hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
染色体のドメイン構造

本研究は、染色体の分離・分配、維持等染色体機能に不可欠なDNAドメインを同定し、またモデル染色体の作成およびその試験管内操作を可能とすることを目標として設定した。以下に述べるように、本年度の研究目標は充分に達成できたと考えられる。1.分裂酵母S.pombeの第【II】染色体の動原体のクローン化に成功した。染色体ウォーキングと染色体組込みの併用による、動原体領域を含む約270KbのDNAをクローン化し、塩基配列決定を含む詳細な構造解析を行なった。その結果、約60Kb長の反復配列を含むドメインに動原体DNAが含まれ、この領域ではほとんど組換えが起こらないことが判明した。しかも、反復配列のうちのひとつは、第【I】および第【III】染色体の動原体領域にも存在し、全染色体の動原体に共通であった。この動原体反復配列は染色体維持に必須であった。大腸菌Fプラスミドの分離を調節する宿主の突然変異株を多数分離した。2.分裂酵母S.pombeにおいて、人工染色体の作成に成功した。この人工染色体は約400Kbの長さで、第【III】染色体の動原体領域とその近傍にある三つの遺伝子を含んでいた。両末端にはテロメア配列が存在する。この人工染色体の挙動は大変興味深く、減数分裂過程において染色体の対合に異常がみられ、二価染色体形成頻度が減少した。3.ヒトの染色体凝縮に直接関与する遺伝子のクローン化に成功した。現在CDNAクローンの塩基配列を決定中である。4.ニワトリ性染色体に特異的な反復DNA配列のクロマチン構造を調べた結果、特異な構築をしていることが明らかになった。5.【II】型のDNAトポイソメラーゼが関与する、非相同的なDNA組換え現象を明らかにした。
サイトカインストーム誘導機構に寄与するArid5aの詳細な働きに関する研究

インフルエンザ等のウイルス感染による肺炎や細菌感染に伴う敗血症は時に重篤なサイトカインストームを引き起こす。サイトカインストームに対する根本的な治療は未だ確立されておらず、その解決は急務の課題である。我々は、サイトカインストームを引き起こす要因となるマクロファージやT細胞における原因遺伝子Arid5aを突き止めた。Arid5aは、炎症に関わる遺伝子の転写物である成熟mRNAの3'非翻訳領域に結合し、それらのmRNAを安定化することにより、発現量を増加させて炎症を亢進させる。本実験により、Arid5aが炎症に寄与するマクロファージやT細胞においてどのようなmRNAと結合し、細胞の活性を調節しているのか整理し、その全体像を理解することを目標とする。また、インフルエンザ等における肺障害とArid5aの役割についてもその関わりを調べた。実験系の樹立のために、血球系マクロファージにおけるArid5a過剰発現株を準備中である。LPS等で刺激後、Arid5a結合mRNAをFlagタグ等により免疫沈降させてeCLIP法により、結合mRNAをRNAシークエンス用のサンプルとして調整する。結合mRNAを同定し、結合するコンセンサス配列、二次構造、さらには結合するmRNAの遺伝子の分類分け等をin silico解析を駆使して行う予定である。インフルエンザによる肺障害おいても、Arid5a欠損マウスにおける肺胞洗浄液中のROS産生の減少、IL-6の減少等が見られ、特定の細胞におけるArid5aの役割を検討中である。
ハルデイン磁性体を対象としたS=1反強磁性ハイゼンベルグ模型の数値的研究

全般に、S=1反強磁性量子スピン鎖の物性を、量子モンテカルロ法を用いて研究した。当初の研究計画を達成するに留まらず、新たな方向性を開拓する事にも成功したものと考えている。まず、現実のハルデイン磁性体を説明する理論的モデルとして、異方性、外場等まで含めたS=1反強磁性ハイゼンベルグ鎖を設定し、これの量子モンテカルロプログラムを作成した。これを用いて、エネルギーギャップ、鎖端磁化、帯磁率などへの異方性の効果、また外場に対する磁化曲線などの計算を行った。これらの研究成果は、従来の実験結果をよく説明するばかりではなく、今後の実験的研究に対する示唆的な役割も十分に果たした。実際既に我々の研究成果は、東京大学物性研究所、理化学研究所、九州大学工学部等の実験研究グループによって比較検討され、論文においても参照されている。一方、虚時間相関数を低温で計算することにより、エネルギーの分散関係を精度良く導出することに成功した。この方法は従来のアイデアを基礎としてはいるものの、その応用において斬新なものであり、今後の量子多体系の素励起の研究に一石を投ずるものである。得られた結果は、中性子散乱の実験結果をよく説明する。さらに上記の研究とは別に、結合交替量子スピン鎖の研究に着手した。これは、結合交替まで含めた量子スピン鎖は、スピン量子数の整数、半奇整数を問わず、ある一定の条件のもとで臨界性を示す(ギャップレスとなる)という、場の理論による提言に刺激を受けてのものであり、ハルデイン問題を、量子スピン系の横断的、普遍的問題として問直したいという動機による。既にS=1スピン鎖において、臨界現象を視覚化することに成功し、その臨界性がセントラルチャージ1の共形場理論で記述されることを明らかにした。
口腔顔面運動神経細胞に入力するコリン作動性C-terminalネットワークの解析

