hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
アクアポリン2のリン酸化と細胞内分布および細胞内移送に関する解析

アクアポリン2の細胞内移送を調節するメカニズムを解明するうえで、重要な知見を得ることができ、次年度のさらなる解析へと発展するものである。バソプレッシン(VP)は、腎臓の水チャネルであるアクアポリン2(AQP2)の細胞内分布を変化させ、腎臓での水の再吸収量を調節する。本研究の目的は、VPによる、AQP2のリン酸化が、細胞内分布・細胞内移送を調節するメカニズムを解明することである。24年度は23年度までに作製したAQP2の256番目と269番目のセリン(S256とS269)のリン酸化を認識する抗体を用いて解析をおこなった。SDラットに5%グルコースと1%エタノールを含む水を与え、1)多量に飲水させ、生体内のVP濃度を低下させた、2)多量飲水後にVPを投与した、3)VP投与後VP受容体の阻害剤であるOPC-31260(大塚製薬より譲り受け)を投与した後の腎臓をそれぞれ採取し、免疫組織化学とウェスタンブロットで解析した。さらにVP欠損DDI/Ddiaラット(ナショナルバイオリソースプロジェクト「ラット」より譲り受け)を用いた解析もおこなった。S256はVPが欠損した状態でもかなりリン酸化されているが細胞内にとどまっており、VP投与でリン酸化が増すとともに細胞膜への集積がみられた。S269はVP濃度が低下した状態でリン酸化はみられず、VP投与後5分で、細胞内でリン酸化がみられその後急激にリン酸化の増加と細胞膜への集積がおこることがわかった。また、AQP2が細胞膜に集積したのちに、VP受容体の阻害剤を投与したところ、AQP2は細胞膜から急激に細胞内に取り込まれた。このときS256のリン酸化はあまり減少することなく細胞内へと取り込まれるが、S269は細胞内へ取り込まれながらリン酸化が急激に減少することが判明した。これまでAQP2の細胞膜への集積に重要といわれていたS256は、VP以外の因子によってかなりリン酸化されながら細胞内にとどまり、細胞膜への集積にはVPの作用とS269のリン酸化が重要であることがわかった。アクアポリン2のS256のリン酸化を認識する抗体を用いて、ラット腎臓で細胞内分布の変化を明らかにすることができた。さらにS269のリン酸化を認識する抗体も作製し、特異性の検討ののちにラット腎臓で細胞内分布の変化の一部を明らかにすることができた。24年度が最終年度であるため、記入しない。ラット腎臓でのアクアポリン2の解析はおおむね順調に進んでいるが、リン酸化と細胞内分布の変化についてさらに詳細な解析が必要と思われ、生化学的検討も含めて今後進めていく予定である。また、アクアポリン2遺伝子を導入した培養細胞系でのリン酸化と細胞内分布の関係に関する種々の解析も必要であり、今後の課題である。
タイ地域保健活動支援システムの汎用性および実用性確認のための長期運用試験

今年度は、東北部では研究協力者と対象フィールドの選定を実施し倫理申請準備に取り掛かった。本来であれば2018年内にこの地域での長期運用試験までこぎつける予定であったが、まだ運用試験は開始できていない状況である。その理由として、フィールド選定時にデバイスの使用状況について確認したところ、iOSのタブレット端末よりもAndroidのタブレット端末のほうが利用率が高く、親しみがあるということが明らかになった。今まではiOS端末で利用することを前提に開発を行っていたため、Android端末におけるシステムの動作確認等の作業が必要になることになった。今後は、Android端末でも問題なくシステムが利用できることが確認でき次第、長期運用試験に取りかかる予定である。東部では、初めてこの研究を行うため、フィールド選定対象地域の看護職、マネージャーに参集してもらい、研究の主旨説明およびフィールドの確認を実施した。参加者の反応としては、ぜひ参加してみたいという意思が確認できるとともに、まだ開発されていない新たなデータセットも作成したいという要望があった。今回の研究では汎用性確認がメインであるため、新たなデータセットの作成については、本研究の進捗状況を見ながら同時進行できれば作成していきたいと考える。東部の一部地域では、iOS端末を仕事で使用しているスタッフも多いことがわかった。東北部の状況も鑑みて、iOS端末、Andoroid端末両方を使用し研究を遂行することとする。今年度は研究実績と言えるような成果は出せていないが、次年度に本格的に運用試験を行う下準備ができたと考える。上述したように、今年度中に東北部における長期運用試験を始める予定であったが、データベースシステムがAndroidにも対応可能か確認作業中であるため、試験開始が遅れている。2019年度は東北部での長期運用試験を実施完了し、得られたデータを当初の計画の通り解析していく。同時に、東部での長期運用試験を開始することを計画する。また、北部での研究協力者を次年度中に確保して、2020年度に長期運用試験が実施できるように準備を進めていく。2019年度中に得られた研究データは随時、国際学会等で発表していく。今年度は研究の第1段階である現地調査にてタイの人々が親しむOSの多様性について明らかになったため、iOSのみで開発していたデータべースシステムがAndroidに対応できるように確認作業が必要になり、改めてどのデバイスを選択するか再検討が必要になったため、新たなデバイスの購入まで至らなかった。2019年度には2018年度に購入予定であったデバイスを購入し、研究を遂行していく。
統合化ゲノムデータベースの開発に関する研究

