hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ビューシーケンスに基づくロボットの経路誘導と環境表現

ビューシーケンスとは,移動ロボット搭載のカメラから見た眺望(ビュー)を並べた画像列である.本研究では建物の屋内自律走行を目指し,ビューシーケンスを用いた環境地図表現,実時間の環境認識および経路誘導手法を開発した.(1)ビューシーケンスによる環境地図の表現法の開発人間の操縦による教示走行時に,時系列的かつ自動的にロボットがビューを得て,画像を平滑化および縮小することで効率良くビュー画像を生成することにより,画像に基づく新たな視覚的環境表現を生成する手法の開発を行なった.この環境表現は生成が容易であり,実際の屋内の経路を表現するのに適したものである.(2)ビューのマッチングによる環境認識手法の開発相関演算に基づきビューのマッチングをリアルタイムでロバストに行なう手法を開発した.マッチングの結果としては,ビューの水平・垂直移動量,およびパターン変化が得られ,それらを用いることによりロボットの現在位置や変化領域(走行時の障害物)の検出等の環境認識を行なうことができる.(3)経路誘導手法の開発ビューのマッチングの結果からロボットのとるべき行動(直線走行,コーナーリング)や制御量(操蛇角,進行速度)を決定し,経路に沿った走行を行なう手法を開発した.以上の手法を総合することにより,教示走行時に生成したビューシーケンスを用いて,ティーチングプレイバック方式による自律走行の実現した.ビューシーケンスとは,移動ロボット搭載のカメラから見た眺望(ビュー)を並べた画像列である.本研究では建物の屋内自律走行を目指し,ビューシーケンスを用いた環境地図表現,実時間の環境認識および経路誘導手法を開発した.(1)ビューシーケンスによる環境地図の表現法の開発人間の操縦による教示走行時に,時系列的かつ自動的にロボットがビューを得て,画像を平滑化および縮小することで効率良くビュー画像を生成することにより,画像に基づく新たな視覚的環境表現を生成する手法の開発を行なった.この環境表現は生成が容易であり,実際の屋内の経路を表現するのに適したものである.(2)ビューのマッチングによる環境認識手法の開発相関演算に基づきビューのマッチングをリアルタイムでロバストに行なう手法を開発した.マッチングの結果としては,ビューの水平・垂直移動量,およびパターン変化が得られ,それらを用いることによりロボットの現在位置や変化領域(走行時の障害物)の検出等の環境認識を行なうことができる.(3)経路誘導手法の開発ビューのマッチングの結果からロボットのとるべき行動(直線走行,コーナーリング)や制御量(操蛇角,進行速度)を決定し,経路に沿った走行を行なう手法を開発した.以上の手法を総合することにより,教示走行時に生成したビューシーケンスを用いて,ティーチングプレイバック方式による自律走行の実現した.ビューシーケンスとは,移動ロボット搭載のカメラから見た眺望(ビュー)を並べた画像列である.本研究では建物の屋内自律走行を目指し,ビューシーケンスを用いた環境地図表現,実時間の環境認識および経路誘導手法を開発した.(1)ビューシーケンスによる環境地図の表現法の開発人間の操縦による教示走行時に,時系列的かつ自動的にロボットがビューを得て,画像を平滑化および縮小することで効率よくビュー画像を生成することにより,画像に基づく新たな視覚的環境表現を生成する手法の開発を行なった.この環境表現は生成が容易であり,実際の屋内の経路を表現するのに適したものである.(2)ビューのマッチングによる環境認識手法の開発相関演算に基づきビューのマッチングをリアルタイムでロバストに行なう手法を開発した.マッチングの結果としては,ビューの水平・垂直移動量,およびパターン変化が得られ,それらを用いることによりロボットの現在位置や変化領域(走行時の障害物)の検出等の環境認識を行なうことができる.(3)経路誘導手法の開発ビューのマッチングの結果からロボットのとるべき行動(直線走行,コーナーリング)や制御量(操蛇角,進行速度)を決定し,経路に沿った走行を行なう手法を開発した.以上の手法を総合することにより,教示走行時に生成したビューシーケンスを用いて,ティーチングプレイバック方式による自律走行の実現した.
睡眠障害が競技パフォーマンスを低下させる機序の解明とその改善法の開発

