hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
COガスを用いたSi表面炭化における平衡反応のメカニズム解明

申請者は,Si基板上の窒化物半導体成長用バッファ層として,表面炭化という簡便な手法で形成したSiC薄膜を提案している.しかし,熱力学データベースから作成した相安定図による予測と実験結果が一致せず,炭化反応の精密な制御が困難であった.そこで本研究では,反応炉内ガス分圧の時間変化と到達値を詳細に測定し,炉内で生じている反応を正確に把握するとともに平衡定数と反応速度定数を定量的に求める.これにより,炭化メカニズムを包括的に明らかにし,高品質SiC薄膜を得ることを最終目標としている.平成29年度よりガス分圧測定および炭化実験のために設置した小型反応装置の加熱部・測温部の不具合・故障が相次いでおり,平成30年度も引き続き,ヒータおよび制御電気系の改造や,熱電対による測温方法の改良,外部への放熱抑制の検討,などを行った.実際のSi表面炭化温度まで昇温することは困難であると結論付け,比較的低温領域での炉内ガス分析のみの利用にとどめることとした.赤外吸収分光装置との配管接続を行い,分析実験環境を整備した.一方,Si表面炭化実験は学外の研究協力研究室に設置の装置を利用して行った.さまざまな面方位・オフ角をもつSi基板を,複数の条件で炭化した.得られたSiC/Si基板上にGaNを成長した.ここで,SiCに対するGaNの濡れ性が低いことが知られており,濡れ性の向上にAl原料先行供給が有効である.Al原料分圧・供給時間を変化させたところ,表面平坦なSiC/Si基板上に最適なAl先行供給条件を用いて表面平坦かつ単一配向の連続GaN膜を得ることに成功した.1)ガス分圧測定用の検量線の作成:炉内のガス分圧(すなわち濃度)の定量評価のために,濃度の分かっているガスを複数種類用意し,吸収ピークの大きさと濃度の関係を表す検量線を作成する.2)ガス分圧の時間変化・平衡値の温度依存性:粉末とガスを導入した反応炉を速やかに設定温度に到達させ,内部が平衡状態に達するまで保持する.その間,反応炉内のガスを取り出し,CO以外にどのようなガス種が存在するかを調べ,1)で作成した検量線をもとに分圧の時間変化と平衡値を求める.これをさまざまな温度で行い,温度依存性を系統的に調べる.なお,測定のために反応炉から取り出すガス量と測定時間を考慮すると,一度の加熱実験で測定できる回数が多くないことから,本研究では先に長時間領域測定を行い平衡分圧を求める.一方,反応は一般に時間に対して指数関数的に進行するため,ガス分圧変化が大きい加熱初期段階に着目して時間依存性を測定し,両者を組み合わせて統一的な時間変化を見る.これらの測定で求めたガス種や分圧変化から,系内で生じている平衡反応を決定する.3)炭化メカニズムの考察:2)で決定した平衡反応のすべてについて,実測した平衡分圧をもとに平衡定数を算出する.これを熱力学データベースの値と比較することで,データベースの値の妥当性を検討する.また,ガス分圧の時間変化から反応速度定数を求める.これらのデータをもとに,SiC-SiO2-CO系平衡反応の炭化メカニズムを考察し,統一的な理解を得る.さらに,Si基板炭化に適切な実験条件を推定する.4) Si基板の炭化:3)で推定した実験条件をもとに,高品質SiC薄膜を形成する炭化プロセス条件を調べる.得られたSiC薄膜の膜厚や平坦性・構造および結晶性などは,各種顕微鏡やX線回折等を用いて評価する.1)ガス分圧の時間変化
循環調節因子アドレノメデュリンの病態における意義と治療薬、診断薬としての臨床応用

1.高血圧性腎障害ラットモデルや悪性高血圧ラットモデルにおいて、アドレノメデュリン(以下AM)の長期投与は腎保護効果を有することを示した。その推定される機序も示した。2.心嚢液中のAMは安定狭心症に比べて、急性冠症候群で有意に高く、分子型はAM-matureがAM-glycineとほぼ同等、高いことを示した。心不全症例では圧負荷で容量負荷よりAMの増加は顕著で、成熟型の比率も高かった。3.褐色細胞腫患者のAMの血中の起源を検討した。褐色細胞腫患者の副腎静脈中のAM濃度は両分子型ともに他の部位からとった濃度と変わらず、我々が以前から提唱している、「血管壁が血中のAMの起源である」という仮説に一致した。4.種々のラットの高血圧性心肥大・心不全モデルにおいて、AMの遺伝子発現、その蛋白レベル、AMの構成蛋白のCRLR、RAMP2、3の遺伝子発現、その蛋白レベル、さらにAMの最終段階の生合成過程に関与するアミド化酵素活性も亢進していることを示した。5.ラットの高血圧性心肥大から心不全モデルを発症するモデルにおいて、AMを長期投与すると、心重量、血行動態、神経体液性因子、心機能、心筋の遺伝子発現が改善することを示した。6.ヒトの先天性心疾患において、血漿でAMの2分子型が増加していることを明らかにし、その増加の原因には低酸素血漿が関与していることを示した。7.培養線維芽細胞は成熟型のAMを分泌し、サイトカイン刺激で増加したAMとその受容体の増加は抗線維化因子として働いている可能性が示唆された。8.AMと関連する作用を有するNa利尿ペプチドが動脈効果抑制作用をもつこと、C型ナトリウム利尿ペプチドが心臓において産生される可能性を示した。9.AMと関連する作用を有するナトリウム利尿ペプチドの受容体の欠損もしくは数の低下が心不全の発症易発症性と関係していることが示唆された。申請者らは『循環調節因子アドレノメデュリンの病態における意義と治療薬、診断薬としての臨床応用』を目的として、各種の循環器疾患の病態モデルやヒトにおける臨床研究により、以下の研究業績を挙げた。1.ラットの高血圧性腎障害モデルにおいて、アドレノメデュリンの長期投与は腎障害を組織学的に改善し、蛋白尿を減らし、その機序として腎臓内のレニン-アンギオテンシン系の抑制が関与していることを示した。2.悪性高血圧ラットモデルにおいて、アドレノメデュリンの長期投与は腎障害を組織学的に改善し、予後を改善することを示した。その機序として、腎臓内のアンギオテンシンIIからTGF-βにいたる経路の抑制が考えられた。3.心臓手術時に心嚢液を採取し、アドレノメデュリンの分子型を測定し、その病態生理学的意義について検討した。安定狭心症に比べて、急性冠症候群ではアドレノメデュリンが有意に高かった。また、心嚢液中の分子型はアドレノメデュリン-matureがアドレノメデュリン-glycineとほぼ同等、高くなっていることが判明した。心嚢液中のアドレノメデュリンは心機能が悪い程高く、心機能低下を代償する防御機序と考えられた。4.褐色細胞腫患者のアドレノメデュリンの血中の起源として、1つは副腎が考えられているが、その真偽は不明であった。そこで褐色細胞腫患者の副腎静脈中のアドレノメデュリンの分子型を測定し、検討した。褐色細胞腫患者の副腎静脈中のアドレノメデュリン濃度は両分子型ともに他の部位からとった濃度と変わらなかった。

