hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
レドックス活性キラル錯体集合体の電気化学的異方性変換

本研究は、レドックス活性能を有するキラル錯体分子集合体を創成し、凝集相における電気化学反応を誘発することで、不斉構造と連動した異方的相状態の動的変換と機能発現を指向している。当該年度においては、シンコニジウムカチオンなどのキラルカチオン認識能を有する[Δ-PV(Cl4Cat)3]-(Δ-TRISPHAT)と類似構造を有するレドックス活性[CrIII(Cl4SQ)2(Cl4Cat)]-を用いることで、動的なレドックス誘起不斉機能変換を指向した。(n-Bu3NH)[CrIII(Cl4SQ)2(Cl4Cat)]と半当量のcinHをCH2Cl2中で反応させ、CH2Cl2に可溶な紫色固体と不溶性紫色固体を単離した。両生成物の溶解度の違いから、前者は(n-Bu3NH)カチオンを含む錯体である一方、後者はかさ高いカチオンであるcinHを含む(cinH)[Δ-CrIII(Cl4SQ)2(Cl4Cat)]であることが示唆された。以上の結果から、本レドックス活性Oh型アニオンの不斉認識能が示唆された。続いて本研究では、不斉レドックス活性錯体を用いた超分子結晶・液晶・液体を創成すべく、レドックス活性錯体に修飾し、中間相の形成に大きな影響を及ぼす側鎖に着目し、従来の剛直且つ疎水性アルキル鎖に加え、柔軟性と両親媒性を併せ持つDEG鎖を修飾した新規錯体群[Pt(R-Cat)(R'-bpy)]を合成し、各物性への導入効果影響を検討した。その結果、[Pt(Cat)(C9bpy)]及び[Pt(Cat)(DEGbpy)]は、鎖種に依存した集積構造を形成した。また[Pt(C8Cat)(DEGbpy)]は異種側鎖の共存により液晶相を形成することも初めて明らかにした。更にDEG鎖修飾により低極性溶媒中で錯体の自己集合を誘発可能であることを明らかにした。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。その主たる課題は、(1)不斉レドックス活性錯体の合成と、(2)その超分子構造体の設計および電気化学的異方性変換である。目的とする不斉レドックス活性分子の具現化として、1八面体型(Oh)や2非対称配位原子を有する四面体型錯体(Td)及び、3ヘリカル(hel)ベンゾキノンからhel型錯体に基づいた錯体合成を指向している。初年度は、レドックスにより多量化を生じないN/Oヘテロ配位元素を持つレドックス活性配位子、3,5-di-tert-butyl-2-[(4-phenyl)amino]phenol、を基本骨格に用いたZn(II)錯体の合成条件の検討を行った。その結果、Zn(II)中心の触媒活性による配位子骨格の変換が生じたため、セミキノネート種のin situ発生による合成または、ベンゾキノン型配位子と亜鉛金属による反応が必要であるとの知見を得た。一方、レドックス活性錯体超分子の設計においては、中性型白金錯体に含まれるカテコラート及びbpyユニットにそれぞれアルキル鎖とエチレングリコキシ鎖を導入した非対称錯体が室温でスメクチック液晶相を発現することを見いだした。またこれらが有機溶媒中で強い自己集合能を有することも見いだした。またイオン性レドックス活性錯体の設計においては、導入するアンモニウムカチオンに修飾するアルキル鎖種とその数を制御し、結晶相、液晶相、液体相の安定性を合理的に設計できたのに加え、室温における直接的なアンバイポーラ型電解による相変換に成功した。本研究では、新規レドックス活性キラル錯体分子を用いて、不斉認識による0・1・2・3次元結晶構造を構築し、秩序構造の次元性を制御することで結晶相・液晶相・液体相を設計する。また、構築されたキラル分子集合体に対する直接電気化学的レドックスを誘発することで、1不斉分子の状態変換に基づいた機能、2集合相に基づいた機能及び、3その相乗効果に基づく機能発現を目指している。不斉レドックス活性錯体の合成においては、第一ターゲットである、N/Oヘテロ配位元素を持つレドックス活性配位子、3,5-di-tert-butyl-2-[(4-phenyl)amino]phenol、を基本骨格に用いたZn(II)錯体の合成を試みたものの、Zn(II)中心の触媒活性による配位子骨格の変換が生じたため、セミキノネート種のin-situ発生、またはベンゾキノンとZn金属との反応による錯体合成を進める必要が生じた。今後、合成条件の最適化を完成させた後、配位子部位にアルキル直鎖/分岐鎖やオリゴエチレングリコキシ鎖を導入し、結晶、液晶、液体相を創成する。また凝集相におけるキラリティー発現と直接的レドックス変換を進める。一方、側鎖にアルキル及びエチレングリコキシ鎖を導入した非対称型レドックス活性錯体の創出に成功した。

興味深いことに本錯体は室温でスメクチック液晶相を形成すると共に、溶液中で相対的に強い自己会合能を発現することが明らかとなり、側鎖種の対称性により集積構造とレドックス特性を制御できる可能性を示唆する。最後に、イオン性レドックス活性液晶の設計においては、導入するアンモニウムカチオンの対称性を制御することで、その集積相を制御できた。またこれらの結晶、液晶、非晶質相に対し、直接的レドックスを誘起しアンバイポーラ型マクロ相変換にも成功し、論文として発表した。本研究は、レドックス活性能を有するキラル錯体分子集合体を創成し、凝集相における電気化学反応を誘発することで、不斉構造と連動した異方的相状態の動的変換と機能発現を指向している。当該年度においては、シンコニジウムカチオンなどのキラルカチオン認識能を有する[Δ-PV(Cl4Cat)3]-(Δ-TRISPHAT)と類似構造を有するレドックス活性[CrIII(Cl4SQ)2(Cl4Cat)]-を用いることで、動的なレドックス誘起不斉機能変換を指向した。(n-Bu3NH)[CrIII(Cl4SQ)2(Cl4Cat)]と半当量のcinHをCH2Cl2中で反応させ、CH2Cl2に可溶な紫色固体と不溶性紫色固体を単離した。両生成物の溶解度の違いから、前者は(n-Bu3NH)カチオンを含む錯体である一方、後者はかさ高いカチオンであるcinHを含む(cinH)[Δ-CrIII(Cl4SQ)2(Cl4Cat)]であることが示唆された。以上の結果から、本レドックス活性Oh型アニオンの不斉認識能が示唆された。続いて本研究では、不斉レドックス活性錯体を用いた超分子結晶・液晶・液体を創成すべく、レドックス活性錯体に修飾し、中間相の形成に大きな影響を及ぼす側鎖に着目し、従来の剛直且つ疎水性アルキル鎖に加え、柔軟性と両親媒性を併せ持つDEG鎖を修飾した新規錯体群[Pt(R-Cat)(R'-bpy)]を合成し、各物性への導入効果影響を検討した。その結果、[Pt(Cat)(C9bpy)]及び[Pt(Cat)(DEGbpy)]は、鎖種に依存した集積構造を形成した。また[Pt(C8Cat)(DEGbpy)]は異種側鎖の共存により液晶相を形成することも初めて明らかにした。更にDEG鎖修飾により低極性溶媒中で錯体の自己集合を誘発可能であることを明らかにした。(1)不斉レドックス活性錯体の合成本研究では、目的とする不斉レドックス活性分子の具現化として、1八面体型(Oh)や2非対称配位原子を有する四面体型錯体(Td)及び、3ヘリカル(hel)ベンゾキノンからhel型錯体に基づいた錯体合成を指向している。昨年度は、レドックスにより多量化を生じないN/Oヘテロ配位元素を持つレドックス活性配位子、3,5-di-tert-butyl-2-[(4-phenyl)amino]phenol、を基本骨格に用いたZn(II)錯体の合成を試みたものの、Zn(II)中心の触媒活性による配位子骨格の変換が生じたため、セミキノネート種のin-situ発生、またはベンゾキノンとZn金属との反応による錯体合成を進める。合成条件の最適化を完成させた後、配位子部位にアルキル直鎖/分岐鎖やオリゴエチレングリコキシ鎖を導入し、結晶、液晶、液体相を創成する。また凝集相におけるキラリティー発現と直接的レドックス変換を進める。(2)不斉レドックス活性錯体を用いた超分子結晶・液晶・液体の創成上述の不斉錯体は、電荷状態により中性またはイオン性結晶・液晶・液体を形成し、レドックス誘起によりそのマクロ物性が変化しうる。中性錯体については、レドックス活性配位子上に排除体積と柔軟性を変化させた長鎖部位を導入することで三相を設計する。
抗ＫＬ－６抗体は分子標的薬の作用を増強しうるか

