hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
汚染土壌由来の有害化合物分解コンソーシアム：分解菌に対する共存非分解菌の役割

有害化合物分解細菌による効率的分解に共存非分解異種細菌が果たす役割とその機構の解明をめざしている。汚染土壌から取得したフェナントレン(Phn)分解コンソーシアに由来するPhn完全分解Mycobacterium株と非分解Burkholderia株の組み合わせを中心にして、前者株がPhnで生育阻害されるGI現象を規定する遺伝子、そして、Phnによる前者株の生育阻害を後者株が緩和するSGI現象に各々関わる遺伝子、の同定・機能解析を行っている。1. Mycobacterium株はPhn以外にもその推定分解中間産物1-ヒドロキシ-2-ナフトエ酸(1H2NA)にもGI現象を示した。一方、1H2NA分解酵素遺伝子phdIの破壊株はPhnと1H2NA分解能を消失したことから、1H2NAがPhn分解中間産物だと明示した。また、phdI破壊株はPhnに対して野生型株より強いGI現象を示した。2. PhnによるMycobacterium株のGIに対して大腸菌株はSGI効果を示すが、後者株の網羅的変異体ライブラリーからSGI効果消失・減少変異株を多数取得した。これらはいずれも栄養要求性変異株で最小寒天培地とPhn最小寒天培地での微小コロニー形成能と生育能が著しく低く、各変異株のSGI効果強度と生育能強度には正の相関があった。3. Mycobacterium株のPhnによるGI現象とBurkholderia株のSGI現象の検討のために、最小培地とPhn添加最小培地を用いて各株単独と両株混合で培養した細菌集団のRNA-seq解析を実施した。両株共存でPhn存在時に特異的に大幅な転写上昇した代表的遺伝子は、前者株では酸素ストレス耐性賦与遺伝子、後者株ではPhn分解中間産物であるフタル酸の分解遺伝子群だった。Mycobacterium株のPhnによる生育阻害機構の解明には、そのPhn分解経路の明示ならびに阻害惹起化合物の同定が必要なことを踏まえ、前年度確立の遺伝学的手法で1H2NAがPhn分解中間産物であることを示し、さらに1H2NAも阻害効果を示すことを示した。Phnや1H2NAを含む化合物による生育阻害が明確になった本結果と生育阻害に耐性を示す変異株の原因遺伝子の機能解析の結果を統合することで、生育阻害機構の解明が大きく進捗する可能性大である。PhnによるMycobacterium株のGIに対してSGI効果消失・減少した大腸菌変異株はいずれもPhn最小寒天培地での生育能が著しく低く、各変異株のSGI効果強度と生育能強度には正の相関があった。この結果から、一定以上の菌密度で存在する非分解細菌株の生細胞がPhn分解菌株細胞との直接的接触によってSGI効果発揮することが強く示唆された。その一方で、広範な非分解菌株が示すSGI効果発揮に特定の遺伝子機能が関与していない可能性も提起された。Mycobacterium株のPhnによる生育阻害現象とこれに対するBurkholderia株の緩和現象を司るゲノムレベルでの解明をめざし、最小培地とこれにPhnを添加した培地で、各株単独と両株混合の各条件で培養した計6種の細胞集団から調製したmRNAを用いたRNA-seq解析で、Phn存在下の単独培養時に認められなかった前者株由来酸化ストレス耐性賦与遺伝子を洗い出せた。前者株のPhnによるGIには酸素ストレスが関与し、後者株が前者株との未知の相互作用を通じて前者株の酸素ストレス緩和を増強した可能性が示唆された点は特筆に値する。Mycobacterium株からPhnによる生育阻害が大幅に緩和した変異株を前年度に加え今年度にも複数取得できたため、これら複数の新規変異株での原因遺伝子の機能解析を行う。生育阻害緩和という同一表現型への複数の遺伝子機能の関与判明時には、各機能間での階層性の検討を推進する。Mycobacterium株のPhn分解能消失変異株の作製に成功し、1H2NAもMycobacterium株にGI現象を示したことから、Phnとその分解中間産物の複数化合物がGI現象を惹起する可能性が高いと示唆された。未だ不明であるPhn分解酵素遺伝子発現制御系の解明が本可能性の妥当性検証と惹起化合物の同定に貢献できることを鑑み、発現制御の解析を次年度に実施予定である。そして、Phn生育阻害緩和株での解析成果も統合して、GI現象発揮機構の提示を行う。前年度並びに今年度の非分解菌株由来のSGI効果消失・減少変異株の解析結果では、広範な非分解菌株が示すSGI効果発揮に特定の遺伝子機能が関与していない可能性が提起された一方で、今年度のRNA-seq解析では分解菌株と非分解菌株共存時に各株での特定遺伝子の顕著な転写上昇が認められた。そこで、これら遺伝子のGI現象並びにSGI効果への関与を各遺伝子の欠失並びに高発現株を用いて解明する。Phnを含む複数の多環芳香族化合物(PAH)分解能を示す上記Mycobacterium株と他の同属細菌株はPAHsに対するGI現象を示す。Mycobacterium株とは進化系統関係が遠くてPhnを含む多環芳香族化合物の分解能を有する様々な環境細菌株の当該化合物に対する生育阻害現象を検討することで、PAHに対するGI現象の細菌界での普遍性の有無を提示する。汚染土壌由来のフェナントレン(Phn)分解コンソーシア

由来のPhn完全分解Mycobacterium株と非分解Burkholderia株の組み合わせを中心にして、(1)前者株のPhnによる生育阻害現象を規定する遺伝子、そして、(2)後者株がPhnによる前者株の生育阻害を緩和する現象とPhn分解能を増強する現象に各々関わる遺伝子の同定・機能解析を行っている。1. Mycobacterium株からPhn耐性能上昇でPhnによる生育阻害の大幅緩和変異体を1株単離した。本変異株ではPhn分解能上昇とともに、野生型株が炭素源にできるが生育阻害をうけるビフェニル(Bph)とナフタレン(Nah)への耐性能上昇も示した。本変異は未知機構での細胞表層構築への寄与が示唆される遺伝子に存在していた。2. Mycobacterium株はPhn添加で細胞表層構造に支障をきたした。また、液体培地を用いた本株トランスクリプトーム解析で、Phn存在下で当該化合物の推定分解酵素群遺伝子の大幅転写上昇に加え、鉄獲得・代謝系などを支配する遺伝子群の転写上昇や好気呼吸に関わる特定酵素の遺伝子群の転写減少が認められ、Phn添加による多面的転写変動を提示した。3. Mycobacterium株の対立遺伝子置換系とベクター系を確立し、両系を用いて推定Phn分解経路中間産物の分解への関与想定遺伝子を解析し、想定機能の妥当性を示した。4.最小寒天培地でのMycobacterium株のPhnによる生育阻害現象はBurkholderia株の共存で大幅緩和されるが、後者株の5種栄養要求性変異体は緩和効果を消失したため、Burkholderia株の寒天培地での生育が緩和効果発揮に重要と示唆された。Mycobacterium株のPhn存在下での生育阻害の共存非分解異種細菌株による緩和効果の包括的解析には、前者株のPhnによる生育阻害機構の解明が必要なことを踏まえ、今年度においては、当該生育阻害現象の解析に力点をおいた。Phnによる生育阻害が大幅に緩和したMycobacterium由来変異体を1株取得・解析したが、本現象のさらなる包括的解明のために、本年度構築の効率的トランスポゾン挿入突然変異誘発系を用いて、更に生育阻害現象が緩和した多数の変異体の取得を実施している。Mycobacterium株での上記2種の遺伝学的解析系の確立とPhn分解経路とその酵素遺伝子群の確定を踏まえ、Mycobacterium株とその分解酵素遺伝子変異株に関して、Phn分解の複数中間代謝産物による生育阻害を検討している。一方、野生型のBphとNahの各々による生育阻害に関しても、その分解経路の検討と推定中間産物による生育阻害を検討している。Mycobacterium株のPhnによる生育阻害現象に対するBurkholderia株の緩和現象の検討のために、最小寒天検定培地とこれにPhnを添加した培地で、各株単独と両株混合の各条件で培養した計6種の細胞集団から調製したmRNAを用いたトランスクリプトーム解析を実施し、Phnと両株が存在する条件で特異的に転写が上昇と減少する各株の遺伝子リストの予備的作成をおこなった。更なる詳細なデータ解析を現在実施している。有害化合物分解細菌による効率的分解に共存非分解異種細菌が果たす役割とその機構の解明をめざしている。
両生類胚における背腹軸決定機構の解明

