hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
Microcystisの群体集積によるアオコ発生メカニズムの解明

調査した結果から冬季でも水中でMicrocysitisの単細胞が多く存在し、一部の小さい群体も生きていることがわかった。今までMicrocysitisは底泥の表層で冬季を過ごしているとされてきたが、水中でも単細胞あるいは小さな群体で越冬しているとする説を提起した。3.風による吹送流の特徴、特に表層水の水平方向の動きを捉えるために、ドップラー・レーダーを用いた。吹送流における表層薄いゾーンの水の流れがMicrocystisの水平集積の重要な働きになるため、この表層流の計測が重要だと思われる。ただし、ドップラー・レーダーが一般的に水面に設置し下向きに計測するため、センサーが水中に入っているため表層が測定できない。この問題を解決するために、ドップラー・レーダーを倒置して上向きに水の動きを計測したら、表層1020cmだけの水が風によって動いていることが分かった。いわゆる表層流を確認できた。研究計画通りMicrocystisの集積によるアオコ形成メカニズムを解明している。今までにMicrocystisの群体サイズ、実際湖沼におけるサイズの変化、群体サイズとアオコ発生の間の関係などを調査で明らかにしてきた。Microcystisの群体の水中における分布について、現場調査、模型実験、浮上を影響する重力密度の計測、調査をしてきた。Microcystis細胞群体が静止している水中ではなく、動いている湖沼の水にいるので、浮上、集積が水の動きに大きく影響されている。いわゆる乱流の影響を解明するため、ドップラー・レーダーを用い実際の湖沼で水の鉛直方向の動きを計測して、Kzという乱流強度係数で鉛直の動きを評価できた。表層流の計測が上手くできたので、計画通りに研究が進んでいる。さらに、シミュレーションプログラムを作ったことと冬季のMicrocystisの過ごし方についての研究は計画よりも進んでいる。Microcystisの鉛直集積と水平集積について明らかにした。太湖における20日昼夜にわたるフィールド調査では日周性の浮上-沈降運動は確認されず、水の動きが細胞の浮上を大きく制約していることが明らかになった。水槽試験では、Microcystis群体が浮上できる鉛直方向の乱流強度Kzの閾値が群体サイズによって決まることが明らかになった。太湖では4月末にMicrocystisの群体サイズが0.30.5 mm程度になり、10月末には大きなもので1 mm程度に達し、11月以後には群体がばらばらになって小さくなった。0.30.5 mm程度の群体が浮上できなくなるKzは、概ね風速3 m/sで生じるので、風速がそれよりも小さいことがMicrocystis群体が水面に集積する条件となる。ケプラー流速計を湖沼の底に逆に設置し、表層の水の流れを計測した。風速0.7 m/s以下では表層の水がほとんど動かなかったが、これを超えると表層20 cm程度の水が流れ始めた。2 m/s程度の風で表層の水の流れが最も速くなったが、3.2 m/sを超えると水が3次元の混合になり、水平方向の流れが消えた。Microcystis群体の実測でも、0.73.2 m/sの風が水平集積を引き起こし、2 m/sで最も効率的な水平集積が起こった。以上の鉛直集積と水平集積の条件を総合すると、Microcystis群体が集積してアオコになりやすい風速は、0.73.0 m/sということになる。
Wiskott-Aldrich症候群原因因子の機能解明と治療選択の試み

5症例の遺伝子解析を施行した。症例1および2は第1エクソンにてGの1塩基欠失、症例3では第2エクソンTCA→TAA(stop)、症例4では第10エクソンGGA→TGA(stop)、症例5では第10エクソン^<1119>Cの1塩基欠失が認められ、それぞれ63、63、53、320、444アミノ酸のtruncated WASPとして読みとられていた。2.保因者診断症例1と2はPCR-SSCP法、症例4はXhol消化、症例5はPCR産物の直接塩基列決定にて保因者診断が可能であった。3.患者・正常人・各種血液細胞株におけるWASPmRNAの発現正常人末梢血単核球・多核球分画の双方にmRNAの発現を認めた。一方患者5名はいずれもノーザンブロット法上検出感度以下の発現であった。白血病細胞核では全例にWASPの発現を見たが、線維芽細胞には発現は認められなかった。4.WASPに対する抗体作成と蛋白発現の検討WASPに対するポリクローナル及びモノクローナル抗体(5A5)を作成した。WAS患者では検出感度以下のWASPの発現しか認められなかった。5.フローサイトメーターによる細胞内WASP蛋白検出法の確率EBV-LCLを使用している限りにおいては、患者は明らかに健常人由来LCLと異なりWASPの発現は認められなかった。しかし末梢血ではいづれの分画にても、非特異的反応が強く診断上の使用には一層の検討を要した。WASに対する骨髄移植症例の検討骨髄移植後の患者末梢血にWASPが発現したことを確認した。その後EBVによるリンパ球増殖症を合併し、ドナーリンパ球輸注にて治癒せしめた症例を報告した。4症例の遺伝子解析を施行した。症例1及び症例2は第1エクソンにてG1塩基欠失のためフレームシフトを生じ、症例3は第2エクソンでのナンセンス変異(TAC→TAA),症例4は、第10エクソンでのナンセンス変異(CGA→TGA)を同定した。症例1と2はPCR-SSCP法、症例4はXho消化にて保因者診断が可能であった。その結果母親はいずれも保因者,また女性同胞の計4名も保因者であった。3.ノーザンブロット法によるWASPmRNAの検出正常人末梢血では単核球、顆粒球分画共にmRNAの発現を見たが、患者ではいずれも非常に弱い発現量であった。白血病細胞株やリンパ芽球様細胞株では、患者由来の細胞株以外には検索した限り全ての細胞株に発現を見た。4.ウェスタンブロット法によるWASP蛋白発現の検討pET-WASPによる融合蛋白を試験管内で作成し精製後、ウサギに免疫しポリクローナル抗体を作成した。得られた抗体をアフィニティーカラムで精製し、ウェスタンブロットを行った。培養細胞株や健常者由来単核球分画では約55kDaの陽性バンドを検出したが、患者には同サイズの蛋白の発現は認められなかった。5.骨髄移植症例でのWASP発現の検討症例1に対して非血縁者間の骨髄移植を施行した。移植後6ヶ月での末梢血単核球分画にWASPの発現がmRNAt蛋白レベルで確認した。6.WASPに対する単クローン抗体の作成ウサギ抗体と同様の抗原を使用し、WASPに極めて特性の高いマウス単クローン抗体を作成した。今後この抗体によりさらに詳細なWASP機能の解析を進めて行く。5症例の遺伝子解析を施行した.症例1および2は第1エクソンにてGの1塩基欠失,症例3では第2エクソンTCA→TAA(stop),症例4では第10エクソンCGA→TGA(stop),症例5では第10エクソン^<1119>

