hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
次世代多層配線プロセス新微細加工技術の研究

最終年度は、ヘルスケアチップにおける「健康・疾病マーカ」の電気化学的検出のための多層配線技術を研究した。本チップは基本的に安価・使い捨てでなければならないので、スクリーン印刷を研究した。チップは流路パターンが射出成型法によって形成されたポリカーボネート基板と多層電極ポリエステル基板からなり、両基板を電極孔を予め抜いた光エポキシ重合性膜を介して常温で貼り付ける。ポリエステル基板上には、数μmのメッシュを用いたスクリーンによって、まずカーボン銀を用いて配線を形成し、その上にマスク合わせをしてセンサ電極としてカーボン、参照電極として銀/塩化銀を多層に形成後、パッドとして銀ペーストを用いる。その際、カーボン電極では、表面が電気的特性を左右するので、粒子径やバインダーなど種々の材料を検討した。これらの電極(有効面積:320μmφ)上にNa^+、K^+イオンセンサとして各々Bis(12-crown-4)とBis(benzo-15-crown-5)のイオン感応膜をアニオン排除剤と可塑剤を導入してPVCで固定化した。pHセンサとして電解重合によりカーボン電極上に絶縁性ポリピロールを形成した。グルコースセンサは、グルコースオキシダーゼとメディエータとしてフェロセンを含ませたものをポリイオンコンプレックス法によりカーボン電極上に固定化した。BUNセンサは、カーボン電極上に絶縁性ポリピロールを形成した後にポリイオンコンプレックス法によりウレアーゼを塗布し、その上からポリ-L-リシン膜で覆い固定したもので形成した。ここでイオンセンサおよびBUNセンサは電位検知のポテンショメトリ法であり、グルコースセンサは電流検知のアンペノメトリ法で計測した。なお、チップ内流路表面は血球などの付着を抑制し、生態適合化を図るためにMPCポリマーを塗布した。次の項目について研究を行った。得られた結果を列挙する。1.無水フッ酸を用いたSiO_2のドライ平坦化無水HFガスとSiO_2の反応SiO_2+4HF→SiF_4+2H_2Oを利用して、絶縁膜(SiO_2)のドライ平坦化を行う。真空容器中にHFガスを導入し、サンプルに平坦な板を繰り返し接触させ、板材や温度を変化させ、接触面にのみ凝縮層を形成しエッチング反応を局在化させ、平坦化を試みた。凝縮層の形成条件は、温度およびHF・H_2O各分圧、さらにはSiO_2の表面状態によって大きく異なることが判った。これを踏まえて次の平坦化実験を行った。まず、温度差を利用した平坦化では伝熱速度が非常に大きいため、接触による温度差を維持できなかった。次にOH基を多く含むTEOS膜と接触させ、凝縮層を局所的に転写させる平坦化では気相中にH_2Oが拡散し、接触面のみに留まらせることができなかった。最後にレジスト膜との接触面でのみ凝縮層が形成されることを利用した平坦化では、一分間で凹部252nmに対して凸部を359nmエッチングし、段差を減少させることができた。2.平坦化カーボン埋め込み電極・配線の作成昨今、DNAやカーボンナノチューブを用いたデバイスの研究が盛んであり、これらとコンタクトを図るために、基板との段差が1nm程度で、表面が化学的に安定な電極・配線が求められている。これらの需要に答えるため、Si基板上の酸化膜に溝を掘り、Crを接着層として、Ptを埋め込み、表面にCVDでカーボンをコートし、全体をCMPで平坦化した電極・配線を作成した。またこれを用いてカーボンナノチューブの電気的特性を測定した。3.カーボン電極・配線を用いたバイオセンサーの開発白金に代わり、より安定で安価なカーボン電極・配線を用いた、酵素固定化センサーの試作を行っている。尿素窒素(BUN)、クレアチニンセンサーの試作を行った。本年度は本研究目的に対して次の4項目の研究を行った。(1)LSIの昨今の進展に大きく寄与したCMP(化学的機械研磨)において、次世代多層配線材料のCuのCMPの終点検出機構と研磨の高速化技術を研究した。まず、研磨中の実パターンが生成されたCu表面にレーザ光を照射し、その0次光を検出し、研磨中は散乱光が増し、平坦化直前になると反射光強度が低下することを見出し、終点検出法を見出した。研磨速度の高速化には酸化剤を用いて軟らかいCuOを生成し、ディシュング防止には硬いCu_2OまたはCuを生成して加重を減少することにより達成されるため、二つのヘッドを有する機構を開発し、片方は、酸化促進、もう片方は酸化剤なしの低加重で研磨を行うことにより、当初の目的を達成した。(2)層間絶縁膜のSi酸化膜の平坦化のため、CMPを用いず、無水HFガスを用いた方法を研究した。原理は、低温にした平坦面にHFガスを吸着させ、Si酸化膜表面に短時間接触させ、生成した凝縮層を揮発させる。実際は、平坦面にレジストを塗布し、HFガスを凍み込ませた。完全な平坦化までは達成されなかったが、原理的には可能と判断した。(3)100μmの超厚膜レジストのSU-8を用い、生成したパターンをマスクに石英板を高アスペクト比で加工することを研究した。マスクをレジスト表面にコンタクトして露光しては良いパターンは得られず、石英の裏面からパターンの露光を行うと高アスペクト比加工が可能なことを見出した。これをマスクに石英板をエッチングしたところ、C_4F_8:H_2:Ar=10:20:30の混合比で100μm厚の垂直形状が得られた。

(4)本研究成果の半導体微細加工技術をバイオチップに応用した。ヘルスケアチップでは、PET板を用い、石英板に形成した血液の流路パターンをモールド法で形成した。本方法は、肝機能を測定する比色用チャンネル形成にも適用され、マーカ測定を可能にした。また、石英基板への流路形成技術により、長鎖DNAの捕獲チップにも活かされ、更に、200nmのピラーを流路中に形成し、長鎖DNAの電気泳動分離を従来のゲル法と比べ400分の1の短時間に縮小した。最終年度は、ヘルスケアチップにおける「健康・疾病マーカ」の電気化学的検出のための多層配線技術を研究した。本チップは基本的に安価・使い捨てでなければならないので、スクリーン印刷を研究した。チップは流路パターンが射出成型法によって形成されたポリカーボネート基板と多層電極ポリエステル基板からなり、両基板を電極孔を予め抜いた光エポキシ重合性膜を介して常温で貼り付ける。ポリエステル基板上には、数μmのメッシュを用いたスクリーンによって、まずカーボン銀を用いて配線を形成し、その上にマスク合わせをしてセンサ電極としてカーボン、参照電極として銀/塩化銀を多層に形成後、パッドとして銀ペーストを用いる。その際、カーボン電極では、表面が電気的特性を左右するので、粒子径やバインダーなど種々の材料を検討した。これらの電極(有効面積:320μmφ)上にNa^+、K^+イオンセンサとして各々Bis(12-crown-4)とBis(benzo-15-crown-5)のイオン感応膜をアニオン排除剤と可塑剤を導入してPVCで固定化した。pHセンサとして電解重合によりカーボン電極上に絶縁性ポリピロールを形成した。グルコースセンサは、グルコースオキシダーゼとメディエータとしてフェロセンを含ませたものをポリイオンコンプレックス法によりカーボン電極上に固定化した。BUNセンサは、カーボン電極上に絶縁性ポリピロールを形成した後にポリイオンコンプレックス法によりウレアーゼを塗布し、その上からポリ-L-リシン膜で覆い固定したもので形成した。ここでイオンセンサおよびBUNセンサは電位検知のポテンショメトリ法であり、グルコースセンサは電流検知のアンペノメトリ法で計測した。なお、チップ内流路表面は血球などの付着を抑制し、生態適合化を図るためにMPCポリマーを塗布した。
レーザードプラー血流測定法による乳歯および幼若永久歯の歯髄診断に関する研究

