hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
慢性腎臓病におけるＣＤ１４７の機能解析と新たなＣＫＤ治療戦略の確立

同時にIn vitroにてCD147があらためてATP産生とGlucose代謝に関与し、新たにインスリン抵抗性についても関与する可能性を認めた。これらをふまえた上で、糸球体病変、血管内皮障害を誘導するモデルマウスから組織採取する8カ月間までに血液・尿サンプルを経時的に採取を行っている。CaMTgのCD147発現は血中・尿中共に実験開始より増加傾向を認めている。併せて、Tail cuff法により血圧を測定している。2.インスリン分泌機構に対するCD147の関与を解明するために膵β細胞を単離し、本実験に使用する。そのためCD147欠損マウス(KO)と野生型マウス両者から単離を開始し、その純度をFlow cytometry法にて確認・改善している。3.CD147KOマウスと野生型マウスの両者にPristanを経腹膜的に投与し、Lupus腎炎モデルの作製を開始した(観察期間は6カ月から9カ月の長期にわたるため24年度の予定であったが、本年度に前倒しした)。1.と同様に実験観察期間中に2・4・6カ月で血液・尿の採取を順次おこなっており、当初の想定とは異なり、野生型よりCD147KOにて尿蛋白の有意な増加を認め、4か月でPreliminaryに採取した組織検体では、その変化に合致してCD147KOに糸球体に免疫複合体と考えられるDepositの沈着が多数であった。しかし、補体C3活性には両群間で差は認めるものの抗dsーDNA抗体では有意な差を認めなかった。現在、腎臓だけではなく免疫複合体の生成・消化過程の検索のため脾臓・赤血球を含めた検索を行っている。当初と異なる結果であったが、Lupus腎炎における解析はほぼ最終段階に到達し、signal pathwayにおけるCD147の関与を検証するのみとなっている。このセクションは当初の予定を上回るペースで進捗している。Lupus腎炎の実験進行が早かったため、インスリン分泌におけるCD147の関与は若干の解析の遅れはあるものの、検体の採取は既に終了しており、本年度中に解析を行う予定である。計画書では24年度より開始する予定であったLupus腎炎に関与するCD147の役割を本年度より開始しており、当初とは異なる結果であったが、実験結果も順調に得ており、その成因についても満足できるものを得ている。糖尿病モデルマウスを使用した実験やそれを補完するIn vitroの実験も計画通りに当初の予測通りの結果を得ている。本年度は、膵臓β細胞の初代培養を通してインスリン分泌と脂肪肝形成過程におけるインスリン抵抗性におけるCD147の役割を検証する。更に、CD147とSTAT3リン酸化に関わるSignal pathwayの解明を行い、LNの病態解明と治療におけるCD147の可能性を検証する。研究課題は、今後も今年度同様に糖尿病およびLupus腎炎に関する実験課題を並行して推進していく予定である。現在、特に問題は生じていないが、CaMTgマウスとCD147Heteroマウスとの交配数が充分に得られない事も考えられる。その際には早急に親マウスの交配数を増やし、実験に必要なマウス数を維持する対策を現在から取っている。該当なし1.インスリン分泌機構におけるCD147の関与(In vitroより)
発語過程において有声・無声が影響を及ぼすしくみと処理のレベル:音韻・音声・調音

欧米言語話者とは異なって日本語話者の音声聴取はモーラ単位(子音+母音:CV)であることが知られている(Otake et al., 1993)。研究者は日本語話者の発話過程にもモーラが重要な役割を果たしていることをプライミング実験(発話する単語の音情報だけを事前に与える手続き)で明らかにした(kureta et al., in press)。日本語話者においては、発話する単語の最初の単音素(子音:C)のみのプライミングで促進効果(発語処理が速くなる)は起こらない(kureta et al., in press)。しかしアルファベット文字を使って語頭音素を強く意識させる手続きを導入すると、単音素レベルのプライミングに促進効果が認められた(昨年までの結果)。ところが、同じ手続きで発話単語の語中音素(CVCV)をプライミングしてもプライミング効果はなかった。プライミングが音韻的な効果であるならば、いずれの場合もプライミング効果が現れたはずなので(e.g., Meyer 1990,1991)、今回の日本語話者の音素レベルのプライミング効果は、音韻レベルの処理ではなく、音声・調音レベルの処理に関わっている可能性が示唆された。以上の結果はプライミングされた音素がすべて有声音(e.g., /m/,/n/,/r/)であったため、有声子音固有の結果なのか、あるいは有声・無声を問わず子音全般に一般化出来るものなのかを現在検討している最中である。また、発語過程における有声・無声子音の影響については、発話単語の語頭が有声・無声子音の弁別素性を説明変数に、音読や命名課題の様々な反応潜時を従属変数にした回帰分析から検討を行った。いずれの場合も統計的に有意な説明変数となり、昨年までの報告と一貫した結果が確認された。さらに、日本語では有声子音のモーラ連続(e.g., /ga//ba//da/)が避けられる傾向にあるが、このような連続の多寡に違いがある単語セットの発話潜時を2つの課題から比較検討した結果、音韻処理から音声処理に至る段階で影響を受けている可能性が示唆された。これまで研究者は、日本語話者の単語の音韻化レベルにはモーラ単位(子音+母音)のユニットが必要であることを明らかにした。この事実は、欧米言語話者が音素単位で音韻的符合化できる結果とは極めて対照的である。例えば、欧米言語話者が/t//e//n//t/と発話する場合、語頭の音素/t/のプライムが促進効果をもたらすのに対し、日本語話者は/t/だけでは効果がなく、母音を付加した/te/ではじめて効果が現れる。これまでの実験ではプライムされる語頭の音素は無声子音(たとえば、/s/,/t/,/k/など)が中心であった。本年度は有声子音(たとえば、/m/,/n/,/r/など)を使ってその効果を再検討した。被験者には、本実験に先立って決められた手がかりに対応する単語を対連合学習してもらった。そして、実験条件のブロックでは語頭に同じ子音をもつ単語を、統制条件のブロックでは語頭に音韻的重複のない単語を、繰り返し発話してもらった。その結果、プライミング効果は現れなかった。ところが、音素レベルの音韻を強く意識させる手続きを導入したところ、促進効果が認められた。これまで対連合学習では漢字やカナ文字で刺激を提示したが、これをローマ字表記に改めて提示した結果である。しかし、今回用いられた刺激は有声子音だけだったので、この効果が、有声・無声を問わず子音全般に生起するものなのか、さらなる検討が必要であろう。これまで研究者は、日本語話者の音韻符号化過程のレベルにはモーラ単位(子音+母音)のユニットが必要であることを明らかにした。昨年度は音素レベルの音韻を強く意識させる手続きを導入したところ、日本語話者においても欧米言語話者と同様に音素レベルのプライミングに促進効果が現れた。しかし、プライムされた語頭子音は全て有声音であったため、この結果が有声・無声を問わず子音全般に一般化出来るものなのかが課題として残されていた。本年度は、有声子音で始まる単語のプライミング効果を直接検討する前に、3モーラからなる無意味単語刺激(合計80語)を発話させ、その潜時を従属変数に重回帰分析を行った。独立変数には刺激語の隣接語数などの属性に加え、頭子音の音声学的特長(調音様式、調音位置、有声・無声)を使用した。被験者は、大学生・大学院生を中心にした若齢者群20名、65歳75歳の前期高齢者群18名、及び75歳85歳の後期高齢者群19名であった。実験ではCRT画面中央に刺激を提示し、被験者には出来るだけ速く、正確に、そして流暢に発話するように教示した。その結果、語頭が有声子音よりも無声子音の発話潜時が有意に速くなった。この結果は、発達において無声音が有声音よりも獲得され易い事実、すなわち、無声音が無標(unmarked)で有声音が有標(marked)であると考える理論と符合する。