アフリカツメガエルの発生にさきだって、まず背腹軸が決められ、その後の体づくりは決められた背腹軸にしたがっておこなわれる。この背腹軸の決定にとって胚の背側細胞が重要な働きをすることが知られていたが、われわれは背側細胞の細胞質に背腹軸を誘導する活性があることを明らかにした。この研究の目的は、この活性をになっている分子を同定し、作用機作を明らかにすることである。まず、多量の背側細胞細胞質を集め、その可溶性分画を調整し、それに背腹軸を誘導する活性があることを確かめた。つぎに、さらに多量の材料を集めるため、卵や初期胚をそのままホモジナイズして、えられる可溶性分画をゲル濾過した。分子量の異なる、いくつかの分画をえたが、大部分の活性は比較的タンパク質の少ない分画3に回収されることがわかった。今後、この分画をさらに精製する。他方、卵および異なる時期の初期胚の、異なる部域から細胞質をとりだし、背腹軸誘導活性をアッセイした。そして、活性はそれが初期胚の背側細胞とくにその赤道域に分布する以前、卵の植物極付近に存在していることを明らかにした。活性は、卵のなかを移動するのである。さらに、その移動が表層回転とほぼ同じ時期におこること、表層回転を止めると活性の移動も止まることなどが示された。表層回転を止めると背腹軸の決定も妨げられることから、これまで表層回転は活性をもった分子を活性化する過程であり、背腹軸の決定にとって必須だと考えられてきた。しかし、さらにわれわれは人為的な方法で活性を移動させ、背腹軸の決定が可能になることを示した。表層回転はかならずしも必須ではないのである。表層回転は、活性を移動させているだけだという可能性が大きい。新しくえられたこれらの知見は、活性をになっている分子の本体やその作用機作を理解するうえで重要である。われわれは、アフリカツメガエル初期胚(16細胞胚)の背側細胞細胞質を同じ時期の受け入れ胚の腹側細胞に注入したとき、二次軸の形成がひきおこされることを明らかにした。この研究の当面の目的は、そのような活性をもった物質を精製し同定することである。まず、アフリカツメガエル16細胞胚をホモジナイズし、7,000g、10分遠心した。上清をさらに100,000g、10分遠心し、得られた上清は凍結保存した。この上清を受け入れ胚の腹側細胞に注入すると、約40%の胚において二次軸が観察される。このことから、ほとんどすべての活性がこの分画に回収されたことがわかる。なお、この分画を熱処理することによって活性が失われる。上記の遠心上清をポアサイズ0.22μmのメンブレンフィルターを通過させた後、濾液をゲル濾過して6つの分画に分けた。それぞれの分画を濃縮し、二次軸形成の活性をしらべた。もっとも活性の高い分画を注射したとき、ほぼ100%の胚が二次軸を形成した。この分画に含まれている物質の量は、280nmの吸収量から推測すると、全体の4%以下であるから、この段階でもすでに活性物質はかなり濃縮されたことになる。つぎにこの分画をタンパク分解酵素やRNA分解酵素で処理し、活性が失われるかどうか調べる。得られた結果を参考にしながら、この分画をさらに精製していく。

この二次軸形成をひきおこす活性は16細胞胚の背側細胞に含まれているのであるが、この時期にはじめて現れるのか、それともそれ以前から存在しているのか、どこに存在しているのか。これらの情報は、この活性物質が背腹軸の決定や形成に際してどのような働きをするかを明らかにしていくうえで重要である。この点についても検討し、受精卵の植物極近くに存在していることを明らかにした。われわれは以前に、アフリカツメガエル初期胚の背側細胞細胞質が背腹軸を誘導する活性をもっていることを示した。この活性をもつ分子を同定し、その作用機作を明らかにすることを目的としてこの研究ははじめられた。本年度明らかにしたことは、次のとおりである。まず、初期胚を多量に集め、その可溶性分画を調整し、さらにゲル濾過カラム(TSK-GEL4000SWLX)をもちいることによって分子量の異なるいくつかの分画に分けた。得られた各分画の背腹軸誘導活性をアツセイしたところ、タンパク質の比較的少ない分画3に大部分の活性が回収されていることがわかった。この分画3の活性はRNアーゼA処理によっては低下しなかったが、プロテイナーゼK処理によっては半分以下に低下した。この分画3をさらに精製して、活性をになっている分子を同定する。他方、活性をになう分子の本体やその作用機作を理解するうえで重要な情報となる活性の出現時期や分布についても、興味深い結果が得られた。すなわち、活性は受精直後の卵の植物極付近にまず出現する。そして、その後、胚の将来の背側の赤道域に分布するようになる。つまり、活性はある時期に卵のなかを移動するのである。この移動は表層回転とほぼ同時におき、しかもそれに依存している。もし表層回転を止めると、活性の移動も止まり、背腹軸の決定も妨げられる。このことから活性の移動に何らかの方法で表層回転が関与していること、そして、活性の移動が背腹軸の決定にとって必須であることが示唆された。
ナミアゲハ幼虫の持つ適応的なふるまいを発見・理解する探究教材の開発、実践

