hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
緑膿菌サイトトキシンとサイトトキシンコンバーティングファージの分子遺伝学的研究

1、ФCTXの解析:(1)cos部位の構造を決定した。(2)attp部位のコア構造を同定すると同時に、新たに見い出されたセリンtRNA遺伝子の3'末端領域が付着部位であることが明らかとなった。この遺伝子の染色体上の存在部位も、遺伝地図で42-45分の領域であり、加えて大腸菌との間で、種の違いを越えてよく保存された領域であることを明らかにした。(3)att-cos-ctx領域に多数のリピート・弯曲DNA・IHF結合配列の存在する特微的なDNA構造を明らかにした。(4)attpの近傍に、ФCTXのintおよびxis遺伝子と推定される遺伝子を見い出した。2、ФCTXとR型ピオシンとの関係:(1)ФCTXは免疫学的性状およびDNAの塩基配列の相同性より、R型ピオシン関連ファージであることが証明された。(2)レセプター分子としてはLPSが同定された。さらに外側コア領域が重要であること、この外側コア領域の構造は血清型と関係があるため、ФCTXの宿主域も一定の血清型に限られることもわかった。(3)R型関連ファージの中でPS21はctx遺伝子をもち、かなり類似したファージであることが認められたが、宿主域・接着部位・免疫学的性状において明らかな違いが示された。(4)他のR型ピオシン関連ファージのうち、ФCTXに対して、限定された一部分にのみ相同性が認められるグループと、ctx遺伝子をもたないが相同性が広範囲に認められるファージのグループが存在することが明らかとなった。3、サイトトキシン類似毒素の検索:ctx遺伝子をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション法により、大腸菌などの腸内細菌・緑膿菌以外のシュードモナス・ナイセリア・ヘモフィルス・動物由来の緑膿菌を全部で数百株スクリーニングしたが、ctxと相同性をもつ遺伝子は見いだされなかった。1.φCTXの解析:(1)cos部位の構造を決定し、21残基からなるco-hesive endの構造を明らかにした。(2)attP部位のコア構造を同定すると同時に、染色体側の付着部位が、今回新たに見い出したセリンtRNA遺伝子の3'末端領域であることが明らかとなった。この遺伝子の染色体上の存在部位も、遺伝地図上で4245分の領域であることさらに、この領域が大腸菌との間で、種の違いを超えてよく保存された領域であることも明らかにした。(3)attP-cos-ctx領域のきわめて特徴的なDNA構造が明らかとなった。すなわち、多数のリピート・弯曲DNA・IHF結合配列などの存在である。(4)attPの近傍に、φCTXのcntおよびxis遺伝子と推定される遺伝子を見い出した。2.φCTXとR型ピオシンの関係:(1)免疫学的にはR1・R5ピオシンに最も近く、宿種域についてはR1ピオシンと同じか、きわめて類似していることがわかった。(2)レセプター分子としては、LPSが同定され、さらに外側コア領域が重要であること、この外側コア領域の構造は血清型と相関があるため、φCTXの宿主域も一定の血清型に限られることもわかった。(3)他のR型ピオシン関連ファージのうちctx遺伝子を持たないPS17とは、尾部をコードしている領域の一部とのみDNA塩基配列の相同性が見いだされた。ctx遺伝子を持つPS23とは、かなり類似したファージであることがわかったが、宿主域・immunityにおいて明らかな違いが認められた。

3.サイトトキシン類似毒素の検索:ctx遺伝子をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション法により、大腸菌などの腸内細胞.緑膿菌以外のシュードモナス・ナイセリア・ヘモフィルス・運物由来の緑膿菌を全部で数百株スクリーニングしたが、ctxと相同性を持つ遺伝子は見い出されなかった。φCTXとRピオシン関連ファージとの関係;φCTXは免疫学的性状およびDNAの塩基配列のホモロジーにより、Rピオシン関連ファージであることが証明された。φCTXとPS21との関係;Rピオシン関連ファージと同定されているファージの中のPS21がctx遺伝子を持ち、CTXが発現されていることを明かにした。その発現量は非常に少量であるが、その免疫学的性状および前駆体として産生されトリプシンで活性化されることより、φCTXの産生するCTXと同様であることが推察された。PS21とφCTXとは、宿主域が異なり、加えて、φCTXの接着部位はPAO1のSpPフラグメントであるのに対し、PS21の染色体への接着部位はSpGフラグメントに存在することがパルスフィールド電気泳動によって明かになった。また、PS21のゲノムサイズは30kbpであることが推察された。しかしながら、両者は交差免疫を示し、ファージゲノム上の広い範囲にわたってDNAのホモロジーがあることより、非常に近縁のファージであることが示唆された。Rピオシン関連ファージのサブグループ化;さらに、広くRピオシン関連ファージをサザンハイブリダイゼーションによって解析することにより、その中にφCTXに対し限定された一部分のみにDNAのホモロジーが認められるグループとctx遺伝子を持たないがホモロジーが広範囲に認められるファージのグループが存在することが明かになった。
植物ホルモン・ジベレリン受容体機構探索分子の設計並びに高効率的合成