本研究では、1睡眠質が競技パフォーマンスに及ぼす影響、2睡眠質が低下する機序、3睡眠質の低下がもたらす競技パフォーマンスの低下を改善する方法を検討した。睡眠質は比較的強度の高い運動中の認知機能に影響を与えることが示された。また、メタボロミクスによる網羅解析にて、睡眠質の低下にはカルノシンやオルニチンなどの代謝産物の低下が関与する可能性が示された。さらに、カルノシン含有のイミダゾールジペプチドの摂取により睡眠改善と競技パフォーマンス向上の可能性が示された。アスリートが試合や競技会などで最高の競技パフォーマンスを発揮するには、睡眠が重要であると考えられる。これまでに、睡眠時間や睡眠質の低下が競技パフォーマンスに関連する身体機能を低下させることは明らかにされているが、そのメカニズムは不明な点が多い。本年度は、アスリートにおける睡眠と睡眠によって変化する代謝産物の関連を横断的に検討することを目的として研究を行った。バレーボールを専門とする若年の女性アスリートを対象に、睡眠質を睡眠測定システム(NemuriSCAN)により測定し、睡眠効率を算出した。NemuriSCANより得られた睡眠効率の中央値を基準に、対象を睡眠効率の高いアスリート(高睡眠効率群)と睡眠効率の低いアスリート(低睡眠効率群)に分けて検討したところ、睡眠時間に両群間の差は認められなかったが、睡眠効率は低睡眠効率群に比べて高睡眠効率群で有意に高いことが示された。また、朝に採取した唾液サンプルを用いて、睡眠中の代謝産物の変化をメタボローム解析にて網羅的に評価した。その結果、尿素サイクルやTCAサイクルに関わるオルニチン、シトルリン、アルギニン、プロリン、チロシン、α-オキソグルタル酸の値が低睡眠効率群に比べて高睡眠効率群で有意に高く、尿素の値は高睡眠効率群で有意に低いことが明らかになった。これらのことから、睡眠質が高いと老廃物の除去に関連するアンモニアや糖の代謝を促進させる可能性があることが示唆された。アスリートにおいて、睡眠は競技パフォーマンスを維持・向上するために重要な役割を果たしている。これまでに断眠や睡眠時間の短縮により、競技パフォーマンスが低下することが報告されている。さらに、睡眠時間だけではなく、就寝前の高照度光照射は睡眠質を低下させ、起床後の競技パフォーマンスを低下させることも示されている。しかし、その機序についてはほとんど明らかにされていない。本年度は、高照度光照射による急性の睡眠障害(睡眠質の低下)で変動する代謝産物をメタボローム解析にて網羅的に評価し、睡眠質の低下に関連する代謝産物を探索することを目的として研究を行った。睡眠障害のない健常男性を対象に、睡眠質を低下させる高照度光照射条件と正常睡眠(対照条件)の2条件を、環境が制御されたカロリーメーター室にてランダムに行った。睡眠質の評価として、睡眠中における睡眠ポリグラフ検査(PSG)と起床時の主観的な睡眠を内省するOSA睡眠調査票を行った。高照度光照射条件では、対照条件と比較し、PSGにて評価した入眠潜時が有意に延長した。また、高照度光照射条件におけるOSA睡眠調査票の疲労回復の得点が有意に低い値を示した。これらのことから就寝前の高照度光照射により、睡眠質が低下する可能性が示唆された。さらに、起床後における尿サンプルをメタボローム解析によって網羅的に評価し、両条件間で比較検討した。その結果、高照度光照射条件では対照条件と比較し、5-Hydroxylysine、Allo-threonineの値が有意に高く、N-Acetylleucine、Ornithine、Carnosineの値が有意に低いことが明らかとなった。これらのことから、就寝前の高照度光照射による急性の睡眠障害(睡眠質の低下)は、タンパク新生やアミノ酸生成、抗酸化作用に影響を与え、疲労回復を低下させる可能性が示唆された。本年度は計画通りに、高照度光照射によって急性的に睡眠質を低下させた時に変動する代謝産物をメタボローム解析にて検討し、タンパク新生、アミノ酸生成、抗酸化物質に関連する物質が睡眠質低下の影響を受ける可能性が示唆された。このように、睡眠質を低下させた介入研究により、睡眠質の低下に関連する可能性のある候補物質が検出されたことから、本研究はおおむね順調に進展していると考えられる。アスリートにおいて、睡眠は競技パフォーマンスを維持・向上するために重要な役割を果たしているが、その機序や改善法については十分に明らかにされていない。本研究課題では、まず睡眠前の光照射は睡眠質を低下させることを明らかにした。さらに、睡眠質低下によって変動する代謝産物をメタボローム解析にて網羅的に探索したところ、睡眠質の低下はタンパク新生、アミノ酸生成、抗酸化物質産生に影響し、カルノシンやオルニチンなどの代謝産物の変化と関連することが明らかになった。そこで平成28年度は、カルノシン含有のイミダゾールジペプチドに着目し、イミダゾールジペプチド摂取が競技パフォーマンスに及ぼす影響を検討した。大学男子バドミントン選手を対象に、1週間のイミダゾールジペプチド摂取もしくはプラセボ摂取の2条件を、1週間のウォッシュアウト期間を設け、クロスオーバーで順番をランダムに実施した。イミダゾールジペプチドもしくはプラセボの摂取中、被験者は通常のトレーニングと日常生活を行い、各条件の前後にて、バドミントンのサービステストによる競技パフォーマンスを評価した。その結果、バドミントン選手におけるイミダゾールジペプチドの摂取は、バドミントンのサービス成功率を向上させる可能性が示唆された。このことから、アスリートにおける1週間のイミダゾールジペプチドの摂取は、競技パフォーマンスを向上させる可能性が示唆された。

本研究では、1睡眠質が競技パフォーマンスに及ぼす影響、2睡眠質が低下する機序、3睡眠質の低下がもたらす競技パフォーマンスの低下を改善する方法を検討した。睡眠質は比較的強度の高い運動中の認知機能に影響を与えることが示された。また、メタボロミクスによる網羅解析にて、睡眠質の低下にはカルノシンやオルニチンなどの代謝産物の低下が関与する可能性が示された。さらに、カルノシン含有のイミダゾールジペプチドの摂取により睡眠改善と競技パフォーマンス向上の可能性が示された。本年度は計画通りに、アスリートを対象に睡眠が代謝産物に及ぼす影響をメタボローム解析にて検討し、睡眠質はアンモニア代謝や糖代謝に影響を与える可能性を見出した。これらの成果からも伺えるように、本研究はおおむね順調に進展していると考えられる。これまでに、就寝前の高照度の光照射により、OrnithineとCarnosineの産生が低下することが示された。このことから、これらの物質を補給することでパフォーマンスの低下を抑制できる可能性が考えられる。そこで、最終年度は睡眠質の低下により不足している物質(Carnosine、Ornithineなど)をサプリメントにより補給することで、競技パフォーマンスに関連する身体機能が改善するか否かについて検討する予定である。さらに、これまでの研究成果をまとめて、睡眠障害が生じた際の競技パフォーマンス向上のためのコンディショニング法を提案する。28年度が最終年度であるため、記入しない。スポーツ医学今後は、当初の計画通りに研究を推進させる予定である。具体的には、急性の睡眠障害(睡眠質の低下)による代謝産物などの変化を同一被験者にて縦断的に検討することを予定している(介入研究での検討)。
分子レベルでのヒトT細胞サーキットの制御機構とその臨床的意義の解析

我々はCD4ナイーブ及びメモリーT細胞機能の鍵となる表面分子のCD27,CD26分子に焦点を当てて、これら分子のヒトT細胞サーキットの制御機構を明らかとすることを目的としている。今回はCD26分子の免疫調節制御機構についての成果を報告する。CD26分子はメモリーT細胞に選択的に発現され、N末端から2番目のプロリンのC末端側ペプチド結合を切る酵素であるDPPIV酵素活性を含んでいる。ケモカインの多くはN末端から2番目がプロリンであることからCD26/DPPIVの基質と成りうる。そこで、CD26/DPPIVとケモカインの相互作用がリンパ球遊走及びHIV感染に及ぼす影響を検討した。野生型可溶性CD26(DPPIV+)の存在下でRANTESによるT細胞の遊走が増加した。しかし変異型可溶性CD26(mCD26)では遊走亢進は認められなかった。このようにCD26/DPPIVはRANTESによるT細胞の遊走を亢進させた。RANTESとsCD26を反応させ、アミノ酸配列を検討したところN末端の2番目のプロリンのところで切断された。RANTESとCD26/DPPIVとの相互作用のM-tropicウイルスの細胞侵入における影響については、RANTESのみの場合と比較して抑制作用の変化は認められなかった。RANTES同様にSDF-1αとsCD26を反応させ、アミノ酸配列を検討したところ、N末端の2番目のプロリンのC末端側で切断された。この様にRANTES,SDF-1αともにCD26/DPPIVの基質であることが明らかになった。SDF-1αとCD26/DPPIVの相互作用がT-tropicウィルス感染における影響を検討した。SDF-1αによるHIVの細胞侵入の阻害はsCD26を添加することによりその阻害活性は失われた。さらに、リンパ球遊走能の亢進作用も消失した。この様にCD26/DPPIVはin vivoにおいてHIV感染や炎症反応を制御する分子として重要であることが示唆された。我々はCD4ナイーブ、CD4メモリーT細胞の鍵となる細胞表面分子のCD27,CD26分子に焦点をあててこれらの分子のヒトT細胞サ-キットでの制御機構を明らかとすることを目的としている。今回はCD27分子の免疫調節制御機構についての我々の成果を報告する。CD40はTNF受容体族の分子でT細胞依存性B細胞活性化に重要な役割を果たしているが、CD27もCD40分子と同じくTNF受容体族に属する分子であるが、最近B細胞の抗体産生に関与していることを明らかにした。我々はCD27とそのリガンドのCD70及びCD40とそのリガンドのCD154との相互作用のB細胞増殖、イミノグロブリン産生細胞への分化における役割を検討した。CD40とそのリガンドのCD154との相互作用と異なり、CD27シグナルはB細胞増殖へはほとんど関与していないが、イミノグロブリン産生においてはCD40シグナルよりはCD27シグナルが主たる役割を果たしていることを明らかにした。次にCD27とそのリガンドであるCD70分子の自己_...抗原混合反応(AMLR)活性化T細胞の機能発現への役割を検討した。CD27シグナルは自己抗原混合反応によるT細胞活性化及びPWM刺激によるB細胞イミノグロブリン

