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戦前・戦時・戦後復興期日本の石鹸・化粧品メーカーの流通戦略の経営史的研究

第一に,1940(昭和15)年頃から,石鹸配給統制機構の確立を目的に,商工省,石鹸製造業者,石鹸元売業者(卸売業者)によって検討が重ねられたが,元売・購買・製造を一体化した配給組織の設立を企図する商工省,既存の配給機構を尊重すべきと主張する卸業者および製造業者の間でさまざまな議論が展開され,収斂にいたるまで時間を要したことである。第二に,結局,その配給統制機能を担う中央組織として設立された日本石鹸配給統制株式会社は,製造業者の販売機能と元売業者の卸機能を吸収することとなり,その株式の7割を製造業者,3割を卸業者が引き受けることとなったことである。また,これに先立って設立されていたメーカーの販売会社(卸機能)も,この中央組織に統合された。第三に,日本石鹸配給統制株式会社は,その後,合併によって,石鹸を含む製品の配給統制機関に転じていったが,戦時中の石鹸配給統制のシステムは,1949年の「石鹸配給規則」施行直前まで継続されていたことである。第四に,「石鹸配給規則」による予約クーポンの集券をめぐって,小売店,卸店,製造業者の各レベルのなかでの競争,そして各レベル間で個別主体間の連携をともなう激しい競争が展開され,流通の垂直的な連携や統合の重要性が再認識されるにいったことである。本年度当初の「研究実施計画」に記したように,平成17年度においては,戦後の配給統制の撤廃期から各メーカーが再販売価格維持制度を導入する直前までの,各メーカーと卸店,卸店と小売店,各メーカーと小売店,のそれぞれの間の取引制度や取引構造がいかに変容したかを明らかにするために,各メーカーの所蔵史料,各地方の大学や公共図書館の所蔵する諸史料について調査を行い,さらに関係者への聞き取り調査を実施した。平成17年度において主な事例研究の対象としたのは,ライオン歯磨,ライオン商事,花王石鹸などであり,それらに関わる取引構造や取引制度について実証的な検討を進めた。これらの検討によって,明らかにされた主な成果は次の通りである。先ず,ライオン歯磨の事例では,都市部卸店の方が地方卸店よりも長期的な取引関係を有していること,都市部卸店の取引関係ではその「専門化」ゆえにライオン油脂よりも花王石鹸との取引を兼ねる代理店が多いが地方卸店の場合その取引品目の「総合性」のゆえにライオン油脂・花王石鹸双方との取引店が多いこと,大阪の代理店の取引関係が京阪神以外の地域にも広く及んでいたこと,などが明らかにされた。次に,ライオン商事とその前身会社の事例では,戦時から戦後の統制期にかけて,ライオン油脂傘下の卸店としての機能を喪失したが,「石鹸配給規則」撤廃後にはライオン油脂直属の卸店としての機能を回復していったこと,などが明らかにされた。第三に,再販導入前の花王石鹸では,返品問題や手形サイト短縮の問題が課題とされており,手形サイトの短縮が推進されるとともに,代理店傘下の特約店の見直しなどの流通機構の改革も進められ,現金取引制度の導入,予約販売制の導入および随時出荷制への移行など,諸種の改革が実施され,それらが後の再販や販社の準備となったことが明らかにされた。
腎グルカゴンレセプターの作用解明

1.全身性グルカゴン遺伝子ノックアウトマウスに高蛋白食負荷を行い、対照群と比較して24時間尿排泄量の有為な増加、血中尿素濃度の低下を伴わない尿中尿素排泄の有為な低下を認めた。また通常食摂取のノックアウト群に認められた尿中Na、Cl濃度の有為な上昇が高蛋白食摂取群では消失していた。高蛋白食負荷において、ノックアウト群と対照群とでGFRの差は認めなかった。2.腎特異的グルカゴンレセプターノックアウトマウスに対し、グルカゴンの急性負荷を行ったところ、対照群と比較しGFRの低下傾向を認めた。また高蛋白負荷において24時間尿排泄量の低下傾向を認め、さらに対照群において認められた通常食群との比較による有為なGFRの上昇が、ノックアウト群では消失していた。今回の研究を通し、グルカゴンの蛋白摂取時における腎血行動態への影響について確認でき、また腎特異的グルカゴンレセプターノックアウトマウスを作成し、腎グルカゴンレセプターの関与の可能性についても確認することができた。グルカゴン遺伝子ノックアウトマウスに関しては、グルカゴンのほかに腎血行動態に影響するGLP-1も消失しているため、それを考慮した上でさらに検討する必要があると思われた。今回の研究成果を踏まえ、今後グルカゴンモノクローナル抗体を1型・2型糖尿病腎症モデルマウス、及び非糖尿病腎症モデルマウスに投与し、グルカゴン抑制による蛋白負荷からの腎保護効果について検討を行う予定である。またさらに筋肉形成への影響、そしてグルカゴンの腎血行動態に対する影響の詳細なメカニズムについても検討する予定である。1.腎臓におけるグルカゴンレセプターの局在を確認するため、In-situ hybridizationを行ったところ、遠位尿細管に確認することができた。さらにmagnet beads法にてマウス糸球体と尿細管を分け、whole length PCRを行い、腎尿細管のみでのグルカゴンレセプターの発現を確認した。2.野生型マウスにグルカゴン単回投与実験を行い、血糖上昇に関係ないGFRの上昇及び血圧低下を認めた。同表現系の機序として、腎臓におけるCOX-2発現の上昇及びPGE2産生の増加を認めた。また高蛋白食摂取下においては、血中グルカゴン値とGFRの更なる上昇を認めた。3.Cre-LoxPsystemを用い、floxed-Gcgrマウスとksp-Creマウスを交配させ、腎臓特異的グルカゴンレセプターノックアウトマウスを作成した。グルカゴンレセプターノックアウトマウスにおいては、対照群と比較し、腎において約85%のグルカゴンレセプター発現低下を認めた。4.腎臓におけるグルカゴンレセプター作用の更なる検討のため、名古屋大学よりグルカゴン遺伝子ノックアウトマウス(Gcg-gfpマウス)を譲り受けた。以上初年度においては、腎臓におけるグルカゴンレセプターの局在確認とそれに基づいた腎臓特異的グルカゴンレセプターノックアウトマウスの作成、また予備実験としてグルカゴン単回投与によるGFRの上昇、血圧の低下と、要因として考えられる腎でのCOX-2発現の上昇、PGE2産生の増加を認めた。腎グルカゴンレセプターの局在を明確に示したことや、グルカゴンがGFRの上昇により糖尿病腎症の進展に大きく関わる可能性を示したこと、そしてその要因を見出したことは大きな意義を持つと思われる。1.当初の予定通り腎におけるグルカゴンレセプターの局在を同定し、その結果に基づき腎臓特異的グルカゴンレセプターノックアウトマウスを作成できた。2.野生型マウスを用いグルカゴン単回投与の実験系を確立し、グルカゴンの腎作用を確認後、現在その機序を解明中であり、これらの実験が予定以上に進んでいるため、多くの時間を要している。3.腎特異的グルカゴンレセプターノックアウトマウスの表現型の確認、グルカゴン遺伝子ノックアウトマウスの腎機能評価にもうしばらくの時間を要する。4.上記表現型の確認後、ノックアウトマウスと糖尿病モデルマウスとの交配を進める予定であるため、まだ遂行していない。1.昨年度得られたグルカゴン投与によるGFRの上昇、血圧の低下及びその機序として考えられるCOX-2-PGE2系の上昇に関し、高血糖の関与を否定するため、グルカゴンと同時にインスリンを投与し検討を行った。結果それぞれインスリン非投与時と同様の結果を得た。2.非選択的COX阻害薬であるインドメタシンを用いてGFRを測定したところ、グルカゴンによるGFRの上昇が抑制された。3.腎臓特異的グルカゴンレセプターノックアウトマウスについて、耐糖能やインスリン感受性、グルカゴン負荷試験を確認したところ、対照群との有意差は認めなかった。4.アミノ酸の代謝産物である尿素によるGFRへの影響を検討するため、直接尿素を投与しGFRを測定したところ、グルカゴン投与と同等の尿素排泄を認めながらGFRの上昇を認めなかった。よって尿素はグルカゴンによるGFRの上昇に関与していないことが明らかとなった。腎臓特異的グルカゴンレセプターノックアウトマウス及び全身性グルカゴン遺伝子ノックアウトマウスの繁殖に時間がかかり、両マウスによる腎血行動態の評価が不十分であるため。マウスに対しグルカゴンモノクローナル抗体によるグルカゴン抑制療法を予定しているが、製薬会社との手続きに時間を要しているため。

