hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
原虫Perkinsus olseniがアサリに蔓延した生理生態学的要因の解明

一方、P. olseniのアサリ間伝播機構に関しては予備的フィールド調査を実施した結果、フィールドでの実施が難しそうな見通しである。そこで、水槽を用いた人為的条件下による実験について計画立案が必要と考えられた。Perkinsus属3種のアサリに対する寄生適応性の比較については実験が終了し、概ね計画通り進んでいる。なお、平成30年度に実施する予定であった宿主体内における生体防御回避機構については、計画よりも早く実験が進行している。研究年度二年目には、まずPerkinsus olseniが宿主であるアサリ等の体内では増殖する一方、感染が成立しないマガキ等の体内では増殖しない現象に着目、in vitro培養実験を実施した。現在、使用している培地には細胞増殖に影響を及ぼす牛胎児血清(FBS)が含まれているため、FBSを含まない培地を新たに作成し、その上で、宿主二枚貝の体液がP. olseniの増殖に与える影響を調べた。その結果、宿主となるアサリにはP. olseniの増殖を促進させる因子が含まれている一方、マガキなどでは逆に増殖を抑制する因子が含まれていることが明らかになった。また、このマガキの増殖抑制因子はP. olseniを殺すことはなく、分裂等を抑制していることが考えられた。このように宿主に含まれる因子がP. olseniの宿主特異性を規定する一つの要因であると考えられた。上に加えて、P. olseniの栄養体から前遊走子嚢への発育に必要な因子の探索を行った。その結果、これまでは前遊走子嚢への発育には貝類組織の添加が必要であったが、一切の宿主因子を排除した新たな培養法の開発に成功した。これにより、滅菌条件下でかつ宿主組織の影響を完全に排除した培養が可能となった。また、時間的発育の詳細を明らかにすることにも成功し、今後、分子生物学的手法および細胞生物学的手法を利用する実験が可能になると考えられる。さらに、前遊走子嚢は主要感染源となる遊走子を産出する。そこで、自然環境下での感染動態とこの感染源作出の関係を調べるため、前遊走子嚢形成に及ぼす環境条件の影響を調べた。その結果、広範囲の塩分条件下で前遊走子嚢形成は起こるが、低温条件では抑制される音が明らかになり、冬期の新規感染抑制は、前遊走子嚢形成が抑制されるためと考えられた。平成30年度の研究計画のうち、宿主細胞内におけるP. olseniの生残メカニズムについては解析が進んでいないが、増殖に必要な培地成分の分析・分裂増殖に及ぼす宿主因子の分析を実施し、一定の結果が得られた。また、アサリ間伝搬機構については、感染源産出に及ぼす環境の影響が評価でき、概ね予定通り進んでいると判断した。平成30年度は前年度に完了できなかった上皮細胞層突破機構の解明と遊走子の変態誘起因子の同定を中心に進めていく。また、アサリの液性因子がP. olseniの生残、増殖におよぼす影響評価に関しては因子の同定を進めると共に、アサリの液性因子をP. beihaiensis、P. honshuensisのin vitro培養系に加え生残、増殖を検討、宿主特異性との関連について調べていく。アサリ血球によるPerkinsus属原虫排除機構に関しては、Perkinsus属3種の栄養体表面にある糖鎖との相互作用、およびPerkinsus属原虫の貪食回避システムについてさらなる解析を進めていく。
導電性ポリマーのモルフォロジー変化に基づくナノ構造制御とその汎用的分離膜への適用

セラミック多孔膜(材質Al_2O_3,孔径0.1μm)上にピロールをFe(ClO_4)_3を用いて化学酸化することにより,膜上層にポリピロールが堆積した複合膜を得た。重合物は元素分析およびIR測定によりポリピロールと同定した。またSEM観察によりポリピロール層は約20μm程度であることがわかった。原料ガスとしてCO_2/CH_4混合ガスを用いて,ポリピロール膜によるガス分離を検討した結果,CO_2/CH_4の選択性が約200という極端に高い値が得られた。通常の高分子において選択性が100を越えるものは皆無であることからも,得られた値は非常に高い値と言える。ポリピロールはほとんど溶解する溶媒がないと言うほど剛直なポリマーであるため,顕著なサイズ選択性が表れたものと考えられる。また,CO_2,CH_4とも透過速度は原料側分圧に依存しておらず,このことはガスは膜中を溶解拡散機構により透過していることを示している。さらに,原料ガスとして数種のガス(He,CO_2,CH_4,C_2H_4)を用いた結果,透過速度はガスの動力学径が減少するほど高い値を示した。この様な傾向は,やはり剛直なポリマーの特徴である。また,NaBH_4により還元,Fe(ClO_4)_3により酸化という操作を繰り返した膜や,p-トルエンスルホン酸ナトリウムによりド-ピングされたClO_4-イオンをイオン交換し,さらにNaClO_4でイオンを交換を行うという操作を繰り返した膜について透過速度の変化を検討した。CO_2の透過速度はサイクル的に還元状態で増加,酸化状態で減少した。また,p-トルエンスルホン酸イオンの導入により減少,過塩素酸イオンの導入により増加という変化がサイクル的に起こった。このことはスイッチング膜としての機能を示唆するものである。
運動量-エネルギー空間における原子層レベルのキャリアダイナミクスと物性制御

