hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
電界駆動型流体トランジスタを用いた高速遺伝子センシングシステムの研究

本研究では、遺伝子解析ツールとして注目されている遺伝子トランジスタの研究を発展させ、簡便で迅速で安価な遺伝子解析ツールにする研究を行った。本研究期間中に、ポンプ-バルブ機能を組み合わせた流体素子の研究を行い、高速スイッチング機能を持った送液制御系の研究を行った。また、送液システムと遺伝子トランジスタと組み合わせるために、集積化プロセスを構築した。個人の体質による個別治療(テーラーメード医療)を実現するためには、体質に関わるSNPsなどの特定遺伝子配列を臨床現場で迅速に診断する必要がある。現在主流の解析装置は高額であり専門の医療・研究機関でしか使うことはできない。また装置が複雑で解析には時間がかかる問題がある。遺伝子の配列情報を臨床利用するためには、簡便・迅速・安価な遺伝子解析のツールが必要である。この課題に対して研究者は、遺伝子解析ツールとして注目されている遺伝子トランジスタの研究を発展させ、本研究で進めるポンプ-バルブ-センサ集積化デバイスの研究と遺伝子トランジスタとの集積化を行い、遺伝子解析システムの装置化を目指している。本研究では高速スイッチング機能を持った送液制御系と遺伝子トランジスタを組み合わせ、迅速な遺伝子解析システムの構築が必要である。この研究を進める上で重要なポイントは電界駆動型流体トランジスタを用いたポンプ-バルブ機能とその素子を複数制御して行う高速スイッチング式送液技術の確立、およびトランジスタを組み合わせた連動型センシングシステム化技術の開発である。平成25年度には高速スイッチング式送液技術の確立の内、重要となる電界駆動型流体トランジスタ試作を行った。電界駆動型流体ゲートは疎水膜を用いて構成する。流路内の液体は疎水性親水性界面で液体は止まる。この性能を用いパターニングした疎水性膜を用いてノーマリークローズのゲートを形成する。流動を起こすためにEWODの原理を用いてゲート電圧を加えることにより液体の界面張力を変調させる。さらに試薬側(ソース)から圧力を加えることで界面を形状変化させ、液体先端がキャピラリ部に到達した際に毛細管力で送液方向(ドレイン)へ試薬を取り出す構造である。25年度には原理検証用のマクロモデルと実デバイスサイズの10mm角チップに関してマスク作製および試作チップ作製を行った。現在主流の解析装置は一台数千万円一億円と高額であり専門の医療・研究機関でしか使うことはできない。この課題に対して、私は遺伝子解析ツールとして注目されている遺伝子トランジスタの研究を発展させ、本研究で進めるポンプ-バルブ-センサ集積化デバイスの研究と遺伝子トランジスタとの集積化を行い、簡便で迅速で安価な遺伝子解析システムの装置化を目指している。26年度は25年度に試作を行った電界駆動型流体トランジスタ試作の改良を行った。本デバイスの電界駆動型流体ゲート部は疎水膜を用いてノーマリークローズのゲートを形成する。昨年度の試作では電界駆動バルブ性能が不十分なであったため、流体ゲートの機能を果たせなかった。これを改善すべく本年度は構造の見直しを行った。バルブ部分は深堀エッチングで作製するSi構造体による疎水性能を利用すると同時に、エレクトロウェッティングの原理を用いて電界駆動の親水性・疎水性の高速切り替えを行う必要がある。そのため、構造体の上の電極形成が必要になり、またバルブ部に疎水性能を持たせる必要がある。現在までは電極形成部の上部に、撥水性膜をパターニングする方法の検討を行っていたが、疎水性が強すぎるため撥水性膜の条件変更を検討した。また並行して、センサ部の作製プロセスの検討も行った。CMOSプロセスで用いる各装置の詳細な条件出しを行い、駆動系回路のためにCMOSプロセスの条件出しを行った。またその条件を本研究のPre-CMOSプロセスへ適用するために調整を進めた。個人の体質による個別治療を実現するためには、体質に関わる特定遺伝子配列を臨床現場で迅速に診断する必要がある。この課題に対して研究者は、遺伝子解析ツールとして注目されている遺伝子トランジスタの研究を発展させ、本研究で進めるポンプ-バルブ素子と遺伝子トランジスタとの集積化を行い、簡便で迅速で安価な遺伝子解析システムの装置化を目指している。27年度は試作した電界駆動型流体トランジスタのバルブ部の駆動制御の研究を行った。流体ゲート部を気泡バルブ駆動に変更し、送液の停止および再流動を確認し、ポンプ-バルブ素子として送液を可能にした。またセンサ部の作製プロセスの検討も行った。プロセスの条件出しを進め、駆動回路で用いる素子の電気特性の調整を行い、駆動回路を作製可能なプロセス条件を選定する事が出来た。また、この工程をPre-CMOS工程へ適用するために、エッチング面の平坦化処理について研究を進めた。平坦化の最適化プロセスを調査し、エッチング面に微細加工プロセスが可能になった。この成果よりCMOS-MEMS融合工程が可能になり、ポンプ-バルブ-センサ集積化デバイス用の一体化プロセスが可能になった。

