hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ニシゴリラにおける比較認知発達科学的研究

京都市動物園では、「知性の展示」として、4種の霊長類(ニシゴリラ、チンパンジー、シロテテナガザル、マンドリル)を対象とした認知課題の学習の様子を公開している。課題はアラビア数系列の学習である。2011年12月生まれのニシゴリラ乳児は2017年3月までに1から13までの系列を習得した。この個体を対象として、系列の最初の数字である1に触れた時点で他の数字がすべて市松模様でマスクされる作業記憶課題を開始した。ゴリラ乳児は1から5までの数系列については、作業記憶課題でも80%以上の正答率を示した。作業記憶課題の習得過程においては、学習の効果が見られた。今後も系列学習課題を継続し、成績の推移を追跡する。平成26年度は,まず京都市動物園に新設されたゴリラ飼育施設内に,認知課題学習用の設備を整備した。屋内居室の1つにタッチモニターを収納できるアクリルパネル製の「モニターパネル」を設置し,京都市動物園で飼育されている3個体のニシゴリラに馴致させた。研究対象としたのは,1986年生まれのメス(ゲンキ),2000年生まれのオス(モモタロウ),2011年生まれのオス(ゲンタロウ)の3個体であった。モニターパネルを導入した初日から,子どものゲンタロウの積極的な反応が見られた。課題は,アラビア数字を用いた系列学習課題であり,「1」から昇順に「2」「3」・・・と画面に提示されたすべての数字に触れられれば,視覚・聴覚のフィードバックに加えて,リンゴ片の食物報酬が得られた。ゲンタロウの学習は順調に進み,平成27年3月時点で1から10までの10個の数字の系列を習得した。また,観察学習,社会的促進により,大人個体のゲンキが26年7月に,モモタロウが27年1月よりタッチモニターへの反応を自発した。これらゴリラの系列学習に加えて,京都市動物園において先行して行っていたチンパンジー,テナガザル,マンドリルの3種についても同様の系列学習を継続して行い,学習の到達度や学習速度を比較した。ニシゴリラの学習の傾向として,他種と同様に顕著な年齢効果が見られ,子どものうちに学習を開始した個体は,大人で開始したどの個体よりも学習速度が速かった。これらの成果の一部は,国内外の学会,シンポジウム等で発表し,現在投稿準備中である。また,京都市動物園で行っている研究を,「知性の展示」として霊長類の高度な知性を来園者に広く知らせるための掲示ポスターを作成し,月例でガイドを行っている。また,本年度はニシゴリラの人工哺育個体の発達と再導入に関する論文を日本霊長類学会の機関誌「霊長類研究」に公表した。平成27年度も、前年度から引き続き、京都市動物園で飼育されている3個体のニシゴリラと、比較対象として同園飼育のチンパンジー、シロテテナガザル、マンドリルの計4種の霊長類を対象として、比較認知科学的研究を実施した。課題は主にアラビア数字を用いた系列学習課題として、タッチモニターを用いて画面上のランダムな位置に提示する数字を昇順に触れることができれば正反応として強化した。とくに平成23年生まれのニシゴリラ幼児は、平成26年5月に本課題を開始してから約1年で110までの10項目も系列を習得した。これは大人になってから本課題を開始したニシゴリラやチンパンジーと比べてもきわめて早い学習速度であり、顕著な年齢効果が示された。現在は項目数を13まで増やして学習中である。一方、平成21年から同課題の学習を継続しているチンパンジーでも1個体(大人、オス)は13項目の系列の順序を学習し、大型類人猿2種で変わらない高い学習能力を示した。また、平成20年から学習を継続しているシロテテナガザル1個体では、25歳という比較的高い年齢から学習を開始し、33歳になる現在でも9項目の系列学習で60%程度の成績を維持しており、従来あまり知られていない小型類人猿の認知能力の高さを示唆している。平成28年度は、ニシゴリラ幼児1個体において、最初の項目1に触れた直後に他の項目がすべてマスクされる作業記憶課題(cf. Inoue & Matsuzawa, 2007)も並行して訓練を開始した。5項目までの課題においては、約90%の高い正反応率を示したが、6項目では40%程度まで成績が低下する状態が続いている。現在も学習は継続しているが、同個体の記憶容量を示唆するものかもしれない。平成28年度は共同研究として、オランウータンの認知エンリッチメント手法の開発にも携わり、(公社)日本動物園水族館協会の機関誌で公表した。京都市動物園におけるニシゴリラをはじめとする認知研究基盤を固めることは順調である。動物園においては比較認知研究を進めるだけでなく、研究そのものを公開で進めることにより、霊長類の認知能力の高さを来園舎に実感を持って知らせるアウトリーチ活動も同時に実施することができる。さらに、参加個体にとっては潜在的にもつ高い認知能力を発揮する機会を得られるという意味で環境エンリッチメントのひとつ、認知的エンリッチメントにもなっている。実験への参加は、いずれの種、個体においても参加個体の自発的意志に任せる手続きをとっているが、参加個体は継続的に課題に取り組んでおり、参加個体のQOLを向上することの一助にもなっていると考えられる。