歯の表面よりレーザー光線(半導体レーザー780nm波長)を照射して生じるレーザードップラー効果を利用して、歯髄血流の有無を検知し、歯髄の生死を判定できることを目的として本研究を行なった。1.医科領域で実際に使用されているレーザー式組織血流計(バイオメディカルサイエンス社製LBFIII、購入機器)は、主として皮膚表面より組織の血流量および血液量を計測する機種であるが、これを歯に使用しても操作性が簡便で低出力(1mW)なため安全性もきわめて高いことが認められた。2.歯の表面にあてるプローベを数種類設計、試作し被験者の歯で試適してみたが、現有する電気歯髄診断器(自作)のものとほぼ同型のコントラアングル式(直径2mm、長径20mm、)が最適であることがわかった。3.歯との接触点での手ブレがテーターに影響するため、シリコン印象材で保定するとより正確な計測ができる。4.得られた信号をデーターレコーダーに記録し再生して観察したが、SN比が大きく、また、計測された電位が安定するまでに5-10分位要するため、実際の臨床での使用には現段階では難しいと思われた。5.抜去乳歯を矢状面で切断し、光量計で歯質の厚さとレーザー光の減衰率を調べたところ、歯質2mmでは17%に、1.5mmでは36%に、1.0mmでは45%に減衰することがわかった。6.通常の組織でドップラー効果を観察するに必要なレーザー光の光量は1mWであるが本実験より得られた結果を考慮すると、歯質を通過したレーザー光が少なくとも1mW以上あるための条件としては、入射光の出力が5mW以上であることが必須であり、今後、半導体レーザーに特有な性質として出力が可変であることに注目し、機種を改良して計測に最適の出力を決定していく予定である。
カチオン－π相互作用に基づくテンプレート型光増感触媒の開発

先に我々は、ベンジルオキシベンゾフェノン誘導体およびアセトフェノン誘導体のNorrish - Yang反応において、テトラアルキルアンモニウム塩を添加すると、基質とのカチオンーπ相互作用によりcis選択的にテトラヒドロベンゾフラノールが生成することを見出しいる。今年度は、増感効果を示す触媒を開発することで触媒量の低減を検討した。基質として、2ーシアノメチルオキシアセトフェノンを用いて、種々の増感剤を検討したところ、4ーメトキシアセトフェノンが増感効果を示すことが明らかとなった。一方、テトラブチルアンモニウムアセテートもカチオンーπ相互作用により反応を促進することが明らかになった。これらの結果から、両者を結合させたテトラアルキルアンモニウム増感触媒を合成し、光反応の経時変化を調べた結果、30 mol%でも著しい加速効果が見られ、目的とする光増感型アンモニウム触媒を開発することができた。さらに、触媒的[2+2]光付加環化反応についても検討を行った。先に我々はスチリルピリジンの光二量化反応において、立体選択的[2+2]光付加環化反応が進行することを明らかにしているが、本研究では、カチオンーπ相互作用による配向制御の一般性を明らかにすることを目的とし、ピリジン以外の含窒素複素環化合物であるスチリルチアゾール類の光二量化反応を検討した。いずれの基質においても塩酸の非存在下では4種の二量体が得られ、選択性は見られなかった。一方、塩酸存在下では高い選択性でsynHT体が主生成物として得られた。これらの結果から、酸の添加により、チアゾール環がプロトン化されて正電荷を持つことで、分子間カチオンーπ相互作用が働きsynHT体が優先して生成したものと考えられる。以上のことから、カチオンーπ相互作用による分子間の配向制御が一般的手法として利用できることを明らかにした。27年度が最終年度であるため、記入しない。今年度は、アセトフェノン類の2位に種々の置換基を有する基質を用いて、Norrish-Yang反応を行い、アンモニウム塩の添加によるcis/trans選択性に及ぼす影響を明らかにした。2位にEtOOCCH2O-基を有する基質では、Bu4NClを添加することで、著しい反応速度の加速効果が見られた。基質とテトラブチルアンモニウムイオンとのコンプレックスの分子軌道計算を行った結果、基質の二つのカルボニル基がアンモニウムイオンとの相互作用により接近したsyn配座を有する比率が3倍に増加することが明らかになった。このコンホメーションは励起状態からの水素引き抜き反応に有利であるため、反応の加速効果が見られたものと考えられる。また、2位にEtO-基を有する基質では、目的生成物であるジヒドロベンゾフラノールの他に、副生成物としてジヒドロイソベンゾフラノールが生成するが、今回新たに合成したアセトフェノン骨格を結合したアンモニウム塩を触媒として用いることで、副生成物が抑制されることが明らかになった。この効果の詳細は明らかではないが、アセトフェノン部位が増感剤として作用すると同時に、アンモニウム部位が相互作用によりコンホメーションを制御することで選択性を高め、副生成物を抑制したものと考えられる。今年度は、アクリルアニリド類の6π電子環化反応ににおけるアンモニウム塩の効果についても検討した。アクリルアニリド類の6π電子環化反応では、ジヒドロベンゾキノロンが生成するが、この場合もcis/trans異性体の混合物が得られる。この時、アンモニウム塩を添加することで高いtrans選択性が得られることが明らかになった。この反応機構として、アンモニウム塩を添加することで光閉環後の分子間水素移動を抑制し、分子内1,5ー水素移動が優先したためであると考えられる。

これらの結果から、酸の添加により、チアゾール環がプロトン化されて正電荷を持つことで、分子間カチオンーπ相互作用が働きsynHT体が優先して生成したものと考えられる。以上のことから、カチオンーπ相互作用による分子間の配向制御が一般的手法として利用できることを明らかにした。テトラブチルアンモニウム塩が、ベンジルオキシアセトフェノン類のNorrish-Yang反応を加速することを見出し、汎用の試薬である塩に触媒作用があることを見出した点は、本研究の基盤を確立できたものと評価できる。さらに本触媒を用いて、[6π]電子環化反応によるジヒドロベンゾキノロンのジアステレオ選択的合成も達成し、概ね順調に研究が進展していると評価できる。27年度が最終年度であるため、記入しない。今後は、これまでに明らかにしたテトラブチルアンモニウム塩のジアステレオ選択的な触媒効果に加え、エナンチオ選択性を達成すべく、光学活性なアンモニウム触媒の合成を行い、Norrish-Yang反応および[6π]電子環化反応に有効な不斉触媒の開発を目指す予定である。
聴覚情報を利用した盲人用道路横断訓練ソフトウエアの開発とその評価

