hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
生体内レドックス・酸素濃度の高解像度3Dマッピング法の開発

本研究では、レドックスと酸素濃度の両方を非侵襲かつ高解像度で検出するオーバーハウザーMRI(OMRI)とMRIの3D融合システムを開発し、消化器系疾患の病態解析への応用を目指した。擬似試料での酸素濃度重畳アルゴリズムを検証した。しかし、十分な精度での3D情報取得には、OMRIの時間分解能向上が望まれた。大腸炎モデルマウスで、炎症進展に伴い直腸局所から大腸全体に炎症性シグナル、レドックス変動が拡がることを明らかにした。今後、OMRIの性能向上によるレドックス・酸素濃度の解析精度向上が期待される。レドックスバランス異常の捕捉は疾患の予防や早期診断に繋がり、低酸素領域の検出は腫瘍進展を推測可能であることから、その生体イメージング技術の開発は非常に重要かつ急務である。昨年度は2次元の酸素濃度画像作成ソフトを作成し、本オーバーハウザーMRI(OMRI)システムでの酸素濃度計測手法の検討を擬似試料で行った。本年度は、まず、酸素濃度計測アルゴリズムについて、擬似試料および動物個体で検証した。次に、重畳ソフトを3次元に拡張し、数値シミュレーションにて検証を行った。一方、レドックスと酸素濃度の3次元情報を、十分な精度で取得するには、OMRIの時間分解能の向上が望まれた。そこで、炎症モデルでの3次元画像解析を円滑に進め、炎症の発症・進展過程でのレドックス変動領域を同定し病態機序の解明に繋げる目的で、潰瘍性大腸炎の動物モデルとして汎用されているデキストラン硫酸ナトリウム(DSS)モデルを用い、大腸の部位とレドックス変動およびその上流の炎症イベントとの関連を検討した。2次元OMRI撮像により、DSS5日目では直腸の細胞内で活性酸素種(ROS)が産生し7日目では大腸全体で細胞内外ROSが産生すること、それらのROS産生はiNOS阻害により抑制されるのに対し、非特異NOS阻害では逆に増加させることを明らかにした。また、DSSにより結腸下部と直腸で発現増強したiNOS由来のNOは、炎症性サイトカインTNF-alpha産生を誘導し、大腸全体における内皮接着分子ICAM-1やP-selectinの発現を増強させ、好中球浸潤を引き起こすことで活性酸素産生を増大し、病態形成に関与することを明らかにした。今後、OMRIの性能向上により詳細な部位解析ができれば、レドックス変動解析や酸素濃度解析の精度が向上し、病態機序解明や創薬シーズ開発に繋がるものと期待される。オーバーハウザーMRI(OMRI)装置から得られるレドックス変動や酸素濃度に関する情報とMRI装置から得られる解剖学的情報を空間的に融合することができれば、種々の疾患での病態解析の精度向上や新薬シーズの早期創出が期待される。そこで本研究は、3次元(3D)のOMRI画像とMRI画像を重畳する融合システムを開発し、大腸ガン等の疾患モデルで検証することを目的に、まずソフト開発より着手した。OMRIを用いた2次元の酸素濃度画像作成の報告例を元に、OS Windows 7搭載パソコンにてVisual Basic言語で2次元の酸素濃度画像作成ソフトを作成した。異なる酸素濃度条件下での酸素濃度感受性ラジカルを含む擬似試料を用いて求めた計算値と実測値の間で非常に良い相関が得られたことから、本OMRIシステムでの酸素濃度計測手法を確立した。次に3DでのMRIとの重畳ソフトを試作し、擬似試料を用いて検証中である。また、次年度に実施予定である、消化管粘膜炎症モデルでのレドックス変動部位と粘膜損傷部位との空間的融合および腫瘍モデルでの低酸素領域、レドックス変動部位と解剖学的情報との空間的融合に先立ち、正常マウスを用いて酸素濃度画像との融合にも適したスライス面や厚さ、枚数、ボクセルサイズ、撮像シーケンスなど各種撮像条件の予備検討を行った。重畳ソフトの検証が終わり次第、速やかに疾患モデルへの応用が可能となり、炎症や腫瘍の発症・進展過程でのレドックス変動領域を同定する精度が格段に向上し、レドックス関連病態解析や新薬シーズ創出への展開が期待される。本研究では、3次元OMRI/MRI重畳ソフトの開発と疾患モデル動物への応用に大別でき、本年度は重畳ソフト開発の検証まで終える計画であった。現在、3D-OMRI/MRI重畳ソフトを試作し、擬似試料を用いて検証中であるため、完全に計画通りの進捗ではないが、疾患モデルへの応用に先立ち、正常動物での各種撮像条件の予備検討を終えており、総合的には概ね順調に進展していると判断した。次年度の研究計画は、(1)重畳ソフトの検証、(2)消化管粘膜炎症モデルを用いたレドックス変動部位と解剖学的部位との空間的融合の検証、(3)腫瘍モデルを用いた低酸素領域・レドックス変動部位と解剖学的部位との空間的融合の検証の3項目である。

(1)について、OMRIおよびMRIの空間的感度分布等を精査し、必要に応じてキャリブレーションを行うことで、空間的融合の検証を行う。その後、(2)を実施するにあたり、易還元性ラジカルはレドックス感受性が高い反面、撮像中に消失する可能性があることから、適度なレドックス感受性を有する造影剤を検討する。(3)を実施するにあたり、まず腫瘍領域での低酸素が報告されている移植腫瘍モデルを用いて酸素濃度、レドックスと解剖学的情報の3次元重畳を検討し、続いて大腸ガンモデルでの応用を試みる。3D重畳ソフトを疾患モデルで検証するための実験動物やモデル作成のための化学物質、造影剤、組織学的病態評価や酸化ストレス評価のための試薬を中心に購入する。旅費として、国内学会にて毎年2回研究成果を発表する計画で、1回あたり75千円×2=150千円、国際学会にて毎年1回研究成果を発表する計画で、1回あたり300千円×1回=300千円を使用する予定である。また、成果をまとめるための印刷費として100千円を使用する予定である。
ＣＤ２６の腎疾患における先端治療法としての分子標的療法の基礎的研究

