hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
鏡視下腫瘍広範切除のための新しい蛍光バイオイメージングの開発

組換えウイルスVSV-Katushkaを作成し腫瘍細胞特異性を確認した。骨肉腫マウスモデルを作成し、VSV-Katushkaを局所投与後、超微弱蛍光イメージングシステム(WinLight32, Berthold)、蛍光顕微鏡(BZ-9000、keyence)にて本システムの腫瘍イメージング能、腫瘍広範切除の再現性、正確性を確認した。VSV-Katushkaを経静脈投与し、本システムを用い血中循環腫瘍細胞を同定、統計学的に有意な生存率の延長を認めた。本研究により四肢悪性腫瘍に対する鏡視下腫瘍広範切除術および血中循環腫瘍細胞治療のための新たな赤外線蛍光バイオイメージング治療法の可能性が証明された。組換えウイルスの作成:大腸菌を用いてVSVゲノムDNA (pVSV-NX2、アクセッション・ナンバー:NC001560)に近赤外線蛍光蛋白KatushkaのcDNA (アクセッション・ナンバー:KF419293)を制限酵素部位(NheI, XhoI)を介して挿入し,全長のDNAプラスミドを作成した。これをヘルパープラスミドであるpIRES-L,pIRES-N,pIRES-Pと共にT7 RNA polymeraseを発現するHamster腎由来BHK21細胞に導入して,組換えウイルスVSV-Katushkaを作成した。段階的に希釈したVSV-KatushkaをBHK細胞に感染させ、TCID50法で力価を測定した。VSV-Katushka蛋白発現の確認:VSV-Katushkaを感染させたBHK21細胞を蛍光顕微鏡下で観察した。また、VSV-Katushka感染BHK21細胞の溶解液にVSV抗体、Katushka抗体を用いてウエスタンブロッティングを行い、各蛋白の発現を確認した。腫瘍細胞への投与:VSV-Katushkaを感染させたラット骨肉腫細胞MSKとヒト正常間葉系細胞MSCを蛍光顕微鏡下に観察した。低濃度の感染でもMSKのみに近赤外線蛍光を認め、腫瘍細胞特異性を確認した。今後の展開:担癌動物を用い蛍光カメラ下における腫瘍可視化を確認、腫瘍切除への応用を検討している。VSV-Katushkaを感染させたラット骨肉腫細胞MSKとヒト正常間葉系細胞MSCを蛍光顕微鏡下に観察した。ネンブタール麻酔下に6週齢F344ラットの下腿筋内に高肺転移性ラット骨肉腫細胞MSK (1 X 107 cells)を移植し、骨肉腫動物モデルを作成した。移植後毎週X線撮影を行い、脛骨骨破壊像、肺転移巣の大きさを観察した。隔週に屠殺し、骨肉腫腫瘍径、肺転移巣数を観察評価した。腫瘍径が10mmに達したことを確認後、Isolated regional perfusion法を用い組換えウイルスを投与した。イソフルレン全身麻酔下に腫瘍移植1週間後、手術用顕微鏡を使用し、患側大腿動静脈に24ゲージカテーテルを挿入し、人工心肺装置を接続、その中枢部で駆血を行い、患側下肢血流を体外循環させる。動脈へのポンプ流量は2ml/mimとし、静脈からのフローはポンプをラットより低い位置に置き、重力により行った。回路中のリザーバーにて1L/minの酸素化を行った。5単位/mlへパリン生食にて5分回路を流した後、VSV1.3x107 plaque-forming unitsをリザーバーより加え15分間循環させた。さらに1分間へパリン入り生食で洗い流した。対照群として生食投与群を作成した。経時的に腫瘍体積、ラット体重を計測した。さらに、比較検討のためウイルスを局所投与、静脈投与した。下記のように計画通り今年度の実験を完了した。VSV-Katushkaを感染させたマウス骨肉腫細胞LM8とヒト正常間葉系細胞MSCを蛍光顕微鏡下に観察した。6週齢C3Hマウスの背部に高肺転移性マウス骨肉腫細胞LM8(1 X 107 cells)を移植し、骨肉腫動物モデルを作成する。腫瘍径が10mmに達したことを確認後、以下の治療を行い、経時的に原発巣、肺転移巣の腫瘍増殖倍率の計測を行った。また、生存曲線を作成し、屠殺時には組織学的評価、免疫染色を行った。VSV-Katushkaを局所または静脈内投与後、超微弱蛍光イメージングシステム(WinLight32, Berthold)、蛍光顕微鏡(BZ-9000、キーエンス)にて本システムの腫瘍イメージング能を確認し、蛍光イメージング下に腫瘍切除を行った。VSV-Katushkaを用いた近赤外線蛍光イメージングは腫瘍広範切除の再現性、正確性を担保することが可能であった。VSV-Katushkaを経静脈的に単回投与、毎週投与群を作成し、コントロール群と比較した。

毎週投与群において、原発巣、転移巣とも腫瘍増大を抑制し、統計学的に有意な生存率の延長を認めた。また、腫瘍移植後、経時的に採取した血液から本システムを用い血中循環腫瘍細胞を同定することが可能であった。血中循環腫瘍細胞は採取した末梢血から赤血球を除去後、VSV-Katushka (近赤外線蛍光蛋白)にて感染させスメアジェルで塗抹標本を作製し、蛍光顕微鏡下に細胞数をカウントした。これによりVSV-Katushkaは骨肉腫原発巣と血中循環腫瘍細胞の両者の腫瘍細胞増殖能、浸潤遊走能を抑制し、生存率の延長に寄与していることが証明された。組換えウイルスVSV-Katushkaを作成し腫瘍細胞特異性を確認した。骨肉腫マウスモデルを作成し、VSV-Katushkaを局所投与後、超微弱蛍光イメージングシステム(WinLight32, Berthold)、蛍光顕微鏡(BZ-9000、keyence)にて本システムの腫瘍イメージング能、腫瘍広範切除の再現性、正確性を確認した。VSV-Katushkaを経静脈投与し、本システムを用い血中循環腫瘍細胞を同定、統計学的に有意な生存率の延長を認めた。本研究により四肢悪性腫瘍に対する鏡視下腫瘍広範切除術および血中循環腫瘍細胞治療のための新たな赤外線蛍光バイオイメージング治療法の可能性が証明された。以下に記する申請時の計画通り実験を完了した。組換えウイルスの作成:大腸菌を用いてVSVゲノムDNA (pVSV-NX2、アクセッション・ナンバー:NC001560)に近赤外線蛍光蛋白KatushkaのcDNA (アクセッション・ナンバー:3PJ7A)をlinker insert (NheI, XhoI)を介して挿入し,全長のDNAプラスミドを作成する。