hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
地震波による断層面の不均質性の解明に向けた理論的研究

大地震の断層として断層破砕帯を想定し、断層破砕帯として数種類のモデルを仮定し、断層破砕帯中に震源を置いて破砕帯中の多数の観測点での地震波形と振幅スペクトルを理論的に計算し、モデルパラメーター依存性を調べた。この結果を1992年Landers地震の断層破砕帯で得られたデータに適用すると、破砕帯の幅が約250m、卓越する亀裂長が約60m、亀裂の分布密度がνa^2=0.12と求められた。ここで、νは亀裂の数密度、aは亀裂長の半分である。2次元媒質中のSH波を仮定し、断層破砕帯として以下のモデルを考える。1.平行で同じ長さ2aの亀裂が周期的に分布する帯状の領域。2.1の亀裂分布は長波長極限では等価な異方性媒質と見なせるので、1の亀裂分布と等価な異方性を持つ帯状の領域。3.帯状の低速度層。4.低速度に加え1の亀裂分布と等価な異方性を持つ帯状の領域。5.平行で同じ長さ2aの亀裂が周期的に分布する低速度層。以上のモデルに対して、断層破砕帯の中心に等方な線震源を仮定し、破砕帯のほぼ中心に観測点を置く。1のモデルで、亀裂の数密度をνとすると、亀裂分布密度が高い時(νa^2=0.1)でも、断層トラップ波は生じなかった。入射波の半波長が亀裂長より短い時には、震源に近い観測点では亀裂からの散乱波が後続波として現れるが、遠い観測点での散乱波は微弱だった。2のモデルでは、断層トラップ波は生じず、散乱波も発生しなかった。したがってトラップ波を生成するためには、低速度になっている必要がある。3のモデルでは、周囲の速度が速い媒質を伝わってきた屈折波が初動として現れ、断層トラップ波が長周期の後続波として生じ、スペクトルを取ると低波数のピークを形成していた。散乱波は発生しなかった。4のモデルでは、3のモデルと同様の特徴を持っ波形になったが、断層トラップ波の部分の低波数のスペクトルのピークが3の場合に比べ二つに分かれた形になった。これは、波の伝わる速さが伝播方向によって変化するため、波の干渉の仕方が変わったためである。5のモデルでは、3の場合の波形の特徴に加え、震源から遠い観測点でも後続波として亀裂からの散乱波が観測された。スペクトルを取ると断層トラップ波に対応した低波数のピークに加え、kを波数とするとka1でスペクトルに高波数のピークが現れた。これは亀裂からの散乱波によるものと考えられる。大地震の断層として断層破砕帯を想定し、断層破砕帯として、水や軟らかい含水鉱物あるいは断層ガウジが存在し薄い低速度層を形成している場合、断層面に配向した微小な亀裂群が分布し速度異方性をもつ薄い層が存在している場合、断層運動が繰り返されたことによって帯状の領域に亀裂が非常に密に分布している場合、および以上のモデルが組み合わさった場合を考える。このうち、平行で同じ長さ2aの亀裂が周期的に分布する低速度層としてモデル化した場合に、モデルのサンプルや観測点によるばらつきを統計的に調べるため、断層破砕帯中に震源を置いて断層破砕帯中の多数の観測点で理論波形とスペクトルを計算し、多数の観測点でのスペクトルの平均値を計算した。このスペクトルの平均値には、断層トラップ波に対応した低波数のピークに加え、kを波数とするとKa1でスペクトルに高波数のピークが現れた。次に、亀裂の数密度をνとすると、亀裂分布密度が高い時(νa^2=0.1)に10通りの亀裂分布モデルを作成し、それぞれのモデルに対して多数の観測点でのスペクトルの平均値を計算し、それぞれのスペクトルの平均値から亀裂からの散乱波による高波数のピークを読み取って、10個の亀裂分布モデルに対する高波数のスペクトルのピークの平均値を求めた。その結果、ピークはKa=0.94±0.161で現れ、ピーク振幅値|μ|は|μ|a=0.077±0.016であった。1992年Landers地震の断層破砕帯でのデータに現れている10Hz付近の高周波のスペクトルのピークを亀裂によるものと解釈し、S波速度2km/sを仮定すると卓越する亀裂長は約60mとなる。さらに、1個の亀裂にP波の平面波が入射する場合に、亀裂面上の相対変位を計算するプログラムを作成した。

大地震の断層として断層破砕帯を想定し、断層破砕帯として、水や軟らかい含水鉱物あるいは断層ガウジが存在し薄い低速度層を形成している場合、断層面に配向した微小な亀裂群が分布し速度異方性をもつ薄い層が存在している場合、断層運動が繰り返されたことによって帯状の領域に亀裂が非常に密に分布している場合、および以上のモデルが組み合わさった場合を考える。このうち、平行で同じ長さ2aの亀裂が周期的に分布する低速度層としてモデル化した場合に、モデルのサンプルや観測点によるばらつきを統計的に調べるため、断層破砕帯中に震源を置いて断層破砕帯中の多数の観測点で理論波形とスペクトルを計算し、多数の観測点でのスペクトルの平均値を計算した。次に、亀裂の数密度をνとすると、νa^2=0.1,0.075,0.05の場合にそれぞれ10通りの亀裂分布モデルを作成し、それぞれのモデルに対して多数の観測点でのスペクトルの平均値を計算し、それぞれのスペクトルの平均値から断層トラップ波に対応した低波数のピークと亀裂からの散乱波による高波数のピークを読み取り、10個の亀裂分布モデルに対するスペクトルのピークの平均値を求めた。その結果、低波数のピークの平均値は亀裂密度が高いほど振幅が大きくなっていたのに対して、高波数のピークはモデル間のばらつきが大きく、亀裂密度依存性がはっきり表れず平均値はほぼ一定になった。この結果を1992年Landers地震の断層破砕帯で得られたデータに適用し、破砕帯中と外側のS波速度をそれぞれ2km/s、3km/sと仮定すると、断層トラップ波のスペクトル形状を説明するモデルの例として、破砕帯の幅が約250m、卓越する亀裂長が約60m、亀裂の数密度がνa^2=0.12と求められた。また、前年度に作成した1個の亀裂にP波の平面波が入射する場合に亀裂面上の相対変位を計算するプログラムの精度チェックを行った。
エルギン伯爵日英条約以降のスコットランド人の日本デイアスポラ（離散共同体）研究

