hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
神経作動薬を用いた脳腫瘍幹細胞ターゲット療法の開発

1)ヒト悪性神経膠腫サンプルから脳腫瘍幹細胞(BTSC)細胞株の樹立平成20年度中に、合計6つ(全例、膠芽腫)の脳腫瘍幹細胞株の樹立に成功した。いずれも当初の計画どおりのプロトコールで樹立をおこない成功したもので、本研究で行っている新規培養法の有用性が確認された。また研究試料提供患者に対しては主治医からインフォームドコンセントを十分行い、本実験の趣旨・目的、治療上患者の不利益となることがないこと、承諾後であっても希望があれば試料提供を撤回できること、患者個人情報に関して公になることはないことを明記した承諾書に本人の直筆サインをもらった。2)細胞株のBTSCとしての特性評価平成20年度中に、樹立した細胞株のうち3つの細胞株で、脳腫瘍幹細胞としての特性評価を終了した。いずれの株もNestin, Sox2といった神経幹細胞マーカーを強く発現し、かつ分化マーカーであるGFAP, TuJ1, CNPaseの発現はほとんど認められなかった。これら3つの細胞株を免疫不全マウス(NOD/SCID)脳に定位的移植し、腫瘍形成能を確認中であるが、現在までに少なくとも2つの細胞株で、少数の細胞移植で膠芽腫のxenograft作成に成功している。CD133陽性率をflowcytometryにて確認したところばらつきがみられており、CD133が必ずしも理想的な脳腫瘍幹細胞マーカーではないことを示唆する所見も得た。以上、平成20年度の実験は当初の計画通り非常に順調に進んでいる。平成20年度中に合計6つ(全例、膠芽腫)の脳腫瘍幹細胞株の樹立に成功していたが、平成21年度に更に3つ(膠芽腫2例、乏突起細胞腫1例)の細胞株樹立に成功した。これら合計9つの細胞株の癌幹細胞としての特性の検証をおこなった。その結果、いずれの細胞もCD133, CD15, CD44、Nestinなどの幹細胞マーカーを発現し、さらに強制分化誘導によりastrocyte、oligodendrocyte、neuron系への多分化能を有することを確認した。またこれら細胞株を免疫不全マウス(NOD/SCID)脳に定位的移植し、腫瘍形成能を確認したところ強い腫瘍形成能を有していることが確認でき、治療実験に向けた材料として申し分のない脳腫瘍幹細胞株であることを確認した。2)グリオーマ幹細胞特異的抗腫瘍効果を持つ薬剤のスクリーニング当初候補薬剤として挙げていたapomorphine, PAPP, ifenprodilも含めて、なるべく多くの薬剤を網羅的に検証(drug screening)すべく、FDA承認薬からなるNIH clinical collectionの480種類の薬剤を網羅的に用いた薬剤治療実験系の構築を行った。効果判定にはtime-lapse imagingを用いたlive-cell imaging screening法を用いることとした。これらシステムはすでに当研究施設内でset upされており本研究費からの支出は今のところ予定していない。これによりin vitroでの薬物治療効果実験を開始しはじめており、データが出始めている。以上、平成21年度の実験は当初の計画通り非常に順調に進んでいる。脳腫瘍幹細胞株樹立およびその特性評価株化を試みた脳腫瘍(グリオーマ)16サンプルのうち11サンプル(成功率69%)で脳腫瘍幹細胞株樹立を達成した。得られた11株の全ての脳腫瘍幹細胞株において、CD133,CD15,CD44、Nestinなどの幹細胞マーカーを発現が確認され、強制分化誘導により多分化能を有することも確認した。またこれら細胞株を免疫不全マウス脳に移植したところ全ての株が腫瘍形成能を有していることが確認できた。以上の実験により本研究で提唱した新規培養法の有用性が証明された。グリオーマ幹細胞特異的抗腫瘍効果を持つ薬剤スクリーニング樹立したグリオーマ幹細胞に対して、当初候補薬剤として挙げていたapomorphine,PAPP,ifenprodilも含む480種類の薬剤を網羅的に用いた薬剤スクリーニングを行いin vitroでの抗腫瘍効果の効果判定を行ったところ、apomorphine,PAPP,ifenprodilのみならずindatraline,sertraline,tegaserodなどの神経作動薬においてもグリオーマ幹細胞特異的抗腫瘍効果が確認された。その抗腫瘍効果はTUNEL染色によりapoptosisを介した効果であることを確認した。これら一連の実験により本研究の目的である神経作動薬がグリオーマ幹細胞に対して特異的な抗腫瘍効果を持つことを実証した。更に当初予定はしていなかったが、追加実験として5-ALA(蛍光色素)を用いた光線力学療法(PDT)の可能性を見るべくグリオーマ幹細胞における5-ALA代謝、PpIX(protoporphyrin)排泄能の評価をflowcytometryを用いて行い、グリオーマ幹細胞におけるPpIX排泄能低下を発見した。この結果、グリオーマ幹細胞に対する治療戦略として5-ALAを用いたPDTも有用な治療ツールとなりうることも実証した。
極低温流体の流動不安定現象に関する研究

極低温流体として超臨界圧ヘリウムを対象として実験および解析を行った。既存の液体窒素二相流不安定解析コ-ドを修正し、線型安定判別計算を行った。その結果、(i)伝熱管内でヘリウムが擬臨界曲線近傍の大きな物性値変化を経験することが、流れが不安定になる主要因である。(ii)周期は通過時間のほぼ1.4倍で、発生した不安定は密度波不安定であると考えられる。(iii)安定判別マップを作成し、不安定化の要因について調べた。次に実験を行った。実験範囲は、圧力が0.2260.42MPa、質量流量が0.030.15g/s、入口温度5.26.0kである。その結果、加熱入力を増すにつれてA,B,Cの順で次の3種類の振動現象が観察された。(A)低加熱入力で発生する、0.71.2秒の周期をもつ振動の圧力、流量ともに振動するが、出口圧力振動振巾が非常に大きいことが特徴である。これは、主に、出口配管(管内で液体ヘリウム温度室温の温度変化がある)で発生するヘルムホルツ型音波振動であると考えられる。(B)周期が1176秒と非常に長い振動。これは、加熱部内の加熱、および出口配管での熱侵入による加熱が原因となって発生した密度波振動であると考えられる。(C)周期が0.82.9秒の振動。これは上記解析結果と、振動発生境界、周期ともによく一致する。従って、加熱部内での加熱が原因となって発生した密度波振動であると考えられる。以上の振動はすべて、入口温度が擬臨界温度以下であるとき発生した。更に、B,Cの振動は管内で流体が擬臨界曲線を横切るように加熱され、その際物性値の大きな変化を経験することに生じることから上記解析結果、ならびにThurstonら多くの研究者の実験結果が裏付けられた。次に実験を行った。
ヒト胃癌細胞株同所性移植による高転移株の樹立と生物学的特性の解析

