hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
設計知識が内蔵された造船概略設計用CADシステムの仕様と実装に関する研究

設計知識の内蔵された造船用CADシステムの新しいアーキテクチャーを提案した。本研究では、船舶の計画段階での設計を中心に検討を行った。船舶の設計は、注文主から、積み荷の種類、積載量、船舶の速度、寄港地などの概略仕様が与えられる。これを元に、かつて建造された船舶の膨大なデータから知識を抽出し、概略一般配置を求め、その後、タンクの分け方や中央断面などの構造の概略や船体の安定性や積み付け状態による荷重に対する強度検討などを行っていく。概略一般配置の設定までを、セマンティックウェブを用いて、XMLで記述されたウェブ上のデータベースを検索して、過去の船舶のデータから知識の抽出と利用を行い、これにより設計値を決定していくメカニズムを提案した。これが確定したら、データを商用造船用CADシステムであるTRIBONにデータを移し、ここでの詳細設計の機能を用いて設計を確定していく。このようにして概略一般配置設計とその後のやや詳細な検討を、二つのフェーズに分けて行っている。この全プロセスにおいて、ワークフローを定義しておき、それぞれのタスクにおいては必要なデータやドキュメントをセマンティックウェブにより簡便に参照することができ、設計の時間的また質的な効率化が図られる。また、ワークフローと必要なドキュメントについても、専門家が自由に定義できるようにしてある。このワークフローシステムでは先生が学生に設計手順を示すことにし、また必要な教科書をウェブ上のドキュメントとして実装すれば、教育用のCADシステムが実現できる。また、ウェブサイトはどこにあってもよく、ワークフローも同様に置くことができるために、国際協力作業によって世界共通の教育用CADシステムが実現でき、現在は諸外国に提案中である。今後はe-learningの実例として検討する。システムの概要と利用法は、に公開してある。最近のCADシステム研究の主たるトレンドのひとつに、設計知識の生成と再利用手法を実装して、初心者でも簡単に製品設計ができるようにすることがある。これにはワークフローなどの実装や、設計のタスクの中での必要知識の運用手法なども研究対象になる。本研究では、研究を2段階に分けて、まず(1)設計知識の創成と運用の手法の検討を行い、さらに(2)詳細構造設計などへの展開を図る。本年度は、造船基本設計を主要目や機関設計などのパラメトリックな設計と考え、その設定手順をワークフローであたえ、そのタスク内での作業を支援するための知識システムについて検討した。設計はネットワーク上に展開したCADやデータベースシステムを用いて行うが、過去の船舶の設計例が1船ごとにWebページにのっているとして、これをデータベースとすることを提案した。これによりホームページのようなマルチメディアデータベースを作ることができる。さらにセマンティックウェブを用いてこれらのウェブデータベースから関連情報を取り出して、統計的な処理を行い設計知識をダイナミックに構成する手法を提案、実装した。セマンティックウェブの設計への応用はあまりなく、そのRDF構成方法も重要な課題であり、今までのセマンティックウェブの構成論から発展した研究となった。また、統計的処理のソフトウエアの開発も、セマンティックウェブの確立された手法がなく、javaによる実装を通して実用的な検討を行っている。このことは、今後のセマンティックウェブの実用化に向けての指針として有用であると考えられる。これらを取りまとめて、修士論文や学会に発表を行っている。来年度はこれらをCADシステムとつなぎ、さらに詳細なシステムとして構成していく。船舶の設計は、注文主から、積み荷の種類、積載量、船舶の速度寄港地などの概略仕様が与えられる。

概略一般配置の設定までを、セマンティックウェブを用いて、XMLで記述されたウェブ上のデータベースを検索して、過去の船舶のデータから知識の抽出と利用を行い、これにより設計値を決定していくメカニズムを提案した。これが確定したら、データを商用造船用CADシステムであるTRIBONにデータを移し、ここでの詳細設計の機能を用いて設計を確定していく。このようにして概略一般配置設計とその後のやや詳細な検討を、二つのフェーズに分けて行っている。この全プロセスにおいて、ワークフローを定義しておき、それぞれのタスクにおいては必要なデータやドキュメントをマンティックウェブにより簡便に参照することができ、設計の時間的また質的な効率化が図られる。また、ワークフローと必要なドキュメントについても、専門家が自由に定義できるようにしてある。このワークフローシステムでは先生が学生に設計手順を示すことにし、また必要な教科書をウェブ上のドキュメントとして実装すれば、教育用のCADシステムが実現できる。また、ウェブサイトはどこにあってもよく、ワークフローも同様に置くことができるために、国際協力作業によって世界共通の教育用CADシステムが実現でき、現在は諸外国に提案中である。今後はe-learningの実例として検討する。
日英混在型入力による動的文脈照合英作文システムに関する研究

英作文において、部分的に適切な英語表現が思い浮かばないとき、本来言い表したい日本語表現(単語またはフレーズ)をそのまま入力するだけで、すなわち、日英混在の入力文から、適切な英語表現を生成してくれる英作文支援システムを開発した。単語レベルでの支援においては最適な文脈による訳語選択手法と大規模で高品質な英語コーパスと超大規模なWebデータの統合利用手法を提案した。フレーズレベルでの支援においては日本語フレーズを構成する各単語の訳語候補の組み合わせによる英語フレーズの生成手法と、大規模で高精度な日英対訳表現抽出手法とそれにより抽出した日英対訳表現を利用した用例ベースに基づく英作文支援手法を開発した。本研究はユーザが英作文する過程において、部分的に適切な英語表現(単語、フレーズ、または節など)が思い浮かばないとき、本来言い表したい日本語表現をそのまま入力するだけで、すなわち、日英混在の入力文から状況に応じて動的に構成される文脈情報と、高品質で大規模な英語コーパスに加え超大規模なWebデータも統合的に利用することにより、適切な英語表現を自動生成する支援システムの研究開発を目指すものである。本研究はユーザが英作文する過程において、部分的に適切な英語表現(単語、フレーズ、または節など)が思い浮かばないとき、本来言い表したい日本語表現をそのまま入力するだけで、すなわち、日英混在の入力文から状況に応じて動的に構成される文脈情報と、高品質大規模な英語コーパスに加え超大規模なWebデータも統合的に利用することにより、適切な英語表現を自動生成してくれる支援システムの研究開発を目指すものである。初年度では、研究実施計画に沿って研究調査を進め、以下のような成果が得られた。まず、研究の準備として、研究を効率的に遂行するため、訳語選択・対訳パターンの自動獲得を中心とした関連技術に対するサーベイを行い、各手法を比較検討した。また、英語表現の生成に必要な大規模英語データの収集及び選別を行い、約900万文の大規模で高品質な英語コーパスが得られた。次に、本研究に関連する要素技術として、機械翻訳システムの性能評価と英語学習者の英語能力推定に関する研究と日英モダリティ翻訳に関する研究を行った。また、提案システムの中核をなす構成要素として、大規模高品質英語コーパスを対象とした、単語列だけでなく品詞やワイルドカードなどを用いた検索も可能な柔軟で高速な検索を可能とする検索システムと超大規模なWebデータも利用可能にするためにWebエンジンを利用する検索プログラムを開発するとともに、訳語選択にもっとも重要な検索クエリの構成方法(文脈可変手法やルールベース手法など)の提案も行った。最後に、上記諸研究成果をベースに、日英混在文を入力とした、日英辞書と検索システムから構成される基本システムを試作した。20年度では、研究実施計画に沿って研究調査を進め、主に以下のような成果が得られた。(1)本研究に関連する要素技術として、引き続き機械翻訳システムの性能評価と英語学習者の英語能力推定に関する研究と問い返しに基づき英作文の支援に関する研究を行い、システムからの問い返しが過去の表現の曖昧さの解消に有効など、英作文支援に役立つ知見が得られた。(2)19年度では最適な文脈による訳語選択手法と高品質コーパスと大規模Webデータの統合利用手法の提案と単語レベルの支援システムの開発を行い、得られた訳語が原文の単語と同じもののみを正解とする評価基準でシステムを評価した。20年度では日本語の訳語は1つとは限らず複数ある場合が多いことを考慮し、プロの日英翻訳者による評価データの作成とシステムの再評価を行った。その結果、統合手法においては80%の正解率が得られ、システムの有効性が実証された。(3)英作文支援の対象を単語からフレーズに拡張し、名詞句と動詞句も取り扱える英作文支援システムを構築した。計算機実験の結果、名詞句の英作文支援が71%、動詞句のそれが67%という正解率が得られた。