本研究の目的は、児童生徒に、生物の食うものと食われるものの関係において、食うものの示す適応を理解させることである。その題材として、ナミアゲハが寄主植物に対して示す適応を観察・理解させるための教材開発と実践を試みている。本年度は、柔らかい幼葉を餌として育てられたナミアゲハの終令幼虫が、硬い成葉を利用する能力が低く、一方、硬い成葉で育てられたナミアゲハの終令幼虫は、成葉を利用できることを明らかにし、日本環境動物昆虫学会、日本応用動物昆虫学会で発表した。また、この現象が、幼虫の終令までの脱皮回数が一度増える「過剰脱皮現象」によって引き起こされることも示した。すなわち、硬い葉で育った幼虫は、成長が遅く、体や大顎のサイズも小さいが、過剰脱皮することで幼虫期間を延ばし、大きな大顎を作ることで成葉を食べることが可能となったことが明らかになった。本研究の成果は、ナミアゲハ幼虫が、自らの餌条件(柔らかい葉が利用できるような条件(寄主植物種、季節、競争者の存在下)に生まれたか)に応じて、生活史戦略を可塑的かつ適応的に変化させていることを示唆している。今後、この現象についてのさらに厳密な検証を行うとともに、児童・生徒にこの現象を再発見させるための教案作り、学校教員が教材を扱うための補助教材作りを進める。教材では、植物の硬さが植食者に対する防御として働いていること、植食者が寄主植物の防御に対抗できるような適応を持っていること、植食者が自己の存在する環境に反応して、生活史戦術を選択することを、児童生徒が自ら考察し、生物学、特に進化生態学への興味を喚起することを目標とする。計画書で(A)基礎的研究段階として示した13のうち、1と2については上記のように十分な成果を得た。3として示した、「幼虫の植物上での行動を定量的に解明する」については、昨年度と本年度に実施する予定であったが、柑橘の植樹スケジュールが遅れたこともあり、本年度のみの取り組みとなった。計画書で(B)応用的研究段階として示した内容について、大学生を対象としたナミアゲハ幼虫の形態観察授業、吐糸行動の観察実習をおこなって、準備を進めた。また、灰色型蛹と緑色型蛹をフォトグラメトリー技術を用いて3Dモデル化し、時期を問わずその形態観察と比較をできる教材を開発し、公開準備を進めている。(A)で得た成果については、本年、大学院生を対象とした授業実践を行い、その成果を公表するとともに、試作教材の公開を行う。・教員養成課程の大学生参加の下、ナミアゲハ幼虫の植物体上の行動観察を行って、教材となる可能性のあるナミアゲハの適応の発見・再発見を行う。植物としては育成の容易なヘンルーダを用いる。・ナミアゲハの過剰脱皮現象の解明と教材化を進める。大学生に向けた教育実践を通じて、教材を評価・改良する。また、教員向けの補助教材を発信し、普及に努める。・そのほか、3Dモデルやスローモーション動画などナミアゲハの形態・行動のICTコンテンツを充実させ、視覚的にわかりやすい教師向け副教材を作成し、発信する。・過剰脱皮現象の基礎研究成果、教材開発など応用研究の成果についての学会発表と論文化を行う。「研究目的」で(A)基礎的研究段階として提示した内容のうち、実験体制の確立(食樹移植、飼育設備の整備、大規模個別飼育法の確立)と基礎研究「葉の硬さの変化への適応の解明」を行った。「実験体制の確立」では柑橘8株の移植と、小型PPケースと恒温器を併用した大規模個別飼育法の確立を行った。後者では、一齢幼虫から蛹化までの期間、幼虫を展葉直後の幼葉のみで飼育できることを確認した。基礎研究「葉の硬さの変化への適応の解明」では、1展葉直後の幼葉のみで飼育した幼虫、23令への脱皮までは展葉直後の幼葉で育て、それ以降は成葉で飼育した幼虫、3成葉のみで飼育した幼虫のパフォーマンスを比較し、2のパフォーマンスが最も低くなることを明らかにした。これは、3令期まで成葉を食べて過ごした場合、幼虫が硬い成葉に見合った咀嚼能力を発達させることを示唆している。本成果は日本環境動物昆虫学会大会で公表した。現在、脱皮した幼虫がのこした頭殻を計測し、3の幼虫が大きな大顎を発達させている可能性を検討中である。次の段階として、展葉直後の幼葉から成葉への切り替えだけでなく、展葉直後の幼葉からやや成熟した幼葉への切り替えを行い、幼虫が餌の硬質化にたいして、どの程度鋭敏に反応するかを明らかにすることを予定している。また、(B)応用的研究段階では、小学校等におけるアゲハチョウ授業の成果を随時フィードバックして検討しており、現時点では、特に幼虫行動の深い理解が現場において不足していると考えている。「実験体制の確立」に若干の遅れが見られるが、基礎研究「葉の硬さの変化への適応の解明」は、成果の公表を含めても予定通りの進捗状況である。また、応用研究段階のうち、教材の開発と実践については、やや遅れており、現在教材としてのとりまとめを行っている。

本年度は、柔らかい幼葉を餌として育てられたナミアゲハの終令幼虫が、硬い成葉を利用する能力が低く、一方、硬い成葉で育てられたナミアゲハの終令幼虫は、成葉を利用できることを明らかにし、日本環境動物昆虫学会、日本応用動物昆虫学会で発表した。また、この現象が、幼虫の終令までの脱皮回数が一度増える「過剰脱皮現象」によって引き起こされることも示した。すなわち、硬い葉で育った幼虫は、成長が遅く、体や大顎のサイズも小さいが、過剰脱皮することで幼虫期間を延ばし、大きな大顎を作ることで成葉を食べることが可能となったことが明らかになった。本研究の成果は、ナミアゲハ幼虫が、自らの餌条件(柔らかい葉が利用できるような条件(寄主植物種、季節、競争者の存在下)に生まれたか)に応じて、生活史戦略を可塑的かつ適応的に変化させていることを示唆している。今後、この現象についてのさらに厳密な検証を行うとともに、児童・生徒にこの現象を再発見させるための教案作り、学校教員が教材を扱うための補助教材作りを進める。教材では、植物の硬さが植食者に対する防御として働いていること、植食者が寄主植物の防御に対抗できるような適応を持っていること、植食者が自己の存在する環境に反応して、生活史戦術を選択することを、児童生徒が自ら考察し、生物学、特に進化生態学への興味を喚起することを目標とする。計画書で(A)基礎的研究段階として示した13のうち、1と2については上記のように十分な成果を得た。3として示した、「幼虫の植物上での行動を定量的に解明する」については、昨年度と本年度に実施する予定であったが、柑橘の植樹スケジュールが遅れたこともあり、本年度のみの取り組みとなった。計画書で(B)応用的研究段階として示した内容について、大学生を対象としたナミアゲハ幼虫の形態観察授業、吐糸行動の観察実習をおこなって、準備を進めた。また、灰色型蛹と緑色型蛹をフォトグラメトリー技術を用いて3Dモデル化し、時期を問わずその形態観察と比較をできる教材を開発し、公開準備を進めている。(A)で得た成果については、本年、大学院生を対象とした授業実践を行い、その成果を公表するとともに、試作教材の公開を行う。現場からのフィードバックをもとに、植物体上の幼虫の行動を重点的に明らかにし、ICTを活用した教材キットの開発を進める。・教員養成課程の大学生参加の下、ナミアゲハ幼虫の植物体上の行動観察を行って、教材となる可能性のあるナミアゲハの適応の発見・再発見を行う。植物としては育成の容易なヘンルーダを用いる。・ナミアゲハの過剰脱皮現象の解明と教材化を進める。大学生に向けた教育実践を通じて、教材を評価・改良する。また、教員向けの補助教材を発信し、普及に努める。・そのほか、3Dモデルやスローモーション動画などナミアゲハの形態・行動のICTコンテンツを充実させ、視覚的にわかりやすい教師向け副教材を作成し、発信する。・過剰脱皮現象の基礎研究成果、教材開発など応用研究の成果についての学会発表と論文化を行う。カンキツの植樹において、当初予定していた植樹場所の一部が利用できなかったため、予定よりも小型の株を導入した。そのため、予算見込みよりも、使用額が少なくなっている。小型の株を導入したことから、一定以上利用した後のカンキツの植え替えが必要になると見込んでいる。予算の差額はこの植え替えのためにあてる予定である。物品調達の際の見積額の変化によるもの。差額は翌年度飼育実験の規模を若干拡大するための、資材調達に用いる。
活性発現を指標とするI-Cell病原因遺伝子のクローニング

