hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
皮膚形成におけるCa2+制御とc-Ablによる分裂軸の配向制御

これまでに全キナーゼのsiRNAライブラリを用いたスクリーニングを行い、候補遺伝子のひとつ、非受容体型チロシンキナーゼであるc-Ablによる細胞分裂軸の配向制御を解析してきた。培養細胞及び皮膚基底細胞において、c-Ablは紡錘体の方向を制御することを見出した。さらにc-Ablは、LGN及びNuMAという紡錘体軸方向制御の中心的制御因子の膜局在を制御することで細胞の分裂軸方向を制御していることを示した。皮膚組織は、真皮層と表皮から成る。表皮は増殖する基底細胞とその増殖により供給される上層の分化細胞から成る。基底細胞の分裂方向は基底膜に対して平行または垂直に制御されていることが報告されている。平行分裂は皮膚の2次元拡張に寄与し、垂直分裂は分化細胞の多層化に寄与する。我々は今回ヒト培養細胞であるHeLa細胞を用いて、分裂軸制御因子をヒトの全キナーゼに対して網羅的に探索し、ABL1チロシンキナーゼが新規分裂軸制御因子であることを見出した。ABL1は進化的に保存された分裂軸制御因子LGN,NuMAの細胞内局在を制御することで、HeLa細胞においてもマウス皮膚基底細胞においても分裂軸を制御していること、その際ABL1によるNuMAのリン酸化が特に重要であることを見出した。これらの成果はNat. Commun. 3: 626.doi:10.1038/ncomms1634.により報告した。一方で、皮膚の分化にはCa2+の濃度が重要である。HeLa細胞において、分裂軸制御にCa2+が関与する可能性について検証を行った。CaMK2阻害剤であるKN-93やCa2+イオノフォアを用いて、細胞内Ca2+シグナルの阻害を行ったが、分裂軸の異常は観察されず、LGNの局在変化も有意な差は認められなかった。HeLa細胞において、ABL1欠損による分裂軸の異常はLGNをさらに欠損させることで分裂軸を正常に戻すことができた。そこで、ABL1/LGNのダブルノックアウトマウス(KOマウス)の作出を試みた。しかし、胎生の早期に致死となるのか、ダブルKO個体を得ることはできなかった。そこで、皮膚器官培養法においてshRNAレンチウイルスによる遺伝子発現抑制の系の立ち上げを試みたが、効率的なウイルス感染を行うことができなかった。今後はKOマウスではない皮膚での遺伝子発現抑制の方法を模索する予定である。本研究の目的は、培養細胞及び皮膚基底細胞でのc-Ablによる分裂方向制御機構の解明である。これまでに全キナーゼのsiRNAライブラリを用いたスクリーニングを行い、非受容体型チロシンキナーゼであるc-Ablによる細胞分裂軸の配向制御を解析してきた。培養細胞及び皮膚基底細胞において、c-Ablは紡錘体の方向を制御することが知られているLGN及びNuMAの細胞表層の細胞膜への三日月様の局在を制御することで細胞の分裂軸方向を制御することを示してきた(Matsumura et al., 2012, Nat. Commun., 3: 626. doi:10.1038/ncomms1634)。さらに、GFP-LGN発現HeLa細胞のクローニングを終え、CaMK2阻害剤であるKN-93やCa2+イオノフォアionomycineを用いて、細胞内Ca2+シグナルの阻害と分裂軸制御およびLGNの膜局在の変化を解析した。しかし、いずれの場合も分裂軸の異常は観察されず、LGNの局在変化も有意な差は認められなかった。そこでCa2+シグナルが働く皮膚器官培養法での検証を行うため系を現在立ち上げている。さらに、c-Ablのノックアウトマウスと譲り受けたLGNノックアウトマウスの掛け合わせによってダブルノックアウトマウスの作出を現在行っている。H23年度後半にc-Ablによる分裂軸方向制御についての解析結果がnature communicationsに掲載され、一定の成果をあげることができた。これにより示した内容により、本研究目的の約50%を達成することができたと考えている。H23年度に予定していたCa2+シグナルと分裂軸制御については、HeLa細胞を用いた検証ではネガイティブな結果が得られたが、H24年度にはin vivoにより近い皮膚器官培養法を用いて検証を行う予定である。さらに、c-AblのノックアウトマウスとLGNノックアウトマウスの掛け合わせ交配は既に行っており、ダブルノックアウトマウスの作出および解析はH24年度に確実にできるものと思われる。以上から、本研究計画はCa2+シグナルに関してうまくいっていないものの、全体としては概ね順調に進んでいるものと考える。皮膚におけるc-Ablの分裂軸制御が果たす役割について、引き続き解析を行う予定である。特に、c-Ablノックアウトマウスの皮膚の分化にも焦点を当てて解析を行う。また、LGNノックアウトマウスとのダブルノックアウトマウスの解析を行う。

一方、HeLa細胞でのCa2+シグナル阻害が分裂軸制御に影響を与えなかったのは、HeLa細胞においてCa2+シグナルが決定的な要素ではないためであろうと考えられた。そこで、in vivoにより近くCa2+シグナルが決定的な要素となる皮膚器官培養実験系を立ち上げ、Ca2+シグナル阻害が基底細胞の分裂軸制御にどのような影響を与えるのか検証する予定である。H23年度同様、特に機器の購入はしない。マウスの実験は動物実験施設における自家交配繁殖である。基本的に実験消耗品、実験試薬の購入により実験を遂行する。また、機会があれば、成果の学会発表を行い意見交換、情報収集を行う予定である。
会社法の下での定款自治のあり方に関する総合的研究

