hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
租税手続法の国際的側面に関する基礎的研究

3非居住者の金融口座情報に関する共通報告基準について,租税条約実施特例法の改正を検討しました。このように,条約と国内法の両面から基礎的研究を行うことができました。国際的なフォーラムで次々に発せられる公文書を、演習参加者との緊密な協力により、じっくりと分析することができました。のみならず、次のような事情によって、国際的なフォーラムで議論されていることが、租税条約の運用に直結するばかりでなく、国内法の改正につながる、という展開がみられ、本研究の3本の柱が有機的につながってきました。すなわち、租税条約上の自動的情報交換の多国間枠組みがきわめて急速に進展し、条約上の枠組みを実施するための国内法整備がはやくも平成27年度税制改正で講ぜられたため、その法的検討に着手するに至っています。租税法計画どおりに進めます。国際的なフォーラムにおける動向の巨視的分析を継続するとともに、租税条約上の情報交換について米国Aloe Vera事件など個別事例の収集・分析に力を入れます。当初の予定よりも研究が進捗するとともに、対象が拡大していますので、最終年度に予定していた、租税条約実施特例法に関する分析にも手を広げます。すなわち、自動的情報交換のために導入される共通報告基準について、条約と国内法の相互関係をくわしく検討する、という作業です。本年度に予定していた2つの作業のうち、まず、国際的なフォーラムにおける動向の巨視的分析については、この時期にBEPSプロジェクトが本格的に始動したこともあり、その分析に多くの時間を必要とすることとなりました。結果的にみて、BEPSプロジェクトとの関係で発出される種々の公的報告書およびそれに対する世界各国の専門家からのコメントを読むことによって、透明性と情報交換に関する動態の把握が進みました。次に、租税条約上の情報交換に関する個別的分析については、予定どおり、多国間税務執行共助条約に関する専門家委員会の注釈の検討をすることができました。図書発注と納入のタイミングが、年度をまたいでしまいました。計画どおりに進めます。とくに、今後もBEPSプロジェクトの進展が予想されるため、国際的なフォーラムにおける動向の巨視的分析にさらに注力します。この分野において英語圏の二次文献の増加が著しいこともあり、限られた予算の中で、書籍の購入にあたってはより強い選別を行います。各国専門家との意見交換の機会は、できる限り増加したいと考えます。年度開始後に納入された図書を、利用いたします。2014年度夏学期に開講した演習のwebページです。
拡張型心筋症における脳セロトニン合成律速酵素Tph2遺伝子機能的多型の役割

昨年度にひきつづき「C57BL/6とBALB/c系統間でTph2遺伝子を入れ替えたΔK210ヘテロ接合体DCMマウス」の兄弟交配を行い、C57BL/6とBALB/c遺伝的背景上にTph2 1473C/CおよびG/GアレルをもつΔK210ホモ接合体DCMマウスの作出を行った。その結果、C57BL/6遺伝的背景上にC/CとG/GアレルをもつΔK210ホモ接合DCMマウスをそれぞれともに計26頭作製することができた。一方、昨年度は十分な個体数を揃えることができなかったBALB/c6遺伝的背景上にC/CとG/GアレルをもつΔK210ホモ接合体DCMマウスはそれぞれ計6頭と16頭作製することができた。死亡時の解析結果から、C57BL/6遺伝的背景にTph2低活性型G/Gアレルを導入すると本来の高活性型C/Cアレルをもつ群に比べて心臓量と肺うっ血レベルが有意に増加することが初めて確認された。また、低活性型G/Gアレルの導入により生命予後が有意に延長することも統計学的に証明することができた。一方、BALB/c遺伝的背景にTph2高活性型C/Cアレルを導入すると本来の低活性型G/Gアレルをもつ群に比べて心重量が減少する傾向がみられると同時に肺うっ血レベルは有意に減少することが確認された。また、BALB/c遺伝的背景では高活性型C/Cアレルの導入により生命予後が有意に短縮することが統計学的に証明された。死因に関しては、C57BL/6遺伝的背景で本来の高活性型C/Cアレルをもつがすべて予期せぬ突然死であったのに対して、低活性型G/Gアレルを導入したものでは予期せぬ突然死と心不全による衰弱死がそれぞれ半分程度見られた。一方、BALB/c遺伝的背景では本来の低活性型G/Gアレルをもつものがすべて心不全による衰弱死であったのに対して、高活性型G/Gアレルを導入したものでは予期せぬ突然死が数例みられるようになった。交配ケージを大幅に増やすことにより昨年度の遅れをかなり取り戻すことができた。しかしながら、特に出生率が低いBALB/c遺伝的背景に関しては信頼性のある統計学的検定を行うために十分な例数を得ることがいまだできていない。C57BL/6遺伝的背景ΔK210ホモ接合体DCMマウスは統計学的検定に十分な例数を得ることができたが、BALB/c遺伝的背景ΔK210ホモ接合体DCMマウスは特に高活性型C/Cアレルを導入したものが依然として十分な例数を得ることができていないため、次年度も交配ケージを増やした状態でさらに研究を進める必要がある。また、BNP・βミオシン重鎖・SERCA2a・NCX1などの心肥大・心不全マーカーの発現量測定、単離心筋細胞収縮性/細胞内カルシウム動態同時測定および脳セロトニンレベルの定量を行うことで最終的にDCM疾患表現型における脳セロトニン機能の役割を明らかにする。我々のこれまでの研究において、拡張型心筋症(DCM)を引き起こす心筋トロポニンT遺伝子突然変異(ΔK210)を導入した2系統の遺伝的背景(BALB/cとC57BL/6)のノックインマウスにおいて、C57BL/6系統は不整脈により突然死するが、BALB/c系統は重篤な心不全により衰弱死することが明らかになっている。BALB/cマウスはトリプトファン水酸化酵素2の遺伝子(Tph2)の一塩基多型により脳セロトニンレベルが低下している。DCM疾患表現型における脳セロトニン機能の役割を明らかにするため、研究実施計画に従って「C57BL/6とBALB/c系統間でTph2遺伝子を入れ替えたΔK210ヘテロ接合体DCMマウス」の兄弟交配を行い、C57BL/6とBALB/c遺伝的背景上にTph2 1473C/G, C/CおよびG/GアレルをもつΔK210ホモ接合体DCMマウスの作出を試みた。本年度の研究では、C57BL/6遺伝的背景上にC/CとG/GをもつΔK210ホモ接合DCMマウスがそれぞれ14頭と10頭ずつ得られた。それらのマウスの死亡時の心重量と肺重量を計測から、Tph2低活性型G/Gを導入した群と本来の高活性型C/Cを導入した群の間で心臓リモデリングと肺うっ血レベルには有意な差は見られなかった。しかしながら、生命予後に関して低活性型G/Gの導入により明らかな延長が見られた。死因としては、高活性型C/Cではすべて予期せぬ突然死であったのに対して、低活性型G/Gを導入したものでは予期せぬ突然死と心不全による衰弱死がそれぞれ半分程度見られた。一方、BALB/c遺伝的背景上にC/CとG/GをもつΔK210ホモ接合DCMマウスはそれぞれ2頭と4頭ずつ得られたが、例数が非常に少ないため心臓リモデリング、肺うっ血レベルおよび生命予後に対する影響に関してはまだ傾向を見出すことも困難であった。BALB/c系統のΔK210ホモ接合体DCMマウスは、おそらく出産時に死亡しやすいため予想よりかなり少ない個体数しか得ることができなかった。また、Tph2 C/GのΔK210ホモ接合体