また通常食摂取のノックアウト群に認められた尿中Na、Cl濃度の有為な上昇が高蛋白食摂取群では消失していた。高蛋白食負荷において、ノックアウト群と対照群とでGFRの差は認めなかった。2.腎特異的グルカゴンレセプターノックアウトマウスに対し、グルカゴンの急性負荷を行ったところ、対照群と比較しGFRの低下傾向を認めた。また高蛋白負荷において24時間尿排泄量の低下傾向を認め、さらに対照群において認められた通常食群との比較による有為なGFRの上昇が、ノックアウト群では消失していた。今回の研究を通し、グルカゴンの蛋白摂取時における腎血行動態への影響について確認でき、また腎特異的グルカゴンレセプターノックアウトマウスを作成し、腎グルカゴンレセプターの関与の可能性についても確認することができた。グルカゴン遺伝子ノックアウトマウスに関しては、グルカゴンのほかに腎血行動態に影響するGLP-1も消失しているため、それを考慮した上でさらに検討する必要があると思われた。今回の研究成果を踏まえ、今後グルカゴンモノクローナル抗体を1型・2型糖尿病腎症モデルマウス、及び非糖尿病腎症モデルマウスに投与し、グルカゴン抑制による蛋白負荷からの腎保護効果について検討を行う予定である。またさらに筋肉形成への影響、そしてグルカゴンの腎血行動態に対する影響の詳細なメカニズムについても検討する予定である。1.野生型マウスへのグルカゴン単回投与実験にてこれまで得られたデータを基に、グルカゴンの腎作用メカニズムの詳細な解明と糖尿病腎症進展への長期的影響の検討、また蛋白摂取による腎負荷におけるグルカゴン作用の影響等を検討していく予定である。2.腎特異的グルカゴンレセプターノックアウトマウスの表現型の詳細な確認とグルカゴン遺伝子ノックアウトマウスの腎機能評価を行い、野生型マウスの実験で得られた結果と照らし合わせ、腎グルカゴンレセプターの働きついて検討を行う。3.グルカゴンの糖尿病腎症進展への影響を評価する際には、糖尿病モデルマウスや糖尿病腎症モデルマウス、またはこれらのマウスとノックアウトマウスを交配させて検討を行う。1.腎臓特異的グルカゴンレセプターノックアウトマウス及び全身性グルカゴン遺伝子ノックアウトマウスによる腎血行動態の検討をまとめ、本研究における仮説の正当性の強化及びグルカゴンによるGFR上昇のメカニズム解明、腎のグルカゴンレセプターの役割解明に結び付ける。2.これまでグルカゴンによるGFR上昇のメカニズムの一端として明らかになっているCOX-2-PGE2系について、さらなる検討を行う。3.グルカゴンモノクローナル抗体を用いて糖尿病性腎症モデルマウス、非糖尿病性腎症モデルマウスに長期投与を行い、protein-energy wastingをきたさないアミノ酸代謝抑制作用による腎保護効果について検討を行う。
難治性不整脈の臨床病理学的研究-モデルマウスおよび剖検心を用いた検討-

近年わが国をはじめ先進国では高齢化社会の到来とともに、心血管系の疾患による死亡が急増している。脳血管障害・心血管障害を含めると全死亡の約1/3は心血管系関連死亡である。なかでも、心疾患に伴う突然死の救命は、医学的にも社会的にも重要課題の一つである。心突然死の原因は、HolterECGの解析より(1)急性心筋梗塞の伴う心室頻拍/心室細動(2)洞機能不全症候群による徐脈(3)心筋症に伴う頻脈性不整脈などによる血行動態の破綻等が機序として挙げられている。急性心筋梗塞は、冠動脈のプラークの破綻に伴う血栓形成が誘引となっていることが知られている。そのトリガーには血圧上昇・交感神経の緊張・冠血管のスパスム・喫煙などが知られているが、疫学的調査より感染がプラーク破綻と関連していることが明らかになってきた。我々は、LPS受容体の一つであるCD14の遺伝子の多型がマクロファージのLPSに対する感受性を変え、急性心筋梗塞を発症に関与することを突き止めた。Klotho遺伝子はその変異マウス(klothoマウス)がヒト型老化を示すことにより、老化類似モデルとして研究されている。我々は、Klothoマウスが20時間の拘束ストレスに暴露されると突然死をすることを見出した。電気生理学的検査により、突然死は洞機能不全症候群による徐脈で生ずることが明らかにした。その機序をさらに解明するために、Klotho遺伝子をβ-Gal遺伝子に置換したマウス(kl-/-マウス)を作成した。驚いたことに、Klotho遺伝子は従来発現部位として知られていた腎臓以外に発生段階では右心房にも発現しており、生後は洞結節に限局して発現していることが判明した。組織学的には、心房筋には明らかな変化を認めなかったが、イソプロテノールに対する陽性変時作用は著しく減少しており、アセチルコリンに対する陰性変時作用は著しく増加していることを見出した(Circulation 2004;109:1776-82)。本研究より、klotho遺伝子の発現低下は高齢者における徐脈の発生機序重要な役割を果たしていることが明らかとなった。現在までに、klotho遺伝子の多型が存在することが知られているが、その多型が心疾患の発症と関係しているか検討中である。我々は、心筋や血管内皮細胞のアポトーシスにともない細胞骨格蛋白の分布が変化することを観察してきた(Kondo T. etal.JCell Biol.1997)。近年、心不全や不整脈の機序に、心筋のアポトーシスの関与が報告されるにいたっている。特定の臓器の細胞のアポトーシスは個体の老化と関与していると考えられる。さらに、高齢化社会に伴い、洞不全症候群・心房細動が増加しており、その治療にペースメーカーやカテーテルアブレーションが駆使されるにいたっている。我々は従来より種々の不整脈患者において、体表面心電図や心腔内心電図を用いて詳細なマッピングを行い、不整脈の起源・機序・回路の同定方を報告している(Yoshida Y., Kondo T. et al. Circulation.2000,Inden Y., Kondo T. et al. J Cardiovasc Electrophysiol.2001)。このたび、我々は老化モデルマウスのひとつにおいて心房性不整脈を生ずることを見出した。マウスにおける心房性不整脈の報告は数少なく、特筆に価する。このモデルマウスでは、老化関連蛋白が、洞結節に限局して発現をしており、さらに電気生理学的検査を行ったところ洞停止をみとめ、ヒトにおける洞不全症候群の機序を考える上で非常に興味深いと考えられた。さらにこのマウスを種々のストレス下の環境に置くと、突然死をすることを見出している(投稿準備中)。現在、このモデルマウスにおける突然死の原因を検索中である。突然死は、虚血性心疾患患者や心不全患者における死因として注目されている課題である。このモデルマウスにおける死因の検討は、臨床上の突然死の解明の一助となると考えられる。今後は、マウスにおける検討とともに、ヒトににおいて老化関連蛋白と不整脈の関連を検討していく予定である。近年わが国では高齢化社会の到来とともに、心血管系の疾患による死亡は、心疾患・脳血管障害を含めると全死亡の約1/3を占めるに至っている。なかでも、心疾患に伴う突然死の救命は、現代医療が取り組むべき最優先課題のうちの一つである。これらの心突然死は、急性心筋梗塞に伴う心室頻拍/心室細動・洞気脳不全症候群による徐脈・心筋症患者における頻脈性不整脈などによる血行動態の破綻がその原因として知られている。急性心筋梗塞は、冠動脈の破綻に伴う血栓の形成がその機序として考えられているが、そのトリガーがいかなるものかは依然不明である。その機序の一つとしてLPS受容体の一つであるCD14の遺伝子多型が関与していることを証明し、感染にともなうLPS受容体の活性化が突然に心筋虚血の原因の一つであることを証明した。また、不整脈に関しては、その原因には心筋細胞や血管内皮細胞のアポトーシスが知られているが、これまでにその際に細胞骨格が変化することを証明している。さらに、カテーテルアブレーションなどの最新の方法を駆使して、上記の不整脈の起源・機序・回路の同定も報告してきた。