退職にともなう環境変化に対応して、1年間の延長をみとめていただき、研究の集大成を考えていた。しかし諸般の事情から研究進展の変更を余儀なくされた。できた部分は、従来の研究のからのメール深化の試みができたことである。具体的には2017年5月フランスのパリ学士院での講演「日本人の経済倫理と宗教」の報告である。フランス学士院の「経済と倫理」部門のリスリー会長から「先進国の中で、なぜ日本は他の西欧職に比して、犯罪率も社会的抗議活動はすくないのか」の質問から始まった。私の説では、明治日本が技術とともに輸入したスコットランドの実学思想の開花が日本の工業化の成功につながった点、またフランスの学士院はフランス革命の翌年の設立されたが、フランスの百科全書派は、18世紀アダム・スミスに象徴されるようにスコットランド啓蒙主義とのつながりがあった点、さらに日本が第2次世界大戦後にアメリカ人マッカーサーがもたらした民主主義が評価されるが、マッカーサ自身はスコットランド移民の末裔であり、思想的にはアメリア主義の信奉者であったし、アメリカ主義は19世紀に生まれるが、その源泉はスコットランドの実学主義にあったことを評価した。つまり、科研費をいただいて研究してきた第8代エルギンが活躍した時代と、スコットランド人牧師・外交官・技師・教師のネットワークの中で、近代世界が形成された歴史の中に、日本の幕末から現代までの社会発展も含まれることを例証できた。パリ学士院の報告は、学士院小冊子以外に、リスリー会長の主催する文明観対話グループの雑誌にも掲載された。そこで報告時にいただいた質問も考慮し、再度まとめて、本学の経済学部の紀要(創価経済論集48巻1ー4号合併号)に掲載してただいた。平成27年度は「エルギン伯爵日英条約以降のスコットランド人の日本でのデイアスポラ(離散共同体)」の基本的方向性を構想した。1先ず従来の研究をまとめ先ず6月に『第八代エルギン伯爵と幕末日本ー日英条約と日本でのスコットランド人デイアスポラ研究』(文生書院ISBN978-4-89253-578-9)を上梓した。310月に静岡県川勝平太知事の招請により(静岡県韮山反射炉が認定されたことに関係し)、同県庁で「幕末明治初期の産業革命遺産とスコットランド人技師)のテーマで講演した。講演後の質疑も有益であった。拙著の公刊ができたことにより、今まで日本語文献になく謎とされていた第代エルギン伯爵、また彼の秘書オリファントと幕末日本との関係が明らかになり、多くの研究者からコメントや励ましをいただいた。幕末・明治日本と当時の外交関係研究者から有益な励ましをいただいた。海外研究家からも、19世紀に大英帝国の影響を受けた中国、インド、タイ、マレイシア、シンガポール等の歴史家(特にアジア歴史家会議IAHAメンバー)からの歴史情報燃えることが出来、今後の研究に役立てられる。特に2016年3月に招待を受けて講演に訪問した中国の上海歴史アカデミー(中国近現代史講座)や南京大学西洋史大学院講座の方々からも関心(つまり19世紀の中国の西欧との対外史への理解)を示されて自分なりに驚いたまた昨年の世界文化遺産に「幕末明治の産業革命遺産」が認定されたことにより、数多くの地方歴史家とのコンタクトもふえ、今後、本格的に幕末明治の外国人居留地(長崎、横浜、函館、大阪・神戸)をスコットランド人移民運動の視角から研究できる客観的環境がでてきているからである。日本各地の旧外国人居留地(長崎、横浜・東京、神戸・大阪、函館)の研究の進展がの中で、幕末明治のスコットランド人の各地での技術・ビジネスの貢献が明らかになりつつつある。私の研究は第八代エルギン伯爵の日英通商条約後の、スコットランド人(外交官、技師、教師、宣教師、銀行家、ジャーナリスト)が来日したかにあったが、今や、その土台の上にスコットランド人の各地への進出が究明されつつあるのは大いに励みになる。私としては自身の研究の集大成を図りたい。、幕末明治に日本へ到来した英国(特にスコットランド)人は、19世紀中葉にスコットランド系のP&O.B.I蒸気船会社の船舶に乗り、インドから中国を経て日本・長崎へ到来した。彼らのネットウークを調べる。ハワイ、マレイシアの調査により、かなり当時の歴史像を考察できた。アジア各地の大学図書館や公文書館の協力で、19世紀中葉の英国系新聞記事の収集から、航海会社の記録をしり交易されていた物品、また日本人の渡航記録も見つけることが出来た。これは幕末明治日本の国際舞台からの解明に大きく貢献できる研究となりうると確信する。ちょうど明治維新150周年を迎えての様々な行事があると聴いている。私は明治維新前後の幕末明治日本とスコットランド人(外交官、技師、牧師、商人)のかかわりかたを追求して、世界各地にスコットランド人が形成した離散共同体(ディアスポラdiaspora)から研究をまとめたいと願っている。その意味でスコットランド人に明治日本での長崎、神戸、横浜、函館等への定住活動は、現在世界で進行中の様々な少数ながら活力あるグループのダイナミズム(離散共同体)研究の古典例研究と確信する。19世紀の幕末日本をアジア史、世界史の中で考える気運は高まりつつあり、その意味で19世紀中葉のスコットランド人外交官第8代エルギン伯爵ブルースのジャマイカ、カナダインド、中国、日本に赴任し、比較史で見た彼の歴史視点に関心が深まっているのを感じる。

国内でも幕末維新研究ブームの中で、日本に最も大きな影響を与えたスコットランド人外交官、技師、宣教師、教師の足跡を調べる地方史家も増えてきた。長年勤務した経済学部を退職し、通信教育非常勤講師に移行したことから、その一身上の環境変化もあり、研究のまとめが遅れた。しかし次第に新しい環境に順応でき、研究も再開でき、きちんとしたまとまりのある形でやれると思います。退職にともなう環境変化に対応して、1年間の延長をみとめていただき、研究の集大成を考えていた。しかし諸般の事情から研究進展の変更を余儀なくされた。できた部分は、従来の研究のからのメール深化の試みができたことである。具体的には2017年5月フランスのパリ学士院での講演「日本人の経済倫理と宗教」の報告である。フランス学士院の「経済と倫理」部門のリスリー会長から「先進国の中で、なぜ日本は他の西欧職に比して、犯罪率も社会的抗議活動はすくないのか」の質問から始まった。私の説では、明治日本が技術とともに輸入したスコットランドの実学思想の開花が日本の工業化の成功につながった点、またフランスの学士院はフランス革命の翌年の設立されたが、フランスの百科全書派は、18世紀アダム・スミスに象徴されるようにスコットランド啓蒙主義とのつながりがあった点、さらに日本が第2次世界大戦後にアメリカ人マッカーサーがもたらした民主主義が評価されるが、マッカーサ自身はスコットランド移民の末裔であり、思想的にはアメリア主義の信奉者であったし、アメリカ主義は19世紀に生まれるが、その源泉はスコットランドの実学主義にあったことを評価した。つまり、科研費をいただいて研究してきた第8代エルギンが活躍した時代と、スコットランド人牧師・外交官・技師・教師のネットワークの中で、近代世界が形成された歴史の中に、日本の幕末から現代までの社会発展も含まれることを例証できた。パリ学士院の報告は、学士院小冊子以外に、リスリー会長の主催する文明観対話グループの雑誌にも掲載された。そこで報告時にいただいた質問も考慮し、再度まとめて、本学の経済学部の紀要(創価経済論集48巻1ー4号合併号)に掲載してただいた。研究は、この方向性の上に展開したい。先ず本年に予定しているのは1ハワイ大学から研究協力の依頼があり、幕末明治に日本へ到来したスコットランド人技師・宣教師達のアメリカ経由の流れを研究・討議する予定である。2本年秋に、英国グラスゴウのミッチェル図書館に、工部大学校初代都検(東京大学校長)のヘンリーダイアーの所蔵品の展示会が予定されておりこの行事の出席をかねて、スコットランドのグラスゴウ、エディンバラ大学の歴史研究舎と懇談することを考えている3函館、東京、横浜、神戸:大阪、長崎にある「明治外国人居留地」研究メンバーとの交信、協力を得て歴史的実像の解明につとめた。特に横浜の開港資料館の資料は存知なので、当時の新聞・ジャーナルを調査したいと思っている。最後の1年を迎えて、今までのスコットランド研究の集大成を試みたい。特に日英通商条約を締結したエルギン伯爵一族とアジアの関係を中心に研究をまとめたい。そのためには本場のスコットランドのグラスゴウ、スターリング、セント・アンドリュー、エディンバラ、アバディーンの大學資料室や公文書記録館とのコンタクトを通じて、19世紀中葉にスコットランドから世界へ派遣された外交官、宣教師、技師、銀行家、教師、商人のネットワークの体系的把握を進めたい.
岐阜・富山県境における地域言語の動態に関する総合的研究

