hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
開発途上国が適用可能なエネルギー最小消費の新規の下廃水処理システムの開発

本研究の目的は,上昇流嫌気性スラッジブランケット反応器(UASB)という高濃度生物保持が可能な嫌気性バイオリアクターと、その後段に下降流ポリウレタン担体懸垂方式(DHS)の好気性バイオリアクターを接続する、新規の廃水処理プロセスを開発することである。DHS(Downflow Hanging)法はスポンジを固定化担体とした新規の散水ろ床法であり、このシステムは(1)エアレーションを必要としない(2)余剰汚泥が必要としない(3)維持管理が容易,などの優れた利点を有している。そこで本研究室では数年来、発展途上国のための低コストで維持管理が容易な下水処理システムとして、UASBと懸垂型スポンジ(DHS)リアクターを組み合わせたシステムを提案してきた。懸垂型スポンジカーテンリアクター第二世代型システム(DHS-G2)、第三世代型(G3)DHSを経て、その後改良型の新たな第四世代型(G4)DHSシステムを開発し実下水を用いた連続運転を行った。全BODの除去率は、システム全体で95%以上を達成し、卓越した有機物除去能が得られた。またCOD除去率は91%、全窒素の除去率は33%を達成し、さらにSS除去率は最も高く94.4%を達成した。DHS-G4流下高さ方向での水質のプロファイルから微生物によって易分解性有機物はリアクター上部で浄化され、下部で硝化反応が進行していることが明らかになった。さらに、インド国カルナール下水処理場にて,我々の提案するUASB法+DHS法の実規模実証実験を行った.2年を越える期間,安定した運転を維持し,最終処理水の全BODは平均5mg/l,浮遊性物質は平均10mg/lであり排出基準を十分に満たす処理水質を得た.また,ふん便性大腸菌群は4乗オーダーまで除去された.本システムは卓越した有機物除去能90%以上および高い硝化能70%を示し、最終的に得られる処理水は、発展途上国の排出基準を満たす値を示していることから、エネルギー最小消費で維持管理が容易なプロセスとして発展途上国への適応が十分可能であるという見解が得られた。
フラビウイルスによる局所翻訳制御ハイジャックが誘発する脳高次機能異常の病態解明

神経向性のフラビウイルスの感染は、様々な脳神経の高次機能障害を引き起こすが、その機序は殆ど不明である。近年、神経細胞は複雑な神経活動の即時的な制御のために、mRNAを神経突起上に輸送し局所的に蛋白合成を行う、局所翻訳制御機構を持つことが分かってきた。本研究ではこの神経細胞の局所翻訳制御に着目して、神経細胞のmRNA局所翻訳制御機構を利用したウイルスRNA輸送の分子機序の解析を行い、ウイルスゲノムRNAの局所輸送・翻訳による神経病態への影響を検討することで、フラビウイルスは局所翻訳制御機構のハイジャックを行い、これにより特徴的な神経病態を発現している事が示された。A)神経突起上の輸送に重要なウイルスゲノムRNA領域の同定初代培養神経細胞に、各種神経向性フラビウイルスを感染させ、神経突起上へのウイルスゲノムRNAの輸送を解析した。その結果、ダニ媒介性フラビウイルス特異的に、ウイルスゲノムRNAは神経突起上を輸送されることが明らかになった。さらに、分化させ神経突起を形成したPC12細胞に、ウイルスゲノムRNAを発現させ、神経突起への輸送を解析することによって、ダニ媒介性フラビウイルスのウイルスゲノムの3'末端非翻訳領域の一部の配列が、この輸送の責任配列であることが同定された。B)ウイルスゲノムRNA輸送に関与する宿主因子の解析神経細胞が神経突起上でmRNAを輸送し蛋白に局所翻訳する過程において、キネシン蛋白やRNA結合蛋白等の宿主蛋白が構成するNeuronal granuleが重要な機能を果たしていると考えられている。ウイルス感染神経細胞において、ウイルスRNAとNeuronal granule構成因子の神経突起上の局在を解析した結果、両者の共局在が認められた。さらにウイルスゲノムRNAとNeuronal granule構成因子との相互作用を免疫沈降法により解析した所、一部の因子とウイルスRNAは結合している事が示され、この相互作用は、上記のウイルスゲノムRNAの神経突起内輸送の責任因子に変異を導入することで阻害されることが明らかになった。以上の解析結果により、ダニ媒介性フラビウイルスのウイルスゲノムRNAは3'末端非翻訳領域を介して、Neuronal granuleを利用することにより、神経突起状を輸送されることが示唆された。当初計画通り、本年度では神経細胞のmRNA局所翻訳制御機構を利用したウイルスRNA輸送の分子機序の解析を遂行することができた。ダニ媒介性脳炎ウイルスの野生型ウイルス及び、前年度の研究により同定された、神経突起への輸送に重要なゲノムRNA領域に変異・欠損を導入した組換えウイルスを用いて、ウイルス感染による神経細胞の神経突起における局所翻訳制御利用とその影響について比較解析をおこなった。A)培養神経細胞における分子機序の解析:初代培養神経細胞や神経突起伸長モデル細胞(PC12細胞)を用いて、フラビウイルス感染による神経細胞の生理機能に与える影響について解析した所、5'非翻訳領域の変異により、ウイルスゲノムRNAの神経突起内の輸送が減少することが明らかになった。さらにウイルスが感染した細胞では、局所翻訳制御機構によって運ばれる宿主RNAの輸送が競合阻害しており、この競合阻害は5'非翻訳領域の変異により減少することが明らかになった。B)マウスモデルを用いた神経病態発現機序の解析:マウスモデルにおけるウイルス感染による影響を解析した所、5'非翻訳領域の変異により、ウイルス感染による死亡率には変化は認められなかったのにも関わらず、神経症状を示すマウスの割合が減少した。さらに神経症状の重篤度をスコア化し比較した所、変異ウイルスの方が有意に神経症状の重篤度は低かった。以上の2年間の成果から、ダニ媒介性脳炎ウイルスは神経細胞内において、5'非翻訳領域を介して、神経細胞の持つ局所翻訳制御機構に重要な因子と相互作用することにより、神経突起内を輸送され翻訳されることにより、局所でのウイルス複製が行うことが明らかとなった。さらにウイルスRNAによる局所翻訳制御機構により、本来運ばれる宿主RNAの輸送・翻訳が競合阻害されることも明らかになった。これらの点が、ウイルス感染による神経病態発現を促進しているものと考えられる。野生型ウイルス及び、前年度の研究により同定された、神経突起への輸送に重要なゲノムRNA領域に変異・欠損を導入した組換えウイルスを用いて、感染による局所翻訳制御機構利用とその影響について比較解析していく。A)培養細胞における分子機序の解析初代培養神経細胞やPC12細胞を用いて、フラビウイルス感染による神経細胞の生理機能に与える影響について以下の点から解析する。神経突起上を輸送される、神経伝達物質や宿主mRNA等の神経突起上への局在・輸送状況を観察し、ウイルス感染による輸送障害を明らかにする。さらに、ii.神経突起の伸長/分岐への影響や、神経突起上のウイルスRNA輸送部位における微細構造の変化を観察し、ウイルス感染による神経突起の変性を明らかにする。これらの解析結果より、神経突起を介した神経ネットワークや付随する神経機能の阻害の分子機序を考察する。

