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中世後期成立の百科全書的テキストに関する基礎的研究

本研究では、室町時代後期から安土桃山時代にかけての、いわゆる乱世における政治や文化を支えた知の問題を、その時代に制作された百科全書的テキスト群の生成と享受という視点から解明するべく、いくつかの作品を取り上げて、基礎的調査を行った。具体的な成果としては、以下の4点が挙げられる。(1)江戸初期成立の、狩野一渓編の画学全書『後素集』が、中国の百科全書『事文類聚』を和訳した、伝一条兼良編の漢故事説話集『語園』を利用している可能性が高いことを明らかにした。(2)戦国期成立の百科全書的編纂物『月庵酔醒記』が、政道に必要な教訓や知識と諸芸に関する雑学的な知識とを同一の地平線上にあるものと捉え、戦国武将に必要な知識の集積として編まれた可能性が高いことを明らかにした。(3)『〓嚢鈔』の編者行誉の著述活動(自伝・『八幡愚童訓』の書写)に注目し、中世を代表する百科事典が生まれた背景を明らかにすべく調査を進めた。(4)同時代に成立したと思われる、百科全書的特徴を持つ『源平盛衰記』が、いかなる論理のもとに、既成の平家物語を再編していったのかという問題を、いくつかの場面を分析しながら明らかにしてきた。21年度は、3年間の土台作りの作業を行うため、百科全書的テキストの定義づけと研究対象作品の選定、『〓嚢鈔』のデータベース化の作業を中心に行う予定であったが、計画通りには進まず、百科事典的テキストの収集とそれらの読み込み作業が中心となった。ただし、対象作品である『後素集』に関する査読論文が公刊されたことに加え、当初の計画にはなかった新たなアプローチの仕方が見いだせたという点で、当該年度は十分な成果が出せたと考えている。まず、純粋な百科事典的テキストとは言いがたいが、当初から研究対象候補の一つと考えていた作品で、他の百科事典的テキストと同一の基盤から生まれたと考えられる軍記物語『源平盛衰記』に着目して研究を進め、その成果の一部を発表した。『源平盛衰記』の記述態度や情報提供の仕方はまさに百科事典的テキストに通じるものがあるため、今後はそのような編集方法の問題も、本研究課題の中で明らかにしていきたいと考えている。また、本研究課題の中心となるテキスト、『〓嚢鈔』の編者に関わる研究として、行誉書写本『八幡愚童訓』の翻刻を発表した。さらに、『〓嚢鈔』編者の自伝、醍醐寺所蔵『僧某(行誉)年譜』の研究に深く関わる研究として、中世における「僧の自伝の系譜」の研究発表を行った。これは行誉を含む、同時代に生きた宗派の異なる僧の自伝の特徴とその研究意義について考察したものであるが、中世後期の寺院社会における僧の知的営為を考える上では必要不可欠な問題であると考えている。以上のように、『源平盛衰記』の問題と中世後期の僧の自伝の問題を本研究の中で明らかにすることは、当初の計画とは若干アプローチの仕方とは異なるが、中世後期における百科事典的テキストの成立環境を明らかにするという意味では、当初の計画に劣らない有効な方法であるという実感を得た。ゆえに、計画に加えて今後も継続したいと考えている。当該年度は、『〓嚢鈔』のデータベース化作業、中国の類書との比較、引用故事の抽出作業、関係する学会・研究会への参加を中心に行う予定であったが、計画通りに進んだとはいいがたい。だが、全体的には実りある1年だったといえる。まず、対象作品の一つである『後素集』と中国の類書『事文類聚』との比較を行っている過程で、それらに共通する漢故事のいくつかが、『事文類聚』を抜き書きして翻訳した本邦撰述の漢故事説話集『語園』(伝一条兼良撰)をもとにしたものである可能性が高いことを発見した。本研究の成果の一部は、22年9月に学習院女子大学で開催された伝承文学研究会大会にて報告した。

また、同じく対象作品の一つである『月庵酔醒記』について、それが引用する『金句集』がいかなる系統のテキストであったのかという調査や、同じく『月庵酔醒記』が引用する『後鳥羽院番鍛冶次第』が『銘尽』のような刀剣伝書の類の中でどのような系統のものに近いのかということを調査し、考察した。この調査の過程で『文明本節用集』などの室町後期の節用集が、金句集や刀剣伝書を取り込んでいくという点で、『月庵酔醒記』に近い特徴を持っていることを確認した。今後はこういった、当時は秘伝とされてきたような資料や情報が、中世後期の百科全書的テキストの内部に取り込まれていく背景や、それらを取り込んだ百科全書的テキストそのものの成立事情などを明らかにできればと考えているが、本科研の期間中に答えを出すことは難しいかもしれない。引き続き調査を継続したい。なお、この成果の一部については、23年2月に南山大学で行われた月庵酔醒記研究会にて報告した。その他、本研究課題の中心となるテキスト、『〓嚢鈔』の編者に関わる研究として、行誉書写本『八幡愚童訓』の翻刻作業とその考察を行った。その中で、甲類系『八幡愚童訓』の諸本の構成比較をし、行誉書写本の特徴を明らかにした。この研究成果の一部については、23年3月に大谷大学で行われた唱導研究会にて報告した。当該年度は、『〓嚢紗』のデータベース化の作業、諸資料による「雑談」の実態調査、研究成果の発表を中心に行う予定であったが、昨年度同様、計画通りに進んだとはいいがたい。とくに『〓嚢紗』のデータベース化の作業は予定通りには進まなかった。また、諸資料による「雑談」の実態調査についても、まだ作業途中のまま、期間が終わってしまった。もちろん『〓嚢妙』のデータベース化作業は今後も公刊を目標に進めていく方針であり、「雑談」の実態調査も作業として継続するつもりである。幸いにして、24年度「中世百科全書的テキストの成立基盤に関する総合的研究」(基盤研究(C))が採択された。これは本研究を発展的に広げるものであるため、本研究で達成できなかった基礎作業を継続しながら、百科全書的テキストの実態および中世における知の享受のありようを明ちかにしていきたい。なお、今年度の成果としては、昨年度の研究成果を2本、論文の形にまとめて公表することができた(2011年8月、2012年2月)。また、8月には、私が百科全書的編纂物に準ずる作品と考えている『源平盛衰記』をテーマにした成果の発表を海外の学会で行うことができた。(13th International Conference of the European Association for Japanese Studies)つまり、本研究の申請時からの目標を達成できたことになる。さらに、本研究課題の中心となるテキスト、『〓嚢砂』の編者に関わる研究として、『八幡愚童訓』甲本の未紹介資料である対馬本の翻刻を年度内に公刊(2012年3月)し、和訳本『帝鑑図説』の基礎的研究とその成果の一部を表す翻刻作業(2012年夏頃公刊予定)も進めることができた。まだ調査中の段階ではあるが、中世後期成立百科辞書的編纂物に関わりの深い、刀剣伝書の調査も進めることができた。今後は、それらの成果をもとに、中世後期を中心とした乱世における政治や文化を支えた知の問題を、百科辞典的なテキスト群の生成と享受という視点から解明していきたい。
憲法と国際人権法の相互関係における「共生」性の萌芽