I-Cell病は常染色体劣性遺伝する糖タンパク質の代謝異常症であり,原因はゴルジ体の中でリソソーム酵素の糖鎖のマンノース残基にリン酸を付加する酵素,N-アセチルグルコサミン-1ーリン酸転移酵素の欠損が原因である.この酵素の精製は非常に困難であるため,酵素学的な性質が充分に解明されておらず,遺伝子もクローニングされていない.この遺伝病のcDNAをクローニングするために遺伝子導入による活性の発現を指標とした方法を試みた.まずI-Cell病の患者由来の培養繊維芽細胞のChen-Okayamaの高効率トランスフェクションを用いてヒト肝pcD2 cDNAライブラリーを導入した.トランスフォーマントはneo耐性になるためG418を用いて選択した結果,約1万個のneo耐性トランスフォーマントが得られた.次にN-ピレン-ドデカノイルスフィンゴミエリンをアポプロテインイAと混合してリポソーム化したものを培地に加えて,細胞内に取り込ませる.その後,トリプシン処理をして生理的食塩水に懸濁し、366nmの紫外線を照射してから培地を加え,さらに培養を続けた.この方法でN-アセチルグルコサミン-1ーリン酸転移酵素を発現している細胞のみがピレンを分解することができて生存可能である.この選択により5個のトランスフォーマントが選択された.現在,これらのトランスフォーマントの細胞内,及び培地のリソソーム酵素活性の測定による細胞生物学的性質の検討をしている.さらに導入された遺伝子を回収し,その構造を解析している.I-Cell病は常染色体劣性遺伝する糖タンパク質の代謝異常症であり,原因はゴルジ体の中でリソソーム酵素の糖鎖のマンノース残基にリン酸を付加する酵素,N-アセチルグルコサミン-1ーリン酸転移酵素の欠損が原因である.この酵素の精製は非常に困難であるため,酵素学的な性質が充分に解明されておらず,遺伝子もクローニングされていない.この遺伝病のcDNAをクローニングするために遺伝子導入による活性の発現を指標とした方法を試みた.まずI-Cell病の患者由来の培養繊維芽細胞のChen-Okayamaの高効率トランスフェクションを用いてヒト肝pcD2 cDNAライブラリーを導入した.トランスフォーマントはneo耐性になるためG418を用いて選択した結果,約1万個のneo耐性トランスフォーマントが得られた.次にN-ピレン-ドデカノイルスフィンゴミエリンをアポプロテインイAと混合してリポソーム化したものを培地に加えて,細胞内に取り込ませる.その後,トリプシン処理をして生理的食塩水に懸濁し、366nmの紫外線を照射してから培地を加え,さらに培養を続けた.この方法でN-アセチルグルコサミン-1ーリン酸転移酵素を発現している細胞のみがピレンを分解することができて生存可能である.この選択により5個のトランスフォーマントが選択された.現在,これらのトランスフォーマントの細胞内,及び培地のリソソーム酵素活性の測定による細胞生物学的性質の検討をしている.さらに導入された遺伝子を回収し,その構造を解析している.
半分のポルフィリン:ジピリン金属錯体を基軸とした階層的π空間の制御

金属配位子としてふるまうπ共役系分子分子は、錯形成やそれにともなう骨格変換に基づいた電子および光物性の変調が可能であり、機能性マテリアルへの応用展開が期待できる。たとえば金属イオン架橋によってらせん構造が形成されれば、π共役系部位のねじれに起因した分光特性を発現することが可能となる。ジピリンユニットがピロールα位間で直接連結した2量体ビジピリンは、Zn^<II>架橋によって[2+2]型二重らせん構造を構築することが知られているが、溶液中で容易にラセミ化する。そこでらせん構造の安定化(キラリティの保持)を目的として、メゾ芳香環部位を共有結合で架橋した誘導体を合成したところ、溶液中、エナンチオマー間で変換しない安定な二重らせん構造の形成が可能であることを明らかにした。このとき、UV/vis吸収およびCDスペクトルなどから架橋鎖長や温度に応じたらせんピッチの変化が確認され、2種類の安定な二重らせんモードの存在、およびスペクトルとらせん構造との相関を理論計算によって明らかにした(論文投稿中)。さらに、らせん構造の制御およびπ共役系拡張による電子・光物性の発現を目的とし、ピロールα位に芳香環を導入したビジピリンを合成し、種々の金属イオンとの錯形成を行った。実際に、金属イオンの配位形態に応じて光学分割が可能な[1+1]型一重らせん構造および[2+2]型二重らせん構造の形成に成功し、分子構造と電子物性との相関を検証した(論文投稿準備中)。ジピリンユニットがピロールα位間で直接連結した2量体ビジピリンは、Zn^<II>架橋によって[2+2]型二重らせん構造を構築することが知られている。しかし、おそらくこの二重らせん型錯体が特定の条件下において溶液中で容易にラセミ化するため、これまでビジピリンからなるこのキラルなπ空間に関する知見がまったく得られていないのが現状である。そこで、安定なキラルπ空間(二重らせん型錯体)形成を目標とし、ジピリン2量体-Ni^<II>錯体([2+2]型環状錯体)を出発原料として、2個のビジピリン配位子を部分ユニットとした共有結合マクロサイクルの合成、さらにZn^<II>4核錯体cBDPR_2・Zn_4の形成に成功した。cBDPR_2・Zn_4は二重らせん構造に起因したエナンチオマーの混合物として存在し、それらが光学分割可能であること、さらに高い安定性を有することを見出した。種々の溶媒中において各種分光測定を行い、外部刺激(温度など)によってばね(二重らせん)構造が制御されることを見出した。たとえば2-メチルTHF中で温度に依存した紫外可視吸収スペクトル変化を示し、円偏光二色性(CD)スペクトルでは、低温でのCD強度の上昇が、溶液状態およびガラス状態(<-136°C)において観測された。また溶液状態と比較して、ガラス状態では低温において蛍光強度の顕著な上昇が確認された(Chem.Eur.J.2010)。
歯周組織の加齢変化が歯の移動に及ぼす影響についての実験的研究

