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脳梗塞巣辺縁部に存在するＮＧ２陽性マイクログリアの病態生理学的意義の解明

本研究では、虚血病巣の周辺領域にNG2陽性マイクログリアの存在を明らかにした。この細胞は、内在性マクロファージ由来であり、梗塞巣に集積する骨髄由来のNG2陽性細胞とは異なっていた。貪食細胞のマーカーであるCD68やTREM-2を発現しており、実際に神経細胞片を細胞内に取り込んでいる像が観察された。梗塞巣で発現量が多いTGF-beta1をマイクログリアに添加すると、NG2タンパクやTREM-2 mRNAの発現量を増加させ、更に遊走能を亢進させた。従ってNG2がマイクログリアによる貪食作用のいずれかのプロセスに関与し、NG2発現誘導因子としてTGF-beta1が関与していると考えられる。本研究では、虚血病巣核心部を取り囲む周辺領域に、BINCsとは異なるNG2陽性細胞の存在を明らかにした。特に、核心部にごく近い領域では、マイクログリアがNG2を発現し、更に貪食細胞マーカーであるCD68を発現していた。これらのNG2陽性マイクログリアは骨髄移植実験から内在性マイクログリア由来であると考えられた。更にアポトーシス神経細胞を認識する受容体であるTREM-2を発現し、実際にNeuN陽性の神経細胞片を細胞内に取り込んでいる像が観察された。核心部から距離を経るにつれ、NG2の発現は失われ、次第に活性化マイクログリアは見られなくなった。梗塞巣核心部から放出される生理活性物質の濃度勾配がこのようなマイクログリアの反応を産み出しているものと考え、梗塞巣で発現量が多いTGF-β1に着目した。一次培養マイクログリアにTGF-β1を添加するとNG2の発現が誘導され、この作用はTGF-β1阻害剤で抑制された。BINCsの培養上清を添加しても同様の結果が得られた。また、TGF-β1はマイクログリアのTREM-2 mRNAの発現量増加させた。以上の結果からNG2がマイクログリア/マクロファージによる貪食作用のいずれかのプロセスに関与し、NG2発現誘導因子としてTGF-β1が関与していると考えられる。ラット一過性中大脳動脈閉塞による脳梗塞巣核心部には、マクロファージマーカーのIba1とオリゴデンドロサイト前駆細胞マーカーのNG2コンドロイチン硫酸プロテオグリカンを同時に発現する、単球由来の特殊なマクロファージであるBINCs (Brain Iba1+/NG2+ Cells)が多数集積する。BINCsは多種多様な生理活性物質を発現するが、IGF-1やHGF等の神経保護的ペプチドの発現レベルが高く、実際に重症ラット脳梗塞モデルの病巣にBINCsを移植すると予後が大きく改善することが分かっている。一方、虚血病巣核心部を取り囲む周辺領域には、活性化マイクログリアが存在する。これらのNG2陽性マイクログリアは、骨髄移植実験から内在性マイクログリア由来であると考えられた。更にアポトーシス神経細胞を認識する受容体であるTREM2を発現し、実際にNeuN陽性の神経細胞片を細胞内に取り込んでいる像が観察された。梗塞巣核心部から放出される生理活性物質の濃度勾配がこのようなマイクログリアの反応を産み出しているものと考え、梗塞巣で発現量が多いTGFβ1に着目している。一次培養マイクログリアにTGFβ1を添加するとNG2の発現が誘導され、この作用はTGFβ1阻害剤で抑制された。また、TGFβ1はマイクログリアのTREM2-mRNAの発現量も増加させた。以上の結果からNG2がマイクログリア/マクロファージによる貪食作用のいずれかのプロセスに関与し、NG2発現誘導因子としてTGFβ1が関与していると考えられる。これまでのところ、NG2陽性マイクログリアの形態的特徴、またペナンブラ領域の変性神経細胞の貪食像を観察した。一次培養マイクログリアを用いた実験からこれらの反応を産み出している物質がTGFβ1であり、NG2発現誘導そして貪食作用のいずれかのプロセスに関与していることを突き止めた。これらのことから、研究計画の達成度については申し分ないと考えている。しかしながら、このNG2陽性マイクログリアが神経細胞保護的であるか否かはまだ明確にできておらず、現在検討を進めている。上記の研究を遂行する過程で、梗塞巣核心部から放出される生理活性物質のひとつにサイトカインの一種であるIL-18が非常に高く発現していることを見出した。

その発現量はTGFβ1よりも高く、IL-18が梗塞巣周囲のグリア細胞および神経細胞に何らかの影響をもたらしているのではないかと考えており、予想外の成果となっている。NG2陽性マイクログリアが神経保護的であるか否かが、現在得ている結果に加えてより強く示すことが喫緊の課題である。そのため、虚血ストレス条件(低グルコース、低酸素)下で、NG2陽性マイクログリアとグリーンラット由来神経細胞を混合培養する。その後、神経細胞の生存状態(免疫染色、イムノブロット)や神経突起の伸長レベルを測定することにより評価する。この結果を踏まえて、in vivo実験において梗塞巣から産生されるTGFβ1の量を制御することによりNG2陽性マイクログリアの発現頻度を変化させ、MRIを用いて梗塞巣体積の測定、ロータロッドテスト(運動/平衡機能)、オープンフィールド(運動、高次機能)、受動回避試験(学習機能)を実施する。その後、灌流固定し凍結切片を作成、免疫染色を行い、梗塞巣及びペナンブラ領域の病理を詳細に検討する。これらのことからNG2陽性マイクログリアを対象とする新たな治療法の目途が立つ。その結果を受けて、TGFβ1またはその阻害剤の投与量や投与スケジュールの適正化を目指す実験を行う。また、上記研究テーマに加え、TGFβ1同様に梗塞巣核心部において高い発現が認められたIL-18のペナンブラに存在するグリア細胞や神経細胞へ及ぼす影響についてはそれ自体が独立しうるテーマであるが、BINCsの機能を知る上で不可分でもあるので、可能な限り連動させて、より意義深く、生体での実態に即した解析とすべく善処する。設備品等は全て所属研究機関の既存設備を使用するため、研究費は細胞培養関連一式、実験動物、生化学研究用試薬、各種抗体購入費および成果発表費用(国内学会参加、外国語論文校正費用、論文印刷費等)として使用する。
単核銅-酵素錯体の機能解明と応用