CD26はdipeptidyl peptidaseIV(DPPIV)酵素を含む分子である。CKD患者における血清の可溶性CD26濃度及びCD26DPPIV活性の検討を行なった結果、両者とも腎機能に依存しないことが判明した。さらに生物学的製剤の治療を受けた関節リウマチ患者における血清の可溶性CD26濃度及びCD26DPPIV活性はRAの活動性の指標であるDAS-28ESR及びDAS-28CRPのいずれとも有意な負の相関を示した。以上のことから可溶性CD26は腎機能に依存せず炎症性疾患において疾患活動性の有力なバイオマーカーとなり得る可能性が示唆された。CD26 dipeptidylpeptidase IV(DPPIV)は腎臓や血管内皮に発現していることから、血清可溶性CD26が糸球体腎炎、血管炎及び膠原病に伴う腎障害において疾患活動性の有用なバイオマーカーとなる可能性が推測される。一方DPPIV阻害剤による糖尿病治療の治療効果には個体差が存在する。その原因として個体間のCD26DPPIVの酵素活性、血清可溶性CD26濃度、糖尿病性腎症及び慢性腎臓病における腎臓及び血管内皮でのCD26の発現量の低下等が推測される。順天堂大学大学院医学研究科免疫病・がん先端治療学講座森本幾夫教授(東京大学名誉教授)の協力のもと慢性腎臓病(chronic kidney disease:以下CKD)患者の血清可溶性CD26濃度及びDPPIV活性を測定した結果、CKD各stageにおける血清可溶性CD26DPPIV及びCD26DPPIV活性に有意差は認められなかった。そこで腎病理組織検査において半月体形成性糸球体腎炎を認めるANCA関連血管炎患者において血清可溶性CD26DPPIV及びCD26DPPIV活性を検討した。その結果、ANCA関連血管炎治療前後において、腎機能障害の程度にかかわらず、疾患活動性が高い時は血清可溶性CD26DPPIV及びCD26DPPIV活性は共に低値であったが、治療に伴い疾患活動性が低下するに従って血清可溶性CD26DPPIV及びCD26DPPIV活性は治療前値より上昇する傾向が認められた。CD26 dipeptidylpeptidase IV(DPPIV)は腎臓や血管内皮に発現していることから、血清可溶性CD26が糸球体腎炎、血管炎及び膠原病に伴う腎障害において疾患活動性の有力なバイオマーカーとなる可能性が推測される。DPPIV阻害剤による糖尿病治療の治療効果には個体差が存在する。その原因として個体間のCD26DPPIVの酵素活性、血清可溶性CD26濃度、糖尿病性腎症及び慢性腎臓病(chronic kidney disease:以下CKD)における腎臓及び血管内皮でのCD26の発現量の低下等が推測される。東京大学医科学研究所先端医療研究センター(森本幾夫名誉教授)の協力のもとCKD患者の血清可溶性CD26濃度及びDPPIV活性を測定し、CKDにおける血清可溶性CD26及びCD26DPPIV活性比を検討した。血清可溶性CD26はCKD stage1+2群:1162±421,CKD stage 3群:1173±400,CKD stage 4+5群:1378±462(ng/ml)と3群間では有意差は認められなかった。また血清CD26DPPIV活性比はCKD stage 1+2群:19.7±3.0,CKD stage 3群:19.7±2.5,CKD stage 4+5群:19.9±3.7(nmol/min/μg)と3群間では有意差は認められなかった。血清可溶性CD26は一部の疾患においてその濃度の増減を認める事が報告されている。また血清CD26DPPIV活性も疾患によりその活性比が低下する事が報告されている。本検討ではCKD各stageにおける血清CD26DPPIV及びCD26DPPIV活性の有意差は認められなかったが、CKD各stag内における血清CD26DPPIV及びCD26DPPIV活性の増減は認められた(第55回日本腎臓学会総会にて報告)。そこで生物学的製剤による治療を要する関節リウマチ患者におけるCD26DPPIVの疾患活動性に関して検討した。なお本研究に関しては東京大学医科学研究所倫理委員会の審査にて承諾を得た。対象は31名の関節リウマチ患者であった。

追跡期間は約28週、DAS28-ESR:5.98±1.28, DAS28-CRP:5.32±1.26であった。ベースラインのsCD26は、RA活動性の指標であるDAS28-ESRおよびDAS28-CRPのいずれとも、有意な負の相関を示した。この事から、sCD26が低いほどRAの活動性が高いことが示唆された。更にsCD26の変化量は、DAS28-ESRおよびDAS28-CRPのいずれの変化量とも有意な負の相関を示した。この事から、sCD26の変化はRA活動性の変化を良好に反映することが示唆された。ベースラインのsCD26-DPPIVは、DAS28-ESRとは有意な相関を示さなかった一方で、DAS28-CRPとは有意な負の相関を示した。以上のことから、炎症性疾患においてCD26DPPIVは疾患活動性の有力なバイオマーカーとなり得る可能性が示唆された。腎臓病学検討対象疾患の検体の定期的な入手が困難であり、解析可能となる十分な検体数が得られていないため、研究課題の遂行にやや遅れを認めている。対象疾患患者の協力が得られており、個々の疾患での検討は可能と思われる。今後、血清CD26DPPIV及びCD26DPPIV活性がいかなる腎疾患及び慢性腎臓病のバイオマーカーになりうるか、個々に検討する予定である。CD26の腎疾患における先端治療法としての分子標的療法の基礎的研究の課題における臨床検体を用いた生化学的また免疫組織化学的検討を継続する予定である。特に糸球体腎炎、血管炎及び膠原病に伴う腎障害を認める疾患患者の疾患活動性と血清可溶性CD26濃度及びCD26DPPIV活性の相関を検討し、バイオマーカーとしての有用性に関して評価する。血清CD26DPPIV及び血清CD26DPPIV活性がいかなる疾患において有用なバイオマーカーとなるかを検討する。また血清CD26DPPIVの増減が生じる機序を検討し、疾患コントロールに対する有用性の有無に関して検討する予定である。CD26の腎疾患における先端治療法としての分子標的療法の基礎的研究において、現在、健常人を対象とした基礎的研究に関してはおおかた順調に達成できているが、臨床検体を用いた研究に関しては解析可能となる十分な検体が得られていないため、その研究に必要とする研究費に残金が発生した状況である。次年度ではCD26の腎疾患における先端治療法としての分子標的療法の基礎的研究の課題における臨床検体を用いた生化学的また免疫組織化学的検討を継続する予定である。未使用の助成金に関して、前述の検討を遂行するための免疫学用試薬及び生化学用試薬等の消耗品費に使用する予定である。また本研究成果を学会発表するための旅費及び論文発表用の経費として使用する予定である。引き続き、当該研究を遂行するために本年度の研究費残金及び次年度の研究費を使用する。また、本研究で得られた成果を学会、雑誌等で報告する目的で使用する。
日本語の交差依存文が誘発するERP計測を通したヒト固有の信号系列処理の検討

