hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
日本におけるアグリ・ブランドの実態およびその育成方法に関する研究

本研究は、日本におけるアグリ・ブランド(ブランドが付与された第一次産品)の実態を明らかにし、その育成方法を個別事業主体のマーケティング行動および政策支援の両面から考察することを目的としている。研究成果は以下の通り。(1)日本におけるアグリ・ブランドの実態調査アグリ・ブランドの保有状況、発売年、販売動向、マーケティング活動等に関して、農業協同組合・漁業協同組合を対象にアンケート調査を実施し、その結果を『アグリブランド実態調査報告書』としてまとめた。(2)アグリ・ブランドの事例研究アグリ・ブランドに対する効果的マーケティング手法を導出するため、個別事業主体を対象に事例研究を実施した。(3)アグリ・ブランド育成のための政策に関する研究アグリ・ブランド育成に必要な政策に関して、文献および海外先進国でのヒアリング調査をもとに整理した。(4)ヴァーチャル研究機関『アグリブランド・プロジェクト』の設立アグリ・ブランド研究の促進および今後の継続的研究環境の整備を目的に、インターネット上にヴァーチャル研究機関『アグリブランド・プロジェクト』(http://agribrand.bus.osaka-cu.ac.jp/agribrand/public/top.php)を設立した。なお、本研究の成果(1)(3)は、ここで公開している。平成13年度は、本研究プロジェクトの1年目にあたり、今後のアグリ・ブランド研究の基礎となる既存研究の収集およびアグリ・ブランドの実態を把握することを主な目的として研究を行った。まず、雑誌記事検索(国会図書館)等を参考にアグリ・ブランドに関する日本の既存研究を収集しデータベース化した(1975年1月2001年7月、175タイトル)。次に、本年度の主要テーマであるアグリ・ブランドの実態把握に関しては、アグリ・ブランドの形態およびその保有者が多岐にわたり一度に全体を把握するのが不可能と判断し、複数のアプローチでアグリ・ブランドの実態に迫ることを試みた。ひとつは登録商標からのアプローチであり、登録商標データの中からアグリ・ブランドに関連するものをリストアップし、商標登録の推移やカテゴリー間の相異等に関して分析した。もうひとつは定量調査に基づくアプローチであり、調査対象を農業協同組合と漁業協同組合に絞り、ブランド化の状況やその方法等に関してアンケート調査を実施した。これら2つのアプローチに基づくアグリ・ブランドの実態よびその分析結果は、平成14年度中に報告書として公表する予定である。また、インターネット上での公開を意図したアグリ・ブランドのデータベース化に必要なハード面での環境整備も本年度の業績のひとつにあげられる。データベースの基礎資料は上記2つのアプローチで収集された情報が使用されるが、このようなデータベースを作成することにより、アグリ・ブランドに対する社会的認知が高まるとともに、今回の調査で抜け落ちたアグリ・ブランド情報の収集が可能となり、1回の調査に終わらず継続的なアグリ・ブランドの実態把握が期待できる。なお、平成14年度中にデータベースを公開する予定であり、現在、そのための準備を進めている最中である。平成14年度は、本研究プロジェクトの2年目にあたり、その進行状況は以下の通りである。(1)農業協同組合および漁業協同組合を対象としたアグリ・ブランド実態調査アグリ・ブランドの実態を把握するため、農業協同組合および漁業協同組合を対象(全単協)に、ブランドの保有状況およびブランド化への取り組みに関するアンケート調査を実施した。本調査結果の概要は、平成15年5月に報告書にまとめ公表する予定である。(2)アグリ・ブランドのデータ公開および継続的データ収集のための環境整備アグリ・ブランドの保有者は多様であり、また、現在、多くの機関が第一次産品のブランド化に取り組んでおり、1回限りのアンケート調査で、その実態を把握するには限界がある。そこで、本プロジェクトでは、インターネット上にヴァーチャル研究組織を構築し、広範囲におよぶアグリ・ブランド保有者から継続的に情報を収集するための仕組みづくりを計画している。平成13年度にそのためのハード面での環境整備を行い、平成14年度はシステム設計などソフト面での環境整備を行った。現在、(1)で収集したデータをもとに公開用データを整備している最中である。(3)アグリ・ブランドの事例研究本プロジェクトでは、(1)の定量調査にもとづくアグリ・ブランドの実態把握と平行して、その育成方法をより深く理解するため、いくつかのアグリ・ブランドを対象にケーススタディを行った。

今後、その成果をワーキングペーパーとして、(2)のヴァーチャル研究組織を通じ、逐次、公表していく予定である。平成15年度は、本研究プロジェクトの最終年にあたり、研究実績は以下の通り。(1)アグリブランドのヴァーチャル研究組織「アグリブランド・プロジェクト」(http://agribrand.bus.osaka-cu.ac.jp/agribrand/public/top.php)の構築(主なコンテンツ)・アグリブランドの説明・プロジェクト研究紹介・アグリブランド関連政策および関連文献紹介・アグリブランド事例紹介(2)アグリブランド実態調査「平成14年度アグリブランド実態調査-農業協同組合・漁業協同組合-」のヴァーチャル研究組織「アグリブランド・プロジェクト」上での公開(3)別委員会およびフランスでのアグリブランド政策に関するヒアリング調査(4)アグリブランド事例研究(3)(4)に関する研究結果も、(2)と同様、ヴァーチャル研究組織「アグリブランド・プロジェクト」上で公開している。実施した調査研究はすべて整理しておらず、成果としてまとまり次第、随時「アグリブランド・プロジェクト」上で公開する予定である。実態調査の結果を見ると、1990年代からアグリブランド(第一次産品のブランド化)に対する関心が急速に高まり、2000年代に入ってもその勢いは衰えるどころかますます高まっていることが明らかになった。その意味で、本研究プロジェクトは、まさにタイムリーでかつ網羅性を有するユニークな研究だと言える。また、研究を進める過程で、BSEや鳥インフルエンザの問題など、アグリブランドを取り巻く環境が大きく変化し、トレーサビリティの実施など新たな課題が生まれるとともに、ブランド化の重要性がますます高まっている。今回の研究プロジェクトの目的は、今後とも継続可能な研究環境の整備にあり、ヴァーチャル研究組織を構築したことで、一応の成果は得られたと思われる。
植物の茎伸長過程におけるサーモスペルミンの作用機構の解明