これをヘルパープラスミドであるpIRES-L,pIRES-N,pIRES-Pと共にT7 RNA polymeraseを発現するHamster腎由来BHK細胞に導入して,組換えウイルスを得る。段階的に希釈したVSV-KatushkaをBHK細胞に感染させ、plaque assays法で力価を測定し以下の実験に使用する。当初の計画通り以下の実験を行う予定である。近赤外線蛍光バイオイメージングを用いた鏡視下腫瘍広範切除VSV-Katushka投与後、近赤外線蛍光観察用マクロイメージングシステムを用い、鏡視下に蛍光を発する領域を一塊に切除。凍結切除標本を作成し、VSV-G抗体を用いて免疫組織化学染色を行う。腫瘍細胞領域、ウイルス感染細胞領域(VSV-G抗体免染標本)、蛍光発色領域を比較し、広範切除の正確性、再現性を検討する。経時的に局所再発、遠隔転移、生存率を観察する。転移巣に対しても同様な実験を行う。骨軟部腫瘍学当初の計画通り以下の実験を行う予定である。骨肉腫ラットへのVSV-Katushka投与:6週齢ラットの近位脛骨内に高肺転移性ラット骨肉腫細胞MSK(1 X 107 cells)を移植し、骨肉腫動物モデルを作成する。腫瘍径が10mmに達したことを確認後、Isolated regional perfusion法(下図)を用いVSV-Katushkaを投与する。患側大腿動静脈に体外循環装置を接続、その中枢部で駆血を行い、患側下肢血流のみを心臓循環から隔離する。
帶電特性を利用した浮遊マイクロバブルの捕獲固定化に関する先進技術の開発

マイクロバブルは直径が10μm数十μmの気泡で電荷を帯びている。水中をゆっくり浮遊することでごみなどを吸着し水質の浄化をするなどの幅広い分野で利用されている。マイクロバブルが電荷を帯びていることを利用して、浮遊しているマイクロバブルの動きを制御し、マイクロバブル単体を映像に捕える装置の開発を行った。発生用ノズルの出口を水槽の底面に取り付けてマイクロバブルを発生させる。マイクロバブルが浮遊しながら水面に近づくため、水深のある水槽を透明アクリル材で製作し、周囲から照明を調整し照射することで乱反射を防ぎ、マイクロスコープに必要な照度を保てるようにした。マイクロバブルを捕獲するため水槽内の上面付近に捕獲用のトレーを固定した。トレー内にはマイクロバブル捕獲固定するために間隔を調節できる電極を製作し取り付けた。電極は1mm厚の銅板で2個平行にし、電極の間に200μm間隔のステンレス製メッシュを置いた。メッシュは電極に接続し、もう一方を短絡しないように5mmの隙間を空けて固定した。実験では二つの電極間にファンクションジェネレータで交流電圧を印加した。電圧、周波数を調整してメッシュ部のマイクロバブルの状態をマイクロスコープで観察した。メッシュには100μm30μm程度のマイクロバブルが多く付着した。20μm以下ではメッシュ間に安定した状態で静止しているものもみられた。また、収縮から消滅までの時間が速いようであった。帯電特性を利用して浮遊しているマイクロバブルの動きを交流電源を用いて制御することは困難であった。しかし、メッシュを用いることでマイクロバブルがより安定した状態を作り出すことができ、マイクロスコープのレンズの被写体深度の調整が容易に行えることで、正確な寸法測定や、マイクロバブル単体の状態を詳細に観察することが可能になった。
誘導加熱を用いたジルコニアセラミックスの積層造形技術に関する研究

本研究の目的は,誘導加熱の原理を用いたジルコニアセラミックスの積層造形技術を提案することであり,2018年度は主にジルコニアセラミックスの加熱方法について重点的に検証した.2018年度までに,イタリアのCeia社が開発・製造しており,日本ではエス・エー・ジャパン株式会社が販売している小型誘導加熱装置"SPW900/56"を導入し,ジルコニアセラミックスの加熱実験を実施した.当初は高温環境におけるジルコニアセラミックスの導電性を利用して,誘導加熱によりジルコニアセラミックスを昇温させることを試みたが,結果として想定した通りには加熱できなかった.一方で鉄製の導電性材料をジルコニアセラミックスの周囲に配置し,ジルコニアセラミックスを間接的に加熱することには成功した.通常,レーザ等を用いて局所的に加熱すると,熱応力によりセラミックス中にクラックが生じ割れてしまうが,本方法では割れることがなかった.これは周囲から均一に加熱されることで材料中に圧縮応力が生じたためであると考えられる.誘導加熱装置は最大出力5.6 kWであるため,セラミックスを数秒で1000°C以上に加熱することができた.短時間でクラックを発生させることなくジルコニアセラミックスを加熱可能であることが分かったため,本方法はセラミックスの焼結にも有効であると考えられる.今後はジルコニアセラミックスの粉体を付着させた状態での焼結を試みる.想定される課題としては粉体を均一にセラミックスの核の周囲に配置することが挙げられる.はじめに考えていた原理がそのままではうまくいかないことが判明し,代替策を考案するのに時間を要したため.ジルコニア粉体を用いて焼結実験を実施する.結果として形成されたセラミックスの微細構造や品質を評価する.さらに焼結のメカニズムをシミュレーションを用いて検証する.ジルコニアセラミックス(イットリア安定化正方晶ジルコニア多結晶体,Y-TZP)は高硬度,高破壊靭性値を併せ持つ高強度セラミックスである.本材料は歯科補綴物の材料として期待されている.現在ジルコニア製の歯科補綴物を製造する際には半焼結体を除去加工により成形し,最終的に本焼結している.本焼結工程は長時間であることに加え,材料の体積が20%程度収縮するため,形状精度を確保することが困難である.そこで本研究では粉体を層毎に焼結しながら積層することで,成形時間の短縮,精度の向上を目指している.本年度は本提案手法の基礎となる技術の調査を主に実施した.Y-TZPという材料は1000°C以上で導電性を有するようになる.高温環境下においては誘導加熱によりY-TZPを加熱することが可能となる.提案手法である“渦電流焼結法"はこの原理を利用している.Y-TZPは常温では導電性を有さないため,レーザを用いて局所的に高温にして導電性を発現させる必要があった.そのために使用するレーザとして,Y-TZPの光吸収特性を考慮して波長10マイクロメートル程度のCO2レーザを用いることとした.当研究室で以前から保有していた小型の誘導加熱装置(800 W)を用いてジルコニアブロックの加熱を試みたが,発熱させることができなかった.そのためより大きな出力の装置を準備する必要があると考えられる.また本研究では焼結前の粉体を効率的に凝集させるために静電気力を用いる.