hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
大規模複雑形状物体まわり流れの数値解析法の開発

大規模複雑な形状を持った物体まわりの流れを数値解析するためには格子生成に難点があり、一方砕波のような非線形な自由表面変形に対しても同様の問題がある。本研究は、これらを新しい数値解析技術の開発によって解決しようとするものである。まず矩形固定格子系を用い、この格子の中で物体表面条件を近似点に満足させる。次に自由表面条件の満足のさせ方と形状表現に密度関数法を用い、マーカー密度というスカラー量を各セルに定義して、この役割を担わせる。自由表面では表面張力と粘性応力を無視する代りに、重力による激しい運動、水面上の空気の運動をシュミレートすることとした。計算法はMAC法に似た差分法で、充分な時間精度を持って時間進行する方法とした。球をすぎる流れ、車をすぎる流れにおいて、この物体形状表現法の精度を評価し、剥離点が明確な物体では、充分な精度があることを確認した。等間隔の格子を使っているため、遠方場ではかえって解像度が高く、3次元剥離渦の構造理解に適していることが判った。密度関数を使った自由表面表現法は、マーカー密度が拡散してしまう欠点があるが、適切な差分スキームと変動格子幅を使えば、実用上充分な精度があることが2次元造波シミュレーションで確認された。同様の手法を3次元船首砕波に応用した結果、良好なシミュレーションができることが確認され、複雑な砕波メカニズムの解明にも役立つことが判った。2次元任意形状物体まわりの流れの計算法として、自由表面も含む流れも取り扱える方法を開発し、実際的な問題に応用できるよう改良を加えた。自由表面形状及び物体形状は線分の連続で近似し、一様流れや波によって発生する物体からの渦や、その自由表面との干渉などをシミュレ-トできるようにした。基本的にはナビエ・スト-ク式の時間発展計算であるので、格子間隔さえ適当であれば、かなりの広範囲の問題に応用できる。しかし、物理現象は本質的に3次元なので、このようなCFD技術の3次元版が必要である。複雑な形状に対応できるように、矩形直交格子系を採用し、この格子系に物理量をスタッガ-ド配置することとして、計算法を構築した。矩形直交格子で複雑な物体形状を取り扱えるようにするためには物体表面の形状表現と物体表面条件の満足のさせ方に工夫がいる。そこで、体積ポロシティ-と面ポロシティ-という考え方を導入し、この問題を解決した。球をすぎる流れをテスト計算に用いて、この取り扱いが適当で、工学的に意味のある精度が得られることを示した。この次元計算法を、海洋工学問題の一例として、地形性湧昇流の問題に応用してみた。海底上の山のような突起が、3次元の複雑な渦流れを生起することを明らかにし、本方法の応用可能性が証明された。3次元の複雑形状まわりの流れを矩形格子系を使ったナビエストークス式の時間発展解法を開発し、継続した改良を行うとともに、各種の問題に応用し、科学的工学的実用性の検討を行った。3次元計算の適用例として、球をすぎる流れ、回転体をすぎる流れ、箱体をすぎる流れ、海底火山をすぎる流れを扱った。大きなポイントは、任意の物体を取り扱える物体境界条件、自由表面のとり扱い方、流出渦の解像である。これらを解決し、有用なシミュレーション技術として証明することができた。徴細な乱流遷移問題には適当ではないが、剥離点の明確な流れに対しては、定性的かつ定量的に物理実験との良い斉合が得られる。最も重要な現象としての3次元剥離渦に関しては、コンピュータグラフィックスによる画像処理が必要である。ヘリシティーや圧力の2階微分の等値面などを使うことによって、剥離渦が変形ドーナツ状のスパン方向の軸を持つ渦と、ヘアーピン状の縦渦によって構成され、周期的な放出が行なわれていることなどが明らかになった。自由表面の新しい取扱いとして、二層流近似による方法を開発したが、その精度を数値造波シミュレーションにより確めた。来年度のより進んだ自由表面を含む大規模複雑形状物体まわり流れ解析への準備である。

複雑3次元形状まわりの物体表面条件を矩形格子の枠内で処理し、適合格子の利用が困難な物体まわりの流れのシミュレーションを行う技術は前年度までに、ほぼ完成されたので、今年度は、3次元複雑形状を持つ自由表面の表現技術の開発に重点を置いた。具体的には3次元砕波のシミュレーションを可能にし、水面に置かれた複雑形状物体まわりの砕波を含む3次元流れを説明することを可能にする。自由表面条件を新たに開発した密度関数法で行うこととし、2次元数値造波例で精度の確認を行い、また密度輸送方程式の解法の改良した。この方法を用い、波の砕波メカニズム、砕波後流場の説明、船首まわり3次元砕波構造の説明などを行った。
細胞内3ゲノムの遺伝子発現同時リアルタイム測定系の開発

本研究では、単細胞性緑藻クラミドモナスを用いて核と葉緑体の遺伝子発現を同時に、且つリアルタイムに測定するための基盤技術の開発に成功した。この成果は、光合成やバイオエネルギーの研究への応用が期待される。真核細胞には核以外にもゲノムを持ったオルガネラが存在する。ミトコンドリアと葉緑体である。これらのオルガネラのゲノムは核と異なり細菌とよく似た遺伝子発現機構で制御されている。生物は様々な環境変化に適応するために核やオルガネラゲノムの遺伝子発現をダイナミックに変化させることで細胞全体の調和をとっている。本研究では異なる波長で発光するルシフェラーゼレポーターを用いて核・葉緑体・ミトコンドリアの遺伝子発現を同時にリアルタイム測定できる世界で初めての実験系の確立を目指す。遺伝子発現のリアルタイムレポーターには大きく分けてGFP等の蛍光タンパク質とルシフェラーゼ等の発光タンパク質がある。クラミドモナスは光合成生物であるため葉緑体の自家蛍光が強く、蛍光タンパク質は不向きである。それに対し、ルシフェラーゼレポーターは励起光が不要であるため自家蛍光に影響されず、さらに定量性において極めて優れており、ダイナミックな量的変化を検出しようとする本研究に適している。申請者はすでにクラミドモナスの葉緑体ゲノムにルシフェラーゼ遺伝子を組み込んだ株(葉緑体レポーター株)を作製し、葉緑体の遺伝子発現モニタリングに成功している(Matsuo et al., 2006, Mol Cell Biol)。本研究ではそれに加え"核レポーター株"と"ミトコンドリアレポーター株"をそれぞれ作製する。核、葉緑体、ミトコンドリアはそれぞれ異なる波長で発光するルシフェラーゼ遺伝子を用いる。その後、交配により3つのレポーターを全て持った細胞を作製し、それぞれのオルガネラ由来の発光を光学フィルターで分光し、別々に定量する。今年度は核のレポーター株を作製した。クラミドモナスの核ゲノムの使用コドンに最適化した赤色ルシフェラーゼ遺伝子(鉄道虫由来)を人工合成により作製し、クラミドモナスの時計遺伝子の制御下で発現させ、生物発光を測定することに成功した。申請者はすでにクラミドモナスの葉緑体ゲノムに緑色に発光するホタルルシフェラーゼ遺伝子を組み込んだ株(葉緑体レポーター株)を作製し、葉緑体の遺伝子発現モニタリングに成功している(Matsuoet al.,2006,Mol cell Biol)。今年度は青色に発光するバクテリアルシフェラーゼの利用を試みた。バクテリアルシフェラーゼはLuxA、LuxBの2つのサブユニットかち成る。本研究ではレポーターとして利用しやすいようにLuxAとLuxBをGSリンカーで連結した融合タンパク質としてデザインした。さらにクラミドモナスにおける発現を増強するため、コドン最適化を施したcrLuxAB遺伝子を人工合成した。大腸菌でこの融合タンパク質を発現させ発光能を保持していることを確認した。その後、クラミドモナスの時計遺伝子の制御下で発現させたが、クラミドモナス細胞においては有意な発光は確認できなかった。
効率的な2本鎖DNA認識を達成するペプチド核酸の開発

