hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
抗腫瘍活性アセトゲニン類の効率的合成法の開発と高活性物質の探索

高収率・高選択性を実現しうるC4ユニットの構造を検討した結果,ベンジリデンアセタール基で保護された3-ブチン-1,2-ジオールが最適なC4ユニットであることが分かり,配位子の不斉を変えることでα-オキシアルデヒドの不斉アルキニル化を完全に立体制御し,2種類のジアステレオ異性体をいずれも高収率・高立体選択性に作り分けることが可能となった.2)THF環セグメントの高立体選択的構築法の確立上記のジアステレオ異性体を,THF環の構築手順を変えることによって,THF環体の4種類のジアステレオ異性体をすべて作り分けることが可能となり,今後実施予定であるポリTHF環骨格構築法開発の基礎となる合成手法を確立することができた.以上のように,今年度計画していた目標をほぼ完全に達成することができた.我々はバンレイシ科の植物から単離された抗腫瘍活性ポリケチド,アノナセオウスアセトゲニン類(以下アセトゲニン類と略す)の系統的不斉合成法の開発が高活性化合物の探索,構造決定,作用機作の解明などに役立つものと考え,研究を行っている.アセトゲニン類は多様な立体化学を持つ連続THF環構造を特徴としており,多数の不斉炭素の集中するTHF環部を高度な立体制御を伴って効率的に構築でき,多様な立体異性体の合成に適用可能な合成経路であることが優れた合成法開発の鍵となる.これらの点を考慮して反復合成法に基づいた系統的合成法を立案し,その確立を目指して検討を行った.今年度は,昨年度に確立した水酸基に挟まれたmono-THF環構造の高立体選択的合成法を更に発展させ,反復合成法によるbis-THF環構造の高立体選択的構築法を確立した.また,mono-THF環構造合成法の応用としてmono-THFアセトゲニン,murisolinの不斉全合成の検討を行った.以下にその成果をまとめる.1)反復合成法によるポリTHF環構造の高立体選択的構築法の開発我々の目指すアセトゲニン類の連続THF環構造の高立体選択的構築法を確立すべく,mono-THF環化合物に対するC4ユニットの導入を検討し,8種類の立体化学を持つbis-THF環セグメントを,それぞれ高度に立体を制御して合成することに成功し,ポリTHF環合成法の基礎を確立することができた.2)γ-ラクトン環THF環セグメントの導入によるアセトゲニン類への誘導我々の方法論が実際にアセトゲニン類の合成法に活用可能かどうかを検証するため,ヒトの肺がん,腎臓がん,大腸腺がん細胞に対して強力な細胞毒性を持つmurisolinの不斉合成を検討した.その結果,ジイン体の不斉アルキニル化を鍵反応として高度に立体を制御して,その不斉全合成に成功した.これによりTHF環セグメントをアセトゲニン類へ導くための基本的な方法論を確立することができた.以上のように,当初計画していた目標をほぼ完全に達成することができた.
結晶成長現象とハミルトン・ヤコビ方程式

平成25年度は、ハミルトン・ヤコビ方程式に対する等高而法の改良について研究した。等高面法は、結晶表面などに代表される曲面(界面)の運動を追跡するための技法で、各時刻における曲面をある補助関数のゼロ等高面として表示し,その補助関数に対する偏微分方程式(等高面方税式)を解くことで曲面の動きを求める。しかし時間が経つにつれて解の傾きが小さくなることがあり,このとき計算機では等高面を正確に取り出せなくなるという問題がある。そこで、元の等高面方程式を適当に修正することで、傾きが小さくならない解を得ることを目的に研究を行った。界面への符号付き距離関数は傾きが1であるという事実に着目し、1 :符号付き距離関数との比較、2 :符号付き距離関数への収束、という二つのアプローチに基づいて修正方程式を導入した。以下にその内容と成果を述べる。1 :界面運動が滑らかであると仮定し、その界面への符号付き距離関数が満たす方程式をテイラー展開して得られる方程式を修正方程式として採用した。そして、初期値が初期界面付近で符号付き距離関数に等しいとき、初期値問題の粘性解が時間大域的にも符号付き距離関数に十分近いことを、比較定理を用いて証明した。2 :元の等高面方程式に、解の傾きを1に補正する効果を持つ項を付け加えた方程式を修正方程式として採用した。そして、補正項の係数であるパラメータを無限大にしたときに、初期値問題の粘性解が界面への符号付き距離関数へと収束することを証明した。また、この修正力程式は、元の等高面方程式と、時間微分が補正項に等しいという方程式とを交互に解く操作を考えたときに、その時間幅を0にしたときの極限を考えることで得られることも明らかにした。これは、時間に関しての均質化理論の応用として示される。この二つの方程式を解く時間比が、修正方程式のパラメータとして現れることも分かった。(抄録なし)私の平成23年度の主な研究は、1:不連続ソース項を持つハミルトン・ヤコビ方程式、2:距離空間上のアイコナール方程式、の2つである。1:ステップ源のある結晶成長の問題に現れる、不連続なソース項を持つハミルトン・ヤコビ方程式について研究した。典型的な方程式は1点での不連続性を持つが、従来の粘性解の意味では解の一意性が成り立たない。そこで従来の粘性解の概念を拡張することにより、適切な解の概念「包粘性解」を定義した。典型的な結果として、ハミルトニアンが強圧的な場合に、任意の有界一様連続な初期値に対して包粘性解が一意的に存在することを示せた。ハミルトニアンが非強圧的な場合は、一般に包粘性解の一意性は期待できないが、一意性が成り立つための十分条件を与えた。また最適制御理論との関係として、ある種の制御可能性条件の下で、不連続なランニングコストを持つ値関数が、包粘性解の表現公式を与えることを証明した。これらの成果は当初の研究目的に沿った満足のいくものである。当研究で扱った1点での不連続性を持つ方程式に対して、適切な解の概念を与える先行研究は無かった。今回の研究において適切な解を構成した点は新しく、意義がある。2:一般の距離空間の開集合上におけるアイコナール方程式に対して粘性解の概念を導入した。そして対応する最適制御問題を考えることによって、境界値問題の一意的な解を構成した。アイコナール方程式とは、未知関数の勾配の長さが既知の関数で与えられる方程式であり、例えば成長する結晶が占める領域と時刻との関係を記述する。従来の研究では、ネットワークなどの特別な距離空間上における方程式に対する解の概念は知られていたが、当研究では全く一般の距離空間という設定でアイコナール方程式の一意的な解を構成している点が新しい。私の平成24年度の主な研究は、1:結晶の蒸発・凝固モデルを記述する曲率流方程式の解の漸近挙動、2:格子点上の等周不等式、の2つである。1:蒸発と凝固により成長する結晶表面の形を記述する方程式が、1957年に材料科学者のMullinsにより導かれた。これは、指数部分に曲率を含む一般化された曲率流方程式に、半空間の境界上での接触角条件(ノイマン条件)が付いた問題として与えられる。Mullinsはこの方程式を近似・線形化することで解を与えたが、私は元の非線形問題そのものを考察した。まず粘性解の一意存在を示し、そして近似方程式の解との関係を明らかにした。適当なスケール変換の下、一般化された曲率流方程式の解が、通常のグラフに対する曲率流方程式の自己相似解に漸近的に収束することを証明した。この収束はより一般的な方程式に対しても得られている。また熱溝の深さ、つまり解の境界上の値についての評価も与えた。特に接触角が0に近づくとき、線形化問題の熱溝の深さが少なくとも3次のオーダーで元の深さを近似していることが分かった。本研究で、蒸発・凝固問題の解の長時間挙動が明らかになったと共に、Mullinsによる近似を適当な意味で正当化することができた。2:n次元格子点の部分集合に対して定義された表面積と体積が満たす不等式、離散等周不等式を導き、等号を成立させる最適な図形は立方体に限ることを示した。証明は、古典等周不等式に対するCabreのアイデアに基づく。

