hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
イネ培養細胞における分化経路の制御に関する免疫組織化学的研究

1.前年度明らかにした、不定胚分化過程で特異的に発現する分子量25kD27kDの4個のタンパク質と、不定胚分化と不定芽分化過程で共通して発現する分子量43kD付近の2個のタンパク質のうち、比較的発現量の多い4個のタンパク質を、2次元電気泳動後のゲルから抽出、回収した。回収したタンパク質のN末端のアミノ酸配列をプロテインシークエンサーにより解析したところ、不定胚分化過程で特異的に発現する27kDのタンパク質のみアミノ酸配列を読むことができた。このタンパク質についての詳しい情報を得る目的で、回収したタンパク質をStaphylococcus aureusのproteaseで断片化したものをSDS-PAGE分離後分子量14.5kDと11.5kDの断片のN末端のアミノ酸配列を解析した。これら3種のアミノ酸配列についてホモロジーサーチを行ったところ、既知のタンパク質の中に高い相同性を示すタンパク質は存在せず、このタンパク質が新規のタンパク質である可能性が示唆された。2.不定胚分化に特異的に発現する分子量25kDと27kDの2個のタンパク質に対する抗血清をマウスを用いて作成し、その経時的変化について検討した。不定胚誘導培地に置床後218日目のカルスを用いてイムノブロッティングにより解析したところ、どちらのタンパク質も不定胚分化カルスに特異的に検出され2日目には既に発現していること、その後増加して15日頃までは発現量が高いが、18日目には減少することがわかった。また、レクチンを用いた解析により25kDのタンパク質はConAに結合する糖タンパク質であることが判明した。イネ培養細胞からの2つの分化経路の制御に関わるタンパク質を濃縮する目的で、以下の実験を行った。1.ニンジンと同様、不定胚分化に糖タンパク質が関与するかどうか明らかにするため、数種のレクチンを用いて不定胚分化誘導後の糖タンパク質の変化についてSDS-PAGEで調べたところ、ConA,SSA,及びAAAに結合する糖鎖を持つ分子量30kDの糖タンパク質が、不定胚分化過程で強く発現することがわかった。さらに、詳細な情報を得るため、2次元電気泳動による解析を行ったところ、ConAで染色される不定胚分化カルス特異的なスポット10個を検出できた。ConAで染色される糖タンパク質を濃縮する目的で、ConAをリガンドとするカラムを用いたアフィニティクロマトグラフィーを行った。カラムに吸着した不定胚分化誘導後7日目のタンパク質を74.3倍濃縮した結果、上述のスポットのうち4個のスポットを濃縮でき、また、それ以外に6個のスポットを新たに検出できた。2.Immunosubtraction法を考案し、分化経路の制御に関わるタンパク質の濃縮を図った。未分化カルスから抽出した全タンパク質でウサギに免疫処理して得た、抗血清をリガンドとしたカルムによるアフィニティークロマトグラフィーを行った。不定胚分化誘導後10日目あるいは不定芽分化誘導後10日目のカルスの全タンパク質をカラムに添加し、非吸着画分(再分化特異的タンパク質)を回収、濃縮した。2次元電気泳動による解析の結果、新たに、不定胚分化特異的スポット6個、不定芽分化特異的スポット2個、及び不定胚と不定芽分化に共通に出現するスポット1個を検出できた。以上のように、免疫学的手法を適用することにより、不定胚分化や不定芽分化誘導後に新たに発現する多くのタンパク質を検出することが可能となった。
天然鉱物(スメクタイト)を複合化した高精度歯科用レジンの開発

【目的】義歯床用レジンの表面は硬質で、義歯装着時に痛みを訴える患者には口腔内で褥瘡の発生が高い確率で診られる。われわれは、水分により粘弾性および膨潤性を示すスメクタイト(Sm)様化合物に着目した。そのSm様化合物を義歯床部で義歯床用レジンと複合化させると、唾液中の水分により粘弾性・膨潤性が増大し、結果として形状的不適合を改善すると考えられる。申請者は、義歯床用レジンとSm様化合物を複合化し、口腔内に適した複合化床部の表面硬さ、水分量に対する義歯の破壊強度の改善を試み、その組成分析を評価した。【研究計画】1)Sm様化合物粉末の合成Sm様化合物粉末の生成を確認するために、X線回折(XRD)による相同定を行った。2)試料の作製金型底部にSm様化合物粉末0.1、0.3、0.5、0.7、1.0gを入れ、その上からレジンを加えて重合を行い複合体の作製を行った。レーザ顕微鏡を用いて、Smの分布状態の観察を行った。3)物性評価物性評価は、曲げ強さ、曲げ弾性率および表面硬さを行い、日本工業規格T6501に準じて評価した。表面硬さは、ISO868デュロメータ硬さ試験法に準じて評価した。【研究成果】XRDにより、用いたSm様化合物は過去に報告されているSm様化合物と同様のピークパターンが認められた。レーザ顕微鏡分析から、Sm様化合物が粉末濃度によらず、レジン底面に均一に分布していることを確認した。また、水分を含むとSmがレジン表面に突出することを確認した。物性評価では、曲げ強さ、曲げ弾性率ともに、粉末濃度によらず、JIS規格内の値を示した。表面硬さ試験では、粉末濃度が多いほど表面硬さは低下したが、Controlと比較したが、優位差は認められなかった。以上の結果より、Sm様化合物粉末を複合化した床用レジンは、物性評価に問題なく、水分を含むことで粘弾性が増大することも明らかになり、臨床応用できる可能性が見出された。
平滑筋細胞におけるCa^<2+>による電位依存性カルシウムチャンネルの不活性化機構

