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中世文芸における花と自己変容-世阿弥能楽論を中心に-

今年度は、科学研究費の補助を受け博士論文を執筆した。以下はその要約である。本論文の立場は、「能」の完成者世阿弥が残した能楽論の中で綿密に語られる「花」に着目し、それが究極的には人の精神の深奥と存在の根拠に立脚していることを論ずるものである。第一章では、能が実現する成立の場をめぐって、世阿弥が示した「序・破・急」という言葉が、存在の始源に対する徹底した受動性を端緒とし、やがてそれが否定に転ずるところにさまざまの演能の態(わざ)が演ぜられ、最終的には全一的な究極に統一せられてゆくという、舞台芸術の本質を述べるものであることを説明する。第二章では、「能」に具体化される「心」のあり方について、能の全体構造が、一瞬一瞬の個別の「態」においても基本的に必ず息づいてあるべき理由を追究して説明する。存在の始源にある造物主の無限な働きは、「万能を一心に綰ぐ」という演者の心、そしてその心に支えられた態によって辛うじて具現化される。この論證に到達することによって、能が漸く時空を超えて普遍的な芸術になったのである。第三章は、「心」のはたらきから一瞬現出した舞台の「花」が、いかにすればその存在を証明されるか、という本論文の中心的課題が追究される。時間の前で徹底して受動的、敗北的なものである「ひと」が、一瞬実現した「花」-造物主の精華-を、持続して保つことはできない。この難関を突破するために、世阿弥が用いたのが「なみ(無化)する」という自己客観化、自己否定の論理であった。自己を否定して飛躍することを通じて、始源の存在ではない一己の人間が、瞬間的に時間を超越し、さらに自(演者)他(見者)二重の視座を獲得することにおいて空間を超越するとき、一瞬「花」は咲くのであるが、その瞬間にこそまた自己否定は要請されるのである。かくて有限なる舞台の上に「花」は、演者の絶えざる自己変容という在り方として咲くことができる。本年度は、世阿弥能楽論の全体構造を捉えるべく、主著である『花鏡』を中心に、全能楽論を精読し、二つの論文にまとめた。以下、新たに得られた知見を述べる。1、まず探究の始めとして、能が現出してくるときの、成立の場そのものに目を向けた。そこにあって、態をなす演習自身は、造化の根源ともいうべき無限なるものに晒され、そこから生命を汲み取っている、そして、かかる端緒にあってこそ、演習が目指しゆく終極のものたる「まことの花」が、無限なる落差を否応なく伴いつつも現前してくる.この端緒と終極との密接な関わりがすなわち「序破急」である.2、次に、演者が様々な態を具体化してゆく様と、そのときの心の在り方について,『花鏡』の具体的な文脈に即して考察し、序破急の全体構造が、個々の場面でいかに息づいているかを浮彫りにした。そこでは、無限なる造化の働きを受容する媒介として、「心」が重要な役割を担っていた。そして、その心を媒介として、それぞれの態が舞台に現出し、ひいてはそうした心と態とが、全体として花の顕現へと披かれているのであった。3、その上で、個々の態の現出の内に潜んでいる、「花」の成就と展開の問題を、改めて全体として吟味した。「花」は一方で、ある無限なるものがそこへと披かれゆく心に宿り、態として現出したものであり、そこには根源の働きに貫かれたという確かさがある。しかし他方、この世の態はどこまでも限定したものである以上、無限なるものを十全に宿した、いわゆる「まことの花」は、この現実の世ではあり得ない。よって、われわれにとっての花とは、その都度ある完成・成就を示しつつも、さらに上の境地を目指して披かれゆき、その都度絶えず変容してゆくべきものとなるのである。

時間の前で徹底して受動的、敗北的なものである「ひと」が、一瞬実現した「花」-造物主の精華-を、持続して保つことはできない。この難関を突破するために、世阿弥が用いたのが「なみ(無化)する」という自己客観化、自己否定の論理であった。自己を否定して飛躍することを通じて、始源の存在ではない一己の人間が、瞬間的に時間を超越し、さらに自(演者)他(見者)二重の視座を獲得することにおいて空間を超越するとき、一瞬「花」は咲くのであるが、その瞬間にこそまた自己否定は要請されるのである。かくて有限なる舞台の上に「花」は、演者の絶えざる自己変容という在り方として咲くことができる。
衛星データを利用した極域の雲水量の経年変動の研究

1987年から1995年のDMSP衛星のSSM/Iのデータを利用して、南極昭和基地の沖合いの雲水量と水蒸気量の季節変動、経年変動の解析を行った。1988、1989年は昭和基地で気象レーダ、マイクロ波放射計等を用いた雲降水の観測が行われており、この期間を特に詳しく解析した。北極域については1992年から1995年のSSM/Iのデータの解析を行った。南極域の結果を示す。昭和基地で低気圧性の降水が観測されたときは、22、37GHz(それぞれはほぼ水蒸気量、雲水量に対応)の高輝度温度部分が昭和基地に近づいているときで、この部分は基地に近づくにつれて広がっている。またSSM/Iデータから、この部分の東側では雲水量は少なく西側では雲水量が多いことが分かる。これは昭和基地のレーダで見られるバンド状構造の通過の状態と良く一致していた。SSM/Iデータから季節変化を見ると、水蒸気量は2月頃にピークを持つのに対し雲水量は10-12月頃と2-4月頃の2つのピークが現れる。昭和基地の観測で降水量に大きな差があった1988年と1989年の海氷縁付近のSSM/Iデータを比較すると、89年は88年に比べて雲水量が多い頻度が高かったことが分かった。特に3-5月、10-11月にその差が顕著である。このことは低気圧活動の違いが少雪年、多雪年をもたらしていることを示している。北極域、特にスバールバル付近の海上の水蒸気量を見ると5月から10月の期間とそれ以外の期間の2つに大きく分けることができる。また1993年のデータは他の年と違いが大きい。この原因は海氷の張り出しと関係があるかも知れない。それ以外の年については雲水量は最大で0.2kg/m^2である。北極域は陸地や海氷の部分が散在していて南極域以上にデータにサイドローブの影響が大きいと考えられるが、天気図とデータを比較すると低気圧、前線と高輝度温度の部分がほぼ一致する。南極域の結果を示す。南極昭和基地の1988年のマイクロ波放射計のデータの整理がほぼ終わり、海氷の無い期間の衛星データとの比較を始めた。地上観測のマイクロ波放射計のデータは様々なノイズが含まれている。使えるデータ、使えないデータに分けた。また1988年については、19GHzと37GHzの2台のマイクロ波放射観測が行われたので両方のデータを比較しながら、より精度の良い雲水量の値(本文で述べる雲水量とは単位気柱当たりの雲水量の総量を言う)を求めるようにした。このようにして求めたデータをまとめ昭和基地の雲水量の季節変化について調べた。可降水量(単位気柱当たりの水蒸気量の総量)については高層ゾンデによる観測があり、気温と水蒸気量の関係から、夏季12、1、2月が大きい値を示す。ところが雲水量の季節変化を見ると必ずしも対応せず3、4、5、11月に大きい値を示していた。この原因は月平均気温、下層雲量などのデータから考えると、擾乱の活動状態に主に依存しているようである。次に海氷の無い3月についてDMSP衛星のSSM/Iデータから求めた雲水量と地上観測から求めた雲水量の比較を行った。

