hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ナノ結晶水分散製剤の長期的な水分散安定性を確保できる方法論の解明と技術開発

本研究のテーマは、ナノ結晶水分散製剤の長期的な水分散安定性を確保できる方法論の解明と技術開発であり、平成30年度の研究目標は、水中でのナノ結晶成長の原因解明(分析と分類)であった。ある種類のステロイド系難水溶性薬剤は脂溶性の物質でナノ結晶表面をコーティングが可能で、それによりナノ結晶が水雰囲気から物理的に隔離され、水中での結晶成長が抑制されたと推測できる。特にこのナノ結晶の水中での結晶成長抑制は重要であるが、難水溶性薬剤の溶解度、分子構造、結晶構造、粒子サイズ・形態等の物性が強く関連していると推測される。その中で特に重要な物性は、対象化合物への水への溶解性であることはおよそ妥当な見解である。それに関連し、対象化合物分子の水への溶解性は、対象化合物分子の置換基や、結晶を形作る上で生じる分子間相互作用に強く依存するように思える。ただ普遍性あるこれらの同定と分類には十分には至っていない。また一方で分子の種類に寄らず、そのナノ結晶製剤の結晶成長を抑制できる技術は重要である。様々な種類のポリマーや分散安定剤の添加が有効に思えたが、あらゆる種類のナノ結晶製剤に万能な結晶成長抑制剤の発見には至っていない。対象化合物分子が有する本質的物理的性質(溶解度、結晶構造等)と分散安定剤等添加物の組み合わせの最適解があるように思えるが、現時点、双方を結びつけるような明快な答えを見出すには至ってない。これらのことを視野に入れ、平成31年度に研究を進める予定である。平成30年度の研究目標は、水中でのナノ結晶成長の原因解明(分析と分類)であった。特にナノ結晶の水中での結晶成長抑制は重要であるが、難水溶性薬剤の溶解度、分子構造、結晶構造、粒子サイズ・形態等の物性が強く関連していると推測される。その中で特に重要な物性は、対象化合物への水への溶解性であることはおよそ妥当な見解でり、また水への溶解性は対象化合物分子の置換基や、結晶を形作る上で生じる分子間相互作用に強く依存するように思える。しかしながら、水中でのナノ結晶成長の原因解明(分析と分類)については、まだ十分には至っていない。平成31年度に研究を進める予定である。ナノ結晶の水中での長期的な結晶成長を抑制するためには、これまでの申請者の研究成果および国内外の研究報告に基づくと、ナノ結晶表面を首尾よく被覆できる基剤を使用することが有望な方法論である。ただどのような基剤がナノ結晶水分散製剤の被覆に適しているかは十分に整理されておらず不明な点が多い。そこで様々な種類の被膜基剤をスクリーニング的にトライし、結晶成長抑制の観点から、様々な薬剤と様々な被覆基剤との有効な関係性を明らかにし分類・整理することで、水中でのナノ結晶成長を抑制できる実験事実に基づいた方法を明らかにし、知識化し技術化に結び付ける。達成目標として室温において3年間結晶成長が起こらないナノ結晶水分散製剤の開発を行う。実質、本長期間に相当する過酷試験を実施することで評価する予定である。

ナノ結晶の水中での長期的な結晶成長を抑制するためには、これまでの申請者の研究成果および国内外の研究報告に基づくと、ナノ結晶表面を首尾よく被覆できる基剤を使用することが有望な方法論である。ただどのような基剤がナノ結晶水分散製剤の被覆に適しているかは十分に整理されておらず不明な点が多い。そこで様々な種類の被膜基剤をスクリーニング的にトライし、結晶成長抑制の観点から、様々な薬剤と様々な被覆基剤との有効な関係性を明らかにし分類・整理することで、水中でのナノ結晶成長を抑制できる実験事実に基づいた方法を明らかにし、知識化し技術化に結び付ける。達成目標として室温において3年間結晶成長が起こらないナノ結晶水分散製剤の開発を行う。実質、本長期間に相当する過酷試験を実施することで評価する予定である。交付決定額が申請時に計画した予算よりも少額であったため、研究期間を通して研究を遂行していくためにも、計画的に本年度の予算執行を抑えた経緯がある。次年度の研究進捗と見合わせながら研究経費を使用していく予定である。
cDNAマイクロアレイ法による癌温熱療法における温熱耐性獲得メカニズムの解析

癌温熱療法において、よく治る癌と治らない癌が存在する。この違いは、癌細胞自身の温熱感受性の違いと温熱耐性の獲得にあると考えられているが、決定的な因子は未だ明らかにされていない。cDNAマイクロアレイ法やこれまでに確認されている誘導遺伝子を基に、温熱感受性、温熱耐性のメカニズムを解析する。遺伝子バックグラウンドがDNA二重鎖切断修復能のみ異なるScidマウス由来の肺繊維芽細胞を用いて、DNA二重鎖切断と温熱感受性、温熱耐性の関係を求めた。Scid細胞は放射線高感受性であり、ヒト8番染色体を導入したHybrid Scid細胞は正常な感受性まで回復している。温熱耐性を抑制すると報告されている薬剤(Vitamin K_2)の効果を検討した。Scid細胞の温熱感受性は、HybridScid細胞やコントロールのBalb/c 3T3細胞と比較し、高感受性を示した。Scid細胞を温熱処理した後、細胞核内のγ-H2AXフォーカスを観測した。温熱処理後30分で最大となり、その後徐々に減少した。γ-H2AXフォーカスは温熱処理時間と共に増加した。Scid細胞のγ-H2AXフォーカス数をHybrid Scid細胞やBalb/c 3T3細胞と比較すると明らかに違いがあった。細胞核内のγ-H2AXフォーカスの増加と温熱感受性には相関関係が見られた。このことはScid細胞で最も多くのDNA二重鎖切断を確認したことになる。温熱耐性の誘導はTTR(温熱耐性比、Thermo-tolerance ratio)で求めた。Scid細胞の温熱耐性誘導は、Hybrid Scid細胞やBalb/c 3T3細胞と比較し、有意な差ではないが温熱耐性誘導が小さい傾向にあった。細胞核内のγ-H2AXフォーカスは、温熱感受性と同じ傾向が見られた。温熱耐性と関連のある熱ショック蛋白質72の発現は、温熱処理後6時間が最大となり、その後徐々に減少した。細胞内に誘導された蛋白量には大きな違いはなかった。薬剤(Vitamin K_2)の癌細胞(A549細胞、HeLa細胞)に対する効果は、温熱感受性を高め、熱ショック蛋白質72の発現を抑制した。以上のことより、温熱感受性、温熱耐性とDNA二重鎖切断修復との関連が強く示唆される結果を得た。癌の温熱療法において、よく治る癌と治らない癌が存在する。癌の温熱療法における問題点は、細胞の温熱耐性獲得にあると考える。我々は、cDNAマイクロアレイによるゲノム解析により温熱処理した細胞に誘導される遺伝子の機能分類を実施し、温熱感受性と遺伝子発現との関連を求める。また、温熱耐性を抑制すると報告されている薬剤Vitamin K_2に対する誘導遺伝子や温熱耐性タンパクと関連する遺伝子産物を求め、温熱耐性獲得のメカニズムを検討する。用いた細胞は、癌細胞(A549細胞、HeLa細胞)と遺伝子バックグラウンドが同じで温熱感受性の異なる細胞(遺伝子欠損細胞のScid細胞、遺伝子修復細胞のヒト8番染色体を導入したScidハイブリッド細胞)である。それぞれの細胞に対する温熱感受性、温熱耐性を求めた。