さらに複数の電界駆動型流体トランジスタを制御し順次送液を行う駆動回路の研究を行い、時間制御法による送液制御システムを構築した。本研究期間では要素技術研究に専念しており、必要な要素技術は確立できたが研究成果として発表するには至らなかった。現在これらの要素研究をまとめ、ポンプ-バルブ-センサ集積化デバイスの作製を行っており、今後この成果をまとめ報告する予定である。本研究では、遺伝子解析ツールとして注目されている遺伝子トランジスタの研究を発展させ、簡便で迅速で安価な遺伝子解析ツールにする研究を行った。本研究期間中に、ポンプ-バルブ機能を組み合わせた流体素子の研究を行い、高速スイッチング機能を持った送液制御系の研究を行った。また、送液システムと遺伝子トランジスタと組み合わせるために、集積化プロセスを構築した。本研究では電界駆動型流体トランジスタ部の作製と、それに伴う駆動回路の作製が重要な課題である。現在までこの二つの課題の内、駆動回路のプロセス工程の検討は、プロセスフローの構築まで終了している。現在はこのプロセスで作製されるデバイスの電気的特性の調整を行っている。またこの工程を私の考案したPre-CMOS工程へ適用するためには、ボッシュプロセスによる深堀工程を行ったエッチング面の平坦化処理が必要になる。平坦化処理はエッチングプロセスの条件、または追加エッチングにより平坦化を行うため、その条件出しを進めている。この工程によりデバイス作製が可能になると、深堀エッチング底面部にCMOSプロセスを行うプロセスになり、CMOS-MEMS融合工程の画期的な研究となる。現在までの研究で、エッチング条件を選定しつつあり、本研究で必要な駆動回路のプロセス部分は約8割の達成度で進んでいる。電界駆動型流体トランジスタ部の作製については、流体ゲートの特性に関して課題が生じている。流体ゲートのバルブ部分は疎水性能とエレクトロウェッティングの原理を利用した電界駆動の親水性・疎水性の切り替えを行う必要がある。現在の構造では疎水性能が強く出てしまい、電界駆動の親水性を実現できなくなっている。この問題のため進捗は約50%程度である。問題を解決するために、疎水性能を示す撥水性膜の成膜条件の変更を検討している。これにより、疎水・親水性の切り替えが可能にし、電界駆動のバルブ部の問題を今後の研究で解決する予定である。総合領域本年度は昨年度までの研究を引き続き進め、電界駆動型流体トランジスタ部の作製と、それに伴う駆動系回路の作製および試作チップの完成を目指す。電界駆動型流体トランジスタに関しては、流体ゲート部の疎水・親水性の高速切り替えを可能にする。そのため、撥水性膜の成膜条件の変更を行い、同時に電極サイズの見直しを行い、電界駆動での親水化(エレクトロウェッティング)が起きやすい構造に修正する。試作を行った後、電界駆動型流体トランジスタとしての基礎データが揃った段階で特許申請を行い、出願と同時に研究内容の公開(発表、論文投稿)を進めて行く。
経時的脳内酸化ストレス評価に基づく重症脳障害患者の抗酸化治療の有効性に関する研究

3年計画の1年目として、平成22年度は、救命救急センターICUの重症脳障害患者5例(頭部外傷2例、くも膜下出血3例)にマイクロダイアリシスモニタリングを行った。マイクロダイアリシスの基本項目(glutamate,glycerol,lactate/pyruvate比,glucose)の測定は、受傷・発症から約2週間継続して1時間毎に行った。脳内酸化ストレスマーカーはまだ十分評価できていないので、重症頭部外傷(Glasgow Coma Scale 313)8例に関して前年からの症例もまとめて解析したものを報告する。びまん性軸索損傷3例、脳挫傷2例、急性硬膜外血腫2例、急性硬膜下血腫1例と病態が混在しているため明確なことは言えないが、重症頭部外傷ではlactate/pyruvate比の高値が持続し、その値が変動する症例では予後不良の傾向にあった。繰り返す皮質拡延性抑制(cortical spreading depression : CSD)が予後不良群において認められるlactate/pyruvate比の大きな変動の要因の一つと考えられる。マイクロダイアリシス測定はプローブ挿入部局所の病態を検出するのみであり、空間的に多様性に富んだ重症頭部外傷の病態把握には、他のmodalityとの併用が必須である。また、マイクロダイアリシスを治療法決定のために手段として用いるには、今後、さらなる検証が必要である。重症頭部外傷15例にマイクロダイアリシス(MD)モニタリングを行い、基本項目(glutamate, glycerol, lactate/pyruvate比,glucose)の測定は、受傷・発症から約2週間継続して1時間毎に行った。脳ヘルニア例あるいはモニタリング期間が24時間未満の症例は除外した。びまん性軸索損傷4例、脳挫傷4例、急性硬膜外血腫4例、急性硬膜下血腫3例を対象とし、1508サンプルを解析した。脳灌流圧と即パラメータとの相関は、転帰良好6例中1例、転帰不良例9例8例に認め、転帰不良例で高率に認めた。び漫性脳損傷例(転帰不良)においてもMDプローブを正常部位に留置した症例においては、MDパラメータは正常域であった。心停止後昏睡例11例にもMDモニタリングを行い、1287サンプルを解析した。他のパラメータに比してglycerolは初期値が著しく高値の2例は転帰不良であり、glycerolは細胞膜破壊の程度すなわち重症度を示すことが示された。また抗脳浮腫薬glycerol使用時には、これにMD glycerol値が影響され、その評価は難しいことが判明した。低体温療法の復温時のglycerol増加には全身脂質細胞分解の影響を除外して考える必要がある。MD測定はプローブ挿入部局所の病態を検出するのみであり、空間的に多様性に富んだ重症頭部外傷の病態把握には、他のmodality(脳灌流圧、局所脳酸素分圧、局所脳血流など)との併用が必須である。MDを治療法決定のために手段として用いるには、今後さらなる検証が必要である。研究施行に必要なマイクロダイアリシスプローブが入手不可能となっている。個人輸入手続き調整中であり、入手でき次第研究再開する。そのためその準備段階として平成24年度は急性重症脳障害に対する神経集中治療としてのtargeted temperature management (TTM)を血管内体温管理装置により施行し、その効果を検討した。1血管内体温管理装置による治療的低体温療法の冷却能力および体温安定性に関する検討重症脳卒中10例、重症頭部外傷6例、心停止後症候群8例を対象とした。血管内体温管理装置法(T群)12例、自動式体表面ジェルパッド法(A群)6例、従来型ブランケットによる体温管理法(M群)6例で比較検討した。導入時目標体温到達までの冷却速度を3群間で比較し、また低体温維持期の24時間を1時間毎、設定温度と膀胱温との誤差を3群で比較した。平均冷却速度(°C/hr)はT群1.56、A群1.11、M群0.38でありT群が有意にM群より高速であった。維持の平均体温誤差(°C)はT群0.09、A群0.12、M群0.32でありT群およびA群の誤差はM群より有意に小さかった。2重症くも膜下出血に対する血管内体温管理装置にいる積極的常温療法の効果の検討破裂脳動脈瘤によるくも膜下出血17例(H-K grade 3-5)に対して積極的常温療法を114±32時間行った(脳血管攣縮期の中期のみ)。体温は常温療法前37.4±0.5°C、常温療法後37.4±0.5°C、であったのに対して常温療法中は36.9±0.5°Cで維持された。症候性脳血管攣縮は16.7 %,退院時転帰良好率は58.3%と当院の過去の成績(それぞれ22.2 %、51.9 %)に比して改善傾向がみられた。今後はTTMにおける脳内酸化ストレス評価をマイクロダイアリシスにより評価し、上記結果と会わせて検討していく予定である。研究施行に必要なマイクロダイアリシスプローブが急遽入手不可能となった。現在調整中である。24年度が最終年度であるため、記入しない。現在調整中である。
分子形質を用いた魚卵の分類体系の確立

