hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
「格子状の局在」と内膜複合体分子から解析するマラリア原虫生殖母体の細胞骨格

本研究の目的は、無性生殖期マラリア原虫の宿主細胞侵入の機構と考えられてきた内膜複合体(Inner Membrane Complex: IMC)の関連分子が、原虫の有性生殖期生殖母体にも発現して、虫体周縁に格子状に局在するとの報告を踏まえて、申請者がIMCとは独立に見出した生殖母体の格子状分子、さらに、マラリア原虫IMC関連分子とされるものの生殖母体では未報告(未解析)の分子も併せて解析の起点とし、原虫生殖母体細胞の骨格形成やその変化に関与する分子群を同定することである。以下のA,B,Cの解析を計画した。A.「格子状に局在」する複数の分子と相互作用する分子(群)は何か?B.生殖母体では未報告(未解析)のIMC関連タンパク質は、実際に生殖母体細胞で発現するか?Yesならば、局在や相互作用分子(群)は?C. A./B.の分子やそれらの相互作用分子(群)を欠くと、表現形質や相互作用分子(群)はどう変化するか?平成30年度は、A./B.で計画した各分子の動物抗血清の調製が進み、年度半ばまでに入手した。これらを用いて、固定したマラリア原虫細胞における各分子の発現を解析した。A./B.の双方について、原虫内で標識化された遺伝子を発現させるためのプラスミドコンストクトの調製は、サブクローニングが計画よりも遅くなった。これとは別に、解析C.のための、変異原虫作製用のプラスミドコンストラクト調製を、前年度に引き続き進めた。これらはいずれも、プラスミドコンストラクトをマラリア原虫に導入を開始する段階までの進捗となった。本研究の目的は、無性生殖期マラリア原虫の宿主細胞侵入の機構と考えられてきた内膜複合体(Inner Membrane Complex: IMC)の関連分子が、有性生殖期生殖母体にも発現して虫体周縁に格子状に局在するとの報告を踏まえて、申請者がIMCとは独立に見出した生殖母体の格子状分子、さらに、マラリア原虫IMC関連分子とされるものの生殖母体で未解析の分子も併せて解析の起点とし、生殖母体細胞の骨格形成やその変化に関与する分子群を同定することである。以下A,B,Cの解析を計画した。A.「格子状に局在」する複数の分子と相互作用する分子(群)は何か?B.生殖母体期では未報告のIMC関連タンパク質は、実際に生殖母体細胞で発現するか?Yesならば、局在や相互作用分子(群)は?C. A/Bの分子やそれらの相互作用分子を欠くと、表現形質や相互作用分子(群)はどう変化するか?平成27年度は、A/B双方に関連して、熱帯熱マラリア原虫をin vitro培養し、生殖母体期の割合を高めて原虫細胞を回収、抗原試料を調製した。Aについては「格子状に局在」する複数分子の組換えタンパク質合成用プラスミドコンストラクトを調製した。また、Bについても、学界の報告とマラリア原虫配列/発現情報データベースの最新の状況を踏まえて、解析するタンパク質分子を複数選定し、これらの組換えタンパク質合成用プラスミドコンストラクトを調製した。A/B双方について、複数の分子のcDNA配列調製に想定以上の時間を要し、組換えタンパク質合成が、プラスミドコンストラクト調製までにとどまった。実際の組換えタンパク質合成と、動物抗血清の作製、および相互作用分子群の探索開始が翌年度(H28)となった。本研究の目的は、無性生殖期マラリア原虫の宿主細胞侵入の機構と考えられてきた内膜複合体(Innner Membrane Complex:IMC)の関連分子が、原虫の有性生殖期生殖母体にも発現して、虫体周縁に格子状に局在するとの報告を踏まえて、申請者がIMCとは独立に見出した生殖母体の格子状分子、さらに、マラリア原虫IMC関連分子とされるものの生殖母体では未報告(未解析)の分子も併せて解析の起点とし、原虫生殖母体細胞の骨格形成やその変化に関与する分子群を同定することである。A.「格子状に局在」する複数の分子と相互作用する分子(群)は何か?B.生殖母体では未報告(未解析)のIMC関連タンパク質は、実際に生殖母体細胞で発現するか?Yesならば、局在や相互作用分子(群)は?C. A/Bの分子やそれらの相互作用分子を欠くと、表現形質や相互作用分子(群)はどう変化するか?平成28年度は、A/B双方に関連して、前年度に引き続き、熱帯熱マラリア原虫をin vitro培養し、生殖母体期の割合を高めて原虫細胞を回収、抗原試料の調製と備蓄を進めた。またAについては「格子状に局在」する複数分子の組換えタンパク質合成用プラスミドコンストラクトの調製を終了した。組換えタンパク質合成に着手し、続く実験に供するべく合成タンパク質の量および質の改善(合成条件の検討)を進めた。また、Bについては、学界の報告とマラリア原虫配列/発現情報データベースの最新の状況を踏まえて選定した10種以上の解析タンパク質分子について、これらタンパク質の合成用プラスミドコンストラクトの調製を、前年度に引き続いて進めた。A/B双方について、プラスミドコンストラクトの調製に想定以上の時間を要し、組換えタンパク質合成が、想定ほど進まなかった。そのため、組換えタンパク質を用いる動物抗血清の作製、および相互作用分子群の探索が翌H29年度となった。

本研究の目的は、無性生殖期マラリア原虫の宿主細胞侵入の機構と考えられてきた内膜複合体(Inner Membrane Complex: IMC)の関連分子が、原虫の有性生殖期生殖母体にも発現して、虫体周縁に格子状に局在するとの報告を踏まえて、申請者がIMCとは独立に見出した生殖母体の格子状分子、さらに、マラリア原虫IMC関連分子とされるものの生殖母体では未報告(未解析)の分子も併せて解析の起点とし、原虫生殖母体細胞の骨格形成やその変化に関与する分子群を同定することである。以下のA,B,Cの解析を計画した。A.「格子状に局在」する複数の分子と相互作用する分子(群)は何か?B.生殖母体では未報告(未解析)のIMC関連タンパク質は、実際に生殖母体細胞で発現するか?Yesならば、局在や相互作用分子(群)は?C. A./B.の分子やそれらの相互作用分子(群)を欠くと、表現形質や相互作用分子(群)はどう変化するか?平成29年度は、とくにB.に関する分子について、組換えタンパク質合成用コンストラクトの調製(前年度の未完了部分)を進めた。さらにA./B.の次のステップとして計画した各分子の動物抗血清の調製を進め(効率化のために外部委託)、当年度末から次H30年度初めにかけて入手した。また、A./B.の双方について、原虫内で標識化された遺伝子を発現させるためのプラスミドコンストクトの調製を進めた。あわせて、A./B.双方の分子について、解析C.のための、変異原虫作製用のプラスミドコンストラクト調製を進めた。A./B.双方について、当初から計画し実施してきた、解析分子群の遺伝子クローニングと種々プラスミドコンスタントの調製に、想定以上の時間を要した。これに伴い、逐次調製後に計画した動物抗血清の作製が後ろ倒しとなり、平成29年度末-30年度初めに各解析分子に対応する抗血清が作製・納品完了となった。A.「格子状に局在」する複数の分子と相互作用する分子(群)は何か?B.生殖母体では未報告(未解析)のIMC関連タンパク質は、実際に生殖母体細胞で発現するか?Yesならば、局在や相互作用分子(群)は?C. A./B.の分子やそれらの相互作用分子(群)を欠くと、表現形質や相互作用分子(群)はどう変化するか?平成30年度は、A./B.で計画した各分子の動物抗血清の調製が進み、年度半ばまでに入手した。これらを用いて、固定したマラリア原虫細胞における各分子の発現を解析した。A./B.の双方について、原虫内で標識化された遺伝子を発現させるためのプラスミドコンストクトの調製は、サブクローニングが計画よりも遅くなった。これとは別に、解析C.のための、変異原虫作製用のプラスミドコンストラクト調製を、前年度に引き続き進めた。
メタノールをメチル基供与体としたS-アデノシルメチオニン再生技術の開発