DCMマウスを作成することは労力が1.5倍になることを意味し、本年度は行う余裕がなかった。昨年度にひきつづき「C57BL/6とBALB/c系統間でTph2遺伝子を入れ替えたΔK210ヘテロ接合体DCMマウス」の兄弟交配を行い、C57BL/6とBALB/c遺伝的背景上にTph2 1473C/CおよびG/GアレルをもつΔK210ホモ接合体DCMマウスの作出を行った。その結果、C57BL/6遺伝的背景上にC/CとG/GアレルをもつΔK210ホモ接合DCMマウスをそれぞれともに計26頭作製することができた。一方、昨年度は十分な個体数を揃えることができなかったBALB/c6遺伝的背景上にC/CとG/GアレルをもつΔK210ホモ接合体DCMマウスはそれぞれ計6頭と16頭作製することができた。死亡時の解析結果から、C57BL/6遺伝的背景にTph2低活性型G/Gアレルを導入すると本来の高活性型C/Cアレルをもつ群に比べて心臓量と肺うっ血レベルが有意に増加することが初めて確認された。また、低活性型G/Gアレルの導入により生命予後が有意に延長することも統計学的に証明することができた。一方、BALB/c遺伝的背景にTph2高活性型C/Cアレルを導入すると本来の低活性型G/Gアレルをもつ群に比べて心重量が減少する傾向がみられると同時に肺うっ血レベルは有意に減少することが確認された。また、BALB/c遺伝的背景では高活性型C/Cアレルの導入により生命予後が有意に短縮することが統計学的に証明された。死因に関しては、C57BL/6遺伝的背景で本来の高活性型C/Cアレルをもつがすべて予期せぬ突然死であったのに対して、低活性型G/Gアレルを導入したものでは予期せぬ突然死と心不全による衰弱死がそれぞれ半分程度見られた。一方、BALB/c遺伝的背景では本来の低活性型G/Gアレルをもつものがすべて心不全による衰弱死であったのに対して、高活性型G/Gアレルを導入したものでは予期せぬ突然死が数例みられるようになった。交配ケージを大幅に増やすことにより昨年度の遅れをかなり取り戻すことができた。しかしながら、特に出生率が低いBALB/c遺伝的背景に関しては信頼性のある統計学的検定を行うために十分な例数を得ることがいまだできていない。交配による出生率が極端に低いBALB/c系統のΔK210ホモ接合体DCMマウスを解析に十分な数揃えるため交配ケージをさらに増やす必要がある。また、Tph2 C/GのΔK210ホモ接合体DCMマウスは研究成果の解釈の信頼性を高めるためには必要なものであるが、本研究の目標を達成するために必須であるというわけではないため、研究の進行状態にあわせて十分に余裕がある場合に行うこととする。C57BL/6遺伝的背景ΔK210ホモ接合体DCMマウスは統計学的検定に十分な例数を得ることができたが、BALB/c遺伝的背景ΔK210ホモ接合体DCMマウスは特に高活性型C/Cアレルを導入したものが依然として十分な例数を得ることができていないため、次年度も交配ケージを増やした状態でさらに研究を進める必要がある。また、BNP・βミオシン重鎖・SERCA2a・NCX1などの心肥大・心不全マーカーの発現量測定、単離心筋細胞収縮性/細胞内カルシウム動態同時測定および脳セロトニンレベルの定量を行うことで最終的にDCM疾患表現型における脳セロトニン機能の役割を明らかにする。本年度の研究を遂行する過程では進捗状況に若干の遅延があったため未使用分が生じた。本研究計画の目的を達成するためには是非とも必要なものであり、翌年分として請求した助成金と合わせて有効に活用する予定である。
プラズマ応用の新機能性進化ナノチューブ創製

単層カーボンナノチューブ(SWNTs)の中空領域にアルカリ金属原子、フラーレン(C_<60>)分子又はその接合構造を内包した新機能性進化ナノチューブの創製実験を行った。また、各種分析装置を用いて、形成された新機能性カーボンナノチューブの詳細な評価・分析を行った。●プラズマイオン照射によるSWNTsへの原子・分子内包及びその機構の解明プラズマイオン照射実験は現有設備であるアルカリ-フラーレンプラズマ発生装置中に設置されたSWNTs塗布基板に、正及び負の直流バイアス電圧を印加して選択的なイオン照射を行った。各種分析装置を用いて行った詳細な分析の結果、SWNTsへのアルカリ金属原子・C_<60>分子内包が明瞭に確証され、内包の最適条件を導出した。SWNTsへの内包メカニズムは、バイアス印加によって基板前面に生じる安定なシース電場によって加速されるイオンが、ナノチューブの構造変形(屈曲や端開口)を発生させ、切断された開口端から内包されると考えられる。●(Cs/C_<60>)内角SWNTsの形成とその評価・分析電子供与・授与体の接合構造を内包した超分子構造SWNTsを創製するため、Cs-C_<60>プラズマ中に挿入したSWNTs塗布基板に正バイアスと負バイアスを一定時間順番に印加することによって、C_<60>負イオン及びCs正イオンの選択的な照射実験を行った。高分解能透過型電子顕微鏡(HR-TEM)による高倍率直接観察と同時に、エネルギー分散型X線元素分析装置(EDS)による組成元素の"その場"同定を行い、セシウムとフラーレンの存在を明らかにすることができ、接合構造を内包した新機能性SWNTsの形成を初めて証明した。●プラズマイオン照射によっ形成多された新機能性SWNTsの電気特性の測定電界効果トランジスタ(FET)構造を用いて、洗浄処理を行ったSWNTsの電気的な特性に関して調べた結果、P-type半導体特性を持つことが明らかになった。また、プラズマイオン照射を行ったSWNTsは内包された原子・分子とナノチューブ間に電荷移動があるという結果が走査型トンネル顕微鏡(STM)や第一原理計算シミュレーションによって明らかになった。単層カーボンナノチューブ(SWNTs)の中空領域に原子・分子を内包した新機能性進化ナノチューブ創製の最適条件を把握するため、SWNTs内部へのアルカリ金属原子又はフラーレン(C_<60>)分子を注入する実験を行った。実験は現有設備であるアルカリーフラーレンプラズマ発生装置中に設置されたSWNTs塗布基板に、正及び負の直流バイアス電圧を印加して選択的なイオン照射を行った。プラズマイオン照射を行なったナノチューブの詳細な評価・分析を、各種分析装置を用いて行った。それと並行して第一原理分子動力学計算を行なった結果、以下のことが判明した。●アルカリ金属イオン照射によるSWNTsの構造変形SWNTsの構造変形度を定量化する目的で、ラマン分光分析を行った。その結果、基板バイアスが負に深くなるにつれて、すなわち照射イオンエネルギーの増加に伴い、屈曲や端開口のSWNTsの構造変形度が上昇する傾向が見られ、Li^+, Na^+, K^+, Cs^+の順に質量の大きい場合の方が効果的であることが明らかになった。●Cs内包SWNTsの形成とその評価・分析ナノスケールで元素の空間分布測定が可能な走査型-透過型電子顕微鏡(STEM)を用いて、Csプラズマ中負バイアス印加後のSWNTsに対してSWNTs内部構造を詳細に調べた。その結果、SWNTsの外側にCsが吸着した場合と内部に内包された場合の違いが明瞭に確証された。電界効果透過型電子顕微鏡(FE-TEM)による高倍率直接観察と同時に、エネルギー分散型X線元素分析装置(EDS)を用いて、組成元素の"その場"同定を行い、アルカリ金属内包SWNTs形成を初めて証明した。SWNTs内へのジグザグ状物質内包が確認されたが、それ以外にも直線状や結晶状に配列した内包物も観察された。すなわち、SWNTs内部のCs配列の形成過程や形態には、SWNTsの切断面状態とCsの導入状態の微妙な違いが大きく影響するものと考えられる。●Cs内包SWNTsにおける電子状態の理論計算第一原理分子動力学シミュレーションによる計算の結果、Cs原子はSWNTsの内壁近くで安定に存在するという結果が得られた。また、内包されたCsとナノチューブ間に電荷移動があるという結果もえられたが、実験結果との比較については更なる詳細な計算が必要である。

