hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
EBウイルスによる自然免疫活性化と病原性に関する研究

また、急性EBV感染症患者の血清中にTLR-3の活性化を誘導するに十分量のEBERが存在することも明らかにした。これらの知見は、何故EBVの急性感染症でサイトカインストームが引き起こされるのかを説明できる可能性がある。本年度の研究では、EBERが樹状細胞の活性化を起こすか否かの検討を行った。ヒト末梢血より樹状細胞を分離し、in vitroで合成したEBERを培地中に加え、各種炎症性サイトカインの誘導をRT-PCR法、EUSA法により調べた。その結果、EBERが樹状細胞の活性化を引き起こすことが確認された。さらに、in vivoでのEBERの活性を調べるために、EBERトランスジェニックマウスを作製した。U6プロモーターに連結したEBER遺伝子を組み込んだマウスでEBERが発現することをin situ Hybridization法で確認した。今後、EBERトランスジェニックマウスでTLR3の活性化、炎症性サイトカインの誘導が起こるか否かを検討する予定である。
Ｍｏｎａｄと相互作用する分子群による癌抑制の分子機序の解明と臨床応用

R2TP複合体は酵母においてHSP90の結合蛋白質として同定され、Pontin,Reptin,RPAP3,PIH1D1からなり、酵母から哺乳類までその構造、機能がよく保存されている。申請者らはMonadの結合蛋白質として見つけたR2TPについて研究を行い、これまでに、R2TP複合体がリボソーム生合成、アポトーシスに関わることを明らかにしているが、研究期間内に、申請者らは、アポトーシス誘導、リボソーム生合成に重要な経路である、mTOR複合体シグナル伝達におけるR2TPの機能解明を行い、癌とR2TPの関連性についてその成果を発表した。われわれが発見したmonadの結合蛋白の解析から新たにR2TP複合体(RPAP3、PIH1D1などからなる)を発見し、R2TP複合体の研究を精力的に行っている途中である。R2TP複合体に関する総説の執筆を依頼され、発表の予定である。R2TP complexは、Rvb1-Rvb2-Pih1-Tah1という4つの異なるタンパク質で形成されるタンパク質複合体で、酵母からヒトまで広く保存されている。Rvb1-Rvb2 (Pontin-Reptin)のヘテロ6量体からなるリングと、Pih1 (PIH1D1)-Tah1 (RPAP3)から成るタンパク質複合体で、ヒートショックシャペロンタンパク質Hsp90と相互作用する因子として単離されてきた。今年度は、とくにMonadの結合蛋白であるRPAP3、PIH1D1について解析を行った。RPAP3については、そのアイソフォームの存在を報告し、PIH1D1については正常乳腺細胞と種々の乳がん細胞の発現の比較を行い、乳がん細胞でPIH1D1が高発現していることを明らかにした。またmTORに及ばすPIH1D1の作用を解析しPIH1D1がmTORを正に調節することでリボソーム合成を促進していることを明らかにし、このことがPIH1D1が癌化に及ばす可能性を報告した。また、Monadの乳がん転移に及ばす影響についてプレスリリースを行い、多くの報道を受けた。バイオマーカーは抗癌剤の治療効果と副作用をあらかじめ予測する手段として重要である。特に分子標的薬の登場をきっかけにバイオマーカーの存在が大きくクローズアップされるようになった。口腔癌領域においてもバイオマーカーを効果的に用いることにより、癌の個別化医療を実施することが期待されている。本年度は、マイクロアレイを用いてMonadの下流で変動している遺伝子を同定することで、Monadのバイオマーカーとしての位置づけを明らかにした。そして我々はMonadの癌抑制機序としてひとつとしてamphiregulinとの関連を見いだした。amphiregulinはEGF receptorのリガンドのひとつであり、EGF receptorを標的とする分子標的薬の効果を予測するバイオマーカーとして注目されている。我々はマイクロアレイを用いて乳がん細胞MDA-MB-231においてMonadの下流で変動している遺伝子を探索し、amphiregulinを同定した(論文投稿中)。しかしながらMonadが口腔癌の診断、治療に役立つかどうかは明らかではない。Monadとamphiregulinの関連を詳細に検討することで、また、更なる標的遺伝子を同定することで、amphiregulinの上位調節因子としてのMonadがバイオマーカーとして有用であることを証明していきたい。R2TP複合体は4種類の異なるタンパク質[RVB1、RVB2、RPAP3、PIH1D1]から成り、巨大複合体のアセンブリーを助けるシャペロン機能があることが明らかとなっている。R2TP複合体の構成因子であるRVB1とRVB2はATPase活性を持ち、ヘテロ複合体を形成する。PIH1D1は、その複合体に直接結合し、さらにRPAP3がPIH1D1に結合して安定なシャペロン複合体を形成している。これまでに、R2TP複合体はリボソーム生合成、アポトーシス、RNAポリメラーゼIIの複合体形成に関わることが明らかにされているが、そのなかで、申請者らは、アポトーシス誘導、リボソーム生合成に重要な2つの経路である、mTOR複合体シグナル伝達やbox C/D snoRNP(核小体低分子リボ核酸蛋白質、pre-rRNAの修飾とプロセシングに必須なタンパク質-RNA複合体)生合成におけるR2TPの機能解明に貢献してきた。以下に申請者らの具体的な研究成果を記す。申請者らは、TNF-α誘導性アポトーシスの促進因子としてMonadを単離し、さらにその結合タンパク質としてヒトR2TP複合体を同定した。その後の解析の結果、1R2TP複合体は、アポトーシス誘導を負に制御する、2Monadの過剰発現が、アポトーシス誘導を促進し、乳癌の浸潤を抑制することが明らかとなった。mTORシグナリングは、細胞周辺の栄養状態と細胞増殖を結びつける重要なシグナル伝達経路であるが、近年、この経路の恒常的な活性化によって癌化が起こることが明らかになってきている。

申請者らは、R2TP複合体がmTOR複合体形成をサポートすることで、リボソーム合成を正に制御し、癌化の一要因となることを明らかにした。歯科薬理学当初の目的のうちMonadの結合蛋白の解析については論文の発表に至った。当初の研究目的であったMonadの下流で変動している遺伝子としてamphiregulinを発見し論文投稿にまで至った。おおむね順調に進展しており、当初の計画を推進する。Monadがamphiregulinを調節するメカニズムを詳細に検討する計画が順調に進行したため、当初の予想を超えて凍結サンプルの量が増加したため、冷凍庫の購入を計画したが、代表者が研究機関を移動することになり、異動後の購入を決めたため。凍結サンプルの保存用に冷凍庫を購入する。Monadとamphiregulinの直接的な結合を調べるためRIP assayを行うための実験系を構築する。Monadのrecombinant蛋白作製に取り掛かる。
開瞼困難、特に眼瞼痙攣の病態生理、治療に関する臨床的及び基礎的研究

