hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
新規に確立したヒト組織モデルによるＥＢウイルス感染病態解析と薬剤スクリーニング

この感染組織から単離したT/NKリンパ球を、フローサイトメータを応用した感染細胞同定法(以下、FISH法)により解析したが、EBV抗原陽性となる細胞数が検出限界に近く、明らかな結論を得ることができなかった。一方、感染モデル組織切片を染色することにより、感染細胞の特定がより明確に行えないか、現在検討中である。FISH法は、染色細胞を変性させて、細胞内のEBV抗原を染色するため、細胞表面抗原の解析がやや困難である。特に、細胞表面を多重染色できれば、感染細胞をより詳細に解析できるため、検討を加え、4種類の表面抗原を同時に解析できる系を確立した。この手法により、感染モデルから単離したリンパ球の性状をより詳しく解析でき、今後解析を進める予定である。(1) EBV感染ヒト組織モデル、FISHによる感染細胞同定法、および感染細胞におけるEBV関連遺伝子発現定量法を利用し、EBVが病初期に感染する細胞(特にリンパ球)の性状を、細胞の表面抗原や発現遺伝子のパターンから明らかにする。-->感染した細胞表面抗原を染色して解析できたが、感染細胞数が少なく、十分な情報が得られなかった。そのため、現在は、組織切片を多重染色し解析を行っている。(2) EBV感染モデルを用いて、細胞株でのみ抗ウイルス効果が報告されている薬剤や、研究中に新たに報告された新規薬剤候補のヒト感染組織における効果を検討する。-->細胞増殖抑制効果が知られているラパマイシンのEBV感染細胞株への効果を分子生物学的に解析し、感染モデル動物における抗腫瘍効果について検証した。(3)小児期の難治性のEBV関連疾患である血球貪食性リンパ組織球症や慢性活動性EBV感染症の末梢血中の感染細胞に関する性状解析を平行して行い、得られた結果とヒト感染モデルで解析した感染細胞の性状を比較検討する。さらに、(難治性EBV関連疾患の代表として)慢性活動性EBV感染症患者からEBV感染細胞を分離し、免疫不全マウスに投与することで、ヒトでの病態が再現できるかどうかを検討する。-->EBV関連血球貪食性リンパ組織球症における感染細胞の性状を経時的に解析した。また、EBV感染細胞を分離し、免疫不全マウスに投与することで、腫瘍を形成するマウスモデルを導入し、上記2)の解析に役立てた。感染モデルを用いて、EBVの感染初期の病態について、FISH法および組織染色を用いて解析を継続している。また、FISH法を改良した。(1) EBV感染ヒト組織モデルの組織切片を、ウイルス抗原と細胞表面抗原を多重染色することにより解析する。(2)ラパマイシン以外の薬剤について新たに検討する(3)マウスモデルの導入はできたが、ヒト組織モデルにおける解析との比較を今後進めていきたい。EBV感染モデルから単離したリンパ球について、改良したFISH法による解析を進める。また、本モデルを使用した新規薬剤のスクリーニングについても検討を行う予定。ヒト組織モデルおよびマウスモデルを用いた実験には、多大な労力を要するため、実験助手の補助が必須である。また、研究成果の報告や当該分野の進展についての情報交換のため、国内外の学会への参加も予定している。研究に要する試薬類も購入する予定。消耗品として、EBV感染モデル培養に必要な試薬、フローサイトメータ用の抗体、使い捨ての実験器具が必要である。
バソプレッシン受容体(V_1)の脱感作現象の成立機序に関する分子生物学的研究

1)我々は、既にヒト血小板を用いた研究により、Vasopressin(V_1)受容体の急性脱感作現象を血小板凝集反応、細胞内遊離Ca^<2+>濃度の測定を行なうことにより確認し、急性脱感作現象が受容体数の低下によるものではなく、受容体とPhospholipase C(PLC)の脱共役による可能性が強い事を示してきた。今回、IP_3を直接測定する事により、急性脱感作現象が少なくともIP_3産生の段階で生じている事を確認した。その経過中に急性脱感作現象はそれ単独では血小板活性化作用を有さない低濃度のVasopressinで引き起こされる事を見いだした。また、低濃度のVasopressinが急性同種脱感作現象を引き起こす一方で、collagenによる血小板活性化閾値を低下させることも見いだした。これは、血小板活性化には非生理的濃度のVasopressinが必要であることから、従来疑問視されてきたV_1受容体を介する血小板活性化の臨床生理学的意義を新たに見いだしたものであると考えられる。2)次に、Vasopressin受容体(V_1)の脱感作現象の分子生物学的機序を検討する目的で、ラットのV_1受容体のcDNAのcloningを行った。発表されたV_1受容体のcDNAをもとにしてPCR法で約1.4kbのプローブを作成し、ラット肝cDNAライブラリーより実際にV_1受容体のcDNAのクローンを取り出しその構造解析を行った。今後、これらのmutant geneを作製し、発現ベクターにサブクローニングする。この発現ベクターをCos細胞に移入し、細胞膜上に発現したmutant受容体の機能解析を行う予定である。予定された研究の完成にはさらに時間を要する。
デジタル情報を搭載した科学技術教材と双方向教育システムの開発

