hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
根圏の塩類動態制御による砂漠化進行地域の高持続性型畑作管理技術

半乾燥地の黄河上流域(甘粛,中国)に実験圃場を設置し,また日本における室内実験を併用して,二種類の塩類化土壌の改良技術,すなわち灌漑畑地の塩類化プロットから塩類を除去する有効な技術として著者によって提案されたPSW-Well法と,土壌からの塩類吸収能力が高い作物(クリーニングクロップ)の栽培に基づく生物学的改良法,についての実験を行った.その結果,両方法が有効に機能するための必要条件が示された:(1)PSW-Well法は,流域内の帯水層系が均質で,宙水面が発達しないことが有効に機能するための必要条件である.(2)クリーニングクロップは,塩類をよく吸収するだけでなく,水要求度が低いことが必要である.半乾燥地の黄河上流域(甘粛,中国)に実験圃場を設置し,また日本における室内実験を併用して,二種類の塩類化土壌の改良技術,すなわち灌漑畑地の塩類化プロットから塩類を除去する有効な技術として著者によって提案されたPSW-Well法と,土壌からの塩類吸収能力が高い作物(クリーニングクロップ)の栽培に基づく生物学的改良法,についての実験を行った.その結果,両方法が有効に機能するための必要条件が示された:(1)PSW-Well法は,流域内の帯水層系が均質で,宙水面が発達しないことが有効に機能するための必要条件である.(2)クリーニングクロップは,塩類をよく吸収するだけでなく,水要求度が低いことが必要である.中国科学院寒区旱区環境工程研究所の協力を得て,中国甘粛省白銀市靖遠県平堡郷に灌漑実験圃場を開設した.圃場内には気象観測露場を設け,高さ6メートルの観測ポールを立て,蒸発散量を評価するための必要最小限のシステムを構築した.また,圃場内には土壌水分と土壌電気伝導度を測定するために10本のTDRを埋設し,さらに地下水汲み上げ用と地下水位測定用の井戸も掘削した.太陽電池を電源として,2007年9月末より自記観測を開始し,2008年2月に第1回のデータ吸い上げを行った.現在,そのデータの解析を進めている.また,現地における作物栽培予備実験も行ったが,既に秋が深まっており,満足できる結果は得られなかった.同時に,現地の土壌の物理性に関する実験を行い,さらに土壌・地下水の塩類化・ソーダ質化の実態調査を行った.また,現地で栽培されている作物に含まれる塩類の分析を行い,平成20年度の実験に用いる作物種の選別を行い,トウモロコシ,コムギ,ヒマワリを栽培することにした.一方,九大構内において,大型ポット実験システムを構築し,土壌組成と断面内の塩類挙動の関係,および作物種と土壌断面内の各種イオン分布の関係等について予備的実験を行った.こちらでも,季節的な原因により,栽培実験については十分な結果は得られなかったが,実験システムそのものは満足できる性能を持つことが確認された.平成20年度は本実験の年と位置づけ,4月下旬の現地での播種を目指して準備を進めている.現地実験と室内実験を実施した.中国甘粛省白銀市の平堡郷に設置した実験圃場においてトウモロコシとヒマワリを栽培し,その間に5回の地下水揚水実験を行った.汲み上げられた水のECを10分間隔で測定した結果,地下水は塩分に関して成層構造を成していること;深層地下水のECは作物の生長とともに上昇し,収穫後に低下する季節変化を示すこと,などが明らかになった.またナトリウム/カルシウム比は,灌漑水である黄河水よりも地下水の方が圧倒的に大きいことも明らかになった.これらの結果から,地下水の塩類化をもたらすのは土壌表面における蒸発と作物の蒸散であり,マクロポア流が塩水の地下水層への輸送に大きな役割を果たしていること;根域における炭酸ガス濃度が大気中よりも大きいことがCaCO^3の析出をもたらし,地下水のソーダ質化に寄与すること,などが導かれた.土壌中の可溶塩類量を表す指数であるEC_eと筆者らが提案した容易に測定可能なEC_<SAT>の比較実験を,実験圃場の塩類化土壌を用いて行った.現地の土壌溶液と実験室で得られる飽和抽出液は,特にCa^<2+>とSO_4^-の含有量に大きな違いが現れること;しかしTDSを表すECには大きな差異はなく,EC_<SAT>はEC_eの約1.1倍になることを明らかにした.一方,昨年に引き続き,国内で大型コラムおよびNFTベッドを用いて作物のイオン吸収実験を行った.その結果,作物の種類によってイオン吸収能は異なるが,地下水と土壌のソーダ質化の主役であるNa^+の吸収能に関しては,トウモロコシよりもヒマワリの方が高いことが明らかになった.中央アジアの乾燥盆地においては,地殻露出部の化学的風化により生成された可溶塩類が高山からの融雪水により流出し,活発な蒸発によってsalt panを形成する.それらが風食され飛散して堆積したのが黄土高原である.本調査・実験対象地域は,黄土高原を切開して流れる黄河流域にある.したがって灌漑水に含まれる塩類は黄土から溶出したものであり,灌漑農業を持続させるためには塩類の制御が重要な課題なる.灌漑水が豊富であれば,塩類を常に地下水に閉じ込めておくかあるいは河川に排水し希釈して海洋に放出することが現実的な方法と考えられる.しかし,黄河流域では淡水の需要が急増して下流まで河川流が届かない断流現象も起きている.

本年度は,灌概農業に変換したために黄土から多量の塩類が溶出し,それが下流部から塩水として湧き出る塩水泉に関する調査を実施した.海水よりもEC値の大きい(約60dS/m)塩水を湧出する泉が河川段丘の麓に無数存在し,それらを集水するために建設された排水路から漏れ出た塩水が周辺の作物栽培に被害を及ぼす実態を明らかにした.また,灌漑水による黄土からの塩類溶出だけでなく,灌概農業によって増える蒸発散に起因する畑地内での塩類集積の実態も明らかにした.乾燥地の灌漑農業にとって塩類化防止技術の発達は不可欠であり,本研究の継続および一層の発展が望まれる.
ミトコンドリア機能障害に対する細胞レベルでの新規生化学診断法の構築