サーモスペルミンはポリアミンの1つで,植物において維管束分化の抑制に関わり,欠乏すると維管束の異常な増殖と矮化が起きる。その作用機構を解明するため,シロイヌナズナのサーモスペルミン合成欠損変異株から,サーモスペルミンなしで茎の伸長が回復する変異株sac53-d, sac56-dを単離し,原因遺伝子としてリボソームタンパクRACK1, L4をそれぞれ同定した。一方,サーモスペルミンの代替効果を持つ活性物質として,ノルスペルミンを見つけた。さらに,サーモスペルミンがオーキシンと拮抗し,維管束形成を抑制する作用を持つことを明らかにした。シロイヌナズナの茎の伸長に著しい欠損を示す矮性変異株ac15の原因遺伝子は,サーモスペルミン合成酵素をコードする。本研究では,サーモスペルミンがどのように茎の伸長を制御しているのか,その作用機構の解明を目指す。具体的にはac15変異株を出発材料に,その表現型が回復したサプレッサー変異株sac51の解析から明らかになりつつある,SAC51遺伝子の翻訳調節におけるサーモスペルミンの作用,ac15変異株において外的なサーモスペルミンに応答する遺伝子の同定,コケ植物におけるACL5相同遺伝子の機能に関する研究をそれぞれすすめた。今年度の主要な結果は以下のとおりである。1)試験管内翻訳系の構築SAC51遺伝子の5'リーダー配列にGFPレポーターをつないだ融合遺伝子を作成し,試験管内翻訳においてサーモスペルミンの効果を調べる実験系を構築した。2)マイナーなポリアミンの生理活性サーモスペルミンを代替する生理活性がノルスペルミンにあることを発見した。3)サーモスペルミン応答遺伝子の同定マイクロアレイ実験およびリアルタイムPCRによる発現解析により,サーモスペルミンに応答して発現が低下する遺伝子に,木部分化に関連する遺伝子が多く含まれていることを明らかにした。4)コケACL5相向遺伝子の解析ヒメツリガネゴケにある3つのACL5相同遺伝子ACL5A,B,Cについて,シロイヌナズナac15変異株に導入し,ACL5B遺伝子に茎の伸長回復効果があることを明らかにした。シロイヌナズナの茎の伸長に著しい欠損を示す矮性変異株acl5の原因遺伝子は,サーモスペルミン合成酵素をコードする。具体的にはacl5変異株を出発材料に,その表現型が回復したサプレッサー変異株sac51の解析から明らかになりつつある,SAC51遺伝子の翻訳調飾におけるサーモスペルミンの作用,acl5変異株において外的なサーモスペルミンに応答する遺伝子の同定,コケ植物におけるACL5相同遺伝子の機能に関する研究をそれぞれすすめた。1)acl5に対するサプレッサー変異株の分子遺伝学的解析新たに単離したacl5変異に対するサプレッサー変異株sac57,59,501,503,504について,遺伝解析をすすめ,次世代シーケンサーによるゲノム配列の解読を行った結果,原因遺伝子の候補を絞り込むことができた。2)植物界におけるサーモスペルミンの分布裸子植物(イチョウ),シダ植物(オシダ)に加え,緑藻(クラミドモナス),褐藻(ヒジキ),紅藻(シアニジウム),卵菌(ジャガイモ疫病菌)について,HPLCによるポリアミン分析を行い,それぞれからサーモスペルミンが検出されることを明らかにした。3)コケACL5相同遺伝子の解析ヒメツリガネゴケにある3つのACL5相同遺伝子ACL5A,B,Cについて,相同組換えによる各遺伝子の破壊株の作成を進めた。シロイヌナズナのacl5変異株は,維管束木部の異常な増殖により茎の伸長が著しく阻害された矮性の表現型を示し,その原因遺伝子ACL5はサーモスペルミン合成酵素をコードする。サーモスペルミンは,スペルミンの構造異性体である。本研究では,木部分化の抑制におけるサーモスペルミンの作用機構を明らかにするため,acl5変異株の茎の伸長が回復したサプレッサー変異株sacを単離し,各sac変異の原因遺伝子として,SAC51はbHLH型の転写因子,SAC52はリボソームタンパク質L10A,SAC53はリボソーム構成要素RACK1A,SAC56はリボソームタンパク質L4Aをそれぞれコードし,これらの変異がSAC51の翻訳を促進して木部の過剰な分化を抑えていることを解明してきた。本年度は,昨年新たに原因遺伝子の候補が限定されたsac57変異について,解析をすすめた。変異の見つかったSAC57遺伝子のmRNA 5'リーダー領域とプロモーター領域を,GUSレポーター遺伝子と融合して植物に導入し,活性を調べた結果,野生型に比べて変異を含む場合に顕著に高いGUS活性が認められた。

すなわち,茎の伸長回復の原因がSAC57遺伝子産物の過剰な翻訳であることが強く示唆された。一方,サーモスペルミンの競合合成阻害剤を開発し,その効果の検証を行った。野生型芽生えを処理することにより,サーモスペルミンの蓄積が検出されなくなり,維管束分化の促進が観察された。さらに,ACL5遺伝子の発現が増加し,合成阻害剤として有用であることが確かめられた。また,サーモスペルミンによる特定遺伝子mRNAの翻訳促進効果について,サーモスペルミンを持たない酵母菌において,生理活性の再現を試みた。薬剤耐性遺伝子をレポーターとして調べた結果,サーモスペルミンを合成させた場合に有為に薬剤耐性が高まり,翻訳促進活性が再現できた。シロイヌナズナのacl5変異株は,維管束木部の異常な増殖により茎の伸長が著しく阻害された矮性の表現型を示し,その原因遺伝子ACL5はスペルミンの構造異性体であるサーモスペルミンの合成酵素をコードしている。本研究では,木部分化の抑制におけるサーモスペルミンの作用機構を明らかにするため,acl5変異株の茎の伸長が回復したサプレッサー変異株sacを単離し,これまでに,各sac変異の原因遺伝子として,SAC51はbHLH型の転写因子,SAC52はリボソームタンパク質L10A,SAC53はリボソーム構成要素RACK1A,SAC56はリボソームタンパク質L4Aをそれぞれコードし,これらの変異がSAC51の翻訳を促進して木部の過剰な分化を抑えていることを解明した。本年度は,未だ原因遺伝子が特定されていないsac55, 57, 59, 501504について,染色体のマッピングと高速シーケンサにより原因遺伝子の同定,解析をすすめた。その結果,sac57変異の原因遺伝子は,SAC51と相同性の高いbHLH型転写因子をコードするSACL3と推定され,sac51変異同様,mRNAの5'領域に保存された短いペプチドコード配列(uORF)に塩基置換が見つかった。また、sac501変異はsac52と同じリボソームタンパク質L10Aの別の変異アレルと推定された。sac変異の原因遺伝子にリボソームタンパク質やuORFが見つかることから,サーモスペルミンが植物の茎の伸長に関わる遺伝子の翻訳制御に重要な役割をもっていることが示唆された。さらに,sac55, sac59変異についても,それぞれ特定の遺伝子に塩基置換を見つけることができた。サーモスペルミンによる茎の伸長制御機構の解明の重要な手がかりになると思われる。acl5に対するサプレッサー変異株の分子遺伝学的解析について,次世代シーケンサーによるゲノム解読が予定したとおり進み,原因遺伝子の候補が絞られつつあることから,順調な進展と判断した。サーモスペルミンとオーキシンの相反作用に関する論文,サーモスペルミンの植物界における分布,その機能と作用機構に関する総説も公表でき,成果発表も滞りなく行えた,25年度が最終年度であるため、記入しない。次世代シーケンサーの利用により,茎伸長の回復変異の原因遺伝子の同定作業がはかどり,今後の研究展開につながる重要な手がかりが得られたと判断されるため。試験管内無細胞タンパク合成系において,サーモスペルミンによる翻訳促進効果を検証する実験に注力する。
アンジオテンシン受容体に直接結合する低分子蛋白による心肥大抑制作用についての検討

