hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
D-アミノ酸オキシダーゼが脊髄侵害受容性シナプス伝達に与える影響

Dアミノ酸オキシダーゼ(DAO)ミュータント系マウスを用いて、侵害受容刺激による脊髄後角表層におけるNK1 receptor internalization(NK1Ri)への影響およびブレインビジョンによるシナプス変化について観察した。ホルマリン試験では、DAOミュータント系マウスにおいて有意な疼痛行動の増強を認めた。またコントロールマウスのホルマリン注射側における脊髄後角NK1Riの増加を認めた。さらにブレインビジョンにおいて、後根流入部位の電気刺激による後角抑制性シナプス成分の減弱を認めた。これらの結果からDAOの侵害受容刺激によるシナプス伝達への関与が示唆された。コントロール群として、5ー8週雄性ICRマウスの左後肢に2.5%ホルマリンを50μL皮下注し、その後4%パラホルムアルデヒドによる全身灌流固定を行い、脊髄を摘出、クリオスタットにて作製したスライスを用いて免疫組織染色を行った。1次抗体として抗NK1受容体ポリクローナル抗体、2次抗体としてAlexa488、Alexa594を使用し、蛍光顕微鏡を用いて脊髄後角を観察したところ、後角表層(lamina I)に多数のNK1受容体陽性ニューロンを認めた。しかし、サブスタンスP放出の指標となるNK1受容体internalization(内在化)を示すニューロンの数は1切片に23個とかなり少なく、いまのところホルマリン誘発性サブスタンスP放出の評価には至っていない。これは、以前使用していた1次抗体が製造中止となっており、別な1次抗体を用いているため観察に至っていないと推測される。また脊髄後角cーFos発現を評価するために抗Fosポリクローナル抗体を用いて免疫組織染色を行っているが、こちらも蛍光染色されるニューロンが非常に少なく、c-Fos発現の評価に至っていない。理由は不明であるが更なる試行が必要と思われる。今後、サブスタンスP放出の評価として他の方法(ELIZA、放射性同位元素などによる方法)を検討している。一方、当研究室において以前施行したDアミノ酸オキシダーゼミュータント系マウスを用いたホルマリンテストでは、第2相の有意な増加を認め、D-アミノ酸が侵害受容性シナプス伝達の変化に関与している可能性が示唆されている。さらにこのミュータント系マウスでは、脊髄のNMDAを介したシナプス伝達がコントロールマウスに比し、亢進していることが電気生理学的実験により観察されている。よって実験方法の変更、改善によりサブスタンスPを介したシナプス変化に関しても観察される可能性が高いと考えている。昨年度に引き続き、NK1受容体internalizationの評価を行った。ICRマウス足底部に2.5%ホルマリンを皮下注し、侵害受容性疼痛モデルを作製、ペントバルビタール麻酔下に4%パラホルムアルデヒドによる灌流固定を行い、取り出した脊髄を一晩後固定、OCTに包埋し、クリオスタットで30μmの厚さにスライスし、1次抗体として抗NK1受容体抗体ポリクローナル抗体を、2次抗体としてAlexa488、594を用いて免疫組織染色を行い、後角表層(lamina I)におけるNK1 internalizationの評価を行った。ホルマリン皮下注をした同側脊髄後角において内在化を示すニューロンを多数認め、第1次求心性線維からのサブスタンスP放出の増加を確認した。しかしながら内在化を認めない、あるいはごく少数しか認めない標本も多く、現段階ではコントロール群の評価には至っていない。原因として、以前、この実験で使用していた1次抗体が製造中止となったため、他の抗体で代用しているためと考えられる。現在、様々な抗体を使用して染色を行っている最中である。一方、現在、c-Fosの評価を行っており、2.5%ホルマリンを後肢に皮下注し、2時間後、ペントバルビタール麻酔下に灌流固定を行い、抗Fosポリクローナル抗体を、2次抗体としてAlexa488、594を用いて蛍光発色による染色を行っている。この方法により、一部、c-Fosの発現を認めたが、ごく少数であり、まだ発現量の評価には至っていない。今後、ABC(avidin biotinylated enzyme complex)法を用いた染色を検討している。1次抗体の製造中止など、想定外の状況により、別の抗体による免疫染色を余儀なくされている。またc-Fosの染色に関しても、評価には至っておらず、実験の進捗状況としてはやや遅れている。膜電位感受性色素で染色したマウス脊髄スライス標本を用い、高速蛍光測定により後根流入部の電気刺激で得られる脊髄後角表層の膜電位変化を記録し、コントロール群と坐骨神経部分結紮群で比較した。ケタミン100mg/kg,キシラジン10mg/kg麻酔下にマウスの椎弓切除を行い、マイクロスライサーを用いて、厚さ450&micro;mの脊髄スライス標本を作製した。膜電位感受性色素であるdi-4-ANEPPS(5mM)40&micro;lにクレブス液480&micro;lとFetal bovine serum480&micro;lを加えたものを100&micro;lずつ滴下し、1520分間暗所にてインキュベーションしたのち、色素を洗浄した。スライス標本を記録用チャンバーに固定し、クレブス液灌流下にCCDカメラ(MiCAM2)を用いた高速蛍光測定法により行われた。後根流入部への刺激により、膜電位変化の広がりを確認することができた。また、これらの蛍光強度変化はグルタミン酸受容体拮抗薬(CNQX 5μM)により減弱した。

さらにビククリン、ストリキニン灌流下において、坐骨神経部分結紮群における蛍光強度変化は有意に増大していた(P<0.05)。NK1受容体インターナリゼーションを用いたサブスタンスP放出の観察を行い、ホルマリン皮下注によるサブスタンスP放出の増加を観察したが、ミュータント系マウスとの比較はできなかった。一方、膜電位感受性色素を用いたイメージングによる観察では、神経障害性疼痛による興奮性シナプス伝達の増加を観察することが可能だった。Dアミノ酸オキシダーゼ(DAO)ミュータント系マウスを用いて、侵害受容刺激による脊髄後角表層におけるNK1 receptor internalization(NK1Ri)への影響およびブレインビジョンによるシナプス変化について観察した。ホルマリン試験では、DAOミュータント系マウスにおいて有意な疼痛行動の増強を認めた。またコントロールマウスのホルマリン注射側における脊髄後角NK1Riの増加を認めた。さらにブレインビジョンにおいて、後根流入部位の電気刺激による後角抑制性シナプス成分の減弱を認めた。これらの結果からDAOの侵害受容刺激によるシナプス伝達への関与が示唆された。免疫組織染色において、NK1受容体陽性ニューロンの観察は可能である。しかし第1次求心性線維からのサブスタンスP放出の指標であるinternalizationを示すニューロンの数が少なく、評価に至っていない。またc-Fosに関しても免疫組織染色による観察には至っていない。現在、本学生理学教室の免疫染色専門の先生に助言を仰ぎながら実験を行っている。さらに別の1次抗体を購入検討しており、それらを使用する予定である。また、本研究について協力を要請しているTony L.Yaksh教授にも相談する予定である。またc-Fos発現の評価については、当講座に、ABC法によるc-Fos染色を経験したことがある助教がおり、そちらに相談する予定である。痛みが脊髄シナプス伝達に与える影響以前使用していた1次抗体の入手困難により、NK1受容体internalizationの観察に至っていない。1次抗体の変更による染色を現在行っているが、他の評価方法についても現在検討中である。計画していた国際学会に参加しなかったため。また実験に必要な薬品等の消費が予想より少なく、予定していた薬品購入を行わなかったため。免疫組織染色に必要な抗体、試薬類購入および研究協力者であるYaksh教授との面談のための渡航費用が必要となり、研究費の前倒し請求を行った。当初、面談を前年度中に行う予定であったが先方との調整がつかず、次年度にずれ込んでしまったため、次年度使用額が生じた。今年度、国際学会などの発表を行う予定である。また薬品等消耗品の購入も必要と考えられる。免疫組織染色に必要な抗体、試薬類およびYaksh教授との研究打ち合わせのための渡航費用。
光および酸化開裂反応を利用したアセン類の合成と有機半導体材料への応用

