hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
脂肪酸誘導性細胞死を利用した細胞小器官に局在するＰＫＣの機能解析

がん細胞選択的に細胞死を誘導するガンマリノレン酸(GLA)を細胞に処理し,種々PKCサブタイプの局在変化を観察した結果,PKCdeltaとzetaが核近傍に集積する様子が観察された.脂肪酸を細胞に処理すると,核近傍で観察される脂肪油滴が出現することを,脂肪油滴を染色するNile Redを用いて確認し,ラマン顕微鏡を用いた解析から,細胞死を誘導する脂肪酸は,脂肪油滴に局在する様子が観察された.しかしPKCdeltaはNile Redとの共局在は観察されなかったことから,他の細胞小器官(ゴルジ体,小胞体,ミトコンドリア等)に移行していると考えている.【目的】脂肪酸は細胞死誘導能を持つと共に,プロテインキナーゼ(PKC)を活性化する.本研究では,脂肪酸で活性化され,細胞小器官に移行するPKCに注目し,脂肪酸を利用して,細胞小器官でのPKCの活性化機構と細胞死制御機構の解明,及びPKCが関与する疾患の病態解明や治療法を提示することを目指す.【方法】細胞死への関与が報告されている代表的なPKCサブタイプ(alpha,gamma,delta,epsilon,zeta)を選択し,遺伝子クローニングと,Venus(蛍光タンパク質)融合タンパク質の発現ベクターを作製した.培養細胞を用いた過剰発現系を構築し,脂肪酸処理後の種々PKCサブタイプの局在変化や,脂肪酸自体の局在を,共焦点レーザー顕微鏡やラマン顕微鏡を用いて観察した.【最終年度の成果】脂肪酸を細胞に処理すると,核近傍で観察される脂肪油滴(lipid droplet)が出現することを,lipid dropletを染色するNile Redを用いて確認した.ラマン顕微鏡を用いた解析から,細胞死を誘導する脂肪酸であるGLAやドコサヘキサエン酸(DHA)は,lipid dropletに局在する様子が観察された.【期間全体の成果】検討したPKCサブタイプの内,PKCdeltaはGLAを処理すると,lipid dropletに局在するように見えたが,lipid dropletを染色するNile Redとの共局在は観察されなかった.またPKCepsilonは細胞質全体に広がる様子が観察され,PKCzetaは核近傍に集積する様子が観察された.【今後の展開に関する計画】細胞内局在の判定のため各種オルガネラマーカーとの共染色と,脂肪酸処理後に見られるlipid dropletとの関係について調べる必要がある.がん細胞選択的に細胞死を誘導するガンマリノレン酸(GLA)を細胞に処理し,種々PKCサブタイプの局在変化を観察した結果,PKCdeltaとzetaが核近傍に集積する様子が観察された.脂肪酸を細胞に処理すると,核近傍で観察される脂肪油滴が出現することを,脂肪油滴を染色するNile Redを用いて確認し,ラマン顕微鏡を用いた解析から,細胞死を誘導する脂肪酸は,脂肪油滴に局在する様子が観察された.しかしPKCdeltaはNile Redとの共局在は観察されなかったことから,他の細胞小器官(ゴルジ体,小胞体,ミトコンドリア等)に移行していると考えている.脂肪酸は細胞死誘導能を持つと共に,プロテインキナーゼ(PKC)を活性化させることが知られている.本研究では特に,脂肪酸で活性化され,細胞小器官に移行するPKCに注目し,脂肪酸を利用して細胞小器官でのPKCの活性化機構と,PKCによる新しい細胞死制御機構を解明し,PKCが関与する疾患の病態解明や治療法を提示することを目指している.本年度は,がん細胞選択的に細胞死を誘導することが知られているガンマリノレン酸(GLA)に関して,AlamarBlueTM assayにより細胞死誘導能を評価した.さらに細胞死への関与が報告されている代表的なPKCサブタイプ(alpha,gamma,delta,epsilon,zeta)を選択し,遺伝子クローニングと,Venus(蛍光タンパク質)融合タンパク質の発現ベクターを作製した.HeLa細胞を用いた過剰発現系を構築し,GLA処理後の種々PKCサブタイプの局在変化を,共焦点レーザー顕微鏡を用いて評価した.AlamarBlueTM assayにより細胞死誘導能を評価した結果,GLAはがん細胞選択的に細胞死を誘導した.GLA処理後の種々PKCサブタイプの局在変化を観察した結果,PKCalphaとgammaは特に局在変化を示さなかった.一方PKCdeltaとzetaは,GLAを長時間処理すると,核近傍に集積する様子が観察された.脂肪酸処理時に核近傍で観察される脂肪油滴(lipid droplet)を染色するNile Redとの共局在は観察されなかったことから,他の細胞小器官(ゴルジ体,小胞体,ミトコンドリア等)に移行していると考えている.当初の計画通り,細胞死を誘導する脂肪酸が,PKCを細胞膜以外のオルガネラへ移行させることが示された.予定していた細胞死の判定とPKCサブタイプalpha,gamma,delta,epsilon,zeta)の遺伝子クローニング,Venus(蛍光タンパク質)融合タンパク質の発現ベクターの作製が完了し,HeLa細胞を用いた過剰発現系と共焦点レーザー顕微鏡を用いたアッセイ系の構築にも成功している.しかし脂肪酸は光と空気によって容易に酸化されることから,再現性が得られないこともあり,quality controlに注意を払う必要があった.そのため本年度はGLAについてのみの検討となったが,他の脂肪酸に関しても検討する準備は整っており,おおむね順調に進んでいると考えている.24年度に引き続き,脂肪酸の細胞死誘導活性のスクリーニングとPKCサブタイプの局在変化の観察を行なう.さらに今年度は脂肪酸との結合,局在変化に関与するPKCのドメインの解析を行なうため, SPRを利用した分子間相互作用解析装置(Biacore)を用いて評価する.

細胞死への関与が知られているタンパク質と,PKCが移行する細胞小器官に着目し,二次元電気泳動と質量分析によるPKCの基質の同定と機能解析を行ない,脂肪酸誘導性細胞死におけるPKCの役割を解明する.次年度は脂肪酸の細胞死誘導活性のスクリーニングと,PKCサブタイプの局在変化の観察を引き続き行なう計画であり,細胞培養用試薬やプラスチック消耗品を購入する.また昨年度検討できなかった細胞内局在の判定のための,各種オルガネラマーカー(ゴルジ体,小胞体,ミトコンドリア等)や,スクリーニングで用いる各種脂肪酸の購入を予定しており,次年度に計上した.前述のように25年度は,タンパク質関連の解析が中心となるため,タンパク質解析用試薬を主に購入する.旅費は研究成果の発表のために使用し,個人で行なう研究のため,謝金は外国語論文の校閲費のみに使用する.
ホログラフィック双対の場の量子論からの導出

d次元の場の量子論とdよりも高い次元の曲がった時空における量子重力理論とが、ある場合に等価になる「ホログラフィック双対」と呼ばれる驚くべき現象が、どのような仕組みで成り立っているのかを解明することを目指し、場の理論側の情報から重力理論の性質を引き出す方法を開発する。特に、場の理論が与えられたときに、それとホログラフィック双対な関係にある重力理論にはどのような場が存在し、どのような時空の上で実現されるのかを、場の理論の解析によって導出する方法を与え、QCDを含む広いクラスの場の理論に対してホログラフィック双対が議論できるようにしたい。
高い視認性を有する総合的な視覚化プラットフォームの開発