S-アデノシルメチオニン(SAM)依存型メチラーゼは、多様な代謝物のメチル化反応を担う酵素群であり、複雑骨格機能分子の構造・機能の多様性創出に重要である。しかしながら、生体内におけるSAM再生の困難性から、メチラーゼ反応を工業応用した事例は無い。そこで、本申請課題では、大腸菌内にメタノールをメチル基供与体としてSAMの再生が可能な人工代謝経路を導入し、種々のメチラーゼを発現させることで、「メチル基を有する機能性分子の大量生産」の実現を目指す。
リゾホスファチジン酸受容体のシグナル異常とがん

リゾホスファチジン酸(LPA)は多様な生理活性を示す脂質メディエーターであり、その作用はLPA受容体(LPA1LPA6)を介して生じる。これまでLPAシグナルががん発生・増殖・進展に関与していることが示唆されており、がん治療の新規標的と考えられている。本研究では、がん組織で発現しているLPA1変異体が異常な細胞内分布を示すこと、その情報伝達も破綻していることを見いだした。また、卵巣がん細胞におけるLPAの作用を検討したところ、LPAシグナルの結果と思われていたがん細胞に対する作用の一部が、その構成成分である脂肪酸に由来するという、新たな知見を得た。しかしながら、LPAシグナル変動とがんの関連について、その詳細は未だ不明である。本研究では、われわれが見出した4種類のLPA1変異体(Phe295Ser、Pro308Ser、Ile310Thr、Tyr311His)の機能解析を行った。また、LPAの分解により産生される脂肪酸が卵巣がん細胞の成長に関わることを見出した。(1)変異体の機能解析;4種類のLPA1変異体はいずれもcAMP産生抑制作用を示さないか、極めて弱い作用を示すのみであった。Rhoの活性化の程度も野生型より弱いものであった。Ca動員作用はPhe295Ser、Pro308Serは野生型と同様の反応を示したが、Ile310ThrおよびTyr311Hisでは野生型よりも低いものであった。Pro308SerおよびTyr311HIsの発現は野生型のそれよりも低かった。これらのことから、LPA1変異体は発現レベル、細胞内分布に異常が生じ、情報伝達も破綻していることを示唆している。(2)脂肪酸の作用解析;卵巣がん細胞HNOAは無血清下で培養すると細胞死を示す。LPAのみならず、その構成成分であるオレイン酸を加えると、細胞死が抑制された。さらにHNOA細胞に[3H]-LPAを加えると、約1時間以内にその80%以上が[3H]-オレイン酸に変換されることが分かった。細胞膜上にLPAを分解するリパーゼ活性が存在すること、産生された脂肪酸が細胞成長に影響することが示唆された。本研究では、(1)われわれが見出した4種類のLPA1変異体(Phe295Ser、Pro308Ser、Ile310Thr、Tyr311His)の機能解析、(2)LPA1のC末端と結合する分子の同定を試みた。また、Pro308Ser、Ile310Thr、Tyr311Hisの3種類は細胞膜上における発現量の低下を示したのみならず、小胞体へ蓄積していた。しかしながら、いずれの変異体も野生型と同様にアゴニスト刺激により細胞内への取込みを示した。これらのことはLPA1変異体が異常な細胞内分布を示し、その情報伝達も破綻していることを示唆している。(2)LPA1のC末端と結合する分子の同定;当該分子を精製し、アミノ酸分析を行ったところ、14-3-3εであることが分かった。しかしながら、免疫沈降により14-3-3εがLPA1と結合しているかどうかを調べたが、LPA1C末端欠損体においても結合が見られたことから、LPA1C末端との特異的結合とは考えられなかった。むしろ、C末端欠損体と結合する分子が複数認められた。このことは、LPA1C末端欠損体とこれらの分子との相互作用が細胞の恒常的活性化に関わっている可能性を示唆している。

