hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
不連続ガレルキン法と事後誤差解析の研究

6.3項の手法を平面応力問題に適用し、基本的な例題について解いて実用性を検討した。その結果、在来の有限要素程度の結果は少なくとも得られることを確認した。本年度は最終年度であり、理論解析、具体的なスキームの作成と数値実験、とりまとめを実施した。1.文献調査では、成書で不連続ガレルキン法についてふれたものが急増しているが、リフティング作用素の性質や離散ボアンカレ不等式等に関する結果などが得られ、一部は活用できた。2.基本的なポアッソン方程式について、代表的な不連続ガレルキン法の数値実験を行った。特に、非対称な双1次形式やリフティングを用いた手法が、安定性の面で有利なことを確認できた。3. Pin Tongのハイブリッド変位法を基礎とする不連続ガレルキン法を発展させ、リフティングも利用できるようにした。この手法では、要素内未知関数の他に要素間境界での未知関数を独立に利用する点に特徴がある。そのため未知量は増えるが、線形の楕円型方程式などでは、要素内未知関数に関する未知量は要素間未知量を用いて消去でき、従来の通常の有限要素法と同様な行列とベクトルを用いて離散化方程式を整理できる利点があり、通常の有限要素との共存や混用が可能である。4.前項の手法につき、類似の手法がCockburn氏らによっても提案されていることを知り、同氏と直接に検討することができ、国際交流の意味でも大いに有益であった。5. 3項の手法につき、基本的な誤差解析も実施した。誤差定数に関する考察も継続したが、かなり多数の定数の評価が必要で、今後の研究のための大きな課題が得られた。6. 3項の手法をピクセル解析(長方形要素などの規則格子のみでの解析)の補正法として利用し、数値計算により実際に精度の向上が得られることを確認できた。これは、本手法が要素形状にロバストであり、5角形要素なども3角形、4角形要素と同様に作成できることを利用したものである。
網膜ペリサイト分泌血管内皮細胞増殖抑制因子の同定

網膜ペリサイトから分泌される因子が網膜毛細血管内皮細胞の増殖を制御しているという仮説から、網膜毛細血管内皮細胞株と網膜ペリサイト株の共培養解析を行った結果、網膜ペリサイト株培養後の培地の濃縮液を網膜毛細血管内皮細胞株に添加すると内皮細胞増殖を著しく抑制することを見いだした。本研究は、網膜ペリサイト細胞株が分泌する網膜毛細血管内皮細胞増殖抑制因子を同定することを目的とした。網膜ペリサイト株培養後の培地の濃縮液からタンパクを回収し、分子量で分画し、網膜毛細血管内皮細胞株の増殖を抑制するフラクションから2次元電気泳動でタンパクを分離した。分離したタンパクをMALDI-TOFMSで分析し、タンパクを同定した。同定したタンパクはtoropomyosin (TM)と高い相同性を示した。Rat TM3を特異的に認識するプライマーを作製してRT-PCR法でオープンリーディングフレームのクローニングを行った。さらに、RT-PCR解析からラット網膜、網膜ペリサイト株に発現が示された。増幅された網膜毛細血管周皮細胞株のPCR産物をDNAシークエンサー解析した結果、rat TM3、rat TM6と異なる配列を示した。得られた遺伝子配列をpGEX-6P-1 vectorに導入し、大腸菌を用いて大量培養した。大腸菌からタンパクを精製し、リコンビナントタンパクを作製した。リコンビナントタンパクはMALDI-TOFMSによってタンパク質量を測定し、さらにprotein sequencerを用いてN末端アミノ酸配列の解析を行い、同定したタンパクであることを確認した。網膜毛細血管内皮細胞株の増殖に対し、同定したタンパクは1μM以上の添加で顕著な細胞増殖抑制効果を示した。以上の結果から、網膜ペリサイトはTMと高い相同性を示すタンパクを分泌していること、およびこのタンパクは網膜毛細血管内皮細胞の増殖抑制効果を示すことが明らかとなった。
日本語の統語構造は発話のタイミング制御を規定するか

日本語の発話を音声分析し、文節読みだけの発話長を基準に文発話での各文節の伸長度を分析した。その結果、深い統語境界直前の文節は相対的に長く発話される傾向にあることがわかった。ただし引伸しが顕著な文節の直前では、統語構造に関係なく文節長が相対的に短くなる傾向があり、統語構造とは関係なく文節長の相対的な長さが「短長短長」のパタンをなす文もあった。クラシック音楽演奏の音響分析からも(小)楽節内での小節長について同様な現象が明らかになっており、日本語発話、音楽演奏の両者に見られるこの種のテンポの揺れ現象のメカニズムは不明ではあるものの、人間の基本的なタイミング制御の特質に根ざす可能性がある。本研究の目的は日本語のいわゆるモーラリズムのタイミングが統語構造により影響を受けるのかを調査し、タイミング制御のメカニズムを探ることである。本年度については東京方言話者4名、近畿方言話者4名、そしてその他方言話者2名について、テスト文発話の文節長ごとの継続長を測定し、統語構造との対応について分析を行った。テスト文の各文節については文節単独発話時の継続長をもとに相対的な伸縮度合を計算した。分析の結果、文末や深い統語境界の前では文節継続長の引き伸しが観察された。ただし引き伸しのある前の文節ではその継続長が相対的に短くなる現象が頻繁に観察された。また、前年度の研究同様に、たとえば4つの文節から成る文発話の場合、統語構造に関係なく相対的継続長が「短長短長」のようなパタンとなることが多かった。クラシック音楽の音響分析も引き続き実施した。やはり早いパッセージの合奏作品の音響分析を行い、小節長を測定したが、1つの小楽節中の最後の小節の継続長は引き伸される傾向があることが今回も確認された。また4小節から成る小楽節において3小節目つまり引き伸しのある小節の前では逆に継続長が短くなる傾向も観察された。小楽節中で各小節の継続長が「長短長短」となる現象も時おり観察された。しかしながら、この傾向とは異なるタイミングパタンを呈する演奏もあった。以上より、文節レベルではあるが文末や統語構造の切れ目の前では相対的な継続長の引き伸しがあることが新たな音声資料からも確認された。また、引き伸ばされた文節の前の文節で継続長が相対的に短くなる、4つある文節からなる文発話で統語構造に関係なく相対的継続長が「短長短長」のようなパタンを呈するという現象は、新たな音声資料の分析結果も含め観察された。過去2年間の研究のまとめとして学会での研究発表に注力するとともに、この3年間学会等で指摘されてきた研究方法上の問題点の検討を行った。学会等で何度か指摘された問題点の1つは、文節中の語のアクセント型で頭高型のものが多く、文節頭の急激なピッチ上昇を実現するために文節の継続時間が長くなるのではないか、つまり統語構造とは関係なくアクセント型による影響を受けて文節長が大となっているのではないかという指摘である。もう1つの指摘は文末の文節に関してであり、「見えた」、「晴れる」のように、その文節中でピッチの下降がある場合には文末モーラの母音長が短くなる傾向があるが、そのようなケースは分析したのかという点である。同様に多かった指摘は、文節が4モーラに統一されており口調が良く、特殊なリズムパタンが生じたのではないかというものである。本研究では、単純に言えば文節のみの繰り返し発話の長さの平均値をもとに文発話における当該文節の長さを相対的に分析しており、これらの問題は該当しないはずである。ただし念のため「金丸が借りたカレンダーを帰りに返します」のような新たなテスト文発話についても音声分析した。その結果、やはり深い統語境界直前の文節は相対的に長く発話されることがわかった。また、これら一連の新しいテスト文発話でも、最後から2つ目の文節は相対的に短く発話されることが明らかになった。これらの結果と昨年度までの分析結果すべてから、日本語の文節長は統語構造に規定されて伸縮している可能性が大であると考えられる。フレーズの最後から2つ目の要素が相対的に短くなる、さらに時に構造に関係なくフレーズ中のユニットの長さが「短長短長」のようなパタンをとるという現象は音楽演奏においても観察され、人間のリズム活動の根底にはこのような何らかのリズムパタンの揺れを生み出すメカニズムが存在しているのではないかと考えられる。