研究者は日本語話者の発話過程にもモーラが重要な役割を果たしていることをプライミング実験(発話する単語の音情報だけを事前に与える手続き)で明らかにした(kureta et al., in press)。日本語話者においては、発話する単語の最初の単音素(子音:C)のみのプライミングで促進効果(発語処理が速くなる)は起こらない(kureta et al., in press)。しかしアルファベット文字を使って語頭音素を強く意識させる手続きを導入すると、単音素レベルのプライミングに促進効果が認められた(昨年までの結果)。ところが、同じ手続きで発話単語の語中音素(CVCV)をプライミングしてもプライミング効果はなかった。プライミングが音韻的な効果であるならば、いずれの場合もプライミング効果が現れたはずなので(e.g., Meyer 1990,1991)、今回の日本語話者の音素レベルのプライミング効果は、音韻レベルの処理ではなく、音声・調音レベルの処理に関わっている可能性が示唆された。以上の結果はプライミングされた音素がすべて有声音(e.g., /m/,/n/,/r/)であったため、有声子音固有の結果なのか、あるいは有声・無声を問わず子音全般に一般化出来るものなのかを現在検討している最中である。また、発語過程における有声・無声子音の影響については、発話単語の語頭が有声・無声子音の弁別素性を説明変数に、音読や命名課題の様々な反応潜時を従属変数にした回帰分析から検討を行った。いずれの場合も統計的に有意な説明変数となり、昨年までの報告と一貫した結果が確認された。さらに、日本語では有声子音のモーラ連続(e.g., /ga//ba//da/)が避けられる傾向にあるが、このような連続の多寡に違いがある単語セットの発話潜時を2つの課題から比較検討した結果、音韻処理から音声処理に至る段階で影響を受けている可能性が示唆された。
死細胞により誘発される炎症応答が老化に伴って悪化する仕組みの解明

本研究では、死細胞による炎症応答がなぜ老化に伴って増強するのか、また老化マクロファージの貪食能が低下するのはなぜか調べた。死細胞とマクロファージを共培養したとき、炎症の指標であるMIP-2の産生が見られた。これは、マクロファージがIFN-γなどにより活性化したときにみられる現象である。また老化マウスは、炎症性マクロファージの指標であるCD40を発現しており、炎症性マクロファージは貪食能が低いことも分かった。これらの結果から、老化に伴ってマクロファージの貪食能が低下する原因として、マクロファージが老化に伴って恒常的に炎症性マクロファージに分化し、貪食能が損なわれていることが明らかとなった。アポトーシス細胞に対するマクロファージの貪食能と炎症応答における老化の影響を解明するため、野生型の若年および老化マウスを用いて腹腔常在性マクロファージの後期アポトーシス細胞貪食能と後期アポトーシス細胞の腹腔投与による炎症応答の解析を行った。in vivoでの結果からマクロファージからのMIP-2産生量を詳しく解析するため、後期アポトーシス細胞と共培養した際のMIP-2産生量を測定した。若年マウスでは、MIP-2は産生されなかったが、老化マウスでは高濃度で検出された。他の研究報告でマクロファージからMIP-2が産生されるにはマクロファージへのIFN-γによる刺激が必要であることが示されている。in vivoでの結果からMIP-2産生へのIFN-γの作用を調べるため、in vitroでマクロファージにIFN-γ刺激を行い、後期アポトーシス細胞を貪食させたところ、若年マウスでもMIP-2産生を確認できたが、IFN-γ刺激を行わなかった老化マウスマクロファージの方が産生量が多いことが明らかとなった。この現象を解析するため、マクロファージの活性化に焦点を当て解析を行ったところ、活性化し分極したマクロファージの表現型の一つであるM1マクロファージのマーカーであるCD40の発現が老化マウスマクロファージにおいて増加し、M1に分極していることが観察された。これらの結果から、老化によって腹腔のマクロファージが活性化し表現型がM1となることで、アポトーシス細胞の貪食能が低下、長時間残存し、多量のMIP-2を産生することによって急速かつ強力な炎症応答を引き起こし、様々な疾患の原因となっていることが示唆された。計画した個体老化による影響については、予定通り成果を出している。また細胞老化についての計画については、長期培養可能なマクロファージの樹立に留まっており、計画していた培養期間と細胞老化との関わりについて詳細な解析にまでは至っていないが、今年度計画していた移植実験の条件検討を先に進めており、全体的に概ね順調とした。老化に伴うアポトーシス細胞に対するマクロファージ貪食能の低下がマクロファージ自体の細胞老化に起因するのか、または老化に伴う個体環境の変化(個体老化)に起因するのか調べるため、老化マクロファージの若年マウスへの移植実験の条件検討を行った。本実験では、レピシエントとして腹腔内マクロファージを枯渇処理した若年マウスを、ドナーとして用いる老化マクロファージとして骨髄細胞から誘導した長期培養マクロファージを用いる。マクロファージの枯渇は、細胞毒であるクロドロネートのリポソームを作製し、それを選択的に取り込むマクロファージにアポトーシスを誘発されることにより行った。クロドロネート・リポソームをマウス腹腔内に投与して2日後には、腹腔内のマクロファージは完全に消失し、そのまま7日目まで回復することはなかった。この結果から、安定して腹腔内マクロファージが枯渇されているクロドロネート・リポソーム投与後4日目の若年マウスをレピシエントとすることとした。一方、骨髄細胞からGM-CSF含有培地で3ヶ月間誘導したマクロファージの調整に成功した。このマクロファージは、マクロファージに特異的な細胞表面抗原(F4/80)を持ち、またアポトーシス細胞を常在性マクロファージと同等に有していることが分かった。この結果から、この3ヶ月間長期培養マクロファージをドナー細胞として用いることとした。さらに、アポトーシス細胞除去に伴う炎症応答の終息期に浸潤してくる好酸球の細胞数が老化に伴って有意に低下していることを明らかにした。この結果は、好酸球が炎症応答の終息に積極的に関わっていることを示すとともに、老化に伴う好酸球浸潤の低下が老化における炎症応答の持続悪化の原因の可能性であると考えられた。計画していたマクロファージ移植実験の条件検討は、ほぼ完了している。また慢性化の実験に関しては、老化に伴って炎症の終息に関わる好酸球の役割についての成果も着実に重ねてきている。これらを総合的に判断して、全体的に概ね順調とした。老化に伴うアポトーシス細胞に対するマクロファージ貪食能の低下がマクロファージ自体の細胞老化に忌諱するのか、または老化に伴う個体環境の変化(個体老化)に起因するのか調べるため、老化マクロファージの若年マウスへの移植実験を行った。本実験では、レシピエントとして腹腔マクロファージを枯渇処理した若年マウスを、ドナーとして骨髄細胞から誘導した長期培養マクロファージを用いた。マクロファージの枯渇は、リポソーム化したクロドロネート(細胞毒)を用い、これをマクロファージが選択的に取り込むことによってアポトーシスに陥らせることによって行った。

