hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
多相ESR分光法による生体超分子系の動的構造

近年、生体系の構造と機能に関する研究において、生体超分子系の存在が注目を浴びている。超分子とは、それ自体すでに高次機能をもつタンパク質はDNA等の高分子どうし、又は低分子量の脂質、ペプチド等の生体分子が凝集した系を意味する。サブユニットの集合構造、生体膜及びクロマチン等は生体超分子であり、構成素子間の相互作用と調節によって、さまざまな生理活性を支配している。一方、生体超分子は本来非平衡熱力学系として定義され、ゆらぎの中で生体系の機能・調節を行う。それ故、個々の分子のゆらぎ、すなわち動的性質および動的構造の情報が必須となる。この様な情報を得るには、1生体分子の拡散運動特に並進拡散および回転拡散の知見と、2広い周波数帯域にわたる同時測定を一挙に行わなければならない。電子スピン共鳴法(ESR)は局所の情報検出と動的構造に極めて敏感な分光学的手法として知られ、現在迄低分子物質を中心とする生体系に応用されてきた。本研究計画では、多種類のESRを組み合わせた多相ESR分光法を生体超分子系に応用し、その構造と動的ゆらぎを解明することを目的とした。さらに、ESR画像法によって高次の細胞レベルの超分子構造の解析を行った。班員による今までに蓄積してきた研究成果をふまえ生体超分子系の動的構造研究を基礎として、生体オキシメトリー(酸素計測)さらに、生体ラジカルの動態の二点に主眼をおき調査研究を行った。また、国際規模の共同研究により単独研究を行う以上の相乗効果を狙うべく、多相ESR分光法の世界第一線の研究者を動員した。この研究組織により生体超分子系の動的構造の広帯域、多モードにおける理解が可能となった。第一に、広い帯域周波数にわたる生体超分子系の同時測定を行うべく、多相ESR、すなわち、CW、飽和移動、ベクトル、パルス多次元ESR、CW-ESR画像そしてパルス-ESRイメージングを組み合わせ総合的検討を行った。1)生体モデル脂質膜の広帯域測定をS,X,QおよびFIR (250 GHz)周波数帯で行い,ゆらぎの周波数分散を明らかにした。さらにCW-ESR画像装置を用い、並進拡散を解析した。2)蛋白質のザブユニット間動的構造について、広帯域測定とCW-ESR画像法を用いて分散特性と運動モード解析を行った。3)生体膜中の、脂質や蛋白質の構成素子間の相関の構造を明らかにし、分散特性運動モード解析を行った。ベクトルESRを用い素子間のエネルギー移動を調べ,脂質-蛋白質の相互作用を究明した。特に、生体における酸素の直接計測、超高磁場ESR、新しいタイプのスピンラベル及びESRイメージングの展開がなされた。特筆すべきは、FreedとBudilによる超高磁場ESR法である。これは、最先端のゆく新しい研究分野である。第二に、生体ラジカルの動態と生体オキシメトリー(酸素計測)研究である。従来のESRでは困難な生体の細胞外在性または内在性フリー・ラジカルのスペクトルおよび緩和計測を可能にすべく、分光装置に幾つかの改良と開発を行った。まずパルスLバンドESRシステムの作製と実験小動物用を対象としたそのイン・ビボESR装置を開発した。cw L-band ESR装置の発展型としての装置は小動物用のレゾネーターも含め日米のそれぞれの施設で試作し、ファントムによる計測を試行し一部成功している。電気回路の改良にノイズの混入のない小動物の可能なシステムとし、上記目的を達成する予定である。以上を要するに、二年度にわたる研究において、生体での酸素の直接計測、超高磁場ESR、新しいタイプのスピンラベル及びESRイメージングの展開がなされた。これらは、生体研究の新しいトレンドであるばかりでなく、同時に最先端のESR分光技術の開発を促し、生物科学には不可欠の学問領域である。本研究計画では、各ESR分野の権威を配し、かつまた最先端をゆく生物科学研究の若手研究者を配置し知識の融合が行われた。この結果、生命現象の解明と解析測定技術の開発という、極めて稀有な組み合わせの学問的成果が得られた。

班員による今までに蓄積してきた研究成果をふまえ生体超分子系の動的構造研究を基礎として、生体オキシメトリー(酸素計測)さらに、生体ラジカルの動態の二点に主眼をおき調査研究を行った。また、国際規模の共同研究により単独研究を行う以上の相乗効果を狙うべく、多相ESR分光法の世界第一線の研究者を動員した。この研究組織により生体超分子系の動的構造の広帯域、多モードにおける理解が可能となった。第一に、広い帯域周波数にわたる生体超分子系の同時測定を行うべく、多相ESR、すなわち、CW、飽和移動、ベクトル、パルス多次元ESR、CW-ESR画像そしてパルス-ESRイメージングを組み合わせ総合的検討を行った。1)生体モデル脂質膜の広帯域測定をS,X,QおよびFIR (250 GHz)周波数帯で行い,ゆらぎの周波数分散を明らかにした。さらにCW-ESR画像装置を用い、並進拡散を解析した。2)蛋白質のザブユニット間動的構造について、広帯域測定とCW-ESR画像法を用いて分散特性と運動モード解析を行った。3)生体膜中の、脂質や蛋白質の構成素子間の相関の構造を明らかにし、分散特性運動モード解析を行った。ベクトルESRを用い素子間のエネルギー移動を調べ,脂質-蛋白質の相互作用を究明した。特に、生体における酸素の直接計測、超高磁場ESR、新しいタイプのスピンラベル及びESRイメージングの展開がなされた。特筆すべきは、FreedとBudilによる超高磁場ESR法である。これは、最先端のゆく新しい研究分野である。第二に、生体ラジカルの動態と生体オキシメトリー(酸素計測)研究である。従来のESRでは困難な生体の細胞外在性または内在性フリー・ラジカルのスペクトルおよび緩和計測を可能にすべく、分光装置に幾つかの改良と開発を行った。まずパルスLバンドESRシステムの作製と実験小動物用を対象としたそのイン・ビボESR装置を開発した。cw L-band ESR装置の発展型としての装置は小動物用のレゾネーターも含め日米のそれぞれの施設で試作し、ファントムによる計測を試行し一部成功している。電気回路の改良にノイズの混入のない小動物の可能なシステムとし、上記目的を達成する予定である。以上を要するに、二年度にわたる研究において、生体での酸素の直接計測、超高磁場ESR、新しいタイプのスピンラベル及びESRイメージングの展開がなされた。これらは、生体研究の新しいトレンドであるばかりでなく、同時に最先端のESR分光技術の開発を促し、生物科学には不可欠の学問領域である。本研究計画では、各ESR分野の権威を配し、かつまた最先端をゆく生物科学研究の若手研究者を配置し知識の融合が行われた。この結果、生命現象の解明と解析測定技術の開発という、極めて稀有な組み合わせの学問的成果が得られた。脂質と核酸の動的構造について:下山らはX線回折、示差熱分析およびESRによりLangmuir-Blodgett膜の構造と物性を解析した。X線回折によりLB膜における層構造の秩序に関する知見を得、示差熱分析ではアラキジン酸とアラキジン酸マンガン塩の粉末試料での相転移を解析し、BSRではLB膜の磁性解析を行い、g値と信号強度の角度変化から単分子膜の空間次元構造の、また線幅の角度変化からスピン鎖の次元性に関する情報を得た。ESRの結果はX線回折による構造情報と完全に一致した。
エンハンサー-プロモーター間相互作用「橋渡し分子」群の赤血球分化における機能

