hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
B型肝炎ウイルスX遺伝子が誘導する細胞死の機構

B型肝炎ウイルスは疫学的な研究から、肝発癌との関連が示されている。ウイルスがコードするX遺伝子が肝発癌の原因遺伝子であることは我々のグループも含めたいくつかのグループの研究により示されてきた。また、近年X遺伝子発現により細胞死が誘導されることも明らかになってきており、肝癌発症のみではなく、肝炎症状の憎悪化にもXタンパク質発現が関与しているものと考えられてきている。X遺伝子は多様な機能が報告されているものの、報告されている機能とウイルス複製の調節および、肝炎症状の憎悪化、肝癌発症との関連などいまだ不明の点が多い。当研究の目的は、X遺伝子の機能を明らかにすることによって、B型肝炎ウイルスによる肝炎および肝癌の発症機構を解明し、創薬研究の基盤とすることにある。我々はXタンパク質がミトコンドリアに局在することを生化学的手法および、細胞染色によって明らかにした。また、Xタンパク質およびその変異体を用いた実験から、68-117番目までのアミノ酸領域がミトコンドリアへの局在、細胞死誘導共に重要であることを示した。また、Xタンパク質がミトコンドリアに局在することにより、ミトコンドリア膜電位の低下を引き起こし、ひいては細胞死を誘導していることを明らかにした。これらの結果は論文として、J.Biol.Chem.誌に掲載予定である。また、Xタンパク質はミトコンドリアに局在する際に、活性酸素が生成され、DNA損傷が引き起こされていることも明らかにし、Xタンパク質発現による癌化の機構がより明確になってきた。これらの結果は、現在、投稿準備中である。今までの研究成果により、Xタンパク質のミトコンドリアへの局在を阻止する、あるいは、活性酸素生成を抑制することができれば、肝癌発症の抑止、また肝炎症状の緩和につながることと思う。B型肝炎ウイルスのX遺伝子はミトコンドリアに局在し、その異常凝集をおこさせ、細胞死を誘導することを明らかにしてきた。X遺伝子による細胞死の機構の解明を目的として解析を行っている。まず、X遺伝子の転写活性化能が細胞死誘導と相関があるかを調べた。転写活性化能を持たないX遺伝子変異体も細胞死誘導能があることから、X遺伝子による細胞死誘導はBax等細胞死を誘導する遺伝子を転写活性化することによるものではないことを明らかにした。さらに、Xタンパク質の細胞死誘導に必要な領域を解析したところアミノ酸68-117の領域で十分であることがわかった。リコンビナントタンパク質を用いた解析の結果、in vitroでもこの領域のみでミトコンドリアに結合するが、Xタンパク質のミトコンドリアへの結合によってチトクロームCやAIFの放出は起こらなかった。しかし、アミノ酸68-117の領域を細胞内で発現させるとミトコンドリアの膜電位の低下が引き起こされることが、ミトコンドリアの膜電位に感受性のある染色剤JC-1を用いた解析によって明らかになった。これらの結果から、ミトコンドリアの膜電位低下がX遺伝子により誘導される細胞死では重要な要因になっているのではないかと考えている。現在さらに、Xタンパグ質がどのような機構で膜電位低下を引き起こすか、またXタンパク質と相互作用するミトコンドリアのタンパク質について解析中である。また、Xタンパク質によって活性化されるシグナル伝達系に関しては:HIV TATとXタンパク質との融谷タンパク質を細胞内に導入する系を確立することができたので、細胞死、細胞増殖の際に活性化されるMAPK,SAPK等のシグナル伝達系の活性化の解析を進めている。B型肝炎ウイルスのXタンパク質はミトコンドリアに局在し、細胞死を誘導することを明らかにしてきた。Xタンパク質のミトコンドリアへの局在が細胞死誘導能と非常に強い相関を示すこと、また、Xタンパク質が細胞死を誘導する際には、ミトコンドリア膜電位の低下が起こることを明らかにした。

さらに、ミトコンドリア膜電位の低下を薬剤等により抑えることによって、X遺伝子導入による細胞死が抑制されることから、膜電位低下が細胞死誘導に重要であると考えられる。また、Xタンパク質はHIV TATタンパク質のように培地にタンパク質を添加することによって、細胞内に導入されることが報告されている。今回Xタンパク質の変異体も作製し、細胞内への導入を調べたところ、Xタンパク質のみならず、作製した変異体もすべて細胞内に導入されることを確認したので、この系を用いて細胞死が起こる過程を解析している。HuH7細胞ではタンパク質導入の系で、WST-1 assayによって細胞死誘導が認められ、この時、細胞内ATP濃度の急激な減少が見られた。さらにこの条件下で、活性酸素が生成していることを明らかにした。これらの結果はXタンパク質がミトコンドリアPTP complexに何らかの傷害を与えていることを示唆している。また、活性酸素は様々な系で癌化および細胞傷害に深く関わっていることがすでに知られている。我々の結果は、B型肝炎ウイルス感染時にはXタンパク質発現に伴って活性酸素が生成し、肝炎の増強および肝癌発症を惹起している可能性を示唆するものである。今後さらにXタンパク質がどのような機構で活性酸素生成を引き起こしているか、その分子機構を解明していく予定である。B型肝炎ウイルスXタンパク質はミトコンドリアに局在し、細胞死を誘導するが、そのミトコンドリアへの局在が細胞死誘導能と非常に強い相関があることを種々のXタンパク質変異体を用いて解析した。その結果、Xタンパク質の68-117アミノ酸がミトコンドリアへの局在に重要であること、また、その部分だけで細胞死を誘導することを明らかにした。また、Xタンパク質はHIV TATタンパク質のように培地に直接添加することによって、細胞内に導入することが報告されていたが、Xタンパク質の変異体も作製し、細胞内への導入を検討したところ、作製した変異体すべてが細胞内へ導入された。現在、Xタンパク質のどの部分が細胞内導入に必須であるかを解析している。さらに、この系を用いて、Xタンパク質により細胞死が起こる過程を解析した。Xタンパク質を導入すると、細胞死誘導に先立っで細胞内ATPの急激な減少、活性酸素の生成が観察された。このことから、Xタンパク質導入によって、DNA損傷が起こっている可能性が考えられたので、コメットアッセイによって、細胞DNAの損傷を調べた。その結果、Xタンパク質導入に伴って、DNA損傷が見られ、これは、活性酸素生成を抑える薬剤により抑制された。そこで、Xタンパク質導入により突然変異率が増加するか調べたところ、コントロールに比べ、有意に突然変異率の増加が観察された。これらの結果から、Xタンパク質はミトコンドリアに局在し、活性酸素生成を引き起こすことによって、細胞死とともに、細胞の癌化をも誘導することが示された。
疲労による自律神経機能変調の分子神経メカニズム研究

