hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
高濃度フッ化物と金属イオンによる根面う蝕抑制と過石灰化の評価

高齢者の根面う蝕の抑制にフッ化物洗口剤の有効性が報告されている。また、38%フッ化ジアンミン銀は、その高濃度フッ化物と銀との作用により、高齢者の根面う蝕の進行抑制への応用が期待されている。本研究では、フッ化物洗口剤に含まれるフッ化物濃度(450ppmF、900ppmF)の使用が、コンポジットレジン修復時の接着に及ぼす影響について検討した。その結果、450,900ppmFともに接着強さへの影響はないが、より高濃度(9000ppmF)のフッ化物塗布では接着の低下が認められた。象牙質表面のXAFS解析結果から低濃度ではフルオロアパタイトの形成が確認され、9000ppmFではフッ化カルシウムの析出が認められた。38%フッ化ジアンミン銀の根面象牙質への塗布について、その脱灰抑制効果をマイクロCTで検討した。その結果、フッ化ジアンミン銀は高い脱灰抑制効果を示し、その効果は高濃度フッ化ナトリウム(9000ppmF)と同程度であった。またフッ化ジアンミン銀の抗菌性について検討するため、ウシ象牙質面にフッ化ジアンミン銀を塗布した後、人工口腔装置内でS. mutansによるバイオフィルムを形成させた。その結果、フッ化ジアンミン銀は象牙質面上へのバイオフィルムの付着を著しく抑制することがわかった。一方、フッ化ジアンミン銀による象牙質の変色が問題となる。我々は抗酸化作用を有するグルタチオンに着目し、フッ化ジアンミン銀と組み合わせることによる変色抑制への効果を検証した。ウシ象牙質に対して38%フッ化ジアンミン銀と20%グルタチオン混合溶液を塗布したところ、象牙質の経時的変色は認められるもののグルタチオン混合によって変色の程度を低下できることがわかった。分担研究者である二階堂徹は、東京医科歯科大学を退職し、朝日大学歯学部に在籍中であるが、東京医科歯科大学の非常勤講師として研究を行う。そのため、研究体制の見直しを行い、月2-3日程度研究遂行、指導、打ち合わせのために東京医科歯科大学を訪問する予定である。研究計画は概ね予定通りに進んでいる。38%フッ化ジアンミン銀の根面う蝕の抑制効果については、フッ化物による歯質の脱灰抑制および再石灰化効果が明らかとなった。また銀の効果としてバイオフィルム形成抑制や抗菌性の効果が明らかとなった。一方、サホライド塗布象牙質においては変色が問題となり、特に脱灰象牙質で変色が強いことがわかった。この変色の要因の一つとして銀の脱灰コラーゲンへの親和性の高さが挙げられる。そのためサホライドの特徴をう蝕治療に応用するのが今後の研究を推進していくための方策である。ウシ歯に対して既報(Joves GJ et al., Dent Mater J, 2013)に準じて人工う蝕モデルを作製し、この人工う蝕象牙質に対して38%フッ化ジアンミン銀を塗布して黒変を確認する。この黒変部を除去し、除去後の象牙質表層から深層部における特性についてSEMとマイクロCT、微小硬さ試験を用いて解析する。一方、臨床で一般に使用されているう蝕検知液を用いて人工う蝕象牙質に対して染色法を用いてう蝕部分を除去し、同様に解析し、前者と比較検討する。さらにう蝕除去後の象牙質に対して各種ボンディングシステムを用いて接着させ、微小引張接着試験により接着性能を評価する。また、う蝕除去面に対する抗菌性について人工口腔装置を用いてバイオフィルムを形成させ、さらにLive/Dead観察を行い、検討する。これにより根面う蝕のサホライド塗布による変色を応用した新しいう蝕検知法およびコンポジットレジン修復技法の妥当性について検証する。わが国は、超高齢社会を迎え、高年者の保有歯数の増加に伴って、歯根面に発生する“根面う蝕"が急増し、臨床において根面う蝕に対する治療が増加している。こうした社会的な背景とともに、最近、高齢者・要介護者の根面う蝕の1次予防としてフッ化ジアンミン銀の歯面塗布による有効性が注目されている。フッ化ジアンミン銀(製品名:サホライド、ビーブランド・メディコーデンタル)は、山賀らにより開発され、う蝕の進行抑制に有効な薬剤であることが知られている。そのう蝕抑制メカニズムについては、不明な点も多く、さらにう蝕病変を黒変させるという審美上の問題が懸念される。今年度は、まずフッ化ジアンミン銀、およびそれと同等の高濃度フッ化物と金属イオン(Zr)を有する各種溶液を試作し、その脱灰象牙質に対する再石灰化効果をTMR法を用いて検討し、さらに脱灰コラーゲンの変性抑制効果についても検討を加えた。その結果、試作材料はそれぞれコントロール群に比べて効果があることがわかったが、フッ化ジアンミン銀は再石灰化促進と脱灰コラーゲンの変性抑制のいずれにおいても高い有効性を示すことがわかった。一方、サホライド塗布後の象牙質に対する接着性についても検討を加えた。すなわちサホライドとその10倍希釈液であるサホライドRCについて象牙質表面に塗布後、2ステップセルフエッチングシステムであるクリアフィルメガボンド(クラレノリタケデンタル)を用いて接着させ、微小引張接着強さ試験を行った。その結果、サホライド塗布により接着強さは低下したが、サホライドRC塗布では接着強さの低下はないことが明らかとなった。本課題に関連する以下の学会発表1題と論文発表1報を行っている。

