hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
腸管局所免疫機構における脳腸ペプチドの役割

[方法]Wistar系雄性ratを用いて、腸管リンパ管リンパ球のmigrationの基礎的検討を行った。すなわち、Willfurらに準じ、腸管リンパ管より採集したリンパ球にFITC(fluorescein isothiocyanate)を標識し、頚静脈より注入した。その後経時的にパイエル板、脾臓、腸間膜リンパ節などのリンパ組織を採取し、凍結切片を作製した。rabbit anti-FITCおよびHRP標識gost anti-rabbitを用いた免疫組織化学的手法により標識リンパ球のmigrationの局在を検討した。さらに、VIPを10ng/kgBW/minの速度で腸間膜動脈へ持続注入し、その影響をみた。[成績・考案]標識リンパ球のmigrationはパイエル板では標識リンパ球注入後30分で旁濾胞領域で確認され、以後2時間まで増加した。脾臓のPALS(periarteriolar lymphatic sheath)、腸間膜リンパ節の旁皮質ではそれぞれ30分、1時間でmigrationがみられ、いずれもT cell領域からmigrationがおこることが確認された。一方、胸腺では観察時間内ではmigrationは認められなかった(リンパ学)。さらに、VIPの腸間膜動脈投与群では、パイエル板において初期(1-2時間)のリンパ球migrationが抑制され、他のリンパ組織では有意な変化は観察されなかった(10th Worldcongress of gastroenterology、1994年10月、ロスアンゼルス)。今回の検討は、リンパ球のFITC標識がmigration studyに有用であることを確認させ、GALTにおいて脳腸ペプチドが何らかの役割を有することを明らかにした。今後、サブスタンスPや種々のサイトカインの影響も検討するとともに、これらの物質がいかなる機序で影響するのかを明らかにする必要がある。
HLA-A24陽性食道癌ペプチドワクチンの開発:ペプチドによる末梢リンパ球からのCTLの誘導

これまでに樹立した食道癌患者由来上皮性癌特異的キラーT細胞株(KE4-CTL)により認識される5つの抗原をSART-1SART-5をクローニングし、それらの各種癌における発現、新規の場合は生物学的機能及び、CTLにより認識されるエピトープ(ペプチド)、さらにはCTL誘導能可能なペプチドの決定等々を実施した。以下その概略を記す。1)SART-1ペプチド:SART-1抗原中にHLA-A24拘束性CTLを誘導できるペプチド分子を同定した。HLA-A26サブタイプの全てにおいてSART-1ペプチドがCTL誘導能を有することを明らかにした。また、腎癌、脳腫瘍、乳癌におけるSART-1抗原の発現を明らかにした。2)SART-2ペプチド:SART-2遺伝子と同抗原ペプチドを解析した。100kdのSART-2抗原はERに選択的に局在し、扁平上皮癌の殆どと一部の肺癌に発現しており、一方正常組織ではその蛋白発現が認められないことより扁平上皮癌ワクチンとして臨床応用可能と判断される。3)SART-3ペプチド:SART-3遺伝子及び同抗原ペプチドを解析した。一方、各種癌におけるSART-3抗原の発現を同定した。4)SART-4(lck)ペプチド:転移性癌に高発現する癌拒絶抗原としてのSART-4(lck)分子の解析と転移癌ワクチンとしてのペプチドを同定した。本研究により食道癌に対する特異的免疫機構の分子基盤が構築され、HLA-A24陽性癌に対するペプチドを基盤とした特異的免疫療法の可能性が大きく開拓されたものと考えられる。以下その概略を記す。本年度は以下の研究成果をえた。1. HLA-A2402cDNA及び癌抗原ペプチドの作製した。即ち、HLA-A2402cDNAはSART-1抗原を同定する際に用いたCTL株と同一患者由来リンパ球よりmRNAを分離し、SART-1抗原遺伝子をコードする蛋白のアミノ酸配列の中からHLA-A2402分離結合ペプチドを作製した。2.癌抗原ペプチドによるCTL株の誘導を実施し、以下の成果を得た。イ.SART-1ぺプチドによるCTL誘導:1)癌ワクチンはHLA-A24拘束性ペプチド(SART-1_<690-698>)がHLA-A24+食道癌患者リンパ球より強いCTL誘導能を有することを見出した(Kikuchi et al.,Int.J.Cancer in press,1999)。2)アジュバントを決定する目的でSART-1_<690-698>ペプチドによるDTL誘導の至適条件を各種サイトカインを用いて解析した。3)HLA-A26拘束性ペプチドSART-1_<736-744>がHLA-A2601,-A2602,-A2603癌患者のいずれからもCTLを誘導することを見出した。ロ.SART-2癌拒絶抗原遺伝子:100kdのSART-2抗原が扁平上皮癌粗面小胞体内に選択的に発現していることを明らかにするとともに、同抗原内にHLA-A24^+食道癌患者リンパ球よりCTL誘導能を有する3つのnonapcptideを同定した。ハ.SART-3癌拒絶抗原遺伝子:140kdのSART-3抗原が増殖細胞に選択的に発現し、かつ癌細胞に限って核内にも発現することを明らかにした。同抗原内にHLA-A24^+扁平上皮癌患者リンパ球よりCTL誘導能を有する2つのnonapcptideを同定した。これまでに樹立した食道癌患者由来上皮性癌特異的キラーT細胞株(KE4-CTL)により認識される5つの抗原をSART-1SART-5をクローニングし、それらの各種癌における発現、新規の場合は生物学的機能及び、

CTLにより認識されるエピトープ(ペプチド)、さらにはCTL誘導能可能なペプチドの決定等々を実施した。以下その概略を記す。1)SART-1ペプチド:SART-1抗原中にHLA-A24拘束性CTLを誘導できるペプチド分子を同定した。HLA-A26サブタイプの全てにおいてSART-1ペプチドがCTL誘導能を有することを明らかにした。また、腎癌、脳腫瘍、乳癌におけるSART-1抗原の発現を明らかにした。2)SART-2ペプチド:SART-2遺伝子と同抗原ペプチドを解析した。100kdのSART-2抗原はERに選択的に局在し、扁平上皮癌の殆どと一部の肺癌に発現しており、一方正常組織ではその蛋白発現が認められないことより扁平上皮癌ワクチンとして臨床応用可能と判断される。3)SART-3ペプチド:SART-3遺伝子及び同抗原ペプチドを解析した。一方、各種癌におけるSART-3抗原の発現を明らかにした。4)SART-4(lck)ペプチド:転移性癌に高発現する癌拒絶抗原としてのSART-4(lck)分子の解析と転移癌ワクチンとしてのペプチドを同定した。本研究により食道癌に対する特異的免疫機構の分子基盤が構築され、HLA-A24陽性癌に対するペプチドを基盤とした特異的免疫療法の可能性が大きく開拓されたものと考えられる。
フィロストラトス『エイコネス』の古代絵画史的研究