平成17年制定の会社法は、株主による定款自治を拡大したが、認められる定款自治の範囲については、なお解釈によってその範囲を決しなければならない場合が少なくなく、またその範囲が明文で明らかとされている事項についても、立法論としてそれが適切かどうかが問題となる。本研究は、全株式譲渡制限会社と公開会社とに区分をし、それぞれ機関関係および株式関係の規律について、あるべき定款自治の範囲について、解釈論・立法論の両面から検討を行った。平成17年制定の会社法は、全株式譲渡制限会社と公開会社とで、相当に異なった規律を採用しており、その違いの多くは、全株式譲渡制限会社について、公開会社には認められない定款自治を認めるという点に存する。そこで本研究は、大きくは全株式譲渡制限会社と公開会社とに区分をして検討を進め、本年度は、まず全株式譲渡制限会社を対象とし、特にその機関関係における定款自治のあり方について検討した。会社法は、機関設計について、とくに全株式譲渡制限会社に大幅な選択の自由を認め、取締役会を置かなくてよいなど、会社法制定前の有限会社と基本的には同様の機関の設置を選択できることとした。会社法が機関設計についてこのように大幅な定款自治を認めた根拠は、株式全部に譲渡制限があれば、株主間に緊密性を確保することができ、真の合意により株主間契約を締結することが不可能でない関係が株主間に存在し、基本的に契約自由の実質が妥当することにあると理解することができる。このような規制根拠に照らし、機関ごとに設計の柔軟性に関する現行法の規律を検討してみると、それぞれ理論的には正当な理由のあることが明らかとなった。もっとも、譲渡制限はあっても多数の株主が存在する会社などで、大幅な定款自治を認める根拠が真に存在するかという問題等、なおいくつかの検討課題のあることも明らかとなった。機関設計以外にも、機関関係では、取締役会設置会社において定款による株主総会の権限の拡大は無制限に認められるか、株主総会決議の効力発生を第三者の承認にかからせる旨を定款で定めることはできるか、譲渡制限株式の譲渡の承認機関を定款でまったくの第三者とすることができるか等の問題は、なお解釈問題として残されているところ、これらの問題についても解釈の方向性につき視座を得ることができた。そこで本研究は、大きくは全株式譲渡制限会社と公開会社とに区分をして検討を進めている。昨年度、全株式譲渡制限会社を対象とし、機関関係の問題について考察を行ったのに続き、本年度は、同じく全株式譲渡制限会社を対象に、株式関係の問題を中心として、主に次のような問題について考察した。株式の種類等に関しては、種類株主総会における取締役・監査役の選解任(会社法108条1項但書・同項9号)、株主の権利に関する事項についての株主ごとの異なる取扱い(同109条2項)、議決権制限株式の発行数(同115条)について、会社法は全株式譲渡制限会社に特に広い定款自治を認めているが、定款自治の範囲が広すぎ、濫用的な利用がされるおそれのあることが明らかとなった。たとえば、種類株主総会における取締役・監査役の選解任の制度において、定款において解任は全体の株主総会で行う旨の定めを設けておかない限りは、ある種類株主総会で選任された取締役に不正行為等がある場合にまで、他の種類の株主は、当該取締役の解任を訴えをもって請求することができない。これは不合理であり、立法的な手当てが必要である。また、定款による株式の譲渡制限の制度については、会社法の下でもなお定款自治の範囲が明らかでない事項が存在することが明らかとなった。たとえば、譲渡を承認する機関について、文言上は単に「別段の定め」を許容するにとどまっているが(139条1項但書)、会社の意思決定機関でないまったくの第三者に決定させることも許容されるかは明らかでない。会社法が定款自治を認めた理由に照らし、解釈により合理的な限定を設ける必要がある。昨年度までは、全株式譲渡制限会社を対象とし、機関関係の問題および株式関係の問題を中心として考察を行ってきたが、本年度からは公開会社を対象とすることとし、特に本年度は公開会社の機関関係の問題について、主に次のような問題について考察した。第1に、公開会社である大会社は、現行法の下で、監査役会設置会社または委員会設置会社のいずれかの機関設計を選択することができ、平成14年改正は、これらの2つの機関設計の間で「制度間競争」が行われることを期待していた。

しかし委員会設置会社の制度は、よく練られた合理的な制度であるにもかかわらず、その利用は思うように進んでいない。本研究では、その原因は何であり、法律によって制度の利用を促進できるのであれば、必要な手当てをすべきではないかという問題について考察を行った。第2に、現在、次期会社法改正に向けた議論が進行中であり、その中では企業統治のあり方が見直しの対象とされている。特に一定の範囲の会社について社外取締役の設置を義務づけるべきではないか、および機関設計の選択肢を増やし、監査・監督委員会設置会社の制度を導入すべきではないか等の問題が議論されており、本研究では、これらの問題について考察を行った。平成17年制定の会社法は、全株式譲渡制限会社と公開会社とで、相当に異なった規律を採用しており、その違いの多くは、全株式譲渡制限会社について、公開会社には認められない定款自治を認めるという点に存する。そこで本研究は、大きくは全株式譲渡制限会社と公開会社とに区分をして検討を進めた。平成21年度および22年度は全株式譲渡制限会社の機関関係および株式関係の問題について、平成23年度および24年度は公開会社の機関関係および株式関係の問題について、それぞれ考察を行ったのに続き、本年度は、会社法制全体について、定款自治に不必要な制約が課せられていないか、逆に定款自治を広く認めすぎていないか等の問題を考察した。この考察においては、特に平成24年9月に法制審議会において次期会社法改正のための要綱がとりまとめられ、平成25年11月に法案が国会に提出されたことを受け、同改正において設けられる予定の新たな規律が、適切な範囲の定款自治を実現するものとなっているかという問題が重要である。たとえば、同改正により、機関関係に関する定款自治が拡大され、会社は、定款により、監査等委員会設置会社という新たな機関形態を選択することが可能となる見込みである。この機関形態は、業務執行担当者の意思決定権限が大きすぎないか等、定款自治の範囲を広く認めすぎているのではないかという問題、または既存の機関形態との均衡を欠いているのでないかという問題のあることが明らかとなった。もっとも、機関形態について定款自治の適切な範囲を判断するに当たっては、実務界にとって使いやすいかどうかという要素等も考慮せざるを得ず、その判断は容易でない。そこで本研究は、大きくは全株式譲渡制限会社と公開会社とに区分をして検討を進めている。平成21年度および22年度は全株式譲渡制限会社の機関関係および株式関係の問題について、平成23年度は公開会社の機関関係の問題について、それぞれ考察を行ってきたのに続き、本年度は、公開会社を対象に、株式・新株予約権関係の問題を中心として、主に次のような問題について考察した。種類株式制度に関しては、会社法の下で定款自治が推し進められた結果、定款自治の範囲が広すぎ、濫用的な利用がされるおそれのあることが明らかとなった。とりわけ、全部取得条項付種類株式の制度が少数株主の締出しの手段として利用されるようになっているところ、このような利用の仕方は制度導入時には想定されていなかったものであり、少数株主を害するおそれがある。
性器ヘルペスの長期ACV療法による,HSVの薬剤感受性変化及び耐性株の出現頻度

