hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
自然生態系におけるトキシンの動態およびトキシン産生の制御

第一班は自然生態系におけるトキシンの動態及びトキシン産生の制御をテーマとして研究を実施するもので、特にその中心となるのは自然生態系のなかで比較的研究の進んでいる腸内生態系と海洋生態系をモデルとしてとり上げた。腸内生態系では腸内常在菌や外来細菌による蛋白トキシンの産生と動態を明らかにする目的で研究が進められているが、これについては細菌性エンテロトキシン産生とその制御における常在細菌叢の役割に関する研究(佐々木)、および種の動物旧来のクロストリヂウム、ディフィレリエの性状を比較検討し、腸内での常在菌によるトキシン産生の動態を観察した研究(光岡)があり、また直接腸内細菌および生態系との関連を問題にしてはいないが、大腸菌の産生する志賀毒素と抗原性の異なるVeroトキシンに関する研究(竹田)、毒素原性大腸菌の振原性プラスミドと血清型に関する遺伝生態学的研究(吉川)など極めて特色ある研究が進められた。またウエルシュ菌の毒素産生機構についての新しい知見(東)、ボツリヌス菌E型毒素に関する研究(阪口)、同じく毒素産生とクアーどの関連性を明らかにしようとする研究(飯田)、など興味ある研究が進めらた。一方海洋生態系においては、バイ(海つぼ)の毒化に関する研究(小管)、有毒フグとの混養による無毒フグの毒化(清水)、オウギガニ科カニ類の毒化に関する研究(橋本)、および下痢性貝毒の分布と毒組成に関する研究(安元)など多くの知見が集められた。また、土壌に分布するエメリセア層およびタラロマイセス層の有毒菌の分布等に関する研究など(山崎)、トキシン産生真菌の分布に関する研究は、生態学のみならず、医学的にも大きな意義をもつものと考えられる。
生体部分肝移植の適応拡大を目指した肝移植遺伝子治療の開発

平成11年度、われわれはヒトIL-1Raをクローニングし、in vitroおよびin vivoにおける肝細胞への遺伝子導入と発現を確認し、平成12年度、この高濃度発現によってラット肝の虚血再灌流障害が劇的に抑制されることを確認したので、ここに詳細を報告する。【方法】1)ヒトIL-1Ra cDNAをクローニングし、これを発現する組換えアデノウイルスpAdexCAIL-1Raを作製した。2)Wistar系雄性ラットをエーテル麻酔下に開腹し、腸間膜静脈の穿刺によりin vivoでの遺伝子導入を行った。経時的に下大静脈血血清中のIL-1Ra値をELISAにより定量し、発現したIL-1Raの血中動態を検討した。3)ラット肝に遺伝子導入後24時間において、80%の肝部分温虚血再灌流を行い、再灌流後180分の時点で血清ALT、AST、IL-6、TNFα、および肝組織中のIL-6、TNFαを測定、また肝組織像を対照と比較することにより、肝障害の抑制効果を検討した。4)上記モデルにおいて、対照群との7日間生存率の比較検討を行った。【結果】pAdexCAIL-1Raによるラット肝へのin vivo遺伝子導入後、24時間における血清中のIL-1Ra値は1.27±0.56μg/mlまで上昇し、その後14日目まで指数関数的に減少した。遺伝子導入後24時間におけるラット肝虚血再灌流モデルでは、再灌流180分後の血清ALT、ASTが対照群で5247.3±3318.8IU/L、5863.2±3932.7IU/Lに対し、IL-1Ra遺伝子導入群では562.3±50.2IU/L、584.0±17.7IU/Lと、有意な障害抑制効果が認められた。肝組織中のIL-6、TNFαはIL-1Ra遺伝子導入群で有意に低下しており、肝組織像においても著明な障害抑制効果が認められた。7日間生存率もIL-1Ra遺伝子導入群で有意な改善を認めた。われわれは移植肝再灌流障害の予防と免疫寛容の確立を目的としたIL-1Ra遺伝子導入による肝移植遺伝子治療を計画し,さまざまなラット肝移植モデルでの検討を行い,予想外の結果も見出したのであわせて報告する.【方法】炎症・免疫反応に作用しうるinterleukin-1受容体拮抗物質(IL-1Ra)を導入遺伝子に選択した.hIL-1RacDNAをアデノウイルスベクターに挿入したAdexIL-1Raを作成し,肝再灌流障害モデル,肝拒絶モデル,肝再生モデルを用いてその効果を検討した.【結果】いずれのラットモデルでも,治療群ではAdexIL-1Ra(108PFU/ml)静注後24時間で血中IL-1Raは10μg/mlまで上昇し以後2週間過剰発現を示した.IL-1Raの過剰発現により肝再灌流後のTNF/IL-6の上昇は有意に抑制され,肝再灌流障害によるGOT/GPTの上昇も有意に抑制された.また,拒絶反応に関しては治療群で遅れて出現する傾向が認められた.しかし,肝切除後の肝再生に関しては治療群で有意に抑制されることが判明し,IL-1が肝再生促進作用を有する可能性とAdexIL-1Raの臨床応用に向けて新たな問題点が明らかになった.【結語】AdexIL-1Raによる肝移植

遺伝子治療は,効果は一過性であるが肝再灌流障害予防と早期拒絶反応抑制の目的で十分臨床応用を目指せることが示された.しかし,本研究でIL-1の肝再生促進作用が判明し,部分肝移植に関しては慎重な検討が望まれる.昨年までにわれわれはヒトIL-IRaをクローニングし、in vitroおよびin vivoにおける肝細胞への遺伝子導入と発現を確認したことを報告した.今年度、この高濃度発現によってラット肝の虚血再灌流障害が劇的に抑制されることを確認したので詳細を報告する。【方法】1)ヒトIL-IRa cDNAをクローニングし、これを発現する組換えアデノウイルスpAdexCAIL-IRaを作製した。2)Wistar系雄性ラットをエーテル麻酔下に開腹し、腸間膜静脈の穿刺によりin vivoでの遺伝子導入を行った。経時的に下大静脈血血清中のIL-IRa値をELISAにより定量し、発現したIL-IRaの血中動態を検討した。3)ラット肝に遺伝子導入後24時間において、80%の肝部分温虚血再灌流を行い、再灌流後180分の時点で血清ALT,AST,IL-6,TNFα、および肝組織中のIL-6,TNFαを測定、肝組織像を対照と比較することにより、肝障害の抑制効果を検討した。4)上記モデルにおいて、対照群との7日間生存率の比較検討を行った。【結果】pAdexCAIL-IRaによるラット肝へのin vivo遺伝子導入後、24時間における血清中のIL-IRa値は1.27±0.56オg/mlまで上昇し、その後14日目まで指数関数的に減少した。遺伝子導入後24時間におけるラット肝虚血再灌流モデルでは、再灌流180分後の血清ALT、ASTが対照群で5247.3±3318.8IU/L、5863.2±3932.7IU/Lに対し、IL-IRa遺伝子導入群では562.3±50.2IU/L、584.0±17.7IU/Lと、有意な障害抑制効果が認められた。肝組織中のIL-6,TNFαはIL-IRa遺伝子導入群で有意に低下しており、肝組織像においても著明な障害抑制効果が認められた。7日間生存率もIL-IRa遺伝子導入群で有意な改善を認めた。
口腔微生物叢の「揺りかご」:舌苔バイオフィルムの生物学

