hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
緑膿菌亜硝酸還元酵素系の発現調節

緑膿菌Pseudomonas aeruginosaは、基本的には好気性菌であるが、酵素非存在下においても異化的硝酸呼吸(脱窒)により生育が可能である。また例外的にアルギニン存在下、呼吸系を用いないで生育することも可能なことが知られている。筆者らは既に、本菌の亜硝酸還元酵素系の構成要素であるニトレ-トレダクタ-ゼとシトクロムCが染色体上に隣接していることを報告している(FEBS Letters,261,196ー198,1990)。本年度の研究では、この両者がオペロンを形成していること、およびこのオペロン(denAB)の発現をコントロ-ルしている要因を明らかにすることを試みた。まず、promoter prove vectorを用い、denAB近辺の様々なDNA断片のプロモ-タ-活性を調べたところ、denABは、オペロンを形成していること、さらには本オペロンは、嫌気的でかつ硝酸または亜硝酸存在下にのみ発現することが判明した(FEBS Letters,280,351ー353,1991)。さらに、Pseudomonasにおいてより効果的な発現ベクタ-を構築し(Agric.Biol.Chem.,55,2431ー2432,1991)、それを用いて嫌気的条件下、硝酸(亜硝酸)の存在の有無による発現の強さを調べた結果、denABは嫌気条件および硝酸(亜硝酸)の存在という少なくとも2段階の発現調節を受けていることが判明した(FEBS Letters,288,227ー228,1991)。さらに本オペロンのプロモ-タ-領域にには、Pseudomonasや大腸菌で嫌気的状態で発現する遺伝子の上流に特異的な配列(ANR配列)が見出された。さらに、denAB下流同方向および上流逆方向にあらたなORFの存在が示唆された。現在これらの点についてさらに研究を進めている。
フェイズフィールド法を基点とした数理解析の展開

時刻でパラメター付けされた滑らかな曲面の族が平均曲率流であるとは、各点各時刻において、その曲面の平均曲率ベクトルが曲面の速度ベクトルに等しいときである.フェイズフィールド法および幾何学的測度論の技術を用いて、研究代表者は特異点集合を持ちつつ動くような平均曲率流の一般解の存在証明およびその正則性理論の構築に成功し、幾何学的な時間発展問題における基礎的理論を進展させた.時刻でパラメター付けされた滑らかな曲面の族が平均曲率流であるとは、各点各時刻において、その曲面の平均曲率ベクトルが曲面の速度ベクトルに等しいときである.フェイズフィールド法および幾何学的測度論の技術を用いて、研究代表者は特異点集合を持ちつつ動くような平均曲率流の一般解の存在証明およびその正則性理論の構築に成功し、幾何学的な時間発展問題における基礎的理論を進展させた.フェイズフィールド法では異なる相の分離状況を表す為に、相の指標関数として領域上に定義された連続関数を導入する.相分離面はεの幅の広がりをもった領域として現されるため厳密な意味での界面ではないが、相分離面のトポロジーの変化などに柔軟に対応できる為、近年特に材料科学における数値解析にはなくてはならないものとなっている.この枠組みにおいて界面面積を表すと考えられているのがGinzburg-Landauエネルギー(数学の分野ではModica-Mortolaエネルギーとも呼ばれている)であり、特にミクロ相分離現象を描写するモデルにおいては界面エネルギーが多大な役割を果たすために重要なエネルギーである.このエネルギーがεの0極限において厳密に界面エネルギーを表す事を様々な条件下で当該研究者は過去の研究で示してきたが、それらの拡張、改良として今年度得られた結果は以下である.1.関数uがModica-Mortolaエネルギーの安定的な停留点であるとする.これはつまり、uはエネルギーに付随するオイラー・ラグランジュ方程式を満たし、また第2変分が非負であるとする.このとき、εが十分小さければ、uが表す相分離面は、領域の次元が7以下の場合、常に実解析的で安定的な極小曲面にハウスドルフ距離の意味で近い.これは近年のWickramasekeraによる安定的な極小曲面の正則性理論を用いたもので、彼との共著論文として現在準備中である.2.関数uが移流効果のついたAllen-Cahn方程式の解であるとき、移流項があるソボレフノルムで有界であれば、εの0極限においてuの2相分離界面は移流項付きの平均曲率流になっていることを示した.ソボレフ関数クラスの移流項を持つ平均曲率流の構成は従来の方法では極めて困難であったが、フェイズフィールド法を用いる事ではじめて可能になったものである.論文は現在査読中である.1.2つの相に分離した非ニュートニアン非圧縮性流体を考える.相の分離面は表面張力を持ち、流体に沿って流れると同時に界面面積を小さくする効果をもつ平均曲率流となっていると仮定する.この条件を満たす物理的な問題としては相分離を伴う高分子メルトなどが考えられる.時刻0で初期流速場と相分離面が与えられたとき、それ以降の時刻でこの問題の解が存在するかどうか(いわゆる時間大域存在定理)を考察した.一般に界面は有限時間内に特異点を持つ可能性があり、そのため弱い解を構成する必要がある.この問題をフェイズフィールド法の枠組みを用いる事で解決した.曲率流などの正則化を伴わない2相流体問題の時間大域問題は未解決問題であるが、平均曲率流を用いた正則性を行えば大域解が存在することを示した点が重要である.論文は査読中である.2.前年度にWickramasekeraとの共同研究で、局所安定的なModica-Mortolaエネルギーの停留点の相分離面は次元7以下では滑らかな極小超曲面に近い事を示した.この結果を用いて、1978年にPittsによって示されたコンパクトリーマン多様体内における滑らかな極小超曲面の存在定理の別証明ができないかを考察し、ある程度の道筋をつけた.この極小超曲面は大域的には不安定で局所的には安定的である.Pittsの証明が局所最小カレントの理論を用いたものである一方、このアプローチではフェイズフィールド法を用いておりかつ極めて簡潔な証明になる点が応用上重要である.またその簡潔さより、Pittsのアプローチよりも汎用性がある点も重要である.本研究課題の一環でフェィズフィールド法を用いてその存在定理を示していた、移流効果のついた平均曲率流の弱解についての研究を主として行った.n次元ユークリッド空間内のk次元多様体が時間に依存して変形していくとする.その法線運動速度がそれ自身の平均曲率ベクトルに等しいとき、そのk次元多様体は平均曲率流であるという.さらにその一般化として、法線運動速度が平均曲率ベクトル十与えられた時間に依存して変化しうるベクトル場に等しい場合、移流効果のついた平均曲率流であるという。

