hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
糖鎖機能の統合的理解を目指した糖鎖改変マウスのＮ－統合グライコプロテオーム解析

マウス腎臓のグライコームを質量分析法により解析した結果、Lewis型フコースの消失だけでなく、様々な構造変化が検出された。ついで、Lewis型フコース糖鎖と結合しているキャリア分子を同定するため、AALレクチンによってフコシル化糖鎖ペプチドを捕集し、IGOT-LC/MS法(Kaji et al (2003) Nat Biotechnol.)で候補タンパク質および糖鎖付加位置を同定した。また、野生型マウスにおけるAAL結合糖ペプチドには、Lewis型フコースをもたず、コアフコースのみをもつ糖ペプチドも共存するため、糖鎖付加部位ごとのグライコーム情報を取得する新規グライコプロテオミクス技術を用いて、Lewis xキャリアを選別、同定した。以上の様に、グライコプロテオミクスの手法・技術を用いることで、糖転移酵素それぞれの糖鎖のキャリア糖タンパク質群を効率良く同定出来ることが示された。26年度が最終年度であるため、記入しない。糖鎖生物学、生化学、免疫学、微生物学26年度が最終年度であるため、記入しない。グライコプロテオーム解析により、糖鎖キャリア分子を網羅的・ハイスループットに同定するための系の構築のモデルとして、まずは糖転移酵素β4GalT1について実証実験を進め、β4GalT1が標的とするタンパク質の分子に共通した特徴・傾向を見出すことに成功した。昨年度までに、基本解析技術・手順を確立したが、標的が別の糖鎖構造の場合は、レクチンの選定と捕集系の構築、最適条件を模索する必要があり、現在までにその作業を進めてきた。標的糖鎖遺伝子欠損マウスは既に樹立済みであるが、必要に応じて、遺伝子欠損培養細胞株の作製も進める。標的糖鎖としたLacdiNAc(LDN)糖鎖は、糖タンパク質ホルモンなどの限られた種類の糖タンパク質上に見出されているが、生体内でのその役割は明らかになっていない。LDN糖鎖の生体機能を理解するために、そのキャリア糖タンパク質を明らかにする必要がある。そこで、マウス組織よりLDN糖鎖含有タンパク質を網羅的に同定する技術開発を行った。まず、B4galnt3、B4galnt4遺伝子欠損マウスを用いて比較検証を行った。B4galnt3が発現する胃とB4galnt4が発現する大脳サンプルを用いて、LacdiNAc-omicsを遂行し、数百種類のキャリアタンパク質候補の同定に成功した。マウス組織に加えて、培養細胞を用いても同様の解析を行った結果、LacdiNAcキャリア候補タンパク質は特徴的な細胞内局在を示す傾向があることが抽出された。また、ルイスx糖鎖でもキャリア糖タンパク質を同定するための系の構築(ルイスx合成酵素Fut9遺伝子欠損マウスあるいは培養細胞株)を行い、糖タンパク質の同定を進めているところである。今後は遺伝子欠損マウスを用いて、糖鎖機能不全もスクリーニングするとともに、他の系統のマウス・培養細胞株についても解析する予定である。糖転移酵素遺伝子ノックアウトマウスを用いて、グライコプロテオーム解析技術により、糖鎖キャリア分子を網羅的・ハイスループットに同定するための系の構築(レクチンの選定とレクチンによる捕集系の構築)のモデルとして、まずは最も糖転移酵素として生化学的に解析が進められてきていたβ4GalT1について実証実験を進めた。
ASEAN諸国の特別支援教育における就労支援と学校管理職養成に関する研究

本研究では、4年間の研究期間で、次の3つの目標を達成する。1)ASEAN諸国それぞれの社会状況や生活文化に基づく就労支援教育プログラムに関する調査・研究・開発を推進する。2)特別支援学校の教育が機能的に実施できるよう、学校管理職の質的向上を目指すための管理職養成プログラムに関する調査・研究・開発を推進する。3)上記2点をテーマとして、ASEAN諸国の特別支援教育に関する研究者・教育者との情報ネットワークを形成し、最終年度に国際シンポジウムを開催し研究成果の普及を図る。
ヒト鼻粘膜上皮バリア機能の分子的基盤

乾燥性鼻炎(ドライノーズ)の疾患概念、天然保湿因子であるフィラグリンの鼻における動態はほとんど知られていない。本研究において、鼻粘膜バリア機能におけるフィラグリンの意義について検討をおこなった。in vivoでは、スギ花粉症患者に対して、抗ヒスタミン薬の季節前投与(初期療法)をおこなうと、季節後投与群に比し、フィラグリンの発現がより増加することが示された。in vitroでは、ヒト鼻粘膜初代培養細胞において、細菌およびウイルス感染のモデルであるLPSあるいはpoly I: C投与により、フィラグリンの発現が減少した。一方、TNFα投与により、フィラグリンの発現は増加する結果を得た。代表的なバリア機能関連タンパクであるフィラグリンの発現を証明するため、ヒト鼻粘膜初代培養細胞を用い、種々条件下でのフィラグリン、代表的な上皮系サイトカインであるThymic stromal lymphopoietin (TSLP)、代表的な炎症性サイトカインであるinterleukin (IL)8などの発現を、real-time PCRおよびELISAを用いて検討した。昨年度までの我々の実験結果では、フィラグリンは、表皮および口腔粘膜上皮と同じく、ヒト鼻粘膜上皮細胞に存在することを、免疫組織学的に証明している。過去に報告されていないこととして、多列繊毛円柱上皮である下鼻甲介後端部分や上顎洞粘膜にも存在することが示された。また、気管支粘膜上皮は既報と同じく、存在が示されなかった。今年度は初代培養をコラーゲンコートしたメンブランフィルター上でおこない、細菌感染のモデルとしてlipopolysaccharide (LPS),ウイルス感染のモデルとしてPoly I:Cをそれぞれ刺激した後の、フィラグリン、TSLP、IL8について、mRNAおよびタンパク量を経時的に測定した。LPSおよびPolyI: Cでは、mRNAおよびタンパク量とも、用量依存的にフィラグリン、TSLPは減少、IL8は増加する傾向を認めた。あわせて、電気的バリア機能の指標である経上皮膜抵抗(TER)を測定したが、TERの低下で示される電気的バリア機能のdown regulationとフィラグリンのmRNAおよびタンパク量の推移と相関している傾向が確認され、現在詳細に検討中である。研究目的1)に記載している「ヒト鼻粘膜でのフィラグリンの発現が、アレルギー性鼻炎と非アレルギー性鼻炎、花粉症飛散前後、難治性副鼻腔炎でどうかわるか」に関して、まず、スギ花粉症患者下鼻甲介粘膜上皮における発現について初期療法(季節前投与)前後で検討した。具体的には下鼻甲介粘膜を綿棒にて擦過することにより得られた細胞について、SV Total RNA Isolation System (Promega)によりRNAを抽出し、Super Script First-strand Synthesis System for RT-PCR (invitrogen)により逆転写反応を行った後、リアルタイムPCRをおこなった。その結果、第2世代抗ヒスタミン薬を用いた初期療法をおこなった群では、鼻粘膜組織内のフィラグリン遺伝子の発現量が有意に増加し、また症状スコアの改善度と正の相関を有していることが認められた。アレルギー疾患の特徴として、自然緩解をしないこと、アレルギーマーチといわれる人生のステージで出現する組織が異なってくる現象が知られている。言い換えれば、人生の場面ごとに、組織を変えてあるいは新たにアレルゲン性を獲得して病態の悪化を惹起する現象がおこっていると考えられる。その意味で、アレルギー発症の予防あるいは難治化に対して早期介入をおこなうことの有用性が最近唱えられてきている。スギ花粉症初期療法(季節前投与)は早期介入の一つのモデルになっている。本結果は早期介入をおこなうことにより、バリア機能関連タンパクのなかでも証明されているフィラグリンの発現が増強されることを示唆しており、鼻炎だけではなく、気管支喘息およびアトピー性皮膚炎などすべてのアレルギー疾患の制御の一つの方向性を示す重要な知見であると思われる。代表的なバリア機能関連タンパクであるフィラグリンの発現について、昨年度おこなったヒト鼻粘膜初代培養細胞だけではなくヒト気管支粘膜およびケラチノサイトも用い、種々条件下でのフィラグリン代表的な上皮系サイトカインであるThymicstromal lymphoprotein (TSLP)、代表的な炎症性サイトカインであるIL8などの発現を昨年度に引き続いて、real-time PCRおよびELISAを用いて検討した。細菌感染のモデルとしてlipopolysaccharide (LPS)、ウイルス感染のモデルとしてpoly I:Cをそれぞれ刺激した後の、フィラグリン、TSLP、IL8について、mRNAおよびタンパク量を経時的に測定した。LPSあるいはpoly I:C刺激後、mRNAおよびタンパク量ともに、ヒト鼻粘膜初代培養細胞では用量依存的にフィラグリン、TSLPは減少、IL8は増加する傾向を認めたが、ヒト気管支上皮細胞では、刺激前後共にほとんど発現がみられなかった。ケラチノサイトも鼻粘膜上皮と同様の傾向を示した。同様の実験を、手術時摘出ヒト鼻粘膜初代培養上皮細胞でもおこなったが、同様の傾向が認められた。

