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遺伝学的組織操作による泌尿生殖器官発生研究: 肛門直腸奇形発症メカニズムの解析

膀胱と腸管は、胎児期に一過的に存在する総排泄腔が分割されることによって形成される。その分割不全は肛門直腸奇形と呼ばれ、原因メカニズムは殆ど明らかとなっていない。現在まで総排泄腔の分割に関わる研究は、組織切片を用いた2次元的な解析が中心になされてきた。本研究では、イメージング技術を用いて3次元的に総排泄腔の構造変化を解析し、かつ遺伝子改変マウス胚を用いて総排泄腔分割不全の起こるメカニズムの解析を行った。その結果、総排泄腔分割過程における総排泄腔上皮のダイナミックな構造変化を明らかにした。本研究で得られた成果は、今後、肛門直腸奇形の原因メカニズムを解析する上で基盤となると考えられる。泌尿生殖器官は、胎児期に一過的に存在する総排泄腔が尿直腸中隔(Urorectal septum: URS)によって尿生殖洞と後腸に分割されることによって形成される。総排泄腔の分割不全は、肛門直腸奇形(Anorectal malformation: ARM)と呼ばれ、出生児の数千人に1人という高頻度で発症する。多数の知見の積み重ねがあるにも関わらず、正常な総排泄腔の分割過程に関わるメカニズム、またARMの発生機序に関して現在まで議論が続いている状況である。本研究課題は、マウス遺伝学的手法、またイメージング技術を駆使して総排泄腔分割に関わるメカニズムを明らかにすることを目的としている。平成26年度は、マウス遺伝学的手法を用いたURS間葉細胞の系譜解析を行なった。胎齢10.5日で形成されつつあるURS間葉全体を標識し、一日後の胎齢11.5日において矢状断切片を作製し解析したところ、URS間葉細胞の一部は胎齢10.5日におけるURS間葉細胞以外の細胞に由来することが示唆された。そこでURSの全体構造の把握のために、連続切片の3D再構築、免疫染色サンプルの共焦点顕微鏡解析といったイメージング解析を行なった。総排泄腔上皮の構造変化を解析したところ、URSは胎齢10.5日から総排泄腔上皮の折り畳みとして確認されはじめ、胎齢11.5日にかけて尿生殖洞側の扁平化と後腸側の狭窄化を伴いながら大きく総排泄腔分割が進むことが明らかとなった。そして三次元解析と連続切片を用いた解析から、URSという構造物は独立した胎児組織としては存在せず、尿生殖洞と後腸の間葉組織を矢状断切片で観察することから観られる構造であるという結論に達した。この知見は、従来のURS依存型の考え方とは一線を画すものであり、さらなる解析により新規総排泄腔分割メカニズムの提唱につながるものであると考えられる。膀胱、尿道、直腸といった器官群は、胎児期に存在する総排泄腔が分割されることによって形成される。そのため、総排泄腔の分割不全は隣接する器官群にわたる広範囲の発生異常となる。このような先天性疾患は肛門直腸奇形(Anorectal malformations: ARM)と呼ばれ、発症頻度も高い。本研究課題の目的は、マウス遺伝学的手法を用いたARM発症メカニズムの解明である。平成27年度は、免疫組織化学染色と組織透明化技術を用いたマウス胚(Shh遺伝子改変マウス及びβ-catenin機能獲得型遺伝子改変マウス等)のイメージング解析を行ない、これらの遺伝子改変マウス胚の表現型を3次元的に示した。Shh遺伝子改変マウス胚は総排泄腔分割不全に加え、総排泄腔分割に伴う総排泄腔-中腎管結合部位の傍側中央から背側上部への移行も不完全であることを見出した。胎生中期(胎齢9.5日胎齢11.5日)における総排泄腔-中腎管結合部位及び総排泄腔-後腸分割領域では共に細胞死を伴いながら形態変化が進んでいくことが知られている。正常マウス胚を用いた解析から、どちらの領域も内胚葉性上皮細胞基底膜の崩壊は観察されず、周辺間葉細胞から内胚葉性上皮細胞への細胞の供給は起こらないと考えられた。また、遺伝学的細胞標識実験により胎齢10日に総排泄腔腹側上皮に存在する細胞は総排泄腔分割が起こる胎齢11.5日においても腹側に存在し、背側に移動する細胞は殆ど観られなかった。加えて、BrdUを用いた増殖細胞のパルスラベリング実験を行なった結果、上部側(頭側)尿生殖洞より後腸側に移動する内胚葉性上皮細胞群の存在が示唆された。これらの知見は、ARMの発症メカニズムの解明につながる正常総排泄腔分割の細胞レベルでの機序を提唱するものであり、今後病態モデルマウスを用いて遺伝子発現解析等の解析を行なっていく予定である。平成27年度は、平成26年度に得られた3次元的解析の結果(総排泄腔の分割に重要であると考えられていた尿直腸中隔は独立した胎仔構造としては存在しないこと)を踏まえ、遺伝子改変マウス胚を用いた3次元表現型解析と遺伝学的細胞標識解析、BrdUパルスラベル実験を行なった。その結果、総排泄腔分割に伴う内胚葉性上皮細胞の総排泄腔側から後腸側への移動の可能性を示唆するに至った。研究手法としてマウス胚レベルでの免疫組織化学染色、3次元イメージング解析を行うことで一定の成果は得られ、これらの結果を組み合わせて学術論文として発表するに至った。

