hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
Ｏ－アシルイソペプチド法：アミロイドペプチドの効率的合成と阻害剤開発への応用

アシルイソペプチドは、25位Gly-26位Serにエステル結合を持つ事以外はネイティブAβと同様の構造をもつにも関わらず、非凝集性を有するため、本研究はAβの凝集メカニズムの解明に貢献する事が期待される。2、Aβのアミノ酸配列を基にデザインしたペプチド性凝集阻害剤の探索Aβのアミノ酸配列を基にペプチド性のAβ凝集阻害剤のデザイン・合成及びそれらの凝集阻害活性の評価を、チオフラビンTアッセイ(Aβ凝集の定量)、ウエスタンブロッティング(Aβオリゴマー形成の定量)、蛍光アニソトロピー測定(Aβの初期凝集の評価)、原子間力顕微鏡(繊維形態の評価)などを用いて行った。これにより、Aβの凝集という複雑な過程を多角的に分析し、合成したペプチド性の凝集阻害活性を総合的に評価する事で、Aβの凝集阻害剤の開発に貢献すると考えられる。本研究は申請者らの研究グループ独自の方法論である「O-アシルイソペプチド法」を応用し、アルツハイマー病関連アミロイドペプチド(Aβ)について、その神経細胞毒性発揮メカニズムの解明と、毒性本体となるAβ分子種の形成を阻害する化合物をデザイン・合成し、その活性を評価する事を目指すものである。申請者の研究グループ独自の化合物であるO-アシルイソペプチドは、Aβの水溶性前駆体として有用なツールである.このO-アシルイソペプチド自身は水溶性かつ非凝集性であり、Aβと共存させた場合には、原子間力顕微鏡を用いた実験より、Aβの繊維形成を阻害する事が明らかとなった.アルツハイマー病の発症とAβの凝集過程は密接に関係している事が示唆されており、従ってAβの凝集を阻害する事は本疾患の治療薬開発に貢献すると考えられる。しかしながら、O-アシルイソペプチドは中性pH条件下では化学構造的に不安定であり、生理条件下でのアッセイ系に用いる事ができなかったため、中性でも安定なN-Me-β-Alaを導入した誘導体の設計・合成を行った。チオフラビンTアッセイ、蛍光アニソトロピーアッセイ、ウエスタンブロット、原子間力顕微鏡などにより評価した結果、本誘導体はAβのオリゴマー形成を遅延させ、Aβの繊維形成を阻害した。O-アシルイソペプチド及び本誘導体は、Aβのβ-シート形成領域(Aβ12-24, Aβ30-40)に着目した既存のペプチド性阻害剤とは異なる位置に修飾部位をもつため(Gly^<25>-Ser^<26>)、これまでとは異なる新たな作用機序を有する可能性があると期待される。申請書に記載した内容に沿って研究を進める事ができている。O-アシルイソペプチド法の開発がやや遅れている分、Aβの凝集に影響を与える化合物の創製が想定よりも進展しているため(2)とした。Aβの凝集メカニズムの解明に向けた研究、及び凝集阻害剤開発研究を現在行っているところであり、O-アシルイソペプチド法の開発研究に関しても、申請者を第3著者として論文発表を行う事ができた。従って、申請書に記載した内容に沿って研究を進める事ができたと考えられる。当該年度はAβの凝集メカニズムの解明及び凝集阻害剤開発研究を行い、当研究室独自の化合物であるO-アシルイソペプチドの構造をもとに設計されたN-Me-β-Ala誘導体がAβの凝集を阻害したという内容でBioorganic & Medicinal Chemistry誌に報告した。Aβのアミノ酸配列に基づく凝集阻害剤の設計・合成に成功し、現在はその阻害メカニズムの考察を行っている段階である。従って、申請書に記載した内容に沿ってある程度の研究を進める事ができたと考えられる。
日本人集団における膠原病関連遺伝子の包括的同定とゲノム医療への展開

日本人集団における全身性エリテマトーデスとTLR7, PHRF1-IRF7, IRF2多型との関連、HLA-DRB1*13:02, 14:03と疾患抵抗性との関連を見いだした。関節リウマチにおいては、疾患感受性とSPP1、薬剤性肺障害とHLA-A*31:01との関連を見いだした。全身性強皮症においてはUBE2L3の関連を、さらに、myeloperoxide-ANCA陽性血管炎においては、IRF5低発現に関連するアリルが疾患感受性に関連することを見いだした。これらの結果は、日本におけるリウマチ性疾患のゲノム医療確立上、有用な情報を提供すると考えられる。1.SPI1と全身性エリテマトーデス(SLE)との関連I型インターフェロンパスウェイ関連遺伝子であるSPI1を候補遺伝子として、SLEとの関連を検討し、3'非翻訳領域に位置する単一塩基多型(SNP)rs1057233との関連を見いだした。リスクアリルではSPI1の発現が上昇し、その機序として、リスクアリルがmiRNAのターゲット配列を置換することである可能性が想定され、リポーターアッセイにより、その仮説が実験的に支持された。2.BLKを含む8p23.1領域における複数の遺伝因子の存在研究代表者らは、これまでに、日本人集団におけるBLK近傍SNP rs13277113が、SLE、関節リウマチ(RA)、全身性強皮症(SSc)に共通に関連することを報告してきた。ヨーロッパ系集団では、同様に8p23.1領域に位置するXKR6,C8orf12との関連も報告されていることから、連鎖不平衡ブロックの異なる日本人集団において、本領域に複数の遺伝因子が存在するのか、一個所の原因的多型との連鎖不平衡でこれらの関連を説明しうるのかを検討した。33個所のSNPの関連研究の結果、SLE,RA,SScのいずれにおいても、rs13277113のほかに、MTMR9-C8orf12領域に有意な関連が検出され、これら2領域は独立に関連することが示された。一方、XKR6のSNPには、日本人集団においては関連が検出されなかった。ヨーロッパ系集団ではXKR6領域とBLK領域には強い連鎖不平衡が観察された一方、日本人集団では連鎖不平衡がみられなかったことから、ヨーロッパ系集団におけるXKR6の関連は、BLKとの連鎖不平衡により説明しうると考えられた。以上の結果、日本人集団には、8p23.1領域に、BLK周辺、C8orf12周辺の少なくとも2個所の独立した自己免疫疾患感受性アリルが存在することが明らかになった。1.遺伝子環境相互作用において鍵を握る免疫系遺伝子として、TLR7およびIRF7を候補遺伝子として、日本人集団における全身性エリテマトーデス(SLE)との関連研究を施行した。PHRF1-IRF7領域については、国外におけるゲノムワイド関連研究によりSLEとの関連が報告されていたものの、結果はさまざまであり、国内における研究も見られなかった。本研究では、機能的重要性が想定されるIRF7遺伝子のリシークエンス解析により、多数の多型部位を検出したものの、SLEとの有意な関連は認められなかった。一方、隣接するPHRF1遺伝子のSNPrs4963128が、抗Sm抗体陽性SLE、腎症合併SLEにおいて有意に関連することを見出した。TLR7遺伝子においては、すでに多施設共同研究により東アジア集団におけるSLEとの関連を報告した3'非翻訳領域の単一塩基多型(SNP)rs3853839とは独立に、イントロンのSNPrs179019とrs179010が関連することを見出した。2.ヨーロッパ系集団、アジア集団においてSLEや関節リウマチとの関連が報告されているユビキチン結合酵素UBE2L3と全身性強皮症(SSc)との関連を検討し、SScにおいても有意な関連が検出されること、関連はびまん皮膚硬化型SSc、抗topoisomeraseI抗体陽性群において顕著であることを、国内外に先駆けて見いだした。3.日本人集団においてSLEとの関連が確立した8遺伝子座に個人が有するリスクアリル数と発症との関連を検討し、健常者の中央値である7アリルと比較して、10アリルを有する場合にはオッズ比が4.17、11アリル以上を有する場合にはオッズ比8.77と有意にリスクが上昇し、4アリル以下である場合にはオッズ比は0.15と有意に低下することを見出した。以上の知見は、膠原病発症における遺伝子環境相互作用の検討の基盤となるとともに、日本人集団における膠原病のゲノム医療の実現上、有用な情報を提供すると考えられる。

