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近世門前町、宇治・山田の社会構造に関する研究

背景には、一八世紀初頭を画期として触穢の発生を避ける作法が様々に発達したことがあった。だが、神官内部では触穢の厳密な適用を主張する勢力もあり、判定をめぐる争論がしばしば発生した。その際に世間の評判・風説、つまり神官や宇治・山田社会が外界からどう見られるのかが大きな問題となっている。死者を送る儀式として前近代の宇治・山田では、建前上は死んでいないとして墓に送る「速懸」という作法がとられた。これを行わないと市中一体の触穢となるのである。だが速懸は本来の神社の触穢体系に反して、死穢の規定を逃れるために用いられるようになったものである。そのあり様は一八世紀初頭頃に変容し、宇治・山田住民たちの意識の上では実質的な葬儀となっていく。なお、この速懸を実施するためには、死の穢れを引き受ける人間を必要とした。当初は死者の家来らが務めたが、次第に宇治・山田の被差別民が専ら引き受けるようになっていくのである。神宮特有の触穢観念は、速懸を含めて明治初年の神宮改革のなかで否定される。だがそれは近代以降に重要な刻印を与えた。近世の伊勢神宮門前町、宇治・山田に居住する非人集団である拝田・牛谷について、参宮客、住民組織の三方会合・宇治会合、山田奉行などとの組織的な関係や経済的基盤、果たした役割、そして彼らが受けた社会的差別の内容と時期的な変化を考察した。また、幕末期に被差別民や仏教徒と同様の忌避された異国人問題について、近代への移行を射程にいれて検討した。分析にあたっては、主として神宮文庫所蔵の「神宮編年記」(神宮長官日記)、「大神宮故事類纂」、伊勢市立図書館架蔵「宇治山田市史史料」を用い、国会図書館、内閣文庫で収集した史料も参考とした。加えて、諸国から訪れた参宮客が記した道中日記類を活用することで、分析を深めることができた。得られた知見は以下の通り。拝田・牛谷の民は、芸能民・宗教者としての側面も持つが、基本的属性は非人集団である。諸国から訪れる参宮客から施される「蒔銭」が重要な経済的基盤であるが、それは宇治・山田社会の中核をなす御師集団と拝田・牛谷の間で制度的に仕組まれたものでもあった。彼らは山田奉行の下で下級警察役を担い、また宇治・山田においては、住民が死穢を忌避するための社会的役割を負わされていた。それゆえに彼らは社会的差別を受けるが、特に一八世紀半ば以降に、経済的豊かさを背景に地位を上昇させる拝田・牛谷の民を、差別を制度化して統制しようとする動きが、三方会合・宇治会合によって進められる。さて幕末期に異国船が紀伊半島に接近してきた時、宇治・山田世界では異国人との接触を拒絶した。だが当初はさほど強いものではなく、またそれは拝田・牛谷ら被差別民や仏教徒らと同様に、神社本来の触穢体系に拠るもので、朝廷の異国人排除の論理とは異なっている。だが朝廷側の強い働き掛けと、異国人の上陸が現実的な恐怖となるに従い、次第に激しい拒絶意識が根付いていく。これは明治維新後の意識をも規定していくことになる。
ボールミルシミュレーションに基づくミルの新しいスケールアップ法の開発

粉体を原料とする材料の開発や製造が盛んである今日,粉砕操作は極めて重要なプロセスの一つとなっている.粉砕には,転動ミル,振動ミル,遊星ミルなどのボールを媒体とする微粉砕機が広く用いられているが,これらの条件設定やスケールアップは,経験に頼っているところが非常に大きい.そこで本研究では,内定者らが開発した「粉砕試料共存下でのボールミルシミュレーション法」を基本として,ボール径ならびにミル回転数を変化させて,スケールアップしたボールミル内の媒体運動をシミュレーションによって明らかにし,ミル動力当たりの試料の粉砕に寄与するエネルギー(媒体運動エネルギー)の最大値を与えるミル運転・操作条件を明確に設定できる手法を開発した.(1)転動ボールミルによる湿式粉砕実験昨年度は,転動ボールミルにより種々の操作条件の下で水酸化アルミニウムを乾式粉砕し,粉砕物の粒子径を求め,粉砕時間との関連性を明確にした.本年度は,ミル径,ボール径ならびにミル回転数が水酸化アルミニウムの湿式粉砕に与える影響を明確にし,さらに,乾式粉砕との差異について検討した.(2)実験結果と操作条件との関連を組み込んだシミュレーション法の開発「粉体共存下でのボールミルシミュレーション法」を用い,実験と同一条件でのボールの運動エネルギーなどの情報を得,粉砕実験結果との関連性を追究して,粉砕に影響を及ぼすシミュレーション情報を抽出した.この抽出された情報と粉砕操作条件との関係を明確化し,粉砕操作条件を与えて,実験結果をシミュレーションできるプログラムを開発した.これより,目的とする粒子径を得るための粉砕操作条件を,ボールミルシミュレーションからの情報に基づき逆に推算できる手法を見出いだした.転動ミルは,操作が容易,シンプルな形状をしていることから多用されているが,これらの条件設定やスケールアップは,経験に頼っているところが非常に大きい.そこで本研究では,水酸化アルミニウムを粉砕試料として,ミル回転数およびミル径が,その粉砕速度に及ぼす影響を実験的に明らかにし,ついで,ボールミル内の媒体運動のシミュレーションを行い,媒体運動挙動と粉砕速度の関係について検討した.●転動ボールミルによる粉砕実験転動ボールミルによるギブサイトを,ミル回転数ならびにミル径を変化させて,ギブサイトの粉砕速度を求めた.ミル回転数が大きくなると,粉砕速度は大きくなるが,臨界回転速度の90%で最大粉砕速度を示し,さらに回転数が大きくなると,粉砕速度は極端に小さくなる.一方,ミル径を大きくすると,粉砕速度も大きくなることがわかった.●実験結果と操作条件との関連を組み込んだシミュレーション法の開発実験と同一条件で転動ミル内のボール運動のシミュレーションを行い,得られた衝突エネルギーは,ミルの回転数が大きくなると増加するが,臨界回転数の90%で,最大値をとり,さらに回転数が大きくなると,衝突エネルギーは,急激に減少する.また,ミル径が大きくなると,衝突エネルギーも増加することがわかった.この傾向は,上記の実験で得られた粉砕速度と非常によく一致しており,粉砕速度は衝突エネルギーに比例することが分かった.これより,目的とする粒子径を得るための粉砕操作条件を,ボールミルシミュレーションからの情報に基づき逆に推算できる手法を見出した.粉体を原料とする材料の開発や製造が盛んである今日,粉砕操作は極めて重要なプロセスの一つとなっている.粉砕には,転動ミル,振動ミル,遊星ミルなどのボールを媒体とする微粉砕機が広く用いられているが,これらの条件設定やスケールアップは,経験に頼っているところが非常に大きい.そこで本研究では,内定者らが開発した「粉砕試料共存下でのボールミルシミュレーション法」を基本として,ボール径ならびにミル回転数を変化させて,スケールアップしたボールミル内の媒体運動をシミュレーションによって明らかにし,ミル動力当たりの試料の粉砕に寄与するエネルギー(媒体運動エネルギー)の最大値を与えるミル運転・操作条件を明確に設定できる手法を開発した.(1)転動ボールミルによる湿式粉砕実験昨年度は,転動ボールミルにより種々の操作条件の下で水酸化アルミニウムを乾式粉砕し,粉砕物の粒子径を求め,粉砕時間との関連性を明確にした.本年度は,ミル径,ボール径ならびにミル回転数が水酸化アルミニウムの湿式粉砕に与える影響を明確にし,さらに,乾式粉砕との差異について検討した.(2)実験結果と操作条件との関連を組み込んだシミュレーション法の開発「粉体共存下でのボールミルシミュレーション法」を用い,実験と同一条件でのボールの運動エネルギーなどの情報を得,粉砕実験結果との関連性を追究して,粉砕に影響を及ぼすシミュレーション情報を抽出した.この抽出された情報と粉砕操作条件との関係を明確化し,粉砕操作条件を与えて,実験結果をシミュレーションできるプログラムを開発した.これより,目的とする粒子径を得るための粉砕操作条件を,ボールミルシミュレーションからの情報に基づき逆に推算できる手法を見出いだした.
グスク出土の貿易陶磁器資料の集成とその情報化