本研究では、平滑筋細胞のCa^<2+>流入経路として最も重要な電位依存性Caチャネルの調節機構について、Ca^<2+>による不活性化機序を明らかにしようとした。得られた成果の概要は次の通りである。1.ムスカリン受容体或いはヒスタミン受容体を刺激すると、脱分極パルスで誘発したCaチャネル電流は、最初の一過性とその後の持続性成分からなる二相性に抑制される。二相性の抑制効果発現にリン脂質代謝が関与している可能性について、リン脂質代謝関連酵素を阻害することが知られているワルトマンニンやD609などの薬物を用いて検討した。その結果、一過性の抑制効果にはホスホリパーゼCが関与し、持続性の抑制効果にはホスホリパーゼC或いはホスホリパーゼD系のある酵素が関与していることが明らかとなった。2.Caチャネル電流の抑制効果の発現に細胞骨格が関与している可能性について、アクチン及び微小管細胞骨格の重合剤又は脱重合剤を用いて検討した。その結果、Caチャネルの活性は微小管の脱重合により促進性の、重合により抑制性の調節を受けること、ムスカリン受容体刺激による二相性の抑制効果発現には微小管の重合過程が関与することが示唆された。3.二相性の抑制効果発現にCaチャネルのリン酸化が関与する可能性について、プロテインキナーゼA、プロテインキナーゼG、プロテインキナーゼC及びカルモジュリン依存性ミオシン軽鎖キナーゼの阻害剤及び活性化剤を用いて検討した。その結果、どちらの抑制効果発現にもチャネルのリン酸化過程は関与していないことが示唆された。以上の成果は論文2編としてBritishi Journal of Pharmacologyに公表した。今後は、ムスカリン受容体刺激からチューブリンの重合に至る情報伝達過程及び重合したチューブリンがどのようにしてCaチャネルの抑制を発現させるのかを検討する予定である。平滑筋細胞のCa(カルシウム)流入経路として最も重要な電位依存性Caチャネルについて、その不活性化機構を明らかにしようとする本研究は、申請した機器が順調に稼働するまでに時間を要したために今年度の計画の一部を次年度計画分と入れ替えることになったものの、おおむね予定通りに進めることができた。(1)ムスカリン受容体或いはヒスタミン受容体の刺激によって、脱分極パルスで誘発したCaチャネル電流は抑制される。この抑制効果の発現にりん脂質代謝が関与している可能性について、りん脂質代謝関連酵素を阻害することが知られているワルトマニンやD609などの薬物を用いて検討した。その結果、受容体刺激の初期に起こる一過性の抑制効果とその後の持続性抑制効果のどちらの発現にも、ホスホリパーゼC或いはホスホリパーゼD系のある酵素が関与していることが明らかとなった。この成果はBritish Journal of Pharmacologyに公表した。(2)ムスカリン受容体刺激によるCaチャネル電流の抑制効果の発現については、微小管細胞骨格が関与してるか否かを微小管脱重合作用のあるコルヒシンや微小管安定化(重合)作用のあるタクソールなどを武器としてさらに検討した。その結果、Caチャネル活性は微小管の脱重合により促進性の、重合により抑制性の調節を受けていること、受容体刺激によるCaチャネル抑制効果の発現には微小管の重合過程が関与していることが分かった。この成果については、第124回日本獣医学会に発表し、さらに論文として投稿した。

(1)ムスカリン受容体を刺激すると、イノシトールリン脂質代謝が促進され、生成されたイノシトール三リン酸により細胞内CaストアからCa^<2+>が放出される。放出されたCa^<2+>は、脱分極パルスで誘発したCaチャネル電流を抑制する。この抑制効果の発現に細胞骨格が関与している可能性について、アクチン及び微小管細胞骨格の重合剤或いは脱重合剤を用いて検討した。その結果、Ca^<2+>によるCaチャネル電流の抑制には、微少管細胞骨格を形成するチューブリンの重合過程が関与することがわかった。(2)Ca^<2+>によるCaチャネル電流の抑制効果発現にCaチャネルのリン酸化が関与する可能性について、プロテインキナーゼA、プロテインキナーゼG、プロテインキナーゼC及びカルモジュリン依存性ミオシン軽鎖キナーゼの阻害剤或いは活性化剤を用いて検討した。その結果、抑制効果の発現にチャネルのリン酸化過程は関与していないことが示唆された。以上の成果はBritishi Journal of Pharmacologyに公表した。
Functional MRIを用いた視中枢および眼球運動中枢の研究

functional magnetic resonance imaging(fMRI)に代表される脳機能画像の登場により,最近ヒトの大脳における中枢機構の研究が可能となってきた.我々はこのfMRIを用いて,高次視覚機能である視覚による空間認知,また眼球運動機能について研究を行った.まず,従来困難であったMRI装置内で適切な視覚刺激を行うために,視覚刺激装置を改良した.すなわち,液晶プロジェクタからの画像をイメージガイドとアイピースを介して被検者に伝達可能とした.またこの刺激装置は両眼分離刺激も可能にした.この装置とコンピュータプログラムにより立体視などの高次視覚刺激も可能となった.この視覚刺激装置を用いて,以下のようなfMRIの実験を行った.まず立体視機能の関連中枢の同定のために,ランダムドットステレオグラムによる視覚刺激でfMRIを施行した.得られた画像データをstatistical parametric mapping(SPM)で統計処理し,上頭頂小葉および中側頭葉皮質(middle temporal area,MT野)に賦活部位が見出された.また上下・左右の周辺視野で視標をランダムに点灯させ被検者にその位置を認識させて,衝動性眼球運動および滑動性眼球運動で視標を追尾させたところ,衝動性眼球運動では上頭頂小葉に,滑動性眼球運動では上頭頂小葉とMT野に大脳賦活部位が見出された.一方,左右画面内で互いに接近・離反運動を繰り返す視標を呈示して被検者に輻湊運動させたところ,上頭頂小葉およびMI野に大脳賦活が認められた.以上の実験結果より視覚による空間認知には頭頂葉,特に上頭頂小葉が深く関与していることが示唆された.視覚刺激法の改良で,より複雑な刺激が可能となり,他の視野による空間認知についても実験を開始している.従来眼科で脳の活性を検出する方法としてvisual-evoked-potential(VEP)やpositoron emission CT(PET)が用いられてきたが、最近Functional MRIは脳の活動部位を局所脳血流の変化によってとらえる方法として注目されている。この方法で、色々な知覚刺激や運動負荷により脳の様々な中枢部位が同定されている。今回の研究ではFunctional MRIを用いて視覚中枢と眼球運動中枢について調べる。視覚中枢の最終的な役割は、両眼からの視覚情報を統合し立体視としての両眼視機能を得ることである。しかしMRI装置の磁場の影響のために、磁性体が含まれた刺激装置は用いることが困難で今までの視覚刺激は、主に閃光刺激のみとなり、複雑な刺激は非常に困難であった。よって今回の研究の主な目的である両眼視刺激を行うのには従来の方法では不可能である。このため本年度の費用で購入した視覚刺激装置を用いて、パーソナルコンピュータによる複雑な視覚刺激を行えるよう改良中である。具体的には両眼用の2つのアイピ-スに2台のパーソナルコンピュータからの視覚刺激を2台の液晶プロジェクターを介して独立して送り、この視覚刺激を融像刺激や立体視刺激として用いる。現在液晶プロジェクターと視覚刺激装置を光学的に結合させるように、光学部を作成中である。今後視覚刺激装置のシステムが完成次第、本格的な両眼刺激でのFunctional MRIに取りかかる予定である。また眼球運動に関しては、従来cine mode MRIで用いたきた視標装置を使用する予定でその至適条件を検討中である。functional magnetic resonance imaging(fMRI)に代表される脳機能画像の登場により,最近ヒトの大脳における中枢機構の研究が可能となってきた.我々はこのfMRIを用いて,高次視覚機能である視覚による空間認知,また眼球運動機能について研究を行った.まず,従来困難であったMRI装置内で適切な視覚刺激を行うために,視覚刺激装置を改良した.すなわち,液晶プロジェクタからの画像をイメージガイドとアイピースを介して被検者に伝達可能とした.またこの刺激装置は両眼分離刺激も可能にした.この装置とコンピュータプログラムにより立体視などの高次視覚刺激も可能となった.この視覚刺激装置を用いて,以下のようなfMRIの実験を行った.まず立体視機能の関連中枢の同定のために,ランダムドットステレオグラムによる視覚刺激でfMRIを施行した.得られた画像データをstatistical parametric mapping(SPM)で統計処理し,上頭頂小葉および中側頭葉皮質(middle temporal area,MT野)に賦活部位が見出された.また上下・左右の周辺視野で視標をランダムに点灯させ被検者にその位置を認識させて,衝動性眼球運動および滑動性眼球運動で視標を追尾させたところ,衝動性眼球運動では上頭頂小葉に,滑動性眼球運動では上頭頂小葉とMT野に大脳賦活部位が見出された.一方,左右画面内で互いに接近・離反運動を繰り返す視標を呈示して被検者に輻湊運動させたところ,上頭頂小葉およびMI野に大脳賦活が認められた.以上の実験結果より視覚による空間認知には頭頂葉,特に上頭頂小葉が深く関与していることが示唆された.視覚刺激法の改良で,より複雑な刺激が可能となり,他の視野による空間認知についても実験を開始している.今年度、本学のMRI装置であるGE社製HORIZONを用いて正常被検者の視覚中枢の活性を閃光刺激にて確認したが、得られた信号が統計学的にも脳の活性であることを証明するためにその信号を統計学的処理を行っている。