赤血球分化に必須な転写因子GATA-1は、種々因子とさまざまな「橋渡し分子」複合体を形成することにより、複数の機能を発揮していると予想される。本研究では、GATA-1の標的遺伝子候補であるGATA-1遺伝子自身の転写制御領域を鋳型として用い、ゼブラフィッシュ胚に対する生体レポーター解析を行うことにより、生理的な条件下で活性をもつGATA-1「橋渡し分子」複合体の作用機序と分子的実体の解明を試みた。まず、ゼブラフィッシュGATA-1ゲノム遺伝子を単離同定し、その翻訳開始点上流8kbにGFP遺伝子をレポーターとして接続したコンストラクトを構築した。この構築をゼブラフィッシュ胚に注入したところ、内因性のGATA-1発現を再現するGFP発光を示したので、この構築をゲノムに安定に組み込んだトランスジェニックフィッシュの系列を作製した。次に、このGATA-1-GFPレポーターフィッシュ胚に対して、GATA-1の過剰発現を行なった結果、体節期において異所的なGFPの発現誘導が観察された。種々の変異GFPレポーター構築を用いた結果、このGFP発現誘導には、翻訳開始点上流約6kbに存在するGATA配列が重要であることがわかった。このことはGATA-1遺伝子の発現における正のフィードバック機構の存在を示唆するとともに、GATA-1遺伝子がGATA-1の直接の標的遺伝子であることを個体レベルで初めて示すものとなった。このGFP発現誘導に必要なGATA-1蛋白質ドメインを明らかにするために、種々の変異GATA-1構築を準備し、過剰発現解析を行なった結果、GFP誘導には2つのZnフィンガーがともに必要であることがわかった。N末側のZnフィンガーは、FOGなどの因子と相互作用することが報告されており、他の因子との相互作用の必要性が示唆された。赤血球分化の進行には、転写因子GATA-1、SCL、LMO2が必須である。その作用機構の一つとして、LMO2とLdb1によるGATA-1ーSCL因子間の相互作用の橋渡しが予想されている。本研究では、「橋渡し分子」複合体の足場となりうるGATA配列などのエレメントが複数見出されるGATA-1遺伝子の転写制御領域を解析系として、また、生体レポーター解析と遺伝子過剰発現解析が併用できるゼブラフィッシュを生物材料として用いて、「橋渡し分子」複合体の作用機序と分子的実体の解明に取り組んでいる。本年度は、GATA-1遺伝子の転写制御領域で駆動されるGFPレポーター遺伝子をもつトランスジェニックゼブラフィッシュの作製と「橋渡し分子」複合体に含まれる因子群のゼブラフィッシュcDNAの収集を行った。まず、ゼブラフィッシュGATA-1ゲノム遺伝子を単離同定し、その翻訳開始点上流8kbにEGFP遺伝子をレポーターとして接続したコンストラクトを構築した。これをゼブラフィッシュ胚に注入したところ、内因性のGATA-1発現を再現するGFP発光を示したので、これをゲノムに安定に組み込んだGATA-1-GFPフィッシュの系列を作製した。一方、「橋渡し分子」複合体に含まれる因子の収集を目的に、既に保持するGATA-1、Ldb1、Ldb2に加え、ゼブラフィッシュcDNAライブラリーより、LMO2、SCL、GATA-2を単離同定した。Ldb2及びLMO2と相互作用する新たな因子に関しては、酵母two-hybrid法を用いて探索中である。来年度は、得られた因子群を様々な組合せで、GATA-1-GFPフィッシュの胚に過剰発現させ、GFP発現に対する影響を観察する予定である。赤血球分化に必須な転写因子GATA-1は、種々因子とさまざまな複合体を形成することにより、複数の機能を発揮していると予想される。本研究では、GATA-1の標的遺伝子候補であるGATA-

1遺伝子自身の転写制御領域を鋳型として用い、ゼブラフィッシュ胚に対する生体レポーター解析を行うことにより、生理的な条件下で活性をもつGATA-1複合体の実体の解明を試みた。昨年度作製したGATA-1-GFPレポーターフィッシュ胚に対して、GATA-1の過剰発現を行なった結果、体節期において異所的なGFPの発現誘導が観察された。種々の変異GFPレポーター構築を用いた解析の結果、このGFP発現誘導には、翻訳開始点上流約6kbに存在するGATA配列が重要であることがわかった。このことはGATA-1遺伝子の発現における正のフィードバック機構の存在を示唆するとともに、GATA-1遺伝子がGATA-1の直接の標的遺伝子であることを個体レベルで初めて示すものとなった。次に、このGFP発現誘導に必要なGATA-1蛋白質ドメインを明らかにするために、種々の変異GATA-1構築を準備し、各々を用いて過剰発現解析を行なった。その結果、GFP誘導には2つのZnフィンガーがともに必要であることがわかった。N末側のZnフィンガーは、FOGなどの因子と相互作用することが報告されており、他の因子との相互作用の必要性が示唆された。現在、どの因子との相互作用が必要であるかを明らかにするために、種々因子との相互作用部位に点変異を導入した変異GATA-1構築を用いた解析を行っている。
自転車事故防止にむけた自転車運転中の注視点移動と能動的注意との関連に関する研究