B)マウスモデルを用いた神経病態発現機序の解析マウスモデルにおけるウイルス感染による影響を、以下の点から解析する。ウイルス感染後のマウスの症状について、体温や体重等の一般項目、神経症状や異常行動(四肢の麻痺、平衡感覚の欠損等)、及び記憶・学習能力や社会性の変化について観察する。また、脳分子イメージングにより、脳内の神経情報伝達物質をはじめとする脳内分子の動態の変化の解析を行う。さらに脳内でのウイルス増殖性、ウイルスゲノムRNAの分布、組織病理学的変化等により病態の進行におけるウイルスの動態を検討する。これらの結果を併せて解析することにより、生体レベルでのウイルス感染による脳の高次機能への影響や、その病態発現機序を考察する。獣医公衆衛生学海外研究協力者と年度末に予定していた研究打ち合わせ及び関連実験が、先方の受け入れ都合により2017年4月以降へ変更しなければならなくなったため。当該研究年度末に予定していた、海外研究者との研究打ち合わせ及び関連実験のための消耗品購入に充てる予定である。
分子気体力学的アプローチによるナノ気体潤滑のメカニズムの解明

本研究では、23m/s程度まで摺動速度を増加させることによってダイヤモンド膜と金属円盤の摩擦係数が急激に低減される現象に注目し、その潤滑機構を数値シミュレーションにより明らかにした。本現象は、微細構造を持つダイヤモンド膜表面と対向面の間を流れるマイクロ・ナノスケールの気体流れによって発生する高い圧力がダイヤモンド膜を浮上させる気体潤滑であり、マイクロ・ナノスケール流れ特有の新しい現象であることを明らかにした。ごく最近、ある程度研磨されたダイヤモンド膜を回転円盤上で摺動させ、動摩擦係数0.01以下という低摩擦が得られることが報告された。この低摩擦状態では、相対速度の増加に伴い、両面間の気流によってスライダーが浮上し、ナノスケールの気体潤滑が起こっているものと考えられるが、その揚力発生のメカニズムは解明されていない。本研究では分子気体力学的アプローチによりナノスケールの気体潤滑現象のメカニズムを解明し、新たな気体潤滑システムの提案につなげる。20年度はダイヤモンド膜と金属面間に挟まれたナノスケールの気体流れを2次元で模擬するDSMCシミュレーションコードを構築し、揚力発生現象の再現を試みた。ある程度研磨したダイヤモンド膜表面は溝と平坦部で構成されている。本研究ではまず、この溝を三角形形状で近似して計算を行ったところ、ある程度の摺動速度で、平坦部や溝が比較的長い条件でスライダーを浮上させることができるほど大きな揚力が得られた。また、三角形の溝のほかに、矩形など別の形状の揚力への影響についても調べた。揚力は溝形状に依存し、矩形よりも三角形の場合の方が揚力は大きくなることがわかった。スライダーと対向面の間の流路は溝と平坦部の繰り返しである。溝部入口から出口(平坦部入口)にかけて圧力が増大し、平坦部入口から出口(溝部入口)にかけて圧力が減少するが、平坦部で圧力が高いまま維持され、出口付近で急激に低下することによって、つまり上に凸な圧力分布によって平均的に上向きの力(揚力)が得られることがわかった。これらの結果を希薄気体に関する国際会議RGD26などで発表したところ大きな反響を得た。部分研磨されたダイヤモンド膜を回転円盤上で摺動させた場合に動摩擦係数0.01以下という低摩擦が報告されている。ここでは、摺動に伴い誘起される両面間の気流によってスライダーが僅かに浮上しナノスケールの気体潤滑が起こっているものと考えられるが、その揚力発生メカニズムは解明されていない。本研究では分子気体力学的アプローチによりこの現象のメカニズムを解明し、新たな気体潤滑システムの提案につなげる。部分研磨したダイヤモンド膜は平坦部と溝で構成されている。この溝を三角形形状で近似して2次元DSMCシミュレーションを行ったところ、ある程度の摺動速度でスライダーを浮上できる大きな揚力が得られることが、平成20年度までの研究で明らかとなっていた。流路が広がる溝入口から出口(平坦部入口)にかけて圧力が増大し、流路が狭まる平坦部入口から出口(溝入口)にかけて圧力が減少するが、平坦部で長い距離にわたって圧力が高いまま維持され、平坦部出口(溝入口)付近でのみ圧力が低下する。平坦部で維持された高い圧力によって揚力が得られる。しかし、溝における圧力発生や平坦部における圧力変化のメカニズムは明らかでなかった。平成21年度には圧力変動を詳細に分析した。その結果、面間距離が分子の平均自由行程より小さい場合には、壁面と気体分子間の衝突頻度が増し、相対的に分子間衝突が不十分となるため、流れに希薄気体効果が現れ、溝の中の分子流れが局所的に希薄化あるいは高密度化し、それが大きな圧力変動を引き起こすことが明らかとなった。また平坦部ではボルツマン方程式に基づいた分子気体潤滑方程式の適用が可能であるため、分子気体潤滑方程式を用いた解析も行ったところ、得られた圧力分布はDSMCシミュレーションの結果と良好に一致した。このことにより本研究の妥当性が確かめられた。部分研磨ダイヤモンド膜を貼付けたスライダを回転金属円盤上に置き摺動させると、数m/s程度の回転速度で摩擦係数が著しく小さくなることが報告されている。摺動音が発生しなかったことから、気体潤滑の状態にあると考えられる。本研究では、ダイヤモンド膜の物性よりも部分研磨された膜の表面微細構造と微小な流路により圧力が発生したものと考え、そのメカニズムをナノスケール流れの数値シミュレーションにより明らかにする。平成22年度は表面微細構造の影響を詳細に調査した。部分研磨ダイヤモンド膜と対向面の間の流路は溝(表面微細構造)と平坦部の繰り返しである。圧力は流路が広がる部分で最も小さく、狭まる部分で最も高くなり、溝部で得られた高い圧力が平坦部で上に凸な曲線状の分布を描いて、長い距離にわたって維持されるため、結果としてスライダに揚力が発生している。得られる圧力の大きさは溝の形状に大きく依存し、同じ摺動速度に対して数倍十倍程度の揚力が得られた。両面間の距離を大きくすると、溝部の圧力変動は劇的に縮小し、平坦部での圧力変化も上に凸な分布から直線的な分布に変化し、揚力が消滅した。