産生を抑制する調節性T細胞の誘導に必須であることが明らかとなった。さらにCD4+CD45RA+ナイーブT細胞上に発現しているCD27はAMLRで活性化された結果、CD4+CD45ROメモリーT細胞上に発現されるCD27リガンドであるCD70とB細胞上のCD27の相互作用を干渉することにより抑制作用を発揮する可能性が考えられた。一方CD8細胞もこの系で抑制作用を誘導するのに必要であるがその抑制作用を発揮するにはCD4細胞と異なりCD27シグナルは関与していないことが明らかとなった。我々はCD4ナイーブ及びメモリーT細胞機能の鍵となる表面分子のCD27,CD26分子に焦点を当てて、これら分子のヒトT細胞サーキットの制御機構を明らかとすることを目的としている。今回はCD26分子の免疫調節制御機構についての成果を報告する。CD26分子はメモリーT細胞に選択的に発現され、N末端から2番目のプロリンのC末端側ペプチド結合を切る酵素であるDPPIV酵素活性を含んでいる。ケモカインの多くはN末端から2番目がプロリンであることからCD26/DPPIVの基質と成りうる。そこで、CD26/DPPIVとケモカインの相互作用がリンパ球遊走及びHIV感染に及ぼす影響を検討した。野生型可溶性CD26(DPPIV+)の存在下でRANTESによるT細胞の遊走が増加した。しかし変異型可溶性CD26(mCD26)では遊走亢進は認められなかった。このようにCD26/DPPIVはRANTESによるT細胞の遊走を亢進させた。RANTESとsCD26を反応させ、アミノ酸配列を検討したところN末端の2番目のプロリンのところで切断された。RANTESとCD26/DPPIVとの相互作用のM-tropicウイルスの細胞侵入における影響については、RANTESのみの場合と比較して抑制作用の変化は認められなかった。RANTES同様にSDF-1αとsCD26を反応させ、アミノ酸配列を検討したところ、N末端の2番目のプロリンのC末端側で切断された。この様にRANTES,SDF-1αともにCD26/DPPIVの基質であることが明らかになった。SDF-1αとCD26/DPPIVの相互作用がT-tropicウィルス感染における影響を検討した。SDF-1αによるHIVの細胞侵入の阻害はsCD26を添加することによりその阻害活性は失われた。さらに、リンパ球遊走能の亢進作用も消失した。この様にCD26/DPPIVはin vivoにおいてHIV感染や炎症反応を制御する分子として重要であることが示唆された。
動脈硬化性巣における新規血管新生調節因子バソヒビンの発現様式と病的意義の解明

頚動脈プラークにおいて、新規血管新生調節因子であるバソヒビン-1は、正常血管内膜と比較して発現量は有意に多く、動脈硬化と関連する炎症性マーカー(ICAM-1、VCAM-1)の発現との間に強い相関関係がみられた。免疫組織学的検討では、血管内皮細胞に特異的な分子であるCD31と同じくプラーク内の新生血管内皮細胞に発現していることを確認した。本研究により、頚動脈プラークの不安定化にバソヒビン-1が強く関与している可能性を示した。頚動脈狭窄症における不安定プラークの分子イメージングおよび分子標的薬の創薬を将来的な目標として、新規血管新生調節因子バソヒビンの頚動脈プラークにおける発現とその意義を明らかにすることが本研究の目的である。平成25年度の研究計画においては、頚動脈狭窄症患者に対する内膜剥離術で摘出されたヒト頚動脈プラークを用いて、プラークの不安定性とバソヒビンの発現様式の関連を明らかにすることとした。平成25年度の研究でこれまでに以下の事実が明らかとなった。RT-PCRによりヒト頚動脈プラークにおいてバソヒビン-1の発現を定量的に評価し、免疫組織化学的手法によりプラークにおける発現分布を確認した。動脈硬化巣においてバソヒビン-1の発現が確認されたのは本研究が初めてである。更に発現分布を詳細に検討することによって、一つの標本内において、線維性成分の豊富な部分、すなわちプラークの安定化と関連性の高い部分では、バソヒビン-1の発現は軽度であり、逆に、プラーク内出血や粥腫などプラークの不安定性に関与する部分の周辺では発現が高度である傾向を確認した。しかし、不安定プラークを有する症候性患者と安定プラークを有する無症候性患者を対象に、バソヒビン-1の発現様式・発現量などの特徴を利用して識別可能か否か、症例を蓄積して比較検討したが、結果的にはバソヒビン-1の発現は症候性患者と無症候性患者群で有意な差を認めなかった。平成24年度の研究計画においては、頚動脈狭窄症患者に対する内膜剥離術で摘出されたヒト頚動脈プラークを用いて、バソヒビンの発現様式を明らかにすることを目標とした。平成24年度の研究でこれまでに以下の事実が明らかとなった。RT-PCRによりヒト頚動脈プラークにおいてバソヒビン-1の発現を、免疫組織化学的手法によりプラークにおける発現分布をそれぞれ確認した。更に発現分布を詳細に検討することによって、一つの標本内において、線維性成分の豊富な部分、すなわちプラークの安定化と関連性の高い部分では、バソヒビン-1の発現は軽度であり、逆に、プラーク内出血や粥腫などプラークの不安定性に関与する部分の周辺では発現が高度であることを明らかにした。現在、不安定プラークを有する症候性患者と安定プラークを有する無症候性患者を、バソヒビン-1の発現様式・発現量などの特徴を利用して識別可能か否か、症例を蓄積して比較検討している。いずれにしても、平成24年度の研究成果として、ヒト動脈硬化巣において新規血管調節因子バソヒビン-1の発現を明らかにし、更に、プラーク内における特徴的な発現の局在を明らかにできたことは、最終目標である不安定プラークの分子イメージングや分子標的治療につなげるうえで極めて重要な成果といえる。不安定プラークの分子イメージングおよび分子標的薬の創薬を将来的な目標として、新規血管新生調節因子バソヒビンの頚動脈プラークにおける発現とその意義を明らかにするために研究を行い、以下の結果を得た。頚動脈動脈硬化巣におけるバソヒビン-1の発現をRT-PCR法によって検討すると、正常の血管内膜に発現しているバソヒビン-1と比較して有意に多く発現していた。また、ICAM-1、VCAM-1といった動脈硬化と関連する各種の炎症性マーカーの発現との関連を検討したところ、バソヒビン-1の発現と強い相関関係がみられ、バソヒビン-1と動脈硬化との関連が強く示唆された。バソヒビン-1の頚動脈プラーク内での発現部位について、免疫組織学的手法を用いて検討した。血管内皮細胞に特異的な分子であるCD31と二重染色を行ったところ、CD31と同じくプラーク内の新生血管内皮細胞に発現していることが確認された。以上より、頚動脈狭窄症においてバソヒビン-1の発現が亢進しており、プラークの不安定化に関与している可能性が示唆された。頚動脈内皮細胞の培養細胞を用いた実験では、センダイウィルスを用いてバソヒビン-1遺伝子のノックダウンを試みたが、ウィルスの導入効率が悪く、有効な検討はできなかった。