本研究では、自転車事故発生要因の科学的理解ならびに安全な自転車利用の促進に役立てるため、自転車運転者の注視点移動パターン及び運転パフォーマンスと能動的注意との関連性を検討することを目指した。被検者に対する教示・刺激提示と注視点移動及び脳酸素動態・事象関連電位の同時計測をオンラインで行うためのシステムを構築することができた。屋外実験では、脳酸素動態データに日光の影響が顕著であるため、十分な遮光を施す必要があった。また、アイカメラの瞳孔検出用の赤外光が脳酸素動態データにノイズとして混入することが技術的課題だった。当初の目的は達成されなかったが、構築したシステムを活用して研究を継続する予定である。本研究は,自転車運転者の注視点移動パターン及び運転パフォーマンスと能動的注意との関連性を検討し,自転車事故発生要因の科学的理解ならびに安全な自転車利用の促進に役立てようとするものである.25年度では前頭前野の神経活動と注視点移動パターンの関連性を調べる課題に着手した。自転車走行中のアイカメラによる注視点移動記録と同時に、前額部に近赤外線組織酸素モニタのプローブを装着し、脳酸素動態を計測したが、屋外での計測のため、プローブに対する日光の影響が見られた。遮光の工夫を検討した結果、ある程度日光の影響を取り除くことが出来た。また、脳酸素動態計測データにおいてアイカメラの赤外光ノイズが混入しており、デジタルフィルタ処理を検討する必要が生じた。この注視点移動と脳酸素動態の同時計測は、ハードウエア及びソフトウエアを一体的にするシステムを用いているが、被験者に対する教示・刺激提示とデータ計測をオンラインでおこなうために専門家の協力を仰いだ。26年度では引き続き専門家の協力を得てシステムを完成させて実験を継続し、注視点移動と能動的注意との関連性を検討する。本研究は,自転車運転者の注視点移動パターン及び運転パフォーマンスと能動的注意との関連性を検討し,自転車事故発生要因の科学的理解ならびに安全な自転車利用の促進に役立てようとするものである.24年度では自転車運転中の注視点移動パターンの解析を中心に行った。大学生15名を対象に、自転車通行可の歩道及び住宅地内の生活道路を走行中の注視点を記録し、信号のある交差点、信号のない交差点、他者とのすれ違い時における注視点挙動を解析した。信号のある交差点(全3カ所)では、注視点移動パターンが個人内で同一であった。信号のない交差点(全2カ所)では、安全確認のために左右方向への注視点移動を行うものが多数であった。他者とのすれ違い時では、すれ違う対象に注視点が移動するものが8名で、個人内で同じ移動パターンを示し、他の7名は対象に注視点が移動しなかった。これらから、自転車走行中の注視点移動は事象ごとに習慣化しているパターンやそうでないパターンがあり、安全確認方法が多様化していることが示唆された。24年度予定より早期に進行したため、次年度計画であった前頭前野の神経活動と注視点移動パターンの関連性を調べる課題に着手できた。自転車走行中、注視点移動記録と同時に、前額部に近赤外線組織酸素モニタのプローブを装着し、脳酸素動態を計測した。屋外での計測のため、プローブに対する遮光の工夫を検討した結果、ある程度日光の影響を取り除くことが出来た。しかしながら、計測データへのアイカメラの赤外光ノイズの混入が有り、デジタルフィルタ処理を検討中である。本研究は、自転車運転者の注視点移動パターン及び運転パフォーマンスと能動的注意との関連性を検討し、自転車事故発生要因の科学的理解ならびに安全な自転車利用の促進に役立てようとするものである。26年度では、被検者に対する教示・刺激提示と注視点移動及び脳酸素動態の同時計測をオンラインで行うため、ハードウエア及びソフトウエアを一体化するシステムを構築することを目指した。前年度にひき続いて専門家の協力を仰いだ。その結果、3種類の音刺激をランダムな間隔・比率で提示するシークエンスと、3チャネルの脳波及び音刺激提示データ及び反応スイッチ作動データをリアルタイムに収録するシークエンスを作成し、これらを同時駆動させるシステムを構築することができた。前年度までの屋外でのアイカメラ実験では、注視点移動記録と同時に前額部脳酸素動態データを収録したが、脳酸素動態データに日光の影響が顕著であるため、十分な遮光を施す必要があった。また、アイカメラで瞳孔を検出するための赤外光が脳酸素動態データに対してノイズとなって混入することが技術的な課題として指摘された。この課題については、オフラインでのデジタルフィルタ処理を検討する必要がある。研究期間全体を通じ、注視点移動と能動的注意との関係を検討するという当初の目的は達成されなかったが、完成されたシステムを活用して研究を継続する予定である。健康・スポーツ科学脳波・脳酸素動態と注視点移動の同時計測のためのシステム開発において、技術的な問題を解消できていない。予定していた注視点移動パターンの抽出は概ね完了した。

次年度のためのシステム開発に着手し、順調に進行している。脳波・脳酸素動態と注視点移動の同時計測収録システムの開発においては、引き続き専門家による技術支援を依頼し、開発を完了させる。同システムを用い、自転車走行中の脳波変動・脳酸素動態を検討する。25年度以降は、脳波・脳酸素動態と注視点移動の同時計測を行い、脳の注意機能および認知機能と注視点移動、自転車走行パフォーマンスとの関連性を検討する予定である。そのため、同時計測収録システムを開発する。これまでの実験の結果、自転車走行中の脳波計測では、脳波用電極の固定が技術的に最重要の問題であり、これをクリアしたいと考えている。また、適切なデジタルフィルタ処理を検討し、脳酸素動態と注視点移動パターンの解析を行う。実験実施における人件費・謝金を使用しなかったため。26年度における実験で使用する消耗品等の購入に充てる。脳酸素動態と注視点移動の同時計測実験を行うため、その消耗品購入や、被験者及び実験協力者への人件費として執行する。24年度予算の残高は、実験協力者数が予定より少なかったために発生したもので、25年度の実験協力者への人件費に充てる。脳波・脳酸素動態と注視点移動の同時計測収録システムの開発においては、専門家による技術支援を依頼済みであり、その役務費を支払う。
戦前日本の初等教員養成における初等教員検定の意義と役割に関する通史的事例研究

本研究は、第二次大戦前日本の初等教員養成史研究として、師範学校制度と併せて考えなければならない初等教員検定制度に関して、静岡県の事例を検討した。検討の結果、師範卒者は服務年限を過ぎると退職する者が多く、それを補うため教員検定制度を利用した教員養成事業が行われていたことが明らかになった。静岡県は、検定制度を利用し教員供給を補うとともに、教員の能力向上の手段としても利用した。初等教員検定制度は戦前の初等教員養成において欠かすことのできない制度であった。また、日本において代表的な教育学者である石山脩平も同制度利用者であったことも明らかになり、軽視してはならない制度である。本年度は、1静岡県の初等教員検定制度に関して、1901-40年度を対象として制度の展開過程を検討した。2また全国的動向に関して、府県統計書・府県教育史に第二次大戦中・戦後の国民学校教員検定に関するデータ・記述があることが判明し、1941-46年度の実施状況も検討した。1に関しては、『静岡県公報』誌を主な資料とし制度の変遷を確認した。その結果、以下のことが明らかになった。1)1900年に小学校教員検定細則制定、08年に改定され、09年に全面的に改定、12、13、26、33、35、36年に部分的に改定され、国民学校教員検定に移行した。2)1926年には教第4851号「小学校教員及幼稚園保姆検定ニ関スル件依命通牒」が出され、試験検定が教員の「素質ノ向上」と結びつけられるようになった。3)静岡県の場合、年2回の試験検定の制度化は1935年であり、他県と異なり遅かった。2に関しては、府県統計書・府県教育史を用いて、特に教員検定を利用した教員養成所・教員養成講習会開設状況に留意して検討した。1)17府県の統計書に国民学校教員検定・検定人員・合格者数が掲載されていた。初等科訓導の合格者が多く、単年度で1000名以上が合格している県、合格率100%の試験検定があった。この時期、多数の合格者が出るような措置がとられていたと考えられた。2)先行研究では教員検定との関係が不明であった山梨、福岡県でも教員検定が利用されており、さらに7府県でも教員検定を利用した教員養成所・教員養成講習会が設置されていたことが判明した。3)1944年8月2日に文部省・発国437号「初等科訓導養成ニ関スル件」が発出され、文部省の指示により無試験検定による初等科訓導養成が実施されていた。4)群馬、千葉、東京などの13府県は高等女学校に教員養成所・教員養成講習会を設置していた。最終年度は、3年間の総括として、静岡県の初等教員検定制度の展開過程を明らかにするとともに、検定制度利用者の実例を位置づけ、初等教員検定の意義について考察した。考察に際しては、主に秋田県との比較を行い、静岡県的特徴の有無に留意した。検討の結果は次の通りである。1)静岡県の場合、1926年に小学校教員検定の無試験検定が県内公立小学校在職者に限定され、無試験検定が厳格化されるとともに、試験検定が従来の年1回から年2回へと改められ、受験機会を増やし試験検定重視へと転換していたことが明らかになった。秋田県ではこうした変化はみられず、これは静岡県的特徴であると考えられた。2)静岡県でも小学校教員講習科、臨時教員養成所などの教員養成施設が教員検定を利用していたが、その他に県・郡レベルで多様に教員供給が試みられ、そこでは教員検定、特に臨時試験検定が実施されていたことが明らかになった。師範学校では補いきれない有資格教員の供給を教員検定が担っていたことが静岡県でも確認できた。3)文部省も教員検定制度を利用していたことが明らかになった。1926年から31年にかけて、文部省は師範教育改善事業として尋常小学校本科正教員講習会を開催し、検定により小学校本科正教員を輩出していた。4)師範学校入学者も大正末期までは准教員を経て入学する者が多く、准教員検定が師範学校進学へのルートないしは呼び水になっていた可能性があると考えられた。その代表例としては、戦前・戦後の教育学者として著名な石山脩平があげられた。石山は、准教員養成所を経て准教員として勤め、教育に深く関心をもち、教育学研究へと進んでいった。以上のように、戦前日本の初等教員の供給において、教員検定が師範学校進学への呼び水、教員供給及び教員の資質向上の重要な手段になっていたことが明らかになった。また、その制度は府県により異なることも明らかになった。

