hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
経皮的心肺補助装置の長期使用に対する再評価

本研究は、心肺補助装置の長期使用への改良と、長期使用における問題点の解明に寄与することを目的とする。心肺補助装置の血液ポンプには、JMSミクスフローを、人工肺には開発中の円形状人工肺を用い検討した。平成18年度にはCFD解析による人工肺内の血栓形成場の解明と慢性動物実験による血液ポンプの血栓形成を検討した。円形状人工肺のCFD解析の結果、現在主流の角形状人工肺では血液うつ滞が生じる四隅で血流改善が認められた。ヤギによる慢性動物実験では、以前に行った可視化試験の血流低下と一致した上部軸受け部分に血栓形成が認められた。実験モデルは生理的・血液検査上異常なく経過していたが、実験6週目に重症感染症となり、実験を終了した。長期使用中の感染対策の重要性を再認識した。平成19年度は慢性・急性モデルによる動物実験と模擬循環回路試験を行った。慢性モデルでは成ヤギを用い抗血栓改良した試作機3タイプを比較検討した。3タイプともに前年度の課題部分の血栓形成と溶血の低減を認めたが、なかでも、入り口の血流を上部軸受けまで誘導するタイプで、強い抑制効果を認めた。慢性実験経過中、生理的・血液検査上異常なく良好な状態であった。人工肺の検討では、模擬回路試験で円形状人工肺は、同等ガス交換膜面積の角形状人工肺より約10%のガス交換性能向上を認め、超小型でありながら成人人工肺のAAMI基準を満たすことが確認された。急性動物実験で、小型犬の人工心肺モデルで超小型円形状人工肺は、4倍の膜面積の市販角形状人工肺と比較し、ガス交換能に有意な差を認めず良好な結果を得た。今後改良型血液ポンプと円形状人工肺による低充填量心肺補助システムを完成させ、長期の生体への影響を継続して検討していく予定である。本研究の目的は、新規の心肺補助システムの慢性動物実験およびコンピュータシミュレーション(CFD)解析から、生体適合性向上と、長期心肺補助の生体、特に生体肺に与える影響を検討することである。現在の経皮的心肺補助システムは、耐久性の低さから短期間での交換が必要である。この問題点を克服すべく人工肺・遠心式血液ポンプの開発を行い、新しい心肺補助システムを構築している。また心肺補助システムが長期使用により生体に与える影響について明らかでないが、慢性動物実験で肺血流の減少から肺実質の線維化病変をきたす危険性が示唆されている。平成18年度は、CFD解析による血栓形成場の解析と、慢性動物実験でシステムの生体適合性の問題点の解明について検討した。パーソナルコンピュータ用CFD解析ソフト(SCRYU/Tetra)を使用して、人工肺内部と血液ポンプの羽根車軸周りの解析を行った。われわれの人工肺モデルは当初の設計案を充分に満たす良好な血液流れの改善結果が示された。血液ポンプの解析結果は、本研究以前の動物実験でのデータをほぼ追従できる結果が得られ、この結果をもとに改良モデルを考案できた。現在平成19年度動物実験による検討に向け心肺補助システムの改良品の試作を行っている。また、成ヤギを用いた慢性動物実験を1例行った。実験動物は術後6週間観察し、本システムの耐久性・生体適合性試験を行い、長期心肺補助の生体への影響を血液・生化学検査で経過観察した。システムでは血栓形成がCFD解析結果に適合する傾向がみられ、次期モデルの改良目標が明らかになった。術後6週に重症感染症から実験を断念し、動物を犠死せしめた。経過中、血液ガス・生化学検査上臓器機能の異常は認められなかった。

組織評価は、感染症のため充分な検索が困難であった。次年度は慢性動物実験にて、長期補助システムの生体に対する影響を重点的に評価検討する。現在の経皮的心肺補助システムは、耐久性の低さから短期間での交換が必要である。この問題点を克服すべく人工肺・遠心式血液ポンプの開発を行い、新しい心肺補助システムを構築している。本研究の目的は、現在開発中の心肺補助システムの生体適合性向上をおよびコンピュータシミュレーション(CFD)解析から、また長期心肺補助の生体に与える影響を慢性動物実験検討することである。本年度は3回の慢性モデルと1回の急性モデルによる動物実験と、模擬循環回路を用いた実験を行った。慢性モデルは体重約30Kgの成ヤギを用いて行ったが、2例を僧房弁閉鎖不全による急性心不全と原因不明の進行性アシドーシスによって失い、長期に観察可能であった1例にて遠心式血液ポンプの生体適合性について評価を行った。本血液ポンプの生体適合性で問題となっていた羽根を支持する軸受け周囲の血栓形成を、3種類の試作品の比較試験で検討した。ポンプ入口付近を改良した2種の試作品で血栓形成の著明な減少とそれに伴う溶血の低減を認めた。長期モデルにおける血液学・血液性化学検査では有意な異常は認められなかった。現在開発中の人工肺は血液流路部分を特殊加工により円柱状に形成されたモデルで、現在の市販品(四角柱状)で見られる四隅での血液流速低下によるガス化不均等や血栓形成が抑制することが可能である。本年度において模擬実験用試作品と1機の動物実験試作品が完成し、模擬循環回路試験と急性動物実験を行った。模擬回路試験では、小型人工肺でありながら成人の人工肺性能AAMI基準を満たしており、同等ガス交換膜面積の四角柱状人工肺と比較して約10%のガス交換性能の向上を認めた。急性動物実験では体重約10Kgの成犬を用い上下大静脈脱血、上行大動脈送血の人工心肺モデルを作製しガス交換性能を評価し、十分な酸素添加、炭酸ガス除去の性能をしめした。今後心肺補助システムとして完成させ長期の生体への影響を継続して検討していく予定である。
フェーズコントラストシネＭＲＩによる肺高血圧症の治療効果評価法の開発