また今後、両眼視すなわち融像や立体視下での視覚刺激を行うためにfunctional MRI視覚刺激装置のイメージガイド部をさらに改良中であるが、MRI装置の性質上、改良を行っている視覚刺激装置のガントリ-に挿入する部分はすべて非磁性体にしなければならず現在適当な材料での部品を検討中である。また両眼視下での視覚刺激として最適条件を検討中である。すなわち融像刺激や立体刺激を撮像時間中にsteadyな刺激として行うのか、またある周期で呈示するon-off刺激として行うか、さらには立体映画のように画像パターンが絶えず変化する動画として行うのかを検討中である。また立体刺激における視差の大きさも検討中である。来年度からは斜視や弱視など両眼視機能異常の患者を選んでfunctional MRIを行い、視路を中心に異常と考えられる部位を検索する予定である。また眼球運動におけるfunctional MRIにても正常被検者を用いて様々な眼球運動、すなわち垂直および水平の衝撃性眼球運動、追従性眼球運動、輻湊開散運動を行わせ、その中枢または中間中枢を同定し、動物実験を用いた過去の報告と比較したい。視覚のfunctional MRIの際に,より適切な刺激が行えるように今年度は視覚刺激装置を大幅に改良した。具体的には,視覚刺激に用いるパーソナルコンピュータでプログラムされた任意の画像を液晶プロジェクターで投影し,投影された画像をfunctional MRI視覚刺激装置のイメージガイドを介して被検者に送ることができる。各二台のパーソナルコンピューター,液晶プロジェクターを用い,更にはアイピース部の改良により,両眼分離刺激による両眼視が容易に可能となった。この改良により視差を用いた立体視刺激をはじめとして,functional MRIにおける様々な刺激法が可能となった。この刺激装置により,今年度から視差刺激によるfunctional MRIを行い,立体視中枢部位の同定を行っている。視差のある立体写真やコンピュータプログラムで作成したランダムドットによる立体図形で刺激を行ったところ,大脳の頭頂葉角回付近に信号強度の増大が認められた。この画像データを画像解析したところ,統計学的にも極めて有意な大脳活性部位と判断された。そして,この部位は高次視覚中枢である視覚連合野の一つの頭頂連合野の一部と考えられ,頭頂連合野が立体視の中枢であることを示唆するものである。この結果は従来の動物実験や最近行われているpositrone emission CTでの報告とも一致する。装置の改良も含め,上記の研究成果を平成11年度の日本眼科学会で発表予定である。
スピン選別XAFS-磁性ナノ粒子の新しい状態分析法-

本研究は、磁性をもったナノサイズの粒子(磁性ナノ粒子)の磁気・電子構造の評価法として、「スピン選別XAFS分光」を確立することを目指したものである。目的達成には、強度の弱い遷移金属のKβスペクトルを、高感度かつ高分解能で測定できるX線発光分光器の開発がかかせない。1年目は、スピン選別XAFSやそれと関連の深い「共鳴X線非弾性散乱」を、標準物質について試験的に測定しながら、現有の分光器をナノ粒子のKβ発光測定用に改造した。標準物質の試験測定では、非弾性散乱を利用した高分解能化の限界を極めることに成功し、またLaMnO_3(単結晶)について「常磁性相中にも局所的な磁気秩序が存在する」という今後の磁性研究に大きなインパクトを与える結論を引き出すなど、予想を上回る成果が得られた。その一方で、放射光による放射線損傷がナノ粒子では顕著であり、現有分光器では「スピン選別XAFS」を精度良く測り得ないことが判明した。これをうけて2年目は、放射線が影響しない時間内で有意なスペクトルが測定できるよう、分光器を全面的に改造した(「孔雀型」分光器と命名)。これを用いて、ZnO上に分散したCuOナノ粒子の寿命幅フリー・高分解能XAFSを測定した結果、Cu濃度にして1%という低濃度試料についても寿命幅フリーXAFSを測定できた。さらに、基本的な超伝導体であるLa_<2-x>Sr_xCuO_4について類似の測定を行ったところ、プリエッジと呼ばれる部分が配位状態に敏感であることを見いだした。分光器の感度について十分な感触が得られたので、酸化鉄や鉄フェライトのスピン選別XAFSを、「孔雀型」分光器で測定しなおした。その結果、試料損傷の影響がほとんどないデータを得ることに成功した。現在、スペクトルの理論的解析を行いながら、論文にまとめている最中である。本研究は、磁性をもったナノサイズの粒子(磁性ナノ粒子)の磁気・電子構造の評価法として、「スピン選別XAFS分光」を確立することを目指すものである。そのためには、強度の弱い遷移金属のKβスペクトルを、高感度かつ高分解能で測定できるX線発光分光器の開発がかかせない。本年度は、1.これまで共鳴X線非弾性散乱の計測に用いてきた現有の分光器を、ナノ粒子のKβ発光測定用に改造することと、2.スピン選別XAFSやそれと関連の深い「X線非弾性散乱」を、標準物質について試験的に測定することに主眼をおいた。分光器の改良は順調に進行し、すでに磁性ナノ粒子(ZnFe_2O_4)について予備的測定を行っている。少数スピン選別XAFSに特にはっきりとした粒径による違いが観測され、その評価法としての有用性が確認された。現在、成果を論文にまとめている最中である。先行して行った標準物質の試験測定では、放射光施設の性能向上のおかげで、予想を上回る成果が得られた。非弾性散乱を利用した高分解能化について、その効果の限界をきわめられた一方(論文1)、広いエネルギー領域に亘る非弾性散乱測定から得られる知見についてまとめることができた(論文2)。さらに微分測定という、高感度測定の新たな可能性を探ることもできた(論文3)。LaMnO_3(単結晶)のスピン選別XAFS測定からは、「常磁性相中にも局所的な磁気秩序が存在する」という、今後の磁性研究に大きなインパクトを与える結論が得られた(論文4)。