活性型天然ジベレリンの中で化学的に比較的安定なGA4或いはGA1を認識部位とする蛍光標識時ジベレリン及びフォトアファニティー標識ジベレリンの設計と合成を目的に合成研究を行った。先ず、ジベレリン母格の化学的安定性を増し適切なスペーサー修飾位置を探る為、種々の誘導体を合成し、大麦の半切り種子を用いたα-アミラーゼ生合成誘導活性試験にてジベレリン活性と検定した。次に、得られた構造活性相関データーに基づき、19-deoxo-GA1型の蛍光標識ジベレリン及びフォトアファニティー標識ジベリンを合成した。現在まで、合成した蛍光標識ジベリンを用いることにより、α-アミラーゼ生合成誘導に関わるジベリン受容体は大麦種子のアリューロン細胞の細胞膜上にあるとの知見を得ている。フォトアファニティー標識ジベリンは外部研究者との共同研究にて受容体タンパク質を含むジジベレリ結合タンパク質の同定研究に用いる予定である。更に、同一の手法を、近年、植物生長調節物質として注目されているジャスモン酸及び植物ホルモンであるブラシノステロイドの受容体機構解明にも拡張すべく、その構造活性相関研究を行った。その過程で、重水素化ブラシノステロイド、5-エピ-ブラシノライド、6a-carba-ブラシノライド、水酸化ブラシノライド及び、ジャスモン酸誘導体の合成法を開発した。又、最近、受容体タンパク質同定のためのスクリーニング法として提唱されているthree hybrid systemをジベリン受容体同定に応用する目的でGA-dexamethasone hybrid ligandの合成研究を行った。その予備実験としてJA-dexamethasone hybrid ligandを合成した。本研究で行った、スペーサーを介しての様々な機能部位を構築する合成手法は、ジャスモン酸或いはブラシノステロイドの機構探索分子合成の際も、ほぼ同様に適用できるものなので、今後は、これらのプローブの合成も同時進行することを考えている。1.大麦のアリューロン細胞のジベレリン受容体が細胞膜上に在ることを明確に証明する為、既に合成した蛍光標識ジベレリン(FLGA)に勝るα-アミラーゼ誘導活性を有するFLGAの合成研究を行った。即ち、これまでの構造活性相関研究により活性及び化学的安定性がGA_4より優れていることが明かとなった合成ジベレリン18-deoxyGA_1を受容体認識部位とし、化学的安定性に優れたピレン環を蛍光標識部位とするFLGA_1-1の合成を検討した。本年度はFLGA_1-1の合成には至らなかったものの、先に確立したジベレリン酸(GA_3)より18-deoxy-17-hydroxy-16,17-dihydroGA_1(A)への変換法を改良し、より効率的なものとした。更に、(A)の17位水酸基を足掛かりとしたスペーサー及び蛍光標識部位導入法の予備実験としてアルキル化を検討し、種々のエーテル誘導体を合成した。現在、α-アミラーゼ誘導活性試験を行い、これらの化合物が18-deoxyGA_1と同程度の活性を再現するかどうかを確認中である。又、受容体認識部位の化学的安定性を増す目的で、GA_1の3位及び13位水酸基のエーテル体を合成、その活性を検定中である。2.1の(A)より光アフィニティー標識GAを合成する目的で、光反応基部位であるトリフルオロメチルアリールジアジリン(TFMADA)誘導体の合成を完了した。又、最近、受容体蛋白質同定の為のスクリーニング法として低分子プローブを遺伝子的な手法に組み入れたthree hybrid systemが提唱されたが、本手法をジベレリン受容体同定に応用する目的でGA-dexamethasone hybrid ligandの合成研究を行った。

現在まで、dexamethasone部の合成を完了し、17-hydroxy-GAとの縮合を検討中である。1.活性型天然ジベレリンであるGA_4を母格として蛍光標識プローブを含む各種誘導体を合成し、α-アミラーゼ生合成誘導活性等の活性評価を行った。その結果、これまで合成した化合物では活性の再現性が不十分であり、実験系に於ける化合物の安定性、及び活性の保持を図る為、ジベレリンの構造活性相関について更なる検討が必要となった。その為、3-ケト、3-メトキシジベレリン類、及びA環が芳香化したジベレリンの合成を計画しその効率的な合成法を開発した。現在、これらの化合物について種々の活性評価を行っているが、その中で、イネ及びキャベツの伸長に関わるジベレリン受容体についての新知見を得た。即ち、前者はGA_1型のリガンドを厳密に認識するが、後者はGA_4型のリガンドを認識し、その構造要求性はイネに比較して低かった。GA_4型の化合物は化学的に扱いやすいので、現在、これまで合成した化合物を用い、GA_4型のリガンドを認識し構造要求性が低い、in vitroなジベレリン活性評価系を探索中である。以上の結果に加えて、本研究の手法を、近年、植物生長調節物質として注目されているジャスモン酸及び植物ホルモンであるブラシノステロイドの受容体機構解明にも拡張すべく、その構造活性相関研究を行った。その過程で、重水素化ブラシノステロイド、5-エピ-ブラシノライド、6a-carba-ブラシノライド、及び、ジャスモン酸誘導体の合成法を開発した。1.前年度迄合成した19-deoxo-Gal型の蛍光標識ジベレリン及びフォトアフィニティー標識ジベレリンをプローブとして、大麦種子のアリューロン細胞プロトプラストを植物材料に用い、その受容体タンパク質を含むジベレリン結合タンパク質を単離・同定する研究は他機関の研究者との共同研究にて現在進行中である.2.GA-dexamethasone hybrid ligand合成の予備実験として、ジャスモン酸-dexamethasone hybrid ligandを合成した.本化合物は、イネのPAL活性発現を指標に活性を評価し、現在、その発現に関わるジャスモン酸受容体の探索研究に使われている.3.化学的に安定である芳香化ジベレリンを受容体認識部位とするプローブの合成は現在進行中である.又、その活性はシロイヌナズナの下胚軸伸長活性を指標として検定した.更に、GAプローブ合成手法を、近年、植物成長調節物質として注目されているジャスモン酸及び植物ホルモンであるブラシノステロイドの受容体機構探索分子の合成にも拡張すべく、前年度に引き続き、その構造活性相関研究を行った。その中で、天然ブラシノステロイドの中で活性本体と考えられているブラシノライドの代謝候補化合物として、14-,20-,25-,26-及び28-水酸化ブラシノライドを合成した.これにより、ブラシノライドの水酸化は不活性化であることを明らかにすると共に、プローブ合成時の修飾位置についての知見を得た.又、ブラシノステロイドのA/Bトランスの立体化学は活性発現に必須であることを確かめた.
グリコシル結合軸の回転の制御に基づく新規糖含有生理活性物質の創製

