hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
白色腐朽菌によるリグニン分解機構の解明 -電子スピン共鳴法による研究-

C.subvermisporaによる選択的リグニン分解には有機ヒドロペルオキシドを介するラジカル反応が関与しているが、その過程で生成するペルオキシルラジカル(PR)、アルコキシルラジカル(AR)、カーボンセンターラジカル(CR)の何れが分解に関与しているのかは明らかでない。昨年度までの研究により、CR、ARはLMC分解能を有する一方、PRはLMCを分解できないことが明らかになった。そこで、各種ラジカルとLMCとの反応に関するさらなる知見を得るために、少量の溶液で高速フローESR測定をおこなうことのできるdielectric mixing resonator (Bruker, ER4117D-MVT)を用いて、ラジカルとの反応直後に生成するLMC由来ラジカルを直接測定することを試みた。本実験では、LMCがどのようなラジカル種によって分解されうるのか、また、ラジカル種によるLMC攻撃部位が何処なのかを直接かつ同時に明らかにすることができる。本実験では、以下に示す反応でラジカルを発生させ、それぞれのLMCとの反応性を調べた。また、LMCとしては水溶性に優れ、安価で大量使用の出来るベラトリルアルコール(VA)を用いた。HO^・とVAとの反応で生成したラジカルのESRスペクトルは、Ce^<4+>による一電子引き抜きで生成したVA、^<・+>のものとは明らかに異なっていた。このラジカルは、VAのパラ位にHO^・が付加して生成したラジカルであると推測される。一方、t-BuOO^・およびHOO^・とVAとの反応は観察されなかった。t-BuO^・はVAと反応していることが推測されたが、生成するVA由来ラジカルを直接測定することはできなかった。本実験の結果は、ARはLMCと反応するがPRは反応しないという昨年までに得られた実験結果と矛盾しない。今後はVAよりも複雑なLMCを用いて同様の実験をおこない、ラジカル反応によるLMC分解の機構をESR測定によって明らかにしていきたいと考えている。実験1実験2C.subvermisporaによる選択的リグニン分解には有機ヒドロペルオキシドを介するラジカル反応が関与しているが、その過程でペルオキシラジカル(PR)、カーボンセンターラジカル(CR)の何れが分解に関与しているかは明らかでない。そこで、N_2通気系ではCRを、O_2通気系ではPRを生成するアゾ化合物を用いて非フェノール性リグニンモデル化合物(LMC)分解実験をおこなった。その結果、CR、PR発生系両方においてLMC分解が観察された。つまり、CRにはLMC分解能が有ることが分かった。一方、PR系においては、PR自体がLMCを分解したのか、PRの前駆物質であるCRがLMCを分解したのかは不明である。昨年度の報告では、窒素通気条件ではCRを、酸素通気条件ではPRを生成するアゾ化合物の熱分解系を用いて非フェノール性リグニンモデル化合物(LMC)分解実験をおこなった。その結果、CRはLMC分解能を有することが明らかになったものの、PR系においては、PR自体がLMCを分解したのか、PRの前駆物質であるCRがLMCを分解したのかは不明であった。そこで本年度は、PRのみを選択的に生成させることのできる4価セリウムイオンとターシャルブチルヒドロペルオキシド(TBHP)との反応を用いてLMC分解実験をおこなった。その結果、現在までにおこなった全ての条件においてPRによるLMC分解は確認できなかった。また、LMC分解実験に用いることのできるAR生成系として、四塩化炭素中における銅イオンとTBHPの反応を考案した。この系においては、反応初期にPRとARが生成するが、先の実験でPRによるLMC分解は起こらなかったので、PRの影響は無視できる。また、四塩化炭素を溶媒として用いることで、ARのベータ解裂によるCRの生成についても無視できる。本実験の結果、CRと同様にARもLMC分解能を有していることが明らかになった。今後は、詳細なLMC分解機構および、CRおよびARによるLMC攻撃部位を電子スピン共鳴法により明らかにする。

HO^・とVAとの反応で生成したラジカルのESRスペクトルは、Ce^<4+>による一電子引き抜きで生成したVA、^<・+>のものとは明らかに異なっていた。このラジカルは、VAのパラ位にHO^・が付加して生成したラジカルであると推測される。一方、t-BuOO^・およびHOO^・とVAとの反応は観察されなかった。t-BuO^・はVAと反応していることが推測されたが、生成するVA由来ラジカルを直接測定することはできなかった。本実験の結果は、ARはLMCと反応するがPRは反応しないという昨年までに得られた実験結果と矛盾しない。今後はVAよりも複雑なLMCを用いて同様の実験をおこない、ラジカル反応によるLMC分解の機構をESR測定によって明らかにしていきたいと考えている。
高易動度2次元電子系におけるバリスティック電子の散乱機構

GaAs/AlGaAs半導体ヘテロ界面の高易動度2次元電子系をメゾスコピックなサイズに微細加工した系で見られるバリスティック伝導とその散乱長を決める様々な散乱の詳細ついて研究した。2次元電子系に平行な向きの強磁場(10T程度)の下での磁気電子フォーカス効果を測定し、フォーカス効果のピーク値の端子距離依存性からバリスティック散乱長を調べた。平行磁場により2次元電子系の厚み方向のローレンツ力が加わるため、ヘテロ界面に閉じ込められた電子の厚み方向の分布が変調される。通常、ヘテロ界面から10nm程度に分布している電子分布を、平行磁場により界面に「押しつける」とき、バリステッィク散乱長は平行磁場の無いときより小さくなり、平行磁場10Tで約15%減少した。また、逆向きの平行磁場下では電子が界面から遠ざかる向きの力を受け、バリスティック散乱長は増大した。大まかに見積もった電子の波動関数の重心位置の変化は非常にわずかであるため、この平行磁場による散乱長の変化は、界面付近の散乱原因であるラフネス散乱や合金散乱の寄与が変化したためと考えられる。さらに、様々な易動度のウエハを使って試料を作製し、バリスティック散乱長に与える平行磁場の影響を調べたところ、元の易動度の高い試料ほど平行磁場の影響が顕著であった。極低温でのHEMT構造の2次元電子系の易動度を決めているのは、もっぱらイオン化ドナーによる不純物散乱であるが、平行磁場により通常表に出にくい界面付近の散乱が増減しているものと考えられる。このほか、平行磁場によるフェルミ面の異方性の研究や、正の磁気抵抗の起源について現在詳しく調べている。
アルケニルホスホナートを基盤とする不斉合成反応開発と有用生理活性物質創生への展開