ミトコンドリア病の一次的病因となりうるミトコンドリア機能傷害を患者組織由来の培養細胞レベルで検出しうる新規な生化学診断技術の創出を目指した。本研究にて確立された網羅的かつ体系的な機能診断技術は、多様なミトコンドリア機能(エネルギー代謝系、酸化ストレス、各種シグナル伝達、アポトーシスの制御)の全体像を分子・タンパク・オルガネラ・細胞レベルで解析可能とし、未知の変異に対する病原性の同定やミトコンドリア病の病態発生機構の解明などにおいて極めて有用であることが示唆された。本研究では、ミトコンドリア病の一次的要因となりうるミトコンドリア機能障害を患者組織由来の細胞レベルで検出しうる生化学的機能解析法を新規に創出することを目指し、細胞内エネルギー産生に関与するミトコンドリア電子伝達系、クエン酸回路、解糖系中の主要な酵素群に対する機能解析技術を構築した。市販の細胞株(HeLa細胞)およびHeLa細胞からの単離ミトコンドリアを用い、解析対象であるミトコンドリア呼吸鎖複合体I、II、III、IV、V、クエン酸合成酵素、ピルビン酸脱水素酵素の機能活性をミトコンドリア・細胞レベルで定量解析可能とした。また、単離ミトコンドリアを用い、他のミトコンドリア電子伝達系構成因子であるチトクロームc存在量の定量化、補酵素Q10の酸化還元状態の検出に成功した。さらに、Blue nativeゲル電気泳動の手法を用い、ミトコンドリア呼吸鎖複合体I、II、III、IV、Vの分子構造の検出手段を確立した。一方、ミトコンドリアはエネルギー産生のみならず、酸化ストレス、各種シグナル伝達、アポトーシスなどの制御を司っていることが知られている。本研究では、培養細胞を用いたミトコンドリア特異的な活性酸素種の検出、膜電位変化依存的なタンパク輸送能の解析、活性型カスパーゼ依存的なアポトーシス細胞死の検出にも成功しており、ミトコンドリア機能の多様性に対応した包括的生化学機能解析の方法論が確立できた。本研究成果から、患者より採取した生検材料(筋肉・皮膚組織)由来細胞および単離ミトコンドリアに対し、タンパク・ミトコンドリア・細胞レベルでの包括的生化学機能解析を導入することで、ミトコンドリア病における新規変異の病因性の検討や病態発生の機序の解明が期待できる。現在、従来の病理組織学的解析・分子遺伝学的解析のみでは確定診断に至らなかった患者群を対象とした生化学的機能解析を実施している。本研究では、ミトコンドリア病の一次的病因であるミトコンドリア機能傷害を患者組織由来の培養細胞レベルで検出しうる新規な機能診断技術の創出を目指した。ミトコンドリア電子伝達系構成因子群の機能・分子構造の解析、エネルギー代謝、酸化ストレス、タンパク輸送能の解析などミトコンドリア機能の多様性に対応した網羅的・体系的機能診断技術の方法論を確立した。これまでの病理組織学的・分子遺伝学的解析では確定診断に至らなかったミトコンドリア病患者群より採取した生検材料(筋肉・皮膚組織)から培養細胞株を樹立し、上述の網羅的・体系的機能診断技術を適用した。いくつかの代表的な結果を以下に示す。1、ミトコンドリアDNA上のtRNA遺伝子群中に新規に検出された種々の変異に対して分子レベルでの病原性を同定したと同時に、これらの変異により誘発されるミトコンドリア特異的なtRNA翻訳機構の異常を一次的病因とするミトコンドリア・細胞レベルでの病態発症機構の分子基盤をそれぞれ解明した。2、病理組織学的解析にてCOX欠損症と診断された患者群から、COX複合体特異的な機能・構造異常に起因するATP産生量低下、酸化ストレス上昇、細胞増殖能低下、アポトーシス惹起などの細胞生物学的・生化学的異常を呈する重篤な症例群を同定した。本結果は、同一疾患においても病態の発症機序や症状の重篤度に明確な差異が存在することを示唆している。本研究結果から、ミトコンドリア病患者由来組織より樹立した培養細胞に対する網羅的・体系的機能診断技術は、多様なミトコンドリア機能(エネルギー代謝、酸化ストレス、各種シグナル伝達、アポトーシスなどの制御)の全体像を分子・タンパクレベルで解析可能とし、新規変異の病原性の検討や病態の発生機序の解明などに極めて有用であることが示唆された。
ホウ素化コレステロールとナノキャリア高機能化による次世代中性子捕捉療法の構築

ホウ素化コレステロールの合成に成功し、次世代中性子捕捉療法のためのホウ素高集積化リポソームの開発に成功した。ホウ素クラスターカウンターカチオンに多価カチオン性のスペルミジニウムカチオンを用いた時に最も効率よくリポソームに内封されることを見出した。さらに、細胞内ホウ素クラスターの局在イメージングに、蛍光イメージング技術とラマン分光イメージング技術を確立した。また、腫瘍への高効率ホウ素デリバリーシステム構築のために、マレイミド結合型ホウ素クラスター(MID)の開発に成功し、MIDが生理条件下においてシステインだけでなくリジンにも結合することを見出した。1、ホウ素化コレステロールの開発とナノキャリア化:高い治療効果のためには、腫瘍内ホウ素濃度が30 ppm以上、腫瘍/血液内ホウ素濃度比が3以上を満たす薬剤の開発が目標となる。この条件を目的として、リポソーム二分子膜へのホウ素内封として、新たにホウ素化コレスレロールを開発し、リポソームを調製しナノキャリア化を検討した。2、ホウ素薬剤の可視化技術の開発:ホウ素薬剤が実際の腫瘍組織内にどのように分布しているか?細胞レベルで検証することが本治療効果の向上に必須である。そこで、26年度では、細胞レベルおよびin vivoでのホウ素コレステロール化蛍光標識の可視化技術の開発のために、クリック反応が可能なホウ素化コレスレロールの合成に成功した。3、ホウ素クラスターのカウンターカチオンの検討と高集積化:ホウ素イオンクラスターのカウンターカチオンを通常臨床に用いられているナトリウム塩から、多カチオン性ポリアミンに変えることで、リポソーム内封効率を向上させることに成功した。実際に、ナトリウム塩の場合、ホウ素リポソームは、ホウ素濃度で3000ppmが限界であったのに対し、スペルミジン塩を用いることで、14000ppmのホウ素高集積化リポソームを開発することに成功した。ホウ素薬剤の可視化技術の開発27年度は、ホウ素コレステロールの可視化技術の開発を中心に研究を推進した。申請書にも記載したように、我々はアセチレン部位を導入したホウ素コレステロールの合成にすでに成功している。そこで、このアセチレンーホウ素コレステロールコンジュゲートに対し、蛍光剤アジドを用いたクリック反応によりマウス大腸がん細胞内イメージングを行ったところ、ホウ素化コレステロールが細胞核周辺に集積することが分かった。一方、ホウ素クラスター認識抗体を用いて、細胞内局在を調べたところ、予想に反して免疫染色は上手く行かなかった。そこで、新しいホウ素クラスターのイメージング法について検討を行った。申請者はホウ素クラスターのもつB-H結合のラマン吸収波長が、他の生体内に存在する官能基とは重複しないいわゆる“生物の窓"領域に現れることに着目し、ラマン分光によるホウ素薬剤のイメージングを新しく着手した。通常、細胞質から得られるラマンスペクトルは、750ー1800 cm-1と2800ー3000 cm-1付近に現れる。申請者は、ホウ素クラスターが有するBーH結合のラマンスペクトルがこれらとは重ならない2523 cm-1に現れることを明らかにした。その結果ホウ素コレステロールの細胞内局在のラマンイメージングに成功した。28年度は、この結果を基に蛍光クリックイメージングと比較・検証するとともに、三次元共焦点ラマン顕微鏡を用いて、細胞内三次元マッピングに挑戦する。一方、27年度に予定していた中性子照射による細胞殺傷効果に関しては、京都大学の原子炉が再稼働しなかったことから、28年度に計画する。また、ペプチドリガンドを導入技術に関しては、28年度にまずcRGDペプチドを用いて行う。27年度に予定していた中性子照射による細胞殺傷効果に関しては、京都大学の原子炉が再稼働しなかったため、実施できなかった。28年9月頃から稼働予定とされていることから、マシンタイムに合わせて、研究計画を遂行する予定であり、本課題研究が終了する来年3月までには、実験を実施可能である。ホウ素薬剤が実際の腫瘍組織内にどのように分布しているのか、細胞レベルで検証する手法の開発を目的に研究を遂行した。本研究では、細胞レベルおよびin vitroレベルでのホウ素クラスターの可視化技術をクリック反応による蛍光色素イメージングだけでなく、新たにラマンイメージング法を適応し、検討した。ホウ素クラスターのB-H結合に起因するラマン吸収は、生体分子の吸収に重ならない波長に吸収帯を持つことに着目し、疎水性ホウ素クラスターであるカルボラン、イオン性ホウ素クラスターであるドデカボレートのラマンスペクトルを測定したところ、濃度依存性を見出すことに成功した。この結果をもとに、本課題研究で開発したホウ素化コレステロールの細胞内ラマンイメージングを行い、細胞内クリック反応の用いた蛍光イメージングにより得られたイメージング画像と比較した結果、局在の一致を確認できた。細胞内局在とBNCT抗腫瘍効果の関係を明らかにするべく準備を行ったが、京都大学原子炉実験所の原子炉が研究期間内に稼働しなかったため、東工大が有する加速器をBNCT基礎研究への利用に関して、学内で検討した。29年度以降、引き続き学内異分野融合プロジェクトとして検討を進める。さらに、細胞内ホウ素