本研究は,耐性株高感度検出法を開発し,本邦におけるAcyclovir(ACV)導入以前の1970年代から現在までのHerpes simplex virus(HSV)臨床分離株を対象に薬剤耐性を量的・質的に検討し,さらに病変部でのウイルス量と耐性株の出現頻度からACV治療による耐性株出現の可能性を検討することを目的とした。その結果,本邦の1970年代から現在に至るまでの性器ヘルペス臨床分離株84株においては,年代によってもまたACVの急性期治療前後でも,ACV感受性,耐性株の出現頻度,phenotypeのパターンには変化が無いことがわかった。さらに1年から9年に渡る長期抑制療法によっても分離株のACV感受性,耐性株の出現頻度,Phenotypeのパターンは,未治療患者の分離株と変化が無いことが明らかとなった。耐性株高感度検出法を用いたことにより,耐性株は10^4PFUに数PFU存在することが明らかになり,再発病変中のウイルス量と耐性株の存在頻度という観点から見ると,ACV治療によっての耐性株発生の確率は非常に低いことが示唆された。このように,性器ヘルペス臨床分離株の耐性株の出現頻度を詳細に解析した本研究から,良く管理されたACV治療においては臨床上問題となるような耐性株の出現が無く,その可能性も非常に低いことが示唆された。
低温イオン注入による蜂の巣構造の形成-その機構の解明と微細構造形成法への応用

この研究の遂行によって得られた成果のその要点は次の通りである。(1)表面欠陥構造の照射量および基板温度依存性より,注入により導入されたフレンケル対の一部が再結合せず,表面欠陥構造を形成することを半定量的に明らかにした。(2)形成されたままのセル状構造は,非晶質である。フォトルミネッセンス測定を行った限りでは,この構造に特別な発光はみられない。(3)集束イオンビームを利用して,この現象を利用した新しい微細構造形成法が有望であることを実証した。(5)その他,セル状構造のイオン注入方位依存性,ZnOに関する異常挙動が検出された。なによりも貴重な成果は,基礎的な面と応用面にわたって今後にいくつかの新課、題を生み出したことである。そのひとつとして,これからの半導体点欠陥の研究に新しい手法を提供したことがある。これまで半導体,特に化合物半導体中の点欠陥についての確実な知見は乏しかった。しかし,セル状構造という見ることのできる構造の形成・成長を利用することによって,点欠陥の形成エネルギーや移動エネルギーなどの評価が可能になった。応用面においては,ナノ構造の作製が可能であることが示され,今後実際のデバイスの実現が課題となった。磁気デバイスとして垂直磁気記録デバイス,電子・光分野で発光デバイスの実現からレーザーへの展望が開けてきた。低温でイオン注入した化合物半導体GaSb表面に,特異な構造が形成される。無数の小さな穴が峰の巣のようにできる。穴の直径は500Å,深さ2500Å,穴を隔てる壁は50Å程度の厚さである。この現象は,材料科学的に新規性があるだけでなく,ナノテクノロジー分野での応用が期待できる。4つの具体的研究項目を設定し研究をすすめており,2003年度には以下の成果を得ている。(1)形成機構モデルの検証:本研究者らは,峰の巣構造の形成はイオン注入によって導入される原子空孔と格子間原子の低温での挙動の違いによるものと考えている。注入時の基板温度,注入且依存性を調べ,これを検証した。(2)蜂の巣構造の電子・光物性:極低温のフォトルミネッセンスを測定した。現在までのところ,新しい発光は観察されていない。これはおそらく注入によって結晶構造が破壊されアモルファス化しているためであろう。(3)微細構造形成法への応用:.FIBでウェーハ上にあらかじめ初期構造を作製し,その後イオン注入をおこなって,規則的な峰の巣構造を作製することを試みた。まず,室温FIB加工によって表面に最近接距離160nmで窪みを稠密に配列した。その後,130Kで4×10^<14>ions/cm^2注入した。結果をFE-SEM, AFMで評価した。初期の規則正しい配列は崩されていなかったが,しかし,構造の成長までは確認できなかった。この理由はFIB加工の際のイオンドーズ量が大きいことにあると判断された。そこで低ドーズ量のFIB照射で初期構造を作製し,低温イオン注入しFE-SEMで評価を試みたが,観察中のコンタミネイションのため,初期構造を見失った。今後AFMのみで評価することによってこれを避ける。(4)新物質の探索:これについては本年度は進展がないが,2004年度Geについて試みる予定である。低温でイオン注入した化合物半導体表面に,特異な欠陥構造が形成される.無数の小さな穴が蜂の巣のようにできる.穴の直径は50nm深さは250nmである.この現象について,2003年度より研究をすすめ,2004年度では以下の成果を得た.[微細構造の形成]FIBで初期構造を等間隔でスポットで配置した。使用したFIBの加速電圧は50keV、イオン種はGa^+である。FIBはMicrion 9500 FIBを用いた。間隔は最小50nmのものまで作製することができる。またドーズ量は10^<10>10^<15>ions/cm^2まで任意に制御できる。