まず用いた長期培養マクロファージが老化マクロファージとして用いて問題ないかを確認するため、老化マーカーであるbeta-SA-galactosidaseの発現とがん抑制遺伝子であるp53の活性化を検証した。その結果、培養三ヶ月で両マーカーとも検出され、三ヶ月培養マクロファージが老化マクロファージに匹敵することを確認できた。得られたマクロファージを後期アポトーシス細胞とともにレシピエントマウスに移植し、経時的に炎症応答を調べたところ、コントロールとして行った若年マクロファージを移植したときと比べて、有意に炎症応答の増強および炎症応答の終息遅延がみられた。これらの結果から、老化に伴うマクロファージの貪食能の低下は、マクロファージ自体が細胞老化することに原因があると推察された。本研究では、死細胞による炎症応答がなぜ老化に伴って増強するのか、また老化マクロファージの貪食能が低下するのはなぜか調べた。死細胞とマクロファージを共培養したとき、炎症の指標であるMIP-2の産生が見られた。これは、マクロファージがIFN-γなどにより活性化したときにみられる現象である。また老化マウスは、炎症性マクロファージの指標であるCD40を発現しており、炎症性マクロファージは貪食能が低いことも分かった。これらの結果から、老化に伴ってマクロファージの貪食能が低下する原因として、マクロファージが老化に伴って恒常的に炎症性マクロファージに分化し、貪食能が損なわれていることが明らかとなった。i)若年/老化マクロファージの老化/若年マウスへの相互移植実験:若年/老化マウスから調整した腹腔マクロファージをクロドロネートによりマクロファージを枯渇処理した老化/若年マウスにそれぞれ腹腔内に相互移植し、アポトーシス細胞の貪食除去への影響および死細胞により誘導される炎症応答への影響、また貪食率への影響および貪食能への影響について解析し、マクロファージの貪食能に対する体内環境の影響を調べ、個体老化と細胞老化との関わりについて明確化する。ii)アポトーシス細胞認識分子への老化の影響:老化マウスおよび若年マウスから腹腔マクロファージを調整し、アポトーシス細胞との相互作用への影響およびMFG-E8およびTim-4の発現への影響について解析し、老化マウスにおけるマクロファージの貪食能低下の分子メカニズムを明らかにする。iii)老化がHMGB-1分子自体に影響を及ぼしている可能性があるので、HMGB-1放出量への影響、放出されたHMGB-1分子の酸化の有無および(酸化が検出された場合)老化・若年マウス間での差異について調べ、炎症応答の元凶となるHMGB-1の機能に対する老化の影響について明確化し、老化における炎症応答の悪化のメカニズムに迫る。また以前からDAMPsの受容体としてMincleという分子が注目されている。そこで、老化による炎症応答の悪化とMincleとの関わりを探るため、Mincleの発現への影響およびMincleのシグナル伝達への影響について調べ、DAMPsへの老化の影響について広範囲にフォローし、さらに老化における炎症応答の悪化のメカニズムを追求する。常在性マクロファージによる貪食応答低下のメカニズムの解明:貪食されたアポトーシス細胞の消化・分解への老化の影響:先に述べたように貪食されたアポトーシス細胞がマクロファージ細胞内で速やかに消化・分解されることが、継続的なアポトーシス細胞の貪食除去に重要である。
簡易専用路網による小型林内作業車搬出作業と林地保全機能に対する影響に関する研究

小型林内作業車による搬出作業を合理的に実施するには、専用の簡易作業道(施業路)を開設する必要がある。今回経営上適切量の路線を開設している現地を実測した。実測地は愛媛県内の民有林地7.06haで、標高600700m,結晶片岩風化土のスギ人工林で一部にヒノキを含み約25年生である。平均傾斜28度35度,最高部は40度に達する南西向斜面である。実測により路線配置図を作製・考察し、次の点を明らかにした。1.簡易作業道(幅員1.5m)を高密度に開設し、小型林内作業車により木寄せ搬出する方式で、材積率で20%以上の間伐を実施している。2.簡易作業道は、一部他人の林地も含め一団地として計画開設している。3.簡易作業道の縦断勾配は、最急部24度,平均20度以上の区間長は全路線の8.3%,平均10度から20度の区間長が約38%,残り約53%が10度以下で、使用小型林内作業車の能力に、十分適應している。4.簡易作業道の系統別延長は、最長413m,次が360m,20系統中8個が300400m程度である。調査区域内の全延長は2147mで、域内での簡易作業道開設密度は303m/haである。5.最大木寄せ距離は1525m,最短部で514m,平均的な最大木寄せ距離は20mで、本簡易作業道1路線の平均受持ち幅は40mである。6.簡易作業道が分岐する、隣接林道の密度は47.4m/haである。7.実測結果に基く林地モデルは、幅40m奥行き190m,簡易作業道の迂回率η′=0.3,延長250m,林道の迂回率η=0.76になる。8.簡易作業道の路面変形は、車輌わだち跡の凹みと雨水侵食で、幹線的区間での深さは10cm,最大16cmに達するが、支線区間では植生が侵入して路面の裸出な少ない。変形の著しい幹線的区間では、丸太利用の横断排水溝等による保全的対策土が必要である。
タウロピンを介する紅藻類と海洋細菌の相互作用に関する研究