生体内のゲノムDNAは、生命の設計図であり、そこから産生されるタンパク質が厳密に制御されることで、複雑な生命現象を構築している。本研究では、人工核酸と呼ばれる化学的に改変したDNAを利用して、ゲノムDNAを配列選択的に認識する新規技術を開発することを目指す。最終的には、本手法を利用することで、生命現象の解明や病気の治療法の開発などにつなげていきたいと考えている。
原子レベルの化学状態解析に基づく（ナノ）タングステンの土壌中での挙動・毒性解明

鉛の代替品としてタングステン(以下W)製品の利用が急増している.これまでWの環境影響・挙動に関する研究は,きわめて不足しており,特に環境中における移動性を把握するためには,土壌中における吸着現象の解明が必要である.本研究によって,水溶液中にW製の散弾およびシンカーからWが溶出することが確認された.シンカーからはW以外にNiの溶出も確認された.土壌に含まれる粘土鉱物に対するWの親和性は,Fe鉱物(ferrihydriteおよびgoethite),Mn鉱物(birnessite),層状ケイ酸塩鉱物(montmorillonite)の順に高いことが判明した.タングステンは,狩猟に用いられる鉛弾や釣りの錘(おもり)の代替材料,ならびにナノ粒子の光触媒効果を利用した消臭剤への利用が近年急速に拡大している.回収されない射撃弾や錘は風食されて,周辺土壌でタングステンが高濃度に蓄積することが確実に予想される.タングステンは,無機および有機化合物に限らず,ナノ粒子を含めて全般的に土壌中での動態がほとんど分かっていない.本研究では,タングステンの土壌・水系における挙動について,特に基本的で重要な溶解性・化学形態と,土壌の性質および水質との関係について明らかにする.平成26年度は,代表的なタングステン製品の,水および弱酸への溶解性を明らかにすることを目的として実験を行った.製品として,タングステン散弾,釣り錘,およびナノタングステン粒子を用いた.酸・弱酸・中性溶液を用いたバッチ試験を行い,短期長期(2.5年)の溶出試験を開始し,随時溶出したタングステンと他の元素濃度の計測を行った.タングステン製品からのWの溶出は散弾(214 mg g-1)ならびにシンカーから(0.040.5 mg g-1)において確認された.実験開始後60日目に溶液中のW濃度が最も高くなったのは,散弾ではpH8,シンカーではpH3の条件であった.シンカーからはNiの溶出が確認された(0.010.5 mg g-1).タングステンは,狩猟に用いられる鉛弾や釣りの錘(おもり)の代替材料,ならびにナノ粒子の光触媒効果を利用した消臭剤への利用が近年急速に拡大している.回収されない射撃弾や錘は風食されて,周辺土壌でタングステンが高濃度に蓄積することが確実に予想される.本研究では,タングステンの水系および土壌における溶解性ならびに土壌鉱物との吸着特性を明らかにすることを目的とする.27年度は,異なるpH条件における各種粘土鉱物に対するWの吸着挙動を明らかにすることを目的として研究を進めた.各種粘土鉱物に対するW吸着試験:Montmorilloniteおよび合成したferrihydrite,goethite,birnessiteに対し種々の濃度のNa2WO4・2H2Oを添加し,pH3,6および9の条件下で吸着等温線を作成した.作成した吸着等温線はFreundlich吸着等温式に回帰し,W吸着の親和性を示す分配係数(Kd)を算出した.酸性からアルカリ性域において,粘土鉱物とWの吸着の親和性を示す分配係数(Kd)は, goethite(4.1464.3) ,ferrihydrite(19.425.9), birnessite(0.3972.17),montmorillonite(0.0270.36)の順に大きくなった.このことから,溶液中のWは層状ケイ酸塩鉱物よりも鉄鉱物に吸着しやすいことが判明した.Goethite,birnessite ,montmorilloniteはpHが3から9に上昇するのに伴いKdは低下した.一方でferrihydriteでは,pH条件によるKdの変化は小さいことが判明した.各種粘土鉱物に対するタングステンの吸着挙動が明らかになり,吸着選択性の序列がpHによって異なることが判明した.タングステン(W)製品の利用の拡大に伴い,土壌および地下水環境中におけるW濃度の増加,ならびに曝露の機会が増加する可能性がある.Wの土壌中における吸着挙動はpHおよび共存するイオンによる影響を受ける.例えば,環境中に放出された単体のWは酸化されてWO4として溶解するため,リン酸(PO4)やモリブデン酸(MoO4)などの陰イオンの存在によって吸着が阻害されることが報告されている.Wの毒性の評価および地下水質汚染に関する議論において,土壌中におけるWの吸着挙動および移動性は重要な知見になると考えられる.本研究では,土壌を構成する主要な層状ケイ酸塩鉱物および酸化物鉱物に対するWの吸着挙動に,PO4およびMoO4が及ぼす影響を明らかにすることを目的とした.研究の結果,粘土鉱物へのWO4の吸着は,溶液中のPO4あるいはMoO4によって阻害あるいは促進される場合もあれば,粘土鉱物によっては影響を受けない場合もあることが確認された.他の粘土鉱物と比較して,ferrihydriteへのWO4の吸着は,PO4およびMoO4の存在によって吸着が顕著に阻害された.Gibbsiteとgoethiteでは,PO4の存在によってWO4の吸着が阻害されたが,MoO4による阻害はほとんど起こらなかった.BirnessiteではPO4およびMoO4の存在によるWO4の吸着阻害はほとんど起こらなかった.MontmorilloniteではMoO4の存在によってWO4の吸着が促進されることが判明した.鉛の代替品としてタングステン(以下W)製品の利用が急増している.これまでWの環境影響・挙動に関する研究は,きわめて不足しており,特に環境中における移動性を把握するためには,土壌中における吸着現象の解明が必要である.