Cの1塩基欠失が認められ,それぞれ63,63,53,320,444アミノ酸のtruncated WASPとして読みとられていた.2.保因者診断症例1と2はPCR-SSCP法,症例4はXhol消化,症例5はPCR産物の直接塩基配列決定にて保因者診断が可能であった.3.患者・正常人・各種血液細胞株におけるWASPmRNAの発見正常人末梢血単核球・多核球分画の双方にmRNAの発見を認めた.一方患者5名はいずれもイ-ザンブロット法上検出感度以下の発現であった.白血病細胞株では全例にWASPの発現を見たが,線維芽細胞には発現は認められなかった.4.WASPに対する抗体作成と蛋白発現の検討WASPに対するポリクローナル及びモノクローナル抗体(5A5)を作成した.WAS患者では検出感度以下のWASPの発見しか認められなかった.5.フローサイトメーターによる細胞内WASP蛋白検出法の確立EBV-LCLを使用している限りにおいては,患者では明らかに健常人由来LCLと異なりWASPの発現は認められなかった.しかし末梢血ではいづれの分画にても,非特異的反応が強く診断上の使用には一層の検討を要した.6.WASに対する骨髄移植症例の検討骨髄移植後の患者末梢血にWASPが発現したことを確認した.その後EBVによるリンパ球増殖症を合併し,ドナーリンパ球輸注にて治癒せしめた症例を報告した.
試験管内増幅法を用いた異常プリオン蛋白質の複製に関与する補因子の探索

本研究は、正常型プリオン蛋白質(PrPC)から異常型プリオン蛋白質(PrPSc)への構造変換に必要となる補因子を同定し、変換プロセスにおける役割を検討することを目的とした。補因子の探索には、我々が以前構築したバキュロウイルス由来組換えプリオン蛋白質(Bac-PrP)を基質として試験管内でPrPScを増幅する改良protein misfolding cyclic amplification (PMCA)法を用いた。PrPSc増幅誘導剤であるプロテアーゼK(PK)・熱処理昆虫細胞溶解液を複数の生体分子分解酵素で処理した後、PMCAを行うことで、PrPScの増幅に関わる生体分子の同定を試みた。その結果、ヘパラン硫酸やコンドロイチン硫酸等のグリコサミノグリカンおよびリン脂質、コレステロールがBac-PrPからBac-PrPScへの構造変換に関与することが明らかになった。しかしながら、これらの因子だけでは、PMCAによるBac-PrPScへの変換は誘導されず、さらなる因子が必要であることが示唆された。また、本研究ではPMCAの反応温度を37°Cから45°Cにあげることで、PrPScシード依存的なBac-PrPScへの構造変換効率が向上し、さらに、PrPScに特徴的な性質であるプロテアーゼ抵抗性を獲得したBac-PrPが自発的に生成することを明らかにした。この結果は高温度条件がBac-PrPの構造に影響することによりPrPScへの構造変換を促進する可能性を示唆してる。本研究は、正常型プリオン蛋白質(PrPC)から異常型プリオン蛋白質(PrPSc)への構造変換に必須である補因子を同定し、変換プロセスにおける役割を検討することを目的とする。補因子の探索には、先に構築したバキュロウイルス由来組換えプリオン蛋白質(Bac-PrP)を基質としてPrPScを試験管内増幅する改良protein misfolding cyclic amplification (PMCA)法を用いる。本年度は候補補因子を絞り込むため、PrPSc増幅誘導剤であるプロテアーゼK(PK)・熱処理昆虫細胞溶解液を分解酵素処理および化学薬剤処理した後PMCAを行い、各処理が変換に与える影響を調べた。さらに界面活性剤を用いて補因子の分画を試みた。1各種酵素処理、化学薬剤処理による補因子の性状解析(1) PK・熱処理昆虫細胞溶解液をコンドロイチナーゼ、ヘパリナーゼ、リゾチーム、βガラクトシダーゼ、αおよびβグルコシダーゼ、ATP加水分解酵素、ウレアーゼで処理した後、PMCAを行ったが、どの酵素処理においても変換に与える影響は認められなかった。(2) PK・熱処理昆虫細胞溶解液を核酸分解酵素で処理し、変換活性を低下させた場合、ある種のグリコサミノグリカン(GAG)を加えると、変換活性の回復が認められた。この結果は、一部のGAGは試験管内増幅において核酸の代替が可能であることを示唆している。(3) PK・熱処理細胞溶解液をNaOHまたはHCl、各種有機溶媒で処理した後、PMCAを行ったが、変換に影響しなかった。2界面活性剤による補因子の分画本研究は、正常型プリオン蛋白質(PrPC)から異常型プリオン蛋白質(PrPSc)への構造変換に必要となる補因子を同定し、変換プロセスにおける役割を検討することを目的とする。補因子の探索には、我々が以前構築したバキュロウイルス由来組換えプリオン蛋白質(Bac-PrP)を基質として試験管内でPrPScを増幅する改良protein misfolding cyclic amplification (PMCA)法を用いる。本年度は昨年度に引き続き、PrPSc増幅誘導剤であるプロテアーゼK(PK)・熱処理昆虫細胞溶解液を複数の生体分子分解酵素で処理し、PMCAを行うことで、PrPScの増幅に関わる生体分子の同定を試みた。PK・熱処理昆虫細胞溶解液をホスホリパーゼA2およびβグルコシダーゼで処理すると、PK抵抗性を示すPrPSc様Bac-PrP(Bac-PrPres)への変換効率の低下が認められた。このことはリン脂質および糖質がPrPCからPrPScへの構造変換に関わる可能性を示唆する。また、コレステロール除去剤を反応液に加えてPMCAを行うと、PrPScの増幅効率が著しく低下したことから、コレステロールもPrPScへの構造変換に関わることが示唆された。昨年度候補補因子として同定したヘパラン硫酸およびリン脂質、コレステロール、糖質のみを用いてPMCAを行ったが、十分な変換活性は認められなかった。