21年度では、研究実施計画に沿って研究調査を進め、主に以下のような成果が得られた。(1)本研究に関連する要素技術として、引き続き機械翻訳システムの性能評価研究の一環として逐語訳に着目した外国語学習者作文の自動評価に関する研究と単語アライメントを用いた英日機械翻訳文の流暢さの自動評価に関する研究を行い、英作文支援システムの性能評価に役立つ評価手法を提案した。(2)前年度では、英作文支援を単語レベルから名詞句と動詞句のフレーズレベルへ拡張した。しかし、英語フレーズは訳語候補の組み合わせのみから生成されるため、支援できるフレーズの範囲が大きく限定されてしまう。また、名詞句などを不定詞句に英訳するような、異なるパターンへの英訳も支援できない。さらに、単語の訳語候補の数が多いためその組み合わせの数が膨大となり処理時間がかかってしまう。このような問題を解決する方法の1つとして、日英対訳パターンに基づくアプローチ、すなわち、日英対訳パターン辞書を構築し,その辞書を介在して英作文支援を行う手法が考えられる。本年度では、このようなパターン辞書を作成するにあたり必要となる大規模な日英対訳表現を大規模な日英対訳コーパスから抽出することを試みた。実験の結果、数十万文の大規模な日英対訳コーパスに対し、数十万の単語n-gramまたは文節n-gramの対訳表現を良好な精度で抽出することができた。本研究はユーザが英作文する過程において、部分的に適切な英語表現(単語、フレーズ、または節など)が思い浮かばないとき、本来言い表したい日本語表現をそのまま入力するだけで、すなわち、日英混在の入力文から状況に応じて動的に構成される文脈情報と、高品質で大規模な英語コーパスに加え超大規模なWebデータも統合的に利用することにより、適切な英語表現を自動生成する支援システムの研究開発を目指すものである。前年度ではフレーズレベルでの英作文支援の問題点を改善するために日英対訳パターンに基づくアプローチを考案し、そのために必要な大規模な日英対訳表現を日英対訳コーパスから抽出することを試みた。本年度では、まず、対訳表現抽出の改良を行い抽出数の向上と精度の大幅な向上に取り組んだ。そのためにまず、より多くの対訳表現が抽出できるように日英それぞれの単語n-gramの抽出方法に改良を加えた。次に,単語列の先頭に「いる」、「こと」、「みたい」などの不適切な単語がつく表現を、n-gram作成時に取り除けるように人手で作成した規則を導入した。さらに、抽出した対訳表現をできるだけ正しいものに絞り込めるように対訳辞書情報を適用した。実験の結果、計28万文対の日英対訳コーパスに対し、10万以上という大規模な対訳表現を0.96という高い精度で抽出することができた。本年度ではさらに、このように獲得した高精度で大規模な対訳表現を利用した日英対訳パターンに基づく英作文支援手法-すなわち、日本語シソーラスと形態素解析を適用し、用例ベース翻訳的な英作文支援手法を具体的に提案し、システムの実装を行った。実験の結果、提案手法の有効性を確認した。
合成ヘムとミオグロビン変異体による亜硝酸還元酵素モデルの構築と反応機構の研究

脱窒過程の一部を担うヘム型亜硝酸還元酵素の反応機構を解明するため、その酵素モデルの作成を行った。本酵素は、ジケト型イソバクテリオクロリンをその活性中心にもつ。そこで、化学的にジケト型イソバクテリオクロリンの合成を行った。ポルフィリンを出発原料としてオスミウム酸化によりモノケト型クロリンとした後、異性体を分離後、もう一度オスミウム酸化を行いジケト型イソバクテリオクロリンを合成することができた。得られたジケト型イソバクテリオクロリンに鉄イオンを挿入した。得られた鉄錯体は、アポミオグロビンに1:1で取り込まれ、安定な複合体を形成できることがわかった。そこで、さらに触媒活性をもたせるため、ミオグロビンの変異体の作成を行った。亜硝酸還元酵素の活性中心と類似の構造をとるようにするため、ミオグロビンのヒスチジン-64をチロシンに変異させた。さらに、触媒活性をあげるため、ロイシン-29とフェニルアラニン-45をそれぞれヒスチジンに変異させた。3重ミュータントを大腸菌で発現させたところ、十分な発現量の変異型ミオグロビンを単離することができた。さらに、これをアポ化したのち、ジオキソイソバクテリオクロリン鉄錯体と複合体を生成させた。カラム分離後、種々の分光学的性質を測定した結果、今回の変異ミオグロビン-ジオキソイソバクテリオクロリン複合体は、亜硝酸還元酵素の分光学的性質とよい一致を示した。これは、変異ミオグロビン-ジオキソイソバクテリオクロリン複合体が、亜硝酸還元酵素のモデル酵素になることを示し、当初の目的の一つを達成すことができた。さらに、このモデル酵素に亜硝酸イオンを添加したところ、鉄3価の活性中心に配位することがわかった。これは、酵素反応が鉄2価を経由して進行するというこれまでの提案とは異なる結果を示し、鉄3価での反応機構の可能性を示唆した。得られた鉄錯体は、ポルフィリン側鎖の置換基に違いがあるにもかかわらず、酵素から単離されたジケト型イソバクテリオクロリンの吸収スペクトルと類似していることがわかった。そこでさらに酵素モデル化を行うため、この鉄錯体とタンパク質(アポミオグロビン)の複合体の生成を検討した。合成した鉄錯体は、アポミオグロビンに1:1で取り込まれ、安定な複合体を形成できることがわかった。カラムクロマトにより精製することができた。今回作成したモデル酵素の吸収スペクトルは、酵素の吸収ピークをよく再現した。酵素内では二つのヘムがあるためジケト型イソバクテリオクロリンの吸収が判別されていなかったが、本研究によりピークの帰属ができた。またEPR測定を行ったところ、鉄3価高スピン状態にあることがわかった。また、ポルフィリン骨格の対称性が低下したにもかかわらず、大きなg値の異方性は観測されなかった。