今回開発した道路横断訓練ソフトウエアは、パソコン上にリアルな道路場面を音で再現する。右側から近づいてきた車が左側に走り去ったかと思えば、また同じ方向から車が近づいてくる等、10種類の状況が再現される。車の音に耳を澄まし、「渡れる」と思ったタイミングでキーを押すと、その判断が正しく安全であったか、危険だったかを音声で教えてくれる。試作ソフトウエアを盲学校教員及び盲人数名に使用してもらったところ、「まるで本当にその場にいる様だ」と高評価であった。ただし、使い勝手の悪い点を何点か指摘された。改良版ではキーの操作性や、状況説明、フィードバックも改善し、より学習しやすいソフトウエアとなった。本研究の目的は,PC及びスマートフォンで使える視覚障害者用の「道路横断訓練ソフトウエア:Road Crossing Training Software,以下,ソフトウエアとする)を開発し,その有用性を明らかにするために,平成26年度は以下の手順で開発を進めた.1.ソフトウエアに組み込む状況音の作成:「あたかも眼前を車が往来する音場」をここでは状況音と呼ぶ.複数の異なる状況音を音響VRで作成した.コンパクトカー,軽トラック,トラック,HV車などを用いて走行音やアイドリング音をPCM録音した.また環境音として雑踏音も録音した.それらのデジタル音声ファイルをサウンドスペースプロセッサで合成編集し,状況音を10種類作成した.2.ソフトウエアのプログラム試作:次の事項を可能とするソフトウエア本体の試作を行った.(1)Windows以後のOSで動作する.(2)10種類の状況音を再生する.(3)横断判断のタイミングをキーボードで入力可能とする.(4)横断判断のタイミングの正誤を合成音声で出力する.(5)車輌の動きを表示する.3.ソフトウエアのヒアリング:試作したソフトウエアを重度視覚障害者5名にモニタリングを行った.状況音の現実感,横断判断の正誤についてのフィードバック,操作性などについて聞き取り調査を実施した結果,以下のことが示唆された.(1)10種類の状況音は全て生活道路及び横断歩道の状況音としてリアリティが高い.(2)複数の車種の違いが聞き分けられた.HV車の音が聞き取りにくいことも改めて認識できた.(3)横断判断の正誤フィードバックをより明確にする必要がある.(4)横断判断のタイミングの難易度を工夫する必要がある.(5)車輌走行音以外の環境音,人の歩行音などの音を付加することで,より現実的な横断訓練に繋がる.これらを踏まえ,試作したソフトウエアの改善を行う.本研究の目的は,盲人が手軽に使える「道路横断訓練ソフトウエア」を開発し,その有用性を明らかにすることである.当事者研究者の参加により,盲人ユーザの視点から開発できる点を特長とする.初年度である26年度には,車両走行音を録音し,それらを音源とした音響VRを作成,PC用訓練ソフトを試作した.操作方法,課題等は全て音声で説明され,キーボードで全てが操作できるため,盲人単独での使用が可能である.試作ソフトでは,信号機のない横断歩道を渡ろうとしている場面が設定された.速度を落とさずに通過する車の音,減速して停止する車の音等,10種類の状況音が提示され,「安全に横断できる」と思ったタイミングでキーを押すと,正誤が音声でフィードバックされる.試用した盲人はいずれも試作ソフトの有用性を認めたが,横断状況の難易度,操作性の問題点の指摘もあった.27年度は,横断場面・状況の音響VRの改良を主とした.横断場面は「生活道路」と「信号機のない横断歩道」の2種類であった.いずれの場面においても,難易度を5段階設けた.難易度は,走行音の聞きやすさ(ハイブリッド車/ガソリン車),車線数,停止している車(アイドリング中/エンジン停止中)の有無等によって変化させた.この改良版ソフトを試用してもらい,音響VRによる状況の実在感,課題の難易度について尋ねたところ,難易度の異なる課題の配列順が適切であるとの評価であった.ただし,フィードバックが正誤のみである点に改善を求められた.なぜ危険であったのかの状況説明,および走行車両の接近に注意を喚起する音声を,フィードバックで付加した(改良版ソフトv2)ところ,盲人ユーザからは単独使用でも安全な横断判断を学習できると高く評価された.当初の計画ではスマートフォンで使えるソフトウエアも作成する予定であったが,期間内の実現には至らなかった.今回開発した道路横断訓練ソフトウエアは、パソコン上にリアルな道路場面を音で再現する。交付申請書に記載した当該年度の目的をほぼ達成している.生態心理学平成26年度に実施した聞き取り調査によって示された現行のソフトウエアの問題点及び視覚障害者当事者からの要望を反映させたソフトウエアの改善を行う.

1.試作したソフトウエアの状況音の改良:VRによる横断状況の音場がわかりやすくなるように音声による状況の説明を付加する.また,状況音に含まれる車輌音や環境音を修正する.さらに,自動二輪車,大型車輌などの車輌をレンタルし録音を行い,車輌音の種類を増やす.加えて,雨音などの自然音,人の音声などを録音し状況音に付加する.2.横断タイミングの正誤のフィードバック:横断タイミングの安全/危険をいっそう明確にフィードバックするようにソフトウエアを改善する.さらに,ゲーム性を帯びるようにフィードバック用のサイン音を作成する.3.訓練プログラムの構成:生活道路と信号機付き横断歩道の2種類にソフトウエアを分割する.さらに,自立移動の初心者及び盲児を対象とした難易度の異なるソフトウエアを試作する.4.ソフトウエアの操作性の改良:10種類の状況音のうち,任意の状況を直接指定できることや,同一の状況音を何度も再生できるようにするなど,ソフトウエアの操作性を改良する.車輛の走行音を録音するために大型車輛及び自動二輪車もレンタルする計画だったが,他の車輛音の録音及び加工に時間がかかったため,次年度に持ち越すことにした.また,予定していた視覚障害者へのソフトウエア聴取実験が一部実行できなかった.平成26年度で実行できなかった大型車輛及び自動二輪車の走行音を録音し,車輛音の種類を増やす.また,同年度で一部実行できなかった視覚障害者への聴取実験を行い,ソフトウエアの問題点及び障害者当事者からの要望を反映させ,ソフトウエアの改善を行う.
平滑筋細胞においてアセチルコリン神経伝達を担う膜ドメイン