しかしながら、これらの因子だけでは、PMCAによるBac-PrPScへの変換は誘導されず、さらなる因子が必要であることが示唆された。また、本研究ではPMCAの反応温度を37°Cから45°Cにあげることで、PrPScシード依存的なBac-PrPScへの構造変換効率が向上し、さらに、PrPScに特徴的な性質であるプロテアーゼ抵抗性を獲得したBac-PrPが自発的に生成することを明らかにした。この結果は高温度条件がBac-PrPの構造に影響することによりPrPScへの構造変換を促進する可能性を示唆してる。本年度リン脂質およびコレステロール、糖質を候補補因子として同定したが、これまで同定した因子のみでは十分な変換活性は認められなかった。したがって、さらなる候補補因子の同定が必要である。平成27年度まで補因子の同定を行う計画であるが、フーリエ変換赤外分光分析や質量分析計を利用した補因子の探索まで至っておらず、研究の進捗は計画よりやや遅れている。研究の進捗はやや遅れているが、候補補因子の同定は進んでいる。平成27年度上半期には補因子の同定を終え、下半期には27年度に計画している補因子のみを用いた試験管内PrPSc増幅系の構築および変換構造体の解析を行う予定である。本年度は補因子のひとつとしてGAGを同定し、補因子が耐アルカリ性、耐酸性、耐有機溶媒性であることを示した。さらに、TritonX100, n-octyl glucoside, CHAPSによる抽出残渣が活性を保持していたことから、これらの界面活性剤で処理することで補因子の粗精製が可能になった。しかし、本年度実験を計画していた限外ろ過や各種クロマトグラフィーを用いた補因子の分画精製を実施できておらず、補因子の絞込みが遅れている。本年度は計画に対して研究の進捗はやや遅れているが、方向性は問題ないと考える。平成26年度は研究実施計画通り、候補補因子の探索・絞り込みを継続しつつ、補因子の同定を行う。研究の進捗が遅れているため、実施を計画していた各種クロマトグラフィーを用いた補因子の精製および生成したPMCA産物についてのバイオアッセイを平成25年度に行っていない。そのため次年度使用額が生じた。平成25年度に実施を計画した各種クロマトグラフィーを用いた補因子の精製およびバイオアッセイを平成26年度に行う。
ステレオコンプレックスに関わるファンデルワールス力測定と界面接合による接着材料

高分子において互いの構造を認識して相互作用するファンデルワールス相互作用の力を見積もることを目的として、ステレオコンプレックス形成に関わる力の測定することが目的であった。異なる基板上に、それぞれポリ(L-乳酸)(PLLA)およびポリ(D-乳酸)(PDLA)の膜を作成し、圧着後に引きはがす力を測定したところ、ステレオコンプレックスが形成されるPLLA/PDLAの組合せが強い力を示すことが分かり、選択的な接着材料へ利用可能であることを示した。高分子相互作用に関わるファンデルワールス相互作用について、単一高分子鎖に働く力を見積もることにチャレンジすることが目的であった。今年度に実施した実験は、試料としてポリ(Lー乳酸)およびポリ(Dー乳酸)を用いて、これらのスピンコート薄膜をガラス基板上に調製し、互いに張り合わせることでその海面における構造変化を観察した。また圧縮して引きはがすときの力を測定し、これらを数値化する実験を行った。スピンコート薄膜のサンプルと交互積層薄膜のサンプルを比較して行うことで優位な差が得られた(学会ポスター賞)。また、シリカゲル表面のヒドロキシル基やアミノ基を利用してポリ乳酸を結合させた粒子を調製した。今後、当初の計画通り相互作用を見積もる予定である。ポリ乳酸と親水性ポリトリメチレンカーボネート誘導体とのブロック共重合体を用いて、そのスピンコート薄膜が調製条件によって偏析する様子を観察し、ポリ乳酸の結晶化など界面における高分子鎖の集合様式を観察するとともに、再表面の組成を観察した(論文受理)。ポリメタクリル酸メチルのアイソタクチック体とポリメタクリル酸のシンジオタクチック体を用いて、基板上に交互積層薄膜を形成した。ここから、単一成分を抽出除去することで多孔性薄膜を得る従来の手法でテンプレート重合反応場の構築を利用し、重合の温度効果を調べることで、相互作用の見積もりにチャレンジした(論文受理)。高分子間相互作用に関連して、高分子鎖同士の光反応を利用したゲル形成を行った。架橋点の密度が影響することを明らかとした(論文受理)。2年目は、1年目から得られた界面における高分子間相互作用の観察結果を基にして、接着力の評価と接着剤など機能性への応用へ展開することが目的であった。まず、バネはかり法によってポリ(L-乳酸)とポリ(D-乳酸)のスピンコート薄膜界面での接着力が、ポリ(L-乳酸)同士の界面および交互積層薄膜の界面と比べて、強い力を示したことを見出した(学会発表済み、論文化中)。また計画通りに、基板界面に粒子を挟み込んで、その選択的な力を観察する実験を行った。当初はシリカゲル粒子を計画していたが、より小さなナノサイズの粒子を用いる必要が判明したため、金ナノ粒子を用いて実験を行ったところ、選択的接着剤として利用可能であることが分かった(特許出願済)。末端にカテキンという抗菌性を有する嵩高い置換基を導入してアセトニトリル溶液中でポリ(L-乳酸)とポリ(D-乳酸)を相互作用させたところ、分子量が数千程度の場合十分に高分子間相互作用が働いてステレオコンプレックスを形成することを確認した(論文受理)。さらにクロロホルム溶液として、インクジェット装置により高速で吐出されたガラス基板上においても、溶媒の蒸発とポリマーの溶解を早く繰り返しながらも高分子間相互作用によりステレオコンプレックスを形成することを確認した(論文受理)。このようにインクジェット装置を用いた高分子間相互作用の発現は溶媒効果や温度効果にも大きく影響することを確認した(論文受理)。なお、関連する研究としてポリ乳酸を用いたオイルゲルから徐放実験を行い、接着材料のみならず、難水溶性薬物の担持材料としても利用可能であることを示した(論文受理)。現在までの研究の達成度は、おおむね順調である。その理由は、ステレオコンプレックスを形成するポリ乳酸やポリメタクリル酸について、既に今年度内に実験を開始したこと、ある程度の成果が得られ、論文2報受理されたからである。平成26年度は、研究計画書に記載した通り、順調に実験を遂行した。まず、ポリ(Lー乳酸)およびポリ(Dー乳酸)高分子間相互作用を提案した手法で確認した。つまり、溶媒を挟み込んだり、加熱したりする種々の条件で、界面における高分子間相互作用が働くかどうかをX線結晶構造解析により観察を行った。また、スピンコート薄膜を圧縮してその時の引き離す力をバネはかり法によって測定した。スピンコート薄膜と交互積層薄膜を用いて実験を行い、測定結果に違いを観測することができた。これらの結果から、高分子鎖のコンフォメーション、配向、および結晶性などの状態の違いによって高分子間相互作用に働く力が異なることが示唆された。交互積層法から得られたサンプルではステレオコンプレックスを既に形成しているため、界面において圧縮した場合、スピンコート薄膜で観測された力と比べて小さな値を示した。これらの結果は、本研究の目的を一部達成したものと言える。また、実験を進めるうちに高分子間相互作用に関連して、新たな実験系を取り入れた。

