hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
TOF-NIRSによる生物素材の新しい非破壊計測手法の確立

超高速パルスレーザ光を照射し、得られる波形形状の変化に測定する測定法-時間飛行近赤外分光法(Time-of-flight Near Infrared Spectroscopy : TOF-NIRS)-に着目し研究を行っている。この方法は、波形変化や強度変化など従来法よりも多くの情報が得られ、また、測定時間も極短(ナノ秒オーダー)であるため既存の測定方法より優れている。この装置を用いて、生物素材である果実と木材を測定対象に基礎的検討を行った。(I)果実(グレープフルーツ)を対象グレープフルーツ等の大径厚皮果実を対象にした非破壊計測実験を行い、糖度・酸度等を高精度に検出できることを明らかにした。この結果を分光学的観点から解明するために、糖度・酸度をいろいろ変更したモデル果汁溶液を作成して同様の計測をした。パルス波形の主成分分析から、糖成分・酸成分の変動、すなわち、光の屈折率によってもたらされる微妙な波形変動が含まれており、このことが濃度推定の鍵となることが明らかにされた。(II)木材を対象木材の内部情報取得のために、本法から得られるパルス波形と材の厚さとの関係に着目し光学特性(光の吸収・散乱状況)を検討した。波形形状の主成分分析により、波形形状と光の吸収・散乱状況との間に有意な関係があることが示唆された。さらに、既知の吸収係数・散乱係数を光拡散方程式に代入して得られたパルス波形(理論値)と、本計測で得られた波形(実測値)を比較した。試料厚さが14.5mm程度の場合は理論値と実測値が一致し、木材を光学的に均質な素材とみなして差し支えないことが明らかになった。さらに、新たにピコ秒オーダーの超高速近赤外パルスレーザおよびストリークカメラから構成される光学システムを導入した。木材の準微視的領域の非破壊材質評価ができる新たなツールとしての有用性を確認するため予備的検討を行った。時間飛行近赤外分光法(以下、TOF-NIRS;超高速パルスレーザ光を試料に照射し、パルス波形の時間変化から内部情報を検出する測定法)を新しい非破壊計測手法として導入・確立するための実験を行っている。今年度は、果実(グレープフルーツ)および木材を対象として以下の実験を行った。(1)果実を対象とした実験果実の糖度および酸度の予測可能性について検討を行った。果実の赤道部にパルス光(波長:750860nm)を照射し、裏面で透過光を検出した。参照光と透過光との相互相関関数を算出し、これを説明変数、糖度・酸度の実測値を目的変数としてPLS回帰分析を行った。波長780nmのパルス光を用いた場合、糖度を精度良く推定できた。酸度の場合は、波長860nmの時に良好な結果が得られた。現在、糖度・酸度予測メカニズムを論理的に解明するために、糖度・酸度の濃度が異なる果汁モデル溶液を作成し透過光の測定を行っている。(II)木材を対象とした実験本法では高出力が得られるため木材内部の情報が検出できると期待される。そこで、透過光を主成分分析することにより、木材内部における光の状況を推定し、試料内部センシングの可能性と問題点を明らかにすることを試みた。カラマツ材の試験片を準備し、柾目面にパルス光を照射してその裏面で透過光を検出した。その後、試料厚さを変更して同様の測定を行った。透過光は、試料厚さが増加するに従って明確な変化が現れた。また、主成分分析の結果から、試料厚さが11.5mmまでは、直進光が支配的であり、それ以上の厚さでは、散乱光が支配的になると推定された。さらに、木材工業で必要な強度ならびに含水率などをオンラインで高精度に予測できる実機を開発し、特許を出願した。このオンライン測定装置は、企業との連帯により実用レベルへの進展があった。

試料厚さが14.5mm程度の場合は理論値と実測値が一致し、木材を光学的に均質な素材とみなして差し支えないことが明らかになった。さらに、新たにピコ秒オーダーの超高速近赤外パルスレーザおよびストリークカメラから構成される光学システムを導入した。木材の準微視的領域の非破壊材質評価ができる新たなツールとしての有用性を確認するため予備的検討を行った。
多彩表現型血栓症を示すVWF特異的切断酵素の活性低下の病態解析

血液難病である血栓性血小板減少性紫斑病(TTP)と溶血性尿毒症症候群(HUS)は、(1)細血管障害性溶血性貧血、(2)破壊性血小板減少、(3)血栓による臓器障害の3徴候を共通して持ち、共に血栓性微小血管障害症(TMA)という病態カテゴリーに分類されている。TMAを構成する基礎病態は様々であるが、これらの鑑別診断にvon Willebrand因子切断酵素(別名ADAMTS13)活性の測定は必須である。本研究では、このADAMTS13が関与する病態について以下の11項目を明らかにした。(1)後天性TTP患者に発生するADAMTS13インヒビター(自己抗体)のエピトープはCys-rich/Spacerドメインにある。(2)ADAMTS13にて切断されるVWFの基質最小単位をA2ドメインの73アミノ酸残基(D1596-R1668)に限定した。(3)本邦のTMA解析センターとして643例の同患者検体のADAMTS13解析を行った。(4)本邦のUpshaw-Schulman症候群の患者家系7家系についてADAMTS13遺伝子解析を行い、全例でその異常部位を同定した。(5)血管内リンパ腫にはしばしば血小板減少が合併するが、この機序にADAMTS13インヒビター発生によるTTP病態がある事を明らかにした。(6)胎盤から精製後、cDNAクローニングにてその構造を明らかにしたecto-NTPDase/CD39 isoformは、アデノウイルスベクターを用いてラット平滑筋内に遺伝子導入すると壁血栓形成が阻害される。(7)HCV肝硬変にADAMTS13活性著減と同インヒビター陽性の定型的TTPが合併する事を明らかにした。(8)ADAMTS13の肝臓での産生細胞が星細胞(旧伊東細胞)である事を発見した。(9)難治・再発性TTPの治療に抗CD20キメラ抗体であるリツキサンが奏功する事を症例報告で示した。(10)アルコール肝炎の患者では血中のADAMTS13活性が著減し、UL-VWFM依存性の血小板血栓が出来易い状態となっており、これが多臓器不全の引き金となっている可能性を示した。(11)生体肝移植後間もなく血小板減少を来す症例が多い。この時、血中ADAMTS13活性は著減しUL-VWFMが出現しているため、血小板輸血はむしろ禁忌で、血漿輸注による同酵素補充療法が卓効する事を証明し、「肝移植時の輸血療法」について革新的なEBMを構築した。