本年度沖縄県内のグスクのうち、本研究の目的に最もかなう勝連グスク出土陶瓷器について下記のような資料を作成した。1983年度、勝連グスク跡本丸南側壁調査出土陶磁器(勝連町教育委員会保管)カラースライド31枚、実測破片数50点1984年度、勝連グスク跡南貝塚・二の丸地点出土陶磁器(勝連町教育委員会保管)カラースライド64枚、実測破片数127点1983年、ジョージ・H・ケア採集資料(沖縄県立博物館保管)カラースライド57枚、実測破片数87点その他勝連グスク跡採集資料(沖縄県立博物館保管)カラースライド5枚以上、カラースライド157枚、実測陶瓷器269点である。これらの画像資料は、データベース『桐』VER.5のうえで扱い、画像資料A(瓷片写真)、および画像資料B(瓷片実測図面)の両種がある。画像資料Aは瓷片写真の高品位描写が必要なため、国際標準企画のJPEGの形式を持ち、画像資料Bは印刷出力に便利な、『桐』の標準画像処理GRPの形式にした。『桐』のうえで、JPEG形式ファイルをモニターに表示するには、通常の640*400ドット(もちろんマルチスキャンモニターでも可)モニターに「フレームメモリー(自然画表示ボード)」必要である。
遺伝子導入を用いた癌細胞浸潤におけるIL-6のMMP活性化の解明

頭頸部癌において実際にIL-6の産生が認められるか否かを確認した。研究の過程において高濃度IL-6・G-CSF産生腫瘍細胞株の樹立をおこなった。多くの頭頸部癌細胞株培養液中にIL-6のみならずG-CSFの活性が認められた。また培養液中のIL-6およびG-CSFの浪度が高い細胞株がinvasion assayでより高い浸潤能を示した。次に癌細胞培養上清中に癌細胞の浸潤に関与するMMP-2,MMP-9の活性が認められるか否かを検討した。癌細胞培養液上清中のIL-6,G-CSFが高濃度を示した細胞株の培養液中のみMMP-2,MMP-9は認められ,その他の癌細胞株の培養上清中ではMMP-2,MMP-9は感度以下であった。培養液中にMMP-2,MMP-9が認められた癌細胞株では培養液にIL-6を添加するとMMP-2,MMP-9が増加したが、その他の癌細胞株では培養液にIL-6を添加しても培養液中のMMP-2,MMP-9は感度以下であり、変化を認めなかった。癌細胞自身のIL-6レセプターの発現をRT-PCR法を用いて確認した。癌細胞培養上清中にIL-6を添加すると濃度依存性に癌細胞のIL-6レセプターの発現は抑制された。またIL-6レセプターからのシグナルは癌細胞の増殖を抑制し癌細胞の浸潤を亢進する作用があることを確認した。頭頸部癌細胞に対する遺伝子導入効率は非常に悪い現実が存在する。そのため今後の研究における遺伝子導入効率を高める方法の確立を検討した。LacZ遺伝子または単純ヘルペスチミジンキナーゼ遺伝子を組込んだAAVベクター(AAVLacZ,AAVtk)を作製し,これらをヒト喉頭癌由来のHEp-2細胞及びHeLa細胞に感染させ,γ線照射の有無によるガンシクロビル(GCV)に対する感受性の差を検討した。更に,HEp-2細胞をヌードマウス皮下に移植し形成した腫瘍にAAVベクターを感染させ,γ線照射の有無による腫瘍内での導入遺伝子の発現及びGCVに対する感受性の差を検討した。その結果AAVtk/GCV単独でも癌細胞に対する十分な殺細胞効果が得られたが、γ線はこの効果を最高で約15倍まで増強した。また腫瘍内でのAAVLacZの発現はγ線で約3倍に増強された。腫瘍増殖はAAVtk/GCV単独でも低下したが、γ線の併用で30日間完全に抑制された。1:頭頸部癌細胞株培養液中のIL-6,G-CSFの濃度をELISAを用いて測定した。いずれの細胞株培養組織中にもIL-6,G-CSFを検出した。

