hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
音響解析を用いた呼吸リハビリテーションの客観的評価について

成人患者4名において呼吸音の音響学的に解析を行った。そのうち2名において呼吸理学療法(呼理法)施行前・中・後の呼吸音および呼吸手技をデジタルビデオカメラに記録して、記録された呼吸音を音響学的に解析した。また、呼理法中には、呼吸管理モニターコズモプラス8100(ノバメトリックス・メディカル・システム社製)を用いて呼吸状態を測定した。残りの2名は、呼理法前・後の呼吸音をミニディスクレコーダーに録音して音響学的に解析した。呼吸音は聴診器のチェストピースとピン型小型マイクロフォンを連結した聴取装置をデジタルビデオカメラ(Sony社製DCR-PC120)に接続して、理学療法士が行っている呼理法と同時に記録した。音響解析は、音響解析ソフトSound Scope(GW Instruments社製)を用いて、呼吸音をサウンドスペクトルグラムに変換して行った。デジタルビデオテープに記録した呼理法手技画像とサウンドスペクトルグラムに変換した呼吸音を比較検討した。さらに、呼理法中の分時換気量、気道内圧、VCO_2,ETCO_2,等の呼吸状態も測定した。結果は、呼吸音は呼理法中だけでなく呼理法後も呼理法前より増強していた。また、呼理法中の呼吸音の変化を記録することができ、呼理法手技により呼吸音が増強している場合や手技と呼吸が合わずに呼吸音の増加が顕著でない場合が見られた。呼理法の手技によっても、呼吸音の増強に差があることがわかった。呼理法中の呼吸状態の測走からはVCO_2の上昇を認めた。その他の分時換気量、気道内圧、ETCO_2等には大きな変化は認められなかった。呼理法中のVCO_2の上昇は呼理法手技によるものではなく、呼理法中に行われる体位変換の影響と思われた。これまでに、呼理法前・後のラ音に着目して排痰訓練評価に呼吸音の音響解析が有効であったと報告してきた。今回の結果からは、排痰訓練に限らず呼理法同一手技でも患者の呼吸に同期して呼理法が行う必要がある。また、呼理法の手技についても患者の状態に合わせて選択する必要がある。この2項目が新たに示唆することができた。また、デジタルビデオカメラとミニディスクレコーダーを用いて呼吸音を記録したが、呼理法手技や呼吸との同期状況を比較できる点で、デジタルビデオカメラによる記録が優れていた。急性呼吸不全に陥り人工呼吸器管理を行なっている成人患者3例、呼吸器管理を行なっていない成人患者3例および人工呼吸管理を行なっている小児患者2例において呼吸理学療法(呼理法)前後の呼吸音を音響学的に解析した。人工呼吸器管理を行なっている成人患者2例、呼吸器管理を行なっていない成人患者2例および人工呼吸器管理を行なっている小児患者1例では、複数日に呼吸音の測定を行ない経時的な変化についても検討した。さらに、人工呼吸器管理を行なっている成人患者2例および小児患者1例で呼理法中の呼吸状態を測定した。呼吸音の解析は、呼吸音をサウンドスペクトルグラムに変換して呼理法前後で比較した。呼理法中の呼吸状態の測定・解析には呼吸管理モニターコズモプラス8100(ノバメトリックス・メディカル・システム社製)およびノート型マイクロコンピュータ(Sony社製VAIO)を用い、分時換気量、気道内圧、VCO_2、ETCO_2等を測定した。音響解析の結果は、分泌物によると思われるら音については呼理法前後でその変化を捕らえることができた。これらの変化は人工呼吸器管理を行なっている成人および小児例で顕著であった。特に、小児例では吸引前後にも呼吸音の変化を捉えることができ、吸引のタイミングの判断には非常に有用であると思われた。経時的な呼吸音の音響学的な変化(音の強さや周波数)については、周辺雑音の影響により比較が難しく今後の検討課題である。呼理法中の呼吸状態の解析では、呼理法中の体位変換時には分時換気量の低下、気道内圧の上昇、VCO_2の低下、ETCO_2の上昇などが認められた。呼理法施行以外の体位変換時にも十分な注意が必要であると思われた。呼吸状態の解析については、呼理法の手技との関係や分時換気量、気道内圧、VCO_2、ETCO_2以外のパラメーターについての検討が今後の課題である。小児患者3例、成人患者2名において呼吸理学療法(呼理法)施行前後の呼吸音を録音し音響学的に解析した。小児3例は急性呼吸不全に陥り人工呼吸管理を行なっていた小児患者で、2名は陣理法施行前後の呼吸音について比較検討した。残りの1名については、デジタルビデオカメラに呼吸音および理学療法士が行っている呼理法手技を記録して、呼吸音と手技と関係について検討した。成人患者2名は腹部手術施行患者で、呼吸理学療法(呼理法)施行前後の呼吸音および経時的(数日間隔)に呼吸音を録音して音響学的に解析した。成人1名については、術前からの呼吸音の変化についても検討した。呼吸音は、聴診器のチェストピースとピン型小型マイクロフォンを接続した聴取装置でミニディスクレコーダーに録音した後、音響解析ソフトSound Scope (GW Instruments社製)を用いて音響学的に解析を行なった。具体的には、呼吸音をサウンドスペクトルグラムに変換して比較した。呼理法施行

手技および呼理法撮影中の呼吸音についてはデジタルビデオカメラ(Sony社製DCR-PC120)を用いてデジタルビデオテープに記録した後に、呼吸音をサウンドスペクトルグラムに変換して画像と比較した。呼吸音の音響解析の結果は、小児例で呼理法前には認め呼理法後には消失していた分泌物によると思われるラ音を画像(サウンドスペクトルグラム)上で確認することができた。成人例では、呼理法前後で呼吸音の増強を認め、換気の改善が推測された。また、呼吸音の経時的な計測では、経時的に呼吸音の増強を認めた。デジタルビデオカメラで記録した呼理法手技とサウンドスペクトルグラムに変換した呼吸音の比較では、呼理法手技のよる呼吸音の変化を捉えることができた。今後は、呼理法施行中の呼吸状態(分時換気量、気道内圧、VCO_2、ETCO_2,等)の測定・記録・解析と呼理法施行手技と呼吸状態の関係の究明が課題である。成人患者4名において呼吸音の音響学的に解析を行った。そのうち2名において呼吸理学療法(呼理法)施行前・中・後の呼吸音および呼吸手技をデジタルビデオカメラに記録して、記録された呼吸音を音響学的に解析した。また、呼理法中には、呼吸管理モニターコズモプラス8100(ノバメトリックス・メディカル・システム社製)を用いて呼吸状態を測定した。残りの2名は、呼理法前・後の呼吸音をミニディスクレコーダーに録音して音響学的に解析した。呼吸音は聴診器のチェストピースとピン型小型マイクロフォンを連結した聴取装置をデジタルビデオカメラ(Sony社製DCR-PC120)に接続して、理学療法士が行っている呼理法と同時に記録した。音響解析は、音響解析ソフトSound Scope(GW Instruments社製)を用いて、呼吸音をサウンドスペクトルグラムに変換して行った。デジタルビデオテープに記録した呼理法手技画像とサウンドスペクトルグラムに変換した呼吸音を比較検討した。さらに、呼理法中の分時換気量、気道内圧、VCO_2,ETCO_2,等の呼吸状態も測定した。結果は、呼吸音は呼理法中だけでなく呼理法後も呼理法前より増強していた。また、呼理法中の呼吸音の変化を記録することができ、呼理法手技により呼吸音が増強している場合や手技と呼吸が合わずに呼吸音の増加が顕著でない場合が見られた。呼理法の手技によっても、呼吸音の増強に差があることがわかった。呼理法中の呼吸状態の測走からはVCO_2の上昇を認めた。その他の分時換気量、気道内圧、ETCO_2等には大きな変化は認められなかった。呼理法中のVCO_2の上昇は呼理法手技によるものではなく、呼理法中に行われる体位変換の影響と思われた。これまでに、呼理法前・後のラ音に着目して排痰訓練評価に呼吸音の音響解析が有効であったと報告してきた。今回の結果からは、排痰訓練に限らず呼理法同一手技でも患者の呼吸に同期して呼理法が行う必要がある。また、呼理法の手技についても患者の状態に合わせて選択する必要がある。この2項目が新たに示唆することができた。また、デジタルビデオカメラとミニディスクレコーダーを用いて呼吸音を記録したが、呼理法手技や呼吸との同期状況を比較できる点で、デジタルビデオカメラによる記録が優れていた。
糖尿病患者の社会経済状況が慢性合併症進行に影響するメカニズムの行動経済学的解明