本研究は、非ヘム遷移金属活性中心における分子状酸素の活性化機構の解明を目指したものである。昨年度は、単核銅酸素錯体の合成とその反応性について検討を行った。その結果、ピリジン環の6位にフェニル置換基を導入した銅(II)錯体と過酸化水素との反応をアセトン中で検討した。その結果、新規酸素活性種として、アセトン分子と過酸化水素を取り込んだ単核銅(II)アルキルペルオキソ錯体を合成できた。さらに、反応性について検討し、フェニル基のオルト位が効率よく水酸化されていることを見出した。一方、単純なビスピリジルメチルアミン3座配位子を用いた銅(II)錯体においては、同様なアルキルペルオキソ錯体が生成するが、アセトンのBaeyer-Villiger型酸化反応が進行し、銅(II)酢酸錯体が生成することを明らかにした。(A.Kunishita et al.Ionrg.Chem.2008, 47, 8222-8232)次に、中心金属の役割を検討する為に、ピリジン環の6位にメタ置換フェニル基を導入したピリジルメチルアミン系3座配位子を用いてNi(II)錯体銅(II)錯体12Xを合成し、Ni(II)錯体と過酸化水素との反応をアセトン中で検討した。その結果、Ni(II)錯体を用いた場合にはBis(μ-oxo)二核Ni(III)錯体が生成し、この酸素錯体から芳香族基の水酸化反応が進行しで最終的にNi(II)-フェノレート錯体が生成する事を明らかにした。本反応はBis(μ-oxo)二核Ni(III)錯体による芳香族水酸化反応の最初の例であり、Ni-活性酸素種の酸化機能について重要な情報を提供するものである(A.Kunishita et al.Ionrg.Chem.2009, 48, 4997-5004)。(A.Kunishita etal.Inorg.Chem.2008,47,8222-8232)次に、アセトン分子と過酸化水素を取り込んだアルキルペルオキソ錯体に導入されたヒドロキシル基の効果を調べるために、フェニル置換基を導入した銅(II)錯体とクメンヒドロペルオキシドとの反応により、生成する単核銅(II)クミルペルオキソ錯体の反応性について検討した。その結果、クミルペルオキソ錯体ではO-O結合の均等開裂が進行し、単核銅(II)オキシルラジカル錯体が生成している事がわかった。さらに、これは、外部基質のC-H結合を活性化する事も明らかにした。(A.Kunishita et al.,J.Am.Chem.Soc.2008,130,4244-4245)このような結果は、単核銅活性酸素錯体の反応機構の解明に対して重要な知見を与えた。本反応はBis(μ-oxo)

二核Ni(III)錯体による芳香族水酸化反応の最初の例であり、Ni-活性酸素種の酸化機能について重要な情報を提供するものである(A.Kunishita et al.Ionrg.Chem.2009, 48, 4997-5004)。
遷移金属錯体を触媒とする制御カチオン重合系の開発と応用

本年度は、昨年度に見いだした単一のルテニウム触媒によるカチオン・制御ラジカル同時重合系の最適化を行った。また、この重合系では達成できていなかった共重合を目指した検討も併せて行った。1,カチオン・ラジカル同時重合-反応の最適化-:昨年度見出した,ルテニウム触媒によるイソブチルビニルエーテル(IBVE)のカチオン重合とメタクリル酸メチル(MMA)の制御ラジカル重合の同時重合系では、IBVEは定量的に消費される一方で、MMAの消費が途中で停止する問題があった。そこで、MMAの消費率の改善を目的とし,還元剤を系統的に検討した。その結果,銅触媒を用いたリビングラジカル重合に還元剤・助触媒として用いられるSn(oct)2を添加することで、MMAがほぼ定量的に消費され,ポリマーを与えることを見出した。生成物はIBVE,MMAそれぞれのホモポリマーの混合物であることがわかった。溶媒分別によって単離したそれぞれのポリマーのGPC測定により、機構の異なる二つの重合(カチオン・ラジカル)が同一系中で各々の長寿命生長種を経て進行していることが明らかになった。2,カチオン・ラジカル同時共重合系の構築:ラジカル重合性モノマーをMMAよりかさ高さの小さいアクリル酸メチル(MA)に変更した。この結果、MMAを用いた場合と比べてやや高温を要するものの、両モノマー(IBVE, MA)とも消費され、ポリマーを与えた。得られたポリマーの13C NMR測定により、IBVEのカチオン重合に加えて両モノマーのラジカル共重合も進行していることがわかった。27年度が最終年度であるため、記入しない。本研究ではカチオン重合のルイス酸触媒としてほとんど検討例のなかった遷移金属錯体に焦点をあて、遷移金属触媒特有の制御カチオン重合系の構築を目指している。平成26年度は、ルイス酸性が期待され、種々の触媒能をもつルテニウム錯体を用いて、ビニルエーテル類(VEs)の制御カチオン重合開始剤系の構築およびその応用に取り組んだ。ルテニウム触媒を用いた制御カチオン重合系の構築:種々のルテニウム触媒によるイソブチルVEのカチオン重合を検討した結果、カチオン性錯体であるCp*Ru(MeCN)3PF6をルイス酸触媒に用いることで、モノマーが迅速かつ定量的に消費され、ポリマーを与えることがわかった。この触媒系にごく少量の四級アンモニウムハライドもしくはかさ高いピリジン誘導体を添加することで、モノマー消費速度を抑えることができ、制御重合が進行することがわかった。添加剤の添加量を詳細に検討したところ、触媒と添加剤との量論比が重合を制御する鍵であることがわかった。すなわち、四級アンモニウム塩ではルテニウム触媒の0.51.0等量、ピリジン誘導体では1等量以上それぞれ用いることで重合を制御できた。また、ホスフィンやビピリジンなどの有機配位子を添加した場合でも、無添加系に比べてモノマー消費速度を抑えられることがわかった。特に先のカチオン性Cp*Ru錯体とトリフェニルホスフィン配位子を組み合わせた触媒系において、イソプロピルVEをモノマーに用いると、制御重合が進行することがわかった。カチオンおよび制御ラジカル同時重合:カチオン性Cp*Ru触媒、ホスフィン配位子及びラジカル重合開始剤であるα-ハロエステル誘導体の存在下で、ビニルエーテルのカチオン重合とメタクリレートの制御ラジカル重合が同時に進行する系を見出した。当初予定していた系とは異なるものの、新たに別の錯体を触媒に用いてビニルエーテル類の制御カチオン重合系を構築することができた。また次年度以降に予定していた遷移金属触媒の特色を生かした高分子合成、反応系の探索も行った。