生体内リン酸化化合物はエネルギー貯蔵や細胞内シグナル伝達に関与し、生命維持において、極めて基本的で重要な働きを担っている。ホスホナート誘導体は、これらリン酸誘導体のアナログとして、また、カルボン酸や、エステル加水分解中間体のアナログとして、生体反応の拮抗薬や作動薬として機能するため、そのいくつかは、既に医薬品として、利用されている。一方、有機合成化学の見地からホスホナート誘導体は、オレフィン形成反応として汎用されるHorner-wadsworth-Emmons(HWE)反応の基質として、また、遷移金属触媒反応で用いられる、ホスフィン配位子の合成中間体などとして有用である。このように、ホスホナートを基盤とする研究開発には、有機合成化学と生物化学の両面での、または、この二者が融合した形での展開が期待できる。本研究で私は、今までに蓄積したボスホナートを基盤とする有機合成技術を展開し、有用生理活性化合物の創製に結びつけることを目的としている。本研究では免疫抑制剤のリン酸化活性体の開発に重点を置き研究を行った。免疫抑制剤FTY-720は生体内でその水酸基がリン酸化されたのち、スフィンゴシン1リン酸受容体に結合することにより、その活性を発現することが知られている。したがって、リン酸化FTY-720はその非リン酸化体に比べて、活性・選択性の向上が期待される。しかしながら、リン酸化FTY-720はそのまま投与すると、生体内で脱リン酸化を受けてしまうと考えられる。そこで本研究では安定活性体として、環状リン酸化FTY-720アナログを設計し合成した。本化合物はモノリン酸化体に比べて加水分解を受けにくいのみならず、不斉点が存在しないため、医薬品の候補化合物として有利である。さらに、ボスホン酸誘導体の合成に成功した。現在、これらの新規リン酸化FTY-720の免疫抑制活性について評価を行っている。一方、有機合成化学の検知からホスホナート誘導体は、オレフィン形成反応として汎用されるHorner-Wadsworth-Emmons(HWE)反応の基質として、また、遷移金属触媒反応で用いられる、ホスフィン配位子の合成中間体などとして有用である。本研究で私は、今までに蓄積せたホスホナートを基盤とする有機合成技術をさらに展開し、有用生理活性化合物の創製に結びつけることを目的としている。ホスホナート類はヒストン脱アセチル化酵素(HDAC)の活性ポケットに加水分解中間体アナログとしてはまりこみ、阻害活性を有すると考えた。実際にホスホン酸誘導体は加水分解性抗体触媒のハプテンとして利用されており、HDACのような加水分解酵素に対しても強い結合性を有することが期待された。そこで、当研究室ですでに開発されているHDAC阻害活剤K-24の酵素結合部位を種々のホスホン酸誘導体に置換した化合物を合成し、活性を測定した。その結果、HDAC阻害活性を有するホスホン酸誘導体を得ることに成功した。

ホスホナート誘導体は、これらリン酸誘導体のアナログとして、また、カルボン酸や、エステル加水分解中間体のアナログとして、生体反応の拮抗薬や作動薬として機能するため、そのいくつかは、既に医薬品として、利用されている。一方、有機合成化学の検知からホスホナート誘導体は、オレフィン形成反応として汎用されるHorner-Wadsworth-Emmons(HWE)反応の基質として、また、遷移金属触媒反応で用いられる、ホスフィン配位子の合成中間体などとして有用である。このように、ホスホナートを基盤とする研究開発には、有機合成化学と生物化学の両面での、または、この二者が融合した形での展開が期待できる。本研究で私は、今までに蓄積したホスホナートを基盤とする有機合成技術をさらに展開し、有用生理活性化合物の創製に結びつけることを目的としている。近年、藤多らにより、免疫抑制剤FTY-720が開発され、臨床試験の最終段階を迎えている。FTY-720はアミノアルコール構造を有し、その活性発現において、アルコールの一つが、スフィンゴシンモノリン酸化酵素により、リン酸化され、これが、活性本体となり、リンパ球のリンパ節へのホーミング作用による免疫抑制活性を発現することが知られている。したがって、活性本体であるリン酸化FTY-720がより活性が強く、選択性が高い免疫抑制剤となることが期待される。しかしながら一般に、リン酸エステルは生体内のホスファターゼにより容易に加水分解を受け、脱リン酸化してしまうと予測される。そこで、我々は、安定なリン酸化FTY-720等価体の合成に着手した。本年度は種々の環状リン酸化誘導体を合成した。生体内リン酸化化合物はエネルギー貯蔵や細胞内シグナル伝達に関与し、生命維持において、極めて基本的で重要な働きを担っている。一方、有機合成化学の見地からホスホナート誘導体は、オレフィン形成反応として汎用されるHorner-Wadsworth-Emmons(HWE)反応の基質として、また、遷移金属触媒反応で用いられる、ホスフィン配位子の合成中間体などとして有用である。本研究で私は、今までに蓄積したホスホナートを基盤とする有機合成技術を展開し、有用生理活性化合物の創製に結びつけることを目的としている。今年度は免疫抑制剤のリン酸化活性体の開発に重点を置き研究を行った。免疫抑制剤FTY-720は生体内でその水酸基がリン酸化されたのち、スフィンゴシン1リン酸受容体に結合することにより、その活性を発現することが知られている。したがって、リン酸化FTY-720はその非リン酸化体に比べて、活性・選択性の向上が期待される。
昆虫複眼の構造と機能-特に時空間的活動パターンとの関連

昆虫の行動と視覚機能との関係について、まず多様な時間的行動パターンを示す鱗翅類について電気生理学的に刺激強度一反応曲線(V-log【I】曲線)を記録し、またそれらの複眼の微細構造特にラブドームの網膜内での占有率を調べ、両者の相関関係を46種類について行った。その結果V-log【I】曲線の直線部分の勾配は夜行性ではゆるやかであるのに対して、昼行性の蝶などでは急になっており、またラブドームの占有率と関係づけると勾配が急なものはその占有率が小さく、ゆるやかなものは大きいという興味深い相関関係がみつかった。このことは彼等の活動時間での光環境の下での差闘と深い関係があることを示したことになる。セセリ蝶がいずれの場合も夜行性と昼行性の中間的値を示したのは彼等の行動や系統進化と密接な関係があるものと思われる。複眼には色覚が存在するのは一般的であり、多くは三四原色によって構成されていると報告されている。しかし今回、アゲハについて電気生理学的方法(細胞内記録法)による分析を行った所、五種類の色受容細胞が存在することが分った。即ち、紫外部,紫,青,緑,赤の各種である。またそれらの各細胞は複眼の各部域により異なりそれは行動と深い関係にあることが分った。またこのような色受容細胞の感度は概日リズムにより各々違いがあることがフナムシを使った実験で明らかになった。即ちフナムシには紫外線と緑の二つの色受容細胞があるが昼間は紫外線に対する感度が高いが、夜間になると緑の細胞の感度が高くなるという現象を見つけた。動物の視物質の発色団はレチナールが大部分で、従来は淡水の魚類両生類にだけ3デヒドロレチナールが見つけられていたが、今回我々は無脊椎動物では始めてこの発色団を見つけ、それが温度によりレチナールと入れかわることを見い出した。
バイアスを除いた検査値の自動抽出手法の確立と臨床疫学研究への応用