しかしながら研究計画に関しては、平成26年度中に得られた結果により総排泄腔分割過程を3次元的に解析する必要性が示唆されたことで、当初予定していた遺伝学的細胞除去実験に用いるCreドライバーマウスのCre組換え酵素発現領域等の再検定、実験の有効性の再検討を行なうなどの見直しが必要となり、予定通りに実験を進めることができなかった。また、遺伝子改変マウス群のコロニー拡大に想定以上の時間がかかり、年度内に十分な表現型・遺伝子発現解析を行うことはできなかった。これらの理由により、全体として研究に遅れが生じていると判断された。膀胱と腸管は、胎児期に一過的に存在する総排泄腔が分割されることによって形成される。その分割不全は肛門直腸奇形と呼ばれ、原因メカニズムは殆ど明らかとなっていない。現在まで総排泄腔の分割に関わる研究は、組織切片を用いた2次元的な解析が中心になされてきた。本研究では、イメージング技術を用いて3次元的に総排泄腔の構造変化を解析し、かつ遺伝子改変マウス胚を用いて総排泄腔分割不全の起こるメカニズムの解析を行った。その結果、総排泄腔分割過程における総排泄腔上皮のダイナミックな構造変化を明らかにした。本研究で得られた成果は、今後、肛門直腸奇形の原因メカニズムを解析する上で基盤となると考えられる。マウスを含む哺乳類において総排泄腔は胎仔期に一過的に存在し、その分割により膀胱、尿道、直腸といった器官群が形成される。総排泄腔分割異常の頻度は比較的高く、多くの器官群に影響を及ぼすことが知られているが、その発症メカニズムは現在までほとんど明らかになっていない。平成28年度は、薬剤誘導型遺伝子組換えマウスを用いて、in uteroで総排泄腔周辺間葉細胞の小集団を標識し、その系譜を解析した。その結果、外生殖器原基の側方部の近位-遠位軸に沿って細胞が分布する様子が観察された。総排泄腔分割領域においては、総排泄腔の分割開始前に標識した細胞が尿生殖洞と腸管の間の間葉領域(尿直腸中隔と呼ばれる)には分布しなかったことから、尿直腸中隔を構成する間葉細胞は標識外の領域から流入したか、非標識細胞に由来することが推察された。また総排泄腔分割における細胞挙動を直接観察するために、蛍光タンパク質発現マウス胚を用いたタイムラプスイメージングを試みたが、蛍光強度、解像度、また培養条件の問題で十分なモニタリングを行うことはできなかった。一方で、BrdU投与による細胞増殖解析実験から、尿直腸中隔間葉では直腸側に比べ尿生殖洞側間葉において細胞増殖が亢進していることを見出した。研究器官全体を通じては、三次元的解析手法を用いることにより、総排泄腔は尿直腸中隔によってではなく直腸と尿生殖洞それぞれの管腔形成の結果として分割を生じるという概念を提示した。また、総排泄腔分割異常を呈するShh遺伝子改変マウス等においても三次元的に表現型を解析し、総排泄腔上皮の形状の表現型を見出した。また腸管の上皮細胞においても腹側-背側の違いが存在する可能性を示した。これらの結果は、今後肛門直腸奇形の原因メカニズムを解明する上で重要な事柄であると考えている。本年度は、前年度延長申請した研究課題の影響のため本研究課題の遂行にかける時間が予定よりも少なかった。しかし、従来は組織学的手法(二次元的解析)を主に用いて解析されていた総排泄腔分割過程を三次元的手法を用いて可視化し、URSの独立構造としての存在そのものに疑問を投げかける新規知見を得ており、研究自体の推進状況は芳しいものであると判断される。
蝸牛外有毛細胞の収縮運動におけるイオン輸送および細胞内情報伝達機構の研究

最初に我々は、、電気刺激による内耳蝸牛外有毛細胞の遅い収縮にはω-コノトキシン感受性PまたはN型カルシウムチャネルを介する細胞外カルシウムイオンの流入にて活性化される、BK型カリウムチャネルよりのカリウムイオンの流出とフロセミド感受性塩素イオンチャネルよりの塩素イオンの流出が各々独立して関与することを解明した。さらにBK型カリウムチャネルの活性化にカルシウム・カルモデュリンカイネースIIが関与していることを解明し、さらに蛋白脱リン酸化酵素阻害薬:カリクリンA,オカダ酸,カンタリジン,デルタメスリン,ベンジルホスホン酸のうち、タイプ1と2A蛋白セリン/スレオニン脱リン酸化酵素の阻害薬であるカリクリンAにより、外有毛細胞の電気刺激による収縮および細胞内塩素イオン濃度の変化が消失することを解明した。この阻害作用は、カリウムイオンコンダクタンスを高めるバリノマイシン存在下やカルシウムイオンコンダクタンスを高めるA23187存在下でも認められたが、塩素イオンの透過性を高めた状態では認められなかった。また蛋白セリン/スレオニン脱リン酸化酵素を活性化するNアセチルスフィンゴシンにより、外有毛細胞の電気刺激による収縮および細胞内塩素イオン濃度の変化は消失した。この作用は、バリノマイシンやタイプ2A蛋白脱リン酸化酵素阻害薬であるオカダ酸存在下では認められなかった。これらの結果より外有毛細胞の収縮に関与するカリウムチャネルの活性化にはオカダ酸感受性の蛋白脱リン酸化が抑制的に関与し、また塩素イオンチャネルの活性化にはカリクリンA感受性の蛋白脱リン酸化が関与していることが示唆された。7年度は、細胞外カルシウムイオンの細胞内流入以後のBK型カリウムチャネルおよびフロセミド感受性塩素イオンチャネル活性化までの細胞内情報伝達系の解明を行なった。カルモデュリンやプロテインカイネースとの関係を阻害薬を灌流することにより確かめた。外有毛細胞の電気刺激による体積減少を伴う収縮および細胞内塩素イオン濃度の変化は、プロテインカイネースA,G,Cおよびミオシン軽鎖カイネースの阻害薬である1μMH-8、1μMKT5720、100nM staurosporine、10μMH-7および10μMML-9いずれの存在下でも、どちらも影響を受けなかった。しかしこの収縮および細胞内塩素イオン濃度の変化は、カルモデュリン拮抗薬である10μMW-7により、いずれも消失した。カリウムイオノフォアであるvalinomycin 10μM存在下では、収縮および細胞内塩素イオン濃度の変化に対するW-7の抑制効果を消失した。この研究経過により、内耳蝸牛外有毛細胞の収縮に関与するBK型カリウムチャネルは、電気刺激によりカルシウムチャネルが活性化されることによりカルシウムが細胞内に流入し、次にカルシウム-カルモデュリン系の細胞内情報伝達機構を介して活性化される事が示唆された。一方、外有毛細胞の収縮つまりはBK型カリウムチャネルおよびフロセミド感受性塩素イオンチャネルを活性化する細胞内情報伝達機構には、プロテインカイネースA,G,Cおよびミオシン軽鎖カイネースの関与の可能性が低いこともわかった。これにより外有毛細胞の収縮に関与する細胞内情報伝達系の一部は解明できたが、BK型カリウムチャネルについてはカルモデュリンカイネースの分類など、またフロセミド感受性塩素イオンチャネルに関しては実際にどの機構が関与しているかの解明が今後の課題である。外有毛細胞の電気刺激による体積減少を伴う収縮および細胞内塩素イオン濃度の変化は、プロテインカイネースA、G、Cおよびミオシン軽鎖カイネースの阻害薬である1μM H-8、1μM KT5720、100nM staurosporine、10μM H-7および10μMML-9いずれの存在下でも、どちらも影響を受けなかった。