例えばこれを類似の高分子を試料として用いることで、当該研究課題の目標達成に向けて異なるアプローチを取り入れている。溶液状態をモデルとして提案していたが、これはヒドロゲル形成を実験的に扱っている。高分子鎖に反応点を導入し、その架橋点の濃度や溶液濃度を変化させることでゲル系性能を比較した。高分子合成今後の研究の推進方策について、まずは研究計画書に記載した通りシリカゲル粒子を基板としてポリ(Lー乳酸)およびポリ(Dー乳酸)を結合させたサンプルを調製する。さらに、平面基板上にポリ(Lー乳酸)およびポリ(Dー乳酸)を結合させたサンプルも調製する。これらの粒子を平面基板に挟み込んで圧縮させ、引張強度を調べることから、高分子間相互作用の力を見積もる。さらに、ポリ(Lー乳酸)、ポリ(Dー乳酸)の組み合わせやポリ(Lー乳酸)同士の組み合わせとを比較して、選択的な接着力の違いを検討する。また、2種の基板上にそれぞれit-PMMAおよびst-PMMA(またはPLLAおよびPDLA)の薄膜を調製する。なお、片側の基板には薄膜を有しない基板の組み合わせを比較とする。この間隙へ高分子に運動性を与える条件(溶媒・温度・添加物など)を施し、ステレオコンプレックス化によって接着させる。接着剤を用いない界面接合に挑戦する。ポリ(Lー乳酸)/ポリ(Dー乳酸)ステレオコンプレックスの融解エンタルピーが142 J/gであり、アイソタクチックポリメタクリル酸メチル/シンジオタクチックポリメタクリル酸メチルのステレオコンプレックスの融解エンタルピーは145°C40時間アニーリングした場合約20 J/g程度であることが知られているので、各サンプルについて示差熱分析により融解エンタルピーを算出し、これを引っ張り強度の結果と比べてモル計算する。また、単一高分子鎖あたりのエネルギーを比較する。最終的に水素結合や静電的相互作用を除いた力を見積もることで、ステレオコンプレックス化に働くファンデルワールス力を算出することに挑戦する。研究代表者は、研究開始時には大阪大学所属であったが、昨年度中に奈良先端大学へ異動して新しい研究室を立ち上げる必要があった。そのため、実験室設計および工事に時間を必要とし、該当期間中には当初予定していた試薬の購入が中断せざるを得ない状況となったから、次年度使用額が生じた。研究代表者の異動が決まった時点で研究計画の修正を行っており、研究成果には支障をきたしていない。しかし、当初購入予定であった試薬等を異動先の奈良先端大において購入し、引き続き本研究課題を異動先で執行する計画である。
有機アニオントランスポータ安定発現細胞構築による薬物認識機構の分子的解明

本研究では、アニオン性薬物の腎排泄挙動に関わると考えられる腎局在性有機アニオントランスポータ(OAT-K1よびOAT-K2)の生理機能について各々の安定発現細胞を構築し、それに基づく構造・機能解析を行い以下の研究成果を得た。有機アニオントランスポータヘ安定発現細胞系による薬物認識特性の比較解析と薬物治療における役割OAT-K1およびOAT-K2安定発現細胞を用い、それぞれの有機アニオン認識特性について比較解析を行った結果、両トランスポータはアニオン性抗癌剤メトトレキサート、アラキドン酸誘導体であるプロスタグランジンE2やプロスタグランジンF2α、胆汁酸、硫酸またはグルクロン酸抱合ステロイド、カビ毒であるオクラトキシンAなどのアニオン性化合物を広く認識するのみならず、カチオン性である抗ウイルス剤ジドブジンも輸送基質として認識することを見出した。一方、古典的な有機アニオントランスポータの基質であるパラアミノ馬尿酸は弱い阻害効果を有するものの基質とならないことが分かった。また、OAT-K1およびOAT-K2間における著明な基質認識特性の違いは認められず、両トランスポータが類似した有機アニオン認識特性を有していることが示唆された。さらに、予め細胞内に負荷したメトトレキサートの細胞外への排出は、細胞外フォリン酸の存在により著しく促進された。従って、OAT-K1およびOAT-K2は近位尿細管刷子縁膜において上皮細胞内に蓄積したメトトレキサートと糸球体濾過されたフォリン酸との交換輸送を媒介し、臨床におけるフォリン酸投与後のメトトレキサート血中濃度低下に少なくとも一部関わっていることが推察された。これらの研究成果は、アニオン性薬物の尿中排泄機構を詳細に理解する上で有用な基礎情報を提供するのみならず、メトトレキサートを用いた癌化学療法に対するOAT-K1およびOAT-K2の重要性を明らかにするものと考える。本年度では、腎局在性有機アニオントランスポータOAT-K1及びOAT-K2の安定発現系の構築を行い、両トランスポータの薬物認識特性並びに薬物輸送の方向性について検討を行った。1)有機アニオントランスポータ安定発現細胞の確立リン酸カルシウム共沈法によって、哺乳類発現ベクターに挿入したOAT-K1及びOAT-K2cDNAをイヌ腎由来培養上皮MDCKにトランスフェクションした。得られた細胞を用いてメトトレキセートなどのアニオン性薬物輸送の方向性及びノーザンブロッティング、ウエスタンブロッティングを行った結果、OAT-K1及びOAT-K2をそれぞれ発現する安定発現細胞MDCK-OAT-K1及びMDCK-OAT-K2を獲得した。本安定発現細胞においてOAT-K1及びOAT-K2は共に頂側膜に局在しており、ラット腎組織での局在と対応するものであった。2)安定発現細胞によるOAT-K1及びOAT-K2の薬物認識特性MDCK-OAT-K1またはMDCK-OAT-K2をディッシュ上または多孔性フィルター上に培養し、種々アニオン性化合物の輸送実験を行った。その結果、OAT-K1はアニオン性抗癌剤メトトレキセートや葉酸を強く認識すること、一方OAT-K2はメトトレキセートはじめタウロコール酸やプロスタグランジンE2など多様なアニオン認識特性を有することが判明した。さらに、両トランスポータは取り込み並びに排出という両方向性の輸送能を有していたことから、尿細管におけるアニオン性薬物の尿細管分泌に関わることが推察された。
就学前の幼児と小学校低学年の児童を対象とした連携図形教育プログラムの開発