本研究では、肺高血圧症患者に対する治療効果の指標に、Phase contrast MRI(PC-MRI)が有用であるかを検討した。初めに異なるMR機器を使用しても同等の測定値が得られるか検討した結果、PC-MRIで得られる肺動脈の血流量や時間流量曲線は同等に評価可能と判明した。次に慢性血栓塞栓性肺高血圧症に対する肺動脈拡張術の術前後にPC-MRIを施行し、治療した肺動脈の血流量増加を検出し、治療効果判定にPC-MRIが有用であることを示した。フェーズコントラストMRI(PC-MRI)による肺高血圧患者の治療効果評価法の開発についての研究経過報告である。1MR機器によるPC-MRIの再現性の検討に関して、被験者のデータ収集を行った。健常ボランティア6例対象に2施設のMR機器でPC-MRIによる肺血流(肺動脈本幹、左右肺動脈)を評価した。結果は面積や速度の計測値は機種の違いにより有意差があったが、血流量や時間流量曲線から得られる指標の有意差はなかった。速度の速い部位では信号強度が強く面積を囲むのは容易であるが、速度が遅い部位では信号強度が弱く面積を囲むのが難しい。このため面積値に有意差が生じたと予測される。速度に関しては心拍数が大きく異なった状況(30拍/分以上)で検査を施行した1症例が多大な影響を及ぼしたと考えている。症例数が6例と少ないために1症例のデータが全体の結果に大きくかかわる。血流量は面積と速度を乗じて算出され、速度が遅い部位では面積は大きくても、小さくても血流量の値に大きな違いは生じない。一方で速度が非常に速い部位では面積の値が異なると血流量に大きな違いが生じる。上述のように速度の速い部位では面積の設定が容易なので、血流量には有意差は生じなかったと考えられる。再現性の検討は本研究の根幹をなし、今後PC-MRIを治療効果判定ツールとして普及を目指す上で非常に重要である。次年度では症例数を増やして再度検討を行う予定である。2慢性血栓塞栓性肺高血圧症に対する肺動脈拡張術前後でPC-MRIが治療効果判定に有用であった2症例を学会で報告した。引き続き症例を蓄積していく。phase-contrast cine MRAによる肺高血圧患者の治療効果判定についての研究の経過報告である。1今年度は慢性肺血栓塞栓症に対する血管拡張術前後で治療効果判定にphase-contrast MRIが有用であるか検討した。両側の肺動脈拡張術を施行された患者で治療後評価でエコーでは効果良好と判定されたが、MRIでは右のみ治療効果良好と判定された症例があった。この症例は、のちにエコー上の肺動脈圧が上昇し、肺シンチや肺動脈造影で左肺動脈血栓の再発が示された。このようにPC-MRIでの左右を分離した治療効果判定が特に有用と考えられる。2013年6月に開催される学会で2症例の報告を行う予定である。2MRIの機器によるPC-MRIの再現性の検討に関しては、本年度は共同施設との打ち合わせを行った。2013年4月5月に両施設で被験者のデータを収集する予定である。3間質性肺炎は肺高血圧を合併することがあり、肺高血圧を合併すると予後が著しく悪くなる。蓄積された症例を後向的に検討し、急性増悪をきたした患者とそうでない患者を分けて、両者の血流量を比較した結果、急性増悪群で有意に肺血流量が低下している事がわかった。このことから肺高血圧症合併間質性肺炎では急性増悪のリスクが高まることが予後を悪化させる一因であることが示唆される。4肺高血圧症合併間質性肺炎では間質性肺炎による低酸素血症が肺高血圧を助長していると報告されてきた。間質性肺炎患者に酸素投与を行い、低酸素血症を改善させ、肺血管抵抗が変化するかPC-MRIを用いて検討した。結果は低酸素血症が有意に改善しても、肺血管抵抗は変化しないことがわかった。これにより間質性肺炎による肺高血圧症は低酸素血症以外の要因の関与が大きい可能性が示唆された。フェーズコントラストMRI(PC-MRI)による肺高血圧患者の治療効果評価法の開発についての最終報告である。1MR機器によるPC-MRIの再現性の検討に関して、症例数を増やし再検討した。健常ボランティア10例対象に2施設のMR機器でPC-MRIによる肺血流(肺動脈本幹、左右肺動脈)を評価した。肺動脈本幹、左肺動脈では面積や速度の計測値に有意差が見られたが、右肺動脈では有意差はみられなかった。PC法での血流評価では対象血管の直交断面での測定が真の値に近くなる。肺動脈本幹や左肺動脈は血管長が短く湾曲しているため直交断面を得るのが難しいが、右肺動脈は長くまっすぐ走行しているため誤差が少ないと考えられる。血流量や時間流量曲線から得られる指標はいずれの血管でも有意差はなく、ブランドアルトマンプロットでも95%信頼区間内に位置した。

よってPC法による血流量測定や時間流量曲線は異なるMR機器でも再現性のある評価が可能と考えられる。2肺高血圧合併は間質性肺炎急性増悪のリスクと報告されている。我々は間質性肺炎の急性増悪とPC法により測定した肺血流量の関連について検討した。PC法により肺血流の測定歴のある43例を後方視的に評価した。MR撮影後に急性増悪を起こした群(8例)と起こさなかった群(35例)に分け比較検討した。急性増悪群では肺動脈本幹の平均流速、平均血流量が有意に低い値であった。肺血流量が低い間質性肺炎患者で急性増悪の可能性が高く、肺高血圧症合併と間質性肺炎急性増悪の関連を裏づける結果となった。放射線診断学共同研究の基礎となる施設間のMR機器の再現性について、本年度でデータ収集、解析を終える予定であったが遅れているため。共同研究の基礎となる施設間のMR機器の再現性について、本年度でデータを収集する予定であったが、達成できなかったため。PC-MRIの再現性の検討と並行して、引き続き慢性肺血栓塞栓症および肺高血圧に対して薬物療法を行う患者の蓄積をしていく。当院では皮膚科が強皮症の患者を多く診療しているので、協力を依頼し肺高血圧患者の蓄積を推進する。今回の検討でPC-MRIは肺高血圧の治療効果判定のみでなく、間質性肺炎急性増悪のリスク評価にも有用である可能性が示唆された。今後は治療効果判定のみでなく、リスク評価に関する検討も視野に入れ症例を蓄積していく予定である。全人件費が確定するのが3月だったため、少し多めに見込んでいた分差額が出た。次年度の人件費に充てる。次年度の研究費使用計画1MR機器による再現性の検証に関して被験者の旅費、検査費用、謝金2研究成果発表に関する費用
固体表面上DNAオリゴマーの高分解能低温STM観察と操作

現在、DNAは分子エレクトロニクスの素子として注目されているが、DNAを素子として用いたデバイスを、Si(001)上で実現するためには、DNA中の異なるそれぞれの官能基が、シリコン表面とどのように反応するかについて研究する必要がある。そこで、DNAに含まれるカルボニル基とSi(001)表面の反応性について研究を行った。カルボニル化合物にはアセトンを選択し、反応温度を変化させることにより、Si(001)との間で起こる二種類の競争反応が、どのような機構を介して起こっているのか、ということに関して、走査型トンネル顕微鏡を用いて研究した。その結果、低温では環化付加反応が優先的に起こり、高温では解離反応が優先的に起こることが示された。環化付加反応が優先的に起こる低温においてSi(001)表面を分子と反応させ、次に、解離反応が優先的に起こる高温でそのサンプルを加熱し、変化が起こるかどうかを調べた。その結果、環化付加によって生じた4員環が、さらなる加熱によって解離反応種へ変化することが明らかとなった。さらに密度汎関数法を用いて2種類の吸着種の安定性を計算したところ、4員環のほうが解離反応種よりも不安定であることが示された。以上の結果から、分子吸着は可逆的であり、低温では速度論的支配によって、高温では熱力学的支配によって、表面種の生成比が決定されると考えられる。また、可逆反応が起こっているという結果は、表面に弱く結合した中間体の存在を強く示唆するものである。Si(001)上で、反応温度を変化させることによって表面種の生成比を変化させうることを示すことができた。この事は、DNAデバイスにおいてばかりでなく、Si(001)を用いた分子デバイス全般において、応用上大変意味のある結果である。
抗菌ペプチドによる免疫器官の機能調節と高速分子進化法を用いた高機能アナログの創出