自然言語の文では,時系列上で離れた語が,隣接する語よりも強い意味的結びつきを持つ「不連続依存」が生じうる。不連続依存は自然言語の文が有限状態文法の生成力を超えることを示す現象で,ヒトの音声伝達を他種と区別する根拠となっていた。但し,ワーキングメモリを備えたローカリストネットワークが,統語構造に対応する内部表現を仮定せずに,英語関係節における不連続依存を生成することに成功し,また,不連続依存制約をワーキングメモリ制約に還元する可能性が示された。本研究では,ヒト言語の文法を有限状態文法に還元する可能性を検討するために,不連続依存制約に対するワーキングメモリと統語構造の影響を事象関連電位を指標として考察した。(1)(2)に示す2種類の複文について,従属節目的語を文頭に置くことで不連続依存を操作し(下線部),従属節主語を保持負荷の高い固有名または負荷の低い「私」とすることで,不連続依存可否に対する従属節種とワーキングメモリ負荷の効果を考察した。(1)目的語名詞節内との不連続依存文借金を|s田中は|s明智/私が返済したと|弁護士に証言した|。(2)副詞節内との不連続依存文*交通塾を|s田中は|s土屋/私が起こしたので|事故現場に駆けつけた|。文を文節毎に視覚呈示した結果,不連続依存文の従属節主語呈示後約400msでワーキングメモリ負荷を示す陰性波が左前頭部に現れ,また,固有名についての振幅は「私」よりも大きかった。さらに(1)と(2)の対比では,文法性の低い(2)にのみ,従属節動詞呈示後約600msで頭頂から後頭にかけて統語的制約違反を表す陽性成分が現れた。本研究の結果は,ワーキングメモリ制約とは独立した,統語構造に対する不連続依存制約の存在を示している。したがって,文処理の脳内メカニズムはワーキングメモリを備えた有限状態オートマトンとは異なると考えられる。自然言語の文では,時系列上で離れた語彙項目が,隣接する語彙項目よりも強い意味的結びつきを持つことがある。これは「不連続依存」と呼ばれる現象で,ヒト種固有の脳機能である。本研究は日本語の不連続依存が誘発する事象関連電位の測定を通して,ヒト固有の信号系列処理とその神経基盤を考察する。本年度はまず(1)(2)の様に,従属節目的語を文頭に置いた不連続依存文について文法性判断を問う行動実験を行い, (2)の文法性が(1)よりも遙かに劣ることを見いだした。(1)筆箱を美幸は[哲夫が盗んだと]クラスメートに言い張った。(2)*脚を上田は[岩井が骨折したとき]救急病院に連絡した。節境界を越える英語の不連続依存については,従属節の統語的特性が制約を与えることが知られていて,本研究は日本語においても,目的語名詞句(1)より副詞節(2)の方が強い制約を課していることを実験的に示した,ほとんど初めての研究である。ただ近年,不連続依存を統語構造ではなく実時間文処理における作動記憶制約に還元しようとする立場があり,本研究では不連続依存に対する作動記憶制約と統語構造の影響をERP計測によって峻別する予定である。(1)(2)のタイプの文を分節毎にRSVP法で視覚提示し,各文節位置における誘発電位を測定する実験が進行中で,研究成果は本年夏の神軽科学大会で報告する予定である。
クリプト藻における光運動反応の系統・分類学的評価

フィコビリン色素組成および細胞構造の異なるクリプト藻5属6種について細胞個体レベルで光運動反応特性を解析し、従来より論議されてきた光受容体とフィコビリン色素との関連を考察するとともに、主として形態上のデータと比較することにより、系統・分類学的側面からの検討を行った。結果は以下の通りである:1.Chroomonas nordstedtiiは顕著な正の走光性を示し、その極大は560nm付近で、以前調査されたクリプトモナス属2種と非常によく似た走光性作用スペクトルが得られた。したがって、これら3種のクリプト藻においては走光性に関与する光受容系の分光特性は普遍的であり、その光受容体は560nm付近に吸収極大をもつ物質である可能性が強く示唆された。また予備実験の結果Cryptomonas platyurisとRhodomonas salinaもおそらく同様の反応特性をもつと考えられる。一方、これら3属でフィコビリン色素組成がお互いに異なることを考慮すると、クリプト藻の走光性の光受容体がフィコビリン色素である可能性は極めて低いと結論される。2.Chroomonas coeruleaは上述のCh.nordstedtiiと同一のフィコビリン色素を有するが、420nm付近に作用極大をもつ負の走光性を示し、その光受容体系は前3種とは全く異なっていた。本種は調査したクリプト藻のうち唯一眼点をもつことから、この違いには眼点が何らかの形で関与していると推測される。3.Chilomonas parameciumは全く光に反応しなかった。このことは本属が葉緑体を持たない点を除いて形態上クリプトモナス属に非常に近縁であるとみなされることを考え合わせると、非常に興味深い。4.Hemiselmis virescensでは刺激光のオン・オフにより運動・静止が切り替えられるという他属では見られない現象が観察された。このことは、形態的特徴とともに、本属のクリプト藻内での系統的な特殊性を示唆する。
8字型閉環連続体ヘリセンの合成とその構造特異性

非平面型の縮合芳香族炭化水素は構造有機化学の分野の中でも特に興味がもたれる化合物群であり、その分子内に存在する大きな歪みが芳香族性や反応性などにどのような影響を与えるかに大きな関心が向けられている。特に、複数のベンゼン環がオルト縮合してできるサーキュレン化合物はフラーレン分子の部分構造ともなることから、この物理的・化学的諸性質には大変興味がもたれる。これまでに、ベンゼン環が7個ドーナツ状につながった〔7〕サーキュレン(1)やベンゼン環が10個8の字型につながった〔7.7〕サーキュレン(2)の合成に成功しているので、この低次同族体である8の字型の〔6.7〕サーキュレン(3)および〔5.7〕サーキュレン(4)の合成を検討した。〔6.7〕サーキュレン(3)の合成研究では、この合成に必要なジブロモペンタ〔6〕サーキュレン誘導体(5)の合成をおこない、これを用いてダブルサーキュレン骨格をもつジエン(6)の誘導に成功している。今後は、(6)より光閉環をへて目的とする(3)を合成したい。一方、〔5.7〕サーキュレン(4)の合成研究では、この合成に必要なジブロモヘキサ〔7〕サーキュレン誘導体(7)の合成に成功しているので、これより目的とする(4)への誘導を検討していきたい。
脂肪細胞から分泌されるlL-1Raの役割

