hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
モノネガウイルス感染による宿主細胞応答ネットワークの解析

我々のこれまでの研究から、マイナス鎖一本鎖RNAウイルスは同種のウイルスでも病原性の違いや細胞の種類によって、感染後に誘発される遺伝子発現動態に違いが生ずるという結果を得ている。本研究では、牛疫ウイルスを中心としたモービリウイルスとニパウイルスについて、感染に起因する宿主細胞応答の転写制御ネットワークおよび蛋白相互作用を、新技術と情報統計学的手法を用いて網羅的・体系的に解明することを目標とする。本年度は、昨年達成したウイルス感染後の転写制御ネットワークの構築をin vitroでvalidationするために、同定された転写因子群の活性変動を模擬的に再現することで、実際にウイルス感染後の細胞の転写動態を再現するかどうかを検索した。また、モービリウイルスは細胞種特異的な宿主応答を誘導することから、上流転写因子群からのシグナルの伝達の差を、標的細胞での活性化動態を指標に解析した結果、転写因子複合体ファミリーのサブユニットの一つが細胞種特異的な活性化を担っている事が示され、さらにこの活性化動態にはウイルスアクセサリー蛋白が関与することを証明した。この違いが最終的な下流の転写動態の大きな違いを生み出すと考えられた。一方で、本年度はもう一つの大きな命題であるニパウイルスの宿主特異的な転写制御ネットワークの解析に着手することができた。ゲノム情報の乏しいブタをヒトと並列して解析するために、RNA-seq法を導入し、ヒトとブタの細胞株へウイルス感染後に細胞内で発現する全mRNA量の変動を網羅的に測定した。そして差の見られた遺伝子についてアノテーションを行ない、どのようなpathwayが転写制御を受けるかを検索した。その結果、両細胞共に激しい遺伝子発現の変動が見られたが、変動した遺伝子がほとんど重複しないという予想外の結果が得られた。本研究課題では、牛疫ウイルスを中心としたモービリウイルスおよびニパウイルスについて、感染に起因する宿主細胞応答の転写制御ネットワークおよび蛋白相互作用を、新技術と情報統計学的手法を用いて網羅的・体系的に解明することを目標とした。昨年度までに転写制御ネットワークの上流転写因子の活性化動態を明らかにしたが、それだけでは網羅されない転写制御機構も示唆されたことから、ハウスキーピング遺伝子群の広範な発現低下を指標に検索した結果、翻訳後修飾を担う宿主蛋白がウイルス感染後に分解をうけ、その後の転写抑制に繋がることが示された。既存の転写ネットワークに加えて新しい機構の存在の可能性が提唱されたと考える。また、昨年までに行ったRNA-seq法によるニパウイルス感染後の宿主転写動態の解析をさらに進め、アクセサリー蛋白をそれぞれ欠損した組換えニパウイルス感染後の転写変動を解析した。その結果、モービリウイルスとは大きく異なり、多岐にわたる細胞機能にアクセサリー蛋白が関与することが明らかになった。加えて、アクセサリー蛋白と相互作用する宿主蛋白を検索し、複数の因子が抗ウイルス応答に関与することを明らかにした。
界面物理現象の詳細解析による流れのマルチスケール性の解明

以下の4つの項目について成果が得られた.(1)分子動力学シミュレーションの結果を直接利用して,粗視化粒子による散逸粒子動力学シミュレーションのための数理モデルを新たに構築した.(2)面活性剤が気泡の3次元運動に与える影響に関して,詳細な実験を通して気泡運動のモデリングを行った.(3)気泡の合体・反発に対する表面活性剤の影響を評価するため,境界適合格子を利用した詳細な数値計算を実施し、気泡が反発するには活性剤吸着によるマランゴニ効果と界面変形の影響が重要であることを示した.(4)マイクロバブル生成用に特化した形状のマイクロチャネルを設計し,直径6 mのマイクロバブルの生成に成功した.さらに,高速マイクロPIV新たな計測システムを構築し,気泡生成に重要となる知見を得た。また,将来のDDS利用に向けて,有機相をコーティングするための新しいチャネルを開発し,気泡表面に有機相をコーティングすることに成功した.以下の4つの項目について成果が得られた.(1)分子動力学シミュレーションの結果を直接利用して,粗視化粒子による散逸粒子動力学シミュレーションのための数理モデルを新たに構築した.(2)面活性剤が気泡の3次元運動に与える影響に関して,詳細な実験を通して気泡運動のモデリングを行った.(3)気泡の合体・反発に対する表面活性剤の影響を評価するため,境界適合格子を利用した詳細な数値計算を実施し、気泡が反発するには活性剤吸着によるマランゴニ効果と界面変形の影響が重要であることを示した.(4)マイクロバブル生成用に特化した形状のマイクロチャネルを設計し,直径6 mのマイクロバブルの生成に成功した.さらに,高速マイクロPIV新たな計測システムを構築し,気泡生成に重要となる知見を得た。また,将来のDDS利用に向けて,有機相をコーティングするための新しいチャネルを開発し,気泡表面に有機相をコーティングすることに成功した.本研究課題では、(1)界面活性剤が気泡(群)の挙動に与える影響の解析、(2)近接界面間の相互作用の詳細解析、(3)微小流路内における固気液三相界面の物理現象の詳細な解明、(4)界面の分子論的解析を対象とし、これらを通して流れのマルチスケール解析手法を確立することを目的としている。平成21年度の実施内容は以下の通りである。課題1に関しては、濃度が既知な蛍光性界面活性剤溶液と高感度高速度デジタルカメラを用い、バルク中の活性剤濃度を蛍光発光強度から測定する手法を開発した。また、超純水中に異なる濃度で界面活性剤を溶解させ、気液界面境界条件をフリースリップからノースリップまでの任意の状態に設定しつつ、気泡運動の軌跡・気泡形状の同時計測を行ない、推定される気液界面状態と気泡運動の関連を定量的に明らかにした。課題2に関しては、近接する二つの気液界面に微小振幅近似を行ない、時間発達する波について調べた。波数と周波数に関する分散関係を、表面張力係数と気液密度比を含む形式で得た。また、得られた固有方程式を解くと二対の固有波が求まり、一つは漸近安定、もう一つは(二つの界面の)位相差によって安定性が変わることが予想される。また界面追跡法の一種を用いた数値計算手法によって、二つの気液界面が接近した後に跳ね返る問題を扱い、表面張力係数をパラメータとして反発の様子について解析を進めている。課題3に関しては、T字型マイクロチャネルを用いた気泡生成過程の計測を目的として、1Mfpsで撮影可能な超高速度カメラを用いて、顕微鏡下で界面の観察及びトレーサー粒子を用いた粒子画像計測法による液相速度場の計測を可能とする実験システムを構築した。なお、課題4に関しては平成22年度に、界面活性剤の吸着による界面の応力分布変化の詳細機構を分子動力学シミュレーションにより解析することを計画している。本研究では,ミクロな界面物理現を分子スケールから詳細に解析し、マクロな流体運動を記述するためのマルチスケール解析手法を確立することを目指している.平成22年度は以下の成果を得た.(1)分子スケールにおける界面近傍の流れ現象の解析手法の開発界面の分子動力学シミュレーションを行うための粗視化手法として散逸粒子動力学法の検討を行った。(2)界面活性剤の吸着した気液界面の可視化手法の構築界面活性剤の気液界面への吸着挙動を明らかにするため、蛍光性界面活性剤を異なる濃度で溶解させた水溶液に関して、界面に吸着した活性剤濃度と蛍光発光量の校正曲線を取得した.また,流れの存在下で界面活性剤の気液界面における濃度分布からもたらされるマランゴニ効果と流れのバランスによる急激な界面濃度の変化を捉えることに成功した.(3)三相界面近傍の流動の詳細解析と界面制御技術の確立T字型マイクロチャネルにおいて10ミクロン程度の微小気泡が生成される際のメカニズムを明らかにするために、超高速度カメラによる界面運動及び液相流体の速度場計測を進め,得られた知見をもとにより小さな気泡を作る方法を検討した.その結果として,流路形状を工夫することにより,T字型チャネルによる気泡生成としては世界最小の6ミクロンの気泡の生成に成功した.平成23年度は,年度当初に挙げた以下の4つの研究項目に関して,それぞれ以下の成果を得た.(1)分子スケールにおける界面近傍の流れ現象の解明およびモデリング複雑流路内における気液界面の挙動解析のために,分子動力学シミュレーションの結果を直接利用して,粗視化粒子による散逸粒子動力学シミュレーションのための数理モデルの構築を行った.その結果,従来は経験的に決められていたいくつかのモデルパラメータを,その物理的意味も含めて考慮すべき微視的因子を詳細に検討することに成功した.