しかしながら、LPAシグナル変動とがんの関連について、その詳細は未だ不明である。これまで、がん組織で発現しているLPA1変異体(Phe295Ser、Pro308Ser、Ile310Thr、Tyr311His)が異常な細胞内分布を示すこと、その情報伝達も破綻していることを見いだした。本年度は、LPA1変異体の機能解析を非クローン細胞集団を用いて検討した。また、LPAの分解により産生される脂肪酸の作用機序およびLPAの分解酵素を調べた。(1)変異体の機能解析;これまで見られたLPA1変異体の細胞内分布の異常や情報伝達の破綻が、用いた細胞株に特有(クローナルバリエーションの結果)であるかどうかについて非クローン細胞集団を用いて検討した。レトロウイルスによりLPA1変異体を導入した細胞集団を作成し、細胞内分布ならびにLPA刺激による細胞骨格変化を調べたが、いずれの変異体もクローン細胞を用いたときと同様の異常が認められた。これらのことから、LPA1変異体の分布および機能異常は細胞クローン特有のものではなく、普遍的であることがわかった。(2)脂肪酸の作用解析;オレイン酸による細胞死抑制作用の一部がグルコース輸送体の発現亢進によることが分かった。また、細胞膜可溶性画分を種々のクロマトグラフィーに適用し、LPAを分解するリパーゼ活性の単離を試みた。SDS電気泳動において分子量250kDa程度の部分にリパーゼ活性が認められた。細胞生物学LPA1変異体による情報伝達系活性化の解析はほぼ終了したが、C末端領域に結合する分子の単離同定は一時中断した。これはいくつか同定した分子のいずれもが特異的結合を示す結果が得られなかったためである。また、本実験遂行中に、LPAの分解がメディエーター産生機構であるという、新規脂質情報伝達系を示唆する結果を得たため、これに関する実験を進めたことが理由である。LPA1変異体の情報伝達機構の解析のうち、Ca動員作用、MAPキナーゼ活性化作用は検討を始めているが、まだ結論が出ていない。細胞増殖や細胞運動性の解析も同様である。これらの進捗がやや遅れているのは、変異体が小胞体に蓄積することを見出したため、この解析に時間を割いたためである。LPA1C末端と相互作用する分子の解析では、複数の分子(14-3-3、カルネキシン)を同定したものの、いずれも目的とする特異性の高い分子ではなかったため、その後の解析に進むことができなかった。LPA1変異体による情報伝達系活性化や細胞内分布に関して論文を作成する。今期新たに明らかにした、新規脂質情報伝達系の解明を進める。具体的には、LPA分解酵素の単離同定である。Ca動員作用、MAPキナーゼ活性化作用、細胞増殖や細胞運動性の解析はいずれも数ヶ月で結論を出すことが可能である。さらに、変異体が小胞体ストレスを引き起こしているのかどうかを、新たなテーマとして解析していく。培養細胞を用いた変異体の機能解析を収束させていく。LPA1のC末端と結合する分子の解析では、今後、別法により検討を進めるが、概要に記したように恒常的活性化型であるLPA1C末端欠損体と結合する分子の機能を検討することも考慮する。該当なし
ケアの越境化と日本人高齢者の国際移動：マレーシア、タイ、フィリピンの事例から

本研究は、日本人高齢者(患者および要介護者)の国際移動に伴うケアの越境化を、マレーシア、タイ、フィリピンの事例から分析した。日本に比べて物価や気候面で利点のある海外に日本人高齢者が長期滞在・居住するライフスタイルの普及によって生じた、高齢者のケアを担う人々を移住先で必要とする側面、つまり「労働力を必要とする」人の国際移動であることに焦点を当て、医療や介護サービスを求める患者・消費者の越境化が、「若い」労働力が豊富であると同時に今後高齢化が進展する現地における高齢者医療や介護の産業化を促進することが明らかとなった。本研究は、日本人高齢者(患者および要介護者)の国際移動に伴うケアの越境化の進展に関して、マレーシア、タイ、フィリピンの事例から明らかにすることを目的としている。日本人高齢者の国際退職移住は1990年代以降からみられる新しい動向であるが、マレーシア、タイ、フィリピンは、退職者向けの受け入れ制度を整備することにより長期居住や滞在型余暇(ロングステイ)の日本人高齢者を受け入れてきた。当該地域では、長期居住する日本人高齢者が増加しており、医療や介護サービスのニーズが徐々に生じている。本研究は、高齢者の国際移動のもつ「労働力を必要とする人の移動」の側面に焦点を当て、医療や介護サービスを求める患者・消費者の越境化を生じさせる重層的構造を解明する。平成25年度は、1)当該地域における各国のメディカルツーリズムの政策的展開と医療・福祉の制度面での整備状況の把握、2)マレーシア(クアラルンプール)での医療機関と日本人高齢者の退職移住者の動向に関する現地調査、3)学会における一部成果発表を実施した。マレーシアでは、日本人高齢者のコミュニティ形成とネットワーク化が顕著であり、現地の医療や介護サービスに関する情報や知識の共有化が進展している状況が明らかとなった。また、将来的な現地社会の高齢化を念頭におきつつ、新たなニーズとなる外国人高齢者を対象に含む医療や介護サービスの事業化を促進する動きが現地の民間病院の一部にみられ、外国人高齢者の国際移動は現地の医療や介護サービスの変容を生じさせる一要因となることが指摘できる。アジアの地域統合に向けた政治経済の動向を背景に、ASEANの高度人材の移動が加速している。当該地域の医療産業は、医療人材、患者、病院経営の国境を越えた移動を操作することが営利に結び付いている。次年度は、メディカルツーリズムや患者の国際移動の媒介となるアクターの実態解明に取り組みたい。平成26年度の研究実績は以下のとおりである。国際民族学人類学連合(IUAES)では、分科会「人の移動のキーワード:比較文化の観点から」において、日本と欧米における退職移住(retirement migration)概念の比較検討に関する発表を行った。次に、国際シンポジウム「アジア諸国における医療ツーリズム:現状とその課題」において、日本からの退職移住の進展により受入れ社会の高齢者介護のサービス化を促進する側面を分析し、発表を行った。また、スロヴェニア・リュブリャナ大学で開催されたヨーロッパ日本研究協会の研究大会において、現代日本社会における男性性の再考に関する分科会において、日本人男性が東南アジアに移住する行為がもつ自己の意味づけに関する分析について発表を行った。さらに、マレーシアで開催されたアジア太平洋公衆衛生学術コンソーシアム(APACPH)研究大会において、外国人であるという属性と国籍がマレーシアにおいてヘルスケアのアクセスに与える影響の分析に関する共同発表を行った。このほか、国立民族学博物館主催の講演会、タイ・チュラロンコン大学アセアン研究センターにおいて講演を行った。本研究の最終年度である平成27年度は、研究成果の公表に取り組んだ。主たる研究実績は以下のとおりである。また『The Daily NNAマレーシア版』に単著エッセイ「マレーシアの医療ツーリズム」が掲載された。本エッセイでは、マレーシアにおけるケアの越境化を促進する政策である医療ツーリズムの概要と最新動向について報告した。平成26年度は、現地調査および成果報告の上で達成度の高い一年であった。上述の研究実績に加え、成果発表の場では、本研究に関連する研究者との意見交換やネットワークを広げられた。平成25年度は、当初計画よりも現地調査の訪問国数を減らし、日本国内で患者や要介護高齢者の国際移動に関わるアクターへの聞き取り調査と資料収集によってアジアにおける患者や要介護高齢者の当該地域への国際移動および介護産業の海外進出状況に関する動向調査に重点をおいた。この成果を踏まえ、平成26年度には、タイと中東(アラブ首長国連邦ドバイとオマーン)において現地調査を実施した。タイのバンコクにおける現地調査では、バンコク市内および近郊の民間病院、日系介護事業者、介護学校、日系人材派遣会社、現地旅行代理店、高齢移住者の市民団体、および日本人の多く居住する地区における日本人高齢移住者への聞き取りを行った。現地調査からは、日本からタイへの患者、要介護高齢者の国際移動を促進させる要因や医療介護産業の動向、さらに現地での移住生活が長期間にわたる日本人高齢者のネットワークと生活実態を把握することができた。