また培養液中のIL-6,G-CSFの濃度が高い細胞株がinvasion chamberを用いてのinvasion assayでより高い浸潤能を示した。2:患者より採取した癌組織と血清中に認められるIL-6,G-CSFをELISAを用いて測定した。両者を検討すると癌組織中のIL-6,G-CSFの濃度が高い患者の血清中のIL-6はやはり高く、両者は相関している傾向を認めた。3:頭頸部癌細胞株培養液中のMMP-2,MMP-9をELIZAで測定した。癌細胞株培養液上清中のIL-6,G-CSFが高濃度を示した細胞株の培養液中のみMMP-2,MMP-9は検出されたが,その他の癌細胞株培養上清中ではMMP-2,MMP-9は感度以下であった。培養液中にMMP-2,MMP-9が検出された癌細胞株では培養液にIL-6を添加するとMMP-2,MMP-9が増加した。しかしその他の癌細胞株では培養液にIL-6を添加しても培養液中のMMP-2,MMP-9は感度以下であり,ELISAでは変化を認めなかった。平成13年度の研究計画は癌細胞にIL-6レセプターを遺伝子導入し、IL-6レセプターを強制発現させることであった。実際に頭頸部癌細胞に遺伝子導入を行うと遺伝子導入効率が悪く、今後の研究計画が円滑に進められないことがわかった。そのため遺伝子導入効率を高める方法の確立が本年度の主たる研究内容となった。【背景】我々はγ線がAAV(アデノ随伴ウイルス)ベクターの二本鎖合成を促進し頭頸部癌細胞での導入遺伝子の発現を増強することを報告している。【目的】癌細胞に対するγ線照射の有無による自殺遺伝子導入の発現の変化を検討する。【方法】LacZ遺伝子または単純ヘルペスチミジンキナーゼ遺伝子を組込んだAAVベクター(AAVLacZ, AAVtk)を作製し,これらをヒト喉頭癌由来のHEp-2細胞及びHeLa細胞に感染させ,γ線照射の有無によるガンシクロビル(GCV)に対する感受性の差を検討した。更に,HEp-2細胞をヌードマウス皮下に移植し形成した瞳瘍にAAVベクターを感染させ,γ線照射の有無による腫瘍内での導入遺伝子の発現及びGCVに対する感受性の差を検討した。【結果】AAVtk/GCV単独でも癌細胞に対する十分な殺細胞効果が得られたが、γ線はこの効果を最高で約15倍まで増強した。また腫瘍内でのAAVLacZの発現はγ線で約3倍に増強された。腫瘍増殖はAAVtk/GCV単独でも低下したがγ線の併用で30日間完全に抑制された。【まとめ】以上よりAAVベクターによる自殺遺伝子導入はγ線を併用した際に増強を認めた。またγ線を併用したAAVベクターによる自殺遺伝子治療の有用性が動物個体レベルにおいても示唆された。【今後の展望】IL-6を導入する際にγ線照射をおこない遺伝子導入効率を高められる。ヒトにおけるγ線を併用したAAVベクターによる自殺遺伝子治療施行の可能性が存在することが示唆された。癌細胞はIL-6を産生する。IL-6は癌細胞の浸潤能を亢進させることがわかっている。今回は癌細胞のIL-6レセプターの発現に関し検討した。癌細胞株を使用し以下を確認した。・癌細胞はIL-6レセプターを発現していた。(RT-PCR法)・癌細胞上清中にIL-6を添加すると濃度依存性に癌細胞のIL-6レセプターの発現は抑制された。(RT-PCR法)
電磁ノイズ抑制のための近傍界ノイズ抑制素子の実用化

電気・電子機器が強い電磁界にさらされると,機器内部の電子回路に不要な電流が誘導され,これが機器の誤動作を引き起こす原因となる.外部から印加される不要な電磁波に対して電気・電子機器が誤動作を起こさないよう,十分な耐性をもたせるためには,電気・電子機器を外部電磁界から遮蔽するとともに,電子回路上に発生した不要な誘導電流の伝播を抑制することが有効である.本研究では,不要な電流を抑制するための「近傍界ノイズ抑制素子」の最適な設計手法を確立するとともに,その実用化を目指している.電気・電子機器が強い電磁界にさらされると,機器内部の電子回路に不要な電流が誘導され,これが機器の誤動作を引き起こす原因となる.外部から印加される不要な電磁波に対して電気・電子機器が誤動作を起こさないよう,十分な耐性をもたせるためには,電気・電子機器を外部電磁界から遮蔽するとともに,電子回路上に発生した不要な誘導電流の伝播を抑制することが有効である.本研究では,不要な電流を抑制するための「近傍界ノイズ抑制素子」の最適な設計手法を確立するとともに,その実用化を目指している.
金属人工格子の解析と評価

X線回折トポグラフィー法による面内方向での膜の均一性を測定することに成功した。スパッタ法により作製したAu/Co人工格子では、膜の縁の部分よりも中心部でのサテライトピークが大きいことから、中心部の構造が優れていることが明らかにされた。高解像度の電子顕微鏡による人工格子の構造解析も行った。Co/Pd人工格子は、柱状構造になっていて、積層方向での結晶粉粒の長さは積層周期よりも長いことがわかった。一方、Ag/Co人工格子では柱状構造は観測されなかった。ラザフォード後方散乱およびメスバウアー分光を用いて、Fe系人工格子の構造を調べた。Ag/Fe人工格子では界面がシャープであり、Feはbccであることがわかった。これに対し、Sn/Fe、Zn/Fe、Hf/Feでは界面で拡散が起きていて、金属間化合物が形成されていることが明らかになった。高圧下でのX線回折実験がSOR光を用いて行われた。この実験では10GPaまでの静水圧をかけることが可能である。その結果、Au/Ni、Mo/Ni人工格子では、積層方向の弾性率がバルクの値に比べて非常に増加していることがわかり、弾性異常を確認することができた。また、巨大磁気抵抗効果の起源を調べる目的で、中性子回折実験により金属人工格子の磁気構造が調べられた。Fe/Crの場合、磁場中では、人工格子の周期に対応するピークのみが観測されるのに対して、無磁場では人工格子の2倍の周期に対応するピークも観測されたことから、隣合うFe層の磁気モーメントは反平行に配列していることが結論された。また、Fe層とCr層の間の界面では磁気構造が乱れていることが発見され、このことが巨大磁気抵抗効果の起源であることが示唆された。
SiC/金属界面レーザーアニールプロセスの動的モニタリング