ペンタセン前駆体であるPDKの溶解性を向上させ、塗布変換型トランジスタへと応用するためにPDKヘアルキル基の導入を行い、2,3,9,10位にアルキル基を有するalkylated-PDK(Et-PDK,Pr-PDK,Hex-PDK)の合成に成功した。合成したEt-PDK,Pr-PDK,Hex-PDKに青色光を照射することによってそれぞれ対応するEt-PEN,Pr-PEN,Hex-PENへと変換した。光反応をuv-Vis,NMR,IRを用いて追跡した結果、定量的に進行していることを確認した。また、薄膜での光反応の進行も確認した。次にEt-PDKを用いて塗布変換型OFETを作成した。測定の結果、トランジスタ特性を観測することはできなかった。そこで原因を追求するために、薄膜のAFMを測定したところペンタセンと比べて結晶成長において明確な差異が認められた。PDKからペンタセンを作成した場合、光反応に伴ってペンタセンの結晶成長が確認できた。しかしながら、Et-PDKからEt-PENを作成した場合、光反応が進行しても結晶成長を確認することができなかった。この結果よりEt-PENの結晶性の低さが電荷輸遂を阻害しているものと考えられる。また、結晶性の違いは結晶からの蛍光によっても確認できる。ペンタセンの場合、会合に由来する発光が675-800nmに観測できる。しかし、Et-PENの場合は会合に由来する発光を確認することができなかった。ペンタセンは結晶性の高い材料であり、その結晶性が短いエチル基の導入によって大きく弱められることは興味深い。結晶中での弱いπ-スタッキングを生かし、alkylated-PENのOFETやOPVCへの応用が期待できる。機薄膜太陽電池への応用が期待できる。
^<60>Co照射による腸管出血性大腸菌O157の殺菌・ワクチン開発と食材からの除去

1996年に、わが国で患者数が9千名以上といった世界最大規模の腸管出血性大腸菌感染症の流行が発生した。全国各地がまさに当該感染症に席巻されてしまうという異常な事態となった。本研究の骨子は、食材中の腸管出血性大腸菌の新しい殺菌法を開発するとともに、新しいタイプの経口型予防ワクチンを開発し、深刻な腸管出血性大腸菌の流行を封じ込めることにある。^<60>Co照射による腸管出血性大腸菌の殺菌:O157を含む各種血清型の腸管出血性大腸菌(10^<10>CFU/ml)は2×10^5rad(2×10^3Gy)以上の照射によって完全に殺菌された。なお、照射線量が少ない場合には、1×10^4rad照射で生菌数が約1/10に、3×10^4rad照射で生菌数が約1/1000に、1×10^5rad照射で生菌数が<1/10^6に減少した。この様な^<60>Co照射による腸管出血性大腸菌の殺菌は、巨大分子である染色体DNAの破壊によるものであった。^<60>Co照射による経口型腸管出血性大腸菌ワクチンの開発:ヒトの腸管粘膜には分泌型IgAを主体とした、血中の免疫系とは異なった強力な免疫機構が備わっている。経口的に投与された抗原は、まず、小腸粘膜に存在するパイエル板のM細胞(抗原摂取細胞)に取り込まれ、下方に位置する"ポケット"リンパ細胞等に伝達されて抗原提示がなされる。開発しようとするワクチンは、鞭毛を回転させて動きまわり、粘着因子を使ってM細胞に粘着する"機能をもった死菌体"(新世代の不活化ワクチン)で、上記の^<60>Co照射によって作製する。2×10^5rad以上の照射によって殺菌された腸管出血性大腸菌は、未処理菌の50%以上のレベルで、運動性を保持していた。さらに、^<60>Co照射死菌体("動き、くっつく死菌体")が、生菌とは違って、腸管の上皮細胞内に高率に取り込まれていく特性をもつことも分かった。効率よく抗原提示される可能性が高い。現在、実用化に向けて動物実験を計画中である。腸管出血性大腸菌(EHEC)は1982年に米国で見いだされたもので、毒素による深刻な微小血管障害(溶血性尿毒症症候群HUSなど)を惹起する食中毒の原因菌である。1996年にはわが国でも患者数9千名以上といった世界最大規模の流行を引き起こした。本研究では、大腸菌O157に対する新世代経口型不活化ワクチン(生菌の性質をもった死菌ワクチン)を^<60>Co照射によって開発すること、また、このような^<60>Co照射による殺菌成績を食材からの大腸菌O157の除去に応用することを目的として実験を行った。腸管出血性大腸菌の生菌数は、1X10^4 radの照射で約1/10に、3X10^4 radの照射で約1/1000に、1X10^5 radの照射で<1/10^6に減少し、3X10^5 radの照射では完全に生菌が検出されなくなる(<1/10^<11>)。高濃度のO157:H7の殺菌条件は3X10^5 rad照射である。また、^<60>Co照射によるO157:H7の殺菌メカニズムは、高分子量DNAの破壊であった。本研究で作成したO157:H7死菌体は、死んではいるが、自ら腸管内を動き回り、局所免疫を担当する腸管粘膜のPeyer板M細胞(抗原摂取細胞)に強く粘着することが確認された。新世代経口型不活化O157ワクチンの開発に向け、さらに研究を進めている。牛肉あるいはカイワレ大根にO157を付着させた場合にも、3X10^4 radあるいは1X10^5 radの照射で、生菌が検出されなくなった。したがって、食材からの除菌(あるいは顕著な生菌数の減少)のためには、1X10^5 radの照射が現実的であると考えられる。食材の^<60>Co照射はトン単位で、しかも短時間(<1時間)で処理することが可能である。

