hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
タイに陸路で渡ってきた南アジア系及びミャンマー系移民：地域研究の新たな地平を拓く

メーソート県政府は、国籍証明手続きを指定のタイ仲介会社に限定することで、高額の費用をミャンマー人移民に課す結果になっており、にもかかわらず、暫定パスポートを所持しタイ国内の移動が自由なはずの移民の県外への移動を阻止する動きが判明した。2014年度はプロジェクトの締めくくりの年度になった。そのため、同年2月に開催した京大でのワークショップでの報告を基に、その補足検証を行うことが主たる内容になった。具体的には、8月9月に高田が竹口の協力を得て北部タイでの聞き取り調査を実施。続いて長田の協力を得てミャンマーでの視察を実施。その終盤には、これまでの調査研究で得られた知見と2月の報告内容を基に、チュラーロンコーン大学のムスリム研究センターで公開での報告を行った。この報告は、本プロジェクトの協力者である同センターのDr.Areeが主催、司会を行って実施されたものである。さらに、2015年2月にはバングラデシュで補足の調査を実施(高田単独)。同時期に協力者の和田が先行してタイでの予備調査を実施。その後、高田と合流し、メーソート(ミャンマー国境の町)で南アジア系移民の現状、特にベンガル語話者の状況について調査を行った。その結果、ミャンマー国内のムスリムが、一方でバングラデシュ側に流れ、他方で、その延長線上で全く逆方向のメーソートへ移動していること、また、一部では彼らの移動と日本国内の中古自動車・中古自転車マーケットが連動している興味深い事実も浮き上がってきた。分担者の藤田はタイに出張し、マヒドン大学人口社会研究所のChalermpol Chamchan准教授に会い、大学特に研究所のミャンマー人移民研究の現状について聞き取りをしたほか、資料情報収集を行った。また、広島に出張し、高田と研究のとりまとめ及び今後の展開について相談した。以上を基に、または2014年2月のワークショップでの報告内容を基に、プロジェクト関係者とe-メールで連絡調整し、その結果、暫定的なレポートのとりまとめを依頼した。現在(2015年4月時点)、報告集の刊行に向けて作業を進行しているところである。26年度が最終年度であるため、記入しない。地域研究、社会学26年度が最終年度であるため、記入しない。すでにチェンマイ調査ではインタヴュー等も進み、バングラデシュ系の祖先の出身地について情報も集まり始めている。また、ネパール系に関しては幾つもの新事実が発見された。ビルマ系ムスリムについても、徐々に聞き取りが進んでいる。ビルマ人労働者に関する調査も、当初、計画していた調査を順調に進めている。いずれも、今後の調査に期待が持てる内容である。上記(研究実績の概要)の通り、2013年度はタイ北部、タイ中部、バングラデシュで調査を行った。研究代表(高田)が統括する部分では、対象とする3グループ(タイ北部の旧ベンガル系(=現バングラデシュ系)ムスリム、ネパール系移民、ビルマ系ムスリム)のうち、特にバングラデシュ系ムスリムについて研究の進展が大きく見られた。
非線形偏微分方程式の理論と応用

研究実施計画に従って各グロ-プごとに研究が行われ,得られた研究成果は次のとおりである。統計・情報研究グル-プでは,新関章三が研究代表者として楕円型非線形偏微分方程式の解の分岐現象を数値解析的立場から研究し,コンピュ-タグラフィックスにより分岐ダイヤグラムを作成して解の分岐の様子を明らかにした。またIR^Nにおけるルベ-グ測度のある種の位相的性質を調べた。また統計学の立場から野間口謙太郎は,局外母数があるにもかかわらず,一様最強力検定が存在するための十分条件を与えた。解析学研究グル-プでは,川下美潮が等方性弾性方程式の外部領域におけるノイマン問題の解の局所エネルギ-は一様減衰しないことを示した。幾何学研究グル-プでは,小林貞一は四元数球型空間形の積空間からユ-クリッド空間の中への埋め込みとはめ込みに関する結果をアチャ-の方法によって得た。梅原純一は位相空間における(r,r')ーopen setと(r,r')ーTi分離公理(i=0,1/2,1.2)を定義して,その性質とrーopen set,rーTi公理との関係を調べた。また逸見豊はhighter homotopy commutatiuityの概念を拡張しこれを用いてHubbuckのtorus theoremのmpdp型を与えた。代数学研究グル-プでは,長沼英久がn次ジ-ゲル・モジュラ-群のルベル2のヘッケ型合同部分群Γ_0^<2n>(2)の交換子部分群を決定した。以上の研究成果は,しかるべき内外の学術雑誌に一部はすでに発表されており,また残りは発表予定となっている。