本年度は、昨年度に引き続き、口臭原因菌の一つと捉えられる口腔Veillonella属の硫化水素産生活性について検討し、(1)環境因子、とくに口腔内に多く存在する乳酸等の有機酸が硫化水素産生能に与える影響、及び、(2)硫化水素産生に関わる代謝酵素の検索を行った。培養したVeillonella atypica、V. dispar、V. parvulaの各標準株(ATCC株)の培養菌にシステインを加えて3時間インキュベートし、産生した硫化水素をメチレンブルー法で定量した。さらにこの反応系に乳酸等の各種有機酸を加え、硫化水素産生活性への影響を検討した。また、培養菌を超音波処理して無細胞抽出液を調整し、システインからの硫化水素産生に関わる酵素活性を検索した。Veillonellaのシステインからの硫化水素産生活性は、乳酸が存在すると著しく増加した。Veillonellaの無細胞抽出液は、システインから硫化水素を産生する酵素活性を示したが、無細胞抽出液に乳酸を添加しても活性の増加は認められなかった。以上のことから、Veillonellaは乳酸の存在下、システインから効率よく硫化水素を産生することが明らかになった。乳酸による促進作用は、酵素の活性化作用ではなく、システインの取込み促進であるものと予測された。口臭源の一つである硫化水素は口腔細菌によって産生されるが、その産生活性はpH(昨年度成果)や有機酸(今年度成果)という口腔環境によって影響を受けるものと考えられ、口腔環境のコントロールによって口臭を抑制し得るものと考えられる。今年度は、1.舌苔バイオフィルムを構成する微生物叢の網羅的解析、2.その中に含まれる主たる口臭産生菌のもつ口臭産生代謝の生化学的機構の解明を研究目的とした。1.舌苔バイオフィルム構成微生物叢の網羅的解析2.口臭産生菌の口臭産生代謝の生化学的機構口臭産生菌の代表としてVeillonella 3菌種(V.atypica、V.dispar、V.parvula.)を選択し、システインとグルタチオンからの硫化水素産生活性を検討した。その結果、増殖中及び菌懸濁液中のいずれにおいても、システインとグルタチオンから硫化水素が産生されることが確認された。また、これらの菌の硫化水素産生活性は中性pH付近で最も高いことが分かった。さらに、培養菌から調整した無細胞抽出液にシステインを加えると硫化水素とともにアンモニア等が産生されることから、cysteine desulfhydrase様酵素の存在が示された。以上のことからシステインあるいはグルタチオンに由来するシステインは菌体内においてワンステップで分解され、硫化水素を放出することが示唆された。本年度は、口腔内に多く存在するVeillonella属3菌種について、代謝基質と環境pHの影響を検討した。Veillonella属は舌苔中の主要な硫化水素産生菌であり、口臭への関与が考えられているが、その硫化水素産生機構については不明な点が多いのが現状である。V.atypiea、V.dispar、V.parvulaの各標準(ATCC)株を1.8%の乳酸ナトリウムを含むtrypton-yeast extract培地を用いて嫌気培養した後、菌懸濁液を作成した。そこへ、cysteine、methionine、glutathione、tryptone、フィルター滅菌唾液上清あるいはオートクレープ滅菌唾液沈渣を加え、37°C、pH7.0で3時間インキュベートし、産生した硫化水素をメチレンブルー法で定量した。また、反応pHを変えた際の硫化水素産生への影響も検討した。Veillonella属3菌種とも、cysteine、glutathione、唾液上清から、硫化水素を産生したが、methionineと唾液沈渣からは産生しなかった。また、各基質からの硫化水素産生量は、pHによって異なり、cysteineはpH6.0-7.0で、glutathioneはpH8.0で、tryptoneは、pH7.0で高かった。口腔Veillonellaは、唾液などを利用して口臭成分硫化水素を産生するが、硫化水素産生能は、菌種、基質、環境pHによって異なることが判明した。

口臭源の一つである硫化水素は口腔細菌によって産生されるが、その産生活性はpH(昨年度成果)や有機酸(今年度成果)という口腔環境によって影響を受けるものと考えられ、口腔環境のコントロールによって口臭を抑制し得るものと考えられる。
リポ蛋白受容体を介した視神経保護薬の開発研究

