hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
質量分析計を用いたがん転移早期検出法の開発

がん(悪性腫瘍)は日本人の死亡原因の第1位で、約1/3を占めている。このがんで死に至るケースのほとんど(9割)で、がん転移を起こしていることが知られている。原発巣での外科治療や化学的療法によるコントロールに成功しても、最終的に転移巣が大きくなって予後不良となる。がん転移を早期に発見する有効な手段はほとんどなく、簡便で低コストかつ効率よくスクリーニングする方法が求められている。がん転移は、上皮性のがん細胞が、より運動性の高い間葉系細胞の表現型を獲得する上皮間葉転換(EMT)がきっかけとなる。このEMTを誘導した乳がん細胞を用いて、がんの転移のバイオマーカー候補である代謝物を発見した。原発巣での外科治療や化学療法によるコントロールに成功しても、最終的に転移巣が大きくなって予後不良となる。がん転移を早期に発見する有効な手段はほとんどなく、簡便で低コストでかつ効率よくスクリーニングする方法が求められている。そこで、がん転移の早期検出法として、代謝物(生体内低分子化合物)プロファイルを利用することを考えた。がん転移に特徴的な代謝物プロファイルを得るために、質量分析計を用いたヒト細胞メタボロミクス解析システムの確立を行った。質量分析計としては、ガスクロマトグラフィー-質量分析計であるGCMS-QP2010 Ultra(島津製作所)を用い、約80種類の水溶性代謝物(アミノ酸、有機酸、脂肪酸等)の検出が可能となった。この解析法を、がん転移を誘導したヒト乳がん細胞由来のMCF7に用いたところ、明確にグループ分けでき、いくつかの代謝物に統計的に有意な変動があることが示唆された。この方法は、少量のサンプルで実施できるので、健康診断で採取する血液の一部を用いて、早期診断ができる可能性がある。また、ある特定の疾患に特徴的なプロファイルを得られれば、他の病気にも応用できるため、この研究は意義深いものと考えられる。がん転移は、上皮性のがん細胞が、より運動性の高い間葉系細胞の表現型を獲得することがきっかけとなる。これを上皮間葉転換(EMT: Epithelial-Mesenchymal Transition)といい、このEMTは、TNF-αとTGF-βの同時投与により誘導できる。これを材料に、ガスクロマトグラフィー-質量分析計(GCMS-QP2010 Ultra)を使用し、EMTをおこしたヒト乳がん細胞とそうでない状態の細胞の代謝物パターンの比較を多変量解析を用いて行い、がんの転移と相関して変動する代謝物群を探索した。その結果、ホスホエノールピルビン酸とピルビン酸に有意な差があることを発見した。今年度の研究目的であった、がん転移に関わる代謝物を同定することができた。当初の計画通り、おおむね順調に進展している。これを上皮間葉転換(EMT: Epithelial-Mesenchymal Transition)といい、TNF-αとTGF-βの同時投与により誘導できる。これを材料にして、EMTをおこした乳がん細胞で変動する代謝物群を同定している。初年度の研究目的であった、質量分析計を用いたヒトの細胞を使ったメタボロミクスの解析プロトコールが確立できた。懸念されていた再現性もよく、当初の予定通り、おおむね順調に進展している。乳がん細胞での転移での代謝物変動を担う代謝酵素の同定を行う。

転移する細胞に特徴的な代謝物パターンの変動に関わる代謝酵素群を同定し、検出された代謝変動が理にかなったものかどうか検討を行う。上皮間葉転換(EMT)を起こした細胞群とコントロール群の細胞を、安定同位体を含むアミノ酸を加えた細胞培養液中で培養(SILAC: Stable isotope labeling using amino acids in cell culture)し、大きく変動する代謝酵素を検出する。当研究室では、300種類の代謝酵素タンパク質の比較定量が可能な系を確立している。生化学がんの転移は、上皮性のがん細胞が、より運動性の高い間葉系細胞の表現型を獲得することがきっかけとなる。これを、上皮間葉転移(EMT: Epithelial-Mesenchymal Transition)といい、このEMTは、TNF-αとTGF-βの同時投与により誘導できる。これを材料に、昨年度確立した方法を用いて、EMTを起こしたがん細胞とそうでない状態の細胞の代謝物パターンの比較を行い、がんの転移と相関して変動する代謝物を、統計解析の中の一つの方法である多変量解析によって探索する。これには、統計解析ソフトであるSIMCA-Pで、主成分分析(PCA)によるローディングプロットを用い、このグルーピングに寄与する代謝物を同定する。さらに、その代謝物プロファイルの違いの機序を明らかにするため、代謝に関わる酵素についても網羅的に量的変化を調べることを考えている。研究成果が学会発表にいたらかなかったため、それに予定していた分を使用しなかった。来年度以降の研究成果の学会発表のために用いる予定である。
生理活性糖鎖のシグル伝達とその遺伝子発現

複合糖鎖の生理活性と遺伝子発現について総合的研究を展開し、以下のような研究成果が得られた。(1)神経芽細胞腫細胞膜表面には神経突起誘導活性を持つGQlbガングリオシドに応答してリン酸化される三種類の蛋白質が存在していることを発見し、新しい糖鎖受容体主導のエクト型・シグナル伝達系の存在を示した。細胞内に侵入しないキナ-ゼ阻害剤を投与すると、このリン酸化活性は阻止されるとともに突起形成能が消失することを明らかにした。(2)各種癌遺伝子DNAを細胞内に導入しガングリオシド代謝変化を調べ、遺伝子の種類に応じて糖鎖発現が特徴ある変化を示すことを明らかにした。核内発現型癌遺伝子であるアデノウイルス初期遺伝子EIAやmycによってGD3の発現が促進され、またレトロウイルス関連癌遺伝子src,fesfps,rasによってラクト糸ならびにガングリオ糸ガングリオシドが新たに発現されるようになった。(3)排卵後の卵胞ホルモン刺激が加わったヒト子宮内膜分泌期においては増殖期に見られないスルファチドが極めて高濃度になっており、両期を通じて変化しないガングリオシドの陰性電荷に付加される形で硫酸基が増加していることが明らかになった。分泌期内膜から上皮性細胞と非上皮性細胞を分離し硫酸基転移酵素活性を調べると上皮性細胞にのみ活性が認められた、この時期の上皮は受精卵の着床に関与していることから新たに増量したスルファチドも着床に関与していると予想される。(4)動物種を越えて哺乳類表皮に特徴的な分子としてNーOーリノレオイルwヒドロキシアシルスフィンゴシルグルコ-スを認め、その役割を明らかにするためにケラチノサイトに対する生理活性を調べたところ、ケラチン合成を促進することが明らかになった、その作用はホルボ-ルエステルと同様蛋白質キナ-ゼCを経る情報伝達システムで発現されていた。(1)超微量のGQ1bについては、構造活性相関の解析から、オリゴ糖鎖を絶対的に要求することがわかり、オリゴ糖鎖による抑制実験は糖鎖受容体の細胞表面での存在を明らかにした。続いて、ATPの存在下でGQ1bが3つの細胞表面蛋白質(54、60、64KDa)のリン酸化が抑制されることから、新しいタイプの細胞表面型(エクト型)蛋白リン酸化を主体とする情報伝達系の存在、特に、糖鎖受容体主導のエクト型伝達系(糖鎖のエクトシグナル伝達系)の存在が示唆された。この蛋白キナ-ゼをエクトGgキナ-ゼと名付け、本酵素の精製に取り掛かっているほか、この酵素の特異の特異的阻害剤の探索に取り掛かっている。(2)培養腎細胞を用いて、GD3ガングリオシドに、イオン、水輸送の促進作用を見いだし、その機構がcAMP依存性でないことを明らかにした。(3)胸腺のステロイド非感受性細胞(内皮系細胞)の細胞表面で、糖脂質の特異なシアル酸付加が起こることを見いだした。これはT細胞系の胸腺より血中への脱離機構と関係があり、細胞の相互認識機構上重要と考えられる。(4)生理活性ガングリオシドの多くがb代謝系列ガングリオシドであることから、その遺伝子発現機構を明らかにする目的で各種癌遺伝子DNAを細胞に導入し、ガングリオシド発現を変動を調べた。