この結果、1温和な条件下でのカチオン・ラジカル同時重合、2ニトリルや二級アミドなど、これまでの典型金属塩化物を用いたカチオン重合では併存させることが難しかった、極性添加剤存在下でのビニルエーテルの重合など、新規高分子合成につながる可能性のある興味深い系も見出しつつあり、当初の計画以上に進展していると考えている。27年度が最終年度であるため、記入しない。平成26年度の研究からカチオン性Cp*Ru錯体がビニルエーテルのカチオン重合の触媒となることがわかった。この錯体は様々な触媒反応において使用例があるので、平成27年度はこの錯体を中心に、単一のルテニウム触媒を用いた1カチオン重合とその他の重合反応を利用した新規ポリマー合成2カチオン重合-ポリマー修飾系の開発、を目標に研究を行う。
甲状腺全摘出後の残存甲状腺組織の検出

分化型甲状腺癌患者の甲状腺全摘出後の残存甲状腺組織の同定において、99mTcO4-シンチグラフィが有用であることを示した。99mTcO4-シンチグラフィを用いることによって、131Iシンチグラフィで必須のヨード制限の必要なく、残存甲状腺組織の検出が可能であることが示された。また、SPECT/CTを追加することによって、残存甲状腺組織の検出率がさらに向上し、より正確な位置情報を得ることができた。昨年度の検討から、99mTcO4-シンチグラフィおよび99mTcO4- SPECT/CTが甲状腺全摘出後の残存甲状腺組織の同定に有用である可能性が示された。本年度は、131I内用療法後の残存甲状腺組織が焼灼されたかどうかの評価に99mTcO4-シンチグラフィが有用であるかどうかの検討を行った。昨年度に初回131I内用療法が施行された13例の分化型甲状腺癌患者のうち、9例で初回131I内用療法の半年から1年後に99mTcO4-シンチグラフィと診断的131Iシンチグラフィまたは2回目131I内用療法が施行された。診断的131Iシンチグラフィまたは2回目131I内用療法後撮像で残存甲状腺組織を認めたのはわずかに1例に1個であり、残存甲状腺組織焼灼の成功率は88.9%であった。一方、99mTcO4-シンチグラフィでは、残存甲状腺組織の検出はできなかった。これは、131I内用療法後では残存甲状腺組織が焼灼されるため、131I内用療法前と比較して残存甲状腺組織の量が減少し、残存甲状腺組織の検出が困難になったためと考えられる。昨年度および本年度の結果から、131I内用療法後の残存甲状腺組織の検出には99mTcO4-シンチグラフィは限界があるが、131I内用療法前の残存甲状腺組織の検出に99mTcO4-シンチグラフィおよび99mTcO4- SPECT/CTが有用であることが示された。99mTcO4-を用いて131I内用療法前に残存甲状腺組織の有無および数を評価することによって、例えば残存甲状腺組織が複数個認められる場合は投与量を多く設定するというように、131I内用療法時の投与放射能量を調整することが可能になる。このような投与量調整の概念は長い131I内用療法の歴史において皆無であり、患者に無用な被ばくを強いることなく効率的に131I内用療法を行えるという点からも、本研究成果はより良い131I内用療法の治療プロトコールを作り出す方向性を示すことができたと考える。本年度は、分化型甲状腺癌のために甲状腺を全摘された患者で初回の131I内用療法を施行された患者を対象として、99mTcO4-シンチグラフィと131I内用療法時画像との比較を行い、99mTcO4-シンチグラフィで131I内用療法後画像と同程度に残存甲状腺組織を検出できるかどうかを検討した。また、99mTcO4-シンチグラフィは一般的に行われている平面像に加えてSPECT/CT撮像を行い、残存甲状腺組織の検出におけるSPECT/CTの付加的意義について検討した。計13例の分化型甲状腺癌患者で、99mTcO4-シンチグラフィの後に初回の131I内用療法が施行された。131I内用療法後画像では、13人全例で合計23個の残存甲状腺組織が検出された。99mTcO4-平面像では、13例中10例(77%)の患者で23個中16個(70%)の残存甲状腺組織を検出できた。99mTcO4- SPECT/CTでは、13例中12例(92%)の患者で23個中19個(83%)の残存甲状腺組織を検出できた。99mTcO4-シンチグラフィでは、平面像のみでもある程度の残存甲状腺組織の検出が可能であるが、SPECT/CT撮像を行うことによりさらに検出感度が向上することが明らかとなった。また、平面像のみでは集積部位の正確な位置を把握することは困難であったが、SPECT/CTでは集積部位の正確な同定が可能であった。これらの結果から、99mTcO4- SPECT/CTが甲状腺全摘出後の残存甲状腺組織の同定に有用である可能性が示された。本年度の研究目的である、甲状腺全摘出後の初回131I内用療法時の残存甲状腺組織の検出における99mTcO4-シンチグラフィの有用性およびSPECT/CTの付加的意義について評価することができた。甲状腺癌で甲状腺を全摘された場合でも、微小な甲状腺組織(残存甲状腺組織)が高率に残る。初回の131I

内用療法が施行された症例では、この残存甲状腺組織が焼灼されるため、131I内用療法前と比較して残存甲状腺組織は消失または減少する。このため、残存甲状腺組織の検出は初回の131I内用療法前と比較して困難となることが予測される。次年度の研究では、131I内用療法後の残存甲状腺組織の有無の評価に、99mTcO4-シンチグラフィが有用かどうかを検討する。初回の131I内用療法の半年から1年後に、99mTcO4-シンチグラフィと診断的131Iシンチグラフィが施行された患者、および、99mTcO4-シンチグラフィと2回目131I内用療法が施行された患者を検討の対象とする。99mTcO4-画像と131I画像の比較を行い、初回131I内用療法後の残存甲状腺組織の検出率を比較する。2名の核医学専門医が、131Iシンチと99mTcO4-シンチそれぞれにおいて残存甲状腺組織の評価を行い、各シンチ間での一致率を調べる。従来から残存甲状腺組織の評価に用いられている放射性ヨードは、検査前に1から2週間のヨード制限が必須である。ヨード制限の患者への負担は想像以上に大きく、ヨード制限が上手くいかないために検査が失敗に終わることもしばしば経験する。99mTcO4-では、このヨード制限が不要となるため、患者に負担を伴うことなく検査を行うことが可能である。本研究において、99mTcO4-シンチグラフィで残存甲状腺組織の検出が十分に可能であることが示されれば、患者の得られるメリットは非常に大きく、日常臨床において非常に大きなインパクトがあると確信する。本年度は物品、成果発表を含む旅費等で研究費を使用したが、効率的な執行により21,179円を次年度に助成金として繰り越した。次年度は、主に解析用ソフトの購入費、成果発表のための旅費、印刷代として使用する予定である。
MOCVD法による応力誘起強誘電体薄膜合成法の開発