ウズラのファブリキウス嚢(BF)から抗菌ペプチドとして知られるfowlicidin-1(f1), -2(f2), -3(f3), cathelicidin-B1(cb1)前駆体cDNAをクローン化した。これらペプチドのmRNAは、f1とf3がBFの濾胞間上皮細胞で、f2とcb1が濾胞間上皮と濾胞内で発現していた。ウズラへのLPSとLTAの投与は、それぞれBFにおけるf3とf1発現を上昇させたが、デキサメタゾン投与はf3の上昇を抑制した。合成f1とf2はLPSとLTAに対して結合し、更に、マウスの抗体産生を刺激した。加えて、高速分子進化法によりLPS結合能を有するペプチドの取得に成功した。本研究は、代表者及び分担者が鳥類や両生類の免疫器官(ファブリキウス嚢、ハーダー腺など)において同定した抗菌ペプチド(AMPs)を対象に、AMPsの発現調節機構と免疫器官の機能に与える影響について解析することを目的としている。併せて、高速分子進化法を用いることでAMPsの高機能アナログの創出を目指している。平成26年度は、ウズラのファブリキウス嚢(BF)からcDNAをクローニングしたfowlicidin-1, -2, -3の発現に関する解析を進め、これらfowlicidinのmRNAは、いずれもBFの分泌性の上皮細胞に発現していること、さらにfowlicidin-2は濾胞内においても発現していることを明らかにした。これらの結果は、同ペプチドのうち抗体が作製できたfowlicidin-1と-2の抗体を利用した免疫組織学的解析結果とも一致した。さらに、BFにおけるfowlicidin-2と-3のmRNAの発現は、グラム陰性菌の膜構成要素であるリポ多糖をウズラの翼の尺骨静脈に投与することで時間依存的に上昇する結果を得た。BFはB細胞の成熟と抗体の産生に関与していることから、fowlicidinが免疫機能に何らかの役割を果たしているのではないかと予測した。そこでマウスの腹腔内へfowlicidinとともに抗原を投与し、抗原のみを投与した場合とその抗体産生能を比較したところ、fowlicidin-2を共投与した場合の方が、抗原に対する抗体価が上昇することを見出した。一方、AMPsの高機能アナログの創出では、適用条件の検討に加えて分子ライブラリーの作成を進めた。本研究は、代表者及び分担者が鳥類や両生類の免疫器官(ファブリキウス嚢、ハーダー腺など)で同定した抗菌ペプチド(AMPs)を対象に、その発現調節と生理機能の解析を進めるとともに、高速分子進化法の適用によるAMPの高機能アナログの創出を目指すものである。平成26年度は、ウズラのファブリキウス嚢(BF)からfowlicidin-1, -2, -3のcDNAをクローニングし、fowlicidin-1と-3のmRNAは濾胞間上皮細胞に、fowlicidin-2のmRNAは濾胞間上皮細胞と濾胞内で発現していることを明らかにした。また、fowlicidin mRNAの発現は、グラム陰性菌と陽性菌の膜構成要素であるリポ多糖(LPS)とリポテイコ酸(LTA)により刺激される可能性を示した。平成27年度は、fowlicidin mRNAの発現調節についてさらに解析を進め、fowlicidin-1と-3のmRNA発現は、ウズラへのLTAとLPSの投与により、それぞれ時間依存的に刺激されること、また、LTAとLPSの受容体として働くToll様受容体-2(TLR-2)とTLR-4のmRNA発現がBF内に認められることを示した。さらに、グルココルチコイドはLPSによるfowlicidin-3 mRNAの発現増加を抑制することを明らかにした。加えて、fowlicidin-1のペプチドを新たに合成し、これを用いて大腸菌や黄色ブドウ球菌に対する抗菌活性、LPSとLTAとの結合活性、LPS作用の中和活性などの生理活性について検討を進めた結果、fowlicidin-1ペプチドは、いづれの活性もにおいてもfowlicidin-2とほぼ同様の活性を示した。一方、AMPの高機能アナログの創出では、高速分子進化法を適用し候補ペプチドの取得に成功した。平成27年度は、抗菌ペプチドmRNAの発現調節機構と生理的役割を解析するとともに、高機能アナログを創出することを主な目的として研究を進めた。その結果、fowlicidin mRNAの発現調節におけるLTAやLPSの関与や抗菌活性を発揮する仕組みの一翼を明らかにするとともに、高速分子進化法を適用し、候補となるペプチドを得るに至った。これらの成果は、国内外の学会で発表済み、もしくは、発表予定であり、また論文投稿準備中である。このため、「(2)概ね順調」と判断した。本研究は、代表者及び分担者が鳥類と両生類の免疫器官で同定した抗菌ペプチド(AMPs)について、それらが免疫器官の機能に与える影響の解析と、AMPの新規アナログの創出を目指したものである。平成26年度は、ウズラのファブリキウス嚢(BF)からfowlicidin-1, -2, -3のcDNAをクローニングし、in situ hybridization法により発現部位を検討するとともに、アナログ創出に必要な分子ライブラリーの作製を進めた。

平成27年度は、生理機能と発現調節について解析を進め、ウズラへの細菌毒素(リポテイコ酸[LTA]とリポ多糖[LPS])の投与がそれぞれBFにおけるfowlicidin-1と-3のmRNA発現を促進すること、しかしこの効果はデキサメタゾン投与により抑制されること、合成fowlicidin-1とfowlicidin-2はほぼ同じ生理機能を持つこと、等を明らかにするとともに、ペプチドアナログの候補配列の取得に成功した。ウズラのファブリキウス嚢(BF)から抗菌ペプチドとして知られるfowlicidin-1(f1), -2(f2), -3(f3), cathelicidin-B1(cb1)前駆体cDNAをクローン化した。これらペプチドのmRNAは、f1とf3がBFの濾胞間上皮細胞で、f2とcb1が濾胞間上皮と濾胞内で発現していた。ウズラへのLPSとLTAの投与は、それぞれBFにおけるf3とf1発現を上昇させたが、デキサメタゾン投与はf3の上昇を抑制した。合成f1とf2はLPSとLTAに対して結合し、更に、マウスの抗体産生を刺激した。加えて、高速分子進化法によりLPS結合能を有するペプチドの取得に成功した。平成26年度は、抗菌ペプチドの発現調節機構と免疫器官における生理的役割を検討することを主な目的としてきた。解析を進めた結果、fowlicidin-1, 2, 3の発現部位と発現調節機構の一端に加え、ファブリキウス嚢(BF)に発現しているfowlicidin-2が抗体産性能を高める可能性を明らかにした。一方、高機能アナログの創出では、必要となる高速分子進化法の適用条件などの検討を進めた。その上でライブラリーの作成を進めるに至っている。このため、「(2)おおむね順調」と判断した。平成28年度は、前年度に得られた結果をもとにして、抗菌ペプチド(AMP)であるfowlicidinの発現調節と免疫器官におけるこれらペプチドの生理的役割をさらに検討する。併せて、高速分子進化法により得られた候補ペプチドの生理活性を調べる。fowlicidin mRNAの発現調節では、LTAやLPS以外の因子(ステロイドホルモン、ペプチドホルモン、アミンホルモンなど)の効果について検討する。また、fowlicidinの合成ペプチドが免疫器官(細胞)における免疫グロブリンやサイトカインなどのmRNA発現に与える影響についても検討する。AMPの高機能アナログの創出では、候補ペプチドを合成し、抗菌活性や抗酸化作用等に与える影響について解析する。形態・構造平成27年度は、前年度に得られた結果を利用して、抗菌ペプチド(AMPs)の発現調節機構と免疫器官における生理的役割を更に検討するとともに、高機能アナログの創出を強力に推進する。AMPsの発現調節機構の解析では、グラム陽性菌の膜構成要素であるリポタイコ酸(LTA)、並びに、代表者がファブリキウス嚢(BF)での発現・合成を明らかにしたホルモン(MSH、性ステロイドホルモン、メラトニン、成長ホルモン、プロラクチンなど)が、AMPsの発現に与える影響について、個体あるいはBF由来の株化培養細胞を用いて検討する。AMPsの免疫器官における生理的役割については、個体あるいは培養細胞を抗菌ペプチドで処理した際、免疫グロブリン及びサイトカインのmRNA発現にどのような影響を与えるか、リアルタイムPCR法を用いて定量的に検討し、解析する。AMPsの高機能アナログの創出では、分子ライブラリーからのスクリーニングを進めるとともに、得られたアナログの抗菌活性や抗酸化作用等に与える影響について解析する。
糖尿病における熱ショック蛋白質の発現とその分子機構に関する研究