本研究は、急速に蓄積するゲノム情報を効率的に管理し、さらにそれらを解析しそこから未知の生物学的知識を引き出すことの可能な統合化ゲノムデータベースの開発を目的として行った。現存のゲノムデータの多くはテキストフォーマット(フラットファイル)のままであり、関係データベースによって管理されているものも一部ある。本研究では、ゲノムデータに共通の特徴を扱う親クラスを頂点に作り、その下に、まず、特に利用頻度が高いと考えられるGenBank、GDB、PIRについてそれぞれに対応したクラスを作り、ゲノム情報を一つのオブジェクト指向データベースの元に統合した。ここで、作成したクラス構造は汎用性があり新しいデータベースを容易に取り込めるように留意した。そのため、GenBankのために生成した約50のクラスのうち、約70%がGDB、PIRのデータを統合するのに再利用できた。また、従来のデータバンクでは、データとその解析ツールが独立に提供されているため非常に使い辛かったが、本研究では、オブジェクトに付随したメソッドとして、現在まで開発されてきた様々な解析ツール群(blast, fastaなど)を再定義し、データベース中に格納した。しかし、本研究の開発はSmalltalk上で行ったため、C言語で実装されている既存のツールに比べて実行速度に関して問題があった。さらに、計算機になじみの薄い生物学者が苦痛なく自由に検索できるよう高機能のグラフィックユーザインターフェイスを開発し、データベース中の全ての情報がマウスのクリックだけで参照できる機能を実現した。また、従来我々が開発してきた演繹データーベースとの統合も行い、ユーザはルール表現に基づいてデータベース検索も可能である。今年度の段階でオブジェクト指向技術を利用したゲノムの統合はほぼ完成したと考えられるので、今後はこれをさらに拡張し、ニューロコンピューティングや遺伝的アルゴリズムの手法をデータベースに統合した知的データベースの開発を目指す予定である。
プラズマ化学による新しい機能性複合粉末の創製とドラッグ工学への応用研究

プラズマ照射低密度ポリエチレン(LDPE)に生成するラジカルのESRスペクトル解析を、高密度ポリエチレン(HDPE)の結果と比較して行った。プラズマ照射LDPEのESRスペクトルはHDPEのスペクトルパターンと大きく異なっていた。組織的なシミュレーション解析の結果、両者の構成ラジカルは本質的には同じであるものの、HDPEは主鎖型ラジカルが最大の構成成分であるのに対し、LDPEは架橋部位に生成するダングリングボンド(DBS)であることを明らかにした。また、多糖類へのプラズマ照射効果に関する基礎知見を得るため、プラズマ照射二糖類(マルトースおよびセロビオース)に生成するラジカルのESRスペクトル解析を行った。詳細なESRスペクトル解析の結果、両者の構成ラジカルを明らかにするとともに、アノマー構造の差異によるESRスペクトル外形の変化や反応性の違いを明らかにした。応用研究として、プラズマ照射高分子粉末と薬物とのメカノケミカル反応によるラジカル再結合を利用した新規マトリックス型DDSの開発を試みた。まず、プラズマ照射ポリエチレンのメカノケミカル再結合反応について検討した。その結果、メカノケミカル反応により容易にラジカル再結合することを明らかにし、かつ主鎖型ラジカルに比べDBSの方が速やかに反応することを見い出した。この知見を基に、プラズマ照射ポリエチレンと薬物とのメカノケミカル反応を実施し、その粉末試料からの薬物放出性について検討した。プラズマ照射試料からの薬物放出は、未処理試料に比べ有意に徐放化されており、固体間架橋反応によるマトリックスが形成されていることを明らかにした。本方法は、高分子基材のプラズマ照射効果を考慮することにより幅広い高分子に適用可能であり、かつ、完全乾式過程におけるマトリックス型DDS構築法として極めて有用であることを明らかにした。1.申請者らはかねてよりアルゴンプラズマ照射によって種々の合成高分子粉末試料に生成する表面ラジカルをそのESRスぺクトル測定とシミュレーションによって明らかにしてきた。本研究においては、同様の方法によって未検討であった合成高分子や糖類(単糖類、多糖類)に種々の条件下でアルゴンプラズマ照射し、生成する表面ラジカル構造と生成特性を明らかにするとともに、それらの無酸素状態でのメカノケミカル再結合反応は、ポリエチレン、ポリメチルメタクリレートなどの合成高分子のみならず、種々の糖類の固体表面ラジカルにおいても首尾よく進行することを明らかにした。さらに、これらの反応を精査するために、高分子粉砕時における種々の高分子のメカノラジカル生成も検討を加えた。2.固体表面ラジカルのメカノケミカル再結合反応を利用する医薬品工学への応用研究において、今年度は低密度ポリエチレン(LDPE)を選び検討した。LDPEはプラズマ照射によって大量の表面架橋層が生成するので、テオフィリンとともに混合粉砕したところ、期待通り、高密度ポリエチレンに比べて、大幅な薬物徐放化効果が得られた。同じ観点から、エチルセルロースを用いて同様に検討したところ、セルロースに比べて大きな徐放化効果も得られた。このような結果から、プラズマ照射条件やメカノケミカル反応条件の設定によって、種々の高分子と薬物の組み合わせにおいても、合目的の様々なモノリティック型DDS製造の可能性が強く示唆された。プラズマ照射しDPEのESRスペクトルはHDPEのスペクトルパターンと大きく異なっていた。

応用研究として、プラズマ照射高分子粉末と薬物とのメカノケミカル反応によるラジカル再結合を利用した新規マトリックス型DDSの開発を試みた。まず、プラズマ照射ポリエチレンのメカノケミカル再結合反応について検討した。その結果、メカノケミカル反応により容易にラジカル再結合することを明らかにし、かつ主鎖型ラジカルに比べDBSの方が速やかに反応することを見い出した。この知見を基に、プラズマ照射ポリエチレンと薬物とのメカノケミカル反応を実施し、その粉末試料からの薬物放出性について検討した。プラズマ照射試料からの薬物放出は、未処理試料に比べ有意に徐放化されており、固体間架橋反応によるマトリックスが形成されていることを明らかにした。本方法は、高分子基材のプラズマ照射効果を考慮することにより幅広い高分子に適用可能であり、かつ、完全乾式過程におけるマトリックス型DDS構築法として極めて有用であることを明らかにした。
マイクロファイバーワイヤリングによる血管-神経網の構築