消化管と気管の平滑筋を対象に、主に免疫細胞化学的手法で平滑筋細胞膜ドメインを解析した。これらの組織はアセチルコリン合成酵素(ChAT)や小胞型アセチルコリントランスポーター(VAChT)の免疫組織化学によりアセチルコリン含有神経終末が豊富であることが確認されている。ムスカリン受容体はM1からM5までサブタイプが存在し、消化管と気管ではM2受容体が多く発現している。消化管においてM2受容体はほぼすべての筋層平滑筋と粘膜内平滑筋に発現したが、その発現量には部位差があった。発現が少なかったのは食道粘膜筋板平滑筋、小腸筋層の最内層平滑筋、小腸粘膜内平滑筋、近位結腸筋層平滑筋であった。食道筋層の横紋筋では発現がなかった。小腸と結腸では平滑筋細胞の他に、カハールの間質細胞と呼ばれる細胞にM2受容体の発現が見られた。平滑筋での発現は細胞周囲に限局しており、免疫電顕の結果、細胞膜の細胞質側に免疫活性が限局し主にカベオラが多数分布する部位と一致した。更に、蛍光2重染色標本を共焦点レーザー顕微鏡を用いて観察した結果、M2受容体の免疫活性はカベオラのマーカー分子であるカベオリンの免疫活性の存在部位と主に一致した。一方、平滑筋細胞には膜関連暗調小体を含む膜ドメインがあるが、そのマーカー分子と考えられるビンクリンの存在する部位とはほとんど一致しなかった。一方、カハールの間質細胞においてはM2受容体の発現が細胞膜のみではなく細胞質内にも瀰漫性に見られ、M2受容体の局在化機構に違いがあると考えられた。気管においても筋層を構成する平滑筋細胞にM2受容体は多量に発現していた。平滑筋細胞における分布様式は消化管筋層平滑筋と同様であった。肺内で気管支と肺動静脈の平滑筋を比較すると気管支壁にのみ発現するのが明瞭に確認できた。
皮質てんかんにおける局所脳冷却による機能的焦点切除に関する研究

てんかん焦点切除術を行う場合には、焦点の空間的広がりや焦点部位固有の脳機能を正確に解析する必要がある。皮質焦点てんかんの場合、焦点の中心領域は比較的容易に決定できるが、焦点周囲の正常脳との境界を決定することは困難である。従来の方法では、焦点内の異常波と軸索投射や電気緊張性に拡散した二次的異常波とを鑑別することが困難であった。この様な観点から、大脳皮質に対する外科治療を行う前に、一過性、可逆的かつ部分的な大脳皮質冷却を行い機能的な皮質切除が可能になれば、手術効果ならびにその危険性の判定が術前に確実に行える様になるものと期待される。上に述べた背景に基づいて、てんかん焦点の可逆的でかつ機能的な切除法を検討した。方法としてはラットならびにマウスのてんかんモデルを作製した上で(ラットはNodaepileptic rat(NER)、マウスはEL mouse)、実験を行った。しかし、ラットやマウスの脳容積が小さく、脳血流が豊富なためか安定した局所脳冷却もしくは全脳冷却は困難であった。また冷却範囲の安定したコントロールも困難であった。このため、関連研究として全脳放射線照射の効果を検討した。その結果、NER rat群で放射線照射によるてんかん原性抑制効果が示唆された。さらに、臨床的に術中に局所冷却法を行いてんかん性発作波の抑制効果を検討した。ラットならびにマウスのてんかんモデルを作製中である。最初の段階では、実験系への人為的な操作を最小限にするために、てんかん動物モデルとしては先天的てんかんモデルを用いることにした。先天てんかんモデルとしては、すでに今までに他施設で確立されているELマウスならびに聴源性ラットを利用している。当初は部分てんかんモデルでの実験を予定していたが、人為的操作によるモデルではてんかん誘発閾値のパラメーターが安定せず実験の遂行が困難と判断したために、まずは先天的全般てんかんに対する全脳冷却もしくは全脳放射線照射による影響の検討をすることにした。冷却効果と放射線照射の効果を対比検討し、全脳冷却によるてんかん抑制効果と全脳への放射線照射による抑制効果の定量的差異を解析している。本年度は、まずこれらの実験を遂行するために必要な装置、てんかんモデルラット・マウスの作製の方法を確立した。さらにてんかん発作の誘発の定量的方法を確立した。このモデルを用いて、次年度は各種パラメーターの変化、てんかん抑制効果、抑制後の可逆性などについて検討する予定である。ラットならびにマウスのてんかんモデルを作製した上で(ラットはNodaepileptic rat(NER)、マウスはEL mouse)、実験を行った。先天的てんかんモデルであるNERとELを用いたのは、実験系への人為的な操作を最小限にするためである。当初は部分てんかんモデルに対する局所脳冷却による一時的かつ可逆的なてんかん原性抑制効果の検討を予定していたが、人為的操作による部分てんかんモデルではてんかん誘発のパラメーター閾値が安定せず実験の安定した遂行が困難でることが予想されたこと、さらにラットやマウスの脳容積は小さく、安定した局所冷却もしくは全脳冷却が困難で、また冷却範囲の安定したコントロールも困難であったことなどから、昨年度は本プロジェクトを脳冷却実験にまで発展させることが出来なかった。脳冷却によるてんかん原性抑制実験の前に全脳放射線照射によるてんかん原性の推移を検討した。現在EL mouseとNER ratに対して放射線の全脳照射を行い、てんかん抑制効果、抑制後の可逆性などについてコントロール群との比較検討を行っている。その結果、NER rat群で放射線照射によるてんかん原性抑制効果の可能性が示唆されたものの、EL mouseではてんかん原性抑制効果を明らかにすることはできなかった。今年度はさらに、脳冷却によるてんかん原性の影響を検討すべく局所脳冷却実験、さらに局所放射線照射実験を行う予定である。

この様な観点から、大脳皮質に対する外科治療を行う前に、一過性、可逆的かつ部分的な大脳皮質冷却を行い機能的な皮質切除が可能になれば、手術効果ならびにその危険性の判定が術前に確実に行える様になるものと期待される。上に述べた背景に基づいて、てんかん焦点の可逆的でかつ機能的な切除法を検討した。方法としてはラットならびにマウスのてんかんモデルを作製した上で(ラットはNodaepileptic rat(NER)、マウスはEL mouse)、実験を行った。しかし、ラットやマウスの脳容積が小さく、脳血流が豊富なためか安定した局所脳冷却もしくは全脳冷却は困難であった。また冷却範囲の安定したコントロールも困難であった。このため、関連研究として全脳放射線照射の効果を検討した。その結果、NER rat群で放射線照射によるてんかん原性抑制効果が示唆された。さらに、臨床的に術中に局所冷却法を行いてんかん性発作波の抑制効果を検討した。
山地流域を対象にした新知見に基づく信頼性ある水循環モデルの構築と将来流出予測

