hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
顕生累代最初の絶滅事変－カンブリア紀礁生態系の崩壊と地球表層環境の変動－

カンブリア紀第二世末に生じた礁生態系の大規模崩壊前後での造礁生物群集の変遷と海洋古環境の変化を明らかにする目的で,本年度,モンゴル西部ゴビ・アルタイ地域と北中国山東省地域の最上部エディアカラ系からカンブリア系第二統の礁の野外地質調査をおこなった.1)モンゴル西部には,最上部エディアカラ系からカンブリア系第二統の礁の変遷が明瞭に記録されている.Zuun-Arts層最下部(最上部エディアカラ系)では,柱状やドーム状形態を示すストロマトライト礁が特徴的に発達する.それらは,ペロイド状粒子,ミクライト質クロッツによって形成されており,石灰質微生物類は認められない.Bayan Gol層下部(最下部カンブリア系)に初めてスロンボライト礁が構築される.その出現は,当該地域での石灰質微生物類の出現や微小骨格化石群の出現,生痕化石の多様化と同時である.Salaany Gol層(カンブリア系第二統)の礁は,樹状や層状,杯状の多様な形態を示す古杯類と石灰質微生物類(Epiphyton, Renalcis等),セメント(初生アラゴナイトのボトリオイドセメント等)によって形成された.これらは,古杯類大繁栄期の礁に相当する.2)北中国山東省朱砂洞層の礁(カンブリア系第二統)は,Salaany Gol層の礁と同時代である.しかし,朱砂洞層からは古杯類は産出せず,多様な石灰質微生物類(Epiphyton, Renalcis他)によって形成されたスロンボライトやストロマトライト礁が発達する.朱砂洞層上位の張夏層(カンブリア系ミャオリン統)の礁も同様にスロンボライトやストロマトライト礁が主体であるが,石灰質微生物類の構成は大きく異なる.礁生態系の崩壊前後で石灰質微生物類の群集構成にも変化が生じていたことが推定される1.モンゴルザブハン地域に分布するSalaany Gol層(カンブリア系第二統)から,石灰質微生物類礁,分岐状小型古杯類礁,板状古杯類礁,radiocyaths-大型古杯類礁などを識別した.石灰質微生物類礁は,石灰質微生物類Epiphyton, Renalcis, Tarthinia, Razumovskia, Girvanellaの密集によって形成された.分岐状小型古杯類礁やradiocyaths-大型古杯類礁では,古杯類が作る枠組み間にセメントがよく発達する.板状古杯類礁では,板状古杯類が形成する陰棲環境を活用し,単体古杯類がペンダント状に成長する.2.北中国山東省地域に分布する張夏層(カンブリア系第三統)には, Epiphyton, Renalcis, Girvanellaが豊富な微生物類礁が発達する.石灰質微生物類は,張夏層の下位に位置する朱砂洞層(カンブリア系第二統)やSalaany Gol層から産出する石灰質微生物類とは異なり,多様性も低い.古杯類消滅前後での礁の構築に関して,主要造礁生物とともに,付随生物の構成的な変化,堆積場の相違などをさらに検討する必要がある.3.生物絶滅事変直後の微生物活動や海洋環境を明らかにするために,南中国湖北省に特異的に発達する最下部トリアス系ストロマトライトについても検討をおこなった.ストロマトライトを構成するラミナは,穿孔性微生物類の間欠的な穿孔作用と穿孔孔への炭酸カルシウムの沈殿によって形成された.また,ラミナを構成する細粒ドロマイトの存在は,無酸素環境下での硫酸還元バクテリアの活動を示唆している.上記の成果を得たが,本年度途中で研究中断をしたため,予定していたモンゴルザブハン地域や北中国山東省地域での野外地質調査を行うことができなかった.研究申請の延長願いを既に提出しており,次年度以降,研究計画に沿って進める予定である.本年度,モンゴル西部ザブハン盆地に分布するエディアカラー下部カンブリア系(Tsagaan Oloom,Bayan Gol,Salaany Gol層)の野外地質調査をおこなった.1. Tsagaan Oloom層に分布する,柱状ストロマトライト“Boxonia"とリン酸塩質頁岩の累重を広範囲に確認した.ストロマトライト層は,下位の柱状ストロマトライトと上位のドーム状ストロマトライトから構成され,その上位には,リン酸塩質頁岩が累重する.柱状ストロマトライトと直下の黒褐色塊状石灰岩との関係は,不整である.現在,ストロマトライトの記載と並行して,柱状からドーム状ストロマトライト,リン酸塩質頁岩への累重が示す,堆積・生息環境の変遷について検討を進めている.また,Tsagaan Oloom層上部からは,石灰質微生物類EpiphytonやRenalcisから構成された多数の微生物類礁を確認した.2. Salaany Gol層の礁を対象として,古杯類が大繁栄した時期の「礁の構築様式」を背後の海洋環境との関連から検討した.(1) 3つのタイプの古杯類礁(樹状,層状,樹状ー層状ー杯状古杯類)が識別された.(2)層状古杯類礁と樹状ー層状ー杯状古杯類礁では,石灰質微生物類による礁の枠組み間への二次的な被覆・充填作用に代わり,「堆積時同時セメントの充填作用」が枠組み構造の補強と維持に重要である.(3)セメントの豊富な古杯類礁との地域的・時代的な比較・検討から,「多様な成長形態の古杯類礁の大繁栄」,「礁内部での隠棲環境の卓越」,「汎世界的なアラゴナイト海の支配」の存在が明らかになった.