本研究の目的は日本語のいわゆるモーラリズムのタイミングが統語構造により影響を受けるのかを調査し、タイミング制御のメカニズムを探ることである。本年度はまず東京方言話者1名、近畿方言話者1名について、テスト文発話の文節長ごとの継続長を測定し、統語構造との対応について分析を行った。テスト文の各文節は文節単独発話時の継続長をもとに相対的な伸縮度合を計算した。その結果、文末や深い統語境界の前では文節継続長の引き伸しが観察された。ただし引き伸しのある前の文節ではその継続長が相対的に短くなる現象が頻繁に観察された。また、たとえば4つの文節から成る文発話の場合、統語構造に関係なく相対的継続長が「短長短長」のようなパタンとなることもあった。次にクラシック音楽において細やかなタイミング制御が不可能と思われる早いパッセージの合奏作品の音響分析を行い、たとえば4小節ごとなどの小楽節、あるいは楽節といったまとまりにおいて各小節の長さの揺れがどうなっているのかを音響分析した。その結果、このような音楽演奏においても1つの小楽節中の最後の小節の継続長は引き伸される傾向があることがわかった。また4小節から成る小楽節において3小節目つまり引き伸しのある小節の前では逆に継続長が短くなる傾向も観察された。小楽節中で各小節の継続長が「長短長短」となる現象も時おり観察された。以上より、日本語発話において文節レベルではあるが文末や統語構造の切れ目の前では相対的な継続長の引き伸しがあることがわかったが、さらに引き伸し現象がある前の文節で継続長が相対的に短くなる、4つある文節からなる文発話で統語構造に関係なく相対的継続長に「短長短長」のようなパタンが観察されることがある等については、音楽も含めた人間の一般的リズム活動を支配する高次の機序が存在している可能性があることが示唆される。当該年度では2件の海外の学会での発表を予定していたが、そのうち1件は授業日程の関係で、断念せざるを得なかった。ただし、国内の学会、小規模研究会においては発表後に示唆に富んだ意見、コメントが多く得られた。なお、音声資料の収集と分析にはかなりの時間がかかることは変わりなく、データ量としてはやや不足ぎみである。クラシック音楽の音響分析については、市販CDなどの音源が多数あるため、音楽演奏の音響分析については比較的多く実施することができた。このためトータルでは、研究の進展状況はやや遅れ気味であると判断せざるを得ない。当該年度の研究実施において、研究に必要な機材の選定と導入が遅れ、このためテスト文の音声分析については、十分な音声資料の収集と分析ができなかった。これはテスト文の発話者に実際に発話をしてもらいデジタル録音するのにかなりの手間と時間がかかり、また収録した発話の音声分析も多くの時間が必要とされることに起因している。しかしながら、クラシック音楽の音響分析については、すでに市販CDなどの音源が多数あるため、こちらの分析を予定以上多く実施することができた。このためトータルではおおむね順調に研究は進展していると評価できる。平成25年度については、さらにテスト文の収録と音声分析を継続し、音楽演奏のテンポの揺れについても分析を継続する。ただ音声収録については、平成24年度の研究発表時のコメントに4モーラのみの文節からなる文は口調がいいため、何らかの特別なリズムパタンを生じるのではないかというものが多かったため、文中の文節のモーラ数にバラエティをもたせたものも音声資料とする予定である。また、バランスの取れた音声コーパスを入手し分析することで、モーラレベルでの継続長の固有値を独自に求め、それをレファレンスとして、文中でのモーラレベルで継続長の伸縮を分析することも行いたい。
保健サービスのQOL向上に寄与する効果測定など評価に関する地域全世帯コホート調査

「研究目的の達成度」1、QOL測定環境を複数の地域世帯コホートにおいて整備した。3、QOL低下の度合いがはっきりしている臨床集団において測定を行い、妥当性を検証する。上記の3点において、"地域のフィールドで健康つくり活動を支援しながら学術的な評価方法を導入する"という形で研究を遂行した。G県K村の住民を対象として、保健サービス=地域における健康つくり活動のメニューとし、特に65歳以上の高齢者の日常生活に関わる視力・聴力・運動機能を中心としたQOL評価のための健診を作った。健康つくり活動の推進と共に、どのように集団のQOLが向上し、健康寿命延伸につながるのか継続して追跡を行う。肝炎患者を対象に臨床ゲノム科学研究成果を用い、健康効用値をアウトカム指標として"個々の患者特性に応じた最適治療戦略モデル"をデザインし、QOLの向上を目標としたオーダーメード医療のモデルを構築した。地域のフィールドにおいて,単年度でQOL向上を評価するのは難しく、保健サービスが寄与しているかどうかの判定は、対照地域の設定の元に評価しなければならない。地域で倫理指針を遵守し、ICを取得し、また参加者の積極的かつ経年的な協力を得るために研究の成果を積極的に広報していく必要がある。この点においての研究フィールド整備には一定の成功を見ている。経年的に追跡調査と、健康効用値の測定を繰り返し、QALYS(quality adjusted life years)を算出する。これを指標として健康寿命の延伸に寄与する保健サービスの寄与を検討する。1、地域における健康効用調査のためのインフラ整備人口4962名、世帯数1522世帯の(2003年4月現在)群馬県中部に位置する小さな地方自治体の群馬県倉渕村を地域コホート群とした。すでに同村において健康にっぽん21に連動した地域の健康つくり運動が開始されており住民・学府・行政の三位一体による組織つくりを行った。住民に対して各自対面式で研究概要を説明し、本調査研究の利益または考えられる不利益に関して説明を実施し、インフォームドコンセントを得た。これと同時に村長、保健福祉課長レベルには健康効用測定理論に関する解説を施行し、村が企画する健康推進活動のいくつかを解説していただき、前向きコホート研究として追跡研究を行う上で、介入施策としての妥当性の検討を行ってきた。これらの基本的な研究協力の合意をもとに、各世帯および各個人レベルでの健康情報へのアクセスに対する承諾を得て、健康効用値測定質問票への回答を求める準備を整えた。2、同村基本健診に時期をあわせた健康状態のベースライン調査同村居住者成人健診対者の健康調査を行い健康状態のベースライン調査を行った。以降、健康教育などの介入を進め健康情報と健康効用値を経時観察する。研究協力者宮口信吾は同村40歳以上の成人健診を榛名荘病院で担当し、インフォームドコンセントが得られた対象者についての健康情報の収集と統括を行う。村長と保健福祉課長は調査データの収集と村民への協力体制つくりとその維持を担当した。武林亨は本コホートの質を高める方策を施行し、分担研究者森口尚史は、対象集団のなかで特に肝炎患者を対象とし、臨床ゲノム科学研究と健康効用値研究の成果を融合させた「個々の患者特性に応じた最適治療戦略モデル」のバージョンアップを図った。1.地域における健康効用調査平成18年1月23日、当該研究コホート地域である倉渕村は合併により高崎市倉渕町となった。行政主導の健康くらぶち21では地域の健康つくり運動が開始されており、研究グループとして、健康教育による緩やかな介入と、学童、成人、高齢者、それぞれの群に健康寿命にインパクトを与える因子に照準を当てたベースライン健康状態の調査を施行した。調査協力にインフォームドコンセントの得られた対象者には個人のデータの返却はもとより地区全体での健康作り運動の推移と成果をフィードバックした。