1.臨床的研究:開瞼因難を来すいわゆる眼瞼痙攣例を多数分析した。特に神経薬投与法によりretrospectiveに44例を、引き続き本研究ではprospectiveにその神経のアンバランスを検討した。Prospectiveには57例を一応対象とし、その病型分類はA)特発性眼瞼痙攣38例、B)原瞼失行を伴った眼瞼痙攣(混合型)18例、C)開瞼失行1例であった。A)はhyper,B)C)はhypodopaminergicとのretrospective study結果をふまえ薬物投与を行った。その結果、A)はその病態は様々であり、B)は私共の初めて提唱した病型であるが、ア-テンが例外なく有効でありhypodopaminergicな病態と確認され、1つのClinical entityと考えられた。本症の中枢神経障害部位を見いだす目的でSPECTによる脳循環、眼球運動(random saccade)、眼輪筋反射(眼窩上神経刺激)などを施行したが共通の特徴的なものは見い出されなかった。さらにdry eyeが80%にみられ一徴候の可能性が疑われた。今回の総合的研究を総活し、いわゆる眼瞼痙攣の発症メカニズムの悪循環図を完成させ、その発症因子などを具体的にすることが出来た。これらを系統的に応用して外科的手段も含め治療が可能となると考えている。2.神経解剖学的研究:あまり関心の向けられていない眼瞼筋群の神経ニュ-ロンの特徴を明かにすることが出来た。坂本は眼輪筋ーニュ-ロンの機能的分化をネコで明確に世界で初めて示した。眼瞼挙筋ニュロンについてはサルで1つのニュ-ロンが分枝して両判の挙筋を支配するという特殊な分化をしていることを哺乳動物の運動ニュ-ロンで初めて示した意義は大きい(Sekiya;投稿中)。またネコ、ウサギについても詳細に検討しその局在、形態学的特徴を確定出来た(平本、1991)。アドリアマイシンの応用は今後共継続し、治療法として発展させたい。本症の発症機構につき更に中枢神経系の異常を明かにしたい。1.眼瞼痙攣症例の分析(1)開瞼困難を呈した44例につきretrospectiveに臨床的分析を行い3型に分類出来た。a)特発性眼瞼痙攣26例、b)開瞼失行を伴う眼瞼痙攣(混合型)16例、c)開瞼失行症2例であった。d)混合型は新しい疾患単位と考えられるものである。神経薬物に対する反応から、概ねa)はhyperdopaminergic、b)c)はhypodopaminergic状況と判断された。(2)上記観察を基にprospectiveに神経薬物治療を行った。現在分析中であり、さらにGABA analogueのBaclofenを試みている。2.眼瞼痙攣、混合型の筋電図所見強い閉瞼時の前頭筋の同時収縮;閉瞼から開瞼移行時、上方注視時、上方追従時に眼輪筋のspasmが見られ、これら核上性神経支配異常は神経薬物で改善された。又代償的現象としてのa)b)型に“Blink-lid opening"と称すべき、瞬目の助けにより開瞼することが初めて見いだされた。3.ネコ、サル眼輪筋・挙筋の神経解剖(1)ネコ眼輪筋筋線維、有髄神経線維、運動

ニュ-ロンの形態学的分類を行い、眼窩部、芽瞼部筋線維、両支配ニュ-ロンの差異から機能分化を初めて考察した(後記発表論文:坂本他)。(2)サル上眼瞼挙筋亜核につきHRP標識で観察し、CCN(亜核)が両側対をなし対側優位(3:2)であり、小細胞(31.0+4.3μm)よりなることを初めて示した(後記発表抄録:関谷他)。4.ネコ眼輪筋、顔面神経枝へAdriamycin応用が顔面神経刺激装置を用いて開始された。1.眼瞼痙攣症例の臨床的研究(1)眼瞼痙攣と考えられる新たな症例50例につきprospectiveに神経薬物治療、外科的治療を合わせ行なった。その結果、a)特発性眼瞼痙攣37例、b)開瞼失行を伴う眼瞼痙攣(混合型)10例、c)開瞼失行3例であった。現在迄のretrospective研究に基づき、a)についてはクロナゼパム、グラマリ-ル、パクロフェンを中心に。b)についてはア-テン、アマンタジン。c)はア-テンを第一選択として投与した。また外科的治療としてAnderson法に代わり、軽症のa),b)については浸襲と手術時間の少ない新手術法(眉毛挙上、眼輪筋挙上術および眼輪筋支配神経部分切断)を試み好結果を得ている。(2)臨床筋電図、臨床分析:前回のBlink lid openingという代償現象に加え水平運動負荷による眼瞼痙攣の変化を見出し検討している。2.サル、ネコ、ウサギ挙筋支配亜核の研究(1)サル上眼瞼挙筋亜核:HRP標識,さらに二種類の色素をtracerとし検討した。その結果、世界で初めて1つの運動ニュ-ロンが両側挙筋筋繊維を支配する二重標識細胞が発見された。サルというヒトに近い高等動物でこの二重支配ニュ-ロン存在の機能的意義は極めて大きい。(関谷他1990:Sekiya etal,1991投稿中)。(2)ネコ、ウサギ上眼瞼挙筋亜核;同様の方法で詳細な亜核の配置が定量的に初めて示された。しかし二重標識細胞は見出されなかった。(Hiramoto,etal 1991投稿中)3.ネコ外眼筋の垂直ともむき筋運動ニュ-ロンの二重支配ニュ-ロンに注目し初めて検討したが見出されなかった。(近藤ら1991)。4.眼瞼異常を特徴とする眼球運動異常を自験の臨床的研究を中心にまとめた。(向野1990)。5.ネコ顔面神経へのアドレアマイシンの応用が開始された。その結果は最終年度にまめられる。1.臨床的研究:いわゆる眼瞼痙攣と考えられる57症例につき、引続きprospectiveに神経薬物治療、一部外科的治療を行ないその結果を詳細に分析した。病型別にはa)特発性眼瞼痙攣38例.b)開瞼失行を伴う眼瞼痙攣(混合型)18例.c)開瞼失行1例であった。それらに対し前回のretrospective studyの結果をふまえ、a)はhyperdopaininergicとの考えからクロナゼパム・グラマニ-ル、ピモンド.b)はhypodopaminergicとの考えからア-テン・アマンタビンを中心に投与した。その結果a)にはその効果には一定の傾向はみられずhyperー,hypoーいずれの状況も存在すると考えられた。
細胞pH摂動現象と電界効果トランジスタを用いた高感度生体バリア評価法の開発