衛星で-たは大陸の影響を受けており、昭和基地付近のデータを用いると値がおかしくなるので、350km海上にでた地点を選び比較を行った。衛星データからは可降水量についても求めることができるので、この値についても地上の高層ゾンデ観測から求めた値と比較をした。可降水量については、3月の変化を見ると変化傾向は良い一致をみた。一方雲水量は350km離れており一致は良くないが、ピークの回数などは似ている。これら両方のデータから1988年3月に昭和基地付近、あるいは沖合いを通過した、擾乱によってもたらされた雲水量、可降水量の値を見積もった。その結果は、雲水量は約50mg/cm2、可降水量は15mmであった。北極スバールバルのマイクロ波放射計はトラブルがあり平成6年度からデータが得られていない。しかしレーダーの観測は順調に行われ雲の特性についての情報は得ることが出来た。この観測から1993年から1995年の雲降水の月ごとの特徴を調べた。降水量、レーダーエコーの出現頻度から見て冬1月頃、夏6月頃に値の小さい月がほぼ毎年現れていた。ところが、月平均雲量の変化では、冬1月頃は同様に値の小さい月が見られたが、夏6月頃は逆に値の大きい月を示していた。これらの結果から次のことが予想される。冬1月頃には月平均雲量及び月降水量の少ない月がある。この期間は北からの水蒸気の少ない気団に覆われている期間であろう。一方夏6月頃は月降水量は少ないが月平均雲量は多い。即ち降水を伴わないような雲の出現頻度が高く、降水を伴う雲の出現頻度が低い月があることを示している。降水を伴うような強い対流雲が形成されるほどではないが、ある程度の水蒸気の供給が続く期間があると考えられる。南極域については、1989年のDMSP衛星のマイクロ波データについて調べた。マイクロ波データから気柱雲水量、気柱水蒸気量を見積もる時、海氷がその領域にあると見積もりが困難になる。現在1989年1年間の毎日の昭和基地沖のマイクロ波データの分布を調べ、海氷の影響の無いどの領域について季節変動を調べるのが良いか検討中である。この結果に基づき平成8年度に気柱雲水量と可降水量の季節変化を調べる予定である。またDMSP衛星のCD-ROMデータについては1992年からフォーマットが変更になり、読み出しプログラムを変更する必要が生じた。このため当初計画に比べデータの解析が遅れているが、新しいフォーマットのCD-ROMに対する読み出しが出来た。平成8年度には上記に述べた北極域のレーダー観測で得られた雲の特徴について、衛星の雲水量データと比較する予定である。1987年から1995年のDMSP衛星のSSM/Iのデータを利用して、南極昭和基地の沖合いの雲水量と水蒸気量の季節変動、経年変動の解析を行った。1988、1989年は昭和基地で気象レーダ、マイクロ波放射計等を用いた雲降水の観測が行われており、この期間を特に詳しく解析した。北極域については1992年から1995年のSSM/Iのデータの解析を行った。南極域の結果を示す。昭和基地で低気圧性の降水が観測されたときは、22、37GHz(それぞれはほぼ水蒸気量、雲水量に対応)の高輝度温度部分が昭和基地に近づいているときで、この部分は基地に近づくにつれて広がっている。またSSM/Iデータから、この部分の東側では雲水量は少なく西側では雲水量が多いことが分かる。これは昭和基地のレーダで見られるバンド状構造の通過の状態と良く一致していた。SSM/Iデータから季節変化を見ると、水蒸気量は2月頃にピークを持つのに対し雲水量は10-12月頃と2-4月頃の2つのピークが現れる。
家族性アルツハイマー病に連関した細胞死に拮抗する物質の研究

本研究の目的は、家族性アルツハイマー病変異体が誘導する細胞死、とりわけ神経細胞死を抑制する生理活性物質を見い出すことである。初期の計画では、その手段として、1996年に作成した2つの系(V642I-APPをCOS-NK1細胞とF11細胞に一過性導入する系)を用いて胎児血清から精製する方針であったが、第一に、一過性導入では遺伝子の細胞死誘導効率が導入効率に直接影響されること、第2に、一回の導入の単価が高価であること等の為に、一過性導入では同定を進めることが困難であることが判明した。そこで、まず、V642I-APPを誘導性に発現するF11細胞の樹立を試み、様々な誘導系につき試行錯誤の後、エクダイソンによる誘導系を確立した。この系では、エクダイソン処理によってV642I-APPが発現し、それと共に72時間以内にほぼすべての細胞が死滅する。次に、細胞死拮抗活性は血清のロットにより大きくばらつくことが判明した。この為、同定の為の基本方針を根本的に転換し、私達独自の発現遺伝子クローニングを開発することにした。更に、予備的検討から、用いるライブラリーに独創的アイデァを加えた。現在数十個の独立した拮抗遺伝子クローンが得られ、それらが、(1)他のアルツハイマー病遺伝子やAβの誘導する神経細胞死に拮抗するか否か、(2)細胞内ではなく細胞外蛋白として作用するものはないか、(3)化学合成可能なサイズの分子はないか、等の検討を急いでいる。本年度はADRF(Alzheimer disease rescue factor)の同定を主として計画を実施した。ADRFは、既に確立した2つの神経細胞系(NK1細胞およびF11細胞)を用いて、家族性アルツハイマー病APP変異体による神経細胞死を阻止する物質として検索を進めている。研究代表者は斯様な拮抗物質の存在を既にウシ胎児血清中に確認しており、予備的検討によると10KDa前後のポリペプタイドであると考えられる。本研究では、まずウシ胎児血清を試料とし、複数のカラムクロマトグラフィー精製法を組み合わせることにより、家族性ア病APP神経細胞死系に拮抗する活性を指標としてADRFの部分精製を行った。さらにそれらからプロテテーゼ分解ペプチドを得て、エドマン分解法に基づいて同定したアミノ酸部分配列情報から、ADRF遺伝子のウシ大脳cDNAライブラリーからのクローニングを実施している。このウシADRFがクローニングされ次第、これをプローブとしたヒト,大脳cDNAライブラリーの解析を開始し、ヒトADRF遺伝子をクローニングする予定である。さらに、同定した遺伝子に基づいて作成する組み換えヒトADRFを用いて、これまでに確立した培養神経細胞系、および目下これらと平行して作成を試みている単一初代培養神経細胞での家族性ア病APP変異体による細胞死に対する拮抗作用を解析する。また、マウス大脳の各部位より単離した初代培養神経細胞系を用いて、ADRFに対する感受性とその差を検討する。一方、上記により同定した組換えADRFが、別のアルツハイマー病責任遺伝子であるプレシナリン1/2の誘導する神経細胞死に拮抗するか否かを解析し、ア病間での神経変性機構の共通性と特殊性を検討し、同時にADRFが、APP変異体の関与するア病にのみ有効なのか、あるいは他のア病にも有効なのかを解明する。そこで、まず、V642I-