本研究では、老化モデル類似マウスであるklothoマウスがストレスに曝露されると、ヒト高齢者と同様の徐脈性不整脈により突然死を起こすことを見出した。電気性理学的検査にて、この突然死の機序は洞機能不全であることを見出した。従来、マウス心臓において心房性不整脈が報告されているものは、チャネル遺伝子やギャップジャンクションを破壊したマウスのみで知られており、klothoのような液性因子が関与する不整脈の報告は皆無であった。そこで、更に詳細に検討するためにklotho遺伝子をβ-Gal遺伝子に置き換えたマウスを作成した。驚いたことに、β-Gal遺伝子は、従来klothoの発現部位をして知られていた腎臓以外に発生初期には右心房領域に発現しており、生後は洞結節に限局して発現していることが判明した。今度は、詳細にklotho遺伝子と心房性不整脈の関連を検討していく予定である。近年わが国をはじめ先進国では高齢化社会の到来とともに、心血管系の疾患による死亡が急増している。脳血管障害・心血管障害を含めると全死亡の約1/3は心血管系関連死亡である。なかでも、心疾患に伴う突然死の救命は、医学的にも社会的にも重要課題の一つである。心突然死の原因は、HolterECGの解析より(1)急性心筋梗塞の伴う心室頻拍/心室細動(2)洞機能不全症候群による徐脈(3)心筋症に伴う頻脈性不整脈などによる血行動態の破綻等が機序として挙げられている。急性心筋梗塞は、冠動脈のプラークの破綻に伴う血栓形成が誘引となっていることが知られている。そのトリガーには血圧上昇・交感神経の緊張・冠血管のスパスム・喫煙などが知られているが、疫学的調査より感染がプラーク破綻と関連していることが明らかになってきた。我々は、LPS受容体の一つであるCD14の遺伝子の多型がマクロファージのLPSに対する感受性を変え、急性心筋梗塞を発症に関与することを突き止めた。Klotho遺伝子はその変異マウス(klothoマウス)がヒト型老化を示すことにより、老化類似モデルとして研究されている。我々は、Klothoマウスが20時間の拘束ストレスに暴露されると突然死をすることを見出した。電気生理学的検査により、突然死は洞機能不全症候群による徐脈で生ずることが明らかにした。その機序をさらに解明するために、Klotho遺伝子をβ-Gal遺伝子に置換したマウス(kl-/-マウス)を作成した。驚いたことに、Klotho遺伝子は従来発現部位として知られていた腎臓以外に発生段階では右心房にも発現しており、生後は洞結節に限局して発現していることが判明した。組織学的には、心房筋には明らかな変化を認めなかったが、イソプロテノールに対する陽性変時作用は著しく減少しており、アセチルコリンに対する陰性変時作用は著しく増加していることを見出した(Circulation 2004;109:1776-82)。本研究より、klotho遺伝子の発現低下は高齢者における徐脈の発生機序重要な役割を果たしていることが明らかとなった。現在までに、klotho遺伝子の多型が存在することが知られているが、その多型が心疾患の発症と関係しているか検討中である。
ヒストン修飾酵素の細胞内エネルギー感知機構の解明