これはAleksandrov-Bakelman-Pucci(ABP)の最大値原理の証明手法を用いるもので、本研究では、ある差分ポワソン・ノイマン問題の可解性を示し、その解に対してCabreの手法を応用している。また格子点上の離散ABP最大値原理を用いて、楕円型差分方程式の解が満たすハルナック不等式の新しい証明を与えた。平成25年度は、ハミルトン・ヤコビ方程式に対する等高而法の改良について研究した。等高面法は、結晶表面などに代表される曲面(界面)の運動を追跡するための技法で、各時刻における曲面をある補助関数のゼロ等高面として表示し,その補助関数に対する偏微分方程式(等高面方税式)を解くことで曲面の動きを求める。しかし時間が経つにつれて解の傾きが小さくなることがあり,このとき計算機では等高面を正確に取り出せなくなるという問題がある。そこで、元の等高面方程式を適当に修正することで、傾きが小さくならない解を得ることを目的に研究を行った。界面への符号付き距離関数は傾きが1であるという事実に着目し、1 :符号付き距離関数との比較、2 :符号付き距離関数への収束、という二つのアプローチに基づいて修正方程式を導入した。以下にその内容と成果を述べる。1 :界面運動が滑らかであると仮定し、その界面への符号付き距離関数が満たす方程式をテイラー展開して得られる方程式を修正方程式として採用した。そして、初期値が初期界面付近で符号付き距離関数に等しいとき、初期値問題の粘性解が時間大域的にも符号付き距離関数に十分近いことを、比較定理を用いて証明した。2 :元の等高面方程式に、解の傾きを1に補正する効果を持つ項を付け加えた方程式を修正方程式として採用した。そして、補正項の係数であるパラメータを無限大にしたときに、初期値問題の粘性解が界面への符号付き距離関数へと収束することを証明した。また、この修正力程式は、元の等高面方程式と、時間微分が補正項に等しいという方程式とを交互に解く操作を考えたときに、その時間幅を0にしたときの極限を考えることで得られることも明らかにした。これは、時間に関しての均質化理論の応用として示される。この二つの方程式を解く時間比が、修正方程式のパラメータとして現れることも分かった。本年度は、不連続項を含むハミルトン・ヤコビ方程式を研究することを目的としていた。そして、ステップ源を持つ結晶成長の問題において、粘性解の理論に基づいてこれまでに無かった新しい解の概念を導入することで時間大域的な一意解が構成でき、また最適制御理論との関係も明らかにできた点において、順調な進展があったと判断した。今年度は結晶の蒸発・凝固モデルを記述する方程式の研究を主な目的としていた。そして、典型例である曲率流方程式のみならず、より一般の2階放物型方程式に対する解の漸近挙動に関する成果を得ることができ、さらに従来の解法で適用されていた近似を適当な意味で正当化することに成功した。これら点において計画以上の成果が得られたと判断した。今後も結晶成長の問題に現れる様々なハミルトン・ヤコビ方程式に対して、微分方程式の粘性解の理論を用いて、時間大域的な一意解を構成することを目標に研究を進める。具体的には、本年度の研究では時間発展形の1階の方程式を主に扱ったが、今後は曲率の効果を考えたときの結晶成長の問題に現れる2階の方程式も研究していきたい。
タンタル酸リチウム系圧電セラミック材料の開発

タンタル酸リチウム圧電体は単結晶としては広く利用されているが、セラミックとしての圧電性はこれまでほとんど報告されてこなかった。まず純粋のタンタル酸リチウムのセラミック焼成を試みたが、これは焼結性が悪く、特性評価に耐えなかった。そこで、Ca(Fe_<1/2>Ta_<1/2>)O_3との擬二成分系セラミックの焼成を試みたところ期待通り顕著な焼結性の改善を得られた。この系のセラミックでは固溶量が増加するにつれて、1mol%あたり16°Cのキュリー点の低下が見られ、20mlo%が固溶限界であった。固溶量が増加するにつれて相転移はいわゆるリラクサー的な特徴を有するようになる。誘電率のピーク温度より100°Cほど高いところから電界を印加しながら冷却する、電界冷却法によって分極処理をすると明瞭な圧電活性を示した。しかしながら、これらの固溶体セラミックは焼成時にしばしば亀裂が入り、あるいはちょっとした機械的衝撃で破損することがあった。タンタル酸リチウムの相図を見ると、化学量論組成よりもB-site(タンタルの位置)が過剰の側に雇用領域が広がっている。そこで、このセラックの焼成においてもB-siteの組成を検討したところ、焼成時にクラックを生じることもなく、破損しにくくなった。その上、0.8% B-site過剰の17% Ca(Fe_<1/2>Ta_<1/2>)O_3固溶の試料においては特に大きな圧電性が観察された。そこでこの圧電セラミックを用いてCMOSのICを使い発振を試みたところ、径方向基本振動に相当する周波数で安定な発振を観察することができ、この系のセラミックが鉛を含まない圧電セラミックとして、少なくとも発振子などの信号デバイスとしては活用できることが明らかとなった。さらにアーチ状の二対の櫛型電極を向かい合わせた試料でLamb波を励振、検出する実験を行い、時間領域で基本応答以下の高次応答まで観察することができ、これらの動作は従来のPZT圧電セラミックとほぼ同等であるということを確認した。さらには演算増幅器の帰還ループにこの素子を挿入して、Lamb波発信器を構成することができた。これによって、この圧電体がLamb波を用いた圧力センサその他の各種センサとして応用できることが明らかとなった。基本的な考察としては、固溶限界に近い17% Ca(Fe_<1/2>Ta_<1/2>)O_3で圧電活性が最大になる点について注目した。従来のPZT系圧電セラミックでは菱面体晶系と正方晶系との相境界(MPB)で圧電活性が最大となることが知られ、その理由の一つとして、ここでは二つの対称性の自由エネルギーが等しいので変形しやすいことが上げられていた。今回のタンタル酸リチウム系セラミックは菱面体晶系と正方晶系との相境界ではないが、固溶限界に近い組成で起こっており、これは結晶構造が不安定になり始め、そのために変形しやすくなると考えた。このような解釈は今後新たな圧電セラミック材料の探索に一つの指針を与えることとなるものと思われる。現在、圧電セラミック材料としては、ペロブスカイト構造を有する強誘電体であるPZT(ジルコンチタン酸鉛)が利用されているが、昨今、環境意識が高まる中で重金属である鉛を含むことが問題視されるようになってきた。そこで、本研究ではニオブ酸リチウム構造を有するタンタル酸リチウム(LT)をベースとしてCaTiO_3を固溶させたセラミックを焼成して圧電性が検出できるかどうかを試みた。その結果、約20%程度までCaTiO_3を加えた試料ではエックス線回折により単相のニオブ酸リチウム構造をとることが確かめられた。最適の焼成温度はおよそ1250°Cで、これより高いとリチウムの分解蒸発で単層構造をとらずまた多孔質のセラミックスしか得られなかった。固溶体とすることで焼結性も改善され、理論密度の98%以上セラミックスも得られた。外観は全くの白色であり、可視領域には吸収がない。そのため、焼結の良好な試料ではワックス状の透明感があり、光学的応用の可能性も考えられるようになった。CaTiO_3を1%入れるとキュリー温度は約15°C低下し、15%固溶させたセラミックスのキュリー温度は450°C近傍にあった。また、CaTiO_3固溶によってキュリー温度での誘電率のピークはなだらかとなり、また周波数に依存するなどメゾスコピック現象に伴う散漫相転移の様相を示した。誘電率のピークをやや超える温度より直流を印加しながら冷却する、いわゆる電界冷却の方法によって、分極処理を試みた。高温では約6mA/cm^2、低温では900V/mmの電界で処理し径方向振動および厚み振動で圧電応答を確認できた。このことはこの系のセラミックとして始めての観察であると思われる。電気機械結合係数は径方向振動で0.05とPZTと比べると小さいが、この材料は単結晶でもそれほど大きくなく、妥当な値と判断される。キュリー点が高いことから、高温でのセンサーや、また誘電率が100以下と小さいことから電圧モードの焦電効果赤外線センサーなども有望と考えられる。さらに、分極処理したセラミック上にすだれ状電極(IDT)を形成、表面波の励振・検出をこころみこれにも成功した。