スギノリ目の紅藻類を中心に分布するタウロピン(紅藻酸)の生理機能解明を目的として,紅藻類と海洋細菌との間にタウロピンを介した相互作用の存在を作業仮説として検討を行なった.紅藻ハリガネ・タウロピン脱水素酵素の精製と性状解析,N-末端および部分アミノ酸配列の解析に成功した.しかし,部分アミノ酸配列情報を利用したタウロピン脱水素酵素cDNAのクローニングには至らなかった.スギノリ目の紅藻類を中心に分布するタウロピン(紅藻酸)の生理機能解明を目的として,紅藻類と海洋細菌との間にタウロピンを介した相互作用の存在を作業仮説として検討を行なった.紅藻ハリガネ・タウロピン脱水素酵素の精製と性状解析,N-末端および部分アミノ酸配列の解析に成功した.しかし,部分アミノ酸配列情報を利用したタウロピン脱水素酵素cDNAのクローニングには至らなかった.紅藻ハリガネAhnfeltiopsis paradoxaよりタウロピン脱水素酵素(TaDH)を精製し,酵素性状と部分アミノ酸配列を分析した.ハリガネTaDHは,分子量43,400の単量体構造を有し,等電点は5.7であった.最適反応pHは7.1(タウロピン合成反応)および8.5(タウロピン分解反応)付近に見られ,ミカエリスーメンテン型の反応様式に従った.基質による反応阻害はめられなかった.精製ハリガネTaDHについて,N末端アミノ酸配列(20残基)およびリシルエンドペプチダーゼ消化物の配列を解析した.アカバギンチンソウおよびツノマタからのTaDHの精製も試みたが,ハリガネに比べて精製酵素の収量が少なく,アミノ酸配列の解析までには至らなかった.ここで得られた部分アミノ酸配列情報はハリガネTaDHのcDNAクローニングを行うために必要なプライマーの作成に足るものである.紅藻類のTaDH遺伝子が共生または寄生細菌由来である可能性を検討するために必要となるタウロピンの合成を行った.現在,目標としていた50gの合成を完了し,タウロピンをCN源とする選択培地を調製して海洋細菌のスクリーニングを進めている.ハリガネ付着細菌をスクリーニングした結果,タウロピンを利用する数株の分離に成功した.今後種の同定を進めるとともに,ハリガネTaDH・cDNAのクローニングを待って,TaDH遺伝子の存在を確認する予定である.(1)精製ハリガネ・タウロピン脱水素酵素のN-末端アミノ酸配列およびリシルエンドペプチダーゼ消化断片ペプチドのアミノ酸配列情報より、cDNAクローニングのための縮重プライマーを設計した。また、藻体からの効率の良いmRNAの抽出・調製法についていくつかの方法を検討した。ハリガネは、粘質多糖含量の比較的少ない海藻種であるが、RNAの抽出は、他の海藻と同様に困難であった。LiCl沈殿法を併用するグアニジウム酸性フェノール法およびOligotex dT30を用いてmRNAの調製が可能であった。しかしながら、1^<st> strand cDNAを調製後、これを鋳型としてPCRを行ったが、cDNAの増幅は認められなかった。プライマーの設計およびmRNAの調製の両面から再検討の必要がある。(2)タウロピン生産海藻藻体からのタウロピン資性化細菌の検索と単離・培養を進めた。昨年度、ハリガネから分離した菌株を3.11の震災の影響で失ってしまったため、再度、検索と分離培養を行った。本年度は、ハリガネ以外のタウロピン生産海藻を含めて検索対象とした。15株の単離培養を進めている。(3)タウロピン以外のオピンの資性化を確認することを目的として、タウロピン以外のオピンの化学合成をおこなった。ストロンビン、アラノピン、β-アラノピン、オクトピンについて35gの合成を完了した。単離済みの細菌について、タウロピン以外のオピン類の資性化は、今のところ、認めていない。紅藻ハリガネAhnfeltiopsis paradoxaよりタウロピン脱水素酵素を精製し酵素性状と部分アミノ酸配列を解析した。N-末端アミノ酸配列および部分アミノ酸配列(リシルエンドペプチダーゼ消化断片)を基に縮重プライマーを設計した。藻体からmRNAを抽出後、逆転写酵素によりcDNAを調製し、これを鋳型としてPCRを行なうことによりハリガネ・タウロピン脱水素酵素cDNAの増幅を試みた。当初、明確なcDNAの増幅が認められなかったが、total RNAの抽出にRNeasy Plant Mini Kit(QIAGEN社)を使用し、mRNAの精製ステップを省略したcDNA調製法に変更することにより、PCRによるcDNAの増幅が可能となった。増幅されたcDNAについてクローニングと配列解析を行ない、演繹アミノ酸配列を得た。これをアミノ酸配列解析結果と比較したところ、目的とするタウロピン脱水素酵素のcDNAではないという結論となった。しかしながら、得られたcDNAの配列に、紅藻類特有の塩基配列が見られたため、RNAの抽出、cDNAの合成までは成功しているものと考えられた。従って、今後の展開としては、今回の実験で得られたcDNAと、塩基配列を変更したプライマーを使用してPCRを行ない、タウロピン脱水素酵素cDNAのクローニングと配列解析を進める必要がある。このためには、部分アミノ酸配列情報をさらに追加し、効果的に増幅可能なプライマーの設計を行なうことも必要である。タウロピンは海産無脊椎動物に広く分布し、嫌気的エネルギー生産に関わる生理機能が明らかにされている。一方、無脊椎動物におけるタウロピンの発見に先んじて、一部の紅藻類に紅藻酸(タウロピン)が分布することは古くから知られていた。

しかしながら、海藻におけるタウロピンの生理機能は全く明らかにされていない。本研究では、陸上植物と土壌細菌の間のオピン類を介した寄生もしくは共生関係に着目し、紅藻と海洋細菌の間にタウロピンを介した寄生または共生関係が存在する可能性を証明しようとしたものである。最終年度である平成24年度には、1ハリガネより精製したタウロピン脱水素酵素の部分アミノ酸配列情報をもとに、mRNAより調製したcDNAを鋳型としてハリガネ・タウロピン脱水素酵素のcDNAを増幅、クローニングし、塩基配列情報と全アミノ酸配列を得て、2既に単離済みのタウロピン資性化細菌に類似の配列を有するDNAが存在するか否かを確認する計画であった。平成23年3.11の東日本大震災の影響を受け、研究拠点を岩手県大船渡市から神奈川県相模原市へ移さざるを得なかったため、材料の紅藻ハリガネは千葉県銚子市、神奈川県横須賀市から入手した(平成25年5月現在も大船渡市沿岸ではハリガネの回復がみられていない)。平成24年4月、11月にハリガネをサンプリングし実験に供したが、銚子産、横須賀産のハリガネでは目的DNAの増幅が確認されなかった。両サンプルについてエキス中のタウロピン含量を測定したところ、前駆アミノ酸であるタウリンは認められたものの、タウロピンの存在を確認することができなかった(大船渡産ハリガネについては、過去にタウロピンの存在を確認している)。このことから、実験に使用したハリガネには目的遺伝子が発現していなかったものと考えられた。研究の実施のためには三陸沿岸の海藻類の再生を待たねばならない。海藻藻体からのRNAの抽出、cDNAライブラリーの調製が困難であったために、遅れが生じている。しかし、平成23年度の研究成果として、これらの問題点はクリアできたものと考えている。24年度が最終年度であるため、記入しない。早急にハリガネ・タウロピン脱水素酵素cDNAのクローニングと配列解析を進める必要がある。今後の展開としては、今回の実験で得られたcDNAと、塩基配列を変更したプライマーを使用してPCRを行ない、タウロピン脱水素酵素cDNAのクローニングと配列解析を進める。このためには、部分アミノ酸配列情報をさらに追加し、効果的に増幅可能なプライマーの設計を行なうことも必要である。
HCV母子感染リスクファクターの解析-特にHIV/HCV重複感染症例との比較