脂肪細胞分化過程における代謝を、細胞外フラックスアナライザーを用いて解析したところ、分化にともない、解糖系、酸素消費量が大きく亢進した。脂肪細胞分化過程におけるメタボローム解析から、解糖系ならびにTCAサイクル代謝物に顕著な変化が見られた。なかでもαKGは3倍上昇し、JmjCヒストン脱メチル化酵素(JHDM)を制御している可能性が考えられた。αKGはTCAサイクルでイソクエン酸からイソクエン酸デヒドロゲナーゼ(IDH)によって合成される。マイクロアレイ解析から、IDH3α,β、γ遺伝子の発現が分化とともに急上昇した。さらにIDH3γをノックダウンしたところ、PPARγならびに脂肪細胞分化マーカー(Fabp4, AdipQ)の発現にはほとんど影響をおよぼさず、解糖系遺伝子(Slc2a4, Hk2)の発現が低下し、これに伴い脂肪の蓄積が激減することを見出した。以上より、脂肪細胞において内在性IDH3によるαKGの産生が、JHDMの活性化を制御して、ヒストン修飾・クロマチン構造変化を誘導する可能性を見いだした。このことは、IDH3は脂肪細胞での脂肪のためやすさ、脂肪の燃えやすさを決定している可能性をも示唆する。25年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では栄養環境・エネルギー状態の変化に伴いHMT, HDMTの補酵素であり、ATP依存性の代謝産物SAM、#61537;KG、FADのレベルがどう変化するか、HDMT、HMTはこれら補酵素の細胞内レベルのダイナミックレンジと連動し代謝のセンサーとなりうるのか、を解明することを目的とし、白色脂肪細胞・褐色脂肪細胞分化モデルにおいて解析する。具体的にはヒストン修飾酵素の活性、エピゲノムの変化、標的代謝関連遺伝子の発現変化、エネルギー代謝経路の変化、ヒストン修飾酵素活性に必須な補酵素(代謝物)レベルの変動の関連性を解明する。これらより、細胞が栄養環境に適応するメカニズムを明らかにする。樹立した褐色脂肪細胞でのマイクロアレイ解析から、JMJD1Aの標的遺伝子候補としてミトコンドリア代謝遺伝子UCP1, Cpt1b, Cox7a1が明らかとなった。絶食・寒冷刺激時における翻訳後修飾解析を行ったところ、JMJD1AはプロテインキナーゼAによりリン酸化されることが明らかとなり、栄養環境に応答したエピゲノム制御にはJMJD1Aのリン酸化が関与していることが示された。3T3-L1脂肪細胞分化過程において細胞外フラックスアナライザーを用いた代謝解析を行ったところ、分化に伴う解糖系ならびにミトコンドリア代謝の亢進が認められた。更にメタボローム解析をおこなったところ、脂肪細胞分化に伴う解糖系ならびにTCAサイクル代謝物の増加が見られた。脂肪細胞分化を抑制するH3K9メチル化酵素の標的遺伝子を同定するために、SETDB1のクロマチン免疫沈降-sequence (ChIP-seq)を行った。SETDB1は転写因子C/EBPa遺伝子に結合し、H3K9トリメチル修飾を入れることにより転写を抑制し、下流のPPARgを介した代謝関連遺伝子の発現を抑制していることを突き止めた。H3K9メチル化酵素SETDB1ならびに脱メチル化酵素JMJD1Aの機能解析により、これらヒストン修飾酵素がエピゲノムを変化させ代謝を制御することを解明した。よって本研究の第一目的である「エピゲノムによる代謝制御機構の解明」は達成された。細胞外フラックスアナライザーによる代謝プロファイルならびにメタボローム解析により、前駆脂肪細胞が脂肪細胞に分化する際には代謝スイッチが起こり、解糖系ならびにTCAサイクルの代謝物が顕著に増加することが見出した。ヒストン脱メチル化酵素の補酵素であるアルファケトグルタル酸が分化前後で顕著に増加していることから、細胞内代謝物がエピゲノムを制御する可能性が示唆された。よって本研究の第二目的である「代謝物によるエピゲノム制御の解明」に向けておおむね順調に進展している。脂肪細胞分化におけるH3K9メチル化酵素SETDB1ならびにH3K9脱メチル化酵素JMJD1Aの活性制御機構を明らかにするために、翻訳後修飾解析、複合体解析、活性測定を行う。またH3K9脱

メチル化酵素JMJD1Aによるエネルギー感知機構の詳細を理解するために、翻訳後修飾、複合体解析、ゲノムワイド局在解析、ヒストン修飾解析を行う。細胞外環境の変化(低グルコース刺激)における細胞内代謝物とヒストン修飾の変化を、メタボローム解析とクロマチン免疫沈降により解析する。脂肪細胞分化過程における細胞内代謝物変化が、ヒストン修飾酵素活性に与える影響を解析する。25年度が最終年度であるため、記入しない。
大脳皮質下病変に関連する認知障害及び機能障害とアミノ酸トランスポーターの関与

実験的に作成した低環流状態の脳では炎症マーカーが亢進し、アストロサイトやミクログリアの活性化を引き起こし、結果として虚血病変が形成されることが確認できた。行動変化としては、慢性脳低還流から皮質下病変を発症した若年マウスおよび60週齢を超えた高齢マウスでは、探索嗜好性や記憶力の低下が認められ、これは大脳皮質下病変を保有するヒトの臨床症状と同様であった。また性別によって行動変化に相違がみられた。【目的】大脳皮質下病変は慢性動脈硬化性疾患の一病型であるという考え方のもと、マウス慢性脳低還流モデルを用いて、病変形成過程を検討することを目的としている。特に中性アミノ酸の輸送体であるL-amino acid transporter(LAT)の関与の有無について研究するとともに、性差や加齢の影響も併せて検討する。【実験】1マウス慢性脳低還流モデルの作成と評価:既報(Stroke 2004; 35: 2598-2603)に従って、911週齢の雄性C57BL6Jマウスの両側頸動脈周囲に狭小コイルを巻き付けることで脳血流量を抑制し、慢性脳低還流状態を誘導した。術後脳を摘出し、パラフィン切片作製後に脳標本を鏡検すると、7,14,28日後と経時的に脳梁などにおいてGlial Fibrillary Acidic Protein(GFAP)免疫染色強陽性を呈した。またLuxol Fast Blue染色を行うと、28日後には脱髄によって示される大脳白質病変が脳梁、内包、線条体などで認められた。傷害脳の大脳白質におけるLATの発現については現在検討中である。2学習記憶試験:コイル装着後28日目から32日目にかけて学習記憶試験として新奇物体認識試験を行ったところ、test phaseにおいて非傷害コントロールマウス(n=10)に比べてコイル装着マウス(n=11)は新奇物体に興味を示さず(p=0.06)、オブジェクトへの総探索回数も少なかった(p=0.03)。すなわち、狭小コイル装着による慢性脳低還流状態で、マウスの探索嗜好性や記憶力が低下していた。【結論】新奇物体認識試験は海馬非依存性、運動能力非依存性であり、さらに事前の食事制限も不要の試験である。今回の検討は若年マウスで行ったが、老齢マウスにも使用可能と考えられる。また本モデルは脳の病変形成と学習記憶試験評価に有用であった。【目的】大脳皮質下病変は慢性的な動脈硬化性疾患の一病型であるという考え方のもと、マウス慢性脳低還流モデルを用いて、病変形成過程を検討することを目的としている。また人で実際に見られる病変形成や発症時の性差や加齢の影響も併せて検討する。【実験】1マウス慢性脳低還流モデルの作成と評価:既報(Stroke 2004; 35: 2598-2603)に従いC57BL6Jマウスの両側頸動脈周囲に狭小コイルを巻き付けることで脳血流量を低下させ、慢性脳低還流状態を誘導した。術後脳を摘出し、パラフィン切片作製後に脳標本を鏡検したところ、7,14,28日後と経時的に脳梁などにおいてGlial Fibrillary Acidic Protein(GFAP)免疫染色強陽性を呈し、アストロサイトの活性化が認められた。また、活性化ミクログリアを示すionized-calcium binding adaptor molecule (iba)1も経時的に強陽性を認めた。アミノ酸トランスポーターの発現および傷害の状態については検討中である。2学習記憶試験:昨年度は新奇物体認識試験をオスに対して行ったが、今年度は同週齢のメスに対して実施した。メスの非傷害コントロールマウス(n=9)に比べて頸動脈コイル装着マウス(n=9)ではtest phase時の総探索回数は有意に少なかった(p<0.05)。しかしtest phase時の新規オブジェクトへの探索回数には両群で有意差が認められなかった(p=0.93)。すなわちメスはコイル装着により探索嗜好性は減少するものの、記憶力の低下は認められなかった。さらに本年度はマウスの行動評価ツールとしてY maze testを導入し、現在検討中である。【結論】頸動脈コイル装着による慢性脳低還流状態にすると、雄性マウスでは探索嗜好性および記憶力低下が見られたが、雌性マウスでは探索嗜好性の低下のみ認められ、記憶力には変化が見られなかった。次年度は脳の病理標本から病態進展に対する性差比較を行う予定である。【目的】慢性脳低還流を誘導して実験的に大脳白質病変を形成させ、病変形成に対して加齢、性差などのリスクがどのように影響するかを調べるとともに、表出する行動変化について検討を行う。【実験】12週齢のC57BL/6Jマウス(雌雄)の両側頸動脈に狭小コイルを巻き付け、脳低還流状態を誘導した。術前および術後4週間毎にY maze testを施行し、自発行動量の評価およびワーキングメモリの評価を行った。さらに手術より1年経過した時点で学習記憶試験として新奇物体認識試験を施行した。【結果および結論】Y mazetestにおいて、コイル非装着マウスでは試験実施回数が進むに従って自発行動量が減少し、迷路に対する興味や意欲が薄れてきたのに対し、コイル装着マウスでは自発行動量の低下は認められなかった。また進入成功回数により表わされるワーキングメモリには統計学的な有意差は認められなかった。