粉体の凝集に関しては平成29年度に具体的な検討及び実験を実施する.昨年度は他の仕事との兼ね合いで十分な時間が確保できなかったため、やや遅れ気味である.本年度はテーマを整理し,遅れを取り戻すべく研究を遂行する.ジルコニアセラミックスの焼結に関して実現可能性を文献を中心に調査した。ジルコニアセラミックスの高温導電性に着目することにより,誘導加熱が実施可能であることを確認した.さらに実験に使用するためのレーザ照射装置を整備した.レーザはCO2レーザを用いることとした.これはジルコニアセラミックスは近赤外領域の光の大部分を透過させるが,遠赤外領域の光を発するCO2レーザを用いることにより,対象を効率的に加熱可能であると考えたためである.粉体を静電気力により凝集させる方法の妥当性を検証するための実験装置を構築している.本方法ではコロナ放電を利用して粉体粒子を帯電させる予定である.現在は実験装置を構築している途中である.基礎的な原理を実証するための実験を計画している.本提案方法は積層造形であるが,原理的に細かな形状を造形することが難しい.そのため仕上げ加工が必要となる.現在ダイヤモンド研削砥石を用いて,焼結後のジルコニアセラミックスを加工する実験を実施しており,研削液を使用することにより加工可能であることを実証した.ジルコニアセラミックスは人工歯冠の材料として期待されているため,本研究で提案している積層造形手法と仕上げ加工としての研削加工を組み合わせることにより,最終的に粉体から人工歯冠を作成することを目指している.なお粉体の粒子が直径100 nm程度と非常に細かいため,実験作業者の安全性には十分配慮して研究を遂行している.大学における教育活動に、想定より時間を割く必要があったため。

本研究の目的は,誘導加熱の原理を用いたジルコニアセラミックスの積層造形技術を提案することであり,2018年度は主にジルコニアセラミックスの加熱方法について重点的に検証した.2018年度までに,イタリアのCeia社が開発・製造しており,日本ではエス・エー・ジャパン株式会社が販売している小型誘導加熱装置"SPW900/56"を導入し,ジルコニアセラミックスの加熱実験を実施した.当初は高温環境におけるジルコニアセラミックスの導電性を利用して,誘導加熱によりジルコニアセラミックスを昇温させることを試みたが,結果として想定した通りには加熱できなかった.一方で鉄製の導電性材料をジルコニアセラミックスの周囲に配置し,ジルコニアセラミックスを間接的に加熱することには成功した.通常,レーザ等を用いて局所的に加熱すると,熱応力によりセラミックス中にクラックが生じ割れてしまうが,本方法では割れることがなかった.これは周囲から均一に加熱されることで材料中に圧縮応力が生じたためであると考えられる.誘導加熱装置は最大出力5.6 kWであるため,セラミックスを数秒で1000°C以上に加熱することができた.短時間でクラックを発生させることなくジルコニアセラミックスを加熱可能であることが分かったため,本方法はセラミックスの焼結にも有効であると考えられる.今後はジルコニアセラミックスの粉体を付着させた状態での焼結を試みる.想定される課題としては粉体を均一にセラミックスの核の周囲に配置することが挙げられる.はじめに考えていた原理がそのままではうまくいかないことが判明し,代替策を考案するのに時間を要したため.本年度は誘導加熱装置を導入し,焼結に関する基礎実験を実施する.8月までに実験装置を準備する予定である.また静電気を用いた粉体の凝集に関しても検証実験を行う.誘導加熱装置を用いた加熱実験を実施する。本年度末までに対外発表できるよう研究を遂行する。ジルコニア粉体を用いて焼結実験を実施する.結果として形成されたセラミックスの微細構造や品質を評価する.さらに焼結のメカニズムをシミュレーションを用いて検証する.昨年度は基礎的検討及び調査に時間を費やし,大型機器の導入を見送ったため.研究実施状況によってまだ調達できていない実験装置が存在している.そのため次年度に実験装置を購入する必要がある.はじめに提案していた方法ではうまくいかないことが判明し,その代替策の考案に時間を要したため.粉体を配置するための装置といった周辺機器を今年度購入する.平成29年度は8月頃までに誘導加熱装置(100-200万円)を導入する.
多文化社会の排除と包摂の論理：ハワイにおける文化創生をめぐる民族間交渉と戦略

白水は沖縄系文化的架橋者のストラテジーを分析することにより、彼らが日系等他エスニック集団を準拠集団として文化的表象を構成していることを見出した。中野は中国系とフィリピン系の民族祭が彼らの文化創生に資していることを明らかにした。李は戦前から戦後にかけてコリア系移民の舞踊活動の変化を歴史的に明らかにした。城田はハワイ、沖縄、福岡における障がい児・者のための芸術療法の現場にて参与観察を実施し、各地域での特徴点と共通点および民族芸術療法の可能性と課題の検討を行った。野入はアメラジアンと帰米2世のナラティブ分析を通じて、ハワイの“ローカル"の構築とディアスポラとの相互行為との関連を検討した。白水は「変容エージェントと文化創生・民族間交渉」研究のために2011年9月と2012年3月にハワイ州オアフ島、マウイ島においてフィールドワークを実施。オキナワン・フェスティバルや宜野湾市人会100周年記念新年会における参与観察をはじめ、継続中の沖縄系や日系社会のエスニック・リーダーに対する深層面接調査を実施。リーダーたちの活動をミクロ・マクロな視点から理解する手がかりを得た。中野は「中国系民族祭を通じた民族間関係」の研究のために、2012年1月にホノルルを訪問し、中華総商会主催の水仙祭(この年100周年)の参与観察を行なった。さらに総商会のキーパーソンへのインタビューを行い、中国系とフィリピン系の民族間関係と民族文化活動に関する貴重な情報を得た。城田は「ハワイと沖縄の芸術療法にみる多文化共生」研究のために、2011年8月9月にはオアフで人類学者やフラの指導者たちへハワイの芸術療法に関するインタビュー等を実施。10月には沖縄で第5回世界のウチナーンチュ大会や「世界エイサー大会2011」参与観察やインタビューを実施し、自閉症児教育などについて貴重な知見を得た。野入は、2011年10月に沖縄県で開催された第5回世界のウチナーンチュ大会で参加者を対象とするアンケート調査を実施し、海外の沖縄県系人の移民世代、階層、アイデンティティに関するマクロデータを得た。また、2012年2月3月初旬にオアフ島とマウイ島で追加の聞き取りと資料収集。