エピタクシャル金属超薄膜や金属的電子状態をもつ表面超構造、低次元導電性固体などは近年興味深い物理現象が数多く見出され、また電子デバイスのミニチュアリゼーションの観点からもその注目度は年々高まっている。本研究では、これまでエネルギー分散関係の直接測定が難しかった低次元プラズモンの精密測定を行うことで低次元電子系・ホール系のダイナミクスの詳細を明らかにし、金属ナノ薄膜など低次元伝導構造をベースとした物質のプラズモン物性と、それを利用した新材料創製へ向けた基礎原理・指針構築の可能性を調べた。初年度は研究代表者の東北大学への転任に伴い実験装置の再立ち上げと高性能化を進めた。その後半導体基板上の金属超薄膜のエピタクシャル成長条件の探索を系統的に進め、成長条件の最適化を行った。また、分担者稲岡の理論研究等をもとに、現象の基礎的理解を深めた。次年以降度はシリコン表面に低温蒸着による「electronic growth法」でナノ構造制御された高品質のAg(111)超薄膜を作成し、その成長ダイナミクスとプラズモン分散関係をエネルギー分解能約10meV、波数分解能0.006l/Åの高波数分解EELS・LEED法により測定し膜厚・波数に応じて変化する2つのプラズモンモードを観察することに成功し、そのうち一つはこれまで理論的には予言されていたが、分散測定の無かった界面プラズモンモードであることが明らかになった。3層モデルにバルク誘電定数を代入することでAg/Siヘテロ系のプラズモン分散関係を計算した結果、実験で観測したモードとほぼ同じエネルギーと形状を持つ分枝が再現できた。また、シリコン高指数表面に金のナノワイヤー列を規則正しく並べ、その1次元プラズモン分散関係を側定し、交換相関効果やワイヤー間の相互作用を調べた。本研究では、これまでエネルギー分散の測定が難しかった低次元プラズモンの精密測定を行うことで低次元電子系、ホール系のダイナミクスの詳細を明らかにし低次元伝導構造をベースとした新材料創製へ向けた基礎原理・指針を探る。さらに、高分解能低速電子回折法(HRLEED)によるナノモルフォロジー制御の技術により低次元系に良く規定されたナノスケール変調構造を導入し、集団運動する電荷(プラズモン)が散乱されたりナノ構造に閉じ込められる際のダイナミクスを調べ、それに起因する新しい機能物性発現の可能性を探索してゆく。本年度は研究代表者が東京大学理学部から東北大学金属材料研究所へと移動した為、実験装置の再立ち上げを行い、その後、試料冷却可能なクライオスタットとそれをマウント可能な特注製作のXYZ移動機構を準備した。また、真空槽内の試料準備ステージにRHEED電子銃クヌーセンセルを装備し、半導体表面の清浄化とエピタクシャル成長の環境を整え、様々な金属の成長を開始した。また、理論面では分担者稲岡が電子相関効果を取り入れたシートプラズモンのエネルギー分散関係を導出し、3次元系に比べて、我々が扱う2次元系におけるプラズモンの解析には電子相関効果が無視できない事を見出した。本研究では、これまでエネルギー分散関係の直接測定が難しかった低次元プラズモンの精密測定を行うことで低次元電子系・ホール系のダイナミクスの詳細を明らかにし、低次元伝導構造をベースとした新材料創製へ向けた基礎原理・指針を探る。

さらに、高分解能型低速電子回折法、高波数分解型エネルギー損失分光法を用い、ナノモルフォロジーを制御性良く作成しながら(例えば低次元系に良く規定されたナノスケール変調構造を導入するなど)、集団運動する電荷(プラズモン)がナノ構造により散乱されたりナノ構造に閉じ込められる際のダイナミクスを調べ、それに起因する新しい機能物性発現の可能性を探索してゆく。本年度は実験装置の再立ち上げと装置高性能化を完了し、シリコン表面に低温蒸着による「electronic growth法」でナノ構造制御された高品質のAg(111)超薄膜を作成し、その成長ダイナミクスとプラズモン分散関係をエネルギー分解能約10meV、波数分解能0.006 1/Åの高波数分解EELS・LEED法により測定した。その結果、膜厚・波数に応じて変化する2つのプラズモンモードを観察することに成功し、そのうち一つはこれまで理論的には予言されていたが、分散測定の無かった界面プラズモンモードであることが明らかになった。半古典的な誘電理論にバルク誘電定数を代入することでAg/Siヘテロ系のプラズモン分散関係を計算した結果、実験で観測したモードとほぼ同じエネルギーと形状を持つ分枝が再現できた。Ag以外の貴金属超薄膜や様々なシリコン表面超構造についても同様な測定を行い、理論と実験との詳細な対比を行った。
IL-18の抗腫瘍メカニズムの解明と頭頚部腫瘍治療への応用:IL-12との比較

我々は、IL-18の抗腫瘍効果の詳しいエフェクター細胞に関してマウスの系を用いて解析を行い、その抗腫瘍効果のエフェクター細胞がNKT細胞ではなくNK細胞であること(論文投稿中)、またIL-18がNK細胞を活性化し腫瘍細胞をアポトーシスに陥らせる結果、樹状細胞を介して効率良く腫瘍特異的CTLを誘導すること(Tanaka et al. C. Res. 2000,60:4838-4844)などを明らかにしてきた。平成13年度は、ヒトでのIL-18の抗腫瘍効果、特にその詳しいエフェクター細胞の解析を行った。ヒト末梢血をHuIL-18で14日間刺激・培養し、リンパ球の表面マーカーの変化を解析したところ、CD3-D56+(NK)細胞が著明に増加することが分かった。また、その際の培養液中のIFN-γ産生量をELISA法にて測定したところ,IL-2単独で培養した場合と比較して、多量のIFN-γ産生がみられることを明らかにした。IL-18の添加培養でNK細胞が増加していること、またIFN-γの産生増強がみられたことより、IL-18がヒトにおいても抗腫瘍効果を発揮することが予想された。そこで次に、IL-18により活性化されたリンパ球が腫瘍細胞に対してアポトーシスを誘導するかどうかを検討した。HuIL-18を添加培養したヒト末梢血リンパ球とヒト腫瘍細胞株とを8時間共培養した後、腫瘍細胞をAnnexin-V, Phi-Phi-Lux, PI等で染色することによりアポトーシスの検出を試みた。その結果、IL-2単独で培養した場合と比べてIL-18+IL-2で培養したとき、腫瘍細胞のアポトーシスが増強された(論文準備中)。以上のことより、ヒトの系においてもIL-18が抗腫瘍効果を有することが明らかになり、ヒト悪性腫瘍治療への臨床応用の可能性が示唆された。我々はIL-18の抗腫瘍効果、特にその詳しいエフェクター細胞に関して解析を行った。ノーマルマウスの肝臓よりリンパ球を分離し、表面抗原を抗CD3、抗NK1.1抗体で染色後、フローサイトメトリーを用いてNK細胞、NKT細胞を分離した。その後in vitroにてIL-18で刺激し48時間後のNK活性、培養上清中のインターフェロン-γの産生を測定した。その結果、IL-18刺激後のNK細胞では、YAC-1細胞に対して著名な細胞傷害活性の増強を示したのに対して、IL-18刺激後のNKT細胞ではわずかな細胞傷害活性の増強しか認められなかった。また、IL-18刺激後にNK細胞からは多量のインターフェロン-γの生産が認められたが、NKT細胞ではわずかな生産しかみられなかった。このことよりIL-18の抗腫瘍効果を担っているエフェクター細胞は、NKT細胞ではなくNK細胞であるこが強く示唆された(投稿準備中)。次に樹状細胞やIL-18、T細胞、NK細胞、そして腫瘍細胞が腫瘍特異的免疫誘導にそれぞれどのような役割を果たすのかを解明するために、マウスのそれぞれの細胞をin vitroで共培養することによって、効率良く腫瘍特異的CTLを誘導することが出来るかを検討した。その結果、IL-18がNK細胞を活性化し腫瘍細胞をアポトーシスに陥らせる結果、樹状細胞を介して効率良く腫瘍特異的CTLを誘導することをin vitroで示した(Tanaka et al.Cancer Res.2000,60:4838-4844)。