3.生物大量絶滅事変直後の微生物活動や海洋環境を明らかにするために,最下部トリアス系ストロマトライト(南中国湖北省)についても検討を進めてきた.本内容に関しては,国際学術誌に論文が公表された.古杯類の大繁栄期とそれ以前の「礁の構築様式」に関するデータを順調に獲得・蓄積することができている.Salaany Gol層から産出する,「古杯類礁大繁栄期の礁の特性」については,日本地質学会にて本年度発表をおこなった.本発表は,「優秀ポスター賞」として表彰された.また,研究実績の概要1, 2で挙げた研究内容に関して,本年度の調査は順調に終了し,現在,「各礁の構築様式」についての記載を進め,論文としてまとめている.以上のことから,おおむね順調と評価した.1. Tsagaan Oloom層下部(最上部エディアカラ系)からは,柱状やドーム状形態で特徴的なストロマトライトが発達する.ストロマトライトは,ペロイド状粒子,ミクライト質クロッツ,石灰泥から構成される.2. Tsagaan Oloom層上部とBayan Gol層下部(第二統カンブリア系)からは,石灰質微生物類(Epiphyton,Renalcis)によって形成された小規模スロンボライト,ストロマトライト礁が発達する.3. Salaany Gol層(第二統カンブリア系)の礁は,多様な古杯類と共に石灰質微生物類(Epiphyton,Renalcis他3属),豊富なセメントによって形成されている.4.モンゴル西部地域の石灰質微生物類は,カンブリア紀に初めて出現する.その出現と同時に,スロンボライト礁が構築されていることは特筆される.石灰質微生物類の多様性は,古杯類の繁栄するSalaany Gol層で最も高い.5.朱砂洞層の礁は,古杯類を含まないスロンボライトとストロマトライト礁からなる.朱砂洞層より上位の張夏層(第三統カンブリア系)からは,スロンボライトとストロマトライト礁が海綿や"サンゴ"を産する礁とともに産出する.石灰質微生物類は,Epiphytonが豊富で,その他Renalcis,Girvanellaを含む.古杯類消滅前後での石灰質微生物類の多様性や礁の構築様式の変化について,海洋の物理・化学的な環境変化を合わせてさらに検討を進めている.古杯類の大繁栄,消滅の前後の「礁の構築様式」について,主要造礁生物(特に石灰質微生物類)の変遷様式や礁の堆積場などについて順調にデータを獲得・蓄積することができている.最終年度に向けて現在研究成果の総括を進めている.本年度,日本地質学会や日本古生物学会の国内学会で6件の発表をおこなった.研究課題に関する論文3編が公表,1編は現在投稿中である.以上のことから,おおむね順調と評価した.カンブリア紀第二世末に生じた礁生態系の大規模崩壊前後での造礁生物群集の変遷と海洋古環境の変化を明らかにする目的で,本年度,モンゴル西部ゴビ・アルタイ地域と北中国山東省地域の最上部エディアカラ系からカンブリア系第二統の礁の野外地質調査をおこなった.1)モンゴル西部には,最上部エディアカラ系からカンブリア系第二統の礁の変遷が明瞭に記録されている.Zuun-Arts層最下部(最上部エディアカラ系)では,柱状やドーム状形態を示すストロマトライト礁が特徴的に発達する.それらは,ペロイド状粒子,ミクライト質クロッツによって形成されており,石灰質微生物類は認められない.Bayan Gol層下部(最下部カンブリア系)に初めてスロンボライト礁が構築される.その出現は,当該地域での石灰質微生物類の出現や微小骨格化石群の出現,生痕化石の多様化と同時である.
中核市の保健師活動における地区活動と業務体制に関する研究

中核市における保健師活動の効率的かつ効果的な体制整備を追究するため、保健師活動の発展と課題について明らかにすることを目的とし,(1)全国の中核市を対象とする調査と、(2)代表的な中核市に対して現地調査を実施した。その結果、政令市から中核市へ移行した市、地域保健法により平成8年以降新たに中核市となった市ともに、個々に活動体制・役割分担のとらえ方や取り組みの工夫があり、それにともなって体制上のそれぞれの課題があると示唆された。本研究は、中核市における保健師の受持ち地区の状況や業務体制、活動実績から、中核市保健師活動の効率的かつ効果的な体制整備を検討し、保健師活動の発展と課題について明らかにすることを目的としている。このため、全国の中核市を対象とする調査の実施と、代表的な中核市に対して現地調査を計画し、中核市保健師の保健師配置や受持ち地区の規模、業務体制などの条件、中核市移行後の保健師活動実績の変遷、中核市の行政組織における保健師の配置状況、保健師の業務体制、受持ち地区の人口規模や面積などの地理的条件、保健センターや公民館など保健師の活動拠点と対象とのアプローチ条件を調査・検討するものである。今年度は、全国の中核市を対象とする調査の実施と、代表的な中核市に対して現地調査の実施にむけて、調査準備のため中核市保健師の配置部署などの業務体制・地区受持ち状況、配置部署別の業務内容・地区受持ち状況の内容などについて、既存の資料の収集と分析、さらに調査手続きの調整、および国内外の文献・資料の収集を実施した。今後は、中核市保健師の活動体制の類型化にむけて、全国保健師長会の協力を得て調査をすすめ、検討会をもち、調査内容の再検討を予定している。これにより業務体制の類型別メリット・デメリットの検討が可能になると考える。今年度は、代表的な中核市に対して現地調査を実施した。政令市から中核市へ移行した市、地域保健法により平成8年以降新たに中核市となった市では、業務体制・地区の受持ち状況、配置部署別の業務内容・地区受持ち状況の内容などについての条件が異なり、それにともなって体制上の課題にも特徴があることが示唆された。本研究は、中核市における保健師の受持ち地区の状況や業務体制、活動実績から、中核市保健師活動の効率的かつ効果的な体制整備を検討し、保健師活動の発展と課題について明らかにすることを目的とした。全国の中核市を対象とする調査の実施と、代表的な中核市に対して現地調査を計画し、中核市保健師の保健師配置や受持ち地区の規模、業務体制などの条件、中核市移行後の保健師活動実績の変遷、中核市の行政組織における保健師の配置状況、保健師の業務体制、受持ち地区の人口規模や面積などの地理的条件、保健センターや公民館など保健師の活動拠点と対象とのアプローチ条件を調査・検討した。全国保健師長会の協力を得て調査を実施し、中核市保健師の活動体制の類型化にむけて、配置部署別の業務内容・地区受持ち状況の内容などについての条件を明らかにし、調査報告書を作成した。代表的な中核市に対する現地調査からは、政令市から中核市へ移行した市、地域保健法により平成8年以降新たに中核市となった市で、業務体制・地区の受持ち状況が異なり、それにともなって体制上の課題にも特徴があることが示唆された。
非アルコール性肝障害の発症機序解明および早期診断法の確立と予防法の提案

