hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ＭＲＩ・ラマン分光による間質液pH・重炭酸イオン濃度の非侵襲的測定法開発

2012年における糖尿病患者数は世界で3億7千万人、我国で2千万人にものぼ、2型糖尿病患者におけるアルツハイマー型認知症発症のリスクが高い。我々は、2型糖尿病での病態の本体ともいえるインスリン抵抗性の発症およびアルツハイマー型認知症におけるアミロイドベータ生成に組間質液pH低下が関与していることを明らかにした。ヒト脳間質液pHおよびHCO3-濃度測定は糖尿病・アルツハイマー型認知症の予防医学的診断に重要な役割を担っているが、ヒトの脳内組織間質液pHおよびHCO3-濃度の非侵襲的測定法は未だ開発されていない。ヒト間質液pHおよびHCO3-濃度の非侵襲的測定法を開発すことも本研究の目的とする。2012年における糖尿病患者数は世界で3億7千万人、我国で2千万人にものぼる。また、2型糖尿病患者におけるアルツハイマー型認知症発症のリスクが高いことも報告されている。従って、ヒト脳間質液pH測定は糖尿病・アルツハイマー型認知症の予防医学的診断に重要な役割を担っているが、ヒトの脳内組織間質液pHの非侵襲的測定法は未だ開発されていない。間質液HCO3-濃度測定は間質液pH低下原因解明のため重要であるが、間質液HCO3-濃度非侵襲的測定法も未だ開発されていない。【研究目的】A)核磁気共鳴画像法を用いて、ヒト間質液pHの非侵襲的測定法を開発する。B)pH低下の原因解明のため、ラマン分光を用いてHCO3-濃度の非侵襲的測定法も開発する。ラマン分光を用いたHCO3-濃度の非侵襲的測定法をほぼ開発し得ている。また、他のイオンについても測定する測定法の開発を行なっているところである。間質液重炭酸イオン濃度測定は間質液pH低下原因解明のため重要であるが、間質液HCO3-濃度非侵襲的測定法も未だ開発されていない。【研究目的】核磁気共鳴画像法およびラマン分光法をを用いて、間質液pHおよび重炭酸イオン濃度の非侵襲的測定法を開発する。【研究結果】まず第一段階として、pHおよび重炭酸イオン濃度を溶液系・細胞系を用いて測定した。その結果、pHおよび重炭酸イオン濃度を測定し得る測定法の開発に成功した。即ち、ラマン分光1016cm-1スペクトル強度が重炭酸イオン濃度変化に応じて線形的に変化することが明らかとなった。一方、二酸化炭素濃度に依存してスペルトル強度が変わりうるバンドをほぼ特定した(論文投稿準備中)。重炭酸イオンおよび二酸化炭素濃度の測定が可能となったことにより、pHの定量的値が計測可能となった。この成果をもとに、ヒト間質液pH測定法の開発を現在進めているところである。動物実験を実施して、溶液中に存在する種々の物質のラマン分光測定における問題点についても検討する。分子細胞生理学
体節形成における分節化開始機構の解析

われわれはすでに、Mesp2ノックアウト(KO)マウスを作製し、このマウスでは、体節の前部の特徴が失われている(後方化している)ことを明らかにしてきた。一方、古閑らによって作成された、PS-1KOマウスは、分節が起こらないといった点では、Mesp2KOマウスと類似した表現形を示すが、その前後極性に関して、対照的な前方化の表現形をしめす。ここで重要な事実として注目したのがDelta-1の発現パターンである。野生型におけるDelta-1の発現は、未分節中胚葉の最も尾部側で非常に強い発現を示すが、分節の直前で発現が低下するとともにその発現領域が体節の後半部分に局在しストライプパターンを示す。そしてDelta-1KOマウスは前方化の形質を示すのである。Mesp2KOマウスではDelta-1の尾芽部分の強い発現が持続し、ストライプも形成されない。すなわち、Mesp2は、Delta-1の発現を抑制するように働く。一方、PS-1KOマウスでは尾芽部分の発現は全く変わらないが、ストライプ部分での発現が完全に失われる。すなわち、*-1は体節の後方部におけるDelta-1の発現を誘導にかかわる。すなわち、ストライプ部分におけるDelta-1の発現量及びパターンがその後の脊椎骨の前後極性とよく一致していることがわかった。しかし、Mesp2KOマウスでは、Notch1の発現が減少しており、その下流にNotchシグナル系が働くことが示唆されていたが、Notchシグナル系に直接関与すると考えられるPS-1のKOマウスが全く逆の形質を示すのは驚きであり、さらに遺伝学的解析の必要性を示唆していた。そこでMesp2及びPS-1のダブルKOマウスを作成し解析した。その結果、ダブルKOマウスはMesp2と全く同様の形質を示すことが判明した。この結果は、単純なカスケードの上下関係では説明できない。そこで、この遺伝学的相互作用がどのような、分子機構によるのかを解析するため、以前作成したMesp2遺伝子座にNotch1をノックインしたマウスを利用してさらに解析をおこなった。Notch1ノックインマウスは一見Mesp2KOマウスと同様の表現形を示すが、Delta-1の発現は減少していることが判明しており、少なくとも、導入したNotch1はDelta-1の発現を抑制する働きを示す。そこで、このマウスとPS-1KOマウスを掛け合わせたところ、さらにDelta-1の発現が減少し、脊椎骨にも一部前方部の形質が現れたのである。すなわち、Delta-1の誘導にかかわるPS-1を介したNotchシグナル系を遮断することより、さらにDelta-1の発現が低下し、その結果、細胞は、前方の性質を示すようになったと考えられた。
分子ナノ界面を利用した高性能フレキシブル熱電変換材料の創成