1.前年度までに、I型インターフェロン経路を対象とした候補パスウェイ解析により、IRF2遺伝子のtag SNPに全身性エリテマトーデス(SLE)との有意な関連が検出されたことを受け、本年度は、この周辺のリシークエンス解析を施行し、病因的多型部位を探索した。見出された複数のSNPについても関連が検出され、レポーター解析により、これらのSNPが形成するriskhaplotypeは、IRF2転写亢進に関連することが示唆された。2.フランス、スペインのグループらとの大規模多国籍共同研究により、SPP1(osteopontin)多型が関節リウマチ(RA)と関連し、特に抗CCP抗体陰性群において関連が顕著であることを見出した。3.日本人におけるRA、SLEにおいて、抗Ro抗体、抗La抗体産生とHLA-DPB1*05:01が関連することを見出した。また、日本人SLEにおいて、HLA-DRB1*13:02, 14:03が疾患抵抗性に関連することを見出した。4.日本人集団におけるANCA関連血管炎において、以前われわれが少数例において報告した顕微鏡的多発血管炎(MPA)、MPO-ANCA陽性AAVにおけるHLA-DRB1*09:01の関連を、サンプルサイズを大幅に増やして確認するとともに、PR3-ANCA陽性群ではDRB1*09:01の増加は見られないことを見出した。DRB1*09:01はアジア集団において頻度が高い一方、ヨーロッパ系集団には稀なアリルであることから、DRB1*09:01が、アジア集団においてMPA、MPO-ANCA陽性AAVが顕著に多く、ヨーロッパ系集団には少ないことの一因になっている可能性を提唱した。[連携研究者]国立病院機構相模原病院・臨床研究センター室長古川宏:リウマチ膠原病試料、臨床情報収集、遺伝子多型解析1)関節リウマチ(RA)におけるmethotrexate(MTX)治療を受ける一部の患者に誘発される間質性肺障害は、しばしば重症化し、致命的となることもある重要な有害事象である。本研究では、HLA-A*31:01がRAにおけるMTX誘発性間質性肺障害誘発性間質性肺障害に有意に関連することを検出した。この成果は、RAの個別化医療の実現に寄与しうる重要な知見である。2)日本人集団におけるANCA関連血管炎(AAV)と,複数の自己免疫疾患に対する関連が確立しているIRF5、STAT4, BLKおよびTNIP1との関連を検討した。STAT4においては、ほかの自己免疫疾患同様、rs7574865T/T遺伝子型がMPO-ANCA陽性血管炎において有意に増加していた。一方、IRF5においては、ほかの膠原病におけるnon-risk alleleであり、IRF5 mRNAレベル低下と関連するrs10954213GアリルおよびG/G遺伝子型が、MPO-ANCA陽性血管炎、顕微鏡的多発血管炎(MPA)群において有意に増加していた。このことから、MPO-ANCA関連血管炎あるいはMPAにおいて、遺伝的に規定されたtype I interferon低産生が発症リスクと関連することが示唆された。4) Type I interferon pathway関連遺伝子群を候補遺伝子とした解析により、IRF2遺伝子多型が全身性エリテマトーデス(SLE)と関連することを示唆する知見を得た。今後、リシークエンス解析により、一義的多型を同定し、分子機構の解明を進める予定である。8個の疾患感受性
ベーチェット病における連鎖球菌の関与および免疫異常に関する分子生物学的研究

ベーチェット病患者由来Streptococcus sanguisから抽出した菌体DNAを制限酵素で切断ののち、λgt11ベクターにクローニングし、作成したライブラリーより、患者血清を一次抗体、抗ヒトIgGおよびIgM抗体を二次抗体とするイムノスクリーニングを行い、得た陽性クローンは、DNAとして約1.5kbpの大きさであり、Western blot法によりDNAの発現する蛋白は分子量33-35kDaであった。この得られたDNAの塩基配列の同定するため、まず単離したDNAのサブクローニングを行い、λgt11ベクターに入った菌体由来DNAを増幅後、EcoRIで切り出し、プラスミドpUC118に挿入し、この後、プライマー伸長法により、全塩基配列を決定した。その結果、1.5kbpの塩基配列の中にATGで始まるふたつのopen reading flame (ORF)と考えられる部分が存在しており、それぞれ590bpと950bpの大きさであった。Western blot法より抗原蛋白は分子量33kDa以上であったが、後者のORFはそのアミノ酸配列から推定して約34kDaの蛋白をコードしていると考えられ、また、16b上流にShine-Dalgarno配列を有していることから、後者のORFが抗原蛋白を発現している可能性が高いと考えられた。そこで下流領域をHindIIIおよびEcoRI CassetteおよびCassette primer【○!R】を用いたPCR法によってcloningし、さらに塩基配列の同定を行った。その結果、下流領域にstop codonが確認でき、抗原を発現していると考えられるopen reading frame (ORF)の全塩基配列が判明した。ORFは2,550bp、849のアミノ酸からなり、分子量は約94,800Daであった。Homology searchでは、ヒト網膜のganglion cellで発現しているhomeobox geneであるBrn-3bと高いhomologyがみられた。ベーチェット病患者由来Streptococcus sanguisから菌体DNAを抽出し、制限酵素で切断ののちλgt11ベクターにクローニングし、ライブラリーを作成した。このライブラリーより患者血清を一次抗体、抗ヒトIgGおよびIgM抗体を二次抗体とするイムノスクリーニングを行い陽性クローンを得た。このDNAは約1.5kbpの大きさであり、Western blot法によりDNAの発現する蛋白は分子量33-35kDaであった。そこでこの得られたDNAの塩基配列の同定を試みた。まず単離したDNAのサブクローニングを行い、λgt11ベクターに入った菌体由来DNAを増幅後、EcoRIで切り出し、プラスミドpUC118に挿入した。この後、プライマー伸長法により、全塩基配列を決定した。その結果、1.5kbpの塩基配列の中にATGで始まるふたつのopen reading flame(ORF)と考えられる部分が存在しており、それぞれ590bpと950bpの大きさであった。Western blot法より抗原蛋白は分子量33kDa以上であったが、後者のORFはそのアミノ酸配列から推定して約34kDaの蛋白をコードしていると考えられ、また、16b上流にShine-Dalgarno配列を有していることから、後者のORFが抗原蛋白を発現している可能性が高いと考えられる。このORFはストップコドンを持たないままプラスミドのDNAに移行しており、ライブラリー作成時に使用したEcoRIで下流部分が切断されていると考えられた。すなわち菌体の中ではもっと大きなORFからなっており、もっと大きな蛋白が抗原として働いている可能性がある。そこで今後はさらに下流領域を調べるため、菌体DNAをEcoRI以外の制限酵素で切断してDNAライブラリーを作成し、これまでにわかっている配列を元にして作った標識プローブを用いてスクリーニングを行っている。さらにこの抗原をベーチェット病患者リンパ球との反応を中心にエピトープレベルで解析する予定である。