本研究によって,水溶液中にW製の散弾およびシンカーからWが溶出することが確認された.シンカーからはW以外にNiの溶出も確認された.土壌に含まれる粘土鉱物に対するWの親和性は,Fe鉱物(ferrihydriteおよびgoethite),Mn鉱物(birnessite),層状ケイ酸塩鉱物(montmorillonite)の順に高いことが判明した.代表的なタングステン製品の,水および弱酸への溶解性を明らかにすることを目的として実験を行い,測定データが蓄積しつつあるため.粘土鉱物に対するタングステンの吸着に及ぼす競合イオンの影響を明らかにしていく.競合イオンとして検討しているのは,同じオキソ酸であるリン酸やモリブデン酸を検討している.これらの元素は土壌中においても重要である.基礎的な知見として学会誌に発表することを目指して取り組む.環境化学タングステンと土壌中に存在する主要な粘土鉱物(層状ケイ酸塩鉱物,酸化アルミニウム・鉄鉱物など)との吸着特性について,実験を行い検討していく.予備的実験に研究の多くの時間を割いたため,予定よりも少ない研究費の使途になった.学会発表をする予定であったが,次年度に変更したため.学会発表のための旅費ならびに現地調査の調査費を行う.実験消耗品や器具の購入に充てる.
Toll様受容体リガンドの骨破壊機序に関する研究

Toll様受容体リガンドの破骨細胞誘導能について検討した。TLR2リガンドの単独刺激で破骨細胞は分化するが、TLR4リガンドの単独刺激では分化が起こらない。TLR4下流に存在するTRIF/TRAM経路から産生されるIFN-βが分化の抑制因子として作用している可能性がある。今回TRIF/TRAM経路を遮断する実験を行ったが、破骨細胞誘導に変化は認められなかった。TLR4を介した破骨細胞分化では、IFN-β以外の抑制要因の存在が示唆された。破骨細胞は骨芽細胞が産生する破骨細胞誘導因子(RANKL)の刺激を受け、成熟破骨細胞へと分化し骨吸収能を発現する。しかしながら、内因性のTNF-αや外因性の細菌由来成分、いわゆる免疫反応に関わる要因によっても破骨細胞誘導が起こることから、炎症(免疫)と破骨細胞分化は密接な関係があるものと考えられる。我々は、菌体成分により誘発される破骨細胞誘導のメカニズムが異なることを見いだした。そこで本年度は、菌体成分であるLPSとPam3、すなわちTLR4とTLR2を介した破骨細胞誘導およびサイトカイン産生にっいて検討を行った。破骨細胞分化誘導は、マウスマクロファージ細胞株RAW264.7またはマウス骨髄由来マクロファージ(BMM)を用い、破骨細胞をTRAP染色により検出した。細胞を低濃度のRANKLで刺激後、LPSまたはPam3を添加するとTRAP陽性多核細胞が多数誘導された。さらに、LPSまたはPam3のみを細胞に添加した場合、TRAP陽性多核細胞はPam3刺激のみでも誘導されることが明らかとなった。この誘導は、BMMよりもRAW264.7でより顕著であった。これらの分化誘導系で産生されたサイトカイン(IL-1β,IL-6,TNF-α)についてELISA法を用いて測定した。RANKLのみで刺激した場合と比較した結果、低濃度のRANKL刺激後にLPS刺激またはLPSのみで刺激した細胞は、いずれのサイトカインも著しく高値であった。一方Pam3は、単独刺激ではいずれのサイトカインもLPSと同様に高値を示したが、RANKLで前処理した場合はRANKLのみ刺激した場合と同程度の産生量であった。このことから、LPSまたはPam3のみで刺激した場合の破骨細胞誘導の違いは、今回検討したサイトカインの関与が低い可能性が示された。TLR4またはTLR2のシグナル系を介して産生される、破骨細胞分化に作用する他のサイトカインの存在が考えられた。破骨細胞分化は、RNAKLの刺激を受けて成熟するが、細菌由来成分に対する免疫反応でも誘導される。我々は、Toll like Receptor(TLR)4は、RNAKL存在下において、LPS刺激により破骨細胞分化を誘導するが、TLR2では、RNAKL非依存的にリガンド成分Pam3単独刺激で破骨細胞を誘導することを見出した。両受容体ともMyD88を介したシグナル伝達系が活性化され破骨細胞誘導に寄与するが、TLR4の下流にはTRIF/TRAM経路が併存し、活性化されると破骨細胞分化抑制因子インターフェロン(IFN)βが産生される。そこで、TLR2とTLR4を介した破骨細胞誘導能の違いはTRIF/TRAM経路の存在にあると仮説を立て、検証実験を行った。破骨細胞の前駆細胞の性質を有するRAW cellを用い、TRAM遺伝子、またはこのシグナル系で活性化されるIRF3遺伝子、IRF7遺伝子を標的に、各knockdown細胞を作製した。各細胞を低濃度のRANKLで刺激した後、LPSまたはPam3を添加するといずれも破骨細胞様細胞が誘導されたが、TRIFのknockdown細胞において、他の細胞に比べ破骨細胞誘導の亢進が認められた。次に、IRF3とIRF7の両方をknockdownした細胞で検討したが変化は認められなかった。このことから、今回の結果では、TLR4経路における破骨細胞誘導の抑制にはシグナル経路上流に位置するTRAMの関与が示唆されるが、下流の転写因子の関与が認めらないことから、インターフェロンγによる抑制なのか、knockdownがうまく作動していないのかなど、さらなる検討が必要であることが考えられた。破骨細胞は、RNAKLの刺激を受けて分化・成熟するが、細菌由来成分に対する免疫反応でも分化誘導される。我々はToll like Receptor(TLR)4は、マクロファージにおいてRNAKL存在下でLPS刺激により破骨細胞分化を誘導するが、TLR2では、RNAKL非依存的にPam3刺激のみで破骨細胞を誘導することを見出した。両受容体ともMyD88を介したシグナル伝達系の活性化が破骨細胞誘導に関与しているが、TLR4にはTRIF/TRAM経路が併存し、活性化されると破骨細胞分化抑制因子となるインターフェロン(IFN)βが産生される。

そこで、TLR2とTLR4を介した破骨細胞誘導能の違いはTRIF/TRAM経路の存在にあると仮説を立て、引き続き検証実験を行った。破骨細胞の前駆細胞の性質を有するRAW細胞を用い、TRIF/TRAM経路で活性化されるIRF3またはIRF7遺伝子を標的にknockdown細胞を作製した。各細胞をRNAKLで刺激すると破骨細胞に分化したが、LPSまたはPam3のみで刺激した場合、Pam3では単核の破骨細胞様細胞が誘導され、LPSでは変化が認められなかった。マーカー遺伝子の発現を調べた結果、分化に必須の転写因子c-fosがLPS、Pam3刺激共に発現上昇していることが分かった、しかし、LPS刺激によるIFN-βの発現は、コントロール群に比べ低下したが、knockdown細胞でも確認された。次に、TRIF阻害剤を用い、TRIF/TRAM経路の阻害を試みた。破骨細胞誘導実験においてLPSまたはPam3のみで刺激した結果、knockdown細胞と同様に、LPSでは変化が認められなかった。また、マーカー遺伝子の発現を調べた結果、LPSはPam3刺激と同じくc-fosの発現が確認できたが、酒石酸耐性酸ホスファターゼ(TRAP)の発現亢進は確認できなかった。TRIF/TRAM経路の阻害においても、LPS刺激で著しい破骨細胞誘導効果は確認できないが、c-fos遺伝子の発現が上昇することから、LPS刺激のみでも破骨細胞分化へ方向付ける刺激が与えられていると考えられる。TLR4とTLR2の刺激による破骨細胞分化の違いはTRIF/TRAM経路から誘導されるIFN-βの影響が強い可能性を考えていたが、確骨細胞誘導を途中で遮断する他の要因の存在が示唆された。
糖尿病性末梢神経症に及ぼす血糖コントロールの影響