SWNTsへの内包メカニズムは、バイアス印加によって基板前面に生じる安定なシース電場によって加速されるイオンが、ナノチューブの構造変形(屈曲や端開口)を発生させ、切断された開口端から内包されると考えられる。●(Cs/C_<60>)内角SWNTsの形成とその評価・分析電子供与・授与体の接合構造を内包した超分子構造SWNTsを創製するため、Cs-C_<60>プラズマ中に挿入したSWNTs塗布基板に正バイアスと負バイアスを一定時間順番に印加することによって、C_<60>負イオン及びCs正イオンの選択的な照射実験を行った。高分解能透過型電子顕微鏡(HR-TEM)による高倍率直接観察と同時に、エネルギー分散型X線元素分析装置(EDS)による組成元素の"その場"同定を行い、セシウムとフラーレンの存在を明らかにすることができ、接合構造を内包した新機能性SWNTsの形成を初めて証明した。●プラズマイオン照射によっ形成多された新機能性SWNTsの電気特性の測定電界効果トランジスタ(FET)構造を用いて、洗浄処理を行ったSWNTsの電気的な特性に関して調べた結果、P-type半導体特性を持つことが明らかになった。また、プラズマイオン照射を行ったSWNTsは内包された原子・分子とナノチューブ間に電荷移動があるという結果が走査型トンネル顕微鏡(STM)や第一原理計算シミュレーションによって明らかになった。
超音波楕円振動切削法を用いた金型の高能率かつ高精度加工

本研究では超音波楕円振動切削法を用いた金型の高能率・高精度加工に着目し、より広範囲の加工環境・加工分野における低コストでの鏡面仕上げ加工の実現を目的とする。楕円振動切削中に発生する摩擦型びびり振動の発生メカニズムを解明してその抑制法まで提案し検証を行った。摩擦型びびり振動とは、工具が仕上げ面に切り込む瞬間に工具逃げ面へ発生する摩擦力が加振力として働き動剛性が弱い周波数成分がびびり振動として励起され成長するものである。その抑制法として以下の案が提案された。切削方向に対して工具リード角を前傾させることる切削を行った。その結果、摩擦力を小さくなり、摩擦力が振動加振へ寄与する割合が減少されるため、摩擦型びびり振動が成長しないことが実験的に確認された.本研究によって特殊なプロセスである楕円振動切削における摩擦型びびり振動問題の発生メカニズムが解明されて,簡単な抑制手法も提案され、その有効性が確認できた成果が述得られた。楕円振動切削プロセスの新しいモニタリング手法が提案された。楕円振動切削の振動モデルの提案より、各切削力成分が振動モデルのバネや減衰として工具振動へどのような影響を及ぼすかについて考察を行った。一方で、加工中に生じる外部力に対して一定の振動を出力するために設計されている楕円振動制御装置内での各振動方向に対する消費電力変化量及び楕円振動の発振周波数の変化量が加工プロセスモニタリングに必要なパラメータとして用いられた。結果として、切削方向振動に対する消費電力の変化量は工具摩耗量と相関があり、切込み方向振動に対する消費電力の変化量は切込み深さと相関があることが示された。本研究より、センサレスで工具摩耗度の推定及び過度負荷警告の機能が付加された超精密切削技術として楕円振動切削技術の高性能化・高精度化が実現できた。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。
急速アパイト転換型リン酸カルシウムセメントの生活歯髄切断法への応用に関する研究

新しく開発された急速アパタイト転換型リン酸カルシウムセメントは,硬化時pH値が上昇するが,硬化後ハイドロキシアパタイトに転換し中性となる特徴を有する。そこで,本材が歯髄切断面に硬組織を誘導させるのに必要なpH刺激を及ぼす可能性があるか否かをラット皮下結合組織を用いて検討し,さらに病理組織学的に生活歯髄切断法への応用の可能性を検討することとした。結果,歯髄刺激性の点からは生活歯髄切断への応用に対して有効であるが,硬組織形成の点からは今後一層の改良が必要であることが示唆された。急速アパタイト転換型のリン酸カルシウムセメント(CPC)は,硬化時pHが上昇するが,硬化後HApに転換し中性となる特徴を有する。本研究の目的は,急速アパタイト転換型CPCの生活歯髄切断法への応用の可能性を検討することであり,本材の硬化時pH値の変化が生体組織のpH値を変化させ得るか否かについて検索した。1、実施計画(pH11.5以上の持続時間の測定)について被験試料として,Ca/P比の異なる2種の急速アパタイト転換型CPC(Ca/P比1.7と2.0)を試作し,従来型CPCのα-TCPおよびCa(OH)_2を対照群として用いた。方法は,被験試料を作用させたラットの皮下結合組織表面のpH(組織pH)値の経時的変化と被験試料自体のpH(試料pH)値の経時的変化とを比較した。その結果,(1)α-TCPは試料pH値,組織pH値ともに中性を示した。また,Ca(OH)_2の試料pH値,組織pH値ともに強アルカリ性を示した。(2)両急速アパタイト転換型CPCの試料pH値は,硬化初期は13以上の値を示したが,1日後には8.48.9に低下した。(3)両急速アパタイト転換型CPCの組織PH値は,硬化初期は11.212.3を示し,Ca(OH)_2の組織pH値との間に有意差は認めなかった。2日後には8.09.5に低下した。2、実施計画(病理組織学的観察および統計学的検索)について実験中で,固定された試料を,脱灰,脱水後,パラフィン包埋し,連続切片標本を作製している。本研究の目的は,急速アパタイト転換型CPCの生活歯髄切断法への応用の可能性を検討することであり,現在までの実験(ラット皮下結合組織表面への試作急速アパタイト転換型CPCの貼付実験)で,本材が歯髄切断面に硬組織を誘導させるに必要なpH刺激を歯髄に及ぼす可能性があることがわかっている。今年度は,ラット歯髄に用いて28日後の状態を病理組織学的に検索した。1、実施計画(ラット臼歯の生活歯髄切断部への試作急速アパタイト転換型CPCの貼付実験)について実験材料は生後68週齢SD系ラット(体重250 g前後)の雄,計12匹を用い,4群に分けた。実験歯は左右下顎の第一臼歯で各群6歯12根管とした。方法は,全身麻酔下で固定板上に固定し,簡易防湿下で実験部位を生活歯髄切断法(chemical surgery method)を臨床的術式に準じて行った。切断面に貼薬した薬剤は,Ca(0H)_2,αTCP(Ca/P比:1.5),2種の試作急速アパタイト転換型CPC(Ca/P比:1.7と2.0)を用いた。なお,αTCPはCaC0_3とNaHPO_4・2H_2Oで,Ca(OH)_2と両試作急速アパタイト転換型CPCは滅菌生理食塩水で練和した。最後に,グラスアイオノマーセメントにて仮封した。今年度は,前年度に続きラット歯髄に用いて28日後の状態を病理組織学的に検索した。