このことは我々が以前から提唱している、「血管壁が血中のアドレノメデュリンの起源である」という仮説に一致する所見であった。以上からアドレノメデュリは高血圧性腎障害や虚血性心疾患の病態を代償する方向で働くことが示唆され、さらにアドレノメデュリン投与は悪性高血圧などの病態の治療薬となる可能性が示唆された。申請者らは『循環調節因子アドレノメデュリンの病態における意義と治療薬、診断薬としての臨床応用』を目的として、各種の循環器疾患の病態モデルやヒトにおける臨床研究により、以下の研究業績を挙げた。1.ラットの高血圧性心肥大モデルにおいて、アドレノメデュリンの遺伝子発現、その蛋白レベル、・アドレノメデュリンの構成蛋白のCRLR、RAMP2、3の遺伝子発現、その蛋白レベル、さらにアドレノメデュリンの最終段階の生合成過程に関与するアミド化酵素活性も亢進していることを示した。2.ラットの高血圧性心肥大から心不全モデルを発症するモデルにおいて、アドレノメデュリンの遺伝子発現・蛋白レベル、アドレノメデュリンの構成蛋白のCRLR、RAMP2、3の遺伝子発現・蛋白レベル、さらにアドレノメデュリンの最終段階の生合成過程に関与するアミド化酵素活性は心肥大期に亢進し、不全心期には、アドレノメデュリンの遺伝子発現・蛋白レベル、およびアミド化酵素活性がさらに亢進することを示した。3.ラットの高血圧性心肥大から心不全モデルを発症するモデルにおいて、アドレノメデュリンを長期投与すると、心重量、血行動態、神経体液性因子、心筋の遺伝子発現が改善することを示した。さらに内因性の心機能も改善することを示した。4.ヒトの先天性心疾患において、血漿でアドレノメデュリンの2分子型が増加していることを明らかにし、その増加の原因には低酸素血漿が関与していることを示した。5.さらにアドレノメデュリンと関連する作用を有するナトリウム利尿ペプチドが動脈効果抑制作用をもつこと、C型ナトリウム利尿ペプチドが心臓において産生される可能性を示した。本年度の研究において以下の研究実績をあげた。1.アドレノメデュリン(以下AM)は食塩感受性ラットの腎障害の程度を示すマーカーとなりうることを示した。さらに新しいRho-kinase阻害薬で治療した時に血中AMの測定は腎障害に対する治療効果の判定になる可能性が示唆された。2.ヒト不全心においてもAMの産生は亢進しており、特に分子型の解析では活性型が心嚢液に多く分泌されていた。容量負荷と圧負荷の不全心では圧負荷でAMの産生が高く、活性型の占めるわりあいも多かった。このことは不全心においてAMの産生様式は負荷によって異なり、さらにアミド化酵素の活性も圧負荷では亢進することが示唆された。3.以前に我々は容量負荷の心不全モデルにおける腎臓皮質、随質におけるAMとその受容体の変化について報告した。今回は同モデルにおける心臓での解析を行った。容量負荷心不全ではコントロールに比べてAMのリガンドだけでなく、受容体め構成蛋白であるCRLR、RAMP2、RAMP3にすべてが亢進していた。4.Dahl食塩感受性ラットに合成AMを長期投与し、その意義について検討した。AMは腎保護作用を有し、その機序として一酸化窒素合成酵素の亢進が示唆された。5.以前に我々は心臓の線維芽細胞がAMを分泌することを示し、サイトカインがAM産生を亢進させることを示した。今回はその意義についてAMのアンチセンスを用いて検討した。
寄生生物ゲノムプロジェクト:種分化・株別変異の分子生物学

本年は、寄生虫学にとって新世紀を開く年となった。新旧の交代は、緩やかな流れとしてではなく、たとえば、神経科学や人類遺伝学で起こった様な急激な研究の転換、研究者人口の転換として起こった。その象徴的な出来事は、1)世界規模のマラリアワクチントライアル(旧世代の最終報告)、2)寄生生物ゲノムプロジェクトの発足(新世代の登場)、として長く伝えられることであろう。本研究は、世界に先駆けて2)の発端となるもので、2年目をむかえ、さらなる充実期に入った。その進展は、1)YACライブラリーを基本とするトータルゲノムプールの完成、2)YACクローンを用いたゲノムマッピング、3)疾病関連遺伝子群の決定、4)種・株別変異の解析、と当初の予定通り進み、さらに5)世界ネットワークによる研究の拡大(グローバルリサーチネットワーク)、6)熱帯病予防・治療ネットワーク、へと拡大し、研究の応用性として考えるべき健康管理法への発展を見た。EST(expressed sequence tag)の解析により、2000種以上の構造遺伝子が決定され、その中には、1989年研究代表者が記載したレトロウイルス関連遺伝子も発見された。住血吸虫における宿主関連遺伝子配列に関しては、長い間世界的論争の的であったが、これにより、田中の報告が世界的に認知され、また、成長期別遺伝子再構成に関しては、1990年の論文のデータがrDNA遺伝子であったため、一時意見を保留していたが、今回telomiric sequence、第3染色体特異的反復配列による同現象を認め、5年間にわたる論争に終止符を打った。このような目覚ましい成果と波及効果は、ゲノムプロジェクトタイプの研究によってのみ可能になるものであり、早期に研究方法の限界を打ち破り、新しい分野として独立して進展させたことに大きな意義がある。
口腔扁平上皮癌における簇出の病理学的検討