天然から得られたトポイソメラーゼ阻害を有する活性物質であるレベッカマイシンの誘導体の化学合成をおこなった。糖を含有するレベッカマイシンの立体構造に興味を持ち、NMRやX線結晶解析などを用いて調べた。また、合成の過程において、インドロカルバゾールにグリコシル化を行う方法について検討し、温和な中性条件下で進行する光延反応を利用したグリコシル化反応を開発した。本法では、異なる溶媒を用いることによって、グリコシル結合の立体選択性を制御できることを見出した。今年度は、抗がん活性を示す天然物であるレベッカマイシン、ブロモレベッカマイシンの全合成及び、その類縁体の合成に注力した。レベッカマイシン、ブロモレベッカマイシンについては、すでに保護基を有する誘導体の合成まではルートが確立した。現在、保護基の効率的除去について検討を重ねている。これと並行して、レベッカマイシン類縁体の合成も行っている。すなわち、ペリ位のブロモ基を他のハロゲンやメチル基に変えた誘導体の合成も試みている。得られたレベッカマイシン類縁体は、グリコシル結合の立体化学によって、全体の立体構造が大きく異なることがわかった。特に、α-グリコシル結合の場合は、結合(sp2窒素ーsp3炭素結合)の周囲が立体的にこみあった状態にあり、軸不斉異性体を含む様々な立体異性体が存在することがわかってきた。これらの立体構造については、X線結晶解析、NMR及びHPLCの検討によって明らかにしつつある。このような合成研究を行うにあたって、インドールのN-グリコシル化反応の開発が必要であった。インドールの窒素は求核性が低く、グリコシル化反応にあたっては、激しい条件を用いて行わざるを得ない。様々な条件を検討したが、現状では、強アルカリである水酸化ナトリウムを用いる方法が最も良い収率を与えることがわかっっている。しかし、このような激しい条件を用いるグリコシル化では、糖類の保護基に制限がかかってしまうため、あまり望ましくない。来年度は、中性条件下でグリコシル化を行うべく、光延反応の応用を検討したいと考えている。さらに、合成されたレベッカマイシン類縁体の生物活性を検討し、真の活性コンホメーションを明らかにしたいと思う。抗がん活性を示す天然物であるレベッカマイシンの全合成及び類縁体合成を行い、構造活性相関研究に展開しつつある。特に、複素環部位と糖部位によって構成される分子全体の三次元的な構造について詳細に検討し、標的タンパクとの相互作用様式解明をめざしている。レベッカマイシンは、インドール環7位にクロロ基が存在するため、グリコシル結合(sp2窒素ーsp3炭素結合)の周囲が立体的にこみあった状態にあると予想される。そこで、今年度は、さらに嵩高い置換基を導入し、より立体障害を高めたレベッカマイシン類縁体を合成している。特に、7位クロロ基の代わりにブロモ基を導入した化合物は、天然物として単離されて(ブロモレベッカマイシン)いるが、未だに全合成はなされていない。本年度は、インドロカルバゾール部位へのグリコシル化を精査し、N-グリコシド結合の立体化学を明らかにしつつある。天然物はβ-結合体であるが、α-結合体では、立体障害によりsp2窒素ーsp3炭素結合の回転がより効率良く制御され、軸不斉異性体を得られる可能性が高い。これまでの検討の結果、高いα選択性を示すグリコシル化反応を見出すことができた。現段階では、保護基を有したブロモレベッカマイシン誘導体の合成まで完成しており、NMRを用いた三次元的な構造解析を詳細に行っている。特に、sp2窒素ーsp3炭素結合の自由回転を抑えた化合物について、軸不斉異性体の分離・単離を試み、立体構造及び安定性を調べている。糖含有天然物の立体構造を明らかにし、生物活性との関連を調べることを目的として研究を遂行した。トポイソメラーゼ阻害作用を有する糖含有天然物であるレベッカマイシン類縁体の合成を検討した。グリコシル結合の形成反応については、これまでにも多くの方法が開発されているが、いずれも強酸性、もしくは強塩基性条件下で行われるものであり、中性条件下で進行する反応は少ない。本研究課題では、他の官能基に影響しないことを第一目的とし、温和な中性条件下で進行するグリコシル化反応を開発することとした。具体的には、光延反応をグリコシル結合形成に応用することとした。様々な条件を検討した結果、溶媒効果が大きいことを見出した。すなわち、溶媒の極性によって、グリコシル結合の立体化学の選択性が変わることを見いだした。これを利用して、レベッカマイシン誘導体について、αグリコシル結合体とβグリコシル結合体を選択性良く合成することができた。天然型のレベッカマイシンは糖がβグリコシル結合したものであるが、今回、αグリコシル結合した化合物が得られたことは、今後の生理活性の検討において非常に有益と考えている。

特に、天然から得られて化学構造は確認されているものの、全合成例が未だに報告されていないブロモレベッカマイシン誘導体の合成に道筋をつけたことは高く評価されるものと考える。得られた様々な誘導体の立体構造をVTNMRによって調べた結果、グリコシル結合の立体化学に関わりなく、おしなべて糖部位がインドロカルバゾールの極めて近傍にある、いわゆるclosedなコンホメーションが優先されていることがわかった。この結果は、糖とインドロカルバゾールを結ぶグリコシル結合が非常に立体的にこみあった環境下に置かれていることを示唆するものである。医薬化学レベッカマイシン及びブロモレベッカマイシンの合成については、ほぼルートが確立された。また、グリコシル化反応についても、ある程度立体選択的に行える反応条件をみつけることができた。得られたレベッカマイシン類縁体の立体構造の解析も順調に進んでいる。レベッカマイシン類縁体の生物活性の検討について来年度は注力したい。今年度は、レベッカマイシンの誘導体の合成を行っているが、すでに、鍵反応となるグリコシル化について立体選択性を高める方法を見出している。また、それぞれの立体異性体を単離し、構造決定することもできている。特に、VTNMRを用いた溶液中での構造の変化について詳細なデータを得ることができており、コンホメーションの予想ができるようになってきた。これは、当初の初年度の計画どおりの進捗状況であり、おおむね順調に進展していると評価した。レベッカマイシン及びその類縁体の合成についてほぼ完成しているので、得られた様々な類縁体について立体構造の解析を進める。同時に、生物活性の検討も行い、活性コンホメーションをあきらかにし、より生物活性の高い新しい分子の設計及び合成に向かいたい。次年度は、レベッカマイシンの誘導体を数種類合成することをめざす。特に、天然物として存在が確認されているブロモ誘導体(ブロモレベッカマイシン)の全合成を世界で初めて完成させたい。グリコシル結合(sp2窒素ーsp3炭素結合)についてもVTNMRやX選結晶解析を用いて三次元構造を明らかにする。立体構造を精査することによって安定な化合物として軸不斉異性体を単離することができれば、これを用いて生理活性の検討を行い、レベッカマイシンとターゲットタンパクとの相互作用様式の解明を行う。以上のような取り組みによって得られた知見に基づき、より高い抗がん活性をもつレベッカマイシン誘導体を創出する。生物活性の検討を来年度に行うことにしたため、ペプチドなどの高価な試薬類を翌年度に購入することになったため。購入予定である高価な試薬類を購入する。今年度は、研究計画に沿ってほぼ予定通りの研究を行うことができた。その際に、使用する試薬やガラス器具を節約する努力を続けたことによって、次年度に使用する助成金が生じることとなった。次年度は、翌年度分として請求した金額とあわせてすべて物品費(消耗品として化学合成用の試薬及びガラス器具)に充てる予定である。
四国海盆の堆積フラックス変化から中新世西南日本テクトニクスを探る