薄膜にかかる応力をモデル化するために、PbTiO_3基とした薄膜の作製を行った。具体的にはAlとNbを添加したPb(Al,Ti)O_3とPb(Nb,Ti)O_3と、Zrを添加したPb(Zr,Ti)O_3薄膜を作製した。(100)MgO基板上に作製したPb(Nb,Ti)O_3薄膜は、Nbの添加量に伴って、c軸の格子定数が低下し、a軸の格子定数が増加して正方晶性が低下した。この時、薄膜は(001)配向性が向上することが観察された。従来のPbTiO_3基薄膜の配向については、すでに申請者が、c軸とa軸の格子定数の比が小さくなると、(001)配向しやすいという法則を見いだし、この理由として、薄膜にかかる応力が大きく影響していることを指摘しいる。今回のPb(Nb,Ti)O_3薄膜の結果はこれと一致している。一方、Pb(Zr,Ti)O_3薄膜については、(100)SrRuO_3//(100)SrTiO_3、(110)SrRuO_3//(110)SrTiO_3、(111)SrRuO_3//(111)SrTiO_3薄膜上への成膜を行った。正方晶系および菱面体晶系の薄膜について強誘電特性を測定した結果、分極軸方向が最も大きな強誘電性が確認されたものの、他の方位の薄膜についても単結晶で予想されているより大きな強誘電性の存在が確認された。この原因としては、応力によって誘起されたドメン構造を考慮することで基本的には説明できることがわかった。しかし正方晶では結果は良く説明できたものの、菱面体晶ではこれだけでは完全には説明できず、結晶内に残留する歪が重要な役割を果たすことが明らかになった.またエピタキシャルと多結晶薄膜について、強誘電性の膜厚依存性を調べた。どちらでも膜厚の減少に伴う強誘電性の劣化が認められた。(100)MgO基板上に作製したPb(NB,Ti)O_3薄膜は、Nbの添加量に伴って、c軸の格子定数が低下し、a軸の格子定数が増加して正方晶性が低下した。従来のPbTiO_3基薄膜の配向については、すでに申請者が、c軸とa軸の格子定数の比が小さくなると、(001)配向しやすいという法則を見いだし、この理由として、薄膜にかかる応力が大きく影響していることを指摘している。

一方、Pb(Zr,Ti)O_3薄膜については、(100)SrRuO_3//(100)SrTiO_3、(110)SrRuO_3//(110)SrTiO_3、(111)SrRuO_3//(111)SrTiO_3薄膜上への成膜を行った。正方晶系および菱面体晶系の薄膜について強誘電特性を測定した結果、分極軸方向が最も大きな強誘電性が確認されたものの、他の方位の薄膜についても単結晶で予想されているより大きな強誘電性の存在が確認された。この事は各方位の薄膜にかかる応力、およびそれによって引き起こされる強誘電体ドメインの存在状態に大きく依存していると考えられる。本研究の目的は、実用化に最適な製膜法であるMOCVD法を用いて、変位型強誘電体薄膜にかかる応力を制御することで、焼結体では得られない優れた強誘電性をもつ新規強誘電体薄膜材料を合成するプロセスを完成し、その実用化の道筋を立てることにある本年度は以下の結果を得た。1)膜厚の異なるエピタキシャル薄膜を合成し、その特性を多結晶と比較検討した。その結果、どちらの薄膜でも膜厚の減少に伴う強誘電性の低下が確認された。2)エピタキシャル薄膜の3次元の格子定数の測定を、高精度XRDを用いて行なった。その結果、正方晶の薄膜では(100)(110)(111)配向薄膜を作製したが、格子定数は粉末のものとほとんど同じであった。このことから正方晶薄膜では、大きな歪は残っていないことが明らかになった。、一方、菱面対晶では、格子は粉末のものとは異なっており、格子の歪が確認された。両者の違いはドメイン構造の違いに起因していると考えられる。したがって、従来指摘されていなかったが、正方晶と菱面体晶では歪に効果が違うことが予想された。実際、正方晶では特性の変化は結晶方位で良く説明できたものの、菱面体晶では結晶方位のみでは十分説明できなかった。
外耳・中耳に発現するABC輸送体と組織環境に伴う中耳真珠腫の発症・進行リスク

遺伝子解析の結果、538AA(乾性)が53.8%(14/26例)、538GA(湿性)が46.2%(12/26例)であった。また、湿性耳垢群で両側真珠腫症例の発生率は58.3%(12例中7例)に対して、乾性耳垢群で両側真珠腫症例は、21.4%(14例中3例)と、湿性耳垢群の方が、乾性耳垢群より両側真珠腫症例の発生率が高かった。視診のみで耳垢型を判別した14症例を含めると、乾性耳垢の割合は62.5%(25/40例)、湿性耳垢の割合は37.5%(15/40例)であった。また、両側真珠腫症発生率関しては、乾性耳垢群24.0%(6/25例)が、湿性耳垢群66.7%(10/15例)と有意に高かった。中耳真珠腫罹患者と健常者のゲノムDNAを鋳型にして、「ABCC11遺伝子上の538番目の一塩基(耳垢の乾・湿を決定する一塩基)が含まれる領域」をPCRで増幅する。そして、この増幅産物にたいしてシークエンス解析を行い、中耳真珠腫罹患者と健常者におけるABCC11遺伝子の遺伝子型を判別した。得られた結果は、X2検定およびロジスティック回帰分析、オッズ比を用いて解析し、中耳真珠腫の発症・進行リスクにおけるABCC11遺伝子の遺伝子型の影響を決定した。なお、3月31日現在、中耳真珠腫罹患者13名について採血が終了している。なお、3月31日現在、中耳真珠腫罹患者13名について採血を行い、ABCC11遺伝子の遺伝子型も決定している。近年の中耳手術症例が減少傾向にある。目標症例は、100例以上をめざしている。緒言:最近、ABCC11遺伝子多型(538G>A)が耳垢の性状(湿性もしくは乾性)を決定することがYoshiuraら(Nature Genetics 38:324ー330,2006)によって報告された。ABCC11 538AAが乾性耳垢に対応し、538GG/GAが湿性耳垢に対応する。本研究では、ABCC11遺伝子多型に伴う耳垢の乾湿の違いが、中耳真珠腫の発生リスクに影響を与える可能性について検討した。方法:口頭および書面同意を得た中耳真珠腫患者から、手術時に摘出される中耳真珠腫と術後血液を得た。血液から抽出したゲノムDNAを鋳型として、ABCC11 538G>Aを含む領域をPCRで増幅し、当該一塩基多型のシーケンス解析を行った。視診においては、健側および患側の病変部から離れている耳垢に着目して、その乾湿を判別した。結果:遺伝子解析をし得た中耳真珠腫26症例全てにおいて、視診による耳垢判別結果と遺伝子解析による結果が一致することが確認された。視診のみで耳垢型を判別した14症例を含めると、全ての中耳真珠腫患者における乾性耳垢の割合は62.5%(25/40例)、湿性耳垢の割合は37.5%(15/40例)であった。また両側真珠腫症発生率関しては、乾性耳垢群24.0%(6/25例)、湿性耳垢群66.7%(10/15例)と、湿性耳垢群の方が、乾性耳垢群に比べ両側真珠腫症発生率が有意に多いことが判明した(χ2 P<0.05)。ABCC11遺伝子検査した症例と視診のみで判別した症例を含めた症例数では、各項目に有意差が出ているが、ABCC11遺伝子検査のみでは、症例数が少なく統計処理は困難である。あと、30症例は、ABCC11遺伝子検査症例を増やしたい。緒言: ABCC11遺伝子多型(538G>A)が耳垢の性状(湿性もしくは乾性)を決定することがYoshiuraら(Nature Genetics 38:324ー330,2006)によって報告された。方法:口頭および書面同意を得た中耳真珠腫患者の血液から抽出したゲノムDNAを鋳型として、ABCC11 538G>Aを含む領域をPCRで増幅し、当該一塩基多型のシーケンス解析を行った。

