hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
霊長類の作業記憶を制御する神経回路と神経活動の解明

本研究では、霊長類に特徴的な作業記憶の制御メカニズムを解明するため、マカク属サルの神経回路を操作する技術の開発を行った。申請者は、この問題に取り組むため、比較的長期の遺伝子発現を可能とするアデノ随伴ウイルスベクター(AAV)を用い、大脳皮質内において最長投射の1つであるサル背外側前頭前野と下側頭葉皮質TE野間において、GFPをマーカーとした遺伝子発現操作に成功した。更に、その応用として、シナプス情報伝達阻害分子であるテタヌストキシン(eTeNT)の誘導にも成功した。これら遺伝子発現誘導はドキシサイクリン(Dox)投与によって可逆的に制御されるよう設計されており、eTeNT誘導による可逆的かつ長期的な神経遮断の電気生理学的検証に研究は進んだ。しかし、TE野への手術ダメージが予想外に大きく、安定的かつ長期的な電気生理記録が困難であることが判明したため、作業記憶に重要であり、長距離でありながら投射が強く、手術ダメージが少なく済む左右半球の運動前野間の交連投射に標的を変更した。上述の投射特異的eTeNT融合GFP発現によって、実際に、運動前野背側前部間神経回路の情報伝達が操作されるかを電気生理学的に確認した。発現系をAAVによって導入した一側F7に刺激電極を挿入し、電気刺激によって神経活動を発生させた後、反対側F7に設置したECoG記録電極において下降した神経活動を検出した。この実験をDox投与前後で行い阻害の程度を比較検討した。結果、左右半球の運動前野間の交連投射における長距離神経回路において、情報伝達を遮断する事に成功した(現在論文作成中)。現在、論文を執筆中であり、研究期間内での出版は果たせなかったが、当初の目的である技術開発は達成された。今後は、開発した当該操作技術を作業記憶課題を訓練したサルへ導入し、霊長類の記憶制御メカニズム解明に繋げる予定である。29年度が最終年度であるため、記入しない。ヒトを含む霊長類の作業記憶は、広範な大脳皮質の中でも特に前頭葉が重要な役割を果たすことが多くのヒト脳損傷患者の心理学的研究、ヒト機能的磁気共鳴画像法、そしてサル脳の破壊実験によって示されている。その制御メカニズムとしては、前頭葉が投射を介して他領野の神経活動を制御するトップダウン制御が提唱されている。しかし、神経回路を直接操作する技術が霊長類で未開発なため、この仮説の検証は国際的に停滞している。申請者は、この問題を解決するため、ヒトと近縁であり、ヒト脳との構造的、機能的相同性が高く、ストレスに強いため困難な認知課題の訓練に耐えられ、侵襲実験が容易なマカク属サルを用い研究を行った。具体的には、比較的長期の遺伝子発現を可能とするアデノ随伴ウイルスベクターを用い、大脳皮質内で最長投射の1つであるサル前頭前野と下側頭葉皮質TE野間において、遺伝子発現誘導を1個体内で繰り返しon/offする試みを行った。結果、シナプス情報伝達阻害分子であるテタヌストキシンの誘導にも成功している。しかし、TEへの手術ダメージが予想外に大きく、安定的なECoG記録が困難であることが判明したため、より大脳皮質への手術負担の少ないことが予想される両側運動前野に標的を変更した。結果、左右半球の運動前野間の交連投射における長距離神経回路において、Tet-Onシステムの遺伝子発現系の導入と予備的成果であるが情報伝達を遮断する事に成功した。F7へ標的を変更した理由は、領野の大部分が脳表面に出ており手術が容易なことに加え、前頭前野領野間投射に特徴的な分散的な特徴を持ち、強い交連投射を有するため、操作技術開発に最適な領野と判断したためである。比較的長期の遺伝子発現を可能とするアデノ随伴ウイルスベクターを用い、大脳皮質内で最長投射の1つであるサル前頭前野と下側頭葉皮質TE野間において、遺伝子発現誘導を1個体内で繰り返しon/offする試みを行った。

これら遺伝子発現誘導はドキシサイクリン(Dox)投与によって可逆的に制御されるよう設計されており、eTeNT誘導による可逆的かつ長期的な神経遮断の電気生理学的検証に研究は進んだ。しかし、TE野への手術ダメージが予想外に大きく、安定的かつ長期的な電気生理記録が困難であることが判明したため、作業記憶に重要であり、長距離でありながら投射が強く、手術ダメージが少なく済む左右半球の運動前野間の交連投射に標的を変更した。上述の投射特異的eTeNT融合GFP発現によって、実際に、運動前野背側前部間神経回路の情報伝達が操作されるかを電気生理学的に確認した。発現系をAAVによって導入した一側F7に刺激電極を挿入し、電気刺激によって神経活動を発生させた後、反対側F7に設置したECoG記録電極において下降した神経活動を検出した。この実験をDox投与前後で行い阻害の程度を比較検討した。結果、左右半球の運動前野間の交連投射における長距離神経回路において、情報伝達を遮断する事に成功した(現在論文作成中)。現在、論文を執筆中であり、研究期間内での出版は果たせなかったが、当初の目的である技術開発は達成された。今後は、開発した当該操作技術を作業記憶課題を訓練したサルへ導入し、霊長類の記憶制御メカニズム解明に繋げる予定である。今後は、以下の2項目を達成するため電気生理学実験をメインに行う。1、サル大脳皮質神経回路の投射特異的操作技術の確立。上述の投射特異的eTeNT融合GFP発現によって、実際に、運動前野背側前部間神経回路の情報伝達が操作されるかを電気生理学的に確認する。発現系をAAVによって導入した一側F7に刺激電極を挿入し、電気刺激によって神経活動を発生させた後、反対側F7に設置したECoG記録電極において下降した神経活動を検出する。この実験をDox投与前後で行い阻害の程度を比較検討する。2、サル大脳皮質神経回路による高次脳機能制御メカニズムの解明。上記の技術確立をうけ、作業記憶評価課題であるウィスコンシンカード分類課題を長期訓練したサルに発現系を導入し、課題遂行中に電気生理学的解析と行動解析を行うことで、作業記憶の制御メカニズムを明らかにする。29年度が最終年度であるため、記入しない。
フランスにおける緊急発掘制度の発展と遺跡の整備活用