その結果、b代謝系列ガングリオシドの初発代謝物であるGD3が、核内発現型癌遺伝子であるアデノウイルス初期遺伝子E1Aやmyc遺伝子によって誘導されること、さらにレトロウイルス関連癌遺伝子src、fes、fps、rasなどによってラクト系ガングリオシドSPGやGD1αが誘導されることを明らかにした。各種哺乳類動物の表皮に動物種を越えて共通に観察される知見として、グルコセレブロシドの酸アミド結合脂肪酸にWーヒドロキシ脂肪酸が結合し、さらにそのW水酸基にリノ-ル酸がエステル結合した糖脂質が検出された。この構造を持った糖脂質は他の組織には全く含有されておらずまた皮膚においても真皮には検出できなかった。この糖脂質の機能を解析するためにラットケラチノサイト(FRSK)細胞の培養培地に1μMの濃度で添加したところケラチン合成と架橋酵素ドランスグルタミナ-ゼの活性が促進されることが明らかになった。そこで、この生理活性糖脂質をリポケラチノゲノシドと命名した。FRSK細胞はホルボ-ルエステルによっても角化過程が促進されるが、両者のシグナル伝達における作用を解析するために蛋白質キナ-ゼCの局在化と細胞内Ca^<2+>イオンの動員に対する効果を比較したところ、いずれも同様の活性を示すことが明らかになった。実際の表皮の角化過程においても蛋白質キナ-ゼCの活性化を引き金として角化促進活性を発揮しているものと思われる。一方、糖鎖発現の制御機構についてはヒト子宮内膜におけるホルモン依存的糖鎖変化について調べた。月経後エストロゲン刺激下で急速に増殖している時期と、排卵後プロゲステロン刺激が加わった時期を比べると、後者の時期にスルファチドが高濃度になっている現象が認められた。硫酸基転移酵素活性を子宮内膜から得た上皮細胞と非上皮細胞について比較すると上皮細胞にのみ酵素活性が検出でき、プロゲステロン依存的に上皮細胞において硫酸基転移酵素が誘導されていることが示唆された。この細胞のシアロ糖脂質含量は両期を通じて変化しないことから、細胞の陰性電荷供与基として硫酸基が付加されていることが明らかになった。硫酸基を持つ細胞は受精卵の着床期に相当することから、新たに付加された硫酸基は着床に関係していることが予想された。
経頭蓋磁気刺激法が神経因性疼痛モデルラットの痛覚過敏に及ぼす効果

経頭蓋磁気刺激(TMS)が難治性疼痛に有効な治療法になり得るかどうかを検討するため、炎症性疼痛を誘起したラットでTMSの鎮痛効果を調べた。【方法】雄性Wistarラット(220-260g)の左足底にcomplete Freund's adjuvant(CFA)100μl(mg/ml)を、対照として右足底に生食100μlを注入した。注入4日後から14日後において、熱刺激に対する逃避潜時と圧刺激に対する反応閾値を両側後肢で測定した。TMSは磁気刺激装置(SMN-1200、日本光電)を用い、CFA注入6-7日後に施行した。ラットをTMS群(T群)とsham TMS群(S群)に分け、T群では円形刺激コイルをラットの頭頂部から1cm離した位置に固定、S群では10cm以上離して固定し、刺激強度100%の電磁波を0.1Hzで30分間(計180発)与えた。また他の2群において、2Hzで10秒刺激、50秒休止を1周期とするTMSを、A群では5回反復(計100発)、B群では2回反復(計40発)施行した。【結果】熱刺激に対する逃避潜時(平均値±SD秒、対照側/炎症側)圧刺激に対する反応閾値(平均値±SDg、対照側/炎症側)【まとめ】0.1Hzで30分間のTMSは、炎症側の熱刺激に対する痛覚過敏を2日間軽減したが、30分の拘束のみでは痛覚過敏を抑制しなかつた。2Hz、で10秒刺激、50秒休止を2回、または5回反復したTMSも温熱性痛覚過敏を抑制し、その効果は5回反復TMSの方が強かった。TMSは機械的圧刺激に対する痛覚過敏に対しては全く影響しなかった。TMSには炎症時の温熱性痛覚過敏を軽減する効果があると思われる。経頭蓋磁気刺激が難治性神経因性疼痛を軽減するか調べるに当たり、本年度はラットに神経因性疼痛や炎症性疼痛を惹起するモデルを確実に作成でき、足底熱刺激装置やVon Frey式圧刺激装置により、痛覚過敏やアロデイニアを定量的に評価できることを目標に実験を行った。神経因性疼痛モデルとして、坐骨神経を結紮するBennettモデルと、第5、第6腰髄神経を結紮するChungモデルを、炎症性疼痛モデルとして、足底にカラニゲンやcomplete Freund's adjuvant(CFA)を注入するモデルを作成した。Bennettモデル22匹中、4匹で熱刺激による痛覚過敏、7匹で軽い圧刺激によるアロデイニアを示した。別の7匹に運動麻痺が認められた。現在実体顕微鏡下に撮影した写真やレーザー血流計で測定した坐骨神経血流を参考に、適切な結紮程度を調べている。Chungモデル5匹中3匹で、モデル作成から1週間ほどで遅発性の運動麻痺を生じた。今後これらの絞扼性神経損傷モデルで、少なくとも50%以上のラットに痛覚過敏が出現するように、モデル作成の習熟度を高めるつもりである。カラニゲンモデル14匹中、痛覚過敏は注入翌日では11匹に現われたが、7日後では2匹のみしか認められず、疼痛期間が短か過ぎるのが問題と思われる。CFAモデル6匹中4匹では注入3日後、7日後とも痛覚過敏、アロデイニアが認められた。今後はCFAモデルの数を増やし、より厳密な疼痛評価を行い、まずはCFAモデルで経頭蓋磁気刺激の効果を調べる予定である。TMSは機械的圧刺激に対する痛覚