半導体と金属電極の合金化にはこれまで熱アニールが一般的に利用されてきており、ワイドバンドギャップ半導体にも同様のプロセスの適用が検討されている。しかし、ワイドギャップ半導体特有の強い結合のため、非常に高温の熱アニールが必要となり、その高温環境ゆえ、デバイスプロセスの制限等の様々な弊害を生じている。そこで、本研究ではレーザー光照射を用いて金属とワイドバンドギャップ界面のアニールを行うことを目指した。具体的には、フェムト秒レーザー照射と、その後の比較的低温な熱アニールによって界面における原子移動が起きることを明らかにした。さらに、連続波レーザー照射によっても同様の現象を確認することができた。シリコンカーバイド(SiC)は高い熱伝導率、絶縁破壊電界などパワーデバイスに必要とされる優れた特性を持つ。しかし、ニッケル(Ni)電極/SiC界面において形成される高いショットキー障壁が、デバイスの電気特性に悪影響を及ぼす。したがって、Ni/SiC界面でのオーミック接触形成技術が重要である。従来のオーミック接触形成技術としては、フラッシュランプを用いて1000°C程度で急熱急冷をする方法が知られているが、1000°Cでのアニールによる材料の制限やデバイスへの熱損傷などの課題がある。そこで本研究では、フェムト秒レーザー照射と低温アニール処理を組み合わせた熱による損傷を低減したオーミック電極形成技術を確立することを目指している。本研究ではフェムト秒レーザーを照射と低温アニール処理を用いて作製したNi/SiC界面の物性分析をおこなった。ラマン分光分析の結果と光学顕微鏡像を比較すると、レーザー照射個所に対応してニッケルシリサイド(Ni2Si他)の強度が強くなっているから、レーザーを照射した所にNi2Siが多く形成されており、ニッケルシリサイドの形成の促進にレーザー照射が関与していることを示している。また、透過型電子顕微鏡観察からもすべての試料で、レーザ照射による改質(ひずみ層)がSiC内部に形成していることを確認した。アニールを行った試料ではNiがひずみ層に沿ってSiC側へ拡散している様子と、Ni/SiC界面に隣接するNi膜内にコントラストの異なる新たな層が形成されたことを確認した。また,NiのSiC側への拡散距離及び層の厚みは,温度と保持時間の増加に伴って増加する傾向を示した。レーザが照射されていない領域との比較から、フェムト秒レーザ照射に伴うSiC内への欠陥導入により、Ni拡散を促進したことは明らかである。SiCデバイスにおけるオーミック電極形成には、Ni蒸着後1000°C程度のアニールが不可欠であるが、アニール温度によりデバイスプロセスが制限される問題がある。本研究では、透明固体材料を加工可能なフェムト秒レーザーをNi/SiC界面へ照射し、従来のアニール温度より低温な熱アニールを行うことでNi/SiC界面の低温シリサイド化を試みた。用いた試料はn型の4H-SiC基板であり、基板のSi面にNiを500nm蒸着した後、Ni/SiC界面へSiC基板側からフェムト秒レーザーを集光照射した。フェムト秒レーザー照射後、400°Cにおいて10分間のアニールを行った。アニール後、試料の元素結合状態を評価するため、フェムト秒レーザー照射領域に対してラマン分光測定をNi電極側から行った。加えて、試料断面の評価をTEMにより観察し、元素分析をEELSにより行った。未照射およびフェムト秒レーザー照射後にアニールを行った4H-SiC基板のラマンスペクトルにおいて100cm-1および140cm-1にNi2Si由来のピークが確認された。これはフェムト秒レーザー照射により結合が切られたSiがアニールによってNi膜側へ拡散し、Ni2Siを形成したためと考えられる。フェムト秒レーザー照射の低温シリサイド化への寄与を調べるため、試料表面のラマンマッピングを行った。その結果、フェムト秒レーザー照射領域でNi2Siのピーク強度が大きくなっていることが明らかとなった。加えて、試料断面のTEM観察結果およびEELSによるTEM試料の元素分析結果から、フェムト秒レーザー照射領域においてSiのNi膜中への拡散を確認した。以上の結果から、フェムト秒レーザー支援アニールは、Ni/SiC界面をより低温でシリサイド化できる可能性を示した。本研究は従来ナノ秒レーザーアニールによる金属/半導体界面アニールプロセスの観測を目指していたが、研究開始早々に現有の装置で試しに行ったフェムト秒レーザー照射に低温アニールを行うという着想が、デバイス作製上極めて有効な手段であることを見出した。本研究は挑戦的萌芽研究という性格を勘案し、共同研究者らと合議の上、応用上の有用性も高いフェムト秒レーザー照射と低温アニールを組み合わせる研究を優先して行うこととした。このような観点から、本研究は挑戦的萌芽研究として当初の計画以上に進展していると判断した。光物質科学

現在までの達成度の欄で記述したとおり、フェムト秒レーザー照射と低温アニールを組み合わせる研究が大きな成果を挙げているので、この研究を来年度も遂行していく予定である。既に研究成果のところで述べたとおり、フェムト秒レーザー照射と低温アニールを用いた金属・半導体界面のアニールが大幅に進んだため、高額な装置の購入を後回しにして、当該研究の遂行に注力したため。次年度ではフェムト秒レーザー照射と低温アニールを用いた金属・半導体界面のアニールに対してその場観察を行う予定であり、そのための装置購入を計画している。
日露戦争期の大衆紙における広告の数量分析

本研究では、大阪の二紙、『大阪毎日新聞』と『大阪朝日新聞』の明治36年(1903)から40年(1907)まで、および東京の二紙『時事新報』と『萬朝報』の明治36年から38年(1905)までの、各年一月の紙面に掲載された広告の数量分析を行った。その結果、総件数の月平均では『時事』が3,751件と最も多く、次いで『大阪朝日』3,203件、『大阪毎日』2,956件、『萬朝報』が2,010件と最も少なく、各紙の広告掲載量および広告収入への依存度の差異が明らかになった。また広告件数の増減では、大阪の二紙は共に、戦前の明治36年に比べて戦後の40年には約1.4倍増加しており、日露戦争期に新聞広告が飛躍的に発展したという通説を裏付けた。広告主旨別件数では、四紙とも商品宣伝の広告が最も大きい割合を占めたが、『萬』では六割以上と高く、『大阪朝日』『大阪毎日』では三割から四割、『時事』では三割程度と差異が見られた。大阪の二紙では商品宣伝に次いで年賀広告と事業広告の割合が高く、組織的かつ定期的な広告活動の比重が大きかったといえる。一方、東京の二紙は対照的に異なり、『時事』では商品宣伝以外では特定の分類への偏りがなく幅広いのに対し、『萬』は商品宣伝への集中度が突出して高かった。広告の大きさでは、五十行以上の大型広告の割合が大阪の二紙で高く、戦後には6-10%に達した。また絵図や写真使用などの視覚的デザインも大阪の二紙の方が使用頻度がほぼ二割以上と東京に比べて高く、特に戦勝広告の華々しさは際だっており、新聞広告の大型化とデザインの発展を牽引したのは大阪の新聞だったといえる。また広告主の地域性では、大阪の二紙では大阪の広告主が五割を、東京の二紙では東京の広告主が六-七割を占め、地域性の高さが明らかになった。なお大阪の二紙で東京の広告主が占める割合は7-12%に対し、東京の二紙で大阪の広告主が占める割合は1-3%と低かった。以上のように、新聞広告における大阪と東京の差異が明確に数量的に現れたのが本研究の成果である。今年度は、本研究の前半として、大阪で発行された日露戦争当時の有力紙である『大阪毎日新聞』『大阪朝日新聞』の二紙について資料収集と予備調査を行った。各紙の紙面における広告記載の位置と構成は両紙ともほぼ共通しており、当時約十頁だての紙面のうち、3,4,8頁の記事下約半頁と最後の10頁目が全面広告用紙面になっている。広告数の全体を見積もるために、明治36年と明治39年で一号あたりの広告件数を測定したところ、元旦などの特別な日をのぞけば、およそ50100件の間で、平均70件ほどが掲載されていることがわかった。月当たりの合計は約二千件を越す。

