hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
胃癌患者における腹腔内及び抹消血リンパ球腫瘍免疫能の解析

胃癌患者において腹膜転移再発は高率に認められる。癌性腹水中のリンパ球においては抗腫瘍免疫からの逃避機構があると考えられているが、胃癌手術時の腹腔洗浄液中のリンパ球の抗腫瘍免疫における役割は未だ不明である。胃癌患者腹腔内のリンパ球を中心とした免疫環境を解析し、今後我々が予定している癌ワクチン臨床治験における対象症例を選択する際の基礎データとすることを目的として、研究を行った。対象は胃癌手術症例50例で、手術時に腹腔洗浄液を採取した。腹腔洗浄液において、細胞診、CEA値測定およびリンパ球解析を行った。リンパ球解析は腹腔洗浄液を遠心後、リンパ球分離比重液を用いてリンパ球を分離、リンパ球の表面抗原をフローサイトメトリーで解析した。結果、腹腔内遊離癌細胞陽性症例では腹腔内CEA値が有意に上昇していた。また腹腔内では末梢血に比べCD8陽性細胞の割合が高く、活性型T細胞が多く発現しており、細胞内サイトカインの非特異的刺激に対する反応性も高いことより、腹腔内は腫瘍局所と同等に癌、宿主間の免疫応答が行われる重要な場であると考えられた。さらに胃癌進行に伴い、腹腔内洗浄液中のCD8陽性細胞の相対的減少や、制御性Tリンパ球の増加、活性型T細胞の減少、サイトカイン産生能の低下などを認め、術中には腹膜転移を認めない症例においても腹腔内免疫抑制の傾向が確認された。以上より、腹腔内免疫環境の解析は、腹膜再発高リスク群の選別に有用であり、腹腔内は癌ワクチン臨床試験における薬剤投与ルートとしても有望であると考えられた。
神経細胞の極性形成を担う分子群の網羅的解析

神経細胞は、1本の軸索と複数の樹状突起を有し神経極性を形成する。神経極性は、神経細胞の基本的な機能であるシグナルの入出力や統合に重要な役割を果たすにも関わらず、その形成および維持の分子機構は未だよくわかっていない。本研究の目的は、プロテオミクスを用いて神経細胞の極性形成に関わる分子群を網羅的に同定し機能解析を行うことにより、神経極性形成・維持の分子ネットワークを明らかとすることである。これまでの研究で、我々は高感度二次元電気泳動法を用いて6,197個のタンパク質スポットを解析し、培養海馬神経細胞の極性形成時に発現が上昇する92個のタンパク質を質量分析装置を用いて同定した。また、5,164個のタンパク質スポットを解析し、82個の神経軸索に濃縮するタンパク質を同定している。本年度は、これらのうち2つの新規タンパク質の機能解析を重点的に行った。そのひとつshootin1に対する抗体を作成し組織分布を調べたところ、shootin1は脳に特異的に発現しその発現量は軸索が形成される生後4日目にピークを迎えた。また、ラット海馬培養神経細胞では、shootin1が極性形成に伴って軸索の成長円錐に強く濃縮することが明らかとなった。さらに、shootin1の異所性の過剰発現は神経極性に乱れを惹き起こし過剰軸索を形成させた。以上の結果から、今回見出したshootin1は極性形成に関与する重要な分子であると結論された(論文投稿中)。もうひとつの新規分子(名前は未定)も脳特異的な組織分布を示し、ラット海馬培養神経細胞では神経細胞の極性形成とともにその発現量が上昇した。また、この分子は成長円錐内でアクチンフィラメントと共局在しており、極性形成に伴った神経突起成長を調節する重要な因子である可能性が示唆された。
姉妹染色分体間接着による局所クロマチン構造変換機構

本研究では、姉妹染色分体間接着のマシナリーがその機能を適切に遂行するために、局所的にクロマチン構造を変化させる機構を明らかにすることを目指す。特に、染色体均等分配における重要性が最も高い染色体領域のひとつであるセントロメア近傍ヘテロクロマチン領域は、姉妹染色分体間接着活性が濃縮された領域として知られているが、ヌクレオソーム密度の高いヘテロクロマチン領域において接着がどのように確立されているのか、その実体は不明である。本研究ではヘテロクロマチン領域に着目し、初年度はショウジョウバエS2細胞を用いて、ヘテロクロマチンに局在する接着確立因子Dalmatian(Dmt)の結合因子から接着必須因子の同定を行った。DmtのC末端側にEGFPを融合させたDmt-EGFP発現ベクターをショウジョウバエS2細胞に導入し、Dmt-EGFP恒常発現細胞を作製した。このDmt-EGFP発現細胞において、Dmt-GFPは内在性と同様の挙動を示すことを確認した。EGFPに結合する性質をもつGFP nanobodyを用いてDmt-EGFP恒常発現細胞からDmt-EGFPをプルダウンし、結合タンパク質を質量分析によって網羅的に同定した。プルダウン実験のネガティブコントロールにはEGFP発現細胞を用いた。Dmtに有意に結合する因子すべてについて、dsRNAをin vitro合成したのち、S2細胞においてノックダウンを行い、分裂期染色体の接着が失われる、あるいは減弱する因子を同定した。現時点でスクリーニングは9割程度完了しており、すでにValidation screeningを終えた因子の中には、DNA結合因子、RNA結合因子、ヒストン修飾因子など、興味深い因子がいくつか同定されている。当初予定していたスクリーニングを初年度のうちに概ね完了させることができた。数遺伝子のValidation screeningを残すのみとなっている。またスクリーニングの結果、興味深いいくつかの因子も同定されており、機能解析のステップに進むことができると考えられる。今後はひきつづきValidationscreeningを完了させるとともに、初年度で同定した接着に必須の、あるいは接着機能に重要と思われるDmt結合因子の働きを明らかにしていく予定である。特にヘテロクロマチンにおける局在や機能に着目し、接着機能との関連を明らかにする。現在同定されているほとんどの因子が、従来の動物細胞を用いた細胞生物学研究で、接着機能との関与が示唆されたことのない新規遺伝子である。このことから、まず、これらの因子の細胞内局在や、染色体上での安定性など、基本的な情報をあきらかにすることからはじめる。さらにDmtと結合することによって、どのように接着機能を制御しているのか、またヘテロクロマチン構造形成にどのような役割を果たしているのかを明らかにしていく。
結晶性チタン酸バリウムゲル粉末の室温合成に関する研究