本年度は、(1)初等教員検定の全国的傾向に関して、1900-40年の無試験検定合格者数の府県間比較を行うとともに、(2)静岡県の初等教員検定制度に関して、1872-1900年を対象とし制度の形成・展開過程を検討した。(1)に関しては、合格者数の多寡に注目し、特徴的な府県を選定するとともに静岡県の位置づけを考察した。(2)に関しては、静岡県における初等教員検定に関する諸規則の有無を検討し、秋田県の場合と比較した。(1)1900-40年の無試験検定合格者の府県間比較に関しては、(a)北海道が教員免許5種のうち4種において最も多く、残り1種も全国第3位と上位にあり、量的にも大量の有資格教員を輩出していたこと、(b)愛媛、福井、徳島の3県はいずれの教員免許種においても低位に位置づき、無試験検定への依存度が低いと考えられること、(c)静岡県は試験検定、無試験検定、いずれも尋常小学校准教員合格者が多く(試験:全国1位、無試験:全国3位)、この点が全国的にみて特徴的であり、静岡県の検討に際しては尋准検定に留意して分析する必要があることが明らかになった。(2)静岡県の初等教員検定制度に関しては、(a)1882年1月に小学校教員免許状授与規則、同年4月に小学教員学力検定法、1886年に小学校授業生免許規則、1893年2月に小学校教員検定等に関する規則が制定されるとともに、1895年には小学校教員検定等に関する細則が改正されていたこと、(b)これらの諸規則の制定は、いずれも、先行して検討された秋田県より時期的に早かったこと、(c)論点の1つである臨時試験検定は1895年の細則改正において制度化されていたこと、(d)その他1894年に受験用参考図書の告示が静岡県連合教育会長から県知事に建議されていたが、この建議は受験者を検定へと誘うための方策であり、検定が教員確保のための手段視されていたこと、等が明らかになった。静岡県お初等教員検定制度に関しては、小学校教員検定細則等の法令等は確認できる限りにおいてすべて確認し、入力を終えた。初等教員検定により教員となった人物に関しても、当初の計画より多く事例を集めることができた。全国的動向に関しても、1941-46年度の実施状況を確認することができ、当初計画以上の成果をあげることができた。制度変遷の理由を可能な限り明らかにする作業は、予想よりも時間がかかり遅れているが、作業はおおむね当初の研究計画に沿って進んでおり、「(2)おおむね順調に進展している」と判断した。平成23年度の計画では、(1)全国的傾向に関して、1872-1900年までの試験検定・無試験検定、1900-1940年の無試験検定を検討すること、(2)静岡県における初等教員検定制度に関して、『静岡県告示』、静岡県連合教育会機関誌『静岡県教育新誌』、静岡県議会議事録を用いて、静岡県における初等教員検定制度の形成・展開過程を明らかにすることであった。(1)に関しては、1900-1940年の無試験検定に関してはデータ入力および検討を終えて、検討の結果を、『宇都宮大学教育学部紀要第1部』第62号に「戦前日本の小学校教員検定合格者の道府県比較(II) 無試験検定・1900-40年ー」として公刊した。1872-1899年に関してもデータ入力をほぼ終えている。(2)に関しては、『静岡県告示』および『静岡県教育新誌』の関連記事の収集及び記事の検討を終え、「研究業績の概要」に記したように、初等教員検定に関する諸規則の展開過程を明らかにすることができた。1872-1899年の全国的傾向に関する検討、静岡県議会議における小学校教員検定
原虫感染における含硫アミノ酸代謝の役割