A549細胞の温熱感受性は他の細胞と比較し抵抗性を示し、Scid細胞は最も高感受性を示した。薬剤Vitamin K_2を用いた場合の温熱感受性は、すべての細胞の感受性が高くなったが、特にA549細胞が高感受性を示した。温熱耐性の獲得はすべての細胞で観察することができた。薬剤Vitamin K_2を用いた場合の温熱耐性は、明らかに抑制される傾向を示した。さらに温熱耐性と関連のあるHSP72をWestern blot解析を行い、44°C、15分の熱ショック前処理で細胞内HSP72のタンパク発現は顕著に現れた。薬剤Vitamin K_2で前処置した場合、細胞内のHSP72の発現を抑制することが示唆された。cDNAマイクロアレイ法によるゲノム解析は、温熱耐性がもっとも顕著に発現する条件の決定を行い、次年度実施を予定している。追加研究として、温熱処理を行った細胞のDNA二重鎖切断(DSB)をγH2AXの形成によりDSB解析を行い、細胞の温熱耐性獲得との関連を求める。癌の温熱療法において、よく治る癌と治らない癌が存在する。この違いは、癌細胞自身の温熱感受性の違いと温熱耐性の獲得にあると考えられているが、温熱感受性決定因子は未だ明らかでない。癌の温熱療法における問題点は、細胞の温熱耐性獲得にあると考える。我々は、in vitroの温熱実験系で放射線に高感受性を示すDNA依存性プロテインキナーゼ(DNA-PK)遺伝子が欠損しているscid細胞が野生株と比較し高感受性であることを報告し、遺伝的因子が温熱感受性に影響している可能性を示した。今回、cDNAマイクロアレイによるゲノム解析により温熱処理した細胞に誘導される遺伝子の機能分類を実施し、温熱感受性と遺伝子発現との関連を求める。また、温熱耐性を抑制すると報告されている薬剤(Vitamin K_2)に対する誘導遺伝子や温熱耐性タンパクと関連する遺伝子産物を求め、温熱耐性獲得のメカニズムを検討する。本年度(平成19年3月31日)の研究実績cDNAマイクロアレイ法によって求めた誘導遺伝子の解析結果を基に、関連する遺伝子産物の推定を行った。また、温熱耐性抑制薬剤とアポトーシス誘導動態の解析を行った。さらに、温熱による細胞致死、温熱耐性とDNA損傷との関係をリン酸化ピストンγ-H2AXを用いて解析をおこなった。これまでに得られた結果を基に温熱耐性獲得のメカニズムを検討した。
Ｅｖｉ１関連白血病における血小板系シグナルの機能解析

Evi1の高発現は、白血病の独立した予後不良因子である。本研究では、我々の作成したEvi1関連白血病モデルマウスを用いて、Evi1白血病における血小板系シグナル(CD41, cMpl)の役割を明らかにすることを目的とした。ヒト白血病検体においてはEvi1とCD41およびcMplの発現には相関を認め、Evi1-KOマウスの造血幹細胞ではCD41およびcMplの発現が低下していた。Evi1白血病幹細胞はCD41陽性分画に存在する。抗CD41中和抗体およびCD41ノックダウンによるEvi1白血病発症の抑制効果は認めなかったが、cMplノックダウンによるEvi1白血病発症の抑制効果を認めた。骨髄性白血病(AML)や骨髄異形成症候群(MDS)で高頻度に活性化されている転写因子のEvi1(Ecotropic viral integration site 1)は、白血病の難治性を規定する重要な因子として注目を集めている。ヒト白血病検体を用いた網羅的解析においては、Evi1高発現と血小板系分子の発現には相関性があり、その中にはCD41(Integrin αIIb)も含まれている。CD41は血小板や巨核球のマーカーとして利用されているが、造血発生期ではstem cell markerであることが知られている。我々はEvi1高発現白血病モデルマウスを作製することに成功した(Blood. 2013;121:4142-55.)。このEvi1関連白血病モデルでは、必ずCD41陽性分画が出現することを発見した。本研究では、このモデルを用いて、Evi1関連白血病における血小板系シグナルの役割を明らかにすることを目的とした。CD41陽性分画の細胞は形態学的にblastであった。CD41陽性・陰性分画の移植によって、CD41陽性分画にEvi1白血病幹細胞が濃縮されていることがわかった。CD41は、CD61(Integrin βIII)とヘテロ二量体を作ることが知られているが、Evi1白血病細胞において、CD41と同時にCD61も発現していることも確認した。Evi1高発現白血病に対する抗CD41中和抗体あるいはCD41-shRNAによるCD41抑制の治療効果をモデルマウスを用いて検証したところ、CD41の抑制では白血病の病勢を抑えることはできなかった。Evi1白血病細胞にはCD41と同時にcMplも高発現しており、TPOに対する感受性が高いことが判明した。cMplをshRNAで抑制したところ、Evi1白血病の病勢を抑えることができた(Blood. on revision)。我々はEvi1高発現白血病モデルマウスを作製することに成功し、このEvi1関連白血病モデルでは、必ずCD41(integrin αIIb)陽性分画が出現することを発見した。CD41陽性分画の細胞をsortingしてギムザ染色してみると、blastであることも確認した。CD41はEvi1白血病の病態となんらかの関係があると考えられる。CD41は、血小板や巨核球のマーカーとして利用されているが、造血発生期では幹細胞マーカーであることが知られている。本研究では、Evi1による白血病発症にインテグリンのシグナル経路が重要な役割を果たしているのかどうかを明らかにすることを目的とした。CD41陽性分画にEvi1白血病幹細胞は存在するのかを確かめるために、CD41陽性・陰性分画の移植をおこなった。その結果、CD41陽性分画のほうが早期に白血病を発症することが判明した。CD41がEvi1白血病の治療標的になりうるかどうかを確かめるために、Evi1高発現白血病に対する抗CD41抗体の治療効果を確かめた。in vitroでCD41抗体およびコントロールIgG抗体を反応させたEvi1白血病細胞をそれぞれマウスに移植したところ、興味深いことに、CD41抗体群でキメリズムは上昇した。shRNAでCD41をノックダウンして移植したが、scrambleとの差は見られなかった。Evi1関連白血病では血小板系の分子が動くという今回の発見から、Evi1白血病におけるTPO感受性についても調べたところ、TPO投与群でコロニー形成能が高いことが判明した。Evi1白血病細胞ではcMplの発現が高いことも判明した。しかし、ヒト白血病細胞におけるEvi1とcMplの発現に相関は認められなかった。現在はshRNAでEvi1白血病のcMplをノックダウンして二次移植を行い、白血病発症が遅延するかどうかを観察中である。24年度の研究計画のうち、(1)CD41陽性・陰性分画の二次移植、(2)抗CD41抗体による治療効果、(3)ヒトEVI1白血病でのcMpl発現解析、(5)Evi1白血病細胞のTPO感受性をcolony assay系を用いて調べる。の4つについては実施して、結果を得た。