幾何学的測度論のバリフォールドを用いることにより、特異点などを自然に内包する平均曲率流の弱解を定義することができるのであるが、その正則性理論はBrakkeの1978年の研究が本質的に唯一のものであった.一方でその内容は専門家にとっても極めて理解するのが困難であり、その後の研究進展を長年阻んでいたのであるが、その中、今年度その正則性理論の見通しの良い新証明および自然な一般化を得ることに成功した.鍵となったのは1990年に発表されたHuiskenによるエネルギー単調性公式を効果的に用いることであり、またBrakkeの証明には欠如していたリプシッツグラフ近似やブローアップの議論を行うこと等である.我々の結果は極小曲面に対する基本的な正則性理論である、Allardの定理の時間発展版となっており、平均曲率流に関する基礎的な定理の一つとなる結果である.これらをまとめた論文は現在査読中である.1.幾何学的測度論の枠組みで考える平均曲率流としてBrakkeの平均曲率流があるが、昨年度の基本的な正則性理論(Kasaiとの共著論文)に関して大きな進展を得たことを受け、そのさらなる研究を進めた。具体的に得た結果としては、昨年度の結果はBrakkeの平均曲率流が古典解になることまでは示していなかったのであるが、その動く曲面の空間方向2回および時間方向1回の微分可能性を示し、古典的な意味で曲面速度が平均曲率に等しい事をほとんど至る所で示すことに成功した。これにより、Brakkeが1978年に主張した、Brakkeの平均曲率流はほとんど至る所で滑らかであるという事実が初めて証明された。2. Brakkeの平均曲率流は一般的に特異点集合を持ちつつ動く事が許される。例えば3重点は曲率流において極めて安定的な振る舞いをすることが様々なレベルで予想される。この点に着目し、特に3重点近傍におけるBrakkeの平均曲率流の正則性理論について研究を行い、ある弱い意味で平均曲率流が3重点に近い場合の正則性理論を構成した。3.フェイズフィールド法の枠組みで、超曲面の速度がその平均曲率と与えられた速度場で決まる時間発展問題について研究した。いわゆる移流項付きのAllen-Cahn方程式の特異摂動を考察する事により、極限で求める界面を得る方法で、弱い解の存在を示した。特徴として、与えられた流速場の正則性は次元的にシャープなクラスであり、従来の等高面法ではその存在が示せなかったものである。これは空間次元が2および3の場合はChun Liu、佐藤規文との共同研究で同様の結果を得ていたが、高棹との共同研究でこの次元の制約を取り払う事に成功した。この研究計画はフェイズフィールド法によって喚起された問題を通じて数理解析の進展を図ることが大きな目的であったのだが、今年度得られた正則性理論の結果は正にフェイズフィールド法によって示されていた平均曲率流の存在無しでは考え付かなかったものである.得られた結果は予想以上に一般的かつ基本的なものであり、当初の計画以上の成果がすでに得られたと言える.24年度が最終年度であるため、記入しない。1.前年度に得られた正則性理論の結果に基づき、平均曲率流の局所正則性理論のさらなる精密化を図る.2.2相流体において、境界面が表面張力を持つ場合のモデルに対して、その弱解の存在定理を研究する.24年度が最終年度であるため、記入しない。
白血病幹細胞化における細胞分化段階と遺伝子異常の関係

本研究では、急性骨髄性白血病(AML)から同定された2種類の遺伝子異常、細胞増殖を促進するclass I異常と分化抑制に作用するclass II異常を導入したヒト臍帯血由来造血細胞を超免疫不全マウスに移植し、白血病を発症するか検討した。class I異常としてFLT3-ITDを、class II異常としてPML-RARAを用いた場合には、FLT3-ITDの共存の有無に関わらず、表現系としても遺伝子発現の面でもヒト急性前骨髄球性白血病(APL)に極めて近い白血病を発症した。本モデルはAPL発症機構の解析に有用と考えられた。急性骨髄性白血病は、細胞増殖を促進する遺伝子異常(class I異常)および細胞分化を抑制する遺伝子異常(class II異常)が作用することにより発症し、一部が幹細胞化して白血病細胞を供給すると考えられているが、詳細については十分に解明されていない。本研究は、前骨髄球の増殖が主体となる急性前骨髄球性白血病(APL)に着目し、class I異常FLT3-ITDおよびclass II異常PML-RARAをヒト臍帯血CD34陽性細胞に導入して、白血病幹細胞の同定を含めた発症メカニズムを明らかにするものである。PML-RARA遺伝子をヒト臍帯血CD34陽性細胞に遺伝子導入したところ、微細なアズール顆粒を有する骨髄芽球様の形態を呈した。これらの細胞におけるPMLの核内分布は微細顆粒状であったが、ATRA投与により、好中球分化に先行して班状分布を呈した。colony assayによる検討では、細胞増殖抑制と骨髄系分化の誘導を認めた。FLT3-ITD遺伝子異常およびPML-RARA遺伝子を導入したヒト臍帯血CD34陽性細胞を、半致死量の放射線照射を受けたNOD/Shiscid,IL-2R γnull(NOG)マウスの尾静脈より移植したところ、3か月後に生着が確認された。これらの細胞は粗大なアズール顆粒を細胞質内に多数有しており、CD13+/CD33+/CD34-/CD117_<W+>/HLA-DR-であった。ExvivoにてATRA存在下で培養すると、成熟好中球への分化が誘導された。以上の所見は、本システムが以前の報告に優るヒトAPL in vivoモデルであると考えられた。今後、白血病細胞の各分画(CD34+/CD38-、CD34+/CD38+、CD34-)の骨髄内分布、および各分画のin vivoにおける白血病発症能の検討を行う予定である。急性骨髄性白血病は、細胞増殖を促進する遺伝子異常(class I異常)および細胞分化を抑制する遺伝子異常(class II異常)が作用することにより発症し、一部が幹細胞化して白血病細胞を供給すると考えられている。本研究は、前骨髄球の増殖が主体となる急性前骨髄球性白血病(APL)に着目し、class I異常FLT3-ITDおよびclass II異常PML-RARAをヒト臍帯血由来CD34陽性細胞に導入して、白血病発症メカニズムを明らかにするものである。我々は、これまでにclass I異常FLT3-ITDおよびclass II異常PML-RARAを臍帯血CD34陽性細胞に導入してNOGマウスに移植することによりAPL様の白血病が発症することを明らかにし、prospectiveなヒトAPL発症モデルを確立した。発症したAPLの遺伝子発現を網羅的に解析すると、APL臨床検体と同様のプロファイルを呈することから、本モデルが遺伝子レベルにおいてヒトAPLに類似することが明らかになった。またこのAPLモデルはPML-RARAが存在すれば、FLT3-ITDが共存の有無にかかわらず一定の割合でAPLを発症した。APL発症前後のDNAについてSNParray解析を行ったところ、大きな異常は存在しなかった。APL幹細胞分画については、CD34+/CD38-、CD34+/CD38+、CD34-/CD33+の3つの分画に分けてPML-RARAキメラ遺伝子を導入したところ、興味深いことにCD34+/CD38+でのみAPL発症した。実際にNOGマウスに発症したAPLにおいても、CD34陽性白血病細胞を骨梁周囲にはほとんど認めてなかった。現在、さらに詳細な解析を行っている。我々はこれまでにPML-RARAを臍帯血CD34陽性細胞に導入してNOGマウスに移植することによりAPLが発症するprospectiveなin vivoモデルを開発してきた。本年度はこのモデルを用いて、APL発症に関する詳細なメカニズムの解析を試みた。昨年までの検討で、PML-RARA遺伝子導入によるAPL発症はCD34+/CD38+分画を用いた場合にのみ認めたことから、より詳細な分画を同定するために、さらにCD123とCD45RAにより詳細に分画して検討したところ、共通骨髄性前駆細胞(common myeloid progenitor:CMP)を用いた場合にAPLのchimerismが最も高くなった。また、2次移植における生着(白血病の維持)が確認された。