これをふまえてパソコン・ソフトを使用した調査票を作成し、新聞号数、月日、頁数、掲載位置とサイズ、広告種類(一般広告、開業広告、決算広告、死亡広告、挨拶広告、連合広告など)、業種、商品名、商店・広告主名、場所、広告文、図の有無などの項目を調べることにした。入力の手間が予想以上にかかったため、今年度はまだ両紙とも数ヵ月分ほどを入力するにとどよったが、大阪在住の広告主が大部分を占めること、タバコ産業の官営化による広告減少の打撃は、全体の広告件数に見る限り大きくないこと、一頁全面を使った大型広告が登場していること、業種別では通説のとおり書籍と医薬・化粧品が多いなどの傾向を確認した。今年度は大阪紙の調査を続けるとともに、これをふまえて東京紙二紙の調査を行う予定である。本年度は、昨年度に行った大阪の有力二紙『大阪毎日新聞』と『大阪朝日新聞』に関する予備調査をふまえ、明治36年から40年までを対象として、上記の大阪二紙および東京二紙『時事新報』および『萬朝報』の調査を行った。まず概容を把握するため、『大阪毎日』の広告件数を調べたところ、日露戦争前の明治36年は合計約31000件、月平均で約2590件だったが、戦争後の明治40年には合計約37800件、月平均で3150件と約二割増加しているのが明らかとなった。これは日露戦争を期に広告が発展したという通説と合致する。また、月別では一年のうち一月が最も広告件数が多いのが確認されたので、明治36年から40年まで五年間の一月分の広告データを調書対象に絞ることにした。予定の調査のうち、調査が終了してない箇所があるが、現在のところ、次のような知見が得られた。大阪の二紙は、毎年およそ2700-2900件の広告件数を記録し、戦争後には三千件を越えたのに対し、東京の二紙は、約二千件ほどで大阪に比べ件数が少ない。大阪の二紙では、大阪の広告主がほぼ七割以上を占め、東京の二紙では、東京の広告主がやはり七割以上を占めた。また、火事見舞い、年賀の挨拶、移転広告など個人名の広告も多く、地域紙としての性格を持っていた。業種別では、件数が多いのは通説のとおり薬・書籍で、両都市とも同じ傾向である。現在、データの補足修正を行う整備作業中であるが、最終年度にあたり、さらに分析中の事項を加え報告書にまとめ提出する予定である。
大動脈瘤における血管修復機構の解明～血管平滑筋に着目した治癒療法の開発～

ヒト及びマウス大動脈瘤の病態にはIL-6系シグナルのSTAT3活性化が関与し、マウス瘤における平滑筋STAT3活性化は、平滑筋細胞の増殖やアポトーシスに関連していることがわかった。しかし、平滑筋細胞におけるIL-6シグナルは、実験的大動脈瘤形成には影響せず、瘤病態には重要でないことが明らかとなった。一方で、大動脈解離においては、平滑筋STAT3をノックアウトすると、より重症化することを見いだした。平滑筋STAT3が大動脈解離病態において重要な役割を果たす可能性を示唆する新たな知見を得ることができ、引き続き、大動脈解離における平滑筋STAT3の役割やその分子メカニズムについて研究を進めている。大動脈瘤は、原因不明の局所的慢性炎症により壁の脆弱化し破裂に至る。大動脈瘤組織は、炎症細胞による組織破壊と血管平滑筋による組織修復が混在し、大動脈瘤の制御には、破裂の抑制のみならず修復の促進が必要と考えられる。本研究では、血管平滑筋による組織修復に着目し、ヒト大動脈瘤組織の平滑筋細胞ではSTAT3が活性化していることから、平滑筋細胞におけるSTAT3の役割に注目して血管修復機構の解明を目的に研究を進めた。(ヒト大動脈瘤組織を用いた検討)免疫組織化学によりヒト大動脈瘤組織におけるSTAT3の活性化を認めた。(マウス大動脈瘤組織を用いた検討)大動脈周囲への高濃度塩化カルシウム塗布で惹起する大動脈瘤モデルを用いて平滑筋におけるSTAT3の活性化、平滑筋細胞の増殖やアポトーシスを、細胞増殖のマーカーKi67やアポトーシスのマーカーTUNELの多重免疫染色を用いて観察した。炎症惹起後急性期のSTAT3の活性化に一致した平滑筋細胞の増殖やアポトーシスを認めた。(遺伝子操作マウスを用いた検討)平滑筋特異的にSTAT3活性化抑制因子であるSOCS3及びSTAT3をノックアウトしたマウスを作成し、大動脈瘤モデルを作成した。肉眼的な腹部大動脈瘤の形成は、いずれのノックアウトでも野生型と同等で、平滑筋特異的なSTAT3操作は、実験的大動脈瘤モデルの形成に影響しないことが明らかとなった。そこで、更なる血管負荷のため、BAPNとアンジオテンシンIIを持続投与したところ、平滑筋特異的STAT3ノックアウトでは、野生型よりも大動脈解離が重症化することを見いだした。以上のように、本研究では、大動脈瘤における血管修復機構の解明には至らなかったが、大動脈解離の病態では、平滑筋細胞におけるSTAT3が重要な役割を果たす可能性を示唆する新たな知見を得ることができ、分子メカニズム解明のため研究を継続している。大動脈瘤は、原因不明の局所的慢性炎症により壁の脆弱化が進行し破裂に至るとされる。大動脈瘤組織は、炎症細胞による組織破壊と血管平滑筋による組織修復が混在している。大動脈瘤の制御には、破壊の抑制のみならず修復の促進が必要と考えられ、炎症メディエーターであるIL-6は両者を制御すると考えられる。本研究では、両者のうちこれまで着目されていなかった血管平滑筋による組織修復に着目した。ヒト大動脈瘤組織の平滑筋細胞では、IL-6系シグナルの1つであるSTAT3が活性化しており、平滑筋細胞におけるSTAT3活性化は、平滑筋細胞の増殖促進やアポトーシス抑制に関与しているとされている。以上から、大動脈瘤組織における平滑筋細胞でのSTAT3の役割に注目して血管修復機構の解明を目的に研究を進めた。(マウス大動脈瘤組織を用いた検討)大動脈周囲への高濃度塩化カルシウム塗布で惹起する大動脈瘤を用いて平滑筋におけるSTAT3の活性化や平滑筋細胞の増殖やアポトーシスを経時的に観察した。多重免疫染色において平滑筋細胞でのSTAT3活性化と炎症惹起後急性期の平滑筋細胞の増殖やアポトーシスを認めた。平滑筋細胞の増殖はSTAT3の活性化に一致してみられた。(遺伝子操作マウスを用いた検討)大動脈瘤における平滑筋細胞でのSTAT3の意義を検討するため、平滑筋特異的にSTAT活性化抑制因子であるSOCS3及びSTAT3をノックアウトしたマウスを作成し、個体数が充分得られた時点で大動脈モデルの作成を開始し、腹部大動脈瘤形成の肉眼的差異を野生型と比較した。大動脈瘤径の有意差は得られていないが、SOCS3ノックアウトマウスでは、組織学的に線維化の抑制がみられ、線維化とSTAT3活性化との関連が示唆される。血管平滑筋による組織修復機構を解明する上で、ヒト大動脈瘤の平滑筋細胞で活性化が確認されているIL-6系シグナルのSTAT3に着目して研究を進めた。