疲労により安静時の交感神経活動の亢進がみられる。しかし、その疲労と自律神経機能変調の分子神経メカニズムは明らかでない。本研究は、機能的磁気共鳴画像法(fMRI)と陽電子放射断層撮影法(PET)を用いて、健常者の急性疲労による自律神経機能変調の分子神経基盤を明らかにすることを目的とした。その結果、帯状回の神経活動低下およびセロトニン神経系の機能低下が疲労による交感神経活動の亢進と関連する可能性を見出した。急性疲労と慢性疲労に共通し、自律神経機能解析により副交感神経活動低下および交感神経活動亢進が観察される。しかしながら、疲労による自律神経機能の変調に関する分子神経メカニズムは未だ明らかでない。このメカニズム解明は、自律神経変調に伴う脳神経活動による機能変化だけでなく機能変化に関連する神経伝達物質といった分子動態変化をも明らかにすることを指し、本研究では、疲労による自律神経機能変調の分子神経メカニズム解明を目的とした。機能的磁気共鳴画像法(functional Magnetic Resonance Imaging, fMRI)を用いた脳機能イメージング研究にて、精神的疲労を引き起こす連続的な作業記憶課題負荷中に、脳活動計測と心電図による自律神経活動の同時計測を行った。その結果、交感神経活動と帯状回の賦活度が相関し、疲労による交感神経の過活動は、帯状回の情報処理が関連することが明らかになった。陽電子放出断層画像法(Positron Emission Tomography, PET)を用いた分子イメージング研究から、炎症マーカーである活性型ミクログリアに発現するTranslocator proteinのリガンド、[11C]PK-11195の脳内局所結合度と自律神経活動との関連は認められなかったことを昨年度報告したが、例数を増やし再検討したところ、脳幹の炎症の程度と交感神経活動間で関連がみられた。また、脳内セロトニン動態として、セロトニン輸送体のPET用リガンド、[11C]DASBと自律神経の関連解析を行い、帯状回と脳幹のセロトニン輸送体の密度が低いほど交感神経活動が高い傾向にあった。よって、疲労による自律神経機能変調に関わる分子基盤として脳幹や帯状回における炎症とセロトニン機能の関連性が示唆された。よって、自律神経機能評価は疲労の客観的評価を可能としてきた。このメカニズム解明は、自律神経変調に伴う脳神経活動による機能変化だけでなく機能変化に関連する神経伝達物質といった分子動態変化をも明らかにすることを指し、メカニズムに基づく抗疲労・疲労回復法の研究推進を導き健康社会実現の一助となることが期待される。よって、本研究は、疲労による自律神経機能変調の分子神経メカニズム解明を目的とした。本研究では、慢性疲労の予防の観点に立ち、健常者の疲労による自律神経機能変調に関する分子神経メカニズム解明に挑戦する。急性精神疲労負荷後の疲労状態において、副交感神活動が低下し、相対的に交感神経活動が亢進することを見出した。また、疲労負荷をかけない安静状態においても、疲労が強いほど副交感神経活動が低下し、相対的に交感神経活動が亢進していることを明らかにした。functional Magnetic Resonance Imaging(fMRI)を用いた脳機能イメージング研究から、精神疲労負荷中において、負荷時間経過に伴い自律神経機能支配に関わる帯状回の賦活度が低下することを見出した。Positron Emission Tomography(PET)を用いた分子イメージング研究から、脳内セロトニン動態との関連が示唆される炎症マーカーである活性型ミクログリアに発現するTranslocator proteinのリガンド、[11C]PK-11195の脳内局所結合度と自律神経活動との関連は認められなかったので、疲労、脳内セロトニン動態および自律神経機能の関連解析のためのPET研究を開始した。健常者の疲労による副交感神経活動低下および相対的交感神経活動亢進状態は再現性よくみられた。fMRI研究から、自律神経機能支配に関わる帯状回の賦活低下と疲労との関連性を見出した。PET研究から、脳内炎症については、直接、健常者の疲労との関連性はみられなかったが、当初の予定通り疲労、脳内セロトニン動態および自律神経機能の関連解析のためのPET研究を開始するこができた。よって、本研究はおおむね順調に進展していると判断した。帯状回を特に関心領域とし、この領域のセロトニン動態変化をPETにより計測する。疲労時の脳内セロトニン動態の定量評価のため、セロトニントランスポーターの結合能の指標となる[11C]N,N-dimethyl-2-(2-amino-4-cyanophenylthio)benzylamine([11C]DASB)を用いる。PET計測と併せて心電図または脈波計測を行い、セロトニン動態変化と副交感神経または交感神経活動レベルの相関解析が可能な実験系を確立し、疲労時における脳内セロトニン動態および自律神経機能の関連解析を行う。

随時、必要に応じて追加のfMRI研究を実施する。大容量PET・fMRIデータ解析・保存のため、大容量外付けハードディスクの購入費を計上する。PET関連試薬等の消耗品費を計上する。健常被験者に対する研究協力謝礼金費を計上する。研究成果を国内外の学会で発表するための旅費と学会参加費を計上する。次年度に使用予定の研究費(繰越を行った研究費)は研究成果発表のため、特に、国際誌における論文発表のための論文校閲費と別刷費として計上する。
未利用周波数帯特にミリ波アンテナ技術に関する基礎研究