強化インスリン療法による糖尿病治療では低血糖の頻度が上がり、このために神経障害がおこることが報告されている。どの程度の低血糖状態で神経病変が誘発されるかを調べるために、ヒトの糖尿病性神経症と類似する病変が形成されるWBN/Kobラットをもちいて、30日間の血糖コントロールが末梢神経病変に与える影響を検討した。その結果、坐骨および脛骨神経では、自然発症糖尿病動物では80週齢では軽度の末梢神経症を発現するに過ぎないが、インスリン投与により血糖値が60mg/dl以下に低下した場合には,重度の低血糖性神経病変が誘発されることがわかった。60mg/dl以上でコントロールすることにより、病変形成は抑制され、神経伝導速度の低下も抑制されることが明らかとなった。そこで、インスリン投与による長期間の血糖コントロールによりWBNにみられる糖尿病性末梢神経症の進行をどの程度抑制できるのかをしらべた。50週間にわたる長期のインスリン投与により、WBNラットの末梢運動神経の病変形成を顕著に抑制することが出来た。このことは、WBNラットの末梢運動神経病変が糖尿病に起因することを証明するとともに、血糖の適切な制御が末梢神経病変形成を抑制することを明らかにした。これらの結果から、血糖を60mg/dl以下にすると、たとえ短期間の低血糖でも末梢神経に器質的な影響を与えることから適切な血糖コントロールが重要であることを明らかになった。くわえて、WBNラットが優れた糖尿病性末梢運動神経症のモデル動物となることも証明された。方法:糖尿病を発症した18カ月齢のWBN/Ko bの雄とその対照として18同月齢のWBNの雌を用いた。インスリンペレットを40日間皮下に埋め込み、血糖値により低血糖群、正常/経度高血糖群、無処置群に群分けした。その後麻酔、全身灌流固定し、坐骨神経、脛骨神経を採取しエポン包埋光顕標本、電顕標本を作製した。標本には免疫染色、酢酸ウラニルクエン酸鉛染色を施して神経、神経内膜や血管の変化などについて光学顕微鏡、電子顕微鏡を用いて詳細に観察した。結果:各群間に、一般状態、体重に有意な差異はなかった。血漿中インスリン濃度は低血糖群、正常/軽度高血糖群で差異はなかった。形態学的に神経病変は低血糖群で高度であった。形態計測を用いた定量的解析で、神経束面積には変化はなかったが、神経線維密度は正常/軽度高血糖群に比べ低血糖群、無処置糖尿病群の両方で減少した。平均神経線維占拠率は特に低血糖群での減少が著しかった。神経線維面積の平均値には差を認めなかったが、ヒストグラムでは無処置糖尿病群、正常/軽度高血糖群、低血糖群ともにきれいな二峰性を示した。しかし、その分布は各群で変動しており、無処置糖尿病群に比べて正常/軽度高血糖群では小口径の線維が増加し、低血糖群では中口径の線維が増加した。まとめ:神経病変は過剰な血糖コントロールよっても誘発されることから、適切な血糖コントロールが必要なことが再認識された。方法:95週齢のラットを用い、以下の4群を構成した。15週齢のWBN/kobにアロキサンを投与し糖尿病を早期に誘発し95週齢まで糖尿病状態を継続させた群(AL群),同様のアロキサン誘発糖尿WBN/kobラットに17週齢からインスリンペレットを皮下に埋め込み血糖を制御した群(AL+I群)、約40週間の糖尿病状態を継続した自然発症糖尿病WBN/kobラット(S群)および対照としてF344ラット(C群)を用いた。それぞれの動物から坐骨神経、脛骨神経を採取しエポン包埋光顕標本、電顕標本を作製した。神経、神経内膜や血管の変化などについて光学顕微鏡、電子顕微鏡を用いて詳細に観察した。結果:AL群で一般状態の悪化と体重の減少を認め、AL+I群では一般状態の改善とともに体重が増加した。

高度の糖尿病状態をSおよびAL群では持続したが、AL+I群では血糖、尿糖値が正常値から高値まで変動した。運動神経伝導速度は、糖尿病の3群では、C群と比較して有意に低下したが、3群間での差は無かった。形態学的観察では、糖尿病の3群においてミエリン層板の離解、脱髄、髄鞘再生、軸索変性、神経内膜の線維化、神経束内血管の基底膜の重層化を認めたが、3群間に差はなかった。また、神経線維のサイズの分布にも差がなかった。まとめ:アロキサンで誘発した糖尿病状態の持続および高度化により、WBN/kobラットの糖尿病性末梢神経症を重度化することは出来ず、インスリンによる治療もこのラットの糖尿病性神経症には顕著な影響をあたえなかった。【目的】短期の血糖コントロール実験の結果、60mg/dl以下に血糖が低下することにより顕著な神経病変が形成されることがわかった。また、その神経病変は、WBNに自然発症する病変とも異なることが明らかとなった。そこで、インスリン投与による長期間の血糖コントロールによりWBNにみられる糖尿病性末梢神経症の進行をどの程度抑制できるのかをしらべることを目的とした。【材料および方法】糖尿病を発症した40週齢のWBN/Kobの雄を用いる。この動物にインスリンを混ぜた樹脂(持続的なインシュリン分泌が可能な樹脂)を50週間、背部皮下織に埋め込み、持続的に血糖値を低下させた。血糖値の過度の低下を防止するために埋め込む樹脂量を調整し、100mg/dlから400mg/dl前後の動物を作製した。対照群として血糖コントロールを行っていないWBN/Kobを用いた。90週齢時に坐骨神経伝導速度(CV)を測定後、剖検し坐骨および脛骨神経病変について形態学的解析をおこなった。【結果】1.インスリン樹脂が40日前後しか持続的にインスリンを放出しないため、インスリン樹脂を約5回程度追加で投与した。このため血糖値は、100mg/kgから400mg/kgの間を変動した。2.CVは対照群およびインスリン投与群で有意な差はなかった。3.インスリン投与群では、対照群と比較して、髄鞘層板の解離、髄鞘崩壊、軸索の萎縮および神経内膜の拡大の程度が軽度となった。特に、軸索の萎縮および神経内膜の拡大の卸制は顕著であった。4.神経病変は、坐骨神経のほうが脛骨神経より強かった。5.脛骨神経の形態計測では各群の神経束の平均口径には変化がなかったが、インスリン投与群では神経線維面積および軸索面積が有意に高値であり、神経内膜の面積は有意に低値を示した。【まとめ】1.インスリン投与により、WBNラットの末梢運動神経の病変形成が顕著に抑制することが出来た。このことは、WBNラットの末梢運動神経病変が糖尿病に起因することを証明するとともに、血糖の適切な制御が末梢神経病変形成を抑制することを明らかにした。2.WBNラットが優れた糖尿病性末梢運動神経症のモデル動物となることを明らかにした。
ヤドカリはなぜ交尾直前に脱皮するのか:変動環境下における成長と繁殖の資源配分戦略