肺胞局所への繊維化抑制遺伝子導入による急性肺障害の新しい治療

本研究では初めにプラスミドDNAをネブライザー、人工呼吸器を用いて経気道的に導入できるか否かを検討した。ラットを気管切開し人工呼吸器に接続、遺伝子導入条件を検討するためにマーカー遺伝子のpCAGGS-luciferazeを250μg(総量500μl)気道より投与し、一回換気量(TV=10、30、40ml/kg)、PEEP(P=0、5、10、20cmH20)、換気回数(f=20、40、60、90回/分)、人工呼吸時問(T=0.5、2、5、10分)の各条件下で人工呼吸換気を行った。24時間後に肺を摘出しルミノメーターを使用してluciferaseを定量した結果、pCAGGS-luciferazeを気道投与し人工呼吸器換気を行わなかった群は1,180±705 RUL/100μg protainであるのに対して、人工呼吸換気を行った群(TV=30ml/kg、PEEP=10cmH20、f=60回/分)では1,1721,438±745,507 RUL/100μg protainと発現量は著しく増加した。また、遺伝子が導入された局在を評価するためにpCAGGS-lacZを同条件下に気道内投与しX-gal染色を行ったところ、散在性に肺胞上皮細胞が強陽性に染色された。次に2つの肺障害モデルを用いて遺伝子導入による治療効果を検討した。(1)ブレオマイシンを気道内投与し肺の線維化モデルを作製した。このモデルに対して線維化を抑制するHepatocyte growthfactor(HGF)遺伝子を導入しその効果を検討したが、遺伝子導入で組織像は改善傾向であったが、統計学的有為差は認められなかった。一方で、肺障害モデルに対して人工呼吸換気を行うと死亡率が高くなった。(2)LPS静脈内投与による肺障害を作成し、サイトカインの変化を解析した。IL-10レベルが高い個体では肺障害が軽減されてることからIL-10導入による治療を予定している。ラットを気管切開し人工呼吸器に接続、マーカー遺伝子のpCAGGS-luciferazeを250μg(総量500μl)気道より投与し、一回換気量(TV=10、30、40ml/kg)、PEEP(P=0、5、10、20cmH20)、換気回数(f=20、40、60、90回/分)、人工呼吸時間(T=0.5、2、5、10分)を設定し人工呼吸換気を行った。24時間後に肺を摘出しルミノメーターを使用してluciferaseを定量した結果、pCAGGS-luciferazeを気道投与し人工呼吸器換気を行わなかった群は1, 180±705RUL/100μgprotainであるのに対して、人工呼吸換気を行った群(TV=30ml/kg、PEEP=10cmH20、f=60回/分>では1, 1721, 438±745, 507RUL/100μgProtainと発現量は著しく増加した。

また、遺伝子が導入された局在を評価するためにpCAGGS-lacZを同条件下に気道内投与しX-gal染色を行ったところ、散在性に肺胞上皮細胞が強陽性に染色された。次に繊維化抑制遺伝子を導入することで急性肺障害が抑制されるか否かを検討した。ブレオマイシンを気道内投与し、肺の繊維化モデルを作製した。2週間後の組織像では、肺胞間質の繊維化と細胞浸潤が確認され、また、肺障害の影響と考えられるラットの体重減少および体重増加不良を認めた。このモデルに対して繊維化を抑制するHepatocyte growthfactor(HGF)遺伝子を上記の方法で導入し、組織像、体重の変化を指標にその効果を検討した。その結果HGF遺伝子を投与した群、投与しなかった群での組織像、体重の変化に有為差は認められなかった。また、肺障害モデルに対して人工呼吸換気を行うと死亡率が高くなった。今後、人工呼吸換気の条件、遺伝子導入の至適時期を検討、評価していく必要がある。また、HGF以外の遺伝子の導入とその効果についても確認を予定している。本研究では初めにプラスミドDNAをネブライザー、人工呼吸器を用いて経気道的に導入できるか否かを検討した。