本年度は、浜名湖に生息する魚類の採集およびこれまでに採集した魚類のDNA解析と、浜名湖内の水流1の観測およびネットサンプリングによる浮遊性魚卵の採集をおこなった。(1)本研究では、まず、浜名湖産魚類を網羅したDNAデータベースを作成することを目的とした。前年度に採集した魚類と本年度に採集した魚類、合わせて15目63科119種類に属する212個体を材料に、ミトコンドリアDNA(mtDNA)の16SrRNA領域の約1000塩基対の配列を決定した。その結果、新たに23種の魚類についてmtDNAの16SrRNA領域のシークエンスデータが得られた。(3)2007年1月23日3月9日に浜名湖内に設けた6定点(水深2.211.5m)において係留計を設置し、長期的な湖水の流れを観測した。その結果、湖口に近い定点では、潮汐に同期した流れが観測され、湖口部においては外海との水の行き来があると考えられた。また、湖中央部においては全体として反時計回りの流れがあることが明らかとなった。(4)2007年3月9日にADCPによる海流観測と、浮遊性魚卵の採集を同時におこなった。ADCPによる観測結果は現在解析中である。浮遊性魚卵は湖内に設けた5定点で、目合い0.33mmのプランクトンネットを表層曳きし採集をおこなった。採集したネットサンプルはホルマリンサンプルとして保存した。このサンプルについても現在解析中である。以上、平成18年度の研究結果から、湿地からのメタン放出量を適切に見積もるためには、噴出による大きなフラックスの変動をカバーする高頻度での観測を行う必要があること(特に気圧が低下局面にある悪天候時に観測を行うこと)、大きな放出が生じる融雪期にも観測を行う必要性があること、が明らかとなった。魚卵の分類は形態によっておこなわれてきた。しかし、明瞭な形態的特徴の少なさや発生にともなう形態変化のためその分類は非常に難しい。DNAを分類形質とすることで魚卵の形態学的分類の問題点を解決できると考えられる。しかし魚卵のDNA分類は、データベースの不足や方法論が未完成であるといった理由のため、野外で採集された不特定多数の魚卵に適用することはできなかった。しかしながら、もし特定の海域を対象として母集団を限定し、完全に網羅したデータベースを作ればDNAによる分類は適用可能であると考えられる。そこで本研究では、半閉鎖的な海水湖である浜名湖をモデル海域とし、出現する魚卵すべての種査定を可能にすることを目的とする。そのためにまず、DNAのみを用いて魚類を分類できるシステムを構築する。さらにそのシステムを使って魚卵を同定し、形態情報を蓄積することで形態による分類も可能にする。以上を総合し、DNAと形態の両者を用いた実用的な分類を可能にする。本年度は平成16年8月から平成17年2月に、浜名湖に出現する魚類および魚卵の採集をおこなった。(1)本研究ではまず浜名湖産魚類を網羅したDNAデータベースを作成することを目的とした。浜名湖においておこなわれている袋網漁の漁獲物から、これまでに計14目55科87種の魚類を採集した。(2)浜名湖内に出現する魚卵をネットサンプリングにより採集した。採集した魚卵は顕微鏡下で写真を撮影した後、DNA解析用標本としてエタノール保存した。これまでに1976個の魚卵を採集した。本年度は、浜名湖に出現する魚類および魚卵の採集、および採集した魚類のDNA解析をおこなった。浜名湖においておこなわれている袋網漁の漁獲物から、2004年4月2005年10月に15目63科119種類に属する計212個体を採集した。そのうち30種についてミトコンドリアDNAの16SrRNA領域の約1000塩基対の配列を決定した。(2)浜名湖内に出現する魚卵を、湖内に8ヶ所の定点を設定し、プランクトンネットにより採集した。2004年8月2005年11月に計6408個の魚卵を採集した。2004年8月2005年2月までのサンプル(1977個)を形態によって分類した結果、26種類に分けられ、5種(イシガレイ、カタクチイワシ、スズキ、ホウボウ、メイタガレイ)は種まで同定できたと考えられた。(3)前述の26種類を含む計258個の卵を孵化実験に供し、その卵内発生を観察、記録した。(4)2004年12月2005年11月の期間で魚卵の出現量の周年変化を調べた。合計5149個の魚卵が採集された。密度は、湖口に近い定点では比較的均一だったのに対し、湖中央部の定点では明瞭なピークが認められた。カタクチイワシの卵はほぼ周年を通して採集されたが、910月に湖中央部から奥部において明瞭なピークが認められた。このことから猪ノ鼻湖から湖中央部がカタクチイワシの産卵場になっていることが考えられた。イシガレイ卵の出現量は1月に明瞭なピークがあった。また、湖口の定点で密度が低く、湖中央部の定点で密度が高かったことから、女ヶ浦沖から湖中央部が産卵場であることが考えられた。

このように、浜名湖内に産卵場をもつ魚種がいることが明らかとなった。本年度は、浜名湖に生息する魚類の採集およびこれまでに採集した魚類のDNA解析と、浜名湖内の水流1の観測およびネットサンプリングによる浮遊性魚卵の採集をおこなった。(1)本研究では、まず、浜名湖産魚類を網羅したDNAデータベースを作成することを目的とした。前年度に採集した魚類と本年度に採集した魚類、合わせて15目63科119種類に属する212個体を材料に、ミトコンドリアDNA(mtDNA)の16SrRNA領域の約1000塩基対の配列を決定した。その結果、新たに23種の魚類についてmtDNAの16SrRNA領域のシークエンスデータが得られた。(3)2007年1月23日3月9日に浜名湖内に設けた6定点(水深2.211.5m)において係留計を設置し、長期的な湖水の流れを観測した。その結果、湖口に近い定点では、潮汐に同期した流れが観測され、湖口部においては外海との水の行き来があると考えられた。また、湖中央部においては全体として反時計回りの流れがあることが明らかとなった。(4)2007年3月9日にADCPによる海流観測と、浮遊性魚卵の採集を同時におこなった。ADCPによる観測結果は現在解析中である。浮遊性魚卵は湖内に設けた5定点で、目合い0.33mmのプランクトンネットを表層曳きし採集をおこなった。採集したネットサンプルはホルマリンサンプルとして保存した。このサンプルについても現在解析中である。以上、平成18年度の研究結果から、湿地からのメタン放出量を適切に見積もるためには、噴出による大きなフラックスの変動をカバーする高頻度での観測を行う必要があること(特に気圧が低下局面にある悪天候時に観測を行うこと)、大きな放出が生じる融雪期にも観測を行う必要性があること、が明らかとなった。
茶で検出されたニコチンの起源の解明

