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共同体の視点から見たカリキュラム理論の構築に関する研究

本研究は、知識経済の時代における共同体としての職場、地域杜会、家族の問題を含みこんだカリキュラム理論の構築を目的とする。研究の方法としては、共同体とカリキュラムの事実と理論に関する資料の収集と検討を行ないながら、知識経済下における共同体の視点から見たカリキュラム理論の構築を行なうという方法をとった。最初に、職場の変容に伴う学校カリキュラムの動向を職場のリテラシー問題を中心にして行なった。次に、カリキュラム構成を研究対象とするのは学問的には教育方法学であるが、日本の教育方法学の構想の起源は、ドイツの1796年のニーマイヤーAugust Hermann Niemeyerの『教育と教授の原理』における広義の「方法学」にあることを明らかにした。次に、その教育方法学が研究対象とするカリキュラムの構成とは、結局、19世紀ドイツのヘルムホルツの述べている意味における作成者によるタクトであることを明らかにした。知識経済下において求められている学力については、よく生きるためのコンテンツ・リテラシーであるとした。共同体には、国家、社会、伝統的共同体、中間集団としての共同体、学習共同体のような意図的な共同体の類型があることを明らかにした。教育方法学の学問的性格を歴史にさかのぽって論究し、レトリックの伝統の中で、子どもたちや社会とのかかわりの場所において成立する統合の学であることを明らかにした。18世紀、イタリアの修辞学の研究者ヴィーコの教育論を検討して、ヴィーコが文明世界は人間が作ったものであるから、文明世界も諸学問も、不完全なもの、修正すべきもの、批判すべきもの、改善すべきものとして若者に提示されるべきであると述べていることを指摘した。そして、レトリックこそ、共同体を建設する技術であることを明らかにした。このような理論的検討のうえで、コミュニティ社会学におけるコミュニティ研究の系譜をたどり、コミュニティという場所における子どもの教育を中心にしたコミュニティ計画を検討した。また、機能的コミュニティ論の系譜に属する学習共同体という概念の起源をたどり、今日におけるその類型を明らかにした。1.本研究のカリキュラム計画上の立場を明確にした。カリキュラムを学校教育計画と定義し、ガリキュラムの立案において求められるリーダーシップは、子どもたちの経験、社会の状況の理解にもとづく、教育的タクトであるとした。(日本カリキュラム学会第15回大会課題研究1:「カリキュラム経営と教師の力量形成」2004年7月3日、於愛知教育大学)2.米国ノースカロライナ州、ドイツバイエルン州、英国ナショナルカリキュラムを検討して、グローバル経済下、知識経済下の職場の変容とその中で求められる能力に対して現代の学校カリキュラムがどのように対応しようとしているかを明らかにした。(日本教育方法学会第40回大会自由研究発表2004年10月9日於和光大学)3.学校で育てる学力を、教科内容にかかわった読み、書き、聞き、話す力ととらえ、教科内容にかかわった、読み、書き、聞き、話す活動を促すような教育的共同体を作ることによって、学力を育てることができるという提案を行なった。(『教科の充実で学力を伸ばす』ぎょうせい2004年)4.地域社会や共同体から独立して、学校の教育方法を考える構想は、18世紀末から19世紀にかけてのドイツの教育方法学の構想の中に見られることを発表した。(中国四国教育学会第56回大会自由研究発表2004年11月28日於鳴門教育大学)研究の遂行のために、カリキュラム理論、カリキュラム史、学習共同体、共同体の問題に関連した地域社会、地域計画、都市計画の歴史、家族史、共同体の問題に関連した社会福祉と労働の歴史に関する文献を多数購入し、多数の文献を複写した。

本研究は、知識経済の時代における共同体としての職場、地域社会、家族の問題を含みこんだカリキュラム理論の構築を目的とする。研究の方法としては、共同体とカリキュラムの事実と理論に関する資料の収集と検討を行ないながら、知識経済下における共同体の視点から見たカリキュラム理論の構築を行なうという方法をとった。最初に、職場の変容に伴う学校カリキュラムの動向を職場のリテラシー問題を中心にして行なった。次に、カリキュラム構成を研究対象とするのは学問的には教育方法学であるが、日本の教育方法学の構想の起源は、ドイツの1796年のニーマイヤーAugust Hermann Niemeyerの『教育と教授の原理』における広義の「方法学」にあることを明らかにした。次に、その教育方法学が研究対象とするカリキュラムの構成とは、結局、19世紀ドイツのヘルムホルツの述べている意味における作成者によるタクトであることを明らかにした。知識経済下において求められている学力については、よく生きるためめコンテンツ・リテラシーであるとした。共同体にほ、国家、社会、伝統的共同体、中間集団としての共同体、学習共同体のような意図的な共同体の類型があることを明らかにした。教育方法学の学問的性格を歴史にさかのぼって論究し、レトリックの伝統の中で、子どもたちや社会とのかかわりの場所において成立する統合の学であることを明らかにした。18世紀、イタリアの修辞学の研究者ヴィーコの教育論を検討して、ヴィーコが文明世界は人間が作ったものであるから、文明世界も諸学問も、不完全なもの、修正すべきもの、批判すべきもの、改善すべきものとして若者に提示されるべきであると述べていることを指摘した。そして、レトリックこそ、共同体を建設する技術であることを明らかにした。
TNF受容体を用いた慢性歯周炎の遺伝子診断と治療薬としての可能性を探る

