hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
悪性骨・軟部腫瘍に対する温熱療法の基礎的実験および臨床応用に関する研究

2.方法:基礎的研究として、(1)骨および軟部組織に対して加温が可能かどうか、生きた豚を用い、サ-モトロンRFで実験を行った。(2)骨・軟部悪性腫瘍に対する温熱療法の有効性を知る目的で、各種の培養細胞を用いて実験を行った。(3)温熱療法と化学療法併用の増強効果につき検索した。(4)抗癌剤の副作用軽減を目的に、武田製薬で現在開発中のTAC-1043(CDDP封入熱感受性リポゾ-ム、41°C以上でCDDP放出)の有用性を実験的に検索した。臨床的研究として、(1)骨・軟部悪性腫瘍患者18名に対し、サ-モトロンRFにて温熱療法を行い、加温状況、またその効果を臨床症状と組織学的に検索した。(2)温熱療法と化学療法、放射線療法の併用効果につき、前記症例につき分析、検討した。3.結果:実験的に、骨および軟部組織に対する加温は可能で、培養細胞にて、骨・軟部悪性腫瘍に有効であった。また、温熱療法と化学療法との併用は治療効果を明らかに増強し、更にTAC-1043も有用であることが証明された。臨床的にも、ほとんどの症例で抗腫瘍効果の強い42.5°C以上の温度上昇が得られ、臨床症状の軽減、組織学的効果が得られた。更に他の併用療法で治療効果は増強した。以上より、骨・軟部悪意腫瘍に対して温熱療法は有用であり、今後、広く行われるべき治療法と考えた。今後更に、この分野での研究を基礎的、臨床的に行っていく予定である。
黒毛和種におけるエピスタシス及び優性効果の全ゲノム探索と交配シミュレータの開発

(一社)家畜改良事業団から提供された561頭の黒毛和種肥育牛のデータを用いた。これらの肥育牛は同団が行う現場後代検定事業における検定肥育牛または同期牛である。形質としては脂肪交雑(BMS)、枝肉重量(CW)、ロース芯面積(REA)、バラの厚さ(RT)、背脂肪の厚さ(BFT)を用いた。これらの肥育牛及び同団の種雄牛722頭について得られている36,749一塩基多型(SNPs)の遺伝子型情報を用いた。まず対立遺伝子組み合わせ効果(優性効果)のゲノムワイドな分布を推定した。組み合わせに拠らない効果(相加的効果)及び優性効果が、観察値(表現型値)に占める割合はそれぞれ0.61及び0.09(BMS)、0.63及び0.37(CW)、0.45及び0.27(REA)、0.41及び0.43(RT)、0.56及び0.03(BFT)であった。CWについては相加的及び優性効果の割合の和がほぼ1となったが、これはデータが小さいためにモデルが過剰適合している影響も考えられた。いずれの形質でも相加的効果及び優性効果はゲノム中にほぼ均等に存在しており、多数の遺伝子の関与が示唆された。次に相加的及び優性効果を考慮した交配シミュレータの開発を行った。開発にはSNP間の染色体交叉確率が必要であるが、これは北米ホルスタイン集団で推定された組み換え確率(Ma et al. 2015 PLoS Genetics)で代用した。開発は統計プログラムRを用いて行った。従来は交配から得られる子の能力を交配前に推測するには、相加的効果の総和(育種価)の両親平均を用いるしかなかった。しかしこのシミュレータを用いることにより相加的及び優性効果の和、つまりより表現型値に近い値が得られる確率分布を推定した上で交配を決定できる可能性が示唆された。これにより生産現場における交配組み合わせの選定をより効率的に行うことができると考えられる。当初の計画通り優性効果のゲノムワイドな分布を推定することができた。計画した通り効果が大きいもの(統計的に優位なもの)だけ検出する方法(厳しい推定)と効果の小さいものも推定する方法(緩やかな推定)の両者を試みたが、優性効果については厳しい推定では有意になるものがほぼ無く、緩やかな推定に基づく交配シミュレータの開発を中心とすることした。また当初は優性効果に続いて相互作用による組み合わせ効果(エピスタシス効果)の探索を行う予定であったが、交配シミュレータの有用性検証に時間を要すると考え、先に優性効果を考慮した交配シミュレータの開発を前倒しで行った。結果、優性効果のゲノムワイド分布の推定と、シミュレータの基礎となるプログラムの開発を終えることができた。2年目以降は以下の3点を行う。(1)厳しい及び緩やかな推定方法を用いたエピスタシス効果の探索、(2)黒毛和種集団を用いたSNP間の組み換え確率の推定、(3)優性効果を考慮した交配シミュレータの有用性検証。いずれについても1年目より大きなデータを用いる。また余力があれば1年目に行った優性効果の分布推定なども規模の大きなデータで再度行い、より正確さを向上させることを試みる。(3)については以下の手順で行う。まずSNP遺伝子型情報を持つ父母子の組み合わせを多数抽出して、子の能力の分布を交配シミュレータで推定する。次に観察された子の能力が得られる確率をその分布をもとに計算する。これを多数の父母子組み合わせについて行うと、交配シミュレータの分布と実際の子の能力分布が等しい場合は、子が得られる確率は0から1まで一様に分布するはずなので、そこからの逸脱を検定する。

従来は交配から得られる子の能力を交配前に推測するには、相加的効果の総和(育種価)の両親平均を用いるしかなかった。しかしこのシミュレータを用いることにより相加的及び優性効果の和、つまりより表現型値に近い値が得られる確率分布を推定した上で交配を決定できる可能性が示唆された。これにより生産現場における交配組み合わせの選定をより効率的に行うことができると考えられる。当初の計画通り優性効果のゲノムワイドな分布を推定することができた。計画した通り効果が大きいもの(統計的に優位なもの)だけ検出する方法(厳しい推定)と効果の小さいものも推定する方法(緩やかな推定)の両者を試みたが、優性効果については厳しい推定では有意になるものがほぼ無く、緩やかな推定に基づく交配シミュレータの開発を中心とすることした。また当初は優性効果に続いて相互作用による組み合わせ効果(エピスタシス効果)の探索を行う予定であったが、交配シミュレータの有用性検証に時間を要すると考え、先に優性効果を考慮した交配シミュレータの開発を前倒しで行った。結果、優性効果のゲノムワイド分布の推定と、シミュレータの基礎となるプログラムの開発を終えることができた。2年目以降は以下の3点を行う。(1)厳しい及び緩やかな推定方法を用いたエピスタシス効果の探索、(2)黒毛和種集団を用いたSNP間の組み換え確率の推定、(3)優性効果を考慮した交配シミュレータの有用性検証。いずれについても1年目より大きなデータを用いる。また余力があれば1年目に行った優性効果の分布推定なども規模の大きなデータで再度行い、より正確さを向上させることを試みる。(3)については以下の手順で行う。まずSNP遺伝子型情報を持つ父母子の組み合わせを多数抽出して、子の能力の分布を交配シミュレータで推定する。次に観察された子の能力が得られる確率をその分布をもとに計算する。これを多数の父母子組み合わせについて行うと、交配シミュレータの分布と実際の子の能力分布が等しい場合は、子が得られる確率は0から1まで一様に分布するはずなので、そこからの逸脱を検定する。データバックアップ用の購入したハードディスクが当初の予定より安価であったため。次年度は旅費として用いる。
細胞内寄生植物病原細菌のポストゲノミクス