本研究では,ミリ波帯アンテナシステムに関して検討を行い,次に示す新知見および成果を得た.1.コプレーナ導波路により給電される二周波マイクロストリップアンテナを用いた準光学アンテナミキサを開発した.このアンテナミキサをアレー化し,LO信号の照射角度もしくは周波数を制御することにより,RF信号の受信角度を走査できることを示した.2.低損失なミリ波導波路として,イメージNRDガイドを開発した.イメージNRDガイドのイメージ面上にスロットを設けることにより,不要モードの発生を抑えた新しいミリ波アンテナ構造を提案した.この構造のアレー設計に用いる規格化インピーダンスの数値解析法ならびに測定法を確立した.3.誘電体イメージ線路に関して,カットオフ現象を応用した同軸プローブ給電方式を開発した.さらに,イメージNRDガイドから誘電体イメージ線路への変換構造を提案し,実験ならびにFDTD法による数値シミュレーションにより,その有効性を確認した.4.トリプレート型電磁結合マイクロストリップアンテナにおけるパラレルプレートモードについて,スペクトル領域モーメント法を用いた理論解析を行い,その発生機構を明確化した.また,この結果をもとに,パラレルプレートモード抑制法を開発し,実験と理論の両面からその有効性を確認した.5.ミリ波帯無線LAN用セクタアンテナの構成要素として,バックワード励振スロットアレーアンテナを開発した.スペクトル領域モーメント法による設計法を確立するとともに,XバンドとKバンドにおいて検証実験を行い,開発したアンテナの有効性ならびに設計法の妥当性を明らかにした.本研究では,ミリ波帯アンテナシステムに関して検討を行い,次に示す新知見および成果を得た.1.コプレーナ導波路により給電される二周波マイクロストリップアンテナを用いた準光学アンテナミキサを開発した.このアンテナミキサをアレー化し,LO信号の照射角度もしくは周波数を制御することにより,RF信号の受信角度を走査できることを示した.2.低損失なミリ波導波路として,イメージNRDガイドを開発した.イメージNRDガイドのイメージ面上にスロットを設けることにより,不要モードの発生を抑えた新しいミリ波アンテナ構造を提案した.この構造のアレー設計に用いる規格化インピーダンスの数値解析法ならびに測定法を確立した.3.誘電体イメージ線路に関して,カットオフ現象を応用した同軸プローブ給電方式を開発した.さらに,イメージNRDガイドから誘電体イメージ線路への変換構造を提案し,実験ならびにFDTD法による数値シミュレーションにより,その有効性を確認した.4.トリプレート型電磁結合マイクロストリップアンテナにおけるパラレルプレートモードについて,スペクトル領域モーメント法を用いた理論解析を行い,その発生機構を明確化した.また,この結果をもとに,パラレルプレートモード抑制法を開発し,実験と理論の両面からその有効性を確認した.5.ミリ波帯無線LAN用セクタアンテナの構成要素として,バックワード励振スロットアレーアンテナを開発した.スペクトル領域モーメント法による設計法を確立するとともに,XバンドとKバンドにおいて検証実験を行い,開発したアンテナの有効性ならびに設計法の妥当性を明らかにした.本一般研究は、ミリ波本来の持つ特徴を十分に引き出すミリ波帯アンテナシステムの在り方の研究・検討を目的としている。本年度は、給電方式を含めたミリ波帯アンテナの基本的な構造に対して以下に示す知見等を得た。1.ミリ波帯において印刷配線方式のアレーを構成する際に問題となる給電損失を低減するために、コプレーナ導波路の適用を提案した。スペクトル領域モーメント法により上記導波路の位相定数および減衰定数を厳密に計算し、その設計パラメータに関して検討を行った。また、低損失な導電体基板として知られるクォ-ツ基板等を用いたアンテナ系について、電磁界シミュレータを用いて、その放射特性等を明らかにするとともに、広帯域化を実現するためのアンテナ構造について検討を行った。2.本年度設備備品費により購入したシンセサイズド・スィーパならびにSパラメータ・テストセットを、本学現有のネットワーク・アナライザ・システムに組み込み、50GHzまでの同軸反射・伝送測定系を構築した。この測定系を用いて、上述のアンテナ系について入力特性の測定を行い、シミュレーションで得られた結果の妥当性を確認した。3.非放射性誘電体導波路(NRDガイド)を積極的に利用した「イメージNRDガイドアンテナ」を提案し、その入力・放射特性等を理論的ならびに実験的に明らかにした。イメージNRDガイドアンテナにおいては、NRD給電部の体積が軽減され、他のRF/IF回路の組み込みが容易となる一方で、不要NRDモードの抑制が可能である。以上報告したように、本年度予定していた研究課題について満足のいく成果が得られた。本基盤研究は、未利用周波数であるミリ波本来の持つ特徴を十分に引き出すアンテナシステムの在り方についての検討を目的としている。本年度は、以下に示す知見と成果を得た。(1)コプレーナ導波路を給電線路とする二周波動作アンテナを、基板の両面にパッチを配することによって実現できることを本年度設備備品により購入したMDSリファレンスシステムにより明らかにした。また、3GHzスケールモデルについて実験により上記アンテナの動作を検証するとともに、コプレーナ導波路終端にショットキーバリアダイオードをミキサとして配し、一方の面からRF信号を、もう一方の面からLO信号をそれぞれ照射することにより、線路を介することなくダウンコンバージョンが行え、IF信号が得られることを確認した。(2)上記の二周波動作アンテナをアレー化し、LO信号の照射角度、もしくは周波数を変化させることによってIF信号が最大となるRF信号の受信角度を制御できることを見いだし、その理論的な背景を明らかとするとともに、その検証実験を3GHzスケールモデルで行い、その有効性を確認した。

(3)イメージNRDガイドのH面にスロットを施すことにより、漏れ波の発生を抑えた新しいアンテナ構造を提案し、Kバンドにおける検証実験により、その有効性を明らかとした。(4)誘電体イメージ線路に関して、カットオフ現象を利用した同軸プローブ給電方式を開発し、その有効性をFDTD法による数値シミュレーションならびにKバンドにおける検証実験で明らかにした。今後、上記アンテナ等に関して応用事例を検討する。また今年度までの成果をもとに、来年度以降ミリ波を利用する通信ならびに応用システムの在り方をアンテナ研究の立場から検討する。以上報告したように、本年度予定していた研究課題について十分な成果が得られた。昨年度まで得られた知見をもとに,給電方式を含めたミリ波帯アンテナシステムに関して,本年度は以下に示す新知見および成果を得た.(1)コプレーナ導波路を給電線路とする三周波マイクロ波マイクロストリップアンテナを設計した.そのアンテナとミキサから構成される準光学アンテナミキサ素子のリニアアレーに関して,局部発振信号の周波数を掃引することによって高周波信号の入射方向を走査できることを実験的に明らかとした.(2)準光学アンテナミキサに利用するコプレーナ導波路給電二周波マイクロストリップアンテナについて,スペクトル領域モーメント法を適用し厳密解を計算した.特に,本学現有の電磁界シミュレータにより計算できない絶対利得の算出が可能となり,本アンテナの設計の妥当性が確認された.(3)イメージNRDガイドのイメージ面上に切られたスロットアンテナに関して,変分法による規格化インピーダンスの計算を行うとともに,プローブ給電されたイメージNRDガイドに関して定在波分布測定を行い,スロットの規格化インピーダンスを明らかとした.(4)誘電対イメージ線路とイメージNRDガイドの変換について,FDTD法による数値シミュレーションにより,昨年度実験的に確立した設計法の妥当性を数値的に確認した.最終年度である来年度は,イメージNRDガイドに関して高周波化を図るとともに,ミリ波を利用した通信ならびに応用システムの在り方をアンテナ研究の立場から検討する.以上,本年度予定していた研究課題について十分な成果が得られた.昨年度まで得られた知見をもとに,ミリ波帯アンテナシステムに関して,本年度は次に示す新知見および成果を得た.(1)コブレーナ導波路を絵電線路とする二周波マイクロストリップアンテナとミキサにより構成される準光学アンテナミキサ素子に関して,IF信号出力に漏洩したRF信号とLO信号を相殺するための配列法を開発し,理論計算と実験の両面からその有効性を確認した.
すべりと双晶を考慮した結晶塑性モデルによるマグネシウム合金の成形性予測技術の構築