同一の親株から血行性転移モデル、リンパ節転移モデル、腹膜転移モデルを樹立することで各転移形式別に特異的に関与する因子を同定することを日的とした。胃癌細胞株AZ521 5×10^6/0.1mlの細胞浮遊液をマウス胃壁に接種する細胞注入法を用い同所性移植を施行した。移植するマウスは生後6-7週、体重16-20gの雌(BALB/cAjcl-nu)を用いた。リンパ節転移巣、肝転移巣の転移細胞を培養しAZL1G、AZH1Gを樹立した。さらに上記のことを4回繰り返しAZL5G、AZH5Gを樹立した。AZ521の同所性移植では腹膜転移を形成しなかったため、腹腔内細胞注入を3回繰り返した腹膜転移株を樹立し、次に同所性移植により腹膜播腫転移巣の転移細胞を培養しAZ3P1Gを樹立した。さらに上記のことを2回繰り返しAZ3P3Gを樹立した。以下、親株との比較検討を行った。1.移植腫瘍の転移率:AZL5Gのリンパ節転移率は85.0%、AZH5Gの肝転移率は87.50%、AZ3P3Gの腹膜播腫転移率は80.0%であった。2.細胞増殖能:in vivoではAZL5G、AZH5G、AZ3P3Gは明らかにAZ521の増殖能を上回った。3.細胞運動能:全ての転移株はAZ521に比し亢進を認め、AZ3P3Gにおいて顕著であった。4.接着分子の発現:FACSによる細胞表面接着分子の発現では、AZL5Gではα_1、α_2インテグリン、AZH5Gではα_1、α_2、α_3、α_5インテグリン、AZ3P3Gではα_2、α_3、α_5、α_6インテグリンの発現が亢進していた。5.細胞接着能:AZL5GはtypeIV collagen、fibronectin、AZH5Gはfibronectin、AZ3P3GはtypeIV collagen、fibronectin、lamininに対する接着能が亢進していた(p<0.05)。6.血管新生因子産生量:VEGFの産生量ではAZL5Gは差を認めなかったが、AZH5Gでは増加、AZ3P3Gでは低下していた。7.血管新生阻害剤による転移抑制はAZH5Gにおいてのみ認められた。8.VEGF-C遺伝子の発現:AZL5GにおいてのみVEGF-Cの発現が認められた。以上のように補助金は補助条件に従って、非常に有用に使用されている。浸潤・転移は癌細胞自体の移動というメカニズムによって、癌が宿主を攻撃する過程に共通の現象であり、この過程においては遺伝子変異の存在や細胞接着分子などの転移関連物質の関与が考えられている。

胃癌治療の臨床上、腹膜転移に関しては、その治療法の開発ならびに防止対策は十分ではなく今後極めて重要な課題であると考えられる。本件研究では種々のヒト胃癌細胞株を用い、同一の親株から腹膜転移モデルを樹立することで各転移形式別に特異的に関与する因子を同定することを目的とした。ヌードマウス可移植性培養株化細胞として低分化型腺癌であるヒト胃癌細胞株AZ521 5×10^6/0.1mlを生後6-7週、体重16-20gの雌(BALB/c Ajcl-nu)マウスの胃壁に接種する細胞注入法を用い同所性移植を施行したが、腹膜転移巣は明らかな形成を示さなかった。そこで腹腔内投与を3回施行し、転移率を増加させた株を同所性に移植することにより腹膜転移株の樹立を試みた。一方、現在までに同一の親株から高肝転移株、高リンパ節転移株を樹立している。また、MKN45、GT3TKBなどの低分化型腺癌株による同所性移植により、高転移株を作成している。腹膜転移株のFACS解析による細胞表面接着分子の発現ではβ1integrinの発現上昇が認められ、また、fibronectinによるchemotaxisでは転移株における細胞運動能の亢進を認めた。この運動能の亢進が腹膜転移の形成に強く関連している可能性が考えられている。現在、転移関連因子を標的とした阻害実験を施行している。微小環境の影響による細胞集団の変化が転移形成に重要な役割を演ずることが明らかにされ、腹膜転移においても特異的に関与する因子が存在すると考えられる。同一の親株から血行性転移モデル、リンパ節転移モデル、腹膜転移モデルを樹立することで各転移形式別に特異的に関与する因子を同定することを目的とした。胃癌細胞株AZ521 5×10^6/0.1mlの細胞浮遊液をマウス胃壁に接種する細胞注入法を用い同所性移植を施行した。移植するマウスは生後6-7週、体重16-20gの雌(BALB/cAjcl-nu)を用いた。リンパ節転移巣、肝転移巣の転移細胞を培養しAZL1G、AZH1Gを樹立した。さらに上記のことを4回繰り返しAZL5G、AZH5Gを樹立した。AZ521の同所性移植では腹膜転移を形成しなかったため、腹腔内細胞注入を3回繰り返した腹膜転移株を樹立し、次に同所性移植により腹膜播腫転移巣の転移細胞を培養しAZ3P1Gを樹立した。さらに上記のことを2回繰り返しAZ3P3Gを樹立した。以下、親株との比較検討を行った。1.移植腫瘍の転移率:AZL5Gのリンパ節転移率は85.0%、AZH5Gの肝転移率は87.50%、AZ3P3Gの腹膜播腫転移率は80.0%であった。2.細胞増殖能:in vivoではAZL5G、AZH5G、AZ3P3Gは明らかにAZ521の増殖能を上回った。3.細胞運動能:全ての転移株はAZ521に比し亢進を認め、AZ3P3Gにおいて顕著であった。4.接着分子の発現:FACSによる細胞表面接着分子の発現では、AZL5Gではα_1、α_2インテグリン、AZH5Gではα_1、α_2、α_3、α_5インテグリン、AZ3P3Gではα_2、α_3、α_5、α_6インテグリンの発現が亢進していた。5.細胞接着能:AZL5Gはtype IV collagen、fibronectin、AZH5Gはfibronectin、AZ3P3Gはtype IV collagen、fibronectin、lamininに対する接着能が亢進していた(P<0.05)。6.血管新生因子産生量:VEGFの産生量ではAZL5Gは差を認めなかったが、AZH5Gでは増加、AZ3P3Gでは低下していた。7.血管新生阻害剤による転移抑制はAZH5Gにおいてのみ認められた。8.VEGF-C遺伝子の発現:AZL5GにおいてのみVEGF-Cの発現が認められた。
視覚素材に対する視知覚分析