クラスターの局在イメージングに、蛍光イメージング技術とラマン分光イメージング技術を確立した。また、腫瘍への高効率ホウ素デリバリーシステム構築のために、マレイミド結合型ホウ素クラスター(MID)の開発に成功し、MIDが生理条件下においてシステインだけでなくリジンにも結合することを見出した。中性子捕捉治療のためには、非常に高濃度でのホウ素薬剤の投与が必要となっている。本研究の目的は、如何に効率よく腫瘍へホウ素を送達するかである。本研究では、リポソームをホウ素キャリアーに用いることでこの目的を達成しようとするものであり、リポソームへのホウ素高集積化が鍵となる。内封ホウ素薬剤としてホウ素イオンクラスターを選択し、そのカウンターカチオンをポリアミン塩に変えることで、高集積化に成功したことは、大きな成果であると考えている。ホウ素クラスター薬剤のイメージングには、アセチレン部位を導入しクリック反応を用いた方法が有力だが、アセチレン部位を有することから本来の薬剤の構造と異なるため、その動態は必ずしも本来の薬剤とは一致しない。また、ラマンイメージングは非破壊での測定も可能であることから、実際の臨床にも応用の可能性をもつ。さらに、ホウ素クラスターのB-H結合はヨウ素と容易に反応することから、放射性ヨウ素の導入によるPETイメージングも可能である。この2つの方法について28年度は強力に推進する。28年度が最終年度であるため、記入しない。有機化学平成26年度で開発したホウ素高濃度集積化手法を用いて、27年度では、さらにホウ素コレステロールとの組み合わせにより、さらに高濃度集積可能なホウ素リポソーム製剤を開発することにつながると考えている。また、現在停止中の京都大学医療用原子炉KURが、27年度中に再稼働する予定であると伺っているので、これらのホウ素薬剤を用いて中性子照射による抗腫瘍効果の検証を進めたい。28年3月に予定していた京都大学原子炉実験所での実験打合せが、28年度以降に延期になったため、その旅費分の経費を次年度に繰り越したため。平成26年度に研究支援技術者の雇用のために人件費を370万円計上していたが、49月雇用後、研究者の都合により本研究課題の継続が出来なくなった。京都大学原子炉実験所での実験打合せ旅費に使用予定。そこで、平成27年度4月より新たに非常勤研究支援技術補助者を週4日間雇用し、本研究を遂行する。
高等学校化学を対象とするITS/Microworld統合型知的教育システムの構築

本研究は、ITS/Microworld統合型知的教育システムの構築技術を用いて、高等学校の化学を対象とする実用的な知的教育システムを構築することを目的とする。現行システムが実用化されていないのは、主として教材知識が対応している化学現象がいくつかの代表的現象に留まっていることによると思われる。そこで、以下の検討を行った。(1)実用化に向けて、現在のITS/Microworld統合型システムの評価を行った。特にユーザビリティに関しては高校の化学担当教師による評価実験を行い、問題点を明らかにした。(2)現実的に一定期間以上に適用可能な知識ベースの開発を行った。具体的には、(a)混合物・化合物・純物質などのいろいろな物質,(b)原子の構造,(c)イオン結合および共有結合,(d)物質量とアボガドロ数,(e)酸と塩基の中和反応と量的関係,という流れを想定し,この範囲内で、知識ベースを構築するとともに、演習問題集、実験指導書に相当するコンテンツを作成してシステムに組み込む。(3)上記(1)の結果を考察し、実用化に向けてシステムの機能の高度化と、ユーザインタフェースの洗練化を行った。特に、長期的な学習支援システムの利用においては学習者による振り返り学習を支援することが重要であるとの知見から、これを支援する機能として、それまでの学習内容を概観するサマリー機能、重要事項を学習者が自ら整理してノートを作成する作業を支援する機能、学習者がシステム上で行った問題演習の問題解決過程と、その際にシステムから受けた学習支援を再現する機能などを実装した。
カドヘリン,カテニンによる細胞周期の制御と癌における異常