口腔扁平上皮癌における簇出がリンパ節転移・予後予測因子として有用であるかについて検討を行った。統計学的検討で単変量解析でリンパ節転移との間に有意差があったのは、budding score、分化度、浸潤の深さ、浸潤様式、脈管侵襲であった。多変量解析では、浸潤様式、リンパ管侵襲、budding highは頸部リンパ節転移の独立危険因子であり、特にbudding highの症例では有意な差が認められた。簇出lowと、intermediate、highとの比較については、lowのリンパ節転移症例が0例であるため、解析できなかった。全ての症例における無再発生存率では、intermediate、highともに有意差を示し、intermediateとhighとの間に差はみられなかった。各グループに分類した無再発生存率では、lowとintermediate、lowとhighの間に有意差を認めたのは、部位では舌、歯肉であり、T1/T2、INFa/b、深さ5mm未満、cN0などの比較的早期症例で有意差を示した。全ての症例における生存率では、lowとhighとの間で有意差を示した。また、cN0における生存率では、intermediate、highともに有意差を示し、cN0でのbudding scoreは患者の予後を検討する上で重要であると考えられた。口腔扁平上皮癌cN0でのbuddingscoreは患者の予後を検討する上で重要であると考えられた。また、T1/T2、深さ5mm未満、INFa/b、cN0症例において、生検標本で簇出scoreが3以上の症例は頸部予防郭清術を考慮する必要性があると考えられた。口腔癌における頸部リンパ節転移の有無は患者の予後を左右する重要な因子である。口腔扁平上皮癌の治療において、術前に頸部リンパ節転移を予測し、予防郭清の適応の有無を判断することは極めて重要である。頸部予防郭清の適応については統一された基準はいまだにない。日本では頸部リンパ節転移の予測因子として、浸潤様式(INF)または山本-小浜の浸潤様式(Y-K分類)が一般的に頻用されている。近年、病理組織学的評価の1つとして簇出(tumor budding)が多くの癌で検討されている。簇出とは癌浸潤先進部において、癌細胞が小胞巣状あるいは個細胞性に遊離して発育・浸潤する所見で、大腸癌sm癌ではリンパ節転移予測因子として知られている。舌・口腔底扁平上皮癌において、術前生検検体での簇出の評価は患者の頸部リンパ転移、予後予測因子として有用であり、口腔扁平上皮癌(下顎歯肉、上顎歯肉、頬粘膜、口蓋、口唇)においてもリンパ節転移、予後予測因子として有用であった。当院では、生検で口腔扁平上皮癌と診断された症例に対して、手術までの待機時間に合わせて腫瘍の増大を防ぐ目的で経口抗癌剤(S-1:フッ化ピリミジン系抗悪性腫瘍薬)の内服を行っている。S-1の術前化学療法施行症例、非施行症例における生検検体と手術検体との間で簇出について関連性があるかどうか、また、簇出減少症例、増加症例が患者の予後と関連性があるかどうかを検討中である。現時点で、S-1内服前後の簇出の評価が終了し、考察中である。S-1内服症例の多くは、切除検体での簇出スコアが低下した。これらの症例のうちいくつかの症例では、壊死細胞は炎症性細胞浸潤に置換されており、簇出の消失の結果、異物巨細胞や線維化がみられた。S-1内服症例のいくつかは、簇出スコアは極端に増加しており、これらの小さな簇出は高密度の線維組織内に散在し、埋め込まれており、免疫染色によっては確認できたがHEではわからなかった。これらの特徴は、簇出スコアが大幅に上昇したS-1内服後の切除標本において特徴的であった。

また、T1/T2、深さ5mm未満、INFa/b、cN0症例において、生検標本で簇出scoreが3以上の症例は頸部予防郭清術を考慮する必要性があると考えられた。S-1の術前化学療法施行症例、非施行症例における生検検体と手術検体との間で簇出について関連性があるかどうか、また、簇出減少症例、増加症例が患者の予後と関連性があるかどうかを検討し、考察を行う。研究結果をまとめ、論文として投稿を行う。次年度使用額(2,392円)であり、値する額の抗体がなかったため。
血小板のコラーゲン受容体GPVIの活性構造と活性化機構の解析及びその阻害剤の探索

血小板のコラーゲンレセプターGPVIの特異的な阻害剤の探索及びそれを用いた反応機構の解析を行った。1. GPVIダイマーと特異的に結合するFabをスクリーニングし、コラーゲンとの結合にはGPVIのダイマー構造が必要なことと、血小板上でGPVIはダイマーとして存在することを示した。2. GPVIと複合体を形成するFcRγ鎖の透過性ペプチドを作製した。このペプチドはコラーゲンを介した血小板の活性化を特異的に阻害し、特にSykのリン酸化を阻害した。3.変異GPVIの解析から、R38とE40およびR65が結合活性に強く関与していることを示した。血小板のコラーゲンレセプターGPVIの特異的な阻害剤の探索及びそれを用いた反応機構の解析を目的として以下の研究を行った。1)抗GPVI抗体の探索以前我々が見出したモノクローナル抗体のヒト型Fabの作製を企業と共同で開発しようとしている。またGPVIダイマーと特異的に結合するFabをファージディスプレイ法を用いてスクリーニングした。このFabはコラーゲンによる血小板の活性化を阻害し、GPVIがダイマーを形成して血小板上に存在することを示している。またGPVIがダイマーを形成することにより特異的な構造を形成することを示している。2)阻害ペプチドの探索GPVIは特異的な血小板活性化機構を有する。特にGPVIと複合体を形成するFcRγ鎖のチロシンリン酸化が重要な寄与をしている。そこでこのFcRγ鎖めリン酸化配列を有する透過性ペプチドを作製し、その作用を解析した。このペプチドはコラーゲンを介した血小板の活性化を特異的に阻害し、特にチロシンキナーゼSykのリン酸化を阻害した。このことはSykのリン酸化γ鎖との績合がSykのリン酸化に重要であることを示している。3) GPVI活性部位の探索コラーゲンとの結合に関与すると予想されるアミノ酸を変異させた組換えGPVIを作製し、これらのアミノ酸の寄与を解析している。血小板のコラーケンレセプターGPVIの特異的な阻害剤の探索及びそれを用いた反応機構の解析を目的として以下の研究を行った。1.特異的抗GPVI抗体の探索コラーゲンとの結合はGPVIダイマーにのみ認められることからGPVIダイマーにコラーゲンとの結合に関与する構造が存在すると考え、GPVIダイマーと特異的に結合するFabをファージディスプレイ法によりスクリーニングした。得られたFabはコラーゲンとGPVIの結合を阻害し、コラーゲンによる血小板の活性化を阻害した。このことはGPVIがダイマーを形成することによりコラーゲンとの結合に重要な構造を形成することを示している。このFabが血小板と結合することから血小板上でGPVIはダイマーとして存在していることが示された。2.阻害ペプチドの探索GPVIは特異的な血小板活性化機構を有する。そこでこのFcRγ鎖のリン酸化配列を有する透過性ペプチドを作製し、その作用を解析した。一方FcRγ鎖のリン酸化は阻害されず、Sykのリン酸化にはリン酸化されたγ鎖との結合が必要であることが示された。3. GPVI活性部位の探索GPVIと相同性の高いKIRとのキメラ分子を作製し、キメラ分子のコラーゲン及びコラーゲンモデルペプチドCRPとの結合活性を解析した。その結果GPVIの結合は主に第一免疫グロブリン様ドメイン(D1)に存在すると考えられた。D1の種々のアミノ酸に変異を加え、その活性を解析した結果、R38とE40およびR65が結合活性に強く関与していることが示され、これらの解離性アミノ酸残基がコラーゲンとの結合に強く関与していると考えられる。
建築材料の湿気物性値の整理と建築環境解析ツールの普及に関する研究