オブジェクトの概観や特徴を理解しやすいように描き出す視覚化システムの実現を目指し、具体的に開発するシステムの検討を行なった。オブジェクトが有する特徴の種類は、オブジェクトの形状的特徴と質的特徴とに大別できる。本研究では、形状的特徴と質的特徴のそれぞれに適した視覚化システムを設計することとした。オブジェクトの形状的特徴に対する視覚化システムを設計するにあたり、レンダリング技術の再検討を行った。本研究は、高い視認性を有するレンダリング手法として、多視点レンダリング技術に着目している。既存の多視点レンダリング技術の調査と実装実験を行った結果、既存の技術は、レンダリング速度において、汎用性とポリゴン数とのトレードオフを有することと、カメラモデルの複雑さが増加すると、リアルタイムレンダリングが困難であることがわかった。本研究では、上記の結果を受けて、複雑なカメラモデルで高速にレンダリングを行う新しい手法を設計し、簡易的な実装実験を行った。質的特徴を考慮した視覚化システムとして、多変量データの次元圧縮アルゴリズムやオブジェクトの再配置アルゴリズムを用いた探索システムを設計し、具体的なデータセットとして、水産業データを用いたプロトタイプ制作を行った。コンピュータグラフィックス分野とビジュアライゼーション分野の文献の調査を行い、先行するレンダリング技術とインタフェース設計の調査、および、設計した視覚化システムの新規性の明確化を行った。オブジェクトの概観や特徴を理解しやすいように描き出すための、具体的に開発するシステムの検討を行なった。オブジェクトが有する特徴の種類は、オブジェクトの形状的特徴と質的特徴とに大別できるので、形状的特徴と質的特徴のそれぞれに適した視覚化システムを設計することとした。オブジェクトの形状的特徴に対する視覚化システムを設計するにあたり、多視点レンダリングの既存技術の調査と実装実験を行い、レンダリング速度において、汎用性とポリゴン数とのトレードオフの関係があることと、カメラモデルの複雑さに強い影響を受けることを確認した。これを受けて、機械学習による回帰に基づいたフィードフォワード型のレンダリング手法を設計し、簡易的な実装実験を行った。今後、より詳細な実装と、提案手法の評価を行い、どの程度複雑なレンダリングが可能であるかを調査して、手法の有効性と制約を明らかにする。質的特徴を考慮した視覚化システムとして、多変量データの次元圧縮アルゴリズムやオブジェクトの再配置アルゴリズムを用いた探索システムを設計し、具体的なデータセットとして、水産業データを用い、t-SNEを用いた視覚化システムを試作した。今後は、機械学習と組み合わせた視覚化手法を開発する。平行して、コンピュータグラフィックス分野とビジュアライゼーション分野の文献の調査を行い、先行するレンダリング技術とインタフェース設計の調査、および、設計した視覚化システムの新規性の明確化を行った。今後は、視覚化システムの具体的な実装を行う。オブジェクトの形状的特徴と質的特徴のそれぞれに対して設計したインタフェースを実現させて、実験を行い、効果を検証する。形状的特徴を考慮した視覚化システムとして、基盤となる多視点レンダリング技術の新たな手法を設計し、簡易的な実験を行った。本研究では、回帰に基づくフィードフォワード型のレンダリング技術を開発しており、今後、提案する手法の精度、速度、および制約を実験により明らかにする。また、ユーザインタフェースの開発や、具体的な応用についても検討と実装を行う。質的特徴を考慮した視覚化システムとして、水産業データを用い、t-SNEを用いた視覚化システムを試作を行ったので、今後、実験によりシステムの有効性の検討を行い、また、機械学習と組み合わせた視覚化手法の開発を行う。このような視覚化システムの実装と並行し、形状的特徴と質的特徴を統合的に取り扱うことができる視覚化システムについても引き続き検討し、特に、シームレスに統合できるようなインタフェースの設計を行う。また、上記視覚化システムに加えて、タブレット端末を用いた、マルチタッチを活用したユーザインタフェースの設計と開発にも取り組む。Webプラットフォーム上での実装についても検討を行う。このような視覚化システムの開発と文献の調査を推進し、開発する視覚化システムの新規性を明確にしつつ、学会発表や論文執筆を行う。多視点画像レンダリング技術を用いてオブジェクトの描画実験および実験結果の検討を行った。実験および検討の結果から、オブジェクト同士の関係性を考慮した視覚化システムの設計を行った。オブジェクトの特徴は一般に多変量データで表されるが、具体的な視覚化システムの検討を行う過程で、効果的なインタフェースは特徴の種類に応じて異なることがわかり、まずは特徴の種類の分類を行なった。特徴の種類は、オブジェクトの形状的特徴と質的特徴とに大別できる。そこで、まずは形状的特徴と質的特徴のそれぞれに適した視覚化システムを設計することとした。形状的特徴を考慮した視覚化システムとして、オブジェクト同士の形状的な関係を考慮したユーザインタフェースをデザインし、ユーザが探索的にオブジェクトの構造を視認できるようなシステムを設計した。質的特徴を考慮した視覚化システムとして、多変量データの次元圧縮アルゴリズムやオブジェクトの再配置アルゴリズムを用いた探索システムを設計し、具体的に使用するデータセットの検討を行った。また、形状的特徴と質的特徴を統合的に取り扱うことができる視覚化システムについても検討を行った。コンピュータグラフィックス分野とビジュアライゼーション分野の文献の調査を行い、先行するインタフェース設計の調査、および、設計した視覚化システムの新規性の明確化を行った。オブジェクトの特徴を理解しやすいユーザインタフェースの設計を行い、具体的に開発する視覚化システムの検討を行なった。