また、25年度計画のうち、(6)Evi1白血病細胞においてCD41の発現をshRNAで阻害し、マウスに二次移植する実験については、24年度に実施し、CD41の発現抑制ではEvi1による白血病発症を抑制できないことを確認した。25年度の計画は、(7)CD41の下流シグナルの阻害剤を用いて、Evi1白血病が抑制できるかどうかをin vivoで確かめる。Evi1白血病細胞を二次移植した後、レシピエントマウスに阻害剤を投与する。インテグリンから細胞内に伝達されるシグナル経路はチロシンキナーゼ型の増殖因子レセプターから細胞内に伝達されるシグナル経路と類似しており、両者が共同して細胞の機能制御を行っていることが推定されている。実際、インテグリンを介する細胞外マトリックスへの接着がRas-MAPK経路やPI3K-Akt経路、細胞内アクチン骨格を制御するRhoファミリーの低分子量GTPaseを活性化することなどが知られている。本研究では、PI3K阻害剤、Srk阻害剤、ERK阻害剤などを試してみる。(8)FibronectinとCD41の結合がEvi1白血病細胞に及ぼす作用を調べる。fibronectinをコーティングしたプレートでEvi1白血病細胞を刺激した場合と、無刺激の場合で、その後の増殖が促進されるか、あるいは静止期への誘導が起こるか、などをFACS, colony assayおよびリキッドカルチャーの系で調べる。(9)浸潤する過程におけるCD41の役割各種臓器への白血病細胞の浸潤の際に、インテグリンが積極的に働いている可能性について調べるため、CD41陽性・陰性の分画を移植した二次移植マウスモデルで、臓器(肺、肝臓、腎臓など)への浸潤度を病理組織標本を作成して計測する。移植後、3ヶ月目、5カ月目、7ヶ月目、9カ月目に、病理組織を作製する。マウスに投与する薬剤の購入。コロニーアッセイ用試薬の購入病理標本作成費学会参加費・論文投稿費。
アクセシビリティからみた都市・地域空間の経済学的評価

上記課題研究は、平成1920年度にかけての二カ年の期間に行われたものである.研究初年度にあたる平成19年度には、アクセシビリティ指標に関する海外の先行論文(約150本)からアクセシビリティ指標に関する最新の動向を把握した.以上の結果に基づき、さらに我が国の経済社会状況を勘案し、今後は我が国における医療施設(医療サービス)へのアクセシビリティを重視した評価指標の構築に焦点を絞り、アクセシビリティ指標の構築を行った.先行論文でも医療施設へのアクセシビリティを扱ったものは幾つか見られたが、我が国の医療行政は他の国とは大きく異なること、逼迫した財政状況や高齢社会の進展といった社会状況の中で現在積極的に医療制度改革が行われていることなどを考えると、優先的に検討・評価すべきテーマの一つであると考えている(なお、これによって得られた指標は、他の分野のアクセシビリティを計測する上でも非常に有用であると考えている).これを受けて研究最終年度にあたる平成20年度には、医療施設へのアクセシビリティを重視した評価指標を構築した.具体的には、医療機関の地理的位置を世界測地系(WGS84)で示した上で、総務省統計局によって算出されている人口重心位置との距離を医療サービスへのアクセシビリティを示す一指標として導入した.また、社会的入院日数を被説明変数、医療サービスへのアクセシビリティ(各都道府県関係局から収集した救急搬送時間等その他のアクセシビリティ指標も勘案)やバリアフリー対応住宅の割合等で代理される「地域の定住性」などを説明変数としたモデルを構築し、その関係性について検証している.上記課題研究は、平成1920年度にかけての二カ年の期間に行われたものである.研究初年度にあたる平成19年度には、アクセシビリティ指標に関する海外の先行論文(約150本)からアクセシビリティ指標に関する最新の動向を把握した.以上の結果に基づき、さらに我が国の経済社会状況を勘案し、今後は我が国における医療施設(医療サービス)へのアクセシビリティを重視した評価指標の構築に焦点を絞り、アクセシビリティ指標の構築を行った.先行論文でも医療施設へのアクセシビリティを扱ったものは幾つか見られたが、我が国の医療行政は他の国とは大きく異なること、逼迫した財政状況や高齢社会の進展といった社会状況の中で現在積極的に医療制度改革が行われていることなどを考えると、優先的に検討・評価すべきテーマの一つであると考えている(なお、これによって得られた指標は、他の分野のアクセシビリティを計測する上でも非常に有用であると考えている).これを受けて研究最終年度にあたる平成20年度には、医療施設へのアクセシビリティを重視した評価指標を構築した.具体的には、医療機関の地理的位置を世界測地系(WGS84)で示した上で、総務省統計局によって算出されている人口重心位置との距離を医療サービスへのアクセシビリティを示す一指標として導入した.また、社会的入院日数を被説明変数、医療サービスへのアクセシビリティ(各都道府県関係局から収集した救急搬送時間等その他のアクセシビリティ指標も勘案)やバリアフリー対応住宅の割合等で代理される「地域の定住性」などを説明変数としたモデルを構築し、その関係性について検証している.研究初年度にあたる平成19年度の研究目的は、我が国の都市・地域における総合的・包括的な「アクセシビリティ指標」を構築するため、1.EUにおいて多く検討されているアクセシビリティ指標を分析すると同時に2.我が国で取得可能なデータを整理し、3.適切かつ妥当な「アクセシビリティ指標」を検討する。であった。この目標を達成するために本年度前中期にはアクセシビリティ指標に関する海外の先行論文(約150本)からアクセシビリティ指標に関する最新の動向を把握した。この中で都市・地域におけるアクセシビリティの確保は非常に重要視されているものの、その計測方法は統一されておらず、一般化されたアクセシビリティ指標が確立されているとは言えないこと(アクセシビリティ指標によって地域の特性を把握するに留まること)、アクセシビリティ指標を構成する要素として重要視されているのは、(1)教育・情報などのソフト面と(2)道路・鉄道整備などのハード面に大別されること、などが明らかとなった。以上の結果に基づき、さらに我が国の経済社会状況を勘案し、今後は我が国における医療施設(医療サービス)へのアクセシビリティを重視した評価指標の構築に焦点を絞ることとした。先行論文でも医療施設へのアクセシビリティを扱ったものは幾つか見られたが、我が国の医療行政は他の国とは大きく異なること、逼迫した財政状況や高齢社会の進展といった社会状況の中で現在積極的に医療制度改革が行われていることなどを考えると、優先的に検討・評価すべきテーマの一つであると考えている(なお、これによって得られた指標は、他の分野のアクセシビリティを計測する上でも非常に有用であると考えている)。現在は、必要データの収集等を行っているところであるが、次年度は我が国に有用なアクセシビリティ指標を作成・公表する予定である。研究初年度にあたる平成19年度には、アクセシビリティ指標に関する海外の先行論文(約150本)からアクセシビリティ指標に関する最新の動向を把握した。