Ca(OH)_2群,αTCP群(Ca/P比:1.5),r-αTCP(1)群(Ca/P比:1.7)およびr-αTCP(2)群(Ca/P比:2.0)の4群を比較検討した。硬組織の形成は,Ca(OH)_2群は91.7%で,切断面における形成は91.7%,αTCP群は83.3%で,切断面では0%,r-αTCP(1)群は50.0%で,切断面では33.3%,r-αTCP(2)群は33.3%で,切断面では16.7%であった。Ca(OH)_2群と両r-αTCP群間(p<0.05)および,αTCP群と両r-αTCP群間(p<0.05)に有意差が認められた。歯髄刺激性はCa(OH)_2群が最も高く,αTCPと両r-αTCP群は低かった。また,αTCP群と両r-αTCP群で硬組織形成量はわずかであった。以上の結果より,r-αTCPは歯髄刺激性の点からは生活歯髄切断への応用に対して有効であるが,硬組織形成の点からは今後一層の改良が必要であることが示唆された。
傾斜放牧地での育成牛放牧方式に関する行動学的研究

1)輪換放牧している放牧育成中のヘレフォ-ド種32頭および18頭にホルスタイン種育成雌牛を5頭ずつ加え、それぞれ地形の複雑な牧区および比較的平坦な牧区に入れ、24時間の行動観察を日中は肉眼、夜間はサ-チライト、肉眼および暗視装置を用いて行った。群構成頭数が大きく地形の複雑な牧区の群は、小群が全体から別れて行動する行動が見られ、日内の敵対行動も増減を繰り返すが、形成された社会構造は比較的安定していたことが示唆された。2)その後両群をそれぞれ地形の複雑な牧区、比較的平坦な牧区に輪換放牧し、夏季間の発育成績を記録したほか、各月2回24時間の行動観察を行った。地形の複雑な牧区の群は比較的平坦な牧区の群に較べて発育はやや劣ったが、やや小型ではあるが足腰の強い牛に育成された可能性があった。また、山地傾斜地における放牧地の地形は、採食時間や休息時間、およびこれらの季節変化や日内変化には影響しなかったが、日内各時間帯における採食や休息の場所には大きく影響を及ぼした。地形の複雑な牧区における観察結果から、放牧牛の休息場所の選択要因には、夏季において風速が大きく影響を及ぼし、気温と風速の関係と給水施設の位置との関係が、休息場所を決定するものと考えられた。3)育成牛群36ー39頭および22ー25頭の2群を簡易電牧により仕切った比較的平坦でほぼ長方形の実験牧区(面積110ー150m^2/頭)にそれぞれ24時間放牧し、群の空間行動および社会行動を比較検討した。その結果。面積が同じでも群構成頭数が大きいと群は相対的に大きく広がる傾向にあることが示された。また、敵対行動数は群構成頭が大きいほど多いが、敵対行動の頻度自体は草量と関連しており。現存草量が比較的豊富な時期は敵対行動数が減少した。その結果。1)1歳齢ヘレフォ-ド種(HF、♂16、♀16、A群)及び18頭(♂9、♀9、B群)を5月から11月まで輪換放牧とし、各月1回A群は地形の複雑な2000m^2/頭の実験牧区(標高150-210m)、B群は比較的平坦な1000m^2/頭(標高110-140m)の実験牧区に1週間程度滞牧させ、各2回24時間の行動を観察記録した。6月に両群にホルスタイン種育成雌牛(HL、5-14か月齢)を5頭ずつ加え、1週間の連続行動観察を行った。2)HLを加える前の両群の日内の敵対行動数は1時間当たりA群が18.5回、B群は13.7回と、既報(Kondo,et al.,Appl.Anim.Behav.Sci.,1989)の推定値よりやや低い値となった。HLを加えた直後は、両群ともHF及びHLの採食時間帯に差がみられたが、約1週間で一致した。しかし、群構成頭数か大きく地形の複雑な牧区のA群は、HLを中心とする小群が全体から別れる行動が見受けられ、採食行動・社会行動とも安定するのにB群より、やや時間がかかった。

3)7月から11月まで各月の両群の1日を昼間(8:00-16:00、DT)、夜間(20:00-4:00、NT)、日の出・日没時(4:00-8:00及び16:00-20:00、ME)に分けると、両群とも季節を通じてDTは採食及び休息、NTは休息、MEは採食行動が主に観察された。4)A群のDTの採食及び休息は南東の標高190m以下傾斜度20度以下の緩斜面、NTの休息は標高190m以上傾斜度20度以下の緩斜面、MEの採食は林地を除いた全牧区内で主に行われ、NT,MEの行動場所は季節を通じて大きな変化はないが、DTの行動場所は変化した。B群ではNTの休息にやや標高の高い場所を選ぶほか一定の傾向はなかった。5)A群の牧区の現存草量は季節を通じて、平坦なB群の牧区より低かったが、林地内を除いて比較的均一で、牧区内微気象は斜面上部の気温の日較差が小さく、南向斜面の風速が高く、林地内のカタ冷却力が低かった。1)0.1ー0.2ha/頭の放牧区で輪換放牧されている育成牛群36頭(ヘレフォ-ト“種32頭ホルスタイン種4頭"36頭群)および22頭頭(ヘレフォ-ト“種17頭、ホルスタイン種5頭、22頭群)の2群をそれぞれ比較的平坦でほぼ長方形の実験牧区(面積約150m^2/頭)に24時間放牧し、各個体の位置(12時ー18時および5時30分ー12時)をタイムラプスVTR装置で撮影した。観察終了後、CRT画面上で30分間隔の両群の採食行動頭数を記録したほか、20頭を抽出し、TVスケ-ル装置を用いて群の平均最近接個体間距離(rA、m)、rAとその期待値との比R、占有面積(m^2)を算出した。2)rA(m)の総平均は36頭群4.3に対し22頭群2.8(P<0.01)で、R値はそれぞれ0.7、22頭群は0.5と、相対的にも36頭群がより広がっていることが示された。平均占有面積(m^2)は36頭群が790.0、22頭群が499.0と有意な差(P<0.05)があった。日の出・日没時の採食行動の時間帯の占有面積(m^2)は36、22頭群で933.1,873.8と差はなかったが、R値はそれぞれ0.8および0.5で、36頭群が1.6倍に広がっていたことを示し、休息時間帯には0.5および0.4とほぼ同じ広がり方を示した。3)同様に、育成牛25頭(ヘレフォ-ド“種20頭、ホルスタイン種5頭、25頭群)および39頭(ヘレフォ-ド“種33頭、ホルスタイン種6頭、39頭群)の2群を6および8月にそれぞれ比較的平坦でほぼ長方形の実験牧区(面積約110m^2/頭)にそれぞれ正午より24時間放牧し、12時ー18時および6時ー12時の行動をタイムラプスVTR装置で撮影し、12時ー18時の敵対行動を観察記録した。4)敵対行動数(回/時)は6月の25頭群が4.7、39頭群が8.2、8月はそれぞれ21.2および29.8で、群構成頭数が大きいほど多く、草量が少ないほど多い傾向にあった。既報の回帰式から敵対行動数(回/時)を推定すると、本実験牧区においては25頭群では21.6、39頭群は32.5と、現存草量が低い時期の観察結果と近い値となった。
中枢性疲労評価システムの構築と疲労制御を指向した食品開発基盤の整備