紀元3世紀に2人のフィロストラトスが書いた『エイコネス』(絵たち)は古代エクフラシスの代表作である。本研究では、『エイコネス』各章の記述において、造形の伝統と文学の伝統がどのように混在しているかを精細に考察し、また各作品中の複数場面を明確に区別することに努めた。個々のモチーフや描法、構図が出現したおおよその年代を、場合によってはその特定の典拠まで、推定できる事例は多い。フィロストラトス『エイコネス』全80数章と、彫刻を扱ったカッリストラトス『エクフラセイス』全14章の翻訳註解に加え、エクフラシス、第二期ソフィストなどの問題についても考察し、さらに一部の章について再現図を制作した。羽田(代表者)はフィロストラトス『エイコネス』の翻訳註解を進め、全82章の7割を終えた。傍ら「ヘレニズム・ローマ絵画における風景」について概観する講演を行った。風景画の概念はヘレニズム時代に生まれた。「トピア」(風景、風景画)はギリシア語の「トポス」(場所)から派生したラテン語である。またギリシアからモチーフを継承して独自の神話表現を開拓した古代ケルト美術について考察した。そこに見られる抽象化による変容は、フィロストラトスに代表されるギリシア人の、美術における「アレーテイア」(真実らしさ)への執着を相対化する。佐野(分担者)はエクフラシスや絵画についてはまだ正面から論じていないが、発表論文はその契機を秘めている。ダフニスを配する牧歌は『エイコネス』中では「I.6エロースたち」、および同時代のロンゴス『ダフニスとクローエ』と情景を共有する。アンティゴネー論は「II.29アンティゴネー」に繋がる。山口(協力者)は『エイコネス』中の3章「II.14テッサリアー」「II.16パライモーン」「II.17島々」について論じた。東日本大震災の衝撃を受けて西洋古代文献中の地震に関わる記述をテーマとして研究を続けており、地震の神ポセイドーンに関わる章に取材してその一環とした。また古代の居酒屋について発表した。『エイコネス』にはディオニューソス関係の章が10ほどある。1)昨年度の前半はフィロストラトス『エイコネス』の翻訳註解を進めた(49月)。研究の根幹をなす作業である。2)その傍らフレスコ画制作の講習を受け、古代フレスコ画について文献調査を行った(78月)。ポンペイ壁画に代表される古代フレスコ画に関し、図像だけでなく素材と技術についても古代文献と遺品を照合する研究を踏まえることは、『エイコネス』の翻訳註解に新しい次元を開くものである。3)次いで所属大学における講義を、それまでにできていた原稿をもとに「オリュンピアー神話群」「テーバイ神話群」「アンドロメダーとヘーシオネー」について考察を深める機会とした(93月)。それぞれの神話について、主としてLIMC(古典神話図像事典)に依拠して文献資料と図像資料をほとんどすべて収集し分類し、それぞれの変遷を照合した。『エイコネス』にあっては、「オリュンピアー神話群」には「I.30ペロプス」「III.9ペロプス」「I.17ヒッポダメイア」の三章、オイディプースを中心とする「テーバイ神話群」には「I.4メノイケウス」「I.27アンフィアラーオス」「II.29アンティゴネー」「II.30エウアドネー」の四章が属し、「アンドロメダーとヘーシオネー」は「I.29アンドロメダー」と「III.12ヘーシオネー」の二章からなるが、作業の結果、それぞれのエクフラシスに、ほぼ対応する遺品が数点ずつ存在することが判明した。成果の一部は今年度論文でも発表する。4)そこから再現画制作の企画が具体化した。対応遺品を核として、来年度まとめて描く予定である。近世にティツィアーノやプッサンが『エイコネス』のテクストに触発されて独自の絵を創造したが、古代文献と古代遺品の悉皆調査に基づく恣意的でない再現画の試みはまだ行われていない。本年度もフィロストラトス『エイコネス』の翻訳註解を進めた。これまでは研究課題名に示したようにギリシア絵画史の視点を重視してきた。しかし註解作業の中で、古来識別されてきた4人のフィロストラトスのうち最も優れた一人の手になると目される『エイコネス』(およびその「孫」による『エイコネス』)以外の全作品ー『テュアナのアポッローニオス』『ソフィスト列伝』『ヘーローイコス』『体育論』『書簡集』「ディアレクシス」「ネロー」ー、さらにはパウサニアース、ルーキアーノス、アキッレウス・ターティオス、ヘーリオドーロス、カッリストラトスなどのエクフラシスについても包括的に知る必要が痛感されたため、それらの読解にも時間を割いた。フィロストラトス『エイコネス』(絵たち)に関する研究は、従来主として次の二つの関心から行われてきた。一つは古典文献学の側から、いわゆる第二期ソフィストの弁論における修辞学の文献の一つとして。二つにはルネサンス以降の絵画史の側から、『エイコネス』のエクフラシス(美術作品の修辞的記述)と、それに基づいてティツィアーノやプッサンが描いた絵画との比較への関心からである。しかし何よりも最初になされるべき研究、すなわち『エイコネス』に記述された計80数点の絵画と、古代遺品の図像との体系的な比較照合は最近まで行われなかった。