CLUSPIシステムを用いたデジタル情報坦体採用により、印刷物および物体表面とデジタルデータとの融合を画期的に発展させることができた。また、後者を実現するために、レーザー照射によるクラスターパターン刻印技術の開発が不可欠となり、そのための技術開発を行った。このようなデジタル情報担体を利用したe-learningシステムは、学習者により具体性を持った高いレベルの理解度Tangible TEL (T-TEL)を提供することができる。本研究では、ある規則性をもって生成されたクラスターパターン(たとえば、ドットやバーなどのグラフィックオブジェクトの組み合わせ)から、平面上の絶対座標を特定する新規技術CLUSPI (Cluster Pattern Interface)を応用して、文章などを印刷した紙媒体教材と関連する音声や画像、映像などのデジタル情報を直接インタラクティブに結合させる方法を提案する。それにより学生の理解度を高め、学習過程を促進する教育環境、特に科学技術教育とグループ単位の学習法に応用する。また、このようなシステムを作る上で必要となる、印刷情報とデジタル情報を結合する斬新なツールを提案・開発し、科学技術教育に関する新たなe-learning環境と学習進捗状況把握システムの構築を目指すものである。大学工学部で教えられる流体力学入門の授業を例に取り、学生の流体力学の原理の理解度やその運用能力を格段に高める潜在的可能性を秘める、先端的Eラーニング環境の構築について検討を行った。特にベルヌーイの式を用いたタンクからの流体流出現象について、流出口のオリフィス形状が与える影響を数値シミュレーションにより可視化し、流体力学の原理についての理解度を増進させる方法を開発した。本ソフトウエアにより、学生はディスプレイ上に仮想的に描かれる現象を見ながら、物理パラメータの影響を擬似体験することが出来る学生が自由にグループを組み変えながら課題研究や演習問題を通して学習する過程で、その学習進捗度をリアルタイムでモニタリングする、計算機援用によるグループ協調学習(Computer-Supported Collaborative Learning (CSCL))の基本的構成について検討を行った。その鍵となるのは、クラスターパターンを用いたデジタル情報担体技術(クラスターパターンインターフェース;CLUSPI)の採用である。本技術により印刷物とデジタルデータの融合を画期的に発展させることができた。物質表面にデジタル情報を埋め込む表面の記号化、それを光学的に読み取り復号化するきわめて汎用性の高い表面情報伝達技術を開発した。本技術でいう物質表面の記号化とは通常の紙媒体の他に、金属やプラスチック表面にレーザーなどで刻印されたクラスターパターンを含むものである。このような物理的に異なる表面処理により記号化された情報を、画像データとして取り込むことが出来る多機能表面情報読み取り器(SCR)の試作を行い、その性能について検討を行った。これまで培ってきた多言語・マルチメディア辞書に関するソフトウエアシステムの上に、さらに機能の高度化と広範囲化を行った。すなわち、手話に関する辞書(データベース)について研究が実施され、ビデオによる映像を取り入れた多言語・マルチメディア辞書への集積・統合化を行なった。デジタル情報への直接かつ迅速なアクセスを可能にするためには、紙面上に印刷した符号パターンに基づくインターフェースを用いて、印刷物またはデジタルコンテンツ情報へのリンク機構を形成した。印刷された文章または画像がインターフェースの一部をなし、手話や読唇術などに関するデジタルデータを含む広範なマルチメディアコンテンツへの結合を可能とした。すなわち対象となるものや教材が認識番号(ID)と対応が付いているシステム基盤構造を導入することにより、人間とコンピュータ間の信頼性ある双方向情報通信手段が提案された。ここで、対象物の検索や確認法に関するいくつかの方法が検討された。その結果、有望な方法として物理的な表面に意味を付与する方法が提案され、種々の符号画像について、符号の大きさ、表面積占い率、およびその符号の表面密度などの観点から検討された。物理的な対象物と関連するデジタルコンテンツが関係付けられたVIDIと名付けられたソフトウエアシステムが開発され、その設計・構成が検討された。コンピュータ援用によって、学生の答案を評価するシステムについて研究を行った。意味情報検索システムを用いることにより、答案の大局的傾向つかむ事が出来ることが示された。また、このアプローチをとることにより、e-learningにおける高度で整合性のある採点法が確立できることも示した。工学部1、2年の学生を対象にした基礎的な専門教科(例えば、流体力学、伝熱工学における相変化現象など)を教育する際に、抽象的な内容を、具体的現象の疑似体験から直感的に理解させるためには、e-Learningが極めて効果的である。多くの学生に同時に実験をさせることは難しいが、これらの学生に現象を同時に疑似体験させることは可能である。一つの例として、本研究では非定常な凝固現象を取り上げ、この実時間では非常に長時間掛かる現象を、早送りの動画にしてe-Learning用教材を完成させた。この教材は、凝固現象の種々のパラメータの変更に対する変化を迅速に計算し、リアルタイムで動画化することができる。この物理現象の動画化のためには、GIFES(Graphical Interface Framework for Educational Support)を用い、数値データを容易に動画として可視化することができ、その有用性を示すことができた。

教科書等の紙ベースの情報を、個々に関連する事項についての注釈や参考資料としてのマルチメディアなどのデジタル情報源と関連付けを行うことにより、紙媒体の有する情報量の飛躍的な増大化を図ることができる。この技術は、マルチメディアとの双方向コミュニケーションを可能とし、新たな教育方法への道を開く可能性があることから、この分野での研究を継続的に推進している。グループ学習法への応用研究について言えば、平面上の絶対座標位置と関連付けされたデジタルデータベースを用いた、音声の生成によるシステムからの応答を可能にする、いわゆるヒューマン・コンピュータ間の双方向コミュニケーションシステムの構築を行った。平面上に座標情報を符号化するための微細レーザー加工法の研究を実施した。そのための透明および不透明物質へのレーザー加工実験を行った。本年度においては、3年間の各担当分野での成果を統合し、e-Learningシステムの中でそれぞれが果たすべき役割、必要な要素技術、及び機能に再検討を加えながら研究を推進した。そのため、工学部1、2年生を対象としたe-Learningを目標として、流体力学、伝熱工学的現象のより直感的理解を助けるため、画像インターフェースGIFES (Graphical Interface Framework for Educational Support)を持つシステムの開発を行った。また、CSCL (Comuter-Supported Collaborative Learning)システムを用いたダイナミックなグループ学習についてさらに研究を推進した。さらに、平面座標とコンピュータ上の音声デジタルデータとのインターフェイス(スマートテーブル)を構築し、教育目的のためのゲーム、ダイナミックなグループ学習法への応用を検討した。スマートテーブルとは、デジタル情報源とそれとの関連付けが為された平面、印刷物、物体上の面などから構成されるものである。これらの要素に基づくシステムの開発は、同時に重要な研究課題を提起した。すなわち、これまでの映像・音声によるプレゼンテーションでは、聴衆はみな一様にスクリーンに注目しなければならなかった。しかし、スマートテーブルの導入により、音声データの提供を個人レベルで選択できるシステムの構築が可能となる。このため、スマートテーブルは遍在的(ユビキュタス)な計算環境の構築へ道を開くことになると考えられる。すなわち、現在のように、一人が一台の独立したコンピュータを占有する環境から、スマートテーブルを介した相互コミュニケーションを重視する新たなシステムの構築が必要になる。
看護免許保持者のキャリアスタイルと看護供給量に関する研究〜全国調査に向けたデータ収集に関する検討