フランスでは、2002年2月の「国立予防考古学研究所l'Institut national de recherches archeologiques preventives」の発足後、この組織に属する考古学者がほぼ独占的に新規の発掘を行ない、情報と研究を独占しつつある。このため、この発掘管理体制の理解と、国立予防考古学研究所のメンバーとの研究上のつながりの構築の必要性が痛感されてきた。さらに、フランス各地における中世考古学研究の展開と現状を、現地調査に基づいて的確に把握するために、より広範な範囲での情報収集を目指した。今年度は、Archeologie medievaleを中心とする雑誌と研究書から得られる情報と同時に、2007年6月と2008年2月の2度にわたり、フランスでの現地調査を行い、フランスの中世考古学研究者からの情報の収集に努めた。その結果、依然として、法制度的にも国立予防考古学研究所を中心とした緊急考古学の発掘体制が継続し、大学研究者の考古学研究が停滞していることが確認された。しかし、そのなかで、緊急発掘後の重要史跡の保存と社会的な面での活用に関しては、各地の地方自治体が、主として、観光資源の整備と地元アイデンティティーの確立という観点から、規模や技術レヴェルの差はあれ、積極的に取り組んでいることを知った。その代表例は、ロワール地方のシノンの中世城砦遺跡であり、ここでは、丘のうえに残る中世城砦跡の復元が積極的に行われ、史跡としての様相が一変しつつあった。復元した遺跡の一部に建てられる予定の建物には、国際的な規模の行事などが行われるようなホールが含まれている。またサン・ズザンヌやランジェの中世中期城砦の内部壁面に新しく、ロッシュ城に設けられている鉄製階段をモデルにした、最上層まで上るための階段が設置されて、3層ないし4層構造からなる、この時期の城砦の構造を非常によく理解することが出来るようになっていた。このような自治体が主導する中世考古学遺跡の整備は、今後とも積極的に行われていくであろうことが予想される。
構造体触媒による反応場の創出

本班は、充填層型触媒反応器に代わる新しい反応場として、ナノ-マイクロ反応場である触媒とマクロ反応場である反応器が一体化した構造体触媒反応器の開発を目的としている。具体的には、触媒と反応器で構成される反応場をシステムとしてとらえ、反応場、伝熱場、および分離場の集積化を図ることによって、伝熱促進、反応分離、および活性種制御の向上を目指している。この目的を達成するために、(1)反応器内壁に活性金属成分を担持したプレート型触媒により熱伝達機能を付与した反応場を創出するグループ(五十嵐、亀山)、(2)各種の選択透過膜分離膜により分離機能を付与した反応場を創出するグループ(増田、草壁、上村)、(3)電気化学的酸素透過膜を用いて触媒上に生成した活性酸素種を制御することによる炭化水素などの選択酸化反応場を創出するグループ(山中、竹平)、の3つのサブグループを編成し、上述の課題に取り組んだ。その結果として得られた成果は、新しい反応場である構造体触媒反応器の学理のための基盤の構築に寄与したと考えられる。さらに、工業的には、水蒸気改質法による水素製造、メタノールからオレフィンの選択的合成、一酸化炭素の高効率酸化、二酸化炭素の一酸化炭素への転化と炭化水素の脱水素の同時制御、またアルケンやアルカンなどの部分酸化などのために新規な手法を提案したと考えられる。さらに、本班の共通概念である構造体触媒についての相互理解を深めるために、平成15年度は「構造体触媒の体系化」に関するミニシンポジウムを開催した。また、平成14年度に行なった本班と他の班の班員による3件の共同研究に引き続き、平成15年度は5件の共同研究を実施し、構造体触媒からのアプローチによる触媒分子反応工学の基盤の構築に努めた。以上、初期に掲げた「構造体触媒を用いた反応工程の高度化」なる目標が、本班の研究活動によって十分に達成できたと考えられる。触媒と反応器で構成される反応場をシステムとしてとらえ,熱移動や物質移動の最適化を行うために,高伝熱性プレート型触媒反応器,透過膜型メンブレンリアクター,および電気化学的メンブレンリアクターなどの触媒と反応器が一体化した構造体触媒反応器の開発のための要素技術の蓄積と技術基盤の構築を図り,新しい反応場を創出することを目的とした。具体的には,以下の3つのサブグループを編成し,上述の課題に取り組んだ。(1)プレート型触媒により熱伝達機能を付与した反応場の創出下記のテーマのもとに,反応器内壁に触媒を担持させることによって熱伝達機能を付与した反応場の創出に努めた。・水素の関与する吸・発熱反応のためのプレート型触媒反応器の開発・熱交換型アルミニウム構造体の触媒化と高伝熱性触媒反応器への応用(2)各種の透過膜により分離機能を付与した反応場の創出下記のテーマのもとに,各種分離膜を用いることによって分離機能を付与した反応場の創出に努めた。・物質移動のベクトル制御が可能なゼオライト触媒膜を用いた逐次反応の中間体選択生成・一酸化炭素の高効率酸化のための多孔質無機触媒膜の開発・選択的水素透過型分離膜反応器の開発と炭素循環制御(3)電気化学的透過膜により活性種を制御した反応場の創出下記のテーマのもとに,電気化学的酸素透過膜を用いて触媒上に生成した活性酸素種を制御することによる炭化水素の選択酸化のための反応場の創出に努めた。・隔膜セルを用いた反応分離型触媒による部分酸化活性の制御・炭化水素部分酸化のための酸素選択透過膜型反応器の開発その結果,初年度である今年度の研究は,ほぼ予定通りに進行した。来年度は,それぞれの研究項目について,より以上に深化させたい。本班では、触媒と反応器で構成される反応場をシステムとしてとらえ、熱移動や物質移動の最適化を行なうために、高伝熱性プレート型触媒反応器、透過膜型メンブレンリアクター、および電気化学的メンブレンリアクターなどの触媒と反応器が一体化した構造体触媒反応器の開発のための要素技術の蓄積と技術基盤の構築を図り、新しい反応場を創出することを目的としている。具体的には、以下の3つのサブグループを編成し、上述の課題に取り組んだ結果、各課題についてほぼ予定通りの成果が得られた。(1)プレート型触媒により熱伝達機能を付与した反応場の創出(五十嵐、亀山、増田)(2)各種の透過膜により分離機能を付与した反応場の創出(草壁、上村)(3)電気化学的透過膜により活性種を制御した反応場の創出(山中、竹平)さらに、本班においては、ミクロレベルの触媒活性点の性能を装置レベルで最大限に引き出せる合理的な触媒反応プロセスの構築に向けて、「構造体触媒を用いた反応工程の高度化の提案」が目標になると考えられる。そこで、本班の共通概念である構造体触媒についての相互理解を深めるために、以下の3回の班内シンポジウムを開催した。(1)「ナノ-マイクロ構造性空間を利用した触媒反応プロセス」(9月、東京)、(2)「構造体触媒の可能性」(11月、名古屋)、(3)「構造体触媒による反応工程の高度化の可能性」に関するシンポジウム(1月、八戸)。来年度は最終年度であるので、それぞれの課題について深化を図るとともに、今年度に開催したシンポジウムを基に構造体触媒についての概念の統一化に努める。