細胞内寄生性植物病原細菌の一種であるファイトプラズマをターゲットとし、そのゲノム配列にもとづいたポストゲノミクス解析を多方面から行った。その結果、ファイトプラズマの宿主特異性を決定している分子メカニズムの解明に成功し、またファイトプラズマが持つ新規な病原性因子の単離にも成功した。本年度は、ゲノム解読を中心に研究を進め、その結果ファイトプラズマの全ゲノム解読に世界で初めて成功した。全構造解析の結果、ファイトプラズマゲノムは、DNA複製や転写、翻訳に必要な基本的遺伝子が認められた一方で、アミノ酸合成系、脂肪酸合成系、TCA回路、酸化的リン酸化に関与する遺伝子を欠いていた。これはマイコプラズマ同様、代謝に必要な物質の多くを宿主細胞に依存していることを示すものと思われる。しかし、ペントースリン酸回路やPTS、ATP合成酵素に関する遺伝子も欠いており、自律増殖する生物において、最少遺伝子を持つとされるマイコプラズマより代謝関連遺伝子が少なかった。これはファイトプラズマがマイコプラズマと異なり、細胞内寄生で栄養豊富な植物篩部に生息するため、退行的進化により遺伝子の多くを失ったのであろう。逆に、ファイトプラズマゲノムには、マイコプラズマには無い膜輸送系遺伝子が多数コードされていた。また、アミノ酸や糖、リンゴ酸などのほか、マンガンや亜鉛、マグネシウム、コバルトなど金属イオンの取り込みに関与する膜輸送系も数多くコードされ、植物の生育に必要なこれらの金属イオンが、ファイトプラズマの感染により宿主から収奪され、ファイトプラズマ病に特徴的な病徴のひとつである養分欠乏に似た症状を引き起こす一因になっている可能性がある。生物の「最少ゲノム」については、これまで数多くの研究があるが、ファイトプラズマゲノムはエネルギー合成系をも欠き、栄養豊富な環境に適応した、新しいタイプの「最少ゲノム」であり、生物は生活する環境によって想像以上に多様な遺伝子構成で生きてゆけることを示唆している。今後昆虫伝搬能決定因子の解明が急速に進むことが期待される。平成16年度に、ファイトプラズマの全ゲノム解読に世界で初めて成功したが(Oshima et al.,Nature Genet.,2004)、今年度はゲノム中に複数コピー存在するパラログ遺伝子に焦点を当てて解析を行った。ファイトプラズマゲノムにコードされる全754個のORFのうち、約30%はゲノム中に複数コピー存在するパラログ遺伝子であり、その多くは遺伝子クラスターを構成していた。また,トランスポゼースをコードするtra5遺伝子の約300bp下流には特異的な組換えが認められ,この遺伝子クラスターがゲノミックアイランドとしてファイトプラズマゲノム内を転移した可能性が示唆された。これらの結果から、ゲノミックアイランドがゲノムの遺伝子重複に大きく関わっているとともに、ファイトプラズマの多様な病原性を生み出す要因の1つであると考えられた。また、ファイトプラズマは細胞壁を持たず、宿主細胞内に寄生することから、その膜タンパク質は宿主との相互作用に重要な役割を果たすと考えられるため、今年度はファイトプラズマゲノムにコードされる主要抗原膜タンパク質(Amp)についても解析を進めた。ゲノムより、amp遺伝子の全長をクローニングし、その抗体を用いたウェスタンブロットを行った結果、感染植物におけるAmpの発現が確認された。また、Ampにはタンパク質分泌系の1つであるSec systemにより認識されるシグナル配列が認められるとともに、大腸菌で発現したAmpはペリプラズム画分に局在したことから、AmpはSec systemを介して細胞膜外に輸送されると考えられた。これらの知見を基に、今後Ampと相互作用する宿主因子の解明が進むことが期待される宿主への適応戦略と多様化機構の解明平成16年度に、Phytoplasma asteris OY strainの全ゲノム解読に世界で初めて成功したが(Oshima et al.,Nature Genet.,2004)、今年度は主にファイトプラズマの膜タンパク質について解析を行った。ファイトプラズマは細胞壁を持たず、宿主細胞内に寄生することから、その膜タンパク質は宿主との相互作用に重要な役割を果たすと考えられる。OYに近縁な4種類のファイトプラズマより、菌体表面に多量に存在すると推定されるantigenic membrane protein (Amp)遺伝子全長をクローニングし、それらの塩基配列を決定・比較したところ、Amp遺伝子にはファイトプラズマ間でかなり(相同性89-98%)の変異が認められた。Amp遺伝子の塩基配列の相同性は、Amp遺伝子の上流や下流の遺伝子、さらにはORF間のintergenic regionの相同性よりもはるかに低かった。また、Amp遺伝子に認められた変異の大部分はアミノ酸置換を伴う変異あり、Ampは多様性が増大する方向に何らかの選択圧がかかっていると推定された。昆虫宿主とファイトプラズマ膜タンパク質との相互作用解析OY保毒ヒメフタテンヨコバイを、抗Amp抗体を用いて共焦点レーザー顕微鏡により観察したところ、Ampは腸管周囲のマイクロフィラメントとの所在が一致した。次に抗Amp抗体の親和性カラムを用いて、Ampと複合体を形成する宿主因子を単離した結果、3種類の主要タンパク質(P30、P42、P200)が検出された。ペプチドシークエンス等により分析したところ、P30はミオシン軽鎖、P42はアクチン、P200はミオシン重鎖と同定された。これらはいずれもマイクロフィラメントを構成するタンパク質であり、ファイトプラズマはAmpを介して媒介昆虫のマイクロフィラメントに結合することが示唆された。