四国海盆の層序において,堆積層解析により半遠洋性とイベント性堆積作用を分離して調査を行ったところ,はっきりとした地史イベントのシグナルが発見された.四国海盆のDSDP,ODP,IODPによる掘削コア試料の分析結果から,1地点を除くすべてのサイトにおいて,3Ma前後で半遠洋性堆積速度が倍増していることが発見された、堆積速度増加のタイミングに関しては地点ごとに2-4Maと多少のばらつきがあるものの,半遠洋性堆積速度の上昇量は一様であり,この地域に何らかの理由で四国海盆への堆積物供給速度が増加したことは明らかである.一方,タービダイトの堆積速度および堆積頻度も増加していることが分かったが,増加のタイミングや両は極めて局地的であり,タービダイトが全く見られない地点もあった.このことは,重力流により運搬されるタービダイトが局地的な地形に支配されるのに対し,拡散で移動する半遠洋性泥はより広域的な状況を反映することを物語っている.半遠洋性堆積速度の増加原因は,西南日本島弧の隆起速度変化に求めることが最も妥当であろう.すなわち,西南日本島弧の隆起速度は3Maごろに変化したということになる.もちろん,堆積物供給量の変化には他にもさまざまな要因が考えられる.しかしながら,粘土鉱物組成を検討結果からは,中新世に見られたようなスメクタイトからイライトへの組成変化は見られなかった.したがって,供給源の火成活動の変化などが堆積物供給量変化の原因であるとは考えづらい.半遠洋性堆積速度の空間分布を考慮すると,堆積物の主要な供給源は風成塵などではなく,西南日本外帯の堆積岩・変成岩と解釈することができる.今後は,独立した手法によりフィリピン海プレートの運動方向変化のタイミングをつかむことができれば,隆起速度変化とプレート運動方向変化のタイミングについて,さらにはそれらの成因的な関連について理解を進めることができるだろう.当初の目的である四国海盆の半遠洋性堆積速度の時空変化についてはほぼ全容が明らかになりつつある,特に,3Ma近辺での変化を明らかにしたことは大きな成果といえる.今後は,より詳細な組成解析により半遠洋性泥の供給源の解析や年代層序の高精度化により,さらに議論を深める予定である.また,独立した手法によりフィリピン海プレートの運動方向変化のタイミングをつかむことができれば,隆起速度変化とプレート運動方向変化のタイミングについて,さらにはそれらの成因的な関連について理解を進めることができるだろう.中新世における西南日本島弧発達史には未解明な点が多い.これまでの研究から,日本海拡大・フィリピン海プレートの沈み込み開始・南海トラフ付加体の形成開始が中期中新世(15Ma)に集中していることは明らかになっている.しかしながら,中期中新世から後期中新世にかけて(15-10Ma)の堆積岩はすべて侵食作用によって陸域から失われているため,この時期の西南日本の地史に関する地質記録はほとんど残されていない.そのため,本研究は,南海トラフの沖合に位置する四国海盆堆積物の層序・堆積相を調査し,そこから西南日本島弧地史に関する何らかのシグナルを読み取ることを試みた.今年度の結果として,四国海盆では中期中新世後期に半遠洋性泥岩の堆積速度が突然変化していることが明らかになった.半遠洋性泥岩は深海盆へほぼ一定の速度で堆積することが一般的だが,四国海盆では,11Maを境として半遠洋性堆積速度が半減している.この現象は,IODP Sites COO11 & COO12を初めとして,これまで四国海盆で掘削されたすべてのDSDP&ODPサイトで検出された.すなわち,この時期には四国海盆全域への堆積物供給速度が半減したということがわかる.この四国海盆における突然の堆積速度変化は,西南日本島弧における何らかのテクトニックイベントに対応している可能性がある,後期中新世(11Ma)は,熊野酸性岩を初めとする西南日本島弧の異常な前弧火成活動が終息した時期に近い.また,フィッショントラック熱年代学は西南日本の付加体が後期中新世に急激に上昇した可能性を示唆している.これらの西南日本前弧域におけるテクトニックイベントの終息は,火山岩・付加体の削剥作用の減少をもたらしたはずである.来年度以降は,調査の範囲拡大・精度向上を目指すと同時に,テクトニックイベントと堆積物フラックスの関係についても考察していく.四国海盆の層序において,堆積層解析により半遠洋性とイベント性堆積作用を分離して調査を行ったところ,はっきりとした地史イベントのシグナルが発見された.四国海盆のDSDP,ODP,IODPによる掘削コア試料の分析結果から,1地点を除くすべてのサイトにおいて,3Ma前後で半遠洋性堆積速度が倍増していることが発見された、堆積速度増加のタイミングに関しては地点ごとに2-4Maと多少のばらつきがあるものの,半遠洋性堆積速度の上昇量は一様であり,この地域に何らかの理由で四国海盆への堆積物供給速度が増加したことは明らかである.一方,タービダイトの堆積速度および堆積頻度も増加していることが分かったが,増加のタイミングや両は極めて局地的であり,タービダイトが全く見られない地点もあった.

このことは,重力流により運搬されるタービダイトが局地的な地形に支配されるのに対し,拡散で移動する半遠洋性泥はより広域的な状況を反映することを物語っている.半遠洋性堆積速度の増加原因は,西南日本島弧の隆起速度変化に求めることが最も妥当であろう.すなわち,西南日本島弧の隆起速度は3Maごろに変化したということになる.もちろん,堆積物供給量の変化には他にもさまざまな要因が考えられる.しかしながら,粘土鉱物組成を検討結果からは,中新世に見られたようなスメクタイトからイライトへの組成変化は見られなかった.したがって,供給源の火成活動の変化などが堆積物供給量変化の原因であるとは考えづらい.半遠洋性堆積速度の空間分布を考慮すると,堆積物の主要な供給源は風成塵などではなく,西南日本外帯の堆積岩・変成岩と解釈することができる.今後は,独立した手法によりフィリピン海プレートの運動方向変化のタイミングをつかむことができれば,隆起速度変化とプレート運動方向変化のタイミングについて,さらにはそれらの成因的な関連について理解を進めることができるだろう.当初の目的である四国海盆の半遠洋性堆積速度の時空変化についてはほぼ全容が明らかになりつつある,特に,3Ma近辺での変化を明らかにしたことは大きな成果といえる.今後は,より詳細な組成解析により半遠洋性泥の供給源の解析や年代層序の高精度化により,さらに議論を深める予定である.また,独立した手法によりフィリピン海プレートの運動方向変化のタイミングをつかむことができれば,隆起速度変化とプレート運動方向変化のタイミングについて,さらにはそれらの成因的な関連について理解を進めることができるだろう.
花幹細胞の時空間性を司る複合鍵の解析