初期構造を作製した後、FIB内で画像観察スキャン(室温で50 kV Gaイオンを一様に照射したことに相当する)し、スキャン前と比較した。そ初期構造をつくったときのドーズ量が1×10^<13> ions/cm^2以上のマトリックスについては、規則性はこわされず、像のコントラストから判断する限り、セル構造は深くなっているものと判断される。注入量が3×10^<12> ions/cm^2以下のものについては、初期構造そのものがまったく観察されず、スキャン後の表面モフォロジーは初期構造なしの領域と同様である。この結果は規則的な初期構造さえ与えられれば、その後室温のイオン注入でも規則的な表面セル構造が形成されることを示している。[新しい系の探索]FIBによる予備的実験により,GeおよびInAsに同様現象の生じる可能性を見出した.基板温度を変えたイオン注入を行って,GeにもGaSbと類似した現象の生じることを見出した.われわれの提唱したモデルでは構造形成は点欠陥の移動に支配されている。ならば点欠陥の量と移動度を変えたとき,構造とその成長は変化するはずいである。そこで,注入量を変えることによって点欠陥量を変え,サンプル温度を変えることによって移動度を変え,構造およびその成長にどのように影響を与えるのか調べた。セル状構造の深さは注入量増加(すなわち点欠陥量の増加)とともに大きくなり,その形状は基板温度(点欠陥特に原子空孔の移動度)の変化により強く影響を受けている。注目すべき新しい知見として,セル状構造の初期構造がボイド形成であること,非晶質化とともにその深さ方向への急激な成長が生じることがあげられる。以上の実験結果より,形成モデルを改良した。この自己組織化的挙動を,ナノファブリケイションに応用することを図った。形成するナノ構造に規則性を与えるために,次のような工程を考えた。まず,規則的初期構造を与え(トップダウン),それを成長させる(ボトムアップ)。実験室的手法としてFIBを利用した工程を考えた。FIB照射によってまずボイドを規則的に配列する。その後温度を制御したイオン照射によって構造を発達させる。3通りの試みを行った。最初の例は初期構造の配列を一定間隔にして,ドーズ量を変えたものである。次の例は,ドーズ量一定にして,間隔を変えたものである。以上は,初期構造作製,構造の発達,いずれの工程も室温で行っている。最後の例は室温で初期構造をつくり,それを低温で発達させたものである。これらの試行より以下の結論を得た。(1)間隔100nm以上の規則的セル構造が形成できる。(2)30kVGa^+を使って初期構造をつくる場合,1スポットあたりのイオン量は10^5イオン以上が必要である。(3)2次構造の形成により,規則構造が壊される。(4)基板温度は重要なパラメータである。
ユビキチン化を介したキチンシグナル伝達制御機構の解析

本研究課題では、我々が同定したシロイヌナズナキチン受容体CERK1と相互作用するユビキチンリガーゼPUB4のキチンシグナル伝達における機能を明らかとすることを目指している。昨年度までの研究でpub4変異体においてキチン未処理の状態から、野生型と比べサリチル酸が高蓄積していることが示された。そこで、サリチル酸合成遺伝子の変異体との二重変異体を作出した。この二重変異体においてpub4単独変異体で見られたサリチル酸の蓄積の有無について検討、サリチル酸の異常な蓄積が消失したことを確認した。次に、この二重変異体に対してキチン処理、各種防御応答指標を評価した結果、これまでpub4単独変異体で見られていた、MAPK活性化や防御応答関連遺伝子の発現誘導の亢進がサリチル酸の高蓄積によるものであると示された。一方で、活性酸素生成の低下は二重変異体でも維持され、PUB4がキチンシグナル伝達の正の制御因子であることが明確となった。また、PUB4のCERK1によるリン酸化を介した活性化機構に関してはPUB4リン酸化部位変異型リコンビナントタンパク質を調製、in vitroユビキチン化解析を行った。その結果、PUB4がリン酸化によって活性化することを強く示唆する結果を得た。PUB4のユビキチン化ターゲット候補として解析してきたPUB4 interacting protein1(PIP1)に関してはPUB4とPIP1/2/3の重複変異体を作出し、応答解析を進めたが、この方法で関連性を示すことは困難であった。またin vitroユビキチン化解析においてもPIP1へのPUB4からのユビキチン化は検出もできなかった。このことからPUB4はPIP1を直接ユビキチン化するのではなく、これら分子間に更なる因子が存在する可能性が考えられた。当初の研究実施計画に基づき研究を進め、おおむね期待どおりの結果を得ている。これまでのpub4変異体を用いた機能評価では解釈の難しかった、キチンシグナル伝達におけるPUB4の機能は、サリチル酸合成遺伝子との重複変異体を用いた解析を行い、PUB4がキチンシグナル伝達の正の制御因子であることを示すことができた。また、PUB4のリン酸化部位を変異させたタンパク質を調製できたことで、PUB4がCERK1によるリン酸化によって活性化することが、さらに強く示唆された。PUB4のユビキチン化ターゲットに関しては、当初想定した因子(PIP1)を直接ユビキチン化しないことが示された。しかし、周辺の知見からPUB4とPIP1の間に存在すると考えられる候補因子をすでに見出しており、この因子の解析の準備が進んでいる。また、網羅的な解析に向けた準備も進行しており、シロイヌナズナ中のユビキチン化タンパク質を免疫沈降によって精製する手法の確立が行えた。PUB4の機能が明確になったことから、これについて論文として報告する。すでに原稿執筆を進めており、早期の発表を目指す。これに加え、研究の過程で構築した実験系に関する論文の公表も進める。また、PUB4のCERK1からのリン酸化を介した活性化メカニズムに関しては、結果が蓄積してきている。今後はより明確に結果を示すために、CERK1とPUB4共存下の実験ではなく、リン酸化したPUB4を精製、この後に評価を進めたい。PUB4ユビキチン化ターゲット候補は、当初とは異なる分子にシフトしている。しかし、すでにリソースから変異体を入手、相補個体の作出も進めている。また、in vitro実験の為のコンストラクトづくりの進めており、これまでの蓄積を踏まえ、解析を進める。さらに、網羅的な解析の為の準備もほぼ完了している。今年度前半には候補を得て、解析を進める。本研究課題では我々が同定したシロイヌナズナキチン受容体CERK1の相互作用因子であるPUB4のキチンシグナル伝達における役割を明らかとすることを目指している。これまでの研究で、PUB4変異体では内在のサリチル酸の増大が示唆されており、これが防御応答解析に影響を与えている可能性が考えられてきた。そこで本年度はまず、PUB4変異体における内在サリチル酸を定量した。その結果、PUB4変異体では野生型に比べて優位にサリチル酸が高蓄積していることが示された。そこで、既知のSA代謝系の変異体および過剰発現体とPUB4変異体の重複変異体の作出を掛け合わせにて試みた。これまでの所、両遺伝子がホモに挿入されていると考えられる個体を得るに至っている。また、PUB4はCERK1からのリン酸化によって活性が制御されることが示唆されていた。そこで、本年度は大腸菌発現系で調製したPUB4タンパク質を用い、in vitroユビキチン化アッセイ系の構築を試みた。まず小麦胚芽抽出物を用いた実験系によって、活性型のPUB4の精製が確認された。次に、各種リコンビナント精製タンパク質を用いた実験系を構築するにあたり、PUBに適したE2酵素を探索し、2つの市販のリコンビナントE2を決定した。また、リン酸化部位変異型PUB4タンパク質調製の為の発現ベクターを構築した。事前の検討からPUB4のユビキチン化ターゲット候補として、CERK1およびPUB4 interacting protein1(PIP1)が挙げられた。そこで、このPIP1とホモログの三重変異体を用い、キチン応答解析を行った結果、PUB4変異体と同様の表現型を示した。このことはPIP1がPUB4の直下で機能することを強く示唆している。