1動物試験・TSODの対照群として用いた非肥満型のTSNOマウスに高脂肪食を与えたところ、予期に反してTSODマウスよりも顕著な炎症や線維化が観察され、やせ型NASH様病態が確認できた。従来、肥満はNASH発症や病態悪化の危険因子であると報告されているが、本現象はその仮説を覆す可能性がある。正常マウス(C57BL/6Jマウス)でも高脂肪食投与で、高血糖やNASH様脂肪肝が見られていることから、非肥満型TSNOマウスも含めた結果解析を行いたい。・各種酸化ストレスマーカーの測定を行った。病態の悪化によっていくつかのマーカーが上昇することを見出し、現在、詳細な解析を実施している。・TSODマウスは自発運動をほとんど実施しないことから、有酸素運動下にて強制運動を実施した。運動後、血糖値の低下、体重減少、肝脂肪も含めた体脂肪量の低下が観察された。今後、運動負荷による脂質・糖質代謝の亢進、NASH予防との観点からも運動後のPCG-1αの発現状況、肝における糖質代謝亢進を網羅的解析にて評価したい。・NASH予防に向けた有効成分の探索の結果、肝障害を明確に示すSTAMマウスの血中アミノ酸変動、ならびにBCAAのうち、Val投与は効果なく、Leu及びIle投与は肝障害の抑制効果ことについて論文化した。2細胞試験・培養肝細胞に対し一重項酸素発生剤エンドパーオキシド(EP)を付与する系を確立し、カロテノイド類による酸化障害抑制効果の定量化を試みた。カロテノイド類を効率良く細胞中に取り込ませる手法として、ミセル化法を確立した。・カロテノイド類による酸化障害抑制効果を分光学的に追跡するとともに、酸化ストレスマーカーの計測も実施した。・EPにより一重項酸素を発生させることで、ストレス誘導性の遺伝子発現が上昇することが明らかとなった。3ヒト試験目標とする疾病患者約100名からの血液採取を達成した。動物試験、細胞試験、ヒト試験とも順調に計画を達成した。1動物試験現在、追試を実施しており、2種類の高脂肪食でTSODおよびTSNOマウスの糖尿病病態が悪化する点については再現性が得られた。今後、病理解析を綿密に行う。・TSNOマウスで観察されたやせ型NASH様病態は非常にインパクトがあるため、追試を実施して確定を急ぐとともに知財、論文として成果を発信する。2細胞試験・脂肪肝モデル細胞において、機能性因子評価を継続して行う。3人試験脂質酸化ストレスマーカーをはじめとするバイオマーカー、病理検査を行を行う。肝疾患患者において、肝所見検査、血清マーカーなどのデータを解析し、肝線維化の進展を予測しうるかどうかについて検討する。1動物試験マウスで得られた知見をヒトに応用するため、2017年度はヒトの糖尿病およびNASH病態を模倣するモデルマウスの作製を行った。・通常食TSODマウスと比較して、高脂肪食を与えたTSODマウスの体重は増加し、耐糖能異常が悪化した。・肝重量はF2WTDでは通常食の約2倍、STHD-01では約2.5倍で顕著な肥大が生じ、肉眼的にも脂肪の蓄積が顕著であった。・以上の結果、高脂肪食F2WTDおよびSTHD-01を負荷することによってTSODマウスの肥満・糖尿病病態が悪化することが明らかとなり、NASH病態も増悪している可能性が示唆された。・高脂肪食F2

WTDを与えることで血糖値、肝機能検査値は漸近上昇することが認められた。また23週間程度の飼育で重篤なNASH様脂肪肝、肝炎症、線維化が認められた。2細胞試験・培養肝細胞に対し脂肪酸添加することで樹立する脂肪肝モデルの作製を試行、NASH同様、肝細胞死が誘導されるパルミチン酸添加条件を決定した。・一重項酸素発生剤エンドパーオキシド(EP)を用いて、ヒト肝がん細胞HepG2内外で一重項酸素を発生させる条件を決定。EPを用いて、高濃度の一重項酸素に暴露された際の細胞応答を解析した。ミトコンドリア内一重項酸素を特異的に検出するプローブを用いた結果、1 mM EP添加後、数分でミトコンドリア内の一重項酸素が発生していることが分かった。3ヒト試験臨床試験を実施する香川県立中央病院実験責任者において研究計画書立案、倫理委員会への申請を行い、承認を得た。また、産総研にて条件付き承認を得た。現在、条件付きについて香川県立中央病院で対応中であり、5月中旬には再承認が得られる見通しである。なお香川県立中央病院ではKaToLEA Studyとして進行中であり、肝臓生検は16サンプル保存済み。血液採取は両施設の承認後とする。動物試験に関しては、延長期間を設けることによって予定通り結果を取得することができた。細胞試験およびヒト試験に関しては当初の期間内に予定を終了した。1動物試験現在、追試を実施しており、2種類の高脂肪食でTSODおよびTSNOマウスの糖尿病病態が悪化する点については再現性が得られた。今後、病理解析を綿密に行う。・TSNOマウスで観察されたやせ型NASH様病態は非常にインパクトがあるため、追試を実施して確定を急ぐとともに知財、論文として成果を発信する。2細胞試験・脂肪肝モデル細胞において、機能性因子評価を継続して行う。3人試験脂質酸化ストレスマーカーをはじめとするバイオマーカー、病理検査を行を行う。肝疾患患者において、肝所見検査、血清マーカーなどのデータを解析し、肝線維化の進展を予測しうるかどうかについて検討する。1動物試験・高脂肪食F2WTDおよびSTHD-01を与えた各TSODマウスの各臓器、血漿等について、血液検査、病理解析を行い、線維化、NASH病態評価を行う。・高脂肪食F2WTDを与えたC57BL/6マウスでの試験結果をも踏まえ、TSODマウスのNASH病態さらには病態モデルとしての有用性を評価する。2細胞試験・脂肪肝モデル細胞において、脂質酸化ストレスマーカーを指標とした脂肪酸が及ぼすNASHメカニズムの解明を行う。・ヒト肝がん細胞において、EPに誘導された一重項酸素の細胞全体への影響について、脂質酸化ストレスマーカーによる定量評価を行い、メカニズム解明を進める。3人試験検体(約100サンプル)が集まった時点で、脂質酸化ストレスマーカーをはじめとする血清マーカー、病理検査を行い、評価を行う。
インテグリンを介するシグナル伝達の制御機構とその多様性に関する研究

基底膜結合型インテグリンを介するシグナル伝達機構に関して以下の成果を得た。1)基底膜結合型インテグリンであるα3β1およびα6β1を精製することに成功し、どちらのインテグリンもα5鎖ラミニンに対して最も高親和性に結合することを明らかにした。2)α5鎖ラミニンへのα3β1インテグリンを介する細胞接着によって、葉状仮足の形成と細胞の遊走が強く誘導されること、これがRhoファミリーG蛋白質の一つであるRacの選択的な活性化に依存して起こることを明らかにした。3)インテグリンα3β1を介するα5鎖ラミニンへの接着は、P13KからAktキナーゼに至るシグナル伝達経路を強く活性化し、その結果として細胞がアポトーシスに対して強い抵抗性を獲得することを発見した。4)血管基底膜に選択的に発現するα4鎖ラミニンの精製に成功し、このラミニンへの血管内皮細胞の接着がインテグリンα6β1依存的におこること、このα6β1を介する内皮細胞の接着においても、Racの選択的な活性化がおこることを明らかにした。5)インテグリンα3β1と共精製される分子量30kDの蛋白質を同定し、これがテトラスパニンの一つであるCD151であること、α3β1/CD151複合体は上皮細胞では細胞-基質間接着部位よりも、細胞-細胞間接着面に豊富に存在することを明らかにした。6)α3β1/CD151複合体が細胞-細胞間接着に直接関与することをCD151の強制発現系を確立して明らかにした。また、CD151から細胞内に伝達されるシグナルがPKC依存的にRhoファミリーG蛋白質の一つであるCdc42を強く活性化することを見いだした。新規基底膜ラミニンアイソフォームの精製のその機能解析:成体基底膜(特に血管基底膜)の主要な接着分子であるラミニン-10/11(LN-10/11)を精製し、その生理活性をインテグリンを介するシグナル伝達に注目して解析し、以下の成果を得た。(1)LN-10/11はフィブロネクチン(FN)より強く細胞の移動を促進し、その細胞移動はインテグリンα3β1依存的であった。(2)FNに接着した細胞では典型的なストレスファイバーや接着斑が明瞭に観察されたが、(1)LN-10/11に接着した細胞ではストレスファイバーや接着斑がほとんど認められなった。(3)LN-10/11に接着した細胞では強いRacの活性化が検出されたが、Rhoはほとんど活性化されなかった。逆に、FNに接着した細胞では強いRhoの活性化が検出されたが、Racは僅かしか活性化されていなかった。(4)LN-10/11上での細胞移動やRacの活性化はCrkIIのSH2またはSH3変異蛋白質によって阻害された。インテグリンα3β1と結合するCD151の機能解析:インテグリンα3β1と強く会合する分子量30kDの膜蛋白質を同定し、これがCD151であることを見いだした。CD151に機能を解析するため、GFPタグをつけたCD151の強制発現系を構築し、これが細胞-細胞間接着部位に局在化することを確認した。また、CD151のC末端側22アミノ酸残基を欠失させると、細胞表面に局在化できないことがわかった。また、CD151遺伝子欠損マウスを作成するためのターゲティングベクターを構築した。