^<60>Co照射による経口型腸管出血性大腸菌ワクチンの開発:ヒトの腸管粘膜には分泌型IgAを主体とした、血中の免疫系とは異なった強力な免疫機構が備わっている。経口的に投与された抗原は、まず、小腸粘膜に存在するパイエル板のM細胞(抗原摂取細胞)に取り込まれ、下方に位置する"ポケット"リンパ細胞等に伝達されて抗原提示がなされる。開発しようとするワクチンは、鞭毛を回転させて動きまわり、粘着因子を使ってM細胞に粘着する"機能をもった死菌体"(新世代の不活化ワクチン)で、上記の^<60>Co照射によって作製する。2×10^5rad以上の照射によって殺菌された腸管出血性大腸菌は、未処理菌の50%以上のレベルで、運動性を保持していた。さらに、^<60>Co照射死菌体("動き、くっつく死菌体")が、生菌とは違って、腸管の上皮細胞内に高率に取り込まれていく特性をもつことも分かった。効率よく抗原提示される可能性が高い。現在、実用化に向けて動物実験を計画中である。
受精のメカニズムの解析と不妊症治療への応用に関する研究

(1).ヒト精子のHyperactivationについて受精における精子側の条件としてCapacitation,Acrosome reactionとともに重要といわれるHyperactivationがヒト精子にも存在することが、高速度顕微境撮影装置による観察で示唆された。このHyperactivationはAcrosom reactionの前に起こり、Hyperactivated spermatozoaの割合が少ない症例は受精(妊娠)しにくいことも確認された。(2).精子ー卵子融合とFibronectin(3).Acrosome reaction発現のメカニズムについてFITC labelledPSA染色法でヒト精子のAcrosome reactionを観察した。その結果ヒト精子のAcrosome reactionは主として透明帯で誘起されるが、顆粒膜細胞層では誘起されない。排卵時の頸管粘液は精子のCapacitationを促進している。(4)、哺乳動物精子核の前核形成能の検討物理的・化学的負荷を与えた後の精子核を卵細胞質内に顕微注入し、その後の雄性前核形成状態を観察した。哺乳動物の精子核は、形態学的に成熟することにより、高温・pHの変化・高浸透圧に対して強い安定性を有していることが明らかにされた。(1)精子の運動性維持は精子の受精能に不可欠な要素である。いわゆるhyperactivationがヒト精子に存在するか否かを高速度顕微鏡撮影装置を用いて調べ、妊孕性との関係についても検討した。ヒト精子の運動形態は4種類に大別される。タイプAは活発な動きを示すものの運動性・方向とも極めて不規則なもの。タイプBは直進するが尾部末端の大きな振幅の割にはスピードがないもの。タイプCは振幅が小さくなりスピードも増すもの。タイプDは尾部全体がダイナミックな動きを示しスピードも速いタイプである。経時的に観察すると運動形態はA→B→C→Dと変化し、Dの出現は先体反応開始の23時間前である。また不妊症治療中の患者の精子について調べてみると、タイプDが30%以下の場合は体外受精が生じない、以上の成績からタイプDへの変化がヒト精子のhyperactivationであろうと推定している。(2)より安全で効率の良い受精卵凍結保存法を開発するため、耐凍剤と希釈剤の検討を行なった。耐凍剤としてジメチルスルフォキサイド(DMSO)、グリセロール、プロパンダイオール(PrOH)を、希釈剤としてシュークロースとトレハロースを用い、マウス2細胞期胚の凍結融解を行い、融解後胚の培養成績を比較した。現在までの成績ではPrOHとトレハロースを組み合わせた場合の胚発生が良好であり、今後の臨床応用が期待できそうである。(3)精子と卵子の接着は受精の第一歩として重要である。この現象にFibronectinが関与することが示唆されていたが、今回金コロイド標識による免疫電顕的手法を用いて精子におけるFibronectinの存在について検討した。その結果、従来報告されている卵子への精子接着部位すなわちpostacrosomalregionに一致してFibronectinの局在が認められた。(1)、囲卵腔内への精子注入による体外受精の予備実験を、ハムスタ-卵とヒト精子を使用して行なった。マイクロマニピュレ-タ-を用いてcapacitation完了ヒト精子をハムスタ-卵の囲卵腔に注入することにより、前核形成を認めることができた。この成績はヒト体外受精への本操作の応用可能な事を示していると思われる。(2)、精子の先体反応発現のメカニズムについて検討した。ヒト精子は、卵透明帯あるいは顆粒膜細胞群とともに培養したときの方が精子単独で培養した場合に比べはるかに先体反応が速やかに進行する。先体反応惹起において卵保護層の重要性が示唆されたものと考える。(3)、胚凍結用溶液として細胞膜透過性耐凍剤であるトレハロ-スを非透過性耐凍剤に添加することで胚の生存性が上昇することが判明した。しかしこれは透過性耐凍剤の濃度が重要で、至適濃度は0.075Mであった。(4)、精子のhyperactivationをおこす精子は頚管粘液通過能の関連を調べた。近い将来hyperactivationと頚管粘液内進行速度が速く、両者間には極めて高い相関が認められた。1).マイクロマニピュレ-タ-使用による体外受精法。ウザギ未受精卵の細胞質内にウサギ

精子核を顕微注入し,29.2%の卵が初期胚に発育した。尾部をともなわない精子の核だけでも発生能のあることが確認されたことになる。しかしこの成績は成熟精子全体を顕微注入したときの初期胚発生率40%に比べると低く,また卵管に移植したにもかかわらず未だ産仔が得られていないことからも,さらに詳細な検討が必要であろうと考えている。2).雄性前核形成能からみた精子の保存方法に関する検討。ハムスタ-の精巣上体尾部精子核を(1)4°C,(2)-40°C,(3)freezーdry(4)自然乾燥にて保存した。一定期間後,各々の精子核をハムスタ-卵子に顕微注入して雄性前核形成能を調べそれぞれの保存法の有益性を検討した。(1)は保存7週までは前核形成率が90%以上と良好であったが,その後は漸減して36週保存のものは0%であった。(2)は63週まで95%以上という良好な結果が得られた。(3)・(4)とも12週保存のものまで調査できたが,全て94%以上という成績であった。しかし,(4)は前核形成が遅延する傾向がみられた。保存の方法としては,(2)と(4)が優れていると思われるが,手技的にも維持量の面からも(4)は簡便で有益性が高く,精子の長期保存方法として今後の応用が期待できると考えている。
新しい炭素-硫黄結合の形成と開裂反応を触媒する酵素の機能解析とその応用