本研究では、電子カルテに蓄積された臨床検査値に対し、データの欠損を医師の推論に関する情報として捉えることで、新たな活用方法を見出すことを目的とする。具体的には、臨床検査の実施間隔に着目し、バイアスを除いた検査値を自動抽出する手法を構築、欠損値の対処や病態抽出への応用に展開するための基盤となる研究を行う。大まかな研究項目として、1)臨床検査値の頻度分布推定における新たな手法の構築2)実臨床データに対する本手法の適用ならびに有効性の評価3)欠損値代入および病態抽出における数値シミュレーションによる有効性の評価、の3つを実施する。
家族/非家族境界と生―政治-新しい「生の基盤」を巡って

最終年度にあたる平成21年度の研究成果は、以下の通りである。本研究の第一の目的は、生活の物理的基盤としての居住を中心として、家族ではない他人との共同居住(非家族居住)の事例を検討していくという経験的なものであった。この点につき、日本でも若者を中心に実践されつつある「シェアハウジング」と呼ばれる非家族居住についてのフィールドワークを行い、単著『他人と暮らす若者たち』として刊行した。また、とりわけ家計経済学とコモンズ論の観点から非家族居住を考察した。このような非家族との居住実践のデータを元に、現在の家族社会学における「家族の多様化」論を批判的に検討したものが「『家族の多様化』論再考-家族概念の分節化を通じて」である。その結果、家族概念を単に押し広げるだけでは、近代家族以外の多様な生活形態を分析から除外してしまい、結局は従来の家族さえも十分に考察できないことを明らかにした。本研究の第二の目的は、「生-政治」の戦略拠点としての近代家族とは異なる、新たな「生の基盤」の可能性を検討するという理論的なものであった。この点につき、個人単位で無条件一律に現金給付を行うというベーシック・インカムの議論を手がかりに、政策単位は家族か/個人かという従来の議論を批判的に検討した。その結果、最低限の生活水準を確定するためには、従来はもっぱら家族が担ってきたケアのコストと、生活の共同による規模の経済を考慮する必要があり、これらの検討なしに個人単位の福祉を議論できないことを明らかにした。以上のような議論は、雇用によっても家族によっても生活を支えることが困難になったと考えられる現代において重要な意義を持っている。また、定額給付金や子ども手当てをはじめとする個人単位給付が導入されつつある現在、その効果と是非をめぐる議論に重要な示唆を与えることになる。初年度にあたる20年度の研究成果は、以下の通りである。第一に、新たな「生の基盤」を考える前提として、これまで社会の基本単位として再生産機能を果たしてきた家族を、生-政治の観点から理論的に検討した。また、80年代からの日本の家族社会学において主流である「家族の多様化」という概念把握を批判的に検討し、人々の生存・生活を家族生活と切り離して保障するための、家族概念の分節化を提唱した。これらの成果は、2009年4月に刊行される『家族社会学研究』21巻1号に掲載が決定している。第二に、家族と非家族の境界に関して、私的所有論、コモンズ論、公共圏・親密圏論、生-権力論から理論的な検討を行った。その中で、(1)居住の協働における共有概念の検討、(2)承認理論と家族/非家族、(3)家族居住における空間配置と生-権力、という三つの視点から、それぞれ論文を執筆している。(1)および(2)は次年度に雑誌論文として投稿され、(3)は共著として刊行される予定である。第三に、研究計画に従いオランダ・アムステルダムでのスクワッティング調査を実施した。具体的には、スクワット運動とアナーキズムに関する英語・オランダ語文献の収集と、実際に運動に携わる人々への聞き取り調査などを行った。その結果、居住運動を、(1)住居自体を求める運動、(2)居住の安定を求める運動、(3)居住の意味を変容させる運動として類型化するならば、居住の意味を変容させつつ((3))住居自体を求めていく((1))スクワット運動と、居住の安定性を求める((2))家族的関係は一種の緊張関係にたち、この緊張関係が運動を拡大する要因でもあることなどが明らかになった。これらの成果は、次年度の第二次フィールドワークの結果と併せて、雑誌論文として投稿する予定である。
新規機能性分子材料の粉末回折からの電子密度レベルでの精密構造決定

最終年度となる今年度は、成果の発表を重点的に行った。口頭発表については、幸いなことに、錯体化学討論会、日本セラミックス協会シンポジウム、フラーレン・ナノチューブ学会シンポジウムの3つの学会で招待講演、特別講演の依頼を受け、成果を発表した。これらの発表における反響は大きく、幾つかの共同研究を新規に進めることにつながった。論文発表については、この研究で開発された手法論に関する発表と、手法を適用した先端材料の構造研究の両面から進めた。特に、分子性物質のMEM解析を発展させタンパク質に適用する方法を開発した研究と遺伝的アルゴリズムによる、130原子からなる医薬品の構造決定の研究は、どちらも4誌程度の新聞にも掲載された。また、熱電変換材料CoSb2の結合形態の実験的観測、金属1次元鎖を構成する金属錯体の構造研究、さらにはHgをドープしたZn4Sb3の構造研究については、Physical Review B, Angew. Chem. Int. Ed.,Chem. Mater.など物理、化学、材料科学分野でインパクトファクターの高い一流雑誌に掲載された。本研究で開発を進めた実験室装置についても、90Kの低温から1000Kの高温まで測定可能なシステムに、自動試料交換が可能となり、構造研究が精力的に行える環境が整った。唯一、残念だった点は、本年度の夏以降、大学の改修工事に伴い、装置を停止しなければならなかったことである。3月に再び装置を起動することができたため、今後はこの装置とSPring-8を効率的な利用により、より多くの研究成果を上げていきたい。本年度は、「新規機能性分子材料の粉末回折からの電子密度レベルでの精密構造決定」のための実験室系超高分解能粉末回折装置を設計し、納入した。この装置の性能目標は、世界最高性能の放射光施設SPring-8を用いた実験で用いる試料の評価・実験条件の最適化を可能とすることである。この装置は、既存の回転対陰極型X線回折装置に組み合わせる、光学系と回折系からなる。光学系は、多層膜ミラーとチャンネルカットモノクロメータの組み合わせである。回折系は半径286.5mmのIPカメラを2θ軸に備えている。X線源はMoKα線のラインフォーカス光源であるため、Moラインフォーカス用の多層膜ミラーを新規に開発した。これは世界でも一号機である。波長の短いMo光源のため、チャンネルカット結晶を透過するX線のために2つのダイレクトビームが存在する問題も見られたが、治具作成などでこの問題を回避し、デーが測定できる状態となった。この装置を用いて、標準試料NIST CeO_2,LaB_6について粉末回折データを測定したところ、SPring-8で使用する直径0.1mm、長さ3mmのμgオーダーの粉末試料から、構造解析をするのに十分なデータが1時間程度で得られることが判明した。この性能は、ほぼ設計値どおりであった。更に分解能をしめす回折線幅もSPring-8の1.1倍程度であり、実験室粉末回折装置としては、強度・分解能の総合性能として世界的にみて最高の性能を持つことがわかった。そこで、SPring-8でしかデータを得ることが出来ない新規機能性分子材料、金属内包フラーレン、金属錯体、カーボンナノチューブについてデータ測定を行った。その結果、従来の汎用実験室X線装置では、試料が微量のためピークすら得られなかったこれらの物質についても回折データが得られることが判明した。現在、さらなる強度の向上を目指して、スリット系などの再設計を進めている。昨年度に納入された、「新規機能性分子材料の粉末回折からの電子密度レベルでの精密構造決定」のための実験室系超高分解能粉末回折装置の立ち上げ、及び高度化を進めた。また、装置を利用して当初の目的であった、放射光でしか測定できないμグラムオーダーの新規機能性分子材料の解説パターンの測定も行い、SPring-8での実験の効率化することに成功した。装置立ち上げについては、強度向上、S/N比の向上のため、スリット系を改良した。納入時に2箇所にあったスリットを3ケ所にした。また、幾何学的な検討から、各スリットサイズの最適を求め、全ての場所に設置するスリットを再設計した。これにより、強度が納入時の3倍以上となった。また、低角領域(回折角で10゚以下)の空気散乱が1/10に減少し、S/Nが飛躍的に高まった。これらによって、μグラムオーダーの試料から、110時間の現実的な時間でデータが測定できるようになった。装置の高度化として、90K1000Kの低温・高温実験が可能なシステムを設計し、納入した。現在温度変化のオンライン化等を進めている。装置を用いて、新規機能性分子材料の構造研究の効率も飛躍的に高まってきた。金属内包フラーレンについて、この装置を用いた、回折データ測定に基づく結晶化条件の最適化を行うことにより、SPring-8での実験効率が飛躍的に向上し、複数の金属内包フラーレンのこれまでにない高品質な解説データからの構造解明に成功した。この結果は2報の論文で発表した。装置のS/Nの向上により、放射光でしかほとんど測定できないカーボボンナノチューブの直径、吸着分子量などの評価が可能なこともわかってきた。ポリイン分子を内包したと考えられるチューブについて、その内包の有無を明らかにすることにも成功した。