細胞外基質からインテグリンを介して伝達されるシグナルが細胞外基質の側からどのように制御されているかを、間質系マトリックス分子であるフィブロネクチンと基底膜の主要構成分子であるラミニン-10との間で比較検討した。本年度は、特に細胞増殖と細胞生存維持に関わるシグナルに着目して解析を進めた。あらかじめ血清飢餓状態においた細胞をフィブロネクチン、シラミニン-10、および対照としてポリリジンをコートした基質上に播種し、引き続き無血清培地中で培養を続け、細胞のアポトーシスを経時的に観察した。その結果、インテグリンを介さずに細胞接着を誘導するポリリジン上では、培養7時間後で50%以上の細胞にアポトーシスが観察され、27時間後にはほぼ全ての細胞がアポトーシスをおこした。フィブロネクチン上では、ポリリジンに比べてアポトーシスの誘導は抑制されているものの、7時間後からアポトーシスが観察され、27時間後ではやはり90%以上の細胞が死滅した。一方、ラミニン-10上に播種した細胞では、培養36時間後でもアポトーシスはほとんど観察されなかった。これらの結果は、ラミニン-10からインテグリンを介して細胞内に伝達されるシグナルが非常に強くアポトーシスを抑制することを示している。このようなラミニン-10上での強いアポトーシス抑制シグナルは、P1 3-kinose/Aktの経路を介することが、(1)リン酸化Aktレベルの解析、(2)P1 3-kinose阻害剤wortmonninやdominont-negative Aktを用いた解析から示された。一方、フィブロネクチン上でのアポトーシス抑制は、P1 3-kinose/Akt経路ではなく、Ros/MEK/ERK経路を介することが(3)リン酸化ERKレベルの解析、(4)MEK阻害剤PD98059とdominont-negative MEKを用いた解析から示された。これらの結果は、異なる基質からインテグリンを介して細胞内に伝達されるシグナルは質的にはっきりと異なることを示している。昨年までの研究において、我々はインテグリンα3β1と特異的に結合する分子量220kDの蛋白質を同定することに成功した。この220kD蛋白質は、エンドサイトーシスに関与する因子として最近線虫で同定されたRME-8蛋白質と相同性を示すことから、哺乳動物細胞のエンドサイトーシスに関与することが推定される。実際、green fluorescent protein (GFP)を付加した220kD蛋白質を細胞内で発現させたところ、細胞内の小胞状の構造に局在していた。この220kD蛋白質の生理的意義を解明するため、220kD蛋白質中に存在するDnaJドメインをベイトとしたyeast two hybrid法による結合蛋白質の検索を行った。その結果、これまで中間径フィラメント結合蛋白質として報告されているペリプラキンが220kD蛋白質と強く結合することが判明した。220kD蛋白質と結合する領域は、ペリプラキンのC末端側に位置し、中間径フィラメント結合領域とほぼ重複していた。ペリプラキンが220kD蛋白質と特異的に結合することは、ペリプラキンあるいは220kD蛋白質に対する抗体による免疫沈降により両者が共沈することからも確認された。以上の結果は、DnaJドメインがいくつかのシャペロン分子に共通して含まれることと考え合わせ、細胞内標的部位へのペリプラキンの輸送あるいは局在化を220kD蛋白質が制御している可能性を示唆している。
腫瘍血管の分子標的・シアル化HEG1の分子性状解析

がん周囲の新生血管(腫瘍血管)はがん組織にがん細胞の増殖を促す。我々は抗HEG1抗体が腫瘍血管の内皮細胞に結合することを見いだした。本研究では、血管内皮細胞におけるHEG1の性状解析と腫瘍血管で特異的に起こるHEG1の糖鎖修飾の解析を行う。本研究によって、腫瘍血管に特異的な分子標的の性状が明らかとなり、新たな血管新生阻害剤の創製に貢献する。
胸腺由来制御性T細胞のin vivoでの誘導による免疫制御の基礎的検討

