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学校教員の身体活動量，仕事時間，及び健康状態と相互の関連性に関する研究

日常生活で悩みやストレスを抱えている教員は小学校で67%,中学校で71%いた.これらのように,多くの教員が自覚症状やストレスにさらされていることが示された.しかしながら,平均睡眠時間は小学校,中学校ともに5時間以上6時間未満と回答する教員が最も多く,十分な休養が得られていないと考えられた.仕事時間について朝,自宅を出発した時刻から夕方,帰宅のために学校を出発するまでの時間を計算すると,小学校教員の平均が11.4時間,中学校教員の平均が12.9時間であった.8時間労働を大きく超える仕事時間であるが,中学校教員の多くが部活動指導に携わることもあり,仕事時間が特に長かった.一方,身体活動量は必ずしも多いというわけではなく,詳細をさらに分析する予定である.本研究の実施期間(3年間)のうち最初の2年間(平成29,30年度)を資料収集にあてているが,以下のような手順で調査を実施している.(1)調査対象校(秋田県内)を選定し,各学校長から調査の許可を得た上で協力依頼の文書を教員に配布する.(2)秋季に身体活動量を測定するため各学校を訪問し,1同意書,2活動量計とメモ用紙,3質問票を調査対象者へ手渡す.活動量計は普通に勤務する日に,着衣時から脱衣時まで腰部に装着してもらう.(3)一週間後に再度,各学校を訪問して上記1,2,3を回収する.上記の調査で活動量計については,歩数,運動強度や運動量を記録している.質問紙では,仕事時間を知るためにOECD国際教員指導環境調査と同じ質問をし,基礎資料として性別,年齢,雇用形態,勤務経験年数,指導教科等を質問している.一方,健康状態を知るために国民生活基礎調査(厚生労働省)の健康票にある質問を引用し,自覚症状の有無と症状,通院の有無と傷病名,過去1か月の欠勤日数,現在の健康状態,ストレスの有無とその原因,平均睡眠時間,現在の精神状態,健康行動,健康診断及び各種検診の受診の有無を質問している.研究実績の概要でも記したように,平成29年度(初年度)に調査した学校教員は合計243人(中学校教員188人,小学校教員55人)と相当数について調査しているので,研究は概ね順調に進捗している.秋田市内にある小学校と中学校の教員を対象に,日常の身体活動量,仕事時間,及び健康状態を調査し,その実態と相互の関連性を分析するのが目的である。学校教員合計308人(中学校教員188人,小学校教員120人)の仕事の状況についてみると,一週間当たりの授業担当コマ数の平均は,小学校教員22.2コマ,中学校教員18.5コマであった。小学校教員の74%,中学校教員の59%が学級担任であり,受け持ちの学級人数の平均は小学校教員が25.6人,中学校教員は26.7人であった。放課後の課外活動の指導をしている者の割合は小学校教員の5.8%,中学校教員の69.7%であり,大きな違いがみられた。通常の一週間で,授業時間以外で従事した仕事時間の最も長いものは男の中学校教員を除いて授業の計画や準備に従事した時間であった。一方,男の中学校教員では課外活動に従事する時間が最も長かった。調査日の出勤時刻(仕事場到着時刻)についてみると,小学校,中学校ともに午前7時半前後であり,男の方が女より早めに出勤していた,帰宅時刻(仕事場出発時刻)は小学校教員で18時半前後,中学校教員で19時半前後であり,男の方が女より遅めに帰宅していた。出勤時刻から帰宅時刻までの仕事場にいた時間を合計の仕事時間とすると,小学校教員は11時間前後,中学校教員は12時間前後であり,男の方が女より30分程度長かった。健康状態についてみると,病気やけがなどで自覚症状のある教員の割合は小学校で男20%,女30%,中学校で男20%,女28%であった.病院や施術所(あんま・はりなど)に通っている教員の割合は小学校で男40%,女28%,中学校で男29%,女30%であった.
遅発生神経細胞死における細胞骨格蛋白の構造変化とカルパインの作用に関する研究

Pulsinelliらの方法により,10週齢のウィスター系雄ラットに一過性(30分)の前脳虚血を負荷した後,0,3,6,12時間,1,2,3,5および7日後に屠刹して連続凍結切片を作成し,海馬の神経細胞における虚血後の経時的な形態変化を病理組織および免疫組織化学的検討に検討した。免疫組織化学的検討には、ヒトのμ-及びm-カルパインのN末端側(μ-,m-CL_<(NH2)>と略)及び両者に共通する活性部位(CL_<(a)>と略)のアミノ酸配列を持つポリペプチドを合成し,これらを認識するウサギポリクローナル抗体を用いてABC法で免疫染色した.また,カルパスタチン(CS)のLドメインに対する抗体を用いて同様に染色した.その結果,正常のCA1,3や歯状回の神経細胞においては,μ-,m-CL_<(NH2)>及びCL_<(a)>は,細胞体や樹状突起の起始部に弱陽性を示し,アイソザイムによる差は認めなかった.CSもCLと同様の局在を示した.虚血後2日目までの海馬神経細胞には明らかな変化を認めず,また,μ-,m-CL_<(NH2)>及びCL_<(a)>およびCSの染色性にも明らかな変化はなかった.虚血後3日目には,CA1の錐体神経細胞に変性,死が見られ,その細胞質や核において,μ-,m-CL_<(NH2)>及びCL_<(a)>の陽性所見が増強していた.CSも同様に細胞質や核に陽性所見が増強していた.以後7日目までは,μ-,m-CL_<(NH2)>及びCL_<(a)>やCSの染色性は,細胞死が進行したCA1神経細胞の核に残存していたが,細胞破壊が進んだ樹状突起における染色性は低下した.これに対して,遅発生神経細胞死が生じなかった歯状回の顆粒細胞には,前脳虚血後μ-,m-CL_<(NH2)>,CL_<(a)>,CSの染色性や局在に明らかな変化を認めなかった.それぞれの酵素活性の経時的変化については,現在検討中であるが,遅発生神経細胞死が進行する過程では,CLの活性化とこれに伴う構造変化が虚血後3日目より生じると考えられ,CSの活性化も同時に生じていると考えられるが,CLの活性がCSの活性を上回っている可能性を明らかにした.Pulsinelliらの方法により,10週齢のウィスター系雄ラットに一過性(30分)の前脳虚血を負荷した後,0,3,6,12時間,1,2,3,5および7日後に屠刹して連続凍結切片を作成し,海馬の神経細胞における虚血後の経時的な形態変化を病理組織および免疫組織化学的検討に検討した。免疫組織化学的検討には、ヒトのμ-及びm-カルパインのN末端側(μ-,m-CL_<(NH2)>と略)及び両者に共通する活性部位(CL_<(a)>と略)のアミノ酸配列を持つポリペプチドを合成し,これらを認識するウサギポリクローナル抗体を用いてABC法で免疫染色した.また,カルパスタチン(CS)のLドメインに対する抗体を用いて同様に染色した.その結果,正常のCA1,3や歯状回の神経細胞においては,μ-,m-CL_<(NH2)>及びCL_<(a)>は,細胞体や樹状突起の起始部に弱陽性を示し,アイソザイムによる差は認めなかった.CSもCLと同様の局在を示した.虚血後2日目までの海馬神経細胞には明らかな変化を認めず,また,μ-,m-CL_<(NH2)>及びCL_<(a)>およびCSの染色性にも明らかな変化はなかった.虚血後3日目には,CA1の錐体神経細胞に変性,死が見られ,その細胞質や核において,μ-,m-CL_<(NH2)>及びCL_<(a)>の陽性所見が増強していた.CSも同様に細胞質や核に陽性所見が増強していた.以後7日目までは,μ-,m-CL_<(NH2)>及びCL_<(a)>やCSの染色性は,細胞死が進行したCA1神経細胞の核に残存していたが,細胞破壊が進んだ樹状突起における染色性は低下した.これに対して,遅発生神経細胞死が生じなかった歯状回の顆粒細胞には,前脳虚血後μ-,m-CL_<(NH2)>,CL_<(a)>,CSの染色性や局在に明らかな変化を認めなかった.それぞれの酵素活性の経時的変化については,現在検討中であるが,遅発生神経細胞死が進行する過程では,CLの活性化とこれに伴う構造変化が虚血後3日目より生じると考えられ,CSの活性化も同時に生じていると考えられるが,CLの活性がCSの活性を上回っている可能性を明らかにした.
固体NMRによる生体分子局所構造の精密解析法の開発