具体的には、触媒と反応器で構成される反応場をシステムとしてとらえ、反応場、伝熱場、および分離場の集積化を図ることによって、伝熱促進、反応分離、および活性種制御の向上を目指している。この目的を達成するために、(1)反応器内壁に活性金属成分を担持したプレート型触媒により熱伝達機能を付与した反応場を創出するグループ(五十嵐、亀山)、(2)各種の選択透過膜分離膜により分離機能を付与した反応場を創出するグループ(増田、草壁、上村)、(3)電気化学的酸素透過膜を用いて触媒上に生成した活性酸素種を制御することによる炭化水素などの選択酸化反応場を創出するグループ(山中、竹平)、の3つのサブグループを編成し、上述の課題に取り組んだ。その結果として得られた成果は、新しい反応場である構造体触媒反応器の学理のための基盤の構築に寄与したと考えられる。さらに、工業的には、水蒸気改質法による水素製造、メタノールからオレフィンの選択的合成、一酸化炭素の高効率酸化、二酸化炭素の一酸化炭素への転化と炭化水素の脱水素の同時制御、またアルケンやアルカンなどの部分酸化などのために新規な手法を提案したと考えられる。さらに、本班の共通概念である構造体触媒についての相互理解を深めるために、平成15年度は「構造体触媒の体系化」に関するミニシンポジウムを開催した。また、平成14年度に行なった本班と他の班の班員による3件の共同研究に引き続き、平成15年度は5件の共同研究を実施し、構造体触媒からのアプローチによる触媒分子反応工学の基盤の構築に努めた。以上、初期に掲げた「構造体触媒を用いた反応工程の高度化」なる目標が、本班の研究活動によって十分に達成できたと考えられる。
溶媒和状態の緩和と再配向

(1)9,9'ービアントリル(BA)の構造変化と電荷分離過程:BAは基底状態では2つのアントラン間の相互作用はなく、互に直交した構造であるが励起状態では少しねじれた構造が安定となる。励起状態における構造変化に要する時間を時間分解レ-ザ-分光法により直接実測した。測定結果は溶媒の粘度への依存性が極めて少く、通常考えられている粘度の逆数に対する依存性は観測されなかった。この結果は、余剰振動エネルギ-を持った状態からの緩和過程として解析する必要があると考えられる。更に、極性溶媒中における電荷分離過程は、上に述べた分子内構造変化と競合していることを時間分割吸収スペクトルの測定により確認した。(2)分子内ドナ-(D)、アクセプタ-(A)化合物の光誘起電子移動過程と溶媒和過程:電子移動に関するDーA間相互作用の弱い場合からかなり強い場合まで種々の分子内DーA化合物の励起状態における電子移動速度の時間依存性を正確に調べた。励起状態で完全な一電子移動する系においても、電子移動速度が時間とともに変化することを種々の溶媒中で見出した。この結果は、溶媒を連続誘電体として取り扱うモデルでは説明できず、ミクロな溶媒和状態が不均一であり、配向緩和時間が溶質からの距離或は溶媒和状態の分布に依存して変化していると考える必要がある。一方、電子移動により生成したイオン対状態の溶媒和過程は、現在のところ通常の誘電縦緩和時間に支配されている結果を得た。(3)動的ホ-ルバ-ニングスペクトルの測定による溶媒の配向緩和過程:アルコ-ル溶媒中のレ-ザ-色素の過渡スペクトルの測定により、基底状態と励起状態における非平衡分布の緩和過程を直接観測した。溶質の大きな構造変化を含まない単純な系における溶媒の不均一分布の緩和過程は、通常の配位座標上の緩和として定性的に説明することができた。
墳墓出土赤色顔料の分析方法に関する基礎的研究-試料の採取、調整、作製について-

平成10年度は、大分県玖珠町陣ヶ台遺跡、福岡県苅田町岩屋古墳群にて試料採取、佐賀県鳥栖市安永田遺跡、兵庫県向山古墳群出土試料については各教育委員会より提供を受ける。各遺跡での赤色顔料出土状況に見合うサンプリング方法、分析方法の検討、遺骸に施す2種類の赤色顔料の在り方、試料の外観色と成分の関係などを特に調査した。平成11年度は、大分県宇佐市川部高森遺跡、福岡県大刀洗町甲条神社遺跡、福岡県春日市立石遺跡出土試料については各教育委員会より提供を受け各遺跡での赤色顔料出土状況に見合うサンプリング方法、分析方法の検討、墳墓に伴う祭祀遺構から出土する土器に付着残存する赤色顔料についても調査検討をおこなった。平成12年度は、大分県宇佐市別府遺跡、大分県大分市玉沢条里遺跡にて試料採取、熊本県天水町天水大塚古墳については町教育委員会より提供を受ける。本研究は、各教育委員会の協力を得て、墳墓発掘調査現場での赤色顔料試料採取とその整理方法および分析試料の作成方法のマニュアル化を目指すものであったが、3年間の調査研究により、遺骸に施す2種類の赤色顔料の在り方を十分把握するための試料採取・調整方法を確立する目途を得ることができた。出土赤色顔料についての一連の非破壊的調査は、単に遺物を壊さないで調査するということではなく、非破壊で調査する方が、より考古学的に有効な情報を読みとることができる可能性が高いことを示すものでもある。大分県玖珠町および宇佐市、福岡県苅田町、岡山県岡山市の各教育委員会の協力を得て、弥生時代から古墳時代の墳墓の発掘調査現場で赤色顔料のサンプリングを行い、採取方法および分析試料の作成についての検討を行った。玖珠町陣ケ台遺跡では、調査後破壊のため埋葬施設床面全面をブロック毎に採取し、赤色顔料の使い分け、拡散範囲などを明らかにした。苅田町岩屋古墳群は礫床なので、多数の地点からテープによるポイント採取を行い、赤色顔料の使い分けを想定することができた。宇佐市川部高森遺跡は史跡として整備保存するため、遺構に採取痕を残すことは避けなければならないので、少量づつ多数の地点からポイント採取を行った。しかし、従来より問題となっていた粘土枕と赤色顔料の状態については、シリンジによる柱状採取を行い、豊前地域の「石棺内面には朱、枕にはベンガラ」という赤色顔料の特殊な使い方を解明することができた。岡山市宗形神社古墳はすでに破壊され、当初の状態は不明であったが、数ヵ所の試料採取により2体埋葬の可能性が裏附けられた。以上の調査により、従来、石棺や石室等の埋葬施設に塗布された赤色顔料はメス等で削り取ることが多かったが、メンデイングテープを用いて赤色物を付着させ、顕微鏡観察や蛍光X線分析の試料とする方法が、遺構に傷をつけず少量のサンプルでも充分有効であることがわかった。また、埋葬施設床面のサンプリングはポリエチレンシリンジを用いて柱状試料を得る方法が有効ではあるが、遺構面に大きく穴を残すため検討が必要で、今後の課題であろう。これらの試料はポリエチレンチューブに脱気シールし、観察可能な状態で保管している。福岡県教育委員会および同県小郡市、大刀洗町、福岡市の各教育委員会の協力を得て、弥生時代から古墳時代の墳墓の発掘調査現場で赤色顔料のサンプリングを行い、採取方法および分析試料の作製をおこなった。特に、今年度は鉱物の顕微鏡試料に準じたものを作成し可否を検討する作業のうち、エポキシ樹脂に埋め込み固化した試料を顕微鏡試料作製装置を使用して研磨しプレパラート試料とする作業のルーチン化を検討した。昨年度に検討、開発した柱状サンプリング試料やブロック採取試料を包埋、固化した薄片試料とすることにより、墳墓床面の遺骸の腐朽や埋没に伴う時間的変化と思われる状況を詳細に観察することができた。

