hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
マイクロ流路システムの構造パターンによる細胞移動の方向性コントロール

代表者の先行研究で、二次元マイクロパターンで細胞移動の速度や方向がコントロールできることが分り、今回それを三次元マイクロ構造で同様のことを試みた。このような、勾配や流体の流れを必要としない構造のみの細胞移動誘導には様々な利点や用途があり、再生医療用の足場材料等の開発にも繋がると思われる。成果として、特定の表面構造の壁際で細胞の移動速度や持続性が飛躍的上がることが分かり、さらに正常細胞とがん細胞で構造の影響が違うことが分かった。また、機械的シグナル伝達を調べ、アクチン繊維の平行化等が起因していることが分かった。しかし、本来の目的である方向性がコントロールできる表面構造は見つかっていない。細胞移動の方向性は臓器形成、免疫反応、癌の転移等、様々な生物学的現象に深く関わっている。このような方向性の制御は、従来化学勾配により行われてきた。しかし近年、化学勾配により細胞挙動を制御するのではなく、細胞接着部位の二次元形状や凹凸といった三次元構造により、細胞の伸展、移動、生死や分化誘導といった細胞挙動を制御する技術が報告されている。本研究では細胞の様々な挙動を、単に二次元マイクロパターンや、凹凸といった形状制御でなく、三次元の非対称マイクロ流路を用い、三次元の非対称性が細胞挙動に与える影響を調べることを目的としている。これまでの申請者による二次元での研究では、図形走性制御に加え、細い線状パターン上での細胞移動速度と持続性の向上や涙型パターン分岐(スプリッター)による細胞の流動変化等、様々な興味深い現象が見いだされてきたが、これらがより重要かつ生理学的にもより相応しい三次元システムでも引き起こされるのかは確認できていない。さらに、非対称な三次元の構造パターンのみ、つまり非勾配構造による効果的な細胞移動の方向誘導は世界でまだ誰も実現できていない。そこで、本研究ではこれまで二次元の表面で細胞の方向性誘導に成功した各種マイクロパターンをマイクロ流路システム用に改造し、これを達成しようと考えている。このような、勾配や流体の流れを必要としない構造のみの細胞移動誘導には様々な利点や用途があり、例えば、各種細胞別の構造標識による細胞整理デバイスや癌細胞特有の構造標識による埋め込み型癌細胞トラップデバイスや組織形成を誘導する構造パターンの組み込まれた再生医療用の足場材料等の開発にも繋がると思われる。さらに、体内に存在する様々な組織構造(例えば毛細リンパ管)が細胞移動、特に癌細胞の転移、に与える影響やそれに携わる機械的シグナル伝達メカニズムを理解するのにも役立つと思われる。26年度が最終年度であるため、記入しない。細胞工学・バイオマテリアル26年度が最終年度であるため、記入しない。昨年度、パターン化されたPDMSマイクロ流路内での細胞移動観察の実験過程において、液体の流れを用いないPDMSでは培地の成長因子や栄養分子の透過率が低すぎて、流路内で細胞が壊死してしまうことが判明した。この問題を克服するためパターン化された流路の材料をPDMSからハイドロゲルに切り替え、再評価を行う必要が生じた。そしてハイドロゲルの材料作製や評価、細胞接着ペプチドRGDが化学結合されたハイドロゲルへの細胞接着、そして50マイクロン幅のハイドロゲル流路の作製に成功した。しかしいざ密閉されたハイドロゲルのマイクロ流路内で細胞の移動を観察しようとすると、細胞の伸展率や移動性が著しく低下してしまった。この原因の解明と解決が本年度の最初の課題である。このハイドロゲル流路内の悪環境の原因として挙げられるのが以下の可能性である:(1)細胞移動性向上のためハイドロゲルの弾性を100kPa以上に高めようとするあまり、より低分子なハイドロゲル構成分子を高濃度で使用しているため、培地内の重要なタンパク質等が透過できていない、または(2)脱離基のスクシンイミジル基が洗浄したにも関わらずゲル内に残り、細胞に直接あるいは間接的(例えばpHを下げる等)に悪影響を及ぼしている。上記問題点の解決方法としては、前者の可能性(透過率の問題)に対しハイドロゲルの層を作成し細胞の成長や移動に関わる培地内の分子(インスリンや上皮成長因子等)が問題なくハイドロゲルを通過できているかを調べ、後者の可能性(脱離基の悪影響)に対しては異なる化学反応(例えばチオールとマレイミド反応)でハイドロゲルを作製し、流路内の細胞への悪影響の有無を確認する。これらの課題が解決した後、ハイドロゲル流路内での細胞の移動や増殖率を測定し、従来の弾性や透過率の違うPDMSの流路内での挙動等と比べる予定である。流路内での細胞移動観察が可能な事を確認次第、様々な種類のパターン化されたハイドロゲルマイクロ流路内の構造が様々な細胞(例えば人正常上皮細胞MCF-10Aと人癌化上皮細胞MCF-7)の方向性移動にどのような影響を与えるのかを調べる。

これらパターンの影響が二次元の時と同等の効果を細胞方向性移動に与えられれば、三次元構造内での細胞移動を、化学勾配等を使わず、材料のトポロジーのみでコントロールできることが世界で初めて可能となると思われる。また、正常細胞と癌細胞を比べることで構造を利用した癌転移の仕組みの理解や癌細胞のみを優先的にトラップできるデバイスの開発も目指している。また、万が一先に述べた問題が解決されなければ、流路の天井部分を取り除いたオープンな溝のようなマイクロパターン構造で研究を進めて行く可能性も検討している。
ウイルス膜-細胞膜融合と細胞膜-細胞膜融合の分子機構の相違に関する研究