その結果、ハワイにおけるミックス・ルーツの人びとと帰米二世のアイデンティティやネットワークに関する異同と共通点を見出した。研究協力者の李は「コリア系移民の集団化過程と民族間関係」研究のため、2012年2月にハワイ州ホノルル市およびワヒアワ市でフィールドワークを実施。集団化過程の知見ならびに、文化創生をめぐるコリア系移民の歴史的側面やハワイの「多文化共生社会」に対するコリア系移民の見解を明らかにした。白水は、研究会を主宰するなど研究チームの総括を行う一方、民族間交渉と文化創生の研究のために、文化的架橋者でもある変容エージェントの調査を通し、民族祭やエスニック集団の展示に表れた各スニシティの表象の仕方、その企図、およびエスニック集団間の交渉過程を明らかにした。中野は、多文化社会における民族を超える交流関係の研究のために、中国系とフィリピン系を中心に民族祭の成立及び変容過程について、フィールドワークと文献によって解明を進めた。とくに中国系の事例については、「水仙祭」を通じた新たな移民文化の創出過程について、当時の中国語一次資料を収集して分析をおこない、それがハワイにおける民族間交渉と密接に関連していることを突きとめた。李は、コリア系民族祭の文化的架橋者に関する調査を行い、一人の舞踊家が民族祭のシンボル的な存在になっていく過程と、その背景にある多文化社会ハワイの変化を解明した。またこれまでの研究成果をアジア系アメリカ学会(米国シアトル市)で発表し、国内外の専門家と意見交換を行った。城田は「ハワイと沖縄の芸術療法にみる多文化共生」の研究のために、マウイ島でフィールドワークを実施した。その結果、マウイ島、エスニック集団別、ハワイ全体等における自閉症児等支援の状況と芸術療法に関する具体例と実態、課題等を把握することができた。野入はこれまでに収集した沖縄系帰米2世のナラティブ分析をすすめた。その成果は、2013年6月に開催された日本移民学会大会シンポジウムにおいて報告された。また、2013年8月にはアルゼンチンのラプラータ大学で開催されたアジア・アフリカ・ラテンアメリカ学会で研究報告を行い、国際学会においても成果を広く還元した。白水は個別テーマ「文化的架橋者の志向と活動の実態の解明」に向けて2012年8月30日から9月7日までオアフ島にてフィールドワークを実施。沖縄系、日系のキーパーソンにインタビューを行った。沖縄系と日系の関係をみた場合、沖縄系がエスニシティの覚醒に向けて求心力を強めているのに対し、双方を繋ぐ役割の人材(架橋者)が不足している点を見出した。

城田は、「ハワイと沖縄の芸術療法にみる多文化共生」に関して、9月6日9月10日の沖縄島調査では、エイサーの現代的展開等の調査。2月5日2月12日のオアフ調査では、ハワイ大学沖縄研究所長、ウクレレ奏者・指導者、フラ実践者、琉球國祭り太鼓ハワイ支部のメンバー、自閉症児をもつ家族等に、ハワイの芸術療法等に関するインタビュー調査を実施した。李は、「コリア系の文化創生と民族間関係」に関して、2012年10月30日11月6日(オアフ島)と2013年2月26日3月8日(ハワイ島、オアフ島)と、2度調査を実施。戦前、戦後のコリア系の文化的架橋者等キーパーソンにインタビュー調査を行った。コリア系の文化的架橋者の志向が戦前から戦後にかけていかに変化し、その背景にはいかなる多文化社会ハワイの変容や民族間関係の変化があったのかを明らかにした。野入は2012年3月14日から19日までの日程でオアフ島に滞在し、沖縄にルーツをもつ帰米2世の調査対象者とその家族に対する研究のフィードバックと追加調査等を行い、ハワイでも知る人の少ない帰米2世の体験についてインテンシブな調査に基づく質的な深みのあるデータを収集した。研究協力者の中野は「中国系民族祭を通じた民族間関係」の研究のために、2013年1月にホノルルに滞在、中華総商会主催の民族祭「水仙祭」の参与観察等の調査を行い、民族祭とエスニック・コミュニティの組織を通じた文化交流と民族間交渉の実態を明らかにした。白水:沖縄系、日系の変容エージェントに対する深層面接を順調に行うことができているため。中野:中国系及びフィリピン系の民族文化活動に関する現地調査と資料収集を当初の予定通り実施し、キーパーソンへのインタビューを実現できたため。城田:ハワイと沖縄における「芸術療法」に関して、調査対象のキーパーソンたちにインタビューを実施し、有意義かつ今後の調査にも有効な情報・知識が入手できたため。野入:オアフ島、マウイ島におけるインフォーマントとのラポールを継続・進化させ、次なるインタビューの課題を析出することができているため。李:現地調査において多くの協力を得、インタビュー調査を順調に実施することができたため。25年度が最終年度であるため、記入しない。ハワイの諸エスニック集団のキーパーソンに対するインタビュー調査、その父祖の地における資料収集やインタビュー調査等、計画された調査については順調に進展している。主題の性質上、長期の参与観察、面接調査を必要とするが、これまでの10年以上にわたる人間関係の蓄積が研究調査の進展を助けていると思われる。そうした、調査地、調査対象者との良好な関係の維持のための努力のひとつが現地におけるイベントへの積極的な参加・助力であり、調査結果の現地語(英語)による公刊およびそれを用いての現地での報告会である。白水:親密な関係を構築した変容エージェントとの深層面接をさらに継続すること。また、これまでの深層面接で得たミクロな情報・知見をハワイの社会構造やハワイをめぐる地域間関係などのマクロな状況に結び付け、理論化への足がかりを得ること。中野:中国系とフィリピン系、さらに他の民族集団との民族間関係が、ハワイにおける新たなエスニック文化の創生にどのようにかかわっているかを、引き続きフィールドワークを通じて明らかにする。
高磁場MRI, MRSを利用した、抗癌剤投与後の精巣障害予防技術の開発