天然の多環含硫化合物という共通点をもち応用的にも基礎的にも重要な化合物であるビオチンとジベンゾチオフェン(DBT)における炭素-硫黄結合(C-S-C)の形成と開裂反応を触媒する酵素(ビオチン合成酵素,DBT脱硫酵素系)について酵素化学的・タンパク質化学的特性と反応機構の解明を中心とした研究を行い次のような結果を得た。(1)ビオチン合成酵素に関する研究(1-1)ビオチン合成酵素BioBを高発現するBacillus sphaericusのbioB組換え株の無細胞抽出液からBioBを高収率でかつ高純度で精製することができた。この精製酵素を用いてビオチンアナログであるチオフェン吉草酸(TVA)およびアシドマイシン(ACM)がそれぞれ20mMおよび10mMでビオチン合成酵素反応を完全に阻害することを見いだした。(1-2)ビオチン合成酵素反応に必須の反応促進因子を見いだした。すなわちB.sphaericus野生株の無細胞抽出液を硫安分画、カラムクロマトグラフィーにより熱失活し分子量10,000の限外ろ過膜を通過する低分子成分(LF)と熱失活する高分子成分(HF)に分画することが出来た。さらにLFとHF単独では促進活性を示さないが、両者を同時に添加することで促進活性を示すことを明らかにした。このHF中には複数の促進活性を示す蛋白質が含まれている可能性が高いことから今後このHFをさらに精製する必要があると考えられた。(2) DBT脱硫酵素系酵素蛋白質の精製と特性の解析(2-1) DBTオキシゲナーゼ(DszC)及びDBT-sulfoneオキシゲナーゼ(DszA)をDBT脱硫菌Rhodococcus erythropolis D-1株より精製すると共にこれらオキシゲナーゼ反応にはreductaseが関与することを明らかにした。DszC,DszAについては結晶化することにも成功した。(2-2) DBT脱硫代謝系の最後の段階を触媒するスルフィナーゼ(DszB)をDBT脱硫菌Rhodococcus erythropolis KA2-5-1株より各種カラムクロマトグラフィーにより高度に精製することができた。本研究の研究実績は次のようにまとめられる。1.ビオチン合成酵素に関する研究ビオチン合成酵素BioBを高発現するBacillus sphaericusのbioB組換え株の無細胞抽出液から2種類のアフィニティクロマトグラフィーによってBioBを高収率でかつ高純度で精製することができた。この精製酵素を用いてビオチンアナログであるチオフェン吉草酸(TVA)およびアシドマイシン(ACM)のビオチン合成酵素反応に対する阻害効果を検討した結果、それぞれ20mMおよび10mMで酵素反応を完全に阻害することを見いだした。本菌のbioB遺伝子はもともとTVA、ACM耐性変異を付与された菌株から得られた遺伝子であるので変異のかかっていない遺伝子の組換え株の酵素に対する影響と比較する必要があると思われた。2.DBT脱硫酵素系酵素蛋白質の精製と特性の解析DBTオキシゲナーゼ(DszC)及びDBT-sulfoneオキシゲナーゼ(DszA)を精製すると共にこれらオキシゲナーゼ反応にはreductaseが関与することを明らかにした。天然の多環含硫化合物という共通点をもち

応用的にも基礎的にも重要な化合物であるビオチンとジベンゾチオフェンにおける炭素-硫黄結合(C-S-C)の形成と開裂反応を触媒する酵素(ビオチン合成酵素,DBT脱硫酵素系)について酵素化学的・タンパク質化学的特性と反応機構の解明を中心とした研究を行い今年度は次のような結果を得た。(1)脂肪酸代謝において重要であるのみならず,アミノ酸発酵の制御因子として,また遺伝子工学での高感度検出試薬として重要な役割を果たしているビオチン(ビタミンH)の生合成における最終段階の酵素ビオチン合成酵素(BioB)の反応に必須の反応促進因子をBacillussphaericusの野生株の無細胞抽出液から硫安分画、Q-Sepharose,Butyl-Toyopearl,Source30-Qカラムクロマトグラフィーを用いて精製を行った結果、熱失活せず分子量10,000の限外ろ過膜を通過する低分子画分(LF)と熱失活する(HF)に分画することができた。LFもHFもそれ自身では促進活性を示さなかったが、この両者を同時に添加することによってビオチン合成酵素活性は発現した。このHFには複数の促進活性を示すタンパク質が含まれていると考えられたので今後さらに精製を進めてそれらの組み合わせによってのみビオチン合成酵素活性を発現するタンパク質が見いだせるものと考えられた。(2)石油中に存在するジベンゾチオフェン(DBT)は石油の燃焼の際に亜硫酸ガスを生成し酸性雨の原因物質となることから地球環境問題のターゲット物質である。DBTを単一硫黄源として増殖できる細菌Rhodococcus erythropolis D-1の無細胞系からDBTオキシゲナーゼ(DszC)を精製すると共に結晶化の条件を検討して板状の結晶を得ることにも成功した。さらに)DBT脱硫代謝系の最後の段階を触媒するスルフィナーゼ(DszB)をDBT脱硫菌R.erythropolisKA2-5-1株より各種カラムクロマトグラフィーにより高度に精製することができた。
オピオイドペプチドの不活性化酵素に関する研究

モルモット回腸(GPI)ならびにマウス輸精管(MVD)などの摘出標本において、エンケファリン(Tyr-Gly-Gly-Phe-Metor-Leu)(MEorLE)は、アマスタチン感受性アミノペプチダーゼ(AsA),ホスホラミドン感受性エンドペプチダーゼ-24.11(PsE)ならびにカプトプリル感受性ペプチジルジペプチダーゼA(CsP)などの酵素により不活性化されること、ならびに、これら3種類の不活性化酵素は、いずれもオピオイド受容体の極めて近くに存在することなどを当該年度以前に見い出し報告した。当該年度では、1.GPIならびにMVDなどと同様に、摘出ラット輸精管標本(RVD)においても、MEはAsA,PsEならびにCsPなどにより不活性化されることを明らかにして報告した(Cui et al.,Japan,J.Phormacol,42:43-49,1986)。また、2.モルモットの線条体ならびに回腸などの粗膜標本において、MEはAsA,PsEならびにCsPなどのみで加水分解されることを明らかにして報告した(Hiranuma et al.,Japan.J.Pharmacol.,41:437-446,1986)。さらに、3.3種類のペプチダーゼ阻害剤を併用すると、ミューならびにデルタなどの受容体における効力の大きさの順位は、ME>LE>β-エンドルフィン(β-End)であることを明らかにした。これは、従来報告されていて、よく知られているペプチダーゼ阻害剤非存在下での効力の順位と異なるものである。なお、RVDにおいては、β-Endはエプシロン受容体に仂くとされているが、MEならびにLEなどは、どのタイプのオピオイド受容体に仂くか明らかにできなかった。RVDにおけるペプチダーゼ阻害剤存在下での効力の大きさの順位は、β-End>ME>LEであった。(Kuno et al.,Japan.J.Pharmacol.,41:273-281,1986)。
脳損傷後の上肢運動訓練がもたらす効果の統合的研究