利水と治水の要衝となる山地流域を対象として、多くの流出解析モデルの基礎式に使用されている貯留関数式について、パラメータ特性を明確にすることにより、信頼性ある水循環モデルの構築を進めた。気候と地質条件の異なる複数の山地流域において解析を行い、1)低水流出に適用する貯留関数式の2つのパラメータは逆数の関係にあること、2)洪水流出に適用する貯留関数式の2つのパラメータは指数関数式で表現できること、を明らかにした。そして、実務で利用しやすいパラメータ値についても検討した。さらに、GCM出力値を用いた水循環解析を行い,2080年から2099年の将来流出を月単位および年水収支量として流域単位で表した。本研究は,利水と治水において,山地流域の流出を的確に把握することの重要性,また,地球温暖化による将来の流出予測を行うことの必要性を背景としている.現在,国内外の流出モデルに多用されている貯留関数式は,式中のパラメータの解釈が定まっていない.そこで,低水流出と洪水流出についてパラメータの特性を明確にし,新たな知見に基づく信頼性ある水循環モデルを構築することを研究目的としている.そして,気候モデルの出力値を基に水循環モデルを用いて将来流出量の予測を行うことも目的としている.当該年度は,対象流域の設定と水文資料の収集と整理,検証作業を中心に行い,そして水文資料がほぼ整理された流域から,順次,水循環モデルのプログラムの修正と動作確認,流出解析を行った.その結果,洪水流出に対しては,四国地方の早明浦ダム流域と鏡川流域において,2つのパラメータの関係が指数関数式として表される可能性を示すことができた.対象流域として設定した四国,東北,北海道の3地方6流域のうち,東北,北海道地方の計4流域については,予定していた1時間単位で10年以上の水文資料の収集作業をほぼ終えることができた.四国地方の早明浦ダム流域については20年間の資料は収集済みであり,近年5年分の資料収集が残っている.また,鏡ダム流域についても資料収集は一部にとどまっている.一方,既に整理,検証された水文資料を用いて,解析可能な期間から水循環解析を進めた.その結果,早明浦ダム流域と鏡川流域における洪水流出に対して,貯留関数式の2つのパラメータは指数関数として表される可能性を示すことができた.以上より,水文資料の収集・整理,検証作業の一部遅れはあるものの,洪水流出については既に解析を進めている段階にあることから,全体としてはおおむね順調に研究は進展していると考えている.現在と将来における治水対策および利水対策の適切な実行を念頭に置き,河川流量の算定精度向上のため,多くの流出モデルの基礎式として使用されている貯留関数式に含まれるパラメータの特性解明を進めている。平成28年度は,1)洪水流出を対象とした貯留関数パラメータの性質把握,2)早明浦ダム流域を対象とした将来気候値を基にした長期水循環解析,を主に進めることができた.1)については,自然条件である気候および地質が異なる四国地方,東北地方,北海道地方の5つの流域において洪水流出解析を行い,最適パラメータを探索し,流域毎に整理してパラメータ特性を考察した.その結果,これまで独立したパラメータとして見なされていた指数pと係数kには相互関係があり,指数関数式で表現できるp-k曲線の存在を明らかにすることができた.解析結果を整理して,国内学会の研究発表会において公表するとともに,リトアニアで開催された国際会議Nordic Water 2016で発表し,さらに,査読付き論文に投稿して受理され掲載された(土木学会論文集G(環境)).2)については,四国地方の早明浦ダム流域を対象に,4つの全球気候モデル(MIROC3.2(hires),MIROC3.2(medres),MRI-AGCM3.1S,MRI-AGCM3.2S)の将来気候値(A1B, 2080年2099年)の公開されている月単位の係数を基にして1時間単位で20年間の長期水循環解析を行い,流出量の月平均値と年水収支量について考察した.その結果,毎月の月流出量の増加傾向,地下水流出量の1月から5月にかけての増加傾向,直接流出量の8月9月にかけての顕著な増加傾向をシミュレーションにより表すことができた.これについての研究成果は,国内学会の研究発表会において公表した.Web等で公開されていない水文資料を河川管理の事業所に赴き,提供をお願いし入手できたことから,解析に必要な資料の整備がはかどった.ただし,流出解析をまだ終えていない流域や将来流出予測に必要な気候モデル値の出力を終えていない流域が残っている.一方で,解析プログラムの修正,動作確認を行い,洪水流出解析,長期水循環解析と将来流出予測の一連の解析の実行プロセスを確実にしているので,流出解析をスムーズに進められる状態にある.全体として,解析結果を順次整理し,国内外の学会で公表している段階にあるため,おおむね順調に進展していると考えている.利水と治水の要衝となる山地流域において,より精度の高い河川流出量を算定するため,そして,地球温暖化による流出量の将来変化を流域規模で表すため,信頼性ある水循環モデルを構築することを本研究の目的とした.

そこで,多くの流出解析の基礎式に使用されている貯留関数式に着目し,式中のパラメータの設定によって解析精度が変化することから,パラメータ特性を明確にすることとした.前年度までは,洪水流出について精力的に解析を進め,これまで独立したパラメータとして見なされていた指数pと係数kは相互関係にあり,指数関数式として表現されるp-k曲線の存在を明らかにした.本年度は,洪水流出に関してさらに解析を進め,多数のp-k値の組み合わせを用意し,同じ組み合わせのp-k値から得た誤差評価値(Nash指数値)を対象洪水全てについて平均化し,その中から最良の誤差評価値を表すp-k値を流域代表値として特定した.一方,低水流出に適用する貯留関数式の最適パラメータについて,既に,指数Nと減水定数Auは逆数の関係にあることが示唆されていたが(藤村ら,2015),四国地方の早明浦ダム流域と東北地方の白川ダム流域と寒河江ダム流域,北海道地方の大雪ダム流域と岩尾内ダム流域の合計5ダム流域に対して長期水循環解析を行った.その結果,N-Auの逆数の関係性を追認することができた.さらに,貯留関数式の最適パラメータを使用し,GCM出力値(MIROC5,RCP8.5排出シナリオ)を用いて,将来期間(2080-2099年)の水循環解析を行い,月単位の流出変化および年水収支量の変化を表した.早明浦ダム流域では,5月から8月にかけて降水量の増加に伴い直接流出量が増加し,東北地方の流域では融雪期の流出が極端に減少し,北海道地方の流域では融雪期の流出の早期化と減少を,定量的に示すことができた.利水と治水の要衝となる山地流域を対象として、多くの流出解析モデルの基礎式に使用されている貯留関数式について、パラメータ特性を明確にすることにより、信頼性ある水循環モデルの構築を進めた。気候と地質条件の異なる複数の山地流域において解析を行い、1)低水流出に適用する貯留関数式の2つのパラメータは逆数の関係にあること、2)洪水流出に適用する貯留関数式の2つのパラメータは指数関数式で表現できること、を明らかにした。そして、実務で利用しやすいパラメータ値についても検討した。さらに、GCM出力値を用いた水循環解析を行い,2080年から2099年の将来流出を月単位および年水収支量として流域単位で表した。当該研究においてまだ全ての資料収集を終えていない早明浦ダム流域と鏡川流域については,Webサイト等での公開資料にはなっていない資料が含まれるため,現地調査を兼ねて河川管理の事業所に赴き,水文資料の提供をお願いする.一方,北海道地方の2流域については,水文資料の検証と水循環解析のプログラムの修正,動作確認が未着手であり,これを進める.東北地方の2流域については,水循環解析を進められる段階にあるので,流出解析を行い,低水流出と洪水流出に適用する貯留関数式のパラメータ特性を明確にさせる.また,気候モデルの出力値を反映させた将来流出の予測は,本年度から進めて行く予定である.これまでに,早明浦ダム流域において気候モデルの出力値を反映させた将来流出予測を予備的に実行し,結果を得ているので,平成29年度は,本格的に6流域全体の全球気候モデル値を出力し,将来流出予測を進めていく.解析を終えて整理された研究内容を順次,学会等で公表し,研究全体の成果をまとめていく予定である.水文学、河川工学四国地方の流域の現地調査を兼ねた水文資料の収集が,現地訪問のための日程調整が行えず,一部達成されていないこと,また,GISソフトのグレードアップ版購入に関して,保守契約の確認と見直しにより費用削減を考えて当該年度の購入は見送ったため,次年度使用額が生じた.平成27年度にGISソフトのグレードアップ版購入を保守契約の関係から費用削減を考え当該年度(平成28年度)の使用額が生じ,その繰り越しが影響して次年度(平成29年度)使用額が生じた.
抗NOR-90(hUBF)抗体が認識する自己抗原エピトープとその臨床的意義に関する研究