独自に開発した細胞非侵襲的なpH摂動操作と電気的イオンセンシング法を用いて、「究極的な高感度」と「高スループット」を実現する細胞膜および上皮タイトジャンクション(TJ)の生体バリアに対するIn vitro評価法を開発する。本手法の有用性を示すために、1.機能性ナノ材料の細胞膜透過性機構の解明、2.上皮TJを標的とする薬剤評価技術の確立、に取り組む。期待成果として、高効率な薬物送達系キャリア分子開発に向けた評価技術の確立や、TJ標的型新規薬剤開発の促進、培養細胞アレイ/培養組織を用いた高スループット薬剤スクリーニング、がん浸潤・転移時の組織物理化学的環境変化の非侵襲計測等が挙げられる。
波動場の時空間勾配解析を用いた微少亀裂検出法に関する研究

[研究の目的]時空間勾配解析を弾性波動場の解析に導入し,波動の伝搬速度や周波数の影響を受けない微少亀裂検出法を確立すること.[研究実績の概要]構造物に応力腐食割れが発生すると,疲労サイクルの増大に従ってその長さや深さが進行する.そこで亀裂や腐食の発生の初期の段階においてそれを検知する事が重要である.従来より,多くの手法による非破壊検査が行われてきたが,中でも音響を用いた手法は最も古く,多くの材質に対して最も一般的に用いられている.音響による非破壊検査では,縦波,せん断波,または両者が利用されてきた.これらは等方性媒質内では非分散性の波であるため,伝搬遅延に基づいた亀裂の深さや形状の計測に有効であった.ところが近年,多くの用途に用いられるようになってきた複合材料では,音速が周波数によって異なる分散性媒質であることが多く,時間の経過とともに入力パルスの形状が崩れ,亀裂や剥離,腐食箇所からの散乱波を検出することが困難となってきた.そのため,分散性の材料内で探傷を効果的に実施するためには,音速や周波数に影響されない検出法を確立した.提案手法は,計測対象表面の法線方向の変位,法線方向の粒子速度,2つの互いに直交する面外せん断歪の4信号間の線形依存特性に基づくものであり,これらの4信号の短時間共分散行列のランクによって欠損部からの反射波の到来を検知するものである,本提案をまとめたものが計測自動制御学会誌および電子情報通信学会英文雑誌に掲載された.また本手法から派生した局所位相速度測定法を特許申請し、同局所位相速度計測法が計測自動制御学会誌に掲載されることが決定された[研究の目的]時空間勾配解析を弾性波動場の解析に導入し,波動の伝搬速度や周波数の影響を受けない微少亀裂検出法を確立すること.[研究実績の概要]構造物に応力腐食割れが発生すると,疲労サイクルの増大に従ってその長さや深さが進行する.そこで亀裂や腐食の発生の初期の段階においてそれを検知する事が重要である.従来より,多くの手法による非破壊検査が行われてきたが,中でも音響を用いた手法は最も古く,多くの材質に対して最も一般的に用いられている.音響による非破壊検査では,縦波,せん断波,または両者が利用されてきた.これらは等方性媒質内では非分散性の波であるため,伝搬遅延に基づいた亀裂の深さや形状の計測に有効であった.ところが近年,多くの用途に用いられるようになってきた複合材料では,音速が周波数によって異なる分散性媒質であることが多く,時間の経過とともに入力パルスの形状が崩れ,亀裂や剥離,腐食箇所からの散乱波を検出することが困難となってきた.そのため,分散性の材料内で探傷を効果的に実施するためには,音速や周波数に影響されない検出法を確立した.提案手法は,計測対象表面の法線方向の変位,法線方向の粒子速度,2つの互いに直交する面外せん断歪の4信号間の線形依存特性に基づくものであり,これらの4信号の短時間共分散行列のランクによって欠損部からの反射波の到来を検知するものである,本提案をまとめたものが計測自動制御学会誌および電子情報通信学会英文雑誌に掲載された.また本手法から派生した局所位相速度測定法を特許申請し、同局所位相速度計測法が計測自動制御学会誌に掲載されることが決定された[研究の目的]時空間勾配解析を弾性波動場の解析に導入し,波動の伝搬速度や周波数の影響を受けない微少亀裂検出法を確立すること.[研究実績の概要]構造物に応力腐食割れが発生すると,疲労サイクルの増大に従ってその長さや深さが進行する.そこで亀裂や腐食の発生の初期の段階においてそれを検知する事が重要である.従来より,多くの手法による非破壊検査が行われてきたが,中でも音響を用いた手法は最も古く,多くの材質に対して最も一般的に用いられている.音響による非破壊検査では,縦波,せん断波,または両者が利用されてきた.これらは等方性媒質内では非分散性の波であるため,伝搬遅延に基づいた亀裂の深さや形状の計測に有効であった.ところが近年,多くの用途に用いられるようになってきた複合材料では,音速が周波数によって異なる分散性媒質であることが多く,時間の経過とともに入力パルスの形状が崩れ,亀裂や剥離,腐食箇所からの散乱波を検出することが困難となってきた.そのため,分散性の材料内で探傷を効果的に実施するためには,音速や周波数に影響されない検出法を確立した.提案手法は,計測対象表面の法線方向の変位,法線方向の粒子速度,2つの互いに直交する面外せん断歪の4信号間の線形依存特性に基づくものであり,これらの4信号の短時間共分散行列のランクによって欠損部からの反射波の到来を検地するものである,本提案をまとめたものが計測自動制御学会誌に掲載された.また本手法から派生した局所位相速度測定法を特許申請すべく手続きに入っている.[研究の目的]時空間勾配解析を弾性波動場の解析に導入し,波動の伝搬速度や周波数の影響を受けない微少亀裂検出法を確立すること.[研究実績の概要]構造物に応力腐食割れが発生すると,疲労サイクルの増大に従ってその長さや深さが進行する.そこで亀裂や腐食の発生の初期の段階においてそれを検知する事が重要である.