本研究は、固体NMR法による生体高分子における特定部位の炭素-炭素,炭素-窒素核間距離,および二面角φ,ψの精密かつ信頼性の高い測定法を開発し,さらにその有効性を示すためにX線回析および溶液NMRでは未解決の構造生物学上の問題に適用することを目的としている.今年度は、これまでに開発した各種方法を発展させるとともに、SSI(streptomyces substilisin inhibitor)-ズブチリシン複合体に適用し、SSIの阻害機構を解明するうえできわめて重要な構造情報を取得した.1.これまでに開発したMLEV-4,4′法,MLEV8/8^R法,RACO法,R2TR法を発展させ,完成させた.2.高周波磁場の振幅,位相,周波数を変調することにより,内部ハミルトニアンを操作する方法論の理論的基礎を構築した.さらに,この理論を適用することにより高速MAS下において化学シフト異方性や^<13>C^<-15>N双極子相互作用による粉末スペクトルを観測する方法を開発し,実験に成功した.3.格子振動がX線回析および固体NMRによる距離測定および角度測定に及ぼす効果の差異を理論的に詳細に検討した.4.SSIの被切断結合の炭素・窒素核を選択的に^<13>・^<15>Nで標識したSSI-ズブチリシン複合体を準備した.5.前項での標識試料を用いて炭素-窒素核間距離を精密に測定し,標識部位の正確な構造情報を得た.6.得られた結果とX線回析で決められた構造との対比を検討し,得られた結果からSSIの阻害機構について考察を行った.本研究は、固体NMR法による生体高分子における特定部位の炭素-炭素,炭素-窒素核間距離,および二面角φ,ψの精密かつ信頼性の高い測定法を開発し,さらにその有効性を示すためにX線回析および溶液NMRでは未解決の構造生物学上の問題に適用することを目的としている.今年度は、これまでに開発した各種方法を発展させるとともに、SSI(streptomyces substilisin inhibitor)-ズブチリシン複合体に適用し、SSIの阻害機構を解明するうえできわめて重要な構造情報を取得した.1.これまでに開発したMLEV-4,4′法,MLEV8/8^R法,RACO法,R2TR法を発展させ,完成させた.2.高周波磁場の振幅,位相,周波数を変調することにより,内部ハミルトニアンを操作する方法論の理論的基礎を構築した.さらに,この理論を適用することにより高速MAS下において化学シフト異方性や^<13>C^<-15>N双極子相互作用による粉末スペクトルを観測する方法を開発し,実験に成功した.3.格子振動がX線回析および固体NMRによる距離測定および角度測定に及ぼす効果の差異を理論的に詳細に検討した.4.SSIの被切断結合の炭素・窒素核を選択的に^<13>・^<15>Nで標識したSSI-ズブチリシン複合体を準備した.5.前項での標識試料を用いて炭素-窒素核間距離を精密に測定し,標識部位の正確な構造情報を得た.6.得られた結果とX線回析で決められた構造との対比を検討し,得られた結果からSSIの阻害機構について考察を行った.本研究は、固体NMR法による同位体ラベルした生体高分子などにおける特定部位の炭素-炭素,炭素-窒素核間距離,および種々の二面角の精密かつ信頼性の高い測定法を開発し,さらにその有効性を示すためにX線回折及び溶液NMRでは未解決の構造生物学上の問題に適用することを目的としている。今年度は下記の研究を行った。1.本研究の測定法の基礎を与える理論を形成し、スペクトル解析のためのシミュレーションプログラムを作成した.測定法としては炭素-炭素距離を与えるMLEV-4,4'法,炭素-窒素核間距離を与えるMLEV8/8^R法,結合角∠DCD,二面角∠D-C-C-Dを与える2次元重陽子交換NMR,二面角∠H-C-C-O(ψ),∠H-C-N-H(φ),結合角∠HNCなどを与えるRACO(Relayed Anisotropy Correlation)法を開発した.2.さらに,三重共鳴NMRプローブおよび第三高電力高周波送信機系を製作した.3.炭素核・窒素核・陽子を必要に応じて^<13>C・^<15>N・^2Hで標識したグリシン,グリシルグリシン,アラニン,アセチルバリン,ポリフェエニルアラニンの多結晶を準備した.4.上記標識体をテスト試料として本研究で開発した各種方法を実行し,炭素-炭素・炭素-窒素核間距離および結合角∠DCD,∠HNC,二面角φ,ψを決定した.得られた結果をX線構造解析の結果と比較検討し,良く一致していることを確認した.