これらの成果は結果が得られた時期の関係で、学術誌にはまだ掲載されていないが、日本セラミック協会、電子情報通信学会などで発表し、また、強誘電体応用会議、国際強誘電体会議にも申し込み中であり、次年度には専門学術誌に掲載となるが予想されている。タンタル酸リチウム圧電体は単結晶としては広く利用されているが、セラミックとしての圧電性はこれまでほとんど報告されてこなかった。まず純粋のタンタル酸リチウムのセラミック焼成を試みたが、これは焼結性が悪く、特性評価に耐えなかった。そこで、Ca(Fe_<1/2>Ta_<1/2>)O_3との擬二成分系セラミックの焼成を試みたところ期待通り顕著な焼結性の改善を得られた。この系のセラミックでは固溶量が増加するにつれて、1mol%あたり16°Cのキュリー点の低下が見られ、20mlo%が固溶限界であった。固溶量が増加するにつれて相転移はいわゆるリラクサー的な特徴を有するようになる。誘電率のピーク温度より100°Cほど高いところから電界を印加しながら冷却する、電界冷却法によって分極処理をすると明瞭な圧電活性を示した。しかしながら、これらの固溶体セラミックは焼成時にしばしば亀裂が入り、あるいはちょっとした機械的衝撃で破損することがあった。タンタル酸リチウムの相図を見ると、化学量論組成よりもB-site(タンタルの位置)が過剰の側に雇用領域が広がっている。そこで、このセラックの焼成においてもB-siteの組成を検討したところ、焼成時にクラックを生じることもなく、破損しにくくなった。その上、0.8% B-site過剰の17% Ca(Fe_<1/2>Ta_<1/2>)O_3固溶の試料においては特に大きな圧電性が観察された。そこでこの圧電セラミックを用いてCMOSのICを使い発振を試みたところ、径方向基本振動に相当する周波数で安定な発振を観察することができ、この系のセラミックが鉛を含まない圧電セラミックとして、少なくとも発振子などの信号デバイスとしては活用できることが明らかとなった。さらにアーチ状の二対の櫛型電極を向かい合わせた試料でLamb波を励振、検出する実験を行い、時間領域で基本応答以下の高次応答まで観察することができ、これらの動作は従来のPZT圧電セラミックとほぼ同等であるということを確認した。さらには演算増幅器の帰還ループにこの素子を挿入して、Lamb波発信器を構成することができた。これによって、この圧電体がLamb波を用いた圧力センサその他の各種センサとして応用できることが明らかとなった。基本的な考察としては、固溶限界に近い17% Ca(Fe_<1/2>Ta_<1/2>)O_3で圧電活性が最大になる点について注目した。従来のPZT系圧電セラミックでは菱面体晶系と正方晶系との相境界(MPB)で圧電活性が最大となることが知られ、その理由の一つとして、ここでは二つの対称性の自由エネルギーが等しいので変形しやすいことが上げられていた。今回のタンタル酸リチウム系セラミックは菱面体晶系と正方晶系との相境界ではないが、固溶限界に近い組成で起こっており、これは結晶構造が不安定になり始め、そのために変形しやすくなると考えた。このような解釈は今後新たな圧電セラミック材料の探索に一つの指針を与えることとなるものと思われる。PZTに代替し得る鉛を含まない圧電セラミック材料としてタンタル酸リチウム系圧電セラミック材料を検討した。
獣医画像診断における超音波特殊診断法の確立に関する研究