今後、前向きコホート研究として追跡研究を行う上で重要な行政協力の素地として合併協議書に研究続行を盛り込むと同時に介入施策としての妥当性の検討を行ってきた。これらをもとに、各世帯および各個人レベルでの健康情報へのアクセスに対する承諾を得て、健康効用値測定質問票への回答を求めた。2.健康状態のベースライン調査同村居住者成人健診対者の健康調査を行い健康状態のベースライン調査を行った。3区、4区、5区、7区の高齢者に感覚器・運動器を中心とした健診を行った。425名で視力、聴力、眼圧、姿勢測定、関接機能、骨密度など。以降、健康効用値を併せ経時観察する。保健福祉課長は調査データの収集と村民への協力体制つくりとその維持を遂行した。武林亨は本コホートの質を高める方策を施行し、分担研究者森口尚史は、対象集団の肝炎患者有病率を想定し、臨床ゲノム科学研究と健康効用値研究の成果を融合させた「個々の患者特性に応じた最適治療戦略モデル」のバージョンアップを図った。
大腸癌化学療法-血管新生阻害剤に対するバイオマーカー

大腸癌に対するbevacizumabの効果予測因子として、末梢循環癌細胞(CTC)、末梢循環血管内皮細胞(CEC)および末梢循環血管内皮前駆細胞(CEP)に注目し研究を行った。bevacizumabの効果予測に、治療開始前のCEC、特にCXCR4陽性CECおよびbevacizumab投与4日目のCEPが有用であることを明らかにした。VEGFに対するモノクローナル抗体(bevacizumab)などの血管新生阻害剤は、従来の抗癌剤とは異なるメカニズムで腫瘍に作用するため、臨床で血管新生阻害効果を定量的に評価するバイオマーカーは確立されていない。有望なものとして、末梢循環血管内皮細胞(CEC : circulating endothelial cell)および末梢循環血管内皮前駆細胞(CEP : circulating endothelial progenitor)が注目されている。CECは末梢を循環する内皮細胞の総称であるが、狭義には成熟内皮細胞を示し、局所の血管壁から剥離した内皮細胞由来と考えられている。一方CEPの発見は比較的最近のことであり、1997年に浅原らによって、成人の末梢血単核球分画に、血管内皮に分化しうる細胞(CEP)が含まれることが発見され、さらにこの内皮前駆細胞が局所で増殖・分化し血管新生に関わっていることが証明された。Willett CGらは、直腸癌症例に対するBevacizumabを用いた放射線化学療法症例でCEPが治療後day3で低下することを報告している。本研究の目的は、BevacizumabによるCECおよびCEPにおける作用について臨床研究を行い、その有用性を確認することである。本研究によりFOLFOX+Bevacizumab投与直後に治療効果ありの症例は有意差をもって低下し、無効例は低下しないことが明らかとなった。またFOLFOX群では、治療効果を認めた症例であったが化学療法投与直後のCEPの低下は認めずなかったことより、Bevacizumabの追加治療による効果を反映するものと考えられた。一次治療としてFOLFOX+Bevacizumabを施行する患者を対象に、治療前、治療開始4日目、2コース開始前にCEC subpopulation, CEPについて、フローサイトメトリー法を用いて解析した。CECのsubpopulationとして、CXCR4,Tie-2,VEGFR1,VEGFR2について解析した。治療開始前にCECのsubpopulationであるCXCR4陽性CECが20%未満の症例は、20%以上の高値の症例に比べ有意にPFS,OSともに延長することを明らかにした。また治療効果がPDの症例は、non-PDの症例に比べ、有意にCXCR4陽性CECが高値であった。他のsubtypeについては、有意な結果は認めなかった。FOLFOX+Bevacizumab投与直後(治療開始4日目)にCEPが0.04%未満に減少した症例は、0.04%以上の症例に比べ有意にPFS,OSともに延長することを明らかにした。この結果はCancerにアクセプトされた。末梢循環血中癌細胞(Circulating tumor cells)は、化学療法薬の効果予測および予後因子として有用であることが報告されている。進行大腸癌に対する化学療法において、CohenらはCTCのcut-off値が3として、治療効果予測および予後因子になることを最初に報告したが、日本人においてもFOLFOX+bevacizumab療法初回投与後のCTC値が3未満の症例は、3以上の症例に比べPFSおよびOSともに有意に延長し、化学療法の効果予測が可能であり、CTCは人種差なく治療効果予測因子であることが明らかにした。Bevacizumabはこれまでの薬剤と作用機序が異なり、標的細胞は血管内皮細胞である。Bevacizumabは単剤での有効性は示されず、化学療法薬との併用による上乗せ効果を認めることより、化学療法薬との併用投与のため、bevacizumabの効果予測因子の探索は非常に困難とされている。CTCはbevacizumab併用化学療法の効果予測因子として有効であることが報告された。しかしFOLFOXにおいても、FOLFOX+bevacizumabにおいても、CTCが3以上の症例は治療効果を認めない事は明らかであるが、bevacizumab自体の治療効果の予測は不可能である。すなわち1stlineにおける化学療法薬+bevacizumabが耐性になった場合、2^<nd>lineとして新たな化学療法薬にbevacizumabを併用すべきかどうかは予測不能である。本研究では、末梢血中血管内皮細胞(Circulating endothelial cell:CEC)および血管内皮前駆細胞(Circulating endothelial progenitor:CEP)に注目した。本研究では、Bevacizumab併用療法において、治療開始前のCEC値が低値症例は、高値症例に比べPFSおよびOSが有意に延長する事を明らかにした。また、高値症例はFOLFOX症例群のPFSとほぼ同じであり、Bevacizumabを併用するbenefitを認めない事が示唆された。さらにbevacizumab治療開始前のCXCR4陽性CEC値が、bevacizumabの治療効果予測因子であることを報告した。PD症例はnon-PD症例に比べ有意に治療開始前のCXCR4陽性CECが高値であること、治療開始前のCXCR4陽性CEC値が低値症例は、高値症例に比べPFSおよびOSが有意に延長する事を明らかにした。
膜ダイナミクスの観点から探るサルモネラオートファジー