1.学会発表エイコーコー,松井七生子,中元絢子,二階堂徹,田上順次.フッ化ジアンミン銀の塗布が象牙質引張り接着強さに及ぼす影響、第35回日本接着歯学会学術大会、北海道大学学術交流会館、平成28年12月3日.2.論文発表わが国は超高齢社会を迎えており、また8020運動の効果もあって高齢者における残存歯数は増加している。その反面、高齢者における根面う蝕の増加が問題となり、その対策は喫緊の課題である。本研究においては根面う蝕の予防とう蝕の進行抑制のため、高濃度フッ化物と金属イオンの効果に着目して研究している。本年は、各種濃度のフッ化ナトリウムの根面う蝕塗布が象牙質の接着に及ぼす影響について、NaFとKFに着目し、接着試験、SEMによる耐酸ー塩基抵抗層(ABRZ)の観察、XAFSを用いた象牙質表面分析を行った。その結果、フッ素イオン濃度の増加により接着強さの低下が認められ、さらにその傾向はNaFで顕著であった。SEM観察の結果、フッ化物の根面塗布によるABRZのスロープ形成が認められた。さらにXAFSによる表面分析の結果、低濃度フッ化物の塗布においてはフルオロアパタイトの形成が認められたのに対して、高濃度フッ化物塗布ではフッ化カルシウムの沈着が認められた。さらにフッ化ジアンミン銀の象牙質塗布による象牙質の着色の程度について測色計を用いて検討した。象牙質表面の研削面、またはEDTAで脱灰した面に対してフッ化ジアンミン銀を塗布し、その後遮光の有無による着色の程度を測色計を用いて検討した。その結果、象牙質の着色の程度は、遮光の有無、象牙質の脱灰の有無によって影響を受け、遮光なしで脱灰した象牙質において最も影響があることがわかった。さらに変色を抑制する方法を探索し、KIあるいはグルタチオンの塗布が変色を低減させるのにゆうこうであることがわかった。フッ化物濃度の象牙質への接着への影響について詳細に検討することができた。また、フッ化ジアンミン銀の変色への影響についてKI,グルタチオンの効果について明らかにすることができた。本研究課題の進捗状況はおおむね良好と判断している。高齢者の根面う蝕の抑制にフッ化物洗口剤の有効性が報告されている。また、38%フッ化ジアンミン銀は、その高濃度フッ化物と銀との作用により、高齢者の根面う蝕の進行抑制への応用が期待されている。本研究では、フッ化物洗口剤に含まれるフッ化物濃度(450ppmF、900ppmF)の使用が、コンポジットレジン修復時の接着に及ぼす影響について検討した。その結果、450,900ppmFともに接着強さへの影響はないが、より高濃度(9000ppmF)のフッ化物塗布では接着の低下が認められた。象牙質表面のXAFS解析結果から低濃度ではフルオロアパタイトの形成が確認され、9000ppmFではフッ化カルシウムの析出が認められた。38%フッ化ジアンミン銀の根面象牙質への塗布について、その脱灰抑制効果をマイクロCTで検討した。その結果、フッ化ジアンミン銀は高い脱灰抑制効果を示し、その効果は高濃度フッ化ナトリウム(9000ppmF)と同程度であった。またフッ化ジアンミン銀の抗菌性について検討するため、ウシ象牙質面にフッ化ジアンミン銀を塗布した後、人工口腔装置内でS. mutansによるバイオフィルムを形成させた。
レジスチンは歯周炎の新規モジュレータ-か

本研究の目的は,糖尿病と関連のあるアディポサイトカインであるレジスチンの歯周炎における役割を検討することである。歯肉溝滲出液(GCF)中のレジスチンレベルを調べると,歯周炎患者と糖尿病関連歯周炎患者のレジスチンレベルは健常者に比べて高かった。また, P. gingivalis由来のリポ多糖(P-LPS)はヒト好中球からのレジスチンの遊離を促進し,その遊離促進はアクチンの重合阻害剤によって阻害された。一方で,マクロファージ様に分化させたヒト単球系細胞株U937におけるレジスチン発現は,終末糖化産物(AGEs)とP-LPSによる著明な影響を受けなかった。これらの結果から,レジスチンは歯周病における炎症のモジュレーターである可能性が示唆された。レジスチンはアディポサイトカインの1つであり、インスリン抵抗性を調節するタンパクとして発見され、糖尿病合併症の炎症病変の発症にも関与している。これまでにレジスチンが歯肉溝滲出液(GCF)中に存在し、歯周炎罹患部位のGCF中に高濃度に存在することを共同研究者らが見出している。歯周炎におけるレジスチンの関与・役割については他に報告がなく全く不明である。本年度の研究では、歯周組織におけるレジスチンの発現調節機構と遊離機構について明らかにした。歯周炎罹患部位のGCF中のレジスチン濃度が高いことから、単球/マクロファージや好中球などの免疫担当細胞から産生されることが想定された。ヒト末梢血より分離した好中球を用い、歯周病原性細菌P.gingivalis由来lipopolysaccharide(P.g-LPS)が好中球からのレジスチンの遊離を増加するかどうか調べた。培養上清中および好中球よりタンパク画分を抽出し、ウェスタンブロット解析およびELISA法により定量測定を行い、蛋白レベルで検討を行った。好中球をP.g-LPSで処理すると、細胞上清中のレジスチンは刺激30分後に対照群の3倍の増加を示した。またこのレジスチンの遊離はP.g-LPSの濃度に依存して上昇した。さらに、レジスチンの遊離促進の機構について調べた結果、アクチンの重合阻害剤によって抑制されることが明らかになった。また、歯周組織を構成する細胞のセルラインを用いてレジスチン発現をmRNAレベルで確認したところ、歯肉上皮細胞、歯肉線維芽細胞には発現が認められず、骨芽細胞での発現も弱かった。しかし、単球では好中球と同様に発現が認められた。以上の結果により、歯周炎罹患部位において病原因子のP.g-LPSが好中球や単球からのレジスチン遊離を促進させ、その結果、GCF中のレジスチンレベルが高まることが推察された。レジスチンはインスリン抵抗性を調節するタンパクとして発見ざれ,糖尿病合併症の炎症病変の発症に関与するとされている。これまでにレジスチンが歯周炎罹患部位の歯肉溝惨出液(GCF)中に高濃度に存在することを共同研究者らが見出しており,昨年度の研究ではヒト末梢血から採取した好中球を歯周病原性細菌P. gingivalis由来lipbpolysaccharide (P.g-LPS)で処理すると培養上清中へのレジスチン遊離が促進されるこどを見出した。本年度の研究では,好中球と同様にレジズチンmRNAの発現を認めた単球/マクロファージ培養系を用い,糖尿病などの慢性的な高血糖状態で産生される後期糖化反応生成物(advanced glycation endproducts ; AGEs)を処理に加え,糖尿病関連歯周炎におけるレジスチンの発現や役割について検討した。単球系細胞株U937の培養系にAGEsを添加すると短時間で炎症性サイトカイン(IL-6,TNF-a,IL-8)やケモカイン(MCP-1)のmRNA発現上昇を認めたが,レジスチンの発現に著明な変化は,なかづた。また,AGEsとP.g-LPSを同時に添加して培養した場合も,同様にレジスチンの発現に変化は認めなかった。昨年度の研究で,歯肉上皮細胞,歯肉線維芽細胞ではレジスチンの発現が無く,骨芽細胞でも発現が弱いのに対し好中球と単球分は発現を認めたことから,GCF中のレジスチンは好中球と単球(主に好中球)に由来すると考えられる。今後,これらの免疫担当細胞がレジスチンを発現するメカニズムや産生されたレジスチンが歯周組織に及ぼす影響を追究することで,糖尿病関連甫周炎の病態解明の一助となるだろう。
重粒子線による突然変異誘発と染色体損傷との相関性に関する研究