カーボンナノチューブ(CNT)の印刷成膜法の確立、CNT/有機強誘電体ナノ粒子/イオン液体コンポジットの作製と熱電特性評価、CNTの安定なn型ドーパント探索を行った。1成膜後に真空アニールにより容易かつ高効率に除去可能な界面活性剤の探索を行った。真空下熱重量測定と赤外分光測定を組み合わせることで、非イオン性界面活性剤が適していることを見出した。インクジェット法によってCNTを所望のサイズにて成膜可能にするとともに、界面活性剤とCNTの吸着エネルギーを定量化した。2再沈法によって有機強誘電体P(VDF/TrFE)のナノ粒子を形成可能とした。これをCNT分散水に添加、印刷成膜することで、双方の材料が良好に分散したコンポジットを作製した。続いてCNTの半導体極性をP(VDF/TrFE)の分極によって制御するため、コロナ放電によるポーリングを行った。しかしコロナ電圧の符号によらずコンポジットはp型を示し、CNTの半導体極性をn型に制御することができなかった。CNTの導電性が高いため、コンポジットにおいてP(VDF/TrFE)に十分な電界が印加されなかったことが原因と考えられる。しかしイオン液体を添加した場合、ゼーベック係数の有意な増加を確認した。3種々のビニル高分子をCNTにドーピングしてゼーベック係数を測定した結果、ポリビニルアルコール、ポリ酢酸ビニルという極めて汎用性・安全性の高い高分子ドーピングによりCNTが大気安定なn型材料に変化することを見出した。また熱電モジュールを簡便・高速に作製するプロセスとして、光によるCNTのドープ・脱ドープ法を着想した。高分子ドープ後、紫外線により高分子の化学構造を部分的に変化させることで、p型およびn型CNTの接続を簡便に作製可能とした。本プロセスは原理的に3Dプリンタとの相性も良く将来的な熱電素子の簡便な製造に有効であると考えている。印刷プロセスの確立、有機強誘電体ナノ粒子・イオン液体との複合といった構造形成、評価をほぼ完了したため。また、資源制約が低く、安全性の高い安定な電子供与体を偶然にも発見するとともに、CNT/ドナーの同一界面から簡便に双極型熱電モジュールを形成する手法を提案することができたため。CNT/イオン液体コンポジットに対してP(VDF/TrFE)層を積層した電界効果型トランジスタ構造にて、ゼーベック係数の増加ならびにp型/n型制御を試みる。CNT/P(VDF/TrFE)積層素子において、ゼーベック係数および導電率のCNT伝導型(半導体、金属)依存性を確認する。
マグネシウム合金の表面化現象と耐食性酸化膜の生成メカニズムに関する研究

本研究は、実用金属としてもっとも軽量であり、省資源、生活環境の向上のために有用であるマグネシウム合金の活用のために、耐食性等に直接影響を及ぼす表面酸化皮膜の微細構造の解析と成長機構の基礎的解明を行うことを目的とした。資料として純マグネシウムおよびAZ系のダイカストを用い、種々の電解液中で電位及び電流制御した条件でアノード酸化して皮膜を作製し、アルミニウムに比較して解明の遅れている表面皮膜の成長機構を明らかにした。得られた結果を以下に要約して示す。1.マグネシウムも電解研磨が可能で、鏡面が得られる。研磨による酸化皮膜は、塩素の凝縮した外装とより緻密な内装の2層構造を持つ。2.多孔質皮膜の生成は基本的にアルミニウムに類似し、バリアー層の生成と微細孔の発生の過程をとる。3.アルカリ溶液中で低電圧アノード酸化したときの電圧と電流値との関係は、純度や合金組成に依存せず5V付近で電流が極大となり、その後低い電流領域を経た後、微少なスパークを伴って絶縁破壊が起こり電流が急上昇する。その臨界電圧は資料純度に大きく依存し、99.6%で50V、AZ91、および99.5%で100Vである。5Vで電流が極大を持つのは皮膜の性質がこの電圧付近で変わるためである。この5Vでの特異な挙動は中性や酸性溶液中では観察されない。電解液がフッ化物系の場合は、AZ91が70Vである以外資料の臨界電圧はほぼ同一の60Vとなる。Alイオンを電解液に添加すると臨界電圧は上昇する。4.素地あるいは電解液中にAlが存在すると、優先的に皮膜に取り込まれスピネル(MgAl_2O_4)を形成する。これがAlの存在により緻密で保護性の高井皮膜が生成する主因となる。本研究は、実用金属として最も軽量であり、省資源、生活環境の向上のために有用であるマグネシウム合金の活用のために,耐食性等に直接影響をおよぼす表面酸化皮膜の微細構造の解析と成長機構の基礎的解明を行うことを目的としている。本年度は,試料として純マグネシウムおよびAZ系のダイカストを用い、標準的な電解液に加えてふっ素を含まない電解液、クロムを含まない電解液による処理膜を、電位および電流制御した条件でアノード酸化して作製し,アルミニウムに比較して解明の遅れている表面皮膜の成長機構を明らかにするとともに、環境問題に配慮した皮膜生成の可能性を探索した。なおこれらの結果は1999年10月のThe 4^<th> Asia-Pacific Interfinish Congress(Seoul,Korea)および1999年3月の表面技術協会の講演大会で発表した。1)マグネシウムも過塩素酸ーエタノール溶液により電解研磨が可能で,鏡面が得られる。研磨による酸化皮膜は,塩素の濃縮した外層とより緻密な内層の2層構造を持つ。2) Alでバリヤー型皮膜が生成する電解液においてマグネシウムでは多孔質型皮膜が生成する。3)多孔質皮膜の生成は基本的にアルミニウムに類似し,バリヤー層の生成と微細孔の発生の過程をとる。4)皮膜の生成電圧は必ずしもバリヤー層の厚さと比例しない。5)ケイ酸ナトリウム溶液中での封孔処理によって,皮膜表面および多孔質中にケイ素を含む水和物層が析出し,スパッタされにくい膜に改質される。マグネシウムは実用合金で最も軽量でかつ人体に無害であり,種々の分野で環境負荷の少ない素材としての活用が期待されるが,活性な金属であり耐食性向上のための表面処理が重要な役割を持つ。

本年度は,耐食性皮膜を得るための基礎研究として,主としてアルカリ性電解液中でのアノード酸化挙動と生成する皮膜構造を,素地純度の効果,および電解液中のAl^<3+>イオン共存の効果と共に検討した。その結果,以下に示す新規な事実を明らかにできた。これらの研究成果は国内学会および国際会議で発表した。1)アルカリ溶液中で定電圧アノード酸化したときの電圧と電流値との関係を調べた結果,純度や合金組成が変わっても,いずれも5V付近で電流が極大となり,その後低い電流領域を経た後,微小なスパークを伴って絶縁破壊が起こり電流が急上昇する。その臨界電圧は試料純度に大きく依存し,99.6%で50V,AZ31で90V,AZ91および99.95%で100Vであった。これは,39%含まれるAlが生成する酸化皮膜の安全性を高め,絶縁破壊を妨げるためである。素地中のAlは電流増加を抑える効果を持つ。5Vで電流が増大するのは皮膜の性質がこの電圧付近で変わるためと推定される。この5Vでの特異な挙動は中性や酸性溶液中では観察されない。2)電解液がフッ化物系の場合は,AZ91が70Vである以外試料の臨界電圧はほぼ同一の60Vとなった。これは皮膜の成分としてMgF_2が生成し,それが皮膜の性質を支配して素地純度の効果を相対的に低下させるためである。AlF_3の溶解度は高いため溶液中に溶出し,Alの皮膜保護性の効果はNaOH溶液の場合に比較して低下する。3)素地あるいは電解液中にAlが存在すると,優先的に皮膜に取り込まれスピネル(MgAl_2O_4)を形成する。これがAlの存在により緻密で保護性の高い皮膜が生成する主因となる。
小児骨髄異形成症候群（RAEB, RAEBT）の分子病態解析