(2)界面活性剤を含んだ水中における気泡の3次元挙動界面活性剤を含んだ水中における気泡の複雑な挙動を計測し,表面活性剤が気泡の3次元運動に与える影響に関して,気泡に働く抗力および揚力のモデリングを行った.(3)近接界面間の相互作用の詳細解析およびモデリング気泡・気泡間の相互作用に対する界面活性剤の影響を調べるため,境界適合格子を利用した詳細な数値計算を実施し、非定常な界面活性剤の分布、それによって誘起される流動構造、界面近傍における主要な流体力を理論的、数値的に評価することにより,気泡の変形を考慮することにより,表面活性剤のもたらすマランゴニ効果により気泡同士の反発現象が引き起こされる可能性があることを示した。(4)三相界面近傍の流動の詳細解析とそれを用いた安定な界面修飾法の確立平成22年度に開発されたマイクロチャネルを用い,高速マイクロPIVによる計測を行ない,気泡サイズを小さくするためには気泡ののど部に向かう流れが重要であることを示した。さらに,チャネル形状に改良を加え,将来の薬剤搬送マイクロバブル開発に向けて、表面修飾をするためのチャネルを準備し,気泡表面に有機相をコーティングすることに成功した.
語による曲線と結び目の研究

(研究対象)各文字に対し,ある固定された集合の元が割り当てられているとする.ここでは,このような文字かちなる有限の文字列を語ということにする.ある性質を持つ語は曲線や結び目と類似の関係が入り,それらに対し普遍的な対象となっている.語による曲線や結び目の研究が本研究の課題である.(研究目的)研究開始時に報告者は語を用いて曲線の新不変量を体系的に構成していたが,それらの不変量の幾何的意味を明らかにしつつ拡張し,新たな応用を見つけることが研究の目的である.(研究成果)当該年度の研究の発端となった1年目の研究成果は次のようなものであった.1年目,報告者は曲面上の曲線に対する有限型不変量という特徴付けを考え,そのような特徴を持つ新たな不変量を具体的に構成した.この新不変量は研究開始時の不変量と深く関係している.さらに語に関する考察により,この新不変量の幾何的意味を与えた.また,結び目の不変量の圏化を語の理論に応用する研究をした.この1年目の成果を踏まえ,当該年度は語の結び目理論への応用を考えた.語の特質を認識しつつ,語の理論が結び目や曲線の不変量にどのような影響を与えるか考えた.その中で語の理論と相性のよい方法により,よく知られているホバノフホモロジーの不変性について,いくつかの結果も得た.これは未解決問題の解決も含んでいる.また,語の理論では未解決であったトラエフの予想の簡明な証明を与える研究に寄与した.(研究対象)各文字にある固定された集合の元が割り当てられているような文字列を語といい,語に同値関係を入れることにより,語は曲線や結び目と対応する.報告者によって,語を用いた種々の曲線の不変量が具体的な構成方法と共に与えられている.(研究目的)本研究の目的は,1.これらの報告者による不変量の拡張,並びにこれらの不変量が持つ幾何学的意味を明らかにすること,2.語の結び目への新たな応用を探すことにある.(研究方法)研究目的1について,結び目理論における有限型不変量の考え方を曲線に対して展開した.研究目的2については,結び目の不変量を圏化し,より強い不変量を得るという結び目理論のアプローチを応用した.(研究成果)当該年度の研究成果は次の三つに大別される.1.報告者による具体的な有限型不変量の構成方法を改良し,階層分けに関する研究を進展させた.2.報告者による曲線の有限型不変量がソリッド・トーラス内の結び目をどう分類するか,不変量の計算を進めた.3.語による曲線や結び目の不変量の圏化を研究し,新不変量の構成に貢献する研究を行い.得られた新不変量の計算を進めた.これらの成果は,量子群,量子不変量,曲面結び目,ブレイド群といった結び目理論に関連した国内外の学会(岡山,名古屋,パリ)に参加し,本研究の発展に関する手がかりを得たことが関係している.また,京都の学会,第4回高木レクチャーにおいて講演者のビロ教授と報告者は報告者の不変量に関する議論を行った.その結果,ビロ教授の不変量と報告者による有限型不変量の関連性から本研究の重要性と着眼点を再認識した.これは上で述べた三つの成果には含まれないが今後の研究に影響する成果といえる.(研究対象)各文字に対し,ある固定された集合の元が割り当てられているとする.ここでは,このような文字かちなる有限の文字列を語ということにする.ある性質を持つ語は曲線や結び目と類似の関係が入り,それらに対し普遍的な対象となっている.語による曲線や結び目の研究が本研究の課題である.(研究目的)研究開始時に報告者は語を用いて曲線の新不変量を体系的に構成していたが,それらの不変量の幾何的意味を明らかにしつつ拡張し,新たな応用を見つけることが研究の目的である.(研究成果)当該年度の研究の発端となった1年目の研究成果は次のようなものであった.1年目,報告者は曲面上の曲線に対する有限型不変量という特徴付けを考え,そのような特徴を持つ新たな不変量を具体的に構成した.この新不変量は研究開始時の不変量と深く関係している.さらに語に関する考察により,この新不変量の幾何的意味を与えた.また,結び目の不変量の圏化を語の理論に応用する研究をした.この1年目の成果を踏まえ,当該年度は語の結び目理論への応用を考えた.語の特質を認識しつつ,語の理論が結び目や曲線の不変量にどのような影響を与えるか考えた.その中で語の理論と相性のよい方法により,よく知られているホバノフホモロジーの不変性について,いくつかの結果も得た.これは未解決問題の解決も含んでいる.また,語の理論では未解決であったトラエフの予想の簡明な証明を与える研究に寄与した.
ラット坐骨神経損傷後の異常感覚に対する各種薬剤感受性と損傷後の時間経過との関係