(1)2年目となる今年度は、岐阜大学への異動もあり岐阜県側の方言の実態を中心に研究・報告した。(2)飛騨地方は岐阜県内でも南部の美濃地方と異なる文法的特徴を多く持つ。その文法的特徴を実地調査と資料検証の両面から記述・分析した。具体的な形式を挙げると、否定の表現は美濃地方で聞かれる「へん」を用いないなどの報告があるが、実際には飛騨地方南部金山町や馬瀬村地内において「へん」やその前身と考えられる「せん」が多数報告されている。アスペクト形式についても富山との県境に位置する河合村において調査を行い、持続を表す「よる」と結果残存を表す「とる」とが、まさに世代的な差において変容しつつあることを観察した。このような細部に渡る調査を継続的に行った。これらの調査結果にもとづいて、今後、大々的な調査を行う予定である。(3)岐阜県方言の文法記述については、美濃地方の終助詞を中心に記述を行った。(4)昨年度まとめた富山方言の文法について、富山県主催による「富山インターネット市民塾」において、Web版の講座を作成。一般の閲覧に供した。なお、「富山インターネット市民塾」は「第2回インターネット活用教育実践コンクール」で、最優秀賞である「内閣総理大臣賞」を受賞。本年度は富山方言について、その音声、語彙、文法的特徴に関する調査・考察を行った。当該研究で重点を置いたのは以下の点である。1.方言の動的側面の記述方言研究は、現在、伝統的な方言の記述という側面から、現時点での動的な実態を記述していくという方向に向かっている。このような現状に合わせ、本研究では、(1)富山方言の語彙に関して、特に方言と気づかれていないもの、もしくは気づかれにくいものを調査した。(2)富山方言の文法に関して、伝統的な文法現象と現在の若年層の使っている方言文法との違いについて、記述を行った。その結果、富山方言では小学校などで用いられる語彙が、方言と気づかれずに用いられていること、「来れば」を「これば」と読むような従来からの方言によっても共通語の影響からも説明の付かない独自の変化をしている側面を観察できた。2.方言の文法体系の記述従来から方言の文法的記述はいくつか見られたが、本研究では、特に体系的な記述を目指して、現代日本語の研究で用いられる手法を取り入れながら、総合的見地からの研究を行った。特にいわゆる形態論に偏向した文法ではなく統語論へ踏み込んだ記述に重点を置いた。本研究によって富山方言の文法体系が初めて明らかにされた。一般の閲覧に供した。
科学的推論における促進要因と阻害要因のメタ認知知識獲得による効果の検証

1.研究目的事前に適切なメタ認知的知識を教示することは適切なメタ認知的活動を促し,科学的探究能力を向上させると考え,本研究では,考察場面に着目することにした。メタ認知的知識を教示する授業と,他者との協働を支援するための授業を開発し,その効果について授業実践を通して評価することとした。2.研究方法1メタ認知を促進させるためには個人内の知識のレパートリーを増やすことが必要であるため,考察場面で生徒が保持しているメタ認知的知識を調査した。調査は, KH Coderを用いて計量テキスト分析を行い,分析のためのカテゴリー(コーディングスキーマ)を生成し,分類を行った。21を踏まえ,考察場面における促進要因のメタ認知的知識,阻害要因のメタ認知的知識を獲得させるための教示授業と,協働的な問題解決を促すための支援授業を行い,「科学的に結果を考察し,論理的に説明する能力」の育成と検証を行った。検証は評価問題得点,学業的援助要請尺度を用いた。3.研究成果1について,考察場面のメタ認知的知識を分類した結果,「自分の考えの変化に目を向ける」「自分の考えが正しいかもう一度考える」といったメタ認知的モニタリングに関する知識を教示することの必要性が明らかになった。それらを促進要因としてメタ認知的知識の教示に組み込んでいくこととした。2について,考察場面においてメタ認知的知識の教示のみや協働的な学びの支援のみでは十分な成果が得られないが,適切なメタ認知的知識を教示した上で,その知識を活用して他者と協働するための支援までを組み込んだ授業は,学習者の考察のパフォーマンスを促進させる可能性が示唆された。また,メタ認知的知識の教示や協働支援といった教育介入は,自律的援助要請型の学習者よりも依存的援助要請型に対してある一定の学習効果をもたらす可能性が示唆された。
白血病性樹状細胞および樹状細胞由来エクソゾームを用いた白血病に対する免疫療法