マウスにおいて高容量の抗原を経静脈投与することで血中抗原が胸腺樹状細胞により抗原提示され胸腺由来の抗原特異的T細胞を誘導し、さらにIL-2-IL-2抗体の免疫複合体(以下IL-2IC)を投与することでこれらの抗原特異的T細胞は効率的に増幅することができることが報告されている。これらの結果に基づき、我々は以下のような結果が得られた。経静脈的に抗原を投与しさらにIL-2ICを投与することで抗原特異的制御性T細胞を効果的に誘導増幅させることができた。それらの細胞群はCCR2依存性に抗原投与部位に集積することが観察され、さらに集積した制御性T細胞は局所の炎症に関与していた。制御性T細胞は、エフェクターT細胞の活性化を抑制することで、過剰な免疫反応を抑制するT細胞の1サブセットである。マウスにおいて高容量の抗原を投与することで、血中抗原が胸腺樹状細胞により胸腺細胞に抗原提示され、胸腺由来の抗原特異的T細胞を誘導し、さらにIL-2ーIL-2抗体の免疫複合体(以下ILー2IC)を投与することで、これらの抗原特異的T細胞は効率的に増幅することできることが報告されている(Plos One 7: e41154, 2012)。この結果に基づき、胸腺由来抗原特異的制御性T細胞を効果的にvivoで増幅させる方法を確立し、さらに増幅させた抑制性T細胞によるアレルギーや自己免疫疾患モデルでの炎症抑制の可能性を検討することを本研究の目的とする。下記のように研究を進める予定である。1)DO11.10マウスに対して経静脈的にOVA(卵白アルブミン)を投与し、さらにIL-2ICを投与することで効果的に抗原特異的制御性T細胞を誘導・増幅させる方法を確立する。2)得られた抗原特異的制御性T細胞が発現する表面マーカー・転写因子などを検討し、抗原特異的制御性T細胞の局所の抗原投与部位への効率的集積過程の分子機構を解明する。3)DO11.10マウスを用いた遅延型過敏反応モデル・関節炎モデルにおいて、抗原特異的制御性T細胞を誘導し、病態への影響を分子病理学的に検索することによって、細胞・分子レベルでの作用機序を解明する。制御性T細胞はエフェクターT細胞の活性化を抑制することで過剰な免疫反応を抑制するT細胞の1サブセットである。マウスにおいて高容量の抗原を投与することで血中抗原が胸腺樹状細胞に抗原提示され胸腺由来の抗原特異的T細胞を誘導し、さらにIL-2-IL-2抗体の免疫複合体(以下IL-2IC)を投与することでこれらの抗原特異的T細胞は効率的に増幅することができることが報告されている(Plos One 7:e41154,2012)。この結果に基づき胸腺由来抗原特異的制御性T細胞を効果的にin vivoで増幅させる方法を確立し、さらに増幅させた抑制性T細胞によるアレルギーや自己免疫疾患モデルでの炎症抑制の可能性を検討させることを本研究の目的とする。研究期間を通じて以下のような結果が得られた。1)DO11.10マウスに対して経静脈的にOVA(卵白アルブミン)を投与しさらにIL-2ICを投与することで効果的に抗原特異的制御性T細胞を誘導・増幅させることができた。2)得られた抗原特異的制御性T細胞ではCCR2の発現が上昇していた。また、マウス背部に作成したエアパウチにさらに抗原を投与したところ抗原特異的制御性T細胞の集積を認め、同部位では高濃度のCCL2が定量された。また、CCR2ノックアウトマウスではこの抗原特異的制御性T細胞の集積は阻害された。さらにOVAとIL-2ICにより抗原特異的制御性T細胞を誘導されたDO11.10マウスにおいてOVAとCFAのエマルジョンを皮下注射し、足底に遅延型過敏反応を惹起したところ、コントロールと比較し炎症が抑制された。OVAとIL-2ICにより誘導された抗原特異的制御性T細胞は抗原特異的な炎症を抑制できることが示された。3)野生型マウスにてOVAとIL-2ICを投与し、遅延型過敏反応を惹起したところDO11.10マウスと同様に炎症の抑制が観察された。胸腺由来制御性T細胞を誘導する、経静脈的な抗原投与とIL-2ICの腹腔内投与の適切なタイミングを確立することができた。胸腺切除マウスではこれらの刺激による制御性T細胞が減少していることから抗原投与とIL-2ICの投与による制御性T細胞の大部分は胸腺由来であることがさらに確認された。

また抗原特異的な制御性T細胞の表現型としてはCCR2を発現していることが観察できた。マウス背部に作成したエアパウチに抗原を投与したところ、抗原特異的な制御性T細胞の集積を認め、CCR2ノックアウトマウスにおいては集積が阻害された。また、エアパウチ内には高濃度のCCL2(CCR2のリガンド)が定量された。よって抗原特異的な制御性T細胞はCCR2依存性に抗原部位に集積すると考えられた。DO11.10マウスにOVAとIL-2ICの投与することにより、OVA特異的な遅延型過敏反応の抑制を観察することができた。よって抗原とIL-2ICに誘導された胸腺由来制御性T細胞は抗原特異的な炎症を抑制することができると考えられた。一方、DO11.10マウスに対してOVA特異的な関節炎を惹起し、OVAとIL-2ICによる炎症の抑制を検討したが、関節炎に対しては抗原特異的制御性T細胞による炎症の軽減は観察されなかった。免疫学OVA特異的なTCR発現マウスであるDO11.10マウスにおいて、抗原特異的な制御性T細胞の誘導や炎症抑制を検討してきた。さらにこれらの現象を野生型マウスにおいても検討するとともに、制御性T細胞が局所で炎症を抑制するメカニズムを明らかにする。これまでに抗原特異的制御性T細胞はCCR2依存性に抗原部位に集積することが確認された。この結果をもとに、CCR2ノックアウトマウスにおいて制御性T細胞の誘導を阻害することで免疫抑制与える影響を検証する。また、動物モデルとしては、関節炎においては抗原特異的制御性T細胞の炎症抑制効果が確認できなかったため、他の疾患モデルでの検証を検討中である。具体的には甲状腺炎や心筋炎における制御性T細胞の炎症抑制効果を検証する予定である。さらにこれらのモデルでは臓器特異的抗原が多量に血中に流出することが予想され、かつ、抗原存在部位が特異的である。そのためIL-2ICの投与のみで制御性T細胞が効果的に誘導できる可能性も考えられ、合わせて検討する。また、実際の臨床応用もめざし、抗原とIL-2免疫複合体投与による生体への副作用などを検討するため肝機能障害や腎機能障害、免疫機能なども検討する。今年度は時間的制約もあり学会発表、参加ができず旅費を使用する機会がなかったことが、未使用金額が生じた理由の一つである。また、望ましい臓器特異的炎症モデルを検討した結果、関節炎において検証したが、制御性T細胞の炎症抑制効果は認められなかった。そのため他のモデルを検索し、心筋炎において再度評価する予定である。しかし、炎症惹起に必要な抗原であるミオシンのペプチド合成が間に合わず、今年度は実験を開始することができなかった。そのため、動物実験に一部遅れが生じたことももう一つの要因と考えられる。合成したミオシンを用いて心筋炎を惹起し、臓器特異的な制御性T細胞の誘導・抑制効果を検討する予定である。心筋炎モデルとしてはすでに報告されており、確立したモデルであるが、IL-2ICの投与のタイミングなどの適切なスケジュールを確立し、その効果の有無を検証する必要がある。また、その抗炎症のメカニズムなども明らかにする予定である。これらの結果をまとめ、国内外を問わず学会発表や、論文として発表する予定である。
オプトジェネティクスによる幹細胞移植後の神経細胞の機能評価

脊髄損傷モデル作成方法の確立のため、まずは実際に8週齢程度、C57BL6約20g雌の脊髄損傷モデルを作成してその自然経過を再確認した。運動機能評価方法の確認のため、inclined plane台の作成などの環境準備を行った。チャネルロドプシン2、ハロロドプシンのプラスミドを選択して購入し、大腸菌にてプラスミド増幅できる環境を整えている。神経幹細胞培養のための、クリーンベンチの設置、幹細胞培養のための実際の環境の調節を行った。また、オプトジェネティクスを行うための光刺激装置(Teleopto)を購入して、実際に実験を開始するための使用計画を立てた。受信機などの消耗品の確認、予備部品の購入と、受信機の機能時間の確認を行った。オプトジェネティクスは現在は最先端技術であり、医学研究への転用はまだ手探りの段階である。我々の研究室でも光刺激装置(Teleopto)を使用するが、実際に起動させるためにはさまざまな付属部品が必要となり、オプトジェネティクスの方法の検討に時間を要している。想定している実験系のがスムースに進行できるように予備実験と実験手順を再度確認・確定する。実験計画の遅延による必要物品(主に消耗品、抗体)購入の延期による物品費の減少せ科発表の遅延による国内学会や国際学会などへの参加の中止による旅費の減少のため。実験計画の進行とともに予定通りの進行に戻れば、次年度に物品費として消耗品などの購入、学会参加により旅費として今年度分の残額が必要となる予定である。
アミノ酸アンモニアリアーゼの自然界からの検索とその有機合成への応用