今回の研究の目的は、神経損傷後の異常感覚モデルにおいて、神経損傷後の時間経過と麻薬系鎮痛薬及びNMDAレセプター拮抗薬の異常感覚に対する効果との関係を明らかにすることにあった.麻薬系鎮痛薬の代表的なものであるモルヒネを髄腔内投与すると,神経損傷後1週間では熱刺激に対する逃避反応の潜時が延長し良好な鎮痛効果を示すが,神経損傷後5週間では逃避反応の潜時は延長することはなかった.一方,NMDAレセプター拮抗薬の代表的なものであるMK-801を髄腔内投与すると,神経損傷後1週間でも5週間でも同様に異常感覚を選択的に抑制した.以上の結果から,神経損傷後の異常感覚に対する麻薬系鎮痛薬の効果は神経損傷後の時間経過とともに変化することが明らかになった.このメカニズムは明らかではないが,このような事実が臨床上麻薬系鎮痛薬の神経因性疼痛に対する効果が一定しないという事実の説明となるものと考えられた.またNMDAレセプター拮抗薬は,神経損傷後の時間経過とは関係なく常に神経損傷後の異常感覚を選択的に抑制する.このことは神経損傷後の異常感覚は脊髄におけるNMDAレセプターを介したメカニズムで常に異常感覚が維持されていることが示唆される.この様に,末梢神経を損傷するとモルヒネの結果からは,脊髄における疼痛伝達機構が時間経過とともに大きく変わっていることが示唆されたが,一方NMDAレセプター拮抗薬の結果からは,脊髄における異常感覚維持におけるNMDAレセプターの普遍的役割が示唆された.従って,今後神経因性疼痛の治療にはNMDAレセプターに注目した治療法の開発が有望であると考えられる.今回の研究の目的は、神経損傷後の異常感覚モデルにおいて、神経損傷後の時間経過と麻薬系鎮痛薬及びNMDAレセプター拮抗薬の異常感覚に対する効果との関係を明らかにすることにあった.麻薬系鎮痛薬の代表的なものであるモルヒネを髄腔内投与すると,神経損傷後1週間では熱刺激に対する逃避反応の潜時が延長し良好な鎮痛効果を示すが,神経損傷後5週間では逃避反応の潜時は延長することはなかった.一方,NMDAレセプター拮抗薬の代表的なものであるMK-801を髄腔内投与すると,神経損傷後1週間でも5週間でも同様に異常感覚を選択的に抑制した.以上の結果から,神経損傷後の異常感覚に対する麻薬系鎮痛薬の効果は神経損傷後の時間経過とともに変化することが明らかになった.このメカニズムは明らかではないが,このような事実が臨床上麻薬系鎮痛薬の神経因性疼痛に対する効果が一定しないという事実の説明となるものと考えられた.またNMDAレセプター拮抗薬は,神経損傷後の時間経過とは関係なく常に神経損傷後の異常感覚を選択的に抑制する.このことは神経損傷後の異常感覚は脊髄におけるNMDAレセプターを介したメカニズムで常に異常感覚が維持されていることが示唆される.この様に,末梢神経を損傷するとモルヒネの結果からは,脊髄における疼痛伝達機構が時間経過とともに大きく変わっていることが示唆されたが,一方NMDAレセプター拮抗薬の結果からは,脊髄における異常感覚維持におけるNMDAレセプターの普遍的役割が示唆された.従って,今後神経因性疼痛の治療にはNMDAレセプターに注目した治療法の開発が有望であると考えられる.
チタン板の水中爆発成形の加工技術

研究目的:工業用純チタンは、鉄・ステンレス等の他金属に比べ、軽量・強度・錆びない等の特徴があるが、高歪加工の適用が活発なアルミニウム等と比べると、変形抵抗が高く加工が容易ではない為、温間加工が一般的である。本校の研究のひとつに爆発成形法があり、火薬類の爆発によって生じる高密度な衝撃エネルギーを破壊エネルギーではなく成形する為のエネルギー源として利用する事で、難加工材料の冷間加工が可能になり、発色を施す事で用途が際限なく広がり、工業用純チタンの需要拡大に繋がる。研究方法:爆発成形法には、試料に爆薬を密着させて直接爆轟圧を負荷する直接法と、試料と爆薬とを間隔を置いて設置し、圧力媒体(水)を介して圧力を負荷する間接法の二通りがある。本研究では、衝撃波の作用により必要最小限の爆薬量で変形量を得る事が可能で、水中爆発により爆音を抑え飛散物を生じない等、安全面も考慮にいれ間接法で行った。本研究では、評価並びに需要を考慮し、A2サイズを実験対象とする。カッティングマシンにて文字・図形を切抜き、シート状の型とし、抜いた文字・図形を水中爆発成形法により、凸に塑性変形させる方法で評価した。A2サイズ以上のチタン板の全面に一括成形する際、導爆線が長くなる為、初めの衝撃波がチタン板に当る箇所と、終りの箇所では凸部のシャープさにバラツキが生じる問題がある。研究方法として1、板厚影響2、文字・図形の配置に対する影響に分け、最適条件を見極めた。研究成果:凸部のバラツキ問題は解決できた。但し、複雑な形状の場合には、凸部のシャープさに多少の課題は残る。詳細は、研究方法1の場合、導爆線の型からの垂直距離にて解決できた。2の場合は、導爆線を文字・図形に対し、曲線的に這わせると共に、並行する曲線同士の間隔を調整する事で解決できた。最終的には、1、2の方法を組合せる事で、基本的最適条件を割出す事が可能となった。
細胞内情報伝達に於けるコリン燐脂質代謝回転とプロテインキナーゼCの共役機構の解析

