hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
精漿中の精子運動抑制因子の基礎的及び臨床的研究

精嚢から分泌され精漿中に存在するブタ精子運動抑制因子(Seminal Plasma Motility Inhibitor以下SMPI)は、分子量14000,16000,18000の3つのポリペプタイドから構成され、その14000のポリペプタイドのcDNAクローニングに昨年度成功した。この645bpのboarSPMIcDNAの核酸シークエンスの分析では137のアミノ酸残基を有し、21アミノ酸残基のシグナルペプタイドと116アミノ酸残基の分泌蛋白を含んでいる。boar SPMIにはN-linked glycosylation siteがN^<15>-Y-SとN^<50>-L-Tの2カ所にあり、アミノ糖の分析結果からN^<50>-L-Tはoligosaccharide chainを含んでいることが推察された。boar SPMIのN末端アミノ酸25残基までと完全に一致していた、ブタ精子頭部に存在するzona pelluciba-binding glycoprotein,AQN-3の全アミノ酸配列とboar SPMIを比較したところ、97%の相同性を有していた。このAQN-3のcDNAクローニングはいまのところ報告されていない。最近、低分子量蛋白がブタ精子及び精漿から分離されており、これらの蛋白はspermadhesinと呼ばれている。精子に結合するspermadhesinはdecapacitationfactor,acrosomal bindingfactor,heparin binding propertiesによるcapacitationfactorあるいはzona pellucida glycoproteinに対してのprimary receptor等の多機能にわたる作用を持つ。spermadhesin familyには現在11のメンバーが含まれており、boar SPMIは12番目のspermadhesin familyと考えられる。boar spermadhesinと相同性を有する蛋白は他の種では今のところ報告されていない。しかしながらヒト精漿に存在するSPMIはboar SPMIとある部分、アミノ酸配列が似ている可能性が考えられるが、現在のところ不明である。SPMIがspermadhesin familyの持つ多くの機能を有するかどうか今後の研究所課題にしたい。ブタの精巣、精巣上体、精嚢、前立腺、尿道腺、腎臓、膀胱、肝臓、脾臓等の臓器、そしてヒト精嚢にて各臓器のmRNAを抽出してNorthern blottingを行ったところ、3時間の露出ではSPMI mRNAはブタ精嚢のみに発現していた。24時間の露出ではブタ精嚢の発現量はさらに顕著となり、わずかに発現したブタ前立腺を除いて他の臓器には発現が見られなかった。前立腺にみられたmRNAが発現量からおそらく、mRNAが高濃度に存在する精嚢上皮が混入したものではないかと考えた。ヒト精嚢は6検体調べたがいずれもboar SPMIと相同なmRNAの発現を見なかった。ブタとヒトのSPMIの構造上の相違が示唆され今後の研究課題としたい。クローニングしたSPMIをpQE30 vectorに組み込んで大腸菌にてSPMI蛋白を発現させる系の作製に成功した。発現蛋白はWestern blotting法で抗SPMI抗体と反応することが確認された。しかし得られた蛋白を種々の溶媒で処理しSPMI生物学的活性を調べてみたが、活性を持った状態で溶解することが出来なかった。この点につき共同研究者Gagnon教授と共に実験を重ね、さらに他の海外研究者との情報交換にても、このプロジェクトの研究期間中には解決しなかった。臨床研究として精子無力症患者の運動不良な精子の細胞内抽出液にSPMIと同一の抑制因子が存在しているかの研究を行っている。除膜精子の運動を抑制する程度とSPMI抗原量がおおむね相関するデーターを得ているが、これだけで精子細胞内抽出液中にSPMIが存在するという証明にならないものと判断し、今後、精子細胞内抽出液の精漿からの混入の可能性を否定する実験が必要である。すなわち精漿中のあるマーカーを見つけ精漿が精子細胞内抽出液に混入していないとのデーターを示さねばならず今後の研究課題としたい。

spermadhesin familyには現在11のメンバーが含まれており、boar SPMIは12番目のspermadhesin familyと考えられる。boar spermadhesinと相同性を有する蛋白は他の種では今のところ報告されていない。しかしながらヒト精漿に存在するSPMIはboar SPMIとある部分、アミノ酸配列が似ている可能性が考えられるが、現在のところ不明である。SPMIがspermadhesin familyの持つ多くの機能を有するかどうか今後の研究所課題にしたい。ブタの精巣、精巣上体、精嚢、前立腺、尿道腺、腎臓、膀胱、肝臓、脾臓等の臓器、そしてヒト精嚢にて各臓器のmRNAを抽出してNorthern blottingを行ったところ、3時間の露出ではSPMI mRNAはブタ精嚢のみに発現していた。24時間の露出ではブタ精嚢の発現量はさらに顕著となり、わずかに発現したブタ前立腺を除いて他の臓器には発現が見られなかった。前立腺にみられたmRNAが発現量からおそらく、mRNAが高濃度に存在する精嚢上皮が混入したものではないかと考えた。ヒト精嚢は6検体調べたがいずれもboar SPMIと相同なmRNAの発現を見なかった。ブタとヒトのSPMIの構造上の相違が示唆され今後の研究課題としたい。クローニングしたSPMIをpQE30 vectorに組み込んで大腸菌にてSPMI蛋白を発現させる系の作製に成功した。発現蛋白はWestern blotting法で抗SPMI抗体と反応することが確認された。しかし得られた蛋白を種々の溶媒で処理しSPMI生物学的活性を調べてみたが、活性を持った状態で溶解することが出来なかった。この点につき共同研究者Gagnon教授と共に実験を重ね、さらに他の海外研究者との情報交換にても、このプロジェクトの研究期間中には解決しなかった。臨床研究として精子無力症患者の運動不良な精子の細胞内抽出液にSPMIと同一の抑制因子が存在しているかの研究を行っている。除膜精子の運動を抑制する程度とSPMI抗原量がおおむね相関するデーターを得ているが、これだけで精子細胞内抽出液中にSPMIが存在するという証明にならないものと判断し、今後、精子細胞内抽出液の精漿からの混入の可能性を否定する実験が必要である。すなわち精漿中のあるマーカーを見つけ精漿が精子細胞内抽出液に混入していないとのデーターを示さねばならず今後の研究課題としたい。1.臨床的研究:精子運動不良(精子無力症)患者の精子細胞内抽出液中に、精子運動を抑制する因子が含まれていることが共同研究者のde Lamirandeらにより予報されており、例数を増やしこの因子の存在を検討した。不妊症患者
次世代型バイオ医薬品のための選択的分子導入システムの開発