平成16年度に,Phytoplasma asteris OY strain弱毒株(OY-M)の全ゲノム解読に世界で初めて成功したが(Oshimaetal.,NatureGenet.,2004),今年度は強毒株(OY-W)との比較ゲノム解析を行い,病原性の強弱とゲノム構造との関連性を解析した。これまで,OY-Mのゲノム解析により,ファイトプラズマが究極的に退行的進化を遂げた微生物であることが明らかとなっているが,病気を引き起こす分子メカニズムは未だ不明であった。OY-Mのゲノムサイズは約860kbpであるのに対し,病原性の強い強毒株(OY-W)では約1Mbpであることがパルスフィールドゲル電気泳動の結果より示唆されており,両株の病原性の違いとゲノム構造との関連が推定されてきた。また,ファイトプラズマはF型ATP合成酵素を持たないことから,ATP合成を解糖系に大きく依存していると考えられており,糖の消費と病原性との関連性が推測されていた.そこで解糖系遺伝子をコードするゲノム領域に焦点を当てて比較ゲノム解析を行った。解糖系遺伝子である6-phosphofructokinase(pfk)をプローブとして用いてサザンプロット解析を行ったところ,OY-Mでは1本のバンドしか検出されなかったのに対し,OY-Wでは2本のバンドが検出され,両株におけるpfk遺伝子のコピー数の差異が示唆された。そこでOY-Wのpfk遺伝子周辺の約80kbpのゲノム配列を決定したところ,OY-Mでは5つの解糖系遺伝子が約30kbpの領域にコードされていたのに対し,OY-Wではこの領域がタンデムに2コピー重複していた。強毒株において解糖系遺伝子群が重複していたことから,植物宿主より取り込んだ糖を積極的に利用することがOY-Wの激しい病原性と関連している可能性が考えられた。世界にさきがけて決定したファイトプラズマの全ゲノム塩基配列をもとに、ファイトプラズマの感染により引き起こされる特徴的な病徴の病原性因子を同定する目的で、まずはファイトプラズマのゲノムデータベースより、ファイトプラズマの分泌タンパク質と膜タンパク質を網羅的に探索した。シグナル配列と膜貫通ドメインの探索を行った結果、28個の分泌タンパク質と、103個の膜タンパク質が選抜された。ファイトプラズマの持つ遺伝子には機能未知のものが多く、選抜された分泌タンパクや膜タンパク質も半分以上が機能未知ではあったが、プロテアーゼドメインを持つ分泌タンパク質など、ある程度機能の推測できるものも含まれていた。これらのうちいくつかについては、植物体における発現実験を試みるため、ウイルス発現ベクターに組み込んだ。併行して、特異的抗体の作製を行った。植物体における発現解析の結果、植物に病徴を誘導する分泌タンパク質を同定した。
1細胞エネルギーマップ作成のための頑強な定量性を担保するATPセンサーの開発

アデノシン三リン酸(ATP)は、エネルギー代謝の研究において、最も大事な分子の一つである。本研究課題では、細胞内のATPの空間的な分布に加えて、標的とする場所のATPの絶対濃度を定量的に解析出来る手法の開発を目的とする。緑色蛍光タンパク質の変異体に、ATP結合タンパク質であるATP合成酵素の一部のユニット(イプシロンサブユニット)を挿入し、ATP結合に伴い、蛍光寿命の値が変化する蛍光センサーの開発に成功した。これを用いて、ATP産生系の特徴が異なる様々な細胞種のミトコンドリアと細胞質のATPの濃度の違いを見ることに成功した。生体の代謝システムにおいて、エネルギーの通貨の役割を果たしているアデノシン3リン酸(ATP)の細胞内の分布を自在に知ることが出来れば、生物学の研究は加速度的に進むに違いない。しかしながら、細胞が生きた状態のままで、標的となる細胞小器官のATPの濃度を定量的に計測する有効な手法は未だに確立されていない。本研究では、細胞の中のATP濃度を蛍光寿命の値へと変換できる遺伝子コード型の蛍光タンパク質のセンサーを開発することを目的としている。蛍光強度の変化を指標とする蛍光センサーは、その輝度の値がセンサーの濃度によって異なるため、輝度値を計測しても、即時に、そこからATPの濃度が算出できない。一方で、蛍光寿命は、輝度の強さとは独立した値であるため、横軸にATP濃度、縦軸に蛍光寿命の値をプロットした検量線を描くことで、その蛍光寿命を測定した後に、ATPの濃度へと直接変換できる大きなメリットがある。当該年度は、緑色蛍光タンパク質の変異体に、ATPを特異的に結合できるユニットを挿入した蛍光センサーの開発(スクリーニング)を開始した。蛍光タンパク質とATP結合のためのユニットを繋ぐ様々な長さや堅さのリンカーをもった変異体を大腸菌に発現させ、これを超音波破砕してセンサータンパク質を抽出、ATP結合に伴って、蛍光寿命が変化する変異体を探索した。結果、幾つかの変異体が、ATP濃度の変化に伴い、蛍光寿命に大きな変化を伴うことが分かった。更に、その中には、生理条件のATP濃度の近い(ミリモルオーダー)範囲で、想定したとおりに作動する変異体も見出すことが出来た。年度の後半より、HeLa細胞へ発現させ、哺乳類の細胞でATP濃度変化を検出できるか、顕微鏡の実験を開始している。ATP濃度を蛍光寿命の値に変換できる蛍光センサーのスクリーニングを開始し、プロトタイプを得ることができた。このセンサーが、生理条件でのATP濃度として既に知られているミリモル濃度で作動するかどうかが懸念事項であったが、この条件を満たす変異体が見つかったことから、概ね、研究は想定した通りに進んでいる。既に、センサーを得るための効率的なスクリーニングの系の立ち上げが完了したことも、本提案を進める上で、今後の強みになってくるものと考えている。既に確立したスクリーニングの系で、更なるセンサー感度の向上(ATP濃度の変化に対して、劇的に蛍光寿命が変化する変異体)を目指す。一方、プロトタイプも十分に作動することがわかってきたことから、センサー改良と併行して、実際の生物学研究でどれくらい有用に使えるかを検討していく段階へと進む。特に、細胞小器官へターゲットするためのシグナル分子(ミトコンドリア、核、ER、細胞膜など)を導入し、ATPセンサーを用いて、細胞内の狙った場所のATP濃度を測定する。また、細胞の種類も、がん細胞の限らず、様々な細胞種のATPの濃度を計測する。一連の実験を通して、エネルギー状態の定量解析を行う。実験で想定した消耗品の使用が、想定よりも多少少なかったため、若干の差額が生じている。次年度の消耗品の購入のために繰り越して、使用する予定である。
運動負荷が骨代謝に及び影響に関する実験的研究