前年度に引き続き、看護有資格者の動態を把握するためのデータを全国的に調査するための方法について、1)既存のデータの有効利用、2)新たな情報インフラとして有用性が期待されているインターネットを利用した調査法、3)現段階で実現可能かつ有用性の高い全国的な看護有資格者の動態を把握するための方法、の3点について検討を行なった。1)に関しては、厚生省報告例の中のデータとして公表されてはいないが、厚生省のデータベースには都道府県別年齢階級別看護就業者数が存在することが判明し、厚生省大臣官房の協力を得て東京都と長野県について過去18年間のデータを入手した。また、従事者届をもとに都道府県が厚生省に提出するフォームが過去にさかのぼって存在していた北海道の協力を得て、過去30年間の年齢階級別就業者数を得た。これらのデータをもとに年齢階級コホート別の集計を行なった結果、看護就業者の動態は県別に異なる様相を呈していることが判明し、看護職の地域偏差や地域間移動を推測するうえで有益な資料となることがわかった。2)に関しては、実際に看護有資格者の履歴調査をウエブサイト上で展開し、その有用性について検討を行なった。その結果、2ヶ月間にアクセス件数117件、回答数6件であり、看護有資格者を対象とした調査媒体としてインターネットを利用することは、現段階では困難であると判断した。3)今までの調査より、継続的な調査を比較的低コストで行なうために、現状では従事者届や免許登録などの既存のデータ収集ルートを利用し、収集するデータ項目の追加および、免許番号による過去のデータとの関連づけという手法によって、看護有資格者の動態を把握する方法が最善であるという結論を得た。少子,高齢社会を迎え,専門的ケアの重要な担い手である看護有資格者の就業や離職あるいは進学の動向を把握することは,今後の看護養成や看護労働力を考える上で必要不可欠なものである.しかしながら,わが国には看護有資格者の動態を把握するためのシステムはなく,隔年実施されている「従事者届」をもとに,その時点で就業している看護職の静態を捉えているのが実状である.筆者は看護有資格者の動態を明らかにするために,N県の看護教育機関卒業者を対象とした履歴調査を実施し,教育課程の相違により卒後の就職動向に差があるということを明らかとする一方で,宛先不明や転居先不明により回収率が悪く,卒業者名簿をもとにした郵送調査法の限界が示唆された.そこで今回,看護有資格者の動態把握のためのデータ収集のあり方を検討することに重点を置いた基礎的調査を行うこととし,今年度は,1)既存のデータを流用できないかどうかの文献の検討,2)有職者へのヒアリング,3)新たな手法としてインターネットを利用したデータ収集の検討に重点を置いて調査を実施した.その結果,1)2)に関しては,データは公表,非公表を含めてさまざまな教育課程を終えた看護有資格者の卒後の動向を具体的に示すデータベースは存在しないこと,さらに,この12年中に新たな統計をとる予定はないことが明らかとなり,独自の調査の必要性が再確認された.なお,具体的な調査方法に関しては,来年度検討していく予定である.また,3)に関しては閲覧者が必ずしも看護有資格者ではないことと,インターネットへの接続環境がまだ十分に整っていないという問題について考慮しなければならないが,全国的な調査を低コストで行うためのツールとしての有用性が示され,今後より精度の高い調査法について検討していく予定である.前年度に引き続き、看護有資格者の動態を把握するためのデータを全国的に調査するための方法について、1)既存のデータの有効利用、2)新たな情報インフラとして有用性が期待されているインターネットを利用した調査法、3)現段階で実現可能かつ有用性の高い全国的な看護有資格者の動態を把握するための方法、の3点について検討を行なった。
加速度センサーを利用した大規模草地における牛の摂食・反芻行動の解析

牛の採食、反芻および休息行動時間の自動的な識別を目的として、加速度の利用と加速度を用いた統計的識別法の開発を行った。小型の加速度計を牛の下顎に装着して、3方向の顎の動きを1秒単位で測定した。得られたデータから単位時間(1分)あたりの加速度の平均値とICV値(平均値/標準偏差)を算出し、それらを独立変数として非線形判別分析を行った。この分析法を行うことにより牛の採食、反芻および休息行動時間の識別が高い精度で可能であった。放牧地における牛の摂食、反芻行動の監視は、個体の健康・栄養状態を知る上で最も有効な方法の1つである。またこれらの行動監視により草地の利用実態や改善点を把握する上での貴重な情報も提供される。しかしながら、行動の直接観察は労力がかかりすぎ、またこれまで、歪みゲージ等を利用して開発されてきた採食行動測定装置についてもその頑健性や装着性などに難があった。本研究では最近のMEMS(Micro Electro Mecanical System)技術の発展によって可能となった小型化した加速度計を牛に装着することにより、1.牛の摂食・反芻行動を安価でかつ省力的に識別する方法の確立、2.放牧地における長期行動観測を実施して、家畜および草地管理に役立つ牛の摂食・反芻行動特性の把握を目的とする。本年度は1について行った。舎飼いの乳牛および放牧地における黒毛繁殖和牛1頭の下顎に小型3軸加速度計を装着し、その加速度を1秒単位で12時間測定した。同時にビデオカメラにより行動を撮影した。加速度データを時系列的に並べ行動調査データと比較した結果、視覚的に摂食・反芻・休息行動を識別できることが明らかとなった。さらに、自動的行動識別法について検討を行った。その結果、1秒ごとの加速度データから計算した1分ごとの平均値とICV(変動係数の逆数)値を用いて、2次判別関数を作成することにより、これらの行動が高精度(舎飼い、放牧ともに95%の正解率)で識別可能であることが明らかとなった。本試験の結果から、加速度計を牛に装着することにより摂食・反芻・休息行動の視覚的な識別が可能であること、さらに2次判別関数の利用により視覚的のみならず統計的な自動分類も可能であることが明らかとなった。放牧地における牛の採食と反芻行動の把握は、草地管理や放牧牛の個体管理を行う上で有用な情報となる。本研究では小型加速度計を牛に装着することにより、1.牛の摂食・反芻行動を安価でかつ省力的に識別する方法の確立、2.放牧地における長期行動観測を実施して、家畜および草地管理に役立つ牛の摂食・反芻行動特性の把握、を目的とする。前年度は舎飼いの乳牛および放牧地におけるその加速度を1秒単位で12時間測定し、その統計的識別法の検討を行った。その結果、2次判別関数を作成することにより、これらの行動が高精度(舎飼い、放牧ともに95%の正解率)で識別可能であることを明らかにした。しかし、野外で行動を監視するためには少なくとも24時間以上の測定が望ましく、そのためにはメモリおよびバッテリーの節約が必要であった。本年度はこの問題を克服するために測定記録間隔を1秒から10秒に延長することにより45時間の連続観測を行い、その精度について検討した。放牧地において成牛4頭を用いて計23回の45時間連続測定を行った。また測定日のいくつかでは6時間の直接行動観察(「採食」,「反芻」,「その他」に分類)を行った。測定されたデータは前年度と同様に統計的処理を行った。加速度データから作成された2次判別式の正解率は平均で74.9%であった。各行動別にみてみると「採食」が93.6%、「反芻」が84.1%と比較的高かったが、「その他」が42.2%と低くなった。前年度の測定では「その他」のうち休息行動の占める割合が高かったが、本年度は測定時間も長く舐め行動などの社会行動や移動に費やす時間も長くなり、休息など加速度値が小さい行動とこれら加速度値が大きくなる行動の同一分類によりその正解率が低下したと考えられた。本試験からある程度の精度で45時間の放牧牛の採食・反芻行動の連続追跡が可能であることが示されたが、一方、今後さらに詳細な知見を得るためには「その他」行動など、行動基準の場合分けの再検討が必要と考えられた。