本研究の目的は、糖尿病における熱ショック蛋白質の発現状態を、健常コントロールと比較し検討することである。熱ショック蛋白質の中でも発現量が多く代表的HSPであるHSP70に着目して研究を行った。研究計画に従い、研究時期を前期と後期に分けた。前期においては、インスリン非依存型糖尿病患者(NIDDM)並びに健常者(C)から採血分離した単核球におけるHSP70の発現を調べるため、HSP70に対するモノクローナル抗体を用いウエスタンブロッティングを行った。予め定量された精製HSP70をコントロールとしデンシトメトリーにて定量化した。HSP70の蛋白発現はC群に比べNIDDM群で有意に増加していた(0.78±0.26 vs 0.41±0.25 ; p<0.05)。逆転写PCRによってHSP70のmRNAレベルの発現を検討した結果、NIDDMにおける単核球HSP70の増加はmRNAの増加によるものと判明した。分離白血球の培養でのHSP70の発現は、低血糖状態(5.5mM)に比べ、高血糖(16.7mM)に高い傾向を示したが有意ではなかった。後期においては、主に糖尿病コントロール、合併症の状態等とHSP70との関係を調べた。糖尿病コントロール状態との関係では、ヘモグロビンAlc、空腹時血糖値(FPG)、食後2時間血糖値のそれぞれとHSP70との相関はいずれも見られなかった。糖尿病性合併症については、網膜症、腎症、神経障害の有無さらにそれぞれのstage別に検討した。合併症の有無とHSP70との相関は見られず、それぞれの合併症のstage別検討においても相関は見られなかった。罹病期間、性、body mass indexとの相関は見られなかったが、年齢とHSP70の間に有意の負の相関を認めた(r=-0.658 ; p<0.05)。健常者の検討で、strenuous exerciseにおいて単核球HSP70の発現と赤血球還元型グルタチオン値が負の相関をすることが分かっており、NIDDMにおけるHSP70の高発現は、高血糖や合併症に関連するものではなく、むしろNIDDMにおける酸化ストレスの増加を反映している可能性が高い。年齢とHSP70が負の相関を示したことは、培養細胞レベルで分裂寿命とHSP70の負の相関が報告されており興味深い結果である。今後は、NIDDMにおいて個々の酸化ストレスの指標とHSP70との関係について検討すると共に、HSP70とAgingの関係についても検討を加える。また、多検体の処理のためELISAの開発を進めている。
メタン発酵槽内の複合微生物系による有機酸代謝ネットワークの解明

1.酢酸分解連続培養系の解析嫌気性消化汚泥を微生物源とし、酢酸を単一炭素源とする合成廃水を連続供給する中温嫌気性ケモスタット培養系を構築し、メタン生成関連遺伝子の発現量を解析した。Methyl CoM reductase遺伝子(mcrA)遺伝子を標的とするプライマーセットを用いて、槽内液から抽出したtotal RNAを鋳型とした定量RT-PCR実験を行った。低希釈率条件(0.01d^<-1>)ではMethanoculleus属の、高希釈率条件(0.3d^<-1>)では、Methanosarcina属のmcrA遺伝子がそれぞれ多く(約10^7copies/μg RNA)発現していることが判明した。昨年度実施した^<13>Cで標識した酢酸を用いた実験結果と併せて、低希釈率条件では酢酸酸化細菌と水素資化性メタン生成古細菌の共生系により、高希釈率条件では酢酸資化性メタン生成古細菌により、それぞれ酢酸がメタンに変換されていることが判明した。2.プロピオン酸分解連続培養系の解析プロピオン酸を単一炭素源とする中温嫌気性ケモスタット培養系を構築し、異なる希釈率条件における槽内の微生物叢を解析した。16S rDNAのクローン解析、メタン生成古細菌を標的とする定量PCR実験および変性剤濃度勾配電気泳動(DGGE)実験を行つた。メタン生成古細菌は、低希釈率条件(0.01d^<-1>)ではMethanosaeta属およびMethanoculleus属が優占し、高希釈率条件(0.3d^<-1>)では、Methanoculleus属とMethanospirillum属が優占することが判明した。真正細菌は、低希釈率条件ではSyntrophobacter属プロピオン酸分解共生細菌が、高希釈率条件ではDesulfotomaculum属の硫酸還元菌に近縁な細菌がそれぞれ優占していることが判明した。1.酢酸分解連続培養系の解析メタン生成古細菌のMethyl-S-CoM reductase遺伝子(mcr)を標的としたRT-PCR実験により、メタン発酵槽内のメタン生成古細菌の活性を評価した。高希釈率(0.6d^<-1>)および低希釈率(0.025d^<-1>)で運転する酢酸分解メタン発酵槽内からRNAを抽出し、RT-PCR実験を行った。得られたRT-PCR産物をクローン化し、塩基配列を決定した。その結果、両希釈率条件において、Methanosarcina属酢酸・水素資化性メタン生成古細菌およびMethanoculleus属水素資化性メタン生成古細菌のmcrの転写が確認された。低希釈率条件では、高希釈率条件よりもMethanoculleusのmcrの発現量が高いことが判明した。^<13>Cで標識した酢酸ナトリウムを基質としたトレーサー実験の結果、高希釈率条件の発酵槽内液を用いた場合、酢酸資化性メタン生成古細菌によるメタン生成反応が優占していることが示された。反対に低希釈率条件の発酵槽内液を用いた場合には酢酸酸化細菌と水素資化性メタン生成古細菌の共生によるメタン生成反応が優占していることが示された。2.プロピオン酸分解連続培養系の解析プロピオン酸を分解するメタン発酵槽内からDNAを抽出し16SrDNAのクローン解析を行った結果、希釈率の違いにより以下のように検出される古細菌の種類に差が見られた。低希釈率条件(0.01d^<-1>)ではMethanosaeta属酢酸資化性メタン生成古細菌およびMethanoculleus属水素資化性メタン生成古細菌が検出された。