この際、骨髄内に直接的に移植する方が静脈へ輸注するよりchimerismが高かった。発症したAPLにおけるclonalityの検索をEGFPに対するプローブによるサザンプロット法とlinear amplification-mediated PCR(LAM-PCR)で検討したところ、各APL発症マウスにoligoclonalな細胞増殖が確認された。さらにLAM-PCR産物についてシークエンス解析を行ったところ、興味深い遺伝子内への挿入が確認された。
癌化におけるde novo DNA methyltransferaseの重要性

(1)NHBE肺癌発生モデルを用いたDNMT3b1/2とDNMT3b3の機能的差異の検討NHB1Eに癌遺伝子であるテロメラーゼ,SV40ラージT抗原,H-rasを順次導入し,細胞を癌化させた.DNMT3bの各spliced formを個別に評価するために,RNA interference (RNAi)の原理を用いて,各spliced formにだけ含まれるシークエンスに対する2本鎖のRNAオリゴヌクレオチドを設計し,癌化したNHBEに対し,すべてのDNMT3b,DNMT3b1/3b2のみ,あるいはDNMT3b3のみを特異的にノックアウトした.特異的にノックアウトされたかどうかは,同様に各spliced formにだけ含まれるシークエンスから設計した,プライマーおよびプローブを用いて,定量的PCRにより確認した.その結果,各siRNA処理により,各spliced formが特異的に抑制されていることが確認された.各spliced formのノックアウトが確認されたこれらの細胞を用いて,コロニー形成能を比較し,癌化能への影響や,DNAメチル化との関連を検討した.コロニー形成能とDNAメチル化の検討により,相互の関連が示唆された.今後,各spliced formに対するRNAiで処理した癌化NHBEを用いて,標的遺伝子の検出を試みる.(2)肺癌臨床検体を用いた検討現在までにinformed consentが得られている数例の凍結標本に対して,microdissection法により,腫瘍部位および正常部位から検体を採取し,DNMT3bの発現を検討した.全DNMT3bに関しては腫瘍部位での発現に差が認められなかったのに対し,spliced formのうちDNMT3b3は腫瘍部位で正常に比し高発現していた.症例の集積とさらなる検証が必要である.(1)NHBE肺癌発生モデルを用いたDMT3b1/2とDMT3b3の機能的差異の検討NHBEに癌遺伝子であるテロメラーゼ,SV40ラージT抗原,H-rasを順次導入し,細胞を癌化させた.DMT3bの各spliced formを個別に評価するために,RNA interference(RNAi)の原理を用いて,各spliced formにだけ含まれるシークエンスに対する2本鎖のRNAオリゴヌクレオチドを設計し,癌化したNHBEに対し,すべてのDMT3b,DNMT3b1/3b2のみ,あるいはDNMT3b3のみを特異的にノックアウトした.特異的にノックアウトされたかどうかは,同様に各spliced formにだけ含まれるシークエンスから設計した,プライマーおよびプローブを用いて,定量的PCRにより確認した.その結果,各siRNA処理により,各spliced formが特異的に抑制されていることが確認された。今後,各spliced formのノックアウトが確認されたこれらの細胞を用いて,コロニー形成能を比較し,癌化能への影響や,DNAメチル化との関連を検討する.機能的差異が存在することが確認されれば,各spliced formに対するRNAiで処理した癌化NHBEを用いて,標的遺伝子の検出を試みる.(2)肺癌臨床検体を用いた検討現在までにinformed consentが得られている数例の凍結標本に対して,microdissection法により,腫瘍部位および正常部位から検体を採取し、DNMT3bの発現を検討した。数例での検討結果であるが、全DNMT3bに関しては腫瘍部位での発現に差が認められなかったのに対し、spliced formのうちDNMT3b3は腫瘍部位で正常に比し高発現していた。今後症例を集積してさらに検証を進めていく予定である。(1)NHBE肺癌発生モデルを用いたDNMT3b1/2とDNMT3b3の機能的差異の検討NHB1Eに癌遺伝子であるテロメラーゼ,SV40ラージT抗原,H-rasを順次導入し,細胞を癌化させた.DNMT3bの各spliced formを個別に評価するために,RNA interference (RNAi)の原理を用いて,各spliced formにだけ含まれるシークエンスに対する2本鎖のRNAオリゴヌクレオチドを設計し,癌化したNHBEに対し,すべてのDNMT3b,DNMT3b1/3b2のみ,あるいはDNMT3b3のみを特異的にノックアウトした.特異的にノックアウトされたかどうかは,同様に各spliced formにだけ含まれるシークエンスから設計した,プライマーおよびプローブを用いて,定量的PCRにより確認した.その結果,各siRNA処理により,各spliced formが特異的に抑制されていることが確認された.各spliced formのノックアウトが確認されたこれらの細胞を用いて,コロニー形成能を比較し,癌化能への影響や,DNAメチル化との関連を検討した.コロニー形成能とDNAメチル化の検討により,相互の関連が示唆された.今後,各spliced formに対するRNAiで処理した癌化NHBEを用いて,標的遺伝子の検出を試みる.(2)肺癌臨床検体を用いた検討現在までにinformed consentが得られている数例の凍結標本に対して,microdissection法により,腫瘍部位および正常部位から検体を採取し,DNMT3bの発現を検討した.全DNMT3bに関しては腫瘍部位での発現に差が認められなかったのに対し,spliced formのうちDNMT3b3は腫瘍部位で正常に比し高発現していた.症例の集積とさらなる検証が必要である.
昆虫サイトカインGBPの作用機構の解明:GBP受容体の単離と高次構造解析