本研究で取り扱っている気体潤滑は、両摺動面が平行な状態で高い揚力を得ており、ハードディスクの磁気ヘッド周りの流れのようにくさび形に流路を絞ることによって揚力を得る従来の気体潤滑とメカニズムが異なる。また、流路幅が大きくなると揚力が消滅することから、本現象はマイクロ・ナノスケール流れ特有の潤滑現象であると言える。本研究の成果は、アメリカで開催された第27回国際希薄気体力学会やロシアで開催された15th International Conference on Methods of Aerophysical Research(招待講演)などで発表され、大きな反響を得ている。
シクロデキストリン包接を利用した結晶多形転移ならびに結晶モルホロジーの制御

本研究では、非晶質性プロスタグランジンE1/α-あるいはβ-シクロデキストリン包接化合物からの薬物の結晶化挙動、α-とβ-シクロデキストリン併用による薬物結晶化の抑制、化学的安定性の改善を企図した。また、シクロデキストリン包接化合物の多形転移挙動を解明するための予備的検討として、イソソルビド/β-シクロデキストリン複合体結晶のX線構造解析を行った。さらに、ゲル相中での薬物の結晶化を検討するため、ポリアクリル酸にβ-シクロデキストリンを化学結合した高分子を合成した。本研究で対象としたシクロデキストリンは分子内に疎水性空洞を有するため、様々な医薬品を空洞内に取り込み、包接化合物を形成することが知られている。製剤学分野では、シクロデキストリンの包接機能を利用した各種製剤特性(溶解性、安定性、苦みの軽減、油性薬物の固形化など)の改善が活発に行われており、国内外で既に十数種類以上のシクロデキストリン含有製剤が上市されている。しかしながら、薬物/シクロデキストリン包接化合物の結晶化、それらの多形転移挙動の詳細はほとんど解明されていない。そこで、本研究では固形薬物自身とともに、シクロデキストリン(CyDs)包接化合物の結晶化ならびにそれらの多形転移挙動の解明を企図する。本年度は、シクロデキストリン包接化合物の結晶多形に関する予備的知見を得るため、イソソルビドならびにそのニトロ誘導体とCyDsとの包接複合体形成に関する検討を行った。これらイソソルビドならびにニトロ誘導体とa-, b-, g-CyDsとの相互作用を溶解度法で検討した結果、全てのCyDs系において溶解度相図はBsあるいはBI型を示し、CyD高濃度において固体複合体の沈澱が観察された。イソソルビド/b-CyD等モル含有水溶液から単結晶を作製し、構造解析を行った。非対称単位にイソソルビドおよびb-CyD分子がそれぞれ1個、水分子が6個存在した。イソソルビドはb-CyD空洞のほぼ中央に位置し、水酸基が空洞外部に配向するように包接されていた。b-CyDはb-軸に沿って堆積し、空洞の両端は隣接するb-CyDにより塞がれた、典型的なカゴ型構造を示した。また、プロスタグランジンに関しては、a-CyDとb-CyDを併用すると両CyDsが包接に関与する三元錯体を形成することを明らかにした。環状オリゴ糖であるシクロデキストリンは分子内に疎水性空洞を有するため、様々な医薬品を空洞内に取り込み、包接化合物を形成することが知られている。製剤学分野では、シクロデキストリンの包接機能を利用した各種製剤特性(溶解性、安定性、苦みの軽減、油性薬物の固形化など)の改善が活発に行われている。しかしながら、シクロデキストリン包接を利用した薬物の結晶化、多形転移挙動、結晶モルホロジーの制御の詳細はほとんど解明されていない。我々は、アセチルサリチル酸(アスピリン)水溶液に疎水性残基を有するシクロデキストリン誘導体(2-ヒドロキシプロピル-b-シクロデキストリン、ジメチル-b-シクロデキストリン)を添加すると、アスピリンの結晶は板状結晶から針状結晶へ変化することを報告した(Crystal Growth & Design, 12, 1985-1991 (2012))。最近、ゲル相中での薬物の結晶化が注目を集めている。溶液状態と異なり、ゲル相中では薬物の拡散速度が著しく制御されているため、異なる結晶多形や晶癖(モルホロジー)を有する結晶が生成することが報告されている。そこで、本研究では、ポリアクリル酸にb-シクロデキストリン(b-CyD)を化学結合したb-CyD/ポリアクリル酸誘導体を合成し、薬物結晶化への影響を検討することを目的とした。本年度は、エチレンジアミンをスペサーとしたグルクロニル-グルコシル-b-CyDとポリアクリル酸を化学結合したb-CyD含有高分子を調製した。本年度はb-CyD含有ポリアクリル酸高分子を調製し、その包接機能を調べた。具体的には、b-CyDの1級水酸基末端にカルボン酸基を有するグルクロニル-グルコシル-b-CyD (GUG-b-CyD)に縮合剤(WSC)を用いてエチレンジアミンを結合させ、一方のアミノ基にポリアクリル酸(MW 5,000, 25,000)をアミド結合させた。ポリアクリル酸とエチレンジアミン化GUG-b-CyDのモル比を変化させて様々な置換度のb-CyD含有ポリアクリル酸高分子を調製した。b-CyD含有ポリアクリル酸高分子中のGUG-b-CyDの置換度はNMRおよびマススペクトル、アンスロン/硫酸法により算出した。GUG-b-CyDの置換度が2%および5%のb-CyD含有ポリアクリル酸高分子を用いて、各種薬物(ビフェニル酢酸、プレドニゾロン、ジクロフェナック、アセトヘキサミドなど)に対する包接機能を溶解度法により検討した結果、ビフェニル酢酸などの比較的細長い分子構造を有する薬物に対して高い包接能を示した。