3 Tesla高磁場MRI装置に適合する超高感度信号受信コイルを開発し、直径約200ミクロンのラット精細管の生体内イメージングに成功した。抗癌剤投与後、精巣は縮小、かつ精細管の陰影が不明瞭化し、MRIを使い精巣障害を診断可能であった。この装置と診断基準を用いれば、将来、ヒトでも抗癌剤投与後の障害精巣の診断に役立つ可能性がある。3 Tesla全身用MRI装置に適合する、ラット精巣計測用高感度信号受信コイルを作製した。ファントム実験において、従来の人体用高感度コイルと比較して約9倍の信号検出感度を達成した。正常ラット精巣のスピンエコー法T2強調画像計測では、4.7Tesla動物用MRI装置を用いた先行研究(Yamaguchi M, et al. ISMRM 2006)と同様、最小64ミクロンの空間分解能にて、直径約200-300ミクロンの精細管の生体内描出に成功した。ヒト計測が可能な全身用MRI装置でも、100ミクロン程度の微細構造を描出可能となった点は、本研究成果を臨床へ応用する契機となりうる点で、大きな意義がある。さらに、MRI測定パルスシークエンスを工夫し、反転回復法T1強調画像(反転時間500-700msec)によるT1強調コントラスト付与にても、精細管の描出に成功した。これは、グラジエントエコー法T1強調画像法による精細管の3次元高分解能生体内画像取得に結びつく、重要な知見である。MRS計測では、オートシミング法を導入し、精巣内代謝物の高感度計測を目指したものの、125mm^3の計測範囲内で、充分な磁場均一性を得ることができなかった(水プロトン信号の半値幅で15-20Hz)。しかし、ラット正常精巣内に比較的豊富に含まれるコリン・クレアチンピークの検出には成功した。この二つのピークは、慢性的な造精障害では、いずれもピークが低下し、造精機能の指標となりうる。従って次年度以降に計画している抗癌剤投与による造精障害の検出に有用と考えられる。3 Tesla高磁場全身用MRI装置に適合する高感度信号受信コイル(平成19年度本研究課題にて開発)の特性を詳細に評価し、コイル部分から遠位ほど受信信号が低く、得られるMRI画像に信号不均一性が生ずると判明した。一方、ラジオ波送信磁場は均等分布を示した。このコイル特性に基づき、画像信号不均一性を改良する手法を開発した。さらに、コイルの回路構成に改良を加え、その結果信号受信感度が大幅に改善した。この改良型コイルにより、ラット精細管をはじめとして、小動物および微小病理組織検体のMR Microscopy(MRM)の画質が飛躍的に向上した。精巣以外においてもラット頚動脈、マウス坐骨神経、マウス実験腫瘍といった微小被写体の高精細画像観測にもこれを応用し、大きな成果を挙げた。抗癌剤投与後の造精障害モデルでは、雄性ラットにドキソルビシンを静脈投与し、MRMを撮像した。投与前と比較して投与後においてMRM上、一部の精細管に径の狭小化が認められた。これらは、摘出組織のex vivo MRM画像および病理組織切片にて造精障害に陥った精細管であると確定診断された。逆に、MRM上、精細管壁と内腔が正常所見を示した場合、組織上、精細管内腔に精子細胞が残存していた。この結果は、抗癌剤投与後の造精障害評価のためにin vivo MRM技術が有用であることを示している。MRSでは、正常精巣にてコリン、クレアチンピークの描出に成功したものの、全身用装置に備え付けの静磁場補正機構が、微小被写体の測定に最適化できず、MRS測定に極めて重要な局所磁場均一性の向上が達成されなかった。その結果、抗癌剤投与後の精巣内の代謝物計測には現状の装置と技術では改善すべき点が多いと判明した。
昆虫ＤＮＡウイルスに対するカイコの応答性防御機構の解析

本研究ではカイコとカイコ核多角体病ウイルス(BmNPV)を用いて、昆虫のDNAウイルス感染に応答してDNAウイルスの増殖を抑制するメカニズムの解析を行った。その結果、膜タンパク質と予想されるテトラスパニン及びインテグリンが、BmNPVの増殖抑制に関わっていることが明らかとなった。またこれまでにBmEtsがBmNPVの細胞内増殖に必須な前初期遺伝子の発現を抑制することで、BmNPVの細胞内増殖抑制がなされていることが知られているが、テトラスパニンはこの抑制に関与していることが示された。今回得られた結果は昆虫ウイルスに対する昆虫の生体防御機構を明らかにする上で重要な知見となり得る。体内に侵入したDNAウイルスの排除あるいは増殖抑制機構を昆虫が有しているかはこれまでは全く不明であった。最近、カイコの転写因子であるBmBtsがカイコDNAウイルスであるBmNPVの応答性細胞内増殖抑制反応に関わる因子であることを見いだし、昆虫にもDNAウイルスに対する積極的な応答性防御機構があることを初めて見いだした。さらに、カイコ細胞へのノックダウン実験により細胞表面タンパク質であるテトラスパニンやインテグリンもBmNPVに対する感染・増殖抑制に関わっていることが示唆されている。本年度はまずテトラスパニンがBmNPVに対する感染・増殖抑制に関わるかをさらに調べるため、テトラスパニンを過剰発現させたカイコ培養細胞にBmNPVを感染させ、一定時間後の細胞中のBmNPV量を測定した。その結果、細胞内のBmNPV量が有為に減少することが明らかとなった。さらに、テトラスパニンをカイコ培養細胞で過剰発現させた場合、BmNPVの前初期遺伝子のプロモーター活性が有為に減少した。このことから、テトラスパミンはBmNPV前初期遺伝子のプロモーター活性を抑制することで、細胞内のBmNPVの増殖を抑制していることが示唆された。BmEtsはBmNPV前初期遺伝子プロモーター活性の抑制に関わっていることが示されている。カイコにはBmEts以外に少なくとも7種類のカイコEtsファミリータンパク質があることが推測されていることから、こうした他のEtsファミリータンパク質もBmNpv前初期遺伝子プロモーターの抑制あるいは活性化に関わっているかをノックダウン実験で調査した。その結果、ショウジョウバエのPointedのオーソログであるBmPTDがこの遺伝子プロモーターの抑制に関わっていることが示された。しかしながら、この遺伝子プロモーターを活性化するEtsファミリータンパク質を見いだすことはできなかった。カイコの転写因子であるBmEtsや膜表面タンパク質であるテトラスパニン等がカイコDNAウイルスである核多角体病ウイルス(BmNPV)の細胞内増殖抑制に関わる因子であることを示唆するデータが得られているが、昆虫のDNAウイルスに対する増殖抑制機構の詳細は未だ不明である。そこで本研究ではこれら応答性ウイルス増殖抑制機構の詳細を明らかにすることを目的とする。昨年度までに、テトラスパニンをカイコ培養細胞で過剰発現させるとカイコ培養細内でのBmNPVの増殖が抑制されること、過剰発現させたテトラスパニンはBmNPVの細胞内増殖に必須なBmNPV前初期遺伝子プロモーターの活性化を抑制することで、細胞内のBmNPVの増殖を抑制していることを明らかにしている。本年度はまず、テトラスパニンがBmEts遺伝子の発現を誘導することでBmNPV前初期遺伝子のプロモーター活性を抑制するかを解析するため、テトラスパニンを過剰発現させたカイコ培養細胞でのBmEts遺伝子の発現量を調査した。