その一方で、研究機関ではない動物園という場所での研究を実施している制約により、研究以外の業務(ガイドやその他一般向けの広報活動等)にエフォートを割かれることが多い。これはアウトリーチ活動により、多くの来園舎、メディアに注目されるほど、よりその割合が大きくなってる。このため、論文執筆のペースが当初想定していたレベルを維持することが厳しい現状であり、トータルとして「おおむね順調に進展」とした。平成28年度は前年度にひき続き、京都市動物園のニシゴリラ3個体(5歳オス、16歳オス、30歳メス)を主たる対象とし、チンパンジー5個体(4歳オス、大人オス2個体、大人メス2個体)、シロテテナガザル1個体(33歳オス)、マンドリル1個体(11歳)を比較研究のための対象種として、アラビア数系列の学習実験をおこなった。5歳のニシゴリラと28歳のチンパンジーは1から13までの数系列を習得した。その他、23歳のチンパンジーが9まで、シロテテナガザルが8まで、推定39歳のチンパンジーが7まで、マンドリルが6までの系列を習得した。他のチンパンジーやゴリラでは2または3までの系列の習得にとどまっている。学習の進んだ5歳のニシゴリラ幼児とチンパンジーの大人オス2個体、およびシロテテナガザル1個体については、1から9までのアラビア数字を使って、非連続な3から6項目の系列を作り、数系列の学習をテストした。その結果、非連続系列であってもほとんど成績が低下することなく、各数字の順序関係を理解していることが示された。ゴリラ幼児とチンパンジー2個体については、第1項目に触れた直後に第2項目以降がマスクされる作業記憶課題を課したところ、チンパンジーでは3項目の系列では75%程度の正答率を示したが、4項目で20-30%の正答率にとどまり、第1項目への反応時に次の項目の位置しか記憶していないことが示唆された。一方、ニシゴリラ幼児では5項目の系列まで90%以上の正答率を示した。6項目の系列では正答率が約50%に低下したことから、ゴリラ幼児は第1項目から第4項目の位置までを第1項目反応時に記憶していたことが示唆された。6項目での成績は訓練を継続しても50%から上昇しなかった。これらの成果は、米シカゴ市で行われた国際霊長類学会で発表された他、国内学会やその他メディア、動物園内掲示物において市民に伝えられた。京都市動物園では、「知性の展示」として、4種の霊長類(ニシゴリラ、チンパンジー、シロテテナガザル、マンドリル)を対象とした認知課題の学習の様子を公開している。課題はアラビア数系列の学習である。2011年12月生まれのニシゴリラ乳児は2017年3月までに1から13までの系列を習得した。この個体を対象として、系列の最初の数字である1に触れた時点で他の数字がすべて市松模様でマスクされる作業記憶課題を開始した。ゴリラ乳児は1から5までの数系列については、作業記憶課題でも80%以上の正答率を示した。作業記憶課題の習得過程においては、学習の効果が見られた。今後も系列学習課題を継続し、成績の推移を追跡する。ニシゴリラ3個体について,子ども個体の学習の速さは当初予測したとおりに推移している。次の段階として,チンパンジーで行われた作業記憶を測る課題の訓練も開始しており,計画通りに進展しているといえる。大人個体では学習があまり進んでいないが,発達による差も予想通りであるので,現在まで順調に進展しているといえる。京都市動物園におけるニシゴリラをはじめとする霊長類を対象とした比較認知科学的研究は順調に進んでいる。
呼吸器疾患に伴う心血管疾患の検出、治療戦略構築へのポジトロン断層撮影法の導入

肺高血圧症患者における検討においては右心室の心筋酸素代謝が上昇していることを明らかにし予後指標とされる平均肺動脈圧、肺血管抵抗に関連し、新たな予後指標の開発を行った。肺高血圧症では適応機構として右心室ではパワーが有意に上昇し、仕事効率も上昇を認め、病態の解明に寄与する治見を得た。血管拡張薬治療を強化することで心筋酸素消費量当たりの容量効率に有意な改善を認め、新たな治療評価指標を開発した。心サルコイドーシスではFDGの左室心筋異常集積が心電図異常と関連があり、左室全体の心交感神経機能の低下もあることを明らかにした。これらは病態解明に寄与する検討である。肺高血圧症患者における検討においてはWHOクラス分類2,3の肺高血圧症患者27例(平均年齢44.8歳, mean PAP (mPAP): 42.9 mmHg, PV resistance: 656.5)を対象に炭素11標識acetate PETにより右心室の心筋酸素代謝の検討を行った。また右室の容積、駆出率は心臓MRIにて解析を行った。肺高血圧症患者のデータは9例の健常者と比較を行った。患者群では右室の心機能が健常者よりも低下していた(RVEF P=0.04),一方で左心室の心機能は両群に差を認めなかった( LVEF ,ns).左室の心筋酸素代謝も両群で差を認めなかった(P=0.597).これに対して右心室の心筋酸素代謝は肺高血圧群で有意に上昇していることを明らかとした(P=0.010)。肺高血圧症では右心室の心筋酸素代謝亢進が心筋傷害の一因となることが示唆された。また右室心筋の関心領域を自動的に設定するプログラムを開発し、再現性の高い計測が可能となった。心サルコイドーシスにおける検討では心筋の炎症部位での心臓交感神経機能を計測するための基礎的準備を行った。炭素11標識HED PET/CTにて心筋局所および全体のretention indexを計測するプログラムを開発した。HEDによる計測は従来心臓交感神経機能計測の標準法とされているMIBG SPECTと相関があることを明らかにし、臨床的な妥当性の検証を行った。この計測法を今後心サルコイドーシスの病態解析に応用していくための計測基盤を構築した。血管拡張薬治療を強化することで肺血管抵抗は低下する傾向(P=0.29)にあり、右室心筋酸素代謝は低下し(0.044±0.008 to 0.039±0.007/min, P=0.002)、一方右心室仕事量は改善した(P=0.017)。結果として心筋酸素消費量当たりの容量効率に有意な改善を認めた(730.8±253.6 to 1038.5±262.7 mL/min・m2, P<0.001)。また右室の駆出率を酸素15標識ガスにて自動的に計測するプログラムを開発した。肺高血圧症患者における検討においてはWHOクラス分類2,3の肺高血圧症患者27例(平均年齢44.8±14.3歳, mean PAP (mPAP): 42.9±15.6 mmHg, PV resistance: 656.5±245.3)を対象に炭素11標識acetate PETにより右心室の心筋酸素代謝が上昇していることを昨年度報告したが、このうち19例の肺動脈性および8例の血栓性患者で詳細な検討を行った。両タイプともに健常者よりも右室酸素代謝が亢進していた(P<0.05)。しかし、この2群間には差は認めなかった。また右室酸素代謝の亢進は平均肺動脈圧、肺血管抵抗に関連していた(mPAP :r=0.44, p=0.021, PVR:R=0.56, P=0.002)。また右室の駆出率を炭素15標識ガスにて自動的に計測するプログラムを開発した。心サルコイドーシスにおける検討では心臓病変を疑われるサルコイドーシス患者においてFDG PETの左室心筋への異常な局所集積と心電図異常の関連性について検討を行った。32例に心電図異常を認め、そのうち13例がAVブロックであった。心電図異常を呈する患者群ではそうでない、患者群に比して、左室心筋へのFDG異常集積を示す領域を多く認めた(3.48±2.73 vs. 1.41±2.09 regions, p = 0.0051).各種の心電図異常と心筋へのFDGの異常集積についての関連を検討したところ、心室中隔とAVブロックについてのみ有意な関連を認めた。