Youngadult(26週齢)のWistar系雄性ラットに最大酸素摂取量の60%の運動強度のトレッドミル走行運動を1日1時間、週5日、12週間負荷し、骨形態計測の手法を用いて、脛骨の近位部海綿骨と中央部皮質骨における骨量し骨代謝の経時的変化について調査し、運動負荷が荷重骨の骨量及び骨代謝に及ぼす影響について検討した。非運動群(対照群)では、海綿骨と皮質骨とも骨量は、0、4、8、12週で有意な増減はみられなかった。すなわち、young adult(26週齢)のラットでは骨成長はプラトーに達していた。運動群では、海綿骨と皮質骨とも、骨量は運動負荷開始後4週では対照群と有意差はなかったが、8及び12週では対照群より有意に大きかった(p<0.05)。一方、骨代謝動態については、運動群では、骨吸収と骨形成とも、運動負荷開始後4週では対照群と有意差はなかったが、8および12週では海綿骨のtrabecular bonesurfaceにおける骨吸収の抑制と骨形成の促進が、また、皮質骨のendosteal surfaceにおける骨吸収の抑制とperiosteal surfaceにおける骨形成の促進がみられた。以上から、中強度の走行運動は、荷重骨では骨吸収の抑制と骨形成の促進により、海綿骨と皮質骨とも骨量の有意な増加が得られることが示された。しかしながら、今回用いた骨形態計測では、運動負荷開始後早期の骨代謝動態を捕らえにくく、これに関しては分子生物学的手法を要すると考えられる。今後の課題として研究を進めていきたい。Young adult(26週齢)のWistar系雄性ラットに最大酸素摂取量の60%の運動強度のトレッドミル走行運動を1日1時間、週5日、12週間負荷し、骨形態計測の手法を用いて、脛骨の近位部海綿骨と中央部皮質骨における骨量し骨代謝の経時的変化について調査し、運動負荷が荷重骨の骨量及び骨代謝に及ぼす影響について検討した。
ゼブラフィッシュ突然変異体を用いたイオンホメオスタシス研究基盤の確立と展開

1)ゼブラフィッシュなどの淡水魚は,イオン濃度が極端に低い環境水に接するために絶えず体内より様々なイオンを流出する傾向にある。このため高い体内イオン濃度を一定範囲内に維持するには環境水より各種イオンを積極的に取り込む必要がある。Mitochondria-Rich Cell(MRC)は体表,特にエラによく発達した細胞で,その細胞形態,および遺伝子発現から淡水環境から様々なイオンを吸収する役割を担う細胞であると考えられてきた。本研究では,まずゼブラフィッシュ幼生の卵黄表面上に発達するMRCが少なくともVacuolar-type H^+-ATPaseに富んだタイプ(vH-MRC)とNa^+/K^+-ATPaseに富んだタイプ(NaK-MRC)の2種類に分けられることを示し,続いてNa^+に反応する蛍光色素(Na-Green)を用いることで,NaK-MRCではなく,vH-MRCがNa^+を吸収していることを明らかにした。さらにMRCの発生が嚢胚後期に始まること,その分化にはfoxi3a転写調節因子の機能が必須であること明らかにした。2)ゼブラフィッシュなどの淡水魚のイオン吸収能力は,接する淡水環境のイオン濃度に依存する。イオン濃度のより低い淡水環境ではイオン流出が激しく,より強力なイオン吸収能力を発揮する必要がある。このような環境イオン濃度に対応したイオン吸収能力の調節にはイオン吸収を担うMRCにおける活性調節だけでなく,内分泌系による統括的な調節が存在することが考えられる。本研究では,イオン濃度・組成が異なる様々な淡水環境で飼育したゼブラフィッシュ幼生における内分泌系遺伝子の発現調節を解析し,いくつかの内分泌系遺伝子において環境イオン濃度に転写レベルで応答していることを見いだした。1)ゼブラフィッシュなどの淡水魚は、イオン濃度が極端に低い環境水に接するために絶えず体内より様々なイオンを流出する傾向にある。このため体内イオン濃度を一定範囲内に維持するには環境水より積極的に各種イオンを取り込むことが必須である。Mitochondria-rich (MR)細胞は体表、特にエラにおいてよく発達した細胞で、その細胞形態、および遺伝子発現から環境水からのイオン吸収を担う細胞と考えられてきた。本研究ではNa^+に反応する蛍光色素を用いることで、生きたゼブラフィッシュ幼生においてMR細胞がNa^+が取り込んでいることを明らかにした。さらにMR細胞はVacuolar-type H^+-ATPaseに富んだタイプとNa^+/K^+-ATPaseに富んだタイプの2種類に分けられること、Na^+は前者のタイプのMR細胞において特異的に取り込まれていることを明らかにした。2)淡水魚の体内イオン濃度は、接する環境水中のイオン濃度変化の影響を直接受けるにもかからず、その濃度を常に一定範囲内に維持する機構が存在し、特に内分泌系による全身でのネットワーク調節が必須の役割を担うと考えられる。本研究では5つの内分泌系遺伝子に注目し、これらの転写量が環境イオン濃度の応答して変動することを明らかにした。現在microarray解析を行い、環境イオン濃度に応答する遺伝子を網羅的に検索している。3)イオンホメオスタシス機能の欠損が疑われるゼブラフィッシュ変異体ftkについてその原因遺伝子の同定を進めた結果、第7染色体の約200kbの領域にその遺伝子座を特定することができた。ゲノムデータベース上ではこの領域には4つの遺伝子が存在する。今後はこれらの遺伝子のいずれに変異が認められるかを解析し、さらにモルフォリノを用いた発現阻害実験、あるいはmRNAの顕微注入による相補性実験を加えて原因遺伝子の特定を進める。

Mitochondria-Rich Cell(MRC)は体表,特にエラによく発達した細胞で,その細胞形態,および遺伝子発現から淡水環境から様々なイオンを吸収する役割を担う細胞であると考えられてきた。本研究では,まずゼブラフィッシュ幼生の卵黄表面上に発達するMRCが少なくともVacuolar-type H^+-ATPaseに富んだタイプ(vH-MRC)とNa^+/K^+-ATPaseに富んだタイプ(NaK-MRC)の2種類に分けられることを示し,続いてNa^+に反応する蛍光色素(Na-Green)を用いることで,NaK-MRCではなく,vH-MRCがNa^+を吸収していることを明らかにした。さらにMRCの発生が嚢胚後期に始まること,その分化にはfoxi3a転写調節因子の機能が必須であること明らかにした。2)ゼブラフィッシュなどの淡水魚のイオン吸収能力は,接する淡水環境のイオン濃度に依存する。イオン濃度のより低い淡水環境ではイオン流出が激しく,より強力なイオン吸収能力を発揮する必要がある。このような環境イオン濃度に対応したイオン吸収能力の調節にはイオン吸収を担うMRCにおける活性調節だけでなく,内分泌系による統括的な調節が存在することが考えられる。本研究では,イオン濃度・組成が異なる様々な淡水環境で飼育したゼブラフィッシュ幼生における内分泌系遺伝子の発現調節を解析し,いくつかの内分泌系遺伝子において環境イオン濃度に転写レベルで応答していることを見いだした。
血液凝固過程の動的細胞観測のためのリアルタイム３次元定量位相顕微鏡の開発