日本第一位の失明原因疾患である緑内障は視神経変性疾患であり、新たな治療薬の開発が望まれている。研究代表者は以前、アポリポ蛋白Eを含むリポ蛋白が培養網膜神経節細胞の栄養因子欠乏で誘導される変性に対し、強力な保護効果を発揮することを明らかにした。本研究では、リポ蛋白受容体を介したグルタミン酸毒性に対する神経保護機構の解明とともに、緑内障モデル動物に対する視神経保護効果を明らかにし、新規治療薬開発につながる成果を得た。我が国第1位の失明原因疾患である緑内障は、視神経を構成する網膜神経節細胞が変性・消失する進行性の視神経変性疾患である。現在、本疾患に対し臨床的に治療効果が確認されているのは眼圧下降のみであり、治療薬も限られているため、新たな作用機序を持つ治療薬の開発が望まれている。ヒト緑内障で誘導される視神経変性の要因の一つとしてグルタミン酸興奮神経毒性がある。研究代表者は以前、グリア細胞から放出されるアポリポ蛋白(アポ)Eを含むリポ蛋白が細胞内シグナル伝達系を介して、網膜神経節細胞の栄養因子欠乏性細胞死に対し、保護効果を発揮することを明らかにした。そこで本研究では、ラット新生児から網膜神経節細胞を初代培養し、グルタミン酸興奮神経毒性に対するアポE含有リポ蛋白の神経保護効果を検討し、緑内障治療への応用の可能性を探った。リポ蛋白による神経保護効果の局在の検討には、コンパートメント培養法を使用した。本研究の結果、アポE含有リポ蛋白がリポ蛋白受容体に結合しグルタミン酸受容体を介した細胞内へのカルシウム流入を抑制することで神経細胞を保護することが明らかとなった。コンパートメント培養法を用いた研究の成果から、この神経保護機構は軸索部分ではなく、細胞体近傍部で発揮されることも示された。また血液から単離したアポE含有リポ蛋白を緑内障モデルマウス(グルタミン酸ーアスパラギン酸トランスポーター欠損マウス)の硝子体内に投与することで、網膜神経節細胞を保護することができた。これらの結果から、アポE含有リポ蛋白の神経保護機構は緑内障治療に応用できる可能性が示された。緑内障は、視神経を構成する網膜神経節細胞の変性・消失を特徴の一つとした視神経変性疾患であり、我が国の第一位、世界では白内障に次いで第二位の失明原因疾患である。現時点で治療効果が証明されている唯一の治療法は、眼圧下降であるが、新たな作用機序の治療薬として神経保護薬の開発が期待されている。研究代表者は以前の研究で、グリア細胞由来のアポリポ蛋白(アポ)E含有リポ蛋白が、栄養因子欠乏による細胞死(アポトーシス)から網膜神経節細胞を強力に保護することを明らかにした。本研究ではヒト緑内障の発症原因の一つとして考えられているグルタミン酸興奮神経毒性に注目し、ラット初代培養網膜神経節細胞を使用して、グルタミン酸に対するアポE含有リポ蛋白の神経保護効果とその機構を解析した。その結果、アポE含有リポ蛋白が、グルタミン酸添加により誘導されるグルタミン酸受容体(NーメチルーDーアスパラギン酸受容体)を介した細胞内への過剰カルシウム流入を抑制すること、また細胞死を誘導する酵素(グリコーゲン合成酵素キナーゼ3ベータ)の活性を抑制することにより、神経細胞を保護することを明らかにした。さらに緑内障モデルマウス(グルタミン酸ーアスパラギン酸トランスポーター欠損マウス)を使用した実験では、人工的に再構成したアポE含有リポ蛋白の硝子体内投与により、網膜神経節細胞の消失を部分的に抑制することに成功した。これらの結果は、アポE含有リポ蛋白による神経保護機構が、緑内障で誘導される視神経変性に対し、治療効果を発揮できる可能性を示している。緑内障は日本の第一位、世界第二位の失明原因疾患であるが、臨床において眼圧を下げる以外の効果的な治療法はなく、新たな機序による治療薬・治療法の開発が期待されている。研究代表者は以前の研究で、アポリポ蛋白Eを含むリポ蛋白が培養網膜神経節細胞の変性に対し、強力な保護効果を発揮することを明らかにした。そこで本研究は、神経変性機序およびリポ蛋白受容体を介した神経保護機構の解明とリポ蛋白受容体シグナルの神経保護効果を応用した新規緑内障治療法の開発を目的とした。初代培養網膜神経節細胞を用いて、グルタミン酸神経毒性を誘導し、神経変性機序の解析およびリポ蛋白の神経保護効果を検討した。その結果、イオンチャネル共役型グルタミン酸受容体を介した細胞内カルシウム濃度の異常上昇に起因するアポトーシスによって神経変性が誘導されること、リポ蛋白が細胞体近傍部のリポ蛋白受容体を介してグルタミン酸受容体活性を抑制し、カルシウム流入を抑制することで神経細胞を保護することを明らかにした。

また緑内障モデル動物(グルタミン酸ーアスパラギン酸トランスポーター欠損マウス)を使用して、リポ蛋白の硝子体内投与による視神経保護効果を検討したところ、ヒトリコンビナントアポリポ蛋白Eを含有する人工的に再構成したリポ蛋白または血液から単離した高比重リポ蛋白の硝子体内注射により、網膜神経節細胞を保護することに成功した。加えてリポ蛋白の脂質組成を改良することで、点眼投与での視神経保護の可能性を試みたが、これまでのところ視神経保護効果は観察されていない。本研究で得られた実績により、グルタミン酸による視神経変性機序の一端を解明し、アポリポ蛋白E含有リポ蛋白のリポ蛋白受容体を介した神経保護機構を明らかにすることができた。緑内障モデル動物に対する視神経保護効果は、本保護機構の応用が新たな緑内障治療薬の開発に繋がる可能性を示している。神経科学研究の目的である「初代培養網膜神経節細胞におけるリポ蛋白受容体を介した神経保護機構の解明」について、本年度の研究により部分的であるが解明を進めることができた。コンパートメント培養法によって、神経保護機構の細胞内局在を明らかにすることもできた。またin vivoでの神経保護効果を人工再構成リポ蛋白だけでなく、血液由来リポ蛋白で確認した。これらから本研究は、おおむね順調に進展していると判断する。初代培養網膜神経節細胞を用いた、グルタミン酸興奮神経毒性に対するアポE含有リポ蛋白の神経保護効果と、その機構の一部を解明し、緑内障モデル動物での保護効果も確認できたことから、おおむね順調に進展していると考えられる。交付申請書の研究実施計画に記載した通り、これまでの研究結果をもとに緑内障治療の候補薬を選定し、緑内障モデル動物に対して保護効果を検討する。またアポE含有リポ蛋白の神経保護機構の詳細な解析を進める。神経保護機構の解析は、初代培養網膜神経節細胞および緑内障モデル動物を使用する。今後の研究は、交付申請書に記載した研究計画に沿って推進する予定である。研究費の使用は、交付申請書に記載した内容に沿って行う計画である。
Riプラスミドによる形質転換を利用した病害感受性・抵抗性遺伝子の解析に関する研究

メロンのプロトプラスト培養系とその再生体の誘導法を確立した,次に同プロトプラストに対してエレクトロポ-レ-ションを用いて外来遺伝子(βーgluwronidase遺伝子)の導入を行い,同法による遺伝子導入法に成功した。さらに,形質転換プロトプラストからカルス培養を経て,植物体再生法を確立し,同植物体が遺伝子転換体であることを確認した。次に,Agrobacterium rhizogenesによりメロンより毛状根を誘導し,さらに,毛状根を培養して,カルス〓由,元の植物体に再生させることに成功した。Agrobacterium rhizogenesの感染により外来遺伝子(GUSgene)を誘導される毛状根に形質転換させることが判明し,サザ-ンブロットハイブリダイゼ-ションによりベクタ-DNA組込みを確認するとともに,毛状根にNPT11及びGUS遺伝子が形質転換していることを確認した。同遺伝子発現がメロンの再分化過程のいずれの段階でも確認された。以上からメロンの毛状根誘導系から得られる遺伝子組換え体がメロンうどん粉病菌等に対する病害抵抗性組換え体の作出に将来非常に有効であるシステムが確立された。一方,トマトよりAgrobacteriun rhizoenesの感染により毛状根誘導を行い80%以上の確率でTーDNA組換え体毛状根を得ることが判明した。多数の毛状根のトマト莓凋病菌に対する病徴変換体を選抜したが,感染に対する変換体は得られなかった。確率の問題とはいえ,相当数の毛状根を調査することが必要と思われた。さらに,タバコ赤星病に対する変異体を選抜するため,毛状根誘導の他に,タバコの半数体花粉細胞集団より直接,毒素を用いて変異体を選抜することが可能である結果を得た。今後,選抜花粉を受粉に利用するか,半数体細胞の細胞融合による抵抗性2倍体の作出の可能性が示唆された。植物の毛状根病を誘導するAgrobacterium rhizogenesにはRiブラスミドがあり、プラスミド中のTーDNA断片が植物体に組み込まれることによって形質転換体を誘導する。この組込みによって、植物が本来保有する遺伝子の発現が損われるため、病害抵抗性や感受性遺伝子の変異体が出る可能性がある。この変異体を用いて遺伝子の解析が可能である。係る研究目標のため、トマト萎ちょう病および青枯病、タバコ赤星病における変異体作出を行、各々の植物から毛状根の誘導を試みた。トマト萎ちょう病菌レース13に特異的反応を示すトマト品種の毛状根誘導を行い、約50個の毛状根誘導に成功し、オパイン類の検出によって3個体が明確な変異体であることを確認、遺伝子転換体の誘導率は6%であった。現在、毛状根を用いた生物検定法を試みている。また、タバコは毒素感受性品種と非感受性品種のF_2種子を作成した。また、F_1植物より毛状根を誘導している。一方、植物の形質転換体の作出に用いるTiプラスミドベクターの改変を試みた。すなわち、ベクター遺伝子の植物体導入法と検出遺伝子の検索を試みた。導入法としては、トマト細胞核へのマイクロインジェクション法が有効で効率よく植物を形質転換できる。この結果については、Plant Cell Reports誌と日本植物組織培養学会誌に報告した。一方、検出用遺伝子としては、微生物からフザリン酸抵抗性遺伝子を分離し、それを用いたベクターを構築した。この結果の一部はすでにJ.Biotechnology誌に発表した。