特徴の種類は、オブジェクトの形状的特徴と質的特徴とに大別できる。そこで、まずは形状的特徴と質的特徴のそれぞれに適した視覚化システムを設計することとした。形状的特徴を考慮した視覚化システムとして、オブジェクト同士の形状的な関係を考慮したユーザインタフェースをデザインし、ユーザが探索的にオブジェクトの構造を視認できるようなシステムを設計した。質的特徴を考慮した視覚化システムとして、多変量データの次元圧縮アルゴリズムやオブジェクトの再配置アルゴリズムを用いた探索システムを設計し、具体的に使用するデータセットの検討を行った。また、形状的特徴と質的特徴を統合的に取り扱うことができる視覚化システムについても検討を行った。視覚化システムの設計と並行して、コンピュータグラフィックス分野とビジュアライゼーション分野の文献の調査を行い、先行するインタフェース設計の調査、および、設計した視覚化システムの新規性の明確化を行った。具体的なシステム開発に必要なソフトウェア開発環境の整備、要素技術の検討、基礎的な機能の実装実験を行った。オブジェクトの概観や特徴を理解しやすいように描き出す視覚化システムの実現を目指し、具体的に開発するシステムの検討を行なった。オブジェクトが有する特徴の種類は、オブジェクトの形状的特徴と質的特徴とに大別できる。本研究では、形状的特徴と質的特徴のそれぞれに適した視覚化システムを設計することとした。オブジェクトの形状的特徴に対する視覚化システムを設計するにあたり、レンダリング技術の再検討を行った。本研究は、高い視認性を有するレンダリング手法として、多視点レンダリング技術に着目している。既存の多視点レンダリング技術の調査と実装実験を行った結果、既存の技術は、レンダリング速度において、汎用性とポリゴン数とのトレードオフを有することと、カメラモデルの複雑さが増加すると、リアルタイムレンダリングが困難であることがわかった。本研究では、上記の結果を受けて、複雑なカメラモデルで高速にレンダリングを行う新しい手法を設計し、簡易的な実装実験を行った。質的特徴を考慮した視覚化システムとして、多変量データの次元圧縮アルゴリズムやオブジェクトの再配置アルゴリズムを用いた探索システムを設計し、具体的なデータセットとして、水産業データを用いたプロトタイプ制作を行った。コンピュータグラフィックス分野とビジュアライゼーション分野の文献の調査を行い、先行するレンダリング技術とインタフェース設計の調査、および、設計した視覚化システムの新規性の明確化を行った。
部分回転楕円面ミラー型光学素子による硬X線自由電子レーザーの高強度集光ビーム形成

部分回転楕円面集光ミラー型光学素子のための作製基盤技術である「高精度表面加工法」と「高精度表面形状計測法」を構築することで,従来作製できなかった1nm形状精度の高精度部分回転楕円面集光ミラーの開発に成功した.7keVのX線において85nm×125nm(半値幅)の2次元ナノ集光ビームを部分回転楕円面ミラーにより世界に先駆けて達成した.本ミラーとX線自由電子レーザーを組み合わせることで10の20乗(W/cm2)の超高フォトン密度集光ビームの形成が期待できる.部分回転楕円面ミラー型光学素子による硬X線ナノ集光の実現を本研究の目的とする.開発した部分回転楕円面集光ミラーを利用して,硬X線自由電子レーザーの高強度集光ビームの形成を行う.このため平成25年度は,部分回転楕円面ミラー光学素子の作製上の課題であった基盤技術「高精度表面加工法」と「高精度表面形状計測法」を開発した.高精度表面加工法:「回転球型加工装置」と「ノズル吐出型加工装置」の特殊研磨法に基づく2種類の高精度表面加工装置の開発を行った.両者とも加工ヘッドの滞在時間分布制御型の数値制御を行うことで,部分回転楕円面ミラーの急峻な表面形状に対応した形状修正加工(1nm(Height))を可能とした.回転球型加工装置は,弾性流体潤滑状態を利用することで,特に表面粗さの除去加工に優れており,表面粗さ2.1nm(RMS: Root-Mean-Square)の研削痕の残る表面を,0.3nm(RMS)のX線ミラーに対応可能な高品質な表面に加工可能であることを実証した.また,ノズル吐出型加工装置は,単位加工痕サイズ0.2mmを実現し,高分解能なX線ミラーの数値制御加工に適応可能であることを示した.高精度表面形状計測法:可視光位相シフト顕微干渉計を利用したスティッチング干渉法に基づく部分回転楕円面ミラー用高精度表面形状計測装置を開発し,安定化評価と共に,系統誤差補正法を開発した.本件の急峻な形状を計測する際に,計測装置固有のレンズ収差が原因で発生する系統誤差を補正することで,1計測画面内の形状データに残存する系統誤差形状を取り除き,ミラー全体形状の算出精度向上を図った.本装置を評価した結果,X線ミラーの作製上要求される測定精度の1nm(RMS)を満足し,0.8nm(RMS)の測定再現性を達成した.部分回転楕円面ミラー型光学素子による硬X線ナノ集光の実現を本研究の目的とする.開発した部分回転楕円面集光ミラーを利用して,硬X線自由電子レーザーの高強度集光ビームの形成を行う.このため,平成26年度は非常に急峻な曲率半径の部分回転楕円面形状を持つ実際のX線ミラー基板に対して,開発したX線ミラー作製基盤技術「高精度表面加工法」と「高精度表面形状計測法」を適用しX線ミラーを作製した.研削加工により作製した表面粗さ4.3nm(RMS)の基板に対して,回転球型加工装置により表面粗さ除去加工を実施した結果,0.1nm(RMS)の表面を達成し,X線ミラーに対応可能であることを確認した.ノズル吐出型加工装置による形状修正加工の高空間分解能化を実施し,単位加工痕サイズに関して従来の0.2mm(半値幅)から0.1mm(半値幅)に向上すると共に,ノズル形状等の改良により高空間分解能かつ高速,安定した数値制御形状修正加工が可能となった.一方で,高精度表面形状計測法に関して,X線ミラーの表面粗さと形状誤差の低減に伴い,X線ミラーに要求される測定精度の1nm(RMS)に対して,従来の計測再現性0.8nm(RMS)から0.5nm(RMS)まで向上した.数値制御加工前後の形状計測結果を比較することで,目的とする分布の形状修正加工がナノ精度で実施できることを確認するなど,これらの特殊加工法と計測法がX線ミラー作製に有効であることを実証した.開発したミラー姿勢調整装置・集光プロファイル評価装置と,作製した部分回転楕円面基板に白金コーティングしたミラーを用いて集光実験を実施した.結果,平成27年3月までに7keVのX線において集光サイズ:460nm×1200nm(半値幅)を達成した.本サイズはミラー加工広さと形状誤差に起因するものであり,今後,加工にフィードバックすることでナノ集光を目指す.部分回転楕円面ミラー型光学素子による硬X線ナノ集光の実現を本研究の目的とする.100nm集光のために,サジタル方向に曲率半径3mm台,傾斜角分布±70mradをもつ部分回転楕円面ミラーを設計した.平成27年度は,本研究で開発したX線ミラー作製基盤技術「高精度表面加工法」と「高精度表面形状計測法」を適用しミラーを作製した.数値制御加工装置において,ノズル流路と形状の改良により80um(半値幅)の単位加工痕を達成し,高空間分解能な形状修正加工を実現した.本ミラー作製システムを利用して,合成石英製基板上に,表面形状について計測再現性と同等の1nm(RMS)の形状精度,表面粗さは0.3nmRMSという超高精度部分回転楕円面ミラーを完成した.ミラーは表面加工後に白金をコーティングし,硬X線領域で全反射可能とした.大型放射光施設(SPring-8, BL29XUL)において集光性能を評価した結果,7keVのX線において,85nm×125nm(半値幅)の2次元集光ビームを部分回転楕円面ミラーにより世界で初めて達成した.本ミラーを用いて走査型X線顕微鏡を構築し,100nmを十分下回るLine&Space