原虫感染症における代謝の役割を明らかにすることを目的に、赤痢アメーバをモデルとして、その代謝機構を、メタボローム・トランスクリプトーム等のオミクス手法を用いて、俯瞰的に解析した。システイン負荷・飢餓ストレスに応答する代謝変化、並びに、細胞分化に伴う代謝変化、更にそれらの変化に伴う遺伝子発現変化などを統合的に解明した。その結果、これまで全く知られていない新しい酸化ストレス応答代謝経路や代謝産物が同定された。また、嚢子化に伴う代謝フラックス、及び遺伝子発現の調節が明らかにされた。以上、原虫におけるオミクス解析による統合的代謝解析系は充分に構築された。含硫アミノ酸代謝はすべての生物に普遍的に存在し、多くの重要な生物反応に必須である。本研究では、寄生性原虫赤痢アメーバをモデルとして、感染における含硫アミノ酸代謝の役割を解析する。具体的には、原虫に特異的に存在している含硫アミノ酸代謝経路及び解糖経路等中心代謝が寄生と環境変化に応答してどのように機能しているかを、遺伝子の転写調節、タンパク質発現、代謝中間産物の解析を統合したアプローチにより明らかにする。初-3年度は、原虫に特異的に存在している含硫アミノ酸代謝経路とエネルギー代謝経路が寄生の過程でどのように機能しているかを、主に遺伝子のトランスクリプトーム解析、メタボローム解析により明らかにしようとした。更に、3年次にはシステイン負荷・除去により発現が大きく変化した酸化還元酵素を抽出し、詳細な生化学的検討を行い、酵素学的特徴、生理機能を解明した。初年度は、原虫に特異的に存在している含硫アミノ酸代謝経路(特に硫黄同化的システイン生合成経路と含硫アミノ酸分解経路)が寄生の過程でどのように機能しているかを、主に遺伝子の転写調節、タンパク質発現の観点から明らかにしようとした。まず赤痢アメーバ9000の全遺伝子を網羅したアリメトリクスプラットフォ-ムのマイクロアレイを作成し、これを用いて、含硫アミノ酸代謝のトランスクリプトーム解析を行った。腸管感染から分離された原虫と無菌培養されている原虫とでトランスクリプトームの比較を行ったところ、セリン代謝経路の2酵素、システイン生合成経路の2酵素、硫酸活性化回路の1酵素の遺伝子、メチオニン分解酵素などに大きな遺伝子発現の変動があった。これらの酵素遺伝子発現はおおむね減少していた。しかし、メチオニンガンマリアーゼ1だけは腸管感染に伴い10倍以上発現が上昇していた。また、解糖経路の5酵素遺伝子にも発現低下が見られた。更に、含硫アミノ酸代謝に関与する酵素活性に影響を与える培養条件のスクリーニングを行い、高濃度のメチオニン並びにセリンにより含硫アミノ酸及びエネルギー代謝が調節を受けることが明らかにされた。次年度以降これらの条件をもとにトランスクリプト-ム解析を行う予定である。含硫アミノ酸代謝はすべての生物に普遍的に存在し、その代謝中間体は多くの生物反応に必須である。含本研究は、腸管寄生性原虫である赤痢アメーバの感染における含硫アミノ酸代謝の調節機構とその生理機能の解明を目的とする。具体的には、原虫に特異的に存在している含硫アミノ酸代謝経路(硫黄同化的システイン生合成、セリン代謝、含硫アミノ酸分解経路)が寄生と環境変化に応答してどのように機能しているかを、遺伝子の転写調節、タンパク質発現、代謝中間産物の解析を統合したアプローチにより明らかにする。これまでに同定された含硫アミノ酸代謝酵素活性を変化させる様々な条件(セリンおよびメチオニン負荷)により生じる遺伝子発現の変化をDNAマイクロアレイを用いて明らかにした。これによリメチオニン、セリン、システインの付加によって増減する遺伝子群が特定された。特にシステイン負荷におり多くの遺伝子が増減した。これらの中には多くの機能未知タンパク質が含まれていたが、同時に病原性の違いと相関するAlfA2遺伝子が含まれていた。更に、原虫の抽出液から約150の代謝中間体をキャピラリー電気泳動法と質量分析計により、網羅的に、各含硫アミノ酸ならびに含硫アミノ酸の代謝に関与する中間代謝物を再現性よく定量する系を確立した。また各代謝経路の各酵素のもつ代謝経路におけるそれぞれの役割を解明するために、含硫アミノ酸分解に重要な働きをするメチオニンガンマリアーゼと、硫黄同化的システイン合成において重要なセリンアセチル転移酵素の過剰発現体を作製した。今後これらの形質転換体を用いたメタボローム解析の準備が整った。また、メチオニンガンマリアーゼの反応機構が確立されるとともに、プロドラッグトリフルオロメチオニンの作用機序が証明された。含硫アミノ酸代謝はすべての生物に普遍的に存在し、その代謝中間体は多くの反応に必須である。

本研究は、腸管寄生性原虫である赤痢アメーバの感染における含硫アミノ酸代謝の調節機構・生理機能を解明することを目的とする。環境変化に応じた転写レベルでの含硫アミノ酸代謝調節を明らかにすることを目的として、システイン負荷により生じる遺伝子発現の変化をDNAマイクロアレイを用いて明らかにした。本年度はシステイン負荷・除去により発現が大きく変化した酸化還元酵素に関して、詳細に酵素学的検討を行い、フェレドキシン:NAPD還元活性、並びに、シスチン・2価鉄還元活性を有することが明らかとなった。同時にメトロニダゾールを還元し、インピボでの薬剤感受性に関与することが明らかとなった。従って本酵素は細胞のレドックス状態により厳密な調節を受け、システインや鉄の代謝に関与する酵素であることが明らかとなった。また、フラクソーム・メタボローム解析により、これまで信じられていた教科書的な赤痢アメーバの解糖経路の流れが謝りであることが示された。具体的には、グルコースの大部分がグリセロール3リン酸に蓄積すること、フォスフォエノールピルビン酸からのピルビン酸への直接の変換が起こらないことなどの新規な知見が得られた。更にグリセロール3リン酸、ピルビン酸、フマル酸などの代謝中間体はシステイン飢餓により上昇し、システインによる解糖経路調節への関与が示された。含硫アミノ酸代謝はすべての生物に普遍的に存在する。その代謝中間体、特にシステイン・メチオニン誘導体は多くの代謝経路及び生化学反応に必須である。他の生物と同様に、システインは赤痢アメーバにおいて必須な生理物質である。そこで、システイン枯渇による中心代謝の変化を、CE-ToFMSを用いたメタボローム解析により解明した。システインの枯渇により、これまで同定されなかった2つの代謝経路が発見された。一つはS-メチル-L-システインの合成経路であった。S-メチル-L-システインの合成は、赤痢アメーバに選択的に存在するメチオニン分解酵素によるメチオニンやホモシステインの分解代謝物であるメタンチオールと、セリンのアセチル化物であるO-アセチルセリンから合成されることが証明された。これにより、これまでシステインのデノボ合成に機能すると考えられてきた経路がS-メチル-L-システインの合成に機能する可能性が示された。今後、その生理機能の解明が必要である。また、システイン枯渇により誘導される2つ目の経路として、イソプロパノールアミンやそのリン酸化物、及びフォスファチジル付加物を合成するケネディー経路が同定された。本経路のシステイン枯渇応答における生理的役割が示唆された。以上本研究は計画通りの成果を収めた。本研究は、腸管寄生虫赤痢アメーバをモデル原虫として感染における含硫アミノ酸代謝の変化をトランスクリプトーム、プロテオーム、メタボロームを融合させた統合的アプローチを用いて解明することにより、感染・寄生及ひ病原機構における含硫アミノ酸代謝の役割を理解することを目的としている。
マイクロデバイスにおける効果的な光触媒の固定と実験システムの構築

細管中に光触媒を様々な形態で固定し、これをマイクロリアクターとした低コスト小型計測システムの作製を行った。以下の研究は特殊な装置、有害物質を使用しないよう心がけた。細管中の光触媒は酸化チタンゾル(酢酸ゾル・ゲル)やゲルを用い、その表面積の増大に微小ビーズや熱線による塗り重ねをし、単純コーティングと比較して飛躍的に反応性が高まった。コストパフォーマンスは熱線による手法(スチロールカッターを流用する)が優れており、簡単に固定できた。色素溶液は、注射器ピストン自重(または加重)による送液で、送液はじめが加圧状態であるため流速の安定のためには、細管の廃液チューブにコックを置き、その開閉度で流速を決定した。紫外線供給のためのLEDは375nm、1mW程度で充分作用し、電池またはACアダプタを使った。実際の色変化はメチレンブルーの水やアルコール溶液・添加剤(犠牲剤)として糖を加えその反応(色変化)を1030秒程度でパソコン画面上にリアルタイムに見ることができる。設定した時間に撮影して、紫外線の強度、色素、アルコールおよび糖の濃度依存性も精度良く確認できた。廃液も紙などに取り込めるため実質廃液0で使用できる。実験精度はカメラ性能に依存するが、安価なwebカメラでも実験できる。またデジタルデータの取得は、小さく画素を切り取った上で、輝度、RGB、HSLなどをフリーソフト等を使って算出した。以上は、誰でも簡単に構築でき、光触媒反応を個人で、または大きく映し出して多くの人が同時に観察できる、教材としても有用なものが完成した。
東アジアにおける人間活動に基づく生態系の劣化と修復