本研究は、固体NMR法による生体高分子における特定部位の炭素-炭素,炭素-窒素核間距離,および二面角φ,ψの精密かつ信頼性の高い測定法を開発し,さらにその有効性を示すためにX線回析および溶液NMRでは未解決の構造生物学上の問題に適用することを目的としている.今年度は、これまでに開発した各種方法を発展させるとともに,SSI(streptomyces subtilisin inhibitor)-ズブチリシン複合体に適用し、SSIの阻害機構を解明するうえできわめて重要な構造情報を取得した.1.これまでに開発したMLEV-4,4′法,MLEV8/8^R法,RACO法,R2TR法を発展させ,完成させた.2.高周波磁場の振幅,位相,周波数を変調することにより,内部ハミルトニアンを操作する方法論の理論的基礎を構築した.さらに,この理論を適用することにより高速MAS下において化学シフト異方性や^<13>C^<-15>N双極子相互作用による粉末スペクトルを観測する方法を開発し,実験に成功した.3.格子振動がX線回析および固体NMRによる距離測定および角度測定に及ぼす効果の差異を理論的に詳細に検討した.4.SSI被切断結合の炭素・窒素核を選択的に^<13>C・^<15>Nで標識したSSI_-ズブチリシン複合体を準備した.5.前項での標識試料を用いて炭素-窒素核間距離を精密に測定し,標識部位の正確な構造情報を得た.6.得られた結果とX線回析で決められた構造との対比を検討し,得られた結果からSSIの阻害機構について考察を行った.
血管新生における内皮の形態形成とその調節の分子機構

血管新生におけるジストログリカンの関与を検討した。内皮細胞とその基底膜成分の一つであるラミニン10,11との結合にジストログリカンが関与していることを見いだした。また、この結合がカルシウム依存性であり結合の阻害物質としてヘパリンを見いだした。血管新生時の内皮細胞の動態として遊走、増殖、管腔形成が生じる事が知られている。これらの内皮細胞の挙動においてラミニンージストログリカン系は、遊走、増殖、管腔形成の全てを阻害することを見いだした。また、これらの制御機構には、ジストログリカンの細胞内領域が必要であることを見いだした。内皮細胞のジストログリカンの発現調節機構を解析したところ、その発現は細胞周期に依存しており、休止期には発現は低レベルに押さえられているが増殖期には発現が亢進することを見いだした。また、組織学的な解析を行ったところ、正常動脈、静脈の内皮細胞でのジストログリカンの発現はほとんど認められないが、ガン組織へ進入してくる新生血管の内皮細胞ではジストログリカンは顕著に発現していることを見いだした。ジストログリカンの細胞内情報伝達経路を解析する目的で結合タンパク質の探索を行い、MAGI-1を見いだした。MAGI-1は2つのWW領域と5つのPDZ領域をもつ。このうちWW領域でジストログリカン細胞内ドメインのPYモチーフと結合することを示した。MAGI-1はアダプター蛋白であるためMAGI-1に結合する機能蛋白を探索したところ、MAGI-1の5つめのPDZ領域にbeta cateninが結合することを示した。さらにMAGI-1はbeta cateninと結合してbeta cateninの分解を阻害していること、beta catenin依存的なTCF/LEF1経路の活性化を行っていることを見いだした。内皮細胞とその基底膜成分の一つであるラミニン10,11との結合にジストログリカンが関与していることを見出した。また、この結合がカルシウム依存性であり結合の阻害物質としてヘパリンを見出した。(J.Biol.Chem.274,11995-12000,1999)。さらに、血管新生時におけるラミニン-ジストログリカン系の関与について解析を進めた。血管新生時の内皮細胞の動態として遊走、増殖、管腔形成が誘発される事が知られている。これらの内皮細胞の反応においてラミニン-ジストログリカン系は、遊走、増殖、管腔形成を阻害することを新たに見出した。また、ジストログリカンの引き起こすこれらの反応はジストログリカンの細胞内領域が必要であることを見出した。このことから、ジストログリカンを介して何らかの信号伝達系路があることを指摘することが出来た。内皮細胞のジストログリカンの発現調節機構を解析したところ、ジストログリカンの発現は細胞周期に依存しており、休止期には発現は低レベルに押さえられているが増殖期には発現が更新することを見出した。また組織学的な解析を行ったところ、正常な動脈、静脈の内皮細胞でのジストログリカンの発現は低いが、一方ガン組織へ進入してくる新生血管の内皮細胞ではジストログリカンは高度に発現していることを見出した。これらのことから、ラミニン-ジストログリカン系の内皮細胞の機能として血管新生の制御をしていることを明らかにした。血管新生時におけるジストログリカンの関与を検討した。生体内では、通常の血管内皮細胞には静脈、動脈ともジストログリカンの発現は低いが、癌組織における新生血管内皮細胞では高発現していることを見いだした。また、培養血管内皮細胞の接着、遊走、増殖、管腔形成を制御していること、この活性には細胞内領域が必要であることを示した。このことはジストログリカンを介した信号伝達経路が存在することそ示唆している。(J cell.Biol.投稿中)

ジストログリカンの細胞内情報伝達経路を解析する目的で結合タンパク質の探索を行い、MAGI-1を見いだした。MAGI-1は2つのWW領域と5つのPDZ領域をもつ。このうちWW領域でジストログリカン細胞内ドメインのPYモチーフと結合することを示した。MAGI-1はアダプター蛋白であるためMAGI-1に結合する機能蛋白を探索したところ、MAGI-1の5つめのPDZ領域にbeta cateninが結合することを示した。さらにMAGI-1はbeta cateninと結合してbeta cateninの分解を阻害していること、beta catenin依存的なTCF/LEF1経路の活性化を行っていることを見いだした。このMAGI-1-betacatenin複合体が筋ジストロフィー症患者の再生筋繊維で活性化されていることを発見した。(Nature投稿中)このことはジストログリカン-MAGI-1-beta catenin複合体が骨格筋細胞のホメオスタシスに関与することを示唆するものである。
脊髄損傷治療のための活性酸素消去ポリマーの新規合成とその機能評価