遺伝子解析の結果、538AA(乾性)が53.8%(14/26例)、538GA(湿性)が46.2%(12/26例)であった。また、湿性耳垢群で両側真珠腫症例の発生率は58.3%(12例中7例)に対して、乾性耳垢群で両側真珠腫症例は、21.4%(14例中3例)と、湿性耳垢群の方が、乾性耳垢群より両側真珠腫症例の発生率が高かった。視診のみで耳垢型を判別した14症例を含めると、全ての中耳真珠腫患者における乾性耳垢の割合は62.5%(25/40例)、湿性耳垢の割合は37.5%(15/40例)であった。また両側真珠腫症発生率関しては、乾性耳垢群24.0%(6/25例)、湿性耳垢群66.7%(10/15例)と、湿性耳垢群の方が、乾性耳垢群に比べ両側真珠腫症発生率が有意に多いことが判明した(χ2 P<0.05)。尚、乾性耳垢群と湿性耳垢群との間で中耳真珠腫の進展度に関する差は認められなかった。視診のみで耳垢型を判別した14症例を含めると、乾性耳垢の割合は62.5%(25/40例)、湿性耳垢の割合は37.5%(15/40例)であった。また、両側真珠腫症発生率関しては、乾性耳垢群24.0%(6/25例)が、湿性耳垢群66.7%(10/15例)と有意に高かった。上記の、症例不足に対して、海外協力施設であるハイデルベルグ大学より、中耳真珠腫患者の中耳真珠腫組織と血液などのサンプルを保存・移送して頂くことになった。上記のごとく、ABCC11遺伝子検査症例を増やすために、海外協力施設であるハイデルベルク大学より、倫理委員会を介して、中耳真珠腫組織と血液などのサンプルを保存・移送して頂くことになった。当院でもさらにサンプル収集に努める。耳鼻咽喉科昨年度は、予測していた中耳真珠腫手術症例が少なく、それに伴い組織、血液のサンプルも少なくなり、研究費が予定より少額となった。研究が当初の予定よりやや遅れている為、平成28年度中に購入を予定していた消耗品の購入を一部見送った。今回の症例不足に対して、海外協力施設であるハイデルベルグ大学より、中耳真珠腫患者の中耳真珠腫組織と血液などのサンプルを保存・移送して頂き、すでにそのサンプルで研究を進めている。そのため、本年度は、研究用サンプルが増えるため、差引額を使用したい。サンプルの収集をより積極的に行い、研究の遅れを解消する為、検体の輸送費や研究遂行の為の消耗品を購入する。また研究成果発表の為、英文校正料や論文投稿料としても使用する。
アセチルCoAを選択的に検出する蛍光プローブを用いた細胞内代謝の可視化解析

アセチルCoAは細胞内に比較的高濃度で存在するポリリン酸種であり、クエン酸回路、脂質合成などの生体内代謝における重要な生体内基質分子である。細胞内アセチルCoAの濃度変動は細胞増殖に伴って起こるため(数μMから数十μMレベルの変化)、細胞の代謝状況の亢進や減衰を捉える有用なパラメーターとなり得る。一方で細胞内アセチルCoAの解析は、もっぱら細胞破砕後のHPLC分析に頼っているのが現状であり、アセチルCoAを簡便に検出できる蛍光プローブ開発例は全くない状況にある。本研究では、このような状況の中で蛍光プローブを用いたアセチルCoAの蛍光イメージングによって細胞の代謝状態を可視化解析することを目的とする。筆者は昨年度までにチオール基を触媒として蛍光色素に直結したアミノ基にアセチル基を転移することにより蛍光変化する新規機構を見出し、アセチル基転移を蛍光検出可能なアントラセン型蛍光プローブの開発に成功した。さらに昨年度は本機構をより長波長で励起可能なフルオレセイン型やローダミン型蛍光プローブの開発を目指して研究を行ってきたが、その開発は未だ途上である。その原因として本研究中で偶然に亜鉛イオンに対する蛍光レシオプローブや過酸化水素を検出可能な蛍光プローブを見出したことからこれら検出系の確立に注力したためである。これら別の研究は既に完了したため、本年度は本研究テーマを再開して集中して取り組むことにより目標の達成が可能であると考える。さらに今後は開発した蛍光プローブを用いて細胞内アセチルCoAの濃度変動とタンパク質のアセチル化修飾率との相関についても検討を行う。細胞内アセチルCoAの濃度変動がどのように細胞代謝や細胞堆殖と相関しているのかを検討することで、細胞代謝のしくみや制御機構を解明する新たな知見を得られると期待される。昨年度は本研究の間に他の研究テーマ(亜鉛イオンの蛍光レシオ検出,過酸化水素の蛍光レシオ検出)を創出し、これら検出系の確立を優先して研究を行ってきた。しかし、その研究テーマについては既にほぼ完了し、本年度は本研究を再開して集中して取り組むことで目標の達成が可能であると考える。上述のとおり、本研究を再開し集中して取り組む予定であり、既に合成する分子の設計を完了している。本年度は本分子を合成するとともに細胞内のアセチルCoA検出に適した分子構造(細胞膜透過性など)へと構造最適化を実施する。アセチルCoAは細胞内に比較的高濃度で存在するポリリン酸種であり(数十μM)、クエン酸回路、脂質合成などの生体内代謝における重要な基質分子である。細胞内アセチルCoAは細胞代謝に伴って数μMから数十μMレベルの濃度変動を生じ、細胞の代謝状況の亢進や減衰を捉える有用なパラメーターとなり得る。そこで本研究では、アセチルCoAを蛍光検出可能な蛍光プローブを開発し、細胞の代謝状態をアセチルCoAの蛍光イメージングを介して解析することを目的とする。筆者は、アセチルCoAと反応する前は蛍光色素に直結した官能基により光誘起電子移動(PeT)が生じて蛍光消光状態にあるが、アセチルCoAから色素に直結した官能基ヘアセチル基が転移すると、PeT消光が解消し蛍光が上昇するアントラセン型の人工小分子を設計した。本蛍光プローブを合成・評価した結果、比較的活性の低いアセチルCoAやチオ酢酸S一フェニルではアセチル基転移反応を生じず、高い活性を有する無水酢酸でのみアセチル基転移反応を生じて蛍光が上昇した。そこで、色素に直結した官能基へのアセチル基転移反応を加速するため、触媒能を有する数種の官能基を蛍光プローブ構造へ導入した分子を設計し、その合成とアセチル基転移反応の反応性評価を繰り返した。その結果、アセチル基転移反応を著しく加速する高い触媒能を有する分子素子を見出すことに成功した。今後は、本システムを用いて細胞などの夾雑な条件下でアセチルCoAを蛍光検出するため、上記と同様の分子設計で色素構造を変更した、長波長励起のフルオレセイン型蛍光プローブを開発する。