中国・三河平原(黄河・海河・淮河の氾濫原から生成した半乾燥地帯の大平原)は古来から中国の重要な畑作農業地帯であり、多くの人口を養うに足りる土地の肥沃性が維持されてきたが,増加し続ける人口圧と頻発する干ばつとにより、過度の農地の開発と不適切な潅漑・水管理が強行されており、次第にこの地域の生態系バランスが崩れ始めており、随所に土地の廃退・砂漠化が目立つようになっている事実を確認した。とりわけ、過度の潅漑による浅層地下水の上昇は、土壌中の塩類の表層土への集積を促し、土壌の著しい塩類化を引き起していることを現地の土壌調査の結果から明らかにした。そこで,この地域の農業生産性を改善し、再び肥沃な土壌を取り戻すべく,中国科学院石家庄農業現代化研究所と共同研究を行うことを決定した。すなわち、塩類土壌の生成の直接の原因である多量潅漑を改め、効率的な水利用方法を確立するための基礎研究に着手する一方で、既に塩類化している土壌に対し、耐塩性作物種の導入を図り、土壌の塩性化に応じた栽培技術の確立を行うことにした。また,貴重な水の確保のために,塩水を含む不良水質潅漑水からきわめて簡易な、低廉な「精製水製造装置」を考案し、次年度以降半乾燥地農業開発には必須の良質な水の節水潅漑法の具体的適用試験を行うことにしている。以上のように,本年度は中国における調査研究の準備を行い、とくに何が問題であるかを現地調査から明らかにして、その具体的実施計画の詳細を検討した。一方、本研究のもう一つの課題である酸性雨の調査研究では,東アジア地域においてSO_2発生量がとくに大きく、大気汚染による森林などの被害が生じている中国と酸性雨に関する共同研究を行うことにした。平成2年11月、日本側共同研究者が中国を訪問し、中国科学院生態環境研究中心、馮教授らと共同研究について綿密な討議と検討を行い,つぎのような項目について調査研究を行うことにした。1)酸性雨の化学成分,2)大気汚染物質の実態,3)酸性雨の湖沼生態系への影響,4)酸性雨の森林生態系への影響,5)酸性雨の土壌生態系への影響,6)大気汚染物質の発生源対策その後、調査研究の対象地となる重慶市を訪問した。重慶市林業局、馬副局長らの案内で大気汚染が著しく、森林被害の大きい南山地区で現地調査を行い,1991年5月より上記項目について調査研究を開始することにした。また,重慶市の電力の90%以上を供給している重慶発電所を見学した。年間使用される石炭(硫黄分4%,灰分20%)は約240万トンであり、発生する媒塵量は年間2万トン,SO_2発生量も多く,質の悪い石炭の大量使用が酸性雨発生の大きな原因になっていることが考えられる。以上のように,平成2年度は塩性土壌関係,酸性雨関係ともに現場の状況把握を行うことができ、その上で、次年度以降の具体的な研究項目と実施内容を明らかにし、いずれも中国側研究者と研究遂行の調印を締結した。1)酸性雨の化学成分,2)大気汚染物質の実態,3)酸性雨の湖沼生態系への影響,4)酸性雨の森林生態系への影響,5)酸性雨の土壌生態系への影響,6)大気汚染物質の発生源対策

その後、調査研究の対象地となる重慶市を訪問した。重慶市林業局、馬副局長らの案内で大気汚染が著しく、森林被害の大きい南山地区で現地調査を行い,1991年5月より上記項目について調査研究を開始することにした。また,重慶市の電力の90%以上を供給している重慶発電所を見学した。年間使用される石炭(硫黄分4%,灰分20%)は約240万トンであり、発生する媒塵量は年間2万トン,SO_2発生量も多く,質の悪い石炭の大量使用が酸性雨発生の大きな原因になっていることが考えられる。以上のように,平成2年度は塩性土壌関係,酸性雨関係ともに現場の状況把握を行うことができ、その上で、次年度以降の具体的な研究項目と実施内容を明らかにし、いずれも中国側研究者と研究遂行の調印を締結した。
動物プランクトンは魚類ウイルス性疾病の感染源になるのか

モデル動物プランクトンとしてミジンコを用い、動物プランクトンがウイルス性疾病の感染源になるのか調べた。VHSV、CyHV-2及びCyHV-3を対象に研究を行った。VHSVではミジンコ体内からVHSVがEPC細胞を用いて分離されたものの、CyHV-2及びCyHV-3では分離されなかった。各ウイルス液に1日間浸漬したミジンコをVHSVではニジマスに、CyHV-2ではキンギョに、CyHV-3ではコイに摂餌させたが、いずれも疾病は起こらなかった。その要因は各ウイルスが消化過程で不活化されるためと推察された。これらより、動物プランクトンが魚類ウイルス性疾病の感染源になる可能性は低いと考えられた。モデル動物プランクトンとしてミジンコを用い、魚類病原ウイルスが動物プランクトンの体内に感染性を保持したまま存在するかどうかを調べた。ミジンコの培養は3cm程度に切った稲わらと市販されているカニ殻等を主成分とするミジンコ繁殖促進飼料とを混合しオートクレーブしたものを用い、ウイルスフリー状態で行った。本実験に使用したミジンコは1個の耐久卵から培養を行い、さらにクローニングした後実験に供した。培養したミジンコを代表的な魚類病原ウイルスの一つであるウイルス性出血性敗血症ウイルス(VHSV)に浸漬し、浸漬開始後3時間後から6日間後までの6日間、VHSVがミジンコの体内から分離されるかどうか調べた。その結果、10の7乗TCID50/mL浸漬区では浸漬開始3時間6日後、10の5乗TCID50/mL浸漬区では浸漬開始1日2日後のミジンコからEPC細胞を用いてウイルスが分離された。これら分離ウイルスはRT-PCR法によりVHSVであることを確認した。ウイルス分離を実施する際には、ミジンコの外部に付着しているウイルスの混入を防ぐため、体表をエタノールで消毒した後、さらにMEM培地で3回洗浄した後実施した。さらに、凍結切片を用いた蛍光免疫染色法でもVHSVに浸漬したミジンコでは陽性像が観察された。なお10の3乗TCID50/mL浸漬区及びミジンコ用培養液に浸漬したミジンコ(陰性対照区)では、いすれの浸漬時間のサンプルからもウイルスは検出されなかった。これらのことから、環境水中のVHSVの濃度が10の5乗TCID50/mL程度である場合、VHSVは感染性を有した状態でミジンコの体内に数日間保たれることが示唆された。本研究を実施する上で基礎となるミジンコをウイルスフリーで培養することができ、ミジンコに対する魚類病原ウイルスVHSVの人為的感染実験の結果、感染性を有するVHSVがミジンコの体内に存在することが示唆され、年度計画通り進捗したため。年度計画通りミジンコに対するcyprinid herpesvirus-2 (CyHV-2)及びcyprinid herpesvirus-3 (CyHV-3)の暴露実験を行い、それらのウイルスがミジンコ体内に感染性を有した状態で保持されるかどうか検討した。その結果、試験した最も高いウイルス濃度である10の3乗TCID50/mL区でも浸漬した13日間を通し、いずれのウイルスも分離されなかった。したがって、CyHV-2及びCyHV-3は10の3乗TCID50/mL程度ではミジンコ体内に残存しない可能性が推察された。一方でこれらのウイルスの分離に用いている魚類株化細胞の感度の低さが本結果を導いた要因である可能性も危惧された。昨年度の継続として、10の8乗TCID50/mLのウイルス性出血性敗血症ウイルス(VHSV)に暴露されたミジンコ体内のウイルス力価の変動を調べた結果、およそ10の34乗TCID50/mLのVHSVを3日間は保持していることが示された。そこで、次年度計画を前倒しし、10の3乗TCID50/mL程度のVHSVを保持しているミジンコをニジマスに2週間摂餌させ、さらに2週間飼育しVHSの発症の有無を観察したが、VHSは発症しなかった。発症に至らなかった要因を調べるため、ニジマス消化内容物のVHSVへの影響を調べた結果、VHSVはニジマス幽門垂の抽出液中では15°Cで4時間後には10の4乗TCID50/mL以上減少することが示された。これより10の3乗程度のVHSVを保持しているミジンコをニジマスが摂餌しても、その消化過程でVHSVが不活化され感染には至らないのではないかと考えられた。計画通り、ミジンコに対するCyHV-2及びCyHV-3の人為的暴露実験を行うと共に、計画の一部は前倒し、ニジマスへのVHSVを含むミジンコの投与試験を行い、さらにニジマス消化内容物のVHSVへの影響を調べたことからおおむね順調に進展していると考える。10の3乗TCID50/mLのCyHV-2及びCyHV-3ウイルス液に25°Cで1日間浸漬したミジンコをCyHV-2ではキンギョに、CyHV-3ではコイに毎日2週間摂餌させ、さらに2週間死亡を観察し、キンギョではキンギョヘルペスウイルス病が、コイではコイヘルペスウイルス病が発症するかどうか調べた。