ベーチェット病患者由来Streptococcus sanguisから抽出した菌体DNAを制限酵素で切断ののち、λgt11ベクターにクローニングし、作成したライブラリーより、患者血清を一次抗体、抗ヒトIgGおよびIgM抗体を二次抗体とするイムノスクリーニングを行い、得た陽性クローンは、DNAとして約1.5kbpの大きさであり、Western blot法によりDNAの発現する蛋白は分子量33-35kDaであった。この得られたDNAの塩基配列の同定するため、まず単離したDNAのサブクローニングを行い、λgt11ベクターに入った菌体由来DNAを増幅後、EcoRIで切り出し、プラスミドpUC118に挿入し、この後、プライマー伸長法により、全塩基配列を決定した。その結果、1.5kbpの塩基配列の中にATGで始まるふたつのopen reading flame(ORF)と考えられる部分が存在しており、それぞれ590bpと950bpの大きさであった。Western blot法より抗原蛋白は分子量33kDa以上であったが、後者のORFはそのアミノ酸配列から推定して約34kDaの蛋白をコードしていると考えられ、また、16b上流にShine-Dalgarno配列を有していることから、後者のORFが抗原蛋白を発現している可能性が高いと考えられた。そこで下流領域をHindIIIおよびEcoRI CassetteおよびCassette primer^<【encircledR】>を用いたPCR法によってcloningし、さらに塩基配列の同定を行った。その結果、下流領域にstop codonが確認でき、抗原を発現していると考えられるopen reading frame(ORF)の全塩基配列が判明した。ORFは2,550bp、849のアミノ酸からなり、分子量は約94,800Daであった。Homology searchでは、ヒト網膜のganglion cellで発現しているhomeobox geneであるBrn-3bと高いhomologyがみられた。
超分子ポルフィリン誘導体を用いた外部シグナル応答型電子移動システムの構築

光を外部刺激として利用し、超分子型光増感剤を用いた電子・エネルギー移動により一重項酸素を発生させることでの生体機能システムに対する影響を検討した。ここでは、植物の光合成に習い、ポルフィリン類を光増感剤として選択した。ポルフィリン類は電子・エネルギー移動を伴う一重項酸素発生には有効であると期待される。また一重項酸素は、近年、生体系への大きな障害から興味が持たれている。生体内で光を活用する場合、組織透過性の観点から、長波長可視光領域の光が有効であることが知られており、今回はまず、長波長光を吸収するポルフィリン誘導体の設計と合成を行った。実際に、ポルフィリン骨格に2個の窒素原子を導入したジアザポルフィリン誘導体を合成し、その光特性を測定したところ、600nm付近に効率的な吸収帯をもつことを確認した。そこで、このジアザポルフィリン誘導体を用いて可視光照射による一重項酸素発生能を検討した結果、一重項酸素発生に関する量子収率が約0.9となり、高効率な一重項酸素発生能を示すことを実証した。次に、実際の生体系への影響を調査するために細胞系実験を行った。光増感効果が癌治療のひとつである光線力学的療法に利用されていることから、癌細胞の壊死化を超分子型ポルフィリン誘導体への光照射によって観測した。カチオン性ポルフィリンを癌細胞と共存させた状態で可視光照射を行うと、ほとんどの癌細胞が死滅することが確認された。ここで、カチオン性ポルフィリン存在下で静電的相互作用によって超分子組織化が可能なアニオン性ポルフィリンを徐々に添加すると、細胞毒性の減少がみられた。これは光増感剤の超分子組織化平衡によって一重項酸素発生能が制御され、細胞に対する影響がコントロールできることを意味する。この制御可能な光増感効果は報告例がなく、光線力学的療法による癌治療後の正常細胞に対する毒性の消去という面で非常に興味深い。外部シグナルとしてクリーンなエネルギーである光を用い、生体機能と密接に関連する生理活性物質の電子・エネルギー移動による構築に関して検討した。ここでは植物の光合成に習い、ポルフィリン類を光吸収物質として利用した。これは光合成中心に存在するクロロフィルと同じ骨格を有するために高効率化を実現できると期待したことが大きな理由である。実際に様々な新規ポルフィリン誘導体(ポルフィリン異性体や多量体等)を合成化学的手法を用いて、創出し、これらに光、特に可視光を照射した。その結果、光エネルギーが新規ポルフィリン誘導体を経由して周りに存在している酸素に伝達され、反応性の高い活性酸素種のひとつである一重項酸素を効率よく生産することに成功した。この励起エネルギー移動によって産出された一重項酸素は細胞に対する毒性が指摘されており、癌細胞の壊死やウイルス・細菌の死滅を行うことによる新たな疾患治療法として医学薬学分野で注目されている。ここでは低エネルギー光を利用した一重項酸素の発生効率はポルフィリン骨格にヘテロ原子を導入することで増大することを証明した。さらに今回は一重項酸素の発生を有機物の添加で調整することを挑戦し、用いたポルフィリン誘導体の三次元立体構造のナノレベルでの変化が関連していることを明らかにした。一重項酸素発生の制御機構にはポルフィリン多量体において中心金属へ配位が可能なゲスト分子を相互作用させ、超分子組織体を構築させることを利用した。実際に直結型ポルフィリン多量体に多座配位性アミン類を添加して、中心亜鉛への協同的配位に伴うポルフィリン環の二面角を変化によって、一重項酸素の発生能は上昇することを確認した。このような一重項酸素発生能のコントロールはこれまで報告例が少なく、これは学術的に大きな意味を持った化学と医学との融合領域の研究のひとつとなり得る。