本年度は主に以下の3点について評価した。まずイオン交換基の種類がタンパク質の吸着配向性へ及ぼす影響について調査した。具体的には両性イオン交換担体であるハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー(HAC)における固相反応、pH勾配クロマトグラフィーによる吸着配向性の評価を実施した。その結果、HACでは標準的なイオン交換クロマトグラフィー(IEC)に比べて数・位置異性体の選択性は低下した。そこで機構モデルにより吸着サイト数B値を評価したところ、IECと比較しHACではB値が1減少した。上述の知見はIECではリゾチーム表層上のK33(アミノ酸配列における33番目のリジン残基)がカラム吸着に使用されるが、HACではK33がPEG修飾可能な位置に存在することを示唆している。次にタンパク質の吸着密度が収率に及ぼす影響について評価した。具体的には移動相塩濃度により吸着密度を変化させ固相反応を実施し、基材とPEG鎖の親和性が収率に影響を及ぼすことを明らかにした。また標準的なIECを用いた場合収率は3割程度にとどまっていたがHACでは収率は9割を超えた。この結果より、修飾位置の限定率に関してはIECよりも劣るものの、HACにより高効率な固相反応操作を確立できると考えられる。さらに拡散係数、分配係数を用いて機構モデルに従いPEG化タンパク質溶出曲線・分離度の流速依存性をシミュレーションした。その結果、溶出曲線を正確に予測できること、PEG化タンパク質を多孔性微粒子型クロマトグラフィーにて分離する際には流速を増加させると分離度が著しく低下することが明示された。加えてモノリスクロマトグラフィーを用いてPEG化タンパク質の分離条件を最適化した。本手法は1測定あたり6分以内で実施できるため、製造工程のモニタリングによって品質を保証するためのシステムであるPATへの応用が期待できる。27年度が最終年度であるため、記入しない。PEG化タンパク質は優れた医薬品であるが、生成反応の制御は困難であり修飾数、修飾位置、活性の異なる異性体の混合物として製品化されているのが現状である。そのため反応を制御する手法の確立が求められている。そこで本研究ではタンパク質の精密分離に用いられるイオン交換クロマト(IEC)担体の分子認識能に着目し、(1)イオン交換担体上へのタンパク質の固定化より反応修飾部位を制御するクロマト固相反応操作の確立と(2)生成物の連続的分離プロセスの構築を目的とした。本年度は(1)の目的を達成するために固相反応時の固液界面におけるタンパク質分子の配向状態を明らかにした。具体的にはタンパク質構造データバンクの3次元構造情報にもとづいた表面電荷計算とpH勾配クロマトにより、固相反応時にリゾチーム表面のある特定の領域に存在するリジン残基のみ(アミノ酸配列における13, 97, 116番目のリジン残基のみ)PEG修飾を受けることをつきとめた。また反応の最適化に向け固相反応収率に及ぼす操作変数の同定を行った。具体的には活性化PEG濃度、担体粒子径、担体骨格構造などの影響を検討した。その結果収率向上のためにはPEGの細孔内拡散に加え、タンパク質の吸着密度を考慮する必要があることが明らかになった。さらに(2)の目的を達成するため、試料の物質移動特性を定量化した。具体的にはカラム性能を評価する理論段相当高さの流速依存性からPEGおよびモデルPEG化タンパク質の細孔内拡散係数Dsを算出した。これは通常クロマトグラフィーでは細孔内拡散が分離性能を支配するためである。一方で巨大分子の分離に適している貫通孔型モノリスクロマトでも分離条件の最適化実験を実施した。具体的には溶媒pH、塩濃度勾配、圧力損失などを考慮し生成物を効率的に分離する手法を開発した。この成果は国際学術誌に一編投稿中である。

加えてモノリスクロマトグラフィーを用いてPEG化タンパク質の分離条件を最適化した。本手法は1測定あたり6分以内で実施できるため、製造工程のモニタリングによって品質を保証するためのシステムであるPATへの応用が期待できる。今年度の課題は(1) IEC固液界面における配向状態の確認、(2)固相反応収率に及ぼす因子の同定、(3)試料の物質移動特性の定量化の3つである。課題(1)については未検討のリガンドが数種類存在する。しかし課題(2)についてはタンパク質の吸着密度および負荷量の影響の検討を残すのみとなった。また課題(3)については予定していたPEGおよびモデルPEG化タンパク質の分子拡散係数および細孔内拡散係数を測定し終え、かなり順調に推移している。このため全体的には「おおむね順調に進展している」という自己評価となった。27年度が最終年度であるため、記入しない。まず両性イオン交換体であるハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー(HAC)担体上でのタンパク質の吸着配向を確認する。なぜならばHAC担体上のカルシウムイオンはタンパク質表面に局在するヒスチジン、システイン、トリプトファンとアフィニティーを持ち、これらが固液界面側へ向くよう吸着配向性が変化すると予想されるためである。次に破過実験を行い各塩濃度条件における吸着量からタンパク質の分子間距離を算出し、その分子間距離と固相反応収率の関係を評価する。またサンプル負荷量が収率に与える影響も検討する。最後に非吸着条件、吸着条件における細孔内拡散係数Dsおよび分配係数Kとピーク幅Wの関係を解明するため、塩濃度直線勾配溶出実験から種々のKにおけるDsを算出する。この結果を機構モデルに組み込むことによりPEG化タンパク質の分離挙動を正確に予測できると期待される。
知覚における異なる感覚モダリティ相互作用