この結果を踏まえ、PUB4とPIP1/2/3の重複変異体を得るために、掛け合わせを行い、スクリーニングを進めた。当初の研究実施計画に基づき研究を進め、おおむね期待どおりの結果を得ている。これまでのPUB4変異体の機能評価では変異体におけるサリチル酸の蓄積が影響をしている可能性が示唆されていたが、本年度、このサリチル酸の蓄積を明らかとし、次年度の解析に必要となる重複変異体を得ることができた。これまでの研究で、クルードなユビキチン化アッセイ系を用いた時にPUB4がCERK1からリン酸化を受け活性が制御されると示唆されてきた。これを明確に示すにはリコンビナント精製タンパク質を用いたin vitroユビキチン化アッセイ系が必須であり、本年度の研究でこの実験系が構築できたことから、CERK1によるリン酸化の機能評価が加速することが期待される。PUB4は何かしらの因子をユビキチン化し、シグナル伝達を制御すると考えられる。先行研究において、PUB4と相互作用する分子が得られていたが、本年度はこの因子の変異体を用いた解析からこの因子がPUB4直下で機能することが強く示唆する結果を得ることができた。本研究課題では、我々が同定したシロイヌナズナキチン受容体CERK1と相互作用するユビキチンリガーゼPUB4のキチンシグナル伝達における機能を明らかとすることを目指している。昨年度までの研究でpub4変異体においてキチン未処理の状態から、野生型と比べサリチル酸が高蓄積していることが示された。そこで、サリチル酸合成遺伝子の変異体との二重変異体を作出した。この二重変異体においてpub4単独変異体で見られたサリチル酸の蓄積の有無について検討、サリチル酸の異常な蓄積が消失したことを確認した。次に、この二重変異体に対してキチン処理、各種防御応答指標を評価した結果、これまでpub4単独変異体で見られていた、MAPK活性化や防御応答関連遺伝子の発現誘導の亢進がサリチル酸の高蓄積によるものであると示された。一方で、活性酸素生成の低下は二重変異体でも維持され、PUB4がキチンシグナル伝達の正の制御因子であることが明確となった。また、PUB4のCERK1によるリン酸化を介した活性化機構に関してはPUB4リン酸化部位変異型リコンビナントタンパク質を調製、in vitroユビキチン化解析を行った。その結果、PUB4がリン酸化によって活性化することを強く示唆する結果を得た。PUB4のユビキチン化ターゲット候補として解析してきたPUB4 interacting protein1(PIP1)に関してはPUB4とPIP1/2/3の重複変異体を作出し、応答解析を進めたが、この方法で関連性を示すことは困難であった。またin vitroユビキチン化解析においてもPIP1へのPUB4からのユビキチン化は検出もできなかった。このことからPUB4はPIP1を直接ユビキチン化するのではなく、これら分子間に更なる因子が存在する可能性が考えられた。これまでのpub
発生とがんの進展に重要なWntシグナルに関連する蛋白Dapleの機能解析

1、遺伝子導入によるDaple蛋白強制発現や、RNA干渉法による発現抑制を行い、Wnt5a刺激して活性化されるRhoファミリーGTPasesの活性状態を調べた。その結果、細胞の極性と移動をもたらすnon・canonical Wnt pathwayにおいて、DapleはRacを特異的に活性化することを証明した。さらに、DapleがDvl/aPKC複合体形成を促すことを示し、未だ解明されていないnon-cannonical Wnt pathwayのRac活性化機構を説明しうる発見となった。2、Daple蛋白強制発現とRNA干渉法による発現抑制を行い、Dapleがもたらす細胞機能を評価した。その結果、DapleはRac活性化による膜状仮足(ラメリポディア)の形成と細胞移動を制御していることを明らかにした。3、昨年度までに作製したDaple遺伝子プロモーター下流におけるLacZ遺伝子ノックインマウスを用いて、Dapleの欠損による個体の構造異常や機能異常を解析した。Daple欠損マウスは生後成長遅延が認められた。また、皮膚の創傷治癒に関与していることを示した。Dapleは、アクチン細胞骨格と結合し癌細胞の移動に重要な蛋白Girdinのファミリー分子である(Ann NY Acad Sci 2006)。DapleはWntシグナル関連分子Dishevelled(DVL)と結合しβ-catenin経路を抑制するとして報告された(Genes cells 2003)が、その詳細な機能は分かっていない。本研究の目的は、個体発生・細胞分化およびがん細胞の増殖・運動におけるDapleの機能を解明することである。1.細胞内におけるDaple蛋白の機能解明に向けて、まずDapleと結合する蛋白を検索した。Dual system社のdual hunter酵母two-hybrid法によりマウス脳cDNAライブラリーから、細胞質内結合蛋白をスクリーニングした。スクリーニングで得られたWntシグナル関連分子群、細胞骨格関連分子群の中から、免疫沈降法によりDapleと結合する蛋白を3つ同定した。現在、これらの分子がもたらすWntシグナル、細胞骨格制御にDapleがどう機能するのか、Daple強制発現とRAN干渉法によるDaple発現抑制にて検討中である。2.Dapleの個体発生における機能を明らかにするため、マウス発生過程におけるDapleの発現部位を検索した。P7、P35 Wild-typeマウスの各臓器の蛋白溶解液を採取し、Western blot法によりDaple蛋白の発現を比較したところ、P7マウスではほとんどの臓器にDapleの発現が見られ、P35マウスでは脳での発現が特異的に認められた。このことから、Dapleはマウス個体発生の初期と生後脳の発達に重要であると考えられる。また、Daple欠損マウスの発生異常を調べるため、現在ノックアウトマウスを戻し交配させて作成している。DapleはWntシグナル関連分子Dishevelled(DVL)と結合しWnt/β-catenin経路を抑制するとして報告された(Genes cells 2003)が、その詳細な分子機構やWntシグナルのその他の経路での機能は分かっていない。癌の進展をもたらすWntシグナルの分子機構と、個体発生でのDapleの役割を調べるため、以下の2点を行っている。1).まず癌の進展をもたらすWntシグナルの重要な経路として、RhoファミリーGTPasesが活性化されるPCP経路に着目した。遺伝子導入によるDaple蛋白強制発現と、RNA干渉法による発現抑制を行い、RhoファミリーGTPasesの活性に与えるDapleの影響を調べた。その結果、Dapleの発現によりRhoファミリーGTPases(Rho,Rac,Cdc42)の中でも、細胞の極性と移動をもたらすRacを特異的に活性化することが明らかになった。さらに、DapleによるRacの活性化はWntシグナル関連分子Dvlを経由した活性であり、未だ解明されていないWnt-PCP経路のRac活性化機構を説明しうる発見となった。2).Dapleの個体発生における機能を明らかにするため、マウス発生過程におけるDapleの発現部位を検索した。胎生期、新生仔期、成獣期のマウス組織切片をDaple抗体にて免疫染色行ったところ、組織特異的な発現が認められた。また、Daple遺伝子プロモーター下流におけるLacZ遺伝子ノックインマウスを用いてLacZ染色を行い、Daple抗体による染色像と差異がないことを確認した。また、Daple欠損マウスの発生異常を調べるため、現在ノックアウトマウスを解析中である。
超難水溶性薬物の製剤化を実現する薬物非晶質ナノ懸濁液の創製