これは光増感剤の超分子組織化平衡によって一重項酸素発生能が制御され、細胞に対する影響がコントロールできることを意味する。この制御可能な光増感効果は報告例がなく、光線力学的療法による癌治療後の正常細胞に対する毒性の消去という面で非常に興味深い。
複合化原子間力顕微鏡を応用した単離心筋細胞骨格化に伴う力学と代謝特性の解析

原子間力顕微鏡をもちいて細胞の弾性率を求める研究はこれまでにも行われているが、動的な筋細胞とは異なる細胞種が対象であった。特に心筋細胞に対する解析は皆無に等しい。その原因は非常に繊細なセンサーである原子間力顕微鏡のカンチレバーの感度に対し、ダイナミックに動く心筋細胞の挙動がノイズとなり、シグナルノイズレシオ(S/N比)が非常に低くなることが原因であると思われる。我々のグループではこの問題を解決するため、心筋の筋長を制御する機構を組み込むことにより任意の筋長での等尺性収縮および制御された短縮様式で測定できる系を立ち上げている段階である。一方、筋細胞に対する原子間力顕微鏡を用いた弾性率変化の解析の妥当性を確認するため、心筋より静的な収縮弛緩をみせる血管平滑筋細胞を用いた測定を行っている。結果は我々の予想したとおり、血管収縮物質であるノルアドレナリンおよびアンジオテンシンIIで処理をした場合には平滑筋細胞の弾性率は増加し、血管弛緩物質であるプロスタサイクリン,NOの投与時には逆に弾性率の低下が確認できた(日本循環器学会、日本ME学会、2002)。したがって当初予定していた心筋細胞の心不全時における細胞骨格の変化は筋弛緩期の、収縮力低下などを引き起こす収縮蛋白の異常は収縮時の弾性率を測定することによりそれぞれ解析できるものと思われる。また、血管平滑筋に対する解析を発展させ肺高血圧症患者由来の平滑筋細胞を用いた解析を行い病態解明の一助としたい。(基盤(S)採択のため年度途中で辞退)原子間力顕微鏡をもちいて細胞の弾性率を求める研究はこれまでにも行われているが、動的な筋細胞とは異なる細胞種が対象であった。(基盤(S)採択のため年度途中で辞退)
フリッカー光により誘起される昆虫の特異的行動の解析とそれに基づく低誘虫技術の検討

昆虫を含めた動物がフリッカー光をどのように知覚し,フリッカー光に対してどう反応するのかについては,これまで断片的にしか明らかになっていない.本研究課題では,農業害虫チャバネアオカメムシにおいて予備実験で観察されたフリッカー光に対する特異的行動とそれに伴うフリッカー光源への低誘虫現象を基盤に,本種をモデルとして,可視周波数の電気生理学的・行動学的解析とフリッカー光の種々の属性に対する行動学的解析を行う.それらの結果に基づいて,フリッカー刺激を利用した新規の低誘虫技術の基礎となる知見を得ることを目的とするものである.平成30年度は,「2.行動学的解析によるCFFと行動メカニズムの推定」と「3.フリッカー4属性に対する行動反応の解析」の2つの行動実験を進めた.「2.行動学的解析によるCFFと行動メカニズムの推定」では,30Hzのフリッカー周波数で点滅する光源に対するチャバネアオカメムシの定位角度を測定した.7種類の波長の光源のいずれに対しても,光源方向への強い定位傾向が認められた.これにより,フリッカー光により誘起される低誘虫現象は,忌避行動によるものではなく,定位阻害による可能性が高いことが改めて推定された.「3.フリッカー4属性に対する行動反応の解析」では,室内実験系において,光強度,デューティー比(DR),変調深度(MD)に対する反応性を解析した.その結果,光強度に関しては,チャバネアオカメムシはその走光性行動で10%の光強度の差を弁別しないが50%の差を弁別すること,光強度が同じ融合フリッカー光と非フリッカー光を弁別しないことを明らかにした.また,デューティー比が低く,変調深度が大きいフリッカー光で誘引率が低くなることが認められた.これらの成果をもとに,各属性を可変することができる大型光源であるLEDパネルを試作した.本年度の課題としていた「2.行動学的解析によるCFFと行動メカニズムの推定」では,定位角度のデータを得ることで,フリッカー光で誘起されるチャバネアオカメムシの特異的行動が定位阻害であることを示すことができた.また,「3.フリッカー4属性に対する行動反応の解析」では,光強度,デューティー比,および変調深度に対する反応性の傾向を明らかにし,大型光源としてLEDパネルを試作するなど,予定していた課題の大半を完了することができた.一方で,ヒトに対する「ちらつきの不快性」については,その確認が進んでいない.総じて,研究全体はおおむね順調に進展していると考えられる.最終年度は,平成30年度の成果を受けて,各属性が調節可能な試作光源を使用し,「4.多種の昆虫類を用いたフリッカー光の低誘虫効果の検証」に移行する.「4.多種の昆虫類を用いたフリッカー光の低誘虫効果の検証」では,2と3で明らかにした低誘虫効果が高い属性を組み合わせた最適なフリッカー刺激をデザインする.このデザインされたフリッカー光で,強い低誘虫効果が見られるかどうかを,チャバネアオカメムシを用いて室内で検証する.また,試作光源を農業圃場や林縁などの野外に設置し,光源に誘引された昆虫の個体数などを,同様に設置した非フリッカー(連続照射)光源と比較することで,その効果の普遍性を実証する.昆虫を含めた動物がフリッカー光をどのように知覚し,フリッカー光に対してどう反応するのかについては,これまで断片的にしか明らかになっていない.本研究課題では,農業害虫チャバネアオカメムシにおいて予備実験で観察されたフリッカー光に対する特異的行動とそれに伴うフリッカー光源への低誘虫現象を基盤に,本種をモデルとして,可視周波数の電気生理学的・行動学的解析とフリッカー光の種々の属性に対する行動学的解析を行う.それらの結果に基づいて,フリッカー刺激を利用した新規の低誘虫技術の基礎となる知見を得ることを目的とするものである.平成29年度は,「1.電気生理学的解析によるCFFの特定」と「2.行動学的解析によるCFFと行動メカニズムの推定」を進めた.「1.電気生理学的解析によるCFFの特定」では,網膜電図法を用いてチャバネアオカメムシの複眼の光強度応答曲線及び分光感度曲線を得た.また紫外および白色のLED光源に対する臨界融合周波数(CFF)が,それぞれ平均74Hzと平均86Hzであることを特定した.「2.行動学的解析によるCFFと行動メカニズムの推定」では,7種類の波長の光源に対して30240Hzまでのフリッカー周波数で点滅する光源に対する走光性行動を観察した.いずれの波長でも60120Hzの間で,光源に対する急激な誘引率の低下が認められた.一方で,周波数と飛翔率との間に関係は認められなかった.30Hzおよび240Hzのフリッカー光源と非フリッカー光源に対する飛翔軌跡を観察したところ,30Hzのフリッカー光源において顕著な転回行動を含む複雑な軌跡が認められ,低周波数のフリッカー光が,光源への正確な定位を阻害していることが示唆された.本年度の課題としていた「1.電気生理学的解析によるCFFの特定」では,網膜電図法により,光強度応答曲線と分光感度応答曲線を得た上で,チャバネアオカメムシのフリッカー光に対する臨界融合頻度(CFF)を特定することができた.一方,細胞内微小電極法によるCFFの特定は遅れている.「2.行動学的解析によるCFFと行動メカニズムの推定」では,各波長の光源に対する走光性において行動学的CFFを推定するなど,予定していた課題の大半を完了することができた.総じて,研究全体はおおむね順調に進展していると考えられる.