本研究は、憲法と国際人権法の「共生」関係を描出するために、両者が相互に影響を及ぼし合いながら継続的に発展する「過程」を究明する。そのために、(1)ヨーロッパ人権条約(以下、ECHR)を国内法化するために制定された1998年イギリス人権法(以下、人権法)が2000年10月に発効するまでの準備過程および(2)発効後の実施過程が主たる検討対象である。平成13年度は、前年度の研究によって調査したECHR国内法化実施準備措置を、発効後の状況の検証によって実効性を評価することを主眼とした。具体的には、行政機関及び司法機関における実効措置の実効性および立法機関への影響である。第一に、行政機関では、各省庁における実施準備には各省庁の性格や業務内容によって力の入れ具合には強弱があるものの、とりわけ人権法が重要な影響を及ぼすことが想定された部門、とくに移民、警察、検察、教育関係においては、実効的な取組があったと評価できる。それは、個別具体的な想定事例集の作成や省内での教育・訓練や啓発セミナーの開催に表れている。第二、司法機関では、人権法に関する事件件数は、比較的穏当な数字で推移(微増)しており、実施前2年にわたる裁判官に対する教育・訓練は一定の成果を収めたと評価できる。しかし、現代社会の変化と多様性を反映した新しい事件は、人権法およびECRHとの関連性のもとに提起されており、今後も人権法を介してECHRが重要な影響を及ぼし続けることは必須である。EHCR側の発展を考慮に入れると興味深い点であり、ECHRおよび人権法の影響は、今後、長期的視点から検証を続けていく予定てある。他方、立法機関に関しては、議会合同人権委員会の今後の動向を検討する必要がある。憲法と国際人権法の「共生」関係という観点からは、イギリス政府がECHR国内法化のために実務レベルで念入りな実施準備を実現した点に注目すべきであり、こうした国内的・具体的な対応こそが、「共生」関係の実現に重要な役割を果す。よって、日本においても参考にすべき点である。そのために、(1)ヨーロッパ人権条約を国内法化するために制定された1998年イギリス人権法が2000年10月に発効するまでの準備過程および(2)発効後の実施過程が主たる検討対象である。平成12年度は、イギリス政府が人権法実施のために行った全措置を網羅的に調査研究することに主眼をおいた。具体的には、まず人権法の内容および実施に関する文献・資料を渉猟し問題点を明らかにし、質問表を作成した。次に、2000年10月29日11月7日にかけて渡英し、主要政府機関、NGO、学者、弁護士に対してヒアリング調査を行った(アポイントメントの設定についてはBritish Councilの援助を受けた)。その結果、(1)人権法実施においては、内務省のイニシアティヴのもとに、二年という時間をかけて、各政府機関において相当入念な実施準備が行われたこと、(2)あらゆる政府機関および裁判官に対して組織的な人権教育が行われたこと、(3)実施準備過程(特に人権教育)において人権NGOが重要な役割を果たしたこと、(4)ヨーロッパ人権条約判例法に関して法律家の間で熱心な取組が観察されること、(5)2000年末段階では実施は比較的成功と評価できることが明らかになった。次年度(平成13年度)は、以上の研究成果を基礎として、発効一年後の人権法の総合的評価を行い、憲法と国際人権法の「共生」関係について、その内容を明らかにしながらイギリスを素材としたモデルを構築する予定である。

憲法と国際人権法の「共生」関係という観点からは、イギリス政府がECHR国内法化のために実務レベルで念入りな実施準備を実現した点に注目すべきであり、こうした国内的・具体的な対応こそが、「共生」関係の実現に重要な役割を果す。よって、日本においても参考にすべき点である。
歯根吸収誘導因子の研究

歯根吸収を誘導する因子を得るために,機械的刺激を与えた歯根膜線維芽細胞においてmRNA量の増加する遺伝子をサブトラクティプハイブリダイゼーション法でスクリーニングした。そして,候補遺伝子を多数クローニングすることに成功し,これらの特徴について以下の結果を得た。1.候補遺伝子の歯根膜線維芽細胞におけるmRNA発現をリバースノーザン法で調べたところ,機械的刺激によってRNA量が顕著に増加する遺伝子断片1-15を得た。2.上記遺伝子断片をプローブしてヒトcDNAライブラリをスクリーニングしたところ,2.3kbのクロンを得ることに成功した.この遺伝子の塩基配列を決定したところ,これはMRGX cDNAであることが判明した。MRGXは最近報告されたタイプの転写因子であった。4.MRGXのantisense RNAを歯根膜線維芽細胞に強制発現させた場合には,TGF-βのmRNA発現量は増加した。このことは,MRGXが直接的にかあるいは間接的に制御する可能性を示すものである。また,機械的刺激を加えない条件下でも,歯根膜線維芽細胞はMRGXを発現していることがノーザンハイブリダイゼーション法で確認できた。従って,歯根膜線維芽細胞は械的刺激を受けると,MRGXを介してTGF-βのmRNA発現が調節されることが考えられた。TGF-βは破骨細胞を活性化する作用がある。外傷力を受けた歯の歯根膜細胞は,MRGXの制御が外れるとTGF-βを旺盛に産生する可能性がある。破歯細胞は破骨細胞に似るとされており,MRGXは歯根吸収に関わる候補因子として位置付けることができる。歯根吸収を誘導する因子を得るために,械的刺激を受けた歯根膜線維芽細胞においてmRNA量の増加する遺伝子をスクリーニングし,以下の成果を得た。1.培養ヒト歯根膜線維芽細胞は,フレクサーセルを用いて機械的刺激を与え,この細胞に発現する特徴的なcDNAをサブトラクティブハイブリダイゼーション法によって得た。mRNA量の増加する遺伝子は,そのcDNAをPCRによって増幅し,電気泳動を行うことでバンドとして検出した。これらはベクターにクローン化し,歯根膜線維芽細胞が機械的刺激によって発現する特徴的遺伝子の候補とした。2.上記候補遺伝子は,歯根膜線維芽細胞において械的刺激によってその転写量を変化するのかを,リバースノーザン法で調べた。10種の候補遺伝子のなかで8種の遺伝子が,械的刺激によって転写量が増加することが判明した。そのなかで,最も転写量の多い遺伝子1-15については,ノーザンハイブリダイゼーションを行い,械的刺激によって転写量が増加することを確認した。3.DNA断片1-15をプローブとして,ライブラリのスクリーニングを行い,新しいグループの転写因子に属する遺伝子を2種類同定した。4.上記の遺伝子産物の機能については,細胞の老化との関連が示唆されてはいるが,いかなる因子の転写を司るのかについては不明である。従って,本研究で同定した2種の転写因子については,歯根膜線維芽細胞においてどのような因子の転写を司るのか,さらには歯根吸収に関わるのかを解析しているところである。歯根吸収を誘導する因子を得るために,機械的刺激を与えた歯根膜線維芽細胞においてmRNA量の増加する遺伝子をサブトラクティブハイブリダイゼーション法でスクリーニングした。2.上記遺伝子断片をプローブしてヒトcDNAライブラリをスクリーニングしたところ,2.3kbのクロンを得ることに成功した。