2017年10月から日本医科大学付属病院糖尿病内分泌代謝内科で専門外来を受診中の患者に対し行動経済学的質問票による調査への参加依頼を開始した。2018年10月までに質問票を配布し、参加に同意し質問票に回答したのは387名、男性236名、女性151名、年齢62.1±12.5歳(平均±SD)であり、疾患の内訳は糖尿病患者305名(1型糖尿病27名、2型糖尿病273名、そのほかの糖尿病4名)、糖尿病以外(甲状腺疾患、下垂体疾患、脂質異常症等)82名であった。質問票の質問例危険回避度;1日以内に1%の確率で10万円の損害が起こるとします。ただし、保険料を払っておけばその損害額を保険会社が払ってくれます。次のように各保険料でその保険をかけることができるなら、あなたは保険をかけますか。【結果】危険回避度に関する質問の回答から、白紙の回答、一部分のみしか○をつけていない回答、標準的経済学の考え方に矛盾する回答を不適切・非合理的回答(非合理)とし、その他を適切・合理的(合理)とした。非合理の比率は年齢とともに上昇したが、糖尿病患者で特に顕著で、65歳以上では非合理は糖尿病以外では19 %であったが、糖尿病患者では44 %と非常に高かった(p=0.0050)。糖尿病患者では合理、非合理でHbA1cに有意差はなかったが、非合理のほうが網膜症を有している率が高く(p=0.0091)、腎症を持つ確率が有意に高かった(p=0.0281)。【結論】糖尿病患者では質問票に対し不適切・非合理的な回答をする患者が多く、またそのような患者では網膜症と腎症を有する頻度が有意に高かった。糖尿病患者は、他の疾患の患者と比べてリテラシー能力の低い患者の比率が高く、糖尿病の発症と進展に深く関係している可能性が示唆された。これらの結果は糖尿病学会および行動経済学会で報告している。本研究は患者調査である。アンケート調査により患者の行動経済学的性向とsocioeconomic statusを調査し、患者データと併せて解析を行い、糖尿病の発症や合併症の進展に患者の行動経済学的性向とsocioeconomic statusが強く影響していることを証明することを研究の目的としている。東京文京区の日本医科大学付属病院において500名を目標としてアンケート調査の依頼を2017年10月より開始し、2018年10月までに500名の配布を終了し、解析を行って実績の概要に示したような結果を得ている。さらに千葉県印西市の日本医科大学千葉北総病院においても同様の質問票調査を行っており、地域や疾患による違いを分析中である。これまで、東京都心の文京区の病院と、首都圏ながら地方と言える千葉県印西市の病院で調査を行ってきた。それだけでは不十分と考えられ、平成31年度からは千葉県浦安市の順天堂大学浦安病院の小谷野准教授に研究分担者に加わっていただき、千葉県浦安市での調査も行う。浦安市は千葉県でも東京都心により近く、印西市と東京都心の中間的な位置に属すると考えられる。これにより地域的な特性を明らかにすることができると考えられる。またさらに、糖尿病以外の疾患、特に甲状腺中毒症など精神状態に影響すると思われる疾患についても調査を行い、糖尿病との違いを明らかにすることで、糖尿病に特異的な行動経済学的性向を明らかにできると考えられる。専門医療機関での治療中の血糖コントロールに影響する行動経済学的および社会経済学的因子について調査を行なった。【方法】対象患者は東京都文京区の日本医科大学付属病院通院中の糖尿病および糖尿病以外の疾患で外来通院加療中患者。アンケートの質問項目はすでに報告した質問票を一部改変して使用した。アンケート参加の同意を得られた105名の内訳は1型糖尿病8名、2型糖尿病77名、そのほかの糖尿病1名、糖尿病以外(甲状腺疾患、下垂体疾患、脂質異常症等)19名。男性62名、女性43名、年齢60.4±13歳(平均±SD)、糖尿病患者のHbA1cは7.2±1.21 %であった。【結果】様々な行動経済学的質問項目を分析したところ、心筋梗塞や脳卒中になる確率が何%だと自分もかかると思うかとの質問で、2型糖尿病でHbA1c 8%以上の患者は41.9 ±5.83 (平均±SE) 8%未満では28.2±2.84と8%未満の患者のほうが有意に危険回避的傾向を認めた。(P<0.0401)また、非糖尿病患者では自分が心血管障害になる可能性を甘くみる患者ほど予防に払う金額が低くなるというリスク評価とその回避に払う費用に一貫した合理性があるのに対し、コンロールの良悪にかかわらず2型糖尿病ではリスク評価とその回避に払う費用に相関が認められなかった。【結論】2型糖尿病患者ではリスク評価に対する経済行動に一貫性が認められない。さらに血糖コントロール不良の患者ではリスクに対する危険回避度が低い傾向が認められた。【意義】2型糖尿病における脳のインスリン抵抗性が代謝異常の原因であることがいくつかのデータから証明されつつある。今回の研究は2型糖尿病では脳の認知機能に問題があることを示しており、この現象は脳のインスリン抵抗性で説明できる可能性がある。