本研究の目的は、生殖器官の形成過程における転写因子とエピジェネティック因子複合体の作用機構の解析を通して、時空間特異性の制御機構を理解することである。これまでに花発生過程において、幹細胞の増殖停止に機能する転写因子の複合体に着目し、それらのターゲット遺伝子の選択性を解析してきた。転写因子であるSUPERMANは花発生初期において、花幹細胞群を取り囲むように発現している。SUPタンパク質は、ポリコム因子であるFIEと直接結合して、オーキシン合成酵素YUUCCA (YUC)遺伝子の発現抑制をおこなっている事、実際にオーキシンの生合成を介して花幹細胞の増殖を抑制していることを示した(EMBO Journal, 2018)。また、CRC転写因子はSUPから2日ほど遅れて、幹細胞を取り囲むように発現する。CRCもまたYUCを直接制御しており、CRCの上流因子であるAGとともにYUC遺伝子座に直接結合する。すなわち、AGはまずクロマチンリモデリング因子の導入により、クロマチン構造を開き、その後にCRCが直接結合することで、YUCを活性化している。そのクロマチンを介したオーキシン合成酵素の制御機構の論文をNature Communications (2018)にて発表した。さらに、細胞自立的に花幹細胞の増殖抑制にかかわる経路の解析を行い、KNUがクロマチンリモデリング因子の結合阻害と抑制的ヒストン修飾酵素の導入という多段階のエピジェネティック制御を介した遺伝子ネットワーク機構を解明して論文報告を行った(Plant Cell 2019 in press)。以上、花幹細胞の増殖抑制の時空間性の制御として、転写因子とヒストン修飾酵素との精緻なクロストークによるエピジェネティク制御機構を解明することができた。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。CRABSCLAW (CRC)遺伝子は花発生中期の雌しべ外側領域においてオーキシンのホメオスタシスにかかわるTORNEDO2遺伝子の発現を抑制することで、花幹細胞の増殖抑制に機能していることを報告した(Nature Comm 2017)。さらに、CRCはオーキシン合成酵素YUUCCA (YUC)も直接制御しており、その作用機構の解析を進めている。また、別の転写因子であるSUPERMANは花発生初期において、花幹細胞群を取り囲むように発現している。SUPタンパク質は、ポリコム因子であるFIEと直接結合して、YUC遺伝子発現抑制をおこなっている事を示した(EMBO J. in press)。これらの結果は、時空間特異的に発現する転写因子によって制御されるオーキシンのシグナル系の調節が花幹細胞の増殖制御に重要であることを示している。今後は、温度や日長などの環境因子によってそれぞれの遺伝子発現がどのように影響を受けるのかを解析し、変動環境下においても一定の決まった表現型をもたらす可塑性と頑強性の作用機序の解明も目指す。さらに本研究は花幹細胞の増殖制御にかかわる遺伝子発現の時空間性の解明により、種分化に至る遺伝子発現制御の一端を解き明かすことを目指していく。CRCによるTRN2の制御を介した幹細胞の増殖抑制機構についての論文は、高品質な重要論文をオープンアクセスで掲載する学際的ジャーナルであるNature Communicationsにて発表した。さらに、SUPによるエピジェネティック制御を介した幹細胞の増殖抑制は、分子生物学のトップジャーナルのひとつであるEMBO Journalに受理され、in pressである。さらにKNUとWUSとのエピジェネティックをかいした制御機構にかんしては、論文を投稿中である。(1)花幹細胞の増殖抑制に機能する2つのZinc Fingerタンパク質

KNUとSUPによるPcGのリクルート機構、および転写抑制における時間軸に沿った作用機序の解析をすすめる。KNUおよびSUPの誘導系を用いたターゲット遺伝子の転写量の変化とH3K27me3抑制的マークを含むヒストン修飾、クロマチン構造の時間的変化を比較解析することで、転写抑制の開始とサイレンス状態の維持機構の解析を進める。これまでにKNUはPcGのFERTILIZATION-INDEPENDENT ENDOSPERM (FIE)タンパク質と直接結合しており、SUPはCURLY LEAF(CLF)と直接結合することを示してきた。領域内では、宮川班との共同研究として、Zinc Fingerタンパク質とPcG複合体の立体構造解析を進めることで、PcG複合体のターゲット遺伝子へのリクルート機構の基本原理の理解を進める。(2)花幹細胞の決定因子の直接的な抑制にかかわるKNU遺伝子が温度や日長環境変動によってどのように影響を受けるのかの環境可塑性を解析する。同時に、変動環境下において、分化マーカー遺伝子の発現および表現型も観察することで、増殖と分化のバランスを保ち、花器官の数を一定に保つための環境頑強性の機能解析を進める。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。新聞記事など1.伊藤寿朗、日本経済新聞「花がめしべづくりを開始するためのDNAの折りたたみ構造変化を解明」奈良先端科学技術大学院大学2018年12月12日アウトリーチ活動など1.奈良先端大サイエンス塾花のABCモデルを平易に解説した。2018年10月13日2.奈良先端大オープンキャンパス植物の花の形作りについて。2018年11月11日
検証技術と非標準型体系を用いたモデル検査器コンパイラの進化的発展