平成9年度は以下の点について明らかにした。1)HCV母子感染リスクファクターについてHIVとの重複感染(キャリア)が最も著名なリスクファクターであるが、分娩時母体血中ALT値もリスクファクターになりうる事が判明した。そのクリティカルヴァリュウは110IU/m1である。2)キャリア化児の予後について一旦キャリア化(6ヵ月以上血中HCV-RNA持続陽性)後、約半数の児が血中HCV-RNA持続陰性(最長4年間)を示すことが判明した。3)HGVとの関連についてHCV/HGV重複感染母(キャリア)の場合、高率にHGVの母子垂直感染(約50%が認められ、同状態がHGV母子垂直感染のリスクファクターになりうる事が判明した。HCVキャリア・非HIVキャリア妊婦(正常リスク群)の出生児57名の長期プロスペクティブ経過観察を行い、3名、5.3%のキャリア化児を得た。1名は生後8カ月間血中HCV-RNA陽性、生後12カ月より陰性化、その後5歳を過ぎても持続陰性である。他の2例は生直後より血中HCV-RNA陽転、以後持続陽性である。始めの1例と後群の1例、計2例、67%に血中ALT/ASTの軽度亢進が認められ、厚生省非A非B肝炎研究班(吉沢浩司班:88例経過観察)の結果に児のキャリア化率(2.3%)を含めてほぼ同様の結果が得られた。また、キャリア母のHCV-genotype,授乳期間がHCV母子垂直感染のリスクファクターにはならないことを明らかにした。分娩時母HCV-RNA力価と児キャリア化との間に正の相関は得られなかったが、結論はなお症例を増やして検討したい。HCV/HIVキャリア妊婦(ハイリスク群)の出生児に関するドイルよりの成績は症例が思うように増えず、平成8年度の継続課題として今後検討したい。以上の結果は下記の論文に発表された。1)岡嶋祐子、深沢一雄、池田和則、稲葉憲之:産婦治療,70:861-865,19952)稲葉憲之、正岡薫、岡嶋祐子、池田和則:産婦実際,44:1575-1580,19953)稲葉憲之、正岡薫、岡嶋祐子:病態生理,14:1024-1027,19954)稲葉憲之:産婦治療,71:86-91,1995平成9年度は以下の点について明らかにした。HCV母児感染における児キャリア化の最も顕著なリスクファクターは母HCV/HIV重複キャリアである。次いで母intravenous drug user(IVDU)である。共に、その理由として母免疫機能低下による移行抗体の減少が考えられる。我々は非HIV,非IVDUのHCVキャリア母(通常群)におけるリスクファクターを検討し、以下の結論を得た。1)分娩時母体血中ALT値上昇はHIV重複キャリア母同様、高いリスクファクターであることが判明した。即ち分娩時母ALT値が110IU/mlを越えた群では57.1%の高い児HCVキャリア化率を示したが、110IU/ml未満の群では5.9%にと止まった。2)HCV-RNA量(半定量)、genotype,授乳期間についても検討したが、有意な傾向は認められなかった。以上の結果より妊娠末期における母体肝機能の改善がHCV母児感染予防として肝要であることが示唆された。そのクリティカルヴァリュウは110IU/mlである。
再生不良性貧血における自己抗原の解析-自己抗体によって同定された造血幹細胞抗原におけるCD4陽性T細胞エピトープの同定-

一部の再生不良性貧血(再不貧)患者血清抗体によって認識される白血病細胞株UT-7由来の80kD蛋白を同定するため、免疫沈降により精製したこの蛋白のアミノ酸配列を質量分析を用いて同定した。その結果、この蛋白は細胞膜関連蛋白のモエシンであることが判明した。患者血清中の抗モエシン抗体価をELISA法により測定したところ、再不貧患者43例中20例(46.5%)が陽性であった。抗体の陽性率は、自己免疫性再不貧のマーカーであるPNH型血球陽性の再不貧患者では22例中14例(64%)であったのに対し、PNH型血球陰性の再不貧患者では18例3例(17%)のみであった。一方、UT-7由来のcDNAライブラリーのスクリーニングにより同定した蛋白diazepam-bindinginhibitor-related sequence-1 (DRS-1)に対する抗体はPNH型血球陽性再不貧例84例中の32例(38.1%)に検出された。DRS-1のcDNA断片に由来するGST融合蛋白を作成し、各々に対する抗体の有無を決定したところ、抗体陽性者の約半数において、173-198位のペプチドに対する抗体が検出された。HLA-DR15蛋白と結合するT細胞エピトープのペプチドを合成し、DRS-1ペプチド特異的T細胞の前駆細胞頻度をELISPOTアッセイで調べたところ、抗DRS-1抗体陽性でDR15を持つ患者では、検討した2例の両例においてDRS-1特異的T細胞の前駆細胞が高頻度に存在することが示された。このDRS-1ペプチドによって患者末梢血単核細胞から誘導したDRS-1特異的CD4陽性T細胞は、DR15陽性白血病細胞株KH88を用量依存性に傷害した。したがって、抗DRS-1抗体を持つHLA-DR15陽性再不貧患者においては、DRS-1特異的CD4陽性が骨髄不全の発症に関わっている可能性が示唆された。一部の再生不良性貧血患者血清抗体によって認識される白血病細胞株UT-7由来の80kD蛋白を同定するため、免疫沈降により精製したこの蛋白のアミノ酸配列をmass fingerprintingを用いて同定した。その結果、この蛋白は、これまで一部の自己免疫疾患で自己抗体が証明されている細胞膜関連蛋白であることが判明した。この蛋白は、RhoAキナーゼによってリン酸化を受けることから、このキナーゼ活性が亢進している発作性夜間血色素尿症(PNH)血球陽性再生不良性貧血の免疫学的な骨髄抑制メカニズムに関わっている可能性がある。現在、この抗体を検出するためのELISAを構築するとともに、この蛋白由来のペプチドに特異的なT細胞が患者の流血中に存在するか否かを検討中である。これらのアッセイについては特許の出願を計画している。一方、UT-7由来のcDNAライブラリーのスクリーニングにより同定した蛋白diazepam-binding protein-related sequence-1(DRS-1)に対する抗体はPNH血球増加再生不良性貧血例84例中の32例(38.1%)に検出された。DRS-1のアミノ酸配列は2種類のHLA-DR15結合配列を含んでおり、その一方は、抗体エピトープと重複していた。