アワヨトウから単離された昆虫サイトカインGrowth-blocking peptide(GBP)の作用機構の解明を目的として、GBPの作用よりリン酸化される血球タンパク質の解析を行った。その結果、GBP作用後急速にチロシンリン酸化が生じる分子量77kDaの膜タンパク質(P77)を発見した。初年度、P77を精製しcDNAを単離した結果、p77はシグナルペプチド配列、細胞外領域、膜貫通領域、細胞内領域からなる一回膜貫通型の新規の分子と推測された。本年度は以下の項目を実施し結果を得た。1、P77発現部位RT-PCR法を用いて、血球、脳での発現を確認した。抗P77抗体を用いた免疫組織化学的解析により、血球ではプラズマ細胞のみで、脳では後部中央の2対の神経細胞での特異的発現を確認した。また、プラズマ細胞では細胞膜上と核周辺で局在していた。2、P77相同遺伝子ヨトウガ血球、ハスモンヨトウ血球、培養細胞Sf9より、相同性遺伝子を単離した。得られた分子は、アワヨトウP77と同様に、一回膜貫通型の膜タンパク質であり、細胞内領域に特に相同性の高い4つの領域を有していた。アワヨトウ血球のp77の発現を特異的に抑制し、その表現系を解析するために2本鎖P77RNA(dsRNA)を作成した。In vitroでdaRNAの効果を解析した結果、p77のmRNAの減少が確認された。4、P77糖鎖解析P77の1次構造から予想される分子量は約60kDaであるが、実際SDS-PAGEによる解析では77kDaである。P77を免疫沈降法を用いて精製し、これにO-グリコシダーゼまたはN-グリコシダーゼを作用させたところN-グリコシダーゼでのみ分子量が減少した事から、細胞外領域にN-グリコシド結合で糖鎖が付加されていることを確認した。アワヨトウ幼虫から単離された昆虫サイトカインGrowth-blocking peptide (GBP)の作用機構の解明、及びGBP受容体の同定を自的として、GBPの作用によりリン酸化される血球タンパク質の解析を行った。その結果、GBP作用後15分で急速にチロシンリン酸化が生じる分子量77kDaの膜タンパク質(P77)を発見した。P77のリン酸化はGBPの作用後早期に起こり、血球細胞の膜成分への局在が予想された事から、GBP受容体そのものである可能性が示唆された。そこで、P77の1次構造決定に向けて精製を試みた。アワヨトウ幼虫7000頭から血球を採取し、GBPを5分間作用させた血球のタンパク質を調整した。この抽出液を出発材料とし、鉄イオンアフィニティークロマトグラフィー、抗リン酸化チロシン抗体を用いたイムノアフィニティークロマトグラフィーによってチロシンリン酸化タンパク質の精製を行った。続いて精製されたP77のトリプシン分解物をMAS/MAS解析することにより、数カ所の部分ペプチド配列を得た。この配列を基にしてプライマーを設計し、PCRにより部分的なcDNAを増幅し、最終的には血球cDNAライブラリーより全長cDNAを得た。ホモロジー検索、ドメイン検索の結果、P77は一回膜貫通型の新規の受容体様分子と推測された。また、予想される細胞内ドメインには多数のチロシン残基、非受容体型チロシンキナーゼが結合するITAM (immunoreceptor tyrosine-based activation motif)が存在していた。現在、昆虫細胞への発現系を準備しており、P77がGBP受容体か否か、血球細胞内シグナル伝達系においてどのような役割を果たしているかを明らかにする予定である。アワヨトウ幼虫から単離された昆虫サイトカインGrowth-blocking peptide(GBP)の作用機構の解明、及びGBP受容体の同定を目的として、GBPの作用によりリン酸化される血球タンパク質の解析を行った。その結果、GBP作用後1分で急速にチロシンリン酸化が生じる分子量77kDaの膜タンパク質(P77)を発見した。昨年度、P77を精製しcDNAの単離をした結果、p77はシグナルペプチド配列、細胞外領域、膜貫通領域、細胞内領域からなる一回膜貫通型の新規の受容体様分子と推測された。1、P77の組織特異的発現様式RT-PCR法、イムノブロット法を用いて、血球、外皮、脂肪体、マルピーギ管、中腸、脳での発現を調べた結果、血球、脳で特異的に発現していた。2、GBPとの結合解析S2細胞にP77の全長を含む発現ベクターを導入し、恒常的にP77を発現する細胞系を構築した。これを用いて^<125>I-GBPの結合を解析した結果、特異的結合は見られなかった。現在GBPとの結合には他分子が協調的に関与していると推測している。3、細胞外領域の発現系の構築他分子と相互作用ができると推測される細胞外領域の高次構造を解析する目的で、大腸菌を用いた多量発現系に取り組んだ。P77の細胞外領域に相当する部分をGST融合タンパク質として発現させ、可溶化タンパク質として得られる最適条件を検討し、数ミリグラムを精製できる方法を構築した。