従来より,多くの手法による非破壊検査が行われてきたが,中でも音響を用いた手法は最も古く,多くの材質に対して最も一般的に用いられている.音響による非破壊検査では,縦波,せん断波,または両者が利用されてきた.これらは等方性媒質内では非分散性の波であるため,伝搬遅延に基づいた亀裂の深さや形状の計測に有効であった.ところが近年,多くの用途に用いられるようになってきた複合材料では,音速が周波数によって異なる分散性媒質であることが多く,時間の経過とともに入力パルスの形状が崩れ,亀裂や剥離,腐食箇所からの散乱波を検出することが困難となってきた.そのため,分散性の材料内で探傷を効果的に実施するためには,音速や周波数に影響されない検出法を確立した.提案手法は,計測対象表面の法線方向の変位,法線方向の粒子速度,2つの互いに直交する面外せん断歪の4信号間の線形依存特性に基づくものであり,これらの4信号の短時間共分散行列のランクによって欠損部からの反射波の到来を検知するものである,本提案をまとめたものが電子情報通信学会英文雑誌に掲載された.また本手法から派生した局所位相速度測定法を特許申請し、同局所位相速度計測法が計測自動制御学会誌に掲載されることが決定された
領域の研究方針の策定

班会議及び総括班会議を外部諮問委員、学術調査官の出席のもとで、平成30年8月8日に東京大学医科学研究所一号館講堂で開催した。各計画研究及び公募研究の進捗状況・今後の研究計画について報告し、外部諮問委員、学術調査官から評価と助言を受けた。班会議の前日の8月7日には、ヒューマンネットワーキングのためにホテル雅叙園東京において「若いと思っている人の会」を開催した。13名の若手研究者が口頭での講演を行い、その後、ポスター発表の形式で懇談会を開いた。がんゲノミクスおよびシステムズバイオロジーにおける人材養成と国際連携のためにJoint Hong Kong-Japan Bioinformatics and Systems Biology Workshop (http://iwsg2018.hgc.jp/)を、平成30年11月19日にホテル雅叙園で開催した(白石友一、宮野悟企画)。また、最終年度に向けてInternational Society of Precision Cancer Medicine (ISPCM)に本領域として貢献することとした(稲澤譲治企画)。アウトリーチ活動としては、ニュースレター(No.15No.20)の編集を行い、公募研究のすべての紹介をすることとなった(公開は平成31年4月)。また、メディア等ではいくつかの記者発表(Nature, Nature Microbiology, Nature Communications等の論文について)を含め複数の発表を行った。支援班活動としてはヒトゲノム解析センタースパコンSHIROKANEを使った「遺伝子ネットワーク解析実習講習会」、「がんゲノム解析Genomon2 Tutorial」、Rの基礎及びRによる統計解析(遺伝子発現解析、遺伝子セット解析、シングルセル解析等)などのハンズオン講習を実施した。前年度に引き続き、遺伝統計学夏の学校(8月25日27日)を大阪大学で開催した(岡田随象企画)。総括班におけるELSIに関する活動としては、平成31年3月17日に総括班員によりこれまでの研究成果に基づいた議論を行った(武藤香織)。本総括班の計画の策定に従って、平成30年度の実績からわかるように、6つの計画研究は一体となって新たな学術領域を形成している。その成果は、各計画研究、公募研究から報告されている。ニュースレターについては、編集量の多さから、発行は平成31年4月となったが、6つのニュースレターの編集作業を行うことができ、これにより計画研究および公募研究のすべての紹介を行った。メディアへのアウトリーチも十分と考えている。岡田随象(総括班員・計画研究代表者)が企画した遺伝統計学夏の学校は前年度に引き続き大きな成功を収めた。小川誠司(総括班員・計画研究代表)が、平成30年4月29日に、腫瘍学研究における貢献により紫綬褒章を授与された。前新学術領域「システムがん」と本領域「システム癌新次元」による貢献が大きいと考えている。また、高橋隆(総括班員・計画研究代表)は、名古屋大学医学研究科におけるシステム生物学講座の創設に貢献し、また、愛知県がんセンター総長に就任してからは、センター研究所にシステム解析学分野を創設し、本領域からの人材をリクルートするなど、人材の養成においても大きく貢献した。総括班による支援活動は、ヒトゲノム解析センターのスーパーコンピュータを使い、前項目に述べたように基礎からハンズオンまでを実施した(宮野悟)。平成31年度は最終年度となるが、平成31年3月17日に開催した総括班員による会議において、稲澤譲治(総括班員・計画研究代表者)は、2020年のISPCM2020を企画し、また、武藤香織(総括班員・計画研究代表者)は最終年度にELSIに関するアウトリーチセミナーを未来科学館で開催することを企画した。以上、総括班としてはその企画及び実施において十分な成果をあげており、進捗は良好であると考える。総括班会議を開催して研究進捗状況を把握し、本領域の開始時点からの内部評価とともに、外部の有識者による諮問委員会による評価と助言を受け、本領域の最終的なゴールへ向けていく。最終年度の令和元年度は領域内の成果および領域外への波及効果をとりまとめ、本領域を創設した意義について総括する。そのために、まず令和元年8月9日に班会議、総括班会議、外部諮問委員会を開催する。また国内外のシンポジウム等への参加・開催によって、計算システム生物学研究者、がん研究者、ELSI研究者が相互に理解を深め、有機的に連携・共同研究を構築する機会を一層発展させる。特に、本領域として国際シンポジウムを開催する。領域外のがん研究者、バイオインフォマティクス研究者、人文系研究者に対して、この新次元へと深化していく本領域の魅力と科学的・社会的インパクトを積極的に伝えて啓発しこの新しい学術領域を我が国に定着させる。アウトリーチ活動としては、各種メディアへのアクセスを継続的に行うとともに、一般を対象としたELSIに関する公開講座とがんの新たな理解に関する公開講座を開催する。研究支援班の活動として、スパコンを使った大規模データ解析、システム生物学的な解析技術の講習会の開催、情報解析支援の調整などを継続し、本領域終了後においてもこの活動が定着するように目論む。この支援機能と調整機能に基づき、宮野、岡田(人工知能・数理・情報・統計的遺伝学)、稲澤、小川、高橋(実験系)は、がん研究に限らずこれからの生命科学を世界トップレベルで推進できる能力を有する人材育成の輩出に努める。武藤はがんELSI研究を遂行し、また、本領域全体のELSIを支える。そして、がん研究、人工知能・数理・情報、ELSIという三つの異分野を融合した学術領域を定着させていく。第1回班会議及び総括班会議を2015年7月18日に東京大学医科学研究所において開催した。