1.シミアンウイルス5 (SV5) WR株のF蛋白のLeu-22をProに置換した変異F蛋白(L22P)は、HN蛋白非依存性の細胞膜-細胞膜融合(細胞融合)誘導活性を持つ。本研究ではL22Pの変異解析を行ない、その結果、F2のN末端とfusion peptideとの疎水的相互作用、およびHR1ドメインとCys-richドメイン下流領域との静電的相互作用が細胞融合誘導活性に影響を与えることが示唆された。2.L22Pの解裂配列をセンダイウイルスのF蛋白の配列で置換し、トリプシンで解裂して細胞融合誘導活性を示すようになった変異F蛋白(Se-L22P)を得た。Se-L22PはWR株のF蛋白と同様に細胞膜のラフト領域と非ラフト領域に均等に分布するが、トリプシンで解裂させると非ラフト領域のSe-L22Pが選択的に構造変化を起こし、その後に細胞融合が誘導されることが明らかになった。3.ヒトパラインフルエンザ2型ウイルスToshiba株を抗HN抗体(M1-1A)存在下で増殖させて得られたescape mutant (F13)は極めて低い細胞傷害性(細胞融合誘導活性)を示す。リバースジェネティクスにより各種変異ウイルスを作製して解析した結果、F13の低い細胞傷害性がHN蛋白の83位と186位の変異に起因することが判明した。一方、F13によるウイルス膜-細胞膜融合はこれらのアミノ酸変異の影響を受けなかったことから、その分子機構は細胞膜-細胞膜融合の分子機構とは異なっていること、また感染細胞内の未知の宿主因子が関与していることが示唆された。また、ヒトパラインフルエンザ3型ウイルスとは異なり、HN蛋白のノイラミニダーゼ活性とウイルス膜-細胞膜融合とに関連が認められなかったことから、2型ウイルスと3型ウイルスの病原性が異なるのは、ノイラミニダーゼの機能的相違が一因であることが示唆された。1.L22PのHR1領域(aa130-172)に位置するGlu-132を他のアミノ酸に置換した変異蛋白を作製しこれらをBHKに発現させて解析したところ、Lys、ArgあるいはAlaに置換した場合はL22Pに比べて細胞融合誘導能が著明に低下したが、Aspに置換した場合にはL22Pと同程度の細胞融合誘導能が認められた。2.近年報告されたニューカッスル病ウイルス(NDV)のF蛋白の三次構造をもとにL22Pの分子モデルを作成した。これに基づいてL22P分子表面の酸性アミノ酸の変異解析を行なったところ、132位と416位のアミノ酸の電荷が一致したときに細胞融合誘導能が亢進することを明らかになった。したがって、これらのアミノ酸が静電的に相互作用しているものと考えられる。すなわち、上記の分子モデルでは(aa94-156を欠いているために)不明であったHR1領域のN末領域の位置は、L22Pのヘッド領域の側面であることが示唆された。3.HR2領域(aa453-477)の位置も上記の分子モデル(aa443-551を欠く)では不明である。そこでHR2領域を含むポリペプチド(aa420-484)を大腸菌で発現精製してマウスを免疫し、2種のモノクローナル抗体を得た。これらの抗体はWestern blotにおいてL22Pに対する反応性を示し、それぞれaa448-451あるいはaa446-451をコアエピトープとする抗体であることが判明した。

次に、L22Pに細胞に発現させて蛍光抗体法により反応性を調べたところ、未固定では反応性が認められたが、ホルマリンで固定すると反応性が低下した。以上のことから、HR2領域のすぐN末側の領域(aa448-451)は分子表面に露出しているももの、わずかな構造変化で秘匿されやすい位置に存在していることが示唆された。PIV2(Toshiba株)の感染性cDNAを構築した。このcDNAにモノクローナル抗体(M1-1A)のescape mutant(F13)のHNに存在する2箇所のアミノ酸変異を両方(Asp83Tyr+Met186Ile)あるいは単独(Asp83TyrまたはMet186Ile)にもたらす塩基置換を導入し、リバースジェネティクスにより3種の変異ウイルス(83/186、83、186)を回収した。これらのウイルスの生物学的性状を比較解析し、F13の弱い細胞傷害性(細胞膜-細胞膜融合の誘導能)がHNの2箇所のアミノ酸変異に起因することを立証した。この2箇所の変異を持つウイルス(83/186)の侵入(ウイルス膜-細胞膜融合)速度は親株Toshibaと同等であったことから、ウイルス感染細胞における細胞膜-細胞膜融合はHNだけでなく未知の宿主因子により制御されている可能性が示唆された。興味深いことに83/186はToshibaよりも極めて高い受容体破壊酵素(ノイラミニダーゼ)活性を示したが、ノイラミニダーゼ活性と細胞膜-細胞膜融合との関連は認められなかった。この結果はPIV3やムンプスウイルスの場合とは異なっており、特筆すべき知見である。また、83/186の高いノイラミニダーゼ活性が186位のIleに起因することも明らかになったが、これは186位のアミノ酸がHNのGlobular head領域の受容体結合部近傍に位置することに関連していると思われた。一方、83位のTyrはHN蛋白のStalk領域に位置していると考えられるが、Globular head領域に活性中心が存在する受容体結合活性やノイラミニダーゼ活性にも影響をあたえたことから、83位と186位のアミノ酸同士に機能的相互作用が存在し、これがPIV2の細胞傷害性に影響を与えていることが示唆された。
画像処理システムを備えた超高分解能走査透過型電子顕微鏡による繊維構造解析に関する研究

本研究の当初の目的は、単原子解像力を持つ画像処理システムを備えた超高分解能走査透過型電子顕微鏡により、繊維を形成する高分子鎖の形態を直接観察し、繊維構造および繊維形成機構を明らかにすることであった。しかし、その試作において当初予定した電界放射型電子銃を装備することができず、分解能が計画値の1/2に低下し、単原子の分解が不可能となった。そのため、試作した電子顕微鏡による研究対象は高分子の単分子鎖ではなくその集合体に留まらざるをえなかった。一方、この間、単分子鎖の形態研究手段としての小角中性子散乱法にはめざましい発展が見られ、本研究においてもこれを代替手段として積極的に利用することにより目的の遂行を計った。紡織繊維の性能はその繊維構造と密接な関係を有する。繊維構造は結晶領域と非晶領域とからなり、特にその非晶領域における高分子鎖の形態は重要な研究課題である。これを直接研究することは非常に困難であるが、本研究ではこのような拘束空間における高分子鎖の形態研究のためのモデルシステムとして、ブロック共重合体のミクロドメインにおける高分子鎖の形態の研究を行い、基礎的知見を得た。またブロックあるいはグラフト共重合体高分子を利用した紡織繊維の改質も重要な研究課題であるが、この目的のために本研究ではブロック共重合体及びその混合系の相分離構造および表面構造を、試作した電子顕微鏡を用いた研究により明らかにした。さらに、電子顕微鏡および小角中性子散乱法は、高強力高弾性率繊維材料である液晶性ポリエステルの構造研究や、繊維の物性を大きく左右する繊維の吸湿機構の研究に対し、非常に有効であり、重要な知見が得られた。これらの研究は次の三つのサブテーマに分類される。1)小角中性子散乱による拘束空間中における高分子鎖の形態に関する研究。2)透過型電子顕微鏡によるブロック共重合体のミクロドメイン構造に関する研究。3)ポリエステル系繊維並びに液晶高分子の高次構造に関する基礎研究。
小児内視鏡手術トレーニングのための客観性と即時性を備えた手技評価システムの開発