このことはIL-18がinnate immunityの増強に関わるのみならず、specific immunityの誘導にも関わることを強く示唆している。我々はこれまでに、IL-18の抗腫瘍効果の詳しいエフェクター細胞に関してマウスの系を用いて解析を行い、その抗腫瘍効果のエフェクター細胞がNKT細胞ではなくNK細胞であること(論文投稿中)、またIL-18がNK細胞を活性化し腫瘍細胞をアポトーシスに陥らせる結果、樹状細胞を介して効率良く腫瘍特異的CTLを誘導すること(Tanaka et al. C. Res. 2000, 60 : 4838-4844)などを明らかにしてきた。平成13年度は、ヒトでのIL-18の抗腫瘍効果、特にその詳しいエフェクター細胞の解析を行った。ヒト末梢血をHuIL-18で14日間刺激・培養し、リンパ球の表面マーカーの変化を解析したところ、CD3-CD56+(NK)細胞が著明に増加することが分かった。また、その際の培養液中のIFN-γ産生量をELISA法にて測定したところ、IL-2単独で培養した場合と比較して、多量のIFN-γ産生がみられることを明らかにした。IL-18の添加培養でNK細胞が増加していること、またIFN-γの産生増強がみられたことにより、IL-18がヒトにおいても抗腫瘍効果を発揮することが予想された。そこで次に、IL-18により活性化されたリンパ球が腫瘍細胞に対してアポトーシスを誘導するかどうかを検討した。HuIL-18を添加培養したヒト末梢血リンパ球とヒト腫瘍細胞株とを8時間共培養した後、腫瘍細胞をAnnexin-V, PhiPhiLux, PI等で染色することによりアポトーシスの検出を試みた。その結果、IL-2単独で培養した場合と比べてIL-18+IL-2で培養したとき、腫瘍細胞アポトーシスが増強された(論文準備中)。以上のことより、ヒトの系においてもIL-18が抗腫瘍効果を有することが明らかになり、ヒト悪性腫瘍治療への臨床応用の可能性が示唆された。
臓器間相互作用による抗転移細胞の解明

癌が原発巣から転移する際には、実際の転移が起きる前に、転移先の臓器において癌細胞の生着を有利にする“転移前土壌"と呼ばれる状態が形成される。これまでの研究から、この転移前土壌を消去することが癌転移の抑制には重要であることがわかってきた。近年、申請者らは、一群のNK様細胞が転移前土壌を解消し転移を抑制する抗転移細胞であることを突き止めた。本研究では、抗転移細胞が転移前土壌を解消する分子メカニズムを徹底的に解明するとともに、細胞の機能が原発癌の進行とともに失われるのはなぜか、抗転移能を回復させることはできないかどうかを動物モデル・細胞生物学・生物化学の複合的観点から明らかにすることを目指す。
外部社会との急速な接続に伴うラオス北部山地部農村の複合生業の機能動態

近年の大規模な交通網整備によって外部社会との接続が急速に進むラオス北部農山村において、これまで不安定になりがちであった農業生産を安定化させてきた複合的な生業活動の機能動態を、個々の連動性に着目しつつ実践的な側面から評価する。ラオス北部山地部における事例研究を通じ、自給的農村が急速に外部とつながる際の適応過程を解明し、より安定的かつ持続的な農村発展のあり方を提示する。
コンクリート内の水の相転移に着目した新しい乾燥収縮メカニズムに関する基礎研究

既往の研究では毛細管張力を基本としたメカニズム理論が最も現象を現しているといわれているが、申請者のこれまでの研究の結果、このメカニズム理論のみでは乾燥収縮を説明できない部分があることを証明している。そこで、申請者は内部の水が外部へ逸散する時、水(液相)から水蒸気(気相)への相転移が起きて乾燥収縮すると考えた。内部の水は、自由水や水和生成物への吸着水、水和物と結合した水など複数の水の変態が存在し、水の形態によって、気相へ相転移する土ネルギーが異なる。つまり、配合によって収縮量が異なる理由は、それぞれの水の量が異なるためと考えられる。したがって、内部水が相転移するエネルギーを算定することにより、新しい乾燥収縮のメカニズムの構築を目指すこととした。この考えを式化すると、内部エネルギー変化dUと考えた場合、雰囲気温度と作用力(大気圧)は一定条件なので、dU=TdS-pdV+ΣμdN(S:エントロピー、T:温度、p:作用力(大気圧)、V:体積、μ:化学ポテンシャル、N:分子数)と表すことが出来る。この式に基づいた理論を構築するための、内部エネルギー変化dUの測定法を確立するための基礎研究として本研究を行った。その内部エネルギーの変化を測定する方法として、示差走査熱量測定法を使用した。まず、示差走査熱量測定法によって、セメント硬化体のエンタルピーの変化dHを測定した。乾燥収縮供試体に掛かる作用応力は大気圧のみであり、定圧変化と考えられるので、dU=dH-pdVによって内部エネルギー変化dUを算定した。この方法によって内部エネルギーの測定法を確立し、確立した内部エネルギーの測定法によりデータを蓄積していったのが本研究の成果である。今後、これまで得てきたひずみ、内部相対湿度(化学ポテンシャル)のデータを組み合わせることにより、メカニズム理論の構築を目指す。既往の研究では毛細管張力を基本としたメカニズム理論が最も現象を現しているといわれているが、申請者のこれまでの研究の結果、このメカニズム理論では乾燥収縮を説明できないことを証明している。内部の水は、自由水や水和生成物への吸着水、水和物と結合した水など複数の水の変態が存在し、水の形態によって、気相へ相転移するエネルギーが異なる。この式に基づいた理論を構築するための、内部エネルギー変化dUの測定法を確立するのが、1年目である今年度の主目的である。これにより、今年度は内部エネルギーの測定法を確立した。来年度は、確立した内部エネルギーの測定法によりデータを蓄積し、これまで得てきたひずみ、内部相対湿度(化学ポテンシャル)のデータを組み合わせることにより、メカニズム理論の構築を目指す。

今後、これまで得てきたひずみ、内部相対湿度(化学ポテンシャル)のデータを組み合わせることにより、メカニズム理論の構築を目指す。
ザリガニ局所神経回路における並列的抑制経路の機能解析

ザリガニ腹部最終神経節は尾扇肢運動制御の場であり、尾部への機械的接触感覚情報は上行性介在ニューロン・スパイキング局在ニューロン・ノンスパイキング介在ニューロンによって構成される局所回路を通じて尾扇肢運動ニューロンに伝達される。この局所回路における主要抑制経路としては、(1)スパイキング局在ニューロンからノンスパイキング介在ニューロンへの(2)ノンスパイキング介在ニューロンから尾扇肢運動ニューロンへの(3)ノンスパイキング介在ニューロン間の抑制性接続があり、(4)また一部の上行性介在ニューロン間でも抑制性シナプスが形成されている。GABA作動性・グルタミン酸作動性ニューロンによって形成される並列的抑制経路の機能的意義を解明するため、本年度はGABA作動性シナプス抑制効果を主に解析した。GABA作動性ニューロンの同定細胞内染色ー抗GABA免疫組織化学染色の二重ラベル法を用い、ザリガニ腹部最終神経節に存在する約35対のGABA作動性ニューロンの同定を試みた。Flexor inhibitor, uropod common inhibitorを含む5対の運動ニューロン、1対のLDS、約10対のPLタイプ・2対のAL-Iタイプ・少なくとも5対のAL-IIタイプのノンスパイキング介在ニューロン及び6対の上行性介在ニューロンがGABA作動性ニューロンであることを確認したが、スパイキング局在ニューロンは一切GABA抗体に対し陽性反応を示さなかった。GABAに対する局所回路ニューロンの応答ニューロパイル内GABA局所微量投与に対する尾扇肢運動ニューロン・ノンスパイキング介在ニューロンの応答を電気生理学・薬理学的に解析した。GABA投与によってこれらのニューロンは膜過分極を示したが、クロライドチャネルブロッカーであるピクロトキシン(PTX)介在下においてGABAに対する運動ニューロンの応答に変化は見られなかった。また、ノンスパイキング介在ニューロンはその応答性の違いから、PTX-sensitive, PTX-insesitive, extraordinaryの3タイプに分けることができた。
被約グレブナー基底のモジュライ空間とその幾何学