癌細胞株を用いて抗KL-6抗体が分子標的治療薬によるADCC活性を増強し得るかを検証した。4つの癌細胞株(SK-BR-3, ZR75-1, PC3, YMB-S)のHER2, KL-6抗原の発現状況をFACSを用いて検討したところYMB-Sでは両抗原ともに高い発現を認めた。抗KL-6抗体によるTrastuzumabのADCC活性の増強効果についてCr-51 release assayにより検討したところ、YMB-Sでは抗KL-6抗体投与により細胞傷害作用が作用細胞:標的細胞比に依存して増強した。これらの結果から抗KL-6抗体は分子標的治療薬のADCC活性を増強し得ることが示された。申請者は,腺癌関連糖鎖抗原としてKL-6(Krebs von den Lungen-6)を発見した.これはMUC1ムチンの亜分子であるが,後に非常に優れた間質性肺炎の血清マーカーであることが明らかとなったのである.一方で,KL-6は癌細胞関連抗原としての性格も有している.本研究では,癌転移モデルにおいて,抗KL-6抗体が免疫細胞の細胞傷害性を増強することにより,既に日常臨床に応用されている抗体治療薬の治療効果を抗KL-6抗体が増強しうるか否かを明らかにすることを目的としている.平成23年度から24年度にかけて,まずハイブリドーマより抗体精製キットを用いて,抗KL-6抗体を大量精製した.血清診断に用いる際と比較して,細胞実験や動物実験で抗腫瘍効果を検討する際には抗KL-6抗体は非常に大量に必要になるために,抗KL-6抗体の精製に多くの時間を要した.一方で,約30種類のヒト肺癌細胞株,約10種類の乳癌細胞株を用いて,KL-6の発現,erbB2の発現,NOD SCIDマウスへの生着率などを検討し, NOD SCIDマウスへの生着率の良い株を約10株程度選んだ.さらに,NOD SCIDマウスを用いた同所性移植癌転移モデル(癌リンパ節転移モデル,癌多臓器転移モデル)の樹立することができた.本モデルを用いて平成25年度以降は既存の抗体治療薬の治療効果を抗KL-6抗体が増強しうるか否かを明らかにすること検討したいと考えている.本研究では,癌転移モデルにおいて,抗KL-6抗体が免疫細胞の細胞傷害性を増強することにより,既に日常臨床に応用されている抗体治療薬の治療効果を抗KL-6抗体が増強しうるか否かを明らかにすることを目的としている.平成23年度から24年度にかけて,まずハイブリドーマより抗体精製キットを用いて,抗KL-6抗体を大量精製した.血清診断に用いる際と比較して,細胞実験や動物実験で抗腫瘍効果を検討する際には抗KL-6抗体は非常に大量に必要になるために,抗KL-6抗体の精製に多くの時間を要した.一方で,約30種類のヒト肺癌細胞株,約10種類の乳癌細胞株を用いて,KL-6/MUC1の発現,erbB2の発現,NOD SCIDマウスへの生着率などを検討し, NOD SCIDマウスへの生着率の良い株を約10株程度選択した.この結果をもとにNOD SCIDマウスを用いた同所性移植癌転移モデル(癌リンパ節転移モデル,癌多臓器転移モデル)を樹立し,既存の抗体治療薬の治療効果を抗KL-6抗体が増強しうるか否かを明らかにする予定である.Cellular-Cytotoxicity:ADCC)活性を増強することができるか否かについて,RI実験施設において51Cr release assayを用いて複数の悪性腫瘍に対する細胞株に対してスクリーニングを行った.乳癌細胞株であるYMB-S細胞において,抗KL-6抗体を分子標的薬であるHerceptinと同時に併用することにより, ADCC活性が増強されることを確認した.癌細胞株を用いて抗KL-6抗体が分子標的治療薬によるADCC活性を増強し得るかを検証した。申請者は,腺癌関連糖鎖抗原としてKL-6(Krebs von den Lungen-6)を発見した.これはMUC1ムチンの亜分子であるが,後に非常に優れた間質性肺炎の血清マーカーであることが明らかとなったのである.一方で,KL-6は肺癌細胞関連抗原としての性格も有している.本研究では,肺癌転移モデルにおいて,抗KL-6抗体が免疫細胞の細胞傷害性を増強することにより,既に日常臨床に応用されている抗体治療薬の治療効果を抗KL-6抗体が増強しうるか否かを明らかにすることを目的としている.平成23年度は,まずハイブリドーマより抗体精製キットを用いて,抗KL-6抗体を大量精製した.血清診断に用いる際と比較して,細胞実験や動物実験で抗腫瘍効果を検討する際には抗KL-6抗体は非常に大量に必要になるために,抗KL-6抗体の精製に多くの時間を要した.同時に,約30種類のヒト肺癌細胞株,約10種類の乳癌細胞株を用いて,今後の検討に用いる細胞株のスクリーニングを行った.