血栓性血小板減少性紫斑病(TTP)は発熱、血小板減少、溶血性貧血、腎機能障害、そして動揺性精神神経症状(Moschowitzの5徴候)を、また溶血性尿毒症症候群(HUS)は、血小板減少、溶血性貧血、そして腎機能障害(Gasserの3徴候)を主徴とする全身性重篤疾患である。近年、血漿von Willebrand因子切断酵素(VWF-CP)、別名ADAMTS13、活性とこのインヒビターの測定法が確立され、TTPとHUSはこれらのマーカーにて大まかに鑑別診断が可能となり、またいずれの疾患群も先天性のものと後天性のものがある事が明らかになった。これらアッセイの基本はVWFマルチマー解析であるが、高度の技術的熟練度が必要で、私のラボはこれが可能な本邦の代表的医療機関として過去7年間に350例を超えるTTP/HUS患者血漿の解析を全国の約150施設より依頼された(現在も継続中)。この内、290例についての解析結果をまず報告し、その内訳は先天性TTP/HUSが33例、後天性TTP213例、後天性HUS44例であった(Seminar in Hematol 41:68-74,2004)。先天性TTP/HUSのうち21例はADAMTS13活性著減(<3%)を示し、最終的にUpshaw-Schulman症候群と確定診断され、うち7家系について同遺伝子解析を行い報告した(Blood 103:1305-1310,2004)。一方、IgG型の自己抗体であるADAMTS13インヒビターを有する後天性TTP4例の抗体エピトープ解析を行い、これらは全てADAMTS13のCys-rich/Spacerドメインにある事を証明した(Blood 102:3232-3237,2004)。さらにrecombinant ADAMTS13を用いてエビトープの異なる2種類のマウスモノクロナール抗体(A10とC7)を作成し、その性状と診断への利用について検討している(現在論文作成中)。血栓性血小板減少性紫斑病(TTP)は所謂Moschowitzの5徴候を主徴とする全身性重篤性疾患である。近年、血漿von Willebrand因子切断酵素(VWF-CP、別名ADAMTS13)活性とこのインヒビターの測定法が確立され、同活性著減によりTTPの確定診断が可能となり、またTTPには先天性と後天性のものがある事が明らかになった。このアッセイの基本はVWFマルチマー解析であるが、私のラボはこれが実施可能な本邦の代表的施設として過去7年間に500例を超えるTTP並びに類縁疾患患者の血漿解析を全国の医療施設より依頼された。この内、倫理委員会承認のもと8家系9症例の先天性TTP(Upshaw-Schulman症候群)についてADAMTS13遺伝子解析を行った(Blood,2004a, Blood,2004b)。一方、遺伝子発現ADAMTS13を用いて2種類のマウスモノクロナール抗体(A10とC7)を作成し、この酵素が肝臓の伊東細胞で産生されている事を証明した(論文投稿中)。さらに、先天性並びに後天性TTP患者血漿中の同抗原をwestern blotで解析し、前者では著減、後者では著減正常と多型を示す事を示した(論文作成中)。また、多彩表現型を示す後天性TTP中で、血管内リンパ腫とC型肝硬変に合併する例では上記5徴候は揃っていないが、共にADAMTS13インヒビター陽性の定型的TTPである事を証明した(Neurology, 2004, J Hepatology, 2005)。
生殖系列発生過程における高次遺伝子発現制御の包括的解析

哺乳類の初期胚には,将来成体のすべての細胞に分化する能力を持つ多分化能細胞が存在し、ここからES細胞のような胚性幹細胞を樹立することが出来る。これらの胚性多能性細胞と始原生殖細胞(PGC)は発生学的にみて、類似した性質を持つことが示唆されており、両者の類似性、相違点を明確にすることはこれらの細胞で生じるゲノム再プログラム化や生殖細胞分化過程の解明に重要と考えられる。我々は各発生段階の胚体から純化したPGC、および代表的な幹細胞であるES細胞、PGCから派生したEG細胞、精原細胞由来のGS細胞などの幹細胞、およびES細胞から試験管内で分化したPGC様細胞(in vitro PGC; iPGC)のトランスクリプトームの比較解析を行った。その結果、ES細胞とPGCは有意に異なる発現プロファイルを持つことが分かった。各細胞タイプの発現プロファイルの主成分分析を行ったところ、これらはES細胞に類似したグループとPGCに類似した集団の2つのグループに大別できることが明らかとなった。GS細胞はPGCと非常によく似たプロファイルを有しており、iPGCもPGCのグループに分類された。調べた6つのEG細胞株のうち、5つはES細胞と同様のプロファイルを示したが、興味深いことに雌由来EG細胞株、TMA58GのみがPGCグループに分類され、この細胞株の遺伝子発現、その制御に関与するエピジェネティック状態がPGCに類似していることが示唆された。また、主成分分析の結果を元にして、ES細胞、PGCを特徴づける遺伝子群(signature gene)を同定することに成功した。これらのsignature geneの解析により、EG細胞やiPGCとES細胞、あるいはPGCの共通点、相違点を明らかにすることに成功した。始原生殖細胞発生全過程、全能性胚細胞における遺伝子発現研究のため、これらの細胞特異的にレポーターを発現するマウスを用いて、始原生殖細胞発生のほぼすべての段階からPGCを単離し、それを材料に16種類のcDNAライブラリーを作製した.これまで、6種の発生段階のライブラリーから計8万クローンを単離し、18000余のEST配列を取得し,その分類を行った.PGC cDNAライブラリー中には新規遺伝子、PGC特異的発現を示す遺伝子が多数含まれることが明らかとなったが,既知遺伝子ではあるが,これまでPGCにおける発現が知られていない遺伝子も多数存在した.例えばその中の一つ,ERR-β(Estrogen related receptor-beta)はこれまで,胚体外外胚葉の一部の細胞で特異的に発現するが,他の細胞,組織では発現していないと考えられていた.しかし,ERR-βはPGCライブラリーにて複数回,ESTが発見され,その後の発現解析の結果,生殖隆起に到達後の始原生殖細胞において特異的に発現していることが確認された.ノックアウトマウスを用いた解析から,ERR-βはPGCの増殖に関与する,との示唆を得た.このように,PGC cDNAライブラリーとそこから得られる遺伝子情報は始原生殖細胞解析のための恒久的研究資源として非常に有用なものと考えられる.現在、これらのEST配列を元にPGCに発現する遺伝子プローブを搭載したcDNAマイクロアレイを作製し,網羅的な遺伝子発現解析を行っている.これまで,ES細胞と始原生殖細胞では共通した遺伝子が発現していると考えられていたが,発現レベルを考慮すると,やはりPGCはES細胞とは異なる発現プロファイルを持つことがわかってきた.始原生殖細胞(PGC)は,生殖系列の最初の細胞として原腸胚の尿膜基部に現れるが,周囲の体細胞とは大きく異なり,むしろ初期胚の細胞によく似た形質を持っている.例えば,PGCからはEG細胞と呼ばれるES細胞と非常によく似た多能性幹細胞が樹立できる.また,PGCでは発生過程で蓄積されたゲノム修飾がリセットされることが知られている.したがって,PGCは胚性幹細胞の起源や特性,ゲノム再プログラム化現象を解析するための好個の材料ということが出来る.しかし,そのような重要性にも関わらず,その分子レベルの実体は未知な点が多い.そこで我々はPGCを純化する方法を確立し,そこに発現する遺伝子の包括的な発現解析を行ってきた.これまで,PGC特異的cDNAライブラリーから18,293のESTを取得し6,159の転写産物,4,833の遺伝子に分類した.ESTの出現頻度から抽出された各種幹細胞の`signature genes'とPGC発現遺伝子の比較を行ったところ,PGCは未分化ES細胞よりも,むしろblastocystやTS細胞に類似しているとの結果を得た.次に,マイクロアレイ解析により,ES細胞,EG細胞,in vitroで形成されたMvh陽性のPGC様細胞の遺伝子発現プロファイルを得て,PGCの発現プロファイルとの比較を行った.EG細胞はPGCに由来する細胞であるが,ES細胞と非常によく似た発現プロファイルを持っていた.対して,PGCはES細胞とは大きく異なるプロファイルを持ち,例えば,ES細胞と13.5日胚より得られたPGCでは,調べた2万余の遺伝子のうち,約17%が有意に変動しており,始原生殖細胞形成過程ではダイナミックな遺伝子発現プログラムの変化が起きていることが示唆された.未分化胚性細胞から生殖細胞へいたる細胞群は全能性、ゲノムの再プログラム化能を有する唯一の細胞系譜である。この細胞系譜の遺伝子発現、その発現制御機構の特質解明を目的に、各発生ステージにおける遺伝子発現プロファイルをESTやマイクロアレイにより詳細に解析してきた。