当研究課題の主な研究対象はグレブナースキームとよばれる、固定した項順序に対して固定した単項式イデアルをイニシャルイデアルとしてもつ被約グレブナー基底のモジュライ空間である。n次元射影空間の固定したヒルベルト多項式をもつ閉部分スキームのなすヒルベルトスキームを考えると、グレブナースキームはヒルベルトスキームと密接な関係を持つ。神戸は当該年度のはじめから夏ごろにかけて、適当な単項式イデアルのクラスMを決定し、ヒルベルトスキームがMに属する単項式イデアルに対応したグレブナースキームに分割されることを示した。そこで、射影平面のd点のヒルベルトスキームについてその分割を計算し、現れるグレブナースキームの次元を数え上げたところ非常に対称的な数値を得た。過去の研究を調べたところ、その数値が射影平面のd点のヒルベルトスキームのベッチ数であることがわかった。射影平面のd点のヒルベルトスキームのベッチ数は、Bialynicki-Birula分割とよばれる手法を用いて計算されている。そこで神戸はヒルベルトスキーム上に項順序に対応した積群k\{0}の作用を導入し、[1]その作用の固定点はMの元から定まる単項式スキームであること、[2]グレブナー分割は集合論的なBialynicki-Birula分割であることを示した。その系として次の2つを得た。[A]Mに属する単項式イデアルJが定めるグレブナースキームが特異点をもつならば、Jが定めるヒルベルトスキームの固定点も特異点である。[B]滑らかなヒルベルトスキームのベッチ数は、対応する次元をもつグレブナースキームの個数である。当初の研究計画におけるグレブナースキームとヒルベルトスキームの関係に関する研究目標は、グレブナースキームからヒルベルトスキームへの自然な射の像を集合論的に特徴づけることであった。現在得られている研究結果はBialynicki-Birula cellという集合論的特徴づけのみならず、グレブナースキームの計算がヒルベルトスキームの特異性やホモロジー群を決定づけることができる。一般論の少ないヒルベルトスキームに対して計算機上に実装可能な一般論を与えたという意味で、現在までの研究は当初の予想を大きく超え今後のヒルベルトスキームの研究に大きく貢献する計算理論となっていくと考えられる。また、グレブナースキームの新たな計算手法を得たり、イタリアではミラノ工科大学でグレブナースキームに関連した研究の第一人者であるPaolo Lella教授、およびその共同研究者Enrico Schlesinger教授との共同研究に参加し、グレブナー変形と呼ばれる平坦変形のリフトに関する問題を一部解決することができた。ヒルベルトスキームの特異点の例の構成は難しい問題の1つであるが、現在得られている結果を用いることで、単項式イデアルから定まるスキームに対応した点におけるヒルベルトスキームの特異性を計算機によって調べことができる。今後はその手法により多くの特異点の例を構成する。その際、神戸が得たグレブナースキームの新たな研究手法が役立つことが期待される。・イタリアにおける共同研究について採用二年目においても神戸はイタリアでPaolo Lella教授、Enrico Schlesinger教授との共同研究を続ける予定である。採用一年目で得られた結果を用いて、局所コーエン・マッコーレー空間曲線のヒルベルトスキームの連結性の研究にグレブナー変形のリフトを用いた新たな手法を確立することを目的とする。

一般論の少ないヒルベルトスキームに対して計算機上に実装可能な一般論を与えたという意味で、現在までの研究は当初の予想を大きく超え今後のヒルベルトスキームの研究に大きく貢献する計算理論となっていくと考えられる。また、グレブナースキームの新たな計算手法を得たり、イタリアではミラノ工科大学でグレブナースキームに関連した研究の第一人者であるPaolo Lella教授、およびその共同研究者Enrico Schlesinger教授との共同研究に参加し、グレブナー変形と呼ばれる平坦変形のリフトに関する問題を一部解決することができた。ヒルベルトスキームの特異点の例の構成は難しい問題の1つであるが、現在得られている結果を用いることで、単項式イデアルから定まるスキームに対応した点におけるヒルベルトスキームの特異性を計算機によって調べことができる。今後はその手法により多くの特異点の例を構成する。その際、神戸が得たグレブナースキームの新たな研究手法が役立つことが期待される。・イタリアにおける共同研究について採用二年目においても神戸はイタリアでPaolo Lella教授、Enrico Schlesinger教授との共同研究を続ける予定である。採用一年目で得られた結果を用いて、局所コーエン・マッコーレー空間曲線のヒルベルトスキームの連結性の研究にグレブナー変形のリフトを用いた新たな手法を確立することを目的とする。
確率モデル構築型共進化アルゴリズムの開発とその応用