上顎両側第一臼歯を10,40gの2段階の力で,1,3,7,14日間移動を行った結果,次のような結果が明らかとなった。1.歯の移動量成長期ラットと成熟期ラットでは,歯の移動の初期段階から移動量に差が生じること,成熟期ラットではlag phaseが長く,過度の矯正力を加えても大きな移動量が得られにくいことが明らかにされた。このことより,加齢に伴う歯周組織の変化が歯の移動に大きな影響を与えていることが強く示唆された。2.光顕的観察10gの矯正力を用いた群の経日的な組織変化に関して,圧迫側における改造過程の初期において成長期群と成熟期群で最も大きな差異が認められた。すなわち,成熟期群では成長期群と比較して圧迫側における組織改造の開始時期が遅れることが明らかとなった。このことより,同じ大きさの力を加えた場合でも歯周組織の加齢変化により,圧迫側の変性組織の吸収遅延が起こり,ひいては歯槽骨の改造機転にも遅れが生じることが示された。3.歯周靱帯内細胞増殖の様相ブロモデオキシウリジン(BrdU)を腹腔内投与,歯周靱帯における増殖細胞の全細胞数に占める割合を牽引側,圧迫側について免疫組織化学的染色により求めた。歯周靱帯の牽引側では,歯の移動1日目における細胞増殖が成熟期ラットよりも成長期ラットにおいてより活発であったことが示された。一方,圧迫側では,その骨改造段階において成熟期ラットの細胞反応の時期的な遅れが明らかとなったが,これは光顕的観察において成熟期ラットの初期に変性組織の吸収が遅延していた所見と一致する結果であった。成人矯正患者に対してより適切な矯正治療を遂行するために,成人の歯周組織が矯正刺激に対する反応の様相が若年者の場合とどのように異なるかを明らかにする必要がある。本研究では,歯周組織の器質的な加齢変化をふまえたうえで歯の実験的移動を行い,組織反応及び細胞動態をさらに詳しく明らかにすることにした。検討項目は歯の移動量の差,経時的な光顕的組織像の差,免疫組織化学的手法を応用した歯周靱帯内の細胞の増殖能の差とし,2段階の強さの矯正力を負荷してそれぞれについて検討することとした。実験的な歯の移動方法の妥当性について:ワイヤースプリングを利用した装置により,実験的な歯の移動が確実に行いうることが確認された。歯周靱帯内細胞の増殖度について:BrdUを用いた免疫組織化学的方法を行った場合,従来の^3H-チミジンを用いたオートラジオグラフィに比べて実験期間が大幅に短縮され,実験の効率化につながることが明かとなった。さらに,実験的な歯の移動を行わなかった生理的状態下において,幼若ラットと成熟ラットでは歯周部靱帯内の細胞の増殖度に差があることが明らかとなった。今後の実験によって,生理的状態下の歯周靱帯内において幼若ラット,成熟ラット間に細胞増殖度の差異があったことにより,実験的な歯の移動における反応性においても十分な差がみられることが予想される。

すなわち,成熟期群では成長期群と比較して圧迫側における組織改造の開始時期が遅れることが明らかとなった。このことより,同じ大きさの力を加えて場合でも歯周組織の加齢変化により,圧迫側の変性組織の吸収遅延が起こり,ひいては歯槽骨の改造機転にも遅れが生じることが示された。3.歯周靱帯内細胞増殖の様相ブロモデオキシウリジン(BrdU)を腹腔内投与,歯周靱帯における増殖細胞の全細胞数に占める割合を牽引側、圧迫側について免疫組織化学的染色により求めた。歯周靱帯の牽引側では,歯の移動1日目における細胞増殖が成熟期ラットよりも成長期ラットにおいてより活発であったことが示された。一方,圧迫側では,その骨改造段階において成熟期ラットの細胞反応の時期的な遅れが明らかとなったが,これは光顕的観察において成熟期ラットの初期に変性組織の吸収が遅延していた所見と一致する結果であった。
ペスチウイルス感染と宿主初期防衛機構の相互作用の解析

牛ウイルス性下痢・粘膜病の病態解明を目的として、細胞病原性(cp)および非細胞病原性(ncp)牛ウイルス性下痢ウイルス(BVDV)を用いて、宿主因子との相互作用を解析したところ、細胞病原性がアポトーシスによって起こること、ウイルスRNAがアポトーシスの原因であることを見出した。また、いくつかの重要な宿主因子がウイルス複製に関与していることを明かとした。研究実施計画に基づき平成18年度は以下の研究を実施した。1.これまでに、初代培養細胞においてはRNA複製に伴う2本鎖RNAの蓄積がアポトーシスの引き金であることを明らかにしており、この結果を元にBVDV持続感染牛におけるアポトーシス関連宿主因子の発現解析を試みた。免疫機構の恒常性維持に重要な器官である脾臓に着目し、宿主因子の転写量をリアルタイムPCRにより定量した結果、in vitroにおいて誘導が見られた5つの因子(Mx1、iNOS、OAS-1、PKR、TNF-α)の内、iNOSを除く全ての因子が有意に誘導されていた。回帰分析の結果、ウイルスRNAの蓄積量がそれらの宿主因子の転写量と正の相関関係にあったことから、ウイルスRNA複製に伴う2本鎖RNAの蓄積がin vivoにおいても先天性免疫反応の誘導に関与している可能性が強く示唆された。2.MDBK-SY細胞と、ncpBVDVが細胞病原性を示さない初代培養細胞を用い、BVDV感染によって誘導される宿主因子をDNAマイクロアレイ解析により網羅的に探索した結果、細胞病原性を示すBVDV感染においては主にインターフェロン関連因子が顕著に誘導されていた。その因子の中にはアポトーシス促進、抗ウイルス活性を持つものが多数含まれており、今後は過剰発現が見られた因子の役割について検討する。3.効率的なウイルスRNA複製に関わる宿主因子を網羅的に探索するため、酵母2ハイブリッド法を用いてRNA複製に関与する非構造タンパクと会合する宿主因子を牛腎臓由来株化細胞(MDBK細胞)由来のcDNAライブラリからスクリーニングを試みた。その結果、腫瘍遺伝子の1つが見出され、共免疫沈降により両者の特異的な結合が明らかとなった。この新たに見出されたウイルス-宿主間相互作用がウイルスRNA複製に与える影響の解析についても現在進行中である。牛ウイルス性下痢ウイルスによる持続感染は発育遅延や免疫抑制を引き起こし,養牛農家の経営上大きな問題となっている。これまでの研究により,持続感染牛の臨床徴候の有無や先天性免疫反応レベルはウイルスRNAの蓄積量と正の相関関係にあることが判明した(Yamane eta1.,Vet Microbio1,inpress)。感染牛の病態形成に深く関わっていると考えられるアポトーシス誘導メカニズム,について,細胞病原性(cp)株と非細胞病原性(ncp)株どちらの感染によっても細胞死を誘導する特殊な性質を持っMDBK細胞とncp株が細胞病原性を示さない初代培養細胞(BFM細胞)を用いてマイクロアレイ解析を行った。解析から得られた情報を元にシグナル伝達経路を分析した結果,MDBK細胞では小胞体ストレス経路が,BFM細胞ではインターフェロン経路が強く誘導されていた。BFM細胞においては小胞体ストレス経路に変化が見られず,更にMDBK細胞においてはMAPキナーゼの一つであるERK1/2のリン酸化誘導が顕著に見られたことから,ウイルス感染細胞におけるシグナル伝達は細胞集団によって異なることが示された。これらの結果はncp株感染に対する両細胞の振る舞いの違いを明らかとする為の,重要な手掛かりとなると考えられた。ウイルス非構造タンパクに対する抗体については,NS5Aについてポリクローナル抗体,モノクローナル抗体の作製を試み,cp,ncp株どちらとも反応する抗体の作出に成功した。得られたモノクローナル抗体を用い,ウイルス株間でのNS5A発現量の違いや細胞内局在について解析中である。同時に,NS5Aと相互作用する宿主因子についてもイースト2ハイブリッド法によって同定しており,モノクローナル抗体を用いて相互作用や共局在についての解析を現在進行中である。昨年まで牛ウイルス性下痢ウイルス(BVDV)のウイルス非構造蛋白(NS)と宿主因子の相互作用に焦点を当て解析してきた。昨年行ったMDBK細胞と初代牛腎臓培養細胞(BFM細胞)を用いたマイクロアレイ解析の結果、cp株感染MDBK細胞においてMAPキナーゼの一つであるERK1/2のリン酸化誘導が顕著に見られたことから、その機構を解析した。この結果、cp株感染細胞上消にERKリン酸化誘導能が認められた。ERKリン酸化は過酸化水素の添加や血清除去によっても誘導され、N-アセチルシステインやグルタチオン処理によって抑制されたことから、ウイルス感染上清中の活性酸素種がERKリン酸化を誘導していることが明らかとなった。ERKの異常な活性化は病体形成との関連が示唆される。また、NSと宿主因子の相互作用は病態解明に必須であるところから、cp株を特徴づけるNSであるNS3と結合する宿主因子を酵母2ハイブリッド(Y2H)法を用いて検索した。この結果、スフィンゴシンキナーゼ1(SphK1)を同定した。NS3はSphK1の酵素活性を著しく抑制し、ウイルス複製を増強することが明らかとなった。