ヤドカリには交尾・産卵直前に雌が(1)常に脱皮する種、(2)脱皮しない種、(3)脱皮したりしなかったりする種がいる。(2)や(3)に属する種の存在は、脱皮がヤドカリの配偶行動に不可欠ではないことを示唆する。しかし多くの種で雌は交尾直前に脱皮する。本研究は交尾直前脱皮の適応的意義の解明を目的としておこなった。上記(3)に属する種では、同一個体群の雌が連続産卵雌(過去に産卵した卵を孵化した雌がすぐに雄と交尾し産卵する)と不連続産卵雌(過去の卵を持たない雌が産卵する)に区分できる。本研究はこの点に着目して以下の仮説を検証した。成長仮説:雌は脱皮のコストで不連続産卵となっても、成長するために脱皮する繁殖仮説:脱皮が抱卵場所の更新に役立つならば、雌は連続産卵時に脱皮する上記(3)に属し高知県で普通に見られるホンヤドカリ属3種(ホンヤドカリ、クロシマホンヤドカリ、ユビナガホンヤドカリ)を対象種として、野外で雄に交尾前ガードされている雌をペアとして採集し、研究室で産卵まで飼育して、連続/不連続産卵の識別と脱皮の有無等を比較した。その結果、全ての種で成長仮説が支持された。さらにユビナガホンヤドカリを用いて、脱卵数、抱卵数、オスとメスの体サイズ、メスが背負っている貝殻サイズが脱皮頻度に与える影響を訥べた結果、脱皮によって脱卵数が増加し抱卵数が減少する傾向を認められた。また、脱皮あたり成長率は有意に0よりも大きく、脱皮によって体サイズが増大することが明らかとなった。以上の結果でも成長仮説が支持された。ホンヤドカリ属の他種を含めた種間比較の結果、成長仮説はホンヤドカリ属における(1)-(3)の種間変異もよく説明することが示唆された。また脱皮はエネルギーコストを伴うと考えられ、このコストは産卵数の減少をまねくかもしれない。このように交尾直前脱皮は甲殻類の生活史における興味深い現象だが、これまで研究例はなかった。本研究はこの点に着目して以下の2つの仮説を検証した;成長仮説:雌は脱皮のコストで不連続産卵となっても、成長するために脱皮する;繁殖仮説:脱皮が抱卵場所の更新に役立つならば、雌は連続産卵時に脱皮する。上記(3)に属し高知県土佐湾で普通に見られるホンヤドカリ属3種を対象種として、野外で雄に交尾前ガードされている雌を、その雄と一緒に産卵まで飼育し、連続/不連続産卵の識別、脱皮の有無、脱皮時の成長率、卵数を比較した。さらに成長仮説は(1)-(3)の種間変異もよく説明することが示唆された。しかし、繁殖盛期には連続産卵雌頻度の増加と同時に脱皮頻度の増加が観察されたため、成長仮説で想定した成長と繁殖のトレードオフは同一繁殖期内の連続産卵頻度と脱皮頻度の時間変化を説明することはできなかった。

ホンヤドカリ属の他種を含めた種間比較の結果、成長仮説はホンヤドカリ属における(1)-(3)の種間変異もよく説明することが示唆された。
直立姿勢と立位運動時の重心動揺解析にる体平衡評価に関する研究

立位の種々の姿勢と運動を重心動揺計で計測する方法の確立と、それによる直立、運動姿勢の解析を目的として3年間の研究を実施した。1、重心動揺計1G06のoutputを直接AD変換し、またSignal Processor7T08の解析記録をそれぞれPC-9801へ転送し、sampling timeを10-50mseoに変えて解析する方法を検討した。重心動揺計は、床面に投影される重心の位置を検出するもので、moment(torque)を体重で除し、XYの位置の経過をanalog deta recorderで記録し、sampling timeを設定し、そのdigital dataをPC-9801へ転送し、軌跡長、速度、確立密度分布、周期波形の各部分要素の平均値、標準偏差を目的に従って求めることが出来た。また、重心動揺計の較正を検討した。2、重心動揺計にて、健康診断受診者285名(男198名、女87名)のロンベルグ姿勢で開閉眼60秒間直立時の重心動揺軌跡長、面積を求めた。10歳代ごとに検討し、閉眼は、開眼より有意に増加した。20歳代に比べ、軌跡長の有意な増加は閉眼ではみられず、開眼では、男性で60、70歳代で、女性では70歳代で有意に増加した。面積では、開閉眼、男女とも70歳代で有意に増加した。3、直立時の各種運動動作の解析を実施した。足踏みでは遊脚相の足挙上時には足圧中心(center of foot pressure CFP)は対側とやや前方へ急速な移動が、足降下時には対側後方への急速な移動が出現した。立脚相ではCFPは最外側に位置しその後やや内側前方に移動した後再び外側後方へ戻り遊脚相へ移行した。足踏み反復では前方凸の円弧を示す。直立で体幹の左右傾、前後傾では、それぞれ左右、前後方向に大きく、左右捻転では左右前後への大きい動きがみられた。閉眼直立での動揺は上記一連の運動後増加したが10分で運動前に復した。直立運動姿勢のEFPの解析は運動リハビリテーションの評価に利用出来ると結論した。直立時重心動揺検査値の加齢変化正常被検者349名について両脚閉足直立(ロンベルグ姿勢)1分間の重心動揺軌跡長,動揺面積を測定した。開閉眼差は,年齢,性に関係なく有意で,閉眼で増加した。男性20ー59歳の平均値は、動揺面積(mm^2)は開眼235ー297,閉眼355ー417,軌跡長(mm)は開眼740ー760,閉眼973ー1070であった。60歳以上では,動揺面積開眼は301,閉眼は467,軌跡長開眼813,閉眼1134であった。女性では男性に比べ動揺が少なく,60歳以上では60歳未満に比し,動揺が有意に増加した。異る直立姿勢での重心動揺の周波数分析による検討50歳未満の正常被検者19名について異なる直立姿勢を1分間とらし,10z Low pass filterを通し,重心動揺をdatarecorderに記録し,結果をsignal processor7T08(三栄測度)で解析した。