すなわち慢性脳低還流状態にある高齢マウスでは、長期にわたる継続的な刺激に対して順応しづらいことがわかった。術後1年時点(65週齢)における新奇物体認識試験では、sample phase時の総探索回数がコイル非装着マウスと比べてコイル装着マウスで有意に低かった(65回vs 43回,p=0.02)。しかしtest phaseにおいて新規オブジェクトを認識する割合には両群間で有意差は認められなかった。すなわち、慢性脳低還流状態にある高齢マウスでは、意欲は低下するものの、短時記憶は保たれていることがわかった。雌性C57BL/6マウスでも同様の検討を行ったが、コイル装着術後の飼育中に白内障を発症するマウスが多かった(6匹中2匹で発症)Y mazetestおよび新奇物体認識試験を施行したが、視覚的な問題もあり結果の解釈が困難であった。以上の行動変化はヒトにおける大脳白質病変を持つ場合の臨床的症状と合致すると考えられた。実験的に作成した低環流状態の脳では炎症マーカーが亢進し、アストロサイトやミクログリアの活性化を引き起こし、結果として虚血病変が形成されることが確認できた。行動変化としては、慢性脳低還流から皮質下病変を発症した若年マウスおよび60週齢を超えた高齢マウスでは、探索嗜好性や記憶力の低下が認められ、これは大脳皮質下病変を保有するヒトの臨床症状と同様であった。また性別によって行動変化に相違がみられた。最も時間がかかると予想される動物の学習記憶試験について順調に遂行することができたため。老年医学当初計画していた実験内容のうち、動物実験については複数の実験計を施行することができた。今後は動物の学習記憶試験の解釈を進めるほか、病変形成時の炎症マーカーの動態についてさらに詳細に検討する。本年度は目的に対する実験系の実用性の検討を中心に行い、動物実験モデルおよび学習記憶試験ともに有効であることが確認できた。予定していた検討方法の全てが遂行できたわけではないが、研究開始一年目に二年目以降予定していた実験の予備検討も開始できたことから、見通しを持って研究が進められていると考えられる。おおむね予定通りの使用額であったが、少額の余剰金について使い切ることができなかった。このため次年度予算と合わせて使用予定である。今後は傷害の形成や進展に関わる炎症物質やトランスポーターの発現量変化について評価する予定である。またマウスの学習記憶試験を複数種類施行し、学習記憶について多面的に評価する必要がある。次年度予算と合わせて、免疫染色用試薬を新調するのに充てる予定である。
局在・伝搬型表面プラズモン励起ラマン計測による反応性ナノ粒子研磨プロセスの可視化

次世代半導体デバイスなどの高度化のための基盤技術である化学機械研磨(CMP)の高効率・高精度化に不可欠な,反応性ナノ粒子によるナノ研磨プロセスの解明を目的として,本研究独自の局在・伝搬型SERS計測基本光学系を設計・試作し,基礎的なSERS計測によって実験装置の基本性能を検証した.さらにそれを用いて,反応性ナノ粒子としての水酸化フラーレンを分散させた溶液中にて,厚さ25nmの銅薄膜を成膜したガラス基板を試料として,水酸化フラーレン分子による局在型および伝搬型表面プラズモン増強ラマンスペクトルの計測に成功し,水酸化フラーレン-銅錯体の形成によって材料除去が進行する化学的相互作用を明らかにした.本研究は,10の14乗倍以上に増強されたプラズモン励起ラマン散乱光計測に基づいた,CMP加工プロセスにおける反応性ナノ粒子の化学的作用の解明を目的とするものである.本研究課題では,提案する反応性ナノ粒子研磨プロセス計測原理を実証するため,水酸化フラーレンおよびポリグリセロール修飾ナノダイヤモンド(ND-PG)を利用した新たな銅配線層表面のCu-CMPに適用することにより,研磨プロセス可視化の可能性について検討した.まず,近接場照明により表面から70 nmの局所領域の分析に特化したラマン分光装置を構築し,局在・伝搬型SERS計測基本光学系の設計・試作を行った.さらにそれを用いてSERS計測を遂行し,実験装置の基本性能を検証した.本提案手法の実現性を示すため,ガラス基板表面に成膜した厚さ25nmの銅薄膜を加工試料に見立てて水酸化フラーレンを分散させた溶液中に浸漬した.その結果,銅表面との反応を開始する水酸化フラーレン分子による伝搬型表面増強ラマンスペクトルの計測および解析に成功した.Cu-O結合のスペクトルが検出されたことから,銅表面において水酸化フラーレンと銅との化学的吸着が起こり,2個のOH基が1つの銅元素に配位した錯体を形成するものと推察される.次に,水酸化フラーレンによる化学的な研磨が進行し,銅表面の微細構造が変化する過程において,局在型表面プラズモンによって励起された,表面近傍の水酸化フラーレンによる表面増強ラマンスペクトルを選択的かつ高感度に計測することに成功した.また,スペクトルの時間変化が水酸化フラーレンと銅との反応過程における表面微細構造変化を反映していることを示した.さらに,多数の水酸基で化学修飾されたND-PGの研磨特性を予測し,100nmサイズのND-PGによるCu-CMPにおいて,仕上げ面表面粗さ0.9nmRMSという高い研磨特性を示した.次世代半導体デバイスなどの高度化のための基盤技術である化学機械研磨(CMP)の高効率・高精度化に不可欠な,反応性ナノ粒子によるナノ研磨プロセスの解明を目的として,本研究独自の局在・伝搬型SERS計測基本光学系を設計・試作し,基礎的なSERS計測によって実験装置の基本性能を検証した.さらにそれを用いて,反応性ナノ粒子としての水酸化フラーレンを分散させた溶液中にて,厚さ25nmの銅薄膜を成膜したガラス基板を試料として,水酸化フラーレン分子による局在型および伝搬型表面プラズモン増強ラマンスペクトルの計測に成功し,水酸化フラーレン-銅錯体の形成によって材料除去が進行する化学的相互作用を明らかにした.反応性ナノ粒子と加工表面との化学的相互作用によって材料除去が進行すると,表面微細構造クラスター状に変化する.このときエバネッセント光と結合していた伝搬型表面プラズモンは,局在型表面プラズモンへ移行すると考えられる.従って,反応性ナノ粒子のラマン散乱光,伝搬型表面プラズモンおよび局在型表面プラズモンのどちらによって励起されたものであるかを識別すれば,加工過程における反応性ナノ粒子の化学的作用と表面状態の両方が同時にわかる.そこで本研究は,10の14乗倍以上に増強されたプラズモン励起ラマン散乱光計測に基づいた,CMP加工プロセスにおける反応性ナノ粒子の化学的作用の解明を目的とするものである.本研究課題では,提案する反応性ナノ粒子研磨プロセス計測原理を実証するため,水酸化フラーレンを利用した新たな銅配線層表面のCu-CMPに適用することにより,研磨プロセス可視化の可能性について検討する.本年度は,局在・伝搬型SERS計測基本光学系の設計・試作を行い,さらにそれを用いてSERS計測を遂行し,実験装置の基本性能を検証した.まず,銅表面近傍のミクロな現象を観察するために,近接場照明により表面から70 nmの局所領域の分析に特化したラマン分光装置を構築した.検証実験として,厚さ10 nm以下の銅フタロシアニン薄膜を検出試料として用い,通常のラマン分光法と比較して20倍のラマン散乱光信号の増強が確認された.その結果,本装置は金属薄膜による電場の増強効果により,界面の微小な生成物を検出することが可能であることが示された.さらに,本提案手法の実現性を検討するため,ガラス基板表面に成膜した厚さ数10 nmの銅薄膜を加工試料に見立てて水酸化フラーレンを分散させた溶液中に浸漬した.その結果,銅表面との反応を開始する水酸化フラーレン分子による表面増強ラマンスペクトルの計測に成功した.フラーレンは520430nm(2.42.9eV)の領域に比較的強い吸収バンドを有していることから,波長532nmの励起光を用いた共鳴ラマン効果を利用し,さらに,伝搬型SERS計測による,銅表面における水酸化フラーレン分子との反応による表面増強ラマンスペクトル計測によって,Cu-O結合を示す400 cm-1のスペクトルが得られた.