重粒子線を含む高LET放射線によるヒト正常細胞の突然変異誘発効果とクロマチン損傷誘発の相関関係を調べ、ヒト細胞を突然変異誘発に導くクロマチン損傷の実体、クロマチンレベルでの誘発機構解明を最終目的として、放射線医学総合研究所の重粒子線がん治療用装置(HIMAC)によって供給された、複数の異なるエネルギーの炭素イオンビームを用いて、今年度は以下の実験を実施した。(1)ヒト正常細胞のhprt遺伝子座をターゲットとした突然変異誘発の線量効果関係のLET依存性、およびX線に対するRBEの算定。(2)早期染色体凝縮法(PCC法)を用いて検出した、Gl期の細胞における修復されないクロマチン切断誘発の線量効果関係のLET依存性、およびX線に対するRBEの算定。(1)の突然変異誘発効果のLET依存性に関して得られた結果は、今回用いた3種類の異なるLTEの炭素イオンビーム(LET=13、77、100keV/μm)に対して、線量効果関係は03Gyの範囲でほぼ直線的に上昇し、LETが高くなるに従って、突然変異誘発率も高くなることが判った。200kVのX線による線量効果関係に対して、10x10^<-6>の突然変異誘発率を与える点で比較したRBEの値は、100keV/μmの炭素イオンビームが8.3、77keV/μmの炭素イオンビームが3.8、13kecV/μmの炭素イオンビームが1.4であると算定した。(2)PCC法で検出した修復されないクロマチン切断誘発の線量効果関係は、03Gyの範囲でほぼ直線的となり、そのLET依存性は、突然変異と同様炭素イオンビームのLET値が高くなるにしたがって誘発頻度は高くなることが判った。今回用いた4種類の異なるLETの炭素イオンビーム(LET=13、40、77、101keV/μm)について、X線に対しするRBEの値は、101kcV/μmの炭素イオンビームが5.8、77eV/μmの炭素イオンビームが4.8倍、40keV/μmの炭素イオンビームが2.6、13keV/μmの炭素イオンビームで2.2であると算定した。X線やガンマ線のような電磁波放射線とはそのエネルギー付与構造の点において、根本的に異なるタイプの重粒子線によるヒト培養細胞の突然変異誘発効果の特性を、細胞レベルの応答として突然変異誘発頻度の線質依存性(重粒子線とX線による違い、重粒子線におけるLET依存性)を調べ、また染色体・クロマチンレベルの応答として放射線損傷の修復性とその結果生じた遺伝的に安定に保持される染色体・クロマチン損傷(修復後になおも存在している細胞を死に至らしめない損傷)誘発の線質依存性を調べ、細胞レベル、染色体・クロマチンレベルの両者の生物効果の関連性の観点から、重粒子線による突然変異誘発のメカニズムを明らかにすることを目的とする。平成9年度においては、放射線医学総合研究所の重粒子線がん治療用装置(HIMAC)によって加速された複数のLETの炭素イオンビームと200kVのX線による、(1)ヒト正常細胞のHPRT遺伝子座の突然変異誘発効果の線量効果関係、(2)早期染色体凝縮法PCC法)を用いてG1期の細胞における修復されないクロマチン切断誘発の線量効果関係修復性、を検討した。まず、ヒト正常細胞における生き残った細胞あたりの突然変異誘発効果の線量効果関係から、誘発頻度はX線よりも炭素イオンビームの方が高く、炭素イオンビームでもLETの高い方が誘発率が高いことがわかった。10x10^<-6>の突然変異誘発率を与える点でのX線に対するRBEの値は、77keV/μmの炭素イオンビームが3.8、13keV/μmの炭素イオンビームが1.4であると算定した。次に、PCC法で求めた修復されないクロマチン切断誘発効果のLET依存性は、突然変異と同様炭素イオンビームのLET値が高くなるにしたがって誘発頻度は高くなり、X線に対して77keV/μmの炭素イオンビームで4.8倍、l3kcV/μmの炭素イオンビームで2.2倍高頻度であることが判った。

(2)PCC法で検出した修復されないクロマチン切断誘発の線量効果関係は、03Gyの範囲でほぼ直線的となり、そのLET依存性は、突然変異と同様炭素イオンビームのLET値が高くなるにしたがって誘発頻度は高くなることが判った。今回用いた4種類の異なるLETの炭素イオンビーム(LET=13、40、77、101keV/μm)について、X線に対しするRBEの値は、101kcV/μmの炭素イオンビームが5.8、77eV/μmの炭素イオンビームが4.8倍、40keV/μmの炭素イオンビームが2.6、13keV/μmの炭素イオンビームで2.2であると算定した。
アクアポリン2のトラフィッキングに重要な分子の同定とトラフィッキング機構の解明