AML(n=22)では,計12/22(54.5%)でメチル化がみられたが(中央値1個, 0-5個),正常検体や寛解期検体ではメチル化はみられなかった。ESR1, CDH13, CDKN2B, CADM1が高頻度にメチル化し,それ以外の18遺伝子ではメチル化はみられなかった。CBF-AMLではnon-CBF-AMLよりメチル化がみられた((7/8 vs. 5/14, p<0.05))。特にt(8;21)の4/4でCDH13 , inv(16)の3/4でESR1のメチル化がみられた。正常核型とFAB-M3(n=3)ではメチル化はみられなかった。ターゲットシーケンスで8個のがん抑制遺伝子について解析したが、変異はみられなかった。それ以外のepigenetic modifierとして有名なDNMT3A/3B, TET2, IDH1/2, ASXL1, EZH2遺伝子などの変異もみられなかった。以上よりがん抑制遺伝子のメチル化はadvanced MDSの状態から開始していることが示唆された。従来、RAEB, RAEBTの治療成績は、造血幹細胞移植なしで化学療法のみでは生存率は30%とされ、造血幹細胞移植が推奨されてきた。一方近年FAB分類でRAEBTと診断された、芽球比率20%以上30%未満の症例は、WHO 2008分類では急性骨髄性白血病(Acute myeloid leukemia, AML)と診断された。これを受け、本邦小児の全国的白血病研究グループであるJapan Pediatric Leukemia Study Group (JPLSG)では、従来のWHO分類のRAEBT症例27例について、AMLの化学療法を行ったところ、22例が寛解に入り、うち10例のみが移植を行い、6例生存しているのに対し、移植なしの症例は12例中10例生存していた。次に日本小児血液・がん学会(Japanese Society of Pediatric Hematology/Oncology, JSPHO)のMDS委員会の協力の元、RAEB例についても後視的解析を行ったところ、データが集まった19例中寛解導入療法が行われた16例については、12例が寛解に入り、うち8例が移植を受け、7例が生存、一方移植を受けなかった4例は全例が生存していた。これらの結果は、RAEBT/RAEB症例の中にも骨髄移植なしで治癒可能な症例が存在することを示唆した(現在Leuk Res投稿し、revised中)。またRAEBT例についてはde novo AMLでみられる、NRAS, KRAS, FLT3, KIT, WT1, NPM1などの遺伝子変異は、de novo AMLでみられるものより明らかに少なく、パイロットで行った、RAEB/RAEBT 3例のターゲットシーケンスによる解析では、GATA3, ASXL1, SETBP1など成人のMDSでみられる変異が見つかっている。25種類のがん抑制遺伝子のプロモーターのメチル化解析ではRCC 4例、RCMD 2例と正常コントロールではメチル化は見られなったのに対しRAEBT/RAEB 4例のうち3例でESR1ないしCADM1遺伝子のメチル化が共通して見られた。これらの遺伝子のメチル化はAMLでもみられるため、病勢の進展に関与しているものと考えられた。過去の臨床データについては、まとめて国際学会で発表し、現在Leuk Resに投稿し、revised中である。target sequenceとepigenetic解析の予備実験は終了している。今後RAEBT/RAEBの多数例の解析については、JPLSGのAML委員会内で承諾を得ており、倫理審査書類準備中である。また日本造血細胞移植学会のTRUMPデータを用いて、これまでAYA世代までのRAEB/RAEBT例に関する移植の全データを集めることも内諾を得ている。FAB分類のRAEBT例についてはWHO2008分類ではAMLに分類され、WHO2016分類でも踏襲された。FAB分類のRAEB例に関してもWHO2016分類で大きな変更はみられなかった。RAEB例はこれまで前方視的解析がなかったため、JPLSG AML委員会で観察研究を行うことが決定した。メチル化解析に関しては、MLPA法による解析に加え、バイサルファイトPCR法を用いた解析も可能となっている。Target sequence法による遺伝子解析もSanger法による確認もできており、可能である。RAEB/RAEBTの多数例での解析について、院内の倫理審査は通過し、JPLSGの倫理審査の結果をまってから解析を開始する予定である。少数例ではあるが、target sequenceとメチル化解析の検討は終了し、2018年度のAACRでポスター発表した。日本小児白血病リンパ腫研究グループ(JPLSG)のRAEB/RAEBT検体については、遺伝子解析を開始する前の倫理審査は、学内の審査は通過しているが、日本小児白血病リンパ腫研究グループの研究倫理審査委員会で現在審議中であるが、2018年5月中には受理される予定である。研究代表者が多忙を極めるなどの理由で、本研究の遂行に時間を要しており、平成29年度内に完了できないため。1年間延長申請を行い、受理された。ESR1, CDH13, CDKN2B, CADM

1が高頻度にメチル化し,それ以外の18遺伝子ではメチル化はみられなかった。CBF-AMLではnon-CBF-AMLよりメチル化がみられた((7/8 vs. 5/14, p<0.05))。特にt(8;21)の4/4でCDH13 , inv(16)の3/4でESR1のメチル化がみられた。正常核型とFAB-M3(n=3)ではメチル化はみられなかった。ターゲットシーケンスで8個のがん抑制遺伝子について解析したが、変異はみられなかった。それ以外のepigenetic modifierとして有名なDNMT3A/3B, TET2, IDH1/2, ASXL1, EZH2遺伝子などの変異もみられなかった。以上よりがん抑制遺伝子のメチル化はadvanced MDSの状態から開始していることが示唆された。今後RAEBT/RAEBの多数例でtarget sequenceとepigenetic解析を行う予定である。また日本造血細胞移植学会のTRUMPデータを用いて、これまでAYA世代までのRAEB/RAEBT例に関する移植の全データを集め、データベースを構築する予定である。また移植されない例は、漏れてしまうので、JPLSG AML委員会内にRAEBのworking groupを立ち上げ、前方視、後方視的データ収集とデータベースの構築を行う予定である。JPLSGの倫理審査が終了次第、速やかに検体をいただき、メチル化解析と変異遺伝子解析を行う予定である。また臨床的にはWHO2016分類に対応し、これまで国内ではRAEBの前方視的疾患登録が行われてこなかったので、JPLSG AML委員会内にRAEBに関するworking groupを立ち上げ、次年度中に開始する予定である。合わせてこれまでの後方視的検討も行う予定である。1年間延長申請を行い、受理されたので、今年度中に鋭意努力して、完了させる予定である。次世代シーケンサー関連試薬が高額なため、次年度に回し、合算して物品購入を行いたいため。予定していた遺伝子解析の検体数に達しなかったためH29年度中に完了できなかった、JPSLGのRAEB/RAEBT検体についての検討を、JPLSGの倫理審査承認後、延長申請の認められたH30年度に実施する予定である。次世代シーケンサー関連試薬の購入倫理審査承認後、多数例での解析を実施予定
雨水浸透処理による都市域の水循環系の保全に関する基礎的研究