この遺伝子の塩基配列を決定したところ,これはMRGX cDNAであることが判明した。MRGXは最近報告されたタイプの転写因子であった。4.MRGXのantisense RNAを歯根膜線維芽細胞に強制発現させた場合には,TGF-βのmRNA発現量は増加した。このことは,MRGXが直接的にかあるいは間接的に制御する可能性を示すものである。また,機械的刺激を加えない条件下でも,歯根膜線維芽細胞はMRGXを発現していることがノーザンハイブリダイゼーション法で確認できた。従って,歯根膜線維芽細胞は械的刺激を受けると,MRGXを介してTGF-βのmRNA発現が調節されることが考えられた。TGF-βは破骨細胞を活性化する作用がある。外傷力を受けた歯の歯根膜細胞は,MRGXの制御が外れるとTGF-βを旺盛に産生する可能性がある。破歯細胞は破骨細胞に似るとされており,MRGXは歯根吸収に関わる候補因子として位置付けることができる。
英語話者と日本語話者による母音間子音群の音節区分

日本語話者と英語話者が、母音間に子音群を持つ2音節からなる英単語と無意味語を、どのように音節に分けるかを実験的に調べた。音節の認識訓練を受けた日本語話者も実験に参加した。oral taskでは、参加者は英語単語と無意味語をポーズを挿入することによって、2つの部分に分けてもらった。written taskでは、3つの文節の候補から、最も自然と思われるものを選んでもらった。結果、最も一般的な分節の型は、子音群を2つの音節に分けるものであった(例:mas/ter)。しかし参加者間で次のような違いが見られた。英語話者は、VCC/V(e.g., mast/er)を他の参加者グループより好み、音節認識訓練を受けた日本語話者は、VC/CV(e.g., mas/ter)をより好み、訓練を受けていない日本語話者は、V/CCV(e.g., ma/ster)をより好んだ。これらの結果を、音節区分に関する言語学的および心理言語学的理論や原則との関係で、考察した。平成14年度は、以下の事を行った。1)実験材料の選定:母音間に2つの子音を含む2音節からなる英単語105個を選定した。これらの単語は、4つの要因(子音群のlegality,強勢母音の位置、強勢母音の長さ、接尾辞を持つかどうか)をコントロールして選定された。2)実験材料の作成とプログラム:上記英語単語を、アメリカ英語話者に発音してもらい、DATに録音した。さらに、コンピュータに入力し、音声提示できるようプログラムした。また、グループによるwritten task用に、オーディオカセットにも入力した。3)writtentaskによる実験の実施:英文学科1回生の学生38名に対し、written taskによる実験を行った。学生は、ヘッドフォンから流れる英単語を聞いた後、用紙に印刷されている3つの音節区分の候補(例:do/ctor, doc/tor, doct/or)からもっとも自然だと思われるものを選んだ。4)結果の考察:次のような、4つの要因の影響が見られた。子音群のlegalityに沿うような形での分節が見られ、強勢母音のある音節に子音が引かれる傾向が見られ、強勢母音が長ければ子音群は第2音節に位置付けられる傾向があり、接尾辞を持つ語は接尾辞の前で分節される傾向が見られた。平成15年度は、oral taskを課し、上記written taskとの結果と比較し、より精微な音節区分の実態を把握し、関連する理論の考察を行う予定である。本研究の目的は、英語話者と日本語話者が母音間に2つの子音を含む音節からなる英単語と無意味語をどのように2つに分けるかを、written taskとoral taskを通して調べることである。平成15年度は、以下の事を行った。1)writtentaskによる実験の成果を口頭発表した。(2004年度日本音声学会全国大会、2004年9月、於:関西大学)2)上記の成果を論文にまとめた。(Essays and Studies,49,京都女子大学英文学会編)3)実験材料としての無意味語の作成:母音間に2つの子音を含む2音節からなる無意味語を84個作成し、DATに録音、PCに保存した。4)日本語話者を対象にしたoral taskによる実験の実施:京都女子大学英文学科の学生29人に対し、oral taskによる実験を行った。参加者は、ヘッドフォンから聞こえる英単語と無意味語を聞いた後、その後を間に約2秒のポーズを入れて、2つに分けた。5)得られたデータを分析中である。平成16年度は、米国でアメリカ英語話者を対象にした実験を実施し、日本語話者の結果と比較し、音節区分および音節構造における普遍性と言語個別性について考察し、成果を発表する予定である。平成17年3月現在、データの解析中である。しかしながら、次のような予想が可能である。1)英語話者・日本語話者とも、最も一般的な型はVC/CVの分節である。3)両言語話者とも形態的知識の影響が強く見られるが、英語話者の方がより強い影響を示した。4)両言語話者とも、ストレスの位置、ストレスのある母音の長さも影響を与える。

5)音節認識の訓練を受けた日本語話者は、CV/CCVV型の分節(ma/ster)が減り、CVC/CVC型(mas/ter)やCVCC/VC型(mast/er)が増え、より英語話者に近い分節を示すようになる。音節区分は、母音間子音のphonotactic legality、形態知識、ストレスの位置、ストレスのある母音の長さという、複数の要因の影響を受けることが示唆されよう。
ファイバスコープを用いた簡便な可視化流速計測システムの開発

本研究の目的は、流れの可視化手段のひとつであるトゥインクルレーザシート法にファイバスコープを組み合わせることにより、非透明壁内の三次元流れ場の任意の二次元断面内の流れの計測手法の構築および得られた生画像データの画像処理手法の構築を行ない、一般には可視化計測が困難とされている部位の可視化計測が簡便にできるような計測システムを開発することである。本年度の研究実施結果として、(1)ファイバスコープの視野特性の調査を行ない、ファイバスコープを通して見られる画像のゆがみの矯正を画像処理時に行なうことにより、計測精度の向上を計った。(2)ファイバスコープを用いて計測した直円管内の流速分布は、従来のトゥインクルレーザシート法を用いて得られた結果やピト-管などで計測した既存の実験結果と良好な一致を示した。このことより非透明壁でおおわれた内部の流れの可視化観測を行なうにあたって、本手法の高い有用性がうかがえた。(3)上記(1)(2)の結果をもとに、半径比1の曲がり管出口部の流れ、軸流ポンプの動翼と静翼間の流れについて、流路内にファイバスコープを挿入し下流側より観測を試みた結果、レーザシート光面とファイバスコープ面とに角度を付け観測面に奥行きをもたすことにより、複雑な三次元流れ場の任意の時間、空間における流速計測が可能であることが判った。
両生類の吸水行動制御機構ならびに浸透圧受容機構の解明