さらに今後は開発した蛍光プローブを用いて細胞内アセチルCoAの濃度変動とタンパク質のアセチル化修飾率との相関についても検討を行う。細胞内アセチルCoAの濃度変動がどのように細胞代謝や細胞堆殖と相関しているのかを検討することで、細胞代謝のしくみや制御機構を解明する新たな知見を得られると期待される。触媒能を有する官能基を様々に検討し、アセチル基転移反応を加速する新たな分子素子を見出すことに成功した。本分子素子を用いればアセチルCoAに対する多様な蛍光プローブを開発可能となる。また、上記とは別に蛍光レシオ変化を生じる新規の蛍光センシングシステムの開発にも成功した。本成果は現在Nature Chemistryに投稿中である。これら研究成果を組み合わせることで、従来の計画に比べてより高機能な蛍光レシオ型のアセチルCoA選択的な蛍光プローブが開発できると期待される。昨年度は本研究の間に他の研究テーマ(亜鉛イオンの蛍光レシオ検出,過酸化水素の蛍光レシオ検出)を創出し、これら検出系の確立を優先して研究を行ってきた。しかし、その研究テーマについては既にほぼ完了し、本年度は本研究を再開して集中して取り組むことで目標の達成が可能であると考える。上述のとおりアセチル基転移反応を著しく加速可能な分小素子を見出すことに成功した。そこで、本分子素手を用いて多様な蛍光プローブを新たに開発可能であり、本年度は細胞実験を指向した長波長励起のフルオレセイン型蛍光プローブを開発する。合成した蛍光プローブはin vitroでの基礎評価を行ったのち、問題なければ細胞内のアセチルCoAを蛍光解析する。また、昨年度において蛍光レシオ変化を生じる新たな蛍光センシングメカニズムを見出すことにも成功した。そこで本機構を応用してアセチルCoAに対する蛍光レシオ型プローブの開発についても模索していく予定である。上述のとおり、本研究を再開し集中して取り組む予定であり、既に合成する分子の設計を完了している。本年度は本分子を合成するとともに細胞内のアセチルCoA検出に適した分子構造(細胞膜透過性など)へと構造最適化を実施する。
世界最高強度パルスミューオンビームを用いた荷電レプトンフレーバー非保存現象の探索