ドバイとオマーンにおける現地調査では、本研究の調査対象国であるマレーシア、タイ、フィリピンへ医療目的で渡航、滞在する外国人患者の送り出しを積極的に奨励しているアラブ首長国連邦ドバイとオマーンの医療事情、および医師、看護師の就労状況、および日系クリニックの実態からみた医療の国際化に関する調査を行った。具体的には、両国の医療機関や医療特区の訪問、さらに中東最大規模の医療展示会であるアラブヘルスに参加し、各国の医療行政担当者、医療機器メーカー、医療機関の担当者に聞き取り調査を行った。調査の結果、中東からみた医療サービスの越境化と東南アジアとの医療交流の現状、および日本の医療機関との医療交流の現状を把握することができた。文化人類学・民俗学本研究は、当初の計画では平成26年度で終了を予定していた。しかし、研究の進展により、中東調査や研究成果発表の機会に恵まれ、当初の研究項目や成果発表の予定に追加で研究活動を実施することができた。その結果、当初の計画で予定していたフィリピンでの現地調査の実施に関し、平成27年度に繰り越す必要が生じた。したがって、本研究は一年間の延長申請を行い、フィリピンでの現地調査を遂行し、調査項目をすべて達成した上で、最終報告を実施する予定である。平成26年度は、研究成果発表の機会に恵まれた。これらの成果発表の場では、本研究に関連する研究を行っている海外の研究者との交流の機会が得られた。とくに、マラヤ大学の研究者との交流、チュラロンコン大学アセアン研究センターの研究者との交流は、今後の研究の進展の上でも貴重な交流の機会であった。平成27年度は、フィリピンへの高齢者移住に関して日本国内とフィリピンにおいて現地調査を重点項目として実施する。日本国内では、主に首都圏で開催される高齢者移住を促進する市民団体の活動現場や旅行会社、および移住・医療介護事業者等の高齢者移住の送り出しに関わる人々への聞き取り調査を行う。さらに、フィリピン(マニラ)での現地調査をおこない、民間病院、日系介護事業者、介護学校、日系人材派遣会社、現地旅行代理店、高齢移住者の市民団体、および日本人の多く居住する地区における日本人高齢移住者への聞き取りを行う。本研究は、当初の計画では平成26年度で終了を予定していた。その結果、当初の計画で予定していたフィリピンでの現地調査の実施について平成27年度に繰り越す必要が生じた。本研究は、マレーシア、タイ、フィリピンの事例からケアの越境化を考察することを目的としているので、初年度に実施していない現地調査を効率的に進めていく。今後の研究の発展のためには、調査国の医療や福祉および国際移動を専門とする現地の研究機関に所属する研究者との意見交換やネットワーク構築を推進することが重要となる。
精神疾患患者の脳脊髄液における神経可塑性関連タンパク質の多分子同時解析

精神科患者と健常者の大規模脳脊髄液検体を用いて、磁性ビーズアッセイで神経可塑性関連タンパク質の多分子同時測定を行う。解析によって見出されたバイオマーカーと臨床情報の関連を調べて、精神疾患の神経可塑性仮説について検証する。
臨界緩和モードとソフトモードが共存する強誘電性相転移の動的研究

1.臨界緩和モードの存在が予想されていた強誘電体LiTIC_4H_4O_6H_2Oの誘電率及び自発分極の測定を行ない、Rhodes-Wohlfarth比を決定した。その結果を基にして、この結晶における強誘電性相転移のメカニズムは変位型であり、臨界緩和モードは存在しないことを指摘した。この結論は、我々の誘電スペクトルの測定結果とも一致した。2.臨界緩和モードとソフトモードの両方が明瞭に観測されている強誘電体(CH_3NHCH_2COOH)_3CaCl_2の誘電スペクトルを測定し、その臨界緩和モードが過減衰ソフトモードとして理解される事を示した。しかしながら、以前に我々が行なった結晶構造解析の結果はこの結果の相転移機構が変位型である事を示唆しており、今回の結果と食い違っている。精密結晶構造解析を再度行ない、この矛盾点を検討した上で最終的な結論を出す予定である。3.相転移温度付近で観測される誘電分散が緩和型か共鳴型かで論争されていた強誘電体PbHPO_4の誘電スペクトルを測定し、その分散が緩和型である事を明確にした。この結果、PbHPO_4の相転移機構は秩序-無秩序型である事が結論された。現在PbHPO_4と同型の強誘電体であるPbHAsO_4についても測定を進めており、両結晶の結果の比較を通してPO_4(AsO_4)四面体が相転移に果たす役割を明確にする予定である。
FALS変異SOD1による神経変性に拮抗する新規神経再生因子の作用機序解析

筋萎縮性側索硬化症(ALS)は、随意運動神経系の進行性変性疾患で、根治薬はなく薬剤シードの発見が待ち望まれている。私達は、9残基のペプチド因子ADNFが優性ALS原因遺伝子であるSOD1変異体が誘導する神経細胞死を顕著に抑制することを見い出した。ADNFは、アミロイドβ誘導性神経細胞死をfMという極めて低い濃度で抑制するが、nM以上ではその活性を失う為、抗AD薬として応用できなかった経緯がある。本研究は、ADNFのALS関連神経細胞死拮抗作用に対し、その分子機構をin vitroで解析し、マウスALSモデルにおける有効性を検証することを目的として始められた。ADNFのSOD1変異体誘導性細胞死抑制作用は、100fMで完全抑制となり、かつそれ以上の濃度でもその効果を発揮し続けた。独創的ADNF誘導体コリベリンも同等の細胞死抑制活性を発揮した。また、ADNF細胞死抑制作用は、何らかのチロシンキナーゼとCaMKIVを含む特異的なシグナル伝達系を介していること等が判明し、ADNFによる運動神経保護作用がAD関連神経細胞死拮抗作用とは全く別のシグナル伝達経路を介することを示唆した。さらに、第2のFALS遺伝子ALS2産物のAlsinはSOD1変異体誘導性神経細胞死を抑制すること、そのシグナル伝達経路、Rac1-PI3kinase-Akt3を明らかにした。In vivo研究としてG93A-SOD1マウスの脳室内にカニューラを留置し生後80日目より2日に1度ADNF或いはコリベリンを投与し続け、ローターロッド試験により運動機能を観察した。その結果、ALSマウスの運動機能はコントロール投与群では14週以降低下したが、ADNF投与群においては、ほぼ17週まで維持された。ADNFの延命効果は運動機能改善ほど著明ではなかったが、コリベリンは運動機能のみならず著明な生命延長効果を示した。
岩石衝撃硬度数による破壊靭性値の評価に関する研究