学習者が視覚素材をどのように見ているかを明らかにするため, Free View T.K.K.2920[○!R](竹井機器工業社製)を用いて眼球運動を測定する実験を行い,以下の結論を得た。1.教育を受けた者に比べ,教育を受ける前の者は視覚素材全体を広く見る傾向にあった。2.視覚素材の中で教育者の意図したことに学習者は注目できていないと思われた。3.視覚素材を見るとき専門家(教育者)は合理的に見るのに対し,学習者は視線の軌跡が複雑となり合理的な見方をしていないといえた。ラバーダム防湿を装着した顔写真とラバーダム防湿の説明文からなるテスト画像を用い,歯学部5年生29名を被験者としFreeViewT.K.K.2920を用いて眼球運動を測定。テスト画像では写真の下方に文章を配置。停留点について,実験画像上に現れた部位別(写真,説明文,その他の3部位に分類)回数と時間を集計し全被験者の平均値を求めた。結果は停留回数・停留時間ともに写真より説明文で優位に多く,説明文における視覚情報処理の複雑さが伺えた。またテスト画像の写真と説明文の配置を替え(写真を左方,説明文を右方)同様に眼球運動を測定。写真を上方,説明文を下方に配置した実験と同様の結果を得た。写真と説明文の配置が異なる二つの実験間で同じ部位毎に停留点を比較したが,回数・時間ともに有意差を認めず。以上を「写真と説明文に関する視覚情報処理-符号化と解読について-」,「写真と説明文に関する視覚情報処理-配置について-」と題し,第20回日本歯科心身医学会学術大会で発表。写真上部に小臼歯用クランプを配置しその下にこれと同じものを左下に含む4つのラバーダムクランプを四角に配置したテスト画像1を用いて学生18名の眼球運動を測定,また下4つのクランプが天地逆のテスト画像2を用いて学生13名の眼球運動を測定した。事前に上部のクランプと同じ型を下の4つの中から探すよう指示した。上部に配置したクランプは標的項目であり,正解以外の3つのクランプは妨害項目となる。テスト画像1では,14名の眼球運動軌跡を3つのパターンに分類できた。テスト画像2では,眼球運動軌跡はほとんどパターン化することがなく,被験者により個々の様相を呈した。正解クランプに到達するまでの時間は短く,また正解クランプへの停留回数,停留時間ともに少なかった。以上よりクランプの再認において学生は標的項目と妨害項目とを逐一見比べたり,全体を見渡してから正解に到達するのではなく,短時間で正解に到達していることがわかった。上部に標的項目としてNo.P1クランプ(乳臼歯用)を配置し,その下にこれと同じものを右下に置いて4つのクランプ(No.P1,P2,200,206)を天地逆向きで四角に配置したテスト画像を用い学生14名の眼球運動を測定した。実験直後に同じ型のものがどの位置にあったかを被験者に確認した。眼球運動軌跡は,(1)反時計回りに周回してP1クランプへ到達,(2)時計回りに周回あるいは直接P1クランプへ到達,(3)周回せずに不規則な軌跡でP1クランプへ到達,に分類できた。標的項目の再認で錯誤した被験者は3名で眼球運動軌跡のパターンは(2)だった。標的項目を速く再認したのは「時計回り」の被験者であるが錯誤した被験者はこの中に含まれ,標的項目と同じクランプへ速く到達するような眼球運動よりも,異なるクランプから見たり,標的項目と各クランプとを見比べていくような眼球運動において錯誤が少ないと推測できた。日本歯科大学新潟生命歯学部5年生のボランティア14名を実験対象者とし,顎模型の写真を提示した後に矢印が指し示した歯に用いるラバーダムクランプを次に提示したテスト画像の中で選択させた。その時の眼球運動を10秒間測定記録した。テスト画像中のラバーダムクランプはNo.P1,No.P2,No.200,No.206の4種とした。眼球運動測定後には,どのクランプを選択したか実験対象者に確認した。矢印の歯は右側第一乳臼歯であり,最も適合するクランプはP2となる。初回停留点の位置はNo.P1:2名,No.P2:3名,No.200:8名そしてNo.206:1名であった。初回停留点はNo.200上に最も多く,テスト画像中No.200の位置は模型写真での矢印の近くに相当し,連続する写真の提示では前画面の注目位置に次画面の初回停留点が誘導されたと考えられる。

各実験対象者の選択したクランプ上に停留回数・停留時間を多く数えたが,選択した後もなお同じクランプの情報収集を継続していたとことがうかがえた。最適なNo.P2クランプを選択した実験対象者は14名中6名であった。他のクランプを選択した実験対象者に実験後質問したところ,多くが矢印の示した歯を小臼歯と答えた。実験では,模型写真で歯の形態を認識し歯種を特定しておく必要があるが,実験対象者は乳歯であることにも気付かず,「大臼歯の近心にある歯」程度の認識を得るに過ぎなかったのではないか。本実験では,模型の向きと適用する際のクランプの向きとを一致させて,実験対象者がクランプを選択する際に向きが障害にならないよう配慮した。歯の形態を認識していた実験対象者は少ないと推測され,視覚素材を提示する際には観察事項を具体的に指示する必要のあることが示唆された。以上を「ラバーダムクランプを選択する際の視知覚情報処理-顎模型を提示した場合-」と題し第45回日本小児歯科学会大会において発表した。歯科医学教育において学習者の理解を助けるために視覚素材が用いられるが,教育者の意図を学習者が正しくつかんでいるかは明らかでない。教育者自身は視覚素材を見たとき,専門家であるがために,情報を探索する上で合理的な見方をしているのではなかろうか。学習者と教育者との間で情報探索の仕方に差が有るとすれば,学習者が教育者と同様な情報探索を行えるよう視覚素材を考慮する必要がある。そこでまず歯学部5年生のボランティア20名に対して混合歯列顎模型と4種のラバーダムクランプの写真を同時に提示するテスト画像を用い,指示した歯に適合するラバーダムクランプを選択する際の眼球運動を測定するとともに,選択するまでの反応時間を記録する実験を行った。また同じテスト画像を用い,小児歯科専門医2名と小児歯科認定医2名の計4名で同様に実験を行った。両実験結果を比較したところ,選択するまでの反応時間は学生の平均が13秒だったのに対し小児歯科医では4秒と短かった。また,指示した歯に最適なラバーダムクランプを選択した学生は20名中7名であったが,小児歯科医は全員が正しく選択した。そしてラバーダムクランプを選択する際の眼球運動の軌跡について比較すると,学生では顎模型と各ラバーダムクランプの間を繰り返し視線が走査し複雑な軌跡を示したのに対し,小児歯科医では模型から目的のラバーダムクランプに至るまで非常に単純な軌跡を示した。以上より,学習者と教育者とでは同じ視覚素材を見ても情報探索の仕方が異なり,学習者は教育者のように合理的に視覚素材を見ていないことが確認できた。
オートマトン、形式言語および計算理論の研究