スペクトル分析の結果,水酸化フラ-レンは銅表面においてCu-O-Cの結合で吸着していることを明らかにするとともに,水酸化フラーレンの銅に対する錯体形成を伴う反応プロセスが,BTA存在下においても起こりうることから,水酸化フラーレンは防腐膜を中和する親水性膜を形成することによって酸化剤・キレート剤の加工起点となる反応モデルを提案した.基本光学系を利用した伝搬型SERS計測による基礎実験から得られた,このような化学的研磨プロセスの知見は,当初計画では予想されなかった大きな展開である.しかし一方で,局在型SERS計測の有効性が未だ明らかになっていないため,平成24年度において設定した,局在・伝搬型SERS計測基本光学系の設計・試作とその検証に関する研究目標に対して,おおむね順調な進展と自己評価した.本提案手法の有効性を詳細な実験データによって明らかにすることを目的とした平成24年度の当初の研究計画を完全に達成するため,エバネッセント光とのカップリングによる伝搬型表面プラズモン励起,および局在型表面プラズモン励起による,それぞれ独立したSERS計測を遂行し,実験装置の基本性能を検証することを目標とした基礎実験を継続的に遂行する.特に,一様な銀および金薄膜をクラスター状態に熱蒸着した石英ガラス基板を参照試料として用い,局在型SERS計測の検証を平成25年度前半の短期間で完遂する.局在・伝搬型SERS計測の基礎実験に基づき,本手法の一般性を示すことによって,本研究課題の基本目標を達成する.今後の推進方策として,特に研究計画の大きな変更は必要としないため,ほぼ当初の実験方針に沿った研究を遂行し,新たな成果をまとめた研究発表等を行う.なお,今後の課題として,実験結果の再現性をより確実に示すことが必要であるため,基礎データの取得と実験装置の安定性を実現するための装置改良を同時に進める.研究を進めていく上で必要に応じて研究費を執行したため当初の見込額と執行額は異なったが,研究計画に変更はなく,前年度の研究費も含め,当初予定通りの計画を進めていく.
SV40tsA58T抗原を発現する遺伝子導入マウスを利用した動物実験技術の開発

本研究では、SV40tsA58T抗原を発現する遺伝子導入マウスから不死化細胞を得る実験技術を利用して、血管・リンパ管新生を細胞培養系において解析するための安定した技術を確立すること、また、遺伝子改変マウスの解析における効果的な細胞培養実験系を構築することを目指した。研究期間内において、マウスの血管・リンパ管内皮細胞の分離・培養技術の開発、および当該方法を利用した遺伝子改変マウスの解析に関する成果を上げた。SV40 tsA58T抗原をコンディショナルに発現する遺伝子導入マウス系統、T26(T26 Tg)は、Creリコンビナーゼによる遺伝子組換えによってtsA58T抗原の発現を誘導することができるマウスである。本研究課題では、このマウスに由来する、tsA58T抗原を発現する内皮細胞を用いて、胎生期の脈管形成、血管新生およびリンパ管新生をin vitroで再構築し、その分化制御機構を理解することを試みることを目的としている。平成19年度では、T26 Tgと内皮細胞での組換えを誘導するCre Tgの交配によって得たT26/Tie2Cre Tgの胎仔を用いて、胎生期内皮細胞の培養方法の検討と、その内皮細胞としての特性の検討を行った。免疫組織化学的検討の結果、胎生期(E9.5およびE15.5)の内皮細胞はtsA58T抗原を発現しており、33°Cでの培養で選択的に増殖した。しかし、in vitroにおける細胞の性質を検討したところ、内皮マーカーを発現する細胞も含まれるものの、tsA58T抗原陽性だが内皮マーカー陰性の細胞も多く存在することが明らかになった。対照的に、成体から得たtsA58T抗原陽性血管・リンパ管内皮細胞は、内皮としての特性をよく保持していた。これらの結果から、tsA58T抗原陽性の内皮細胞はin vitroで培養可能であるものの、胎生期内皮の培養過程では、内皮・間充織転換による形質の変化、あるいは増殖が盛んなtsA58T抗原陽性の非内皮細胞の混入が起こりやすいことが示唆された。研究目的を達成するためには、tsA58T抗原陽性細胞の温度依存性増殖を利用した培養法に加え、内皮マーカー陽性細胞を早期に分離して培養する方法の確立が望まれた。本研究の目的は、SV40tsA58T抗原をコンディショナルに発現する遺伝子導入マウスから条件的不死化内皮細胞を得る実験技術を確立し、胎生期の脈管形成、血管・リンパ管新生をin vitroで再構築し、その分化制御機構の理解を試みること、また、遺伝子改変マウスの解析におけるin vitroでの効果的な実験系を構築することにあった。平成20年度の研究実施計画として、胎生期内皮細胞の分離・培養、および分化マーカーの発現の検討を計画していたが、胎生期(E9.5-E11.5)の内皮細胞の培養では、内皮・間充織転換に類似した内皮細胞自体の性質の変化が顕著であることが明らかとなった。その性質の変化にTGF-betaシグナルが関与することを示唆する結果を得たものの、当該シグナル伝達の阻害によって培養結果が大きく改善されるわけではなく、成体の内皮細胞のような安定した長期培養を成立させるには至らなかった。しかし、SV40tsA58T抗原を発現する遺伝子導入マウスを利用した、成体の血管・リンパ管内皮細胞の分離・培養技術の開発については論文で公表し(Yamaguchi et al., 2008)、得られたマウス内皮細胞を解析に利用した成果も公表した(Ichise et al., 2009)。したがって、in vitroでの効果的な実験技術の開発という点では、意義の高い成果をあげることができた。また、論文の公表により、遺伝子改変マウスの解析においてSV40tsA58T抗原を発現する遺伝子導入マウスを利用した細胞培養実験を計画する、国内外の複数の研究グループからの共同研究の依頼を受けることとなり、本研究成果の波及効果も充分得られる結果となった。
プロテオバクテリアにおけるメチル化DNA関連遺伝子群の網羅的研究