レニン-アンジオテンシン系の生理活性物質アンジオテンシンIIは主要な受容体であるAT1受容体に作用して下流の情報伝達系を活性化することにより,高血圧,心肥大,心不全,動脈硬化,腎障害などの心血管系疾患や社会的脅威となりつつある生活習慣病・メタボリック症候群の発症・進展に深くかかわっている.研究代表者らは,このAT1受容体への新規結合因子ATRAP (Angiotensin II Type 1 Receptor-Associated Protein)を世界で初めて報告した.本研究では,発生工学的手法による心臓特異的ATRAP高発現マウスおよびATRAP欠損マウスを用いて,ATRAPの新規心肥大抑制因子としての可能性について生体レベルで明らかにした.レニン-アンジオテンシン系の生理活性物質アンジオテンシンIIは主要な受容体であるAT1受容体に作用して下流の情報伝達系を活性化することにより,高血圧,心肥大,心不全,動脈硬化,腎障害などの心血管系疾患や社会的脅威となりつつある生活習慣病・メタボリック症候群の発症・進展に深くかかわっている.研究代表者らは,このAT1受容体への新規結合因子ATRAP (Angiotensin II Type 1 Receptor-Associated Protein)を世界で初めて報告した.本研究では,発生工学的手法による心臓特異的ATRAP高発現マウスおよびATRAP欠損マウスを用いて,ATRAPの新規心肥大抑制因子としての可能性について生体レベルで明らかにした.A.遺伝性高血圧ラットの心血管系組織におけるATRAPの発現調節の検討:遺伝性高血圧モデルラットである自然発症高血圧ラット,Dahl食塩感受性高血圧ラットにおける高血庄および高血圧性心肥大、動脈硬化性病変の進行にともなう,心血管糸組織におけるATRAPおよびAT1受容体の発現調節を,Northern blot法,Real-time PCT法,Western blot法,および免疫組織法によって検討した.また,これらの遺伝性高血圧ラットに対してレニンーアンジオテンシン系拮抗薬を投与し,心血管系組織におけるATRAP発現,AT1受容体発現,および組織でのAT1受容体とATRAPの発現量の相対比(=組織レニン-アンジオテンシン系活性の新しい指標)に与える影響について検討した.B.アンジオテンシンII負荷心肥大高血圧モデルにおけるATRAPの発現調節の検討:正常野生型マウスを用いてアンジオテンシンII負荷による心肥大合併高血圧,大動脈縮窄による実験的肥大心における心血管性組織におけるATRAPの発現調節を,Northern blot法,Real-time PCT法,Western blot法,および免疫組織法によって検討した.連携研究者横浜市立大学・医学部・准教授田村功一(ATRAP発現解析を担当).本年度も引き続いて1)遺伝性高血圧ラットの心血管系組織におけるATRAPの発現調節の検討:遺伝性高血圧モデルラットである自然発症高血圧ラット,Dah1食塩感受性高血圧ラットにおける高血圧および高血圧性心肥大.動脈硬化性病変の進行にともなう.心血管系組織におけるATRAPおよびAT1受容体の発現調節を,Northern blot法,Real-time PCT法,Western blot法,および免疫組織法によって検討した.また.これらの遺伝性高血圧ラットに対してレニン-アンジオテンシン系拮抗薬を投与し,心血管系組織におけるATRAP発現,AT1受容体発現,および組織でのAT1受容体とATRAPの発現量の相対比(=組織レニン-アンジオテンシン系活性の新しい指標)に与える影響について検討した2)アンジオテンシンII負荷心肥大高血圧モデルにおけるATRAPの発現調節の検討:正常野生型マウスを用いてアンジオテンシンII負荷による心肥大合併高血圧,大動脈縮窄による実験的肥大心における心血管性組織におけるATRAPの発現調節を,Northern blot法,Real-time PCT法,Western blot法,および免疫組織法によって検討した連携研究者横浜市立大学・医学部・准教授田村功一(ATRAP発現解析を担当)
インフルエンザ誘導サイトカインストームを制御するウイルス遺伝子ＮＳ１による評価法