糖尿病患者および非糖尿病患者について、その行動経済学的および社会経済学的状況(Socioeconomic status)を調査し、2型糖尿病は脳のインスリン抵抗性に原因があり、認知機能やその結果として社会経済学的状況に影響しているという仮説を検証している。アンケート調査は1,000名を予定している。これまでの研究を分析して、新しい質問票を作り、アンケート調査内容および方法について倫理委員会の審査で承認されて、印刷をして調査を開始するのが10月となった、12月までで100名のデータを集めて分析を行って上記のような結果を得て、2018年の日本糖尿病学会で発表することした。アンケート調査は順調にすすんでおり、3月まで約500名にアンケートを配り終えている。順調に進んでいると考えられる。2017年10月から日本医科大学付属病院糖尿病内分泌代謝内科で専門外来を受診中の患者に対し行動経済学的質問票による調査への参加依頼を開始した。2018年10月までに質問票を配布し、参加に同意し質問票に回答したのは387名、男性236名、女性151名、年齢62.1±12.5歳(平均±SD)であり、疾患の内訳は糖尿病患者305名(1型糖尿病27名、2型糖尿病273名、そのほかの糖尿病4名)、糖尿病以外(甲状腺疾患、下垂体疾患、脂質異常症等)82名であった。質問票の質問例危険回避度;1日以内に1%の確率で10万円の損害が起こるとします。ただし、保険料を払っておけばその損害額を保険会社が払ってくれます。次のように各保険料でその保険をかけることができるなら、あなたは保険をかけますか。【結果】危険回避度に関する質問の回答から、白紙の回答、一部分のみしか○をつけていない回答、標準的経済学の考え方に矛盾する回答を不適切・非合理的回答(非合理)とし、その他を適切・合理的(合理)とした。非合理の比率は年齢とともに上昇したが、糖尿病患者で特に顕著で、65歳以上では非合理は糖尿病以外では19 %であったが、糖尿病患者では44 %と非常に高かった(p=0.0050)。糖尿病患者では合理、非合理でHbA1cに有意差はなかったが、非合理のほうが網膜症を有している率が高く(p=0.0091)、腎症を持つ確率が有意に高かった(p=0.0281)。【結論】糖尿病患者では質問票に対し不適切・非合理的な回答をする患者が多く、またそのような患者では網膜症と腎症を有する頻度が有意に高かった。糖尿病患者は、他の疾患の患者と比べてリテラシー能力の低い患者の比率が高く、糖尿病の発症と進展に深く関係している可能性が示唆された。これらの結果は糖尿病学会および行動経済学会で報告している。本研究は患者調査である。アンケート調査により患者の行動経済学的性向とsocioeconomic statusを調査し、患者データと併せて解析を行い、糖尿病の発症や合併症の進展に患者の行動経済学的性向とsocioeconomic statusが強く影響していることを証明することを研究の目的としている。東京文京区の日本医科大学付属病院において500名を目標としてアンケート調査の依頼を2017年10月より開始し、2018年10月までに500名の配布を終了し、解析を行って実績の概要に示したような結果を得ている。さらに千葉県印西市の日本医科大学千葉北総病院においても同様の質問票調査を行っており、地域や疾患による違いを分析中である。現在、アンケート調査は順調に進んでおり、2年目には詳細なデータの分析に入る予定である。6月には約700名のアンケート調査が終了し、患者データの入力にかなりの時間が必要となると考えている。
寒冷地におけるコンクリート構造物の塩害に対する照査基準の提案

凍害環境下でコンクリート表面の液体が結氷する場合の限界塩化物イオン濃度は,結氷がない場合の限界塩化物イオン濃度よりも10%30%程度小さく設定する必要があると言える.また,凍害環境下においてコンクリート中への塩化物イオン浸透を予測する場合,一般的に算出される表面塩化物イオン量を2倍に設定することで,凍結融解作用に伴う,コンクリート内部での塩化物イオンの濃縮現象を安全側に見積もることができる.平成25年度に計画していた「凍結融解環境下・20°C環境下での発錆試験の実施による腐食性状およびCl-量分布の測定」および「使用材料および配合が発錆位置とCl-量分布の関係に及ぼす影響の比較整理および考察」に関する検討を行った。特に,Cl-量分布の測定については,凍結融解作用を受けるモルタルに対して,方向によって浸透状況の異なる塩化物イオンの浸透性状をEPMAにより実験的に把握した.また,実験から得られた塩化物イオンの濃度分布から,凍害を受けるモルタルへの塩化物イオン浸透に関する二次元的な計算を行うことで,凍害環境下における塩化物イオン浸透性状を評価した.また,凍害および塩害の複合劣化を受けるコンクリートの塩化物イオン浸透性状が鉄筋腐食に与える影響に関する知見を得ることを目的とした検討を行い,凍結融解作用を受けたコンクリートへの塩化物イオンの浸透は表面に近いところで留まりやすいこと,およびコンクリート表面が結氷する場合における限界塩化物イオン量は,結氷しない場合の約0.9倍の値で設定する必要があることを明らかとした.凍害環境下でコンクリート表面の液体が結氷する場合の限界塩化物イオン濃度は,結氷がない場合の限界塩化物イオン濃度よりも10%30%程度小さく設定する必要があると言える.また,凍害環境下においてコンクリート中への塩化物イオン浸透を予測する場合,一般的に算出される表面塩化物イオン量を2倍に設定することで,凍結融解作用に伴う,コンクリート内部での塩化物イオンの濃縮現象を安全側に見積もることができる.寒冷地におけるコンクリート構造物の塩害に対する根拠の希薄な現行耐久設計および維持管理体系を見直すための成果を上げる.そのために,複数の異なる材料から構成されるコンクリートに対し,スケールの異なる材料領域に着目してコンクリート中の鋼材発錆原理を解明することにより,凍結と融解を繰返し受ける寒冷地のコンクリート中鋼材の腐食発錆に対する塩化物イオンの限界濃度と規制の在り方を提案することを目的としている.そのために,凍害を受けるコンクリート中の鋼材腐食に対するCl-の限界濃度と規制の在り方について考察し,寒冷地におけるコンクリート構造物の適切な耐久設計および維持管理体系を提案するため,本申請による研究期間内に1)凍結融解作用下におけるCl-固定化現象のモデル化,2)凍結融解作用下での鉄筋コンクリート供試体を用いた発錆試験によるClimの実験的算定値, 3)実験的に算定されたClimとの整合性評価に基づく構築したCl-固定化モデルの妥当性,および4)Cl-固定化モデルおよび発錆メカニズムに基づいた適切な照査および材料選定方法について明らかとする.特に、平成24年度においては、1セメントペースト,モルタルおよびコンクリートの塩水浸漬および凍結融解試験の実施し,2所定の試験期間終了後,各Cl-量の測定およびCl-固定化モデルを検討し,さらに3かぶりを連続的に変化させた鉄筋コンクリート供試体を作製し,発錆試験を開始した.積雪寒冷地におけるコンクリート構造物に対して凍結防止剤を散布する場合,凍害と塩害が複合的に作用し,構造物を劣化させることが問題となっている。しかし,凍害を受けるコンクリートへの塩化物イオンの浸透予測については明確な定義がなされておらず,検討が必要である。凍結融解作用を受けるモルタルへの塩化物イオンの浸透性状の把握および凍結融解に伴うモルタルの細孔構造の変化と塩化物イオンの浸透性状の関係性について検討することを目的とした結果,以下の結論を得た。1)凍結融解サイクル数の増加に伴い,塩化物イオンの浸透量は増加し,浸透面から深く浸透する。2)本研究における塩化物イオンの浸透予測では,浸透面からの深さ約20mmまでの範囲において,実測値が解析値を大きく上回る。3)凍結融解サイクル数の増加に伴い,本研究における塩化物イオン濃度の浸透予測と実際の浸透量の間に差異が生じる。本研究では,塩化物イオンの浸透のみ考慮して拡散係数を算出した。凍害劣化による細孔構造の変化をもとに拡散係数に重みを付けるなど,供試体の性能の変化を浸透解析に適用することでより精度の高い複合劣化の浸透予測が実現できると考えられる。また,解析を行うにあたり,表面塩化物イオン濃度を浸透面上で一定であるとし,拡散係数を深さ方向で一定であるとしたが,これらに対しても,凍害劣化の度合いや組織の変質に基づいて変化をつけることが必要であると考えられる。他にも,実験のパラメータとして,結氷する氷の量や凍結融解速度などの違いによる影響を検討することで,予測の精度を高めることができると考えられる。また,実験における凍結融解サイクルと,実環境課における凍結融解作用の関係性を明確にする検討も今後の課題である。コンクリート工学当初の研究計画においては,平成26年度内に「寒冷地におけるコンクリート構造物の適切な設計・維持管理基準の構築および提案」に関する知見を取り纏めることとしていたが,平成25年度終了時点において,寒冷地において提案することで,凍害および塩害の複合劣化をうけるコンクリート構造物の照査基準として新たな提案の一部を示すことができている。すなわち,凍害環境下においては,鉄筋の腐食発生の加速を安全側に見積もるため,腐食発生限界