またVEGFに対する中和抗体を使用し、VEGF刺激下でのバソヒビン-1の発現量について比較を試みたが、安定した結果が得られなかった。ラットの頚動脈動脈硬化モデルを用いて、ラットの動脈硬化巣でのバソヒビン-1の発現をRT-PCR法を用いて検討したが、定量の評価に十分なRNAを採取することができず、こちらも有効な検討ができなかった。なおバソヒビン-2についても同様に頚動脈動脈硬化巣における発現を検討したが、免疫染色において発現が十分に見られず、RNAの定量評価においても十分な発現量が見られなかったため、研究は中断した。脳神経外科学バソヒビン-1については予定通り研究が進んでいるが、バソヒビン-2については現在までのところ免疫組織学的手法を試みたが、ヒトプラークでの発現が確認できなかったため当初の計画からやや遅れている。ヒト頚動脈プラークにおけるバソヒビン-1発現の解析により、発現量および発現様式は明らかになったが、現在までのところ、不安定プラークの診断に応用可能なバソヒビン-1発現の特徴を明らかにするまでには至っていないため、当初予定していたウサギ大動脈プラークを利用した検証には進めていない。バソヒビン-1については予定通り研究が進んでいるが、バソヒビン-2については現在までのところ免疫組織学的手法を試みたがヒトプラークでの発現が確認できなかったため当初の計画からやや遅れている。これまでの研究より、ヒト頚動脈プラークにおいて、バソヒビン-2お発現は確認出来なかった。今後は、バソヒビン-1を中心に研究を進める。具体的には、以下の研究を進める方針である。1ヒト頚動脈プラーク標本の比較検討を蓄積し、プラークの不安定化におけるバソヒビン-1役割を明らかにする2血管内皮の培養細胞を用いた、バソヒビン-1のRNAによるノックダウン実験を行い、各種血管新生因子への内皮細胞の反応を検証し、バソヒビン-1の血管内皮細胞への作用機序を明らかにする。バソヒビン-2の発現が確認できない原因が、免疫組織化学的な手法によるものか、そもそもヒトプラークで発現がないのか、抗体の調整やRT-PCRを併用することで早急に確認する。バソヒビン-2の発現がないという結果になれば、バソヒビン-1に絞って、標本の比較検討を蓄積し、プラークの不安定化における役割を明らかにする。これまでの研究成果を踏まえ、バソヒビン-2に対する研究が一時中断しているため、当初の研究計画で予定していたバソヒビン-2研究に要する試薬等の支出が余剰となった。バソヒビン-2に関する研究の再開に伴い、次年度に使用する予定である。該当なし
脳性小児麻痺治療薬脳指向性エリスロポエチン含有PLGAナノスフェア製剤の開発