口頭発表については、幸いなことに、錯体化学討論会、日本セラミックス協会シンポジウム、フラーレン・ナノチューブ学会シンポジウムの3つの学会で招待講演、特別講演の依頼を受け、成果を発表した。これらの発表における反響は大きく、幾つかの共同研究を新規に進めることにつながった。論文発表については、この研究で開発された手法論に関する発表と、手法を適用した先端材料の構造研究の両面から進めた。特に、分子性物質のMEM解析を発展させタンパク質に適用する方法を開発した研究と遺伝的アルゴリズムによる、130原子からなる医薬品の構造決定の研究は、どちらも4誌程度の新聞にも掲載された。また、熱電変換材料CoSb2の結合形態の実験的観測、金属1次元鎖を構成する金属錯体の構造研究、さらにはHgをドープしたZn4Sb3の構造研究については、Physical Review B, Angew. Chem. Int. Ed.,Chem. Mater.など物理、化学、材料科学分野でインパクトファクターの高い一流雑誌に掲載された。本研究で開発を進めた実験室装置についても、90Kの低温から1000Kの高温まで測定可能なシステムに、自動試料交換が可能となり、構造研究が精力的に行える環境が整った。唯一、残念だった点は、本年度の夏以降、大学の改修工事に伴い、装置を停止しなければならなかったことである。3月に再び装置を起動することができたため、今後はこの装置とSPring-8を効率的な利用により、より多くの研究成果を上げていきたい。
血管内皮障害のプロテオーム解析

メタボリック症候群の病態形成時には非常に多くの遺伝子産物が複雑に絡み合い相互作用している。よって本研究は、そのキー分子であるAktに着目し、メタボリック症候群の病態形成をAkt会合分子の変化という観点からプロテオミクスにて明らかにすることを目的とした。平成20年度はAkt-TAPおよびAkt-strep組換えアデノウイルスをラット血管内皮細胞に発現させ、高グルコース濃度、アンジオテンシンII受容体拮抗薬、長時間作用型Ca拮抗薬存在下で培養することで刺激に応じたAkt会合タンパクの変化を解析した。Akt-TAPについてはカルモジュリンビーズ、IgGビーズの二段階精製、Akt-strepについてはstrep-TactinにてAkt会合タンパク質をアフィニティー精製した。精製後に、SDS-PAG/銀染色を行い、会合分子のパターンの違いを比較した。さらに、バンドをゲル内トリプシン消化し、MALDI-TOF型質量分析計にて順次、同定した。複数の会合分子の変化を認めたが、変化するバンドほど量が少なく、同定に至らなかった。年度途中より安定同位体による標識とnanoLC/MS/MSを使用した同定を新たに始めたが、現段階では有効な結果は得られていない。以上、刺激に依存したAkt複合体の変化を分子レベルで同定することについては十分な結果を得ることができなかった。この理由としてAktの基質に対する結合が一過性であり、Akt複合体の維持が十分でなかった可能性が示唆される。それに対して、Aktキナーゼ活性欠失型変異体の作製や架橋剤の使用を検討したが解決には至らなかった。一方で、恒常的に結合している分子の同定には成功し、タンパク質相互作用から生理現象を説明するという本法はbait分子の選択によっては十分機能すると考察した。今後、baitを変更して本法によるネットワーク解析を継続する。メタボリック症候群は肥満、糖尿病、高脂血症、高血圧症などを同時に併せ持ち、血管内皮の調節能を傷害することで内皮機能の低下を来すと考えられている。これらの疾患の病態形成時には非常に多くの遺伝子産物が複雑の絡み合い相互作用をしていることが知られているが、中でもAktはそのキーとなる分子の一つである。よって本研究は、メタボリック症候群の病態形成とAkt遺伝子の多様な機能に注目し、Aktがどの病態時にどの蛋白質群と相互作用し、経時的にどの様に変化していくのかを明らかにすることである。平成19年度は実験系の確立と基礎データの取得、障害時のメカニズム解明を中心に行った。まずstrepタグ付きAkt遺伝子組み込みベクターを作製した。これをラット血管内皮細胞に発現させ、タグ付きAktに会合する蛋白群をstrep-Tactinにてアフィニティー精製した。精製後にMALDI-TOF型質量分析計を用いてPMF法、シークエンスタグ法を施行し、順次、結合分子を解析同定した。結合分子としてHsp70、Hsp90などのシャペロン分子や、酵素、actinやVimentinといった骨格系タンパクを多く同定した。しかし、シグナル分子の同定が少なかったことからさらに、精製条件を検討したが現段階では有効な解決法は得られていない。また、血管内皮傷害モデルの作成として伸展負荷培養を行った。その結果、経時的なAktのリン酸化、細胞の形態変化を認めた。Aktは物理的刺激、pH環境、グルコース負荷等、様々な刺激下で活性化され、内皮機能の根幹に関わる分子であることが示唆された。
無証拠性・耐強制性・否認可能性を保証するプライバシ保護が可能な認証プロトコル