平成23年度は、無尾両生類の水分摂取行動である吸水行動を制御する脳領域について明らかにするため、水分摂取行動を促すホルモン(Ang IIとAVT)や体液変動によって神経活動が活性化する領域の探索を行った。神経活動のマーカーとして用いられている転写因子c-fos発現を指標に、ホルモン投与及び体液変動時にFosタンパクが増加する脳領域・神経核を免疫組織化学的に精査した。その結果、第3脳室前壁を構成する領域である前交連や間脳視索前野、視床下部背内側核で顕著なFos発現が見られ、これら領域がホルモン増加や体液変動時に活性化する領域であることが示唆された。これら脳室周囲領域は、哺乳類においてホルモン及び体液情報の受容部位及び飲水行動の制御中枢であることが知られており、これら領域が両生類における相同器官である可能性が示唆された。一方で、昨年度に同定したTRPVチャネルが浸透圧センサーとして機能する可能性について検証するため、Xenopus卵母細胞へTRPV遺伝子を導入してタンパクを発現させ、膜電位固定法による解析を行った。その結果、明確な浸透圧応答性を確認するまでには至らなかったが、解析した各サブタイプがそれぞれ異なる温度域に反応してイオン流入に付随した電位変化を生じさせること、すなわち温度センサーとして機能するイオンチャネルであることを明らかにした。以上の研究から、体液変動やホルモンにより活性化する領域を同定し、両生類の吸水行動の制御中枢である可能性を示した。これにより非哺乳類における水分摂取行動の制御機構の一端を明らかにしたため、脊椎動物に共通して存在する水分摂取行動の制御機構を解明する上での重要な知見となりうる。またTRPVは、非哺乳類では機能的解析が進んでおらず不明な点が数多く残されているため、本研究成果は脊椎動物のTRPVの生理学的意義を解明する足がかりとなると考えられる。本研究における目的の一つとして「両生類の水分摂取行動を制御する脳領域・神経核の特定」をあげ研究を進めてきた。22年度及び本年度における研究により、ホルモン投与や体液環境が変動した際に応答する領域を組織学的に同定することには成功したが、それら領域に各ホルモンの受容体や細胞膜センサータンパクが発現しているか、核領域同士が神経連絡網を形成しているかを突き止めるには至らなかった。またTRPVチャネルが浸透圧応答能を有するかについても、明らかにすることはできなかった。本研究により、ホルモンの作用部位であり体液環境の変動を受容する領域であることが示唆された領域に各ホルモンの受容体が発現しているか、また浸透圧や圧受容センサーなどのタンパクが発現しているかについて精査する必要があると考えられる。また、本研究で解析したホルモン以外にも脳内で発現している神経ペプチドや神経伝達物質の局在や相互作用について調べ、複雑な神経回路網を形成しているかについても明らかにしなければならない。特に、分子生物学的手法を用いた解析では、状況に応じて両生類のモデル生物であるツメガエルを用いることで、円滑な研究の遂行が期待できると思われる。以上に加え、本課題においておこなった研究内容を生息環境の異なる両生類種を用いて行い比較することで無尾両生類の水分摂取制御について、より詳細に明らかにできると考えられる。昨年度までの研究において、ニホンアマガエルをモデル動物として、薬理学的な解析により両生類の水分摂取行動(吸水行動)が水・電解質代謝関連ホルモンであるアンジオテンシンII(Ang II)やアルギニン・バソトシン(AVT)のなどの内分泌系の制御下にあることを明らかにしてきた。さらに、受容体アンタゴニストを用いた作用経路解析及び分子生物学的手法を用いた遺伝子解析により、両ホルモンの作用発現に関わると考えられる受容体を特定し、その遺伝子(AT_1受容体及びVT_1受容体)を単離・同定した。これまで、下等脊椎動物の水分摂取制御についてはホルモン投与による薬理学的な解析に留まっており、受容体アンタゴニストを用いた解析や遺伝子解析はなされてきていなかった。本研究は、脊椎動物に広く存在する水分摂取行動の制御機構の一端を担う候補分子を、非哺乳類において初めて明らかにした。また、両生類の浸透圧受容機構を解明する一環として、哺乳類において浸透圧受容器の分子実体として考えられている候補遺伝子trp(カチオンチャネルの一種)をアマガエルにおいて単離・同定した。こちらについても、現在までに非哺乳類においては詳細な報告は無い。さらに、哺乳類において神経活動の活性化の指標として用いられる転写因子c-fosに対する免疫染色を、乾燥環境下へ曝露したアマガエルの脳に施すことで、脱水条件下で活性化する脳領域を精査し、両生類脳における体液変動への応答に関わる神経活動の一端を示した。平成22年度は、実験材料であるアマガエルにおける各種体液恒常性維持に関わる因子の分子基盤を充実させるべく、平成21年度に引き続き、主に遺伝子クローニングに重点を置いて研究を進めてきた。21年度に行った、ホルモンに代表させる内分泌性の体液調節因子に加え、体液の変化をセンシングする因子を同定すべく、両生類の浸透圧受容器の探索とその分子実体の同定を試みた。その候補として、哺乳類における研究により浸透圧受容器としての機能分子であると考えられているtransient receptor potential channel(TRPチャネル)に着目し、アマガエルにおいて3つのサブタイプを得、それらを日本アマガエルTRPVチャネルファミリーとして特徴付けた。現在は、同定したアマガエルTRPVの機能解析を進めている。これまで、下等脊椎動物においてTRPVの存在は示唆されているものの、その機能や構造に関する詳細な報告はないため、本研究の遂行により脊椎動物全般におけるTRPVの生理的意義が解明されることが期待できる。