本研究の目的は,大強度陽子加速器施設J-PARCにおいて,荷電レプトンフレーバー非保存現象であるミューオン電子転換過程を従来の100倍以上の精度で探索し,標準模型を超える新物理現象を検証することである.感度向上のためにはミューオン源の大強度化が必須であるが,それに伴うイベントレートの増加が大きな問題であった.信号となる電子は磁場中に設置される円筒型ドリフトチェンバー(CDC)で測定する.本研究計画はCDCからの情報を用いた新しいトリガーシステムを完成させ,実験を遂行することである.本年度は,主に「シミュレーションによるトリガーアルゴリズムの最適化」と,「試作機回路を使った接続試験」を予定していた.トリガーアルゴリズム開発では,シミュレーションデータを使っていくつかの機械学習について性能を評価した.結果として,Gradient Boosted Decision Treeを本トリガーシステムに採用した.各種パラメータを最適化することで,99%の信号イベントに感度を持ちながら,最大96%の背景事象を排除可能なアルゴリズムが完成した.ビームの大強度化に伴う高放射線環境が想定されていたため,本年夏までに回路素子の放射線耐性を評価し,国際学会にて結果を発表した.試験結果に基づいて作成した回路を使い,CDCの読み出し回路との通信試験を行った.この読み出し回路は6 us間しかデータを保持できないため,新しいトリガーシステムの遅延時間はこれ以下でなくてはならない.上記と同様のアルゴリズムを回路に実装し,全ての回路をつないだ接続試験を行った.結果として,総遅延時間は2.8 usだとわかり,遅延時間に対して要求値を満たす性能を実証した.最終的にCDC実機の宇宙線試験に実装した.宇宙線用に一部アルゴリズムを変更して,新しいトリガーシステムによる初の宇宙線イベント観測に成功した.測定器システムのトリガーレート耐性は約3 kHzであるが,現状想定されるトリガー検出器のみを用いたトリガーレートは20 kHzで,要求を満たさない.当初の計画では,新しいアルゴリズムによる背景事象トリガーの排除率は86%であった.本研究の新しいトリガーシステムでは主検出器であるCDCからの情報を使って信号を評価する.本年度の研究では,さらにトリガー検出器の情報も評価に加えることで,背景事象トリガーの排除率を96%にまで向上することに成功した.その結果,トリガーレートは0.8 kHzまで削減でき,要求を満たせるトリガーアルゴリズムの開発に成功している.本実験は150日間の測定を想定しているが,この間に安全係数を含めて1 kGyのガンマ線と1.0E+12 /cm^2の中性子流量が想定されている.回路の設計を完了するためにも,この放射線レベルに耐え得る回路素子の選定が急務であった.本年度春の実験までで,全ての回路素子に対して要求する放射線耐性を持つものを選定でき,新しいトリガー用回路の試作機も完成した.この回路は,複数のCDC読み出し回路と通信する必要があり,通信の同期が問題となった.それぞれの通信を完全に同期させることは難しいが,同期リセット信号と小さなバッファを加えることで,各回路からのデータのずれを1クロック周期(8.3 ns)にまで抑えることに成功した.さらに,CDCの宇宙線試験へ本システムを実装し,CDCのセルフトリガーによる初の宇宙線イベント取得にも成功している.このように,ソフトウェア側の開発とハードウェア側の開発の両者で,要求値を十分超えた性能を発揮できた.また,次年度より取り組む予定であった検出器を使った試験にも既に着手済みである.本年度の回路を使ったトリガーシステム全体の試験によりそのハード的特性を理解した.データの非同期問題はアルゴリズムの性能を下げる可能性がある.現状のシミュレーションでは,これら回路の性能は含まれていない.また,CDCの性能についてもシミュレーションに組み込む必要がある.今後は,回路特性や検出器特性がアルゴリズムの性能にどのような影響を与えるかシミュレーションを使って評価する.処理時間にはまだ余裕があるため,場合によっては新たなロジックを加える.現状のCDCを使った試験では,使用できる読み出し回路数に制限があり,CDCの一部領域を使った試験に止まっている.来年度夏にはCDCの全領域が使用可能になるため,トリガーシステムで用いる領域もこれに合わせて拡張する.また,トリガー回路は現状試作機であるため,最終版の設計を完了する必要がある.本年度の試験より,回路の変更部分はほとんどなく,「不要な回路素子の取り外し」と「通信用ポート1つを新たに加える」だけだとわかった.これらの変更は2ヵ月程度で完了でき,速やかに最終版に移行する.その後,CDC全領域でのトリガー試験と性能評価を実施し,ビームラインと検出器ソレノイドの完成を待ってインストールし,実験を開始する.本研究の目的は,大強度陽子加速器施設J-PARCにおいて,荷電レプトンフレーバー非保存現象であるミューオン電子転換過程を従来の100倍以上の精度で探索し,標準模型を超える新物理現象を検証することである.感度向上のためにはミューオン源の大強度化が必須であるが,それに伴うイベントレートの増加が大きな問題であった.信号となる電子は磁場中に設置される円筒型ドリフトチェンバー(CDC)で測定する.本研究計画はCDCからの情報を用いた新しいトリガーシステムを完成させ,実験を遂行することである.本年度は,主に「シミュレーションによるトリガーアルゴリズムの最適化」と,「試作機回路を使った接続試験」を予定していた.

トリガーアルゴリズム開発では,シミュレーションデータを使っていくつかの機械学習について性能を評価した.結果として,Gradient Boosted Decision Treeを本トリガーシステムに採用した.各種パラメータを最適化することで,99%の信号イベントに感度を持ちながら,最大96%の背景事象を排除可能なアルゴリズムが完成した.ビームの大強度化に伴う高放射線環境が想定されていたため,本年夏までに回路素子の放射線耐性を評価し,国際学会にて結果を発表した.試験結果に基づいて作成した回路を使い,CDCの読み出し回路との通信試験を行った.この読み出し回路は6 us間しかデータを保持できないため,新しいトリガーシステムの遅延時間はこれ以下でなくてはならない.上記と同様のアルゴリズムを回路に実装し,全ての回路をつないだ接続試験を行った.結果として,総遅延時間は2.8 usだとわかり,遅延時間に対して要求値を満たす性能を実証した.最終的にCDC実機の宇宙線試験に実装した.宇宙線用に一部アルゴリズムを変更して,新しいトリガーシステムによる初の宇宙線イベント観測に成功した.測定器システムのトリガーレート耐性は約3 kHzであるが,現状想定されるトリガー検出器のみを用いたトリガーレートは20 kHzで,要求を満たさない.当初の計画では,新しいアルゴリズムによる背景事象トリガーの排除率は86%であった.本研究の新しいトリガーシステムでは主検出器であるCDCからの情報を使って信号を評価する.本年度の研究では,さらにトリガー検出器の情報も評価に加えることで,背景事象トリガーの排除率を96%にまで向上することに成功した.その結果,トリガーレートは0.8 kHzまで削減でき,要求を満たせるトリガーアルゴリズムの開発に成功している.本実験は150日間の測定を想定しているが,この間に安全係数を含めて1 kGyのガンマ線と1.0E+12 /cm^2の中性子流量が想定されている.回路の設計を完了するためにも,この放射線レベルに耐え得る回路素子の選定が急務であった.本年度春の実験までで,全ての回路素子に対して要求する放射線耐性を持つものを選定でき,新しいトリガー用回路の試作機も完成した.この回路は,複数のCDC読み出し回路と通信する必要があり,通信の同期が問題となった.それぞれの通信を完全に同期させることは難しいが,同期リセット信号と小さなバッファを加えることで,各回路からのデータのずれを1クロック周期(8.3 ns)にまで抑えることに成功した.さらに,CDCの宇宙線試験へ本システムを実装し,CDCのセルフトリガーによる初の宇宙線イベント取得にも成功している.このように,ソフトウェア側の開発とハードウェア側の開発の両者で,要求値を十分超えた性能を発揮できた.また,次年度より取り組む予定であった検出器を使った試験にも既に着手済みである.本年度の回路を使ったトリガーシステム全体の試験によりそのハード的特性を理解した.データの非同期問題はアルゴリズムの性能を下げる可能性がある.現状のシミュレーションでは,これら回路の性能は含まれていない.また,CDCの性能についてもシミュレーションに組み込む必要がある.
鎮咳薬の作用機序の電気生理学的検討