本研究では,吸放湿性能を有する建築材料が室内の温湿度環境におよぼす影響を定量的に把握することを目的として,建築材料の湿気に関わる物性値を同定する方法の提案ならびにそれら物性値の整理,実測実験と数値解析の併用による建材の評価を進めている。その中で,地域によっては湿気に関わる物性値(透湿抵抗他)が潜熱負荷の10%近くを占めることを明らかにした。また,吸放湿現象を考慮した建築の温湿度・熱負荷計算ソフトウェアの汎用性向上のため,計算負荷の低減とユーザ支援システムの構築を進めており,ユーザ支援ツールとしてグラフィックユーザインターフェイスの制作を行い作業の効率化を図った。平成27年度は、実験と数値計算の併用により建築材料の湿気物性値(水分容量、水分伝導率)を同定する方法の確立のため、複数材料を対象とした実験と数値解析によりその精度検証に着手した。具体的には湿度応答法(JIS A 1470-1)および温度応答法(JIS A 1470-2)に則り、模型実験を進めた。また、カップ法および平衡含水率測定法により、対象材料の水分容量、水分伝導率を測定を進めた。並行して、数値計算ソフト(建築の温湿度・熱負荷計算ソフトウェア)の計算アルゴリズムの解析による高効率化とユーザ支援ツールの設計・制作に着手した。本研究は、調湿建材が室内の温湿度環境におよぼす影響を定量的に把握することを目的とした一連の研究に必要となる、湿気に関わる材料物性値(水分容量、水分伝導率など)の推定方法の提案と確立、その物性値の整理と、実測実験と数値解析の併用による調湿建材の評価(室内温湿度および暖冷房消費エネルギーへの影響)を目的としている。また、数値計算ソフトの汎用性向上と普及のため、計算アルゴリズムの解析による高効率化とユーザ支援システムの構築(ユーザ支援ツールの開発、普及、サポート)を行う。これは、より長期的な目標として、建築への調湿建材導入の検討を設計の段階で行えるようにすることを掲げており、そのために、指標作成(調湿建材の性能-使用量など)や湿害予防・解決方策の整理、検討に用いるツール(数値計算ソフト)の普及が必要になるという考えによる。おおむね順調に進展している。一部、建築材料の水分容量および水分含水率測定では、予定より時間がかかっている。これは、実験準備(おもに平衡状態に保つまでに日数を要する)や計測機器を占有できないことに起因しており、都度調整をはかっている。本研究では、吸放湿性能を有する建築材料が室内の温湿度環境におよぼす影響を定量的に把握することを目的として、建築材料の湿気に関わる物性値(水分容量、水分伝導率)を同定する方法の提案・確立およびそれら物性値の整理、実測実験と数値解析の併用による、吸放湿性能を有する建築材料の評価(室内温湿度や暖冷房消費エネルギーにどのように影響するかなど)を勧めている。その中で、環境試験室による模型実験、吸放湿現象を考慮した建築の温湿度・熱負荷計算ソフトウェアによる数値解析に加え、実証住宅での実測実験などにより、建築材料の湿気に関わる物性値(水分容量、水分伝導率)を測定する方法(実験と数値計算の併用による同定/実験による推定)について、実測実験との比較によりその精度と妥当性の検証を進めている。実測実験と並行した数値解析では、湿気に関わる、建材の透湿抵抗値などが、潜熱負荷の10%近くを占めることを明らかにした。また、現在開発を進めている「吸放湿現象を考慮した建築の温湿度・熱負荷計算ソフトウェア」の汎用性向上と普及のため、計算負荷の低減とユーザ支援システムの構築を行った。具体的には、ユーザ支援ツールとしてJavaのswingによるGUIを含めたソフトウェアの制作を行い作業の高効率化を図った。基本的には計画通りに研究を遂行する。先述の、実測に時間を要する点や計測機器の使用については、夏期休暇などを利用することで調整を図る予定である。建築環境工学実験計画の若干の遅延に伴う支出予定の変更。時期が若干ずれたのみで使途は計画通り。平成28年度、夏期休暇を利用して実験を遂行する予定のため、その準備段階で支出する予定。
児童の自然事象に対する直覚的認識に関する調査研究

(研究の視点と方法)本研究は、「児童・生徒、あるいは大学生は現代自然科学の概念とは必ずしも一致しない、独自のナイ-ブ理論(Naive Theory)を持つ」「問題設定場面が異なると、同一事象に対しても反応の形式が選択的になる」という仮説のもとに、学習者の直覚的な認識について調査した。児童の直覚的な認識の特微を明らかにする為には、同一事象に対する大学生や高校生・中学生の直覚的な認識と比較することが必要であると判断し、小学生・中学生・高校生・大学生までを調査範囲とした。(結果)水蒸気に関する認識は、その熱源がガスの燃焼による場合、電流の発熱による場合、フラスコのような実験的な加熱の場合によって異なった特徴を持つことが見いだされ、人は問題設定場面によって選択的な認識を示すことが結論された。電気回路の認識には学習者の電流に関する固有のナイ-ブ理論の存在が確認された。また、それは授業によってかなり改善されたが、時間の経過によって再び学習前の状態に帰る可能性が高いことが見いだされた。(今後の課題)流体中の物体の浮遊に関する調査もすすめたが、調査方法において、また、得られた事例の解釈において改善すベき問題が生じた。このため平成3年の3月までには一定の結論を得るに至っていない。これについては更に調査を進め、できるだけ近い将来に適切な学会の研究紀要に報告する。この研究は最終的には理科指導法の改善に資する基礎資料を得ようとするものである。そのため、学習者の直覚的な認識の存在を前提とした授業構成の可能性を検討するために、小学校における「人体」の指導を調査した。この結果は、授業の中に学習者の直覚的な認識の存在を仮定した授業を構築する可能性を示唆するものであった。本研究は、成人にもかなりの割合で存在し、しかも児童期において特微的な、科学的には誤っている直覚的な自然認識の実体を調査し、それを類型化することを目的としている。1.本年度(初年度)の研究経過(1)研究の枠組みをより明確にするために、広島大学および神戸大学附属小学校教師から直覚的認識と思われる事例を収集した。(2)附属教師から得られた直覚的認識の事例と諸外国での事例とを基礎として、磁力と重力に関する認識、電気回路に関する認識、水の三態に関する大学生(合計165名)直覚的認識の実態を調査した。これは、小学生を対象とした本調査の内容決定のために行ったものである。(3)大学生の調査結果から、小学校児童を対象としたアンケ-ト調査の内容を決定した。2.大学生対象の基礎調査に見られた直覚的自然認識の特徴(1)磁力と重力に関する直観的な認識:反発しあって空中に浮いている状態の磁石の重さは消失していると認識する者がかなりの割合を占めた。(2)電気回路に関する直覚的な認識:同一の電気回路でも、図の描き方で、回路を流れる電流値の大きさに差があると認識する学生がかなりの割合を占めた。(3)水の三態に関する直覚的な認識:沸騰している水中から生じている気泡を空気、あるいは酸素・水素と認識しているものが見られた。フラスコ中での沸騰と電気ポット中での沸騰という同一現象でも認識のしかたに違いが見られた。次年度は、大学生の結果を基礎とし、児童を対象とした調査を行う。