腎臓集合管細胞で、バソプレッシンによって細胞内から細胞膜へ移行するアクアポリン2について、269番目のセリン(S269)のリン酸化・脱リン酸化と細胞内トラフィッキングに関する解析を、ラットと培養細胞でおこなった。Ser269のリン酸化を認識する抗体について、その特異性を十分に確認し、S269は間違いなく細胞内でリン酸化されることと、脱リン酸化されなくても細胞内へ戻ることが確認できた。また、脱リン酸化酵素としてカルシニューリンの可能性を考え、シクロスポリンによってカルシニューリンを阻害した状態ではS269の脱リン酸化が阻害されるか否かの解析を試みたが、条件設定において更なる検討が必要となった。本研究の目的は、腎臓の細胞膜水チャネルであるアクアポリン2のトラフィッキング機構を解明することである。26年度はアクアポリン2のC末領域のセリンのリン酸化と細胞内分布の様子を、培養細胞系で検討した。腎臓での結果をもとに、アクアポリン2のC末に存在する4つのセリンのうち256番目のセリン(S256)と269番目のセリン(S269)にとくに注目した。腎臓では、バソプレッシンによってS269が急激にリン酸化され、アクアポリン2が細胞膜へ移行することから、これまで示唆されていたS256よりもS269のリン酸化がアクアポリン2の細胞膜への移行には重要であると考えた。セリンのアラニン置換体、アスパラギン酸置換体はそれぞれ非リン酸化、リン酸化擬似体としてはたらくことを用いてS269D変異体遺伝子、S256A-S269D変異体遺伝子をLLC-PK1細胞に導入し、解析した。その結果、S269Dでもバソプレッシンの作用が無ければ細胞膜へは行かず、S256A-S269Dではバソプレッシンの作用があっても細胞膜へ行かないことが判明した。つまり、バソプレッシンによるアクアポリン2の細胞膜への移行に関してはS269よりもS256のリン酸化が重要であるという結果であった。これらの結果を含めて、腎臓でのバソプレッシンによるアクアポリンの調節について、総説としてまとめることができた。加えて、26年度は腎臓の近位尿細管に発現するアクアポリン11についても解析をおこなった。アクアポリン11は遺伝子をノックアウトすると嚢胞腎を形成するが、その機序が不明である。アクアポリン11は腎臓以外にも生体内に広く分布すると考えられるが、特異抗体の性能にやや問題があり、腎臓での細胞内レベルでの局在を含めて生体内分布の解析が進んでいない。そこで、候補となる抗原部位を複数試し、さらなる抗体の作製を試みた。27年度は、アクアポリン2の269番目のセリンのリン酸化が、バソプレシンに反応して細胞内でおこり、細胞膜へ移行すること、またバソプレシン拮抗薬を投与すると急激に細胞内へ取り込まれるが、その過程で脱リン酸化がおこることを原著論文としてまとめ、投稿した。また、追加実験として、リン酸化アクアポリン2に対する抗体の特異性を検討し、再投稿の準備をおこなった。また、アクアポリン2を含めて、腎臓でのアクアポリン全般について総説として学術雑誌に発表し、国際会議においてはキーノートプレナリーレクチャーとして成果を発表した。加えて、27年度は、アクアポリン2とともに腎臓の集合管細胞で、水の再吸収にはたらくアクアポリン3について、胎仔マウスの造血細胞でも発現するという興味深い現象をみつけたので解析した。胎仔期の造血はまず卵黄嚢で始まり肝臓へ移行し、生まれる直前に骨髄へ移行する。生後骨髄での造血細胞、とくに赤芽球から赤血球ではアクアポリン1の発現がみられることはよく知られているが、造血がおこなわれているマウス胎生13日や16日の肝臓をRT-PCRと免疫組織化学で解析したところ、アクアポリン3の発現が多くの細胞でみられることが判明した。肝芽細胞と造血細胞とを判別するため、肝芽細胞マーカーであるアルファフェトプロテインや、赤芽球マーカーであるアルファ1スペクトリンとの二重染色をおこなったところ、アクアポリン3陽性細胞は肝芽細胞ではなく、ほとんどは赤芽球であることが判明した。また、アクアポリン1についても解析した結果、胎生13日ではほとんど発現がみられなかったが、16日ではアクアポリン3と同程度に陽性細胞が認められた。つまり、胎仔造血細胞ではアクアポリン3は早期から必要とされるが、アクアポリン1は遅れて必要となることがわかった。造血環境により必要とされるアクアポリンのアイソフォームが異なると考えられる。アクアポリン2のリン酸化の変化について、これまでの成果を原著論文としてまとめる過程で、確認のための実験等をおこない、時間がかかってしまった。また、追加実験をおこない再投稿の準備をおこなった。アクアポリン2のトラフィッキング機構の解明についてはやや遅れているが、アクアポリン3について新たな知見を得ることができた。他の研究グループの報告では、アクアポリン2の269番目のセリン(Ser269)のリン酸化は集合管細胞の頂部細胞膜上でおこり、脱リン酸化されたアクアポリン2が細胞内へ取り込まれるとされてきた。しかし我々は細胞内でSer269がリン酸化され、頂部膜にトラッフィキングされること、さらに脱リン酸化されなくてもアクアポリン2は細胞内へ取り込まれることを示し、論文投稿した。

自作抗体の特異性を指摘されたため、追加の確認実験をおこない、特異性に疑いないこと、他の研究者が用いている市販抗体よりも特異性において優れていることがわかった。論文は再度の投稿準備中である。また28年度にはSer269の脱リン酸化について注目した解析をおこなった。Ser269がリン酸化された状態でもアクアポリン2は細胞内へ取り込まれるが、バソプレシン拮抗薬の投与により急激に脱リン酸化されることも事実であり、脱リン酸化酵素の重要性が示唆される。過去に脱リン酸化酵素であるカルシニューリンのノックアウトマウスではアクアポリン2のトラフィッキングに変化がおこることが示されていることから、カルシニューリンに注目した。5%グルコース-1%エタノール水溶液を一晩飲ませて水負荷状態にしたラットに、カルシニューリン阻害薬であるシクロスポリンを腹腔投与し、30分後にバソプレシン投与、さらにその30分後にバソプレシン拮抗薬を投与し、30分後に腎臓をサンプリングした。コントロールではバソプレシンでリン酸化されたSer269はバソプレシン拮抗薬投与後30分ではほとんどが脱リン酸化されるが、カルシニューリンが阻害されると脱リン酸化が抑制されると推測した。しかし実際にはシクロスポリン投与の影響は明らかとならなかった。例数が少ないことと、シクロスポリンがカルシニューリンを阻害したことが確認できていないことから、29年度はさらに検討をおこなう。本研究では、さらなる解析をおこなううえでもSer269リン酸化特異抗体が重要であるが、論文として投稿した際に特異性についての指摘を受け、確認実験に時間がかかってしまった。前年度までの研究で、腎臓集合管のアクアポリン2(AQP2)はバソプレシン(VP)により細胞内でSer269がリン酸化されて細胞膜へ移行し、VP拮抗薬を投与すると、脱リン酸化されなくても細胞内へ取り込ませることを示した。学術雑誌に投稿した際に、自作のリン酸化Ser269抗体(pS269抗体)の特異性についての指摘を受けたために、入念に確認実験をおこなった。その結果、VP投与直後の細胞内のシグナル、VP投与30分後の細胞膜のシグナル、VP投与30分後にVP拮抗薬投与後の細胞内のシグナルのいずれもホスファターゼ処理で完全に消えたことから、自作pS269抗体の特異性に問題なしとの結論に至り、学術誌に掲載された。さらに29年度は、脱リン酸化酵素であるカルシニューリンがSer269の脱リン酸化に関与するのではないかとの仮説に基づき、研究を継続した。前年度はラットで検討したが、今年度は培養細胞を用いた。まず、すでに我々が確立したラットAQP2を遺伝子導入した、ブタ腎臓由来LLC-PK1培養細胞で、VP処理後にVP拮抗薬を作用させ、生体内と同様に脱リン酸化が起こるか否かを免疫染色で検討した。しかし、VP拮抗薬を加えて60分経過しても、脱リン酸化があまり進まないという結果であった。LLC-PK1細胞に加え、マウス腎臓髄質内帯集合管由来のmIMCD3細胞を用いて同様の実験を試みたが、VPによるSer269のリン酸化がみられず、VP受容体を発現しない細胞であることが示唆され、本研究目的では使用できないことがわかった。培養細胞での実験には更なる条件検討を要することとなった。また、29年度は学外研究者との共同研究で、尿中エクソソームのAQP2のリン酸化についての検討をおこなった。我々はリン酸化Ser256抗体(pS256抗体)も作製したので、特異性の検討を十分におこない解析に用いた。
不斉自己触媒反応を活用したキラル化合物の不斉起源の研究