古代遺品の整理分類が進んでいなかったためである。そうした状況を一挙に打開したのがLexicon Iconographicum Mythologiae Classicae, 1981-1999; 2009の刊行である。それ以後、神話画と古代遺品との図像学的照合は遙かに容易になった。『エイコネス』と古代遺品の照合が盛んになったもう一つの要因は、陶器画ではなく、古代の大型絵画の実際の描法に近い、大理石や漆喰の上に描かれた絵画遺品の陸続たる発見と、それに対する自然科学的研究の進展である。こうして図像学とは別の視点からも研究が進んだ。古典文献学的手続きの上でも絵画史的註解という意味でも、これまでで最も優れた『エイコネス』の註解はO. Schoenberger et al., Philostratos: Die Bilder, 1968であるが、上記2つの意味で、今ではきわめて不十分と言わざるを得ない。これを更新することが本研究課題の目標であった。最終年度は、以上すべての視点・問題意識からこれまで4年間追究してきた成果をまとめることに努めた。今後、彫刻に関するエクフラシスの代表作であるカッリストラトス『エクフラセイス』の註解を加えて、2017年に刊行する予定である。紀元3世紀に2人のフィロストラトスが書いた『エイコネス』(絵たち)は古代エクフラシスの代表作である。本研究では、『エイコネス』各章の記述において、造形の伝統と文学の伝統がどのように混在しているかを精細に考察し、また各作品中の複数場面を明確に区別することに努めた。個々のモチーフや描法、構図が出現したおおよその年代を、場合によってはその特定の典拠まで、推定できる事例は多い。フィロストラトス『エイコネス』全80数章と、彫刻を扱ったカッリストラトス『エクフラセイス』全14章の翻訳註解に加え、エクフラシス、第二期ソフィストなどの問題についても考察し、さらに一部の章について再現図を制作した。『エイコネス』の翻訳註解に手間取ったため研究期間を一年延長した。古代ギリシア文化圏美術最終年度『エイコネス』に一応のまとまりをつけた上で、その後もフィロストラトスとエクフラシスについての研究を継続する所存である。本研究で予定していた海外研究者との共同研究は、その中で果たしたい。今年度は順調に推移したが、初年度の遅れを取り戻すには至らなかった。昨年度はフィロストラトス『エイコネス』の翻訳註解を80%ほどまで終える予定であったが、所属大学で急遽その内容を紹介する講義を任されたため、あまり前に進めなかった。しかし、全80数章中10章ほどについては特に深く考察する機会となった。研究期間内に『エイコネス』の翻訳註解を仕上げるため、研究期間を一年延長した。羽田の『エイコネス』執筆が遅れているため、最終年度開催予定の国際シンポジウムを一年延期し、研究期間を一年延長する予定である。26年度、羽田は『エイコネス』の翻訳註解を完成し、出版社に原稿を渡す。ナラティヴ、テクストとイメージ、『エイコネス』各章の組合せ原理、構図、ギリシア・ローマ絵画における素材と技法についても概観する。佐野、山口はシンポジウム発表論文を準備する。27年度、同書を刊行。それに合わせて海外協力者23名を日本に招聘して、『エイコネス』ないしエクフラシスに関するシンポジウムを開催する。日本側発表者は羽田、佐野、山口ほか数名を予定。可能であれば会場に『エイコネス』の数章の再現画を展示する。論文集の刊行は研究期間終了後になる。
ペリネイタル・ロスによる心理的問題の実態調査と支援プログラムの開発

ペリネイタル・ロスは死産、流産など周産期に起こる、新生児死亡のことを指す。ペリネイタル・ロスを経験した母親の悲嘆プロセスは1年以上持続するといわれ、不安、抑うつ、心的外傷後ストレス障害などのメンタルヘルスの問題との関連が指摘されている。本研究の目的はペリネイタル・ロスのケアに関する前向き調査を含めた精度の高い実態調査を行いペリネイタルロス当事者とその関係者に対する心理的支援法のニーズを確認することである。また、行った調査の結果や海外の支援プログラムをもとに本邦における標準的な本人と関係者に対する支援プログラムを作成し効果を確認することである。本年度は,調査用のウェブフォーマットの作成と,事例研究を行った。1.ウェブフォーマットの作成:面接調査への参加をつのり、事前情報を得るためにWebによるアンケートフォームを作成した。なお、アンケートフォームは現在テストページの状態としている。2.事例研究:先行して行っている聞き取り調査の事例について分析を行い、事例研究として発表を行った。また、助産師・看護師からの聞き取り調査も行った。助産師・看護師からの聞き取り調査の結果をもとに、経験者に対する本調査の項目内容についてブラッシュアップを行っている。これまで調査に協力いただいていた滋賀医科大学精神科にて研究協力者が異動となったことから研究にかかわる人間が大きく変わることとなり体制の再構築が必要となった。このため、研究遂行に大きな遅れを呈している。調査を協力していただいていた滋賀医科大学にて研究協力者が異動することに伴い、調査体制の見直しを迫られたた。また、昨年後半に主任研究者が体調不良となったことから大幅に作業が遅れることとなった。現在、調査体制の再整備を早急に進めているが、研究計画の見直しが必要となる見通しである。県内の基幹病院に協力を依頼し、聞き取り調査を行うための対策を図る予定である。それによりデータ収集を進めていく。データ収集の進行度に伴い、逐一中間解析を行い、研究のfeasibilityを高める工夫を行う。研究の遅れにより、研究計画の修正を行う予定である。特にデータの信頼性を確保すべく、研究機関の修正を予定している。研究目的はペリネイタル・ロスのケアに関する前向き調査を含めた精度の高い実態調査を行うことと,本人と家族に対する支援プログラムを作成することである。本年度は,海外の文献研究と,事例研究を行った。1.文献研究ペリネイタル・ロスのケアに関する海外の研究を調査し,システマティックレビューを行いつつ,我が国と海外のケアの実態の差について検討を行った。2008年以降に報告された83報の論文のうちメンタルヘルスケアについて主題として取り上げられていた67件の文献について精読し検討を行った。メンタルヘルスケアについてはランダム化比較試験などの報告は少なく,コホート研究や前後比較についての研究が中心を占めていた。また,脆弱性因子についての研究なども行われていた。2.事例研究遷延したうつ病の背景にペリネイタル・ロスが関与していた事例について,実践過程を振り返り事例研究を行った。また,夫婦で早期来談された事例についても事例研究を行った。3.前方視的調査体制の構築滋賀医科大学精神科,新潟大学産婦人科などと前向き研究を行うための準備を行った。後方視的研究のための患者会へのアクセスとウェブ調査についての準備が遅れており,未だ着手に至っていない。すでに質問項目などは定まっているため,早急にウェブ調査を実施できる体制を整え,前方視的調査のための準備を整える。協力組織の力も借りて速やかに前方視的調査を開始する。

研究の遅れにより、研究計画の修正を行う予定である。特にデータの信頼性を確保すべく、研究機関の修正を予定している。当該年度に使用予定であった人件費などが研究の遅れから使用されなかったため。研究体制の再構築などに伴い進捗が遅延している。このため、本来今年度行うはずであった支援プログラムの開発などの作業が行えず残額が発生した。
早期な新生骨形成が可能な生体骨アパタイトを利用したインプラント表面処理法の開発

通常の歯科インプラント手術は骨形成に3-6ヶ月の治癒期間がかかる。インプラント治療のアンケート調査では、治療期間が長く不満を挙げる患者が76%と高い結果を示している。よって、インプラント治療は従来法よりも更に治療期間の短縮が必要である。本研究は新規な生体骨アパタイトをインプラントにコーティングする表面処理法を開発し、埋入後に形成される早期な新生骨形成と骨質向上を明らかにする。生体骨アパタイト表面処理法の開発は治療期間が短縮し、QOLの向上や生体骨アパタイトの医療発展に寄与することが期待できる。
子宮癌および卵巣癌由来の抗癌剤耐性癌に対する耐性克服分子標的療法の開発