炎症性サイトカインは、炎症のメディエーターとして知られていると同時に、神経・免疫・内分泌系に対して様々な作用を及ぼすことが知られている。最近のWeisbergらの研究から、肥満に伴って、脂肪組織において、弱い慢性、炎症が引き起こされ、肥満の脂肪組織にマクロファージの浸潤が起こっていることが報告されている。また、Meier, C.Aらの研究から、IL-1 receptorアンタゴニスト(IL-1Ra)の血中レベルが、肥満患者で上昇しており、IL-1Ra遺伝子が、脂肪組織において発現していることが示されているので、IL-1Raは、肥満や代謝を制御するアディポサイトカインのひとつであると捉えることが出来る。我々は、これまでに、IL-1Ra欠損マウスが痩せており、血中インスリンレベルが低下していることを報告した(1).本研究において、我々は、IL-1システムの肥満、代謝における役割を検討することを目的として研究を行っている。サイトカインネットワークを介した肥満制御IL-1Ra欠損マウスにおけるIL-1の過剰シグナルが痩せを引き起こすサイトカインネットワークを解析した。他のグループの研究から、IL-6欠損マウスが肥満を引き起こすことが報告されており、IL-1は、様々な細胞種においてIL-6を強く誘導することが報告されているので、IL-1とIL-6の関係、IL-1の体重制御及びグルコース代謝における役割が、IL-1の下流でIL-6が関与している可能性を検討した。そのために、IL-6、IL-1Raダブル欠損マウスを作成した。IL-6/IL-1Raダブル欠損マウスは、IL-6欠損マウスと比べて有意に痩せており、白色脂肪組織が減少し、インスリン感受性が良くなっており、血中インスリンレベルが低下していた。これらの結果から、IL-1Ra欠損マウスで見られる痩せは、IL-6に依存しないことが明らかになった。また、IL-6、IL-1ダブル欠損マウスを作成し、肥満に対する影響を検討した。IL-6/IL-1ダブル欠損マウスは、野生型マウス、IL-6欠損マウス、IL-1欠損マウスと比べて若い週齢から有意に肥えており、白色脂肪組織が増加していた。これらの結果から、IL-1とIL-6の欠損は、相乗的に肥満を引き起こすことが明らかになった(Chida et al.2006Diabetes in press.)。肥満に伴う炎症性変化におけるIL-1システムの役割肥満におけるIL-1システムの役割を検討するため、IL-1欠損マウスに高脂肪食を負荷し、糖尿病発症に対する影響を検討した。IL-1欠損マウスでは、肥満に伴って起るインスリン抵抗性が抑制されていることが明らかになった。白色脂肪細胞における遺伝子発現パターンの解析から、インスリン抵抗性に関与することが知られているTNF-aやMCP-1の発現上昇が抑制されており、脂肪細胞における炎症が抑制されていることが示唆された。このことから、肥満に伴って脂肪細胞で誘導されるIL-1Raは、肥満に伴う炎症によって誘導される炎症に対して抑制的に働き、善玉のサイトカインとして働いている可能性が示唆された。我々は、これまでに、通常食条件下でのIL-1Ra欠損マウスにおけるエネルギー産生を解析したが、野生型マウスとの差は見出せなかった。IL-1Ra KOマウスは、高脂肪食に対して抵抗性で、太らず、血糖値やインスリンレベルも正常である。この条件下で、改めてエネルギー産生を解析したところ、高脂肪食負荷によって、肥満した野生型マウスと比べて、エネルギー産生が昂進し、RERが低下していることを見出し、脂肪酸酸化が昂進している可能性が示唆された。さらに、内臓脂肪では、顕著な差が見られなかったが、皮下白色脂肪細胞の肥大化が抑制されていることが明らかになった。これらのことから、IL-1Ra KOマウスは、脂肪細胞における脂肪酸酸化が促進されていることが痩せの一つの原因となっている可能性が示唆された。IL-1,TNF-α,IL-6のような炎症性サイトカインは、炎症のメディエーターとして知られていると同時に、神経・免疫・内分泌系に対して様々な作用を及ぼすことが知られている。最近のWeisbergらの研究から、肥満が慢性、弱い炎症を伴っており、肥満の脂肪組織にマクロファージの浸潤が起こっていることが報告されている。我々は、IL-1Ra欠損マウスが痩せており、血中インスリンレベルが低下していることを報告した。本研究において、我々は、IL-1Ra欠損マウスとIL-1α/β欠損マウスを用いて、IL-1システムの肥満、代謝における役割を検討する。本年度は、IL-1Ra欠損マウスにおけるIL-1の過剰シグナルが痩せを引き起こすサイトカインネットワークを解析した。他のグループの研究から、IL-6欠損マウスが肥満を引き起こすことが報告されており、IL-1は、血球においてIL-6を強く誘導することが報告されているので、IL-1とIL-6の関係、IL-1の体重制御及びグルコース代謝における役割が、IL-1の下流でIL-6が関与している可能性を検討した。

IL-6/IL-1Raダブル欠損マウスは、IL-6欠損マウスと比べて有意に痩せており、白色脂肪組織が減少していた。インスリン感受性が良くなっており、血中インスリンレベルが低下していた。これらの結果から、IL-1Ra欠損マウスで見られる痩せは、IL-6に依存しないことが明らかになった。炎症性サイトカインは、炎症のメディエーターとして知られていると同時に、神経・免疫・内分泌系に対して様々な作用を及ぼすことが知られている。最近のWeisbergらの研究から、肥満に伴って、脂肪組織において、弱い慢性、炎症が引き起こされ、肥満の脂肪組織にマクロファージの浸潤が起こっていることが報告されている。また、Meier, C.Aらの研究から、IL-1 receptorアンタゴニスト(IL-1Ra)の血中レベルが、肥満患者で上昇しており、IL-1Ra遺伝子が、脂肪組織において発現していることが示されているので、IL-1Raは、肥満や代謝を制御するアディポサイトカインのひとつであると捉えることが出来る。我々は、これまでに、IL-1Ra欠損マウスが痩せており、血中インスリンレベルが低下していることを報告した(1).本研究において、我々は、IL-1システムの肥満、代謝における役割を検討することを目的として研究を行っている。サイトカインネットワークを介した肥満制御IL-1Ra欠損マウスにおけるIL-1の過剰シグナルが痩せを引き起こすサイトカインネットワークを解析した。他のグループの研究から、IL-6欠損マウスが肥満を引き起こすことが報告されており、IL-1は、様々な細胞種においてIL-6を強く誘導することが報告されているので、IL-1とIL-6の関係、IL-1の体重制御及びグルコース代謝における役割が、IL-1の下流でIL-6が関与している可能性を検討した。そのために、IL-6、IL-1Raダブル欠損マウスを作成した。IL-6/IL-1Raダブル欠損マウスは、IL-6欠損マウスと比べて有意に痩せており、白色脂肪組織が減少し、インスリン感受性が良くなっており、血中インスリンレベルが低下していた。また、IL-6、IL-1ダブル欠損マウスを作成し、肥満に対する影響を検討した。IL-6/IL-1ダブル欠損マウスは、野生型マウス、IL-6欠損マウス、IL-1欠損マウスと比べて若い週齢から有意に肥えており、白色脂肪組織が増加していた。これらの結果から、IL-1とIL-6の欠損は、相乗的に肥満を引き起こすことが明らかになった(Chida et al.2006Diabetes in press.)。肥満に伴う炎症性変化におけるIL-1システムの役割肥満におけるIL-1システムの役割を検討するため、IL-1欠損マウスに高脂肪食を負荷し、糖尿病発症に対する影響を検討した。IL-1欠損マウスでは、肥満に伴って起るインスリン抵抗性が抑制されていることが明らかになった。
ゲノム解析と実験的検証から探る極小イントロンの存在意義とそのスプライシング機構