このDR15蛋白と結合するT細胞エピトープのペプチドを合成し、DRS-1ペプチド特異的T細胞の前駆細胞頻度をELISPOTアッセイで調べたところ、抗DRS-1抗体陽性でDR15を持つ患者では、検討した2例の両例においてDRS-1特異的T細胞の前駆細胞が高頻度に検出された。現在、このDRS-1特異的T細胞の機能を検討している。平成15年度の研究により同定した再生不良性貧血の自己抗原候補80kD蛋白(特許出願中のため実名を伏す)が、再生不良性貧血の病態発生に果たす役割を明らかにするため、リコンビナントの80kD蛋白を作成し、この蛋白に対する血清中の抗体価をELISA法により測定した。その結果、再生不良性貧血患者43例中20例(46.5%)にこの蛋白に対する抗体が検出された。エピトープマッピングを行ったところaa 347-360(TKKAQQELEEQTRS)が抗体エピトープのホットスポットとして同定された。抗80kD抗体は、再生不良性貧血患者だけでなく、慢性関節リウマチ患者の約4割の患者血清中にも検出されることが知られている。慢性関節リウマチ患者血清中の抗モエシン抗体が同じエピトープを認識するかどうかについて現在検討を進めている。一方、再生不良性貧血患者の血清中に検出された抗DRS-1抗体は、慢性骨髄性白血病(CML)患者の血摘中にも33例中14例(42%)に検山された。CML細胞株におけるDRS-1発現の有無を、DRS-1に対するモノクローナル抗体を用いたWestern blottingにより検索したところ、K562、KH88、KU812など検索した8細胞株のうち7細胞株がDRS-1を高発現していた。HLA-DR15によって提示されるDRS-1ペプチドと、抗DRS-1抗体陽性者の末梢血中核細胞を用いてDRS-1特異的CD4陽性T細胞を誘導し、DR15陽性のKH88に対する細胞障害性を検討したところ、T細胞の用量依存性にKH88が傷害された。これらの所見から、抗DRS-1抗体を持つHLA-DR15陽性CML患者においては、DRS-1特異的CD4陽性がCML幹細胞の抑制に関わっている可能性が示唆された。
通電膜の浄水処理への応用に関する基礎的研究

本研究は水道原水中に存在する有機、無機の懸濁質の表面電位が負に帯電している特性を活かし、膜ろ過の過程で膜に直流電気を流し、膜を負極にすることで、電位反発力を利用し、懸濁質の除去ができるのではないかという点に着目し開始したものである。平成7年度の実験で膜ろ過を行う際に膜に負の電荷を印加すると、電位の反発力でトリハロメタン前駆物質であるフミン酸の除去率が高まることが確認できた。平成8年度の研究は前年度の知見を踏まえて、実用化を念頭に置き、ろ過方式を膜表面撹拌を伴ったデットエンドろ過からクロスフローろ過に変え、新たに開発した円筒状の膜ろ過体を用い、円筒管中心部に陽極を配することで実装置に近づけて実験を行った。実験は市販のフミン酸を3mg-TOC/Lに調整した人工原水を用い、セラミックにプラチナをスパッタリングしたMF膜を用いた実験、および腐葉土から抽出したフルボ酸を溶解させたものを原水として、カーボン製のUF膜を用いた。その結果、MF膜、UF膜とも電気印加にともにないTOC,E260ともに除去率が上昇し、TOC除去率はMF膜では75mAで76%、UF膜では30mAでほぼ100%に達した。しかし、膜構造上の差から、MF膜では透過流束は電気印加とともにやや大きくなる傾向が得られたが、UF膜では透過流束で低下し、30mAでほぼゼロになった。これは今後の検討課題である。水道は若年労働力の不足、複雑深刻化する水源汚染に対応するため、小規模水道を中心に無人で管理できる確実な浄水システムの確立を模索している。そのため、膜ろ過が今後の浄水処理で特に小規模施設において、除濁処理の中心となることと期待されているが、この方法では溶解性成分に近い粒径を持つ物質の除去は容易でない。これらの物質の中にはトリハロメタンの前駆物質である腐植物質が含まれ、有効な対応策の検討が課題となっている。本研究は水道原水中の懸濁液の表面が負に帯電していることから、膜を負に帯電させることで膜の目詰まりを防ぎ、高フラックスで除濁を行うことを目的としている。また、無機質の除濁のみならず、トリハロメタンの前駆物質である腐植物質も負に帯電しているので、通電膜での除去が期待できると考えられる。本年度は通電膜によるフミン質の除去、ファウリングの抑制に重点を置き、デットエンドろ過で、主に印可電圧の影響について検討した。実験は3種類のフミン質を用い、無機懸濁液質としてカオリンを共存させる条件で行った。その結果、印可電圧が高くなればフミン質の除去率が高くなること、また、より高分子のフミン質ほど除去率が高くなることが判明した。さらに、膜のファウリングについても、ろ過継続に従いフラックスは低下するものの、印可電圧が高いほどその低下割合が緩慢なことが分かった。しかし、予め凝集処理をした場合には印可電圧に関係なくフラックスの低下が見られることから、電位による反発力が有効に働いていると考えられ、通電膜の利用は明らかにファウリング防止に有効なことが判明した。平成7年度の実験で膜濾過を行う際に膜に負の電荷を印加すると、電位の反発力でトリハロメタン前駆物質であるフミン酸の除去率が高まることが確認できた。本年度の研究は前年度の知見を踏まえて、実用化を念頭に置き、濾過方式をデットエンド濾過からクロスフロー濾過に変え、新たに開発した円筒状の膜濾過体を用い、円筒管中心部に陽極を配することで実装置に近づけて実験を行った。膜はセラミックにプラチナをスパッタリングしたMF膜、カーボン製のUF膜を用意し、MF膜では市販のフミン酸、UF膜では腐葉土から抽出したフルボ酸を溶解させたものを原水として実験を行った。