しかし、非開裂型NSのNS2-3も同様にSphK1に結合し、抑制することから、SphK1の酵素活性抑制はBVDVの噌殖戦略に必須である可能性が示された。さらに、昨年度作製したNS5Aに対するモノクローナル抗体を用いて、BVD VNS5Aの細胞内局在について検討したところ、NS5AはERのマーカーであるカルネキシンの局在と一致し、ウイルス感染期間を通してERに存在することが明らかとなった。さらに、NS5Aと結合する宿主因子をY2H法を用いて検索した結果、NIBP(NIK and IKK beta binding protein)を同定した。現在、NS5AとNIBP結合箇所など詳細について解析中である。
筋細胞の組織構築における細胞骨格蛋白質タリンの役割について

タリン(230kD)をタンパク質分解酵素、カルパインで処理して得られたC-端側の190kD断片にはアクチン結合能があることをすでに明らかにしたが、本研究の目的はさらに190kD断片中の詳細なアクチン結合ドメインを調べると共に、N-端側の47kD断片と細胞膜との連繋の可能性も探ることである。そこでまず、190kD断片を酵素処理した分解産物を一次元あるいは二次元電気泳動により泳動後、それらのバンドあるいはスポットをPVDF膜に転写し、アクチンオーバーレイ法によりアクチン結合能を有するバンドあるいはスポットを確認した。それらのバンドあるいはスポットをマイクロシケンス法により、N-端側からのシーケンスを調べた。また、アクチン結合能を有しないスポットのシーケンス解析も行った。これらの結果から、タリンのN-端より529アミノ酸残基から852アミノ酸残基までの範囲にアクチン結合ドメインがあることが明らかになった。また、作製したモノクローナル抗体(No. 1, 2, 3. 4)のタリン分子の認識部位を知るためにエピトープ解析を行った。No. 4の抗体は他の3種とは異なるタリンの部位を認識し、Actin Competition法を用いたELISA法による分析結果から、アクチンとタリンの結合の阻害活性を有する新奇なモノクローナル抗体であることが明らかになった。この抗体も二次元電気泳動のアクチン結合能を有するスポットを認識した。一方、タリンのN端側47kD断片、C端側190kD断片と、細胞膜を主に構成しているリン脂質であるホスファチジルコリンとホスファチジルセリンの混合物との共沈実験では、190kD断片ではなく、47kD断片がリン脂質と相互作用することが示された。またそのとき、ホスファチジルコリンではなく、酸性のリン脂質であるホスファチジルセリンが必要であることが明らかになった。
プラズマ材料プロセスにおける固体表面フリーラジカルの動力学に関する研究

1.申請者らはかねてより、非反応性プラズマ照射によって種々の高分子粉末に生成する表面フリーラジカルの構造、反応性などをそのESRスペクトル測定とシミュレーションによって明らかにしてきた。本研究においては、ポリエチレン(PE)とポリテトラフルオロエチレン(PTFE)のプラズマ照射によるフリーラジカル生成特性の詳細に新たな知見を付け加えるとともに、それらの生成が分子内競争反応によって直接比較できるエチレン-テトラフルオロエチレンの1:1交互共重合体(ETFE)にArプラズマ照射し、生成する表面ラジカル構造をESRスペクトルによって解析した。その結果、プラズマ照射ETFEの室温ESRスペクトルは、beta-Hとbeta-Fの超微細結合定数に大差がないためにPEと類似の六重線を示し、系統的なシュミレーションの結果、主生成ラジカルは主鎖型ラジカルに帰属された。しかし、本ラジカルを空気に曝すとPEと異なり室温でも容易にパーオキシラジカルが観測された。また、ArとO_2プラズマ照射によるエッチング速度比(O_2/Ar)はPE、PTFEのいずれの単一高分子よりも著しく大きくなるなど興味ある共重合体効果の特異性が認められた。2.基本的なIV族元素の炭素活性種(・CH_3、CH_2)間および珪素活性種(SiH_3、:SiH_2)間の基底状態での再結合反応について分子軌道計算によって評価した。その結果、珪素活性種においてはラジカルの軌道再混成による立体構造変化の影響は炭素活性種と比較して微少であることが示された。また、:CH_2間および:SiH_2間の反応においては、それら活性種の多重度の安定性の差異(:CH_2は三重項が、:SiH_2は一重項が安定)を考慮することが重要であることが示された。このように、固体表面での薄膜形成におけるフリーラジカルの構造緩和過程に新たな知見を加えた。
低酸素PETによる膵癌の治療ストラテジー構築