遺伝子配列中、タンパク質に翻訳されない部分(イントロン)の長さを集計すると、ほとんどの真核生物では最頻値周辺に分布の集中(クラスタ)があり、イントロンは、クラスタ以短では存在しないと考えられていた。本研究では、ヒトにおいてクラスタ以短にもイントロン(ultra-short intron)が存在することを明らかにした。ultra-short intronは近縁種間で保存され、ヒトへの進化の過程でそれぞれ独立に派生したことが分かった。これらの特徴を検討することで、複数の生成機構があることが推察された。「イントロンの長さは如何に決定されるのか」という問いに対し、2009年度は次の3方面からアプローチした。1.各モデル生物における全遺伝子のイントロン情報抽出と解析モデル生物では最頻値より短いイントロンは急激に少なくなるという分布パタンはスプライセオソームの構成や立体構造を解く手掛かりを与えるとの仮説に基き、ヒトのイントロン長をヒト転写物DBを元に集計したところ、イントロン長65塩基から最頻値の83塩基まで転写物総数および座位あたりの転写物数が急激に増加していた。また、65塩基長より短くとも座位あたり複数の転写物が存在し、しかも近縁種の転写物に相同なギャップが保存されている、イントロン有力候補が認められた。よって、ヒトイントロンには65塩基長以上の長さが必要であるが、それよりも短いイントロンが存在し、特殊な条件あるいは新規機構のもとでスプライシングされると考えられた。2.スプライシング因子の進化的解析まずスプライシング因子のオロソログの系統ごとの出現や消失を明らかにするために、反応初期のA複合体タンパク質100種のおよび次のB複合体タンパク質176種について、真核生物各分類群23種のオルソログを独自のアルゴリズムを使うRECOGにより、すべて同定した。次に、極端に短いイントロンのみをもつ生物(極短限定種)がスプライセオソームの物理的な限界をクリヤーするには、スプライシング因子が一様に小型である(仮説1)、あるいはスプライセオソームが単純な構成である(仮説2)に基づき、RECOGおよびDB検索の結果を以下の2極短限定種について検討したところ、ヨツヒメゾウリムシでは仮説1タイプであり、微胞子虫は仮説2タイプであることを示した。3.スプライシング実験ヒト培養細胞内在性mRNAでは43塩基長以上のイントロンが検出できた。ミニ遺伝子実験では56塩基長以上について再現できた。「イントロンの長さは如何に決定されるのか」という問いに対し、次の二方面からアプローチした。1.ヒトのイントロン長分布:昨年度ヒトのイントロン長分布を調べた際に、従来注目されていなかったほど短い(65塩基長未満)分布域に、イントロン様のゲノムと転写物配列の間にギャップがあることを発見した。2010年度は、これらのうち実際に生体内でイントロンとして機能しているものを厳選することを第一の目的とした。そこで、これらのイントロン様配列のうち、近縁種で保存されているものを転写物データベースおよびゲノムデータベースをそれぞれ検索し、結果を照合した。その結果、23個が保存されたイントロンであることが分かった。さらに、これら65塩基未満のイントロンをもつ遺伝子は特定の種類の転写因子結合配列をプロモータ領域にもつことが有意に多いことが示された。また、これら65塩基未満のイントロンの配列は、G塩基の組成が他の階級よりも高く、既知のGリッチなスプライシング・エンハンサー配列との関連が示唆された。このエンハンサー配列について、研究協力者が細胞の系でスプライシング実験を行って、スプライシング効率への影響を調べたところ、これら65塩基未満のイントロンがスプライシングされるために重要な配列であることを見出した。2.スプライシング因子の進化的解析:後生動物/菌類の系統以外の生物ゲノムにおいて、スプライシング関連因子遺伝子の存在について知見を得ることで、イントロン長分布の進化に迫るため、昨年度RECOGにより同定した23種の真核生物のスプライシング因子オロソログを検討した。その結果、U1 snRNAとU1-70kの相同遺伝子の配列はヨツヒメゾウリムシにおいても、U1 snRNP構成に必要な領域が保存され、後生動物/菌類以外の系統でもU1 snRNPを介するスプライシング機構が保存されていることが示唆された。次世代シークエンサーデータ探索によるヒトの微小イントロンのスプライシング証明:昨年度までに本研究プロジェクトで明らかにされた、従来外れ値とみなされてきた短さでありながら、近縁種で保存されている、23個のヒトのイントロンについて、次世代シークエンサーによる公開済みデータの中で、ヒト組織中で転写・スプライシングされている証拠を探した。ヒトの脳内における公開データ探索の結果、次の遺伝子、HNRNPH1、PLXNA1、ARHGDIG、TNFRSF18、ADAM11の転写産物において、その証拠を得ることができた。

ヒトの微小イントロンの進化的解析:上記、微小イントロンについて、相同的イントロンの出現パターンを調べたところ、ほとんどがヒトに至る系統に近い系統的位置で派生した形質であることが分かった。これにより、従来から知られていた、ゾウリムシや微胞子虫といった短いイントロンばかりをもつ生物で使われているスプライシング機構とは別の機構で人の微小イントロンはスプライシングされていることが分かった。本プロジェクトを通じて、従来無視された65塩基長以下であっても、ヒトにおいてスプライシングされているイントロンが存在することを示した。このことは遺伝子アノテーション作業における重要な判断基準を与えることになろう。イントロンは通常、転写物配列をゲノム配列にマップすることで両者の差異として検出される。そのようにして得られたイントロンのうち短いものについては実験上の誤差やゲノム多型と区別が難しかった。その点を本研究によって、判断できることを示した点は、重要な歩である。
非ブレーザー活動銀河核の超高エネルギーガンマ線放射領域及び放射機構の研究