先行論文でも医療施設へのアクセシビリティを扱ったものは幾つか見られたが、我が国の医療行政は他の国とは大きく異なること、逼迫した財政状況や高齢社会の進展といった社会状況の中で現在積極的に医療制度改革が行われていることなどを考えると、優先的に検討・評価すべきテーマの一つであると考えている(なお、これによって得られた指標は、他の分野のアクセシビリティを計測する上でも非常に有用であると考えている)。これを受けて研究最終年度にあたる平成20年度には、医療施設へのアクセシビリティを重視した評価指標を構築した。具体的には、医療機関の地理的位置を世界測地系(WGS84)で示した上で、総務省統計局によって算出されている人口重心位置との距離を医療サービスへのアクセシビリティを示す-指標として導入した。また、医療費を非説明変数、医療サービスへのアクセシビリティ(各都道府県関係局から収集した救急搬送時間等その他のアクセシビリティ指標も勘案)やバリアフリー対応住宅の割合等で代理される「地域の定住性」などを説明変数としたモデルを構築し、その関係性について検証している。
Diels-Alder反応を触媒する酵素が持つ遷移状態制御の解明

糸状菌Chaetomium globosumによって生産されるSch210972は、その分子内にオクタリン(octahydronaphthalene)骨格を有することから、生合成にDiels-Alder反応が関与すると推測されていた。我々はこれまでに、C. globosumにおける遺伝子破壊実験、Aspergillus nidulans異種宿主発現系による生合成系の再構築により、Diels-Alder反応を触媒する酵素遺伝子としてcghAを同定した。cghA存在下における生合成産物は単一の立体異性体であるのに対し、非存在下では非天然型のジアステレオマーが生産されたことから、CghAは立体選択的なDiels-Alder反応を触媒する酵素と予想された。そこで、本研究においてはCghAの触媒機構を実験的に解明することを目指した。タンパク質のX線結晶構造解析により、CghAの触媒する反応の機構を解析できると考えた。はじめに、C. globosumより調製したcDNAをもとに5'-および3'-RACE法によりcghAの全遺伝子配列を決定した。種々検討の結果、コドンを最適化させたcghA合成遺伝子の利用により、大腸菌を宿主とした目的タンパク質の大量生産に成功した。続いて、クロマトグラフィーによる精製、結晶化条件のスクリーニングを経て、CghAタンパク質結晶の獲得に成功した。さらに計算化学を用い、基質、生成物および得られたタンパク質構造を用いたドッキングシミュレーションを行い、活性部位を予測した。予測された活性部位近傍のアミノ酸残基に変異を導入した変異体酵素の変換活性を観測することで、位世界で初めて酵素Diels-Alderaseがどのようにして立体選択的な環化反応を触媒するのかを示すことに成功した。2-pyridone alkaloidleporins生合成において、これまでに報告の無かった酵素的ペリ環状反応を発見し、反応メカニズムを解明した。全合成研究により、tetrahydropyran骨格形成過程でDiels-Alder反応(DA)とhetero-Diels-Alder反応(HDA)が競合しDA/HDA前駆体であるquinonemethideのgeometryの制御が反応制御に重要であることが示されていた。そこで、生合成においては何らかの酵素がalcoholからquinonemethideへの脱水反応とその後のHDA反応を触媒すると考えた。我々は、生合成遺伝子クラスターの中にO-methyltransferas(LepI)を見出し、これが反応を触媒していると考えた。そこで、Aspergillus nidulansを異種発現宿主としてleporin生合成経路の再構築し生成物を調べた。その結果、LepIの基質がalcoholであることを確認することができた。alcoholを基質に用いた経時変化の観測により(1)quinonemethideからDAとHDA反応(ambimodal反応)が同時に起きていること、(1)DA生成物からHDA生成物へのretro-Claisen rearrangementが起きている可能性が示唆された。(1)と(1)をさらに詳細なin vitro解析により明らかにしたところ、LepIにはSAM結合モチーフ(GXGXG)が保存されていたため、反応がSAM依存的かどうか確認した。その結果、脱水反応とretro-Claisen rearrangementはSAM依存的に進行するもののSAMはメチル基供与体ではなく、SAMのpositive chargeが関与していることが明らかとなった。これらのデータは計算化学によっても強く支持された。我々はこれまでに分子内Diels-Alder反応を触媒する酵素の解析実績があり、最近ではmyceliothermophin Eの生合成で酵素MycBがDiels-Alder反応を触媒する酵素であることが突き止められた。このMycBは、オクタリン環を構築する点で同様にDiels-Alder反応を触媒する酵素で、互いに約30%の相同性を示す酵素CghA(Sch210972生合成酵素の一つ)、CcsF(cytochlasin生合成酵素の一つ)およびCgbE(chaetoglobosin生合成酵素の一つ)が見出されている。これら酵素の結晶化を試み、X線結晶構造解析を行う。このとき基質アナログを合成しタンパク質との共結晶により反応機構の詳細について解析する。続いて、活性部位近傍のアミノ酸と基質アナログの相互作用および変換反応における遷移状態活性化エネルギーを計算化学で導き出し、上記4つの酵素に関して比較する。これにより環化および立体選択性の普遍性を解明する。また、酵素的なDiels-Alder反応では立体化学としてendo体が生成されるが、非酵素的な環化反応ではexo体も観測される。従って、計算化学で導き出されるendo体およびexo体の活性化エネルギーを比較することで、どのようなメカニズムで高立体選択的な生成物になるのかを解明する。さらに実用化を指向した基質の拡張、すなわち、環化生成物のバリエーションを多くすることが出来るのかを計算化学を用い予測する。上記4種類の酵素の関与を考慮した基質(ジエンージエノフィル)の遷移状態のエネルギー計算および基質から生成物へ至るまでのエネルギー準位を包括的にシミレーションした結果を基にして、拡張型基質特異性および高代謝回転数を持った高性能Diels-Alderaseをデザインする。取り組んでいる研究課題は化合物の基本骨格において2種類ある。両者とも糸状菌Chaetomium globosumから単離され、Diels-Alder反応の関与により生合成されると推定される。二つに分けて以下に記載した。C. globosum ΔCgligD/ΔCgpyrGから相同組換えにより、CgbE破壊株を作製し抽出物を解析した。