チタン酸バリウムは強誘電体材料として知られており、電子部品への応用のため、その薄膜化に期待がよせられている。高純度の結晶性チタン酸バリウム粉末は、金属アルコキシドを原料とするゾル・ゲル法によって、約50°Cの温度で合成することができる。チタン酸バリウム薄膜は、粉末の場合と同様にゾル・ゲル法によって合成することは可能であるが、粉末場合と異なって、薄膜形状を保つため溶液のゲル化の過程が必要となり、最終的に結晶性薄膜を合成するためには600°C以上の高温焼成が必要となる。このような結晶化に要する温度の差は主にゲル中に含まれる残留有機成分のためとされているが、その詳細については明かとなっていない。本研究では、種々のプロセスで合成したゲル体から得られたゲル粉末の結晶化挙動について検討し、室温合成したチタン酸バリウム粉末の結晶化学的特性を明らかにした。バリウムとチタンのアルコキシドを非水溶媒に溶解し、攪拌もしくは還流し、脱炭酸水によって加水分解し、20°Cでは維持してゲル化させる。その後、真空乾燥によってゲル粉末を合成する。チタン酸バリウムの結晶化には十分な加水分解量とエージング時間が必要であることがわかった。また、加水分解ゲル化時の粉末は結晶化していないが、ゲル化後収縮離液反応が進行したゲルからは結晶性の粉末が得られることがわかった。一方、このようにして得られた粉末の結晶化学的特性をX線粉末回折によって検討した結果、結晶ゲル粉末の格子定数は通常の粉末に比べてわずかに大きいことがわかった。この原因を説明することは困難であるが、ゲル粉末を仮焼した粉末のX線粉末回折の結果とDTA-TG測定の結果から、このような格子定数の差異は主に残留有機成分に基づくものであることがわかった。残留有機成分が格子定数にどのように影響を与える機構については、ゲル化および結晶化過程をシミュレーションすることによって明確にする必要がある。
厚生経済学の非厚生主義的基礎:手続き的衡平性と帰結主義

伝統的な規範的経済学は、3つの点で限定的な情報的基礎に依拠して展開されてきた。1、厚生主義の観点:経済システムの成果を評価する際に、システムがもたらす帰結に排他的に注目する帰結主義の観点に依拠するのみならず、帰結の価値を評価する際にはその帰結が各個人にもたらす厚生のみを評価に採り入れて、帰結の非厚生的な特徴を無視する考え方。2、序数主義の観点:個人的厚生の基数的な意義を一切否定して、厚生は単に選択肢に対する選好の序数的な数値表現であるとする考え方。3、個人間比較の不可能性の仮定:個人的厚生の水準にせよ測定単位にせよ、個人間でその大小を比較することに対して操作的な意義を全く認めない考え方。このプロジェクトは、仮定2、3、を除去して厚生主義の枠内で伝統的な規範的経済学を拡張する作業--これには既に多くの先行例がある--を越えて、仮定1、それ自体を除去する理論の構築を目指して構想・執行された。得られた代表的な成果は以下の通りである。1、帰結主義と非帰結主義の公理主義的な特徴付けに成功したこと。2、厚生主義的な枠組みを越えて分析の枠組みを拡張した場合には、伝統的な枠組みのもとで解きがたい難問とされてきた不可能性定理を解消するきっかけを発見できることを論証したこと。3、選択機会の内在的価値や選択手続きの内在的価値に正統な位置つけを与える枠組みは、例えばGATT/WTOのような国際ルールの設計の意味と意義に対する新たな理解をもたらすこと。これらの研究成果は全て国際的研究雑誌に既刊ないし近刊予定になっている。社会的意思決定の非厚生主義的特徴を明示的に取り入れて、厚生経済学の新たな枠組みを作るためには、社会状態の記述と分析に、社会的意思決定の手続き的特徴を含ませた新たな分析的フレームワークを発展させる必要がある。筆者の方法の独創的な特色は、社会状態と並んでその社会状態を実現する経済メカニズムを評価の対象とする点にある。本年度は、手続き的考慮を内生化した社会的選択と厚生経済学の基礎理論を展開する理論パートの第1年度であり、(1)このアプローチが伝統的な厚生経済学のいかなる欠陥に対処するために必要とされるかを明らかにすること、(2)筆者が展開中のアプローチと、やはり非厚生主義の規範的経済学を模索中のアマルティア・センのアプローチを比較・対照して、先行研究の欠陥を指摘するとともに、筆者のアプローチがもたらす新しい成果を明らかにすることに努力を傾注した。この努力はプロジェクトの2年目にも継続されるが、今年度に限れば以下の成果を得ることができた。成果の第1は、アマルティア・センの潜在能力アプローチの問題点を(1)潜在能力集合の定義に含まれる欠陥、(2)福祉の評価に際して社会的選択メカニズムの手続き的特性を評価の対象に取り入れないことに起因する欠陥、の2点に纏めて明らかにして、これらの欠陥を克服するチャンネルを見出したことである。成果の第2は、GATT/WTOの機能に即して筆者のアプローチがもたらす新たな知見を具体化して、国際取引ルールと紛争処理メカニズムの《公平性》に関して結果主義的アプローチに対抗するルール志向型アプローチを確率したことである。本年度は、手続き的衡平性を帰結の善悪と並んで厚生経済学的な考慮に取り入れる理論的枠組みを展開することに努力を傾注して、いくつかの成果を得た。(1) Social Choice and Welfareに掲載された第1論文は、帰結の考慮と並んで手続き的衡平性を考えることが不可欠的な重要性をもつことを例示する理論モデルを提供すると同時に、2つの考慮事項を同時に取り入れた理論のフレームワークを提示して、リベラル・パラドックスを素材としてこの新たなフレームワークの有効性を示した。

(2) Economic Journalに掲載された第2論文は、ピグーの旧厚生経済学から厚生主義的帰結主義を継承した新厚生経済学の論理的性格を明確にして、厚生主義的帰結主義がなぜ福祉の経済学の基礎としては不適切であるかを示した。(3)『貿易と関税』に掲載された第3論文は、第1、第2論文の理論的基礎に立って、貿易政策・措置の衡平性を巡る国際的紛争を貿易ゲームの公平な設計とフェア・プレーの義務という2つの視点から分析したものである。(4)『経済研究』に掲載された第4論文は、厚生経済学の非厚生主義的基礎を模索している先駆者であるアマーティア・センの福祉の経済学を検討して、その基礎概念を解説・整理すると同時に、今後の研究が待たれる焦眉の検討課題を提起したものである。この問題提起は、筆者自身の今後の課題のシナリオと重なりあうものであることは当然である。(5)東京大学出版会から上梓された共編著『日本の競争政策』は、従来の効率性の観点から専ら検討されてきた競争政策に対して、競争という手続き的ルールの衡平性を補完的な視点として活用しつつ、日本の競争政策を理論的・実証的に検討した研究成果である。厚生経済学の非厚生主義的な基礎を構築する今年度の作業は、2つの線に沿って推進された。第1の線の基本的な考え方は、政策ないし行動の帰結に関心を集中する代わりに、その帰結の背後にあって、選択しようとすれば選択できた機会集合を、実際に選択された帰結と並んで考慮に取り入れるものである。この考え方の重要性は、他の選択肢が存在しない場合にある帰結xをとることと、他の選択肢を敢えて棄却してxを選択することとの間に存在するギャップにある。もしわれわれが、選択という行為それ自体に内在的な価値を認めるならば、このギャップを分析的に捉える経済理論が非常に重要になる。この考え方に基づいて、われわれは帰結主義と非帰結主義の公理化に成功して、さらに非帰結主義的な厚生経済学の建設に踏み出すことができた。第2の線の基本的な考え方は、政策ないし行動を実際に選択する手続きないしメカニズムの内在的な価値に注目するものであって、われわれはこの考え方に基づいて手続き的衡平性という概念に明確な定義と分析を与えることに成功した。これら2つの線に沿う研究は現代の厚生経済学と社会的選択理論が、ややもすれば効率性のみに関心を絞って衡平性や貧困・飢餓といった焦眉の経済問題と取り組めないでいる現状を脱却するうえで、重要な役割を果たし得るものと確信している。この確信を体系的に述べて、今回のプロジェクトで据えた基礎のうえに福祉の経済学を建設するプランを述べたのが、日本経済学会で行われた筆者の会長講演"Welfare Economics Beyond Welfarist-Consequentialism"である。伝統的な規範的経済学は、3つの点で限定的な情報的基礎に依拠して展開されてきた。1、厚生主義の観点:経済システムの成果を評価する際に、システムがもたらす帰結に排他的に注目する帰結主義の観点に依拠するのみならず、帰結の価値を評価する際にはその帰結が各個人にもたらす厚生のみを評価に採り入れて、帰結の非厚生的な特徴を無視する考え方。2、序数主義の観点:個人的厚生の基数的な意義を一切否定して、厚生は単に選択肢に対する選好の序数的な数値表現であるとする考え方。3、個人間比較の不可能性の仮定:個人的厚生の水準にせよ測定単位にせよ、個人間でその大小を比較することに対して操作的な意義を全く認めない考え方。
指標生物を用いた海洋におけるダイオキシン類汚染モニタリングとその生体影響評価