ラットを気管切開し人工呼吸器に接続、遺伝子導入条件を検討するためにマーカー遺伝子のpCAGGS-luciferazeを250μg(総量500μl)気道より投与し、一回換気量(TV=10、30、40ml/kg)、PEEP(P=0、5、10、20cmH20)、換気回数(f=20、40、60、90回/分)、人工呼吸時間(T=0.5、2、5、10分)の各条件下で人工呼吸換気を行った。24時間後に肺を摘出しルミノメーターを使用してluciferaseを定量した結果、pCAGGS-luciferazeを気道投与し人工呼吸器換気を行わなかった群は1,180±705RUL/100μg protainであるのに対して、人工呼吸換気を行った群(TV=30ml/kg、PEEP=10cmH20、f=60回/分)では1,1721,438±745,507RUL/100μg protainと発現量は著しく増加した。また、遣伝子が導入された局在を評価するためにpCAGGS-lacZを同条件下に気道内投与しX-gal染色を行ったところ、散在性に肺胞上皮細胞が強陽性に染色された。次に2つの肺障害モデルを用いて遺伝子導入による治療効果を検討した。(1)ブレオマイシンを気道内投与し肺の線維化モデルを作製した。このモデルに対して線維化を抑制するHepatocyte growthfactor (HGF)遺伝子を導入しその効果を検討したが、遺伝子導入で組織像は改善傾向であったが、統計学的有為差は認められなかった。一方で、肺障害モデルに対して人工呼吸換気を行うと死亡率が高くなった。(2)LPS静脈内投与による肺障害を作成し、サイトカインの変化を解析した。IL-10レベルが高い個体では肺障害が軽減されてることが明らかになった。今後IL-10遺伝子導入による治療を予定している。
Ni基超超合金の創製と応用展開

L1_2相(Ni_3Al)とD0_<22>相(Ni_3V)とが2重に複相共存し、かつ、整合性の良い微細組織を形成する複相金属間化合物合金を見出し,高温材料として優れた特性を発現する基本成分と組織を創製した。本複相金属間化合物合金の組織形成機構,高温強度特性,耐環境特性についての研究を行い、先進超合金に匹敵する高温力学特性さらには耐環境特性を発現することを観察した。また、これら優れた高温特性に基づき、幾つかの耐熱部材・部品のプロトタイプ製造を企業との連携により行い,次世代型耐熱熱材料開発の道筋を切り拓いた。1.微細な2重複相組織からなるNi_3Al-Ni_3Ti-Ni_3V擬3元系合金では、大半の汎用超合金を上回る、そして先進超合金に匹敵する引張り強度を低温から高温までの広い温度域まで発現することを観察した。2.延性についても、一定の値を低温から高温域で兼備していることを観察した。3.Ni_3Al-Ni_3Nb-Ni_3TiならびにNi_3Al-Ni_3Ti-Ni_3Vマルチ・インターメタリックス合金は強度の逆温度依存性と塑性変形能を示し、長時間保持によっても組織安定性が高く、そのため高温強度の劣化(低下)がないことを観察した。4.Ni_3Al-Ni_3Ti-Ni_3VならびにNi_3Al-Ni_3Nb-Ni_3Vマルチ・インターメタリックス合金について、溶解法、鍛造法、単結晶法〈一方向凝固法〉による製造プロセスが可能であることを検証し、製造性に優れていることを明らかにした。5.高温引張り特性は凝固材、鍛造材、一方向凝固材(単結晶)等の製造プロセに依存してること、高温域の強度と延性さらにはクリープ特性(速度、寿命)は一方向凝固材(単結晶)で優位な値を示すことを観察した。他方、低温域では鍛造材で優れていることを観察した。6.Ni_3Si-Ni_3Nb-Ni_3Ti合金系では、構成相間の固溶限の温度変化を利用しての析出強化機構が発現することを観察し、組織制御が可能であることを見出した。1.Ni_3Al-Ni_3Nb-Ni_3TiならびにNi_3Al-Ni_3Ti-Ni_3Vマルチ・インターメタリックス合金は強度の逆温度依存性と塑性変形能を示し、長時間保持によっても組織安定性が高く、そのため高温強度の劣化(低下)がないことを観察した。2.Ni_3Al-Ni_3Ti-Ni_3VならびにNi_3Al-Ni_3Nb-Ni_3Vマルチ・インターメタリックス合金について、溶解法、鍛造法、単結晶法<一方向凝固法>による製造プロセスが可能であることを検証し、製造性に優れていることを明らかにした。