本研究では、顕微鏡法及び分光法の応用測定を用いて、非晶質ナノ粒子の構造・分子状態を精密に評価すること目的としている。本年度は、難水溶性薬物glibenclamide(GLB)及び添加剤hypromellose(HPMC)を用いて、anti-solvent法により得られる非晶質ナノ粒子について検討を行った。Anti-solvent法により2種の方法で非晶質ナノ粒子を調製した。調製法Aでは、GLBを溶解させたDMSO溶液をHPMC水溶液に対して注入し、nano-A懸濁液を得た。調製法Bでは、GLB及びHPMCを共に溶解させたDMSO溶液を蒸留水に対し注入し、nano-B懸濁液を得た。Nano-A及びnano-B懸濁液について超遠心処理を行い、得られた沈殿の凍結乾燥試料をそれぞれnano-A及びnano-Bとした。Cryo-TEM及び固体NMR測定の結果、nano-A及びnano-Bは共に平均粒子径約100 nmの非晶質ナノ粒子を形成していることが明らかとなった。STEM-EDX測定の結果より、nano-A及びnano-Bの形態はそれぞれ球形の中空粒子と非球形の中実粒子と大きく異なった。さらに、DSC測定及び溶液NMR測定の結果、得られた2種類の粒子中のGLBとHPMCの相溶性は大きく異なっており、これがナノ粒子中のGLB非晶質の保存安定性に大きく寄与していることを見出した。上記で明らかとしたナノ粒子の構造と分子状態より、各ナノ粒子の調製メカニズムについて考察した。そして、ナノ粒子形成時の溶媒粘度が得られるナノ粒子の構造及び分子状態に大きく影響することを明らかとした。これまでに非晶質ナノ粒子の構造・分子状態及びその形成メカニズムについて検討した報告は数えるのみである。本研究で得られた知見は、今後の発展が期待されている高品質の薬物非晶質ナノ粒子製剤創生の一助になると期待される。本年度の目標であった、anti-solvent法による非晶質ナノ粒子の調製及びTEM(Cryo-TEMとSTEM-EDX)及びNMRによる構造・分子状態の評価を達成できた。来年度は、非晶質ナノ懸濁液についての検討を予定している。懸濁液中のナノ粒子の構造と分子状態をダイレクトに評価するため、本年度よりも検討が試料の調製と評価が難しくなることが予想される。調製法として湿式粉砕を用い、懸濁液中でより安定な非晶質ナノ粒子を形成する組成を選択することで、濃厚な薬物濃度の懸濁液を調製し、解析を行う予定である。
肝硬変腹水病態への腹腔マクロファージと反応性中皮細胞の関与