近年、脊髄損傷治療のための骨髄系間葉系幹細胞の移植が注目を集めている。従来の方法は、血液中に間葉系幹細胞を静脈注射する方法が行われていたが、その効果を高めるため、本研究では、損傷部位に幹細胞を直接移植するためのペプチドナノファイバーゲル足場材料の開発を目指した。疎水性相互作用を駆動力とする自己組織化ペプチドナノファイバーゲルは、自己組織化直後にはゾル状態であるため、幹細胞を懸濁し、損傷部位に注射すると、ファイバー表層にあるシステイン同士が炎症環境で生じた活性酸素と反応しジスルフィド結合を形成することでゲル化する可能性がある。またナノファイバー表層に存在するシステインは、ジスルフィドを形成することで、ゲルの構造安定化に寄与するだけでなく、活性酸素を消去することで幹細胞を保護し、周囲の炎症も抑えることが期待できる。本研究では、L体とD体のアミノ酸からなるFmoc-FFCペプチドナノファイバーゲルに骨髄系の間葉系幹細胞を封入し、ゲル内での細胞の分化状態について調べた。その結果、幹細胞はL体のペプチドナノファイバーゲル内でよく増殖し、また細胞が伸展していることを確認した。その結果、L体のペプチドナノファイバーゲル内では、脂肪・神経・骨髄細胞への分化が起きやすく、一方、D体のペプチドナノファイバーゲル内では、未分化状態が維持されやすいことを見出した。本研究成果は、ペプチドナノファイバーの異性体の制御を行うことにより、移植後の間葉系幹細胞の分化・未分化状態を制御できる可能性を示唆する。脊髄損傷は、これまで有効な治療法が存在しなかったが、近年、神経幹細胞移植が失われた機能の回復に有効であることが報告され、注目を集めている。しかしながら、損傷部位における炎症・酸化ストレスが幹細胞に影響を与えることから、本研究では酸化ストレス抑制剤の開発およびストレス下での幹細胞の挙動について調べている。本年度は、物理刺激に対する幹細胞の分化についての研究を進めた。はじめに、誘電泳動デバイスを用いて間葉系幹細胞に対して物理刺激を与えることで、分化挙動がどのように変化するのかを調べた。この誘電泳動デバイスを用いることで、流路内の細胞を電界強度の強い方向に移動させたり(正の誘電泳動),電界強度の弱い方向に移動させたりすることができ(負の誘電泳動)、細胞を電極に押し付け、物理的な刺激を与えることができる。本研究では、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞株UE7T-13細胞に正の誘電泳動をかけたところ、骨芽分化および神経分化に関わる遺伝子の発現が抑制され、脂肪分化に向かうことが明らかとなった。また別の実験では、ポリエチレングリコールゲルがコーテイングされたマイクロパターンデバイスを用いて、細胞積層が細胞の分化に与える影響についても調べた。ヒト脂肪細胞由来間葉系幹細胞を積層させることにより、脂肪分化が抑制され、骨芽分化が促進することが確認された。これまで、二次元培養では、高密度の時に幹細胞は脂肪細胞に分化することが知られていたが、今回用いた三次元培養の実験では、二次元培養とは反対の興味深い結果を得た。本研究では、細胞に物理刺激を加えたり、細胞周辺の環境を変えることにより幹細胞の分化の方向が変化することが明らかとなり、この点に関しては、当初の計画以上に研究が進展した。また酸化ストレス抑制剤の開発に関しては、当初の予定とは多少異なるが、イオントフォレシスを用いて活性酸素を消去するナノ粒子を経皮投与することで、ナノ粒子が表皮に蓄積し、UV照射により惹起されるメラニン産生を抑制することに関する論文を発表した。この研究から、合成ポリマーを経皮投与を経て、組織下に蓄積させる知見を得た。しかしながら、抗酸化能を有する新規高分子材料の開発と評価についての実験に関しては、当初の予定よりも多少遅れている。近年、幹細胞の移植技術の発展により、脳や脊髄などの中枢神経障害の治療に兆しが見えつつあります。しかしながら、損傷部位は、炎症が生じており、幹細胞を移植しても移植した細胞もダメージを受け、正常に機能しないことが問題となっています。本研究では、損傷部位の炎症を抑制し、移植した幹細胞が活発に活動できる高分子足場材料を構築している。本年度は、活性酸素消去機能を有するトリペプチドとポリエチレングリコール架橋剤から成るナノファイバーペプチドゲルを新規に作製した。疎水性相互作用を駆動力とする自己組織化ペプチドナノファイバーは、自己組織化直後にはゾル状態であるため、幹細胞を懸濁し、損傷部位に注射した後、紫外線照射でゲル化するように設計を行った。これまでに、L体とD体のアミノ酸からなるペプチドナノファイバーゲルに間葉系幹細胞を封入したところ、L体のペプチドナノファイバーゲル内で幹細胞はよく増殖・伸展し、分化能も増加することを明らかにした。一方、D体のペプチドナノファイバーゲル内では、増殖・進展がL体のゲルに比べると遅く、分化を抑制する性質を明かにした。また並行して、前年度から引き続き行っている誘電泳動デバイスを用いた骨髄由来間葉系幹細胞の分離を行い、同じ骨髄由来の細胞との分離に成功した。近年、骨髄由来の間葉系幹細胞は、脳梗塞や脊髄損傷などの再生医療への応用が期待されていることから、この分離技術と前述した足場材料の技術を融合した再生医療が期待できる。研究実績の概要に記載した内容の成果を現在投稿中である。

従来の方法は、血液中に間葉系幹細胞を静脈注射する方法が行われていたが、その効果を高めるため、本研究では、損傷部位に幹細胞を直接移植するためのペプチドナノファイバーゲル足場材料の開発を目指した。疎水性相互作用を駆動力とする自己組織化ペプチドナノファイバーゲルは、自己組織化直後にはゾル状態であるため、幹細胞を懸濁し、損傷部位に注射すると、ファイバー表層にあるシステイン同士が炎症環境で生じた活性酸素と反応しジスルフィド結合を形成することでゲル化する可能性がある。またナノファイバー表層に存在するシステインは、ジスルフィドを形成することで、ゲルの構造安定化に寄与するだけでなく、活性酸素を消去することで幹細胞を保護し、周囲の炎症も抑えることが期待できる。本研究では、L体とD体のアミノ酸からなるFmoc-FFCペプチドナノファイバーゲルに骨髄系の間葉系幹細胞を封入し、ゲル内での細胞の分化状態について調べた。その結果、幹細胞はL体のペプチドナノファイバーゲル内でよく増殖し、また細胞が伸展していることを確認した。その結果、L体のペプチドナノファイバーゲル内では、脂肪・神経・骨髄細胞への分化が起きやすく、一方、D体のペプチドナノファイバーゲル内では、未分化状態が維持されやすいことを見出した。本研究成果は、ペプチドナノファイバーの異性体の制御を行うことにより、移植後の間葉系幹細胞の分化・未分化状態を制御できる可能性を示唆する。平成29年度は、引き続きメカノストレスや細胞周囲の環境が幹細胞の分化に与える影響等について調べていく。現在は、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞株やヒト脂肪細胞由来間葉系幹細胞を用いているが、今後、神経幹細胞などを用いることにより今後、脊髄損傷治療への有用な知見が得られると考えている。また一方で、当初の計画していたポリマーの合成と評価に関しては引き続き実験を進める予定である。今後は、L体とD体のアミノ酸からなるペプチドゲル内での幹細胞の機能(例:神経細胞分化能及び幹細胞性)等を評価する予定である。H28年度は、物品費に関しては、当初の予定通り使用したが、旅費及び謝金の使用額が少なかったため、次年度使用額が生じた。論文執筆および追加実験を行うため、一年間延長申請を行った。そのための予算を次年度使用額とした。H29年度に、様々な生物学的評価のための物品を購入する予定であるため、その予算にあてる。
母体へのストレス刺激が胎仔の脳活動に及ぼす影響