移動期の始原生殖細胞(primordial germ cell : PGC)から出生直前胎児のPGCに至るステージから12種のライブラリーを作製し、45,173のESTを取得し、データベース化した.これらのESTに加え、全蛋白質コード遺伝子に対応する計44,000プローブを搭載したマイクロアレイを作製し、11ステージにおける発現プロファイルを取得した.PGCと類似した生物学的形質を持つと考えられるES細胞、EG細胞、GS細胞、およびES細胞から派生したin vitro PGCなどの幹細胞から発現プロファイルを得て、各プロファイル間の相関を調べた.PGC同士の相関は非常に高く、また後期のPGCはGS細胞と高い相関を示した。しかし、ES細胞とPGCは有意に異なり、ESで発現する多くの遺伝子がPGCでは抑制されていた。In vitro PGCはESよりもPGCに近いパターンを示しており、PGCへの分化がアレイ解析によっても確認された.プロファイルの比較に伴い、各種幹細胞、PGCに共通する遺伝子群、およびESやPGCを特徴づける遺伝子クラスタの同定に成功した。また、雌雄のPGCの比較から、性特異的に発現する遺伝子群の同定にも成功した。これらの知見は始原生殖細胞発生の基礎過程を研究するにおいて非常に有用な情報であり、また、より高効率のin vitro生殖細胞分化技術の開発にも利用可能と考えられる。哺乳類の初期胚には,将来成体のすべての細胞に分化する能力を持つ多分化能細胞が存在する。これらの胚性多能性細胞と始原生殖細胞(PGC)は発生学的にみて、類似した性質を持つことが示唆されており、両者の類似性、相違点を明確にすることはこれらの細胞で生じるゲノム再プログラム化や生殖細胞分化過程の解明に重要と考えられる。我々は各発生段階のPGCを胚体から純化し、そのトランスクリプトーム解析を行った。また、immunosurgeryによって内部細胞塊(ICM)、およびエピブラストを単離し、その発現プロファイルを得て、PGCとの比較を行った。その結果、内部細胞塊からエピブラストに発生していく過程で大規模な遺伝子発現プロファイルの転換が見られること、多能性幹細胞であるES細胞やEG細胞は内部細胞塊よりもエピブラストに発現プロファイルが類似していること、原腸胚に出現した初期始原生殖細胞はエピブラストから派生すると考えられているが、その発現プロファイルはむしろエピブラストよりも内部細胞塊と共通性が高いことが明らかとなった。それと同時にそれぞれの細胞タイプ、あるいはPGC発生段階に特異的発現を示す遺伝子群を同定することができた。上述した各種細胞間の差次的遺伝子発現の基盤となるエピジェネティック状態の解析を行ったところ、ICMとPGCは共通してDNAメチル化レベルが低く、特にPGCでは、ヘテロクロマチン上のメチル化がほぼ消去されていた。対して、エピブラストではDNAメチル化レベルは概して高いが、興味深いことに、エピブラストの中には比較的低DNAメチル化状態を示す細胞集団が存在しており、この集団からPGCが派生してくることが示唆された。哺乳類の初期胚には,将来成体のすべての細胞に分化する能力を持つ多分化能細胞が存在し、ここからES細胞のような胚性幹細胞を樹立することが出来る。
書簡に見るエリザベス一世の言語的特徴と国民言語としての英語観