APPを誘導性に発現するF11細胞の樹立を試み、様々な誘導系につき試行錯誤の後、エクダイソンによる誘導系を確立した。この系では、エクダイソン処理によってV642I-APPが発現し、それと共に72時間以内にほぼすべての細胞が死滅する。次に、細胞死拮抗活性は血清のロットにより大きくばらつくことが判明した。この為、同定の為の基本方針を根本的に転換し、私達独自の発現遺伝子クローニングを開発することにした。更に、予備的検討から、用いるライブラリーに独創的アイデァを加えた。現在数十個の独立した拮抗遺伝子クローンが得られ、それらが、(1)他のアルツハイマー病遺伝子やAβの誘導する神経細胞死に拮抗するか否か、(2)細胞内ではなく細胞外蛋白として作用するものはないか、(3)化学合成可能なサイズの分子はないか、等の検討を急いでいる。
新規中性脂肪吸収抑制薬であるSAR1B抑制PIポリアミドの開発

PIポリアミドは新規遺伝子発現制御技術であるが、本研究ではSar1bを抑制するPIポリアミドを高中性脂肪血症や肥満症の治療薬として開発した。ヒトおよびラットSar1bプロモーターに結合するPIポリアミドをそれぞれ2つづつデザイン合成し、ターゲット配列への結合を確認した。次いで培養小腸上皮細胞にPIポリアミドを添加しSar1b mRNA発現を抑制することを確認した。さらにラットにPIポリアミドを隔日で2週間経口投与し、小腸のSar1b発現減少、体重増加の抑制作用を確認した。Sar1b抑制PIポリアミドは経口投与により肥満、脂質異常症を治療する新しい薬物として有用であると考えられる。Sar1b発現抑制するPIポリアミドをデザインするためにensemble databaseを用いてヒトSar1bプロモーター遺伝子配列を抽出した。このプロモーター領域における転写因子結合部位を解析するために、抽出したプロモーター配列を転写因子結合配列データベースであるTransFacにより解析、ヒトSar1bプロモーターにおける転写因子結合予想部位のマップを作成した。この中で、最初のPIポリアミド結合ターゲット配列として脂質代謝調節において非常に重要と考えられているSREBPが結合するSREとし、その部位に結合するPIポリアミドを2種類デザインした。デザインしたPIポリアミドをペプチド合成機PSSM-8を用いて固相法で合成し、HPLCで精製した。乾燥後に蒸留水で溶解し、HPLCにて確認した。合成した2種類のPIポリアミドのターゲット部位を含むヒトSar1bプロモーター20bp分の配列でセンス、アンチセンスのオリゴヌクレオタイドを作成し、2本鎖DNAとした後にPIポリアミドとともに電気泳動するゲルシフトアッセイにてPIポリアミドのターゲット配列への結合を確認した。次に、Sar1bPIポリアミドの評価系を確立するために、小腸培養細胞であるCaco2細胞を用いて、Sar1b発現を増加させる刺激の探索を行った。Caco2細胞はTranswell上で培養することで、小腸細胞類似の形態を示した。この細胞に100nMインスリン、50mM、100mMグルコース、LPDSを添加したが、SRBP1、Sar1b mRNAの発現量の有意な変動は認めなかった。LXRアゴニストであるTO901317を10μMで添加するとCaco2細胞のSREBPは増加したが、Sar1bは明らかな発現変動は見られなかった。さらに25μMシンバスタチンも加えたが、明らかな変化は認めなかった。初年度にデザイン合成し、ターゲット配列への結合が確認できた2種のヒトSar1bに対するPIポリアミドをヒト小腸上皮細胞Cell lineであるCaCo2細胞に1μMで添加しSar1b mRNA抑制効果を検討した。作成した2種類のポリアミドはともに有意にSar1b mRNAを抑制した。さらに、CaCo2細胞を継続培養して小腸上皮様に分化させ、PIポリアミドの脂質合成への影響を評価したところ、PIポリアミドはCaCo2細胞の脂質合成を抑制させた。さらにPIポリアミドの効果をin vivoで評価するために、ラットSar1bを抑制するPIポリアミドの作成を行った。ラットSar1bプロモーター配列をTransfacデータベースにて解析し、そのプロモーター領域に2カ所のSRE配列を同定した。その下流SREに結合する2種類のラットPIポリアミドをデザイン、合成し、ゲルシフトアッセイにてそのターゲット配列への結合を確認した。次いで、ラット小腸上皮細胞であるICE-6を用い、2種のPIポリアミドのSar1b mRNA抑制効果を検討した。反復して検討を行ったが、2種のPIポリアミドともにSar1b抑制効果は確認できなかった。そのため、上流SREをターゲットとしたPIポリアミドをさらに2種類デザイン合成し、そのターゲットへの結合をゲルシフトアッセイで確認した。この2種のPIポリアミドのうちの1種でICE-6細胞のSar1b mRNA発現を有意に抑制することを確認できた。ラットin vivoでの研究を目指し、PIポリアミドの小腸への取り込みを検討した。培養液中に10μMでFITCでラベルしたPIポリアミドを添加し切除したラット小腸をオーバーナイトで静置し、翌日に凍結切片を作成して取り込みを検討したが、明らかな取り込みは確認できなかった。Sar1bは小腸上皮細胞におけるカイロミクロン合成分泌においてその重要な過程を担い、発現抑制することで小腸からのカイロミクロン合成を抑制させることができる。その抑制薬として新規遺伝子発現制御技術であるPIポリアミドをSar1b遺伝子プロモーターに結合するようにデザイン合成し、その効果をin vitro実験で確認した。次いでこのPIポリアミドを用いたラットでのin vivo実験に先立ち、FITCでラベルしたPIポリアミドをWistarラットに経口投与し、小腸細胞内への取り込みを蛍光顕微鏡を用いて検討したが、取り込みの確認に至らなかった。そのため、麻酔下で回復したラット小腸を結紮し、1.0×10-3 M , 0.1 mlのPIポリアミド溶液を直接注入して取り込みを検討したところ、小腸上皮細胞内へのFITCラベルポリアミドの取り込みが蛍光顕微鏡により確認された。経口投与でFITCラベルポリアミドの取り込みが確認できなかった原因はFITCポリアミドが胃酸により変性していた可能性があると考えられる。ここまでの研究でPIポリアミドがラット小腸上皮細胞に取り込まれることが確認できたので、ラットに対する経口投与実験を行った。3週齢のWistarラットを普通食で飼育し、2週間Sar1bPIポリアミドを7.5mg/kgにて隔日経口投与した(合計7回)。