(マウス大動脈瘤組織を用いた検討)大動脈周囲への高濃度塩化カルシウム塗布で惹起する大動脈瘤を用いて、STAT3及び活性化型STAT3であるphospho-STAT3の免疫組織化学や多重免疫染色を行い、マウス大動脈瘤でもSTAT3が活性化していることを確認した。また、同マウス大動脈瘤組織を用いて、細胞増殖のマーカーである細胞周期関連核蛋白Ki67やアポトーシスのマーカーであるTUNELの多重免疫染色を行い、マウス大動脈瘤組織においても平滑筋細胞の増殖やアポトーシスがみられることを確認できた。(遺伝子操作マウスを用いた検討)平滑筋特異的にSTAT3活性化抑制因子であるSOCS3やSTAT3をノックアウトしたマウスを作成し、個体数が充分得られた時点で大動脈モデルの作成を開始した。腹部大動脈瘤形成の肉眼的差異を野生型と比較し、明らかなはみられていないが、SOCS3ノックアウトマウスでは組織学的に線維化が減少している印象であった。STAT3の関与が示唆され、比較する個体数を増やし、さらなる追求が必要である。引き続き、平滑筋特異的SOCS3ノックアウトマウス及び平滑筋特異的STAT3ノックアウトマウスの個体数を増やして野生型との比較を行っていく。瘤径の肉眼的差異のみではなく、組織解析やこれまで確認してきたSTAT3、pSTAT3、Ki67やTUNELなどを始めとする細胞内シグナルや分子についても野生型との比較をする。これまでの結果から、平滑筋細胞の増殖やアポトーシスは、炎症惹起後急性期に認めることから、経時的な大動脈瘤モデルを作成し、組織学的及び分子学的解析を行う。さらに組織修復に関わるその他の分子についての遺伝子学的解析も行う。上記した研究の推進方策を進めていく上で、マウスの購入や飼育費、組織培養試薬や生化学実験の消耗品費用及び人件費として使用する。また、遺伝子学的解析も行う場合はその費用として使用する。
人工関節感染症における自然免疫系受容体ＴＬＲとＮＬＲの機能解析

感染性人工関節周囲組織と非感染性弛緩人工股関節周囲組織におけるToll様受容体(TLR)、Nod様受容体(NLR)の発現様式について、TLR1, TLR2, TLR6並びにNLRP3の組織学的局在を明らかにし、マクロファージ、線維芽細胞、好中球に発現していることを明らかにした。またグラム陽性球菌菌体成分であるリポタイコ酸(Lipoteichoic acid: LTA)を用いてマクロファージの刺激試験を行い、TLR2、NLRP3、TNF-αおよびIL-1βのmRNA発現が亢進する一方で、骨溶解を誘導する催炎性サイトカインTNF-αおよびIL-1βの分泌には乖離が生じることを明らかにした。手術時に得られた、感染性(10例)及び非感染性弛緩人関節周囲組織(14例)、変形性股関節症(10例)及び関節リウマチ(10例)由来滑膜組織を用いて、病理・免疫組織学的検討を行いました。検討の詳細はパラフィン包埋切片及び凍結組織切片を用いてHE染色による細胞形態評価と免疫組織染色によるマクロファージと好中球の同定を行い対象組織における細胞分布を明らかにしました。また蛍光二重染色法を用いてマクロファージと好中球における自然免疫受容体TLRs及びNLRs,これら受容体の関連アダプター分子,催炎性サイトカインの共局在の発現様式について明らかにしました。以上につきましては第28回日本整形外科学会基礎学術集会(2013年10月幕張)並びに第58回日本リウマチ学会総会・学術集会(2014年4月品川)で報告しています。またマウス骨髄細胞由来マクロファージ並びにマクロファージ細胞株RAW264.7を用いて、エンドトキシン付着Ti粒子による刺激・貪食時にTLR及びNLR反応系の分子動態に与える影響について検討を行いました。エンドトキシンにはインプラント感染症の原因菌の中で最大の割合をしめるグラム陽性球菌の細胞膜蛋白であるlipoteichoic acid (LTA)を用いました。刺激試験をおこなった細胞での自然免疫受容体TLR1, TLR2, TLR6, NLRP3,についてmRNA発現様式,骨溶解を誘導する催炎性サイトカインTNF-alpha, IL-1betaのmRNA発現様式について明らかにしました。以上の詳細につきましては前述の2学会に加えて、2014 ORS Annual Meeting (2014年3月New Orleans, LA)で報告しております。これまで我々は人工関節摩耗粉に対する骨溶解や周囲結合組織の脆弱化における生体反応機構に関する研究においてマクロファージを中心とした細胞性反応と破骨細胞性骨吸収機構を解析してきた。この一連の研究の過程で人工関節周囲の生体反応に自然免疫機構が関与することを示し、インプラント感染症におけるToll様受容体(TLR )、NOD様受容体(NLR)を介した自然免疫応答の解析を行った。TLR、NLRは病原性細菌の菌体成分や自己構成成分を認識しNF-κβ, AP-1, caspase-1の経路を通してTNF-αやIL-1βの産生を誘導する。菌体成分を用いたリガンド刺激ではTLRを介したシグナル伝達間に促進的ないしは抑制的な相互作用が存在することを報告してきたが(Takagi M 2011)、これに加え、NLRもまたこれらの自然免疫応答に関与していることが示唆された(Naganuma Y 2013)。インプラント感染症ではバイオフィルム形成性の病態を示し、遷延化することも少なくない(Sasaki K 2009 ,高木2010 )。この過程にTLRおよびNLRを含む病原体認識受容体を介した免疫応答が深く関与する可能性が示唆され(Takagi 2011 )、同時に免疫応答調節分子の使用やインテリジェントマテリアルの併用によって、自然免疫応答を制御してインプラント感染症の発生、炎症の遷延化を抑制できる可能性が示されつつある(Takagi 2011 )。人工股関節全置換術における無菌性の弛みは未だ克服されていない合併症の一つである。摺動面由来のインプラント摩耗粉はマクロファージに貪食され、異物肉芽腫反応を生じ、それに伴う催炎性サイトカイン過剰産生は、骨溶解を惹起し人工関節の弛みを引き起こす。マクロファージの異物認識反応に関わるToll様受容体(Toll-like receptor: TLR)の一部やNOD(Nucleotide oligomerization domain)様受容体(NOD-like receptor: NLR)の一つであるNLR witha pyrin domain 3 (NLRP3)は無菌性弛緩人工関節の病態形成に関与する可能性が示唆されている。しかし無菌性弛緩人工関節におけるTLR系やNLRP3のの詳細な役割については不明のままである。