その結果、endo体1およびexo体2の生成が確認されたことから、CgbEがシクロヘキセン環の立体制御に関与することが示唆された。現在、1の生合成に必要と考えられる上記3種の遺伝子(CgbC、DおよびE)をAspergillus nidulansに導入し、異種発現を試みると共にin vitro実験によるCgbEの変換反応の観測を目指して研究を進めている。化合物3の生合成に必要とされるcghAを含む4種の遺伝子をAspergillus nidulansに導入し、異種発現を試みた。その結果、4つの遺伝子全てを導入した株では化合物3の発現を確認したが、cghAを除く3種の遺伝子導入株では化合物3およびジアステレオマー4の生産を確認した。このことから、Diels-Alder反応の立体選択性はC. globosumのCghAにより生じるものと推定された。現在、in vitro実験による変換反応の観測を目指しDiels-Alder反応の直接の基質の特定を進めている。糸状菌Chaetomium globosumによって生産されるSch210972は、その分子内にオクタリン(octahydronaphthalene)骨格を有することから、生合成にDiels-Alder反応が関与すると推測されていた。我々はこれまでに、C. globosumにおける遺伝子破壊実験、Aspergillus nidulans異種宿主発現系による生合成系の再構築により、Diels-Alder反応を触媒する酵素遺伝子としてcghAを同定した。cghA存在下における生合成産物は単一の立体異性体であるのに対し、非存在下では非天然型のジアステレオマーが生産されたことから、CghAは立体選択的なDiels-Alder反応を触媒する酵素と予想された。そこで、本研究においてはCghAの触媒機構を実験的に解明することを目指した。タンパク質のX線結晶構造解析により、CghAの触媒する反応の機構を解析できると考えた。はじめに、C. globosumより調製したcDNAをもとに5'-および3'-RACE法によりcghAの全遺伝子配列を決定した。種々検討の結果、コドンを最適化させたcghA合成遺伝子の利用により、大腸菌を宿主とした目的タンパク質の大量生産に成功した。続いて、クロマトグラフィーによる精製、結晶化条件のスクリーニングを経て、CghAタンパク質結晶の獲得に成功した。さらに計算化学を用い、基質、生成物および得られたタンパク質構造を用いたドッキングシミュレーションを行い、活性部位を予測した。予測された活性部位近傍のアミノ酸残基に変異を導入した変異体酵素の変換活性を観測することで、位世界で初めて酵素Diels-Alderaseがどのようにして立体選択的な環化反応を触媒するのかを示すことに成功した。2-pyridone alkaloid
霊長類成体脳における神経細胞の新生と移動

従来、中枢神経系を構成する神経細胞は、胎生期および幼弱期にのみ発生するものと考えられてきた。ところがマウスなどの齧歯類成体脳においては、側脳室の側壁に面した脳室下帯と、海馬の歯状回において新しい神経細胞が生まれることが明らかになった。近年、ヒトを含む霊長類の脳においても同様に新しい神経細胞が生まれていることが報告されているが、そのしくみと意義については充分な研究が行われていない。そこで本研究では、霊長類の脳室下帯の構造を詳しく解析し、謁歯類のものと比較した。17年度では、マーモセット成体脳室下帯の切片を作成し、細胞種特異的なマーカーによる染色と電子顕微鏡による観察を行い、マウスの脳室下帯に存在が報告された細胞と同様の細胞群が存在することを確認した。そこで18年度は、さらにサンプル数を増やし、細胞の組成を定量的に解析した。マウスと比べ、一過性増殖細胞(typeC細胞)の同定が困難であったが、電子顕微鏡の連続切片による三次元的解析によって、少数ではあるが存在することが確認された。新生仔マーモセットを用いて同様の解析を行ったところ、成体よりも多くの増殖細胞が観察された。また、脳室下帯の構造を電子顕微鏡で観察したところ、アストロサイトが帯状に存在すること、上衣細胞が脳室面のみでなく脳室下帯内部に異所的に存在することなど、ヒトの脳室下帯に類似した特徴を有することが明らかになった。これらの研究成果により、コモンマーモセットは、再生医学への応用を目指して成体脳の神経細胞新生を研究する良いモデルとなると考えられた。ところがマウスなどの齧歯類成体脳においては、側脳室の側壁に面した脳室下層と、海馬の歯状回において新しい神経細胞が生まれることが明らかになった。そこで本研究では、霊長類の脳室下層の構造を詳しく解析し、齧歯類のものと比較した。さらに霊長類成体脳において新しく生まれる神経細胞の移動経路とその運命を明らかにするため、新生細胞を標識して観察した。マーモセット成体脳室下層の構造を詳細に解析することを目的として脳の切片を作成し(本研究費で購入した振動刃ミクロトームを使用)、細胞種特異的なマーカーによる染色を行った。その結果、GFAP陽性のアストロサイト、MASH1陽性の一過性増殖細胞、PSA-NCAM陽性のニューロブラストなど、マウスの脳室下層に存在が報告された細胞と同様の細胞群が観察された。さらに、電子顕微鏡による観察を行い、脳室下層を構成する細胞の種類と割合を明らかにした。微細形態学的にもマウス脳室下層に存在する上衣細胞(タイプE細胞)、アストロサイト(タイプB細胞)、一過性っ増殖細胞(タイプC細胞)、およびニューロブラスト(タイプA細胞)に類似した細胞が観察された。次に、BrdUを腹腔内投与して一ヶ月後に固定し、抗BrdU抗体と、各種細胞特異的マーカーの二重染色を行い、新生ニューロンの場所と運命を特定した。増殖細胞の大部分はMash1陽性であり、一ヶ月後にその一部が嗅球内でニューロブラストに分化することが明らかになった。
EGFRキナーゼ阻害剤を用いた膠芽腫治療戦略を新規アプローチで「再」開発する

本研究は、治療困難な脳腫瘍の代表格である「グリオブラストーマ」を対象とした新規治療方法樹立を目指した研究です。グリオブラストーマでよくみられる「EGFR」という部分をターゲットとした「タグリッソ」という副作用の少ない薬を転用する研究ですが、効きそうにみえるものの、そのままではすぐに効きません。そこで、どうして効かないのか?を問いつつ、同時にタグリッソ+αという治療方法でグリオブラストーマ根治を狙います。その「α」が、安くて、副作用が少なくて、そもそも脳腫瘍の症状コントロールにとっても魅力的な薬で樹立できないか?という内容の、脳腫瘍研究を行う腫瘍内科医ならではの治療戦略研究です。
未利用資源としてのハダカイワシ科魚類の生態学的研究