また、遺伝子クローニングに平行して、両生類の浸透圧受容機構を解明する一環として、哺乳類において神経活動の活性化の指標として用いられる転写因子C-fosに対する免疫染色をおこない、生息環境の変化によって体液に変動が生じた際、あるいは水分摂取を促すホルモンを投与した際に神経活動が活性化される脳領域、神経核を精査した。以上の研究により、両生類における体液浸透圧受容機構を解明するための足がかりとして、浸透圧受容に関わると考えられる膜タンパク遺伝子の同定と、体液変動をセンシングする脳領域を精査し、その機構の一端について明らかにした。平成23年度は、無尾両生類の水分摂取行動である吸水行動を制御する脳領域について明らかにするため、水分摂取行動を促すホルモン(Ang IIとAVT)や体液変動によって神経活動が活性化する領域の探索を行った。神経活動のマーカーとして用いられている転写因子c-fos発現を指標に、ホルモン投与及び体液変動時にFosタンパクが増加する脳領域・神経核を免疫組織化学的に精査した。その結果、第3脳室前壁を構成する領域である前交連や間脳視索前野、視床下部背内側核で顕著なFos発現が見られ、これら領域がホルモン増加や体液変動時に活性化する領域であることが示唆された。これら脳室周囲領域は、哺乳類においてホルモン及び体液情報の受容部位及び飲水行動の制御中枢であることが知られており、これら領域が両生類における相同器官である可能性が示唆された。一方で、昨年度に同定したTRPVチャネルが浸透圧センサーとして機能する可能性について検証するため、Xenopus卵母細胞へTRPV遺伝子を導入してタンパクを発現させ、膜電位固定法による解析を行った。その結果、明確な浸透圧応答性を確認するまでには至らなかったが、解析した各サブタイプがそれぞれ異なる温度域に反応してイオン流入に付随した電位変化を生じさせること、すなわち温度センサーとして機能するイオンチャネルであることを明らかにした。以上の研究から、体液変動やホルモンにより活性化する領域を同定し、両生類の吸水行動の制御中枢である可能性を示した。これにより非哺乳類における水分摂取行動の制御機構の一端を明らかにしたため、脊椎動物に共通して存在する水分摂取行動の制御機構を解明する上での重要な知見となりうる。またTRPVは、非哺乳類では機能的解析が進んでおらず不明な点が数多く残されているため、本研究成果は脊椎動物のTRPVの生理学的意義を解明する足がかりとなると考えられる。本研究における目的の一つとして「両生類の水分摂取行動を制御する脳領域・神経核の特定」をあげ研究を進めてきた。22年度及び本年度における研究により、ホルモン投与や体液環境が変動した際に応答する領域を組織学的に同定することには成功したが、それら領域に各ホルモンの受容体や細胞膜センサータンパクが発現しているか、核領域同士が神経連絡網を形成しているかを突き止めるには至らなかった。またTRPVチャネルが浸透圧応答能を有するかについても、明らかにすることはできなかった。
倒産手続と債務者の財産状態の開示

本研究の目的は、債務者の財産状態が適切に開示されていなければ(企業の情報開示が十分でないなら)、倒産処理手続は、十分にその目的を達成することはできないことを、明らかにすることである。研究の発端は、ドイツ倒産法の機能不全である。すなわち、1877年のドイツ破産法は、制定当初は効果的に機能していた。しかし、その後、破産手続により確保される債務者財産が減少を続け、まず無担保債権に対する配当率の低下が問題となり、次に財団不足に基づく破産申立の棄却や破産手続の廃止の頻発が問題とされるに至った。この点では和議手続も同様であった。その原因は、公示されない別除権が創設され、債務者の財産状態が外部に対してきわめて不明確となったため、支払不能発生時の債務者財産を拘束し破産債権者に分配するという無担保債権者を保護するための制度が機能しなくなったことである。そこで、公示されない担保権につき、五四四条(a)と五四七条(e)をもつアメリカ合衆国連邦倒産法を研究したが、その結果は以下のとおりである。公示されない(後れて公示された)担保権を無効にする制度は、担保権を公示する登記・登録が無担保信用を供与する者に対して有用な情報を提供することを前提としている。ところが、アメリカ合衆国では、無担保信用は財務諸表制度に依拠して供与されている。登記・登録制度の無担保債権者保護機能は、無担保信用が債務者が占有する個々の財産に着目して供与された時代にはそれらはきわめて重要な役割を果たしたが、現代ではそうではない。そこで、以下の如き結論を得ることができた。我が国の財務諸表が債務者の財産状態を正確に反映させること、そのような情報に基づいて無担保信用が供与される実務を確立することが、倒産処理手続が効果的に機能するための、絶対的に必要な条件である。ただし、限定的ではあるが、担保権の公示が決定的な重要性をもつこともあり、そのような場合対抗要件否認が重要な役割を果たす。アメリカ合衆国連邦倒産(破産)法下での倒産手続と債務者財産状態の開示について、2000年10月5日から12日までの在外研究も含めて、研究を行なった。内容は、植民地時代におけるイギリス法の登記の継受に始まり財務諸表制度の展開を経て、信用調査機関による情報開示に至る、米国の債務者の財産状態の開示の手段の変遷を明らかにした。そして、このような変遷が倒産法にどのような影響を与えたのかを明らかにするために、Strong Arm Clauseという制度と、Perfection Ruleという制度をとらえて、その生成から展開までを明らかにした。(最新の情態までを明らかにした)。次に我国では、偶然にも、管財人の差押債権者としての地位の法理と破産法・会社更正法上の対抗要件否認の制度が、米国のPerfection RuleとStrong Arm Clauseにほとんどぴったりと合致することを明らかにした。その上で、我国の債務者の財産状態の開示は遅れているので、現状からすれば差押債権者の法理と対抗要件否認はどのように解釈されるのが最も効果的かを明らかにした上で、今後進むべき進路を示し、倒産法改正についての提言も行なった.米国連邦倒産における公示されない担保権等の取り扱いの歴史的展開を研究する過程で、現在米国では無担保信用供与は専ら財務諸表に依拠して行なわれ、登記精度やU.C.Cの登録制度は無担保債権者保護との関係では全く機能していないことが明らかとなった。

また、たんに財務状況を開示するだけでは不十分で、それを基礎に債務者の収益がどうなるかを予測する技術が重要であることも明らかになった。とりわけ、再建型倒産手続きでは、債務者が提示する再建計画が適切か否かは、十分に開示された情報を基礎に様々な債権者が議論しつつそのような計画に基づく収益をある程度正確に予測できなければ、判断できない。こうした判断ができなければ、再建手続(民事再生法、会社更生法)は収益力のない企業を延命させ不良債権をさらに増やすだけの手続になってしまう。本年度は以上までが明らかとなったので、この点についての研究を発展させたい。次に公示されない担保権の一つである相殺権の破産法上の取り扱い(どの範囲で尊重し、どの範囲で排斥するかという問題)につき、我国の破産法の母法である1877年のドイツ破産法、それを改正してできた1994年のドイツ倒産法の規定の形成と展開を研究し、我国の破産法改正を提案する論文を執筆した(現在初稿の校正を終了)。また、このテーマで本年5月の民事訴訟法学会のシンポジウムで報告する予定である。さらに、同様に公示されない担保権の一つである優先権の排除の原則の形成と展開につき、ドイツ(1855年のプロイセン破産法、ドイツ破産法、ドイツ倒産法)、及び米国(1938年のチャンドラー法、1978年の連邦倒産法)での歴史的展開につき、基礎的な研究を完了した。この成果は、平成14年度中に、「破産法における形式的平等と実質的平等」(仮題)という論文にまとめる予定である。優先権は無担保債権者に優先した満足を与えられるにもかかわらず、原則として公示されることはなく、しかも満足の対象も特定されていないことから、公示されない担保権同様、債務者の財産状態を隠蔽するものと位置づけられている。角度を変えていうなら、もはや支払不能だとして債務者の事業を停止せしめたとき、優先権の額が多ければ、債務者の財産状況の実態はそれよりもずっと悪くなっており、一般の無担保債権者からすればもっと早い時期に債務者の事業を止めるべきであったということになるわけである。そこで、この問題についての、ドイツ破産法とアメリカ合衆国連邦倒産法の規制の歴史的展開を実証的に研究した。1887年のドイツ破産法は、優先権が多すぎてこのような弊害が生じたため、不動産上の優先権を一掃し、動産上の優先権は全て一般の無担保債権とした。ドイツ破産法は当初非常に効果的に機能したが、その後歴史的経緯を忘れ数多くの優先権を創設してしまったことから、倒産法は再び機能不全に陥った。歴史は繰り返されたのである。そこで、1994年の新倒産法が、より徹底して優先権を廃止するに至った。アメリカ連邦倒産法は、倒産法は連邦法であるが、優先権か否かを決定する実体法は州法である。すなわち、州法は、弱者保護の名目で数多くの優先権を創設し、それが倒産法で尊重されることとなった。そのため、連邦倒産法も機能不全に陥ったとされている。これを回避するため、チャンドラー法で、州法が作る優先権を可及的に削除する連邦は算法の規定が創設され、この規定はその基本構造を変えることなく現在も維持されている。以上から、優先権が倒産手続にもたらす弊害と、それを除去するための法技術につき、詳細な理解を得ることができた。ただ、以上の成果を論文にすることは果たせなかった。しかし、今年度中には現在出版が予定されている書籍の一部として公刊できるものと期している。
転写とDNA修復のカップリングの分子機構の研究

