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水泳プール浸水前の入浴を用いた温熱刺激は浸水時の動脈壁硬化を抑制する

水温30°Cへの浸水前における入浴時間の違いと入浴水温の違いが浸水時の動脈スティフネスに及ぼす影響について検討した。入浴時間の違い:健康な成人男性を対象とし、入浴なし浸水条件(コントロール条件)、浸水前入浴1分条件(1分条件)、3分条件、5分条件および入浴10分条件の5条件を実施した。陸上安静後、各条件時間の入浴(水温:40°C)を行った。その後、簡易水槽(水温:30°C)を用いて15分間の浸水を行った。測定項目は、心-頸動脈間脈波伝播速度(hcPWV)、心-大腿動脈間PWV(hfPWV)、大腿-足首動脈間PWV(faPWV)、上腕-足首間PWV(baPWV)、心拍数、血圧、直腸温、皮膚温および皮膚血流量とした。5分条件および10分条件における入浴時の皮膚温は、コントロール条件と比較して、有意に高値を示した(P<0.05)。このことから、入浴に伴う温熱刺激が身体に加わっていたものと推測する。浸水時の皮膚温は、10分条件のみコントロール条件と比較して有意な差が観察された(P<0.05)。浸水時の各PWVは、条件間に有意な差は観察されなかった。温熱刺激温度(水温)の違い:入浴なし浸水条件(コントロール条件)、浸水前水温25°C入浴条件(25°C条件)、30°C条件、35°C条件および40°C条件の5条件を実施した。実験プロトコルおよび測定項目は、上述と同様とした。入浴時および浸水時における10分条件の皮膚温は、コントロール条件と比較して有意に高値を示した。両実験において条件間における浸水時のPWVに有意な差が観察されなかったことから、入浴なし浸水条件と同様の変化であり、PWVへの影響は、入浴での温熱刺激よりも浸水に伴う冷刺激が大きい可能性が考えられた。水泳プールの水温は、約30-32°Cに保たれているところが多い。水泳プールへの浸水は、ヒトの身体には急速な寒冷刺激となり、皮膚温低下および皮膚血管収縮を生じさせる。また、浸水に伴う皮膚温低下および皮膚血管収縮は、血圧変化と関連し、一過性の動脈スティフネスの上昇(脈波伝播速度(PWV)の上昇)を引き起こす。先行研究において、下肢温熱刺激後に下肢PWVが有意に低下することが報告されている。入浴は、水泳プール浸水前の身体の洗浄効果および全身への急速な血液循環促進効果がみられることから、水泳プール浸水前の温熱刺激に最適であると考える。これらのことから、水泳プール浸水前の入浴により浸水に伴う血管緊張の抑制効果があるものと推測する。水泳プール浸水前の温熱刺激(入浴)が浸水時の部位別動脈スティフネスに及ぼす影響を検証している。健康な成人男性を対象とした。実験条件は、陸上安静条件、入浴なし浸水条件および水温40°C入浴後浸水条件(入浴時間:5分)とした。浸水の水温は30°Cとし、浸水時間は15分とした。動脈スティフネスを測定する方法として、脈波検査装置を用いて評価した。その結果、水温40°C入浴後浸水条件の心臓ー頚動脈間PWV、心臓ー大腿動脈間PWV、大腿動脈ー足関節動脈間PWVおよび上腕ー足首間PWVは、入浴なし浸水条件と比較して有意な差は観察されなかった。今後、入浴時間の違いおよび入浴水温の違いについて検討を進める。直腸温、皮膚温および皮膚血流は、季節の影響を受けるため、実験時期を揃えたことが影響している。実験計画については、実験機器、対象者、験者の協力など、実験を行う上で問題はない。平成29(2017)年度岡山体育学会研究発表会で口頭発表し、学術的な評価を受けた。

実験プロトコルおよび測定項目は、上述と同様とした。入浴時および浸水時における10分条件の皮膚温は、コントロール条件と比較して有意に高値を示した。浸水時の各PWVは、条件間に有意な差は観察されなかった。両実験において条件間における浸水時のPWVに有意な差が観察されなかったことから、入浴なし浸水条件と同様の変化であり、PWVへの影響は、入浴での温熱刺激よりも浸水に伴う冷刺激が大きい可能性が考えられた。平成29年度の結果から、水泳プール浸水前における温熱刺激時間(入浴時間)の違いが浸水時の動脈スティフネスに及ぼす影響(実験2)および水泳プール浸水前における温熱刺激温度(水温)の違いが浸水時の部位別動脈スティフネスに及ぼす影響(実験3)について実験を行い検討を進めていく。測定方法については、これまで(実験1)と同様の方法で実施する。次年度使用額が生じた理由は、直腸温、皮膚温および皮膚血流が季節の影響を受けるため、実験時期を揃えたことが影響している。使用計画は、実験計画がやや遅れていることによる対象者への謝品費用および実験機器の防水のための消耗品費に使用予定である。学会参加においては、7月にアイルランド(ダブリン)にて開催されるヨーロッパスポーツ科学会議(European College of Sport Science)および9月に開催される第73回日本体力医学会大会(福井県)に参加予定である。
選択的聴取における注意機構に関する心理生理学的研究

聴覚刺激の選択過程における注意の機能について,事象関連脳電位(event-related brain potential, ERP)を指標として検討を行った。特に,非注意刺激の処理過程に注意が及ぼす効果について重点的に調べた。実験2においては,非注意刺激に対して150-300ms潜時帯で出現する陽性波(Pd)が反映する処理過程が,注意痕跡と非注意刺激との比較・照合過程と何らかの関係があるのかという点について,刺激呈示チャンネルの相対的な呈示確率を操作することによって検討した。純音を左右耳に,200-500msの刺激間間隔で無作為な順序で呈示した。チャンネル確率としては,25%,50%,75%の3水準を設けた。被験者には,指定されたいずれかの耳(チャンネル)に注意を向け,時折呈示される周波数のわずかに高い音に対してボタン押し反応をするよう求めた。実験の結果,Pdはチャンネル確率が低いほど増大した。ERP振幅が刺激呈示確率の効果を受けることは,そのERPの発生に何らかの記憶プロセスが関与していることを示している。さらに,確率の低下に従って振幅が増大する方向に確率効果が現れることは,記憶表象と入力刺激との不一致がERPの発生の基盤となっていることも示している。これらの推測と,Pdが処理陰性電位(PN)に連続して出現し得ることを示した先行研究結果を合わぜで考えると,PdはPNに皮映される注意痕跡と非注意刺激との不一致によって生じる電位であることが示された。実験1および実験2の結果から,Pdは注意痕跡と非注意刺激との不一致によって駆動される何らかの制御的処理過程を反映することが推測された。今後は,その処理過程について,より具体的に指摘するための実験が必要である。聴覚刺激の選択過程における注意の機能について,事象関連脳電位(event-related brain potential,ERP)を指標として検討を行った。実験1においては,非注意刺激に対して150-300ms潜時帯で出現する陽性波(Pd)が反映する処理過程が,自動的処理あるいは制御的処理のいずれを反映しているのかについて,刺激を高速(刺激間間隔20-150ms)で呈示することによって検討した。このような事態では,非注意刺激に対して制御的処理を行うための時間的余裕はほとんどないと仮定できる。したがって,もしPdが制御的処理を反映しているのであれば,その振幅は減衰すると予測される。純音を左右耳に,上述の刺激間間隔で無作為な順序で呈示した。さらに,比較のためにPdが出現することが知られている,比較的長い刺激間間隔(200-500ms)で刺激を呈示する条件も設けた。被験者には,指定されたいずれかの耳に注意を向け,時折呈示される弱い音の呈示回数を計数するよう教示した。実験の結果,刺激間間隔が長い場合にはPdが出現したが,短い場合には出現しなかった。このことから,Pdは制御的処理を反映することが示唆された。今後は,Pdに反映される制御的処理が具体的にどのようなものなのかを検討する必要がある。
皮膚における抗炎症作用に着目したダチョウ脂質中の新規機能性分子の解明