テスト構造を観察することで2次元集光が同一焦点面内で非点収差無く実現できていることを確認した.さらに,開発した部分回転楕円面集光ミラーをX線自由電子レーザー施設で利用することで,10の20乗(W/cm2)の高フォトン密度集光ビームが期待できることが計算から示された.本研究で作製可能となった部分回転楕円面ミラーにより,X線自由電子レーザーや放射光ユーザーに高安定・高強度ナノビームが提供できるばかりでなく,本研究で確立した精密生産技術は,天体望遠鏡や短波長高出力光源等の他分野の様々な高精度2次元非球面形状を要する光学素子の開発に応用が可能である.部分回転楕円面集光ミラー型光学素子のための作製基盤技術である「高精度表面加工法」と「高精度表面形状計測法」を構築することで,従来作製できなかった1nm形状精度の高精度部分回転楕円面集光ミラーの開発に成功した.7keVのX線において85nm×125nm(半値幅)の2次元ナノ集光ビームを部分回転楕円面ミラーにより世界に先駆けて達成した.本ミラーとX線自由電子レーザーを組み合わせることで10の20乗(W/cm2)の超高フォトン密度集光ビームの形成が期待できる.部分回転楕円面ミラー光学素子のために開発した基盤技術「高精度表面加工法」と「高精度表面形状計測法」に関して,平成26年度は当初の計画通りこれらの技術を実際のX線ミラー基板に対して適用し,ミラー作製を実施した.平成26年度は,さらにノズル吐出型加工装置の高空間分解能化と加工レート向上を実施した.結果,ナノ集光X線ミラーに要求される形状精度1nm(RMS),表面粗さ0.3nm(RMS)を満足する次の作製精度:形状計測再現性0.5nm(RMS),加工精度に関して水平空間分解能0.1mm,高さ分解能1nm以下,表面粗さ0.1nm(RMS)を実現した.さらに,SPring-8において集光実験を実施し,基礎的な集光特性評価に至った.以上の様に本研究はおおむね順調に進展している.研究費の繰越金額は本年度研究費の全体に対して1%であり,予算執行計画通り研究が進捗している.27年度が最終年度であるため、記入しない。X線光学本研究で開発・高度化した高精度加工法と高精度表面形状計測法から成るX線ミラー作製プロセスを利用し,部分回転楕円面ミラーを完成し,硬X線によるナノ集光を実現する.作製目標の部分回転楕円面ミラーは,数mmの非常に小さな曲率半径を持つなど,従来の高周波加工装置では水平空間分解能が不足していた.この問題に対応するため,平成26年度は数値制御加工装置の高空間分解能化を行った.平成27年度は,本装置を利用しミラー表面に残る形状誤差の数値制御形状修正加工を継続して実施する.高精度加工法と高精度表面形状計測法から成るナノ集光X線ミラー作製プロセスを実際のX線ミラーの加工に適用した結果,表面粗さを良好に保ちつつ,安定して形状修正加工が実施できることを昨年度確認済みである.加工と形状計測を何度か繰り返すことで,ナノ集光に必要となる表面形状精度1nm(RMS)まで,基板の形状誤差の修正加工を実施する.
小腸蠕動運動のNOおよびその関連物質による調節

腸の運動を調節する主要な反射の一つである蠕動反射は腸の刺激部位の口側での運動促進(上行性収縮)と肛門側での運動抑制(下行性弛緩)の2つの反射によって構成されている。この反射は蠕動運動を誘起し,内容物を口側から肛門側へ輸送する役割を担っている。最近我々はイヌの生体内実験において,セロトニン受容体のサブタイプのうち5-HT3受容体が蠕動反射に重要な役割を果たしていることを見つけた。この5-HT3受容体を介する蠕動反射に対して,一酸化窒素(NO)の関与を調べた。実験は麻酔下のイヌで行い,外来神経の支配を除去した約10cmの空腸を切断分離した。分離腸管の血流を口側部と肛門側部に分け,両部位に別々に薬物を投与した。口側部と肛門側部の収縮運動はそれぞれの内腔に置いたゴム球により,内腔の圧変化として記録した。粘膜を擦過する実験では口側あるいは肛門側部を縦切開してその粘膜面を露出して行った。5-HT3受容体の選択的刺激薬である2-メチル-セロトニン,5-HT4受容体の刺激薬である5-メトキシトリプタミン,アセチルコリン,および粘膜の機械的刺激によって誘起した各上行性収縮反応は,いずれもNO合成阻害剤であるニトロアルギニン(L-NNA)の肛門側あるいは口側部の処理によって増強した。これらの増強効果はL-アルギニンによって遮断されたが,D-アルギニンによって遮断されなかった。また,2-メチル-セロトニンおよび粘膜の機械的刺激によって誘起した下行性弛緩反応は,肛門側部のニトロアルギニンの処理によって抑制され,この抑制効果はL-アルギニンによって拮抗された。ニトロアルギニンの処理は自発性収縮に対しては無効果であった。これらの結果から,NOは蠕動反射を誘発する刺激によって壁内神経から放出され,下行性弛緩反応を誘発する反射経路の最終ニューロンの伝達物質として働いていること,上行性収縮反応を誘発する反射経路のコリン性伝達を部分的に抑制して,その大きさを調節していることが明らかになった。腸の蠕動反射機構を明らかにする目的で実験を行った。ウレタンとクロラロースで麻酔したイヌの生体内空腸を用いた。外反射の影響を除去する目的で,全外来神経(迷走神経と内蔵神経)を切断して行った。長さ約10cmの空腸を切断分離し,その分離腸管の口側部と肛門側部の運動をそれぞれの腸内腔に入れたバルーンによって記録した。分離腸管の血流を口側部と肛門側部に分け,各部位に分布する動脈の分枝よりカニューレを介して,薬物を各部位に別々に投与した。セロトニン受容体サブタイプの1つである5-HT3受容体刺激薬(2-methyl-5-HT)を肛門側部へ投与すると,肛門側部とともに,非投与部位である口側部にも収縮(上行性収縮)が誘発された。この上行性収縮は,肛門側部のニフェジピンの前処理によって肛門側部の収縮を抑えても起こった。