その結果、テトラスパニンを高発現させてもBmEts遺伝子の転写量の変動は見られなかったことから、テトラスパニンはBmEts遺伝子の発現誘導を介さずに前初期遺伝子プロモーター活性を抑制することが明らかとなった。次に、カイコ培養細胞にインテグリンを過剰発現させても細胞内のBmNPVの増殖抑制がみられるかを調査したところ、テトラスパニン同様、BmNPVの増殖抑制が確認された。一方、テトラスパニンとインテグリンの相互作用をPull downアッセイで解析したが、両者の相互作用は認められなかった。さらに、テトラスパニンによるBmNPVの細胞内増殖抑制が、幼虫個体でも示されるかを調査するため、テトラスパニンを脂肪体で高発現する遺伝子組換えカイコを作出した。今後このカイコにBmNPVを接種し、体内でのウイルス量が減少するかを解析する予定である。これまでに遺伝子ノックダウン等の実験により、カイコ転写因子であるBmEtsや膜タンパク質と予想されるテトラスパニン、インテグリン等がカイコDNAウイルスである核多角体病ウイルス(BmNPV)の細胞内増殖抑制に関わる因子であることを示唆するデータが得られているが昆虫のDNAウイルスに対する増殖抑制機構の詳細は未だ不明である。作出したテトラスパニンを脂肪体で高発現する遺伝子組換え

カイコに出芽型のBmNPVを経皮投与し、48時間後のカイコ体液中のBmNPV量を測定したところ、テトラスパニンの過剰発現により、ウイルス量が減少する傾向が見られた。また、個体におけるテトラスパニンの機能をさらに検証するため、TALEN(転写活性化様エフェクターヌクレアーゼ)法を用いてテトラスパニンノックアウトカイコを作製した。本カイコにBmNPVを経口接種し、カイコ体内でのウイルス量に変動がみられるかを今後実施する予定である。カイコ培養細胞で、Tetraspanin遺伝子を過剰発現させると、BmNPV前初期遺伝子プロモーター活性が抑制されることから、Tetraspanin遺伝子の過剰発現による細胞内ウイルス量の減少は、BmNPV前初期遺伝子プロモーター活性の抑制が原因と考えられている。このプロモーター活性の抑制にBmEtsが関与しているかを調べるため、BmEtsをノックダウンしてBmNPV前初期遺伝子プロモーターの活性量を測定すると活性が有意に上昇したことから、BmEtsが関与していることが示唆された。カイコ培養細胞でのノックダウン実験により、細胞中のウイルス増殖の促進に関わるEtsファミリータンパク質が同定され、これがBmNPV前初期遺伝子プロモーターの活性化に関わることが推測された。26年度が最終年度であるため、記入しない。昆虫免疫学26年度が最終年度であるため、記入しない。ほぼ計画通りに進捗しているほぼ計画通りに進捗している。当初の予定通りに推進する当初の予定通りに推進する。研究用試薬やガラス・プラスチック器具等を効率的に使用した結果、研究費に余剰が生じた。これらは次年度の研究費と合わせて、人件費や遺伝子発現解析実験に必要な試薬類、器具類の購入にあてる。余剰が生じた研究費は次年度の研究費と合わせて、人件費や遺伝子発現解析実験に必要な試薬類、器具類の購入にあてる。
一分子生理学による生体分子機械の動作機構の解明

光学顕微鏡下の一分子生理学、とくに「一目で分かる」研究を標榜し、巨大目印による分子機械の動き・構造変化の直接可視化を通じて、動作機構の解明を試みた。回転分子モーターF1-ATPaseにおける化学反応→力学的仕事の共役スキームをほぼ完成させ、分子機械一般に通じ得る共役原理を提出した。一方、回転軸無しでも回転するという意外な発見をし、構造に基づく機能の説明は振出しに戻った。二本足のモーター、ミオシンの脚の動きの直接観察に成功し、ブラウン運動をうまく使って歩くことを証明した。(1)F_1-ATPaseのATP駆動の(正)回転機構3つの活性部位における化学反応と回転の連携を明らかにするため、磁気ピンセットで回転角を制御しながら、蛍光性ATPアナログの結合・解離の可視化を試みている。ADP解離のタイミングがほぼ分かった。また、極低濃度ATPに駆動される回転は、高濃度と機構が違うことが示唆された。一方、回転子の先端の17アミノ酸を削除しても回転特性は変わらない。回転機構の見直しが必要かもしれない。F_1の強制逆回転でATPが合成されることはすでに示したが、合成機構に迫るには定量測定が必要である。問題の一つは、フローチェンバーの床だけでなく天井にもF_1が吸着してしまうことだったが、表面処理法の工夫によりほぼ解決した。溶液組成なども改善し、高い合成効率を示す系ができつつある。(3)ATP合成酵素のFo部分(Foモーター)の回転の証明の試み東工大吉田研と協同で、同研究室開発のFoF_1-ATP合成酵素の大量発現系を用いて、プロトン流駆動のATP合成に伴う回転を検出する試みを開始した。Foモーターの回転子部分とF_1モーターの固定子部分のそれぞれにtagを入れ、前者をプラスチックビーズに、後者をガラス面に固定することに成功した。まずはATP駆動によるF_1主導の回転を観察し、反時計回りのステップ回転を確認した。(4)ミオシンの歩行運動の可視化の試みミオシンVの脚部(軽鎖結合部位)に、脚の動きを反映する巨大目印として、ミクロンサイズの微小管を結合させることができた(早大石渡研、東大豊島研と共同)。今のところ片足への結合にしか成功していないが、ATP存在下で、あたかも「歩き」を反映しているかのごとく、アクチン線維上で微小管が前後に振れるのが観察された。まだ例数が少ないが、歩行動作であることの確認を急ぐとともに、歩行機構に迫りたい。(1)ミオシンの歩行運動の可視化ミオシンVの脚部にミクロンサイズの長い目印として微小管を結合させ、「歩行動作」の直接観察を試みている。目印の動きを邪魔しないよう、レールであるアクチンを2個の巨大ビーズの間に橋渡しし、微小管付きミオシンを結合させたところ、脚(微小管)が2つの向きの間を行き来しながら進んでいくのが見えた。この系の実現はきわめて困難で観察例がなかなか増えないので、逆に微小管を固定し、アクチン線維のほうが動く系も開発した。これにより長時間観察が可能となり、着地した(と考えられる)脚がぐっと前に傾くところ、引き続きその脚が持ち上がって回転ブラウン運動するところ、が交互に見えるようになった。2本足の分子モーターに期待されている歩行動作を、初めて直視できたわけである。現在、さらに新しい観察系の開発に取組んでいる。