今後は、このようなベクターを使用し、病害抵抗性変異体の作出と選抜を認みる予定である。また、毛状誘導による転換体の作出も可能であることを確認したので、今後継続して変異体の選抜を行う予定である。タバコ赤星病菌の分泌する宿主特異的毒素に対する感受性遺伝子解明のため、感受性品種と抵抗性品種の雑種F_1の葯由来の再生体、および花粉の毒素感受性について調べたところ、再生体の感受性は約1:1に分離して現われた。葯由来の再生体には半数体植物(n体)が含まれるので、半数体植物の感受性、抵抗性系統が得られることが判明した。現在染色体の確認を行っている。また、半数体植物よりRiプラスミドによる毛状根の誘導を試みている。トマト萎凋病抵抗性、感受性植物より毛状根を多数誘導し、形質転換の有無をオパイン類生成の有無を検定することにより判定した。また、Fusarium菌体壁由来の成分の毛状根に対する生物検定を行い、同菌レ-スに対する特異的反応の有無についてスクリ-ニングしている。一方、トマト青枯病に対する抵抗性変異体の選抜を培養カルスより行いフザリウリム菌による萎凋病抵抗性の植物の作出に成功した。また、同様の方法でタバコTMV抵抗性植物も得た。現在、これらの抵抗性を獲得した理由について検討を加えている。Riプラスミドを利用した変具体の誘導系は確立し、生物検定法も行えるようになったが、毒素感受性に対する変異体の選抜には至っていない。確率的にもかなり低いことは想像されるが、なお一層の継続をする必要がある。メロンのプロトプラスト培養系とその再生法確立を検討した。次にプロトプラストに対してエレクトロポ-レ-ション法を用いて外来遺伝子(βーglucuronidase遺伝子)の導入を試み,プロトプラストへの外来遺伝子導入法を確立した。また,同組換プロトプラストを0.1mg/l 2.40と0.5mg/lBAP含有1/2MS培地で培養し,カルス増殖に成功し,0.15mg/lIAAと1.0mg/lBAPで培養継代し,グリ-ンスポットを形成させることに成功した。ようにホルモンフリ-培地で継代培養したところ,シュ-トと根の再生に成功し,再生体は圃場で成体にまで生育させることに成功した。一方,Agrobacterium rhijogenesにより毛状根を誘導した後毛状根を培養してカルス細胞化した。次にそのカルスから再生体を形成させることに成功した。A.rhijogtnesの感染により外来遺伝子(Gus gene)を形質転換した毛状根を形成させることに成功した。サザ-ンブロットハイブリダイゼ-ションによりソベクタ-DNA組込みを確認した。さらに,毛状根がNPillA及びGUS遺伝子を形質転換していることを証明した。さらに,メロンのいずれの分化段階でも同遺伝子が発現していることを確認した。一方,トマトの毛状根をA.rhijogenesにより誘導し,多数の形質転換毛状根の培養系と確立した。つぎに同毛状根とフザリウム萎凋病菌を対峙培養し,インビトロ示での毛状根に対する感染過程を比較し,フザルウム菌に対する低抗性変異体の芝抜系を確立した。
多様な障害を併せ有する重度・重複障害児との関係性のあり方に関する実践的研究

重度・重複障害児3事例を対象として,彼らが表出した行動を確定し,その意味を見出すとともにその際のやりとりにおける関係性のあり方について検討した.その結果,(1)対象児から表出された微弱微細な状態変化を糸口として係わりを展開することが妥当であること,(2)視覚的に確認できないほど微弱な身体の動きが係わり手との共同的活動のなかで拡大すること,(3)重度肢体不自由事例との話題の共有化過程の様相,等が明らかになった.重度・重複障害児3事例を対象として,彼らが表出した行動を確定し,その意味を見出すとともにその際のやりとりにおける関係性のあり方について検討した.その結果,(1)対象児から表出された微弱微細な状態変化を糸口として係わりを展開することが妥当であること,(2)視覚的に確認できないほど微弱な身体の動きが係わり手との共同的活動のなかで拡大すること,(3)重度肢体不自由事例との話題の共有化過程の様相,等が明らかになった.本研究の目的は,第1に,多様な障害を併せ有する重度・重複障害児を対象として,彼らが表出した行動を確定し,その意味を見出すこと,第2に,彼らが表出した行動を糸口とした双方向性のやりとりに基づく関係性の形成の実現を図り,その特性を記述するとともにそこに関与している諸条件を明らかにすることであった.本年度は, 3事例(超重症児1事例,重度・重複障害1事例,肢体不自由を主とする重複障害1事例)への教育的対応を継続するとともに, 1事例(超重症児)の経過を分析,検討した,岡澤・川住(2008)の研究では,当初,身体の動きが全く見出されなかった超重症児への教育的対応の経過を整理した.結果では,本児に対して実行された係わりの内容と方針を整理した,結果に基づき,身体の動きが極めて微弱微細な超重症児への係わりの展開のあり方について以下のように考察した,係わりの内容は,本児が受信可能な感覚系と発現可能な運動系とを考慮し,本児に見出された状態変化を糸口として着想,実行され,展開することができたものであった,すなわち,周囲の状況変化や筆者らの係わりと本児の状態変化との関連性に絶えず注意を払い,本児の状態変化に関与していると思われる条件を見出し(あるいは仮定し),そこで見出された(仮定された)条件を組み込んだ係わりの内容を実行し,その際の本児の状態変化から係わりの妥当性を検討するという流れのなかで係わりは展開した.また,本児への係わりにおいては,特に,左手に見出された動きを係わりの方向性を定める大きな糸口の1つとしてきた.こうした状態変化に応じて,係わりの内容を実行,継続あるいは終了して他の係わりに切り替えた,超重症児への係わりは特に臨機応変に実行,調節される必要がある.また,現在,教育的対応を継続している重度・重複障害3事例の経過を整理,分析中であり,次年度以降,適宜,論文として発表する予定である.3年間の研究計画の2年次に当たり,研究の対象となる3事例(超重症児1事例,重度・重複障害1事例,肢体不自由を主とする重複障害1事例)について,大学における教育相談あるいは対象児の所属機関への訪問により行動観察および教育的対応を重ね,対象者のコミュニケーション行動および係わり手である筆者との関係性の成立・拡大に関し,主としてビデオ映像により記録を収集した.映像資料は,1セッションあたり,各々1時間30分から2時間程度であった.教育的対応の頻度は,各々の事情によって異なっており,超重症児事例(事例1)は週に1回,重度・重複障害事例(事例2)は数カ月に1回,肢体不自由を主とする重複障害事例(事例3)は月に1回程度であった.今年度,事例1については40回分,事例2については3回分,事例3については8回分の教育的対応に関する映像資料が得られた.こうした資料に基づき,現在,各々の事例に関して,対象者のコミュニケーション行動の変化および筆者との関係性を中心に,平成21年度の経過を整理するとともに,平成22年度に実施する教育実践の内容・方法を検討している.事例1は,常時,人工呼吸器を装用し頻回の痰の吸引を要し,経管栄養であるなど継続的で濃厚な医療的ケアを必要とし,寝たきりで自発的な移動や寝返りはできず,自発的な運動も乏しいが,周囲の視覚的,聴覚的変化に関連する眼球や口元の動きなどの表情変化や眠気や身体状態の不快感に関連すると思われる不快様の発声行動がある.事例1とは,本児の微弱な右手の動きの発現を手掛かりとした共同的活動の成立を試みている.