本研究課題では、神経細胞、血管内皮細胞を細胞ファイバーとし、デバイス中でアセンブリすることにより3次元的な血管ー神経網を構築することを目指した。神経幹細胞ファイバーは、直径が細いほど分化誘導後に神経細胞の割合が高く、高配向性となることがわかった。神経ファイバーから数mmの神経ユニットを作製し、アセンブリによる神経回路構築法を確立した。一方、HUVECからは血管新生能を有する血管内皮細胞ファイバーの作成に成功した。最終的に、神経ファイバーをフィブリンゲル内部でデバイスにより固定し、血管内皮細胞と3次元共培養することで神経ファイバー周辺部に血管網を有するような血管ー神経網の構築に成功した。平成26年度の研究計画は、異なる直径の細胞ファイバー作製法の確立と作成された血管ファイバーと神経ファイバーの機能評価であった。ガラス管と光造形を用いた2重同軸層流マイクロデバイスを用いて、細胞を封入したコアシェル型のゲルファイバーを作製するわけだが、細胞・ECM(コラーゲン)の存在するコア領域の流量・流速とアルギン酸から形成されるシェルの流量・流速を変化させる事で、直径サイズの異なる細胞ファイバーを作製する事に成功した。神経ファイバーに関しては、細胞ファイバー作製時に神経幹細胞を用いて作製し、数日間培養後分化誘導させる事により作製した。免疫染色、電子顕微鏡観察から作製された神経ファイバーは内部に神経細胞、アストロサイト、オリゴデンドロサイトを有し、さらに複数のシナプスを介した神経回路を構築している事が確認出来た。一方血管ファイバーに関しては、HUVEC細胞を用いて血管腔を形成するファイバーを作製した。血管ファイバーに関しては、神経幹細胞ファイバー作製時とは異なり、3軸の層流デバイスを利用した。HUVECファイバー作製後、数日間培養する事でセンチメートルオーダーの血管腔を有するような血管ファイバーの作製に成功した。さらに血管ファイバーの内部を液体が還流出来る管腔構造を構築する事に成功し、作製された血管ファイバーへの因子添加や、線維芽細胞と共培養する事による血管新生を観察する事も確認出来た。本プロジェクトの当初から取り組んできた神経細胞ファイバー技術を用いて、異なる神経組織から採取した神経ファイバーをアセンブリする方法を確立し、in vitroで3次元神経ネットワークの構築に成功した。本技術により、それぞれ初代培養大脳皮質細胞と初代培養海馬細胞より構築される神経ファイバー間の神経回路の構築、神経幹細胞からの複雑な神経ネットワークの構築に成功した。本成果は、国際的な学術誌に掲載することができた(Midori Kato-Negishi, HiroakiOnoe, Akane Ito and Shoji Takeuchi: Rod-Shaped NeuralUnits for Aligned 3D Neural Network Connection, Advanced Healthcare Materials, Version of Record online: 21 April 2017, DOI: 10.1002/adhm.201700143)。また、HUVEC細胞を用いて、流体マイクロデバイスから管腔構造を有するような血管ファイバーの構築にも成功した。現在学術誌に掲載するため論文を執筆中である。さらに、ヒト及びマウスの神経幹細胞から構築された神経幹細胞ファイバーを分化誘導し、分化誘導した神経ファイバーとHUVEC細胞をフィブリンゲル中で共培養をすると、生体内で神経細胞の周りに血管構造が構築されるように、神経ファイバー周辺で優位に血管網構造が構築されることが観察された。本技術を利用し、神経ファイバーを3次元培養デバイス中にパターニングすることにより、神経組織の周囲に血管網を有する3次元組織の構築にも成功した。本技術を利用することで、今後in vitroで神経ー血管網を有する組織の再構築が可能になると考えられる。当初の計画の目的である、「直径の異なる細胞ファイバー作製法の確立」は成功した。また神経細胞ファバーの形成と血管ファイバーの形成も成功し、これらの細胞ファイバーの基礎データも取得する事が出来た。本年度は最終年度にあたるため、血管ファイバの形成に関する論文の執筆・投稿を行う。さらに神経ファイバとHUVEC細胞との共培養系にともなうキャピラリーフォーメーションの解析を行い、論文の執筆・投稿を行う。28年度が最終年度であるため、記入しない。神経科学、マイクロデバイス本年度は、神経細胞ファイバーに関してその基礎的な形態および機能解析が終了した。一方で、血管ファイバーに関しては、血管腔内部を液体が還流出来る構造を構築出来たが、細胞の極性評価などは不十分である。そこで、翌年度は血管ファイバーに関して詳細な機能解析を行う事を予定している。さらに神経ファイバーと血管ファイバーの共培養系を確立し、お互いの細胞の相互作用を解析する。最終年度に技術補佐員を雇用することで、研究を円滑に、より加速して行うため。またその実験にともなう消耗品などの購入を行うため。本年度は、神経細胞ファイバー、血管ファイバーの基本的な形態的、機能的な解析を行ったため、既存の実験設備で行う事が可能となった。また高額予算として購入予定であった

3次元画像解析ソフトは、研究室で購入した代価ソフトやフリーのソフトを用いる事で対応出来る事が判明したため、次年度の研究計画にある共培養系の観察・解析に関わる装置を購入する事に変更した。技術補佐員を約3ヶ月雇用し、主に培養細胞の管理を行っていただく。また神経ファイバの作成とHUVECとの共培養系の維持をしていただき複数回の実験を行うことで再現性ある結果を取得する28年度が最終年度であるため、記入しない。る共培養系の観察・解析のために、共焦点レーザー顕微鏡に用いる高解像レンズを購入する。また、卓上インキューベーションシステムも購入する予定である。28年度が最終年度であるため、記入しない。
数理統計学における情報抽出の理論と応用に関する研究