コントロールにはミスマッチPIポリアミドを7.5mg/kg隔日投与した。投与後の体重を比較すると、Sar1b PIポリアミド投与群で体重は低下傾向であった。又、投与後の血清中の脂質(T-chol、HDL-chol、TG)については有意な変化を認めなかった。投与後の上部、中部、下部小腸におけるSar1b mRNA発現をリアルタイムPCRにて比較した。空腸、回腸において、PIポリアミド投与群で有意にSar1b mRNAの発現低下を認めた。十二指腸においてもSAR1bの発現は低下傾向であった。以上の結果より、Sar1b抑制PIポリアミドの投与により小腸上皮におけるSar1b発現抑制できることが確認された。PIポリアミドは新規遺伝子発現制御技術であるが、本研究ではSar1bを抑制するPIポリアミドを高中性脂肪血症や肥満症の治療薬として開発した。ヒトおよびラットSar1bプロモーターに結合するPIポリアミドをそれぞれ2つづつデザイン合成し、ターゲット配列への結合を確認した。次いで培養小腸上皮細胞にPIポリアミドを添加しSar1b mRNA発現を抑制することを確認した。さらにラットにPIポリアミドを隔日で2週間経口投与し、小腸のSar1b発現減少、体重増加の抑制作用を確認した。Sar1b抑制PIポリアミドは経口投与により肥満、脂質異常症を治療する新しい薬物として有用であると考えられる。初年度にSar1bPIポリアミドの効果を評価する培養細胞系の確立に時間を要したために、全体として進行がやや遅れている。それに加え、最初に2種類ラットPIポリアミドをデザイン、合成したものが、培養細胞系で効果が得られず、さらに反復して評価を行った。それでも効果が確認できず、やむを得ず別のプロモーター領域に結合するPIポリアミドを再度合成して評価を行った。最終的には有効なラットPIポリアミドを得ることができたが、多くの時間を必要としたためにさらなる遅れの原因となっている。脂質代謝ラットPIポリアミドが確立されたので、今後はまず、PIポリアミド投与経路の検討に入る。PIポリアミドはこれまで静注での有効性が示されているが、経口投与にて小腸上皮細胞へ取り込ませることを目指して検証を重ねていく。具体的にはFITCラベルしたPIポリアミドを塩酸で処理した後に電気泳動、HPLCで評価し、胃酸に対する安定性を確認する。さらに、FITCポリアミドをラットに経口投与して後に小腸を切除して凍結切片を作成して検鏡し、小腸細胞への取り込みを確認する。小腸細胞への取り込みが確認されれば経口で投与し、確認できなければ静注にて投与して小腸Sar1b mRNAに対する効果、血清脂質に対する効果を評価する。ヒトのPIポリアミドについてはCaCo2細胞を用いた検討を続ける。
アロステリックPHD阻害による選択的HIF活性化：新規慢性腎疾患治療薬の開発

分子標的経口虚血治療薬の開発を目的に研究を行う。まず。2-OGの構造を持たず、アロステリックにPHDを阻害できる新規低分子化合物の合成法を確立する。続いて標的のPHDタンパク質を合成し、分子レベルで相互作用があることを明らかにし、選択性を調べる。細胞レベルでHIFタンパク質が安定化されていることを明らかにし、最終的にマウス及びラットを用いた活性試験・毒性試験・代謝試験により、動物個体での作用を明らかにする。まず。
エビ類に見られる特異的生体防御能の水産増殖への応用

エビ類の養殖は、white spot syndrome virus(WSSV)などのワイルス感染症により甚大な被害を受けている。積極的なWSSV対策としてワクチンの開発が上げられるが、無脊椎動物であるエビ類は抗体を持たず、ワクチン開発は困難とされてきた。しかし、これまでの研究で、WSSV感染耐過エビがWSSVの再感染に対し抵抗性を獲得すること、またWSSV構造タンパク質を筋肉内接種することでWSSVに対する抵抗性が誘導されることを明らかにした。本研究では、WSSVの構造タンパク質であるVP26およびVP28を用いた経口ワクチンの開発(調整法、投与方法ならびにウイルス攻撃法)を行い、以下の成果を得た。1.大腸菌で発現させたWSSVの遺伝子組換えタンパク質(rVP26およびrVP28)をクルマエビに経口投与し、経口、浸漬および注射の3法でWSSVよる攻撃を行い、経口投与ワクチンの効果について検討したところ、何れの攻撃法においても経口投与区の死亡率が対照区に比べ有意に低かったことから、rVPsの経口投与によりWSSVに対するクルマエビ防御効果が誘導されることを明らかにした。2. rVP26あるいはrVP28を経口投与したクルマエビの感染防御能の持続期間および特異性について検討したところ、感染防御効果は、投与45-55日後にピークとなったが、その後減少し106日後には消失した。また、追加投与により感染防御能が維持・回復することを明らかにした。さらに、誘導されたクルマエビのWSSVに対する感染防御能には、ある程度の特異性があることを明らかにした。以上、本研究の成果は、クルマエビの養殖過程において、WSSVrVPsを経口投与することでWSSV感染症の予防が可能であることを明らかにした。本成果により、養殖クルマエビにおける本病被害は大幅に軽減されると考える。エビ類の養殖は、white spot syndrome virus (WSSV)などのウイルス感染症により甚大な被害を受けている。積極的なWSSV対策としてワクチンの開発が上げられるが、無脊椎動物であるエビ類は抗体を持たず、ワクチン開発は困難だとされてきた。しかし、これまでの研究で、WSSV感染耐過エビがWSSVの再感染に対し抵抗性を獲得すること、またWSSV構造タンパク質を筋肉内接種することでWSSVに対する抵抗性が誘導されることを明らかにしてきた。本研究はWSSVの経ロワクチンの開発をゴールとし、本年度はWSSVの成分ワクチンの調整法、投与方法ならびにウイルス攻撃法について主に検討し、以下の成果を得た。1)WSSVの構造タンパク質で、WSSV感染防御抗原でもあるVP26およびVP28をコードする遺伝子を発現ベクター(pET-25bおよびpET-22b)にクローニングし、大腸菌を用いたrVP26およびrVP28の大量発現系を確立した。2)クルマエビに対するWSSV攻撃法として、筋肉内接種、浸漬攻撃および経口攻撃法の条件設定について検討し、各攻撃法におけるWSSVの最適攻撃量を明らかにした。3)WSSV経口ワクチンとして、rVP26およびrVP28のエビ配合飼料を開発した。4)rVP26あるいはrVP28配合飼料をクルマエビに15日間投与し、経口投与終了2030日後に,経口、浸漬および注射法によりWSSV攻撃した結果、何れの攻撃法においても対照区の死亡率と有意差が認められ、上記配合飼料の経口投与によりWSSVに対する防御効果が誘導されることが明らかになった。5)rVP26およびrVP28を精製し、抗VP26および抗VP28家兎血清を作製した。本血清は、VP26およびVP28の定量検出に使用する予定である。本研究ではWSSVの経口ワクチンの開発を目標に、本年度は大腸菌発現WSSV組換構造タンパク質rVPsを経口投与することで誘導される防御効果の発現時期および持続期間について検討し、以下の成果を得た。1.rVPs投与区では、投与後30日目までWSSVに対する防御効果は認められなかったが、投与後36日目からその効果が認められ始め、45-55日目をピークに減衰し、106日目には効果が認められなくなった。2.初回投与の防御効果が残存する75日目にrVPsを追加投与した場合、初回投与から106日目においても防御効果が認められ、追加投与による防御効果の持続が明らかになったが、その効果は135日目には認められなくなった。一方、初回投与の効果が認められなくなった104日目にrVPsを追加投与した場合、初回投与より126日目(追加投与後22日目)に防御効果のピークが認められたが、135日目(同31日目)には防御効果は認められなくなった。3.以上の結果から、rVPsの経口投与によるWSSV感染防御効果の持続期間は自然感染耐過エビに比べ短いものの、追加投与により同効果を持続させる可能性が示された。また、追加投与による免疫記憶様の現象が認められた。