3.高温引張り特性は凝固材、鍛造材、一方向凝固材(単結晶)等の製造プロセスに依存していること、高温域の強度と延性さらにはクリープ特性(速度、寿命)は一方向凝固材(単結晶)で優位な値を示すことを観察した。4.Ni_3Si-Ni_3Nb-Ni_3Ti合金系では、構成相間の固溶限の温度変化を利用しての析出強化機構が発現することを観察し、組織制御が可能であることを見出した。5.企業あるいは産官学との連携により、本合金のジェットエンジン用タービンブレード、高融点・硬質金属用摩擦攪拌接合ツール、耐熱・耐食ボールベアリング部材への適用を、部材に応じた改良成分と組織の適切化あるいは製造プロセスの開発により行い研究室プロトタイプの製造にまで行った。これにより実用化への一定の道筋をつけることができた。本年度は、Ni3_Al-Ni_3V擬2元合金系に立脚するマルチ・インターメタリックスin-situ複合材料(すなわちNi基超・超合金)の研究開発を合金設計と組織制御に基づき行うと共に、用途開発についても検討を加え、以下のような結果を得た。1.高温での長時間保持によっても2重複相組織の安定性が高く、そのため高温強度の劣化(低下)が少ないことを観察した。2.2重複相組織の強度を支配する組織因子の抽出をはかり、初析L12相の体積率が重要な因子であること、加えて、初析L12相とチャンネル部の界面による効果(すなわち界面強化)が存在することを把握して、それらの強化機構について検討を加えた。3.本合金の高温工具としての展開を図るために必要な表面強化(硬化)をプラズマ浸炭ならびに窒化により試み、顕著な表面強化(硬化)を発現させることに成功した。これら強化はVCあるいはVN化合物による分散強化によることを明らかにした。4.Ni_3Si-Ni_3Nb-Ni_3Ti

合金系では、構成相間の固溶限の温度変化を利用しての析出強化機構が発現することを観察し、常温域で際立った塑性加工能を有するNi3Si基複相金属間化合物創製の道を切り拓いた。5.企業あるいは産官学との連携により、本合金のジェットエンジン用タービンブレード、高融点・硬質金属用摩擦攪拌接合ツール、耐熱・耐食ボールベアリング部材への適用を、部材に応じた改良成分と組織の適切化あるいは製造プロセスの開発により行い研究室プロトタイプの製造にまで行った。これにより実用化への一定の道筋をつけることができた。
θ波に依存した嗅内皮質・海馬神経回路のダイナミックスに関する研究(発ガン遺伝子c-fosの発現を利用した研究)

神経回路の研究は、神経活動のパターンに依存したダイナミックなものとして、調べ直すことが必要になってきた。θ波は、中隔領域が海馬の活動様式をコントロールする際に生じる脳波である。θ波ONの状態では、歯状回顆粒細胞は活動が高く、アンモン角の錐体細胞は活動状態はスパースで低い。θ波OFFの状態では、逆に顆粒細胞の活動は低い。嗅内皮質は第2・3層の細胞により、海馬の全ての領域に入力するが、たとえ一定の入力をするとしても、受ける側の状態の違いにより、海馬内に起こる変化は、全く違ったものとなることが考えられる。この様な神経活動の状態に依存した神経回路のダイナミックスを調べるのに、発ガン遺伝子c-fosの発現に依る方法がある。本研究の目的は、c-fos発現分布の違いから、海馬神経回路のダイナミックスを探り、海馬の短期記憶形成と長期記憶への変換のメカニズムに迫ることにある。ラット覚睡時に嗅内皮質表面に植え込んだ慢性電極で高周波刺激を与え、海馬でのc-fos蛋白の発現をc-fos蛋白に対する抗体を用いて免疫組織化学により、発現領域を3次元的に調べた。類似した既存の報告は総て、嗅内皮質の一部でなくPerfornt Pathを刺激しており、嗅内皮質からの総ての線維とCA1領域、海馬台からの線維を刺激することになる。この様な条件下では私の目指す処のデータは得られない。嗅内皮質表面のポイント刺激によるc-fos蛋白の発現は、海馬長軸方向に約1mmにおよび、長軸直行断面では総ての範囲に広がっており、嗅内皮質第2層星状細胞の軸索展開から考えられる情報の広がりと非常によく一致する。つまり嗅内皮質の一点からの情報は、歯状回、CA3領域全体の1/3に伝えられていると考えられる。今後は、θ波ONの状態、θ波OFFの状態、脳弓刺激下での、嗅内皮質表面刺激によるc-fos蛋白発現の3次元分布を調べていく。