我々はこれまで、皮膚保護作用で知られるダチョウ油を作用させたヒト皮膚角化細胞に対して網羅的遺伝子解析を行い、Toll様受容体(TLR) 10の発現誘導作用を見出したほか、発現誘導に関わる分子としてトリグリセリドやその構成脂肪酸を遊離型で作用させることで誘導作用が増強されることを明らかにした。本研究は遊離脂肪酸の皮膚角化細胞におけるTLR2誘導性の炎症応答に対する抑制作用について評価を行った。ヒト皮膚角化細胞HEKaの培養系にTLR10発現増強作用のみられたトリグリセリドならびに脂肪酸を添加し24時間の培養を行った。その後市販TLR2リガンドであるPam2CSK4、Pam3CSK4、FSL-1により炎症応答の誘導を行った。抗炎症作用の評価は、TLR2リガンド添加46時間後の培養上清中に産生されたIL-8をサンドイッチELISA法で測定することにより行った。トリグリセリドでは脂肪酸の種類にかかわらずTLR2リガンド誘導性のIL-8産生を抑制する作用はみられなかった。遊離脂肪酸では3種のリガンド対しても抑制作用が観察されたが、とくにTLR1/TLR2リガンドであるPam3CSK4誘導性の炎症に対して効果が認められ、作用の強さでは一価不飽和脂肪酸であるパルミトレイン酸でもっとも顕著であった。以上のことから遊離型となった脂肪酸の一部がダチョウ油の抗炎症に大きく寄与している可能性が示唆された。また、TLR10誘導に関与する受容体としてPPAR、GPRを対象に受容体アゴニストやアンタゴニストを用いた試験の結果、単独の分子が誘導を担っているのではなく、複数の分子が関与した結果TLR10が誘導されていることを示唆する結果が得られた。市販ダチョウ肉をホモジナイズしてBligh-Dyer法により脂質の抽出を行い、ウシ血清アルブミンならびにシクロデキストリン(CD)で可溶化させた。炎症誘導時の角化細胞遺伝子発現に及ぼす影響を評価するため、ヒト皮膚角化細胞株HaCaTの培養系に可溶化した脂質を添加して培養後、TNF-α刺激により炎症性遺伝子発現の誘導を行い、自然免疫・アレルギー・皮膚の物理的バリアに関係する462遺伝子の発現に及ぼす影響について網羅的解析を行った。HaCaT細胞はTNF-α刺激によってケモカイン類やマトリックスメタロプロテアーゼ類などに顕著な誘導が観察された。しかしながらダチョウ油の添加によって、これらの誘導された遺伝子発現に対する抑制作用は観察されなかったことから、作用機構としてTNF-αの作用に対する直接的な抑制作用はないものと考えられた。一方でTLR10やUnc93 homolog B1(Unc93B1)などTLRのシグナルを調整する作用が報告されている遺伝子に顕著な発現増強が確認された。最も発現誘導作用がみられたTLR10に着目し、遺伝子発現の誘導がタンパク質レベルで影響を及ぼしているかをフローサイトメトリー法で確認したところ、HaCaT細胞の表面においてはTLR10発現レベルが非常に低く、ダチョウ油の機能性を評価することが困難であると判断された。そこでヒト成人正常角化細胞であるHEKa細胞を入手し、検討を行ったところ、十分な発現が確認できた。さらにダチョウ油をHEKa細胞に作用させることで、TLR10発現細胞の割合が有意に増加することが明らかとなった。この作用に関わる脂質成分を明らかにするために、CDで選択的に可溶化させたダチョウ脂質でTLR10発現誘導作用をみたところ、脂肪酸などを幅広く可溶化するγ-CDで可溶化時にBSA可溶化時と同様の顕著な誘導作用が確認された。市販ダチョウ肉からの脂質画分の調製については、研究計画に示したBligh-Dyer法により脂質の抽出を行うことができた。これを可溶化する手段としてウシ血清アルブミンを用いた可溶を行い、目的とする可溶化物を得ることができた。またCDの包接作用を利用した可溶化についても検討を行い、α-CD、メチル化β-CD、γ-CDのいずれにおいても可溶化物が得られることを確認した。HaCaT細胞の炎症性応答に対するの効果の検討については、TNF-αによる刺激下における免疫学的応答ならびに皮膚バリア維持応答に関わる遺伝子の発現について網羅的な解析を行った結果、TLRのシグナル伝達を抑制的に制御する遺伝子の誘導作用を見出すことができた。またTLR4を介した刺激には十分な応答性はみられなかった。この検討においてHaCaT細胞だけではなくヒト成人正常角化細胞(HEKa)細胞を用いた検討も取り入れた。炎症シグナル伝達分子における影響の評価については、遺伝子発現解析の結果よりTLR10の発現誘導作用が見出され、標的候補分子が細胞表層に発現する受容体であったため、フローサイトメトリー法での確認を行った。TLR10はTLR2の作用を制御する作用が報告されているため、グラム陽性菌への炎症性応答の制御という視点から、新たな抗炎症作用の可能性を示唆する成果を得ることができた。マスト細胞との共培養試験も視野に入れて条件検討を進めているが、すでに角化細胞単独培養系において抗炎症作用を示唆する結果が得られつつあるため、本研究の全体の目標としてはおおむね順調に進展していると考えている。研究代表者らはH28年度において抗炎症作用を持つとされるダチョウの脂質機能性に着目し、ヒト皮膚角化細胞における抗炎症作用を明らかにするためにマイクロアレイによる網羅的解析を行い、Toll様受容体(TLR)10の発現増強作用を見出すに至った。