口腔顔面筋を支配する運動ニューロンには,大型のコリン作動性神経終末C-terminalが接しており,運動ニューロンの興奮性調節に機能する.本研究では,まず口腔顔面筋の運動ニューロンに対してC-terminalを投射するニューロン(C-terminal起始細胞)の分布領域を,神経トレーシング法により同定した.次に,単一細胞レベルでコリン作動性ニューロンを可視化するためのウイルスベクターを作製し,脊髄におけるC-terminal起始細胞の形態学的特徴を明らかにした.口腔顔面の筋を支配する運動ニューロンはコリン作動性神経終末C-terminalの入力を受けており、その入力は運動ニューロンの活動調節を行うことで口腔顔面運動の制御に関与すると考えられる。一方で、コリン作動性介在ニューロン(C-terminal起始細胞)がどのようにC-terminalを投射するのかについては不明な点が多く、その機能的役割も明らかにされていない。そこで我々はまず、マウス脳幹において運動ニューロンにC-terminalを送る起始細胞の分布を検討するために、順行性トレーサーBDAを用いた神経トレーシングを行った。その結果、C-terminal起始細胞は延髄から橋の大細胞性網様体に分布しており、両側性かつ複数の運動神経核にまたがった投射をもつ可能性が示された。続いて、C-terminal起始細胞の詳細な形態学的特徴を解析するため、レポーター遺伝子GFPを発現するCre/loxP誘導性アデノウイルスベクターを用いて少数細胞レベルでの可視化を試みた。脳幹網様体のC-terminal起始細胞を理解するためには、類似した細胞集団と考えられる脊髄のC-terminal起始細胞の形態を把握し、比較することが必要である。そこで平成25年度では、脊髄のC-terminal起始細胞(パーティション細胞)ついて上記の手法で可視化を行い、その樹上突起の分枝様式を解析した。その結果、従来は大きな細胞集団として考えられていたパーティション細胞が細胞位置と形態学的特徴に基づいて3群に分類でき、各群に属す細胞はそれぞれ異なる樹上突起分布を持つことが示された。次年度は脊髄での所見を活用して、脳幹網様体におけるC-terminal起始細胞の詳細な形態解析を進める予定である。脳幹網様体に分布するコリン作動性介在ニューロンは,口腔顔面の筋を支配する脳神経運動核に大型の神経終末C-terminalを投射する.これらニューロン(C-terminal起始細胞)のうち,延髄尾側の中心管近傍に分布する集団は転写因子Pitx2を発現する.脊髄では,コリン作動性介在ニューロンの1種:partition細胞がC-terminal起始細胞であり,その細胞マーカーとしてPitx2が知られている.このことから,脳幹のC-terminal起始細胞は脊髄のpartition細胞に類似した細胞特徴を持つと予想される.そこで両ニューロン間の形態学的特徴を比較するため,Cre/loxP誘導ウイルスベクターとChAT-Creトランスジェニックマウスを用いて,脊髄partition細胞の可視化を行った.その結果,partition細胞の樹状突起分枝が可視化されるとともに,軸索は両側の脊髄前角運動ニューロンに投射することが示された.脳幹に分布するC-terminal起始細胞の神経トレーシングでも,両側性かつ複数の運動神経核にまたがった投射が観察されることから,脳幹と脊髄のC-terminal起始細胞が類似した投射様式をもつ可能性が明らかにされた.加えて,アセチルコリン前駆体のコリンを輸送することが報告されている有機カチオントランスポーターOCT2について,抗OCT2抗体を用いた免疫組織化学でマウス脳幹における局在を検討した.OCT2は脳神経運動核運動ニューロンに接する神経終末に分布しており,コリン作動性神経マーカーとの共局在性が観察された.以上から,OCT2は脳神経運動核のコリン作動性神経終末において,シナプス間隙に遊離されたコリンの再取り込みに機能することが示唆された.脳神経運動核の運動ニューロンには,コリン作動性の神経終末C-terminalが接しており,運動ニューロンの興奮性調節に関与する.前年度までの研究により,脳神経運動核にC-terminalを投射する起始細胞は,延髄の大細胞性網様体に分布するコリン作動性ニューロンであることが示された.そこで本年度は,脳幹網様体のC-terminal起始細胞と感覚性/運動性など他ネットワークの間の神経連絡を明らかにするため,逆行性神経トレーシングによる解析に取り組んだ.逆行性トレーサー(フルオロ・ゴールド,ビオチン化デキストランアミン)は神経終末から細胞体に向かって輸送される物質であり,C-terminal起始細胞の分布領域にトレーサーを注入することで,その領域に軸索を投射するニューロンが標識される.その結果,逆行性標識されたニューロンは,脊髄後角・三叉神経脊髄路核および中脳路核といった感覚性神経核,脳幹網様体(小細胞性および大細胞性網様体),赤核(小細胞部)などで多数観察された.加えて中脳中心灰白質の外側部,結合腕傍核,縫線核,上丘などにおいても,少数の標識ニューロンの分布が確認された.以上から,C-terminal起始細胞が分布する網様体領域は,口腔顔面領域からの感覚を受ける感覚性中継核や自律神経系を含めた運動性中継核と神経連絡を持つ可能性が示唆された.今後,逆行性標識ニューロンが存在した神経領域に順行性トレーサーを注入し,これらの神経領域が脳幹網様体のC-terminal起始細胞に対して直接の神経連絡を持つのか検討してゆく予定である.

口腔顔面筋を支配する運動ニューロンには,大型のコリン作動性神経終末C-terminalが接しており,運動ニューロンの興奮性調節に機能する.本研究では,まず口腔顔面筋の運動ニューロンに対してC-terminalを投射するニューロン(C-terminal起始細胞)の分布領域を,神経トレーシング法により同定した.次に,単一細胞レベルでコリン作動性ニューロンを可視化するためのウイルスベクターを作製し,脊髄におけるC-terminal起始細胞の形態学的特徴を明らかにした.平成26年度の当初計画では,1)コリン作動性ニューロン選択的な標識によるC-terminal投射系の可視化,2)C-terminal起始細胞の新規マーカーの探索,3)C-terminal起始細胞に対する入力の神経化学的性状の解明,の3点を予定していた.1)について,脊髄に分布するC-terminal起始細胞(partition細胞)の可視化を行い,その樹状突起分枝および軸索投射様式を明らかにした.2)については,アセチルコリンーリサイクリング機能分子であるOCT2の分布を検討し,OCT2が脳において脳神経運動核でコリン作動性神経終末に分布することを示した.3)については,当初計画よりも神経トレーシングとニューロン全体像の構築に時間がかかり,C-terminal起始細胞に対する入力の解析までは進めていない.以上から,一部計画において若干遅れが生じているものの,研究計画全体はおおむね順調に進展していると評価した.組織形態学,神経解剖学当年度は,次の2点について研究を進める予定である.1.ウイルスベクターの改良とコリン作動性介在ニューロンの形態解析現在,ニューロンの標識に利用しているCre/loxP誘導性ウイルスベクターは,樹状突起を精細に可視化するのに対して軸索の可視化を若干苦手とする.当年度はこの問題点を解決するため,レポーター遺伝子の膜移行シグナルを変更したベクターを作製する.続いて,このベクターを用いて脳幹網様体に分布するコリン作動性介在ニューロンの可視化を行い,その形態学的特徴を決定する.2.脳幹網様体のコリン作動性ニューロンに対する神経連絡の解析脳幹網様体に分布するコリン作動性介在ニューロンの一部は,脳神経運動核を構成する運動ニューロンの興奮性調節に関与する.この調節系の機能を理解するには,コリン作動性介在ニューロンに連絡するニューロンの分布と性質を明らかにする必要がある.そこで逆行性トレーサーを脳幹網様体へ注入し,コリン作動性介在ニューロンに連絡する神経核を検討する.また同定された神経核に順行性トレーサーを注入し,コリン作動性介在ニューロンのどの細胞部位(細胞体や樹状突起など)にシナプスを形成するのか解析する.平成25年度の当初計画では、1)従来の順行性トレーサーを用いたC-terminal投射様式の解析、2)Cre/lox組み換えシステムとウイルスベクターを利用したC-terminal起始細胞の可視化、の2点を予定していた。1)については、脳神経運動核に投射するC-terminal起始細胞の脳幹網様体における分布、C-terminalには複数の脳神経運動核にまたがり同側性に投射する傾向があることを査読付論文として報告することができた(Matsui T., et al., Neuroscience
serrated pathway由来大腸癌の個別化医療の確立に向けて