多機能サイトカインGBPの受容体動作機構の解析

多機能サイトカインGBPに対して結合能を有する調節蛋白質GBPBPの大量発現構築に、大腸菌を利用した発現系を用いて成功したのでこれを利用し、GBPBPと、GBP間の相互作用について表面プラズモン共鳴センサーを用いて解析を進めた。また、このGBPBPをN末端、C末端ドメインに分割した発現系を構築し、その結合能の解析を行なった。その結果、GBPとGBPBPの相互作用は、各ドメインのみでは観察されず、両ドメインが必要なこと、また生体内の環境と近い生理食塩水中では、GBPBPの立体構造がかなりの速さで失われ結合能も失っていくことが明らかになった。また、GBP分子のN末端の分子の自由度を高めている残基についての重要性を検討するために、これらの領域に対する変異を導入した変異体の作成を重点的に行い、機能と立体構造相関に関する知見を蓄積した。自由度を高めている要因と考えられるGly残基を自由度の低い残基に置換した変異体をプローブとすることで、受容体のリガンド結合部位に関する知見を得た。また、この知見を基にアンタゴニストとして働くペプチドの作成に成功した。さらに、GBPの立体構造形成に重要と考えられるTyr11をAlaに置換した変異体では、溶液中での立体構造が失われるにもかかわらず、活性を保持するという極めて興味深い現象を発見した。さらに詳細な解析から、受容体結合時に本来の分子の立体構造が誘導形成され、活性を発現しているという可能性を示唆する研究結果を得た。多機能なサイトカインであるGBPに結合し、その活性を調節すると考えられる因子GBP結合タンパク貿(GBPBP)について、大腸菌を利用した大量発現系の構築に成功し、この系を利用する事で、GBPとの相互作用解析を進めた。表面プラズモン共鳴センサーを用いた実験から、血中から得られたGBPBPと遺伝子組換えGBPBPとでは、ほぼ同等のGBP結合能を有することが明らかになった。さらに、GBPBPとGBPの相互作用には、GBPの自由度が重要である可能性が示唆された。また、GBPのアミノ酸を置換した変異体を利用し、その活性と立体構造の変化から、受容体との相互作用を検討する研究では、GBPと相同性の高いペプチドにおいて保存される芳香族残基に注目した研究と、GBPのN末端の収束した立体構造を有しない領域に注目した研究を進めた。前者の研究から、GBPのPhe3の疎水性が受容体結合に重要である事、Try11がコアの構造の維持に不可欠である事を明らかにした。また、後者の研究から、N末端の収束しない領域のもつ主鎖の自由度が、受容体の活性化に重要であることを明らかにした。これらの成果から、GBPのアンタゴニストをデザインし、実際に活性を阻害することを明らかにした。また、GBPの研究に必要なペプチド試料を調整するために、メタノール資化酵母を用いた大量発現系を構築し、活性型でのGBPの産生に成功した他、すでにGBPが結合することが明らかになっているEGF受容体に関連した、他のリガンドの立体構造解析を進めた。
ＨＴＬＶ―Ｉ発がん機序における脱ユビキチン化酵素ＵＳＰ２０・ＵＳＰ３３の役割

HTLV-1は成人T細胞白血病(ATL)の原因ウイルスである。宿主の脱ユビキチン化酵素USP20はNF-kB経路を抑制しATL細胞の増殖を阻害するが、ATL細胞では発現が低下している。したがってUSP20のATL発がんへの関与が示唆される。本研究ではUSP20および近縁分子USP33がp53と結合し、機能を活性化することを見出した。またHTLV-1のがん蛋白TaxとHBZは共に細胞内でユビキチン化され、活性が増強されることも判明した。USP20は両者のユビキチン化を減少させた。ATL細胞はUSP20の発現を抑制することにより、TaxとHBZのユビキチン化を維持していることも示唆される。Human Tcell leukemiavirus type I (HTLV-I)は成人T細胞白血病(ATL)の原因ウイルスである。研究代表者は脱ユビキチン酵素ubiquitin specific peptidase 20 (USP20)がNF-κB経路を抑制し、ATL細胞の増殖を阻害することを報告した。これらの所見はUSP20の発がんメカニズムへの関与を示唆させる。