研究代表者らは,従前,オンラインでの生体認証プロトコルにおいて,プライバシに関連する2つの性質を定義した。実行中に認証に関する証拠を取得できない性質(無証拠性)及び,外部の強制者に対してユーザが証拠を提示ができない性質(耐強制性)である。本来この議論は生体認証に限定されないと考えられるので,本研究では,インターネットを介した認証プロトコル一般の議論に拡張することとした。無証拠性・耐強制性・否認可能性(自身が認証を要求した事実を否認できる性質)のアプローチに基づいて,プライバシに関する厳密な定義や評価手法を確立するとともに,評価の高くなる認証プロトコルを理論的に明らかにし,そのプロトタイプ実装を開発することを目的に研究を開始した。平成30年度は,無証拠性・耐強制性・否認可能性の定義の精密化を検討し,主に否認可能性に関連する成果が2つ得られた。1つめは,サービスに登録された利用者を廃止することができて,なおかつ否認可能性をもつ認証プロトコルを提案したことである。これは属性(所属など)を利用して,個人のプライバシ性を担保することができる暗号化法を用いて,秘密情報を知っていることを対話的に示す認証を行うものである。2つめは,否認可能性を担保した秘密ハンドシェークプロトコルにおける問題の指摘である。インターネットなどの通信において,ペアリング暗号を用いて当事者同士がお互いのIDなどを秘密に保ってハンドシェークを行う秘密ハンドシェークのプロトコルにおいて,提案者が想定していた否認可能性が保たれず,通信の証拠となる情報を残すケースがあることを理論的に示した。当初の計画では,無証拠性・耐強制性・否認可能性についての厳密な定義を目指していたが,現時点においては,無証拠性と耐強制性については遅れが出ている。他方,否認可能性については,認証プロトコルの提案に至っており,想定より進展が出ている。以上の理由から,トータルとしておおむね順調と判断するものである。無証拠性・耐強制性・否認可能性の定義を確実に行う。そのための調査と検討を加速させる。また,平成30年度の成果をさらに進展させ,プライバシと否認可能性との関連を明らかにしつつ,認証プロトコルの改良を行う。次年度使用額を生じた理由としては,謝金に関する支出が全くなかったことと,学会参加に関する旅費支出が想定額に達しなかったことが挙げられる。次年度使用額は次年度以降の成果発表等の旅費の一部に充当することを計画している。
インスリン遺伝子発現機序の解明と新たな膵β細胞の再生

糖尿病の病因はインスリンの作用不足であり、進行した病態では膵β細胞からのインスリン合成/分泌不全が生じる。インスリン遺伝子転写の生理的刺激は血中糖濃度の変化であり、インスリン遺伝子プロモーター内にグルコース応答領域が数カ所存在している。我々は新たな転写因子PREBがグルコース応答領域に結合してインスリン遺伝子転写を促進することを明らかにした。さらにグルコース応答に関与するglucokinaseを調節することで、膵β細胞の機能改善をおこなうことを明らかにした。我々は膵β細胞におけるインスリン遺伝子転写機構について検討してきた。現在までにグルコース応答領域に結合する転写因子がいくつか報告されているが、我々はPDX-1がサイトカインに応答してインスリン遺伝子発現を制御すること、また新たな転写因子PREBがグルコース応答領域に結合してインスリン遺伝子転写を促進することを明らかにした(Diabetologia 2006)。またグルコースによるインスリン遺伝子発現の細胞内情報伝達系としてCaMKK/CaMKIVカスケードを新規に同定してきた(Diabetes 2004)。これらの研究の最終目的は糖尿病患者の治療方法の改善にある。本年度は、膵β細胞においてglucose sensorとしてインスリン遺伝子発現を調整するglucokinaseについて検討し、発現調節機構を解明した。インスリン受容体の細胞内情報伝達系と同一のPI3-K/Akt pathwayはglucokinaseを発現誘導し、インスリン生合成を促進する作用を認めた(Endocrinology 2007)。現在こられの知見を総合して、新たな膵β細胞の再生実験を遂行している。我々が目指す再生膵β細胞は、生理的でより安全かつ簡便に作成できる細胞である。また、我々は血液疾患の治療として骨髄移植を手掛けてきた経験を生かして、多能性幹細胞としてのヒトの骨髄中のmesenchymal stem cellに着目している。この細胞は同定/分離が簡便であり、増殖能を有し、生着率が高いことが知られている。また最近の報告によれば、様々な細胞に分化誘導が可能であると報告されている。今回の研究はこのmesenchymal stemcellから膵β細胞を分化誘導し、さらにグルコース応答性インスリン遺伝子発現機構の解明から得られた知見を利用して、再生膵β細胞に生理的なグルコース応答性を獲得させるものである。インスリン遺伝子プロモーター内にグルコース応答領域が数カ所存在する。現在までにグルコース応答領域に結合する転写因子がいくつか報告されているが、我々は新たな転写因子PREB(prolactin regulatoryelement binding protein)がグルコース応答領域に結合してインスリン遺伝子転写を促進すること発見した。またPREBはGlucokinase(GK)遺伝子の発現を増加させることが明らかになった。GKは膵β細胞ではグルコセンサーとして働き、グルコース応答性インスリン分泌に重要な役割がはたすことを報告されている。今回の実験によりPREBの過剰発現によりGK発現が上昇することを明らかにした。またPREBの過剰発現は、GKの蛋白発現を進するのみならず、GK活性を亢進させた。GK遺伝子はcAMPにより発現が上昇することが知られている。そこでPREBをknock downすることでcAMPによるGKの活性化はなくなることが判明した。最終的にはPREBが結合する領域がGK promoter内に存在することをChIP assayにて確認した。以上のことより、転写因子PREBはグルコース刺激に応答し、インスリンのみならずGK活性を上昇させることより、グルコース応答性に重要な役割を果たすことが判明した。
海ボタルルシフェラ-ゼcDNAを用いた遺伝子発現ベクタ-の開発