肝硬変腹水中における主要な細胞成分である腹腔マクロファージと反応性中皮細胞の共培養上清において,強力な血管透過性因子であり腹水の難治化への関与が報告されているVEGF-Aの産生が腹腔マクロファージ単独培養の上清に比して著明に亢進すること,また,腹腔マクロファージと反応性中皮細胞の混在する比率によって,腹腔内の環境に大きな影響を与える炎症性サイトカインのプロファイルが変化することが示唆された.肝硬変腹水中における主要な細胞成分である腹腔マクロファージと反応性中皮細胞の共培養上清において,強力な血管透過性因子であり腹水の難治化への関与が報告されているVEGF-Aの産生が腹腔マクロファージ単独培養の上清に比して著明に亢進すること,また,腹腔マクロファージと反応性中皮細胞の混在する比率によって,腹腔内の環境に大きな影響を与える炎症性サイトカインのプロファイルが変化することが示唆された.肝硬変腹水病態と、その腹水中に認められる腹腔マクロファージおよび中皮細胞の出現様式との関連を解析するために、当該細胞を免疫標識し、フローサイトメトリーにより分離する方法について検討した。肝硬変患者から採取した腹水400mlの穿刺排液を直ちに遠心し、沈渣を回収した。回収した細胞成分をBSA-PBSで洗浄後、調整検体とし、標識抗体としてFITC標識抗サイトケラチン抗体、PE標識抗CD14抗体およびPreCP標識抗CD45抗体を用いフローサイトメトリーを施行した。その結果、中皮細胞の特徴であるサイトケラチン強陽性細胞はCD45強陽性細胞およびCD14強陽性細胞とそれぞれ独立した分布を示し、本法における標識抗体の組み合わせを用いて、中皮細胞がマクロファージ、顆粒球やリンパ球と異なる分布を示す独立した細胞集団であることが示唆された。ただし、フローサイトメトリーでカウントされた全細胞数に対するサイトケラチン陽性細胞の割合(陽性率)は0.020.76%に過ぎず、文献にて報告されている腹膜透析排液における陽性率(6.75%)に比しても低く、肝硬変腹水検体から中皮細胞をフローサイトメトリーを用いて、さらなる解析を行うことは困難であることが予想される。一方、CD14+/CD45+を示すマクロファージも本法において独立した分布を示す細胞群として捉えられ、その陽性率も1.1724.45%を示した。今後、マクロファージのソーティングを含めたフローサイトメトリーによる追加解析と従来からのマクロファージ分離・培養法によって得られる知見とを比較検討し、本研究において肝硬変腹水の病態と腹水中のマクロファージとの関連の解析を展開する予定である。当施設における医の倫理委員会の承認を得た実施計画に基づいて肝硬変患者から無菌的に腹水を採取し、遠心後その沈渣を回収した。回収した沈渣中の有核細胞成分の90%以上が生細胞であることをトリパンブルー染色により確認し、1)単核球・リンパ球分離用試薬を用いて分取した単核球成分からなる細胞群と、2)赤血球成分のみ取り除いた細胞群に分け、コートされていないプラスチックディッシュ上で培養し、付着細胞のみを回収した。単核球成分からの付着細胞群は免疫染色でCD14陽性・サイトケラチン陰性を示すマクロファージであることが示され、単核球分離を経ずに得られた付着細胞群はマクロファージのみならずCD14陰性・サイトケラチン陽性の中皮細胞も混じていることが示された。このマクロファージ単独群およびマクロファージ・中皮細胞混在群を1)無添加、2) LPS添加、3) IFN-γ添加後24時間培養し、その上清中の総窒素酸化物およびVEGFをELISAにて定量した。その結果、1)マクロファージ単独群に比してマクロファージ・中皮細胞混在群でVEGFが著明に高値を示したが、総窒素酸化物は両群に有意差を認めなかった。2)両群とも総窒素酸化物はLPS刺激およびIFN-γ刺激により上昇を認めたが、VEGFはこれらの刺激による変化は認められなかった。以上の結果から、VEGFはマクロファージと中皮細胞が相互作用してその産生が亢進し、それがNOに関与しない機序で起こる可能性が示唆された。来年度の本研究において、1)磁気細胞分離システムを用いてマクロファージおよび中皮細胞のより純化した分離を行い上記の結果を確認し、2)さらに症例数を増やして腹水の背景となる因子とVEGF/NOの関連を明らかにするとともに、3) NO関連遺伝子およびVEGF遺伝子発現解析を加えて、腹腔マクロファージと中皮細胞の相互作用について検討を重ねる予定である。回収した沈渣中の有核細胞成分の90%以上が生細胞であることをトリパンブルー染色により確認し、コートされていないプラスチックディッシュ上で(1)10%FBS添加M199培地および、(2)マクロファージ・単球用無血清培地で培養し付着細胞のみを継代した。両群の培養細胞を回収し、フローサイトメトリーで解析したところ、腹膜中皮細胞と考えられるサイトケラチン陽性細胞の割合は(1)で9.8%、(2)で27、5%であった。

また、上記(1)(2)の培養系にLPSもしくはIFN-γ添加し20時間後の培養上清中の炎症性および抗炎症サイトカインをマルチプルプロテインアレイで定量した。その結果、LPSおよびIFN-γ添加による培養上清中のIL-6およびIL-8の上昇には(1)(2)の培養系の間に差異を認めなかったが(1)では検出されなかったTNF-αとIL-10の上昇が(2)で認められた。以上より、肝硬変腹水から分離された付着性細胞群における腹膜中皮細胞の占有率の増加と炎症性サイトカインであるTNF-αとそのカウンターバランスを担うと考えられる抗炎症性サイトカインであるIL-10の上昇との関連が示唆され,腹膜中皮細胞と腹腔マクロファージが相互作用して炎症性・抗炎症性サイトカイン産生のプロファイルに影響する可能性が示された。
第三共和政前期のパリにおける同郷集団と選挙についての実証的研究

本研究は、19世紀後半から20世紀初頭にかけてパリでおこなわれた国政および地方選挙において、地方出身者の集団がいかなる役割を果たしたのかを調査したものである。その結果、地方出身でありながら選挙を通じて市政や国政に進む者は多かったが、彼らが選挙において同郷会の積極的な支持を得ることは少なかったことが判明した。これは、地方出身者がパリ社会に統合されていたという近年の見解を確認するものであり、同時に、地方出身議員の経歴や支持層について、新たな疑問を導き出すものでもある。昨年度は、研究課題に関連する先行研究を歴史学のほか社会学なども含めて把握し、そのうえで、パリ警視庁文書館およびフランス国立図書館で史料収集をおこなった。このとき収集した史料は、第三共和政前期(1870ー1914年)にパリ第5区・11区・14区でおこなわれた選挙のポスター・ビラ類、警察による選挙運動監視報告、および諸同郷会が刊行する新聞・会報類であった。本年度は、昨年度に引きつづき関連分野の研究書を閲覧して先行研究を整理したほか、いくつかの新聞をオンライン上で閲覧した。ただ、同郷会の選挙への関与が史料からはさほど浮かび上がってこなかった。理由として、サンプルにした地域が不十分であった可能性がある。この点については、本年度に史料調査をおこない対象地域を広げることで確認する予定であったが、史料調査は来年度に実施することになった。もうひとつ、そもそも同郷会の政治活動が活発ではなかった可能性もある。この場合、先行研究で取り上げられたオーヴェルニュ出身者やリムーザン出身者の事例がむしろ例外的だったということになる。ただ、地方出身者がパリで市議会議員に当選し、そののち国政に転出した事例が多いことはたしかである。同郷会が選挙にさほど関与しなかったとすれば、議員はパリ選挙区の利害を代表する議員として国政に関わったこと、一方、同郷会はもっぱら親睦・互助活動をおもな目的にしていたことが想定できる。これらの点を、最終年度である次年度に明らかにする。本研究は、第三共和政前期(1870-1914年)にパリでおこなわれた国政および地方選挙において、同郷集団がいかなる役割を果たしたのかを研究するものである。用いた史料は、パリ第5区・11区・14区でおこなわれた下院議員選挙および市議会議員選挙のポスター・ビラ類、警察による選挙運動監視報告、および諸同郷会が刊行する新聞・会報類である。最終年度でもある本年度は、これまで収集・閲覧した文献および史料を分析し、研究のとりまとめに向けて作業を進めた。現在のところ、同郷会の選挙への関与は総体的に弱かったという結論に至っている。具体例にした区は地方出身者の集住が比較的目立った地区であるため、サンプルの問題とは考えにくく、同郷会の政治活動そのものが活発ではなかった可能性が高い。その一方で、地方出身者がパリで市議会議員に当選し、そののち国政に転出する事例が多かったことも判明している。この点で、同郷会が地方すなわち議員の出身地と国政とを結ぶネットワークとして機能していた可能性を当初は想定していた。しかし、同郷会の政治活動が低調だったことから、このような可能性は否定されることになる。つまるところ、議員はもっぱらパリ選挙区の利害を代表する存在として国政に関わっていたのである。他方で、研究代表者がこれまでおこなった研究によれば、同郷会の活動は経済的な互助が中心であり、言語的・文化的な活動は重視されていなかった。本研究課題からの知見と併せれば、同郷会の活動はほぼ経済面に限定されていたことになる。19・20世紀転換期のフランスでは地域文化が称揚されるが、それは都市社会の現実とはかなり異なるものであったと言える。本年度の研究実績は二つに大別できる。第一に、研究課題に関連する先行研究を分析したこと、第二に、現地図書館・文書館での資料収集をおこなったことである。第一の点については、歴史学のほか社会学など隣接諸分野の研究も収集・閲覧し、それを通じて研究の視座の妥当性を確認した。第二の点については、平成23年7月下旬から8月中旬にかけて、フランス・パリで実施した。まずパリ警視庁文書館では、第三共和政前期(1870ー1914年)にパリ第5区・11区・14区でおこなわれた選挙について、候補者のポスター・ビラ類、および警察による選挙運動監視報告を閲覧した。ついでフランス国立図書館では、さまざまな同郷会が刊行する新聞・会報類を調査した。この第一回目の資料調査は、十分な量の資料を発見できなかったという点で、今後に課題を残すものとなった。パリ警視庁文書館の選挙関連資料はBA系列に体系的に保存されているが、同郷会に関するものは、当初想定していた以上に少なかった。他の資料からは同郷会の活動自体が決して低調ではなかったことが示唆されているので、資料の残存の問題である可能性が高い。