炎症のメディエーターであるTNF(腫瘍壊死因子)は、その受容体が歯周炎を含む炎症性疾患においてTNFの制御の点で大きく病態に関与していることが近年明らかになってきている。我々はこれまでに慢性歯周患者において、血清中ならびに歯周炎局所における可容型TNF受容体の1型と2型の不均衡が歯周炎の重症化に影響すること、TNF受容体2型+587遺伝子多型が慢性歯周炎に遺伝子学的に関与することを明らかにしてきた。本研究の目的は歯周炎におけるTNF受容体2型遺伝子多型の機能をin vitroにおいて解明することであった。本研究によりTNFR2型+587遺伝子多型と慢性歯周炎患者血清中IL-6濃度との間の関連が示唆された。遺伝子多型と歯周炎との関係を明らかにする一助となったと考えられる。【本研究の概要】新潟大学医歯学総合病院歯周病診療室を受診し、研究に関しインフォームドコンセントの得られた歯周炎罹患者よりこの歯肉溝滲出液と血清を採取し、その中のTNFならびに可溶型TNF受容体濃度をELISA法にて測定した。また同時に採取した血液よりDNAを抽出し、TNF受容体2型+587遺伝子多型における個々の遺伝子型を決定し、この遺伝子型の違いにより、臨床データならびに歯肉溝滲出液と血清のTNFならびに可溶型TNF受容体濃度に違いが見られるかを比較検討した。【成果】現在まで計357名の被験者でTNF受容体2型+587遺伝子多型の遺伝子型を決定している。これを、(1)健常軽度歯周炎群、(2)中等度歯周炎群、(3)重度歯周炎群の3群に分けてその遺伝子型の分布を比較検討したところ、多型である(=変異型である)T/GもしくはG/G型を有するものの割合が、それぞれ15.1%、20.0%、32.7%となり、重度歯周炎群において有意にその頻度が高いことが明らかとなった。このことからTNF受容体2型+587遺伝子多型の変異型を有するものは重症歯周炎の発症のリスクが高いという以前の報告(Shimada, et. al. 2004)をさらに裏付けることが可能となった。さらに40名の対象者において、+587遺伝子多型と末梢血より採取した血清、歯肉溝浸出液との関連を検討したところ、統計学的な有意差は認めなかったが、TNF受容体2型+587遺伝子多型の変異型を有するものはいずれもその濃度が低い傾向を認めた。これは他疾患での報告とも合致しており、さらに対象者を増やしていくことが可能であれば興味深い結果となり得ると考えられる。【目的】炎症のメディエーターであるTNF(腫瘍壊死因子)は、その受容体が歯周炎を含む炎症性疾患においてTNFの制御の点で大きく病態に関与していることが近年明らかになっている。我々はこれまでに慢性歯周炎患者において、血清中ならびに歯周炎局所における可溶型TNF受容体の1型と2型の不均衡が歯周炎の重症化に影響すること、TNF受容体2型+587遺伝子多型が慢性歯周炎に遺伝学的に関与することを明らかにしてきた。【結果】TNFR2型+587遺伝子多型とIL-6産生量との関連が報告され、このIL-6は歯周炎の病態形成における重要なサイトカインの一つであるため、In vitroにおける検討の前に、In vivoにおけるIL-6の検討を先に行うこととした。慢性歯周炎患者n=80において、有意差はないがTNFR2型+587遺伝子多型Gアレル(変異型)を保有する者に血清中IL-6が低い傾向が見られた。リスクである遺伝子多型を保有する者に血清中IL-6が低いことは相反する事象であるためTNF受容体2型遺伝子多型の機能は他の要因もふまえて検討していく必要があると考えられた。TNFはアポトーシス誘導能もあるため、今後はTNF受容体2型遺伝子多型がアポトーシス様の歯周組織破壊を促進することで歯周炎を重症化させるのではないかという観点に立ち解析を進めていきたいと考えている。
往復逓倍変調を利用した波長多重光無線信号一括発生技術に関する研究

本研究では一つのデバイスで複数のファイバ無線信号の一括生成を可能とする光変調技術の実現を目指している。光の往復を利用し,高速信号発生を可能とする往復逓倍変調器を利用する。往復逓倍変調器は2つの光フィルタと1つの光位相変調器から構成され,所定の無線信号周波数と入力光波長の組み合わせに対して高効率で動作する。これにより,光位相変調器部分に印加する電気信号よりも遙かに高速の成分を持つ光変調信号の発生が可能となる。これまでに400GHzを超える超高速信号発生に成功している。この往復逓倍変調器を含め,これまでの光信号発生では,複数の信号を発生させる場合には,それぞれに変調デバイスを準備する必要があり,波長多重で容量拡大する場合に,送信機が複雑になるという問題があった。これに対し,多波長成分の入力に対しては光フィルタが複数の反射帯域,透過帯域をもつものとすることで,一括信号生成が可能とする,新たな方式を検討する。各反射帯域がそれぞれ異なる反射点をもつようにすることで,波長成分ごとに異なる周波数の無線信号での変調が実現でき,非常にシンプルな構成で,各波長成分をそれぞれ別の無線信号で同時に変調することが可能となる。今年度は,数チャネルで一括信号発生可能な往復逓倍変調器の変調効率向上を図るために,光増幅機能をもった導波路構造に関する研究を進めた。エルビウムを添加することにより変調器内部での光損失を補償する原理の確認については昨年度完了しているが,今年度,往復逓倍変調器に適用し,ファイバ無線信号の発生効率の向上を達成した。さらに,複数チャネル同時変調の実証実験を行い,多数のチャネルで同時変調が可能であることを確認した。2つの光フィルタと1つの光位相変調器から構成される往復逓倍変調器を用いた複数チャネル同時光変調技術に関する研究を行った。往復逓倍変調器が所定の無線信号周波数と入力光波長の組み合わせに対して高効率で動作する。既存の往復逓倍変調器では動作可能な無線信号周波数は2つの光フィルタの間隔で決定されるが、光位相変調器に加える直流電圧を変化させることで微調整が可能である。これは、フィルタ間の往復にかかる時間を調整することで様々な無線周波数で動作可能となることを意味している。多波長成分の入力に対しては光フィルタが複数の反射帯域、透過帯域をもつものとすることで、一括信号生成が可能となる。各反射帯域がそれぞれ異なる反射点(群遅延特性)をもつようにすることで、波長成分ごとに異なる周波数の無線信号での変調が実現できる。往復逓倍変調器の大きな特徴である変調用電気信号周波数の低減効果(数GHz以下)により、複数の電気信号を一括して発生させる任意波形信号発生器が利用可能になると期待される。非常にシンプルな構成で、各波長成分をそれぞれ別の無線信号で同時に変調することが可能となる。17年度は同時変調の原理実証実験を行った。2組(計4個)の光フィルタを用いて、一つの往復逓倍変調器での複数チャネル同時変調に成功した。今後、多チャンネル化を目指し、変調特性の詳細評価を進める予定である。また、さらなる高速信号への対応も検討しており、今年度は160GHz信号の発生にも成功している。本研究では一つのデバイスで複数のファイバ無線信号の一括生成を可能とする光変調技術の実現を目指す。往復逓倍変調器は2つの光フィルタと1つの光位相変調器から構成され、所定の無線信号周波数と入力光波長の組み合わせに対して高効率で動作する。各反射帯域がそれぞれ異なる反射点をもつようにすることで、波長成分ごとに異なる周波数の無線信号での変調が実現でき、非常にシンプルな構成で、各波長成分をそれぞれ別の無線信号で同時に変調することが可能となる。本研究では多チャンネル信号一括光無線信号発生の原理実証を行い、数チャンネルで一括信号発生可能な往復逓倍変調器を完成させることを目標とする。今年度は2つの波長成分で一括光無線(60GHz帯)信号発生の安定化を目的とした制御技術の検討を行った。フィルタ部分の詳細設計を行い、作製したフィルタの特性を評価した。入力光発生に現有設備である波長可変レーザをそれぞれ利用し、発生した信号の評価に現有設備であるミリ波スペクトラムアナライザと光スペクトラムアナら名座を用いた。また、変調器部分の高周波特性改善を目指して、光導波構造、電極構造の最適化を行った。これには現有設備である露光装置、拡散炉、電子ビーム蒸着装置などを活用し、各要素の作成技術を確立した。往復逓倍変調器によるさらなる高速信号発生に関する研究もあわせて行った。160GHzを超える極めて高い周波数の変調信号発生に成功している。