しかしこの収縮および細胞内塩素イオン濃度の変化は、カルモデュリン拮抗薬である10μM W-7により、いずれも消失した。カリウムイオノフォアであるvalinomycin 10μM存在下では、収縮および細胞内塩素イオン濃度の変化に対するW-7の抑制効果は消失した。8年度は、7年度の結果を踏まえ研究を進めCaMKIIの阻害薬である10μM KN-62が、やはりこの外有毛細胞の体積減少を伴う収縮および細胞内塩素イオン濃度の変化を消失させる事、またその効果は、valinomycin 10μM存在下では失われる事が解った。また、蛋白脱リン酸化を阻害する0.2μM Calyculin A存在下では、この収縮も細胞内塩素イオン濃度の変化も消失するが、valinomycin 10μM存在下でも、この効果は、消失しなかった。この結果より、内耳蝸牛外有毛細胞の収縮に関与するBK型カリウムチャネルは、電気刺激によりカルシウムチャネルが活性化されることによりカルシウムが細胞内に流入し、次にカルシウム-カルモデュリン系の細胞内情報伝達機構を介して活性化させる事がさらに示唆された。また同時に、この収縮に関与するフロセミド感受性塩素イオンチャネルの活性化には、Calyculin A感受性蛋白脱リン酸化酵素の活性化が関与していることが示唆された。
初期ニューロンを介した大脳新皮質構築機構の解明

近年の神経科学研究の進展により、大脳皮質神経回路の構築を担う分子やその作用機序が明らかになりつつあるが、哺乳類以降で急速に発達し、ヒトにおいて最も数が増大した大脳皮質で最初に誕生するニューロン群についてはその発現分子も含め、知見が極めて乏しい。本研究は大脳皮質形成のグローバルメディエーターであるFoxg1が大脳皮質で最初に誕生するカハール・レチウス細胞とサブプレート細胞の分化を制御することを受け、ゲノムワイドアプローチによる初期ニューロンに特異的に発現する新規遺伝子群の同定とその機能を明らかにすることを目的とした。今年度は種間比較解析と生化学的アプローチにより、哺乳類カハール・レチウス細胞とサブプレート細胞特異的分子の発現制御機構について解析を進め、さらに主要候補遺伝子についてマウス胚での機能解析、およびトリ胚への異種間遺伝子導入・細胞移植を行い、大脳皮質構築とニューロンの分化における影響を検証した。またこれと並行して遺伝学的手法を用いたサブプレートの特異的標識と操作により、発生期大脳皮質における初期ニューロンの動態について詳細に検討した。これら一連の実験から、胎生期から生後早期に至るまでの大脳皮質において、初期ニューロンと大脳皮質層ニューロン間の相互作用が見出され、進化の過程で新たに獲得された初期ニューロンの分子多様性が高次の脳神経回路形成において重要な役割を担っていることが示された。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。大脳皮質で最初に誕生するニューロン群は哺乳類以降で急激に発達し、ヒトで最も数が増大したが、大脳皮質の神経回路形成における機能については知見が乏しい。これまで初期ニューロンに発現する分子としてはReelinやp73、CTGF等が知られているが、これらは哺乳類以外の脳の細胞にも発現しており、カハールレチウス細胞やサブプレート細胞に発現する分子の全貌とその機能については不明である。本年度は、生体内で転写因子Foxg1の発現に抑制応答を示す遺伝子を抽出し、in situハイブリダイゼーションと定量的PCR解析により、これらの遺伝子が既知のカハールレチウス細胞とサブプレート細胞マーカーを含むことを確認した。さらにFoxg1抗体を用いたクロマチン免疫沈降、および上記のトランスクリプトーム解析から得られた抑制応答遺伝子群のうちFoxg1の直接的結合遺伝子について、その結合配列が哺乳類特異的なものについて選定を行った。これらのスクリーニングから、全マウスゲノムのうち44個の候補遺伝子を抽出し、胎生10日目から18日目までのマウス脳を用いて初期ニューロンにおける発現の特異性について検討を行った。これらのスクリーニングの結果、8個の初期ニューロン発現候補遺伝子について絞り込みを行い、またこの中で発現がReelinには依存しない遺伝子をReelerマウス(Reelin遺伝子欠損マウス)を用い同定した。これまでの予備実験の結果から、大脳皮質の初期ニューロンに発現する遺伝子群のスクリーニングを高効率に行うことが可能となった。また同定した遺伝子群については既知の初期ニューロンマーカーが抽出されたことから、データの信頼性についても確認された。本研究は大脳皮質で最初に誕生し、哺乳類以降で急速に発達した初期ニューロンについて、その分子多様性と機能を解析することで大脳新皮質の構築機構を明らかにすることを目的としている。これまでの転写因子Foxg1の下流解析により、哺乳類特異的なFoxg1標的遺伝子のうち、胎生期マウス脳においてカハールレチウス細胞およびサブプレートニューロンに発現する遺伝子群を同定した。そこでこれらの遺伝子について、非哺乳類および霊長類胚脳での発現パターンを解析し、非哺乳類脳で発現せず霊長類で発現パターンが保存されているものを、哺乳類特異的初期ニューロン発現遺伝子として解析を進めた。次にこれらの遺伝子群について、生体内でFoxg1の誘導を操作したマウスを用い発現動態を解析した結果、これらの遺伝子の発現がFoxg1に依存して時期特異的に制御されることが示された。またこれら遺伝子の時空間的な発現パターンの解析により、異なる大脳皮質領域から産生されるカハールレチウス細胞群を同定し、これらの細胞群が大脳皮質の表層において領域特異的に分布することが示された。これらの結果を受け、カハールレチウス細胞を過剰産生するFoxg1欠損マウスの大脳皮質細胞を単離し、ニワトリ胚由来の大脳神経幹細胞に異種間移植しその影響を評価したところ、放射状グリア型突起伸長、移動細胞の双極性の獲得等の表現型が見出された。これらの結果から、哺乳類で新たに獲得された初期ニューロンの分子多様性が大脳新皮質型神経細胞の特性に寄与することが示された。今年度は大脳皮質の初期ニューロンに発現する分子群について、種間における時空間的遺伝子発現の比較および機能解析を行い、実験は概ね計画通りに進行しているといえる。