数多くの外界シグナルが、コリン燐脂質の代謝回転を亢進することが種々の細胞系で証明されつつある。コリン燐脂質代謝により産生されるジアシルグリセロールによるプロテイン・キナーゼCの長期活性化が、細胞分化、増殖、癌化を始めとする細胞の長期効果に重要であると考えられているが、このジアシルグリセロールの分子レベルでの産生調説機構には現在尚不明な点が多い。初年度は、受容体刺激に連動するコリン燐脂質加水分解とPKC活性化の共役機構の解析を、コリン燐脂質加水分解反応の主要酵素であるホスホリパーゼD(PLD)に焦点を絞り、細胞レベルで解析を行った。ヒト白血病由来HL-60細胞に於いて、プロテイン・キナーゼCの活性化剤であるTPAをもちいてPLDの活性を測定したところ、TPA濃度依存性にPLDの顕著な活性化を認めた。更に分子レベルでこの活性化機構を解明する目的で、細菌毒素ストレプトリジンOを用いて細胞膜透過性細胞を作成し、解析した結果、上記のTPAの効果には、GTP-γ-Sが必須であり、PLDの活性調節には、G蛋白質とプロテイン・キナーゼCによる蛋白質燐酸化反応が密接に関与していることが明らかとなった。最終年度は、更に分子レベルでのPLDの活性調節機構に着目し、解析を行った結果、以下の研究成果を得た。PLDを動物組織より抽出し、その活性を測定したところ、脾臓、腎臓に最も高い酵素活性が見い出され、用いる酵素活性測定条件により、今までの報告とは全く異なった分布結果が得られることを明らかにした。PLDは細胞膜結合型蛋白質であり、その酵素活性発現には、細胞質の可溶性画分に存在するG蛋白質、更に複数の蛋白質が関与することを示す実験的根拠を得た。現在これらの蛋白質を分離精製し、コリン燐脂質代謝回転とプロテイン・キナーゼC活性化の共役機構を分子レベルで解析している。数多くの外界シグナルが、イノシトール燐脂質の代謝回転を介する情報伝達系により細胞に伝えられ、細胞機能の調節に重要な役割を演じていることが古くから知られている。最近では、多くの生理活性物質によりイノシトール燐脂質のみならず、コリン燐脂質の代謝回転も亢進することが種々の細胞系で証明されつつある。コリン燐脂質代謝により持続的に産生されるジアシルグリセロールによるプロテイン・キナーゼCの長期活性化が、細胞分化、増殖、癌化を始めとする細胞の長期効果に重要であると考えられているが、このジアシルグリセロールの分子レベルでの産生調説機構には現在尚不明な点が多い。平成5年度は、プロテイン・キナーゼCによるコリン燐脂質代謝回転の調節機構と、持続的プロテイン・キナーゼCの活性化機構解明に主力を向け、研究を行ってきた。そこでまず初めにコリン燐脂質代謝に於ける重要な酵素と位置付けられている、ホスホリパーゼDのプロテイン・キナーゼCによる調節機構について解析を行った。ヒト白血病由来HL-60細胞に於いて、プロテイン・キナーゼCの活性化剤であるTPAをもちいてホスホリパーゼDの活性を測定したところ、TPA濃度依存性にホスホリパーゼDの顕著な活性化を認めた。更に分子レベルでこの活性化機構を解明する目的で、細菌毒素ストレプトリジンOを用いて細胞膜透過性細胞を作成し解析した結果、上記のTPAの効果には、GTP_γSが必須であり、ホスホリパーゼDの活性調節には、G蛋白質とプロテイン・キナーゼCによる蛋白質燐酸化反応が密接に関与していることが明らかとなった。

現在、これらの反応に関与するG蛋白質ならびにホスホリパーゼDの精製が進行しており、精製酵素を用いた反応系により、プロテイン・キナーゼCによるホスホリパーゼDの分子レベルでの活性調節機構を明らかにしてゆきたい。平成5年度は、受容体刺激に連動するコリン燐脂質加水分解とPKC活性化の共役機構の解析を、コリン燐脂質加水分解反応の主要酵素であるホスホリパーゼD(PLD)に焦点を絞り、細胞レベルで解析を行った結果、ヒト白血病由来HL-60細胞に於いてPLDの活性調節には、G蛋白質とプロテイン・キナーゼCによる蛋白質燐酸化反応が密接に関与していることを明らかにした。平成6年度は、分子レベルでのPLDの活性調節機構に着目し、解析を行った結果、以下の研究成果を得た。PLDを動物組織より抽出し、その活性を測定したところ、脾臓、腎臓に最も高い酵素活性が見い出され、用いる酵素活性測定条件により、今までの報告とは全く異なった分布結果が得られることを明らかにした。一方、脾臓PLDはその活性にGTP-γ-Sが必須であり、GTP-γ-S存在下にPKC、及びチロシンキナーゼによる燐酸化反応が、酵素反応を更に活性化することを明らかにした。PLDは細胞膜結合型蛋白質であり、その酵素活性発現には、細胞質の可溶性画分に存在するG蛋白質、さらに複数の蛋白質が関与することを示す実験的根拠を得た。細胞膜に与えられたシグナルは、こららの蛋白質を介し、更にPKC、チロシンキナーゼ等の蛋白質燐酸化による調節を経てPLD活性を調節し、細胞膜コリン燐脂質の可水分解を引き起こすことを明らかにした。また、細胞膜コリン燐脂質代謝の結果産生されるジアシルグリセロールが、再びPKCを活性化することにより、PKCの持続的活性化の機序を説明し得る実験モデルが示されたと言えよう。
多彩な形状を持つ金属酸化物ナノ結晶表面への配位結合能の付与と異方集積化手法の開発