過敏に対しては全く影響しなかった。TMSには炎症時の温熱性痛覚過敏を軽減する効果があると思われる。1)経頭蓋磁気刺激(TMS)が坐骨神経を結紮して神経因性疼痛を誘起したラットの疼痛行動に与える影響について、足底熱刺激に対する逃避潜時とVon Frey式圧刺激により肢を挙上する閾値を調べて検討した。TMS(20 Gauss,25 HZ,20分間)を1日1回、4日間連続で与えたTMS群6匹中の2匹において、TMS刺激を行わなかった対照群(8匹)に比べ、患肢の逃避潜時の延長と圧刺激閾値の増加、他の1匹で圧刺激閾値のみの増加を認めたが、6匹の平均値は対照群と比較し有意差は認めなかった。逃避潜時、圧刺激閾値とも測定毎のばらつきが大きいことが評価を困難にしている原因として挙げられ、現在測定の評価法を改良中である。2)中枢神経のNMDA受容体は痛覚過敏の発現機序に深く関与しているとされる。NMDA受容体はラット海馬CA1神経細胞に誘起される興奮性シナプス性電位(EPSP)の長期増強(LTP)にも関わっていることから、TMSがLTPを抑制するか調べた。TMS20分間刺激を与えて2日後に脳スライス標本を作製し、細胞外記録によりEPSPの傾きを測定した。TMS群4匹、15脳切片標本でのLTPの平均は138±47%で、対照群4匹、13脳切片標本でのLTPの平均値206±73%に比べ有意に減少していた。TMSがLTPを抑制した結果から、TMSはNMDA受容体応答を抑制する可能性が示唆される。TMSがNMDA受容体を介するイオン電流も抑制するかさらに研究を進めている。経頭蓋磁気刺激(TMS)が難治性疼痛に有効な治療法になり得るかどうかを検討するため、炎症性疼痛を誘起したラットでTMSの鎮痛効果を調べた。【方法】雄性Wistarラット(220-260g)の左足底にcomplete Freund's adjuvant (CFA) 100μl (mg/ml)を、対照として右足底に生食100μlを注入した。注入4日後から14日後において、熱刺激に対する逃避潜時と圧刺激に対する反応閾値を両側後肢で測定した。TMSは磁気刺激装置(SMN-1200、日本光電)を用い、CFA注入6-7日後に施行した。ラットをTMS群(T群)とsham TMS群(S群)に分け、T群では円形刺激コイルをラットの頭頂部から1cm離した位置に固定、S群では10cm以上離して固定し、刺激強度100%の電磁波を0.1Hzで30分間(計180発)与えた。また他の2群において、2Hzで10秒刺激、50秒休止を1周期とするTMSを、A群では5回反復(計100発)、B群では2回反復(計40発)施行した。【まとめ】0.1Hzで30分間のTMSは炎症側の熱刺激に対する痛覚過敏を2日間軽減したが、30分の拘束のみでは痛覚過敏を抑制しなかった。2Hzで10秒刺激、50秒休止を2回、または5回反復したTMSも温熱性痛覚過敏を抑制し、その効果は5回反復TMSの方が強かった。TMSは機械的圧刺激に対する痛覚過敏に対しては全く影響しなかった。
光触媒を用いる有機環境汚染物質の新しい分解法の開発-光触媒・多重光励起法-

光触媒として一般的な酸化チタン(TiO_2)を用いた。新規分解法の開発にあたり機構的解明を行った。TiO_2コロイド水溶液中における有機化合物の一電子酸化反応過渡吸収法を用いてTiO_2コロイド水溶液中での基質の一電子酸化反応過程について詳細に検討した。355nmのナノ秒レーザー照射内での4-メチルチオフェニルメタノールラジカルカチオン(MTPM^<●+>)の生成と基質濃度に依存したマイクロ秒の時間領域でのMTPM^<●+>の生成を直接観測した。時間変化の速度論的解析から、それぞれTiO_2ホールによる直接一電子酸化過程およびフリーなOHラジカルによる一電子酸化過程によって生成したことが明らかになった。TiO_2表面における有機化合物の一電子酸化反応時間分解拡散反射法を用いてアセトニトリル溶媒中でのTiO_2表面上における基質の吸着と一電子酸化反応過程の関係について詳細に検討した。355nmのレーザー照射直後に基質のラジカルカチオンに帰属されるスペクトルを観測した。また、種々の基質について得られた吸着量とラジカルカチオン生成量の関係から得られた一電子酸化効率は、基質の酸化電位だけでなく、基質とTiO_2との電子的な相互作用の大きさ(H_<DA>)に著しく依存することを明らかにした。非吸着分子の一電子酸化過程-カスケードホール移動反応4-フェニル安息香酸(PBA)を表面修飾したTiO_2を用いることにより、TiO_2ホールから溶液中に存在するフリーな非吸着分子へのホール移動反応を時間分解拡散反射法により直接観測した。また、第2のホール移動における二分子反応速度は均一溶液中のそれと比べ立体障害により、およそ3分の2程度減少することを明らかにした。平成15年度、TiO2光触媒反応における重要な初期過程である一電子酸化反応機構の詳細を明らかにした。TiO2光励起により進行する一電子酸化過程を芳香族スルフィドラジカルカチオンの生成により検討した。TiO2コロイド水溶液においては、TiO2光励起による芳香族スルフィドラジカルカチオンの生成は基質の濃度に依存した。高濃度領域では、レーザーパルス内でのTiO2ホールによる直接酸化が、低濃度領域ではレーザー照射後数マイクロ秒の時間領域でフリーなOHラジカルによる一電子酸化が進行することを明らかにした。TiO2光励起で生成するOHラジカルによる基質の一電子酸化kineticsは、パルスラジオリシス法により生成させたフリーなOHラジカルの一電子酸化kineticsに一致した。TiO2光励起で生成するフリーOHラジカルによる有機化合物の酸化過程を直接観測することに成功した。また平成15年度、TiO2粉末表面での一電子酸化過程を明らかにすることを目的として、拡散反射型過渡吸収測定システムを構築した。吸着サイトとしてカルボキシル基あるいはヒドロキシル基を有する芳香族スルフィドではレーザーパルス内でのTiO2ホールによる直接一電子酸化過程が進行し、効率的なラジカルカチオンの生成が観測された。基質濃度の増加に伴い、ラジカルカチオンの生成は著しく増加した。基質吸着量の測定から、生成するラジカルカチオンの濃度は基質吸着量と良い相関関係を示すことを明らかにした。基質の直接一電子酸化過程では基質のTiO2への吸着過程が大きく影響することを明らかにした。光触媒として一般的な酸化チタン(TiO_2)』を用いた。355nmのナノ秒レーザー照射内での4-メチルチオフェニルメタノールラジカルカチオン(MTPM^<・+>)の生成と基質濃度に依存したマイクロ秒の時間領域でのMTPM^<・+>の生成を直接観測した。