2018年度は,MAGIC望遠鏡により,多波長同時観測キャンペーン期間を含めて19夜39.84時間,M87の観測を行った.その結果250GeV以上で,8.43 σのガンマ線信号を検出し,平均の積分フラックスとして,350GeV以上で,(1.65±0.28)×10^-12 cm^-2s^-1を得た.この間M87は基本的に静穏期にあり,日毎の積分フラックスはほとんどの夜が上限値で,光度曲線に有意な変動は検出できなかった.しかしながら,多波長観測のキャンペーン期間中,MAGICが天候不良により観測できなかった期間に,他の大気チェレンコフ望遠鏡グループから提供されたconfidential data(公開不可)から,超高エネルギーガンマ線の放射領域サイズとしてシュワルツシルト半径の2 δ倍(δはビーミング因子)という上限値を得た.一方,MAGICで得られた100GeV6TeVの範囲のスペクトルエネルギー分布(SED)は単一の冪関数で表すことができて,べきΓ=-2.56 ±0.13を得た.また,2008年から2018年までの10年間のM87方向からのFermi-LATガンマ線データの解析を行った結果,100MeVから300GeVの間をべきΓ=-2.03 ±0.03の冪関数で表せて,100GeVでスペクトルに明らかな折れ曲がりが見られた.さらに詳しく見ると,20GeV付近にディップが見られた.1ゾーンSSCモデルでGeV領域のべきとTeV領域のフラックスを同時に説明することは難しく,Spine-Layerモデル等を適用することによって観測されたSEDをよく説明できることがわかった.放射領域の特定については,現在EHTの解析結果の提供を待っている段階である.本研究では,世界最高感度の大気チェレンコフ望遠鏡.MAGIC望遠鏡を用いて非ブレーザー活動銀河核(主に電波銀河)を超高エネルギーガンマ線で観測し,特にその時間変動を詳細に調べ,VLBI電波観測によるジェット根元のイメージ及びその変化と比較することにより,超高エネルギーガンマ線の放射領域を特定することを目指している.本年度の一番のターゲットは,赤方偏移z = 0.0042の近傍電波銀河M87である.M87は,中心に巨大ブラックホールが存在すると考えられていて,非ブレーザーとして最初にTeVガンマ線で検出された活動銀河核である.MAGIC望遠鏡を用いてM87を1月1日から3月9日の間で16夜,3月21日から4月6日の間で15夜観測を行った.特に3月22日から4月6日はHESS,VERITASという他の大気チェレンコフ望遠鏡との同時観測キャンペーン期間であり,この時期に合わせて電波によるVLBI観測,SwiftとChandraによるX線観測,Fermi-LATによるToO観測など,多波長同時観測が行われている.MAGICによる有効観測時間は,1月は約16時間,3,4月は約19時間で,現在解析中である.予備的な結果としては,M87の方向から300 GeV以上の超高エネルギーガンマ線検出のヒントが得られているが,まだ公表できる段階にはない.また,もう一つのターゲットである赤方偏移z = 0.018のFR-I型電波銀河NGC1275に関しては,昨年10月とこの年末年始にかけて,超高エネルギーガンマ線フレアの検出に成功した.特に12月31日から1月1日にかけては,1.5倍のCrab bebula fluxを観測し,多波長同時観測を呼びかけた.これとは別に,NGC 1275からのガンマ線について,2009年から2014年のこれまでの観測結果をアップデートし,詳細なスペクトルを得た.本年度は当初,フレアー時のMAGIC望遠鏡による超高エネルギーガンマ線のToO観測を目指していたが,NGC 1275に関してはモニター観測を,M87に関してはスケジュール観測を行った.その結果,NGC 1275に関しては2016年10月29日と12月31日にフレアーを検出し,いずれも数日間連続観測を行い,多波長同時観測を呼びかけた.また,M87に関しては2017年1月1日から3月9日までと3月21日から4月6日まで観測を行った.いずれも年度の後半,特にM87に至っては年度末に年度をまたいでの観測となり,解析は未だ進行中で公表できる結果は出ていないが,解析は順調に進んでいる.また,VLBIイメージとの比較を計画していたが,観測はなされており,現在解析中で結果を待っている状況である.以上のように,全体として本年度の研究課題の進捗状況は,研究計画に沿って概ね順調に進行していると判断できる.スペインのラ・パルマにあるMAGIC望遠鏡を用いて,2017年1月1日2017年6月25日の期間に,電波銀河M87をモニター観測した.総観測夜数は60夜,観測時間は約82時間であった.月明の影響がなく,天頂角が35度以下のデータの質のよい観測ライブタイムは約42時間であった.解析の結果,M 87方向から154イベントのガンマ線信号を,有意度5.4σレベルで検出することができた.それより計算した微分

フラックスは,0.44 TeVで(3.21±0.66)×10^-12 cm^-1 sec^-1 TeV^-1で,過去の静穏期に観測されたフラックスレベルと一致している.日毎のフラックスを計算し,ライトカーブを描いた.統計が足りず上限値が得られただけの日が多いが,有意にフラックスが変動をしていることは確認できなかった.また,残念ながら特にフレアーアップした日もなかった.スペクトラルエネルギー分布は,データポイントが少ないが,過去の静穏期に観測された冪指数-2.2の冪函数で矛盾なくフィットできた.月明下での観測データを有効に利用するため,かに星雲の観測データを用いて,夜光が多い場合の解析方法の最適化を行い,その結果をM 87の観測データにも適用した.月の無い夜に比べて夜光量が23倍の場合と35倍の場合に分けて解析した.その結果,それぞれのライブタイムは5.6時間と6.6時間で,いずれも有意なガンマ線信号は検出できなかった.これは,観測時間が短かったうえに,エネルギーしきい値が上がり統計量が少なかったこと,系統誤差が月がない場合に比べて10%程度大きいことを考慮すれば,全く矛盾のない結果であった.平成29年度は,電波銀河M 87のモニター観測はほぼ予定どうりで,ライブタイムで50時間以上の観測を行うことができた.解析も順調に進んでおり,今のところ予期しないトラブルには遭遇していない.しいて言えば,突発的なフレアーや,有意な比較的長い時間スケールのフラックス変動が観測されていない点が残念である.また,月明下での観測データが10時間以上含まれており,その解析手法の改良に結構な時間を費やした.その成果として,月明の無い夜の観測データと比べて,解析の系統誤差を10 %以内に抑えることができ,改良はうまくいったと考えている.一方,静穏期のライトカーブを有意に求めるためには,統計量を増やすために解析のエネルギーしきい値をもっと下げる必要がある.この点についても,実際に低エネルギーに最適化した解析を行なっており,予備的な結果として42時間の観測(ライブタイム)で2.9σのガンマ線信号を得ている.解析結果の系統誤差の推定とその低減,GeVガンマ線観測データの解析及び多波長の観測結果との比較などやり残していることはまだまだあるが,研究は概ね順調に進展していると考えている.2018年度は,MAGIC望遠鏡により,多波長同時観測キャンペーン期間を含めて19夜39.84時間,M87の観測を行った.その結果250GeV以上で,8.43 σのガンマ線信号を検出し,平均の積分フラックスとして,350GeV以上で,(1.65±0.28)×10^-12 cm^-2s^-1を得た.この間M87は基本的に静穏期にあり,日毎の積分フラックスはほとんどの夜が上限値で,光度曲線に有意な変動は検出できなかった.しかしながら,多波長観測のキャンペーン期間中,MAGICが天候不良により観測できなかった期間に,他の大気チェレンコフ望遠鏡グループから提供されたconfidential data(公開不可)から,超高エネルギーガンマ線の放射領域サイズとしてシュワルツシルト半径の2 δ倍(δはビーミング因子)という上限値を得た.一方,MAGICで得られた100GeV6TeVの範囲のスペクトルエネルギー分布(SED)は単一の冪関数で表すことができて,べきΓ=-2.56 ±0.13を得た.また,2008年から2018年までの10年間のM87方向からのFermi-LATガンマ線データの解析を行った結果,100MeVから300GeVの間をべきΓ=-2.03 ±0.03の冪関数で表せて,100GeVでスペクトルに明らかな折れ曲がりが見られた.さらに詳しく見ると,20GeV付近にディップが見られた.1ゾーンSSCモデルでGeV領域のべきとTeV領域のフラックスを同時に説明することは難しく,Spine-Layerモデル等を適用することによって観測されたSEDをよく説明できることがわかった.
脳における時間表現の研究