例えば、閉鎖性血栓血管炎に伴う潰瘍や疼痛などの虚血性症状の改善に臨床使用されているプロスタグランジンE1 (PGE1)は、その溶解性や安定性を改善するため、a-シクロデキストリン複合体の凍結乾燥製剤として製剤化されるとともに、PTP包装により市場へ提供されている。しかしながら、最近では服用性を向上し、飲み忘れやの飲み誤りを防止するため、複数の内服用固形製剤が処方された場合、それらの一包化が広く行われている。PGE1の一包化を企図する場合、その安定性を更に向上させる必要がある。固体状態におけるPGE1/シクロデキストリン複合体の安定性は、薬物あるいはシクロデキストリンの結晶化が大きく影響することが考えられる。そこで本研究では、a-あるいはb-シクロデキストリン複合体、さらにa-シクロデキストリンとb-シクロデキストリンを併用した場合のPGE1の安定性とシクロデキストリンの結晶化挙動を追跡し、安定性と結晶化の関係を明らかにすることを目的とした。本研究では、非晶質性プロスタグランジンE1/α-あるいはβ-シクロデキストリン包接化合物からの薬物の結晶化挙動、α-とβ-シクロデキストリン併用による薬物結晶化の抑制、化学的安定性の改善を企図した。また、シクロデキストリン包接化合物の多形転移挙動を解明するための予備的検討として、イソソルビド/β-シクロデキストリン複合体結晶のX線構造解析を行った。さらに、ゲル相中での薬物の結晶化を検討するため、ポリアクリル酸にβ-シクロデキストリンを化学結合した高分子を合成した。本年度は、シクロデキストリン包接化合物の結晶多形に関する予備的知見を得るため、イソソルビドならびにそのニトロ誘導体とCyDsとの包接複合体形成に関する検討を行った。これらイソソルビドならびにニトロ誘導体はa-,b-, g-CyDsと結晶性複合体を形成することが明らかとなった。イソソルビド/b-CyD等モル含有水溶液から単結晶を作製し、構造解析を行った結果、イソソルビドはb-CyD空洞のほぼ中央に位置し、水酸基が空洞外部に配向するように包接されていた。b-CyDはb-軸に沿って堆積し、空洞の両端は隣接するb-CyDにより塞がれた、典型的なカゴ型構造を示した。一方、プロスタグランジンに関しては、a-CyDとb-CyDを併用すると両CyDsが包接に関与する三元錯体を形成することを明らかにした。今後の研究計画は以下の通りである。高分子量のポリアクリル酸(MW 50,000および100,000、既に合成済)にGUG-b-CyDを導入した高分子を調製し、これらの包接機能を明らかにする。さらに、これらのb-CyD含有ポリアクリル酸高分子の溶液あるいはゲル中に各種薬物を添加し、結晶化速度、多形転移挙動、形態変化を観察するとともに、その機構について考察する。医歯薬学今後の研究計画は以下の通りである。イソソルビドあるいはプロスタグランジンとCyDsとの複合体結晶を単離し、薬物自身とともに、CyDs複合体の結晶化、多形転移、晶癖を明らかにするとともに、それらの制御を企図する。また、各種スペクトル法(UV, CD, NMRなど)を用いて溶液中の包接構造を明らかにし、結晶化や多形転移機構を解明する。
microRNAを介したイネ種子根の皮層細胞層数の制御

イネの根は根端分裂組織で内皮細胞が分裂を繰り返すことで複数層の皮層細胞を形成する。イネのT11-22-2変異体は皮層細胞層数の増加により種子根が太くなり、原因遺伝子はmicroRNAの合成に関わるOsDCL1をコードしている。そこで本研究はイネの複数層の皮層細胞の形成がmicroRNAの制御を受けているか明らかにすることを目指した。その結果、Class III homeodomain leucinezipper転写因子をコードしている2つのOSHB遺伝子がmicroRNAの制御を受けて根の太さや長さの決定に関与する可能性の高いことがわかった。1. miR166の種子根における時空間的発現を調べるイネ種子根におけるmiR166の局在を調べるために、OsHB1、OsHB2、OsHB3、OsHB4、OsHB5遺伝子の各々のmiR166認識配列を改変した5種類の遺伝子組換え体および5つのOsHBの全てのmiR166認識配列を改変した遺伝子組換え体をCRISPR法により作出するためのコンストラクトを作成した。作成したコンストラクトにより遺伝子組換え体の作出を試みたが、未だ組換え体が得られていない。OsHB遺伝子のmiR166認識配列はゲノム上ではイントロンを含んでおり、正常にスプライシングされた転写物のみがmiR166認識配列を持つようになる。CRISPR法によりOsHB遺伝子のmiR166認識配列を含むゲノムの塩基配列に変異が入ると、OsHBタンパク質の機能低下または欠損を引き起こし、遺伝子組換え体が発育しない可能性が考えられた。2. OsHB遺伝子の種子根における時空間的発現を調べるwild typeの種子根におけるOsHB遺伝子の発現が成長段階や乾燥ストレスによって変動するのか明らかにするために、成長段階の異なるイネ種子根のサンプリングや、PEG処理により擬似的な弱い乾燥ストレスを与えたイネ種子根のサンプリングを行った。イネ種子根におけるmiR166の局在を調べるために必要なmiR166に認識されない改変型OsHB遺伝子を持つ組み換えイネの作出がCRISPR法では成功していないため、組換え体を用いたmiR166の発現解析が進められていない。加えて、産休・育休を取得したため、OsHB遺伝子の発現解析等の平成27年度に計画していた実験の実施が遅れている。イネのOSHB遺伝子はClass III Homeodomain Leucine Zipper (Class III HD-Zip)遺伝子ファミリーに分類され、植物の発生の制御に重要な転写因子をコードしている。OSHB遺伝子はmicroRNA166(miR166)認識配列を持ち、miR166により負に制御されている。本研究は、イネ種子根においてmiR166に制御されたOSHB遺伝子の発現が、種子根の太さ(皮層形成)に及ぼす影響を明らかにすることを目的としている。本年度は、種子根の太さの決定に関与するOSHB遺伝子を明らかにするために、種子根が太くなる変異体においてOSHB遺伝子の発現量解析を行った。その結果、種子根が太くなる変異体の種子根においてwild typeと比較して発現の上昇しているOSHB遺伝子を特定し、種子根の太さに関与するOSHB遺伝子を同定した。また、miR166に制御されたOSHB遺伝子の発現が、種子根の太さに及ぼす影響を明らかにするために、miR166に認識されない改変型OSHB遺伝子をもつイネを作出し、その表現型の解析を行った。当初、改変型OSHB遺伝子をもつイネは根が太くなることが予想されたが、実際は根の短い表現型を示した。よって、イネの種子根におけるOSHB遺伝子の発現は、種子根の太さだけでなく、長さの決定にも関与していることが明らかとなった。本年度は種子根の太さとOSHB遺伝子の発現量の関係を明らかにするため、wild typeに比べて種子根が太くなる変異体を用いて、イネに5コピー存在するOSHB遺伝子の発現解析を行った。その結果、種子根の太さに関与するOSHB遺伝子を同定することができた。また、miR166に認識されない改変型OSHB遺伝子をもつイネを作出し、その表現型の解析を行った。改変型OSHB遺伝子をもつイネは根が太くなることが予想されたが、実際は根の短い表現型を示した。根の太さや長さは作物の根系形態を決定する重要な要素である。本研究はイネの種子根の太さが、どのように制御されているか明らかにするため、種子根において複数層からなる皮層細胞層の形成に着目して研究を進めた。イネの根は1層の内皮細胞と複数層の皮層細胞をもち、根端分裂組織において内皮細胞が並層分裂を繰り返すことで複数層の皮層細胞が形成される。これまでにwild typeに比べて種子根が太くなる変異体では、皮層細胞層数が増加して根が太くなることが明らかになっている。これらの変異体の原因遺伝子はmicroRNAの生成経路に関与しており、変異体ではOSHB遺伝子の発現が上昇していた。イネのOSHB遺伝子はClass III Homeodomain Leucine Zipper遺伝子ファミリーに分類され、植物の発生の制御に重要な転写因子をコードしている。OSHB遺伝子はmicroRNA166 (miR166)認識配列をもち、miR166により負に制御されている。