H29年度はその研究成果を受け、ダチョウ脂質中に含まれるTLR10発現増強成分を明らかにするため研究を実施した。ダチョウ脂質中に含まれる主要脂肪酸成分であるオレイン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、パルミトレイン酸を対象に、遊離型の脂肪酸ならびに単一脂肪酸で構成されるトリグリセリドのTLR10発現に及ぼす影響を評価した。ウシ血清アルブミンで各サンプルを可溶化させ、ヒト成人正常皮膚角化細胞(HEKa)の培養系に各サンプルを脂肪酸は0.37 M、トリグリセリドは0.12Mで添加し、TLR10の発現状況ならびに抗炎症作用の発現に関わるTLR1、TLR2、TLR6の発現に及ぼす影響について確認を行った。検討の結果、今回検討を行った脂肪酸、トリグリセリドの全てにおいてTLR10発現量の有意な上昇が確認された。全体の傾向として遊離型の脂肪酸の方が、トリグリセリド型と比較してTLR10誘導能が強いことが明らかとなった。脂肪酸種の比較においては、飽和脂肪酸であるステアリン酸とパルミチン酸、一価不飽和脂肪酸であるパルミトレイン酸であったが、ステアリン酸とパルミチン酸は、TLR10がTLR2を介した抗炎症作用を発揮するうえで競合するTLR1も同時に誘導してしまうことが明らかとなった。結論として、1価不飽和脂肪酸とくにパルミトレインさんの遊離型が多いほど、競合分子を誘導させることなく効率的にTLR10発現が誘導され、皮膚を介した感染性炎症に対して有効と思われるTLR2による炎症性応答を抑制できる可能性が明らかとなった。本研究ではダチョウ脂質成分の抗炎症作用につながる新規機能性の探索を目的としている。昨年度から継続的に実施してきた検討によって、これまで全く知られていなかった脂肪酸やトリグリセリドのTLR10発現増強作用を見出すことに成功した。TLR10はヒトがもつTLRの中で唯一リガンドが明らかとなっていないオーファン受容体である。そのため生体における役割は完全に明らかにされていないが、近年の報告でTLR10がTLR2誘導性の炎症性シグナル応答を抑制する作用が報告され、抑制性受容体としての作用に注目が集まってきている。皮膚における炎症の主要な要因の一つとして、皮膚バリアから侵入した黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)やアクネ菌(Propionibacterium acnes)などの皮膚常在菌の存在が挙げられ、これらの細菌はTLR2を介した免疫応答を引き起こすことが知られている。今回、我々が見出した脂質の機能性は、これらに対し抑制作用をもつことを示している可能性が高い。その点において、新規機能性探索としての進捗はおおむね順調であると判断した。我々はこれまで、皮膚保護作用で知られるダチョウ油を作用させたヒト皮膚角化細胞に対して網羅的遺伝子解析を行い、Toll様受容体(TLR) 10の発現誘導作用を見出したほか、発現誘導に関わる分子としてトリグリセリドやその構成脂肪酸を遊離型で作用させることで誘導作用が増強されることを明らかにした。本研究は遊離脂肪酸の皮膚角化細胞におけるTLR2誘導性の炎症応答に対する抑制作用について評価を行った。ヒト皮膚角化細胞HEKaの培養系にTLR10発現増強作用のみられたトリグリセリドならびに脂肪酸を添加し24時間の培養を行った。その後市販TLR2
超低雑音撮像型蛍光比例計数管の開発

本研究は現在軌道上で観測を続けている「あすか」衛星に搭載された撮像型蛍光比例計数管(GIS)の成果を踏まえた上で、この検出器をドリフトレスタイプとすることにより、バックグラウンドの除去能力と位置分解能の両方を高めることを目的として進めた。第一段階としてまずドリフトレス型のガスセルの製作を行なった。内径は93mm、深さは2025mmとした。これに紫外線用の位置検出型でないフォトチューブを取り付けて非X線のバックグラウンドの除去効率を上げる試験を進めた。信号を処理するために波形デジタイザーを導入し、電子がガスセル中を進む間の全発光量や発光量の時間変化を測定した。これらの情報を用いて、X線の止まる深さを用いたバックグラウンド除去と、発光の時間変化を用いた除去とを行なった。2-3keV以下のエネルギーではX線はすべて入射窓から数mm以内の浅いところで止まるため、発光時間の短いイベント(深いところで止まったもの)除去した。また発光の時間変化をパルスの前半と後半とで比較し、後半の発光が長いものをバックグラウンドとして除去した。これによりドリフトレスSPCで硬X線領域で「あすか」GISと同レベルのバックグラウンド除去ができるだけでなく、3keV以下では一桁ほどバックグラウンドを減らせることが実証された。この実験に引続き、ガスセルと位置検出型フォトチューブを組み合わせ、位置分解能を調べる実験を行なった。0.1mm径のコリメータを用いX線発生装置からX線を入射して測定した。この結果位置分解能は0.3mmとなり、これは「あすか」GISの約0.6mmに比べ2倍ほどの改善となった。こうしてドリフトレス型の蛍光比例計数管は低バックグラウンドと優れた位置分解能を同時に実現する検出器であることが実証された。将来さまざまな方面への応用が期待される。平成5年度は本研究の最初の年であり、次の二つのテーマを軸として研究を進めた。1.波形デジタイザーを用いた波形データ取り込みシステムを構築する。(主に都立大学で担当)2.ドリフトレスSPCのガスセルを実際に製作し基礎データを取得する。(主に東京大学)第1のテーマについては、まず「あすか」に搭載されたGIS検出器のスペアカウンターを用いて信号を作り、それを波形デジタイザー(ソニーテクトロRTD710A)へ入力し、1波形を10ビット×2048チャネルに分解し、デジタル出力をGPIBを通してVMEモジュールへ取り込んで解析するという方法で進めた。これにより従来パルスハイトと立ち上がり時間だけしか波形情報がなかったのに比べて、はるかにきめ細かい解析が行なえるようになった。波形データの転送速度は現在毎秒数波形であるが、これを速くすることを検討中である。第2のテーマに関しては、試作したガスセルが順調に働きつつあり、ほぼ予想通りの性能が得られている。特に一次電子群の縦(電場に平行)方向の広がりが出力に直接影響するため、きめ細かく波形を解析する必要があることがわかった。また波形情報を基にバックグラウンド除去能力をある程度高めることができるということもわかったので、来年度は波形デジタイザーと結合して実験をさらに進める予定である。平成6年度は本研究の2年目にあたり、初年度の成果を踏まえ、次の二つを柱として研究を進めた。1.初年度でほぼ完成した、波形デジタイザーによる解析システムを用いて、ドリフトレスSPCの波形を調べる。(主に都立大学で担当)2.ドリフトレスSPCのガスセルと位置検出型フォトチューブを組み合わせ、位置分解能を測定する。(主に東京大学)