本研究は癌細胞の細胞増殖の異常に対し、細胞間接着がどのような関与をしているかを明らかにしようとするものである。ここ1,2年の進歩によりβ-cateninがkey moleculeとして働いていることが明らかになりつつあり本研究もβ-cateninを中心に行われた。1)大腸癌におけるβ-cateninのチロシンリン酸化について調べた。癌組織において有意にチロシンリン酸化の亢進が見られた。(British Journal of Cancer,77,605-613,1998)2)細胞画分法により、細胞内に存在するカドヘリンと結合しないtreeのβ-cateninを簡便に定量する方法を開発した。食道癌で検索したところ約半数の症例で癌組織におけるfreeのβ-catenin増加を認めた。さらにこれらの症例にはAPCやβ-catenin自身の遺伝子変異は存在せず、未知のメカニズムがβ-catenin増加に関与していることが示唆された。(International Journal of Cancer,1999 in press)3)細胞周期を同調させた状態では、特にM期における細胞間接着の阻害は顕著であったが、β-cateninの発現量、リン酸化状態には有意な変化は認められなかった。(ne9ative data)4)細胞周期調節分子との関連を検討した。β-cateninと各種サイクリンとは有意な関連は無かったが、p27KIPlとβ-cateninの発現に関連を認めた。(投稿準備中)両者はともにユビキチンプ口テアソームで分解されており、今後はこのプロテアソーム系を中心に研究を進めたい。本研究は癌細胞の細胞増殖の異常に対し、細胞間接着がどの様な関与をしているかを明らかにしようとするものである。1)癌細胞においてはcyclinD1の過剰発現が高頻度かつ重要で(Cancer Research,57,1569-1574,1997)、これはしかも、p27KIP1,Rbの過剰発現を伴っていることを報告した。(Carcinogenesis,18,1139-1148,1997)pp27KIP1は細胞接着による細胞増殖の制御に関わることが報告されており、E-cadherinによる細胞周期制御に関与いているかもしれない。2)血清飢餓状態でG1停止を起こしている細胞を血清刺激にて増殖刺激を加えた。このとき、カルシウム除去または抗E-cadherin抗体により細胞間接着を阻害することにより細胞周期の進行にどのような影響がでるかを検討している。現在までに細胞接着の障害による差は見られていない(negative data)。3)細胞周期においてβ-catenin、E-cadherinの発現量が変化するかどうかを検討したが、蛋白全体量としては有意な変化は見られなかった。しかし、M期において著明な細胞間接着の障害、E-cadherinの機能低下が認められた。この原因を今後、β-cateninの局在、リン酸化状態の変化などから検討したい。3)大腸癌におけるβ-cateninのチロシンリン酸化について調べた。癌組織に置いて有意にチロシンリン酸化の亢進が見られた。(BritishJournal of Cancer,77,605-613,1998)4)近年、細胞質内でE-cadherinと結合しないfreeのβ-cateninが転写因子と結合して増殖を支配している可能性が示唆されている。食道癌組織を用いてこの細胞質内free β-catenin poolを調べたところ、癌でかなりの頻度で増加していることを発見した(投稿準備中)。今後、この細胞内free β-catenin poolと細胞周期との関係を検討して行きたい。
筋再生時の筋管細胞形成に対する運動療法の役割

骨格筋には再生能力があることは広く知られ,この再生機構は詳細に調べられている。しかし,加齢によりどの程度再生能が低下するかはよく知られていない。一方,筋組織の修復中に持続的に張力を加えたり,あるいは運動負荷を加えると再生能がどのように修飾されるのかについても調べられていない。従い,以下のような実験を行った。I.加齢にともなう変化.2年齢と3カ月齢のラット前脛骨筋に塩酸ブビバカインを注射し,変性後の再生の過程を検索した。2年齢のラットは注射1週後に初めて筋管細胞(再生線維)が出現した。3週後には一部成熟細胞が認められたが,多くは中心核を含んだ再生細胞であった。4週後も同様であった。3カ月齢のラットでは,3日後に再生は始まり、2週までには再生が完了し、全てが成熟細胞であった。加齢により筋衛星細胞の減数,分裂増殖能の低下が示唆された。II.共同筋腱切離による再生の影響.ラット長趾伸筋の塩酸ブビバカイン処理後、前脛骨筋腱を切離し,持続的な張力が加わると再生はどのように修飾されるか検討した。3日後より筋鞘下から筋原線維が新生された。その後細胞中心部に変性部が残るためCore/targetoid fiberが認められた。Coreは次第に縮小し,56週後成熟筋線維となるが,対照群と比べ,再生はやや遅れた。III.運動負荷による再生能の変化.マウスの長趾伸筋に塩酸ブビバインによる変性を起させ,その後トレッドミル上で運動を負荷させた。[3H]TdRを注射し,筋衛星細胞のDNA合成能を検索した。運動を加えると合成は2日後より認められ,対照群に比べ12時間早かった。すなわち,運動は筋細胞の修復と成熟の促進に効果があることが確認された。塩酸ブピバカイン(BPVC)の筋内投与は、筋の損傷-再生機序を調べるためのモデルとして汎用されている。本年(平成8年)度は、ラット前脛骨筋にBPVCを投与し、筋の形態、機能を回復の過程を検索した。ウィスター系雄性ラットを用い、全身麻酔下で右前脛骨筋に150μlのBPVCを注射針を用いて投与した。BPVC投与から3日から4週間後に、in siteでの等尺性筋収縮特性について調べた。その後、凍結切片を作製し、ヘマトキシリン・エオジン染色、坑マクロファージ抗体、抗デスミン抗体、抗ブロモデオキシウリジン(BrdU)抗体を用い、光顕的観察を行った。等尺性強縮張力を筋重量で除した相対張力は、投与後1週間までは激減するが、2週間後には対象群の8090%程度まで回復し、4週後までこの値のままであった。形態学的変化は、BPVC投与3日後にデスミン陽性の単核細胞が長軸方向に融合した筋管細胞が形成されていた。その周囲にはデスミン陰性のマクロファージが散在していた。また筋線維は過収縮および膨張し、それらは多数の貧食細胞で満たされた壊死線維も観察された。1週間後には筋原線維も増加し、小型の再生筋線維が認められた。2週後には、大型の核と好塩基性の胞体を持つ再生線維となり、それの径は非壊死線維の約1/2となり、4週後には再生は完了した。

筋衛星細胞の増殖をDNA合成という指標で調べると、増殖のピークはBPVC投与3日後であり、マクロファージの数のピークとほぼ一致していた。すなわち、再生のときに浸潤してくるマクロファージが分泌する因子により、傷害の部位に筋衛星細胞を遊走させ、増殖させ、これは互いに融合し、新たな筋線維を形成する。そして筋の再生が完了するには約4週間を必要とする。骨格筋には再生能力があることは広く知られ、この再生機構は詳細に調べられている。しかし、in vivo、in vitroの研究では若齢動物のものであり、加齢によりどの程度再性能が低下するかはよく知られていない。また再生中に運動負荷を加えると再生能がどの程度変化するかについても調べられていない。よって以下の実験を行った。2年齢と3カ月齢のラット前脛骨筋に塩酸ブピバカインを注射し、筋細胞に変性を起こさせ、再生の過程を組織学的に検索した。3ヶ月齢ラットでは注射3日後に筋管細胞が出現し、1週後には小径の成熟細胞が現れ、2週後には完全に再生は終わり、成熟細胞が占めた。2年齢ラットでは、1週後に初めて筋管細胞が出現した。3週後には一部成熟細胞が認められたが、多くは中心核を含んだ再生細胞であった。4週後でも同様の傾向であり、再生に関与する筋衛星細胞の減数、あるいは筋衛星細胞の分裂増殖能の低下が示唆された。再生中に筋に運動負荷を加えると再生能がどのように修飾されるか、筋衛生細胞の活性化の観点から検索した。マウス長趾伸筋に塩酸ブピバカインを注射し、筋細胞に変性を起こさせ、その後トレッドミル上で運動をさせた。2、3日、2週後に[^3H]TdRを注射し、筋衛星細胞のDNA合成能を検索した。運動を加えると合成は2日後より認められるようになり、対照群に比し、12時間早かった。すなわち、運動は筋細胞の修復と成熟の促進に効果があることが確認された。
サイロキシン結合グロブリン遺伝子及びその発現異常に関する分子生物学的研究