本研究は細胞内たんぱく質分解現象であるオートファジーが哺乳類の上皮系の細胞に侵入したサルモネラの増殖制御に関与する分子機構を明らかにする目的で行った。サルモネラは腸皮細胞など上皮系細胞へと侵入後、サルモネラ含有小胞と呼ばれる膜構造体で緩やかな増殖をするが、オートファジーの欠損したマウス胚性線維芽細胞ではそれに加えて細胞質中で爆発的な増殖が見られる。オートファジー関連タンパク質LC3は侵入したサルモネラの一部の周囲にリクルートされてくるが、それはLC3のユビキチン脂質化反応に依存していた。ところが興味深いことに、やはりオートファジーに関わるAtg9L1の欠損したマウス胚性線維芽細胞では、サルモネラの増殖抑制が見られないにもかかわらずLC3がサルモネラの周囲に効率よくリクルートされてきた。この細胞ではオートファジーによる2重のも開く構造が見られなかく、サルモネラを囲む一重の膜構造にLC3がリクルートされることがわかった。このことよりサルモネラオートファジーにおいてLC3はオートファゴソーム様の膜構造ができなくても、サルモネラの周囲に特異的にリクルートされてくる機構が存在することが明らかになった。細胞内の大規模な分解機構であるオートファジーには多くの蛋白質が関与している。とくにAtgと呼ばれるオートファゴソームの形成に関与する一群の分子群が存在し、我々を含めこれまで多くの研究がなされてきた。特にバクテリアが哺乳類細胞に侵入してきたとき、Atgが関与して、バクテリアを取り囲む現象が知られているが、その詳細は不明の点が多い。Group Astreptococcusは細胞侵入時に膜に取り囲まれ、オートファゴソームに比べ大きな膜構造体GcAVができる。蛍光顕微鏡による生細胞観察の結果、GcAVは小さな前駆体構造が、互いに融合しながら、巨大化していくことが明らかになった。またRab7の優性附害変異体を発現させると、このGcAVの形成は全く起こらなかった。その局在の解析からRab7が直接この膜の形成に関与していることが示唆された。またサルモネラを使って、Atgがどのような挙動を示すのかの解析も進めている。
ガン化に関連する糖転移酵素に対して特異的阻害活性を持つチオ糖の酵素を用いた合成

癌化に伴って異常に多く発現することが知られている糖転移酵素の一つ、グルコサミニルトランスフェラーゼVを阻害する物質が合成できれば、癌の治療や機構解明に大きく貢献することが期待される。当研究ではこの目標に向ける第一段階として、全く新しいタイプの遷移状態類似体であるイミノチア糖が合成された。この化合物はフラノースの環硫黄原子置換類似体であり、硫黄原子にはトルエンスルホニルイミノ基が付加され、3価となっている。この化合物はプロトンNMRおよび分子モデルより、糖転移反応の遷移状態に構造および電荷分布が似通っていることが示された。また、糖転移酵素阻害剤への応用の指標として行った糖加水分解酵素に対する阻害実験では、この化合物の酵素に対する結合が基質よりも2倍ほど大きいことが示された。温度可変による阻害実験では、この結合にはエンドロピーの寄与がないことが示され、トルエンスルホニル部分が結合の邪魔をしている可能性が示唆された。したがって、さらに阻害活性を向上させるには、トルエンスルホニルイミノ基のうち、特にかさ高いスルホニル部分を除去した化合物が有力であることが示された。また、この化合物の合成途上、環化反応の進行がアノマー効果の有無に依存するという有機化学上の新しい発見がなされた。以上のように、本研究では新しいタイプの糖類似体イミノチア糖の効率的合成法および糖転移酵素阻害剤としての可能性が示された。
プラズマ対向材料の表面化学反応における電子励起効果

炭素材、ボロンコーティング材、及び金属材へ、高粒子束水素(重水素)ビームを照射した場合に、化学スパッタリング現象や水素吸蔵現象における電子表面励起効果の有無を調べることが本研究の目的である。今年度の研究内容は以下の通りである。○昨年度来、電子ビーム照射のための小型電子ビーム源の調整を続けている。電子放出部には、LaB_6を使用している。電子放出面の裏側から、ヒーターにより最大1200°C程度まで加熱し電子を放出させる。ヒーターには、窒化硼素板で炭素ヒーターを挟んで、絶縁・機械的強度の強化を行った平板ヒーターを用いている。ビーム径は約10mmφである。電子放出部の加熱安定性に問題があり、現在のところ安定な電子ビームが引き出せていない。今後、問題点を解明して安定な電子ビームの引き出し方法を検討し、イオンビームと電子ビームの同時照射実験を行う。○高粒子束ビーム装置を用いて、イオンビームの単独照射を行った場合のビーム・材料相互作用について調べた。タングステンへの照射実験では、冷間圧延材、応力除去材(900°Cで熱処理)、及び再結晶材(1300°Cで熱処理)を用いて、水素ビーム照射(エネルギー1keVH_3^+、フルーエンス、3x10^<24>m^<-2>、炭素割合0.7-1.0%)を行い、前2試料では多くのブリスタが観測されたが、再結晶材では全く観測されなかった。ボロンコーティング膜では、フルーエンスと水素吸蔵量の関係について調査し、炭素割合が1%程度の場合は、炭素がボロン膜の上に堆積し水素吸蔵量はフルーエンスとともに増加した。低放射化フェライト鋼については、温度を100°Cから600°Cまで変化させて水素・炭素混合ビームを照射したところ、損耗量が温度とともに増加した。これは、温度が上がると炭素が内部に拡散し、炭素の堆積による損耗抑制効果が減少するためと考えられる。炭素材、ボロンコーティング材、及び金属材へ、高粒子束水素(重水素)ビームを照射した場合の、化学スパッタリング現象や水素吸蔵現象における電子による表面励起効果の有無を調べることが、本研究の目的である。今年度は、以下のような研究を行った。○電子ビーム照射のための小型電子ビーム源を製作した。電子放出部にはLaB_6を利用し、背面からヒーターにより、最大温度1200°C程度まで加熱する。ヒーターには、窒化ホウ素板で炭素ヒーターを挟んで、絶縁・強化した平板ヒーターを用いている。加熱部の大きさは約12φである。電子ビームは、LaB_6板とグリッド板の間に加速電圧を印加して引き出す。ビーム径は約10φで、電子ビーム電流はLaB_6の温度(熱電子電流)を制御することで変化させる。最大電子電流は、約50mAである。○高粒子束水素ビーム照射装置の最適化、及びタングステンヘの照射実験を行った。実験では、1keVH_3^+が主となるビームを照射し、炭素不純物量を0.07%と0.7%に変化させて、炭素不純物が水素の吸蔵現象に及ぼす影響を調べた。照射フルーエンスを1.6x10^<24>m^<-2>から7.2x10^<24>m^<-2>まで変化させると、炭素不純物量にかかわらず、水素吸蔵量は増加した。また、炭素不純物の多い方が総吸蔵量は大きく、主に800K以上の温度領域での吸蔵量が増加した。このことから、炭素不純物が800K以上の高温領域での水素の捕獲サイトになっていることが示唆される。

