hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
心筋細胞の分化制御機構に関する分子生物学的研究

心筋細胞においては、その分化制御機構について不明な点が多く残されている。そこで心筋細胞の分化制御機構を明らかにするためには、新しい分化制御因子の検索が必要であると思われる。これまで、我々は分化制御機構の中でのカルシウム結合蛋白質の関与を検索してきたが、その中でもS100蛋白質ファミリーの分化調節への関与が強く示唆されている。最近、我々が心筋より精製し、cDNAクローニングに成功したS100Cは、培養細胞においてG0期に発現量が著しく増加し、G1期に移行するに伴いその発現量が著減することから、S100CがG0期に発現量が増加する唯一のS100蛋白質であることが明らかになった。これらの成果より、S100Cが細胞分化に関与することが強く示唆され、特に心筋での発現量が多いことより、心筋細胞の分化に関与していることが考えられる。そこで、心筋細胞の分化制御機構におけるS100Cの役割を明らかにするために、ヒトおよびラットS100CのcDNAクローニングを試みた。さらに、胎児、新生児および成体ラットの心筋におけるS100Cの発現とその変化について検討した。その結果、S100Cの発現量が経時的に変化することが明らかとなった。さらに、S100C以外にもラット心筋の胎生期から新生児期、成体への過程で発現が大きく変化する遺伝子群が存在することを見出した。また、これら遺伝子群の発現変化は大きく三つのパターンに分類できることが明らかとなった。すなわち、胎児期に多く発現しその後減少してゆく群、新生児期に発現が増加する群、成体への発達に伴い発現が漸増してゆく遺伝子群である。今後、これら遺伝子群の心筋細胞の分化機構における役割を解析する。
代替炭素源に基づいたグリオーマ幹細胞の分類及び代謝柔軟性を規定する分子の同定

これまでの研究結果からグリオーマ幹細胞が乳酸をグルコースの代替炭素源として利用できることがわかっていたが、乳酸がどのような代謝経路でレスキュー効果を付与するのか、というメカニズムはわかっていなかった。過去の文献においては、乳酸はピルビン酸に変換された後TCA回路に入ってバイオマスとして利用され、電子伝達系経由でATP合成に利用されるという報告されている。しかしながら、酸素消費量やATP産生について詳細に解析した結果、少なくとも慢性期において、乳酸は酸化的リン酸化によりATP合成に利用されているというよりは、糖新生経路経由でペントースリン酸経路の酸化的経路の上流反応により産生されるNADPHの合成に利用されている、ということを示唆する知見が得られた。さらにグルタチオンの濃度を測定したところ、乳酸投与群においてはコントロール群よりも有意にグルタチオンが上昇していることがわかった。H2O2を投与して死細胞比率を比較しても、乳酸投与群ではコントロール群よりも死細胞比率が低いことが示された。これらの結果から、グリオーマ幹細胞がグルコース飢餓環境下において乳酸を糖新生経路経由でNADPH産生に利用し、さらにグルタチオン合成を促進することで酸化ストレス抵抗性を獲得している可能性が示唆された。申請者はこのNADPHが脂質合成に利用されているのではないかと考えており、今後はメタボローム解析を追加して仮説の検証を行う。グルコース飢餓環境をin vivoで再現する目的で、マウス脳腫瘍移植モデルを用いてケトン食による治療実験を試みた。しかしながらケトン食治療群のマウスの血中グルコース濃度はコントロール群と有意差はなく、in vivoでの再現は困難と考えられたため、代替方策としてex-vivoでの追加実験を予定している。今後も研究を継続し、脂質合成の結果と合わせ報告する予定である。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。グルコース、グルタミンをそれぞれ枯渇させた培地を用いてin vitroで基質飢餓環境を再現し、異なる代謝形質をもつ2種類のグリオーマ幹細胞を用いてスフェア形成アッセイを行い、さらに様々な異なる基質を加えることによってスフェアの増大抑制が解除されるかを検証した。その結果、GSC OXPHOSにおいてはグルコース飢餓環境に対してlactateを加えた際に濃度依存的にスフェアの増大抑制が解除されることが判明した。さらに、グルコース飢餓環境におけるGSC GLY、GSC OXPHOSの酸素消費量を測定し、そこにlactateを注入して酸素消費量の変動を確認すると、GSC OXPHOSにおいてはlactateを投与直後から酸素消費量が経時的に有意に上昇することが確認された。このことからGSC OXPHOSはlactateをTCA回路の基質として用いている可能性が示唆された。続いてMCTの発現をウェスタンブロットで確認したところ、MCT2はGSC OXPHOSで優位、MCT4はGSC GLYで優位に発現していることがわかった。さらに、グルコース飢餓環境で24時間培養してそれらの発現を確認すると、GSC OXPHOSにおいてのみMCT2の発現が上昇していることがわかった。また、GSC GLYではLDHA優位、GSC OXPHOSではLDHB優位に発現が上昇していることが確認された。これらの結果からGSC OXPHOSはグルコース飢餓環境においてlactateをMCT2によって細胞内に取り込み、pyruvateに変換してTCA回路の基質と利用できる能力が相対的に高いこと、また、グルコース飢餓環境におかれるとMCT2の発現を上昇させることができ、代替基質であるlactateをより多く取り込むことができるという「代謝柔軟性」を持ち合わせていることが示唆された。当初はシングルセルクローニングで樹立した各クローンに対してグルコース、グルタミン、脂肪酸代謝の阻害剤を用いて依存炭素源による仕分けを行うという予定であったが、阻害剤を用いた細胞外フラックスアナライザーによる解析がうまく機能しなかったため計画を変更せざるを得なかった。しかし筆頭研究者はこの問題に柔軟に対応し、基質枯渇培地に対して各種代替炭素源をレスキューするというスフェア形成アッセイによるスクリーニング方法へと速やかに方針を転換し、結果的にはGSC OXPHOSがグルコース枯渇培地においてlactateを代替炭素源として用いることができることを発見した。さらにシーホースフラックスアナライザーを用いた解析ではlactateがTCA回路の基質として用いられていることを示唆する知見が得られ、qPCRやWestern blottingの結果からMCT2がlactateの取り込みに大きく関わっている可能性が示唆された。今後はメタボローム解析やMCTの機能阻害実験などが予定されており、GSC OXPHOSの代替炭素源利用能の分子メカニズムの解明につながることが十分に期待できる。