白血病をはじめとする癌に対する有効な特異的免疫療法を確立することを目的として、白血病由来樹状細胞と樹状細胞が分泌するMHC/抗原ペプチド複合体(エクソゾーム)についての検討を行った。1)白血病由来樹状細胞についての検討:急性白血病、CMLCPおよびBCの白血病細胞から以下の方法で白血病由来樹状細胞の培養を行った。(1)GM-CSF+IL-4+TNF-α添加培養、(2)calcium ionophore(A23187)添加培養。2)樹状細胞由来エクソゾームについての検討:癌抗原ペプチド(SART-1)をパルスした樹状細胞から調製したエクソゾームで自己のリンパ球を刺激することにより、CTL lineの樹立を行った。1)白血病由来樹状細胞についての検討:(1)GM-CSF+IL-4+TNF-α添加培養;AMLやCML-myeloid BCでは2/3以上の症例で、またCML-CPではほぼ全例でCD1a and/or CD83陽性の樹状細胞が誘導され、FISHにより白血病由来が確認された。これらの樹状細胞はアロおよび自己リンパ球に対する抗原提示能が認められ、一部の症例でCTL lineが樹立された。これらのCTL lineは、白血病クローンに由来する細胞に対しては障害活性があるが、正常細胞に対する障害活性は認められなかった。(2)A23187添加培養;多くの症例で、培養早期(2日目位)にCD83の発現が強い白血病由来樹状細胞が誘導され、強い抗原提示能が認められた。2)樹状細胞由来エクソゾームについての検討:SART-1ペプチドをパルスした樹状細胞が分泌するエクソゾームで刺激することによりCTL lineが樹立され、SART-1を発現する株化癌細胞やSART-1ペプチドをパルスした自己のマクロファージに対する障害活性が認められた。以上より、GM-CSF+IL-4+TNF-αやA23187を加えることにより、抗原提示能を有する白血病由来樹状細胞が多くの症例で培養可能で,CTLも誘導されることから、これらの白血病由来樹状細胞は白血病に対する免疫療法に応用できるものと考えられた。また、樹状細胞由来エクソゾームもCTL誘導能を有することから、エクソゾームを用いた細胞成分の入らない癌ワクチン療法の可能性が想定された。
大腸運動機能の生理学的意義と便通異常疾患の原因究明

イヌの大腸運動をストレインゲージトランスデューサー法により観察した結果、ヒト大腸運動とはまったく異なる収縮群が観察された。また、大腸内容である位鎖脂肪酸の大腸内投与により、大腸運動は亢進することが認められた。ヒト大腸運動は、Perfusion法による内圧検査では、3side hole以上を内圧波が伝播する蠕動運動と隣合ったside hole間に何ら関係のない非蠕動運動が存在することが確認された。蠕動運動には、順蠕動運動と逆蠕動運動が存在し、有意に近位結腸で観察された。また順蠕動運動の伝播距離は、そのほとんどが脾弯曲部までであり、逆蠕動運動のほとんどは、横行結腸に発現することが明らかとなった。一方、非蠕動運動は、遠位結腸に有意に存在し、大腸内容の急速な直腸内流入阻止を生理学的に調節しているものと考えられた。このように、ヒト大腸運動は遠位と近位結腸とで収縮様式は大きく異なり、この収縮運動のCo-ordinationが障害されると下痢、便秘という症状が起こるものと考えられた。次いで、外科治療を必要とした難治性便秘症8例を対象として大腸内圧検査、直腸肛門内圧検査およびBa粒子排出能試験(Silz mark)を行なった結果、便秘症は、大腸輸送能の低下に伴うslow transit constipationと排便障害に基づくpelvic outlet obstructionに2大別された。それぞれに対し、大腸亜全摘術および肛門形成術が試行され、術後経過は良好で患者の満足も得られている。大腸内圧などの機能検査をこれらの症例に行なうことで、外科治療の選択が可能となった。しかし、慢性便秘症の中には、chronic Idiopathic pseudo-obstructionがあり、この治療および病因は現在まったく不明である。大腸運動の生理学的意義を解明するため、盲腸から直腸に至る全大腸運動を測定した。12のSide holeを有する内圧測定用カテーテルを大腸鏡を用いて盲腸部まで挿入した。大腸運動には.蠕動性収縮運動と、非蠕動性収縮運動に2大別された。近位大腸では、蠕動運動が優位があり、遠位大腸では、非蠕動運動が優位に認められた。全大腸運動量は、遠位大腸に向うにつれてその運動量は亢進する。蠕動運動の伝播速度も同様に遠位大腸に向うにつれ速くなった。特に、脾変曲部より近位では3cm/secを越えないのに対し、遠位大腸では、3cm/secよりも速い伝播速度を示した。antegrade propagationとretrograde propagationは、近位大腸に有意に認められ、回腸末端から流入した腸内容を攪伴させ、ある一定期間、近位大腸に貯留させることによって、水、電解質の吸収を容易にしているものと考えられた。他方、遠位大腸においては、非蠕動運動が優位であり、蠕動運動の頻度が少ないことから、腸内容の貯留および大腸内容の急速な直腸流入阻止という機構があるものと思われる。このような大腸の運動生理の解明には、長時間の詳細な大腸運動の測定が必要である。研究成果大腸鏡を用いて,内圧測定用カテーテルを挿入し大腸の収縮運動による内圧の変化を圧力トランスデューサーを介して記録した。ヒト大腸運動は,血管神経支配の相違より近位大腸と遠位大腸とでは本質的に収縮様式が異なる。

すなわち,大腸の運動様式を蠕動性収縮運動と非蠕動性収縮運動とに分類すると,蠕動性収縮運動は,近位大腸に有意に認められ,非蠕動性収縮運動は,遠位大腸,特にS状結腸に有意に認められた。蠕動性収縮運動には,肛門側へ内圧波が伝播する順蠕動と頻度的には少ないが,口側へ内圧波が伝播する逆蠕動運動がある。近位大腸の内容は,半流動態であり,順蠕動,逆蠕動により容易に腸内容の移動が起こり,さらに近位大腸で混和撹拌され大腸粘膜による再吸収がすすむものと理解される。一方,遠位大腸における非蠕動運動は,分節運動ともよばれ,急速な大腸内容の直腸内流入を阻止しているものと考えられた。このような運動様式により,日常の生理的な排便がコントロールされている。しかし,不眠などのストレスのかかった状態下では,この運動様式のバランスが失われ,下痢,便秘という症状が出現する。この現象を反映している疾患として,過敏性大腸炎があげられる。これと似たような疾患として若年女性の難治性便秘症を経験し,大腸内圧検査,直腸肛門反射を検討し,これを手術的に治癒せしめた。大腸内圧検査の結果は,著しい遠位大腸の運動低下が認められたが,直腸肛門機能および小腸運動は正常に保たれていた。この症例にたいして,大腸亜全摘,上行結腸直腸吻合術を施行した。このような症例を扱うのには,どの部の機能障害が起こっているのか内圧検査を行い的確な診断が必要であるものと考えられた。ヒト大腸運動を内圧法(perfusion system)で観察した結果、ヒト大腸には3Side hole以上内圧波が伝播する蠕動運動と隣合ったSide hole間に何ら関係のない非蠕動運動に2大別された。蠕動運動は近位結腸に有意に認められその伝播距離は、順蠕動の場合は脾弯曲部であり逆蠕動は肝弯曲から発することが証明された。逆に非蠕動運動は有意に遠位結腸に認められた。ヒト大腸運動は遠位と近位結腸とで本質的に収縮様式は異なり、この収縮運動のコーディネーションが障害されると便秘,下痢という症状をもたらすものと考えられた。次いで、外科治療を要した難治性慢性便秘症8例を対象として、大腸内圧検査、直腸肛門内圧およびPa粒子排出能検査(Sitzmark)を行なった結果、便秘症は、大腸輸送能の低下に伴うSlow transit constipationと排便障害に基づくpelvic outlet obstructionに2大別された。それぞれに、大腸亜全摘術および肛門形成術が試行され、術後経過は良好で患者の満足も得られている。大腸内圧検査をこれら症例に行なうことで、外科治療の選択が可能となった。
毛上皮形成における亜鉛シグナル伝達蛋白質群機能制御カスケードの構造生物学的解明