本研究の目的は我が国における就学前教育と小学校低学年教育の接続を考慮した幼児・児童のための連携図形教育プログラムを確立することである。そのために,図形教育に関する問題点を解明するための調査を実施し,その結果及びアメリカ合衆国の就学前教育の研究プロジェクトの成果を踏まえ,就学前の幼児及び小学校低学年の児童を対象とした図形に関する指導の内容,配列及び方法を構想した。また,その指導の一部を実施し,その前後で質問紙調査等を行い,その効果を検証し,その結果を基に,幼児と児童を対象とした連携図形教育プログラムを提案した。そのために,図形教育に関する問題点を解明するための調査を実施し,その結果及びアメリカ合衆国における就学前教育の研究プロジェクトの成果を踏まえ,就学前の幼児及び小学校低学年の児童を対象とした図形に関する指導の内容,配列及び方法を構想する。その指導を実施し,その前後で質問紙調査や面接調査を行い,その効果を検証し,幼児と児童を対象とした連携図形教育プログラムを提案する。本研究は就学前から小学校第2学年の子どもを対象とした図形指導プログラムを開発することを目指している。本年度の主要な成果は以下の2点である。第一に,図形指導プログラムを構築するために,その内容選択の基準を明らかにした。そのために,まず,思考の発達及び幾何学的思考の側面から図形指導プログラムの対象範囲を明らかにした。次に,幾何学における図形の捉え方を基に図形指導の内容を特定した。続いて,幼少期の子どもを対象としたプログラムとして,アガム・プログラム,年少の子ども向けスタンダード,ビルディング・ブロツクス・プロジェクト及びNCTMスタンダードを概観し,図形指導の内容について比較した。以上の結果を踏まえ,プログラム構築のための内容選択の基準を抽出することができた。その結果,就学前及び小学校低学年の子どものための図形指導プログラムの内容選択の基準として,空間,図形,位置,大きさ,運動,構成要素及び構成要素の配置を提示した。第二に,アガム・プログラムにおける実態調査の問題を参考にして,四角形や円の認識,図形の再生,記憶・再生,図形の構成要素の認識,色板並べ,図形の合同・相似の認識を含む問題を用いて,小学校第1学年の2校5学級の児童を対象に実態調査を行った。主な結果としては,次の3点が挙げられる。(1)曲線図形と直線図形の識別,多角形の識別及び再生については適切に行えること,(2)複雑な図形の中に単純な図形を見つけることの発速度が多様であること,(3)同じ図形という認識が多様であること。第一に,千葉県内の小学校教師に対して,小学校第1学年から第3学年までの図形の内容,その取り扱い等に関する質問紙調査を実施し,その結果を考察することにより,小学校低学年の図形指導に関する問題点を明らかにした。結果として,小学校教師が考えている問題点は作図等の道具を使った作業に関する子どもの困難性や図形についての見た目による子どもの判断であり,図形の分類や図形さがし等の学習内容については問題点を見出していないことが分かった。一方で,小学校入学前の子どもたちの経験に関して理解している教師は少なく,就学前教育と小学校教育との連携の必要性が強く示唆された。第二に,就学前から小学校低学年の子どもを対象とした図形指導プログラムに含める必要のある平面図形に関する活動を提案した。まず37歳の視覚的認知の開発のためのアガム・プログラムにおける調査内容を踏まえ,調査問題を作成し,それを用いて,幼稚園年長児と小学校第1学年児童に平面図形の認知に関する実態調査を実施した。次に,その結果を比較分析することを通じて,幼稚園年長児から小学校第1学年児童の図形認知の発達を明らかにし,発達が十分でない内容を特定し,その向上を目指した活動を提案した。その結果,図形指導プログラムの活動内容として,以下の3点を含めることが必要であるとわかった。移動可能な操作具を用いて,ものの形や図形を構成・分解する活動,図形を大まかに,また,細部まで瞬時に捉える活動及び図形のはめ込み・取り外しの活動である。第一に,小学校第1学年における色板による形構成・形置き換えの活動が図形のdisembeddingの改善に有効であることを示した。そのために,まず図形のdisembeddingに関する先行研究を整理し,次に我が国における図形のdisembeddingに関する幼稚園児及び小学校1年生の実態を解明した。その結果を踏まえ,小学校第1学年における色板による構成の授業を構想し,実施した。

特に,形構成,形置き換えの活動の効果を明らかにするために,形構成を取り入れた授業と形構成・形置き換えを取り入れた授業を実施し,両授業クラスの児童に対して,図形のdisembeddingに関する事前事後調査を行い,その結果を比較し,分析した。その結果,1つのピースから成る三角だけを選んだ児童の人数が減少し,色板による形構成・形置き換えの活動が図形のdisembeddingの改善に有効であることが分かった。第二に,アメリカ合衆国で実践され,報告されているearly mathのプログラムを参考にして,図形指導プログラムの構築のための枠組みを提案した。具体的には,就学前の幼児から小学校1年生の児童を対象とした図形指導プログラム構築のための枠組みとして,年齢段階と,内容項目の2次元を示し,年齢としては,4歳児7歳児の段階で,また,内容としては、図形,運動及び構成要素に関する活動内容を組み込むことにした。特に,(1)図形間の類似点及び相違点を捉えること,(2)図形を分類して仲間作りをすること,(3)図形の構成及び分解ができるようになること,(4)図形のembedding及びdisembeddingができるようになること,(5)移動(変換),すなわち,平行移動,回転移動及び対称移動ができるようになること,(6)辺の長さと角の大きさについて,等しいかどうか判断を求める活動を位置づけることとした。本研究の目的は就学前の幼児教育と小学校低学年教育の接続を考慮した連携図形教育プログラムを開発することである。今年度は,第一に,幼稚園年長児に対して行われた図形指導,すなわち,形構成,形置き換えの活動による指導の効果を明らかにした。そのために,まず図形のdisembeddingに関する先行研究を整理し,次に我が国における図形のdisembeddingに関する幼稚園年長児及び小学校1年生の実態を解明した。その結果を踏まえ,幼稚園年長児における色板による形構成及び形置き換えの活動を取り入れた指導を実施し,この指導を受けた年長児に対して,図形のdisembeddingに関する事前事後調査を行い,その結果を比較し,分析した。結果として,1つのピースから成る三角だけを選んだ年長児の人数が減少し,色板による形構成・形置き換えの活動が図形のdisembeddingの改善に有効であることが分かった。特に,幼児期において,disembeddingが成功するための5条件を明らかにした。それは,形構成・形置き換えの活動において,与えられた図形に対して,正しくはめ込むことができること等である。第二に,アメリカ合衆国で実践され,報告されているearly mathのプログラムと,これまでの研究結果を踏まえて,図形指導プログラムの構築のための枠組みを提案した。具体的には,就学前の幼児から小学校1年生の児童を対象とした図形指導プログラム構築のための枠組みとして,年齢段階と内容項目の2次元を示し,年齢としては,4歳児7歳児の段階で,また,内容としては,図形,運動及び構成要素に関する活動内容を組み込むことにし,その内容を具体化した。
意思表示できない脳血管疾患患者の高齢配偶者が行う代理意思決定プロセスのモデル構築