まず,肺癌細胞株における発現を,抗KL-6抗体,抗erbB2抗体などにより細胞の免疫染色,FACS解析を用いて検討した.MUC1遺伝子多型については、全血よりゲノムDNAを抽出し,Real time定量PCRsystem (Applied Biosystems PRISM 7500)を用いてrs4072037遺伝子多型を検討した.また,肺癌の代表的な遺伝子変異であるEGFR遺伝子変異,NOD SCIDマウスへの生着率を検討した.これらのスクリーニングにより,肺癌細胞表面における発現レベル,遺伝子多型,遺伝子変異,人種的な由来などが異なる肺癌細胞株でNOD SCIDマウスへの生着率の良い株を約10株程度選んだ.平成23年度から24年度にかけてはハイブリドーマより抗体精製キットを用いて,抗KL-6抗体を大量精製したが,血清診断に用いる際と比較して,細胞実験や動物実験で抗腫瘍効果を検討する際には抗KL-6抗体は非常に大量に必要になるために,抗KL-6抗体の精製に多くの時間を要した.大量に精製したこれら抗KL-6抗体が本当にKL-6を認識するのか否かについて,フローサイトメトリー,組織免疫染色,ウェスタンブロットなどを用いて確認することにも多くの時間を要した.さらに,NOD SCIDマウスを用いた同所性移植癌転移モデル(癌リンパ節転移モデル,癌多臓器転移モデル)の樹立に時間を要した.しかし最終的には,NOD SCIDマウスの胸壁より,マトリゲルと混合させた癌細胞株を直接肺内へ注入することにより,肺内に腫瘍を形成し,なおかつ高率に縦隔リンパ節転移を来す癌リンパ節転移モデルを作製することが可能になった.一方で,NOD SCIDマウスの尾静脈より,癌多臓器転移モデルの作製が可能になった.抗KL-6抗体が免疫細胞のADCC活性を増強することにより,Herceptinなどの抗体治療薬の治療効果を増強しうるか否かを細胞傷害性検出キット(LDH)というRIを用いない方法でスクリーニングすることで大幅に時間を短縮することが可能になった.一方で,当初予定していたKL-6分子の精製が本年度は行うことができなかった.平成25年度は,研究スタッフの増員などにより,当初の予定通りに研究成果を達成する予定である.平成23度はハイブリドーマより抗体精製キットを用いて,抗KL-6抗体を大量精製したが,血清診断に用いる際と比較して,細胞実験や動物実験で抗腫瘍効果を検討する際には抗KL-6抗体は非常に大量に必要になるために,本年度は抗KL-6抗体の精製に多くの時間を要した.また,当研究室では約30種類のヒト肺癌細胞株をすでに入手していたが,本年度新たに約10種類の乳癌細胞株を入手した。このために,今後の検討に用いる癌細胞株のスクリーニングには,当初の予定より多くの時間を要した.そのために,当初予定していたKL-6分子の精製,肺癌細胞株に対する抗KL-6抗体の抗腫瘍効果の検討が本年度は行うことができなかった.今後は研究スタッフの増員などにより,当初の予定期間で研究成果を出すようにしたいと考えている.平成25年度は,以下の検討を行う.(1)抗KL-6抗体単独療法の癌細胞株に対する抗腫瘍効果:癌細胞株に抗KL-6抗体を添加することで,細胞増殖能,細胞浸潤能ならびに細胞接着能を抑制しうるかについて検討する.同時に,抗KL-6抗体がADCC活性,CDC活性,LAK活性を来しうるかについても検討をする.
超高齢者フレイル対策の提言に資する国際比較共同研究

85歳以上の超高齢者を対象にした学際的研究Tokyo Oldest Old Surveyon Total Healthは、20082009年の第一次、20112012年の第二次、20152016年の第三次健康調査からなる。超高齢期の健康長寿阻害要因として重要なフレイルに関連する項目を縦断調査した。第三次健康調査には218名(93.4±1.7歳)が参加した。コックスハザード回帰分析で、6年間の総死亡予測因子としてIADLと握力の重要性が示唆された。超高齢社会への対応は世界共通の課題であり、英国、ニュージーランド、オランダと国際比較共同研究を推進していく。日本は食習慣と口腔機能を担当する。東京都心部在住の85歳以上の高齢者を対象にしたコホート研究、The Tokyo Oldest Old Survey on Total Health(TOOTH)は、平成20年度に開始した高齢者の健康状態や暮らしぶりに関する包括的な学術調査で、継続して3年ごとに追跡調査を行っている。調査項目は、健康状態、病歴、身体計測、口腔機能、認知機能、栄養調査、体組成、血液・尿検査などである。平成26年度は、6年後の追跡調査(第3次健康調査)を行った。平成21年度に第1次健康調査に参加した363名のうち、118名は死亡、52名は追跡不能(脱落)であった。第3次健康調査への調査協力の同意が得られたのは163名であった(45%)。平均年齢93.1歳と高齢であるため、来院できない調査協力者には訪問調査をおこなった。主な死亡原因は、悪性腫瘍、心血管疾患(突然死含む)、肺炎、末期認知症であった。総死亡に関連する要因をコックス比例ハザードモデルで検討した結果、単変量解析では、年齢、性別、Barthel Index、MMSE、BMI、握力、ALB、CRP、慢性疾患数がそれぞれ有意に関連した(P < 0.05)。多変量解析では、年齢、性別、MMSE、BMI、握力、血清ALBが有意に総死亡に関連する因子として抽出された。すなわち、高齢、男性、認知機能低下、やせ、握力低下、低栄養は6年間の総死亡リスクと関連していた。以上の結果から、健康長寿にはフレイル予防が特に重要であることが示唆された。海外の超高齢者研究と比較共同研究を計画しており、フレイル予防に関係が深い口腔機能や栄養状態に関して、イギリスニューカッスル大学と共同研究を推進中である。TOOTHの6年後調査に関しては、ほぼ計画通りに遂行できた。現在、データベースの整理を行っている。また、国際比較共同研究として日本(TOOTH)と英国(Newcastle85+)の超高齢者コホート研究のデータベースの統合を計画していたが、こちらは予定より遅れている。口腔機能と栄養に着目してデータベースを調べたところ、口腔機能の調査項目が偏っていることや食習慣の違いを無視できないことなどから、容易には統合できないことが判明した。以上より、進捗状況は「やや遅れている」と判断した。東京都心部在住の85歳以上の高齢者(超高齢者と定義)を対象にしたコホート研究、The Tokyo Oldest Old Survey on Total Health (TOOTH)は、超高齢者の健康状態と暮らしぶりに関する包括的な学際的研究で、第1次基礎調査(初年度、平成2021年度)、第2次追跡調査(3年後、平成2324年度)、第3次追跡調査(6年後、平成2627年度)までの縦断研究を完了した。主な調査項目は、健康診査、病歴、身体計測、口腔機能、認知機能、栄養調査、身体活動、パーソナリティ(性格5因子)、精神的健康度、血液・尿検査などである。これらの基礎データから、超高齢者の生命予後(健康長寿)と関連する要因を探索した。6年間の追跡率は約87%。特に第2次追跡調査以降の脱落が多かった。6年間の死亡率は約35%であった。6年後総死亡に関連する要因として、高齢、男性であることに加えて、認知機能低下、低栄養、やせ、握力低下といったフレイルに関連する要素が重要であることが明らかとなった。食習慣調査からは、緑黄色野菜や果物に多く含まれるベーターカロテンと握力の関連が示された。また、パーソナリティ(性格5因子)の検討では、外向性と誠実性が高い方が精神的健康度が高く、歩行時間などの身体活動量が多かった。これらは健康長寿にも関連があると思われた。そこで、性格5因子と総死亡との関連を多変量解析で検討したところ、性格5因子のうち総死亡と関連があったものは神経症傾向のみで、外向性や誠実性は関連がなかった。神経症傾向は、精神的健康度や認知機能、健康行動などは独立して総死亡と関連を示した。英国ニューカッスル大学の超高齢者研究(Newcastle85+)との国際比較共同研究として、口腔機能と生命予後、栄養摂取状況等について検討中である。また、超高齢者の食事調査では、研究協力者の負担を考慮して比較的簡便な質問票である簡易型自記式食事歴法質問票(BDHQ)を用いてきたが、超高齢者におけるBDHQの妥当性について、これまで十分な検討がなされていないという問題点があった。今回、食事歴法(DR)をゴールドスタンダードにBDHQの超高齢者における妥当性を検討したところ、多くの栄養素で受容可能な相関が得られた。この結果をもとに栄養解析を進めており、今後の国際共同研究における栄養調査をさらに発展させる予定である。