塩化物イオンの照査基準について,根拠のない数値が推奨されていたのに対し,本研究では,実際の構造物・環境条件,すなわち,桁上部での劣化が著しく,桁の上面においては,排水溝などを伝って溜まった凍結防止剤の溶液による凍害と塩害の複合劣化を受け,側面では,上面から流れ落ちた溶液による塩害を主に受けることを考慮した上で,コンクリート表面が結氷する場合における腐食発生限界塩化物イオン濃度について定量的な値を既に示している。当初には,平成24年度内に鉄筋コンクリート供試体を作製し,塩水浸漬試験および凍結融解試験で発錆試験を開始し,平成25年度以降,鋼材あるいは分割鉄筋を斜めに配置し「かぶり」を連続的に変化させることで発錆開始時期に依存しないClimの実験的算定方法および分割鉄筋を用いた腐食速度解析を行う予定であったが,平成24年内に上述の一連の実験に着手しており,すでに結果を得つつある.また,平成24年度内の実験により得られた成果について,本研究の目的の一部である,材料領域により異なるスケールでコンクリートを捉える多次元的評価手法に基づいた劣化メカニズムの解明に関してられた知見を取り纏めた結果を既に複数の学術論文を投稿している.研究計画は予定の達成度を満足しているが,これまでに得られた実験結果の比較および考察を進めることで,平成26年度に予定していた,材料の条件が鉄筋の腐食に及ぼすCl-量の相互作用関係に及ぼす影響について考察する.さらに,実験計画が予定よりも進んでおり,最終的に結論付けることを計画していた「寒冷地におけるコンクリート構造物の塩害に対する適切な材料選定方法および照査の提案」について,さらに環境条件として,コンクリート表面の塩化物イオン濃度の違いを実験的に把握するための実験結果を取得して,上記の考察に加える。これにより,以上の結果に基づき,計画通りに最終年度には,凍結融解作用を受けるコンクリート中の鋼材発錆原理に基づいたコンクリート構造物の適切な耐久性設計(特に,材料選定)・維持管理(点検・照査)基準の構築を目指す.平成24年度内の研究の進捗状況は予定よりも進んでおり,詳細な検討を進められている.すなわち,平成25年度以降に実施予定であった実験的に算定されたClimに対するCl-固定化モデルに基づく発錆開始Cl-量の比較および考察を既に開始しており,これまでに得られた全Cl-,固定Cl-,自由Cl-量およびEPMA法により得られる全Cl-量分布曲線と目視で確認される腐食長および発錆の先端位置におけるかぶり深さCfから算定されるClimを基に,構築するCl-固定化モデルから得られる全Cl-,固定Cl-および自由Cl-量の相互作用関係を比較整理する.特に,使用材料および配合がCl-量の相互作用関係に及ぼす影響について考察する.さらに,寒冷地におけるコンクリート構造物の塩害に対する適切な材料選定方法および照査の提案について,今後のコンクリート構造物の部材レベルの結果に基づき,凍結融解作用を受けるコンクリート中の鋼材発錆原理に基づいたコンクリート構造物の適切な耐久性設計(特に,材料選定)・維持管理(点検・照査)基準の構築を目指す.分析用薬品および消耗備品が充足したため。計画に基づく分析を進めるための薬品購入に充てる。
微量金属の生体中における存在状態に関する研究