H2O2を投与して死細胞比率を比較しても、乳酸投与群ではコントロール群よりも死細胞比率が低いことが示された。これらの結果から、グリオーマ幹細胞がグルコース飢餓環境下において乳酸を糖新生経路経由でNADPH産生に利用し、さらにグルタチオン合成を促進することで酸化ストレス抵抗性を獲得している可能性が示唆された。申請者はこのNADPHが脂質合成に利用されているのではないかと考えており、今後はメタボローム解析を追加して仮説の検証を行う。グルコース飢餓環境をin vivoで再現する目的で、マウス脳腫瘍移植モデルを用いてケトン食による治療実験を試みた。しかしながらケトン食治療群のマウスの血中グルコース濃度はコントロール群と有意差はなく、in vivoでの再現は困難と考えられたため、代替方策としてex-vivoでの追加実験を予定している。今後も研究を継続し、脂質合成の結果と合わせ報告する予定である。今後はMCT2, MCT4の機能阻害実験、過剰発現実験を行い、in vitroとin vivoにおける表現型の解析を進め、それらの分子がGSCの代謝表現型を担保する分子であるかどうか検証を行う。また、GSC GLY, GSC OXPHOSそれぞれを低グルコース、低グルタミン環境でそれぞれ培養し、その代謝産物を通常の培地で培養したものとメタボローム解析を用いて比較する。さらに、13Cでラベルしたlactatel, glucose, glutamineなどを用いてフラックス解析を行い、代替炭素源が辿る経路を明らかにしていく。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
ピア教授法を取り入れたコンピュータ認知行動療法の臨床的経済的効果の検証

うつ状態(病)の勤労者に対して7週の完全自習eラーニングによる抗うつ効果を無作為統制試験で検証した。加えて、“習ったことを誰かに話す"ペアワークの併用で学びが深まり、自習効果の増強が得られるかも検討された。結果、単独学習群では何もしない待機群に比べて中大の有意な効果量(p=0.003)(偏差値で6.5相当の改善)が得られたが、ペアワーク群では待機群と変わらなかった(そのため経済効果解析の意義はないと結論づけられた)。ペアワークには賛否両論だったが、開始時に不安の強い人に限ってはペアワークを重ねるほど抗うつ効果が増強する有意傾向が示された。近年、抑うつに対する認知行動療法(CBT)のエビデンスが集積されてきている一方で、治療者不足や費用面の問題から諸外国では、インターネットを利用した自助型認知行動療法であるICBT(Internet Cognitive Behavioural Therapy)が注目され、英国では既に医療制度にも組み込まれている。筆者らのメタ解析(2013)では、ICBTの利用効果は短期では有意な効果が認められるが、効果の長期持続や機能回復においては有意差は認められず、脱落も高いなど課題が示された。そこで平成26年度10月から12月にかけて、都内職場のメンタルヘルスサービス(EAP)クライアント企業社員に公募し、うつ状態を呈する180人の成人を対象として、ピア教授型強化学習(学んだ内容を家族や親しい他人に話すと理解が深まる学習法)を活用したICBTの臨床効果の増強を明らかにし、脱落率の高さなどの既存のICBTの問題点を克服できるかを検証した。また、ITを使った精神及び生体反応評価技術の尺度妥当性の検証、CCBTの医療経済効果の検証も合わせて行った具体的には平成26年10月に公募を行い、同年11月から12月まで7週にわたりICBT単独群60名、強化学習付加ICBT群60名、待機群60名に対しての無作為統制試験が行われた。その結果、不安や社会機能の改善は認められなかったが、抑うつ尺度であるBDI-2においてはICBT単独で有意な抑うつ減少効果が認められた。教授型強化学習では待機群と変わらない結果となった。自律神経不均衡度指数と抑うつ、不安はどちらも有意な相関は認めず、また一度許可を得ていた音声感情分析は使用不許可となり本研究には含まれなかった。経済的効果は現在解析中である。2014年度に行った無作為統制試験を行った結果、CCBT単独施行群ではベースラインにおいてBDI-2で中等度の抑うつを正常と異常の境界領域まで軽減させた一方で、CCBTに10分のペアワークを付加した群(ペアワーク群)ではCCBT単独群で得られた抗うつ効果が相殺されることが明らかになった。また、不安STAI、機能SF-12については、すべて有意差が認められなかった。つまり適切なガイダンスのない安易な相互扶助はむしろCCBTで得られるべき効果を減少させるリスクがあることが示唆された。しかし、その後、より詳細に解析を進めていく中で、中間段階(4週時点)での不安はペアワークにおいてのみ有意傾向で軽減が認められ、また7週後における機能においては、SF-12総得点としては有意な所見は得られていなかったが、「身体的側面」および、「精神的側面」に分けて分析した結果、両者それぞれにおいてペアワークを付加したCCBT群のみにおいて有意な改善が認められていた。また、ベースラインにおける高不安群においては、ペアワークの回数が多いほど得られる抗うつ効果が高いことが有意傾向を持って示された。完遂者の中から無作為に選ばれた人に対し、満足度等を評価した。調査協力に関する電子メールを送付し、協力する意思を示した28人を対象に行われた。日本語版利用者満足度調査票(CSQ8-J:Client Satisfaction Questionnaire)を用いた結果、総じて高い満足度が得られていたが、自由回答では、「フィードバックがないため物足りない」という声が複数寄せられたため、CCBTへの付加サービスの検討が示唆された。現在、主要解析、二次的解析、追加的調査もほぼ終了し、論文投稿の作業中である。主要評価項目において期待した結果が得られなかったために、論文投稿に際して、二次的解析に関してその合理的な説明のために構造方程式モデリング(SEM)が必要と判断されたため、現在、追加解析中である。研究結果は国内外の研究雑誌に投稿し、社会に発信していく。既に本研究結果は、2014年の日本うつ病学会での発表に加えて、2015年は認知行動療法研究会(3月12日)、慶應義塾大学精神神経科教室報告会(9月12日)、慶應義塾大学信濃町キャンパス公開講座(10月10日)において発表された。また、2016年は日本産業衛生学会全国協議会における教育講演「受動から能動のメンタルヘルスへ: e-learningを用いた自習型認知行動療法(CBT)の現状と産業応用」で発表される予定である。経済損失が大きいにも関わらず、病気ではないとして精神医療の対象外とされてきた軽症うつを呈する勤労者に対して、軽症には効果の期待されない薬物療法ではなく精神療法的介入が求められている。特に、経済性に優れエビデンスも有する自助型認知行動療法に諸外国では期待が集まっている。しかし、脱落率の高さや社会機能面における改善の欠如が課題とされている。