高難度小児内視鏡手術は小児独自の技術が医師に要求されるが、多くの小児外科疾患は希少で内視鏡手術を行う機会が制限されon the job trainingとなっている。そのため、術前トレーニングの必要性が認識され様々なツールが開発されてきたが、訓練者にとって魅力的なツールがない。その一因として手技評価方法が十分に確立されておらず、特に手技操作中の手技評価方法は有用なものが少ない上、評価結果をすぐに訓練者にフィードバックできていない。そこで、本研究は、小児疾患モデルを用いて縫合時の鉗子操作を客観的かつ迅速に評価する方法を開発することを目的とする。今までの研究では正確に計測できなかった、鉗子の速度や加速度を計測する新手法を協力企業とともにハプティックデバイスの技術を利用して達成し、評価手法の確立も行う。今年度は協力企業とともに、計測システムの開発を行った。左右鉗子のシャフトの根元にデバイスを取り付け、その取り付けた部位から鉗子先端の挙動を演算処理して推定する機構とした。現在先端の推定位置と実際の位置との誤差が1cmほど生じており、その位置調整のためのキャリブレーション機能を作成している。また、操作の正確性を迅速に評価するため、訓練者の手技を録画した画像を用いた画像認識の手法で、手技を自動解析評価するシステムを開発する。当初は大学機関との協力を検討していたが体制構築が難しいと判断し、本研究に協力してもらえる企業を探し、画像解析手法の検討を開始した。鉗子先端の速度や加速度、位置を計測するシステム自体の開発は概ね予定通り進んでおり、現在小児外科医の仕様に合わせた調整を行っている。一方で、画像解析を用いた評価手法に関しては、当初予定していた研究機関から一般企業へ依頼することとしたため、研究開始の時期が遅れてしまった。以上のことから進捗状況についてはやや遅れているとした。鉗子先端の速度や加速度、位置を計測するシステムの開発については、実際の医師に使用してもらい使用感を確認する。また、熟練度の異なる医師のデータを集め、どのような評価項目が技術の違いを判別するのに有用か検証する。画像解析を用いた評価手法に関しては、現在評価手法をいくつか検討しているので、サンプルデータを用いてそれらの手法が有用か検証する予定である。鉗子先端の位置や速度の計測に関する物品を購入したが、画像解析手法の検討については研究開始が遅れたため、次年度に使用する予定とした。
アクティブエレメント集合体の数理と実現

複雑な自然現象や生命現象、社会現象などを多数の振動子、カオス素子、興奮性素子などが様々な様式で相互作用する系、すなわちアクティブエレメント集合体として捉え、数理とモデル実験系の両面からアプローチを行った。素子のタイプと結合様式の組み合わせを考えると、結合様式としては、拡散結合、全結合、中間距離結合などがある。また、素子としては、空間的に運動性を持つ素子や興奮・抑制性素子の場合にどのような振る舞いが得られるかこれまであまり知られていなかった。運動素子の集団のモデルを作り、解析とシミュレーションを行なった。相互作用する質点系に向きの内部自由度を付加したモデルにより、これまで知られていない様々な動的な振る舞いが見い出された(編隊、旋回、迷走、蚊柱など)。これらは、動物の群れ形成のモデルとも関連しており、無次元量を導入することにより集団運動の転移現象を説明した。また、実際の動物の次元解析からモデルとの比較的よい一致を見い出した。さらに、興奮・抑制(activator-inhibitor)素子の集団モデルを考え、一つの素子だけでは安定だが、平均場で結合すると(globally coupled system)、二つの状態に分かれ、二つのクラスターに属する要素数の比率は或る範囲で一定に保たれる現象を見い出した。この系は、細胞集団の分化や社会的生物集団における分業などの比率制御のモデルとも考えられる。
メカノケミカル的手法による細胞挙動のダイナミック制御用バイオチップの開発

近年,多くの筋神経系の疾患の研究がおこなわれてきている.このような実験では動物実験が盛んに行われている.しかし,このような動物実験は今後縮小する必要が社会的に叫ばれている.そのためには,培養細胞を用いた効果的な実験系と評価方法の確立が必要である.最終年度では,細胞転写技術を神経芽細胞(NG108-15)と筋芽細胞(C2C12)に応用した.まず,筋芽細胞をフィブリンゲルシート上に容易にライン状のパターンを転写することが可能であることを示した.続いて,フィブリンゲルシート上に転写した筋芽細胞パターンを分化誘導し,容易にパターン化筋細胞への分化が可能であることを示した.さらにこの転写後のパターン化筋細胞のゲルシートへ電気刺激を付加することで,従来の平面基板上での実験系と比較し,より効率的に培養筋細胞への運動能力の付加が可能となることをしめした.また,このパターン化培養筋細胞ゲルシートと神経芽細胞のパターンを転写したゲルシートとを張り合わせることによって容易に3次元ゲル培養において,筋-神経接合部様構造の構築を実現した.また,着脱式細胞培養基板を用いて,観察が容易な筋-神経接合部の構築も行った.従来の共培養手法の多くは,ランダムな培養が多く,特定の領域に細胞間接合部を作りこむことが難しかった.このために,共培養を単に行っても,目的の接合部位が不明確であり,接合部位を指標とした評価を行うことは難しかった.そこで,細胞-細胞間の接着部位を特定の領域に作製可能な着脱式培養基板を使用することで,容易に観察が可能な培養系が構築可能となる.具体的には,ポリスチレンとポリジメチルシロキサン(PDMS)で作製した着脱式培養基板上に筋芽細胞と神経芽細胞を培養し,各細胞を適切なタイミングで分化し着脱することで,着脱面付近に筋-神経接合様構造の作製が可能であることを示した.近年,ES細胞やiPS細胞などの研究により培養細胞から,生体内の各細胞種を作り出せる時代が訪れようとしている.しかし,依然として培養細胞から,生体内の組織と同様の機能を有する組織の構築には,技術的な課題も多く,実現にはまだ困難な壁が多数残されている.特に今年度は培養細胞を用いた筋細胞に着目し,機械的と化学的に細胞培養環境を制御することで効率的に筋組織様のサンプルを作製することを目指して行った.特に機械的制御として力学刺激用の専用チャンバーを作製し,筋芽細胞を3次元培養した状態での分化誘導について検討した。現在,既に行っている3次元培養系への細胞パターンの導入法を応用し筋芽細胞のパターンをゲル内に配置し,効果的に生体組織に近い機能の付与が可能かどうかを検討している。また従来の研究者の報告によれば電気的刺激と薬剤刺激により,筋芽細胞を収縮能を持った筋細胞へと分化させることが報告されていることから,電気刺激や薬剤刺激をそこに応用する,培養系の構築も今後行う.また,脱着式培養基板を作製し,血管内皮細胞(HUVEC)と子宮頸癌細胞(HeLa細胞)を用いたランダム共培養系の確立を行った.さらに,この脱着式培養基板を流路構造へと組み込むことで異種細胞間のコミュニケーションの詳細な解析を目指している.既に,脱着式培養基板を用いることでHUVEC細胞とHeLa細胞の共培養によりHUVECの遊走性に変化が生じることを見出しており,HeLa細胞からのパラクライン的なシグナルによることが示唆されている。現在,さらにマイクロ流路構造と組み合わせ,流速の制御を行うことで細胞が産生するシグナル伝達物質の拡散方向を制御し,より詳細な細胞間相互作用の検討を行っている.再生医療や新薬の創生といった医薬品関連の分野をはしめ、多くの生物学的実驗を必要とする分野において、培養細胞を用いた実験系は従来にも増してその重要度を高めている。本研究では、培養細胞を取り巻く培養環境をより生体内の環境に近い形で制御する手法を機械的・化学的制御の両者を応用することで実現する新たなチップデバイスの創出を目的としている。研究計画の2年目である当年度では、2次元細胞パターンを容易に3次元培養可能な細胞転写技術を駆使し複数の細胞が転写可能であることを確認した。また、転写後の細胞へ力学刺激や電気刺激を印加することで細胞機能の制御が可能であることを確認した。具体的には、血管内皮細胞をフィブリンゲルへ転写し力学刺激を印加することで管腔化方向を制御可能であることを見出した。また、筋芽細胞の2次元パターンを転写し、電気刺激を印加することで効果的に収縮機能を付加することが可能であることを確認した。そして、神経細胞も転写可能であることを確認し筋芽細胞との共培養系の可能性を見出した。また、ユニット化した脱着可能な培養基板を作製し、血管内皮細胞と子宮頚癌細胞の共培養を容易に行える培養チップの作製と相互作用の解析も行った。具体的には、内皮細胞とがん細胞の共培養においてな特異的な内皮細胞の挙動ががん細胞からのパラクラインシグナルに起因している事を見出した。脱着式基板を用いた実験では内皮細胞ががん細胞から逃げる方向に遊走していくことを確認しており、それがおらくパラクラインシグナルによるものであると考えられていた。そこで、この確認のために脱着式培養基板を微小流路構造と組み合わせシグナルの伝播方向を培地流れで制御可能なデバイスを作製した。これにより、内皮細胞の後退現象がパラクラインシグナルによることを見出した。