遺骸に施す赤色顔料は主として朱とベンガラの2種類であるが、この両者の施される場所と時間について少なからぬ情報を得るため、例えば頭胸部での朱とベンガラの関係(混じっているか、混じっていないか、離れているか、近接しているか)を中心に観察した。上記調査遺跡のうち大刀洗町甲条神社遺跡2次調査出土例において、頭胸部周辺の試料から、遺骸に直接施された朱と遺骸上半身全体に施されたベンガラとの位置関係の差を把握することができた。なお、今年度は顕微鏡試料作製装置のうち研磨器のみの設置であり、切断作業は手作業で行ったため時間的にやや無理があったが、来期は切断機は設置し作業の効率を上げ、さらに成果を増やしたい。福岡市育委員会、佐賀県教育委員会、大分県宇佐市教育委員会、佐賀県鳥栖市教育委員会の協力を得て、弥生時代から古墳時代の墳墓の発掘調査現場で赤色顔料のサンプリングを行い、採取方法および分析試料の作製をおこなった。特に、今年度は前年度までに行っている、鉱物の顕微鏡試料に準じたものを作成し可否を検討する作業のうち、エポキシ樹脂に埋め込み固化した試料を顕微鏡試料作製装置を使用して研磨しプレパラート試料とする作業のルーチン化について引き続き検討を重ねた。今年度は顕微鏡試料作製のための装置のうち、昨年度設置の研磨器についで切断機を設置したので前年度までよりは作業の効率が上がった。前年度までに検討、開発した柱状サンプリング試料やブロック採取試料を包埋、固化し薄片試料とすることにより、墳墓床面の遺骸の腐朽や埋没に伴う時間的変化と思われる状況を詳細に観察することができた。今年度は、特に上記調査遺跡のうち宇佐市別府遺跡調査出土例において、胸部周辺の試料から、朱が極めて遺骸に直接的に施された可能性を物語る石灰花と朱の状況を観察することができた。本研究は、各地教育委員会の協力を得て、墳墓発掘調査現場での赤色顔料試料採取とその整理方法および分析試料の作成方法のマニュアル化を目指すものであったが、3年間の調査研究により、遺骸に施す2種類の赤色顔料の在り方を十分把握するための試料採取・調整方法を確立する目途を得ることができた。
イミペネムに特異的な透過孔を形成する緑膿菌ポーリンOprD2の透過特性

緑膿菌は多くの抗生物質に耐性を示すことから病院内感染起因菌として問題である。しかしながら近年開発されたカルバペネム系(β-ラクタム剤)の薬剤は強い抗緑膿菌活性を示す。ところが間もなくイミペネム耐性菌が出現するようになった。イミペネム耐性菌の多くは外膜ポーリンprotein D2(D2)が欠損していることからD2はイミペネムの透過経路を形成していると考えられた。そこで本研究では緑膿菌外膜蛋白D2の透過特異性の研究を中心として緑膿菌における薬剤耐性の研究をし、その理解を助けると共に新しい薬剤開発に寄与することを目的とした。先ず取り組んだ研究はD2を平面脂質二重膜(黒膜)に組み込みD2を介しての単一チャンネル伝導度を計測することであった。この検定系を用いてD2とイミペネムの特異的会合を単分子レベルで明らかにしようとした。高度に純化されたD2を平面脂質膜の層に添加すると0.1M Nacl溶液中で約100pSの電気伝導度を示し、チャンネルは開閉を繰り返す。そこでこの状態の膜にイミペネムを添加すると、イミペネムの濃度が0.7mMより高くなるにつれてD2チャンネルの開の頻度が減少し、またチャンネル伝導度が低下することが明らかとなった。約4mMのイミペネムではD2チャンネルはほぼ完全に近く閉じた。このことはイミペネムがproteinD2チャンネルと結合したことを示すものである。同様の実験を別のカルバペネムであるDX8739を用いて行ったところDX8739はイミペネムよりもさらに低い濃度(1mM)でprotein D2チャンネルを閉じさせることが明らかとなった。これらの結果はカルバペネム抗生物質がproteinD2チャンネルと特異的に結合してこのチャンネルを介して細胞内に透過することを単分子レベルで証明したことになる。これで研究計画に記した実験は完全に成功を納めたことになる。緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)は一般に抗生物質に対して自然耐性である。ところが低分子カルバペネム(イミペネム)はこの菌に対して強い抗菌活性を示す。本研究ではこのイミペネムの抗菌活性に係わる外膜透過性の研究を行った。緑膿菌外膜からイミペネム透過性に係わると考えられているproteinD2(OprD2)の高純度に精製しておき、これを人工平面脂質二重膜に再構成すると塩溶液の中でチャンネル活性(電気伝導度)を測定することができる。この方法によってOprD2の単一分子のチャンネル活性をdiphytanoyl phosphatidyl choline(DDPC)膜を用いて1MNaCl中で測定すると訳40pS(pico siemens)の伝導度を示した。この伝導度を示すような大きさのチャンネルを会してはとうていイミペネムが透過できるとは考えられない。そこでこのOprD2チャンネルの大きさを変化させるような物質を検索したところDPPC膜に少量(約5%)のリポ多糖(LSP)を添加すると効果があることがわかった。DPPC+LPSの膜を用いた1MNaCl中でのOprD2のチャンネル活性は約40pSであると計算された。この大きさの孔を介してイミペネムは透過するものと解釈できる。