本研究では、7週にわたる完全自習型eラーニングによる抗うつ効果について無作為統制試験を通じて、特に“習ったことを誰かに話す"ピア教授型ペアワーク強化学習法の併用で学びが深まり、自習での抗うつ効果増強やその他の課題も克服されうるかを検証した。結果、CCBT単独施行群では待機群に対して中大の有意な効果量(p<0.005)(偏差値換算で6.5相当の改善)が得られ、ベースラインにおいてBDI-2で中等度の抑うつが正常との境界領域にまで軽減された。しかし、ペアワーク付加群では7週後において待機群と比較して、うつ状態において有意差を認めなかった。これは、適切なガイダンスのない安易な相互扶助は、CCBT単独群で得られるはずの抗うつ効果を毀損し、むしろリスクとなりえることが示唆された。更に、脱落では群間で有意差を認めなかった。一方で、ペアワーク付加群は介入中には一時的に状態不安は軽減させ、機能面において身体的側面において有意な改善を最終的に認めていた。アンケートでは、ペアワークには賛否両論であった。しかし、探索的解析では開始時に不安の強い層に限っては、ペアワークを重ねるほど抗うつ効果が増強することが有意に示された。また、ペアワークに抗うつ効果を認めなかったことから費用対効果は劣るという結論に至った。本研究から、今後の健康教育や自助治療におけるペアワークの学習効果増強が、特に高不安者には期待されることが示唆されたことは意義深い一方で、更なる検証が望まれる。うつ状態(病)の勤労者に対して7週の完全自習eラーニングによる抗うつ効果を無作為統制試験で検証した。加えて、“習ったことを誰かに話す"ペアワークの併用で学びが深まり、自習効果の増強が得られるかも検討された。結果、単独学習群では何もしない待機群に比べて中大の有意な効果量(p=0.003)(偏差値で6.5相当の改善)が得られたが、ペアワーク群では待機群と変わらなかった(そのため経済効果解析の意義はないと結論づけられた)。ペアワークには賛否両論だったが、開始時に不安の強い人に限ってはペアワークを重ねるほど抗うつ効果が増強する有意傾向が示された。本介入研究は、平成26年10月12月と研究計画通りに無事終了し、詳細な主要解析もほぼ終了し、現在は下位分析に取り掛かっている。現在までは予定通りに進められている。主要評価項目において期待した結果が得られなかったために、論文投稿に際して、二次的解析に関してその合理的な説明のために構造方程式モデリング(SEM)が必要と判断されたため、現在、追加解析中である。研究結果は国内外の研究雑誌に投稿し、社会に発信していく。認知行動療法予想通りの研究結果が示されなかった理由の考察をより深めるために、ad hocで強化学習群の参加者にインタビュー調査を用いた質的研究によるアプローチを加えることに一部計画変更を決定した。そのため、現在、その準備と実施により半年ほどの研究計画の戦略的な遅延が予想される。既に、参加者5名は同意を得られ、追加調査のための準備や倫理委員申請等を行っている段階である。
SCDaseを用いたスフィンゴ脂質誘導体の構築と脂質マイクロドメインの機能の解明

SCDaseを用いて蛍光標識スフィンゴ脂質ライブラリーを構築した。蛍光標識GM1、スフィンゴミエリンおよびセラミドを合成した。前駆物質であるアミノスフィンゴ脂質については、ガラクトシルセラミド、グロボシド、スルファチドについても調製した。SCDaseを用いて単一脂肪酸含有スフィンゴ脂質ライブラリーを構築した。GM1の脂肪酸部分をSCDaseを用いて酵素工学的に置換してパルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、α-リノレン酸、EPA、DHAを含有したGM1を合成した。α-リノレン酸含有GM1が神経細胞にアポトーシスを誘導することを見い出し、このメカニズムについて脂質マイクロドメインの点から解析した。リゾGM1が溶血、SAPK/JNK経路の活性化、脂質マイクロドメイン構造の崩壊を引き起こすのに対して、α-リノレン酸含有GM1はこのような作用を示さずに脂質マイクロドメインの構造に変化を及ぼした。このことはリゾGM1は界面活性剤様の物理的ストレスで、一方のα-リノレン酸含有GM1は脂質マイクロドメインにおけるシグナル伝達の撹乱というよりマイルドな作用でアポトーシスを誘導することを示唆している。このように、単一脂肪酸含有スフィンゴ脂質は、脂質マイクロドメインの機能解析に大変有用である。SCDaseを、ラット中性セラミダーゼの分泌シグナルとムチンボックスとの融合タンパク質、またはGPI-アンカー付加シグナルとの融合タンパク質として細胞に発現させた。これらのSCDaseが形質膜表面に特異的に発現すること、また、十分な活性を保持していることを確認した。また、GPI-アンカー型のSCDaseが脂質マイクロドメインに特異的に分布することを明らかとした。これらの形質膜表層発現型のSCDaseは、形質膜上および脂質マイクロドメイン上のスフィンゴ脂質の機能を解明するのに有用である。SCDaseの縮合反応を用いて蛍光標識スフィンゴ脂質ライブラリーの構築を行った。蛍光標識GM1(スフィンゴ糖脂質の一種)、およびスフィンゴミエリンとセラミドを合成した。また、前駆物質であるアミノスフィンゴ脂質については、ガラクトシルセラミド、グロボシド、スルファチドについても調製を行った。SCDaseを用いて単一脂肪酸含有スフィンゴ脂質ライブラリーの構築を行った。GM1の脂肪酸部分をSCDaseの縮合反応を用いて酵素工学的に置換してパルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、α-リノレン酸、EPA、DHAを含有したGM1を合成した。また、これらの脂肪酸を含有したセラミドを合成することも可能である。α-リノレン酸含有GM1が神経細胞にアポトーシスを誘導することは、すでに見い出している。このアポトーシスのメカニズムについて、脂質マイクロドメインとシグナル伝達という点から解析を行った。脂肪酸部分を持たないリゾGM1が、溶血能を示す、SAPK/JNK経路のシグナル伝達を活性化する、脂質マイクロドメインの構造を完全に崩壊させる、といった作用を示すのに対して、α-リノレン酸含有GM1はこのような活性を示さなかった。そして、α-リノレン酸含有GM1は脂質マイクロドメインの構造を崩壊させるのではなく、構造に変化を及ぼすことがわかった。このことはリゾGM1については界面活性剤様の作用の物理的ストレスでアポトーシスを誘導しているであろうことを、一方のα-リノレン酸含有GM1については物理的ストレスではなく、脂質マイクロドメインにおけるシグナル伝達の撹乱という、よりマイルドな作用でアポトーシスを誘導しているであろうことを示唆している。このように、脂肪酸部分を単一の脂肪酸で再構築したスフィンゴ脂質は、脂質マイクロドメインの機能解析に大変有用である。
オリゴデンドロサイトにおけるホスファチジルイノシトール-3,5-二リン酸の役割