破壊靭性試験のISRM推奨案では、採取した岩石を規定の形状・精度に整形する必要がある。しかし、このような整形を行うことができる岩石は、インタクトなものがほとんどであり、潜在亀裂を多数有する岩石では、一般に整形が困難であるか、整形し得たとしても不正確さを免れ得ないことが多い。そこで、比較的簡単な整形で得られる岩石衝撃硬度数RIHNを用いて、破壊靭性値を評価し得るか否かについて検討した。その結果、非線形補正前の破壊靭性値および非線形補正後の破壊靭性値と岩石衝撃硬度数の間には正の相関が認められることが分かった。これは、衝撃破砕試験では打撃により発生する亀裂が供試体全体に及んでいるのに対し、破壊靭性試験では2つの破断面が形成されるという相違点はあるが、両者とも亀裂の進展性を表すパラメータであるという意味で類似しているためであると考えられる。また、非線形補正後の破壊靭性値と岩石衝撃硬度数の相関よりも非線形補正前の破壊靭性値と岩石衝撃硬度数との相関の方が強いことが分かった。これは、衝撃破砕試験では、供試体に動的な荷重を与えるために非線形度が小さくなり、破壊亀裂進展の際、線形弾性体に近い挙動を示すためである。以上のことから、比較的簡単な試験方法により得られる岩石衝撃硬度数から亀裂の進展性を表す破壊靭性値の概値を推定することが可能であることが分かった。
磁気駆動型体内埋込み電極による脊髄損傷ラット麻痺筋の電気刺激

【目的】本研究では、ラット脊髄損傷モデルを作成し、磁気駆動型体内埋込み電極を用いて麻痺筋の刺激を行い、麻痺筋の筋萎縮回復・機能改善が可能か検証した。【方法】成熟Wistar系ラットを用いて全身麻酔下に胸髄完全脊髄損傷モデルを作製し、完全麻痺になっている右下肢坐骨神経近傍に磁気駆動型体内埋込み電極を埋め込み、翌日から刺激を開始した。刺激条件は周波数20Hz、パルス幅0.2ms、最大上定電流刺激とし、1日2回各1時間1週間施行した。刺激終了後、刺激・非刺激側のヒラメ筋を摘出してmyosin ATPase染色により遅筋であるタイプ1線維、速筋であるタイプ2線維に分類し、筋線維短径を比較検討した。実験は秋田大学動物実験委員会の許可を得て施行した。【結果】MyosinATPase染色による組織学的検索では、筋線維短径は刺激側、非刺激側の順にタイプ1で平均44.0±1.2μm(mean±SD)、39.0±0.7μm、タイプ2で39.1±1.0μm、36.2±1.3μmだった。タイプ1、2とも刺激側の法が非刺激側より短径が有意に小さくなり(p<0.05)、磁気駆動型体内埋込み電極による刺激は筋萎縮抑制効果があることが明らかになった。【結論】磁気駆動型体内埋込み電極による麻痺筋の刺激は、脊髄損傷後の筋萎縮および機能低下進行予防効果がある。磁気駆動型体内埋込み電極は、脊髄損傷者の麻痺筋に対する治療的電気刺激において有益であり、今後は最も有効な刺激条件の検索、至適刺激開始時期などの検証を進めていく必要があると考えられる。【目的】本研究では、ラット脊髄損傷モデルを作成し、磁気駆動型体内埋込み電極を用いて麻痺筋の刺激を行い、麻痺筋の筋萎縮回復・機能改善が可能か検証する。【方法】成熟Wistar系ラットを用いて脊髄損傷モデル(胸椎下位レベル)を作製し、完全麻痺になっている右下肢総腓骨神経近傍に磁気駆動型体内埋込み電極を埋込み、20Hz刺激を1日1時間1週間施行した。刺激終了後、前脛骨筋等尺性最大筋収縮力、myosin ATPase染色によるタイプ1・2A・2B線維の大きさ比較、RT-PCR法によるミオシン軽鎖・ミオシン重鎖mRNAの発現の違いを刺激側と非刺激側で比較検討した。【結果】前脛骨筋の等尺性最大筋収縮力は、刺激側群で平均0.86±0.24N(Mean±S.D.)、非刺激側群で平均0.46±0.27Nであり、刺激側で有意に筋収縮力が大きかった(t-test ; p<0.0001)。MyosinATPase染色による組織学的検索では、筋線維短径がタイプ1・2A・2Bいずれも刺激側群で有意に大きく筋萎縮進行予防変化を認めた。また、RT-PCR法による検索では、MHCIβ、IIa、IIbそれぞれのmRNA発現量のGAPDH mRNAに対する相対値は、刺激側群では1.1、1.3、1.0、非刺激側群では0.5、0.4、0.7となり、刺激側群で高かった。【結論】磁気駆動型体内埋込み電極による麻痺筋の刺激は、脊髄損傷後の筋萎縮および機能低下進行予防効果があることが明らかになった。磁気駆動型体内埋込み電極は、脊髄損傷者の麻痺筋に対する治療的電気刺激において有益である可能性がある。
CO2濃度上昇に対する進化的応答の分子古生物学的解析