耳鼻咽喉科バリア機能保持に密接に関連していることが有力視されているフィラグリンのヒト鼻粘膜上皮における局在を形態学的に証明した後、日本における代表的なアレルギー性鼻炎であるスギ花粉症患者に対する初期療法(季節前投与、3次早期介入)前後でのフィラグリンの推移を擦過鼻粘膜上皮細胞を用い、分子生物学的に、また各種サイトカインの動態を、鼻呼気凝集液を用いた解析で検討している。それに加えて、ヒト鼻粘膜初代培養細胞を用い、各種刺激におけるフィラグリン、サイトカインの動態をin vitroで検討し上記結果を得ている。フィラグリンの発現が上皮膜抵抗と相関し、鼻粘膜上皮バリア機能維持に役立っていることがより直接的に証明された。バリア機能関連タンパクと病態との関連性に関して、治療効果も含め、新知見が得られ始めている。今年度得られた知見に関して以下の国内特許を申請している(出願番号:特願2012-225608発明名称:アレルギー性鼻炎の判定方法出願日:2012/10/11)。ヒト初代培養鼻粘膜上皮細胞を用い、LPSやPolyI:C刺激後のフィラグリンの発現低下をどのように防ぐことができるかを、まず電荷性をもった各種ポリカチオン、ポリアニオンで検討する。そのことにより、アレルギーマーチの進行を防ぎ、いまだ特異的IgEが産生されていない個体での早期介入(一次介入)の道が開拓できると考えられる。1)難治性副鼻腔炎である好酸球性副鼻腔炎を含めた副鼻腔炎の発症および難治化に対して、フィラグリンがどのように関連しているかについて、粘膜擦過細胞および摘出組織標本を用いて検討する。2)初代培養ヒト鼻粘膜上皮細胞でフィラグリンの発現をノックダウンした場合、バリア機能が変化するか。リポポリサッカライドあるいはアレルゲン刺激によるバリア機能の変化に対して、フィラグリンの発現をノックダウンした場合どう変わるか。3)連携研究者はフィラグリンノックアウトマウスを現在飼育しており、花粉抗原に感作させた前後でワイルドタイプのものとの症状、好酸球浸潤、サイトカインの発現の相違について検索する。予定していた海外出張が諸般の事情により不可能となったため。次年度に同出張を遂行予定です。遺伝子関連試薬、一般試薬、器具類、国内外での成果発表のための旅費などに使用する予定である。
凝集体形成分子p62による神経変性疾患封入体形成機構

研究目的オートファジーは、ダイナミックな膜形成(オートファゴソーム形成)を伴う真核生物に保存された蛋白質分解システムである。酵母などの下等単細胞生物においては、オートファジーは飢餓に応答した自己分解を介したアミノ酸供給による生存戦略が唯一の働きと考えられてきた。一方、申請者らは脳特異的オートファジー不能マウスを作製・解析し、オートフナジー不全がヒト神経変性疾患の特徴的構造体であるユビキチン陽性封入体形成を伴った神経変性疾患を引き起こすことを明らかにした。さらに、封入体形成の責任分子としてオートファジーにて選択的に分解されるユビキチン結合タンパク質p62の同定に成功した。つまり、オートファジー不全よるp62過剰蓄積が、ユビキチン-p62陽性の封入体形成を導くことを見出した。本研究では、封入体形成因子p62の神経変性疾患における病態生理的意義の解明を目指す。研究結果今回、我々は、オートファジーの障害がp62の異常な蓄積・凝集化に依存して抗酸化たんぱく質群の遺伝子発現誘導を起こすことを見出した。抗酸化たんぱく質群の遺伝子発現は転写因子Nrf2により正に制御されることが明らかにされているが、我々は、p62がNrf2の分解を制御するユビキチンリガーゼKeap1と直接相互作用することを発見した。さらに、構造学的解析から、p62の結合するKeap1の領城が、Nrf2の結合するKeap1の領域と同じ領域であることを明らかにした。つまり、P62が細胞内に過剰に蓄積した場合、Keap1とNrf2の結合を競合的に阻害し、Nrf2の分解が阻害され、その結果、抗酸化たんぱく質群の遺伝子発現が誘導されるという新しい生体防御の仕組みがあることが判明した。今後、神経変性疾患モデルマウスおよびヒト病態部位でも同様の現象が起こっているか否かを検証する予定である。オートファジーは、ダイナミックな膜形成(オートファゴソーム形成)を伴う真核生物に保存された蛋白質分解システムである。一方、申請者らは脳特異的オートファジー不能マウスを作製・解析し、オートファジー不全がヒト神経変性疾患の特徴的構造体であるユビキチン陽性封入体形成を伴った神経変性疾患を引き起こすことを明らかにした。本年度は、神経変性疾患モデルマウス群とp62ノックアウトマウスの交配、繁殖を行なった。また、併せて臓器特異的p62過剰発現マウスの作成を行なった。
ガラニン様ペプチドによる摂食・エネルギー代謝調節の機能形態学的解析