高病原性トリインフルエンザウイルス(A/H5N1)感染は急性呼吸窮迫症候群(ARDS)を誘発し60%の高死亡率を示す。その発症にNS1タンパク質構造が関与することを明らかにした(Kato YS, Fukui K, Suzuki K, Prot Pep Lett, 23(4), 2016、372-8)。すなわち、二本鎖RNAに結合するSer42が、A/H5N1では、Pro42となり結合を示さなかったことがH5N1の病原性に影響したと考えられる。一方、PLサイトにGSEVをもつNS1が肺上皮細胞のバリア機能を低下させ、劇症肺炎を誘発する可能性が示唆された。【目的】肺上皮培養細胞を用いた研究では、劇症ARDSをmimicした条件下でNS1タンパク質の発現がサイトカインストームの引き金になり得ることが示された。NS1タンパク質がサイトカインストームを引き起こす際のキーとなる変異を探る目的でホモロジーモデリングによる解析を実施する。【方法】NS1 RNA結合ドメインタンパク質(RBD)が、実際にどのような性質をもつのか調べるために大腸菌発現系を作成した。pGEX発現系を利用してグルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)との融合タンパク質として、野生型RBDの発現を確認した。【結果】大腸菌の細胞破砕後にグルタチオンセファロースを用いてワンステップで純度を高めることに成功した。また、S42P変異体タンパク質の発現も同様の系を利用して試みた。野生型RBDと比較して全く同じ条件でS42Pタンパク質のサンプル調製を行い、大量に高純度なS42P変異型タンパク質を得ることに成功した。この結果は意外であった。RBDの重要なαヘリックス上のProへの変異にも関わらず、全体構造への影響が最小限に食い止められている可能性が示唆された。16塩基長の2本鎖RNAの調製にも成功した。分光学的な手法やX線結晶構造解析等を利用することでこれらのタンパク質の構造や安定性の違いを比較することを検討している。またRNAとの相互作用の違いがあるのかどうか生化学的あるいは分子生物学的な手法で解析することも検討している。最終的にはこれらの変異がヒト細胞に及ぼす影響も評価していきたいと考えている。NS1蛋白質と相互作用する因子を、リコンビナントとして作製し、NS1との相互作用様式をin vitroで検討することを目的とした。1.NS1蛋白質の作用、発現系構築および精製:1)トリインフルエンザ(A/H5N1)感染でARDSを発症した小児患児の肺洗浄液中のサイトカイン/ケモカインの多量増加と好中球myeloperoxidase(MPO)活性の血中濃度が上昇に、NS1タンパク質が関与していることをA549肺上皮細胞による解析で明らかにした。A549肺上皮細胞にNS1プラスミッドを感染後H2O2-MPOの存在下ではA549肺上皮細胞は活性化し、大量のIL-8とMCP-1産生を誘導したが、IFNa, IFNb, TNF-aには顕著な変化はなかった。この結果は、インフルエンザウイルス感染によってH2O2-MPO系が誘導され、NS1と連動して肺上皮細胞のサイトカインストームが誘発されるARDSの過程の一端が明らかになった。2)NS1のホモロジーモデリングを用いた研究: NS1タンパク質がサイトカインストームのキーとなることが示されたことから、NS1タンパク質の変異をホモロジーモデリングにより検討した。その結果、A/H5N1におけるNS1遺伝子の変異(S42P)をモデル構造に導入して解析した。この部位がProに変換されることでRNAとNS1の間の相互作用が弱まることが予想された。S42はαヘリックス中央部に存在する残基であることから、Proへの変換はRNAとの相互作用のみならず、NS1分子の全体構造を不安定化させることも予想された。この結果を踏まえ、NS1 RNA結合ドメインの大腸菌発現系にpGEX発現系にTEV protease切断サイトを導入し、確実性の高いNS1生産の発現条件を室温程度の低温としてグルタチオンセファロースを用いた1ステップ精製を可能にした。In virtoでのインフルエンザウイルスNS1によるサイトカイン遺伝子発現の調節を実施した。ヒト肺上皮細胞株(A549およびH292)に、インフルエンザウイルスH1N1あるいはH5N1それぞれのNS1遺伝子を導入し、そのNS1導入細胞にRSL1リガンドによってNS1を条件的発現誘導する系を利用できるように設定した。RSL1リガンドの刺激条件として500 nMで24時間刺激することがサイトカインmRNAの発現誘導に適していることが分かった。そこで、H5N1-NS1導入A549およびH292細胞、とH1N1-NS1導入A549およびH292細胞を500nM RSL1リガンドで刺激した時に、インタフェロン(IFN)-α, IFN)-β, IL-6, IL-8の発現の相違を調べた。その結果、RSL1リガンドの誘導によって、H5N1-NS1細胞ではIL-6およびIL-8の発現がH1N1-NS細胞1よりも強く発現した。これは、H5N1インフルエンザウイルスによって誘導されるサイトカインストームは、H1N1インフルエンザウイルスより強いことを示唆している。これらのin vitroでのサイトカインの発現が、生体でのインフルエンザウイルスNS1によって誘発する劇症化を裏付けるものと考えられる。インフルエンザウイルス(IFV)の感染により劇症型となる重篤な肺炎を併発することがある。

近年では、高病原性トリインフルエンザ(A/H5N1型)がヒトで60%もの高死亡率を示している。病態は急性呼吸窮迫症候群(acute respiratory distress syndrome: ARDS)を示し呼吸不全に至る。その発症機構には不明な点は多く、現在その1番の候補として考えられている要因としてNS1タンパク質がある。近年、高病原性IFVのNS1タンパク質に共通する変異が見られることが明らかになった。本研究では、インフルエンザ重症化因子に関連する遺伝子NS1:昨年度に引き続き、NS1遺伝子の機能について検討した。トリインフルエンザウイルスH5N1の重症化因子としてのNS1遺伝子の解析: H5N1の遺伝子変異が及ぼすNS1のたんぱく質構造変化についてシミュレーション解析により、たんぱく質構造の関与を明らかにした(Kato YS, Fukuia K, Suzuki K. Mechanism of a Mutation in Non-Structural Protein 1 Inducing High Pathogenicity of Avian Influenza Virus H5N1. Protein & Peptide Letters, in press)。具体的には、NS1のRNA結合ドメインの42番目のアミノ酸における変異が、H5N1の病原性に決定的な影響を与える。RNA結合ドメインに対する機能的な影響を調べたところ、42番目の残基がセリンの場合には、二本鎖RNAに対する結合を示したのに対し、プロリンの場合には結合を示さなかった。本解析結果から、変異によりRNA結合インターフェイスの構造に違いが見られた。一方、インフルエンザウイルス遺伝子のNS1が、どのように劇症化に関与するかを解析した結果、NS1遺伝子のPLサイトに「GSEV」の構造が関与している可能性が浮上した。具体的には、インフルエンザウイルスが肺上皮細胞に感染するとタイトジャクション分子の発現調節因子にNS1が結合しバリア機能を低下させ、劇症化肺炎を誘発する可能性が示唆された。高病原性トリインフルエンザウイルス(A/H5N1)感染は急性呼吸窮迫症候群(ARDS)を誘発し60%の高死亡率を示す。その発症にNS1タンパク質構造が関与することを明らかにした(Kato YS, Fukui K, Suzuki K, Prot Pep Lett, 23(4), 2016、372-8)。すなわち、二本鎖RNAに結合するSer42が、A/H5N1では、Pro42となり結合を示さなかったことがH5N1の病原性に影響したと考えられる。一方、PLサイトにGSEVをもつNS1が肺上皮細胞のバリア機能を低下させ、劇症肺炎を誘発する可能性が示唆された。おおむね予定通りに進んでおり、今年度は、in vitroでのインフルエンザウイルスNS1がサイトカインの発現にかかわることを明らかにし、かつインフルエンザウイルスH5N1とN1N1が持つNS1がその発現量を調整している可能性を示すことができた。感染症と免疫インフルエンザウイルスNS1にターゲットして抗インフルエンザの治療薬の開発につなげる。
乳癌ホルモン療法の効果・耐性化に関連する血中微量ステロイドホルモンの探索的研究