前年度までの研究成果を踏まえて、より実応用的な問題にも進化的アルゴリズムが効果的に適用可能であるか確認するための発展研究を行った。具体的問題例として、弾性波動場の構造同定問題を取り上げ、前年度の研究で用いた差分進化法(Differential Evolution)を適用し、計算機実験により問題の分析とアルゴリズムの性能評価を行った。なお、本年度に取り扱った課題については名古屋大学情報科学研究科・石井克哉研究室において以前から取り組まれており、共同で研究を行った。本研究では、人工的に生成した弾性波を構造物に照射し、構造物に設置した複数の観測点から得られる周波数応答データを基に、内部の状態(媒質の物性や亀裂の位置など)を同定する問題を進化的アルゴリズムの応用例として取り扱った。このような振動生成・観測システムを地盤に設置し、地下構造解析に用いることを目的として、精密制御定常信号システム(ACROSS)が開発されている。近年は、様々な人工構造物内部の詳細な構造パラメータ解析や、その時間変化の常時監視システムとしても有用であると考えられているが、実応用については計測の手法とデータ解析手法の両面で改良の余地がある。このような課題の解決につなげるという点も考慮して本研究を行った。弾性波動場構造同定問題について、共同研究先の石井研究室では遺伝的アルゴリズムを用いた研究をすでに行なっていた。本研究では前年度に行った研究の成果を踏まえ、差分進化法をこの問題に適用した。差分進化法は実数値関数の最適化を行うアルゴリズムの一種であり、プログラムの実装が簡単であり、かつ高い性能を示す手法として注目されている。本研究では計算機実験による構造同定問題の特性分析、及びアルゴリズムの性能評価・比較を行った。最終年度最終年度平成23年度は確率モデル構築型共進化アルゴリズムの一実装であるCA-PBIL法を開発し、計算機実験を通してアルゴリズムの挙動を調べた。また、進化計算手法の一種であるDifferential Evolutionに着目し、この手法を拡張した多峰性関数の最適化アルゴリズムを開発した。計算機実験を通して既存手法との性能比較を行い、提案手法の有用性を示した。これらの研究成果について学術論文を執筆し、また国際会議および国内研究会において研究報告を行った。まず確率モデル構築型共進化アルゴリズムの一実装として、分布推定アルゴリズムの一種であるPopulation-based Incremental Learning法を共進化アルゴリズムの枠組みに取り入れたCA-PBIL法を開発した。このアルゴリズムの挙動を調べるために、非推移的ナンバーズ・ゲームという簡単な問題を用いた計算機実験を行った。この実験より、共進化アルゴリズムでは通常の進化計算では生じないような複雑な進化挙動により、適切な進化が妨げられる状況があることを確認した。さらに、共進化アルゴリズムで用いる各集団の進化の速度に差をつけることで適切な共進化を促せる場合があることを明らかにした。また関連する研究として、進化計算手法の一種であるDifferential Evolutionに着目し、拡張手法の開発を行った。このアルゴリズムに、孤立個体に基づく変異操作を導入することで多峰性関数の最適化に対応した拡張手法DE/isolated/1を開発した。複数のベンチマークを用いた計算機実験を通して既存手法との性能比較を行い、特に大小の谷が混在する関数において、提案手法が有効であることを示した。平成23年度の研究計画として、提案する確率モデル構築型共進化アルゴリズムのプログラムを実装し、その性能・特性について調査することをあげていた。これについて、実際にプログラムの開発および計算機実験を行い挙動の分析を行ったことで、次年度の計画である実応用に向けた準備ができたと考えている。また、関連する研究として多峰性関数の最適化アルゴリズムを開発することができた。これらの成果について、論文誌等での研究報告も適宜行なっていることから、おおむね順調に進展していると評価する。

最終年度本年度に行った研究では、比較的規模の小さい問題を用いて進化挙動の調査や性能比較を行ったが、実応用を考えた場合にはより大規模な問題にも効果的に適用可能であるか確認しなければならない。今後、適切な問題を選定した上で、アルゴリズムの適用および性能評価を行うことを考えている。また、実際の問題では時間経過にともなって関数が動的に変化する場合や、得られる情報に誤差が含まれる場合など、より複雑な状況を考慮しなければならない。そのような状況においても対応できるようにアルゴリズムを改良することや、新たな手法を開発することを検討している。最終年度
骨髄間質由来成体幹細胞の歯原性細胞への分化誘導と歯の再生医療への応用

マウス由来骨髄間質細胞(MMSC-3)は遺伝子操作を行うことなくその培養条件を変更することにより、in vitroにおいて中胚葉系機能細胞(骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞)、外胚葉系機能細胞(神経細胞)、内胚葉系機能細胞(肝細胞)への分化能を示し、マウス骨髄由来成体幹細胞であることが示唆された。同細胞を用いて、歯への分化誘導を行ったところ、in vitroおよびin vivoにおいて歯に関連する遺伝子ならびにタンパク質発現を示し、歯の再生医療を実現する細胞源として利用できることが考えられた。現在の歯科医療において歯の喪失に対する加療は義歯やインプラントなどの人工物による機能補填が大部分である。そのとき人類の福祉とQOLのさらなる向上を図る上で歯の再生医療の実現は大きな意味を持つ。この際再生医療実現のための幹細胞の供給源として期待されてきたES細胞や組織特具的幹細胞に代わり、患者自身の身体を構成している最終分化した機能細胞がなお分化の可塑性を有している可能性に着目し、生体内においては本来最終分化した機能細胞を歯原性細胞に再分化させ歯の再生に応用できる可能性につき検討した。まず、マウスの歯胚より歯乳頭細胞、歯小嚢細胞、歯原性上皮細胞を分離し、これらを安定し培養できる条件を獲得した。さらにこれらの細胞を用いて、種々の細胞外基質(コラーゲンIV、フィプロネクチン、ラミニン、マトリゲル、エナメル基質蛋白)を含むメンブレンを中間におき、一方に間葉系歯胚細胞、もう一方に上皮性歯胚細胞をシート上に培養し、生体内により近い環境を作ることに成功し、三次元細胞塊を形成させた。これにより歯原性上皮-間葉間の分化の相互誘導が可能となり、実験系を構築できた。この三次元構築を用いて、今度はマウス骨髄より骨髄間質由来成体幹細胞を分離し、培養系を確立した上で、三次元構築の歯胚細胞の代わりに播種し、各種マトリックスにより培養したところ、いくつかのマトリックスで骨髄間質由来成体幹細胞が歯原性上皮に分化誘導されることを確認した。今後はこの誘導系を用いて誘導された細胞を、マウス生体内に移植し、移植細胞の分布・局在、分化について検討する。また、マトリックスを用いることで、誘導のシグナルを発現すると思われる間葉系歯胚細胞や歯原性上皮細胞を用いることなく、歯原性細胞への分化誘導が可能かどうかに付き検討する予定である。1.マウス由来骨髄間質細胞(MMSC-3)は間葉系細胞のマーカーであるVimentinおよび未分化間葉系細胞のマーカーであるCD34、c-kitおよびSca-1のmRNA発現を示した。2.MMSC-3は遺伝子操作を行うことなくその培養条件を変更することにより、in vitroにおいて中胚葉糸機能細胞(骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞)、外胚葉糸機能細胞(神経細胞)、内胚葉糸機能細胞(肝細胞)への分化のを示し、マウス骨髄由来成体幹細胞であることが示唆された。3.MMSC-3は、テット由来歯原性上皮細胞(HAT-7)との共培養により、in vitroにおいて3次元的な細胞増殖を示し、DSPPを遺伝子レベル、タンパク質レベルで発現した。4.HAT-7との共培養により、MMSC-3は歯の発生過程で発現する転写因子Msx-1、Pax9のmRN発現を示した。またMsx1の発現はエムドゲインまたはマトリゲルにより促進され、エムドゲインおよびマトリゲルの併用によって、さらに増強される傾向がみられた。5.HAT-7の非存在下においても、MMSC-3はエムドゲインまたはマトリゲルの存在下にDSPPおよびMsx1のmRNAを発現し、それらの発現はエムドゲインおよびマトリゲルの併用でより促進された。Pax9の発現は誘導されなかった。6.MMSC-3はHAT-7の有無に関わらず、エムドゲインの存在下のみでLhx6を発現した。7.HAT-7の非存在下にエムドゲインおよびマトリゲルにより培養を行ったMMSC-3をラット上顎臼歯歯髄腔へ移植したところ、細胞移植後2週間においては明かな硬組織の形成は認められなかったものの、同細胞は生体内においてもDSPPのタンパク質発現を維持していることが確認された。これらにより、骨髄由来成体幹細胞は歯の再生医療において有用な資源になりうると考えられた。
腸内恒常性維持における腸管内常在菌の糖代謝の役割