本研究成果はこれまでサルコイドーシスにおけるFDGの左室心筋異常集積の臨床的な意義付けを行ったものである。平成23年度進捗状況平成23年度にて肺高血圧症患者を対象に右心室の酸素代謝の評価およびプログラム開発を当初の予定どうりに推進してきた。また研究成果については2011年米国核医学会にて右心室の解析プログラム開発について報告を行った。右心室の酸素代謝の臨床的意義について2011年に米国心臓病学会の学術集会にて発表を行った。右心室における心仕事効率については現在最適なモデルを検討中であり、この点は次年度も継続した検討を進めていく予定としている。心サルコイドーシスにおける心筋交感神経機能評価についてであるが、炭素11標識HED PETの健常者による初期検討を予定どうりに実施した。局所HED集積を定量的に評価することが可能となってきたため、今後心サルコイドーシス患者へ応用していく予定である。25年度が最終年度であるため、記入しない。平成23年度、24年度にて肺高血圧症患者を対象に右心室の酸素代謝の評価およびプログラム開発を当初の予定どうりに推進してきた。また研究成果については2011年米国核医学会にてプログラム開発について報告を行った。右心室の酸素代謝の臨床的意義について2011年に米国心臓病学会および米国心臓協会の学術集会にて発表を行った。右心室における心仕事効率については計測モデルを確定することが出来たので、現在計測を進めている。また治療効果評価については現在治療強化群5例と対象群9例の初期データを得ている段階であり、現在症例を積み重ねている段階である。研究成果については現在論文投稿中となっている。心サルコイドーシスについてはこれまでにベースラインのデータ解析を行ってきている。FDG PETの臨床的意義に関しては現在論文のrevisionを投稿中であり、査読結果を待っている段階である。ステロイド治療効果および不整脈との関連性については現在症例の蓄積を行っている段階である。肺高血圧症の研究は当初の画像解析技術の開発がほぼ終了したため、次年度から臨床評価、治療効果評価に向けて計画どうりに研究を進めていく予定である。今年度にまず肺高血圧症患者では右心室の心筋酸素代謝が過剰に亢進していることを明らかにしたので、更にカテーテル検査、心不全の生化学マーカーや臨床指標と対比を行い、代謝亢進に関する危険因子について検討を行っていく。また予後規定因子ともなる右心室の心機能を自動的に計測するプログラムを酸素15標識一酸化炭素ガスを用いて開発していく予定としている。これらの技術開発を進めながら、同時に肺高血圧症に対する血管拡張薬療法の治療効果を評価するために治療強化予定群の症例エントリーを進めて行く予定である。肺高血圧症の研究は論文が現段階では未採択であり、若干遅延を認めているが、当初の画像解析技術の開発から臨床評価、治療効果評価に向けて計画どうりに研究を進めている。最終年度の課題としては現在計測を実施している右心室の仕事量および仕事効率の臨床的意義付けを明らかにする。次いで、健常者との比較を行い、患者群において右心室での仕事効率に低下を来しているか検討する。この仕事効率の定量解析は肺高血圧症の血管拡張薬療法の治療効果評価に応用が可能であり、現在症例を蓄積している治療効果評価の研究に応用し、本研究のゴールである治療効果評価の達成を目指す。心サルコイドーシスに関しては現在肺高血圧症の研究で開発した右心室の病変検出法の応用を開始し、初期の成果が2013年の米国核医学会に演題採択されており、右心室への異常集積について臨床意義を明らかにする。
運動によるインスリン抵抗性改善機序の解明

これまでに運動によって筋肉でのGLUT4発現量を調節するシス領域がGLUT4の転写開始点の-551と-442の間に存在することを明らかにしている。そこで、-551から-442のDNA配列に結合する核蛋白質が骨格筋中に存在すること、さらにその結合DNA配列を特定する目的で、骨格筋より核抽出物を調製し、gel shift法により検討した。その結果、核蛋白質中に-551と-442の間のDNA配列に結合する核蛋白質が数種類存在することを明らかにした。またこれらが結合するDNA配列を特定した。運動はミトコンドリアとGLUT4を増加させる。最近、転写共役因子PGC-1αがミトコンドリアの合成を促進することが示された。そこで筋肉組織特異的にPGC-1αを過剰発現させたマウスを作成し、表現型の変化を調べた。PCC-1α過剰発現マウスでは、ミトコンドリアの増加に伴い、筋肉の赤化が認められたが、GLUT4の発現量は逆に低下した。それに伴い、インスリン抵抗性も認められた。以上のことからPGC-1αの増加はミトコンドリアを増加させるが、GLUT4の発現量は増加させないことがわかった。脂肪組織のGLUT4発現を特異的に抑制したマウスがインスリン抵抗性を来すことが報告され、脂肪組織のGLUT4も糖代謝に重要な役割を果たすことが示されている。これまでにトランスジェニックマウスを用いた実験により、GLUT4の脂肪組織発現に関与するシス領域(ASE)が-551と-442の間に存在することを明らかにしている。そこで、その領域をさらに絞り込むため新たにトランスジェニックマウスを作製して検討した結果、ASEが-551と-506の間に存在することを明らかにした。さらにgel shift法によりこの領域のどの部分に核蛋白が結合するのかを特定し、UV-cross link法によりその核蛋白質の分子量を測定した。これまでに運動によって筋肉でのGLUT4発現量を調節するシス領域exercise responsive element (ERE)が-551と-442の間に存在することを明らかにしている。そこで、-551から-442のDNA配列に結合する運動反応性転写因子を、酵母one-hybrid法を用いて解析した。その結果、A-type microphthalmia associatedtranscription factor (MITF-A)、Transcription factor binding to IGHMenhancer 3 (TFE3)の2種類の転写因子と、オーファン受容体Nuclear receptor subfamily 4,group A, member1 (NR4A1)を陽性クローンとして検出した。これらの転写因子とGLUT4運動反応性シス領域との結合をGel shift法により検討したが、いずれも結合は見いだせず、これらは偽陽性クローンであることが判明した。In vitroでの検討の他に、ERE配列をin vivoで同定するために、GLUT4のプロモーターの+1から-506までを含んだminigeneトランスジェニックマウスを作成し、2つの独立したラインを得ることができた。ある程度の数が揃った段階で運動負荷を行い、ERE配列がGLUT4プロモーター上の-506よりも上流なのか下流なのかを明らかにする予定である。転写共役因子の一つであるPPARγcoactivator-1 (PGC-1)がGLUT4発現に必要であることが報告されたため、PGC-1を「おとり」とした酵母two-hybrid法でPGC-1を含めたGLUT4の運動反応性転写因子複合体の同定を試みた。その結果、DNA結合タンパク質を4種類、RNA修飾に関与するタンパク質を4種類検出した。
新規ソリューションプラズマプロセスによるカーバイド微粒子の合成とその応用