チャ葉から検出されたニコチンの起源を明らかにすることは,食の安全・安心の観点からも非常に重要である.本研究では,チャから検出されたニコチンの起源を決定付け,その原因の詳細について明らかにすることを目的とした.我々は,チャにおける高感度ニコチン分析方法を確立し,世界中に流通している茶製品をはじめとする多くの茶サンプルについてニコチ含量を分析した.その結果,ほとんどのサンプルから残留基準値以上のニコチンを検出した.環境中からのニコチン汚染が限りなく低いサンプルからも普遍的にニコチンを検出したため,チャはニコチンを生合成している可能性を示唆した.茶葉から検出されたニコチンの起源を探索するため,世界各地の茶産地または品種についてニコチン含量を分析し,データの再取得を試みた.まず,以前までのGC-MSを用いたニコチン定量法では多検体を扱う分析作業能と定量性に問題があったため,LC-MSを用いたQuEChERS法について分析条件の最適化を行った.その結果,ニコチン定量に対する検出感度を1オーダー向上させることに成功した.茶品種のニコチン定量に関しては,野菜茶業研究所内圃場の茶コアコレクション(48品種およびツバキ近縁種)について分析を行い,ニコチン含量には品種間差があることを明らかにした.また,茶製造過程におけるニコチン含量の変化を調査したが,ニコチン含量と製造工程との関連性は見られなかった.ニコチン生合成に関連する鍵遺伝子のQPTとPMTの単離を試みた結果,現在までにQPT遺伝子の全長単離に成功した.一方,効率的なチャの形質転換のために,すでにチャへの感染報告があるLBA4404およびEHA105のほかにGV3101株を入手し,それぞれのアグロの形質転換および植物への感染条件を検討するための増殖曲線を求めた.まず,上記の3種類のアグロバクテリウムを完全に滅菌し,かつ,チャの不定胚の生育に影響を及ぼさないセフォタキシム濃度を明らかにした.また,培地支持体にキムワイプを用いることで,チャの不定胚を迅速に緑色の幼植物体に育成する方法を確立した.現在までに,不定胚からの発根に成功しており,遺伝子導入後のチャの不定胚を速やかに固体にすることが可能となった.昨年度までの研究結果より,茶葉から検出されたニコチンの起源については,内因性の可能性が示唆されているが,確証を得るまでには至っていない.そこで,平成27年度はチャにおけるニコチン生合成経路の探索と同時に,世界各地の茶製品,茶品種,チャ培養細胞を対象に,LC-MS/MSによるニコチン含量の定量を行った.まず,世界各地の茶製品102点を分析したところ,その全てから残留基準値以上のニコチンが検出され,特にインド産紅茶からは乾物1 gあたり最大0.7 μgと,日本産の緑茶と比べ35倍以上のニコチンを検出した.茶品種のニコチン定量に関しては,野菜茶業研究所内圃場のチャコアコレクション(192系統)の成葉を対象にニコチン含有量を調査し,ニコチン含量には品種間差があることを明らかにした.チャのmRNA配列データベースからニコチン生合成関連遺伝子群(PMT,QPT,MPO,ODC,QS)の配列取得を行い,PMTを除く遺伝子群についてmRNA配列を取得した.チャ培養細胞を用いて,これら遺伝子群のジャスモン酸メチル(MeJA)応答性とニコチン生合成能との関連性について調査した.MeJA処理により,これら遺伝子群の発現量が増加したものの,ニコチン含量の有意な増加は見られなかった.ニコチン生合成関連遺伝子のチャ組織への導入のために,主としてパーティクルガンによる遺伝子導入法の検討を行った.その結果,射入距離6 cm、ヘリウムガス圧11000 psi,金粒子径1 &micro;mの条件下において,導入したプラスミドのイネユビキチンプロモーターおよびCaMV35Sプロモーターがチャ組織で機能することが分かった.また,形質転換材料である不定胚の安定供給およびチャに特有のパーティクルガン処理後の培養プロセスを考案したところ,マンニトール処理は不定胚の生存率を低下させること分かった.QuEChERS法による抽出法とLC-MS/MSを用いたニコチン定量法の最適化により,多検体の分析サンプルを迅速且つ正確に定量可能となった.茶園でのサンプリングは概ね順調に遂行でき,定量実験も順調に行っている.生合成遺伝子について,PMTについては以前難航しているものの,チャのRNA-seq解析を用いたデータベースを構築したことにより,多くのニコチン生合成関連遺伝子を単離することに成功した.チャ組換え体の作製については,ボンバードメント前後に多くの植え替え操作を行うことで不定胚の生存率を低下させることが分かった.チャの不定胚にパーティクルガン処理を行う際には,オーキシン存在下で不定胚を培養し,ボンバードメント処理後には植え替えずそのまま暗黒下で培養を行い,約1ヵ月後にホルモンフリー培地に移植することで形質転換二次胚を誘導することが可能であることが明らかとなった.昨年度までの研究結果より,茶葉から検出されたニコチンの起源については,内因性である可能性が高いことが示唆されたが,直接的な確証は得られていない.