1.浸透性能の評価手法:昨年度、数値計算により浸透速度を評価する方法を提案した。これは非定常問題のため多大の計算時間を要し大型計算機を必要とした。しかし、施設の設計という面からみると終期浸透速度が第1の関心事である。また、非定常数値解析の結果、ある一定時間が経過すれば飽和域の形がほぼ定常に達することがわかっていたので、パソコンによって浸透性能の評価が簡単にできる定常解析モデルの開発を試み成功した。また、異なる2水位による原位置小型ボアホール試験と上述の解析法を組み合わせることにより、異方性地盤の浸透性能を評価するアルゴリズムを開発した。このアルゴリズムの妥当性は、推定値と現地注入実験結果を比較することにより検証された。2.既存施設の追跡調査:千葉実験所のろ過層と浸透トレンチ、ならびに住都公団が東京都昭島つつじケ丘ハイツに設置した各種浸透施設を追跡調査した結果、次のことがわかった。(1)浸透性能の変化とその原因ろ過層および浸透桝は、礫層の表面が目詰まりしているだけであり、浸透トレンチには目詰まりが認められなかった。以上のことにより、ろ過層ないしは浸透桝を適当に管理すれば、浸透の主力部分であるトレンチの目詰まりは防げるものと判断される。(2)土壌水の水質千葉実験所内浸透トレンチでは、T-NとTOC、昭島つつじケ丘ハイツでは水道水の検査項目について水質試験が行われた。その結果、屋根排水に関する限り、浸透水が土壌ひいては地下水汚染につながる懸念は少ないと判断される。他の土地用途から排出される雨水が土壌水に及ぼす影響については来年度の課題としたい。
ストレス応答タンパク質Ｍ６ａのエピジェネティクスからみる神経可塑性とその異常

我々は、ストレス応答タンパク質M6aが、発生過程において神経成長円錐で最も多く発現する膜タンパク質の一つであり、細胞内外のシグナル伝達分子との相互作用により,細胞外基質依存的な神経極性決定を制御することを見出した。M6aは、海馬にも大脳皮質にも発現し、両神経細胞において極性決定を制御していた。マウス胎児脳でのM6aノックダウン実験は、大脳皮質での急激なM6aの発現低下が,中間帯における遊走神経細胞の極性決定や、軸索伸長も遅延させることを示した。本研究により、M6aのエピジェネティクスな発現抑制が、脳神経回路形成に不可欠な神経極性決定の遅延を引起こし得ること、及びその分子機構を明らかにした。M6a発現の脳形成における役割とその抑制による作用について、分子レベルから細胞、脳組織に至るまでを解析した。分子レベルにおいて、生化学的にM6aと神経極性決定を制御する分子との相互作用を調べ、その下流に既知の神経極性決定経路があることを明らかにした。また、M6aが特定の微小膜領域に存在し、M6aの発現がその膜領域における神経極性決定関連分子の分布や活性に関与する事を明らかにした。細胞レベルでは、siRNA導入によりM6a発現抑制した海馬・大脳皮質や、M6aトランスジェニックマウスの海馬・大脳皮質の神経細胞の発生過程を調べ、M6aの発現抑制が、ラミニン基質上における神経極性決定を阻害する事を明らかにした。組織レベルにおいて、子宮内エレクトロポレーションを用いてマウス胎仔脳へのshRNA導入をおこない、脳内においてM6a発現が抑制された際の脳形成への影響を調べた。shRNAと共発現するGFPの解析から、導入細胞の脳内における発生過程を調べたところ、導入細胞の発生過程の遅延がみられた。今後、更に組織レベルでの解析が必要とされるが、上記の結果から、M6a発現が、特定の微小膜領域において神経極性決定関連分子と相互作用し、神経極性決定を制御し、脳形成において重要な役割を持つことを明らかにした。また、M6aの発現抑制が、神経極性決定を阻害し、脳形成の遅延を引き起す事を明らかにした。これらの成果は、本研究課題であるM6a発現のエピジェネティックな抑制が、shRNAと同様に脳形成を阻害し得る事を示唆している。1, M6a発現と神経発生の関係を明らかにするため、海馬ならびに大脳皮質の培養神経細胞において、M6aに対するsiRNAをエレクトロポレーションにより導入し、M6aの発現を急性にノックダウンした神経細胞を作製、M6a発現抑制の神経発生における作用を解析した。これまでの我々が明らかにしてきた、M6aの「神経極性決定」や「突起伸長作用」における役割に焦点をおいて、M6aの発現抑制による軸索-樹状突起形成への影響を、免疫染色や、Green Fluorescent Protein (GFP)発現ベクターとsiRNAとの共導入を用いたイメージング法により解析した。培養神経細胞を用いることにより細胞外環境を人為的に変化させ、M6aの発現が、ラミニン基質依存的な神経極性決定や突起伸長において重要な役割を持つ事を明らかにし、海馬-大脳皮質のいずれの脳領域においてもM6aの発現が同様な作用を持つ事を示した。さらにM6aをノックダウンした神経細胞の免疫染色により、M6aの発現抑制が、既に相互作用分子として同定しているM6BP、Rap2を介して、神経極性決定因子を制御する事を明らかにした。2,生体マウス脳におけるM6a発現量と神経回路形成の関係を明らかにするため、M6aに対するshRNAを、マウス胎仔脳に子宮内エレクトロポレーションにより導入し、M6aの発現を急性にノックダウンしたマウスの作製を開始した。同手法にてGFPをコードするDNA配列を含むプラスミドを導入することで、GFP発現による脳内の神経細胞の可視化に成功している。本研究は、ストレスに伴う、糖タンパク質M6aのエピジェネティクスな発現低下と、脳形成異常との関係を明らかにし、脳形成に関与するエピジェネティクスの標的としてのM6aの役割を解明するものである。我々は、分子レベルの解析より、M6aは神経軸索成長円錐において、極性決定に関与する分子群と蛋白質複合体を形成することを明らかにした。海馬・大脳皮質神経細胞を用いた細胞レベルの解析では、RNAiによるM6aの発現抑制が、ラミニン基質上における神経極性決定を阻害し、軸索形成を抑制した。これらの結果は、M6aの発現低下が、脳形成に作用する可能性を示唆していた。本年度の研究では、子宮内エレクトロポレーション法を用いて、マウス胎仔脳へのshRNA導入を行い、脳内においてM6a発現抑制した際の脳形成への影響を調べた。