動物細胞における遺伝子発現機構を解析するためには,その遺伝子のプロモ-タ-領域を何らかのレポ-タ-遺伝子(例えば大腸菌クロランフェニコ-ルアセチルトランスフェラ-ゼ)と連結して動物細胞に導入し,細胞内におけるその活性からプロモ-タ-活性を類推する。最近,ルシフェリンを基質として発光を触媒するルシフェラ-ゼは,その感度などの観点から注目され,遺伝子発現のレポ-タ-として使用されつつある。ところで,海ボタル(Vargula hilgendorfii)は夜行性の動物であり,刺激が加わるとルシフェラ-ゼ,ルシフェリンを放出し,発光する。私達は,海ボタルルシフェラ-ゼのこの特徴に注目し,そのcDNAを単離した。そして,海ボタルルシフェラ-ゼはアミノ酸555残基から成る分泌性タンパク質であることを示した。次いで,この海ボタルルシフェラ-ゼcDNAを種々の動物遺伝子(SV40,RSV,ペプチド鎖延長因子,GーCSF)などのプロモ-タ-の下流に挿入した。これらのハイブリド遺伝子をヒトやマウスの細胞株に一過的に導入したところ,それぞれのプロモ-タ-活性に対応して,ルシフェラ-ゼが培地中に分泌され,その感度はCAT assayに較べ数段優れていた。現在,このルシフェラ-ゼcDNAを動物細胞染色体に組み込み,定常的にルシフェラ-ゼが分泌されるかどうか検討している段階である。ところで,海ボタルルシフェラ-ゼの基質であるルシフェリンは,特殊なルシフェリンであり,現在までのところ,海ボタルより精製して用いているが,大量に得ることは困難である。また,その有機合成も困難であることから,このルシフェラ-ゼcDNAを遺伝子発現のレポ-タ-として用いることが限定されているのが現状である。海ボタル(Vargula hilgendorfii)は夜行性の動物であり、刺激が加わると発光を触媒するルシフェラ-ゼ、及びその基質ルシフェリンを海水へと放出する。海ボタルルシフェラ-ゼによる発光反応はATPやCa^<2+>などの補助因子を必要とせず、かつその反応もルシフェリンが十分量存在する限り継続する。私達は、海ボタルルシフェラ-ゼのこれらの特徴に注目し、そのcDNAの単離を試みた。すなわち、海ボタルルシフェラ-ゼを精製し、その部分アミノ酸配列を決定した。次いで、それに対応するオリゴヌクレオチドをプロ-ブとして、海ボタルcDNAライブラリ-より、ルシフェラ-ゼcDNAを単離した。このルシフェラ-ゼはアミノ酸555残基から成り、そのNー末端には細胞外への分泌に必要な疎水性のアミノ酸から成るシグナル配列が存在した。実際、このcDNAをサルCOS細胞で発現させると、その大部分のタンパク質は培養液中に検出された。ところで、通常、動物細胞の遺伝子発現機構の解析には大腸菌CAT遺伝子がレポ-タ-として用いられている。私達は、海ボタルルシフェラ-ゼが細胞外へ分泌されること、その感度が非常に高いことから、遺伝子発現の効率よいレポ-タ-として使用できると考え、本研究ではその可能性について検討した。すなわち、種々の動物遺伝子のプロモ-タ-(SV40,RSV,EF1ーαやGーCSF)の下流にルシフェラ-ゼ遺伝子を挿入したハイブリド遺伝子を構築した。このハイブリド遺伝子を、ヒトやマウスの様々な細胞へ導入し、CAT遺伝子をレポ-タ-とした場合と比較した。その結果、マクロファ-ジを除くほぼ全ての細胞において海ボタルルシフェラ-ゼは細胞外へ分泌され、その量比はCAT活性とよく相関した。すなわち、海ボタルルシフェラ-

ゼ遺伝子は、CAT遺伝子より数段簡便、かつ感度の良いレポ-タ-遺伝子となり得ることを示した。動物細胞における遺伝子発現機構を解析するには,その遺伝子のプロモ-タ-領域を何らかのレポ-タ-遺伝子(例えば大腸菌クロランフェニコ-ルアセチルトランスフェラ-ゼ)と連結して動物細胞に導入し,細胞内におけるその活性からプロモ-タ-活性を類推する。最近,ルシフェリンを基質として発光を触媒するルシフェラ-ゼは,その感度などの観点から注目され,遺伝子発現のレポ-タ-として使用されつつある。ところで,海ボタル(Vargula hilgendorfii)は夜行性の動物であり,刺激が加わるとルシフェラ-ゼ,ルシフェリンを放出し,発光する。私達は,海ボタルルシフェラ-ゼのこの特徴に注目し,そのcDNAを単離した。そして,海ボタルルシフェラ-ゼはアミノ酸555残基から成る分泌性タンパク質であることを示した。次いで,この海ボタルルシフェラ-ゼcDNAを種々の動物遺伝子(SV40,RSV,ペプチド鎖延長因子,G-CSF)などのプロモ-タ-の下流に挿入した。これらのハイブリド遺伝子をヒトやマウスの細胞株に一過的に導入したところ,それぞれのプロモ-タ-活性に対応して,ルシフェラ-ゼが培地中に分泌され,その感度はCAT assayに較べ数段優れていた。現在,このルシフェラ-ゼcDNAを動物細胞染色体に組み込み,定常的にルシフェラ-ゼが分泌されるかどうか検討している段階である。ところで,海ボタルルシフェラ-ゼの基質であるルシフェリンは,特殊なルシフェリンであり,現在までのところ,海ボタルより精製して用いているが,大量に得ることは困難である。また,その有機合成も困難であることから,このルシフェラ-ゼcDNAを遺伝子発現のレポ-タ-として用いることが限定されているのが現状である。
終止コドン非依存的翻訳終結の分子機構