第1のテーマについては、X線イベントの一個一個について波形データを取得し、発光のプロセスや電子群の広がりを調べることと、多数のイベントを集積して、波形と立ち上がり時間の間の相関を元に波高を復元する作業とを並行して進めた。その結果、電子群の電場方向の広がりが6keVではFWHMで約1mmと極めて小さいことがわかり、高率よいバックグラウンド除去の見通しが得られた。また波高の復元によりエネルギー分解能も6keVでFWHM約9%が得られている。一方、位置分解能については、6keVでFWHM0.5mmと従来型に比べて改善が見られない。電子群の広がりは小さくなったものの、紫外線の広がりが位置分解能を決定してしまっていると考えられる。来年度ガスセルの構造に検討を加え、位置分解能の改善も目指したいと計画している。平成7年度は本研究の最終年度にあたり、これまでの成果を踏まえ、次の三つを柱として研究を進めた。1.ドリフトレスSPCをフルに稼働させ、本研究で作られた波形デジタイザーシステムを用いて、X線やバックグラウンドのデータをとりその特性を総合的に解析し、低バックグラウンドへの最善の方策を探る。(主に都立大学で担当)2.位置検出型フォトチューブをたち上げ、その特性を試験しガスセルと組み合わせる。(都立大学で担当)3.ドリフトレスSPCのガスセルを新たに製作し、ガスセルのパラメータによるバックグラウンド特性の変化を調べる。(東京大学、都立大学で担当)波形を見ることでガスセル中での電子の振舞いの理解が大きく進んだ。プリアンプの出力波形を微分すると電子群の刻々の発光の様子や、発光開始・終了がどの程度の時間内におきているかを直接観測することができる。この結果、電場が強い状態でも電子の拡散が理論の予想より数倍大きいらしいことが分かった。こうした波形情報を利用し、エネルギーに応じてX線として許されるガスセルの深さを制限することにより、2keVでのバックグラウンドを1/10に減らすことができた。またより高いエネルギーでも波形を用いることで大幅にバックグラウンドを減らせることが実証できた。これと平衡して位置検出型フォトチューブの試験が進み、新たに作られた薄型のガスセルと組み合わせるところまで来ている。低バックグラウンドで、しかも位置分解能の良いSPCが開発できたと考えている。年度の最後に成果報告書を作成する。
近世期学校の研究ー学習活動の実態分析を通して

両年度の研究活動をとうして得られた知見は以下のとおりである。1.幕府や諸藩の学校の場合、政治を担う、民の上に立つサムライ的人間を養成するという目的に関しては、儒教の学派間の違いはなかった。2.身分の高い武士の教育に関心があり、出席強制もそうした人びとを対象にすることが多かった。3.幕末維新期には、しだいに教育対象を武士階級以外の人びとに拡大していったが、そのいわゆる門戸開放はさまざまな面で制限付きであった。4.公権力が設立した庶民の教育施設ー郷校・教諭所、心学舎などは幕藩社会にふさわしい良民、被治者のための教育をめざすものであり、風俗維持という点から、知育よりもむしろ徳育に重点を置いた。5.明治初年に確認された寺子屋、私塾などのさまざまな教育施設をすべて合わせると何万にもなり、その結果が庶民階級の3分の1ちかい読み書き能力を生み出したと思われる。6.幼児期に「読むこと」よりも「書くこと」が優先し、習字があらゆる教育の基礎教養であった。7.学校では儒教の古典を使用するため、どのような授業でも素読から始めた。書物の種類や学ぶ順序は学派によって異なり、身分や家柄による違いもあった。8.学校がマンモス化すると、個別教授より一斉教授が普通になったが、一方でまた、自学的方法や共同学習の工夫も盛んに行なわれた。近代学校に見られる学習法のほとんどすべての原型を認めることができる。9.学習者に刺激を与え、競争させるために等級制が採用された。等級制をうまく機能させるには、点数評価を下敷きにした試験が効果的であり、さまざまな方法が開発された。10.試験の弊害をいうものはいたが、これを否定し、廃止しようとする意見はなかった。封建社会を支える身分や家柄より、試験で確認できる実力の方がはるかに信頼できたからであろう。幕府当局が取り組んだ庶民教育機関-郷校、教諭所、心学舎という本年度テ-マに関して得られた知見は、以下のとおりである。1.この種の教育機関の育成策は、幕府天領のような庶民への締め付けが比較的緩やかな地域、そしてまた私塾、寺子屋などが早くから発達した、庶民層の教養レベルの高い地域で特色的に見られる。2.サムライ学校に見られる漢学中心の知的教科の教授にはさほど熱心でなく、むしろ道徳教育を重要視し、ひたすら知足安分の分限道徳の注入・鼓吹につとめた。3.上からの要請で始められた教育のため、出席強制を行うことが稀でなく、出入り自由の学習形態とはあまり関係がなかった。4.テキストの使用は極めて珍しく、大ていは教師の口授、すなわち説教形式をとった。5.講釈中心のため、会読、会講、討論、策問など、近世の学校に普通に見られた授業方法はほとんどなかった。6.官選教師が定期的に巡回する、つまり一回かぎりの読み切り講釈が多く、師弟間の結びつきが稀薄であった。7.サムライ学校が整備されていく過程で、逐次その周辺を穴埋めする、いわば封建学校の補完物的な役割を果たすものが多かった。8.幕末最後の時期になると、民間在野の有志者が発起した自生的な学舎も見られるようになるが、幕藩当局の支配から完全に自由なものはなく、またその教育レベルも読み・書き・ソロバンの寺子屋程度のものであり、したがってイデオロギ-的性格はほとんど認められない。9.郷校と呼称されるものの中に、武士、それも下士層を対象にした学舎があるが、多くは庶民の教育機関をも兼ねた。