意思表示できない脳血管疾患患者の高齢配偶者が行う代理意思決定プロセスを明らかにするため、5名の研究参加者に半構成的面接を行った。その結果、そのプロセスは、[代理意思決定の認識]、[意思決定のためのリソース]、[意思決定への影響要因]、[代理意思決定全体の評価]という4つの構成要素から成り立っていた。また、代理意思決定の認識には、リソースと影響要因が関係しており、全体の評価へと繋がっていることが示唆された意思表示できない脳血管疾患患者の高齢配偶者が行う代理意思決定プロセスを明らかにするため、5名の研究参加者に半構成的面接を行った。また、代理意思決定の認識には、リソースと影響要因が関係しており、全体の評価へと繋がっていることが示唆された本研究は、入院期間中における高齢配偶者の代理意思決定の特徴を知るために、医療面や生活面における具体的な意思決定の内容および、どれくらいの期間をかけて意思決定がなされていったのかについて、配偶者からインタビューを行い実態を明らかにするものである。これにより、高齢配偶者は、無理のない範囲で後悔しない、その段階で最も適切だと思える意思決定を心理的安定のもとに行うことができる。また、看護師は、今まで家族のみで対応してきた代理意思決定過程に適切な時期に介入する方策を見出すことができると考えている。本年度は、参加者のリクルートとデータ収集を中心に行った。まず、先行研究より概念枠組みを作成しそこから質問内容として意思決定内容及びその順序、意思決定時の影響要因とリソース、意思決定に要した時間、意思決定後の評価の項目を含むインタビューガイドを作成した。65歳以上を含む3名にプレテストを行い、インタビュー技術の改善やインタビューガイドの確認を行った。次に参加者のリクルートとして当初A県内で内諾を受けていた5施設を対象病院としていたが、リクルートに困難を要したため、北陸3県内の11施設に協力病院を拡大した。現在1事例のインタビューが終了し、逐語録や、付加資料として意思決定内容事項記載用紙、日記・手帳のコピー、看護記録や診療記録からの情報、フィールドノート等のデータ化が完了している。今後も引き続き研究参加者の事例を集め、データを蓄積していく予定である。本研究は、入院期間中における高齢配偶者の代理意思決定の特徴を知るために、医療面や生活面における具体的な意思決定の内容および、どれくらいの期間をかけて意思決定がなされていったのかについて、配偶者からインタビューを行い実態を明らかにするものである。本年度は、データ収集と分析を中心に行った。協力病院を北陸3県内11施設に拡大し、計6名の研究参加者を募ることができた。(1名は今回の研究の条件から逸脱したため、除外した。)インタビューは、病棟師長から紹介を受けた時、患者の入院期間に合わせて約3週間毎、転院(退院)後の配偶者の精神状態が落ち着いた頃にそれぞれ行った。場所は病院内の面談室あるいは自宅など研究参加者が希望する所で行い、インタビュー回数は1人につき26回、所要時間は30150分/回であった。分析方法は、質的内容分析Hsieh & Shannon(2005)のDirected content analysisを活用し、帰納的に得られたデータに忠実に分析を進めた。また、インタビューによって得られた質的なデータを多元的に解釈するために、意思決定内容事項記載用紙・日記・手帳などのコピー、看護記録や診療記録からの情報、フィールドノートの結果を活用した。研究データの真実可能性の確保のために、インタビューによって得られた逐語録を研究参加者にフィードバックを行い内容確認を行った。現在、インタビューや観察、文書類の分析を通して多元的に情報を収集し、3名のスーパーバイザーの指導のもと検討を重ねている段階である。本研究は、入院期間中における高齢配偶者の代理意思決定の特徴を医療面や生活面から明らかにするものである。本年度は、研究参加者5名のインタビューデータをHsieh & Shannon(2005)のDirected content analysisによって質的内容分析を行なった。研究参加者と患者の概要では、研究参加者5名(男性1名、女性4名)は、6080歳であった。患者5名は6075歳であり、全員が脳出血で、うち3名が手術を受けていた。脳血管疾患患者の高齢配偶者が入院中に行なう代理意思決定の構成要素は、[代理意思決定の認識]、[意思決定のためのリソース]、[意思決定への影響要因]、[代理意思決定全体の評価]の4つに分類された。特に、代理意思決定の認識では、手術、転院(退院)、医療処置、生活全体の4場面に大別され、手術場面では、【決断を下すのは自分しかいない】という積極的な認識であった。

転院(退院)場面では、【折り合いをつけながら、最終的に決断するのは自分】という能動的な認識であった。しかし、医療処置場面では、医師からの説明後同意書にサインするのが当たり前という雰囲気の中で、【自らの判断で選択する余地がない】という受け身的な認識であった。また、生活全体の場面では、代理意思決定の認識は薄く、長年夫婦として暮らしてきた中で、【無我夢中で配偶者として当然のことを行う】という曖昧な認識であった。参加者のリクルート、カルテ開示における倫理面において時間を要したが、あらかじめ1年間という長めのデータ収集期間を設けていたため、6名の研究参加者を募ることができた。(1名は今回の研究の条件から逸脱したため除外した。)5名のインタピューデータと、付加資料として意思決定内容事項記載用紙、日記・手帳等のコピー、看護記録や診療記録からの情報、フィールドノートの結果を活用し、多面的に解釈することにより、5事例の事例毎に見出せる特異性と他事例との共通性を検討できると考えている。よって、得られた結果と文献検討から得られた概念枠組みを参考にすることにより、本研究の目的である意思表示のできない脳血管疾患患者の高齢配偶者が入院中に行った代理意思決定の内容や、それに要した時間とそのプロセスについて明らかにできるのではないかと考えているため。24年度が最終年度であるため、記入しない。今後得られたデータのさらなる分析と結果報告を行う予定である。
宗教的信念の心理的起源の探る：“心の理論仮説”の再検討

たとえ特定の宗教への信仰を持たずとも、例えば「困ったときには思わず神頼みをしてしまう」とか「神社・仏閣で神聖な何かがいるように感じてしまう」といった経験を持つ人は少なくないだろう。このように信仰の有無とは別に、素朴に神様や精霊といった存在を素朴に認める人は多くいる。ではこうした“神・精霊を信じる気持ち"は、一体どこからやってくるのだろう?本研究では、この問題について近年提唱された“心の理論仮説"の妥当性を検証することを目的とする。具体的には、メタ分析、“神を信じる気持ち"の非意識的側面を測定する測度の開発、そして文化比較研究を実施し、“神・精霊を信じる気持ち"の心理的な由来を探求する。
グラウバウマン-渡辺対応とブロックの導来同値性に関する研究