85歳以上の超高齢者を対象にした学際的研究Tokyo Oldest Old Surveyon Total Healthは、20082009年の第一次、20112012年の第二次、20152016年の第三次健康調査からなる。超高齢期の健康長寿阻害要因として重要なフレイルに関連する項目を縦断調査した。第三次健康調査には218名(93.4±1.7歳)が参加した。コックスハザード回帰分析で、6年間の総死亡予測因子としてIADLと握力の重要性が示唆された。超高齢社会への対応は世界共通の課題であり、英国、ニュージーランド、オランダと国際比較共同研究を推進していく。日本は食習慣と口腔機能を担当する。TOOTHの6年後追跡調査の結果から、ほとんどの方が身体機能、認知機能の低下を認める中で、90歳を過ぎても高い認知機能を維持している方がいることが明らかとなった。認知機能の維持は、フレイル予防に極めて重要であり、生活習慣(知的活動、身体活動、栄養調査など)との関連に興味がもたれる。また、脳の構造に関する評価も重要であると考えられる。そこで、特に認知機能の優れた方に脳MRI検査を追加して行うことを計画している。日本(TOOTH)と英国(Newcastle85+)の超高齢者コホート研究のデータベースの統合は、包括的に統合するのは困難であることが判明したため、項目を絞るなど工夫が必要である。現在、口腔機能と健康状態のデータ統合を進めている。2017年開催予定の国際老年病学会(IAGG)で合同シンポジウムを計画している。平成29年7月に開催予定の国際老年病学会(IAGG 2017)では、ニューカッスル大学の共同研究者とミーティングを予定している。老年医学TOOTH6年後の第3次健康調査を実施するにあたって、参加者の多くが来院困難であったため、半数以上が往診調査となった。その結果、調査補助員などの人件費が予定より少なくなった。日英国際比較共同研究の合同会議が英国で開催されたが、開催時期が助成金開始前であったため、旅費などが少なくなった。TOOTH 6年後調査の調査協力者のうち、脳MRI検査に参加した方が予定よりも少人数であった。そのため、調査費用(MRI検査費用、交通費、調査協力者謝金、調査補助員人件費など)の支出が予定より少なくなった。TOOTH6年後調査の結果から、特に認知機能が高い高齢者の脳MRI検査を予定している。その調査費用(MRI検査費用、交通費、調査協力者謝金、調査補助員人件費など)に使用する。次年度以降、英国との合同会議または国際学会での合同シンポジウムを予定しており、旅費などに使用する。次年度に開催予定の国際老年病学会(IAGG 2017)への参加費用、並びに、ニューカッスル大学との合同会議開催費用に使用する。研究成果発表のための論文作成費用やホームページ作成費用に使用する。webページは現在作成中。
高速有機トランジスタを用いたフレキシブル情報デバイス

短チャネル構造を有する新しい段差型縦構造有機トランジスタ(SVC-OFET)を開発し、アンテナと有機トランシスタを一体化した次世代フレキシブル情報処理デバイスの基礎研究を行った。SVC-OFETの作製条件の最適化と表面処理等の改善を行った結果、高い電流密度と過去報告例のない高い動作周波数(1.5MHz)を実現した。また、SVC-OFETとループアンテナを一体化させた情報タグ用アクティブアンテナを提案し、シミュレーションおよび素子特性を調べた結果、外部からの電磁波に対してのアンテナ応答を制御できる可能性が示された。平成19年度は,高速有機トランジスタの基礎特性とアクティブアンテナの設計と作製技術に焦点を絞り研究を進めた。高速有機トランジスタの基礎特性では,電荷移動錯体材料として,有機Mott絶縁体である(BEDT-TTF)(TCNQ)に着目し,錯体薄膜作製に適する塗布技術を確立し,有機層電荷移動錯体薄膜のX線回折および高分解能走査プローブ顕微鏡による結晶薄膜構造の評価を行った。作製した電荷移動錯体薄膜トランジスタの電気物性評価を行った結果,両極性電界効果トランジスタ特性を示し,280-330Kの温度領域で金属-絶縁体転移に起因すると考えられる特異な電気特性を示すことが判明した。また,既存の導電性AFM探針を用いたナノスケール電位分布評価装置によってチャネル領域の電位分布と薄膜構造の均一性を評価し,トランジスタ特性と薄膜結晶構造には密接な相関があることが示された。アンテナの設計と作製技術では,有機トランジスタ特性から送受信特性に必要なアクティブアンテナの基本設計を進めた。まず,アクティブアンテナとして印刷可能な線幅と電極材料の抵抗から作製可能なサイズのループアンテナを設計し,電磁界解析法としてよく用いられる有限差分時間領域法をベースとした専用高速数値計算機を活用し,数値シミュレーションによる素子の基本パラメーターの絞り込みを行った。シミュレーションによるアクティブアンテナの設計に基づき,有機スイッチングトランジスタを組み込んだ情報タグ用アクティブアンテナ部分の作製技術を検討し,銀を主成分とする低抵抗金属ペーストと溶媒溶解性を有する有機導電性材料からなる材料を検討した。また,電極材料の接触抵抗をFET特性のチャネル長依存性から評価した。今後,アンテナ設計と有機トランジスタ基礎特性からアクティフアンテナを作製し,特性評価を行う。平成20年度は、19年度の研究成果を元に、有機トランジスタの高性能化とアクティブアンテナの基礎的設計に関する作製技術に焦点を絞り研究を進めた。高速有機トランジスタの基礎特性では、ステップエッジを利用した段差型有機トランジスタ(SVC-OFET)の素子作製条件の最適化(段差形状、ペンタセン蒸着条件)と表面処理(hexamethyldisiazane(HMDS)処理)の改善を行い、遮断周波数500kHz以上の高速動作特性を確認した。アンテナの設計と作製技術では、段差型有機トランジスタ(SVC-OFET)と送受信アンテナの基礎特性から送受信特性に必要なアクティブアンテナの基本設計を進めた。まず、アクティブアンテナとして印刷可能な線幅と電極材料の抵抗から作製可能なサイズのループアンテナを設計し、有限差分時間領域法をベースとした専用高速数値計算機を活用し、数値シミュレーションによる素子の基本パラメーターの絞り込みを行った。シミュレーションによるアクティブアンテナの設計に基づき、有機スイッチングトランジスタを組み込んだ情報タグ用アクティブアンテナ部分の作製技術を検討し、低抵抗金属ペーストと溶媒溶解性を有する有機導電性材料からなる材料と作製条件を検討した。また、電極材料の接触抵抗をFET特性のチャネル長依存性から評価した。その結果、有機トランジスタのさらなるオン抵抗の低減とアクティブアンテナの最適化が必要であることが判明した。今後、情報通信に必要なアクティブアンテナに必要な有機トランジスタ特性の改善とアンテナ設計を進め、実用的デバイス作製に必要なデバイス評価を行う。平成21年度は、19-20年度の研究成果を元に、有機トランジスタの高性能化とアクティブアンテナの基礎的設計に関する作製技術と特性評価に焦点を絞り研究を進めた。高速有機トランジスタの基礎特性では、ステップエッジを利用した段差型縦構造有機トランジスタ(SVC-OFET)の素子作製条件の最適化(段差形状、ペンタセン蒸着条件)と表面処理(hexamethyldisilazane (HMDS)処理)の改善を行い、遮断周波数1MHz以上の高速動作特性を確認した。アンテナの設計と作製技術では、SVC-OFETと送受信アンテナの基礎特性から送受信特性に必要なアクティブアンテナの基本設計を進めた。また、電極接触抵抗とFET特性を検討し、MHz帯からGHzのアクティブアンテナ特性に情報処理信号の変調が見られることを検証した。今後、有機材料の特長であるフレキシブル性を活かすためにプラスチック基板上でのプロセス技術の開発を行い、さらに商品化に必要な高速情報通信機能や多機能化に向けたデバイス設計と性能向上に関する研究を計画中である。
越境と共生の文化学ーラフカディオ・ハーンと夏目漱石を中心に