そこで,平成28年度は水耕チャ樹またはチャ培養細胞を用いた生体内での生合成経路の探索を中心に行なった.チャのmRNA配列データベースからニコチン生合成関連遺伝子群(PMT,QPT,MPO,ODC,QS)の配列取得を行い,これら遺伝子群のジャスモン酸メチル(MeJA)応答性とニコチン生合成能との関連性を調査した.その結果,チャ培養細胞ではMeJA処理により,これら遺伝子群の発現量増加とニコチン含量の有意な増加が見られた.しかし,水耕チャ樹ではニコチン含量の有意な増加は見られなかった.また,茶品種のニコチン定量に関しては,野菜茶業研究所内圃場のチャコアコレクション(192系統)の成葉を対象にニコチン含有量の経年変化を調査し,ニコチン含量には季節間差があることを明らかにした.チャの細胞内におけるニコチン生合成経路解明のツールとして,形質転換技術の確立を目指した.一度に多くの培養物について処理でき,植物種を選ばないパーティクルガン法について試みたところ,モデル植物のタバコを用いたパーティクルガン処理の培養方法をチャの不定胚に適用すると,高頻度の移植そのものが不定胚を枯死に至らせることが明らかとなった.また,抗生物質添加液体培地では,固形培地よりも3週間早く不定胚が枯死することが分かった.一方,宿主ゲノム中への挿入が可能なアグロバクテリウム法,特に毛状根形成アグロの形成能ついて,それぞれチャにおける形質転換のための条件検討を行った.その結果,さまざまな毛状根形成がみられたため,チャに親和性のあるアグロを検討する必要性がある.また,茶抽出物を添加したLB培地ではアグロバクテリウムの生育が抑制傾向であることが示唆された.チャ葉から検出されたニコチンの起源を明らかにすることは,食の安全・安心の観点からも非常に重要である.本研究では,チャから検出されたニコチンの起源を決定付け,その原因の詳細について明らかにすることを目的とした.我々は,チャにおける高感度ニコチン分析方法を確立し,世界中に流通している茶製品をはじめとする多くの茶サンプルについてニコチ含量を分析した.その結果,ほとんどのサンプルから残留基準値以上のニコチンを検出した.環境中からのニコチン汚染が限りなく低いサンプルからも普遍的にニコチンを検出したため,チャはニコチンを生合成している可能性を示唆した.LC-MSを用いたQuEChERS法によるニコチン定量法の最適化を行ったことにより,多検体の分析サンプルを迅速に,かつ,正確に定量可能となった.茶園における分析対象検体のサンプリングはおおむね順調に遂行でき,定量実験も順調に行っている.生合成遺伝子については鍵遺伝子のQPTについて単離できたが,PMTについては難航している.部分配列の単離は成功しているため,単離することは可能であると考えられる.チャ組換え体の作製については,安定的に不定胚が増殖しないことが形質転換実験における問題点であったが,チャの不定胚への遺伝子導入後の個体育成プロセスについて方法を確立できた.これまでと同様に,世界各地の茶産地または品種についてニコチン含量の定量を行う.現在までに,ニコチン含有量には品種間差が確認できた.そこで,茶期別のサンプル間差と年次間差についても検討する.また,平成28年度は,水耕栽培系またはチャ培養細胞の無菌培養系を用いた生体内での生合成経路の探索を中心に行う.具体的には,ニコチン生合成系遺伝子群のさらなる単離・同定を進め,MeJA応答性などの生理応答試験を行う.遺伝子同定試験についてはAgrobacterium rhizogenesを用いた組換え系をにより実施する.さらに,ニコチンの生合成経路を基に,より低濃度に抑えることができる栽培技術を開発し,栽培現場にアウトプットする.
非可逆圧縮過程における暗号学的性質を利用したデジタル署名技術の開発

本年度は,不可逆圧縮過程をともなうデータ圧縮技術のセンサーネットワークへの適用を検討し,その情報理論的及び暗号学的な分析を行った.特に,冗長性を全く有しない2値系列の情報源を精密に分析し,不可逆データ圧縮によって非自明なシステムの最適化が実行できる事実を発見した.ここで,同一の対象物を複数のセンサーが観測する「最高経営責任者(CEO)問題」を一般的枠組みとして採用し,システム全体が不可逆データ庄縮によって享受する情報利得を解析的に計算した.まず,観測ノイズと通信コストが一定という現実的制約によって,システムに非自明な利得構造がもたらされることを証明した.直感的には,センサー数の増加は(1)観測ノイズの相殺による情報利得の増加をもたらすが,同時に(2)高い圧縮率に起因する情報利得の低下を誘発するはずである.ところが.(1)と(2)のどちらの効果が優勢になるかは容易に判断できない.本研究では,この未解明の問題に対して情報理論的解答を与えた.つまり,観測ノイズが小さい領域では,少数のセンサーによる適度な分散化が情報利得を最大化し,逆に観測ノイズが大きい領域では,多数のセンサーによる圧倒的分散化が情報利得を最大にすることが数学的に示された.この結果は,不可逆データ圧縮が理想的な圧縮限界を達成する場合だけでなく,符号化のアルゴリズムが容易に構成できるような単純な圧縮形式に対しても同様に成立する.そして,最新の不可逆データ圧縮技術として注目を浴びている低密度生成行列(LDGM)符号がこの枠組みで有効に機能することも証明された.将来的には,同システムの暗号学的な分析と共に,各種の信号処理技術との融合も視野に入れた学際的研究の方向性が有望である.この研究の目的は、不可逆圧縮技術を利用することにより従来とは全く異なった原理によるデジタル署名の数学的原理を提案し、より実用的な認証のアルゴリズムを確立することにある。提案するデジタル署名のプロトコルは、以下のように構成される。1.復号が密行列による線形操作になるような不可逆圧縮を、秘密情報を利用してデジタル文書に行う。2.圧縮されたデジタル文書を「署名」としてもとのデジタル文書に添付する。3.「署名」に密行列を作用させてデジタル文書が歪み基準内で復元されたら認証とする。このとき密行列による復号は簡単だが(単なる線形操作)、不可逆圧縮過程は計算量的に困難になっている。そのため署名を添付するには密行列の非自明な分解に基づく特異的な圧縮過程を開発する必要があり、同時にこの分解そのものがデジタル文書の正当性を保障する秘密情報となる。この研究では、低密度パリティ検査符号を利用した公開かぎ暗号系と同様に検証情報となる密行列を構成する。この秘密情報によって符号化は大規模疎行列を用いた不可逆圧縮に帰着し、計算量的により簡単な問題に帰着する。つまり、この研究で提案するデジタル署名の原理は「(有限体上で定義された)行列の因数分解の困難性」および「行列の疎密に動作性能が極端に依存する符号化アルゴリズムの存在」に基礎を置いている。本年度は、符号化の設計原理とそれに基づく具体的な圧縮のアルゴリズムを開発した。この圧縮法は暗号用途と離れても高性能な不可逆圧縮の方法として有望であり、その見地からの関連研究も同時に進めている。本年度は,提案する認証方式の基礎になる非可逆圧縮過程を汎用的な計算機言語(C++)で実装した。この圧縮方式は,完全な乱数列を「レート・歪み関数」と呼ばれる理論限界の近傍まで効率的に符号化する方法を,アルゴリズムとして実現した唯一の方式である.この方式は,本研究課題の提案書に記載した符号化のモデルを採用し,計算量的に実現不可能とされてきた探索技術をアルゴリズム的に実装することで可能となった.また,このモデルの静的性質,つまり符号語が存在する限界圧縮率は,統計物理学における場の理論的解析手法を導入することで厳密に評価できることが確認された.この場の理論的方法は「レプリカ法」と呼ばれ,近年ヨーロッパを中心にさまざまな数理工学的な諸問題に応用が試みられている方法である.今回,データ圧縮の分野でこの解析手法を全面的に応用したが,これは世界で唯一の肯定的な成果報告にもなっている.しかし,このモデルの動的性質,つまり具体的な符号化のアルゴリズムをモデル化した上での圧縮率の時間変化の様子には,数理的にまだ未解明な部分が多い.そのため,本年度は,この動的性質を数値的に評価する立場に徹した.その結果,符号化が成功する一連のアルゴリズムの族に普遍的な構造があることが発見された.具体的には,符号化の操作においては,逐次的に有望な符号語の候補を絞っていく「ビリーフ・プロパゲーション」などの確率的推論法が極めて有効であることが判明した.これは,可逆圧縮が辞書法など全く異なる枠組による符号化を行っているのと対照的である.本年度は,不可逆圧縮過程をともなうデータ圧縮技術のセンサーネットワークへの適用を検討し,その情報理論的及び暗号学的な分析を行った.特に,冗長性を全く有しない2値系列の情報源を精密に分析し,不可逆データ圧縮によって非自明なシステムの最適化が実行できる事実を発見した.ここで,同一の対象物を複数のセンサーが観測する「最高経営責任者(CEO)問題」を一般的枠組みとして採用し,システム全体が不可逆データ庄縮によって享受する情報利得を解析的に計算した.まず,観測ノイズと通信コストが一定という現実的制約によって,システムに非自明な利得構造がもたらされることを証明した.