本研究では、数理統計学における各種の情報抽出の方法についての理論とその実際問題への応用に関して、様々な観点から総合的に研究を行った。11のテーマを設定し、研究集会を開催する形式で研究を遂行した。その結果、特に以下のような項目に関して、新しい理論や方法論の発見、実用上有益な知見の獲得、統計ソフトウェアの構築等が行われたと共に、各研究集会における討論や研究打ち合わせ等を通して新たな問題提起も行われた。(1)非局所的・複雑非線形データ解析のための理論と方法論の開発とその適用限界の研究。(2)多変量解析技法の記述統計的問題、推測統計的問題および乖離をつなぐ理論開発と応用研究。(3)数理計画モデルの最適化に関する数学理論の発展と実際への応用可能なモデル開発の研究。(4)時系列に対する漸近理論、大偏差理論、モデル選択、経済学・工学等への応用の研究。(5)統計的推測を行う際に要求される標本数に関する逐次推測の理論と方法論に関する研究。(6)各種統計モデルに現れる確率分布や統計的推測の際に必要となる標本分布の性質に関する研究。(7)統計モデル構築や推論における、組み合わせ数学・可積分条件・最適化(変分原理)に関する研究。(8)計算機を利用した統計手法の理論と応用、実際に使える形の統計ソフトウェアの開発の研究。(9)計算機利用に伴う統計的漸近理論の発展と、アルゴリズム開発を伴うその周辺理論の研究。(10)多変量モデル、確率過程の母数モデル、時系列モデル、ベイズモデル等における統計的推測の研究。(11)各種推定量の構成と性質の比較・検討、同時信頼区間の構成、確率密度関数の推定問題等に関する研究。本研究は、数理統計学における種々の方法が、データの持つどのような情報を、どのようにして抽出しているのかという情報抽出の構造を把握し、それらを整理して情報抽出の構造を統一的に捉えることを目的として、2年継続で研究するものである。今年度はその初年度であり、ノンパラメトリック解析法、多変量解析法、数理計画法、時系列解析法、逐次統計解析法、確率分布論の各分野についての研究を行った。その結果、これらの各分野について、情報抽出の構造解明のための方法論の発見、情報抽出の構造の究明、新しい方法の発見とその有効性等についての知見が得られた。これに関連して今年度開催された研究集会の概要は次の通りであった。(1)複雑非線形現象の「離散・ノンパラ・セミパラ」解析(平成8年10月1718日,於熊本大学工学部,発表件数11件)(2)多変量解析の理論と応用の研究(平成8年11月1416日,於東京工業大学国際交流会館および百年記念館,発表件数21件)(3)数理計画モデルの最適化と応用に関する研究(平成8年12月46日,於金沢大学工学部,発表件数31件)(4)時系列解析の理論と応用の研究(平成8年12月57日,於大阪大学基礎工学部,発表件数13件)(5)逐次統計解析に関する研究(平成8年12月1214日,於九州大学国際ホール,発表件数12件)(6)確率分布論とその応用の研究(平成9年1月68日,於大阪大学基礎工学部,発表件数17件)本研究では,数理統計学における各種の情報抽出の方法についての理論とその実際問題への応用に関して、さまざまな観点から統合的に研究を行った。これは平成8年度からの継続研究であり、平成9年度は特に次のテーマに焦点をあて、各テーマごとに研究集会を開催する形式で研究を行った。(1)統計的推論のフレームワークの基礎的研究,(2)計算機統計学の理論と応用の研究,(3)統計的漸近理論とその応用の研究,(4)統計的推測の基礎理論と応用の研究,

(5)推定論とその応用の研究(1)については、組み合わせ数学の統計的推論、可積分条件と推定方程式論、変分原理に基づく統計モデル構築・推論法等についての研究成果が得られた。(2)については、変数選択法、多重比較法、最適化法、検定過程、インターネットを利用した統計解析法、統計ソフトウエア等についての研究成果が得られた。(3)については、多変量解析、空間予測、時系列解析、ノンパラメトリック法、解散型、医学データ等の領域における近似理論、漸近理論、極限分布論等についての研究成果が得られた。(4)については、数理統計学における基礎的諸問題、多変量モデル、確率過程の母性モデル、時系列モデル、ベイズモデル等における統計的推測についての研究成果が得られた。(5)については、良い性質を持つ推定量の構成、各種推定量の性質の比較・検討、同時信頼区間の構成、確率密度関数の推定問題等についての研究成果が得られた。
チロシン生産菌による植物アルカロイド発酵生産

大腸菌において、芳香族アミノ酸代謝にかかわる遺伝子群全般の発現を制御する転写調節因子(tyrR)を欠損させた。そして、フィードバック阻害耐性3-deoxy-D-arabino-heptulosonate-7-phosphate synthaseとchorismate mutase/prephenate dehydrogenase、さらにPhosphoenolpyruvate synthetaseとtransketolaseを過剰発現させることで、チロシン生産菌を作製した。このチロシン生産菌に、Ralstonia solanacearum由来tyrosinaseとPseudomonas putida由来DOPA decarboxylase、およびドーパミンからのレチクリン生合成酵素を導入することで、微生物発酵法によるイソキノリンアルカロイド生産システムを構築した。本生産システムを用いることで、効率的な植物アルカロイドの生産が可能になった。医薬的に重要なイソキノリンアルカロイド(モルヒネやコデイン)は、植物の産生する二次代謝産物であり、チロシンから生合成される。これまでに我々は、ドーパミンを基質にした微生物発現系でのイソキノリンアルカロイド生産に成功している。そこで、本研究ではチロシンからドーパミンまでの生合成経路をチロシン生産大腸菌内で再構成し、構築済みの生産システムと組み合わせることで、ドーパミン添加を必要としない、微生物発酵法による効率的なアルカロイド生産を行った。大腸菌において、芳香族アミノ酸代謝にかかわる遺伝子群全般の発現を制御するDNA結合型の転写調節因子(tyrR遺伝子)を欠損させた。そして、フィードバック阻害耐性3-deoxy-D-arabino-heptulosonate-7-phosphatesynthase (aroG gene)とchorismate mutase/prephenate dehydrogenase(tyrA gene)、さらにPhosphoenolpyruvate synthetase(ppsA gene)とtransketolase(tktA gene)を過剰発現させることで、チロシン生産菌を作製した。このチロシン生産菌に、Streptomyces castaneoglobisporus由来tyrosinaseとPseudomonas putida由来DOPA decarboxylase、およびドーパミンからのレチクリン生合成酵素を導入することで、微生物発酵法によるイソキノリンアルカロイド生産システムを構築した。本生産システムは、グリセロールから、最大で6mg/Lのレチクリンを培地中に生産した。医薬的に重要なイソキノリンアルカロイド(モルヒネやコデイン)は、植物の産生する二次代謝産物であり、L-tyrosineから生合成される。これまでに微生物のモノアミン酸化酵素と植物のイソキノリンアルカロイド生合成酵素を組み合わせ、dopamineを基質にして、イソキノリンアルカロイドの重要な中間体であるreticuline、さらには抗HIV作用および抗腫瘍作用を有するmagnoflorineの微生物発現系における生産に成功している。昨年度は、L-tyrosine生産大腸菌を作製し、L-tyrosineからdopamineまでの生合成経路を導入することで、dopamine添加を必要としない、微生物発酵法によるアルカロイド生産システムを構築した。本生産システムは、15g/Lのグリセロールから最大で6mg/Lのreticulineを培地中に生産した。今年度は、さらなる生産効率の改善を目的として、生合成経路の最適化を行った。生合成経路における律速段階を明らかにするため、生成物の解析を行った。LC-MS/MS解析の結果、最終産物であるreticulineだけでなく、dopaquinoneの蓄積が見られた。TyrosinaseはL-tyrosineからL-DOPAへの変換を触媒するだけでなく、さらにL-DOPAをdopaquinoneへと変換する。そこで、L-DOPAからdopaquinoneへの酸化活性の低いRalstonia solanacearum由来tyrosinaseを生産システムに用いることにした。その結果、15g/Lのグリセロールから、46mg/Lのreticuline生産に成功した。本生産システムを用いることで、植物アルカロイドの実用生産が可能になると考えられる。
高山植物数種における各種環境への化学的適応の多様性の解明