これらの結果は、培養細胞を用いた新規実験系の確立に大いに貢献できると考えている。近年,多くの筋神経系の疾患の研究がおこなわれてきている.このような実験では動物実験が盛んに行われている.しかし,このような動物実験は今後縮小する必要が社会的に叫ばれている.そのためには,培養細胞を用いた効果的な実験系と評価方法の確立が必要である.最終年度では,細胞転写技術を神経芽細胞(NG108-15)と筋芽細胞(C2C12)に応用した.まず,筋芽細胞をフィブリンゲルシート上に容易にライン状のパターンを転写することが可能であることを示した.続いて,フィブリンゲルシート上に転写した筋芽細胞パターンを分化誘導し,容易にパターン化筋細胞への分化が可能であることを示した.さらにこの転写後のパターン化筋細胞のゲルシートへ電気刺激を付加することで,従来の平面基板上での実験系と比較し,より効率的に培養筋細胞への運動能力の付加が可能となることをしめした.また,このパターン化培養筋細胞ゲルシートと神経芽細胞のパターンを転写したゲルシートとを張り合わせることによって容易に3次元ゲル培養において,筋-神経接合部様構造の構築を実現した.また,着脱式細胞培養基板を用いて,観察が容易な筋-神経接合部の構築も行った.従来の共培養手法の多くは,ランダムな培養が多く,特定の領域に細胞間接合部を作りこむことが難しかった.このために,共培養を単に行っても,目的の接合部位が不明確であり,接合部位を指標とした評価を行うことは難しかった.そこで,細胞-細胞間の接着部位を特定の領域に作製可能な着脱式培養基板を使用することで,容易に観察が可能な培養系が構築可能となる.具体的には,ポリスチレンとポリジメチルシロキサン(PDMS)で作製した着脱式培養基板上に筋芽細胞と神経芽細胞を培養し,各細胞を適切なタイミングで分化し着脱することで,着脱面付近に筋-神経接合様構造の作製が可能であることを示した.
脳波－機能的MRI同時記録によるウエスト症候群のてんかん焦点の解明と予後予測

平成30年度までに新規にウェスト症候群を発症した7名の乳児で患者家族の同意を得て脳波-fMRI同時記録(EEG-fMRI)の撮像を行った。トリクロリール内服による鎮静下での撮像に成功しデータ収集ができた。EGI社のソフトウェアを用いてMRI撮像中の脳波でウェスト症候群に特徴的なヒプサリズミアと呼ばれるてんかん放電の発生するタイミングを同定した。そして画像解析プログラムSPMを用いて、てんかん放電のある時間帯とない時間帯のBOLDシグナルの変化を画像化した。その結果、大脳皮質には多発性の活動亢進部位が認められ、脳幹部にも活動上昇が見られた。また1名の患者では脳波上のてんかん放電が左側有意に見られ、EEG-fMRIで左海馬にBOLDシグナルの上昇を認めた。大脳皮質と脳幹部の異常なてんかん性ネットワークを形成することがウェスト症候群の発症に関わっていることが推測され、また海馬など大脳辺縁系の関与も考えられた。ACTH療法後の生後12か月に脳波検査で焦点性てんかん放電が残存していた患者3名で、生後12か月にEEG-fMRIを再検した。その結果、2名では前頭葉、1名は左海馬に陽性BOLDシグナルが残存していたが、脳幹部の異常所見は消失していた。治療により脳波でヒプサリズミアが焦点性てんかん放電に変化するのに伴い、脳幹の異常活動が消失したことから、ヒプサリズミアを引き起こす病態に脳幹が強く関わっていることが明らかになり、治療効果の客観的評価にも有用と考えられた。研究を開始するにあたって、乳幼児のてんかん患者において安全に本検査専用の小児用脳波キャップを装着し機能的MRI(fMRI)を記録できることを再確認した。新規にウェスト症候群を発症した2名の乳児で患者家族の同意を得て脳波-fMRI同時記録の撮像を行った。1名ではトリクロリール内服による鎮静下での撮像に成功しデータ収集ができた。もう1名では撮像中に患者が覚醒したために解析に必要な撮像が十分できなかった。撮像できた1名においてEGI社のソフトウェアを用いてMRI撮像中の脳波でてんかん放電の発生するタイミングを同定した。その結果、West症候群における特徴的なてんかん放電であるヒプスアリズミアに伴って脳幹部の血流上昇がみられることが明らかになった。また別のACTH療法を行い発作が消失した1名の患者で脳波-fMRI同時記録検査を行ったところ、脳幹部の血流上昇は認められなかった。今後は、本研究に参加する患者数を増やすとともに、ウェスト症候群を発症時に脳波-fMRI同時記録を行った患者において、治療後の再検査を行い、所見の変化を確認する予定である。その結果から、ウェスト症候群におけるてんかん性活動の起源、分布、経時変化を明らかにする。また脳波-fMRIの所見とてんかん発作の予後、精神運動発達の予後、positron emission tomography (PET)やMRI拡散テンソル画像の所見との比較を行い、脳波-fMRI検査の臨床的有用性を明らかにする。得られた研究成果を国内および国際学会、医学雑誌で公表する。乳幼児のてんかん患者において、小児用脳波キャップを装着し機能的MRI(fMRI)を記録できることを確認した。もう1名では撮像中に患者が覚醒して解析に十分な撮像ができなかった。撮像できた1名においてMRI撮像中の脳波でてんかん放電の発生するタイミングを同定した。以上のように、まだ症例数は少ないが研修を進めることができている。29年度までに新規にウェスト症候群を発症した3名の乳児で患者家族の同意を得て脳波-fMRI同時記録(EEG-fMRI)の撮像を行った。EGI社のソフトウェアを用いてMRI撮像中の脳波でてんかん放電の発生するタイミングを同定した。29年度までに新規にウェスト症候群を発症した3名の乳児で患者家族の同意を得てEEG-fMRIの撮像を行った。MRI撮像中の脳波でてんかん放電の発生するタイミングを同定した。そして画像解析プログラム