本研究は、磁性をもったナノサイズの粒子(磁性ナノ粒子)の磁気・電子構造の評価法として「スピン選別XAFS」を確立することを目指すものである。スピン選別XAFS分光では、強度の微弱な遷移金属のKβスペクトルを高感度かつ高分解能で測定する必要がある。そのためには、放射光の利用と、Kβ発光を高感度かつ高分解能で測定できる分光器の開発が欠かせない。ところが残念なことに、昨年度の研究で、放射光による試料の放射線損傷が無視できぬこと、特にナノ粒子においてその影響が顕著であることが判明した。これを受けて本年度は、放射線が影響しない時間内で有意なスペクトルが測定できるよう、分光器を全面的に改造した(論文2)。この分光器は、球面湾曲結晶を共通の方位角(135°)上に多数配置し、高感度で集光分光を行うものである。全体の形状が孔雀を連想させたので、「孔雀型」分光器と命名した。この分光器を用いて、まずZnO上に分散したCuOナノ粒子の寿命幅フリー・高分解能XAFSを試験的に測定した。結果、「孔雀型」分光器を用いることで、Cu濃度にして1%という低濃度試料についても、寿命幅フリーXAFSを測定できた(論文2)。さらに、基本的な超伝導体であるLa2_<2-x>Sr_xCuO_4について類似の測定を行い、プリエッジと呼ばれる部分が配位状態に敏感であることを見いだした(論文1)。高感度化について十分な感触が得られたので、酸化鉄や鉄フェライトのスピン選別XAFSを孔雀型分光器で測定しなおした。結果、試料損傷の影響のほとんどないデータが得られた。現在、論文にまとめている最中である。以上と平行して、スピン選別XAFSについての理解を深めるため、多重散乱理論によるスペクトル解析にも着手した(論文3)。さらに、上記の成果を含む、X線発光分光に関するレビューを、教科書「内殻分光」の中で分担執筆した(図書1)。
超親水性ケイ酸アルミニウムナノチューブを用いたポリマー系複合材料の生体機能高度化

本研究は、無機イオン(カルシウム、ケイ酸イオン)を徐放することで骨形成を促進し、いかなる形状にも対応できる柔軟性と延伸性を付与した人工骨材料の作製をめざしたものである。高い延伸性を示すポリヒドロキシアルカノエートにシロキサン含有炭酸カルシウム粒子を分散して繊維化し、これを骨格とする綿状構造体を作製した。さらにその繊維表面に親水性のケイ酸アルミニウムナノチューブ(イモゴライト)を被覆することに成功した。この材料は、適度なカルシウムイオンとケイ酸イオンを徐放し、蛋白質吸着性、細胞接着性に優れることが明らかとなり、順調に骨芽細胞様細胞の増殖が進むことが示された。本研究は、ケイ素含有炭酸カルシウム(SiCC)/PHA複合材料を繊維化し、これを骨格とする綿状構造体としたものを基材とし、さらにその繊維表面に親水性のケイ酸アルミニウムナノチューブ(イモゴライト)を被覆して、機能を高度化させるものである。本年度は先ず、それらの構造を制御する方法を検討した。1.SiCC粒子の作製:アミノプロピルトリエトキシシランを含む液を用いて炭酸ガス化合法でSiCC粒子を生成させた。SiCC粒子中にはバテライトが520 nmのラメラ状一次粒子として含有され、そのc面にはシロキサンが配位していること、またシロキサンがバテライトを安定化し、生理緩衝溶液中での溶解を律速することを明らかにした。合成の際、SiVの前駆体内部でシラン源の縮合とバテライトの結晶化が並進し、上述の一次粒子構造の生成に寄与することを見出した。また、炭酸ガス化合法における溶媒中の炭酸イオンの溶存性に着目し、これを調節することにより、SiCC中のバテライト一次粒子のc面配向制御ができることを見いだした。2.イモゴライトの作製と評価:(1)イモゴライトの組成を変化させるべく諸条件を調整したが、化学量論組成から大きく変化させることは難しかった。得られたイモゴライトの親水性はいずれも非常に高く有意差は見られなかった。(2)イモゴライトの生体親和性をMC3T3-E1細胞を用いて培養試験により評価した。初期接着性が高いが、増殖性には影響がないことが示された。(3)Lysozyme吸着性の評価を試みたが、多量のイモゴライトを準備するのが難しく、有意差を確認できなかった。さらに検討を続ける。3.綿玉状構造体の作製: SiCCを用いて、P(3HB-co-4HB)との複合材料を作製し、電界紡糸法で約510μmの繊維径の綿玉状構造体に成形することができた。今後さらに繊維径を太くする条件を検討する。昨年度は、ケイ素含有炭酸カルシウム(SiCC)粒子の作製およびこれを用いたP(3HB-co-4HB)との複合材料を作製し、電界紡糸法で約510μmの繊維径の綿状構造体に成形した。本年度は、綿状構造体へのイモゴライト被覆法について検討した。電界紡糸法によりSiCC/P(3HB-co-4HB)綿状構造体を作製した。繊維径は平均約16 μmであった。繊維表面には溶媒の揮発孔とSiCCと思われる粒子が確認された。イモゴライトを分散した水溶液を用いて被覆を試みたが、被覆は難しかった。一方、当初計画した電着法は、膜形状ならば有望であるが、綿状構造では、得策ではない。そこで、P(3HB-co-4HB)をシリカとハイブリッド化して親水性が向上するか調査した。アミノプロピルトリエトキシシランの添加によりアミド結合を介したハイブリッド化に成功し、接触角は約20°減少したが十分な親水性とは言えない状況であった。そこで、イモゴライトをエタノールに分散した溶液を用意し、ディップ法によりコーティングを行った。SEMレベルでは処理前後の表面形態に違いは見られなかったが、EDS分析により処理したサンプルにて、イモゴライトに由来するAl元素の存在が確認された。綿状構造体に水滴を落下させたところ、処理していない試料では水滴が10分以上浸透しなかったのに対して、ディップコーティング後では5秒以内に浸透した。SiCC/P(3HB-co-4HB)複合体表面が親水化に成功したことがわかった。本年度はディップ法によるコーティング条件の抽出に時間を要し、細胞培養試験やタンパク吸着試験を十分に検討するところまでには至らなかった。しかし、条件検討は完全に終了したので、次年度には本研究の目標を達成できる見込みである。本研究は、『ケイ素含有炭酸カルシウム(SiCC)/P(3HB-co-4HB)複合材料を繊維化し、これを骨格とする綿状構造体としたもの』を基材とし、さらに『その繊維表面に親水性のケイ酸アルミニウムナノチューブ(イモゴライト)を被覆』して、機能を高度化させるものである。昨年度までに、電界紡糸法で平均約15 &#181;mの繊維径の複合体を作製し、これへのイモゴライト被覆に成功した。本年度は、タンパク吸着試験、およびマウスおよびヒト骨芽細胞様細胞を用いたイモゴライト被覆型綿状構造体への初期接着性・増殖性について観察した。Lysozymeの吸着量を調べたところ、12 hでコーティング物に有意差が出た。その後、コーティングしていないものも24 hまでに吸着量が大きく増加した。