ヒト胎盤およびヒト甲状腺癌由来のλgtll cDNAライブラリーより、抗NOR-90抗体陽性を確認したTT例の血清を用いてスクリーニングを行い、hUBFをコードする単一のクローンを得た。インサートcDNAは1.8および2.8kbの大きさを持ち、それぞれNOR1.8、NOR2.8と名付けた。NOR1.8発現産物を用いた免疫ブロット法で、教室の抗核小体抗体陽性91例をスクリーニングしたところ、9例(9.9%)が抗NOR-90抗体陽性であった。初診時高齢者が多く、一次性または二次性シェ-グレン症候群(SjS)が7例(78%)、肺線維症が5例(56%)、慢性関節リウマチ(RA)が4例(44%)と、従来から関連が報告されていた強皮症(3例、33%)より高頻度であった。全長cDNAであるNOR2.8を制限酵素で切断後、蛋白発現ベクターにサブクローニングし、抗NOR-90抗体陽性血清を用いたコロニーブロット法によりスクリーニングした。その結果異なる5つのcDNA断片が得られ、それらの発現産物と抗NOR-90抗体陽性血清9例との反応性を検討した。反応様式は多様で、hUBF上に少なくとも5つのエピトープが存在することが判明した。特にDNA結合部位とされるアミノ酸89221のA領域と、別の転写因子であるhSL1の結合部位であるアミノ酸388453のD領域に主要エピトープが含まれると考えられた。また全例がhUBF分子上に少なくとも2つのエピトープを有した。以上の結果は抗NOR-90抗体産生に関し、antigen drivenの仮説を支持するものである。さらにSjSまたはRA患者では、強皮症患者に認められなかったマイナ-エピトープ(B、C、E領域)との反応性が認められ、疾患によって反応性が異なる可能性が示唆された。
レーザー爆縮における流体不安定性の非線形発展-渦の生成・消滅を伴うダイナミックス

レーザー核融合における燃料の高密度圧縮に関連して、圧縮過程で生じる様々な流体不安定性の非線形発展を渦のダイナミックスの観点から明らかにしてきた。特に本研究では凹凸のある物質界面を衝撃波が通過することによって生じる不安定性を中心にして、渦度の生成・消滅を伴う界面での非一様渦のダイナミックスを記述する非線形理論モデルの構築、分子動力学シミュレーションなどを行い、爆縮に伴う非線形成長の加速の存在などを明らかにした。リヒトマイヤー・メシュコフ不安定性で生じる界面の不安定性について、渦生成の観点からその非線形発展を明らかにした。また、レーザー生成プラズマについては、レーザーアブレーションに伴う加速系の密度、温度などの空間プロファイルについて、その非線形発展を記述する一般的な自己相似解を導出した。さらに、有限質量のプラズマの膨張についても、自己無撞着な電場を含む自己相似解を求めた。リヒトマイヤー・メシュコフ不安定性については、特に、円筒座標系での非線形ダイナミックスを記述する非線形発展式を導出し、その数値計算により、円筒座標系の渦シートのダイナミックスが、2つの特徴的な長さ、すなわち半径と波長によって決まること、したがってモード数によって異なった時間発展をすることを明らかにした。また、円筒座標系での渦シートにおける渦度の集中によるコアダイナミックスの運動を明らかにした。リヒトマイヤー・メシュコフ不安定性の粘性の影響についても非線形成長率のレイノルズ依存性を数値計算により求めた。さらに、磁場中のリヒトマイヤー・メシュコフ不安定性の可能性についても、磁場に垂直に伝播する衝撃波に起因する場合については、磁場の再結合を伴い非線形成長をすることを1流体MHDシミュレーションにより調べている。レーザーアブレーションの構造については、定常解で問題となった特異点が、熱伝導を含む自己相似解を求めることにより解決できることを明らかにした。その結果レーザーアブレーションの構造を一意的に求めることができた。また、レーザーで加熱したプラズマの膨張についても、膨張フロントでの非中性を矛盾無く記述できる自己相似解を求め、イオン加速エネルギーが初期半径とデバイ長の比で一意的に決まることを示した。本研究の目的は、レーザー核融合における燃料の高密度圧縮に関連して、圧縮過程で生じる様々な流体不安定性についてその非線形発展過程を渦のダイナミックスの観点から明らかにすることである。本年度は、分子動力学シミュレーションコードの開発とレーザーアブレーションの解明、リヒトマイヤー・メシュコフ不安定性(RMI)の非線形発展における表面張力の効果、磁場中のRMIの成長について研究を行った。具体的な成果は、以下の通りである。1.分子動力学シミュレーションコードを開発し、通常の流体シミュレーションでは困難な、超短パルスレーザー照射に伴うレーザーアブレーションのダイナミックス、特にレーザーアブレーションによる物質中の強い衝撃波や渦度の成長などに起因するクラスターの生成、固相-液相、および液相と気相との混合相への相転移、さらに負圧力生成に伴いクラックの生成などを明らかにした。2.分子動力学シミュレーションを用いて、円筒座標系でのリヒトマイヤー・メシュコフ不安定性について、3重層からなる系について反射衝撃波に伴い非常に乱れた状態ができることを見出した。3.理論モデルについては、表面張力の導入を行った。表面張力の導入は、これまで多くの試みがなされているが成功した例がない。RMIの非線形発展による局所的な渦度の集中と表面張力によりドロプレットが形成されることを明らかにした。4.通常プラズマは磁場を横切れないため、磁場中では渦度の成長が困難でありRMIは生じないと言われているが、有限の抵抗を導入し磁場の再結合を伴うRMIの成長を示した。本研究の目的は、レーザー生成プラズマのダイナミックスを流体不安定性の観点から明らかにすることである。本年度は、分子動力学シミュレーションを用いたレーザーアブレーションの解明、レーザープラズマの膨張過程と粒子加速などについて研究を行った。具体的な成果は、以下の通り。1.開発した分子動力学シミュレーションコードの粒子間ポテンシャルに改良・高精度化を行い、クリティカル圧力などについて実験との比較によるベンチマークテストを行いコードの精度を検証し、通常の流体シミュレーションでは困難な、超短パルスレーザー照射に伴うレーザーアブレーションの閾値、レーザーアブレーションによる渦度の成長などに起因するクラスターの生成、相転移、さらに負圧力生成に伴うターゲット表裏でのクラックの生成などを明らかにした。2.レーザー生成プラズマを用いた極端紫外光源(EUV)に関連して、レーザーアブレーション領域の流体ダイナミックスを放射流体シミュレーション、ならびに理論的に調べ、照射レーザーからEUV光への変換効率の最適化を行うための条件などを明らかにした。3.高強度レーザーとクラスターとの相互作用についてプラズマ粒子シミュレーションを行い、高エネルギーイオン生成機構を解明した。また、有限質量クラスターの膨張についての理論モデルを構築し、高エネルギーイオンのエネルギースペクトル、最大エネルギーなどのパラメータ依存性を明らかにし、シミュレーションによる検証を行った。4.高強度レーザーとクラスター群との相互作用について、その結果生じるクラスター群の光学的特性について、特に高調波、低周波の生成機構などの検討を行った。
シスタチンスーパーファミリーとは異なる新奇インヒビター群の構造機能相関