ガラニン様ペプチド(GALP)は摂食調節に深く関与している神経ペプチドであり、投与短時間では摂食促進、長時間では摂食抑制作用のあることが明らかになっている。さらにGALPは熱産生およびエネルギー代謝にも関与している。しかし、GALPニューロンの求心性支配とその起始部位、さらには末梢組織へのエネルギー代謝経路は不明である。そこで本研究ではトランスジェニックマウスを用いてGALPニューロンを支配している入力路を形態学的に同定すること、GALPの熱産生に及ぼす影響を生理学的にしらべ、さらに末梢臓器でのエネルギー代謝経路の同定を行うことを目的に実験観察を行なった。ラット脳内におけるGALP産生ニューロンの分布・局在を免疫組織化学的に観察し、さらに他の摂食関連ペプチドとの神経相関を免疫組織細胞化学的に観察した。GALP含有ニューロンは摂食調節を行なう数種のニューロンとシナプス形成をしていること、さらに生殖腺刺激放出ホルモン含有ニューロンを神経支配していることも分かった。GALP遺伝子プロモーター制御下で逆行性輸送機能を有するEGFPを発現するトランスジェニック(GALP-逆向性輸送する緑色蛍光タンパク質(EGFP-TTC)Tg)マウスを2系統作出することに成功し、現在その系統の繁殖と系統維持を行なっている。現在1系統繁殖しているGALP-EGFP-TTC Tg miceを用いてGALP含有ニューロンへの起始部位および求心路を明らかにするために、実験観察を行なっている。さらに、GALPのエネルギー消費をしらべるために、GALPまたは生理食塩水を脳室内投与し、麻酔下で酸素消費量、心拍数、深部体温、皮膚温度を測定し、GALP投与群とVehicle投与群を比較検討した結果、GALPは視床下部のグリア細胞を刺激してプロスタグランディンを産生し、それが発熱中枢を活性化すること、また末梢神経を介して熱産生およびエネルギー代謝を亢進させることが明らかになった。ガラニン様ペプチド(GALP)はブタ視床下部より単離・同定された生理活性ペプチドであり、GALP含有ニューロンは脳内で複数の摂食調節ニューロンと神経相関を持っている。GALPは短期的には摂食充進作用をもち、長期的には摂食量および体重減少作用のあることが多数の研究者によって認められている。GALPは摂食調節のみならずエネルギー代謝調節にも関与することが示唆される。我々は、ラット麻酔下でのGALPの脳室内投与後、心拍数、深部・皮膚体温、酸素消費量を4時間にわたり経時的に測定した。また、脳内の熱産生経路の1つであるプロスタグランジン系を介する経路をCOX2選択的阻害薬により前投与してこの系をブロックした場合のGALPによる心拍数、深部・皮膚体温、酸素消費量の上昇抑制をしらべた。さらにGALPの脳内の標的細胞を同定するために、c-Fos抗体を用いて免疫染色を行ないc-Fosを発現する細胞種の同定をした。さらにGALP投与2時間後の骨格筋、褐色・白色脂肪細胞などにおけるグルコースの取り込みを2-DG法にて測定し、GALPのエネルギー代謝調節への関与をしらべた。GALPの脳室内投与後、濃度依存的に心拍数、酸素消費量は上昇し、投与後1時間と2時間に2相性のピークを示した。深部体温は150分後に上昇ピーク値を示したが、熱放散を示す皮膚温の変化はみられなかった。脳内プロスタグランジン系を介する経路をブロックするとGALPによる熱産生の効果は消失した。GALP脳室内投与後の末梢臓器における2-DGの取り込みは、末梢骨格筋において有意に増加した。

褐色脂肪細胞における2-DGの取り込みは増加傾向を示した。以上の研究結果よりGALPは摂食調節のみならず、エネルギー代謝調節にも深く関与することが明らかになった。ガラニン様ペプチド(GALP)は摂食調節に深く関与している神経ペプチドであり、投与短時間では摂食促進、長時間では摂食抑制作用のあることが明らかになっている。さらにGALPは熱産生およびエネルギー代謝にも関与している。しかし、GALPニューロンの求心性支配とその起始部位、さらには末梢組織へのエネルギー代謝経路は不明である。そこで本研究ではトランスジェニックマウスを用いてGALPニューロンを支配している入力路を形態学的に同定すること、GALPの熱産生に及ぼす影響を生理学的にしらべ、さらに末梢臓器でのエネルギー代謝経路の同定を行うことを目的に実験観察を行なった。ラット脳内におけるGALP産生ニューロンの分布・局在を免疫組織化学的に観察し、さらに他の摂食関連ペプチドとの神経相関を免疫組織細胞化学的に観察した。GALP含有ニューロンは摂食調節を行なう数種のニューロンとシナプス形成をしていること、さらに生殖線刺激放出ホルモン含有ニューロンを神経支配していることも分かった。GALP遺伝子プロモーター制御下で逆行性輸送機能を有するEGFPを発現するトランスジェニック(GALP-逆向性輸送する緑色蛍光タンパク質(EGFP-TTC)Tg)マウスを2系統作出することに成功し、現在その系統の繁殖と系統維持を行なっている。現在1系統繁殖しているGALP-EGFP-TTC Tg miceを用いてGALP含有ニューロンへの起始部位および求心路を明らかにするために、実験観察を行なっている。さらに、GALPのエネルギー消費をしらべるために、GALPまたは生理食塩水を脳室内投与し、麻酔下で酸素消費量、心拍数、深部体温、皮膚温度を測定し、GALP投与群とVehicle投与群を比較検討した結果、GALPは視床下部のグリア細胞を刺激してプロスタグランディンを産生し、それが発熱中枢を活性化すること、また末梢神経を介して熱産生およびエネルギー代謝を亢進させることが明らなった。
小児におけるインスリン抵抗性と単球アポリポ蛋白E分泌能に関する研究