時間変化の速度論的解析から、それぞれTiO_2ホールによる直接一電子酸化過程およびフリーなOHラジカルによる一電子酸化過程によって生成したことが明らかになった。TiO_2表面における有機化合物の一電子酸化反応時間分解拡散反射法を用いてアセトニトリル溶媒中でのTiO_2表面上における基質の吸着と一電子酸化反応過程の関係について詳細に検討した。355nmのレーザー照射直後に基質のラジカルカチオンに帰属されるスペクトルを観測した。また、種々の基質について得られた吸着量とラジカルカチオン生成量の関係から得られた一電子酸化効率は、基質の酸化電位だけでなく、基質とTiO_2との電子的な相互作用の大きさ(H_<DA>)に著しく依存することを明らかにした。非吸着分子の一電子酸化過程-カスケードホール移動反応4-フェニル安息香酸(PBA)を表面修飾したTiO_2を用いることにより、TiO_2ホールから溶液中に存在するフリーな非吸着分子へのホール移動反応を時間分解拡散反射法により直接観測した。また、第2のホール移動における二分子反応速度は均一溶液中のそれと比べ立体障害により、およそ3分の2程度減少することを明らかにした。
OpenFlowによるネットワークデザインの実習への導入研究

1.研究目的ソフトウェアプログラムで定義したネットワーク(SDN)を実現するOpenFlow(以下OF)の実習への導入を想定し、実機での動作検証を基に実習内容を検討する。実習を通して将来的に通信の設計や制御・運用といったネットワークデザインができる人材の育成を目指す。2.研究方法パソコン2台にubuntuをインストールし、1台はOFコントローラ兼スイッチ、もう1台はOFスイッチとして動作させる。このOFスイッチに端末2、3台の構成で接続を変更しながら様々なプログラムを試行し通信の可不可を確認する。これによりOFで可能なことを検証し、ネットワークデザインの礎となるような基礎から応用までの実習案を策定する。3.研究成果OFコントローラにtrema、OFスイッチにOpenvSwitchをインストールし、15個以上のプログラムを試行した。公開されているプログラムの多くはそのままでは動作せず、バグ取り、改良を要した。またOFの仕様にはあるがtremaには未実装のクラスのうち必要なものは開発した。検証の結果、プログラミングにはネットワークに関する基礎知識が必須であり、プログラミング経験およびtremaで採用されているrubyでの実現方法の解明が必要となるが、OFではどんなパケット(マッチ条件)をどう処理する(アクション)のかを記述するフローエントリの作成が最大の要となるため、プログラミングはフローエントリの作成部分に絞ればよいと見通しが立った。ただし未実装のクラスは開発しておく必要がある。更に手引書原案を作成し、OFで現存するネットワーク機器などを実現して通信の学習も取り入れた内容とした。具体的な実習項目は、リピータハブ、ラーニングスイッチ、ルータ、ポートグループ化とVLAN、アプリケーション分散(TCPポート番号で宛先を分ける)とNATの5項目6プログラムの基礎から応用までとした。
表情認識過程における怒り顔の優位性と注意機能の関連について

本研究では、表情検出における怒り顔の優位性について、空間的注意機能および時間的注意機能の観点から実験的に検討した。その結果、従来の研究において主張されている怒り表情に対する特別な注意機能は確認できなかった。表情の処理様式から見た場合も、検出を促進すると考えられる全体処理優先の傾向は、怒りよりは幸福の表情において強いことが示された。したがって、表情認識過程において主張されている怒り顔の優位性は、頑健な現象とはいえず、実験で用いる表情刺激に強く依存すると結論づけることができる。このことは、今後の表情認識過程を整合的に解釈する際の大きな手がかりとなる。前年度、視覚探索課題における怒り顔の優位性について検討した結果、怒り顔の優位性は図式顔を刺激とした場合にのみ観察され、実際の(歯の露出していない)表情写真を使った場合には、幸福顔との比較において優位性は観察されず、条件によっては逆に、幸福顔の優位性が観察された。特定の表情が他の表情より処理が速い場合、その要因として、表情の処理様式に差異があることが考えられる。そこで、今年度は、表情の処理様式の差異について、合成顔効果を指標にして検討した。合成顔効果とは、2人の顔写真を上下に切り分け、1人の顔の上部ともう1人の顔の下部をつなぎ合わせて合成写真を作成すると、全く新しい人相が生成され、上部あるいは下部の人物の同定が妨げられる現象を指す。この妨害効果は、顔の処理が顔の部分ではなく、顔の全体性に基づく処理であることを示すものと考えられている(Calder, Hellawell, & Hay, 1987)。合成顔効果は表情判断においても生じることが報告されているが(Calder et al., 2000)、表情によって効果がどのように変動するかは明らかではない。そこで、本研究では、怒り、悲しみ、幸福、驚きの4つの表情判断において、合成顔効果がどの程度生じるかについて実験的に検討した。実験を行った結果、合成顔効果の強度が、判断する表情によって異なることが示された。すなわち、合成顔効果は幸福顔の判断において最も強く表れ、したがって、幸福顔の処理が他の表情と比較して全体的処理が優勢であると推測される。怒りは幸福と悲しみよりも合成顔効果の影響をうけにくく、相対的に部分的処理が優勢だと考えられる。驚きは合成顔効果が最も起こりにくく、部分的な処理が容易である可能性がある。今回の実験結果から、表情の処理様式は一様ではなく、表情によって部分処理、全体的処理の重み付けが異なる可能性が示唆された。今年度は高速系列視覚提示(RSVP)状況における注意の瞬き現象(attentional blink)を指標として、注意資源の配分に及ぼす怒り顔および幸福顔の影響について実験的に検討した。注意の瞬きとは、RSVP状況において、第1標的の提示後約500ミリ秒以内の間隔で提示される第2標的の報告が困難になる現象で、この現象には容量に限界のある注意資源の配分が関与するとされる。すなわち、第1標的の知覚に向けられた注意資源は、第1標的の知覚が確立するまでの一定の間は第2標的に配分されず、これによって第2標的の知覚が妨げられるという。この仮説を前提とした場合、第1標的への注意停留が長いほど、注意の瞬きは大きくなること、また、注意資源をそれほど必要としない刺激が第2標的として設定された場合、注意の瞬きは小さくなることが予測される。先行研究では、検出課題の場合、怒り顔は他の表情顔より迅速に検出されること、また、怒り顔への注意の停留が長いことが報告されている。ただし、先行研究においては、表情顔の歯の露出という要因が統制されていない。そこで、今回の実験では、表情顔の歯の露出を要因に加え、怒り顔、幸福顔、中立顔を第1標的および第2標的にした場合に、注意の瞬き現象がどのように変動するかについて検討した。実験の結果、表情顔が第1標的の場合は、歯の露出の有無によらず、怒り顔条件より幸福顔条件において注意の瞬きが大きくなることが示された。これに対して、表情顔が第2標的の場合は、歯の露出要因と表情の交互作用が見られた。すなわち、歯の露出がない場合は、怒り顔条件で最も注意の瞬きが大きくなり、歯の露出がある場合は、注意の瞬きは怒り顔条件と幸福顔条件で同程度となった。これらの結果は、これまでの先行研究が主張する怒り顔に対する優先的な注意配分とは異なり、注意配分における幸福顔優位性を示すものと解釈される。表情探索課題における怒り顔の優位性について、初年度は妨害刺激の冗長度(stimulus redundancy)の要因を中心に検討した。表情写真を刺激として用いた場合、妨害刺激の冗長度によって優位な表情が変動することが報告されている(Ohman et al.,2010)。