この往復逓倍変調器を含め,これまでの光信号発生では,複数の信号を発生させる場合には,それぞれに変調デバイスを準備する必要があり,波長多重で容量拡大する場合に,送信機が複雑になるという問題があった。これに対し,多波長成分の入力に対しては光フィルタが複数の反射帯域,透過帯域をもつものとすることで,一括信号生成が可能とする,新たな方式を検討する。各反射帯域がそれぞれ異なる反射点をもつようにすることで,波長成分ごとに異なる周波数の無線信号での変調が実現でき,非常にシンプルな構成で,各波長成分をそれぞれ別の無線信号で同時に変調することが可能となる。今年度は,数チャネルで一括信号発生可能な往復逓倍変調器の変調効率向上を図るために,光増幅機能をもった導波路構造に関する研究を進めた。エルビウムを添加することにより変調器内部での光損失を補償する原理の確認については昨年度完了しているが,今年度,往復逓倍変調器に適用し,ファイバ無線信号の発生効率の向上を達成した。さらに,複数チャネル同時変調の実証実験を行い,多数のチャネルで同時変調が可能であることを確認した。
賃金,退職金の決定と雇用調整

昨年度に引き続き,90年代以降の日本の賃金・退職金の決定メカニズムおよび雇用調整のあり方に関して実証的に分析した,本年度は主に2つの研究を行った.まず,企業内賃金構造と退職金および雇用との関係について,特に90年代における大企業の高卒ブルカラー長期勤続者を中心に分析し,以下の暫定的な結果が得られた.インセンティブ仮説によれば賃金と退職金はトレードオフの関係にあるが,本研究では固定効果推定法を用いて欠落変数バイアスを除去した上でも,賃金と退職金の間には正の相関が部分的に検出された.これは,日本の退職金は賃金と連動して決定されるという制度的特徴が強いことを示唆する.また他の条件を一定とした下で,退職金と平均勤続年数の間に負の相関があることや,企業の赤時期に退職金が増加することが部分的に観察されるなど,90年代には割増退職金等による雇用調整の実施という退職金の離職促進効果が存在した可能性も示唆された,本研究には仮説検証を行うために必要な情報量を十分に得ることが困難である等の問題点もあるため,今後も注意深く研究を継続していくことが課題である.次に,上記の研究は内部労働市場のミクロ的な分析を主眼としているが,外部労働市場やマクロ経済との相互依存関係を把握することも必要であると考え,マクロ的な分析を行った.労働市場セクターを正規雇用と非正規雇用に分け,各々の賃金調整と雇用調整を内生化した四半期マクロ計量モデルを作成して,各種シミュレーション実験等を行った.比較的コンパクトなモデルではあるものの,90年代以降のマクロ経済と労働市場(内部・外部)との関係や,賃金上昇政策等の効果を考える上で参考となるようなマクロ計量モデルのプロトタイプを作成した。今後の課題は,他の方程式の追加,データの期間拡張,推定方法の改良などのモデルの精緻化である.本年度のこれら2つの研究成果は,現在論文に取り纏めている.90年代以降の日本の賃金・退職金の決定メカニズムおよび雇用調整のあり方に関して実証的に明らかにすることが本研究の目的である.日本の賃金・雇用に関する研究は多く蓄積されているが,退職金まで考慮したものはマイクロデータの利用可能性等の問題によりあまり行われていない.本研究は,企業レベルのモデル賃金・退職金データを財務諸表等の企業特性データとマッチングしたパネルデータを独自に作成して分析に用いることでこの分野の研究進展を試みるものである.本年度は,退職金制度等のサーベイ,集計データによる実態把握,企業別パネルデータの構築などを重点的に行った.パネルデータには拡張の余地があるため,データ構築作業は次年度も継続する予定である.このパネルデータを用いて,賃金と退職金の間にトレードオフの関係は存在するのかどうか,企業の生産性などによって退職金は影響を受けるのかどうか,退職金による離職抑制・促進の効果は存在するのかどうか,などについてパネル推定を行った.これらの試験的分析から得られた結果は,次年度に行う詳細な実証分析のための足懸りとなった.本研究は内部労働市場のミクロ的な分析を主眼としているが,外部労働市場やマクロ経済の変化が内部労働市場に及ぼす影響(あるいはその逆)を把握することが必要であると考え,マクロ的な分析も行った.具体的には,労働市場セクターを正規雇用と非正規雇用に分け,各々の賃金調整と雇用調整を内生化した四半期マクロ計量モデルを作成して,シミュレーション実験等を行った.現在,モデルの改良を行い,分析中である.昨年度に引き続き,90年代以降の日本の賃金・退職金の決定メカニズムおよび雇用調整のあり方に関して実証的に分析した,本年度は主に2つの研究を行った.まず,企業内賃金構造と退職金および雇用との関係について,特に90年代における大企業の高卒ブルカラー長期勤続者を中心に分析し,以下の暫定的な結果が得られた.インセンティブ仮説によれば賃金と退職金はトレードオフの関係にあるが,本研究では固定効果推定法を用いて欠落変数バイアスを除去した上でも,賃金と退職金の間には正の相関が部分的に検出された.これは,日本の退職金は賃金と連動して決定されるという制度的特徴が強いことを示唆する.また他の条件を一定とした下で,退職金と平均勤続年数の間に負の相関があることや,企業の赤時期に退職金が増加することが部分的に観察されるなど,90年代には割増退職金等による雇用調整の実施という退職金の離職促進効果が存在した可能性も示唆された,本研究には仮説検証を行うために必要な情報量を十分に得ることが困難である等の問題点もあるため,今後も注意深く研究を継続していくことが課題である.次に,上記の研究は内部労働市場のミクロ的な分析を主眼としているが,外部労働市場やマクロ経済との相互依存関係を把握することも必要であると考え,マクロ的な分析を行った.労働市場セクターを正規雇用と非正規雇用に分け,各々の賃金調整と雇用調整を内生化した四半期マクロ計量モデルを作成して,各種シミュレーション実験等を行った.比較的コンパクトなモデルではあるものの,90年代以降のマクロ経済と労働市場(内部・外部)との関係や,賃金上昇政策等の効果を考える上で参考となるようなマクロ計量モデルのプロトタイプを作成した。今後の課題は,他の方程式の追加,データの期間拡張,推定方法の改良などのモデルの精緻化である.本年度のこれら2つの研究成果は,現在論文に取り纏めている.
リゾホスファチジン酸受容体に対する抑制シグナルとグリオーマの細胞遊走・浸潤制御