本研究では,マグネシウ合金板が張出変形において極端に成形性が低い原因を明らかにすることを目的としている.圧縮双晶,二重双晶を予測し,損傷を考慮することのできる結晶塑性モデルを構築した.本モデルを有限要素法に導入し,平面ひずみや等2軸の方が,圧縮双晶と二重双晶が早期に多く発生し,それが早期の破断を引き起こしていることを突き止めた.単軸引張,平面ひずみ引張,等2軸引張を負荷した試験片をEBSDで観察した.引張双晶が最も活発に活動し,圧縮双晶と二重双晶の発生量は明らかに少ないことが分かった.本実験結果内において,双晶は極微量であり破断との明瞭な相関は確認されなかった.AZ31マグネシウム合金板に対して単軸引張試験ならびに平頭張出し試験を実施して,単軸引張り・平面ひずみ引張り・等2軸引張りの状態における成形限界ひずみを測定した.単軸引張では約0.25の伸びを示したが,平面ひずみ引張りと等2軸引張りにおいては約0.05しか伸びず,張出し領域において極端に成形限界が低下することが分かった.試験片に生じるひずみ分布をデジタル画像相関法によって測定したところ,全ての試験片において破断時のひずみ分布はおおよそ一様であった.つまり,板厚方向の局所くびれが発生することなく破断に至っていることが明らかとなった.ただし,CCDカメラによる画像測定は0.5秒/枚であったことから,最終画像が撮影され後,破断に至る間にくびれが発生している可能性があった.そこで,破断後の試験片を切断して,圧延方向ー板厚方向からなる横断面を光学顕微鏡によって測定した.観察の結果,やはり板厚方向のくびれが発生することなくせん断破壊していることが明らかとなった.また,破断面は直線的であることは無く,ぎざぎざした形状の破断面が多く観察された.鋼・アルミニウム合金と言った延性金属では,局所くびれが発生してその中にさらにひずみが集中したせん断帯が形成され,それに沿って直線的な破断面が形成される.マグネシウム合金のひずみ局所化ならびに破断現象は,このような従来から良く知られている延性金属が有する特徴と大きく異なっていることが明らかとなった.この事実は,破断に至るメカニズムが異なっていることを示唆している.マグネシウム合金AZ31の種々の変形状態における成形限界の測定が完了した.具体的には,デジタル画像相関法を用いることで,破断に至る変形過程がおおよそ一様変形であり,局所くびれが発生しないことを明らかにした.また,破断面の観測より,破断面がぎざぎざしていることが多く観察された.以上の結果は,今後,結晶塑性モデルを構築し,有限要素法解析を実施する際に貴重な参照データとなる.マグネシウム合金板AZ31(板厚1mm)に単軸引張,平面ひずみ引張,等2軸引張の3種類の変形を破断するまで負荷した.破断後に至るまでの変形は,デジタル画像相関法によって計測した.破断直前に板厚くびれが発生することなく,突如,破断した.マグネシウム合金は,このような破断形態をとることが知られている.そして,そのメカニズムに関する研究が,近年活発に行われており,圧縮双晶および二重双晶の発生に起因したボイドが破断の起点となることを示唆する結果が,単軸引張後の試験片観察から得られている.本研究では,それが平面ひずみや等2軸引張の状態の低延性の直接的な原因であるか否かの検証を行っている.本年度は,X線回折による結晶方位測定を行った.X線回折の結果より,負荷前の供試材と破断後の供試材の集合組織を比較したところ,単軸引張後の試験片では,引張双晶による方位回転ならびにすべり変形による方位回転が確認された.一方,平面ひずみ引張,等二軸引張においては,破断後の集合組織を測定しても初期状態と有意な差はなかった.これより2つのことが結論付けられる.この結果をもたらした第一の要因は,これらのひずみ状態では破断ひずみが約5%であり,変形が小さいために集合組織が大きく変化しないことである.そして第二に,この結果は,破断発生時に材料全体において圧縮双晶や二重双晶が発生していないことを示している.したがって,二軸変形においても圧縮双晶が破断の起点であると仮定しても,それは局所的に発生しており,巨視的に観察される現象ではない可能性が高い.破断の原因として,双晶変形が起因することが示唆されているが,本年度の実験より,材料全体において双晶が発生していないことが明らかとなった.今後は,EBSDを活用した微視的な測定を行い,破断の直接的要因を検討する.マグネシウム合金板に単軸引張,平面ひずみ引張,等2軸引張の変形を破断するまで負荷した.破断直前に板厚くびれが発生することなく,試験片は,突如,破断した.この破壊は圧縮双晶および二重双晶の発生に起因したボイドが破断の起点となることを示唆する結果が,単軸引張後の試験片観察を基に報告されている.そこで,本研究では,それが平面ひずみや等2軸引張の状態の低延性の直接的な原因であるか否かの検証を行った.次に,引張双晶,圧縮双晶を予測できる結晶塑性モデルを構築した.このモデルを用いた数値解析の結果,双晶が発生し,そこにひずみが集中する過程をシミュレートすることができた.

また,ひずみの集中によってボイド形成が進み,破壊に至ることの再現に成功した.単軸引張,平面ひずみ引張,等2軸引張の変形モードにおける試験片の変形を解析したところ,平面ひずみや等2軸の方が,圧縮双晶および引張双晶の発生量が多いことが分かった.さらに,早期に発生することによって,これらの変形状態での成形限界を低くしていることを明らかにした.次に,実験結果をもとにX線回折ならびにEBSDを用いた結晶方位測定を行った.X線回折の結果より,負荷前の供試材と破断後の供試材の集合組織を比較したところ,単軸引張後の試験片では,引張双晶による方位回転が確認されたが,平面ひずみ引張,等二軸引張においては,破断後の集合組織を測定しても初期状態と有意な差はなかった.一方,EBSDを用いた結果,全ての変形モードにおいて引張双晶,圧縮双晶,二重双晶の活動が観察された.引張双晶が最も活発に活動し,圧縮双晶と二重双晶の発生量は明らかに少ないことが分かった.また,双晶の発生と応力状態との対応関係を調査した.応力状態は圧縮双晶と二重双晶の発生しやすい状態であった.破断と双晶との対応関係を確認したが,本実験結果内においては明瞭な相関は確認されなかった.本研究では,マグネシウ合金板が張出変形において極端に成形性が低い原因を明らかにすることを目的としている.圧縮双晶,二重双晶を予測し,損傷を考慮することのできる結晶塑性モデルを構築した.本モデルを有限要素法に導入し,平面ひずみや等2軸の方が,圧縮双晶と二重双晶が早期に多く発生し,それが早期の破断を引き起こしていることを突き止めた.単軸引張,平面ひずみ引張,等2軸引張を負荷した試験片をEBSDで観察した.引張双晶が最も活発に活動し,圧縮双晶と二重双晶の発生量は明らかに少ないことが分かった.本実験結果内において,双晶は極微量であり破断との明瞭な相関は確認されなかった.すべりと双晶を考慮した結晶塑性モデルを構築する.さらに,損傷力学の概念を取り入れて,双晶内部で発生した過剰なすべり変形に起因して材料の応力負担能力が低下するようなモデルを取り入れる.それらを有限要素法に組み込み,AZ31の成形性を解析する手法を構築する.EBSDによる破断部近傍の結晶方位の測定を行い,破断の要因を検討する.その後,すべりと双晶を考慮した結晶塑性モデルを用いた有限要素法による結果と比較検討し,破断の要因を明らかにする.塑性力学予定していた自動研磨機を購入する必要がなくなったためである.試料研磨用の消耗品に要する支出が予想より少額であったためであり,研究の進行は順調である.次年度以降は,実験の測定分解能の改善のために,新たな計測機器の導入,ならびに研磨面精度を改善のために,研磨用備品(研磨クロス等)の購入に研究費を使用する計画である.実験とモデリングとの比較のため,大規模な有限要素法解析を実施する予定である.今後,そのための計算機の性能向上に予算を支出する予定である.
ランダム行列模型を用いた原子核のトンネル効果の研究