そこで、本研究では口を閉じた表情写真を刺激とし、さらに、妨害刺激が標的刺激と同一人物の場合(実験1:冗長度高)と、妨害刺激が標的刺激とは異なる複数の人物の表情の場合(実験2:冗長度低)で、表情の優位性がどのようになるか実験的に検討した。顔表情データベース(ATRーPromotions)の中から男性5名の中立、幸福、怒りの表情(口を閉じたもの)を刺激とした。実験計画は、実験1、2とも標的なしの場合は3(表情)×3(セットサイズ)、標的ありの場合は4(標的・妨害の表情の組み合わせ)×3(セットサイズ)で、いずれの要因も参加者内要因であった。実験1では、標的なしの条件では、幸福顔の走査が最も速く、次いで中立顔、怒り顔の順となった。標的ありの条件では、妨害刺激が中立顔の場合は、怒り顔及び幸福顔の検出に差は見られなかった。これに対して、妨害刺激が表情顔の場合は、幸福顔を背景とした怒り顔の検出が、怒り顔を背景とした幸福顔の検出より速く、怒り顔の優位性が観察された。実験2では、標的なしの条件では、中立顔の走査が最も速く、幸福顔の走査がこれに続き、怒り顔の走査は極端に遅くなった。標的ありの条件では、いずれの表情の優位性も観察されなかった。ただし、妨害刺激としての怒り顔に対する走査が極端に遅いにもかかわらず、標的刺激としての幸福顔の検出は、走査が速い幸福顔を妨害刺激とした場合の怒り顔の検出と同等であったことを考慮すると、本実験の結果を幸福優位の傾向と見ることもできる。これまで、怒り顔の優位性について、空間的注意(視覚探索課題)と時間的注意(高速系列視覚提示課題)、さらに視覚処理様式(合成顔課題)の観点から検討した。その際、課題に大きく影響する低次の刺激特徴である歯の露出を統制した。その結果、空間的注意・時間的注意の両面において、怒り顔の優位性は観察されなかった。したがって、怒り顔の優位性が少なくとも頑健な現象ではないなら、その現象の生理学的基盤として仮定されている皮質下視覚経路についても、その機能について再検討する必要がある。Pessoa & Adolphs(2010)は、怒り情報が、皮質を経由せず、皮質下視覚経路によって扁桃体に伝えられ、そこで感情処理が行われるという考え方を標準仮説と呼んでいる。標準仮説では、皮質下の処理は皮質経由の処理と比較して、情報の解像度は粗いが高速であること仮定されている。彼らは、感情を処理する脳の部位は扁桃体に限定されないこと、扁桃体は恐怖や怒りのみならず幸福や中立の表情に対しても反応すること、皮質経由の処理が皮質下の処理と比較して決して遅くないこと、上丘、視床枕、扁桃体には皮質の多くの領域と双方向の連絡経路が存在することを指摘した上で、扁桃体の機能を怒り感情の処理に限定せず、生体にとって重要な刺激の評価へと広げている。つまり、皮質下視覚経路に設定された恐怖の感情処理は、その経路が担う機能のうちの1つに過ぎないと考えている。また、怒り顔を空間周周波数の観点から検討したSmith & Schyns(2009)は、怒り情報は低空間周波数領域には含まれず、皮質下に想定されている低空間周波数領域への感受性とは整合しないことを指摘している。したがって、本研究において怒り優位性が観察されなかったことは、皮質下経路を怒り表情専用の処理モジュールと仮定しないならば、整合的に解釈することができることが明らかになった。
ノンコーディング遺伝子の発現制御領域の数理的解析