グルオーマは浸潤性が高く、予後の悪い癌の一つである。リゾボスファチジン酸(LPA)はグリオーマ細胞の浸潤に対する強力な促進因子であることから、このLPA受容体シグナルを抑制することがグリオーマの浸潤に有効であると期待される。そこで、本研究ではLPA受容体を介した遊走応答を著明に抑制するスフィンゴシン1-リン酸(S1P)/S1P2受容体系、β-アドレナン受容体/cAMP系などLPA受容体に対する抑制シグナルの詳細を解析し、癌治療の新しい標的分子としての可能性について解析した。その結果、(1)S1P2受容体を介したLPA作用の抑制作用に関して、Gi(百日咳毒素)、Gq(YM-254890)、G_<12/13>(p115PhoGEFのRGSドメイン(p115RGS))に対する特異的なツール、また、低分子G蛋白の変異遺伝子(T19-rhoA、T17-rac1, Rap-GAP)の発現実験などによって介在するG蛋白質を解析した結果、S1P2受容体はG_<12/13>/RhoAを介していると推定された。(2)最近、Rhoを介したシグナルにはtumor suppressor phosphatase and tens in homobg deleted on chromosome 10(PTEN)の関与が報告されているが、グリオーマでは不明である。そこで、PTEN欠損のグリオーマ(U87、1321N1 astrocytoma cellsなど)とPTENを発現するグリオーマ(GNS-3314、CGNH-89、rat C6 glioma cellsなど)でのS1P作用を比較した結果、S1Pによる抑制応答の抑制はPTEN欠損のグリオーマ、PTENに対するsiRNAを用いたノックダウン細胞でも観察されPTENは介在していないと結論された。(3)LPA1受容体を介した細胞運動(遊走、浸潤)に対してβ-アドレナリン/cAMPは抑制応答を発揮する。この抑制作用はcAMP依存性プロテインキナーゼ(PKA)阻害薬では無効であるが、EpaG阻害薬、siRap1で解除された、Epac/Rap1系の関与が考えられた。(4)このβ-アドレナリン/cAMPの抑制応答はSIP2受容体とは異なりPTEN欠損のグリオーマでは観察されず、PTENの関与が示唆された。このように、SIP2受容体、β-アドレナン受容体は全く異なったG蛋白質、細胞内シグナル伝達系を介してLPAの細胞遊走を抑制していると考えられる。基盤Cグルオーマは浸潤性が高く、予後の悪い癌の一つである。基盤C
皮膚樹状細胞とアレルギー,Th_1/Th_2サイトカイン群と抗原提供能

ランゲルハンス細胞は強力な抗原提供細胞で、皮膚免疫・アレルギーの病態形成に重要な役割をはたすことが知られている。一方、炎症の形成に関与する各種のサイトカインの役割も大きくクローズアップされている。しかしながらランゲルハンス細胞がどのようなサイトカインで、どの程度、どのような影響を受けるのかについてはほとんど知られていない。我々はマウス表皮よりランゲルハンス細胞を含む表皮浮遊細胞を得、Th1サイトカイン(IL-2,IFN-γ),Th2サイトカイン(IL-4,IL-5,IL-6,IL-10)、またその他表皮細胞が産生しうるサイトカイン(TNF-α,IL-1α,IL-1β,IL-3,IL-7,GM-CSF)の存在下で培養し、ランゲルハンス細胞の抗原提供能に重要な意味をもつMHCdass II分子、MHCdassI分子、ICAM-1,B7-1の発現に対する影響をflow cytametryを用いて検討した。その結果、各分子は種々のサイトカインによってかなり選択的に調節されていることが判明した。1)MHCdassII分子の発現にはどのサイトカインも影響を与えない。2)MHCdassI分子の発現は、IFN-γによって強く、IL-4によって中等度に亢進される。その発現を抑制するサイトカインはなかった。3)ICAM-1の発現は、TNF-αによって強く亢進され、ついでGM-CSF,IL-1α,IL-1βによっても亢進作用がみられた。IL-10は常に濃度異存的にその発現を抑制した。4)B7-1の発現は、GM-CSFによって強く亢進され、ついでTNF-α,IL-1α,IL-1βにも亢進作用がみられた。IL-10とIFN-γはその発現を強く抑制した。これらの実験結果は、ランゲルハンス細胞の抗原提供能がGM-CSFによって増強され、IL-10によって抑制されるという従来の実験結果とある程度合致し、興味深いものであった。今後、他の接着分子への影響を観察することでランゲルハンス細胞の免疫生物学的理解が大きく進むと思われる。
アストロサイトと神経シナプスとの構造的・機能的相互作用機構

生体内のアストロサイトは多数の細かい突起を有し、その突起を介してシナプスの構造や機能に重要な役割を果たしているが、アストロサイト突起とシナプスとの接着については生体内に近い形態を示すアストロサイトの培養法が確立されていなかったため、ほとんど解明されていない。研究代表者は、生体内で観察される多数の細かい突起を持ったアストロサイトと神経細胞の共培養系を新たに開発し、このアストロサイトー神経細胞共培養系を用いてアストロサイトのシナプス形成・維持における役割と作用機構を明らかにすることを目的にしている。平成30年度は、まず、興奮性シナプスにおけるアストロサイトのシナプス形成・維持における役割と作用機構に焦点を絞り、様々な条件で培養したアストロサイトー神経細胞共培養系を用いて解析した。高解像度顕微鏡および電子顕微鏡を用いた解析により、アストロサイト突起とシナプスの接着部位に局在する細胞間接着分子やシナプス分子、アストロサイトの機能分子の詳細な局在部位やアストロサイトー神経細胞共培養系のシナプス周囲の構造が生体と類似した構造であることが明らかになりつつある(電子顕微鏡を用いた解析は東京大学大学院医学系研究科岡部繁男教授との共同研究)。さらに、アストロサイトー神経細胞共培養系を用いた機能的解析として、電気生理学的手法を用いて興奮性シナプスの機能におけるアストロサイトの役割の解析にも着手した(電気生理学的解析は大阪医科大学栗生俊彦博士との共同研究)。また、アストロサイト突起とシナプスの接着部位に局在する細胞間接着分子を欠損したアストロサイト、または神経細胞を用いてシナプス形成・維持における役割を調べるため、これらの欠損マウスの導入、繁殖をおこない、解析を開始した。平成30年度は、興奮性シナプスにおけるアストロサイトのシナプス形成・維持における役割と作用機構に焦点を絞り、新たに開発したアストロサイトー神経細胞共培養系を用いてアストロサイト突起とシナプスの接着部位に局在する細胞間接着分子の解析と、様々な条件で培養した際、またはこれらの分子を欠損したアストロサイトや神経細胞を用いた際のアストロサイトの形態とシナプス分子の動態を解析することを計画していた。高解像度顕微鏡および電子顕微鏡を用いた解析により、これらの分子の詳細な局在部位やアストロサイトー神経細胞共培養系のシナプス周囲の構造が生体と類似した構造であることが明らかになりつつある(電子顕微鏡を用いた解析は東京大学大学院医学系研究科岡部繁男教授との共同研究)。アストロサイト突起とシナプスの接着部位に局在する細胞間接着分子を欠損したアストロサイトや神経細胞を用いた解析は、これらの分子の欠損マウスの導入・繁殖に時間を要したため、現在、この解析を順次おこなっている。このため、次年度に予定していたアストロサイトの機能分子の局在を前倒しして解析し、アストロサイト突起とシナプスの接着部位に局在する細胞間接着分子がこれらの機能分子と共局在することが明らかになった。さらに、電気生理学的手法を用いて興奮性シナプスの機能におけるアストロサイトの役割の解析にも着手した(電気生理学的解析は大阪医科大学栗生俊彦博士との共同研究)。本研究によってアストロサイト突起とシナプスの間の接着の形成・維持機構の一端の解明につながることが期待され、おおむね順調に進展していると考えている。今後は、前年度に引き続き、アストロサイトー神経細胞共培養系を用いて興奮性シナプスにおけるアストロサイト突起とシナプスの接着部位に局在する細胞間接着分子の解析をおこなうとともに、機能的な解析として電気生理学的解析や細胞内のカルシウムイオン変化の解析をおこなう(電気生理学的解析は大阪医科大学栗生俊彦博士との共同研究)。また、アストロサイト突起とシナプスの接着部位に局在する細胞間接着分子との共局在が確認された機能分子については、これらの分子をHEK293細胞に発現させて、免疫沈降により相互作用の有無を調べる。さらに、これらの成果を論文発表するための準備も進める。これらと並行して、抑制性シナプスにおけるアストロサイトのシナプス形成・維持における役割と作用機構についても同様の手法を用いて解析をおこなう。