新潟県三市中蒲地区の肥満小児290名(男児96名,女児194名,年齢10.3±2.1歳,肥満度(標準体重比)+52.6±14.1%)を対象に,空腹時に採血を実施し,血中インスリン(IRI),血清脂質およびアポリポ蛋白を測定した.また,同時にbiological impedance法(BIA)により体脂肪率を測定し,腹部エコーにより脂肪肝を無し,軽度,中等度,高度の4群に分類し,以下の結果を得た.血中IRIは肥満度(p<0.001),体脂肪率(p<0.001),HDL-C(p<0.05),LDL-C(p<0.05),中性脂肪(TG)(p<0.001),アポA-1(p<0.01),アポB/A-1比(p<0.05)と有意の正の相関を示したが,総コレステロール(T.Chol),アポB,アポEとは有意の相関はなかった.しかし,アポEを従属変数(Y),肥満度,体脂肪率,血中IRI,HDL-C,LDL-C,アポA-1,アポBを独立変数(X_<1-7>)として多変量解析を行なったところ,血中IRI(p<0.05),アポA-1(p<0.01)が高いほどアポEは高くなる傾向を示した.また,アポEは脂肪肝無し群,軽度群,中等度群,高度群ではそれぞれ5.5±1.3,6.0±1.8,6.2±1.4,6.8±1.6mg/dlであり,脂肪肝の程度はアポE濃度に左右されていた.今回の検討により,小児においても肥満度,体脂肪率が多いほどインスリン抵抗性が高くなり,TGを中心とした脂質代謝に異常を来たし,これに伴いアポEにも変動が生じ,さらに脂肪肝を来たす可能性が示唆された.今後は,単球アポリポ蛋白分泌能が血中アポ蛋白の変動に影響を及ぼすのか検討したい.新潟県三市中蒲地区の肥満小児290名(男児96名,女児194名,年齢10.3±2.1歳,肥満度(標準体重比)+52.6±14.1%)を対象に,空腹時に採血を実施し,血中インスリン(IRI),血清脂質およびアポリポ蛋白を測定した.また,同時にbiological impedance法(BIA)により体脂肪率を測定し,腹部エコーにより脂肪肝を無し,軽度,中等度,高度の4群に分類し,以下の結果を得た.血中IRIは肥満度(p<0.001),体脂肪率(p<0.001),HDL-C(p<0.05),LDL-C(p<0.05),中性脂肪(TG)(p<0.001),アポA-1(p<0.01),アポB/A-1比(p<0.05)と有意の正の相関を示したが,総コレステロール(T.Chol),アポB,アポEとは有意の相関はなかった.しかし,アポEを従属変数(Y),肥満度,体脂肪率,血中IRI,HDL-C,LDL-C,アポA-1,アポBを独立変数(X_<1-7>)として多変量解析を行なったところ,血中IRI(p<0.05),アポA-1(p<0.01)が高いほどアポEは高くなる傾向を示した.また,アポEは脂肪肝無し群,軽度群,中等度群,高度群ではそれぞれ5.5±1.3,6.0±1.8,6.2±1.4,6.8±1.6mg/dlであり,脂肪肝の程度はアポE濃度に左右されていた.今回の検討により,小児においても肥満度,体脂肪率が多いほどインスリン抵抗性が高くなり,TGを中心とした脂質代謝に異常を来たし,これに伴いアポEにも変動が生じ,さらに脂肪肝を来たす可能性が示唆された.今後は,単球アポリポ蛋白分泌能が血中アポ蛋白の変動に影響を及ぼすのか検討したい.
癌幹細胞の細胞周期制御機構の解明と治療法の開発

治療抵抗性の癌幹細胞は、正常の組織幹細胞と同じく非増殖画分(G0期)にあると考えられている。多くの抗癌剤や電離放射線による癌治療は、細胞周期が高度に進行している細胞を標的としており、G0期にある癌幹細胞に対しては無効である。われわれは、生化学的方法または遺伝学的方法によって、G0期維持因子(G0 maintenance factor: G0-MF)の条件を満たす二つの分子Fbxw7とp57を同定した。さらにわれわれは、白血病幹細胞(白血病における癌幹細胞)においてFbxw7とp57がG0-MFとして機能するかどうかを実証した。平成22年度は主に次世代プロテオミクス技術を用いたGO-MFの発現解析とGO-MFの条件的遺伝子改変マウスの作製を行った。われわれは最近次世代プロテオミクスを利用した情報基盤定量法を開発し(特許出願済)、非常に少ない細胞においてタンパク質を網羅的に同定できるシステムを確立した。このシステムを癌幹細胞分画に応用し、GO期維持因子(GO-MF)の候補分子である種々のサイクリン、c-Myc等の癌遺伝子産物、CDKインヒビター、Skp2やFbw7等のユビキチンリガーゼのタンパク質発現量を絶対定量した。同時に転写レベルにおいてもリアルタイムRT-PCR法でその量を確認した。その結果、CDKインヒビターp57とユビキチンリガーゼFbw7が癌幹細胞分画に高発現していることを発見した。既にこれらの因子は正常幹細胞において必須の役割を果たしていることをわれわれは突きとめているが、癌幹細胞における役割は不明である。そこでこれらGO期維持因子(GO-MF)の有力候補について、その遺伝子構造を調査し、機能的に必須であって代替する産物が生じないような設計の下、コンディショナルノックアウトマウスの作製を行った。現在これらのコンディショナルノックアウトマウスを用いて骨髄細胞にレトロウイルスベクターを用いて癌遺伝子を導入し、白血病を生じさせる発癌モデルを構築し、白血病を起こした後にこれらの遺伝子を欠損するシステムを用いて、これらGO期維持因子(GO-MF)が癌幹細胞に必須であるかどうかを判定する。がん幹細胞の特徴の一つは、長期にわたって静止期(GO期)にとどまっていることである。われわれは特に1)GO期への進行を促すメカニズムと、2)GO期からの脱出を阻止するメカニズムをそれぞれ明らかにし、その分子実体を明らかにした。1)はユビキチンリガーゼFbw7によるc-Mycのユビキチン依存性分解が大きなキーファクターとなっており、2)はCDKインヒビターp57がCDK活性を抑制することがその中心となっていることを突きとめた。そこでマウス慢性骨髄性白血病モデルを作製して、そのがん幹細胞においてFbw7を条件的に欠損させる実験を行った。Fbw7が欠損するとc-Mycのユビキチン化が阻害され、その結果c-Mycが蓄積して一過性の前駆細胞の増加が起こるが、このような異常な細胞増殖はp53が活性化されてアポトーシスが誘導され、最終的には白血病幹細胞の枯渇が起こる。つまりFbw7の抑制は一過性の異常増殖を経て、最終的にがんを消滅させる方向へ向かう。しかし白血病細胞の一過性の増殖は個体死を招くため、実際にヒトのがん治療には応用できない。この問題を解決するため、Fbw7の欠損と同時に従来の抗がん剤投与によって増殖細胞を殺す併用療法を行ったところ、最終的に白血病の完全寛解に成功した。Fbw7の抑制は正常細胞にも強い効果があると考えられたが、白血病幹細胞は正常幹細胞よりもはるかにFbw7欠損によるアポトーシスへの感受性が高く、これが治療ウィンドウになることが期待される。この結果はマウスだけでなく、実際にヒト白血病細胞を用いても同様の効果が確認された。つまり本研究により、Fbw7の抑制によってがん幹細胞をGO期から追い出し、増殖を始めたところを従来の抗がん剤で叩くという「GO期追出し療法」が現実的にがん治療にとって有効であることを証明した。近年、少なくとも一部の癌において癌幹細胞が存在し、癌組織は癌幹細胞により維持されていることが明らかとなった。これまでの抗癌剤治療や放射線療法は増殖期にある癌細胞を標的としてきたが、癌幹細胞は増殖期を脱出して静止期に留まっているため、これらの従来の癌治療に耐性を示す。治療後に残存した癌幹細胞は再発や転移を引き起こすため、癌幹細胞の静止期維持機構の解明は癌の根絶に向けた新たな治療法の開発にとって重要である。しかし、その分子機構はこれまでほとんど明らかになっていなかった。われわれは今回、サイクリン依存性キナーゼ(CDK)阻害分子p57が慢性骨髄性白血病(CML)における癌幹細胞(白血病幹細胞)の静止期維持に重要な役割を果たしていることを発見した。まず、CMLマウスモデルにおいてp57を欠損させると、細胞周期が再開し、静止期が維持されなくなることを見出した。