実験結果はTOC、紫外部吸光度(260nm)、SECによる分子量分画(紫外部吸光度検出)、透過流束で評価を行ったが、両膜とも印加電力の上昇とともにTOC、紫外部吸光度の除去率が上昇することが確認された。また分子量分画の結果、分子量の大きい画分ほど除去が進行することが確認できた。また、電気印加が透過流束に与える影響ではMF膜では電力量を増しても透過流束に影響はなかったが、UF膜では印加電力量の増加に伴い透過流束の低下が観察された。これは電気分解により発生した微細な気泡が膜の細孔を閉塞し、透過流束が低下したためで、細孔口径の大きいMF膜では流束の低下が生じなかったが、微細な細孔を持つUF膜ではその影響が出たためと考えられる。
逐次的な確率的アルゴリズムと制御問題への応用に関する研究

遂次的な確率的アルゴリズムの中でも,その基礎となる確率近似法のアルゴリズムの収束性についての研究を主に行った.特に,代表者によって研究されている観測列が従属確率変数列である場合の収束性についての研究がなされた.従来の確率近似法においては,観測誤差は平均値0の独立な確率変数列かあるいはもう少し一般的な, martingale difference列の場合を想定し,確率1及び平均収束の十分条件が得られている.この条件を従属の場合に置き代えた研究は,ほとんどが確率1での収束(概収束)に関してであり,平均収束の場合はほとんどない.代表者は平均収束を2つのタイプのmixing-条件(4-mixing,strong mixing)を与えることにより,回帰関数が線型とは限らぬ場合の平均収束の十分条件を得た.さらに,その収束のorderを得た.この成果を得るために,確率論,数理統計学,関数方程式,数値解析値の研究者を分担者とし,彼等の知識を幅広く吸収することが出来たことはこの研究にとって大変有益であった.この課題の研究計画においては,さらに,中心極限定理と関連させて停止時刻の導入及び,色々な制御問題への応用が目的としてあったが,現在,それらは,今までの研究成果,議論のもとに,グループ内で成果を得つつある.今年度は,科学研究費の助成を受け,グループ以外の遠方の研究者と情報,資料の交換をすることが出来,大変有益であった.遂次的な確率的アルゴリズムの中でも,その基礎となる確率近似法のアルゴリズムの収束性についての研究を主に行った.特に,代表者によって研究されている観測列が従属確率変数列である場合の収束性についての研究がなされた.従来の確率近似法においては,観測誤差は平均値0の独立な確率変数列かあるいはもう少し一般的な, martingale difference列の場合を想定し,確率1及び平均収束の十分条件が得られている.この条件を従属の場合に置き代えた研究は,ほとんどが確率1での収束(概収束)に関してであり,平均収束の場合はほとんどない.代表者は平均収束を2つのタイプのmixing-条件(4-mixing,strong mixing)を与えることにより,回帰関数が線型とは限らぬ場合の平均収束の十分条件を得た.さらに,その収束のorderを得た.この成果を得るために,確率論,数理統計学,関数方程式,数値解析値の研究者を分担者とし,彼等の知識を幅広く吸収することが出来たことはこの研究にとって大変有益であった.この課題の研究計画においては,さらに,中心極限定理と関連させて停止時刻の導入及び,色々な制御問題への応用が目的としてあったが,現在,それらは,今までの研究成果,議論のもとに,グループ内で成果を得つつある.今年度は,科学研究費の助成を受け,グループ以外の遠方の研究者と情報,資料の交換をすることが出来,大変有益であった.
幼稚園における道徳教育プログラムの開発

本研究の目的は,幼稚園における道徳教育プログラムを開発することである。小中学校と比べ,幼稚園教育には幼児の道徳発達を促すプログラムはわずかしか存在しない。本研究では,子どもの道徳発達に関する心理学的研究の成果を踏まえ,また幼稚園現場での実践事例の収集と分析を通して,幼児の道徳的自律を支える環境づくり,道徳的体験を促す活動と仲間遊び,道徳教育に有効な絵本を用いた指導方法,動物の飼育を通した教育方法を包含した教育プログラムを開発した。さらに,プログラムの評価を目的として,幼児の道徳発達と学級の道徳的雰囲気を測定する方法を考案した。研究1:幼稚園の教師254名を対象にした調査から、教師は幼児期の思いやりの発達にとって仲間との相互作用経験が最も大きく影響すると考えており,仲間とのトラブルに対しては教師は見守るという態度が有効であると信じていた。このような信念をもとに,保育環境をつくり出すと考えられる。研究2:幼児の罪悪感の発達と、幼児の対人葛藤場面での保育者のかかわり方について調査を行った。そして、謝罪行為、向社会的行動と罪悪感との関係を考察し、罪悪感の発達環境としての大人のかかわり方に関する自己評価項目を作成した。研究3:絵本を用いた教育プログラムを試作し、東京都の区立幼稚園教師一人が実践を行った。絵本通して,子どもの道徳的な感性,言葉の感覚,友達や幼稚園に対する興味が総合的に育成されていくことが示唆された。研究4:幼稚園での小動物の飼育を用いた道徳教育、及び集団場面での絵本を用いた教育実践をプログラム化した。これまでの研究成果を踏まえ、5歳児の研究データから3歳4歳の学級へ応用するため、プログラムに含める小動物、特にムシ類の飼育方法、及び絵本のレパートリーを増やした。それを10名の幼稚園教師に評価してもらった。昨年までと同様に、3年間のプログラムは妥当性、実用性、経済性、発展可能性のすべての観点で高い評価が得られた。小中学校と比べ,幼稚園教育には幼児の道徳発達を援助するプログラムはわずかしか存在しない。本研究では,子どもの道徳発達に関する心理学的研究の成果を踏まえ,また幼稚園現場での実践事例の収集と分析を通して,幼児期の子どもの道徳的自律を支える環境づくり,道徳的体験を促す活動と仲間遊び,道徳教育に有効な絵本等の資料,教師の役割を包含した教育プログラムを開発する。さらに,このプログラムの評価を目的として,幼児の道徳発達と学級の道徳的雰囲気を測定する方法を考案する。平成15年度は,まず幼稚園における道徳教育実践事例の収集を行った。資料集として記録の残っている実践を収集し,分析用にデータ化していった。データ化の観点として,幼稚園の規模や幼児の年齢といった要因のほか,「道徳発達の援助が必要な場面」と「教師の援助・指導」を軸にした。また,文科省あるいは県の研究委託を受けた幼稚園5カ所(埼玉県,福島県,千葉県)をまわり,実践の基盤となった教師の考え方を聞き取り調査した。幼稚園での道徳教育に有効な絵本,劇的活動,現場教師のアイディアなどを収集し,整理した。次に,幼児の道徳発達評価方法の開発,および園内の道徳的環境の評価ガイドラインの作成を検討した。まだ探索的な水準であるが,幼児の対人行動(思いやりと自己表現)と社会的規範意識を通して道徳発達の評価方法案を作成した。さらに,教師のかかわり方,職員間の協力体制,家庭との連携のあり方を幼児の道徳発達の環境ととらえ,それらを評価し改善する上でのガイドラインを作成した。これは教師による自己評価の形式を採用した。これらの妥当性の検討は平成16年度の課題である。