本研究では小型加速度計を牛に装着することにより、1.牛の摂食・反芻行動を安価でかつ省力的に識別する方法の確立、2.放牧地における長期行動観測を実施して、家畜および草地管理に役立つ牛の摂食・反芻行動特性の把握、を目的とする。過去2年間の研究により、加速度計を用いた牛の摂食、休息および反芻行動の識別には、加速度を1秒間隔以下で測定し、その加速度値から1分あたりの平均と変動係数の逆数(ICV)を変数とした2次判別関数を作成することにより、高精度(95%の正解率)で識別可能であることを明らかにした(http://cryo.naro.affrc.go.jp/seika/h20/09.06/043/main.htm)。本年度は、これらの成果を活かして、野外放牧地において牛にGPSと加速度計を装着し、その行動について解析した。北海道農業研究センター内の傾斜を含む放牧地(7.6ha)に10頭の仔付き繁殖黒毛和牛を放牧し、その内2頭に10月の2週間に連続して、首にGPS機器(CM10xk,古野電気)、顎下に改良した頭絡を用いて加速度計(AirSense,日立)を装着した。また加速度による行動識別推定式作成のために各牛それぞれ20時間ずつ目視により行動観察を行った。加速度とGPSのデータセットにより牛はこの試験草地で夜間は傾斜部分での休息と摂食(特に休息)を有意に好み、昼は平坦部での摂食と休息(主に摂食)を有意に好むことが明らかとなった。反芻行動の識別については現在解析中である。加速度計とGPSの組み合わせによるデータ取得と本試験で用いた解析法により、省力的に長期間の行動モニタリングが可能であることが示された。
伊東細胞の形質変換制御因子の解析とその収縮機構への関与について

様々な病態でおこる線維化過程にはマクロファージやリンパ球などの炎症性浸潤細胞が産生する各種増殖因子やサイトカインが密接に関連している。肝線維化過程においては,肝組織内での伊東細胞の形質変換(Phenotypic modulation)がとくに重要なステップである。今回の研究では,TGF-beta(beta1とbeta2)による伊東細胞の形質変換過程の制御機構について検討した。【.encircled2.】肝硬変症例での血中TGF-beta1値は慢性肝炎症例および正常人に比べて明らに高値であったが、いずれの対象例においても血中TGF-beta2は測定感度以下であった。また,血中IL-1,IL-6,TNF-alphaは測定感度以下だあったが,血中CSF-1値は炎症の程度と相関する傾向が見られた。【.encircled3.】慢性肝疾患症例における組織中でのTGF-beta1とTGF-beta2およびalpha型平滑筋アクチン(形質変換の指標)の発現について免疫組織学的にも解析したところ、線維化の進展とともにTGF-beta1とalpha型平滑筋アクチンの発現は増強しそれぞれの分布も一致していた。TGF-beta2の発現は活動性肝硬変例における一部の炎症浸潤細胞にみとめられるのみであった。以上の結果から,in vivoではTGF-beta1はautocrine機構により,TGF-beta2はparacrine機構を介して伊東細胞の形質変換に関与している可能性が示唆された。そこで,ヒト肝より伊東細胞を含む活性化線維芽細胞を分離し培養系での実験を行った。【.encircled4.】ヒト肝由来活性化線維芽細胞ではalpha型平滑筋アクチンの発現が認められ,この発現はTGF-beta1とTGF-beta2の添加により増強された。また同処理ではHGF産生も明らかに抑制され,IL-1とIL-6およびTNF-alphaの添加では同様の結果は得られなかった。したがって,in vitroにおいてもTGF-betaは伊東細胞の形質変換を促進し,同細胞からのHGF産生を制御することによって肝再生の抑制にも関与していると考えられた。
可積分な離散ハングリー系に付随するアルゴリズムの高速化と理論解析