本研究では、新規ソリューションプラズマ法によりカーバイド微粒子の合成を行い、さらに合成したカーバイド微粒子の超硬材料ならびにキャパシタ材料への応用を検討した。作製したタングステンカーバイド試料は、湿式処理では完全にカーボン不純物を除去することは出来なかったので、水素ガス中で800から1100°Cで加熱処理を行い、カーボン不純物を除去することが出来た。しかし、粒子同士の焼結が進行しており、これは今後の課題となった。また、ベンゼン溶液中で作製したタングステンカーバイド試料のキャパシタ材料としての評価をサイクリックボルタンメトリーにより行うことにより、この試料のキャパシタ材料としての可能性が示された。ベンゼン溶媒中で作製したタングステンカーバイド微粒子試料のキャパシタ用材料としての評価を行った。試料作製では、アノード電極として純タングステン線、カソード電極として先端に純タングステン板を溶接した鉄製チップを装着した超音波ホーンを用いた。ベンゼン中(または液体エタノール中)での超音波キャビテーションの生成は、超音波ホモジナイザーを用いて、出力600 W、周波数20 kHzの条件で行った。放電は安定化電源を用いて、直流電圧55Vで行った。ベンゼン溶媒中で作製した試料のSEMならびにTEM観察より、試料はアモルファスカーボン中にタングステンカーバイド微粒子が分散した状態であり、また、タングステンカーバイド微粒子は数層のグラファイト層に覆われていることを確認している。キャパシタ材料としての評価は、サイクリックボルタモグラムにより行った。サイクリックボルタモグラムの測定は、1MのH2SO4溶液中で、作用極に作成した試料を塗布・接着させて行った。参照極としてAg/AgCl電極を用い、電圧の掃引速度は1mV/sとした。サイクルは100回まで行っている。その結果、作製した試料は比較的高い静電容量を持つことが示唆され、また、100回のサイクルでは静電容量にほとんど変化はなかった。また、作製したタングステンカーバイド試料中の混入カーボン不純物の除去を水素ガスにより行った。作製した試料を、濃塩酸溶液、10%H2O2溶液、KOH(8M)溶液で精製したが、このような湿式精製では除去できないグラファイトカーボンの不純物が残留する。そこで、温度8001100°Cで水素ガス精製を行った。水素ガス精製後の試料をSEM観察すると、タングステンカーバイド微粒子同士の焼結が進行しているものの、混入グラファイト不純物の除去が確認され、水素ガス精製の効果が示唆された。本研究では、タングステン等のカーバイド微粒子(φ10nm以下)の新規ソリューションプラズマ合成方法の開発を行い、さらに合成したカーバイド微粒子の超硬材料ならびにキャパシタ用電極材料への応用を行う。本方法では、有機溶媒中に浸漬した電極間ギャップを超音波キャビテーション(真空に近い微細気泡集団)で満たすことにより、有機溶媒中でも数アンペアの低電流でアーク放電の生起が可能となる。アノード電極の金属を任意に選択することにより、プラズマ場で蒸発金属と有機溶媒分子の熱分解カーボンが反応し、電極金属のカーバイド(炭化物)微粒子が生成する。数アンペアで電流を制御できるため、金属の蒸発を精密に制御でき、通常は非常に困難であるカーバイド微粒子の合成が本方法では容易である。本年度は、バッチ式のソリューションプラズマ装置を用いて、タングステン電極を用いた実験を行った。有機溶媒に関してはエタノールならびにベンゼンを用いて実験を行った。合成したカーバイド微粒子に関しては、SEMならびにTEMによる形態観察、結晶構造解析に関してはTEMによる制限視野回折とXRDにより行った。生成した試料のXRD分析結果より、cubic WC1-x、hexagonal α-W2Cならびにorthorhombic β-W2Cが確認された。その試料をAr雰囲気下(900 °C)でアニール処理するとhexagonal WCに転換した。精製後の試料のTEM像を見ると、シート状カーボン内部に、グラファイト層に覆われた多数のタングステンカーバイドナノ粒子が確認された。グラファイト層数はナノ粒子のサイズに依存しており、100nm以上のタングステンカーバイド粒子のグラファイト層の厚さは212nmであり、414nmの微小な粒子のグラファイト層の厚さは1.52nmであった。本研究により、タングステンカーバイドのナノ粒子の合成に成功し、今後の応用利用への試験を行う見通しがついた。今後は、キャパシター材料としての評価ならびに超硬材料へ応用可能な不純物除去方法の検討を行う。

まずは、キャパシタ材料としての評価をサイクリックボルタモグラムにより行うが、この場合、タングステンカーバイドに混入しているカーボンの除去を綿密に行わなくても良いと考えられる。しかし、超硬材料としては、タングステンカーバイドナノ粒子に付着しているカーボンを除去する必要がある。過酸化水素水等による湿式での化学処理を試みたが、完全除去は難しく、これが超硬材料としての評価の壁となっている。今後は、水素ガスによる乾式処理等も考慮し、来年度は、超硬材料として可能な純度のタングステンカーバイドのナノ粒子の精製が可能かどうかを検討する。次年度の使用額は、今年度の研究を効率的に推進したことに伴い発生した未使用額であり、平成25年度請求額とあわせ、平成25年度の研究遂行に使用する予定である。
酵母のHOG-MAPキナーゼカスケードによる細胞周期調節機構の解析