本研究の目的は,幼稚園における道徳教育プログラムを開発することである。小中学校と比べ,幼稚園教育には幼児の道徳発達を援助するプログラムはわずかしか存在しない。本研究では,子どもの道徳発達に関する心理学的研究の成果を踏まえ,また幼稚園現場での実践事例の収集と分析を通して,幼児期の子どもの道徳的自律を支える環境づくり,道徳的体験を促す活動と仲間遊び,道徳教育に有効な絵本等の資料,教師の役割を包含した教育プログラムを開発する。さらに,このプログラムの評価を目的として,幼児の道徳発達と学級の道徳的雰囲気を測定する方法を考案する。平成16年度は,保育の質を大きく左右する要因として,保育者の保育信念とストレス対処能力について調査を行った。いずれの調査も,東京都と千葉県の公立及び私立の幼稚園教師が対象になった。信念については254名,ストレスについては420名の協力があった。幼稚園教師は幼児期の思いやりの発達にとって仲間との相互作用経験が最も大きく影響すると考えており,仲間とのトラブルに対しては教師は見守るという態度が有効であると信じていた。このような信念をもとに,保育環境をつくり出すと考えられる。また,幼稚園教師は平均10時間も園で仕事をしており,ストレス反応を示す者も少なくなかった。慢性的にストレス反応を示す者は,子どもに対する言動にもストレスからくる乱暴な言葉づかい等が目立つと報告していた。絵本を用いた教育プログラムを試作し,東京都の区立幼稚園教師一人が実践を行った。絵本通して,子どもの道徳的な感性,言葉の感覚,友達や幼稚園に対する興味が総合的に育成されていくことが示唆された。小中学校と比べ、幼稚園教育には幼児の道徳発達を援助するプログラムはわずかしか存在しない。本研究の目的は、幼稚園における道徳教育プログラムを開発することである。本研究では、子どもの道徳発達に関する心理学的研究の成果を踏まえ、また幼稚園現場での実践事例の収集と分析を通して、幼児期の子どもの道徳的自律を支える環境づくり、道徳的体験を促す活動と仲間遊び、道徳教育に有効な絵本等の資料、教師の役割を包含した教育プログラムを開発する。さらに、このプログラムの評価を目的として、幼児の道徳発達と学級の道徳的雰囲気を測定する方法を考案する。平成17年度は、幼児の罪悪感の発達と、幼児の対人葛藤場面での保育者のかかわり方について調査を行った。そして、謝罪行為、向社会的行動と罪悪感との関係を考察し、罪悪感の発達環境としての大人のかかわり方に関する自己評価項目を作成した。調査は幼稚園の4歳児と5歳児、小学校2年生と5年生、合計105名を対象に個別形式で行われた。保育者対象の調査は140名を対象に、質問紙形式で実施された。偶発的な加害行為の後、4歳児は自発的に謝罪行為はとるものの、補償行動や向社会的行動までは進まないことが示された。補償行為(向社会的行動)が出現するのは小学校にあがってからであった。5年生になると、過失を再発しない約束が可能になることも示された。
NK細胞と主要組織適合遺伝子複合体Class I 分子の関連

2) Killerinhibitory receptorのひとつであるLy-49Aはそのcytoplasmic domainにimmunoreceptor tyrosine based inhibitory motif (ITIM.YxxV))を有しH-2D^d、H-2D^kより抑制シグナルをうける。マウスのB細胞株A20にLy-49Aをtransfectし、B細胞受容体(BCR)とLy-49AのクロスリンクによってBCR刺激によるIL-2分泌がLy-49Aの発現レベルに比例して抑制されることを確認した。BCR刺激による細胞内カルシウムの上昇はほとんど影響を受けなかった。ITIMの機能に重要なtyrosineをphenylalaninに置換したmutant cloneY/F(FxxV)ではIL-2の部分的抑制が見られたのに対し、細胞内領域の欠損したcloneΔN37この抑制は全く認められなかった。チロシンリン酸化されたwild typeのLy-49AのみSHIPではなくSHP-1に会合したことから、ITIM内のtyrosineがSHP-1の会合に必要なことが確かめられた。Ly-49Aの抑制経路にはITIM/SHP-1に依存する経路としない経路があると考えられる。1)現在ヒトのNK細胞より抗CD3、抗CD4、抗CD8、抗CD19抗体を利用しNK細胞をnegative selectionにより精製したが、NK細胞の長期維持には失敗している。精製されたNK細胞をNK細胞receptorに対する抗体であるEB6(Cw2,4,5,6)、GL183(Cw1,3,7,8)、DX9(Bw4)を利用しHLAの異なる患者において検討しているが、一定の傾向を認めていない。すなわちCw2,4,5,6を有しないヒトでもEB6陽性のNK細胞を認め、逆にCw1,3,7,8を有しないヒトにもGL183を認める。現在、NK細胞cloneからの抗体作製をあきらめ、精製NK細胞からの新しいNK細胞receptorに対する抗体の作製を試みている。3)NK細胞receptorのnegative signalをNK細胞receptorの一つであるP58のcytoplasmic domainとCD3ζのtransmebraneとCD16のouter membraneのchimeraを作製し、これをB細胞であるA20にtransfectionした。このtransfectionされた細胞では抗CD16抗体とヤギ抗マウスIgGにより部分的にIL-2の産生が抑制され、B細胞において確立されているnegative signalと同じまたは類似のsignalがNK細胞においても働いていることが推定され、現在解析を進めている。2)NK細胞においてNegative signalに関与するNK細胞receptorの一つであるLy-49Aのcytoplasmic domain(ITIM like motif,VxYxxVを持つ)とCD3ζのtransmebraneとCD16のouter membraneのchimeraを作製し、これをB細胞であるA20にtansfectionした。このtransfectionされた細胞では抗CD16抗体とヤギ抗マウスIgGにより部分的にIL-2の産生が抑制され、B細胞において確立されているITIMmotifによるnegative signalと類似のsignalがNK細胞においても働いていることが推定されたが、これにはCa++は関与しておらずこの機構ついて現在解析中である。2) Killerinhibitory receptorのひとつであるLy-49Aはそのcytoplasmic domainにimmunoreceptor tyrosinebased inhibitorymotif(ITIM,YxxV))を有しH-2D^d.H-2D)^kより抑制シグナルをうける。