昆虫を含めた動物がフリッカー光をどのように知覚し,フリッカー光に対してどう反応するのかについては,これまで断片的にしか明らかになっていない.本研究課題では,農業害虫チャバネアオカメムシにおいて予備実験で観察されたフリッカー光に対する特異的行動とそれに伴うフリッカー光源への低誘虫現象を基盤に,本種をモデルとして,可視周波数の電気生理学的・行動学的解析とフリッカー光の種々の属性に対する行動学的解析を行う.それらの結果に基づいて,フリッカー刺激を利用した新規の低誘虫技術の基礎となる知見を得ることを目的とするものである.平成30年度は,「2.行動学的解析によるCFFと行動メカニズムの推定」と「3.フリッカー4属性に対する行動反応の解析」の2つの行動実験を進めた.「2.行動学的解析によるCFFと行動メカニズムの推定」では,30Hzのフリッカー周波数で点滅する光源に対するチャバネアオカメムシの定位角度を測定した.7種類の波長の光源のいずれに対しても,光源方向への強い定位傾向が認められた.これにより,フリッカー光により誘起される低誘虫現象は,忌避行動によるものではなく,定位阻害による可能性が高いことが改めて推定された.「3.フリッカー4属性に対する行動反応の解析」では,室内実験系において,光強度,デューティー比(DR),変調深度(MD)に対する反応性を解析した.その結果,光強度に関しては,チャバネアオカメムシはその走光性行動で10%の光強度の差を弁別しないが50%の差を弁別すること,光強度が同じ融合フリッカー光と非フリッカー光を弁別しないことを明らかにした.また,デューティー比が低く,変調深度が大きいフリッカー光で誘引率が低くなることが認められた.これらの成果をもとに,各属性を可変することができる大型光源であるLEDパネルを試作した.本年度の課題としていた「2.行動学的解析によるCFFと行動メカニズムの推定」では,定位角度のデータを得ることで,フリッカー光で誘起されるチャバネアオカメムシの特異的行動が定位阻害であることを示すことができた.また,「3.フリッカー4属性に対する行動反応の解析」では,光強度,デューティー比,および変調深度に対する反応性の傾向を明らかにし,大型光源としてLEDパネルを試作するなど,予定していた課題の大半を完了することができた.一方で,ヒトに対する「ちらつきの不快性」については,その確認が進んでいない.総じて,研究全体はおおむね順調に進展していると考えられる.次年度は,平成29年度の成果を受けて「2.行動学的解析によるCFFと行動メカニズムの推定」と「3.フリッカー4属性に対する行動反応の解析」の2つの行動実験を網羅的に進める.「2.行動学的解析によるCFFと行動メカニズムの推定」では,行動メカニズムの推定を引き続き行う.「3.フリッカー4属性に対する行動反応の解析」では,2で用いた実験系を利用し,波長,光強度,デューティー比,変調深度といったフリッカー光の4つの属性を変化させ,その行動反応を定量化する.これらの解析結果から,低誘虫効果の高いフリッカー光の属性の組み合わせを特定し,ヒトへの視認性と低誘虫効果の検証が可能な大型光源の試作に入る.最終年度は,平成30年度の成果を受けて,各属性が調節可能な試作光源を使用し,「4.多種の昆虫類を用いたフリッカー光の低誘虫効果の検証」に移行する.
腫瘍特異的発現プロモーターを用いた肺癌の遺伝子治療

(1) CEA産生肺癌に対する特異的遺伝子治療(2) Myc高発現小細胞肺癌に対する特異的遺伝子治療Myc蛋白の結合配列をHSV-tkプロモーター上流に連結し、Myc高発現小細胞肺癌に特異的にHSV-tk遺伝子を発現するアデノウイルスベクター(Ad.Myc-TK)を作成した。Myc高発現小細胞肺癌株をヌードマウスの腹腔内に接種し、Ad.Myc-TK感染後GCVで治療後、腹腔内腫瘍重量を測定した。Ad.Myc-TK/GCV治療群では、対照群に比して、腫瘍重量は14分の1と有意に少なく、また8匹中2匹のマウスで腫瘍は完全に退縮していた。CEA高値の肺腺癌株に対し、CEAプロモーターの制御下にHSV-tkを発現する非増殖型アデノウイルスベクター(Ad.CEA-TK)を用いて治療実験を行った。ヌードマウスの皮下に移植されたCEA産生癌に同ベクターで遺伝子導入後、ガンシクロビル(GCV)を投与したが、その治療効果は不充分であり、増大速度の抑制が得られる程度であった。これは、CEAプロモーターの活性の低さに起因するところが大きいと考えられた。現在、我々は、この問題点を克服すべく、Cre/loxPシステムを用い、特異性を保ち且つより強力なHSV-tkの発現を目指している。すなわち、CEAプロモーターの制御下にCreリコンビナーゼを特異的に発現するAd.CEA-Creと、Creにより2つのloxP siteに挟まれたstuffer遺伝子が外れて初めて、強力なCAGプロモーターの制御下にHSV-tkを発現するAd.CAG-loxP-TK)を、同時にCEA産生癌細胞に感染させることにより、上記問題点を解決しようというものである。すでにこれら2種のアデノウイルスベクターが管制しており、その有効性を、従来のAd.CEA-TK単独感染症と、in vitroにて比較検討中である。Myc癌遺伝子増幅小細胞肺癌に対しては、皮下腫瘍モデルにおいて、OC-10株(c-myc高発現)OS2-R株(L-myc高発現)ともに、Ad.Myc-TKで遺伝子導入後のGCV投与により、有意な腫瘍退宿を認めた。OS2-R株を用いた癌性腹膜炎モデル(人の癌性胸膜炎のマウスモデルになると思われる)では、Ad.Myc-TKを腹腔内投与後GCV治療群で、腫瘍接種130日後においても、約1/4(15匹中4匹)で、desease freeの状態であった。現在、この結果が統計学的に有意なものかどうかを判定するため、数を増やして追試を行なっている。(1)CEA産生肺癌に対する特異的遺伝子治療(2)Myc高発現小細胞肺癌に対する特異的遺伝子治療Myc蛋白の結合配列をHSV-tkプロモーター上流に連結し、Myc高発現小細胞肺癌に特異的にHSV-tk遺伝子を発現するアデノウイルスベクター(Ad.Myc-TK)を作成した。
再生医工学および感染症への展開を目指したグライコ・ナノマテリアルズの創製