研究代表者は、エリザベスが幼少期から即位直前までの約10年間に認めた直筆書簡10点について調査を行った。まず、"Elizabeth I: Collected Works" (2000)を参照しながら日本語訳を試みた。そして、9月に渡英し、The British LibraryやOxford University、The National Archivesにおいて書簡の閲覧および画像データの取得を行った。10代前半の書体は当時の家庭教師たちの筆跡(例えばBelmain hand)を忠実に真似しており、文体は簡潔で丁寧な傾向にあった。その後、エリザベスは2つの事件に巻き込まれ、書簡を護身の武器として認めていく。詳細な状況説明、明快な論理構成を取りながら淡々と、また関係詞やカンマを駆使しながら冗長に身の潔白を述べていく。別の事件でも、身の潔白を訴えるとはいえ感情に訴えるようなことはなく、客観的事実を述べた上で女王メアリー一世に面会の機会を願い出ている。興味深いことに、本文と署名の間には11本の斜線が引かれており、他人によって加筆されることを防ぐ意図があったと推測される。また、文字列に傾きが見られる。10代半ば以降のエリザベスの書体・筆致の特徴は均整のとれたイタリック体と言えるためこれは注目に値する。そして、加筆や修正も他の書簡と比べると多い。命の危機に瀕した感情の揺れが文字に現れていると考えられる。概して、自筆書簡を分析することで得られる情報が多く有益な調査となった。エリザベスの言語の形成及び特徴の解明には、彼女の読書歴の考慮が重要であるため、研究分担者は幼少期から即位までの間に読んだと思われる書物一覧(とりわけ宗教書関連)の作成を試み、言語分析のための基盤を整えた。また、宗教改革前夜の修道院閉鎖をめぐる社会的状況について調査・発表を行った。研究代表者は当初の計画通り、エリザベスが幼少期から即位するまでの約10年間に認められた書簡について考察を一通り終えることができた。しかし、研究報告までには至らなかったため、今後の課題とする。研究分担者は研究計画に基づき、幼少期から即位までの間のエリザベスの読書歴(特に宗教書関係)を明らかにすることを企図してリストを作成した。併せて、彼女の言語形成期となる宗教改革前夜の修道院閉鎖をめぐる社会的状況について調査・発表を行っている。これらのことから、おおむね順調に進展していると判断した。2019年度は、研究代表者はエリザベスが即位してから晩年までの約45年間に認められた書簡を分析する。例えば、スコットランド女王メアリー一世や息子ジェームズ六世への書簡を扱う。2018年度と同様に、9月に渡英し、The British LibraryやThe NationalArchivesにおいて、直筆書簡の現物を閲覧したり電子データの取得を行う予定である。また、学会や雑誌論文にて研究報告を計画的に行いたいと考えている。そして、研究分担者はエリザベスの読書歴の再現を行うとともに、特定の宗教書散文と彼女の言語との関連性について考察を加える。

2018年度と同様に、9月に渡英し、The British LibraryやThe NationalArchivesにおいて、直筆書簡の現物を閲覧したり電子データの取得を行う予定である。また、学会や雑誌論文にて研究報告を計画的に行いたいと考えている。そして、研究分担者はエリザベスの読書歴の再現を行うとともに、特定の宗教書散文と彼女の言語との関連性について考察を加える。2018年度の旅費が当初の概算よりも少なくなったため、繰越金は2019年度の旅費に充てる。
魚類レプチンが持つ有用機能を解明する

効率的に魚類養殖を推進するには,魚類の摂食・栄養素利用の調節機構に着目した技術開発が有効と考えられる。そこで本課題では,効率的な養殖技術開発へ向けた基盤研究として,摂食や代謝に重要な役割を持つ魚類レプチンの機能を調べることを目的としている。これまでに2種のレプチンリガンド欠損(AおよびB)にレプチン受容体欠損(R)を加えた3重欠損魚(メダカ)を作出してきた。今年度は,これまでに作出したレプチン関連遺伝子欠損魚(A欠損・B欠損・R欠損・AB欠損・ABR欠損)を用いて成長,摂食量,酸素消費量(代謝量の指標)の比較を行った。しかし,これら遺伝子欠損魚は,野生型に対してまたは各欠損体間においていずれの指標も差を確認することができなかった。これまでの研究によって,レプチン受容体欠損メダカは摂餌量が増大し,成長も早くなることが知られている。一方,本研究ではリガンドのみならず既報と同じ受容体遺伝子の欠損魚においても野生型との間に明瞭な差が確認されなかった。近年,他魚種(ゼブラフィッシュ)においても,別々の研究グループからレプチン受容体欠損魚の摂食量・成長の表現型について異なる結果(摂餌量・成長増加の有無)が報告されている。本研究で作出した欠損魚を含めて,これまでに報告されているものはいずれも完全な機能欠損が予測される変異を有するものではあるが,微妙な変異の違いによってその表現型も異なってくるのかもしれない。本研究は,ゲノム編集技術を用いてレプチンの欠損モデル魚(メダカ)を作出し,その表現系を解析することで魚類レプチンの有用機能を解明しようとするものである。今年度は,これまでに明らかにしてきたメダカレプチン2種( aとb )の遺伝子構造を基にTALENコンストラクトを作成し,そのRNAを顕微注入することでそれぞれの遺伝子に変異を導入した。続いてHRMなどの手法を用いて有用変異個体を選別し,交配することで目的遺伝子の欠損魚を作出することに成功した。また,同時にCRISPRを用いたレプチン受容体欠損モデルの作出も行った。当初の予定通り,2種レプチンの欠損個体を作出することに成功している。加えて,レプチン受容体の欠損個体も作出しており,計画は順調に進展している。本研究は,ゲノム編集技術を用いてレプチン(リガンド2種: aとb)の欠損魚(メダカ)を作出し,その表現型を解析することで魚類レプチンの有用機能を解明しようとするものである。これまでの取組によりレプチンa,レプチンbおよびレプチンab二重の欠損メダカの作出に成功した。また,より詳細な検討を行うため,当初予定には無かったレプチン受容体の欠損体作出も行った。これら現在までに作出したレプチン関連遺伝子欠損魚を用いて予備的に摂食に関する表現型解析を行ったところ,野生型に比べていずれの欠損体も摂餌量の増大が確認され,特にレプチンabの二重欠損体では摂食量の増加が他よりも突出していた。当初予定通りに2種類のレプチンリガンドの欠損体を作出し,予備的な検討として摂食に関する表現型を解析した。また,予定には無かった受容体の欠損魚も加えて作出することで今後のより詳細な検討を行うことが可能となった。これらのことから,順調に進展していると判断した。レプチンは食欲調節と栄養素の利用効率に重要な役割を果たす内分泌因子として知られている。しかし,魚類ではレプチンがどのようなメカニズムで栄養代謝を調節するのかは不明であり,応用研究を展開するには多くの基礎情報が不足している。そこで本課題は,効率的な養殖技術開発へ向けた基盤研究として,魚類レプチンが持つ摂食・代謝機能の解析を目的としている。平成27年度は,計画通りTALENを用いることでメダカレプチン2種(aとb)の遺伝子欠損体を作出した。また加えてCRISPRを用いたレプチン受容体欠損体も作出している。平成28年度は,それら欠損体を掛け合わせることでリガンド2種(レプチンaとb)の二重欠損体を作出した。受容体欠損体と合わせて摂食に関する予備的な表現型解析を実施したところ,野生型に比べていずれの欠損体も摂餌量の増大が確認され,特にレプチンab二重欠損体では摂餌量の増加がレプチン単独欠損(aもしくはbのみ)および受容体単独欠損よりも突出していた。本結果は,レプチンが既知の受容体以外の作用経路を持つ可能性を示唆している。このことから,平成29年度はより詳細な解析を可能にするため,リガンド2種の二重欠損体に受容体欠損体を掛け合わせることでリガンド・受容体の三重欠損体を作出したところである。また,これまでに使用していたHRM(High Resolution Melting)法を改良することで,これら遺伝子が欠損したヘテロおよびホモ個体のより簡便なスクリーニングを可能にした。これまでの解析からレプチンが既知の受容体以外の作用経路を有する可能性が示唆された。リガンド2種にその受容体を加えた三重欠損体を作出し,より詳細な解析が可能になったところであり,研究は順調に進展している。