高希釈率条件(D=0.3d^<-1>)では、Methanoculleus属とMethanospirillum属のみが検出された。一方、希釈率の違いにより、プロピオン酸の分解に関与していると考えられる細菌の種類にも差が見られた。低希釈率条件ではSyntrophobacter属プロピオン酸分解共生細菌が多く存在していた。しかし、高希釈率条件ではDesulfotomaculum属の硫酸還元菌に近縁な細菌が優占している結果が得られた。1.酢酸分解連続培養系におけるメタン生成関連遺伝子の発現解析下水処理場の嫌気性消化汚泥を微生物源とし、酢酸を単一炭素源とする合成廃水を連続供給する中温嫌気性ケモスタット培養系を構築し、メタン生成関連遺伝子の発現量を解析した。MethylCoMreductase遺伝子(mcrA)遺伝子を標的とするプライマーセットを用いて、槽内液から抽出したtotal RNAを鋳型とした定量RT-PCR実験を行った。低希釈率条件(0.01d^<-1>)ではMethanoculleus属の、高希釈率条件(0.3d^<-1>)では、Methanosarcina属のmcrA遺伝子がそれぞれ多く(約10^7copies/μgRNA)発現していることが判明した。昨年度実施した^<13>Cで標識した酢酸を用いた実験結果と併せて、低希釈率条件では酢酸酸化細菌と水素資化性メタン生成古細菌の共生系により、高希釈率条件では酢酸資化性メタン生成古細菌により、それぞれ酢酸がメタンに変換されていることが判明した。2.プロピオン酸分解連続培養系の解析プロピオン酸を単一炭素源とする中温嫌気性ケモスタット培養系を構築し、異なる希釈率条件における槽内の微生物叢を解析した。本年度は、メタン生成古細菌を標的とする定量PCR実験および変性剤濃度勾配電気泳動(DGGE)実験を行った。メタン生成古細菌は、低希釈率条件(0.01d^<-1>)ではMethanosaeta属およびMethanoculleus属が優占し、高希釈率条件(0.3d^<-1>)では、Methanoculleus属とMethanospirillum属が優占することが判明した。真正細菌は、低希釈率条件ではSyntrophobacter属プロピオン酸分解共生細菌が、高希釈率条件ではDesulfotomaculum属の硫酸還元菌に近縁な細菌がそれぞれ優占していることが判明した。
歯髄・根尖歯周組織の慢性炎症抑制と硬組織形成を同時誘導する再生療法の開発

本研究では歯髄・根尖歯周組織の慢性炎症抑制と硬組織形成を同時誘導する再生療法の開発するため,新規開発セメントの各種細胞への影響,ステロイドコアクチベーターMTI-IIの骨芽細胞様細胞への影響,PRP,BBMP-2の象牙芽細胞様細胞への影響,アメロブラスチンの上皮細胞への影響について検討した.その結果,BMP-2は象牙芽細胞様細胞の分化に影響を与えること,新規開発セメントは各種細胞に親和性を有すること,アメロブラスチンは上皮増殖を抑制すること,MTI-IIは骨芽細胞様細胞の炎症応答を抑制すること,PRPが象牙芽細胞様細胞の分化関連遺伝子の発現を誘導することを明らかにした.本研究は,抗炎症能あるいは組織誘導能が知られている生体分子,多血小板血漿(Platelet Rich Plasma; PRP)が各種細胞に与える影響を検討し,生体分子,PRP応用による断髄部,根尖病変部再生療法の実用化を目的としている.これまでに私達は,Fibroblast Growth Factor-2(FGF-2)徐放による象牙質欠損部への新生象牙質形成誘導や象牙芽細胞様細胞株の樹立等,歯髄再生に必須の研究成果を挙げてきた.本年度は,私達が開発している新規セメントの象牙芽細胞様細胞,骨芽細胞様細胞,神経細胞への影響,ステロイドコアクチベーターMTI-IIの骨芽細胞様細胞,象牙芽細胞様細胞への影響,PRP,アメロブラスチンの上皮細胞への影響について検討した.その結果,BMP-2は象牙芽細胞様細胞の分化に影響を与えることを明らかにした(Kitamura et al., Polymers, 2011; Washio et al., Int J Dent, 2012; Jimi et al., Int J Dent, 2012).また,新しく開発したセメントは象牙芽細胞様細胞,骨芽細胞様細胞に親和性を有するとともに神経細胞の突起伸長を誘導すること,MTI-IIは骨芽細胞様細胞,象牙芽細胞様細胞の炎症応答を抑制すること,PRPが象牙芽細胞様細胞の炎症応答遺伝子の発現を誘導すること,さらにアメロブラスチンは上皮増殖を抑制することを明らかにした.今後はそれぞれの誘導・抑制における機能解析を実施する予定である.本研究は,抗炎症能あるいは組織誘導能が知られている薬剤,生体分子,多血小板血漿(Platelet Rich Plasma; PRP)が各種細胞に与える影響を検討し,歯髄・根尖歯周組織に薬剤・生体分子,PRPを組み合わせて応用することを目的としている.これまでに私達は,歯髄創傷治癒における歯髄アポトーシスと修復象牙質形成の相互作用,及びFibroblast Growth Factor-2(FGF-2)徐放による象牙質欠損部への新生象牙質形成誘導や象牙芽細胞様歯髄細胞株の樹立等,歯髄再生に必須の研究成果を挙げてきた.本研究では,新規開発セメントの象牙芽細胞様細胞,骨芽細胞様細胞への影響,ステロイドコアクチベーターMTI-IIの骨芽細胞様細胞への影響,PRP,Bone Morphogenetic Protein-2(BMP-2)の象牙芽細胞様細胞への影響,アメロブラスチンの上皮細胞への影響について検討した.その結果,BMP-2は象牙芽細胞様細胞の分化に影響を与えること,FGF-2は象牙芽細胞様細胞の細胞突起伸長を誘導すること(Kitamura et al., Polymers, 2011; Washio et al., Int J Dent, 2012; Jimi et al., Int J Dent, 2012).新規開発セメントは象牙芽細胞様細胞,骨芽細胞様細胞に親和性を有すること(Washio et al.,J Biomed Mater Res B, 2014 accept),アメロブラスチンは上皮増殖を抑制すること(現在投稿中),MTI-IIは骨芽細胞様細胞の炎症応答を抑制すること,精製したPRPが象牙芽細胞様細胞の分化関連遺伝子の発現を誘導することを明らかにした.今後はそれぞれの分化誘導因子,炎症抑制因子の誘導・抑制における機能解析を実施する予定である.本研究では歯髄・根尖歯周組織の慢性炎症抑制と硬組織形成を同時誘導する再生療法の開発するため,新規開発セメントの各種細胞への影響,ステロイドコアクチベーターMTI-IIの骨芽細胞様細胞への影響,PRP,BBMP-2の象牙芽細胞様細胞への影響,アメロブラスチンの上皮細胞への影響について検討した.その結果,BMP-2は象牙芽細胞様細胞の分化に影響を与えること,新規開発セメントは各種細胞に親和性を有すること,アメロブラスチンは上皮増殖を抑制すること,MTI-IIは骨芽細胞様細胞の炎症応答を抑制すること,PRPが象牙芽細胞様細胞の分化関連遺伝子の発現を誘導することを明らかにした.本研究は,抗炎症能あるいは組織誘導能が知られている薬剤,生体分子,多血小板血漿(Platelet Rich Plasma; PRP)が各種細胞に与える影響を検討し,断髄部,根尖病変部に薬剤・生体分子,PRPを組み合わせて応用・実用化することを目的としている.これまでに私達は,歯髄創傷治癒における歯髄アポトーシスと修復象牙質形成の相互作用,歯髄細胞回復能への各種刺激の影響等ついて明らかにしてきた.