本課題は、魚介類を指標生物として利用したダイオキシン類による水域汚染のモニタリング手法を確立することにある。本年度は、対象汚染物質として水酸化PBDEs(OH-PBDEs)に着目した。OH-PBDEsはダイオキシンの類縁物質PBDEsの水酸化代謝物である。それらは甲状腺ホルモンと類似の化学構造をもつことから、血液中の甲状腺ホルモン輸送タンパク質などと結合して内分泌かく乱物質として作用することが知られている。本課題ではOH-PBDEsの化学分析手法の開発と環境試料からの検出を目的とし、本年度は湖水や雨などの試料を対象とした。その成果は以下のようにまとめられる。なお本研究は海外渡航先であるカナダ環境省National Water Research Instituteにて実施されたものである。2.OH-PBDEsの化学分析手法を検討し、ガスクロマトグラフ高分解能質量分析計を使った高感度検出法を確立した。3.化学分析に供した全ての試料(水、雨、雪)からOH-PBDEsが検出され、これら物質による汚染が広がっていることが明らかとなった。4.OH-PBDEsは雪より雨から高濃度で検出され、夏の強い紫外線によりPBDEsがOH-PBDEsに酸化されていることが示唆された。5.都市下水処理場周辺の水試料から高濃度のOH-PBDEsが検出され、都市で使用されたPBDEsが下水処理場で分解代謝を受けていることが示唆された。6.これら環境水中から検出されたOH-PBDEsの生物蓄積特性とその毒性影響が今後の課題となった。本研究では海洋、とくに近海や外洋域におけるダイオキシン類汚染の実態を、魚介類を利用して把握することを目的としている。今年度はダイオキシン類の分析システムを確立し、指標生物として着目したカツオとイカを収集・分析することで、以下のような成果を得た。1、瀬戸内海区水産研究所および遠洋水産研究所、愛媛大学と協力し、太平洋外洋域を中心に数100検体を越えるカツオとイカを収集・整理した。2、ダイオキシン類および類縁物質である残留性有機汚染物質(POPs)の魚介類試料分析システムを、瀬戸内海区水産研究所で確立した。分析法は既存の方法を組み合わせ、魚介類海水に最適化した。3、化学分析に供した全てのカツオとイカ試料から、ダイオキシン類および有機塩素系農薬が検出された。外洋域のカツオにはポリ塩素化ビフェニル類(PCBs)が最も高い濃度で残留しており(73-920 ng/g脂肪重当たり)、次いでジクロロジフェルトリクロロエタン類(DDTs)=クロルダン類(CHLs)≧ヘキサクロロシクロヘキサン類(HCHs)=ヘキサクロロベンゼン(HCB)>ダイオキシン類(PCDDs)=フラン類(PCDFs)の順であった。4、カツオから検出されたこれら物質の残留濃度を沿岸と外洋で比較したところ、PCBsやHCHs、HCB、PCDFsは外洋域でも比較的高い濃度で検出された。人間活動によって環境中に放出されたこれら物質が近海から外洋まで拡散し、海洋環境を広く汚染していることが示された。これら物質は地球汚染型の物質であり、外洋生態系の保全にはこれら物質の低減が重要であることが示唆された。5、一方、外洋域から採取されたカツオ中のPCDDsやDDTsの濃度は、沿岸域で検出されたものと比べ極めて低濃度であった。これら物質は地球規模での移動拡散性は低く、局所汚染型の物質として沿岸域生態系へ影響することが考えられた。本年度は、対象汚染物質として水酸化PCBs(OH-PCBs)に着目した。OH-PCBsは前年度に化学分析したダイオキシン種の水酸化代謝物である。本年度は魚類を指標生物として用いたOH-PCBsのモニタリング手法を確立することを目的とし、その成果は以下のようにまとめられる。なお本研究は海外渡航先であるカナダ環境省National Water Research Instituteにて実施したものである。2.化学分析の結果、全ての水試料と魚血漿試料からOH-PCBsが検出された。3.分析に供した3魚種のOH-PCBs濃度を調べたところ、蓄積濃度と組成に種間差がみられた。4.魚類中OH-PCBs濃度と環境水中のOH-PCBs濃度、あるいは血漿中のOH-PCBsとPCBsの濃度は相互に関連をもたないことが示唆された。5.一方で、魚類中OH-PCBs濃度とそれら試料が採取された水域の水温との間には明瞭な関係がみられ、水温が高い水域の魚類から高濃度のOH-PCBsが検出された。6.魚体内に蓄積しているOH-PCBsの由来を考えると、その大部分は魚体内に蓄積した親化合物のPCBsが代謝されたものであり、水中のOH-PCBsが生物濃縮されたものではないと推察された。7.魚類のOH-PCBsをモニタリングする際、種間差および水温を考慮する必要があることを指摘した。

OH-PBDEsはダイオキシンの類縁物質PBDEsの水酸化代謝物である。それらは甲状腺ホルモンと類似の化学構造をもつことから、血液中の甲状腺ホルモン輸送タンパク質などと結合して内分泌かく乱物質として作用することが知られている。本課題ではOH-PBDEsの化学分析手法の開発と環境試料からの検出を目的とし、本年度は湖水や雨などの試料を対象とした。その成果は以下のようにまとめられる。なお本研究は海外渡航先であるカナダ環境省National Water Research Instituteにて実施されたものである。2.OH-PBDEsの化学分析手法を検討し、ガスクロマトグラフ高分解能質量分析計を使った高感度検出法を確立した。3.化学分析に供した全ての試料(水、雨、雪)からOH-PBDEsが検出され、これら物質による汚染が広がっていることが明らかとなった。4.OH-PBDEsは雪より雨から高濃度で検出され、夏の強い紫外線によりPBDEsがOH-PBDEsに酸化されていることが示唆された。5.都市下水処理場周辺の水試料から高濃度のOH-PBDEsが検出され、都市で使用されたPBDEsが下水処理場で分解代謝を受けていることが示唆された。6.これら環境水中から検出されたOH-PBDEsの生物蓄積特性とその毒性影響が今後の課題となった。
胃癌新規癌抑制遺伝子RUNX3の異常を伴う胃癌前駆細胞の同定と遺伝子診断への応用