本研究では,止血機構や脳卒中・心筋梗塞の原因となる血栓症において重要な血液凝固過程を,広視野かつ非破壊・非侵襲にリアルタイム3次元観測が可能な定量位相顕微鏡であるディジタルホログラフィック顕微鏡を用い,血管内で生じる血栓の3次元凝集構造と血栓形成時間により高精度な血液凝固診断システムを構築し,開業医レベルで導入可能かつ集団検診等による早期診断・発見に最適で低コストな可搬装置の設計・開発を行った.本研究では,止血機構や脳卒中・心筋梗塞の原因となる血栓症において重要な血液凝固過程を,広視野かつ非破壊・非侵襲にリアルタイム3次元観測が可能な定量位相顕微鏡であるディジタルホログラフィック顕微鏡(DHM)を用いて,血液細胞により血管内で生じる血栓の3次元凝集構造と血栓形成時間により高確度・高精度な血液凝固診断システムを構築し,開業医レベルで導入可能かつ集団検診や在宅健康診断による早期診断・早期発見に最適で低コストな可搬装置の設計・開発を目的としている.初年度では,まず,血液細胞観測のためのDHMを構築した.細胞観測が前提であるので,安定した計測結果が取得可能な透過型のマッハツェンダー干渉計に基づくDHMを構築した.DHMは振動ノイズに強い顕微鏡であるが,血液凝固過程を時系列で観測するためには振動ノイズをさらに軽減する必用がある.そのため,本年度の予算で高性能除振台を新規購入した.新規除振台にDHMを構築後,血液凝固過程観測の基礎となる,血液細胞観測の実験,および再生像を取得するプログラムの開発を行った.再生像の位相分布は血球の重要な物理的パラメータである幾何学的厚みと屈折率に対応するが,構築した光学系に固有の位相ノイズが生じる.このノイズを除去するプログラムを開発した.また,個々の血球の三次元的な位置情報を取得するためのマルチフォーカスプログラムを開発した.申請時には緑色レーザの購入を予定していたが,研究環境の変化があったため,除振台を新規購入して現有の赤色レーザで研究を進めた.それ以外は,申請時の内容をほぼ達成しており,順調に研究を遂行している.本研究では,止血機構や脳卒中・心筋梗塞の原因となる血栓症において重要な血液凝固過程を,広視野かつ非破壊・非侵襲にリアルタイム3次元観測が可能な定量位相顕微鏡であるディジタルホログラフィック顕微鏡(DHM)を用いて,血液細胞により血管内で生じる血栓の3次元凝集構造と血栓形成時間により高確度・高精度な血液凝固診断システムを構築し,開業医レベルで導入可能かつ集団検診や在宅健康診断による早期診断・早期発見に最適で低コストな可搬装置の設計・開発を目的としている.平成27年度は,基礎的実験および解析プログラム開発のために,DHMによる赤血球の観測を行なった.平成28年度では,前年度の研究を基礎として,血液凝固現象をリアルタイムに可視化するための実験方法の確立を行った.まず,血管内部での血液凝固現象を模擬するために,新規購入したフローセルに血液と凝固促進剤を注射器で注入して,毛細管現象により流れ場を生成する.この流れ場のホログラム動画をCCDカメラにより取得し,平成28年度に作成した解析プログラムを適用することで血液凝固現象のリアルタイムな3次元的可視化を実現した.また,凝固構造の3次元的定量評価には,一般的な濃淡画像の特徴抽出法であるモーメント,フラクタルおよびテクスチャ解析などを適用する予定であったが,上記の実験法の確立のために予定よりも時間がかかったため,平成29年度でも引き続き解析を行う.昨年度の実績報告書に記載した理由から,除振台を購入した.申請時に購入予定だったCCDカメラは若干低スペックではあったが研究室で以前購入したものを使用した.また,自動移動ステージは血液の流速を一定に保つために新規購入予定であったが,代わりにフローセルの毛細管現象を利用して,観測時間内での流速の維持を実現した.それ以外は,申請時の内容をほぼ達成しており,順調に研究を遂行している.本研究では,止血機構や脳卒中・心筋梗塞の原因となる血栓症において重要な血液凝固過程を,広視野かつ非破壊・非侵襲にリアルタイム3次元観測が可能な定量位相顕微鏡であるディジタルホログラフィック顕微鏡(DHM)を用いて,血液細胞により血管内で生じる血栓の3次元凝集構造と血栓形成時間により高確度・高精度な血液凝固診断システムを構築し,開業医レベルで導入可能かつ集団検診や在宅健康診断による早期診断・早期発見に最適で低コストな可搬装置の設計・開発を目的としている.平成29年度では,昨年度の研究で取得した血液凝固現象の観測結果から,血液凝固時間の定量評価と各血液細胞イメージングのための画像拡大プログラム作成および顕微鏡の可搬設計を行なった.血液凝固時間の定量評価では,視野域内のフローセル底面に,凝固現象により固着する赤血球を利用して,画像処理における空隙度の時間変化を凝固時間の評価関数とした.その結果と一般的な凝固試験で使用されるプロトロンビン時間との比較により,妥当性を確認した.次に,各血液細胞観測のための画像拡大プログラムについての検討を行った.多段階再生法により,空間分解能を保ちつつ,画像を拡大するプログラムを作成したが,画像全体にノイズが生じるという問題が発生し,引き続き原因を調べる予定である.

顕微鏡の可搬設計は,レーザ光源,対物レンズ,CCDカメラにより顕微鏡を構成し,3Dプリンタで固定具を作成して装置開発を行った.小型化に関する改善点がいくつか残った状況ではあるが,アタッシュケースに搭載できるサイズまでの小型化は容易に可能であると考えられる.本研究では,止血機構や脳卒中・心筋梗塞の原因となる血栓症において重要な血液凝固過程を,広視野かつ非破壊・非侵襲にリアルタイム3次元観測が可能な定量位相顕微鏡であるディジタルホログラフィック顕微鏡を用い,血管内で生じる血栓の3次元凝集構造と血栓形成時間により高精度な血液凝固診断システムを構築し,開業医レベルで導入可能かつ集団検診等による早期診断・発見に最適で低コストな可搬装置の設計・開発を行った.初年度,研究環境の変化があったため,除振台を新規購入した.本研究では研究内容を2つに分轄して大学院生が行なっているため,もう一台の除振台が必要であり,2年目の本予算で購入する.初年度の研究は順調に進んでおり,次年度も申請した通りの計画で研究を遂行する予定である.平成28年度に申請した前倒し支払請求をしたが,今年度に必要な物品を早期購入するためのものであるため,今年度の研究に影響はない.研究はおおむね順調に進んでおり,平成29年度は申請書通りに研究を遂行する予定である.光計測,計測工学,生体計測申請書を作成した当初と,実際に購入する際の価格の誤差が生じた.申請書を作成した当初と,実際に購入する際の価格の誤差が生じた.次年度の光学素子等の消耗品を購入する予算として用いる.次年度の消耗品費として用いる.
分子生物学・環境化学の手法を用いた赤潮鞭毛藻シスト発芽制御法の開発