本研究は、脳性小児麻痺治療薬を目指したエリスロポエチン含有乳酸・グリコール酸共重合体(PLGA)ナノスフェア製剤の開発を目的とした。本研究では、エリスロポエチンの大量投与による副作用の発現を回避するため、エリスロポエチンの徐放性製剤化を行った。徐放性製剤化による副作用回避に加え、PLGAのガラス転移点で製剤調製を行うことにより、表面構造の改善および比表面積の低下が認められ、初期バーストの抑制、血液脳関門透過性の向上が認められたことから、本製剤は脳性小児麻痺治療薬として有用な製剤となりうる可能性が示唆された。平成25年度は、脳性小児麻痺治療薬を目指したエリスロポエチン含有乳酸・グリコール酸共重合体(PLGA)ナノスフェア製剤の調製方法について検討を行った。本研究室の従来法に従い、w/o/wエマルション型エリスロポエチン含有PLGAナノスフェアを調製し、整粒性に富んだ表面構造の滑らかな粒子を得た。さらに、従来法に加えて外水相にキトサンまたはカチオン性界面活性剤を添加することで非添加製剤より小さな粒子径を有する粒子を得ることに成功し、特にキトサンが最も良好であった。次に、脳移行性の評価としてBBBキットを使用しBBB透過性の確認を行った。マイクロスフェアよりもナノスフェアはより高いBBB透過性を示し、キトサン添加ナノスフェアはキトサン非添加ナノスフェアと比較し有意に高いBBB透過性を示した。今後、粒子のゼータ電位の測定を行い、キトサンを添加したことによる表面電荷の変化を確認予定である。表面電荷の確認により、キトサン添加によって表面電荷が変化した結果、細胞内取り込み効果が高まることを予想している。また、薬物の徐放化を目的に低濃度で血中濃度を維持するための本研究における製剤開発で重要なことは、投与初期の薬物放出を抑制し副作用を軽減することにあり、薬物の初期放出の抑制の工夫の一つとしてPLGAの自己修復作用を利用した製剤調製を行った。乳化後の撹拌過程においてガラス転移点以上の温度で撹拌を行うことで、粒子表面に生じる微細な細孔が閉鎖し、薬物放出が抑制されることを見出した。自己修復作用を利用した製剤は、SEM画像撮影により粒子表面の細孔が減少していること、薬物放出試験により初期放出が抑制されていることを確認した。自己修復作用を利用して薬物の初期放出が抑制できた事実は、今後の徐放性製剤開発への応用が期待できると考える。平成26年度は、脳性小児麻痺治療薬を目指したエリスロポエチン含有乳酸・グリコール酸共重合体(PLGA)ナノスフェア製剤の調製時にPLGAの自己修復作用を応用したガラス転移点で溶媒留去を行うという新たな調製方法を用いることで初期バーストを抑制し、脳移行性を向上することができる事実を見出した。ナノスフェアの調製は、w/o/wエマルション型溶媒留去法を用い、使用するPLGAのガラス転移点で外水相を保温して調製を行った。自己修復エリスロポエチン含有PLGAナノスフェアは、整粒性に富んだ表面構造の滑らかな粒子を得た。自己修復を行った製剤の初期バーストは、自己修復を行わなかった製剤のそれと比較して低値を示した。この理由として、粒子表面構造の小さな凹凸が減少したことおよび比表面積が減少したことにより、粒子からの安定した低濃度での薬物放出をもたらしたことが示唆された。さらに、自己修復を行った製剤は自己修復を行っていない製剤よりも高いBBB透過性を示し、キトサン添加製剤はキトサン非添加製剤と比較し有意に高いBBB透過性を示した。自己修復により粒子表面構造が滑らかになったこと、キトサン添加により粒子表面に正電荷が付加されたことが、BBB透過性を高めたと考えられる。本開発製剤は、エリスロポエチン含有徐放性製剤の一つの剤形を提案するものであり、その高い脳移行性から脳性小児麻痺治療薬としての有効性が期待できる。また、自己修復を応用した調製方法による初期バースト抑制と脳移行性向上、キトサン添加による脳移行性向上という本研究で得られた知見は、今後のタンパク含有徐放化製剤開発への応用が期待できる。医療薬学・製剤学本研究室の従来法に従った実験であり、w/o/wエマルション型エリスロポエチン含有PLGAナノスフェアの調製が早期段階で可能であった。さらに、予備実験ですでに確認していた外水相にキトサンまたはカチオン性界面活性剤を添加することで非添加製剤より小さな粒子径を有する粒子が得られることについては、本研究により再現性が確認でき、実験計画の導入部分に大きな問題がなかった。w/o/wエマルション型エリスロポエチン含有PLGA

ナノスフェアを調製し、外水相にキトサンまたはカチオン性界面活性剤を添加することで30-100nmの整粒性に富んだ表面構造の滑らかな粒子を得ることに成功した。キトサン添加w/o/wエマルション型エリスロポエチン含有PLGAナノスフェアは、キトサン非添加製剤と比較し、高いBBB透過性を示した。薬物の初期放出の抑制の工夫の一つとしてPLGAの自己修復作用を利用した製剤調製を行い、乳化後の撹拌過程においてガラス転移点以上の温度で撹拌を行うことで、粒子表面に生じる微細な細孔が閉鎖し、薬物放出が抑制されることを見出した。平成25年度はin vitroにおける製剤調製と調製製剤の脳移行性の評価を終了したことから、研究計画はおおむね順調に進捗していると判断した。平成26年度の研究計画・方法は、以下の通りである。平成25年度はほぼ予定通りに研究が進捗していることから、当初の計画通りの内容を実施予定である。平成26年度は、平成25年度にin vitroで行った実験について動物を用いて検証する。まず一つ目は、動物体内での薬物動態を評価するため血中濃度の測定を行う。二つ目は、分子イメージングを利用し、製剤を皮下投与後、粒子の脳内分布について検証する。三つ目は、低酸素性・虚血性脳症(HIE)モデル動物を使用し水迷路課題による学習能改善評価と脳組織切片を用いた免疫染色による脳保護作用を検証する。以上、3項目について検証を行い、平成26年度は本研究の最終年度として2年分の研究成果を報告である。当初平成25年度に予定していたナノスフェアの調製回数を減らすことができたので、調製回数の減少に伴いエリスロポエチンの購入量が減少したため。平成26年度は、動物実験におけるエリスロポエチン含有ナノスフェア製剤の体内動態や薬効評価を行う。よって、主に動物・試薬代に使用し、研究成果発表のための学会参加のための旅費に使用する。平成26年度使用予定の156万円のうち、物品費に100万円、旅費に40万円、その他に16万円を使用する予定である。
共役イミンへの多段階反応を基軸とする新規合成反応の開発