S100A3は、毛髪表層のキューティクル細胞に多量に含まれ、脱イミノ化酵素(peptidylarginine deiminase:以下PAD)によって、アルギニン残基がシトルリン残基に転換される。ヒトには5種類のPADアイソザイム(PAD14, PAD6)が存在し、そのうちのPAD3はヒトキューティクル細胞にのみ多量発現している。PAD3はS100A3のArg51を選択的にシトルリン化する。Arg51がシトルリン化したS100A3はホモ二量体から四量体に構造変化を起こし、その過程でS100A3のCa2+とZn2+に対する親和性が飛躍的に高まる事などが報告されていた。また、同様に毛髪に発現しているPAD1, PAD2は、試験管内では、S100A3の全てのアルギニン(Arg3, Arg22, Arg51, Arg77)をシトルリン化する。前年までの研究の結果、PAD3がPAD4と類似した二量体構造を形成していることが明らかになっていたが、PAD1の結晶構造では、PAD3, PAD4とは異なる二量体を形成しているか、あるいは、単量体で機能しているのではないか、ということが示唆されていた。本年度は、主に基質結合型のPAD3の構造解析と、基質特異性の異なるPAD1の溶液構造解析を行った。PAD3はC646A変異体が基質を結合することを確かめたが、結晶構造では得られなかった。だが、2.2Å分解能の基質非結合型の構造を得るに至っている。PAD1に関してはX線小角散乱実験で、溶液中では単量体で存在していることを強く示唆する結果を得た。その結果から、二量体の成り立ち方は、基質特異性に影響を与えることを提唱したいが、ごく最近になり、アイソザイムであるPAD2の構造が発表され、我々の説では説明できない結果になっていたため、今後のさらなる研究が必要な状況である。26年度が最終年度であるため、記入しない。Peptidylarginine deiminase (PAD)は、Ca2+存在下で、基質蛋白質中のアルギニン残基をシトルリンに変換する酵素である。毛髪キューティクルでは、Ca2+結合蛋白質S100A3がシトルリン化されており、その翻訳後修飾反応は、毛髪内に発現するPAD1PAD3の三種類のアイソザイムが担っていると考えられる。PAD1, PAD2は、S100A3の4つのアルギニン全てをシトルリン化するが、PAD3は、Arg51のみを特異的にシトルリン化するという特徴がある。本研究の目的は、その基質特異性の違いを構造から解明することである。昨年までにPAD1, PAD3の結晶構造解析を行い、両者とも結晶の非対称単位中に二分子存在することが分かった。PAD1に関しては、結晶の非対称単位の取り方により、二分子の相対配置が二通り考えられ、一義的には決まっていない。PAD1とPAD3の単量体構造は類似していたが、二量体として見ると全体構造は大きく異なっていた。ゲル濾過クロマトグラフィーによる分子量分析、活性測定、静的光散乱、X線小角散乱(SAXS)の結果から、PAD3の溶液構造は、結晶構造とよく一致した二量体であることが明らかになった。一方、PAD1とPAD2は、凝集しやすい不安定な状態であることがわかり、溶液中の構造は現時点で決定できていない。また、最近になり、PAD2の結晶も得ることに成功した。

その結果から、二量体の成り立ち方は、基質特異性に影響を与えることを提唱したいが、ごく最近になり、アイソザイムであるPAD2の構造が発表され、我々の説では説明できない結果になっていたため、今後のさらなる研究が必要な状況である。26年度が最終年度であるため、記入しない。本研究の本来の目的は、基質特異性やその際の構造変換機構を原子レベルで解明することである。PAD3とS100A3の複合体のX線結晶構造解析を行うことが、大きな目標の一つであるが、現在複合体の構造解析はできていない。その準備段階として、まず、PAD3変異体とアルギニン誘導体の複合体の構造解析、あるいは、野生型PAD3と阻害剤の複合体の構造解析を行おうと試みているが、現在のところ、複合体結晶が得られていない。PAD3単独の結晶は、野生型も変異体も得られているが、ソーキング法においても、今日結晶化法においても複合体構造を見るに至っていない。また、基質特異性を解明するためにもPAD1, PAD2の構造解析を行おうと試みている最中だが、両者ともPAD3に比較して、沈殿しやすく、X線小角散乱による溶液構造解析さえうまくいっていない。PAD1については、低分解能のX線結晶構造解析ができたが、PAD2についてはまだ回折強度データが収集できていない状態である。PAD1のダイマー構造が、PAD3とは著しく違っていたのが、結晶中の分子パッキングの影響なのかどうかを確認するためにも、溶液構造をぜひ成功させる必要がある。その意味で、当初の予定より、やや遅れているのは否めない。ただし、着実に成果を出しつつ、最終目標に向かって前進はしている。まず、PAD1, PAD2を安定的に得る条件を確立することが喫緊の課題である。そのためには、リアルタイムPCRの装置を活用して、温度上昇にできるだけ耐えうる緩衝液条件を検討する。現在使用している緩衝液よりもできるだけ安定でいる条件を探し、それが達成されれば、PAD1, PAD2の溶液構造をX線小角散乱法により、決定する。また、並行して、PAD2の結晶化条件を探索し、より質の良い結晶を得ることを目指す。今までに、最高4Å程度の回折点を得ているので、その条件周辺の条件と、スクリーニングによるまったく別の条件の検討を行いたい。良質な結晶が得られれば、Photon Factory(つくば)やSPring-8(播磨)の大型放射光施設でできるだけ高分解能回折データを収集する。構造はPAD4, PAD3などをモデルとした分子置換法で得る。また、PAD3の基質結合型の構造解析は、基質濃度条件の検討と、ソーキング法、共結晶化法の両方を行い、条件を詰めていく。アルギニン誘導体や阻害剤との複合体構造解析ができれば、S100A3のR51周辺アミノ酸を基に化学合成した短いペプチドとの複合体結晶の作成に取り掛かる。
PACAP-RegIIIbetaの膵組織リモデリング制御に関する研究