本研究は鋸歯状腺癌のなかで予後不良な群の特徴を病理組織所見や内視鏡所見、ゲノム変異などから体系的に解明する研究である。前年度までの研究にて我々は癌での鋸歯状構造の有無が癌の悪性度と関連することを報告した。当該年度についてはゲノム変異について検討を行った。大腸癌における網羅的な研究の結果、大腸癌を3つのタイプに分けることができ、これらはCCS1=MSS, CCS2=MSI, CCS3=serrated pathwayに関連することを報告されている(Nat Med. 2013;19: 614-618.)、このため我々はこの分類を判定に重要なCDX2の免疫染色とMSI解析を早期鋸歯状腺癌の臨床病理学所見を比較することとした。当院で加療した早期鋸歯状腺癌24症例について、CDX2の免疫染色とMSI解析にて検討を行なった。さらに癌関連15遺伝子について次世代シークエンサーを用いたtarget-capture sequenceを行った。この結果、24症例はCDX2陽性、MSS群14症例、MSI 5症例、CDX2陰性、MSS群5症例に分類できた。MSSの早期鋸歯状腺癌ではCDX2陰性癌は陽性癌に比べて、有意にSM癌が多く、KI67 LIも高かった。このことからMSS癌のうちCDX2陰性癌はCDX2陽性癌と比べて悪性度が高いことが示唆された。さらにMSSのCDX2陰性癌やMSI癌ではMSSのCDX2陽性癌と比べては近位結腸癌が有意に多かった。またtarget-capture sequenceの結果、MSSの早期鋸歯状腺癌ではCDX2陰性癌は陽性癌に比べて、KRASもしくはBRAFの変異が癌化によって蓄積する割合が有意に多く、これらの遺伝子の蓄積が悪性度と関連することが示唆された。以上のことをまとめ論文化した。概要に示したように、鋸歯状腺癌の悪性度の指標となるバイオマーカーを同定でき、論文化してまとめることができたため。BRAFやKRASの蓄積が鋸歯状腺癌の悪性度に与える影響について機能解析を行う。大腸癌の発癌経路は従来のadenocarcinoma sequenceに加えて、近年では新たな経路としてserrated pathwayが提唱され注目されている。遺伝学的な研究においては予後不良な群に分類される腫瘍が、serrated pathwayに関連する遺伝子変異が多いことが報告されている。一方、病理学的には、いくつかの特徴的な病理所見をもつ腫瘍が鋸歯状病変として定義されている。しかしながら、鋸歯状病変は病理学的に多彩な像を持っており、一概に全ての鋸歯状病変が予後不良であるとは言えないと考えられる。このため本研究では早期鋸歯状腺癌において悪性度の高い病変に特徴的な病理所見を同定し、さらに遺伝学的に予後不良と呼ばれるpathwayにはどのような特徴があるのかを検討した。当院で経験した早期鋸歯状腺癌40症例について検討したところ、癌部に鋸歯状構造をもつ腫瘍(17病変)と鋸歯状構造を持たない腫瘍(23病変)があることがわかった。さらに鋸歯状構造を持つ腫瘍ではT1癌の割合が鋸歯状構造を持たない腫瘍と比べて有意に多く、内視鏡での拡大観察所見でも悪性度の高い所見をもつ腫瘍が鋸歯状構造を持つ腫瘍で有意に多かった。さらに、この40症例において、sessile serrated adenoma (SSA)、traditional serrated adenoma (TSA)、unclassified、non-serrated adenoma由来の癌であるか比べたところ、SSA、unclassified、non-serrated adenoma由来の癌ではTSAと比べて有意にT1癌の頻度が高かった。このため癌部に鋸歯状構造をもつ腫瘍、TSA由来ではない腫瘍は悪性度が高い腫瘍であることを同定し、論文化して報告した。当初の計画通り、一年目は早期鋸歯状腺癌の集積と症例の臨床病理学的な背景について解析を行った。その結果、悪性度と関連する特徴的な病理所見として癌部での鋸歯状構造、非traditional serrated adenoma由来の腫瘍、ということを同定し、論文化して報告を行った。さらにこの早期鋸歯状腺癌症例を用いて、遺伝学的な解析を行うべく、マイクロダイセクションにて癌部と正常部を分けて切り出しを行い、gDNAの抽出を行っている。

この結果、24症例はCDX2陽性、MSS群14症例、MSI 5症例、CDX2陰性、MSS群5症例に分類できた。MSSの早期鋸歯状腺癌ではCDX2陰性癌は陽性癌に比べて、有意にSM癌が多く、KI67 LIも高かった。このことからMSS癌のうちCDX2陰性癌はCDX2陽性癌と比べて悪性度が高いことが示唆された。さらにMSSのCDX2陰性癌やMSI癌ではMSSのCDX2陽性癌と比べては近位結腸癌が有意に多かった。またtarget-capture sequenceの結果、MSSの早期鋸歯状腺癌ではCDX2陰性癌は陽性癌に比べて、KRASもしくはBRAFの変異が癌化によって蓄積する割合が有意に多く、これらの遺伝子の蓄積が悪性度と関連することが示唆された。以上のことをまとめ論文化した。概要に示したように、鋸歯状腺癌の悪性度の指標となるバイオマーカーを同定でき、論文化してまとめることができたため。臨床病理学的な解析が終了したため、遺伝学的な解析を今後は行なっていく予定である。本研究の主目的は、遺伝学的な解析からみたserrated pathwayが臨床的な鋸歯状腺癌の一部にすぎないのではないかということを証明すること、serrated pathwayに相当する鋸歯状腺癌の臨床病的学的特徴の同定である。このため早期鋸歯状腺癌症例を遺伝学的解析でのserrated pathwayを含む3つの遺伝学的なタイプに、既報に準じて免疫染色とMSI解析にて分類する。また遺伝子タイプ別に臨床病理学的所見を比較し、serrated pathwayと関連をある臨床病理学的特徴を明らかにする。さらに早期鋸歯状腺癌のゲノム変異については明らかになっていないため、癌部、腺腫部それぞれからgDNAを抽出し、次世代シークエンサーを用いたdeep sequenceによってそれぞれのタイプ別に特徴的なゲノム変異を明らかにする。研究計画段階ではExome解析を行う予定であったが、FFPE切片であり、サンプルの質なども考慮して癌関連遺伝子のdeep sequenceを行う予定とした。BRAFやKRASの蓄積が鋸歯状腺癌の悪性度に与える影響について機能解析を行う。研究分担者が担当している部分の、マイクロダイセクションでの癌部の切り分けについて3月末まで検証に時間を要し、標本作成、測定による経費支払いを4月に持ち越したため。
マイクロビーズを用いたタンパク質-糖質間結合の電気化学的研究