非手続き型高水準言語の適用分野として,さまざまな系のモデリングと検証が今後重要性を増すと期待される.研究代表者らはモデル検査機能を通常の計算と同一の枠組で提供するグラフ書換え言語処理系の開発と公開を進めてきたが,コンパイラの進化的発展と信頼性確保が課題であった.本研究では,コンパイラと実行時処理系をつなぐ抽象機械によるグラフ書換え操作の形式化と検証を行うことで,コンパイラの検証に向けた一歩を踏み出した.また,モデルの解析,理解,最適化に役立つグラフ書換え言語のための新たな型体系を,微視的な接続関係に着目した体系とグラフ全体の形状を扱う体系の両面から検討してそれぞれ構築した.階層グラフ書換えに基づくモデリング言語LMNtalは,高水準言語プログラムが直接モデル検査できる処理系をもつことを特徴とする.ソフトウェア検証系として,LMNtal処理系自体の正当性を検証することは重要かつ基本的な要請であるが,グラフ書換え言語プログラムの抽象機械コードへのコンパイルは大きなセマンティックギャップの橋渡し作業であり,信頼性と保守性の改善が強く求められている.本年度は,モデル検査器コンパイラの信頼性と保守性の改善に向けて,以下の研究開発を進めた.1.処理系の単純さと信頼性向上のために前年度提案した,リンクの互換に基づくグラフ書換えを実現する抽象機械について,新たに導入した命令を実行時処理系slimに実装するとともに,抽象機械へのコンパイラの整備を進めた.2.より高い表現力をもつハイパーグラフ書換えに進化させるべく,抽象機械およびコンパイラの拡張を行った.また,多相ラムダ計算の型体系の記述実験を通じて拡張機能の妥当性を確認し必要な改良を行った.3.リンク互換操作を導入した抽象機械におけるグラフ書換え操作の形式化と種々の性質証明を,定理証明支援系Coqを用いて行った.まず,グラフ構造と基本的な書換え命令の動作をCoq上で形式化した.グラフ構造の定義は,書換え操作を厳密に論じることができるように,実装に近い構造を選択した.次に,形式化した定義の上で成り立ついくつかの重要な性質,すなわち(i)形式化した各グラフ書換え命令の形式的仕様,および(ii) LMNtalグラフのwell-formedness保存定理を証明した.実装レベルのデータ構造はLMNtalグラフとみなせない不正な構造も含むので,各命令におけるwell-formednessの保存は,命令列の実行の安全性を論じる上で重要な性質である.この作業を通じて221個の定理を証明し,証明スクリプトは全体で4100行におよんだ.非手続き型高水準言語の適用分野として,さまざまな系のモデリングと検証が今後重要性を増すと期待される.研究代表者らはモデル検査機能を通常の計算と同一の枠組で提供するグラフ書換え言語処理系の開発と公開を進めてきたが,コンパイラの進化的発展と信頼性確保が課題であった.本研究では,コンパイラと実行時処理系をつなぐ抽象機械によるグラフ書換え操作の形式化と検証を行うことで,コンパイラの検証に向けた一歩を踏み出した.また,モデルの解析,理解,最適化に役立つグラフ書換え言語のための新たな型体系を,微視的な接続関係に着目した体系とグラフ全体の形状を扱う体系の両面から検討してそれぞれ構築した.階層グラフ書換えに基づくモデリング言語LMNtalは,高水準言語プログラムが直接モデル検査できる処理系をもつことを特徴とする.そのコンパイラの正当性の保証はモデル検査器の正当性にかかわる重要な技術課題となるが,グラフ書換え言語プログラムの抽象機械コードへのコンパイルは大きなセマンティックギャップの橋渡し作業であり,信頼性と保守性の改善が強く求められていた.そこで,モデル検査器コンパイラの信頼性と保守性の改善に向けて,本年度は,以下の二つの視点から基礎検討を行った.1.これまでの抽象機械は,無方向リンクによって形成されるグラフの書換え作業を,手続き型言語におけるポインタ代入に近いレベルの操作列で扱っており,過去の処理系は修正困難な問題点をかかえていた.そこで,リンクの代入ではなくリンクの互換(exchange)に基づくグラフ書換え作業の実現方法を,LMNtalの意味論との整合性や中間コード生成法などの観点から検討し,膜をもたないLMNtalサブセットに対して新たなコンパイル手法を確立した.2.モデル検査の空間効率や時間効率の改善に型体系が果たすと期待される役割は大きいが,これまで,LMNtalの型体系の提案はあったもののコンパイラとの連携はとられてこなかった.そこで,最近仕様が確立し処理系の稼働も始まっているHyperLMNtal(ハイパーリンクの導入によるLMNtalの拡張)に対する型体系を新たに設計した.この型体系は,実数領域[-1,+1]で表現されるケイパビリティの概念を用いてリンクおよびハイパーリンクの向きを表す.本年度はこの型体系の定式化を行うとともに,いくつかのプログラムに対する型推論などを通じて,その設計の妥当性確認を行った.また今後のコンパイラ進化に備えて,既存のLMNtalコンパイラのコードレビューを行い,本質的な部分の抽出を行った.階層グラフ書換えに基づくモデリング言語LMNtalのコンパイラの進化およびグラフ書換えの記述力の強化を目指し,以下の研究開発を進めた.1. LMNtalの書換え規則は,マッチすべき部分グラフを具体的に指定するか,連結グラフなどあらかじめ定められた一定の性質を満たす部分グラフを包括的に指定することを許していたが,部分グラフの族を利用者が自由に定義することはできなかった.

そこで,グラフの集合を表現するための再帰的な生成文法を設計し,グラフの持つべきパターンによって簡約基を指定できる処理系をGaucheで実装した.実装にあたって,パターンマッチングのメモ化が多くの例題で計算量を改善することを確認した.パターン記述言語の表現力の確認のために,評価文脈を用いたプログラミング言語の操作的意味論や一級継続の意味論をグラフ書換え系として記述し,実行することに成功した.2.グラフ構造を扱う型体系であるShape TypeをLMNtalに導入した.グラフが特定の構造を持っているかどうかの検査(グラフの型検査)および書換え規則がその構造を崩さないかどうかの検査(ルールの型検査)の概念を定め,前者に関してはアルゴリズムを提示し,その停止性と健全性の証明を与えた.グラフやルールの型検査がグラフ書換えを用いた探索に帰着でき,LMNtalプログラムの非決定的な実行を探索に利用できることに着目し,既存のLMNtal処理系を用いて検査を行う手法を実装した.3.ハイパーリンク機能をもつHyperLMNtalの言語仕様の妥当性評価のために,高階単一化機能をもつ高階論理型言語のHyperLMNtalへのエンコーディングを行い動作確認を行った.また,稼働中のLMNtal処理系への諸研究成果の統合を目指し,コンパイラの整備改良を進めて新たにソースコードをGitHubから公開した.プログラミング言語平成25年度の研究実施計画のうち「コード生成器の記述と検証」については、グラフのマッチングと書換えのうちの後者に絞って、個々の抽象機械命令の定式化と性質検証を着実に進め、証明支援系の活用法を含めて多くの知見を得ることができた。また、前年度に設計した高抽象度の抽象機械命令の実装を進めた。一方、抽象機械の命令列の検証をはじめとするより上位の検証は今後の課題となった。もう一つの項目である「静的型体系」については平成24年度に前倒しで研究を進めてハイパーリンクを扱う型体系を構築したが、平成25年度は、例題記述を中心としたハイパーリンク機能の妥当性評価を主に進めてきた。今後のソフトウェア進化の準備としての既存コンパイラの整備,抽象機械語の再検討,型体系の設計などの点で順調に研究が進展した.今後のコンパイラ進化のためには,抽象機械語の形式化と,それに基づく書換え型言語コンパイラの正当性検証の枠組みが必要となるが,それらの研究開発が今後の重要課題となってきた.平成25年度までの研究によって、グラフ書換えに基づくモデル検査器コンパイラの検証作業の規模感がつかめてきた。本萌芽研究の範囲では、コンパイラの各フェーズのうち、グラフ書換え操作に絞っての正当性検証への道筋をつけることを目標とする。一方、コンパイラ全体の進化の観点からは、大学院生の協力を得ながら、高抽象度の抽象機械命令の採用をはじめとする種々の技法によって、信頼性と保守性の改善をさらに推進する。
人工酵素