自然界からβ-メチルアスパルターゼ活性を生産する微生物のスクリーニングを行なった。培地として、偏性嫌気性細菌における本酵素の誘導剤であるL-グルタミン酸を含み、適当量の酵母エキスを添加したものを用いた。微生物の分離源としては泥、堆肥、沼等の比較的酸素に乏しい環境の物を用い、上記培地にて嫌気的に集積培養を行なった。窒素雰囲気下で単菌化することにより通性嫌気性細菌のみを選択的に分離した。得られた各菌を培養して無細胞抽出液を調整し、β-メチルアスパルターゼ活性を測定した。その結果、活性株として腸内細菌群に属する4株を得、それらを菌学的諸性質より、Citrobacter sp.YG-0504、Morganella morganii YG-0601、Citrobacter amalonaticus YG-1002、Enterobacter sp.YG-1202株と同定した。各菌の本酵素活性産生に及ぼす培養条件及び培地組成を種々検討したところ、いずれの菌も、L-グルタミン酸または(2S,3S)-3-メチルアスパラギン酸の存在下、嫌気もしくは静置培養にて成育された時にのみ本酵素を強力に発現することを見いだした。メサコン酸、エチルフマル酸、クロロフマル酸といった各種のフマル酸誘導体を合成し、各活性株から調整した粗酵素液を用いてアンモニア付加反応を行ったところ、43^78g/L(収率38^69%)の(2S,3S)-3-メチルアスパラギン酸、(2S,3S)-3-エチルアスパラギン酸、および(2R,3S)-3-クロロアスパラギン酸を99%以上のジアステレオ及びエナンチオ選択性をもって合成することができた。以上の様に独自のスクリーニングを行うことにより、初めてβ-メチルアスパルターゼの生産株が通性嫌気性細菌中にも分布していることを見いだし、これを各種の非天然型L-アスパラギン酸誘導体の高選択的合成に応用することができ、所期の目的を達成することができた。本研究を進めるにあたって、培地、試薬、ガラス器具等の各種の消耗品を購入するために、本補助金が大いに役立った。
柔らかなタンパク質反応場の論理設計に基づく高活性な金属酵素の開発

柔らかな反応場であるタンパク質マトリクスと高活性な金属錯体から構成される人工金属酵素について、その論理的設計に関する革新的かつ実用的な手法を創出し、実験化学的に示すことを目的とした。具体的には、生体内で様々な転移反応を触媒するビタミンB12依存酵素等の反応性を単純なヘムタンパク質で再現し、さらに人工金属酵素として展開した。本年度は、昨年度に得られた知見を元に、活性の向上を精力的にめざした。昨年度に実施した人工金属酵素の調製とその同定に基づいて、論理的な活性中心の作り込みと反応の評価を実施した。反応場を与えるタンパク質として従来より用いてきたミオグロビンに対し金属錯体の配位環境が大きく異なる西洋ワサビペルオキシダーゼを用いた。コバルトコリン錯体と複合化したところ、狙い通りに金属中心への強いヒスチジンによる配位を分光学的に確認した。また反応の活性種となり得るコバルト一価種を吸収スペクトルにより同定した。ニッケル錯体ではメタン発生反応を実施し、シトクロムb562内においてメチオニンからのメタン発生を予備的ではあるが確認した。また鉄ポルフィセンを含むミオグロビンが金属カルベン錯体を経由したスチレンのシクロプロパン化を円滑に進めることを発見した。天然のヘムを含むミオグロビンに比べて反応速度は600倍になり、反応性の違いをDFT計算を用いて考察した。上記のように高活性な人工酵素開発に関する重要な知見を得た。上記の研究成果は学会や学術論文として発表している。平成29年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では、柔らかな反応場であるタンパク質マトリクスと高活性な金属錯体から構成される人工金属酵素について、その論理的設計に関する革新的かつ実用的な手法を創出し、実験化学的に示す。具体的には、生体内で様々な転移反応を触媒するビタミンB12依存酵素の反応性を単純なヘムタンパク質で再現し、詳細に解析する。活性中心に反応性の高いポルフィリン類縁体の金属錯体を用い、ヘムポケット内における反応性および構造を詳細に評価する。アルキル錯体を形成する活性中心を錯体化学の知見に基づいて構築し、タンパク質マトリクスを理論計算により設計し、高い活性を示す人工金属酵素の実現をめざす。本年度は、特に人工金属酵素調製法の確立とその詳細な同定を実施した。反応場を与えるタンパク質として、扱いの容易な酸素貯蔵ヘムタンパク質であるミオグロビンを選択、調製・精製した。一方で、活性中心になる人工補因子として、ヘムの配位子部分であるポルフィリンの類縁体、コリンやオキサポルフィリンの金属錯体を新規に設計・合成した。金属には、貴金属ではないコバルトやニッケルを用いた。ヘムタンパク質補因子置換法(再構成法)に基づき、ミオグロビンからヘムを除去し、人工補因子を挿入し、これらの複合化を調製した。サイズ排除クロマトグラフィーにより精製し、可視紫外吸収スペクトルや電子スピン共鳴法(EPR)を用いて同定した。還元剤により一価種が生成することをEPR法により確認し、アルキル化剤との反応性評価を実施した。また異性化反応の評価を実施し、反応機構を考察しながら、高活性な人工酵素開発に関する重要な知見を得た。本研究では、柔らかな反応場であるタンパク質マトリクスと高活性な金属錯体から構成される人工金属酵素について、その論理的設計に関する革新的かつ実用的な手法を創出し、実験化学的に示すことを目標としている。本年度は、特に人工金属酵素調製法の確立とその詳細な同定に重点を置いて実験を行った。ミオグロビンを反応場を与えるタンパク質として、選択し、その機能改変を実施した。活性中心になる人工補因子として、ヘムの配位子部分であるポルフィリンの類縁体、コリンやオキサポルフィリンの金属錯体を新規に設計・合成し、これらのコバルトやニッケル錯体の調製に成功している。ヘムタンパク質補因子置換法(再構成法)に基づき、ミオグロビンからヘムを除去し、人工補因子を挿入し、これらの複合化を試み、サイズ排除クロマトグラフィーにより精製し、可視紫外吸収スペクトルや電子スピン共鳴法(EPR)を用いて目的の人工蛋白質が調製できていることを確認した。特筆すべきことに、本来は生成しにくい一価種が比較的弱い還元剤により生成することをEPR法により確認し、さらにアルキル化剤との反応が進行することを確認している。また予備的ではあるが、異性化反応の評価を実施し、反応機構を考察しながら、高活性な人工酵素開発に関する重要な知見を得た。上記のように、研究計画に基づいておおむね順調に進展している。