原子核には、アルファ崩壊や核分裂、超変形状態の崩壊など、多自由度系における複雑なトンネル過程が数多く存在する。これらのトンネル確率は、原子核の内部構造の変化に敏感であり、そのことが原子核の寿命の理論的な予言を困難にしている。他方、理論的な問題として、Calaeira-Leggettは、準安定系のトンネル過程に対する摩擦を効果を見積もることに成功しており、その有限温度への拡張版は、高温極限でkramers型1(摩擦の小さな極限ではBohr-Wheelen型)を与えることが知られており、核分裂の実験データとの比較により、摩擦の大きさを求めることが出来る。本研究では、多自由度系における複雑なトンネル過程を調べる模型として、独立フェルミ粒子系の一粒子準位が原子核の変形とともに、ランダム行列に従って変化すると仮定し、内部状態間の変化が、トンネル確率にどのように影響するかを、我々によって開発された動的ノルムの方法(Phys.Rev.C51(1994).187)を使って調べた。多準位系の計算機実験によって明らかになったことは、(1)準位交差的近くの非断熱効果が重要であり、(2)その効果は、クランキング質量として見積っただけでは不十分であり、エネルギー損失の効果が大切であること、(3)多準位間の遷移を多く、繰り返すことで、Ohmicな摩擦と似たエネルギー損失が得られ、(4)そのトンネル確率への影響は(多ホゾン系による摩擦を考えたCaldeira-Leggettの場合と同じように)指数関数的に、トンネル過程を抑制する。というものである。これらのトンネル確率は、原子核の内部構造の変化に敏感であって、そのことが原子核の寿命の理論的な予言を困難にしている。一方、CaldeiraとLeggettは、準安定な多自由度系の模型を用いて、摩擦がトンネル効果に与える影響を調べることに成功しており、その寿命の表式が高温極限でKramers型、摩擦のない極限でBohr-Wheeler型を与えることから、原子核の分裂過程に対する内部運動の影響を知る上で重要な模型であることが知られている。以上を研究の背景として、本研究では、複雑な原子核の内部運動をランダム行列模型を用いて統計的に記述し、それらが原子核の形の変化におけるトンネル過程の動力学にどのような影響を与えるかを調べることを目的とする。具体的には、準古典的な多自由度トンネル系に対するわれわれの理論(Phys.Rev.C51,1994,p187)を多フェルミ粒子系に適用し、計算機実験によって、トンネル確率に対する準位間遷移の非断熱効果を調べ、結果を「摩擦」や「有効質量」といった巨視的な量で理解できるかどうかを考察することを目的とする。本年度は2年間の研究計画の準備段階として、ワークステーションおよびその関連ソフトウエアを導入した。予備的な数値実験を行った結果、次のような結果を得た。(1)巨視的なトンネル確率は準位回避点における非断熱遷移により抑止される、(2)原子核の理論でしばしば使われるクランキング型有効質量は準位回避点近傍で特異的に大きな値を持つけれども、動的なトンネル確率の計算を行うとその影響は比較的容易にsmear outされる。より進んだ定量的な議論は、現状のワークステーションの記憶容量では困難なので、来年度に継続した研究計画において、準位数や粒子数を増やした数値実験を行ったあとに行う予定である。というものである。
窒化インジウム系半導体の合成法確立と高性能p/n接合素子への展開

InGaN混晶では組成制御(バンドギャップ: 0.65 3.4 eV)の観点から太陽光スペクトル全域をカバーする高性能太陽電池や三原色(青・緑・赤)LED発光素子が理論上期待される。本課題ではNH3窒化法の弱点を克服し、最も欠陥抑制が困難な窒化インジウム(InN)のp型ドーピングを目的とし、In系窒化物p/n接合素子応用へ展開する。
高温で強磁性的挙動を示すキラル有機ラジカル液晶の低磁場・電場応答性に関する研究