赤潮発生の1主要要因としてシスト発芽の変動があることが明らかにされているが、本試験研究はシスト発芽制御をとおして赤潮発生を制御する事を目的として、基礎的技術の開発を行った。1.播磨灘で得られた柱状堆積物試料を用いて過去数百年間の海域環境の変遷と、それに伴うシャトネラシストの分布を明らかにする目的で実験を行った。その結果、シャットネラシスト数は、1900年前後から急増しており、海域の富栄養化と共にシャットネラがそのバイオマスを増大させてきた過程が認められた。しかし、1960-1970年をピークに、その後のシスト数は大きく減少していた。また1700年頃にもシスト数の小さなピークがあること、さらに少なくとも1600年代には、既にシャットネラが播磨灘に生息していたことも明らかになった。シャットネラシストの発芽制御のために様々な刺激をシストに与えたところ、一定の通電によって発芽能が急に減少することが確認された。この方法は閉鎖系におけるシスト発芽制御に有効と思われる。2.赤潮鞭毛藻シストの識別及び定量に応用することを目的として、Scrippsiella trochoideaのシストに対する5種類のマウスモノクローナル抗体(IgG型2種類とIgM型3種類)を作成した。これらの抗体はいずれもシスト表面に存在するスパイン(角状突起)と特異的に反応したが、栄養細胞には反応しなかった。また、パーオキシダーゼ標識精製抗体を用いた酵素免疫測定法による海泥中のシストの定量と検出法が開発できた。3.Chattonella marina2種、Chattonella antiqua2種、種未同定のChattonella 1種、Alexandrium catenella、Scrippsiella trochoidea、Heterosigma akashiwoの8種を純粋培養し、DNAを抽出後、フィンガープリント分析を行った。この結果、各プランクトンの識別に有効であろうと考えられるバンドを同定することが出来た。4.海産微小藻類Gymunodium A3及びCocholodinium polykrikoidesが生産する酸性多糖の精製及び構造決定を行った。エタノール、Cetavlon沈殿で分画し、DEAEカラムクロマトグラフィーで精製した多糖画分A-1とA-2は超遠心及び電気泳動的に均一であり、フコース、マンノース、ガラクトース、グルコース及びガラクツロン酸からなる事が確認できた。硫酸基は7-8%含まれていた。この多糖はCC_<50>100μg/mlで培養細胞に毒性を示さなかった。研究初年度における研究の重点として、各種有毒赤潮鞭毛藻の培養、Scrippsiella trochoidiaなどのシストの大量調製、鞭毛藻シストの海底泥からの分離同定技術の開発、シストに対するモノクローナル抗体調製、微小生物由来DNAを用いるフィンガープリント技術の開発を行なった。

具体的には2.大量調製したシストの多糖抽出条件を検討し、化学的構造解析の予備実験を行なった。3.Scrippsiella trochoidiaのシスト(約2.x10^4個)をBALB/Cマウスに10日間隔で4回投与した。最終免疫から3日後、採血しポリクローナル抗体を得るとともに、脾臓細胞とミエローマ細胞(SP2/0株)をポリエチレングリコール存在下で融合させた。融合細胞を2週間培養後、56wellの培養上清について蛍光抗体法でシスト表面に対する抗体の存在を調べた。強い反応性を示した2well中の細胞について限界希釈法で2回クローニングを行ない2株のモノクローナル抗体産生株を樹立した。現在、取得したポリ及びモノクローナル抗体を用いて各種シスト及び栄養細胞に対する交差反応性などの免疫的特異性を検討するとともに、多量の抗体を得るためモノクローナル産生細胞を腹腔に接種したマウスの腹水から抗体を精製している。4.各種鞭毛藻のシスト、栄養細胞をDNAフィンガープリント法で識別するための予備実験として、PCR法と銀染色法による生成DNA検出技術を確立した。微生物DNAを標準試料として、この手法が鞭毛藻シストに適用可能であることを示した。平成5年度は、以下のような研究実績を得た。2種の海産渦鞭毛藻(Alexandrium catenellaとScrippsiella trochoidea)の生活史環における細胞内核酸関連物質の変化過程を明らかにした。これらの2種とも、シスト中の核酸関連物質が定常期の栄養細胞中のそれより多く、シストが接合によって生じていることを示唆した。細胞の活性の一つの指標であるエネジーチャージ値は両種とも培地に接種直後、急に上昇した。このことは鞭毛藻類は新しい培地環境下におかれた場合、速やかに自らの代謝機能を増進させることが可能であることを示唆している。またシスト中のエネジーチャージ値は栄養細胞のそれより低かったことからシストの代謝レベルは栄養細胞よりかなり押さえられていることを明らかにした。Scrippsiella trochoideaのシストにたいするモノクローナル抗体を取得するため、2回の融合実験を行った。その結果、昨年度の成果と併せIgM,IgGクラスの抗体を産生する5株の細胞を確立できた。今後は両クラスの抗体を組み合わせたサンドイッチELISA法により高感度なシストの検出や定量が可能であるのでビオチン標識抗体を調製するため、現在IgMクラスの抗体を培養上清から精製している。DNAフィンガープリントを赤潮藻体及びシストから得るための予備実験を環境した。土壌微生物を用いた予備実験では同種の59菌株がすべて異なったフィンガープリントを示し、微細なDNA構造変化を検討するのに有望であると判断された。Gymnodium属微細藻の生産する多糖を電気泳動的に均一な標品にまで精製し、構造を検討したところ、構成単糖にはガラクトースのみが認められ、ガラクトースと硫酸基からなる硫酸ガラクタンと推定された。研究最終年度であるので、試験研究の目的に対応した成果がえらえるよう配慮した。具体的には1.播磨灘で得られた柱状堆積物試料を用いて過去数百年の海域環境の変遷と、それに伴うシャトネラシストの分布を明らかにする目的で実験を行った。
Clostripainの活性制御と炎症反応の修飾の機構について