マウスにおいて軽度の運動負荷によって引き起こされ、自発行動量の低下で示される疲労が回復する過程を経時的に測定し、疲労度を評価する系を確立した。この評価系が摂取した物質により抗疲労・疲労回復作用を持つもの、および疲労を促進するものの両方を検出できることを行動する動機に影響する薬物で確認した。この系でグルコース、クエン酸の直前摂取が、またホエータンパク質の慢性摂取が疲労の軽減作用を持つことを示唆した。肉体的疲労を伴わない疲労モデルの確立実験動物において、肉体的疲労を伴わない疲労モデルを確立することを目的として、コミュニケーションボックスを用いた実験系が利用できるかどうか検討した。コミュニケーションボックスはラットが電気ショックを受ける床面、および受けない床面を交互に格子状に配置しており、電気ショックによる肉体的ストレス、および電気ショックを受ける動物を見ることによる精神的なストレスを動物に与える装置である。この装置を用いて動物に2種のストレスを与えた結果、肉体的ストレスを受けた動物は同然のことながら、肉体的負荷がないと考えられるラットにおいても自発行動量の低下が認められ、精神的ストレスによって疲れたような行動が観察されることがわかった。このことから、この実験系が肉体的疲労を伴わない疲労モデルとして利用可能である事が示唆された。抗疲労および迅速な疲労回復機能を有する食品のスクリーニングシステムの確立動物の疲労に対し抗疲労、あるいは疲労回復作用を持つ食品(成分)をスクリーニングするため、動物に疲労を生じさせ、食餌成分が動物の疲労回復過程にどのように影響するかを検討することでその作用を評価する実験系の確率を試みた。低強度の歩行を1時間負荷することで軽度の疲労を生じさせ、その回復過程を自発行動量が回復する過程によって評価した。疲労の程度が軽度であるためある成分が疲労を回復する、もしくは増悪する作用があっても両方向の結果が検出できることを証明するため、行動量を増加させる作用を持つセロトニン再取込阻害剤、減少させる作用を持つドーパミンアンタゴニストを投与し、何も投与しないコントロールに対しそれぞれが見かけ上自発行動回復を早める作用、および回復を遅らせる作用を持つことを明らかにした。この結果からこの実験系が疲労に対し影響する食品成分の検出に利用できることが示唆された。肉体的疲労を伴わない疲労モデルの解析(井上)ラットに強い精神的ストレスを負荷するが、肉体的な負荷はないコミュニケーションボックスを用い、ストレス負荷後の行動を解析して疲労様行動が生じるか、またそのときに脳内での活性型TGF-β濃度が増大するかを検討した。昨年度はコミュニケーションボックスによる精神的ストレス負荷後にラット自発行動量が減少すると報告したが、その後ストレス負荷条件を検討した結果自発行動量には影響しないことが明らかとなった。また精神的ストレス負荷後のラット脳脊髄液中のTGF-β濃度についても変化がないことが明らかとなった。しかしながら精神的ストレス負荷後の摂食量は有意に減少することから、ラットに対してストレスが負荷されたことは確認できた。疲労度の測定に関して自発行動量が適切な指標となるかどうかさらに検討を要すると考えられた。抗疲労および迅速な疲労回復機能を有する食品のスクリーニングシステムの確立(井上)ラットに軽度の運動を負荷して疲労を生じさせ、これに予め摂食させておいた食事成分がどう影響するか自発行動の回復で検討するとともにそのときの脳内TGF-β濃度を測定する実験系の確立を試みた。傾斜角10度のトレッドミルにて10および15m/min.の速度でラットを30分走行させた後にその自発行動量を測定した。その結果いずれも自発行動量の減少が見られたが、ラット個体によってその程度が異なり、結果が安定しない。このため運動負荷条件と、行動慮測定条件について細部を検討する必要がある。肉体的疲労を伴わない疲労モデルの解析ラットに強い精神的ストレスを負荷するが、肉体的な負荷はないコミュニケーションボックスを用い、ストレス負荷後の行動を解析して疲労様行動が生じるかを検討した。精神的ストレスを負荷した場合、疲労の指標として用いてきた自発行動量は減少するよりもむしろ増加傾向であり、疲労様の行動は見られなかった。一方、ホームケージに設置した回転カゴで走行する量を測定する自発運動量では、精神的ストレス負荷後その量が減少する傾向がみられた。回転カゴによる自発運動は自ら運動しようという意志がなければ行われないため、精神的ストレス負荷後には運動する動機が減少することが示された。即ち、ヒトでは疲労感を引き起こすことが経験的に知られている精神的ストレスは、実験動物でその測定を行う場合、測定法の選定が重要であり、肉体的疲労を測定できる方法が必ずしも適切でない場合があることが示された。抗疲労および迅速な疲労回復機能を有する食品のスクリーニングシステムの確立動物の疲労に対し抗疲労、あるいは疲労回復作用を持つ食品(成分)をスクリーニングするため、動物に疲労を生じさせ、食餌成分が動物の疲労回復過程にどのように影響するかを検討することでその作用を評価する実験系の確立とその応用が可能かどうかを検討した。マウスに低強度の歩行を1時間負荷することで軽度の疲労を生じさせ、その回復過程を自発行動量が回復する過程によって評価した。

強制歩行を開始する30分前に水、グルコース、クエン酸、コハク酸を強制投与しておいたマウスで自発行動の回復を比較したところ、水に比べてグルコースとクエン酸では早期に自発行動が回復したが、コハク酸投与では自発行動の回復は見られなかった。
ヒスチジン脱炭酸酵素遺伝子改変マウスを用いたヒスタミンの機能解析