分子の中心部にニトロキシド構造を有する安定な中性およびイオン性のキラルモノラジカル液晶性化合物を種々合成することに成功した。ついで、これらの化合物の液晶相に弱い磁場を印加すると、スピングラスに類似の強い磁気相互作用(J > 0)が発現することを発見した。そこで、高温測定に有利な電子スピン共鳴スペクトル法を用いて、有機ラジカル液晶中で発現する磁気相互作用と分子・液晶相構造との相関関係を明らかにし、磁性発現のメカニズムを提唱した。(1)分子のコア部分に、電気双極子モーメントと磁気双極子モーメントを併せもつニトロキシド構造を有する安定な中性またはイオン性のキラル有機モノラジカル液晶性化合物を種々合成し、これらの分子・液晶相構造と強磁性的性質との相関関係を系統的に検討し、これまで明らかにしてきた液晶相中での強磁性的性質発現のメカニズムを探る。(2)上記の化合物中、大きな磁性的相互作用と強誘電性を示すキラル有機ラジカル液晶については、ニトロキシル基由来の電気双極子モーメント(約3デバイ)と磁気双極子モーメント間の協働効果である磁気電気効果が発現するか否かを検討する。(3)中性またはイオン性の有機ビラジカル液晶性化合物の合成を検討する。分子設計によっては、モノラジカル液晶と比較して、より大きな電気双極子モーメントとより強い磁気的相互作用を発現する液晶の開発を期待できる。いずれも液晶性を示すが、基本骨格の異なるキラル有機ラジカル化合物を新たに5系統合成し、さらにそれぞれの系統について、アルキル側鎖長の異なる誘導体(ラセミ体と光学活性体)を種々合成し、分子の基本骨格・アルキル側鎖長・キラリティーが相構造や液晶相発現温度に及ぼす影響を明らかにした。これらの化合物はネマチック相の他に、スメクチックC(C*)相を示すものと、スメクチックA(A*)相を示すものに、二分された。分子軌道計算により、分子内の双極子モーメントの方向が、発現する液晶相の種類を決定する最大要因となっていることが示された。また、キラリティーの導入によって相構造は大きく変化し、同じ分子でもラセミ体と光学活性体では、その液晶超構造に大きな違いが見られた。合成した化合物のうち、スメクチックC相を示したものについて、SQUID磁束計を用いて、磁化率の温度依存性を測定したところ、昇温過程で、結晶相から液晶相へ転移する際に、磁化率の異常な増加がみられた。また、液晶相を維持している間は、その値は低下しなかった。この事実は、ラジカル化合物が液晶相において強磁性的な相互作用を発現したことを物語っている。そこで、この液晶物質を温水上に浮かべて、永久磁石を作用させたところ、磁石の動きにしたがって、自由に水面上を迅速に動くことが観察された。さらに、電子スピン共鳴スペクトル法を用いて、同じラジカル化合物のスペクトル強度の温度依存性を測定したところ、やはり結晶相から液晶相へ転移する際に、スペクトル強度の異常な増加がみられ、強磁性的相互作用の発現を確認できた。以上のように、本研究により、有機ラジカル液晶中で初めて強磁性的相互作用を観察することができた。これまでに合成した液晶性を示すキラル有機ラジカル化合物のラセミ体と光学活性体について、それぞれの相構造と液晶相発現温度について総括し、アルキル側鎖長の影響について定量的に評価した。ついで、キラルスメクチックC相を示す化合物については、配向処理を施した電極付きサンドイッチ形ガラスセル(セル厚:4μm)に封入した試料を作成し、自発分極・電場応答性・チルト角などの強誘電性発現の確認に必要な各種測定を行い、強誘電性と分子構造の相関関係を明らかにした。ついで、これらの液晶性化合物について、SQUID磁束計を用いて、磁化率の温度依存性を測定したところ、昇温過程で、結晶相から液晶相へ転移する際に、磁化率の異常な増加を確認した。この磁化率の増加は、ネマチック相では小さいが、キラルネマチックス相では大きくなることが判明した。さらに、スメクチック相やキラルスメクチック相でも大きな増加が認められた。また、いずれの場合も、液晶相を維持している間は、上昇した磁化率の値に変化は見られなかった。この事実は、有機ラジカル化合物が液晶相において強磁性的な相互作用を発現し、その相互作用の大きさは液晶相の超構造に依存することを物語っている。そこで、これらの液晶物質を温水上に浮かべて粒子とし、永久磁石を作用させたところ、磁石の動きに応じて、自由に水面上を動いた。この際、ネマチック相を示す液晶の動きは遅かったが、キラルネマチックス相・スメクチック相・キラルスメクチック相を示す液晶の動きは速く、磁化率の温度依存性の結果と一致した。さらに、電子スピン共鳴スペクトル法を用いて、これらの液晶性ラジカル化合物について、スペクトルのg値・線幅(ΔHpp)・強度(I)から得られる常磁性磁化率について、温度依存性を測定したところ、やはり結晶相から液晶相へ転移する際に、常磁性磁化率の異常な増加がみられ、強磁性的相互作用の発現を再確認できた。以上のように、本研究により、種々の有機ラジカル液晶相中で強磁性的相互作用が発現することが明らかとなった。新たに液晶性を示す、キラルな中性モノラジカル化合物(4種類)・中性ビラジカル化合物(1種類)

・イオン性モノラジカル化合物(1種類)を見出し、それぞれの化合物について側鎖長を変えて系統的な合成を行った。合成した化合物が示す液晶相の同定については、温度可変偏光顕微鏡観察・示差走査熱量分析・温度可変X線回折測定を用いた。合成した4種類の中性モノラジカル化合物のうち、3種類が新たに強誘電性を示すことが明らかとなった。また、SQUID磁束計を用いて磁化率の磁場依存性を測定したところ、合成したいずれの化合物も液晶状態で、強い磁気的相互作用を示すことが明らかとなった。しかし、SQUID磁束計を用いる高温での磁化率の測定には大きな誤差が伴うため、より正確な高温での磁化率の測定を目指して、電子スピン共鳴(EPR)スペクトル法を用いて得られるデータから常磁性磁化率の温度依存性を測定する方法を検討し、確立した。この測定法を用いることにより、液晶相中でのマクロと同時にミクロな磁気的相互作用の同時観察が可能となった。この手法は、今後、高温での常磁性ソフトマテリアル中の磁気的相互作用の観察法として広く用いられると予想している。さらに予備実験として、強誘電性と強い磁気的相互作用を示す液晶物質を、配向処理を施した電極付きサンドイッチ型ガラスセルに封入し、EPR法により磁化率の電場依存性を測定したところ、明らかに磁気電気効果と考えられる現象が観察された。今後、再現性を確かめる必要があるが、もしそうであれば、常磁性強誘電性液晶で磁気電気効果が観察された最初の例となる。高温測定に有効な電子スピン共鳴(EPR)スペクトル法を用いて、これまでに合成したキラル有機ラジカル化合物について、液晶相中で発現する磁気相互作用と分子構造との相関関係、およびそめ磁性発現のメカニズムについて検討した。その結果、負の誘電異方性(Δε<0)を示す化合物は、液晶相がキラルかアキラルかにかかわらず、一様に強い正の磁気相互作用(J>0)を示した。一方、正の誘電異方性(Δε>0)を示す化合物については、アキラルなネマチック(N)相では弱い反強磁性的相互作用(J<0)が観測されたのにたいして、キラルなスメクチックA(SmA)相では、強い磁気相互作用(J>0)の発現が観測された。これらの事実は、分子の誘電異方性がアキラルな液晶相中での分子配列を支配し、正の誘電異方性を示す化合物では中心対称な二量体構造が形成され、その結果スピン間相互作用が反強磁性的に作用することが明らかとなった。これに対して、負の誘電異方性をもつ化合物のキラルとアキラルの液晶相、および正の誘電異方性をもつ化合物のキラル液晶相では、中心対称な分子配置をとらず、そのためスピン間相互作用は強磁性的に作用することが判明した。一方、いずれの化合物も高温め結晶状態では、常磁性を示すのみであった。以上の結果から、液晶相は分子の回転と並進が自由に起こる準安定状態であり、そのため結晶状態では見られない磁気相互作用が発現することがわかった。ついで、液晶相中で発現した正の磁気相互作用に異方性が見られるか否かを検討した。キラルスメクチックC(SmC*)相を示す化合物を、配向処理を施した電極サンドイッチ形ITOガラスセルに封入した試料を作成し、EPRスペクトル法を用いて、g値・線幅・磁化率の電場(+25V-25V)依存性を測定した。その結果、磁場が分子長軸方向に平行な場合に磁化率が最大となり、分子間磁気相互作用に異方性が見られることが判明した。分子の中心部にニトロキシド構造を有する安定な中性およびイオン性のキラルモノラジカル液晶性化合物を種々合成することに成功した。
網膜再生にかかわる傷害組織再構築を制御する細胞間相互作用に関する研究