他方、フランス国立図書館で調査した定期刊行物については、同図書館での保存状態が良くないため、閲覧申請の大半が謝絶された。このような課題はあるにしても、研究の問題設定と方向性には大きな問題はないと考えられること、今年度の調査サンプルがパリ全20区のうち3区のみと限られていたことから、24年度は対象となる地区を広げる方向で研究を進める計画である。「研究実績の概要」でも述べた通り、現時点では史料調査の結果が量的にみてやや少なく、この点の改善が望まれる。前回の調査が地域的にかなり限定されたものであったため、25年度の夏期に、同様の史料について地理的範囲を広げて調査をおこなうことで、目的を達成できると考えられる。上の「研究実績の概要」でも述べた通り、現地での資料調査の成果は、これまでのところ量的にはやや少ない。ただし、この問題は調査対象地区を広げることである程度まで解決できるものであり、残る2度の現地調査でそれを達成できるものと考えられる。この点を除けば研究は計画通りに進められている。上記「研究実績の概要」および「現在までの達成度」にも記した通り、研究の方向性そのものは妥当であると考えられる。次年度は、これまで同様の史料について、地理的な範囲を広げて調査をおこない、それを分析することで目的を達成できると考えられる。上記「研究実績の概要」および「現在までの達成度」にも記したとおり、研究の方向性はこれまで通りで妥当であると考えられる。現地での資料調査の範囲については、対象地区を広げて資料を量的に増やす必要がある。25年度への繰越額の発生は、第2回目の史料調査を24年度に実施しなかったことが主な理由である。この史料調査は25年度夏の早い段階に実施する。繰越額については、その際の旅費に充てる予定である。(1)24年度への繰り越し額の発生は、23年度夏に収集した資料の分析に時間を要したことがおもな理由である。(2)23年度中に実施する予定であった第2回資料調査は、24年度夏期に実施する。繰越額については、その際の出張旅費に充てる。また、24年度冬期には第3回の資料調査をおこなう予定である。その出張旅費は24年度請求分を充てる。
Belle実験におけるB中間子希崩壊の研究

現在、高エネルギー加速器研究機構においてはB-ファクトリー加速器、KEKB、とBelle実験装置が順調に稼動し、このタイプの電子・陽電子ビーム衝突型加速器としては世界最高の性能を実現している。これに伴い、Belle実験はこれまでに最大のB中間子崩壊のデータを収集した。現在、このデータの解析を精力的に行い、多くの学術論文として発表してきた。Belle実験においては、高い頻度でビーム衝突が繰り返され、膨大な粒子反応が観測される。このうちから、興味ある事象のみを効率よく選び出し記録することが実験の成功の鍵を握る。現在、KEKB加速器の性能は当初の計画値を超えて優れた性能を発揮して折り、これに対応してBelle実験のデータ収集効率を改善する必要に迫られている。Stamen氏はグループの他のメンバーと共同してBelle実験のイベントトリガーシステムの改善を試み、データ収集能力を飛躍的に向上させた。一方、物理解析においては、B中間子崩壊のうち、K中間子とパイ中間子のみを終状態に含む崩壊反応を詳細に分析し、これらの反応におけるCP対称性の破れと、他の反応で観測されているB中間子崩壊におけるCP対称性の破れとの比較検討を行い、標準理論を越えるような現象の存在の有無を研究している。
社会的学習における適応的道具箱アプローチ

これまでに経験したことがない新しい問題に直面したとき、人はしばしば他者からアドバイスを受ける正しい解を得ようとする。こうした、社会的な情報に基づく意思決定(社会学習とも呼ばれる)において、人々が用いる戦略として、多数派同調戦略とベスト・メンバー戦略がある。本研究の目的は、環境構造に応じて人々が適応的に2つの戦略を使い分けていることを実証する事にある。本年度は、2つの実験と1つのコンピュータ・シミュレーション研究を実施した。コンピュータ・シミュレーション研究を通じて、本研究の出発点となったKamedaとその同僚による一連の理論研究では、重要なパラメータ領域が恣意的に制約されていたこと、また、そのために「ほぼ全ての状況において多数派同調戦略がベスト・メンバー戦略の成績を凌駕する」というKamedaらの主張には重大な瑕疵があることが明らかとなった。1つの実験研究では、本年度に実施したコンピュータ・シミュレーション研究の前提の妥当性を検証した。また、もう1つの実験研究では、場面想定法を用いて、人々の判断の相関が高い場面では、多数派よりも少数の有能な専門家の意見に影響されやすいとする仮説を検証した。