細胞接着性については、無血清培地中では有意差は見られなかったのに対し、血清含有培地中ではイモゴライトコーティング物で有意に高い値を示した。また、培地浸漬7 d後のATR-FTIRスペクトルでは、アミド結合に由来するピークが強く現れた。このことから、多くのタンパク質の存在が示唆された。イモゴライトが細胞接着性のタンパク質を吸着したことで接着性が向上したと考えられた。両試料とも培養期間に伴い細胞数が増加し、コーティングの有無による細胞増殖率への影響は見られなかった。一方、キャスト膜試料上にて増殖性評価を行った際には、コーティング無よりも有意に高い細胞数及び増殖率が確認された。ナノレベルでの表面粗さ、及び材料表面の親水性が細胞増殖性に寄与することが報告されているが、キャストフィルム状ではその効果が顕著に現れたものの、綿状構造体では接着面できる表面が様々な形態であり、また3次元的な気孔構造を有することなど、多くの因子の影響によって細胞増殖性の向上に有意差が出なかったと考えられた。本研究は、無機イオン(カルシウム、ケイ酸イオン)を徐放することで骨形成を促進し、いかなる形状にも対応できる柔軟性と延伸性を付与した人工骨材料の作製をめざしたものである。高い延伸性を示すポリヒドロキシアルカノエートにシロキサン含有炭酸カルシウム粒子を分散して繊維化し、これを骨格とする綿状構造体を作製した。さらにその繊維表面に親水性のケイ酸アルミニウムナノチューブ(イモゴライト)を被覆することに成功した。この材料は、適度なカルシウムイオンとケイ酸イオンを徐放し、蛋白質吸着性、細胞接着性に優れることが明らかとなり、順調に骨芽細胞様細胞の増殖が進むことが示された。繊維表面の親水化が大きな鍵であったが、本年度の検討で極めて容易にかつ十分な親水化を達成できることがわかった。昨年度からの課題であったタンパク吸着と細胞培養試験については、これまで疎水性の強い試料での実験を進めなければならなかったため進んでいないが、繊維の親水化が可能となったことで大きく進捗できると期待される。無機材料・物性タンパク吸着性試験、およびマウスおよびヒト骨芽細胞様細胞を用いたイモゴライト被覆型綿状構造体への初期接着性・増殖性・分化能・石灰化についての観察を実施する。イモゴライト被覆の効果としては、おそらくは、初期接着性で大きな差が出るものと期待される。増殖性に大きな差はなくても、結果としては骨形成が早まる可能性がある。また、SiCCからのケイ酸イオンの徐放が増殖性や分化能・石灰化を早めることが期待される。これらの効果が区別できるよう実験系を組み、それぞれの役割を明らかにし、細胞培養試験の結果で有効性を判断することとしたい。時間的な余裕があれば、小動物への埋入実験で有効性を検証するところまで進めたい。目的として設定した項目について順調に結果が出ていると判断する。とくに、ケイ素含有炭酸カルシウムの構造解析についてはかなり進んだと思われる。一方、イモゴライトの組成制御については当初計画のような制御は容易ではなく、また組成を変化させても親水性に大きな違いが出ないことがわかった。また、タンパク吸着の実験方法を見直す必要もある。以上を総合的に見て、「おおむね順調に進展している」と判断した。本年度は親水性向上のための方策を見いだすことに注力し、当初計画したタンパク吸着性試験、細胞培養試験で十分な結果を得るところまで進んでいない。本年度の実験で再度確認が必要な部分を次年度に実施するため、その費用を確保する。
犬の難治性がんにおけるがん幹細胞の特性解析とがん幹細胞標的治療法の基盤構築