本研究では、擬似細胞表面で起こる生体分子間の結合をモニタリングし、生体分子をセンシングする電気化学的システムを構築した。具体的には、擬似細胞をデザインするアプローチとして、直径が数μm程度であるマイクロビーズ表面にタンパク質や糖鎖の修飾を試みた。これらのビーズを用いることで酵素や分子認識タンパクを固定することができ、電極活性物質をプローブとすることでタンパク質-糖質間結合を評価する手法を開発した。磁性ビーズを擬似細胞とみなし,グルコサミン修飾ビーズ上でのwheat germ agglutinin(WGA)の結合をボルタンメトリーにより評価した。その結合を評価するために,アミノ基を有するビーズに架橋剤を介して糖質を修飾し,電極活性物質でラベル化したグルコ・ースを調製した。まず,WGAと修飾ビーズを溶液中でインキュベーションした後,ラベル化グルコースを加えた。その結果,ラベル化グルコースの電極活性部位はWGAに被覆されるため,電極応答の減少が観察された。それに対して,グルコサミンやグルコースに対して結合サイトを持たないレクチンと修飾ビーズとを混合すると,ピーク電流値の減少は認められなかった。それゆえ,ビーズ表面上でグルコサミン部位とWGAとの結合が選択的に起きていることが明らかとなった。マンノース-シリカビーズで修飾したカーボンペースト電極を用い,マンノース残基を認識するconcanavalin A(ConA)との結合を電気化学的にモニタリングする方法を開発した。電極活性物質でラベル化マンノースによりCon Aとビーズ表面のマンノース残基との結合は,電極応答の変化から測定される。未修飾電極において,電極活性部位に起因する酸化ピ-クが観察される。次に,Con Aを含む溶液中に電極を浸し,Con Aなしの溶液でラベル化マンノースの測定を行った。その電流値は,先の測定で得られた電流値の80%程度になった。これは,Con Aが疎水性が高いため未修飾電極表面に吸着し,ラベル化マンノースがConAの結合サイトに取り込まれたものと考えられる。一方,修飾電極での電流値はCon Aと反応させない場合の約30%になった。修飾電極ではCpn Aの疎水的相互作用に加え,電極表面に存在するマンノース残基とCon Aとの選択的な結合により電流値の減少が大きくなることが見いだされた。1.生体適合性が高いキチンに分子認識機能を有するタンパク質を修飾するならば、新しい機能をキチンに持たせることができる。本研究では、このコンセプトに基づき粒径の異なるグラッシーカーボン粉末(GCP)とキチン、白金、バインダを混合してカーボンペースト電極を作製した。そして静電的相互作用によりグルコースオキシダーゼを電極表面に固定し、グルコースのセンシングを試みた。グルコースの添加により生成する過酸化水素応答は、GCPに対するキチンの添加量を10%としフタル酸ジオクチルをバインダとした場合では、GCPの粒径が0.4-10μm、10-20μm、20-40μm、50-80μmでは10-20μmでもっとも再現性のよい明瞭な電極応答を示した。それゆえ、GCPの粒径が電極応答に大きく影響すること力脇かであり、酵素センサの開発において重要な要因となる。2.小麦由来レクチン(WGA)とセロヘキソースとの結合を評価するために、シッフ塩基反応によりアミノ基を有する磁性ビーズにセロヘキソースを修飾した。その糖鎖は、WGAの分子認識部ならびWGAをビーズに固定するためのスペーサとして働く。WGA-糖鎖間結合の評価には電極活性物質でラベル化したグルコース(LG)を用い、ボルタンメトリーによる測定を行った。LGの電流値は溶液中でWGAとの結合に基づいて減少した。一方で、修飾磁性ビーズとWGAとをインキュベーションした後にLGを添加すると、電流値はビーズましの測定に比べて増加した。その結果は、WGA-LG間結合はビーズ上の糖鎖とWGAとの相互作用によって抑制されていることを示す。さらに、ビーズに他のセロオリゴ糖を修飾してWGAに対する結合力を比較したところ、その親和力は糖質の長さに依存していることが見いだされた。従って、一連のビーズはタンパク質と糖鎖間の結合のモニタリングに有用であると考えられる。
シナプスレベルでのRgk1機能解析による記憶成分特異的神経子機構の解明

ショウジョウバエ嗅覚記憶中枢であるキノコ体における遺伝子発現解析をもとに特定した遺伝子rgk1について、成虫期キノコ体で特異的に発現しており、かつ、ショウジョウバエの嗅覚記憶の維持に必要であること、rgk1がシナプス領域に特異的に局在していることなどを明らかにした。トランスジーンを用いた詳細な解析により、rgk1が記憶成分である麻酔感受性記憶ASM及び麻酔耐性記憶ARMの両方において重要な働きを有する因子であることを明らかにした。本研究により、Rgk1は、異なる強度を有している記憶成分の制御を介して嗅覚記憶の安定性を規定する、記憶維持機構における重要な分子ファクターであることが示唆された。Rgk1のputative GTPase domainに変異を導入したDominant-negative transgeneによるrescue実験を行った。その結果rgk1変異体の機能が回復しなかったことから、Rgk1のGTPase domainが記憶形成に重要であることが示唆される。rgk1変異体における微小な神経構造変化を検出するために、single cell markingにより樹状突起と軸索部位それぞれの長さと形態を調べた。軸索についてはsynapse marker(synaptotagmin-HA)を用いることでシナプル数の計測も行った。その結果、rkg1変異体のキノコ体gamma神経において異常伸張と、シナプス数の増加が観察された。rgk1変異体では記憶形成能が低減するためこのシナプスの増加は一見して相反するが、記憶形成においてはシナプスのturn overが重要であることを考えると、rgk1変異体においてはこのサイクルに異常があり、本来消失すべきシナプスが除去されずに残っているという仮説が成り立つ。rgk1変異体において、蛹期の腸における老廃物が異常集積していることが確認された。腸の収斂運動ではGPCR経路、cAMP経路等の関与が重要であり、rgk1が関与する分子機構を解明する上で一つの手がかりとなる。キノコ体における遺伝子発現プロファイルの結果と、これまでに得られたrgk1に関する表現系(記憶形成異常の他、過剰発現体における羽の伸展異常、腸内老廃物の除去異常)をもとに、選択的な変異体スクリーニングを行い、rgk1と相互作用する遺伝子の探索を行った。これまでに68系統について記憶形成を調べた結果、G-protein, cAMP経路、長期記憶に関与する因子など5遺伝子について相互作用が示唆された。ドメインを欠いたrgk1 transgeneによるrescue実験などから、Rgk1はN末部位依存的にシナプスへ移動し、それが強固な記憶の形成に必要であることがこれまでにわかっている。本年度はこの知見を軸として、Rgk1が神経細胞内で果たす役割について、分子的側面(相互作用する因子)と形態的側面(樹状突起と軸索の構造とシナプス数)から解析を行った。その結果、rgk1がシナプスの形成に直接関与していることを示唆するデータや、GPCR経路、cAMP経路との関連が示唆され、rgk1の機能についてより理解を深めることができた。一方で、キノコ体におけるrgk1のheterogeneousな分布様式を指標としたキノコ体を中心にした神経ネットーワークのクラス分けについては、これまでのところ確実な知見は得られていない。一部ドメインを欠いたRgk1配列にGFPを付加したコンストラクトを用いて、各ドメインがシナプスレベルでのRgk1の局在にどの様に働くのかを調べた。具体的には、Brp抗体で可視化したシナプスに対してGFP融合コンストラクトのシグナルがどの様に局在するのかを調べた。その結果、N末部位にあるドメインを欠いたRgk1は、野生型Rgk1で見られる様な凝集体が見られないことがわかった。次に、その凝集体がどこに局在するのかを、NMDARやDrep-2などのポストシナプスマーカーを用いて調べたところ、凝集体はポストシナプスには存在せず、プレシナプスのactive zoneに隣接した領域(peri-active zone)に局在する可能性が示唆された。これまでに、過剰発現させたRgk1によってRac依存的な忘却が抑制されることを示唆するデータが得られていた。そこで、内在的なRgk1が野生型において同様の働きを持つかどうかを調べるために、Racを恒常活性化させた個体で内在rgk1レベルを落とす実験を行った。その結果、内在rgk1レベルを下げるとRac恒常活性による影響がさらに強く見られるようになった。したがって、Rgk1はRac依存的な忘却を抑えることにより、記憶の維持に働いていると考えられた。これまでの成果から、rgk1がanesthesia-sensitive memoryとanesthesia-resistant memoryの両方を制御している可能性が示唆されている。そこで、それぞれのmemory componentに特異的に働くことが知られているrutabagaとdunce遺伝子の変異体を用いて、rgk1が記憶を制御する分子機構に属するかどうかを調べた。その結果、cold shock後の記憶において、rgk1変異体のスコアが、rutabagaとdunceの中間程度の値を示した。したがって、rgk1はこれら既知の経路とは独立に記憶を制御している可能性が示唆された。Rgk1の解析から得られた結果を論文としてまとめ、Journal of Neuroscience誌に投稿し、受理された。論文という形でこれまでの研究をまとめることができた。また、Rgk1のシナプスレベルでの局在とその制御について、一定の成果を上げることができた。