これまでに脳内での神経極性形成過程について解析されている大脳皮質での、shRNAによるM6a発現抑制の作用を解析したところ、導入したM6aノックダウン細胞における軸索伸長の遅延が確認された。更に、発生過程の早い段階で解析したところ、大脳皮質中間帯において、神経細胞の多極性細胞から二極性細胞への極性変化が遅延していることが明らかになった。M6aは、発生過程の大脳皮質において中間帯に多く発現しており、M6aの発現が大脳皮質中間帯における極性決定過程に重要な役割を持つ事が分かった。細胞レベルにおける結果は、M6aが大脳皮質だけでなく、海馬においても同様に極性決定に関与することを示しており、本研究成果により、ストレス等によるM6aのエピジェネティクスな発現低下が、脳形成過程において神経回路決定に不可欠な神経極性決定を抑制・遅延させることが示唆された。神経科学これまでに、細胞レベルにおけるM6aの発現抑制が神経極性決定を阻害すること、またその分子機構を明らかにしてきた。更に、子宮内エレクトロポレーションを用いたshRNA導入による、マウス胎仔脳でのM6aの発現抑制が、脳形成における神経発生を停滞させることを確認した。このことは、M6a発現とその抑制が、細胞レベルだけでなく、脳形成に深く関与している事を初めて示唆するものであり、本研究目的を満たしている。しかし、細胞レベルでのM6aのエピジェネティクス制御機構の解明が未だ不十分であり、shRNA導入によるM6aノックダウンマウス脳において組織解析が、更に必要であることから、本研究の目的達成についてやや遅れていると評価される。初年度は、M6aの発現と神経発達の関係を明らかにすることを目指しており、そのために申請者は分散培養した脳神経細胞におけるノックダウン法を用いて、M6aの発現抑制が、ラミニン依存的神経極性決定に重要な役割を持つことを明らかにした。さらに申請者は、M6a発現の作用機序を明らかにするため、M6aと相互作用する分子を解析し、M6a-M6BP-Rap2という複合体を同定。この複合体が、ラミニン依存的神経極性決定に関係する最も重要であり、極性形成時に特定の細胞外シグナルに対応していち早く形成され、既知の極性形成分子群の集積を誘導することを証明した。この知見は、M6aにより形成されるタンパク質複合体が、今まで多数見出されてきた極性関連分子とは全く別個な機構で働くことを見出したもので、脳神経発生過程におけるM6a発現の重要性を強く示唆しており、本年度目的としても充分に達成されており、学術的にも非常に高い評価を得ることができると考える。また申請者らは、脳発生過程における上記M6a発現の重要性を証明するため、脳内におけるM6aノックダウンマウスの作成に着手している。これまでに、M6a結合タンパク質M6BPノックアウトマウスにおける子宮内エレクトロポレーションによるGFP発現プラスミド導入により、脳内における神経極性形成の異常を観察するなど、M6aノックダウンマウスにおける神経極性形成への影響を強く指示する知見も得ており、次年度の実験計画内容に進展できるものと評価している。1、子宮内エレクトロポレーションを用いたマウス胎仔脳におけるshRNA導入により、in vivoにおけるM6a発現抑制が、脳形成においてどのように作用するのかを明らかにする。既に、shRNAを導入した胎仔脳内において、神経発生過程が遅延していることを確認している。
均一な空間分布のマイクロ波誘起常圧プラズマ発生のための誘起体のマクロ構造制御

本研究では、誘起体の微細構造および組成変化を伴わずに、長期間安定して大気圧の空気中でプラズマを発生できる新たなプラズマ誘起体を、Mosi_2やFeSi等のケイ化物を中心に探索し、さらに、均一な空間分布の大気圧プラズマを発生させるためにマクロ構造制御を行うことを目的とした。具体的には、まず、SiC、MoSi_2ハニカムおよびFeSiを誘起体に用いてマイクロ波誘起プラズマの発生状態を調べた。本研究で用いたMosi_2ハニカムは、アルミナハニカムの表面をMoSi_2粉末でコーティングしただけの材料であったので、そのプラズマ発生能はSiCおよびFeSiに比べて劣り、ハニカムの空洞内部でプラズマを発生させることはできなかった。また、N_2キャリアーガス中での長期間のプラズマ発生では、SiCおよびFeSiのどちらの場合でも誘起体としての熱安定性に問題があり、さらに熱安定性の高い誘起体の探索が必要と考えられる。また、SiCおよびFeSiから発生したN_2プラズマによるMCBの分解特性に及ぼす雰囲気中のO_2濃度の影響を調べた。どちらの誘起体を用いた場合でも、プラズマが発生すればMCBの転化率はほぼ100%となった。ただし、O_2の添加量が3.0%と少ない場合には、300600ppm程度のCOが生成し、モノクロロベンゼンを完全には酸化分解できなかった。なお、どちらの誘起体の場合でも、O2添加量を増やすと、COの生成量は減少し、完全酸化が促進された。ただし、完全酸化という観点からは、誘起体としては、FeSiよりもSiCの方が優れていることがわかった。本研究では、モノクロロベンゼン等のダイオキシン類似化合物をマイクロ波誘起プラズマで高効率に分解するために、プラズマ誘起体の最適なマクロ構造を設計することを目的としている。この目的のために、まず、マクロ構造を制御していない各種プラズマ誘起体からのO_2-N_2混合ガス中でのプラズマの発生状態と発生したプラズマによるモノクロロベンゼン(MCB)の分解特性を比較検討した。プラズマ誘起体としては、SiC多孔質焼結体、FeSi、シリコンスクラップおよびMoSi_2を用いた。0.16%MCB-3.010%O_2-N_2気流中でこれらの誘起体にマイクロ波(150W程度)を照射してプラズマを発生させ、モノクロロベンゼンの分解挙動を調べた。用いた誘起体の中では、MoSi_2のみプラズマの熱によって微細構造が変化し、N_2ガス気流中で長時間安定にプラズマを発生できなかった。他の誘起体については、プラズマを長時間安定に発生でき、プラズマが発生していれば雰囲気中の酸素濃度に係わらず、MCBの転化率はほぼ100%になった。ただし、酸素濃度が3.0%と低い場合にはCOが300ppm程度生成し、酸素濃度の増加とともにCOの生成量は減少した。したがって、CO_2への完全酸化のためには、10%程度の酸素の添加が必要であった。なお、酸素添加量を増加すると、NO_xの生成量は逆に増加した(10%O_2添加時に約1.5%のNO_xが生成)。以上の結果から、SiC多孔質焼結体、FeSiまたはシリコンスクラップを誘起体に用いて窒素ガス雰囲気中で発生させたマイクロ波でMCBをほぼ完全に分解できることがわかった。ただし、N_2ガス雰囲気中でのプラズマ発生により多量のNO_xが生成するので、その除去方法を検討する必要がある。
大腸癌間質由来のmicroRNAの臨床的意義の解明と機能解析