研究代表者が所属する研究室では、神経ペプチドPACAPがII型糖尿病で認められる膵島の過形成を抑制することを明らかにするとともに、PACAPの新規標的因子としてRegIIIbeta、を同定した。本研究では膵疾患におけるPACAP-RegIIIbetaパスウェイの機能解明を目的とし、本年度は以下の結果を得た。1.II型糖尿病を誘発したPACAP過剰発現マウス(Tg)の膵臓において、膵島よりもむしろ膵腺房で強度なRegIIIbeta発現誘導が見られることを見出した。一方膵腺房細胞株AR42J細胞においてPACAPはinsulinと協調してRegIIIbetaを相乗的に発現誘導することを見出すほか、膵β細胞株INS-1細胞ではRegIIIbeta添加により、それ自身の発現が増加すること、および高グルコース選択的な細胞増殖抑制が見られることを見出し、II型糖尿病下の膵組織において、RegIIIbetaがオートクラインあるいはパラクライン的に機能する可能性を示した。2.AR42J細胞でPACAPは、cerulein(急性膵炎誘発性の薬物)と協調してRegIIIbeta発現を相乗的に誘導すること、およびH_2O_2誘発細胞死を抑制することを見出した。また、抗RegIIIbeta中和抗体およびRegIIIbeta発現性アデノウイルスを用いた解析により、PACAPおよびceruleinによる細胞死抑制作用にRegIIIbetaが関与することを明らかにするとともに、これら細胞死抑制作用にはp38 MAP kinaseの活性化が重要な役割を果たすことを示した。3.膵β細胞特異的RegIIIbeta-Tgを作製し、II型糖尿病モデルであるKKA^yマウスと交雑させたところ、II型糖尿病時の代償反応である膵島数増加がRegIIIbetaの過剰発現で促進される可能性を見出した。また高脂肪食負荷KKA^y:PACAP-Tgでの検討から、膵島数制御におけるPACAPシグナルの重要性を支持する知見を得た。当初の研究目的に関して全ての実施項目が達成されたことに加え、特に、1)膵臓におけるPACAP誘発性のRegIIIbeta発現誘導が予想外にも膵腺房細胞で誘発されることの発見、2)そのメカニズムとしてのPACAPとinsulinとの協調作用やRegIIIbeta自身のポジティブフィードバックループの同定、については当初の予測を上回る進展である。さらには3)in vitro急性膵炎モデルにおけるRegIIIbetaの機能に関してP38 MAP kinaseの関与を同定できたことも大きな成果である。以上、今年度の研究成果により、PACAP-RegIIIbetaパスウェイの膵臓における病態的意義や膵疾患における創薬標的としての可能性が強く示唆できたと考える。平成24年度は進路変更に伴い、本研究の特別研究員を辞退する予定である。しかし以上の成果は、いずれもこれまでに得られたデータのみで科学的な妥当性に支持された研究として論文公表が可能であることから、今後、所属機関の受け入れ研究者と協力して、成果の論文公表まで責任をもって成し遂げたいと考えている。

しかし以上の成果は、いずれもこれまでに得られたデータのみで科学的な妥当性に支持された研究として論文公表が可能であることから、今後、所属機関の受け入れ研究者と協力して、成果の論文公表まで責任をもって成し遂げたいと考えている。
大動脈瘤発生のメカニズム解明による新規大動脈瘤破裂予測因子の探索

本研究では未だ機序が不明である腹部大動脈瘤の病態進展過程において、Angiopoietin-like protein 2(Angptl2)が果たす役割を明らかにすることで、治療標的として臨床応用へ展開することを目的としている。本研究の結果、ニコチンがAngptl2の発現を促進し炎症性サイトカインやマトリックスメタロプロテアーゼ(MMP)9の発現上昇を来たすほかに、炎症に関連するmicroRNAの発現上昇を引き起こし腹部大動脈瘤形成に寄与していることを明らかにした。また大動脈瘤患者血清の解析ではAngptl2濃度と喫煙歴との相関性が示唆されており、さらなる研究が必要である。本研究は、大動脈瘤患者の検体およびモデルマウスを分子生物学的手法で解析し大動脈瘤発生から拡大に至るメカニズムをさらに詳細に解明することで、肥満病態や動脈硬化、癌における基盤病態として注目される「慢性炎症」の重要な鍵因子であるAngiopoietin-like protein 2(Angptl2)を、大動脈瘤径拡大予防の治療標的として臨床応用へ展開するための研究基盤を確立することを目的としている。これまで大動脈血管壁の構造破壊から脆弱化に最も大きな役割を果たすMMP-9の制御をAngptl2が行っていることに加え、血管内皮におけるAngptl2発現上昇によって動脈硬化の進展が促進されることを明らかしてきたが、平成27年度はニコチン投与による大動脈瘤モデルマウスを用いて、大動脈瘤病態におけるAngptl2の発現制御機構についてさらに解析をおこなっているところである。具体的にはニコチンを投与したApoE-KOマウスの腹部大動脈を経時的に採取し、候補として選択したmicroRNAの発現変化についてリアルタイムPCR法により解析を行っている。また、ヒト大動脈瘤患者および冠動脈バイパス術施行患者の血清については、患者さんに十分な説明をおこない同意を得たうえで血清を採取しAngptl2濃度をELISA法にて測定し、大動脈瘤径による変化や喫煙歴など動脈硬化を進展させる因子と血清Angptl2濃度との関連性についての解析進めている。引き続き本研究を進めることにより、早期の診断に加えさらに低侵襲な治療や動脈瘤発症予防につなげることができる。本研究においてはマウスを用いた大動脈瘤モデルを作成する必要がある。さらに継時的解析をするためにはApoE-KOマウスが多数必要であり、飼育の面から個体数を揃えることに時間を要したため、平成27年度においては研究成果について論文や学会などで発表するうえで十分数の解析を行うことができなかった。またヒトのサンプルにおいては同意が得られないケースがあったことから当初予定よりも少ない人数分しか集められていない状況となった。これらのことから、当初計画した研究内容および方法について再検討を要する状態ではないものの、予定していた進捗度が得られなかったため「やや遅れている」と自己評価した。本研究は、腹部大動脈瘤患者の検体や大動脈瘤モデルマウスを分子生物学的手法を用いて解析することにより、大動脈瘤発生から拡大に至るメカニズムをさらに詳細に解明することで、肥満病態や動脈硬化、癌における基盤病態として注目される「慢性炎症」の重要な鍵因子であるAngiopoietin-like protein 2(Angptl2)を、大動脈瘤径拡大予防治療標的として臨床応用するための研究基盤を確立することを目的としている。これまで大動脈血管壁の構造破壊から、血管壁の脆弱化、瘤化に最も大きな役割を果たすMMP-9の発現制御をAngptl2が行っていることに加え、血管内皮におけるAngptl2発現上昇によって動脈硬化の進展が促進されることを明らかにしてきたが、H28年は大動脈瘤モデルマウスを用いて、大動脈瘤病態におけるAngptl2の発現制御機構についてさらに詳細な解析を行っているところである。具体的にはニコチン投与による大動脈瘤モデルマウスの血管壁を経時的に採取し、候補とするmicroRNAの発現変化についてリアルタイムPCR法を用いて解析している。またヒト大動脈瘤患者血清中のAngptl2濃度をELISA法にて測定し、大動脈瘤径および喫煙歴、その他動脈硬化関連因子との相関についての解析を行なっている。引き続き本研究を遂行することでヒト大動脈瘤病態の解明につなげ、大動脈瘤発症の予防につなげることができる。大動脈瘤患者の検体及びモデルマウスを分子生物学的手法で解析し、大動脈瘤発生の機序を詳細に解明することで、Angptl2を大動脈瘤径拡大予防の治療標的として臨床応用することを目的としてH27年より研究をおこなってきたが、H28年4月に発生した熊本地震の影響でこれまで保管してきた検体や試料が散逸し、再度検体収集や実験をやり直さねばならなくなったため、「遅れている」と自己評価する。本研究は、腹部大動脈瘤患者の検体や大動脈瘤モデルマウスを分子生物学的手法を用いて解析することにより、大動脈瘤発生から拡大に至るメカニズムをさらに詳細に解明することで、肥満病態や動脈硬化、癌における基盤病態として注目される「慢性炎症」の重要な鍵因子であるAngiopoietin-like protein 2(Angptl2)を、大動脈瘤径拡大予防治療標的として臨床応用するための研究基盤を確立することを目的として行った。これまで大動脈血管壁の構造破壊から、血管壁の脆弱化、瘤化に最も大きな役割を果たすMMP-9の発現制御をAngptl2が行っていることに加え、血管内皮におけるAngptl2発現上昇によって動脈硬化の進展が促進されることを明らかにしてきたが、今回の研究期間においては大動脈瘤モデルマウスを用いて、大動脈瘤病態におけるAngptl2の発現制御機構についてさらに詳細な解析を行った。

