を与えないと考えられるループやヘリックスの周辺部分を欠損させた変異体を作成し、細胞内結晶化を試みた。実際には、細孔は数nmまで拡張でき、数十kDa程度の蛋白質の取り込みが可能と予想できた。得られた結晶の構造解析は、数μm以下の微小蛋白質結晶に特化したビームラインであるSPring-8にて行い、鋳型多角体結晶の結晶構造を得た。当初の計画通り、高く結晶中の分子間相互作用に大きな影響を与えないと考えられるループやヘリックスの周辺部分を欠損させた変異体を作成し、細胞内結晶化を試みた。得られた結晶の構造解析は、数μm以下の微小蛋白質結晶に特化したビームラインであるSPring-8にて行い、鋳型多角体結晶の結晶構造を得ている。本研究の目的は、迅速結晶構造解析に向けた革新的な結晶化手法の確立にあり、従来の培養・精製した蛋白質の結晶化とは全く逆の発想により達成する。具体的には、(1)細胞内で鋳型となる細孔を蛋白質の結晶化により作成し、(2)構造解析の目的となる蛋白質を同じ細胞内で同時に発現させ、鋳型蛋白質結晶の細孔へ規則正しく集積し、(3)細胞に封入されたまま目的蛋白質を含む複合結晶の形成を達成した。本手法は、蛋白質結晶化反応から単離精製までを一つの細胞内で完遂する斬新な手法であり、生命原理の理解や、創薬等に向けた革新的な分子技術となる。本研究では細胞内の蛋白質結晶化反応に着目し、(1)細孔を有する鋳型蛋白質結晶の設計と細胞内合成、(2)目的蛋白質の鋳型蛋白質結晶細孔への細胞内精密集積、(3)目的蛋白質を内包した鋳型蛋白質結晶のX線結晶構造解析までを、精製した蛋白質を全く使用せず、一つの細胞内で完遂することを目指した。本研究で達成される細胞内結晶構造解析の学術的意義は、鋳型蛋白質結晶へ集積する蛋白質に制約がなく、安定性や収率が低く結晶化が困難な蛋白質の結晶構造解析への拡張性が高い点にある。現在も様々な結晶化手法や構造解析の自動化法が開発されているものの、精製したタンパク質が必要という点では抜本的な解決策は示されていない。本研究成果は、生命現象解明の新しい分子ツールとこの長年の課題に解決策を与えるものである。前年度作成した鋳型多角体結晶を用い、目的蛋白質集積反応を行う。最初に、サイズが比較的小さく(約4 nm)、熱的安定性が高い蛍光蛋白質として知られているsuper-folder GFP(sf-GFP)を用いる。昆虫細胞へ多角体を発現するウイルスとsf-GFPを発現するウイルスを同時に感染させる。この方法により、一つの細胞の中で鋳型多角体結晶が形成されるのと同時に、目的蛋白質であるsf-GFPが産生され、鋳型結晶へのsf-GFP集積が促進されると考えられる。結晶への取り込み反応を共焦点

蛍光顕微鏡により追跡し、結晶内部への均一な取り込みと、その取り込み速度等を評価する。鋳型多角体結晶への取り込みには、細孔のサイズと形状に加え、静電的相互作用も大きな影響を与えると考えられることから、表面電荷を変えたsf-GFP変異体を作成し、鋳型多角体結晶への取り込みを比較する。生体関連機能化学当初予定していた変異体合成より少ない数で合成が可能であったため。さらなる、変異体の最適化のためにタンパク質合成を追加して進める。