ピリミジルアルカノールの不斉自己触媒反応(そ合反応)は,キラル化合物が自己を生成する触媒として作用して自己増殖しつつ,鏡像異性体過剰率を向上させる。不斉の起源の解明は多くの興味を集めている。そ合反応を用いてキラル化合物の不斉起源の研究を行った。アキラルな無機結晶である石膏のエナンチオトピック表面,窒素同位体によるキラルジアミン,アキラルな化合物が形成するキラル結晶を,鉱物であるレトゲルサイトのキラル結晶,およびキラルなメソポーラスシリカ等が,不斉自己触媒反応の不斉起源として有効に作用することを見出した。さらに,不斉自己触媒の構造を解明し,温度によるエナンチオ選択性の逆転現象を見出した。ピリミジルアルカノールの不斉自己触媒反応は,ピリミジンカルバルデヒドとジイソプロピル亜鉛の反応において,生成物が自己を合成する不斉触媒となり,キラル化合物が不斉自己増殖する独創的はものである。まずX線結晶構造解析による触媒構造の解明を行い,アルカノール亜鉛アルコキシドが亜鉛試薬の比率により4量体もしくはオリゴマー構造を形成することを明らかにした。つぎに,不斉自己触媒反応を用いて,ホモキラリティーの起源を明らかにする研究を行った。まず,アキラルな化合物であるエチレンジアミン硫酸塩のキラル結晶存在下でピリミジンカルバルデヒドとジイソプロピル亜鉛を作用させると,わずかに不斉が偏ったピリミジルアルカノール亜鉛アルコキシドが生成し,続く不斉自己触媒反応により鏡像体過剰率が向上し,エチレンジアミン硫酸塩のキラリティーに相関した絶対配置のピリミジルアルカノールが得られることを明らかにした。さらに,人工的に設計されたキラルなヘリカルメソポーラスシリカを不斉開始剤とえいて不斉じこ触媒反応を行ったところ,ヘリシティーに相関した絶対配置のピリミジルアルカノールが高い鏡像体過剰率で生成した。キラルなヘリカルシリカが有機化合物の不斉の起源となり得る事を示したものである。また,天然に存在する鉱物であるレトゲルサイト(硫酸ニッケル六水和物)はキラル結晶であり,これの存在下でピリミジンカルバルデヒドとジイソプロピル亜鉛を作用させたところ,レトゲルサイトのキラリティーに相関した絶対配置のピリミジルアルカノールが生成することを明らかにした。さらに,アキラルなケトンであるベンゾフェノンが形成するキラル結晶の絶対構造と固体CDスペクトルの関係を明らかにした。キラル化合物が自己増殖しつつ鏡像体化合率が増幅するという不斉自己触媒反応は,我々が発見してから20年を経ても現在まで唯一知られているもので,人名(Soai)反応として言及されている。その反応機構は多くのグループが研究を報告しているが,触媒構造を直接決定することができた本研究は大きな進捗と考えている。さらに,通常の反応では不斉の起源となり得ないとされる,アキラル化合物が形成するきあっる結晶が,不斉自己触媒反応では不斉の起源となり得ることをエチレンジアミン硫酸塩で示すことができた。天然鉱物であるレトゲルサイトおよび人工合成されたヘリカルメソポーラスシリカなども不斉の起源として作用することを明らかにした。さらに,アキラルなベンゾフェノンが形成するキラル結晶の絶対構造と固体CDスペクトルの関係を明らかにした。以上のとおり,おおむね順調に進展していると考えている。ピリミジルアルカノールが不斉自己触媒として作用し,ピリミジン-5-カルバルデヒドへのジイソプロピル亜鉛の不斉付加において自己と同一構造のキラル生成物を与え,しかも鏡像体過剰率が向上する反応(そ合Soai反応)を用いて,不斉の起源の解明を目指した。まず,不斉自己触媒の構造を解明するため,反応系中で生成するピリミジルアルカノール亜鉛アルコキシドの単結晶X線構造解析を行い,4量体またはオリゴマー構造を形成することを明らかにした。次にアキラルな有機化合物であるジブチルヒドロキシトルエンが形成するキラル結晶の絶対構造とCDスペクトルを関連付け,キラル結晶存在下で不斉自己触媒反応を行って,結晶キラリティーと相関した絶対配置のアルカノールを得ることができた。また,窒素14と15同位体の違いにより生じるキラルなジアミンを不斉開始剤とする不斉自己触媒反応を行い,窒素同位体によるキラル化合物が不斉起源となることを見出した。さらに,種々のキラル化合物を不斉開始剤とする不斉自己触媒反応を行って不斉識別にも適用した。アキラルな無機結晶である石膏(硫酸カルシウム・二水和物)の劈開面はキラル表面を形成するので,本表面上で不斉自己触媒反応を行って表面不斉に相関した絶対配置のピリミジルアルカノールが高い鏡像体過剰率で生成することを明らかにした。本成果はアキラルな無機結晶のキラル表面がキラル有機化合物の不斉起源となることを示した意義をもつ。また,キラルな芳香族アルコールの存在下で不斉自己触媒反応を行うと,温度の違いにより生成するピリミジルアルカノールの絶対配置が逆転する興味深い現象を見出した。さらに,1-アザ[6]ヘリセンと2-アザ[6]ヘリセンとでは不斉開始剤に用いたとき,同一らせんであっても生成するピリミジルアルカノールの絶対配置が逆になることを明らかにした。窒素14と窒素15同位体置換によるキラルジアミンが不斉起源となることを示した論文は,Angew. Chem. Int. Ed.のVery Important Paper及び表紙に採用され,高く評価された。本結果は全く前例がない。