本研究はHTLV-Iによる細胞不死化におけるUSP20とそのファミリーであるUSP33の詳細な機能解析を目的とし、NF-κB経路のみならず、細胞増殖や細胞死に関わる様々な経路における基質の同定とその機能制御メカニズムを明らかにすることを目的としている。1. USP20/33の新規基質の同定と、USPsがその機能に与える影響USP20もしくはUSP33との結合分子の同定を試み、USP20およびUSP33がDNA損傷応答分子と結合することを見出した。p53反応性レポーターベクターを用いて、ルシフェレースアッセイを行い、USP20とUSP33が上記シグナル伝達の活性化に関与していることが示唆された。現在その機序について解析を進めている。さらに、Usp20ノックアウトマウス、Usp33ノックアウトマウスを作成し、表現型を解析中である。2. HBZ蛋白およびTax蛋白のユビキチン修飾の解析HTLV-1 HBZ蛋白がTax同様ユビキチン修飾を受けているかどうかについて解析し、HBZは細胞内でユビキチン化されていることが明らかとなった。HBZの機能におけるユビキチン修飾の意義、また修飾の分子機構を解析中である。Human Tcell leukemia virus type I (HTLV-I)は成人T細胞白血病(ATL)の原因ウイルスである。1. USP20/33の機能解析USP20もしくはUSP33との結合分子の同定を試み、USP20およびUSP33がp53と結合することを見出した。p53反応性レポーターベクターを用いてルシフェレースアッセイを行い、USP20とUSP33がp53の転写能活性化に関与していると考えられた。一方、USP20の脱ユビキチン化能欠失型変異体がp53活性機能を保持していることが判明し、USP20によるp53活性化は脱ユビキチン酵素活性に依存しない機序によると考えられた。Usp20ノックアウトマウス、Usp33ノックアウトマウスを作成した。これらは全て正常に生育し、肉眼的に明らかな異常を認めなかった。2. HBZ蛋白およびTax蛋白のユビキチン修飾の解析HBZは細胞内でユビキチン化され、HBZのTGF-b/Smad経路の活性化に関与することを見出した。さらに、USP20がTaxのみならずHBZのユビキチン化を減少させることが明らかとなった。本研究は脱ユビキチン化酵素USP20、USP33の詳細な機能解析を通して、human T-cell leukemia virus type 1 (HTLV-1)による細胞不死化のメカニズムを解析している。1. USP20の新規基質の同定:脱ユビキチン化酵素は細胞内において基質と物理的に結合するため、USP20もしくはUSP33との結合を指標にこれらの基質分子の同定を試み、USP20がDNA損傷応答分子と結合することを見出した。2.ルシフェレースアッセイ:共

免疫沈降法により同定したUSP20/USP33結合分子の機能解析のためp53反応性レポーターベクターを用いて、ルシフェレースアッセイを行った。USP20/USP33の強制発現、および内在性発現のRNAiによるノックダウンにより、USP20とUSP33が上記シグナル伝達に関与している可能性が示唆された。3. HBZ蛋白およびTax蛋白のユビキチン修飾の解析:HTLV-1 HBZ蛋白がTax同様ユビキチン修飾を受けているかどうかについて解析した。具体的にはHEK293細胞にHAタグ付加ユビキチン分子とmycタグ付加HBZの発現ベクターを導入し、抗mycタグ抗体で免疫沈降後ウエスタンブロットを行い抗HA抗体にてユビキチン化HBZ蛋白の検出を試みた。その結果、HBZは細胞内でモノユビキチン化されている可能性が示唆された。当初の目的であったUSP20/33の新規結合分子を同定し、機能評価も順調に進んでいる。生体におけるUsp20およびUsp33の機能解析に重要である、各々のノックアウトマウスも樹立した。また、HTLV-1 HBZタンパクがユビキチン化されることも見出しており、その発がんにおける意義についても解析を進めている。当初の目的であったUSP20/33の新規結合分子を同定し、機能評価も順調に進んでいるため。また、HTLV-1 HBZタンパクがユビキチン化されることも見出している。1.新規USP20/33結合因子の機能解析およびノックアウトマウスによるUSP20/33の機能解析同定した新規のUSP20/33結合分子における、ユビキチン化、脱ユビキチン化修飾の生理学的意義、またUSPがその活性に及ぼす影響について解析を進める。