10Hz以下を7用波数帯域に分け,各用波数帯域のパワ-のル-ト変換値を百分率で求めた。ロンベルグ姿勢開眼では0.5Hz未満,1Hz未満,1Hz以上5Hz未満を4域にそして5Hz以上に分け,左右方向動揺ではそれぞれ,51,14,12,5,3,3,12%であり、前後方向動揺では57,10,9,4,3,2,13%であった。ロンベルグ姿勢閉眼では左右,前後とも5Hz以上で有意に減少した。開眼マン姿勢,暈脚直立、膝関節屈曲直立,つま先立ち,飛行機型暈脚直立では,前後方向については,5Hz未満の6用波数帯域でいづれも,ロンベルグ姿勢開眼と比べて有意な増減が認められた。しかし,左右方向ではマン姿勢,暈脚直立,飛行機型暈脚直立を除き変化はみられなかった。この結果は今後,立位運動時の重心動揺の評価に役立つと考えられた。1重心動揺計の校正:重心動揺計は、被験者を検査台上に直立させ、台上に投影される身体の重心を、足圧中心のxy方向の位置で検出し、その動揺を捉える。内蔵の計算システムにより、体重で補正しモ-メントを距離出力とし、重心動揺計1G06では、出力感度はxy方向にそれぞれ、100mv/cm±10%、精度は±1%FSとある。検査台上で、半径7cmの円弧上に鉄製砲丸7.25kgを転がし、作図し校正した。機器納入の時点での校正で、作図上の円は歪み、それを修正したが、出力誤差はxyとも+12%であった。重心動揺計の校正はJISで規定されているが、絶対値については、なお検討の余地がある。2重心動揺軌跡長、動揺面積の測定:アニマ社製、立位平衡訓練評価システムJー6100Sを使用して、健康診断受診者男198名、女87名について、ロンベルグ姿勢、閉足姿勢60秒間の軌跡長は、次の通りであった。以下開眼、閉眼の平均値(mm)と標準偏差を示す。20歳代:男(N:15)768ー174/1132ー309女(N:15)723ー174/1082ー31430歳代:男(N:15)835ー180/1203ー361女(N:10)825ー243/1139ー23540歳代:男(N:60)826ー199/1287ー404女(N:15)690ー123/1034ー31650歳代:男(N:60)835ー174/1316ー411女(N:30)796ー157/1108ー25260歳代:男(N:39)926ー261/1385ー480女(N:13)841ー169/1205ー38070歳代:男(N:9)1037ー194/1459ー559女(N:4)911ー164/1297ー394アンダ-ラインのみ20歳代に比べ有意に増加した。動揺面積については開閉眼とも、男女ともに、20歳代に比べ、70歳代のみが有意に増加した。60歳未満では20歳代と同じと結論した。3単脚、マン直立、頚部捻転、足踏みの重心動揺:単脚では、xy方向へ、マン直立では、x方向へ、動揺が増加し、頚部捻転の変化は微小であった。足踏みは、歩調に合わせて、前方凸の円弧を描いた。重心動揺計により検査台の上での各種の直立動作を計測し、Deta recorderの記録をSignal processor7T08、ならびにAD変換し、PC-9801 Computorに転送し、10-50msecにsampling timeを変えて解析した。足踏み:両側上肢を体側につけたまま、大腿を45度まで挙上し、60歩の開眼足踏み運動を計測した。足挙上時には足圧中心(center of foot pressure、CFP)は前方対側へ移動し、足降下時には再び後方対側へ向かい接床する。足踏みの繰り返しではこれを反復し前後方凸の円弧を描く。
放線菌の生産するプレニルインドールアルカロイドの生合成研究

本年度は放線菌の生産するプレニルインドール化合物カルキノスタチンAの生合成マシナリーの解明に取り組み、そのカルバゾール骨格形成の分子機構の解明を目指した。標識前駆体を用いたトレーサー実験の結果から、カルバゾールの炭素骨格はトリプトファン、ピルビン酸、2分子の酢酸に由来することが示唆されていた。この結果を考慮し、カルバゾール生合成の初期段階ではトリプトファンおよびピルビン酸の縮合、およびアシル側鎖の付加が生じ、次いでこれらの炭素鎖を骨格として閉環反応が進み、カルバゾール環構造が形成されると予想した。そこで、炭素ー炭素結合形成および環化反応に関与すると推定したケトアシルACP合成酵素CqsB1、機能未知タンパク質CqsB2、チアミン依存型酵素CqsB3に着目し、これらの組換え酵素を用いてin vitro解析を実施した。その結果、CqsB1, 2, 3の全酵素を含む反応系においてのみ、カルバゾール骨格を有する生合成中間体を確認することができた。この結果から、カルバゾール骨格の生合成における一連の増炭、閉環、酸化反応の全てをCqsB1, 2, 3が担うことが明らかとなった。特に、CqsB2は閉環反応およびオルトキノン形成を触媒するカルバゾール環合成酵素であることが判明した。カルバゾール環形成の鍵酵素であるCqsB2の反応機構を解明するため、さらに本酵素のX線結晶構造解析を実施した。SeMet置換体結晶を用いたSAD法により構造決定を行った結果、CqsB2の初期構造が明らかとなった。今後、立体構造に基づく機能解析を進めることで、前例のないカルバゾール環形成の触媒機構を解明できると考えている。本研究により、自然界におけるアルカロイドの生合成機構の多様性の一端を示すことができたと同時に、新たな生物活性物質の創出に向けた生合成経路あるいは酵素の改良・設計への貢献が期待される。29年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では、放線菌の生産する生物活性物質であるプレニルインドールアルカロイド(カルキノスタチンA, Bおよびラバンドキノシン)の生合成マシナリーを明らかにすることにより、微生物を利用した医薬品リード化合物の効率的な生産や新規有用化合物の創製に取り組むことを目的としている。本年度は、以前に同定したSqualene synthase-likeな新規のプレニル基転移酵素(CqsB4)の機能解析、およびシクロラバンデュリルジリン酸合成酵素(CLDS)のX線結晶構造解析を実施した。CqsB4の基質を同定するため、cqsB4遺伝子破壊株を作製しその培養抽出物を分析した結果、カルキノスタチンAのイソプレノイド側鎖が失われたカルバゾール化合物4を単離・構造決定することができた。そこでCqsB4の組換えタンパク質を化合物4およびDMAPPと反応させたところ、その反応産物からカルキノスタチンAの生成が確認できた。このことから、CqsB4は化合物4にジメチルアリル基を転移することで、カルキノスタチンA生合成の最終段階の反応を担っていることが明らかとなった。さらに化合物4およびDMAPPを基質として、CqsB4の動力学的パロメーターを算出した。加えて、ラバンドキノシンの生合成に関与すると予想されるシクロラバンデュリル2リン酸合成酵素(CLDS)のX線結晶構造解析に取り組んだ。その結果、セレノメチオニン置換体タンパク質の回折データをもとにCLDSの構造を決定することができた。今後、その立体構造情報に基づいた生化学的解析を進めることで、CLDSの触媒する2分子のDMAPPの縮合と環化の反応機構に関する知見が得られると考えている。プレニル基転移酵素CqsB4の基質となる生合成中間体の同定に成功し、カルキノスタチンA生合成における本酵素の機能を明らかにすることができたため。また平成28年度研究計画に記載したCLDSの構造の解明を本年度達成することができたことから、おおむね順調に進展していると判断した。本年度は、2分子のジメチルアリル二リン酸(DMAPP)からシクロラバンデュリル二リン酸(CLPP)を生成するテルペン合成酵素CLDSの反応メカニズムの解明に取り組んだ。CLPPの生合成機構を明らかにするため、メチル基の水素原子を重水素で置換したラベル化DMAPPを用いて、そのプロダクトの標識パターンを解析した。GC-MSおよびNMR解析の結果、非標識のCLPPの分子量154に対して、ラベル化DMAPPを基質としたプロダクトの分子量は12増加した166であったことから、2分子のラベル化DMAPPに含まれる計12個の重水素が全てCLPPに残ることが判明した。また昨年度にCLDSの結晶構造の決定に成功していることから、その立体構造情報をもとに活性部位近傍のアミノ酸残基を置換し、その変異体の解析を実施した。その結果、基質結合ポケット付近に位置するアミノ酸残基を置換した変異体において、CLPPの他に新たなプロダクトの生成を確認することができた。そこでGC-MSによる保持時間とマススペクトルの比較を行ったところ、このプロダクトは非環状のラバンデュリル二リン酸(LPP)である可能性が高いことが明らかになった。以上のトレーサー実験と変異体解析の結果を考慮すると、CLDSの触媒機構により2分子のDMAPPが縮合して中間体LPPが生成したのち、閉環反応が進行してCLPPが生成するものと予想できる。