これまでの研究代表者らの研究において,離散ハングリーロトカ・ボルテラ系に基づく非対称帯行列に対するdhLVアルゴリズムと離散ハングリー戸田方程式に基づくtotally nonnegative行列に対するdhTodaアルゴリズムをそれぞれ定式化している。本研究では,これらのアルゴリズムに対して,収束の高速化手法を組み込み,丸め誤差解析,大域的収束性,局所的収束性,収束次数等の解析により,多くの理論的性質を明らかにした。さらに,これらのアルゴリズムが対象とする行列に対して,固有ベクトルが効率よく計算できることを示した。研究代表者らのこれまでの研究において,可積分な離散ハングリー戸田方程式の数理構造をもとに,totally nonnegative行列の固有値を高精度に計算できるdhTodaアルゴリズムを提案している。dhTodaアルゴリズムには収束を加速するための「原点シフト」と呼ばれる手法が組み込まれており,反復毎にシフト量が改善される実装法を既に提案している。さらに,離散ハングリー戸田方程式の収束性について,古典的な解析手法である中心多様体理論を用いた局所解析を行い,平衡点付近における指数的収束性を示すことに成功した。研究成果をまとめた論文は海外の学術論文誌に投稿中である。当初の研究計画に含まれてはいないが,離散ハングリー戸田方程式に関連する箱玉系に関する研究も行い,保存量の構成方法についても新たな知見が得られた。dhTodaアルゴリズムと数学的に等価であるqd型dhLVアルゴリズムの収束性に関して,古典的な解析手法である中心多様体理論に基づく局所解析を行い,収束の終盤において指数的な収束性を示すことが理論的に示された.研究成果をまとめた論文はApplicable Analysis誌に掲載された.dhTodaアルゴリズムの収束を高速化させるため,原点シフト操作を組み込んだシフト付きdhTodaアルゴリズムについてまとめた論文がMonatshefte fur Mathematik誌に掲載されている.シフト量の計算に関して,反復ごとにシフト量が改善されるような実装法を提案し,日本応用数理学会にて口頭発表を行った.本研究は,ハングリー型離散可積分系に基づいて定式化された固有値計算アルゴリズムに対する高速化やそれに付随する理論解析を目的とし,以下の成果が得られた。(1)離散ハングリー戸田方程式の数理構造に基づき,totally nonnegative行列の固有値を計算するdhTodaアルゴリズムを提案している。dhTodaアルゴリズムに対する丸め誤差解析を行い,相対誤差の意味で高精度に固有値を計算できることが明らかとなった。(2) dhTodaアルゴリズムに対して,原点シフトと呼ばれる収束の高速化手法を組み込み,その大域的収束性を示した。さらに,シフト量の計算方法として,Newtonシフトに基づく,反復毎にシフト量が改善されるシフト戦略を提案している。また,収束次数の解析も行い,弱2次収束することの理論保証を与えた。(3) dhTodaアルゴリズムと数学的に等価であるqd型dhLVアルゴリズムの収束性に関して,古典的な解析手法である中心多様体理論に基づく局所解析を行い,収束の終盤において指数的な収束性を示すことが示された。dhTodaアルゴリズムについては,ある条件の下で同様の収束性を示すことが明らかになった。(4)離散ハングリーロトカ・ボルテラ系の数理構造を基に定式化された,非対称帯行列の固有値を計算するdhLVアルゴリズムについて,固有ベクトル成分の分布を利用することで固有ベクトを効率よく計算できることを示した。(5)離散ハングリーロトカ・ボルテラ系に関する,全ての独立な保存量の導出に成功した。応用可積分系研究代表者らが提案したtotally nonnegative行列に対する固有値計算アルゴリズムについて,その誤差解析,収束次数,局所収束性の理論的な解析,および数値実験などがおおむね完了し,アルゴリズムの理論的・数値的特性が明らかになったため。H24年度に計画していたdhTodaアルゴリズムの誤差解析と収束の高速化については当初の予定通りに研究成果が得られている.得られた成果は国内外の学会・研究集会等において口頭発表を行い,海外の学術論文誌に掲載されている.さらに,dhTodaアルゴリズムと数学的に等価なqd型dhLVアルゴリズムの局所的な収束性の解析を行ったことで,dhTodaアルゴリズムに対する解析の目途が立っている.H25年度に付随的に得られた離散ハングリー戸田方程式に関連する箱玉系の保存量に関する研究を進める。離散ハングリー戸田方程式とB\"acklund変換によって結びつく離散ハングリーロトカ・ボルテラ系の保存量の線形代数の観点からの導出,離散ハングリー戸田方程式に関連する新たな箱玉系の定式化などを進める。さらに,離散戸田方程式に関連する加速アルゴリズムについて,文献調査を行う。H25年度はまず,dhTodaアルゴリズムに対する局所的収束性の解析を行う.qd型dhLVアルゴリズムに対して

行った手法に倣い,中心多様体理論を利用することで,平衡点付近での局所的な収束性について解析する.また,シフト付きdhTodaアルゴリズムに対する収束次数の解析を行い,シフトを導入前よりも高次収束することの理論保証を与える.解析手法は,固有値計算のためのdqdsアルゴリズムで用いられている方法を参考にする.得られた成果は適切な国際会議および国内の学会にて口頭発表し,論文としてまとめ,海外の学術論文誌に投稿する予定である.今年度は研究費の大半を旅費に使用しているが,5707円の次年度使用は国内・国外旅費に係る航空券費用の前後により発生したと考える。当該年度に得られた研究成果を国内外の適切な研究集会で発表するための旅費,H25年度に投稿中であった2編の論文に関わる投稿料,研究に必要な専門書の購入に使用する予定である。また,国内の適切な学会(日本応用数理学会,日本数学会),研究集会等にて研究成果の発表,情報収集を適宜行う予定であり,その旅費・宿泊費・参加費に使用する予定である.さらに,採録された論文の別刷り代に使用する.
内因性ジギタリス様物質の循環機能調節における役割ならびに病態生理的意義

食塩と高血圧との関連で重要視されているジギタリス様物質をヒト尿から単離し,その化学的性質および生物学的作用とを検討した。大量ヒト尿を出発材料として逆相ならびにゲル濾過高速液体クロマトグラフィ-(HPLC)を主に利用する分離法にてジギタリス様物質を精製した。ジギタリス様活性の指標としては感度および選択性の面から,ヒト赤血球への^3H-ウアバイン結合の抑制活性を用いた。得られた標品につき化学的分析を行うとともに標的臓器の一つとして重要と考えられる血管平滑筋に対する作用を調べた。さらにヒトを含む哺乳類血漿やラット諸臓器での存在についてもHPLCを利用して検討した。逆相C_<18>カラムから18%アセトニトリルで溶出される高極性の非ペプチド性・低分子量のジギタリス様物質が単離された。この物質は酸加水分解・アルカリ加水分解にて活性が消失し,また高濃度の抗ジゴキシンIgG分画との反応にても活性を失った。精製物質は^3H-ウアバイン結合の可逆的・競合的抑制因子であるとともに,イヌ腎Na^+,K^+-ATPase酵素活性の直接抑制およびヒト赤血球へのウアバイン感受性^<86>Rb取りこみの抑制などのジギタリス様活性を示した。その作用はNa^+,K^+-ATPaseに特異的であり,Kと拮抗的であった。血管平滑筋細胞に対してはそのNaポンプ活性調節に関与するとともに,^<45>Ca流入亢進,^<45>Ca流出抑制,細胞内遊離Ca^<2+>濃度上昇およびウサギ大動脈張力の増加をもたらした。さらにHPLC上,同一の挙動を示すジギタリス様物質が哺乳類血漿,ラット諸臓器およびヒト胆汁などに広範囲に存在することが確認された。ヒト尿から単離したジギタリス様物質は広く生体内に存在し,Naポンプに対する哺乳類由来の生体内リガンドと考えられ,血管作動物質として機能している可能性が大きい。今後さらにNa利尿因子としての役割を明らかにするとともに,最終的に化学構造を解明することが必要である。
イオンビームを利用した蓄光体の残光寿命改善