日本人乳癌の75%は女性ホルモン(エストロゲン)依存性乳癌であり、ホルモン療法は最も重要な治療薬である。本研究ではホルモン療法の効果と耐性化に関わる要因について、ステロイドホルモンの変化という視点で研究をおこなった。様々な実験から、エストロゲンの濃度変化により、治療耐性化に関わる膜受容体の一つHER3の分解効率が変化することを見いだした。この分解はプロテオソーム経路によっており、エストロゲンの受容体(ER)を分解するユビキチンリガーゼNedd4-1がHER3の分解にも関与していることを同定した。Nedd4-1は増殖にも影響しており、これら3つの相互関係を解明していくことが重要と考えられた。・主任研究者は福島県立医科学への異動後(平成26年9月)、福島県内の主要乳癌治療施設での診療支援を開始するとともに、本研究の計画にあるホルモン療法患者の血清集積に関する研究体制についての協議を開始した。・本研究で用いる予定となっている患者検体のうち、JBCRG M04臨床試験に附随する検体集積については、試験患者登録が平成27年末に予定症例数を達成して終了した。現在も試験治療中の規定タイミングでの検体集積が継続している。・メカニズム研究としての細胞実験を福島県立医科大学でも開始した。異動にともない、当初計画にあったFACS等の研究機材の使用が当初は困難なため、実験計画を見直した上で必要な研究試料、細胞などの集積を年度前半でおこなった。これまでの実験結果の蓄積から、ユビキチンリガーゼの細胞導入とユビキチン化に関するアッセイを使用する必要がでてきたため、これに関する研究試料を整備するとともに、学外研究施設と連携して実験をすすめる体制を構築した。ある膜受容体の分解に関するユビキチンリガーゼの同定と、その変化が細胞動態に与える影響の実験をおこなっている。臨床試験を基盤とした附随研究としての患者検体集積については予定通り進捗している。本研究では、患者検体でのデータ解析をもとにして、メカニズム研究へ橋渡しをしていくことを当初の計画としていた。しかし、これまでのメカニズム研究の進捗結果から、当初予定と違う方向性の新規知見が得られてきており、メカニズム研究を先に進捗させる必要性が生じている。このため、患者検体を用いたアッセイの実施が遅れることから、当初の計画案よりもやや遅れていると判断した。・昨年度に引き続き、メカニズム探索のための細胞実験を中心に研究を実施した。ホルモン療法の耐性化に関連する膜レセプターとしてHERファミリーの存在が知られているが、このうちのHER3のタンパク質分解機構に関して女性ホルモンであるエストラジオールが促進的に作用することを見いだした。またプロテアソーム阻害剤エポキソマイシンやライソソーム阻害剤クロロキンなどを用いた分解経路阻害実験から、HER3の定常状態での分解はユビキチンプロテオソーム経路によっておこなわれていると判断されるが、この分解機構にエストロゲン受容体(ER)が直接的に関与する可能性を示唆するデーターを得ている。これまで、ホルモン陽性乳癌細胞におけるHER3とERの相互作用に関しての研究報告は少なく、ホルモン療法耐性化におけるこの機構の関与も含めて、今後の研究を継続していく。これらの成果については、2017年度の日本乳癌学会総会、および日本癌学会総会において発表する予定である。・本研究の目的の一つである、患者検体を用いたトランスレーショナルリサーチとしては、ホルモン陽性転移性進行乳癌を対象にした臨床試験JBCRGM04試験(1次登患者数160名)における附随研究として実施している、患者血液検体集積については、2017年4月時点で366本の血漿サンプルが参加施設より回収、蓄積されている。試験治療継続中の今後の集積分を加えて最終的には約450本のサンプルが次年度以降の測定対象となる予定である。計画立案時の患者検体解析スケジュールからは外れているものの、本年度はメカニズム研究においての進捗が予定をこえるスピードで得られており、全体としては予定どおりの進捗と判断した。将来の解析対象になる患者血漿サンプルは予定どおり集積できている。昨年度に引き続き、メカニズム探索のための細胞実験を中心に研究を実施した。エストロゲン受容体(ER)陽性乳癌に対するホルモン療法への薬剤耐性化に関連し、活性化する膜レセプターとしてHERファミリーの存在が知られている。HER1、HER2に関しての研究は比較的広く行われているが、ER陽性乳癌におけるHER3の役割についての報告は少ない。我々は、このHER3に着目して研究を行ってきており、昨年度までの研究からHER3の蛋白分解に関してエストラジオールが促進的に作用すること、この作用は1nMの濃度で最も強くみられること、この分解はユビキチンプロテオソーム経路によることを確認している。本年度はさらに標的分子のノックダウン実験を数多く行い、いくつかの候補分子から、この分解促進に関わるユビキチンリガーゼがNedd4-1であることを同定した。様々な条件下における、ERのノックダウン実験とあわせ、HER3の分解をERが抑制しており、エストラジオールによってERが急速に分解されることで(既知)、HER3の分解抑制が外れ、HER3も分解が亢進する作用機序が最も妥当と考えられるデータを得た。またNedd4-1はERの分解にも関与しており、ER陽性乳癌におけるユビキチンリガーゼNedd4-1の生物学的な重要性について、今後さらに研究が必要と考えられた。これら3年間の研究成果について、2018年5月の第22回日本がん分子標的治療学会で報告するとともに、論文投稿を行う。本研究の目的の一つとして患者検体を用いたトランスレーショナルリサーチも実施してきたが、

JFMC 34-0601試験(原発乳癌に対するアロマターセゼ阻害薬エキセメスタンによる術前ホルモン療法試験; UMIN試験登録番号C000000345)について、長期予後データを論文報告した。日本人乳癌の75%は女性ホルモン(エストロゲン)依存性乳癌であり、ホルモン療法は最も重要な治療薬である。本研究ではホルモン療法の効果と耐性化に関わる要因について、ステロイドホルモンの変化という視点で研究をおこなった。様々な実験から、エストロゲンの濃度変化により、治療耐性化に関わる膜受容体の一つHER3の分解効率が変化することを見いだした。この分解はプロテオソーム経路によっており、エストロゲンの受容体(ER)を分解するユビキチンリガーゼNedd4-1がHER3の分解にも関与していることを同定した。Nedd4-1は増殖にも影響しており、これら3つの相互関係を解明していくことが重要と考えられた。細胞実験環境の整備が整いつつあり、この面での共同研究施設との連携も可能になってきたことから、細胞実験におけるメカニズム研究を先行させる。計画立案時には想定していなかった標的因子を含んだ実験計画となるが、新規知見が得られる可能性を優先して研究をすすめていく。実験環境が整備され、共同研究施設との連携も継続的に実施しており、研究推進環境としては問題ないと考えている。患者検体での検証を最終年度である来年度で実施できるかについてはまだ不確定な部分があるが、次年度以降の外部資金の獲得への準備もおこない、継続的な研究が実施できるよう務めていく。腫瘍内科(乳癌)、エストロゲン受容体H26年度後半での主任研究者の異動と新規講座・研究室開設のため、平成27年度前半は実験機器・研究環境整備などに時間を要した。このため、まだ執行できていない経費項目がある。おおよそ予定通りの予算執行ができているが、試薬等の選定で経済的なものを購入できたことなどから当初計画より支出を抑えることができたため。実験環境整備が整いつつあり、平成27年度分とあわせ、本年度に予定していた物品等を支出していく。外注検査分に関しては、来年度の執行になる可能性が高い。来年度は成果の発表を伴う学会報告を予定しており、旅費などの執行もおこなう。外注検査費用として計上していた予算については、今後の研究進捗状況にあわせて判断していく。
クロイツフェルト・ヤコブ病の発症因子と発症機序の解明