獣医学臨床領域で、通常の対象臓器のほかに超音波診断の対象とし得臓器や器官、および病態について、基礎的検討を経て多数の臨床例を対象に種々の走査法を用い、超音波特殊診断が可能かどうかを検討した。広範な領域に亘るが、それらの成果の概要は以下のごとである。1.ウシ乳房では経皮走査で触知不能の深部および小なる膿瘍が抽出され、早期診断が可能であった。びまん性乳房炎で細線状エコ-が慢性例で高頻度に出現した。内部乳管の明確に診断し得た。2.ウシの頚部臓器・器官では頚動・静脈、喉頭・気管、食道、甲状腺、胸腺等が経皮および水浸走査で映像化され、血管炎、食道梗塞、胸腺退化など新しい知見が得られた。3.経直腸走査によって骨盤腔内のリンパ節の腫大が明瞭に見られ、牛白血病の臨床診断に極めて有用であることが判明した。また他の腹腔内腫瘍の診断も可能となった。4.ウシの腎臓を経直腸走査によって映像化することにより腎石症、各種腎疾患の形態情報が得られ、泌尿器疾患に有用であった。5.ウシの関節異常で、関節炎と関節周囲炎との鑑別、四肢軟部組織との関係などが超音波映像によって明らかとなった。他方ウマでは四肢の腱疾患で腱の映像化により従来にない障害程度の診断が可能となった。6.経頭蓋走査による脳エコ-から、子牛および犬の水無脳症および水頭症の診断が可能となった。7.実験動物の超音波映像は種々の臓器で取得が可能であり、ウサギ、ラット、マウス等について、また胎子、実験的に作出した疾態の映像など、薬物開発に関連する疾態の把握に利用性が大きいと思われた。以上獣医学臨床領域では、超音波の有用性は高く今後特殊診断法として多くの生体情報がもたらされると思われる。獣医学臨床の領域において従来の超音波診断の対象臓器とは異る部位の映像学的診断情報を取得する目的で,大動物を中心に実験用小動に至るまで基礎的な検討を試みた.現在まで得られた成績の概要は以下のごとくである.1.ウシ乳房については,健常例の周産期乳房について経時的に観察した.分娩前2週間前から乳房の急速な腫脹が認められ皮下水腫は1週前に最大となり分娩直前に消失した.乳槽乳腺部と乳管の拡脹も明瞭に映像化し得た.2.腹腔内腫瘍では膿瘍との区別が容易で,経時的観察による両者の変化が補促され,病期との関係をある程度明確化し得た.3.腹腔内臓器では,経直腸法によりウシ腎臓の映像は経皮法より明瞭でとくに石灰沈着および化膿性疾患で有用であった.後大静脈像も得られた.4.四肢の軟部組織および関節疾患で,特殊な方法により基礎的に正常像を得た.病的例では正常例よりも描出が容易で,とくに骨周辺の変化が観察出来た.その中では靭帯の出血と離断,関節周囲炎の範囲決定に有用である.5.子ウシの頭蓋内映像は容易に得られ,正常例と脳形成不全との鑑別に有用であるが,リニア型探触子では走査範囲が限られることから少なくとも頭蓋内走査には,セクターまたはコンベツクス走査が必要であった.

6.ウシ頭頸部の映像は,ウシ頭頸部脈管,気管,食道で断層像として得られ,頸静脈炎,頸静脈の怒張,食道通過障害,耳下腺部の腫張などの程度判定に有用であった.とくに触知不能の頸動脈の映像は明瞭であった7.実験動物では体格が小で全身像が描出でき,体腔内貯溜液の早期判定,妊娠の診断,実質臓器の大小など有用な情報が得られた.8.野生動物ではエツヒグマの妊娠診断と胎児像を少数例ながら観察した.尚63年度は症例の追加と疾態に応じた走査法の開発に研究の主眼を置く予定である.前年度に引続き各分担において基礎ならびに応用的検討さらに症例の追加を試みた。大動物を主としたが実験小動物も検討した。現在まで得られた成績の概要は以下の如く要約される。1.牛乳房について、膿瘍形成例の触知不能の深部および小疾巣について明瞭な映像が得られ早期診断が可能であった。びまん性乳房炎では細線状エコーが慢性例で高頻度に描出され組織変化との関連が伺われた。乳頭損傷では内部乳管の損傷度が明確に診断し得た。2.腹腔内腫瘍の標的器管として骨盤付近の腸骨大腿リンパ節と内側および外側腸骨リンパ節の映像化を試みた。牛健常例では困難を伴うが、逆に病的に腫大した場合その描出は容易で、BLV抗体陽性牛について追跡中である。腎臓および後大動脈周辺も定査したが映像化は困難。3.腎臓結石および尿石症の牛の例で、腎結石では貝殻状結石エコー(腎杯を充す結石)、斑状結石エコー(10mmまたは1.5mmの結石の単在または十数個集積)および点状エコー(米粒大または0.5mm大の結石の単在と集積)を区別し得、腎結石の的中率は93.6%と高く尿石症の早期診断に有用であった。4.牛の前後肢の軟部組織の横断面を直接法と間接法によって映像化した。皮膚は高エコー、各筋の腱と周辺の皮下織はエコーフリーないし低レベルおよび靱帯は線状の高エコーであった。間接法がすぐれ、胃の評価は出来なかった。関節周辺の異常像は目下集収中である。5.牛の頸静脈怒張、頸静脈炎、食道拡張と梗塞、宗腺腫などについて特徴的エコー像を得た。耳下腺や甲状腺も映像化が可能であった。6.子牛と犬の頭蓋内映像を開頭例とともに検討し解剖学的構造との対比をし、無脳症などの例の診断が可能であった。7.ウサギ胎子・胎盤の発育過程を見異常例の診断基準を検討した。最終年度に当るので、各分担において年度の前半は前年度に引続き症例の追加を行った。年度の後半は研究成果のとりまとめを行って統括をした。研究実績の概要は以下のごとく要約される。1.牛の頭頚部の器官について、膿浸法と経皮走査により、喉頭・気管、食道、耳下腺、顎下腺、甲状腺および胸腺をそれぞれ映像化し得た。加齢に伴う胸腺の退化と脂肪組織に置換される様相も捕促した。2.牛白血病の症例で骨盤腔内のリンパ節の腫大、腫瘤物および腎臓の腫瘍などを経直腸走査により容易に映像化され病巣の拡がりと程度を明確にすることが出来た。とくに成牛形白血病の診断には骨盤腔内のリンパ節の映像は必須であると思われた。3.牛の間質性腎炎、化膿性腎盂腎炎および水腎症例で経直腸走査により腎内病変部位の特定が可能であり、また尿管・膀胱も映像化出来るので、牛泌尿器疾患の診断に経直腸映像は極めて有用である。また牛の腎石症において微細な結石の存在を確定するための経直腸走査による映像所見は高い診断率をもたらした。4.肺は超音波診断の対象とならないが、肺炎など実質性変化を来す例では体表走査により肺病態を映像化出来るので利用価値は大きい。5.子牛と犬の水無脳症と水頭症例で、経頭蓋走査によってその程度を識別し得る。脳エコ-の臨床的有用性は極めて高い。6.実験動物(ウサギ)で抗生物質投与による腎臓映像の変化を追跡した。これらの所見は、薬物性腎障害の診断に有用で、新薬開発に関連して実験動物領域でも超音波診断の有用性が高いことを示している。
感染性心内膜炎治療における抗MRSA薬テイコプラニンの適正な負荷投与方法の確立