ウェルシュ菌のclostripain(Clp)の病原的意義を調べるため、Clp変異株と野生株をマウスの大腿筋に接種した。両株ともガス壊疽とleukostasisを認め、組織学的には有意差は見られなかった。in-frame deletion法を考案し、各種変異株を作成した。さらに、各種の毒素や変異酵素を量産するために、キシロース誘導発現系を構築した。リンカーペプチドによる活性制御や、Clpによる多形核白血球のeat-meシグナルへの影響について、検討を試みたが明確な結論を得るには至らなかった。Clp変異菌は加熱処理で凝集する現象を見出した。Clpの阻害剤であるEDTA添加により野生株は自己凝集を起こした。クロストリパインのリンカーペプチドの野生型と変異型の酵素をコードする遺伝子を構築し、これをClostridium perfringens13株で発現させた。野生型の酵素を分離精製する方法を確立した(Microbiology 2010に発表)。現在、変異型酵素の精製、ならびにリンカーペプチドの分離精製を検討している。Ca^<2+>キレート剤を培地に加えると、成熟酵素の生成が抑制されることが明らかとなった。これは遺伝子発現レベルの抑制によるものか、成熟過程の阻害によるものかについて現在検討している。マウスの大腿部の筋肉内接種による実験的ガス壊疽の結果では、クロストリパインの野生型(C. perfringens 13株)と変異型(C. perfringens 13ΔClp株)ではいずれも10^9PFUの生菌数が発症に必要であり、両者が起こすガス壊疽の症状(発赤、腫脹、ガス産生、筋肉壊死)と感染組織の病理像(C. perfringensの増殖と白血球の浸潤、炎症像)において有為な差は認められなかった。C. perfringensの感染における食細胞の役割については、初期が重要であるとされており、現在少量の生菌(10^510^7)接種の効果について、野生株、変異株、高度産生株を用いて比較検討を行っている。なお、当初の目的とは異なるが、クロストリパイン非産生の条件では、菌体内の蛋白が培地中に蓄積されやすく、菌の凝集性が高まるという現象が見られ、この凝集性は菌体内蛋白と低分子のペプチド成分の作用を示唆する結果が得られたので、クロストリパインの新しい生理学的機能と考えている。ウェルシュ菌のClostripain-like protease (Clp)は、ヒストリティカム菌のClostripain (CLO)とは、リンカーペプチドの長さと両端のアミノ酸残基が異なる。基質特異性を比較したところ、Clpはアルギニン以外に、弱いながらリジンも切断し、CLOはアルギニン特異性が高いことから、リンカーペプチドの相違がその基質特異性の差異の一つと考えられた。また、Clpは、重鎖や軽鎖を自己消化するので、リンカーはシャペロン機能を持つことが示唆された。Clpのリンカーの分離や変異導入は実施できなかった。極めて精巧に変異を導入するシステムを構築することに成功したので、それを用いてClpの変異導入が可能となった。また、その系を利用して構築した6個の遺伝子を欠損するウェルシュ菌宿主で、Clpの大量調整が可能になった。Clpによる組織障害作用をマウスの実験的ガス壊疽で調べた。野生株とClp欠損株で、10^9PFUをマウスの大腿の筋肉内に接種し、8時間後に病理学的な観察を行った。両株ともガス産生を伴う腫脹、筋肉組織の広範な壊死とLeukostasisが観察され、発症時間、障害の程度で差を認めなかった。なお、Clpはマウスの皮下投与で、血管透過性を高める作用が認められた。これは、ギンギパインで報告されているプレカリクレイン活性化によるブラジキニン生成作用によると考えられる。ガス壊疽発症実験では、菌の少量接種時に食細胞の影響が、本症の発症や進展を左右するとの報告もあり、野生型とClp変異株の少量接種実験を行い、その機能を評価する必要性が明らかとなった。好中球との相互の作用で、毒素以外に菌の作用から、eat-meシグナル解析する方向を検討しているが、その解析適した各種の毒素の変異株を作成した。ウェルシュ菌の各種毒素の量産化のために、キシロース誘導系を用いた発現系を作出することに成功した。我々の確立した大量精製系により、高純度のClpの精製を行った。そのClpをヒトの白血球、マクロファージに作用させ、膜画分のプロテオミック解析を試みたが、結論を導く実験結果を得ることはできなかった。リンカーペプチドの効果についても、その分離精製が困難であったため、リンカーペプチドによる活性制御の実験には至らなかった。

各種の変異株のマウスへの接種実験では、α毒素とθ毒素の効果が主要であり、Clpの有無による病原性の相違については、有意差を認めなかった。以上より、「Clpはガス壊疽発症の重要な病原因子であるとする」我々の仮説を立証する成果は得られなかった。しかし、初年度に見出した「Clp変異菌は細胞内成分を培養上清中に蓄積し、凝集性を高める」という現象について検討したところ、その機構とウェルシュ菌の病原性について、幾つかの新しい知見を得ることができた。glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenaseの解析から、この酵素のウェルシュ菌の菌体表層への集積が見られ、このことが菌の凝集性に関与する可能性が示唆された。この酵素については、原核真核細胞ともに表層での機能が注目されており、今後も検討を進める予定である。Clp変異菌の特徴として観察された熱凝集性と自己凝集性との関係性を明らかするため、Clpの阻害剤であるEDTAをウェルシュ菌培養液に添加したところ、自己凝集性が誘発された。使用した菌株は芽胞非形成性のstrain 13であるため、芽胞形成性の菌株について現在検討を行なっている。
生理的流血状況におけるフォンヴィレブランド因子のずり速度依存性機能の解析

本研究では、生理的血流下におけるフォンヴィレブランド因子(VWF)のずり速度依存性の機能を解析し、以下の知見を得た。フローチャンバーシステムを用いて、生理的な血流状況を再現し、従来静止系の結合実験で評価されてきたvon willebrand因子(VWF)の機能を様々な速度下で評価し直した。実際、心筋梗塞や脳血栓などの致死的な動脈血栓症は、極めて高いずり速度で成立することが最近注目を集めており、VWFの高ずり速度下における決定的な血栓形成への貢献が重視されている。今回、従来のEpifluorescence顕微鏡での観察システムを改良し、共集点レーザー顕微鏡、走査電子顕微鏡を組み合わせた解析システムを確立し、個々の血小板の粘着から血小板血栓の3次元的進展に至る全過程を詳細に観察し、VWFのdynamicなずり速度依存性機能を解析した。その結果、(1)生理的なthumbogenicsurfaceに固相化されたVWFは、血小板のDynamicなshape changeをインテグリンαIIbβ3を訂した"Inside-out"又は"outside-in"シグナルで司どっており、このshape changeは、高ずり速度下での高速血流に対抗すべく合理的に制御されていることが判明した。(Artertosclr. Thumb, Vasc Biol,22:329-33,2002)。(2)また、高ずり速度下においてSoluble VWFは、もう一方の粘着蛋白であるフィブリノゲンとの連携機能で、血栓の3次元的進展を制御していることが判明した(Int. J. Hematol,75:19-24,2002)。
動的環境に適用可能な３次元分散協調型視覚環境モニタリングシステムの構築