OprD2がDPPC膜とDPPC+LPS膜において各々に約40pSと400pS伝導度を示したということは前者はOprD2が閉の状態に、また後者は開の状態にあるものと解釈できる。それではOprD2チャンネルは開閉する機能が備わっているかという疑問が残る。DPPC+LPS膜にOprD2を組み込み電極の極性及び電圧(ポテンシャル)を変化させる実験を行なうと負の電圧をかけたときにOprD2チャンネルは開の状態(つまり伝導度が大である)が長続きするか、もしくは開の状態の頻度が大であることが明らかとなった。このようにイミペネムの透過チャンネルを形成するOprD2は開閉機構を備えたチャンネルであるという興味ある知見が得られた。別の研究としてはイミペネム耐性菌ではOprD2蛋白が欠損するメカニズムの研究を行った。その結果イミペネム存在下ではOprD2遺伝子に欠失変異が起こることが明らかとなった。緑膿菌は多くの抗生物質に耐性を示すことから病院内感染起因菌として問題である。緑膿菌が問題となるのはこの菌の外膜を介して抗生物質の透過性が悪いことにある。緑膿菌に強い抗菌活性を示すイミペネムに対する耐性菌の多くは外膜ポ-リンproteinD2(D2)が欠損している。そこで本研究では緑膿菌外膜蛋白D2の透過特異性の研究を中心として、抗生物質の膜透過性のメカニズムを明らかとすることを目的とした。平面脂質二重膜を0.1MNaCl中で形成し、これに高度に純化されたD2を添加すると約100pSの電気伝導度を示し、チャンネルは開閉を繰り返す。そこでこの状態の膜にイミペネムを添加すると、イミペネムの濃度が0.7mMより高くなるにつれてD2チャンネルの開の頻度が減少し、またチャンネル伝導度が低下することが明らかとなった。約4mMのイミペネムではD2チャンネルはほぼ完全に近く閉じた。このことはイミペネムがproteinD2チャンネルと結合したことを示すものである。次にD2のイミペネムに対する特異性がどの様に決定されているかを考え、もしかしたら蛋白分解酵素と同じような作用ではないかと考えた。そこで高度に精製されたD2をプロテアーゼ基質と混合して基質の分解を調べたところD2は活性は弱いもののセリンプロテアーゼ活性を有していることがわかった。チャンネル蛋白質に酵素活性が発見されたのはこの例が世界で初めてである。これらの結果はカルバペネム抗生物質の細胞膜透過性のメカニズムを明らかとしたのみならず、D2蛋白質の基質特異性決定のメカニズム、及び機能を解明したものである。
ファブリー病酵素補充療法の確立

1、改変体酵母によるα-ガラクトシダーゼの大量発現と精製法の確立酵母(Pichia pastoris)遺伝子相同組み換えベクター(アルコール酸化酵素プロモーターを持つ分泌型)に、α-ガラクトシダーゼcDNAの挿入をおこなった。このベクターを用いた遺伝子相同組み替え・クローニングをおこない、α-ガラクトシダーゼcDNAを染色体上にもつ酵母株を得た。α-ガラクトシダーゼの発現には、酵母のメタノール資化性を利用し、発現酵素の精製には、2段階のカラム・クロマトグラフィーからなる簡便かつ有効な方法を確立した。さらに組み換え体酵母株の大量培養をおこない、精製酵素標品のストック作製をおこなった。2、細胞による発現α-ガラクトシダーゼ取り込みの検討Pichia属酵母の糖鎖の特徴は、ホスホ・マンナン骨格の含量が高いことである。得られたα-ガラクトシダーゼの糖鎖部分に対し、α-マンノシダーゼによるトリミングをおこない、ホスホ・マンナン部分(リン酸化マンノース)の露出を試みた。次に、糖鎖改変による、細胞内への取り込み効率を検討するため、ファブリー病患者由来の培養ヒフ線維芽細胞(酵素欠損)を用い、発現α-ガラクトシダーゼの添加実験をおこなった。1)α-ガラクトシダーゼcDNAを組み込んだ改変体酵母の作製酵母(Pichia pastoris)遺伝子相同組み換えベクター(アルコール酸化酵素プロモーターを持う分泌型)に、α-ガラクトシダーゼcDNAの挿入をおこなった。遺伝子相同組み替え操作に続くクローニングにより、α-ガラクトシダーゼcDNAを遺伝子にもつPichia株を得た。この場合、コロニーのピック・アップ、それに続く小スケールの増菌培養をおこない、培地中に発現したα-ガラクトシダーゼ活性を蛍光基質により特定した。また、細胞による取り込み効率を規定すると考えられる糖鎖改変と並行して、α-ガラクトシダーゼC末端に、細胞接着分子インテグリン・ファミリーに対する結合リガンドであるトリペプチド・タグ(Arg-Gly-Asp)を付加した改変体の作製もおこないつつある。2)改変体酵母によるα-ガラクトシダーゼの大量発現と精製法の確立クローニングにより得られた、組み換え体Pichia株の大量の培養をおこない、発現α-ガラクトシダーゼの簡便な精製法を確立した。3)細胞添加による取り込みの検索発現により得られたα-ガラクトシダーゼを用い、ファブリー病患者由来の培養ヒフ線維芽細胞(酵素欠損)による取り込み効率の検討を進めている。
c-myc遺伝子転写抑制因子のスプライシングによる発癌解析と癌治療法開発

近年の研究により多くの癌で遺伝子のスプライシング変異が高頻度に起こっていることが明らかとなった。本研究ではc-myc遺伝子転写抑制因子FIRが消化器癌組織で高発現しており、その原因がFIR遺伝子自身のスプライシング変異によるものであることを手がかりに、癌における遺伝子のスプライシング変異の意義やその原因について検討した。FIRの発現を各種癌組織で調べることは、このような新規薬剤の抗癌作用や副作用の予測に応用可能であると考えている。本研究は我々が10年来行ってきたc-myc遺伝子転写抑制因子FIR(FUSE-Binding Protein-Interacting Repressor)の発癌への関与および食道癌に対する重粒子線治療の臨床研究から得られた結果に基づき独創的で新規性の高い食道癌遺伝子治療法を開発することを目的とする。多くのヒト癌では癌遺伝子c-mycが発現増大している。FIRはc-myc遺伝子の転写抑制因子である。我々は(1)食道癌、大腸癌をはじめとする消化管癌ではFIRのスプライシングバリアントが発現し、正常型FIRのc-myc遺伝子転写抑制が拮抗阻害されc-mycが発現増大していること、(2)FIRによりc-myc遺伝子を発現抑制された細胞では細胞死が誘導されること、(3)従ってFIRによる細胞死誘導効果は癌治療に応用可能であることを報告してきた。一方、千葉大学医学部附属病院では切除不能食道癌に対する世界初のp53Adenovirus vectorを用いた遺伝子治療を行い、5年以上の長期生存例を得ている。現在までFIR Adenovirus vector単独の癌治療効果は動物実験で確認済みである。さらに最近では重粒子線照射((独)放射線医学総合研究所:千葉市との共同研究)を併用することにより食道癌の治療成績を向上させようとする臨床試験が開始されている。FIRは「c-Mycで発現誘導されるDNA修復蛋白の発現を抑制することにより重粒子線によるDNA損傷の修復を遅延させる可能性がある」との実験結果が得られており、重粒子線とFIR遺伝子を併用した治療効果の高い消化管癌遺伝子治療法の開発についてもあわせて報告する。本研究ではAdenovirus vectorのみならず、本邦が特許を有するSendai virusvectorを用いたFIR遺伝子治療の開発も同時に行っている。本研究の目的のためには、関連特許の取得が必須である。我々はFIRに関する特許を千葉大学知財本部経由で科学技術振興事業団より申請し韓国特許は成立した。米国、中国、欧州、日本に審査請求中である。我々は(1)食道癌、大腸癌をはじめとする消化管癌ではFIRのスプライシングバリアントが発現し、正常型FIRのc-myc遺伝子転写抑制が括抗阻害されc-myc発現増大していること、(2)FIRによりc-myc遺伝子を発現抑制された細胞では細胞死が誘導されること、(3)従ってFIRによる細胞死誘導効果は癌治療に応用可能であることを報告してきた。一方、千葉大学医学部附属病院では切除不能食道癌に対する世界初のp53 Adenovirus vectorを用いた遺伝子治療を行い、5年以上の長期生存例を得ている。本研究ではAdenovirus vectorのみならず、本邦が特許を有するSendai virus vectorを用いたFIR遺伝子治療の開発も同時に行っている。
癌転移に関与する細胞側要因の解析