次にわれわれは、p57欠損白血病幹細胞が抗癌剤に感受性を示すことを突き止め、さらにp57欠損と抗癌剤を併用することにより、白血病幹細胞を根絶させ、抗癌剤単独投与群と比較してCMLマウスの再発率を減少させ、生存率を著明に改善させることに成功した。最後に、この併用療法がCML患者由来の白血病幹細胞に対しても有効であることを確認し、p57がヒト白血病の治療において有望な標的であると結論づけた。これは先行して行っているFbxw7阻害実験と同じ結果である(Takeishi et al., Cancer Cell, 2013)。今回われわれは、癌幹細胞の静止期を直接制御している分子を世界で初めて同定した。さらに本研究は、癌幹細胞を静止期から追い出すことにより、抗癌剤感受性を増大させるというp57標的療法が、癌治療において生存率を著明に改善できることを示している。前年度まで、われわれはG0期維持因子(G0 maintenance factor: G0-MF)としてFbw7とp57という二つの分子を同定し、これらが正常幹細胞におけるG0期維持にとって必要条件になっていることを実証してきた。また癌幹細胞についても、慢性骨髄性白血病モデルマウスで実際にFbw7がG0期維持及び幹細胞性に必要であることを明らかにし、Fbw7の機能阻害によってこのモデルマウスにおける慢性骨髄性白血病はイマチニブ投与後もほとんど再発しないことを確認した。それを受けて今年度は、急性骨髄性白血病モデルマウスの作成と固形癌モデルマウスの作成を主に行った。急性骨髄性白血病モデルマウスは、レトロウイルスベクターを利用してMLL-AF9-IRES-GFPをMx1-Cre/Fbw7(flox)マウスまたはMx1-Cre/p57(flox)マウスの骨髄幹細胞に感染させ、これを放射線照射したレシピエントマウスに移植することによって、急性骨髄性白血病を起こすことに成功した。また固形癌モデルマウスは、腸管腺腫を発症するAPCΔ716マウスや胃癌を発症するGANマウスを共同研究者である武藤誠博士(京都大学)や大島正伸博士(金沢大学)より供与していただき、これにわれわれの作製したVillin-Cre/Fbw7(flox)マウスまたはVillin -Cre/p57(flox)マウスを交配して、当該マウスを得ることに成功した。今後は、これらのマウスで発症する癌(腺腫)におけるFbw7やp57の欠失の効果を判定し、これらのG0-MFが慢性骨髄性白血病だけでなく、急性骨髄性白血病や固形癌においても癌幹細胞のG0期維持や幹細胞性の維持に必須であるかどうかを検討する。われわれが発見したG0期維持因子(G0-MF)の一つであるFbxw7の機能阻害をする低分子化合物をスクリーニングするアッセイ系の構築を行った。まずFbxw7を蛍光タンパク質monomeric AzamiGreenと融合した組換えタンパク質をバキュロウイルスシステムによって大量に作製し、c-Myc結合部位のリン酸化ペプチドをプレートに固相化して結合すると蛍光を発するようなプレートアッセイ系を構築した。リン酸化有り無しによって結合の特異性を検証し、この結合がリン酸化に依存していることを確認した。本研究の範囲はここまででその後の実際の創薬過程については別の応用研究で行う予定である。
気道上皮細胞単一イオンチャンネル電流に対する神経ペプチドの影響と情報伝達系の関与

犬摘出気管粘膜をコラ-ゲンサポ-トに培養し、ウッシング法を用い、ボルテ-ジクランプの状態で短絡電流を測定した。また、オ-プンサ-キットの条件で細胞間電位差を測定し、細胞のコンダクタンスも算出した。さらにパッチクランプ法により、単一イオンチャンネル電流を解析し、細胞内情報伝達系のうちサイクソックAMPについての役割を検討した。内因性のペプチドであるエンドセリンと血小板活性化因子は、いずれも、細胞の粘膜側に投与した際に短絡電流を用量依存性に増加せしめ、細胞間電位差とコンダクタンスも有意に増大した。以上の反応は、サブスタンスPの場合と同様、Naチャンネル阻害薬のアミロライドの前処置による影響を受けなかったが、Clトランスポ-ト阻害薬のフロセミド、Clチャンネルブロッカ-のジフェニラミンカルボキシレ-ト、Clのイオダイドによる置換などの処理による著明に抑制された。また細胞内のサイクリックAMPの軽度増加とともにCa濃度の上昇が認められた。したがって、以上のメディエ-タ-は、上記のセカンドメッセンジャ-を介し、粘膜側のClチャンネルの開口を選択的に亢進せしめるものと考えられた。また、パッチクランプでは、細胞の漿膜側のみならず粘膜側にもKチャンネルが存在することが明らかとなった。これは細胞外にKを排出させることにより細胞の過分極をきたし、粘膜側からのCl分泌を維持するための電気的な駆動力となり得る可能性が示唆された。一方、粘膜側のインサイドーアウト法によりClチャンネル由来の単一イオンチャンネル電流を同定し、サブスタンスPの投与により開口確率が増加し、似上の反応は細胞内サイクリックAMPの増加を伴うことを確認した。平成2年度補助金のとに行なった研究の実績は下記の諸点である。(1)呼吸音の量子化:アナログ呼吸音時系列デ-タをアナログ/ディジタル(A/D)変換器(ADXー98E,カノ-プス社製)を用いて量子化し,離散的な時系列デ-タを,コンピュ-タに記憶させるシステムを完成した。そのシステムは標本化周波数10kHzで5秒間連続A/D変換可能であった。(2)量子化された呼吸音デ-タ-の解析アルゴリズム:この様に量子化された呼吸音の数値デ-タ-から不連続性ラ音を抽出するアルゴリズムを検討した。適応化平滑化法,フ-リエ変換,周波数領域平滑化,積算平均化,線形予測法を用いてスペクトルム包絡を求める方法,ケプストラム法,PARCOR係数法などの方法を検討対象とした。検討した範囲では不連続性ラ音を抽出する最適な方法は適応化平滑化法であった。比較的簡明であること,人為的に入力すべきパラメ-タ-が比較的少ないことなどがそのアルゴリズムの利点として挙げられた。(3)不連続性ラ音の抽出精度の検討:種々の症例から録音された不連続性ラ音を含む呼吸音を上記のアルゴリズムによって解折し不連続性ラ音を抽出した。不連続性ラ音がどの程度正確に抽出されたかを以下の方法によって検証した。(1)抽出された不連続性ラ音以外の部分を雑音部分を雑音と判断し,その除外し不連続性ラ音のみからなるディジタルデ-タ-ファイルを各症例について作成した。このディジタルデ-タ-をディジタル/アナログ(D/A)変換器(DAXー98,カノ-プス社製)で再生した。この不連続性ラ音だけからなる再生音と不連続性ラ音を抽出する前の生の音とを複数の呼吸器専門医が聞き比べた。両者に差異を指摘する医師はいなかった。(2)従来から行なわれている方法によって症例から録音された生デ-タ-を周波数分析した。抽出された不連続性ラ音のみからなるディジタルデ-タ-を周波数分析した。

周波数分析にはフ-リエ解折および自己回帰モデル解折を用いた。生デ-タ-からの周波数分折結果と抽出された不連続性ラ音のみからなるディジタルデ-タ-からの周波数分析結果との間に有意な差を見出さなかった。(4)今後この方法による不連続性ラ音抽出方法を臨床応用するすることが可能であり有用性があると考えられた。
原発性瘢痕性脱毛症における上皮間葉転換の関与の解析