直感的には,センサー数の増加は(1)観測ノイズの相殺による情報利得の増加をもたらすが,同時に(2)高い圧縮率に起因する情報利得の低下を誘発するはずである.ところが.(1)と(2)のどちらの効果が優勢になるかは容易に判断できない.本研究では,この未解明の問題に対して情報理論的解答を与えた.つまり,観測ノイズが小さい領域では,少数のセンサーによる適度な分散化が情報利得を最大化し,逆に観測ノイズが大きい領域では,多数のセンサーによる圧倒的分散化が情報利得を最大にすることが数学的に示された.この結果は,不可逆データ圧縮が理想的な圧縮限界を達成する場合だけでなく,符号化のアルゴリズムが容易に構成できるような単純な圧縮形式に対しても同様に成立する.そして,最新の不可逆データ圧縮技術として注目を浴びている低密度生成行列(LDGM)符号がこの枠組みで有効に機能することも証明された.将来的には,同システムの暗号学的な分析と共に,各種の信号処理技術との融合も視野に入れた学際的研究の方向性が有望である.
冷暖房の普及が児童の体温調節機能の発達に及ぼす影響

実験は隣接する2つの人工気候室を利用し、一方を前室(気温28°C)、もう一方を高温室(気温30°C、相対湿度70%)とし、暑熱負荷条件は42°Cの下腿温浴を40分間とした。被験者には健康な710歳の男子15名女子14名、計29名を用いた。被験者は前室に30分間以上滞在し、汗が引いたのを確認した後、30°Cの高温室で60分間椅座位安静の姿勢をとった。高温室入室20分目からは、42°Cのお湯に両下腿を温浴させ、実験中はビデオを鑑賞させた。実験により得られたデータは、暑さ寒さに関するアンケート・被験者の身体的特徴に基づき、幼児期のクーラーの使用別・運動習慣別・性別・年齢別・体重別の5つの項目内で2グループに分け、対応のないt検定およびX^2検定を行い、それぞれの平均値を比較した。クーラー使用群では足浴開始後の直腸温の変化量が有意に高い値を示した。平均皮膚温・前腕皮膚温・血流量の経時変化も一貫して使用群の方が高い傾向が見られた。クーラー使用群は皮膚血管拡張による体温調節に負っているところが大きいことが示唆された。しかしながら、発汗機能に関してはどの測定項目にも有意差が得られなかった。生育環境が能動汗腺数を決定するということに着目すると、クーラーの使用による体温調節機能への顕著な影響は見られなかった。冷暖房の急速な普及は、快適な人工環境を拡大した。快適環境にいれば、精神的に快適となるだけでなく、体温調節のためのエネルギー消費は最小となる。この様な状態に長くいると、体温調節能力が衰えて、温度変化にきわめて弱い人間が出来るのではないかと危ぐされている。本研究の目的は、冷暖房の普及が児童の体温調節機能の発達に及ぼす影響を環境人間工学の観点から明らかにすることである。成人を対象として開発された耐暑性テストの児童への有効性を、数名の児童において詳細に検討した。その結果、成人に行われている下腿部温浴60分間は、68歳の児童には負担が大きすぎることが明らかとなった。耐暑性を調べる実験を人工気候室内で行った。すなわち、児童を裸体で30分間30°C、70%の高温室に滞在させ、後に下腿を42°Cの湯に30分間温浴させた。その間、直腸温、皮膚温、血圧、心拍数、総発汗量、カプセル法、濾紙法による局所発汗量を連続測定した。対照として大学生の女子を被験者とした。青年と比較すると、児童の体表面積あたりの発汗量は多く、しかも、皮膚血流量が大きいことが示された。しかしながら、平熱の程度、冷房の使用頻度、男女等で、耐暑性を比較検討したが、大きな差異は認められなかった。次年度には、被験者数を増やし統計処理行なう予定である。さらには、児童の耐暑性と青年男女との比較、夏季と冬季の比較検討を行なう。実験は隣接する2つの人工気候室を利用し、一方を前室(気温28°C)、もう一方を高温室(気温30°C、相対湿度70%)とし、暑熱負荷条件は42゚Cの下腿温浴を40分間とした。

実験により得られたデータは、暑さ寒さに関するアンケート・被験者の身体的特徴に基づき、幼児期のクーラーの使用別・運動習慣別・性別・年齢別・体重別の5つの項目内で2グループに分け、対応のないt検定およびX^2検定を行い、それぞれの平均値を比較した。クーラー使用群では足浴開始後の直腸温の変化量が有意に高い値を示した。平均皮膚温・前腕皮膚温・血流量の経時変化も一貫して使用群の方が高い傾向が見られた。クーラー使用群は皮膚血管拡張による体温調節に負っているところが大きいことが示唆された。しかしながら、発汗機能に関してはどの測定項目にも有意差が得られなかった。生育環境が能動汗腺数を決定するということに着目すると、クーラーの使用による体温調節機能への顕著な影響は見られなかった。
次世代シーケンサーを用いた過大侵襲下におけるdysbiosisの病態解明