CLDSは、イソプレン側鎖の縮合と環化反応を同一酵素が触媒する初めてのテルペン合成酵素であり、本研究により自然界におけるテルペン合成反応の多様性の一端を示すことができると期待している。研究計画に記載したように、CLDSの基質認識や環化反応に重要と考えられるアミノ酸残基を見出し、本酵素の推定反応機構を支持する結果を取得することができたため、おおむね順調に進展していると判断した。本年度は放線菌の生産するプレニルインドール化合物カルキノスタチンAの生合成マシナリーの解明に取り組み、そのカルバゾール骨格形成の分子機構の解明を目指した。標識前駆体を用いたトレーサー実験の結果から、カルバゾールの炭素骨格はトリプトファン、ピルビン酸、2分子の酢酸に由来することが示唆されていた。この結果を考慮し、カルバゾール生合成の初期段階ではトリプトファンおよびピルビン酸の縮合、およびアシル側鎖の付加が生じ、次いでこれらの炭素鎖を骨格として閉環反応が進み、カルバゾール環構造が形成されると予想した。そこで、炭素ー炭素結合形成および環化反応に関与すると推定したケトアシルACP合成酵素CqsB1、機能未知タンパク質CqsB2、チアミン依存型酵素CqsB3に着目し、これらの組換え酵素を用いてin vitro解析を実施した。その結果、CqsB1, 2, 3の全酵素を含む反応系においてのみ、カルバゾール骨格を有する生合成中間体を確認することができた。この結果から、カルバゾール骨格の生合成における一連の増炭、閉環、酸化反応の全てをCqsB1, 2, 3が担うことが明らかとなった。特に、CqsB2は閉環反応およびオルトキノン形成を触媒するカルバゾール環合成酵素であることが判明した。カルバゾール環形成の鍵酵素であるCqsB2の反応機構を解明するため、さらに本酵素のX線結晶構造解析を実施した。SeMet置換体結晶を用いたSAD法により構造決定を行った結果、CqsB2の初期構造が明らかとなった。今後、立体構造に基づく機能解析を進めることで、前例のないカルバゾール環形成の触媒機構を解明できると考えている。本研究により、自然界におけるアルカロイドの生合成機構の多様性の一端を示すことができたと同時に、新たな生物活性物質の創出に向けた生合成経路あるいは酵素の改良・設計への貢献が期待される。カルキノスタチンA生合成遺伝子クラスターに存在する機能未知遺伝子の酵素学的解析を進め、カルバゾール骨格形成機構の全容解明を目指す。また、CqsB4を含む各酵素の構造解析に取り組み、基質特異性や触媒機構に関する情報を取得する。現在予想しているCLDSの反応機構の妥当性を、計算化学により検証する。さらに、ゲノムマイニングにより複数の放線菌からCLDS遺伝子ホモログが見出されていることから、本遺伝子の周辺領域を詳細に解析し、シクロラバンデュリル構造を有する未知のテルペン化合物の同定に取り組む。29年度が最終年度であるため、記入しない。
肺線維症における細胞増殖と癌化機構の研究

特発性間質性肺炎(IIP)患者の730%は肺癌を合併すると報告されており、逆に肺癌患者の約8%にIIPがみられ約35%に肺の間質性変化が認められる。すなわち、肺の線維化は肺癌の発生素地として重要な意味を持つと考えられる。そこで、肺の間質性変化を有する肺癌患者20例を対象に肺線維症における細胞増殖と癌化機構の検討を試みた。癌組織におけるp53の発現は70%の症例でみられた。線維化を呈した部位では、45%の症例に肺細胞上皮と細気管支上皮におけるp53の過剰発見を認めたが、染色性は弱く部位によって不均一であった。p21の陽性率は癌で67%、線維化部分で50%であった。PCNAの陽性率は癌で90%に、線維化で60%にみられたが部位は気管支上皮を中心に不均一に分布していた。Fasは癌では発現がなく、線維化の部位に発現がみられた。線維化部におけるTUNEL染色陽性率は50%であった。また、連続切片を作成したケースで多視野にわたって検討したところp53,PCNA,TUNEL染色の陽性部位は巣状に分布しかつ同部位に認められた。これらの結果より、線維化を有する組織では細胞増殖と細胞傷害(またはアポトーシス)の機序が同時に生じていることが示された。これらの結果は、線維化組織においてはDNA傷害や修復が起こっており、肺発癌の発生母地となりうることを示唆している。線維化の部位におけるp53過剰発現は癌化の前段階としての遺伝子変異を反映するのか、アポトーシス誘導によりDNAのstabilityを保つための生体反応なのかを確認するために、同部位におけるp53遺伝子解析を行っている。肺線維疾患者に肺癌が多発することは知られているが、その機序は不明である。我々は、肺線維疾患者からの生検材料を用いて、その機構を分子生物学的な検討を加えた。1)14人の肺線維症患者から得た肺組織を癌抑制遺伝子であるp53およびp21の抗体を用いて免疫染色を行った。p53は全例、p21は9例が陽性を示し、過形成を示す気管支上皮や肺胞上皮細胞にp53とp21の過剰発現がみられた。また、これらの細胞の多くはTUNEL染色も陽性を示し、アポトーシスが誘導された。これらの所見は、慢性の炎症に伴い気管支や肺胞上皮にDNA障害が起こりp53やp21が発現したものと考えられるが、このp53が発癌に関連するmutant typeであるかどうかは今後PCRを用いて検討を加える予定である。対照として肺癌の手術で摘出した肺と肺気腫患者の組織のp53とp21の発現を調べたが、殆ど検出されなかった。2)肺癌合併肺線維症7例と非合併肺線維症8例の組織を用いてアポトーシス関連因子Fas抗原の免疫染色を行った。両群とも80%以上の症例で気管支、肺胞上皮が陽性を示し、Fasの発現を認め、またTUNEL染色でも陽性を示しアポトーシスの誘導を認めた。しかし、癌組織にはFasの発現は認めなかった。また、Fas LをmRNAのレベルでPCRそ用いて測定したが、リンパ球(T細胞)に主に発現がみられた。従って、気管支や肺胞上皮はFAS-Fas Lシステムを介したアポトーシスの誘導が起こるが、癌細胞ではFasの発現がないためにアポトーシスが誘導されず、細胞の癌化ならびに増殖に関連するかも知れない。