イオンビームを用いた蓄光体の残光寿命の改善に関する研究を行った。基礎特性を調べるために入射イオン種およびエネルギーを変化させ発光スペクトルを測定した結果、発光スペクトルの形状が入射イオン種およびそのエネルギーによって異なることから、発光を用いたイオン種・エネルギー弁別の可能性があるということを見出すことができた。ここで照射損傷による発光量の減少を測定したところ、重イオンになるにつれ減少量が大きく、プロトンが残光寿命改善に適していると分かった。プロトンを用いた残光寿命改善を試みた結果、6.8×10^<20>/m^2を照射した蓄光体が最も残光寿命が長いということが確認できた。蓄光体(長残光性蛍光体)は紫外線等の外部エネルギーを蓄積し、外部刺激停止後も長時間にわたり発光を続ける特性(残光特性)を持った材料である。残光特性は、不純物や欠陥に起因するエネルギー準位により決定するため、衝突作用(核的作用)を有するイオンビームを利用することで、残光寿命の長寿命化が可能であると考えられる。イオンビームを用いた照射の前に、予備実験として核的作用の大きい高速中性子を用いた照射を行った。これまで、高速中性子照射によって残光寿命に変化が生じることは見出していたが、更なる研究を進めることで、最も残光寿命が長くなる照射量が存在することを発見した。そのため、イオンビーム照射でも同様に長寿命化に最適な照射量が存在するであろうとの見通しを得た。イオンビーム照射下での発光特性(強度、劣化特性等)は、試料の作成条件によって大きく異なる。そこで様々な条件でセラミックスを作成し、蓄光体が優れた発光特性を持つ試料の作成を試みた。蓄光体として広く知られているアルミン酸ストロンチウム系長残光性蛍光体(Sr_xAl_yO_z:Eu,Dy)の母材であるSrAl_2O_4(添加物無し)の焼結を行ったところ、13001400°Cにおいて強度、光透過率に関して良好なセラミックスが作成できた。しかしながら組成比の異なる同材料(Sr_4Al_<14>O_<25>)を同温度で焼成したところ、SrAl_2O_4へと変化することが分かった。そのため1200°C以下でSrAl_2O_4:Eu,Dy、Sr_4Al_<14>O_<25>:Eu,Dyセラミソクス試料を作成した。作成した試料のフォトルミネッセンスを測定した結果、可視光に十分な強度の発光を有し、残光成分も有することが分かった。今後はこの試料に対してイオンビームを用いた特性試験を行う予定である。荷電粒子、ここではプロトン(P)、ヘリウム(He)、酸素(O)を用いて蓄光体に対する照射効果を調べた。ここで核的作用はO、He、Pの順で大きい。核的作用が大きいものは照射損傷が大きく、O照射の場合、照射後すぐに照射誘起発光が減少し、残光を観測することができなかったが、P照射時は発光量の減少は観測されなかった。P、Heの残光寿命を比較すると核的作用の大きいHeの方が残光寿命は長かったが、照射損傷によって発光量は小さいため、残光寿命改善にはPが適していると結論づけることができた。核的作用により残光寿命の変化は期待できるが、同時に核的作用により照射損傷も引き起こす、すなわち寿命改善・発光量減少が相補的関係にあり、結果として、イオンビーム照射できる中で最も軽い粒子であるプロトン照射か最も残光寿命・改善に効果的であった。次年度はプロトン照射のパラメータ(照射量、照射温度等)を変化させ、最適な条件を導き出す。蓄光体は長残光性蛍光体とも呼ばれ、夜光塗料の代替品としてとして開発されたものである。その特性は残光時間および発光波長で決められており、残光寿命特性は、捕獲中心である準安定状態のエネルギー準位の有無、およびそのエネルギーにより決定する。本年度は衝突作用(核的作用)を生じ、材料中に構造変化をもたらすイオンビーム源としてプロトンを用い、プロトンのエネルギーを変化させながら蓄光体に対して照射を行い、その照射効果を調べた。ここで蓄光体はイオンビーム照射下で強い発光(照射誘起発光)を持ち、その入射粒子のエネルギーに対して依存性を有しているということがわかった。このことから、発光を用いたエネルギー弁別の可能性を見出した。

残光寿命を測定したところ、その寿命は入射プロトンの照射量によって異なり、6.8xl0^<20>/m^2以下の照射量では、プロトンの照射量が大きくなるにっれ残光寿命が長くなるということが分かった。プロトンを用いることで発光(捕獲)中心の構造変化、およびそれに伴うエネルギー準位の変化を生成させ、蓄光体の機能(寿命)を改善できたと考えられる。前年度の結果より、イオンビームの核的作用により残光寿命の変化は期待できるが、同時に核的作用により照射損傷も引き起こす1すなわち寿命改善・発光量減少が同時に生じるということが分かっている。しかしながら、本年度の結果では、6.8x10^<20>/m^2以下の照射量では残光寿命の改善効果は顕著であったが、照射損傷による発光量減少は確認できなかった。
ヒト血漿カリクレインの新しい基質蛋白質PKー120の構造解析に関する研究