1)オートマトンの代数的構造の研究を行った。とくに、オートマトンの状態集合を層に分解し層間に半順序関係を導入し、与えられたオートマトンの部分オートマトンの構造の決定に応用した。またオートマトンの自己同型群の構造とオートマトンの層との関係を研究した。2)言語および語上の演算子の研究を行った。とくに重複閉包演算の研究を重点的に行った。文脈自由言語の有界重複閉包は文脈自由言語になるが正規言語の有界重複閉包は必ずしも正規言語にならないことを示した。正規言語の有界重複閉包が正規言語になるための条件を調べた。3)分担者は、Groverの量子探索アルゴリズムの改良を試みた。研究代表者の平成24年度の研究実施計画の「語および言語上の演算の研究」に関しては、重複閉包演算による言語階層の保存性の条件が詳しく検討された。また前年度の研究実施計画にあった、回文からなる文脈自由言語の構造の研究が継続された。その成果は研究代表者とP. Domosiの共著書「Context-Free Languages and Primitive Words」(World Scientific)の一節に盛り込まれると同時に、研究集会「代数系および計算機科学基礎」において発表された。平成25年度の研究実施計画の「オートマトンの代数的研究」が平成24年度に先行して行われた。この研究での成果として、与えられたオートマトンのすべての部分オートマトンの集合がなす上半束の構造が明らかにされた。この結果はTheoretical Computer Scienceで公刊された。もうひとつの成果として、自己準同型単位半群が下半束になるようなオートマトンの構造が決定された。この結果は、研究集会「代数とコンピュータサイエンス」で発表された。研究分担者による「量子探索アルゴリズムの研究」に関しては、従来の単一位相整合の一つであるLi & Li位相整合に基づき、任意の与えられた標的割合に対して必ず成功確率が1になる位相因子を決定する最もコンパクトな表式の厳密解を求めた。また、単一位相整合法で成功確率が1の探索を達成するための探索ステップ数と、グローバーのアルゴリズムの最適探索ステップ数との関係を明らかにした。さらに、Li & Liあるいはそれと物理的には等価なLongの位相整合が、任意の標的割合に対して探索成功確率が1という強い条件の下で、HoyerやHsieh & Liによって提案されたより複雑な位相整合と比較して、探索スピードにおいても最適であることの明確な証明が得られた。研究代表者の平成25年度の研究実施計画の「語および言語上の演算の研究」に関しては前年度に引き続き言語上の重複閉包演算の研究を行いほぼ最終的な結果が得られた。とくに文脈自由言語の重複閉包演算による文脈自由性の保存に関しては、与えられた文脈自由言語を受理するプッシュダウンオートマトンからその文脈自由言語の重複閉包を受理するプッシュダウンオートマトンを完全に構成することが出来た。この結果は京都大学数理解析研究所研究集会「計算機科学における論理・代数・言語」に於いて発表された。またイエナ大学G. Lischke博士とはオートマトンの部分オートマトン類のなす半束の研究と語の周期性の研究を行った。とくに部分オートマトン類のなす半束に関してはその構造を決定した。以上の研究の成果に関しては雑誌論文として投稿準備中である。「オートマトンの代数的研究」に関しては強連結オートマトンの表現である群行列型オートマトンに関しハンガリーのデブレツェン大学大学院に於いて集中講義を行った。その過程中に一般群行列型オートマトンの正規性に関してのヒントが得られた。研究分担者は平成25年度には量子演算子の解法に関しての基礎的研究を行った。すなわち、調和振動子のコヒーレント波束解を従来の伝統的な方法と時間発展演算子を用いた方法の2つの異なった方法で求めると異なった解析解が得られというパラドックスが指摘されていたが、この見かけ上全く異なる形をした2つの解析解が実は同じであることを解析的に示した。この結果は量子探索アルゴリズムの研究に応用出来る可能性がある。なお、平成25年度の研究代表者の経費執行額が0円となっている理由は、研究室の確保等のために海外研究協力者の招聘にかかわる経費の執行を研究分担者にして貰ったためである。研究実施計画の「形式言語の代数的研究」に関しては、回文からなる文脈自由言語を生成する文法の研究が研究代表者、P. DomosiおよびSz. Fazekasとの共同研究として行われた。その成果は研究代表者とDomosiの共著書「Context-Free Languages and Primitive Words」(World Scientific, Singaporeより刊行予定)の一節に盛り込まれた。

「非通常計算理論の研究」に関しては、研究分担者達の提唱した多重位相整合の量子探索アルゴリズムの位相パラメータの最適解を、多項式の解として得る方法が開発されY. Nogami達との共著論文としてCanadian Journal of Physicsで公刊された。「オートマトンの代数的研究」に関しては、オートマトンの構造に関して新しい理論が構築された。オートマトンの状態集合上にある種の同値関係を導入することにより、オートマトンの状態集合が層とよばれる同値類に分解される。これらの層のなす半順序集合の構造を調べることにより、与えられたオートマトンのすべての部分オートマトンの構造、部分オートマトンがなす半順序集合の構造等が明らかになった。また、層を用いて、オートマトンをその自己同型群と関連させながら分解・合成する新しい理論も構築された。これらの結果はTheoretical Computer Scienceで公刊された。平成24年度の研究実施計画に記載した「語および言語上の演算の研究」も先行して行われた。重複閉包演算の研究で、複製される語の集合が有限集合の場合には、正規言語の重複閉包は必ずしも正規言語にならないことの証明、重複閉包演算で正規性が保存されるための条件等が検討された。その成果は、ハンガリーで開催された国際会議での招待講演として発表された。平成23年度および平成24年度の研究のうち、「有向オートマトンの最短有向語の長さに関しての研究」、「半群論とオートマトン理論の統合」および「語の周期性の研究」は実施されていない。理由は、当初の計画のうちの一部の研究計画は単年では完了せず継続して研究する必要があったためである。このことを除けば、平成25年度の研究実施計画に記載した「語および言語上の演算の研究」および「オートマトンの代数的研究」も先行して行われており、未実施の研究計画を補っているとも言える。当初の計画のうち、「有向オートマトンの最短有向語の長さに関しての研究」は実施されなかった。ひとつの理由は、オートマトンの代数的構造に関しての新しい結果が得られて研究の関心がそちらに向いたためである。このことを除けば、平成24年度の研究実施計画に記載した「語および言語上の演算の研究」も先行して行われており、ある意味では「当初の計画以上に進展している」とも言える。研究代表者の研究としては、平成23年度および平成24年度に未実施であった研究を優先的に行う。特に「語の周期性の研究」は、この課題で共著論文を刊行したことのあるG. Lischkeから5月に研究代表者がJenaに招待されていることと、7月に研究代表者がLischkeを科学研究費補助金により京都に招待する予定なので集中的に研究を行う。研究方法としては数学的手法、特に組合せ論および代数系理論(半群論、群論および束論)の適用が主となる。研究分担者は、平成25年度も引き続き、複数の古典的粒子間の相対論的衝突過程における粒子間のエネルギー移行の問題と量子探索アルゴリズムとのアナロジーについて研究する。研究代表者の研究としては、平成23年度に未実施の研究「有向オートマトンの最短有向語の長さに関しての研究」を実施するとともに、交付申請書に記載した平成24年度、25年度の研究計画を順次実施して行く。
接合伝達を利用した遺伝子移動システムの構築