さらに、RacとRgk1との関連を裏付けるデータを得ることができ、Rgk1が属する分子機構について理解を深めることができた。一方で、Rgk1のシナプスにおける局在については、論文に含められる様な確かなデータを得ることができず、今後さらなる解析を必要とすることになった。ショウジョウバエ嗅覚記憶中枢であるキノコ体(mushroom body)における遺伝子発現解析により得られた情報をもとに特定した遺伝子Rgk1について、行動解析及び免疫蛍光染色によるたんぱく局在解析などを行い、この遺伝子Rgk1が、成虫期キノコ体で特異的に発現しており、かつ、ショウジョウバエの嗅覚記憶の維持に必要であることなどを明らかにした。最終年度においては、特にシナプスレベルでのRgk1の局在について、プレ及びポストの各種シナプスマーカーを用いた観察を行った。Rgk1のN末側領域の一部を欠損しているRgk1トランスジーン(Rgk1ΔN)ではASMが正常である一方ARMの形成に異常が見られるが、GFP融合トランスジーンを用いて、Rgk1ΔNのシナプス領域におけるタンパクの局在の観察実験により、正常なRgk1タンパクに見られるシナプスにおける特徴的な局在パターンが消失していることが確認された。なおASM及びARMは、嗅覚記憶を構成する記憶成分である。当該実験により得られた画像データを用いて、Rgk1の各種トランスジーンのシナプス近傍での局在パターンを定量的に解析し、シナプス近傍におけるRgk1の局在が、特定の記憶成分の形成・維持において重要な意味を有していることを示唆する結果を得た。また、Rgk1の各種変異体の嗅覚忌避行動、及び電気刺激反応性について定量解析を行い、Rgk1変異体ではこれらが正常であることを裏付ける結果を得た。したがって、Rgk1は嗅覚記憶に特異的に働いている因子であることがさらに示されることになった。本研究を通じて、Rgk1が記憶成分であるASM及びARMの両方において重要な働きを有する因子であることが明らかとなり、Rgk1が、異なる強度を有しているこれら記憶成分の制御を介して嗅覚記憶の安定性を規定する、重要な分子ファクターであることが示唆された。ショウジョウバエ嗅覚記憶中枢であるキノコ体における遺伝子発現解析をもとに特定した遺伝子rgk1について、成虫期キノコ体で特異的に発現しており、かつ、ショウジョウバエの嗅覚記憶の維持に必要であること、rgk1がシナプス領域に特異的に局在していることなどを明らかにした。トランスジーンを用いた詳細な解析により、rgk1が記憶成分である麻酔感受性記憶ASM及び麻酔耐性記憶ARMの両方において重要な働きを有する因子であることを明らかにした。本研究により、Rgk1は、異なる強度を有している記憶成分の制御を介して嗅覚記憶の安定性を規定する、記憶維持機構における重要な分子ファクターであることが示唆された。
TDP43及びFUSの細胞内局在制御因子の探索によるALSモデルと治療法の開発

マウス初代培養神経細胞に対してFUS遺伝子に対するshRNAをlentivirusを用いて導入し、FUS発現を抑制する系を構築し、イメージアナライザーにて神経突起伸長および突起の分岐数の変化を観察するとcontrolに比べ突起伸長および突起の分岐数の低下を認めた。FUSのターゲットの一つであるisoform (RD4)の発現をFUS抑制ニューロンで特異的に抑制するレスキュー実験を行うと、FUS抑制によって生じた突起伸長および突起の分岐数の低下が回復されることがわかった。以上のことから、タウのisoformであるRD4がFUSの機能喪失によるALSモデルの分子治療ターゲットになり得ることが推測された。TDP-43およびFUSを分化運動ニューロンに発現させた細胞モデルを最新のイメージアナライザによって細胞内局在を自動スキャンするシステムを開発と、TDP-43およびFUSの細胞内局在変化を生じさせるような薬剤のスクリーニング・システムの開発を目指し、NSC34細胞を分化させた後にイメージアナライザ(Arrayscan VTI system, Thermofisher社)を用いて解析する系を立ち上げた。この系ではわずかな神経突起伸長および突起の分岐数の変化をヒストグラムにすることで捉えることを可能にした。mouse primarycortical neuronおよびmouse primary motorneuronでFUS遺伝子に対するshRNAをlentivirusを用いて導入し、FUS発現を抑制する系を構築し、神経突起伸長および突起の分岐数の変化を観察するとcontrolに比べ突起伸長および突起の分岐数の低下を認めた。エクソンアレイを用いた網羅的なFUSのRNAターゲット探索より、FUSのターゲットの一つとしてタウの遺伝子のMaptのexon10 inclusionがFUS抑制により増加することが判明した。このexon10を含むisoform (RD4)の発現をFUS抑制ニューロンで特異的に抑制するレスキュー実験を行うと、FUS抑制によって生じた突起伸長および突起の分岐数の低下が回復されることがわかった。実際に、FUSをノックダウンするshRNAを誘導する系ではcontrolに比べ突起伸長および突起の分岐数の低下を認めた。同時に変異型FUSの過剰発現を誘導する細胞で検討を行うと、やはり変異FUSの過剰発現により神経突起伸長および突起の分岐数の減少を認めた。同様の系をmouse primary cortical neuronおよびmouse primary motorneuronでも構築して、現在イメージアナライザで解析を進めている。過剰発現系においては野生型のFUSやTDP-43でも発現量によって毒性を発揮することが判明したために、真に疾患に有効な薬剤スクリーニングのためにはより厳密な発現量コントロールが必要と考えられた。また局在変化については変異体による違いが大きいために、神経突起伸長および突起の分岐数の変化を指標にした神経細胞機能異常を指標にしたほうが正確な機能改善を捉えることができると考え、局在変化と同時に神経突起の計測によるスクリーニングシステムを開発中である。以上の理由から研究計画はやや遅れている。当初予定ではprimary neuronでの評価はスクリーニングの後に行う予定であったが、系がうまく立ち上がる可能性が高くなったので先にスクリーニングをprimary neuronで行うことを念頭に計画を進めていく。このことは株細胞での薬剤スクリーニングに比べて、よりin vivoに近い環境で神経機能やFUS, TDP-43の局在変化の検討をスクリーニングの段階から行うことができるメリットがある。また現在FUS、TDP-43 KOマウスを作成中であり、これらのprimary neuronを使用しlentivirusで変異体の発現を行うことで、発現量の調節が容易になりかつknock-inモデルに近い系を作成することができるので、その計画も追加し薬剤スクリーニングへと進む予定である。primary neuronとレンチウィルスを作成維持するための諸費用。コンパウンドスクリーニングに使用するLopac1280の購入費用など
魚類群集における反対称捕食の維持機構の数理生態学的研究