近年、標的遺伝子の翻訳を制御する22塩基前後のsmall RNAであるmicroRNA(miR)が注目されている。miRは様々な遺伝子翻訳を制御することで発癌、癌進展に寄与することが明らかとなった。一方、癌細胞の周囲環境、つまり癌間質での遺伝子発現が癌細胞そのものの進展を制御するエビデンスが近年盛んに報告されているが、癌間質のmiRが癌細胞に対してどのような働きをするかは明らかとなっていない。本研究では癌特異的分子機構解明のため癌間質におけるmiR発現を調べることとした。まずLaser microdissection法を用いてRNAを抽出した。次にmiRマイクロアレイ(Agilent : 15K)を施行し、正常大腸腺管、正常大腸間質に比較して大腸癌細胞、癌間質において発現差を示すmiRプロファイルを調べた。その結果、癌間質で特異的に低発現であったmiRはlet-7, miR-17, miR-18, miR-20など21個で、逆に高発現であったのはmiR-192, miR-194など4個であった。これらのmiR発現と臨床病理学的因子の関係を調べたところ、16個のmiR発現量がリンパ節転移の有無と有意な関連を示した。本研究により癌間質におけるmiR発現プロファイルの変化が癌浸潤に関与することが明らかになった。今後はこれらのmiRがどのような標的遺伝子の発現を制御することで癌進展を制御するのかをあきらかにしていく必要がある。
フォリスタチンを用いた新しい肺線維症治療法の確立

1)これまでにアクチビンAがブレオマイシンなどにより誘発された肺障害の急性期において肺胞上皮細胞、マクロファージなどで発現が増加し、アクチビン受容体も発現することを示した。また急性炎症の収まる時期においては筋線維芽細胞においてアクチビン発現が著明に亢進することをも明らかにしてきた。このアクチビン作用は炎症促進作用、線維化促進作用を持つことが考えられる。そこでこのアクチビンの作用を拮抗作用をもつフォリスタチンを投与することによりブロックすると、急性炎症が抑制されるとともに、線維化が抑制されることを明らかにしてきた。また急性炎症期をすぎた後に投与しても線維化が抑制されることから、単に炎症を抑えるだけでなく、直接的な抗線維化作用を持つことを示してきた。さらにフォリスタチンの効果をより持続させる目的で、アデノウイルスベクターを用いた遺伝子導入を行ったところ、より強い抗線維化作用を示した。2)血管新生促進因子として知られている線維芽細胞増殖因子(FGF2)の作用におけるアクチビンの意義について検討を行った。その結果、コラーゲンゲル内の3次元培養系において、血管内皮細胞の管腔形成を促進する作用をもつFGF2の作用が内皮細胞の産生するアクチビンを介して発現されていることを明らかにした。アクチビン作用をブロックすることにより、FGF2の作用が抑制され、逆にアクチビンを添加することによりFGF2作用が増幅されることから、血管新生を促進あるいは抑制することが有効である様々な病態の治療に応用可能であると考えられる。ラットにブレオマイシンを気管内投与し,これによって誘発される肺線維症(ブレオマイシン誘発肺線維症)をモデルとして検討を行った。まずブレオマイシン投与後の肺におけるアクチビン、アクチビン受容体、アクチビンのアンタゴニストであるフォリスタチンの発現の変化を検討した。アクチビンのβAサブユニットはブレオマイシン投与後に発現が増加した。免疫組織化学法により投与後7日以内は肺胞マクロファージ、肺胞上皮細胞などに発現が増加し,それ以降ではさらに増生した線維芽細胞に発現が著明であった。アクチビン受容体の発現は肺胞上皮,マクロファージ、気管平滑筋細胞、線維芽細胞などに認めたが、ブレオマイシン投与後に変化は見られなかった。フォリスタチンはマクロファージ、肺胞上皮細胞などに発現していたが,ブレオマイシン投与後増加した。とくに7日以降には線維芽細胞に多く発現が見られた。そこでアクチビンの作用を抑制する作用を持つフォリスタチンをブレオマイシン投与後に静脈内に投与すると,ブレオマイシン投与初期(-7日後以内)の急性炎症が有為に抑制され,肺胞マクロファージ数も減り,肺胞洗浄液のタンパク量やLDH量も減少し,また細胞数も有為に減少した。それとともに投与4週後の組織における肺線維化も著明に改善していた。また肺線維症のメルクマールであるハイドロキシプロリン含量も有為にフォリスタチン投与群で低下していた。以上の結果から,ブレオマイシン誘発肺線維症にはアクチビンが関与しており、それをフォリスタチンで抑制することにより肺線維化が抑制できることが明らかになった。
疾患特異的マイクロRNAを治療標的とした頭頸部癌の新規治療戦略

本研究は、臨床検体を用い、喉頭癌に特徴的に発現し、様々なしくみで遺伝子発現をコントロールしているマイクロRNAを複数(miRNAs)見出した。さらにはこれらのmiRNAsのうち、癌組織で上昇傾向を示したものに対してはその作用を阻害する遺伝子を、減少傾向を示したものに関してはその作用を模倣する遺伝子を頭頸部の癌細胞に導入し、その細胞増殖を抑制する効果を確認した。さらに、動物モデルを用い、同様の治療で癌の増殖ならびに転移の抑制が可能であることを突き止めた。結果として、疾患に特徴的なmiRNAsが、頭頸部癌の診断・治療標的として有用である可能性を示唆することができた。本研究は、頭頸部癌における独自のマイクロRNA(miRNA)発現プロファイルをもとに、治療標的として有用な疾患特異的miRNAsを、臨床情報が管理された豊富な臨床検体を用いて解析・選定し、頭頸部癌の新規治療システムを構築することを目的としている。3年計画の1年目である本年度は、治療標的を絞り込むため、これまでのマイクロアレイ解析で疾患に特徴的な発現傾向を示したmiRNAsにつき、多検体で定量的に発現を解析した。まず同一患者の非癌部分と癌部分での発現量を5組で比較し、4つのmiRNAsの発現量が有意に異なることをつきとめた。これらのうち、(1)良性疾患、(2)前癌病変、(3)癌の3群における発現量の比較で、(1)と(3)ならびに(2)と(3)で有意差を認めたmiR-196aを有望な標的候補と考え、91検体で解析した。その結果、早期癌(T1-T2)と進行癌(T3-T4)、さらに前癌病変(dysplasia)と極めて初期の癌(T1a)のいずれの比較でも後者で有意に発現増加を認め、miR-196aの疾患バイオマーカーとしての有用性、疾患の進行との関与、治療標的としての可能性が示唆された。下咽頭癌及び子宮体癌においてもmiRNA発現プロファイルは疾患に特徴的であり、このことはmiRNAsが疾患特異的なバイオマーカーとなり得ることを支持した。さらに、組織検体を用いた27,578か所のCpGサイトのメチル化状態の解析の結果(illumina Human Methylation27)と併せ、喉頭癌では11のmiRNAsの発現に、それら近傍のゲノム上メチル化制御が関与している可能性をつきとめ、miRNAsのエピジェネティックな発現制御機構の一端を明らかにした。なお、関東労災病院、ケアタウン小平クリニックの2施設が新規参画し、共同研究先が5施設に増えたことは、解析結果に普遍性を増し、今後の研究の質を向上させる。3年計画の2年目である本年度は、これまで我々が喉頭癌に特徴的な発現傾向を認めることを見出したmiRNAsのうち、発現の上昇傾向を示したmiR-196aに関してはその阻害遺伝子を、低下傾向を示したmiR-133b、miR-375に関してはその模倣遺伝子を頭頸部扁平癌細胞に導入し、その治療効果を検討した。喉頭癌由来のJHU-011細胞(Johns Hopkins医科大学のJoseph A.Califano医師より供与)を用い、まず遺伝子導入による細胞増殖抑制効果を検討した。いずれの系でも細胞増殖の抑制を認めたが、とくにmiR-196aを用いた場合、有意な細胞増殖抑制効果を認めた。さらに、cell viabilityを定量的に測定するアッセイとしてmultitox-fluor multiplex cytotoxicity assay(Promega)を行ったところ、生細胞数の有意な減少と、死細胞数の有意な増加を認めた。これらの結果はいずれも、頭頸部癌に特徴的な発現傾向を認めるmiRNAsが治療標的となり得ることを示唆するものであった。さらに、喉頭組織検体を次世代シーケンス技術(SOLiDtmシステム:Applied Biosystems)を用いた解析の結果、複数の新規miRNAsを見出した。これらは今後、頭頸部癌における新たな診断・治療標的となる可能性がある。また、国家公務員共済組合連合会立川病院が新規参加したことで共同研究組織が計6施設4診療科となり、本研究の汎用性・普遍性が増し、より質の高い研究となることが期待できる。