資源生物学的知見:生物量の豊富さを考慮し、対象魚種を親潮域と移行域に生息する13種にしぼり資源情報として最も基本的な生息深度・日周鉛直移動のパターンを各層採集により調査した。13種は日周鉛直移動の様式から、1.日周鉛直移動を行わない種・・・・セッキハダカ、ミカドハダカ、オオメハダカ2.日周鉛直移動を行う種・・・・ナガハダカ、ホクヨウハダカ、アラハダカ、トドハダカ、オオクチハダカ、スイトウハダカ、カガミハダカ、イサリビハダカ3.一部の個体のみが夜間浮上する種・・・・コヒレハダカ、マメハダカに分類できる。それぞれの種は固有の生息深度と適応水温範囲をもつことを示し、複雑な海洋構造をもつ移行域での分布様式を明らかにし、各種を漁獲する際の知見を得た。食品・利用化学的知見:1.親潮域・移行域・黒潮域のハダカイワシ科魚類20種の脂質組成とその特徴を明らかにした。2.従来問題とされてきたワックス含量については、亜寒帯海域のセッキ、コヒレ、ミカドの3種が脂質の90%以上を占めるワックスを含むことを明らかにした。3.ワックスを含む種は、日周鉛直移動を行わない種に多く、ワックスは浮力獲得のための適応と考えられる。4.他の17種は、トリグリセリドを主とした一般有用魚と大差ない脂質組成を示し、食用または家畜飼料の材料として問題がないことを明らかにした。5.ワックスは、生体内で合成されることを明らかにした。本年は、フィールド採集を以下の通り行った。1994年8月1日8月30日海洋資源開発センターのチャータ-船・丸定丸により親潮・黒潮海域において21種約1トンの試料を得、親潮域における殆ど全ての種の分析試料を得た。また10月25日より12月17日にかけて水産庁チャータ-船・青海丸にて西部熱帯太平洋において20種約400kgの試料を得た。これらの試料は東京大学海洋研究所で順調に種同定、選別が行われ、計画通り東北大学に送られ、食品化学的特性が分析された。(結果)1.親潮系の優占種6種について、脂肪含量、脂質クラス、脂肪酸組成等を分析し、食用とする際最も注意すべきワックスに関し、セッキハダカ、コヒレハダカ、ミカドハダカの脂質の90%以上がワックスであることを明らかにした。その他のハダカイワシ類の脂質は一般の有用魚と大差ないことが分かった。2.生態的には、日周鉛直移動を顕著に行わない種がワックスを多く含むことが明らかとなった。3.黒潮種9種の脂質組成、脂肪酸組成を明らかにし、ワックスのないこと、その脂質組成は一般の有用魚と大差ないことを明らかにした。4.親潮・黒潮・混合域における夜間表層に浮上したハダカイワシ類各種の水平的並びに鉛直的分布パターンを水塊との関係で明らかにし、今後の漁獲方法確立のためのデータを得た。今年度の結果をふまえ、来年度は主要種の生活史、食性などの生態学的知見をさらに得るとともに、食品化学的にはアミノ酸分析、脂質の示差熱分析を行っていく。平成67年度のフィールド・サンプリングを順調に終了し、資源生物学的知見として、日周鉛直移動、食性の分析が進んでいる。これにより、親潮域から移行域にかけて生息するハダカイワシ類を、日周鉛直移動のパターンから、以下の4つのグループに分類した。1.全く日周鉛直移動を行わない。(セッキハダカ、ミカドハダカ)2.一部が浮上する。(オオクチ

ハダカ、マメハダカ、コヒレハダカ)3.日周鉛直移動を行うが、温度範囲が狭く、上昇限度が高水温に制限される。(トドハダカ、ナガハダカ)4.日周鉛直移動を行い、上昇限度が水温に影響されない。(カガミハダカ)その結果の一部は学会発表((1)(2))され、現在論文としてまとめ中である。一方食品化学的研究((3)(4))では、亜寒帯および亜熱帯域のハダカイワシ類20種の脂質組成とその特徴を明らかにするとともに、さらに進んで筋肉蛋白質の特性を明らかにした。一部はすでに論文として発表(別紙参照)済み、他は学会発表し論文としてとりまとめ中である。〔学会発表〕(1)黒潮とその隣接海域における夜表性ハダカイワシ科魚類群集生物量の長期変動および深海への物質輸送にはたす役割(1995年度日本海洋学会春季大会)(2)親潮一黒潮移行域におけるハダカイワシ科魚類の日周鉛直分布様式(1996年度日本海洋学会春季大会)(3)ハダカイワシ科魚類の脂質特性(1995年度日本水産学会春季大会)(4)ハダカイワシ科魚類の筋肉蛋白質の特性(1996年度日本水産学会春季大会)資源生物学的知見:生物量の豊富さを考慮し、対象魚種を親潮域と移行域に生息する13種にしぼり資源情報として最も基本的な生息深度・日周鉛直移動のパターンを各層採集により調査した。13種は日周鉛直移動の様式から、1.日周鉛直移動を行わない種....セッキハダカ、ミカドハダカ、オオメハダカ2.日周鉛直移動を行う種....ナガハダカ、ホクヨウハダカ、アラハダカ、トドハダカ、オオクチハダカ、スイトウハダカ、カガミハダカ、イサリビハダカ3.一部の個体のみが夜間浮上する種....コヒレハダカ、マメハダカに分類できる。それぞれの種は固有の生息深度と適応水温範囲をもつことを示し、複雑な海洋構造をもつ移行域での分布様式を明らかにし、各種を漁獲する際の知見を得た。食品・利用化学的知見:1.親潮域・移行域・黒潮域のハダカイワシ科魚類20種の脂質組成とその特徴を明らかにした。2.従来問題とされてきたワックス含量については、亜寒帯海域のセッキ、コヒレ、ミカドの3種が脂質の90%以上を占めるワックスを含むことを明らかにした。3.ワックスを含む種は、日周鉛直移動を行わない種に多く、ワックスは浮力獲得のための適応と考えられる。4.他の17種は、トリグリセリドを主とした一般有用魚と大差ない脂質組成を示し、食用または家畜飼料の材料として問題がないことを明らかにした。5.ワックスは、生体内で合成されることを明らかにした。
新しい実験モデルによる脳血管萎縮の研究