平成30年度は、興奮性シナプスにおけるアストロサイトのシナプス形成・維持における役割と作用機構に焦点を絞り、新たに開発したアストロサイトー神経細胞共培養系を用いてアストロサイト突起とシナプスの接着部位に局在する細胞間接着分子の解析と、様々な条件で培養した際、またはこれらの分子を欠損したアストロサイトや神経細胞を用いた際のアストロサイトの形態とシナプス分子の動態を解析することを計画していた。高解像度顕微鏡および電子顕微鏡を用いた解析により、これらの分子の詳細な局在部位やアストロサイトー神経細胞共培養系のシナプス周囲の構造が生体と類似した構造であることが明らかになりつつある(電子顕微鏡を用いた解析は東京大学大学院医学系研究科岡部繁男教授との共同研究)。アストロサイト突起とシナプスの接着部位に局在する細胞間接着分子を欠損したアストロサイトや神経細胞を用いた解析は、これらの分子の欠損マウスの導入・繁殖に時間を要したため、現在、この解析を順次おこなっている。このため、次年度に予定していたアストロサイトの機能分子の局在を前倒しして解析し、アストロサイト突起とシナプスの接着部位に局在する細胞間接着分子がこれらの機能分子と共局在することが明らかになった。さらに、電気生理学的手法を用いて興奮性シナプスの機能におけるアストロサイトの役割の解析にも着手した(電気生理学的解析は大阪医科大学栗生俊彦博士との共同研究)。本研究によってアストロサイト突起とシナプスの間の接着の形成・維持機構の一端の解明につながることが期待され、おおむね順調に進展していると考えている。今後は、前年度に引き続き、アストロサイトー神経細胞共培養系を用いて興奮性シナプスにおけるアストロサイト突起とシナプスの接着部位に局在する細胞間接着分子の解析をおこなうとともに、機能的な解析として電気生理学的解析や細胞内のカルシウムイオン変化の解析をおこなう(電気生理学的解析は大阪医科大学栗生俊彦博士との共同研究)。また、アストロサイト突起とシナプスの接着部位に局在する細胞間接着分子との共局在が確認された機能分子については、これらの分子をHEK293細胞に発現させて、免疫沈降により相互作用の有無を調べる。さらに、これらの成果を論文発表するための準備も進める。これらと並行して、抑制性シナプスにおけるアストロサイトのシナプス形成・維持における役割と作用機構についても同様の手法を用いて解析をおこなう。
同性間生殖臓器移植における細胞導入の解析

生殖組織移植による生殖機能の再建の可能性は性同一性障害のみならず、腫瘍切除後の再建にも重要なテーマである。同性間の精巣移植においては超微小外科手技による低侵襲移植法を確立し、テストステロン分泌と精子形成がより高い成功率で得られた。卵巣移植においてもエストロゲンの産生と妊孕性を確認した。GFPトランスジェニックラットを用いた実験ではgerm cell traffickingは実証できなかった。陰茎移植手技を確立し今後連続した陰茎精巣同時移植へ改良予定である。免疫抑制が不要な近交系LEWISラットを用いて、同性間精巣移植を行った。レシピエントの精巣を両側とも切除し、鼠径部皮下にドナーからの精巣を移植した。動静脈および精管を吻合した。従来の精巣動静脈に下大動静脈を付けて挙上する方法では無く、ドナーの精巣動静脈を直接レシピエントの下腹壁動静脈に端々吻合する低侵襲モデルの確立を目指している。これにより下大動静脈を犠牲とせず、腹腔内操作も必要としない、低侵襲な手術が行えるようになる。しかし、この方法を行うには直径0.3mm程度の精巣動静脈を吻合するための、ウルトラマイクロサージャリー技術が必要となる。まずは安定した移植が行えるように、ウルトラマイクロサージャリー技術の向上や術式の工夫を行っているところである。しかし、直径0.3mm程度の血管を吻合することは容易ではなく、まだ安定して開存するには至っていない。免疫抑制が不要な近交系LEWISラットを用いて、同性間卵巣移植を行った。レシピエントの卵巣を両側とも切除し、鼠径部皮下にドナーからの卵巣を移植した。動静脈および卵管を吻合した。こちらは下大動静脈からの卵巣動静脈分岐部周囲の下大動静脈の血管壁を円周上に採取し、口径を調整して大腿動静脈に端々吻合した。今後、レシピエント由来のエストロゲンが血中から消失するまで2ヶ月間待機し、ELISA法を用いて血清エストロゲン値を測定して移植卵巣の働きを評価する予定である。免疫抑制不要な近交系Lewisラットを用いて、同性間精巣移植を行った。レシピエントの精巣を両側とも切除したのち、ドナーの精巣を鼠径部皮下に移植し動静脈と精管を吻合した。精巣動静脈は直径0.3mm程度と非常に細く血管吻合の成績が安定しないため、下大動静脈や腎動脈レベルでの吻合に変更して行った。しかし、移植後の生存率が50%と低く、移植精巣の生着率は17%程度とGFPラットを用いた本格的な調査が行えるレベルには至っていない。精巣動脈が腎動脈から分岐しているものに関しては、大腿動脈と腎動脈はほとんど口径差なく吻合可能であった。しかし下大動脈から分岐しているものや、下大静脈から分岐している精巣静脈に関しては、レシピエント血管となる大腿動静脈とは2倍程度の口径差があるため、吻合後の開存成績が安定しない要因と考えられた。移植後に血清テストステロン値をELIZA法で定量した。動物実験施設が耐震補強工事中のため実験動物の飼育期限が30日間に制限されており、実験計画では術後2ヶ月で測定する予定であったが、実際は術後3週間で測定するほかなかった。しかし、生着したラットでは血清テストステロン値626pg/mlであったのに対し、生着しなかったラットでは100pg/ml程度であり、ホルモン分泌機能が保たれていることを確認することが出来た。さらに、H-E染色にて移植精巣を組織学的に検査した。しかし、残念ながら精子の形成は認めなかった。引き続き、免疫抑制が不要である近交系のLewisラットを用いて、同性間で精巣移植を行った。しかし、これまでと同様に精巣移植後のラットの生存率は50%程度と低いままであった。精巣動脈が腎動脈から分岐しているものは、腎動脈を血管茎として移植出来、生着率も比較的良好であった。しかし多くの場合は精巣動脈が下大動脈から分岐しているため、精巣動脈基部は細すぎて吻合に適さないため下大動脈を血管茎として移植したが、大腿動脈との口径差が大きく生着率は低かった。術式や吻合技術の改善を行っても、生着率は改善しなかった。移植精巣が生着したものに関しては、3週間後に血清テストステロン値をELIZA法によって定量した。その結果、正常ラットと同程度の血清テストステロン値を示した。しかし、組織を採取してH-E染色を行って精子形成を検索したところ、精子の形成は認めなかった。移植精巣が生着しているにも関わらず精子が形成されない原因としては、精母細胞はテストステロンを産生する間質細胞よりも虚血に弱い可能性が考えられた。そこで、虚血時間を短縮するよう手術術式等に配慮して移植を行った。しかし、それでも精子形成には至らなかった。最終目標として、LewisラットからGFPトランスジェニックラットへの同性間精巣移植を行い、生殖幹細胞のcell traffickingの解明を目指していたが、移植精巣における精子形成が認められないため、GFPトランスジェニックラットを用いた実験は断念した。