【目的】テイコプラニン(以下、TEIC)は、有効血中濃度早期到達のため初期負荷投与が必要である。2012年の日本化学療法学会/日本TDM学会の抗菌薬TDMガイドライン(以下、ガイドライン)で添付文書より高用量の400mg2回2日間負荷投与法(2012GL法)が推奨されて以降、さらに高用量負荷のレジメンも多く報告されている。一方、これらは目標血中濃度到達率で評価されており、投与方法別に入院期間に与える影響を調査した報告はない。そこで、処方実態と入院期間に対する調査を行った。【方法】全国13大学病院のレセプトと処方データによる医療情報データベースを用いた後方視的調査研究を実施した。過去10年間の感染性心内膜炎の成人患者を抽出し調査対象とし、対象患者をTEICの処方実績からガイドライン等で推奨されている代表的な負荷投与方法別の各群に分け、以下の項目を調査し比較した。抗MRSA薬併用状況、TEIC負荷投与方法、ガイドライン発行による投与方法の変化、年齢、性別、入院期間、入院総費用、TEIC処方量、TEIC処方期間、特定薬剤治療管理料算定(以下、TDM)の有無。【結果と考察】感染性心内膜炎治療におけるTEICの負荷投与量は2012年のガイドライン発出後はガイドラインが推奨するいわゆる2日間ローディングの処方割合が増えており、ガイドラインを参考とした治療が実施されていることが推察された。全体としては添付文書記載の1日間ローディングの割合が最も多かったが、調査対象期間で、2012年以前の割合が多いことによると考える。TEICのみで治療が完了している症例での解析では、負荷投与方法による入院期間やコストに有意差は認められなかった。初期投与後のTDMによる用量補正が影響していると考えられるが、今回め調査では不明である。今後、前向き調査などでローディングドーズの有益性をさらに検討する必要があると考える。
南インドアイティーセクターの女性ピアグループ研究

本研究は2004年から2007年にかけて南インドチェンナイ市における面談と調査表によるフィールド調査、および新聞の求婚広告の分析調査に基づいている。質問調査、面談、広告の分析という三種類の調査を組み合わせることにより、南インド都市部のミドルクラスにおけるITセクターを中心とした若い女性たちの結婚戦略の変貌を調査した。調査の結果あらわれてきたのは結婚相手の選択についてはカースト成員権はかならずしも絶対的なものではなく、単なる地位指標のひとつとしてクラス意識のなかに取り込まれている点である。特にIT部門という1990年代にインドの市場開放にともなって出現してきた新しい職種においては女性の恋愛婚および恋愛見合い婚への希求が非常に高い。これは専門性が高く高給が保証され、女性の経済的自立が若年層においても可能となっている点と連動している。従来型の婚姻選択は親族を中心とするカースト内での地位に基づいた見合い型カースト内婚であったが、このような新種のセクターにおいては親族内の年長者が及ぼす結婚への影響が減じつつある。そしてむしろ、大学や職場などの友人関係にみられる横のつながりによる水平的仲間関係(ピアグループ)の及ぼす影響が大きい。ピアグループが社交だけでなく婚姻選択におよぼす影響は確実に増大しており、そこでクラス編成の重要な差異化がおこなわれている。この点をさらにインドの求婚広告の分析によって考察すると、高学歴の女性たちが望ましい配偶者要件としてあげている志向のなかには差異化志向としての教育・職種・さらに趣味や人生観の共有といった点への言及がみられる。それらがブルデューの論じる社会資本、経済資本との交換可能性をめざしたより多くの指標によるクラス性の表現となっており、インドのITセクターをはじめとした高学歴女性たちの婚姻戦略が変貌をとげていることを如実に示している。チェンナイ市における調査によって、ITセクターに働く女性集団ならびにそれ以外の専門職セクター(医師・弁護士・エンジニア、編集者、自営業など)、大学生集団などに対し270の質問票による回答を得た。またこの集団とは別にそれぞれの部門における面談調査を合計100名に行い、成果を現在整理分析中である。インドにおけるカースト制の中枢装置としてのカースト内婚を維持するためのカースト内見合い婚の比率は依然として高く、ダウリ(女性側から花婿側に支払う高額な金品)の支払いも続いているものの、ITセクターの女性群ではこれらに対する批判が他グループよりも多かった。恋愛婚と恋愛見合い婚の希望者が他グループよりも比率として多い状況は、職場環境における男女交流、ピアグループの存在と低カーストから階層上昇を遂げた女性が多いために適当な配偶者がカースト内見合い婚によっては見出しにくいという事情があると思われる。こめ結果ダウリの支払いについても授受そのものを否定する比率が他集団より高かった。調査の当初段階では高収入・多元的な視野を得られるグローバルな顧客との接触・専門性・ピアグループの存在、低カースト出身者の進出などによる職場意識の変貌をITセクターに予測し、他セクターとの対比を予定していた。しかしITセクター以外にも上記の条件にあてはまる職場として、例えば弁護士や医師といったセクターの女性たちが同様な反応を示すことが面談調査によって明らかになってきた。他方そのようなピアグループが存在しない女性の場合、恋愛婚やダウリ拒否に向かう可能性は小さいということも面談調査のなかで示された。インドにおける縦関係の中枢のひとつである世代的・ジェンダー的に編成されたカースト制における家父長制のパワーを弱体化させる機能をもつピアグループの存在を予期させる結果となった。今後はこのようなピアグループの存在を可能とするようなセクターとそれ以外のセクターにおける差異を分析の対象として調査を続けたい。当該年度はインドの求婚広告の分析により、女性側がどのような条件を望ましい配偶者用件として挙げておりそれがどの程度クラス性と連動しているかを研究した。

カーストよりもクラス性に固執した婚姻選択をする場合、若者世代が配偶者選択に深く関与し、カースト内の長老や祖父母などの父権にかかわる人々の介入は弱まっていく。カースト内を流れる資本の一部、カースト内でのステイタス誇示の道具としてのダウリが消滅してゆくものの、それは一様に起こりえる現象ではない。カースト志向をとるか、クラス志向をとるかは集団によって、あるいは家族によっても異なっている。グローバル化によって女性の職場進出が進み、経済的自立性をもった女性が増えることで恋愛婚は増えつつあるものの、村落部におけるカースト内婚とダウリ授受の慣習への波及効果をもたらすまでにはかなりの時間がかかると思われる。また、都市部のミドルクラスの間でダウリの消滅が起こっているとはいえ、それはクラス性を逆に強調するような方向に向かっているともいえる。具体的なモノの代わりに象徴資本としての高度な教育やそれに支えられた家庭環境、人脈などの複雑なネットワークが配偶者選択において吟味されるからである。他方、ITセクターや弁護士・医師などの専門職セクターの女性達にみられるように、配偶者選択や個人のライフスタイルの選定においてピアグループの影響力が強まっていることが確認された。家庭内の父権に対する忠誠には揺らぎがみられるものの、それゆえの葛藤も女性の心理のなかで生じており、決して一様ではない。従来型の見合い婚から恋愛婚へと移り変わりつつあるなかで婚姻選択の変貌は、逆に職場のピアグループの重要性をも際立たせている。
Sema4Dによるオリゴデンドロサイトとミクログリアの発達制御機構の解明