放線菌線状プラスミド、SAP1の系が有効であることは確認できた。接合伝達利用の有効性は十分発揮できたことより、他のベクターに接合能を付与できれば、さらに接合系の有用性は広がる。我々が研究してきた放線菌伝達性プラスミドpSN22の伝達に関与する必須領域traR, traA, traB, cltを同定し、それらを移植することで非伝達性のプラスミドを伝達性に変換可能か否かを試した。Chenらが開発した線状クローニングベクターpLUS9800に上記必須領域(RABclt)をクローン化した。本ベクターは線状にしない限り、環状でθ複製型のプラスミドとして存在する。また大腸菌から分離したのち、制限酵素で処理して線状化した後、放線菌に導入すると線状プラスミドとして存在する。RABcltをクローン化したベクターは伝達能を示した。また、SAP1の伝達必須領域の移植によるpLUS9800の伝達も確認したが、線状レプリコンにした場合にはttrAを要求した。IncP1グループに属する広宿主域プラスミド、RP4の接合伝達系を利用した遺伝子操作系の確立を目指した。RP4は多くの菌株に対する接合伝達が可能な系であり、本研究で中間宿主として選択した枯草菌に対しても接合伝達する可能性が高いと予想した。シャトルベクターを作製し、大腸菌S17-1ΔMuから枯草菌BEST22142A(Spc)への接合伝達条件を検討し、接合の最適化を行った。培養条件、接合条件などを検討し、RP4システムによる接合を最適化した。また、大腸菌の系では効率が高すぎて、はっきりとした結論が得られていなかったoriTの最適長について、属間接合の系を用いてはっきりとした結論を得ることができた。この系は既に希望する研究者に配布して実効性をチェックしている。26年度が最終年度であるため、記入しない。平成25年度は、放線菌線状プラスミドSAP1の接合を用いた生合成遺伝子クラスターの簡易操作をさらにブラッシュアップする予定であった。しかし放線菌中間宿主のゲノムチューニングやSAP1上への複数組み込み部位の構築などの初期計画は比重を下げて研究を行い、26年度計画の枯草菌への接合を中心に研究を進めた。広宿主域接合系であるRP4系を用いた大腸菌から放線菌への種間結合は、初発大腸菌のゲノムチューニングと放線菌への属間接合の最適化を目標に初期計画に上げていた。これに関してはこれまで利用していた属間接合のシス領域であるoriT領域が効率的接合には短すぎることが判明し、最適な長さのoriTを再定義した。このoriTの長さによる影響は大腸菌間の接合では見られない系であった。また、主たるRP4系の宿主菌としてゲノムにRP4のtra遺伝子群を有するS17-1系のゲノムを相同組換えで操作し、構造上株の不安定要因であったMuファージ部分を欠失し、さらに放線菌の制限修飾系を部分回避するためにdcm遺伝子の破壊も行った。なお、これらの遺伝子破壊は連携研究者である奈良先端大の森浩禎教授の下で実施したものである。また、放線菌の初期計画が計画班で達成されたため、平成26年度計画であった枯草菌の生合成マシナリー化を目指した、大腸菌から枯草菌への接合系の開発を開始した。現在まで定量的データで語られたことのない枯草菌への接合伝達を確認し、系の最適化を行った。

26年度が最終年度であるため、記入しない。放線菌におけるSAP1のベクター化に関しては、既にSAP1の供給元であり、本領域研究計画班の池田研究室で大きな進展を遂げている。申請者の研究室でもいくばくかの成果は上がって来たが、池田研ほどの成果を上げるには至っていない。この点で達成度は低かったと判断する。しかし計画班が先行した結果であり、申請者は計画班の研究協力者でもあり、サブグループとしては喜ばしい結果であった。大腸菌から放線菌への種間接合に関しては、現在までに知られていなかった効率化因子や、S17-1などのtra領域ゲノム組み込み株をつかう事の是非など、現在まで報告のなかった事実が明らかになってきており、また、Mu欠損による株の安定性の向上などが見られた。ただし、S17-1が持つ初発宿主としての不都合も同時に明らかになってきており、より最適な系を求める探索を始めている。この項目に関しては、未知の事実も明らかになっており、普通の達成度と判断した。枯草菌への接合伝達系はこれまでほとんど知られておらず、定量的データや標準プロトコールもない状態からはじめ、定量的な比較データをだし、接合実験のプロトコールも固定化できた。この部分関しては初期計画よりも遙かに進んだと判断した。これらの結果よりやや標準よりは遅れているという判断を下した。放線菌に関しては計画班が世界最高レベルにまで系をブラッシュアップしているため、大腸菌からの接合伝達に注力する。特にS17-1でなく、RP1系やR6K系を用いた系を開発する準備にはいっている。枯草菌への接合伝達をプロコール化できたことは、納豆菌など自然形質転換能をもたない枯草菌の近縁種への遺伝子導入、しかも巨大な遺伝子の導入方法確率の可能を示している。これらの自然形質転換能を持たない株への接合伝達系をさらに開発する。また、プロトコール化した手法に関しては投稿準備中であり、最終年度中には論文として発表する予定である。
LKB1を介した胃腸管における腫瘍抑制機構の解析