卵巣移植においてもエストロゲンの産生と妊孕性を確認した。GFPトランスジェニックラットを用いた実験ではgerm cell traffickingは実証できなかった。陰茎移植手技を確立し今後連続した陰茎精巣同時移植へ改良予定である。移植成績が安定せず、研究の遂行に苦慮している。精巣移植ラットの術後生存率が低い原因は不明である。移植精巣の生着率が低い原因は、血管吻合における技術的な問題と考えている。形成外科今後は、低侵襲精巣移植モデル確立は保留し、血管吻合後の開存率上昇を目指し、口径差の少ない部位での吻合を検討している。具体的には、腎動静脈分岐部以遠の下大動静脈での吻合を考えている。移植成績が安定したら、GFPトランスジェニックラットでの移植実験で生殖管細胞のcell traffickingについて調査する予定である。ドナーの下大動静脈を温存した低侵襲精巣移植モデルの確立に労力を要している。ホルモン値の測定や、組織学的評価には至っていない。物品を予定よりも安く購入出来たため未使用額が生じた。場合によっては、低侵襲モデルの確立は断念し、従来の方法により計画の遂行を目指す。まずは、術後のホルモン値の測定と組織学的評価を行う。最終的にはGFPトランスジェニックラットから移植を行い、生殖幹細胞のcell traffickingについて調べる。ラット、免疫染色試薬、ELISAキット等の購入に使用する予定である。物品を予定より安く購入できたため未使用額が生じた。
アパタイト系骨補填材の組成および形態が骨伝導性および骨置換性に及ぼす影響

炭酸アパタイトハニカムの骨伝導性、骨置換性を解明することで生体と人工骨補填材との関わりについて学理構築の一助を目指す。炭酸アパタイトは骨の無機組成であり、水酸アパタイトと異なり破骨細胞による吸収を顕著に受けるため、インプラント時には新生骨への置換が起こる。本研究では炭酸アパタイトに一次元方向に連通気孔を有するハニカム構造を導入し、その気孔径の大きさなどが与える骨置換性への影響を動物実験などにより評価する。2018年度は、水酸アパタイトハニカムおよび炭酸アパタイトハニカムを作製することを目的としていた。ハニカムは細孔径150μmー壁厚150μmに設計されたハニカム金型を搭載した押出成形機を用いて作製した。水酸アパタイトハニカムは、水酸アパタイト粉末含有ワックスベースバインダーの押出成形、その後の脱脂・焼結により作製した。炭酸アパタイトハニカムは、水酸化カルシウム粉末含有ワックスベースバインダーの押出成形、その後の脱脂・炭酸化、リン酸化により作製した。水酸アパタイトハニカムおよび炭酸アパタイトハニカムともにハニカム構造の特徴である規則的に配列した一軸連通孔(マクロポア)を有していた。水酸アパタイトハニカムおよび炭酸アパタイトハニカムの平均マクロポア径はそれぞれ84μm、118μmであり、焼結により、マクロポア径が減少した。また、焼結によりマイクロポロシティにも違いが生じ、水酸アパタイトハニカムではマイクロポアが確認されなかったが、炭酸アパタイトハニカムにはマイクロポアが存在していた。水酸アパタイトハニカムのマクロポア形成方向の圧縮強さは約32 MPaであった。炭酸アパタイトハニカムの圧縮強さは作製条件により制御可能であり、100 MPaを超えるようなハニカムも作製することができている。圧縮強さはポロシティとトレードオフであるため、用途に合わせて、ポロシティと圧縮強さのバランスを最適化することを検討している。また、これらのハニカムをウサギ大腿骨欠損に埋入しており、2019年度中に結果が得られると思われる。当初計画していた水酸アパタイトハニカムおよび炭酸アパタイトハニカムの作製に成功し、動物実験に取り掛かることができたため。培養細胞を用いた実験により、骨伝導性等の評価を行う。また、水酸アパタイトハニカムおよび炭酸アパタイトハニカムを埋入したウサギ大腿骨欠損部のμCTおよび病理組織学的解析により、水酸アパタイトハニカムおよび炭酸アパタイトハニカムのin vivo吸収性、新生骨形成、血管新生等を評価する。
カンチレバーの固有振動振幅マッピングによる固体表面物性の可視化