1.転写及びDNA除去修復反応に必須な因子TFIIHの大量精製転写再構成系を構築する目的で、昨年度確立したヒトHeLa細胞の大量培養システムを用い、高密度でのHeLa細胞培養を200リットルの培養規模で行った。この培養細胞からDignamらの方法を用いて調製した核抽出液は、大熊が米国のRoeder研で用いたものと同程度の転写活性を示した。この抽出液を材料に、基本転写因子TFIIHの精製を行なった。3つのサブユニットに対する抗体でその挙動を追いながら、4つのカラムを用いて精製した約50μgのTFIIHには、転写再構成反応において十分な活性が検出された。現在、このTFIIHを用い、9個のサブユニットの一部を欠いたサブタイプや一つのサブユニットに変異が入ることである機能を失った変異TFIIHの活性との比較を行うことで、転写におけるTFIIHの機能、役割を解析している。2.無細胞DNA除去修復系の確立と修復機構解析DNA修復関連因子(XPC/HHR23B、XPF/ERCCI、XPG等)を新たにバキュロウイルスにより発現し、高度に精製した。これらは、色素性乾皮症XP群の患者からのXP-C、XP-F、XP-G等の細胞抽出液のDNA除去修復欠損を回復させることを確認した。そこで現在、我々はこれらを他の精製XP群蛋白質と合わせ、無細胞修復系を再構成する試みをしている。また転写の鋳型となる遺伝子DNAのプロモーターの転写開始点から下流の領域にピリミジン・ダイマーや6-4紫外線照射産物等のDNA傷害部位を作製し、転写とカップルしたDNA除去修復機構を解析しようとしている。現段階では、TFIIHと他の修復因子との相互作用を解析する一環で、XPCとXPGがTFIIHと結合することを見出している。
分泌果粒の元素組成と燐脂質の組織・細胞化学

分泌果粒の形成と放出にはその内容のホルモンや酵素等の成分以外の物質が重要な役割を持つと考えられ,特に電解質が注目されている。われわれはいく種類かの分泌果粒が燐脂質の染色法により濃染し特にLuxol Fast Blue染色により陽性であることを観察した。一方,分泌果粒には高濃度の電解質元素を含むものがあることを、新鮮凍結乾燥超薄切片を用いた定量的X線微小部分析で発見し、報告して来た。多くの種類の動物と細胞の果粒について燐脂質と電解質濃度を検討したところ,粒液細胞果粒に高濃度のカルシウムまたはマグネシウムを含むものが多くみられたが、高濃度の硫黄が検出される果粒では,カルシウムやマグネシウムの濃度と強い相関を示したが(粗関係数=0.9),燐の濃度とは相関がみられなかった。さらに肥満細胞果粒には高濃度の硫黄が含まれるが,果粒にヒスタシンを持つラットではマグネシウムやカルシウムは少なく,果粒にヒスタミンの無い蛙ではマグネシウムが高濃度に含まれ,硫黄と強い相関を示した(相関係数=0.96)。高分子電解質である糖タンパク質とプロテオグリカンに二価陽イオンが働き、分泌果粒の内容をしぼませて保存し,放出のとき重要な機能をはたすと考えられる。果粒や細胞内小器官の元素組成を調べるには新鮮凍結乾燥超薄切片が必須であるが,切片作製には技術的な困難が有る。コロジオン膜を張ったグリツドに組織片切断面を軽く接触させてスタンプ標本を作製し,電子顕微鏡観察すると微細構造がよく観察され,定量的X線微小部分析により電解質元素が非常によく保存されることが明らかとなった。スタンプ標本を用いて分析すると、多数の果粒を分析することが出来,動物、細胞,果粒により元素細成は大きな巻を示したが、動物,細胞,果粒の種類により一定の傾向が見られた。新鮮凍結乾燥超薄切片の分析結果と比較して検討すると両現性のある,興味深い結果が得られるようになった。細胞内の小器管にカルシウムやマグネシウムおよび他の電解質元素が高濃度に貯蔵されていることが分析電子顕微鏡を用いた研究により次第に明らかとなって来た。我々は既に分泌顆粒の元素組成を新鮮凍結乾燥超薄切片を用いて定量的エネルギ-分散型(EDS)X線微小部分析により顆粒にいろいろな量のカルシウムやマグネシウムを持つものがあることを報告してきた。これらの元素の貯蔵の部位と機序を解明することはこれらが細胞内で遊離して働く過程を調節する機序を知り、これをコントロ-ルするために重要な知見と考えられる。これらを結合するものとしては、ヌクレオチド、糖、アミノ酸、ペプチド、タンパク質等が知られているが、脂質との結合について細胞内や組織内で検討したものはほとんど無い。燐脂質に特異性を持ち髓鞘染色に広く用いられているLuxol Fast Blao-MBS,-ARN,-Gで染色すると下垂体前葉酸的性細胞、膵臓チモ-ゲン顆粒、顎下腺顆粒管細胞顆粒と精巣上皮細胞顆粒が染色され燐脂質の存在が明らかとなった。また新鮮凍結乾燥超薄切片を用いた定量的X線微小部分析によりこれらの顆粒に高濃度の燐が検出された。試料電流を2nAから0.8nAにさげて分析するとコンタミネ-ションのスポットがはるかに小さくなり限局した領域の組成を知ることとが出来るが顆粒にかなりの量の燐が検出された。