3年計画の2年目までに、我々は喉頭癌に特徴的な発現傾向を認めるmiRNAsを見出し、さらにはこれらのmiRNAsのうち、上昇傾向を示したmiR-196aに対してはその阻害遺伝子を、減少傾向を示したmiR-133b、miR-375に関してはその模倣遺伝子を頭頸部扁平上皮癌細胞に導入し、その細胞増殖抑制効果を確認してきた。本年度は、in vitroでとくに顕著な腫瘍細胞増殖抑制効果を示したmiR-196a阻害遺伝子の導入によるin vivoでの頭頸部癌治療効果の検討を行った。まず、ヌードマウスの頸部に喉頭癌由来のJHU-011細胞(Johns Hopkins医科大学のJoseph A. Califano医師より供与)を皮下注射して同所異種移植モデルを作成した。腫瘍径が3mm大となった時点で、週に1度、計3回miR-196aの阻害遺伝子を局注し(治療群)、治療効果を検討した。腫瘍細胞の皮下注射後12週まで追跡したところ、治療群において腫瘍の増殖は継続して有意に抑制された。さらに、頸部リンパ節を摘出してホルマリン固定し、HE染色にて検討すると、治療群においてリンパ節転移の抑制効果も認められた。本研究は、喉頭癌を例に、頭頸部癌に特徴的な発現傾向を認めるmiRNAsの存在の一端を明らかとし、その特徴的な発現署名が、将来的な診断の指標となる可能性を示唆した。さらに、疾患に特徴的な発現傾向を示すmiRNAsの治療標的としての有用性も示す結果を得ており、将来的な頭頸部癌の診断・治療技術の進歩に大いに寄与する成果を得ることができたと考えている。本研究の立案当初は、喉頭癌に特徴的なmiRNAsを治療標的として応用することを目的とした。研究を進める中で、1年目にはゲノム上での近傍のメチル化が、miRNAsのエピジェネティックな発現制御機構の一端を担うことを示唆する結果を得た。さらに2年目には、次世代シーケンス技術を用い、疾患の発症・進展に関与し得ると考えられる、新規miRNAsを複数見出すことができた。これらの結果から、我々は申請時の想定以上に、今後頭頸部癌を含めた多くの疾患の診断・治療において極めて有用となり得る成果を生み出していると考えている。24年度が最終年度であるため、記入しない。2年目の検討により、in vitroでは抗腫瘍効果が認められたmiRNAsにつき、そのin vivoでの効果を検証する。まず、マウス頸部に、喉頭癌由来のJHU-011細胞を注射して同所異種移植モデルを作成する。続けて、対象となる治療遺伝子を、腫瘍とその周囲に局注し、経時的に腫瘍経を測定する。一定サイズになるまで観察した上で腫瘍を摘出し、組織像を検討する。また、頸部の領域リンパ節も摘出し、転移抑制効果についても検討を加える。さらに、これまでの経過中、腫瘍の発症・進展に関与する可能性が示唆されたゲノム上でのメチル化の程度、あるいは我々が見出した、腫瘍関連遺伝子である可能性もある新規miRNAsの発現状況に関しても、これらのバイオマーカーとしての意義を、共同研究先の頭頸部以外の組織・疾患を対象に含めて引き続き検討し、本研究の幅を広げたい。
脳腫瘍における抗癌剤耐性の作用機序および克服に関する分子生物学的研究

脳腫瘍細胞(9LとC6細胞)を用い、抗癌剤に対する内因性および獲得性耐性をコロニ-形成法で解析した。抗癌剤としてAGNU、MCNU、NCS、BLM、CDDPを用い、親細胞に50%生存率量までの濃度系列で隔日に10回まで作用させた。9L細胞はACNU 10μMの5回以上の反復処理後に24μM濃度で100倍以上、直線部分での37%生存量で約6倍以上の耐性があった。一方、MCNU 3μMの10回処理細胞では24μM濃度での耐性が100倍以上であった。この感作方法でNCS、BLM、CDDPは耐性を誘導しないかった。C6細胞は内因耐性が9L細胞より高かったが、薬剤処理による耐性は獲得されなかった。脳腫瘍細胞DNAにおける抗癌剤の損傷部位は、ACNUとMCNUがDNA断方のguanine(G)ニ一致してDNAstrand breaks(SB)とalkali-labele sitesを選択的に形成した。一方、BLMはG-C(cytosime)、G-T(thymine)配列で、NCSはTとAでSBを形成したが、CDDPでは特異的な部位にSSBとalkali-labele sitesがともに検出されなかった。雌BALB/(nu/mu)マウスの背皮下移植脳腫瘍はACNU処理後に9L腫瘍の腫瘍体質が著しく減少したのに対して、C6腫瘍の減少は少なく、コロニ-法における内因性耐性の差異を反映した。AGNU耐性細胞(ACNU10回処理細胞)はMCNUに対して24μM濃度で親細胞の80倍の耐性があり、また、MCNU耐性細胞もACNUに対して耐性を示した。一方、ACNUおよびMCNU耐性細胞の用量生存曲線はNCSに対して親細胞とほぼ同様であり、BLMとCDDPに対して親細胞より感受性が高かった。以上、抗癌剤の反復投与でニトロソウレア剤(ACNU,MCNU)は耐性を誘導しやすく、DNA損傷の作用点を共有するACNUとMCNUは交差耐性を示し、作用点の異なったBLM、NCSおよびCDDPで殺細胞効果が認められ、ニトロソウレア剤耐性細胞の治療にはDNA損傷部位の異なる抗癌剤が有効であることが示唆された。
筋小胞体カルシウムポンプ細胞質ドメインの動きにおける静電的相互作用の役割の解析