これらの結果は、アポミオグロビン内で酵素と同様にヘム鉄にヒスチジン残基が配位していることを示した。さらに来年度は、ミオグロビンにミューテーションを導入して、酵素機構の発現をめざす。昨年度に合成したジオキソイソバクテリオクロリン鉄錯体をミオグロビンに再構成を試みた。ミオグロビンのヘムを分離してアポミオグロビンとした後、ジオキソイソバクテリオクロリン鉄錯体のアルカリ溶液を添加した、カラムにより精製を行ったところ、合成したジオキソイソバクテリオクロリン鉄錯体が再構成されることがわかった。再構成されたミオグロビンは、本来のミオグロビンとは異なり、むしろ目的とする亜硝酸還元酵素の分光学的性質と類似していた。そこで、さらに触媒活性をもたせるため、ミオグロビンの変異体の作成を行った。亜硝酸還元酵素の活性中心と類似の構造をとるようにするため、ミオグロビンのヒスチジン-64をチロシンに変異させた。さらに、触媒活性をあげるため、ロイシン-29とフェニルアラニン-45をそれぞれヒスチジンに変異させた。3重ミュータントを大腸菌で発現させたところ、十分な発現量の変異型ミオグロビンを単離することができた。さらに、これをアポ化したのち、ジオキソイソバクテリオクロリン鉄錯体と複合体を生成させた。カラム分離後、種々の分光学的性質を測定した結果、今回の変異ミオグロビン-ジオキソイソバクテリオクロリン複合体は亜硝酸還元酵素の分光学的性質とよい一致を示した。これは、変異ミオグロビン-ジオキソイソバクテリオクロリン複合体が、亜硝酸還元酵素のモデル酵素になることを示し、当初の目的の一つを達成すことができた。さらに、このモデル酵素に亜硝酸イオンを添加したところ、鉄3価の活性中心に配位することがわかった。これは、酵素反応が鉄2価を軽油して進行するというこれまでの提案とは異なる結果を示し、鉄3価での反応機構の可能性を示唆した。
腫瘍内で過酸化水素を徐放する新規放射線増感剤の開発に関する実験的研究

癌放射線治療の領域において、従来から放射線の効果を高める放射線増感剤の開発が行なわれてきたが、現在のところ臨床使用可能な増感剤は未だ完成していない。現在、デンマークでニモラゾールの臨床使用が認められているが、その効果は限定的である。従来、増感剤として酸素の代わりにラジカルを固定する電子親和性の高いゾール系化合物が開発されてきたが、効果を高めるためには酸素以外に、抗酸化酵素を不活性化するという視点が重要である。このためには過酸化水素を用いることが必要であり、その効果を持続させるために従来のKORTUCのヒアルロン酸のほかにハイドロゲルを用いることが必要となりその有効性を実験的に明らかにした。腫瘍内で過酸化水素を徐放する新規放射線増感剤の開発に関する実験的研究として、以下の如く実験を行った。過酸化水素を徐放するために、過酸化水素をハイドロゲル(架橋ゼラチン)に含浸して用い、その効果を検証するためのマウス実験を施行した。実験には、C3H/Heマウスと同系のSCCVII腫瘍を用い、SCCVII腫瘍細胞を各マウスの右下肢皮下に注射して、その径が約6 mm大に成長した時点で実験を行った。各マウスの右下肢の腫瘍に対して、過酸化水素を含浸したハイドロゲル粒子あるいは従来のKORTUCとして過酸化水素+ヒアルロン酸を注射針で注入し、その24時間後、48時間後、72時間後に、各マウスの右下肢に限局して、Linacの6 MeV電子線30 Gyの照射を行った。その結果、従来のKORTUCとしての過酸化水素+ヒアルロン酸では、マウス腫瘍に対する抗腫瘍効果(放射線増感効果)は、24時間後に照射した群では、明らかな抗腫瘍効果を認めたが、48時間後ないし72時間後に照射した群では、抗腫瘍効果を認めなかった。一方、過酸化水素を徐放する新規放射線増感剤の候補として、過酸化水素を含浸したハイドロゲル粒子では、マウス腫瘍に対する抗腫瘍効果は、24時間後ないし48間後、または72時間後に照射したいずれの群においても、明らかな抗腫瘍効果を認めた。このことは、実際の癌・放射線治療の臨床現場で、例えば、月曜日の午前10時に過酸化水素を含浸したハイドロゲル粒子を腫瘍に注射した場合、その放射線増感効果は、24時間後である翌日火曜日の午前10時の放射線治療はもちろん、48時間後の翌々日水曜日の同時刻の放射線治療および72時間後の木曜日の同時刻の放射線治療をも増感することとなり、96時間後の放射線治療を増感するかどうかは未だ不明ではあるが、概ね、週に1回の注射で済む、徐放性の新規放射線増感剤を開発することができた。腫瘍内で過酸化水素を徐放する新規放射線増感剤の開発に関する実験的検討として、以下の如く実験を行なった。実験には、C3H/Heマウスと同系のSCCVII腫瘍を用い、SCCVII腫瘍細胞を各マウスの右下肢皮下に移植して、その径が約6mm大に成長した時点で実験を行なった。ハイドロゲルには3種類があるが、今回の実験ではPI5とPI9を用いた。各マウスの右下肢の腫瘍に対して、過酸化水素を含浸した各ハイドロゲル粒子、シートあるいは従来のKORTUCとして過酸化水素+ヒアルロン酸を注射針で注入し、その24時間後、48時間後、72時間後に、各マウスの右下肢に限局して、Linacの6 MeV電子線30Gyの照射を行なった。その結果、従来のKORTUCとしての過酸化水素+ヒアルロン酸では、マウス腫瘍に対する抗腫瘍効果(放射線増感効果)は、24時間後に照射した群では、明らかな抗腫瘍効果を認めたが、48時間後ないし72時間後に照射した群では、放射線増感効果を認めなかった。一方、過酸化水素を徐放する新規放射線増感剤の候補として、過酸化水素を含浸したハイドロゲル粒子では、マウス腫瘍に対する放射線増感効果は、24時間後ないし48時間後、または72時間後に照射したいずれの群においても、明らかな放射線増感効果を認めた。なお、腫瘍体積の変化をPI5群内で比較すると、最も腫瘍の成長抑制を示したのは、48時間後照射群であった。また、PI9群内で腫瘍体積の変化を比較すると、最も腫瘍の成長抑制を示したのは72時間後照射群であった。以上より、今回の実験で使用したハイドロゲルは、PI5ならびにPI9ともに、ヒアルロン酸に代わって過酸化水素の支持体になり得ると考えられた。平成25年度および平成26年度に行なった実験により得たデータに基いて論文化を行なった。本研究の研究課題名である「腫瘍内で過酸化水素を徐放する新規放射線増感剤の開発に関する実験的研究」の成果として、過酸化水素をハイドロゲル(架橋ゼラチン)に含浸して用いる新規放射線増感剤は、マウス腫瘍を用いた実験では、週に1回の腫瘍内への局所注射ないし注入することにより効果を発揮することを示すことができた。以前に我々が開発した酵素標的・増感放射線療法KORTUCでは、週に2回の腫瘍内への局注が必要であったため、これを1回に減少させることができれば、対象患者さんならびに担当医師にとっても、身体的また時間的負担の軽減ができ、大きな改善につながるものと考えられる。