多くの魚類に右利きと左利きの遺伝的2形があり、捕食者が自分とは利きの違うほうの被食者を食べることによって維持されることを室内実験、野外標本の胃内容物調査、および数理モデルにより検証した。数理モデルによる検証により、雑食性(ギルド内捕食、最上位捕食者が中位捕食者だけでなく、最下位の餌生物も直接捕食すること)がある場合には右利きと左利きが共存しつつも、頻度が必ず振動することを明らかにした。これにより、異なる利きの被食者を食べることが新たな概念として学界で認められた(Nakajima, Matsuda, Hori 2004:American Naturalist)。ただし、名称は反対称捕食ではなく、cross predation(交差捕食と訳出)として認められた。すなわち、「捕食関係を通じた頻度依存淘汰という新しい分断性非対称の維持機構を新たな概念として定式化する」という「本研究の第一の目的」、ならびに「雑食が左右二型の頻度の安定性にどう寄与するかを明らかにする」という第2の目的を果たした。さらに、遺伝的浮動のある集団遺伝モデルによる解析も行った(Nakajima, Masuda, Hori印刷中)。また、室内実験ならびに胃内容物調査から、魚食性の魚の場合には交差捕食が100%ではなく、並行捕食(捕食者と被食者の危機が同じもの)が1/4程度含まれる例も明らかになった。さらに、利きの程度を定量化する試みもブラックバスなどを用いて進めており、左右性の進化に関わるモデル作りを継続して進めている。いくつかの魚類において,体が右か左に曲がる二型があることが報告され,これが分断非対称性の例とみなされ始めている.この左右二型は遺伝子,各種における右利きの頻度は0.5を中心に周期変動し,右利きの捕食者はおもに左利きの被食者を食べ,左利きの捕食者は右利きの被食者を食べる(交差捕食)ことが報告されている.われわれはこの交差捕食が左右二型の維持に有効な頻度依存淘汰をもたらす(右利きの捕食者が少数派になったとき,左利きの捕食者は被食圧が低く頻度が増え,結果的に右利きの捕食者が有利になる)と考え,捕食者と被食者の左右性を同寺院考えた数理モデルを解析した.その結果,被食者と捕食者の2種からなる左右二型の頻度変化は,たいへんゆっくりとではあるが,左右半々の定常点に漸近する.しかし,3栄養段階系を考え,最上位捕食者が中位も下位も捕食する雑食者の場合,3者は永久に振動し続けるリミットサイクルが現れることを数理モデルの安定性解析,存続可能性解析により見出した.それに対して,右利きの捕食者が右利きの被食者をより多く食べる(平行捕食の)雑食者がいる3種系の数理モデルでは,左右二型は維持されず,どちらか一方のみが存続するか,3栄養段階のうち中位もしくは上位捕食者が絶滅することが理論的に示された.本研究の成果をAmericanNaturalist誌に投稿し,先日受理通知が届いた.多くの魚類に右利きと左利きの遺伝的2形があり、捕食者が自分とは利きの違うほうの被食者を食べることによって維持されることを室内実験、野外標本の胃内容物調査、および数理モデルにより検証した。

さらに、遺伝的浮動のある集団遺伝モデルによる解析も行った(Nakajima, Masuda, Hori印刷中)。また、室内実験ならびに胃内容物調査から、魚食性の魚の場合には交差捕食が100%ではなく、並行捕食(捕食者と被食者の危機が同じもの)が1/4程度含まれる例も明らかになった。さらに、利きの程度を定量化する試みもブラックバスなどを用いて進めており、左右性の進化に関わるモデル作りを継続して進めている。
懐徳堂の和学の研究