また,アキラル無機結晶である石膏の劈開面を不斉の起源とする反応も前例がなく,独創的と言える。さらに,同一不斉の方口座区アルコールを不斉源に用いたばあいでも,反応温度により生成物の絶対配置が逆になる現象は予期せぬ興味深いものであり,英国化学会機関紙Chemistry Worldにトピックスとして取り上げられた。1-アザ[6]ヘリセンと2-アザ[6]ヘリセンを不斉開始剤とする不斉自己触媒反応では,同じらせん方向であっても生成物であるピリミジルアルカノールの絶対配置が逆になることも予期せぬ興味深い結果である。以上のとおり,前例がない窒素同位体不斉やアキラル無機結晶のキラル表面を不斉起源とする不斉自己触媒反応を実現して,不斉の起源の知見を深めた。さらに反応温度による生成物の絶対配置の逆転,アザ[6]ヘリセンの窒素原子の位置が1位か2位かによる生成物の絶対配置の逆転など,不斉の起源に関して予期せぬ興味深い結果を得ている。生物を構成するアミノ酸,糖類などは,二つの鏡像異性体のうち一方のみのキラル化合物から構成されており,これは生命のホモキラリティーと呼ばれている。キラル化合物の不斉起源を解明することは,広く生命の起源解明にも関連するとされている。従来から提唱されてきた不斉の起源がもたらす不斉の偏りは一般に極めて小さく(2% ee以下),高い鏡像体過剰率をもつキラル化合物との関連は明らかにされていない。我々は先に不斉自己触媒反応を見出している。本反応ではピリミジルアルカノールの初めの極めて小さい不斉の偏り(鏡像体過剰率)が,アルカノールが不斉自己増殖しつつ,極めて高い鏡像体過剰率に不斉増幅する。本研究では不斉自己触媒反応を活用してキラル化合物の不斉起源の研究を行った。アキラルな有機化合物であるオルトーテルフェニルが形成するキラル結晶を不斉開始剤として用いてその存在下でピリミジン-5-カルバルデヒドとジイソプロピル亜鉛を作用させて不斉自己触媒反応を行ったところ,キラル結晶の絶対構造に相関した絶対配置を持つピリミジルアルカノールが再現性良く得られることを明らかにした。また,アキラルな2-ピリドンが形成するキラル結晶が不斉自己触媒反応の不斉開始剤として有効に作用することを確認した。さらに,ピリミジン-5-カルバルデヒドにジイソプロピル亜鉛を作用させる絶対不斉合成を実現した。また,キラルな金クラスターによる不斉誘導を不斉自己触媒反応を用いて行った。1-および2-アザ[6]ヘリセンを不斉開示剤に用いる不斉自己触媒反応において,ヘリセンのヘリシティーが同一であっても窒素原子の位置により不斉誘導の方向が逆転することを明らかにした。ピリミジルアルカノールの不斉自己触媒反応(そ合反応)は,キラル化合物が自己を生成する触媒として作用して自己増殖しつつ,鏡像異性体過剰率を向上させる。不斉の起源の解明は多くの興味を集めている。そ合反応を用いてキラル化合物の不斉起源の研究を行った。アキラルな無機結晶である石膏のエナンチオトピック表面,窒素同位体によるキラルジアミン,アキラルな化合物が形成するキラル結晶を,鉱物であるレトゲルサイトのキラル結晶,およびキラルなメソポーラスシリカ等が,不斉自己触媒反応の不斉起源として有効に作用することを見出した。
極微小トンネル接合高磁場SQUIDの開発と応用

本研究の目的は微小トンネル接合を利用したdc-SQUIDの基本的特性を調べ、センサー応用の適否を確認することにあり、実施計画に基づいて以下の研究を行った。1.前年度までは4(μm)^2のループ面積をもつ素子を中心に調べたが、今年度は接合部分は微小のままループ面積を400(μm)^2まで大きくした素子を作製し、センサー特性を調べた結果、面積の増加によって磁場変調が見られる最大磁場がやや減少するものの、低磁場ではほぼ同様な特性を持つことが確認された。2.マイクロSQUID素子の磁化測定への適用性を調べた。試料は代表的な常磁性塩であるクロムカリ明礬の微小結晶片(質量約0.3μg)とし、これをSQUID素子の直上に置き、19年度に作製したベクトル型超伝導マグネットを用い、SQUID面にほぼ水平方向で印加磁場を-3000+3000Gの間で掃引した。このときSQUID電圧の周期を解析し、こらから試料の微分帯磁率および磁化曲線を求めたところ、常磁性スビン系の磁化曲線とよい一致が見られた。さらに-5+5Gの微小磁場範囲で磁場を掃引することで帯磁率の温度変化を測ることができた。このように、希釈冷凍温度域において微小トンネル接合小型SQUIDが数千Gの磁場まで有効な磁気センサーとして働くことを確認し、これを用いて0.1μgオーダーの極微小試料の磁化測定が可能であることを実証した。今後実用レベルの計測装置とするには、外来磁気信号の低減、絶対値の評価方法の確立、高磁場でのフラックスジャンブの低減、測定可能磁場・温度領域の拡大などの検討が必要である。このうち、磁場・温度領域の拡大をめざし、AIではなくNbによる微小トンネル接合型SQUIDの作製についても一部研究をすすめた。1.電子線リソグラフィーとリフトオフによってアルミニウムDC-SQUIDを作製した。ループは一辺が2μm、線幅0.2μmの四角形であり、トンネル接合面積は0.015μm^2、トンネル抵抗は約10kΩである。接合に並列抵抗は付加していない。2.希釈冷凍機温度域でこの接合の基礎特性を調べ、以下を確認した。(1)電流・電圧特性に抵抗ゼロの超伝導分枝はなく、代わって低電流領域ではほぼオーミックな特性が見られる。(2)このオーミック抵抗値は外部磁場によって変化する。定電流バイアスしSQUID両端の電圧の垂直磁場依存性を測定した結果、垂直磁場に対して電圧が周期的に振動した。磁場周期はリングサイズから期待される値と矛盾せず、位相の拡散運動によって超伝導分枝が有限抵抗値を持ったと理解できる。(3)さらに強い磁場をSQUIDループにほぼ平行にかけた測定の結果、振動振幅は磁場の増大とともに徐々に変化し、特に0.5T付近で大きく減少した。しかし、小さな振動はその後も続き、約1Tで最終的に消失することがわかった。これは薄膜A1の超伝導臨界磁場にほぼ対応する。3.このように、この素子が最大1Tまで動作する磁気センサーとなることが確認された。通常のSQUIDでは磁束情報を読み出すために超伝導臨界電流以上の電流で素子を駆動する必要があるが、準オーミック特性を示す本素子ではそのような下限はなく、10fW以下という極微少の発熱量で十分測定が可能であることが確認できた。4.なお、本実験用のベクトル型超伝導電磁石を設計・作製するとともに、温度安定性の高いPESレジストを用いて、リフトオフによるNb DC-SQUIDの作製も試みた。
光遺伝学的アプローチによる神経分泌ニューロンへのシナプス入力修飾メカニズムの解明