産業革命以降、大気CO2濃度は上昇をし続け、特に近年の上昇速度の増加は著しい。例えば、ハワイのマウナ・ロアでの観測によれば、この50年の間に315ppmから380ppmへと変化している。そこで本研究では、CO2濃度上昇に対する進化的応答を明らかにするために、ハクサンハタザオの現生個体と標本個体を用いて、奥新川・月山・板室・伊吹山・藤原岳・箕面集団におけるCO2応答関連遺伝子の時空間動態を解析した。特に気孔の形態形成や密度調節に重要な役割を持つHIC、HT1、SDD1、TMM、SLAC1、STOMAGEN、SCRM1、SPCH、MUTE、MKK4、EPF2遺伝子に着目した。伊吹山・藤原岳の現生集団における多型解析の結果、HIC、HT1、TMM、STOMAGEN、SCRM1、SPCH、MKK4、EPF2遺伝子において、集団内アミノ酸変異が見つかった。そこで、これらの遺伝子を対象に標本個体の多型解析を行なったところ、HIC、MKK4、EPF2遺伝子において対立遺伝子頻度が時間的に変動していることが明らかとなった。さらに、奥新川・月山・板室・箕面集団において、これらの遺伝子の対立遺伝子頻度の変化を解析した。その結果、奥新川・月山・板室・箕面集団では、伊吹山あるいは藤原岳集団において保持されていたアミノ酸変異が見られない事が分かった。その一方で、奥新川・月山・板室・箕面のそれぞれの集団でのみ多型のあるアミノ酸変異が見つかり、それらの対立遺伝子頻度に時間的変動は見られない事が分かった。この事は、異なる機能をもつ対立遺伝子がそれぞれの集団で独立に進化し、それが集団内に広がってきた可能性を示唆している。研究目的どおり、複数のCO2応答関連遺伝子に着目し、多数の標本個体と現生個体を用いてその時空間動態を解析する事に成功したため。また、集団ごとに動態が異なることを明らかにし、さらには時間とともに対立遺伝子頻度が変化する遺伝子も発見する事ができたため。標本個体において遺伝子を解析するのは、DNAの断片化の影響によって、現在でも容易ではない。今後は、DNAが断片化していても効率的に遺伝子を解析できる次世代シーケンサーを導入する。そこで、このようなCO2濃度の変化が野生植物の進化的応答に与える影響を明らかにするために、モデル植物シロイヌナズナに最も近縁な植物であるハクサンハタザオの現生個体と標本個体を用いて、CO2応答関連遺伝子の時空間動態を解析した。滋賀県伊吹山と三重県藤原岳の集団を対象に、CO2応答関連遺伝子の中でも特に気孔の形態形成や密度調節に重要な役割を持つHIC、HT1、SDD1、TMM、SLAC1、STOMAGEN、SCRM1、SPCH、MUTE、MKK4、EPF2遺伝子を対象に、その対立遺伝子頻度の変化を過去100年に渡って解析した。各遺伝子についてプライマーを設計し、PCRとDNAシーケンスを行い、アミノ酸配列変異を示す一塩基多型(SNP)と挿入欠失(indel)を探索した。現生集団における多型解析の結果、HIC、HT1、TMM、STOMAGEN、SCRM1、SPCH、MKK4、EPF2の8遺伝子において、集団内アミノ酸変異が見つかった。この中には、伊吹山内のみあるいは藤原岳内のみで多型が検出された遺伝子や、生育標高と対立遺伝子頻度に緩い相関が見られる遺伝子が存在した。そこで、これらの遺伝子を対象に標本個体の多型解析を行なったところ、多くの遺伝子において対立遺伝子頻度が変動していること、遺伝子によって変動の仕方が異なることが明らかとなった。また、気孔の密度調節機能の一端を担うHIC遺伝子は時間とともに対立遺伝子頻度が変化していることがわかった。その一方で、奥新川・月山・板室・箕面のそれぞれの集団でのみ多型のあるアミノ酸変異が見つかり、それらの対立

遺伝子頻度に時間的変動は見られない事が分かった。この事は、異なる機能をもつ対立遺伝子がそれぞれの集団で独立に進化し、それが集団内に広がってきた可能性を示唆している。研究目的どおり、複数のCO2応答関連遺伝子に着目し、多数の標本個体と現生個体を用いてその時空間動態を解析する事に成功したため。また、集団ごとに動態が異なることを明らかにし、さらには時間とともに対立遺伝子頻度が変化する遺伝子も発見する事ができたため。標本個体において遺伝子を解析するのは、DNAの断片化の影響によって、現在でも容易ではない。今後は、DNAが断片化していても効率的に遺伝子を解析できる次世代シーケンサーを導入する。
がんの核医学診断,治療を目的とする放射性テクネチウムおよびレニウム標識抗腫瘍抗体

本研究はがんの核医学診断に使用する99mーTc標識抗腫瘍抗体の新しい研究展開をめざし、著者らが見いだした99mーTcージメルカプトコハク酸多核錯体(Tc..DMS)のがん細胞集積性と抗体のがんタ-ゲッチング機能とを同時に備える99mーTc標識抗体の開発を検討し、さらにその成果をTcと同族金属であるReに展開させ、186ーReを用いる治療用抗腫瘍抗体の開発を検討することを計画したものである。最初に、標識抗体開発の基礎になるTcーDMSの特徴とする体内挙動すなわち血液中での安定性とがん細胞集積挙動を多核錯体の化学的性質との関係において基礎的に検討した。特に、投与されたTcーDMSの血液中の環境、すなわち血液による希釈の条件下における錯体の解離平衡を調べた結果、配位した全DMSの2030%に当たる部分的なDMSの解離が進行するものの、Tcに多核状態は安定に保持されることが認められた。さらに、部分的なDNS解離の進行後、Tcの多核状態はpHに極めてsensitiveとなり、中性から僅かのpH低下に伴い、TcO_4 ^<3->への解離とがん細胞への取り込みが劇的に進行することがインビトロ実験で認められた。がん細胞周辺が低pHの雰囲気にあり、またTcO_4 ^<3->ががん細胞集積に関係することはすでに明かとされている。すなわち、血中での希釈に伴う解離平衡がTcーDMSの独特の体内挙動の鍵を握ることが明らかにされた。以上の成果を踏まえて、続いてTcーDMSの多核錯体構造を標識部位にもつ標識抗体の基礎的検討を進めた。現在まだ続行中であるが、DMSとNー(εーmaleimidocaproyloxy)succinimideを架橋試薬とする抗体とのconjugateを使用する標識抗体作製の可能性を見いだすなどの結果を得ており、今後の研究展開に期待をよせている。また、186ーRe標識抗体への研究展開の可能性も得られたものと理解している。本研究は核医学診断および治療にそれぞれすぐれる99m-Tcおよび186-Reの多核錯体を標識部位とする新しいタイプの放射性金属標識抗腫瘍抗体を作製し、がんの核医学診断、治療への有用性を基礎的に検討することを目的としている。この研究の基本となる考えは抗腫瘍抗体の体内分布におけるがん抗原の認識とそれに続く多核錯体から解離する5価オキソアニオンのがん細胞内への移行である。この考えに従い、1)99m-Tc多核錯体の解離とがん細胞内へのTcオキソアニオンの移行との関係および2)多核錯体と抗体との結合に関する基礎的検討をまず計画したが、本年度は、これまでの研究成果に基づき、ジメルカプトコハク酸(DMS)をリガンドとする99m-Tc多核錯体を主な対象として研究を進めた。1)に関しては、Tc-DMS多核錯体に希釈によって解離状態を与え、TLCでの解離状態の分析と共に、エ-ルリツヒ腹水がん細胞を用いるインビトロの実験系で、錯体の解離とがん細胞への移行の関係を調べた。