本研究では、酸化物ナノ結晶上に有機分子を結合して配位結合能を付与することを目的とした。化学結合を自由度高く可逆的に制御できる配位結合を用いることで、温度、pHなどの条件で自在に集積を制御できるデバイスの構築が期待できる。既に研究申請者は、酸化物ナノ結晶の合成場にカルボキシル基を有する有機分子を共存させることで、有機分子が表面に結合した無機ナノ粒子を合成することに成功している。そこで、この手法を応用して、ナノ粒子表面に配位結合能を有する有機分子を結合させた。さらに、この配位結合能を活用して、粒子同士を複合化させたクラスター構造の形成を行った。1酸化物ナノ結晶への配位結合能の付与有機分子を表面に結合させた酸化物ナノ結晶を合成した。具体的には、両端にカルボキシル基を有する有機分子、もしくはカルボキシル基とカテコール構造を有する有機分子の存在下で金属イオン水溶液を200300°Cに加熱することで、酸化物ナノ結晶を合成した。合成されたナノ結晶の表面には、カルボキシル基ないし、カテコール構造が配位して有機分子が複合化されている。もう一端に存在するカルボキシル基が外側を向いているため、カルボキシル基を介して粒子同士が結合することが可能となった。2ナノ結晶間の複合構造形成合成条件を変えることで、外側にカルボキシル基を向けている酸化物ナノ結晶が複合化した構造の形成に成功した。Fe304ナノ結晶の場合、1次粒子径が20nm程度であり、この粒子が複合化したナノクラスターの形成が可能となった。ナノクラスターの構造は数百nm程度まで大きくすることが可能であり、磁場に対する応答性を制御することができた。まず、酸化物ナノ結晶への配位結合能の付与を検討した。硝酸セリウム水溶液に、両端にカルボキシル基を有する直鎖の炭化水素であるアジピン酸を加え、流通式反応装置を用いて200300°C、250気圧の条件で5秒程度加熱した。その結果生成したナノ粒子を精製、乾燥後、構造を走査電子顕微鏡で観察した。すると、生成したナノ粒子は70nm程度の大きさを持ち、形状は立方体状であったが、その構造を詳細に観察すると、立方体ナノ粒子は10nm程度の正8面体ナノ粒子から構成されることが明らかとなった。この正8面体粒子がどのように配列をしているか明らかにするため、立方体ナノ粒子の断面に対して走査電子顕微鏡内で電子線回折像を評価した所、正8面体のナノ粒子は向きをほぼ揃えて配列しており、結晶方位のずれはほぼ1deg以下であることが明らかとなった。本研究では、正8面体のナノ粒子が向きを揃えている理由は、1次粒子が正8面体という多面体の形状を有するためであると考え、これを積極的に利用した構造形成を次年度に目指す。
情報空間の幾何学理論の統一的構成と形態情報科学の構築

本研究の目的は,統計科学における幾何学的手法論の統一的な基礎理論を構築するとともに,情報空間における抽象的な「図形」に関する数理解析手法の構築を行うことである.まず本研究では,再生核理論やカレントなどを用いた図形の特徴づけが目標である.この問題に対し,統計学などで重要な役割を果たすダイバージェンス関数から,カレントが構成できることがわかってきた.カレントの能力がダイバージェンスなどを用いて統計的に議論できると,応用上は非常に有用ではあると考えている.しかしながら,研究成果としては未だにまとまっていない状況である.来年度も引き続きこの問題を精査し研究を遂行する.また平成28年度に関連研究において,統計モデルにおける期待値の階層構造という概念が発表された.これは研究開始当初には想定していなかった結果であり,図形の特徴量などに大きな影響を与える.そのため平成30年度も昨年度に引き続き,期待値の階層構造という視点から幾何学の考察を行った.この幾何学では変形対数関数が重要な役割を果たすが,変形対数関数の構成とモデルの正規化が密接に関係していることがわかった.そのため,既存の変形対数関数の修正を行い,統計モデルの正規化問題などを議論した.さらに通常の対数関数の性質に関して,ユークリッド空間の熱流が保つ最強の凹性が対数凹性ではないことがわかり,最強の凹性が何であるかを決定した.対数関数に付随する情報幾何学の既存の理論は,この最強の凹性を特徴付ける関数を用いて一般化できることが期待できる.対数関数に関連した幾何学について,来年度以降も研究を継続する.カレントの情報幾何学的な構成について目途がついたことは大きな進展である.この結果エントロピーやダイバージェンス関数を用いて,従来の情報幾何学とカーネル法,カレントなどが統一的に議論できると期待している.また,確率変数の期待値が階層的に定義されるという考え方も,本研究において非常に重要であると考えている.熱流に関する研究を発展させ,確率変数の階層的な期待値に新しい解釈を与えることができると考えている.本研究の開始段階では,エントロピー汎関数,または一般化したMathieu汎関数が時間や温度に依存する場合や,汎関数が定義されないが勾配写像は定義される場合のWasserstein幾何学や情報幾何学の考察なども研究目標としていた.非可積分な推定関数に関する幾何学が進展しつつあるので,関連研究の情報収集も行いながら研究を遂行する.また熱流に関する凹性の特徴付けを,期待値の階層構造と,そこから構成される幾何学構造へ応用できると考えている.期待値系列とエントロピー汎関数の系列の関係性などについても議論をする.本研究の目的は,統計科学における幾何学的手法論の統一的な基礎理論を構築するとともに,情報空間における抽象的な「図形」に関する数理解析手法の構築を行うことである.平成28年度はWasserstein幾何学における確率分布の最適輸送問題を,再生核とカレントを用いた表示に書き換えを行うことが目標であった.この問題にはいくつかの先行研究があり,確率測度の最適輸送に情報論的なエントロピーから正則化を行ったもの,微分同相写像に正則化を行ったものなどが知られており,いずれにしても適切な正則化が問題となる.関連研究においていくつかの実験的な成果は得られたが,残念ながら本研究が目標とする数理的基礎を与えるまでには至らなかった.一方,他の関連研究において,確率変数の期待値という概念が不変なものではなく,統計モデルや統計量に依存して階層的に表れるとという結果が得られた.この事実は研究開始当初には想定していなかった結果であり,図形の特徴量などに大きな影響を与えると考えられる.そのため,期待値の階層構造という視点から,統計モデルの幾何学についての考察も行った.また,この研究成果は平成29年度以降に議論を予定してたエントロピーが時間に依存するWasserstein幾何学などとも関連があると予想している.平成28年度には出版された論文としての成果は得られなかったが,研究代表者,研究分担者ともに国際会議において招待講演を実施し,最適輸送理論や情報幾何の周知に貢献することが出来たと考えている.最適輸送問題の図形や画像への応用のための正則化の問題については,関連問題の情報収集や実験的な結果を得るには至ったが,数理的基礎を与えるまでには至らなかった.一方,関連研究において,確率変数の期待値の階層構造という新しい概念が発見された.この結果は図形の特徴量などに大きな影響を与えると考えられるため,期待値の階層構造という視点から,統計モデルの幾何学についての考察も行った.また,機械学習理論の分野を中心に,エントロピーが時間に依存するWasserstein幾何学,Wasserstein距離の情報幾何学など,新しい研究成果が発表されつつある.これらの研究は本研究とも密接に関連があると予想しているため,情報収集などに努めた.本研究の目的は,統計科学における幾何学的手法論の統一的な基礎理論を構築するとともに,情報空間における抽象的な「図形」に関する数理解析手法の構築を行うことである.研究開始当初は,再生核理論やカレントなどを用いた図形の特徴づけの研究などを想定していた.しかしながら関連研究において,統計モデルにおける期待値の階層構造という概念が発表された.画像処理などから図形の特徴を抽出する場合,期待値は重要な概念であるが,これが不変なものではなく,統計モデルや統計量に依存して階層的に表れるとという内容である.これは研究開始当初には想定していなかった結果であり,図形の特徴量などに大きな影響を与える.そのため,平成29年度は昨年度に引き続き,期待値の階層構造という視点から幾何学の考察を行った.