生後マウスの大脳皮質発達におけるオリゴデンドロサイトの成熟化とミクログリアの発達の時期や分布が類似すること、オリゴデンドロサイトが細胞膜型Sema4Dを発現し分泌すると考えられること、Sema4Dがオリゴデンドロサイトの発達・成熟に抑制性に関与することから、生後に著しく形態変化し、数を増加し、分布を拡大するミクログリアの発達に同分子が関与すると仮説を立て実験を進めた。Sema4D欠失マウスの大脳皮質では、オリゴデンドロサイトの発達亢進がみられたが、ミクログリアの発達や成熟化に明らかな遅れあるいは亢進は観察できなかった。そこで、脳虚血傷害モデルを使って、傷害によって活性化されたミクログリアに対するSema4Dの影響を検証した。梗塞叢とその近傍で生じたミクログリアの活性化、特に傷害によるNO産生の上昇がSema4D欠失により緩和されていたことから、Sema4Dがミクログリアの活性化や炎症性サイトカインの発現に関与することが示唆された。このNO産生の上昇の緩和機序について、iNOSの基質であるArginineと基質を競合するArginaseの発現は変化しなかったが、Arginase活性は亢進していた。さらにArginaseの産物であるOrnithineから合成されるポリアミンについて調べた。ポリアミンは細胞増殖に必須であること、Sema4D欠失の梗塞脳ではオリゴデンドロサイト前駆細胞やミクログリアの増殖が亢進していたことから、Sema4D欠失によってArginine→Ornithineから産生されるポリアミン合成が亢進したため、基質であるArginineを取り合ってNO産生が抑制された可能性が考えられたので、これを検証している。以上の結果から、関与する傷害によるミクログリアの炎症性や細胞増殖制御に関与するSema4Dの作用にポリアミン産生系が関与することが示唆された。生後のオリゴデンドロサイト発達と成熟化はSema4D欠失により亢進したが、ミクログリア発達・成熟化への関与を見出すことができなかった。そこで、オリゴデンドロサイトとミクログリアの発達における相互作用を調べる代わりに、成熟マウスの傷害モデルを用いた実験を進めることとした。平成30年4月に研究実施場所、研究メンバー、研究動物の移動や変更があった。また、6月の大阪北摂地震の影響のため自宅と研究実施場所が被害を受け、建物や機器の修理が必要となった。これらの理由により研究が遅延した。その後、脳傷害モデルを用いて進めた解析はほぼ順調に進んでいる。脳組織や細胞活動に必須である脳組織のポリアミン量は安定しているため、傷害などによるその変動は小さいが細胞活動に大きな影響をもたらすと考えている。そのため、脳傷害によるポリアミンの変動、Sema4D欠失によるポリアミンの変動を丁寧に、再現性に注意を払い検証する。また、Sema4Dの作用を調べるために、Sema4D欠失マウスから取り出した一次培養細胞に対しSema4D添加によるポリアミンの変動を丁寧に検証する。Sema4D欠失によるオリゴデンドロサイトの発達・成熟の亢進や傷害誘導性iNOS発現緩和作用の機序が不明なため、iNOS発現にかかわる細胞情報伝達シグナルを調べることにより糸口をつかみたいと考えている。さらにミクログリアの仲間である単球やマクロファージの性質にSema4Dが関与するか調べ本研究を発展させる予定である。中枢神経系においてオリゴデンドロサイト(OL)は髄鞘形成細胞で、ミクログリア(MG)は内在性の免疫細胞である。私達はこれまでに、Sema4D欠失が大脳皮質におけるOLの発達を促進することを報告してきたが(Yamaguchi et al, EJN 2012)、その機序は未だ不明である。成体脳虚血モデルでは頭頂葉皮質の梗塞近傍領域におけるMGの強い活性化がSema4D欠失により緩和され(Sawano et al., Glia 2015)、虚血傷害からのOLの回復が亢進した(Wada et al., NsR 2016)ことから、MGの活性化緩和とOLの回復促進が関連する可能性が示唆された。そこで発達期大脳皮質のMG発達に対するSema4D欠失の影響を検討した。1)生後発達期の頭頂葉一次知覚野MGの発達に対するSema4D欠失の影響を調べた。iba1陽性MGの数は生後著しく増加し、14日齢でピークとなったが、Sema4D欠失による影響は見られなかった。生後しばらくはMGの形態は成体とは著しく異なり、成体活性化MGに類似したアメボイド様を示す。次に、MGの活性化に及ぼすSema4D欠失の影響を調べるため、活性化の指標として、脳梗塞傷害動物でSema4D欠失マウスで有意に低下していたiNOS発現について調べた。生後発達期中、大脳皮質ではほとんどiNOS陽性細胞を検出できなかった。そこで別の活性化(貪食)マーカーであるCD68を活性化の指標として検討した。iba1陽性でCD68強陽性の活性化MGは大脳皮質ではほとんど検出できなかったため、iNOSと同様に活性化の緩和についての検討ができなかった。生後発達期の頭頂葉皮質のMGは形態的には活性型を示すが、iNOSや強いCD68の発現はほとんど見られないことから、成体の脳梗塞傷害モデルで見られたMGの活性化とは異なることが確認できた。

実験の解析結果を統計処理に必要な、同腹で日齢が同じ、野生型とホモKO型の、十分な数のマウスが予定通り生まれなかったこと、使用できることを期待していたミクログリア活性化マーカーなどのうちいくつかが期待通り使用できなかったため追加の購入が不要になったこと、担当していた進学予定の学生が進学しなかったこと、などの理由のため研究がやや遅れている。生後発達期大脳新皮質頭頂葉におけるオリゴデンドロサイトとミクログリアの関連性について調べた。どちらのグリアも生後著しく細胞数が増加する。オリゴデンドロサイトの発達に対してSema4D欠失は細胞数増加の促進作用を示した。一方、ミクログリア数の増加に対しては有意差が見られなかった。また、発達期や健常な大脳皮質ではiNOSやCD68発現による活性化ミクログリアの検出は困難であったことから、傷害による成体大脳皮質のミクログリア活性化と発達期におけるミクログリア活性化は質的に異なり、Sema4D欠失によるミクログリア活性化への影響を検討するためには新たな計画を要することが判明した。オリゴデンドロサイトは中枢神経系における髄鞘形成細胞で、ミクログリアは中枢神経組織特異的な内在性免疫細胞である。Sema4D欠失の成体マウスでは脳梗塞によって活性化するミクログリアのiNOSの発現やNO産生が低下したことから、特に傷害性のミクログリア活性化が緩和されたと考えた(Sawano et al, 2015)。さらにSema4D欠失マウスではオリゴデンドロサイトの脳梗塞後の回復が促進していた(Wada et al., 2016)。私達は1)脳梗塞傷害により誘導されるミクログリアのiNOS発現の緩和が、オリゴデンドロサイトの回復促進につながったと仮定した。また、私達はこれまでに、Sema4D欠失が発達期大脳皮質のオリゴデンドロサイトの発達・成熟を促進することから(Yamaguchi et al, 2012)、2)発達期のSema4D欠失マウスでは傷害性ミクログリアの活性化が抑制され、オリゴデンドロサイトの発達・成熟を促進すると仮定した。平成29年度は発達期の大脳皮質や外包近傍の活性化ミクログリアに及ぼす影響について検討した。発達期の脳にはiNOSを発現するミクログリアがほとんどみられなかったことから大きな影響は見出せなかった。以上から発達期におけるオリゴデンドロサイトの発達・成熟に及ぼすSema4D欠失の作用はミクログリア活性緩和によるもの、とは示唆できなかった。一方、傷害による誘導されるiNOS活性が、iNOSと基質、L-Arginineを同じとするArginaseと拮抗する可能性を調べるため、Arginase1の発現を調べたが、Sema4D欠失マウスでiNOS陽性のミクログリアが減少したもの、Arginase1陽性ミクログリアも減少した。以上からSema4Dがミクログリアの活性化を傷害性に誘導することが明らかになった。実験の解析結果を統計処理に必要な、同腹で日齢が同じ、野生型とホモKO型の、十分な数のマウスが予定通り生まれなかったこと、発達期マウスのミクログリア発達に期待された結果が得られなかったことから計画の変更がなされたことなどの理由で研究がやや遅れている。
P.gingivalis赤血球凝集因子の解析とリプレイスメントテラピーへの応用