過大侵襲の病態の一つである重症急性膵炎1症例での腸内細菌叢のdiversityの急性期での経時的変化と腸管粘膜障害のバイオマーカーの推移を解析した。ゲノム解析で得られた腸内細菌叢のdiversityの経過と、ELISAでの腸管粘膜障害の経時的変化が比較的相関している。特に腸管粘膜障害の局期と考えられるDay2においてBacteroides/Firmicutes比の極端な低下が観察された。これらの結果が互いにどのように相関しているかはさらなる検証を要する。近年、次世代シーケンサーを用いた腸内細菌叢のゲノム解析により、腸内細菌叢の変化(dysbiosis)が各種疾患(炎症性腸疾患、喘息、抗菌薬関連下痢症など)の病態に重要な役割を果たすことが明らかにされている。過大侵襲下においてもdysbiosisの重要性が示唆されているが、未だその詳細な解析は少ない。そこで本研究は、2つの代表的な重症病態であれ敗血症性ショックと心肺停止蘇生後の患者群において次世代シーケンサーを用い、以下の2つの項目について解析することとした。1dysbiosisの詳細な動態評価、2dysbiosisと腸管上皮障害・透過性更新との関連解析。これらの解析により重症患者におけるdysbiosisの実態と早期診断法の確立をめざすことを目的とした。平成28年度の研究実施計画は、敗血症性ショックの患者と心肺停止蘇生後の患者でICUに7日以上集中治療を要した患者を対象に、計6ポイント(ICU入室時、48時間後、1週間後、30日後、60日後、90日後)における便、尿、胃液検体を採取し、次世代シーケンサーを用いてゲノム解析を行う。これによりdysbiosisの動態把握と経時的変化を観察することを目的としていた。症例数はそれぞれ20例を目標とした。本臨床研究の遂行のために千葉大学病院臨床研究倫理委員会に書類を提出し漸く認可されたところであり、今後検体採取を開始する。本臨床研究の遂行のために千葉大学病院臨床研究倫理委員会に書類を提出していたが認可までに時間を要したため、今年度は準備のみにとどまった。集中治療を要する重症病態において7日以上集中治療を要した例を選択し、急性期に複数のタイミングにおいて尿や便、血液の検体を採取し、次世代シーケンサーを用いて腸内細菌叢のゲノム解析を行い、また腸管上皮障害・透過性亢進の指標となるバイオマーカー測定をELISAで解析しその相関や急性期のdysbiosisの動態把握と経時的変化をみることとした。検体収集は平成29年度末までで2例収集した。ICUで集中治療を要した重症急性膵炎1例について上記の解析を行った。ゲノム解析で得られた腸内細菌叢のdiversityの経過と、ELISAで得られた腸管粘膜障害の経時的変化が比較的相関していた。特に腸管粘膜障害の局期と考えられるDay2においてBacteroides/Firmicutes比(B/F比)が極端に上昇していた。既報ではB/F比が極端に低下(<0.01)もしくは上昇(>10)することとmortalityとの相関が示されているが、本研究でも同様の結果が得られた。しかし腸内細菌叢のdiversityの喪失と腸管粘膜障害とが病態が相互作用しているかは不明であり、今後解析を要すると考えられた。・腸内細菌叢:細菌叢の多様性について結果:D7において細菌種の種類の減少があり、その後D14で種類がD1, D2まで回復している。解釈:一過性に腸内細菌叢の多様性diversityが減少したが、その後回復した。Diversityの経時的変化が観察された。・尿IFABP結果:D1からD2にかけて2倍に上昇、その後D7からD14にかけて緩徐に低下。意義:IFABPは腸管上皮絨毛の先端に存在し、上皮細胞障害により全身性に放出されるためenterocyte damageもしくはintestinal ischemiaを評価できる。解釈:一過性に腸管上皮障害を来し、徐々に改善した過程をみている可能性あり。千葉大学病院臨床研究倫理委員会の承認を得られたため、今後は検体採取を開始しゲノム解析を行う。さらにdysbiosis発現と腸管上皮機能をモニタリングするbiomarkerとの関連性をみるために、腸管特異的biomarkerである尿中intestinal fatty acid binding protein (IFABP)測定を行う。救急集中治療医学研究解析に必要となる次世代シーケンサーの必要物品を購入したが、研究開始に至らなかったため次年度繰越金が生じた。
昆虫病原性線虫の卵巣内幼虫発育、資源競合および乾燥耐性の生存戦略的意義

Steinernema属およびHeterorhabditis属昆虫病原性線虫の生存戦略を明らかにすることを目的に、(1)感染態幼虫(IJ)の卵巣内幼虫発育(Endotokia matricida)、(2)昆虫死体をめぐる資源競合、(3)乾燥耐性に焦点を絞ってフィールド及び室内試験を行い、以下の知見を得た。A.卵巣内幼虫発育1.3種昆虫病原性線虫(H.bacteriophora, S.glaseri, S.carpocapsae)の感染性は、昆虫死体から遊出したIJ(N-IJ)に比べて卵巣内幼虫発育を経て生産されたIJ(E-IJ)の方が低かった。E-IJの感染力は、大型の第1世代雌成虫に比べて、小型の第2世代・第3世代雌成虫が生産したIJで低下した。2.線虫の発育、増殖及び感染力は、E-IJの方がN-IJより低く、病原性の低下程度は、腸内腔内の保持細菌数と関連した。E-IJ感染後に昆虫死体内で再生産されたIJの感染力と細菌保持数は、N-IJのレベルまで回復した。3.日本産Heterorhabditis属線虫2種9系統の共生細菌(P.luminescens)を共存培養した結果、同種線虫内で、細菌との親和性に差異が認められた。昆虫病原性線虫の感染、発育、増殖、IJ生産に深く関わる共生細菌の役割を解析するため、トランスポゾンTn-10を挿入した共生細菌と無菌化した線虫を共存させて培養した結界、昆虫死体の蛍光発色が異なるP.liminescensの突然変異株が得られた。B.資源競合1.土壌無脊椎動物は、昆虫死体に対して、異なる誘引性を示した。2.アリ(トビイロシワアリ、アズマオオズアリ)は、線虫感染の有無に関わらず、昆虫死体を摂食した。摂食率は、線虫の種類で異なり、S.monnticolumで約5%、H.inidcaで約38%、S.carpocapsaeで約70%であった。3.オサムシは、線虫感染死体を忌避し、絶食させた後でも忌避した。4.昆虫死体内でのIJ生産は、土壌メソファウナ(ダニ類、自活性線虫、等)との競合により阻害された。C.乾燥耐性1.乾燥耐性獲得の経緯を行動学的に評価するシステムを確立し、昆虫病原性線虫の乾燥耐性評価への導入を可能にした。1.卵巣内幼虫発育:Xenorhabdus属及びPhotorhabdus属細菌と共生関係をもつSteinernema属及びHeterorhabditis属昆虫病原性線虫の卵巣内幼虫発育(Endotokia matricida)について比較研究した結果、両属線虫は、繁殖様式、発育速度、ならびに栄養要求の違いを反映して、異なる卵巣内幼虫発育パターンを示した.両属線虫は、いずれも、卵巣内幼虫発育を経由する感染態幼虫(IJ)の産生機構を有していた.IJ産生は無菌培養条件下でも生起したが、その産生量は、共生細菌が存在する条件下で有意に多かった.