さらに、これまでの一連の研究に基いて、「放射線効果のターゲットはDNAである」という従来の概念のParadigm shiftとして、「癌に対する放射線効果を向上させるためには、リソソームに対する過酸化水素効果を利用する必要がある」という新しい概念を提唱する論文を発表した。癌放射線治療の領域において、従来から放射線の効果を高める放射線増感剤の開発が行なわれてきたが、現在のところ臨床使用可能な増感剤は未だ完成していない。現在、デンマークでニモラゾールの臨床使用が認められているが、その効果は限定的である。従来、増感剤として酸素の代わりにラジカルを固定する電子親和性の高いゾール系化合物が開発されてきたが、効果を高めるためには酸素以外に、抗酸化酵素を不活性化するという視点が重要である。このためには過酸化水素を用いることが必要であり、その効果を持続させるために従来のKORTUCのヒアルロン酸のほかにハイドロゲルを用いることが必要となりその有効性を実験的に明らかにした。腫瘍内で過酸化水素を徐放する新規放射線増感剤の開発に関する実験的研究として、以下の如く実験を行なった。過酸化水素を徐放するために、過酸化水素を2種類のハイドロゲル(架橋ゼラチン)PI5(粒子状)ならびにPI9(シート状)に含浸して用い、その効果を検証するためのマウス実験を施行し、そのいずれにおいても注射後72時間後までの放射線増感効果を確認できた。したがって、概ね、週に1回の注射で効果が期待できる、徐放性の新規放射線増感剤を開発することができたといえる。今後は、この新規放射線増感剤の有効性をさらに検証するとともに、安全性についてもさらに検討を加え、実際の臨床応用へと発展させていく予定である。放射線腫瘍学「ハイドロゲルを担体として過酸化水素を徐放する腫瘍内局注用の放射線/化学療法増感剤」は、現在、わが国はもちろん、欧米諸国への特許申請中であり、各国移行期限は8月15日となっております。その国際予備審査においては、新規性、進歩性、産業利用性ともにありと認められております。日本科学技術振興機構(JST)の審査会は、本年の6月4日になる見込みであり、各国移行にかかる費用について、特許事務所に見積りを依頼中であります。腫瘍内で過酸化水素を徐放する新規放射線増感剤の開発に関する実験的研究として、以下の如く実験を行った。過酸化水素を徐放するために、過酸化水素をハイドロゲル(架橋ゼラチン)に含浸して用い、その効果を検証するためのマウス実験を施行し、概ね、週に1回の注射で済む、徐放性の新規放射線増感剤を開発することができた。薬剤等の購入にあたりまして、少額の次年度使用額が発生致しました。すなわち、ハイドロゲル(架橋ゼラチン)の種類を、何種類か選択し、それぞれについて、抗腫瘍効果(放射線増感効果)を検証する。その上で、最適なハイドロゲルを選択し、実際の癌・放射線治療へ応用すべく、必要な検討を加える。次年度の薬剤購入等に使用させて戴く予定です。
アポCIIIの動脈硬化における役割 -新規遺伝子改変ウサギによる検討

ヒトと類似した脂質代謝系を有するウサギを用いて、ヒトアポリポ蛋白CIII(アポCIII)トランスジェニック(Tg)ウサギを開発し、脂質代謝と動脈硬化におけるアポCIIIの役割を明らかにすることを目的とした。初年度のマイクロインジェクションにて500個を超える胚に遺伝子導入したが、当初の予想よりも産仔数が少なく、Tgウサギは得られなかった。そのため、材料と方法の改善を行った結果、格段に産仔数の増加が認められ48匹の産仔を得たが、ヒトアポCIII遺伝子を発現する個体は得られなかった。改善された方法によってTgウサギを得られる可能性が高くなったため、今後もマイクロインジェクションを継続する。アポリポ蛋白CIII(アポCIII)は、中性脂肪に富むリポ蛋白の主要な構成蛋白であり、最近の臨床研究の結果から、アポCIIIが動脈硬化の発生進展に深く関与する可能性が示唆された。アポCIIIの解析において、マウスのアポCIII並びに脂質代謝系はヒトとは大きく異なるため、本研究では、ヒトと類似したアポCIIIと脂質代謝系を併せ持つウサギを用いて、ヒトアポCIIIトランスジェニックウサギを開発し、脂質代謝と動脈硬化におけるアポCIIIの役割を明らかにすることを目的とした。本年度は昨年度に引き続き、アポCIIIトランスジェニックウサギを作製すべく、マイクロインジェクションを行った。採卵ドナーウサギにFSHによる過排卵処置を行い、♂ウサギとの交配を行った後、19時間後に採卵した。本年度は、受精卵へのマイクロインジェクション後、3-4時間培養し、生存胚(2細胞期ないし4細胞期への卵割)を選抜して、レシピエントウサギ1匹あたり30個の受精卵を戻した。240個の受精卵を9匹のレシピエントウサギに移植したところ、全てのウサギが正常に妊娠し、出産した。計48匹の仔ウサギが生まれ、32匹が離乳まで正常に成長した。これらの仔ウサギの耳組織の一部を採取し、PCRによるアポCIII遺伝子の導入を確認したところ、残念ながらアポCIII遺伝子が導入されたウサギは得られなかった。しかしながら、マイクロインジェクション法の改善により、昨年度に比べ、格段にレシピエントの妊娠・出産率が向上したため、今後もマイクロインジェクションを継続し、アポCIIIトランスジェニックウサギの開発を試みる。アポリポ蛋白CIII(アポCIII)は、トリグリセリド(TG)-richリポ蛋白の主要な構成蛋白であり、最近の臨床研究の結果から、アポCIIIが動脈硬化の発生進展に深く関与する可能性が示唆された。アポCIIIの解析において、マウスのアポCIIIと脂質代謝系はヒトとは大きく異なるため、本研究では、ヒトと類似したアポCIIIと脂質代謝系を持つウサギを用いて、ヒトアポCIIIトランスジェニック(Tg)ウサギを開発し、脂質代謝と動脈硬化におけるアポCIIIの役割を明らかにすることを目的とした。本年度は、アポCIIIトランスジェニックウサギを作製すべく、マイクロインジェクションを行った。まず受精卵採卵のため、採卵ドナーウサギに対してFSHによる過排卵処置を行い、♂ウサギとの交配を行った。19時間後に卵巣と卵管を取り出し、培養液にて受精卵を洗い出した。採取した受精卵の雄性前核にアポCIIIの遺伝子コンストラクトを注入した。1羽のレシピエントウサギあたり、30個の受精卵を子宮に戻し、妊娠を誘発するためhCGを静注した。2週間後に腹部を触診し、妊娠の有無を確認した。1ヶ月後に出産した子ウサギの数を確認し、耳組織を一部採取し、ゲノムDNAを抽出して、ゲノムPCRにより遺伝子が導入されているかをチェックした。平成23年度中には、125羽のウサギから受精卵を採取し、29羽の子ウサギが生まれたものの、死産などもあり、アポCIII遺伝子が導入された子ウサギは得られなかった。そのため、ドナーウサギの卵の質の確認など行い、改善を加えながら、現在もマイクロインジェクションを継続中である。アポリポ蛋白CIII遺伝子を導入されたトランスジェニックウサギを初年度に開発する予定であったが、それがかなわなかった。しかし、マイクロインジェクション後にレシピエントに戻した受精卵が子ウサギとして出生できているため、トランスジェニックウサギの誕生は時間の問題と思われる。昨年度計画でTgウサギ作出に至らなかったため、それ以降の実験計画(Tgウサギの遺伝子解析と脂質代謝に関係した表現型解析、繁殖)に必要となる経費が残存した。H24年度は、当初H23年度に完了する予定であった、Tgウサギ作出、表現型解析、繁殖と、H24年度に行う予定の動脈硬化実験までを行うことを計画しているため、H23年度残額分とH24年度分の経費を使用する予定である。