脳損傷後の運動訓練が上肢の機能回復に及ぼす効果を,“行動解析",“陽電子断層画像診断(PET)を用いた脳活動イメージング",“神経可塑性にかかわる遺伝子の発現解析",といったレベル縦断的手法を用いて解明することを目的とする。第一次運動野指領域の損傷後に積極的な運動訓練を行ったマカクザル個体群と運動訓練を行わなかった個体群の間で回復過程を比較した。全ての個体で損傷直後に指運動の完全麻痺が生じ,その後運動機能が徐々に回復した。損傷後2-3週間で両群ともに指の動きが多く見られるようになり,把握運動課題の成功率は,損傷前の4-8割程度にまで回復した。ただ損傷前は拇指と示指の対向による指先での把握(精密把握)が見られたのに対して,この時期には拇指と示指の対向が見られず,拇指の背側面で把持する代償的な把握が多く見られた。その後の1ケ月間に訓練群では代償的な把握の割合が減少し,精密把握の割合が増加するのに対し,非訓練群では代償的な把握の割合が高いまま推移し,精密把握がほとんど見られなかった。以上のことから,特に第一次運動野損傷後の精密把握の回復には,損傷後の訓練が必要であると考えられる。陽電子断層画像診断(PET)を用いて,上肢把握運動課題遂行中の脳活動イメージングを行ったところ,損傷前は第一次運動野に高い活動が見られたのに対し,運動機能回復後は運動前野腹側部に高い活動が見られた。さらに神経可塑性にかかわる遺伝子の発現解析を行い,神経成長関連タンパクの一つであるGAP-43の遺伝子発現が損傷後に運動前野腹側部で上昇することを明らかにした。これらの結果から,運動前野腹側部において,第一次運動野の機能を代償する可塑的な変化が生じた可能性が強く示唆される。脳に損傷を受けると、失われた脳領域の機能の障害を受けるが、リハビリテーション訓練を行うことにより、失われた機能が代償されることがある。しかし現在においては、リハビリテーション訓練が脳内の神経回路にどのような効果をもたらし、機能代償を促進するのかは明らかになっていない。脳損傷後の訓練が脳内神経回路に及ぼす効果を明らかにすることは基礎研究として興味深いのみならず、臨床にも有益な情報をもたらすものであると考えられる。本年度はニホンザルをモデル動物として用い、第一次運動野損傷後の運動機能回復を行動学的に解析した。皮質内微小刺激法により第一次運動野の機能地図をマッピングした後、指運動の支配領域にイボテン酸による脳損傷を作成した。イボテン酸の注入直後から指運動の完全麻痺が生じたが、その後運動機能は徐々に回復した。第一次運動野損傷後に積極的な運動訓練を行った個体群(n=3)と運動訓練を行わなかった個体群(n=3)ともに、第一次運動野指領域の損傷直後は指運動の完全麻痺が生じたが、その後運動機能は徐々に回復した。損傷後2-3週間で両群ともに指の動きが多く見られるようになったが、拇指と示指の独立した動きは不充分であった。この時期に円筒状の孔から小球状の物体を把握する課題を行わせたところ、両群ともに損傷前よりも課題成績(成功した把握の割合)は劣るものの、把握は可能であった。ただ損傷前は拇指と示指の対向による指先での把握(精密把握)が見られたのに対して、この時期には示指の屈曲にともなって拇指の屈曲が生じるため、拇指と示指の対向が見られず、拇指の背側面で把持する代償的な把握が多く見られた。その後1ヶ月の間に訓練群では代償的な把握の割合が減少し、精密把握の割合が増加するのに対し、非訓練群では代償的な把握の割合が高いまま推移し、損傷後6カ月の時点においても精密把握がほとんど見られなかった。以上のことから、第一次運動野損傷後の運動機能回復過程には訓練を必要とする要素と訓練を必要としない要素の両方があり、特に精密把握の回復に関しては損傷後の訓練が必要であると考えられる。現在、損傷後の機能回復の基盤となる神経回路の変化を明らかにするために、回復途中または回復直後の脳組織を採取し(現在11頭分のサンプルを採取)、神経回路変化に関わる分子の発現を解析中である。

以上のことから,特に第一次運動野損傷後の精密把握の回復には,損傷後の訓練が必要であると考えられる。陽電子断層画像診断(PET)を用いて,上肢把握運動課題遂行中の脳活動イメージングを行ったところ,損傷前は第一次運動野に高い活動が見られたのに対し,運動機能回復後は運動前野腹側部に高い活動が見られた。さらに神経可塑性にかかわる遺伝子の発現解析を行い,神経成長関連タンパクの一つであるGAP-43の遺伝子発現が損傷後に運動前野腹側部で上昇することを明らかにした。これらの結果から,運動前野腹側部において,第一次運動野の機能を代償する可塑的な変化が生じた可能性が強く示唆される。
エレクトロスプレー－レーザー誘起蛍光法による孤立状態イオンのダイナミクス観測