当該年度は補助事業期間の最終年度となったが、ラフカディオ・ハーン(1850-1904)と夏目漱石(1867-1916)の文学と思想について、異文化接触や多文化共生研究の視点を導入して検討するという基本方針に基づきながら、共同研究の参加者各自が発展的研究を進めると同時に、補助事業期間中の研究成果の総合に取り組んだ。第一に、2016年度から継続のハーン・漱石研究から見た東アジアにおける越境と共生というテーマに関しては、研究代表者の坂元昌樹と研究分担者の西槇偉が中国の内蒙古大学で開催された国際学会に参加して研究発表と学術交流を行うなど、同テーマに関する研究の一層の深化を図った。第二に、2017年度から継続のハーン・漱石研究から見たヨーロッパにおける越境と共生というテーマに関しても、研究分担者の濱田明と福澤清が、各自の専門領域に関連して発展的な研究に取り組んだ。また同様に研究分担者の永尾悟と平野順也も、本研究課題に関係するそれぞれの英語圏の文学・文化についての個別研究を進めた。そして第三に、それら一連の共同研究と成果発信を基礎として、研究代表者と研究分担者による3年間の共同研究の成果を中心とする論集『夏目漱石の見た中国』を刊行し、研究成果の公開と発信に努めた。さらに第四に、所属機関の熊本大学に設立された文学部附属漱石・八雲教育研究センターの教育研究活動と連携しつつ、補助事業期間3年間の研究活動の報告と総括を兼ねた公開フォーラム「漱石・ハーン研究の新展開」を開催し、ハーンと漱石を中心とした共同研究成果の総合の試みを進めた。以上の通り、本研究課題の共同研究は、3年間の補助事業期間の全体を通して、漱石とハーンの研究を基礎とした異文化接触と多文化共生研究の基盤形成において、確かな成果を得ることが出来たと判断するものである。本研究課題は、ラフカディオ・ハーン(1850-1904)と夏目漱石(1867-1916)の文学と思想について、異文化接触や多文化共生研究の視点を導入しながら、越境と共生の文化学の構想の一部としてアプローチすることを目的とする。ハーンと漱石の両者を、帝国と植民地によって特徴づけられる19-20世紀の近代世界における移住や移民、亡命などの集団的な経験を表現した存在として理解した上で、研究代表者・分担者の所属機関である熊本大学に存在する各種の文化的資源を活用した共同研究を意図している。当該年度においては、年度計画に基づいて、ハーン・漱石研究から見た東アジアにおける越境と共生を主なテーマとして、ハーン・漱石を通して見える文化的越境の諸ケースについて各自が研究を進めた。年度計画中の東アジア地域での国際研究活動については、研究代表者の坂元昌樹と研究分担者の西槇偉が、中国の杭州師範大学で開催された国際学術検討会に参加し、同分科会で漱石に関して研究報告を行った。また杭州師範大学の関係者や同学会に参加した研究者との学術交流を行い、中国での資料収集と調査を実施した。研究分担者の福澤清は、島根県松江市における各種の資料調査を行うなど、ハーンを中心としつつ漱石を含めた調査研究を遂行した。研究分担者の濱田明は、次年度の研究計画で予定されるハーン・漱石研究から見たヨーロッパにおける越境と共生というテーマを視野に収め、ハーンとフランスに関する各種研究を実施した。研究分担者の永尾悟と平野順也は、それぞれの英語圏の文学・文化についての個別研究を通して、次年度以降の共同研究計画へ向けての準備を進めた。研究代表者と各研究分担者は、定期的に研究打ち合わせを実施し、共通の所属機関である熊本大学におけるハーンと漱石についての文化的資源の活用方法の検討を含めて、共同研究を進める上で必要な情報の共有に努めた。年度計画におけるハーン・漱石研究から見た東アジアにおける文化的越境の諸ケースの検討というテーマについては、中国杭州師範大学での国際学術検討会での研究発表と現地での資料収集と調査を実施するなど当初の計画に従って進めることができた。また、次年度のヨーロッパにおける文化的越境の諸ケースの検討という年度計画に向けても、当初の計画に沿って共同研究の準備を進めている。当該年度においては、ラフカディオ・ハーン(1850-1904)と夏目漱石(1867-1916)の文学と思想について、異文化接触や多文化共生研究の視点を導入して検討するという基本方針に基づきながら、所属機関の熊本大学における教育研究組織の設置とも連動しつつ共同研究を進めた。第一に、2016年度から継続のハーン・漱石研究から見た東アジアにおける越境と共生というテーマに関して、研究代表者の坂元昌樹と研究分担者の西槇偉を中心に研究を進めた。東アジアでの国際研究活動として、坂元昌樹と西槇偉が中国の延辺大学で開催された国際学会に参加して漱石に関する研究発表を行い、同学会に参加した研究者との学術交流を行った。また、本研究課題に関係して、中国東北地方(大連・瀋陽・営口など)での資料調査ならびに現地研究者等との研究上の交流を2回にわたって実施した。第二に、2017年度はハーン・漱石研究から見たヨーロッパにおける越境と共生というテーマに関して共同研究の形で検討を進めた。研究分担者の福澤清は、近代アイルランド文化におけるハーン評価の検討に関して、アイルランド各地(ダブリン・スライゴー・ウォーターフォードなど)での資料収集と研究交流を行った。また、研究分担者の濱田明は、フランスのパリ13大学での研究集会に参加して、ハーン・漱石を視野に収めて文学とルボルタージュに関する研究報告・学術交流を行った。