昨年度で実現出来なかったマイクロインジェクションのためのウサギの購入と消耗品の購入、ウサギの遺伝子検査のためのゲノム抽出とPCR用消耗品、脂質代謝解析までの研究を昨年度の残存金にて行い、H24で行うことが当初から予定されていた動脈硬化研究に関する消耗品(血液成分測定キット、特殊餌の購入など)にH24に交付される経費を使用する。また、国内学会(実験動物学会、動脈硬化学会)への出席に旅費を使用する。
多数遺体に対する簡易的遺体衛生保全 -アロマオイルの効用-

大事故・大災害で、多くの身元不明遺体が発生した場合、簡易的な遺体衛生保全としての、アロマオイルの使用は有用であると考えられた。研究に使用したアロマオイルのなかでは、Lemongrassの抗菌作用が最も大きかった。また、においに関しては、Cedarwood、Peppermint、Eucalyptus、Grapefruitが嗜好性に左右されにくく、簡易的遺体衛生保全に使用するのに、適したアロマオイルであると考えられた。腐敗等の死後変化を防止、遅延させる方法として、エンバーミング(遺体衛生保全)がある。近年、多発している大事故・大災害等で多数遺体が発生した場合の身元確認従事者の安全、公衆衛生や心情などを考慮し、アロマオイルを応用した簡易的な遺体衛生保全の可能性を検討した。アロマオイルは、抗菌作用が強いとされるEucalyptusやLemongrass、Peppermint、Tea Tree、消臭作用を有するとされるCinnamonやFennel、Pine、鎮静作用を有するとされるCedarwood、LavenderやMyrrhを選択し、検討を行った。また、臭気官能試験によるアロマオイル10種の快不快度を調べたところ、最高は+3(非常に快)、最低は-2(不快)の評点であった。被験者のほとんどが78種のアロマオイルに0(快でも不快でもない)+(快)の評点を与えた。しかしながら、遺体に応用するという本来の目的に対し、嗜好性を重視し、適切なにおいを選択したとは言い難いとの意見も聞かれた。本研究により、簡易的遺体衛生保全におけるアロマオイルの使用の有用性が示唆された。今後、遺体への使用に際し、濃度や作用方法、評価方法のさらなる検討を進める予定である。個人識別(身元確認)は、歯科医師の役割として認識されており、事故や災害の規模や種類によって、遺体の個人識別が完了するまでに時間がかかる場合がある。本研究は、遺体が遺族の元にかえり、埋葬されるでの間、簡易に行える防腐や感染予防として、アロマオイルを用いた遺体衛生保全の可能性について検討したものである。また、アロマオイルの一般的な使用目的であるにおいに着目し、遺族等のグリーフケアへの応用についても検討した。昨年度の研究結果より、細菌学的に効果を認めたEucalyptus、Lavender、Lemongrass、Peppermint、Pine、Tea Treeを使用し、臨床検体(皮膚、鼻腔、口腔のスワブ懸濁液)や真菌に対する抗菌力をディスク拡散法に準ずる方法にて検討した。菌株に対する抗菌力に比較し、臨床検体に対する抗菌力は低下した。また、真菌に対する抗菌力は、阻止円が認められなかったアロマオイルについても、Controlに比較し、細菌の発育抑制が認められた。細菌学的検査の結果、最も有効と考えられるアロマオイルは、Lemongrassであった。効果的な使用方法の検討のため、直接作用(アロマオイルをしみ込ませたディスクを培地に直接置いたもの)と、拡散作用(ディスクをシャーレの蓋に置いたもの)の比較を行った。作用方法による影響はそれほど大きくはなかったが、Eucalyptus、Pineは検体に関わらず、直接作用より拡散作用による効果が大きいと考えられた。この研究のもう一つの目的である、においによる心情的負担の緩和やグリーフケアへの応用について、におい官能試験にて検討した。使用目的から、適切なアロマオイルは、快・不快の個人差が少なく、評点0(快でも不快でもない)評価が多いものと考えた場合、Peppermintが最も適していると考えられた。以上の研究結果より、アロマオイルを使用した簡易的遺体衛生保全の有用性が示唆され、大事故・大災害時だけでなく、死に関係する現場においても、遺族のみならず、遺体に接する方々の心情を考慮し、活用することが期待される。
肉腫の脱分化の生物学的意義