児童の直覚的な認識の特徴を明らかにする為には、同一事象に対する大学生や高校生・中学生の直覚的な認識と比較することが必要であると判断し、小学生・中学生・高校生・大学生までを調査範囲とした。本年度は最終年度として、選択された事例の中から、水蒸気に関する調査と電気回路に関する調査、および流体中の物体に加わる力に関する認識について調査を行い、その結果の一部を日本理科教育学会で発表するとともに、結果を報告書にまとめた。(結果)水蒸気に関する認識は、その熱源がガスの燃焼による場合、電流の発熱による場合、フラスコのような実験的な加熱の場合によって異なった特徴を持つことが見いだされ、人は問題設定場面によって選択的な認識を示すことが結論された。電気回路の認識には学習者の電流に関する固有のナイ-ブ理論の存在が確認された。また、それは授業によってかなり改善されたが、時間の経過によって再び学習前の状態に帰る可能性が高いことが見いだされた。直覚的な認識を前提として授業構成の可能性を検討するため小学校「人体」の授業を試みた。(今後の課題)流体中の物体の浮遊に関する調査もすすめたが、調査方法において、また、得られた事例の解釈において改善すべき問題が生じた。これについては更に調査を進め、できるだけ近い将来に適切な学会の研究紀要に報告する。今後は授業改造と直覚的な認識との関連から研究を進める予定である。
スポーツ政策の公共性に関する国際比較研究

本研究は、我が国のこれまでのスポーツ政策のあり方を社会学的な「公共性」の観点から批判的に検討し、これからのスポーツと政治、政策の枠組みを再検討するとともに、欧米およびアジア圏(イギリス、アイルランド、ドイツ、フランス、カナダ、中国、韓国、台湾)におけるスポーツ政策の現状と課題を明らかにしながら、我が国の今後のスポーツ政策の目的、内容、方法について新たな公共性概念にもとづくビジョンを提言した。本研究の目的は、我が国のこれまでのスポーツ政策のあり方を主に社会学的な「公共性」の観点から批判的に検討し、これからのスポーツと政治、政策の枠組みを再検討するとともに、欧米およびアジア圏におけるスポーツ政策の現状と課題を明らかにしながら、我が国の今後のスポーツ政策の目的、内容、方法について新たな公共性概念にもとづくビジョンを提言することにある。そのため、本年度は、主に文献研究により新たな公共性概念のフレームを構築し、我が国のこれまでのスポーツ政策批判によってこれからのスポーツ政策に蘭する分析枠組みを設定しながら、研究分担者による欧米、アジアのスポーツ政策の現状に関する予備調査(文献収集、インタビュー調査、研究ネットワーク作り)を実施した。新たな公共性概念については、従来からの政治的公共性の概念にとらわれず、近代スポーツを支える社会構造の特徴から近代社会における公共性とのアイソモルフ(異次元相同)的関係を考え、楽しさを追求するプレイの自由性と拘束性の概念による「スポーツからの公共性」構築の可能性とその政策的意味が検討された。従来の政治的公共性を援用してスポーツの公共性を論じるのではなく、スポーツのプレイ特性から公共性を論じることによってスポーツ先進国と後進国とにどのようなスポーツ政策に対する公共性のとらえ方に関する相違がみられるのかの基本的フレームが見えてきたところである。また、各国の予備調査では、イギリス、アイルランド、ドイツ、フランス、台湾、韓国が対象となったが、ヨーロッパ諸国では、スポーツのプレイ性を第一に担保しつつ、その政策の公共性が高度化レベルと大衆化レベルの二方向に分岐している。これをある一定の法体系で保障するのか、レポートによって時限的に保障するのかの違いがみられる。アジアでは、政権によるパワーがストレートに政策に反映される傾向があった。2年次の研究目的は、欧米やアジアのスポーツ政策の現状と課題に基づいてスポーツ政策の公共性概念からみた我が国のスポーツ政策システムの検討を行うことであった。調査対象国は韓国、中国、ドイツ、フランス、イギリス、アイルランド各国であり、それぞれの現状と課題の特徴が検討された。具体的には、スポーツに関する基本法の成立過程とその実効性を担保する「権威」がどのように形成されるのかが各国のスポーツと社会との関係性及び歴史性によって規定されていること、そのことが政治的な概念である「公共性」概念の形成過程と並行した特徴を示しているということであった。総じて、アジアではスポーツの公共性が当初から政策的な道具としてとらえられており、我が国もそのような特徴をもっている。これに対して、今回の調査対象であったヨーロッパ各国では、総じてスポーツと人間との内在的な関係や内在的価値(intrinsic value)それ自体を公共性の出発点としてとらえ、これに基づく道具的価値の「可能性」を期待しているところに止まっている。ここで言う「止まっている」というのは、その成果をあくまでスポーツの自由性や自在性に委ねている、という意味で、極めてopenな、下からの「公共性」概念であり、その社会的モデルとして機能しているということである。ときあたかも、本年度は我が国において「スポーツ基本法」の制定とそれに続く「スポーツ基本計画」が策定され、その政策形成過程の問題が明らかになりつつある一方で、日本体育協会・日本オリンピック委員会が創立100周年を記念して「スポーツ宣言日本」を内外に示した。両者のスポーツのとらえ方は対照的であり、スポーツ政策の公共性を考察する上においても興味深い論点を浮かび上がらせている。本研究における比較考察は、今後の我が国おけるスポーツ政策の公共性をどのように形成し、ビジョン化していくべきかを示す重要な意義を持つことものと考えられる。本研究の目的は、我が国のこれまでのスポーツ政策のあり方を社会学的な「公共性」の観点から批判的に検討し、これからのスポーツと政治、政策の枠組みを再検討するとともに、欧米およびアジア圏におけるスポーツ政策の現状と課題を明らかにしながら、我が国の今後のスポーツ政策の目的、内容、方法について新たな公共性概念にもとづくビジョンを提言することにあった。振り返ってみると、1961年にスポーツ振興法が制定されて以来、スポーツ振興基本計画すら策定されなかった約50年間の空白期間において、本研究は、1990年代から今日に至るまで「スポーツと公共性」をキーワードとして、政策とスポーツとの関係を地道に研究してきた延長線上にある。その成果は、主にマクロな社会学的研究の理論的視点に基づきながら、「公共性」をキーワードにしたスポーツの被存在的根拠と社会変動との関係から明らかにされてきた。その意味で本研究は、主に欧米と東アジアを中心としたスポーツ政策の公共性を論じようとしたが、その成果や課題は、個々の論文のなかで示された。そのテーマは、1)欧米におけるスポーツ政策の公共性に関する比較分析として、2)東アジアにおけるスポーツ政策の公共性に関する比較分析として、それぞれ論じられた。

総じて、ある一定の領土的単位を前提とする政治権力に担保された政策の対象としてのスポーツの可能性はさまざまに議論されるが、東アジアでのトップダウン的なスポーツ政策に対する公共性の担保には明らかな限界があることは示唆された。このことは、組織的担い手であるスポーツ組織の公共性をさらに追及していくことで明らかにされる必要があると考えられる。つまり、スポーツの中間組織や中間集団の公共性をどのように考え、これらを具体的な政策過程に組み込んでいくのかは、とくにヨーロッパを中心とするスポーツ先進国の共通な課題であることが理解されたのである。当初予定していた調査対象国の調査の本調査をほぼ終えることができ、各国のスポーツ政策の基本フレームから公共性を視点とした比較がほぼ可能な段階まで到達することができた。また、各調査内容から利用可能なデータベースの作成もほぼ行うことができた。しかしながら、北米の調査については予備的な段階に止まっていることや共通の調査項目の策定については、なお未完成な部分があり、これらの課題を多少残していることから、現在の達成度を「おおむね」とした。24年度が最終年度であるため、記入しない。今後は、次年度の研究最終年における計画に沿って、内外の研究発表を通じて本研究に資する有益な意見を聴取するとともに、国際比較からみた我が国スポーツ政策の公共性のあり方やビジョンをまとめていく。その要点は、1)定義2)目的3)方法4)内容の各比較によって構成される予定である。しかし、スポーツの公共性を定義するグローバルな観点からみた歴史社会的な把握については、なお共通の課題を残しているところがあるので、文献研究を通じた再精査を行う必要があると考えている。
阮朝・太廟・昭敬殿の復原計画－ヴィエトナムの文化遺産に関する国際協力－