Peutz-Jeghers症候群(PJS)は胃腸管に過誤腫を形成し、高い発癌率を示す遺伝性疾患である。PJSのモデルマウスであるLkb1+/-マウスは、胃腸管および、肝臓に腫瘍を形成する。p53がLKB1と結合しLKB1の機能を制御している報告があることから、当研究室ではLkb1+/-p53-/-複合変異マウス(Lkb1+/-p53-/-マウス)を作出した。1,Lkb1+/-p53-/-複合変異マウスの解析Lkbl+/-p53-/-マウスは、Lkb1+/-マウスに比べ、胃や肝臓における腫瘍形成が早まることが明らかになったことより、腫瘍形成においてLKB1とp53が協調していることが示された。また、Lkb1+/-p53-/-マウスは、Lkb1+/-マウスでは観察されない卵巣痛を発症した。卵巣癌はPJSにおいて高頻度で観察される腫瘍のひとつであることより、Lkb1+/-p53-/-マウスは、よりよいPJSのモデルとなることが示唆された。2,培養細胞におけるLKB1とp53の相互作用の解析LKB1のDNA損傷応答への関与が示唆されることから、大腸がん細胞株において、siRNAによりLKB1や,p53の発現をノックダウンし、DNA損傷応答への反応性を以下の点について対照細胞株と比較した。(1)細胞生存性10Gyのγ線を照射後、対照細胞株に比べ、LKB1ノックダウン細胞株においては細胞死が多く観察され、また、照射して長期培養後のコロニーの形成率も低かった。(2)p53のリン酸化10Gyのγ線を照射した後、LKB1ノックダウン細胞において,53のリン酸化状態が少なかったことから、LKB1がp53の活性を制御している可能性が示唆された。(3)G2アレストへの影響10Gyのγ線を照射した後、分裂細胞の割合を調べると、LKB1の発現を抑制した細胞株では対照細胞株に比べて割合が高かったことから、LKB1のG2アレストへの関与が示唆された。また、LKB1とp53の発現を同時にノックダウンした細胞株では、γ線を照射後の分裂細胞の割合がさらに高かったことから、DNA損傷応答におけるLKB1とp53の協調作用が示唆された。(1)Lkb1+/-p53-/-マウスの胃における腫瘍形成の解析Lkb1+/-p53-/-マウスの胃における腫瘍発生時期を解析したところ、Lkb1+/-マウスに比べ、8週早く腫瘍形成が始まることが示された。次に腫瘍の組織型を比較したところ、Lkb1+/-マウスに形成される腫瘍と同様の組織型であることが示された。Lkb1+/-マウスはLkb1のhaploinsufficiencyが原因で腫瘍を形成する。Lkb1+/-p53-/-マウスにおいても同様の機構で腫瘍が形成されるかどうかを調べるために、胃の正常部と腫瘍部において、Lkb1の野生型DNA量とタンパク質をゲノミックPCRとウェスタンブロッティング法を用いて、比較した。これらが正常部と腫瘍部で変化がなかったことから、Lkb1+/-p53-/-複合変異マウスにおいても、Lkb1のhaploinsufficiencyが原因で腫瘍が形成されることが示された。以上のことより、p53をLkb1+/-マウスにおいて欠損させると、腫瘍の発生時期を早めることが示された。(2)Lkb1+/-p53-/-マウスの肝臓における腫瘍形成の解析Lkb1+/-p53-/-マウスの肝臓における腫瘍形成時期を解析したところ、Lkb1+/-マウスに比べて腫瘍形成が早まることが明らかになった。Lkb1+/-マウスはLkb1のLOHが原因で肝臓に腫瘍を形成する。Lkb1+/-p53-/-マウスの肝臓における腫瘍においてもLkb1のLOHが観察されたことから、p53を欠損させることで肝臓におけるLkb1のLOH頻度をあげ、腫瘍発生時期を早めていることが示唆された。(3)Lkb1+/-p53-/-マウスの卵巣における腫瘍形成の解析Lkb1+/-p53-/-マウスは卵巣に悪性の腫瘍を形成する。これらの腫瘍ではLkb1のLOHが観察され、組織型はPJS患者でよく見られる型のものであった。以上より、Lkb1+/-p53-/-マウスは卵巣癌の有用なモデルとなる可能性がある。

Peutz-Jeghers症候群(PJS)は胃腸管に過誤腫を形成し、高い発癌率を示す遺伝性疾患である。PJSのモデルマウスであるLkb1+/-マウスは、胃腸管および、肝臓に腫瘍を形成する。p53がLKB1と結合しLKB1の機能を制御している報告があることから、当研究室ではLkb1+/-p53-/-複合変異マウス(Lkb1+/-p53-/-マウス)を作出した。1,Lkb1+/-p53-/-複合変異マウスの解析Lkbl+/-p53-/-マウスは、Lkb1+/-マウスに比べ、胃や肝臓における腫瘍形成が早まることが明らかになったことより、腫瘍形成においてLKB1とp53が協調していることが示された。また、Lkb1+/-p53-/-マウスは、Lkb1+/-マウスでは観察されない卵巣痛を発症した。卵巣癌はPJSにおいて高頻度で観察される腫瘍のひとつであることより、Lkb1+/-p53-/-マウスは、よりよいPJSのモデルとなることが示唆された。2,培養細胞におけるLKB1とp53の相互作用の解析LKB1のDNA損傷応答への関与が示唆されることから、大腸がん細胞株において、siRNAによりLKB1や,p53の発現をノックダウンし、DNA損傷応答への反応性を以下の点について対照細胞株と比較した。(1)細胞生存性10Gyのγ線を照射後、対照細胞株に比べ、LKB1ノックダウン細胞株においては細胞死が多く観察され、また、照射して長期培養後のコロニーの形成率も低かった。(2)p53のリン酸化10Gyのγ線を照射した後、LKB1ノックダウン細胞において,53のリン酸化状態が少なかったことから、LKB1がp53の活性を制御している可能性が示唆された。(3)G2アレストへの影響10Gyのγ線を照射した後、分裂細胞の割合を調べると、LKB1の発現を抑制した細胞株では対照細胞株に比べて割合が高かったことから、LKB1のG2アレストへの関与が示唆された。また、LKB1とp53の発現を同時にノックダウンした細胞株では、γ線を照射後の分裂細胞の割合がさらに高かったことから、DNA損傷応答におけるLKB1とp53の協調作用が示唆された。
インスリン抵抗性とGLUT4トランスロケーションの障害に関する研究

インスリン抵抗性病態では、インスリン応答性のGLUT4トランスロケーションが著しく減弱しているが、その病態機序の全貌については未解明である。生化学的およびナノ計測学的な解析により、Vps10p受容体ファミリーに属するSortilinがインスリン応答性GLUT4貯蔵小胞の形成に必須であること、さらにインスリン抵抗性病態ではSortilin減少に伴うGLUT4のソーティング障害が惹起されていることを明らかにした。既知の「シグナル伝達系の減弱」に加えて、「ソーティング障害」に起因したインスリン抵抗性病態の発症機序が存在することを示す新知見である。インスリン依存性糖輸送作用に関わるGLUT4は、そのインスリン応答性を獲得するためにGLUT4貯蔵小胞とよばれる特別な小胞コンパートメントにソーティングされることが第一義的に重要である。そのためGLUT4貯蔵小胞の形成不全はインスリン抵抗性の直接的な原因になると考えられるが、解析の難しさからその不全の詳細についてはほとんど解明されていなかった。本研究では、このGLUT4貯蔵小胞の形成に関わるソーティング蛋白(Sortilin)に注目して上記の点について解析を行った。その結果、パルミチン酸などの高濃度飽和脂肪酸によって惹起されるインスリン抵抗性病態筋細胞では、Sortilin蛋白量の顕著な減少が惹起されていることをまず発見した。このSortilin蛋白量の減少には、mRNAの発現低下とSortilin蛋白の寿命(Half-life)減少の2つの機序が関与していること、さらにパルミチン酸処理により惹起されるストレス応答性キナーゼ(Protein Kinase theta/PKCθ)が、その蛋白量減少に深く関与していることを明らかにした。一方、不飽和脂肪酸であるオレイン酸には、上記の様な悪影響は全くなく、むしろパルミチン誘導性の増悪作用に対する抑制効果(インスリン抵抗性の改善効果)が認められた。また、Sortilin量の人為操作により、インスリン反応性GLUT4トランスロケーション大きく影響されるだけでなく、インスリン抵抗性改善薬として知られるチアゾリジン系の薬剤は、パルミチン酸誘導性のSortilin蛋白減少を有意に抑制することを見いだした。これらの結果から、Sortilinはインスリン応答性GLUT4貯蔵小胞形成に必須の役割を果たしており、Sortilin蛋白とその分子基盤はインスリン抵抗性病態の新たな治療標的として重要であると考えられた。インスリン抵抗性病態では、Vps10p受容体ファミリーに属するSortilinの減少とGLUT4(インスリン反応性糖輸送担体)のトランスロケーション障害が生じていることを昨年度までに明らかにしている。本年度は、独自に開発した「単一分子ライブイメージング解析手法」を駆使することにより世界最高精度にてGLUT4分子挙動をナノ計測し、Sortilinが減少した病態時における病態分子機序を解明するこどを試みた。その結果、(1)Sortilinは再循環エンドソームからトランスゴルジ網(TGN)へのGLUT4分子選択的な逆行性輸送に必須の役割を果たすこと、(2)このSortilin依存性のGLUT4逆行性輸送にはRetromer複合体とgolgin-97による協調作業が関与すること、(3)TGNへとソーティングされたGLUT4分子はこの領域に繋留され、その結果GLUT4の分子動態は極めて低く保持されていること、(4)TGN領域にて繋留されたGLUT4分子(小胞)がインスリン刺激に反応して放出されるためにはRabGAPとして機能するAS160/Tbc1d4(とそのAkt依存性リン酸化反応)が必須であることをGLUT4分子動態ナノ計測法により世界で初めて解明することに成功した。よって、(5)病態時においてSortilin減少が惹起されると、上述したGLUT4分子の適正なソーティングに障害が生じ、結果としてインスリン反応性を所持するGLUT4小胞の形成不全が起きていると考えられた。これらの研究成果は、これまでに明らかにされている「シグナル伝達系の減弱」に加えて、「ソーティング障害」に起因したインスリン抵抗性病態の発症機序が存在することを示す非常に重要な新知見である。インスリン抵抗性の病態細胞モデルにおいて、Sortilin量の減少があること、さらにSortilinはGLUT4のソーティング制御に必須を果たすことを明らかにし、病態下で惹起されるSortilin量減少はインスリン反応性を所持するGLUT4含有小胞の形成不全を惹起することを見いだしている。最終年度はこの新知見をさらに深化させ、Sortilin機能により核周辺部位へと繋留されるGLUT4小胞のインスリン依存性輸送活性化機序について調べた。その結果、TBC1DファミリーRabGTPase活性化蛋白(RabGAP)であるTbc1d1とTbc1d4(AS160)は、Sortilin機能により生合成されたGLUT4貯蔵庫の繋留状態を解放する役割を有することを明らかにした。1Tbc1d4(AS160)はインスリン刺激に反応しGLUT4解放を誘導するが、2Tbc1d1はインスリン応答性を示さず、GLUT4輸送促進できなかった。