10.これまで強調されてきた社会教化的な役割だけでなく、読み書き能力の普及という側面も過小評価できない。11.多くは官・公立的な設立、および維持・運営の形態をとったため、維新後、容易に新設の小学校に移行していった。幕藩学校の周辺に位置する民間在野の自生的な教育機関を取る上げるという本年度テ-マに関して得られた知見は、以下のとおりである。1.維新期には寺子屋は1万以上、また私塾は千ちかく普及していた。2.大部分が調査漏れの諸技芸の塾のうち、武芸関係は少なくとも1500以上、医学や裁縫関係がいずれもこれに匹敵し、宗教関係も数百あったから、この種の塾のみで何千という数が見込まれる。3.前年度に見た郷校、教諭所、心学舎、それに若者・娘組などのインフォ-マルな教育活動も含めれば、庶民階級の読み、書き、計算能力の習得に関係した各種の施設はおそらく何万もを数え、その結果が相当程度の識字率につながったと思われる。4.小規模校が多いため、一斉教授よりむしろ個別教授が普通であるが、競争的な集団学習の工夫も意欲的に行なわれ、今日知れらているほぼすべてが出揃った。5.公権力に一定の距離を置いたため、教師各人の人格や識見がそのまま教育活動に反映された。学統、学派の教育観を各々の学校が正確に実現したのも、そのことと無関係ではない。6.諸技芸の塾の場合、なかんずくマン・ツウ・マンの秘事口伝的な授受がみられたが、これは教育的にはともかく、学問や研究の面ではマイナスに機能した。7.学校の設立や維持・運営が生徒主導であることが多く、カリキュラムの作成にもそうした傾向が強い。8.規模の大小を問わず、等級制の導入が遅かれ早かれ見られるが、これは競争主義の採用と関係している。ただ、そのことが点数による成績評価に直結したわけではない。9.医学や蘭学を教える専門性のつよい学校では、近代学校に類似したカリキュラムを導入したが、国学塾や諸技能の塾はこれとあまり関係がない。10.官公立学校に普通に見られた試験制度は一部の有名校を除き、ほとんど普及しなかった。
音声対話データのタグ付テキスト化による研究促進のための基礎的研究

自然な対話を転記して、研究資料として共有するための基本的な方法の確立を目的として、(1)社会言語分野における関心および転記方法を検討し、(2)その問題点を指摘し、(3)それに基づいて、SGML/TEIに準拠する統一的は表記方法を検討し、その改良を提案する。とくに本年は、「発話」の概念とその表現方法について検討を加えた。そのために、英語の対話コーパスを中心としてその実際の方式を検討するとともに、日本のコーパスを試作することによって、概念と方式の妥当性を確認した。対話あるいは会話においては、自然言語と特徴づけるとされている線状性と連結性が破壊されている場合が多い。連結性の破壊は、単独の発話の表現においても重要な問題である(self-repair,interjection,etc)が、対話においては、参考者の複数性によって、線状性(同時にはひとつの発話のみが存在する)が破壊されることになる。通常の転記方法はこれに対してかならずしも十分な表現力を持つものではないので、対話の記録には、この問題に対処するための特殊な表記方式を確立する必要がある。また、そのようにして表記された資料を共有し、活用するためには、表記方法を規格化することが必要になる。この解決をTEIの方式によることとした。しかし、TEIの方式だけでは、具体的は発話をどのようにマークアップするか確定しないので、それをコーパス作成に反映させた。また、コーパスである以上、それぞれの言語要素の言語的性質を表現しておかなければならい。これは、書き言葉のコーパスと共通の方式にしたがう必要があるり、したがって、コーパス一般にかかわるのでここでは省略するが、基本的には、各単語をSGML entityをつけたものとして表現する。あるいはentityへのpointerとなるempty tagによって表現することも可能である。しかしそれだけでなく、日本語の正書法で転記する場合の、(1)「単語」の切れ目を示す正書法上の仕組みが存在しない、(2)自動的な形態素解析はどのような辞書を利用するかによって成果がことなるが、コーパスはむしろそのような自動解析の結果を評価するものであるから完全に自動化してはいけない、(3)そもそも日本語において「単語」とはば何であるかという問題について解決を与えた。実際のコーパスにおいては、さらに、<w>タグとそのattributeを活用して品詞の情報を与える方法を提案、実験した。このようにしては、言語的特徴づけ以外の情報記載もSGMLによることとなり、統一的なSGMLアプリケーションが利用できる対話記録の方式を確立するとともに、TEIコンフォーマットなSGMLアプリケーションとして試作コーパスを作成した。
脂質非対称センシングの分子機構と細胞応答

細胞膜は脂質二重層構造から成るが、その外層と内層で脂質組成が異なっている。その様な「脂質非対称」の状態を適切に維持・管理することは細胞の生存に必須である。本研究では、脂質非対称の状態をモニターするセンサーとして、Rim21を同定し、「細胞が脂質非対称の状態をモニターする仕組み」と言う新規概念を具現化した。また、脂質非対称が乱れた際にRim21の下流で発現が誘導され、脂質非対称の修繕に働くと考えられる新規因子Opt2を発見した。その様な「脂質非対称」の状態を適切に維持・管理することは細胞の生存に必須であり、その部分的な破綻でさえ様々な疾病や生活習慣病を引き起こす。本研究では、脂質非対称の状態をモニターするセンサータンパク質の同定を試み、Rim21が細胞膜上で脂質非対称を感知するセンサーである事を突き止めた。さらに、Rim21がDfg16やRim9といった膜貫通タンパク質とセンサー複合体を形成していることを明らかにした。Dfg16とRim9はセンサーの本体であるRim21を細胞膜へ輸送するのに必要な補助因子であった。私達はこれまでに「細胞が脂質非対称の状態をモニターする仕組み」と言う新規概念を提唱してきたが、本研究によるセンサータンパク質の同定によって、その新規概念が具現化された。また、脂質非対称が乱れた際に、細胞は応答を起こし、それを修繕すると考えられるが、乱れた脂質非対称への細胞応答の俯瞰図は全く見えていなかった。そこで、DNAマイクロアレー解析を行い、脂質非対称が乱れた際に誘導される遺伝子群を網羅的に検出した。その結果、脂質非対称の乱れに応答して糖代謝の変化、エンドサイトーシスの変化などが生じている可能性が浮上した。また、脂質非対称の乱れに応じて誘導される機能未知の膜貫通タンパク質群に注目し、その中でもOpt2というタンパク質が脂質非対称の乱れに対する細胞応答で中核的な働きを担っていることを見出した。その後の解析により、Opt2がゴルジ体と細胞膜を行き来しながら、ホスファチジルエタノールアミンやホスファチジルセリンなどの脂質の内外層間移動を行い、脂質非対称の乱れを修繕する可能性を示唆した。ここまでの研究をまとめ、投稿論文の発表および学会発表を行った。平成23年度は、脂質非対称の乱れを感知すると考えられるRim21, Dfg16, Rim9の膜貫通タンパク質の解析を通して、Rim21が実際にコアセンサーとして働き、Dfg16とRim9が補助的に働く事を明らかにした。また、そのセンサーモチーフとして酸性残基のクラスターを絞り込んだ。また、細胞内層に存在し、負電荷を持つ脂質であるホスファチジルセリンが、脂質非対称の感知に抑制的に働く可能性を示した。この結果は、酸性残基クラスターとホスファチジルセリンの負電荷の反発が、脂質非対称感知を通常は抑制している可能性を示しており、興味深い結果である。また、そのセンサーモチーフを含む領域を蛍光タンパク質GFPに融合し、細胞内で発現させ、局在変化を追跡する系を確立した。一方、脂質非対称が乱れた際に発現が誘導される遺伝子群をマイクロアレー解析で探索し、その中から脂質非対称の乱れの修繕に寄与する可能性がある遺伝子群を選抜した。実際には、機能未知の膜貫通タンパク質を1つ、および転写因子を1つ選抜した。特に膜貫通タンパク質に注目し、解析を続けた。脂質非対称が乱れた株で、この遺伝子を欠損させると、生育が顕著に悪化した事から、この遺伝子が脂質非対称の乱れに対する細胞応答で非常に重要な機能を担っている事が分かった。この遺伝子がコードするタンパク質の局在をGFPを用いて調べたところ、主にゴルジ体と思われる細胞内膜系に局在している事が分かった。また、脂質非対称が乱れた株で、さらにこの遺伝子を欠損させると液胞の極度の断片化が引き起こされた。この事から、このタンパク質は、脂質非対称が乱れた状態で液胞の形態の維持に働く事が示唆された。平成23年度には、脂質非対称のセンサータンパク質およびセンサーモチーフを同定する予定であった。結果として、Rim21がまさにコアセンサーとして機能し、Dfg16とRim9が補助的な因子として働く事を明らかにする事が出来た。またその事により、Rim21により特化した解析が可能となり、Rim21のC末端にある酸性残基のクラスターに注目し、このクラスターが脂質非対称の感知において重要である事を示唆した。したがって、脂質非対称センサーの同定とセンサーモチーフの絞り込みについては、概ね順調に進行していると言える。また、そのセンサーモチーフの挙動を追跡するために、蛍光タンパク質GFPを融合したコンストラクトを作製し、細胞内で発現させる系を確立した。実際に顕微鏡観察を行い、DATAを取得中であり、これも当初の計画に近い形で進行してるため、概ね順調である。センサーモチーフの組換え