一方,もう1つのセロトニン受容体サブタイプである5-HT4受容体刺激薬(5-methoxytryptamine)も同様に上行性収縮を起こしたが,この上行性収縮は肛門側部のニフェジピン,あるいは5-HT3受容体拮抗薬の前処理によって抑制された。これらの結果は蠕動反射の上行性収縮に5-TH3受容体が関与していることを示唆し,5-HT3刺激薬は壁内神経中の5-HT3受容体を直接刺激し、5-HT4刺激薬は肛門側部の収縮を介して,上行性収縮を起こすことが明らかとなった。これらの両上行性収縮反応に対して,一酸化窒素(NO)の関与を検討した。NO合成阻害剤(LNNA)の肛門側処理によって,両上行収縮反応は増強され,この増強作用はL-arginineによって阻害され,D-argininによって阻害されなかった。したがって,NOおよびNO関連物質が,蠕動反射の上行性収縮反応を緊張性に抑制していることが明らかとなった。腸の蠕動反射機構を明らかにする目的で実験を行った。ウレタンとクロラロースで麻酔したイヌの生体内空腸を用いた。外反射の影響を除去するため外来神経は切断された。長さ約10cmの空腸を切断分離し,その分離腸管の口側部と肛門側部の運動をそれぞれの腸内腔に入れたバルーンによって記録した。分離腸管の血流を口側部と肛門側部に分け,各部位に分布する動脈の分枝よりカニューレを介して,薬物を各部位に別々に投与した。粘膜を擦過する実験では口側あるいは肛門側部を縦切開してその粘膜面を露出して行った。アセチルコリンを肛門側に投与すると,投与部位の収縮と同時に,口側部に上行性収縮が誘発された。この上行性収縮はセロトニン受容体のサブタイプである5-HT_3受容体遮断薬の肛門側処理で抑制されたが,5-HT_4遮断薬では影響を受けなかった。肛門側部の収縮をニフェジピンによって抑えておくと,上行性収縮は消失した。したがって,アセチルコリンによる上行性収縮は投与部位の収縮によって誘起され,5-HT_3受容体を介して起こると考えられる。一方,粘膜の擦過による上行性収縮は5-HT_3受容体を介して起こると考えられる。一方,粘膜の擦過による上行性収縮は5-HT_3受容体を介して起こる(Neya et al., 1993)。上述の両上行性収縮反応は,NO合成阻害剤(L-NNA)の肛門側あるいは口側部の処理によって増強した。この増強効果はL-arginineによって阻害されたが,D-arginineによって阻害されなかった。粘膜の機械的刺激による下行性弛緩反応は肛門側部のL-NNA処理によって抑えられた。自発性収縮に対しては無効果であった。これらの結果から,NOは蠕動反射を誘発する刺激によって壁内ニューロンから放出され,下行性弛緩反応を誘発する反射経路の最終ニューロンであるNANC神経の伝達物質として働いていること,上行性収縮反応を誘発する反射経路のコリン性伝達を部分的に抑制して上行性収縮反応の大きさを調節していることが明らかとなった。
自己組織型ナノ凹凸基板上の超高密度熱アシスト記録用複合媒体

FePt孤立微粒子媒体につき、近接場光アシスト記録過程のモデル計算を行い単一微粒子の磁化反転条件を明らかにした。また、2種のナノ構造基板上へ、高速昇温加熱法によりFePt、FeCuPt微粒子を形成した。自己組織化法により作成した配列周期14nmの表面ナノ凹部を有する基板、ディップコートにより粒径18nmのナノシリカ球を単層相当塗布した基板である。いずれも、磁性微粒子の平均径の減少、面内粒子数密度の増大に寄与した。記録密度1平方インチ当り2テラビット(2Tb/in^2)以上の超高密度磁気・光・ハイブリッド記録媒体のための交換結合型孤立粒・連続膜の複合媒体技術、BPM用高Ku孤立微粒子およびその高充填率・規則配列化のための自己集積型凹凸下地基板の実現により超高密度磁気記録媒体実現を目的とする。本年度は、本研究計画の中核をなす、2種のナノスケール凹凸構造を有する下地基板の作製プロセス、磁性微粒子数密度の増大効果検証につき以下の進展が得られた。1:ナノ凹部を有する下地基板の作成高分子の自己組織化現象により生じる球状ミセルを利用し、自己集積作用により形成した多孔質SiO_2表面をArエッチングすることにより、周期約14nmの凹部を有する基板(NDA)を作成した。平均凹部密度は、3.7T dents/inch^2である。2:ナノ凸部を有する下地基板の作成上記NDAと凹凸が双対な基板として、ディッピング法により溶液中に分散したナノシリカ粒子を熱酸化Si基板上へ自己集積したシリカ粒子層(SASP)を表面に有するテンプレート基板作成プロセスの検討、作成を行った。平均粒径18nmのナノシリカ球を12粒子層厚で形成可能なプロセスを明らかにした。このとき、ナノ粒子の平均面粒子密度は2.2T particles/inch^2である。3:ナノ凹凸下地基板利用による磁性微粒子形成密度の増大上記ナノ表面構造を有する下地基板を用いる事による磁性微粒子形成密度の増大効果につき検証を行った。SASP上へFe/Pt多層膜製膜、その後急速昇温結晶化法を用いることで作製したFePtナノ磁性微粒子形状は、平坦な熱酸化Si基板上へ作製した場合に比べ、平均粒子直径は29.6nmから14.8nmへ減少し、粒子数密度は0.16から0.74T particles/inch^2へと著しく増加する事を確認した。本年度は、本研究計画の中核をなす、シミュレーション手法による記録条件の探索、ナノテンプレート利用磁性微粒子の形成、につき以下の進展が得られた。(1)レーザ照射下でのハイブリッド動的記録過程のLLGシミュレーション記録媒体として、六方格子状に規則配列したL1_0-FePt孤立ナノ微粒子(直径15nm)からなるものとし、熱アシスト磁気記録の方式として一様磁界中で急峻な熱勾配を利用し記録を行うものとし,近接場光による局所過熱による磁性微粒子の磁化反転の可否について検討した.1ns間のレーザー光照射により注目粒子の温度が770K(キュリー温度)に達した後、冷却とともに反転磁化が時定数260ps程度で形成し得る事が分かった。記録過程を総合的に取り扱うため、1.FDTD法により近接場光による媒体内部の光エネルギー密度分布を計算,2.熱伝導解析による温度分布を求め、3.その温度分布の時間依存性を用いたマイクロマグネティックシミュレーション、を統合した手法を開発した。(2)凹凸基板上でのFePt孤立粒子の結晶解析前年度作成プロセスを検討した自己集積したシリカ粒子層(SASP)を表面に有するテンプレート基板上へ、実際にFe/Pt多層膜を製膜、その後急速昇温結晶化法を用いることで(001)優先配向したL1_0-FePt完全孤立ナノ磁性微粒子を作製した。また、最少の直径5.1nmの微粒子についても、電子線回折パターン観察より(001)優先配向したものが存在することを確認した。本年度の主要な成果を以下に示す。(1)ナノスケール凹凸を有する自己配列基板の改良ナノ凹凸構造の高強度化、均質化、表面残留物除去を図り、前年度検討した平均直径18nmの自己集積シリカ粒子層(SASP)をマスクパターンとし、エッチング(ICP-RIE)処理による熱酸化Si基板へのナノスケール転写構造形成につき作成を行い、作成が可能であることを確認した。

(2)急速昇温結晶化(RTA)法によるFePtCu磁性孤立粒子の形成過程解明と結晶構造解析本年度新たにRTA直後の急冷プロセスを導入しRTA後の残留熱効果による結晶粒同士の結合を抑制することで、孤立微結晶粒形成過程の構造と熱処理条件との相関につき検討した。Fe/Cu/Pt三層膜を出発構造とし、種々の最高到達温度Tm、昇温速度Trにおける微粒子形成および析を実施した結果、Tr=150°C/s、Tm=460°C付近において、孤立微粒子が得られ、XRDプロファイルより主にLlo規則合金相に相当する(001)超格子ピークが見られるが、(002)ピーク周辺部に不規則相によると思われる分布が出現した。詳細構造検討として単一微粒子に対する面内TEM観察及び電子線回折より、微粒子の核となる大部分は規則相となり、周辺部に不規則相が出現している事が明らかとなった。以上より、約3sの急速熱処理及び時定数4.4sの冷却プロセスで、Llo規則相を主成分としたFeCuPt微粒子を形成した。
口腔癌をターゲットとする腫瘍溶解アデノウイルスと抗癌剤の併用療法の開発