本研究では,位置や姿勢・ズーム倍率が制御可能な複数の視覚センサを用いた,環境モニタリング手法の構築を目的としている.その達成のため,2018年度はジョージア工科大学Magnus Egerstedt教授の研究室に滞在した.本滞在を通じて,視覚センサを搭載した複数台のクアッドコプターの位置とズーム倍率を協調制御することで,効率的なモニタリングを達成する手法を提案した.以下に詳述する.まず,本研究では(I)環境中の重要領域を高解像度で捕捉すること,(II)視野の重複を避けて,広範囲をモニタリングすること,(III)クアッドコプターの視野に囲まれた領域に未監視領域ができないようにすることの三つを同時に達成することを目指した.ここで目的(II)を達成しようとすると,各クアッドコプターは互いの視野が重ならないようにするため,視野間に未監視領域が発生して目的(III)が達成できない.この視野間の未監視領域は,目的(I)で各クアッドコプターが重要領域を捕捉しようとすることを踏まえると,重要領域に発生することが多い.そのため,目的(III)が満たされないとモニタリング性能が著しく劣化してしまう.一方で,目的(II)と(III)は相反する目的であり,従来手法だとこれら全ての目的を達成することは困難であった.そこで,研究員がこれまでの研究で進めてきた視覚環境モニタリングに関する知見と滞在先研究室が理論構築を推し進めている「制約条件に基づく制御手法」を融合させることで上記の目的全てを達成させることを図った.具体的には,目的(I)と目的(II)の達成度を示す評価指標を最適化するための入力を,制約条件として定式化した目的(III)を満たすように最小限修正するという意味合いの最適化問題を解き,その解を各クアッドコプターへ入力した.以上の成果をロボティクス分野における国際会議に投稿し,採録が決定された.平成30年度が最終年度であるため、記入しない。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。位置・姿勢・ズーム倍率が制御可能な複数の視覚センサを用いた,動的な3次元環境のモニタリング問題に対して,2016年度は以下の4つのことに重点的に取り組んだ.まず,3DCGソフトウェアによって模擬した遮蔽物や監視対象が複数ある3次元環境下で,提案モニタリング手法の有効性を検証するシミュレータを構築した.これにより,従来のシミュレータで検証できなかった画像取得や画像処理を含む,提案手法の全プロセスの有効性を検証可能となった.加えて,複数の視覚センサや監視対象,遮蔽物が存在する広い3次元環境といった,実験で検証するには時間・コストの面から困難なシナリオに対する有効性検証も容易に行えるようになった.つぎに,先行研究で提案したモニタリング手法に,機械学習を用いた人間の検出法を新たに導入することで,計算時間・精度を向上させた.また,上述のシミュレータと改良を加えた実験システムを用いて提案手法の定量的評価と有効性検証も実施した.本結果は,制御分野で最高峰の国際学術論文誌に投稿中である.さらに,監視対象である歩行者の3次元位置・体積を楕円体として推定する問題を考察し,上記のシミュレータにより検証をした.この際,上記の推定問題を分散最適化問題として定式化し,提案手法が最適解に収束することを,凸最適化問題が持つ受動性という性質から保証した.この理論的結果は世界的にみても新規性が高い結果である.最後に,今まで制御対象を姿勢とズーム倍率のみが制御可能な設置式の視覚センサとしてきたが,新たに並進運動も可能な視覚センサへと拡張することを目指した.このために2016年度は検証用の実験環境構築に取り組んだ.現在までに,複数のクアッドコプターを,パソコンから送信した所望の位置に移動させることができている.2017年度も引き続き実験環境の構築をすると共に,提案モニタリング手法の拡張をしていく.本年度は,当初計画していた目標の内(i)3DCGを用いたシミュレータの構築と(ii)3次元環境上での監視対象の3次元位置・体積推定の2つをおおむね達成することができた.さらに,当初の計画をより発展させた方向に研究を進めることもできた.まず,(i)に関して遮蔽物や監視対象が多数ある複雑な実環境を3DCGにより模擬し,その仮想空間内で提案モニタリング手法の有効性を検証できるシミュレータの構築を完了した.本課題は当初予定した通りに進んでいる.来年度以降も本シミュレータを改良しつつ,提案手法の検証を進める予定である.つぎに,(ii)に関して3次元環境上での監視対象の3次元位置・体積を楕円体として推定する問題を,分散最適化問題として定式化した.さらに,提案手法が最適解に収束することを,凸最適化問題が持つ受動性という性質から保証した.当初の計画では,この推定した監視対象の重要度の推定・関数化まで予定していたものの,後述の新たな研究方向性の下では比較的優先度が低いと判断し,今年度は実施を見送った.来年度以降も,他の研究課題と優先度を比較しつつ,計画を立て直すつもりである.最後に,当初計画していた研究計画をより発展させ,姿勢・ズーム倍率だけでなく並進運動も可能な視覚センサへも適用できるように提案手法を拡張することにした.このために,本年度は関連研究の調査と実験システムの構築に取り組んだ.現在までに,複数のクアッドコプターを,パソコンから送信した所望の位置に移動させる実験システムを構築済みである.位置・姿勢が制御可能な複数の視覚センサを用いた,動的な3次元環境のモニタリング問題に対して,2017年度は以下の2つのことに重点的に取り組んだ.

まず,先行研究で提案した監視対象の3次元位置・体積を楕円体として推定する手法の改善を行った.2016年度までに,本問題を分散最適化問題として定式化し,受動性に基づく分散最適化アルゴリズムを提案した.しかし,この手法では最適解への収束速度が遅いことから,歩行者といった動的な対象に対しては推定が追いつかず精度が悪くなるという問題点があった.さらに,一部の視覚センサが歩行者を見失うと,その影響が大きく推定結果に影響するという問題点もあった.これらの問題を解決するために,2017年度は従来手法に位相進み補償器を導入した新たな分散最適化アルゴリズムを提案し,本問題に適用した場合においても最適解への漸近収束が保たれることを証明した.また,新たに導入した位相進み補償器の設計手順をループ設計法に基づき示した.この結果,最適解への収束性の向上と推定対象を見失った際の影響の低減化を達成することができた.最後に,3DCG描画ソフトにより模擬した3次元環境下でシミュレーションによる検証をし,動的な対象に対しても良好な推定結果を得られることを確認した.つぎに,今まで制御対象を姿勢とズーム倍率のみが制御可能な視覚センサとした環境モニタリング手法を提案してきたが,並進運動も可能なロボットなどに搭載された視覚センサを用いた環境モニタリングを扱えるように本研究を拡張することを目指した.このために2017年度は2016年度に引き続き実験環境の構築に取り組んだ.現在までに,パソコンから送信した制御入力に応じて,視覚センサを搭載した複数台のクアッドコプターを動かすと共に,搭載された視覚センサからの画像データをパソコン側にフィードバックする実験環境の構築が完了している.2017年度は,当初計画していた目標の内,(ii)3次元環境下での監視対象の3次元位置・体積推定を動的な対象に対しても十分な精度で達成できるように改善した.さらに,当初の計画をより発展させた方向に研究を進めた.まず,2016年度に提案した監視対象の3次元位置・体積を楕円体として推定する分散最適化アルゴリズムを改善した.従来手法でも静的な監視対象に対しては良好な推定精度が見られた.しかし,本研究が目標としている視覚センサの視野を遮る障害物がある環境下での動的な監視対象に対する推定では,推定結果の楕円体が監視対象よりも極端に大きくなる,推定が追いつかないという問題点が残った.2017年度では,従来手法に位相進み補償器を新たに導入した分散最適化アルゴリズムを提案し,最適解への収束性を保証したまま,最適解への収束速度の向上を達成した.これにより,動的な対象に対しても従来手法と比べて良好な推定結果を得ることが可能となった.当初の計画では,この推定した楕円体に監視対象の重要度を反映した関数をマッピングすることも考えていたが,後述の新たな研究方向性の下では優先度が低いと判断したため実施を見送った.つぎに,当初計画していた研究計画をより発展させ,姿勢に加えて位置も制御可能なロボットに搭載された視覚センサによる環境モニタリングへ本研究の拡張を試みている.