また、研究分担者の永尾悟と平野順也は、本研究課題に関係するそれぞれの英語圏の文学・文化についての個別研究を進めた。そして第三に、所属機関の熊本大学では2017年12月に学内組織として文学部附属漱石・八雲教育研究センターが設立されたが、本研究課題の研究代表者と各研究分担者は、本研究課題の遂行とも様々に関係する同センターの教育研究活動にも関与することとなり、共同研究上で必要な情報共有と研究成果の発信に努めた。研究計画におけるハーン・漱石研究から見た文化的越境の諸ケースの検討というテーマに関して、第一に東アジア地域については中国の延辺大学での研究発表ならびに2度にわたる中国での資料調査と学術交流を行ったこと、第二にヨーロッパについてもアイルランド及びフランスでの資料調査と学術交流を実施したことなど、当初の計画に従って進めることができた。そして、研究代表者と各研究分担者の所属機関の学内組織である漱石・八雲教育研究センターの活動とも連動しつつ、おおむね研究計画に沿って共同研究を進めていると判断する。当該年度は補助事業期間の最終年度となったが、ラフカディオ・ハーン(1850-1904)と夏目漱石(1867-1916)の文学と思想について、異文化接触や多文化共生研究の視点を導入して検討するという基本方針に基づきながら、共同研究の参加者各自が発展的研究を進めると同時に、補助事業期間中の研究成果の総合に取り組んだ。第一に、2016年度から継続のハーン・漱石研究から見た東アジアにおける越境と共生というテーマに関しては、研究代表者の坂元昌樹と研究分担者の西槇偉が中国の内蒙古大学で開催された国際学会に参加して研究発表と学術交流を行うなど、同テーマに関する研究の一層の深化を図った。第二に、2017年度から継続のハーン・漱石研究から見たヨーロッパにおける越境と共生というテーマに関しても、研究分担者の濱田明と福澤清が、各自の専門領域に関連して発展的な研究に取り組んだ。また同様に研究分担者の永尾悟と平野順也も、本研究課題に関係するそれぞれの英語圏の文学・文化についての個別研究を進めた。そして第三に、それら一連の共同研究と成果発信を基礎として、研究代表者と研究分担者による3年間の共同研究の成果を中心とする論集『夏目漱石の見た中国』を刊行し、研究成果の公開と発信に努めた。さらに第四に、所属機関の熊本大学に設立された文学部附属漱石・八雲教育研究センターの教育研究活動と連携しつつ、補助事業期間3年間の研究活動の報告と総括を兼ねた公開フォーラム「漱石・ハーン研究の新展開」を開催し、ハーンと漱石を中心とした共同研究成果の総合の試みを進めた。以上の通り、本研究課題の共同研究は、3年間の補助事業期間の全体を通して、漱石とハーンの研究を基礎とした異文化接触と多文化共生研究の基盤形成において、確かな成果を得ることが出来たと判断するものである。本共同研究の研究成果の発表を計画的に進めたい。また、次年度においては、年度計画に基づいてハーン・漱石研究から見たヨーロッパとその文化的越境の諸ケースの検討を主要なテーマに、共同研究を進める予定である。本共同研究の研究成果の発表を、引き続き計画的に進めたい。また、次年度は過去2年間の研究成果に基づきながら、ハーン・漱石研究から見た文化的越境の諸ケースの総合的検討を主要なテーマに、共同研究を進める予定である。物品費等の一部執行を次年度以降に延期した。
水棲生物の体表・体形パターンと多様性に関する理論と観測

水棲生物の遊泳、歩行の様式を理論計算と実際の系との比較から議論した。珊瑚礁域を含む浅い海洋では様々な遊泳、海底歩行の生物がみられる。我々はこれらの水棲生物をグラフィクスコンピューター中に3次元的に再構築し、簡単な流体力学、力学を導入した土で、それらの動きの様子を進化計算の枠組みを用いて求めた。流体力学としては、体の一部分が動くと、その速度と逆向きに面の垂直の成分だけ、反作用が加わるという簡単なモデルを採用した。進化計算の枠組みは、多自由度のシステムにおいてあるコスト関数の近似最適解を得ることが知られており、かつ様々な解のバリエーションをもたらすことが知られている。本研究では、体節を動かす為のパラメーターのセットをまず乱数として与え、遊泳能力の高い個体を選択し変異を加え再び評価を行うということを繰り返し、運動性能の高い個体を求めた。この計算の結果、解として様々な近似解が得られることがわかった。おおきなグループとしてはヒレにねじりを加えながら上下させるものと、ヒレ全体を使って漕ぐやり方である。我々の実際の観測によっても、これらの動きが実際に存在することが確認された。また、歩行様式として、直線型の生物の長さが変わった場合と、足を使って歩く生物の歩行様式、運動能力について議論した。その結果、前進能力だけを比較すると、直線型の生物においては、体全体を回転させて前進するやり方が非常に速い歩行様式として出現することがわかった。更に、これら体の構造が変わった時の運動能力の違いを、動物の体の形の進化と関連づけて、議論した。本研究においてはまず現生生物の水中での運動性を観察し、これらの様子を力学計算によりコンピューターシミュレーションで解析した。流体中における生物の力学計算は静止座標系から運動体が受ける力を計算し、その力を推進力としてモデル生物をニュートン方程式により運動させる。運動性には独自の進化アルゴリズムを適用し、形態から出現する運動を自発的に生成させる。進化アルゴリズムは運動角のパラメーターを変異、融合させ、運動性が高いものが生き残るという条件を課し集団中の個体を進化させる。計算の結果、初期条件によって異なる運動様式に進化し、その状態で安定化することがわかった。パラメーターが多い個体の進化を考える場合、一度あるスタイルの運動性に進化しだすと、変異が局所的に起こる為、全く別のスタイルの運動性に途中で進化することは不可能であり、進化の定方向性のような状態が再現される。これは本研究の進化アルゴリズムが、運動性を扱うものであるにもかかわらず、実際の生物進化にみられる一定方向性(一度ある方向に進化しだすとその方向がつきつめられる)を再現していると考えられ極めて興味深い結果が得られた。
骨髄間質細胞を標的とした、悪性骨軟部腫瘍の新規治療法の開発