そのなかで,活動の進展において本児の右手の動きが頻回になる傾向と筆者への視覚的接近行動との関連を検討している.事例2とは,対象者が所属する施設において,約9年間にわたり食事場面における教育的対応を継続しているが,今年度は,週に数回の係わりを持っていた教育的対応の初期に形成された筆者との関係性が,その後,係わりの頻度が数カ月に1回に減少しても保たれていることを示すエピソードが得られている.事例3は,不安定ながらも歩行が可能であり,コミュニケーションにおいて音声言語による発信はないが,特定の音声言語の受信が可能である.教育的対応の経過では,筆者との関係性の拡がりと双方向性のやりとりとの関連を示唆するエピソードが得られている.3年間の研究計画の最終年次に当たり,研究の対象となる3事例(超重症児1事例,重度・重複障害1事例,肢体不自由を主とする重複障害1事例)について,引き続き,大学における教育相談あるいは対象者の所属機関への訪問により教育的対応を重ね,主としてビデオ映像により記録を収集するとともに研究成果を取りまとめた.ここでは,事例1の研究成果の概要を述べる.事例1は,係わり開始当時5歳3ヵ月の女児である.超重症児スコアは42点.気管切開し常時人工呼吸器を装着.寝たきりの状態で,経鼻経管栄養.人の動きや傍にある光りながら回転する玩具などを注視,追視することがある.大きめの音や人の話し声などに対応した眼球の動きが見出される.眼球運動,瞬き,口元の動きなどによる表情変化があり,不快様の表情や発声も見出される.四肢の運動は,痙攣様の動きが散見されるが,それ以外に表出を視認できる自発的なものは見出し難い.本研究では,筆者の右手の甲の上に本児の右掌を重ね,本児の微弱な入力を感じて筆者が物を操作したりする共同的活動を試み,重ね合わせた掌から筆者が本児の入力を感じた回数と本児の口元の動きの発現数との関連を分析した.その結果,両者の最頻値の時間帯が対応する傾向が窺え,視認できない本児の右手の動きが口元の動きと連動/同期していることが推測された,また,右手の動きの発現に先行して本児の視線が操作対象に向いて注視したり,操作対象が停止した後,数秒後にタイミング良く再度右手の入力があったりすることが複数回確認されている.以上から,本児が口元の動きを伴いながら随意的に右手に力を入れて対象を操作する活動を能動的に展開していると仮定することができる.ここに本児のイニシアチブに基づく共同的活動の進展をみることができる.今後は,上記の仮定の妥当性について,長期間に渡る教育的対応の経過,省察に関する資料に基づき検討を進める必要がある.
Danon病iPS細胞由来心筋・骨格筋細胞の解析と治療薬効果の評価

女性Danon病患者からiPS細胞(iPSC)の作製に成功した。しかし、LAMP2蛋白の免疫染色においてDanon病患者全てのiPSCが染色され、LAMP2陽性、陰性のiPSCに対する検討は行えなかった。採取したcDNAに対しLAMP2のPCRを行ったところ、Exon6欠損Line(miPSC)と発現Line(ciPSC)を確認することが出来た。miPSCと、ciPSCにおいてiPSC、iPSC由来心筋様細胞に関して検討を行った。心筋様細胞の透過電子顕微鏡での形態評価では、miPSCでDanon病に特徴的な自己貪食空胞の存在が確認出来た。治療候補薬の投与と評価は行うことができず、期限となった。Danon病患者、母親の末梢静脈血からT細胞を分離、活性化させ、山中4因子をsendai virusを用いて導入し、iPS細胞の作製に成功した。しかしながら、LAMP2蛋白の免疫染色においては母親、Danon病患者共にすべてのiPS細胞が染色された。また、光学顕微鏡レベルでは明らかな空胞、肥大の出現は認められなかった。iPS細胞がLAMP2遺伝子変異を持つリンパ球からは作成できなかった可能性も考慮し、サンガー法を用いて遺伝子検索を行ったところ、Danon病患者由来のすべてのラインのiPS細胞において、LAMP2遺伝子のヘテロの異常を同定できた。iPS細胞においてはX染色体のsilencingが起こっていない可能性も考え、心筋細胞、骨格筋細胞におけるLAMP2蛋白の欠損、透過電子顕微鏡での表現系の異常を確認する方針としたが、従来の当研究室のサイトカイン法では分化能に乏しく、現在異なった方法での心筋分化を試している段階である。今後はまず、既知の様々な手法を使用した心筋分化の方法を試すことでDanon病iPS細胞由来心筋を安定して確保することが最優先事項である。その後、再度LAMP2の免疫染色、更にジストロフィンの免疫染色を行い、心筋におけるLAMP2の有無を確認する。iPS細胞同様LAMP2の欠損が認められなかった場合にも、ウエスタンブロットを用いてControleとの比較で異常蛋白が発現していないかを確認し、更に透過電子顕微鏡においても自己貪食空砲の有無を確認する予定である。女性Danon病患者からiPS細胞の作製に施行した。しかしながら、LAMP2蛋白の免疫染色においては母親、Danon病患者全てのiPS細胞が染色され、光学顕微鏡レベルでは明らかな空胞、肥大の出現を認めなかったため、当初の予定であったLAMP2陽性、陰性のiPS細胞に対して解析を行うことはできないことが判明した。サンガー法を用いて遺伝子検索を行ったところ、Danon病患者由来全てのラインのiPS細胞においてLAMP2遺伝子のヘテロの異常を同定できた。心筋分化においては、Nat Protoc. 2013Jan;8(1):162-75.において発表されたGiWiプロトコルを適用したところ、十分な心筋への分化が認められた。本年度末には培養iPS細胞から採取したcDNAに対しLAMP2のPCRを行い、その発現を確認したところ、Danon病患者由来iPS細胞のLineによってExon6が欠損しているLine(miPSC)と発現しているLine(ciPSC)を確認することが出来た。miPSCと、ciPSCにおいてそれぞれ未分化なiPSC、分化させたiPSC由来心筋細胞に関して比較検討を行ったが、光学顕微鏡、免疫染色においては明らかな差異を認めなかったが、誘導心筋細胞の透過電子顕微鏡での形態評価を行ったところ、miPSCにおいてDanon病に特徴的と考えられる自己貪食空胞の存在を確認することが出来た。残念ながら予定としていた治療候補薬の投与とその評価は行うことができず、期限となった。免疫染色でLAMP2蛋白がDanon病由来iPS細胞において染色されたため、その原因検索のためにシークエンスでの遺伝子発現の確認を要した。また、心筋細胞への分化効率が通常のiPS細胞と比較して悪く、安定して実験、特に電子顕微鏡での観察に必要な心筋細胞を得ることができていないことが遅れの原因と考えられる。循環器内科今後はまず、既知の様々な手法を使用した心筋分化の方法を試すことでDanon病iPS細胞由来心筋を安定して確保することが最優先事項である。心筋細胞においてLAMP2蛋白の発現の欠損が確認できるかどうかが課題である。もし免疫染色で欠損の確認ができなかった場合にも透過電子顕微鏡で自己貪食空砲などDanon病に特徴的な所見の有無を確認する。その所見を元に治療薬候補の投与を行う。
スケーラブルな監視とアドレス空間の動的利用が融合した情報通信基盤