出芽酵母のHOG-MAPキナーゼカスケードを構成するHOG1遺伝子やPBS2遺伝子破壊株の示すカルシウム感受性をマルチコピーで抑圧することのできる遺伝子断片を含むいくつかのプラスミドを単離したが、それらを再度、別途構築したhog1 Δ、pbs2 Δ株に導入しカルシウム感受性を検討した結果、再現性を確認することができなかった。その原因については不明である。一方、HOG-MAPキナーゼ系の下流で機能する遺伝子のクローニングを行ったところ、2-デオキシグルコース-6-リン酸ホスファターゼをコードするDOG2遺伝子を取得した。本遺伝子の発現は、浸透圧ストレスのみならず、酸化的ストレスやグルコース飢餓にも応答して発現誘導された。発現制御機構の詳細な解析から、本遺伝子の発現はSer/Thrキナーゼの一つであるSnf1キナーゼと、MAPキナーゼであるHog1、あるいはMAPキナーゼキナーゼであるPbs2によって協調的に制御されていることを明らかにした。とくに興味深い点は、従来、浸透圧ストレスのみを伝えると考えられてきたHOG-MAPキナーゼ系が、酸化的ストレスをもシグナル伝達し得ることを明らかにした点である。分裂酵母のMAPキナーゼ系(あるいはstress-activated protein kinase系ともいう)は、種々のストレスをシグナル伝達するとともに、細胞周期の制御にも深く関わっていることが知られている。一方、出芽酵母を過酸化水素やスーパーオキシドラジカル発生剤で処理すると、特異的な細胞周期の停止が起こることが報告されている。今回、DOG2遺伝子の発現制御機構の解析を通してHOG-MAPキナーゼ系が酸化的ストレスをもシグナル伝達することができることを明らかにしたことから、本MAPキナーゼ系と細胞周期の研究がより進展することが期待される。酵母(Saccharomyces cerevisiae)の浸透圧ストレスは、HOG-MAPキナーゼ系によってシグナル伝達される。本申請者は、HOG1遺伝子破壊株、あるいはその機能的上流に位置し、Hog1をリン酸化するMAPキナーゼキナーゼであるPBS2遺伝子破壊株が、カルシウム感受性を示すことを見いだした。一方、S.cerevisiaeではカルシウム処理によってG2期からM期への移行の遅延が起こる。これらの事実から、浸透圧ストレス応答とカルシウムシグナルによる細胞分裂周期の調節という2つの異なった事象を、統一的に理解できるのではないかという着想に至った。即ち、HOG-MAPキナーゼ系は浸透圧ストレス応答に必要な遺伝子の発現を制御しているが、細胞内外の浸透圧バランスがとれていない状態で娘細胞が母細胞から切り離された場合、細胞内成分の漏えい等が起こり、娘細胞、母細胞ともに致死的なダメージを受けることが予想される。これを回避するため、G2/M期のcheckpoint機構としてHOG-MAPキナーゼ系を稼動させて、細胞内環境を整えているのではないかと本申請者は考えた。そこで本研究では、酵母がストレスを負荷された際に示す適応応答が、細胞周期との関係においてcheckpointを通過させるに足る細胞内環境をと整えるための適応として機能しているかどうかを、HOG-MAPキナーゼ系とカルシウムシグナリング系との関係において明らかにすることを目的としている。そこで、hog1△株の示すカルシウム感受性をマルチコピーで抑圧できるサプレッサー遺伝子のクローニングを試みた。YEp13をベクターとして構築したS.cerevisiaeのゲノムDNAライブラリーをhog1△株に導入し、150mMカルシウム含有培地で生育可能なクローンの取得を試みた。その結果、約60株のクローンが得られた。それらの株からプラスミドを調製し、現在、解析を進めている。
細胞膜異常とオートファジーに注目したライソゾーム病の中枢神経変性メカニズムの解明

GM1-ガングリオシドーシスはライソゾーム酵素β-ガラクトシダーゼの遺伝的欠損によりおこるライソゾーム病で、小児期に進行性の中枢神経症状を発症する疾患である。本研究で、患者培養細胞およびモデルマウスを用いた解析により、神経細胞膜シグナル(神経栄養因子受容体シグナル)異常とオートファジー機能異常を明らかにし、神経変性との関連性を明らかにした。これらの成果は、本疾患の発症メカニズムのみならず分子標的治療に向けた新たな視点となる。GM1-ガングリオシドーシスなどのライソゾーム病の中枢神経障害のメカニズムは、未だ不明な部分が多い。GM1は神経細胞膜マイクロドメインに豊富に存在し、神経細胞の生存・分化に重要な種々の細胞内シグナル伝達に関わっている。β-ガラクトシダーゼ遺伝子欠損ノックアウトマウスは脳神経細胞内のGM1/GA1の蓄積と進行性中枢神経症状を示すGM1-ガングリオシドーシスモデルである。我々はこのノックアウトマウス脳から採取した初代神経系細胞および繊維芽細胞株を用い、GM1蓄積から神経細胞障害に至る分子機構の解明を行った。モデルマウス生後8日目小脳由来培養神経細胞および脳組織において、GM1の細胞膜蓄積、異常局在が認められた。細胞膜マイクロドメインでGM1と結合している神経栄養因子受容体(Trk)が著しく減少し、Trk受容体のリン酸化および下流シグナルも低下していた。また、ノックアウトマウス由来培養小脳顆粒細胞はプレアポトーシスマーカーのアネキシンV陽性を示したが、これに対し脳由来神経栄養因子(BDNF)を培養液中の添加はTrk受容体のリン酸化を誘導し、細胞死を有為に抑制した。一方、ライソゾームによる分解系オートファイジー(自食作用)は、飢餓や炎症により誘導され、自らの構造を壊すことで細胞の生存・維持に働く生理機能であるが、ある病的な状態における過度のオートファジーはアポトーシスやネクローシスとは異なるオートファジー性細胞死として、近年ある種の神経細胞死との関連が報告されているが、その実態は不明である。これまで結果、GM1-ガングリオシドーシスモマウス脳においてオートファジーマーカーLC3はGM1の蓄積小胞と共局在し、活性型LC3の有為な上昇が認められ、ライソゾーム内の糖脂質の蓄積によるオートファジーの異常な活性化を示唆している。また、GM1-ガングリオシドーシスの治療法としてケミカルシャペロン法を開発しているが、ヒト繊維芽細胞に対する効果をまとめ報告した(Brain Dev 2006)幼児型GM1-ガングリオシドーシスモデルマウスであるβ-ガラクトシダーゼ遺伝子欠損マウスを用い、神経変性機構と神経栄養因子シグナルおよびオーファイジー異常との関連性を検討した。新生児期のモデルマウス脳組織(大脳・小脳)および小脳由来初代培養神経細胞においてリン酸化Trk蛋白質が正常マウスに比べ著しく減少していた。培養液への脳由来神経栄養因子(BDNF)の添加は、β-ガラクトシダーゼ遺伝子欠損神経細胞のリン酸化Trkの発現を上昇し、細胞死を抑制した。一方、神経症状発症後の8-10ヶ月齢のモデルマウス脳では、Trkリン酸化が正常マウスに対し異常に亢進していた。リン酸化Trkの亢進は、GM1ガングリオシドとコレステロールの蓄積した神経細胞に特異的であった。また、Trk蛋白質はエンドソーム分画に集積し、ユビキチン化されていた。オートファジーに関連するLC3IIとBeclin-I蛋白質は、β-ガラクトシダーゼ遺伝子欠損マウス脳GM1蓄積細胞において亢進し、Akt/Erk/mTORのリン酸化が正常マウスに比べ亢進していた。また、モデルマウス大脳由来培養アストロサイトは、ミトコンドリア形態異常と膜機能の低下を示した。また、ミトコンドリア酸化ストレス誘導に対し高感受性を示し、ATP、オートファジー抑制剤(3-MA)およびカスパーゼ阻害剤によりその作用は抑制された。また、正常アストロサイトにクロロキンを添加したアストロサイトでも同様の効果を認めた。以上から、オートファゴソーム-ライソゾーム融合不全から引き起こされるオートファジー異常がミトコンドリア異常を介した細胞死を引き起こしていることが示されたGM1-ガングリオシドーシスの神経障害に関わる細胞膜機能異常とシグナル伝達系について解析を行った。モデルマウス脳組織、および小脳初代神経細胞の細胞膜脂質ラフトにGM1-ガングリオシドとコレステロールが蓄積し、膜流動性が低下していた。また、疾患神経細胞では糖脂質のエンドサイトーシス後のゴルジ体への輸送が異常を来たし、エンドソーム系に蓄積することを見いだした。これらが原因となり、脂質ラフトでの神経栄養因子受容体Trkシグナルの恒常的な亢進を引き起こし、下流シグナルの異常を来していることも見い出した。一方、ライソゾーム内のGM1の蓄積はオートファジーの機能異常とミトコンドリア機能低下を引きおこし、神経細胞障害と関連していることも明らかにしている。このオートファジーの異常は、siRNAを用いβ-