4、ヨトウガからの相同分子の同定近縁のヨトウガ血球より、p77相同分子をRT-PCR、3'-RACE、5'-RACE法を用いて同定した。得られた分子は、557アミノ酸残基からなり、アワヨトウp77との相同性は61%であった。現在、この2分子の保存領域を利用してトランスジェニック操作が可能なカイコガからの相同分子の単離にも取り組んでいる。アワヨトウから単離された昆虫サイトカインGrowth-blocking peptide(GBP)の作用機構の解明を目的として、GBPの作用よりリン酸化される血球タンパク質の解析を行った。その結果、GBP作用後急速にチロシンリン酸化が生じる分子量77kDaの膜タンパク質(P77)を発見した。初年度、P77を精製しcDNAを単離した結果、p77はシグナルペプチド配列、細胞外領域、膜貫通領域、細胞内領域からなる一回膜貫通型の新規の分子と推測された。本年度は以下の項目を実施し結果を得た。1、P77発現部位RT-PCR法を用いて、血球、脳での発現を確認した。抗P77抗体を用いた免疫組織化学的解析により、血球ではプラズマ細胞のみで、脳では後部中央の2対の神経細胞での特異的発現を確認した。また、プラズマ細胞では細胞膜上と核周辺で局在していた。2、P77相同遺伝子ヨトウガ血球、ハスモンヨトウ血球、培養細胞Sf9より、相同性遺伝子を単離した。得られた分子は、アワヨトウP77と同様に、一回膜貫通型の膜タンパク質であり、細胞内領域に特に相同性の高い4つの領域を有していた。アワヨトウ血球のp77の発現を特異的に抑制し、その表現系を解析するために2本鎖P77RNA(dsRNA)を作成した。In vitroでdaRNAの効果を解析した結果、p77のmRNAの減少が確認された。4、P77糖鎖解析P77の1次構造から予想される分子量は約60kDaであるが、実際SDS-PAGEによる解析では77kDaである。P77を免疫沈降法を用いて精製し、これにO-グリコシダーゼまたはN-グリコシダーゼを作用させたところN-グリコシダーゼでのみ分子量が減少した事から、細胞外領域にN-グリコシド結合で糖鎖が付加されていることを確認した。
網羅的なゲノム解析によるテーラーメイド腫瘍抗原の同定

腫瘍における体細胞遺伝子変異のうちアミノ酸置換を伴うものは、非自己として細胞傷害性T細胞(CTL)に認識されるため、腫瘍関連抗原となり得る。以前より我々が開発しているCD40活性化B細胞を用いる方法は、10-20mlと少量の血液より抗原提示細胞とCTLの双方を樹立可能であるため、急性骨髄性白血病の治療として同種造血幹細胞移植を行った症例を対象として、これら変異に基づく抗原の同定を試みた。計2例より文書同意を得て研究を行ったが、FLT3 Y572C変異を認めた症例ではT細胞の反応が確認できず、またもう1例では対象の変異を絞り込むことができず、同定には至らなかった。次世代シーケンス技術の進化によって、各患者の腫瘍細胞における体細胞遺伝子変異を網羅的に解析することが可能となった。これらの変異のうちアミノ酸置換を伴うものは、自己体内には存在しない非自己の抗原であるため、HLAクラスIのいずれかに提示され、細胞傷害性T細胞(CTL)の標的となり得る。腫瘍における体細胞遺伝子変異の総数が10個程度と少ない急性骨髄性白血病を対象とし、免疫による抗腫瘍効果が確立している同種造血幹細胞移植において、移植後の患者リンパ球の白血病体細胞遺伝子変異に由来するエピトープの認識を解析する。なお、HLAについては、患者のもつすべてのHLAクラスIを対象とする。本研究の成果は、同種造血幹細胞移植における腫瘍特異的ドナーリンパ球輸注や固形がん患者も含めたテーラーメイド腫瘍免疫療法の開発の基礎となる。・本研究を「網羅的なゲノム解析によるテーラーメイド腫瘍抗原の同定」をしてプロトコール作成し、当院ヒトゲノム・遺伝子解析研究倫理審査委員会に申請、承認を受けた。・該当患者1名より文書同意を得て、末梢血単核球を分離、凍結保存するとともに、初診時白血病細胞の全エクソン解析を開始した。・人工遺伝子作成の準備として、GSリンカー部分を含めたプライマーを作成し、目的の遺伝子配列をクローニング、それぞれのPCRプロダクトをoverlappingPCR法で結合し、ダイレクトシークエンス法にて、正しく合成されていることを確認した。・抗原提示細胞として用いるCD40活性化B細胞作成について、現在NIH3T3由来細胞株を用いているが、抗CD40抗体による方法でも作成を行い、CD40-B細胞樹立を確認した。・該当患者2名より文書同意を得た。1名の初診時白血病細胞のターゲットシークエンスを行い、FLT3 Y572C変異、BCORL1 A581T変異を検出した。ヒトゲノム・遺伝子解析研究倫理審査委員会での承認が昨年度12月と時間がかかったが、以後生殖細胞系列遺伝子変異を含む遺伝子変異解析を行っている。

・抗原提示細胞として用いるCD40活性化B細胞作成について、現在NIH3T3由来細胞株を用いているが、抗CD40抗体による方法でも作成を行い、CD40-B細胞樹立を確認した。本研究について2症例より同意を得て、網羅的なゲノム解析によりアミノ酸置換を伴う遺伝子変異を確認、細胞傷害性T細胞の認識する抗原ペプチドについて順次スクリーニングを行っているが、現在までに同定できたものはなく、対象となる遺伝子変異の再検討、およびT細胞クローンのスクリーニングへの追加を必要としているため。次世代シーケンス技術の進化によって、各患者の腫瘍細胞における体細胞遺伝子変異を網羅的に解析することが可能となった。これらの変異のうちアミノ酸置換を伴うものは、自己体内には存在しない非自己の抗原であるため、HLAクラスIのいずれかに提示され、細胞傷害性T細胞(CTL)の標的となり得る。腫瘍における体細胞遺伝子変異の総数が10個程度と少ない急性骨髄性白血病を対象とし、免疫による抗腫瘍効果が確立している同種造血幹細胞移植において、移植後の患者リンパ球の白血病体細胞遺伝子変異に由来するエピトープの認識を解析する。なお、HLAについては、患者のもつすべてのHLAクラスIを対象とする。本研究の成果は、同種造血幹細胞移植における腫瘍特異的ドナーリンパ球輸注や固形がん患者も含めたテーラーメイド腫瘍免疫療法の開発の基礎となる。本研究を「網羅的なゲノム解析によるテーラーメイド腫瘍抗原の同定」をしてプロトコール作成し、病院ヒトゲノム遺伝子解析研究倫理審査委員会に申請、承認を受けた。該当患者2名より文書同意を得た。1名の初診時白血病細胞のターゲットシークエンスを行い、FLT3 Y572C変異、BCORL1 A581T変異を検出した。また、他1名の再発時白血病細胞検体より全エクソンシークエンスを行った。人工遺伝子作成の準備として、GSリンカー部分を含めたプライマーを作成し、目的の遺伝子配列をクローニング、それぞれのPCRプロダクトをoverlappingPCR法で結合し、ダイレクトシークエンス法にて、正しく合成されていることを確認した。抗原提示細胞として用いるCD40活性化B細胞作成について、現在NIH3T3由細胞株を用いているが、抗CD40抗体による方法でも作成を行い、CD40-B細胞樹立を確認した。腫瘍における体細胞遺伝子変異のうちアミノ酸置換を伴うものは、非自己として細胞傷害性T細胞(CTL)に認識されるため、腫瘍関連抗原となり得る。以前より我々が開発しているCD40活性化B細胞を用いる方法は、10-20mlと少量の血液より抗原提示細胞とCTLの双方を樹立可能であるため、急性骨髄性白血病の治療として同種造血幹細胞移植を行った症例を対象として、これら変異に基づく抗原の同定を試みた。計2例より文書同意を得て研究を行ったが、FLT3 Y572C変異を認めた症例ではT細胞の反応が確認できず、またもう1例では対象の変異を絞り込むことができず、同定には至らなかった。
クエリをサポートする効率的なグラフのコード化に関する研究