【1】エピジェネティクス制御による抗癌剤耐性克服法の検討(1)プロモーターメチル化制御と抗癌剤感受性変動:我々はCDDP耐性化子宮頚癌細胞の脱メチル化実験で新CDDP耐性化機序(強力なRNA翻訳障害)を報告した。そこで、同癌種での他抗癌剤耐性と脱メチル化効果、他CDDP耐性癌種(特に卵巣癌)と脱メチル化効果、を検討したところ、脱メチル化はtopo-Iinhibitor耐性を部分的解除し(論文執筆中)、topo-II inhibitor耐性はCDDP耐性同様、プロモーターメチル化と相関した。脱メチル化抗癌剤感受性回復に関与する分子は、mRNA発現プロファイリングでは見出せていない。細胞内シグナル阻害剤と脱メチル化処理の併用解析からも、抗癌剤感受性回復シグナル同定には至っていない。(2)DAPK発現制御と抗癌剤感受性の解析:メチル化制御を受けやすいDAPK発現はCDDP耐性化機序と関連することから、脱メチル化処理とDAPK発現、siRNA-DAPK発現ノックダウン制御、につき解析した。脱メチル化後耐性克服度とDAPK発現は弱い逆相関を認めたが、DAPK以外のメチル化制御分子の寄与が大きいと結論した。DAPK発現ノックダウン制御は、CDDP耐性とVP16耐性を部分的克服し、5FU耐性を完全克服した。【2】漢方成分由来の抗癌剤アポトーシス抑制シグナルの同定と分子標的療法開発:生薬有効成分に強力な抗癌剤抑制活性を見いだし(論文執筆中)、このアポトーシス抑制現象の細胞内シグナルを突き止めるべく、以下の実験を行った。(1)生薬成分添加に伴う分子応答の解析(論文執筆中):MAPKK関与とDAPK発現の関与が認められたが、現在も検証中である。(2)生薬成分添加に伴う細胞内シグナル応答解析:mRNAprofiling、siRNA実験を検証中である。本研究では、以下の2つの研究課題に分けて、抗癌剤耐性克服法の開発を行なってきた。【1】エピジェネティクス制御による抗癌剤耐性克服法の確立特にこれまでの実験で耐性克服が確定しているDAP kinaseの発現制御を中心に研究を進めると同時に、DAP kinase以外の関連分子の検索も行ってきた。(1)siRNAを用いたDAPK発現ノックダウン制御による抗癌剤感受性変動メカニズムの詳細な解析:この実験で新しいCDDP耐性化機序(強力なRNA翻訳障害)を発見した。(1)細胞内シグナル伝達阻害剤によるシグナル制御のスクリーニング。(2)遺伝子発現プロファイリングによる遺伝子発現変動分子の特定と検証。抗癌剤耐性株細胞・親株細胞におけるmRNA発現プロファイリングとDAP kinase発現とDAP kinase promotorメチル化と抗癌剤耐性レベルとの相関性の比較を行なってきた。現在はデータ整理中である。【2】漢方成分由来の抗癌剤アポトーシス抑制シグナルの同定とsiRNAによる分子標的療法の開発:本研究内容はメチル化制御では克服できない抗癌剤の耐性化を克服できる可能性に関する研究である。漢方薬由来成分によるアポトーシス抑制現象の細胞内シグナルを突き止め、その制御法を見いだすことができれば、メチル化制御では克服できない抗癌剤耐性について別の克服療法を開発できることを示している。データ解析から結論が明確となれば、以下の2計画を開始する。(1)抗癌剤アポトーシス阻害物質添加に伴う癌細胞の分子応答の解析と発現制御実験を行なう。(2)抗癌剤アポトーシス阻害物質添加に伴う癌細胞の細胞内シグナル応答の解析と発現制御実験を行なう。【1】エピジェネティクス制御による抗癌剤耐性克服法の検討(1)プロモーター

メチル化制御と抗癌剤感受性変動:我々はCDDP耐性化子宮頚癌細胞の脱メチル化実験で新CDDP耐性化機序(強力なRNA翻訳障害)を報告した。そこで、同癌種での他抗癌剤耐性と脱メチル化効果、他CDDP耐性癌種(特に卵巣癌)と脱メチル化効果、を検討したところ、脱メチル化はtopo-Iinhibitor耐性を部分的解除し(論文執筆中)、topo-II inhibitor耐性はCDDP耐性同様、プロモーターメチル化と相関した。脱メチル化抗癌剤感受性回復に関与する分子は、mRNA発現プロファイリングでは見出せていない。細胞内シグナル阻害剤と脱メチル化処理の併用解析からも、抗癌剤感受性回復シグナル同定には至っていない。(2)DAPK発現制御と抗癌剤感受性の解析:メチル化制御を受けやすいDAPK発現はCDDP耐性化機序と関連することから、脱メチル化処理とDAPK発現、siRNA-DAFK発現ノックダウン制御、につき解析した。脱メチル化後耐性克服度とDAPK発現は弱い逆相関を認めたが、DAPK以外のメチル化制御分子の寄与が大きいと結論した。DAPK発現ノックダウン制御は、CDDP耐性とVP16耐性を部分的克服し、5FU耐性を完全克服した。【2】漢方成分由来の抗癌剤アポトーシス抑制シグナルの同定と分子標的療法開発:生薬有効成分に強力な抗癌剤抑制活性を見いだし(論文執筆中)、このアポトーシス抑制現象の細胞内シグナルを突き止めるべく、以下の実験を行った。(1)生薬成分添加に伴う分子応答の解析(論文執筆中):MAPKK関与とDAPK発現の関与が認められたが、現在も検証中である。(2)生薬成分添加に伴う細胞内シグナル応答解析:mRNAプロファイリング、siRNA実験を検証中である。
神経因性疼痛におけるモルヒネ抵抗性形成の分子機序の検討