ガラクトシダーゼ遺伝子をノックダウンした培養神経細胞株PC12で同様に観察され、神経栄養因子NGF刺激により細胞死が誘導された。このKGF刺激による細胞死はK252aによるTrkシグナル阻害とともに、オートファジー阻害によっても抑制された。これらの結果は、Trkシグナルとオートファジーの異常が神経細胞障害に互いにクロストークしていることを示唆する。今後、共通するシグナル経路についてさらに詳細な解析を行うことで、新たな分子標的療法の可能性を探ることができると考えている。また、オートファジーについては、ニーマン・ピック病C型、ムコリピドーシスII/III型の細胞でも同様の機能異常を明らかにした。オートファジー異常はライソゾーム病に共通に見られ、発症メカニズムや治療戦略にも新たな視点を得られたと考えている。
末梢味覚器におけるインスリンシグナルの機能の解明

本研究の目的は味細胞におけるインスリンシグナルの役割を解明することである。昨年度、マウス味覚器にインスリンレセプターのmRNAおよびタンパク質が強く発現していることを明らかにした。本年度は、味細胞幹細胞3次元培養系である「taste bud organoid」を用いて、味細胞の前駆細胞の分化・増殖におけるインスリンの影響を検証した。本研究ではインスリンを含まない調整培地を新たに調合し、そこに様々な濃度のインスリンを添加してその中でorganoidを3週間培養した。その結果、培地中のインスリン濃度依存的に、味細胞を含むオルガノイドコロニー数の減少、また、各種味細胞マーカー(nucleoside triphosphate diphosphohydrolase-2:I型味細胞、Tas1R3、gustducin:II型味細胞、carbonic anhydrase 4:III型味細胞)のmRNA発現量が有意に減少することが明らかとなった。GLUT8やSGLT1といったグルコーストランスポーターのmRNA発現も同様にインスリン濃度依存的に減少した。さらに、インスリンを含む様々な成長因子、栄養因子によって活性化され、細胞分裂や生存などの調節に関わることが知られるセリン・スレオニンキナーゼ「mammalian target of rapamycin(mTOR)」を薬理学的に阻害すると、前述のインスリンによる味細胞数減少は抑制され、コロニー中に含まれる味細胞の有意な増加が認められた。以上の結果から、血液中のインスリンは末梢の味細胞に発現するインスリンレセプターを介して直接作用し、下流のmTOR経路を活性化することで味細胞の分化/増殖を調節している可能性が示唆された。組織学的実験、3次元培養を用いた実験に関してデータが出揃ってきており、おおむね順調に進展していると考えられる。また、本研究結果の一部は第60回歯科基礎医学会学術大会アップデートシンポジウム4「若手の口腔生理学研究最前線」(2018年9月5日、福岡)、日本味と匂学会第52回大会(2018年10月31日、大宮)、FAOPS2019(2019年3月29日、神戸)で発表した。これまでに、味細胞幹細胞の3次元培養系である「taste bud organoid」を用いて、培地中のインスリン濃度依存的に、味細胞を含むオルガノイドコロニー数の減少、各種味細胞マーカーmRNA発現量が有意に低下することを確認した。この結果から、肥満や糖尿病といった高インスリン血症を引き起こす病態では、味細胞の分化・増殖が正常に行われなくなる可能性が示唆される。事実、糖尿病患者、また肥満者で味覚障害が起こるという臨床報告は多数あり、今回の発見はこの病態発症メカニズムを裏付けるデータとなるかもしれない。また、mammaliantarget of rapamycin(mTOR)経路を阻害剤であるラパマイシンを培地中に添加することで、オルガノイドコロニー中に含まれる味細胞数、各種味細胞マーカーmRNA発現量の有意な増加が認められた。この結果は、糖尿病や肥満に伴う味覚障害の新たな治療ターゲットとしてmTORシグナリングが浮上する可能性がある。今後は、高インスリン血症を示すマウス(db/dbマウスなど)または正常型マウスにラパマイシンの投与を行い、in vivoでmTORシグナリングを阻害した場合、味細胞の分化・増殖にどのような影響があるのかを探索する。得られた研究結果は味と匂学会、歯科基礎医学会、生理学会等の学会で積極的に発表していく予定である。また、本年度中にこれまでに得られた研究結果をまとめて、論文として学術誌に投稿することを目標とする。本研究の目的は末梢味覚器におけるインスリンシグナルの役割を解明することである。初年度は、主に分子遺伝学的、免疫組織化学的手法を用い、マウス味覚器におけるインスリン及びその関連分子のmRNA、タンパク質の発現を探索した。その結果、マウス味蕾にインスリンホルモン自体の発現は見られなかったが、インスリンレセプターのmRNAおよびタンパク質は味上皮に強く発現していることが明らかとなった。インスリンレセプターは、舌前方部茸状乳頭内味蕾、後方部有郭乳頭内味蕾ともに、甘味受容体サブセットであるT1R3発現味細胞に多く発現していた(約80%)。さらに、酸味受容細胞と考えられるGAD67陽性味細胞でも6070%の共発現率を示し、その他の味細胞でも発現が見られたことから、味細胞全体に広く発現していることが予測された。また、味細胞幹細胞3次元培養系である「taste organoid」を用いて、味細胞の前駆細胞の分化・増殖におけるインスリンの影響を検証した。従来organoidを培養するのに用いられていた培地には、はじめから多量のインスリンが含まれているため、インスリン自体の効果を検証することは不可能であった。そこで、今回はインスリンを含まない調整培地を新たに作成し、そこに様々な濃度のインスリンを添加してその中でorganoidを培養することを試みた。その結果、インスリン濃度依存的に(0nM50nM)播種後20日目のオルガノイド中に含まれる味細胞の数が減少していくことがわかった。この結果は、味細胞がその前駆細胞から成熟、増殖していく過程にインスリンが影響することを示唆する。平成29年度途中より、九州大学歯学研究院の動物舎が改装・消毒作業のためにクローズしているため、実験に用いるマウスの繁殖飼育がストップしている。そのため、実験に用いるマウスの供給が間に合っていない状況であるため、実験は予定よりやや遅れている。