SPMを用いて、てんかん放電のある時間帯とない時間帯のBOLDシグナルの変化を画像化した。その結果、West症候群における特徴的なてんかん放電であるヒプスアリズミアに伴って、広汎な大脳皮質にBOLDシグナルの上昇が見られ、脳幹部のシグナル上昇がみられた。1名の患者では脳波上のてんかん放電が左側有意に見られ、EEG-fMRIで左海馬にBOLDシグナルの上昇を認めた。以上のように、まだ症例数は少ないが研究を進めることができている。平成30年度までに新規にウェスト症候群を発症した7名の乳児で患者家族の同意を得て脳波-fMRI同時記録(EEG-fMRI)の撮像を行った。トリクロリール内服による鎮静下での撮像に成功しデータ収集ができた。EGI社のソフトウェアを用いてMRI撮像中の脳波でウェスト症候群に特徴的なヒプサリズミアと呼ばれるてんかん放電の発生するタイミングを同定した。そして画像解析プログラムSPMを用いて、てんかん放電のある時間帯とない時間帯のBOLDシグナルの変化を画像化した。その結果、大脳皮質には多発性の活動亢進部位が認められ、脳幹部にも活動上昇が見られた。また1名の患者では脳波上のてんかん放電が左側有意に見られ、EEG-fMRIで左海馬にBOLDシグナルの上昇を認めた。大脳皮質と脳幹部の異常なてんかん性ネットワークを形成することがウェスト症候群の発症に関わっていることが推測され、また海馬など大脳辺縁系の関与も考えられた。ACTH療法後の生後12か月に脳波検査で焦点性てんかん放電が残存していた患者3名で、生後12か月にEEG-fMRIを再検した。その結果、2名では前頭葉、1名は左海馬に陽性BOLDシグナルが残存していたが、脳幹部の異常所見は消失していた。治療により脳波でヒプサリズミアが焦点性てんかん放電に変化するのに伴い、脳幹の異常活動が消失したことから、ヒプサリズミアを引き起こす病態に脳幹が強く関わっていることが明らかになり、治療効果の客観的評価にも有用と考えられた。本研究に参加する患者数を増やすために、名古屋大学小児科の関連施設で新規にウェスト症候群と診断された患者の家族に本研究の目的、方法を説明し、研究への参加の希望を確認していく。ウェスト症候群を発症時に脳波-fMRI同時記録を行った患者において、治療後の再検査を行い、所見の変化を確認する予定である。その結果から、ウェスト症候群におけるてんかん性活動の起源、分布、経時変化を明らかにする。また脳波-fMRIの所見とてんかん発作の予後、精神運動発達の予後、positron emission tomography (PET)やMRI拡散テンソル画像の所見との比較を行い、脳波-fMRI検査の臨床的有用性を明らかにする。得られた研究成果を国内および国際学会、医学雑誌で公表する。ウェスト症候群を発症時にEEG-fMRI同時記録を行った患者において、治療後の再検査を行い、所見の変化を確認する予定である。
大規模POSデータを用いた解析手法の確立およびその応用

当該年度では消費者の購買行動の解明を目的に商品販売数推定の基本モデルの構築、特売実施時の来店者数への影響、商品カテゴリ毎の売上の特性の解析など多角的な観点から解析した。消費者の購買行動の理解を目的に商品販売数時系列を解析した結果、来店者数の変動と時期による平均値の変動の2つの効果を考慮することで価格一定時の商品販売数分布がポアソン分布に近似される商品が多数存在することを示した。これらの解析し得られた統計性を元に商品販売数の推定モデルを構築した。実データの来店者数を与えた上で、過去の販売数から算出したボアソンパラメータを用いて販売数を推定すると複数の定番商品の定価時の販売数が理論誤差程度で推定できることを示した。各店舗では来店者を引き付ける為に様々な販売戦略を実施する。そこで、来店者数変動の解明を目的に店舗で販売される商品の総販売数と来店者数の関係を解析した。その結果、来店者数が少ない日は総販売数が来店者数に対して線形に近い関係で変動するが、来店者数が多い日には非線形に変動する傾向を複数店舗において示した。その要因として商品の特売に着目し、特売商品を除去することで総販売数と来店者数の関係が線形に近づくことを示し、特売による影響を示した。本データには食品からトイレタリまで多様な商品が記録されている。そこで本データを用いて商品毎の売れ行きの特性を理解するため、商品カテゴリ毎の販売数の周期性を解析した。その結果、季節に依存して販売数が増減するカテゴリや、特定のイベントの直前に販売数が急激に増加するカテゴリなど商品カテゴリ毎の特性を定量的に示した。当該年度はスーパーマーケットにおける大規模POSデータを用いて2つの観点から解析した。1.商品価格時系列の解析直近の20年間で日本経済はバブル・デフレ・近年の大不況など経済状況が急激に変化した。本データには同期間における小売の商品販売価格が記録されており、小売における商品価格変動の特性を理解することを目的に商品価格に対して時系列解析を行った。具体的には複数店舗で販売されている同一商品の平均価格を定義し、複数商品に対してケーススタディを行った。先に定義した価格時系列は非定常であるために移動平均を用いてトレンドとそれ以外の成分に分離し、トレンドを除去した時系列に対してARモデルを用いて近似した結果、AR1で近似される商品があることを示した。また、トレンドに関して原材料価格の高騰との関係からも解析を行い、原材料価格の上昇と連動して商品価格が上昇していることを示した。2.商品販売数時系列の解析消費者の購買行動の理解を目的に商品販売数時系列の解析を行った。小売店において商品は定価と特売により販売されている。商品の販売数は特売時には定価時に比べて販売数が数百倍程度に急激に上昇することはこれまでの解析で示した。該当年度では価格変化が見られない定価時の販売数時系列に着目した。解析の結果、価格が一定である際には販売数は来店者数と線形に近い比例の関係で示されること、時々刻々と平均販売数が変動することを示し、これらの2つの効果を補正することで販売数時系列がポアソンプロセスで近似される商品が多数存在することを示した。
ｉＰＳ細胞のガン化を判別する高感度ナノワイヤバイオセンサアレイの創製