近年小胞体ストレス反応が神経変性疾患や躁うつ病、糖尿病を始めとする数々の疾患に関与していることが示唆されている。我々は、野生型マウスを用いて神経因性疼痛モデルを作成して化学シャペロンをモルヒネと併用投与し、野生型神経因性疼痛モデルマウスにおけるモルヒネ抵抗性が抑制されるかどうかを検討した。化学シャペロンは小胞体ストレス反応を抑制し、疼痛が抑制される傾向が見られた。小胞体ストレス反応とmuオピオイド受容体の細胞内情報伝達系との関連をin vivoで検討するために、野生型マウスおよび変異Bipマウスを用いて神経因性疼痛モデルを作成し、モルヒネ抵抗性を検討した。これらのマウスは少なくとも生後6ヶ月程度までは表面的には異常は認あられていない。モルヒネの鎮痛効果は熱刺激を加えるホットプレートテストとプランターテストで評価した。ホットプレートテストの結果はマウス間での比較のため、反応時間は%MPE(% maximum possible effect=(測定値-基準値)/(最大値-基準値)×100)として算出し、モルヒネに対する時間反応曲線を得た。またプランターテストでは患側と健側の比較を行った。テスト後にマウスの脳、脊髄を摘出し、組織学的に、また、生化学的に、GSK3βなどの細胞内情報伝達分子やBipなどの分子シャペロンの発現を調べ、モルヒネの鎮痛効果との相関を検討した。また臨床的に投与可能な薬剤として、内因性の胆汁酸の成分である、taurine-conjugated ursod eoxycholic acid(TUDCA)をモルヒネと併用投与して、野生型神経因性疼痛モデルマウスにおけるモルヒネ抵抗性が抑制されるかどうかを検討を行った。TUDCAはシャペロンとして機能し小胞体ストレス反応を抑制すると考えられるが、詳しい機序は引き続き検討を行う予定である。また、GSK3β阻害活性を持つバルプロ酸をモルヒネと併用投与して同様の検討を行っている。小胞体機能が虚血、再還流、低栄養、低酸素、スーパーオキシド、毒物などの外界からの侵襲や遺伝子変異によって阻害されると、小胞体内に折りたたみ構造の異常な蛋白質が蓄積し、分子シャペロンの産生増加、蛋白合成の抑制、異常蛋白質の分解、細胞死といった小胞体ストレス反応が起こる。近年こうした小胞体ストレス反応が神経変性疾患や躁うつ病、糖尿病を始めとする数々の疾患に関与していることが示唆されている。我々は野生型マウスを用いて神経因性疼痛モデルを作成し、モルヒネ抵抗性を検討した。投与薬剤は内因性の胆汁酸の成分である、taurine-conjugated ursodeoxycholic acid (TUDCA)をモルヒネと併用投与し、野生型神経因性疼痛モデルマウスにおけるモルヒネ抵抗性が抑制されるかどうかを検討した。モルヒネの鎮痛効果は熱刺激を加えるホットプレートテストやプランターテストで評価した。テスト後にマウスの脳、脊髄を摘出し、組織学的に、また、生化学的に、GSK3βなどの細胞内情報伝達分子やBiPなどの分子シャペロンの発現を調べ、モルヒネの鎮痛効果との相関を検討した。TUDCAはシャペロンとして機能し小胞体ストレス反応を抑制する傾向がみられた。また、GSK3β阻害活性を持つバルプロ酸をモルヒネと併用投与して同様に検討を行ったが、バルプロ酸もシャペロンとして機能し小胞体ストレス反応を抑制し疼痛が抑制される傾向がみられた。
歯髄感覚受容性視床ニューロンの大脳皮質第一次体性感覚野への投射様式に関する研究

本研究は視床に存在する歯髄駆動ニューロン(視床TPN)が、どのような投射様式で大脳皮質第一次体性感覚野(SI)に歯髄感覚情報を送っているかを明らかにすることにより、三叉神経系侵害感覚情報処理に対する視床-SI系が果たす役割を明らかにすることを目的とした。当初、以下に示す3つのテーマを掲げ研究をスタートした。第1は視床TPN軸索の大脳皮質における分布様式の電気生理学的検索、第2は視床TPN軸索の大脳皮質内分布様式の解剖学的検索、第3に電気生理学的に同定された視床TPN軸索の皮質内分布様式の検索である。本研究の結果から、歯髄感覚入力を受ける視床TPNはSIの異なる場所にクラスターを形成して投射していることが明らかになった。これまでの研究により、SIは機能円柱というカラムにより構成されており、各々の感覚情報は異なるカラムの中に存在するニューロンに投射し、各カラムは類似の感覚情報処理を行っているとされていた。しかし、本研究結果から、侵害情報はこのカラムを超え幾つかの異なる皮質領域に分布する侵害受容ニューロンに投射する可能性が示唆された。この結果から、侵害感覚は低閾値感覚と異なり、視床に存在する少数の侵害受容ニューロンが一度に多数の大脳皮質第一次体性感覚野ニューロンを同時に活性化し、これにより侵害刺激に対し生体がより迅速に対処できるように機能しているものと考えられる。単一の視床TPN軸索内にトレーサーを注入し、単一ニューロンレベルでの解析を試みたが成功していない。しかし、今回得た電気生理学的方法による結果およびPHA-Lを用いたトレース実験の結果により、視床に分布する歯髄駆動ニューロンが大脳皮質第一次体性感覚野にいかなるメカニズムで歯髄感覚情報を送っているかについては、ほぼ解明されたと考える。本年度は、歯髄刺激に応答する歯髄駆動ニューロン(TPN)活動を視床後内腹側(VPM)核から記録し、大脳皮質第一次体性感覚野の微小刺激に対する逆方向性応答を指標に、視床TPN軸索の皮質内分布様式を詳細に検索した。また、VPM核内の歯髄感覚入力投射部位に神経トレーサーであるPHA-Lを微量注入し、大脳皮質内における軸索分布様式についても併せて検索した。その結果、視床TPNはVPM核の尾側部から多く記録され、皮質内微小刺激により逆方向性応答を誘発する皮質内刺激部位は冠状回中央部から前方部を中心とした3a野および3b野の両領野に位置していた。これら皮質領域は、VPM核内へのPHA-L注入により順行性に標識された軸索終末の分布領域とほぼ一致とていた。軸索終末の分布領域は、細胞構築学的分類から3a野および3b野のIII層を中心とした領域に相当していた。さらに、微小刺激実験の結果から、TPN軸索は皮質内において、クラスター状を成して分布していることが示唆された。このような皮質内における軸索のクラスター状の分布は、PHA-Lを用いたトレース実験においても観察された。今年度は、平成7年度に行った研究をさらに進め、皮質内における視床TPNが3a野および3b野内において同一の分布様式を示すのか、また各視床TPNの軸索投射様式と受容野特性との関係についても検索を進める。さらに、視床TPNの単一軸索内にneurobiotinを注入することにより、その皮質内分布様式についても併せて検索を進めることを計画している。