そこで本課題では,効率的な養殖技術開発へ向けた基盤研究として,摂食や代謝に重要な役割を持つ魚類レプチンの機能を調べることを目的としている。これまでに2種のレプチンリガンド欠損(AおよびB)にレプチン受容体欠損(R)を加えた3重欠損魚(メダカ)を作出してきた。今年度は,これまでに作出したレプチン関連遺伝子欠損魚(A欠損・B欠損・R欠損・AB欠損・ABR欠損)を用いて成長,摂食量,酸素消費量(代謝量の指標)の比較を行った。しかし,これら遺伝子欠損魚は,野生型に対してまたは各欠損体間においていずれの指標も差を確認することができなかった。これまでの研究によって,レプチン受容体欠損メダカは摂餌量が増大し,成長も早くなることが知られている。一方,本研究ではリガンドのみならず既報と同じ受容体遺伝子の欠損魚においても野生型との間に明瞭な差が確認されなかった。近年,他魚種(ゼブラフィッシュ)においても,別々の研究グループからレプチン受容体欠損魚の摂食量・成長の表現型について異なる結果(摂餌量・成長増加の有無)が報告されている。本研究で作出した欠損魚を含めて,これまでに報告されているものはいずれも完全な機能欠損が予測される変異を有するものではあるが,微妙な変異の違いによってその表現型も異なってくるのかもしれない。2種レプチン(aとb)およびレプチン受容体の欠損個体を作出しており,現在はそれらを掛け合わせることで遺伝子の2重・3重欠損個体を作出しているところである。今後,すべての遺伝子欠損個体が得られ次第,それらの表現系を解析してゆく予定としている。今後より詳細な検討を行うため,これまでに作出済みのレプチンリガンドab二重欠損体へ受容体欠損体を掛け合わせることで三重欠損体を作出し,作出した全ての欠損体についてその表現型を改めて解析してゆく。当初計画では,レプチンのリガンド2種(aおよびb)のみが欠損したメダカを作出し,その表現型解析を行う予定であったが,これらに加えて受容体の欠損体も作出した。また,それら遺伝子欠損体を用いた予備的な解析からレプチンが既知の受容体以外の作用経路を有する可能性が示唆された。このことから,より精緻に研究目的を達成するため,現在はリガンド2種に受容体を加えた三重欠損体を作出したところである。平成30年度は,本課題の最終年度としてこれまでに作出してきた遺伝子欠損体における摂食および代謝に関する表現型を解析する。本研究では,レプチンリガンド2種(aとb)についての欠損魚を作出してその表現型を解析する計画としていた。それらリガンド欠損体の作出後に,当初予定には無かった受容体についての欠損体の作出にも成功し,今後より詳細な検討が可能となった。そこで今後は,3種の標的遺伝子すべてについて単独から三重までの欠損体が揃った時点で詳細な表現型解析を同時に行うこととした。現在すでに作出済みのレプチンリガンドab(単独および二重)および受容体(単独)の欠損体については,ごく予備的な表現型解析のみを行うことで今年度の使用金額を最低限にセーブし,次年度以降にその使用を繰り越すこととした。当初予定では,H29年度はこれまでに作出済みの遺伝子欠損体(レプチンa,bおよびそれらの二重欠損)の表現型解析を行う予定であったが,より精緻な結果を得るためにさらにレプチン受容体を加えた三重欠損体をしたことから,次年度使用額が生じた(より精緻な結果を得るための研究計画の変更)。生じた次年研究予算は,これまでに作出した全ての遺伝子欠損体の表現型解析に使用する。
磁気刺激を利用した拘縮の新たな治療法の確立のための実験的研究

本研究では,不動によって惹起される拘縮の新たな治療方法の確立を目的に,磁気刺激や電気刺激により誘発する筋収縮運動が拘縮の発生・進行ならびにその病態の一つである線維化の発生・進行におよぼす影響についてラット足関節拘縮モデルを用いて検討した.その結果,不動状態に曝したラットヒラメ筋に磁気刺激や電気刺激により周期的な単収縮を負荷すると,線維化の発生が軽減されて拘縮の進行が抑制されるが,強縮を負荷しても線維化は軽減されず,収縮様式の違いにより拘縮の進行抑制効果が異なることが示唆され,骨格筋への周期的な単収縮の負荷は拘縮の新たな治療方法の一つになり得る可能性が示唆された.本年度は、不動により惹起される拘縮の発生・進行に持続的磁気刺激による筋収縮運動がおよぼす影響について検討する予定であったが、これまでの実験に用いていた磁気刺激装置の使用が困難になったため、電気刺激による周期的な筋収縮運動が拘縮の発生およぼす影響ついて検討した。具体的には、8週齢のWistar系雄性ラット21匹を無処置の対照群(n=7)とギプス包帯を用いて両側足関節を最大底屈位で4週間不動化する実験群(n=14)に振り分け、さらに、実験群は不動のみを行う不動群(n=7)と不動状態のまま電気刺激を用いて両側ヒラメ筋に筋収縮運動を負荷する刺激群(n=7)に振り分けた。なお、刺激群のラットに対してはリード線付きの表面電極を下腿後面に貼付した状態でギプス包帯による不動化を行い、電気刺激の際はこのリード線に電気刺激装置を接続した。そして、周波数1Hz、刺激強度4mAの条件にて、1日1回60分、週5回の頻度で電気刺激による周期的な筋収縮を負荷した。その結果、実験期間終了後の刺激群と不動群の足関節背屈可動域は対照群のそれより有意に低値であったが、刺激群は不動群と比べて有意に高値を示した。また、タイプ1コラーゲンと筋線維芽細胞のマーカーであるα-SMAのmRNA発現量は刺激群と不動群は対照群より有意に高値であったが、刺激群は不動群より有意に低値であった。また、TGF-βとHIF-1αのmRNA発現量は不動群のみ対照群と刺激群に比べて有意に高値で、この2群間には有意差は認められなかった。つまり、これらの結果から、低酸素状態の惹起が拘縮の進行のキーファクターの一つになっている可能性があり、また、周期的な筋収縮運動は低酸素状態の軽減に効果があり、不動の過程においてこれを負荷することで骨格筋の線維化ならびに拘縮の発生が軽減することが明らかとなり、新たな拘縮に対する治療戦略の可能性が示唆された。本研究では,不動によって惹起される拘縮の新たな治療方法の確立を目的に,磁気刺激や電気刺激により誘発する筋収縮運動が拘縮の発生・進行ならびにその病態の一つである線維化の発生・進行におよぼす影響についてラット足関節拘縮モデルを用いて検討した.その結果,不動状態に曝したラットヒラメ筋に磁気刺激や電気刺激により周期的な単収縮を負荷すると,線維化の発生が軽減されて拘縮の進行が抑制されるが,強縮を負荷しても線維化は軽減されず,収縮様式の違いにより拘縮の進行抑制効果が異なることが示唆され,骨格筋への周期的な単収縮の負荷は拘縮の新たな治療方法の一つになり得る可能性が示唆された.本年度は間欠的磁気刺激が拘縮の発生・進行におよぼす影響について検証した。8週齢のWistar系雄性ラットを無処置の対照群と実験群に振り分け、実験群はラット両側足関節を最大底屈位でギプス包帯にて4週間不動化する不動群とその過程においてギプス固定下で間欠的磁気刺激を負荷する刺激群に振り分けた。間欠的磁気刺激は、刺激頻度0.1Hz、出力70%、1日1回30分(週6回)の条件でL3L5を経皮的に刺激し,両側ヒラメ筋の周期的な筋収縮を誘発した。実験期間終了後は、全てのラットの足関節背屈可動域(ROM)を測定し、両側ヒラメ筋を摘出した。そして、組織学的検索および分子生物学的検索に供して、骨格筋における線維化の発生状況と線維化関連分子について検索を行った。結果、ROMは不動群、刺激群ともに対照群に比べ有意に低値であったが、刺激群は不動群より有意に高値を示した。また、各群のピクロシリウスレッド染色像を検鏡すると、不動群と刺激群は対照群に比べ筋周膜や筋内膜に肥厚が認められ、その程度は刺激群が不動群より軽度であった。次に、RT-PCR法によるmRNA発現量の結果をみると、タイプIコラーゲンは、不動群、刺激群ともに対照群に比べ有意に高値であったが、刺激群は不動群より有意に低値を示した。また、タイプIIIコラーゲンは,不動群が対照群,刺激群より有意に高値であり、対照群と刺激群の間には有意差は認められなかった。今回の結果から、不動の過程で骨格筋に周期的な単収縮を誘発し張力を負荷した刺激群では、組織の線維化ならびに拘縮の発生が軽減されることが明らかとなった。本年度は磁気刺激により不動状態に曝されたラットヒラメ筋に強縮を誘発し,骨格筋の線維化ならびに筋性拘縮におよぼす影響について検討する予定であったが,磁気刺激装置に不具合が生じたために,筋収縮運動を誘発するツールを電気刺激装置に変更して実験を実施した.