懐徳堂の助教であった五井蘭洲による古典の注釈書、例えば、『古今通』や『勢語通』などを中心に、その和学の特徴、および学芸史上における意義について検討した。直接の影響を与えた契沖の注釈書、および地下歌人らの著作について考察し、従来、契沖から宣長へと一足飛びに論じられることの多い「上方学芸史」に、懐徳堂の和学、特に蘭洲の著作を加えることで、よりいっそう、その流れを具体に、精緻に把握することが可能になった。また、その結果、学芸史の埒外に置かれていた上田秋成の学芸について、再検討するべきことが、今後の課題として浮かび上がることになった。本年度は、五井蘭洲著古今集注釈書の『古今通』翻刻を継続して行い、さらにその注釈書を古今和歌集注釈史上に位置づけるべく、他の注釈書との比較研究、並びに伝本間の比較研究を行った。大部なものであるため、時間はかかったが、ようやく全体が見渡せるところまできた。その『古今通』の基盤には、契沖の学芸があり、特にその契沖の注釈方法について百人一首の注釈書を題材に検討し、論文としてまとめた(「契沖『百人一首改観抄』再考」)。当初の計画では、『伊勢物語』の注釈書である『勢語通』の研究も始める予定であったが、年度初めにコンピュータが壊れ、コンピュータなしに研究の継続は見込めないことから、やむなくコンピュータを購入した。当初の計画よりも物品費を多く使うことになり、結果として、調査のための旅費が十分に取れなかったため、伝本の十分な調査ができなかった。そのため大阪府立図書館所蔵の懐徳堂関係書籍の調査を中心に行った。活字化するにはさらに伝本の調査などを進める必要があるが、歌学を中心に様々なことについて、覚書風に記した、「雑纂」を翻字した。本年度も、昨年度引き続き五井蘭洲著の古今和歌集の注釈書『古今通』の翻刻を継続して行った。特に本年度は伝本によって大きく異なっている「仮名序」の部分を、伝本間の比較を行うとともに、他の注釈と比較し、その影響関係についても検討した。また、大阪府立中之島図書館に蔵せられている同じ蘭洲著の『古今序紀聞』についても翻刻するとともに、『古今通』との比較研究を行った。作業が年度末までかかってしまったため、発表には至っていないが、来年度には公刊したい。これらの作業を通して、ようやく『古今通』の『古今和歌集』注釈史上における位置づけが明らかになった。この点については、WEB上で公開予定の辞典の項目として簡略にまとめたが、研究論文としても発表することにしたい。『伊勢物語』の注釈書である『勢語通』についても、その内容検討を進めてきたが、2011年11月に片桐洋一氏蔵本と大阪大学懐徳堂文庫所蔵本が田中まき氏によって翻刻、刊行され(和泉書院)、今後は、この成果を踏まえての考察が必要となった。『詠歌大概』の蘭洲の注釈書である『詠歌大概紀聞』については、翻刻をはじめている。『古今通』の検討を通して、改めて、当時の古今伝授の具体の様相が課題として浮かび上がってきた。その点については、さかのぼって古今伝授そのものの意義を問う論文(「切紙とは何か-古今伝授「三鳥」をめぐって」)を発表した。本年度も、昨年度に引き続き五井蘭洲著の古今和歌集の注釈書『古今通』の翻刻を継続して行った。特に本年度は伝本によって大きく異なっている「仮名序」の部分について代表的な伝本である大阪府立中之島図書館蔵本・ノートルダム清心女子大学附属図書館正宗敦夫旧蔵本・国会図書館本・国文学研究資料館初雁文庫本の四本の対照翻刻し、刊行した(上方文化研究センター研究年報14号)。また、大阪府立中之島図書館に蔵せられている同じ蘭洲著の『古今序紀聞』『詠歌大概紀聞』についても翻刻はすませたが、ともに今のところ他に伝本が知られないため、本文に不審な点を残しているので、公刊には至っていない。今後の課題としたい。本年度は縁あって、「懐徳忌」で講演を行うこと機会を得た。この科学研究費の総まとめとして、「五井蘭洲の和学」と題して、講演した。加えて懐徳堂記念会の刊行する『懐徳』81号(2013年2月刊行)に「蘭洲の和学ー『古今通』をめぐってー」という論文を投稿し、審査のうえ掲載された。懐徳堂の和学を代表する五井蘭洲の和学について、『古今通』を中心に、『勢語通』などとも比較検討し、その学の特徴や文学観について考察した。三年間の科学研究費の成果として、契沖から本居宣長へと一直線に記述されることの多かった従来の学芸史に新たな知見を加えることができたのではないかと思われる。

扱っている資料は、活字化されていないので、まず基礎研究として、翻字、本文の制定、注釈の必要がある。交付申請書に記載した資料の翻字については、ほぼ順調に進んでいる。『勢語通』については、新たな資料の翻刻が出てしまったため、その点を考慮する必要が出てきたが、それ以外の資料については、内容の検討も予定通り進めつつある。24年度が最終年度であるため、記入しない。今後も、当初の予定通り、『古今通』の四伝本を対照した翻字を進めるとともに、『詠歌大概紀聞』など、蘭洲の注釈書を翻字する。新たな課題として、蘭洲の和学に直接影響を与えた父・持軒のことや、持軒と交流のあった下河辺長流についても検討する必要がある。この点については、持軒関係の資料を探索しなければならないだろう。
熱産生蛋白サーモジェニンの卵細胞膜への発現を用いた電気生理的, 電子顕微鏡的研究

最初に5゚Cの寒冷および25゚Cの温暖馴化を施したラットの肩胛骨間の褐色脂肪組織を採取した。またアフリカツメガエル(Xenopus)を飼育し受精卵を採取した。次に採取した褐色脂肪組織より核酸分画を調製し、全リボ核酸分画よりミトコンドリアの非共役、熱産生蛋白サーモジェニンの相補的遺伝子の転写産物を精製した。またサーモジェニン遺伝子の転写産物のXenopus Oocyteへの注入を行い、共焦点レーザー顕微鏡で観察しつつパッチおよびホールセルクランプ法を適用し、Ca^<2+>感受性色素(fluo-3)でCa^<2+>濃度を、H^+勾配提示色素(アクリダイオレンジ)でH^+勾配を測定しつつK^+やCl^-電流を測定し、熱産生亢進時の非共役熱産生蛋白をめぐるイオン動態を明らかにする実験を進めた。さらにサーモジェニン遺伝子転写産物を注入発現させたXenopus Oocyteを凍結しその凍結切片を電子プローブX線微小部分析法に供し、非共役発熱蛋白の活動時の細胞膜および内膜系を介してのイオン、元素動態を明らかにした。同時にそのOocyteにサーモジェニンの標識(酵素および蛍光)抗体を注入し、一部のOocyteは免疫電顕用の固定包埋を行い、他の一部はそのまま共焦点レーザー顕微鏡で観察し、サーモジェニン発現の正確な位置関係を明らかにした。以上の実験より寒冷馴化ラットの褐色脂肪細胞はノルアドレナリンのαアゴニスト作用によって、Ca^<2+>をセカンドメッセンジャーとしてミトコンドリア内膜のサーモジェニンに作用し、そのH^+に対する透過性を上昇させ、非ふるえ熱産生を引きこすことが明かとなった。寒冷および温暖順化ラットを飼育し、その代謝機能を測定した後、褐色脂肪組織を採取した。またアフリカツメガエル(Xenopus)を飼育し、受精卵を採取した。次に採取した褐色脂肪組織より核酸分画を調製し、全リボ核酸分画よりミトコンドリアの非共役、熱産生蛋白サーモジェニンの相補的遺伝子の転写産物を精製している。またサーモジェニン遺伝子の転写産物のXenopus Oocyteへの注入を行い、共焦点レーザー顕微鏡で観察しつつパッチおよびホールセルクランプ法を適用し、Ca^<2+>感受性色素(fluo-3)でCa^<2+>濃度を、H^+勾配提示色素(アクリダイオレンジ)でH^+勾配を測定しつつK^+やCl^-電流を測定し、熱産生亢進時の非共役熱産生蛋白をめぐるイオン動態を明らかにする実験を進めている。さらにサーモジェニン遺伝子転写産物を注入発現させたXenopus Oocyteを凍結しその凍結切片を電子プローブX線微小部分析法に供し、非共役発熱蛋白の活動時の細胞膜および内膜系を介してのイオン、元素動態を明らかにしつつある。同時にそのOocyteにサーモジェニンの標識(酵素および蛍光)抗体を注入し、一部のOocyteは免疫電顕用の固定包埋を行い、他の一部はそのまま共焦点レーザー顕微鏡で観察し、サーモジェニン発現の正確な位置関係を明らかにしつつある。温暖および寒冷順化ラットを飼育し、その代謝機能を測定した後、褐色脂肪組織を採取した。またアフリカツガエル(Xenopus)を飼育し、Oocyteを採取した。