(1)生分解性糖糖鎖高分子の酵素化学的合成酵素触媒Lipaseによって、トレハロースおよびガラクト型トレハロース(GT)をセバシン酸ジビニルで位置選択的にエステル化し、重合性糖エステルへと変換した。続いて過酸化水素/アスコルビン酸を用いたラジカル単独重合によってポリビニルアルコール型糖鎖高分子(PV-TとPV-GT)へと導き、蛍光測定およびQCMによって糖結合性タンパク認識能について解析した。(2)硫酸化糖を基本骨格とする抗インフルエンザ薬の分子設計_c6-硫酸化N-アセチルグルコサミン(6-sulfo-GlcNAc)がホスト細胞表層のシアル酸(Neu5Ac)Neu5Acのミミックとして機能し、抗インフルエンザ薬のリード化合物となることをすでに報告した。本研究では4位の立体配置が異なる6-硫酸化N-アセチルガラクトサミン(6-sulfo-GalNAc)が、シアリルα2-6ガラクトース(Neu5Ac α2-6 Gal)をミミックしていることに着目して、ヘマグルチニンとシアリダーゼの両者を阻害できる新しいリード化合物になりうると考えた。6-sulfo-GalNAcはシアリダーゼやヘマグルチニンに対するin vitroアッセイでは阻害活性を示したにもかかわらず、細胞上ではウイルスに対し顕著な阻害活性を示すにはいたらなかった。そこで細胞親和性を高めるために、塩基性基のグアニジル基の導入を試みた。pNP基末端をアミノ基に変換してアルギニンと縮合することで、グアニジル基を導入した6-sulfo GalNAcおよび6-sulfo GlcNAcを合成した。(3)病原性マイコプラズマに由来する新規糖脂質GGPLsの絶対構造・生理活性相関の解析マイコプラズマの一種であるM.fermentansは、関節炎リウマチの原因菌ではないかと疑われている。本菌に新しいタイプの糖脂質GGPLs(GGPL-IおよびGGPL-III)に関連する目的の4種の立体異性体およびGGPL-IIIの効率的な合成に成功した。炎症抑制性サイトカインであるIL-10の誘導阻害試験では、合成GGPL-IおよびIIIに阻害活性が見られた。立体異性体間では、π-A等温線で特異な膜特性を示したGal-(S)型に天然型をしのぐ強い活性が見られ、GGPL類の膜中での集合体構造がM.fermentansの病原性と深く関係していると考えている。我々はこれまでに、ポリスチレンやポリアクリルアミドに生理活性糖鎖を結合した糖鎖高分子を合成し、これらが細胞接着性の向上やウイルス、毒素の中和活性を効果的に示すことを報告してきた。しかしながら、糖鎖高分子の合成には糖の水酸基の保護、脱保護を含む多くの煩雑な操作を必要とし、より簡便な合成法が望まれている。本研究では酵素の分子認識能を利用し、生分解性のポリビニルアルコールを主鎖に有する糖鎖高分子の簡便かつ精密な合成法を確立した。得られた糖鎖高分子(PV-Lac、PV-Mal)のレクチン認識能について検討を行った。また本糖鎖高分子の肝細胞培養材料への応用検討を行ったので報告する。

乳糖,麦芽糖の還元糖(ラクチトール、マルチトール)と、カルボン酸ジビニルエステルとをプロテアーゼやリパーゼを触媒として反応を行うと、位置選択的エステル化が効率よく起こることを見出した。これにより重合官能基を有する糖モノマーをOne-stepで合成でき、このモノマーを重合することにより簡便に糖鎖高分子(PV-Lac、PV-Mal)を得ることに成功した。また、これらの糖鎖高分子は糖クラスター効果によりレクチンに対し高い特異性と親和性を示した。今回合成した糖鎖高分子(PV-Lac)は、側鎖にβ-Galを有するため、アシアロ糖タンパクレセプターを持つ肝細胞と特異的に接着することが考えられる。そこで本糖鎖高分子をコーティングした培養皿にて癌化肝細胞(HepG2)の接着実験を行ったところ、Β-Galを有する糖鎖高分子(PV-Lac)をコートした培養皿でのみ、HepG2細胞の接着性が向上するという結果が得られた。このことによりPV-Lacは優れた肝細胞培養材料となることが示唆された。(1)分子の自己組織化(bottom-up)と光リソグラフィー(top-down)を組み合わせて,糖鎖の微細構造形成を目指して,(1)有機シラン分子の自己組織化単分子膜の調製,(2)光リソグラフィーによるマイクロパターン化,(3)疎水性相互作用による糖質自己組織化膜の形成とミクロ構造化,(4)レクチンによるパターン形成を明らかにした。(2)抗生物質の一種であるアミカシンをBoc化した後、DMF中でエステル化した。得られたアミカシンモノマーとマルチトールビニルエステルの共重合により,多価アミカシンを合成した。多価アミカシンは弱いタンパク質合成阻害能を示したが、抗菌性は示さなかった。一方,酵素存在下で抗菌性を検討したところ、僅かながら抗菌性が回復することから、プロドラック効果が発現されることがわかった。(3)6硫酸化-GlcNAc誘導体がセレクチンアンタゴニスト活性だけでなく、シアリダーゼ活性を示すことを見出した。pNP-6-sulfo-GlcNAcをpNP-_-D-GlcNAcに対するMe_3NSO_3を用いた直接硫酸化によって合成し、コレラ菌由来のシアリダーゼに対する阻害活性をMU-Siaを基質とする蛍光法によって調べたところ、高濃度(IC_<50>= 2mM)ではあるが阻害活性を示すことが明らかとなった。別途合成した硫酸基の位置の異なる3-sulfo及び4-sulfo-GlcNAcや、アセトアミド基のない6-sulfo-Glcが顕著な阻害活性を示さないことから、pNP-6-sulfo-GlcNAcのシアリダーゼ阻害活性はNeuAcとの構造類似性に基づく結果であることが予想できた。同時に、インフルエンザウィルス由来のシアリダーゼ阻害活性も測定し、各種硫酸化糖の構造と活性の相関を調べた。(1)生分解性糖糖鎖高分子の酵素化学的合成酵素触媒Lipaseによって、トレハロースおよびガラクト型トレハロース(GT)をセバシン酸ジビニルで位置選択的にエステル化し、重合性糖エステルへと変換した。続いて過酸化水素/アスコルビン酸を用いたラジカル単独重合によってポリビニルアルコール型糖鎖高分子(PV-TとPV-GT)へと導き、蛍光測定およびQCMによって糖結合性タンパク認識能について解析した。(2)硫酸化
腺様嚢胞癌の神経周囲浸潤に関与する神経栄養因子と免疫逃避機構の解明