その結果,期待値の階層構造から統計モデルの空間に,自然な多様体構造やダイバージェンス関数を構成できた.また,図形の直感的な特徴量と,統計解析における図形の特徴量は異なることも予想される.そこで,深層学習機械が捉えることができる特徴量はどのようなものであるかということを,線形代数の視点から解析するなどの予備的な考察も行った.ある種の深層学習機械が自然にWasserstein幾何学の構造を持つことも知られており,また,近年は画像処理において深層学習機械は多用されていることからも,深層学習機械そのものの幾何学的性質の解明は,今後も検討が必要な研究内容である.確率変数の期待値が階層的に定義されるという考え方は,本研究において非常に重要であると考えている.関連研究課題において,具体的な画像データ処理に形式的に情報幾何学を応用し,統計モデルを構築したという研究成果が得られているが,これは期待値の階層構造から統計モデルに定めた統計多様体構造であるということが解明されつつある.また,図形の位相的な情報に対する数理解析手法の構成,深層学習機械の持つ幾何学的性質の解明など,情報幾何学以外の図形に関連した数理解析手法についても予備考察を進めるとともに,関連研究分野の情報収集などを進めている.本研究の目的は,統計科学における幾何学的手法論の統一的な基礎理論を構築するとともに,情報空間における抽象的な「図形」に関する数理解析手法の構築を行うことである.まず本研究では,再生核理論やカレントなどを用いた図形の特徴づけが目標である.この問題に対し,統計学などで重要な役割を果たすダイバージェンス関数から,カレントが構成できることがわかってきた.カレントの能力がダイバージェンスなどを用いて統計的に議論できると,応用上は非常に有用ではあると考えている.しかしながら,研究成果としては未だにまとまっていない状況である.来年度も引き続きこの問題を精査し研究を遂行する.また平成28年度に関連研究において,統計モデルにおける期待値の階層構造という概念が発表された.これは研究開始当初には想定していなかった結果であり,図形の特徴量などに大きな影響を与える.そのため平成30年度も昨年度に引き続き,期待値の階層構造という視点から幾何学の考察を行った.この幾何学では変形対数関数が重要な役割を果たすが,変形対数関数の構成とモデルの正規化が密接に関係していることがわかった.そのため,既存の変形対数関数の修正を行い,統計モデルの正規化問題などを議論した.さらに通常の対数関数の性質に関して,ユークリッド空間の熱流が保つ最強の凹性が対数凹性ではないことがわかり,最強の凹性が何であるかを決定した.対数関数に付随する情報幾何学の既存の理論は,この最強の凹性を特徴付ける関数を用いて一般化できることが期待できる.対数関数に関連した幾何学について,来年度以降も研究を継続する.カレントの情報幾何学的な構成について目途がついたことは大きな進展である.
過形成副甲状腺に対する臨床応用可能な光線力学的治療法の開発

進行した二次性副甲状腺機能亢進症(SHPT)患者に副甲状腺摘出術(PTX)が適用される際に、副甲状腺の周辺組織への癒着や埋没により腺の視認が困難となる場合が多々あり、手術時間の延長や、腺の一部取り残しなどの原因になっている。この問題解決のため、腫瘍親和性光感受性物質プロトポルフィリンIXの前駆物質である5-アミノレブリン酸(5-ALA)を術前に投与して過形成副甲状腺を特異的に蛍光ラベルする手法が開発されている。私は、いろいろな腫瘍の光線力学的治療(PDT)手法を参考にして、過形成副甲状腺に対するPDT手法をモデル動物を用いて開発してきた。本研究では、将来的にヒトへの応用が可能な、より効率的なPDT手法の開発を目的に以下の研究を行った。(1) 5/6亜腎摘ラットを用いた高効率PDTの手法の開発:5-ALAの高用量投与下かつ高熱量照射による生存率の低下をカルシウム静注により抑制して、PDTの成功率を上げる手法を開発し、照射直後のカルシウム投与により高用量高熱量照射後の低カルシウム血症による生存率の低下を75%にまで上げる事が可能となった。(2)照射副甲状腺の再生抑制手法の開発:PDT処置後の副甲状腺の再生を抑制するために、照射された副甲状腺における血管形成を阻害する実験を行った。低用量5-ALAと低熱量光照射による5/6亜腎摘ラットに負担の少ない条件でのPDTを行った後に、ラットでの血管新生阻害効果を持つことの知られているCaptoprilを継続投与し、照射副甲状腺における有意な血管新生阻害効果を確認した。(3) PDTの実用化の検討:臨床応用への課題検討のために中型動物を用いたPDTを実施する目的で腎不全ヤギを作製し、副甲状腺機能亢進症の進行を確認し、効果的なPDT手法の開発を試みた。(1) 5/6亜腎摘ラットを用いた高効率PDTの手法の構築:腫瘍親和性光感受性物質プロトポルフィリンIXの前駆物質である5-アミノレブリン酸(5-ALA)の高用量投与下における高熱量照射による生存率の低下をカルシウム静注により抑制して光線力学的治療(PDT)の成功率を上げる手法を構築し、照射直後のカルシウム投与により高用量高熱量照射後の低カルシウム血症による生存率の低下を75%にまで上げる事が可能となった。(2)血管形成阻害による照射副甲状腺の再生抑制手法の構築:PDT処置後の副甲状腺の再生を抑制するために、照射された副甲状腺における血管形成を阻害する実験を行った。(3)過形成副甲状腺に対するPDTの実用化の検討:臨床応用への課題検討のために中型動物を用いたPDTを実施する目的で、ヤギにおける腎不全の作製手法を開発し、副甲状腺の過形成進行と機能亢進について確認した。これにより、副甲状腺機能亢進症モデル動物の作製手法が確立され、PDT処置実験の施行が可能になった。当初予定していたニワトリを用いたPDTは、腎不全動物を作製するための腎臓の摘出が骨格の問題で難しいことが判明し、中止された。ブタの使用可能性については次年度、検討することとした。高用量高熱量PDT後の低カルシウム血症による死亡率の増加を、照射直後のカルシウム投与により防ぐことで生存率を75%にまで上げることができた。投与量と投与のタイミングを調整することで、さらに生存率をあげることも可能と思われる。また、血管新生阻害剤による照射副甲状腺の血管新生が抑制されることが明らかになり、再生抑制の可能性が示された。さらにヤギを用いた二次性副甲状腺機能亢進症のモデル動物も作製可能となり、これに対するPDTを行うことで、臨床応用に向けた課題を明らかにすることが可能となった。これらの成果は、二次性副甲状腺機能亢進症に対する光線力学的治療法の臨床応用の可能性を示しており、昨年度の課題はおおむね達成したものと考えられる。