本年度は以下の3つのアプローチで研究を行った.「観測空間相互の相関解析」では,時間・アドレス空間のにおける攻撃パターンの相関解析を行い,比較的小規模の監視アドレスブロック(32ホスト分)のデータから1000アドレス程度離れたアドレス空間の統計的な挙動が推定可能であることを明らかにした.同様に,攻撃者の平均的な攻撃速度(伝播遅延)の推定方法を確立した.また,これらの伝播速度はベースとなる監視アドレスの位置によって大きく変化することを明らかにした.これらの結果は分散協調観測の際の監視アドレス配置を決定する上での重要な指針である.「断片Darknet用パケット収集ブリッジ」は実ネットワークにおける各種サービスの利用と攻撃情報の収集を並立させることを目指した基盤技術である.実トラフィックの流れを監視・制御しつつDarknetを実現するブリッジを実現したことにより,分散協調のポリシに基づいた観測アドレス空間の変更を容易に行うことが可能となり,さらにネットワークの利用状況に応じた柔軟な攻撃情報の収集が可能となった.「アドレス空間の変更による自律防衛基盤」では,サービス提供用に公開しているアドレスを動的に入れ替えながら運用を行うことが可能なアーキテクチャを提案・実装した.サービスを提供するサーバに対する攻撃を抑制(抑制率: 18-60%)するとともに,攻撃性のトラフィックを効率的に収集することが可能となった.本研究では,多数のネットワークが協調的にネットワークトラフィックの観測を行うことで,ネットワーク全体の安全性を高めることが可能となるような通信基盤の構築を目指している.情報爆発時代のネットワーク環境においては,爆発する情報やネットワークの規模に応じて,スキャン・進入・DDoS等の各種の攻撃も増大することが予想される.スケーラビリティを確保するためには,分散して観測することが必要となってくるが,全体としての十分な情報量を確保するためには相互の連携・協調が重要となる.ここで目指している情報基盤を実現するためには,(1)監視対象のIPアドレス空間とサーバなどのサービスで利用するIPアドレス空間の効果的な分布を推定する技術,(2)その効果的な分布に応じて,動的にサービスアドレスと監視対象アドレスを割り当てる技術,の双方が必要であり,ネットワーク上の攻撃性トラフィックの監視技術についての様々な知見と効率的な情報収集の仕組みを得ることを目標としている.本年度は3つのアプローチから研究を進めた.(1)多地点攻撃情報収集基盤の構築と攻撃情報の収集を国内4拠点にて開始し現在も継続的にデータを収集中である.(2)被攻撃アドレス特性の解析の結果,特定のアドレスパターンに対する局所性の存在が示された.(3)観測空間相互の相関解析の結果,/24未満の監視領域でも1000アドレススペース程度離れたアドレススペースへの攻撃の統計的予測が可能であることがわかった.本年度は以下の3つのアプローチで研究を行った.「観測空間相互の相関解析」では,時間・アドレス空間のにおける攻撃パターンの相関解析を行い,比較的小規模の監視アドレスブロック(32ホスト分)のデータから1000アドレス程度離れたアドレス空間の統計的な挙動が推定可能であることを明らかにした.同様に,攻撃者の平均的な攻撃速度(伝播遅延)の推定方法を確立した.また,これらの伝播速度はベースとなる監視アドレスの位置によって大きく変化することを明らかにした.これらの結果は分散協調観測の際の監視アドレス配置を決定する上での重要な指針である.「断片Darknet用パケット収集ブリッジ」は実ネットワークにおける各種サービスの利用と攻撃情報の収集を並立させることを目指した基盤技術である.実トラフィックの流れを監視・制御しつつDarknetを実現するブリッジを実現したことにより,分散協調のポリシに基づいた観測アドレス空間の変更を容易に行うことが可能となり,さらにネットワークの利用状況に応じた柔軟な攻撃情報の収集が可能となった.「アドレス空間の変更による自律防衛基盤」では,サービス提供用に公開しているアドレスを動的に入れ替えながら運用を行うことが可能なアーキテクチャを提案・実装した.サービスを提供するサーバに対する攻撃を抑制(抑制率: 18-60%)するとともに,攻撃性のトラフィックを効率的に収集することが可能となった.
セラミックスの技術革新の解析と体系化