1)サイロキシン結合グロブリン(TBG)のcDNAのクローニングとその構造解析:λgt11に組みこまれたヒト肝cDNAライブラリーを抗TBG抗体を用いてスクリーニングし, TBGcDNAクローンを単離した.そのcDNAインサートの塩基配列を決定することによりTBGが395個のアミノ酸からなり,糖鎖が付加され得るアスパラギン残基が5つ存在することが推定された.2)TBGゲノム遺伝子のクローニングとその構造解析:正常人の末梢白血球よりDNAを抽出ゲノムライブラリーを製作TBGcDNAをプローベとしてこれをスクリーニングし, TBG遺伝子をクローン化し,その構造を解析した.この結果TBG遺伝子が約5Kbpで4つのエキソンからなることを明らかにした.3)TBG完全欠損症におけるTBG遺伝子の解析:6家系のTBG完全欠損症のゲノムTBG遺伝子の制限酵素断片の多形性を分析し,この疾患の成因として,大きな欠損,挿入,置換などが無いことを明らかにした.4)TBG増多症におけるTBG遺伝子の増幅:1家系のTBG増多症を対象として,制限酵素断片の多形成及び遺伝子のコピー数を検討した.この結果,対象とした家系のTBG増加の原因として,遺伝子の増幅を示唆する結果を得た.5)異常TBG症(TBG-Gary)のTBG遺伝子の解析:甲状腺ホルモン結合能を殆ど示さず,等電点電気泳動にて正常より陽極側に泳動される異常TBGを有する患者のTBG遺伝子をクローニングし,その構造を解析した.その結果この異常が単一塩基の突然変異により96番目のアミノ酸がイソロイシンよりアスパラギンに変化することにより起こることが推定さた.1)サイロキシン結合グロブリン(TBG)のcDNAのクローニングとその構造解析:λgt11に組みこまれたヒト肝cDNAライブラリーを抗TBG抗体を用いてスクリーニングし, TBGcDNAクローンを単離した.そのcDNAインサートの塩基配列を決定することによりTBGが395個のアミノ酸からなり,糖鎖が付加され得るアスパラギン残基が5つ存在することが推定された.2)TBGゲノム遺伝子のクローニングとその構造解析:正常人の末梢白血球よりDNAを抽出ゲノムライブラリーを製作TBGcDNAをプローベとしてこれをスクリーニングし, TBG遺伝子をクローン化し,その構造を解析した.この結果TBG遺伝子が約5Kbpで4つのエキソンからなることを明らかにした.3)TBG完全欠損症におけるTBG遺伝子の解析:6家系のTBG完全欠損症のゲノムTBG遺伝子の制限酵素断片の多形性を分析し,この疾患の成因として,大きな欠損,挿入,置換などが無いことを明らかにした.4)TBG増多症におけるTBG遺伝子の増幅:1家系のTBG増多症を対象として,制限酵素断片の多形成及び遺伝子のコピー数を検討した.この結果,対象とした家系のTBG増加の原因として,遺伝子の増幅を示唆する結果を得た.5)異常TBG症(TBG-Gary)のTBG遺伝子の解析:甲状腺ホルモン結合能を殆ど示さず,等電点電気泳動にて正常より陽極側に泳動される異常TBGを有する患者のTBG遺伝子をクローニングし,その構造を解析した.その結果この異常が単一塩基の突然変異により96番目のアミノ酸がイソロイシンよりアスパラギンに変化することにより起こることが推定さた.1.発現ベクターλgtllに組み込まれたヒト肝cDNAライブラリーを用いたサイロキシン結合グロブリン(TBG)cDNAのクローニングλgtllのEcoRI部位に組み込まれたヒト肝cDNAライブラリー(約2×【10^6】の独立した組換え体)を大腸菌Y1090株に吸着させ、150mm径のプレートに2×【10^4】pfuの濃度で軟寒天と共に培地に重層した。42°C4時間インキュベートした後、10mM IPTGで飽和後乾燥したニトロセルロース(NC)紙を重ね、挿入された遺伝子の産物とβガラクトシターゼとの融合蛋白を2時間誘導、NC紙に吸着せしめた。このNC紙と抗TBG抗体をインキュベーション後、結合した抗TBG抗体をアルカリフォスファターゼ結合抗兎1gGを用いて検出、2万個のコロニーから数個のクローンを得た。この融合蛋白は、精製TBGと抗体結合に競合することからTBGcDNAと固定した。2.TBGcDNAの塩基配列の決定:得られたTBGcDNAクローンのうち最長のインサートをpSP65に再度組み換えし、大量のインサートを得、これをM13バクテリオファージの二重鎖DNAに挿入、ジデオキシ法による塩基配列の決定を開始した。この際、本年度購入した遺伝子情報処理コンピュータが役立っている。3.TBGcDNAによるTBGmRNAの解析:TBG産生肝癌細胞株Hep G2より抽出したRNAをグリオキサール処理し、電気泳動後NC紙に転写(Northern Blotting)、これと【^(32)P】-dCTPで標識したプローベとハイブリダイズさせた。この結果、TBGmRNAは約16Sで、70-80塩基長さの異なる二つのmRNAの存在が確認された。4.健常者、ゲノムTBG遺伝子の構造解析:健常者の抹消血中のリンパ球より採取したDNAを種々の制限酵素により分析後、アガロース電気泳動を行い、これをNC紙に転写後、【^(32)P】-dCTP標識プローベとハイブリダイズした。その結果、TBG遺伝子は一つであること、少なくともHae【III】、BanH【I】、Pvu【II】、Hinf【I】部位の多形性のないことが明らかになった。
アストロサイト特異的小胞体ストレスセンサーによる神経保護作用の解析