毛孔性扁平苔癬(LPP)を含む原発性瘢痕性脱毛症は疼痛、炎症、浸出液、感染を伴う永久脱毛になる疾患であるため、QOLは著しく低下するが、発症メカニズムは明らかではなく、治療も症状緩和と増悪を止めることに留まっている。我々はLPP患者の毛包上皮幹細胞において上皮間葉転換が生じていることを示し、これがLPPの発症機序の一つであることを証明した。また毛器官培養で、毛包上皮幹細胞に上皮間葉転換マーカーの特徴的変化を発現させることができた。このモデルにPPAR gamma作動薬を投与することで上皮間葉転換マーカーの変化を阻止し、PPAR gamma作動薬がLPPの新規治療薬になりうることを示唆した。Immunohistomorphometryについては、Eカドヘリン(上皮系マーカー)、Vimentin(間葉系マーカー)、Slug(転写因子)について既に検討済みだったため、その他のEMTマーカーについて精査した。Fibronectin(間葉系マーカー)、Snail(転写因子)、Twist1(転写因子)については、いずれも有意に上昇していた。ただし、alpha-SMA(間葉系マーカー)、CD44(間葉系マーカー)、Zeb1(転写因子)については有意な変化は認めなかった。全てのEMTマーカーではないが、主要なマーカーの変化が、毛包上皮幹細胞でのEMTの発現を示唆した。LPP患者の毛包上皮幹細胞でのEMTの発現について、タンパク質レベルでの解析及び転写レベルでの解析が予定通り終了した。また毛器官培養でのEMT導入の実験についての条件を検討しており、先行した実験では一部結果が出ている。毛孔性扁平苔癬(LPP)を含む原発性瘢痕性脱毛症は疼痛、炎症、浸出液、感染を伴い永久脱毛になる疾患である。QOLは著しく低下し、不可逆性の脱毛により社会心理面でも大きな不利益がある。しかし、決定的な治療方法は確立されていない。発症メカニズムとして毛包上皮幹細胞の不可逆的な障害によって生じると考えられている。我々は毛包上皮幹細胞における上皮間葉転換(EMT)の発現について着目した。昨年度までで、LPP患者の毛包上皮幹細胞において、タンパク質レベル及び転写レベルで上皮間葉転換の発現を確認し、同疾患の発症メカニズムに毛包上皮幹細胞のEMTが関与していることを示した。今年度は、まずLPP患者検体において毛包上皮幹細胞を電子顕微鏡で観察し、線維芽細胞様の細胞への変化や膠原線維の産生を認めた。これにより、超微細構造でもEMTの関与が示唆された。これまで毛器官培養での瘢痕性脱毛症の実験モデルは確立されていなかった。我々は正常ヒト頭皮の検体を用いた毛器官培養で、毛包上皮幹細胞にEMTを導入することで、原発性瘢痕性脱毛症のex vivoモデル確立を試みた。TGFb1、EGFを含む4種類の薬剤を投与することで、ヒト毛器官培養での毛包上皮幹細胞にEMTを導入することに成功した。また過去の報告で、糖尿病治療薬であるPPARgアゴニストは、培養細胞レベルでEMT抑制効果が示唆されている。更に臨床的にも、糖尿病を合併している原発性瘢痕性脱毛症患者にPPARgアゴニストが投与されたところ、同疾患が改善された報告がある。我々が確立した瘢痕性脱毛症のex vivoモデルにPPARgアゴニストを投与したところ、培養毛器官の毛包上皮幹細胞でのEMTの発現を抑制することができた。これにより、EMT発現抑制の観点からも、PPARgアゴニストが新たな原発性瘢痕性脱毛症の治療法になる可能性を見出すことが出来た。細胞培養でEMTを導入し得た報告がある薬剤をヒト毛器官培養に添加することで、毛包上皮幹細胞にEMTを導入する。これにより毛器官培養におけるEMT導入モデルを確立する(ex vivoでの原発性瘢痕性脱毛症モデルの確立)。次の段階として、過去の報告から細胞培養でEMTを阻害し得る薬剤をこのモデルに投与することで、毛器官においてEMTを阻害できる薬剤を検討する(新規治療法の探索)。28年度が最終年度であるため、記入しない。形成外科学28年度が最終年度であるため、記入しない。
操作を触覚的に疑似体験させる技術によるユーザインターフェイスの設計効率向上

本課題では、ロボット技術の進歩と共に性能が画期的に向上したセンサとアクチュエータからなる制御システムを、触覚に情報を提示する手段として利用して、仮想的な世界で任意の形状をした仮想上のハンドヘルド機器を操作する触感を感じさせ、さらにボタンやスイッチに触った触感や操作する感触を上記アクチュエータで指に加える力を通じて再現する技術を開発してきた。そうした中で、近年、スマートフォンやタブレット端末等、タッチパネルをユーザインターフェイスとして利用したハンドヘルドデバイスが急速に普及していることから、最終年度の平成24年度には、タッチパネル上で触感を生成するデバイスを付加したユーザインターフェイスについて、操作を触覚的に疑似体験させることにより操作性を向上する方法を併せて研究した。具体的には、タッチパネルを動かして操作中の指に触覚的フィードバックを加えるアクティブ型のデバイスと、ゴムの弾性を利用して操作中の指に触感を付加するパッシブ型のデバイスを多数試作して、その効果を評価した。その結果、開発したデバイスは、触感が不足しているタッチパネルに触覚フィードバックを効果的に付加し、触感を疑似体験させることでユーザインターフェイスの操作性を向上できることが明らかになった。当成果は、平成25年3月に国際会議VR2013で発表し、IEEEのComputer Societyからベストデモ賞を受賞した本課題では、ロボット技術の進歩と共に性能が画期的に向上したセンサとアクチュエータからなる制御システムを、触覚に情報を提示する手段として利用して、仮想的な世界で任意の形状をした仮想上のハンドヘルド機器を操作する触感を感じさせ、さらにボタンやスイッチに触った触感や操作する感触を上記アクチュエータで指に加える力を通じて再現する技術を開発してきた。当成果は、平成25年3月に国際会議VR2013で発表し、IEEEのComputer Societyからベストデモ賞を受賞したこの1年の間に、当研究課題が対象としている携帯機器の主流が、従来のキーボードを搭載した機器から、タッチパネルをベースとするユーザインターフェイスを用いるスマートフォンやタブレット端末などに急速に移行してきた。そこで本課題開始時の計画を修正し、従来型のキーボードをベースとしたユーザインターフェイスの操作を疑似体験させる技術については、22年度中に完了するように前倒しで研究を進めてきた。その結果、キーボード型ユーザインターフェイスに関して操作を疑似体験する技術を予定より早く完成し、その効果を評価する実験も完了し、その成果を日本バーチャルリアリティ学会の論文誌に投稿し、査読を経て、採択が決定した。またこうした研究と並行して、急速に普及しているタッチパネル型ユーザインターフェイスに対応できるように本課題の計画を修正し、社会的なニーズの変化に適合するように努力してきた。従来から、当研究室では、触覚的フィードバックが不足しているタッチパネル型ユーザインターフェイスに、触感を付加するデバイスの研究を行っており、タッチパネルにそうしたデバイスを付加する場合について、本課題を適用し、ユーザインターフェイスの設計効率を向上することを目的として、各種の試作を行ってきた。またマウスやタッチパネルを操作中の指に、触覚フィードバックを与えて、仮想空間内で操作の触感を疑似体験できるようにするデバイスも製作し、2つの国際会議でその成果を発表した。さらに本課題の主目的は、ユーザインターフェイスの設計効率の改善であるが、その副産物として、タッチパネルを使いやすくする上で、本研究課題で研究してきた操作の触感を生成する技術が応用できることになり、本課題の成果の新しい用途が開けることとなった。本研究課題が対象としている携帯機器の主流が、従来のキーボードを搭載した機器から、タッチパネルを用いるスマートフォンやタブレット端末などに急速に移行してきたことから、23年度は本課題開始時の計画を修正し、タッチパネルをベースとしたユーザインターフェイスの操作を疑似体験させる技術を開発してきた。具体的には、指とタッチパネルの間に介在して、タッチパネルの操作時に指の触覚に刺激を与えるデバイスを各種試作した。タッチパネルで指の運動を検出し、特定の指の動作に同期させて、試作デバイスで各種の触覚フィードバックを指に加えるようにした。触覚フィードバックは、前年度に開発した「ワイヤの張力で操作中の指に力を加えるデバイスを用いて、タッチパネル上の指の操作に同期してモータでワイヤの張力を変化させて指に加える方式」、23年度に開発した「指で保持するペン型デバイスの指に接触する位置、またはタッチパネルに接触する位置に設けた刺激子をモータで駆動してその変位を指の触覚に伝える方式」及び、「モータを使わずに、指の操作を通じてゴムに弾性エネルギーを蓄積し、そのエネルギーを操作中に適切なタイミングで開放することで、ゴムの弾性や反発力を活用して指に触覚刺激を加える方式」の3つの方式で指に加えるようにし、従来のキーボードやスティック、トラックボールを操作する際に指が感じる触覚情報をタッチパネル上で疑似体験させて、それが操作性に与える影響を評価した。多数の被験者を通じて、こうしたデバイスを通じて生成される触覚フィードバックの効果を評価する実験を行い、その結果を国際会議や学術誌で報告した。