本研究では、心理物理学的手法と非侵襲脳活動計測法を用いて「どんな順番で」出来事が起きたかを判断する時間順序判断の脳内メカニズムを調べた。また、すばやい眼球運動(サッカード)の直前に視覚刺激の順序判断が逆転するという現象がなぜ生じるのかを明らかにするために、サルの脳から神経活動を記録した。得られた結果は「何が」「どこで」起きたかという頭頂葉と前頭葉の情報と、2つの刺激の間の「動き」を表現する側頭葉の情報を統合して、脳が時間順序を再構成しているという仮説(動き投影仮説)を支持していた。我々は腕の交差に伴う時間順序判断の逆転現象(Yamamoto & Kitazawa, Nate Neurosci,2001a,b)をてがかりとして、2つの信号の時間順序は、信号の空間的な「位置」の情報と「動き」の情報から再構成されるという「動き投影仮説」を提唱した(Kitazawa et al.,2007)。本研究では新たに発見されたサッケード眼球運動直前の時間順序判断の逆転現象(Morrone, Ross & Burr, Nat Neurosci,2005)を実験系に選び、ヒトとサルを使った実験により「動き投影仮説」の検証に取り組む。I.心理物理実験:最近、Teraoら(Nat Neurosci,2008)は2名の被験者でMorroneの結果が再現しなかったと報告した。Morroneの報告も2名のみの被験者に基づく。我々は10名の被験者を用いて詳細に検討し、8名で有意な逆転が生じることを見出した。少数の被験者では逆転を生じない可能性があるが、基本的にMorroneらの報告を指示する結果が得られた。II.経頭蓋磁気刺激(TMS)実験:腕交差に伴う右手と左手刺激の時間順序逆転には脳のどの領域が関与しているのだろうか。この点を明らかにするため、時間順序判断課題で活動が生じる側頭頭頂接合部にTMS刺激を一側性に加えて(0.9Hz,7分,110%運動閾値)活動を抑制し、逆転に対する効果を調べた。その結果、刺激と反対側の手を先行して刺激した場合のみ、逆転が回復することが明らかとなった。側頭頭頂接合部が時間順序判断の逆転現象に関与していることが示唆された。我々は腕の交差に伴う時間順序判断の逆転現象(Yamamoto & Kitazawa, Nate Neurosci, 2001a, b)をてがかりとして、2つの信号の時間順序は、信号の空間的な「位置」の情報と「動き」の情報から再構成されるという「動き投影仮説」を提唱した(Kitazawa et al., 2007)。本研究では新たに発見されたサッケード眼球運動直前の時間順序判断の逆転現象(Morrone, Ross&Burr, Nat Neurosci, 2005)を実験系に選び、ヒトとサルを使った実験により「動き投影仮説」の検証に取り組んでいる。1.心理物理実験:5-12Hzの経頭蓋交流刺激を行い、課題成績と刺激位相の相関を調べる実験を開始した。2.非侵襲脳機能計測実験:サッケードの前後のタイミングで時間順序判断課題を行う際の脳磁図計測を開始した。3.サルのニューロン活動記録実験:1頭のサルのMT野とMST野から動き刺激に対する応答を計測し、サッケードの前後のタイミングで適方向が逆転するかどうかを調べた。刺激には一般的なグレーティング刺激に加え、細分化した領域への運動インパルス刺激を用いた。スパイクで時間を揃えて、スパイクの原因となった運動インパルス刺激を平均加算することで、各細胞の動き刺激の受容野と入力から応答までの潜時を明らかにすることができる(動き逆相関法、motion reverse correlation)。この手法を用いることで、サッケード開始前60-100msの時間帯に適方向が逆転するニューロンがMT野にもMST野にも存在することを見出した。我々の仮説を強く支持する結果である。次年度はサルを1頭増やし、成果をまとめる。我々は腕の交差に伴う時間順序判断の逆転現象(Yamamoto & Kitazawa, Nat Neurosci,2001a,b)をてがかりとして、2つの信号の時間順序は、信号の空間的な「位置」の情報と「動き」の情報から再構成されるという「動き投影仮説」を提唱した。本研究では新たに発見されたサッケード眼球運動直前の時間順序判断の逆転現象(MorroneらNat Neurosci,2005)を実験系に選び、ヒトとサルを使った実験により「動き投影仮説」の検証に取り組んでいる。1.心理物理実験サッケード直前の時間順序判断の逆転は6度離れた視覚刺激では生じず、24度離れた刺激のみで生じることが明らかになった。サッケードの影響を受けるのは、6度よりも大きい受容野を持つ領域、すなわちMT野ではなくMST野意向であることを示唆する結果である。