小胞体ストレスはアルツハイマー病をはじめとする種々の神経変性疾患の病因のひとつに挙げられている。グリア細胞に特異的に発現する小胞体ストレスセンサーOASISのノックアウトマウスでは野生型マウスに比べ、カイニン酸投与による神経細胞死が顕著に亢進する。本研究においてOASISによる神経細胞保護作用を解析した結果、OASISがアストロサイトにおける脳由来神経栄養因子(BDNF)の発現と分泌に重要な役割を担っている事を示唆するデータが得られた。アストロサイト特異的小胞体ストレスセンサーOASISを欠損するマウスは、野生型マウスに比べ、カイニン酸が持つ神経毒性に対して脆弱となる。本研究では、アストロサイトが持つ神経保護作用に焦点を絞り、OASISの生理機能の解析を行っている。本年度得られた成果は以下のとおりである。1) OASISが欠損すると初代培養アストロサイトは小胞体ストレスに脆弱となり、ストレス負荷時における細胞増殖能が低下した。それゆえ、OASISの活性化は小胞体ストレス状態におけるアストロサイトの増殖や生存を助け、アストロサイトによる神経保護作用を増強させている可能性を見出した。2)カイニン酸の投与は海馬においてglialcell line-derived neurotrophic factorやbrain-derived neurotrophic factor (BDNF)の発現レベルが上昇することが知られている。これらの神経栄養因子の発現レベルを、カイニン酸を投与したOASISノックアウトマウスで調べたところ、BDNF mRNAの発現レベルが野生型マウスに比べて有意に減少していた。3)アストロサイトに小胞体ストレスを負荷するとBDNF mRNAの発現レベルが上昇した。4)海馬領域に発現するグルタミントランスポーターGLT1およびGLASTのmRNAレベルはOASISノックアウトマウスと野生型マウスで差が認められなかった。従来の研究により、アストロサイト特異的に発現する小胞体ストレスセンサーOASISが、カイニン酸投与による神経障害から海馬神経細胞を保護する事を明らかにしていた。OASIS欠損マウスの海馬ではカイニン酸投与により上昇するbrain-derived neurotrophic factor (BDNF)のmRNAレベルが野生型に比べて低下していた。そこで、本研究ではOASISによるBDNF発現制御機構に関する解析を行い、以下に示す成果を得た。1)初代培養アストロサイトに小胞体ストレスを付加するとBDNFのmRNAレベルが上昇するが、OASIS欠損マウスに由来する細胞では、野生型ほどの上昇が認められなかった。同様の結果はC6 gliomaをOASIS siRNAで処理した場合でも認められた。2)BDNFのプロモーター領域をルシフェラーゼアッセイにより解析したところ、Exonlに含まれる翻訳開始点の上流496bpが小胞体ストレスによるBDNFの転写に必要なことを明らかにした。更に、との領域に存在するCRE-like配列にOASISが作用してBDNFの転写を誘導することを明らかにした。3)アストロサイトの培養上清に産生されたBDNFを免疫沈降により濃縮するアッセイ系を開発した。このシステムを用いれば小胞体ストレス付加時におけるBDNFの産生を蛋白質レベルで解析することが可能となり、小胞体ストレスがBDNFの産生に及ぼす影響を詳細に解析できると期待している。
ポスト=コロニアル状況下における日本の人類諸科学

本研究は、アジア太平洋戦争に敗北し、日本が東アジアに保有した広大な植民地を喪失した1945年以降の日本における人類諸科学(自然人類学、民族学、民俗学など)の歴史を跡付け、人類諸科学における戦時中との連続性/非連続性について考えようとするものである。(1)九学会連合の対馬調査(1950・51年)と(2)自然人類学者による混血児研究、生理学者による環境適応能力研究に焦点を当て、これらの研究が、アジア太平洋戦争とその後の東アジアにおける冷戦構造の枠組みの中で行われていたことを明らかにした。1、国内、国外における人類諸科学(自然人類学、文化人類学、民俗学、霊長類学)の歴史に関わる先行研究(論文、図書)を幅広く収集し、当該テーマに関する理解を深めるとともに、戦前・戦後の人類諸科学の主要著作・論文を収集、それについて分析を加える作業を行った。この作業を通じて、日本のポスト=コロニアル状況下における人類諸科学の展開についてある程度の見通しが得られたが、来年度からは特に戦後日本における霊長類学の歴史に焦点を絞り込んだ上で、さらに文献収集・分析を進めていく予定である。2、平成17年度から研究代表者が運営している「植民地主義と学知研究会」において月1回程度の研究会を実施し、様々な領域の研究者から専門的知識の供与を受けた。(その際、関東以外の地域からも研究者を招聘した)また、研究代表者自身、当研究会において、当該テーマに関わる発表を2回実施した。3、平成19年度の日本科学史学会総会(京都産業大学)において、「混血研究の政治学」と題する研究発表を行った。ここでは、戦後日本の「混血」をめぐる研究が、いかに戦時中の研究と連続しているか、さらには「混血」研究とポスト=コロニアル状況との関わりについて論じた。同テーマをさらに発展させた内容の発表を、平成20年5月の日本文化人類学会(京都大学)及び6月のAmerican Association for the Advancement of Science, Pacific Divisionのシンポジウム(ハワイ)で発表の予定である。(1)国内、国外における日本の人類諸科学(自然人類学、文化人類学、民俗学、霊長類学)の歴史に関わる先行研究(論文、図書)を幅広く集め、当該テーマに関する理解を深めるとともに、日本の霊長類学を中心に、戦後の人類諸科学の主要著作・論文を収集、それについて分析を加える作業を行った。その結果として、特に1950年に対馬で実施された八学会連合の総合調査が「帝国」の記憶と冷戦構造の構築という日本のポスト=コロニアル状況下における人類諸科学について考えるとき重要な意義をもつことを発見し、それについての分析を集中的に行った。その成果は、平成21年度中に研究代表者が編者となって刊行予定の研究書(『帝国の視角/死角-<昭和史>の中の知とメディア(仮題)』青弓社刊)において論文(「対馬・済州島・社会的緊張-泉靖一と朝鮮戦争(仮題)」として発表予定である。(2)平成17年度から研究代表者が運営している「植民地と学知研究会」において、月1回程度の研究会を実施し、様々な領域の研究者から専門的知識の供与を受けた。また、研究代表者自身、当該テーマに関わる発表を2回実施した。「戦後」日本、特にGHQ統治時代の調査研究の中から、日本で最初の本格的な総合学術調査と言われる九学会連合(人類学、民族学、民俗学など九つの学会の連合体、1947年に六学会連合として発足)による対馬調査を中心に分析を行った。その結果、判明したのは下記の通りの事実である。1、対馬が調査地として選択された背景には、日本敗戦の結果、国境線の島となった対馬に対する地政学的関心が存在したこと。2、特に朝鮮半島と日本の間に位置する対馬に対しては、当時、韓国との間に政治的軋轢が生じていたが、さらに調査直前にける朝鮮戦争勃発という社会的背景が九学会連合の調査に大きな影響を与えていたこと。具体的には、対馬が「日本」であることを学術的に「証明」することが調査団員の大きな目標となったこと。3、対馬調査の成果として有名な宮本常一(民俗学者)の「寄りあい」民主主義の議論(対馬の一集落で宮本が見聞した村の「寄りあい」から、近代以前から伝統的に残る日本的「民主主義」として定式化された)の背景には上述の対馬調査実施時の政治状況が影響を与えている可能性があること。九学会連合の地域調査については、対馬に続いて能登半島(1952・53年)、奄美(1955・56・57年)の調査についても現在、調査・分析を進めており、それと併せて当時の人類諸科学の学術調査が「戦後」日本社会の政治的状況といかなる関係を有していたかを明らかにしていく計画である。