ヒトやマウスの全ゲノム配列データのタンパク質遺伝子間領域やnon-coding RNA遺伝子の出現位置情報を抽出したデータベースを作成し、タンパク質遺伝子の発現制御領域配列中のシスエレメントの稼働率は30%程度であること、イントロン内在型non-coding遺伝子をもつタンパク質は、ヒトの脳や神経発達と関連性が高いこと、non-coding遺伝子とタンパク質遺伝子の発現制御制御領域は異なる1次配列構造を持つことを見出した。Ensemblデータベースから、ncRNAデータセットおよび遺伝子情報データセットの取得と選別を行い、ヒト、マウス、ラット、ショウジョウバエ、線虫、酵母の各生物種毎に、独自のncRNAデータベースとGeneデータベースを作成した。データベース管理システムとしてMySQLを用いている。ncRNAの位置情報を基に、集計したところ、登録されているncRNAの件数は、ヒト、マウス、ラット、ショウジョウバエ、線虫、酵母で、それぞれ、19505件、7886件、4828件、1396件、23872件、413件であった。このうち、遺伝子間領域に位置しているもの(intergenic ncRNA)は、それぞれ、16055件、6410件、3937件、1302件、20116件、363件となっていた。一方、タンパク質のイントロン領域に存在しているもの(intronic ncRNA)は、ヒト、マウス、ラット、ショウジョウバエ、線虫、酵母で、それぞれ、2817件、1343件、837件、8件、3549件、13件となっていた。近年の研究によりアルツハイマー等の病気との関連性も指摘され注目されているintronic RNAについて、さらに、分類してみると、ヒトにおいては、mi RNA、sense_intronic、sno RNAやsnRNAなど、遺伝子長が短いものの件数が高かったものの、これらの領域にlinc RNAが47件登録されていることが判った。上記のように、6種の生物種において、ncRNAの情報を網羅的にデータベース化できており、おおよそ計画通り、研究は遂行していると思っている。昨年度は、データ収集とncRNA遺伝子のアノテーション情報を基にした解析を行い、アルツハイマー等の病気との関連性も指摘され注目されているintronicRNAについて、さらに、分類してみると、ヒトにおいては、mi RNA、sense_intronic、sno RNAやsnRNAなど、遺伝子長が短いものの件数が高かったものの、これらの領域にlinc RNAが47件登録されていることが判った。これまでに、Ensemblデータベースから、ncRNAデータセットおよび遺伝子情報データセットの取得と選別を行い、ヒト、マウス、ラット、ショウジョウバエ、線虫、酵母の各生物種毎に、独自のncRNAデータベースとGeneデータベースを作成した。これらのデータを基に、本年度は、イントロン領域に位置するncRNAを中心に解析をに着手した。ncRNAのプロモーター領域の予測を行い、ncRNAの遺伝子上流配列の規則性について調査している。本年度は、過去2年間で研究用に作成したデータベースを外部に公開すべき、ユーザインタフェースの開発を行った。また、本研究のテーマである。ncRANの転写制御領域のパターン解析を行った。データ公開用のインタフェースとして、1)一昨年度に行った、long nc RNAのデータをとりまとめたデータベースの公開および2)ENSENBLデータベースより取得したヒトのintronic ncRNAについて、ncRNA遺伝子領域と、それをイントロンにもつタンパク質遺伝子の双方が検索できるシステムの開発と公開準備を行った。nc RNAの転写制御領域研究については、ヒトのmiRNAプロモーター領域の配列情報をもとに,8生物種において,let-7iとmir-21のプロモーター領域を同定した.その後Swiss Institute of Bioinformaticsが提供しているSignal Search Analysis Server内のOProf (Signal Search Analysis Server : http://ccg.vital-it.ch/ssa/)を用いてプロモーター領域内のTATA-box,GC-box,CCAAT-boxの配列について探索を行い,その有無と分布の様子について,既存のprotein-coding geneプロモーター領域と比較を行った。さらに、ヒトとマウスのmiRNA gene,protein-coding gene,mirtron gene(新規のmiRNAであるintronic miRNA)の上流配列(それぞれ5002000個のsequenceを用意)において上記の塩基配列パターン検索を行い,制御領域が持つ塩基配列について、1)ヒトでもマウスでもAAAA、TTTTの配列はよく用いられること、2)mirtron及びmiRNA上流2kBでは種族ごとに特有の塩基配列パターンをもつこと、3)protein coding geneではCC,GGの並びが多く用いられるが,mirtron及びmiRNA上流2kBではあまり用いられないといった知見を得た。

ヒトやマウスの全ゲノム配列データのタンパク質遺伝子間領域やnon-coding RNA遺伝子の出現位置情報を抽出したデータベースを作成し、タンパク質遺伝子の発現制御領域配列中のシスエレメントの稼働率は30%程度であること、イントロン内在型non-coding遺伝子をもつタンパク質は、ヒトの脳や神経発達と関連性が高いこと、non-coding遺伝子とタンパク質遺伝子の発現制御制御領域は異なる1次配列構造を持つことを見出した。昨年度い示した今後の推進方針通り、昨年度のデータベース作成を基に、ncRNA遺伝子上流配列の解析に着手できているため。また、解析のためのツールとして、オントロジー判別ツールや進化トレース法の評価等の、周辺技術についても新たな知見が得られていること等の理由による。応用ゲノム科学現在は、遺伝子上流の解析をヒトゲノムに限定して行っているが、マウスやラット等にも広め、比較ゲノム解析による成果を上げるようにしたい。(次年度使用額が生じた理由と使用計画)日程上の理由から、国際会議への参加ができなかったことによる。(使用計画)国内の学会や論文での成果発表に着手できているので、本年度は、国際会議を含め、より積極的に学会等での成果発表を行っていく予定である。また、データ更新用やアプリケーション実装費を確保する予定である。long ncRNAを含む、ncRNAの位置情報について6種の生物種で網羅的にデータベース化できているため。日程上の理由から、国際会議への参加ができなかったことによる。イントロン内のlong ncRNA遺伝子の上流配列を抽出し、長さが4から8文字のウィンドウ解析を行う。当該イントロンをもつタンパク質のオーソローグが6種類の生物種間で見つかった場合、イントロン内long ncRNAの上流配列の保存性を検討する。また、long nc RNAを有するタンパク質の規則性について分析する。国内の学会や論文での成果発表に着手できているので、次年度は、国際会議を含め、より積極的に学会等での成果発表を行っていく予定である。また、データ更新用のアプリケーション実装費用を確保する予定である。研究進行に伴うデータ量の増加や要求される処理速度を勘案したところ、申請時の備品費だけでは、十分な機器が購入できなかったため、旅費を備品費に移管して支払いを行ったため、当初予定していた学会への参加を見送ることになり、その差額が発生した。次年度以降は、成果発表のための学会等への参加を増やし旅費として使用する予定である。
ミトコンドリアK^+チャネルを標的とした神経・心筋細胞保護の分子機構解明