本研究では、WSSVの構造タンパク質であるVP26およびVP28を用いた経口ワクチンの開発(調整法、投与方法ならびにウイルス攻撃法)を行い、以下の成果を得た。1.大腸菌で発現させたWSSVの遺伝子組換えタンパク質(rVP26およびrVP28)をクルマエビに経口投与し、経口、浸漬および注射の3法でWSSVよる攻撃を行い、経口投与ワクチンの効果について検討したところ、何れの攻撃法においても経口投与区の死亡率が対照区に比べ有意に低かったことから、rVPsの経口投与によりWSSVに対するクルマエビ防御効果が誘導されることを明らかにした。2. rVP26あるいはrVP28を経口投与したクルマエビの感染防御能の持続期間および特異性について検討したところ、感染防御効果は、投与45-55日後にピークとなったが、その後減少し106日後には消失した。また、追加投与により感染防御能が維持・回復することを明らかにした。さらに、誘導されたクルマエビのWSSVに対する感染防御能には、ある程度の特異性があることを明らかにした。以上、本研究の成果は、クルマエビの養殖過程において、WSSVrVPsを経口投与することでWSSV感染症の予防が可能であることを明らかにした。本成果により、養殖クルマエビにおける本病被害は大幅に軽減されると考える。
次世代微細PCRAMに向けた相変化材料／電極間の接触界面抵抗に関する研究

相変化メモリの大容量化には相変化材料(PCM)/電極構造の微細化がカギとなるが、微細メモリセル抵抗はPCM/電極間の接触抵抗に支配される。本研究では、PCMの接触抵抗率を評価すると共に、次世代メモリの創成を試みた。その結果、アモルファスCu2GeTe3/電極はショットキー伝導を示し界面伝導に支配される事が分かった。また、耐熱性に優れる新PCMとしてCr2Ge2Te6を見出した。Cr2Ge2Te6は通常とは逆に、結晶抵抗率がアモルファス抵抗率よりも高い。更に、その抵抗率差は一桁であるが、接触抵抗率差は二桁を示すためメモリへの適用が可能であり、また、動作エネルギーを大幅に低減できる事が分かった。本研究では、データ保持性に優れる高結晶化温度を持つ新規相変化材料(PCM)であるGeCu2Te3(GCT)を用い、PCM/電極のRcの定量的評価およびその電極材料依存性を決定する因子を解明する事を目的とし、本期間において以下の知見を得た。(1) GCT/W電極間の相変化に伴う接触界面抵抗率ρc:本研究では、Circular Transfer Length Method(CTLM)パターンを作製し、GCT/W電極のρcを測定した。GCT/W電極のρcはGCTの抵抗率と同様に、結晶化温度で急峻な減少を示し、四桁程度低下する事が分かった。光電子分光測定の結果から、アモルファスGCTにおいては、フェルミレベルにおける状態密度は殆ど見られず半導体的性質を持つ一方、GCTのフェルミレベルにおける状態密度は結晶化に伴い増加し、結晶相GCTは金属的な性質を示す事が分かった。この事から、相変化に伴う四桁程度のρc変化は、GCTの電子物性が半導体的なアモルファス相から金属的な結晶相へ変化したことに起因する事が分かった。また、結晶化に伴うGCT/W電極のρcの変化は、既存材料であるGe2Sb2Te5(GST)/W電極に対して約四倍大きい事が分かった。(2) PCM/電極界面の電子状態:Spring-8のビームラインBL47を用い、GCT/金属電極界面の電子状態を硬X線光電子分光(HX-PES)により評価した。その結果、アモルファスGCTでは、電極直下においてバンドベンディングが生じ、そのバンドベンディングの大きさは、金属電極の電子親和力に依存する事が分かった。また、金属電極によっては界面反応が生じ、化合物が形成している事が示唆された。(3)メモリ動作性:GCTおよびW電極を用いたメモリセルを作製し、その動作性を評価した。微細セルでは、SET(結晶相)およびRESET(アモルファス相)状態の電気抵抗差は、それぞれの接触界面抵抗の差に起因し、三桁以上の電気抵抗差が得られる事が分かった。これまでの研究により、W電極と相変化材料間の接触界面抵抗率および相変化に伴う接触界面抵抗率変化について定量的に評価を行うと共に、相変化材料/電極界面の電子状態評価より、相変化材料の界面近傍のバンドベンディングに及ぼす金属電極依存性についても実験を行った。それら知見から、特に、新規GCT化合物は、既存材料であるGe2Sb2Te5(GST)に比して、相変化に伴う接触界面抵抗の変化は約四倍程度大きい事が分かった。メモリセルの微細化に伴い、メモリセルの全抵抗は接触界面抵抗に支配されることになる。即ち、GCTメモリセルはGSTよりも、熱的安定性が優れているだけでなく、データ読み取りの信頼性(アモルファス相と結晶相状態の電気抵抗差が大きい)が高いということが分かってきた。以上のように、既存材料および新規材料について、相変化材料/電極間の接触界面抵抗率およびその相変化に伴う変化について定量的な成果が得られており、当初の計画通りに進展している。本研究では、データ保持性に優れる高結晶化温度を持つ相変化材料(PCM)を開発すると共に、将来の微細相変化メモリ(PCRAM)セルの動作性能を左右するPCM/電極間の接触界面抵抗率ρcの定量的評価および電極材料依存性を決定する因子を解明する事を目的とし、本期間において以下の知見を得た。1.耐熱性に優れる新しいタイプのPCMであるGeCu2Te3(GCT)について、GCTアモルファス/W電極間のρcに及ぼすGCTアモルファス表面クリーニングの影響を調査した。尚、本実験ではAr逆スパッタリングによりGCT表面をクリーニングした。その結果、クリーニング無しのGCT/W界面のρcは8.0×10^-5 Ωcm^2、一方で、クリーニング有りのGCT/W界面のρcは6.7×10^-3 Ωcm^2であり、クリーニング無しの場合はρcが二桁程度低い事が分かった。表面分析の結果、表面クリーニングをしない場合は、GCT表面にGe酸化物並びにその下層にCuリッチ層が形成されており、それら表面層の存在によりρcが低くなっていることが分かった。GCTメモリセルにおいて、アモルファス/結晶間の電気抵抗比を大きくする手法として、Ar逆スパッタリングによるGCT表面クリーニングが極めて有効であることが明らかとなった。2.GeTeアモルファスの結晶化温度を上昇させる添加元素として、Cuのみならず、V、CrおよびNiが有効である事が分かった。特に、CrおよびVの添加は極めて有効であり、300°C以上の結晶化温度を実現する。