本研究はイネ種子根においてmiR166に制御されたOSHB遺伝子の発現が、種子根の太さ(皮層形成)に及ぼす影響を明らかにすることを目指した。本年度は昨年度までの研究結果をふまえて、種子根の太さや長さに影響を及ぼすと考えられる2つのOSHB遺伝子の種子根における発現領域をin situ hybridization実験により明らかにした。その結果、wild typeでは着目した2つのOSHB遺伝子の発現が根端分裂組織の中心柱で見られたのに対して、種子根が太くなる変異体では中心柱の外側まで発現領域が拡大していた。よってイネの種子根ではmiR166の制御によりOSHB遺伝子の発現が中心柱に制限されていると考えられる。またイネの種子根ではコルメラ始原細胞でもOSHB遺伝子が発現していることが明らかになった。イネの根は根端分裂組織で内皮細胞が分裂を繰り返すことで複数層の皮層細胞を形成する。イネのT11-22-2変異体は皮層細胞層数の増加により種子根が太くなり、原因遺伝子はmicroRNAの合成に関わるOsDCL1をコードしている。そこで本研究はイネの複数層の皮層細胞の形成がmicroRNAの制御を受けているか明らかにすることを目指した。その結果、Class III homeodomain leucinezipper転写因子をコードしている2つのOSHB遺伝子がmicroRNAの制御を受けて根の太さや長さの決定に関与する可能性の高いことがわかった。イネ種子根におけるmiR166の局在を調べるため必要な、miR166に認識されない改変型OsHB遺伝子を持つ組み換えイネを、従来の同義置換変異を導入する方法で作出できるか検討する。イネ種子根におけるOsHB遺伝子の発現解析を進めることで、まず5つのOsHB遺伝子のうち、どのOsHB遺伝子が種子根の皮層細胞形成に関与するのか絞り込む。その後、同義置換変異を目的とするOsHB遺伝子に優先順位をつけて解析する。5つのOsHB遺伝子の発現量解析にあたり、非特異的増幅が見られる場合は、プローブを用いた発現量解析の実施も検討する。種子根の太さや長さに影響を及ぼすと考えられる2つのOSHB遺伝子に着目して、今後の研究を進める。具体的には、種子根におけるOSHB遺伝子のin situ hybridization実験を行い、OSHB遺伝子の種子根における時空間的発現を調べる。in situ hybridization実験でシグナルが検出ができない場合は、OSHB遺伝子のプロモーターからmiR166認識配列までをGFPに繋いだコンストラクトを作成し、コンストラクトを導入したイネの種子根において発現場所を調べる。またCRISPR法により作出した改変型OSHB遺伝子をもつイネの種子をカルス培養し、OSHB遺伝子の二重変異体が得られた場合は、その表現型を解析する。以上により、OSHB遺伝子の発現が種子根の太さや長さの決定に及ぼす影響を明らかにすることを目指す。植物遺伝学平成27年10月から平成28年3月まで、第2子の出産・育児にかかる産前産後休暇および育児休業を取得していたため、計画していた研究を一時中断せざるを得なかった。
ゲノム分節化技術を用いた新型モノネガウイルスベクターの開発と応用

ウイルスは、特定の細胞に感染し、効率的に遺伝子発現を行い、条件によっては細胞傷害を起こすことなく持続感染を引き起こす。すなわちウイルスは、効率的に外部から新たな遺伝子を導入できるベクターである。このようなウイルスの性質を利用して開発されたベクターを用いて実際に、遺伝子治療や癌治療の臨床試験が行われている。しかしながら、現状では、どのウイルスベクターも長所と短所を併せ持ち、理想的なベクターが開発されたとは言い難い。本研究では、モノネガウイルスのゲノムを分節化するという斬新な発想で開発した新型のウイルスベクター(特許国際出願番号PTC/JP2006/314333)を用いて、これまでになかった理想的なウイルスベクターを開発するものである。主な用途として再生医療をターゲットにiPS細胞作製用、iPS細胞からの分化誘導用ベクターの開発を計画している。本年度の主要な成果として、(1)以前の手法と比較して、安全性、簡単さ、効率の全てにおいて、格段に良くなった新たな麻疹ウイルスベクター作製手法の開発に成功した。(2)in vivoにおいて効率的に遺伝子発現を行うためには、ウイルスベクターにワクチン株ではなく、野生株のウイルスポリメラーゼ遺伝子を用いることが重要であることを明らかにした。(3)iPS細胞作製に必要な4つの遺伝子(Oc3/4, Sox2, Klf4, myc)を発現する麻疹ウイルスベクターの作製に成功した。(4)現在、iPS作製実験を進行中である。このようなウイルスの性質を利用して開発されたベクターを持ちて実際に、遺伝子治療や癌治療の臨床試験が行われている。麻疹ウイルスゲノムには、麻疹ウイルスの6つの必須遺伝子(N,P,M,F,H,L)がコードされている。これらの遺伝子をさまざまな組み合わせでもつ二分節あるいは三分節のウイルスベクターを作製し増殖性を解析し、指摘な分節構造を検討した。また、必須遺伝子であるF遺伝子を欠いたウイルスの作製に成功し、安全性向上を図った。これまでのわれわれのシステムは、プラスミドからのベクターウイルス粒子作製を作製する際に、組換えワクシニアウイルスを利用していた。そこでワクシニアウイルスの利用を必要としない、安全かつ簡単なシステムを構築するために、ウイルスRNAゲノムをコードするプラスミド、麻疹ウイルスのリボ核タンパク質複合体の形成を助けるプラスミドの構造を改良し、効率のよりワクシニアウイルス非依存的な系の構築に成功した。本研究成果を基盤に、現在再生医療への基礎応用研究を行っている。
胎児・新生児・妊婦の心拍数変動における非平衡ダイナミクスの解析と臨床応用