本研究の目的は,(1)Ca^<2+>活性化K^+チャネルを介した神経,心筋細胞保護作用の分子機構,(2)Ca^<2+>活性化K^+チャネル開口薬による神経,心筋細胞保護を明らかにすることであった。(1)については,18年度の研究成果を発展させ,Ca^<2+>活性化K^+チャネルの活性化により惹起される細胞内Ca^<2+>流入経路の分子基盤の同定に成功し,「Ca^<2+>活性化K^+チャネルのMAKキナーゼ経路,カスパーゼ経路への影響」についても研究成果が得られた(Yamazaki, et. al.,2007)。また,松果体細胞におけるCa^<2+>活性化K^+チャネルのCa^<2+>オシレーション発生への寄与について,Ca^<2+>イメージング解析により明らかにした(第111回日本薬理学会近畿部会にて発表)。最近では,扁桃体神経細胞においてアンドロゲン枯渇によりCa^<2+>活性化K^+チャネル発現,活性が顕著に減少することを明らかにした(第85回日本生理学会大会にて発表)。(2)については,Ca^<2+>活性化K^+チャネルβ1サブユニットの変異体を作成し,β1サブユニット選択的新規Ca^<2+>活性化K^+チャネル開口薬DiBAC4(3)の認識部位に第2膜貫通ドメインのいくつかのアミノ酸が関与することを明らかにした(日本薬学会第128年会にて発表)。また,Ca^<2+>活性化K^+チャネル開口薬ジクロロデヒドロアビエチン酸がミトコンドリア呼吸,容積,Ca^<2+>過負荷を改善することを明らかにした(投稿中)。ミトコンドリアCa^<2+>活性化K^+チャネルの分子実体については,候補分子の同定を含めて一定の研究成果が得られたものの,再構築系での更なる研究成果の蓄積が必要である。本研究の目的は、(1)ミトコンドリアCa^<2+>活性化K^+チャネル(mitoK_<Ca>チャネル)をクローニングすること、(2)mitoK_<Ca>チャネルを介した神経、心筋細胞保護作用の分子機構を明らかにすること、(3)mitoK_<Ca>チャネル開口薬の薬物探索をすることであった。(1)については、RT-PCRクローニングにより、細胞膜の大コンダクタンスCa^<2+>活性化K^+チャネル(120kDa)と比較すると低分子量である2種類の異なるスプライスバリアントをラット心筋cDNAから単離した。遺伝子工学的手法によりこれらのクローンに蛍光タンパク質を融合させ、細胞内分布を共焦点レーザー顕微鏡で観察したところ、ミトコンドリアへの高い移行性を示した(投稿準備中)。(2)については、Ca^<2+>活性化K^+チャネル開口薬ジクロロデヒドロアビエチン酸がミトコンドリア呼吸、容積、Ca^<2+>過負荷を改善することを明らかにした(投稿準備中)。Ca^<2+>活性化K^+チャネル開口薬のMAKキナーゼ経路、カスパーゼ経路、活性酸素依存性経路への影響については、次年度の検討課題とした。(3)については、心筋ミトコンドリアに特異的発現するβ1サブユニットを選択的に認識する新規かつ高活性のCa^<2+>活性化K+チャネル開口薬としてオキソノール系電位感受性色素DiBAC4(3)を見出した(研究発表参照、Morimoto et al.,Mol. Pharmacol.,2006)。また、構造活性相関により、DiBACのバルビツレートを連結するトリメチン鎖がCa^<2+>活性化K^+チャネル開口活性に必須であることを発見した。ミトコンドリアCa^<2+>

活性化K^+チャネルの分子実体については,候補分子の同定を含めて一定の研究成果が得られたものの,再構築系での更なる研究成果の蓄積が必要である。
遅発型男子オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症の発症の分子機構

遅発型男子オルニチントランスカルバミラーゼ(OTC)欠損症症例のOTC遺伝子を解析し、5家系6症例に40番コドンのアルギニンがヒスチジンに変化する変異(R40H)および1例に55番コドンのチロシンがアスパラギン酸に変化する変異(Y55D)を発見した。これらの変異OTCを持つ患者の発症が遅い原因を解明する目的で以下の知見を得た。1.それぞれの変異を持つOTCcDNAおよび細菌β-ガラクトシダ-セ遺伝子を組み込んだ発現ベクターをCos1細胞に導入、72時間目にハーベストし、標識OTCcDNAをプローブとしてmRNAの発現レベルを解析したところ、R40H、Y55Dのいづれも野生型OTCのそれと発現レベルには有意差を認めなかった。2.また、同じCos1細胞中に発現したOTC活性(β-ガラクトシダーゼ活性で補正した相対活性)は、野生型に対する相対活性はR40Hは29%、Y55Dは28%(n=3)と低下していた。これらの発現酵素は5回の凍結融解処理後、処理前野生型OTC活性(100%)に対して、R40H変異OTCは5.5%に低下した。いっぽうY55D変異OTCは有意の低下を認めなかった。3.その後に発見された3症例でR40H変異が同定され、うち1例の生検肝でのOTCmRNAレベルは正常対照と有意差を認めなかった。4.他の1例の剖検肝でOTCのL-オルニチン、カルバミルリン酸に対する見かけのKm、pH-活性プロファイルを検討したが、いずれも正常対照と有意差を認めなかった。以上の結果から、R40H変異OTC活性低下の機序は、翻訳以降のタンパクの不安定性によること、また、そのR40HOTCの基質特異性等の酵素学的性状は大きな障害はない事が明らかになった。いっぽう、Y55DOTCの活性低下については今後の検討を要する。5.R40H変異の1家系で変異遺伝子の父娘伝達が遺伝子レベルで証明された。これは、OTC欠損症は母からのみ伝達されるという従来の知見とは異なる新しい知見である。また、この事により、本変異は幼若時に発症する変異よりも、集団中により保存されやすいと考えられる。1)新規症例での遺伝子変異の同定:われわれは過去に、遅発型男子ornithine transcarbamylase(OTC)欠損症例についてOTC遺伝子解析を行い40番目のアルギニンがヒスチジンに置換する変異(R40H)および55番目のチロシンがアスパラギン酸に置換する変異(Y55D)の2種類の変異を見いだした。これらはいづれも過去に報告のない変異である。その後さらに3家系4症例の遅発型男子例を解析し、うち1例はR40H変異を見いだした。それ以外の症例では同変異は検出されず、現在解析中である。2)変異OTC酵素の性質:R40H変異の証明された1症例の培検肝を用いてOTCの活性および基質親和性、pHプロファイルにつき検討したところ、活性は有意に低下しているが、基質親和性、pHプロファイルは正常対照と差がなかった。

Western blottingでは活性低下に見合う程度のcross-reactive materialの減少を認めた。変異OTC遺伝子の発現実験:3)野生型OTCcDNAおよびsite-directed mutagenesisによって作成したそれぞれの変異OTCcDNAをlipofection法でcos-1細胞に導入、発現させ、OTCmRNAの発現レベルとOTC酵素活性を検討した。その結果、R40H、Y550変異のいづれもOTCm TNAのレベルは野性型と差を認めなかったが、OTC酵素活性はR40Hの変異では野生型の10-20%、Y55Dも30%程度の活性低下を認め、少なくともR40H変異に関しては病因的変異と考えられた。4)以上の結果から、両遺伝子変異ともmRNAの発現、安定性は損なわれておらず、また動力学的性質も明かな変化を来さないが、生成した変異OTCタンパクの細胞内targetingまたは3量体の形成あるいは安定性に異常を来す可能性が考えられる。平成6年度までの研究で、遅発型男子オルニチントランスカルバミラーゼ(OTC)欠損症4症例のOTC遺伝子を解析し、うち3例に40番コドンのアルギニンがヒスチジンに変化する変異(R40H)および1例に55番コドンのチロシンがアスパラギン酸に変化する変異(Y55D)を発見した。さらに平成6年度から7年度にかけての研究で以下の知見を得た。1.それぞれの変異を持つOTCcDNAを組み込んだ発現ベクターおよび細菌β-ガラクトシダーゼ遺伝子を組み込んだ発現ベクターpSAc-lacZをCosl細胞に導入、72時間目にハーベストし、標識OTCcDNAをプローブとしてmRNAの発現レベルを解析したところ、R40H、Y55Dのいづれも野性型OTCのそれと発現レベルには有意差を認めなかった。2.また、同じCosl細胞中に発現したOTC活性(β-ガラクトシダーゼ活性で補正した相対活性)は、野性型に対する相対活性はR40Hは29%、Y55Dは28%(n=3)と低下していた。これらの発現酸素は5回の凍結融解処理後、処理前野性型OTC活性(100%)に対して、R40H変異のOTCは5.8%に低下した。いっぽうY55D変異OTCは有意の低下を認めなかった。3.その後に発見された3症例でR40H変異が同定され、うち1例の生検肝でのOTCmRNAレベルは正常対照と有意差を認めなかった。4.他の1例の培検肝でOCTのL-オルニチン、カルバミルリン酸に対する見かけのKm、pH-活性プロファイルを検討したが、いずれも正常対照と有意差を認めなかった。以上の結果から、R40H変異OTC活性低下の機序は、翻訳以降のタンパクの不安定性によること、また、そのR40HOTCの基質特異性等の酸素学的性状は大きな障害はない事が明らかになった。いっぽう、Y55DOTCの活性低下については今後の検討を要する。
S.mutans gbpC遺伝子のGcrR蛋白による発現調節機構の解明