今年度は種間比較解析と生化学的アプローチにより、哺乳類カハール・レチウス細胞とサブプレート細胞特異的分子の発現制御機構について解析を進め、さらに主要候補遺伝子についてマウス胚での機能解析、およびトリ胚への異種間遺伝子導入・細胞移植を行い、大脳皮質構築とニューロンの分化における影響を検証した。またこれと並行して遺伝学的手法を用いたサブプレートの特異的標識と操作により、発生期大脳皮質における初期ニューロンの動態について詳細に検討した。これら一連の実験から、胎生期から生後早期に至るまでの大脳皮質において、初期ニューロンと大脳皮質層ニューロン間の相互作用が見出され、進化の過程で新たに獲得された初期ニューロンの分子多様性が高次の脳神経回路形成において重要な役割を担っていることが示された。本年度に同定した遺伝子群の発現が哺乳類特異的に制御されているかについて検討を行うため、非哺乳類および霊長類胚脳(鳥類:ニワトリ、フィンチ、爬虫類:ヤモリ、霊長類:コモンマーモセット)での発現パターンについて明らかにする。これにより非哺乳類脳で発現せず、霊長類のカハールレチウス細胞、サブプレート細胞で発現パターンが保存されているものを、哺乳類特異的発現遺伝子として同定する。また同定した遺伝子群について、Foxg1の誘導のタイミングを生体内で操作したマウスでの発現挙動について解析を行う。Foxg1による制御の実体については、経時的ChIP-qPCR、バイオインフォマティクス、レポーターアッセイ等により評価する。また並行して、これらの遺伝子のマウス胎児での強制発現実験により、Foxg1を介した初期ニューロンの発現遺伝子の制御様式と分化決定機構について解析を行う。これまでの実験から、ヒトとマウスでサブプレートに発現し、大脳皮質形成期を通じてサブプレートニューロンに発現が限局する候補遺伝子についてその制御下でCreを発現する遺伝子改変マウスとレポーターマウスとの掛け合わせにより、生後1週齡までにサブプレート特異的な組換え、標識ができることが確認された。そこでこのマウスをアブレーション(除去)実験に用い、今後は1単一ニューロンレベルで蛍光標識したサブプレート-Cre; DTAアブレーションマウスの脳スライスを作製と層特異的な樹状突起パターニングについての定量的解析、2サブプレートニューロンアブレーションの各領野形成への影響を検証していく。特にサブプレート細胞は視床軸索のガイダンスを担うと考えられているため、サブプレート-Creとレポーターマウスとの交配により、視床軸索末端とサブプレート細胞の相互作用について可視化し、視床入力と領野パターニングの関係性について詳細に検討する。またアブレーションによるサブプレート細胞サブタイプ間の補償や特異的機能についても明らかにする。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
東南アジアにおけるイスラム諸国の新規株式公開(IPOs)の特性と企業特性

まず,2000年ー2015年における東南アジア地域のイスラム諸国(マレーシア)におけるイスラム法準拠企業と非イスラム法準拠企業とのデータベースを構築した。構築されたデータベースをもとに,当該諸国におけるイスラム法準拠企業と非イスラム法準拠企業とを比較し,実証研究を行った。その研究成果は以下の通りである。平成29年度までに,2000年ー2015年における東南アジア地域のイスラム諸国(マレーシア,インドネシアそしてシンガポール)におけるイスラム法準拠企業と非イスラム法準拠企業とのデータベースを構築する予定であったが,まだ十分に東南アジア地域のイスラム諸国国のデータの収集ができていない。さらにデータの欠損や不備等が考えられる。また相手方の育児のため,十分な研究打ち合わせができていない。今後引き続き,Backar and Uzaki(2019)での共同執筆者である海外研究協力者のNashirah Abu Backar(国立ウタラマレーシア大学のシニアレクチャラー)氏にデータの補完とアドバイスを受ける予定である。さらに,インドネシアそしてシンガポールのデータベースの構築を行う予定である。ASEAN(Association of South-East Asian Nations:東南アジア諸国連合)は,過去10年間に高い経済成長を見せており,今後,世界の「開かれた成長センター」となる潜在力が,世界各国から注目されている。本研究では,その中で多くのイスラム教の人が住み,名目GDPでシンガポールの次に成長しているマレーシアを取り上げ,新規株式公開(IPOs)の際に生じるアンダープライシングについて分析を行う。マレーシア証券取引所(MSE)における新規株式公開に関する様々な研究がなされている。しかしながら,それらの多くは,法律の異なるイスラム法準拠企業と非イスラム法準拠企業を区別せず分析を行っている。そのため,本研究ではこれらを区別し比較することにより,より明確な分析を行なう。近年イスラム法準拠企業は,イスラムの人々が国際資本市場に参加するようになったため,これらの市場においてより重要になってきた。また2011年末において,MSEに上場した企業の89%は,イスラム法準拠企業であり,イスラム教の投資家であるか否かに関わらず,これらの企業はマレーシアの市場に大きな影響を及ぼしている。本研究では,MSEにおいて新規株式公開する企業のアンダープライシングの存在を明らかにし,その原因を分析する。本研究では,2000年-2011年のマレーシアにおけるイスラム法準拠企業とイスラム法非準拠企業の新規株式公開(IPOs)時におけるアンダープライシングが,存在するのか,もしそうであったら,どのような要因によって決定されるかを検討した。そこでは,説明変数としてアンダーライターの名声,産業の種類,そして超過募集を用いて分析を行った。本研究では,アンダーライターの名声,産業市場の種類,市場の種類,そして超過募集を説明変数として分析を行っているが,決定係数が28.3%であり,本研究のモデルではアンダープライシングにより影響を及ぼしている要因を十分に特定することはできなかった。また,イスラム法非準拠企業のIPOs企業数が少なく,十分にイスラム法準拠企業と比較分析できたとはいいえない。今後世界でイスラム法準拠企業がより多く創業・成長し,IPOsを行う機会が増えると考える。今後は,インドネシアやタイ等のイスラム金融の経済国家の研究を加えてサンプル数を増やし,イスラム法準拠企業のIPOsとイスラム法非準拠企業のIPOsとを比較分析したいと考える。大学のイベントとの調整が難しく,現地調査に行くことができなかった。本年度には,現地調査(マレーシア)を行う予定である。また,物品費に関しても,データベースの購入を予定している。東南アジア地域のイスラム諸国(マレーシア,インドネシアそしてシンガポール)におけるイスラム法準拠企業と非イスラム法準拠企業とのデータベースを構築する予定であったが,まだ十分に東南アジア地域のイスラム諸国国のデータの収集ができていない。本年度は,データベースの完成を目指すとともに,東南アジアへ行き,研究打ち合わせと欠損データを補完したいと考えている。物品費:1,000,000,旅費:500,000,人件費・謝金:100,000,その他:96,334
ヒトゲノム構造解析ツールとしての高密度genomic DNAマイクロアレイの開発

ポストゲノムシークエンスの時代を迎え、ゲノムの一次構造の異常をhigh-throughputに探索していくツールの開発は、隣接遺伝子症候群などの先天異常や癌など病型が同じでありながら複雑な表現型を示す疾患をはじめヒト疾患の遺伝的要因を迅速に明らかにしていく上で必須である。このため、網羅的かつ高精度にゲノムDNAコピー数の変化を検出する高密度・高感度ゲノムDNAマイクロアレイの開発研究を推進し、以下の成果を得た。1.マイクロアレイ作成に必要なゲノムDNAの単離、標的DNAの作成、試作アレイの作製:マイクロアレイの標的DNAとして、癌関連遺伝子特異的、染色体特異的CGHアレイ用などのBAC/PACクローンからのDNA単離をほぼ終了した。このDNAを材料として、実際にスポットするDNA断片のPCR法による作製を開始した。さらに、作製されたDNA断片の一部を用いて、試作アレイの作製を行い、また小規模の実用アレイの作製に着手しその評価を開始した。2.試作レベルのマイクロアレイを用いた解析技術・結果の評価:試作レベルのマイクロアレイ(癌関連遺伝子特異的アレイなど)を用いたゲノムDNAコピー数解析を、これまでの基礎技術開発により確立したプロトコールに従い行った。正常DNAならびにCGHやFISH法によりゲノムコピー数の変化を詳細に解析済みである食道癌細胞株から得られたDNAなどを対象にした検討によって、これまでに、再現性、分解能、1コピーの変化まで検出できる感度を確認している。また、得られた結果を元にさらに実用アレイ用に、プロトコールの改良を行った。
園芸作物の貯蔵性を著しく高める新包装資材高活性光触媒コーテイングフイルムの開発とその機能性解析