1.中性子放射化分析法を植物試料に対して適用する場合の正確さおよび精度に関し, 3種の植物標準試料を用いて検討し, Na, K, Rb, Ca, Cr, Mn, Fe, Co, Zn, As, Sbについて満足すべき結果を得た.この方法によって,マツおよびリョウブの葉の中の遷移元素(Mn, Fe, Co, Znなど),アルカリ金属(Na, K, Rb, Cs)およびランタノイド元素を定量し,同一地域で採取した2種の植物の間で各元素含有量にかなりの違いがあること,従来知られていたリョウブによるコバルトの濃縮がその生育地域と関係なく普遍的におこっていることを確認した.2.原子吸光分析装置を設置して,含有量既知の試料を用いて各元素の検出感度などの性能について検討し, Cr, Mn, Fe, Co, Znなどについては本研究の目的に適する精度と正確さをもって定量しうることを確認した.しかし松葉試料の場合,灰化して酸に溶かし,これを試料として直接測定する方法では,含有量が比較的多いMnとKのほかは,定量結果は必ずしも満足すべきものではなかった.干渉の除去のために何らかの簡単な化学処理が必要であると思われる.また原子吸光分析法はSr中に混入したBaの定量にも役立つことがわかった.3.EXAFSおよびXANESの測定を生体試料中の微量金属の存在状態の研究に利用するための準備として,数種の金属錯体結晶,金属錯体を含む数種の溶液系およびNiゼオライト解媒中の金属元素について検討した.ついでこれを亜硝酸還元酵素およびアスコルビン酸酸化酵素の中に含まれる銅の存在状態の研究に適用した.4.植物から微量金属含有成分を抽出してその実体を解明しようという計画は,研究者の所属機関変更によっておこった制度上の要請による研究組織縮れのため,これを中止した.1.中性子放射化分析法を植物試料に対して適用する場合の正確さおよび精度に関し, 3種の植物標準試料を用いて検討し, Na, K, Rb, Ca, Cr, Mn, Fe, Co, Zn, As, Sbについて満足すべき結果を得た.この方法によって,マツおよびリョウブの葉の中の遷移元素(Mn, Fe, Co, Znなど),アルカリ金属(Na, K, Rb, Cs)およびランタノイド元素を定量し,同一地域で採取した2種の植物の間で各元素含有量にかなりの違いがあること,従来知られていたリョウブによるコバルトの濃縮がその生育地域と関係なく普遍的におこっていることを確認した.2.原子吸光分析装置を設置して,含有量既知の試料を用いて各元素の検出感度などの性能について検討し, Cr, Mn, Fe, Co, Znなどについては本研究の目的に適する精度と正確さをもって定量しうることを確認した.しかし松葉試料の場合,灰化して酸に溶かし,これを試料として直接測定する方法では,含有量が比較的多いMnとKのほかは,定量結果は必ずしも満足すべきものではなかった.干渉の除去のために何らかの簡単な化学処理が必要であると思われる.また原子吸光分析法はSr中に混入したBaの定量にも役立つことがわかった.3.EXAFSおよびXANESの測定を生体試料中の微量金属の存在状態の研究に利用するための準備として,数種の金属錯体結晶,金属錯体を含む数種の溶液系およびNiゼオライト解媒中の金属元素について検討した.ついでこれを亜硝酸還元酵素およびアスコルビン酸酸化酵素の中に含まれる銅の存在状態の研究に適用した.4.植物から微量金属含有成分を抽出してその実体を解明しようという計画は,研究者の所属機関変更によっておこった制度上の要請による研究組織縮れのため,これを中止した.1.機器中性子放射化分析法によって、リョウブおよびマツの葉の中の遷移元素(Mn,Fe,Co,Znなど),アルカリ金属(Na,K,Rb,Cs)およびランタノイド元素を定量した。従来知られていたリョウブの中のCoの濃縮が生育地域と関係なく普偏的に存在すること、同一地域で採取した2つの植物の間で各元素の含有量に大きな差があることを見出した。現在結果の解析の途中であるが、アルカリ金属についても元素毎の分別が著るしい傾向が現れている。2.原子吸光分析装置を設置して、検出感度などの性能について検討した。元素含有量が既知の標準試料の分析によって、Cr,Mn,Fe,Co,Znなどの諸元素については、本研究の目的に適当な精度・正確度をもつ分析値が得られることを確認した。3.特にリョウブの中に含まれるコバルトに着目し、それを含む成分を能率よく抽出する方法を検討しているが、現在のところ必らずしも有効な手段は見出されていない。4.EXAFS法および核磁気共鳴法については、本研究と関連がある金属酵素,金属含有蛋白質に関する測定をおこない、いくつかの興味ある知見を得ている。5.今後は特に植物の中で金属を濃縮している成分の抽出と同定に力を注ぎ、その実体の解明を目指す予定である。
ミトコンドリア発生スーパーオキサイドの半定量的検出法の開発

本研究の目的は、細胞内ミトコンドリア発生スーパーオキサイドの検出法を世界に先駆けて開発することである。活性酸素の検出には電子スピン共鳴法(ESR)を用いる。今までのESR装置ではミトコンドリア内発生スーパーオキサイドの検出は検出限界以下であり、申請者も試みたが成功しなかった。最近このESR装置の感度をおよそ100倍以上高くする装置(RRX-1X)が開発され、当教室に世界2号機を購入した。本研究ではこの装置を用いた。本年度は、平成15年度の結果を踏まえ、継続して当教室で保有のヒト培養細胞(ヒト骨芽細胞腫細胞;143B)に照射(015Gy)後のミトコンドリア発生スーパーオキサイドのESR装置(RRX-1X)を用い半定量的検出を試みた。スピントラップ剤には、5,5-Dimethyl-1-pyrroline N-oxide(DMPO)が最も一般に使用されているヒドロキシラジカルを捕獲するスピントラッピング剤である。最終0.69mM濃度でDMPOを使用し、照射2時間後の細胞内活性酸素発生検出を試みたが、検出されなかった。一方、スーパーオキサイドに対し感受性の優れる5-Diethoxyphosphoryl-5-methyl-1-pyrroline-N-Oxide(DEPMPO)を使用(最終濃度10mM)し、同様に照射2時間後の活性酸素検出を試みたが、やはり検出されなかった。しかし、細胞内、スーパーオキサイドを除去する酵素である、スーパーオキサイドディスムターゼ(MnSOD)に対するRNAiを作成し、トランスフェクトさせた場合のみ、スーパーオキサイドのシグナルが観察された。これにより、ミトコンドリア由来のスーパーオキサイド検出が見られた。しかし、感度の面で、スーパーオキサイド発生を増大させないと見られないことも分かった。本研究の目的はミトコンドリア内スーパーオキサイドの検出法の樹立を世界に先駆けて行う事である。我々は、まず、平成14年度に当教室に導入したESR装置の感度をおよそ100倍以上高くする装置(RRX-1X)の世界2号機を用い、スーパーオキサイドをトラップしやすいトラッピング剤を細胞に入れスーパーオキサイドの検出を試みたが、結果は、波形が小さく検出されなかった。そこで、生細胞を用い、共焦点レーザー顕微鏡でミトコンドリアから発生する活性酸素の画像的検出を試みた。現在まで、組胞内活性酸素の検出には2,7-dichchlorofluorescein diacetate(DCF)、およびdihydrorhidamine 123(DHR)、及びhydroethidine(HE)があるが、いずれも、活性酸素発生細胞内小器官を特定できない。我々の新しく作成した2-[6-(4'-hydroxy)phenoxy-3H-xanthen-3-on-9-y1]benzoic acid(HPF)は、OHラジカルを特異的に検出する。このHPFを用い、細胞内ROS検出を行うと、1)蛍光はミトコンドリア付近に集中して認められた。2)ミトコンドリアを特異的に認識する蛍光試薬(Mitotracker)を用い、1)の画像を重ねると両者が一致して認められた。さらに、HPFの蛍光は細胞内MnSOD遺伝子の発現により抑制された。これらより、1)で認められた蛍光部はミトゴンドリアから発生し、スーパーオキサイドに起因すると言う事が明かにされた。従って、細胞内に発生する活性酸素のほとんどはミトコンドリアから発生する事が世界で初めてわかった。来年度は、きらにミトコンドリアDNA障害とミトコンドリア発生活性酸素について調べ、ミトコンドリア発生活性酸素を明かにする予定である。
脂溶性物質が膵導管細胞における陰イオンチャネルに与える影響に関する研究