筋小胞体カルシウムポンプ細胞質ドメインの動きにおける静電的相互作用の役割を、変異体を用いた反応速度論的解析によって調べた。その際反応速度の対数と活量係数の二乗との間に直線関係が成り立つことを見出し、このプロットを用いて、カルシウムポンプのドメインの動きをガイドするドメイン間の静電的相互作用の存在を明らかにすることができた。この研究で見出された反応速度の対数vs活量係数の二乗のプロットはタンパク質の分子内、分子間相互作用中の静電相互作用の寄与を定量的に見積もる有効な手段となりうる。筋小胞体Ca^<2+>-ATPaseのP-Nヒンジ領域に存在するイオンペアR556-E644およびD557-R638に変異を導入しその影響を調べた。その結果R556およびR638を負電荷すなわちGlu及びAspに置換した変異体においてE1PからE2Pへの変換速度に顕著な抑制が見られたが、負電荷を持つ側鎖(D557,E644)をArgに置換した変異体では顕著な変化は見られなかった。またR556,R638への負電荷の導入によるE1P変換の抑制は対を成す側鎖へのArgの導入により解除されることが見出された。この結果はE1PからE2Pへの転換過程においてこのイオンペアが何か役割を持っているというより、この領域に正電荷が過剰になるとE1PからE2Pへの変換が抑制されることを示している。すでに知られている分子モデルを元に、P-Nドメインのみを抜き出して電場を計算し変異導入による電場の影響を予測したところ、野生型ではP-Nドメイン間にE1P-E2P転換に伴う動きの向きに電気力線がならんでおり、E1P変換に影響の無かった変異体でもこの電気力線の流れが保存されていたが、E1P転換の抑制が見られた変異体では電気力線流れが大きく乱されていた。またE1P変換速度の回復した戻し変異体では電気力線の流れも回復していることが明らかになった。以上の結果、筋小胞体Ca^<2+>-ATPaseのE1P-E2P変換においてP-Nドメイン間の静電的相互作用が大きな役割を持つことが示唆された。前年度までに、筋小胞体Ca^<2+>-ATPaseの静電的相互作用の役割を明らかにするため、P-Nヒンジ領域に存在する荷電側鎖の置換変異体作成し、E1P-E2P転換速度の変化および付近の電気力線の変化から、この領域の電荷がE1P-E2P転換ステップに重要な役割を持つことを明らかにしていた。今年度はCa^<2+>-ATPaseの反応サイクルにおける静電的相互作用の寄与を定量的に示すことを試みた。この目的のため、溶液の塩濃度を変化させることにより、静電的相互作用の強度を変化させ反応速度への影響を調べたところ、野生型Ca^<2+>-ATPaseはK^+存在下で塩濃度を増加させた場合、E1P-E2P転換速度は濃度に応じて低下することが分かった。このことはE1P-E2P転換ステップにおいてK^+静電的相互作用が促進効果を持つことを示唆している。しかしながらK^+非存在下では塩濃度を変化させてもE1P-E2P転換速度は変化せず、静電的相互作用はこのステップにおいて大きな影響を持たなかった。この結果はK^+の結合したE1PとK^+の結合していないE1Pは異なる経路を通ってE2Pに転換する可能性を示している。このとき静電的相互作用を定量化するため、横軸に活量係数の2乗、縦軸に反応速度の対数をとるプロットをしたところ、良い直線性が得られ、傾きとy切片から、静電的相互作用の影響とそれ非静電的な力の関与を見積もることが出来るようになった。このプロットを用いて、変異体の解析を行ったところ、R556EとR638Dでは、K^+存在下でE1P-E2P転換を促進する静電的相互作用が影響を受けてこの速度遅くなっているが、非静電的な部分に影響が出ていないことが明らかとなった。このプロットによる静電的相互作用の関与の見積もりは他の酵素反応でも有用であると考えられ、反応解析の重要なツールとなりうる。前年度までに、筋小胞体Ca2+-ATPaseのE1P-E2P転換速度の変化および電気力線の変化から、この酵素のP-Nヒンジ領域の電荷がE1P-E2P転換ステップに重要な役割を持つことを明らかし、横軸に活量係数の2乗、縦軸に反応速度の対数をとるプロットにより静電的相互作用の影響とそれ非静電的な力の定量化が出来るようになった。今年度はK+によるCa2+-ATPaseに対する特異的な効果と塩濃度の影響についてさらに詳細な検討を行った。野生型Ca2+-

ATPaseについて反応溶液中のKCl濃度を0.1Mから1Mまで変化させてEP転換の速度を測定したところ、KC1濃度の上昇に伴いEP転換速度の減少が見られた。KCIの代わりにNaCl濃度を変化させても同様の結果が得られたが、LiCl及びcholine-Clの場合はイオン強度を上昇させてもEP転換速度は大きく変化せず、choline-Clの場合はむしろ速度が増した。次にKCl濃度を0.1Mに固定しLiClあるいはcholine-Clでイオン強度を変化させたところKCl単独でイオン強度を変化させた場合とほぼ同様の結果が得られた。この結果はKCl濃度上昇で見られたEP転換速度の低下がK+を結合したCa2+-ATPaseにおいて起きる現象であり、かつK+上昇によるものではなくイオン強度の上昇の影響であることを示している。P-Nドメイン間の電気力線を描画すると、EP転換ステップでP-Nドメインの動く軌跡に沿った形になり、この形状からP-Nヒンジから離れた残基間の相互作用が予想できた。そこでこれら残基の変異体を作成しその影響を調べた結果、新たに作成したこれら変異体でもEP転換での静電相互作用による促進が弱くなることが示された。これは速度vs活量のプロットが、新たな静電的相互作用を予測し検証できたことを示している。このプロットは他の酵素反応でも有用であると考えられ、反応解析の重要なツールとなると思われる。
日本におけるリン資源循環政策のライフサイクル持続可能性評価（LCSA）

翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。