(1)セラミックス技術の公開いままでの調査を基礎として、それぞれの技術革新の歴史的展開を分析し、その技術展開の必然性をまとめ、将来の技術発展に貢献する知識基盤の集大成として国際セラミックス総合展2009に参加し、セラミックスアーカイブズについて出展した。関連分野の研究者から活発な質問を受け、本研究が高く評価されている事を実感でき、今後の研究の進め方について大いに役立つものであった。また、第5回シンポジウムでセラミックスアーカイブスとして最後のまとめについて講演を行った。(2)インターネット博物館セラミックスに関するバーチャルな博物館を設立するため、これらの成果を日本セラミックス協会の「セラミックス博物館」として公開した。(3)研究成果の出版アーカイブズ出版小委員会を2月に開催、出版方針について検討し、英語版として出版することとした。セラミックス誌編委員会と協力のもと、セラミックスの技術革新を使った製品を体系的に分類し、開発した研究・技術者からの情報収集を行い、連載コーナー「セラミックスアーカイブズ」に誌面掲載している。平成20年度は下記の項目について情報収集を行い、製造生産と医療衛生、日常生活におけるセラミックスの役割を明らかにしてきた。1.セラミックスアーカイブズへの掲載とウェブ公開セラミックス誌43巻5号「第15回住宅・建築/住宅」セラミックス誌43巻6号「第16回製造産業/半導体製造」セラミックス誌43巻8号「第17回製造産業/機械部品と素材加工」セラミックス誌43巻9号「第18回製造産業/素材製造」セラミックス誌43巻11号「第19回医療・衛生/生体関連」セラミックス誌43巻12号「第20回医療・衛生/医療・分析」セラミックス誌44巻3号「21回生活・日用品/生活・調理器具」以上の成果はインターネット物館として公開するため、日本セラミックス協会のウェブサイトに公開準備中である。セラミックス博物館「セラミックスの使われ方」: http://www.ceramic.or.jp/museum/contents/product.html2.出版活動日本セラミックス協会のアーカイブズ出版小委員会を開催し、出版方針について検討した。第1回セラミックスアーカイブズ出版小委員会平成20年6月3日日本セラミックス協会第2回セラミックスアーカイブズ出版小委員会平成20年8月5日日本セラミックス協会第3回セラミックスアーカイブズ出版小委員会平成20年11月11日日本セラミックス協会第4回セラミックスアーカイブズ出版小委員会平成21年2月21-22日鹿児島(京セラアァインセラミックス館)(1)セラミックス技術の公開いままでの調査を基礎として、それぞれの技術革新の歴史的展開を分析し、その技術展開の必然性をまとめ、将来の技術発展に貢献する知識基盤の集大成として国際セラミックス総合展2009に参加し、セラミックスアーカイブズについて出展した。
農民女性の「労働」と家族・地域生活

平成13年度は、本研究の最終年度であり、調査対象地としてとりあげてきた岩手県沢内村、長野県丸子町の農民女性の労働に関する補足的な調査を行ったうえで、データ整理、資料収集分析などを行い、最終報告書としてまとめた。具体的には、(1)過疎山村である沢内村N地区においては、農家女性の労働に着眼したインタビュー調査を行い、世帯の生業と、女性の農業・兼業・家事労働とのかかわりについて分析した。多くの女性たちが家事労働を担いながらも、農業や兼業にも従事しており、多層的な労働生活を送っていることが明らかになった。また(2)同じ農村地域でありながらも、製造業の比率が高い「内発型工業地域」である丸子町においては、職場としてのA警報器で働く女性たちに焦点をあて、その労働(兼業)と農業、家事労働とのかかわりについて分析を加えた。丸子町においては、女性たちは家の生業や夫の起業(農業と零細規模の製造業を含む)に合わせた形で農業や自営業に従事していたが、子どもの出産養育期を含め、彼女たちは複数の職場(多くは製造業)で働き続けていた。本研究の目的は、農民女性の労働生活をトータルなものとしてとらえ、それを地域労働市場の中に位置づけることにあったが、本研究期間においては、両フィールドにおける農民女性の労働をライフサイクル別に整理することを通し、女性の労働を、家族とのかかわりと、農業の社会的位置づけ、地域労働市場の特質(変容を含む)とのかかわりの中で考察することができた。本研究は、農民女性の労働生活をトータルにとらえることを目的としている。すなわち、従来「労働」とされてきた賃労働、自営労働に限定することなく、家事労働を含めた実証的分析を試みようとするものである。よって研究の中心は調査研究であるが、本年度はその準備作業と理論整理を試み、(1)諸関連資料とテーマに関わる最新の文献の収集、(2)論査対象地である岩手県沢内村と長野県丸子町についての資料整理、資料収集を行った。(2)のうち、沢内村については、これまで収集した調査資料や統計資料に基づき、実験補助のアルバイト学生の労力を頼み、調査対象地区(長瀬野地区)の女性の労働状況(農業・兼業・家事)についてのデータベースを作成した。また丸子町については、行政機関等におけるヒアリング並びに資料収集を行い、調査対象者らがおかれている地域の概況及び労働市場の把握に努めた。特に、来年度の調査対象者として予定している、丸子警報器労働組合のパートの女性労働者(農民)については、現在、東京高等裁判所において係争中の賃金差別訴訟、解雇撤回訴訟の裁判資料や裁判の傍聴、ヒアリング等を通じて、より具体的なデータを収集し、これを用いて、農民女性の生活史を分析した。これは来年度予定している調査の基本枠組の一部をなすものでもある。すなわち、地域労働市場の変動の中で、パート等非正規労働者の戦力化は、資本の戦略の要であり、企業は農民女性の(賃)労働力を活用しながらも「パート」として据え置くことにより賃金コストを削減している。これに対し、農民女性は正当な労賃を要求し、家族の生活基盤を安定させようとする。地域はこのように資本の論理と生活の論理が直接対決する場であり、今や農民女性は(賃)労働の現場において最前線にいるのである。本年度は、長野県と岩手県の2つのフィールド調査を予定していたが、様々な理由から今年は主に長野県のフィールド調査に絞った。主な研究実績は以下の3点に要約される。(1)本研究年度89月にかけて、研究代表者と雇用した調査員が現地に赴き、かねてから継続中の長野県の中堅企業「(株)A警報機」(仮名)で働くパートの女性労働者へのインタビュー調査を実施し、退職者を交えた大半の聞き取りを終了した。調査項目は、職場・農業・家事労働における性別職務分離の状況、資金の家計への寄与、家計構造、女性労働者の労働歴、家族歴、生活時間等であり、個別の労働者のケーススタディはほぼ完了した。