がん幹細胞は、自己複製能、多分化能、免疫不全マウスにおける高い腫瘍形成能を示す細胞集団と定義され、がん発症だけでなく、がん進展、再発、転移に重要な役割を果たすだけでなく化学療法に抵抗性を示すため、がん幹細胞を標的とした治療戦略は必要不可欠と考えられている。本研究は、極めて病態進行が早く、効果的な治療法がない犬の難治性がんを対象とし、難治性がんのがん幹細胞の同定を行い、薬剤ライブラリーを用いてがん幹細胞の自己複製能を抑制する阻害剤を抽出し、がん幹細胞移植モデルマウスにおける抗腫瘍効果を評価した。その結果、mTOR阻害剤の抗癌幹細胞効果を明らかにし、獣医医療に有用な候補治療薬として同定された。近年、薬剤や放射線に低感受性を示すがん幹細胞を標的とした新規治療法の開発に向けて取り組まれている。本研究では極めて病態進行が早く、効果的な治療法がない難治性がんを対象とし、獣医療におけるがん幹細胞標的療法の基盤を構築することを目的としている。犬の乳がん幹細胞集団は、1)sphere(浮遊細胞塊)assay、2)がん幹細胞表面マーカー(CD44, CD24、CD133)解析、3)幹細胞の特性である色素排出能を利用したside population(SP)解析、4)アルデヒド脱水素酵素(ALDH)活性を用いたaldefluor assayを用いて効率よく濃縮できる。平成26年度は、犬の乳癌の癌幹細胞標的治療の臨床試験に向けて、がん幹細胞の自己複製能に着目し、まずはじめに自己複製能を標的とした低分子標的薬のin vitroスクリーニングを遂行した。sphere assayを用いたin vitroスクリーニングでは、化合物ライブラリー(333種、文部科学省)を用いて、最終濃度10nM, 100nM, 1μM, 10μM添加時におけるCTBpおよびCNMpのsphere形成を抑制する化合物をスクリーニングし、低濃度でsphere形成を阻害する化合物22種(PI3K/Akt/mTOR経路セリン・スレオニンキナーゼ阻害剤、受容体型チロシンキナーゼ阻害剤、HDAC阻害剤、プロテアソーム阻害剤、Hsp90阻害剤など)を同定した。次に、抽出した化合物のin vivo抗腫瘍効果を評価するために、犬乳癌移植モデルマウスへの投与を行った。現在、実験中であり、詳細な解析を行っている。また抽出された化合物の薬剤感受性についてはがん幹細胞に加え、非がん幹細胞(がん細胞)においても評価を進めている。近年、抗がん剤や放射線に低感受性を示す、がん幹細胞を標的とした新規治療戦略の開発が取り組まれている。本研究は、極めて病態進行が早く、効果的な治療法がない犬の難治性がん(炎症性乳癌、メラノーマ、横紋筋肉腫など)を対象とし、獣医療における難治性がんのがん幹細胞標的療法の基盤を構築することを目的とし、がん幹細胞の特性解析を実施した。犬の炎症性乳癌では、in vitroスクリーニングで抽出した候補阻害剤compound Aの抗腫瘍効果を検討した。犬の乳癌幹細胞移植モデルマウスを作出し、compound A単独投与群、抗がん剤カルボプラチン投与群、compound Aおよびカルボプラチン併用投与群、対照群に分け、抗腫瘍効果を検討した結果、compound A単独投与群および併用投与群において他の群よりも腫瘍抑制効果が認められた。現在、抗腫瘍効果のメカニズムの解析を進めている。犬の口腔内メラノーマでは、メラノーマ株化細胞6株を対象に、sphere assay、幹細胞マーカーによる細胞表面抗原解析、aldefluor assayを実施し、犬のメラノーマ幹細胞の存在を明らかにした。現在、がん幹細胞集団が濃縮されているsphere形成細胞を用いて、in vitroおよびin vivoにおける間葉系細胞への分化能を検討し、がん幹細胞の分化誘導療法の開発に向けて取り組んでいる。犬の横紋筋肉腫では、株化細胞2株を対象に、犬の炎症性乳癌のin vitroスクリーニングで抽出された数種の候補阻害剤を用いてsphere形成細胞における薬剤感受性試験を行った。その結果、炎症性乳癌と同様に、横紋筋肉腫においてもがん幹細胞の自己複製能を阻害することが明らかとなった。本年度の研究成果は概ね順調である。in vitroスクリーニングで得られた候補阻害剤を用いて乳癌幹細胞移植モデルマウスを用いてin vivoスクリーニングが実施でき、候補阻害剤の抗腫瘍効果を検討することができた。in vitroスクリーニングで得られた候補阻害剤を用いて、炎症性乳癌だけでなく、横紋筋肉腫におけるがん幹細胞の薬剤感受性も評価でき、癌幹細胞の自己複製能を標的とした阻害剤を見出すことができた。がん撲滅に向けて、抗がん剤や放射線に低感受性を示す、がん幹細胞を標的とした新規治療法の開発が世界的に取り組まれている。本課題研究は、極めて病態進行が早く、効果的な治療法がない犬の難治性がん(炎症性乳癌、メラノーマ、横紋筋肉腫など)を対象とし、獣医医療における難治性がんのがん幹細胞標的治療法の基盤を構築することを目的とし、がん幹細胞の特性解析を行った。犬の炎症性乳癌およびメラノーマのがん幹細胞の特性解析は、主に平成26および27年度に実施し、平成28年度以降は、主に横紋筋肉腫の肉腫幹細胞を対象に行った。犬横紋筋肉腫細胞株2株を対象に、成長因子存在下低接着培養による3次元spehre assayを実施し、自己複製能を有する細胞集団(sphere;肉腫幹細胞)を同定した。sphereおよび2次元培養に接着細胞(対照細胞集団)について未分化関連遺伝子(oct-4、nanog、sox-

2、CD133)のRT-PCR解析、免疫不全マウスの皮下移植による腫瘍形成能、抗がん剤(ビンクリスチン、ミトキサントロン、ドキソルビシン)の感受性等の特性を行い、sphere形成細胞において横紋筋肉腫幹細胞が濃縮されていることが明らかとなった。さらにこれまでのin vitroスクリーニングにより得られた分子標的阻害剤を用いて横紋筋肉腫幹細胞の自己複製能を評価した結果、炎症性乳癌と同様に、横紋筋肉腫においてもがん幹細胞の自己複製能を阻害することを明らかにした。がん幹細胞は、自己複製能、多分化能、免疫不全マウスにおける高い腫瘍形成能を示す細胞集団と定義され、がん発症だけでなく、がん進展、再発、転移に重要な役割を果たすだけでなく化学療法に抵抗性を示すため、がん幹細胞を標的とした治療戦略は必要不可欠と考えられている。本研究は、極めて病態進行が早く、効果的な治療法がない犬の難治性がんを対象とし、難治性がんのがん幹細胞の同定を行い、薬剤ライブラリーを用いてがん幹細胞の自己複製能を抑制する阻害剤を抽出し、がん幹細胞移植モデルマウスにおける抗腫瘍効果を評価した。その結果、mTOR阻害剤の抗癌幹細胞効果を明らかにし、獣医医療に有用な候補治療薬として同定された。本年度の研究成果は概ね順調である。まずsphere assayを用いて犬乳癌におけるがん幹細胞の自己複製能を阻害する低分子化合物(既知化合物)を多種類抽出することができ、さらに一部の化合物に対しては犬乳癌モデルマウスにおける抗腫瘍効果について実験中であるが、期待される成果が得られる可能性が高い。研究計画通り実施する予定である。炎症性乳癌におけるin vitroスクリーニングにより候補阻害剤は数多く得られており、残りの阻害剤についても継続して抗腫瘍効果を検討する。また、抗腫瘍効果のメカニズムも詳細な解析を通じて明らかにする予定である。さらに、癌幹細胞の自己複製能を標的した治療法開発だけでなく、癌幹細胞の分化誘導に向けた治療法開発にも取り組む。28年度が最終年度であるため、記入しない。分子腫瘍学研究計画通り遂行する予定である。in vitroスクリーニングで抽出された既知化合物が乳癌だけでなく、多くのがん幹細胞(横紋筋肉腫、骨肉腫、メラノーマなど)においても自己複製能を阻害するかどうか詳細に検討する予定である。また標的シグナルについても共同研究者とともに詳細に解析を進めていく予定である。乳癌モデルマウスに形成された腫瘍組織中に含まれる癌幹細胞の割合を免疫組織化学染色により評価する予定であったが、これまで市販されていた抗体が販売中止になり、抗体の選定に時間を有したため、次年度に繰り越しした。当機関に類似した機器が先に導入されたため、計画していた機器の購入を断念した。その代わり、本研究に必要不可欠な初代細胞および株化細胞、腫瘍新鮮凍結材料(遺伝子およびタンパク質発現解析)、症例血液(遺伝子検査)のストックの増数が見込まれたため超低温フリーザーを購入したが、残額は使用しきれず繰越した。
被災高齢者の中長期的な精神・身体・社会的健康についての研究