本研究においては、フラクタル解析法を考案し、ヒト胎児・新生児・成人の心拍数の各種時間スケールにおけるフラクタル構造の解明ならびに複雑系解析を行い、と胎児・新生児・成人の中枢神経系の発達ならびに種々の病態との関連を解明した。本研究の結果、以下のアルゴリズムからなるフラクタル解析法を開発した。1)時系列データ(N)をn点のボックスに分割、2)ボックス毎に平均からの偏位を順次積和した時系列を作成し、ボックス毎にこの時系列の平均値を引いた新時系列を作成、3)この新時系列(N)の標準偏差(S(n))を算出する。以上の計算をnを変化させて繰り返し(4≦n≦N/10)、S(n)のスケーリング特性をfractal scaling exponentとして両対数グラフ上での傾き(α)をpiecewise linear regression analysisによって算出する。本法は旧来のスペクトル解析を用いるよりも著しくフラクタル次元の推定精度が向上した。さらに、正常ならびに異常胎児・新生児・妊婦において、longitudinalに24時間心拍数データを収録し、本法を心拍毎の微細な変動の解析に応用し、1)胎児・新生児・妊婦個々の心拍数変動のスケーリング特性とその母児の関係解明、2)妊娠進行に伴う胎児と新生児心拍数変動のスケーリング特性の変化の解明、3)同一症例に対する従来の心拍数変動の評価結果とスケーリング特性比較、生理的ならびに病的状態における心拍数変動におけるスケーリング特性の変化の解明、に取り組んだ。特に、無脳児と正常胎児を比較検討することによって、1/fゆらぎならびにカオスの発現機構の解明に有用な知見を得た。今後も、カオス理論を応用した心拍数ゆらぎの解明のために、時間遅れ座標系を用いたアトラクタの構築と状態空間表示法、サロゲートデータ法を用いた検定による埋め込み次元の同定について研究を続ける予定である。我々が開発した10分間の胎児心拍数データを解明する目的で作られたrandom-walk analysisの一種であるQIS-Aをもとに、24時間以内なら解析時間を自由に設定出来、より解析精度を向上させた新フラクタル構造解析法(new QIS-A)を作成した。新プログラムのアルゴリズムは以下の4点に要約される。1)現時系列データ(N)をn点のボックスに分割、2)ボックス毎に平均からの偏位を順次積和した時系列を作成し、ボックス毎にこの時系列の平均値を引いた新時系列を作成、3)この新時系列(N)の標準偏差(S(n))を算出する。さらに、シミュレーション・データの利用によって、従来のスペクトル解析を用いた方法より、new QIS-Aは個々の心拍毎の微細な変動(基線細変動)からultradian rhythmを越えてcircadian rhythmにおよぶスケーリング特性を解明し、胎児・新生児心拍数変動の制御系の発達や胎児仮死の定量的評価(フラクタル次元)への有用性が証明された。データ収集に関しては、本院の胎児・新生児心拍数データベースにノン・ストレス・テストの約1時間の胎児心拍数データ、さらに、24時間胎児・新生児心拍数データにおいては、正常妊娠症例、異常妊娠症例として妊娠中毒症、切迫早産、内分泌疾患合併、胎児仮死、子宮内胎児発育遅延、胎児奇形を収録中である。同時に、new QIS-Aによる解析を行っている。

本研究においては、フラクタル解析法を考案し、ヒト胎児・新生児・成人の心拍数の各種時間スケールにおけるフラクタル構造(時系列データにおいては時間経過を経ても相関の強さが不変:スケーリング特性が不変:power law)と胎児・新生児・成人の中枢神経系の発達ならびに種々の病態との関連を解明する。本研究の結果、以下のアルゴリズムからなるフラクタル解析法を開発した。1)時系列データ(N)をn点のボックスに分割、2)ボックス毎に平均からの偏位を順次積和した時系列を作成し、ボックス毎にこの時系列の平均値を引いた新時系列を作成、3)この新時系列(N)の標準偏差(S(n))を算出する。以上の計算をnを変化させて繰り返し(4≦n≦N/10)、S(n)のスケーリング特性をfractal scaling exponentとして両対数グフフ上での傾き(α)をpiecewise linear regression analysisによって算出する。本法は旧来のスペクトル解析を用いるよりも著しくフラクタル次元の推定精度が向上した。さらに、正常ならびに異常胎児・新生児・妊婦において、longitudinalに24時間心拍数データを収録し、本法を心拍毎の微細な変動の解析に応用し、1)胎児・新生児・妊婦個々の心拍数変動のスケーリング特性とその母児の関係解明、2)妊娠進行に伴う胎児と新生児心拍数変動のスケーリング特性の変化の解明、3)同一症例に対する従来の心拍数変動の評価結果とスケーリング特性比較、生理的ならびに病的状態における心拍数変動におけるスケーリング特性の変化の解明、に取り組んでいる。特に、無脳児と正常胎児を比較検討することによって、1/fゆらぎの発現機構の解明に有用な知見を得た。本研究においては、フラクタル解析法を考案し、ヒト胎児・新生児・成人の心拍数の各種時間スケールにおけるフラクタル構造の解明ならびに複雑系解析を行い、と胎児・新生児・成人の中枢神経系の発達ならびに種々の病態との関連を解明する。以上の計算をnを変化させて繰り返し(4≦n≦N/10)、S(n)のスケーリング特性をfractal scaling exponentとして両対数グラフ上での傾き(α)をpiecewise linear regression analysisによって算出する。
伸展培養法を応用した、より迅速なGreen型培養表皮シート作成の試み