過去3年の成果として、転移にかかわる因子のいくつかについて相互の関連が明らかになった。先ず、転移の初期過程に関与すると思われる細胞接着因子カドヘリンについては、それと細胞内で結合するCAP102蛋白の遺伝子がクロ-ニングされ、またsrcによる癌化、fosによる転移性の上昇に伴うCAP102リン酸化と接着機能の低下が示された(竹市、永渕)。膜受容体erbB2遺伝子の発現は癌の悪性度と相関するが、エストロゲンE2はこの蛋白に結合し、自己リン酸化を促進することが明らかとなった(松田)。src導入で転移性の上昇するマウス変異細胞株は、新たに同定された膜受容体のリン酸化に関する変異体であることがわかった(榎本)。原発巣からの離脱にかかわると思われる細胞運動因子リセプタ-が同定され、また細胞外マトリックス受容体の結合機構が明らかになった(渡辺、長井)。膜蛋白の機能は細胞骨格と密接に関連するが、転移抑制作用をもつβmアクチンのアクチンケ-ブル形成への関与と、転移能上昇に伴う蛋白合成に関与するEF1αレベルの上昇が明らかになった(谷口)。血小板凝集には3つの機構があるが、腫瘍細胞の血流中での塞栓形成には41kdの膜蛋白が関与することが示された(杉本)。組織特異的転移に関しては、homing receptorであるセレクチンに結合すると思われる61kdの糖鎖抗原が同定された(村松)。細胞の挙動を直接的に規定するこれらの因子の他に、癌細胞の遺伝的不安定性と、それを促進する腫瘤微小環境腫の役割が明らかにされた(丹羽、横路、武市)。臨床面ではヒト悪性黒色腫について表面抗原に対するアンチイデイオタイプ抗体による治療が試みられた(三島)。以上、これまで明確でなかった転移に関与する諸因子の相互の関連、および転移の各段階との関連が位置づけ得る状況となってきた。また、癌細胞の個々の行動を支配する因子以外に、癌細胞の内的あるいは炎症巣での変異しやすさが重要な意味を持つことが示された。
男女共同参画社会における男女共学化、共修化の研究

本研究では、日本が男女共同参画社会をめざすためには、男女共学、共修がどのように実施されるべきかについて、高校を対象に分析検討を行った。男女共学、共修は男女平等教育にとって必要な基礎的条件ではあるが、隠れたカリキュラムにおけるジェンダーに無自覚なまま共学、共修を実施しても、共学、共修がただちに男女平等教育には結びつかない。そのため、男女共学や共修の現状を明らかにしながら、男女平等をつくるための共学、共修とはどうあるべきなのかについて、以下の3つの調査領域における研究において析出した。1,福島県の男女共学化および共修の現状調査福島県は、男女共同参画社会の実現のための施策の一環として、長らく残っていた別学高校をすべて共学化した。その共学化実現過程や高校の現状について、聞き取りと観察および質問紙調査を組み合わせて分析、考察した。2,関西(大阪)の私立高校の共学化戦略と共学、別学の現状調査福島県とは対照的に公立高校はすべて共学だった大阪府では、私立高校が別学校を提供してきた。近年、共学化が進んでいる大阪の私立学校での別学、共学の経営戦略および生徒への質問紙調査によって、共学、別学の比較検討を行った。3,高校での体育共習の指導場面の観察調査男女共修の高校の体育の授業場面において、教師の声かけが生徒が男子か女子かで異なること、そこに教師のジェンダー観があらわれ、ジェンダーの利用と再生産が行われていることなどについて、授業観察の分析を行った。本研究では日本の男女共学政策の進行を歴史的に明確化した上で、男女共同参画基本法成立以降の男女共学化の潮流を分析する。現在の男女共学化は表面的には男女相互のコミュニケーションの促進と男女平等を目指したものであるが、実質的にはその実現のほど遠い。何がそれを促進もしくは阻害しているのか検討する。1.福島調査近年全県男女共学化を行った福島県の公立高等学校をフィールドに、男女共学化の過程、生徒、教員の意識など、聞き取り調査を中心に行った。予備調査として、男女共学過渡期に高校在籍していた福島出身大学生へ聞き取りを行った。また進学校と非進学校や学校種別、地域階層差を考慮し、県北地域進学校の教員への聞き取りと、県南非進学校の教員、生徒への聞き取りを行った。2.関西三都市調査戦後公立高校はすべて共学化された関西地方、とりわけ都市部(大阪、京都、兵庫)において、別学の私学が発展してきた経緯と現在進行している共学化の流れの社会機能を確認し、その功罪を男女平等の観点から分析する。まずは別学・共学状況の全体的把握のため学校組織・カリキュラム・教育目標等の収集整理を行うとともに、三都市の中等教育について各学校の社会的位置など歴史的に確認した。また、女子校・男子校の学校文化の実態にアプローチするため、別学経験者へ準定型の聞き取り調査を行った。3.高校体育調査男女共学校の学校体育に生起するジェンダー問題について、男女共学のなかで体育の選択制・男女共修が積極的に行われてきた京都府の高校をフィールドに参与観察、資料収集、聞き取り調査を行った。具体的に、体育での持久走の授業を観察することで、教師の期待と生徒の受け止め方の差異をジェンダーの視点から考察した。4.海外調査アメリカの大学や体育関連団体や施設、フランス、オーストラリアの高校や大学、ジェンダー関連施設などから男女平等(教育)に関わる資料を収集した。現在の男女共学化は表面的には男女相互のコミュニケーションの促進と男女平等を目指したものであるが、実質的にはその実現はほど遠い。何がそれを促進し、もしくは阻害しているのか検討する。1)福島調査:2004年度は福島県の公立高等学校(旧男子進学校、旧女子進学校、共学非進学職業高校など)に、男女共学化の過程、生徒、教員の意識などの聞き取り調査、授業・学校観察調査を行った。また調査対象校4校に、男女共学に関する質問紙調査を行った。