中枢性鎮咳薬の作用を電気生理学的により詳細に検討するため、昨年度より咳反射の求心路をi形成する延髄・孤束核の2次ニューロンより興奮性シナプス後電流(EPSCs)を記録し、そのEPSCsに対する鎮咳薬の作用を検討している。昨年度の研究結果により、コデインはNTSにおけるシナプス伝達をシナプス前抑制の形で抑制することが示されており、今年度はその抑制のメカニズムを解明することを目指した。モルモット延髄よりスライス標本を作製し、2次ニューロンにホールセル・パッチクランプ法を適用することにより膜電流を記録した。EPSCsは孤束を電気刺激することにより誘発した。オピオイドによるシナプス伝達の抑制には電位依存性K^+チャネルの活性化が関与しているという報告があるため、コデインの作用に対する電位依存性K^+チャネルブロッカー、4-aminopyridine(4-AP)の影響を解析した。その結果、コデインによるシナプス伝達の抑制は4-APによって遮断されることが明らかとなった。さらにコデインは自発性のEPSCsも抑制することがあきらかとなっていたが、こちらの抑制作用は4-APでは遮断されなかった。以上より、コデインによる誘発性EPSCsの抑制は電位依存性K^+チャネルの活性化が関与していることが明らかとなったが、自発性EPSCsの抑制は電位依存性K^+チャネルの活性化以外のメカニズムによることが示唆され、コデインによる誘発性EPSCsおよび自発性EPSCsの抑制に別の機構の関与が考えられる結果となった。鎮咳薬の作用を電気生理学的により詳細に検討するために、咳反射における求心経路に介在する延髄・孤束核(NTS)の2次ニューロンより興奮性シナプス後電流(EPSCs)を記録し、EPSCsに対する鎮咳薬の作用を検討した。モルモット延髄よりNTSスライス標本を作製し、2次ニューロンにホールセルパッチクランプ法を適用する事により膜電流を記録した。EPSCsは孤束を電気刺激する事により誘発し、この誘発性EPSCs(evoked-EPSCs)に対するコデインの作用を検討した。まず、2次ニューロンに誘発されたEPSCsはAMPA受容体のブロッカーによって遮断された事から、このEPSCsはグルタミン酸受容体のうち、AMPA受容体の活性化によって生じている事が確認された。次にEPSCsに対するコデインの作用を検討した所、0.33mMのコデインによってEPSCsは用量依存的に抑制され、その抑制はオピオイド受容体の拮抗薬であるナロキソンによって遮断された。以上の事より、コデインの作用はオピオイド受容体を介した作用である事が確認された。次にこのEPSCsの抑制がシナプス前抑制なのか、シナプス後抑制なのかを確認するために、paired-pulse刺激法によってEPSCsを誘発してコデインの作用を解析した所、コデインの投与によってpaired-pulse ratioの上昇が見られた事から、この作用はシナプス前抑制である可能性が考えられた。さらに直接、灌流液中にAMPAを投与してAMPA誘発性電流を観察し、その電流に対するコデインの作用を検討した所、コデインの抑制作用は見られなかった。この事からもコデインのEPSCs抑制作用はシナプス前抑制である事が示唆される結果となった。
肝再生・肝線維化に及ぼすアクチビンAの効果

我々は以前アクチビンAが肝細胞の増殖抑制に関与していることを報告したが、その臨床的応用を考え、アクチビンAと1対1結合を有し、アクチビンAの効果を阻害するフォリスタチンが果たしてin vivoの系で作用するかどうかを検討した。肝切除ラットモデルを作成し、門脈からフォリスタチンを注入した。コントロールラットは細胞周期も促進され(BrdUでフォリスタチン群は18時間後で発現するのにコントロール群では24時間から36時間後にしか発現しない)しかも、コントロール群に比べ、フォリスタチン群は血清アルブミン値及び血糖値も早期に回復した。さらに肝細胞におけるアクチビンAは肝細胞に対してどのような受容体を有しているかどうかを検討した。アクチビンAが肝細胞に対して特異的な受容体を有しており、TGFβと同様にtype1及びtype2受容体が存在するようである。しかもlow affinityの結合部位はフォリスタチンの結合するところであると思われる。これらのことからアクチビンは肝細胞増殖において、抑制的に作用し、その効果を抑制するフォリスタチンを用いて、細胞増殖を促進することも可能であることが判明した。更に我々はLECラットあるいは劇症肝炎モデルを作成しin vivoの系でもアクチビンAが劇症肝炎の機序と深い関わりがあり、しかもアクチビンAと拮抗して作用するフォリスタチンが劇症肝炎の治療に用いられる可能性も証明するように現在検討しているところである。肝再生時には様々なオートクリン或いはパラクリンの肝細胞増殖抑制因子が誘導されることが知られている。本研究の目的は肝細胞増殖抑制因子のひとつであると考えられるアクチビン及びそれに拮抗する蛋白であるフォリスタチンを用いることによって肝再生や肝線維化を治療することが可能であるかどうかを検討することである。1)まず、アクチビン-フォリスタチン系によって肝再生が生ずるかどうかを検討した。70%肝切除はFaustoらによって始められた最も標準的な肝再生モデルである。我々の以前の系では肝細胞を用いて^3H-thymidineの肝細胞の取り込みでみたが、in vivoに近い系で見るためにDNA前躯体であるBrdUを投与し、ラベルされる核を指標にS期の細胞数をカウントする。アクチビンと結合してその作用をブロックするフォリスタチンの門脈内投与を行なった群はフォリスタチンを投与していない群はDNA合成が36時間くらいでピークになったのに対し、フォリスタチン投与群はそのピークは24時間くらいに短縮した。それに反し、アクチビンを大量に投与した群はDNA合成の時間が36時間よりもかなり延長した。これらの結果によりアクチビン-フォリスタチンの系はin vitroの系のみではなく、in vivoの系では十分に作用することが判明した。2)ラット培養伊東細胞系を用いて、その線維化を指標にする系を作成した。即ちプロナーゼで肝実質細胞を破壊し、メトリザマイド密度勾配法で伊東細胞を選択的に分離できることが確認され、その生存率は95%以上であった。更にアクチビンの伊東細胞に対するDNA合成及びコラーゲン合成に及ぼす影響を検討する予定である。これらのことより、アクチビン-フォリスタチン系によって肝再生や肝線維化がどのように調節できるかを明らかにすることが可能となる。我々は以前アクチビンAが肝細胞の増殖抑制に関与していることを報告したが、その臨床的応用を考え、アクチビンAと1対1結合を有し、アクチビンAの効果を阻害するフォリスタチンが果してin vivoの系で作用するかどうかを検討した。

アクチビンAが肝細胞に対して特異的な受容体を有しており、TGFβと同様にtype1及びtype2受容体が存在するようである。しかもlow affinityの結合部位はフォリスタチンの結合するところであると思われる。これらのことからアクチビンは肝細胞増殖において、抑制的に作用し、その効果を抑制するフォリスタチンを用いて、細胞増殖を促進することも可能であることが判明した。更に我々はLECラットあるいは劇症肝炎モデルを作成しin vivoの系でもアクチビンAが劇症肝炎の機序と深い関わりがあり、しかもアクチビンAと拮抗して作用するフォリスタチンが劇症肝炎の治療に用いられる可能性も証明するように現在検討しているところである。