網膜再生治療に関わる組織修復過程に誘導される細胞と分子シグナルについて解析した。1視神経傷害モデルにおいて傷害組織に誘導されるミクログリアの特性と機能、貪食に関わる分子シグナルを明らかにした。2眼疾患サンプルを用いた解析により疾患で異なる生理活性物質の発現と網膜疾患の硝子体液の網膜色素上皮細胞に対する形質転換誘導作用が認められた。3組織線維化を制御する分子メカニズムの一つとしてエピジェネティックな制御機構を明らかにした。難治網膜疾患に対する網膜再生治療のより有効かつ安全な移植技術の開発のため、組織構築時の神経・グリアー血管相互作用に着目して、疾患モデル、病的網膜における網膜組織幹細胞の維持、機能発言に影響を与える細胞間相互作用とその分子メカニズムを解析し、それらの制御機構を解明する。(1)網膜傷害モデルにおける増殖に関わる細胞の同定・機能解析:成体ラットにグルタミン酸受容体阻害剤NメチルDアスパラギン酸(NMDA)硝子体内投与による網膜神経傷害モデル、視神経クラッシュ(ONC)傷害モデルを作成し傷害後網膜内における細胞増殖と細胞の同定を行なった。NMDA傷害モデルでは網膜神経節細胞、内顆粒層で毛様体由来神経栄養因子(CNTF)の発現上昇をみた。ONC傷害モデルでは傷害後網膜内神経節細胞層に細胞増加を認めミクログリアのサブタイプが同定された。(2)虹彩上皮細胞、色素上皮細胞の増殖、形質転換に関わる細胞内シグナルの解明:ブタ摘出眼球より虹彩上皮細胞を単離培養し、血管内皮増殖因子(VEGF)添加による増殖因子、炎症性サイトカインの発現を調べた。(3)網膜血管性疾患における機能的タンパク質の同定:血管新生緑内障房水中のVEGF、炎症性サイトカイン濃度を測定した。血管新生緑内障では炎症性サイトカイン、血小板由来増殖因子、血管内皮増殖因子(VEGF)の発現上昇が認められた。抗VEGF抗体硝子体内投与によりVEGFの産生のみ抑制が観察された。難治網膜疾患に対する網膜再生治療のより有効かつ安全な移植技術開発のため、組織構築時の神経・グリアー血管相互作用に着目して、疾患モデル、病的網膜における網膜組織幹細胞の維持、機能発現に影響を与える細胞間相互作用とその分子メカニズムを解析し、それらの制御機構を解明する。(1)網膜ミクログリア細胞の単離と発現の解析(2)病的網膜における細胞形質転換に影響を与える分子メカニズムの解析(3)網膜血管性疾患における機能的タンパク質の同定(4)線維芽細胞の分化を制御する分子メカニズムの解析疾患サンプルによる解析は概ね計画通り進行している。血管新生緑内障房水中のVEGF,炎症性サイトカイン濃度を測定し、虹彩上皮細胞におけるVEGFの発現誘導機構を明らかにした。傷害モデルに関してはONCモデルにおいてミクログリアのサブタイプ解析、機能解析を行い、傷害時におけるミクログリアの機能を明らかにした。さらに組織再生に影響する炎症制御の破綻機構を明らかにするため、炎症の慢性化を誘導、維持する因子を同定中である。難治網膜疾患に対する網膜再生治療のより有効かつ安全な移植技術開発のため、織構築時の神経・グリアー血管相互作用に着目して、疾患モデル、病的網膜における網膜組織幹細胞の維持、機能発現に影響を与える細胞間相互作用とその分子メカニズムを解析し、それらの制御機能を解明した。(1)網膜ミクログリア細胞の単離と発現の解析:マウス視神経機械的損傷モデルを作成し、ミクログリアのサブタイプの発現を特異的マーカーを用いて明らかにした。さらにミクログリアの機能について貪食能を解析し、視神経傷害時におけるミクログリアの機能を明らかにした。(2)網膜幹細胞における分化に影響を与える分子メカニズムの解析:in vitroで網膜幹細胞としての機能が報告されている虹彩上皮細胞を単離培養しVEGF添加による増殖因子、炎症性サイトカインの発現を調べた。(3)網膜血管性疾患における機能的タンパク質の同定:血管新生緑内障房水中のVEGF、炎症性サイトカイン濃度を測定し、虹彩上皮細胞におけるVEGFの発現誘導機構を明らかにした。(4)線維芽細胞の分化を制御する分子メカニズムの解析:組織再生に影響する炎症制御の破綻機構を明らかにするため炎症の慢性化を誘導、維持する因子を解析するため生体内における炎症細胞の可視化同定法の開発を行った。またヒストン脱アセチル化酵素阻害薬を線維芽細胞に添加し形質転換におけるエピジェネティック制御を明らかにした。疾患サンプルによる解析は概ね計画通り進行している。傷害モデルに関してはONCモデルにおいてミクログリアのサブタイプ解析を予定している。In vitroでの実験が組織由来網膜幹細胞の増殖能が低く共培養の実験まで至っていない。疾患モデルでは遺伝子変異マウスでの解析を準備している。網膜幹細胞を用いた共培養の実験の遂行が困難であることから胎仔脳由来神経幹細胞、ミクログリアを用いて培養の条件設定を行う予定である。眼科学疾患モデルでは遺伝子変異マウスでの解析を準備している。。In vitroの実験に関してはこれまで網膜幹細胞の機能が報告されている虹彩上皮細胞、網膜色素上皮細胞を用いて培養の条件設定を行なう予定である。
C型肝炎ウイルス治療薬の新規スクリーニングシステムの構築