本研究の主な目的は、園芸産物の流通過程のおける廃棄ロスを軽減させるため、光触媒二酸化チタンを用いた貯蔵性を高めことのできる包装資材の開発を目指すものである。目的としては大きく次の3項目に分けられる。1)工業生産レベルでの実用に達する二酸化チタンコーティングフィルムの開発、2)園芸産物の鮮度保持と貯蔵性を高める二酸化チタンコーティングフィルムの機能解析、特に、植物老化ホルモン「エチレン」や悪臭の分解能と細菌類の滅菌能の検討、3)二酸化チタンコーテイングフィルムが園芸産物の品質に及ぼす影響である。これまでの試験結果から、エチレン分解能を高めるためにはフィルムに二酸化チタンを均一に厚くコーティングするために、コーティングするフィルム資材の種類とコロナ処理並びにプラズマ処理について検討したところ、ポリプロピレン(OPP)、ポリエチレン、塩化ビニールにコロナ処理すれば、二酸化チタンを従来の印刷技術(グラビア法)で適切な溶媒を使用することで工業的にコーティングできることが判明した。それらフィルムのエチレン分解能をGCにて検定したところ、OPPコロナ処理フィルムに二酸化チタンを印刷処理したフィルムが著しくエチレンを分解することをつき止めた。当フィルムはこれまで報告されているフィルムに比べ、ほぼ10倍の分解能を有しており、しかも、殺菌力や青果物の鮮度保持に極めて有効であり、実用レベルに達していることが判明した。今後は、等フィルムを使用した、使用現場でのモニター試験を実施すべきと考えられる。1)実用レベルに達する二酸化チタンコーティングフィルムの開発、2)園芸産物の鮮度保持と貯蔵性を高める二酸化チタンコーティングフィルムの機能解析、特に、植物老化ホルモン「エチレン」や悪臭の分解能と細菌類の滅菌能の検討、3)二酸化チタンコーティングフィルムが園芸産物の品質に及ぼす影響であり、一年目は主に、実用レベルに達するエチレン分解活性を有するコーティングフィルムの開発を目指した。これまでの試験結果から、エチレン分解能を高めるためにはフィルムに二酸化チタンを均一に厚くコーティングできるかが課題となっており、コーティングするフィルム資材の種類とコロナ処理並びにプラズマ処理について検討した。フィルムは、ポリプロピレン(OPP)、ポリエチレン、塩化ビニールを用い、それぞれのフィルムにコロナ処理もしくはプラズマ処理したフィルム等に二酸化チタンをスプレー処理もしくは印刷処理をしてフィルムに二酸化チタンをコーティングした。当フィルムはこれまで報告されているフィルムに比べ、ほぼ10倍の分解能を有しており、実用レベルに達していることが判明した。今後は、殺菌力、青果物に及ぼす影響など検討する必要がある。
高血圧・心不全時の末梢抵抗血管平滑筋のG蛋白質の量的・機能的研究

I.高血圧の発症・維持におけるG蛋白質の役割高血圧発症前期の自然発症高血圧rat(SHR)を用いて免疫組織化学により末梢細動脈のGi,Gs蛋白質の量を正常血圧ラットさらに二次性高血圧ラットと比較検討。大動脈の変化も比較検討。機能的検討はβ-AR-Gs系,α2-AR-Gi系の検討をin vitroにて検討。免疫組織学的検討:4,10,20週齢のSHRと対照のWKYを比較。右腎摘出左腎動脈狭窄ラット(RHR)も使用。一次抗体に抗Gsα,Giα蛋白質抗体、二次抗体にHRP標識抗ラビットIgGを用いた。機能的検討:4-5週の右睾丸挙筋の径約100μmの最小動脈を摘出しピペットにて固定、血管径を計測。β-AR-Gs系はatenolol存在下のisoproterenolを、α2-AR-Gi系はUK13401の濃度反応曲線をSHRとWKYを比較し、さらに百日咳毒素(PTX)によるGi遮断の効果を比較。結果;SHRは各週齢共にWKYと比べ免疫組織学的濃度が低下。RHRはWKYと有意差がなかった。大動脈ではSHR,WKY,RHRに有意差は認めなかった。β2-ARによる血管拡張反応はSHRにおいて有意に低下。nitroprussideによる血管拡張反応はSHR,WKY間には有意差はなかった。α2-AR-Gi系による血管収縮はSHRで現象を認めPTX処置にて同程度まで減少したことよりα2-AR-Gi系の減少はGiの減弱によると考えられた。高血圧発症以前の早期より末梢の細動脈レベルの平滑筋でのGs蛋白質量が低下し機能の低下が認められたことよりSHRの高血圧発症においてβ受容体-G蛋白質系の低下による血管拡張反応の破綻が一因である可能性が示唆された。代償的にGiの減少による収縮低下をきたしていることが考えられた。II.心不全における末梢血管平滑筋のGTP結合蛋白質の役割心不全modelにおける末梢抵抗血管でα2-AR-Gi系の機能面を検討。ratの冠動脈結紮による心不全ratに選択的α2-agonistであるUK-14,304の濃度反応曲線を描き百日咳毒素(100nM/ml)処置後再びUK-14,304の濃度反応曲線を描き比較検討,心不全時、α2-ARを介する細動脈収縮機能は減弱するが、この変化にGiは関与せず、α2-AR自体の機能的変化と考えられた。Giの量的検討とGsの量的・機能的検討は現在検討中。【目的】高血圧・心不全における末梢血管のG蛋白質の役割の研究のうち、抑制性GTP結合蛋白質(Gi)は末梢細動脈