私たちは,ヒスタミンの合成酵素であるヒスチジン脱炭酸酵素(HDC)遺伝子をノックアウトしたマウスを作製して,ヒスタミンの生体内における機能を評価した.この遺伝子はヒスタミンの合成能のある細胞,すなわち肥満細胞,好塩基球,神経細胞,胃壁細胞などで発現しており,その機能はアレルギー疾患,睡眠,胃液の分泌に重要な働きをしていることが判明した.また,今まで未知であった,感染,慢性肉芽種などにも影響をあたえることを明らかにした.すなわち,具体的には全身性アナフィラキシー反応においては,体温,呼吸パターンにヒスタミンは重要であるものの,血圧のコントロールにおける寄与は少なく,また,活動時に睡眠の脳波が占める割合が非常に多かった.更に,ガストリンによる胃酸の分泌において,ヒスタミンは必須な物質であった.腹腔内における大腸菌の感染モデルでは,ヒスタミンを抑制することによって,感染からの回復が早いことが判明した.また,ヒスタミンは慢性肉芽種の形成に重要であり,ヒスタミンがないと慢性肉芽種が形成されないことがあきらかになった.このように,ノックアウトマウスを使って生体内におこる反応を観察するとともに,in vitroにおいても興味ある知見を得た.すなわち,ノックアウトマウスの骨髄由来肥満細胞を用意し,培養液中にヒスタミンを加え,その吸収を観察すると,ヒスタミンは分泌顆粒内までとりこまれ,IgEを介する刺激で再び分泌することが判明した.私たちは,ヒスタミンの合成酵素であるヒスチジン脱炭酸酵素(HDC)遺伝子をノックアウトしたマウスを作製して,ヒスタミンの生体内における機能を評価した.この遺伝子はヒスタミンの合成能のある細胞,すなわち肥満細胞,好塩基球,神経細胞,胃壁細胞などで発現しており,その機能はアレルギー疾患,睡眠,胃液の分泌に重要な働きをしていることが判明した.また,今まで未知であった,感染,慢性肉芽種などにも影響をあたえることを明らかにした.すなわち,具体的には全身性アナフィラキシー反応においては,体温,呼吸パターンにヒスタミンは重要であるものの,血圧のコントロールにおける寄与は少なく,また,活動時に睡眠の脳波が占める割合が非常に多かった.更に,ガストリンによる胃酸の分泌において,ヒスタミンは必須な物質であった.腹腔内における大腸菌の感染モデルでは,ヒスタミンを抑制することによって,感染からの回復が早いことが判明した.また,ヒスタミンは慢性肉芽種の形成に重要であり,ヒスタミンがないと慢性肉芽種が形成されないことがあきらかになった.このように,ノックアウトマウスを使って生体内におこる反応を観察するとともに,in vitroにおいても興味ある知見を得た.すなわち,ノックアウトマウスの骨髄由来肥満細胞を用意し,培養液中にヒスタミンを加え,その吸収を観察すると,ヒスタミンは分泌顆粒内までとりこまれ,IgEを介する刺激で再び分泌することが判明した.当教室の大津らが作成したヒスタミンの合成酵素であるヒスチジン脱炭酸酵素(HDC)遺伝子ノックアウト(KO)マウスの表現系を評価した。皮膚のアレルギー反応について、特に、血管透過性亢進反応を調べた。WT-、KO-マウスでヒスタミンに対する反応は見られたが、肥満細胞からのヒスタミンを遊離させる化合物48/80の反応は、KOマウスではみられなかった。胃酸分泌においては、ヒスタミンに対する反応はKOマウスで野生型(WT)マウスで増強しており、カルバコールに対する反応にはWTとKOで違いがなく、ガストリンに対する反応はKOマウスでみられなかった。[^3H]チオチジン結合量もKOマウスで増加していた。即ち、ヒスタミン欠損によりH2受容体のアップレギュレーションがおこっていた。また、ガストリンの反応は、ヒスタミンを介することが判明した。KOマウスでは、自発運動の概日リズムが減少し、昼間でもよく動いた。脳波測定でもリズムの乱れが確認された。新規知見として、KOマウスでは腹腔内へ投与された大腸菌の排泄がWTより促進していた。KOマウスにおいては皮膚の一部を切開して作成した創傷の治癒がWTより遅延していた。KOおよびWTマウスの骨髄細胞から調製した骨髄由来肥満細胞の遺伝子発現をSAGE(Serial Analysis of Gene Expression)法を用いて検討したところ両者間で差があった。私たちは,ヒスタミンの合成酵素であるヒスチジン脱炭酸酵素(HDC)遺伝子のノックアウト(KO)・マウスおよびHDC高発現マウスを作製し,その解析を行った.以下得られた成果につき説明する.a)感染防御:ノックアウトマウスが感染に強いことが判明し,その機構として大腸菌の排除機構がノックアウトマウスで活性化されており,それは,食細胞の遊走能が高まっているためであると考えられた(J Immunol 2002).b)呼吸循環:マウスを卵白アルブミンで感作後,吸入にてアレルギー反応を誘発する.その結果起きてくる好酸球増多は,ヒスタミンが無いと起きてこないことが判明した(Am J Respir Crit Care Med 2003).c)アレルギー:皮膚における木綿糸に対する肉芽腫はヒスタミンが無いと形成できない.その反応にはVEGFを介する血管新生が重要であることが判明した(J Exp Med 2002).e)ヒスタミントランスポーター:ノックアウトマウスの肥満細胞を使い,ヒスタミンの顆粒内までの輸送について明らかにした(Eur J Immunol 2002).,ヒスタミンの高産生マウスを作製して,皮膚の創傷治癒過程について反応を観察した.
質量分析における新たなイオン化法の開発・研究

まず、染料およびニトロソ化ペプチドの分析を行った。Electrospray Droplet Impact法を用いることにより、質量分析では検出が難しい、ニトロソ化ペプチドが検出可能となったことが特筆すべき点である。また、合成高分子の分析への応用研究も行った。分子量5000以下の合成高分子であれば、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法と同様の結果が得られた。そしてマトリックス支援レーザー脱離イオン化法では分析の難しい、分子量1000以下の合成高分子も容易に分析可能であった。さらに、Electrospray Droplet Impact法の定量分析への応用として、薬物をモデル試料として定量性の確認を行い、4桁の範囲において定量が可能であることが認められた。これにより、Electrospray Droplet Impact法による定量分析が可能であることがわかった。これらに加え、Electrospray Droplet Impact法によるマウス脳の直接分析を行った。Electrospray Droplet Impact法を用いることにより、従来のマトリックス支援レーザー脱離イオン化法に比べ簡便に脳組織の測定が行え、イメージング質量分析への応用が期待される方法であることがわかった。本年度は主に顔料の質量分析、探針エレクトロスプレー法について研究、帯電水滴衝撃法の基礎および応用研究を行った。顔料の質量分析:顔料は、質量分析による正確な分析が困難であったが、負イオンモードのマトリックス支援レーザー脱離イオン化法により、正確な分析が可能となることを発見し、論文発表を行った。探針エレクトロスプレー法:探針エレクトロスプレー法のイメージング質量分析への応用として、生体組織の直接分析を試みた。探針エレクトロスプレー法では生体組織を前処理することなしに、分析することが可能であり、生体組織の情報を反映した結果が得られた。また、探針エレクトロスプレー法の基礎研究として、レーザーを用いて針からのスプレーの様子を撮影し、メカニズムの解明に向けた研究を行った。帯電水滴衝撃法の基礎および応用研究:基礎研究として、帯電水滴衝撃法によるイオン生成メカニズムについて、衝撃を行う水滴の持つエネルギーの観点から考察を行った。応用研究として、染料およびニトロソ化ペプチドの分析を行った。質量分析では検出が難しい、ニトロソ化ペプチドが検出可能となったことが特筆すべき点である。さらに、帯電水滴衝撃法の定量分析への応用として、薬物をモデル試料として定量性の確認を行い、4桁の範囲において定量が可能であることが認められた。これにより、帯電水滴衝撃法による定量分析が可能であることがわかった。
巨大惑星内部における液体水素の分子解離・金属化プロセスの解明