本年度は、前年度により同定した視床TPN分布領域に順行性トレーサーであるPhaseolus vulgaris-leucoagglutinin(PHA-L)を微量注入し、視床ニューロン軸索の大脳皮質第一次体性感覚野への投射様式を詳細に検索した。実験には、ケタラール(50mg/kg,i.m.)およびハロ-セン(2-3%)で麻酔した成ネコを用いた。PHA-L注入に先立ち、視床内における歯髄感覚入力投射部位を同定するため、片側の上下顎犬歯歯髄を電気刺激し、multiple unit活動を記録した。視床TPN活動が多数記録された部位を同定後、その中心部にハミルトンシリンジの先端にガラス管を装着した微小ピペットを用い、PHA-Lを微量注入(0.04-0.08μl)した。動物を2週間生存させた後にネンブタールで深く麻酔し、4%パラフォルムアルデヒドにて灌流固定し、厚さ50μmの連続前額断組織標本を作製する。各組織切片をgoat anti-PHA-Lにincubateし、ABC法(Vector Lab.)により反応させ、DAB(3,3'-diaminobenzidine-tetra HCl)によりPHA-L陽性軸索を発色した。PHA-L陽性軸索は、前年度の実験で明らかになった領域、すなわち大脳皮質第一次体性感覚野の顔面口腔領に多数見い出された。また、これらのPHA-L陽性軸索は大脳皮質内においてクラスターを成して分布していた。しかしこのクラスターは、皮質刺激に対する逆方向性応答を指標に調べた実験により同定されたクラスターより空間的に広い分布を成していた。また、皮質内においては、第III層および第V層を中心に分布していた。以上の結果から、個々の視床歯髄駆動ニューロンはPHA-Lトレース実験で得たよりも小さなクラスターを有する可能性が示唆された。前年度までネコを用いて、視床歯髄駆動ニューロン(TPN)軸索の大脳皮質第一次体性感覚野(SI)口腔領への投射様式について、視床TPNに逆方向性応答を誘発するSIにおける刺激部位の分布様式の検索、およびPHA-Lトレース法を用いた複数視床TPN軸索終末のSI内分布様式の検索等を行って来た。その結果、視床TPNの軸索はSI内において、クラスター状を成して分布していることが明らかになった。本年度はさらに、ラットの視床TPN活動を細胞内記録し、neurobiotinを細胞内注入し、視床TPN軸索のSI投射様式を検索した。実験にはnenbutal Na(50mg/kg,ip)で麻酔したSD系ラットを用いた。ラットの上下顎中切歯および臼歯に双極ステンレス線電極を装着し歯髄を電気刺激した。動物を脳定位固定装置に装着し、視床後内腹側(VPM)核から単一ニューロン活動を細胞内記録した。視床内において、多くのTPNはVPM核の内側部領域から検出された。視床TPNは約5-10msの応答潜時を有し、そのほとんどが口腔内あるいは顔面皮膚の触刺激に反応するマルチモダール型TPNであった。現在、視床TPNの細胞体および樹状突起の形態を明らかにするまでには至っていないが、さらに本研究を継続し単一視床TPN軸索のSI投射様式を解明したいと考えている。
膜結合型カルシウム非依存性ホスホリパーゼA2(iPLA2γ)の生体機能の解析

本研究では、機能が明らかになっていないiPLA_<2γ>について、その遺伝子欠損マウスの解析を行い、iPLA_<2γ>の生体内の機能を明らかにすることを目指した。その結果、iPLA_<2γ>欠損マウスは通常飼育下において、成長遅延、筋力低下など外見上明白な表現型を示すことが明らかとなった。さらに、欠損マウスの筋肉組織中で、ミトコンドリアの主要構成脂質であるカルジオリピンや、その他のリン脂質が変化していることを見出した。本研究では、iPLA2γ遺伝子改変マウス用いた解析により、特に明らかな表現型が認められた筋肉組織、脂肪組織、血小板・血液凝固おける本酵素の機能を解明することにより、本酵素の生体内における特有の機能を解明すると共に、本酵素をターゲットとした治療薬の発見を目指している。本年度は以下のことを明らかとした。筋肉組織における解析iPLA2γ欠損マウスの筋肉組織では、ミトコンドリアの消失及び機能障害が生じていることが明らかとなった。また、筋肉組織中の過酸化脂質量の増加を始めとする酸化ストレスが生じていることが明らかとなった。さらに、欠損マウスの筋肉組織ではミトコンドリアの主要構成脂質であるカルジオリピン量が野生型のものと比べて有意に減少した。脂肪組織における解析野生型とiPLA2γ欠損マウスの胎児から胎児由来線維芽細胞MEFを調製し、脂肪細胞へ分化誘導させたところ、iPLA2γ欠損マウス由来のMEFは野生型のものと比べて脂肪細胞への分化、すなわち脂肪の蓄積が少ないことが明らかとなった。血小板における解析野生型あるいはiPLA2γ欠損マウスから、血小板を単離して、血小板を活性化する作用をもつコラーゲン、ADP、トロンビン、U46619(トロンボキサン受容体活性化剤)で血小板を刺激し、この時の血小板の活性化の度合いを、凝集の度合い、トロンボキサンA2産生量、ATP放出量を測定することで評価した。その結果、iPLA2γを欠損した血小板はADPで刺激した際の凝集度合いとトロンボキサン産生量が野生型のものと比べて有意に減少することが明らかとなった。また、コラーゲンで刺激した時のトロンボキサン産生量も欠椙マウスで有意に減小した。血小板における解析本年度は、生体レベルでの血小板機能を明らかとするために野生型マウスと欠損マウスを用いて解析を行った。その結果、欠損マウスは出血時間が野生型に比べて優位に延長した。さらに、コラーゲン・エピネフリン誘発性血栓症モデルを用い、病態時における血小板凝集について検討した。この検討によっても欠損マウスでは血栓症が軽減することが明らかとなった。
ＷＥＢ文書の動的な読解支援システムに関する研究

インターネット文書の読解支援を動的に行うためのユーザインターフェース技術ならびに自然言語処理上の研究を行った。特に、ユーザがweb文書をブラウザで閲覧している際に、文書部分に関してアクションをとると、関連する情報を取得してユーザに動的に提示するweb mash up技術を中心に研究を進めた。内容は、web mash upをブラウザと連携して行うクライアントと、関連情報を抽出するサーバの研究に分かれる。クライアントについては特許を取得し産学連携上の成果につながり、プロトタイプを共に構築した学生が起業しその会社が育った。また、サーバに関しては関連情報を抽出する手法に関して種々の研究成果が挙がった。文書を閲覧する際、語学能力や知識の不足により、文書の内容を完全には理解することができなかったり、解釈判断に困ることがある。本研究の目的は、動的な文書処理を用いて、ユーザの文書閲覧上の支援を行う言語技術を構築することである。本研究目的には、クライアントとしてのユーザインターフェースからの研究と、サーバとしての自然言語処理に基づくソフトウエアの研究の二つの側面がある。(1)クライアントに関しては、ブラウザ閲覧時にユーザアクションに基づき、閲覧を補助する情報を提示するweb mash upのための汎用インターフェースの研究を行う。(2)サーバに関しては、汎用インターフェースと共に用いるもので、翻訳、文書の有害性判定、マーケッティングの三つの応用を提案した。web文書を閲覧する際、語学能力や知識の不足により、文書の内容を完全には理解することができなかったり、解釈判断に困ることがある。本研究の目的は、昨今研究がさかんなweb mash up技術を用いて、web文書閲覧時のユーザ支援を行うことである。具体的にはユーザがブラウザを用いてweb文書を閲覧する際、入力デバイスを用いて文書部分について指示を行うと、ブラウザpluginがその部分に関する補助情報を所定サーバと通信して取得し、提示する。この予算の目的は、web mash upのためのクライアントに関する研究と、自然言語処理を用いた各種応用サーバの研究である。本年度の成果は大きく分けて二つである。第一に、クライアントに関して、共に研究してきた学生が夏に起業し、それまでの蓄積を産業移転し、クライアントは誰でもダウンロード可能となった。本研究では、クライアントの産業移転を申請当初掲げていたが、その意味で一つの目標は達成された。起業は特許に基づき、また競合システムも今年度は多かったため、成果を公知のものとする論文は戦略上書くことができなかった。これも含め、産業移転と研究は切り分けが難しく、初年度はこの意味で大きな経験をした。今年度はクライアントについての学術上の成果発表を行っていきたい。第二にサーバの研究については、マーケッティング、セキュリティ、語学学習の3つの応用について当初申請した。web mash upに関する研究は今まさに旬で、産業上多くの競合者がいる。本研究の独自性を出すため、応用サーバの具体的内容は、申請当初から分野範囲内で少し変化させた。まず、マーケッティング応用に関して、当初は関連商品を提示することを提案していたが、既存研究が多い。一方、経済新聞のマイニングのニーズが高まっており、ユーザが株などの経済記事を閲覧中に類似内容中の差分をポラプアップ表示するものを構築した。現在精度向上のための基礎研究をしている。第二に、セキュリティ応用に関しては、当初悪質サイトの自動検出を提案したが、既存のウィルス検知ソフトウエアなどで確立した技術がある。一方、学生や研究者の剽窃防止が問題となっており、その検知サーバを現在構築中である。剽窃では二つの文書を付き合わせる必要があり、web mash upは効果的である。第三の語学学習応用については、当初翻訳サーバと関連技術を構築することを提案したが、競合技術が多く技術的にもトリビアルなものが多い。そこで、外国語文書を閲覧する際の総合的な支援サイトを現在設計中である。特に、外国人が日本語文書を閲覧する上での支援、そして日本人が外国語文書を閲覧するする上での支援の二つを目指す。初年度は、研究代表者が内科関連の病気(腫瘍)になり、9月と3月末に二回入院の上、手術を行った。このため、定期的な各種検査のため国際会議への出席を予定することができず、当初予定していた今年度の旅費は、謝金や物品購入のために用いた。これを原因として今年度は本予算に直接関連する論文成果はなく,次ページに示した論文成果は本研究で将来利用することができる要素技術で、今年度出版されたものである。今年度は成果発表に務めたい。本研究の目的は、昨今研究がさかんなweb mash upの技術を用いて、ユーザのこのような閲覧上の問題に対する支援を行うことである。研究は、web mash upのためのクライアントならびに自然言語処理を用いた各種応用サーバの研究の二つの側面がある。