本計画において、有限群の表現論における現在の基本的問題である可換不足群予想について、特に、Glauberman-渡辺対応との関わりから考察した。1.Glauberman-渡辺対応の指標理論は、対応するブロック多元環A、Bの中心間の同型を与える。この同型は、ある種の2つの両側(A,B)加群の指標の差として解釈される。AとBの導来同値を与えるようにこの加群間の写像を構成することを目標としてきた。Rouquierの貼り合わせ理論の応用で、群U(4,q^2)で安定的同値を与える写像を構成した。本研究課題の考察の中で、有限代数群におけるAlvis-Curtis-Kawanakaのdualityと自己導来同値性に関する予想、及び、そのHecke環における予想を解決した。2.有限代数群の体の自己同型による拡大群は、Glauberman型設定と関わって興味深い。自己同型の固定部分群のブロックと、拡大群のブロックを関連づけることが考察対象となる。Holloway-Koshitani-Kunugiによる、群SL(2,q)の研究の中で提起された群Sz(q)における問題に取り組み、ブロック多元環がある種の分裂をもつことを示した。ここでは、不足群は焦点部分群が巡回群の非可換群であるが、導来同値なブロックの例となる。3.Broue予想に関わって、様々な拡張が試みられている。Narasaki-Unoによるperfect isometryの拡張概念に関する予想について、群U(3,q^2),Sz(q)の定義体と同じ標数の体上のブロックに関して解決した。また、群^2F_4(2)と^2F_4(q)のブロック間の導来同値についても考察した。18年度19年度の2年計画の初年度の取り組みについて、「研究の目的」、「研究実施計画」にそって、以下の2点について報告する。1.グラウバウマン--渡辺対応ブロック上のある種の両側加群の構成についてグラウバウマン--渡辺対応の指標理論から、対応するブロック多元環A、Bの中心の間の同型が得られる。この同型は、ある種の2つの両側(A, B)加群の差として解釈される。この加群間の写像「関連子」を構成し、ブロック間の導来同値を与える傾斜複体の構成を目標としてきた。RouquierのGlueing up手法と帰納的考察から、対応するブロックが安定的同値である事実の確認に目処がついた。導来同値性についての考察をさらにすすめていく。グラウバウマン対応の設定は、有限代数群における新谷ディセント、川中の指標の持ち上げ理論と密接に関連している。本研究課題の考察の中で、有限代数群におけるAlvis-Curtis-Kawanakaのdualityと自己導来同値性に関する予想の解決を見、発表準備中である。2.可解群、不足群が巡回群である場合の傾斜複体の構成について1に述べた対応するブロック間の安定的同値は、不足群が正規部分群である場合、及び群が可解群である場合には、森田同値となり、Harris、田阪の結果の別証明を与える。不足群が巡回群である場合、越谷-Kulshammerのブロックの分裂定理の精密化を鈴木群Sz(q)で考察し、導来同値なブロックの新しい例を得た。この例では、不足群は非可換群であるが、焦点部分群が巡回群で、ブロック多元環がある種の分裂をもつ。考察の過程で、ある種のp-群のコホモロジー環を決定でき、Ree群Re(q)での同様の考察にその応用をさらに探っていく。また、考察の中で、ある種のEndotrivial加群が出現し、相対射影被覆の理論の有用性が確認され、次年度にその応用を図りたい。

18年度19年度の2年計画の2年目の取り組みについて、「研究の目的」、「研究実施計画」にそって、以下の3点について報告する。1.グラウバウマン-渡辺対応ブロック上のある種の両側加群の構成についてグラウバウマン-渡辺対応、また、川中の指標の持ち上げ理論は、対応するブロック多元環A、Bの中心の間の同型を与える。この同型は、ある種の2つの両側(A,B)加群の差として解釈される場合が多く、ブロック間の導来同値を与える傾斜複体の構成を目標としてきた。Rouquierの貼り合わせ手法と帰納的考察の適用例として、U(4,q^2)について考察し、安定的同値のブロックの例を確認した。2.不足群が巡回群である場合の傾斜複体の構成について不足群が巡回群である場合、様々な傾斜複体の構成方法が知られている。不足群が非可換だが焦点部分群が巡回群であるブロック間の導来同値性について、SL(2,q),鈴木群Suz(q),Ree群Re(q)などの体の自己同型群による拡大の群を例に考察した。3.導来同値性のコホモロジー理論的考察について前年度の取組みで、有限代数群における指標環のdualityを実現する傾斜複体を構成した。その応用として、対称群のある種の既約加群のコホモロジー的性質を考察し、そのcomplexityを決定した。上記の考察の中で、ある種のEndotrivial加群が出現し、相対射影被覆の理論の有用性が確認されるとともに、コホモロジー的考察の重要性が課題となった。
固体高分解能NMRによる膜蛋白質構造解析と機能の担関に関する

バクテリオロドプシン(bR)を典型的な膜蛋白質としてとりあげ、そのフラグメントの一部を化学合成するとともに、野生株および部位特異変異株の[2-^<13>C]-,[1-^<13>C]-,[1,2,3-^<13>C_3-Alaおよび[1-^<13>C]Val-標識蛋白質を、これら安定同位体によって置換した人工培地を用いて大量調製を行い、固体高分解能NMRスペクトル測定をもとに、以下の結果を得ることが出来た。(1)フラグメントの化学合成膜貫通αへリックスを含む種々の^<13>C標識フラグメントを化学合成し、脂質二重膜にうめこみ固定のスペクトルデータと比較し、膜中での遅い異方的な揺らぎ運動の存在によって、α_<II>へリックス様の挙動が見られることを明らかにした。(2)スペクトル分解能と同位体標識位置これまでに研究を積み重ねてきた[3-^<13>C]Ala標識bR試料にくらべて、今回の実験からえられたbRの^<13>CNMRスペクトルの分解能は、特にループ部位のように信号が完全に消滅するか、膜貫通αへリックスのようにその線幅の拡がりが著しいことがわかった。これらは、標識位置にある炭素の化学シフト異方性が数kHz程度で、これらを平均化するのに必要なマジック角回転に干渉したり、スピン-スピン緩和時間の短縮がその原因であることがわかった。(3)膜表面残基の構造とダイナミックス前項の結果、ループ部位は従来考えられていたような静的な構造ではなく、10kHz程度で揺らいでいる構造であることがわかった。また、C末端αへリックスがC末端に存在することが既に報告しているが、その揺らぎの相関時間をスピン格子緩和時間およびスピンスピン緩和時間の測定値から推定することができた。、また、膜貫通αへリックス構造もふくめ、プロトンデカップリング周波数と干渉するもう一つの揺らぎの検出の可能性を検討した。このC末端へリックスと細胞質ループの間の相互作用についても、種々の変異株のスペクトルパターンの変化から議論することができた。構成アミノ酸が1個ないしは2個置換されたバクテリオロドプシン(bR)変異株約15種類について、順次[3-^<13>C]Ala、[1-^<13>C]AlaおよびVal, Leuなどの安定同位体を行い、そのNMRスペクトルから、次の結果を得た。(1)サンプリング時間を50ミリ秒まで延伸することにより、従来の2本の単一炭素をふくめた7本の信号から、5本の単一炭素に由来する信号を含めて、12本の信号が分離するなど、大幅なスペクトル分解能を達成することができた。(2)とりわけ、細胞外側に位置するAla126, 196に関しては、アミノ酸置換によってその構造を変化させず、信号の帰属が一義的に達成することができた。(3)一方、細胞質側にある残基、Ala103, 160, 39などにおいては、本来の信号のみならず膜貫通ヘリックス部位の信号にも変化を与えることがわかり、ループ部位はそれぞれ特異なコンホメーションをとることを示している。