本研究では腺様嚢胞癌の神経周囲浸潤メカニズムを多方面から解析している。ACCにおけるPD-L1の発現評価を主に行い、ACCの約20%で発現し、局所予後不良という結果であった。さらに他がんにおいて、神経周囲浸潤との関与が指摘されている、Garanin/GALR-2系、VEGF/VEGFR-2系の関与については、ACCでは関連性を認めなかった。平成28年度は、腺様嚢胞癌の免疫逃避機構の解析を主に行った。PD-L1の発現評価を免疫染色にて行い、PD-L1抗体はclone SP142 (Spring Bioscience)を使用した。腫瘍細胞における10%以上の発現をPD-L1陽性と判定したが、解析37症例における発現率は21%であった。神経周囲浸潤や病理組織型やNGF/TrkA過剰発現といった臨床病理学的因子とPD-L1の発現状況に関連性は認めなかった。また生存率との関連性は認めなかったが、PD-L1陽性症例では、局所制御率が統計学的に有意に低かった(陽性vs陰性, 0% vs 54%, p=0.01)。さらに、多変量解析では独立した因子であった(HR 2.96, 95%CI 1.07-8.15)。次年度はさらなる、免疫応答の解析を計画している。本研究では、腺様嚢胞癌においてNGF/TrkA系シグナルの過剰発現が65%で生じ、神経周囲浸潤及び、局所予後に関与していることがすでに明らかになっている。次年度はNGF/TrkA系の下流シグナルの解析に加え、Trk受容体をコードしているNTRKを含めた遺伝子の変異解析を検討中である。特にTrkA受容体をコードしているNTRK1に関しては、他癌において、様々な遺伝子との融合が報告されておりこれらについて集中的に解析を考えている。腺様嚢胞癌におけるPD-L1の検討は過去に報告がないため、その評価解釈に時間を要した。またNGF/TrkA系の下流シグナルを明らかにすることを目的に、神経周囲浸潤最終段階で関与すると考えられるタンパク分解酵素であるMMP-2及びMMP-9の発現評価を免疫染色で試みたが、条件検討がうまくいかず、評価が困難であった。後述の通り、近年Trk受容体阻害薬が臨床応用されており、Trk受容体の責任遺伝子であるNTRKの解析が重要と考え、NTRK解析も検討している。平成28年度はACCにおけるPD-L1の発現評価を主に行い、PD-L1はACCの約20%で発現し、発現症例では局所予後不良という結果であった。NGF/TrkA系シグナルがACCの神経周囲浸潤に関与していることから、そのシグナルの原因になりうる、Trk受容体の責任遺伝子であるNTRKに注目的解析を行った。しかしながら、RNAseqによる融合遺伝子の検討では残念ながら、NTRKに対する融合遺伝子は同定できず、既知のMYB-NFIB融合遺伝子しか同定できなかった。また、同時に行った変異解析ではSP1, CEP57, DST, FGFR2, KANK1, EPCAM, NOTCH1の変異をみとめた。さらに他癌において、神経周囲浸潤との関与が指摘されている、Garanin/GALR-2系、VEGF/VEGFR-2系の関与については、免疫染色での検討を行ったが、条件検討がうまくいかず、評価が困難であった。免疫逃避機構の評価はPD-L1のみ評価では不十分であり、CD8、CD4、Treg、PD-1、PD-L2などを含めた包括的な免疫応答の評価が必要であると考えている。NGF/TrkA系シグナルの解析においては、下流シグナルの評価だけでなく、シグナル過剰発現の原因についても解析を検討している。Trk受容体をコードする遺伝子であるNTRKが同定され、NTRK融合遺伝子陽性腫瘍ではこのシグナルが過剰発現するこが明らかになりつつある。さらに、近年Trk阻害薬が臨床応用されており、今後この経路の解明は重要と考える。最終年度にむけて、免疫逃避機構の評価はPD-L1のみ評価では不十分であり、CD8、CD4、Treg、PD-1、PD-L2などを含めた包括的な免疫応答の評価が必要であると考えている。NGF/TrkA系シグナルの解析についは、シグナル過剰発現の原因として、NTRKの融合遺伝は現在解析を行った症例では同定できていない。今年度でさらに残りの症例につても、RNAseqを行う方針である。またRANseqの変異解析で明らかになった、NOTCH1に注目して、active Notch1の免疫染色を施行し、臨床予後との関連性の検討を計画している。実験系の遅れにより、今年度の解析数が少なく、今年度分の予算に若干の余りが生じた。次年度は、今年度行えなかった分の解析も行う方針である。
電子教科書・電子ノートの活用を想定したリアルタイム授業改善方法の研究