これまでに我々は、世界に先駆けてRurx3ノックアウトマウスを作製し、その解析よりRUNX3遺伝子が胃粘膜の発生や分化に重要な役割をはたしており、この異常が胃粘膜の脱分化や異常増殖や癌化に関連することを示した。さらに胃癌細胞株及び臨床検体におけるRUNX3遺伝子の高頻度のコピー数減少、主にメチル化による発現低下、機能喪失型変異を確認しており、RUNX3が胃癌の新規がん抑制遺伝子であることを報告した(Lie, Ito, Sakakura, Fukamachi,(equally contributed) et al.,Cell,2002)。また胃癌の発生母地である慢性胃炎粘膜や腸上皮化生におけるRUNX3の解析や胃癌の転移浸潤におけるRUNX3の関与を明らかとし、将来的にはこれらに基づく胃粘膜の発ガンリスク予測、胃癌の発ガン予防や消化管粘膜再生にも応用しると考えている。RUNX3ノックアウトマウスの胃粘膜を経時的に観察すると、通常のmucous neck cellからの分化異常が認められ、Muc陽性、PCNA陽性、CDX2陽性の細胞が多数認められた。これらの分化異常を来した細胞群が胃癌の前癌病変である可能性が示唆された。これらの結果を基づきヒト胃癌臨床検体における胃癌の前駆細胞がヒト胃粘膜、特に癌部周囲に存在するかを検索する。これらを経時的に経過観察し、実際に発癌するか否かを確認する。さらにこれらを指標とした胃癌の発ガンリスク評価を多施設によるコホート研究にて行う予定である。これまでに我々は、世界に先駆けてRunx3ノックアウトマウスを作製し、その解析よりRUNX3遺伝子が胃粘膜の発生や分化に重要な役割をはたしており、この異常が胃粘膜の脱分化や異常増殖や癌化に関連することを示した。さらに胃癌細胞株及び臨床検体におけるRUNX3遺伝子の高頻度のコピー数減少、主にメチル化による発現低下、機能喪失型変異を確認しており、RUNX3が胃癌の新規がん抑制遺伝子であることを報告した。(Lie, Ito, Sakakura, Fukamachi, (equally contributed)et al., Cell,2002)。また胃癌の発生母地である慢性胃炎粘膜や腸上皮化生におけるRUNX3の解析や胃癌の転移浸潤におけるRUNX3の関与を明らかとし、将来的にはこれらに基づく胃粘膜の発ガンリスク予測、胃癌の発ガン予防や消化管粘膜再生にも応用すると考えている。これらの結果に基づきヒト胃癌臨床検体における胃癌の前駆細胞がヒト胃粘膜、特に癌部周囲に存在するかを検索する。
バキュロウイルス感染細胞を利用した無細胞蛋白質生産系の構築

バキュロウイルス感染細胞から翻訳後修飾が可能な無細胞蛋白質生産系を構築するための基礎的技術開発を目的として、N型糖鎖付加修飾反応に焦点を絞り、まず使用する昆虫細胞の選定を行った。組換え糖蛋白質(PTTH)を数種バキュロウイルスベクター系で発現させ、付加される糖鎖の主要な構造をレクチンブロットなどで比較検討したところ、High Five細胞では、アレルゲンとなるコアα1,3フコースの分岐が比較的多いことと、サクサン細胞ではわずかに複合型糖鎖の付加がおこるなど若干の細胞間差異があるものの、いずれの鱗翅目昆虫細胞でも末端マンノースとコアα1,6フコースの分岐を有する構造が主体であった。そこで、ウイルスと細胞の両方のゲノム情報が最も豊富なカイコ核多角体病ウイルス(BmNPV)とBmN4細胞を実験材料に供試して研究をすすめることにした。その手始めとしてDNAマイクロアレイを使用して、BmN4細胞と別のカイコ培養細胞BoMoの遺伝子発現パターンを網羅的に比較したところ、想像以上に多くの違いが認められ、この違いが細胞株間の翻訳後修飾特性の差を生み出していると考察された。BmNPVにおけるvery lateプロモーターからの糖蛋白質生産パターンの解析を容易にするために、バキュロウイルスにおける生産効率の高いラブドウイルスIHNVの表面膜糖蛋白質遺伝子の膜結合領域以降をコードする配列をヘキサヒスチジンタグ配列に置換したcDNAを作製し、BmNPV感染BmN4細胞で発現させたところ、分泌されずにゴルジ体で不溶化することが、糖鎖構造の解析と共焦点顕微鏡による免疫組織化学で明らかになった。この不溶化回避に有効な分子シャペロンの探索が今後の無細胞蛋白質生産系構築に必要な課題として残された。BmNPVにおけるvery lateプロモーターからの糖蛋白質生産パターンの解析を容易にするために、バキュロウイルスにおける生産効率の高いラブドウイルスIHNVの表面膜糖蛋白質遺伝子を改変し、膜結合領域以降をコードする配列をヘキサヒスチジンタグ配列に置換したcDNAを作製し、BmNPV感染BmN4細胞で発現させたところ、感染多重度20pfu/cellで感染後36時間目には糖鎖が付加された産物がイムノブロットにより明瞭に確認された。ただし、産物は分泌されず、細胞内で不溶化し蓄積することが判明した。以上の成果に基づき、次年度は、感染後36時間前後の細胞を分画抽出し、無細胞蛋白質翻訳修飾系の構築を試みると同時に、組換え糖蛋白質不溶化のメカニズムの解明と細胞外での不溶化阻止技術の開発にも取り組む。
新たな異所性骨形成モデルの確立と骨化メカニズムの解明