ホスファチジルイノシトール3,5-二リン酸(PI(3,5)P2)の中枢神経系における生理機能を解明するため、唯一の合成酵素、ホスファチジルイノシトール3-リン酸5-キナーゼ(PIPKIII)の遺伝子欠損マウスを独自に作製し、解析を行った。その結果、PI(3,5)P2が中枢神経系において、髄鞘形成という極めて重要な生理機能を制御することが明らかとなった。さらに細胞系譜特異的な遺伝子欠損を導くことで、PIPKIIIが神経細胞ではなく、グリア細胞の一つオリゴデンドロサイトにおいて重要な役割を持つことを見出した。イノシトールリン脂質は3つの水酸基のリン酸化状態の違いにより全8種類が存在し、リン酸化・脱リン酸化酵素により相互に変換されることで、多様な生理機能を制御している。中でも最も遅れて発見されたホスファチジルイノシトール3,5ー二リン酸(PI(3,5)P2)は、酵母から哺乳動物に共通して細胞内小胞輸送の制御に関与している。これまでに研究代表者は、PI(3,5)P2の唯一の生成酵素であるホスファチジルイノシトール3リン酸5ーキナーゼ(PIPKIII)の遺伝子欠損マウスを作製・解析することで、個体発生における必須の役割と腸上皮細胞における生理的な重要性を明らかにし、報告してきた。本研究課題においては、中枢神経系前駆細胞特異的なPIPKIII遺伝子欠損マウスを作出することで初めて明らかになった「髄鞘(ミエリン)形成におけるPI(3,5)P2の重要性」について解析を進めてきた。その結果、オリゴデンドロサイトにおけるPI(3,5)P2こそが髄鞘形成に必須であることをマウス個体のレベルで明らかにした。平成26年度にはオリゴデンドロサイトの初代培養細胞系における解析についての条件検討を行った。本実験系を用いて、平成27年度以降に、PI(3,5)P2の重要性について明らかにする計画である。さらにPI(3,5)P2脱リン酸化酵素遺伝子欠損マウスの作製・戻し交配を進め、申請時の計画通りに5系統のfloxマウスと、1系統の活性消失変異体ノックインマウスを得ることが出来た。次年度以降に、これらのマウスを用いて、いずれの脱リン酸化酵素が髄鞘形成に関与しているのかを解明する。平成27年度には、PI(3,5)P2脱リン酸化酵素遺伝子改変マウス6系統の作製・戻し交配を進め、そのうち1系統の活性消失変異体ノックインマウスを用いた解析を進めた。平成28年度中に残りの5系統については解析を行う予定である。平成27年度の研究計画では、(1)初代培養細胞系を用いた髄鞘形成機構の解析と、(2)PI(3,5)P2脱リン酸化酵素遺伝子欠損マウスを用いた髄鞘形成機構の解析を予定していた。このうち、(2)の解析については、6系統のうちノックインマウスを用いた1系統の解析を行った。残りの系統についても平成28年度の早い段階で解析を完了するべくマウスの交配を進め、準備が整った。(1)、(2)については、やや遅れている状況である。一方で、当初平成28年度に計画していた(3)PI(3,5)P2プローブの開発については、これまでに最も有望と考えられていたプローブについて、詳細に解析を行うことで、実際にはPI(3,5)P2以外の分子を認識している可能性が極めて高いことを明らかとし、平成27年度中に査読付論文として報告することが出来た。(3)については、当初の計画以上に進展している。以上を踏まえて、概ね順調に進展していると考えている。

本研究課題においては、中枢神経前駆細胞特異的なPIPKIII遺伝子欠損マウスを作出することで初めて明らかになった「髄鞘(ミエリン)形成におけるPI(3,5)P2の重要性」について解析を進めてきた。その結果、神経細胞におけるPI(3,5)P2ではなく、オリゴデンドロサイトにおけるPI(3,5)P2産生こそが髄鞘形成に必須であることをマウス個体のレベルで明らかにした。続いて、産生されたPI(3,5)P2を分解するPI(3,5)P2脱リン酸化酵素が髄鞘形成に果たす役割について研究を進めた。これまでに脱リン酸化酵素5分子の関与について検証を行ったが、明らかに関与する分子は同定できなかった。オリゴデンドロサイトでのPI(3,5)P2代謝には、これらの脱リン酸化酵素が複数関わっているために、1分子の欠損では顕著な表現型が見出されなかったものと考えられる。ホスファチジルイノシトール3,5-二リン酸(PI(3,5)P2)の中枢神経系における生理機能を解明するため、唯一の合成酵素、ホスファチジルイノシトール3-リン酸5-キナーゼ(PIPKIII)の遺伝子欠損マウスを独自に作製し、解析を行った。その結果、PI(3,5)P2が中枢神経系において、髄鞘形成という極めて重要な生理機能を制御することが明らかとなった。さらに細胞系譜特異的な遺伝子欠損を導くことで、PIPKIIIが神経細胞ではなく、グリア細胞の一つオリゴデンドロサイトにおいて重要な役割を持つことを見出した。平成26年度の研究計画では、(1)初代培養細胞系を用いた髄鞘形成機構の解析と(2)PI(3,5)P2脱リン酸化酵素遺伝子欠損マウスの作製及び戻し交配を予定していた。このうち(1)については、条件検討を進めている段階であり、計画の一部が次年度に持ち越されることになった。一方、(2)については、計画していた6分子の遺伝子欠損マウスの作製及び戻し交配を終了し、中枢神経系における髄鞘形成への影響を検討するための交配を開始することができた。これらの状況から、現在までの達成度は「概ね順調に進展している」ものと考えられる。平成28年度までに完了していない(1)初代培養細胞系を用いた髄鞘形成機構の解析と、(2)PI(3,5)P2脱リン酸化酵素遺伝子欠損マウス(残り5系統)を用いた髄鞘形成機構の解析を進めていく。脳の組織学的解析においては、クリューバー・バレラ染色による光学顕微鏡レベルでの解析に加え、脳梁部の電子顕微鏡像を用いた詳細な解析を行う。細胞生物学まず平成26年度に中途となっていた「初代培養細胞系を用いた髄鞘形成機構の解析」を速やかに行う。続いて、「PI(3,5)P2脱リン酸化酵素遺伝子欠損マウスを用いた髄鞘形成の解析」を行う。
頚髄損傷者の自律神経機能維持を目指した身体活動管理に関する研究