具体的には,8週齢のWistar系雄性ラットを用い,1)無処置の対照群(n=10),2)ギプス包帯を用いて両側足関節を最大底屈位で4週間不動化する不動群(n=8),3)不動状態のまま周波数10Hzの電気刺激により単収縮を負荷する単収縮群(n=8),4)同様に周波数50Hzの電気刺激により強縮を負荷する強縮群(n=9)に振り分けた.そして,刺激強度4mA,1日1回30分,週6回の頻度で電気刺激を行った.実験期間終了後は足関節背屈可動域(ROM)を計測し、ヒラメ筋における線維化関連分子(HIF-1α,TGF-β1,α-SMA,タイプIコラーゲン)の動態について免疫組織蛍光染色ならびにreal time RT-PCR法にて解析した。その結果、ROMについては対照群が最も高値で,次いで,単収縮群,強縮群,不動群の順に有意に高値であった.そして,単収縮群の線維化関連分子の発現量は対照群と同程度で,不動群より有意に抑制されていた.一方,強縮群については線維化関連分子の発現量は対照群より有意に増加しており,不動群と同程度であった。今回の結果から,不動状態に曝された骨格筋に単収縮を負荷すると,骨格筋の低酸素状態の惹起やTGF-β1の発現が抑制され,線維芽細胞の筋線維芽細胞への分化やコラーゲンの産生が軽減されることが明らかとなり,これは磁気刺激により単収縮を誘発した場合と同様の結果であった.一方,骨格筋に強縮を負荷しても不動によって惹起される線維化は軽減されず,収縮様式の違いにより拘縮の進行抑制効果が異なることが示唆された.理学療法学本研究は、磁気刺激により経皮的に脊髄前角細胞を刺激することで筋収縮運動を負荷し、これが不動によって惹起される拘縮の発生・進行におよぼす影響について検討することで、得られた成果を基に新たな拘縮の予防・治療方法の確立をすることを目的としている。本年度は持続的刺激による筋収縮運動の効果について検討する予定であったが、これまでに使用してきた磁気刺激装置はヒト用の装置であり、昨年度実施した間欠的刺激は実施可能であったものの、持続的刺激は装置の仕様上困難であることが判明した。そこで、本年度は当初の予定を変更して電気刺激装置を用いて昨年同様に間欠的な筋収縮運動を負荷することで実験を行った。その結果、ほぼ昨年度と同様の結果が得られており、間欠的な筋収縮運動は拘縮の進行抑制に有効であり、これは不動によって惹起される骨格筋の低酸素状態を緩和することでその線維化を抑制することにより得られることが示唆された。今後は現在開発途中である小動物用磁気刺激装置を用いて本年度の実験結果について再検討するとともに、持続的刺激による筋収縮運動の効果についても検討する予定である。本研究では、リハビリテーション医療における拘縮の新たな予防・治療方法を確立することを目標としている。具体的には、不動によって惹起される拘縮に対する磁気刺激の効果について検討するとともに、その効果に関するメカニズムについて検討する作業を通して、不動によって惹起される拘縮に対する効果的な予防・治療方法を提示することを目的としている。まず、本年度は不動によって惹起される拘縮に対する間欠的磁気刺激の効果について検討を行い、その結果、不動の過程においてギプス固定の状態にあっても間欠的磁気刺激による筋収縮を負荷することで、不動によって惹起される骨格筋の線維化を軽減でき、その結果、拘縮の発生・進行を抑制できることを明らかにすることができた。
微小脳血管における血流維持機構と静脈麻酔薬作用の遺伝子工学的手法による研究