平成24、25年度の本研究経過報告において無菌性弛緩人工股関節周囲組織においてマクロファージを主とした炎症性細胞にTLR並びにNLRP3の反応に関与する分子の発現が亢進していること、さらに異物貪食マクロファージにおいてTLR1、TLR2、TLR6、NLRP3、催炎性サイトカインのmRNAの発現が亢進することについて明らかにした。本年度ではRAW264.7細胞を用い、チタン粒子及びリポタイコ酸(LTA)付着チタン粒子の異物貪食試験を行い、ELISAによるサイトカインの分子動態の解析を行った。TNF-αの分泌量はLTA付着チタン貪食RAW264.7細胞ではチタン貪食細胞に比して増加したが、IL-1β分泌量はいずれの細胞群でも検出限界以下であった。LTA付着チタン貪食細胞においてTNF-αとIL-1βのmRNAと蛋白分泌において乖離がみられたが、この現象はIL-1β誘導性の急性炎症を伴わない無菌性弛緩人工関節周囲組織の病態に合致しうる現象と考えられた。整形外科学マウス骨髄細胞由来マクロファージ並びにマクロファージ細胞株RAW264.7を用いた、エンドトキシン付着Ti粒子による刺激・貪食試験を行っていますが、刺激試験をおこなった細胞での自然免疫受容体TLR1, TLR2, TLR6, NLRP3,及び骨溶解を誘導する催炎性サイトカインTNF-alpha, IL-1betaのタンパク発現様式についてWestern blottingでの解析を行っています。股関節ないしは膝関節手術から得られた感染性人工関節周囲組織、非感染性弛緩人工関節周囲組織、変形性関節症、関節リウマチ由来の滑膜組織を用いて、病理組織学的検索を行いました。パラフィン包埋組織切片・HE染色による細胞形態評価と凍結組織切片・免疫組織染色によりマクロファージ(CD68)、好中球(CD15)を同定し、対象組織の細胞分布を明らかにしました。また免疫組織学的にマクロファージ(CD68)、好中球(CD15)における自然免疫系受容体TLRs, NLRs及びそれらの関連分子TLRs、NLRs、caspase 1, TNF-α, IL-1βの局在の有無を蛍光二重染色法で判定しました。以上については日本整形外科学会基礎学術集会(2013年10月、千葉)、Orthopaedic Research Society(2014年3月、New Orleans)で発表予定です。また細胞株RAW264.7を用いてTitanium particle及びエンドトキシン付着Titanium particleによる刺激試験を行い、TLRs、NLRs及びこれらの関連分子、TNF-α、IL-1βについてmRNA発現動態、Western blottingによるタンパク発現動態の解析を行いました。解析結果に関しては第86回日本整形外科学会学術集会(2013年5月、広島)で報告予定です。以上より概ね研究計画通りに進展していると考えられます。H26年度はRNA干渉法によるTLR2及びNLRP3をknockdownした細胞や、TLR2 knockout mouseから得られた骨髄細胞由来マクロファージを用いて刺激試験を行います。
胃炎胃潰瘍胃ガンの原因であるピロリ菌等の多型形成にはたす制限修飾酵素遺伝子の役割

A.ゲノムダイナミクスの実験的解析。(A-1)制限修飾遺伝子の自己増殖の発見。制限修飾遺伝子が枯草菌染色体上で自己増殖する場合を発見した。この発見は、制限修飾遺伝子が、潜伏感染型ウイルスのような増殖サイクルによって自己の頻度を増加させることを想像させた。(A-2)制限修飾遺伝子のゲノム内転移。PaeR7I制限修飾遺伝子の大腸菌でのプラスミドから染色体への転移を検出した。その産物のシークエンスから、転移の機構を推測した。(A-3)制限修飾遺伝子のゲノム攻撃に対する細菌側の防御。EcoRIIによる宿主大腸菌の染色体攻撃を、単独メチル化酵素Dcmのゲノムメチル化が抑えることを示した。大腸菌染色体の特定のサイトで働く組み換え機構が、制限酵素の攻撃からゲノムを守ることを示した。B.ゲノム配列の比較と情報解析。近縁細菌のゲノム配列を比較して、ゲノム多型の形成機構とくに制限修飾遺伝子の役割を推測した。(B-1)ブドウ球菌。薬剤耐性黄色ブドウ球菌S.aureusのMRSA,VRSA2株のゲノム配列を比較し、中規模多型をカタログ化し、形成機構を推測した。別の種S.hominisについても、動く遺伝子単位に乗った制限修飾遺伝子の残骸を発見した。(B-2)髄膜炎菌。N.meningitidis(髄膜炎菌)の二株、N.gonorhoeae(淋菌)の一株を比較し、制限修飾遺伝子と関連したゲノム多型を検出した。ISと制限修飾遺伝子が関与した新しいゲノム再編機構を発見した。(B-3)ゲノム比較ツールの開発。これらの過程で、近縁ゲノムの配列を比較し大規模ゲノム多型を検出するツールCGATを改良した。C.制限酵素メチル化酵素の新しい命名法。制限酵素修飾酵素とその遺伝子の多様性の認識に基づいて、新しい命名法体系を提唱した。(B-2)髄膜炎菌。(A)全ゲノム配列間の比較による多型の検出。(1)ピロリ菌。制限修飾遺伝子のホモログを洗い出し、進化系統樹の形にした。それらのコドン使用の偏り、コドン3字目のGC含量の偏りから、水平伝達を推定した。ゲノムDNAの配列を両株で比較し、「大きな欠失を伴う挿入」および「長い標的重複を伴う遺伝子挿入」特徴的な構造を探し出したた。それらについて、制限修飾酵素の認識配列の分布を調べ「利己的な転移モデル」を検証した。(2)パイロコッカス。ピロリ菌と同様な解析を、好熱古細菌Pyrococcusの2つの種Pyrococcus horikoshiiとPyrococcus abyssiについて行い、制限修飾遺伝子らしいと思われる遺伝子群に連鎖した大規模多型を6カ所同定した。置換、逆位、転移である。それらは、制限修飾遺伝子が隣接する遺伝子を引き連れて転移することを示唆した。(3)髄膜炎菌、黄色ブドウ球菌。(4)近縁ゲノム配列比較ツールの開発。これらの過程で、ドットプロットに基づいて近縁ゲノムの配列を比較し、大規模ゲノム多型を検出するツールを開発している。(B)多型部分のダイナミクスの実験室での解析。(1)推定構造の検証。ゲノムが解読されたピロリ菌株のゲノムDNAについて、「大きな欠失を伴う挿入」「長い標的重複を伴う挿入」構造をPCRで実証した。(2)制限修飾遺伝子の転移。制限修飾