平滑筋においてα2-adrenoceptor(α2-AR)の刺激を伝達し血管収縮に関与し組織灌流の制御に重要な役割を果たしていることから、今年度は高血圧発症前の細動脈平滑筋Giの量的機能的変化から高血圧発症にGiが関与しているか否かを検討した。【方法】1.機能的:高血圧前期4-5週齢のSHRとWKYの精巣挙筋内径約100μmの細動脈の両端をピペットにて固定し血管径を測定した。β,α1遮断剤、内皮依存性拡張因子阻害剤存在下にα2-ARの刺激薬(UK-14,304:UK;10^<-9>-10^<-5>M)の濃度反応曲線(CRC)後、同じ血管にて百日咳毒素(PTX)を前処置後再度のUKのCRCを比較した。2.量的(免疫組織化学):灌流固定後の細動脈の10μmの切片に抗Gi抗体を反応させHRP標識2次抗体を反応後gray scaleにて半定量評価を行った。なおone-clip one kidney二次性高血圧ratも量的検討を加えた。【結果】PTX前のUK-CRCではSHRがWKYに比し10^<-8>Mより有意に減弱。PTX処置後はSHRとWKYは抑制され両群の有意差は消失。免疫組織ではSHRがWKYに比し有意にGi量は低下。二次性高血圧ratのGiはWKYと有意差なし。【総括】SHRのα2-AR-Gi系の収縮反応は高血圧発症前においてすでに機能的に減弱を認め、PTXでWKYとの反応の差がなくなることより、Giでの機能の低下が反応の低下の要因でありまた量的な減少が機能低下の一因と考えられた。二次的高血圧ではGi量の低下は認めず、SHRでは高血圧発症前よりα2-AR-Gi系の収縮反応が抑制されており、高血圧発症には関与しないが、交換神経の亢進による血管収縮亢進に対する代償機転の可能性が示唆された。I.高血圧の発症・維持におけるGsの役割高血圧発症前期の自然発症高血圧rat(SHR)を用いて免疫組織化学により末梢細動脈のGs蛋白質の量を正常血圧ラットさらに二次性高血圧ラットと比較検討。大動脈の変化も比較検討。機能的検討はβ-AR-Gs系の検討をin vitroにて検討。免疫組織学的検討:4,10,20週齢のSHRと対照のWKYを比較。右腎摘出左腎動脈狭窄ラット(RHR)も使用。一次抗体に抗Gsα,Giα蛋白質抗体、二次抗体にHRP標識抗ラビットIgGを用いた。機能的検討:右睾丸挙筋の径約100μmの最小動脈を摘出しピペットにて固定、血管径を計測。atenolol存在下のisoproterenolの濃度反応曲線をSHRとWKYを比較。結果;SHRは各週齢共にWKYと比べ免疫組織学的濃度が低下。RHRはWKYと有意差がなかった。大動脈ではSHR,WKY,RHRに有意差は認めなかった。Isoproterenolの反応曲線(β2-ARによる血管拡張反応)はSHRにおいて有意に低下。nitroprussideによる血管拡張反応はSHR,WKY間には有意差はなかった。SHRは高血圧発症以前の早期より末梢の細動脈レベルの平滑筋でのGs蛋白質量が低下し機能の低下が認められたことよりSHRの高血圧発症においてβ受容体-G蛋白質系の低下による血管拡張反応の破綻が一因である可能性が示唆された。II.心不全における末梢血管平滑筋のGTP結合蛋白質の役割心不全modelにおける末梢抵抗血管でα2-AR-Gi系の機能面を検討。
腫瘍細胞と微小環境のクロストークに着目した化学療法耐性機構の解明と治療への応用

本研究は、犬のリンパ系腫瘍に関して、細胞外小胞の一つであるエクソソームを介した腫瘍細胞と免疫細胞の相互作用という新たな観点からその病態を解析し、特に化学療法耐性獲得の分子機構を解明することを目指している。昨年度の研究成果から、抗がん剤に感受性のリンパ系腫瘍細胞株由来エクソソームと耐性のリンパ系腫瘍細胞株由来のエクソソームの間で、含有量に違いが認められる複数のmiRNAとタンパク質が同定された。そこで特にCD82というタンパク質に着目しその生物学的機能の解析を試みた。まずこのタンパク質をノックアウトした細胞株の樹立を試みたところ、ノックアウトによって腫瘍細胞の生存率が劇的に低下することが明らかとなりその後の解析が困難となった。これはCD82の発現が腫瘍細胞の生存・増殖に不可欠である可能性を示唆するものと考えている。この結果に基づき、このタンパク質をノックダウンした細胞株を樹立し、現在次世代シーケンサーなどを用いてCD82の発現低下が腫瘍細胞にどのような影響を与えるか検討を行っている。次にリンパ系腫瘍細胞株由来のエクソソームが免疫細胞に与える影響を検討した。まずは犬の末梢血液由来の単球を活性化し得られたマクロファージに対しエクソソームを添加したところ炎症性サイトカインの発現量に変化は認められなかった。これは試薬による単球の活性化が生理的な範囲を超えていたことによりエクソソームによるその阻害効果が認められなかった可能性を考えている。そのため末梢血液由来の単球を分離し、活性化させていない状態でエクソソームを添加したところ、炎症性サイトカインの発現量に有意な変化が認められた。この結果に基づき、エクソソーム添加によって単球におこる遺伝子発現変化を網羅的に検討すべく、次世代シーケンサーを用いた解析を現在行っている。前年度の成果に関しては学術論文としてすでに採択されており、その研究成果に基づく更なる研究も進展させる予定であったが、その適切な実験条件の検討に当初の予定より時間がかかった。そのため今年度は本研究の一部に関して国立台湾大学との共同研究とすることで進行を早めていく予定である。本年度は最終年度であり、以下の3つの研究計画を実施する予定である。まずは、抗がん剤感受性腫瘍細胞と抗がん剤耐性腫瘍細胞の間でエクソソーム中の含有量が有意に異なっていたCD82の生物学的機能の探索を継続する。次にリンパ系腫瘍細胞株由来エクソソームが免疫細胞に与える影響の検討とその責任分子の同定を継続する。健常犬から分離した単球に対して犬のリンパ系腫瘍細胞株から回収したエクソソームを添加した上での、網羅的な遺伝子発現解析を目的としたRNAシーケンシングはすでに前年度に終えており今年度はそのデータ解析を行う。また、人工抗原提示細胞を用い末梢血単核球由来CD8+リンパ球を活性化する条件を前年度から検討しており、これが終了次第リンパ系腫瘍細胞株由来エクソソームを添加することで認められる遺伝子発現プロファイルの変化を解析する。また、同様の手法で準備された免疫細胞にリンパ系腫瘍細胞株由来エクソソームを添加した上で、培養上清中の各種サイトカインを定量するとともに、細胞周期分布の解析やマクロファージの貪食能を解析しその変化を検討する。これらの研究の結果から、エクソソーム添加による免疫細胞の遺伝子発現プロファイルや表現型の変化において重要な細胞内シグナル経路を探索しエクソソーム側の責任分子を推定する。最後にエクソソームが持つ機能に重要な分子を標的とした新規治療法の開発を目指す。上記の研究から、エクソソームが持つ機能に重要な役割を果たすと推察された分子に対して、モノクローナル抗体を用いてその機能阻害を行った後にリンパ系腫瘍細胞と免疫細胞の相互作用における変化を検討することでその分子の生物学的機能の解析を行う。さらに免疫不全マウスを用いた犬リンパ系腫瘍モデルを作成した上で、標的分子に対してその機能の阻害効果を持つことが明らかとなった抗体を投与することで、その抗腫瘍効果を検討する。本年度はまず4つのリンパ系腫瘍細胞由来のエクソソームが含有する分子プロファイルの網羅的解析および細胞株間での比較を行った。まずmiRNAに関しては、エクソソームに特に多く含有されるmiRNAは4細胞株においてそのほとんどが共通していた。しかしながらmiRNA含有プロファイル全体を比較した場合、エクソソームに含有されるmiRNAのプロファイルは、由来する親細胞のプロファイルに類似しており各細胞株間で違いが認められた。特に薬剤感受性株由来のエクソソームと薬剤耐性株由来のエクソソームに含まれるmiRNAの含有量を比較した際に、これらの間で有意に含有量が異なる複数種のmiRNAが抽出された。これらのmiRNAは、腫瘍細胞の増殖などに関与する細胞内シグナルに関わるタンパク質の発現を制御するとされており、今後その生物学的機能と薬剤感受性との関連の解明を行う予定である。次にエクソソームに含有されるタンパク質に関しても解析した結果、やはり特に多く含有されるタンパク質は4細胞株においてほとんどが共通しており、細胞骨格に関わるタンパク質などが含まれていた。しかしながら、薬材感受性株由来のエクソソームと薬剤耐性株由来のエクソソームでは含有量が明らかに異なるタンパク質が同定された。このタンパク質は腫瘍細胞の転移などその挙動に関与することが明らかとなってきている分子であり、このタンパク質に関しても今後その生物学的機能と薬剤感受性との関連を詳細に検討する予定である。