C型慢性肝炎患者に対する治癒率の改善のためには、現在のインターフェロン(IFN)とリバビリンの併用療法の改善だけでなく、IFNよりもC型肝炎ウイルス(HCV)の排除に効果的な薬剤をスクリーニングすることも重要である。そこで、従来のシステム(レポーター蛋白質の酵素活性を利用し、細胞内のHCV RNA複製レベルを定量、しかし生細胞のままの定量は困難)より簡便かつ安価に大規模な薬剤スクリーニングを遂行するために、緑色蛍光蛋白質であるEGFPをレポーター蛋白質に用いて、生細胞のままHCV RNA複製レベルの定量を可能にするシステムの開発を試みた。前年度までに、このシステムに必要なEGFP遺伝子を含む全長HCV RNA複製細胞を数クローン樹立することができ、細胞内でのHCV蛋白質およびEGFPの発現や、EGFPによる蛍光は観察できている。今年度は、この樹立した全長HCV RNA複製細胞を用いて、生細胞のままHCV RNA複製レベルを定量できるシステムの構築を行った。樹立できた数クローンのうち、OGN/C-5B/KE細胞(EGFP遺伝子をネオマイシン耐性遺伝子の前に、また適応変異としてNS3領域にK1609Eのアミノ酸置換を導入した全長HCV RNAが持続的に複製している細胞)のあるクローンが最も効率よく経時的に蛍光強度を上昇していることが確認できた。この細胞にIFN-αを処理し、その蛍光強度を生細胞のまま測定したところ、IFN-αの濃度依存的に減少していた。また、その値は、リアルタイムPCR法により定量したHCV RNA量と相関していた。また、ウエスタンブロット法により、EGFPやHCVコア蛋白質も減少していることが確認された。IFN-α以外に、HCVの排除に効果を示すことが報告されているIFN-β、IFN-γ、シクロスポリンAやフルバスタチンを同様に処理したところ、その蛍光強度とHCV RNA量の値は相関していた。また、IFN-αとシクロスポリンAあるいはIFN-αとフルバスタチンの併用処理は、それぞれの単剤処理に比べ、その蛍光強度は減少していた。これらの結果は、生細胞のままHCV RNAの複製レベルを定量することができるシステムを開発することができ、また、種々の薬剤処理も可能であることを示している(今研究実績は、現在、投稿準備中である)。C型慢性肝炎に対する有効な治療法としてインターフェロン(IFN)とリバビリンの併用療法が現在、主流であるが、その治癒率は50%程度である。OR6アッセイシステム(ルシフェラーゼ活性の測定によりHCV RNAの複製レベルを定量的にかつ簡便に測定できるシステム)により、ミゾリビンが抗HCV活性を有することが示されたが、IFNに代わりうるところまでには至っていない。そこで、特異的治療薬の大規模スクリーニングを行うための新規システムの開発を目的として、可視化遺伝子(EGFP)を全長HCV RNA複製系に導入し、生細胞のままHCV RNAの複製レベルの観察を可能にする系の開発を試みた。このシステムに必要なEGFP遺伝子を含む全長HCV RNA複製細胞の樹立の準備段階として、以下の項目について検討した。1)EGFP遺伝子を全長HCV RNAのどの部分に挿入するか、2)HCV RNAの複製効率を上昇させる適応変異のどれをHCV RNAに導入するか、3)レシピエント細胞として、どの治癒細胞(HCV RNA複製細胞からHCV RNAをIFN-αで排除した細胞)を用いるか。1)に関しては、EGFP遺伝子をネオマイシン耐性遺伝子の前、コア遺伝子の前、NS5A遺伝子の後ろなどに挿入したものを作成した。また、それぞれの場所にEGFP遺伝子を1コピー有するものや組み合わせでEGFP遺伝子を2あるいは3コピー有するものも作成した。2)に関しては、NS3領域の適応変異であるE1202G(当研究室で見出された)あるいはK1609E(すでに報告されたものであるが、当研究室の全長HCV RNA複製細胞にも見出されている)のアミノ酸置換を導入したEGFP遺伝子を含む全長HCV-O RNAを作成した。また、両アミノ酸置換を有する場合に複製効率がさらに高まることが見出されたことから、両アミノ酸置換を有するものも同様に作成した。また、全長HCV RNA複製細胞の長期培養により複製効率が上昇している可能性を示す知見が得られたことから、それらのアミノ酸置換も今後、導入予定である。3)に関しては、O細胞(全長HCV RNA複製細胞)、あるいはOR6細胞(ルシフェラーゼ遺伝子を含む全長HCV RNA複製細胞)から作成したOcあるいはOR6c治癒細胞を用いた。また、HCV蛋白質が細胞内のIFNシステムに影響を与えている可能性を示す知見が得られたことから、IFN耐性を示す全長HCV RNA複製細胞から作成した治癒細胞も今後、使用する予定である。これらのHCV RNAをエレクトロポレーション法により、それぞれ治癒細胞に導入したところ、蛍光が観察される様々なG418耐性のクローン細胞が樹立できた。また、それらの細胞内でのHCV蛋白質やEGFP蛋白質の発現が確認された。

そこで、従来のシステム(レポーター蛋白質の酵素活性を利用し、細胞内のHCV RNA複製レベルを定量、しかし生細胞のままの定量は困難)より簡便かつ安価に大規模な薬剤スクリーニングを遂行するために、緑色蛍光蛋白質であるEGFPをレポーター蛋白質に用いて、生細胞のままHCV RNA複製レベルの定量を可能にするシステムの開発を試みた。前年度までに、このシステムに必要なEGFP遺伝子を含む全長HCV RNA複製細胞を数クローン樹立することができ、細胞内でのHCV蛋白質およびEGFPの発現や、EGFPによる蛍光は観察できている。今年度は、この樹立した全長HCV RNA複製細胞を用いて、生細胞のままHCV RNA複製レベルを定量できるシステムの構築を行った。樹立できた数クローンのうち、OGN/C-5B/KE細胞(EGFP遺伝子をネオマイシン耐性遺伝子の前に、また適応変異としてNS3領域にK1609Eのアミノ酸置換を導入した全長HCV RNAが持続的に複製している細胞)のあるクローンが最も効率よく経時的に蛍光強度を上昇していることが確認できた。この細胞にIFN-αを処理し、その蛍光強度を生細胞のまま測定したところ、IFN-αの濃度依存的に減少していた。また、その値は、リアルタイムPCR法により定量したHCV RNA量と相関していた。また、ウエスタンブロット法により、EGFPやHCVコア蛋白質も減少していることが確認された。IFN-α以外に、HCVの排除に効果を示すことが報告されているIFN-β、IFN-γ、シクロスポリンAやフルバスタチンを同様に処理したところ、その蛍光強度とHCV RNA量の値は相関していた。また、IFN-αとシクロスポリンAあるいはIFN-αとフルバスタチンの併用処理は、それぞれの単剤処理に比べ、その蛍光強度は減少していた。これらの結果は、生細胞のままHCV RNAの複製レベルを定量することができるシステムを開発することができ、また、種々の薬剤処理も可能であることを示している(今研究実績は、現在、投稿準備中である)。