回転と活性部位における化学反応の連携を明らかにするため、(磁気)ビーズにより回転を観察ないし制御しながら、蛍光性ATPアナログの結合・解離を観察している。結合した蛍光性ヌクレオチドは回転子であるγサブユニットがちょうど240°回転したとき解離する;これと符牒を併せ、結合した蛍光性ヌクレオチドの数は正常な120°ステップ回転を行っている最中は常に2個;この数が1個に減ると80°近辺での短い停止を含む不規則な回転が始まる、などが分かりつつある。また、ATP結合が回転の大部分を駆動するという従来の結果と表裏の関係にある、回転に伴うATP親和性の変化も、可視化できつつある。一方、回転子γの固定子にもぐり込んだ先端部分を大きく削除してもトルクが出るという、まったく予想外の結果が得られ、回転機構の解明は振出しに戻るかもしれない。回転の温度特性からの回転機構の推定、トルクの直接測定、逆回転によるATP合成、などにも取り組んでいる。(1)ミオシンの歩行運動の可視化昨年度、ミオシンVの脚部にミクロンサイズの目印として微小管を結合させ、アクチン線維上を歩かせる、あるいは逆に微小管を床面に固定しアクチン線維の動きを見る、ことにより歩行運動の詳細が見え始めたことを報告した。さらに微小管を溶液中に固定してアクチンの三次元運動を許す系も開発し、詳細な解析を行った。着地した脚は、それが前脚である場合、従来の説のように能動的な足首の曲げにより前傾する。

後脚は持ち上がったのち回転ブラウン運動をし、空間のあらゆる向きを経巡り、その速度は粘性で規制される。後者は、脚の付け根がほぼ完全に自由な自在継ぎ手となっていることを示す。ブラウン運動の直接可視化は初めてである。F1はATP一分子の分解に付き120度回転し、最初の80度はATP結合が駆動することを以前報告した。今回、超高速イメージングにより、残りの40度は燐酸解離が駆動することが分かり、さらにこの回転に伴い燐酸に対する親和性が何桁も低下することを示せた。逆回転によるATP合成の場合、燐酸に対する親和性が増して、合成に必要な燐酸を溶液中から取り込めることになる。昨年報告したADP解離のタイミング(ATP結合とほぼ同時)と合わせ、回転中にF1の3つの活性部位のどこでどんな化学変化が起きるのか、基本となる反応経路の全貌が明らかになった。さらに、ADP解離の時間経過から、回転に伴いADPに対する親和性も低下することが示唆された。すなわち、最初の80度部分は、ATP結合だけでなくADP解離によっても駆動される可能性が高い。回転子γの固定子にもぐり込んだ先端部分を、昨年の報告以上に削除しても回転することが分かった。固定子の入口部分の変化だけでトルクを発生できるらしい。低温顕微鏡の開発により、従来知られていなかった律速過程が見つかりつつある。F1は、α_3β_3の6個のサブユニットが作る筒の中でγサブユニットが回転する回転分子モーターである。結晶構造をみると、γのアミノおよびカルボキシル末端はそれぞれαヘリクスを形成し、両者がコイルドコイルとなってα_3β_3の筒の中央に深く突き刺っている。いわば回転軸である。この回転軸を遺伝子的に全部削り取って、残りのγ頭部がα_3β_3の筒の入り口にちょこんと乗っただけにしてしまっても、γは正しい方向に100回転以上回るという、驚くべき結果が得られた。時々不規則な動きも見られるのだが、これはγ頭部の向きが結晶中と大きく異なるとしないと説明できそうもない。いずれにしても、結晶構造に基づいた従来の回転モデルは振り出しに戻ると言わざるをえない。逆に、ヘリケースなどF1に類似の構造を持つ他のたんぱく質も回転する可能性があることを示唆するものともいえる。一方、回転軸のカルボキシル末端を、βサブユニットと遺伝子的につないでしまっても、野生型とほとんど遜色のない回転をすることがわかった。この変異体を用いると、上記の回転軸の切り欠き以外の欠損をγサブユニットに加えることが可能であり、どこまで削っても回転が失われないかを調べている。4°Cから50°Cの間でF1の回転および加水分解活性を調べたところ、低温では、ATP待ちの角度付近に、ATP待ち以外の律速過程が出現することがわかった。ADP解離が有力である。(2)トポイソメラーゼの働きの可視化光ピンセットを使って2本のDNAを絡ませ、そこにトポイソメラーゼを作用させると、絡まりが解けてビーズが浮き上がることを示した。(3)ミオシンの足首の運動我々の提唱しているミオシンの爪先上下機構を検証するため、ミオシンVの足首の角度がATP依存的に変化するのを一分子観察する試みを開始した。
水生植物アサザを用いた科学的リファレンス像の構築に関する研究

水生植物アサザの遺伝的分化の度合いは非常に低く,地理的構造は存在しなかった.また,琵琶湖の能登川と霞ヶ浦の富田浜の二つの小集団においては,それぞれの小集団が国内のアサザの遺伝的変異の大半を保有していた.相補性の観点からは,琵琶湖と霞ヶ浦の小集団のどちらか一方と河北潟または佐賀平野の小集団の一つを保全することで,遺伝的多様性を効果的に保全できることが示された.また,霞ヶ浦について過去の航空写真解析を行った結果,1947年当時には浮葉植物帯がほとんど存在していなかった.自然湖沼と農耕の両方の水湿地環境に生育するアサザは,その生育場所や分布が人為活動とともに短期間で大きく変化してきたと考えられる.野外個体群の観察とDNAサンプル収集を,秋田県八郎潟および周辺湖沼群,宮城県伊豆沼,茨城県霞ヶ浦,石川県河北潟,長野県諏訪湖,滋賀県琵琶湖において行った.その結果,秋田県の八郎潟,能代市小沼,秋田市男潟および長野県諏訪湖の個体群では開花が観察されず,これらの個体群は通常開花しないと考えられた.一方,宮城県伊豆沼では長花柱花型のみの生育が確認され,霞ヶ浦では長花柱花と短花柱花の両方の花型が確認され,これらの観察結果は過去の報告と一致した.また,琵琶湖東近江市の個体群については,従来知られていた短花柱花に加えて新たに長花柱花の生育を見いだした.霞ヶ浦における過去のアサザ個体群の生育状況を把握するため,東京大学小石川植物園と茨城県自然博物館において標本調査を実施した.その結果,1970年以前の標本はごくわずかであることが判明した.また,1990年代の霞ヶ浦での生育状況について文献調査を実施した結果,おおよそ半数の個体群が水路状部に生育していたことが明らかになった.DNAサンプルについて,マーカー開発を含めた分析の準備を進めた.上記の成果の一部(花型および非開花個体群情報,霞ヶ浦での過去の生育状況など)は,2013年度までの研究成果とあわせて次の論文として投稿し,受理された:藤井伸二・上杉龍士・山室真澄.