Clostridium difficile (CD)の病原性に対するBacteroides thetaiotaomicron (BT)の抑制効果を無菌マウスの混合感染モデルで評価した。BTの野生株投与群はPS6莢膜欠損株および多糖輸送能欠損株群と比べ便中Toxin A量が低く、CDの毒素産生抑制因子はBT由来の莢膜等の高分子多糖である可能性が示唆された。糞便懸濁液上清中のToxin A量をHT-29に対する細胞毒性も同様の傾向を示した。野生株を接種した群は他群と比べてグラム陽性に染まるCDの割合が高く、CDの病原性に対するBTの抑制効果はBT由来の多糖がCDの溶菌を阻害することを明らかにした。Clostridium difficileは偏性嫌気性グラム陽性菌であり、抗菌薬投与などにより腸内細菌叢が攪乱された場合に増殖し、抗菌薬関連下痢症や偽膜性大腸炎の原因となる。C. difficileの主要な病原因子はエンテロトキシン(Toxin A)とサイトトキシン(Toxin B)であり、腸管内でのこれらの毒素レベルがC. difficile関連下痢症の発症と密接に関連する。我々は腸内常在菌であるBacteroides thetaiotaomicronの培養上清中にはC. difficileのToxin AおよびToxin Bの産生を抑制する効果があり、この作用の責任分子は10-100 kDaの耐熱性因子であることを見出した。さらにB. thetaiotaomicronのトランスポゾン挿入変異ライブラリーを用いて、この毒素産生抑制因子をコードする遺伝子群を探索した結果、B. thetaiotaomicronの莢膜多糖合成や多糖分解に関する遺伝子群がC. difficileの病原性の抑制に関与していると考えられた。これらの結果は、B. thetaiotaomicronの糖代謝における中間代謝分子がC. difficileの毒素産生を抑制していることを示唆しているが、これらの分子がC. difficileにどのような遺伝子発現変化をもたらしているのかについては不明であった。そこで、C. difficileに対する毒素産生抑制作用が減弱した11株のトランスポゾン挿入変異株と野生株の培養上清をそれぞれ添加した培地でC. difficileを培養し、RNAを抽出してRNAseq解析を行った。RNAseq解析の結果、B. thetaiotaomicron野生株培養上清添加ではC. difficile 630株の糖代謝系遺伝子の発現が顕著に上昇していた。腸管内常在菌であるBacteroides thetaiotaomicronはClostridium difficileの溶菌を抑制し、毒素の遊離を阻害する。この阻害効果にはB. thataiotaomicronが有する菌体外多糖が関連していることをトランスポゾン挿入変異株のスクリーニングにより明らかにした。Bacteroides thetaiotaomicronとClostridium difficileを混合培養した場合、Clostridium difficileの糖代謝関連遺伝子の発現が上昇することから、Bacteroides thetaiotaomicronの産生する菌体外多糖が、Clostridium difficileによって利用されていると考えられる。この菌種間のクロストークの解明は腸管病原菌の毒素産生抑制法の開発に多大な情報を与える。本年度はB. thataiotaomicronが産生する7種類の莢膜多糖の中で、どの莢膜多糖が溶菌阻害活性を担うのかを、Triton X100を用いた溶菌アッセイにより調べた。その結果、B. thataiotaomicronの莢膜多糖PS-6の欠損株が溶菌活性の消失が最も大きかった。PS-6はその合成遺伝子領域の構造から、糖鎖末端にシアル酸を結合していると予測される。B. thataiotaomicronの野生株よりhot-phenol法により莢膜多糖を精製したが、複数の多糖が混在しており、PS-6の構造解析のためには特定の莢膜多糖のみ産生する株が必要となった。そこで、現在、PS-6以外の莢膜生合成領域を欠失させた株を作製を試みている。本研究ではC. difficileの毒素遊離阻害作用を有するB. thataiotaomicronの莢膜多糖の構造決定を行う予定であったが、野生株からhot-phenol法により抽出した画分には複数の莢膜多糖が含まれており、目的の糖鎖構造の解析が困難であった。B. thataiotaomicronのゲノム上には7箇所の莢膜生合成遺伝子領域が存在する。したがって、目的の莢膜多糖以外の生合成遺伝子領域を欠失した変異株の作製が必要となったため。本年度は研究課題最終年度であることから、in vivoでのBacteroides thetaiotaomicron (BT)のClostridium difficile (CD)の毒性に対する抑制効果を検討した。BT野生株を接種した群ではCD感染後1週間後でも100%が生存したが、BTのPS6莢膜変異株(BTΩps6)を接種した群では50%、多糖輸送関連遺伝子であるgcpE変異株(BTΩgcpE)を接種した群では80%のマウスが死亡した。またCD毒素産生抑制効果が認められないBacteroides uniformis(BU)を定着させた群では、1日目に全例死亡した。以上より、CD毒素産生抑制因子はBT由来の莢膜等の高分子多糖である可能性が動物実験より示唆された。混合感染モデルで得られた糞便懸濁液上清中のToxinA量をToxinA抗体を用いたDot blot解析で検討した。