研究期間全体としては、イミンの潜在能力をフルに活用し、α位に電子求引基を有するイミン誘導体の極性転換共役付加反応を含む異常付加を探索した。また、オキシムあるいはヒドラゾン誘導体の窒素原子上での置換反応を基盤としたタンデム反応等の各種多段階反応の探索と、グリシンタイプ1トランスポーターの効率的合成へ展開した。すなわち、α位に電子求引基を有するオキシムおよびヒドラゾン誘導体に対し、窒素原子上でのSN2型の求核置換反応を活用して窒素原子に二つの異なる置換基を導入し、イミニウム塩に変換した後に第三の求核剤と反応させ、一挙に三種類の置換基の導入が可能であることを明らかにした。特に最終年度は以下の2項目で顕著な成果を得た。(1)N-トリメチルシリル-α-イミノエステルを用いる極性転換反応:出発物としてN-シリル-α-イミノエステルを用いることで望みのN上への付加が円滑に進行することを見出した。また、種々の有機金属反応剤や基質への適用範囲も広く、窒素上に様々な置換基を導入することができた。さらに、極性転換反応に続く求電子付加反応によりN,N-ジアルキル化が進行することも見出し、この性質を利用して、極性転換反応に続く分子内環化反応にも成功した。この分子内環化反応は、反応温度およびTNSOTfの添加により位置選択制を制御することができた。(2)α-N,N-ジ置換ヒドラゾノエステルを用いる極性転換反応:α-ヒドラゾノエステルに対する極性転換反応において、Nアルキル化に続く分子内アミド化反応が進行し、アトムエコノミーにα-アミノアミドの合成に成功した。更に、不斉プロトン化を活用し高ジアステレオ選択的にα-アミノアミドの合成に成功した。応用として、α-ヒドラゾノエステルに対する極性転換反応を用いたグリシンタイプ1トランスポーターの全合成を検討し、高収率で目的化合物を得ることができた。α位にエステル、チオエステル、ニトリル、アミド、ケトン、リン酸エステルなど電子求引部位を有する各種イミンに対して有機金属試薬を作用させることによりC-アルキル化体の生成を抑制し、N-アルキル化された中間体のα-メタロアミン生成の選択性を向上させることができた。見いだした中間のα-メタロアミン生成の最適条件下、アルデヒド、イミン、カルボン酸クロリド等の求電子剤を作用させ、3成分カップリング反応が可能であることを明らかにした。リン酸エステル誘導体の場合は中間のα-メタロアミンにアルデヒドを作用させ、一挙にHWE反応を経るエナミンの選択的合成を見出した。さらに生成したエナミンに対し、各種求電子剤、次に求核剤を作用させ反応の集積化に展開した。環状のイミノ化合物であるオキサキノキサリン誘導体を用い、同様に3成分カップリング反応を検討した。特に、生成物にジオレフィンを有する化合物に応用し、閉環メタテシスを経るトリシクロ環化合物合成に応用することができた。次にα-アシロキシイミノエステルに対して有機金属試薬を作用させることにより、窒素原子上でSN2反応を起こし、選択的にN-モノアルキル化反応が進行する条件を、各種N-アシロキシ誘導体および各種有機金属試薬を用いて検討した。この条件下、第二の求核剤を作用させ、異なる二つの置換基を導入できるN,N-ジアルキル化を見出した。さらに中間体のN,N-ジアルキル化されたエノラートに対して各種求電子剤を作用させ三種類の置換基を導入した四級α-アミノエステル、また酸化剤の作用によりイミニウム塩を発生させ、第三の求核剤の付加によるN,N,C-トリアルキル化生成物を収率良く合成できることに発展させた。イミンの潜在能力をフルに活用し、α-イミノエステル、α-イミノチオエステル、α-イミノニトリル、α-イミノリン酸エステル、さらにそのオキシムおよびヒドラゾン誘導体など、α位に電子求引基を有するイミン誘導体の極性転換共役付加反応を含む異常付加を探索できた。また、オキシムあるいはヒドラゾン誘導体の窒素原子上での置換反応を基盤としたタンデム反応等の各種多段階反応の探索と、ファインケミカルズの効率的合成への展開も並行して行なっている。特にα位に各種電子求引基を有するイミノ化合物の電子求引基と極性転換の関連も徐々に解析できている。極性転換反応/酸化反応後生成するイミニウム塩に対しても求核付加反応を検討し、二重求核付加反応が可能である事を明らかにした。また、α位に電子求引基を有するオキシムおよびヒドラゾン誘導体に対し、窒素原子上でのSN2型の求核置換反応を活用して窒素原子に二つの異なる置換基を導入し、エノラートのアルキル化、Claisen転位、あるいはイミニウム塩に変換した後に第三の求核剤と反応させ、一挙に三種類の置換基の導入が可能であることを明らかにすることができた。(1)α-イミノエステルのイミノ窒素上の保護基に注目しN-シリルα-イミノエステルおよびα-ヒドラゾノエステルに対する極性転換反応の検討を行い、N-シリルα-イミノエステルに酸性条件下求核剤としてケテンシリルチオアセタールを用いることで、イミノエステルに対してエノラートシントンがN上への求核付加が進行することを見出した。

(2)キラル補助基を有するα-ヒドラゾノエステルに対してGrignard反応剤を用いることで、N,N-ジアルキル化が起こり、続いてエノラート中間体に対してプロトン化剤を作用させ、不斉プロトン化により高ジアステレオ選択的にキラルなα-アミノアミドを得ることができた。(3)アルケンの末端にアルキルチオ基を有するβ,γ-アルケニルα-イミノエステルに対するタンデムN-アルキル化/ビニロガスアルドール反応においてBF3・Et2O錯体を作用させることでアルキルチオ基を脱離させ、3-アミノ-2-ピロンを得ることができた。Grignard反応剤およびアルデヒドの検討を行った結果、第一級Grignard反応剤を用いた場合および芳香族、ヘテロ芳香族、脂肪族アルデヒドのいずれを用いた場合にも良好に反応が進行した。(4)末端にフェニルチオ基を二つ導入したβ,γ-アルケニルα-イミノエステルに対するタンデムN-アルキル化/ビニロガスアルドール反応による3-アミノ-2-ピロンの合成を利用し、抗がん活性を有する化合物である三環式ピラノインドール誘導体の合成を達成し、本反応の有用性を示した。(5)末端に2,6-ジメチルフェニル基を有するβ,γ-アルケニルα-イミノエステルに対してGrignard反応剤を作用させて得られたジエノラートに対し、求電子剤としてイミンを作用させることでタンデムN-アルキル化/ビニロガスMannich反応が進行し、δ-ラクタムが得られることも見出した。現在までのところ、α-ヒドラゾノエステルに関しては、予定よりも順調に研究を遂行することができ、不斉プロトン化でも90% deを超えるジアステレオ選択性を達成することができた。この成果により、高い効率の不斉合成反応が、本反応中間体のプロトン化でも達成することが可能なことを示すことができ、アミノ酸類の不斉合成の新たな方法論を提供することができた。さらに,γ-アルケニルα-イミノエステルに対するタンデムN-アルキル化/ビニロガスアルドール反応においては、末端にフェニルチオ基を二つ導入し、得られたフェニルチオ基を持つ3-アミノ-2-ピロンに対する脱硫反応経て、目的の3-アミノ-2-ピロンJを得た。次にブロモ基を導入し、ビストリフェニルホスフィンパラジウムジクロリドを一当量作用させ、塩基としてピバル酸カリウムを二当量用い、溶媒としてDMAを用い、140°Cで24時間反応させることで、目的の三環式ピラノインドール誘導体の合成に成功した。このようにピラノインドールを始めとする、生理活性化合物の合成に利用できることがわかり、その有用性を示すことができた。以上のように29年度は、予定よりも順調に研究を遂行することができた。研究期間全体としては、イミンの潜在能力をフルに活用し、α位に電子求引基を有するイミン誘導体の極性転換共役付加反応を含む異常付加を探索した。また、オキシムあるいはヒドラゾン誘導体の窒素原子上での置換反応を基盤としたタンデム反応等の各種多段階反応の探索と、グリシンタイプ1トランスポーターの効率的合成へ展開した。すなわち、α位に電子求引基を有するオキシムおよびヒドラゾン誘導体に対し、窒素原子上でのSN2型の求核置換反応を活用して窒素原子に二つの異なる置換基を導入し、イミニウム塩に変換した後に第三の求核剤と反応させ、一挙に三種類の置換基の導入が可能であることを明らかにした。特に最終年度は以下の2項目で顕著な成果を得た。(1)N-トリメチルシリル-α-イミノエステルを用いる極性転換反応:出発物としてN-シリル-α-イミノエステルを用いることで望みのN上への付加が円滑に進行することを見出した。また、種々の有機金属反応剤や基質への適用範囲も広く、窒素上に様々な置換基を導入することができた。
動物プランクトン鉛直移動によるアクティブフラックスの推定