さらに、今年度の成果として、対馬調査において中心的役割(現地責任者)を果たした泉靖一(文化人類学者)による同時期の他調査(東京都在住の済州島出身者調査、東京都民の人種偏見調査)についても分析を行い、かかる調査が日本敗戦と植民地帝国崩壊という政治状況を大きく反映するものであることも明らかになった。特に泉靖一の1950年代初頭に調査については従来ほとんど知られていなかったが、本研究によってその全貌をある程度明らかになったと思われる。なお、以上の研究成果の一部は、研究代表者が編者となり、今年9月頃に刊行予定の著作(坂野徹・愼蒼健編『帝国の視角/死角-<昭和期>日本の学術とメディア』青弓社刊)において発表予定である。
子どものアトピー性皮膚炎が家族に与える影響とそれに対する家族の対処行動

子どもがアトピー性皮膚炎に罹患することによって,家族がどのような影響を受けるのか,また,その影響に対して両親がどのように対処しているのかを把握することを目的とし,アトピー性皮膚炎の子どもをもつ両親を対象に,インタビュー調査を実施した.その結果,子どものアトピー性皮膚炎は,両親,特に母親の睡眠に影響を与えている他,ライフスタイルにも影響していた.また,両親は,環境整備や情報収集,治療方法の模索といった対処行動をとっていることが分かった.子どもがアトピー性皮膚炎に罹患することによって,家族がどのような影響を受けるのか,また,その影響に対して両親がどのように対処しているのかを把握することを目的とし,アトピー性皮膚炎の子どもをもつ両親を対象に,インタビュー調査を実施した.その結果,子どものアトピー性皮膚炎は,両親,特に母親の睡眠に影響を与えている他,ライフスタイルにも影響していた.また,両親は,環境整備や情報収集,治療方法の模索といった対処行動をとっていることが分かった.本研究は,子どもがアトピー性皮膚炎に罹患することによって,、家族がどのような影響を受けるのか,そのプロセスと構造を明らかにすること,また,その影響に対して家族,特に両親がどのように対処しているのかを把握することを目的とした.当初の計画では,本年度は母親にインタビュー調査を実施し,来年度父親にインタビュー調査を実施する予定であったが,分析の過程で,父親との比較検討をおこなうことの必要性を感じ,父親にもインタビュー調査を実施した.そのため,当初の予定よりもまだ対象者数が少なく,次年度引き続き,母親,父親双方にインタビュー調査を実施する予定である.グラウンデッド・セオリー・アプローチという分析手法をとっている関係上,現時点での分析結果であり最終的な報告は難しいが,次のようなことが明確になった.子どものケアを中心となっておこなっていたのは,主に母親であった.アトピー性皮膚炎だけでなく,食物アレルギーも併発している場合,家族,特に母親は,子どもの食事の管理に関してストレスを強く抱いていた.それに対し父親は多くの場合,母親の話し相手になったり,アレルギーに関する情報収集をしたり,など母親のおこなっているケアをサポートする形で関わっていた.現段階では,子どもがアトピー性皮膚炎に罹患することによって受ける影響の内容が分かったに過ぎないため,今後もインタビュー調査と分析を進め,そのプロセスと構造を明らかにしていきたい.本研究は,子どもがアトピー性皮膚炎に罹患することによって,家族がどのような影響を受けるのか,そのプロセスと構造を明らかにすること,また,その影響に対して家族,特に両親がどのように対処しているのかを把握することを目的とした。当初の計画では,本年度は父親に対してインタビュー調査をおこなう予定であったが,昨年度から,母親,父親双方のインタビューを同時期におこない,比較する必要性が生じたため,今年度も昨年度に引き続き,両親へのインタビュー調査を実施した。グラウンデッド・セオリー・アプローチという分析手法をとっている関係上,現時点での分析結果であり最終的な報告は難しいが,次のようなことが明確になった。子どものケアを中心となっておこなっていたのは,主に母親であったが,父親もアトピー性皮膚炎に関する情報収集や薬の塗布などできるところを協力していることがわかった。ただ,どのような時にどのような協力体制をとっているのかは,まだ明確ではない。現段階では,子どもがアトピー性皮膚炎に罹患することによって受ける影響の内容が分かったに過ぎないため,今後もインタビュー調査と分析を進め,そのプロセスと構造を明らかにしていきたい子どもがアトピー性皮膚炎に罹患することによって,家族がどのような影響を受けるのか,そのプロセスと構造を明らかにし,その影響に対して家族,特に両親がどのように対処しているのかを把握することを目的とし,アトピー性皮膚炎の子どもをもつ両親とその子どもを対象に,インタビュー調査を実施した.その結果,子どものアトピー性皮膚炎は,両親,特に母親の睡眠に影響を与えていた.痒みによる夜間の睡眠障害は,子どもの年齢にかかわらず生じていた.また,情報収集をおこなったり,民間療法をおこなったりすることによる経済的な影響も生じていた.その他,両親は兄弟への影響も懸念していた.さらに,母親が仕事をしている場合,子どものケアのために職場復帰への時期を考慮するなど母親のライフスタイルにも影響していた.子どもがアトピー性皮膚炎であることによる影響に対し,主に対処行動をおこなっていたのは母親であった,母親は,医師の指示がなくても,環境整備をおこない,アレルゲンを隔離するために環境をかえるという対処もおこなっていた.子どもの皮膚のケアも母親が中心となっておこなっていた.父親が中心となっておこなっていたのは,情報収集であった.アトピー性皮膚炎のことを気にかけて,同僚から清報収集をしたり,本を購入したりしていた.そして,母親とともにそれらの情報を共有し,治療法を模索していた.本研究により,アトピー性皮膚炎であることによる家族への影響とその対処行動の概要については明らかになったものの,それらの構造とプロセスについては分かっておらず,また,理論的飽和にも至っていない.そのため,今後もデータ収集をおこない,分析を続ける必要がある.
ヒトiPS細胞由来異所性ヒト骨髄を用いた急性骨髄性白血病幹細胞維持機構の解明