開眼者が視覚的な形の知覚を成立させるには,視覚自体だけではなく触覚が大きな役割を演じていることが明らかにされており(鳥居・望月,1992,1997;梅津,1997),active touchの重要性が示されている(鳥居・望月,1992,1997)。このactive touchの重要性は視覚正常者においても示されている。Katz(1925)はテクスチャーを知覚するときにpassive touchではなく,active touchによって弁別できるようになることを実験的に示し,日常生活では能動的に触れることで外的環境を知覚していることを指摘した。また,形を知覚する際にもactive touchの重要性が示されている(Gibson,1970)。そこで本研究では,active touchとpassive touchによる触覚情報が湾曲錯視の見えに与える影響を検討した。その結果,active touchによる触覚情報もpassive touchによる触覚情報も見えに対して影響を与え,触覚情報の方向へ偏向することが示され,特にactive touchが"見え"に対して影響を与えやすいことが明らかとなった。これは,active touchが見えに対する影響を規定する要因の一つとなっていることを示唆している。また,これまでの研究から錯視図形の見えは触覚情報の影響を受け,その方向へ偏向することが明らかとなった(大森ら,2005)が,これらの実験では,触覚情報が3次元的に触ることができる木の板を用いていた。そこで本研究では,触覚情報を2次元面の紙面上(立体コピー)に示し,触覚情報が錯視に及ぼす影響を検討し,先行研究で明らかにされた3次元的な触覚情報の効果と比較を行った。その結果,錯視図形における主線の見えは平面的な触覚情報の影響を受け,その触覚情報の湾曲方向へ偏向することが示された。これらの結果を,立体的な触覚情報が視覚に及ぼす効果(大森ら,2005)と比較すると,立体的な触覚情報では,触覚情報が凸・平行・凹のすべてにおいて見えに影響を及ぼすことが示されたのに対し,平面的な触覚情報が見えに与える効果は部分的である。これらのことから,立体的な触覚情報は見えに対してより強く影響することが明らかとなった。開眼受術者の知覚体験から,かたちの知覚の成立には触覚が大きな役割をはたしているということが明らかにされている(鳥居・望月,1992,1997;梅津,1997).それに対して視覚正常者における空間的な知覚では,他の感覚モダリティよりも視覚が優位であるということが報告されている(Gibson, 1933 ;Rock & Victor, 1964).このような感覚モダリティ問相互作用の研究においては,空間定位が影響を与えると言われており(Spence, 2002),開眼者が視覚における知覚を成立させるためにも重要であると考えられている(鳥居・望月,1992,1997).また,現実場面におけるかたちの知覚に近づけるためにも,空間定位の問題は重要であると考えられる.そこで,視覚パターンとしてヘリング錯視とヴント錯視を,触覚パターンとして木の板を用いるとともに,視触覚提示台を用いて視覚と触覚の空間定位を一致させ,視覚正常者を対象に,触覚が視覚に対して与える影響について検討した.その結果,湾曲錯視図形における主線の"見え"は,触覚情報の方向へ偏向することが示された.さらには,目と手の協応動作によって"見え"はより触覚情報の方向へ偏向することが明らかとなった.また,各視覚パターンにおける触覚パターンなし条件では,主線の"見え"に差がなかったことから"見え"は見方によって変化するのではなく,自と手の協応動作が"見え"に対する影響を規定する要因の一つとなっていることが示された。また,視覚と触覚の空間定位を一致させた状態と,不一致状態との比較を行い,触覚が視覚に対して与える影響について検討した.その結果,空間定位一致・不一致両状態において主線の"見え"は,触覚情報の方向へ偏向することが示されたが,空間定位が一致した場合の方が,不一致の場合よりも,"見え"はより触覚情報の方向へ偏向することが明らかとなった.われわれは,対象が持つかたちや大きさ,質感などの情報を視覚と触覚両方から得ることができる。視覚からの情報と触覚からの情報が同時に獲得されるとき,それらの情報はどのように処理されているのか?Berkeley(1709)は,空間知覚は視覚ではなく触覚の経験に基づいていると論じた。この主張に対して,初期の心理学における実験的な研究の多くは,視覚が触覚よりも優位であることを示してきた(e.g., Rock & Victor,1964)。しかし,早期失明者の開眼手術後の知覚に関する研究においては,視覚的なかたちの知覚の成立には視覚自体だけではなく,触覚が大きな役割を演じていることが明らかにされている(鳥居・望月,1992,1997;梅津,1997)。また近年の心理学では,視覚正常者においても,触覚が視覚よりも優位になる場合があることが報告されている(e.g., Ernst,& Banks 2002)。このような点から,視覚正常者を対象とし,湾曲錯視図形と錯視を生じさせない線図形を用いて,触覚情報が視覚に対して影響を与えるのか比較検討を行った。

その結果,湾曲錯視図形を用いた検討では,主線の湾曲の"見え"は触覚情報の影響を受け,触覚情報の方向へ偏向することが示唆された。しかし線図形を用いた検討では,線図形の"見え"は触覚情報の影響を受けないことが示された。今回用いた湾曲錯視であるヘリング錯視図形とブント錯視図形は奥行(3次元)を見ることができる錯視図形である。それに対して線図形は,2次元で捉えることのできる図形である。触覚の世界は常に立体であり,3次元に強いと考えられ,そのため錯視図形では触覚情報の影響を受け,線図形では受けなかったのではないかと推察される。開眼者が視覚的な形の知覚を成立させるには,視覚自体だけではなく触覚が大きな役割を演じていることが明らかにされており(鳥居・望月,1992,1997;梅津,1997),active touchの重要性が示されている(鳥居・望月,1992,1997)。このactive touchの重要性は視覚正常者においても示されている。Katz(1925)はテクスチャーを知覚するときにpassive touchではなく,active touchによって弁別できるようになることを実験的に示し,日常生活では能動的に触れることで外的環境を知覚していることを指摘した。また,形を知覚する際にもactive touchの重要性が示されている(Gibson,1970)。そこで本研究では,active touchとpassive touchによる触覚情報が湾曲錯視の見えに与える影響を検討した。その結果,active touchによる触覚情報もpassive touchによる触覚情報も見えに対して影響を与え,触覚情報の方向へ偏向することが示され,特にactive touchが"見え"に対して影響を与えやすいことが明らかとなった。これは,active touchが見えに対する影響を規定する要因の一つとなっていることを示唆している。また,これまでの研究から錯視図形の見えは触覚情報の影響を受け,その方向へ偏向することが明らかとなった(大森ら,2005)が,これらの実験では,触覚情報が3次元的に触ることができる木の板を用いていた。そこで本研究では,触覚情報を2次元面の紙面上(立体コピー)に示し,触覚情報が錯視に及ぼす影響を検討し,先行研究で明らかにされた3次元的な触覚情報の効果と比較を行った。その結果,錯視図形における主線の見えは平面的な触覚情報の影響を受け,その触覚情報の湾曲方向へ偏向することが示された。これらの結果を,立体的な触覚情報が視覚に及ぼす効果(大森ら,2005)と比較すると,立体的な触覚情報では,触覚情報が凸・平行・凹のすべてにおいて見えに影響を及ぼすことが示されたのに対し,平面的な触覚情報が見えに与える効果は部分的である。これらのことから,立体的な触覚情報は見えに対してより強く影響することが明らかとなった。
金属間化合物とジルコニア系セラミックスの複合材料の作製と特性評価