マウスの後肢骨格筋に対して、Cardiotoxin (CTX)を注入して筋損傷を誘発した群と筋損傷を誘発しない群の2群に分け、超音波遺伝子導入法により緑色蛍光タンパク(GFP)発現プラスミドベクターを導入し、導入効率を蛍光顕微鏡にて評価した。筋損傷を誘発した群ではGFPの発現が上昇していた。つぎに、ヒト骨形成因子(BMP2)発現プラスミドベクターを導入したところ、筋損傷を誘発した群では、異所性骨の形成がより顕著に確認された。以上の結果から、本方法はBMPによる骨誘導のメカニズムや生体内での骨形成の解析に有用となる可能性が考えられた。進行性骨化性線維異形成症(FOP)は、筋組織内で異所性に骨形成が生じる難治性疾患で、骨形成に重要な役割を担うBone Morphogenetic Protein(BMP)の受容体であるALK2の変異により発症する。我々は、in vitroの解析からこの変異ALK2がBMPのもう1種類の受容体(II型受容体)によってリン酸化を受けやすく、BMP非存在下でも細胞内シグナルを活性化することを見出した。そこで本申請課題では、ソノポレーション法を用いて、BMP受容体や下流の情報伝達分子の遺伝子導入による骨誘導活性を評価できる新たなin vivoの実験系を確立し、FOPの発症メカニズムの解明や、生理的な骨形成に重要な分子メカニズムの解明を目指す。本年度はソノポレーションを用いたBMP受容体や下流の情報伝達因子の遺伝子導入による新たなin vivoの骨誘導実験系を確立するため、まず野生型マウスの下腿骨格筋に対して、ソノポレーションによりFOPで見出された変異BMP受容体(ALK2)の遺伝子導入を行うことを試みた。骨形成因子(BMP2)発現ベクターを用いた骨誘導実験ではpCAGGS-BMP2ベクターを用いた群で骨形成を誘導できた。一方、pcDEF3-BMP2ベクターを用いた群では骨形成が誘導できなかった。またGFP発現ベクターを用いた実験では、pCAGGS-GFPを用いた群では対象の筋組織にGFPの発現が確認できたが、pCDEF3ベクターを用いた群では、微弱なGFPの発現に止まった。そこで本申請課題では、ソノポレーション法を用いて、BMP受容体や下流の情報伝達分子の遺伝子導入による骨誘導活性を評価できる新たなin vivoの実験系を確立し、FOPの発症メカニズムの解明や、生理的な骨形成に重要な分子メカニズムの解明を目指した。まず、マウスの後肢骨格筋に対して、ヘビ毒(Cardiotoxin)を注入して筋損傷を誘発した群と筋損傷を誘発しない群の2群に分け、それぞれ超音波遺伝子導入法により緑色蛍光タンパク(GFP)発現プラスミドベクターを導入し、導入効率を蛍光顕微鏡にて評価した(実験1)。つぎに、同様の実験系において、それぞれヒト骨形成因子(BMP2)発現プラスミドベクターを導入し、骨誘導能について軟X線、マイクロCT撮影、および組織学的解析を行った(実験2)。実験1では筋損傷を誘発した群では筋損傷を誘発しない群と比較して、GFPの発現が上昇していた。さらに実験2では筋損傷を誘発した群では、筋損傷を誘発しない群と比較してBMP2遺伝子発現の結果である筋組織内における異所性の骨形成がより顕著に確認された。これまでの我々がin vitroにおいて行ってきた実験では、pCAGGSベクターよりもpCDEF3ベクターで導入遺伝子の良好な発現が確認されており、筋組織に対するin vivoソノポレーションにもこのベクターを応用する予定であった。しかしながら、in vivoソノポレーションではpCAGGSベクターの発現の方が優れているという結果となった。このため、当初予定したベクターをそのまま使用することが出来なくなり、進捗が遅れた。口腔内科学本研究計画で当初から準備していたpcDEF3ベクターのコンストラクトをpCAGGSに移し換えた上で、今後の実験を行っていく必要があるため、現在サブクローニングを行っている。サブクローニングが終了し次第、野生型マウスの下腿骨格筋に対して、ソノポレーションによりFOPで見出された変異BMP受容体(ALK2)の遺伝子導入を行い、経時的に4週後までの骨誘導活性を評価する。受容体の共発現で骨誘導が認められない場合、ALK2のリガンドとなるBMP遺伝子の共発現や、筋損傷を誘発するヘビ毒投与の併用などを検討する。また、我々が最近構築した構成的活性型Smadをそれぞれ筋組織に遺伝子導入し、各Smad経路の骨誘導活性について比較検討する。

また、BMPのSmad経路の下流ではOsterixやRunx2の発現が誘導されることから、これらの転写因子の遺伝子導入による骨誘導活性についても検討する。Smad経路単独で骨誘導活性が認められない場合、BMP受容体との共発現でSmad以外の経路を活性化した条件を併せて解析する。
酵素と基質の分子共進化の研究-硬骨魚の孵化の機構をモデルとして

真骨魚類の孵化は、単一酵素系から、効率の良い2種(cladeIとII酵素)の分解系に進化したことがわかる。卵膜分解機構を調べるとcladeI酵素が祖先型活性を維持し、cladeII酵素は、2つの新たな卵膜切断点を獲得することで新規機能酵素へと進化したことが考えられる。新規切断点の獲得は、卵膜の配列変化が強く関与していることが示唆される。本研究は、基質と酵素の分子共進化をタンパク質機能のレベルで示した一例となる。孵化酵素遺伝子を硬骨魚類で網羅的に解析すると、単一酵素の分解系から、2種の酵素の分解系に進化したことがわかる。卵膜分解機構をいろいろな系統の魚種を用いて調べ、比較することで孵化酵素タンパク質の機能進化の過程を解明する。分子系統解析から、2つの複数酵素の酵素系が存在することがわかっている。先に明らかとされている正真骨魚類のHCE-LCE系にくわえグループAとBの酵素系の卵膜分解機構を明らかとすることを目的とする。グループAとBの酵素系は、ニシン・骨鰾類の早くに分岐する魚種で見られるもので、系統的にHCE-LCE系とは異なる進化を経ていると考えられる。AとBの酵素系を持つニシンとアユ孵化酵素精製を試みているが若干時間がかかることが予想される。一方、平行して行った実験で、同様にAとBの酵素系を持つカタクチイワシとミルクフィシュより、十分に活性のあるリコンビナント孵化酵素が大腸菌の系により作製できることが明らかとなった。現在、カタクチイワシとミルクフィシュを材料として卵膜の分解機構を進めており、予備的な実験より、新規の機構であることが予想されている。今後は上記した魚種の卵膜の分解機構を解明し、酵素の基質特異性と卵膜の構造の変異が、進化過程でどのように新規の分解系を獲得したかを明らかとする。進化過程での特異性の変化に重要な孵化酵素アミノ酸残基と、卵膜タンパク質の切断部位アミノ酸配列の変異から、タンパク質レベルでの酵素と基質の共進化のメカニズムを考察することを目指している。また、卵膜タンパク質遺伝子をクローン化して、分子系統樹を作製し、孵化酵素遺伝子の分子系統樹と比較することにより、遺伝子レベルでの共進化過程の研究も同期して進行中である。真骨魚類孵化酵素遺伝子の分子系統樹によると、初期に分岐する魚では、単一種の酵素遺伝子であるが、遺伝子重複・多様化により、後期に分岐した魚では、2種の遺伝子(cladeIとcladeII遺伝子)を持つことが知られている。遺伝子重複は、正真骨魚類とニシン・骨ピョウ類が、分岐する以前に起きており、2つの魚種では、それぞれが2種の酵素系により卵膜を分解していることが示唆される。タンパク質レベルの研究により、単一の酵素系では、卵膜を部分分解して膨潤化させ胚の運動により卵膜を破って孵化することがわかっている。一方、正真骨魚類の魚では、2種の酵素が共同して卵膜を完全分解することから、効率の良い分解系に進化しているといえる。本研究の目的は、いまだ解明されていないニシン・骨ピョウ類の魚の酵素系を調べることと、孵化酵素の進化過程で、卵膜タンパク質(基質と酵素)がどのように分子共進化して効率の良い分解系が生じたかを明らかとすることを目的とした。正真骨魚類では、cladeI遺伝子が、祖先型の機能(卵膜膨潤)を維持し、cladeII遺伝子が、膨潤卵膜の可溶化という新規機能を獲得したと考えられている。ニシン・骨ピョウ類のミルクフィシュの2種の酵素の性質を調べると、両酵素とも卵膜を膨潤させる作用を持つことがわかった。このことから、ニシン・骨ピョウ類の2種の酵素系は、効率の良い分解系に進化しなかったことが示唆される。合成ペプチドを用いて両系統のcladeIとcladeII酵素の基質特異性を調べると、cladeI同士、または、cladeII同士でその特異性は、良く似ている。一方、基質(卵膜構成タンパク質)のアミノ酸配列を見ると、正真骨魚類において切断点近傍に多くのアミノ酸置換が観察された。このことから、効率の良い卵膜分解機能の獲得には、基質側のアミノ酸変異が大きく関与していることが示唆された。申請者は、卵膜分解機構の進化をタンパク質機能のレベルで研究している。魚類の孵化酵素は進化過程で重複して、2種の酵素へと多様化したことが分子系統解析より明らかである。孵化酵素の卵膜分解様式を調べると、真骨魚類の孵化は、もともとは、単一酵素で行われ、その後、効率の良い2種の分解系に進化したことがわかる。単一酵素系の孵化は、卵膜の軟化・膨潤である。2種の酵素系では卵膜が完全に可溶化し、一つ酵素(cladeI酵素)が卵膜膨潤化の活性を持ち、もう一方(cladeII酵素)は、その膨潤卵膜を可溶化する。