長方形を幾つかの長方形に分割したものを、矩形描画という。矩形描画をわずか5m/3bitのみを用いて符号化する手法を設計した。これに、o(n)bitのテーブルを追加することにより、矩形描画に関する様々なクエリを高速に計算できるようなデータ構造も開発した。本手法により、巨大な矩形描画を、少量もメモリに格納しているにもかかわらず、基本データを高速に取り出すことができるようになった。例えば指定した2つの面が隣接しているかどうかや、指定した面が、隣接する他の面の東西南北のいずれの方向にあるか、等である。また、4連結極大平面グラフや、一般の平面グラフを高速に、抜けも重複もなく列挙するアルゴリズムを開発した。一般に列挙アルゴリズムの出力は膨大な個数のグラフを出力するので、出力を効率よく、圧縮する技術が高速化の鍵となる。今回開発した、2つのアルゴリズムでも、対象のグラフを効率よく、圧縮する符合を開発している。これら、および関連する結果を2007年度は、6件の国際会議論文として発表できた。また、一部の手法の簡易実装し、おおまかではあるが、その性能を計測することができた。この部分については今後の研究でも継続していく予定である。大規模なグラフを計算機上に、コンパクト、かつ、機能的、かつ、効率的に格納する新しいデータ構造を開発することが本研究の目的である。本年度は、方形描画されたグラフを、わずか5m/3 bitの文字列を用いて格納する手法を設計した。ここでmはグラフの辺の本数である。また、これにo(n)bitの文字列を追加することにより、格納したグラフの方形描画に関する各種情報をO(1)時間で計算する手法も設計した。この結果は6月に開催される国際会議AAIM2007(オレゴン州、USA)に採録されており、高く評価されている。また、既存の方法に関して様々な調査を行っている。理論的に最適な方法でも、実用化に際して多くの困難があることがわかり、現在、これを克服すべく、研究を続けている。具体的には、数百万数億個の点をもつグラフに対象をしぼって、これを効率的に格納する手法を開発中である。理論的に最適な方法では、これよりもはるかに大きなグラフでないとその有用性が発揮できないことがわかった。また、グラフのコンパクトな表現に、深く関連する、グラフの列挙アルゴリズムやグラフの一様ランダム生成アルゴリズムについても、幾つかの成果を得ている。2006年度は4編の論文が学術雑誌に掲載となった。長方形を幾つかの長方形に分割したものを,矩形描画という。これに,o(n) bitのテーブルを追加することにより,矩形描画に関する様々なクエリを高速に計算できるようなデータ構造も開発した。本手法により,巨大な矩形描画を,少量もメモリに格納しているにもかかわらず,基本データを高速に取り出すことができるようになった。例えば指定した2つの面が隣接しているかどうかや,指定した面が,隣接する他の面の東西南北のいずれの方向にあるか,等である。また,4連結極大平面グラフや,一般の平面グラフを高速に,抜けも重複もなく列挙するアルゴリズムを開発した。一般に列挙アルゴリズムの出力は膨大な個数のグラフを出力するので,出力を効率よく,圧縮する技術が高速化の鍵となる。今画開発した,2つのアルゴリズムでも,対象のグラフを効率よく,圧縮する符合を開発している。これら,および関連する結果を2007年度は,6件の国際会議論文として発表できた。また,一部の手法の簡易実装し,おおまかではあるが,その性能を計測することができた。この部分については,今後の研究でも継続していく予定である。
電子線励起・深紫外窒化物半導体レーザ