低放射化フェライト鋼については、温度を100°Cから600°Cまで変化させて水素・炭素混合ビームを照射したところ、損耗量が温度とともに増加した。これは、温度が上がると炭素が内部に拡散し、炭素の堆積による損耗抑制効果が減少するためと考えられる。
DIBの解明のための炭素クラスター負イオンのレーザー誘起蛍光分光

前年度に引き続き、申請者が開発したパルス放電ノズルとステップスキャンFT-IR分光器とを組み合わせた装置を用いた赤外分光実験を行った。10%のC_2H_2をAr中に希釈し、背圧3.5atmで直径0.8mmのノズルからパルス的に真空中へ断熱膨張させたところ、3270-3310cm^<-1>の領域に回転温度が約12Kと低いC_2H_2のv_3振動バンドが確認でき、同時に3232cm^<-1>付近にピークを持つ幅広いバンドが見られた。バンド幅が広く、個々の回転構造が分離できていないこのバンドのピーク位置とバンド幅は、立方晶C_2H_2エアロゾルによるものと一致した(Hirabayashi and Hirahara, J.Mo1.Spectrosc.Submitted)。同様のC_2D_2の吸収分光でも、分子のスペクトル線に加えて低波数側にシフトした幅広いバンドがみられ、そのピーク波長はアセチレン内のH/D同位体置換効果により完全に説明することが可能であることを見出した(Hirabayashi,Yazawa,and Hirahara,in preparation)。また、パルスノズル全体を加熱することにより、ベンゼンなど芳香族炭化水素単量体およびクラスターの赤外吸収スペクトルの取得にも成功した。本研究の結果、星間空間に類似した条件でのスペクトル測定が可能となり、この分光装置とレーザーとを組み合わせることにより、気相でのPAHの赤外蛍光スペクトル測定に対して相当の性能を発揮することが期待される。可視・近赤外線領域に存在する一連の未同定線であるDiffuse Interstellar Band(DIB)のキャリアーの候補となる各種炭素化合物の生成法として有力な、パルス放電ノズルをステップスキャン型FT-IR分光器(Bio-Rad社製FTS-6000、分解能0.07cm^<-1>)に同期させ、多様な分子の断熱冷却赤外吸収スペクトルの測定を行った。FT-IRを含む測定系と真空チャンバー内のパルス放電ノズル試料生成系との結合を最適化し、吸収スペクトル感度向上のためにマルチパス光学系を構築した。その結果、アセチレンおよび一酸化炭素の各振動回転スペクトルについて、吸光度8x10^<-4>程度の高感度測定に成功した。得られたスペクトルから励起計算によって回転温度を求めたところ、約5Kと見積もることができ、本研究において設計・製作したパルス放電ノズルが断熱自由膨脹による高速自由噴流の生成条件を満たした動作をしうる事が明らかになった。また、並行してBBO光パラメトリック発振器と現有のNd-YAGレーザー(Lotis社製LS-2134)とを組み合わせた、紫外近赤外線域における連続掃引可能な狭帯域の励起光源(線幅1cm^<-1>)を構築を行い、基本動作およびその条件に詳細な検討を行った。今後この光源を用いた、炭素クラスターや芳香族炭化水素イオンなど、星間有機分子の候補となる化学種の蛍光スペクトルの測定が可能になった。
口腔癌の浸潤増殖能の解析と治療に関する実験的研究-MMP産生を標的とした腫瘍の抑制効果について-

1)当科において樹立されたNOL-1,NOL2-2,FZK、細胞開発銀行より供与されたHSC-2,3,4,HO-1-u-1,HO-1-N-1,KBについて培養上清中へのMMP産生を検定した。いづれの細胞においてもMMP-2もしくはMMP-9の産生が確認された.2)上記細胞のうち活性型MMP-2およびMMP-9をともに良く発現しているHSC-3を用いてラフトカルチャーinvasion assayによりin vitroにおけるMMP阻害薬(MMI-166)の腫瘍浸潤抑制効果を検討した。投与群において濃度依存性に浸潤が抑制された。MMP阻害によりin vitroの腫瘍浸潤が抑制されることが確認された。2.ヌードマウス同所移植モデルを用いたMMP阻害剤の腫瘍浸潤増殖抑制効果の検討.1)上記の結果からMMP産生と浸潤能の因果関係が明らかと思われるHSC-3を用いてを口腔扁平上皮癌同所移植モデルを作製した.培養細胞浮遊液をヌードマウスの舌に注入したところ,95%以上の確率で腫瘍の形成を認め,高分化型の扁平上皮癌の組織像を示した。さらに腫瘍辺縁における浸潤像,血管内浸潤など局所浸潤を示す組織像を認め,悪性腫瘍の局所浸潤モデルとして適当であると考えられた。2)上記の同所移植モデルにMMI-166を投与し,浸潤増殖抑制効果を検討した。腫瘍体積は投与群で非投与群に比べ約60%の腫瘍増殖抑制を認めた.組織学的には投与群において腫瘍辺縁における浸潤形態,腫瘍の血管内浸潤が抑制された.以上の結果より口腔癌の局所浸潤および増殖においてMMPが関与していることが示唆された.さらに、MMP阻害により浸潤増殖抑制効果が得られることが明らかとなり、癌細胞の口腔局所における浸潤増殖に対してMMP阻害薬が有用であることが示唆された。1)当科において樹立された口腔扁平上皮癌株NOL-1,N0L2-2,FZK、細胞開発銀行(理化学研究所)より供与された口腔扁平上皮癌株HSC-2,3,4,HO-1-u-1,HO-1-N-1,について培養上清中へのMMP産生を検定した。いづれの細胞においてもMMP-2もしくはMMP-9の産生が確認されたが,その発現様式については細胞間で多少異なっていた。2)上記細胞のうち活性型MMP-2およびMMP-9をともに良く発現している事が確認されたHSC-3を用いてコラーゲンゲルを用いたラフトカルチャーinvasion assayによりin vitroにおけるMMP阻害剤(MMI-166)の腫瘍浸潤抑制効果を検討した。HSC-3は強い浸潤能を認めたが,MMI-166投与群において濃度依存性に浸潤が抑制された。100μMの濃度で,ほぼ浸潤が阻止され,MMP阻害によりin vitroの腫瘍浸潤が抑制されることが確認された。2.ヒト口腔扁平上皮癌のヌードマウス同所移植モデルを作製し,MMP阻害剤の腫瘍浸潤増殖抑制効果の検討.1)口腔扁平上皮癌同所移植による浸潤モデルの作製:上記1.-1)2)の結果からMMP産生と浸潤能の因果関係が明らかと思われるHSC-3を用いてを口腔扁平上皮癌同所移植モデルを作製した.