タンパク質とリポソームを用いたin vitro実験系については、その準備段階で留まっており、当初の計画からは若干の遅れがある。一方、脂質非対称の乱れに対する細胞応答では、マイクロアレー解析で得られた結果を精査し、脂質非対称の乱れに対する細胞応答において、重要な役割を担う因子をさらに絞り込んだ。実際には、脂質非対称が乱れた株において、さらに欠損させると生育の著しい悪化を招く遺伝子を選抜した。その結果、特に著しい生育悪化をもたらす因子として、機能未知の膜貫通タンパク質と転写因子を選抜できた。さらに、その膜貫通タンパク質の解析を進め、貴重な基礎情報を得た、この点に関しては、当初の計画を上回る成果である。総合すると、概ね当初の計画通りに順調に進んでいると考えられる。平成23年度に得られた結果を受けて、引き続き「脂質非対称センシングの分子機構と細胞応答」を明らかにする。具体的には、センサーモチーフを含む領域の細胞内での挙動を、平成23年度に構築した系を用い、顕微鏡下で追跡し、脂質非対称の状態とセンサーモチーフの挙動との関係を明らかにする。また、大腸菌を用いてセンサーモチーフの組換えタンパク質を作製し、様々な脂質組成のリポソームとの相互作用を解析する。相互作用の検出には、pull-down法やFRET法を用いる予定である。脂質非対称の乱れに対する細胞応答については、平成23年度に絞り込んだ遺伝子をさらに深く解析する。特に、脂質非対称の乱れに対する細胞応答において、重要な役割を担う事が判明した、機能未知の膜貫通タンパク質については、その機能解明を目指す。実際には、脂質非対称の乱れを直接修繕する機能を有するか、すなわち脂質の内外層間移動(フリップ・フロップ)を担う新規のタンパク質であるかどうかも検討していく予定である。平成23年度と同様に、物品費、旅費、その他の経費に使用する予定である。また、英文での論文発表を予定しており、英文校閲費として、人件費・謝金を使用する予定である。特に物品費は、多額の消耗品が必要になる事から、平成23年度同様に比率が多くなる予定である。旅費は、学会発表のための費用として使用する予定である。収支状況報告書の次年度使用額については、平成23年度に実施した物品費の支払に使用する。
消化管悪性リンパ腫における遺伝子異常と臨床病理学的因子に関する研究

【目的】消化管濾胞性リンパ腫における遺伝子学的異常の有無を検索し,臨床病理学的因子との関連を明らかにする。【方法と結果】消化管濾胞性リンパ腫48例を対象としてt(14;18)(q32;q21)/IGH-BCL2の有無をfluorescence in situ hybridization (FISH)法で検索した結果,39例(81%)でt(14;18)転座が検出された。転座陽性群は陰性群よりも,消化管の複数領域浸潤(69%vs.0%),ポリポーシス成分(72%vs.22%),組織grade 1-2(92%vs.56%)例の頻度が高く,寛解導入例は低頻度であった(56%vs.100%)。さらに,転座陽性群は進行・再燃が多く(22%vs.0%),無イベント生存率不良の傾向がみられた(P=0.09)。一方,t(14;18)陰性の9例中3例で他の遺伝子異常(BCL6転座,トリソミー3,トリソミー18)が検出された。【考察】濾胞性リンパ腫におけるt(14;18)転座の頻度は発生臓器によって異なる。消化管濾胞性リンパ腫における研究は少なく,今回多数例の解析で80%にt(14;18)転座を認めることを明らかにした。本転座の臨床的意義について一定の見解はないが,本研究で転座陽性例が臨床経過不良である可能性が示唆されたことは新たな知見である。さらにt(14;18)転座陰性例においてBCL6転座やトリソミー3,18がみられることも確認した。今後は腸管MALTリンパ腫やDLBCL(diffuse large B-cell lymphoma)における遺伝子異常の検索を計画しており,消化管リンパ腫の病態解明をさらに進めたい。【研究の目的】消化管悪性リンパ腫における遺伝子学的異常の有無をfluorescence in situ hybridization(FISH)により検索し、免疫組織化学染色および臨床病理学的因子との関連を組織型別に検討する。【方法と結果】本年度は、新たに診断された症例を主体として、消化管悪性リンパ腫49例(濾胞性リンパ腫38例、MALTリンパ腫ll例)における染色体転座およびコピー数の異常の有無をFISH法で検索した。事前に免疫染色がなされていない症例に対しては、CD10およびBCL2蛋白の免疫染色を行い、リンパ腫の組織型を確認した。FISHの結果、濾胞性リンパ腫では38例中29例(76%)にt(14;18)(q32;q21)/IGH-BCL2が検出された。MALTリンパ腫では、11例中3例(27%)にt(11;18)(q21;q21)/API12-MALT1を認め、5例(45%)にMALT1遺伝子の過剰コピー(完全または部分的トリソミー18が示唆)が検出された。【考察および次年度の計画】FISH法による濾胞性リンパ腫におけるt(14;18)(q32;q21)/IGH-BCL2の頻度は、リンパ節に発生する例では約90%と報告されている。今回の消化管濾胞性リンパ腫における頻度(76%)は、リンパ節発生例より低く、臓器特異性の可能性が考えられる。今後は、さらに症例数を増やして、消化管の臓器別、臨床病期、治療反応性と予後などの臨床病理学的特徴との関連を検討する。