孤立分子イオン種のレーザー誘起発光スペクトルを観測することを目指して、エレクトロスプレーイオントラップーレーザー励起発光観測ー飛行時間型質量分析装置を開発し、以下の成果を上げた。(1)人工光合成系で重要な錯イオンRu(bpy)32+を孤立分子状態でレーザー光解離アクションスペクトルを初めて測定した。溶液中で観測されるMLCT吸収帯に対応する450nm付近の2光子で配位子の脱離が主に起こっていることが明らかになった。(2)ローダミン590色素イオンをイオントラップに保持し、レーザー誘起蛍光スペクトルの観測に成功した。これにより、発光を介したさまざまなイオンの観測が可能になると期待される。生体高分子などの質量分析に広く用いられているエレクトロスプレーイオン化法と、レーザー誘起蛍光法を結びつけ、錯イオンや生体高分子イオンなどの化学種を発光観測する手法として確立することを目指して研究を始めた。本年度、実現を目指した課題は以下の3点である。(1)既存のエレクトロスプレー-イオントラップ-質量分析装置を改良し、イオントラップへ保持できるイオン濃度を上げ、低温に冷却できるようにする。(2)高い蛍光の捕集効率を持つ、集光系を設計し、トラップした低温のイオンをレーザー蛍光観測可能にする。(3)改良した装置を用いて、孤立分子状態にある錯イオンの光解離による減衰を観測し、励起状態ダイナミクスを解明する。この計画に基づき、(1)ESI-IT-LIF装置に対して、つぎの改良を行い、調整を行った。(1)イオントラップに保持できるイオンを増やすために、イオンファネルを導入た。(2)イオントラップと冷凍機(設備備品費で購入)を結び、10K程度に冷却できるようにした。(2)改良した装置を用いて、イオン強度の評価を行い、レーザー照射による光解離一イオンの減衰を測定した。その結果、イオンファネルは現状ではほとんど効果がなく、むしろESIで生成したイオンが失われてしまうことが明らかになった。また、金属錯イオンとして、Ru(bpy)_3^<2+>をイオントラップし、光解離による減衰をモニターして、「吸収スペクトル」の測定を実現した。低温冷却条件でも測定したところ、スペクトルに大きな変化は見られず、冷却効率など検討の必要性が明らかになった。生体高分子などの質量分析に広く用いられているエレクトロスプレーイオン化法と、レーザー誘起蛍光法を結びつけて、これまで孤立分子状態で発光観測が行われてこなかった錯イオンや生体高分子イオンなどの化学種を、発光観測する手法として確立することを目指して研究を進めた。昨年度、既存のエレクトロスプレーイオントラップー飛行時間型質量分析装置を改良し、保持できるイオン密度を上げ、イオントラップを極低温に冷やすことによって単一量子状態密度を上げることを目指した。光解離過程をモニターすることで、吸収スペクトルを観測することには成功したが、発光を観測することはできなかった。そこで、本年度の課題は、イオントラップに更に高密度のイオンを保持することにあった。そのために、(1)昨年うまく動作しなかった、イオンファネルを改良し、イオントラップへ導くことのできるイオン量を増やす、(2)エレクトロスプレーイオン化以外の、高密度にイオンを生成できる方法を導入する、ことを計画した。イオンファネルはRFパワーを上げるなどの改良により、これまでより数倍高い濃度のイオンをイオントラップへ導くことができるようになった。Ru(bpy)32+の発光の観測を試みたが、トラップ中のイオンの有無によらずかなり寿命の長い発光が観測された。これは、イオントラップの内壁の汚れなどを観測している可能性もあり、光学系の調整と頻繁な洗浄が必要であることが明らかになった。年度末に、真空ポンプが故障したためにイオントラップへ保持できる濃度の測定、レーザー励起発光の測定は実現していないが、新年度に入り次第、成果を検証することができると期待している。一方、短波長レーザーを購入して、エレクトロスプレー以外のイオン源を導入する計画は、新年度に持ち越しとなっている。生体高分子などの質量分析に広く用いられているエレクトロスプレーイオン化法と、レーザー誘起蛍光法を結びつけて、これまで孤立分子状態では発光観測が行われてこなかった錯イオンや生体高分子イオンなどの化学種を、発光観測する手段として確立することを目指して研究を進めた。本年度、エレクトロスプレー-イオントラップ-飛行時間型質量分析装置に次のような改良を行った。(1)イオンファネルを調整し、イオントラップに保持できるイオン量を数倍に上げることができた。(2)8極子イオンガイド、RFトラップなどを調整することによって、チトクロームcなど質量数が1000を超えるタンパク質をトラップに保持し、質量スペクトルを観測できるようになった。(3)8極子イオンガイドの中間にセルを取り付けた。これは、エレクトロスプレー後、キャピラリー-イオンファネル内で溶媒分子を取り去った裸のイオンを生成し、任意の溶媒分子を新たに付着できることを狙ったものである。このような改良により、より高濃度のイオンをイオントラップに保持し、発光の観測を試みた。発光の観測対象は、これまでRu(bpy)32+イオンの観測を試みてきたが、発光の量子収率などの観点から、より強い発光の期待できるローダミン色素を試みた。532nm光照射による発光観測を試みたが、まだ検出には成功していない。Ru(bpy)32+イオンについては、溶液中の第1吸収帯である500nm付近のレーザー照射による、光解離反応の観測に成功した。主生成物は配位子が1つ脱離したもので、生成物および解離による減衰をモニターした励起スペクトルの観測が実現した。

生体高分子などの質量分析に広く用いられているエレクトロスプレーイオン化法と、レーザー誘起蛍光法を結びつけて、これまで孤立分子状態では発光による観測が行われてこなかった錯イオンや生体高分子などの化学種を、発光観測することを目指して研究を進めてきた。昨年度までに真空中にトラップできるイオン濃度をできるだけ上げるために改良を行い、飛行時間質量スペクトルを観測することは容易にできるようになったが、目的とする錯イオンRu(bpy)32+からの発光を観測することはできなかった。本年度は、より発光の量子収率の高い色素分子(ローダミン590)を用いて観測を試み、孤立分子状態にある色素分子イオンの蛍光の観測に成功した。イオントラップへの保持時間を長くし、1秒程度にすると、蛍光強度は強くなり、光子計数法によらなくてもLIFスペクトルを観測することができた。観測したスペクトルは、溶液中のものと比べ50nm以上短波長へシフトしており、大きな溶媒効果があることが示された。同様のイオン濃度条件でRu(bpy)32+イオンについて観測を試みたが、「蛍光」は観測されなかった。また、孤立分子状態にあるローダミン590色素分子イオンの蛍光スペクトルの観測を試みたが、感度が不十分でまだ成功していない。孤立分子イオン種のレーザー誘起発光スペクトルを観測することを目指して、エレクトロスプレーイオントラップーレーザー励起発光観測ー飛行時間型質量分析装置を開発し、以下の成果を上げた。(1)人工光合成系で重要な錯イオンRu(bpy)32+を孤立分子状態でレーザー光解離アクションスペクトルを初めて測定した。溶液中で観測されるMLCT吸収帯に対応する450nm付近の2光子で配位子の脱離が主に起こっていることが明らかになった。(2)ローダミン590色素イオンをイオントラップに保持し、レーザー誘起蛍光スペクトルの観測に成功した。これにより、発光を介したさまざまなイオンの観測が可能になると期待される。エレクトロスプレーイオン源で生成し、イオントラップに保持した孤立分子状態にあるイオンの蛍光観測を、今年度実現する予定であったが、まだ実現していない。その理由としては、イオントラップに保持できるイオン量が十分ではない、低いイオン量から放出される発光を検出する十分な感度がないことであると考えている。発光観測は、レンズ-光学ファイバー-光電子増倍管によっているが、この集光系は効率が十分高くない可能性がある。より、効率の良い集光系を構築することが必要である。27年度が最終年度であるため、記入しない。物理化学「達成度」で述べたように、効率の良い集光系を構築することが必要だと考えている。イオントラップ内でレーザーイオン化で生成したイオンについては、レーザー誘起蛍光の観測に成功している。これは、空間電荷極限以下のイオン濃度でも発光が観測できることを示している。
多変量解析におけるPermutation testの研究

外国での文献収集や情報交換等を行いPermutation testに関する研究を行った。昨年度に引き続き、主成分分析、正準相関に関するPermutation testに関する研究を続け、さらに級内相関係数の同等性に対するPermutation test等新しい方法論の研究にも取り組み、新しい検定方法などを提案した。検定法の有効性を国際統計学会(I.S.I.)において下記のタイトルで発表した。また日本国内では、日本統計学会をはじめとしてシンポジウム等で以下のような研究成果の発表を行った。「多変量解析におけるパーミュテーションテストについて」他日本国内だけでなく、外国での文献収集と情報交換も含めてPermutation Testに関する研究業績を整理統合し、Permutation Testの基礎的な研究を行った。新しい展開として、主成分分析の固有値、固有ベクトルに関するPermutation Testを研究し、新しい検定方法を提案した。その検定法の有効性を国際統計学会において下記のタイトルで発表した。"各固有根の同等性に関する検定法について"現在は正準相関分析等の多変量統計解析法に対するPermutation Testを研究中である。「多変量解析におけるパーミュテーションテストについて」他
根圏微生物の宿主との共生制御剤の創製とその利用による無機元素循環の効率化