研究計画の中から、タンパク質の二次元電気泳動に関する実験を先に着手し、新たに我々が先に報告したクロイツフェルト・ヤコブ病(CJD)妊婦症例の知見を踏まえ、CJDの周産期感染のリスクを実験的に検討した。1:非平衡pHグラジエント電気泳動とSDS-PAGEとの組合せでマウス脳の12個のタンパク質スポットの経時的変動を解析した結果、正常群では一定であるが、感染群で顕著に増加する3個のスポットを特定することができた。現在アミノ酸配列を含めて構造解析中である。2:周産期および母体感染の可能性について〔実験1・母系、父系感染の検索〕感染♀マウスから生まれた仔マウスを実のCJD母マウスで哺育、正常母マウス(foster mother)で哺育、および正常マウスから生まれた仔マウスをCJD接種母マウス(foster mother)で哺育させる場合の3つのケースについて仔マウスの発育状態を観察したが、400日齢現在、仔マウスの発症は認められない。CJD♂マウスからの感染も認めていない。〔実験2・新生仔マウスへの接種〕生後3、7、21、28日齢のマウス腹腔内にCJD株を接種し、症状発現までの期間を観察した結果、いずれの日齢群でも240-270日の間に発症した。〔実験3:感染マウスの胎盤、胎児脳、精子、精液の感染性の検索〕妊娠CJDマウスから採取した胎児と胎盤、感染♂マウスの精子と精液の感染性を検索した。母マウスの脳と脾臓は100%感染性を示しが、胎盤と胎児脳には370日現在感染性は認めていない。発症直前の15週目で採取した精子、精液にも感染性はない。Western blotによりPrP^<OJ>の検出を試みたが、PrP^<OJ>がCJD接種母マウスの脳で検出されている場合でも、その胎盤と胎児脳にPrP^<OJ>は検出されなかった。〔結論:感染因子への感受性に年齢差は無い。周産期感染の結論は次年度に得られる。
産業廃棄物を有効利用した廃油の処理・処分方法の開発に関する研究

本研究は有害成分や不純物を含有し,処分や管理の困難な廃油の安全で経済的な処理・処分方法の開発を目的としている。具体的にはフライフッシュ,砕石微粉末,製紙焼却灰や水砕スラグなどの産業廃棄物に廃油などを含浸させ,セメント系安定材により固化し,その硬化体を建設材料として有効利用する可能性を検討した。1.高炉水砕スラグ硬化体がその潜在水硬性により最も大きな強度を発現し,コンクリート二次製品のような高強度を必要とする材料としての利用が可能である。2.製紙焼却灰は廃油を最も多く含浸し,処理能力が高い。(1)最大乾燥密度が得られる程度の含浸液の量では,含浸液中の油の割合が少ないほど強度が発現する。この場合,固化材添加率3%で道路路床に,9%で下層路盤に使用できる。(2)含浸液の量が多くなると,長期(28日以上)の強度発現が顕著であり,含浸液中の脂の割合が2030%の時に最も大きな強度を示す。固化材を11%添加すると上層路盤としても使用できる。3.廃油中の硫黄分と固化材との反応によって生成されるエトリンガイトが養生初期の強度発現に大きく貢献し,長期にわたる強度発現には固化材のポゾラン反応によるCSH系反応物の生成が重要である。そして,硬化反応の促進には処理灰中の水分の存在が重要であり,最適水分量の存在することがわかった。その結果,廃油と固化助材中の水分量を調整することにより効果的な廃油の固化処理が可能となる。4.硬化体からの油の溶出試験の結果,混合液中の油の割合が30%の時には固化材添加率12%以上で,油の割合が10%の時には固化材添加率3%で,「産業廃棄物の処理及び清掃に関する法律」に定められている判定基準値以下の溶出量となり,周辺環境へ及ぼす影響は少ないことが明らかとなった。1.検討に用いた廃油は座礁した貨物船から回収された燃料用の廃重油であり、産業廃棄物としてはフライアッシュ、砕石の微粉末、製紙焼却灰の三種類、さらに高炉水砕スラグを助材として用いた。固化処理材の特性として四種類の助材を化学組成、物理的性質および固化活性から比較すると、CaO含有量の多い高炉水砕スラグがその潜在水硬性により最も大きな強度を発現する。一方、廃油を最も多く含浸し、処理能力の高いものは製紙焼却灰であり、この二種類の固化助材が廃油の処理・処分に有効に使用できることがわかった。2.固化材は炭酸アルミネ-ト系塩材料(成分はセメント80%、硫酸アルミニウム9%、炭酸ナトリウム6%、酸化カルシウム5%である)が有効であり、養生初期から長期にわたる強度増加が期待できる。廃油を含浸させた水砕スラグでは固化材添加率が3%程度で1日養生強度が約100kgf/cm^2となり、高強度を必要とする材料としての利用が可能である。一方、廃油を含浸させた製紙焼却灰では固化材添加量に応じて有効に固化効果を発揮しており、約3%の固化材添加により下層路盤に適用できる程度の強度発現のあることが明らかになった。3.固化反応メカニズムとしては、固化助材に含浸させる廃油中の硫黄分と固化材との反応によって生成されるエトリンガイトが養生