一方、MALTリンパ腫におけるt(11;18)(q21;q21)API2-MALT1およびMALT1過剰コピーの頻度(27%および45%)は既報と同様であるが、症例数が少ないので、今後さらに検討を重ね、報告の少ない腸管例における頻度と臨床像との関連について解析したい。以上の結果の一部は、平成21年5月の第95回日本消化器病学会総会(札幌)で発表する予定である。【研究の目的】消化管悪性リンパ腫における遺伝子学的異常の有無をfluorescence in situ hybridization(FISH)により検索し,臨床病理学的因子との関連を検討する。【方法と結果】新たに診断された症例を追加して,消化管濾胞性リンパ腫45例におけるt(14 ; 18)(q32 ; q21)/IGH-BCL2の有無をFISH法で検索した。FISHの結果、45例中36例(80%)にt(14 ; 18)転座が検出された。転座陽性群は,陰性群と比べて,複数臓器浸潤(67% vs. 0%), MLP(multiple lymphomatous polyposis)成分(67% vs. 22%),組織grade 1-2(92% vs. 56%)の例が多く,CR(complete remission)導入例が少なかった(56% vs. 100%)。さらに転座陽性群は進行・再燃が多く(22% vs. 0%), event-free survival不良の傾向がみられた(P=0.09)【考察および次年度の計画】濾胞性リンパ腫におけるt(14 ; 18)転座の頻度は発生臓器によって異なり,リンパ節に発生する例では60-90%,皮膚では0-40%,甲状腺では約50%と報告されている。消化管濾胞性リンパ腫における報告は少なく,今回多数例で80%にt(14 ; 18)転座を認めることを明らかにした。また,本転座と治療効果・予後との関連は一定しておらず,本研究で転座陽性例が予後不良の可能性が示唆されたことは興味深い。今後は,t(14 ; 18)転座陰性濾胞性リンパ腫におけるBCL6転座やトリソミー3, 18の検索,腸管MALTリンパ腫やDLBCL(diffuse large B-cell lymphoma)におけるt(11 ; 18)/API2-MALT1やトリソミー3, 18の検索を行う予定である。【研究の目的】消化管濾胞性リンパ腫における遺伝子学的異常の有無をfluorescence in situ hybridization (FISH)により検索し,臨床病理学的因子との関連を明らかにする。【方法と結果】消化管濾胞性リンパ腫48例を対象としてt(14;18)(q32;q21)/IGH-BCL2の有無をFISH法で検索した結果,48例中39例(81%)でt(14;18)転座が検出された。転座陽性群では,陰性群よりも,消化管の複数領域浸潤(69%vs.0%),ポリポーシス成分(72%vs.22%),組織grade 1-2(92%vs.56%)例の頻度が高く,寛解導入例は低頻度であった(56%VS.100%)。さらに,転座陽性群は進行・再燃が多く(22%vs.0%),無イベント生存率不良の傾向がみられた(P=0.09)。一方,t(14;18)陰性の9例中3例で遺伝子異常(BCL6転座,トリソミー3,トリソミー18)が検出された。【考察】濾胞性リンパ腫におけるt(14;18)転座の頻度は発生臓器によって異なり,リンパ節に発生する例では60-90%,皮膚では0-40%,甲状腺では約50%と報告されている。消化管濾胞性リンパ腫における研究は少なく,今回多数例で80%にt(14;18)転座を認めることを明らかにした。
キネシンとダイニンを用いた分子ナノソーティングシステムの開発

モータタンパク質であるキネシンとダイニンの微小管上での運動極性を利用して、微小流体デバイス内でナノスケールの対象分子などを大量・並列に操作し、分離することのできるナノアクチュエータの創出を目指した。微小管の極性配置技術を確立し、二種類のモータタンパク質が極性に従って効率よく運動する系を微小流体デバイス内で構築した。本研究の全体構想は、生体内物質輸送を担っているモータタンパク質の駆動系をマイクロ・ナノデバイス内で再構築することによって、キネシンとダイニンの運動によりナノスケールの対象分子などを大量・並列に操作できるナノアクチュエータを創製することである。平成19年度は、以下の二点について研究を実施した。(1)キネシンとダイニンによるビーズ搬送系の確立従来のキネシンによるビーズの搬送では、Poly-L-Lysineで固定した微小管上において80%以上の駆動率を実現してきた。本研究で新たに導入したダイニンについても、バッファ条件、ダイニンとビーズの混合比率などを最適化することで80%程度の駆動率を実現した。さらに、キネシンとダイニンを付加した直径320nmおよび500nmのビーズを同時に微小管上で駆動することを可能にした。モータタンパク質を大過剰にビーズに付加することで、搬送効率を上昇させると共に、搬送距離についても生物物理学分野で検討されている1分子による搬送よりも23倍程度増大させることができた。(2)微小流体デバイスの製作と利用マイクロ流路内においてビーズのソーティングをおこなうためのデバイス開発をおこなった。倒立型蛍光顕微鏡下で微小管とビーズの観察をおこなうため、流路の底面にはカバーガラス(24x60 mm)、上面にはPDMSを用いた。ここで、PDMSは厚膜レジストSU-8を用いたモールディングにより製作し、ガラスに接着した。このマイクロ流路内に、既に確立した微小管の配向技術(基盤(B)17310082)を用いて微小管を配置し、キネシンとダイニンを付加したビーズの駆動方向の解析をおこなった。この結果、それぞれのモータタンパク質によって独立にビーズが搬送されていることがわかり、今後分子搬送とソーティングへの展開を図る。平成19年度において、キネシンとダイニンを付加したビーズの同時搬送と微小流体デバイスめ製作をおこなった。本年度は、それらの要素技術を用いて分子ソーテイングを実現するため、以下の二項目について研究を実施した。1.目的分子結合方法の検討本項の目的は、アビジンービオチン結合などの分子特異的な結合を用いて、ビーズ表面に目的分子を固定する技術を開発することである。目的分子として、ビオチン(biotin-4-fluorescein)とIgG(Rabbit anti-mouse IgG AlexaFluor 568)のビーズへの付加を確認することができた。特に、目的分子の濃度によってキネシンおよびダイニンの活性が変化することが分かった。2.分子ソーティングの実現マイクロ流路内に配向した微小管上で、分子ソーティング技術の検討をおこなうことを目指した。微小管の配向、各ビーズの搬送を確認することができた。ただ、ビオチンやIgGを付加したビーズを大量かつ同時に搬送、ソーティングには至らなかった。今後、定量的に目的分子の付着量を評価し、ビーズの同時駆動を実現させたい。
癌遺伝子の転写と複製の調節