またFibroblast Growth Factor-2(FGF-2)徐放による象牙質欠損部への新生象牙質形成誘導や象牙芽細胞様細胞株の樹立等,歯髄再生に必須の研究成果を挙げてきた.本年度は,私達が開発している新規セメントの象牙芽細胞様細胞,骨芽細胞様細胞への影響,ステロイドコアクチベーターMTI-IIの骨芽細胞様細胞への影響,PRP,Bone Morphogenetic Protein-2(BMP-2),FGF-2の象牙芽細胞様細胞への影響,アメロブラスチンの上皮細胞への影響について検討した.その結果,BMP-2は象牙芽細胞様細胞の分化に影響を与えること,FGF-2は象牙芽細胞様細胞の細胞突起伸長を誘導することを明らかにした(Kitamura et al., Polymers, 2011; Washio et al., Int J Dent, 2012; Jimi et al., Int J Dent, 2012).また,新しく開発したセメントは象牙芽細胞様細胞,骨芽細胞様細胞に親和性を有すること,MTI-IIは骨芽細胞様細胞の炎症応答を抑制すること,精製したPRPが象牙芽細胞様細胞の分化関連遺伝子の発現を誘導すること,さらにアメロブラスチンは上皮増殖を抑制することを明らかにした.今後はそれぞれの分化誘導因子,炎症抑制因子の誘導・抑制における機能解析を実施する予定である.現在実施しているのは,新規セメントの象牙芽細胞様細胞,骨芽細胞様細胞,神経細胞への影響,ステロイドコアクチベーターMTI-IIの骨芽細胞様細胞,象牙芽細胞様細胞への影響,多血小板血漿(Platelet Rich Plasma; PRP),Fibroblast Growth Factor-2(FGF-2)の象牙芽細胞様細胞への影響,ならびにアメロブラスチンの上皮細胞への影響についての検討である.平成24年度は,新規セメントについては象牙芽細胞様細胞,骨芽細胞様細胞への親和性を有するとともに神経細胞の突起伸長を誘導すること, MTI-IIについては骨外細胞様細胞,象牙芽細胞様細胞における遺伝子発現レベルでの炎症抑制が示されたこと,FGF-2の象牙芽細胞様細胞への影響についてはFGF-2が象牙芽細胞様細胞の突起伸長を誘導すること,PRPについては抗炎症応答,分化誘導能が遺伝子レベルで確認されたこと,さらにアメロブラスチンについては上皮細胞の増殖を抑制することが明らかとなった.現時点で論文公表に至る成果はないが,順次学会発表をしており,当初に予定していた進行度合はおおむね達成しているため,自己点検による評価としてはおおむね進展していると言える.現在実施しているのは,新規セメントの象牙芽細胞様細胞および骨芽細胞様細胞への影響,ステロイドコアクチベーターMTI-IIの骨芽細胞様細胞への影響,多血小板血漿(Platelet Rich Plasma; PRP),Fibroblast Growth Factor-2(FGF-2)の象牙芽細胞様細胞への影響,ならびにアメロブラスチンの上皮細胞への影響についての検討である.新規セメントについては象牙芽細胞様細胞ならびに骨芽細胞様細胞への親和性を有していることが明らかになったこと,ステロイドコアクチベーターMTI-IIについては遺伝子発現レベルでの炎症抑制が示されたこと,FGF-2の象牙芽細胞様細胞への影響についてはFGF-2が象牙芽細胞様細胞の突起伸長を誘導すること,PRPは精製過程がほぼ安定したので,今後実施する予定であるPRPの高精製過程の確立の準備が整ったこと,さらにアメロブラスチンについては精製がある程度安定したことがある.現時点で論文公表に至る成果はないが,当初に予定していた進行度合はおおむね達成しているため,自己点検による評価としてはおおむね進展していると言える.
英国の信託法理と英国会社法の戦略報告書作成規定の理論的関係性