遺伝子の大腸菌でのプラスミドから染色体への転移を、「分離後宿主殺し」の条件で検出した。その産物のシークエンスを解析し、転移の機構を推測した。A..ゲノム配列の比較と解析。(A-1)ゲノム比較ツールの開発。以下の過程で、近縁ゲノム比較ツールCGATを改良した。(A-2)ピロリ菌、パイロコッカス。二株を比較して、ゲノム多型への制限修飾遺伝子の関与を示唆した。(A-3)ブドウ球菌Staphylococcus。薬剤耐性黄色ブドウ球菌S.aureusのMRSA, VRSA2株のゲノム配列を比較し、中規模多型をカタログ化し、形成機構を推測した。毒素原性を担う「動く遺伝子」塊に乗っている制限修飾遺伝子ホモログを解析し、二つの座にまたがる「二つの顔を持つ制限修飾系」を推測した。また、制限修飾遺伝子の毒素遺伝子群の重複と多様化への関与を提唱した。別の種についても、動く遺伝子単位に乗った制限修飾遺伝子を解析した。これら制限修飾遺伝子がこれらの動く遺伝子単位の安定化に関与している可能性を提唱した。これらのゲノム中に遠縁の生物との遺伝子水平伝達の候補を同定した。(A-4)髄膜炎菌Neisseria。N.meningitidis(髄膜炎菌)の二株、N.gonorhoeae(淋菌)の一株を比較し、制限修飾遺伝子と関連したゲノム多型を検出した。反復配列のゲノム多型をカタログ化した。B.多型ダイナミクスの実験室での解析。(B-1)制限修飾遺伝子のゲノム内転移を実証した。(B-2)染色体上の制限修飾遺伝子の増幅を発見し、構造とダイナミックスを解析した。考察:以上の成果は、制限酵素修飾酵素遺伝子が「利己的な動く遺伝子」であり、病原細菌など細菌ゲノムの多型形成に寄与していることを示唆する。制限修飾遺伝子の存在が脅かされたときにおきる染色体攻撃は、「異変が起きた細胞を排除することによってゲノムを安定維持する」と同時に、「再編ゲノムをおこし」、「そのうち制限修飾遺伝子の発現が回復したものを生き残らせる」効果がある。(A)多型部分のダイナミクスの実験室での解析。(A-1)制限修飾遺伝子の自己増幅。Bacillus属の染色体上のBamHIが、縦に数十コピー増幅することを発見した。その増幅を1コピーから再現した。FISHによって爆発的増幅を可視化した。制限修飾遺伝子がウイルスのような増殖サイクルを取るという仮説を提唱した。(A-2)制限修飾遺伝子のゲノム内転移。大腸菌のPaeR7Iのゲノム内転移を、試験管内で実現した。それが、制限酵素による染色体攻撃によって、引き起こされ、かつ選択されたことを示す結果を得た。(A-3)制限修飾遺伝子のゲノム攻撃に対する細菌側の防御。EcoRIIが、高温で宿主大腸菌の染色体を攻撃することを発見した。
超音波セラノスティクスを実現するバブル製剤の開発

(1)セラノスティクスバブル製剤の開発:前年度から検討していたDSPC:DSPE-PEG2000をベースにした組成にDSPGを添加し、パーフルオロプロパンガス(PFPガス、bp -36.7°C)存在下ホモジナイザー(15,000rpm、5分)を用いてバブルを調製し、マウスの血流造影時間で比較検討した。その結果、PFPガスを内核とし、外殻素材として“DSPC:DSPG:DSPE-PEG2000=30:60:10(モル比)"から成る、平均粒径12μmのバブル製剤が最も安定な造影能を示し、最終セラノスティクスバブル製剤に決定した。凍結乾燥を専門とする業者から得た凍結乾燥プロトコールにしたがって、以降の動物実験用セラノスティクスバブル凍結乾燥製剤を300バイアル製作した。(2)セラノスティクスバブル製剤の機能評価:ルシフェラーゼ発現プラスミドDNAとセラノスティクスバブル製剤をddYマウスの静脈内に同時投与し、直ちに肝臓または腎臓に向けて超音波(周波数:1 MHz、照射時間率:50%、照射強度:1 W/cm2、照射時間:1分、繰り返し周波数:2 Hz)を照射した。24時間後、ルシフェラーゼ活性を測定した。その結果、肝臓または腎臓に超音波を照射した群では、超音波のみを照射した群と比較し高いルシフェラーゼ活性が認められた。このことから、セラノスティクスバブル製剤と超音波を組み合わせることで、ソノポレーションが誘導されpDNAが導入されたと考えられ、in vivo遺伝子デリバリー機能を確認した。また、100mmディッシュにドキソルビシン耐性細胞K562/Adrを培養し、ドキソルビシン送達を行った。その結果、セラノスティクスバブル製剤+超音波の組合せ群で高い細胞傷害性が認められた。凍結乾燥条件の再検討を行ったため、時間を要した。治療用超音波装置を犬にセットする方法について、小動物用を用意したが、施術条件の設定に時間がかかり、年度後半にずれ込み、期間内に成果を出すことができなかった。新しい凍結乾燥セラノスティクスバブル製剤の造影能とソノポレーションによる治療を、小動物、大動物で検証する。イヌでのセラノスティクス評価として麻布大学附属動物病院において、鎮静や麻酔の施術を行い、超音波造影装置(現有)で血管や主要臓器の造影の持続時間、鮮明性を評価する。癌罹患犬に対して、治療超音波装置で血管オープニングによるDOXIL送達治療や温熱療法を実施し、治療効果のほかに組織の損傷度合や傷害性を検討する。セラノスティクスバブル製剤の開発:既に特許申請したバブルをプロトタイプとし、外殻素材について検討した結果、パーフルオロプロパンガスの保持性を高め、安定性を高める脂質とその添加量を決定することができた。最終剤形は、室温で保存できる造影ガス充填凍結乾燥製剤でバイアル瓶で供給することが目標なので、等張量のスクロースを添加して凍結乾燥製剤化を検討した。常法に従って、-30度の冷蔵庫で事前に凍結し、凍結乾燥装置でバブルの凍結乾燥製剤化を行った。凍結乾燥直後の製剤について、特性を評価したところ、凍結乾燥前の特性を示し、バブル数も元の数だけほぼあった。ところが、約1ヶ月の室温保存中に、凍結乾燥製剤のケーキの縮みや割れる状態が出現した。このものを復水すると、バブルの数の減少が起きており、超音波造影能も低下していた。この解決に取り組み、約半年以上の時間を費やしたが、凍結乾燥機の冷却装置で凍結することと、減圧と冷却速度などの微妙なコントロールが重要であることが判った。結果として、ケーキの縮みや割れを生じない凍結乾燥条件を見出すことができ、再現性のあるバブルの凍結乾燥製剤を得ることができるようになった。外殻素材の無菌化と乳化操作を無菌的に行う必要があるが、オートクレーブ可能な装置を用いることで、解決できた。スケールアップの問題があるが、最終製剤処方、無菌的な製造法、室温保存できる凍結乾燥製剤化を完成した。特に、凍結乾燥操作で減圧と冷却温度の制御が重要である点を知れたことが大きな成果である。セラノスティクスバブル製剤の機能評価:凍結乾燥製剤を復水し、In vitroキャビテーション、生体内安定性と滞留性、造影性能について検討した。外殻素材の検討の結果、パーフルオロプロパンガスの保持性が良い、つまりマウス体内でも、30分程度まで血流観測できる生体内安定性と滞留性をもつ組成比を見出すことができた。最終剤形は、室温で保存できる造影ガス充填凍結乾燥製剤でバイアル瓶で供給することが目標なので、室温保存化での機能変化について慎重に検討した。この問題の解決に取り組み、半年以上の時間を費やすことになった。解決作は、凍結乾燥機の冷却装置で凍結することと、減圧と冷却速度などの微妙なコントロールが重要であることが判った。凍結乾燥を専門とする業者に相談し、実用に耐える新しいプロトコールを完成することができた。(1)セラノスティクスバブル製剤の開発:前年度から検討していたDSPC:DSPE-