2.非侵襲脳機能計測実験腕交差時の脳磁図計測データの解析を行った。従来発見していたα帯域の位相と回答の相関に加え、左右の半球間のコヒーレンスとの相関を示唆するデータが得られた。3.サルのニューロン活動記録実験MT野やMST野など動く視覚刺激に応答する領域のニューロンには、好んで反応する視覚刺激の方向(適方向)を持つものが多い。我々の作業仮説が正しいとすれば、サッケード直前に「動き」の領域のニューロンの適方向が半数以上のニューロンで逆転するはずである。昨年度までに開発した動き逆相関法を使って、2頭のサルのMT野、MST野とその周辺領域から神経活動計測を行った。その結果、サッケード開始前60-100msの時間帯に適方向が逆転するニューロンがMST野やV4t野に存在することを見出した。我々の仮説を指示する結果である。しかし、細胞群全体としては、サッケードの開始直前に相関が0に向かい、適方向反転以外にも動きの情報をキャンセルするためのメカニズムが存在することが示唆された。
国産技術を用いた臨床応用可能な眼科遺伝子治療と染色体治療の開発

我々のこれまでの研究により、アデノウイルスベクターなどによる網膜への遺伝子導入は組織障害性があることがわかった。しかし、その中でサルレンチウイルスベクター(SIVベクター)は細胞障害性(電子顕微鏡的観察、網膜電図による解析)が最も少ないことがわかったので、SIVベクターを用いた網膜遺伝子導入実験を行った。その結果、ラット、マウスでは色素上皮由来因子遺伝子導入により網膜変性を抑制できることを見い出した。また、導入遺伝子発現期間は、最短でも360日間という長期であった。これらのことより、SIVベクターによる遺伝子治療は臨床応用が可能と考え、大型動物に対する長期の安全性を探るためにサルに対して、SIVベクターを用いた遺伝子導入実験を行った。サルに対してはヒトと同じように硝子体切除を行い網膜下にSIVベクターを注入した。遺伝子発現は緑色蛍光蛋白(GFP)の発現期間をマーカーとした。一部にごく軽度の炎症を惹起したものがあったが、現在までの所、遺伝子発現は良好で、合併症もなく推移している。これとは別に、超音波遺伝子導入を研究した。Electroporation法は、小動物では優れた遺伝子導入法であるが大型動物では筋肉拘縮などが起こるため、臨床応用は容易ではない。超音波は、臨床応用の長い歴史があり、安全性が確立されている。そこで、超音波と造影バブルを用いた遺伝子導入実験を行った。その結果、角膜・網膜への効果的遺伝子導入が安全に施行できた。この点に関して現在特許申請を準備中である。遺伝子導入の研究:国産遺伝子導入ベクターであるサルレンチウイルスベクターを用いて、網膜へ遺伝子導入が可能であることを見い出した。特に網膜色素上皮細胞への遺伝子導入が効果的であり、アデノウイルスベクターのような炎症を惹起することもなかった。また、導入遺伝子の発現期間は2年以上にわたった。網膜電位図で評価した網膜機能は一過性に障害を受けるが、2ヶ月以内に正常に復帰することが分かった。一方、もう一つの国産ウイルスベクターであるセンダイウイルスベクターは遺伝子導入期間が2週間と短いものの、網膜色素上皮に極めて強い遺伝子導入が可能であった。網膜変性症の病態解明研究:遺伝子治療対象疾患である網膜変性症では網膜視細胞のアポトーシスが重要な過程である。網膜のアポトーシスの処理機構は極めて独特であり、このメカニズムを明らかにすることは網膜変性症の病態解明に役立つ。それによると、網膜アポトーシス細胞は、骨随由来マクロファージにより処理されるがその過程に、インテグリンが深く関与していることが分かった。一方、網膜内層のアポトーシス細胞はED2溶性の組織マクロファージに処理されていた。昨年まで行ってきた遺伝子導入用のウイルスベクターの特徴を調べたところ、網膜変性疾患の治療にはアデノウイルスベクターよりも、遺伝子発現期間が長いレンチウイルスベクターの方が適当であると結論した。そこで、本年度は主にレンチウイルスベクターについて研究を行った。まず、レンチウイルスベクターをラットやマウスに投与して発現期間を調べたところ、2年以上にわたって導入遺伝子の発現が網膜色素上皮細胞にみられた。さらに生直後のラット眼球に注射すると視細胞にも遺伝子導入が可能であった。また、網膜電位図や組織学的検索ではレンチウイルスベクター遺伝子導入による有毒な作用はみられなかった。そこで、網膜変性症治療のために網膜保護作用のある機能的因子を導入するためにpigment epithelium derived factor(PEDF)に注目してPEDF遺伝子を組み込んだウイルスベクターを製作した。これを網膜変性動物モデルであるRCSラットの眼球に注入して影響を見た。その結果、機能的、形態学的にもPEDF遺伝子を導入した網膜の変性が有意に軽度であった。このことはレンチウイルスベクターによる神経保護因子遺伝子導入治療は網膜変性疾患治療に効果がある事をしめすものである。そこで、臨床応用する前に、大形動物あるいはサル眼球に対する遺伝子導入の安全性を調べるために、サルの眼球にレンチウイルスベクターを注入して安全性ならびに遺伝子導入効率の評価研究を現在行っているところである。

また、臨床的に安全な遺伝子導入手術を開発するためステロイドをもちいた遺伝子導入硝子体手術法の開発を進めている。我々のこれまでの研究により、アデノウイルスベクターなどによる網膜への遺伝子導入は組織障害性があることがわかった。しかし、その中でサルレンチウイルスベクター(SIVベクター)は細胞障害性(電子顕微鏡的観察、網膜電図による解析)が最も少ないことがわかったので、SIVベクターを用いた網膜遺伝子導入実験を行った。その結果、ラット、マウスでは色素上皮由来因子遺伝子導入により網膜変性を抑制できることを見い出した。また、導入遺伝子発現期間は、最短でも360日間という長期であった。これらのことより、SIVベクターによる遺伝子治療は臨床応用が可能と考え、大型動物に対する長期の安全性を探るためにサルに対して、SIVベクターを用いた遺伝子導入実験を行った。サルに対してはヒトと同じように硝子体切除を行い網膜下にSIVベクターを注入した。遺伝子発現は緑色蛍光蛋白(GFP)の発現期間をマーカーとした。一部にごく軽度の炎症を惹起したものがあったが、現在までの所、遺伝子発現は良好で、合併症もなく推移している。これとは別に、超音波遺伝子導入を研究した。Electroporation法は、小動物では優れた遺伝子導入法であるが大型動物では筋肉拘縮などが起こるため、臨床応用は容易ではない。超音波は、臨床応用の長い歴史があり、安全性が確立されている。そこで、超音波と造影バブルを用いた遺伝子導入実験を行った。その結果、角膜・網膜への効果的遺伝子導入が安全に施行できた。この点に関して現在特許申請を準備中である。