培養細胞浮遊液(5x10^6個)を4週齢のBalb/C系ヌードマウスの舌に注入したところ,95%以上の確率で腫瘍の形成を認め,高分化型の扁平上皮癌の組織像を示した。さらに腫瘍辺縁において辺縁形態の乱れ,腫瘍小胞巣の散在,血管内浸潤など局所浸潤能の指標となる組織像をみとめ,悪性腫瘍の局所浸潤モデルとして適当であると考えられた。2)MMI-166経口投与により腫瘍増大抑制が認められた。口腔癌治療におけるるMMP阻害薬(MMI-166)の有用性を検討するために,口腔局所において浸潤増殖およびMMP産生の確認された実験的ヌードマウス舌癌モデルを用いMMP阻害薬による腫瘍浸潤増殖抑制効果を計測学的,組織学的に観察した.1.口腔癌の浸潤増殖に対するMMP阻害薬(MMI-166)の抑制効果の検討前年度本研究において作成されたHSC-3ヌードマウス同所移植モデルにMMI-166を経口投与した.2週間後に屠殺し腫瘍の大きさを実体顕微鏡下に計測し増殖抑制効果を検討した。(1)MMI-166投与群,非投与群において体重変化に有意差は認めなかった.(2)腫瘍体積はMMI-166投与群で非投与群に比べ約60%の腫瘍増殖抑制を認めた.2.MMP阻害薬(MMI-166)の抑制効果の組織学的検討上記実験により得られた組織標本において組織学的検討を行った(1)MMPの局在と発現の変化への影響を免疫組織学的に検討した。(2)投与群において腫瘍辺縁における浸潤形態が抑制された.(3)投与群において腫瘍の血管内浸潤が抑制された.以上の結果及び平成11年度の結果より口腔癌の局所浸潤および増殖においてMMPが関与していることが示唆された.さらに、MMP阻害によりin vivoにおける浸潤増殖抑制効果が得られることが明らかとなり、癌細胞の口腔局所における浸潤増殖に対してMMP阻害薬が有用であることが示唆された。
植物細胞内光機能分子・粒子の空間階層Ｘ線イメージング

本研究は、X線構造解析手法を用いて、2つの異なる空間階層での構造解析を展開し、植物の環境感覚応答研究に貢献することを目指す。具体的には、分子レベルにおいて、植物青色光受容蛋白質、赤色光受容体のドメインやフラグメントの立体構造をX線結晶構造解析やX線小角散乱実験を通じて明らかにし、植物光受容の分子メカニズムの理解を助ける。また、ミクロン・サブミクロンサイズのオルガネラ等、結晶化が原理的に不可能な細胞内粒子については、X線回折顕微鏡法を適用し、植物環境感覚応答が細胞内でどのような変化をもたらしうるのかを光学顕微鏡よりも高い解像度で明らかにする。平成24年度は、その全長が大腸菌で大量発現可能となったクラミドモナスphototropinについて、光刺激による細胞内信号伝達の初発過程を探るためのX線小角散乱実験をSPring-8のBL45にて実施した。これにより、初めて全長phototoropin分子の形状を明らかにし、また、光応答構造変化を確認することができた。さらに、クラミドモナス全長phototropin、光応答・リン酸化能を失ったシロイヌナズナphototropin LOV2-kinaseフラグメント、赤色光ー近赤外光可逆反応を担うphytochrome Bの結晶化を試みた。後者については、光学顕微鏡下で微小結晶様の凝集を見出すことができた。オルガネラの構造研究では、これまでに設計・製作した回折装置とミクロンサブミクロン粒子を低温凍結試料作製システムを使用し、単細胞生物シゾンの葉緑体について、X線自由電子レーザー施設SACLAでのコヒーレントX線回折イメージング実験を実施した。その結果、まだ数は少ないが、2次元電子密度投影図の位相回復を50 nm程度の分解能で達成できるようになった。作成した試料の状況の把握には、購入した卓上走査型電子顕微鏡が極めて有効であった。24年度が最終年度であるため、記入しない。本申請では、植物細胞内での空間階層X線イメージングを実施するにあたって、以下の3通りの実験手法を使い分けながら、分子レベルからオルガネラレベルに至る階層構造が外部環境に応じてどのように変化するのかを探る。また、他の研究グループとも積極的に連携して、申請者らの実験手法による構造研究を展開し、裾野を広げたいと考えている。平成23年度は以下を実施した。光受容蛋白質の構造研究では、大阪府立大学の徳富研究室と共同で、phototropin2のLOV2-kinaseフラグメントとphytochromeBの光受容ドメインについて結晶化を行った。この際には、試料性状を動的光散乱装置で確認後に仕込みを行っている。また、phototropin1のLOV2-kinaseフラグメント野生型、phototropin2のLOV2-kinaseフラグメント野生型、光反応能欠損変異体、リン酸化活性能欠損変異体についてSPring-8BL45でのX線小角散乱実験を実施した。phototropin2のLOV2-kinaseが青色光照射下で構造変化を起こすことを既に見出していたが、変異体実験により、構造変化がLOV2ドメインの光受容に起因することが明白となった。オルガネラの構造研究では、複膜系オルガネラの代表である葉緑体のX線回折イメージング実験をSPring-8のBL29XUにて実施した。これまでに設計・製作した回折装置とミクロンサブミクロン粒子を低温凍結試料作製システムを使用し、また、東京理科大の松永研究室と連携して、最小真核生物シゾンのX線自由電子レーザーを用いたX線回折イメージング実験を行った。これら実験では、カーボン薄膜作成装置で作成した試料マウント膜に細胞やオルガネラを載せた。また、顕微鏡システムを用いて凍結後試料様態を確認することを試みている。