大腸菌染色体分配の分子機構について研究を行い下記のことを明らかにした。1.染色体DNAの複製の開始の調節機構に関与する半メチル化GATCに特異的に結合するSeqAタンパク質は複製開始タンパク質DnaAが半メチル化oriC領域のDnaAボックスに結合することを競合的に強く阻害することにより、複製の再開始を抑制する。2.SeqAのクラスターは複製フォークの半メチル化DNAに結合したSeqA分子の集合体であることを証明した。3.DNAポリメラーゼIIIホロ酵素のβサブユニット(DnaN、DNAスライデングクランプ)の細胞内分布の解析は、oriCから開始した2方向の複製のための2組の複製装置が複製途中で2つに分かれ1/4、3/4の位置に移動するという先に我々が提出したTranslocating Replication Factoriesモデルを支持するものである。4.染色体の分配に必須なMukFEBタンパク複合体とMukBタンパクの分子形態を電顕により解析した(生物分子工学研究所の森川耿博士らとの共同研究)。5.複製の同調系においてoriCおよび他の染色体領域をFISH法で解析し、複製後に姉妹染色体が接着(cohesion)している現象をバクテリアで初めて発見した。この接着した姉妹染色体の解離はSeqA焦点の2分裂の後、複製の後期に起った。mukB欠失株では姉妹染色体の接着は観察されなかった。6.新生細胞ではMukB-GFPの焦点が2ヶでSeqAの焦点は1ヶであった。細胞分裂前の細胞は4ヶのMukB-GFP焦点と2ヶのSeqA焦点を持っていた。このMukB-GFP焦点の機能については今後の課題である。7.理化学研究所の胡桃坂仁志博士らとの共同研究でSeqAの結晶化構浩解析に成功した。
家禽の放卵に関与する下垂体後葉ホルモン放出におけるプロスグランジンの役割

家禽の放卵に関与する下垂体後葉ホルモン放出におけるプロスタグランジンの役割を明らかにするために本研究では(1)家禽の脳下垂体後葉にPGの受容体が存在すること、PGの受容体の結合性が放卵現象と共に変化すること、(2)PGが放卵を誘起するための下垂体後葉ホルモンの放出を促すことについて明らかにしようとした。(1)鶏の脳下垂体後葉の細胞膜画分を遠心分離法で調整し、この画分に[^3H]PGF_<2a>を加えるラジオリガンドアッセイ法により検討した。その結果、下垂体後葉の細胞膜画分におけるPGF_<2a>の結合物質は結合特異性、結合飽和性および高い結合親和性と低い結合容量を有し、PGF_<2a>に対する受容体であることを明らかにした。下垂体後葉におけるPGF_<2a>・レセプターの結合量は、産卵鶏においては放卵直前に増加し、直後に減少した。これに対して、休産鶏においては一日のいろいろな時間で顕著な変化は認められなかった。したがって、産卵鶏の放卵時の前後で認められたPGF_<2a>・レセプター結合量の変化は放卵と密接に関与しているものと推察された。(2)産卵している鶏と休産している鶏の下垂体後葉および血液における(1)PGFと(2)バソトシンのそれぞれの濃度をラジオイムノアッセイ法で測定した。この結果、(1)下垂体後葉におけるPGF量は休産鶏の方が大であったが、血中のPGF濃度は逆に産卵鶏の方が大であった。そこで次に、産卵鶏においてはクラッチ第1卵の放卵前後のいろいろな時間、休産鶏においては一日のいろいろな時間に血液を採取し、(1)PGFと(2)バソトシンのそれぞれの濃度を測定したところ、産卵鶏では放卵時(午前7時)に血中バソトシンとPGFの濃度の増加が認められた。休産鶏においては血中PGF濃度の増加は午前7時に認められ、バソトシンの顕著な増加は認められなかった。さらに、産卵鶏においてはクラッチ第4卵の放卵前後のいろいろな時間に血液を採取し、(1)PGFと(2)バソトシンのそれぞれの濃度を測定した。この結果、血中バソトシンとPGF濃度の増加は放卵時(午前10時)に認められ、さらにPGF濃度の増加は午前7時に認められた。これらのことより、PGFは下垂体後葉からバソトシンの放出に関与していることが推察された。鶏の視床下部および脳下垂体後葉の細胞膜画分を遠心分離法で調整し、これらの細胞膜画分に[^3H]放射能で標識したプロスタグランジンF_<2α>(PGF_<2α>)を加えるラジオリガンドアッセイ法を用いて検討した。