このことより、cladeI酵素が祖先型活性を維持し、cladeII酵素は、新規機能を獲得した酵素と考えられる。各酵素の卵膜切断点を調べるとcladeI酵素は、N-末端領域を細かく切断する一方、cladeII酵素は、ZPドメインのN-末端側(N-ZPd)とZPドメインの真中(Mid-ZPd)というcladeI酵素酵素とは異なる2箇所を切断する(Yasumasu et al.2010)。つまり、cladeII酵素は、祖先型の活性(N-末端領域の切断活性)という本来の活性を失い、新たに2つの切断点を獲得することで、卵膜可溶化という新機能を獲得したと考えられる。正真骨魚類とニシン・骨鰾類は、ともに2種の酵素を持つ。しかしながら、新規機能を獲得したのは、正真骨魚類のcladeH酵素で、ニシン・骨鰾類cladeII酵素は、卵膜を膨潤化する酵素で、CladeI酵素と同様のN-末端領域の切断活性をもち、2つの切断点のうち1つ(N-ZPd)のみ切断する。ニシン・骨鰾類cladeII酵素では、卵膜可溶化のキーサイトであるMid-ZPdは切断しない。ニシン・骨鰾類ZP-タンパク質のMid-ZPd切断点に対応する配列を見ると、そこにはプロリンの連続配列が保存されている。一方、正真骨魚類のMid-ZPdには、プロリン配列は見られない。つまり、卵膜の配列変化が新たな切断点の獲得、つまり孵化酵素の新規機能に強く関与していることが示唆される。
モバイルGISシステムを用いた森林利用の高度化に関する研究

本研究では、GSP受信機、無線送受信機を用いて、森林内の位置情報をリアルタイムに取得するシステムを完成した。さらに、本研究では、ノートパソコンを使用して、GPS搭載型携帯情報端末のプロトタイプの開発を行っている。この携帯情報端末を用いることにより、ユーザーはディスプレイに表示された地図を参照しながら歩くことが可能になり、森林内での移動が容易になる。GPSによる単独測位では100m程度の位置誤差が生じることが知られているが、今回開発した携帯情報端末にはDGPSによる位置誤差補正機能を搭載することにより、森林内においてもリアルタイムに誤差数メートル以内の位置情報を得ることに成功した。本研究では基地局からRTCMSC-104という補正情報を、特定小電力無線を用いて移動局側に送信することにより、位置誤差の補正を行っている。例えば、森林内で過去に杭を打った正確な場所を見つけたい場合には、そこに到達するための方向と距離を表示されるので、ユーザーは容易に目的地に到達することが可能である。ユーザーの位置はパソコンの画面上に2Dあるいは3Dで表示されるが、この地図のオルソフォトマップを使用して作成した。オルソフォトマップを用いることにより、ユーザーは自分の位置を視覚的にとらえることが可能になっている。この携帯情報端末のもう一つの特色は、フィールドデータ収集の際、取得したデータに自動的に正確な位置、日付、時刻の情報が付加されることであり、データの整理・検索が容易であることであり、林業、登山、研究、測量などさまざまな分野で応用が可能である。本研究の目的は、GPS受信機、無線送受信機を用いて森林内の位置情報をリアルタイムに取得するこである。固定局で受信した補正情報を無線によって移動局へ伝えることができれば、携帯型パソコンの画面にリアルタイムで移動局の位置を表示することが可能になる。まず、京都大学和歌山演習林周辺の山頂付近の開けた場所に固定局としてGPS受信機を設置した。固定局のGPS受信機には、特定小電力無線を用いた無線モデムを接続して移動局にGPSの補正情報を送った。その補正情報を移動局のGPS受信機が受信して、移動局側の正しい位置情報を取得することができた。一方、このシステムを山岳地で利用する際には、GPS衛星の一部が山影に隠れることがあるため、3次元測量に必要な4つの衛星が捕捉できないことがある。そこで、測量を行う時間帯に利用できるGPS衛星の数を事前に知ることが必要となる。そこで、GPS衛星の高度・方位から、その衛星が利用できるかどうか判定するソフトウェアを開発した。具体的には、国土地理院のCD-ROM版数値地図50mメッシュ(標高)(DEMデータ)から求められる測量地点の地形状況を計算することにより、捕捉可能な衛星数を予測した。その結果、予測精度は、DEMを利用した場合が89.6%となった。この結果は、単純に0°以上の衛星はすべて捕捉可能であると予測した場合の予測精度53。0%と比較して十分に大きく、DEMを利用した効果があったものと考えられる。
喘息肺における濾胞性ヘルパーT細胞の分化誘導の仕組みと喘息病態での役割の解明