脊髄損傷による麻痺と自律神経系の関係性を検討する動物実験系の確立のため、ラットの循環動態モニタリングを試みた。自律神経の機能をより正確に評価するために血圧計測を試みたが、尾部にマンシェットを装着しての非侵襲的な計測は再現性が低かった。このため、血管内にカテーテルを留置する方法を採択し、以後は安定して循環動態を評価することができるようになった。運動と自律神経の関係性を動物実験で評価するため、定期的なトレッドミル歩行を実施して血圧変動を観察する実験系を確立した。人実験系については、定期的な運動実践に参加する受傷から5年以上経過している慢性期脊髄損傷者をリクルートし、研究体制を確立した。健康状態は安定している被験者であっても、高感度CRPでの評価では軽度な上昇を示す症例が多く、慢性炎症の存在が疑われた。また、ベースラインとなる心拍による自律神経評価を検討したところ、計測するタイミングによる差異が大きいことが問題となった。そのため、長期間(3日間)の持続的なモニタリングを検討することとなり、障害のある状態でも持続的に装着が可能な心拍計の導入を行った。脊髄損傷者においては皮膚障害のリスクが高く、また上肢に装着する心拍計はHRV算出には精度に問題があった。最終的に前胸部に張り付け可能なフレキシブル電位計を用いる方針とした。計測によって得られる心拍データは大きなデータサイズになるため、その解析システムの構築に着手した。臨床評価が重要となる研究であり、初年度にて調査対象集団を確保できたことで、次年度以降もデータ収集がスムーズに進むことが期待される。また、動物実験系ではモニタリング方法の確立が懸念されたが、侵襲的計測法の導入により、これも安定することができた。計画に沿って推進する見込みである。脊髄損傷患者における横断調査として、慢性期の頸髄損傷者に対する心拍モニタリングを継続する。活動量と自立神経の関係を明らかにするために、活動量の高いケースと低いケースをそれぞれ横断的に計測・評価する。また運動療法を実施する症例に対して前後での評価を行う。動物実験系については、動物実験における自律神経機能の評価のため、交感神経活動の指標となる尿中エピネフリン測定などを行い、自律神経活動を多面的に捉えることを試みる。また脊髄損傷モデルラットに対してトレッドミルを用いた運動介入の実験系を整備し、前後評価の準備を進める。
19世紀後半以降のドイツ各地域におけるトウルネス・スポーツ産業の生成過程の究明

本研究は従来のドイツのトゥルネン・スポーツ史研究にあっては等閑視されがちであった、産業史的パースペクティブによる歴史像の再構築を目的としたものである。1年間という研究期間しかも資史料の収集からスタートせざるをえないという条件を踏まえ、現時点では以下の研究成果及び課題の概要を記しておくこととしたい。1.Neuendorff,Eichel,Duding,Zieschang,Neumann,Peiffer,Ueberhorst等の著作の上記観点による再検討を試みたが、トゥルネン機器類の規格化・商品化(Turngerat-Industrie)コミュニケーション手段としての情報(広義のトゥルネンメディア)産業の生成と展開(発行あるいは廃刊年月、発行部数の増減など)、指導者の養成等に関する叙述は看取できるものの、おしなべて「企業」史あるいは産業連関という媒介項が欠落しているため、商品開発主体の意図(商品コンセプト、価格及び消費対象の確定等)が不問に付されており、この点を鳥瞰した叙述が今後必要となること。2.DerTurner(1846-1849),Turn-Zeitung(1846-47)を中心に入手史料の整理と調査を行ったが、この2つの史料からいえることは、(1)で指摘した商品の開発母体たる「企業」の内実に関する記事は管見のかぎりなく、したがってこの段階(19世紀中頃)では「企業」としてまだ十分に成熟していないことが推測されること。しかしこの判断には新史料による史料批判が当然要求される。F.ヤーンの時代からすでに祝祭、祭典のもつ意味は大きかったといえるが、これら祝祭の構図全体を産業史の観点からも意味付けしていく必要がある。不十分ながらこの点と関わって論文を書いたが、例えばトゥルンフェストのなかにイベント的様相がどのようにして組み込まれていったのか、は深化さすべき課題の一つといえよう。
ポリエーテル鎖におけるゴーシュ酸素効果の量子化学的研究