上記のように、本年度実施した4つのリンパ系腫瘍細胞由来のエクソソームが含有する分子プロファイルの網羅的解析および細胞株間での比較によって薬剤感受性株および耐性株の間で含有量が明らかに異なるmiRNAおよびタンパク質が同定された。これらの分子は腫瘍細胞の増殖や転移に関与することが近年示唆され始めている分子であるものの、これまでに人医学および獣医学領域の双方において薬剤感受性との関連は詳細に検討されてきておらず、その生物学的機能の解明を行うことでさらに新たな知見が得られる可能性が高い。これらの知見はエクソソームの分子プロファイルという新たな観点から化学療法耐性に関する研究を遂行した成果と言える。現在この研究成果を学術論文として公表する準備を進めるとともに、すでにその生物学的機能の解明のための研究に着手している。本研究は、犬のリンパ系腫瘍に関して、細胞外小胞の一つであるエクソソームを介した腫瘍細胞と免疫細胞の相互作用という新たな観点からその病態を解析し、特に化学療法耐性獲得の分子機構を解明することを目指している。昨年度の研究成果から、抗がん剤に感受性のリンパ系腫瘍細胞株由来エクソソームと耐性のリンパ系腫瘍細胞株由来のエクソソームの間で、含有量に違いが認められる複数のmiRNAとタンパク質が同定された。そこで特にCD82というタンパク質に着目しその生物学的機能の解析を試みた。まずこのタンパク質をノックアウトした細胞株の樹立を試みたところ、ノックアウトによって腫瘍細胞の生存率が劇的に低下することが明らかとなりその後の解析が困難となった。これはCD82の発現が腫瘍細胞の生存・増殖に不可欠である可能性を示唆するものと考えている。この結果に基づき、このタンパク質をノックダウンした細胞株を樹立し、現在次世代シーケンサーなどを用いてCD82の発現低下が腫瘍細胞にどのような影響を与えるか検討を行っている。次にリンパ系腫瘍細胞株由来のエクソソームが免疫細胞に与える影響を検討した。まずは犬の末梢血液由来の単球を活性化し得られたマクロファージに対しエクソソームを添加したところ炎症性サイトカインの発現量に変化は認められなかった。これは試薬による単球の活性化が生理的な範囲を超えていたことによりエクソソームによるその阻害効果が認められなかった可能性を考えている。そのため末梢血液由来の単球を分離し、活性化させていない状態でエクソソームを添加したところ、炎症性サイトカインの発現量に有意な変化が認められた。この結果に基づき、エクソソーム添加によって単球におこる遺伝子発現変化を網羅的に検討すべく、次世代シーケンサーを用いた解析を現在行っている。前年度の成果に関しては学術論文としてすでに採択されており、その研究成果に基づく更なる研究も進展させる予定であったが、その適切な実験条件の検討に当初の予定より時間がかかった。そのため今年度は本研究の一部に関して国立台湾大学との共同研究とすることで進行を早めていく予定である。
NTCP吸着後のB型肝炎ウイルス細胞進入機構の解析

B型肝炎ウイルス(HBV)は、感染レセプターであるNTCPに吸着後、多段階的な制御機構により細胞内へ侵入すると考えられるがその詳細な機構は不明である。申請者はHBV感染感受性に影響する因子としてホルボールエステルおよびadhesion型Gタンパク質共役受容体(GPCR)を得た。今後の解析でホルボールエステルの標的因子を特定し、この標的因子あるいはGPCRのHBV侵入過程における役割を解析することで新たなHBV侵入制御機構を明らかにする。さらにこれら因子がHBV感染の組織・種特異性に寄与するか否かを評価し、HBV宿主域決定への意義を明らかにする。
運動トレーニングのアディポネクチン受容体転写因子に対する効果