本研究は、価値創造プロセス(ビジネスモデル)を受託責任として情報開示する企業情報開示のあり方について、先駆的な英国2006年会社法の戦略報告書の実務・制度を手掛かりに考察・提示しようとするものである。具体的には、英国2006年会社法第172条の取締役の義務(会社の成功を促進する義務)が成文化された必然性を解明した。戦略報告書の目的は、第172条の取締役の義務をどのように果たしたのかを株主に通知し、株主の評価に役立てるための取締役の報告手段といえる。さらに、コーポレートガバナンス理論の類型化を提示し、英国の信託法理が株式会社制度や受託責任制度の基礎となっていることを指摘した。伝統的な企業報告の情報開示のあり方は、財務的資本の保全管理(スチュワードシップ)に焦点が当てられ、財務的価値創造の結果としての財務的業績を説明責任(アカウンタビリティ)の対象としてきた。本研究は、ますます複雑になる企業活動の非財務情報から財務情報への関連性を結びつける価値創造連鎖のプロセス(事業モデル)に関する企業情報開示のあり方について、特に、先駆的な英国の実務・制度を手掛かりに考究・提示しようとするものである。第一年度(平成27年度)は、比較法学や国際法学での「行動規範」に関する分析に用いられるソフトロー概念の研究成果を手掛かりとして、英国で公表された取締役による戦略報告書の作成規範がハードローである2006年会社法で規定された理由を浮き彫りにしようと試みた。具体的には、民間の国際機関である国際統合報告審議会(IIRC)が提唱する統合報告フレームワークと比較する方法を行った。また、英国の戦略報告書が出現した背景として、英国会社法所管の事業イノベーション職業技能省(BIS)がロンドン・ビジネス・スクール(LSE)のジョン・ケイ教授に依頼して公表されたケイ報告書(政策提言)が重要な位置づけにあることを指摘した。英国2006年会社法の戦略報告書の内容要素については、固定されたものではなく、特に非財務情報の開示に関するEU指令の内容に依存し、開示拡充の方向に将来変更することが予測できる。英国法の信託法理に関しては、その生成と形成の歴史的分析に取り組んでいる。第一年度(平成27年度)において、国内学会の発表を1回行っている。国際統合報告フレームワークで提唱されている統合報告書の6つの資本概念について、その生成理由と概念拡張の可能性の分析がまだまとめられていない。本研究は、ますます複雑になる企業活動の非財務情報から財務情報への関連性を結びつける価値創造連鎖のプロセス(事業モデル)に関する企業情報開示のあり方について、コーポレート・ガバナンスの履行状況とその結果の影響(アウトカム)を説明する視点から、特に先駆的な英国の実務・制度を手がかりに考究・提示しようとするものである。第二年度(平成28年度)は、英国企業の戦略報告書に関する実態調査に加え、英国のコーポレート・ガバナンスの捉え方について、その類型化(分類化)を試み、英国をモデルとする南アフリカ共和国の統合報告におけるコーポレート・ガバナンスの捉え方についても比較検討した。英国企業の戦略報告書の作成プロセスおよび内容については、追跡調査と確認調査のために、渡英によるミーティング調査を行った。英国法の信託法理に関しては、法体系・法哲学・法理学の理解に裏付けられる法的理論研究を含め、その生成と形成の歴史的分析に取り組んでいる。また、非財務情報の電子化(XBRL化)に関する現状と課題の分析に関しては、英国においては財務情報の電子化にとどまっていることを確認している。英国は平成28年度の6月に国民投票によりEU離脱を決定し、3月にはEU側に離脱手続きの通告を行った。これにより、今後英国の法体系のあり方がどのようになるのか不確定な時期に入ったことを認識している。非財務情報の開示に関するEU指令およびEU規則の制定が英国会社法の戦略報告書の内容の変更にどのように影響するのか不確定となった。英国の統合報告を議論する際に、英国会社法の戦略報告書作成規定に基づく報告なのか、民間の国際機関である国際統合報告審議会(IIRC)が提唱する国際統合報告フレームワークに準拠する統合報告なのか、その両方を兼ね備えた報告なのか、見極めた上で比較検討しながら行っている。英国企業の戦略報告書について、追跡調査と確認調査のために、渡英調査によるミーティング調査を行った。本研究は、近年の企業の非財務情報から財務情報への関係性を結びつける価値創造プロセス(ビジネスモデル)について、企業の中長期的展望を視野に入れた受託責任(Stewardship)に基づく企業の説明責任をより一層促進する、という企業情報開示のあり方について、特に先駆的な英国2006年会社法の戦略報告書の実務・制度を手掛かりに考察・提示しようとするものである。具体的には、ソフトローを重視する英国で、戦略報告書の作成義務がなぜハードローである英国2006年会社法で規定されたのか、第172条の取締役の義務(会社の成功を促進する義務)がこれまでのコモンローから成文化された意義について、その必然性を解明した。戦略報告書の目的は、第172条の取締役の義務をどのように果たしたのかを社員(株主)に通知し、社員の評価に役立てるための取締役の報告手段といえる。一方で、英国法と米国法の不一致を指摘し、英国の信託法理が株式会社制度や受託責任制度の基礎となっていることを指摘した。

本研究は、価値創造プロセス(ビジネスモデル)を受託責任として情報開示する企業情報開示のあり方について、先駆的な英国2006年会社法の戦略報告書の実務・制度を手掛かりに考察・提示しようとするものである。具体的には、英国2006年会社法第172条の取締役の義務(会社の成功を促進する義務)が成文化された必然性を解明した。戦略報告書の目的は、第172条の取締役の義務をどのように果たしたのかを株主に通知し、株主の評価に役立てるための取締役の報告手段といえる。さらに、コーポレートガバナンス理論の類型化を提示し、英国の信託法理が株式会社制度や受託責任制度の基礎となっていることを指摘した。英国企業が戦略報告書を実際にどのように作成して開示しているのかについて、ウェブサイトによる調査を基本としてケーススタディ(実態調査)を行う。戦略報告書の規定が施行されて3年目の決算期を迎える年となるため、施行後の課題を見いだせることを期待するものである。また、ケーススタディの追跡調査と確認調査のために、渡英調査によるミーティング調査を行う予定である。研究成果を社会に還元すべく、学会報告、ジャーナル投稿により公表する予定である。研究成果を社会に還元すべく、学内のエクステンション・カレッジによる講座開設、学会報告、ジャーナル投稿、シンポジウムの開催により、公表する予定である。国際会計物品費(英国法・会計関連の文献・資料:81,943円の未使用)については、信託法理関連の資料収集を計画通り行っていなかったことが原因である。旅費(国内旅費:44,020円の未使用)については、東京出張を1回分行っていなかったことが原因である。その他(通信費:30,000円の未使用)については、計画通り行っていなかったことが原因である。第二年度(次年度)には、パソコンを購入する計画を立てているので、パソコン・プリンタトナー・文献資料の購入に物品費を用いる計画である。渡英出張を計画しているので、国内出張とともに旅費を使用する計画である。その他の費用については、渡英出張時のインターネット回線を確保するためのレンタルルータ料(訪問先との連絡手段・勤務先本学との連絡手段・訪問先での情報収集手段)として用いる計画である。
子育て支援における親同士のピア・サポート効果の研究

1.研究目的近年は様々な子育て支援の取り組みが行われているが、子どもだけでなく親自身が育つことを支える実践を行っている保育施設がいくつかある。そのような保育施設では、職員が親を支援するだけでなく、親同士の支えあいの関係(ピア・サポート関係)によって子育てを支援する実践が行われている。本研究では親同士の支えあいの関係が構築されている保育施設で、新入園の親がどのように親同士の関係を築いていくのか、また、その関係の中で親同士がどのように支えあって子育てをしているのかという点に注目した。2.研究方法調査対象の保育施設において、新入園児の親が、他の親とどのような関わりによって支えられているのか、アンケート、インタビュー、ビデオ定点撮影による観察を通して親のピア・サポート関係の構築過程や内容を明らかにする。3.結果ピア・サポート関係構築の過程では保育施設での在籍年数が長い親が、新しく入園した親に積極的に声かけをして関係を築いていっており、親の先輩としてのアドバイスというよりも、まず同じ親という立場で悩みや喜びなどの、ありのままの感情を共有するという関わりによって、新しい親との信頼関係をつくっていることが明らかになった。アンケートやインタビューからは、自分が気付かなかったわが子の良いところを褒めてくれることが励みになること、先輩保護者の生き生きした姿が目標になったこと、不安な時に先の見通しを示してくれたことなど、親同士の支え合いが子育てに良い影響を与えていることが読み取れた。このような結果から、保育施設において職員が親を支援することに加えて、親同士の支えあいの関係(ピア・サポート関係)が構築できる環境を意図的につくっていくことで、子育てを支える力をより大きなものにすることが出来ると考えられる。
培養ヒトグリオーマ細胞株を用いた温熱療法の生物学的検討