初期の強度発現に大きく貢献し、その後の養生に伴う強度発現の継続には固化材のポゾラン反応によるCSH系反応物の生成が重要である。そして、固化反応の促進には処理灰中の水分の存在が重要であり、最適水分量の存在することがわかった。その結果、廃油と固化助材中の水分量を調整することにより効果的な廃油の固化処理が可能となることが明らかになった。4.固化処理した硬化体の環境への影響評価および試験施工方法については実験方法などを検討している。廃油を含浸した製紙焼却灰にセメント系固化材を添加した固化処理材料の強度発現と建設材料としての可能性を検討するため、廃油の代わりに水とマシン油の混合液を用いて硬化反応メカニズムを追究した。1.最大乾燥密度の供試体が得られる混合液の配合(低コンシステンシー)の場合は含浸させる混合液中の油の割合が少ないほど強度発現は顕著となる。一方、低コンシステンシーより混合液が10%多い配合(高コンシステンシー)では養生初期の強度増加は小さいが長期の強度発現が顕著であり、28日養生以後では低コンシステンシー供試体を上回る強度になり、油分を1020%程度混合した場合にも最も大きな強度になる。2.硬化体の油の溶出試験(環境庁告示第3号)の結果、混合液中の油の混合比が30%の場合は12%、また、混合比が10%では3%の固化材添加率で「産業廃棄物の処理及び清掃に関する法律」に定められている油分を含む産業廃棄物の判定基準値以下の溶出量となり、周辺環境へ及ぼす影響の少ないことが明らかになった。3.低コンシステンシーの固化処理材料は固化材添加率3%で路床、約9%添加率で下層路盤に使用が可能である。また、高コンシステンシー処理灰は約6%程度の固化材添加率で路床に、そして、8%、11%の程度の添加率で下層および上層路盤としての適用が可能であり、建設材料として有効に利用できる。4.硬化反応生成物としては油を混合した高コンシステンシー処理材でエトリンガイトの成長が顕著である。そして、CSH系反応生成物とともに養生に伴う強度発現に大きく貢献していることが明らかとなった。しかし、油の存在によりX線回折などによる定量は困難であった。今後の課題は固化処理材の油臭さの減少対策や硬化体の耐久性および長期安定性を検討する必要がある。
日本式バースセンターに関するシステム開発研究-病院内潜在助産師の人的活用

産科以外で働く助産師の有効活用と新たな周産期システム開発目的で本研究を行った結果、正常分娩は医師立会いのもと助産師主導の分娩とともに助産師のみの分娩希望が11.9%あり、院内助産のニーズがあることがわかった。人的資源の有効活用のために神奈川県内の2次医療圏(11地域)で病院のみで分娩するシステムの場合、6地域で計153261床の増床と、10地域での医師344名、助産師627人の増員が必要となる。2007年度の調査から、病院勤務の助産師のうち16.3%が産科の関連しない病棟や外来に配属されていること(病院内潜在助産師の存在)がわかった。また、近年の産科医師不足を背景とした周産期医療問題の改善策としてめオープンシステム(妊婦健診はクリニックで、分娩は契約した病院でクリニックの医師の立ちあいで行う)導入は、病診連携の義務化などが必須となり既存の開業医からの反発が予想される(多和田、2005)。研究者はバースセンターを病院内潜在助産師の人的活用法としてとらえ、バースセンター(正常分娩を医師の立会いなしに助産師のみが介助を行う)を含めた新たな周産期医療提供システムについて検討する。平成21年度は、セミオープンシステム方式を実施している英国のバースセンターおよび助産師教育と業務範囲についての現状と量の課題等を明らかにすることを目的として、英国のバースセンターの視察、およびインタビュー調査を実施した。その結果、(1)イギリスのバースセンターは、分娩の集約化を緩和する目的で設置されたのではなく、女性が望む分娩方法を提供する施設の選択肢として設置されていること、(2)バースセンターでの分娩数ほ全分娩数の9.6% (2007年)で、利用率は徐々に上昇していること、(3)マンツーマンのケアである特性上、バースセンターでケアできる産婦の数に制限があること、(4)産科病棟での分娩のうち、助産師のみが分娩を担当している割合は60.3%を占めることなどが明らかとなった。これは、一般の産科病棟かバースセンターかという場所の問題ではなく、分娩における助産師の主体的なケアのニーズが高いことを示唆している。また、分娩のセンター化が進められた結果、NHS(National health service)1施設の分娩数は20007000件と莫大な数になっており、そこで勤務する助産師はハードワークに疲弊してきていることが明らかとなった。その一方で、バースセンターでは1人の産婦に2人の助産師が付き添い、入院から分娩、退院まで管理しており、ゆったりしたケアが提供されていた。日本の場合、助産師のみが分娩に立会い介助する助産所の利用者はわずか1%しかおらず、産科医師のいる施設での分娩が大半を占める。その一方で、自然分娩を求める産婦も多く、医師の立会いに対する一般妊産婦のニーズや、病院管理者や産科病棟看護管理者のニーズもふくめた調査を今後実施する必要がある。本研究に付随して、2010年度は正常分娩時の産科医療システムに関する妊婦のニーズに関するネット調査も実施した。その結果、日本の妊婦は、正常分娩時の分娩介助は助産師主体をのぞんでいるが、同時に異常発生時に対処できるよう産科医師の分娩立会いも望んでいることが明らかとなった。そこで、日本式バースセンターでの病院内潜在助産師の人的活用法の課題を明らかにするために、全国の周産期医療センターの看護管理者に対するアンケート調査を行った。その結果、施設間で差はあるものの、各勤務帯で分娩を担当する助産師は平均13例の分娩にあたりながら他の看護業務も兼任していた。妊産褥婦のニーズに対応するために質の高い看護ケアを提供しようと努力している日常とともに、半数以上の産科病棟看護管理者が助産師不足を指摘していた.また、緊急時以外は現在の助産師業務範囲の拡大は求めないという意見が多く、多忙な業務遂行の中で対象の安全を保つためには、異常発生時の即時の対応が可能となるよう産科医師との協働が不可欠であるということが明らかとなった。その一方、産科病棟・外来以外に配置されている助産師数は平均6(±14)名と、依然助産師の専門性を活かしきれない部署で勤務する助産師の実態が明らかとなった。病院内潜在助産師を産科病棟・外来に配置することで助産師の不足の解消につながるとともに、分娩取り扱い施設数の減少に伴う分娩数の増加に対し、安全に分娩ケアを提供できる。多くの施設で夜間帯の陣痛主訴の入院決定を助産師が判断しているという結果からも、正常分娩における助産師の必要性は高く、産科医師との協働により異常発生時も速やかに対応可能となる。しかし、産科クリニックでの分娩取り扱いの減少により、病院における産科医師および助産師への負荷は大きいのが現状であり、地域の産科クリニックの医師も巻き込んだ周産期医療システムの構築が必要である。