本年度は、PKー120の構造解析に関して以下のような成果を挙げた。1.PKー120の基本構造並びにカリクレインによる切断様式の解明:PKー120はカリクレインにより、まず100kDaと20kDaとに切断され、次いで70kDaと40kDaとに切断された。70kDaフラグメントは60kと10kの2本鎖構造をしていることが分かった。この各フラグメントを精製し、そのNー末端アミノ酸配列から、次図のようなカリクレインによる限定分解様式が明らかになった。2.PKー120のカリクレイン切断反応に伴うプロテア-ゼ活性の発現:PKー120のカリクレインによる切断にともない、新たにプロテア-ゼ活性が発現することを見いだした。この活性は、PKー120が70kDaと40kDaとに切断される反応に伴って発現し、70kDaフラグメントがプロテア-ゼ活性を示すことを見いだした。この活性は、DFPなどにより阻害されるところから、セリンプロテア-ゼに属することが明らかになった。3.PKー120のcDNAのクロ-ニング:PKー120に対する抗体を用いて、肝や胎盤などのcDNAライブラリ-からPKー120のcDNAを探索した。一般に、血液蛋白質は肝で生合成されるにも拘わらず、肝のcDNAライブラリ-からはPKー120のcDNAを分離することが出来なかった。しかし、胎盤のcDNAライブラリ-から部分長のcDNAを分離することに成功した。現在、この部分cDNAを用いて、完全長のcDNAのクロ-ニングを行っている段階である。
造血器腫瘍細胞におけるアポトーシス検出の臨床検査医学的応用

【研究目的】骨髄異形成症候群などの骨髄不全状態では造血幹細胞に原因不明の異常があり,アポトーシスが亢進していると推定される.また骨髄不全状態でのアポトーシスの割合の増加は,重要な予後因子と考えられている.本研究では,各種血球におけるアポトーシスの定量を行い,各種疾患による予後推定などの臨床的有用性を目的とする.【研究方法】疾患の対象として,白血病,骨髄異形成症候群で行なった.検体サンプルをあらかじめアポトーシスを誘導試薬(C_2-セラミド20μM)で15分反応後,目的細胞抗原,Annexin Vの染色しサンプルをフローサイトメーター(FCM)にて測定,解析した.【研究結果】1.健常者10名において好中球およびリンパ球におけるAnnexin Vの測定結果はそれぞれ26.0±2.7%,11.4±4.0%であった.2.骨髄異形成症候群(MDS)20名(RA15名,RCMD2名,RARS1名,RAEB2名)において好中球におけるAnnexin Vの測定結果は54.3±8.4%と健常者好中球と比較し高値傾向を示した.しかしMDSの病型による傾向は今回の結果では認めなかった.3.急性白血病11名(AML7名:内M1;3名,M4;2名,M5;2名,ALL4名:内B-ALL;2名,T-ALL;2名)において芽球におけるAnnexin Vの測定結果は11.1±3.1%で健常者リンパ球と同等の値を示した.また病型による傾向は今回の結果では認めなかった.4.今回の検討よりMDSにおける好中球のAnnexin Vの測定は健常者に比し高値傾向を示た.これはMDSにおいてアポトーシスの亢進状態を示しているためと考えられた.以上よりAnnexin Vの測定はMDSの診断の有用な1指標と成りうると考えられた.また急性白血病においては今後,症例を追加し,また臨床経過をあわせ検討していく予定である.【研究目的】骨髄異形成症候群などの骨髄不全状態では造血幹細胞に原因不明の異常があり,アポトーシスが亢進していると推定される.また骨髄不全状態でのアポトーシスの割合の増加は,重要な予後因子と考えられている.本研究では,各種血球におけるアポトーシスの定量を行い,各種疾患による予後推定などの臨床的有用性を目的とする.【研究方法】疾患の対象として,白血病,骨髄異形成症候群で行なった.検体サンプルをあらかじめアポトーシスを誘導試薬(C_2-セラミド20μM)で15分反応後,目的細胞抗原,Annexin Vの染色しサンプルをフローサイトメーター(FCM)にて測定,解析した.【研究結果】1.健常者10名において好中球およびリンパ球におけるAnnexin Vの測定結果はそれぞれ26.0±2.7%,11.4±4.0%であった.2.骨髄異形成症候群(MDS)20名(RA15名,RCMD2名,RARS1名,RAEB2名)において好中球におけるAnnexin Vの測定結果は54.3±8.4%と健常者好中球と比較し高値傾向を示した.しかしMDSの病型による傾向は今回の結果では認めなかった.3.急性白血病11名(AML7名:内M1;3名,M4;2名,M5;2名,ALL4名:内B-ALL;2名,T-ALL;2名)において芽球におけるAnnexin Vの測定結果は11.1±3.1%で健常者リンパ球と同等の値を示した.また病型による傾向は今回の結果では認めなかった.4.今回の検討よりMDSにおける好中球のAnnexin Vの測定は健常者に比し高値傾向を示た.これはMDSにおいてアポトーシスの亢進状態を示しているためと考えられた.以上よりAnnexin Vの測定はMDSの診断の有用な1指標と成りうると考えられた.また急性白血病においては今後,症例を追加し,また臨床経過をあわせ検討していく予定である.
組織浸潤アロT細胞の標的抗原とクロノタイプに着目したGVHDバイオマーカーの開発