またサーモジェニン遺伝子の転写産物のXenopus Oocyteへの注入を行い、共焦点レーザー顕微鏡で観察しつつパッチおよびホールセルクランプ法を適用し、Ca^<2+>感受性色素(fluo-3)でCa^<2+>濃度を、H^+勾配提示色素(アクリダイオレンジ)でH^+勾配を測定しつつK^+やCl^-電流を測定し、熱産生亢進時の非共役熱産生蛋白をめぐるイオン動態を明らかにする実験を進めている。さらにサーモジェニン遺伝子転写産物を注入発現させたXenopus Oocyteを凍結しその凍結切片を電子プローブX線微小部分析法に供し、非共役発熱蛋白の活動時の細胞膜および内膜系を介してのイオン、元素動態を明らかにしつつある。同時にそのOocyteにサーモジェニンの標識(酵素および蛍光)抗体を注入し、一部のOocyteは免疫電顕用の固定包理を行い、他の一部はそのまま焦点レーザー顕微鏡で観察し、サーモジェニン発現の正確な位置関係を明らかにしつつある。ラットを寒冷および温暖馴化し、その代謝機能を測定した後、褐色脂肪組織を採取した。またアフリカツメガエル(Xenopus)を飼育し、受精卵を採取した。次に採取した褐色脂肪組織より核酸分画を調製し全リボ核酸分画よりミトコンドリアの非共役、熱産生蛋白サーモジェニンの相補的遺伝子の転写産物を精製した。またサーモジェニン遺伝子の転写産物のXenopus Oocyteへの注入を行い、共焦点レーザー顕微鏡で観察しつつパッチおよびホールセルクランプ法を適用し、Ca^<2+>感受性色素(fluo-3)でCa^<2+>濃度を、H^+勾配提示色素(アクリダイオレンジ)でH^+勾配を測定しつつK^+やCl^-電流を測定し、熱産生亢進時の非共役熱産生蛋白をめぐるイオン動態を明らかにする実験を進めた。さらにサーモジェニン遺伝子転写産物を注入発現させたXenopus Oocyteを凍結しその凍結切片を電子プローブX線微小部分析法に供し、非共役発熱蛋白の活動時の細胞膜および内膜系を介してのイオン、元素動態を明らかにした。同時にそのOocyteにサーモジェニンの標識(酵素および蛍光)抗体を注入し、一部のOocyteは免疫電顕用の固定包埋を行い、他の一部はそのまま共焦点レーザー顕微鏡で観察し、サーモジェニン発現の正確な位置関係を明らかにした。以上の研究を押し進めると共に、パッチおよびホールセルクランプ法、X線微小部分析法のデータの検討を行い、卵細胞膜および内膜系に発現した熱産生機構の本態を明らかにした。以上の研究成果を国内学会および国際学会で発表し、論文として国内外の専門誌に発表した。
微小超音波振動による血栓溶解療法に関する研究

超音波発振器の大型にし、使用周波数を20KHzとし、出力を1Watt以上とすればその先端の形状が3mm径と細くても十分な成果を得ることができ、試験管内にて実験的に作製した血餅、血栓を速やかに破砕した。一方、微小超音波発振子を臨床に用いるべく、径1mmおよび2mmの超音波発振子をセラミックにて作製した。この共振周波数を水中での微小気泡の拡散程度から判断し求めた.発振子固有の共振周波数がこの方法で得られたので,それ以外の周波数の効果は検討しなかった.発信音波の波形として正弦波形、矩形波、鋸状波の3種類を検討したが,水中の微小気泡の拡散程度から判断すれば正弦波形が最も効率が良さそうであった.電圧は過負荷にならない範囲で最大とした.この条件下では、試験管内の微小粒子に対しての音圧の影響を可視化でき、本法の臨床応用の可能性が示唆された。in vitroの検討として、輸血用採血バッグに保存の血液をトロンビンを添加して凝個血液を作成した.これに対し,現存の血栓溶解剤(ウロキナーゼ)血清中のFDPおよびD-dimerを経時的に計測した.その結果微小超音波振動を加えると,血栓溶解が促進される結果を得た.超音波発振器の大型にし、使用周波数を20KHzとし、出力を1Watt以上とすればその先端の形状が3mm径と細くても十分な成果を得ることができ、試験管内にて実験的に作製した血餅、血栓を速やかに破砕した。in vitroの検討として、輸血用採血バッグに保存の血液をトロンビンを添加して凝個血液を作成した.これに対し,現存の血栓溶解剤(ウロキナーゼ)血清中のFDPおよびD-dimerを経時的に計測した.その結果微小超音波振動を加えると,血栓溶解が促進される結果を得た.強力超音波を用いれば体外からの照射でも腎結石を破砕し得るので、急性心筋梗塞に対して冠動脈内血栓の破砕も超音波法にて可能と予想される。超音波発振器を大型にし、使用周波数を20KHzとし、出力を1Watt以上とすればその先端の形状が3mm径と細くても十分な成果を得ることができ、試験管内にて実験的に作製した血餅、血栓を速やかに破砕した。一方、微小超音波発振子を臨床に用いるべく、径1mmおよび2mmの超音波発振子をセラミックにて作製し、カテーテルを想定したflexible wireに装着したものを試作した。これに周波数として250KHzまたは500KHzの2種類、波形としては正弦波形、矩形波、鋸状波の3種類、作用様式を連続及び1秒毎の断続の2種類、電圧として50、100、250Vp-pの4種類を選び、その組合せにて水槽内にての出力を検定した。受信波は発振子よりの距離に応じて指数関数的に減少し、1mmの距離にても1mWattのパワーが得られたのみであった。種々の検討の結果100mWatt/cm^2のパワーを得るためには500KHz連続波駆動にて250Vp-pが必要であった。この条件下では、試験管内の微小粒子に対しての音圧の影響を可視化でき、本法の臨床応用の可能性が示唆された。しかし、長時間の作動にて発振子は発熱するようで、現在の発振子の作用効率が必ずしも良いとは言えず、発振子の形状を改良し、出力を上げ得る方策を検討し、さらに作動様式の再検討を行う必要がある。なお、実際の血栓に対する作用を検討するためには凝固血液の安定標本が必要であり、そのためにチャンドラ法で作製した血栓の安定性をトロンボブラストグラフを用いて検討中である。これに周波数として250KHzまたは500KHzの2種類、波形としては正弦波形、矩形波、鋸状波の3種類、作用様式を連続及び1秒毎の断続の2種類、電圧として50、100、200、250V_<p-p>の4種類を選び、その組合せにて水槽内にての出力を検定した。