高山帯における各種環境に対する二次代謝産物、特にフラボノイドを用いた植物の環境適応を研究するために、ヨモギ属、キク属各種、シオガマ類などの高山帯あるいは亜高山帯に生育する植物を材料として、それらに含まれるフラボノイドの質的および量的解析を行った。またこれと並行して類似した激しい環境である、直接潮風や塩水にさらされるフクド、ハママツナ、ハマサジのような海岸に生育する植物のフラボノイドやフェノール系化合物についても同様の解析を行った。これらについては年間を通して経時的にサンプリングを行い、その変動も調査した。本研究では、紫外線、低温、pH,貧栄養などの各種ストレスがかかる高山帯に生育する代表的な植物に焦点をあて、これらが合成するフラボノイドなどのポリフェノールによる各種環境への化学的適応を解明することを目的としている。これを踏まえて、平成25年度には、平成25年度の大雪山、鳥海山、月山などで採集したウルップソウ類、ヨモギ類、シオガマギク類、トウヒレン類、イワブクロ、チョウノスケソウなどの葉に含まれるポリフェノール化合物を分析した。またこれらとは別に、ブータンの標高4千メートルを越える高山帯で、シオガマギク類やメコノプシス類を調査採集し、これらのポリフェノール成分を分析した。これらの植物のうち、ヨモギ属とシオガマギク属についてはそれぞれ学会での発表を行った。また前年まで行っていたイワショウブについては論文として発表した。本研究では、紫外線、低温、pH、貧栄養などの各種ストレスがかかる高山帯あるいは、低地から高山まで分布を広げる代表的な数種の植物において、これらが合成するフラボノイドなどのフェノール化合物による各種環境への化学的適応を解明することを目的とした。これを踏まえて、平成24年度には、北海道の大雪山と斜里岳、東北の鳥海山と月山でホソバウルップソウ、ヨモギ類、シオガマ類、トウヒレン類、イワブクロ、チョウノスケソウなどの調査を行い。これらの紫外線防御や抗ストレスに関与すると推定されるフラボノイドの予備的分析を行った。さらに今年は予備的に行っていたイワギキョウとチシマギキョウについて、紫外線防御物質の探索に関して学会で発表を行った。またこれまで継続して行っていたキク類などについても、細胞内と細胞外の両方にフラボノイドを蓄積し、それらがそれぞれに紫外線、低温、pH、貧栄養などの各種ストレスに対して反応し、利用していることを明らかにして、論文として発表を行った。今年度は高山帯における各種環境に対する二次代謝産物、特にフラボノイドを用いた植物の環境適応を研究するために、ウルップソウやヨモギ属各種、エゾヨモギギク、キク属各種のような高山あるいは亜高山に生育する植物を材料として、それらに含まれるフラボノイドの質的および量的分析を行った。またこれと平行して、類似した激しい環境である、直接潮風や塩水にさらされるフクド、ハママツナ、ハマサジのような海岸に生える植物のフラボノイドやフェノール化合物についても定性および定量的実験を行った。この実験については、年間を通して定時的にサンプリングを行い、量的変動も観察した。その結果、例えばフクドでは細胞外にフラボノイドが存在し、このうち細胞外のものについてアセトンで抽出し、これを各種クロマトグラフィーなどで分離し、さらにNMR、LCーMS,基準標品とのHPLCやTLCでの比較の結果、ポリメチル化されたAxillarin, Jaceosidin, Sudachitinなどのフラボノール、あるいはHispidulinなどのフラボン系のフラボノイドを多量に蓄積していることが判明した。一方、細胞内にはクロロゲン酸を主要成分として2種類の芳香族有機酸が含まれていたが、フラボノイドはほとんど認められなかった。以上の結果からフクドについては主に細胞外のフラボノイドが海岸のさまざまな環境圧に対して、反応している事が判明した。キク属植物では環境圧に対して細胞内の一部のフラボノイドを特異的に増加させ、また細胞外では、特に塩および乾燥によってほぼすべてのフラボノイドを一様に増加させる傾向がみられた。以上より、葉の細胞外と細胞内に存在するフラボノイドは環境ストレスによって、植物によってもその応答は異なり、その機能も異なると予想された。今年度は高山帯における各種環境に対する二次代謝産物、特にフラボノイドを用いた植物の環境適応を研究するために、オオバコのいっそうの解析を行った。これではこれまでに行った研究で見過ごしていたフラボノイド成分を探索する事ができ、その同定も行う事ができた。本年度は最終年度でもあったので、上記のようなその前年度までにやり残した研究を完遂することも行ったが、これまでに得られた結果を論文として公表することに重点を置いた。その結果、7本の論文を主にアメリカとイギリスで発行している科学雑誌に掲載する事ができた。そればかりでなく、5本の発表を国内外の学会においても公表を行った。