本研究では、iPS(人工多能性幹)細胞のガン化の原因を解明するため、iPS細胞の分化挙動を調べるための高感度バイオセンサの研究開発を目的とする。平成30年度は、以下の4項目について研究し、成果を挙げた。(1)電子線描画法によるレジストナノワイヤ(NW)細線化及びSi層への転写によるSiNW形成:電子線描画装置を用いて最小線幅18.7 nmの高分解能レジストHSQのNW列をSilicon on insulator (SOI)基板上に形成した。そして、HSQ NW列をマスクとして反応性イオンエッチング(RIE)によってSiへパターン転写した結果、最小線幅16.2 nmのSiNW列の形成を確認した。(2) SiNW列への電極形成によるバイオセンサ作製技術の確立:フォトリソグラフィの重ねプロセスにより、SiNW列にTi電極と絶縁保護膜を形成し、SiNW列の周囲に内径2 mmの反応セルを設置後に絶縁被覆してSiNWバイオセンサを作製した。(3)低濃度生体分子測定による検出感度評価:ホスホン酸処理によりSiNW表面に自己組織化単分子膜を形成した後に、卵白アルブミン及び免疫グロブリンG(IgG)を反応させた結果、濃度6 aMの超低濃度IgGの検出が確認できた。なお、コントロールIgGには反応しないこと、IgG濃度600 nMまでの増加に伴ってSiNWを流れる電流の連続的な減少も確認した。(4) SiNWバイオセンサによる受精卵の活動状態モニタリング:SiNWバイオセンサの反応セル内にウニ受精卵を入れてSiNWに流れる電流を測定した結果、1細胞期から2細胞期までの約75分間に約5 nAの電流増加を確認した。これは、受精卵の成長に伴って卵膜から放出される水素イオンを検出したことを示唆しており、生きた細胞の活動モニタリングの可能性が確認できたことから、iPS細胞の評価への応用が期待できる。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。平成29年度は以下の4項目について研究を進め、それぞれ成果を挙げた。(1)電子線描画法を用いたサブ20 nm幅のHSQレジストナノワイヤ(NW)列の形成:電子線描画装置(現有設備)を用いて高分解能レジストHSQのNW列をSilicon on insulator (SOI)基板上に形成した。スピンコートによるHSQの薄膜化と電子線描画の露光条件最適化により、幅約20 nmのHSQレジストNW列の形成を確認した。(2)Si層へのレジストNW列転写技術の確立:(1)で形成したレジストNW列をマスクとして、反応性イオンエッチング(RIE)を用いてSOI基板のSiデバイス層をエッチングして、SiNW列を形成した。RIEのパワー、反応ガス種、流量等を最適化することで、最小線幅18 nmのSiNW列の作製に成功した。(3)SiNW列への電極配線によるSiNWバイオセンサ作製技術の確立:フォトリソグラフィを用いて、SOI基板上にTi電極を形成し、その電極間に架橋するSiNWを(1)と(2)で得た条件を用いた電子線描画の重ねプロセスにより形成した。さらに、NWのみ露出するよう電極部を絶縁性レジストのSU-8で被覆した。ソースメータを用いた電流電圧(I-V)測定からオーミック特性が得られ、良好な接合が形成できたことを確認した。(4)低濃度生体分子測定による検出感度評価:ホスホン酸処理によりSiNW表面にアミノ基を形成した後に、PBSで希釈した免疫グロブリンG(IgG)を反応させたところ、6 fMの低濃度IgGでも約5%の抵抗変化が確認できた。前記(1)の電子線描画法を用いたレジストNW列の形成では、幅約20 nmのHSQレジストNW列の形成が確認できた。当初計画のブロック共重合体を用いた自己組織化によるサブ10 nmのNW列の形成は実施できていないが、(1)で形成したHSQ-NW列は10 um程度の長さまで平行に形成できたことから、列間隔を広げれば整列した自己組織化のためのガイドライン形成が可能と考えている。(2)では、レジストNW列をマスクとしてSi層へパターン転写するためのRIE条件が最適化でき、幅約18 nmのSiNWの作製に成功した。この条件を用いれば、自己組織化によるサブ10 nm幅のNW列についても転写が可能と考えている。(3)の電極形成では、フォトマスクの作製からはじめて、Ti電極を形成した後に電子線描画の重ねプロセスまで実現できた。さらに、絶縁被覆を施して良好なオーミック特性が得られたことにより、(4)で6 fMという極めて低濃度のIgG検出に成功した。以上の結果から、自己組織化によるNW列の実現までは至っていないが、SiNW列の作製プロセスおよびバイオセンサの動作も確認できたことから、概ね順調に研究推進できていると考える。(1)電子線描画法によるレジストナノワイヤ(NW)細線化及びSi層への転写によるSiNW

形成:電子線描画装置を用いて最小線幅18.7 nmの高分解能レジストHSQのNW列をSilicon on insulator (SOI)基板上に形成した。そして、HSQ NW列をマスクとして反応性イオンエッチング(RIE)によってSiへパターン転写した結果、最小線幅16.2 nmのSiNW列の形成を確認した。(2) SiNW列への電極形成によるバイオセンサ作製技術の確立:フォトリソグラフィの重ねプロセスにより、SiNW列にTi電極と絶縁保護膜を形成し、SiNW列の周囲に内径2 mmの反応セルを設置後に絶縁被覆してSiNWバイオセンサを作製した。(3)低濃度生体分子測定による検出感度評価:ホスホン酸処理によりSiNW表面に自己組織化単分子膜を形成した後に、卵白アルブミン及び免疫グロブリンG(IgG)を反応させた結果、濃度6 aMの超低濃度IgGの検出が確認できた。なお、コントロールIgGには反応しないこと、IgG濃度600 nMまでの増加に伴ってSiNWを流れる電流の連続的な減少も確認した。(4) SiNWバイオセンサによる受精卵の活動状態モニタリング:SiNWバイオセンサの反応セル内にウニ受精卵を入れてSiNWに流れる電流を測定した結果、1細胞期から2細胞期までの約75分間に約5 nAの電流増加を確認した。これは、受精卵の成長に伴って卵膜から放出される水素イオンを検出したことを示唆しており、生きた細胞の活動モニタリングの可能性が確認できたことから、iPS細胞の評価への応用が期待できる。平成30年度は、(1)HSQレジストNW列をガイドラインとした自己組織化ブロック共重合体NW列の形成、(2)SiNWバイオセンサを用いた溶液中でのイオン濃度特性の評価、(3)SiNWバイオセンサアレイを用いたイオン濃度分布の連続測定による細胞活動状態のモニタリングおよびiPS細胞の分化挙動の解明について研究する。(1)では、電子線描画によって数100 nmの間隔に配列させたHSQレジストNW列を形成し、それをガイドラインとしてブロック共重合体のPS-PDMSを用いて、PDMSのNW列を形成する。そして、RIEを用いてSi層への転写を行い、サブ10 nm幅のSiNW列の形成を目指す。(2)では、溶液中での微小イオン濃度変化を検出するため、SiNW表面の修飾法を確立した上で、低濃度イオン溶液を用いた感度評価を行う。(3)では、サイズ100 μm角の範囲にSiNWセンサを20 μm間隔で配置したバイオセンサアレイを作製する。各センサにソースメータを接続して、溶液中での電気特性およびイオン濃度変化に伴う応答等を確認する。その後、センサアレイ上にiPS細胞を搭載して、細胞表面から出るイオン濃度分布をソースメータおよびデータ集録システムを用いてモニタリングする。そして、正常細胞とガン化細胞のイオン濃度分布と時間変化を解析して、細胞分化機構の解明を目指す。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
病原細菌エフェクター分子における分子多型を引き起こすメカニズムの解明