福島地方との比較対象として東京の私立高校(男子進学校、女子進学校、近年共学化した旧女子校など)の観察調査も行った。2)大阪私学調査:戦後、関西地方の公立高校はすべて共学化さたが、とりわけ都市部(大阪、京都、兵庫)において、別学の私学が発展してきた経緯及び現在進行している共学化の流れの社会的機能を確認し、その功罪を男女平等の観点から分析する。2004年度は大阪私立高校8校(共学校・別学校含む)に対し、学校関係者への聞き取り調査、資料収集、男女共学や男女平等に関する質問紙調査を行った。また、私学女子校の卒業生に対しても聞き取り調査を行った。3)高校体育調査:2004年度も引き続き、男女共学のなかで体育の選択制及び男女共習が積極的に行われてきた京都府の高校をフィールドにして、男女共学校の学校体育に生起するジェンダー問題について、参与観察、資料収集、聞き取り調査を行った。具体的に、持久走・マット運動・ハードルなどの授業を観察した。4)総合研究会を年間2回設け、各調査グループの交流、調査内容の検討、海外調査の報告・検討などを行った。1)福島調査:これまでに行った男女共学化の過程、生徒、教員の意識などの聞き取り調査、授業・学校観察調査簿記録を作成し、分析した。また調査対象校4校に行った男女共学に関する質問し調査の集計結果を分析した。2)大阪私学調査:これまでに行った大阪私立高校8校(共学校・別学校含む)の学校関係者への聞き取り調査、および資料の検討を通して別学の私学が発展してきた経緯および現在進行している共学化の社会的機能について検討した。また男女共学に関する質問し調査の集計結果を分析し、日本教育社会学会の大会において発表した。3)高校体育調査:これまでに行った京都の高校の体育授業の参与観察記録をまとめ、学校体育に生起するジェンダー問題について分析・検討を行い、スポーツとジェンダー学会の学会誌に発表した。4)フィンランドとドイツの視察調査を行った。学校空間で生徒に生起するジェンダーについてエスノグラフィによる研究を進めてきたヘルシンキ大学エリナ・ラッヘルマ教授らと研究討議した。またフィンランド、ドイツの学校を訪問し、男女共学の授業風景や学校施設などを査察、生徒や教職員に聞き取り調査を行った。その他、福祉施設等を訪問し、男女共学、性教育、ジェンダー問題等の資料を収集した。5)3年間の研究をまとめるため、関東と関西の各グループでの研究会、全体研究会を持ち、最終報告に向けての研究討議を行った。
単一細胞内における情報伝達物質の濃度変化を計測する細胞内蛍光センサーの開発

細胞は、外界からの刺激に応じて特異的なシグナルカスケードを活性化し、情報を伝えている。情報伝達分子の中でもInsPnは、細胞内Ca2+濃度を制御し、転写・翻訳等の応答を司る。個々のInsPnは、構造上僅かな違いがあるのみで、各々独立した機能を担っている。従って、これらInsPnの挙動を、生きた細胞内でリアルタイムに高感度で計測できる技術は、生命現象を理解する上で有用である。本研究では、各InsPnに対する人工受容体及びこれらを蛍光修飾したセンサーを構築し、細胞内InsPnの挙動を観察して、各InsPnの生体内での役割を明らかにした。生物の細胞内では、必要に応じて様々な情報伝達物質が産出され、その濃度を変化させる事で下流に情報を伝達している。情報伝達物質の中でも、イノシトールポリリン酸類(InsPn)は細胞内Ca2+を制御する分子群として重要だが、最も代表的なIns(1,4,5)P3やその代謝産物であるIns(1,3,4,5)P4以外の各誘導体の、生きた細胞内における検出手段は非常に限られている。本研究では、細胞内の様々なInsPnのうち、Ins(1,4,5)P3のすぐ下流で産出されるIns(1,3,4)P3とIns(1,3,4,6)P4に対して、その濃度挙動の経時変化を、生きた単一細胞内で、蛍光法を用いて高感度で検出できる技術を開発し、これらを用いて細胞内Ca2+制御の機構を明らかにすることを目的とする。標的物質であるIns(1,3,4)P3・Ins(1,3,4,6)P4と、他のInsPnの間には非常に僅かな差しかなく、各々に特異的な天然受容体は報告されていない。この差を見分けて選択的に検出する人工受容体の作製には、なるべくたくさんの受容体候補の中から、目的に合う分子を選び出す手法が適切であると考え、平成26年度はまず、7残基のアミノ酸ライブラリーの中から、Ins(1,3,4)P3に特異的に結合する配列をphage display法で選択することを試みた。5ラウンドの結合・洗浄による選択の後、Ins(1,3,4)P3に結合する分子種のプールが得られた。各配列の、標的に対する親和性・選択性については今後評価を行う。こうして得られた最適配列をIns(1,4,5)P3に特異的に結合する天然のタンパク質、PLCδ1 PH domainの基質結合部位周辺に導入することで、Ins(1,3,4)P3に特異的な人工受容体を作製する。同様の手法をIns(1,3,4,6)P4にも試みる。細胞は、外部からの刺激に応じて様々なシグナル伝達系を走らせ、その下流の細胞応答を制御している。中でも、イノシトールポリリン酸類(InsPn)は、細胞内Ca2+濃度を制御しており、転写・翻訳等を司っている。InsP3/Ca2+シグナルによる細胞内情報伝達は、広範囲な生物種において様々な生命現象に関与していることが報告されている。InsP3は細胞内で更に代謝されて、イノシトール四リン酸(InsP4)、イノシトール五リン酸(InsP5)などのInsPnが産出される。個々のInsPnは、各々が独立した機能・役割を持っていると考えられている。しかし、現況では生きた単一細胞内でのInsPn動態をリアルタイムにモニターするための手法が限られているため、細胞内での役割や産出・代謝経路は完全には明らかにされていない。細胞内InsPnを検出するためには、多数の細胞を集めて、そこから抽出して検出するしか定量的な解析方法が存在しないが、この手法は細胞の破壊を伴う上に時間的に連続した情報は得られない。また、検出される情報は多数の細胞の平均であり、必ずしも個々の細胞応答を反映していない。そこで本研究では、InsPnの濃度挙動の経時変化を、単一細胞内で、細胞を破壊する事なく、高感度に計測できる技術を開発を行い、このセンサーを用いて、InsP4の生理学的な意義の探索を試みた。まず、InsP3をInsP4に変換する酵素(IP3K)の新規阻害剤を見出し、そのInsP4産出阻害能を、作製したInsP4センサーを用いて評価した。次に、この阻害剤を処置した細胞に、細胞外からのCa2+流入を促す刺激を与えたところ、阻害剤処置がない場合と比較してCa2+流入が抑制されている傾向が観測できた。以上の結果から、InsP4が細胞内へのCa2+流入を制御する役割を担っていることが明らかとなった。