【目的】アセチルコリンエステラーゼ阻害薬であるドネペジル(アリセプトTM)は、脳内アセチルコリン濃度を上昇させて神経伝達を活性化し、アルツハイマー病の症状を改善すると考えられている。しかし、本薬剤が、実際に脳血管を拡張させるか否かについては明らかでない。また、脳内でアセチルコリン濃度が上昇した場合、一酸化窒素合成酵素が活性化され、産生された一酸化窒素により脳血管が拡張する可能性があるが、これについても不明である。本研究では,臨床有効血中濃度のドネペジルが、ラット脳実質内微小血管を拡張させるか否か、またこれらの血管拡張反応が一酸化窒素合成酵素活性を介するかどうかを検討した。【方法】Live computerizedvideomicroscopyシステムを用い、ラット脳スライス内の細動脈(内径5-9μm)を観察した。一酸化窒素合成酵素阻害薬L-NAME(100μM)存在下または非存在下にプロスラグランディンF2α(0.5μM)でスライス内の血管を収縮させ、アセチルコリン(1,10,100μM)およびドネペシル(1,3nM)による拡張反応を観察した。【結果】アセチルコリンおよびドネペジルは脳スライス内の細動脈を濃度依存性に拡張させた。L-NAMEは、アセチルコリンおよびドネペジルによる血管拡張反応を完全に抑制した。【結論】ドネペジルは一酸化窒素合成酵素活性を介して脳微小血管を拡張させることが明らかとなった。ドネペジルは、脳血管を拡張させるという薬理学的特性からもアルツハイマー患者の治療に貢献しているかもしれない。(目的)脳実質内細動脈の反応性変化は、脳血管抵抗を大きく左右すると考えられるが、炭酸ガスがこれらの血管径を拡張させる機序は検討されていない。本研究では、高炭酸ガスがATP感受性カリウムチャネル(KATP)を介して脳実質内細動脈を拡張させるか否かを明らかにすることを目的とした。(方法)ラットの脳を約250μmの厚さの新皮質を含むスライス標本とした。標本を観察用容器に入れ、酸素93%+炭酸ガス7%(PCO2=40mmHg)または酸素90%+炭酸ガス10%(PCO2=50mmHg)で飽和したクレブス液で持続還流した。コンピューターに接続した顕微鏡で脳実質内細動脈(内径3-10μm)を観察した。血管径の変化はコンピューター上で専用の画像解析ソフトを用いて測定した。血管をプロスタグランディンF2αで収縮させ、KATP拮抗薬グリベンクラミド、カルシウム依存性カリウムチャネル拮抗薬イベリオトキシンが、炭酸ガスによる脳血管拡張反応に及ぼす作用を検討した。さらに、KATP開口薬レブクロマカリムあるいはニトロプルシドによる血管拡張反応に及ぼすグリベンクラミドの影響を検討した。(結果)高炭酸ガスによる脳血管拡張反応はグリベンクラミドで完全に抑制されたが、イベリオトキシンでは影響されなかった。グリベンクラミドはレブクロマカリムによる血管拡張を完全に抑制したが、ニトロプルシドによる拡張は抑制しなかった。(結論)KATPはラット脳実質内細動脈での高炭酸ガスによる血管拡張反応に重要な役割を果たしていることが明らかとなった。【目的】脳では、神経細胞の活動に伴い、細胞外カリウムイオン濃度が上昇する。この増大した細胞外カリウムイオンは、内向き整流性K+チャネル(KIR)を開口させ、脳血管を拡張させる。したがって、KIRは、代謝に伴う脳血流調節機構で重要な役割を果たすと考えられている。しかし、これらチャネルを介する脳微小血管拡張反応は明らかにされていない。また、高血圧症のような病態時に、KIRを介する脳微小血管の血流調節機構が修飾されるか否かは検討されていない。本研究は、脳微小血管拡張反応におけるKIRの役割を明らかにし、正常血圧および高血圧でのこのチャネルを介する拡張反応の違いを検討することを目的とした。【方法】顕微鏡、コンピュータを含む脳実質内微小血管観察システムを用い、高血圧(SHR)、正常血圧ラット(WKY)の脳スライス中の細動脈(内径5-10μm)を観察した。プロスタグランディンF2α(0.5μM)でスライス中の血管を収縮させ、KC1(5-15mM)による拡張反応を観察した。【結果】KC1(5-10mM)はSHRおよびWKYの脳スライス中の細動脈を濃度依存性に拡張させたが、SHRの脳細動脈での拡張反応はWKYでの反応より大きかった。KIR拮抗薬塩化バリウム(BaCl2、10μM)はこれらの拡張反応を完全に抑制した。【結論】正常血圧および高血圧動物いずれでも、KIRは脳微小動脈拡張反応に重要な役割を果たすことが明らかとなった。カリウムイオン濃度増大による、このチャネルを介する拡張反応は、高血圧症で著明であったが、その病態生理上の意義は明らかでない。

本研究では,臨床有効血中濃度のドネペジルが、ラット脳実質内微小血管を拡張させるか否か、またこれらの血管拡張反応が一酸化窒素合成酵素活性を介するかどうかを検討した。【方法】Live computerizedvideomicroscopyシステムを用い、ラット脳スライス内の細動脈(内径5-9μm)を観察した。一酸化窒素合成酵素阻害薬L-NAME(100μM)存在下または非存在下にプロスラグランディンF2α(0.5μM)でスライス内の血管を収縮させ、アセチルコリン(1,10,100μM)およびドネペシル(1,3nM)による拡張反応を観察した。【結果】アセチルコリンおよびドネペジルは脳スライス内の細動脈を濃度依存性に拡張させた。L-NAMEは、アセチルコリンおよびドネペジルによる血管拡張反応を完全に抑制した。【結論】ドネペジルは一酸化窒素合成酵素活性を介して脳微小血管を拡張させることが明らかとなった。ドネペジルは、脳血管を拡張させるという薬理学的特性からもアルツハイマー患者の治療に貢献しているかもしれない。
二官能性有機触媒による軸不斉ヘテロビアリールのエナンチオ選択的合成

研究計画の通り、本年度申請者はシンコナアルカロイドから誘導した二官能性有機触媒を用いた芳香族求電子的ハロゲン化反応を利用した軸不斉キノリン誘導体の効率的な不斉合成手法を開発し、高いエナンチオ選択性で目的化合物を得ることができた(Chem. Eur. J. just accepted(DOI: 10.1002/chem.201701707)にて報告。日本化学会第97春季年会にて口頭発表)。キノリン骨格を有する化合物は配位子や生物活性物質としての利用が古くから知られているが、ヘテロ原子の配位等が問題となり、軸不斉を有する含キノリンヘテロビアリールのエナンチオ選択的な合成例はほとんど達成されておらず、本手法により、様々なキノリンビアリールを高エナンチオ選択的に合成することができた。なお、本手法はヨウ素化反応にも適用できることを見いだしており、これについて更なる検討も行った。その結果、生成物として臭素とヨウ素の二種類のハロゲン原子を選択的に導入して軸不斉キノリン誘導体を高いエナンチオ選択性で合成することができた。反応機構に関する考察も行っており、本反応においては二段階目のハロゲン原子導入反応においてエナンチオ選択性が決定されていることが示唆されている。これは申請者がこれまでに報告していたハロゲン化に基づく軸不斉化合物のエナンチオ選択的合成とは異なる傾向であり、更なる反応機構に関する詳細を今後解明していこうと計画している。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。
モノマーを認識する触媒による精密重合