昨年度は脆性の金属間化合物のホウ化チタニウム(TiB_2)に強靭性ジルコニア(ZrO_2(2モル%Y_2O_3))を添加した複合材料を作製し,その機械的特性を評価した.今年度は窒化チタニウム(TiN)にZrO_2(2Y)を添加した二種類(試料A:ZrO_2(2Y)/TiN=40/60,試料B:70/30モル%)の複合材料を熱間静水圧プレス(HIP:1500°C-2h-196MPa)を用いて作製した.複合材料は粒径0.23umの正方晶ZrO_2(2Y)粒子と粒径1.5umのTiN粒子から構成された緻密な焼結体(相対密度【greater than or equal】99.5%)であった.電気抵抗率(p)は試料Aの金属的低抵抗率(p_A【product】x10^<-6> Ω・m)から試料Bの絶縁体的高抵抗率(p_B【product】x10^9 Ω・m)へと極端に変化した.なお,それぞれのpの値は「実効媒質理論(GEM)」に基づいて計算して得られた値と一致した.昨年度は脆性の金属間化合物のホウ化チタニウム(TiB_2)に強靭性ジルコニア(ZrO_2(2モル%Y_2O_3))を添加した複合材料を作製し,その機械的特性を評価した.今年度は窒化チタニウム(TiN)にZrO_2(2Y)を添加した二種類(試料A:ZrO_2(2Y)/TiN=40/60,試料B:70/30モル%)の複合材料を熱間静水圧プレス(HIP:1500°C-2h-196MPa)を用いて作製した.複合材料は粒径0.23umの正方晶ZrO_2(2Y)粒子と粒径1.5umのTiN粒子から構成された緻密な焼結体(相対密度【greater than or equal】99.5%)であった.電気抵抗率(p)は試料Aの金属的低抵抗率(p_A【product】x10^<-6> Ω・m)から試料Bの絶縁体的高抵抗率(p_B【product】x10^9 Ω・m)へと極端に変化した.なお,それぞれのpの値は「実効媒質理論(GEM)」に基づいて計算して得られた値と一致した.高温度下で使用可能な構造用材料であるケイ化モリブデン(MoSi_2)は,耐酸化性,耐食性および高融点(2030°C)といった優れた特性を有しているが,破壊靭性値K_<IC>が小さいという欠点がある.そこでMoSi_2の脆性を改善するため,2モル%のイットリア(Y_2O_3)を含むジルコニア(ZrO_2)を添加した各種組成の複合材料を熱間静水圧プレス(HIP: 1400°C-2h-196MPa)を用いて作製し,機械的特性を評価した.複合材料中のZrO_2(2Y)粒子(粒径0.23μm)は正方晶であり,MoSi_2(粒径1.8μm)との反応は認められなかった.添加量の増加(0→40モル%)とともに密度は97.1→99.0%に増加し,硬度は10.2から15.0GPaに向上した.K_<IC>は2.5から約2.5倍の6.0MPa・m^<1/2>へと著しく改善され,また強度も616から1034MPaと1GPaを超える高強度材料が得られた.さらにMoSi_2をWSi_2に置きかえたWSi_2/ZrO_2(2Y)系の複合材料も同様のプロセスで作製した.但し,WSi_2の融点(2164°C)を考慮しHIP焼結は1500°Cで行った.焼結中にWSi_2の1部はW_5Si_3と非晶質のSiに分解した.添加量の増加とともに密度は増加し(98.6→99.4%)かつWSi_2の結晶粒径は4.0から1.7μmへと減少した.K_<IC>は2.5から約2.7倍の7.0MPa・m^<1/2>へ,また強度は456から1011MPaへと2倍以上の向上が認められた.機械的特性が向上した理由は,準安定正方晶相として均一に分散させた(科研費にて購入した遊星ボールミルを使用)ZrO_2(2Y)粒子の変態強靱化と密度の向上に起因している.高融点と高硬度を持つ金属間化合物のホウ化チタニウム(TiB_2)は,高温度での耐酸化性と良好な熱伝導性という特長を有しているが,破壊靱性値K_<IC>と曲げ強度が小さいという欠点を持っている.そこでTiB_2の機械的特性を改善するため,2モル%のイットリア(Y_2O_3)を固溶させた強靱性ジルコニア(ZrO_2)を添加した各種組成(TiB_2/ZrO_2(2Y)=100/0-50/50モル%)の複合材料を熱間静水圧プレス(HIP:1500°C-2h-196MPa)を用いて作製し,その機械的特性を評価した.複合材料中に均質に分散したZrO_2(2Y)

粒子(粒径0.7-1.3μm)のうち8090体積%の粒子は単斜晶であり,TiB_2粒子(粒径1.75μm)との反応は認められなかった.複合材料の相対密度はZrO_2(2Y)の添加量が20モル%の時最大値98.6%を示した.K^<IC>は【product】3.7MPa・m^<1/2>から30モル%のZrO_2(2Y)添加で【product】1.2MPa・m^<1/2>と約3倍値が向上した.なお,本研究で得られた【product】1.2MPa・m^<1/2>の値は以前報告された値(7-8.4MPa・m^<1/2>)に比べて格段に高い.この強い靱化機構は単斜晶ZrO_2によるマイクロクラック強化と考えられる.一方,曲げ強度は,TiB_2のみの焼結対で645MPaであり,相対密度が最大値を示した組成の複合材料で最大値910MPaが得られたが,K^<IC>の最高値が得られたTiB_2/ZrO_2(2Y)=70/30モル%組成の複合材料では680MPaに低下した.この理由は,ZrO_2比率の増加によってもたらされたマイクロクラックの増加のためである.複合化することで機械的特性が大幅に向上したのは,複合材料中に単斜晶ZrO_2粒子を均一に分散させた(科研費にて購入した遊星ボールミルを使用)ことに起因する.昨年度は脆性の金属間化合物のホウ化チタニウム(TiB_2)に強靱性ジルコニア(ZrO_2(2モル%Y_2O_3))を添加した複合材料を作製し,その機械的特性を評価した.今年度は窒化チタニウム(TiN)にZrO_2(2Y)を添加した二種類(試料A:ZrO_2(2Y)/TiN=40/60,試料B:70/30モル%)の複合材料を熱間静水圧プレス(HIP:1500°C-2h-196MPa)を用いて作製した.複合材料は粒径0.23μmの正方晶ZrO_2(2Y)粒子と粒径1.5μmのTiN粒子から構成された緻密な焼結体(相対密度【greater than or equal】99.5%)であった.電気抵抗率(ρ)は試料Aの金属的低抵抗率(ρ_A【approximately equal】1x10^<-6>Ω・m)から試料Bの絶縁体的高抵効率(ρ_B【approximately equal】1x10^<-9>Ω・m)へと極端に変化した.なお,それぞれのρの値は「実効媒質理論(GEM)」に基づいて計算して得られた値と一致した.
圧入空気による地盤強化と地下水の制御手法の基礎的研究