しかし、3Tbc1d1はAMP依存性キナーゼ(AMPK)活性化によってGLUT4輸送活性を促進した。興味深いことに、4AMPK活性化を一端経験した後では、Tbc1d1は「インスリン反応性を獲得」してインスリン依存性のGLUT4輸送活性化を示した。さらに重要なことに、5女性超肥満患者において同定されたTbc1d1変異(R125W)では、この運動刺激後に獲得されるインスリン応答性の亢進が全く欠落していること、6R125を含むリン酸化チロシン結合(PTB1)領域の人為変異体(PTB機能欠損変異)でも同様に運動効果が欠落することを明らかにした。これらの結果はTbc1d1依存性のインスリン応答性獲得機構が運動効果の分子基盤としてあり、その障害はヒト肥満を惹起する病理機序の一つであることを示唆する重要な発見である。インスリン抵抗性病態時におけるGLUT4(インスリン反応性糖輸送体)のトランスロケーション障害について理解するために、「生化学的解析」と「生細胞イメージング解析」を推進した。パルミチン酸誘導性の病態時では、PKCθの異常活性化によるSortilinの遺伝子発現抑制と蛋白寿命減少が惹起されることを生化学的に明らかにした。さらにSortilinの減少がいかにして「GLUT4トランスロケーション障害」を引き起こしているのか、その病態分子基盤を独自のナノ計測技術によって世界最高精度にて明らかにすることに成功した。24年度が最終年度であるため、記入しない。当初予定していた研究計画を達成し、インスリン抵抗性病態の新たな発症機序として「ソーティング障害」が存在することを示した。Sortilinを含むVps10p受容体ファミリーメンバーの機能不全が、高コレステロール血症や2型糖尿病などの生活習慣病やアルツハイマー病や進行性認知症といった遅発性疾患の原因となっている可能性が多数報告されている。今後は、Vps10p関連蛋白質の機能不全による「ソーティング障害」が広範な生活習慣病の共通病理として関与する可能性を視野に入れた研究へと展開したい。
Toll様受容体刺激による樹状細胞の成熟分化機構の解明

TLRファミリーのシグナル伝達には、TLRの細胞質内領域に会合するアダプター分子MyD88が必須である。野生型マウス由来のマクロファージにおいては、TLR4、TLR2、TLR9を介した刺激により、転写因子NF-κB、MAPキナーゼ群が活性化される。また、同時に、TNF-αなどのサイトカインの産生が誘導される。MyD88欠損マウス由来のマクロファージにおいては、TLR2,TLR9のリガンドによるNF-κB、MAPキナーゼの活性化は全く認められず、サイトカイン産生も全く消失する。したがって、MyD88は、TLR2,TLR9シグナルに必須のシグナル伝達物質であると考えられる。しかし、MyD88欠損マクロファージのLPSによるサイトカイン産生は全く消失するが、NF-κB、MAPキナーゼの活性化は、保持されていた。このMyD88非依存性シグナル伝達経路の生物学的意義を明らかにする目的で、樹状細胞の機能を解析した。1.正常樹状細胞は、TLR4のリガンド(LPS)により、IL-12,TNF-αなどのサイトカインを産生し、CD40など補助機能分子の発現を増強し、アロT細胞の増殖刺激活性が亢進した。一方、MyD88欠損樹状細胞は、LPS刺激により、サイトカイン産生誘導は全く認められなかったが、補助機能分子の発現、アロT細胞の増殖刺激活性の亢進はみとめられた。これらの活性は、TLR4欠損樹状細胞では、全く認められなかった。すなわち、TLR4のシグナルは、MyD88非依存性に樹状細胞の成熟分化を惹起しうることが明らかとなった。2.TLR9を介した刺激は、LPSと同様の生物活性を示す。しかし、MyD88欠損樹状細胞は、CpG DNAによるサイトカイン産生誘導、補助機能分子の発現亢進、T細胞刺激活性の増強などすべての生物活性が欠如していた。すなわち、TLR.ファミリーのシグナルには、heterogeneityが存在することが明かとなった。
下肢深部静脈血栓症の予防-遺伝子導入による試み