本研究は、低酸素細胞に特異的に集積するpositron emission tomography (PET)トレーサを利用し、主に膵臓癌患者を対象に癌の低酸素環境が治療に与える影響を検討するものである。過年度までの成果として、低酸素を評価するトレーサ[18F]fluoromisonidazole(FMISO)を用いたPET検査の撮像プロトコールを確立した。これをベースとして膵臓癌の臨床例に対しFMISO-PET/CTを行い、これが治療方針決定に有用であるかどうかを検討を進めてきた。前年度までに収集を行った膵癌術前症例27例について、最終的な検討を行った。検討の概要は以下の通り。研究参加同意を得た未治療膵臓癌症例に対しFMISO-PET/CTを行った。膵癌部の集積と大動脈の集積比を利用した腫瘍血液比(tumor blood ratio: TBR)を用いて解析することとした。主な解析項目として、(1) FMISO-PET/CTは手術適応を判断することができるか、(2)病理学的な低酸素マーカーであるhypoxia inducible factor (HIF)-1αの発現はFMISO集積と関連するか、(3)FMISO集積は予後に関連するか、という3点について検討を行った。本年度は初期検討として10例の被験者を対象にFMISO-PET/CTでの撮像を行った。撮像条件(FMISO投与量、投与から撮像までの間隔、撮像時間)や画像処理法(各種計算処理、呼吸同期の有無など)を検討し、おおむね良好な画像が得られるプロトコールを確立したといえる。前年度の10例につづき、7例の被験者を対象にFMISO-PET/CTでの撮像を行った。本年度の主たる検討項目としては、(1)撮像プロトコールおよび適切な画像処理法の確立、(2)手術標本における病理学的因子とFMISO集積との関連性の検討、(3)術後の経過(無再発生存率・全生存率)とFMISO集積との関連性についてである。(1)については、おおむね昨年度に確立されているが、引き続き検討を加えた。投与量については、7MBq/kgは妥当なものと考えられた。また撮像時間についても、2.5時間で特に問題ないものと考えられた。(2)については、病理学的因子、特にHIF-1αとの関連性について検討した。その結果、HIF-1αが強く発現しているものは、FMISO集積も強い結果が得られた。これにより、膵癌におけるFMISO集積が低酸素を反映していることが裏付けられた結果となる。膵癌に発現するHIF-1αは、予後と関連することが知られており、これによりFMISOと予後との関連についても想定されるものと考えられる。(3)について、まず術後無再発生存との関連性について検討され、FMISO集積が強いものについては、弱いものに比べて再発期間が短いことが示唆された。また、術後全生存との関連についても、一定の関連性が示された。このように、FMISO集積は治療成績や治療後の予後との関連性があることが示唆されるものと考えられた。しかしながら、この検討については、症例数が少なく、統計量として十分とはいえない。さらに症例を増やした検討が必要と考えられる。それぞれ前述のごとく検討が行われており、おおむね順調に進展している。本研究の目的は、膵臓癌に対して行われたFMISOーPET/CTが治療方針決定に有用であるかどうかを検討するものである。前年度に続き引き続き研究症例を重ねた。本年度末で最終的に27例となり、十分に統計学的解析可能なデータを得たと考えられる。研究参加同意を得た未治療膵臓癌症例に対しFMISOーPET/CTを行った。画像評価は、昨年度以前に行われた検討の結果に基づき、膵癌部の集積と大動脈の集積比を利用した腫瘍血液比TBRを用いて解析することとした。主な解析項目として、(1)FMISOーPET/CTは手術適応を判断することができるか、(2)病理学的な低酸素マーカーであるHIFー1αの発現はFMISO集積と関連するか、(3)FMISO集積は予後に関連するか、という3点について検討を行った。本年途中で行われた中間解析において、(1)手術不可能例は手術可能例に比べて有意にFMISO集積が高かった、(2)手術施行例における摘出標本のHIFー1α発現は、高発現群で低発現群においれ有意にFMISO集積が高かった、(3)集積の高かった群で、低い群より有意に無再発生存率が低かった、という結果が得られた。以上よりFMISOーPET/CTは、膵癌の術前予後予測因子として期待されるものとの結果が得られつつある。

この結果は、11月に行われた国際学会で発表した。今後は全症例について分析を行い、最終発表を行う予定である。症例データの蓄積はほぼ完了した。手続き等に時間を要したため、最終的な解析および報告は来年度に行う予定とした。本研究は、低酸素細胞に特異的に集積するpositron emission tomography (PET)トレーサを利用し、主に膵臓癌患者を対象に癌の低酸素環境が治療に与える影響を検討するものである。過年度までの成果として、低酸素を評価するトレーサ[18F]fluoromisonidazole(FMISO)を用いたPET検査の撮像プロトコールを確立した。これをベースとして膵臓癌の臨床例に対しFMISO-PET/CTを行い、これが治療方針決定に有用であるかどうかを検討を進めてきた。前年度までに収集を行った膵癌術前症例27例について、最終的な検討を行った。検討の概要は以下の通り。研究参加同意を得た未治療膵臓癌症例に対しFMISO-PET/CTを行った。膵癌部の集積と大動脈の集積比を利用した腫瘍血液比(tumor blood ratio: TBR)を用いて解析することとした。主な解析項目として、(1) FMISO-PET/CTは手術適応を判断することができるか、(2)病理学的な低酸素マーカーであるhypoxia inducible factor (HIF)-1αの発現はFMISO集積と関連するか、(3)FMISO集積は予後に関連するか、という3点について検討を行った。確立した撮像プロトコールに則り、手術予定膵癌患者(約20-30例)に対してFMISO-PETを撮像する。手術後に得られた病理標本から、HIF-1α、VEGF、p53などの因子と集積の分布や程度を比較検討する。その後化学療法予定患者(約20-30例)に対して、治療前後でFMISO-PETを撮像する。FMISO集積の変化を治療前後の腫瘍径の変化、糖代謝の変化と比較し、治療効果の判定基準としての適性を評価する。ゲムシタビン単剤、ゲムシタビンと他の薬剤併用、FOLFORINOXなど化学療法プロトコールの違い、放射線治療併用時のおける反応性の変化についても検討し、低酸素との関連性を検討する。引き続き手術予定膵癌患者に対しFMISO-PETの撮像を継続し、低酸素に関連する病理学的な裏付けを得ていく。また化学療法予定患者に対するFMISO-PET集積の変化についても、引き続き検討していく予定である。各種解析をすすめ、予後因子との関連についても深く検討していく。分析の上、学会および論文上で発表していく予定である。研究全体の予算が不十分であったため一部の内容を変更した。そのため本年度に予算を計上していた研究の一部が、本年度に行う必要がなくなり、次年度に行うこととなった。そのため本年度に予算を計上していた研究の一部を次年度に繰り越した。諸手続きに時間を要したため、発表や論文作成までの計画が全体に遅延したため。次年度で終了予定。次年度において解析に使用する記憶媒体等の購入を予定している。本年度は残された研究課題の内容を処理する予定である。
α-アミノ酸の自在合成を指向した触媒的化学選択的無保護アミノ基導入反応の開発