夏季の北太平洋亜寒帯域における動物プランクトンを介した物質輸送量として、糞粒生産による受動的な輸送量(パッシブフラックス)と、日周鉛直移動と季節的な鉛直移動による能動的な輸送量(アクティブフラックス)を推定した。このうち、日周鉛直移動による能動的輸送量は相対的に小さいが、糞粒生産による受動的輸送量と季節的鉛直移動による能動的輸送量はセジメントトラップによる沈降粒子輸送量のそれぞれ20-32%または39%に相当すると推定され、動物プランクトンによる輸送量は、糞粒による受動的輸送量と季節的鉛直移動による能動的輸送量が重要なことが示された。北部北太平洋4147°N, 165°Eの4定点、4150°N, 165°Wの8定点およびベーリング海の1定点の計13定点において日周鉛直移動性カイアシ類Metridia pacificaによる物質輸送量を見積もった。本種雌成体はいずれの定点でも昼間は水深50m以深に分布し、夜間にのみ水深50m以浅に分布していた。昼夜の出現個体数の差から、275422inds.m^<-2>の雌成体が夜間に上層に移動していることが分かった。M.pacifica雌成体による上層での摂餌量は0.0514.8mgCm^<-2>d^<-1>と推定され、下層での呼吸量は0.028.57mgCm^<-2>d^<-1>と推定された。M.pacificaの日周鉛直移動による能動輸送量は地理的に出現個体数の多かった定点(>50°N)にて高かった。これは1個体あたりの呼吸量や摂餌量では定点間の差は2.4倍程度でしかないが、出現個体数では200倍もの差があることの反映であった。いま仮に該当海域で既報の6月8月の一次生産量227mgCm^<-2>d^<-1>があると仮定すると、M.pacifica雌成体による摂餌量はこの0.026.5%に相当する。またf-ratioを0.4と仮定すると有光層以深への沈降粒子フラックス量は91mgCm^<-2>d^<-1>である。M.pacifica雌成体による下層での呼吸量はこの0.029.4%に相当している。今回能動輸送量を推定したのは日周鉛直移動性動物プランクトン単一種の雌成体のみであったが、実際には他の動物プランクトンや、より大型なマイクロネクトン類によるものも加わるので、熱帯・亜熱帯域だけではなく亜寒帯域の物質循環においても能動輸送量の重要性が示唆された。夏季の西部北太平洋(158°E線に沿った3定点[39°N,41°N,44°N])においてMOCNESSによる大型動物プランクトンの昼夜の定量採集を行い、特に端脚類とオキアミ類の日周鉛直移動について明らかにし、またそれに伴う能動輸送量の推定を行い、当海域の物質循環における大型動物プランクトンの寄与を明らかにした。端脚類は17属25種が出現し、バイオマスは昼間は26-110mg DMm^<-2>、夜間は18-1178mg DMm^<-2>の範囲で変化していた。亜熱帯域では暖水性種であるPhronima属が昼夜の個体数、バイオマス共に優占していた。移行領域では昼間はThemisto pacificaが個体数、バイオマス共に優占していたが、夜間にはCyphocaris challengeriとVibilia gibbosaがバイオマスの大半を占めており、顕著な日周鉛直移動を行っていた。オキアミ類は7属19種が出現し、バイオマスは昼間は18-176mg DMm^<-2>、夜間は437-1562mg DMm^<-2>の範囲で変化し、いずれの定点でも夜間のバイオマスの増加が顕著であり、0-40m層に明瞭なピークが見られた。夜間のバイオマスの多い層では、Euphausia属とThysanoessa属がその占有率のほとんどを占めていた。本研究で推定された夜間表層での摂餌量は9.10-30.63mg Cm^<-2> day^<-1>、呼吸量は4.20-18.53mgCm^<-2> day^<-1>であった。この大型動物プランクトンの摂餌量は一次生産量の4-13%に相当した。深層での呼吸量は沈降粒子フラックス量の3-14%に相当しており、当海域の物質循環における大型動物プランクトンの能動輸送の寄与の大きさが示された。

2006年6月14-16日にかけて南部ベーリング海および北部北太平洋の各1定点にて、目合い60μmのVMPSによる水深0-3000mを15層に分けた鉛直区分採集を行い、カイアシ類の出現個体数、バイオマスおよび群集構造を明らかにし、摂餌量と排泄量を推定した。カイアシ類の出現個体数およびバイオマスは深度増加に伴って減少し、両者と深度の関係は両対数式によって表せた。全水柱を通してカラヌス目カイアシ類は、15科34属72種(ベーリング海)または13科32属63種(北部北太平洋)が出現した。両定点のカイアシ類群集はクラスター解析によって5群集に区分され、各群集の分布は鉛直的に明確に分かれていた。水深500-1500mには酸素極小層(OML)に適応した群集が見られ、OMLではカイアシ類死骸の個体数が生体よりも多かった。両海域は世界の全海洋の中でOMLが最も発達する海域であるため、低溶存酸素に適応した群集が出現し、OMLでは捕食者が少ないため、カイアシ類の死骸が摂餌・除去されずに増加したと考えられる。両海域の全水柱を通してカイアシ類は沈降有機炭素輸送量(POC flux)の20±13%(平均±標準偏差)(ベーリング海)または32±19%(北部北太平洋)を消費すると推定された。POC fluxの行方として、カイアシ類による摂餌、バクテリアによる分解および直接沈降の3つが考えられる。両海域とも、0-100皿ではカイアシ類による摂餌の影響が大きく、100-1000mではバクテリアによる分解、1000-3000mでは直接沈降が多いことが明らかになった。水深1000-3000mにおいて直接沈降するPOC fluxの割合が増加するのは、上層で生物による摂食が何回も行われた結果、POCの栄養分が少なくなったためと考えられる。
水田土壌中のメタン生成微生物生態系における鉄還元の位置と機能