ただし、GeTeへのそれら遷移金属の過剰な添加は、結晶化後の二相分離を招き、PCMとして適切ではないことが分かった。3.また、Cr-Ge-Te三元化合物については、従来のPCMとは逆に、結晶の方がアモルファスよりも電気抵抗が高いといった特異な物性変化を示す事が分かった。前年度は、W電極と相変化材料間の接触界面抵抗率および相変化に伴う接触界面抵抗変化について定量的に評価を行うと共に、相変化材料/電極界面の電子状態評価より、相変化材料の界面近傍のバンドベンディングのに及ぼす金属電極依存性について実験を行ってきた。それら知見を踏まえ、本年度では、接触界面抵抗に及ぼす相変化材料、特にGe-Cu-Te三元化合物の表面クリーニングの影響を調査し、Ar逆スパッタリングにより、接触抵抗を制御できる事が分かった。この事は、表面クリーニングにより、実際のメモリセル抵抗比を制御できる事を意味する重要な知見となった。また、Ge-Cu-Te化合物のHAXPES実験を詳細に解析する事により、Cuの内殻d電子が、アモルファス相の高い熱的安定性と高速相変化の重要な役割を担っていることが分かってきた。それら知見を基に、他の遷移金属元素の添加を試みた結果、期待通り結晶化温度の上昇を得た。これら知見は、将来の相変化材料創製の新たな指針となる。以上のように、相変化材料/電極間の接触界面抵抗およびその相変化に伴う変化を定量的に明らかにし、また、新しい相変化材料の設計指針についても興味深い成果が得られており、当初の計画通りに進展している。本研究では、データ保持性に優れる高結晶化温度を持つ相変化材料(PCM)を開発すると共に、将来の微細相変化メモリ(PCRAM)セルの動作性能を左右するPCM/電極間の接触界面抵抗率ρcの定量的評価および電極材料依存性を決定する因子を解明する事を目的とし、本期間において以下の知見を得た。1.CGTを用いた単純なメモリセルを構築し(上下電極:タングステン)、そのメモリ性能を評価した。リセット時とセット字のメモリセル抵抗比は、約8×103程度であったが、この抵抗比は、CTLM法にて測定したCGTアモルファス/W間およびCGT結晶/W間のコンタクト抵抗比の8×103と一致し、メモリセル抵抗比はコンタクト抵抗比に支配される。また、その書換え耐久性は105回数程であった。2.CGTアモルファス/Wコンタクトは整流性を示し、ショットキー伝導を示す事が分かった。この事は、CGT材料においては、相変化材料と電極間の界面伝導メカニズムが極めて重要である事を示唆する。3.Cr-Ge-Te三元化合物(CrGT)については、従来のPCMとは逆に、結晶の方がアモルファスよりも電気抵抗が高いといった特異な物性変化を示す事を見出してきたが、そのアモルファス相と結晶相の電気抵抗率比は一桁程度と小さい。しかし、CrGT/Wコンタクトにおいては、アモルファス相と結晶相で二桁以上の抵抗差が得られる事が分かった。これは、CGTと同様に、微細メモリセルでは、相変化材料/電極界面がその伝導を支配する事に起因する。また、CrGTメモリセルでは、既存GSTに比較して、85%程度の動作エネルギー削減が可能である事が分かった。この低動作電力は、CrGTの高い結晶相電気抵抗とメモリセルの界面伝導支配によって実現されることを電流のパーコレーションモデルの観点から明らかにした。
我が国特許権侵害訴訟における出願経過の位置付け――比較法的観点から