本研究課題では医療・バイオ・微細加工など広く応用分野があると考えられる電子線励起によるAlGaN系紫外レーザの実現を目指して研究を行った。レーザ発信可能な電子線源を組み込んだ装置がないことから装置開発からはじめ、電子線シミュレータを活用することによって電子線励起特有の問題があることを明らかにした。さらにデバイスシミュレータを活用することによって、最適な構造を明らかにし、最終的にAlGaN系電子線励起レーザを実現した。本研究課題では、未踏領域波長である330nm以下の電子線注入型・深紫外窒化物半導体レーザの実現を目指して研究を行う。深紫外レーザは医療、環境分野、殺菌、化学分析や3Dプリンター等の工業的な応用も期待でき実現できれば学術的および産業的な価値は極めて大きい。本研究グループは2000年前後から電流注入型・紫外半導体レーザの検討を進めてきており、発振波長が350nmの紫外線レーザの発振実績を持っている。その一方で、高い自由正孔濃度を持つp型AlGaNの実現が現状されていないことから、発振波長の短波長化が困難な状況となってきている。本研究課題では、それを打破するために電子線励起という窒化物半導体系では本グループのみが報告している方法を適用し、未踏領域波長の深紫外レーザを実現させる。初年度は、その研究目標を実現するために、特に2つの課題に関して検討を行った。1つ目の検討としてAlGaN系材料を用いたレーザ構造の作製技術において結晶成長およびデバイスプロセス技術の観点から最適化を進めた。具体的には、MOVPE法を用いて最適な層構造さらにはドーピング濃度などの最適化を進めること、さらには光共振器の作製技術に関して詳細な検討を行った。その結果として光励起測定によって閾値パワー密度を算出した結果として、世界最高レベルの低閾値光励起紫外レーザを実現可能であることを見出した。2つ目の検討として、電子線源の納入を進めた。納入メーカーと10回以上の検討を進めた結果、短パルスかつハイパワー励起が可能な電子線源の導入を実現した。平成28年度はこれらの電子線源およびAlGaNレーザ構造を用いて当初の目的を達成することを目標に研究を推進する。本研究課題では、当初の予定通り電子線源の導入を行い、また光励起による低閾値AlGaN系レーザの作製技術を確立した。これらの検討にはデバイスシミュレータの活用が重要であるとして、その検討を進めてきたが、デバイスシミュレータが当初の予定以上に検討が順調に進んだため、素早く最適な構造を作製することが可能となった。また光共振器に関しても、同様に当初劈開法によって同共振器を作製する予定であったが、ドライエッチング法とウェットエッチング法を組み合わせることによって、再現性良くかつ高性能な光共振器を作製することが可能となった。これらの多くは当初の予定では、平成28年度に実施するべき内容で、当初の計画以上に進展しているとしてよいと判断した。平成28年度は、電子線励起レーザの発振を確認することに加え、当初平成29年度に実施すべき縦モード・横モードの解析や低閾値化の検討を進めたいと考えている。本研究課題では、未踏領域波長である深紫外領域の電子線励起の半導体レーザを実現することを目標に研究を進めてきた。半導体レーザを実現するためには、材料自体が光学的な利得を有していること、光共振器を形成することが可能であること、さらにキャリア(電子・正孔)を活性層中に注入することが必要である。紫外発光材料として、窒化物半導体(GaN、AlN、InNおよびそれらの混晶)は高いポテンシャルを有しており、既に高効率な紫外LEDが実現され、現在社会実装が進められつつある。その一方で、同材料は直接遷移型半導体であるため、半導体レーザとしての高いポテンシャルがあるとされ、世界的に研究化が進められている。これまでに、光励起の手法により、同材料は光学的な利得を有していること、また光共振器を形成することが可能であることが確認されてきた。その一方で、キャリアの注入に関しては、高い正孔濃度を持つp型AlGaN結晶を得ることが非常に困難であるため、一般的な半導体レーザで用いられているpn接合による方法が用いられていない。本研究課題では、それらの問題を打破するために、電子線励起という新しい方法を適用することを検討してきた。平成27年から電子線励起の装置を導入し、紫色領域でのレーザ発振を確認し、平成28年度は紫外領域の電子線励起を検討してきた。また、加速電圧によって、注入されるキャリアの効率が変化することが確認されたため、電子線シミュレータを導入し、電子線の軌跡を解析することによって効率よく発光層を励起できる方法を検討してきた。結果として、350nm帯の紫外線レーザを実現することが確認できた。さらに光励起の方法を活用することによって、200nm帯の低閾値化にも成功した。最終年度となる平成29年度は、これらの成果を活用し、200nm帯の電子線励起レーザおよびその学理を探求する予定である。本研究課題では、電子線励起による紫外線レーザを実現することを目的としてきた。初年度は、レーザ発振に必要な電子線源の設計から装置導入を進め、電流注入実績のあるGaInN活性層を用いたレーザの実証まで確認をした。

その結果を用いて、平成28年度は電子線励起による紫外線レーザを検討し、結果としてGaN/AlGaN活性層を用いた紫外線レーザを実現するに至っており、当初予定していた研究内容を順調に進めてきたと考えている。また、学理に関しても検討を進めており、加速電圧や電子線パルス幅、スポットサイズの依存性を検討した結果から、これまでに加速電圧の違いによって活性層の励起効率が変化することを確認した。それらを学術的に理解且つ制御することをめざし、電子線シミュレータを導入し、解析を行った結果、電子線の軌跡を理解することによって最適な加速電圧、さらに電子線励起レーザを実現するのに最適な構造に関しての知見を深めた。さらに最終年度に向けて光励起法を用いて200nm帯のレーザ構造の最適化を進めており、サファイア基板上に作製したAlNテンプレート、およびAlN基板上に作製したAlNテンプレートなどを用いて低閾値レーザの実現を進めており、最終年度で実現を目指す200nm帯の電子線励起・深紫外レーザを実現するうえで非常に良い知見を得たと考えている。これらの結果は、学術論文や国内・国際学会で発表しており、国際学会の招待講演にも3回選出されており、高い学術的な評価を得ていると考えられる。本研究課題では、電子線を励起源とするAlGaN/GaN系の紫外線レーザを実現することを目標に研究を行った。レーザ発振に必要な電子線装置を実現すること、レーザ発振可能な高品質な結晶を作製すること、さらに光共振器を形成することが当初の課題としてあり、それらを研究代表者を中心に最適化を進めた。結果として、当初の目的通りAlGaN/GaN系量子井戸構造を用いることによって、350nm帯のレーザ発振をこの波長域で世界で初めての発振を実現した。さらに学術的な理解を進めるために電子線の加速電圧や活性層の構造に関してデバイスシミュレータ、電子線のシミュレータの活用、さらには実験的な検証によって低閾値で発振するのに必要な構造の検討を行った。これらの検討を進めるにしたがって光出力もmWを超える高出力化が達成された。また光励起との比較をはじめとして様々な検討を行うことによって電子線励起レーザの有用性を検討した。また、付帯的な成果として高品質なAlGaN結晶の実現、従来困難とされていたAlGaN系材料のウェットエッチング法の確立、さらには高感度な受光素子の実現などの成果を達成した。今後は、さらなる短波長レーザの実現などの課題が残されている。2017年度の研究によって光励起では280nm帯のレーザを実現することができた。その一方で、350nm帯のレーザとはレーザ発振に必要な光励起パワー密度が高いという課題が残されており、結晶品質のさらなる向上、さらには光学ロスの低減などが必要であると考えられる。以上のように、本研究課題は当初の研究目的を達成し、さらに付随した成果を得た。その一方で、さらに本研究を発展させ、最終的に実用化可能なデバイスとして発展させることが重要だと思われる。本研究課題では医療・バイオ・微細加工など広く応用分野があると考えられる電子線励起によるAlGaN系紫外レーザの実現を目指して研究を行った。レーザ発信可能な電子線源を組み込んだ装置がないことから装置開発からはじめ、電子線シミュレータを活用することによって電子線励起特有の問題があることを明らかにした。さらにデバイスシミュレータを活用することによって、最適な構造を明らかにし、最終的にAlGaN系電子線励起レーザを実現した。平成27年度の取り組みを引き続き実施する。
神経細胞の活動依存的なリボソーム機能の調節機構とシナプス可塑性