本研究においては、培養表皮作成過程を通して、進展刺激による表皮角化細胞の速やかなspreadingが得られ、その結果、より早期の培養表皮シート作成が達成される可能性が示唆された。一方、培養表皮シートの組織像ではコントロール群との間に、明らかな構造的差異は見いだせず、伸展刺激が最終的に組織像、および最終目標である生体への移植成績に影響を及ぼすかについては明らかにすることができなかった。動物実験においては、両群の差より移植手技による部分が大きいと考えられるため、手技を改良し全体の生着率を向上させることで、進展刺激付加した表皮培養シートの優位性を明らかにしたいと考えている。研究計画にそって、Green型培養表皮シート作成実験を行った。当初feeder layerとして使用した3T3 Swiss Albino(RIKEN CELL BANK)は入手容易ではあったもののfeederとしての機能に劣っている可能性があり、良好な表皮細胞シート作成に至らなかったため臨床及び原法で使用されている3T3 J2(kerafast)を新規入手し、これを変更した。まず、静置培養条件にて至適なfeeder layer(3T3 J2)の作成手順、表皮細胞NHEK(KURABO)の播種密度等を検討し、Greenの報告に近い重層化した表皮細胞シートを得られるまでとなった。その後、前実験で得られた至適条件に則り、伸展培養器での培養表皮シート作成実験を開始した。全て同型の培養容器を使用し、伸展刺激群(伸展率10%、伸展→30秒保持→解放→30秒保持を繰り返し)、非伸展群(コントロール)で最長3週間培養し1,2,3週時点での表皮シートサンプルを得た。得られた表皮細胞シートを固定後にH-E染色し、組織学的に厚みおよび基底層の細胞核数を解析、検討した。またシートとして採取不可能な培養初期(表皮細胞播種後1、3、5日目)における表皮細胞のspreadingの評価は上皮系細胞を選択的に染色するRhodamine B染色を直接容器上で行い、染色された表皮細胞部分の面積占有率を計算した。結果、両群間において得られた表皮シートの性状、厚みに有意差はなく、培養初期のspreadingでは伸展群がやや劣る傾向にあった。原因として伸展培養環境では、培養容器への細胞の定着が不安定となるため、feeder細胞が早期に剥離、損失してしまうためと考えられた。そのため、培養容器の各種コーティング処理および伸展刺激の設定を調節中である。概要に記載のごとく、現在は伸展刺激によるfeederの安定性の確保および、至適伸展刺激条件の検索に時間を要している状態である。特にfeederの安定性については、伸展培養容器の素材(シリコン樹脂製)そのものが細胞との定着性に乏しいことも影響しており、種々のコーティング法を試験中である。過去の我々の研究ではヒト3次元培養全層皮膚に伸展培養を加え表皮の重層化が促進されることが確認されており、当実験においてもfeederの安定化が得られれば同様に良好な表皮細胞の重層化が得られると予想される。前年度に引き続き、研究計画にそって、Green型培養表皮シート作成実験を行った。3T3 J2(kerafast)細胞をfeederとしてヒト正常表皮角化細胞NHEK(KURABO)を基に作成した培養表皮シートの作成実験を行った。前年度報告で報告した培養初期の細胞が剥がれる問題については、コーティングと進展刺激の強度を調整することで克服を試みた。最終的にはコラーゲンゲル培養を応用することで、細胞の剥がれを克服するとともに、良好な伸展の刺激を伝えることが達成できた。続いて、計画に則り、免疫不全動物を用いた培養表皮シートの生体への移植実験を行った。免疫不全マウスBALB/nuおよびNOD scidを用い、マウス背部に2か所、1cm四方の皮膚欠損を作成し皮膚移植モデルとした。モデルの皮膚欠損部へ、それぞれ進展刺激を加えて作成した培養表皮と、加えていない培養表皮をコントロールとして移植した。移植方法は培養表皮シートのみでは強度が足りないため、通常の臨床と同様に濾紙を担体として用い、濾紙ごと背部へ縫合固定した。移植後1週で固定の濾紙を除去して創部を確認したところ、両群とも培養表皮の一部の生着は確認されたものの、大部分は融解、脱落した。培養表皮の生着が不十分であった原因としては、感染、マウスの免疫反応、固定不良、培養表皮自体の活性の他、移植先の皮膚欠損創の環境(脂肪、筋膜上、あるいは真皮様構造の必要性等)が関係していると想定された。前記事項を明らかにするため、引き続き、動物実験の改良を行っている。まず現在継続している伸展培養の至適条件を検索する。

コーティング方法の見直しおよび、進展刺激の緩和等を検討し、それでもfeederの安定性が得られず、完全なgreen型培養表皮での進展実験が困難な場合は、過去我々が作成した3次元全層皮膚と同様の手法を用い、ゲル培養したfeeder上に表皮細胞を播種する方法も考慮する。続いて、得られた表皮細胞シートを用いてヌードマウスへの移植実験を行う。ヌードマウス(BALB/c-nu)の背部に10×10mmの皮膚欠損を2か所作成し、伸展刺激群および非伸展群の表皮培養シートを皮膚欠損に移植する。移植後2週および4週での面積評価を行い、シート面積の収縮率を計算、更に組織採取を行い、表皮層の厚さ、基底層における基底細胞の細胞密度を計測する。更に、透過型電子顕微鏡を用いた基底膜構造の観察や、細胞増殖マーカーであるPCNA、表皮角化細胞の分化マーカーであるK10/14およびinvolucrinに対する免疫組織染色を行う方針である形成外科学今回、経費に計上していた機械負荷装置(STB140、ストレックス社製)を新規購入する予定であったが、他教室の中古機械をレンタルしていただけることになり、現時点での購入の必要がなくなったため。他教室からレンタルした機械が故障した際は、新規購入を検討する。また、今年度培養表皮の安定した培養方法の確立に苦慮しており、来年度は培養方法、器材の大幅な変更を検討しており、予定以上の経費がかかることが見込まれるため、これに使用する予定である。
泌尿器癌に汎用性を有する癌特異的プロモータを利用した抗癌ウイルス療法の開発

第三世代遺伝子組換え単純ヘルペスウイルス1型はウイルス自体ががん細胞特異的に増殖して死滅させる新しい治療の最先端で、3つのウイルス遺伝子機能を欠落させ、高い安全性と強力なウイルス複製能を実現しすでに臨床試験を開始している。理論上欠落したICP6機能を代償する細胞の酵素活性に依存するため、緩徐に増殖する癌の一部ではウイルス複製能が低い可能性が残る。そこでICP6遺伝子をがん特異的プロモータで制御することにより、常に高いウイルス複製能を呈する新規HSV-1を開発した。緩徐に進行する癌にも高い治療効果を発揮する万能型HSV-1の開発は、癌治療におけるウイルス療法の実用化を更に促進すると期待される。本年度は癌治療用HSV-1作成用のbackboneとなるBACの作成、およびそれをもとにした新規ウイルスの作成を行った。既存BACとの相同的組換えにより臨床応用の障害となるICP6領域の重複配列を除去し、新規ウイルスとの組換を可能とするmultiple cloning siteを組み込んだ。さらに汎用性の高いpromoterをshuttle vectorに組込み、BACとの組換により新規ウイルス2種類の作成を完了した。新規ウイルスの複製能・殺細胞効果についての検証を進めていく予定である。本研究の目的は、癌特異的に目的遺伝子を発現するプロモータを利用して、安全性を担保しながら癌細胞でのみ野生株と同等の抗腫瘍効果を発揮する、究極の抗癌ウイルスを作製することにある。抗癌ウイルス治療に用いられるヘルペスウイルス(HSV-1)は、癌特異性を持たせるためにウイルス遺伝子に遺伝子操作が加えられているが、遺伝子操作されていない野生株と比較すると弱毒化してしまっている。そのため、ICP6遺伝子で減弱したウイルス複製能を癌細胞に限って回復させて野生株と同等の抗腫瘍効果を発揮させる一方、正常細胞では増殖しない抗癌ウイルスの作製を目指すことが本研究の目的である。前立腺癌および腎癌では検証済みで、膀胱癌や肉腫などについても特異的なウイルスの作製に成功した。現在、in vitroおよびin vivoでの抗腫瘍効果の検討を行っている。平成26年度に作成したウイルスの膀胱癌および肉腫での解析が進んだたため。in vitro解析は終了し、in vivoの抗腫瘍効果に関しては進行中である。本研究の目的は、がん特異的に目的遺伝子を発現するプロモーターを利用して、安全性を担保しながらがん細胞でのみ野生株と同等の抗腫瘍効果を発揮する、次世代の抗ガンウイルスを作成することにある。抗ガンウイルス治療に用いられるヘルペスウイルス(HSV-1)はがん特異性を持たせるためにウイルス遺伝子に操作が加えられたものだが、遺伝子操作されていない野生株と比較すると弱毒化してしまっている。そのため、ICP6遺伝子で元弱慕うウイルス副性能をがん細胞特異的に回復させて野生株と同等の抗腫瘍効果を発揮させる一方、正常細胞では増殖しない抗ガンウイルスの作成を目指すことが本研究の目的である。前立腺がんおよび腎がんでは検証済みで、膀胱がんや肉腫に対し特異的なウイルスの作成に成功した。in vitro, invivoでの抗腫瘍効果の検討を進めるまえに、構造確認や遺伝子配列の解析を行っている。現在新規挿入領域のプロモーターおよびICP6領域の解析を中心に研究は進行している。制限酵素処理・電気泳動でのおおよその構造解析は進んでいるものの、遺伝子配列の解析は今後の課題となる。また、抗腫瘍効果を試す肉腫のcell lineの培養や動物モデルの作成を同時に行っており、そちらはウイルス解析が終了次第開始可能な状態となっている。本年度の目標はウイルス作成までとしていたため、目標は達成したと考える。本年度に途中まで進行したin vivoでのマウス皮下腫瘍における抗腫瘍効果を検討する方針である。泌尿器科学本年度作成したウイルスの複製能試験を行い、従来ウイルスとの比較を行ったうえで、in vitroの殺細胞効果、in vivoでの抗腫瘍効果の検証を進めていく。研究初年度のため、研究室内での共有物品の使用分の請求が発生せず、比較的少額な差額として生じたと考えます。実際に使用した物品の学は請求分と同等と考えるため、研究室の人員の異動や研究年度の進行とともにバランスアウトされると考えられ、タイムラグをもって当研究費に計上されるものと考えます。
紀元3世紀のロ-マ帝国に関する政治史的・社会史的研究