AVP-ChR2-eGFPトランスジェニックラット(5-7週齢)に、2%食塩水負荷を5日間行い、脱水状態にする。その後、麻酔下で迅速に脳出しを行い、SONを含む300 μmの切片を作成した。SONを含む脳スライス標本を用い、蛍光顕微鏡でAVP-ChR2-eGFP陽性ニューロンを同定した。同定したニューロンに対しホールセルパッチクランプ法により膜電位を固定した状態で膜電流は問題なく記録できた。次に記録しながら青色光照射した。青色光が照射された際に細胞内へのinward currentが照射前より増加していることが複数回、異なった切片で確認できた。また、この変化は青色光の照射を中止すると速やかに元に戻った。これにより細胞単離だけでなく、スライスの状態でもAVPニューロン中のChR2が正常に機能していることが確認できた。次に固定膜電位が変化することにより青色光照射中のinward currentも変化することが確認できた。また、固定膜電位を変化とさせることにより膜電流の変化も起こることが観察できた。交付申請書の研究実施計画の項目に記載した、AVP-ChR2-eGFPトランスジェニックラットを使用し2%食塩水飲水負荷における視床下部視索上核でのAVPニューロンの興奮時の膜電流変化・AVP-ChR2-eGFPトランスジェニックラット(5-7週齢)に、2%食塩水飲水負荷を5日間行いその後、麻酔下で脳出しを行い、SONを含む300 μmの切片を作成し、SONを含む脳スライス標本を用いてAVP-ChR2-eGFP陽性ニューロンからホールセルパッチクランプ法により膜電流を記録しながら青色光照射し、その際膜電位を変化させることにより膜電流の変化を観察するという平成30年度の予定をほぼ終了できたため。交付申請書の研究実施計画の項目に記載した、AVP-ChR2-eGFPトランスジェニックラットを使用した2%食塩水飲水負荷における視床下部視索上核でのAVPニューロンの興奮時のAVPが及ぼす作用を調べるためにAVP-ChR2-eGFPトランスジェニックラットで前年度とと同様に、2%食塩水飲水負荷を5日間行い、AVP-ChR2-eGFP陽性ニューロンからホールセルパッチクランプ法により膜電位を固定した状態で青色光照射前の膜電流を観察し、その後照射し、人為的にAVPニューロン終末からAVPが放出させた後の膜電流を観察実験を行う。具体的には照射前(AVP放出前)と照射後(AVP放出後)でEPSCやIPSCの頻度やその電流の大きさに変化があるかを観察し、膜電位を-70mv固定でEPSC、-15mv固定でIPSCを観察する。それに変化がある場合はAVP受容体拮抗薬を投与しその電流変化が修飾されるかを確認する。また同様の実験をAVP-ChR2-eGFP陰性のAVPニューロンでも行う。

それに変化がある場合はAVP受容体拮抗薬を投与しその電流変化が修飾されるかを確認する。また同様の実験をAVP-ChR2-eGFP陰性のAVPニューロンでも行う。実験キットの単価が当初の予定より値下がりしたため。繰り越し金は実験キットの購入にあてる。
土壌線虫を用いた森林の生物多様性指標の開発

青森県白神山地のブナを中心とした広葉樹天然林と、広葉樹を伐採後に植栽されたスギ林の土壌を採集し、線虫を分離した。分離された線虫についてバーコード領域(リボゾーム遺伝子)によるDNAタイピングを行った結果、235個のMOTU (molecular operational taxonomic units)が検出された。これらの線虫相データを元に各種の多様性指数と線虫の食性に基づいた指数を算出して比較したところ、ブナ林とスギ林の間には有意な差は認められなかった。ブナ林を伐採して植林されたスギ林においても、土壌中の線虫についてはブナ天然林と同等な多様性を維持していると考えられた。生物多様性の保全を考慮した森林管理手法の開発のため、様々な生物群で多様性指標の開発を目的とする研究が進められている。しかし、その多くが地上部の昆虫類や菌類を対象とする研究であり、その重要性とは裏腹に、地下部(森林土壌)を対象とした研究例は非常に少ない。森林全体の生物多様性を評価するには、森林の地上部から地下部までを総合的に考慮する必要がある。本研究は、日本の代表的な森林であるブナを中心とした広葉樹天然林と伐採後に植栽されたスギ人工林の土壌線虫相を明らかにし、これらを比較することにより、森林地下部に対する生物多様性指標としての土壌線虫の有効性を検証することを目的としている。本年度は、土壌線虫相の年次変動について検討するために、前年度に設置した青森県白神地域のブナ天然林と近接のスギ人工林について、線虫分離用の土壌を採集した。採集した土壌から線虫を分離し、形態的観察に顕微鏡プレパラートを作製するとともに、DNAバーコード用によるタイピング用のサンプル調整を行った。これらの形態およびDNAバーコードによる同定を進めているところである。現在までのところ、植物寄生性線虫であるLongidorus属、Helicotylenchus属、植物寄生性または菌食性線虫であるTylenchidae科、雑食性線虫であるQudsianematidae科、細菌食性線虫であるCephalobidae科などに属する線虫が分離されている。青森県白神地域のブナ天然林とブナ天然林伐採後にスギを植栽した人工林の各5林分の土壌を採集し、採集した土壌から線虫を分離するとともに線虫の標本を作製した。分離された線虫の中についてバーコード領域によるDNAタイピングを行った結果、235個のMOTU (molecular operational taxonomic units)が検出された。これらはかなり幅広い分類群に属し、多様性を調査する上でも充分なMOTU数であると考えられる。ブナ林とスギ林の線虫について各種の多様性指数、線虫の食性に基づく指数などを求めた結果、各指数についてブナ林とスギ林との間に有意な差は認められなかった。食性に基づく指標からは、両林とも比較的安定した森林の土壌線虫相であると判断された。以上の結果から、ブナ林を伐採して植林されたスギ林においても、土壌中の線虫についてはブナ天然林と同等な多様性を維持しているといえる。本研究は、日本の代表的な森林であるブナを中心とした広葉樹天然林と伐採後に植栽されたスギ人工林の土壌線虫相を明らかにし、これらを比較することにより土壌線虫の生物多様性指標としての有効性を検証することを目的としている。本年度は、青森県白神地域のブナ天然林と近接のスギ人工林に調査プロットを設定し、線虫分離用の土壌を採集した。採集した土壌から線虫を分離し、形態的観察とDNAバーコードによるタイピングを進めているところである。プロットからの土壌採集および線虫サンプル調整が完了したことから、おおむね順調に進展しているものと考えている。試験プロットの選定と土壌採集が完了したことから、おおむね順調に進展しているものと考えている。次年度は、形態的観察とDNAバーコードによるタイピングによって、分離された線虫の同定を完了する。得られたデータから、森林地下部の生物多様性指標としての土壌線虫の有効性を検証する予定である。