申請者はシステインプロテアーゼ阻害活性をイチジクの果実組織(アメリカカリフォルニア産)にパパイン阻害活性を見いだした。前年度ではゲル濾過そしてイオン交換カラムにかけ単離精製した。本年度ではこの活性画分を高速液体クロマトグラフにかけ最終精製した後、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法飛行時間型質量分析器にかけた結果、分子量約1,100であることを明らかにした。さらに種々の実験(ポリアクリルアミドゲル電気泳動、核磁気共鳴、Lowry法など)により、このインヒビターは非蛋白性のものであることがわかった。またシステインプロテアーゼパパインを阻害し、セリンプロテアーゼキモトリプシンは阻害するが同じクラスのトリプシンには作用しないという非常に興味深い特性を示した。将来的には、この非蛋白質性インヒビターのさらに詳しいキャラクタリゼーションを行い、その詳細な高次構造も明らかにしていく予定である。天然有機化合物として動植物の死骸や排泄物などの腐敗によってできるフミン酸は、土壌の有機物の主成分で地球上もっとも多量に存在する有機物である(土が黒いのはこのためである)。当然これが地球環境に与える影響は非常に大きいと思われる。しかしながらフミン酸の構造はおろかその特性さえもよくわかっていない。興味深いことに、フミン酸の赤外吸収スペクトルとこのインヒビターのそれとが非常によく似たパターンを示した。よってこのインヒビターの構造解析はフミン酸の構造解析に一役買う可能性が大いにあるし、また非蛋白質性のインヒビターでこれ程大きい分子量でしかも特異性のあるものは余り報告されていない中、この構造解析は大きな意味を持っている。申請者はパイナップルAnanas comosasの茎由来ブロメラインインヒビターが二本鎖構造というユニークなトポロジーをとるため、BIの遺伝子構造を明らかにするためにパイナップルのゲノムライブラリーを作成し、目的とする遺伝子のクローニングを行う研究も共同研究者と進めている。現在コロニーハイブリダイゼーションによって幾つかのポジティブクローンがとれ、その中からBI構造遺伝子の3'末端を補足し決定できた。申請者はこれと平行してシステインプロテアーゼ阻害活性をスクリーニングしたが、パパイヤCarica papayaそしてイチジクFicuscarica乳液にはそのような活性は存在しなかった。しかしイチジクの果実組織(アメリカカリフォルニア産)にパパイン阻害活性を見いだした。本研究ではそれをホモジナイズして20,000rpmで超遠心にかけた。上澄みを凍結乾燥した後、十分に透析にかけゲル濾過Sephadex G-50(2.5cm×95cm)にかけた。これを何度か繰り返し、阻害活性をその他より分離した。これをイオン交換DEAEーSephadexカラムにかけ、pH勾配をかけシステインプロテアーゼ阻害活性を単離精製した。このサンプルはSDS-PAGEでは染色されなかったがゲル濾過より分子量20kDa位と推察される。またシステインプロテアーゼパパインは阻害するが、セリンプロテアーゼトリプシンは阻害しない。しかし同じキモトリプシンは阻害するという非常に興味深い特性を示した。
新規睡眠制御遺伝子Ｓｌｅｅｐｙの機能解析による睡眠覚醒制御の分子・神経基盤の解明