成人性歯周炎の原因菌の一つであるP.gingivalisの、宿主への付着に関与する分子として赤血球凝集因子が知られている。また、P.gingivalisは、増殖に強いhemin、鉄の要求性を示す細菌であり、赤血球凝集因子がその赤血球付着能を介して、鉄獲得系にも寄与すると考えられる。これらのことから赤血球凝集活性をブロックすることによって、P.gingivalisの歯周組織への定着および増殖が阻止され、歯周病の発症・進展の抑制しうるのではないかと考えられる。生体組織への定着に機能する赤血球凝集因子の機能部位を分子レベルで解析し応用することによって、新しい安全性の高い歯周病療法の開発を目指すことを目的とし、以下のように研究を行った。1.P.gingivalisの赤血球凝集因子に関わる130kDaタンパク質をクローニングし、赤血球凝集活性に関与する機能部位の存在を明らかにした。2.赤血球凝集活性を抑制する抗体の認識部位を同定し、抗体認識部位のペプチドを合成し、最小限の有効なペプチドの探索と効果を検討した。4.130k-HMGDタンパク質認識モノクローナル抗体の抗体可変領域のみから成るリコンビナント抗体を基にして、リプレイスメントテラピーの実現に向け、このリコンビナント抗体の分泌系ホストへの変換を行った。5.130k-HMGDタンパク質を強く認識するヒト抗体産生細胞をスクリーニングし、ヒト型モノクローナル抗体を作成した。6.ヒト血清中のインフルエンザ赤血球凝集素に対する抗体とP.gingivalis赤血球凝集因子に対する抗体との交差性について検討を試みる。成人性歯周炎の原因菌P.gingivalisは強い赤血球凝集能を持つことから、歯周組織への付着に本菌の赤血球凝集因子が密接に関係すると示唆されてきた。また、P.gingivalisは、その増殖に強いhemin要求性を示す細菌であり、赤血球凝集因子が赤血球付着能を介して、鉄輸送系にも寄与すると考えられることから赤血球凝集活性ドメインをブロックすることは、P.gingivalisの歯周組織への定着及び増殖を阻止し、歯周病の発症・進展を抑制できると考えられる。本年度は、P.gingivalisの赤血球凝集因子の機能部位を分子レベルで解析することを中心に次の結果を得た。(1)モノクローナル抗体が認識するP.gingivalis381のl30kDa分子をコードする遺伝子クローンのシークエンス結果から、本分子は、P.gingivalis W12株のプロテアーゼPrtPの赤血球凝集ドメインと高いホモロージーを示すことが判明し、同プロテアーゼの381型と示唆された。(2)deletion mutantを用いて、抗体認識部位の局在を検討した結果、130kDa分子中には抗体認識部位が2ヵ所存在していた。両部位の共通アミノ酸配列PVQNLT配列と、Phage Display Peptide Library Kit(7 type)を用いた抗体認識ペプチド(7アミノ酸残基の2X10^9独立ペプチド配列を含む)とは類似性が認めらた。(3)PVQNLT配列は、多くの赤血球凝集活性をもつプロテアーゼに必ず存在することが検索の結果判明した。(4)PVQNLTを含む12残基の合成ペプチドが赤血球凝集活性を抑制した。以上の結果から、P.gingivalis赤血球凝集ドメインの最小モチーフが判明し、本菌の付着抑制のための予防・治療法の確立のための標的部位が明かとなった。P.gingivalisの赤血球凝集活性には、赤血球凝集活性の関わる分子に存在する配列「PVQNLT」が重要なことから、このアミノ酸配列に注目した実験を行った。

1.合成ペプチドのを用いた抑制効果赤血球凝集活性抑制抗体が認識する部位(PVQNLT配列)と、抑制抗体結合ファージ発現ペプチド実験の情報をもとに、最小限の有効なペプチド、若しくは赤血球凝集活性を抑制可能な構造をとりうるペプチドの探索を目指し、PVQNLT,PLQNLT,PVSQRL,LKWDAP,PVSNLT,APVQNLTのぺプチドをを合成し、赤血球凝集活性抑制効果を検討した。これらのうち、PVQNLT,PLQNLT,PVSQRL,LKWDAPに弱いながらも赤血球凝集活性抑制作用が認められた。2.ラクトシアル酸の抑制効果平成10、11年度の研究で、P.gingivalisのもつ赤血球凝集活性に関わる分子が明かになった。P.gingivalisの赤血球凝集活性は、赤血球凝集活性の関わる分子群の機能ドメインとして、赤血球凝集活性に関わると示唆されていた多くのプロテアーゼ類やHagA分子に共通して存在すること、さらに、それらの分子中に存在するショート配列「PVQNLT」が重要であろうことが示された。この配列は、赤血球凝集活性という機能は同一でありながら全く分子構造の異なる、インフルエンザウィルスの赤血球凝集素の分子の突端に存在する配列と相同性が認められた。本年度は、ヒト血清中に存在するインフルエンザに対する抗体とP.gingivalis赤血球凝集素に対する抗体との交差性について検討を試みた。P.gingivalis 130kDaタンパク質(HAG)を強く認識する人の抗体産生細胞をスクリーニングし、ヒト型モノクローナル抗体を作成した。これらのP.gingivalis HAG抗体がインフルエンザウィルスのヒト細胞への感染を抑制可能かを検討した結果、A型インフルエンザウィルス(H3N2)の数種のタイプで赤血球凝集活性を抑制し、さらに、A/Udorn/307/72(H3N2)を用いて感染抑制実験を行った結果、感染抑制が認められた。A型のうち、(H1N1)および、(H2N2)では関与は認められなかった。また、(H3N2)の中で、1979年以前の流行タイプの赤血球凝集活性を抑制したが、1982以降の流行タイプのものを抑制しなかったことから、インフルエンザウィルスのPVQNLT類似配列の流行株における変化を比較したところ、この部位に変化が見られた。以上、リプレイスメントテラピーの実現に向け、抗体の生体での影響を推測することによって、安全な材料の検討の一因子として生体側の抗体との関わりも重要な可能性が示された。
ウイルスを吸着捕捉する新素材を活用した環境浄化のための新しい手法