本研究では、液体の構造の圧力変化、とくに分子性液体の分子解離現象を高温高圧下X線回折法により観察することを目的として、外熱式ダイヤモンドアンビル装置の開発を行った。昨年度は、主に高温発生のための小型ヒーターの設計・製作、加熱試験を行った。本年度は、高圧発生のための装置開発を行った。外熱式ダイヤモンドアンビル装置は、1300K程度の高温で超高圧を発生させるため、その部品は高温で高強度でなければならない。室温での実験では、荷重を支えるための部品の材料としてタングステンカーバイド(超硬合金)を使用するのが一般的であるが、この材料は高温で化学的に不安的であり超高圧の発生に耐えることは困難であると考えられる。そこで、我々はタングステンカーバイドに代わる新素材として、ホウ化モリブデン系のサーメット材について試験を行った。この素材は、室温ではタングステンカーバイドの約半分の強度であるが、1000K以上の高温までその強度が低下しない。また、熱伝導率がタングステンカーバイドの約1/4であり、加熱ヒーターからの熱を装置外部に逃がさないこと、耐熱衝撃性に優れるため、装置内部に温度勾配があっても破壊が起りにくいこと等の利点がある。試験の成績は非常に優秀で、0.1MPa・1100K、17GPa・900K程度の条件まで正常に機能することが確認された。今後、より高い温度圧力条件の発生試験を行う予定である。50GPa・1300K程度の発生を可能にした後、本研究の目的である分子性液体の構造の圧力変化を明らかにしたい。本年度は、当初の計画通り、高温高圧条件下における液体試料のX線構造解析用に新装置を試作し、性能評価を行った。本研究では、超高圧実験に広く用いられるダイヤモンドアンビル装置の試料部近傍に小型ヒーターを設置して高温発生を行う外熱式ダイヤモンドアンビル装置を設計・製作した。試行錯誤の結果、以下に示す方法で1300K程度の高温発生が確認された。数値制御加工機を用いて成形した高熱伝導率の快削性セラミックス(主成分は窒化アルミニウム)にモリブデン線を巻き通電することでジュール熱を発生させた。周囲は低熱伝導率のランタンクロマイトで覆った。ダイヤモンドアンビルの受台には低熱伝導率・高靭性・高強度のジルコニアセラミックスを用いた。装置内は、アルゴン(水素2%)ガス雰囲気に保ち、ダイヤモンドやモリブデン線などの劣化を抑えた。本研究では、X線回折法を用いて標準試料の熱膨張を測定することで温度を求めた。こうして求めた温度は、従来の熱電対を用いた方法で測定した温度に比べて著しく低いことが分かった。この不一致は、熱電対での測定が装置内の温度分布の影響を強く受け不正確であることに起因すると推測される。X線を用いた測定での1300Kに到達することは極めて困難であったため、これまでの実験は3万気圧程度に留まっている。ようやく高温発生の目処が立ったので、今後は圧力領域の拡大を図る予定である。50万気圧・1300K程度の安定発生を可能にした後、本研究の目的である分子性液体の構造の圧力変化を明らかにしたい。
肺癌の進展における血管新生の関与とその生物学的修飾に関する研究

肺癌患者を対象とした検討において、血管新生の促進や抑制に関与する因子と、その発現に関する制御機構を特にTh2細胞由来サイトカインの面から解析した結果、以下のような結果を得た。1、癌性胸膜炎を対象とした癌局所におけるTh1/Th2バランス、血管新生促進因子、抑制因子の動態の解析。肺癌に合併した癌性胸膜炎において、Th2細胞由来サイトカインであるインターロイキン-10(IL-10)が存在することを既に報告したが、更に血管新生促進因子に関する検討を行い、vascular endothelial growthfactor(VEGF)レベルが肺癌に合併した癌性胸膜炎において、良性浸出性胸水、漏出性胸水より有意に高いこと、また遠隔転移のある肺癌症例でより高値を示す傾向を示すことを明らかにした。さらにinterferon-γを用いた胸腔内治療において、胸水中のVEGFが治療有効症例においてのみ低下することを見い出した。2、肺胞マクロファージを用いた肺癌患者におけるTh2サイトカイン産生動態の検討。肺癌患者の肺胞マクロファージを用いた検討で、IL-10の産生能は健常人のそれとほぼ同等であること、しかも肺癌の種々の組織型、遠隔転移を有さない例(StageI-IIIB)と遠隔転移の存在する例(StageIV)でIL-10の産生能に差はないことを示し、肺癌患者に見られるTh1/Th2バランスの偏位は単にマクロファージのサイトカイン産生異常のみに起因するのではない可能性を示した。今後、肺癌患者に見られる血管新生促進因子と抑制因子の動態をTh1/Th2バランスとの関係を介してさらに解析し、特に臨床的に癌性胸膜炎を対象とした治療において見られる動態の詳細な検討を行う予定である。本研究の目的は肺癌患者を対象とし、担癌状態において血管新生の促進や抑制に関与する因子を解析し、その制御機構を特にTh2細胞由来サイト力インの面から明らかにすることであり、今回得られた成果は以下のように要約される。肺癌に合併した癌性胸膜炎において、Th2細胞由来サイトカインであるインターロイキン-10(IL-10)が存在し、マクロファージ機能などの細胞性免疫反応を抑制する可能性を示した。血管新生促進因子に関する検討ではvascular endothelial growthfactor(VEGF)レベルが肺癌に合併した癌性胸膜炎において、良性浸出性胸水、漏出性胸水より有意に高いことを確認した。さらにVEGFは遠隔転移のある肺癌症例でより高値を示す傾向を認めた。2、Th1/Th2バランスの偏位からみた肺癌治療法の検討。IL-15を用いた検討で、肺癌患者末梢血単核細胞(MNC)はIL-15刺激にて健常人のそれとほぼ同等のキラー活性を発現し、しかも遠隔転移を有さない例(StageI-IIIB)と遠隔転移の存在する例(StageIV)で末梢血MNCのIL-15誘導キラー活性に差はなかった。さらに、TIh2由来サイトカイン(IL-5,IL-10)の産生誘導能はIL-2よりIL-15が低く、Th1/Th2バランスの偏位におよぼす影響がより低いことから、臨床応用を考える上でIL-15はより有利である可能性を示した。。今後、肺癌患者に見られる血管新生促進因子と抑制因子の動態をTh1/Th2バランスとの関係を介してさらに詳細に解析する予定である。
ダイアンソウイルスの遺伝子発現制御と複製機構の解明