コバルトコリン錯体と複合化したところ、狙い通りに金属中心への強いヒスチジンによる配位を分光学的に確認した。また反応の活性種となり得るコバルト一価種を吸収スペクトルにより同定した。ニッケル錯体ではメタン発生反応を実施し、シトクロムb562内においてメチオニンからのメタン発生を予備的ではあるが確認した。また鉄ポルフィセンを含むミオグロビンが金属カルベン錯体を経由したスチレンのシクロプロパン化を円滑に進めることを発見した。天然のヘムを含むミオグロビンに比べて反応速度は600倍になり、反応性の違いをDFT計算を用いて考察した。上記のように高活性な人工酵素開発に関する重要な知見を得た。上記の研究成果は学会や学術論文として発表している。今後は本年度に実施した人工金属酵素の調製とその同定に基づき、論理的な活性中心の作り込みと反応の評価を実施する。反応場を与えるタンパク質として従来より用いてきたミオグロビンとその変異体に加えて、金属錯体の配位環境が大きく異なる西洋ワサビペルオキシダーゼを用いる。特に本年度調製したコバルト錯体を含む人工酵素ではメチル基転移反応および1,2異性化反応をターゲットとする。ニッケル錯体ではメタン発生反応を実施し、より難度の高い基質(メチオニン等)からのメタン発生を検討する。錯体には電子供与基や電子求引基の導入により反応性の微調整を行い、分子動力学計算に基づく、タンパク質反応場の作り込みを実施する。各種分光測定やクロマトグラフィ測定を実施し、結果に基づいて反応機構や機序を考察しながら高活性化を試みる。平成29年度が最終年度であるため、記入しない。
肺癌脳転移に関与する新規分子標的遺伝子の同定と機能解析

本研究の目的は、脳転移モデルを用いて肺癌の難治化・予後悪化の要因である脳への遠隔転移形成を惹起する要因の検索を行い、その転移因子を分子標的とした新規治療法を確立することにある。ヒト肺癌細胞株PC14らin vivo selectionを行い、高脳転移株PC14Brを作成し、親株をコントロールとした高脳転移株PC14Brの遺伝子発現プロファイルをcDNAマイクロアレイにより取得、肺癌脳転移に特異的な分子であるTKS-HBS3分子に着目し機能解析を行っている。TKS-HBS3は正常臓器での発現はほとんどなく、非小細胞肺癌において原発巣と同様に特異的に発現していることをRT-PCRにて確認し、Multiple Tissue Northernでも、同遺伝子が正常脳には発現がないことを確認した。加えて、TKS-HBS3の強制発現安定株を作成し、これを強制発現したCos7細胞は、糸状偽足を有して多層性に細胞増殖を行い、悪性化することが観察された。Matrigel Invasion AssayによりTKS-HBS3の浸潤能について確認したところ、TKS-HBS3を強制発現させたCos7細胞はmock比較してその浸潤能が著しく上昇しており、癌細胞株のTKS-HBS3をRNAiを用いてノックダウンするとその細胞の浸潤能は低下した。以上よりTKS-HBS3が肺癌脳転移において特異的に重要な役割を担っている可能性が示唆され、今後の動物実験への応用を考えて現在高脳転移株であるPC14BrにおけるTKS-HBS3の機能について解析を行っており、今後予後不良とされる脳転移抑制への解明が期待される。
災害時における「黒エリア」での対応に向けた実践モデル的教材の開発

本研究の目的は、国内における災害現場でのトリアージによって「黒」のトリアージ・タグを付された傷病者(黒タグ者)に看護師が対応するための訓練教材としての試作のDVDを製作し、また、このDVD教材の使用効果を検証のうえ、量産化と普及に向けた準備を行うことである。具体的には、黒タグ者を収容する場所(黒エリア)における看護師に必要な対応を想定したシナリオを作成し、黒エリアの立ち上げから撤収までの一連の流れや必要な対応を総論的にイメージすることができ、かつ、各論的にも学べるような実践的な教育教材を製作する。そして、このDVD教材を病院の研修などで使用し、その効果を検証する。
薬物スクリーニングに最適な抗体分子の三次元構造解析に基づく創出と薬物検出法の構築

法医学実務において、薬毒物を簡便・迅速にスクリーニングできる免疫学的検出法は有用である。我々は、遺伝子工学的技術の利点を活かした抗薬物抗体の作製と薬物検出法構築に取り組んでいる。本課題では、二種の抗薬物抗体をモデルとし、薬物スクリーニングの目的に応じた最適な抗体を分子レベルでデザインし、機能改変した新しい抗体を用いた薬物検出法を構築する事を目的とした。本年度は、薬物と抗体の相互作用部位を解析するため、抗体と薬物の共結晶作製を試みた。1)抗原結合フラグメント(Fab)の調製抗フルボキサミンモノクローナル抗体(IgG)産生ハイブリドーマをCELLine Bioreactorを用いて無血清培地で培養し、その培養上清からアフィニティークロマトグラフィーを行ってIgGを精製した。パパインによるIgGの酵素処理を行ってFabを調製し、その後各種クロマトグラフィー(アフィニティ、イオン交換、ゲルろ過)を行って高純度に精製した。精製度の確認は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法で行った。本精製にて約4 mgの高純度精製Fabを得たため、これを結晶化条件の検討に用いた。2)フルボキサミン結合Fabタンパク質の結晶化条件の検討Fabタンパク質に対して過剰のフルボキサミンを混合させ、共結晶化を試みた。結晶化は蒸気拡散法(Hanging Drop法)で行った。結晶化スクリーニングの結果、結晶化用緩衝液は20%ポリエチレングリコール4000を含む0.1Mビストリス緩衝液(pH6.0)と2.0M硫酸アンモニウムを含む0.1Mトリス緩衝液(pH8.5)で再現性良く結晶を得る事ができた。今後は結晶化条件の詳細な検討を進め、得られた結晶のX線構造解析を行う予定である。本課題では、二種の抗薬物抗体をモデルとし、薬物スクリーニングの目的に応じた最適な抗体を分子レベルでデザインし、機能改変した新しい抗体を用いた薬物検出法を構築する事を目的とする。本年度は、薬物検出法に用いる蛍光免疫測定素子Quenchbodyの作製とその薬物検出能の解析を行った。1)Quenchbodyタンパク質発現ベクターの構築Quenchbody発現ベクターは、抗フルボキサミン抗体の抗原結合領域発現遺伝子を用いて作製した。なお、ベクターは蛍光色素までのリンカー長が異なるものと色素標識位置の異なるもの(N末端やC末端を標識)5種類を構築した。Quenchbodyは、リンカーにあるシステインを利用して蛍光色素標識したタンパク質である。蛍光色素はタンパク質内に保持されて消光状態となるが、抗原添加によって色素が表出して蛍光を発する。リンカー位置やリンカー長の違いは、蛍光上昇率に大きく影響する事が報告されている。本研究では、さまざまな抗薬物抗体遺伝子を後に挿入できるように、これらのベクターをテンプレートとして作成した。2)Quenchbodyの作製とフルボキサミン検出能の解析上記のベクターで形質転換した大腸菌を用いて、既報に従ってQuenchbodyの前駆タンパク質を得た。さらに、このタンパク質を用いて既報に従ってQuenchbodyを作製した。得られたQuenchbodyは、N末端標識群ではフルボキサミン添加に伴い1分以内に蛍光値の上昇が認められたが、C末端標識群ではほとんど認められなかった。また、リンカー長の異なる3種のN末端標識群の蛍光上昇率に有意差は認められず、各々のEC50は約30 nMであった。本課題の研究目的は、二種の抗薬物抗体をモデルとし、薬物スクリーニングの目的に応じた最適な抗体を分子レベルでデザインし、機能改変した新しい抗体を用いた薬物検出法を構築する事である。その目的に従い平成28年度には、二種の抗薬物抗体の抗原認識に重要な部位の検索を熱力学的解析や薬物ー抗体タンパク質複合体のX線結晶構造解析を行って調べ、平成29年度には、前年度の結果に基づいて二種の抗薬物抗体の改変体を作製し、そして平成30年度にはQuenchbody法による各薬物の検出法を構築する事を予定していた。しかし、薬物ー抗体タンパク質複合体の結晶作製のための条件設定に時間がかかっている事、また平成28年4月に発生した熊本地震により多くの分析機器が使用できない状況になった事などから、本年度は平成30年度に予定していたQuenchbodyの作製と薬物検出能の解析を前倒しして実施した。本年度作製したQuenchbody発現ベクターは、抗原認識部位遺伝子を入れ替える事で、新たな抗原に対するQuenchbody作製時に利用できるものである。つまり、以後利用できるテンプレートとなるものであり、また本年度の検討は後の参考データとなるため、大幅な遅れや計画変更には至っていないと考えている。本年度は、フルボキサミン(FLV)をモデル化合物として、薬物検出法に用いる蛍光免疫測定素子Quenchbody(Q-body)の最適な条件について検討した。1)で調製したQ-bodyを用いて、FLV添加による蛍光変化を調べた。