地下水にある地盤中に空気または気泡及び若干の補助充填材の圧入により形成される飽和度の低い部分(エア-カ-テンと呼ぶ)を実現することにより、止水効果や地盤強度を改善する手法を開発するための基礎的技指針を究明することが目的である。このため、次の3点から検討した。(1)一次元土柱への空気送気の透気試験と気泡材圧入による止水性試験:乾燥土柱の下端から空気を送ると、浸透破壊に対するテルツア-ギの限界動水勾配に対応して、ic=Gs/(1+e)でほぼ近以されることが判明した。一方、湿潤土の場合には含水状態により挙動が変化するが、(1)高含水状態のときは空気流により、まず飽和度の鉛直方向分布の均質化が生じることが理論的にも実験的にも確認されること、(2)ある飽和度以上の場合、間隙水が土表面上に浸出するが、その後さらに空気圧を上昇させると`噴発'を発生させることになること、などが判明した。(2)土の間隙構造の研究:土の透気性や透水性に対して影響する要因はその間隙構造であるので、間隙構造を究明するために、土の比表面積・間隙径分布の測定による検討を試みた。その結果、市販の島津製SSー100により計測される比表面積と透気係数から推定された、平均間隙径は透水性・透気性を表現するうえで非常に効果的な量であり、従来あいまいであった粒子の形状係数を包含した形式でうまく表現されることが判明した。また、水銀圧入式ポロシメ-タによる砂質土の間隙径計測では、従来より若干大きめの48μmまで測定でき、間隙比の増加につれ間隙径も増大すること、及び水分特性曲線の推定にも有効であることを明かにした。(3)2次元場(砂模型内のトンネル)での圧入空気挙動:砂模型地盤内のトンネル部からの圧入空気により地下水流を遮断して、止水効果が現れるか否かを調べた結果、空気圧力と空気流量の間にはトンネル規模により決まる関係があること、若干の止水効果が水面形状に現れたけれども、顕著に遮水できるほどでないこと、及びその原因は空気の通過する道が砂地盤中の弱部を探索する形でランダムに形成されるためであることが判明した。このため、空気道をトンネル直上部に集中させるためのハ字の形状の空気制御部分を造った場合の実験で、止水効果を調べた結果、地表に漏れる空気が直上部に制御できる傾向を認めた。研究目的は地下水のある地盤中に空気または気泡を圧入して形成される飽和度の低い部分(エア-カ-テン)を実現することにより、止水効果や地盤改良の手法を開発するための基礎的技術指針を究明することである。初年度の平成2年度は、(I)湿潤土の1次元透気性試験,(II)圧入効率試験(土粒子特性、間隙特性と注入の関係)、(III)2次元的エア-カ-テンの形成機構の究明、の3点に重点をおいた研究を実施した。

得られた知見を箇条書きにすると次のようである。(I)に対して、(1)圧入空気による間隙水の相対運動が解析的・実験的に説明できる。(2)噴発条件についても限界動気勾配が浸透破壊と類似した形式で表現できる。(II)に対しては、(3)土粒子特性や間隙特性をフロ-ソ-ブによる比表面積測定やポアサイザ-による間隙形分布測定により計測・評価した結果、間隙径により透水性や透気性が極めてよい精度で表現できることを見い出した。(4)間隙径分布を用いた不飽和透水特性の定式化も試みた。(III)に対しては、2次元砂模型実験により次の事項が判明した。(5)一次元で予想されるより相当高い空気圧で空気圧入しても噴発が発生しにくいこと、注入空気流量の増加とともに遮水効果が現れ、みかけの透水係数が減少すること、および注入圧力に対する空気流量が最大になるような状態が存在することがわかった。(6)空気注入するトンネル部口径は小さいものを多くした方が効果的である。(II)で当初予定していた気泡材を用いた実験は不十分な数しか実施できなかったが、次年度(最終年度)には気泡の注入効率も研究する予定である。研究目的は地下水のある地盤中に空気または気泡を圧入して形成される飽和度の低い部分(エア-カ-テン)を実現することにより、止水効果や地盤改良の手法を開発するための基礎的技術指針を究明することである。初年度の(1)1次元土中への透気試験、(2)圧入効率試験、(3)2次元的透気試験、に対して2年目の平成3年度は、(1)圧入空気による2次元的止水効果試験、(2)圧入空気と土粒子・間隙構造試験、および(3)不飽和シルト質土の透水試験、などを実施した。得られた結果を要約すると次のようである。(1)圧入空気による2次元的止水効果試験:2次元土層地盤模型の底面に設けた小トンネルから圧入した空気による止水効果を実験的に調べた。空気圧と空気流量の間にはトンネル規模により決まる関係が見いだされたけれども、透水性を著しく低下させるにはかなり多量の空気流量が必要で、噴発させない範囲では止水性を実現することは困難であることが分かった。このため気泡材を代用して圧入することを試みようとしたが、気泡材がメ-カ-指示に従っても形成されず、好結果にはつながらなかった。改善を加えて更に検討する予定である。(2)圧入空気と土粒子間隙構造試験:土粒子から成る間隙構造によって透水性が変化するが、透水性の約100倍も高い透気性試験により、その性状を調べたところ、島津製・比表面積測定器SS-100による測定値を利用して算出される間隙径が有力な説明変数となること、及び間隙の不安定さの表現因子となる可能性を見いだした。(3)シルトの不飽和透水試験:砂質土に較べてシルトの不飽和透水には時間が透水係数に反比例して所要であること、土の水分保持特性を同時に得るためには薄い試料が好都合であることが分かった。
新規キラル触媒開発と不斉反応への展開