本年度は主に運動やトレーニングによって転写因子がどのように変化するかを把握し、その変化がアディポネクチン受容体の遺伝子発現の調節に与える影響とそのメカニズムを厳密に検討する。1.C57BL6マウスを用い、急性運動をさせ転写因子の変化を検討する。結果:急性運動により、2時間後の血中遊離脂肪酸濃度が著しく上昇し、同時に血中インスリン濃度と血糖値が減少したことが認められた。そこで、急性運動がインスリン感受性を改善するメカニズムにアディポネクチン受容体の発現が関わるか否かを検証したところ、骨格筋と肝臓のアディポネクチン受容体1のmRNAレベルの上昇が認められた。さらに、アディポネクチン受容体の転写因子と言われているFoxolも、骨格筋では約10倍、肝臓では約2倍mRNAレベルが上昇した。2.糖尿病モデルマウスKKAyを用い、8週間のトレーニングを行い転写因子の変化を検討する。結果:8週間のトレーニングによって、糖尿病モデルマウスKKAyの骨格筋と肝臓のアディポネクチン受容体1のmRNAレベルが増加した。しかしながら、転写因子であるFoxolの変化は認められなかった。3.C57BL6マウスに高脂肪食を与え、肥満とインスリン抵抗性を引き起こしてから8週間のトレーニングを行い転写因子の変化を検討する。結果:2ヶ月の高脂肪食を与えた結果、C57BL6マウスの体重が著しく増加し、インスリン感受性が低下したことが認められた。そこで、8週間のトレーニングを行った結果、インスリン感受性を改善し、骨格筋と肝臓のアディポネクチン受容体1のmRNAレベルが増加した。しかしながら、KKAyマウスと同様に、転写因子であるFoxolのmRNAレベルの変化は見られなかった。これらの結果から、運動によってアディポネクチン受容体1を制御する転写因子はFoxol以外にも存在することが示唆された。4.転写因子SP1とアディポネクチン受容体結果:培養細胞C2Cl2(マウス骨格筋細胞)とHEPG2(肝細胞)を用い、アディポネクチン受容体のプロモーター解析を行ったところ、基本転写因子SP1がアディポネクチン受容体の発現に不可欠であることが分かった。また、アデノウィルスを用い、細胞のSP1の発現をノックダウンしたところ、アディポネクチン受容体1の発現が減少したことが認められた。現在、アデノウィルスsiRNASP1をC57BL6マウスに投与(筋肉投入と静脈投入)し、筋肉と肝臓のアディポネクチン受容体の発現の変化を検討中。遺伝子発現に関わる転写因子がアディポネクチン受容体調節に与える影響を調査し、アディポネクチン受容体の遺伝子発現量増加のメカニズムを以下の順に検討した。1.インスリン抵抗性に関わる臓器である骨格筋と肝臓の培養細胞を用い、Reporter gene assayにて、アディポネクチン受容体の転写調節領域の活性を解析した。1)アディポネクチン受容体1の転写開始から上流に2000bp DNAをCloningし、骨格筋(C2C12)と肝臓(HepG2)の培養細胞を用い、Promoter活性を測定し、それぞれのタイプ細胞では高い活性が観察できた。2)その活性責任領域が果たして2000bpのどこに存在するのか特定するため、2000bpのPromoterをさらに500bpずつに分割作成し、それぞれの活性を測定したところ、転写開始から上流500bpまでに活性が見られた。3)その500bpを100bpずつ5つに欠損させて活性を計ったところ、転写開始点から上流に141bpに活性が見られた。1)Report gene assayで得た責任領域のDNA配列をDATAbaseにて照らし合わせたところ、そのDNA断片にCCAATボックスとGCボックスが存在し、それぞれに転写因子であるNF-YとSP-1と結合しうることが分かった。2)転写因子であるNF-YをC2C12とHepG2に転写活性責任領域と思われる転写開始点から上流に141bpを共強制発現させたところ、NF-Yはその領域に影響がないことが分かった。3)SP-1に関して、Gene Shift assayとCHIP assayを行った結果、その責任領域に結合することが分かった。今現在、Adenovirus-siRNA-SP-1を作成中で、この転写因子を細胞あるいは個体にて、SP-1をKnock-downすることによって、アディポネクチン受容体の遺伝子発現に影響あるがどうかをチェックしているところである。3.主に運動やトレーニングによって転写因子がどのように変化するかを把握し、その変化がアディポネクチン受容体の遺伝子発現の調節に与える影響とそのメカニズムを厳密に検討する。さらに、先行研究によって(Tsuchida A(2004)Insulin/Foxol pathwayregulatesexpreesion levels of adiponectinreceptors and adibonectin sensitivity. Journal of Biological Chemistry 279:30817-30822.)アディポネクチン受容体Promoterに結合しうる転写因子はFOXO1があることが明らかになっているため、動物を用いて実験を行った。同一遺伝的背景を持つ8週齢のC57BL6マウスに一過性運動をさせたところ、骨格筋、肝臓のAdipoR1mRNAの発現量は有意に増加した。さらに、同時に骨格筋と肝臓のFOXO1の遺伝子発現量がそれぞれ10倍、2倍の増加が確認された。このことから、運動が骨格筋や肝臓の転写因子FOXO1の発現を何らかの理由で増加させ、その結果、アディポネクチン受容体の発現を引き起こすことが考えられる。この研究成果は既にExperimental and clinical endocrinology & diabetesに掲載されている。

本年度は主に運動やトレーニングによって転写因子がどのように変化するかを把握し、その変化がアディポネクチン受容体の遺伝子発現の調節に与える影響とそのメカニズムを厳密に検討する。1.C57BL6マウスを用い、急性運動をさせ転写因子の変化を検討する。結果:急性運動により、2時間後の血中遊離脂肪酸濃度が著しく上昇し、同時に血中インスリン濃度と血糖値が減少したことが認められた。そこで、急性運動がインスリン感受性を改善するメカニズムにアディポネクチン受容体の発現が関わるか否かを検証したところ、骨格筋と肝臓のアディポネクチン受容体1のmRNAレベルの上昇が認められた。さらに、アディポネクチン受容体の転写因子と言われているFoxolも、骨格筋では約10倍、肝臓では約2倍mRNAレベルが上昇した。2.糖尿病モデルマウスKKAyを用い、8週間のトレーニングを行い転写因子の変化を検討する。結果:8週間のトレーニングによって、糖尿病モデルマウスKKAyの骨格筋と肝臓のアディポネクチン受容体1のmRNAレベルが増加した。しかしながら、転写因子であるFoxolの変化は認められなかった。3.C57BL6マウスに高脂肪食を与え、肥満とインスリン抵抗性を引き起こしてから8週間のトレーニングを行い転写因子の変化を検討する。結果:2ヶ月の高脂肪食を与えた結果、C57BL6マウスの体重が著しく増加し、インスリン感受性が低下したことが認められた。そこで、8週間のトレーニングを行った結果、インスリン感受性を改善し、骨格筋と肝臓のアディポネクチン受容体1のmRNAレベルが増加した。しかしながら、KKAyマウスと同様に、転写因子であるFoxolのmRNAレベルの変化は見られなかった。これらの結果から、運動によってアディポネクチン受容体1を制御する転写因子はFoxol以外にも存在することが示唆された。4.転写因子SP1とアディポネクチン受容体結果:培養細胞C2Cl2(マウス骨格筋細胞)とHEPG2(肝細胞)を用い、アディポネクチン受容体のプロモーター解析を行ったところ、基本転写因子SP1がアディポネクチン受容体の発現に不可欠であることが分かった。また、アデノウィルスを用い、細胞のSP1の発現をノックダウンしたところ、アディポネクチン受容体1の発現が減少したことが認められた。現在、アデノウィルスsiRNASP1をC57BL6マウスに投与(筋肉投入と静脈投入)し、筋肉と肝臓のアディポネクチン受容体の発現の変化を検討中。