当初予定していた高山植物ばかりでなく、類似の激しい環境である海岸に生育する植物の二次代謝産物、特にフラボノイドの定性および定量的研究も行う事ができ、この1年で、ある程度の結果をまとめる事ができると予想されるため。植物化学適応学今年度は最終年度であるため、これまでのまとめを行う。これと平行して、まだ研究の足りない植物群について補足的な研究も行う。平成24年度に採集を行った植物群については、今年度中にそれらに含まれるポリフェノール化合物について、かなり分離同定を行うことが出来たが、他の仕事が多く、今年度は新たな山域での調査を行うことが出来なかった。しかし、その代わりに、ブータンにおいて、日本ではあり得ない標高の4千ー5千メートルに生育する数種の植物について調査を行うことが出来た。平成24年度には今回の研究で研究対象として考えていた植物についての現地調査をおおむね完了することが出来、また予備的な解析も始められ、さらにはこれまで継続していた植物群の化学的適応に関しても論文としてまとめられたので、おおむね順調に研究が進展したと考えている。平成26年度も引き続き、東北地方の山、特に蛇紋岩のような特殊な基質で出来ている山を中心に、植物を調査し、これらの各種環境に対する化学的適応を解明する。また、これまで採集することができたものについて、いっそうの解析を進め、複数の論文の出版および学会での口頭発表を行う。平成25年度も引き続き、北海道、東北、さらには中部山岳地域への高山植物の調査を実施する。またこれと並行して、研究試料として用いる植物サンプルの各種環境に対する適応物質について、これを解析し、定性および定量実験を開始する。国内での調査を行う旅費を予定していたが、悪天候のために、中止したため。昨年行うことが出来なかった調査を行うための旅費とする。平成25年度の研究費の使用については、平成24年度に引き続き、各調査山域への出張費が中心になる。またこれと並行して、植物材料の各種環境への適応物質の各種クロマトグラフィーなどを用いた分離ならびに単離した化合物の各種スペクトルなどを用いた同定用の実験試薬などの購入を行う。またこれらの成果を発表する学会への参加のための交通費としても使用する。
遺伝的アルゴリズムを用いる適応型命令スケジューリングの研究

本年度はSparc系RISCプロセッサに対する適用結果を論文に纏め情報処理学会論文誌2000年4月号に発表した。また高性能のPentiumプロセッサとしてPentiumIIIチップを取り上げて遺伝的スケジューリングの適用実験を行い、昨年度行ったPentiumIIプロセッサに対する結果と同等の、BorlandCコンパイラの生成コードを最大5%上回るプロセッサ性能を得た。さらに命令の参照する主記憶アドレスの関係を木目細かに解析する事により命令の入れ替えの自由度を増し、それに対して遺伝的スケジューリングを適用することにより、メモリ参照の多い命令列に対してPentiumIIIでコンパイラ生成コードを最大で14.8%上回る性能を達成した。これはPentiumIIプロセッサに対してもほぼ当てはまる結果であることを確認した。すなわちPentium系のコンパイラはロード/ストア命令のスケジューリングに大きな改良の余地のあることが明らかになった。一方、ループアンロールを施した命令コードに遺伝的スケジューリングを行い、これがソフトウエアパイプライニングによりスケジュールされたコードに近い性能を示すことを明らかにした。これらの結果を発表すべく論文を準備中である。遺伝的命令スケジューラの効果を実機上で検証するために、個体命令列の評価をシミュレータ上のサイクル数ではなく実機上の実行時間を計測することにより行うようスケジューラプロブラムを改造した。検証にあたっては、評価用のベンチマークジョブとしては米国Livermore研究所が制定した24個の科学技術計算カーネルループ(通称リバモアカーネル:LFK)を取りあげ、実機として性能の異なる3種類のSPARCチップであるUltra2(300MHz)、Ultra1(143MHz)、Sparc(100MHz)を使ったワークステーションを対象とした。最適化機能を持つGNU-Cコンパイラの生成する命令列を出発点として、より良い性能を示す命令の並び順を遺伝的アルゴリズムにより探索した。その結果、10世代の探索の後Ultra2とUltra1においては、出発点の実行時間を100とするとき、それをカーネルにより74.2から99.6(平均90.0)、74.1から99.9(平均89.9)に短縮する効果を得た一方、Sparcにおいては92.1から、105.3(平均99.0)と余り効果が見られなかった。またUltra2とUltra1ではカーネル毎の相対実行時間も似た傾向を示した。これからUltra2/1とSparcではプロセッサの特性に差があり、GNU-Cコンパイラの命令スケジューリング機能はSparcに対しては適切であるがUltra2/1に対しては改善の余地があることが明らかになった。また遺伝的スケジューラの発見した最良命令列を解析することによりUltra2/1に向けたスケジューリング方式の改良指針が得られ、これは現在GNU-Cコンパイラに組み込むべく準備中である。今後の課題としては、コンパイラへの組み込みの他PentiumIIなど他のプロセッサ系列や並列プロセッサにおける効果の検証が挙げられ、次年度以降に取り組む予定である。本年度はSparc系RISCプロセッサに対する適用実験をさらに推進し、Ultra SparcIIチップに対するデータの収集と、従来のGccコンパイラに加えてSunCコンパイラの生成する命令コードに対する適用を行った。この結果、いずれの場合も遺伝的スケジューラが既存コンパイラよりも優れた命令スケジューリングを行う事を実証した。また、遺伝的スケジューラが予想通りチップの特性に応じた適応的スケジューリングを行っていること、Gccコンパイラに対する遺伝的スケジューラの優位が新しいチップ程際立つ事からGccコンパイラがハードウエアの進化から乖離した状況にあることなどが明らかになった。これらの成果は情報処理学会論文誌2000年4月号に掲載される予定である。さらに今年度は、PC用プロセッサの代表としてPentiumIIプロセッサに対する適用実験を行い、現代でBorlandCコンパイラの生成コードを最大5%上回るプロセッサ性能を得ている。Sparc系の最大20%を下回る要因としてはPentiumIIがCISCのアーキテクチャを踏襲していることが挙げられ、またハードウェアレベルのスケジュールが徹底しているために命令スケジュールの余地の少ない事が予測される。今後さらに高性能のPentiumチップに対し実験を行いたい。
多発性骨髄腫進展のドライバー因子の同定と早期治療介入への応用