その結果、予想通り両者が並行することを認めたが、さらに、この錯体はオ-レ-ションで形成されたTcの多核コアを中心に、周辺にDMSが配位した構造をとり、希釈に伴ってDMSの解離が先行して進み、この一部DMSの解離したTc多核錯体ががん集積に重要に関係することが予測された。この結果は今後の研究の展開を大きくもたらすものである。2)に関しては、まず多核錯体と抗体との疎水結合を期待し、抗体と多核錯体との単純なmixturlを用いたエ-ルリッヒ担がんマウスでのがん集積挙動を調べた。多核錯体単独投与の場合と比較して、確かにがん集積の向上がみられたが、期待し得る程のデ-タではなく、結合様式に関して、1)の研究の展開を眺めつつ、今後さらに検討することの必要性を認めた。昨年度に引き続き、ジメルカプトコハク酸を配位子とする99mーTc多核錯体(TcーDMS)のがん細胞内移行機序の検討およびその成果に基づくTcーDMSー抗体のConjugateの考案とその検討を以下のように行った。1。TcーDMSのがん細胞内移行機序に関しては、これまでに多核錯体から解離するTcO_4^<3->オキソアニオンが重要な役割をもつことが示されていた。本年度の研究においては、まず生理食塩水中の希釈に伴うTcーDMSの解離現象を詳細に検討し、生体内に投与されたTcーDMSが必然的に受ける解離要因である血液による希釈条件が与えられたとき、20ー30%に当たる一部のDMSの解離が進行するものの、Tcの多核化状態は全体として大きな影響を受けないことが認められた。また、TcーDMS多核錯体はそれぞれ約10原子のTcおよびDMSの組成からなることが予想され、さらに希釈による初期のDMS解離の進行に伴い、僅かのpH低下でTcの多核化状態の劇的な崩壊すなわち劇的なTcO_4^<3->への解離の進行とがん細胞内移行が観察された。がん細胞周辺の低pH環境は多くの研究が認めているところである。2。TcーDMSー抗体のConjugate作製に当たって、上記の検討結果を踏まえ、TcーDMSにおけるTcの多核化状態とDMSの配位状態とを保持させることを基本方針として、(1)予め作製したTcーDMSを用いて抗体との単純な混合標識溶液および(2)Nー(εーMaleimidocaproyloxy)succinimide(EMCS)を用いてDMSーEMCSー抗体Conjugaateを作製後、過剰DMS存在下の99mーTc標識によって得られるTcーDMSーEMCS抗体溶液を対象に、それぞれの体内挙動、がん集積などの基礎的検討を現在進めているところである。
完全なＥＳ／ｉＰＳ細胞に由来する歯形成細胞誘導に関する研究

奇形腫から由来する細胞群から歯構成細胞を特異的に非侵襲的に検出するため、エナメル芽細胞特異的な遺伝子の下流に蛍光遺伝子と薬剤耐性遺伝子を繋げた構築体(pT-ARIP)をpiggyBacトランスポゾンによる遺伝子導入システムを用いて導入した。残念ながら、pT-ARIP導入iPS細胞からはそれ由来の奇形腫を得ることができなかった。そこで、遺伝子導入前のiPS細胞から得られた奇形腫を初代培養し、得られた培養細胞に対しRT-PCR解析と免疫組織学的解析を行ったところ、DSPPやAMELXの存在を確認した。以上より、in vitroでiPS細胞から歯形成に係わる細胞群を分化誘導できる可能性が示された。iPS細胞は、自家移植が可能で多分化能を有し、かつ細胞増殖も活発なため、それを用いた再生医療への応用が期待される。歯学領域でもiPS細胞を用いた歯の再生が待望されているが、まだ実現していない。その要因として、歯形成が複雑な細胞間相互作用で進むため、in vitroでの歯の再生には様々な因子を検討する必要があるからである。本研究課題では、このようなin vitroでの問題を回避し、マウスES細胞をヌードマウス精巣内に移植し、形成された奇形腫を初代培養し、in vitroで組織再構成を行うという独創的な方法を用い、当該細胞に由来する3次元構造を持つ歯の形成を行う。本研究の計画は以下のとおりである。1歯形成細胞特異的に蛍光タンパク遺伝子を発現するプラスミドを作製、2上記プラスミドをマウスES細胞株に遺伝子導入し、組換えES細胞を作製、3この細胞に歯形成誘導のための処理を施し、細胞集合体をヌードマウス精巣内に移植、4得られた奇形腫を初代培養系に移し、in vitroでES細胞由来の歯組織を含む組織再構成体を得る、5歯組織再構成体をヌードマウス上顎骨と精巣内に移植し、3次元構造を持つ歯が形成されるか検討する平成23年度の研究成果としては、ameloblastとodontoblastの歯形成細胞に特異的に蛍光タンパクを発現するプラスミドを構築した。平成24年度は、nucleofectionシステム(Lonza)を用いた遺伝子導入法で、マウスES細胞E14株に上記プラスミドの遺伝子導入を試みたが、導入効率が低く、また、遺伝子導入後のクローンの樹立や維持が困難だった。そこで、後述の方法を用いることでマウスES細胞E14株への遺伝子導入を可能にした。iPS細胞は自家移植が可能であり、様々な分化細胞を生み出すことができるため、再生医療への応用が大いに期待されているが、歯学領域ではiPS細胞由来の歯関連細胞への明確な分化誘導法はまだ確立されていない。in vitroでの歯の再生には様々な因子を検討する必要があるからである。本研究課題では、このようなin vitroでの研究のアクセスの困難性を回避するため、ES/iPS細胞をヌードマウスに移植し、形成された奇形腫を初代培養し、in vitroで組織再構成を行い、当該細胞に由来する歯の形成が可能かどうかを検討することを目的とする。マウスES細胞株を扱う前に、当研究室ではヒト乳歯歯髄細胞からiPS細胞を樹立することができたため、上記実験の最終目標であったiPS細胞を用いて実験を進めることにした。奇形腫から由来する細胞群から歯構成細胞を特異的に非侵襲的に検出するため遺伝子工学的トリックをiPS細胞に加えた。即ち、エナメル芽細胞(ameloblast)特異的な遺伝子amelogenin (AM)promoterの下流に蛍光遺伝子と薬剤耐性遺伝子を繋げた構築体(pT-ARIP)をpiggyBacトランスポゾン(PB)による遺伝子導入システムを用いて導入した。なお、PBによるiPS細胞への効率的遺伝子導入については論文作成中である。おそらく遺伝子導入過程で細胞の分化ポテンシャルが低下していた可能性がある。