昨年度までにダニ抗原(HDM)と卵白アルブミン(OVA)によるマウス喘息モデルを用いて肺組織及び縦隔リンパ節での濾胞性ヘルパーT細胞(Tfh)、特異的IgE/IgG1抗体、好酸球性気道炎症の誘導を確認し、これらのモデルにおける抗原提示細胞である肺樹状細胞(LDC)のサブセットを単離同定した。今年度、我々はOVA喘息モデルから単離したLDCの主要な2つのサブセット(cDC1; CD11c+MHC class2+CD64-F4/8-XCR1+CD172a- cells, cDC2; CD11c+MHC class2+CD64-F4/8-XCR1-CD172a+ cells)とOVA特異的に反応するT細胞受容体を持ったOT-IIトランスジェニックマウスから単離したナイーブT細胞を用いてex vivo共培養アッセイを確立し、それぞれのLDCサブセットによるヘルパーT細胞への分化誘導能の確認を行なった。その結果、その中でも本課題の仮説であるcDC2がcDC1と比較し、効率よくTfh細胞を分化誘導することが確認できた。さらに誘導されたTfh細胞の解析を行うため、喘息モデル及び共培養アッセイから誘導されたTfh細胞を単離し、ナイーブB細胞との共培養アッセイを確立した。現在、この共培養アッセイを用いてクラススイッチ誘導能および特異的抗体産生誘導能の解析を行なっている。一方、一部のLDCにおいて、IL-10産生能が高く、TGF-β1存在下ではあるが効率よく制御性T細胞(Treg)を誘導するサブセットを確認しており、今後はこのLDCサブセットの同定及び解析も予定している。我々は、肺樹状細胞(LDC)サブセットについて、それぞれ異なるヘルパーT細胞(Tfh)へ分化誘導能を有し、B細胞を介した抗体産生を誘導する能力も違うことを示してきた。気管支喘息におけるアレルゲン特異的IgE抗体産生において中心的な役割を担う濾胞性ヘルパーT細胞(Tfh細胞)に着目して、肺においてTfh細胞が分化誘導される仕組みを解明し、Tfh細胞がどのように喘息の病態に関わっているかを明らかにするのが目的である。平成28年度は、ダニ抗原(HDM)喘息モデルの作成し、同モデルと正常マウスの肺組織および縦隔リンパ節におけるLDCサブセットであるCD103+LDC、CD11b+LDC、monocyte-derived LDCを磁気分離装置とフローサイトセルソーターを組み合わせて、高純度で単離できることを確認した。さらにHDM喘息モデルにおける縦隔リンパ節でのTfh細胞の単離同定および局在解析をフローサイトメータと共焦点顕微鏡を用いて確認した。また同モデルのHDM特異的IgE/IgG1抗体量の測定、単離した各LDCサブタイプの共刺激分子等の表面抗原の発現および単離細胞のサイトカイン産生能の違いをELISA法とフローサイトメータで確認している。当初の計画では、平成28年度中に卵白アルブミン(OVA)喘息モデルから単離した各LDCサブセットとOVA特異的に反応するT細胞受容体を持ったOT-IIトランスジェニックマウスを用いてex vivo共培養アッセイを確立し、Tfh細胞の分化誘導能を比較検討する予定であったが、OT-IIマウスの購入および搬入手続きに時間を要した。現在は入手し繁殖を開始しているが、平成29年度に予定していた野生型マウスを用いたHDM喘息モデルの研究を先行し、LDCサブセットやTfh細胞の解析を行っている。その他の点については概ね計画通りに進行している。我々は、肺樹状細胞(LDC)サブセットについて、それぞれ異なるヘルパーT細胞(Th)へ分化誘導能を有し、B細胞を介した抗体産生を誘導する能力も違うことを示してきた。平成28年度はダニ抗原(HDM)喘息モデルにおける肺組織及び縦隔リンパ節のLDCサブセットの単離同定と縦隔リンパ節でのTfh細胞の単離同定・局在解析、更にHDM特異的IgE/IgG1抗体量や気道抵抗の測定、肺組織学的評価により、同モデルの気道炎症や抗体産生能の亢進を確認した。平成29年度は、卵白アルブミン(OVA)喘息モデルを用いて上記解析を再検し、HDM喘息モデルと同様の結果であることを確認した。また単離したOVA喘息モデルの各LDCサブセットとOVA特異的に反応するT細胞受容体を持ったOT-IIトランスジェニックマウスから単離したナイーブT細胞を用いてex vivo共培養アッセイを確立し、喘息モデルから単離した各LDCサブセットによりナイーブT細胞が異なるTh細胞サブセットへ分化誘導することを確認した。当初の計画では、平成29年度中にOVA喘息モデルを用いたLDCサブセットとOT-IIマウスとのex vivo共培養アッセイにより、どのLDCサブセットが効率的にTfh細胞を誘導可能か検討する予定であったが、Tfh細胞の分化誘導が不十分であり、抗IL-4抗体、抗IFN-γ抗体、IL-6等のTfh細胞誘導を増強できる既報の環境下での追加検討を行なっている。また同共培養アッセイで分化誘導されたTh細胞サブセットについて、表面抗原・転写因子の解析により同定を行なっている。

昨年度までにダニ抗原(HDM)と卵白アルブミン(OVA)によるマウス喘息モデルを用いて肺組織及び縦隔リンパ節での濾胞性ヘルパーT細胞(Tfh)、特異的IgE/IgG1抗体、好酸球性気道炎症の誘導を確認し、これらのモデルにおける抗原提示細胞である肺樹状細胞(LDC)のサブセットを単離同定した。今年度、我々はOVA喘息モデルから単離したLDCの主要な2つのサブセット(cDC1; CD11c+MHC class2+CD64-F4/8-XCR1+CD172a- cells, cDC2; CD11c+MHC class2+CD64-F4/8-XCR1-CD172a+ cells)とOVA特異的に反応するT細胞受容体を持ったOT-IIトランスジェニックマウスから単離したナイーブT細胞を用いてex vivo共培養アッセイを確立し、それぞれのLDCサブセットによるヘルパーT細胞への分化誘導能の確認を行なった。その結果、その中でも本課題の仮説であるcDC2がcDC1と比較し、効率よくTfh細胞を分化誘導することが確認できた。さらに誘導されたTfh細胞の解析を行うため、喘息モデル及び共培養アッセイから誘導されたTfh細胞を単離し、ナイーブB細胞との共培養アッセイを確立した。現在、この共培養アッセイを用いてクラススイッチ誘導能および特異的抗体産生誘導能の解析を行なっている。一方、一部のLDCにおいて、IL-10産生能が高く、TGF-β1存在下ではあるが効率よく制御性T細胞(Treg)を誘導するサブセットを確認しており、今後はこのLDCサブセットの同定及び解析も予定している。平成28年度に予定していた各LDCサブセットとOT-IIトランスジェニックマウスを用いたex vivo共培養アッセイを確立し、Tfh細胞の分化誘導能を比較検討する。現在、OVAとHDMの両喘息モデルでの縦隔リンパ節におけるTfh細胞の経時的な局在の変化を共焦点顕微鏡で確認している。また喘息モデルで誘導されたTfh細胞を単離し、ナイーブB細胞とのex vivo共培養アッセイを確立し、クラススイッチ誘導および特異的抗体産生誘導能の検討を行う予定である。今後、喘息モデルあるいは共培養アッセイからTfh細胞を単離し、ナイーブB細胞との共培養、クラススイッチ誘導および特異的抗体産生誘導能の検討を行う予定である。また、Tfh細胞を持たないBcl-6欠損マウスを用いたHDM及びOVA喘息モデルを作成し、気道炎症やIgE抗体誘導能を野生型マウスと比較する予定である。OT-IIトランスジェニックマウスの購入および搬入手続きに時間を要し、購入搬送費用は次年度へ持ち越したため。(理由)細胞単離のためのフローサイトセルソーターパネルを作成するのに必要な抗体を購入する予定であったが、当施設の研究棟移転工事により作成及び購入を一時延期したため。(使用計画)移転工事終了後より抗体を購入し、次年度に使用する予定である。上記のトランスジェニックマウスの購入搬送費用に使用する予定である。
新しい放射性薬剤を用いたがん治療:ルテチウム-177(177Lu)標識抗体の開発