「眠気」の脳内での物理的実体や、日々の睡眠量を一定に保つ根本原理は未知である。当研究室ではフォワード・ジェネティクス研究により、睡眠過多を呈するSleepy変異マウス家系とその原因遺伝子Sik3を見出した。SIK3はリン酸化酵素で、中央部にプロテインキナーゼA(PKA)認識部位があり、551番目のセリン(S551)により規定される。Sleepy変異家系は、S551を含む13番目のエクソンを欠損していた。そこで申請者は、進化的に保存されたPKA認識部位S551と睡眠覚醒制御の関係性を検証すべく、CRISPR法によりS551に点変異を導入し、S551A家系、S551D家系を作製、脳波・筋電図解析を行なった。その結果、両家系ともに同腹の野生型マウスに比べ、24時間を通じて顕著な覚醒時間の減少、ノンレム睡眠時間の増加がみられた。脳波スペクトラム解析の結果、睡眠要求量を評価する指標であるノンレム睡眠時の徐波(デルタ波)量が顕著に増加していた。分子レベルでは、培養細胞を用いた生化学解析の結果、SIK3 S551の変異・欠損により、リン酸化型PKAからの認識が減少し、蛋白質の局在や相互作用を司る14-3-3との結合が失われていた。この結果はPKA/SIK3/14-3-3を介した適切なシグナル伝達が正常な睡眠覚醒制御に不可欠であることを示唆する。本研究は、細胞内シグナル伝達系と個体レベルのダイナミックな睡眠覚醒行動を繋ぐ成果であり、単一遺伝子Sik3の単一アミノ酸S551が1日の睡眠量や睡眠要求量・眠気を規定する上で重要な役割を担うことを示した。また、当初の計画より更に発展した研究として、申請者は順遺伝学により同定した新規睡眠異常マウス家系に対し独自に網羅的行動テストバッテリーを構築・実施し新規表現型を明らかにした。今後は分子遺伝学や電気生理学等を組み合わせ、分子神経基盤の解明を進める。平成29年度が最終年度であるため、記入しない。申請者の所属する研究室では、候補遺伝子からではなく、睡眠異常という表現型をもとに原因遺伝子を探るフォワード・ジェネティクスの手法によって、睡眠制御機構の中心を担う新たな遺伝子の同定に挑んできた。これまでに、極端な睡眠時間延長を呈するSleepy変異家系や、顕著なREM睡眠の短縮・断片化を呈するDreamless変異家系などが発見された。睡眠異常の原因となる遺伝子変異はSleepy遺伝子に存在する(投稿中)が、Sleepy蛋白の睡眠覚醒を含めた脳神経機能制御における役割は報告がなく、Sleepy蛋白の研究を通じて睡眠覚醒制御を含む高次機能の理解が広がると考えられる。これらの経緯から、申請者は、Sleepy遺伝子の機能解析を通じた睡眠覚醒を制御する細胞内シグナル伝達系・神経回路の同定を進めている。変異型Sleepyはスプライス部位の点突然変異によって、種を超えて保存されたリン酸化部位を含むエクソンがスキップしたものであることが明らかとなった。従って、Sleepy変異家系マウスでは、リン酸化部位の欠損より、極端な睡眠時間延長という表現型に至ると予想される。上記仮説を検証するために、本年度、目的のリン酸化部位に点突然変異を導入し、1)恒常的に非リン酸化された状態、2)恒常的にリン酸化された状態、を模倣した状態を生体内で再現した遺伝子改変マウスをCRISPR法により作製することに成功した。加えて、上記の遺伝子改変マウスの脳波・筋電図(EEG・EMG)測定による睡眠覚醒の表現型を解析し、顕著な睡眠異常の表現型が得られている。順遺伝学により樹立されたマウス家系は、睡眠覚醒疾患モデルマウスとして、睡眠と精神疾患、学習・記憶、認知脳機能等との関連性についても検討できる。本年度、Sleepy・Dreamless変異家系に対し、網羅的行動テストバッテリーを実施し、新規の行動表現型を明らかにした。初年度の計画通りに、目的の2種類の遺伝子改変マウスをCRISPR法により作製完了した。また、それらの遺伝子改変マウスの脳波・筋電図(EEG・EMG)解析を進め、顕著な睡眠覚醒異常の表現型を明らかにした。合わせて、それらの結果をサポートするmRNA・タンパク質レベルでの検証実験を遂行した。また、当初2年目以降に予定していた、網羅的行動テストバッテリーは、初年度の段階で、独自に立ち上げ、最適化を進め、新規の行動表現型を得ている。これらの表現型の記述は、睡眠と精神疾患や認知脳機能等との関連性を理解する上で重要である。また、同定した新規睡眠制御遺伝子の生体内における未知の機能を探る上でも、今後の分子・神経回路基盤の解明が期待される。本年度、申請者の所属する研究室の成果として、フォワード・ジェネティクスの手法により、覚醒時間が大幅に減少するSleepy変異家系と、レム睡眠が著しく減少するDreamless変異家系を樹立し、それぞれの責任遺伝子(Sik3およびNalcn)を同定することに成功した(Funato H, Honda T, Yanagisawa M et al., Nature 2016)。申請者は共著者として、ランダム突然変異を導入したマウスの一連の睡眠覚醒表現型スクリーニング・解析に携わった。SIK3蛋白はリン酸化酵素であることから、申請者は睡眠覚醒を制御する細胞内シグナル伝達系の同定を進めている。Sleepy変異家系ではSik3遺伝子のスプライス部位の点突然変異によって、リン酸化部位を含むエクソンがスキップしており、リン酸化部位の欠損により、極端な睡眠時間延長という表現型に至ると予想される。

上記仮説を検証するために、リン酸化部位に点突然変異を導入し、1)恒常的に非リン酸化された状態、2)恒常的にリン酸化された状態、を模倣した状態を生体内で再現した遺伝子改変マウスをCRISPR法により作製し、脳波・筋電図(EEG・EMG)測定による睡眠覚醒の表現型を解析、顕著な睡眠異常の表現型を得ている(投稿準備中)。それらの表現型の分子機構を解明すべく、上記2種の遺伝子変異に加え、FLAG/HAタグを導入したマウス個体・培養細胞での免疫沈降法、ウェスタンブロッティング等の生化学的解析により、リン酸化部位への変異導入により、SIK3蛋白との結合パターンの変化する2種類の分子を同定した。合わせて、Sleepy・Dreamless変異家系に対し、網羅的行動テストバッテリーを実施、新規の行動表現型を明らかにし、薬理学・電気生理学実験などを組み合わせて、行動表現型の分子・神経回路基盤の解明を進めている。本年度、当研究室の成果として、フォワード・ジェネティクスにより、これまで全く知られていなかった、睡眠・覚醒を制御するふたつの遺伝子変異(Sleepy、Dreamless)を見出し、責任遺伝子(Sik3およびNalcn)を同定した論文を報告した(Hiromasa Funato, Takato Honda, Masashi Yanagisawa et al., Nature 2016)。申請者は共著者として、一連の睡眠覚醒表現型スクリーニング・解析に貢献した。申請者は計画通りに、目的の2種類の遺伝子改変マウスをCRISPR法により作製完了し、脳波・筋電図(EEG・EMG)解析を進め、顕著な睡眠覚醒異常の表現型を明らかにした。それらの表現型の分子機構を解明すべく、上記2種の遺伝子変異に加え、FLAG/HAタグを導入したマウス個体・培養細胞での生化学的実験により、リン酸化部位への変異がSIK3を中心としたシグナル伝達系にいかに影響を及ぼすかを検証した。その結果、リン酸化部位への変異導入により、SIK3蛋白との結合パターンの変化する2種類の分子を同定した(投稿準備中)。合わせて、Sleepy・Dreamless変異家系に対し、網羅的行動テストバッテリーを実施し、新規の行動表現型を明らかにした。部位・細胞種特異的検証・薬理学・電気生理学実験などを組み合わせて、得られた行動表現型の分子・神経回路メカニズムを記述し得るデータを得ている。その一環で米国マサチューセッツ工科大学(MIT)のin vivo電気生理学を専門とする研究室に留学し、そこで習得した技術を解析手法として組み込むことで、当初の計画よりプロジェクトが発展した。これら新規睡眠覚醒異常マウス家系の行動表現型ならびに分子・神経回路基盤の記述は、睡眠と精神疾患や認知脳機能等との関連性を理解する上で重要である。「眠気」の脳内での物理的実体や、日々の睡眠量を一定に保つ根本原理は未知である。当研究室ではフォワード・ジェネティクス研究により、睡眠過多を呈するSleepy変異マウス家系とその原因遺伝子Sik3を見出した。SIK3はリン酸化酵素で、中央部にプロテインキナーゼA(PKA)認識部位があり、551番目のセリン(S551)により規定される。