各Q-bodyの蛍光上昇率は、R6G、TAMRA-C5、TAMRA-C2の順に1.5、1.3、1.2、倍であり、ATTO520では0.01 mM FLVでも蛍光上昇が認められなかった。R6Gは最も脂溶性が高いため、抗体分子(VH-VL)間によくクエンチングし、その結果として高い蛍光上昇を示したと考えられる。本課題の研究目的は、二種の抗薬物抗体をモデルとし、薬物スクリーニングの目的に応じた最適な抗体を分子レベルでデザインし、機能改変した新しい抗体を用いた薬物検出法を構築する事である。本研究では、二種の抗薬物抗体の抗原認識に重要な部位の検索をX線結晶構造解析等によって行い、その後抗薬物抗体の改変体を作製、最後にQuenchbody法による各薬物の検出法を構築する事を予定していた。しかし、薬物ー抗体タンパク質複合体の結晶作製に時間がかかっている事、また熊本地震後に分析機器が使用できない状況があった事から、Q-body法による薬物検出法の構築を先行して実施してきた。平成28年度には、各薬物に対する抗体遺伝子を挿入可能なQ-body発現ベクターの構築を行い、調製法を確立した。また、平成29年度には調製したQ-bodyについて、最も高い抗原応答性を示すリンカー長や色素に関する知見を得た。今後は、これまでに作製したQ-body発現ベクターに抗原認識部位遺伝子を挿入する事で新たな抗原に対するQ-bodyを作製できるものである。また、FLVに対する各種Q-bodyの蛍光応答性に関する知見は今後の参考データとなるものである。しかし、今後の検討項目が多いため進捗状況としては「やや遅れている」と考えている。法医学実務において、薬毒物を簡便・迅速にスクリーニングできる免疫学的検出法は有用である。我々は、遺伝子工学的技術の利点を活かした抗薬物抗体の作製と薬物検出法構築に取り組んでいる。本課題では、二種の抗薬物抗体をモデルとし、薬物スクリーニングの目的に応じた最適な抗体を分子レベルでデザインし、機能改変した新しい抗体を用いた薬物検出法を構築する事を目的とした。本年度は、薬物と抗体の相互作用部位を解析するため、抗体と薬物の共結晶作製を試みた。1)抗原結合フラグメント(Fab)の調製抗フルボキサミンモノクローナル抗体(IgG)産生ハイブリドーマをCELLine Bioreactorを用いて無血清培地で培養し、その培養上清からアフィニティークロマトグラフィーを行ってIgGを精製した。パパインによるIgGの酵素処理を行ってFabを調製し、その後各種クロマトグラフィー(アフィニティ、イオン交換、ゲルろ過)を行って高純度に精製した。精製度の確認は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法で行った。本精製にて約4 mgの高純度精製Fabを得たため、これを結晶化条件の検討に用いた。2)フルボキサミン結合Fabタンパク質の結晶化条件の検討Fabタンパク質に対して過剰のフルボキサミンを混合させ、共結晶化を試みた。結晶化は蒸気拡散法(Hanging Drop法)で行った。
ごみ減量・リサイクルシステムの国際協力による地域活性化

1研究の目的これまで地方自治体は、国際協力を、地域経済の成長・発展、地域社会の安定性、あるいは地域住民の福利厚生として積極的には活用してこなかった。現在、日本の地域社会で行われている市民と行政との協働によるごみ減量・リサイクルの取り組みを、中国の市民が視察することは、同国の環境問題解決のためにもとても意義があると思われる。一方、日本にとっても、「ごみ減量・リサイクルシステム」の国際協力を「観光資源」の一つとして活用して、購買意欲の高い中国人観光客を地元の商店街に呼び込むことにより地域経済の活性化の可能性も生まれるのではないかと考える。2研究の方法日本の清掃工場や環境関連施設を見学し、環境に対する理念及びゴミ分別等の先進的な取組について学ぶことを目的とした無錫市青少年環境大使団が、平成27年8月17日から23日まで、友好都市である相模原市を訪問した。本研究は、同団の小中学生10名に対してインタビュー調査と、その保護者に対するアンケート調査を実施し分析を行った。調査項目は、性別、職業、ごみの分別や日本での交流活動等についてである。3研究の成果インタビュー調査から、中国で「ごみ減量・リサイクルシステム」が行われていない要因として、市民の意識が足りないことが析出された。無錫市青少年環境大使団に参加した10名の小中学生は、帰国後も地域や学校で環境保護活動に積極的に関わり、日本で学んだ環境意識や技術を広く市民に呼びかけることで、無錫市民の環境意識の向上に繋がっている。また、保護者に対するアンケート調査から、今後もこうした教育を目的とした訪問団の派遣を継続して欲しいとの意見が多かった本研究から、「ごみ減量・リサイクルシステム」が「観光資源」の一つとして有効であることが明らかとなった。