大腸菌リボソーム解放因子ArfAによるリボソームの解放に,クラスI終結因子RF2が必須であることを明らかにした。また,ArfAの一時構造上,特徴的にリシン残基が多く見られる領域の正荷電がArfAのリボソームとの結合,リボソームの解放に重要であることを示した。さらに,ラジカルプロービング法によりArfAとリボソームとの結合様式を明らかにし,ArfAによるリボソーム解放の分子機構の解明の端緒とした。平成24年度には,リボソーム解放因子ArfAによるNTC(non-productive translation complex)の解消,すなわちnon-stop mRNAの末端で立ち往生したリボソームの解放に,通常の翻訳終結においてペプチジルtRNAの加水分解を司るクラスI終結因子の一つ,RF2が必須であることを明らかにした。このことはArfAがRF2をNTCにリクルートし,リボソーム内に存在するペプチジルtRNAを加水分解させることでNTCを解消していることを強く示唆した。しかし,プルダウンアッセイ等で調べた限り,ArfAとRF2との相互作用は観察されなかった。ArfAとリボソームの相互作用は既に示されていたので,ArfAはNTC中のリボソームに結合することでRF2をリクルートすると考えられた。ArfAによるリボソーム解放の分子機構を明らかにするためには,ArfAとリボソームの相互作用の詳細,すなわち,リボソームに置けるArfAの結合部位を特定することが重要である。そこで,ArfAと各リボソームタンパク質との相互作用を調べることとした。NBRPより配布されている大腸菌全ORFのアーカイブクローン,ASKAライブラリから各リボソームタンパク質遺伝子を選び,大腸菌内でArfAと共発現させてプルダウンアッセイをおこなったところ,L2タンパク質とArfAとの相互作用が確認できた。ArfAがリボソームの,特にL2の近辺に結合することが示唆された。また,ArfA自体の構造解析を目的として複数のアミノ酸置換体を作出し,in vivo,in vitroでのリボソームとの結合を調べたところ,特徴的にリシン残基が多く見られる領域の正荷電がArfAのリボソームとの結合,リボソームの解放に重要であることが示唆された。我々のグループが同定したリボソーム解放因子ArfA,ArfBを,大腸菌S30抽出液中で形成,単離したnon-productive complex(NPC)に作用させると,ArfBはそれ自体でリボソームの立ち往生を解消するのに対し,ArfAは単独では解消出来ないことから,ArfAによるリボソーム解放には何らかの細胞性因子が必要とされることが予想された。そこで,知られている翻訳因子(開始因子,伸長因子,終結因子,tRNAなど)およびそのホモログを精製し,単離したNPCに精製したArfAと共に加え,NPCが解消されるかどうか調べた。NPCの解消は,Bis-Tris中性アクリルアミドゲル電気泳動で検出されるペプチジルtRNAの消失を指標に確認した。その結果,ArfAによるリボソーム解放にはクラスI翻訳終結因子の一つであるRF2が必要であることを見出した。RF2によるペプチジルtRNA加水分解に必須とされるGGQモチーフを破壊するとリボソームは解放されなかった。一方,終止コドンの認識部位を改変してもリボソームは解放された。このことから本来終止コドンUAG,UAAを認識して翻訳を終結させるRF2が,ArfA存在下でNPCに作用すると終止コドン非依存的にペプチジルtRNAを加水分解し,翻訳を終結させることが判明した。また,この反応はtRNA存在下で亢進した。以上の結果より,ArfAはRF2をNPCにリクルートし作用させることで立ち往生したリボソームを解放することが明らかとなった。これで,これまでに報告のあるリボソーム解放機構,翻訳終結機構は全てGGQモチーフを必要とすることとなり,翻訳終結反応一般におけるGGQモチーフの重要性が示された。前年度までに大腸菌リボソーム解放因子ArfAによるNTC(non-productive translational complex)解消にRF2が必要とされることを明らかにし,さらに,ArfAと相互作用するリボソームタンパク質の探索,ArfAとリボソームとの相互作用に重要な残基の特定を目指した解析を行った。本年度,ArfAに対するアミノ酸残基置換導入がArfAのリボソーム結合能,及びリボソーム解放能に与える影響をより詳細に解析したところ,ArfAに特徴的な塩基性アミノ酸残基クラスターの正荷電がリボソームとの結合に重要であることを示す結果を得た。また,リボソームのA及びPサイト近傍に存在するリボソームタンパク質S9とArfAとの相互作用も観察された。さらに,Fe-BABEを用いたラジカルプロービング法により,結合状態におけるArfAとリボソームの相対的位置関係の解析を行ったところ,人工的に再現したNTC中のリボソーム上,mRNA結合部位に相当する領域にArfAが存在すること,また,その結合状態がRF2の有無により変化することが明らかとなった。

ArfAとRF2とは直接相互作用せず,リボソームを介してのみ挙動を一にした。これらの結果は,これまでに提唱していたモデル,すなわちArfAがNTC中のリボソームの空のAサイトを認識・結合し,おそらくはリボソームのコンフォメーションを変化させることでRF2をリクルートするという機構に合致するものである。分子生物学ArfAと相互作用するリボソームタンパク質のスクリーニング,ArfAへのアミノ酸置換変異の導入ともに技術的な問題で,研究が遅れ,思うような解析が実行出来なかった。しかし,今後の研究の方向を定める上で重要な知見を得られたことも考慮し「やや遅れている」と自己評価する。ArfAによるリボソーム解放に必要な因子としてRF2を同定出来たことは当初の計画を上回る成果である。一方,同時に進行予定だった変異導入や遺伝学的アプローチによるArfAの機能解析は充分な成果を得られておらず,総合すると「おおむね順調に進展している」と評価出来る。ArfAアミノ酸置換変異体の作出とそのリボソーム解放活性,リボソームとの相互作用の解析を引き続き推進するとともに,特徴的な性質を示す変異体に関しては実際にin vitroでのリボソーム解放活性を詳細に解析し,ArfAによるリボソーム解放の分子機構の解明を目指す。アミノ酸置換変異を導入した際のArfAの機能を詳細に解析し,また遺伝学アプローチを駆使してArfAの機能を解明することに注力する。当初より計画的な執行を心がけてはいたものの,計画通りに研究が進まないこともあり,結果として22万円強を次年度に執行することとなった。当初配分予定額と合わせ,消耗品(機器等修繕費を含む),機器更新費(不慮の故障等,予定外のものへの対応)に使用する。消耗品の購入,研究打合せや成果発表等のための旅費に支出する予定であるが,使用している機器の中には更新時期が来ているものもあるため,必要であれば随時更新することも考慮している。
Bcl-2ファミリー分子による生殖細胞の腫瘍化および増殖・分化の制御

本研究では、胎仔生殖細胞および精原細胞の細胞の生死、増殖の制御における、Bcl-2およびp53の役割を解明することを目的に、これら遺伝子を操作したマウスの生殖細胞の性質を解析した。まず、Bcl-2を過剰発現したトランスジェニックマウスの精原細胞を正常な精子形成環境をもつ精巣に移植することにより、精原細胞自身で発現したBcl-2がこの細胞に内在する機構を介して、その細胞死と増殖を抑制する働きがあることを明らかにした。また、精原細胞で機能するBcl-2関連遺伝子を同定することをめざして、これまでに報告された16種類の関連遺伝子の精巣での発現を調べたところ、全ての発現が検出され多くのBcl-2関連遺伝子が精原細胞で機能していることが示唆された。一方、胎仔生殖細胞の細胞死におけるp53の働きを明らかにする目的で、まず胎仔生殖巣でのその発現を調べたところ、16.5日胚以降の精巣で特異的に発現していることを見い出した。さらに、p53ノックアウトマウスと正常マウスで細胞死を起こしている生殖細胞数をTUNEL法により比較したところ、p53の発現パターンに対応し、卵巣および16.5日胚までの精巣では差はなかったが、それ以降の精巣では正常マウスではノックアウトマウスにくらべて細胞死を起こしている生殖細胞が2.5倍程度多く、この時期特異的にp53が関与する機構により細胞死が誘導されることが明らかになった。また、生殖細胞腫瘍のモデル動物を作ることをめざして、ともに生殖細胞の細胞死が抑制させるBcl-2トランスジェニックマウスとp53ノックアウトマウスと交配したが、得られたマウスではBcl-2トランスジェニックマウスの精巣と同様の表現形を示し、また精巣内に腫瘍を形成することはなかった。
進行肝癌に対するインターフェロン,抗FGFR-1ヒト抗体併用療法