(2)照射副甲状腺の再生抑制手法の開発:PDT処置後の副甲状腺の再生を抑制するために、照射された副甲状腺における血管形成を阻害する実験を行った。低用量5-ALAと低熱量光照射による5/6亜腎摘ラットに負担の少ない条件でのPDTを行った後に、ラットでの血管新生阻害効果を持つことの知られているCaptoprilを継続投与し、照射副甲状腺における有意な血管新生阻害効果を確認した。(3) PDTの実用化の検討:臨床応用への課題検討のために中型動物を用いたPDTを実施する目的で腎不全ヤギを作製し、副甲状腺機能亢進症の進行を確認し、効果的なPDT手法の開発を試みた。(1) 5/6亜腎摘ラットを用いた高効率PDTの手法の構築:前年度の成果を元に設定されたいくつかのPDT実施条件について、照射の間隔や回数などの最適化を図り、長期飼育での生存率、PTH分泌能の低レベルでの維持、副甲状腺退縮などへの効果を検証する。これらの検討により過形成副甲状腺に対する高効率PDTの手法を構築する。(2)血管形成阻害による照射副甲状腺の再生抑制手法の構築:前年度の成果に加え、その他の血管新生阻害薬(血管内皮増殖因子の阻害薬や抗体、Cox-2阻害剤、マルチキナーゼ阻害剤、mTOR阻害剤、アルテミシニン誘導体など)も試験して、副甲状腺再生抑制効果の認められたいくつかの薬剤を、(1)で開発された高効率PDT手法と組み合わせ、より確実なPDT手法の開発について検討する。(3)過形成副甲状腺に対するPDTの実用化の検討:中型動物の副甲状腺機能亢進症モデルに対して、これまでに構築されたPDT手法を実施し、臨床応用へ向けた手法の改良を行う。予測される課題としては、動物の大型化にともなう5-ALAやカルシウムの投与量、照射光源強度や照射時間などの適正化が考えられる。また、副甲状腺の大きさや位置(深さ)の変化による照射範囲の拡大が必要な場合は、光源の数を増やすなどして対応する。経費はほぼ計画通りに使用され、多少の誤差があったが1万円以内に収められた。残額は次年度の物品費に追加する予定である。
神経線維腫症増殖因子に関する基礎的研究と臨床への応用

神経形維腫症は、遺伝性の疾患であるレックリング病に発生する難治性疾患で、その出現は患者および家族に心理的、社会的苦痛をあたえる。我々はさきに、患者血液から、腫瘍の構成細胞の一つである神経線維腫線維芽細胞(NF細胞)の増殖を亢進させる因子を見いだした。今回の研究では、1)患者の協力を得て、できるだけ大量の増殖因子を得、2)得製因子を用いて血液、培養細胞液中の増殖因子測定系を確立する、3)その成果を、神経線維腫症の治療の判定、腫瘍細胞活性の判定に応用する、4)他方増殖因子の構造決定を行なうなどを目的とした。1.増殖因子の分離、純化、構造決定。患者血清よりの増殖因子の純化はある程度成功した。しかし、再現性及び、収量の点で難点が残った。そこで神経線維腫より増殖因子分離を試みるとともに、本増殖因子活性標的細胞についても下記3.の成績より、NF細胞と同様に反応し、今回の実験に適する細胞株の検討を行なった。現在、ラット腎間質細胞由来NRK細胞を標的とし、神経線維腫由来増殖因子について、分離、純化を試みている。2.増殖因子の測定。患者血清由来増因子を単一ピ-クとして採取し、NF細胞を標的細胞とし、competitive binding assayで患者血清中の増殖血清中の増殖因子を測定した結果、神経線維腫を有する患者9名中6名で増殖因子の存在を確認した。一方、正常人5名、および小児患者で神経線維腫を未だ認めない2名では、増殖因子を検出出来なかった。3.増殖因子標的細胞の検討。NF細胞はin vitroで継代培養した場合、継代初期に増殖が停止するため、本増殖因子の生物学的活性の測定の標的細胞としては適しないことが判明した。NF細胞のcell generationは正常皮膚維芽細胞に比し、半減していた。増殖因子の同定に必要な、出来るだけ大量の精製因子を得ることを目的として、増殖因子の純化、増殖因子の測定法について検討した。<1、患者血清由来増殖因子の分離精製。>___ープ-ルした複数患者血清2,000mlを材料とし、Pー4カラム、monoQ,YMCーpack Dial 120,CHEMCO3C_<18>カラムを用い増殖因子を単一ピ-クとして採取し、cell line化した神経線維腫perineural fibroblastsを標的細胞とし、competitive binding assayで患者血清の増殖因子を測定した。その結果神経線維腫を有する患者9名中6名で増殖因子の存在を確認した(0.43±0.26μg/ml,平均値±標準偏差)。一方正常成人5名及び小児でなお神経線維腫を認めない2名では何れも増殖因子を認めなかった。<2、神経線維腫由来増殖因子の分離。>___ー上述の患者血清よりの増殖因子の分離に引き続き、腫瘍組織より増殖因子の分離を行なった。その理由として、1、での成績、文献的にも腫瘍増殖因子が腫瘍組織により産生されているという報告が多いこと及び患者血清よりの分離では、多量の血液を必要とするため、以後の精製、化学構造の同定が困難になることの計3つの理由による。58才、男性レックリングハウゼン患者から、手術時切除したplexiform neurofibromaを材料とした。約15gの材料を蛋白分解酵素阻害剤入り緩衝液でホモジナイズ、超遠心後、上清を凍結乾燥した、同試料を酢酸に溶解し、Pー4カラムでゲル濾過し、2mlずつ分画した。各画分について、2ー5代継代培養の神経線維腫線維芽細胞(1例)を対象とし、FCS無添加の状態で^3Hーthymidineの取り込みを検討した。その結果、No.27の分画にDNA合成の亢進を認めた。これは繰り返し行なった実験で再現性を確認した。他方、腫瘍切除患者の正常部皮膚より採取、培養した線維芽細胞に対してはDNAの合成亢進は認められなかった。現在同画分の蛋白分解酵素による不活性化の検討及び、精製について検索を続行中である。2.増殖因子の測定。