その結果、1週間通してBT野生株を接種した群はBTΩps6株またはBTΩgcpE株を投与した群に比べて糞便中のToxinAの毒素量は低い傾向を示した。特にBTΩgcpE株を投与した群はBTの野生株を投与した群に比べて、ToxinAの毒素量が多い傾向にあった。最後に糞便上清中におけるCD由来ToxinAのHT29細胞に対する細胞毒性をNeutral Red Assayによって検討した。その結果、BT野生株を投与した群はBTΩps6株、BTΩgcpE株を投与した群に比べて、HT29細胞に対する細胞毒性が低い傾向を示した。Clostridium difficile (CD)の病原性に対するBacteroides thetaiotaomicron (BT)の抑制効果を無菌マウスの混合感染モデルで評価した。BTの野生株投与群はPS6莢膜欠損株および多糖輸送能欠損株群と比べ便中Toxin A量が低く、CDの毒素産生抑制因子はBT由来の莢膜等の高分子多糖である可能性が示唆された。糞便懸濁液上清中のToxin A量をHT-29に対する細胞毒性も同様の傾向を示した。野生株を接種した群は他群と比べてグラム陽性に染まるCDの割合が高く、CDの病原性に対するBTの抑制効果はBT由来の多糖がCDの溶菌を阻害することを明らかにした。Bacteroides thetaiotaomicronの培養上清中にはC. difficileのToxin AおよびToxin Bの産生を抑制する効果があり、この抑制作用を臨床応用にするのが本研究計画の目的である。今年度に実施したRNAseq解析により、本抑制作用にはC. difficileの糖代謝の関連を見出すことができ、これは大きな進展であった。また、従来から候補分子としてB.thetaiotaomicronの莢膜多糖を想定していたが、この点もRNAseq解析から確認することができ、計画通りの進捗状況である。B. thataiotaomicronのゲノム上に存在する目的の莢膜多糖の合成領域以外の6箇所の莢膜生合成遺伝子領域を欠失した株を作製する。この変異株から莢膜多糖を精製し、糖鎖構造を決定する。微生物学C. difficileの菌体外への毒素の放出には菌体の自己融解が関連していると考えられている。RNAseq解析データをもとに溶菌酵素遺伝子の発現を比較すると、B. thetaiotaomicron野生株培養上清の添加により、溶菌に関連する遺伝子群の発現が減少しており、B. thetaiotaomicronはC. difficileの溶菌を抑制することにより、毒素の遊離を阻害していると考えられた。そこで来年度は、Triton X-100などの界面活性剤を用いたlysis assayによりB. thetaiotaomicronの莢膜多糖がC. difficileの溶菌に関与しているのか否かについて検討していく方針である。目的の多糖の構造解析が精製度の問題で実施できなかったため、そのための費用を次年度に繰り越した。感染実験に使用する無菌動物を購入する予定であったが、年度内に条件に合致する週齢のマウスの入手が困難となり、次年度に購入を延長することとした。
データ同化型ビジョンによる人物行動解析

本研究では,人物行動をコンピュータ上で解析するために,複数人物の行動を模擬する確率的シミュレーションモデルを導入し,そのモデルに含まれるパラメータを実際の画像計測から推定するデータ同化法を開発し,人工データおよび実動画像を用いて性能を検証した.さらに,ウェアラブルカメラを用いた個人行動認識および可視化のための画像系列からの3D地図作成および自己位置推定アルゴリズムを開発した.人物行動解析はセキュリティだけでなく空間利用調査に基づくマーケティングなど多様な応用展開を持つ技術として期待されている.本研究では,人物行動をコンピュータ上で解析するために,複数人物の行動を模擬する確率的シミュレーションモデルを導入し,そのモデルに含まれるパラメータを実際の画像計測から推定するデータ同化法を提案している.主な研究成果は次の通りである.1)確率的セルオートマトンに基づく複数人物行動シミュレーションモデルを実装した.このモデルには,環境や他者との相互作用を表現するパラメータが含まれている.これらのパラメータを画像計測で得た人物位置を用いて粒子フィルタによるデータ同化アルゴリズムを開発した.人工データによる数値実験で,人物移動の一期先予測性能を評価し,粒子フィルタに用いる粒子数の増加に伴い推定性能が向上すること,他者との動的な相互作用を組み込むことで大幅に推定性能が向上すること,人物数がある一定以上にならないと推定誤差が大きく,一方で人物数を増加させても推定性能はある一定以上では向上しないことが示された.実際の動画像に関しても同様な結果を得ている.2)データ同化アルゴリズムに加えて,その入力として必要な画像計測について次のような開発を実施した.ここでは,人物行動を俯瞰的に捉えるカメラ映像だけでなく,ウェアラブルカメラを用いて一人称視点映像も対象にしている.まず,屋内環境(大学図書館)に限定して,個人の行動を一人称視点映像から認識するアルゴリズムを開発し,3つの行動に関して67%の認識率を達成している.次に,人物行動の可視化を目的に,画像系列からの3D地図作成および自己位置推定アルゴリズムを実装した.本研究では,人物行動をコンピュータ上で解析するために,複数人物の行動を模擬する確率的シミュレーションモデルを導入し,そのモデルに含まれるパラメータを実際の画像計測から推定するデータ同化法を開発し,人工データおよび実動画像を用いて性能を検証した.さらに,ウェアラブルカメラを用いた個人行動認識および可視化のための画像系列からの3D地図作成および自己位置推定アルゴリズムを開発した.本研究では,空間での人物移動を確率的にモデル化し,データ同化と呼ばれる計算枠組みを用いて,そのモデルに含まれるパラメータを実際の動画像から推定することを目的としている.主要な実績は次のとおりである.・確率的セルオートマトンモデルとSocial Forceモデルに基づいて人物移動をモデル化し,それをコンピュータ上でシミュレーションできるように実装している.・歩行モデルに含まれるパラメータを実際のデータから推定するために,最尤推定法と逐次ベイズ推定法の2つを導入した.前者は,観測値がすべて与えられたもとで推定値を求めるオフライン型の手法であり,後者は,推定すべきパラメータを状態ベクトルの中に組み込んだ自己組織型の状態空間モデルに基づいてオンライン型である.・評価実験では,位置が未知の出口が歩行者に与える相互作用を対象に,人工的に作成した数値データを用いて検証した.実験結果では,精度の観点からは,最尤推定法のほうが逐次ベイズ推定が上回る結果を得た.一方,計算時間の観点からは,後者のほうが数十倍高速である.これらのことから,時間変化しない一定パラメータについては,オフラインで最尤推定しておき,動的に変換するものに対しては,逐次ベイズ推定で計算するほうがよいと結論付けた.・今後,複数のモデルを切り替えながらパラメータを推定する方法を導入するために,その基礎として,モデル切り替え型の状態空間モデルに基づくアルゴリズムを開発し,数値データを用いて,従来手法より性能がすぐれていることを示した.さらに,同様のアルゴリズムを手の形状推定にも適用し,応用展開を図っている.平成23年度では,人物移動のモデルとして,確率的セルオートマトンモデルとSocial Forceモデルの2つをコンピュータ上に実装している.さらに,データ同化の枠組みに基づく統計的なパラメータ推定法として,一般状態空間モデルのよるモデル表現とそのための最尤推定法と逐次ベイズ推定法も開発している.これらの成果は,当初の研究実施計画通りである.ただし,確率的セルオートマトンモデルに基づくプログラム開発では,動的に変化する歩行者間の相互作用については,単純化したものに実装が留まっている.さらに詳細化したモデルを構築する必要があるが,根本的な設計変更をともなうものではなく,開発済のソースコードをもとに改良を図ることができ,次年度の前半期には実装できる見込みである.また,データ同化のための基礎アルゴリズムとして,モデル切換え型状態空間モデルを新たに提案し,数値データによる評価も実施している.以上より,当初計画に対して,おおむね順調に進展していると判断する.平成23年度に得られた結果を基にして,平成24年度では,確率的セルオートマトンとSocial Forceに基づく数値モデルと画像計測を融合するデータ同化アルゴリズムを開発する.動画像から人の位置を検出する手法については,すでに実装済であり,実際に撮影した動画像から人位置を取得する.とくに,応用展開の1つとして想定している大学図書館内での人物行動解析のために,大学図書館内で撮影したデータも用いる.さらに,インターネット上に公開されているベンチマークデータも用いる.この空間における人位置の座標値の時系列データは,数値データにすぎないため,前年度に開発した数値モデルへ入力は容易に可能である.実際のデータを用いて評価することにより,数値モデル自体の改良につなげる.また,人位置だけでなく,複雑な手形状の推定などにも応用展開を進める.平成24年度では,ハイエンドのデスクトップコンピュータを導入する.