ヒト急性移植片対宿主病(GVHD)組織に浸潤しているT細胞の多様性は非常に低く、ヒト急性GVHDが限られたごく少数のアロ抗原特異的細胞傷害性T細胞クローンにより発症することが示された。また、ヒト急性GVHD発症に関わるT細胞クローンは、GVHD臓器ごとに異なること、同じ臓器のGVHDであっても患者ごとに異なることが示された。さらに、組織浸潤T細胞repertoireの偏りを数値化することで急性GVHDの治療反応性を予測するバイオマーカーを樹立できる可能性が示唆された。GVHD発症に関与するドナーT細胞についてより正確に評価するためには、アロ抗原特異的な細胞傷害活性を有し、かつ実際にGVHD組織に浸潤しているT細胞分画に着目して解析することが望ましい。本研究では、GVHD組織や末梢血からT細胞を採取しTCRクロノタイピングを行うと同時に、機能解析によりアロ反応性を有することが確認されたT細胞分画に限定したTCRクロノタイピングも行うことで、GVHD組織や末梢血などにおけるアロ抗原特異的T細胞頻度の経時的変化を明らかにし、さらに臨床経過と照合することで、GVHDの重症化や治療反応性を予測可能にするバイオマーカーの開発を目指している。今年度は以下の成果を得た。1.造血幹細胞移植患者3名のGVHD組織(皮膚等)からT細胞を分離し、limiting dilution法を用いてT細胞をクローン化、増幅し、さらに患者とドナーの細胞を標的とするCr放出試験により、それらT細胞クローンのアロ反応性を評価した。2.同じGVHD組織からRNAを抽出し、次世代シークエンサーを用いてTCRのtarget deep sequenceを行った。1で得たT細胞クローンのTCRをSanger sequence法で決定し照合することで、GVHD組織に浸潤するT細胞全体におけるアロ反応性T細胞の頻度(割合)を決定した。3.またそれらの患者の末梢血単核球を経時的に採取し、RNAを抽出し、TCRのtarget deep sequenceを行うことで、末梢血中の組織浸潤アロ反応性T細胞の頻度の推移を決定した。これまでのところほぼ計画通りに進捗している。解析した3名のうち1名については、組織浸潤T細胞全体におけるアロ反応性T細胞の頻度を既に決定済みであり、興味深い結果が得られている。ただし皮膚の生検検体は比較的得られやすいものの、今年度は肝GVHD組織を得ることができなかった。同種造血幹細胞移植後にGVHDを発症した患者の末梢血やGVHD組織中に含まれるT細胞のTCRクロノタイピングを行うとともに、T細胞をクローニングしてその機能解析を行うことで、GVHD発症時の末梢血やGVHD組織におけるアロ抗原特異的T細胞頻度を定量化する。さらにその経時的変化をGVHD臨床経過と合わせて解析し、GVHDの重症化や治療反応性を予測可能にするバイオマーカーの確立を目指す。今年度は新たに以下の実績を得た。1.新たに3名の移植後GVHD患者から皮膚等の生検組織提供を受け、それら組織からT細胞を分離、限界希釈法によりT細胞をクローン化、培養・増幅したのち、それらのアロ反応性を、患者とドナーの細胞を標的とする細胞傷害試験により評価した。2.同じGVHD組織からtotal RNAを抽出し、次世代シークエンサーを用いてTCRのtarget deep sequenceを行った。1で得たアロ反応性T細胞クローンのTCR塩基配列と照合することで、GVHD組織におけるアロ反応性T細胞クローンの頻度を解析した。その結果、GVHD組織には非常に限られた種類のアロ反応性T細胞クローンが浸潤していることが分かった。現在は、それらT細胞クローンが、患者間で共通しているのか、あるいは当該患者の異なるGVHD組織間で共通しているのか等について、検討を加えている。3.同時期の末梢血中T細胞についても同様にTCRのtarget deep sequenceを行い、組織浸潤アロ反応性T細胞クローンの頻度を解析した。今後は、GVHDの臨床経過との相関について解析を加えていく予定。昨年度からさらに検体を追加して解析することができた。また興味深い結果が得られつつある。ただし、皮膚や消化管(胃、大腸)の生検検体は得られているが、肝GVHD組織が得られなかったため、その点でおおむね順調とした。今年度は、新たに2名の急性GVHD患者から皮膚等のGVHD生検組織と同時期の末梢血の提供を受けた。それら試料からRNAを抽出し、T細胞受容体(TCR)遺伝子塩基配列のdeep sequenceを行った。そして組織浸潤T細胞のTCR塩基配列と末梢血中T細胞のTCR塩基配列を照合、比較した。本研究期間全体の研究実績をまとめる。計8名の急性GVHD患者から生検組織12個と同時期の末梢血8本の提供を受けた。症例1のGVHD皮膚より、患者由来細胞を傷害するがドナー由来細胞を傷害しない2つのアロ反応性T細胞クローンを分離した。これら2つのアロ反応性T細胞クローンのTCRbeta CDR3アミノ酸配列は、その皮膚GVHD組織における頻度第1位および第2位のTCRbeta CDR3アミノ酸配列と同一であり、皮膚浸潤T細胞全体におけるそれら2つの占める割合は98%だった。症例2の皮膚、胃、大腸GVHD組織における頻度第1位のT細胞クローンは、それぞれ組織浸潤T細胞全体の93%、64%、99%を占めており、またそれらT細胞クローンは組織ごとに異なっていた。

生検組織中T細胞の多様性をシンプソンの多様性指数(1/Ds)で評価したところ、GVHD組織浸潤T細胞は同時期の末梢血中T細胞と比べて多様性が有意に低かった。グレードIIIのGVHD生検組織はグレードI-IIのGVHD生検組織と比べて組織浸潤T細胞の多様性(1/Ds)が有意に低く、またステロイド抵抗性GVHDの生検組織はステロイド感受性GVHDの生検組織と比べて組織浸潤T細胞の多様性(1/Ds)が有意に低かった。ヒト急性移植片対宿主病(GVHD)組織に浸潤しているT細胞の多様性は非常に低く、ヒト急性GVHDが限られたごく少数のアロ抗原特異的細胞傷害性T細胞クローンにより発症することが示された。また、ヒト急性GVHD発症に関わるT細胞クローンは、GVHD臓器ごとに異なること、同じ臓器のGVHDであっても患者ごとに異なることが示された。さらに、組織浸潤T細胞repertoireの偏りを数値化することで急性GVHDの治療反応性を予測するバイオマーカーを樹立できる可能性が示唆された。実験方法は既に確立済みであり、今後はさらに多くの生検検体を解析するとともに、得られたアロ反応性T細胞の標的抗原の同定も進める。先述のとおり検体収集が今後の重要な課題である。HLA一致移植と不一致移植とで組織浸潤T細胞のTCRレパトアに差があるのか、それぞれ経時的にどのような変化を来すのか、標的とする抗原に一定の傾向はあるのかなどについても解析を進める。最終的には臨床経過と照合して新しいGVHDバイオマーカーの開発を目指す。実験系は滞りなく機能しており、データは得られている。今後は、さらに検体を集積して、アロ反応性T細胞頻度の経時的変化を、GVHD臨床経過と合わせて解析することで、新しいバイオマーカーの確立を目指す。血液内科購入する予定だった物品(消耗品)が、当該年度内に納品することが不可能となり、その支払い予定額を次年度に繰り越したため。購入予定だった試薬が当該年度内に納品できず、その支払いを次年度に繰り越したため。上述のとおり、物品(消耗品)に使用する。上述のとおり、試薬代(消耗品費)として使用する。