摩擦力顕微鏡は微小なカンチレバーの先に付けた突起(探針)を試料に接触させ、カンチレバーのねじれから摩擦力を検出する。本研究者らはカンチレバーのねじれ固有振動がこの検出信号に重畳していることを見出し、この固有振動から試料表面性状を検出・可視化する方法を研究している。前年度はカンチレバーの根元もしくは試料の下にせん断ピエゾ素子を取り付け、強制的に数百pm_<p-p>から数nm_<p-p>の振動を加えていたが、固有振動数(450kHz付近)の両側で周波数特性(Qカーブ)の増減が逆転するため固定周波数の励振では測定条件によりコントラストが反転していた。今年度は、検出された振幅を励振信号に帰還することで、常に固有振動の励起を行なっている。固有振動を用いることにより、安定した小振幅の振動を維持しやすいと考えられる。金表面に生成した自己組織型単分子膜の観察では、終端が疎水性の分子と親水性の分子で振幅が変化することを確認している。従来は励振周波数を一定に保って振動振幅の変化を検出していたが、本手法では周波数も変化するため、周波数変化の可視化を試みている。現状では単分子幕の土台となる金薄膜の数十nmに及ぶ凹凸に対応してパターン化された二値画像が得られており、それぞれが探針-試料間のスティック状態およびスリップ状態の共振周波数に対応するものと考えている。厚み数nmの単分子膜の特性変化を捉えるためには、平坦な金薄膜の生成および走査速度の最適化が必要である。走査型力顕微鏡は微小なカンチレバーの先に付けた突起を試料に接触させて探針として用いることにより、数十nmから数百nm程度の高分解能で試料表面の凹凸や力学的特性を可視化することができる。摩擦力顕微鏡においてはカンチレバーのねじれから摩擦力を検出するが、本研究者らはカンチレバーのねじれ固有振動がこの検出信号に重畳していることを見出し、固有振動数の振幅成分から試料表面性状を可視化する方法を研究している。当初は走査中に熱振動などで生じる振幅10pm_<p-p>程度の固有振動を検出していたが、振幅が不規則に変化して観察が困難なため、カンチレバーの根元もしくは試料の下にせん断ピエゾ素子を取り付け、強制的に数百pm_<p-p>から数nm_<p-p>の振動を加えている。窒素を用いて湿度を変化させながらシリコン上に形成した酸化シリコンのパターンを観察する実験では、試料表面の酸化(12nm程度)が進むにつれてパターンのコントラストが劣化することから、本手法が比較的表層の特性を捉えていることがわかった。また、金で被覆した雲母上のチオール系自己組織化単分子膜観察では、加える振動数を変化させて周波数によるコントラストの違いを調べた結果、(1)低周波(10kHz程度)の加振では主に探針-試料間の摩擦力変化が観察されること、(2)固有振動数以上(500kHz程度)では試料に対して相対的に探針が硬くなり試料の横方向の弾性変化が観察されること、(3)固有振動数(450kHz)付近ではメニスカスカなどの粘性の変化が観察されるが、同時に振動特性のQカーブが変化するため固定周波数の加振では固有振動数の前後でコントラストが反転すること、などの知見を得ている。現在、検出された振幅を加振信号に帰還することで自励振動を励起することに成功しており、今後はこの方法を用いて観察結果を増やし、現象の解析を続ける。
プラナリアの脳組織再生に関する物質の探索研究

プラナリアは淡水及び海水に生息する扁形動物で、M.エッシャーのだまし絵でも知られるように、個体中央部での横切断すると、前横切片虫、後横切片虫の両者とも再生し、最終的に2個の完全個体となる。本研究では、プラナリア再生には何らかの化学物質が関与していると想定、探索研究を行なった。種々アッセイシステムを検討したところ、高濃度で飼育した飼育液中では脳を持たない後切片中の再生が著しく再現性良く阻害されることを見出した。この飼育液を凍結乾燥、或いは減圧濃縮後、同体積に再希釈した液も脳再生を阻害し、物質が関与が示唆された。この活性成分は、有機溶媒に抽出されず、熱にも比較的安定で、さらに、ペプチダーゼ処理を行なっても活性は維持された。しかし、ゲル濾過で活性の溶出位置に再現性がなく、ODSクロマトグラフィーを行なうと活性が消失した。以上の実験結果から、無機物質の可能性が示唆された。飼育液を減圧濃縮するとカルシウム塩が不溶化したが、ろ過後も活性に大きな変化がなかったことから、カルシウム塩の可能性は否定された。最終的には、この脳再生阻害活性はアンモニウムイオンであることが判明したが、当時、中性水溶液を濃縮していることから、アンモニアの可能性は否定できると考えていたが、飼育液凍結乾燥パウダーには、飼育液の約半量のアンモニウムイオンが含まれており、約50ppmの塩化アンモニウム濃度で活性が再現された。プラナリアは再生能力が強いことで知られており、完全固体を横方向に切断しても前切片虫および後切片虫とも再生し、最終的には二つの完全個体になる。それどころか、いくつかの種類においては、ある一定の大きさになると自ら分裂(fisshon)して二個体となることも知られている。このような不思議な性質から「プラナリアは刃物に対して不死身」とも呼ばれ、一般にも知られている。プラナリアの再生に関する研究はT.H.Morganをはじめ多くの生物学者によって研究され、その機構について生理勾配説、極性説、物質説などさまざまな学説が提出されてきたが、いまだに確定されるにいたっていない。報告者は、プラナリアの再生には、何らかの物質が関与していると仮定し、本研究を行った。実験には、再生能力の高いリュウキュウナミウズムシのクローンOH株を用いた。研究開始当初数匹であったプラナリアを数千匹以上に殖やすことには昨年までに成功している。それらを用いて、物質関与を証明する実験を検討した。生物学者を中心としたこれまでの研究から、脳を持たないプラナリアの切片虫は、まず脳を再生しその後に各組織の再生が始まることが知られている。以上、無秩序状態から脳は再生することから、物質関与の証明がしやすいと考え、脳再生に注目した。各部再生ホモジナートを、プラナリアに注入する方法や、飼育液に加える方法など様々な実験を行ったところ、いくつかにおいて脳再生抑制効果を観察したが、再現性において問題があった。一方、高密度(10匹/3mL)で飼育した飼育液中では、断頭した切片虫の脳再生を著しく阻害することがわかった。この方法で調製した飼育液は、再現よく脳再生を抑制することが判明した。さらに正常な頭部と比較して、脳再生が不充分な状態でも眼点の再生が起こりうるという、これまでの報告とは異なった現象も観察した。この活性は、熱処理(100°C,5分)でも維持された。比較として10倍濃度のアルブミン水溶液中での再生実験を行ったところ、本現象は観察されず、飼育液の汚染が原因ではなく、特定の物質が関与していると予想することが出来た。次に、活性成分の分画を検討した。酢酸エチル-水で分配したところ、水層に活性あることが判明した。また、ゲル濾過では後半溶出部分に、限外濾過では外液に活性を回収した。以上のことから、活性成分はペプチド或いは、水溶性多糖ではないかと推定している。現在、活性成分のHPLC分析について検討している。

最終的には、この脳再生阻害活性はアンモニウムイオンであることが判明したが、当時、中性水溶液を濃縮していることから、アンモニアの可能性は否定できると考えていたが、飼育液凍結乾燥パウダーには、飼育液の約半量のアンモニウムイオンが含まれており、約50ppmの塩化アンモニウム濃度で活性が再現された。
高次神経系におけるカルシウム依存性情報伝達調節因子に関する研究