2018年度は本研究課題の最終年度であり、研究をまとめるべく、主に日本・英国の判例学説の最新の動向を調査し比較を行った。日本法に関しては、均等論の適用要件の明確化を図ったマキサカルシトール知財高裁大合議判決(2016年)、同最高裁判決(2017年)の後の下級審判決を調査した。出願経過に関係するのは、均等論の第1要件(非本質的部分)と第5要件(出願手続における意識的除外等の特段の事情の不存在)であるところ、上記2判決の前後でこれらの要件の運用にどのような変化があった又はなかったのかを分析し、成果の一部を公表した(「均等論の現在」ジュリスト1522号(2018)94-95頁)。英国法に関しては、2017年に下されたActavis v. Eli Lilly最高裁判決が、従来の実務を転換し、均等論を正面から認め、また、一定の場合に出願経過を参照する可能性を示した。そこで、Actavis判決の内容とこれに対する学説の反応、及び、その後の下級審判決の動向を分析した。その結果、Actavis判決により出願経過が参照され得る特定の状況が例示されたものの、それに当てはまるとされる事案は決して多くないと考えられること、同判決がドイツ判例と軌を一にして示唆するように、補正がされた文脈(先行技術回避のためになされたか、それとも開示要件や新規事項追加禁止等の関係でなされたか)が意味を持つであろうこと、同判決は禁反言(estoppel)という形では論じていないこと等から、英国の立場と、日本(や米国)の出願経過禁反言とには依然として開きがあるという認識に至った。同判決は、有効性判断と侵害成否判断のためのクレーム解釈の関係についても議論を生んでおり、この点も日本法との関係で興味深い。以上について研究会(11月の株式会社商事法務知的財産判例研究会)で報告し、その後、論文にまとめる作業を行っている。2013年度は、我が国及び欧米諸国において、特許発明の保護範囲画定の局面で出願経過がどのように考慮され、そして逆にどのようには考慮されていないのかにつき、歴史的変遷も含めて整理・分析し、さらにそのような扱いの理由を考察した。これにより、我が国において所与のものとされてきた出願経過の位置付けを相対化する視座を得ることができた。この研究の成果の一部を5月の日本工業所有権法学会研究大会において報告し、また、拙稿「特許発明の保護範囲の画定と出願経過(1)-(8・完)」法学協会雑誌130巻6号、7号、8号、9号、10号、11号、12号(以上、2013年)、131巻3号(2014年)という形で公表した。主たる研究対象国であったドイツ・英国は、我が国とは異なり、出願経過の考慮に積極的態度を見せないのであるが、その理由として、クレーム・明細書・図面と出願経過の性質の異同、法的安定性の把握の仕方、信義則・禁反言の適用場面等につき、基本的な考え方に差異が見られることが判明した。本研究は、最終的には、出願経過の位置付けに関するあるべき規律を探求しようとするものであるところ、このテーマには、保護範囲画定方法全般、保護範囲画定と有効性判断の両局面のクレーム解釈基準の異同、後の侵害訴訟との関係において審査のあり方をいかに考えるか等の諸問題が関連していることが、2013年度の研究により一層明確となった。これらの点にまで目を配った検討が必要であり、次年度以降の課題となる。最近の欧州諸国の裁判例の動向は、出願経過の位置付けについて研究する意義が、世界的に見ても一層高まっていることを示すものと理解され得たため、引き続き諸国の動向に注意して研究を行うこととする。本研究課題について2013年度に公表した成果(「特許発明の保護範囲の画定と出願経過(1)-(8・完)」法学協会雑誌130巻6-12号、131巻3号)は、従来の日本では必ずしも整序しては論じられてこなかった、出願経過の(1)クレーム解釈資料性と(2)禁反言の問題を区別して論じるべきことを示すものであった。同成果についての再検討、及び、研究者や実務家との意見交換を踏まえて、2014年度は、上記(1)に関して、クレーム解釈資料論全般の検討に入った。出願経過も、クレーム、明細書・図面、公知技術と並び、「クレーム解釈の際にどの範囲の資料をどのように考慮することができるか」という問題にいう「資料」の一つであることから、他資料との関係を含める形でのより高次の視点から研究する必要があると考えたためである。また、本研究課題が直接の対象としているのは侵害訴訟であるが、現在の制度の下では、侵害訴訟においても特許の有効性判断が行われることから、有効性判断と技術的範囲画定の両局面に関してクレーム解釈方法を考える必要がある。この問題について、ドイツ法を主な比較法対象として検討するうちに、特許法は当業者がどこから発明の実体を把握できることを予定しているかという観点から、上記両局面で統一して、クレーム解釈の資料を、原則的に、クレーム・明細書・図面(特許書類)、及び、クレーム解釈の基準となる主体である当業者の一般的専門知識に限るという着想(「特許書類内限定説」)を得るに至った。これについて、2014年12月に早稲田大学の研究会で報告し(早稲田大学知的財産法制研究所知的財産特別講演会「クレーム解釈における明細書に開示した実施例およびその均等の機能」

西井志織発表標題「クレーム解釈の資料及び当業者基準の観点を中心として」)、論文(2015年7月刊行の論文集に掲載予定)にまとめた。2015年度は、前年度に引き続き、出願経過とクレーム解釈論の研究を進め、主に最近のドイツ法・英国法の判例・学説の検討を行った。具体的には、ドイツで2010年代前半に注目すべきBGH判決がいくつか出されたため、それまで含めた上で、クレーム解釈資料についてのドイツ判例・学説の基本的な姿勢をいかに整理できるか、分析した。その成果の一部として、論文「クレーム解釈資料に関する特許書類内外性基準ードイツ法からの示唆」(設樂隆一ほか編『飯村敏明先生退官記念論文集現代知的財産法実務と課題』(発明推進協会)所収)を公表した。ここでは、特許法は当業者がどこから発明の実体を把握できることを予定しているかという観点から、原則的に、クレーム解釈の資料は、有効性判断と技術的範囲画定の両局面で統一的に、クレーム・明細書・図面、及び、当業者の一般的専門知識に限るという着想について論じた。さらに、12月には、名古屋大学で行われた日台シンポジウムにおいて、“Claim Interpretation: especially the material for interpretation and the viewpoint of the person skilled in the art"との題目での英語報告を行った。上記着想について、研究者・実務家との意見交換を行い、日本の裁判制度・実務との整合性をさらに検討することとなった。また、英国法についても、出願経過の考慮に消極的な姿勢を示した2004年の貴族院判決後の下級審判決の動向を注視しながら、整理を続けた。以上の研究を進めていく中で、クレーム解釈において基準となるべき主体である「当業者」の位置付けについて、日本法とドイツ法・英国法との異同を研究する必要があるという認識に至り、それを含めた研究を構想中である。2015年度の研究は、昨年度に引き続き、出願経過のみならず他の資料にも目を向けた形でのクレーム解釈資料論に重点を置いたものとなり、他方で、禁反言の研究に関しては、成果を発表するまでに至らなかった。しかし、上記解釈資料論は、これまでの研究から得た成果に基づき、より高次の視点から問題を設定し直すことを試みたという意味で評価に値すると思われ、扱う問題の大きさからしても、こちらへの傾注はやむを得ないものと考える。解釈資料論については、ドイツ・英国を中心に判例・学説の調査を進めており、研究論文の発表、英語での報告を行うことができた。国際的な研究会では、外国の研究者との意見交換も行うことができ、今後の研究を進める上での示唆を得た。2016年度も、出願経過とクレーム解釈・均等論について、裁判例・学説を対象に、比較法研究を進める一年となった。日本では、2016年3月に、ボールスプライン最高裁判決(1998年)以降、知財高裁が大合議として均等論の適用を審理・判断した初めての判決が下された。その中で、均等論の第五要件(「対象製品等が特許発明の特許出願手続において特許請求の範囲から意識的に除外されたものに当たるなどの特段の事情もないとき」。出願経過禁反言の原則を述べたものと理解されている。)についても、いわゆるdedicationの法理を含む重要な判示がなされた。
量子通信路におけるユニバーサル符号化と量子系での群共変的漸近理論の構築

今年度は量子系のユニバーサルな情報源符号化の簡単な構成をMatsumotoと共同に行った。この構成は以前にHayashi-Matsumotoが行ったものに比べかなりシンプルであるという利点を持つだけでなく、以下の設定にも応用できるという利点がある。一般に、量子情報源符号化では、ある確率に従って量子状態が発生するという仮定の下でその量子状態を送る際に必要な空間の次元を減らすことがテーマになる。しかし、その他に、エンタングルした量子状態を伝送するという問題設定も可能であり、この場合、エンタングルした量子状態の片方を保存するために必要な次元を見積もることがテーマとなる。本研究では、そのような目的のためにもここで構成した圧縮法が有効であることも示した。本研究では、情報源に仮定する確率分布が独立同一分布であったため、Markov情報源などのような場合には直接適用できない。しかし、本研究でなされた構成方法は、一般の場合につながるものであり、今後、相関のある情報源にも適用する圧縮法の構成が期待される。その他、本研究の基礎となる研究では群論的対称性が用いられた。この手法は色々な量子情報理論のテーマに適用することが期待できる。その他、部分的にエンタングルした量子状態から完全にエンタングルした量子状態を局所操作と古典通信のみで構成する際の成功確率をMatsumoto, Koashi, Morikoshi, Winterとの共同研究で厳密に行った。このような操作はエンタングルメント集中化と呼ばれ、量子情報理論のテーマの一つである。この研究では、先行研究としてBennetteらの漸近的設定で、漸近的に失敗確率が0となる場合の研究と、Morikoshi-Koashiによる失敗確率0でどれだけの完全にエンタングルした状態が構成できるかという研究があった。これら2つの研究では、微妙に設定が異なるため、生成できる完全にエンタングルした状態の量が異なる。本研究ではこれらの2つの設定での限界の差を埋めるべく、中間的な問題設定として、失敗確率に指数拘束を課した場合を考え、この場合での生成できる完全にエンタングルした状態の量を見積もった。実用的視点を強調するのであれば、単に失敗確率が漸近的に0になる場合を考えるのではなく、それが0に収束する速さをみる必要がある。
EBウイルス陽性胃癌のTETを介した網羅的エピゲノム変化の解明