昨年度、マウス味覚器にインスリンレセプターのmRNAおよびタンパク質が強く発現していることを明らかにした。本年度は、味細胞幹細胞3次元培養系である「taste bud organoid」を用いて、味細胞の前駆細胞の分化・増殖におけるインスリンの影響を検証した。本研究ではインスリンを含まない調整培地を新たに調合し、そこに様々な濃度のインスリンを添加してその中でorganoidを3週間培養した。その結果、培地中のインスリン濃度依存的に、味細胞を含むオルガノイドコロニー数の減少、また、各種味細胞マーカー(nucleoside triphosphate diphosphohydrolase-2:I型味細胞、Tas1R3、gustducin:II型味細胞、carbonic anhydrase 4:III型味細胞)のmRNA発現量が有意に減少することが明らかとなった。GLUT8やSGLT1といったグルコーストランスポーターのmRNA発現も同様にインスリン濃度依存的に減少した。さらに、インスリンを含む様々な成長因子、栄養因子によって活性化され、細胞分裂や生存などの調節に関わることが知られるセリン・スレオニンキナーゼ「mammalian target of rapamycin(mTOR)」を薬理学的に阻害すると、前述のインスリンによる味細胞数減少は抑制され、コロニー中に含まれる味細胞の有意な増加が認められた。以上の結果から、血液中のインスリンは末梢の味細胞に発現するインスリンレセプターを介して直接作用し、下流のmTOR経路を活性化することで味細胞の分化/増殖を調節している可能性が示唆された。組織学的実験、3次元培養を用いた実験に関してデータが出揃ってきており、おおむね順調に進展していると考えられる。また、本研究結果の一部は第60回歯科基礎医学会学術大会アップデートシンポジウム4「若手の口腔生理学研究最前線」(2018年9月5日、福岡)、日本味と匂学会第52回大会(2018年10月31日、大宮)、FAOPS2019(2019年3月29日、神戸)で発表した。今後はオルガノイドの成熟にインスリンがどの様に影響しているのかそのメカニズムに切り込んでいく予定である。過去に、膵島培養細胞を用いた実験ではインスリンがmTORを介する経路を活性化しα細胞の分化に影響することが報告されている(Liu et al., PLOS one 2011)。当研究室では既にmTORのmRNAが味細胞に発現することをRT-PCRで確認しており、この経路が味細胞の分化・成熟に何らかの関わりがあるのではないかと予想している。昨年度、オルガノイドを用いた実験結果から、培地中のインスリンは味細胞の分化・増殖を抑える方向に働く可能性が示唆された。ここにmTOR経路のブロッカーであるラパマイシンを添加することで、インスリンの効果がどの様に変化するのかを検証する。
連星中性子星合体によるマグネター形成と核物質状態方程式

2015年9月14日にアメリカのLIGOが人類初の重力波直接検出に成功した。波源は連星ブラックホールの合体と推定され、重力波と連星ブラックホールの実在証明が初めて与えられた。さらに2015年12月26日にはもう一例の連星ブラックホール合体からの重力波観測が成功した。この観測をもって重力波天文学が開闢した。そこで本申請課題では連星中性子星に焦点を当てて研究を行った。連星中性子星は現在までに実在証明が与えられている天体であり、宇宙年齢以内に重力波放出により合体することが知られている。日本のKARGAを含めた重力波干渉計の世界的ネットワークの構築が進んでいるが、連星中性子星合体はこれらの干渉計の重要なターゲットの一つである。特に連星中性子星合体からの重力波からは中性子星物質の真の状態方程式、ショートガンマ線バーストの中心動力源、宇宙における鉄より重い元素の起原に関して重要な知見が得られるため、その観測がもたらす情報は連星ブラックホール合体からの重力波の持つ情報とは質的に異なる。そこで本申請課題では中性子星を特徴付ける重要な物理量である磁場に焦点をあて、中性子星磁場が連星合体の過程にどのような影響を与えるかを数値相対論シミュレーションで調べた。スーパーコンピューター京や国立天文台アテルイを使用して、既存の研究より遥かに高い解像度のシミュレーションを実行した。その結果を以下に要約する。合体時の星の接触面は逆向きの速度場が存在するため、ケルビンーヘルムホルツ不安定性が発現し乱流渦が生成される。この渦に磁場が巻かれ、磁場が合体後数ミリ秒間に少なくとも1,000倍程度効率的に増幅される様子がシミュレーションからわかった。さらに合体後には磁気回転不安定性により磁気乱流状態が実現される。この結果実行的な粘性が生み出され、合体後の進化の描像を定性的に変え得るという帰結を本研究を通して得た。28年度が最終年度であるため、記入しない。今年度2月11日にアメリカのAdvanced LIGOから人類初の重力波直接観測に成功したという報告があった。アインシュタイン最後の宿題と題された重力波の直接検出とブラックホールの2重連星の存在証明がもたらした科学的意義は計り知れない。宇宙を見る新しい目として重力波天文学が開闢したが、連星ブラックホール以外にも中性子星からなる連星合体も地上型重力波干渉計の有望なターゲットである。Advanced LIGOに加え、イタリアーフランスのAdvanced VIRGO、日本のKAGRAも本格観測を控えていることから、近い将来連星中性子星合体からの重力波が観測される可能性は高い。連星ブラックホールの合体と異なり、連星中性子星合体からの重力波は核密度状態方程式、ショートガンマ線バーストの中心動力源、速い中性子捕獲反応による重元素合成に関する重要な知見が得られると期待されている。連星中性子星合体は激しい動的現象であるため、解析的な手法を用いた理論研究は不可能である。数値相対論と呼ばれる数値シミュレーションが唯一の方法であり、本研究ではこれを採用する。特に中性子星磁場に着目し、連星合体おける磁気流体効果をスーパーコンピューターで調べた。本課題に関する論文を主著者として1遍科学雑誌に掲載した。また、関連する研究課題について主著者として1遍、共著者として1遍発表済みである。さらに国際会議における招待講演を2件、一般講演を4件行い、また国内学会における講演を2件行った。本年度は連星中性子星合体時におけるケルビンーヘルムホルツ不安定性に着目した研究を行った。合体時の星の接触面は必ずケルビンーヘルムホルツ不安定と呼ばれる流体不安定性に対して不安定になる。その結果生み出される乱流渦が中性子星が持つ磁場を効率よく増幅することがこれまでにない高解像度シミュレーションで分かった。具体的には先行研究で設定された解像度より約10倍高い解像度を用いたシミュレーションをスーパーコンピューター京で実行した。これにより観測から示唆される10の13乗ガウス程度の中性子星磁場が合体後4ミリ秒程度の非常に短い時間の間に10の15乗から16乗ガウス程度まで効率的に増幅されることが判明した。この結果をまとめた論文は昨年12月に出版されたが、既に引用数は9を超えている。以上から概ね順調に進展していると結論付ける。