本研究では、ストレス刺激を妊娠ラットに与え、活動の増加した神経細胞の核そのものを同定することができるc-fos免疫組織化学法を用いて、胎仔ラットの脳への影響について検討した。実験には、妊娠20日目のラットを用い、腹腔内に細菌内毒素(LPS)を注射し、発熱を発現させる。その後ラットをエーテルで麻酔し、胎仔ラットを取り出す。胎仔ラットを左心室より生理食塩水で潅流し、次いで4%パラホルムアルデハイド含有20mMリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で潅流固定する。脳を取り出し、後固定、ショ糖液で処理した後、ドライアイス粉末で凍結する。10μmの凍結切片を作製し、スライドグラスに貼る。通常のc-fos免疫組織化学の手法により、切片の発色反応を惹起さらる。その結果、母体へのLPS注射では胎仔脳でc-fos陽性細胞は認められなかった。妊娠末期における母体の発熱反応が抑制されたということに起因している可能性が考えられた。そこで、その原因を探る目的で、母体の発熱反応抑制反応について研究を進めた。妊娠末期の母ラットにLPSを投与したが、発熱が抑制された。その時の脳脊髄液中のプロスタグランジンE_2(PGE_2)を測定すると、LPSによる増加が非妊娠ラットと比べて少なかった。さらに、PGE_2合成に関与するシクロオキシナーゼ2(COX-2)の視束前野及びその近傍のくも膜下腔での発現を調べたところ、母ラットの脳において、LPSにより誘導されたCOX-2陽性細胞の数が非妊娠ラットの場合と比べて有意に減少していた。以上のことから、妊娠末期ラットにおける発熱反応の減弱は、PG産生系の抑制が関与していることが明らかとなった。本研究では、ストレス刺激を妊娠ラットに与え、活動の増加した神経細胞の核そのものを同定することできるc-fos免疫組織化学法を用いて、胎仔ラットの脳への影響について検討する。本年度は、母体への温度刺激が胎仔ラットの脳活動に及ぼす影響を調べる。実験には、妊娠20日目のラットを用い、腹腔内に最近内毒素(LPS)を注射し、発熱を発現させる。通常のc-fos免疫組織化学の手法により、切片の発色反応を惹起させる。神経活動が増加すると、細胞内のc-fos mRNAが増加して、c-fos蛋白が合成される。胎児脳でc-fosの発現を観察することによって、母体刺激で活性化された胎児脳の神経細胞を固定する。組織切片の顕微鏡像をコンピユ-タに取り込み、画像解析ソフトにて、陽性細胞数を定量化し、脳の各領域について刺激群と対照群で比較する。これは妊娠末期における母体の発熱反応が抑制されたということに起因しているのかもしれない。今後は他のストレス刺激で同様の実験を行う。前年度において、母体ほのLPS注射による刺激が胎仔ラットの脳活動に及ぼす影響を調べた。これは妊娠末期における母体の発熱反応が抑制されたということに起因している可能性が明らかとなった。

そこで本年度においては、その原因を探る目的で、母体の発熱反応抑制反応について研究を進めた。妊娠末期の母ラットにLPSを投与したが、発熱が抑制された。その時の脳脊髄液中のプロスタグランジン(PG)を測定すると、LPSによる増加がvirginラットと比べて少なかった。さらに、PG合成に関与するシクロオキシゲナーゼ(COX)の視束前野及びその近傍のくも膜下腔での発現を調べたところ、母ラットの脳において、LPSにより誘導されたCOX-2陽性細胞の数がvirginラットの場合と比べて有意に減少していた。以上のことから、妊娠末期ラットにおける発熱反応の減弱は、PG産生系の抑制が関与していることが明らかとなった。
吸汁を成立させるツマグロヨコバイ唾腺遺伝子の解析

前年度にツマグロヨコバイの唾腺遺伝子NcSP75遺伝子が篩管吸汁に必須なエフェクターであることを同定した。NcSP75遺伝子の研究をまとめた論文がPLOS ONEに受理された。ツマグロヨコバイ吐出タンパク遺伝子、唾腺高発現遺伝子を中心に、これまでに約70種類の遺伝子について幼虫RNAiを行い、生存率や発育速度への影響が出るものをスクリーニングしている。明らかなハウスキーピング遺伝子を除くと、NcLac5遺伝子のノックダウンで高い死亡率が観察された。NcLac5は唾腺特異的に発現し、そのタンパクはMulticopper oxidaseと相同性がある。ただし配列から銅を含まずかつ酸化活性を持たない可能性も高く機能は不明である。ヨコバイのMulticopperoxidase遺伝子はこれを含め計6種類見つかった(NcLac1S, 1G, 2-5)。これらのうちNcLac1S, 3, 5が唾腺特異的遺伝子であった。唾腺で発現し口針鞘に残存するラッカーゼ活性が見出されていたが、これはNcLac3によるものであることを明らかにした。それぞれ幼虫RNAiをテストすると、NcLac5に加えNcLac2で高い死亡率が見られた。NcLac2は表皮硬化や色素沈着に作用していて、ノックダウンによる高死亡率は予測できた。NcLac5の機能は不明である。3,4,5齢幼虫のNcLac5 RNAiの結果、脱皮(羽化)後に多数が死亡した。一方でNcLac5成虫RNAiでは生存率は低下せず、産卵数も対照に比べ減少しなかった。NcLac5は唾腺特異的であるが脱皮の際に新しく作られる細胞で必須であることが示唆された。これらのMulticopperoxidase遺伝子についても論文にまとめている。これまでに約70種類の遺伝子について幼虫RNAiを行った。先に同定されたツマグロヨコバイ吐出タンパク遺伝子についてはほぼ網羅することができた。いくつかの遺伝子については複数同時RNAiを行ったが、明らかな影響は見られなかった。ツマグロヨコバイ唾腺遺伝子について、吐出タンパクや分泌タンパクを中心に引き続きにdsRNAを作成する。幼虫RNAiでの成育速度や死亡率を観察することで重要な遺伝子をスクリーニングする。NcSP75遺伝子について機能を調べるため、形質転換によってNcSP75発現イネの作出を試みる。ツマグロヨコバイの約30種の唾腺遺伝子でparental RNAiを試みた。試行した遺伝子では、次世代幼虫の成育に負の影響は見られなかったが、孵化幼虫の数自体が減少する遺伝子が2種類見つかった。1種類はハウスキーピング遺伝子でもあったため、卵の発生自体が停止したと考えられた。もう1種は種特異的かつ唾腺特異的な遺伝子NcSP75 (Nephotettix cincticeps salivary protein, 75 kDa)であった。NcSP75遺伝子について詳しく解析を行った。Parental RNAiを行ったメスの産卵数が対照の10.9%に低下しており、孵化幼虫数の減少はこれによるものであった。3齢幼虫RNAiを行ったところ、4齢、5齢幼虫の期間が対照より約2倍長くなり、その間に大半が死亡した。オス成虫RNAiでは生存日数が約3分の1に短縮された。オス成虫を人工飼料で飼育した場合は対照と差がなかったためNcSP75とイネとの相互作用が示唆された。EPG(電気的吸汁行動解析)法から、NcSP75 RNAi個体では篩管吸汁の時間が対照の半分以下に短くなっていた。導管吸汁を含めたほかの行動時間には有意差がなく、また甘露(排泄物)の量自体には差がなかった。甘露に含まれる糖は篩管由来であるが、その含量は対照の9.8%に低下していた。NcSP75ノックダウンによって篩管吸汁が阻害されていることが示された。In situハイブリダイゼーションより、NcSP75遺伝子はヨコバイ唾腺のタイプIII細胞で発現していた。口針鞘の形態には変化が見られなかった。NcSP75タンパクは篩管吸汁を成立・持続させるエフェクターであることが示唆された。本研究をまとめて論文とし、投稿中である。初め、約30種類の遺伝子についてparental RNAiを行い(複数のdsRNAを同時にインジェクションしたものも含む)、次世代幼虫への影響を見た。重要な唾腺遺伝子の発現低下により、孵化幼虫の2齢になるまでの生存率が低下することを期待したものである。試行した遺伝子ではその現象が見られなかった。一方で孵化幼虫数自体が減るという現象が見られた。メス成虫の吸汁、栄養吸収に影響が出たためと考えられる。この手掛かりからNcSP75遺伝子が吸汁に必要なエフェクターであることが示唆された。NcSP75遺伝子ノックダウンの影響は、幼虫RNAiの実験で、より明らかに見えた。Parental RNAi以外にも、幼虫RNAiを併用することで、生存率と成育速度への影響を観察する。