当研究者等は培養血管平滑筋細胞を用いて脳血管萎縮の慢性in vitroの新しい実験モデルを開発し、既に発表した。Hemolysateと共に血管平滑筋細胞を一週間培養すると細胞は進行性に収縮し、一部はmyonecrosisに陥る。この観察は臨床で経験される脳血管萎縮の経過と病理学的所見とに極めて良く似たものである。しかし本研究の初期の観察は電子顕微鏡下に行われたものであり、細胞を生きたまま追跡観察したものではない。そこで今回の研究では細胞の収縮と微細構造の変化を同時に観察でき、且つ観察期間中の細胞の収縮能を生きたまま観察できるさらに新しい実験法を考察した。ウサギ脳低動脈から酸素分離法によって得られた継代3代目の平滑筋細胞を実験に用いた。細胞の同定は免疫蛍光抗体法によるFITC標識抗アクチン及びミオシン抗体により確認した。Nomarski differential interference microscopeをvideo-analysing systemに接続し、細胞の収縮と微細構造の変化を生きたままの状態で連続的に観察した。平滑筋細胞の収縮は細胞面積の減少率をもって評価した。ノルエピネフリン、セロトニン、KCl、LTC_4、hemolysateに対して細胞は濃度依存性に収縮し、S字状曲線が得られた。セロトニン10^<-5>Mのときに得られた最大面積減少率の平均値を100としたときにノルエピネフリン10^<-5>Mでは71、hemolysate 10^<-3>Mでは75、Kcl 50mMでは74であった。本システムは急性及び慢性の平滑筋細胞の収縮と微細構造の変化を一週間にわたって併行して追跡できる点で脳血管萎縮の新しい実験モデルとして極めて有用であると考えられる。当研究者等は脳血管変縮の新しい実験モデルを開発し、以下の如き観察結果を既に発表した。ラット胸部大動脈から培養した平滑筋細胞をhemolysateと共に一週間培養すると進行性の細胞收縮と組織学的変化を生じ、しかもこの組織学的変化はmyonecrosisと類似する。これらの観察結果は臨床で観察される経過と病理学的所見とに極めて良く似たものである。しかし今までの観察は電子顕微鏡で行われたものであり、この間に細胞がどのような機能的変化を示すかは不明であった。そこで今回は上記の観察期間中細胞が生きたままの状態で観察できる新しい実験モデルを開発し、同時に観察期間中の細胞の收縮能をも調べた。今回の研究では平滑筋細胞をラビット脳底動脈より培養した。Nomarski differential interference microscopeにvideoーanalysing systemを接続し、細胞の收縮と微細構造を同時に観察できるようにした。Hemolysateと共に培養を行った細胞は5HTとLTC_4に対する收縮が増強する(augmenting effect)が、KCLに対する收縮には変化がない。このaugmenting effectはphospholipase Cのblockerで消失する。またこのaugmentationは培養日数とともに減弱し、day3以降はcontrolとの差が無くなる。これらの観察から1.細胞は観察期間中收縮能を保っている。2.Hemolysateはreceptorーmediatedのinositol phospholipid breakdownを促進してaugmenting effectを示す。3.細胞の進行性收縮は細胞の收縮能自体を低下させている、と結論される。Hemolysateの平滑筋に対する作用は1.細胞の急性收縮、2.平滑筋細胞の收縮をaugnentする、3.慢性持続性の收縮とmyonacrosisを生じる、と考えられる。脳血管変縮ではこれらの作用が互いに関係し合って悪循環を形成していることが予想される。
泌尿器科領域悪性腫瘍の発生、進展に関与する遺伝子変異の検索とその臨床的応用

尿路上皮癌において、従来の病理組織学的な悪性度の評価では不十分な症例がしばしば観察されるため、より的確な悪性進展に関わる遺伝子変化の検出を確立し、これを臨床の場に応用することを目的とし、研究を進めてきた。1、癌抑制遺伝子の不活化の際に生じる対立遺伝子の欠失、またはヘテロ接合性の消失を様々な病期、異型度の尿路上皮癌においてサザンブロット法により調べ、染色体11p、17p、13q等での癌抑制遺伝子の不活化が尿路上皮癌の悪性進展に関わっていることを示した。この中でも17pの変化が最も悪性度を反映する所見を得た。(Int.J.Cancer,53:579-584,1993)(第81回日本泌尿器科学会総会シンポジウム、平成5年4月、京都)2、染色体17p上に位置する癌抑制遺伝子p53遺伝子に的を絞り、尿路上皮癌においてPCR法を用いてp53遺伝子の変異が悪性進展に深く関与していることを示した。さらにp53遺伝子の変異パターンが患者の喫煙歴により違いが生じることを示し、従来疫学的に示されていた喫煙と尿路上皮癌の関係を分子遺伝的に示した。(Cancer Res.,53:3795-3799,1993)(第81回日本泌尿器科学会総会、平成5年4月、京都)(第52回日本癌学会総会、平成5年10月、仙台)3、尿路上皮癌におけるp53遺伝子の解析を進め、尿路上皮癌の際だった特徴である異時性、異所性の多発発生が多くの例で尿路内の播種により生じることを証明し、denovoの発生により多発するという可能性が少ないことを証明した。(Lancet,342:1087-1088,1993)現在この尿路内播種を規定する遺伝子変化を捉えることを目的に研究を進めるとともに、尿路上皮癌のp53遺伝子の変化と悪性進展について研究を進めている。
中山間地域における高齢者の認知機能維持を目的とした社会生活構造の解明

本研究は,地縁的な社会とのつながりが比較的残っているという特徴をもつ中山間地域の暮らしの中の社会関係性に着眼し,どのような社会生活(社会生活意識・社会とのつながり・人との関係等)が認知機能によい影響を与えるのか,その構造を明らかにすることを目的とする。認知機能に良い影響を与える社会との関係性を具体的に示していくことは認知機能を維持するための高齢者支援に活用できると同時に認知症を予防する地域づくりに貢献できる。本研究の成果は、日本の国土の7割を占める中山間地域の認知症予防の施策に活かすことができ,地域包括ケアシステムの構築に最も求められる互助意識を高めた地域づくりに貢献できる。
神経発生を負に制御するヘリックス・ループ・ヘリックス転写因子の作動機序