特発性間質性肺炎(IIP)患者の730%は肺癌を合併すると報告されており、逆に肺癌患者の約8%にIIPがみられ約35%に肺の間質性変化が認められる。すなわち、肺の線維化は肺癌の発生素地として重要な意味を持つと考えられる。そこで、肺の間質性変化を有する肺癌患者20例を対象に肺線維症における細胞増殖と癌化機構の検討を試みた。癌組織におけるp53の発現は70%の症例でみられた。線維化を呈した部位では、45%の症例に肺細胞上皮と細気管支上皮におけるp53の過剰発現を認めたが、染色性は弱く部位によって不均一であった。p21の陽性率は癌で67%、線維化部分で50%であった。PCNAの陽性率は癌で90%に、線維化で60%にみられたが部位は気管支上皮を中心に不均一に分布していた。Fasは癌では発現がなく、線維化の部位に発現がみられた。線維化部におけるTUNEL染色陽性率は50%であった。また、連続切片を作成したケースで多視野にわたって検討したところp53,PCNA,TUNEL染色の陽性部位は巣状に分布しかつ同部位に認められた。これらの結果より、線維化を有する組織では細胞増殖と細胞傷害(またはアポトーシス)の機序が同時に生じていることが示された。これらの結果は、線維化組織においてはDNA傷害や修復が起こっており、肺発癌の発生母地となりうることを示唆している。線維化の部位におけるp53過剰発現は癌化の前段階としての遺伝子変異を反映するのか、アポトーシス誘導によりDNAのstabilityを保つための生体反応なのかを確認するために、同部位におけるp53遺伝子解析を行っている。
高尿酸血症モデルマウスにおけるアルツハイマー病予防機構の解明

本研究課題では、次世代型アルツハイマー病モデルマウスと血中尿酸値を上昇させたマウスを組み合わせ、血中尿酸値の上昇がアルツハイマー病の病態を抑制するメカニズムを明らかにすることを目的とした。最終年度は、前年度に樹立した次世代型アルツハイマー病モデルマウス(APPKI)-尿酸分解酵素ウリカーゼノックアウトマウス(UoxKO)の複合変異ホモマウス(APPKI-UoxKO)とAppKIマウスが病理学的、行動学的に違いを示すかどうか検討を行った。16週齢および32週齢のマウス由来の脳切片を用いてアミロイドβの免疫染色を行ったところ、APPKI-UoxKOマウスにおいて大脳皮質領域におけるアミロイド斑の蓄積は抑制されず、逆に増強されていることが明らかとなった。その理由としては、尿酸値の上昇が十分でない可能性や尿酸がアミロイド斑の蓄積自体には影響しない可能性が考えられる。行動学的解析としては、2931週齢の雄マウスを用いてY迷路試験を行った。過去の報告では6ヶ月齢のアルツハイマー病モデルマウスにおいて有意な自発的交替行動率の低下が見られていたが、我々の実験条件では野生型マウスに比べて交替行動率の低下傾向はあるものの個体差が大きく、今回は尿酸値の変動がアルツハイマー病モデルマウスの認知機能の低下に影響するかどうか明らかにすることができなかった。今後は、尿酸代謝系をよりヒトに近づけたモデルマウスを用いて認知機能の評価を行うとともに、アミロイド斑蓄積以降のイベントに対する尿酸の影響についても検討していく予定である。痛風患者ではアルツハイマー病を発症するリスクが減少することが報告されているが、血中尿酸がアルツハイマー病の病態を改善するメカニズムの詳細は不明である。本研究では、高尿酸血症がアルツハイマー病の病理学的変化を抑制するかどうか、また血中尿酸濃度の上昇が脳内の尿酸動態にどのような影響を与えるか、マウスを用いて明らかにすることを目的とする。平成28年度は高尿酸血症モデルである尿酸分解酵素ウリカーゼ(Uox)のノックアウトマウスと理化学研究所バイオリソースセンターより導入した次世代型アルツハイマー病モデルマウスであるアミロイド前駆体タンパク質(APP)ノックインマウスの交配を開始した。ダブルヘテロマウスの作出後は、Uoxノックアウトホモ出生仔の生存率改善のため、尿酸生成抑制薬であるアロプリノールを含有する飼料で飼育した。これまでに1匹のダブルホモマウスを得ることができている。いずれかの遺伝子にホモ変異を有するマウスは雌雄共に複数得られているので、今後ダブルホモマウスをさらに作出し、ダブルホモマウス雌雄個体による繁殖維持が可能であるかどうか検討する。病理学的解析の予備実験としてAPPノックインマウスおよびUoxノックアウトマウスを用いて免疫染色を行ったところ、APPノックインマウスでのみアミロイド斑の形成が確認できた。脳内尿酸濃度の測定系の構築に関しては、外部に尿酸バイオセンサーの作製を依頼中である。産前産後休暇および育児休業の取得に伴い、マウスの交配実験に遅れが生じたため。平成29年度は前年度に完了できなかったマウスの樹立を継続して行い、尿酸分解酵素ウリカーゼノックアウトマウス(Uoxノックアウトマウス)とアルツハイマー病モデルマウス(APPノックインマウス)の複合変異ホモマウスを維持・繁殖できる体制が整った。また、免疫組織化学的にアミロイドβ、アストロサイト、ミクログリア等の集積を定量的に解析する手法を確立した。抗アミロイドβ抗体を用いた免疫染色により血中尿酸値の大小によってアミロイド斑形成に差が見られるか予備的に検討したところ、高齢マウスでは大きな差はなく、経時的に各種抗体染色の結果を比較検討することとした。脳内尿酸濃度の測定系の構築に関しては、側脳室から脳脊髄液を採取して尿酸濃度をHPLCで測定することができるかどうかの検討を進めたが、現状では血液の混入なく脳脊髄液を採取することができていない。今年度採取方法の改良を進める予定である。複合変異マウスの系統を樹立することができ解析に必要な個体を一定数揃える環境が整えられたことに加え、比較検討を行う手法を確立できたため。