早急に領域の研究方針の策定する必要性から総括班員のみにより開催し、採択までの経緯を振り返り、2015年度の研究の進め方について長時間の議論を重ねた。第2回班会議及び総括班会議を2016年3月22日に東京大学医科学研究所において、外部諮問委員、並びに学術調査官の出席のもとで開催し、研究の進捗状況、今後の研究計画について各計画研究代表者が報告し、外部諮問委員、並びに学術調査官から評価と助言を受けた。既に大きな成果がでていること、今後、重要な成果が期待できること、領域の運営に問題がないことが確認された。ホームページを開設し、ニュースレターを発行した。新学術領域「がん研究分野の特性を踏まえた支援活動」の開催する公開シンポジウムにおいて班員が研究の成果を発表する機会を得た。また、総括班内に設けられた研究支援班により、スーパーコンピュータを使った大規模データ解析、システム生物学的な解析等を実施し、ELSI研究者が相互理解の場の設定等、課題横断的に研究を進めた。また、ヒトゲノム解析センターのスーパーコンピュータ利用講習会の場を借りて、本領域の情報解析支援を実施した。また、アウトリーチとして、新聞、NHK、共同通信、記者発表、AERA、子供の科学、実験医学等、多くの取材に対応し、社会へ本領域の重要性と成果を発表した。さらに、領域外のがん研究者、バイオインフォマティクス研究者、人文系研究者に対して、この新次元へと深化していく本領域の魅力と科学的・社会的インパクトを積極的に伝えて啓発し、平成28年度から始まる公募研究へ対応した。このように、この新しい学術領域を我が国に定着させ、研究成果を最大限に引き出し、がん研究、数理・情報、ELSIという三つの異分野を融合した新しい学術領域を創成することを目指した。本総括班の平成27年度の実績からわかるように、6つの計画研究は相互に深く共同・協力している。既に論文として共同研究の成果、例えば、Muramatsu T et al. Oncogene. 2016 (稲澤譲治と宮野悟の共同研究、記者発表)、Kataoka T etal. Nature Genetics. 2015 (小川誠司と宮野悟の共同研究、記者発表)などが出ている。小川誠司と宮野悟は洗練されたシステムとして研究が稼働しており、研究テーマごとに、新たなデータ解析の方式が開発された。稲澤譲治と宮野悟は、ロングノンコーディングRNAを含むネットワーク解析についても研究が進みつつある。さらに、ロングノンコーディングRNAの制御に関する高橋隆と宮野悟の共同研究も画期的な進展があった。武藤香織のELSI研究では、Watson Genomic Analyticsの導入に伴い、東大医科学研究所ゲノム診療部の古川洋一教授、血液腫瘍内科の東條有伸教授らの臨床現場、及びがんの基礎研究と密着したELSI研究ができるように準備をした。
心電図と動脈圧波形の時相差を利用した非侵襲的心筋収縮能評価法への試み

申請者は非侵襲的心筋収縮能評価として心電図と動脈圧波形の時相の遅れに注目し、心電図のQ波形から動脈圧の最低血圧が確定するまでの時間をQD時間、また最低血圧から最高血圧が確定するまでの時間をDS時間と呼び、これらの時相遅れを1心拍毎に測定し、人工心肺の部分潅流時から離脱完了までの経過を観察した。その結果成人では心拍開始後、自己の動脈圧が検出できた段階ではDS時間で300400m秒の遅れがあり、また部分潅流のまま心機能が回復する過程で遅れ時間は急速に減少し、およそ120m秒になった段階で無事に人工心肺から離脱できることを確認した。小児心臓手術でも同様に心抑制時でのQD時間に大きく時間遅延することはないが、DS時間では時間遅延の状態から人工心肺離脱時にはおよそ120m秒で離脱できた。成人でも小児でも時間差が殆んどないことは体重当たりの心拍出量に差が少ないこと、手足の発達がほぼ成人と相似であることから、椀骨動脈への拍動遅延時間が同等と見ることができる。心抑制の間でもQD時間に差異がなかった理由は心臓の電気的興奮から大動脈弁開放までの心収縮に大きな負荷がないことが考えられる。またDS時間が心抑制と相関する理由は血液を駆出して、さらに大血管の充満を行い、最高血圧に至るまでの仕事量に十分な仕事量を行わなければならない。所定の一回抽出量を駆出するのに要する仕事量は心収縮力とその作動時間との積であらわされる。従って心抑制時にDS時間が円強することは当然の結果である。今後はパルスオキシメトリーの脈波と心電図との相関を調べるなどして、救急時でのフィールドワークでの応用を試みたい。また同様の現象が小児心臓手術でも確認した。本研究開始までの分析法ではアナログデータレコーダに記録し、その記録結果を電子タイマーを用いて解析していたが、現在オンラインでの即時分析ができるようにコンピュータカードをもちいて開発中である。
ヒト間葉系幹細胞のピオグリタゾンによる活性化-心筋再生医療での役割

ヒト骨髄由来間葉系幹細胞の心筋誘導効率はきわめて低いことがこれまでの研究で明らかにされていた。我々は、ピオグリタゾンにより間葉系幹細胞の心筋誘導効率を著明に改善できることを証明した。また、ピオグリタゾン前処理した間葉系幹細胞をラットの心筋梗塞部位に移植することで心機能の改善と心筋梗塞範囲の縮小を確認した。今後、ピオグリタゾン前処理した間葉系幹細胞を用いての心筋再生医療の確立とさらなる発展が大いに期待される。(1)ピオグリタゾンによる心筋誘導効率の検討ヒト間葉系幹細胞(骨髄・胎盤)において、マウス胎仔心筋との共培養において、ピオグリタゾン前処置における心筋誘導効率の改善を明らかにした。特に、骨髄由来の間葉系幹細胞においては、心筋誘導効率が10倍以上に著明に改善した。しかしながら、ピオグリダゾン添加だけでは、ヒト間葉系幹細胞の心筋誘導は生じなかった。またPPAR-γ受容体の選択的阻害薬である、GW-9662投与によってピオグリタゾンの効果が消失するかどうかを検証し、GW-9662によってピオグリタゾンの効果が完全に抑制されることを明らかにした。ピオグリタゾンの心筋誘導率に及ぼす効果が、Orphan受容体依存性の反応ではなく、PPAR-γ受容体依存性であることが示唆された。(2)ヒト骨髄間葉系幹細胞に対するピオグリタゾンの効果・生体位心での検討ヌードラットを用いた心筋梗塞モデルにおいて、心筋梗塞作成2週間後に移植する骨髄間葉系幹細胞をピオグリタゾン処理・非処理群で無作為割当した後、心臓超音波検査施行し、左心機能を評価した。さらに2週間の後、再度心臓超音波検査ならびに左心室内圧を測定し、左心機能を評価した。ピオグリタゾン処理を行った群にて%FSおよび左室収縮期圧が有意差を持って改善することを示した。その後組織学的検討を行い、心筋梗塞領域(マッソントリクロム染色)の計測を行い、ピオグリタゾン処理群にて繊維化領域が有意に減少しており、心筋梗塞領域のリモデリングの抑制が増強されていることが示唆された。PPAR-γ受容体はプロスタグランジンJ2(PGJ2)を生理的リガンドとして認識している。そのため、心筋誘導時にアスピリン・COX-2阻害薬を投与して、マウス培養細胞からPGJ2の分泌が無い状態でも心筋誘導改善効果は認めた。またPPAR-γ受容体の選択的阻害薬である、GW-9662投与によってピオグリタゾンの効果が消失した。これらの結果から、ピオグリタゾンの心筋誘導効率改善効果はPPAR-γ受容体依存性の効果で有ると証明出来た。我々は更に生体位心においてピオグリタゾンが及ぼす影響について検討を行った。In vivoでの移植実験では、拒絶反応の少ないヌードラットを用いた。イソフルレン吸入深麻酔下に左側開胸・前壁冠動脈を5-0フローリン針で結紮心筋梗塞作製後へ閉胸。心筋梗塞が完成する2週間後に、移植する骨髄間葉系幹細胞をピオグリタゾン処理・非処理群で無作為割当後、心臓超音波検査施行し、左心機能を評価した。さらに開胸し、単離心筋細胞を心筋梗塞周辺に31Gハミルトンシリンジにて移植後閉胸した。4週間後に、再度心臓超音波検査による左心機能評価では有意に左室収縮能がピオグリタゾン前処置によって改善した。左室収縮末期圧も著明に改善した。心筋梗塞領域(マッソントリクロム染色)も著明に改善していた。さらに、免疫組織学的検証によって、移植した骨髄間葉系幹細胞が多数心筋細胞へ分化している事が観察された。上記の結果を踏まえ、既にアロ移植においても免疫学的寛容が成立することを確認し、in vitro心筋誘導アッセイシステムを用いた実験では心筋誘導率が35%程であった、ヒト羊膜由来間葉系幹細胞をピオグリタゾン前処理し、ウイスターラット心筋梗塞モデルに移植した。ピオグリタゾン前処理したヒト羊膜由来間葉系幹細胞は、非前処理細胞に比べ細胞生着率が上昇することを認めた。
有機ゲルマニウム基を有するビニルモノマーの選択的合成を目的とする触媒の精密設計