ある特定の方向への分化が明らかな肉腫で部分的にその分化が不明瞭となり、悪性線維性組織球腫や低分化の線維肉腫に類似する組織像が出現する脱分化型肉腫の脱分化部の腫瘍細胞の性格を明らかにし、それを分化した部ならびに悪性線維性組織球腫の腫瘍細胞と比較しつつその形態発生を考察し、更には脱分化を起こした肉腫の生物学的態度を明確にしようと試みた。九州大学医学部第二病理において収集されいてる1085例の軟部肉腫を検討した結果、全脂肪肉腫128例の11%(高分化型脂肪肉腫48例の29%に相当する14例、平滑筋肉腫105例中6例(6%)、骨外性軟骨肉腫39例中5例(13%)ならびに横紋筋肉腫98例中2例(2%)が未分化な部分を有するいわゆる脱分化型軟部肉腫であり、脱分化型肉腫はそれほどまれな軟部肉腫ではなく、また特殊な肉腫に限定されないことが明らかになった。これらの脱分化型軟部肉腫および対照とした軟部悪性線維性組織球腫32例を主に市販の種々の抗体およびレクチンを用いて免疫組織化学的ならびにレクチン組織化学的に検討し、あわせて電子顕微鏡的にも観察したところ、脱分化部はまれに一部で母肉腫の性格を発現するものの、組織化学的ならびに超微形態学的に悪性線維性組織球腫に類似しており、特殊な分化を示さない未分化間葉細胞のクロ-ンの増殖がいわゆる脱分化部に相当することが想定された。また悪性線維性組織球腫自身も単球大食細胞系由来の腫瘍とは考えがたく、未分化間葉細胞を組織起源とする可能性が示唆された。予後調査の結果、27例のうち19例は死亡しており、脱分化部を有する軟部肉腫は悪性度の高い肉腫であり、分化型軟部肉腫における脱分化部の存在の認識は治療方針決定および予後判定に重要と思われた。ある特定の方向への分化が明らかな肉腫、例えば脂肪肉腫や平滑筋肉腫の中には時に部分的にそれらの分化が不明瞭となり、悪性線維性組織球腫や低分化の線維肉腫に類似する組織像が出現することがある。現在まで骨の脱分化型軟骨肉腫では臨床病理学的にかなり研究されているものの、他の肉腫特に軟部発生の脱分化型肉腫に関しては散発的な報告をみるのみで、その生物学的意義は解明されていない。本研究では脱分化部の腫瘍細胞の性格を明らかにし、それを分化した部ならびに悪性線維性組織球腫の腫瘍細胞と比較し、その形態発生を考察し、更には脱分化を起こした肉腫の生物学的態度を明確にしようと試みるものである。本年度はまず九州大学医学部第二病理(主任:遠城寺宗知教授)において既に収集されている1000余例の軟部肉腫および新たに追加収集された肉腫の組織切片を再検討し、今一度脱分化型肉腫の診断根拠を明確にして、症例を整理することから始めた。その結果、脂肪肉腫14例、平滑筋肉腫5例、骨格外軟骨肉腫5例および横紋筋肉腫2例に脱分化型肉腫を見出し、いわゆる脱分化型肉腫が特殊な肉腫に限定されないことが想定された。

これらの脱分化型肉腫および対照として軟部悪性線維性組織球腫30例を市販の種々の抗体およびレクチンを用い検討したところ、脱分化部で免疫組織化学的にα_1-アンチキモトリプシンやα_1-アンチトリプシンなど、更にはレクチン組織化学的にRCAなどのいわゆる組織球性マーカーが陽性のことが多く、悪性線維性組織球腫に類似していることが明らかになったが、一方では平滑筋肉腫におけるデスミンやアクチン、軟骨肉腫におけるS-100蛋白などが脱分化部でもまれに発現することがあり、少なくとも一部の例では母肉腫の性格を併存する可能性が示唆された。最近経験した3例の脱分化型脂肪肉腫を除いた23例の脱分化型肉腫のうち19例は死亡しており、悪性度の高い肉腫であることが判った。ある特定の方向への分化が明らかな肉腫で部分的にその分化が不明瞭となり、悪性線維性組織球腫や低分化の線維肉腫に類似する組織像が出現する脱分化型肉腫の脱分化部の腫瘍細胞の性格を明らかにし、その意義を明確にしようと試みた。昨年度に続き、九州大学医学部第二病理(主任:遠城寺宗知教授)において収集されている1,100余例の軟部肉腫を今一度再検討した結果、全脂肪肉腫128例の11%(高分化型脂肪肉腫48例の29%)に相当する14例、平滑筋肉腫105例の6%(6例)、骨外性軟骨肉腫39例の13%(5例)並びに横紋筋肉腫98例の2%(2例)が未分化な部分を有するいわゆる脱分化型軟部肉腫であり、脱分化型肉腫は当初考えられていたほどまれな軟部肉腫ではなく、また特殊な肉腫に限定されないことが明らかになった。これらの脱分化型肉腫および対照として軟部悪性線維性組織球腫32例を主に市販の種々の抗体を用いて免疫組織化学的に検討し、あわせて電子顕微鏡的にも観察したところ、脱分化部では組織化学的並びに超微形態学的にも悪性線維性組織球腫に類似しており、特殊な分化を示さないもう一つの未分化間葉細胞のクロ-ンの増殖がいわゆる脱分化部に相当することが想定された。また悪性線維性組織球腫自身も、単球・大食細胞系由来の腫瘍とは考えがたく、未分化間葉細胞を組織起源とする可能性が示唆された。なお予後調査の結果、27例のうち19例は死亡しており、脱分化部を有する軟部肉腫は悪性度の高い肉腫であることが判った。特定の方向への分化が明らかな肉腫,例えば分化型脂肪肉腫や平滑筋肉腫の中で、部分的にそれらの分化が不明瞭となり、悪性線維性組織球腫や低分化の線維肉腫に類似する組織像が出現する脱分化型肉腫の腫瘍細胞の性格を明らかにし、脱分化部出現の意義を明らかにしようと試みた。九州大学医学部第二病理において収集されている1085例の軟部肉腫を再検討し、脂肪肉腫128例中14例(11%)、平滑筋肉腫105例中6例、骨外性軟骨肉腫39例中5例および横紋筋肉腫98例中2例の脱分化型軟部肉腫を再検討した。これらの肉腫の脱分化部は免疫組織化学的にα_1ーアンチキモトリプシンやα_1ーアンチトリプシンなど、レクチン組織化学的にはRCAやConーAなどのいわゆる組織球性マ-カ-の染色態度が対照として用いた32例の悪性線維性組織球腫と類似し、電子顕微鏡で観察できた3例では、脱分化部は超微形態像も悪性線維性組織球腫に類似することが確認できた。また両者とも腫瘍細胞は大食細胞に対する単クロ-ン抗体であるMAC387やHAM56に陰性であり、脱分化型肉腫の脱分化部は特殊な分化を示さない未分化間葉細胞のクロ-ンの増殖から成り、悪性線維性組織球腫自身も単球・大食細胞由来の腫瘍とは考えがたく、未分化間葉細胞を組織起源とする可能性が想定された。今一つの知見は8例の悪性線維性組織球腫および9例の脂肪肉腫ならびに1例の軟骨肉腫の脱分化部においてデスミン陽性の腫瘍細胞を見い出したが、これは腫瘍構成細胞の一つである筋線維芽細胞の反応である可能性と多分化能を有する未分化間葉細胞の筋原細胞への分化表出の可能性が考えられた。
咬合刺激が歯周組織の血管動態および歯根吸収発現に及ぼす影響の解明