系統的化学療法導入により原発性悪性骨軟部腫瘍(以後、肉腫)の予後は改善したが、進行例の予後は極めて不良である。本研究では、肉腫細胞および、肉腫周囲の腫瘍間質細胞の中で、特に骨髄間質細胞(Bone marrow stromal cells: BMSC)に焦点をあて、肉腫の新規治療法の開発をめざした。その結果、Ewing肉腫とBMSCの異種細胞間接着や骨転移に、Cad-11が重要な役割を果たしている事、滑膜肉腫の分子標的薬Pazopanib(PAZ)の耐性化にはErk情報伝達系が関与し、Erk阻害剤によりPAZ耐性が克服されることを確認した。系統的化学療法導入により原発性悪性骨軟部腫瘍(以後、肉腫)の予後は改善したが、遠隔転移や薬剤耐性例を来した進行例の予後は極めて不良である。腫瘍の転移や薬剤耐性化においては、腫瘍細胞とその周辺の腫瘍間質との相互作用が重要な役割を担っている。本研究では、肉腫周囲の腫瘍間質細胞の中で、特に骨髄間質細胞(Bone marrow stromal cells: BMSC)に焦点をあて、肉腫の悪性化におけるBMSCの役割を解明するとともに、BMSCを標的とした新規治療法の開発をめざす。代表的な悪性骨腫瘍であるEwing肉腫は効率に骨/骨髄へ転移し、患者の予後を悪化させる。また、Cadherin-11(Cad-11)はカドヘリンファミリーの接着因子でBMSCに高発現することが知られており、前立腺癌や乳癌患者ではその発現が骨転移に関連していることが示唆されている。そこで本年度は、Ewing肉腫におけるBMSCの役割について検討した。その結果、Ewing肉腫細胞株とBMSCの異種細胞間接着に、Cad-11が重要な役割を果たしている事を見いだした。また、Cad-11はEwing肉腫細胞株の運動能を正に制御していることも明らかにした。In vivoにおいてマウス骨転移モデルで、Cad-11の発現抑制により骨転移が低下していた。さらに、Ewing肉腫患者において、Cad-11の高発現は骨転移と正相関し、多変量解析においても有意な予後不良因子の一つであった。これらの結果より、Cad-11は、Ewing肉腫の骨転移を促進している可能性が高く、Ewing肉腫の骨転移治療における有望な分子標的になりうると考えられた。本年度は、腫瘍細胞そのものに焦点をあて、代表的な軟部肉腫である、滑膜肉腫の薬剤耐性機構について、検討をすすめた。Mult-kinase阻害薬であるpazopanib (PAZ)は肉腫における初めての分子標的治療として承認され、軟部肉腫の2nd-line chemotherapyの有効な手段となっている。しかし、PAZが初期に有効であっても、投与が長期化するにつれ徐々に耐性化する例があり、新たな問題が生じている。そこで、滑膜肉腫細胞株のPAZ耐性株をいち早く樹立し、その耐性化メカニズムの検討を行った。その結果、PAZは親株の細胞周期をG1/S期で停止させること、耐性株ではErk情報伝達系が活性化され、G1/S期停止が回避されていることを見いだした。さらに、Erk阻害剤によりPAZ耐性が克服されることを確認している。臨床的に極めて高いインパクトを持つ結果であり、早期の臨床応用を目指している。本年度は、腫瘍細胞そのものに焦点をあて、高悪性度の軟部肉腫である、悪性末梢神経鞘腫瘍の新規治療に関して検討をすすめた。腫瘍の増大に伴い、腫瘍内部は低酸素環境となり、低酸素誘導因子Hypoxia Induced-factor 1(HIF-1)が誘導される。HIF-1の発現に伴い、血管内皮細胞増殖因子VEGFの誘導や、アポトーシス耐性が生じ、腫瘍の悪性化が進行する事が報告されているため、MPNSTにおけるHIF-1の役割について解析した。約400種類に薬剤ライブラリーをスクリーニングしたところ、HIF-1の阻害剤がMPNST細胞株に殺細胞効果を持つ事、siRNAによるHIF-1の発現阻害によりMPNST細胞株にアポトーシスが生じることを見いだした。また臨床的にもHIF-1の高発現がMPNSTの独立した予後不良因子であることも確認、HIF-1がMPNSTの治療標的、ならびに有効なバイオマーカーとなることを証明した。系統的

化学療法導入により原発性悪性骨軟部腫瘍(以後、肉腫)の予後は改善したが、進行例の予後は極めて不良である。本研究では、肉腫細胞および、肉腫周囲の腫瘍間質細胞の中で、特に骨髄間質細胞(Bone marrow stromal cells: BMSC)に焦点をあて、肉腫の新規治療法の開発をめざした。その結果、Ewing肉腫とBMSCの異種細胞間接着や骨転移に、Cad-11が重要な役割を果たしている事、滑膜肉腫の分子標的薬Pazopanib(PAZ)の耐性化にはErk情報伝達系が関与し、Erk阻害剤によりPAZ耐性が克服されることを確認した。本年度は、肉腫細胞の薬剤耐性化におけるBMSCの役割に関して、重点的に解析をすすめる。具体的な手法として、(1)複数の肉腫細胞株をBMSCと共培養することで、肉腫細胞が薬剤耐性化することを確認する。(2)上記における、肉腫細胞の薬剤耐性化メカニズムをDNA microarray, proteosome、ギガシークエンサーなどを用いて解析し、候補となる遺伝子群をクラスタリング解析で同定する。(3)それらの遺伝子群のpathway解析や、転写因子結合部位解析を行い、上流に位置する遺伝子を探索する。薬剤耐性化に加え、細胞増殖などを同時制御する遺伝子が発見可能な可能性がある。(4)さらに、臨床検体を用いて、(1)-(3)で得られた結果を検証し、肉腫の薬剤耐性克服のための、新規治療法の開発を目指す。本年度は、肉腫細胞の薬剤耐性化における腫瘍細胞とBMSCの相互作用に関して、重点的に解析をすすめる。具体的な手法として、(1)骨転移を生じた骨軟部腫瘍のサンプルより、レーザーマイクロダイセクション法を用いて、肉腫細胞とBMSCを別々に採取する。(2)上記サンプルも用いて、肉腫細胞の薬剤耐性化メカニズムをDNA microarray, proteosome、ギガシークエンサーなどを用いて解析し、候補となる遺伝子群をクラスタリング解析で同定する。(3)臨床検体を用いて、(1)-(2)で得られた結果を検証し、肉腫の薬剤耐性化のバイオマーカーを同定し、抗がん剤治療におけるPrecision medicineの基盤確立を目指す。整形外科実験を効率行う事により、消耗品の使用量が少なかったため。また、旅費に関しても十分に計画的に使用したため効率的な消耗品の使用が可能であったため本年度も計画的に、研究遂行のための各種試薬、実験動物の購入などに使用する。また、旅費を使用し国際学会においても発表を予定している。物品費として使用
野生マウスにおける補体C4,S1p遺伝子の重複,欠損の頻度とその分子機構の解析