1近年、治療効果の増強を目的として抗体に放射性同位元素(RI)を結合したRI標識抗体による治療(放射免疫療法)那注目されている。抗体が腫瘍へ集積するのには数日を要することから、6.7日と比1鯨的長い半減期を有する『ルテチウム・177(177Lu)』は、放射免疫療法に適した核種であると考えられるそこで本研究では、177Lu標識抗体を用いた効果的な放射免疫療法を目指して、177Lu標識抗体に関1する基礎的検討を行った。抗CD20抗体にキレート剤であるDTPAを結合し、177Luで標識したところ標識率90%以上で標識することが出来た。ゲルろ過法により精製を告ない放射化学的純度95%以上とIiした後、CD20陽性のバーキットリンパ腫細胞(RAMOS)を皮下に移植した担癌マウスに177Lu標識抗体を投与し、体内分布を検討したところ、腫瘍への特異的な集積性および滞留性が認められた。177Luがキレート剤から外れた場合は骨へ集積することが知られているが、投与7日後においても骨への集積がほとんどみられなかったことから、177Lu・DTPAの結合は生体内で安定であると考えられる。続いて、同様の担癌モデルに対して、治療量の177Lu標識抗体を投与し、治療実験を行った結果、投与時の3腫瘍サイズが小さいものでは、未治療群に比べて明らかな腫瘍増殖抑制効果が認められた。また、177Lu標識抗体投与を行った一部のマウスでは腫瘍の縮小がみられ、腫瘍全体が白く変色したことから腫瘍が壊死していることが示唆された。以上の結果より、177Lu標識抗体の放射免疫療法薬剤としての有用性が示された。^<177>Luは酢酸緩衝液(pH5.5)中で90分間反応させることでDOTA-NuB2に標識した。その後,ディスポーザブルカラムであるPD-10によってゲルろ過精製し,^<177>Lu標識抗体,^<177>Lu-DOTA-NuB2を得た。^<177>Lu-DOTA-NuB2の比放射能は400μCi/mgであった。当初,治療効果判定に用いるモデル動物はヒトB細胞株でかつCD20陽性のRPMI1788細胞を移植したSCIDマウスの1種類だけを考えていたが,同じようにCD20陽性のヒトバーキットリンパ腫であるRamos細胞を得ることができ,Ramos細胞を移植したヌードマウスも同様にモデル動物として検討した。6週齢のマウスの腹側部に上記細胞を1×10^7個移植し,2-3週間腫瘍が成長させた。両動物とも移植した腫瘍サイズは治療実験に適したものとなり,モデル動物としての方法論を確立し,かつ安定的に作製することが可能となった。
骨髄移植後合併症の新規予防・治療法開発：炎症関連因子の遺伝子解析と活性制御

インフラマソームは多くの炎症性疾患に関与する自然免疫因子である。本研究ではヒトのインフラマソーム遺伝子NLRP1-3の多型と非血縁者間骨髄移植の予後との関連を調べた。その結果、ドナー患者間のHLAミスマッチと患者NLRP3遺伝子多型の交互作用が、2級以上急性移植片対宿主病(GVHD)と統計的有意に関連していた。また、ドナー患者間のHLA-CのミスマッチとドナーNLRP3遺伝子多型の交互作用が、広範性慢性GVHDと統計的有意に関連していた。さらに、サイトメガロウイルスの有無と患者NLRP3遺伝子多型の交互作用が全生存率と統計的有意に関連していた。これらの結果はより大きな集団で再確認すべきである。骨髄移植推進財団から提供を受けている骨髄移植のドナーとレシピエントの1051ペア、計2102検体について、炎症関連因子インフラマソームの構成因子の遺伝子変異と予後の関連を解析した。まず、欧米において移植関連疾患に関与していると報告されているNLRP1-3のSNPのなかで、日本人集団での頻度が0.1以上のもの1個ずつを解析の対象に選択した。これら3つのSNPにおける遺伝子型を、骨髄移植ドナー・レシピエント由来のゲノムDNAについてTaqMan PCR assayによって決定した。さらにTaqMan PCRの結果がDNAシーケンス直接決定の結果と一致することを、数十検体を用いて確認した。解読したSNPの頻度はHapMap計画等で報告されている日本人集団における頻度とほぼ合致していることからも、解読結果に技術的問題はないと考えられる。これらのSNPの遺伝子型(Genotype)および対立遺伝子型(Allele)と(1) GVHD発症の有無、(2) GVHDの重症度、(3)骨髄移植後の生存との関連をドナー・レシピエントの双方について統計解析によって調べた結果、以下の有意な関連を認めた。(1) GVHD発症の有無は、ドナー側のNLRP1のSNPと関連していた。(2) GVHD発症の重症度は、ドナー側のNLRP3のSNPと関連していた。まず、欧米において移植関連疾患に関与していると報告されているNLRP1-3の一塩基多型(SNP)のなかで、日本人集団での頻度が0.1以上のもの1個ずつを解析の対象に選択した。これらのSNPの遺伝子型(Genotype)および対立遺伝子型(Allele)と1. GVHD発症の有無、2.GVHDの重症度、3.骨髄移植後の生存との関連をドナー・レシピエントの双方について統計解析によって調べた結果、以下の有意な関連を認めた。1. GVHD発症の有無は、ドナー側のNLRP1のSNPと関連していた。2. GVHD発症の重症度は、ドナー側のNLRP3のSNPと関連していた。3.骨髄移植後の生存については、現在解析中である。骨髄移植推進財団から提供されたドナー・レシピエント検体を用いて、前年度は(産休や育児休暇のため)実施が困難であったNLRP1-3に関するより詳細な解析を行った。その結果、慢性GVHD(移植片対宿主病)と関連するドナーNLRP1およびNLRP3のSNPを見いだした(P < 0.05)。この慢性GVHDに関連していたのはこれらNLRP1・3の機能上昇ではなく機能低下を伴うアリルであった。NLRP1・3インフラマソームの機能上昇はIL-1βの分泌増加につながるので、この結果は慢性GVHDはIL-1βの低下に関連していることを示唆している。急性GVHDにはIL-1βの増加が影響していることが動物モデルを中心とした知見により確立されているので、この結果は驚きである。NLRP2のSNPは慢性GVHDとは関連していなかった。急性GVHDの発症と関連しているSNPは競合リスクモデルなどを用いて詳細に解析したが見つからなかった。全生存率にはレシピエントのNLRP3およびドナーNLRP2のSNPと関連があった(P < 0.05)。解析対象の検体数が当初の予定の800例から2102例と大幅に増えたため、SNP解析および臨床データとの関連についての解析にかかる時間・経費も予定より増えたが、今年度(H27年度)の詳細な解析から有意義な結果が得られた。今年度の解析により新たに見いだした、慢性GVHDに関連するNLRP1およびNLRP3のSNPは、機能低下を伴うアリルであることが報告されている。今年度までの計画としては、GVHDに関連するSNPの機能解析までを想定していたので、研究全体としてほぼ予定通りに進んでいる。