今年度はヒドロゲルマニウム化合物とオレフインから直接ビニルゲルマニウム化合物を合成する新しい触媒反応の検討を目的とした。多くのRh錯体およびRu錯体を中心に検討を行った結果、Ru_3(CO)_<12>が有効な触媒であることを見い出した。例えばヘキサンを溶媒とし100°C,3時間の反応条件下で,過剰のスチレンとトリブチルゲルマニウムとの反応により,93%の高収率でしかも選択的に対応するビニルゲルマニウムを与えることを見い出した。この反応は反応温度に大きく影響される。トルエンを溶媒とする反応では,バス温80°Cでは全く反応はしなかったが,100°Cでは34%,140°Cでは67%で対応するビニルゲルマニウムを与えた。溶媒効果の検討では,ヘキサン,トルエン,アセトニトリルは生成物を与えたが,THFおよび塩化メチレンはビニルゲルマニウムを全く与えなかった。オレフィンの適用限界についても検討を行った。スチレン誘導体である,p-CH_3,p-CF_3,p-F,およびp-C1は良好に反応し,対応するビニルゲルマニウムを与えたが,脂肪族のオレフィンである1-ヘキセンやアリルベンゼンは対応するビニルゲルマニウムは得られず,ヒドロゲルマニウムが未反応のまま回収された。この違いを説明するためにアリルベンゼンを用いた反応の初期における経時変化を調べたところ30分後アリルベンゼンはほとんどβ-メチルスチレンに変化していることが明らかとなった。この結果は,1-ヘキセンやアリルベンゼンは反応の初期の段階で反応性が低い内部オレフィンに異性化することにより反応は進行しなかったものと理解された。
カラマツにおけるカリウム膜輸送体遺伝子の機能および時空間的発現パターンの解明

カリウム(K)イオンは、樹木の成長や生理機能に必須な陽イオンである。樹木体内におけるKイオンの働きは、細胞の生体膜を横切るKイオンの選択的取り込み・排出調節(膜輸送)と密接な関係があり、このKイオン膜輸送は膜中に存在する膜輸送体が担っている。本研究は、針葉樹(カラマツ)におけるKイオン膜輸送の機構を分子(遺伝子)レベルで解明し、それをもとに成長・生理に関する様々な過程でのKイオン膜輸送の役割を明らかにすることを目的としている。本年度は、カラマツから単離したKイオントランスポーター候補遺伝子のLkKUP1とLkKUP2を対象として、機能解析と発現解析を行った。機能解析では、大腸菌のKイオン取り込み能欠損株を用いた相補性試験を行い、Kイオン取り込み機能の解析を行った。その結果、LkKUP1、LkKUP2ともにKイオン取り込み機能を持つことが明らかになった。また、LkKUP1によるKイオン取り込みはセシウム、カルシウム、ナトリウムの各陽イオンに影響を受け、LkKUP2によるKイオン取り込みはセシウム、カルシウム、アンモニウムの各陽イオンに影響を受けることが分かった。発現解析では、カラマツの成木と苗木から針葉、分化中木部、内樹皮など、各部位の試料を採取し、リアルタイムRT-PCRによりLkKUP1およびLkKUP2の発現量を定量的に解析した。その結果、LkKUP1は雄花で高い発現が見られた。LkKUP2の発現量は針葉、雄花、雌花で発現量が高かった。本年度の研究から、2個のカラマツKイオントランスポーター候補遺伝子について、遺伝子産物(輸送体)のKイオン輸送機能や樹体内での発現の特性について新規の知見を得た。2個のカラマツ由来Kイオントランスポーター遺伝子について、機能解析によりKイオン取り込み機能に関する知見を得ることができた。そして、発現解析により、カラマツ樹体内の各部位における2遺伝子の発現量データを得ることができた。また、新たなカラマツ由来Kイオン膜輸送体遺伝子の単離するための準備作業も完了し、さらに詳細な発現解析のための試料採取・RNA抽出にも着手している。カラマツから新たにKイオン膜輸送体遺伝子の単離を行う。そして、単離した遺伝子について本年度と同様に相補性試験を行い、遺伝子産物のKイオン取り込み機能について明らかにすることを目指す。さらに、リアルタイムRT-PCRによりカラマツ体内における発現パターンの解析を行う。また、2019年10月まで1か月ごとにカラマツの苗木から針葉、内樹皮、分化中木部、根の試料を採取(2018年3月から採取を開始している)し、LkKUP1、LkKUP2の各部位における発現パターンをより詳細に明らかにしたいと考えている。