前年度に引き続き,ポリエーテル鎖のモノマーモデルである1, 2-ジメトキシエタンに関する非経験的ab initio分子軌道法計算を行うことにした.まず,ゴーシュ効果を再現するのに必要な基底関数の大きさと計算の近似度を知るために,より小さな分子で計算が容易な筈の1, 2-ジフルオロエタンについて検討した.結果として,予想外に大きな基底関数,すなわちマルチゼータ十分極関数+diffuse関数(D95+^<**>または6-311++G^<**>)を用いて,電子相関をほぼ完全に取り込んだMP3レベルの計算を行う必要があることがわかり(J.phys.Chem.に発表),従来ab initio法では再現出来なかったゴーシュ効果として-0.86kcalを得,並行して行った気相高分解能NMRからの実測値-0.81kcalとよく一致した.そこで,ポリエーテル鎖のモデル化合物1, 2ジメトキシエタンについても, D95+^<**>基底関数を用いるMP3レベルの計算を行ってみたが,東京大学大型計算機センターにおける作業用ディスクファイルの容量の制約から,電子相関を含むMP3の計算は出来ず,ハートリーフォックレベルの計算にとどまり,ゴーシュ効果を再現出来ずに終ってしまった.ここでab initio計算を断念し,かわりに半経験的分子軌道法であるCNDO/2法に切りかえた. CNDO/2法による計算ではポリエーテル鎖におけるゴーシュ酸素効果の実験値(-0.4kcal)をよく再現する値-0.39kcalを得ることが出来たので,ゴーシュ効果の内味の検討を行ない, ab initio計算では計算出来なかった電子相関の効果,とりわけ結合を通しての1.4-相互作用が重要であることがわかった.この知見をもとに, 1, 4-相互作用関数の導入,モース関数の導入,振動周波数をも用いる最適化を骨子とする新しい分子力場の作成を考え,所期の目的であるゴーシュ酸素効果を表現しうる力場の決定を試みた.最適化プログラムAMPOP2が完成し,現在C, Hを含む部分のパラメーター化が終了した段階にある.モノマーモデルとしての1,2-ジメトキシエタンのab initio計算については、1,2-ジメトキシエタンそのものの計算に入る前に、より小さい1.2-ジフルオロエタンでどんな基底関数を用いれば良いかを検討した。その結果、ゴーシュ安定化をもっとも良く再現するのは【D95^(**)】基底であることがわかったが、この計算を行うためには非常に多くの作業用ファイルが必要であった。1,2-ジメトキシエタンは1,2-ジフルオロエタンよりもかなり大きな分子であるから、より多くの作業用ファイルが必要となると考えられるため、計算の実行は東京大学大型計算機センターの閑散期を待つこととした。半経験的分子軌道法AMIによるゴーシュ安定化要因の解析については、計算用プログラムパッケージMOPACの整備を終わり、ようやく計算に入れる状態となった。そこで62年度には、実際に計算を行いAM1分子軌道法によるゴーシュ安定化の要因の解析と1,4-相互作用ポテンシャル項の型と大きさの見積りを行う。MM2分子力場法による1,4-相互作用項の再較正については、分子の構造データ,振動周波数などをもとに分子力場法のパラメータを最適化するためのプログラムを作成することができた。本プログラムを用いて1,2-ジフルオロエタンについて試験的に1,4-相互作用ポテンシャルを最適化したところ、1,2-ジフルオロエタンのゴーシュ安定化および構造についてオリジナルのMM2よりも良好な結果を得ることができた。この結果は1,4-相互作用ポテンシャルの有効性を示しており、ポリエーテル類においても良好な結果を与えることになるであろうと考えられる。したがって、62年度はab initio計算の結果に合わせてポリエーテル用のパラメータを決定し、このポテンシャルを用いて種々のポリエーテルの分子力場計算を行う。前年度に引き続き,ポリエーテル鎖のモノマーモデルである1, 2-ジメトキシエタンに関する非経験的ab initio分子軌道法計算を行うことにした.まず,ゴーシュ効果を再現するのに必要な基底関数の大きさと計算の近似度を知るために,より小さな分子で計算が容易な筈の1, 2-ジフルオロエタンについて検討した.結果として,予想外に大きな基底関数,すなわちマルチゼータ十分極関数+diffuse関数(D95+^<**>または6-311++G^<**>)を用いて,電子相関をほぼ完全に取り込んだMP3レベルの計算を行う必要があることがわかり(J.phys.Chem.に発表),従来ab initio法では再現出来なかったゴーシュ効果として-0.86kcalを得,並行して行った気相高分解能NMRからの実測値-0.81kcalとよく一致した.そこで,ポリエーテル鎖のモデル化合物1, 2ジメトキシエタンについても, D95+^<**>基底関数を用いるMP3レベルの計算を行ってみたが,東京大学大型計算機センターにおける作業用ディスクファイルの容量の制約から,電子相関を含むMP3の計算は出来ず,ハートリーフォックレベルの計算にとどまり,ゴーシュ効果を再現出来ずに終ってしまった.ここでab initio計算を断念し,かわりに半経験的分子軌道法であるCNDO/2法に切りかえた. CNDO/2法による計算ではポリエーテル鎖におけるゴーシュ酸素効果の実験値(-0.4kcal)をよく再現する値-0.39

kcalを得ることが出来たので,ゴーシュ効果の内味の検討を行ない, ab initio計算では計算出来なかった電子相関の効果,とりわけ結合を通しての1.4-相互作用が重要であることがわかった.この知見をもとに, 1, 4-相互作用関数の導入,モース関数の導入,振動周波数をも用いる最適化を骨子とする新しい分子力場の作成を考え,所期の目的であるゴーシュ酸素効果を表現しうる力場の決定を試みた.最適化プログラムAMPOP2が完成し,現在C, Hを含む部分のパラメーター化が終了した段階にある.
胃癌腹膜播種の微小環境における上皮間葉転換の解明と治療標的の意義

胃癌腹膜転移側の宿主細胞である腹膜中皮細胞(HPMC)において、TGF-β1や胃癌細胞との共培養によるEMT(上皮間葉転換)誘導を証明した。またマウス皮下腫瘍モデルを用い、胃癌細胞とHPMCの共投与は腫瘍増殖能や間質線維化の増生に促進的に作用する事を示した。さらにBRM製剤であるPSKは非免疫学的機序である抗TGFβ作用によって、これらのEMT誘導に伴う癌間質の線維化を抑制する事を証明した。平成24年度は、ヒト大網より分離培養したHPMCはTGF-β処理によりEMTが誘導され、BRM製剤であるPSKによって用量依存性にそのEMT変化が抑制される事を証明した。このPSKによるEMT抑制機序として、PSKはHPMCにおけるTGF-β経路であるSmad2のリン酸化を抑制する事をwestern blotにて蛋白レベルで確認した。さらにHPMCを胃癌細胞株OCUM-2MD3と共培養した結果、TGF-β刺激と同様な上皮系マーカーの発現減弱、間葉系マーカーの発現亢進を認め、細胞間相互作用によるEMT誘導が確認され、この共培養によるEMT誘導は、PSK500μg/mlにより抑制される事を証明した。■マウス線維化皮下腫瘍モデルを用いたPSKの抗線維化作用に関する研究平成25年度は、胃癌SCIDマウス皮下腫瘍モデルを作製し、1胃癌細胞PSK(-)2胃癌細胞PSK(+)3胃癌細胞+HPMC PSK(-)4胃癌細胞+HPMC PSK(+)の4群間の皮下腫瘍の造腫瘍性、EMT markerの発現状況、腫瘍内線維間質量を比較検討した。その結果、胃癌細胞とHPMCの共投与により胃癌細胞単独投与に比較して有意に皮下腫瘍容積は増加したが、共投与を行った3、4群間の比較では、PSK投与群である4群の腫瘍サイズはPSK非投与群よりも有意に縮小した。また、免疫組織染色にて皮下腫瘍内の上皮系マーカー(E-cadherin)と間葉系マーカー(αSMA、vimentin)の発現状況を検討した結果、PSK投与群において上皮系マーカーの発現亢進と間葉系マーカーの発現抑制が確認された。また、腫瘍内の線維間質量をazan染色で定量し、PSK投与により腫瘍内の線維化抑制が認められた事からPSKのTGF-β阻害によるEMT抑制を介した抗線維化作用の可能性が示された。近年、悪性腫瘍の浸潤、転移、線維化にEMTが重要な役割をはたしている事が明らかになった。これまで癌細胞側のEMTに関する報告は多いが、転移側のホスト細胞のEMT誘導に注目した報告はまれである。このホスト細胞のEMT誘導も転移成立における重要な要素であり、さらには癌間質の線維化にも深く関与する事が推察される。研究初年度である平成24年度は、胃癌細胞と腹膜転移のホスト細胞である腹膜中皮細胞(HPMC)を用い、細胞間相互作用によるEMT誘導を検証し、さらに代表的なBRM製剤のひとつであるPSKによる抗TGF-β作用に着目しEMT誘導の抑制効果の有無をin vitroにおいて以下の項目に関し研究を行った。HPMCにTGF-β10 ng/mlを投与した結果、紡錘様の形態変化を呈し、E-cadの発現低下,α-SMAの発現亢進などのEMT様変化を呈した。これにPSK 100500μg/mlを添加すると用量依存性に紡錘形への形態変化から敷石状となり、上記EMT markerの発現変化は抑制された。【研究2】胃癌細胞株とHPMCの共培養によるEMTの誘導と、PSKによる抑制効果に関する研究HPMCをMKN-45と共培養した結果、E-cadなどの上皮系マーカーの発現減弱、α-SMAなどの間葉系マーカーの発現亢進を認め、細胞間相互作用によるEMT誘導が確認された。また、共培養によるHPMCのEMT markerの発現変化はPSK500μg/mlの添加により抑制される事が証明された。PSKはsmad2のリン酸化を阻害することで-βのシグナル伝達系をブロックし、EMT誘導を抑制する可能性が示唆され、現在検討中である。初年度は【研究1】TGF-β処理による胃癌細胞とHPMCのEMT誘導とPSKのTGF-β/Smad経路に対する阻害作用に関する研究、【研究2】胃癌細胞株とHPMCの共培養によるEMTの誘導と、PSKによる抑制効果に関する研究、に関して検討を行った。実験成果は先述の如くであり、MKN-45とHPMCの共培養の結果誘導されたEMTにおけるTGF-β/Smad経路に対してPSKが与える影響に関して、現在検討中である。当初、初年度に予定していた【研究3】TGF-β添加によるHPMC、胃癌細胞の浸潤能の亢進にPSKが与える影響、に関しても現在検討中であるが、実験系が確立し、手技が安定したため次年度において検証可能であると考えている。