第二世代雌成虫が産生した正常なIJと卵巣内幼虫発育を経て産生されたIJの間には、侵入力・殺虫力において差異が認められた.2資源競合:野外調査地の土壌上に置いた昆虫死体は、腐食性や雑食性の昆虫によって摂食・利用された.しかし、昆虫死体の利用は、昆虫病原性線虫の感染により低下した.昆虫死体内の線虫の正常な発育・増殖の可能性を高めるこの摂食忌避効果はオサムシに対して特に顕著で、効果は、感染態幼虫が昆虫死体内に運び込んだ共生細菌の働きによるものと推察された.調査地における線虫相を環境耐性との関係に焦点を絞って明らかにするとともに、昆虫病原性線虫の分布調査を継続・拡大し、未記載種を含む3種類を検出した.3乾燥耐性:昆虫病原性線虫の種族維持にとって最も重要な発育ステージである感染態幼虫の乾燥耐性を明らかにするための基礎として、菌食性線虫Aphelechus avenaeをモデルとして、ビデオ画像解析法を用いて耐乾性発現過程を行動学的に調べ、多くの新知見を得た.平成15年度は、上記の諸知見を基に研究を進め。生存戦略的意義を解析する。Steinernematidae科及びHeterorhabditidae科の昆虫病原性線虫は、各種昆虫に対して高い殺虫力と増殖力をもつが、その棲息環境である土壌中の棲息密度は高くない.その原因は、宿主昆虫への侵入力をもつ感染態3期幼虫(IJ)の自然環境中での生存と、昆虫死体内での発育、増殖、IJ生産が、物理的・化学的要因に加えて、生物的要因により大きく影響されることである.平成15年度の研究では、生物的要因についてさらに解析を進め、下記の知見を得た.1線虫が感染した昆虫死体に対する土壌棲息性昆虫の摂食性を調べた結果、土壌生態系の主要構成生物であるアリ(トビイロシワアリ、アズマオオズアリ)の平均摂食率は感染線虫の種類で異なり、S.monticolumで約5%、H.inidicaで約38%、S.carpocapsaeで約70%であった.2昆虫死体内でのIJ生産に及ぼす昆虫死体損傷の影響をモデル実験で解析した結果、Steinernema属に比べてHeterorhabditis属で損傷の影響は大きく、線虫感染後の損傷時期が早いほど影響は大であった.3昆虫死体内でのIJ生産は、土壌メソファウナ(ダニ類、自活性線虫、等)との競合により阻害された.4 3種昆虫病原性線虫(H.bacteriophora, S.glaeri, S.carpocapsae)の感染性は、昆虫死体から遊出したIJ(N-IJ)に比べて卵巣内幼虫発育を経て生産されたIJ(E-IJ)の方が低かった.また、E-IJの感染力は、IJを産出した雌成虫の世代に異なり、大型の第1世代雌成虫に比べて、小型の第2世代・第3世代雌成虫で低下した.5昆虫死体に感染後の線虫の発育、増殖及び感染力は、E-IJの方がN-IJより低く、病原性の低下程度は腸内腔内の保持細菌数と関連していた.しかし、E-IJを感染させた後に昆虫死体内で再生産されたIJの感染力と細菌保持数はN-IJのレベルまで回復した.6昆虫病原性線虫の感染、発育、増殖、IJ生産に深く関る共生細菌の役割を解析するため、トランスポゾンTn-10を挿入した共生細菌と無菌化した線虫を共存させて培養した結果、昆虫死体の蛍光発色が異なるP.luminiscensの突然変異株が得られた.7日本産Heterorhabditis属線虫2種9系統と共生細菌(P.luminsescens)を共存培養した結果、同種線虫内で細菌との親和性に差異が認められた.
DNA転写時のRNAポリメラーゼ分子の動きの高感度リアルタイム計測

本研究の目的は,転写中のRNAポリメラーゼ(以下RNAP)自身の動きを直接観察することにより,DNAの2重らせんに沿ったRNAPの回転運動を詳細に観察することにある。そのためには,ねじれ方向に柔らかいDNAをしっかりと固定し,観察に適したDNAを作製し,転写活性を保持した可視化の目印付きRNAPを作製する必要がある。本年度は,計画に基づき,主に実験材料の作製を行った。DNAの固定は,DNAの両端に化学修飾を施し,一端をガラスに,もう一端を磁気ビーズに結合させ,磁気ビーズを磁石で引っ張ることで行った。顕微鏡を用いて磁気ビーズのブラウン運動の減少を観察し,DNAが固定出来たことを確認した。転写過程を観察するためには,鋳型DNAに,適したプロモーター配列を挿入する必要がある。実験にはT7ファージ由来のRNAPを使うため,φ10T7プロモーター配列を1っ持ち,適当な長さの転写領域を持つDNAを作製した。それを材料に,PCR法を用いて観察用のDNAを増幅した。PCR時に用いるプライマーに修飾を加えておくことで,両端が化学修飾されたDNAを得た。転写領域の長さや配列を変えたもの,ガラス面からプロモーター配列までの距離を変えたものを実験目的に合わせて数種類作製した。RNAPの可視化には,機能に影響を与えないと思われる領域に,目印として蛍光ビーズや蛍光標識アクチンフィラメントを付けることにした。RNAPのN末に,ビオチン化酵素が認識するAviTag配列を組み込み,大腸菌を用いて発現,精製を行った。さらにin Vitroで,ビオチン化酵素を用いて,RNAPをビオチン化した。作製したラベル入りDNAと作製したビオチン化RNAPを用いて,活性測定を行い,両者ともに活性を保持していることを確認した。