本課題では、ロボット技術の進歩と共に性能が改善したセンサー、アクチュエータからなる制御システムを、触覚に情報を提示する手段として利用して、仮想的な世界で任意の形状をした仮想上のハンドヘルド機器を操作する触感を感じさせ、さらにボタンやスイッチに触った触感や操作する感触を上記アクチュエータで指に加える力を通じて再現する技術を開発してきた。そうした中で、近年、スマートフォンやタブレット端末等、タッチパネルをユーザインターフェイスとして利用したハンドヘルドデバイスが急速に普及していることから、平成24年度には、タッチパネル上で触感を生成するデバイスを付加したユーザインターフェイスについて、操作を触覚的に疑似体験させることにより操作性を向上する方法を研究する。具体的には、タッチパネルを動かして操作中の指に触覚的フィードバックを加えるアクティブ型のデバイスと、ゴムの弾性を利用して操作中の指に触感を付加するパッシブ型のデバイスを多数試作して、その効果を評価した。その結果、開発したデバイスは、触感が不足しているタッチパネルに触覚フィードバックを効果的付加し、触感を疑似体験させることでユーザインターフェイスの操作性を向上できることが明らかになった。当成果は、平成25年3月に国際会議VR2013で発表し、IEEEのComputer Societyからベストデモ賞を受賞した。多数の触覚フィードバックデバイスを考案、試作し、評価データを蓄積し、学会発表も多数行えた。24年度が最終年度であるため、記入しない。23年度には、モータを利用して能動的に触覚刺激を生成して指を刺激するアクティブ方式とモータを使わずにゴムの弾性エネルギーで触覚刺激を生成するパッシブ方式を開発したが、24年度は両方式を組み合わせたハイブリッド方式を開発し、より小型、低消費電力のデバイスで操作性の改善につながる触感を模擬的に生成できるようにする計画である。
溶融塩を用いたアルミニウムドロスからのアルミニウムの回収

申請者は、アルミニウム鋳造工程で生ずるアルミニウムドロスを効率よく酸化物とアルミニウム合金に分離し、その酸化物から電解反応によって金属を生産し、系外に廃棄物を出さない所謂ゼロエミッションプロセスを検討してきた。平成11年度は、主にアルミニウムドロス中のアルミニウム合金と酸化物が効率よく分離可能な溶融塩組成を検討し、その組成中最も酸化物(主にアルミナ)が多く溶解する組成を見出した。今年度は、その溶融塩を電解浴として用い、アルミナからアルミニウムが製造することが可能であるかどうかを検討した。本研究では、先ずドロス中の酸化物を使用する前に、試薬のアルミナによる模擬実験により、データを蓄積することにした。電解浴組成は16mol%BaCl_2-49NaF-35AlF_3を用い、800°Cのグラファイトるつぼ内で電解浴を調製した。電解には、アノード、カソード共にグラファイトの丸棒を用いた。電解浴中のアルミニウム成分の定量分析には、蛍光X線分析装置を用い、電析アルミニウムの純度はICP発光分光分析装置を用いた。その結果、電解浴中にアルミナを溶解させ、その溶解したアルミニウムイオンを電解により消費したさいに、アルミナはある溶解速度で連続的に電解浴中に溶解することが明らかになった。電解の電流密度は、電解浴を700g用いたさい0.02Acm^<-2>程度で継続的な電解が可能であることが示唆された。しかし、電解における電流効率は2530%と低く、電流効率を改善するための電解槽型状、電解浴の前処理、電解法の見直しなどが今後の課題として明らかになった。自動車のアルミホイール等のアルミニウム鋳造製品を製造するさい、アルミニウム合金溶湯の上部が空気中の酸素と反応し、アルミナおよび合金添加元素の酸化物が生成する。これらの酸化物をアルミニウムドロスと呼んでいる。年間約400万トンのアルミニウム製品を生産するのに伴い、約9%に相当する35万トンのドロスが発生している。しかしこのドロスの効果的な処理法が無く最終的に埋立などに頼っているのが現状である。本研究は、このアルミニウムドロスのゼロエミッション化を目指し、このドロス中のアルミニウム合金と酸化物を溶融塩中で密度の差によって分解し、アルミニウム合金は浮上させて回収し、酸化物は電解によってアルミニウムとして回収するプロセスを開発することである。本年度は、アルミニウム合金が浮上し、酸化物が沈降する、両者の中間の密度を有する溶融塩を見出し、さらにその後の電解工程のためのより多くのアルミナ溶解する溶融塩組成を探索した。BaCl_2-NaF-AlF_3およびBaCl_2-NaCl-NaF-AlF_3系溶融塩について、まずこれらの系の融点を明らかにするために、各種組成について高速デジタルマルチメーターによって冷却曲線を測定し800°Cの実験温度において使用可能な組成域を明らかにした。次にその範囲における密度条件を満たした組成域を決定した。その結果、800°Cの16mol%BaCl_2-49%NaF-35%AlF_316mol%BaCl_2-46%NaF-38%AlF_3組織がアルミナ投入時に溶融塩中のアルミナ濃度として0.9mol%に達し、測定組成中最も大きな溶解量であることが明らかになった。現在、この溶融塩を電解浴として用い、ドロスを電解浴に投入する前後における電極反応についてグラファイト電極における酸素発生領域を検討中である。
高配位リン化合物を配位子とする遷移金属錯体の創製