前者については、初年度に共に研究してきた学生が起業したことにより、クライアンはフリーダウンロードできる状況となっている。後者については、研究課題採択当初の提案の新規性に問題があることが明らかとなり、二年目は研究の方向性を再考して課題を推進した。具体的には、語学学習やセキュリティなどといった分野別の応用の軸でweb mash upを捉えるのではなく、web mash upを行うために必要な基本的機能とは何かに焦点を当て、その観点で問題を捉え直した。Web mash upとは「異種の文書を動的に有効に扱う方法の研究」であり、この観点で、以下の三つの軸を立てている。●多言語文書処理:1.異なる言語の文書を含む文書集合から、同じ内容の文書を抽出する方法:ある新聞記事を読んでいる際に、別言語で同じ内容の記事を提示したい。このためには「異言語文書集合を内容別に分類する」ことが必要となり、このための基礎研究を行う。2.文書内の異言語を動的に検出する方法:昨今のweb文書は、異なる言語が入り乱れている。たとえば、アフリカの言語で記述されたwikipediaはその中に英語が多く混じっている。現在の言語処理手法は言語別に構築されているので文書内のある一部分が何語であるかを動的に判定することが必要となる。●言語汎用の言語解析手法の基礎的研究:現在の言語処理手法は言語別に構築されており、これがweb mash upを行う上で大きな問題となる。なぜなら、文書がまずどのような種類かを特定しなければ、どの解析器を用いるべきかが決まらないからである。そこで、さまざまな解析器を言語汎用のものとして構築する基礎研究を行っている。この点、言語汎用の形態素解析器の研究では研究上の成果が申請者の手によりすでにあるため、本課題では、言語汎用の構文解析器の研究に取り組む。●「今ここ」の情報抽出と処理:web mash upなどの動的な処理において、最重要の情報とは「今ここ」に関するものである。昨今のTwitterの人気などは、この点を如実に反映している。本研究では、「今ここ」を現す情報を抽出し、効果的に提示する方法を研究し、提案する。なお、この軸の変更は、研究をより活発にするためのweb mashp upの捉え方の変更に過ぎず、研究の目的は当初より変更はない。最後になるが、代表者は、初年度に引き続き二年目も健康上の問題に対処しながら課題を推進せざるを得なかった。このため、代表者自身は一度も国際会議に参加することができず、その分の旅費を返納した。とはいえ、研究は計画どおりに進んでおり、特に問題はない。文書を閲覧する際、語学能力や知識の不足により、文書の内容を完全には理解することができなかったり、解釈判断に困ることがある。本研究の目的は、動的な文書処理を用いて、ユーザの文書閲覧上の支援を行う言語技術を構築することである。
海馬記憶神経回路においてニューロン新生が持つ調節機構の解明