具体的にはニコチン投与による大動脈瘤モデルマウスの血管壁を経時的に採取し、Angptl2の発現と関連するmicroRNAの発現変化についてリアルタイムPCR法を用いた解析をおこない検討した。発現制御につながるmicroRNAを同定するまでには至らなかったもののAngptl2の発現と相関するmicroRNAの候補は絞ることができており、引き続き研究を進めていく必要がある。またヒト大動脈瘤患者血清中のAngptl2濃度をELISA法にて測定し、大動脈瘤径および喫煙歴その他動脈硬化関連因子との相関についての解析を行なった。サンプル数の関係から統計学的有意差を示すまでには至っていないが相関する傾向は認めており対象数を増やしてさらなる解析が必要である。本研究では未だ機序が不明である腹部大動脈瘤の病態進展過程において、Angiopoietin-like protein 2(Angptl2)が果たす役割を明らかにすることで、治療標的として臨床応用へ展開することを目的としている。本研究の結果、ニコチンがAngptl2の発現を促進し炎症性サイトカインやマトリックスメタロプロテアーゼ(MMP)9の発現上昇を来たすほかに、炎症に関連するmicroRNAの発現上昇を引き起こし腹部大動脈瘤形成に寄与していることを明らかにした。また大動脈瘤患者血清の解析ではAngptl2濃度と喫煙歴との相関性が示唆されており、さらなる研究が必要である。平成28年度は、前年度研究において統計学的解析にまで至らなかったin vivoの実験に関しては、本学分子遺伝学分野の他の研究者に協力を依頼することで使用するマウスの確保を増加させ、モデルマウスの解析を加速させることとしている。ヒトサンプルについては患者数に影響されるうえに、さらに自由意思に基づく同意が得られた症例に限られるため研究者側からの介入は困難であるが、十分数の症例数の確保が困難な場合に備えて、他の施設から研究協力が得られるよう準備を開始したところである。本学分子遺伝学分野および心臓血管外科の他の研究者にも協力を依頼し、使用するマウスを確保しモデルマウスの解析を再開させているところである。ヒトサンプルについては患者数の急激な増加は起こりえず、また自由意思に基づく同意を前提としているため研究者による介入は困難であるため、他の施設などとの研究協力なども行いつつ検体の確保に努めている。心臓血管外科マウス飼育室の都合により、個体数を増やすためのマウス購入代金が予定よりも少なかったことに加え、解析に使用する試薬の必要量が予定よりも少なかったため、次年度使用額が生じたものである。大動脈瘤患者の検体及びモデルマウスを分子生物学的手法で解析し、大動脈瘤発生の機序を詳細に解明することで、Angptl2を大動脈瘤径拡大予防の治療標的として臨床応用することを目的としてH27年より研究をおこなってきたが、H28年4月に発生した熊本地震の影響でこれまで保管してきた検体や試料が散逸したこと、また解析に用いていた機器の修理に時間を要し研究が中断したため。
キネシン一分子の構造変化と力発生の同時計測によるエネルギー変換機構の研究