植物と共生し栄養吸収効率を高めるアーバスキュラー菌根菌(AM菌)は、植物ホルモンであるストリゴラクトン(SL)により菌糸分岐さらには宿主植物との共生が促進される。本研究は我々がこれまでに合成してきた種々のSL類縁体でありデブラノン化合物をこのAM菌による共生促進に利用することを目的にしている。しかしこれらのデブラノン化合物はいずれも弱い菌糸分岐誘導能しか示さなかった。そこで我々は、新たに多様な構造を持つSL類縁体を合成し、それらの植物ホルモン活性、寄生植物の種子発芽誘導活性を評価し分類した。さらにSL受容体阻害剤も創製し、AM菌のSL受容機構解明のツールを整えた。アーバスキュラー菌根菌(AM菌)は、植物と共生し、植物の栄養吸収を高める。植物ホルモンであるストリゴラクトンは、植物の生育環境に応じて生合成が制御され、AM菌の菌糸分岐を促進し、生長・共生を促進することが知られている。研究代表者らの研究室ではこれまでに多数のストリゴラクトンミミックを合成し、その生理活性を解析してきた。これらの化合物のAM菌菌糸分岐誘導活性を調べ、枝分かれ抑制や根寄生雑草発芽促進活性と比較することにより、選択的で高活性なAM菌共生制御剤を創製することを目的としている。本年度は、デブラノン類のAM菌菌糸分岐誘導活性を調べた。デブラノン類はベンゼン環がフラノン環とエーテル結合で結ばれた簡素な構造をしており、三環構造がエノールエーテル結合でフラノン環と結ばれた天然ストリゴラクトンと異なり、合成が比較的容易なストリゴラクトンミミックであり、研究代表者らの研究室では種々の類縁体を合成してきた。供試したデブラノン類はいずれも天然型のストリゴラクトンと類似した構造を持つ合成ストリゴラクトンGR24と比較してAM菌菌糸分岐誘導活性が低かった。この結果は植物とAM菌とでは異なるストリゴラクトン受容機構を持つことを示唆している。来年度はデブラノン類以外のストリゴラクトンミミックや、化合物ライブラリーの中から活性化合物を探索する。また、実際に植物との共生条件で化合物が共生促進活性を持つかどうかの評価系を検討した。その目的で、AM菌共生時に発現が誘導される遺伝子にGFP遺伝子を融合させ、AM菌共生細胞を可視化できるイネを入手した。現在栽培条件・化合物処理条件とAM菌共生との関係を調査している。来年度はここで得られた共培養条件をもとに、化合物の共生促進活性評価を行う予定である。昨年度はすでに合成済みであったデブラノン類に関してAM菌分岐誘導活性を調べたが、活性を持つデブラノン類は得られなかった。本年度は新たなストリゴラクトンミミックの創製を行うことにした。ストリゴラクトン生合成中間体であり、そのもの自体がストリゴラクトン活性を有することが知られているカーラクトン構造を基にした新規のストリゴラクトンミミックを15種類合成し、それらのD14タンパク質との相互作用、D14による被分解性、イネの分げつ抑制活性、根寄生植物ストライガの種子発芽誘導性などを調べ、根寄生植物特異的なもの、分げつ抑制特異的なもの、いずれの活性も有するものを得ることができた。現在、これらのAM菌菌糸分岐誘導活性を調べているところである。また、上記の目的の達成のため、ストリゴラクトンシグナル阻害剤の利用も有効であると考えられる。根寄生植物特異的なストリゴラクトンシグナル阻害剤とストリゴラクトンミミックとの共投与は、AM菌共生を高め、根寄生植物の感染を予防できることが期待できる。今年度、D14の触媒活性阻害、D14とリガンドの結晶情報によるin silico解析、D14と標的タンパク質の相互作用阻害を指標にしたケミカルライブラリーからのスクリーニングにより新規ストリゴラクトンシグナル阻害剤を複数取得した。新たなストリゴラクトンミミックを合成し、その活性特性を詳細に解析することができた。また、ストリゴラクトンシグナル伝達阻害剤の利用も目的達成のために有効と考え、阻害剤の開発も行い、いくつかの有用な化合物を得ることができた。デブラノン類は我々の研究室で開発したベンゼン環がフラノン環(D環)とエーテル結合で結ばれた簡素な構造をしたストリゴラクトン(SL)ミミックであり、我々は本課題において種々の類縁体を合成し、AM菌菌糸分岐誘導活性を調べた。しかしながら、供試したデブラノン類はいずれも天然型のSLと類似した構造を持つ合成SL、GR24と比較してAM菌菌糸分岐誘導活性が低かった。この結果は植物とAM菌とでは異なるSL受容機構を持つことを示唆している。そこで、新たなSLミミックを設計することにした。

D環と様々なカルボン酸誘導体をエステル結合させたエステル型化合物、およびD環とフタルイミドの窒素原子を結合させたフタル酸型化合物、さらにSL生合成中間体カーラクトンの構造をもとにした化合物を新規に合成し、これらの化合物のSL活性を評価した。また、植物における生理活性はイネの分げつ伸長抑制活性によって検討した。さらに、根寄生植物ストライガの種子発芽を誘導する活性についても調べた。さらに、D14およびストライガのSL受容体ShKAI2による被分解活性についてもLC-MSや蛍光SLプローブであるYoshimulactone Gを用いて評価した。この結果、今回合成したSLミミックの中にはD14とShKAI2両方に共通して認識されるものと、ShKAI2に特異的に認識されるものが存在していたことが判明した。現在これらの化合物のAM菌菌糸分岐誘導活性を調べている。さらに我々は、D14の加水分解活性中心に特異的に共有結合し、SL受容を強力に阻害する化合物を創製し、特許出願を行った。さらに、この化合物の構造をもとに、根寄生植物ストライガのSL受容体に特異的な阻害剤のスクリーニングを行っている。このような化合物と汎用的、あるいは選択的SLミミックの組み合わせで、新たな根圏共生系の制御法を開発できるのではないかと考えている。植物と共生し栄養吸収効率を高めるアーバスキュラー菌根菌(AM菌)は、植物ホルモンであるストリゴラクトン(SL)により菌糸分岐さらには宿主植物との共生が促進される。本研究は我々がこれまでに合成してきた種々のSL類縁体でありデブラノン化合物をこのAM菌による共生促進に利用することを目的にしている。しかしこれらのデブラノン化合物はいずれも弱い菌糸分岐誘導能しか示さなかった。そこで我々は、新たに多様な構造を持つSL類縁体を合成し、それらの植物ホルモン活性、寄生植物の種子発芽誘導活性を評価し分類した。さらにSL受容体阻害剤も創製し、AM菌のSL受容機構解明のツールを整えた。これまでに我々は様々な官能基で修飾したデブラノン類の生理活性とその特異性について解析を行ってきたが、本年度はデブラノン類のAM菌菌糸分岐誘導活性を調べ、いずれのデブラノン類も既知の合成ストリゴラクトンGR24よりもAM菌菌糸分岐誘導活性が低いことを見出した。この結果は植物とAM菌のストリゴラクトン認識様式の違いを示唆していると考えている。この知見は本研究の今後の展開において非常に重要な基礎的知見になると考えている。また、本年度はイネとAM菌の共培養系も整備することができた。まだ改善の余地はあるが、今後の化合物評価系として有用だと考えている。本年度合成したストリゴラクトンミミックについてAM菌菌糸分岐誘導活性を調べる。またイネーAM菌共生系による評価も行う。さらに阻害剤を利用した評価も行う。農芸化学研究代表者らの研究室で開発された、デブラノン類以外のストリゴラクトンミミックについてAM菌菌糸分岐誘導活性を調べる。また、化合物ライブラリーを用いたスクリーニングも着手する。イネーAM菌共生系はまだ最適化されていないため、最適化を進め、化合物の評価を行う。また、根粒菌の共生への効果についても、ミヤコグサー根粒菌系を用いて検討を行う。AM菌の培養に必要なCO2インキュベーターを新規に購入予定であったが、中古の既存のCO2インキュベーターを利用可能になったため、購入の必要がなくなった新たに構築したイネーAM菌共生系によるスクリーニングにかかわるAM菌胞子、培土、消耗品等の費用に使用する。
臨床・教育場面におけるトラブル事例の実践分析～帰属バイアスの相互解消に向けて