カルボン酸等価体のα-アミノ化反応によるN-無保護α-アミノ酸の合成法の効率的な合成法の開発を行なった。本反応の特徴1.デザイン型カルボン酸誘導体を用いることで、事前活性化が不要で変換反応も容易となり、従来法と比較して全合成プロセスの反応工程数の削減が可能2.従来法では適用困難であった、反応性の高いケトンやアルデヒド等の官能基存在下、目的の反応を化学選択的に進行させることが可能(化学選択性の逆転)であることである。触媒的な、直接無保護アミノ基導入反応は、報告例の無い新規反応であり、他の多くの反応開発へと適用可能で、有機合成化学分野におけるイノベーションを促進させるものである。申請者らのこれまでの「触媒制御型の化学選択的反応開発」と「デザイン型カルボン酸誘導体を用いた触媒的不斉反応」の知見を基盤とした、炭素&#8211;窒素結合形成反応(アミノ化反応)によるN-無保護α-アミノ酸の合成法の確立を目的とする。本反応の特徴は以下の通りである。1.デザイン型カルボン酸誘導体を用いることで、事前活性化が不要で変換反応も容易となり、従来法と比較して全合成プロセスの反応工程数の削減が可能2.従来法では適用困難であった、反応性の高いケトンやアルデヒド等の官能基存在下、目的の反応を化学選択的に進行させることが可能(化学選択性の逆転)3.アミノ基保護(一級アミン)のα-アミノ酸誘導体を直接得ることが可能触媒的な、直接無保護アミノ基導入反応は、報告例の無い新規反応である。また本コンセプトは他の多くの反応開発へと適用可能で、有機合成化学分野におけるイノベーションを促進させるものである。平成27年度は、目的に適したデザイン型カルボン酸誘導体の探索、Synergistic CatalysisとしてLewis酸(エノラート化)/遷移金属(ナイトレノイド生成)協働触媒系の探索を行い、二座配位型のデザイン型カルボン酸誘導体の特徴を生かし、他の高反応性のカルボニル化合物共存下において、デザイン型カルボン酸誘導体のα位選択的にアミノ化反応を進行させる条件の探索を行った。カルボン酸等価体として二座配位可能な活性アミドを中心に検討を行った結果、3,5-位にMe基を有するアシルピラゾールが最適であることを見出した。これはアシルピラゾールのアミドN上の不対電子対のカルボニルへの共鳴が抑えられているため、一般的なアミドに比べてα位の酸性度が高くなっていることに加え、金属中心に二座配位することでアミドの電子密度が低下するため、さらにα位の酸性度を高めることが可能となっていることに由来する。続いて、Lewis酸触媒と遷移金属触媒の組み合わせを様々検討を行ったところ、Cu(OTf)2が最適触媒であり、Lewis酸触媒としてアシルピラゾールを活性化するとともに、遷移金属触媒としてPhI=NTsからのナイトレノイドを生成するという、二つの機能を有する協働触媒として働いていることを見出した。新たに開発した本触媒系は、様々な官能基を有するカルボン酸から容易に誘導できるアシルピラゾールのα位アミノ化反応を促進し、Lithocholic AcidのLate-Stageアミノ化にも成功した。本触媒系の最も特徴的な性質は、分子内にケトンや、さらに酸性度の高いα位水素を有するニトロ基などの官能基が存在しても、アシルピラゾールのα位選択的にアミノ化反応が進行する点である。本研究成果はJ. Am. Chem. Soc.誌に発表し、2016年2月のMost Read Articlesに選ばれている。本触媒反応は、カルボン酸等価体のα位アミノ化という従来の炭素-炭素結合形成反応とは全く異なるアプローチでの非天然αアミノ酸合成法であり、本触媒反応の実現は世界的に大きく注目されているため、本研究課題は「当初の計画以上に進展している」と判断した。炭素-窒素結合形成反応(アミノ化反応)によるN-無保護α-アミノ酸の合成法の確立を目的として検討を行なった。目的に適したデザイン型カルボン酸誘導体の探索、Synergistic CatalysisとしてLewis酸(エノラート化)/遷移金属(ナイトレノイド生成)協働触媒系の探索を行い、二座配位型のデザイン型カルボン酸誘導体の特徴を生かし、他の高反応性のカルボニル化合物共存下において、デザイン型カルボン酸誘導体のα位選択的にアミノ化反応を進行させる条件の探索を行った結果、カルボン酸等価体として二座配位可能な活性アミドである3,5-位にMe基を有するアシルピラゾールが最適であることを見出し、触媒としてCu(OTf)2を、窒素化試薬として金属カルベノイド種を生成可能なPhI=NTsを用いる触媒系を開発することに成功した。

本触媒系の最も特徴的な性質は、分子内にケトンや、さらに酸性度の高いα位水素を有するニトロ基などの官能基が存在しても、アシルピラゾールのα位選択的にアミノ化反応が進行する点であ理、基質の酸性度を触媒によって逆転可能であることを示した重要な研究であると自負している。カルボン酸等価体のα-アミノ化反応によるN-無保護α-アミノ酸の合成法の効率的な合成法の開発を行なった。本反応の特徴1.デザイン型カルボン酸誘導体を用いることで、事前活性化が不要で変換反応も容易となり、従来法と比較して全合成プロセスの反応工程数の削減が可能2.従来法では適用困難であった、反応性の高いケトンやアルデヒド等の官能基存在下、目的の反応を化学選択的に進行させることが可能(化学選択性の逆転)であることである。触媒的な、直接無保護アミノ基導入反応は、報告例の無い新規反応であり、他の多くの反応開発へと適用可能で、有機合成化学分野におけるイノベーションを促進させるものである。平成28年度は、平成27年度の研究で達成できなかった(1)触媒的不斉反応への展開、(2)無保護一級アミノ基の導入反応に焦点を絞り検討を行う予定である。まず、再度、Lewis酸触媒と遷移金属触媒の組み合わせの検討を行い、より高活性な触媒系の探索を行うとともに、それぞれの金属に特徴的な不斉配位子を検討することで、高収率・高エナンチオ選択的に反応を促進することを目指す。Lewis酸触媒としては、金属触媒の他に、有機触媒も合わせて検討する予定である。さらに、アミノ化試薬として、直接無保護一級アミノ基を導入可能なDPH及びその誘導体を用いて反応の条件の検討を行う。これらの触媒系の再検討に加え、様々な官能基を有する天然・非天然のカルボン酸のαアミノ化によるαアミノ酸合成を行い、本触媒系の有用性を示すとともに、ライブラリー構築を行うことで、メディシナルケミストリーへの貢献も合わせて検討していく予定である。有機化学当初の想定よりも早く最適触媒を見出すことができたため、高価な遷移金属触媒の購入費が抑制できたため。平成28年度は、再度、ルイス酸触媒と遷移金属触媒のスクリーニングを行う予定であるため、それらの購入費として使用する。また、不斉触媒反応の検討も予定しているため、不斉配位子の購入費としても使用する予定である。さらに、平成27年度の研究で大きな成果を上げることができたため、研究成果の発表のための旅費として使用する予定である。