1.マウスES細胞を胃オルガノイドへと分化させる実験系を構築した。ES細胞の培養技術を習得し、まず、過去の報告を参考に、胚葉体から胚体内胚葉へと分化誘導をかけ、前腸部位を模すスフェロイドを作成した。それらのスフェロイドをマトリゲル内で培養することにより、オルガノイド様の細胞塊に成長することが確認された。また、これらの細胞塊を凍結切片にして観察したところ、胃上皮細胞と間葉系細胞・粘膜筋板を含む二つの層が出来ていることが確認された。胃上皮細胞は胃に特有とされるムチン、ムチン5ACと胃幽門部に分泌されるといわれているムチン6を産生する細胞が含まれた。2.これらの胃オルガノイドの内腔側に胃上皮細胞にレンチウィルスベクターを用いてcagA遺伝子を導入、および液体培養したピロリ菌を導入した。12時間後の胃上皮細胞における形態変化を観察したところ、発がんタンパク質を発現するピロリ菌を導入したオルガイドに於いて激しい細胞の損傷が確認された。また、マイクロアレイ解析の結果、癌関連遺伝子の上昇を確認した。これらの損傷が具体的にどのようにして起こっているかを今後観察していきたいと考えている。3.自然に発生した遺伝子組換えによって樹立された弱毒株と呼ばれるピロリ菌をオルガイドに導入したところ、2.でみられたような著しいオルガノイドの損傷がみられなかった。28年度が最終年度であるため、記入しない。マウスES細胞から胚葉体に分化誘導をかけ、さらにWnt,Notchなどのシグナルを制御することによって前腸部のスフェロイドを得ることに成功した。また、それをマトリゲル内で更に培養することにより胃オルガノイドの作製に成功した。この胃オルガノイドはこれまでに報告されている胃オルガノイドに比べてより生体の胃組織に近く、今後の胃がん研究に大きく貢献できるものと考える。また、マイクロインジェクションの技術を習得し、胃オルガノイドへのピロリ菌の導入にも成功した。ピロリ菌導入の結果、オルガノイドへのフェノタイピックな変化が認められ、今後さらにマイクロアレイなどを用いて解析を進めていく予定である。のちに、これまでに報告されている様々な地域のピロリ菌株をオルガノイドにマイクロインジェクションすることによって、株間の差を出していきたい。また、最終的にはオルガノイド内でのピロリ菌の長期培養の系を立ち上げ、EPIYA繰り返し領域の遺伝子組み換えの有無も確認していく予定である。今年度中にマウスES細胞から胚葉体に分化誘導をかけ、さらにWnt,Notchなどのシグナルを制御することによって前腸部のスフェロイドを得ることに成功したため、計画通りに進行していると考えられる。今後さらにマイクロアレイなどを用いて解析を進めていく予定である。
腸管吸収機能の部位勾配とその発現調節機構

ラット空回腸に部分切除手術(resection,以下Rと略記)または位置置換手術(transposition,以下Tと略記)を施し、R,T両群における術後の残存腸管の機能および形態変化の差異を調べた。十二指腸、空腸、回腸重量(g/cm)のいずれにもT>Rの傾向がみられ(絨毛伸長)、膵肥大もあった。しかしRNA/タンパク比に両群間で有意な差はなく、刷子縁膜酵素の比活性、グルコースやタウロコール酸の取り込み能にも差はみられなかった。一方、術後の早い時期(2,5days)の初期応答遺伝子やIGF-1遺伝子の動きを探るため、小腸粘膜からpoly(A)^+RNAを調製しNorthern blot分析を行なった。その結果c-mycやIGF-1遺伝子の小腸における発現はほとんどみられず、わずかに発現のみられたc-fosやODC遺伝子でもβ-actin遺伝子との対比から小腸部位間に差異のないことが確かめられた。次に機能的には回腸に局在することが知られているNa^+依存性胆汁酸輸送系の遺伝子発現について検討したところ、空回腸における位置置換や部分切除手術の違い、あるいは術後経過時間の長短(5,80日目)さらには過形成の程度の如何にもかかわらず、Na^+/胆汁酸共輸送担体遺伝子の存在は回腸由来の小腸部位にのみ見い出された。またアフリカツメガエル卵母細胞を用いた輸送担体発現実験でも、回腸由来のpoly(A)^+RNAを注入した場合にのみNa^+依存性胆汁酸吸収活性の顕著な増大が認められた。しかし、空腸部位へ置換された回腸粘膜の絨毛や固有層が上述のような著しい過形成をうけるためには、腸腔粘膜からの刺激(例えば、経腸栄養)を考慮する必要があろう。膜消化にかかわる刷子縁膜水解酵素活性や糖・アミノ酸・胆汁酸などの吸収能は、小腸の部位によって差がみられる。このような勾配差の離乳後の発現には、内分泌ホルモンと食餌性因子のかかわりが示唆されているものの、調節や適応に関する知見は乏しい。そこで本年度は、空回腸に部分切除手術(resection,以下R群)と位置置換(transposition,以下T群)を施し、R,T両群における術後の絨毛伸長やNa^+依存性のグルコースおよび胆汁酸吸収系の適応の違いを調べた。術後の体重増加はT<Rの傾向であったのに対し、十二指腸、空腸、回腸の重量(g/cm)にはいずれもT>Rの傾向がみられた。因みに、Tの腸管は顕著な肥厚を示し、絨毛高にも有意な伸長があった。臓器重量は(g/100gBW)、胃、肝臓、盲腸でT≒R、膵臓でT>Rとなった。腸管各部位のDNA量(mg/cm)はT>Rであったが、RNA量(mg/mgDNA)とタンパク質量(mg/mgDNA)はT,R間で有意な差はなく、刷子縁膜水解酵素の比活性(U/mg protein)は術前部位と同じであった。反転腸管を用いたタウロコール酸とグリコースの吸収能も、位置置換された部位で新たな誘導や減退が起きないことが観察された。一方、膵臓ではDNA含量に差が無かったのに対し、RNAやタンパク質量(mg/mgDNA)にはT>Rの傾向がみられた。なお、膵消化酵素の比活性には差はなかった。また、食塊の移動速度も1時間後ではTの方で有意に遅いが、2時間後に差はみられ無くなった。このように、空回腸位置置換手術は単純な切除手術より残存部位の粘膜上皮細胞増殖に大きな影響を与えた。