本研究の目的は、腫瘍溶解アデノウイルス(AdΔE4)が、シスプラチン(CDDP)に抵抗性を示す口腔がんに奏功し、AdΔE4とCDDPとの併用療法が成り立つかを検討することである。申請者はCDDP耐性細胞に対するAdΔE4の腫瘍殺傷効果が正常細胞と比較して高いことを示し、CDDPとAdΔE4の併用により腫瘍殺傷効果が増強されることを示した。また、CDDPとAdΔE4の併用による腫瘍殺傷効果の増強のメカニズムについて検討し、がん細胞にCDDPを投与すると、HuR/ARE-mRNA複合体が核外輸送されてARE-mRNAが安定化し、AdΔE4の生産効率が増加することで腫瘍溶解効果が高まることを示した。本研究の目的は、我々がこれまで研究を続けてきた腫瘍溶解アデノウイルスが、シスプラチン(CDDP)に抵抗性を示す口腔がんに奏功し、併用療法として成り立つかを検討することである。CDDPは口腔がんの治療に広く用いられている抗癌剤の一つだが、CDDPに対して抵抗性を示す腫瘍があり問題となっている。これまで申請者らは、アデノウイルス(Ad)の増殖には細胞内のAU-rich element (ARE) -mRNAの安定化が必須であり、それにはAd初期遺伝子E4領域が重要であることを明らかにしてきた。多くの癌細胞では恒常的にARE-mRNAが安定化することが知られており、E4領域を欠失したアデノウイルス(AdΔE4)でも、癌細胞では増殖できると考えられ、我々はこのウイルスの腫瘍溶解効果について研究を行ってきた。本研究では、AdΔE4とCDDPとの併用療法について検討を行った。申請者らは、口腔がん細胞株SASからシングルセルクローニング法によって、数種の細胞株を樹立した。それらの細胞株はそれぞれCDDPによる感受性が異なることが明らかとなり、感受性が低いものを耐性株、感受性が高いものを感受性株とした。これらの細胞に対するAdΔE4の腫瘍殺傷効果をXTT assayで検討した。その結果、耐性株と感受性株でAdΔE4の腫瘍殺傷効果にほとんど差がないことが示された。SAS耐性株、感受性株で、CDDPとAdΔE4の併用による腫瘍殺傷効果をXTT assayで検討した。その結果、CDDPとAdΔE4の併用によりそれぞれの単独使用よりも腫瘍殺傷効果が増強されることが示された。これらの結果より、CDDPとAdΔE4の併用によりCDDPの投与量を減少することができ、CDDPの副作用を低減させる可能性が示唆された。本研究の目的は、我々がこれまで研究を続けてきた腫瘍溶解アデノウイルスAdΔE4が、CDDPに抵抗性を示す口腔がんに奏功し、併用療法として成り立つかを検討することである。申請者らが樹立したCDDP耐性株、感受性株でAdΔE4の腫瘍殺傷効果にほとんど差がないことが示され、CDDP耐性株に対してもAdΔE4は腫瘍殺傷効果を持つことが示された。また、CDDPとAdΔE4の併用によりそれぞれの単独投与よりも腫瘍殺傷効果が増強されることが示された。以上の結果より、CDDP耐性腫瘍でもAdΔE4は効果があることが示され、またCDDPとAdΔE4の併用によりCDDPの投与量を減少することができ、CDDPの副作用を低減させる可能性が示唆された。以上から本研究はおおむね計画通りに進行しているといえる。本研究の目的は、我々がこれまで研究を続けてきた腫瘍溶解アデノウイルス(AdΔE4)が、シスプラチン(CDDP)に抵抗性を示す口腔がんに奏功し、AdΔE4とCDDPとの併用療法が成り立つかを検討することである。昨年度は口腔がん細胞株からCDDP耐性株、感受性株を樹立し、これらの細胞に対するAdΔE4の腫瘍殺傷効果が正常細胞と比較して高いことを示した。また、CDDPとAdΔE4の併用による腫瘍殺傷効果の検討の結果、それぞれの単独使用よりも併用により腫瘍殺傷効果が増強されることが示された。今年度はCDDPとAdΔE4の併用による腫瘍殺傷効果のメカニズムについて検討した。これまで申請者らは、Adの増殖には細胞内のAU-rich element (ARE) -mRNAの安定化が必須であることを示している。また、RNA結合タンパクHuRはARE-mRNAと結合し、ARE-mRNAの核外輸送、安定化に関与することが知られており、HuRがより多く核外輸送されている細胞でAdが増殖し、細胞溶解効果が増強されることが考えられる。そこで申請者はCDDPで処理したがん細胞を細胞質分画と核分画に分けて、western blotting法によりCDDP処理によるHuRの局在の変化を検討した。その結果、CDDP処理したがん細胞でHuRの細胞質における局在が増加し、CDDP処理によりHuRが核外輸送されることが示された。このことからがん細胞にCDDPを投与すると、HuR/ARE-mRNA複合体が核外輸送されてARE-mRNAが安定化し、AdΔE4の生産効率が増加することで腫瘍溶解効果が高まることが示唆された。本研究の目的は、我々がこれまで研究を続けてきた腫瘍溶解アデノウイルスAdΔE4が、CDDPに抵抗性を示す口腔がんに奏功し、CDDPとの併用療法として成り立つかを検討することである。

これまでにCDDP耐性腫瘍でもAdΔE4は効果があることが示され、またCDDPとAdΔE4の併用によりCDDPの投与量を減少することができ、CDDPの副作用を低減させる可能性が示唆された。次に、CDDPとAdΔE4の併用による腫瘍殺傷効果のメカニズムについて検討し、CDDP投与によるRNA結合タンパクHuRの核外輸送とAdΔE4の腫瘍溶解効果に関連があることを示した。実際に口腔がんの治療に用いられているCDDP投与により、腫瘍溶解ウイルスAdΔE4の効果を増強できるということを示したことで、CDDPとAdΔE4の併用治療の臨床への応用の可能性が期待される。以上から本研究はおおむね計画通りに進行しているといえる。本研究の目的は、腫瘍溶解アデノウイルス(AdΔE4)が、シスプラチン(CDDP)に抵抗性を示す口腔がんに奏功し、AdΔE4とCDDPとの併用療法が成り立つかを検討することである。申請者はCDDP耐性細胞に対するAdΔE4の腫瘍殺傷効果が正常細胞と比較して高いことを示し、CDDPとAdΔE4の併用により腫瘍殺傷効果が増強されることを示した。また、CDDPとAdΔE4の併用による腫瘍殺傷効果の増強のメカニズムについて検討し、がん細胞にCDDPを投与すると、HuR/ARE-mRNA複合体が核外輸送されてARE-mRNAが安定化し、AdΔE4の生産効率が増加することで腫瘍溶解効果が高まることを示した。今後はマウスに移植した腫瘍においても、CDDPとAdΔE4の併用療法は効果的かどうか検討する。ヌードマウスに移植したCDDP耐性細胞株に対するAdΔE4の腫瘍溶解効果をin vivoで検証し、また実際にウイルスが腫瘍で増殖しているか免疫組織学的に検討する。次にAdE4タンパクによるProcessing bodies (PB)の形態的変化について、分子生物学的に解明する。AdE4タンパクがARE-mRNAを安定化するメカニズムは明らかではない。そのひとつとして、我々はPBに注目している。真核細胞が種々のストレスに暴露された時、細胞質内にmRNP granulesが形成され、そのうちARE-mRNAを含むmRNAを分解する場となるのがPBである。これまでに、申請者らはE4によりPBに形態変化および不活化が起き、ARE-mRNAの分解機構に影響を与えることを明らかにしてきたが、詳細な分子メカニズムは未だに不明であり、この解明もAdΔE4を用いる上で非常に重要である。申請者が既に入手している、PBの形態変化を起こさないE4のmutantの発現ベクターを用いて、PBの形態変化にどのPB構成タンパクが関与しているか検討し、そのタンパクの強制発現やknock downによりARE-mRNAの安定化に影響が生じるかどうか検討する。また、耐性細胞株と感受性細胞株において、PBの形態変化とARE-mRNAの安定化を確認し、PBの形態変化がCDDP耐性と関連があるかどうか検討する。もし関連があればこれまでに報告がない全く新しい知見である。まずヌードマウスに移植したCDDP耐性細胞株に対するCDDPとAdΔE4との併用治療の効果をin vivoで検証する。具体的にはヌードマウスの皮下に耐性細胞を移植することで形成された腫瘍に対して、CDDPを尾静脈から投与し、その後AdΔE4を腫瘍に直接投与し、腫瘍の大きさを測定し、CDDPとAdΔE4との併用治療の効果を検討する。
インヒビター保有血友病A患者の新たな止血治療戦略における凝血学的基礎研究