平成二十九年度は前年度に得られた結果を基に、作製されたダブルトランスジェニックマウスを使用して記憶関連細胞群の時間経過に伴う変化をより明確にすると同時に、遠隔記憶時に再活性化する細胞群の機能性についての解析を進めた。1.記憶想起のタイミングを変え、海馬歯状回において各時点で活性化される細胞群の比較を行った。実験の結果から、遠隔記憶となった時間枠では、同じ記憶の想起においても近時記憶よりも記憶関連細胞群の再編成が行われにくいことが示唆された。2.オプトジェネティクスの手法を用いた活性操作を行ない、同領域の遠隔記憶関連細胞群について機能性の評価を行なった。上記の標識系に使用した遺伝学的ツールと対応したウイルスベクター発現系を作成し、任意の細胞群に限局してChR2(チャネルロドプシン)をはじめとする細胞活性操作が可能な遺伝子を発現する系を作成した。まず、ChR2を遠隔記憶想起時に活性化した細胞群に発現させ、その後光照射により同細胞群を人為的に再活性化させた。また、同じウイルスベクター発現系を用いて細胞活性化を抑制するArchT(アーキオロドプシン)を同様に発現させ、活性を人為的に抑制した。以上の結果から、遠隔記憶想起時に活性化した神経細胞群の再活性化により記憶想起が誘導されること、また反対に同細胞群の抑制により、記憶想起が抑制されることが示された。まとめると、海馬領域は近時記憶のみならず、遠隔記憶の想起プロセスにもなんらかの機能を有していることが推測される。先行研究は海馬機能が不全であったとしても記憶想起ができることを示したが、本研究より、海馬機能は遠隔の記憶想起に際し不要ではなく、大脳新皮質領域とはまた別の想起プロセスにも関与するものと考えられる。29年度が最終年度であるため、記入しない。平成二十七年度は、恐怖条件付け課題による記憶形成・想起の手法の確立、それぞれのフェーズにおける記憶関連細胞群の標識、定量、解析方法の確立を行った。1)トランスジェニックマウスにおける活性化細胞群を標識するレポータータンパク質の発現条件の検討本研究で用いるダブルレポーター発現トランスジェニックマウスは、神経細胞の活動依存的かつ薬剤投与依存的に引き起こされるリコンビネーションによりレポータータンパク質を発現する。そこでより正確な活性化細胞群標識を行う為に、刺激入力の時間に対する投薬のタイミング及び薬剤の検討を行いマウスでのリコンビネーション効率について測定した。結果、刺激入力と薬剤投与をほぼ同タイミングにおこなった際にリコンビネーション効率が最大になることが分かった。さらに新規環境に曝露させたマウスでの細胞群標識により、生理的活性でのレポータータンパク質による標識の期間を測定したところ、同一細胞で最低でも一ヶ月以上標識しつづけることが可能であることが分かった。2)記憶関連細胞群の定量方法の確立記憶制御プロセス群の解明のために多用される記憶形成の手法に恐怖条件付け課題がある。最初に恐怖記憶条件付けの条件刺激、非条件刺激のパラメータを振って課題を行い、本研究で使用するトランスジェニックマウスの記憶形成・想起に適した恐怖条件付けの手法を確立させた。次に課題時に標識された記憶関連細胞群について、固定した脳切片上における標識細胞の定量、解析を行うための手法を確立した。初年度おける成果として、ダブルトランスジェニックマウスにおいて最適な活性化神経細胞群標識手法、恐怖条件付けを用いた記憶形成の実験系、固定した脳切片の免疫染色サンプルをもとにした標識細胞集団の解析手法といった本課題全体の基盤となる技術を確立することが出来た。A.記憶想起時活性化細胞群の定量恐怖記憶条件付けによる記憶形成を施したダブルトランスジェニックマウス用い、記憶形成後に恐怖を与えた環境に曝露して恐怖記憶を想起させ、その際の海馬歯状回領域における活性化細胞群を蛍光タンパク質で長期標識した。それぞれのインターバルの後、マウスを同じ環境に暴露し恐怖記憶を遠隔記憶として想起させ、この時点での活性化細胞群を別の蛍光タンパク質発現で一過的に標識した。各時点における標識された細胞群の定量と局在比較をおこなった結果、遠隔記憶として二時点で想起された際、それぞれの海馬歯状回領域での記憶想起時活性化細胞群には、共通して活性化される細胞群が存在することが分かった。さらに、この再活性化細胞群の発生頻度は記憶獲得時点から想起時点までのインターバルにより変化することが分かった。これら再活性化細胞群の時間変化に伴う変化を明確にすることで、継時的に変化するとされる記憶想起時の海馬機能を明らかにすることができると考えられる。B.標識細胞群の人為的活性化操作方法の確立記憶想起時における海馬歯状回活性化細胞群の機能性について明らかにするため、想起時に活性化した細胞群に限局した活性操作方法の確立を進めた。今回の遺伝学的ツールの標識系と対応したウイルスベクター発現系を使用し、任意の時点での活性化細胞群に限局してチャネルロドプシンもしくはDREADDの異なる2種類の神経活動操作が可能な遺伝子を発現する系を作成した。本研究において重要な要素の一つである想起時活性化細胞群の継時的変化の解析結果より、海馬活性が遠隔記憶想起に寄与するという説に対して興味深い知見が得られた。また、想起時に活性化された細胞群に限定した細胞活性の人為的操作系の確立も予定通り進んでいる。

平成二十九年度は前年度に得られた結果を基に、作製されたダブルトランスジェニックマウスを使用して記憶関連細胞群の時間経過に伴う変化をより明確にすると同時に、遠隔記憶時に再活性化する細胞群の機能性についての解析を進めた。1.記憶想起のタイミングを変え、海馬歯状回において各時点で活性化される細胞群の比較を行った。実験の結果から、遠隔記憶となった時間枠では、同じ記憶の想起においても近時記憶よりも記憶関連細胞群の再編成が行われにくいことが示唆された。2.オプトジェネティクスの手法を用いた活性操作を行ない、同領域の遠隔記憶関連細胞群について機能性の評価を行なった。上記の標識系に使用した遺伝学的ツールと対応したウイルスベクター発現系を作成し、任意の細胞群に限局してChR2(チャネルロドプシン)をはじめとする細胞活性操作が可能な遺伝子を発現する系を作成した。まず、ChR2を遠隔記憶想起時に活性化した細胞群に発現させ、その後光照射により同細胞群を人為的に再活性化させた。また、同じウイルスベクター発現系を用いて細胞活性化を抑制するArchT(アーキオロドプシン)を同様に発現させ、活性を人為的に抑制した。以上の結果から、遠隔記憶想起時に活性化した神経細胞群の再活性化により記憶想起が誘導されること、また反対に同細胞群の抑制により、記憶想起が抑制されることが示された。まとめると、海馬領域は近時記憶のみならず、遠隔記憶の想起プロセスにもなんらかの機能を有していることが推測される。先行研究は海馬機能が不全であったとしても記憶想起ができることを示したが、本研究より、海馬機能は遠隔の記憶想起に際し不要ではなく、大脳新皮質領域とはまた別の想起プロセスにも関与するものと考えられる。前年までに確立した細胞群解析系を応用し、まずは近時記憶と遠隔記憶それぞれの関連ニューロン群の経時的変化についてそれぞれの記憶に関連があるとされる各脳領域において測定、解析を行う。続けて記憶関連細胞群をターゲットとして選択的に直接操作できる系を確立し、記憶プロセスでの標識細胞群の機能測定を行う。例えば標識により同定された細胞群に限局した機能制御を行い、人為的な記憶関連回路の操作を目指す。また研究の第二段階として、ニューロン新生が海馬・歯状回での記憶関連細胞群へ寄与している可能性を検証するべく、他トランスジェニックマウスとの組み合わせや薬剤投与等によりニューロン新生の阻害、亢進を操作した場合での記憶関連細胞群のリマッピングへの影響を解析する予定である。当初の実験目標では、遺伝学的ツールを用いて獲得された記憶が遠隔記憶に至る時間での既存の回路に対する新生ニューロンの組み込みの観察を予定していたが、前年度に得られた結果を基に遠隔記憶時に再活性化する細胞群の機能性についての解析も進める。現在二つの実験手法により、再活性化細胞群の機能性について検討している。A.作成されたウイルスベクターを用い、想起時活性化細胞群に限定してチャネルロドプシンなどを発現させ細胞活性化の制御を人為的に行い、遠隔記憶想起の誘導が亢進されるかを確かめる。さらに開発中の別のウイルスベクター系を用いて、再活性化細胞群限定的にDREADDを発現させて活性抑制を行い、生理的条件下における想起での再活性化細胞群の機能について検討する。