世界中で自然災害が繰り返し起こりその度に多くの健康被害が発生している。震災後の精神的健康被害の研究は多いが、被災前の健康水準などの状況を考慮しておらず、また、身体的な機能・社会的な活動に注意が払われていない。加えて、震災後1年程度の研究が多く、中長期の被害・健康推移については明らかにされていない。高齢者は「災害弱者」に分類されるが、高齢者固有の研究はほとんどない。本研究では世界でも稀な自然実験デザインで、東日本大震災前の人々のつながりが被災後の健康保持に寄与していたことを明らかにした岩沼市の全高齢者を対象とする縦断研究を継続し,被災5年後の精神・身体・社会活動の推移を把握し、健康保持と回復・悪化に関連する要因を明らかにし,人々のつながりなどソフト面からの被災前後での減災対策を提言する。地域高齢者の健康と社会的決定要因についてのコホート研究であるJAGESプロジェクトのこれまでの調査の後続調査として行う。今回の調査で得られたデータを震災前調査(2010-2011年)および震災後調査(2012-2013年)のデータと結合させることで、震災前情報、および震災後(短期、中長期)の推移を把握できるデータセットを作成する。これを用いて、被災高齢者における、中長期的な、精神・身体の健康および社会活動などの推移を記述すると共に、それらに関連する要因を明らかにする。上記の調査は、予定通り2016年度に実施した。集まったデータを、解析するために、データベースを作成する必要がある。現在そのデータベースを作成しているところである。2016年度に予定していた調査は、予定通り実施することができた。これまで大災害震災後の精神的健康被害の研究は多いが、以下に記すような多くの限界があった。1)被災後1年程度までのフォローアップの研究がほとんどである。2)精神面の健康ばかりが注目され、「身体の健康(機能)」がフォローされていない。3)被災者の「震災前の情報」が利用可能ではないために、震災の影響を適切に評価できていない。4)災害弱者に分類される「高齢者」に注目した研究がない。東日本大震災後の日本をみれば明らかなように、大震災による影響は1年程度ではまったく解消されない。また、震災が影響を及ぼすのは、メンタルヘルスだけではない。震災前のデータが利用可能でなければ、震災前から病気があったのかどうかの区別が極めて困難である。高齢者は、若年者と違い虚弱であり、健康影響の被害が生じやすい。これらの限界を超えるべく、本研究課題では、東日本大震災前の人々のつながりが被災後の健康保持に寄与していたことを明らかにした岩沼市の全高齢者を対象とする縦断研究を継続し分析を行った。2017年度は、2016年度に実施した調査データの分析を行う予定である。2017年度は、解析に必要なデータベースを作成し、分析を行い、学会・論文発表を行う。公衆衛生学当初の計画よりも物品の購入や調査費用を抑えることができたため。2017年度、分析および情報収集に活用する。
NASHにおける肝線維化と肝内マクロファージ活性化における組織線溶因子の役割

本研究では、1NASHにおける肝臓線維化が病態悪化の主因であるか随伴病態であるかを高脂血症マウスと線溶関連因子のノックアウトマウスを用いて、四塩化炭素によるNASH誘導モデルを用いて組織線維化の程度を調節することで解析する、2NASHにおいてはメタボリック症候群などで潜在的に活性化している肝内マクロファージが腸内細菌などによる暴露でさらに活性化してしまうことが原因とされてきているが、線溶因子が影響するかを1で使用したマウスの肝内マクロファージや骨髄細胞由来マクロファージを用いて解析する、3線溶因子がNASHに関連している場合、線溶因子の薬剤投与による調節でNASHの治療や予防の可能性を1で使用するマウスで探索する、ことを目的としている。本年度は、Wtマウス、L-/-/A-/-マウスを24週齢で安楽死させ、肝臓と血液を採取し各種マーカーや組織学的形態変化を検討した。Wtマウスと同様、高脂血症モデルであるL-/-/A-/-マウスにおいて、肝臓における組織学的変化は全く認めず、血清中の肝臓障害マーカーにおける変化も認めなかった。NASHを誘発するために四塩化炭素を用いることが一般的に行われているが、効果発現には時間がかかるため様々な誘導を行っているので、本年度は肝内マクロファージをBCGにより賦活化し、その後四塩化炭素を投与することで効果的に肝内病変を誘導することが出来るか試みた。BCG非投与群におけるWtマウスとL-/-/A-/-マウスを比較した場合、L-/-/A-/-マウスにおいてやや症状発現が促進されていることが判明し、この発現時期と発現状態はBCG投与によって大幅に促進されることが判明した。今後はこのモデルをベースとして各遺伝子の機能を解析していく予定である。昨年度に続き、四塩化炭素の腹腔内投与による肝臓線維化の進展をBCGによるプライミングや遺伝子組み換えマウスであるL-/-/A-/-マウスを用いて検討した。その結果、12週間の四塩化炭素投与ではWtマウス、L-/-/A-/-マウス間で顕著な差が得られなかったが、BCGによるプライミングは四塩化炭素の肝臓線維化を相乗的に増強することを見出した。また、他の薬剤による肝障害及び肝臓線維化の影響をアセトアミノフェンの自発経口摂取によって四塩化炭素と同様に検討したところ、Wtマウスに比べてL-/-/A-/-マウスの肝障害が増強されていた。一方BCGのプライミングによって肝障害は減弱されており、この点は四塩化炭素とは逆の結果が得られた。今後は四塩化炭素用いての線維化に関して、線溶因子の欠損状態をWtマウス及びL-/-/A-/-マウスに導入したマウスで行い、NASHにおける線溶因子の機能を解析していく予定である。またアセトアミノフェンの投与用量を決定し、四塩化炭素と同様に解析する予定である。本年度は、Wtマウス、L-/-/A-/-