理由:当初計画時よりも研究用物品(試薬類、器具類)が安価で購入できたため、次年度使用額が生じた。使用計画:次年度(2019年度)請求額と合わせて、旅費と消耗品(機能解析用や発現解析用の試薬類、器具類)に使用する。次年度は、海外出張(アメリカ合衆国開催の国際学会での成果発表・情報収集)を予定している。さらに、名古屋や岐阜で開催される国内学会での成果発表・情報収集も予定しており、今年度よりも多くの旅費を使用する予定である。また、発現解析用の消耗品については、より詳細に解析を行うために本年度よりも多くの研究費を使用する予定である。
魚肉水溶性タンパク質のゲル化特性とその高機能化

魚肉水溶性タンパク質(WSPC)のゲル化特性の解明とその高機能化を図ることを目的として,WSPCのカプリン酸ナトリウム誘導ゲル形成能をオボアルブミン(OVA)の存在下並びに非存在下で調べた.まずゲル形成に先立ち,無添加魚肉水溶性タンパク質(WSP)の動的粘弾性挙動をオレイン酸ナトリウムの存在下及び非存在下で調べたところ,無添加WSPの場合に比べ、このタンパク質-脂質混合系において水素結合が混合系サスペンジョンの弾性率の増加を促していることが示唆された.次に、WSPCを用いたレオロジー測定により、WSPC単独ではゲル形成に至らないが、OVAとの混合タンパク質では常温下でゲルを形成することが判った.この混合ゲルの微細構造を走査型電子顕微鏡観察したところ、カプリン酸ナトリウム誘導OVAゲルのそれに匹敵するくらいの微細な網目構造を持っている事が判った.更に,フーリエ変換赤外分光分析により、カプリン酸ナトリウム誘導OVAゲルの場合には、そのゲル形成過程に分子間β-シートに基づくアグリゲーションバンドが現れることが明らかになった.しかしながら,WSPCとOVAから成る混合タンパク質の場合には顕著なアグリゲーションバンドが見出されず,混合タンパク質でのゲル化に伴う二次構造変化の挙動は明らかにはできなかった.今後更に,WSPCの混合ゲル中での物性発現がどのような機構に基づいているものかを解明する事が必要である.魚肉水溶性タンパク質(WSPC)のゲル化特性の解明とその高機能化を図ることを目的として,WSPCのカプリン酸ナトリウム誘導ゲル形成能をオボアルブミン(OVA)の存在下並びに非存在下で調べた.まずゲル形成に先立ち,無添加魚肉水溶性タンパク質(WSP)の動的粘弾性挙動をオレイン酸ナトリウムの存在下及び非存在下で調べたところ,無添加WSPの場合に比べ、このタンパク質-脂質混合系において水素結合が混合系サスペンジョンの弾性率の増加を促していることが示唆された.次に、WSPCを用いたレオロジー測定により、WSPC単独ではゲル形成に至らないが、OVAとの混合タンパク質では常温下でゲルを形成することが判った.この混合ゲルの微細構造を走査型電子顕微鏡観察したところ、カプリン酸ナトリウム誘導OVAゲルのそれに匹敵するくらいの微細な網目構造を持っている事が判った.更に,フーリエ変換赤外分光分析により、カプリン酸ナトリウム誘導OVAゲルの場合には、そのゲル形成過程に分子間β-シートに基づくアグリゲーションバンドが現れることが明らかになった.しかしながら,WSPCとOVAから成る混合タンパク質の場合には顕著なアグリゲーションバンドが見出されず,混合タンパク質でのゲル化に伴う二次構造変化の挙動は明らかにはできなかった.今後更に,WSPCの混合ゲル中での物性発現がどのような機構に基づいているものかを解明する事が必要である.未利用食品タンパク質資源の一つである魚肉水溶性タンパク質の高度利用を図るため、甘鯛から得られた希薄な本タンパク質溶液を中性親水性ポリマー(Ficolle 400、ファルマシア製)を用いて未変性のまま濃縮し、濃縮魚肉水溶性タンパク質を得た。これを用いて以下の3点について検討した。1、濃縮魚肉水溶性タンパク質の加熱誘導ゲル形成性のレオロジー解析。2、濃縮魚肉水溶性タンパク質の動的粘弾性特性に及ぼす脂肪酸塩添加の影響を調べる。3、卵白アルブミン添加による濃縮魚肉水溶性タンパク質-脂肪酸塩混合系のレオロジー変化の解析。その結果、下記の事項が明らかとなった。即ち、濃縮魚肉水溶性タンパク質単独ではタンパク質濃度10%,中性pHで加熱処理を施す事により白濁ゲルを形成した。また、ゲル形成に対するカプリン酸ナトリウム添加の効果を調べたところ、加熱を伴う場合には保水性の高いゲルを形成するが、常温でのインキュベーション下では粘度上昇にとどまり、自重で流れないゲル状凝集体の形成にまでは至らなかった。しかしながら、この系に卵白アルブミンを補足すると顕著にゲル化が促進される事が微少変形下でのレオロジー解析により明らかになった。次年度は、この時に生じるタンパク質高次構造変化を中心に研究を展開する予定である。H15年度は,前年度に検討した魚肉水溶性タンパク質の最適ゲル化条件とそのレオロジー測定の成果に立脚し,12%魚肉水溶性タンパク質の2.5%カプリン酸ナトリウム添加(付加食塩0.2,pH7.8)による高次構造変化並びに卵白アルブミン添加の高次構造への影響についてFT-IR解析の手法を用いて調べた.その結果,魚肉水溶性タンパク質単独にカプリン酸ナトリウムを添加した場合,混合時1692,1680,1648,1638,および1626cm^<-1>にピークを有し,タンパク質二次構造の一般的な帰属に合致することが判った.非加熱では時間経過による顕著なスペクトル変化は観察されなかったが,加熱処理を施すことにより1618cm^<-1>のピークが増加することが判った.一方,卵白アルブミン共存下(8%魚肉水溶性タンパク質+4%卵白アルブミン)では,非加熱条件下でも時間経過に伴い次第に構造変化が生じていることが判った.魚肉水溶性タンパク質単独の場合と卵白アルブミン混合の場合を、共に加熱処理したスペクトル間で比較すると,卵白アルブミンを共存させた場合により1680および1618cm^<-1>(共に分子間β-シート)の顕在化が進んでいることが判った.これら一連のFT-IR解析に基づき,魚肉水溶性タンパク質

単独または魚肉水溶性タンパク質に卵白アルブミンを共存させた系では、そのゲル形成時にはα-ヘリックス(1640cm^<-1>)が分子間β-シートに変換されるとともに,新たに分子間β-シートにより構築されると考えられているアグリゲーションバンド(1618cm^<-1>)の出現が起こることが示唆された.また,卵白アルブミン共存下においてよりその変化が顕著に認められることが判った.
人細膜色素上皮細胞におけるフィフロネクチン産生能の研究