この結果、脳下垂体後葉にはPGF_<2α>に対する特異的に結合する物質の存在が認められた。この結合物質の特異的[^3H]PGF_<2α>結合量と培養温度(4°C、30°C)および培養時間(5480分)との関係について検討したところ、特異的結合量は30°Cで60480分間培養した場合に高い一定な値が得られた。結合量は細胞膜画分の蛋白質量が6.2550μgで直線的に増加することが認められた。従って、脳下垂体後葉のPGF_<2α>受容体を検索するためには細胞膜画分の蛋白質量15μgを用いて30°Cで60分間培養する条件が至適であることを明らかにした。これに対して、視索前野および正中隆起部を含む視床下部ではPGF_<2α>に対して特異的に結合する物質の存在は上記の条件下では認められなかった(川島担当)。鶏の視床下部、脳下垂体後葉および血液における(1)プロスタグランジン(PG)量と(2)脳下垂体後葉ホルモン(バソトシン、メソトシン)量をラジオイムノアッセイ(RIA)法で測定するための測定条件について検討した。(1)PG量をRIA法で測定するためには、視床下部および脳下垂体後葉ではこれらの組織からエタノールでPGを抽出すること、血液ではエーテルでPGを抽出することが必要であることを明らかにした(田中担当)。(2)脳下垂体後葉ホルモン(バソトシン、メソトシン)量をRIA法で測定するには、視床下部および脳下垂体後葉では組織を酸性溶液で抽出した後、血液では血清を酸性にした後にいずれもSep-packsカラムで分離精製する操作が必要であることを明らかにした(安岡担当)。鶏の下垂体後葉をCa^<++>を含む緩衝液でホモゲナイズし、遠心分離法で細胞膜画分を調製した。この細胞膜画分に[^3H]プロスタグランジンF_<2α>(PGF_<2α>)を加えるラジオリガンドアッセイ法で検討した。このアッセイ条件は前年度において明らかにした条件(Ca^<++>を含む緩衝液、細胞膜画分の蛋白質量:15μg/tube、培養温度:30°C、培養温度:60分間)で行った。この結果、下垂体後葉の細胞膜画分におけるPGF_<2α>の結合物質は結合特異性、結合飽和性および高い結合親和性(解離定数Kd:3.3nM)と低い結合容量(Bmax:145fmol/mg protein)を有し、PGF_<2α>に対する受容体であることを明らかにした。(川島担当)前年度で明らかにした組織および血液からプロスタグランジンF(PGF)およびバソトシン(下垂体後葉ホルモンの一つ)を抽出する方法により、鶏の視床下部、下垂体後葉および血掖における(1)PGFと(2)パソトシンのそれぞれの濃度をラジオイムノアッセイ法で測定した。この結果、(1)視索前野を含む視床下部(HPOA)、正中隆起部を含む視床下部(HMEA)および下垂体後葉におけるPGF量は休産鶏の方が産卵鶏よりも大であったが、血中のPGF濃度は産卵鶏の方が大であった。そこで、休産鶏に性ステロイドホルモンであるプロジェステロン、エストラシジオールおよびジヒドロテストステロンを投与したところ、PGF量はいずれの組織においても減少することが認められた。(安岡担当)(2)放卵時およびそれ以外のいずれの時期においても、産卵鶏の血中パソトシン濃度は休産鶏よりも大であった。そこで、休産鶏に上記の性ステロイドホルモンを投与したところ、エストラジオールを投与した場合のみ血中パソトシン濃度の増加することか認められた。(田中担当)以上の結果より、エストロジェンは視床下部および下垂体後葉に作用し、下垂体後葉からプロスタグランジン分泌し、プロスタグランジンは下垂体後葉のPGF受容体に結合することによりパソトシンの放出を促すものと推察された。
プロスタグランジン受容体を介した眼表面上皮細胞による炎症制御機構の解明

本研究によりPG受容体サブタイプEP3が眼表面上皮に優位に発現しており、炎症抑制に働くことにより、眼表面の恒常性維持に大きく貢献していることが、マウスアレルギー性結膜炎モデルの解析で明らかとなった。また、ヒトにおいても、EP3が眼表面上皮に優位に発現していること、ならびに、Stevens-Johnson症候群や眼類天疱瘡などのヒト眼表面炎症性疾患においてEP3発現が著明に減少していることも明らかとした。これらの結果は、眼表面炎症性疾患の病態にPG受容体が大きく関与していることを示している。"眼表面粘膜上皮細胞による眼表面炎症制御機構の解明"を最終目標として、本年度は、ヒト結膜上皮細胞におけるPG受容体、特にPGE受容体に着目して、その発現ならびに機能について解析した。PGE_2は、免疫学領域において単球や樹状細胞のLPS誘導性のサイトカイン産生を抑制する事が報告されているが、上皮細胞における報告はほとんどない。研究代表者は、結膜上皮細胞における各種PGE_2の発現ならびにその機能を解析した。健常ボランティアよりbrush cytologyにより採取した細胞を用いてRT-PCRを行い各種PGE_2受容体(EP1-4)mRNAの発現を解析したところ、ヒト結膜上皮細胞では、EP2,3,4 mRNAが発現していることが確認された。結膜弛緩症患者の切除結膜から分離培養したヒト培養結膜上皮細胞(PHCjE)を用い、polyI : C刺激にて各種サイトカイン産生を誘導し、さらに、polyI : C添加と共に、PGE_2または各種PGE2受容体刺激剤を添加し、サイトカイン産生抑制作用をELISAならびに定量PCRにて解析したところ、PGE_2は、polyI : C刺激によって誘導されたIL6, CXCL10, CXCL11, CCL5の産生を抑制した。また、CXCL10, CXCL11, CCL5産生はEP2ならびにEP3アゴニストによっても抑制されたが、IL6についてはEP3アゴニストによってのみ抑制された。一方、EP4アゴニストは、いずれのサイトカイン産生も抑制しなかった。以上の結果は、ヒト結膜上皮細胞において、PGE_2はEP2ならびにEP3を介してpolyI : C誘導性IL6, CXCL10, CXCL11, CCL5の産生を抑制することを示している。よって、ヒト結膜上皮細胞に発現しているEP2ならびにEP4は、眼表面炎症を抑制していると考えられた。本年度は、"プロスタグランジン受容体を介した眼表面上皮細胞による炎症制御機構の解明"を目的に下記に示す実験を行い、以下の結果を得た。1)上皮細胞に発現しているPG受容体に着目した炎症制御機構の解明A)ヒト培養結膜上皮ならびにヒト培養角膜上皮を用いて、各種PGE2受容体(EP2、EP3,EP4)アゴニストを用いて、サイトカイン産生抑制作用を解析した。その結果、polyICによるサイトカイン産生誘導に対して、EP2アゴニストならびにEP3アゴニストは、CXCL10,CXCL11などのサイトカインの産生を抑制した。B)申請者が確立した眼表面炎症マウスモデルを用いて、眼表面炎症におけるPG受容体の働きを解析した。具体的には、PGE2受容体サブタイプEP3欠損マウスにアレルギー性結膜炎を誘発し、遅発相の結膜好酸球浸潤の程度を、野生型マウスと比較した。その結果、EP3欠損マウスでは、アレルギー性結膜好酸球浸潤が野生型マウスを比較して有意に上昇していた。また、EP3の局在を調べたところ、結膜上皮、角膜上皮からなる眼表面上皮に優位に発現した。このことは、眼表面に発現しているEP3がアレルギー性結膜好酸球浸潤を制御していることを意味する。2)眼表面炎症制御機構全体におけるPG受容体の役割ならびに位置づけの解明難治性眼表面炎症疾患患者が眼表面再建術を受ける際に摘出される眼表面炎症病態組織を用いてPGE2受容体サブタイプEP3の免疫組織化学的解析を行った。コントロールとしては結膜弛緩症患者が余剰結膜切除術を受ける際に摘出される結膜組織を用いた。その結果、コントロール結膜では、マウス同様に、ヒト結膜上皮細胞にEP3が強く発現していた。しかし、重症眼表面炎症性疾患であるStevens-Johnson症候群では、眼表面におけるEP3の発現は著明に減弱していた。このことは、アレルギー性結膜炎だけではなく、癌表面炎症全体の制御に、PGE2受容体が関与する可能性を示している。研究代表者はPG受容体サブタイプEP2, EP3とEP4を介した眼表面上皮細胞による眼表面炎症制御機構の解明を目的として、以下を解明した。1培養ヒト結膜上皮を用いてEP2, EP3, EP4アゴニストによる炎症性サイトカイン抑制効果を、ELISAならびに定量PCRで解析した。その結果、polyI:C刺激培養ヒト結膜