触媒的不斉合成反応は、光学活性化合物を得る上で、最も有用な方法論の一つである。その触媒の多くは金属を活性中心として持っているため、あまり用いられていない金属を用いることや新たな不斉配位子を開発し適用することは、既存の不斉反応の改良や新たな不斉反応の開発の可能性を生み出すという点で非常に重要な研究テーマであり、このような概念をもとに筆者らはニオブを活性中心とするキラル触媒の開発を行った。ここで、アジリジンは窒素原子を含む歪んだ三員環構造を有し、窒素求核剤を用いて反応させると1,2-ジアミンが生成する。光学活性ジアミンは、生理活性物質や天然物、さらに不斉配位子の合成前駆体としても非常に重要な化合物群である。このような背景を元に筆者はキラルニオブ触媒を用いるアジリジンの不斉開環反応の研究を行った。アジリジンの窒素上の保護基の検討を行ったところ、電子吸引性基を有する活性化アジリジンでは反応性は鈍く不斉誘起はほとんど起こらないことを見出した。また、生成物阻害が起こるために脂肪族置換基は有効ではなく、アジリジンの保護基は芳香環である必要があった。また、触媒調製についても非選択的経路で反応が進行することを見出し、これを抑制する方法論を見出した。このような知見を元に筆者は反応の基質一般性を検討し、中程度から良好なエナンチオ選択性をもって目的の化合物が得られることを明らかとし、さらに生成物の多くは簡単な再結晶操作によって光学純度を容易に高められることを確認した。以上、筆者はキラルニオブ触媒を用いて、これまでにあまり報告が成されていないアジリジンのアニリンによる開環反応について検討を行い、光学活性な1,2-ジアミンを効果的に得る方法を見出した。この化合物群は天然物などに広く見られ、選択的に片方の芳香族を脱保護することで光学活性な非対称ジアミンなどへと変換することができる。本研究は、これまでにLewis酸としてほとんど活用されてこなかった金属元素であるニオブやバナジウム、タンタル、モリブデンなどに着目して、それらを不斉配位子と組み合わせることによって新しい光学活性Lewis酸触媒を創製し、その特徴を活かした触媒的不斉反応を開発することを目的としている。その一端として既に当研究室では、ニオブ(V)アルコキシドと光学活性三座型ビナフトール誘導体とから調製したLewis酸触媒が、触媒的エナンチオ選択的Mannich型反応において有効に機能し、高い立体選択性が得られることを明らかにしている。またこれを発展させて、ニオブ(V)アルコキシドと光学活性四座型ビナフトール誘導体とを組み合わせると、メソエポキシドの窒素求核剤による開環反応が、高いエナンチオ選択性を持って進行することを見出している。そこでこれらの知見を基に、本研究では類縁反応であるアジリジンの窒素求核剤による触媒的不斉開環反応へと展開することとした。この種の反応はこれまで数例しか報告されておらず、非常に意義深いもと考えられるからである。アジリジンの窒素上の置換基や、触媒調製法、反応条件を種々検討した結果、本反応が円滑に進行し、良好なエナンチオ選択性を持ってジアミン生成物が得られることを明らかにした。興味深いことに、本反応の触媒系はエポキシドの反応において有効であったニオブ触媒を基礎にしているにも関わらず、エポキシドとは異なる選択性や基質依存性が発現するという知見を得ている。現在、更に効率的な反応系を達成すべく、反応の改良を進めているところである。本研究は、Lewis酸触媒の新しい可能性を拓くものである。
近現代ドイツ語の規範形成に関する社会言語学的研究 -コーパス分析による研究の可能性

高田は、1800年頃の言語的日常を「社会語用論的」に把握する目的で、Adelungの『ドイツ語辞典』(1793-1801年)のなかの「親しい話し方」という概念を抽出し、それを「上品さ」と「礼儀正しさ」との関わりにおいて、当時の教養市民層の言語観を辞書記述から再構成することを試みた。これを2003年3月22日に、ハイデルベルク大学での国際シンポジウム『言語変化と社会変化』において口頭発表した。16世紀の都市言語と官庁語の関係を課題とした森澤は、官庁のテキスト及び異なる社会グループに属する書き手の私的テキストに、複数の競合する関係詞がどのように分布するかを調査した。その結果、16世紀前半では官庁とはかなり異なる方法で関係詞を用いていたグループ(「一般市民、女性」)も、後半では官庁のそれにより近づいた方法で関係詞を使用していると解釈できるデータを得た。阿部は、16世紀から18世紀までの期間に、同一人物が異なるテクスト種(公的テクストおよび私的テクスト)において語順(主文の枠構造)を使い分けているのか否かを明らかにする調査を行った。収集した用例(約2400件)の分析の結果、枠構造使用に関する差は認められ、特に、公的テクストにおいては枠構造の中に従属文がより頻繁に挿入され、結果として枠構造の規模が私的テクストにおけるより大きくなっていることが確認された。中川は、2002年9月28日に開催された日本独文学会秋季研究発表会で、「枠外化の再検討-転写前後の談話を手がかりに」と題して研究発表を行った。また、「話し言葉における枠外化と後域配置」に関する論文を阪神ドイツ文学会の『ドイツ文学論攷』第44号に投稿し、採択・受理された。18世紀における言語状況を「社会語用論的」に把握する目的で,高田はAdelungの『ドイツ語辞典』(1793-1801年)(CDROM版を利用)のなかの「丁寧さ」という概念を抽出し,「上品さ」と「親密さ」との関わりにおいて,当時の教養市民層の礼節観を辞書記述から再構成することを試みた.森澤は,都市言語と官庁語の関係をさぐるにあたり,2001年夏のドイツでの資料調査に基づき,今後数多くの資料にあたって調査を行う際に重要となるポイントをまとめ,競合する関係代名詞のひとつで,元来は官庁体特有といわれるものが,16世紀における様々な社会グループに属する書き手のテキストにどのように分布するか,という点を中心に調査を進めた.中川は,ドイツ・マンハイムにあるドイツ語研究所のコーパス検索プログラムCOSMASIを用い,社会言語学に応用可能な語彙頻度の暦順変化やコロケーション分析,さらには演算子と正規表現を活用したメタレベルからの言語学的検索など,ドイツ語学研究に寄与しうるより高度な使用法を考案した.この研究は,次年度で展開を予定している質的なドイツ語研究との融合の基盤となるものである.阿部は,同一文筆家のテクスト種による統語論における相違の解明を目標とし資料収集を始め,17世紀後半に完全な枠構造使用が飛躍的に増加することを考え合わせ,調査対象とする時代を17世紀にまで発展的に変更・拡大し,2002年2月に資料収集を行った.

試験的調査からは,枠構造の急増が認められた後の18世紀において,例えばLessing(1729-81)やGellert(1715-69)での方が,枠構造浸透以前よりもテクスト種による差異がより明確であるという兆候が認められた.高田は、1800年頃の言語的日常を「社会語用論的」に把握する目的で、Adelungの『ドイツ語辞典』(1793-1801年)のなかの「親しい話し方」という概念を抽出し、それを「上品さ」と「礼儀正しさ」との関わりにおいて、当時の教養市民層の言語観を辞書記述から再構成することを試みた。これを2003年3月22日に、ハイデルベルク大学での国際シンポジウム『言語変化と社会変化』において口頭発表した。16世紀の都市言語と官庁語の関係を課題とした森澤は、官庁のテキスト及び異なる社会グループに属する書き手の私的テキストに、複数の競合する関係詞がどのように分布するかを調査した。その結果、16世紀前半では官庁とはかなり異なる方法で関係詞を用いていたグループ(「一般市民、女性」)も、後半では官庁のそれにより近づいた方法で関係詞を使用していると解釈できるデータを得た。阿部は、16世紀から18世紀までの期間に、同一人物が異なるテクスト種(公的テクストおよび私的テクスト)において語順(主文の枠構造)を使い分けているのか否かを明らかにする調査を行った。収集した用例(約2400件)の分析の結果、枠構造使用に関する差は認められ、特に、公的テクストにおいては枠構造の中に従属文がより頻繁に挿入され、結果として枠構造の規模が私的テクストにおけるより大きくなっていることが確認された。中川は、2002年9月28日に開催された日本独文学会秋季研究発表会で、「枠外化の再検討-転写前後の談話を手がかりに」と題して研究発表を行った。また、「話し言葉における枠外化と後域配置」に関する論文を阪神ドイツ文学会の『ドイツ文学論攷』第44号に投稿し、採択・受理された。
緑茶カテキンのがん細胞殺傷のしくみに基づいた新しい子宮頸部病変治療法の開発