ミジンコの体表に付着しているウイルスからの感染を防ぐため、各供試魚へ給与されたミジンコは体表をMEM培地で洗浄した後、エタノールで消毒し、さらにMEM培地で洗浄した後ものを与えた。その結果、いずれのウイルスと魚種の組み合わせでもウイルスに暴露したミジンコを与えた魚で病気は起こらず、生残魚からもウイルスは検出されなかった。なお、CyHV-2ウイルス浸漬区及びCyHV-2-ミジンコ浸漬液区(ミジンコを浸漬していた溶液に浸漬した試験区)の累積死亡率はそれぞれ83%及び43%であり、CyHV-3浸漬区及びCyHV-3-ミジンコ浸漬液区の累積死亡率はそれぞれ100%及び62%であったことから、CyHV-2及びCyHV-3でもVHSウイルスに浸漬したミジンコを与えたニジマス同様、キンギョやコイの消化過程で不活化され発症に至らなかったのではないかと考えられた。これまでの結果から、動物プランクトンが魚類ウイルス性疾病の感染源になる可能性は低いと考えられた。なお、昨年度までに得られたウイルス性出血性敗血症ウイルス(VHSV)に関する成果を水生生物の疾病に関する国際誌と第10回下等脊椎動物のウイルスに関する国際シンポジウム及び第18回ヨーロッパ魚病学会で口頭発表した。モデル動物プランクトンとしてミジンコを用い、動物プランクトンがウイルス性疾病の感染源になるのか調べた。VHSV、CyHV-2及びCyHV-3を対象に研究を行った。VHSVではミジンコ体内からVHSVがEPC細胞を用いて分離されたものの、CyHV-2及びCyHV-3では分離されなかった。各ウイルス液に1日間浸漬したミジンコをVHSVではニジマスに、CyHV-2ではキンギョに、CyHV-3ではコイに摂餌させたが、いずれも疾病は起こらなかった。その要因は各ウイルスが消化過程で不活化されるためと推察された。これらより、動物プランクトンが魚類ウイルス性疾病の感染源になる可能性は低いと考えられた。当初の年度計画通り、ミジンコに対し魚類病原ウイルスであるCyprinid herpesvirus-2 (CyHV-2)及びCyprinid herpesvirus-3(CyHV-3)の浸漬実験を行い、感染性を有するCyHV-2及びCyHV-3がミジンコの体内から検出されるかどうか調べる。CyHV-2及びCyHV-3の分離に用いている魚類株化細胞の検出感度の低いことが危惧されることから、当初の予定通りCyHV-2及びCyHV-3に人為的暴露したミジンコをCyHV-2ではキンギョ、CyHV-3ではコイに摂餌させ、キンギョではキンギョヘルペスウイルス病が、コイではコイヘルペスウイルス病が実際に発症するかどうか調べる。魚病学
難治性乳癌におけるNFκB恒常的活性化の分子機構と癌悪性化に対する役割の解明