本研究は、ロ-マ帝国史研究の中で最も解明困難とされてきた紀元3世紀の帝国史について、政治史的社会史的考察を試みたものであった。まず、解明困難の最大の原因であった史料の不足について、研究代表者(南川)は、文学的史料・法的史料の収集、分析に努めるとともに、碑文史料やその分析を行なった研究書の収集、分析に力を注いで、その克服に努力した。そして、碑文史料やその分析の成果を、社会学的手法で検討した結果、この世代における政治支配層の交代、すなわち、2世紀までの元老院議員身分に代わって、新たに興隆してきた騎士身分の動向を、在来の研究よりもより一層明確に把握しえた。こうした社会層の変動の考察をふまえてこの時代の政治史の展開をも検討し、この世紀における皇帝政治、所謂元首政の変質をより深く理解することに努力したが、とくに、238年の最初の軍人皇帝マクシミヌスに対して一致団結して反抗した元老院の動きに、帝国政治の一つの画期的な転換点を見い出すことができた。つまり、マクシミヌスは元老院議員たちと結びついて統治した従来の皇帝とは全く異なる新たなタイプの統治者であり、この皇帝以降、皇帝とその統治は元老院議員身分より明確に遊離していったのである。こうした変化に対する危機感ゆえに、元老院議員たちは一致団結してマクシミヌスに反抗したのであった。マクシミヌス以後約50年間のあいだに元首政は崩壊してしまったのであり、これらの知見から逆に考えれば、12世紀に機能した元首政は、皇帝と元老院議員階層が共同した政治形態であり、元老院アリストクラシ-呼びうるものと把えられるのである。以上の如き本研究から得られた結論は、さしあたり論文にまとめられて、歴史学の総合研究雑誌『史林』(史学研究会刊行)の74巻3号に掲載され、広く発表される予定である。
ヒト遺伝病のATを用いた放射線損傷に関係するDNA修復遺伝子の単離と解析

放射線にたいする高感受性を特徴とするヒト劣性遺伝病のアタキシア・テランジェクタシア(AT)はヒト細胞における遺伝子情報維持の機構を解析するためのひとつのモデル系である。このATの原因遺伝子の単離を目的とし、ヒト染色体11q23領域の解析とここからのDNAの分離を試み、以下の成果が得られた1.AT細胞への染色体移入実験からAT遺伝子の座位をヒト染色体11q23領域にマップした。この遺伝子座位近傍に転座点をもつヒトX/11転座染色体を出発材料とし、高線量のX線照射と細胞融合から、AT遺伝子座位近傍の微小な染色体断片をもつ放射線ハイブリドを作成した。2.得られた放射線ハイブリドについて、ヒト特異的反復配列をプライマーとしたPCR法によりマウス細胞内でのヒトDNAを解析した。今年度購入したDNA酵素反応装置は、このPCR解析に使用した。PCRによる解析から染色体の細片化のみられたクローンについてその染色体領域を調べた。5クローンの染色体断片は11/X転座点から11S14411S385間に亙るものであった。さらにこれらのクローンをAT細胞に移入したところ、5クローンのうち1クローン(RH12/1)がAT細胞の放射線高感受性を相補した。3.ATの原因遺伝子を含むクローンRH12/1からゲノム・ライブラリーを作成した。作成したライブラリーから、ヒトDNAを含むクローンを選択し解析中である。
細胞死にともなう細胞死抑制因子(Bcl-2)の動態に関する研究

平成12年度に採取したヒトbcl-2-GFP遺伝子導入PC12細胞と同遺伝子導入HeLa細胞を免疫組織化学的手法を用いて、観察検討した。すなわち、通常状態で培養したヒトbcl-2-GFP遺伝子導入PC12細胞と同遺伝子導入HeLa細胞、また、細胞死を誘導した後の同細胞(PC12細胞は血清除去24時間後、HeLa細胞はTNF-αにて細胞死を誘導した)を0.1%グルタールアルデヒドならびに4%パラホルムアルデヒド(0.1MPB緩衝液)で固定し、凍結薄切切片を作製し、抗GFP抗体、抗Bcl-2抗体を用いて、免疫染色を施し、電子顕微鏡にて観察を行なった。その結果、通常状態で培養したヒトbcl-2-GFP遺伝子導入PC12細胞と同遺伝子導入HeLa細胞では、いずれの細胞でもBcl-2はミトコンドリアの内外膜、特に内膜に局在し、その他、核膜や小胞体と思われる構造物にも局在していた。一方、細胞死を誘導されたヒトbcl-2-GFP遺伝子導入PC12細胞と同遺伝子導入HeLa細胞では、Bcl-2の局在に変化が起こり、Bcl-2はミトコンドリアの内膜から、ほとんどが消え、ミトコンドリアの周囲に観察された。また、Bcl-2をtime-lapse microscopeで経時的に観察したところ、Bcl-2は顆粒状であった。細胞死を誘導したところ、顆粒状だったBcl-2は細胞質に拡散するように観察された。それぞれの細胞を固定し、免疫染色したところ、チトクロームcは細胞死誘導前はミトコンドリアに局在し、細胞死誘導後は細胞質に流出した。これらのことから、Bcl-2がミトコンドリアから細胞質に移行した後に、チトクロームcがミトコンドリアから流出することが強く示唆された。