我々は最近、鉄に配位しているリン原子に直接求核攻撃を行わせて、リンの原子価を遷移金属上で拡張し、異常原子価リン化合物を配位子とする鉄ホスホラン錯体が合成できることを報告した。本研究では、この鉄ホスホランの反応性について調べたので報告する。鉄ホスホラン錯体であるCp(CO)_2Fe{P(OC_6H_4NMe)_2}に弱いプロトン酸であるPhOHを反応させると、1つのN原子がPから解離した[Cp(CO)_2Fe{P(OC_6H_4NMe)-(OC_6H_4NMeH)}]^+が生成した。この錯体は、n-BuLi共存下[Cp(CO)_2Fe{P(OPh)_3}]^+とo-N-methylaminophenolとの反応における中間生成物と考えることができる。実際、今回単離した陽イオン錯体にNaNH_2を反応させると、ほぼ定量的にもとのホスホラン錯体が生成することが認められた。鉄ホスホラン錯体Cp(CO)_2Fe{P(OC_6H_4NMe)_2}にLewis塩基であるLDAを反応させ、その後MeIを反応させると、ホスホランフラグメントがCp環に結合した鉄のメチル錯体が生成することが分かった。生成物はX線構造解析より決定した。また、LDAを反応させた段階での錯体の考察より、この段階で、ホスホランフラグメントがCp環に転位していることがわかった。この反応は遷移金属に結合したホスホランフラグメントが転位反応をすることを示した最初の例であり、大変興味深い。
脳シナプス解析からみた脳梗塞ラットの介入別の運動麻痺改善効果の検討

本課題では脳卒中後の運動麻痺回復に有効なリハビリテーション(リハビリ)開発、ならびに運動麻痺回復メカニズムの解明を目的に、脳梗塞モデルラットを用いてリハビリ実施ならびに脳機能解析を実施した。PIT法により右前肢に限局した運動麻痺を呈する脳梗塞モデルラットを作出し、麻痺肢の強制使用(CI療法)群、CI療法に餌へのリーチ課題を併用し実施群、非介入群の3群に分類した。運動機能評価はSingle pellet reaching, Forelimb reachingtest(前・側方), ladder testを用い、術前、術後1-28日目まで実施した。その結果、訓練実施群は非介入群よりも有意な麻痺改善を認め、さらに介入群の中でもCI療法単独よりもリーチ課題併用群は回復が良好であった。以上より、粗大運動は麻痺肢の不使用の防止により回復が見込めるが、巧緻運動は課題特異的に回復する可能性が示された。さらに、リーチ課題の難易度を変えて訓練を行ったところ、高難易度の課題実施群は低難易度の課題実施群よりも回復効果が高かった。現在、同モデルに対して関節運動覚などの求心性刺激を用いた運動介入を実施しており、運動種類やその難易度が麻痺改善に及ぼす効果を継続して検証する予定である。さらに、運動麻痺改善メカニズム解明に向け、リハビリ後のラット脳を採取し免疫染色法を用いて脳機能解析を行った。損傷後の神経細胞新生の評価のためにBrdUによる染色を行った結果、リーチ課題によるリハビリ実施群では非介入群に比べてBrdU陽性細胞数が多い印象であり、細胞新生が促進されている可能性が示された。今後NeuNとの二重染色により神経細胞新生の有無を評価していく。また、神経ネットワークの評価に向け、パッチクランプを用いたシナプス解析に関する予備実験を継続していく予定である。1)脳卒中モデルラットの作成:脳卒中後の運動麻痺の病態および回復機序を明らかにするために、運動麻痺を呈するモデル動物の作成を行った。脳梗塞作成のための設備改良を行う間、脳出血モデルの作製およ評価を行った。コラゲナーゼ注入法を用い線条体を損傷させることで、半身に運動麻痺を呈する線条体出血モデルラット(以下、脳出血ラット)を作成した。2)脳卒中モデルラットに対するリハビリテーション実施:運動介入の実施:脳出血ラットは強制運動群、自発運動群、非運動群に分けた。運動介入を実施した群にはそれぞれ、強制的運動としてトレッドミル、自発的運動として回転ケージを行わせた。運動麻痺評価:運動麻痺はMotor Deficit Scoreを用いて測定し、術前および術後の経過評価を行った。脳出血モデルラットは手術実施後の覚醒後には運動麻痺を呈し、自然回復は認められるものの、術後2週間以上に渡って運動麻痺が残存した(非運動群)。リハビリテーションの効果を検討したところ、強制運動・自発運動ともに実施することにより運動麻痺改善が促進され、特に自発的運動による運動麻痺の改善効果が高いことが明らかとなった。次年度は、実施する運動介入の違いによって脳内でどのような変化が生じているかの解析を行う準備を進めている。また、当初予定していた梗塞モデル作成のための設備が整ったため、脳出血モデルに加えて梗塞モデルおける発症から回復にかけての運動機能や脳内変化を観察していく。1)脳卒中後の運動麻痺評価・治療のための介入は順調に進んでいる。梗塞モデル作成のための設備が整ったため、次年度は脳出血モデルに加えて脳梗塞モデルによる病態評価、リハビリテーション実施を進める。2)モデル動物の症状が均質にならない時期があったため、安定したモデルを作成した後に脳解析を行うこととした。次年度は解析実施が可能となる1)脳梗塞モデルラットの作成:脳卒中後の運動麻痺の病態および回復機序を明らかにするために、光増感反応を用いたPIT法により前肢に限局した運動麻痺を呈するモデル動物を作成した。2)脳梗塞モデルラットに対するリハビリテーション実施:●リハビリテーション介入:介入手法には麻痺側肢集中使用(以下、CI療法)ならびにSingle pellet reaching(以下、リーチトレーニング)を用いた。脳梗塞モデル動物は、CI療法群、CI療法+リーチトレーニング群、非介入群の3群に分けて、それぞれの群に対して必要な介入を行った。その結果、脳梗塞モデルラットは術後には前肢に限局した運動麻痺を呈し、自然回復は認められるものの、術後2週間以上に渡って運動麻痺が残存した(非介入群)。リハビリテーションを実施した2群では、運動麻痺が改善する傾向にあったが、特にCI療法単独で実施するよりもリーチトレーニングを併用した群において回復が顕著であった。回復が認められた機能は特に粗大運動機能であり、巧緻運動では有意な回復が認められなかった。1)脳梗塞モデル動物が安定して作出できるようになり、運動麻痺評価・治療介入も順調に進んでいる。2)巧緻運動機能の改善が認められなかったため、次年度は治療手法を検討していく予定である。3)脳機能解析のための準備が整ったため、次年度は発症から回復にかけての脳機能解析を進める予定である。