(2)現在、東京高裁で進行中である「パート差別訴訟」については、和解交渉の現況についてのヒアリングと平行して関連する集会に出席してきたが、当該研究年度の11月29日に和解が成立した(1999年)。裁判は、構造不況の中で、非正規労働者(農家の女性労働力を含む)をいかに安価で使い捨て可能な労働力として留め置きつつ戦力化するかという資本の論理と、女性労働力の価値評価を訴える女性労働者の論理がぶつかりあう場であったが、裁判所は、原告代理人(弁護士)の積極的な議論に耳を傾け、女性の非正規労働者と正規労働者間の労働条件や賃金格差を撤廃すべきであるという論理での和解を成立させた。(3)(2)に関連するが、司法構造自体の分析をすすめるため、傍聴を主とする裁判についての調査研究や法社会学の関連資料を収集し、司法における各アクターの役割や具体的な審議の進め方などについての考察を深めた。裁判といっても民事、刑事ではだいぶ様相が異なるが、いずれにせよ、裁判官や弁護士(検察官)のイデオロギー性、あるいはジェンダー意識が、判決・和解に深く関連している。なお、この分析視角は、また別の形で「日本の司法構造」の分析につなげていきたい。本年度の主な研究実績は以下の3点に要約される。(1)昨年度行った、長野県丸子町の中堅企業「(株)A警報器」の、女性労働者調査のデータ整理を行った。当該女性労働者の賃労働のみではなく、農業労働、家事労働等の分担などトータルな「労働」実態、及び職場・農業・家事労働における性別り職務分離の状況等を分析し、当該地域の農民女性の生活構造を明らかにした。分析結果を要約するなら、賃労働においては、男性が検査・管理職等に就いているのに対し、女性は組み立てライン、秘書、受付にといった性別職務分離が、また雇用形態も男性は正社員か嘱託(定年後の再雇用の場合)であるのに対し、女性は臨時社員と正社員という差異がみられた。農業労働については、自家用野菜程度の農業にまで縮小している世帯から米農家までさまざまなバリエーションが見られたが、概ね自家用の畑や補助的な草むしり作業は女性が担当していることが多く、基幹的な農業労働は夫や親夫婦などが分担していることが多かった。これらの労働力構造を振り分けるイデオロギー装置についてはさらに詳細な分析を試みたい。(2)-昨年11月に東京高裁で和解が成立した「(株)A警報器」の「賃金差別訴訟」は、司法が、非正規労働者(農家の女性労働力を含む)を安価で使い捨て可能な労働力とする企業の論理に対する一定の歯止めを打ち出したとして注目されたが、連合が2001年春闘を「パート春闘」と称したように、労働運動においても全国的に女性パート労働者の重要性が認識されはじめている。また雇用形態のみならず、男女の賃金差別等もさまざまな形で告発されはじめているが、今年度はこれらのケースについての収集も行った。(3)岩手県沢内村については、村内の事業所並びに農業、農家の現況についての資料、統計データ収集を行い、地域における農民女性、女性労働者の実態を明らかにした。平成13年度は、本研究の最終年度であり、調査対象地としてとりあげてきた岩手県沢内村、長野県丸子町の農民女性の労働に関する補足的な調査を行ったうえで、データ整理、資料収集分析などを行い、最終報告書としてまとめた。具体的には、(1)過疎山村である沢内村N地区においては、農家女性の労働に着眼したインタビュー調査を行い、世帯の生業と、女性の農業・兼業・家事労働とのかかわりについて分析した。
神経変性疾患の分子遺伝学的研究

本研究では、以下の3つの課題について明らかにした。1)ポリグルタミン病における筋エネルギー代謝の解析を行い、マシャドジョセフ病において筋エネルギー代謝が有効性判定の生化学的指標になり得る可能性を見い出した。2)SCA14モデルマウスの作製を試み、ヒトPRKCGノックインマウスを作製した。3)外眼筋麻痺を伴うパーキンソニズムについて遺伝子解析研究を行い、本邦の進行性外眼筋麻痺を伴うパーキンソニズムには複数の要因が関与していることと、未知の原因による進行性外眼筋麻痺を伴うパーキンソニズムにおいてもmtDNA修復機能の障害が関与していることを明らかにした。本研究では、1)ミトコンドリア遺伝子重複変異を伴う家系の臨床像の検討を行い、MELAS/MERRF overlap症候群の臨床像と筋病理所見を明らかにした。2)ポリグルタミン病における筋エネルギー代謝の解析を行い、マシャドジョセフ病において筋エネルギー代謝が有効性判定の生化学的指標になり得る可能性を見い出した。3)SCA14モデルマウスの作製を試み、ヒトPRKCGノックインマウスを作製した。ミトコンドリア遺伝子重複変異を伴う家系については、発症者は全員ミトコンドリア遺伝子tRNA領域にT8356CとA3243Gの2つの変異を認めた。両変異とも病的意義が確定している変異であり、このような病的意義の確定したミトコンドリア遺伝子変異を持つ家系の報告は世界初である。臨床病型はMELASとMERRFの重複型であり、筋病理所見もそれに合致するものであった。ポリグルタミン病における筋エネルギー代謝の解析については、汎用機である1.5TMRIを用いて^<31>P-MRSによる筋エネルギー代謝測定を行い、ポリグルタミン病であるMachado-Joseph病(MJD)において、その測定法を試行した。その結果、筋エネルギー代謝がMJDにおいて有効性判定の生化学的指標になり得る可能性が示唆された。SCA14モデルラットについては、ヒト野性型と変異型PRKCGを組み込んだノックインマウスが完成し、現在繁殖作業を行っている。本研究では、1))ポリグルタミン病における筋エネルギー代謝の解析を行い、マシャドジョセフ病において筋エネルギー代謝が有効性判定の生化学的指標になり得る可能性を見い出した。3)外眼筋麻痺を伴うパーキンソニズムについて遺伝子解析研究を行った。ポリグルタミン病における筋エネルギー代謝の解析については、汎用機である1.5T MRIを用いて^<31>P-MRSによる筋エネルギー代謝測定を行い、ポリグルタミン病であるMachado-Joseph病(MJD)において、その測定法を試行した。SCA14モデルラットについては、ヒト野生型と変異型PRKCGを組み込んだノックインマウスが完成し、現在繁殖作業および行動観察を行っている。外眼筋麻痺を伴うパーキンソンニズムの研究においては、臨床所見としては、本邦の患者のパーキンソニズムはパーキンソン病によるものとして矛盾しないことと、遺伝子解析においては、筋組織でのmtDNA欠失は認めないものの、POLG1遺伝子の複合ヘテロ接合変異を認めるものと、mtDNA欠失は認めるが、いずれの候補遺伝子にも変異を認めなかいものがあることを報告し、本邦の進行性外眼筋麻痺を伴うパーキンソニズムには複数の要因が関与していることと、未知の原因による進行性外眼筋麻痺を伴うパーキンソニズムにおいてもmtDNA修復機能の障害が関与していることを明らかにした。本研究では、1)ポリグルタミン病における筋エネルギー代謝の解析を行い、マシャドジョセフ病において筋エネルギー代謝が有効性判定の生化学的指標になり得る可能性を見い出した。2)SCA14モデルマウスの作製を試み、ヒトPRKCGノックインマウスを作製し行動解析を行った。4)ALSにおける高次脳機能解析をPETを用いて行った。その結果、ポリグルタミン病における筋エネルギー代謝の解析については、汎用機である1.5T MRIを用いて31P-MRSによる筋エネルギー代謝測定を行い、ポリグルタミン病であるMachado-Joseph病(MJD)において、その測定法を試行した。外眼筋麻痺を伴うパーキンソンニズムの研究においては、臨床所見としては、本邦の患者のパーキンソニズムはパーキンソン病によるものとして矛盾しないことと、遺伝子解析においては、筋組織でのmtDNA欠失は認めないものの、POLG1遺伝子の複合ヘテロ

接合変異を認めるものと、mtDNA欠失は認めるが、いずれの候補遺伝子にも変異を認めなかいものがあることを報告し、本邦の進行性外眼筋麻痺を伴うパーキンソニズムには複数の要因が関与していることと、未知の原因による進行性外眼筋麻痺を伴うパーキンソニズムにおいてもmtDNA修復機能の障害が関与していることを明らかにした。また、ALSにおける書字障害は前部帯状回の機能が関与している可能性を明らかにした。