進行肝癌に対する治療として、IFNα/β併用5FU動脈内注入療法に加え、IFNα/βによる過剰発現を確認したfibroblast growth factor receptor-1(以下FGFR-1)に対するヒト抗体を併用し、これまでの抗癌剤を主体とした化学療法ではなく、それらの生物活性物質を主体とした治療法の検討を行い、進行肝癌に対する全く新しい治療法を確立することを目的とした。本年度はこのうち特に、抗FGFR-1抗体の作成を行った。以下にその概要を示す。1.FGFR-1のクローニング2.安定発現株作成NIH-3T3細胞にhumanFGFR-1を遺伝子導入し安定発現株を作製した。3.免疫4.細胞融合血清中で力価上昇の認められたマウス脾臓を摘出し、脾臓細胞を抽出し骨髄腫細胞と細胞融合を行った。5.抗体スクリーニング融合細胞の培養上清でCell ELISA、FACSを行い、FGFR-1に特異的に反応するクローンを採取し、さらにサブクローニングを繰り返した。6.抗腫瘍効果の検討確立した抗FGFR-1マウス抗体を用い、肝癌細胞株に対して、その抗腫瘍能・抗増殖能・抗転移能の検索を行った。現在、本抗体のヒト化を行っている。
低酸素環境を利用した呼吸筋トレーニングの開発と持久的パフォーマンスへの効果

低酸素環境における呼吸筋トレーニングによる呼吸筋由来の代謝受容器反射への影響に関する研究を実施した.大学陸上部に所属する長距離選手を常酸素および低酸素群に振り分けた.6週間(30分/日)の呼吸筋トレーニング前後に,呼吸筋持久的テストによる循環応答を測定した.トレーニングは最大随意換気量の50%とし徐々に増加させた.低酸素群の動脈血酸素飽和度を80%に設定した.呼吸筋持久力テスト時の血圧応答は両群で有意な低下が認められたが,応答の低下に両群間で差はなかった.呼吸筋の持久的トレーニングは,呼吸筋由来の代謝受容器反射を低下させるが,低酸素環境でのトレーニング実施による付加効果はないことが示唆される.本年度の目的は,低酸素環境を利用した呼吸筋トレーニングプログラム作成のための基礎データを収集することであった.目的:低酸素環境が吸息筋活動および筋酸素飽和度に及ぼす影響を明らかにする.方法:8名の健康な男性が本研究に参加した.安静状態にて,随意過換気(1回換気量:肺活量の30-40%,呼吸数:60回/分)を常酸素(吸入酸素濃度:21%)および低酸素(吸入酸素濃度:10-12%,動脈血酸素飽和度:81.7%)環境で10分実施した.吸息筋である胸鎖乳突筋および外肋間筋から,表面筋電図および近赤外分光装置を用いた組織酸素飽和度を連続的に記録した.呼気終末二酸化炭素分圧を一定に保つよう,吸入炭酸ガス濃度を調整した.随意過換気による表面筋電図および組織酸素飽和度の変化の再現性を確認するため,3名の被験者において常酸素ガス吸入における測定を2度実施した.異なる日の測定に対する変動係数は,組織酸素飽和度では7.8%,表面筋電図では16.3%であった.結果:随意過換気中の筋酸素飽和度は,低酸素試行で有意な低値を示した(胸鎖乳突筋,低酸素:56.5%,常酸素:65.0%).10分間の過換気により,吸息筋からの表面筋電図の漸増が認められ,その増加の程度が低酸素ガス吸入で大きかった(胸鎖乳突筋,低酸素:+83.6%,常酸素:+47.9%).結論:これらの結果から,低酸素環境では呼吸筋においてその活動が大きくなることが明らかとなった.目的:呼吸筋活動の増加に対する血圧応答の変化を明らかにすること方法:日常的にトレーニングを実施している持久的ランナーおよび一般健常者において呼吸筋活動の増加に対する血圧応答の変化を比較した結果:呼吸筋活動に対する血圧応答は,持久的ランナーで低値を示した.まとめ:持久的トレーニングは,呼吸筋活動に対する代謝受容器反射を抑制することが示唆呼吸筋トレーニングデバイスの作成:常酸素環境においても呼吸筋の低酸素トレーニングが可能となる装置を作成した.呼吸筋トレーニングに向けて,持久的アスリートにおける基礎データを取得した(現在論文投稿中).昨年度から引き続き実施している低酸素環境における呼吸筋トレーニングデバイスの作成を行った.当初は低酸素室を使用したトレーニングを考案していたが,デバイスを改良することにより,常酸素環境においても低酸素における呼吸筋トレーニングを実施可能なデバイスを作成することに成功した.持久的アスリートでは,運動時の代謝要求にみあったガス交換が行われず,呼吸筋の疲労もまたパフォーマンスの制限要因となる.低酸素環境で呼吸筋のトレーニングを実施することで,呼吸筋の疲労耐性がより向上する可能性がある.目的:低酸素環境における呼吸筋トレーニングに対する呼吸筋の機能変化を明らかにすること方法:日常的にトレーニングを実施している持久的ランナー12名を,常酸素群6名,低酸素軍6名に振り分けた.1日30分の呼吸筋トレーニングを,週に45日,6週間(合計28日)実施した.呼吸筋トレーニング機器は昨年度作成した装置を用い,低酸素環境は動脈血酸素飽和度が8090%になるように吸気酸素濃度を変化させた.トレーニング前後に,肺機能テストおよび呼吸筋持久力テストを実施した.初期負荷を30%最大随意換気量とし,3分ごとに10%ずつ増加させた.この際,1回換気量は肺活量の60%に固定し,呼吸数のみを増加させた.連続的に心拍数および血圧を測定した.設定された1回換気量か呼吸数が維持できなくなった時点を終了とし,この時点までの時間を呼吸筋持久力の指標とした.結果:肺活量,努力性肺圧量は両群ともに有意な変化はなかった.最大随意換気量は両群ともに増加の傾向が認められた.常酸素群および低酸素群いずれも呼吸筋の持久力が有意に増加した.呼吸筋持久力手テスト実施時の血圧応答は両群ともに有意に低下した.しかしながら,両群間に差は認められなかった.まとめ:呼吸筋トレーニングにより,呼吸筋の持久力および血圧応答は低下する.しかしながら,低酸素環境でのトレーニングの実施による効果は認められなかった.低酸素環境における呼吸筋トレーニングによる呼吸筋由来の代謝受容器反射への影響に関する研究を実施した.大学陸上部に所属する長距離選手を常酸素および低酸素群に振り分けた.6週間(30分/日)の呼吸筋トレーニング前後に,呼吸筋持久的テストによる循環応答を測定した.トレーニングは最大随意換気量の50%とし徐々に増加させた.低酸素群の動脈血酸素飽和度を80%に設定した.呼吸筋持久力テスト時の血圧応答は両群で有意な低下が認められたが,応答の低下に両群間で差はなかった.