ツマグロヨコバイ吐出タンパク遺伝子、唾腺高発現遺伝子を中心に、これまでに約70種類の遺伝子について幼虫RNAiを行い、生存率や発育速度への影響が出るものをスクリーニングしている。明らかなハウスキーピング遺伝子を除くと、NcLac5遺伝子のノックダウンで高い死亡率が観察された。NcLac5は唾腺特異的に発現し、そのタンパクはMulticopper oxidaseと相同性がある。ただし配列から銅を含まずかつ酸化活性を持たない可能性も高く機能は不明である。ヨコバイのMulticopperoxidase遺伝子はこれを含め計6種類見つかった(NcLac1S, 1G, 2-5)。これらのうちNcLac1S, 3, 5が唾腺特異的遺伝子であった。唾腺で発現し口針鞘に残存するラッカーゼ活性が見出されていたが、これはNcLac3によるものであることを明らかにした。それぞれ幼虫RNAiをテストすると、NcLac5に加えNcLac2で高い死亡率が見られた。NcLac2は表皮硬化や色素沈着に作用していて、ノックダウンによる高死亡率は予測できた。NcLac5の機能は不明である。3,4,5齢幼虫のNcLac5 RNAiの結果、脱皮(羽化)後に多数が死亡した。一方でNcLac5成虫RNAiでは生存率は低下せず、産卵数も対照に比べ減少しなかった。NcLac5は唾腺特異的であるが脱皮の際に新しく作られる細胞で必須であることが示唆された。これらのMulticopperoxidase遺伝子についても論文にまとめている。これまでに約70種類の遺伝子について幼虫RNAiを行った。先に同定されたツマグロヨコバイ吐出タンパク遺伝子についてはほぼ網羅することができた。いくつかの遺伝子については複数同時RNAiを行ったが、明らかな影響は見られなかった。ツマグロヨコバイ唾腺遺伝子について、吐出タンパクや分泌タンパクを中心にさらにdsRNAを作成する。幼虫RNAiでの成育速度や死亡率を観察することで重要な遺伝子をスクリーニングする。予備実験であるが、複数のdsRNAを同時にインジェクションすることで死亡率が上昇したケースがあった。このような手法も試みる。ツマグロヨコバイ唾腺遺伝子について、吐出タンパクや分泌タンパクを中心に引き続きにdsRNAを作成する。NcSP75遺伝子について機能を調べるため、形質転換によってNcSP75発現イネの作出を試みる。サーマルサイクラーが故障し、修理不可能となったため、29年度繰越分と30年度の予算を合わせて新規購入を計画している(約50万円)。現在作成中の論文の掲載料を予定していた(次年度に使用する予定)
アルブミン微粒子を担体としたＮＯトラフィックナノ医薬の開発と集学的癌治療への応用

シグナル分子でユニークかつ多様な生物活性を有する一酸化窒素(NO)は、癌治療においてもその応用が切望されている。しかしながらNOは、低分子のガス分子であるため、何らかの方法で、NOの体内動態を制御することが必要不可欠である。本研究では、生体内のNOのキャリアとして存在しているアルブミン(HSA)を担体としてNOのデリバリーシステムを構築することで、癌治療、中でも高分子抗癌剤の移行性を増強させるようなNO付加HSAの作製に成功した。本知見は、抗癌剤の副作用の軽減や、医療経済的にも貢献するものと考えられる。本研究では、ヒト血清アルブミン(HSA)分子をNOトラフィックシステムの担体に活用し、集学的癌治療へ応用することを目的とした。担癌マウスの腫瘍体積及び細胞生存率の評価より、Poly-SNO-HSAは、耐性獲得細胞において低下したdxの抗腫瘍効果を回復させた。この機序として、cGMP経路の関与に加えHIF-lalfa及びP-gpの発現量低下に伴う細胞内dx蓄積量の増大が確認された。以上の結果より、Poly-SNo-HSAは自身の抗腫瘍効果に加えて抗癌剤感受性増強作用を併せ持つ新規抗癌剤としての可能性が示唆された。一酸化窒素(NO)はシグナル分子でユニークかつ多様な生物活性を有しており、癌治療への応用が切望されているが、臨床応用に際しては体内動態制御が課題となっている。本研究では、これまで申請者が長年研究してきたヒト血清アルブミン(HSA)分子へナノ技術を導入したHSAナノ粒子(重合体、ナノカプセル及び磁性体)をNOトラフィックシステムの担体に活用し、1殺細胞効果、2化学療法増感・耐性克服作用、3放射線治療増感効果、を併せ持つDDS製剤を開発して、集学的癌治療へ応用することを目的としている。最終年度にあたる本年度は高分子抗癌剤の腫瘍部位移行性増大作用を有するSNO-HSA Dimerを用いて、実薬であるドキシルやアブラキサンとの併用効果、加えて腫瘍の種類による移行性変化を中心に検討を行った。その結果、HSA Dimerを用いることで、分子サイズの最適化(30 nm)を達成し、併用剤としての移行性増大効果に関して、ドキシルやアブラキサンといった高分子抗癌剤の移行性を約3倍高めることに成功した。加えて、この高分子抗癌剤の移行性増強効果は、enhanced permeability and retention (EPR)効果を示しにくい癌種に関しても、奏効した。本研究成果は、癌患者の副作用の軽減やQOLの向上のみならず、医療経済的にも極めて意義深い知見であると考えられる。本研究では、これまで申請者が長年研究してきたヒト血清アルブミン(HSA)分子へナノ技術を導入したHSAナノ粒子(重合体、ナノカプセル及び磁性体)をNOトラフィックシステムの担体に活用し、1殺細胞効果、2化学療法増感・耐性克服作用、3放射線治療増感効果、を併せ持つDDS製剤を開発して、集学的癌治療へ応用することを目的としており、本年度は、1NO付加HSAナノ粒子の抗腫瘍活性増感作用の検討を行った。その結果、現在、高分子抗癌剤の腫瘍部位移行性増大作用を有するSNO-HSA Dimerを用いて、分子サイズの最適化(30 nm)や投与設計に関する詳細な知見を得ることに成功している。また、併用する高分子抗癌剤の検討を始めており、既存の高分子抗癌剤であるドキシルやアブラキサン等の併用効果を検討中である。今後難治性の癌種モデルにおいても同様に効果があるのかを検証していくことを予定している。Poly-SNO-HSAの抗腫瘍効果に加えて抗癌剤感受性増強作用を併せ持つ新規抗癌剤としての可能性を見出すと共に、EPR増強剤としてのHAS Dimerの有用性を見出したことから当初の目標は概ね達成できた。25年度が最終年度であるため、記入しない。当初の予定として、本年度行うべき項目は、以下の3点としていた。1NO付加HSAナノ粒子の抗腫瘍活性増感作用の検討、2NO付加HSAナノ粒子の放射線感受性増感作用の検討、3NO付加HSAナノ粒子のin vivo安全性評価これまでに1と3の項目をある程度完了しているが、2に関しては、まだ検討を始めていない。これは、研究の遅れというよりも、研究を遂行していく中で、興味深い新たな可能性を見出しているために、その検討を並行して行っていることが原因であり、特に本研究においての進展が遅いという訳ではないと考えている。今年度は当初の研究計画を概ね達成したことから、来年度以降も今年度同様に研究分担者との連携を密にして研究計画を遂行する予定である。今後は、上記昨年の実施予定であった項目のまとめと以下の項目を重点的に行っていく予定としている。