構造的に安定なモデル系を創出することにより,酵素機能の本質を見究めるとともに,汎用性をもった触媒としての人工酵素の開発を意図している.1.補酵素機能を規範とした高活性触媒の開発-特異的コバルトシッフ塩基錯体を触媒として用い,ジオキシゲナーゼのモデル反応としてのニトロアルカン類への酸素導入,スチレンの酸素酸化によるノーフェニルエタノールの生成と不斉導入,脂肪族ヒドラゾンの酸素酸化による新規有機コバルト錯体の生成反応について成果を得るとともに,触媒活性発現の主要因について有用な知見を得た(西長).2.酵素タンパクの機能評価にもとづく人工発光系の開発-オワンクラゲの発光に関連してセレンテラジンのモデル化合物を用い発光収率に影響する要因について重要な知見を得た.また,ウミホタルルシフェリンの類縁体を用いて活性酸素による化学発光についてせいか得た(後藤).3.人工ホロ酵素系の開発-合成二分子膜のアポ酵素モデルとしての反応場特性を明らかにするとともに,疏水性ビタミンB_<12>を二分子膜内に固定化して人工ホロ酵素を構築した.この人工酵素を用いてメチルマロニルーCoAムターゼ,グルタミン酸ムターゼと同様な触媒反応の実現に成功した(村上).ミセル系集積反応場を用いて金属イオンによるエステル基質及び求核性配位子の活性化能について明らかにした.逆ミセル系によるエステル交換反応についても検討し,エステル合成系についての基礎的知見を得た(太垣).構造的にも機能的にも精度の高いチトクロームP-450モデルとしてチオレート基を軸配位子とするポルフィリン錯体を用い,酸化触媒機能について検討し,顕著な軸配位子効果を明らかにした.また,いくつかのモデル基質を用いて人工P-450系と生体P-450系の比較代謝化学的検討を行い,有用な成果を得た(広部).構造的に安定なモデル系を創出することにより,酵素機能の本質を見究めるとともに,汎用性をもった触媒としての人工酵素の開発を意図している.1.補酵素機能を規範とした高活性触媒の開発-特異的コバルトシッフ塩基錯体を触媒として用い,ジオキシゲナーゼのモデル反応としてのニトロアルカン類への酸素導入,スチレンの酸素酸化によるノーフェニルエタノールの生成と不斉導入,脂肪族ヒドラゾンの酸素酸化による新規有機コバルト錯体の生成反応について成果を得るとともに,触媒活性発現の主要因について有用な知見を得た(西長).2.酵素タンパクの機能評価にもとづく人工発光系の開発-オワンクラゲの発光に関連してセレンテラジンのモデル化合物を用い発光収率に影響する要因について重要な知見を得た.また,ウミホタルルシフェリンの類縁体を用いて活性酸素による化学発光についてせいか得た(後藤).3.人工ホロ酵素系の開発-合成二分子膜のアポ酵素モデルとしての反応場特性を明らかにするとともに,疏水性ビタミンB_<12>を二分子膜内に固定化して人工ホロ酵素を構築した.この人工酵素を用いてメチルマロニルーCoAムターゼ,グルタミン酸ムターゼと同様な触媒反応の実現に成功した(村上).ミセル系集積反応場を用いて金属イオンによるエステル基質及び求核性配位子の活性化能について明らかにした.逆ミセル系によるエステル交換反応についても検討し,エステル合成系についての基礎的知見を得た(太垣).構造的にも機能的にも精度の高いチトクロームP-450モデルとしてチオレート基を軸配位子とするポルフィリン錯体を用い,酸化触媒機能について検討し,顕著な軸配位子効果を明らかにした.また,いくつかのモデル基質を用いて人工P-450系と生体P-450系の比較代謝化学的検討を行い,有用な成果を得た(広部).
学習/研究活動のためのコンテンツ構築とその利用支援に関する認知科学的研究

本研究は、「認知科学」を対象分野として、学習/研究用の学部内データベースを構築し実際協調的な授業に活用して学習者の深い理解を導くことを目的としている。データベースの構築に関しては、学習者自らが学習しながらレベルや興味、関心にしたがってダイナミックに変化させることの出来るようカリキュラムを開発し、実際使用評価した。3年間に亙る実践的な研究の結果、データベースを協調的に構築して行くための基本的なやり方は分かってきた。今後は、これから蓄積されるデータの利用の仕方を支援するための強力な手段が必要になると思われる。データベースの構築の基盤となる、読みの支援方略については、文章を文単位でカード化し2次元配置しながら読み、その履歴によって読みを深めて行く方法の有効範囲が明らかになってきた。今後、この方法を専門書を読むような現実的な読みの支援方法として確立するため、カードの単位の切り方などに新しい展開が必要である。データベースをグループで有効利用するためのノート共有/相互参照支援システムReCoNoteについては、選択科目での希望者のみの利用から必修科目での全員利用まで段階的に3年間に亙って段階的に実践対象をスケールアップしてきた。昨年度の実践ログや学習成果物の分析などから、協調的なカリキュラムによって学習者の活動をうまく構造化することによって、これらの協調的な学習用データベース利用が高い効果を生むことがはっきりした。本研究は、「認知科学」を対象分野として、学習/研究用の学部内データベースの構造を学習者の学習レベルや興味、関心にしたがってダイナミックに変化させながら提示し、学習や知的生産性を向上させることを目的とする。本年度は、データベース構造の読み取り支援を目指した読みの支援に関する基盤研究と、データベースをグループ活動で活用するためのノートシステムの試作と評価を行なった。読みの支援としては、文章を文単位でカード化し2次元配置しながら読み、その履歴を再吟味して読みを深める支援システムのプロトタイプを作成し、その効果について実験を行なった。実験で使用した材料文についてはシステムによる読みの支援効果が確認できた。データベースをグループで有効利用するための基盤研究として、授業配布資料、これまでの受講生が電子会議システム上で交換した意見、受講生のノートなどを相互に参照しながら利用できるノート作成システムReCoNoteを試作し、使用評価をした。ノートやメモなど自分が書いたものを見直す時作成時に利用した資料が参照できると、作成時の文脈を再構成し易く、書かれた内容を発展的に利用できると考えられる。ReCoNoteは、そのような相互参照の履歴を活用する「相互リンク機能」を備えた協調学習支援用ノートシステムとして試作した。実際に大学の授業で使用したデータを分析したところ、相互リンクが積極的に利用されること、及び相互リンクによってグループ活動が活発に行なわれることが確認された。相互リンク機能は、前に書いたノートに戻った時や他人のノートを利用しようとする時、作成時に何を考えていたかを思い出すきっかけになったり、お互いに考えていることを共有するための基盤を提供していたと考えられる。本研究は、「認知科学」を対象分野として、学習/研究用の学部内データベースの構造を、学習者自らが学習しながら学習者自身のレベルや興味、関心にしたがってダイナミックに変化させ、学習や知的生産性を向上させることを目的としている。本年度は、昨年度試作し評価を始めた読みの支援に関する研究と、データベースをグループ活動で活用するためのノートシステムの活用研究との両方において、課題をスケールアップし、実際の授業や研究活動により近い形での応用がどこまで可能かを調べた。読みの支援としては、文章を文単位でカード化し2次元配置しながら読み、その履歴を再吟味して読みを深める支援方法に付いて、実際専門書の1章を2人で相談しながら読み進めるプロセスの記録を4章分記録し、その分析を開始した。データベースをグループで有効利用するために試作したノート作成/相互参照支援システムReCoNoteについては、昨年度よりさらに対象をスケールアップし、受講者60人全員に半期に亙ってReCoNoteを使用させた。その中ではグループ毎に取り組んだ課題を発表し合い、相互吟味し合う取り組みの過程を記録した。