阮朝フエ王宮における昭敬殿の上部構造を以下の方法によって復原した。1昭敬殿と隆徳殿の柱間寸法の比較および基壇構造の比較によって昭敬殿が隆徳殿と同一規模、同一形式であることを明らかにした。2昭敬殿の復原は、隆徳殿の寸法計画、建築技法、細部意匠を踏襲することによって実施した。3隆徳殿と同様に復原設計に倣って原寸図を作成し、その寸法を基準に施工した。4昭敬殿の基壇は、地盤の地耐力を考慮して、隆徳殿基壇修理と同様に、各柱礎石下にレンガ積独立基礎を新設した。5昭敬殿の軸部および屋根の組立は、隆徳殿の施工に倣って行われた。6昭敬殿復原の参考資料として、復原図、基壇詳細図、原寸図、竣工写真などをまとめた。平成17年度から21年度にかけて、阮朝王宮内の隆徳殿を、わが国における木造建築の修復技術および方法を基準として、修復した。その過程において、勤政殿再建のための技術的データを収集することができた。本研究では、昭敬殿の復原工事を通して、ヴィエトナム建築の再生技術の検討を行うことによって、ヴィエトナム技術者に木造建築の日本的復原技術の移転を試みようとするものである。平成22年8月15日-27日に第1次調査が行われ、(1)工事監理事務所を西方向に7m移動した。(2)昭敬殿の素屋根および南側・西側部材格納小屋を建設した。平成23年2月26日-3月8日に第2次調査が行われ、(1)隆徳殿の実物大構造実験を行った。(2)隆徳殿の正面建具を建て込んだ。(3)素屋根の南側・西側部材格納小屋の屋根を連結した。(4)昭敬殿の基壇の発掘調査を行った。HMCCが申請した、昭敬殿復原工事の許可(ヴィエトナム政府文化情報省)が遅れたため、平成23年5月29日に木材調達委託契約を締結し、柱・ケオ・頭貫・飛貫の木材15.281m^3を購入した。平成22年度末に、昭敬殿基壇の発掘調査が2011年3月1日から3月26日まで行われた。その結果、昭敬殿の基壇構造が隆徳殿と同じであったことが明らかになった。平成23年度に実施した研究として、第3次・第4次調査および第1次・第2次臨時調査が行われた。第3次調査は、8月15日(日)から8月24日(土)まで行われ、その内容は(1)昭敬殿原寸場の設置、(2)昭敬殿原寸図の作成であった。復原柱間は、中間3264.8mm(7.7越尺)、脇間2756mm(6.5越尺)、端間1950.4mm(4.6越尺)を採用した。復原柱高は、身舎柱5512mm(13越尺)、庇柱4028mm(9.5越尺)、裳階柱2586.4mm(6.1越尺を採用した。柱径は、身舎柱220.5mm(5.2越寸)、庇柱207.8mm(4.9越寸)、裳階柱195mm(4.6越寸)とした。柱の伸びは、隅庇柱が84.8mm(2越寸)、隅裳階柱が127.2mm(3越寸)、脇間外側裳階柱が63.6mm(1.5越寸)とした。軒反りは、隅庇柱位置で1696mm(4越寸)、隅裳階柱位置で2120mm、(5越寸)とした。屋根勾配は、上屋で5.42/10、下屋で4/10とした。第4次調査は、2012年2月26日(日)から3月26日(月>まで行われ、その内容は、(1)基壇の修理、(2)穆思殿の基壇調査であった。現状基壇:は、礎石が西側方向に大きく沈下し、礎石配置の基準グリッドが直行せず、歪んでいた。礎石レベルは、1A礎石高さを基準に、また礎右配置の直交グリッドは、A通りの礎石南端の東西線を基準に割り出した。礎石の沈下を防ぐため、礎石下に800mm×800mm×750mmの煉瓦積独立基礎を設けた。外側周りの煉瓦積布基礎は、そのままにしていじらず、礎石のみを据え直した。

またフエの宮殿建築とハノイの建築(寺・亭・祀・廟)を比較するため、第1次臨時調査を9月5日(月)から9月10日(土)まで、第2次臨時調査を2012年3月22日(木)から27日(火)まで行い、ハノイ建築の基礎的な資料を作成した。平成25年度に実施した研究として、第7次・8次調査および、第68次臨時調査が行われた。第7次調査は、8月16日30日まで行われ、その内容は、1昭敬殿軸部組立、2世祖廟の実測調査などであった。昭敬殿の部材加工は6月までに完了し、第6次臨時調査(5月2131日)で確認をした。軸部組立は、6月から開始され、第7次調査期間中に、柱・ケオ・大梁・大貫・頭貫・飛貫が組立てられた。引き続き母屋受け・母屋桁が取り付けられ、第7次臨時調査期間中(9月11日14日)の9月12日に上棟式が行われた。その後垂木・鼻隠し板が取り付けられ、12月末に木工事が完了した。第8次臨時調査を12月22日26日に行い、木工事の完了を確認した。木工事の完了によって、隆徳殿で明らかになった阮朝初期の建築技法(柱の伸び・転び、軒反り)に基づいて昭敬殿を復原することができた。第8次調査は、2月24日3月4日まで行われ、その内容は、1世祖廟の実測補充調査などであった。世祖廟の実測調査を踏まえて、世祖廟の寸法計画および太祖廟の復原研究を行った。また2013年度日本建築学会大会学術梗概集(pp.593-598,2013.9)に「昭敬殿基壇の修理について阮朝・太廟・昭敬殿の復原計画(その8)」「現状太祖廟の寸法計画について阮朝・太廟・昭敬殿の復原計画(その9)」「創建太祖廟の平面計画について阮朝・太廟・昭敬殿の復原計画(その10)」、日本建築学会計画系論文集(No696,pp.517-524,2014.2)に「阮朝フエ王宮における隆徳殿の番付についてー隆徳殿の建築技法その2」を発表した。さらに2014年3月『阮朝・太廟・昭敬殿復原計画ヴィエトナムの文化遺産に関する国際協力ー2013年度活動報告ー』をまとめた。平成24年度に実施した研究として、第5次・第6次調査および、第35次臨時調査が行われた。第5次調査は、8月16日から9月12日まで行われ、その内容は、1昭敬殿の木材場の調達2太祖廟の実測調査などであった。現状太祖廟の平面計画は、梁行身舎柱間8.5越尺、庇柱間7.4越尺、中央柱間7.5越尺と考えられる。柱径は、実測値を元に計画寸法を推定すると、身舎柱0.85越尺、庇柱0.7越尺、裳階柱0.6越尺、下屋柱0.5越尺と考えられる。断面寸法は、身舎柱高さ=身舎柱間+庇柱間、庇柱高さ=庇柱間×√2、裳階柱高さ=庇柱間というように、梁行柱間を基準に決定されていると考えられる。第6次調査は、2013年2月26日から3月13日まで行われ、その内容は、1柱・ケオの加工2世祖廟の実測調査などであった。世祖廟の計画寸法は、基準柱間10越尺、庇柱間・裳階柱間8.3越尺と考えられる。柱径は、正殿身舎柱1.0越尺、前殿身舎・庇柱0.95越尺、裳階柱0.9越尺と考えられる。断面寸法は、正殿身舎柱高さ19.69越尺、庇柱高さ15越尺、裳階柱高さ8.8越尺、前殿身舎柱高さ15.6越尺である。正殿身舎柱高さは身舎外から反対側庇柱外までの寸法、正殿庇柱高さは身舎外々の延べの寸法、正殿裳階柱高さは庇柱心から裳階柱外までの寸法であることがわかった。また、フエの宮殿建築と、フエ・ハノイおよびホーチミンの建築(寺・亭・祀・廟)を比較するため、第3次臨時調査を7月4日から8日まで、第4次臨時調査を9月9日から12日まで、第5次臨時調査を2013年3月21日から24日まで行い、基礎的な資料を作成した。平成26年度に実施した研究として、第9次調査、第10調査を行った。第9次調査は、8月17日から9月4日まで行われ、その内容は、1昭敬殿の素屋根解体2太祖廟の1/10模型の検査であった。素屋根の解体は、8月18日(日)から開始され、フエ遺跡保存センターが所有するクレーンおよびトラッククレーンを使用して、日本人3人、ベトナム人3人で解体を実施し、8月25日(月)に完了した。
骨・軟骨腫瘍で特異的変動しているmicroRNAの同定とその生物学的意義の解析