SV40の転写調節領域はDNA複製開始点(ori)を含み、T抗原遺伝子の上流約300-bpの範囲にあり、眞核生物のそれのプロトタイプと言えるものである。調節領域にある各種の信号(特定の塩基配列)に細胞蛋白やウイルス蛋白がくっついて、それらの相互作用で遺伝子と複製が調節されるとされている。研究目的はポリオーマウイルス群,アデノウイルス,動物細胞などで調節にかゝわる信号と蛋白を同定し、癌遺伝子の転写と複製のしくみを明らかにする事であり、その流れにそって研究全体は進められている。成果のうち注目すべきものは「BKウイルス,エンハンサーの実体」と「細胞DNA複製におけるmyc遺伝子産物の関与である。一般にエンハンサー活性と信号の方向は無関係であるとされているのであるが、BKの場合、特定の信号の数と方向がウイルス癌遺伝子発現を決める因子である事がわかった。また、myc遺伝子産物が細胞のoriにくっつく事がわかり、その性質を利用して、マウスとヒト細胞からoriを含むDNA断片がクローン化された。これらの注目すべき成果は、研究開始前には予想されなかったものであり、それぞれ新しい仮説を立て、解析をする必要があろう。myc遺伝子産物で制御されるoriを含むプラスミドが得られたことは、今後様々の利用が予想され、成果が期待される。
計算問題の並列化可能性と並列化不能性

本研究では、最適化問題の並列近似可能性に焦点を当てた。大まかに言うと、二つの問題を考えた。最初の問題は最短超文字列問題(shortest superstring problem)である。この問題はデータ圧縮とDNAの研究に応用性があるため、今まで盛んに研究されてきた。特に、この問題に対する近似アルゴリズムの研究は最近非常に盛んである。本研究の前に、Rytterらはこの問題のNC近似アルゴリズム(圧縮率=1/(4+ε))とRNC近似アルゴリズム(近似率=2+5/6、圧縮率=1/2)を提案した。本研究では、Rytterらの結果を改善できた。具体的には、この問題のNCアルゴリズム(圧縮率=1/(3+ε))とRNC近似アルゴリズム(近似率=2+50/63、圧縮率=38/63)を設計できた。次に考えた問題はグラフを(できるだけ少ない)森に分割する問題である。この問題はVLSIに応用があるが、NP困難である。そこで、本研究ではこの問題の並列近似アルゴリズムを設計しようとした。まず、平面グラフを三つの森に分割する最適のNCアルゴリズムを設計し、このアルゴリズムを利用して平面グラフ上で定義される様々なNP困難な最適化問題の並列近似アルゴリズム(近似率=3)を設計した。次に平面グラフの拡張となる疎なグラフに着目した。この拡張は問題を難しくした。疎なグラフを森に分割する一般的なNCアルゴリズムを設計できなかったが、どのような条件の下でNCアルゴリズムがあるかを明らかにした。この条件を利用して、平面グラフの特別な拡張であるK_<3,3>-freeグラフやK_5-freeグラフを森に分割するNCアルゴリズムを設計できた。
ヒト血液凝固第XIII因子の生合成と放出の機構の分子、細胞及び個体レベルでの解析

分子レベルでは,様々なポリペプチド鎖長のXIIIBタンパク質を作製し,同種二量体形成,XIIIAとの異種四量体形成に関わる領域が,それぞれ第4と第9,第1寿司ドメインであることを発見した。この複合体形成によりXIIIAが安定化されることをprotease抵抗性試験で示し,XIIIBがfibrin crosslinkingを促進する効果を持つことを新たに見出した。また,XIIIBタンパク質の4つの表現型の相違が遺伝子型の違いに基づくという分子機序を解明した。細胞レベルでは,平成1114年度の研究でXIIIAがフィラメント様の構造及び核内への局在を示すことを初めて観察したので,Yeast Two-Hybrid法でのXIIIAと相互作用するタンパク質を検索し,80を超える侯補タンパク質を見い出した。actin, trimereic G protein β-subunit(Gβ2)などについては,in vitrotranscription/translation系を用いた免疫沈降実験と共焦点レーザー顕微鏡による共局在の観察から,XIIIAとの相互作用を確認した。また,培養培地に低分子アミンを添加して核内タンパク質にアミン分子が取り込まれることを見いだし,分離した核を用いてこれがtransglutaminase反応によることを実証した。Gβ2については,細胞の脂質ラフトでのXIIIAとの共局在を確認したが,これは細胞質で生合成されたXIIIAが形質膜外に輸送されることを意味するので,放出機構の存在を初めて確認した画期的な発見である。個体レベルでは,XIII因子両サブユニット欠損マウスの作製に成功し,XIIIA及びXIIIBが異なる組織・細胞で産生されることを確認し,雄XIIIA欠損マウスは出血に起因した心筋障害を引き起こして生存率の低下を示すことを新たに見出した。また,6例のXIII因子欠損症疑いの症例を解析して3例にXIII inhibitorの存在を認めたので,後天性XIII因子欠損症に注意すべきことを強調した。XIIIA KOは、オス、メス共に野生型とほぼ同様の成長を示すが、時間の経過上共に、オスのホモ接合体の生存率が低下した。オスのホモ接合体は、6ヶ月後までに約40%、8ヶ月後には約50%が死亡しており、その主因は胸腔内あるいは腹腔内出血で、特に最初に死亡した3匹には巨大な心嚢血腫が見つかった。死亡したマウスの形態学的検索により、心筋組織間にび漫性の繊維化が例外なく認められたので、生存中のマウスをsacrificeして心臓の病理学的検索を実施したところ、XIIIA KOオスのホモ接合体は外見上正常ではあっても、微少出血、ヘモジデリン沈着、繊維化の箇所が散在性に多数認められた。KOマウスオス、メス×野生型オス、メスの4種類の交配を行なうと、XIIIA KO同士では野生型同士の交配に比べて出産数が少なく、自然流産を頻回に起こす妊娠メスマウスがみられた。半数のメスマウスは妊娠期に膣からの出血過剰で死に至った。これに対し、KOオスと野生型メスの交配では野生型同士と比べても出産数に有意な差は認められなかった。妊娠期に出血過剰で死亡したXIIIA KO同士で交配のメスマウスの開腹を行なうと、血液で充満した子宮並びに貧血を呈した肝臓が認められた。他の臓器には異常がなく、子宮以外の箇所での出血も認められなかった。病理学的解析の結果、子宮内胎児死亡、並びにこの胎児の胎盤でのSpongiotrophic Zoneの発育不全が示唆された。連続薄切切片では、胎盤絨毛部位での明らかな出血性病変が認められた。1.細胞内XIIIAと相互作用するタンパク質の検索(1)Yeast Two-Hybrid法によるヒト