<研究目的>今回の研究では、遺伝子導入により下肢静脈壁において抗血栓因子を持続的に高発現させ、局所での血栓形成を抑制することを検討する。血管壁への遺伝子導入では、局所においてのみ抗血栓効果を有し、その効果は12週間見られるものと予想される。したがって、必要な場所(下肢静脈)、および必要な時(周術期)でのみ効果を発する、非常に有効な手段と考えられる。<研究内容と結果>1、遺伝子組換えベクターの作製Ecto-NTPDaseの発現plasmidおよび組換えアデノウイルスを作製した。遺伝子導入はこの2種類のベクターを用いて行った。2、培養細胞への導入実験作製した遺伝子組換えベクターによる遺伝子導入効率を培養細胞にて検討した。培養細胞に対し、発現plasmidおよび組換えアデノウイルスにて遺伝子を導入した結果、持続的に目的蛋白が発現することを確認し、細胞膜および培養液中での酵素活性の上昇を認めた。3、動物実験モデルの作製、遺伝子導入、評価SDラット(♂、生後8週)の腸骨静脈を露出・結紮した後、下肢静脈末梢より遺伝子組換えベクターを注入し、遺伝子導入を行った。遺伝子導入により目的蛋白の持続的発現を確認した。当初の予定では、この腸骨静脈にレーザー照射により血栓形成を惹起させる計画であったが、十分な血栓が形成されなかった。これは腸骨静脈の内腔容量が血栓形成に十分でないと考えられた。このためラットの下大静脈を結紮することにより、下大静脈に遺伝子導入およびレーザー照射による血栓形成を行うこととした。この結果、血栓形成抑制効果の評価が可能となり、Ecto-NTPDaseによる静脈血栓抑制効果が示唆される結果が得られた。今後この結果を投稿予定である。<研究内容と結果>1)遺伝子組換えベクターの作製t-PAおよびEcto-NTPDaseの発現plasmidおよび組換えアデノウイルスを作製した。このPlasmidにはサイトメガロウイルスの初期プロモーターが組み込まれており、その末梢側に目的蛋白のcDNAを入れ込むことにより、動物細胞内にて蛋白を強制発現させることが可能となる。組換えアデノウイルスは、アデノウイルス遺伝子のEl、E3領域を欠落させ、自己増殖能を欠落させたアデノウイルスに対し、上記の発現plasmidから切り出した遺伝子を入れ込むことにより作製した。2)培養細胞への導入実験作製した遺伝子組換えベクターによる遺伝子導入効率を培養細胞にて検討した。培養細胞にはアフリカミドリサル腎臓由来のCOS7およびヒト血管内皮細胞を使用した。これらの細胞に対し、発現plasmidおよび組換えアデノウイルスにて遺伝子を導入した結果、持続的に目的蛋白が発現することを確認し、細胞膜および培養液中での酵素活性の上昇を認めた。3)動物実験モデルの作製、遺伝子導入、評価SDラット(♂、生後8週)の腸骨静脈を露出・結紮した後、下肢静脈末梢より組換えアデノウイルスベクターを注入し、遺伝子導入を行った。今後この遺伝子導入血管における抗血栓効果を検討する予定である。
複合ヘテロ原子を有する電子供与体の開発及び有機伝導体への応用

有機伝導体の構成分子として、酸素、硫黄、セレンなどの複数のヘテロ原子を含む新規電子供与体を合成し、これらを用いた新規有機伝導体の開発に成功した。X線結晶構造解析により、新規有機伝導体の結晶状態においてヘテロ原子の特性に基づく分子間相互作用が形成されていることを明らかにした。以上の結果から、有機伝導体の構造・物性制御の指針を得ることに成功した。研究対象である「複合ヘテロ原子を有する電子供与体」として、メトキシ基を導入した新規TTP系電子供与体を合成した。メトキシ基を有する電子供与体の合成は極めて難易度が高く、報告例が非常に少ない。本研究では原料を十分確保できるノウハウを確立させることにより、新規電子供与体の合成を効率的に行うことができた。また、メトキシ基の有機溶媒に対する高い溶解性を利用して新たな合成経路の開拓も行っている。この新たな合成経路では、従来法で使っていた高い毒性の試薬を必要としないため、実験者の安全が確保され、環境への負荷が軽減されている。新規電子供与体BMO-TTPのカチオンラジカル塩を電解酸化法で作製し、黒色の板状晶として(BMO-TTP)_2X(X=PF_6,ClO_4)が得られた。これらの塩の結晶構造は母体であるBDT-TTPの塩とよく似ており、同じカルコゲノメチル基であるチオメチル基を有する電子供与体BTM-TTPの塩とは異なっている。そこで得られた塩の構造を詳しく調べてみると、メトキシ基を有するBMO-TTP塩ではメトキシ基が分子内で水素結合を形成しており、一方のメチル基は分子平面内にあることが判った。この様な水素結合はチオメチル基を有するBTM-TTP塩ではみられず、二つのメチル基は分子平面に対し垂直に立った構造をしている。これがBMO-TTP塩とBTM-TTP塩の結晶構造の違いに反映されていると考えられる。結晶構造解析の結果を基に計算したBMO-TTP塩のバンド構造とフェルミ面は擬一次元的であり、この塩がBMO-TTP分子の積層方向に擬一次元的な電子構造を有していることが示唆された。しかしながら、この塩の伝導性を四端子法で測定したところ、本質的にはヘリウムの液化温度(4.2K)まで金属的であり、低次元性特有の絶縁化が起きないことが判った。昨年度に引き続き複合ヘテロ原子(酸素及び硫黄原子)を有する電子供与体としてメトキシ基を有する新規TTP系電子供与体を合成した。既に合成経路が確立されていた新規電子供与体MOET-TTPのカチオンラジカル塩の作成を検討したところ、比較的良質の単結晶として(MOET-TTP)_2X(X=BF_4,ClO_4,PF_6,AsF_6,SbF_6)が得られた。これらの塩における分子配列は昨年度報告した(DMO-TTP)_2X(X=ClO_4,PF_6)に類似しており、低温まで金属的性質を示すことが期待された。しかしながら、これらMOET-TTP塩は半導体的な性質を示した。そこで金属相の発現を目指し、MOET-TTPの分子骨格に第3のヘテロ原子であるセレン原子の導入を行った。TTP骨格内にセレン原子を導入したMOET-TS-TTP及び、TTP骨格の外側にエチレンジセレノ基を導入したMOES-TTPの合成に成功し、これらのPF_6塩の結晶構造と伝導性を調べた。いずれの塩も電子供与体と対アニオンの比は2:1であり、本質的な結晶構造はMOET-TTP塩に類似している。(MOET-TS-TTP)_2PF_6は室温から低温(10K)まで金属的な性質を示し、最高被占軌道(HOMO)の寄与が大きいTTP骨格にセレン原子を導入することにより金属相が発現することが分かった。一方、HOMOの寄与が小さい置換基側にセレン原子を導入したMOES-TTPのPF_6塩では、セレン原子は立体障害として働き分子間の距離を遠ざけることが分かった。このことからこの塩ではMOET-TTP塩同様に半導体的性質を示すと考えられたが、実際には室温から230Kまで金属的な性質を示した。これは分子間距離が遠ざかっているものの、分子軌道の有効な重なりが確保されていることが原因であることが分かった。以上の研究成果の中で(MOET-TS-TTP)_2PF_6については10K以下の伝導性に興味が持たれ、超伝導相の有無について他機関の研究者と共同研究を行っている。