野性マウスにおけるC4,S1p遺伝子の重複、欠損を検出するために両遺伝子の転写開始点から約250bp上流に存在するCAGAの繰り返しからなるマイクロサテライト配列を狭むプライマ-を用意した。このマイクロサテライト配列はS1pの方が約60bp短く成っているため、全DNAをPCRで増幅したあとアガロ-ス・ゲルを流す事により両遺伝子の相対濃度からコピ-数の異常が検出される事が期待されたが、実際にコピ-数の異常が知られている数種のインブレッド・マウスを用いた予備実験によりその有効性が確認された。そこで国立遺伝学研究所より供与された日本産、中国産及びヨ-ロッパ産の野性マウスのDNA約200サンプルをスクリ-ニングした。その結果、約80%のサンプルにおいてPCRによる増幅に成功した。日本産、中国産のマウスからはマイクロサテライトの長さのポリモルフィズムは検出されたが、コピ-数の異常は見つからなかった。一方、ヨ-ロッパ産のマウスからはデンマ-ク産の一頭からC4遺伝子の欠損をヘテロに有する事を示唆するパタ-ンが検出された。サザン・ブロッティングによる解析でもこの結果は確認された。このデンマ-ク産のマウスの系統は国立遺伝学研究所に維持されているため、今後ホモ欠損個体を捜しC4遺伝子領域をクロ-ニングし、欠損の範囲、機構を明らかにしたい。以上の結果により、野生マウスにおけるC4,S1p遺伝子の欠損、重複の頻度はヒトの場合よりかなり低い事が判明した。一方、北米産野生マウスより単離され、C4,S1p遺伝子を5コピ-有する事が示されたw7、及び4コピ-有するw16,w19の三つのH-2ハプロタイプのC4,S1p遺伝子領域を解析した結果,この三種のハプロタイプは互いに極めて類似しておりw16,w19からさらなる重複によりw7が生じたか、又はw7から欠損によりw16,w19が生じたことが示された。
1細胞計測系を用いたシアノバクテリアにおける窒素固定と毒生産の表現型可塑性解析

シアノバクテリアは、共通祖先が獲得した原始的形質として窒素固定能と毒生産能をもつ。しかしDNA分子系統解析により多くの分類群で両機能が失われつつあることが明らかになってきた。この理由として、両機能を保持するコストが生じているという仮説を立てシアノバクテリアの遺伝的変異系統を用いて検証した。ネンジュモ目の野外系統株を用い一細胞培養計測系での細胞計測手法の確立、遺伝子組み換え体の作成、および培地中の栄養塩濃度と毒遺伝子発現量の関連について解析を行った。その結果、毒遺伝子発現量は、窒素制限下でもっとも多く発現し、リン制限下では実験経過時間とともに減少することが明らかになった。平成26年度は研究対象であるネンジュモ目Cuspidothrix issatschencoiの新規野外単離株作成のため、複数の湖沼・池を訪れて採水を行い、同種の存在が確認された地点から新規の単離株作成・培養を行った。また一細胞培養計測系での蛍光顕微鏡下でC. issatschencoi培養株を用い、撮影・培養条件検討を行った。C. issatschencoiは光捕集色素フィコビリソームを持つことから、フィコシアニンを励起した際に放出される蛍光を蛍光フィルター(TRITC)を用いて検出し、細胞の全体構造を蛍光顕微鏡の励起光下で撮影可能であることを確認した。この手法により糸状体を形成するこのシアノバクテリアのバイオマスを測定することが可能となった。表現型の可塑性を測定するのに用いる窒素固定能と毒生産能(神経毒:アナトキシン)の遺伝子発現形質転換体作成については、手間と時間の制約から、毒生産能の形質転換体に的を絞り作成をすることとした。このシアノバクテリアには無毒株と有毒株が存在し、顕微鏡観察だけでは形態から無毒株か有毒株かを判断することができない。以前は生成される毒を直接測定していたが、近年の分子遺伝学的手法の発達により、毒生成を行うジーンクラスタに着目し毒遺伝子の一部を検出することで有毒株と無毒株を識別することが可能になっている。神経毒アナトキシンを生成するアナトキシンジーンクラスタについては、アナトキシンを生成する近縁のAnabaena属やOscillatoria属でその合成遺伝子群が近年明らかになってきた。本研究対象種でもアナトキシンジーンクラスタを構成する一部配列から、プロモーター領域の探査をprimer walking法を用いて行っている。今後primer waking法によって明らかになったプロモーター領域をベクターに取り込み、形質転換体を作成する。シアノバクテリアでは、共通祖先が獲得した原始的形質として窒素固定能と毒生産能があることが知られている。しかし、多くの分類群でこれらの機能が失われつつあることがDNA系統解析から明らかになっている。この理由として、両機能を保持するコストが生じているという仮説を立てた。この仮説を検証するため、ネンジュモ目のシアノバクテリアの遺伝的種内変異系統を用いコストの有無を環境変化への応答(反応基準)から判断する必要がある。本研究では反応基準の検出手法として、一細胞計測系を用いることを試みた。実験に使用したネンジュモ目は2013年にアジア初記載となる日本国内で見つかった有毒シアノバクテリアで、生理的生態学的特性は未解明な部分が多い。このため平成26年度は国内の広範囲の野外湖沼で採水を行い、実験室内で同種の有無を確認し、単離株作成を試みた。また1細胞培養計測系で表現型可塑性を測定するためには、遺伝子発現時に蛍光を発するような遺伝子組み換え株を作成する必要がある。そこで平成27年度は、同種別系統株の毒遺伝子アナトキシンジーンクラスターのプライマーを用いて、毒遺伝子発現のプロモーター領域を確定するための遺伝子配列の決定を行い遺伝子組み換え体の作成を試み、形質転換の際に必要となる寒天培地上での条件検討を行った。野外系統株を使用した遺伝子組み換え株の作成は、当初予期しなかった細胞レベルの生得的生理活性で多くの問題が生じたが、試行錯誤を行なった。さらに栄養塩と毒遺伝子の発現についてmRNAの発現量を比較することを試みCT培地中の窒素、リンの濃度を変化させ、この時の発現量の比較を行った。野外単離株の新規作成や培養を順調に行っている。窒素固定能の有無、アナトキシン遺伝子の有無のスクリーニング用の実験条件などの検討も行い、一細胞培養計測系での顕微鏡下の設定条件など検証も行った。毒遺伝子(アナトキシン)の遺伝子発現をみるための形質転換体を作成するため、現在未知のプロモーター領域をprimer walking法により探索を開始した。進化生態学研究対象のネンジュモ目シアノバクテリアC. issatschencoiの有毒株は、アジアでは2013年に報告されたばかりであり、いまだ生理生態学的に未解明な部分が多い。

現在行っているアナトキシンの生成に関与する遺伝子群でのprimer walkingは、アジア初の報告となった単離培養株(有毒株)で行っている。アナトキシン遺伝子のプロモーター領域については順調にいけば数か月内に解析が終了する。その後目的とするベクター(蛍光色素GFP+アナトキシンプロモーター領域を組み込んだもの)が研究対象種C. issatschencoiに取り込まれ増幅されるかどうかは、このシアノバクテリア種の特性に依存し、既存の手法が応用できないほど多くの制限酵素を持つなど不測の事態が起こることも考えられる。このため少し時間を要する可能性もあるが、最終的には毒遺伝子(ana)発現を観察可能な形質転換体の作成を試みたいと考えている。もしこの形質転換株の作成に成功すれば世界初の毒遺伝子発現に着目した形質転換体となり、現在の栄養塩との関連での表現型可塑性の測定だけでなく、さまざまな実験に使用することが可能となる。野外から採取した研究対象種の単離培養株(約150株)の増殖速度にばらつきがあり、多くの系統株で十分なDNAを得るまでに時間を要した。このため、DNA配列の外注料金(約100個体分4万円×3回×税1.08)の料金を繰り越した。今月末から来月初めにはすべての株で十分なDNAを採取できる量となると考えられるため、DNAを抽出し遺伝子配列を外注して決定する予定である。このため使用目的に変更はない。