「金属触媒によるリビングラジカル重合」に対し,溶媒分子が弱く配位した「カチオン性ルテニウム錯体」が触媒として機能することを見出し,モノマー認識触媒に対する足がかりを得た。また,このカチオン性錯体の触媒プロセスが,配位子の脱離を伴わない機構であることを見出し,組み合わせる配位子を多様化させ,金属まわりの環境設計が可能になった。さらにフェロセン助触媒を組み合わせた協奏触媒機構を見出し,触媒活性を著しく高めることに成功した。また,これらの知見から,超高活性水中重合触媒や,高耐性鉄触媒などを展開し重合触媒の機能化を実現した。生体内反応では、高選択的な分子認識を通じて、酵素が反応を触媒し、高度な基質選択性を発現する。特に、タンパク質のアミノ酸配列が、核酸塩基配列(コドン)によるアミノ酸モノマーの特異的認識によって制御される点は、分子認識に基づく重合制御の重要性を物語っている。一方、申請者が研究してきたリビング重合では、触媒や開始剤の設計により重合活性種の副反応を抑制し、ポリマーの分子量や末端構造の精密制御が可能となる。しかし、生体内重合に迫る高度制御(立体構造と分子量の同時制御、共重合組成の任意制御、繰り返し単位(機能基)の配列制御など)を実現するには、新たな制御原理、触媒機構が求められる。本研究では,「金属触媒によるリビングラジカル重合」に対し,モノマーを認識可能な触媒を設計することで,上述したような高度制御を目指してきた。平成23年度までに,溶媒分子が弱く配位した「カチオン性ルテニウム錯体」が触媒として機能することを見出し,モノマー認識触媒に対する足がかりを得た。平成24年度は,組み合わせる配位子の設計や,この触媒と融合させることが可能な「フェロセン助触媒を用いた協奏触媒機構」について知見を深化させ,触媒性能を高めることに成功した。さらに,カチオン性錯体にヨウ素型開始剤とフリーラジカル重合開始剤(AIBNなど)を組み合わせることで,酢酸ビニルに代表される重合制御が困難なモノマー群(低重合性モノマー)の重合活性が向上できることを明らかにしつつある。本研究では,金属触媒によるリビングラジカル重合に対し,モノマーを認識する触媒を設計することで,より高度な重合制御を目指している。平成23年度は,まず計画通りに,配位子に認識サイトを組み込む目的で,カルボン酸モノマーを認識できるグアニジンを有するホスフィン配位子を設計・合成し,ルテニウム錯体に導入して,リビングラジカル重合触媒として用いた。重合制御は可能であったものの,酸モノマーの認識による機能が見いだせなかったので,「配位子による認識」から「中心金属による直接認識(配位)」へ計画をシフトし,カチオン性錯体の設計とその重合制御を検討した。従来は中性の配位飽和錯体を用いており,配位空きサイトは存在しなかったが,カチオン性にすることで,モノマーが中心金属に弱く配位できるようになった。さらに,中性錯体を用いる場合,生長末端活性化に伴うハロゲン授受のために,配位子脱離を必要としたが,カチオン錯体ではそのプロセスが不要になり,よりスムーズな触媒が進行することを明らかにした。これにより,助触媒を必要としない高活性触媒系を見出した。さらに,カチオン性錯体にフェロセンとフェロセニウムイオンの酸化還元を共存させることで,50ppmという極少量のルテニウム量で分子量10万のポリマーを精度よく合成できる超高活性システムを開発した。これまでは触媒として中性錯体の配位飽和錯体を用いており,配位空きサイトは存在しなかったが,カチオン性にすることで,モノマーとの相互作用が可能な触媒へと展開しうる基盤触媒を見出した。しかし一方で,その触媒活性は中性錯体に比べて低い場合が多かった。今年度は,この配位性を維持したまま,触媒活性を高めることに成功しており,本研究で目的としている「低重合性モノマーの重合制御」「立体構造制御」へと展開する足掛かりを築けたという点で「おおむね順調に推移している」と評価できる。当初計画していた配位子によるモノマー認識に基づく触媒設計は困難であったが,中心金属がモノマーを直接認識できるカチオン錯体を新たに開発した意義は大きい。

触媒反応は中心金属で起こるため,金属に直接相互作用できると,配位子との組み合わせによって,選択性が発現しやすいと期待される。これにより,本研究で目的としている「低重合性モノマーの重合制御」「立体構造制御」へと展開するためのベース触媒を築けたと考えている。以上から,「おおむね順調に推移している」と評価できる。今後はカチオン性錯体の対アニオンの設計によって,モノマー配位サイトの構築を検討しながら,これまで得られた高活性化の知見を融合することで,モノマーを認識できる高活性触媒の開発を目指す。そして,アクリロニトリルなどの配位性モノマーの重合制御,酢酸ビニルやαオレフィンなどの低重合性モノマーの重合制御を検討する。さらに「立体構造制御」に向けた触媒システムの構築を目指し,モノマー認識サイト周辺へのキラル環境の導入を検討する。本年度はカチオン性錯体によるリビングラジカル重合を開発し,「モノマーが弱く配位可能」「配位子脱離が不要」というカチオン性錯体の特徴を明らかにしたので,今後は「低重合性モノマーの重合制御」,「立体構造制御」に向けた触媒システムの構築を目指す。具体的には,対アニオンの設計によるモノマー配位サイトの構築と,キラル配位子の導入である。また,本年度明らかにしたフェロセン添加についてもカチオン性錯体と組み合わせ,触媒サイクルの効率化を目指す。モノマーを認識できる高活性触媒の開発に向け,出発となるルテニウム錯体前駆体,カチオン化剤,配位子,配位子合成のための原料などの消耗品に使用する。特に,立体構造制御に重要になると考えられるキラル配位子の購入に充てる。さらに,得られたポリマーの構造を解析するために,NMR重溶媒や排除体積クロマトグラフィーカラムなどの消耗品を購入する。カチオン性ルテニウム触媒の開発に向け,ルテニウム錯体前駆体,カチオン化剤,配位子,ガラス器具などが,得られたポリマーの構造を解析するために,NMR重溶媒や排除体積クロマトグラフィーカラムなどが必要となるので,次年度は研究費をこれら消耗品に使用する計画である。