胃癌は大きく3つのサブタイプに分類され、Epstein-Barr(EB)ウイルス陽性胃癌はヒト悪性腫瘍の中でも最もDNA高メチル化を呈するサブタイプを形成する。EBV感染そのものがこの特異的な異常高メチル化を誘導する原因であるが、低メチル化胃癌上皮細胞株へin vitroにEBV感染を行うと、DNA脱メチル化酵素であるTETファミリーの発現が抑制され、中でもTET2がメチル化抵抗因子として働くことが明らかとなった。本研究では、メチル化抵抗因子であるTET2を過剰発現させた胃上皮細胞株にEBウイルスを感染させることに成功し、TET2の標的遺伝子に関して通常のメチル化誘導が阻害されること、また通常の感染時に比べヒストン活性化マークH3K4me3及びH3K27acが上昇することを明らかにした。それらTET2の標的と考えられる遺伝子において発現上昇も伴った。このことから、TET2と共にヒストン修飾変化に働く協働因子の存在が示唆されたため、それらの蛋白質を同定することを目的に、Haloタグを付加したTET2を胃上皮細胞株にて強制発現させた。細胞破砕液をビーズ精製し、TET2結合蛋白質をSDSPAGEゲルにて確認した。またTET2の協働因子候補のノックダウン胃上皮癌細胞株を作成した。TET2共同因子候補ノックダウン株においてもH3K4me3, H3K27ac等ヒストン活性化マークを標的としたChIP-seq解析を行い、TET2ノックダウン時の抑制変化との重複を認め、それらの因子が協働している可能性が考えられた。共免疫沈降後のウェスタンブロッティング及び、MALDI-TOF MS解析によりそれら協働蛋白質を同定する予定である。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。今年度の研究では、メチル化抵抗因子であるTET2を過剰発現させた胃上皮細胞株にEBウイルスを感染させることに成功し、TET2の標的遺伝子に関して通常のメチル化誘導が阻害されること、またヒストン活性化マークが上昇することを明らかにした。それらの標的遺伝子において発現上昇も伴った。このことから、ヒストン修飾変化に働くTET2の協働蛋白質の存在が示唆されたため、それらの蛋白質を同定することを目的に、Haloタグを付加したTET2を胃上皮細胞株にて強制発現させた。MALDI-TOF MSにてそれらの結合蛋白質を同定する。TETを介した包括的なエピゲノム解析は、このin vitro EBウイルス感染モデルを用いることにより詳細に解析することができるが、その成果はEBウイルス陽性胃癌のみならず、TET関連遺伝子変異による血液腫瘍やグリオーマ含め、多様な高メチル化疾患分子機構解明に寄与し、治療薬開発や既存薬再開発、より効率的な診断方法の確立等直接的に幅広く医学生物学に貢献する。今年度は、メチル化抵抗因子であるTET2を過剰発現させた胃上皮細胞株にEBウイルスを感染させること(TET2OE_EBV)、及びEBV感染株にTET2を過剰発現させることに成功した(EBV_TET2OE)。TET2OE_EBVに関しては、TET2の標的遺伝子において通常の感染時のメチル化誘導が阻害される領域があることを確認した。それら過剰発現によりメチル化誘導が阻害される遺伝子の発現上昇も伴った。またエンハンサー領域のヒストン修飾変化も認められ、周辺遺伝子の活性化及び不活化を通して癌化に寄与する可能性が示唆された。TET2のノックダウンのみによってもそれらヒストン活性化マークの減少の一部が認められた。それらの領域において、TET2と協働して働くエピゲノム関連蛋白質を同定することを目的に、Haloタグ付のTET2を胃上皮細胞株にて過剰発現させた。細胞破砕液をカラム精製することで、SDSPAGEゲルにてTET2に結合していると考えられる蛋白質の確認に成功した。今後はMALDI-TOF MSにてそれらの精製済蛋白質を同定する。

このことから、TET2と共にヒストン修飾変化に働く協働因子の存在が示唆されたため、それらの蛋白質を同定することを目的に、Haloタグを付加したTET2を胃上皮細胞株にて強制発現させた。細胞破砕液をビーズ精製し、TET2結合蛋白質をSDSPAGEゲルにて確認した。またTET2の協働因子候補のノックダウン胃上皮癌細胞株を作成した。TET2共同因子候補ノックダウン株においてもH3K4me3, H3K27ac等ヒストン活性化マークを標的としたChIP-seq解析を行い、TET2ノックダウン時の抑制変化との重複を認め、それらの因子が協働している可能性が考えられた。共免疫沈降後のウェスタンブロッティング及び、MALDI-TOF MS解析によりそれら協働蛋白質を同定する予定である。先行研究により、EBV感染によりエンハンサー領域のヒストン修飾に変化が生じ、周辺遺伝子の活性化、不活化を通して癌化に寄与する可能性が報告された。申請者はTET2ノックダウンのみによってもそれらの変化の一部が生じることを明らかにし、TET2を介したヒストン修飾変化及びDNAメチル化への影響を解明する。Haloタグを付加したTET2を胃上皮細胞株にて強制発現させ、カラム精製を行うことにより、TET2と協働して働くと考えられる蛋白質の抽出をSDSPAGEゲルにて確認した。今年度はそれらのサンプルをMALDI-TOF MSにて解析し、抽出されたエピゲノム関連因子を同定する。それらの因子や産物であるヒストン修飾の局在及び、TET酵素、DNAメチル化、ヒドロキシメチル化の局在をEBV感染前後、必要に応じて強制発現・ノックアウト下にて比較検討することにより、感染による異常高メチル化への相反的ないし協調的な作用を、TETとの相互作用を含めゲノム網羅的に解析する。それらTET2と協働していると考えられるヒストン修飾酵素に制御される遺伝子群及びその下流の遺伝子群の機能解析として、増殖制御作用の有無をコロニー形成能やヌードマウスでの腫瘍形成能で検証する。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。