ラット脳より神経系に特異的な分子量約23,000のカルシウム結合蛋白質を精製,部分アミノ酸配列を決定し,ラット脳cDNAライブラリーをスクリーニングし,相同性の高い数種の異なるクローンを得た.1番目のクローンはアミノ酸193個からなる3つのEF-hand構造を持つ蛋白質をコードしており,網膜の明暗順応調節蛋白質のリカバリンやS-モジュリンと高い相同性を示した.この蛋白質は,3個のカルシウムを10^<-6>Mレベルで結合し,カルシウムを結合することによりミリスチン酸化されたアミノ末端が蛋白質分子の表面に現われ,アンカーとなって細胞膜と結合することが示された.mRNAおよび蛋白質は海馬で非常に高く発現していることから,ヒポカルシンと命名した.海馬錐体細胞に特に高く発現し,大脳皮質錐体細胞の一部および小脳プルキンエ細胞に中等度に発現していた.海馬錐体細胞では発育にともなって発現量が増加するが,大脳皮質錐体細胞や小脳プルキンエ細胞ではシナプス形成期一致し一過性に高く発現した.このことからヒポカルシンはシナプスの可塑性と関連していることが示唆された.フィルターオーバーレイ法により数種の蛋白質とカルシウム依存性に結合することが示された.この内,分子量45Kの細胞質蛋白質を精製,部分アミノ酸配列決定をしたところ,クレアチンキナーゼであった.2番目のクローンは191個のアミノ酸からなる蛋白質をコードしており,ヒポカルシンと高い相同性を示した.この蛋白質は,大脳皮質錐体細胞の一部と海馬歯状回顆粒細胞に強い発現を認めた.さらにヒト・脳cDNAライブラリーより5種類の異なったcDNAクローンを単離した.これらの結果から,相同性の高い数種の蛋白質が神経系に存在し,局在する神経細胞が異なっていることが考えられ,機能の解明が期待される.ラット脳より神経系に特異的な分子量約23,000のカルシウム結合蛋白質を精製,部分アミノ酸配列を決定し,ラット脳cDNAライブラリーをスクリーニングし,相同性の高い数種の異なるクローンを得た.1番目のクローンはアミノ酸193個からなる3つのEF-hand構造を持つ蛋白質をコードしており,網膜の明暗順応調節蛋白質のリカバリンやS-モジュリンと高い相同性を示した.この蛋白質は,3個のカルシウムを10^<-6>Mレベルで結合し,カルシウムを結合することによりミリスチン酸化されたアミノ末端が蛋白質分子の表面に現われ,アンカーとなって細胞膜と結合することが示された.mRNAおよび蛋白質は海馬で非常に高く発現していることから,ヒポカルシンと命名した.海馬錐体細胞に特に高く発現し,大脳皮質錐体細胞の一部および小脳プルキンエ細胞に中等度に発現していた.海馬錐体細胞では発育にともなって発現量が増加するが,大脳皮質錐体細胞や小脳プルキンエ細胞ではシナプス形成期一致し一過性に高く発現した.このことからヒポカルシンはシナプスの可塑性と関連していることが示唆された.フィルターオーバーレイ法により数種の蛋白質とカルシウム依存性に結合することが示された.この内,分子量45Kの細胞質蛋白質を精製,部分アミノ酸配列決定をしたところ,クレアチンキナーゼであった.2番目のクローンは191個のアミノ酸からなる蛋白質をコードしており,ヒポカルシンと高い相同性を示した.この蛋白質は,大脳皮質錐体細胞の一部と海馬歯状回顆粒細胞に強い発現を認めた.さらにヒト・脳cDNAライブラリーより5種類の異なったcDNAクローンを単離した.これらの結果から,相同性の高い数種の蛋白質が神経系に存在し,局在する神経細胞が異なっていることが考えられ,機能の解明が期待される.中枢神経系の神経細胞に特異的に存在するカルシウム結合蛋白質を見い出し,ラット脳より分離,精製した。電気泳動上の分子量は23000,等電点は51で,分子当り2分子のカルシウムを解離定数0,2および13μMで結合,アミノ末端は脂肪酸で修飾されていた。蛋白質分解酵素断片についてアミノ酸配列を決定したところ,EFハンド構造を持つカルモジュリンスーパーファミリーに属するカルシウム結合蛋白質で,網膜視細胞で光受容の感度調節を行っているリカバリンやS-モジュリンと高い相同性を示した。そこで部分アミノ酸配列をもとに,脳cDNAバンクよりcDNAクローニングを行ったところ,2種類の相同性の高いクローンが得られた。1つのクローンについて,アミノ酸コーディング領域の全塩基配列を決定した。195個のアミノ酸残基よりなり,計算分子量21,600,3個のEFハンド構造とアミノ末端のミリスチン酸修飾の共通配列を有していた。mRNAはノーザンブロットから約2kbで,中枢神経系に特異的に分布し,中でも海馬に著しく発現していた。さらに大腸菌で発現させた蛋白質を用いて特異抗体を作製し,蛋白質の発現分布をイムノブロットで検討したところ,mRNAと同様に海馬に著しい発現を認めた。そこでこの蛋白質をヒポカルシンの命名した。海馬において,刺激受容に伴って増加する細胞内カルシウム濃度を感知して,刺激に対する反応性を調節している可能性が考えられ,標的酵素の検討を行っている。また同時に得られたcDNAクローンについても,塩基配列の決定など解析を進めている。平成4年度に海馬特異的カルシウム結合蛋白質ヒポカルシンをラット脳に見い出した。

この蛋白質は細胞膜とカルシウム濃度依存性に結合することが知られていたが、反応部位はミリスチン酸化されたアミノ末端で、カルシウムを結合することによりアミノ末端が蛋白質分子の表面に現われ、アンカーとなって細胞膜と結合することが示された。発育にともなった発現を検討したところ、海馬錐体細胞ではシナプス形成にともなって発現量が増加するが、大脳皮質錐体細胞や小脳プルキンエ細胞ではシナプス形成期に高い発現を認めるが形成後はむしろ発現量が減少することが示された。このことはピポカルシンがシナプスの可塑性と関連していることを強く示唆する。放射性標識ヒポカルシンを作製し、フィルターオーバーレイ法により標的蛋白質を検討したところ、分子量45Kの細胞質蛋白質とカルシウム依存性に反応することが示された。この蛋白質を精製し、部分アミノ酸配列を決定したところ、クレアチンキナーゼであることが示された。したがって、ピポカルシンは神経細胞の活動に応じた局所のカルシウム濃度を感知し、その部位にエネルギーを運搬する可能性が考えられる。しかし、クリアチンキナーゼ以外にもピポカルシンと結合すると思われる蛋白質が存在しており、他の機能を有することが考えられる。また、ヒポカルシンと相同性の高いcDNAクローンを単離し、191個のアミノ酸からなる蛋白質をコードしていることを見い出した。特異抗体を作製し組織分布や神経系内での局在について検討したところ、大脳皮質錐体細胞の一部と海馬歯状回顆粒細胞に強い発現を認めた。さらにヒト・cDNAクローンの解析を進め、5種類の異なったcDNAクローンが単離した。これらの結果は、相同性の高い数種の蛋白質が神経系に存在し、局在する神経細胞が異なっていることを示しており、機能の解明が期待される。