ヒトグリオーマに対する温熱療法でも、正常脳組織への障害をいかに抑えて、最大の腫瘍増殖抑制効果を得るかが重要な課題である。そこで、当部門にて樹立されたヒトグリオーマ由来のNP-1,2,3,ヒト髄芽種由来のMN-1と、正常ヒト胎児脳細胞HFBを用い、温度感受性について検討した。すべて対数増殖期に温水にて加温し(day0),1,3,5,7日に生細胞数を算定し、推移をみた。至適加温条件の検討;NP-3とHFBを用い、42°C60分,44°C30分,60分,45°C30分,46°C30分加温した。温度上昇に伴い、双方とも増殖抑制効果がみられた。46°C30分ではNP-3で著明な殺細胞効果がみられ、生細胞数が減少したのに対し、HFBでほぼ横ばい状態であった。グリオーマ細胞株間での殺細胞効果の検討;46°C30分加温にて行った。MN-1<<NP-1<NP-3<NP-2と殺細胞効果が上昇した。植え込み数を変えても効果は同様であった。生細胞数の推移をみると、MN-1はday1、3でもわずかな殺細胞効果がみられたにすぎなかった。一方、NP群はいずれもday5まで効果がみられた。37°Cの増殖曲線から平均倍加時間はMN-1>NP-1>NP-3>NP-2と短くなっていた。加温による形態変化;NP群では、加温直後よりday5まで、著明な細胞膜の退縮,変性,さらに細胞死の過程が観察された。まとめ;1.46°C30分加温で、HFBの増殖曲線がほぼ横ばいであるのに対し、ヒトグリオーマ細胞株では著明殺細胞効果がみられ、これは5日間持続した。2.殺細胞効果は増殖能の高い細胞株程強い。3.グリオーマ細胞群と髄芽腫由来株の殺細胞効果の差が、培養下での増殖能の差によるものか腫瘍発生母地の差によるものか、などについては、今後さらに検討すべき課題と思われた。
ヘムオキシゲナーゼと弱い相互作用を示す複合体の立体構造解析

ヘムオキシゲナーゼ(HO)はNADPH-シトクロムP450還元酵素(CPR)からの還元力を利用してヘムを分解する酵素で、ヘムの代謝に必須である。本研究ではヘムーHO複合体に対して強く相互作用する変異CPR(ΔTGEE)を見出し、ΔTGEEーヘムーHO複合体の結晶構造解析を4.3Å分解能で決定した。その結果、CPRの大きな構造変化を伴うヘムーHO複合体への電子移動機構を提唱することができた。その裏付けを取るために、X線小角散乱を使った解析、架橋実験、超遠心分析による相互作用解析などを行い、提唱した電子移動機構を支持する結果が得られた。ヘムオキシゲナーゼ(HO)は、分子状酸素とNADPH-シトクロムP450還元酵素(CPR)からの還元力を利用し、ヘムをα-ビリベルジン、一酸化炭素、鉄に分解する酵素である。本研究ではCPR-HO複合体もしくはCPRの各ドメインとHOの複合体の立体構造解析を行い、CPRとHOの相互作用の詳細およびCPRからHOへの電子伝達経路について明らかにすることを第一の目的とした。本年度はCPR-ヘム-HO複合体の構造解析および機能解析を計画しており、結果としてCPR-ヘム-HO複合体の4.3Å分解能での結晶構造決定に成功した。これまでの研究からCPRを構成するFMNドメインとFADドメインをつなぐループの一部を切除した変異CPR(ΔTGEE)はヘム-HO複合体と安定な複合体を形成することが分かっていた。その複合体を精製し、X線結晶構造解析およびX線小角散乱測定を行なった。結晶構造解析の結果、CPRはopen型と呼ばれるFMNが露出した構造でHOに結合していた。FMNとヘムの距離は最短で6Å程度であり、十分に電子伝達可能な距離であった。しかし、FADとFMNは20Å以上離れており、直接の電子伝達は難しい距離であった。一般にCPRからヘムタンパク質へは、NADPH→FAD→FMN→ヘムという順序で電子が流れるが、この構造のままでは、FAD→FMNの電子伝達は難しい。CPRはclose型と呼ばれる構造も取ることが分かっており、close型の構造はFAD→FMNの電子伝達に適している。すなわち、CPRのopen-closeの構造変化とリンクしたHOへの電子伝達機構が明らかとなった。この立体構造はCPRとその還元相手との複合体構造として世界初であり、インパクトの高い結果といえる。本研究ではCPR-HO複合体もしくはCPRの各ドメインとHOの複合体の立体構造解析を行い、CPRとHOの相互作用の詳細およびCPRからHOへの電子伝達経路について明らかにすることを目的とした。現在までに、CPR-HO複合体を変異CPR(ΔTGEE)を用いることで安定化し、低分解能ながらX線結晶構造解析に成功した。ΔTGEE-HO複合体中で電子はNADPH→FAD→FMN→ヘムと伝達されると推定しているが、FADとFMNは20Å以上離れており、FAD→FMNの直接の電子伝達は難しい位置関係にあった。実際にΔTGEEからヘム-HO複合体への電子伝達速度は野生型CPRを用いた場合の1/250程度であり、非常に遅くなっていた。これまでの海外の研究グループ(米ウィスコンシン大Kim博士)らの報告では、CPRはopenとclosedの二つ以上のコンフォメーションを行き来しながら電子伝達を行うことが推定されている。ΔTGEEはopenコンフォメーションが安定化された変異CPRであり、このことと我々の決定した立体構造を合わせて考えると、openコンフォメーションはHOに結合するのに都合が良く、結合すると、FMNとヘムが近接するので、CPR-HO間の分子間電子伝達に都合の良い形、closedコンフォメーションはFMNとFADが近接しているので、CPR内部の分子内電子伝達に都合の良い形と考えることができる。CPRはこの二つのコンフォメーションを行き来することで、HOなどにうまく電子伝達を行っていると推定できた。[背景]ヘムオキシゲナーゼ(HO)は分子状酸素とNADPH-シトクロムP450還元酵素(CPR)からの還元力を利用し、3段階の酸素添加反応によってヘムを部位特異的に開裂し、ビリベルジン、鉄、一酸化炭素に分解する酵素である。これらの生成物は体内の鉄の恒常性維持、抗酸化作用、種々のシグナル伝達に関わり、HOは生理的に重要な酵素と言える。これまでに、HOの反応機構を解明するために、種々の構造生物学的研究(様々な反応中間状態のX線結晶構造解析や分光学的解析、量子化学計算による解析など)が行われてきた。しかし、CPRからHOへどのように還元力が受け渡されるのかについては、CPR-HO複合体の立体構造が不明であったこともあり、なかなか理解が進んでいなかった。本研究では構造生物学を基盤としたHOの機能研究をさらに進めるべく、HOとCPRとの相互作用に着目して研究を進めた。CPRはHO以外にシトクロムP450やシトクロムb5と相互作用し、電子を受け渡す。したがって、本研究の成果はCPRから他のタンパク質への電子移動機構の解明についても波及することが期待される。