(4)カチオン除去による青膜の形成により、中性状態のスペクトルに比べて著しい変化が見られたが、この原因は表面pHの低下による蛋白構造変化であることを明かにし、特異なカチオン結合サイトの存在に関する知見を得た。(5)bRのプロトン輸送機構に関連して、Asp96-Thr 46- Val 49-Asp85の水分子が関与した水素結合ネットワークについての知見を得るために、D96N, T46VについてVal標識化合物を調製したが、その高次構造自身は変化せずダイナミックスに違いが生じた。バクテリオロドプシン(bR)における、光駆動プロトンポンプの分子機能の解明を目的として、野生株および種々の部位特異変異株を[1-^<13>C]Val-,[3-^<13>C]Ala-標識タンパク質を大量に調製し、それらの固体高分解能NMRスペクトルの解析から次の結果を得た。(1)細胞質側ループの高次構造への寄与細胞外側にあるC末端部位がαヘリックスを形成する。このヘリックスの安定性がE-Fループの変異株A160Gにおいて著しく減少し、タンパク骨格全体のスペクトル変化をもたらし、さらにパパインによるC末端切除試料におけるこのループに構造変化がおこるところから、C末端ヘリックスはE-Fループをはじめとするループと、金属カチオンを含む塩橋形成によって相互作用を行い、タンパク質全体の安定性に寄与していることがわかった。(2)金属カチオンの効果金属カチオンは、脱カチオンおよび2価金属イオンのみを除去したbRを調製し、特に2価イオンは上記の塩橋の他に細胞外側F-Gループにより選択的な結合場所をもち、タンパク質骨格の安定性に寄与していることがわかった。(3) M様中間体D85Nの^<13>CNMR解析により、Asp85のプロトン化にともなうレチナールとの相互作用の減少により、タンパク質全体のコンホメーション変化ならびに、ms-μsオーダーの揺らぎがを生じさせ、次のステップに移行することを明らかにした。(4)プロトン移動経路におけるコンホメーションカップリング光反応による細胞外側へのプロトンの放出、細胞質側でのプロトンの取り込みにともなう構造変化の“スナップショットを、プロトンが移動する経路に関与するアミノ酸残基の局部的なコンホメーション変化として、関与する変異株を調べることにより、それぞれの変化を室温で調べることができた。バクテリオロドプシン(bR)を典型的な膜蛋白質としてとりあげ、そのフラグメントの一部を化学合成するとともに、野生株および部位特異変異株の[2-^<13>C]-,[1-^<13>C]-,[1,2,3-^<13>C_3]-Alaおよび[1-^<13>C]Val-標識蛋白質を、これら安定同位体によって置換した人工培地を用いて大量調整を行い、固体高分解能NMRスペクトル測定をもとに、以下の結果を得ることが出来た。(1)フラグメントの化学合成膜貫通αへリックスを含む種々の^<13>
骨細胞ciliaの機能解析を基軸としたインプラント周囲骨吸収制御戦略

本研究は、物理刺激遮断による骨細胞の繊毛関連シグナル伝達および骨吸収抑制制御に関わる生体分子についてその一端を解明することとした。マウス由来株化骨細胞IDG-SW3は、分化開始をDay0とし、その分化段階でのDmp1発現に伴うGFP蛍光発色を確認した。また、マウス長管骨を、コラゲナーゼおよびEDTA溶液を交互に用いて溶解・脱灰処理し、回収した最後の3分画を骨細胞分画として実験に用いて解析中である。近年、骨吸収に関する骨細胞の役割が徐々に明らかになってきており、骨細胞のメカノセンサーとしてcilia(繊毛)が重要と考えられているものの、そのメカニズムは判っていない。そこで本研究の目的は、生理的な術後骨吸収に密接に関わっている『物理刺激』に焦点を当て、人工無重力装置を用いたいわゆるメカノバイオロジーによる研究デザイニングにより、『骨細胞の繊毛』が関与する骨吸収メカニズムの一端を解明し、臨床における生理的骨吸収制御のストラテジー構築の端緒を目指すものである。骨細胞は、長期の培養が可能で骨細胞として複数の分化段階を発現する株化細胞IDG-SW3および長期の実験には適さないものの実際にマウス長管骨内に存在する骨細胞を抽出したプライマリー細胞を用いた。IDG-SW3は、増殖培地(INF-γを含む)を用いて33°Cインキュベータ内で培養.実験開始には2日でコンフルエントになるよう4 x 104cells/cm2で播種。コンフルエントに達したら分化培地(INF-γを含まず、50 μg/mlビタミンCおよび4mM βグリセロリン酸を含む)に交換して37°Cのインキュベータに移して培養。細胞の分化を、Day34でDmp-1の発現とともにGFPが発現することで、顕微鏡下で観察確認し、さらにDay 1014で強い発現を確認。23日ごとに培地交換し、0日および3,7,10,14,21,35日でのN=3でのサンプルを回収。細胞数のカウント、回収した細胞よりtotal RNAおよびtotal proteinを抽出。一方、プライマリー細胞は、トランスジェニックによりDmp-1とGFPが同時に発現するマウスより大腿骨および脛骨を回収。培地内で骨を分割し、コラゲナーゼおよびEDTAを含む培地にシェーカーにかけながら交互に浸漬して細胞を抽出。抽出した細胞は4日間静置後に培地交換してから実験に使用した。現在まで細胞の安定した抽出および培養に時間を要してきたが、人工無重力装置による実験に着手しており、実験結果を検討中である。医歯薬学