さらに200kV電顕により加速電圧200kVで透過走査像で明瞭な微細構造を観察しながらEDS分析を行なうとスポットが顆粒内に限局しているのが確かめられたが、かなりの量の燐が検出された。また顆粒によりカルシウムやマグネシウムが検出され、現在燐とカルシウムやマグネシウムとの量の相関を調べ、これらの結合性の検討を行っている。また低分子物質の抗体作成にヒスタミンを用いて、さらに電解質と結合するフォスファチドと、セリンに対する抗体を作り電顕的に分布を検討していく。新鮮凍結乾燥超薄切片を用いた定量的X線微小部分析により,細胞の微細構造の元素組織を調べて来た。分泌果粒にしばしば大量に検出されるマグネシウムとカルシウムの結合の材序を解明するため,果粒内の燐との関係を検討した。今年度は引き続き,分泌果粒と髄鞘および膵臓腺房細胞粗面小胞体,系粒体,水解体等の細胞小器官を調べ,興味ある所見が得られた。髄鞘では燐とカリウムが大量に含まれるが、カルシウムもマグネシウムも小量しか検出されない。膵臓腺房細胞4モ-ゲン果粒にはマグネシウムと燐は小量であるが存在することが確認され、粗面小胞体では高濃度のマグネシウムと燐が含まれている。サらにラット,モルモットとハムスタ-の尿道球腺の粘淡細胞果粒に大量のマグネシウムと硫黄が含まれることが明らかとなり,その結合の材序の解明を行っている。また蓚酸カリによるマイクロウェ-ブを用いた前処理後グルタ-ルアルデヒドと四酸化オスシウムによる固定を行い、定量的X線微小部分析によりカルシウムとマグネシウムをはじめ他の元素の保存状態をしらべた。微細構造と高電子密度沈澱物の分布は電子顕微鏡により良く観察されたが、X線微小部分析によりカルシウムは保存されたがマグネシウムをはじめ多くの元素はほとんど検出できなかった。蛙舌の粘淡細胞果粒では四酸化オスシウムの後固定により燐が保存され、この果粒では大量の燐脂質とカルシウムが存在する可能性が示めされた。燐脂質の特異染色によりその確認とカルシウムの結合の材序をしらべていく。これまでの結果では、分泌果粒に大量に存在するカルシウムやマグネシウムは細胞の種類によりまた個々の果粒によって必ず下もムコ多糖類や燐脂質とも直接関係ないと予測されるものも見られた。果粒中に存在する化合物でーCOOH基を持つものと結合しているものもあることが予想され、検討する必要がある。新鮮凍結乾燥超薄切片を用いた定量的X線微小部分析により、細胞の微細構造の元素組成を調べて来た。舌下腺粘液細胞,小腸と結腸の杯細胞,結膜杯細胞,尿道球腺の粘液細胞の果粒に高濃度のマグネシウムやカルシウムが含まれることが明らかとなった。これらの果粒内の他の成分との結合材序と働きを解明するため、多数の果粒の分析といくつかの種類の下等脊椎動物の肥満細胞と好塩基球の果粒を調べ,次の二つの大きな成果が得られた。1)新鮮スタンプで定量分析が可能であり、いくつかの利点を持つ。新鮮詰結乾燥超薄切片は標準試料を用いた定量化ソフトの作製や、細胞微細構造レベルの正確な元素組成を調べるには必須であるが、標本作製が困難であり、いつも良い切片が得られるとはかぎらない。新鮮スタンプは作製が非常に簡単で再現性があり、細胞の微細構造が明瞭に観察され、定量分析において、電解質元素が良く保存される。特に真空装置を用いた乾燐法で作製した標本ではシリコンが検出されるが、スタンプではほとんど検出されない。
骨再生に優れた新しい生体吸収性骨セメントの開発

独自に開発した骨接着性リン酸系多糖誘導体を用い、生体吸収性骨セメントを創製し、物性と骨再生に関する実験データを集積した。本セメントは既存の骨セメントよりも優れた骨接着性を認めた。動物実験モデルでは骨欠損部に本セメントを充填することで本セメントは徐々に吸収され、骨へと置換された。新規骨セメントとして今後臨床応用ができるようさらなる研究を継続していく予定である。申請者らは独自に開発した硬組織接着性多糖誘導体を用い,生体親和性が高く,かつ骨に対し強固に接着する生体吸収性骨セメントを創製した。アパタイトとチタンに対する引っぱり強さをPMMA,Calcium phosphorylate (CPC)を対称として検討した。アパタイトに対しては、新規セメントは平均14.7MPa、PMMAは11.4MPa、CPCは1.3MPaであった。チタンに対しては、新規セメントは18.3MPa、PMMAは10,1MPa、CPCは接着しなかった。これらは有意に強く接着していた。(one-way ANOVA p<0.05)また、新規骨セメントをマウス(BL6雌)の大腿骨内に投与しそれらの吸収速度を組織学的変化を観察し評価した。投与時に新規骨セメントにβTCPやDCPDを混和し投与した。βTCPを混和し投与することで投与後5週の組織学的評価でセメントの周辺に骨化が認められた。また、8週の時点でもセメントの残存が認められた。DCPDを混和したマウスにおいては、8週の時点でセメントはすべて骨化し吸収されていた。これらのことから、セメントの吸収速度に関しても他の成分を混和することで調節が可能であることがわかった。来年度以降に行う予定であるBMP等の成長因子を併用した骨再生の実験のために骨粗鬆モデルマウスの作成を行った。マウスの卵巣を摘出し、さらにステロイドを投与することでより骨粗鬆症が進行することを放射線的に評価を行っている。本年度はマウスを用いた骨再生を評価するため骨粗鬆モデルの作成を行った。まず、卵巣摘出マウスを作製した。これらを経時的に動物用μCTを用いて撮影した。そのデータをもとに骨密度を計測した。卵巣摘出後2ヵ月で卵巣非摘出群と比べて骨密度の低下を認めた。また、それらのマウス大腿骨よりRNAを抽出し骨形成マーカーの発現も検討した。とれらは、データにばらつきがあるため現在も継続して行っている。動物実験と平行しさらに優れた骨セメントの開発のためリン酸化プルランの改良も行っている。リン酸化プルランにDCPD OCPグラスアイオノマーなどを混和し強度の増加、硬化時間、生体吸収性を検討している。また、ラットの大腿骨へリン酸化プルランの投与も行い現在観察中である。投与後1週間,3週間でμCTを撮影したが明らかな骨化は認めていない。経過観察期間を延長し再度検討する予定である。来年度は、代表的な骨形成タンパクrhBMP-2をリン酸化プルランに混和し骨形成の促進を図るとともに、さらに優れた骨セメントの配合をマウスやラットを用いて検討を継続する。申請者らは独自に開発した硬組織接着性多糖誘導体を用い、生体親和性が高く、かつ骨に対し強固に接着する生体吸収性骨セメントを創製した。本年度はさらに優れた骨セメントの開発のためリン酸化プルランの改良も行った。リン酸化プルランにα-TCPおよび昨年度に引き続きDCPD、OCP、グラスアイオノマーなどを混和し強度の増加、硬化時間、生体吸収性を検討した。In vitroにてリン酸化プルランの成長因子徐放特性について検討した。成長因子としては骨形成促進作用があると言われるBMP-2を用いた。方法は、BMP-2を含有させたリン酸化プルランをビーズ状に成型し、PBSバッファーに浸漬した。37°Cで24時間毎にPBSバッファーを交換し、それをリン酸化プルランが完全に溶解するまで繰り返した。徐放されたBMP-2の量をELISAにて測定した。結果、回収したサンプルから検出されたBMP-2は微量であり、明らかな徐放性は確認できなかった。また、マウスおよびラットの大腿骨へリン酸化プルランおよびBMP-2を混和したものを投与し、投与後4週間でμCTを撮影した。結果、骨形成の促進の傾向を認めたものの生食投与群との有意差は認めなかった。今後の課題としては、最も優れた強度、硬化性、そして生体吸収性を有するリン酸化プルランの配合の追究と徐放性の確認、また適切な経過観察期間を設けた動物実験での骨形成促進の証明であり、実験系を再検討していきたい。当初の計画書通りに実験は進行している。