リアルタイムに授業改善を行うために、学習活動ログを収集して学習活動様式を類型化できるシステムを開発した。小テストの実施回数と得点が正の相関関係にあることや、小テスト得点が高い学生は期末試験の文章題でも高い得点であることが分った。事前に性格検査を行っておくことにより、各個人の性格と学習態度との関連もあることが分った。これらを総合的に分析することで、授業回毎は勿論のこと、リアルタイムでの授業改善が可能になったと考えている。前年度に実施した実証実験のデータを分析した結果、当初の仮説どおり、模擬「電子教科書」を活用した授業において、学生の主要5因子性格検査(ビッグ・ファイブ)特性値と学習行動との間に以下の関連性が認められた。(1)「外向性」が高い学生は、教師が提示するぺージと自分が参照する「電子教科書」ぺージの同期比率が低い。(2)「勤勉性」が高い学生は、教師が提示するぺージと自分が参照する「電子教科書」ぺージの同期比率が高い。またリアルタイムでの状況把握に関しては、(1)毎授業後に実施する小テストと期末試験との関連が高い。(2)取分け、知識獲得的な語群選択の問題だけでなく、小論文での多面的な考察力をみる問題との関連もあることが判明。上記に関してその成果を日本教育工学会の全国大会で2件の発表を行った。さらにリアルタイム性を高めるために、授業受講時にノートに筆記を多くさせる手法の検討を目的として、穴埋記述方式と自由記述方式を比較した。その結果、(1)穴埋記述方式では93.9%もの書込みがあった。(2)一方、自由記述方式は僅か14.0%であった。(3)テスト結果では自由記述方式に比べて有意に高いことが分かった。本件に関しては東北大学での教育システム情報学会研究会で発表し、東京工業大学でのリスクソリューションプロジェクトの冊子にも報告をした。さらに、平成25年6月にオランダで開催されるECIS2013のWorkshop IEETeL2013での発表が決定している。初年度に開発した「疑似電子テキストの閲覧ページログ収集システム」を用い、2年度には実授業で収集したログデータを分析した。今年度は、教師と個別学習者との閲覧ページの遷移をグラフ化して検討した結果、各学習者の学習スタイルが可視化できることが分かった。学習スタイルの例としては「教師とは異なるページを頻繁に参照する」、「最初はページ送りしなかったが後半は忠実に教師と同じページを閲覧する」等があった。本結果をHCI (Human Computer Interaction) International 2014 (2014/6/22-24, Crete, Greek)で招待発表することが決定した。本研究の重要な課題であった、電子教科書時代の学習行動データ収集および分析の方法論を確立することができた。今後、「問題解決型サービス科学研究」として本研究結果を一層発展させていくことが決定している。電子教科書や電子ノートなどのICT活用メディアに関する先行研究をサーベイした.その結果,メディアを単なる学習支援ツールとした研究や利用結果を事後に解析する研究は行われているものの,学習態度に対する形成的評価を行うために,学習中にデータを収集するツールと位置づけた研究はほとんど見当たらなかった.そこで,これらのツールが能動的・主体的学習を促し教育効果を高めるための形成的評価データ収集ツールとしても活用できることを検証するため,実証実験システムを構築した.まず、電子教科書を模倣するものとして,学生一人一人が教材資料のページをそれぞれ自由にWebで閲覧できるとともに,その閲覧ページの時間経緯に沿った履歴ログを学生別に収集できる簡易実験システムを開発した.また,電子ノートを模倣するものとして,学生が書き込みを行えるPDF形式の資料を作成した.これらのツールから収集されたデータで推定する「学習態度」は,学生一人一人がもつ異なる「学習行動様式」に基づいて発現するというモデルを仮説設定した.先行研究調査を踏まえ,この「学習行動様式」のデータ収集方式として「5因子性格検査」を採用した.前述の実験システムを用いて,研究協力者の所属する専門学校の授業(「アサーション・トレーニング」,受講者60名)でこれらのツールを用いた実証実験を実施し,学生別の学習態度に関するデータとして,教師の提示ページと学生の閲覧ページの一致時間比率,PDF資料への書込み数などのデータを収集し,「5因子性格検査」との相関を分析した.その結果,いくつかの項目間に相関があることが示唆された.今後の研究を進める上で,本実験システムと本実験手法が有効であるとの確証を得た.実験は松本未来学舎と信州大学経済学部のご協力を得て、順調に実施が出来た。また、データ分析に関しても良い結果が出ており、学会でも既に3件を発表することが出来た。平成24年6月にオランダで開催されるECIS2013のWorkshop IEETeL2013(査読済)での発表も決定している。本研究の基本的フレームワークと実証実験システムに関する確認が取れたため,平成24年度以降に本格的な実証実験を実行できる目途が立った.

特に,実験システムを利用した学生の各ツールに対する評価も良く,実験に対する支障は生じないことも判明している.また、前述したとおり平成23年度に収集したデータからも,興味深い相関関係がいくつか判明しているため,これらを更に詳細分析しその結果を平成24年度の実証実験に反映させることもできると考える.なお、申請時点ではNEC製のコラボレーション支援システムを貸与してもらう予定であったが、認可額が減額となったため金額面で折合いがつかなかった。その為、実験内容を修正して新たにソフトウエアを開発することとし、サーバリース費も取止めてPCとした。それらの変更により若干の日程と出費の遅れが発生した。研究の最終年度にあたり、H23年度とH24年度の実証実験データを総括し、学習者特性(ビッグ・ファイブ)と学習行動指標(閲覧ページ同期比率、ノート書込み量)との関係性を分析考察する。特に、「閲覧ページの遷移軌跡パターン」を新たな評価指標として検討するために、指標算定式を考案し評価する。対象とする独立変数に名義尺度項目が多いことを踏まえ、従来の共分散構造分析とともにベイジアンネットワーク分析も適用し両者の結果を比較照合する。併せてベイジアンネットワーク分析に関する有効性や有用性を検証考察する。また授業改善の一貫として、授業の途中で脱落する学生を事前に把握する目的で、学生のノート記述状況や小テスト、性格検査結果などを分析する予定である。上記考察結果も踏まえ、学習者特性に応じて学習効果を向上させるために必要となる電子教科書/電子ノートの追加機能を構想提案する。そして、特定の学習者特性を有する学生を対象とした新たな電子教科書/電子ノート追加機能の有効性検証実験で、その一部を確認評価する。以上、本年度の研究結果も含めた3年間の研究内容を、日本教育工学会や教育システム情報学会の研究会で発表し、論文投稿する。併せて、6月のオランダでの学会の結果も踏まえて全体のまとめを行う。「学習行動特性」と「学習態度」の相関に加えて「学習態度」と「学習効果」との相関も分析し,3者の因果モデルの仮説検証を最終目標とする.これにより、「学習態度」の形成的評価に基づくリアルタイム授業改善が「学習効果」に効果を及ぼすことができることを立証できる.平成24年度の未使用額が37万円となった。主な要因は、本来はアルバイトを使ってデータ収集・整理をする予定であったものを、平成25年度にオランダでの学会発表が入ったため、研究協力者の六浦教授が自ら実施して頂いた為の経費節減であった。なお、平成25年度は上記の節減経費も含めて、下記のように全額利用予定である。平成25年度使用予定総額1,361千円。《国内旅費》570千円。学会の全国大会・研究会参加(延べ3人・回)。研究打合せ述べ15人・回)《外国旅費》311千円《謝金等》200千円実験参加者への謝礼《その他・参加費》その他・書籍》30千円《その他・参加費》90千円国内・海外学会参加(延べ5人・回)