本研究は精神障害や発達障害の当事者たちが直面するコミュニケーショントラブルの原因を周囲の人々との「あいだ」にある関係性の問題として捉え直すことで新しいコミュニケーションケア方策の提案に繋げることを目指した。研究の結果、そうしたディスコミュニケーション状況は、両者の認知機制や感覚の差異と深く関わっているが、そうしたimpairmentとしての障害に対する不十分な理解が、医療制度や教育制度とその中で構築された物理的環境等と相まって、本人のdisability状況を作り出すとともに、社会的なhandicapとしてのディスコミュニケーション状況を強化・固定化している可能性が強く示唆された。本研究の目的は、(1)統合失調症および高次脳機能障害者への医療・福祉場面、(2)四年生大学内での教育場面、という2つの異なる領域におけるコミュニケーショントラブル事例を並行的に捉え、医療福祉従事者と障害当事者間、および大学教職員と大学生間に生じるディスコミュニケーションへの新しいケア方策を探ることである。本年度は、まず代表者岡本が中心となって、(a)コミュニケーショントラブルを生じさせる認知的基盤について参与者間の立場性、話題の転換、聞き手行動に焦点を当てた認知語用論研究を実施した。さらに、(b)発達障害の当事者研究を実践する研究者達、及び所属する大学の特別ニーズ学生支援室の専門スタッフと意見交換を行い、コミュニケーションの当事者研究の可能性を検討した。一方、分担者山川は、(c)大人の発達障害の事例検討と、(d)講演による基礎的知識の整理を行った。(c)については、「茨城ケアコンソーシアム」を四回開催し、成人の発達障害の事例検討を行うとともに、実際にアスペルガー症候群の就労支援例を報告し、(d)については元・大学保健管理センターの医師(現県立精神科病院副院長)を招聘して成人の発達障害の講演会を開催した。さらに連携研究者松嶋は(e)文化人類学的見地から「出会い」に焦点を当て自閉症者の生きるリアリティの解明を図り、研究協力者小谷は(f)高次脳機能障害者が多く入居するケアホームについて、高次脳機能障害者が地域で暮らすために必要なサービスを調査し、介護施設に勤務経験があり、現在ケアホームに勤務する3名に半構造化インタビューを行い、データを質的に分析した。そして研究協力者松岡は、(g)大田区の高次脳機能障害者への地域支援活動を継続し、週2度の認知的支援(PCによる文書作成の指導など)を行うほか、大田区家族会の月例会合および高次脳機能障害支援者ネットワークの運営協力を行った。本年度の活動として、代表者岡本は当事者の「語り」を聞く立場としての援助者の「聞き手行動」に焦点を当て〈リスナーシップ〉の認知語用論研究を行った。具体的には、聞き手側の振る舞いが会話の場に対してどのような効果をもたらしているかを知るために、まちづくりワークショップにおけるファシリテーターの聞き手行動、一斉授業における生徒の挙手行動、腹話術師の聞き手演技、といった多様なコミュニケーション場面の事例分析を行い、当事者とのディスコミュニケーション解消へのヒントとなる知見を得た。一方、分担者山川は、引き続き多職種による精神障害の事例検討会「茨城ケアコンソーシアム」を茨城県立医療大学付属病院デイケアにおいて5月、10月、11月、2月の4回開催し、自閉症スペクトラムやADHDなど大人の発達障害の事例について、家族を含めた今後の支援の方向性について検討した。また、発達障害の支援についての啓蒙活動として、臨床・教育場面で発達障害に関わる相談支援事業所職員、小中学校教員、障害者歯科センター職員などを対象に講演を行い、現場でのトラブル事例を集約した。その結果、医療と就労、医療と教育など連携先との意思疎通不足がトラブルを生じさせていることが推察された。そして連携研究者松嶋は、イタリアでの地域精神保健サービスの活動および、近年日本でも急速に普及しつつある当事者を中心としたケアについて調査・研究をすすめ、特にコミュニケーションに関わるサポートのあり方の特徴と差異について検討した。さらに研究協力者松岡は、地域臨床の観点から、自身が代表をつとめる蒲田寺子屋を拠点として高次脳機能障がい者に対するリハビリテーション活動ならびに家族会活動の支援などを行い、それらの臨床的活動および学術的な知見などから得られた考察をシンポジウムや講演にて発表した。当初の年度計画で予定されていたトラブル事例データの収集がまだあまり進んでいないが、前年度の各人の研究成果とプロジェクト会合での討議により、量的なデータ収集よりも質的な理論構築に方針転換を行ったため、上記の評価とした。具体的には、代表者岡本の本年度の認知語用論分析は、いわゆる医療・福祉場面とは異なる、一見すると本研究課題とは関連のない様々な制度的なコミュニケーション場面で実施されているが、その結果得られた〈リスナーシップ〉としての聞き手行動の知見は、自閉症スペクトラム症やADHDなどのコミュニケーション障害を抱える者達とのディスコミュニケーションの基盤を浮き彫りにする可能性を有しており、こうした領域横断型のコミュニケーション研究は申請時からの狙いの一つであった。また、分担者山川と研究協力者松岡が精神科病院やリハビリ施設での事例研究を継続的に進めており、理論と実践の相互往復によるディスコミュニケーション研究は他に類を見ないものであると考える。本年度の活動として、代表者岡本は発達障害当事者と周囲の定型発達者との会話場面における「メタ・コミュニケーション」に焦点を当て、当該概念の認知語用論的再検討を行った。特に、メタ・コミュニケーションが動的な「フレーミング」による「境界づけ」と「方向づけ」の二つの機能によってコミュニケーションの場を多層化し、参与者たちの認知と相互行為のインタフェースとなっていることを明らかにした。この成果は査読付き論文誌に掲載された。