筆者はこの課題の下,まずgcrR遺伝子について,二成分制御系のレスポンスレギュレータという観点からこの遺伝子によるgbpC遺伝子の発現調節機構の解明を試みた.レスポンスレギュレータはそのカウンターパートであるセンサータンパクからリン酸化によるシグナルを受け取る.その受容サイトと推定されたアスパラギン酸をアラニンに変えた変異を導入し,シグナルを受け取れない状態にして調べたところ,GcrRタンパクは二成分制御系の因子としてよりは,単純にリプレッサー様タンパクとして働いていると解釈した.別の研究者らも"orphan response regulator"として,同様な見解をとっている.GbpCタンパクは細胞壁アンカータンパクであるので,実際に細胞壁に発現していることをウェスタンプロット分析で確認し,これを介してS.mutansの菌体が固定化グルカンへ結合出来ることを示した.また,細胞壁へのアンカーリングには酵素ソルターゼが関与しており,この欠損変異株ではグルカン依存性凝集が消失することも示した.S.mutans GS-5株ではgbpC遺伝子にnonsense変異が認められたことが契機となり,gbpC遺伝子には一塩基多型が多く存在することを明らかにし,その保存された領域からPCRプライマーを設計し,Streptococcus macacaeからgbpC遺伝子ホモログを同定することができた.これは,他のミュータンスレンサ球菌にも同ホモログの存在を伺わせる結果に至った,更にS. mutansのグルカン依存性凝集の観察から,見かけ上よく似た現象であるが,これとは別の低温凝集という現象を見出し,ミニトランスポソンを利用したin vitro変異導入法の適用により,コラーゲン結合アドヘシンの同定へと至った.これは口腔常在菌からの同タンパクの存在に関する最初の報告となった.筆者はこの課題の下,まずgcrR遺伝子について,二成分制御系のレスポンスレギュレータという観点からこの遺伝子によるgbpC遺伝子の発現調節機構の解明を試みた.レスポンスレギュレータはそのカウンターパートであるセンサータンパクからリン酸化によるシグナルを受け取る.その受容サイトと推定されたアスパラギン酸をアラニンに変えた変異を導入し,シグナルを受け取れない状態にして調べたところ,GcrRタンパクは二成分制御系の因子としてよりは,単純にリプレッサー様タンパクとして働いていると解釈した.別の研究者らも"orphan response regulator"として,同様な見解をとっている.GbpCタンパクは細胞壁アンカータンパクであるので,実際に細胞壁に発現していることをウェスタンプロット分析で確認し,これを介してS.mutansの菌体が固定化グルカンへ結合出来ることを示した.また,細胞壁へのアンカーリングには酵素ソルターゼが関与しており,この欠損変異株ではグルカン依存性凝集が消失することも示した.S.mutans GS-5株ではgbpC遺伝子にnonsense変異が認められたことが契機となり,gbpC遺伝子には一塩基多型が多く存在することを明らかにし,その保存された領域からPCRプライマーを設計し,Streptococcus macacaeからgbpC遺伝子ホモログを同定することができた.これは,他のミュータンスレンサ球菌にも同ホモログの存在を伺わせる結果に至った,更にS. mutansのグルカン依存性凝集の観察から,見かけ上よく似た現象であるが,これとは別の低温凝集という現象を見出し,ミニトランスポソンを利用したin vitro変異導入法の適用により,コラーゲン結合アドヘシンの同定へと至った.これは口腔常在菌からの同タンパクの存在に関する最初の報告となった.二成分制御系のレスポンスレギュレータホモローグであるGcrRがどうシグナルに応答して,どのようなメカニズムによりGbpC蛋白発現を調節しているのか検討するため,GcrRの「センサー蛋白」からのシグナル受容サイトと考えられる53番目に位置するアスパラギン酸(D53)をアラニンに変え,更にこの構築フラグメントをGbp発現がβガラクトシダーゼ活性でモニターできるS.mutansの変異株SCSR6株に導入して,今までの実験結果からGbpC発現を誘導することが分かっている亜致死濃度の抗生物質やキシリトールの添加でGbpC発現の応答がどうなるかを調べた.その結果は,このアミノ酸置換変異導入株におけるGbpC発現の応答は,野生型のgcrR遺伝子導入変異株とほとんど変わらなかった.これらのことから,筆者はGcrR蛋白は非リン酸化型が負の調節をしていると現在考えている.また,GbpC蛋白質はそのC末端のアミノ酸部分で細胞壁に結合した状態で存在しているものと考えていることを昨年度の報告に記したが,この分画法により正しく分画されているかを,細胞内タンパク質マーカーであるHsp70の抗体を用いて確認した.更にこの細胞壁に発現しているGbpC蛋白により,S.mutansの細胞がプラーク中のグルカンに結合できるか否かを推定するモデルとして,固相表面に存在するグルカンにS.mutansの細胞がGbpC蛋白質を介して結合するか否かを,今までの実験で既に得られているGbpC蛋白質欠失変異株や強発現変異株を供試して,Biacore装置を用いて調べた.欠失変異株と野生株の比較では明らかにGbpC蛋白発現に応じた結合が観察された.しかし,強発現変異株においてはその発現量に応じた多量の結合は観察されなかった.昨年度に行ったGcrRについての研究の結果,GcrRタンパクのgbpC発現に対する作用形式が二成分制御系(2CS)の典型的な調節形式ではないと考えられた.しかし,S. mutansのゲノムシーケンスデータベースから13組の2CSが検出されている.