平成25年度から26年度までの研究結果より、咬合刺激の低下は歯根形態や歯根膜腔に退行性変化を生じさせるが、このような変化は、咬合刺激の獲得により回復することが明らかとなった。また、咬合刺激の負荷は、ラット歯根膜腔内における血管新生関連因子の発現を介して歯周組織の構造を調節することが示唆された。さらに、咬合機能低下歯に矯正力を負荷すると、歯根吸収を生じ易くなることが示され、矯正的歯の移動前に咬合機能低下歯へ咬合刺激を与えることにより、歯根吸収発現を抑える可能性が強く示唆された。H25年度研究では、最初にラット上顎大臼歯を咬合機能低下、咬合機能回復、正常咬合機能条件下におき、マイクロCTを用いて、歯根および歯根膜腔の形態学的検討を行ことにより、咬合刺激が歯根および歯周組織形態に及ぼす影響について明らかにする。そして、上記3群の組織切片を作製後、歯根膜内毛細血管数の算定、毛細血管の直径および断面積の計測を行い、機能回復群におけるbFGFおよびVEGF陽性細胞数の経日的変化を検討した。マイクロCTによる解析の結果、機能低下群においては他の2群より歯根長が長く、歯根幅が狭い傾向が認められた。また、歯根膜厚経および歯根膜腔面積については、機能低下群が対照群より有意に小さく、機能回復群が機能低下群より大きい値を示した。一方、歯根膜内毛細血管数については、機能低下群では対照群より有意に少なく、機能回復群では機能低下群より有意に多いことが明らかとなった。また、機能低下群では歯根膜内毛細血管の直径および断面積が対照群より有意に小さく、機能回復群では機能低下群より有意に大きいことが明らかとなった。免疫組織学的検索の結果、機能低下群の歯根膜ではbFGF、VEGFの発現がほとんど認められなかったのに対し、機能回復群では対照群と同程度の発現が観察され、機能低下群と比較して陽性細胞数が有意に多いことが明らかとなった。以上の結果より、咬合機能低下歯への咬合刺激の負荷により、血管新生関連因子を介して歯周組織の構造が回復することが明らかとなった。H26年度の研究では、矯正力負荷による歯の移動量、歯根表面に発現する破歯細胞数および歯根吸収窩面積の経日的変化について、組織切片を用いて検討を行うと同時に、歯根膜腔内におけるRANKL、M-CSFおよびIL-8発現について免疫組織学的検索を行った。これにより、咬合刺激が実験的歯の移動時の歯根吸収発現に及ぼす影響について明らかにすることを目的とした。矯正力負荷による歯の移動量については、各群間に有意な差は認められなかった。また、対照群および機能回復群の破歯細胞数は、実験開始7日目以降大きな変化を示さなかったが、機能低下群では増加が認められ、21日目では他群より有意に大きい値を示した。さらに、機能低下群の歯根吸収率は他群より有意に高かったのに対し、機能回復群における破歯細胞数および歯根吸収率については対照群と有意な差が認められなかった。また、矯正力負荷によるRANKL、M-CSFおよびIL-8発現を免疫組織学的に検索した結果、対照群および機能回復群では主に圧迫側歯槽骨に、機能低下群では主に歯根膜、歯根表面に多く発現していた。以上の結果より、咬合機能低下歯に矯正力を負荷すると、歯根吸収を生じ易くなることが示され、矯正的歯の移動前に咬合機能低下歯へ咬合刺激を与えることにより、歯根吸収発現を抑える可能性が強く示唆された。医歯薬学本研究室に所属する大学院生と連携し、研究成果について研究協力者を含む研究チーム内での討論を繰り返しながら進めていった結果、順調に進展したと考えられる。今後も同様に、本研究室に所属する大学院生と連携し、研究成果について研究協力者を含む研究チーム内での討論を繰り返しながら進めていく。次年度使用額が生じた理由として、CT画像データの解析に必要なPCとその周辺機器を購入するために次年度科学研究費と合算で購入予定のため。CT画像解析用PCおよびソフト、データバックアップ用ハードディスクの購入を計画。
電子スプレーで生細胞にあらゆるナノ分子を定量的・非損傷的に注入する技術の開発

我々は分子や粒子をイオン化・加速して特定の神経細胞に穿通させるナノ電子スプレー微小管を設計、2本の同心の表面疎水処理ガラス管内部の溶液を電子スプレーにして標的に局所的に到達させた。液滴の安定噴射には管配置と電圧波形が重要で、20-250nAのパルスピーク電流が得られた。しかし陰イオン色素と蛍光顕微鏡で観察すると粒子は管先端-培養液面境界のほか外管内壁にも急速に蓄積、終には管内部への引水と溶液流出が生じ、菅形状の調整を重ねたが不可避だった。静電的性質のシミュレーションによる改良型を提示する。特定の生細胞に機能分子を導入するため、本研究課題では内外2本のガラスピペットで構成される電子スプレーを用いる。導入する分子は液体に溶解し内側ピペットに充填する。研究の第一段階として、この装置から電子スプレーを発生させる理論モデルを構築、多様なパラメターの各々につき予想される最適値の範囲をシミュレーションで割り出した。次に試作機を作成、高電圧供給電源(0-2kV,0-0.4A)を購入し、(1)低ノイズ電流電圧変換器でスプレーの電流値(10^<-12>-10^<-8>)を精確に測定、(2)蛍光液を充填した本機を落射蛍光顕微鏡の対物レンズ焦点に配置し、スプレーの発生を高解像度で観察、(3)電子スプレー処理中の生細胞を良好な状態に保つ条件(温度・無菌性等)を確立した。また実験の過程で次の2点の重要性が判明した;(1)スプレー中に生じるピペット内の伝導性物質の蓄積を防ぎ、内側ピペットの電気的絶縁を保持すること。電子スプレーはピペット内外の溶液の電圧差によって生じる。従って、ショートを防ぐには絶縁の維持は必須である。外側ピペットの内側面を疎水性パラフィンの薄膜で覆い、ピペット内を窒素ガスで陽圧にすることにより伝導性物質の蓄積は緩和したが、高電圧をかけた際のショートを回避することはできなかった。(2)安定かつ予測可能なスプレー電流を得るため電圧パルスを適切に設計すること。当初試みた一定電流では、0.4kV以下ではスプレーが発生せず、0.4kV以上に上げても安定した電流は得られなかった。そこで定電流と正弦曲線の交流電流とを組み合わせたところ、より弱い電圧(0.1-0.5kV)で5-15nAのスプレーを数時間にわたり維持することに成功した。この手法には標的に導入する物質の量を容易に制御できるという利点もある。これらの知見を踏まえ、ピペット-細胞間の距離を最適化し、絶縁破壊を完全に防ぐよう設計を再検討中である。エレクトロスプレー(=「ナノスナイパー」、以下「本機」)の仕様には、以下の2つの課題がある。(1)内外2本のピペットを精確に配置する(粒子の照射範囲に向けた効率的かつ精確な流れを可能にするため)(2)外側ピペット外部の細胞培養液がピペット内部に入らないようにする(ショートを避けるため)これらの課題を解決するためには、問題がどのような原因によって生じているのかを特定する必要がある。そこで本年度は、実験によるフィードバックに基づくCADモデルを作成、シミュレーションを行って、本機内部と周辺の電場の様相について手がかりとなる情報を得ようと試みた。このシミュレーションによれば、電場の強度は、内側ピペット先端周辺では非常に高く(300megaV/m)、外側ピペットの先端付近では急激に減少していた。また、外側ピペットの開口部においては、電場の力は中心部においてより高く、周辺部(=外側ピペット内壁付近)ではゼロであった。これらのシミュレーションが正しいと仮定すると、本機にかかる電場の強度そのものは、本機開口部直下にある細胞培養液を必然的にピペット内部に引き込むほどには大きくないと考えられる。この考察から、本来親水性であるガラスの表面に、何らかの疎水性コーティングを施す等の適切な工夫を加えることにより、細胞培養液のピペット内への取り込み=ショートのリスクを軽減することは可能であると結論することができた((2))。また、内外ピペットの配置をより容易にするための手段として、外側ピペットの開口部をより大きくすることが可能であると結論することができた((1))。本機を設計・安定した低流量電子スプレーを空気中で発生させる実験条件を最適化した後、先端を溶液に浸しても内側ピペットに電圧を加えている間は液体がピペット先端に入らないような現実的モデルを作成した。次に、ナノ電子スプレーの先端を塩溶液/細胞培養液に浸し、標的細胞の近傍によせた状態で評価した。電子スプレーの先端をマイクロマニピュレータに接続し、落射蛍光顕微鏡で観察しながらチャンバー内の液体に浸したところ、内外ピペットの間の空間に精確に調節した圧力をかけることにより、スタンバイ(=電圧をかけていない)状態で電子スプレーの疎水性先端部への液体の侵入を防ぐことができた。