H23年度は2次医療圏での年間分娩数や助産師数・産科医療施設数等を検討し、病院内潜在助産師の人的活用モデルの開発目的で地域の産科クリニックの医師も参加する日本式バースセンターシステムのシミュレーションを実施した。分娩施設の集約化を実施している英国の大ロンドン地域の面積(1577.3km^2)や人口(775万人)が神奈川県と同程度であったため、神奈川県の2次医療圏を対象とするシミュレーションを行った。大ロンドン地域には24トラストに31分娩取扱い施設(病院)があり、2010年度の大ロンドン地域年間分娩件数は132,453件(うち正常分娩68.7%)で、産科専門医師294名と助産師4110名で93.6%(職種別分娩介助者の内訳は産科専門医44.2%、助産師49.4%)の分娩を介助していた。助産師ひとりに対する分娩数は32.2件/人で、産科専門医師数が限られるため助産師が多くの業務を担っていると考えられる。H22年度の神奈川県下の分娩取扱い施設は助産所を含め160施設で、年間分娩数69,485件、産科医師479名、助産師1787名(非常勤含)であり、ロンドン地域に比べ分娩件数が約1/2程度だが、分娩施設は約5倍、産科医師数1.6倍に対し、助産師数は0.4倍にとどまり助産師ひとりに対する分娩件数は38.9件/人であった。県内の周産期医療センターは16施設で分娩件数に応じて13施設設置されているが、厚木(県中)地域には一つもない。集約化のために周産期医療センターのみを分娩取扱い施設とした場合1施設で20007000件の分娩件数となり、イギリスの現状と同等となる。各施設専属の産科医師を約15名程度配置した場合(英国では920名)、残り239名の産科医師は自分の所属する産科クリニックから当番制で正常分娩の立ち合いを行うことができる。産科医師との協働のために正常分娩を助産師中心で担当する必要があり、英国と同程度の助産師数の増員が必要となるため、他部署に配属されている病院内潜在助産師の配置をまず実施する必要がある。(詳細は研究成果報告書参照)
アクアポリンによる細胞膨張性アミノ酸放出の制御機構

平成15年度-平成16年度にわたり、「アクアポリンによる細胞膨張性アミノ酸放出の制御機構」というテーマで研究を行った。細胞が種々の条件のもとで膨張すると細胞膜透過性が亢進し、細胞内に存在する通常では細胞膜を通過し得ないようなアミノ酸分子が細胞外に流出するにとが知られてきたが、それらを簡便に測定する手法がなかった。本研究では、とくに脳神経系において細胞障害に関与するグルタミン酸に着目して、グルタミン酸の測定方法の開発を行った。同人化学(株)の開発した水溶性ホルマザンを生成するテトラゾリウム塩WST-8とグルタミン酸脱水酵素を組み合わせて、簡単に溶液中のグルタミン酸を測定するシステムを作った。このシステムを利用して、代謝阻害薬投与時のグリオーマ細胞C6からのグルタミン酸放出を測定した。代謝阻害剤であるNaN3を細胞に投与して、30分後に細胞外液のグルタミン酸濃度を測定すると、阻害剤投与前の3μMから10μM程度までグルタミン酸の上昇が観察された。このグルタミン酸上昇は種々のClチャネル阻害剤では阻害されず、これまで観察を行ってきた低浸透圧によるグルタミン酸放出と同様のメカニズムによりグルタミン酸が細胞外に放出されることが示唆された。アクアポリンの水透過性を阻害するHgCl2を投与すると、代謝阻害剤によるグルタミン酸放出には、影響が無かったものの、代謝阻害剤非存在下でもグルタミン酸がHgCl2投与により放出されることが明らかになった。この過程は、HgCl2がアクアポリンに作用してグルタミン酸を放出させるというより、HgCl2が細胞膜にダメージを与えたことが示唆された。また、今回の一連の研究のなかで、細胞外にグルコースが存在するとグルタミン酸放出が促されることを見出した。この結果は、高濃度グルコースの組織に対する障害メカニズムと関連があることが予想された。低浸透圧性アミノ酸放出を起こす細胞として、グリオーマ細胞(C6)を使用した。既に、C6細胞においては、低浸透圧刺激に応じてグルタミン酸放出が起こることを確認し、その放出経路が従来予想されてきたような容積感受性Cl-チャネルや、グルタミン酸トランスポータとは異なることを報告しているが、その過程で、低濃度の水銀が細胞膨張性グルタミン酸放出を抑制するという予備的な知見を得ていた。しかし、酵素的発色反応によるグルタミン酸測定システムを用いた場合は、見かけ上、グルタミン酸放出の抑制が認められたものの、HPLCを用いた測定では、細胞外への水銀投与により、むしろグルタミン酸が上昇するという結果を得た。これは、水銀自体が、酵素的な測定系に影響を与えていたものと考えられた。このことから、水銀をアクアポリンの抑制剤として使用するプランは実行できなかった。一方、一連の実験の過程で、偶然、細胞外液にグルコースを加えた際に、細胞外グルタミン酸が上昇することを見出した。これは、低浸透圧刺激は必要とせず、グルコース単独でグルタミン酸放出を引き起こした。この過程は、Cl-チャネル阻害剤や、グルタミン酸トランスポータ阻害剤では抑制されなかった。また、ショ糖、乳糖、ガラクトース投与では、グルタミン酸放出は惹起されなかった。これらの結果は、平成16年度生理学会において発表予定である。種々の細胞は、低浸透圧環境下におかれると細胞膨張を起こす。また、低酸素条件下(虚血条件下)においても細胞膨張を起こすことが知られている。

本研究においては、グリオーマ細胞株C6を用いて、そのような細胞膨張時に、細胞内からアミノ酸(特にグルタミン酸)が放出されるかどうか、またアミノ酸放出にアクアポリンが関与するか否かを検討した。放出されたグルタミン酸の検出については、グルタミン酸脱水素酵素およびホルマザン色素(同仁化学WST-8)を用いた我々が開発した測定系を用いた。この測定系を利用すると1μM以上の濃度のグルタミン酸をプレートリーダを用いて効率よく測定することが出来る。C6細胞を用いて細胞外浸透圧を約7割に低下させると、それに応じて細胞外のグルタミン酸濃度は数μMから約20μMへと上昇が観察され、その上昇は、グルタミン酸の透過路の候補であるCl-チャネルの阻害薬では抑制されなかった。また、細胞外に代謝阻害剤であるNaN3を投与し、低酸素条件のモデルとした。NaN3投与においても低浸透圧条件と同様にグルタミン酸の上昇が認められ、その上昇はCl-チャネル阻害薬により抑制されなかった。また、グルタミン酸トランスポータ阻害薬でも抑制されなかった。一方で、bafilomycin A1投与によりグルタミン酸放出は抑制され、開口放出の関与が示唆された。アクアポリンの関与について、水チャネルの阻害薬であるHgC12により抑制が認められなかったが、HgC12自体の代謝阻害効果との関係から明らかな結論を出すのが困難であった。アクアポリンについては、AQP6について細胞内ベジクルに留まるwild typeと細胞膜まで移行するmutantが最近得られたことから、それを利用したアクアポリンの膜発現とアミノ酸放出の関係を調べているところである。また、細胞外グルコース投与によってもグルタミン酸放出の上昇が起こることを見出したが、その機序についても研究を進めている。