申請者はダイアンソウイルス属レッドクローバーネクロティックモザイクウイルス(RCNMV)が持つ特殊な翻訳機構と遺伝子発現制御メカニズムを研究することにより、植物RNAウイルスの時空間的遺伝子発現制御機構の解明を目的としている。本年度は2つの研究で大きな成果が得られた。1)RCNMV RNA1には存在しないRNA2が独自に持つ、ウイルス複製酵素タンパク質認識RNA因子の同定ウイルス複製酵素は大量に存在する宿主のRNAの中からウイルスRNAを特異的に認識しなければならないが、その機構は未だにほとんど分かっていない。複製酵素によるRCMNVのゲノムRNA認識機構を解析するため、ストレプトマイシンに結合するアプタマー配列(ストレプトタグ)を付加したゲノムRNAの様々な断片を、植物無細胞系内で発現されたウイルス複製酵素と混和し、ストレプトマイシン結合カラムで精製した。その結果、複製酵素はRNA2の3'UTRに存在するY字型構造に特異的に結合することが分かった。一方RNA1は、複製酵素を翻訳したRNAのみが複製酵素と相互作用することが明らかとなった。現在研究をまとめ国際誌への投稿準備中である。2)RCNWVのゲノムRNAに結合する宿主タンパク質の同定、及び機能解析ウイルスは様々な宿主タンパク質を利用して効率よく遺伝子発現およびRNA複製を成し遂げる。RCNMVのゲノムRNAに結合し、翻訳または複製に関わる宿主因子を同定するため、ストレプトタグを融合したウイルスRNA断片を植物抽出液と混和しRNA結合タンパク質を精製した。その結果、ゲノムRNAに結合する9種の宿主タンパク質を同定することに成功した。その中の一つ、ポリ(A)結合タンパク質はRNA1 3'UTRのアデニンが豊富な領域に結合しRNA1の翻訳を促進することが明らかとなった。平成19年度の成果は以下の4つである。(1)これまで研究を続けていた「RCNMV RNA1における翻訳及び複製に必要なRNA因子の解析」をまとめ、雑誌Virologyに投稿したこと。(2)試験管内ウイルス複製系を用いることによって、RCNMV RNA1は自らが作り出した複製酵素成分しか複製に用いることが出来ないことを証明したこと。(3)RCNMV RNA1から生成される低分子量RNAは、RNA1上に存在するRNA因子がRNA分解酵素から3 ́末端側の配列を守ることによってできた分解中間体であり、試験管内及び生体内においてRCNMV RNA1の翻訳と宿主mRNAの翻訳を抑制する機能があることを明らかとしたこと(4)ストレプトタグアフィニティー精製法を用いて、RNA1の3 ́UTR及び3'TE-DR1に変異を持つ3 ́UTRに結合する宿主タンパク質を精製し、電気泳動後、銀染色すると宿主因子と思われる幾つかの特異的なバンドを検出できたこと。以上の結果はダイアンソウイルスの複製機構解明につながり、これまで知られていなかった低分子RNAによるウイルス遺伝子発現制御機構の存在を示唆するものである。ダイアンソウイルス属のRed clover necrotic mosaic virus(RCNMV)を1本鎖プラスセンスRNAのモデルウイルスとして用い,ウイルスタンパク質翻訳,RNA複製の制御に関わるいくつかの新たな機構を明らかにするとともに、これらの機構に関わる可能性のある数種の候補宿主タンパク質を同定した.(1)感染後期に細胞内に蓄積するRCNMV RNA1の3'非翻訳領域(UTR)に由来する約450塩基の低分子量RNA(SR1f)がin vitroで濃度依存的にcap依存的翻訳とcap非依存的翻訳をいずれも抑制すること,また,SR1fは,サブゲノムRNAではなく,RNA1 3'UTRの5'側近傍に存在するRNA因子が5'→3',エクソリボヌクレアーゼ分解から3'側RMAを守ることにより蓄積する分解中間体であることを示した.SR1fは,感染後期でのウイルスの翻訳を抑制し,複製段階へとスムーズに移行させるリボレギュレイターである可能性を示唆した.(2)ストレプトタグ融合ウイルスRNA断片を用い、in vitroウイルス翻訳・複製系からアフィニティー精製し、質量分析によりRCNMV RNAに特異的に結合する約10種のタンパク質を同定した。その内の3つは、RNA1の5'UTRに結合するAC rich binding factor(ACBF)とThreonyl-tRNA synthetase(ThrRS),RNA1の3'UTRに結合するPoly(A)-binding protein(PABP)である。これら3種の遺伝子の完全長cDNAをタバコBY-2細胞より単離し、これらタンパク質の過剰発現のRCNMV3'TE-DR1介在キャップ非依存的翻訳に及ぼす影響をin vitroウイルス翻訳系で調べた。いずれのタンパク質も3'TE-DR1依存キャップ非依存的翻訳を促進したことから、これらのタンパク質は宿主因子の候補である可能性が示唆された.申請者はダイアンソウイルス属レッドクローバーネクロティックモザイクウイルス(RCNMV)が持つ特殊な翻訳機構と遺伝子発現制御メカニズムを研究することにより、植物RNAウイルスの時空間的遺伝子発現制御機構の解明を目的としている。

複製酵素によるRCMNVのゲノムRNA認識機構を解析するため、ストレプトマイシンに結合するアプタマー配列(ストレプトタグ)を付加したゲノムRNAの様々な断片を、植物無細胞系内で発現されたウイルス複製酵素と混和し、ストレプトマイシン結合カラムで精製した。その結果、複製酵素はRNA2の3'UTRに存在するY字型構造に特異的に結合することが分かった。一方RNA1は、複製酵素を翻訳したRNAのみが複製酵素と相互作用することが明らかとなった。現在研究をまとめ国際誌への投稿準備中である。2)RCNWVのゲノムRNAに結合する宿主タンパク質の同定、及び機能解析ウイルスは様々な宿主タンパク質を利用して効率よく遺伝子発現およびRNA複製を成し遂げる。RCNMVのゲノムRNAに結合し、翻訳または複製に関わる宿主因子を同定するため、ストレプトタグを融合したウイルスRNA断片を植物抽出液と混和しRNA結合タンパク質を精製した。その結果、ゲノムRNAに結合する9種の宿主タンパク質を同定することに成功した。その中の一つ、ポリ(A)結合タンパク質はRNA1 3'UTRのアデニンが豊富な領域に結合しRNA1の翻訳を促進することが明らかとなった。