前年度において、空回腸置換手術を施したラット腸管中の空腸位置へ移した回腸が、空回腸間を部分切除後そのままの位置で縫合した空腸や回腸より、更に著しい絨毛の伸長と粘膜固有層の肥厚を伴うことを観察した。この背景となる遺伝子レベルでの動きを探るため、術後2,5日目の小腸粘膜からpoly(A)^+RNAを調製し、初期応答遺伝子c-mycとc-fos,細胞成長因子insulun-like growthfactor-1(IGF-1)の遺伝子およびポリアミン(プトレッシン)生成酵素ornithine decarboxylase(ODC)の遺伝子に対するNorthern blot解析を行なった。その結果、c-mycやIGF-1遺伝子の小腸における発現はほとんどみられず、わずかに発現のみられたc-fosやODC遺伝子でもβ-actin遺伝子発現量との対比から小腸部位間に差異のないことが確かめられた。しかし、置換された回腸粘膜上皮細胞が前述のような顕著な過形成を受けるためには何らかの因子の関与があり、今後は腸腔粘膜側からの刺激(例えば消化産物による)作用解明に目を向ける必要があろう。次に、機能的には回腸に局在することが知られているNa^+依存性胆汁酸輸送担体(ileal bile acid transporter,以下IBAT)遺伝子の発現応答について検討した。Northern blot用のプローブは、最近塩基配列の決定されたラットIBAT c-DNAの494-973bpをprimer pairに用い、ラット回腸poly(A)^+RNAをRT-PCRで増幅、これをpUC19のSmalに組み込みE.coli DH5に導入、増殖された大腸菌より当該プラスミッドを単離し、制限酵素(Ncol,Xho l)処理して得た。解析の結果、空回腸置換手術の有無や術後時間経過の長短(5日目、80日目)あるいは過形成の程度の如何にかかわらず、IBAT遺伝子の存在は回腸由来の小腸部位のみに見い出された(ただし、発現量の定量的評価は困難)。また、アフリカリツメガエル卵母細胞を用いた機能タンパク質の発現実験でも、回腸由来のpoly(A)^+RNAを注入した場合のみ輸送活性の有意な増大が認められた。
大区画化再圃場整備のための農地・農業地域の実態分析

昭和38年に発足した現行の圃場整備事業は、現在全国水田の約10%整備し、近年では事業がより困難な中山間地帯いへと進行すると同時に、既に圃場整備済みの水田についても大区画での再整備が並行して行われている。しかし水田の大区画化は用意にできうるものではなく、解決すべき課題は多い。そこで、昭和38年度に大区画を実現した水田モデル圃場3地区の事例調査、細菌各地で行われている大区画水田の参考事例調査、および各種メッシュデータの統合的解析による大区画水田賦存量の推算とを行った。モデル圃場では当初7ha規模の均平区、2ha規模の耕区がつくられていたが、その後のモデル事業の終結による営農体系の変化をうけて、耕区規模も変わってきている。野尻地区では長辺長200mが長過ぎて結局換地単位に細分化されてたため、排水路へのアクセスで問題が生じ排水路が補強さている。三瀦地区でも同様であるが、用排水路が長短辺両面に接していたため細分化による困難は生じていない。高須輪地区では長辺長を125mに押さえ無理を行わなかった。しかし均平単位の大きさがのちの耕区結合を容易にし、現在では2ha規模以上の耕区が見られる。これらより、換地配分の設定の仕方と均平単位の大きさとが大区画化に重要な因子であることがわかった。メッシュデータ解析にあたっては大区画化はそれ自体が目的ではなく省力化、低コスト化の一手段であるという認識に立って、単なる大区画化のみならず湛水直播、乾田直播、播種期後か潅漑バックアップをそなえた乾田直播の3種の新技術の適用可能な地域の抽出を試みた。関東地方での解析では41万haの水田のうち60%にあたる25万haで大区画化が可能であり、さらに湛水直播はほぼ全域で、乾田直播は25%程度可能ということが明らかになった。以上より、地域の自然立地条件・営農形態にあった区画規模・用排水形態のあり方を示すことができた。昭和38年に発足した現行の圃場整備事業は,現在全国水田の約40%を終え近年では事業がより困難な中山間地帯へと進行してきている.と同時に,既に圃場整備済みの水田(および転換畑)についても,農業内外の情勢の変化により見直しが必要になってきている.とくに,区画割りは事業実施時に想定した作業機械体系および土地所有形態等をもとに決定されているが,受委託の進行,集団的転作の進行といった状況の変化は,それに適合する圃場基盤を必要としている.また,現行圃場整備体系は,現行の作業機械を前提に組み立てられているが,本来は望ましい農業形態の模索から出発すべきものである.との認識から,現行圃場整備のモデル地区となった3地区と地域特性・地形特性にもとづいて抽出した数地区を対象に,再整備の視点から調査・検討を行い,農地基盤という土地資源の効率的運用方向を明らかにすることを試みた.その結果,以下のことが明らかになった.1)38年度実施の水田モデル圃場(野尻,高須輪中,三瀦)を対象に,当時の設計概念と,この20年間の実際の使用状態とを,事業実施当時からこれまでの資料を各々の地区の関係土地改良区,行政官庁から収集・分析し,さらにヒアリング調査により明らかにした.

2)38年度以降実施の都道府県営圃場整備事業地区のうち手に入る限りの計画書を入手し,一農区内の耕区間高低差を設計理念(切り盛り量最小化を目指すか,あるいは出来得る限り段差を少なくするか)の観点から年度別,地域別,立地条件別に一次整理した. 63年度にはさらに計画書を堀り起こしたうえで,これらのクロス分析に取り組む予定である.3)2)で一次整理したものから,条件別に数地区を抽出し,実際の使用状態を現地調査(資料,ヒアリング)により明らかにする体制を整えた.最終年度にあたる63年度は、昭和38年度実施の水田モデル圃場3地区のその後の経緯の現地調査およびとりまとめと、各種メッシュデータの統合的解析による大区画水田賦存量の推定とを行った。モデル圃場で明らかになったことの要点は以下の通りである。野尻地区では長辺長200mがとられ大型機械による営農が試行されたが長辺長が長過ぎて結局換地単位に細分化されている。そのため排水路へのアクセスで問題が生じ排水路が補強されている。三潴地区でも同様であるがここでは用排水路が長短辺両面に接していたため細分化による困難は生じていない。高須輪中地区では7.5haという最大規模の均平単位がとられたが耕区規模では長辺長を125mに抑え無理を行わなかった。しかし均平単位の大きさがのちの耕区結合を容易にし、現在では2ha規模以上の耕区が見られている。これらより、換地配分の設定の仕方と均平単位の大きさとが大区画化にとって重要な因子であることがわかった。メッシュデータ解析に供したデータは農水省農地整備情報を主に、国土庁国土数値情報の土壌および標高、気象庁アメダスの平年値を併用した。解析にあたっては大区画化はそれ自体が目的ではなく省力化・低コスト化の一手段であるという認識に立って、単なる大区画化のみならず湛水直播、乾田直播、播種期の地下灌漑バックアップを備えた乾田直播の3種の新技術の適用可能な地域の抽出を試みた。関東地方での解析では41万haの水田のうち60%にあたる25万haで大区画化が可能であり、そのうち湛水直播は4月第3半旬で91%、同第6半旬では全ての面積で可能と判明した。乾田直播は土壌および地下水位の制約を受けるため大区画化可能地の25%程度しか出来ない。以上より、地域の自然立地条件・営農形態に合った区画規模・用排水形態のあり方を示すことができた。