平成24年度は昨年度の研究成果を学会発表する。同時にin vitroで得られたデータをもとに胃癌細胞とHPMCを同時移植させたマウス線維化皮下腫瘍モデルを用い、in vivoにおいてPSKのEMT抑制効果を検証すると共に、癌間質の抗線維化作用の有無を評価する。また、胃癌細胞におけるEMT誘導と抗癌剤耐性獲得の関連性に関して検討し、PSKによって耐性解除が誘導されるかを研究し、それらの成果を、国内外の学会や論文で発表予定である。次年度の研究費使用については当初の計画から変更はない。
抗体固定化磁性細菌粒子によるアレルゲンの認識および除去

本年度の研究ではアレルゲンの分離と検出のさらなる高感度化のため、IgGをサンプルとして一次抗体を固定化した磁気微粒子を用いて回収し、アルカリフォスファターゼ標識した二次抗体により検出するシステムの構築について検討を行った。磁性細菌粒子への、抗IgG抗体の固定化は、二価架橋試薬であるSPDPを用いて行った。まず、ね性細菌粒子表面を覆う有機薄膜に含まれるアミノ基とSPDPを反応させ、ピリジルジスルフィド基を導入させる。抗体はジチオスレイトールを用いて還元し、SH基を持たせた。このようにしてSH基を持たせた抗体と磁性細菌粒子との間にジスルフィド結合を形成させ、抗体固定化磁性細菌粒子を作製した。次に作製した抗体固定化ね性細菌粒子を用いて、IgGの分離及び検出について検討した。抗体固定化磁性細菌粒子をIgG溶液(0-10^2pg/ml)にまぜ、37°C、1時間反応させ磁石により磁気分離し、抗原抗体反応によって結合したIgGの回収を行った。さらに二次抗体であるアルカリフォスファターゼ(AP)によって酵素標識した抗IgG抗体を抗体固定化磁性細菌粒子に反応したIgGとまぜ、37°C、1時間反応させ磁気的分離の後、発光基質としてLumi-Phos530(Lumigen Inc製)を加えた。その後ルミネッセンスリーダーBLR-301(アロカ株式会社製)によって発光強度が安定したところで測定しIgG濃度の検出を行った。まず、二次抗体の濃度を6μg/mlの濃度で反応を行ったところ、IgG濃度と発光強度の間に相関関係が得られ、1pg/mlの濃度までIgGの濃度を検出することが可能であることが示された。
紙・デジタルペン・タブレット端末利用による“書く”を重視したデジタル教科書の研究