膵導管細胞の陰イオンコンダクタンスは、主として管腔側膜に発現しているCFTR陰イオンチャネルによって形成されている。本研究では、主にパッチクランプ法を用いてCFTRイオンチャネルに対する脂溶性物質の影響を調べた。芳香族カルボン酸などの負電荷を持つ小分子量の比較的弱い脂溶性の薬剤は、CFTRチャネルのシングルチャネルコンダクタンスの低下と同時に開口確率の増加を引き起こしたが、電荷を持たない小分子量の脂溶性薬剤は、シングルチャネルコンダクタンスの低下を起こさず、開口確率の増加のみを引き起こした。本研究によりシングルチャネルコンダクタンスの低下は、薬剤がチャネルポア内部にある結合サイトに結合することによって起こり、一方、開口確率の増加は細胞内ドメインのある部位に薬剤が直接結合することによって起こされることが明らかになった。また本研究では、コレステロールの形質膜含有量変化がCFTRチャネルのATP依存性ゲーティングに大きな影響を与えることが明らかになった。この現象については、CFTRチャネルのATP依存性ゲーティング機構についての研究結果から、CFTRチャネルの開閉に伴った膜貫通ドメインの構造的変化に対する機械的抗力がATPの加水分解速度に影響を与えている可能性が示唆された。以上、本研究によってCFTRチャネルに対する脂溶性物質の影響は"脂溶性"という共通した性質のみではなく、それぞれの物質に特有の性質によって大きく異なることが明らかになり、脂質代謝を介した複雑なCFTRチャネルの制御システムの存在が示唆された。また、CFTRチャネル分子について数多くの分子生理学的に重要な知見も得られた。さらに、本研究の次の展開へとつながるBK_<Ca>チャネルのゲーティングおよび末梢組織に発現しているGABA_Aチャネルについての基礎的研究も平行して行なった。I)エタノールの膵導管細胞における陰イオンコンダクタンスへの影響相馬と進藤は、ホールセルクランプ法を用いて、Forskolinによって活性化されたモルモット単離膵導管細胞の陰イオンコンダクタンスへの1mMエタノールの影響を重炭酸緩衝溶液中にて測定した。その結果、1mMエタノールは、陰イオンコンダクタンスの大きさおよびそのCl^-/HCO_3選択性に対して、特に影響を与えないという結果が得られた。石黒が行った実験では、1mMエタノールがSecretin刺激下における膵液分泌速度を上昇させると同時に分泌液の重炭酸イオン濃度を減少させることを示したが、これらのエタノールの効果は膵導管細胞の管腔側膜の陰イオンコンダクタンスのCl^-/HCO_3選択性を変化させることによって引き起こされたものではなく、エタノールが分泌刺激中の導管細胞内のクロライドイオン濃度を上昇させることによって管腔内へのクロライドイオン分泌速度が増加し、それによって膵液分泌速度を上昇および重炭酸イオン濃度の減少が引き起こされた等の可能性が示唆される。II)小分子量脂溶性物質のCFTRチャネル活性への影響とその作用機構相馬とHwang(海外共同研究者)は、比較的小分子量の脂溶性物質であるanthracene-9-carboxylic acidやbenzoic acidなどの芳香族カルボン酸が、CFTRチャネルに対してシングルチャネルコンダクタンスの低下と開口確率の増加という2つの異なる作用を持つことを示した。また、シングルチャネルコンダクタンスの低下は、薬剤がチャネルポア内部にある結合サイトに早いkineticsで結合する(fast block)ことによって起こり、また、開口確率の増加はチャネルポア内部以外の細胞内ドメインにある結合サイトに薬剤が直接結合することによって引き起こされることを明らかにした。CFTRチャネルのイオン輸送能に対して、それぞれ抑制および促進という相反する2つの作用を同時に示すことが、これらの脂溶性物質が膵外分泌に複雑に作用する理由であると考えられる。I)脂溶性物質のCFTRチャネル活性への影響とその作用機序他方、進藤と相馬が行なった予備実験ではリノレン酸は、9-ACとは逆に、CFTRチャネル活性を抑制することが示された。

このことは、これらの物質が、"脂溶性"であること以外に、CFTRチャネルのゲーティング機構に対してそれぞれ特異的な作用を持っていることを示唆しており、その作用機序を知るためには、まずCFTRチャネルのゲーティング機構自体の解明が必須であると考えられた。CFTRチャネルは、nucleotide結合部位(NBD)におけるATPの加水分解に依存したゲーティングを行なう。相馬とHwangは、Rドメインを取り除いたCFTR変異体(ΔR-CFTR)が、チャネルの不活性化が起こりにくく、しかも野生型CFTRと同様なATP依存型ゲーティングを行うことを明らかにし、ΔR-CFTRがCFTRチャネルゲーティングの研究のための有用なモデルとなりうることを示した。また、CFTRチャネルのATP依存性活性のADPによる阻害が、既知であるADPのATPとの競合的阻害以外に、2つあるNBDのN末端側のドメイン(NBD1)にADPが結合することによっても引き起こされることを示した(J.Gen.Physiol.印刷中)。I)高親和性ATP類似薬を用いたCFTRチャネルのATP依存性ゲーティング機構の研究II)形質膜含有コレステロール量のCFTRチャネルのゲーティングへの影響とそのメカニズムの解明サイクロデキストリンを用いて、形質膜に含まれるコレステロールの量の変化がCFTRチャネルのATP依存性ゲーティングに与える影響とそのメカニズムの研究を行った。コレステロールの形質膜含有量変化はCFTRチャネルのATP依存性ゲーティングに大きな影響を与えた。現在までの研究成果によると、2つのnucleotide結合ドメイン(NBD)が2つのATPを挟みこんだ形で2量体を作り(dimerization)、その構造的変化が膜貫通ドメインにあるチャネルゲートの開閉を行うための機械的応力を発生させていると考えられる(J.Gen.Physiol.,2005ab)。したがって、その逆に、コレステロールの形質膜含有量変化は、CFTRチャネルの膜貫通ドメインの構造的変化に対する機械的応力を介して、NBD2量体内部に結合したATPの加水分解速度に影響を与えている可能性が示唆された。
加齢に伴い減少する蛋白質SMP30の遺伝子構造と発現の解析