現在その分析に取りかかったところだが、受講生がどのようなノートを作成したか、またノートとノートの間をどのように結び付けて吟味したかを調べた限りですでに、受講生のほぼ全員が他人の作成したノートをくまなく参照して、互いに他人のグループ活動の成果を利用して自ら学んでいた様子が窺われる。本研究は、「認知科学」を対象分野として、学習/研究用の学部内データベースを構築し実際協調的な授業に活用して学習者の深い理解を導くことを目的としている。データベースの構築に関しては、学習者自らが学習しながらレベルや興味、関心にしたがってダイナミックに変化させることの出来るようカリキュラムを開発し、実際使用評価した。3年間に亙る実践的な研究の結果、データベースを協調的に構築して行くための基本的なやり方は分かってきた。今後は、これから蓄積されるデータの利用の仕方を支援するための強力な手段が必要になると思われる。データベース構築の基盤となる、読みの支援方略については、文章を文単位でカード化し、2次元配置しながら読み、その履歴によって読みを深めて行く方法の有効範囲が明らかになってきた。今後、この方法を専門書を読むような現実的な読みの支援方法として確立するため、カードの単位の切り方などに新しい展開が必要である。データベースをグループで有効利用するためのノート共有/相互参照支援システムReCoNoteについては、選択科目での希望者のみの利用から必修科目での全員利用まで段階的に3年間に亙って段階的に実践対象をスケールアップしてきた。昨年度の実践ログや学習成果物の分析などから、協調的なカリキュラムによって学習者の活動をうまく構造化することによって、これらの協調的な学習用データベース利用が高い効果を生むことがはっきりした。
緑膿菌のefflux、invasion、quorum sensingの相互関係

緑膿菌quorum sensing変異株であるPAO1 lasI欠損株、rhlI欠損株の組織侵入性を、比較検討した。また薬剤排出システム変異株であるmexAB-oprM欠損株の組織侵入性の低下にquorum sensing機構が関与しているか否かについて、合成homoserine lactone (HSL)の添加の組織侵入性に及ぼす影響を比較することで検討を行った。lasI欠損株、rhlI欠損株ではWTと比較しmexAB-oprM欠損株ほどではなかったものの組織侵入性が有意に低下していた。またlasI欠損株にC_<12>-HSLを、rhlI欠損株にC_4-HSLを加えると組織侵入性は回復傾向を示し、とくにrhlI欠損株にC_4-HSLを加えた場合は有意な回復を認めた。しかしmexAB-oprM欠損株にC_<12>-HSL、C_4-HSLを加えても組織侵入性の回復傾向は認めなかった。quorum sensing機構は部分的に緑膿菌の組織侵入性に影響を与えるものの、mexAB-oprM欠損株の組織侵入性低下には、別の因子がより強く関与していると考えられた。これらのデータを専門誌に発表した。また、efflux pump inhibitor (EPI)を添加したWTではEPIの濃度依存性に組織侵入性が有意に低下していた。この現象はnalB (MexAB-OprMポンプ高発現株)においても同様に認めた。以上から組織侵入性に関する因子は主にMexAB-OprMポンプより排出され、それをEPIで阻害することで、組織侵入性が低下することが示唆された。これらの結果は、EPIは単に抗菌薬との共存下で抗菌活性を高めるのみならず、さらに緑膿菌の病原性を抑制する作用も有することを示しており、今後の抗緑膿菌製剤の開発上重要な知見であると考えられる。以上のデータを専門誌に投稿中である。緑膿菌の多剤耐性のメカニズムのひとつである薬剤排出システム(effluxシステム)、組織侵入性(invasion)、病原遺伝子の発現の制御機構であるquorum sensingの相互関係について研究を行った。緑膿菌quorum sensing変異株であるPAO1 lasI欠損株、rhlI欠損株の組織侵入性を、MDCK(Madin-Darby canine kidney)細胞モノレイヤーシステムを用いたpenetration assayにて比較検討した。また薬剤排出システム変異株であるmexAB-oprM欠損株の組織侵入性の低下にquorum sensing機構が関与しているか否かについて、合成homoserine lactone(HSL)の添加の組織侵入性に及ぼす影響を比較することで検討を行った。PAO1WTは感染後3時間以内にMDCK細胞モノレイヤーを通過したのに対し、lasI欠損株、rhlI欠損株ではWTと比較しmexAB-oprM欠損株ほどではなかったものの組織侵入性が有意に低下していた。以上からquorum sensing機構は部分的に緑膿菌の組織侵入性に影響を与えるものの、mexAB-oprM欠損株の組織侵入性低下には、別の因子がより強く関与していると考えられた。現在以上のデータを英文原著として専門誌に投稿中である。

緑膿菌の多剤耐性のメカニズムのひとつである薬剤排出ポンプ(efflux pump)、およびそのポンプインヒビター(efflux pump inhibitor ; EPI)と組織侵入性への関連性について研究を行った。緑膿菌の組織侵入性がEPIによって影響を受けるかどうかを、MDCK(Madin-Darby canine kidney)細胞モノレイヤーシステムを用いたpenetration assayにて比較検討した。EPIとしては、MC-207,110を使用した。PAO1WTは感染後3時間以内にMDCK細胞モノレイヤーを通過したのに対し、EPIを添加したWTではEPIの濃度依存性に組織侵入性が有意に低下していた。この現象はnalB(MexAB-OprMポンプ高発現株)においても同様に認めた。しかし、nfxB(MexCD-OprJポンプ高発現株)においては、EPIを添加してもこのような組織侵入性の低下は認めなかった。以上から組織侵入性に関する因子は主にMexAB-OprMポンプより排出され、それをEPIで阻害することで、組織侵入性が低下することが示唆された。これらの結果は、EPIは単に抗菌薬との共存下で抗菌活性を高めるのみならず、さらに緑膿菌の病原性を抑制する作用も有することを示しており、今後の抗緑膿菌製剤の開発上重要な知見であると考えられる。現在以上のデータを英文原著として専門誌に投稿する準備中である。さらに、多剤耐性のメカニズムのひとつである薬剤排出ポンプ(efflux pump)、およびそのポンプインヒビター(efflux pump inhibitor ; EPI)と組織侵入性への関連性について研究を行った。緑膿菌の組織侵入性がEPIによって影響を受けるかどうかを、検討した。その結果、組織侵入性に関する因子は主にMexAB-OprMポンプより排出され、それをEPIで阻害することで、組織侵入性が低下することが示唆された。現在後半のデータを英文原著として専門誌に投稿する準備中である。