24年度が最終年度であるため、記入しない。phototropin2のLOV2-kinaseフラグメントとphytochromeBの光受容ドメインについて結晶化では、溶液性状の回線の結果、結晶化に明るい兆しがある。また、X線小角散乱実験から、phototropinの光受容構造変化のメカニズムについて、一歩進んだ議論が可能となった。オルガネラや細胞イメージングでは、世界でも指折りの実験が開始された。次年度も、このペースで研究を展開したい。結晶が得られれば、即座に構造解析を実施できる準備が整っている。また、sPring-8のBL29xuLにx線回折イメージング実験専用の実験ハッチが平成24年夏には完成の予定で、実験の円滑化が期待される。
新しい非対称構造パラジウム触媒によるジエンの環化重合反応の遠隔立体制御

非対称構造パラジウム錯体触媒を用いてジエンの環化重合とトリエンの二重環化重合を行い、主鎖に規則正しく環構造を有する高分子を得た。その構造単位連結の立体化学について検討し、対称性の低い低対称性錯体触媒がジエンの場合の環構造の相対配置に大きく影響していることを明らかにした。新しい低対称性錯体触媒として大環状配位子を有する二核パラジウム錯体触媒を設計し、これを重合触媒に用いた。ジエンの環化重合には十分な触媒能を示さなかったものの、エチレン、αーオレフィンの重合とエチレンとアクリレートとの共重合に新しい触媒機能を示した。本研究の目的は、C1対称構造(低対称構造)のジイミン配位子を有するニッケル、パラジウム錯体触媒を新たに合成し、重合反応触媒に用いることである。具体的には官能基化した1,5ージエンの立体選択的な環化異性化重合を検討し、五員環と炭素数1ー10個のポリメチレンスペーサーとを交互に含み、かつ五員環がアイソタクチック型の立体化学をもって配列したポリマーの合成を実現する。本年度は新たに低対称構造をもつ触媒を合成し、これを用いるジエンの環化重合において、中程度のアイソタクチック性の結果を得た。ジエンの置換基をメルドラム酸、環状アセタールなどの環構造に固定した時にはその選択性は高く、三連子の選択率で60-80%に達した。一方で非環状の置換基をもつジエンの環化重合では立体選択性は低く、配位子および触媒の対称構造の効果が顕著でないことがわかった。全体として、低対称構造の触媒を用いる重合反応で立体選択性が生じたことは極めて新規性が高い結果である。すなわち、低対称構造の触媒によっても立体選択性が発現し、さらにその重合反応結果と錯体構造、特に対称性が明確になった。このような反応の研究成果の報告例は高分子合成分野では極めて少なく、また広く合成化学の分野においても例のない結果である。特に前年度に合成した錯体触媒と比較することによって錯体構造と重合の選択性との関連を明らかにすることができたことは大きな研究の進展であるといえる。昨年度までに合成した低対称型パラジウム錯体を触媒とするオレフィン重合、ジエンの環化重合を行った。その結果、相当程度のアイソタクチック選択性をもつ高分子を得ることができた。今年度は、パラジウム及びニッケル錯体触媒を環状配位子を用いて積層二核化し、新しい構造の二核パラジウム、ニッケル錯体の構造を明らかにするとともに、その触媒活性を検討した。エチレンと末端ジエンとの共重合においては、ニッケル錯体がすぐれた反応性を示し、ジエンの分子鎖長によって反応性、反応生成物の構造の両方が変化することがわかった。この錯体では配位平面上下が非対称であり、低対称構造の触媒ということができる。この構造上の特性を生かして、適当なレベルでのジエン取込みと環化重合が進行したといえる。パラジウム錯体触媒を用いるとエチレンとアクリル酸エステルとの共重合が円滑に進行した。特筆すべき点として、分岐状の高分子の分子鎖にアクリル酸エステルが導入され、かつその密度が高いことがわかった。この構造上の特徴によって、本高分子は引っ張りに強い膜成形が可能であり、通常の錯体触媒を用いて得られる高分子が油状化するか、脆い固体になることと対照的である。さらに、得られた共重合体膜のヤング率を測定したところ、従来知られていたエチレンーアクリル酸エステル共重合体に比べて十分に高いヤング率を示することが明らかになった。昨年までに研究を行った平面錯体の低対称構造をもつ触媒に加えて、二核錯体にすることで、低対称構造をもつオレフィン重合触媒が開発できた。本研究で用いる触媒の配位子となる非対称のN,N'-ジアリールジイミンを、1,2ージケトンに異なる2種類のアニリン誘導体を逐次反応させる、段階的なアリール基導入によって合成した。定法によって、上記配位子のパラジウム錯体を合成単離することに成功した。そのC1対称構造は、NMR,X線結晶構造解析などで検討した。X線結晶構造では重合に適する配位構造が認められたが、NMRによる溶液中の構造解析によって、複数のコンフォメーション異性体が生成していることがわかった。実際の触媒活性種の構造決定を検討したが、最終結果を得ていない。上で合成したパラジウム錯体触媒を用い、エステル基、アセタール基、イミド基を有するジエンの環化重合反応を行った。対称ジイミン配位子をもつパラジウム錯体よりも高い反応温度、長い反応時間を必要とする事がわかり、配位子の立体的なかさだかさが、反応に強く影響している事がわかった。メチル及びエチル置換基をアルキル末端として有するモノマーをそれぞれ合成し、重合反応を行った。