一方、正常人5名、および小児患者で神経線維腫を未だ認めない2名では、増殖因子を検出出来なかった。3.増殖因子標的細胞の検討。NF細胞はin vitroで継代培養した場合、継代初期に増殖が停止するため、本増殖因子の生物学的活性の測定の標的細胞としては適しないことが判明した。NF細胞のcell generationは正常皮膚維芽細胞に比し、半減していた。神経線維腫症は、遺伝性の疾患であるレックリング病に発生する難治性疾患で、その出現は患者および家族に心理的、社会的苦痛をあたえる。我々はさきに患者血液から、腫瘍の構成細胞の一つである神経線維腫線維芽細胞(NF細胞)の増殖を亢進させる因子を見いだした。今回の研究では、1)患者の協力を得て、できるだけ大量の増殖因子を得、2)精製因子を用いて血液、培殖細胞液中の増殖因子測定系を確立する、3)その成果を、神経線維腫症の治療の判定、腫瘍細胞活性の判定に応用する、4)他方増殖因子の構造決定を行なうなどを目的とした。1.増殖因子の分離、純化、構造判定。患者血清よりの増殖因子の純化はある程度成功した。しかし、再現性及び、収量の点で難点が残った。そこで神経線維腫より増殖因子分離を試みるとともに、本増殖因子活性標的細胞についても下記3.の成績より、NF細胞と同様の反応し、今回の実験に適する細胞株の検討を行なった。現在、ラット腎間質細胞由来NRK細胞を標的とし、神経線維腫由来増殖因子について、分離、純化を試みている。2.増殖因子の測定。患者血清由来増殖因子を単一ピ-クとして採取し、NF細胞を標的細胞とし、competitive binding assayで患者血清中の増殖因子を測定した結果、神経線維腫を有する患者9名中6名で増殖因子の存在を認識した。一方、正常人5名、および小児患者で神経線維腫を未だ認めない2人では、増殖因子を検出出来なかった。NF細胞のcell generationは正常皮膚線維芽細胞に比し、半減していた。
S. sanguinisによるIL-1α産生誘導機構の解明

S. sanguinisはA/Jマウス由来樹状細胞(XS-106細胞)ならびにC57BL/6マウス由来の骨髄由来マクロファージ(BMMs)にIL-1αの産生を誘導し、caspase-1、NLRP3ならびにASCをノックアウトすることにより有意に減弱した。また、本活性はcalpain阻害剤であるMDL28170により阻害されたが、caspase-1阻害剤であるz-YVAD-fmkでは阻害されなかった。本活性は、貪食阻害剤、P2X/P2Yレセプター阻害剤で阻害された。さらに、Proximity ligation assayによりIL-1αとcaspase-1が細胞質で共局在することが観察された。本研究では、口腔連鎖球菌Streptococcus sanguinisがInterleukin-1α(IL-1α)の分泌を誘導する分子機構を明らかにし、本菌による感染性心内膜炎の病因論解明ならびに新規予防・治療法開発の一助とすることを目的とする。S. sanguinisは、A/Jマウス由来樹状細胞(XS-106細胞)ならびにC57BL/6(B6)より採取した骨髄由来マクロファージ(BMM)にIL-1αの産生を誘導したが、それらの活性はcaspase-1、NLRP3あるいはASCノックアウトマウス由来BMMで有意に減弱した。また、本活性はcalpain阻害剤であるMDL 28170により阻害されたが、caspase-1阻害剤であるz-YVAD-FMKでは阻害されなかった。これらの結果から、S. sanguinisはBMMに対してIL-1α産生を誘導する活性を有し、その活性発現にはNLRP3インフラマソームが関与していることが示唆された。しかしながら、NLRP3インフラマソームの活性化で誘導されるcaspase-1のタンパク質分解活性が重要ではなく、caspase-1とIL-1αが細胞質で共局在していることが何か重要な役割を果たしているのではないかと推測された。これまでの研究で、S. sanguinisはXS-106細胞ならびにB6由来BMMに対してIL-1α産生を誘導する活性を有し、その活性発現にはNLRP3インフラマソームが関与していること、ならびにIL-1αとcaspase-1が細胞質で共局在していることが示唆され、学会発表を行った。今後より詳細なメカニズムを明らかにしていく予定である。S. sanguinisは、A/Jマウス由来樹状細胞(XS-106細胞)ならびにC57BL/6より採取した骨髄由来マクロファージ(BMMs)にIL-1αの産生を誘導したが、それらの活性はcaspase-1、NLRP3あるいはASCノックアウトマウス由来BMMsで有意に減弱した。また、本活性はcalpain阻害剤であるMDL28170により阻害されたが、caspase-1阻害剤であるz-YVAD-FMKでは阻害されなかった。また、XS-106細胞に対するIL-1α産生誘導活性は、貪食阻害剤であるサイトカラシンD、P2X/P2Y(ATP/ADPレセプター)の阻害剤であるoATPにより阻害された。また、菌体刺激時の細胞外ATP濃度を測定したところ、菌量ならびに時間依存的に増加し、それに伴いIL-1αの産生も誘導された。さらに、細胞外ATP濃度の増加は、サイトカラシンDにより阻害された。また、Proximity ligation assayによりIL-1αとcaspase-1が細胞質で共局在することが観察された。これらの結果から、S. sanguinisはXS-106細胞ならびにBMMsに対してIL-1α産生を誘導する活性を有し、その活性発現にはNLRP3インフラマソームが関与していることが示唆された。XS-106細胞ならびにBMMを標的細胞とし、菌体刺激時にIL-1αが種々のNLRP(NLRP3の他にNLRP1, NLRC4)、AIM2

ならびにASC、caspase-1ならびにIL-1βと複合体を形成しているかどうかを明らかにする。1)抗caspase-1抗体、抗IL-1β抗体、抗NLRP3抗体、抗ASC抗体、抗NLRP1抗体、抗NLRC4抗体あるいは抗AIM2抗体で免疫沈降し、抗IL-1α抗体で検出する。さらに免疫染色を行い、共焦点レーザー顕微鏡を用いて解析する。2.菌体あるいは菌体成分が細胞質内に取り込まれることによる直接的な作用なのか、あるいは、菌体成分が細胞内に入ることを必要としない細胞表面の何らかのレセプターを介したエンドサイトーシス非依存的な作用であるのかを明らかにする。1)菌体成分がエンドサイトーシスやエンドソームの成熟により細胞質内に取り込まれることを必要とするのかを明らかにするため、XS-106細胞ならびにBMMを標的細胞とし、各種のエンドサイトーシス阻害剤を用いて、IL-1αの産生を調べる。2)エンドソームから、菌体成分が細胞質に放出されるメカニズムを明らかにするため、XS-106細胞ならびにBMMにおいて、エンドソーム酸性化阻害剤(NH4Cl)、プロテアソーム阻害剤(MG-132、lactacystin)、カテプシンBの阻害剤(CA-074Me)を用いて、IL-1αの産生を調べる。また、ペプチドトランスポーターSLC15Aを介して菌体成分が細胞質へ放出される可能性を検討するために、XS-106細胞においてSLC15A1, SLC15A2, SLC15A3あるいはSLC15A4をCRISPR-Cas9システムによりノックアウトし、IL-1αの産生を調べる。歯学試薬等の消耗品費や旅費、学会参加費等に使用したが、未使用額がある。未使用額は、次年度の試薬等の消耗品費に充てる。