次に、蛍光色素を入れた内側ピペットに直流バイアスの交流電圧をかけたところ、はじめは(1)ピーク時50250nAの電子スプレーパルス電流が流れ、(2)外側ピペットの内側がやや蛍光で染まり、(3)開口部にも蛍光が確認できた。さらに、ピペット先端近傍の神経細胞も急速に染まった。しかしその直後(1-2分後)、電流が急激に大きくなると同時に外側ピペット先端が蛍光色素で満たされ、培養液中にも漏れた。このことは、(1)内側ピペット先端で生成した荷電粒子は次第に外側ピペット内壁に蓄積し、想定したとおりにイオン収束効果を発揮するが、(2)この収束効果では、液滴が限界密度に至るまで蓄積し終には膜となって外部塩溶液を先端に引き込んでしまうのを避けることができないことを示唆している。初期に観察された近傍神経細胞の蛍光は、いくばくかの色素が細胞内に到達したことを示している。しかし、蛍光タンパクをコードするプラスミドをスプレー液の中に入れてもその発現は確認できなかった。このことから、今回の手法は小分子には有効だが、上記の先端の問題が示すとおり電圧とスプレー照射時間に限界があるため、より大きな分子の導入には不適当であるとわかった。-内側のピペットの先端を外側のピペットの開口部に対して精確に配置することが非常に困難である。-ピペット外部の培養液とピペット内部のコンパートメントの水/空気の境面が不安定である(細胞培養液がピペット内部に入り込み、ショートしてしまうことがある)。24年度が最終年度であるため、記入しない。以下のような新しい仕様の電極を導入する。-外側ピペットの開口部を大きくする。(=>内外ピペットのアラインメントがより容易になる)-外側ピペットの先端部内壁にかかる電荷を大きくする。(=>強い電場を作ることにより、電子をより狭い範囲に向けて直進させることが可能になる)-不活性ガスを内外ピペットの間に連続的に流す。(=)導入粒子の流れを促進する。標的細胞をおおう培養液表面にくぼみを作ることにより、ピペット先端と細胞の距離を縮める。)24年度が最終年度であるため、記入しない。
肝における脂質輸送機構に関する研究

肝臓で合成されたトリグリセリド(TG)は他の脂質とともにアポ蛋白Bと結合しGolgi装置において超低比重リポ蛋白(VLDL)に組み込まれ分泌される。通常、アポBの合成量は過剰でありVLDL分泌に使用される以外のアポBは細胞内分解を受けているという。従って、脂質の合成過剰はVLDLの分泌過剰を引き起こし高TG血症の原因となりうる。一方、脂質のアポBのアセンブリーの異常は脂質輸送の障害を引き起こし肝内脂質蓄積(脂肪肝)を引き起こす。この肝における脂質とアポBのアセンブリーの機構については十分なコンセンサスが得られていない。我々は空腹という簡単な操作で脂肪肝が形成されるスンクスという実験動物を通して肝におけるVLDLアセンブリー機構について検討してきた。最もアセンブリーに関与しているとされる脂質はTGであるが近年コレステロールエステル(CE)もそれ自身がアセンブリーのキ-ポイントであるとする報告が相次いでいる。本研究において肝におけるCE形成酸素であるAcyl CoA Acyltransferase(ACAT)活性を検討したところ、極めて低値を示した。一方、小腸におけるACAT活性はほぼラットと同様であったことより、肝臓に特異的と考えられた。一方、最近、無βリポ蛋白血症の研究からVLDLのアセンブリーにmicrosomal triglyeeride transferprotein(MTP)が関与しているとする報告がある。そこで、スンクスにおいても本蛋白の活性を検討したところ、ラットに比較して約30%と著明な低活性を示した。空腹にしても活性の変動は認められなかったが、再摂食により著明な活性亢進を認め、同時に脂肪肝の改善も認められている。従って、MTP活性が肝内脂質輸送に重要な役割を演じていることは間違いのない事実であると考えられる。さらに、VLDLのアセンブリーに関与するものとしてアポ蛋白Bの合成と細胞内異化機構が重要である。そこで、スンクスの初代培養肝細胞を用いて、アポ蛋白Bの合成と細胞内異化について検討した。結果は細胞内異化の亢進は認められなかったが、アポ蛋白B合成の著明な低下が認められた。今後、これらのACAT活性の低下、MTP活性の低下、アポ蛋白Bの合成低下などを統合する原因について検討を進める必要があると考える。スンクスという実験動物において24時間の絶食により脂肪肝が形成されることを原点としてアポ蛋白B含有リポ蛋白の肝におけるアセンブリーの機構について検討することが本研究の目的であるそこで、VLDLアセンブリーにおけるコレステロール代謝の役割を検討する目的で肝臓におけるコレステロールエステル形成酵素であるacyl coenzyme A cholesterol acly-transferase(ACAT)を測定した。スンクスにおいて肝臓ではACAT活性は極めて低値を示し、そのことを反映して肝臓コレステロールエステル(CE)含量が低下していることが判明した。次に肝臓でのCEを増加させる手段として、高コレステロール食でスンスクを飼育し、VLDL分泌に及ぼす影響を検討した。コレステロール吸収に重要な役割を果たす小腸のACAT活性は高い活性が認められ、コレステロール吸収には支障がないものと考えられた。しかし、コレステロール食による小腸ACATの上昇は認められず、肝臓でも本来のACATの著明な低活性が亢進されることはなかった。一方、高コレステロール食により食後血清コレステロールの上昇は認められ、肝臓のCE、トリグリセリド含量は微量であるが有意に上昇した。