分子量、収量などを比較することによって最適条件を定める事ができた。ポリマー生成物の構造を通常のNMR等の分光法とGPCによる分子量決定などにより行った。メチル末端をもつジエンの環化重合体の立体選択性は13CーNMRにより評価し、二連子で90%以上のアイソタクチック選択性を有する高分子を得た。エチル末端をもつジエンの環化重合体の立体選択性をNMRで決定する事はできなかったが、広角X線散乱などの結果をメチル置換ジエンの重合体と比較することによって高い選択性を有することを確かめた。新規構造をもつ低対称構造の金属錯体触媒を新たに合成し、その立体選択性を評価することができた。前年度の成果とあわせて研究目的の基本的な部分を達成した。カルボキシル基、イミド基のような極性官能基とメチルまたはエチル末端を有するモノマーの重合に成功し、かつ高い立体選択性を得た事は、きわめて優れた結果であり、類例を見ない。また、これを類似の単量体に適用することによって、本研究の目的が達成されると判断される。次年度が最終年度となり、本研究の成果を系統的に整理する必要がある。したがって新たな触媒の開発とともに、研究期間を通じて、用いた触媒の種類と重合反応の選択性、立体選択性を多角的に比較しつつ、実験をすすめる。初年度の研究によって、C1対称パラジウム錯体の合成、これを用いる数種のジエンの環化重合、重合の高い選択性の達成、に成功した。次年度以降は、この錯体触媒、ジエン単量体を新規合成によってさらに多く準備し、その重合を行う。さらに、官能基の分子間相互作用を用いた分子間のネットワークによる高分子ゲルの形成など、分子構造と機能の関係を明らかにする。該当なし前年度の研究に引き続き、新規C1対称パラジウム錯体を合成し、これを触媒とするジエンの環化異性化重合を行う。重合反応及び重合生成物のキャラクタリぜーションについては、従来の対称パラジウム錯体触媒によるジエン環化重合及び前年度の本研究に基づいて行う。単量体としては、前年度のカルボキシル基、イミド基を有するメチル、エチル末端ジエンに加えてプロピルからデシルまでの広範囲の長さのアルキル基を有する類縁ジエンを新たに合成して反応に用いる。さらに、スルホンアミド窒素を官能基として含む片末端ジエンを合成し、その環化異性化重合を検討する。上記の単量体と触媒を用いることによって、主鎖五員環に酸素または窒素、硫黄官能基を有する高分子を合成し、その立体構造についてNMR等の分光手段と広角X線測定やDSC結果の類似性に基づいて、精密に解析する。それぞれの官能基をもつジエンにおいて、メチル、エチル末端ジエンの重合体でのアイソタクチック選択性が高い触媒と反応条件を得るように最適化を行い、これに基づいてより長いアルキル基を有するジエンの重合を行い、広範囲のアルキル基を含む単量体の重合反応の選択性向上を効率よく行う。極性の高い官能基を含み、かつ単量体のアルキル鎖が長いジエンの重合によって、生成する高分子は、炭化水素鎖に規則的に極性基が分布した、構造の整った構造を有する。これらの極性基同士の分子間相互作用、さらに、ピペラジンなど水素結合アクセプター性分子の添加により、さらに強い相互作用に基づいた高分子ネットワークの形成を試みる。23年度の研究において、薬品等の物品を3月に購入したため、執行時期が遅れた。相当部分については、24年度初頭に予算執行を行う。
認知機能改善薬ST101誘導体の標的分子の機能解明と創薬研究

認知機能改善薬ST101の構造最適化を行い、新規スピロイミダゾピリジン誘導体SAK3を創製した。SAK3 (0.5mg/kg)を経口投与するとT型カルシウムチャネルを介して、海馬のアセチルコリン遊離を促進した。嗅球摘出マウスに経口投与すると、海馬のCa2+/カルモデュリン依存性プロテインキナーゼII(CaMKII)を活性化して認知機能を改善した。さらに、アルツハイマー病モデルAPP23マウスに3ヶ月間SAK3(0.5mg/kg)経口投与すると大脳皮質におけるアミロイドベータ蛋白質の蓄積を抑制し、認知機能を改善することを確認した。安全性と薬物動態について前臨床試験を実施している。私達はアルツハイマー病治療候補化合物spiro-imidazopyridine誘導体ST101の臨床開発に加わり、2012年にST101の作用標的分子がT型カルシウムチャネルであることを発見した。本研究ではST101の認知機能改善作用、抗うつ作用、アミロイドβ産生抑制作用におけるT型カルシウムチャネルの関与を調べた。ST101はT型カルシウムチャネルを介して、海馬アセチルコリン遊離を促進した。認知機能改善効果はアセチルコリン遊離促進作用と相関し、T型カルシウムチャネル阻害薬でアセチルコリン遊離促進作用は消失した。ST101の抗うつ効果は海馬歯状回の神経新生促進効果と相関し、その効果はニコチン性受容体の阻害薬で消失した。アミロイドβ産生抑制効果をアルツハイマー病モデルマウス(APP23)で検討した。一ヶ月の投与ではアミロイドβ産生抑制効果は見られなかった。次に、ST101誘導体を創製し、パッチクランプ法を用いてT型カルシウムチャネル活性化作用を指標にして、シーズとしての最適化を図った。その結果、さらに活性の強いSAK3を創製した。海馬シナプス伝達長期増強(LTP)を指標にして、ST101との効果を比較した結果、ST101はLTPに対して効果を示さないのに対して、SAK3は有意にLTPを促進した。嗅球摘出マウスの行動薬理試験においてもSAK3は単回投与で認知機能を改善した。今後は、SAK3の原末の安定試験、薬効薬理試験、毒性試験について、非臨床POCを取得する。ST101誘導体を創製し、パッチクランプ法を用いてT型カルシウムチャネル活性化作用を指標にして、シーズとしての最適化を図った。その結果、さらに活性の強いEthyl 2',3'-dyhydro-8-methyl-2',4-dioxo-2-peperidinospiro [2-cyclopentene-1,3'-imidazo[1,2-a]-pyridine]-3-carboxylates (SAK3)を創製した。海馬シナプス伝達長期増強(LTP)の誘導に対する効果を比較すると、ST101は海馬LTPに対して効果を示さないのに対して、SAK3は有意にLTPを促進した。同様に、海馬LTPの誘導に必須のCa2+/カルモデュリン依存性プロテインキナーゼII (CaMKII)の海馬での活性に対して、ST101は影響しないのに対して、SAK3は有意に増強した。嗅球摘出マウスの行動薬理試験においてもSAK3は急性投与で認知機能を改善した。アルツハイマー病モデルマウス(APP23)のアミロイドベータ蛋白質の発現に対する効果を検討した。SAK3の2ヶ月間の慢性経口投与はアミロイドベータ蛋白質のレベルを有意に低下させた。今後は、慢性投与APP23マウスの大脳皮質の遺伝子のマイクロアレイ解析により、アミロイドベータ蛋白質産生抑制にメカニズムを追究する。本研究ではST101およびその誘導体SAK3の認知機能改善作用、アミロイドβ産生抑制作用におけるT型カルシウムチャネルの関与を調べた。本年度はST101誘導体を創製し、パッチクランプ法を用いてT型カルシウムチャネル活性化作用を指標にして、シーズとしての最適化を行い、活性の強いSAK3を創製した。SAK3 (0.5mg/kg)の急性経口投与で海馬内アセチルコリン遊離とグルタミン酸遊離促進し、これらの効果はT型カルシウムチャネル阻害薬あるいはニコチン受容体阻害薬で完全に抑制された。同様に、新規物体認識試験による認知機能の評価において、嗅球摘出マウスの認知機能障害は急性投与で改善された。これらの効果はST101の急性投与では見られなかった。さらに、アルツハイマー病モデルAPP23マウスに3ヶ月間SAK3を経口投与するとアミロイドβ蛋白質の産生と凝集が抑制されることを確認した。今後は、SAK3の原末の安定試験、薬効薬理試験、毒性試験について、非臨床POCを取得し、前臨床試験を確実に実施する。アルツハイマー病モデルマウスにSAK3を3ヶ月間投与して、アミロイドβ産生抑制に対する効果をドネペジルと比較検討する。SAK3慢性投与後に、脳内におけるアミロイドβの代謝関連遺伝子について網羅的に検証し、アミロイドβ産生抑制の機序を明らかにする。T型カルシウムチャネルは心臓など末梢組織にも発現が高いことから、一般毒性試験にて安全性を確認する。