ウイルスによる病気には特効薬がなく、ウイルスによる汚染を防除するための効果的な方法は確立されていない。筆者の研究グル-プで開発した不溶性ピリジニウム型樹脂が水中のウィイルスを強力に吸着捕促する性質を持っている。本研究の目的は、この樹脂の特性を活用してウイルスによる環境汚染を防止するための新しい手法を開発することである。昨年度の研究によって、不溶性ピリジニウムに対しても強力な吸着捕促作用を示すことが明らかにされた。そこで本年度においては、本研究の手法を実用化に移すための具体的な技術的問題に取り組んだ。これはでの研究においては不溶性ピリジニウム型樹脂をビ-ス状樹脂として用いてきたために表面しか利用されず無駄が多い。このためにコストのかさむことが実用化の障害になっている。そこでウイルスを吸着捕促する性質を効率よく活用するために、水には不溶性であるが有機溶媒には可溶性のピリジニウム型ポリマ-を合成し、これを不識布の表面に薄くコ-ティングし、これを水中ウイルスを捕促除去するためのフィルタ-として用いることについて検討した。この目的に用いる可溶性のピリジニウム型ポリマ-として4-ビニルピリジンとスチレンのモル比1:3の共重合体を合成して用いた。不織布としてレ-ョン100%の厚さ0.5mmの不織布を用いた。可溶性ピリジニウム型ポリマ-を19.1g/m^2コ-ティングした不織布を40枚重ねてフィルタ-とし、バクテリオファ-ジT4の水溶液を空間速度2で流したところ、99.9%のウイルスが除去された。不織布はメンブランフィルタ-と異なり目が粗いので、ウイルス水溶液を流しても抵抗殆んどない。それにもかかわらず高いウイルス除去率が得られたのは、不織布の表面にコ-ティングしたピリジニウム型ポリマ-が強力な捕促作用を示したためと思われる。
脱カルボニル型変換反応の非線形展開：転位・脱酸素・メタセシス

脱カルボニル型カップリング反応においては国内外で10以上のグループが開発を行っているが、今回対象とする主に3つの課題に関しては過去に例のない新奇有用反応開発である。「結合切断化学」という観点から考えるとエステル切断という1つの反応に絞ることになるが、これまでエステルを様々な求核剤に変えることしかできなかった脱カルボニル型反応において、大きな飛躍のチャンスであり、研究費により研究を加速することで、同反応形式の第一人者を目指したい。
胚性幹細胞を用いた効率的なトランスジェニックニワトリの作成技術の確立

本研究はキンカチョウの多能性細胞培養法の確立を目的とする。キンカチョウの胚はニワトリ胚に比べて若いステージであることがわかった。また孵卵前のキンカチョウとニワトリの卵では細胞の特性と挙動に大きな違いが見られた。一定培養条件下では、キンカチョウの単離細胞は幹細胞マーカーを発現するが、ニワトリは発現しなかった。今回我々は初めて、鳥類の桑実胚期後胚の詳細な分子解析と、初期胚培養法および無血清フィーダーセルフリー条件での幹細胞様細胞培養法について報告した。トリES細胞の培養に最適な手法を確立するために、我々は複数の哺乳動物ES細胞の培養法(2iおよび3i培養)をトリES細胞に応用してきた。これまでに得た結果から、鳥類の胚盤葉細胞はマウスのES細胞とは異なる性質を持つ可能性がある。鳥類の胚盤葉細胞はマウスとは違い、無血清培養やフィーダー細胞フリー培養や2iおよび3i培養では維持できない。また、通常のマウスES細胞培養法(血清,BMP4,LIF存在下)でも培養できない。一方、Fgf2とアクチビンAを混合して鳥類の胚盤葉細胞を培養したところ、アルカリフォスファターゼに反応するコロニー形成が確認できた(未発表データ)。現在、特定の培養条件で培養した細胞を同定するために培養を続けている。我々は更に、NanogやSox2などの多能性マーカを用いて、ニワトリの胚盤葉と培養胚盤葉細胞に免疫染色を施した。そして、今後の解析に有効な抗体をいくつか発見した。しかし、鳥類に特異的な抗体が不足しているため、これらの細胞を特定のRNAプローブを用いたIn SituハイブリダイゼーションとRT-PCR解析によって更に特定するつもりである。また、実験用の卵を絶えず供給してくれる健康なキンカチョウのコロニー作りに成功した。そして、キンカチョウ胚の初期胚盤葉段階の特徴を明らかにするため、免疫組織化学的染色を行った。キンカチョウにおける様々な推定ES細胞マーカ発現プロファイルをニワトリと比較したところ、キンカチョウとニワトリでは発現プロファイルに重要な違いがあることが判明した。この知見によって、キンカチョウES細胞培養法を確立し、トリES細胞を維持する生物学的メカニズムを理解できると考えている。今後もキンカチョウ特有のプローブを用いて、In SituハイブリダイゼーションおよびRT-PCR解析を進めていく。1.我々はこれまでニワトリROSA26の遺伝子発現パターンを分析してきた。しかし分析の結果、ニワトリROSA26はマウスのホモログとは異なり、ユビキタスに発現しないことが分かった。ユビキタスに発現する遺伝子座を探していたため、実験計画を変更し、NCBI GEOデータベース上のマイクロアレイデータを用いて発現率の高いユビキタス遺伝子を特定する。現在、多数の候補遺伝子を特定中である。2.2つの蛍光タンパク(核局在標識タンパクmCherryと細胞膜標識タンパクVenus)で構成された導入遺伝子を作成した。(タンパクはウイルス由来2A配列で自己プロセシング開裂する。)現在、培養細胞株を用いてその有用性を確認している。3.実験には質の高いキンカチョウ受精卵が大量に必要なため、キンカチョウに効率よく卵を産ませる飼育技術を身につけた。4.胚盤葉の培養においてニワトリとキンカチョウでは細胞集団の様相が異なるが、我々はそれが産卵時の発生ステージの違いに因るものだと確認した。胚盤葉細胞の培養において多数の異なる因子がどのように作用するかを徹底的にスクリーニングした結果、培養したニワトリおよびキンカチョウ胚盤葉からES細胞様の細胞を培養することに成功した。4日間の培養でコロニー形成を確認し、そのコロニー形成細胞がNanogやOct3/4のような推定ES細胞マーカーを初めて発現したのである。現在、feeder-free培養下でのコロニー形成条件を最適化している。本研究は、ウイルスを用いない鳥類トランスジェニック作製技術を確立することを目的としている。本年度の研究結果より、後期のニワトリ胞胚に比べて、キンカチョウの初期胞胚は形態学的にマウス胚のE4.5前の着床前期に近いと考えられる。この初期胞胚は、多能性関連遺伝子Nanog, Pou5f1, Sox2などを発現していたが、マウスのepi-stem cell (mEpiSc)マーカーであるFgf5の発現は見られなかった。また、キンカチョウの初期胚盤葉細胞は、1i / 2i (単独あるいは2つの阻害剤)存在下において無血清培地とフィーダーセルフリー条件での培養が可能で、NanogとPou5f1の二重染色陽性およびアルカリホスファターゼ陽性の細胞塊を形成した。一方、同条件で培養されたニワトリEGK10胚盤葉