本研究では、子宮頸癌およびその前癌状態である子宮頸部異形成における緑茶ポリフェノールEGCG(エピガロカテキンガレート)とPDE5阻害剤(vardenafil)を併用による治療の可能性を検討した。今回、HPV 16/18陽性の子宮頸部発癌モデルにおいて、PDE5阻害剤5μMを併用することでEGCG 10μMという低濃度でも90%程度の強い増殖抑制効果が認められた。また、子宮頸癌症例においてHPVタイピングにて40歳未満の若年者の子宮頸癌は、91.7%がHPV16あるいはHPV18陽性であることを確認した。この新規治療法はHPV16/18陽性の若年子宮頸癌効果が期待できることが示唆された。1.子宮頸部病変におけるホスホジエステラーゼ5(PDE5)発現子宮頸がん組織においてPDE5発現を免疫組織染色で検討した。扁平上皮癌と腺癌においてそれぞれ摘出標本のパラフィン封埋切片で抗PDE5抗体を用いて染色を行った。どちらの組織型でも癌組織の核にPDE5が発現していた。2.子宮頸部発癌モデルにおけるEGCGとPDE5阻害剤併用による細胞増殖抑制効果子宮頸癌細胞株SiHa(扁平上皮癌由来)とHeLa(腺癌由来)においてPDE5阻害剤(vardenafil)の細胞増殖抑制効果を検討した。これまでの研究で緑茶ポリフェノールEGCGは、50 μM以上の高濃度でしか増殖抑制効果が認められなかったが、今回vardenafil 5μMを併用することでEGCG 10μMという低濃度でも増殖抑制効果が認められた。この濃度は緑茶を実際に飲用した場合の血中濃度に近く、またvardenafilの濃度も臨床応用されている男性性機能障害治療薬バイアグラを服用した場合の血中濃度に近い。3.子宮頸癌症例におけるHPVタイピング子宮頸癌症例においてHPVタイピングを行い、今後EGCGとDE5阻害剤の併用効果とHPV型との関連を調べるための基礎データとした。腺癌や特殊型である小細胞癌からはHPV18が検出された。扁平上皮癌からはHPV16型やその関連する型が検出された。これらの結果は、目的とする子宮頸癌におけるEGCGによる治療や化学予防の可能性を十分示唆するものであり、今後予定どおり研究を継続する意義が確認できた。初年度は研究を継続する妥当性を検討する意味合いがあったが、子宮頸癌組織において初めてホスホジエステラーゼ5(PDE5)の発現が確認できたことは大きな意味を持つ。さらに実際に、子宮頸癌由来細胞株でEGCGの細胞増殖抑制効果がPDE5阻害剤で増強されることも確認できた。今後、研究を継続、進展させる意義が確認でき、今後につながるものであった。1.子宮頸部発癌モデルにおけるEGCGとPDE5阻害剤併用による細胞増殖抑制効果子宮頸部由来不死化細胞株においてもPDE5阻害剤(vardenafil)の細胞増殖抑制効果を検討した。HPV18陽性不死化細胞株においては、これまでの研究でも腺由来の細胞株は扁平上皮由来の細胞株に比べ、緑茶ポリフェノールの増殖抑制効果が弱かったが、今回veardenafil 5μMを併用することでEGCG 10μMという低濃度でも90%程度の強い増殖抑制効果が認められた。扁平上皮由来の細胞株での効果はさらに強力で、95%の増殖抑制効果だった。2.子宮頸癌由来細胞株における効果HPV18陽性腺癌由来細胞株であるHeLaにおいてさらに詳細な検討をおこなった。EGCG10μM単独での増殖抑制効果は、veardenafil 5μM単独と同様、ほとんど認められなかった。EGCG50μMでも増殖抑効果はなかったが、veardenafil 5μMの併用でEGCG10μMであっても約30%の効果が認められた。40歳未満の若年者の子宮頸癌は、90%以上がHPV16あるいはHPV18陽性であり、また腺癌はHPV18陽性であった。これらの結果は、若年子宮頸癌や腺癌症例におけるEGCGによる治療や化学予防の可能性を十分示唆するものであり、今後予定どおり研究を継続する意義が確認できた。初年度は、研究を継続させる妥当性の検討、そして次年度は、その発展の意味合いがあった。子宮頸癌由来細胞株、とくにHPV18由来の子宮頸部腺癌株でもEGCGとPDE5阻害剤併用による細胞増殖抑制効果が確定できた事は、大きな意味があった。また、子宮頸部多段階発癌モデルにおいて異形成に相当する不死化細胞株における極めて強い効果は、異形成を外科的でなく内服により治療できる可能性を示唆する結果であった。また、若年子宮頸癌や腺癌症例でHPV16/18の陽性率は極めて高かった結果は、今回検討している治療法の対象となり得ることを示している。