当初,平成23年度に導入予定であったが,その代わりにデータ収集制御用のためのラップトップパソコンを平成23年度に優先的に導入した.当初計画では,ラップトップパソコンは平成24年度の導入であった.この変更は,本研究の撮影シーンの1つとして想定している大学図書館内の撮影が平成23年度に許可されたため,その間にデータを取得するための措置であった.さらに,コンピュータの性能向上と価格下落の製品動向も鑑み,デスクトップコンピュータの導入は平成24年度の実施することにした.以上の変更により,「次年度使用額」が生じた.また,次年度は最終年度であるため,学会発表を積極的に実施する予定である
糖尿病による骨／骨髄相互連関の幹細胞分化誘導障害における線溶系因子の役割の解明

骨損傷後の修復過程で線溶系因子であるプラスミノーゲン(Plg)の関与が考えられる。本研究は、骨損傷早期の骨髄造血幹細胞の誘導における組織線溶系の関与について検討した。Plg欠損は、骨損傷後の修復を遅延させ、SDF-1とTGF-β発現増加を阻害した。さらに、野生型マウスに対するTGF-βシグナル阻害剤投与は、骨損傷で誘導される骨髄HSC数の低下を阻害した。さらに、骨損傷により誘導されるSDF-1発現増加を抑制した。以上より、骨損傷後の骨修復早期における骨局所への骨髄からのHSC誘導に、組織線溶系により誘導されるTGF-βとそれに続く骨損傷部のSDF-1が関与することが示唆された。平成27年度は、マウス骨損傷モデルにおける骨再生過程での骨髄幹細胞の挙動を解析し、骨と骨髄との相互連関による骨髄幹細胞の分化誘導機構の解明を行った。また、GFPマウスの骨髄細胞を移植したマウスを用いて骨髄幹細胞の分化誘導機構の解析とSDF-1/CXCR4系の関与について解析した。1.骨再生過程における骨と骨髄との相互連関による骨髄幹細胞の分化誘導機構の解析:マウスの右大腿骨に骨損傷を作製し、骨損傷モデルを作成した。骨損傷マウスから骨髄細胞および脾臓細胞を採取し、FACS解析により造血幹細胞(HSCs)と間葉系幹細胞(MSCs)の挙動を測定した。その結果、損傷2日目に骨損傷部で非損傷部(反対側)に比べHSCsが低下し、MSCsが増加した。脾臓ではこの骨損傷による幹細胞変化が認められなかった。2.骨髄細胞移植による骨軟骨再生過程の解析:GFPマウスの骨髄細胞を放射線照射したマウスに移植し、そのマウスに骨損傷モデルを作成した。F4/80陽性細胞(マクロファージ)とトラップ染色陽性細胞(破骨細胞)にGFP陽性細胞が確認された。しかし、オステリックスとアルカリフォスファターゼ陽性細胞(骨芽細胞系)にはGFP陽性細胞が認められなかった。3.骨髄幹細胞の分化誘導機構におけるSDF-1/CXCR4系の解析:SDF-1に対する抗体の損傷部位局所徐放投与マウスおよびCXCR4のアンタゴニストの腹腔内連続投与マウスの骨損傷モデルでの骨髄幹細胞の挙動をFACSで解析した。その結果、両薬剤投与マウスでは骨損傷によって誘導される骨髄幹細胞数変化は見られなかった。さらに、定量CT解析ではSDF-1抗体投与マウスが対照マウスに比べ、骨軟骨再生能の遅延が認められた。以上の平成27年度の解析結果から、骨欠損により骨髄幹細胞変化が誘導されその誘導にSDF-1/CXCR4系が関与することを見出した。平成27年度は、マウス骨損傷モデルにおける骨再生過程での骨髄幹細胞の挙動を解析し、骨と骨髄との相互連関による骨髄幹細胞の分化誘導機構を解明する。さらに、GFPマウスの骨髄細胞を移植したマウスを用いて骨髄幹細胞の分化誘導機構の解析とSDF-1/CXCR4系の役割について解析することを計画した。研究実績の概要のように、ほぼ計画通り進み、予測されうる結果が得られた。平成28年度は、線溶系因子遺伝子欠損(KO)マウスと糖尿病病態マウスの骨損傷モデルを用いて、骨修復過程での骨髄幹細胞の分化誘導機構に対する線溶系因子の役割と糖尿病の影響を解明する目的で行った。1.骨修復過程の骨髄幹細胞の分化誘導に対する線溶系因子の解析:線溶系因子(プラスミノーゲン:Plg)のKOマウスとその対照(WT)マウスの骨損傷モデルを作成した。骨損傷マウスから骨髄細胞を採取し、FACS解析により造血幹細胞(HSCs)を解析した。その結果、WTマウスでは、損傷2日目に骨損傷部で非損傷部に比べ、HSCsが有意に低下したが、PlgKOマウスではその低下が抑制された。2.骨修復過程における線溶系因子とSDF-1発現の解析:PlgWTおよびPlgKOマウスの骨損傷2日目における損傷部位でのSDF-1発現について、定量PCR法によるmRNAと免疫染色法におけるタンパク質を検討した。PlgWTマウスにおける骨損傷2日目の損傷部位でのSDF-1発現は、mRNAおよびタンパク質とも有意に増加した。これに対し、PlgKOマウスでは、骨損傷によるSDF-1発現増加がPlgWTマウスより抑制された。3.骨修復過程の骨髄幹細胞の分化誘導に対する糖尿病病態の解析: WTマウスに対してストレプトゾトシン(STZ)投与により糖尿病病態を誘導し、そのマウスに骨損傷モデルを作成した。骨損傷マウスの骨髄細胞のFACS解析によりHSCsを解析した。その結果、STZ投与マウスでは、損傷2日目に骨損傷部および非損傷部ともにSTZ非投与マウスに比べHSCsが有意に低下した。これらの結果から、骨損傷後の修復過程で誘導される骨髄造血幹細胞数変化に線溶系因子のPlgの関与し、さらに、そのPlgはSDF-1発現に関わることを示唆した。また、マウスにおける糖尿病病態は骨髄幹細胞の異常を引き起こすことを示唆した。平成28年度は、マウス骨損傷モデルにおける骨修復過程での骨髄幹細胞の挙動に対する線溶系因子の関与を解析した。その結果、線溶系因子の主因子であるプラスミノーゲン(Plg)の欠損は、骨損傷により誘導される骨髄造血幹細胞数変化を抑制することを見出した。