本研究課題では、このようなin vitroでの問題を回避し、マウスES細胞をヌードマウス精巣内に移植し、形成された奇形腫を初代培養し、in vitroで組織再構成を行うという独創的な方法を用い、当該細胞に由来する3次元構造を持つ歯の形成を行う。歯形成細胞特異的に蛍光タンパク遺伝子を発現するプラスミドを作製し、これらをマウスES細胞株に遺伝子導入し、組換えES細胞を作製する。この細胞に歯形成誘導のための処理を施し、細胞集合体をヌードマウス精巣内に移植し、奇形腫を作製する。奇形腫を初代培養系に移し、in vitroでES細胞由来の歯組織を含む組織再構成体を得る。歯組織再構成体をヌードマウ上顎骨と精巣内に移植し、3次元構造を持つ歯が形成されるかどうか、癌の再燃があるかどうかを検討することが目的である。平成23年度の研究成果としては、Ameloblastとodontoblastの歯形成細胞に特異的に蛍光タンパクを発現するプラスミドを構築した。さらに現在、pOEINと新規作成2種のプラスミドをマウスES細胞E14株にnucleofectionシステム(Lonza)を用いて遺伝子導入し、G418/Hygromycin B/puromycinの3重選別により、最終的にpARP, pDCH, pOEINの3種を内蔵する組換えES細胞を作成中である。当初、マウスES細胞E14株にameloblastとodontoblast特異的蛍光遺伝子の発現プラスミドを導入する方法として、nucleofectionシステム(Lonza)を用いていたが、導入効率が低かったため、エレクトロポレーション法を採用した。しかしながら、遺伝子導入が困難だったり、遺伝子導入後の細胞の樹立や維持が困難だった。そこで、哺乳類細胞への遺伝子導入の効率が非常に高いとされるトランスポゾンの一種PiggyBacの系を遺伝子導入に適用することで、ES細胞へのプラスミドの遺伝子導入と細胞の維持、継代が可能になった。遺伝子導入後の薬剤の選別によるpARP, pDCH, pOEINの作成にやや手間取っているものの、研究の進展に関しては、おおむね順調に進展している。今後は得られた組換えES細胞を、ヌードマウス精巣内へ移植し、奇形腫を作製する。組み換えES細胞をそのまま移植する群(対照群)、組み換えES細胞をLIF不在下懸濁培養して得られた幾つかの初期分化細胞を含む胚様体を移植する群(実験-1群)、胎齢14日目の胎仔歯胚に由来する単一化した上皮細胞と間葉系細胞とES細胞とを混合したものを移植する群(実験-2群)、既に樹立されたラット由来ameloblast細胞株とES細胞を混合したものを移植する群(実験-3群)、BMPやGDF11等の成長因子を染み込ませたバイオマテリアルとES細胞とを混合したものを移植する群(実験-4群)で検討し、得られた奇形腫内の歯組織の分化状態を調べる。消耗品費:遺伝子工学実験、細胞工学実験、動物購入等の消耗品は、本研究遂行上必須である。旅費:国内の各種学会への発表・参加するための旅費と資料収集のための旅費も計上している。謝金、その他:免疫組織化学、H-E染色、RT-PCR解析等は、その経験がある大学院生に補助をお願いする予定である。また、論文作製のため論文の校閲とジャーナルへの論文投稿費を計上している。
スクアレン閉環酵素反応の有機化学及び分子生物学的手法による多面的機能解析

スクアレン環化メカニズムの解明を目的にして、スクアレン閉環酵素の部位特異的変異株を作成し、その酵素反応を追跡した。また、基質アナログを合成しその環化生成物を同定することによって基質認識機構を探ることも本研究の目的とした。以下の実験結果を得て、6報の学術論文としてまとめた。1)開始段階であるスクアレン末端二重結合のプロトン化は、D374とD376によって達成される。また、D313,D447,H451はプロトン供与体の酸性度を増加させる機能,W312は開始段階において基質結合部位として働いている。2)377は、B環形成段階においてC10カルボカチオン中間体の安定化に機能している。3)F365は、5員環のC環形成段階においてカチオン-π電子相互作用によってC8カルボカチオン中間体の安定化に機能している。この研究は、カチオン-π電子相互作用の存在を強く示唆する初めての実験的事実である。4)W169とW489は、6員環のD環形成(環拡張反応)段階において基質結合部位として機能している。W489はC17カルボカチオンの安定化にも寄与している。5)DXDDTAモチーフのAsp残基(D374,D376,D377)は、活性部位であり、開始段階からB環形成までの触媒反応に機能している。また、T378は活性部位ではない。6)変異酵素W169F,W169H,W489Fの生産するトリテルペンのD環が5員環の構造を有している事実から、ホペンの6員環のD環形成はまず5員環中間体が形成され、その後6員環へと環拡張するという新しい反応機構を提案できた。7)Y420の変異実験から、6/6/5-fused tricyclicのmalabaricane骨格及びF605の変異実験から、新規骨格物質を生産することを見い出した。これをprohopene A,Bと命名した。また、F605の機能をC-17cationの安定化に関与すると結論付けた。また、基質アナログの研究をとうして8)環化開始には末端にジメチル基が必須である。9)C-10位のメチル基が活性型コンフォメイション規定するはじめてのデータを得た。以下の実験結果を得て、五報の学術論文としてまとめた。2)D377は、B環形成段階においてC10カルボカチオン中間体の安定化に機能している。

3)F365は、5員環のC環形成段階においてカチオン-π電子相互作用によってC8カルボカチオン中間体の安定化に機能している。この研究は、カチオン-π電子相互作用の存在を強く示唆する初めての実験的事実である。4)W169とW489は、6員環のD環形成(環拡張反応)段階において基質結合部位として機能している。W489はC17カルボカチオンの安定化にも寄与している。5)DXDDTAモチーフのAsp残基(D374,D376,D377)は、活性部位であり、開始段階からB環形成までの触媒反応に機能している。また、T378は活性部位ではない。6)変異酵素W169F,W169H,W489Fの生産するトリテルペンのD環が5員環の構造を有している事実から、ホペンの6員環のD環形成はまず5員環中間体が形成され、その後6員環へと環拡張するという新しい反応機構を提案できた。7)環化開始には末端にジメチル基が必須である。スクアレン環化メカニズムの解明を目的にして、スクアレン閉環酵素の部位特異的変異株を作成し、その酵素反応を追跡した。また、基質アナログを合成しその環化生成物を同定することによって基質認識機構を探ることも本研究の目的とした。以下の実験結果を得て、6報の学術論文としてまとめた。1)開始段階であるスクアレン末端二重結合のプロトン化は、D374とD376によって達成される。また、D313,D447,H451はプロトン供与体の酸性度を増加させる機能,W312は開始段階において基質結合部位として働いている。2) 377は、B環形成段階においてC10カルボカチオン中間体の安定化に機能している。3) F365は、5員環のC環形成段階においてカチオンーπ電子相互作用によってC8カルボカチオン中間体の安定化に機能している。4) W169とW489は、6員環のD環形成(環拡張反応)段階において基質結合部位として機能している。5) DXDDTAモチーフのAsp残基(D374,D376,D377)は、活性部位であり、開始段階からB環形成までの触媒反応に機能している。7) Y420の変異実験から、6/6/5-fused tricyclicのmalabaricane骨格及びF605の変異実験から、新規骨格物質を生産することを見い出した。これをprohopene A,Bと命名した。また、F605の機能をC-17 cationの安定化に関与すると結論付けた。また、基質アナログの研究をとうして8)環化開始には末端にジメチル基が必須である。9) C-10位のメチル基が活性型コンフォメイション規定するはじめてのデータを得た。