我々は、老齢Ratの肝臓において減少する新しい蛋白質SMP30を発見した。SMP30はAndrogenによる発現制御を受けず雌雄共に老齢ラットの肝臓で減少し、肝可溶性蛋白質の2%と多量に存在するにも関わらず新しい蛋白質と考えられた。さらにSMP30は肝実質細胞と腎臓の近位尿細管のみに強い発現が見られそれらの組織では共に物質の代謝、輸送、解毒等が活発でありその組織特異性にも興味が持たれた。本研究では、SMP30の生理機能を明かにしその発現制御と老化との関連を解析することを目的にしてSMP30の生理機能の解明の試みと遺伝子発現制御領域の解析のための基礎実験を行った。まずラットSMP30に相同なヒトcDNAの単離を行なった。その結果、ORFを完全に含むクローンを得ることができた。ORFは897bpからなり299アミノ酸残基をコードすると考えられた。ラットSMP30とORFの長さは全く一致しており、アミノ酸レベルで88.6%という非常に高い相同性を示した。genomic Southern hybridizationにおいてSMP30が高等動物に強く保存されていたことも考え合わせてSMP30は高い相同性をもって広く高等動物に存在していることを示唆した。さらにNorthern hybridizationの結果、ヒト正常肝においても強く発現していたことからSMP30の遺伝子発現制御と老化との関連を明らかにすることは加齢における一般的な遺伝子発現制御機構の解明の良いモデルになり得ると考えられた。次に遺伝子発現制御領域解析のための基礎実験としてCAT Assayによる転写調節領域解析のために用いる培養細胞の検討を行なった。肝臓および腎臓の正常ならびに癌化株化培養細胞のいずれにおいてもSMP30の発現はほとんど認められず著しい発現の低下を示した。しかし、ヒト肝癌細胞のHepG2およびHep3Bにおいて僅かではあるが発現が認められた。よってこれらの細胞を転写調節領域解析のために用いることができると考えられた。さらにSMP30は多くの培養細胞系において発現していないことから、逆にこれらの培養細胞系を用いて種々の薬物によるSMP30誘導の実験を組めることが明らかになった。SMP30はつい最近、山口らによって発見されたCa^<2+>結合蛋白質であるレギュカルチン/Regucalcin(RC)と同一であることが明らかになった。RCはCa^<2+>による種々の酵素活性化を制御する蛋白質として報告されている。よってSMP30/RCが老齢で減少することが老化機構にどのように結びついているのか今後の研究に期待が持たれる。我々は、老齢Rat肝においてAndrogen-independentに減少する蛋白質SMP30を発見した。現在までにSMP30の蛋白質の精製ならびにcDNAの単離に成功している。SMP30は、既存のデータベースとのHomology検索の結果、一致するものはなく全く新しい蛋白質であると考えられた。

SMP30は雌雄共に老齢で減少すること、ならびに高等動物に広く保存されていることより、その遺伝子発現制御と老化との関連を明かにすることは加齢における一般的な遺伝子発現制御機構の解明の良いモデルになり得ると考えられた。我々は、SMP30の生理機能を明かにし、その発現制御と老化との関連を解析することを目的にして、まず年限内に、Rat SMP30 cDNAに相同なHumanのcDNAの単離を試みた。その結果、1.4kbのcDNA(pHSMP6)の単離ができた。pHSMP6は1356bpでORFを完全に含んでいた。Rat SMP30とORFの長さは全く一致しておりしており、アミノ酸配列は、Ratのものと88、6%という非常に高い相同性を示した。以上の結果は、SMP30はHumanにおいても非常に高い相同性をもって保存されていることおよび、genomic Southern hybridizationにおいても高等動物に強く保存されていたことも考え合わせてSMP30は高い相同性をもって広く高等動物に存在していることが明かになった。一方、SMP30遺伝子の発現制御領域の解析のための基礎実験として様々な培養細胞についてSMP30遺伝子の発現をNorthern hybridizationによって調べた結果、HepG2細胞に発現量は減少しているものの発現していることが明らかになった。今年度は昨年度得られたヒトSMP30cDNAを用いて大腸菌の系を用いたヒトSMP30蛋白質の産製を行なっているが未だ精製にはいたっていないものの、この蛋白質を用いて各種モノクローナル抗体を作製し各種肝疾患、腎疾患との関連及び蛋白質の機能等の解析が可能になるものと考えられる。昨年にひきつずいて遺伝子発現制御領域解析のための基礎実験としてCAT Assayによる転写調節領域解析のために用いる培養細胞の検討をさらに行なった。ヒト肝癌細胞のHepG2、Hep3Bのほかヒト腎癌細胞のG401、VMRC、ラット肝癌細胞のHepaI、マウス肝細胞(3105)、その他腎上皮細胞のMDCK、MDBK、LLC-PK1についてSMP30の発現をNorthern hybridizationによって調べた。その結果肝臓および腎臓の正常ならびに癌化株化培養細胞におけるSMP30の発現はいずれの株化培養細胞においてもほとんど認められず著しい発現の低下を示した。しかし、ヒト肝癌細胞のHepG2およびHep3Bにおいて僅かではあるが発現が認められた。よってこれらの細胞を転写調節領域解析のために用いることができると考えられた。このため当初はラットゲノムDNAをとる予定であったがヒトゲノムに変更することになった。さらにSMP30は多くの培養細胞系において発現していないことから、逆にこれらの培養細胞系を用いて種々の薬物によるSMP30誘導の実験を組めることが明らかになった。次にSMP30mRNAレベルでの発現の加齢変化をNorthern hybridizationにより調べた。
溶液の分布関数理論に基づく蛋白質のリガンド結合部位および親和性の予測と解析

分子性液体の統計力学に基づく3次元RISM理論を蛋白質におけるリガンド(多原子分子)の結合部位および結合親和性の予測に応用する第一段階として、ミオグロビンに対するキセノン、一酸化炭素、酸素分子の結合に注目した。各リガンドと水の混合溶媒中のミオグロビンについて、3次元RISM理論を用いてミオグロビン周囲のリガンドの分布関数を求めた。その結果、ミオグロビン内部の4つの空洞にキセノンの吸着を示す鋭いピークを検出した。この結果はX線結晶解析の結果と一致する。また、その結合サイトには一酸化炭素や酸素分子も吸着することが分かった。この結果は、X線結晶解析で得られたキセノン結合サイトが一酸化炭素や酸素分子がヘムから放出されるときの通り道になっているとする従来のモデルを裏付けている。また、各リガンドの結合親和性の物理的要因を明らかにするため、水の静電的相互作用をオフにした仮想溶媒を用いた計算を行った。その結果、各リガンドの結合親和性を決めている主要な要因はパッキングの効果であることを明らかにした。水の水素結合ネットワークの効果(疎水効果)は、空洞の化学的性質やリガンドによって、比較的大きくでる場合とほとんど無視できる場合があることが分かった。以上のように、本研究では、3次元RISM理論が蛋白質における2原子分子リガンドの結合部位および結合親和性を予測、解析する方法として十分な能力を持っていることを示した。本研究は、今後、さらに複雑なリガンド分子に拡張する際の足掛かりとして位置付けられる。
定性かつ定量的な解析に基づくスフィンゴ脂質の消化管吸収機構と体内動態の解明