本研究は、紙・デジタルペン・タブレット端末の組み合わせによる、“紙に書く(描く)"ことを重視した視点からデジタル教科書を開発する実践的研究である。デジタルペンシステムとタブレット端末により、教員のパソコンと生徒側の紙に書く情報がリアルタイムに反映されるシステムを使い、どのような授業実施が可能なのか、様々な取り組みを小学校の実際の授業で実験を行った。まず、授業実践に使用するために機器の充電保管が可能なシステムを構築し、国語、算数、理科、総合学習などで日常的な生徒達の発表とディスカッションの授業を実施した。この実験授業は、京都教育大学付属桃山小学校の協力のもと実施した。本年度は、紙・デジタルペン・タブレット端末の組み合わせによる、“紙に書く(描く)"ことを重視した視点からデジタル教科書を開発する実践的研究である。調査研究は、デジタル教科書関連技術の動向調査及び、デジタルペン用ソリューションと研究協力者である大日本印刷株式会社の実験授業などを参照した。また初等教育で実践される「新教科メディア・コミュニケーション科」について、情報教育・メディア教育に関する実践的な視点から京都教育大学付属桃山小学校と連携しリサーチと実験授業を行った。また、コンテンツ関連については、教科書出版社へのデジタル教科書事情についてヒアリングを行い、研究におけるデータ提供を打診した。次年度の弱視者の為の教科用特定図書作成の協力と合わせて数社を候補に検討している。実施研究に関しては、紙・デジタルペン・タブレット端末のネットワーク構成を実現する為の検討を実施している。デジタルペンは、大日本印刷株式会社のOpenSTAGEとOpenNOTEの機能をカスタマイズして使用し実験を進めている。タブレット端末との連携については市販品の導入を検討しているが、タッチパネルが標準で使用できることからWindows8の機種を採用することが望ましいと考えている。しかし、周辺機器やソフトウエアの対応状況などさらに調査が必要であり、実施に向けて慎重に検証したい。実際の授業実践の準備としては、電子ペン収納ボックスの制作と改良、電源・充電環境の検討を実施した。現在、京都教育大学付属桃山小学校の授業にて、電子ペンの活用から徐々に実践で使用を行っている。本研究は、紙・デジタルペン・タブレット端末の組み合わせによる、“紙に書く(描く)"ことを重視した視点からデジタル教科書を開発する、教科書のユニバーサルデザインの実践的研究である。本年度の活動は、これらデバイスのネットワーク構成を確立し、主に電子ペンと紙の連携を授業に活用させる為の実施実験を行った。実際の授業での使用にあたり、デジタルデバイスは、調整と準備に時間がかかり少しでもスムーズにストレスなく、授業進行をできる環境の構築が重要である。授業を想定した準備として、電子ペン整備・収納ボックスを制作し、ストレスなく生徒達にデジタルペンを使ってもらえ、充電整備にも手間のかからない環境構築を目指した。また、タブレット端末の活用についても電子ペンの表示以外にインターネットや編集アプリを活用できるように環境の構築を行った。本研究に協力している京都教育大学付属桃山小学校とは、定期的に打合せを行いデバイスの環境整備や授業実施のコンテンツの検討などを行っている。メディアコミュニケーションの観点から“紙に書く(描く)"ことを重視したデジタル教科書とはどのようなものなのか。また、授業案の構築により授業で行うべき学びのあり方について、幾つかのアイデアを実施する為の準備を行っている。また、これらのシステムの動作確認として愛知県立芸術大学の授業において「デザインプレゼンテーション」2コマ、「デザイン実技III」10コマを実施した。実際の授業に活用し紙・デジタルペン・タブレット端末の効果の検証と、授業実施に問題がないように重ねて検証を行った。次年度においては、京都教育大学付属桃山小学校にて、様々な授業案を実施する予定である。本研究は、紙・デジタルペン・タブレット端末の組み合わせによる、紙に書く(描く)ことを重視した視点からデジタル教科書を開発する、教科書ユニバーサルデザインの実践的研究である。デジタルペンにより、教員のパソコンと生徒の紙に書く情報がリアルタイムに反映されるシステムを使い、どのような授業実践が可能なのか様々な取り組みを小学校の実際の授業で実験を行った。26年度は、実際の授業に使用するためにシステムを構築し、充電保管が可能な安定した環境を実現することを目標に収納ボックスを整備したが、27年度の活動はこれらのデバイス構成を、実際の授業でのできるだけ多くの活用経験を積むことを心掛けた。現在の協力校である、京都教育大学付属桃山小学校、平岡信之教諭の協力のもと、4年生35名に実験授業を計10回行った。定期的に学習進度に合わせた授業テーマをもとに打合せを行い、1授業案の作成、2デジタルペン用ワークシートの作成、3授業実施の流れで準備を行った。主な授業内容としては、漢字ドリル、算数(式の解き方)、理科(動物の骨格)、その他総合学習での子供達の発表にもとづく自由討論などに活用した。日常的に授業に活用することにおいては、タブレットが3名に1台ということや、Wifi環境の不具合等で表示に関してトラブルがあり、使いにくい状況も生まれた。また授業準備が教諭だけでは手間がかかり、適切なサポートが必要であることも感じられたが、生徒達が使用に慣れることにより、徐々に授業に集中できる状況になってきた。28年度はこれらの検証を繰り返し、作成したデータの分析を行い、紙・デジタルペン・タブレット端末を使用した教科書のイメージをさらに具体化したいと考えている。紙・デジタルペン・タブレット端末の組み合わせによるシステムの導入や機器の調整に時間がかかったことや、実際の小学校において通常授業での実験を目指したため、受入側の小学校のネットワークシステムと合わせることなどの問題が生じ調整に時間がかかった。また、27年度の実験授業で、生徒側のスキルの向上も見られ、継続して実験を続けることが重要と考えた。

本研究は、紙・デジタルペン・タブレット端末の組み合わせによる、“紙に書く(描く)"ことを重視した視点からデジタル教科書を開発する教科書のユニバーサルデザインの実践的研究である。デジタルペンの機能により、教員のパソコンと生徒側の紙に書く情報がリアルタイムに反映されるシステムを使い、どのような授業実施が可能なのか様々な取り組みを小学校の実際の授業で実験を行った。28年度は、27年度から継続している授業実践に使用するために充電保管が可能な安定したシステムを再構築し、授業実施の継続を行った。研究協力校は、京都教育大学付属桃山小学校、平岡信之教諭の協力のもと、授業内容としては、国語、算数、理科に加え、総合学習での日常的な生徒達の発表とディスカッションをサポートした。後半は、本研究のまとめとして、生徒達の記入内容やディスカッションに関して分析を行い“紙に書く"ことを重視したデジタル教科書のアイデアをまとめた。本研究全体を通しては、限られた予算の中でのシステム仕様でもあり、既存のWifi環境との不具合の発生や使う上での破損、一部の機器の不具合で予定していた授業をこなすことができない状況や、デジタル機器に特有の解決できない問題が発生したこともあった。しかし実際に様々な授業実践を行い、そのデータが克明に紙とデジタルに残っていることは、大きな成果であったと考えている。また本研究は“紙に書く(描く)"ことを重視した視点からデジタル教科書を考えることが課題であるが、具体的には教科書から実践する指導案として様々なワークシートを作成し、それを共有することにより充実したコンテンツが制作が可能になることがわかった。実施においては、様々な実験的な授業が構築できたことや、タブレットPCの書き込み機能にくらべ、活発な使い方が実施されたのは成果であった。本研究は、紙・デジタルペン・タブレット端末の組み合わせによる、“紙に書く(描く)"ことを重視した視点からデジタル教科書を開発する実践的研究である。デジタルペンシステムとタブレット端末により、教員のパソコンと生徒側の紙に書く情報がリアルタイムに反映されるシステムを使い、どのような授業実施が可能なのか、様々な取り組みを小学校の実際の授業で実験を行った。まず、授業実践に使用するために機器の充電保管が可能なシステムを構築し、国語、算数、理科、総合学習などで日常的な生徒達の発表とディスカッションの授業を実施した。この実験授業は、京都教育大学付属桃山小学校の協力のもと実施した。計画としては概ね進展しているが、デジタルペン・タブレット端末の導入と機器の調整に時間がかかり、実際の授業での実施スケジュールが遅れている。また、協力校の体制も変化があり受入側の準備等にも時間を要した。