スーパーコンピューター京や国立天文台アテルイを使用して、既存の研究より遥かに高い解像度のシミュレーションを実行した。その結果を以下に要約する。合体時の星の接触面は逆向きの速度場が存在するため、ケルビンーヘルムホルツ不安定性が発現し乱流渦が生成される。この渦に磁場が巻かれ、磁場が合体後数ミリ秒間に少なくとも1,000倍程度効率的に増幅される様子がシミュレーションからわかった。さらに合体後には磁気回転不安定性により磁気乱流状態が実現される。この結果実行的な粘性が生み出され、合体後の進化の描像を定性的に変え得るという帰結を本研究を通して得た。今年度は引き続き連星中性子星合体による強磁場中性子星形成に関する研究を続ける。具体的には、核密度状態方程式と連星質量を変え系統的な研究を推進する。連星中性子星合体において強磁場中性子星が不可避的に形成するというパラダイムを確立する。また、磁場の飽和強度は合体時の力学的エネルギーとのequipartitionで決まると予想されるが、この点についても精査する。可能であれば蓄えられた磁場が磁気散逸により熱化されるプロセスを再現する為の中性子星物質の磁気散逸についてモデル化を行う。28年度が最終年度であるため、記入しない。
葉緑体Stromuleの細胞内3次元構造の構築と塩ストレス耐性との関連性の解明

ミトコンドリアやペルオキシソームが細長いストロマを含む構造で葉緑体に取り囲まれる構造は、葉緑体ポケットとよばれている。葉緑体が作る細長い突起状の構造であるstromuleが関与すると予想される。そのため、3次元立体像を構築することで、stromuleとポケット構造の関係を調べた。TEMとFIB-SEMを用いて葉緑体ポケット構造を含む葉緑体の連続画像を取得し、3次元再構築法によって観察した。その結果、葉緑体が大きなシート構造を作り、それがポケット構造を作っていることが明らかとなった。また、ポケット構造で取り囲まれているオルガネラとして、ミトコンドリアとペルオキシソームが一番多く観察された。これまでにFIB-SEMで報告されてきた主な試料は、動物の組織片であり、観察時に方向性に決まりがなく、FIBによる切削もランダムに切ればよいものが多かった。しかし、今回はイネの葉を一般的な横断切片と同じ方向性を保ってFIBで切削する必要があったので、試料台への取り付けとトリミングを工夫し、ブロック中の葉切片がFIBに対して直角に入るようにセッティングした。これまで、SEMによるブロック表面観察には、樹脂包埋前に酢酸ウランや鉛染色液によるブロック染色を施す必要があるとされてきたが、本研究で使用したFIB-SEMは、FIBとSEMが直行配置になっており、電子染色の弱い試料でも観察できるように改良されていた。そのため、ブロック染色を施さずに、固定時に用いるオスミウム染色のみで良質な画像を得ることができた。本年度は、対照条件で水耕栽培したイネ葉肉細胞を観察し、立体像の構築を行った。ペイントツールSAIで目的の画像をトレースし、AVIZOで立体像を構築する方法が最も効率的な手法であった。この手法を用いて、FIB-SEMで取得した200枚程度のイネ葉肉細胞の平面像から立体像を構築し、葉肉細胞の右腕構造を3次元的に明らかにした。(2) TEMによる観察ウルトラミクロトームを用いて40枚前後の連続切片を作成し、塩ストレス下で葉緑体が形成するオルガネラ陥入構造を観察した。70個の葉緑体陥入構造を含む葉緑体を連続切片で観察したところ、陥入構造に含まれるオルガネラの半分がミトコンドリアであった。ペルオキシソームだけが取り囲まれている構造が8個、ミトコンドリアとペルオキシソーム両方が取り囲まれている構造も8個観察できた。陥入構造に含まれるオルガネラの多くはミトコンドリアとペルオキシソームに関係しており、塩ストレス下における両者の強い結びつきが示唆された。FIB-SEMを用いたこれまでの研究では、動物組織が主に用いられており、植物を用いた観察例はほとんど存在しない。そのため、その手法も十分に検討されておらず、方法論の確立に時間を要することが予想された。とくに、動物組織を用いた研究で行われているブロック染色を検討する必要があることが予想され、時間を要することが懸念された。しかし、本研究において、植物組織では固定時のオスミウム染色だけで良質な画像を取得できることが明らかとなり、ブロック染色の必要がないことが明らかになった。そのため、固定や観察手法の確立が大幅に削減され、研究を効率的かつ迅速に進展させることができた。FIB-SEMによって迅速に良質な連続画像を取得することができたため、続く作業である画像トレースや立体像の構築の手法も確立することができた。そのため、FIB-SEMを用いた研究は順調に研究が進展した。TEMを用いた観察研究においては、連続切片を作成する必要があったため、難航することが予想された。これまでも、いくつかの研究で連続切片を作成してTEMで観察する手法が行われてきたが、多量の連続切片の取得には多くの時間と労力が必要であることが懸念されていた。しかし、葉緑体の陥入構造を含む部分のみだけであれば、多くても40枚ほどの連続切片があれば十分であることが明らかとなり、作業に必要な時間と労力が大幅に節約できた。そのため、70個のオルガネラを含む葉緑体陥入構造の観察像を取得することができ、取り囲まれるオルガネラを分類することができた。以上のことから、予定していた研究を十分に遂行することができ、「おおむね順調に進展している」とした。(1)葉緑体陥入構造の3次元立体構造の構築イネ葉緑体陥入構造の連続画像を透過型電子顕微鏡(TEM)と集束イオンビームSEM (FIB-SEM)を用いて観察した。TEMによる観察から立体構造を構築したところ、陥入構造には以下の3つのパターンが観察された。(1)陥入構造の両側が閉じられてオルガネラが完全に葉緑体に取り囲まれる型(Close)、(2)陥入構造の両端は閉じているが一部に隙間ができる型(Gap)、(3)陥入構造の片側が空いている型(Open)。さらに、FIB-SEMで陥入構造を持つ葉緑体を観察して立体像を構築したところ、葉緑体からシート構造が出現し、そのシート構造がペルオキシソームの一部を取り囲んでいる像が観察された。これらの結果から、葉緑体陥入構造は、葉緑体からシート状構造が出現し、それが他のオルガネラを取り囲むことで構築されることが予想された。さらに、GapやOpenタイプの陥入構造は、シート構造がオルガネラを取り囲む途中の像、または閉じた陥入構造が再び開いた像であることが予想された。