アサザの生育環境・花型・逸出状況と遺伝的多様性に関する追試.保全生態学研究(2015年3月15日受理済み)野外集団:霞ヶ浦,河北潟,諏訪湖,香川県,徳島県,佐賀県において,アサザの野外集団の自生状況と花型の調査を行った.また,これらの各集団について花型と対応したDNA解析用の試料を収集した.栽培:各地から収集してきた総計約20系統のアサザを圃場で栽培し,維持した.また,野外調査で非開花であった系統についての圃場における開花挙動を観察した.その結果,野外で非開花であった集団の大半は圃場栽培条件下でも開花しないことが明らかとなった.標本調査:東北大学植物園,東京大学総合研究博物館,首都大学東京牧野標本館,神奈川県立生命の星・地球博物館,富山市立科学博物館,大阪市立自然史博物館,倉敷市立自然史博物館において,アサザの標本調査を行った.その結果,一部の地域では新しい標本のみが存在することから,近年の人為的な移入や栽培からの逸出が疑われた.DNA解析の結果と照合するため,そのような移入の疑わしい集団に関する情報を整理した.文献調査:霞ヶ浦について,第二次世界大戦直後に米軍によって撮影された航空写真を解析した.まだ解析途中であるが,沈水植物帯の面積は大きかったが,浮葉植物帯の面積は小さいことが示唆された.野外調査,文献調査,標本調査は順調に進捗しているが,遺伝子に関する解析がやや遅れている.その理由は,遺伝子解析にはかなりの経費が必要であるが,コストダウンにはなるべく多くの試料を同時に解析することが望ましい.このため,できるだけ多くの試料収集が完了する年度末に解析を予定していた.そして,1月になってより低コストのMIG-seq法が開発・発表されたために,この新しい解析方法を導入するために遺伝子解析スケジュールを28年度に先送りにした.低コストのため,当初に予定していたよりも多くの試料の解析が可能となり,より精度の高い結果が得られると判断した.1)野外集団の調査:北海道,関東,信州,山陰,紀伊半島,九州の各地域での試料収集を行った.これらのうちのいくつかの集団については,当該水域が埋め立てによって消滅していた.さらに,これまでの継続観察により,アサザ個体群規模は,数年で10倍程度の拡大または縮小を行う場合のあることが明らかとなった.2)開花および花型の調査:各地での野外観察および収集株の栽培によって各集団の花型の特定を行った.従来は開花が観察されていなかった愛知県の1集団について,短花柱花であることが明らかとなった.3)米軍撮影の航空写真を用いた霞ヶ浦の湖岸植生の解析について,投稿論文の執筆を行った.4)遺伝的変異の解析:RADseq法を用いて,系統解析,ネットワーク解析,クラスター解析を行った.その結果,3タイプの遺伝子型に分化しており,それらの遺伝子型がお互いに交雑することで,アサザ全体の遺伝的な多型が構成されている可能性が示唆された.すなわち,A(東北・関東・信州に分布), B(九州・四国に分布),C(九州・琵琶湖に分布)の3タイプと,それらの交雑型である.交雑型では,A×Bタイプが東北南部から九州に卓越しており,A×Cタイプが霞ヶ浦のみで見いだされた.

5)リファレンス像の構築:遺伝子型とその地理的分布から,アサザの交雑による多様化の実態と人為的な移入について検討し,リファレンス像についての予備的な構築を行った.最新のRAD seq法は,正確で大量の遺伝情報を得られる一方で,膨大なデータ取得とその解析のために1タームあたり約3ヶ月の期間を要する.加えて,多量のサンプルを同時に分析することがコストダウンとなるため,分析に供する多試料の調整にかなりの手間と時間が必要であった.このため,当該年度は1タームの試料分析となり,これまでに収集した試料の1/3程度の解析にとどまった.一方,野外調査と試料収集および花型の調査は順調に進み,とくにDNA用の試料収集については予定を超える地域空の収集に成功した.新しい解析方法であるMIGseq法を用いることで,安価で多数サンプルのDNA配列データを得ることに成功した.その結果,アサザの遺伝的構造が明らかになるとともに,その保全について有効な提言を作成することができた.1)アサザの遺伝的変異は非常に小さい.クラスター分析によってアサザの遺伝的変異は2群に分割され,多くの集団でこれら2群が共存していた.また,両者の遺伝子型が混じりあった交雑個体も見いだされた.遺伝子型2群は,アサザの花型(長花柱花,短花柱花,等花柱花)とは対応していなかった.2)NJ法による樹状図およびPCA解析からは,アサザの遺伝的変異に地理的構造の存在しないことが明らかになった3)霞ヶ浦(北浦と西浦の合計14集団),河北潟(2集団),琵琶湖(2集団),佐賀平野(8集団)の3地域について十分な個体数を解析した結果,最も遺伝的な変異の大きかったのは霞ヶ浦と琵琶湖であった.とくに,琵琶湖の能登川1集団と霞ヶ浦の富田浜1集団では,それぞれが全国のアサザ全体の遺伝的変異を内包するほどの多様性を保有していた.4)琵琶湖の能登川1集団と霞ヶ浦の富田浜1集団の遺伝的多様性に内包されない遺伝子型が,佐賀平野の一部の集団・河北潟・猪苗代湖鬼沼で見いだされた.相補的保全の観点からは,琵琶湖の能登川1集団または霞ヶ浦の富田浜1集団のうちのどちらか1集団に加えて,佐賀平野(3集団)・河北潟(2集団)・猪苗代湖鬼沼のうちのどれか1集団を保全することが有効と考えられた.5)アサザの遺伝的変異の保全はごく少数の集団の維持によって達成できることが明らかになった.これは,遺伝的変異に地理的構造がなく,集団内での変異の大きいことが要因と考えられる.霞ヶ浦全体で行われているような大規模な保全事業は,本種の遺伝的多様性の維持については必ずしも効果的ではなく,再検討の余地がある.水生植物アサザの遺伝的分化の度合いは非常に低く,地理的構造は存在しなかった.また,琵琶湖の能登川と霞ヶ浦の富田浜の二つの小集団においては,それぞれの小集団が国内のアサザの遺伝的変異の大半を保有していた.相補性の観点からは,琵琶湖と霞ヶ浦の小集団のどちらか一方と河北潟または佐賀平野の小集団の一つを保全することで,遺伝的多様性を効果的に保全できることが示された.また,霞ヶ浦について過去の航空写真解析を行った結果,1947年当時には浮葉植物帯がほとんど存在していなかった.自然湖沼と農耕の両方の水湿地環境に生育するアサザは,その生育場所や分布が人為活動とともに短期間で大きく変化してきたと考えられる.野外個体群の花型情報の収集と解析資料のサンプリングについて,当初の計画通りの調査が実施された.