急性骨髄性白血病(AML)治療後の再発は、骨髄微小環境で維持されるAML幹細胞(AMLSC)が原因であることが明らかになってきている。ヒト造血幹細胞(HSC)とAMLSCの骨髄微小環境での機能をin vivoで解析するために免疫不全マウスなどの遺伝子改変マウスが開発されてきたが、種差の大きな問題がある。In vivoでヒト由来細胞の機能解析を行なう目的でこれまで様々な遺伝子改変マウスが作製されてきた。ヒト細胞の生着能を改善した免疫不全マウスへのAML患者細胞の生着率は約50%であり、加えてヒトサイトカイン(IL3、GM-CSF、SCF)のトランスジェニックマウスではさらに生着能が高まることが示された。しかし、これらの研究はマウス骨髄微小環境とヒトAML細胞との関係を解析する方法である。本研究では免疫不全マウス体内にヒトiPS細胞から異所性ヒト骨髄を作り出し、ヒト骨髄微小環境内でHSCやAMLSCがどのように維持されているかを明らかにすることを目的としている。本研究期間内に免疫不全マウス体内にヒiPS細胞から異所性ヒト骨髄を作製することに成功した。今後は作製した異所性ヒト骨髄へのHSCやAMLSCの生着能の確認を行う。本研究の成果は、ヒト骨髄微小環境によるAMLSC維持機構の解明へとつながり、骨髄微小環境を標的としたAML新規治療標的分子の同定が期待される。また、ヒトiPS細胞を利用した骨髄微小環境の解析方法は、再生不良性貧血など骨髄微小環境をターゲットとした治療薬開発に応用されることが期待できる。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
新規遺伝子Spredsのマウス造血における機能解析

昨年度までで当初の研究計画に記載したSpredsの研究が一通り終了した。この研究の目的は、血液悪性腫瘍に多いRas-MAPK恒常的活性化について、これを負に制御するSpredの機能解析を行ない、治療に関連する知見を得ることが目的であった。本年度はより直接的に、この恒常的活性化シグナルに対する治療方法開発に取り組むこととした。変異Nrasは古典的な癌遺伝子であるが、unduggableと言われる程その治療法開発は困難であった。そこで我々は、synthetic lethalの概念を利用して、shRNAiでkinase, phosphataseその他をノックダウンすることにより、変異Nrasを持つ細胞の増殖のみを抑制するNras特異的なターゲット遺伝子を同定することとした。候補遺伝子はNRasの上流、下流などNrasそのもの以外、特に薬剤の開発につなげやすいkinase, phosphataseに求めることとした。<方法>細胞は野生、変異Rasの細胞株3種ずつを用いる。主としてkinase, phosphataseを含む5000以上の遺伝子からなるレンチウイルスshRNAライブラリー(Hahn WC et al, Cell, 2006)により遺伝子をノックダウンする。1つの遺伝子にヘアピンは5-8存在し、1つのwellに1種類ずつヘアピンを加える。培養後、コントロールヘアピンと比較して、変異細胞株のみにおいて増殖を強く阻害したものを候補遺伝子として複数選ぶ。<結果>現在スクリーニングが終了し、アポトーシス関連遺伝子や機能が十分解明されていないものなど8つの候補遺伝子を選んだ。特にNrasそのものが候補遺伝子のランキングの4番目となっており、これはポジティブコントロールとしてデータの信頼性を示すと考えられる。今後in vitro, in vivoにおいて検証していく予定である。Spred-1はサイトカインにより誘導されるERK活性化を抑制することによって造血を負に制御することがin vitroの系で示された。しかしSpredsの、マウスのvivoの造血における役割は未だ明らかでない。そこで今後マウス造血におけるSpred-1の生理作用について解析することにより、造血におけるERKの役割の一端を明らかにすることが可能と考えられる。既にSpred-1,2それぞれのノックアウト(KO)マウスは樹立されており、造血における表現型を解析することにより、成体マウス造血におけるERKの役割を明らかにすることを目的としている。Spred1、Spred2それぞれの単独欠損マウスは頭蓋の形成異常や造血系の亢進が認められるが、ともに出生、生殖は可能であることを発見した。しかしSpred1欠損マウスでは著明な脾腫が認められ、骨髄増殖性疾患を認めた。現在その詳細な発症メカニズムを検討している。またSpred1/Spred2両ホモ欠損(DKO)胎仔を作製したところ、著明な出血、浮腫を認め、胎生12.515.5日に100%致死であった。出血は主に頸部、腎臓周囲を中心にみられ、リンパ管あるいは血管の異常が予想された。そこでリンパ管内皮細胞マーカーであるLYVE-1および血管内皮細胞マーカーであるPECAM-1/CD31のwhole mountの免疫染色を行なった。その結果、血管はほぼ正常であるが、拡張した不整な管腔はLYVE-1陽性であり、拡張した管腔はリンパ管であると考えられた。またリンパ管の数自体も増加していた。Spredはリンパ管発生、特に静脈からの適切な分離に必須の分子であることを明らかにした。新規遺伝子SpredはERK経路の負の調節因子として発見され、in vitroにおいてマウス造血を抑制することが示されたが、in vivoにおける機能の詳細は次に研究するべき課題であった。本年度は骨髄移植を中心とした解析を行った。2.野生型マウスとSpred-1,2KOマウス各々の骨髄を用いて、LTC assayを行った。3.Spredsはファミリー分子間で重複性があり、ダブルノックアウト(DKO)マウスの解析が不可欠であるが、DKOマウスは、100%胎生致死(E12-14)であるため、胎児肝細胞を用いてLTC assayを行った。結果は、キメリズム、各lineageともに野生型と有意な差がみられなかった。これはSpredsの機能が、in vivoにおいて他の分子によって代償されていることを示唆した。また平行してconditional double KOマウスの作成を継続した。1年目に作成したES細胞よりマウスを作成し、Spred-2欠損マウスと交配し、Spred-2 flox/-マウスを樹立した。これを、Spred-1欠損マウスと交配し、Spred-1-/-Spred-2-/floxマウスを作成した。さらに、Mx1-Creトランスジェニックマウス(Tg)と交配を重ね、Spred-1-/-,Spred-2-/flox,Mx1-Cre Tgマウスを得た。今後このマウスを用いて、成体マウス造血系特異的なSpredsの役割について、解析をしていく予定である。

変異Nrasは古典的な癌遺伝子であるが、unduggableと言われる程その治療法開発は困難であった。そこで我々は、synthetic lethalの概念を利用して、shRNAiでkinase, phosphataseその他をノックダウンすることにより、変異Nrasを持つ細胞の増殖のみを抑制するNras特異的なターゲット遺伝子を同定することとした。候補遺伝子はNRasの上流、下流などNrasそのもの以外、特に薬剤の開発につなげやすいkinase, phosphataseに求めることとした。<方法>細胞は野生、変異Rasの細胞株3種ずつを用いる。主としてkinase, phosphataseを含む5000以上の遺伝子からなるレンチウイルスshRNAライブラリー(Hahn WC et al, Cell, 2006)により遺伝子をノックダウンする。1つの遺伝子にヘアピンは5-8存在し、1つのwellに1種類ずつヘアピンを加える。培養後、コントロールヘアピンと比較して、変異細胞株のみにおいて増殖を強く阻害したものを候補遺伝子として複数選ぶ。<結果>現在スクリーニングが終了し、アポトーシス関連遺伝子や機能が十分解明されていないものなど8つの候補遺伝子を選んだ。特にNrasそのものが候補遺伝子のランキングの4番目となっており、これはポジティブコントロールとしてデータの信頼性を示すと考えられる。今後in vitro, in vivoにおいて検証していく予定である。