平成26年度はまず、本研究で標的物質としているIns(1,3,4)P3に対する人工受容体構築のために、Ins(1,3,4)P3に高選択的に結合する7残基のアミノ酸配列をT7 phage display系でランダムに提示させたライブラリーの中から選び出すことを試みた。7残基のアミノ酸を用いることで、理論上ライブラリーの多様性は20の7乗通りが確保できる。ライブラリーの準備は順調に進んだが、次の段階であるライブラリーからの目的アミノ酸配列の選択系の確立において、結合配列が既知のポジティブコントロールとして用いたビオチンに対する結合アミノ酸配列の選択について予想される結果が得られなかったため、詳細な条件の検討を行う必要が生じた。その後Ins(1,3,4)P3に対して結合する配列の選択を行い、目的分子種のプールを得た。次に、他のInsPnに結合する分子種を排する逆選択を行い、標的物質にのみ高選択的に結合する配列を選び出す予定である。当初の予定ではもう一つの標的物質であるIns(1,3,4,6)P4に対して結合する分子種も並行して選択する予定であったが、最適な選択圧条件を再検討するために別々に行うこととした。平成27年度においては、他の標的物質であるIns(1,3,4,6)P4に対する結合配列を選択する操作(選択系が確立済み)と、得られた配列からの人工受容体作製・蛍光発色団融合の操作を同時並行で行うことができる。その後、作製したセンサーの細胞内での評価を行い、立案段階当初の研究計画を研究実施年度中に達成できる見込みである。生体関連化学平成27年度は当初の計画通り、得られた配列から作製した受容体を蛍光発色団と融合させ細胞内で評価する。GFP付加型InsPnセンサーの作製には、遺伝子上でGFPのループ部位を切断し、作製したInsPn特異的な人工受容体を基質結合部位付近で二分割したものをそれぞれ付加する。この設計により、基質結合に伴う僅かな構造の変化が節動としてGFP発色団に伝わり、基質濃度依存的な蛍光強度の変化を測定できる。改変部位は、三次元結晶構造情報から、発色団形成や基質結合に影響のない残基を選ぶ。このセンサーは、遺伝子導入のみで非侵襲的に細胞内発現ができる。また、必要に応じて恒常的にセンサーを発現する株の作製も検討している。一方、蛍光分子修飾型センサーには、作製した人工受容体上で、基質との結合部位付近、かつ基質と直接相互作用しない残基を選び出す。この残基を遺伝子上でシステインに変異させ、チオール選択的に蛍光分子で修飾し、蛍光性センサーに変換する。このセンサーは更なる遺伝子操作なしで、細胞内に外から導入できる。導入する蛍光分子の種類や、蛍光分子導入残基を変えることで、ダイナミックレンジや検出波長の異なる様々な類縁体を作製予定である。このようにして作製した各センサーを用いて、蛍光顕微鏡で細胞内InsPn類を個別にリアルタイムに観察する。外部からの刺激に対し、各InsPnがどのような時間軸で、産出・代謝されるか定量的に計測する。また、蛍光特性の異なるセンサーを複数併用して、細胞内の同一の場所において各InsPnが互いに及ぼす影響の評価を試みる。神経・皮膚組織・免疫細胞など様々な細胞種を用い、さらには細胞内の各小器官への局在シグナルを付加し、細胞内部位特異的なInsPn産出を検出する。研究の進行上、ライブラリーからのセレクション系の確立に手間取り、標的分子に結合する分子種を得る過程が若干遅れた。そのため、得られた分子種の、標的分子に対する選択性・親和性を試験管内で評価するための標準試料とする競合各種InsPn、および得られた分子種を化学修飾するための各種蛍光試薬類について予算執行が遅れた。
デコイ核酸による炎症性疾患治療用炎症標的遺伝子ベクターの開発

リウマチ疾患においては、炎症部位において集積した活性化マクロファージから炎症性サイトカインが産生・分泌され、炎症が持続すると考えられる。炎症性サイトカインの発現には、転写因子であるNFκBが重要な役割をしており、炎症性サイトカインの発現を誘導する転写因子として働く。NFκBデコイ核酸は、NFκBと特異的に結合するオリゴDNAで、特異的にNFκBと結合して転写阻害作用を持つ。昨年度、葉酸修飾した非ウイルス性の炎症標的遺伝子ベクター(葉酸修飾ナノ粒子)を開発した。そして、NFκBデコイ核酸を活性化マクロファージに、葉酸受容体を介して選択的に導入できることを明らかにしている。今年度は、葉酸修飾ナノ粒子による抗炎症効果と安全性をin vitro及びin vivoで評価することを試みた。葉酸修飾ナノ粒子よりNFκBデコイ核酸を導入したマクロファージRAW264.7細胞では、核内へのNFκB移行を阻害できた。さらに、マクロファージ培養細胞を用いて葉酸修飾ナノ粒子の細胞毒性を評価したところ、葉酸修飾ナノ粒子は細胞毒性をほとんど示さなかった。in vivoでの評価のため、炎症性疾患モデル動物としてアジュバント誘導炎症モデルマウス(関節リウマチモデル)を作製し、葉酸修飾ナノ粒子を用いてNFκBデコイ核酸を患部に投与し、抗炎症作用を観察することを試みた。アジュバントにより誘導されたマウスの炎症部位をMRIで撮像し、治療効果の評価を行ったが、炎症部位をMRIで明確に判断することは難しく、明確な治療評価のためには血液中のTNF-αなどの炎症性マーカーの濃度測定が必要であると考えられた。炎症性疾患においては、炎症部位において集積した活性化マクロファージから腫瘍壊死因子(TNF-α)やインターロイキン等の炎症性サイトカインが産生・分泌され、炎症が持続すると考えられる。炎症性サイトカインの発現には、転写因子であるNFκBが細胞質で活性化されて核に移行することが必要である。NFκBデコイ核酸は、NFκBと特異的に結合する配列を含む2本鎖オリゴDNAで、特異的にNFκBと結合して転写阻害作用を持つことから、抗炎症核酸治療薬として期待されている。また、炎症性疾患患者から採取した活性化マクロファージにおいて葉酸受容体が存在することが報告されていることから、我々は葉酸修飾脂質微粒子を調製し、NFκBデコイ核酸を活性化マクロファージRAW264.7細胞に葉酸受容体を介し効率的に遺伝子導入できるかどうか評価を行い、炎症性疾患治療用炎症標的遺伝子ベクターとして使用できるかどうか検討を行った。脂質微粒子の組成として、正電荷脂質3([N(N'N'-dimethylaminoethane)-carbamoyl]cholesterol、Tween80、葉酸修飾polyethylene glycol脂質を用いて修正エタノール注入法により、約170nmの粒子径を有する葉酸修飾脂質微粒子(NP-F)を調製した。そして、NP-Fを用いて蛍光標識したNFκBデコイ核酸を、リポポリサッカライド(LPS)により活性化させたマクロファージ培養細胞に投与し、効率的にNFκBデコイ核酸が取り込まれているかどうかを共焦点レーザー顕微鏡により観察した。その結果、LPSによりマクロファージ細胞を活性化させることで、NP-FはNFκBデコイ核酸を高効率に細胞質に導入できることが明らかとなった。さらにNP-FによりNFκBデコイ核酸を導入したマクロファージ細胞の核内NFκB量を定量した結果、NFκBの核移行が阻害されていることも明らかとなった。以上の結果から、葉酸修飾脂質微粒子は、リウマチ等の炎症性疾患における活性化マクロファージへNFκBデコイ核酸を送達させるための抗炎症核酸医薬品として使用できる可能性が考えられた。