1NO付加HSAナノ粒子の放射線感受性増感作用の検討2改良型NO付加HSAナノ粒子の開発1に関しては、防衛医大の木下先生との共同研究にて、すでに遂行している段階であり、2に関しては、静岡県立大の岩尾先生との共同研究にて材料の提供を行い、ナノ粒子の作製を依頼している。以上のことから、今後の研究に支障を来すような要因はないと考えている。
大脳皮質の局所神経回路構築の形態的解析

本研究は、大脳皮質の神経回路構築を明らかにするために、生理的形態的に同定された非錐体細胞に関してその神経終末を詳細に観察しその出力構造を明らかにすることを目的とする。ラットを実験動物に用い、前頭皮質のスライスを作成し、ホールセル記録法で電気的な特徴を記録解析した後バイオサイチンを注入した。固定後、ABC液で反応しDAB染色を施しエポンに包埋した。これらの非錐体細胞を光学顕微鏡で観察した後、neurolucida解析システムに入力し形態的な特徴を3次元的にとらえ、その情報をもとに主成分分析とクラスター分析で解析処理した。その後、軸索部分を電子顕微鏡で観察し、3次元再構築画像解析ソフトで前、後シナプス要素の3次元像を再構築し、その出力構造を形態的に解析した。本年度は、カルレチニンを含有することを免疫組織化学法であらかじめ同定したダブルブーケ(DB)細胞を中心に解析を進めた。主成分分析とクラスター分析で解析した結果、カルレチニンを含有するものは3種類の形態に分けられた。その中の2種類はともに白質方向に下降する軸索束を有するDB細胞であった。うち一方の細胞は細胞体のレベルで軸索が横方向に600μm程度伸張していた。また、3番目の種類は、小型のバスケット細胞であった。これまでに、1種類目のDB細胞(タイプ1)を2個、2種類目のDB細胞(タイプ2)を1個解析した。その結果、ターゲットの特徴は、タイプ1、2共に、約半数のものが非錐体細胞と思われる棘突起のほとんどない樹状突起の幹であった。また、半数近くのものが、棘突起の頭部や柄部であった。それらの棘突起には興奮性と考えられる入力が認められたことから、ある特定の興奮性入力信号に影響を与えていることが示唆された。また、タイプ2に関しては、細胞体に非常に近い部分(1-10μm)にシナプス入力している事例が比較的多く認められた。本研究では、生理的形態的に同定された大脳前頭皮質の非錐体細胞の各タイプに関して、神経終末を電子顕微鏡で連続で観察撮影し、3次元再構築画像解析システムで、その立体像を作成し解析する。ラットを実験動物に用い、前頭皮質のスライスを作成し、非錐体細胞と思われる神経細胞を選び、ホールセル記録をとり、バイオサイチンを電極を通じてその神経細胞に注入した後、スライスを固定した。次に、ABC液で反応した後にDAB染色を施し注入神経細胞を茶色く染色し、電子顕微鏡解析用にエポンで包埋した。こうして注入記録した大脳皮質の各種非錐体細胞ごとに軸索部分を電子顕微鏡で観察した。連続超薄切片上で後シナプス樹状突起(棘突起)を追い、連続画像を電子顕微鏡に装備した高解像度CCDカメラでワークステーションに入力し、3次元再構築画像解析ソフトで前・後シナプス要素の3次元像を再構築することで形態的に解析した。その結果、fast-spikingバスケット細胞とnon-fast spiking-ダブルブーケ細胞の神経終末のターゲットは、主に樹状突起、わずかに棘突起、細胞体であったが、non-fast spiking-マルチノッティ細胞とlate-spiking-ニューログリアフォーム細胞は、より細い樹状突起と棘突起の頭部、細胞体であった。これらの棘突起頭部には、ほとんどの場合別の非対称性神経終末が入力していた。上記4種類の非錐体細胞の神経終末が形成するシナプス結合部位の面積は、シナプスを受ける樹状突起・棘突起の周径や体積に比例して増加したが、その比例係数はサブグループで異なっていた。以上の点から、これらのサブグループのシナプス後細胞への抑制作用は異なると推測している。
労働契約法制のあり方に関する比較法的研究