次年度は、形態的観察とDNAバーコードによるタイピングによって、分離された線虫の同定を進める。さらに、同一の調査プロットから再び土壌を採集して線虫を分離同定することにより、土壌線虫相の年次変動を明らかにする。最終的に、森林地下部の生物多様性指標としての土壌線虫の有効性を検証する予定である。研究室のシークエンサーの更新が行われたこともあり、本年度予定していたDNA解析の一部を次年度に行うことにした。その分の「物品費」と「謝金」を次年度使用額とした。主に分離線虫のDNAタイピング用の試薬類等に「物品費」、試験プロットの土壌採集のための出張に「旅費」、試験補助員の雇用のために「謝金」、出張に関わるレンタカー代などに「その他」の支払費目の研究費の使用を予定している。
臨床応用を目指したスクテラリンのＧｉｒｄｉｎ抑制による膵癌抗血管新生効果の検討

膵癌細胞株におけるGirdinの機能解析膵癌の悪性度を規定する因子として,局所浸潤能や転移能が高いことが挙げられる.我々はこれらに血管新生能が関与していることを報告してきた.一方,Girdinは2005年に本邦で発見された細胞運動に関わるタンパクで,近年,癌の浸潤能に加え血管新生能への関与が示唆されたが,そのメカニズムは十分に解明されていない.さらに,フラボノイドの一種であるスクテラリンが,肝細胞癌でSTAT3シグナルを介してGirdinを抑制することが報告された.しかし膵癌の浸潤および血管新生に対するGirdinの役割の解明と治療への応用に着目した報告はない.膵癌細胞株におけるGirdinの機能解析膵癌の悪性度を規定する因子として,局所浸潤能や転移能が高いことが挙げられる.我々はこれらに血管新生能が関与していることを報告してきた.一方,Girdinは2005年に本邦で発見された細胞運動に関わるタンパクで,近年,癌の浸潤能に加え血管新生能への関与が示唆されたが,そのメカニズムは十分に解明されていない.さらに,フラボノイドの一種であるスクテラリンが,肝細胞癌でSTAT3シグナルを介してGirdinを抑制することが報告された.しかし膵癌の浸潤および血管新生に対するGirdinの役割の解明と治療への応用に着目した報告はない.
IL-18のもたらす抗腫瘍効果についての研究

IL-18はマクロファージ系の細胞から産生され、T細胞によるIFN-γの産生を誘導する因子として発見されたI型サイトカインである。従来その作用の多様性が報告されているが、共同研究者らのこれまでの研究においても、IL-18のもつ生理活性、呼吸器や皮膚疾患に対する関与について、分子免疫学的手法で解明されてきた(Hoshino et al. J Immunol,1999/Eur J Immunol,2000,etc)。癌においては、IL-12と共にNK細胞を活性化し、Th2誘導を抑制・Th1型細胞への分化を強力に誘導することにより抗腫瘍効果を発揮すると考えられている。IL-18のもたらす抗腫瘍効果について我々のin vitroでの解析においても、樹状細胞の成熟や、誘導された細胞障害性T細胞(CTL)のdeathligand発現増強など、免疫エフェクター相での効果が示唆された。一方、in vivo解析を目的に新しく樹立したCD11bプロモーターを用いたマクロファージ発現系IL-18トランスジェニック・マウスについての解析においては、従来報告されたイムノグロブリン・プロモーターを用いたリンパ球発現IL-18トランスジェニック・マウス(Hoshino et al. J Immunol,2001)に比してIL-18産生量が低く、癌モデルの確立・in vivo解析のためには、後者の方が適当であると考えられた。今後引き続きの検討を予定している。共同研究者らのこれまでの研究において、IL-18のもつ生理活性、呼吸器や皮膚疾患に対するIL-18の関与について、IL-18トランスジェニック・マウスを用いた分子免疫学的手法で解明されてきた。その中で、当施設において、IgGプロモーターを用いたIL-18トランスジェニック・マウス、ならびに最近IL-1bプロモーターを用いたIL-18トランスジェニック・マウス(C57/BL6系統)が樹立された。前者については既にその免疫学的解析について報告されており(Hoshino et al. J Immunol,1999/eur J Immunol,2000)、IL-18がTh1誘導だけでなくNK細胞及びTh2 T細胞誘導を介し抗体(IgE)産生誘導、Th2誘導、アレルギー成立にも関与していることが示唆された。同様にIL-1bプロモーターを用いたIL-18トランスジェニック・マウスについて、現在基礎的解析を進行中である。具体的には、1)ELISA, flow cytometory, Western法によるIL-18の局在、2)各種マーカーを用いた樹状細胞の解析、3)抗原特異的T細胞誘導能の解析、4)NK, NKT活性、5)T細胞のTh1/Th2バランス、サイトカイン産生能、6)マクロファージの活性化状態、サイトカイン産生能、等について解析を進行中または予定しており、イムノグロブリン・プロモーターを用いたリンパ球発現IL-18Tgトランスジェニック・マウス、およびWTマウスとの比較検討を行っている。IL-18はマクロファージ系の細胞から産生され、T細胞によるIFN-gammaの産生を誘導する因子として発見された1型サイトカインである。従来その作用の多様性が報告されているが、共同研究者らのこれまでの研究においても、IL-18のもっ生理活性、呼吸器や皮膚疾患に対する関与について、分子免疫学的手法で解明されてきた(Hoshino et al.J Immunol,1999/Eur J Immunol,2000,etc)。IL-18のもたらす抗腫瘍効果について我々のin vitroでの解析においても、細胞障害性T細胞(CTL)のdeath ligand発現増強など、免疫エフェクター相での効果が示唆された。

一方、新しく樹立されたIL-1bプロモーターを用いたマクロファージ発現系IL-18トランスジェニック・マウスについての解析においては、従来報告されたイムノグロブリン・プロモーターを用いたリンパ球発現IL-18トランスジェニック・マウス(Hoshino et al, J Immunol,2001)に比してIL-18産生量が低く、癌治療モデルの確立・in vivo解析のためには、後者の方が適当であると考えられた。今後引き続きの検討を予定している。