本研究は、スフィンゴ脂質の食品機能性の解明につなげるために、定性かつ定量的な解析に基づき、その消化管吸収機構と体内動態を明らかにすることを目的とした。そのために、菌体を利用して安定同位体ラベル化物作成し、LC-MS法を応用することで、経口摂取されたスフィンゴ脂質の消化管吸収における未知の機構を明らかにするとともに、体内動態と代謝的構造変化を詳細に解明しようとした。培養細胞系を用いた分子の詳細な解析を試みた。13Cラベル化スフィンゴ脂質画分(セラミドとグルコシルセラミドを含む)を小腸上皮モデル細胞であるCaco-2に添加したところ、添加試料と同じ分子種の標識されたセラミドおよびグルコシルセラミドが検出された。したがって添加したスフィンゴ脂質の一部は、構成要素にまで分解されずにそのまま取り込まれることが示された。さらに、細胞から試料中で検出されなかった標識セラミドが検出され、標識グルコシルセラミドが吸収後に細胞内で加水分解されて生じることも示された。一方、標識スフィンゴイド塩基と非標識脂肪酸を有するセラミドも検出され、外因性のスフィンゴイド塩基を利用してセラミド分子が細胞内で再合成される可能性も示唆された。標識セラミドと非標識グルコースを有するグルコシルセラミドも確認され、外因性のセラミドが細胞内でグルコシル化されることも示唆された。以上のことから、小腸上皮細胞によって取り込まれた食事性のスフィンゴ脂質は、細胞内で代謝変換される得ることが明らかとなった。また動物試験により、海産物に特有のスフィンゴイド塩基構造も吸収されることを見出した。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。スフィンゴ脂質の食品機能性が注目されているが、消化管吸収機構を含めて、未だ不明な点も多く残されている。したがって、定性かつ定量的な解析に基づくスフィンゴ脂質の消化管吸収機構と体内動態の解明は不可欠といえる。そこで本研究では、安定同位体ラベル化物を用いたLC-MS解析を応用することで、経口摂取されたスフィンゴ脂質の消化管吸収における未知の機構を明らかにするとともに、体内動態と代謝的構造変化を詳細に解明しようとした。本年度は、高度不飽和脂肪酸を生産することが見出されており、多くの変異株の解析や分子育種法の確立がなされている糸状菌Mortierella alpinaを用いて、安定同位体ラベル化したスフィンゴ脂質の作成を検討した。その結果、構成炭素をすべて安定同位体ラベル化したグルコース(13Cーグルコース)で培養することで、菌体によって生合成される内因性スフィンゴ脂質(グルコシルセラミドとセラミド)のラベル化が可能であることが分かった。その置換率は分子種にもよるが、約50%程度であった。気相を窒素で置換することでより置換率を向上できることも示されたが、菌体の増殖が低下することもわかった。また、P-タンパク質阻害剤を用いて、in vivoにおけるスフィンゴイド塩基吸収選択性に対するP-タンパク質の関与を調べた。ラット胸管リンパカニューレ手術を行い、代表的な植物由来スフィンゴイド塩基として4,8-スフィンガジエニンの吸収を解析したところ、P-タンパク質阻害剤によって、スフィンガジエニンの吸収が増加した。したがって、スフィンガジエニンの吸収にはP-糖タンパク質が関与することが、個体レベルで明らかとなった。当初の計画通り、菌体を用いた安定同位体ラベル化スフィンゴ脂質(グルコシルセラミドとセラミド)の作成に成功した。また、動物試験により、スフィンゴ脂質の吸収にP-糖タンパク質が関与することを個体レベルで初めて示すことができた。スフィンゴ脂質の食品機能性が注目されているが、消化管吸収と体内動態を含めた作用メカニズムについては、いまだ不明な点が多く残されている。消化管吸収や体内動態を調べるためには同位体ラベルを用いたトレーサーが有効である。そこで本研究では、菌体培養を利用して、安定同位体ラベル化スフィンゴ脂質の調製を検討した。また、得られた試料を用いたLC-MS解析によって、経口摂取されたスフィンゴ脂質の消化管吸収における機構と体内動態の解明を目的とした。菌体培養によって得られた13Cラベル化スフィンゴ脂質画分(セラミドとグルコシルセラミドを含む)を解析したところ、セラミド分子はトリヒドロキシ型スフィンゴイド塩基にヒドロキシ脂肪酸が結合したものであり、グルコシルセラミドはジヒドロキシ型スフィンゴイド塩基にヒドロキシ脂肪酸が結合したものが主成分であった。この試料をマウスに経口投与し、血漿脂質のLC-MS解析を行った。その結果、経口投与した安定同位体ラベル化セラミド分子とグルコシルセラミド分子を血漿から検出することができた。見かけ上の吸収率は極めて低く、これまでの知見とほぼ同レベルであった。消化管内で分解された構成成分(脂肪酸、スフィンゴイド塩基、グルコース)が吸収されることがこれまでに示されていたが、本研究結果において、血漿から検出された分子は、経口投与した分子と同じものであったことから、消化されずにそのままの分子として直接吸収される可能性も考えられた。菌体を用いて、安定同位体ラベル化スフィンゴ脂質の調製が可能となった。また、LC-MS解析により、安定同位体ラベル化セラミドやスフィンゴイド塩基が、経口投与された実験動物の生体試料から検出可能であることが確認できた。

本研究は、スフィンゴ脂質の食品機能性の解明につなげるために、定性かつ定量的な解析に基づき、その消化管吸収機構と体内動態を明らかにすることを目的とした。そのために、菌体を利用して安定同位体ラベル化物作成し、LC-MS法を応用することで、経口摂取されたスフィンゴ脂質の消化管吸収における未知の機構を明らかにするとともに、体内動態と代謝的構造変化を詳細に解明しようとした。培養細胞系を用いた分子の詳細な解析を試みた。13Cラベル化スフィンゴ脂質画分(セラミドとグルコシルセラミドを含む)を小腸上皮モデル細胞であるCaco-2に添加したところ、添加試料と同じ分子種の標識されたセラミドおよびグルコシルセラミドが検出された。したがって添加したスフィンゴ脂質の一部は、構成要素にまで分解されずにそのまま取り込まれることが示された。さらに、細胞から試料中で検出されなかった標識セラミドが検出され、標識グルコシルセラミドが吸収後に細胞内で加水分解されて生じることも示された。一方、標識スフィンゴイド塩基と非標識脂肪酸を有するセラミドも検出され、外因性のスフィンゴイド塩基を利用してセラミド分子が細胞内で再合成される可能性も示唆された。標識セラミドと非標識グルコースを有するグルコシルセラミドも確認され、外因性のセラミドが細胞内でグルコシル化されることも示唆された。以上のことから、小腸上皮細胞によって取り込まれた食事性のスフィンゴ脂質は、細胞内で代謝変換される得ることが明らかとなった。また動物試験により、海産物に特有のスフィンゴイド塩基構造も吸収されることを見出した。前年度に引き続き、消化管吸収機構の解明に向けた検討を進める。平成29年度には安定同位体ラベル化したスフィンゴ脂質のより詳細な構造解析を行う。また、同位体ラベル化スフィンゴ脂質を実験動物に経口投与し、体内からの検出を試みることで、吸収と代謝の解明に用いるための検討を進める。さらに菌体の大量培養により、安定同位体ラベル化スフィンゴ脂質の大量調整を試みる。現時点では、ラベル化されたスフィンゴ脂質が、生体内に取り込まれることが確認できたが、試料組成が複雑であり、詳細な解析が困難である。そこで、得られた試料の純度をより高めるための検討を行い、精度の良いデータ収集を図る。また投与後の経時変化や組織ごとの蓄積量などを調べることで、吸収と体内動態について知見を得る。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。