血友病Aは血液凝固第VIII因子(FVIII)の欠乏で生じる重篤な出血性疾患である。FVIII補充治療に伴う抗FVIII同種抗体(インヒビター)の出現は、治療を難渋化し、今日の血友病医療における重要課題である。そこで本研究では、インヒビター保有血友病A患者の治療モデルをin vitroで構築し、その凝固抑制機序の解明とそれに基づく新たな治療戦略の開発検討を行った。その結果、インヒビターの抑制機序の差により抗体中和療法の効果が異なること、インヒビター存在下でもFVIIIがバイパス製剤による治療下で止血増強効果を発揮することを凝血学的に証明し、より効果的な治療法を見出した。インヒビターを保有する血友病患者において、より凝血学的機能を向上させる治療方法の開発を目的として、本年度は、研究計画に従い、インヒビター存在下での血液凝固第VIII因子(FVIII)の活性化に関与する凝固メカニズムの解明と、FVIIIと他の凝固因子との相互作用について機能解析を進めた。研究の結果、FVIIIの変異体であるArg1781Hisは、野生型FVIIIと比較して第X因子との親和性が高いことが判明した。この結果はFVIIIの凝血学的特性に新たな知見をもたらすものである。また、インヒビター患者に対する既存の治療製剤であるAPCC製剤は、インヒビターが存在してもFVIIIを活性化することができるということ、さらに現行の治療量よりも極少量のAPCC製剤であってもFVIII活性化を起こしうることを凝血学的及び免疫学的手法を用いて証明した。一方、構築したFVIII製剤中和療法モデルによる検討により、中和療法の治療効果がインヒビターの特性(抗原認識領域や阻害カイネティクスの違い)によって異なることを証明した。これらの研究成果は、国内外の学会及び原著論文にて発表を行った。加えて、本年度は、軽症血友病Aに発生したインヒビターを患者血漿より抽出し、そのインヒビターの特性及び抑制機序について解明し、さらに患者のFVIII遺伝子変異を有するFVIIImutantを発現し、その機能解析を行った。患者のFVIIIは遺伝子変異の存在する部位とは異なる部位の立体構造が変化していることが凝血学的及び免疫学的手法により示唆され、結果としてリン脂質とVWFとの結合能力が低下するとともに免疫原性の変化をもたらす可能性があることが分かった。1.インヒビター(inh)保有血友病A(HA)患者治療に重要なAPCC製剤は、組織因子の存在下で、凝固反応極初期相に第VIII因子(FVIII)を直接活性化することを明らかにした。またこの反応は極少量のAPCCでも起き、inhはその活性化機序を抑制せず、新規止血治療戦略への応用性を示唆した。2.APCC製剤によるFVIII活性化はリン脂質(PL)依存的で、APCCに含有する成分のうち、寄与する重要な凝固因子はFVIIaとFXであることを証明した。3.ROTEM及び血流下flow chambersystemを用い全血中でinh存在下でのAPCC製剤によるFVIII凝固促進作用を一部明らかにした。4.FVIIIをinh(5-10BU/ml)添加FVIII欠乏血漿及び全血に混和してFVIII製剤中和療法モデルを構築し、包括的凝固機能検査(TGT,CWA)を用いその凝血学的中和特性を検討した。結果、抗体認識部位及び反応kineticsの差により中和特性が異なり、A2type1抗体の方がC2type1抗体よりも中和効果が持続し、C2type2抗体では中和効果はほとんど抑制されないことを証明し報告した。5.新規FVIII変異P1809Lを有する軽症HA患者に発生したinhは、自己FVIIIを抑制せず非自己FVIIIに対して軽鎖C2ドメイン上のアミノ酸残基を認識してtype2抑制様式を示すことを明らかにした。またその抑制機序がFIIa及びFXaによるFVIII活性化阻害であることを証明した。医歯薬,内科系臨床医学,小児科学,血液血栓止血学APCC製剤によるFVIII活性化・不活化におけるインヒビターの影響、FVIII製剤による中和療法におけるインヒビターの種類による影響について凝血学的手法及び免疫学的手法を用いて証明し、学会及び論文発表を行うことができた。血友病患者におけるFVIIIの機能、インヒビター出現との関連についても、蛋白発現実験及び凝血学的手法により検討を行うことができた。本年度得られた基礎的研究成果に基づいて、全血を用いた検討や血流存在下での検討などより生理的条件下での研究を引き続き進行し、学会発表及び論文発表を行う方針である。また、FVIIIの機能解析について得られた知見を論文化する予定である。本年度は、予定通り研究実験を遂行した結果、試薬の節約等の努力により当初の使用額よりも少額の支出となった。次年度は、より発現実験等で支出が増えることが予想される。
尿細管上皮細胞を用いたハイブリッド人工尿細管の作成とその機能評価