本研究の目的は、APOBEC3遺伝子の異常ががん関連遺伝子の点突然変異やゲノムの不安定性を惹起しMGUSから多発性骨髄腫の進展および多発性骨髄腫の悪化を促進するという仮説の検証、ならびにAPOBEC3遺伝子の骨髄腫の進展予測と治療介入のマーカーとしての応用・これを標的とする新規抗骨髄腫薬の開発である。以下に結果を要約する。骨髄腫細胞においてはAPOBECファミリーのうちAPOBEC3B(A3B)が特異的に強発現していたが、骨髄腫細胞株ではその中でもintron7が含まれた異常なmRNA(A3Bi7)が発現していることを見出した。上記結果を踏まえ、A3BおよびA3Bi7を強発現するトランスジェニックマウスを作成した。多発性骨髄腫が発症するかどうかを確認するため、トランスジェニックマウスのライン化を現在準備している。また、A3Bi7と正常A3Bの機能の違いを明らかにするため、A3Bi7と野生型A3B cDNAを293細胞に導入し、C>T変異が入ると発光するプローブを用いてcytidine deaminase活性を測定する実験系を確立し、C>T変異をDNAシークエンシングにて確認している。正常A3BとA3Bi7をそれぞれ特異的に増幅するPCR primerを設計し、real-time RT-PCRによって発現を定量化する実験系を確立し、健常人末梢リンパ球などを対照に用いて、共同研究施設におけるMGUS/骨髄腫患者におけるA3B強発現とA3Bi7の特異的発現を確認している。実験系の確立と、トランスジェニックマウスの作成は成功したが、継代化に時間を要している。また、臨床検体の集積も予定より遅れがみられている。予定通り、骨髄腫細胞に発現しているA3Bi7と正常A3Bの機能の違いを明らかにしていく。引き続きトランスジェニックマウスのライン化・観察を行い、骨髄腫発症を確認する。患者検体のA3Bi7の発現解析を継続し、進展予後との関連を評価する。患者検体集積を増やすため、共同研究施設の追加を検討する。A3B/A3Bi7 transgenic mouseのライン化が遅れているため、維持継代・繁殖の費用として計上していた予算が余った。次年度早々にはライン化が可能となるため、繰り越した予算で繁殖を行い、研究を進める。
高次漸近許容性に基づく新しい統計的手法の開発

統計的推測における高次漸近理論は,大標本論の中でも特にリスク関数の高次の項に着目し,観測データを分析する統計的手法に関する理論体系であり, 1960年代から現在まで,正則モデルを中心に様々な角度から詳細に研究されてきた.しかしながら,その中でも,推定方式の高次の漸近許容性に関する理論体系は必ずしも明確にはなっていない.本研究課題の目的は,統計的推測の観点からリスク関数を通して,推定量の高次の漸近許容性の理論の構築,および推定量の特徴付けを与えるという問題について,未解決な問題を理論的に明らかにし,その構造を解明することである.統計的推測における高次漸近理論は,大標本論の中でも特にリスク関数の高次の項に着目し,観測データを分析する統計的手法に関する理論体系であり, 1960年代から現在まで,正則モデルを中心に様々な角度から詳細に研究されてきた.しかしながら,その中でも,推定方式の高次の漸近許容性に関する理論体系は必ずしも明確にはなっていない.本研究課題の目的は,統計的推測の観点からリスク関数を通して,推定量の高次の漸近許容性の理論の構築,および推定量の特徴付けを与えるという問題について,未解決な問題を理論的に明らかにし,その構造を解明することである.
水稲湛水直播栽培の苗立ち安定化に圃場の均平状態が与える影響

1.農家が直播稲作導入を判断する過程に関する検討大規模稲作農家が新技術としての直播の導入を判断する過程を考究し,実際の事例を用いて検証した.農家が直播の導入を判断する過程は,必要性を前提として,1)春先の省力化で所得機会が増大できる場合に直播を必要だと発想する(発想段階),2)地域条件から導入が可能と判断する(可能性判断段階),3)直播の経済性を評価し,特に最大のリスクである「収量が激減する危険性」が回避可能と判断する(経済的評価段階),の3段階に区分される.このうち最大の障壁は直播技術の困難さによる収量激減の危険性と考えられる.2.直播稲作の定着条件に関する考究直播稲作の導入・定着の是非は営農主体である農家が判断すべきであるとの観点で,直播面積が多い条件を4タイプにわけ,それぞれの定着条件を面積の推移に注目して考究した.面積変化を市町村単位で見れば大勢の把握は可能であり,また定着のためには農家自身が直播に必要性を感じて導入を判断することが重要なことが示唆された.3.水稲湛水散播での播種深度に関わる諸因子湛水散播は省力的だが播種深度が制御しにくい.その播種深度に関わる諸因子について整理・検討し,田面の硬度よりも湛水の方が影響が大きいこと,均平技術を鑑みると,湛水散播では播種深度は制御しにくいことを示した.なお,種籾の質量についてはさらに検討を要する.4.代かき排水中のSSに関する考察代かき時のSS流出について検討した結果,排水中のSS濃度は田面水と同程度になりうること,SS流出量には排水口の垂直位置が関係すること,事例水田での土壌流亡は数μmであることが,また実験から,代かき時の湛水深が浅く,代かきが軽度かまたは念入りなほどSS濃度は低下することがわかった.よってSS流出の軽減には湛水深を浅くすることが有効で,そのためには均平管理が重要である.1.農家が直播稲作導入を判断する過程に関する検討(農業土木学会論文集・印刷中)大規模稲作農家が新技術としての直播の導入を判断する過程を考究した.農家が直播の導入を判断する過程は,必要性を前提として,1)春先の省力化によって所得機会が増大できる場合に直播を必要だと発想する(発想段階),2)地域条件を踏まえて導入が可能であると判断する(可能性判断段階),3)直播の経済性を評価し,特に最大のリスクである「収量が激減する危険性」が回避可能と判断する(経済的評価段階),の3段階に区分される.このうち最大の障壁は直播技術の困難さによる収量激減の危険性と考えられる.また,このことを実際の事例を用いて検証した.2.代かき排水中のSSに関する考察(2000年度農業土木学会大会にて発表予定)代かき排水によるSS(水中浮遊物質)で排水が汚染される問題について,灰色低地土水田を事例として現地における実態把握を行い,続いて実験室内にて,代かき時の湛水深や,どの程度念入りに代かきを行うかなどの影響について検討した.現地調査の結果,事例水田における代かき排水時には,10aあたり2.4kgの土粒子がSSとして放逐されていることが計測された.これは土層厚にして数ミクロンのオーダーである.また,SSの排出量には,排水口の配置も大きく影響し,排水口を浅く設置して田面に近づけすぎるとSS流出が多くなることも示唆された.続いて,代かきを攪拌によって模擬的に表現して,その後の土壌の沈降の具合を測定する実験を行った.その結果,代かきを念入りに行うほど,また湛水深を少なくすれば少なくするほど,沈降が早く,短時間SS濃度が低くなることがわかった.これは土粒子間の吸引力によるものだと考えられる.すなわち,実際の水田においても,浅水で,念入りに代かきを行えば,代かき排水のSS負荷が軽減されることが示唆された.1.農家が直播稲作導入を判断する過程に関する検討大規模稲作農家が新技術としての直播の導入を判断する過程を考究し,実際の事例を用いて検証した.農家が直播の導入を判断する過程は,必要性を前提として,1)春先の省力化で所得機会が増大できる場合に直播を必要だと発想する(発想段階),2)地域条件から導入が可能と判断する(可能性判断段階),3)直播の経済性を評価し,特に最大のリスクである「収量が激減する危険性」が回避可能と判断する(経済的評価段階),の3段階に区分される.このうち最大の障壁は直播技術の困難さによる収量激減の危険性と考えられる.2.直播稲作の定着条件に関する考究直播稲作の導入・定着の是非は営農主体である農家が判断すべきであるとの観点で,直播面積が多い条件を4タイプにわけ,それぞれの定着条件を面積の推移に注目して考究した.面積変化を市町村単位で見れば大勢の把握は可能であり,また定着のためには農家自身が直播に必要性を感じて導入を判断することが重要なことが示唆された.3.水稲湛水散播での播種深度に関わる諸因子湛水散播は省力的だが播種深度が制御しにくい.その播種深度に関わる諸因子について整理・検討し,田面の硬度よりも湛水の方が影響が大きいこと,均平技術を鑑みると,湛水散播では播種深度は制御しにくいことを示した.なお,種籾の質量についてはさらに検討を要する.