1.子宮頸部発癌モデルにおけるEGCGとPDE5阻害剤併用による細胞増殖抑制効果:これまでの研究でも腺細胞由来の不死化細胞株は扁平上皮由来の細胞株に比べ、緑茶ポリフェノール(EGCG)の増殖抑制効果が弱かったが、今回veardenafil 5μMを併用することでEGCG 10μMという低濃度でも90%程度の強い増殖抑制効果が認められた。扁平上皮由来の細胞株での効果はさらに強力だった。HPV18陽性不死化細胞株だけでなく、HPV16陽性不死化細胞株でも同様であることを確認した。これらの濃度は実際に飲用した場合や内服薬バイアグラを服用した場合の血中濃度に近い。EGCGのveardenafil併用による効果増強作用が示唆された。2.子宮頸癌由来細胞株における効果:HPV18陽性腺癌由来細胞株であるHeLaにおいてもEGCG10μMとveardenafil 5μMの併用でEGCG 10μMであっても約30%の効果が認められた。HPV16陽性扁平上皮癌細胞株での効果はより強力だった。3.子宮頸癌症例におけるHPVタイピング:子宮頸癌症例においてHPVタイピングを行い、今後EGCGとDE5阻害剤の併用効果とHPV型との関連を調べるための基礎データをさらに積み上げた。40歳未満の若年者の子宮頸癌は、90%以上がHPV16あるいはHPV18陽性であり、また腺癌はHPV18陽性であった。なお、小細胞がんは、HPV18陽性だった。これらの結果は、若年子宮頸癌や腺癌症例におけるEGCGによる治療や化学予防の可能性を十分示唆するものであった。本研究では、子宮頸癌およびその前癌状態である子宮頸部異形成における緑茶ポリフェノールEGCG(エピガロカテキンガレート)とPDE5阻害剤(vardenafil)を併用による治療の可能性を検討した。今回、HPV 16/18陽性の子宮頸部発癌モデルにおいて、PDE5阻害剤5μMを併用することでEGCG 10μMという低濃度でも90%程度の強い増殖抑制効果が認められた。また、子宮頸癌症例においてHPVタイピングにて40歳未満の若年者の子宮頸癌は、91.7%がHPV16あるいはHPV18陽性であることを確認した。この新規治療法はHPV16/18陽性の若年子宮頸癌効果が期待できることが示唆された。今後は、子宮頸癌の症例を増やしてPDE5の発現に組織型や進行期などで相違があるのかを検討する、さらに、前癌病変である異形成ではどうかも検討する。増殖抑制効果をわれわれが樹立している子宮頸部前癌病変モデルである不死化細胞株においても調べる。これらの結果によりこのEGCGと抗PDE5阻害薬の併用が、子宮頸癌の治療だけでなくいわゆる化学予防にも応用できるのかを検討する。併用効果の重要な因子であるPDE発現に組織型や進行期で差があるかを検討する。また、異形成でも検討する。さらに、効果のメカニズムの解明も進めていく。婦人科悪性腫瘍端数が生じたため、あえて使い切らずに翌年に回すことにした。端数が生じたたため、あえて使い切らずに次年度に回すことにした。翌年度は予定に従って実験を行う。また、その他としてHPVタイピングの検査費用にも支出予定である。翌年度も予定に従って研究を行う。また、物品費と予定していた一部をその他として、HPVタイピング検査費用にも支出する予定である。
深海由来の新奇セルロース分解菌が生産するセルラーゼの特異性を探る

深海由来のセルラーゼ生産菌について酵素の機能解析を行った。セルラーゼは生産菌の培養液から直接精製したものや、ゲノム解析から得た遺伝子情報をもとに大腸菌を形質転換し生産された酵素を用いた。それぞれの酵素の性質を調べた結果、深海環境に近い低温下、弱アルカリ性付近、食塩の存在下で良好に(リン酸膨潤)セルロースを分解した。酵素の分子量が大きいことも特徴の一つであり、糖鎖を有する酵素や特異なセルロース結合様部位を個有するようなセルラーゼも見出され、深海環境においては陸生由来の酵素とは明らかに異なるセルラーゼを生産する新奇な細菌が生息していることが判った。深海環境で進化したセルラーゼの特異的性質に関する基礎的知見を取得する事を研究目的とする。本年は深海由来の難培養性の細菌であるGE09株及びTYM08株のドラフトーケンス及びそのシーケンスの精査を行った。その結果、セルラーゼファミリーの酵素であるGH5及びGH9ファミリーのエンドグルカナーゼ、GH6及びGH9ファミリーのセロビオハイドロラーゼをコードする遺伝子を共に複数発見した。これらはどれも既知のセルラーゼと比較して相同性が低く高い新規性が予想された。特に特徴的な配列を保持する事が明らかになったGE09株について詳細な解析を行った。その結果、いくつかのセルラーゼはセルロース分解において重要な役割を果たす触媒部位のアミノ酸であるアスパラギン酸残基がグリシンやアスパラギンに置換されていることが確認された。また1つの酵素はN末側にセルラーゼには報告の無い機能ドメインを保持している可能性が詳細な構造予測の結果から示唆された。得られた配列情報を元に遺伝子組換えによるGE09株のセルラーゼの大量発現を試みた。その結果、コールドショック発現系を用いる事により可溶性タンパク質として上述の新規機能ドメインを保持する酵素を含めた2種のセルラーゼの発現に成功した。発現酵素の機能解析からこれらの酵素は10°C以下から活性を保持し25°C前後で最適反応温度を有するが30°C程度までしか酵素機能を保持する事ができない、低温酵素であることが明らかになった。また、ある程度の濃度までは塩依存的に活性の増加が認められ、NaClやKClなど2%最終濃度において塩を含まない条件と比較して比活性の上昇が確認された。さらにpH7から8前後が最適pHであった。これらの実験結果から、低温及び海水中という深海環境類似条件におけるセルラーゼ活性が確認された。深海環境で進化したセルラーゼの基礎的知見を取得する事を研究目的とする。平成27は深海由来の難培養性の細菌であるGE09株及びTYM08株の各種酵素の詳細な解析を行った。GE09株については触媒部位のアミノ酸が置換がされている事が明らかになった酵素を大腸菌を用いて組換え発現した結果、セルロースの分解を確認する事はできなかった。平成26年度の解析結果からセルロースの分解が確認できた組換え酵素は10°C程度でも活性がある事が判明していたが、さらなる詳細な結果から4°C以下の低温中においても活性を保持している事が明らかになり、水深1000mで5°Cを切るような深海環境に適応していることの一部が確認できた。構造予測から報告の無い機能ドメインを保持している可能性が高いと考えられたセロビオハイドロラーゼに関して基質との結合や分解を中心に解析を実施した。その結果、解析では機能保持が予想されていなかった領域においてセルロースとの結合を示唆する結果が得られた。TYM08株に関しては僅かながらに酵素を精製できる程度の培養系の確立、またブレビバチルスを宿主とした組換え酵素生産系の確立を行った。その結果、得られた酵素の1つであるエンドグルカナーゼはGE09株の酵素と比較して最適温度が高いこと、また大変興味深い事に組換え酵素との比較及びPAS染色の結果などから糖鎖を共有結合で保持するグリコプロテインである可能性が高い事が明らかになった。これらの実験結果から深海環境への適応を具体的に示すところまでは明らかにする事ができなかったが、セルロース分解とはイメージ的に結びつきにくい深海環境において、ユニークなセルラーゼを生産する細菌が生息している可能性が高い事が示された。ドラフトシーケンスの解析及びシーケンスの精査を予定通り実施した。その結果、新規性の高いセルラーゼと予想される多くの遺伝子の取得に成功した。得られた配列を元に遺伝子及び構造の予測を予定通り実施した。複数の遺伝子について、酵素活性において最も重要で保存性が求められる触媒ドメインのプロトンドナーであるアスパラギン酸残基がグリシンやアスパラギンへの置換が認められた事から活性を保持している可能性が低いという結果が得られた。しかし他の酵素の中に極めて特徴的な機能ドメインと示唆される配列も見つかった事から深海環境で進化したセルラーゼの特異的性質に関する基礎的知見を取得する目的は十分に達成できると考えている。