骨セメントの改良のために繰り返し同様の実験はさらに必要である。24年度が最終年度であるため、記入しない。当初の経過通りに実験は進行している。使用動物もマウス、ラットを今後も使用していく。さらに臨床使用に近づけるためウサギの使用も計画している。
新しい抗血栓性治療薬開発のための基礎研究

1978年、森田らはEchis carinatus毒からプロスロンビンを特異的に活性化するアクチベータ-を単離し、金属プロテアーゼの1種であることを明らかにした。その後、このアクチベータ-はEcarinと呼ばれ、今日、プロスロンビンの活性化に広く利用されている。本年度は、Ecarinの厳密な基質特異性を明らかにするとともに、より多くのdisintegrinについての構造情報を得るため、EcarinのcDNAクローニングを行った。ケニア産の毒から精製したEcarinの部分アミノ酸配列をもとに、オリゴヌクレオチドプライマーを合成し、次いで、PCR処理産物を用いて毒腺由来のcDNAライブラリーのスクリーニングを行った。その結果、全長2,386bp、アミノ酸616残基をコードするクローンを単離した。その塩基配列は全体を通して、最近、cDNA配列の明らかにされた高分子量出血因子のjararhaginと高い相同性を示した。また、成熟Ecarinはプロシークエンス領域と考えられるアミノ酸190残基が切り出されたもので、残りの部分の配列は高分子量出血因子HR1B(ハブ毒)や血栓毒RVV-Xのheavy chainと相同性があった。すなわち、Ecarinはmetalloproteinase,disintegrin及びCys-richという3つのドメイン構造から成るモザイクタンパク質であることが明らかとなった。さらに、プロシークエンス領域に哺乳類プロコラゲナーゼ族の活性化に関与する“cysteine switch"様の配列が見い出された。さらに本年度は、これまで我々の研究室で構造決定してきたHR1BやHR1A,RVV-X,HT-1,Ecarinから由来するdisintegrin族のアミノ酸配列を基に、抗血栓性を示すとされるペプチド領域のドラッグデザインを試みた。それらペプチドの合成と抗血栓性については、目下、研究を進めつつある。また、久留米大学分子生命科学研究所の諸井将明教授との共同研究において、HR1Aに極めて強い抗血小板粘着(コラーゲン)活性を見い出した。今後もdisintegrinの機能発現領域の特定を行うとともに、それらの構造情報を広く活用しつつ抗血栓剤開発の基礎研究を進めたい。ハブ毒中の出血因子、HR1B(60kDa)は、NH_2末端側に金属プロテアーゼ領域及び中央にdisintegrin(血小板凝集阻止因子)、COOH末端にCys-rich領域を含むモザイク様タンパク質である。一方、disintegrinポリペプチド族の一種であるtrigraminやrhodostomin前駆体タンパク質のNH_2末端側には、HR1Bと相同性の高い配列を示す金属プロテアーゼを含む。従って、最近、多数の蛇毒から単離された抗血小板凝集因子のdisintegrin族はすべて翻訳後、毒腺あるいは採毒時に自己消化で生成した可能性が高い。本年度は、このことを検証するため、HR1B及び新たにハブ毒から単離した出血因子のHR1A、さらにガラガラ蛇毒の出血性金属プロテアーゼのHT-1を、Ca^<2+>非存在下で自己消化(37°C、312時間)させるとともに、遊離した断片の構造を調べた。その結果、いずれの出血因子も3134kDaの断片を遊離することが明らかとなった。そこでこれら断片をそれぞれ単離し、全アミノ酸配列を決定した結果、それらの断片はdisintegrinとCys-rich領域を含んだ。

従って、disintegrin族はいずれも蛇毒中の金属プロテアーゼ分子から由来した可能性が考えられる。本年度は、さらにこれまで我々の研究室で構造決定したHR1B及びHR1A、RVV-X、HT-1から由来するdisintegrin族のアミノ酸配列を基に、抗血栓性を示すと思われる領域を推定し、幾つかのペプチドを合成した。これらのペプチドの抗血栓性については目下評価実験を進めつつある。1978年、森田らはEchis carinatus毒からプロスロンビンを特異的に活性化するアクチベーターを単離し、金属プロテアーゼの1種であることを明らかにした。その後、このアクチベーターはEcarinと呼ばれ、今日、プロスロンビンの活性化に広く利用されている。本年度は、Ecarinの厳密な基質特異性を明らかにするとともに、より多くのdisintegrinについての構造情報を得るため、EcarinのcDNAクローニングを行った。ケニア産の毒から精製したEcarinの部分アミノ酸配列をもとに、オリゴヌクレオチドプライマーを合成し、次いでPCR処理産物を用いて毒腺由来のcDNAライブラリーのスクリーニングを行った。その結果、全長2,386bp、アミノ酸616残基をコードするクローンを単離した。その塩基配列は全体を通して、最近、cDNA配列の明らかにされた高分子量出血因子のjararhaginと高い相同性を示した。また、成熟Ecarinはプロシークエンス領域と考えられるアミノ酸190残基が切り出されたもので、残りの部分の配列は高分子量出血因子HR1B(ハブ毒)や血栓毒RVV-Xのheavy chainと相同性があった。すなわち、Ecarinはmetalloproteinase,disintegrin及びCys-richという3つのドメイン構造から成るモザイクタンパク質であることが明らかとなった。さらに、プロシークエンス領域に哺乳類プロコラゲナーゼ族の活性化に関与する“cysteine switch"様の配列が見い出された。さらに本年度は、これまで我々の研究室で構造決定してきたHR1BやHR1A,RVV-X,HT-1,Ecarinから由来するdisintegrin族のアミノ酸配列を基に、抗血栓性を示すとされるペプチド領域のドラッグデザインを試みた。それらペプチドの合成と抗血栓性については、目下、研究を進めつつある。また、久留米大学分子生命科学研究所の諸井将明教授との共同研究において、HR1Aに極めて強い抗血小板粘着(コラーゲン)活性を見い出した。今後もdisintegrinの機能発現領域の特定を行うとともに、それらの構造情報を広く活用しつつ抗血栓剤開発の基礎研究を進めたい。