集学的治療法の進歩により、骨腫瘍の治療は飛躍的に進歩している。しかし、依然として遠隔転移例の予後は不良であり、手術・放射線療法を含めた局所療法に加えて遠隔転移の制御法の開発は極めて骨・軟部腫瘍の治療戦略上極めて重要なテーマである。本研究では、高肺転性骨・軟骨腫瘍細胞株を用いて、転移関連のnon-coding RNAの同定を試みた。両者で共通に過剰発現していたlincRNA-ARF6を同定した。lincRNA-ARF6は、ARF6の発現抑制に関連していたが、細胞生物学的検証では運動浸潤能には影響を与えなかった。lincRNA-ARF6の過剰発現については今後更なる検討が必要と考えられた。本研究では,高肺転移骨肉腫(LMOSi3)および軟骨肉腫(LMCSi4)細胞株で過剰発現するlincRNAに注目し、骨・軟骨悪性腫瘍の肺転移に係るlincRNA(lincRNA-ARF6)の生物学的役割を明らかにする。本年度は,以下の解析を行った.1.lincRNA-ARF6の発現抑制による、ARF6の発現変動の検証.2.lincRNA-ARF6とcomplexを作る抑制蛋白群の同定.3.細胞運動能、浸潤転移能に係る分子機構の解析.次世代シークエンサーを使用した網羅的解析から,ダイナミックに変動していたlincRNAは,それぞれ高肺転移骨肉腫(LMOSi3)8種類(2上昇,6低下),軟骨肉腫(LMCSi4)6種類(3上昇,3低下)lincRNAの同定に至った.このうちバイオインフォマティクスにより遺伝子情報から予想された,近傍の標的遺伝子が転移関連分子であったものは,lincRNA-ARF6のみであった.polycome遺伝子を中心にIP-western blotおよび、IP-RT-PCR法による解析をお今合ったところ,lincRNA-ARF6とPC2との結合が認められる事が明らかとなった.これらのcomplexはARF6のプロモーター領域に結合している事は明らかになったため,現在ノックアウトマウスでのin vivo効果の検証を予定し実験を進めている.これとは別に,anti-senseによる生物学的効果を検証し,浸潤能の増加を認めている.近年,蛋白質をコードしないnon-coding RNAが,蛋白質の翻訳抑制に働いていることが明らかとなり,post-transcriptionalな発現制御きこうとして注目を浴びている.本研究では,高肺転移骨肉腫(LMOSi3)および軟骨肉腫(LMCSi4)細胞株で過剰発現するlincRNAに注目し、骨・軟骨悪性腫瘍の肺転移に係るlincRNA (lincRNA-ARF6)の生物学的役割を明らかにする。研究期間内に以下の解析を行う.1.lincRNA-ARF6の発現抑制による、ARF6の発現変動の検証,2.lincRNA-ARF6とcomplexを作る抑制蛋白群の同定,3.細胞運動能、浸潤転移能に係る分子機構の解析,4.SCIDマウスxenograftでのlincRNA-ARF6発現制御系による転移抑制実験.平成26/27年度には, lincRNA-ARF6がARF6の発現変動に関与している事,PC-2蛋白質とcomplexを形成しクロマチン修飾に関与している事を明らかにし,現在論文を投稿中である.また,このcomplexが作用する遺伝子領域をChIP-sequenceにより網羅的に解析し,高密度に濃縮される領域にヒアルアドヘリンのfamily遺伝子群がある事を明らかにした.本研究成果については,査読者からノックアウトマウス等の動物モデルを使用した系での検証が要求されており,ジャーナル変更を考えている.概ね実験は終了し,レフリーからの追加実験への対応を行っている.集学的治療法の進歩により,骨腫瘍の治療は飛躍的に進歩している.しかし,依然として遠隔転移例の予後は不良であり,手術・放射線療法を含めた局所療法に加えて遠隔転移の制御法の開発は極めて骨・軟部腫瘍の治療戦略上極めて重要なテーマである.高転移株を樹立しその生物学的特性を解析する方法は,各種悪性腫瘍で古くから行われてきた研究手法であり,本研究では高肺転移骨肉腫(LMOSi3)および軟骨肉腫(LMCSi4)細胞株で過剰発現するlincRNAに注目し、骨・軟骨悪性腫瘍の肺転移に係るlincRNA(lincRNA-ARF6)の生物学的役割を明らかにする。研究期間内に以下の解析を行った.1.lincRNA-ARF6の発現抑制による、ARF6の発現変動の検証.2.lincRNA-ARF6とcomplexを作る抑制蛋白群の同定.3.細胞運動能、浸潤転移能に係る分子機構の解析.4.SCIDマウスxenograftでのlincRNA-ARF6発現制御系による転移抑制実験.lincRNA-ARF6 inducibleを作成し、ARF6の発現変動が抑制される事を確認した.lincRNA-ARF6とcomplexを作る抑制蛋白群ではポリコーム蛋白であるPC2が結合していた.lincRNA-ARF6はepigeneticsの制御機構を介して高肺転移株の特性形成に関与している可能性が示された.NGS解析によりにinducible cloneを用いた細胞接着,運動能,EMTに係る遺伝子を同定した(8高発現,3低発現).これらの遺伝子を遺伝子工学的に発現制御する事で,in vitroでのLMOSi3,LMCSi4の浸潤転移能は抑制された.しかし,xenograftでの転移抑制には失敗した.集学的治療法の進歩により、骨腫瘍の治療は飛躍的に進歩している。