牛胎児血清と人血漿よりフィブロネクチンを精製した.次に各社の抗人血漿フィブロネクチンモノクローナル抗体をELISA(enzymelinked immunosorbent assay)法にて検定したところ、Hybritech社のものは牛フィブロネクチンと交叉しないことがわかった。またウエスタンブロッティング法にても確かめた.この抗体でELISA法用いてフィブロネクチン定量法が確立できた.この抗体が培養人網膜色素上皮細胞のフィブロネクチンを認識しているかどうか間接蛍光抗体法による染色像で確認するとともに、ウエスタンブロッティング法にて確認した.これらの方法によりconfluentの状態の人培養網膜色素上皮細胞では,基底膜だけでなく培養液中にフィブロネクチンが大量にの産生されていることが証明できた.デキサメサゾンの影響を調べたが,フィブロネクチンの産生に影響を及ぼさないことがわかった.牛胎児血清と人血漿よりフィブロネクチンを精製した.次に各社の抗人血漿フィブロネクチンモノクローナル抗体をELISA(enzymelinked immunosorbent assay)法にて検定したところ、Hybritech社のものは牛フィブロネクチンと交叉しないことがわかった。またウエスタンブロッティング法にても確かめた.この抗体でELISA法用いてフィブロネクチン定量法が確立できた.この抗体が培養人網膜色素上皮細胞のフィブロネクチンを認識しているかどうか間接蛍光抗体法による染色像で確認するとともに、ウエスタンブロッティング法にて確認した.これらの方法によりconfluentの状態の人培養網膜色素上皮細胞では,基底膜だけでなく培養液中にフィブロネクチンが大量にの産生されていることが証明できた.デキサメサゾンの影響を調べたが,フィブロネクチンの産生に影響を及ぼさないことがわかった.
外因性神経細胞変性モデルとしてのメチル水銀による神経細胞特異的変性機構の解析

メチル水銀によって引き起こされる小脳神経細胞の変性について,その機構を分子レベルで解析し,水俣病発症機構のみならず,様々の外因によって引き起こされる選択的神経細胞変性の機構解明にも貢献することを目的として,特にアルツハイマー病における神経変性過程への関与が示唆されているcalpain、P35、cdk5カスケードに着目して検討を行った。これまでに,メチル水銀の標的部位の一つである小脳の初代培養系において,ごく低濃度(10-30nM)のメチル水銀による神経細胞変性が曝露4872時間目に不可逆的なものへと決定される試験系を確立している。この,メチル水銀曝露によって誘導される小脳初代培養細胞死に対するcalpain阻害剤およびcdk5阻害剤の影響について調べた結果,その神経細胞死を両阻害剤が抑制することが明らかになった。さらに,メチル水銀曝露により小脳初代培養神経細胞においてcalpainの基質であるα-fodrinが分解されていたことからメチル水銀によるcalpain活性化が確認された。しかしながら,メチル水銀処理によるp35からp25の断片化ついては,calpainの阻害剤を用いてもその断片化は若干抑制されるだけで,cdk5により生じるリン酸化tauの量は,メチル水銀処理後もほとんど増加しなかった。またメチル水銀は,小脳神経細胞死を生じる30nMという低濃度でも、細胞死決定時期にあたる曝露24時間後で,有意にFluo-3により検出される細胞内カルシウム濃度を増加させた。以上の結果から,メチル水銀は細胞内でcalpainの活性化を引き起こし,p35からp25へ一部断片化を誘導するが,この断片化だけではメチル水銀による細胞死を全ては説明できず,活性化したcalpainによる軸索等の細胞骨格系蛋白質の分解など他の機構も関与している可能性が示唆された。メチル水銀によって引き起こされる小脳神経細胞の変性について、その機構を分子レベルで解析し、水俣病発症機構のみならず、様々の外因によって引き起こされる選択的神経細胞変性の機構解明にも貢献することを目的として、特にアルツハイマー病における神経変性過程への関与が示唆されているcalpain、p35、cdk5カスケードに着目して以下の検討を行った。メチル水銀による小脳神経細胞変性過程に対するcalpain阻害剤及びcdk5阻害剤の影響の解析これまでに、メチル水銀の標的部位の一つである小脳の初代培養系において、ごく低濃度(10-30nM)のメチル水銀による神経細胞変性が曝露48-72時間目に不可逆的なものへと決定される試験系を確立している。この、メチル水銀曝露によって誘導される小脳初代培養細胞死に対するcalpain阻害剤(calpain inhibitor II)およびcdk5阻害剤(butyrolactone I)の影響について調べた結果、その神経細胞死をcalpain inhibitor IIおよびbutyrolactone Iが抑制することが明らかになった。メチル水銀による小脳神経細胞変性過程におけるcalpain活性の変化の解析メチル水銀暴露によるラット小脳神経細胞変性の初期過程において、calpainの基質である440 kD ankyrin_Bが分解されていた。さらに、神経細胞にのみ発現するcdk5の活性化タンパク質であるp35のp25への断片化が観察され、同時にFluo-3をプローブとした解析から細胞内カルシウム濃度が増加していることも明らかとなった。以上の結果から、メチル水銀による神経細胞死にもcalpain/cdk5/p35カスケードが関与している可能性が強く示唆された。

メチル水銀によって引き起こされる小脳神経細胞の変性について、その機構を分子レベルで解析し、水俣病発症機構のみならず、様々の外因によって引き起こされる選択的神経細胞変性の機構解明にも貢献することを目的として、特にアルツハイマー病における神経変性過程への関与が示唆されているcalpain、p35、cdk5カスケードに着目して以下の検討を行った。メチル水銀による小脳神経細胞変性過程における軸索蛋白質の変化の解析メチル水銀曝露により小脳初代培養神経細胞においてcalpainの基質であるα-fodrinが分解されていたことからメチル水銀によるcalpain活性化が確認された。しかしながら、メチル水銀処理によるp35からp25の断片化ついては、calpainの阻害剤を用いてもその断片化は若干抑制されるだけであった。さらに、cdk5により生じるリン酸化tauの量は,メチル水銀処理後もほとんど増加しなかった。メチル水銀による小脳神経細胞内カルシウムレベル変動の解析メチル水銀は、小脳神経細胞死を生じる30nMという低濃度でも、細胞死決定時期に相当する曝露24時間後で有意にFluo-3により検出される細胞内カルシウム濃度を増加させた。メチル水銀による小脳神経細胞変性機構の総合的考察メチル水銀は、細胞内でcalpainの活性化を引き起こし、p35からp25へ一部断片化を誘導するが、この断片化だけではメチル水銀による細胞死を全ては説明できず、活性化したcalpainによる軸索等の細胞骨格系蛋白質の分解など他の機構も関与している可能性が示唆された。