4.代かき排水中のSSに関する考察代かき時のSS流出について検討した結果,排水中のSS濃度は田面水と同程度になりうること,SS流出量には排水口の垂直位置が関係すること,事例水田での土壌流亡は数μmであることが,また実験から,代かき時の湛水深が浅く,代かきが軽度かまたは念入りなほどSS濃度は低下することがわかった.よってSS流出の軽減には湛水深を浅くすることが有効で,そのためには均平管理が重要である.
糖尿病スクリーニングの有効性評価のための新しいシミュレーションモデルの開発

マルコフモデルとモンテカルロ・シミュレーションを用いた手法により、糖尿病スクリーニングの有効性評価モデルを構築した。分析の立場として社会の立場を用い、対象者を40歳の一般的な地域住民として、スクリーニングを実施しない場合を基準に評価したところ、生存年を1年延長するのに要する費用は、毎年実施、5年ごと実施、1回のみ実施で、それぞれ690万円、675万円、341万円であった。生活の質を調整した生存年を1年延長するのに要する費用は、それぞれ381万円、381万円、187万円であった。(いずれも費用と効果を5%で割り引いた場合)。つぎに、地域住民に対してアンケート調査を実施し、各種介入に対するスクリーニング受診行動の変化を調査した。その結果をコンピュータ上に実装し、地域への健康介入活動に対する効果を評価するためのシミュレーションシステムを開発した。このシステムを用いて、スクリーニング受診の行動変容に結びつく要因を解析したところ、社会的および精神的な支援介入では、「病気発覚後のサポート体制が充実したとき」、「健診仲間ができたとき」、「土日・深夜でも健診が受けられるようになったとき」に、受診行動の意識が増加する可能性が示された。また、周囲の人からの介入では、「医療関係者」、「発病者」、「家族」の助言が、意識変化に影響する可能性が示された。マスメディアによる情報提供の介入では、「テレビ」が意識変化に正の影響を示していた。とくに、「健康への不安」が受診回数や健康診断に対する意識に対して正の影響を示しており、こうした不安をあおる運動とマスメディアを組み合わせることで、より有効性が高まるものと思われた。今後は、本システムを用いて最適条件を模索し、地域特性や地域のニーズに適した介入方法を検討したいと考えている。マルコフモデルとモンテカルロ・シミュレーションを用いた従来型の手法による評価を実施した。評価では、分析の立場として社会の立場を用い、対象者を40歳の一般的な地域住民として、スクリーニングを実施しない場合を基準に、生涯にわたり毎年、5年ごと、および1回のみ実施の3条件を用いた。その結果、スクリーニングを実施しない場合と比べ、その効果は0.07年(1回のみ実施)0.14年(毎年実施)の生存年延長であった。生活の質を調整した生存年(QALY)では、0.10年(1回のみ実施)0.19年(毎年実施)の延長であった。生涯の総費用は、スクリーニングの実施によって、13万円(1回のみ実施)63万円(毎年実施)増加した。費用・効果ともに年率5%で割引いた場合、生存年を1年延長するのに要する費用が、毎年、5年ごと、1回のみ実施で、それぞれ1,844万円、1,825万円、1,603万円であった。同様に、QALYを1年延長するのに要する費用は、それぞれ957万円、954万円、805万円であった。感度分析の結果、以上の結果は合併症の費用、合併症の発症率に比較的敏感であり、スクリーニングの費用、糖尿病の発症率、有病率、受動的発見による受療率には敏感ではなかった。以上の結果は、2型糖尿病スクリーニング実施に対して、中等度の根拠を示すと考えられる。ただし、結果の安定性については、設定条件についての追加研究による検討が必要と考えられる。
不規則複雑系多孔体に適用可能なナノ細孔“形状”評価手法の確立

多孔体の特性評価の基となる細孔構造解析は、細孔形状を“仮定"して行われることが往々にしてある。その主な要因は、複雑かつ無秩序な細孔を有する多孔体に適用可能なナノ細孔“形状"評価法の欠落にある。本研究は、あらゆる不規則複雑系多孔体に適用可能なナノ細孔“形状"評価手法の確立を目的とする。また、主目的を達成する過程で、ナノ制限空間内に捕らわれた分子の電子分布が細孔形状によってどう変化するかという問いに対する解を得る。この解は、ナノ制限空間内における特異な分子挙動の理解と制御の足がかりとなる。理想モデルから市販材料に亘るマルチスケールの多孔体を用いた実験的検討によってこれらの目的を達成する。