シナプスの伝達効率は、神経細胞の活動性が高い場合に増強される。この現象は記憶の分子機構と考えられている。我々は、これまでの報告から、リボソームタンパク質(RP)の中のRPS19のリン酸化が、シナプス局所でのタンパク質産生を増加させる可能性を考えた。今回、試験管内、神経細胞の培養系および脳内での検討から、CaMキナーゼIが、神経細胞の活動依存的にRPS19をリン酸化することで、リボソームの形成を調節していることを示唆する結果が得られた。これらの研究成果は、記憶の分子機構の理解に大きく貢献するものと期待される。シナプス可塑性の電気生理学的モデルとして、長期増強現象(LTP)が知られている。現在でも、LTPの中・長期間の維持に関与する分子機構については不明の点が多い。我々は、リボソームタンパク質(RP)のリン酸化が、LTPの中・長期間の維持に関与している可能性を考えた。今回、LTPで活性化されることが知られているCaMキナーゼによるRPS19のリン酸化反応について検討した。1)RPS19は、調べた酵素の中でCaMキナーゼIαによってのみ、試験管内で強くリン酸化された。2)リン酸化される可能性があるセリンあるいはトレオニンをアラニンに置換した複数の変異体を作製した。変異体のリン酸化の実験から、59番目のセリン残基(Ser59)が主にリン酸化されることが示唆された。3)Ser59がリン酸化されたRPS19に対する抗体を作製した。抗体を用いた免疫プロット法により、本部位がリン酸化されることが確認された。4)培養神経細胞であるGT1-7細胞内でのRPS19のリン酸化反応について検討した。抗体を用いた免疫プロット法によりRPS19が細胞内でもリン酸化されていることが明らかになった。さらに、そのリン酸化反応は、CaMキナーゼIαの阻害剤で抑制された。すなわち、細胞内でもCaMキナーゼIαがRPS19をリン酸化していることが示唆された。5)ラットの脳内でもRPS19がリン酸化されていた。細胞分画法による検討で、そのリン酸化は、リボソームに組み込まれたRPS19で強いことがわかった。これらの検討から脳内でのRPS19のリン酸化が初めて明らかになった。ヒトの遺伝病の研究から、Ser59がフェニルアラニンに変異するとリボソーム形成が阻害されることが知られている。すなわち、本部位のリン酸化によりリボソーム形成が調節されている可能性がある。我々は、神経細胞でのリボソーム蛋白質(RP)のリン酸化が、リボソーム機能を調節することで、シナプス可塑性に関与している可能性を検討している。以前に、CaMキナーゼIαがRPの一つであるRPS19を強く燐酸化することを見いだした。今回、1)RPS19に結合することが知られているPIM1キナーゼによってもRPS19が燐酸化されることを見いだした。2)PIM1キナーゼによる燐酸化部位を検討し、CaMキナーゼIαと同様に59番目のセリン残基(Ser59)をリン酸化することを見いだした。3)Ser59が燐酸化されたRPS19に対する抗体を作製した。培養神経細胞であるGT1-7細胞での、細胞分画後の抗体を用いた免疫プロット法により、燐酸化されたRPS19は核小体に多量に存在することが明らかになった。4)RPS19の燐酸化は、CaMキナーゼIαの阻害剤とPIM1キナーゼの阻害剤により抑制された。5)以前に我々が見いだしたRPS19結合蛋白質とRPS19の結合実験により、Ser59の燐酸化は結合を増強させることが明らかになった。RPS19結合蛋白質は核小体に局在することから、RPS19の燐酸化はRPS19を核小体に移行させ、核小体でのリボソーム形成を促進させている可能性が考えられる。ヒトの遺伝病の研究から、Ser59がフェニルアラニンに変異するとRPS19の核小体への移行が障害されることも知られている。今後は、GT1-7細胞を興奮性神経伝達物質で刺激した時のRPS19の燐酸化とリボソーム形成の変化を詳細に検討する予定である。我々は、神経細胞でのリボソーム蛋白質(RP)のリン酸化が、リボソーム機能を調節することで、シナプス可塑性に関与している可能性を検討してきた。平成21年度までの研究で、CaMキナーゼIαとPIM1キナーゼがRPの一つであるRPS19を強く燐酸化することを見いだした。リン酸化部位は主に59番目のセリンであった。さらに、リン酸化特異抗体を作製し、様々な条件でのリン酸化反応の変化を検討して来た。

今回、神経細胞に多量に存在する微小管の破壊によるRPS19のリン酸化の変化について検討した。1)培養神経細胞(GT1-7細胞)をコルセミドで処理し、微小管を破壊させた。微小管の破壊により、RPS19のリン酸化が著明に増加した。2)コルセミド処理によるRPS19のリン酸化の増加は、神経細胞以外の培養細胞でも認められた。すなわち、コルセミド処理により活性化されるタンパク質リン酸化酵素が多種類の細胞に存在する可能性が示唆された。3)これらの細胞でのコルセミド処理によるRPS19のリン酸化は、CaMキナーゼIαとPIM1キナーゼの阻害剤によっては抑制を受けなかった。4)細胞染色による検討では、コルセミド処理によりリン酸化されたRPS19は、細胞周期のM期にある細胞で増加していた。5)培養肺胞上皮細胞を用いた研究で、微小管の破壊により活性化されるタンパク質リン酸化酵素の存在が示唆された。ヒトの遺伝性貧血症の研究から、リン酸化を受けない変異RPS19を発現する細胞では、リボソーム形成が障害されることも知られている。今後は、微小管の破壊により活性化され、RPS19をリン酸化する酵素を同定し、RPS19のリン酸化反応の生理的意義を様々な培養細胞を用いて検討する予定である。