本研究では,まず労働契約法制について,アメリカを中心としたアングロサクソン系の法制とドイツ,フランス,オランダ,イタリアを初めとする欧州大陸法系諸国の法制とに分けて情報を収集し,分析を行った。なかでも,分析の中心としたのは,解雇法制についてである。というのは,労働契約法制の内容は,解雇法制の内容に大いに依存するものだからである。現に,解雇法制については,アメリカのような「随意雇用(employment at will)」の国と欧州諸国におけるような解雇に関する規制がある国があり,それぞれの国において,労働契約法制のあり方もかなり異なっていることが明らかとなった。具体的に述べると,市場の変化などに応じて企業が労働条件を弾力的に変更しようとする場合,解雇規制がない国では,解雇による対処がなされやすいのに対して,解雇規制がある国では,このような方法を採用することができず,労働組合,従業員代表との合意を得ながら労働条件の不利益変更をしたり,個別的労働条件の変更の場合には労働者の黙示の承諾といったテクニックを使いながら実質的に妥当な処理が模索されていることが明らかとなった。本年度は,まず労働契約法制について,アメリカ,イギリスといったアングロサクソン系の法制とドイツ,フランス,イタリアを初めとする欧州大陸法系諸国の法制とに分けて情報を収集し,分析を行った。現に,解雇法制については,アメリカのような「随意雇用(employment at will)」の国と欧州諸国(イギリスも含む)におけるような解雇に関する規制がある国があり,それぞれの国において,労働契約法制のあり方もかなり異なっていることが明かとなった。具体的に述べると,市場の変化などに応じて企業が労働条件を弾力的に変更しようとする場合,解雇規制がない国では,解雇による対処がなされやすいのに対して,解雇規制がある国では,このような方法を採用することができず,労働組合,従業員代表との合意を得ながら労働条件の不利益変更をしたり,個別的労働条件の変更の場合には労働者の黙示の承諾といったテクニックを使いながら実質的に妥当な処理が模索されている。また,このような比較法研究と並行して,日本法上の解雇法制についても分析を行った。その分析の結果,解雇法制のあり方については,労働市場の構造に規定されており,基本的には雇用政策と密接な関連性を有しているものなので,政策のダイナミックな展開と平仄をあわせるために,ある程度の弾力性を維持しておく必要があり,そのような観点から,現行の解雇権濫用法理は判例法理であることのメリットがあるという結論に至った。他方で,解雇制限の内容は,できるだけ労使自治を重視した処理をすべきという観点から,労使自治と労働契約法制との関係の研究を継続中であり,比較法的成果をとりいれたその成果の一部は,平成14年度5月に開催されるの日本労働法学会で報告する予定である。
気候風土に依拠した住居・集落が呈する環境と意匠の設計手法分析

平成30年度は、地域性風土性が伝統的住宅の形態意匠に影響を与えているかについて検証するため、県レベルでの地区特性による伝統的住宅の緩衝空間の形態意匠の特徴はどのようなものであるか明らかにすることを目的とし研究を行った。縁側・ぬれ縁・土縁・土庇・出入り口および開口部・壁を住宅の緩衝空間の形態意匠を示す構成要素として取り上げ、これらの構成の様相が意匠性を表していると考え各要素の寸法を採取し基礎データとした。地理、地形的条件の多様性と人文的・歴史的にも地区的特徴を有する宮崎県を対象とし検討を行った。県内で選定された7地区での住宅の緩衝空間の構成要素を抽出し、その出現頻度を求めた。地区ごとの特徴が縁側・ぬれ縁・土縁・土庇の出現頻度およびその平均比率の値に現れた。すなわち緩衝空間の各要素の相対出現頻度は、宮崎県内全地区共に入口は高千穂町の一部を除き全戸に存在している。その他の開口部は30%の日向灘沿岸を除いて、ほとんどの地区に存在している。入郷地区を含めて北部の中山間地域ではぬれ縁が高い頻度で出現する。縁側は、西諸県郡高原町と日向灘沿岸では全戸に存在していた。他地域ではほぼ40%以下あるいは存在しない。土庇は入郷および西米良村に30%程度存在するのみである。土縁あるいはその類似形が高千穂町に見られた。このデータを基に地区の分類を試みた。さらに気候条件を用いた地区分類も行った。すなわち気象庁AMeDASデータの宮崎県内の該当する地区における観測点の30年平年値の降水量、平均気温、最高気温、最低気温、平均風速、日照時間を用い地区分類を行った。その結果、緩衝空間の意匠の指標と気候条件による分類の両者の間に強い相関性が見いだされた。住宅の緩衝空間はその地区の意匠的特徴を示し、気候条件とも関係性を有する示唆を得た。平成27年度は、第一に九州福岡県南部および佐賀県における伝統民家である「くど造り」住宅(コの字あるいはロの字型をした平面形態を持つ住宅)並びに炭田都市の市街地住宅を中心に現存状態と保存実態の把握のための現地調査を行った。その地域の地形にある敷地に対する立地性と形態意匠の現状をサンプル調査した。多くの住宅では草屋根についての鉄板覆いがなされることが多く、窓サッシの交換や玄関戸のアルミ化が多くみられるのが現状であった。これは、住宅の密閉性を増すことで、現代的生活への適応の形態であると判断される。保存復原住宅では、川内家などかなり典型的な事例が保存されていることで建設当時の環境状態と意匠性を実体験できるが、多くの場合メンテナンスについての考慮がなく、課題点であることが見いだされた。室内の明るさを通風性は平面形態の閉鎖性を想像させる以上に良好であることが見いだされた。第二の調査としては神奈川県の保存住宅の調査を行った。この住宅は、行事を行うなどにより統一的に管理されておりその保存管理レベルは高い。ここでは、主に屋根・軒の深さおよび南面する開口部についての調査を行い、日中に最低限必要な室内の明るさを確保し、夏季には日射を十分遮蔽する性能が、南面ファサードに表れていることを確認した。すなわち、日照調整効果が大きい軒の出のかなりの深さが、独特のファサード意匠として認識される特徴であることが把握できた。以上の現地調査データを、ファサード意匠、平面外形形態として整理し、環境条件を与えた場合の日照と通風状況を模式化することを試みデーターシートのプロトタイプを模索した。一方で、従来行ってきた日本各地における伝統民家および集落(都市)の形態と立地環境の姿の分析のため、既存資料と論文から意匠の構成要素と環境要素を抽出し整理を行っている平成27年度には、現地調査を近隣を含めて複数個所行くことを予定していた。しかし、研究者の所属する愛知産業大学に日本高等教育評価機構による大学機関別認証評価があり、さらに文部科学省による学校法人運営調査が重なったため、その資料準備等対応があり、当初予定した現地調査が2か所にとどまってしまった。ただ資料等の分析については当初の目論見通りに進行していると判断される。そのため、やや遅れていると判定した。本年度は、伝統住宅の形態と意匠を提示する要素の系統的表示を試みた。特に軒回り、開講周辺、縁・庇の形態意匠を中心に取り扱った。既存の伝統住宅調査、実地住宅調査および文献調査によって、現存・保存遺構・復原を問わずに、原立地を特定できるものに関して、その立地環境に応じた室内や周囲環境を調節するあるいは立地環境から影響を受ける効果を示すものおよび影響に対処する手法を形態として可視化されている部位、要素、モノを対象とした。この視点からの環境調節法の分類を行い、対応する要素等を有する住宅を各地から選定した。それらについて、屋根型、開口部と主に室内外の連結性の形状、軒・ひさし等の装備とそれによって閉鎖・開放される空間特性を中心に特徴抽出を行った。分類には、気候と地形および特異的環境特性に関わる形態・意匠の形状・寸法性・疎密を表示・示唆する要素を抽出し比較分類し系統化した。そのために、伝統的住宅の部位とそれを構成する形態と意匠の部位要素の分類表を作成した。以下に得られた知見を示す。対象住宅から時空間と演出性の因子、住宅を構成する基礎要素を抽出した。マス、内部容積と点、線や面で構成される。