現行の間欠的血液透析の限界を克服し、多くの合併症の発症を未然に防止するために、(1)持続濾過に(2)尿細管機能を付加する治療法を目指した。既に1日10リットル(L)の持続濾過により、現行の血液透析や透析濾過よりも著しく血清尿素(UN)、クレアチニン(Cr)、β_2-microglobulinが低値に維持されることを確認しており、7ml/minの濾液を得て、3ml/minを廃棄し4ml/minを再生し体内に戻す人工尿細管開発のため、尿細管上皮細胞種、人工膜素材、マトリックス、成長因子、細胞播種法などの条件を検討した。そして、PVPを含有しないPolysulfone膜中空糸内面をcollagen 1でcoatingし、ブタの近位尿細管上皮細胞(LLC-PK_1)を10^8個/mlで90度毎に4回播種し、約48時間培養し(中空糸内側,外側両側に培養液を潅流させる)、膜面積に関らず中空糸内面にコンフルエントな単層を形成できることが判明した。そして、循環実験として、UN 50mg/dl、Cr 5.0mg/dlを含有させたメディウムをLLC-PK_1細胞生着中空糸内腔を潅流させ、外側へのH_2O, Na^+,グルコースの能動輸送量、UN, Crのリーク率を10日間にわたり計測した。膜面積1m^2の中空糸モジュール内面にLLC-PK_1細胞を生着させ人工尿細管で24時間に対側に輸送できるH_2O、Na^+、グルコースは、1日6Lを移送する目標の夫々67%、93%、70%であった。この実験では、対側溶液中にアルブミン(Alb)2.5g/dlが添加されたが、静水圧は加えられていない。H_2Oを目標量だけ輸送するには、膜面積1.6m^2が必要となる。LLC-PK_1細胞にratのaquaporin1遺伝子を導入して、対側にAlb3.5mMolを加えてH_2Oの移送を測定すると、遺伝子非導入LLC-PK_1細胞のそれに比し、約2倍の移送能を示した。イヌを用いた体外循環実験を、膜面積0.2m^2の持続血液濾過器により2.6ml/mmの濾液を得て、0.4m^2の人工尿細管内腔を24時間潅流し、中空糸外側に血液濾過器を経た血液を潅流することにより1.5ml/minの濾液を再生し静脈に戻すことが出来た。今後、ヒト尿細管細胞を用いる検討に移れば、臨床応用も十分視野に入る直径300μの中空糸10本(膜面積10cm^2)を包含するミニモジュールにブタの近位尿細管上皮細胞であるLLC-PK_1細胞をコンフルエントに生着させ、内腔に腎不全血漿濾過液を通し、対側のアルブミン含有メディウム(膠質浸透圧100mOsm相当)側への再生濾液の移行にともなう対側の溶質濃度を測定した。細胞を生着させないモジュールと生着モジュールの対側尿素窒素濃度は41.0±0.2と22.5±3.4、creatinine 4.6±0.2と2.4±0.5mg/dl、Na 161±0.3と161±2.9、K6.2±0.1と6.1±0.2mEq/lであった。窒素化合物の対側への一定量の移行も認められ、濾液再生上よりtightな細胞生着の検討が望まれる。カニクイザルの近位尿細管細胞であるJTC-12細胞は接着後剥離し易いことから、ポリスルフォン膜中空糸フィルタ(膜面積10cm^2)内表面へのLLC-PK_1細胞生着を細胞外マトリックス毎に評価したところ、コラーゲンIが最も接着率を向上させることが判明したので、それを用い膜面積0.9m^2の同一素材フィルタ内面へのコンフルエントな生着を試みた。生着率は約70%と十分とは言えず、引き続きマトリックスを人工膜に化学的に付けることや、使用尿細管上皮細胞の種類とprogenitor cells使用の検討が必要と考えられ、引き続き検討を行なう。そして、循環実験として、UN 50mg/dl、Cr 5.0mg/dlを含有させたメディウムをLLC-PK_1細胞生着

中空糸内腔を潅流させ、外側へのH_2O, Na^+,グルコースの能動輸送量、UN, Crのリーク率を10日間にわたり計測した。膜面積1m^2の中空糸モジュール内面にLLC-PK_1細胞を生着させ人工尿細管で24時間に対側に輸送できるH_2O、Na^+、グルコースは、1日6Lを移送する目標の夫々67%、93%、70%であった。この実験では、対側溶液中にアルブミン(Alb)2.5g/dlが添加されたが、静水圧は加えられていない。H_2Oを目標量だけ輸送するには、膜面積1.6m^2が必要となる。LLC-PK_1細胞にratのaquaporin1遺伝子を導入して、対側にAlb3.5mMolを加えてH_2Oの移送を測定すると、遺伝子非導入LLC-PK_1細胞のそれに比し、約2倍の移送能を示した。イヌを用いた体外循環実験を、膜面積0.2m^2の持続血液濾過器により2.6ml/mmの濾液を得て、0.4m^2の人工尿細管内腔を24時間潅流し、中空糸外側に血液濾過器を経た血液を潅流することにより1.5ml/minの濾液を再生し静脈に戻すことが出来た。今後、ヒト尿細管細胞を用いる検討に移れば、臨床応用も十分視野に入るrat aquaporin 1 cDNA from plasmid pSP64,CHIP28k導入LLC-PK_1細胞の導入遺伝子のmRNA発現を検索したところ、population doublinglevel 24まで発現は低下せず、人工尿細管作成に適すると考えられた。人工膜上のAquaporin 1導入LLC-PK_1細胞層の水移動能をブドウ糖並びにアルブミン添加による100mOSMの浸透圧下で検索したところ、非導入LLC-PK_1細胞層のそれの約2倍であった。ブドウ糖は対側へ移行することより、アルブミンに比し水移動能が低く、アルブミンにより浸透圧を加えることが好ましいと判断された。また、人工膜上に接着、増殖する尿細管上皮細胞の機能評価のために、LLC-PK_1細胞を再生セルロース(RC)、セルロース酢酸(CA)、そしてポリスルフォン(PS)膜上に播種、培養しコンフルエントになる前に剥離し、Na^+、グルコース・コトランスポーターのmRNAの発現をRT-PCRにより検索したところ、RC、PSに比しCA膜上のLLC-PK_1細胞における発現が強く、これはコラーゲン1など細胞外マトリックスCoatingの有無に関係なかった。この検索は人工膜上の尿細管細胞機能を評価するのに有効な方法と考えられた。PS製中空糸モジュール(膜面積:70cm^2)にPorcineの尿細管上皮細胞LLC-PK_1細胞をコンフルエントに生着させ、内側メディウム中に尿素,クレアチニン,尿酸を添加して静水圧を加えずに透過性実験を行ったところ、対側への尿素などの移行は10%内に止まり、そのコンフルエンシーが確認された。膜面積0.4m^2のPS製モジュール中空糸内面にLLC-PK_1細胞を生着させ同様の透過性実験を行ったところ、15-20%の尿素の移行が認められており、約80%の人工膜表面が細胞で覆われていると判断された。ブタの近位尿細管上皮(LLC-PK_1)細胞を用いた播種の改良試験で、1^8個/mlの細胞密度で中空糸モジュールを90度毎に回転させて4回播種することにより、コンフルエントな単層を形成させるのに2週間の培養が必要であったものが、中空糸膜面積の大きさに関らず、約48時間の培養でコンフルエンシーが得られるようになった。膜面積0.4m^2のモジュールの中空糸内面にLLC-PK_1細胞をコンフルエントな単層を形成させたバイオ人工尿細管を用い、尿素窒素(UN)50mg/dl、クレアチニン(Cr)5.0mg/dlを含有したメディウムを中空糸内腔を潅流させ、それらを含有せず、アルブミンを2.5g/dl含有したメディウムを中空糸内側に潅流させた循環実験を10日間行ない、H_2O、Na^+、グルコースの能動輸送量と、UN、Crのリーク率を計測した。