本研究では水田からのメタン放出を抑制する可能性のある湛水土壌中における微生物的鉄還元について検討し、以下の結果を得た。1.水田土壌中のメタン生成活性と2価鉄量の季節的変化を測定した。作土層土壌のメタン生成活性は湛水後間もなく急速に上昇し、7月上旬の中干し後に低下した。土壌中の2価鉄量はメタン生成活性の増加よりさらに早く増加したが、メタン生成活性とほぼ並行して季節変化し、メタン生成活性と2価鉄量との間に高い正の相関が認められた。水田土壌中のメタン生成古細菌の生息密度は土壌の鉄還元の進行に大きく依存して変化することが分かった。2.水田土壌中の鉄還元細菌の集積培養を行うための培地の組成や鉄源について種々検討し、電子供与体として、酢酸塩、H_2、またはフマル酸塩を電子供与体とする鉄還元集積培養を確立した。このうち電子供与体としてH_2+フマル酸塩を用いて継代された集積培養は、H_2またはフマル酸塩のみを電子供与体としても活発に鉄を還元した。この他、ギ酸塩、ピルビン酸塩、乳酸塩、コハク酸塩、リンゴ酸塩等の有機酸、グルタミン酸塩、アスパラギン酸塩、セリン等のアミノ酸存在下でも鉄が還元され、多様な基質が鉄還元の電子供与体として消費されることが分かった。3.この集積培養から鉄還元細菌を数株分離した。これらの菌株はいずれもH_2の他、ピルビン酸塩とセリンを電子供与体としても速やかに鉄を還元した。これらの菌株はいずれもグラム陰性、カタラーゼとオキシダーゼが共に陽性の運動性のある短桿菌で、好気条件でもよく増殖した。これらの菌株の16SrRNA遺伝子を、真正細菌に特異的なプライマーを用いてPCR増幅し、その塩基配列を決定し、データベース上で近縁種を検索した。これらの菌株はいずれもProteobacteria γグループのAeromonas種に99%以上の類似性を示し、その生理的性質もAeromonas種のそれと一致した。これまでAeromonas種が鉄還元能を持つとの報告はなく、この結果は注目される。本研究では、水田土壌中のメタン生成に関わる各種細菌の生理・生態と水田からのメタン放出との関係を明らかにするための一環として湛水水田土壌中における還元反応の中で、特にメタン生成への影響が大きいと考えられる微生物的鉄還元について検討し、これまでに以下の結果を得た。(1)水田土壌の作土層の深さ別のメタン生成活性と2価鉄量の季節的変化を測定し、両者の関係を調べた。水田土壌のメタン生成活性は、採取した土壌試料を同量の嫌気的希釈液に懸濁してスラリー状にし、N_2ガス下で30°Cで保温し、気相中に蓄積するメタンの濃度増加の初速度から決定した。水田土壌のメタン生成活性は土壌の深さにより多少差があるものの湛水後間もなく急速に上昇し、7月上旬の中干し後に低下した。土壌中の2価鉄量はメタン生成活性の増加より早く湛水直後から増加し、やはり中干しを境に低下した。土壌スラリーにメタン生成の基質である酢酸かH_2を添加すると、メタン生成は殆どの場合基質無添加と比べ大幅に上昇した。

土壌中の2価鉄量は各基質添加条件下で測定したメタン生成活性とほぼ並行して季節変化し、基質添加条件下で測定したメタン生成活性と2価鉄量との間に高い正の相関が認められた。この結果は、水田土壌のメタン生成菌の生息密度は水田土壌の酸化還元電位に大きく依存して変化するか、あるいはメタン生成活性は土壌中の鉄還元細菌の活性または2価鉄の有無と大きな関係があることを示している。(2)水田土壌中の鉄還元細菌の集積培養を行うための倍地の組成、特に鉄源について種々検討し、可溶性の鉄源としてFe(III)-Nitrilotriacetateを用いる倍地を確立した。この鉄源を用いて、電子供与体として,酢酸、H_2、またはフマル酸を用いて集積培養を行い、それぞれを電子供与体とする鉄還元細菌の集積培養を確立した。この集積培養から、鉄還元能のある菌株をそれぞれ数株ずつ純粋分離し、各菌株の鉄還元と電子供与体の動力学について検討した。本研究では水田土壌中のメタン生成に関わる各種微生物の生理・生態と水田からのメタン放出との関係を明らかにするための一環として、メタン生成の主要な基質でもある酢酸塩やH_2を電子供与体として消費し、水田からのメタン放出を抑制する可能性のある湛水水田土壌中における微生物的鉄還元について検討し、以下の結果を得た。水田土壌を出発材料とし、可溶性の鉄源としてFe(III)-Nitrilotriacetateを用い、酢酸塩、フマル酸塩等を電子供与体とする鉄還元細菌の集積培養を昨年度から継代してきている。このうち電子供与体としてH_2+フマル酸塩を用いて継代されて来た集積培養では、活発な鉄還元と,電子供与体の酸化が進行したため、この集積培養を用いて各種有機酸やアミノ酸、アルコール、H_2等の鉄還元への電子供与体としての利用性を調べた。電子供与体無添加の培地に集積培養を接種しても鉄は還元されず、また、集積培養未接種の培地では、鉄は全く還元されなかった。このため、この集積培養においては鉄は完全に微生物的に、また添加した電子供与体を利用して還元されることが分かった。この集積培養ではH_2+フマル酸塩の他、H_2またはフマル酸塩のみを電子供与体として培養しても活発に鉄還元が進行し、鉄還元の進行に伴い白色の沈殿が生成された。この他、ギ酸塩、ピルビン酸塩、乳酸塩、コハク酸塩、リンゴ酸塩等の有機酸、グルタミン酸塩、アスパラギン酸塩、セリン等のアミノ酸存在下でも鉄が還元された。このうち、H_2、フマル酸塩、ギ酸塩、ピルビン酸塩、乳酸塩、セリンなどで最も活発な鉄還元が進行し、多様な基質が鉄還元の電子供与体として消費される可能性が示された。しかし、酢酸塩、プロピオン酸塩、酪酸塩、エタノール等では鉄は還元されなかった。このH_2+フマル酸塩を電子供与体とする集積培養の他、酢酸塩や乳酸塩を電子供与体とするいくつかの集積培養から鉄還元細菌を分離してその鉄還元能を調べたが、一般に純粋培養ではどの菌株も増殖が微弱で、活発な鉄還元を示さなかった。本研究では水田土壌中のメタン生成に関わる各種微生物の生理・生態と水田からのメタン放出との関係を明らかにするための一環として、水田からのメタン放出を抑制する可能性のある湛水水田土壌中における微生物的鉄還元について検討してきている。本年度は、水田土壌を出発材料とし、可溶性の鉄源としてFe(III)-Nitrilotriacetateを用いて継代してきている、H_2を電子供与体とする鉄還元細菌の集積培養から、嫌気性ロールチューブ法により鉄還元細菌を分離し、その電子供与体利用性や系統学的位置づけを明らかにした。この集積培養から無酸素培養条件下で増殖する菌株を数株分離したが、これらの分離菌株のうち3菌株が、H_2を電子供与体として鉄を還元した。