難治性乳癌ではNFκBというタンパク質が活性化し癌悪性化を促進している。本研究では、NFκBの役割と活性化を誘導する分子メカニズムについて詳細な解析を行った。その結果、NFκBは癌細胞の生存に関わる因子や癌細胞の転移・浸潤を促進する因子の発現を増強していることを明らかにした。活性化誘導機構の解析ではNFκB活性化因子の一つであるNIKの高発現が原因であることを明らかにした。本研究は乳癌の新たな治療法開発の足がかりになると考えている。転写因子NFκBは、乳癌を始めとする様々な癌細胞において恒常的に活性化し、細胞増殖や転移・浸潤、血管新生などに関わる様々な遺伝子の発現を誘導して癌の悪性化をもたらす。従ってNFκBは抗癌剤の格好の標的であるが、NFκB阻害剤の開発は難航していること、およびNFκBは感染防御や骨代謝制御などの多様な生理機能を有することから、癌細胞においてNFκB恒常的活性化を導く上流のタンパク質や癌の悪性化に関わる標的遺伝子に対する阻害剤の開発が必要とされている。これまでに我々は、ヒト乳癌細胞株35種を収集してそれぞれのNFκB活性をゲルシフト法にて測定し8種のNFκB恒常的活性化株を同定した。その結果、これらのNFκB恒常的活性化株は、内分泌療法やハーセプチン療法といった既存の治療法に耐性を有するbasal-likeサブタイプであることが判明した。これらの株にNFκB抑制タンパク質のIκBαを強制発現すると細胞増殖が抑制されたことから、NFκBはこれらの増殖に必要であることが示された。さらに、これらの株の遺伝子発現情報をもとにNFκB恒常的活性化の上流因子を探索し、NFκB活性化を導くタンパク質キナーゼであるNFκB-inducing kinase(NIK)が高発現し恒常的活性化の一因となっていることを明らかにした。次に、basal-like乳癌細胞は乳癌幹細胞様の細胞を多く含むことが報告されていたことから、NFκBと乳癌幹細胞の関連について解析した。その結果、NFκB活性化因子や抑制因子の発現によりNFκB活性化を調節すると、乳癌幹細胞も同様に増減することがわかった。以上の結果より、basal-likeサブタイプ乳癌において、NFκBは恒常的に活性化し細胞増殖や癌幹細胞の維持に寄与しており、この乳癌の治療標的になることが示唆された。転写因子NFκBは、様々な癌細胞において恒常的に活性化し、細胞増殖や転移・浸潤、血管新生などに関わる様々な遺伝子の発現を誘導して癌の悪性化をもたらす。従ってNFκBは抗癌剤の格好の標的であるが、NFκB阻害剤の開発は難航していること、NFκBは感染防御や骨代謝制御などの多様な生理機能を有することから、癌細胞においてNFκB恒常的活性化を導く上流のタンパク質や癌の悪性化に関わる標的遺伝子に対する阻害剤の開発が必要とされている。これまでに我々は、難治性のbasal-like乳癌細胞において、タンパク質キナーゼNIK依存的にNFκBが恒常的に活性化し細胞増殖に必要な役割を果たしていることを明らかにした。本年度は、basal-like乳癌細胞におけるNFκB標的遺伝子の探索とNIK恒常的活性化機構の解析を行った。標的遺伝子探索の結果、NFκBが乳癌幹細胞の維持に関わるシグナル伝達系リガンドの発現を促進し乳癌幹細胞維持に寄与していることを明らかにした。さらに、癌細胞の転移・浸潤を促進する細胞骨格制御因子も同定した。NIK活性化機構の解析としては、basal-like乳癌細胞ではNIK遺伝子のエピジェネティック変異によりNIK mRNAが高発現してNFκB恒常的活性化を誘導していることを明らかにし論文発表を行った。さらに、プロテオーム解析によりNIK活性化の新たな制御因子も同定しており、詳細な機能解析を進めている。
HTLV-I感染細胞の造腫瘍性に必要な因子の解析

まず我々は、ATL患者由来新鮮白血病細胞をSCIDマウスに接種した所、ATL症例8例中6例においてマウスに腫瘍形成を認め、これらのマウス体内で増殖している腫瘍細胞は、もとの症例のATL細胞と同じクローンである事を示した。次に、種々のHTLV-I感染T細胞株をSCIDマウスに接種した所、ある種の細胞株のみが造腫瘍性を示したが、これらの造腫瘍性を示す細胞株は、主に患者白血病細胞由来のクローンであり、非白血病細胞由来のin vitroにおいて不死化した細胞株は造腫瘍性を示さなかった。また、造腫瘍性を示す細胞株のなかには、in vitroにおいてIL-2依存性増殖を示すものも含まれており、in vivoにおける造腫瘍性とin vitroにおけるIL-2非依存性とは必ずしも相関しなかった。これらの細胞株のin vivoにおける増殖に関して、IL-2オートクリン機構の関与、およびHTLV-Iウイルスの発現との関連をノーザンブロッティング及び、RT-PCR法を用いて検討したが、その直接的な関与は否定的であった。さらに、HTLV-Itax遺伝子を導入したヒトT細胞株をSCIDマウスに接種した所、これらの細胞は造腫瘍性を示さなかった(国立ガンセンターウイルス部・下遠野邦忠博士との共同研究)。このことはin vivoにおいて造腫瘍性を示すためには、tax遺伝子のみでは不十分であることを示していると考えられた。上記の結果より、SCIDマウスを用いた系により、従来in vitroの培養系では困難であったATL患者白血病細胞の増殖をin vivoにおいては高率に再現可能であることが示され、また、種々のHTLV-I感染T細胞株、及びHTLV-Itax遺伝子導入ヒトT細胞株を用いた実験結果と併せて考えると、これらの細胞のSCIDマウスにおける造腫瘍性が、ATL細胞の腫瘍性増殖と深い相関を示すと考えられ、このin vivo増殖モデルがATL細胞の増殖機構、造腫瘍性のより詳細な解析を行ううえで非常に有用であると考えられた。種々のHTLV-I感染T細胞株を用いた実験結果からは、in vivo腫瘍性増殖へのIL-2オートクリン機構の関与やHTLV-Iウイルスの発現との関連は否定的であった。したがって、今後、このモデルを用いて、ATL細胞の腫瘍性増殖を規定する新たな因子の解析を進め、さらにそれらを通じて、新たな治療法の開発を併せて行ってゆきたいと考えている。
ルーメンバクテリアのH^+-ATPaseの性質とその遺伝子のクローニング

ルーメン内に生息する低pH耐性菌であるStreptococcusbovisおよび、セルロース分解菌であるRuminococcus albusのH^+-ATPaseをコードする遺伝子郡(atpオペロン)をInverse PCR法によりクローニングし、全塩基配列を決定した。また、S.bovisのatpオペロンについてPrimer extensionを試みた結果、長さの異なる3つのatp-mRNAが存在することが明らかとなった。また、これらの3つのRNAの相対量は培養時のpHによって異なっていた。従って、本酵素の合成はpHによって転写もしくは転写後レベルで調節される可能性がある。セルロース分解菌が低pHに弱い理由の一つは細胞内phを調節する能力が低いことにあり、それは細胞膜のH^+-ATPaseの活性が低いためであることをこれまでに明らかにした。その活性の低さは細胞当りの酵素量が少ないことによるが、酵素の性質の問題もあると考えられるので、この点について検討した。低pHに耐性のある菌としてStreptococcus bovisを、また耐性のない菌としてRuminococcusalbus(セルロース分解菌)を供試し、各菌のH^+-ATPaseを精製して性質を比較した。精製過程での酵素の失活はR.albusの方が大きく、また膜からの酵素の可溶化やF部分とFの部分の解離され方も異なっていたことから、酵素の含量だけでなく、性質も両菌で異なると推定された。カラムクロマト後、電気泳動により調べたサブユニットのパターンからも、両菌のH^+-ATPaseが構造的にも異なることが示唆された。更に詳しく調べるために、両菌のunc遺伝子(H^+-ATPaseをコードする)のクローニングとシークエンスを行った。先ずβ-サブユニットについて調べ、決定した塩基配列から推定したアミノ酸配列を解析した結果、両菌とも、Bacillsu属の菌やEnterococcus Hirae(Streptococcus faecalis)などとの相同性がかなり高かった。また、S.bovisとR.albusとの相同性は約80%であった。15EA09:このことから、両菌のH+-ATPaseは構造的にもかなり異なると考えられる。他のサブユニットについては目下分析中であるが、H^+-ATPaseは多数のサブユニットから成る巨大分子(分子量3540万)なので、全構造遺伝子を解析するには更に多くの時間を要するであろう。いずれにしても、両菌でH^+-ATPaseの構造がかなり異なると言えそうである。また、S. bovisのatpオペロンについてPrimer extensionを試みた結果、長さの異なる3つのatp-mRNAが存在することが明らかとなった。