しかし、依然として遠隔転移例の予後は不良であり、手術・放射線療法を含めた局所療法に加えて遠隔転移の制御法の開発は極めて骨・軟部腫瘍の治療戦略上極めて重要なテーマである。本研究では、高肺転性骨・軟骨腫瘍細胞株を用いて、転移関連のnon-coding RNAの同定を試みた。両者で共通に過剰発現していたlincRNA-ARF6を同定した。lincRNA-ARF6は、ARF6の発現抑制に関連していたが、細胞生物学的検証では運動浸潤能には影響を与えなかった。lincRNA-ARF6の過剰発現については今後更なる検討が必要と考えられた。平成26年度は,概ね予測に準じた結果が見出された.一方,新規の興味あるlincRNAに加えて,AS-RNAによるZEB2/E-cadherinの発現制御のルートに関与するmiRNAを見出したのでこちらの研究も派生して行う.追加実験を行い,論文のアクセプトを目指す.人体病理
がん細胞の生存に必須な遺伝子を探索する

ゲノム編集技術を利用してがん細胞の遺伝子を網羅的に破壊し、その結果として機能を失った遺伝子の中から、特定の状況下でがん細胞が生き残るために必須な遺伝子群を探索する方法を確立した。まず、抗がん剤であるアドリアマイシンに抵抗性のある卵巣癌細胞株A2780ADRに対してゲノムワイドな遺伝子破壊を行った。ゲノム編集用のレンチウイルスライブラリーを感染させたA2780ADR細胞を2週間培養することで、ゲノム編集が起こる時間を十分に確保し、その後にアドリアマイシンを添加した。この状況下でアドリアマイシン耐性であるA2780ADRは生存可能であるが、ゲノム編集によってアドリアマイシン耐性遺伝子を破壊された細胞は死んで培養容器から脱落する。この死細胞を遠心分離によって回収し、ゲノムDNAを抽出・精製した。死細胞のゲノムDNAには遺伝子破壊に用いられたベクターの配列が挿入されているため、その配列を解読することでアドリアマイシン耐性に関与する遺伝子を同定できる。実際に精製した死細胞のゲノムDNAを鋳型としてPCRを行い、次世代シーケンサーを用いて挿入されているライブラリーの配列を解読したところ、複数の候補遺伝子がリストアップされた。そこで、候補遺伝子を4種類に絞り込み、それらの発現を抑制した状況下でのアドリアマイシン感受性を評価した。結果として、4種類の候補遺伝子のうち、3種類については遺伝子発現抑制下でアドリアマイシン感受性が高くなった。(2種類のsiRNAで効果が見られたものと、1種類のsiRNAのみで効果が見られたものが存在する。)これらの3種類の遺伝子は、アドリアマイシン抵抗性を獲得したがん細胞に対して感受性を回復させるような、新たな治療標的としての可能性を有している。以上より、本研究で確立したスクリーニング法は、がん治療における新たな標的分子の探索に有用であると考えられる。本研究の目的は、細胞の生存に必須な遺伝子のリストを作成し、その中から、がんの治療に直結する分子標的を同定することである。ゲノム編集技術を利用してがん細胞の遺伝子を網羅的に破壊し、遺伝子破壊の結果として死んだ細胞由来のDNA情報から次世代シーケンサーを用いて生存必須遺伝子を同定する。それによって、全てのがん細胞に普遍的な弱点(生存必須遺伝子)を明らかにし、その情報を複数のがん細胞株間で比較することにより、個別のタイプのがん細胞に特徴的な弱点(治療標的候補)を見つけ出す。本年度は培養上清中に放出された死細胞由来のゲノムDNA断片を回収する方法の確立と、そこからゲノムDNA上に存在する標的遺伝子を増幅する方法の確立を目指した。まず、ゲノム編集を用いた実験系を確立するためのモデル実験系(卵巣癌細胞株A2780とそのアドリアマイシン耐性株であるA2780ADRを利用)を構築した。GFP遺伝子を導入したA2780細胞(A2780GFP)とA2780ADR細胞をアドリアマイシン存在下で共培養するとA2780GFP選択的に細胞死が誘導され、その結果としてA2780GFPのゲノムDNAが培養上清中に放出されるはずである。DNA抽出法を検討した結果、実際に培養上清から短鎖のゲノムDNA(約200bp)を精製することが可能であった。精製したゲノムDNA断片に対してPCRを行ったところGFP遺伝子の断片を検出することができた。また、このモデル実験系構築の過程では培養上清中のゲノムDNAの安定性に関する情報や検出感度に関する情報を得ることができた。以上の結果は死細胞由来のゲノムDNAを対象とした解析が実施可能であることを示唆している。研究立案時の最大の懸念事項であった死細胞由来のゲノムDNAを解析対象とすることについては、本年度の研究結果から実施可能であると考えられ、実験系構築の目処が立ったと考えている。しかし、ライブラリーを用いた網羅的な解析を行うためにはさらなるスケールアップのための条件検討が必要である。本研究では、ゲノム編集技術を利用してがん細胞の遺伝子を網羅的に破壊し、遺伝子破壊の結果として死んだ細胞由来のDNA情報から、がん細胞の生存に必須な遺伝子を明らかにすることで、がんの治療に直結する分子標的を同定することを目的としている。昨年度に実施した研究から、スモールスケールのモデル実験系においては、培養上清中に放出された死細胞由来のゲノムDNA断片を回収する方法と、そこからゲノムDNA上に存在する標的遺伝子を増幅する方法が確立できた。今年度は実際のスクリーニング規模に対応するラージスケールの試料からの精製条件を検討したが、培養上清を含む多量の試料から死細胞由来のDNAを精製することは困難であった。そこで培養上清に含まれるDNAは解析の対象から外すこととし、ディッシュから脱離した死細胞を回収し、そこからDNAを精製することで標的遺伝子をPCR法で増幅する方法を確立した。昨年度の研究で使用したモデル細胞であるA2780ADR(卵巣癌細胞株A2780のアドリアマイシン耐性株)のCas9発現クローン株を樹立し、この細胞株に対してガイドRNAのライブラリーをレンチウイルスベクターを用いて感染させた。細胞の生存に必須である遺伝子が破壊された場合にはこの時点から細胞死が誘導される。研究立案時にはこれらの生存必須遺伝子も解析対象としていたが、研究環境の制約などもあり、対象から外すこととした。ガイドRNAライブラリーを感染させたA2780ADR細胞を複数回継代することでゲノム編集が起こる時間を十分に確保し、その後にアドリアマイシンを添加した後、脱離した細胞を回収した。回収した細胞からDNAを精製し、ガイドRNAを含む領域をPCR法で増幅することに成功した。