神経発生の分子メカニズムを明らかにすべく、ヘリックス・ループ・ヘリックス転写因子Hairyによる異所性の神経発生の抑制機構について研究を進めた。これまで我々は、Hairyはその標的遺伝子Achaeteの5'上流に存在するCACGCG配列に結合しAchaeteの転写活性化を抑制することによって異所性の神経細胞の発生を防ぐことを明らかにしてきた。本研究において、Hairyが標的遺伝子DNAに結合してからいかに転写を抑制し神経発生をネガティブに調節するかその作用機序について解析を行った。培養細胞系を用いた実験から、Hairy関連タンパクのC末端に存在する4アミノ酸のみからなるWRPWモティーフが、転写抑制に十分なドメインであり、それ自身はDNA結合能を持たないWD40リピートを持つGrouchoコリプレッサーとの結合に十分な機能ドメインであることが明らかになった。また、Grouchoタンパクは標的遺伝子のプロモーターに直接繋ぐことによって転写を抑制することができ、Groucho関連タンパクのN末端側に進化上良く保存された転写抑制ドメインが存在することがわかった。さらに、トランスジェニックフライを用いたアプローチによって、Hairy関連タンパクのWRPWモティーフおよびGroucho転専抑制ドメインは標的遺伝子Achaeteに繋ぐことにょって、神経発生をネガティブに制御するリプレッサーとして機能できることが明らかになった。このように、HairyはWRPWモティーフを介して、DNA結合能を持たないGrouchoコリプレッサーを特定のDNA配列に繋ぐことによって転写を抑制し神経発生をネガティブに調節するものと考えられた。神経発生を制御する分子機構を明らかにするための一つのステップとして、ヘリックス・ループ・ヘリックス転写因子Hairyによる異所性の神経発生の抑制機構について研究を進めている。これまで、我々はHairyはその標的遺伝子Achaeteの5'上流に存在するCACGCG配列に結合しAchaeteの転写活性化を抑制することによって異所性の神経細胞の発生を防ぐことを明らかにしてきた。本年度は、HairyがDNAに結合してからいかに転写を抑制し神経発生をネガティブに調節するかについて検討した。Achaeteの5'上流にあるHairy結合部位を酵母のGal4の結合部位に置き換えたAchaete5'上流0.9kbpをルシフェレース遺伝子と繋いだレポーターを作成し、Daughterless、AchaeteとGal4DNA結合ドメイン(DBD)-Hairy融合発現ベクターを、Schneider細胞で一過性に発現させ、転写活性化に対する抑制作用を調べた。一連の欠失変異体Gal4DBD-Hairyの解析から、Hairy bHLH関連タンパクすべてのC末端に存在する4アミノ酸のみからなるWRPW(Trp-Arg-Pro-Trp)モティーフが、転写抑制に十分な機能ドメインであることが判った。さらに、WRPWモティーフは、それ自身はDNA結合能を持たないWD40リピートを持つGrouchoコリプレッサーとの結合に十分な機能ドメインであること、Groucho関連タンパクのN末端側に進化上良く保存された転写抑制ドメインが存在することが明らかになった。このように、Hairy bHLH関連タンパクはWRPWモティーフを介して、DNA結合能を持たないGrouchoコリプレッサーを特定のDNA配列に繋ぐことによって転写を抑制し神経発生をネガティブに調節するものと考えられた。神経発生の分子メカニズムを明らかにすべく、へリックス・ループ・へリックス転写因子Hairyによる異所性の神経発生の抑制機構について研究を進めた。培養細胞系を用いて既に明らかにしたHairy bHLG関連タンパクの転写抑制ドメイン、WRPWモティーフとGroucho転写抑制ドメイン、Groucho 1-264のin vivoにおける機能を明らかにするために、神経発生のモデル系として用いられているショウジョウバエの感覚器官形成における抑制作用を調べた。Hairy特異的結合部位をGa14結合部位に置き換えたAchaeteミニ遺伝子を、P因子を利用してAchaete遺伝子を持たないショウジョウバエに導入した。この中にはHairy変異体と同様にハネのL2veinに感覚毛を持つラインが得られたので、これを機能的レポーターとして用いた。

一方、エフェクターとして、熱ショックプロモーター下流にGal4-DNA結合ドメイン(DBD)のみ、Gal4-DBD-WRPWあるいはGal4-DBD-Groucho 1-264融合タンパクを繋いだコンストラクトを導入したトランスジェニックフライを作製した。交配によって機能的レポーターとエフェクター両方を持つトランスジェニックフライをつくり、蛹化後(通常は25°C)36°C5分の熱ショック処理を行い、羽化後ハネのL2 veinの感覚毛の有無を観察した。HS-Gal4DBD-WRPWおよびGal4-DBD-Groucho 1-264トランスジェニックフライにおいては、熱ショック処理をする時間に依存してL2veinの感覚毛が消失したが、HS-Gal4DBDトランスジェニックフライには効果が見られなかった。このように、WRPWモティーフとGroucho 1-264は培養細胞系だけでなく、in vivoの感覚器官形成においても転写抑制ドメインとして十分に機能できることが明らかになった。
ハイパワーレーザー衝撃圧縮を用いた溶融鉄合金の輸送特性解明

当該計画ではハイパワーレーザー衝撃圧縮の方法を用いて、地球核・マントルのダイナミクス、冷却進化などの解明に重要な外核の輸送特性に実験的にアプローチすることを目標に研究を推進した。ハイパワーレーザーの方法が得意とする超高温高圧の生成法を生かして、地球外殻条件の液体鉄合金の生成と観測に応用した。大阪大学レーザー科学研究所のハイパワーレーザーを用いてレーザー衝撃超高圧実験を行い、約150 - 450 GPa範囲の圧力条件における液体状態の鉄合金の生成を実証した。圧力の決定は多チャンネルの線結像型速度干渉計を用いて行った。酸化マグネシウムを圧力保持のショックウィンドウに用いた独自のターゲットを開発し、圧力と同時に光反射率を時間分解して測定した。酸化マグネシウムの高温高圧における基礎光学特性については独立な実験により明らかにすることに成功した。シリコンを含有した鉄シリコン合金試料の作成に、パリ大学の研究グループと共同で取り組み、シリコン含有量と密度の再現性を確認した。比較のために、約50 GPaの固体鉄状態における光反射率も測定した。その結果、ショック圧縮下の固体鉄および液体鉄の反射率に有意な変化が見られない反面、高温高圧の液体鉄合金では250 GPaの領域で得意な反射率の振る舞いを明らかにできた。29年度が最終年度であるため、記入しない。地球外殻の溶融鉄合金の熱輸送形式は、磁場形成やマントルの対流など、全地球のダイナミクスに大きな影響を与えている。本研究計画では、ハイパワーレーザーショック圧縮が得意とする超高温高圧の生成法を生かして、地球外殻条件の液体鉄合金の生成と観測に応用する。当該年度においては、液体鉄合金の生成が可能であること、また輸送特性に関わる物理パラメータのその場リアルタイム測定が可能であることを実証した。大阪大学レーザーエネルギー学研究センターの大型レーザーを用いてレーザーショック超高圧実験を行い、約150 GPa及び250 GPaの圧力条件における液体状態の純鉄の生成に成功した。圧力のキャラクタライズは多チャンネルの線結像型速度干渉計を用いて行った。その結果、ショック圧縮下の固体鉄の反射率に有意な変化が見られない反面、高温高圧の液体鉄では固体鉄に比べて1桁程度の反射率の低下が確認された。また、ニッケルを10%程度含有した液体合金鉄ターゲットの開発及び予備実験も開始し、自由電子モデルを用いて電気伝導度の変化について検討を着手した。独自のターゲットと線結像型VISARを中心とした光学的計測系を利用して、150 GPa及び250 GPa領域の圧力条件を高精度にキャラクタライズしながら、光反射率の時間変化を測定できることを実証した。光学特性を明らかにした独自のショックウィンドウ材料により、300万気圧超の領域まで液体鉄測定に耐えうる実験スキームを確立することができた。ニッケルを含有した液体合金鉄ターゲットの開発にも成功し、予備実験を既に開始するとともに、純鉄との電気伝導度の比較検討も既に開始している。鉄ニッケルだけでなく、鉄シリコンなどの合金鉄ターゲットを開発製作し、前年と同様の手続きで衝撃超高圧実験を実施する。不純物による衝撃波到達タイミングや合金/ウィンドウ界面速度の変化を実験により詳細にモニターする。到達する圧力温度域の変化は輻射流体力学シミュレーションコードを用いて詳細な予測を行い、実験条件の決定に活かす。前年と同様の手続きでハイパワーレーザーショック超高圧実験を実施する。また、その場リアルタイムの温度測定、レーザーパルス波形整形技術を利用した低エントロピー圧縮状態についても検討を行う。