マウスにおける非刺激状態での肝臓障害の有無の組織学的及び血清学的検討を行うことと、NASH誘発のための四塩化炭素の投与量及び投与期間などを検討したが、L-/-/A-/-マウスにBCGを投与することで大幅に四塩化炭素の効果の発現を増強することが見いだせた。本研究では、1NASHにおける肝臓線維化が病態悪化の主因であるか随伴病態であるかを高脂血症マウスと線溶関連因子のノックアウトマウスを用いて、四塩化炭素によるNASH誘導モデルを用いて組織線維化の程度を調節することで解析する、2NASHにおいてはメタボリック症候群などで潜在的に活性化している肝内マクロファージが腸内細菌などによる暴露でさらに活性化してしまうことが原因とされてきているが、線溶因子が影響するかを1で使用したマウスの肝内マクロファージや骨髄細胞由来マクロファージを用いて解析する、3線溶因子がNASHに関連している場合、線溶因子の薬剤投与による調節でNASHの治療や予防の可能性を1で使用するマウスで探索する、ことを目的としている。本年度は、Wtマウス、L-/-/A-/-マウスを24週齢で安楽死させ、肝臓と血液を採取し各種マーカーや組織学的形態変化を検討した。Wtマウスと同様、高脂血症モデルであるL-/-/A-/-マウスにおいて、肝臓における組織学的変化は全く認めず、血清中の肝臓障害マーカーにおける変化も認めなかった。NASHを誘発するために四塩化炭素を用いることが一般的に行われているが、効果発現には時間がかかるため様々な誘導を行っているので、本年度は肝内マクロファージをBCGにより賦活化し、その後四塩化炭素を投与することで効果的に肝内病変を誘導することが出来るか試みた。BCG非投与群におけるWtマウスとL-/-/A-/-マウスを比較した場合、L-/-/A-/-マウスにおいてやや症状発現が促進されていることが判明し、この発現時期と発現状態はBCG投与によって大幅に促進されることが判明した。今後はこのモデルをベースとして各遺伝子の機能を解析していく予定である。昨年度に続き、四塩化炭素の腹腔内投与による肝臓線維化の進展をBCGによるプライミングや遺伝子組み換えマウスであるL-/-/A-/-マウスを用いて検討した。その結果、12週間の四塩化炭素投与ではWtマウス、L-/-/A-/-マウス間で顕著な差が得られなかったが、BCGによるプライミングは四塩化炭素の肝臓線維化を相乗的に増強することを見出した。また、他の薬剤による肝障害及び肝臓線維化の影響をアセトアミノフェンの自発経口摂取によって四塩化炭素と同様に検討したところ、Wtマウスに比べてL-/-/A-/-マウスの肝障害が増強されていた。一方BCGのプライミングによって肝障害は減弱されており、この点は四塩化炭素とは逆の結果が得られた。今後は、現在までに確立したL-/-/A-/-マウスへのBCG投与並びに四塩化炭素投与による肝臓障害の誘導を基本モデルとして確立することとともに、さらなる実験系の検討を行う予定である。また、当初の目的の通り、確立したNASH誘発方法を線溶因子の欠損状態をL-/-/A-/-マウスに導入したマウスで行い、NASHにおける線溶因子の機能を解析していく予定である。今後は四塩化炭素用いての線維化に関して、線溶因子の欠損状態をWtマウス及びL-/-/A-/-マウスに導入したマウスで行い、NASHにおける線溶因子の機能を解析していく予定である。
フランスにおける指導力不足教員への対応-機能回復制度を中心に-

○研究発表平成16年6月5日、上越教育大学で開催された日本教育経営学会第44回大会にて、「フランスにおける指導力不足教員への対応-機能回復制度を中心に-」と題して研究発表を行った。この研究発表において、教員の機能回復制度について、その歴史や目的、制度運営の基本原則等を明らかにするとともに、機能回復制度の運営において中心的な役割を果たす国立遠隔教育センターにおける機能回復の具体的な内容をまとめた。そして、フランス国民教育省による機能回復制度に関する2001年度の調査報告書その他資料を分析して、十分に職責を果たすことができない状態に至った教員の機能回復制度を利用申請の状況、制度利用後の教育現場への復帰や職場転換など、機能回復期間を終えた教員への対応の方策等機能回復制度の運用実態を明らかにすることを通して、機能回復制度の意義を検討した。○研究のまとめ機能回復制度について、その制度的な概要をまとめて「フランスにおける病気休職を経た教員のための機能回復制度の概要」と題する論文を(第42号)に掲載した。また、機能回復制度運用について、特に、遠隔教育センターにおける機能回復制度の在り方と制度運用の実態をまとめ、「フランスにおける教員の機能回復制度運用の実態」と題する論文を『高松大学紀要』(第43号)に掲載した。また、本研究課題のまとめとして、研究報告書を作成した。平成14年度は、フランスにおける指導力不足教員のための機能回復制度について、その制度的な枠組みを理解するために、法制度及び制度の運用の概要について、まず国内において、文献資料の収集・分析を行った。フランス本国における調査としては、平成15年3月20日から平成15年3月31日までフランスに滞在し、フランス国立教育研究所等で文献資料の調査を行った。また、オルレアン大学区人事部のドミニク・コステル氏及びクレテイユ大学区人事部のシミュラ氏及びクレルク氏に対して、面接調査を行った。特に、オルレアン大学区人事部においては、指導力不足教員に対する機能回復制度のみならず、人的資源の管理の在り方、オルレアン大学区及びフランス全土における、指導力不足教員による機能回復制度の運用実態やその問題点について聞き取り調査を行うとともに、制度の実態を把握するための統計資料を得ることができた。また、機能回復制度を利用する教員の転職先としての国立遠隔教育センターの概要や指導力不足教員が教育職を離れて行政職へ転じるための方策等についても調査することができた。これらの成果は、平成15年度に、研究発表を行う予定である。○研究発表平成15年10月4日、上越教育大学で開催された日本教師教育学会第13回大会にて、「学習指導に困難を有する教員への対応-フランスの機能回復制度の概要と運用-」と題して研究発表を行った。この研究発表において、教員の機能回復制度の概要として、機能回復制度の定義、機能回復制度を支える組織、機能回復の為の研修組織-特に国立遠隔教育センターにおける機能回復-の具体的な制度的枠組みを明らかにした。また、教育現場への復帰や職場転換など、機能回復期間を終えた教員への対応の方策を明らかにした。そして、フランス国民教育省による機能回復制度に関する2001年度の調査報告書を分析して、制度の運用の実態を明らかにすると共に、制度の運用上の課題を明らかにした。○海外実地調査平成16年3月に、フランス本国において機能回復制度に関する実地調査を行った。・フランス国立遠隔教育センターヴァンヴ(Vanves)支局訪問機能回復のための主要研修場所である同支局において、機能回復の為のシステムや機能回復期間にある教員の職務状況をインタビュー調査した。・オルレアン-トゥール大学区人事局人事担当者から、機能回復制度の現状と機能回復制度が抱える運用上の問題点等についてインタビュー調査を行った。