運動中のキネシンに負荷をかけ、そのときの構造状態を観察するための実験系を構築した。まずキネシン2量体の尾部に微小管に結合した後解離できない変異体頭部をつけることにより、運動を束縛して負荷をかけることに成功した。また一分子FRET法を用いることにより、運動中のキネシンの構造変化を検出することに成功した。これらを組み合わせることによって、キネシンの力発生の原因となる構造変化を明らかにした。分子モーターキネシンの構造変化を一分子レベルで検出するために、一分子蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)法を用いた分子内距離変化の測定を行った。本年度は、微小管上を運動中のキネシンダイマーが両足を交互に動かしている様子を直接観察するために、2つの頭部に一つずつ結合させた色素間の距離を一分子FRET法で測定した。片方の頭部の前方ともう一方の頭部の後方にシステイン残基を導入し、この部位を蛍光色素で標識した。AMPPNP(加水分解されないATPアナログ)存在下では、両足結合状態に相当するFRET効率が観察され、低濃度のADP存在下では、片足結合状態に相当するFRET効率が観察された。ATP存在下で微小管上を運動中のキネシンのFRET効率を測定したところ、高ATP濃度では両足結合状態を主に取ること、また低ATP濃度条件下では片足結合状態を長く取ることが明らかになった。この結果は、ATP結合を待っている状態では片足のみで微小管に結合した構造をとることを示すものである。片足結合構造の維持はATPの選択的な結合を可能にし、それゆえATPの加水分解が2つの頭部で交互に起きることを保証していると考えられる。次に、運動中のキネシンに負荷をかけるためのアプローチとして、2分子のキネシンを架橋し、片方のキネシンをアンカーとしてもう一方のキネシンに負荷をかける実験系の開発を行った。野生型キネシン2分子にそれぞれ異なる蛍光色素をつけて2つの蛍光を同時に観察することにより、2分子の架橋がある程度の割合で成功していることを確認した。分子モーターキネシンの構造変化を一分子レベルで検出するために、一分子蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)法を用いてキネシン2量体分子内での距離計測を行った。2つの頭部に一つずつ結合させた色素間の距離を一分子FRET法で測定することによって、キネシンの両足結合状態と片足結合状態を区別して検出することに成功した。この方法を用いて様々なATP濃度存在下で運動中のキネシンの構造変化の観察を行い、キネシンはATP結合を待っている状態では片足結合状態を主に取ることを示した。また、片方の頭部が微小管に結合することのできない変異体ヘテロダイマーキネシンを用いることによって、微小管に結合している頭部にATPが結合すると、そのネックリンカーが構造変化して浮いている頭部を前方に移動させ、それによって両足結合状態を取り一歩前にステップするという仕組みを明らかにした。次に、光ピンセットを使わずに運動中のキネシンに負荷をかけ、そのときの内部構造状態を観察するための実験系を構築するために、キネシン2量体の尾部に微小管に結合した後解離することのできない変異体キネシン頭部を融合したコンストラクトを作成した。このキネシンの運動を一分子イメージング法を用いて観察したところ、一部のキネシンは野生型と同じ速度で運動したものの、大部分のキネシンは見かけ上停止して、微小管上で固定されることを明らかにした。今後この実験系を一分子FRET法と組み合わせることによって、負荷存在下でのキネシンの構造変化の検出を試みる予定である。分子モータータンパク質キネシンの研究は一分子計測法の進展と共に急速に進んできたが、依然として力が発生する仕組みの理解にまでは至っていない。本研究では、キネシンによる力発生の構造基盤を明らかにすることを目的として、まずキネシンに負荷をかけた状態で構造変化を検出する方法の確立を行い、さらにその方法を用いて負荷存在下で運動中のキネシンの構造変化の観察を行うことにした。本年度はまず、昨年度確立した光ピンセットを使わずにキネシンに負荷をかける実験系において、実際に負荷がかかっていることを確認した。具体的には、キネシン2量体の尾部に微小管に結合した後解離することのできない変異体キネシン頭部を融合したコンストラクトを用いた。尾部と変異体キネシンとの間にランダムコイルペプチドを挿入し、その前後にFRET用のドナーとアクセプターの蛍光色素を導入した。ATP非存在下と比べてATP存在下ではFRET効率の低下が見られた。これはキネシンに十分な負荷がかかってランダムコイルが伸びていることを示すものである。次に、野生型キネシンの2つの頭部にそれぞれドナーとアクセプターの蛍光色素を導入し、FRET効率を一分子レベルで観察することにより、キネシンが両足結合状態と片足結合状態を交互に遷移しながら運動する様子を観察した。

その結果、飽和ATP存在下で負荷を受けて運動しているときには無負荷の場合と比較して、片足結合状態を取る時間が大幅に長くなることが分かった。この結果は、片足結合状態から両足結合状態への遷移が最も負荷の影響を受けること、また浮いた頭部の拡散による前方への移動が負荷により抑えられることがその構造基盤であることを示すものである。
脳精巣に特異的に発現する新規免疫グロブリンスーパーファミリーメンバーの機能解析

脳や精巣に特異的に発現している免疫グロブリンスーパーファミリーメンバーの一つであるBT-IgSF(brain-and testis-specific immunoglobulin superfamiliy)の機能を明らかにするため、中枢ニューロンや精巣での局在を調べた。まず、培養細胞に遺伝子導入した実験から、BT-IgSFはホモフィリックな結合様式を示すことを明らかにした。そこで、BT-IgSF蛋白質塗布皿で培養海馬ニューロンを培養したところ、著しい突起伸展が認められた。抗BT-IgSF抗体処理では、その伸展が著明に抑制された。一方、培養ニューロンあるいは胎児脳ニューロンにBT-IgSFを遺伝子導入すると、BT-IgSFの過剰発現ニューロンは、周囲の細胞との接着性を低下させ、結果として変性・死滅に至った。これらのことから、BT-IgSFはホミフィリックな様式で細胞接着を促進するだけでなく、おそらく、ヘテロフィリックな様式で抑制的に制御をする可能性が考えられた。精巣ではBT-IgSFの遺伝子発現は円形精子細胞で一過性に増大し、成熟精子でその蛋白質分子が機能することが判明した。現在、抗BT-IgSF抗体処理により受精に及ぼす効果を検討しつつあるが、今後さらに精子の形成過程や受精に至るプロセスでの役割を明らかにする研究を行っていきたい。さらに、アルツハイマー病病態モデル細胞系の変性過程におけるBT-IgSFの関与を解析したが、結局、この変性過程にはBT-IgSFは著しい関与がないとの実験結果であった。しかし、アミロイドを生産する前駆体蛋白質とBT-IgSFの局在がグリア細胞で一致したことから、なんらかの相互作用があると考えられた。その分子構造から細胞接着分子としての機能が推測されるため、まず、培養COS7細胞にBT-IgSF遺伝子を導入した。その結果、培養皿基壁への細胞接着が著しく低下し、むしろ遺伝子導入細胞間での細胞接着が増強された。また、遺伝子導入細胞では、細胞増殖の抑制も認められた。この抑制効果は、あるフェーズで細胞周期が阻止されたためか、接着系細胞が浮遊することによるものかを明らかにするため、現在、アデノウイルス系を用いて精査している。また、脳や脊髄組織における免疫化学により、脳梁のみならず脊髄の交連線維などに内在性BT-IgSF発現を認めた。現在、培養神経細胞とBT-IgSF遺伝子COS7細胞の併置培養を進めており、神経突起伸展の促進や分枝効果の作用を確かめているところである。一方、精巣におけるBT-IgSF発現パターンを解析した実験から、精子形成ステージIIからVII(特にIVVI)の円形精子細胞期に特異的発現をしていることが明らかになった。ウエスタンブロツト法での解析により、精巣では脳と同様に52hDa分子が認められたが、精巣上体や精漿では、23kDaの分子が多く認められた。今後、これらの差異のみならず、脳や精巣におけるBT-IgSF作用の分子機構を明らかにしたい。海馬ニューロンを初代培養すると、始め培養1週間ほどでは、BT-IgSFは神経細胞の細胞膜に均一に分布していた。培養時間の経過と共に、次第に局在化を示す傾向にあり、培養3週間で局在する神経突起部分とそうでない非局在領域が明確になった。グリア細胞のコンフルエントにして、新たにニューロンを添加しコカルチャーを実施すると、局在化の現象は加速された。また、可溶化させたBT-IgSFを塗布した培養皿でニューロンを培養すると、ニューロンの細胞接着や神経突起の伸展は著しく促進されたが、それらの促進効果は、その抗体により阻害された。これらのことから、BT-IgSFは神経細胞接着を制御する細胞接着分子作用を有することが明らかとなった。一方、培養ニューロンにBT-IgSF遺伝子を導入すると、それらのニューロンは、他のニューロンやグリアなどとの細胞接着性を低下させ、23日のうちに変性、死滅した。