また、Usp20およびUsp33のノックアウトマウスの表現型について評価を進める。2. HBZにおけるユビキチン化修飾の意義HBZの機能にユビキチン化修飾が及ぼす影響、また修飾の機構を解析する。同定した新規のUSP20/33結合分子における、ユビキチン化、脱ユビキチン化修飾の生理学的意義、またUSPがその活性に及ぼす影響について解析を進める。当初計画していなかった、USP20/33のノックアウトマウスの作成も開始しており、生体におけるこれらの重要性について評価する予定である。該当なしUSP20/30の機能解析を目的とし、ルシフェレースアッセイ、免疫沈降法、ウエスタンブロット、免疫組織染色等の実験を予定しており、抗体、遺伝子導入試薬、ルシフェレース基質等の消耗品購入を予定している。国内1回、海外1回の学会参加を予定しており、旅費および参加費に使用する。
都市におけるエコミュージアム的視点

本研究は、台東区谷中地区の街づくりNPO「谷中学校」中心に開催されている「谷中芸工展」をケーススタディとして、コミュニティを基盤とするパブリックアートの可能性が、都市におけるエコミュージアム(以降EMと略記)的視点を導くことを検証した。それは、行政主導による地域振興策として、住民不在のまま展開しがちなEMに対するアンチテーゼであると共に、多元主義の時代における芸術のあり方を示唆するものである。本来EMとは、その発祥の地フランスにおいて「ある一定の地域にて、住民参加により、地域で継承されてきた環境と生活様式を表す自然・文化遺産を総体にして、恒久的な方法で、研究・保存・展示・活用する機能を保証する文化機関」と定義づけられている。それは、地方分権主義による地域振興策として展開するが、その運営には主体的な住民の積極的参加が必要である。そして、核となる施設と多くのサテライト施設を配置し、ネットワーク構築により、地域の同質性が強調されることになる。しかし、住民が管理・運営する主体者として自律していく過程にあって、同質性からの離脱は必至であり、多くの主体者が調整しあい節合を模索することとが要求される。それは、多元化した社会における公共圏のモデルであり、オルタナティブな社会理念の提示ともいえる。同様に、芸術が生産される場において、非営利で主体的な市民による活動は、美の自律性に立脚する旧制度を否定し、新しい美的環境を提示する。それは、行き詰まった芸術行政を是正し、芸術支援や芸術運営を円滑にして、社会と芸術の結びつきを強固にする。このとき、芸術の主体は私的所有を放棄し、他者との調整を通して領有を受け入れることになる。それは、オルタナティブな公共圏における芸術の可能性であり、パブリックアートの本質を開示するとともに、多元主義の時代におけるEMの方向性をも提示する。本年度は、東京都台東区谷中地区におけるアートプロジェクトを中心に、新しいパブリックアートの可能性と、それが都市におけるエコミュージアム的視点を導くことを検証した。具体的には、街づくりNPOである「谷中学校」を中心に開催された「谷中芸工展」に積極的に関わり、それが、地域独特の芸術的な場の力と記憶を喚起することに注目した。また、他のアートプロジェクトと連携し催した「ART Link上野・谷中」と、大阪市平野区で開催された「モダンde平野」を分析し、非営利で自発的な市民主体の芸術活動の可能性と問題点を考察した。ここで、従来のパブリックアートとは異なる「コミュニティに結びついたパブリックアート」という立場を確認するが、それはオルタナティブな意識を高め、公共空間におけるアクティビストとしてのア-ティストという立場を明確にする。このような新しい立場は、80年代以降の欧米の事例の中に多く確認され、それがモダニズムの美学を乗り越えるものとして意識された。つまり、美や芸術の自律性を標榜する純粋美学は有効性を失っているのである。それは、平成9年度美学会全国大会において中心テーマとなった環境美学の構想と軌を一にするものでもある。環境美学は、応用美学として積極的に社会との関わりを提示するが、ここで人間が環境の主体となることの弊害は強く意識すべきである。つまり、環境は主体としての人間が「所有」するのでなく、環境に対する意識を「領有」するという立場が必要となる。すると、エコミュージアムやパブリックアートにおいては、スペクタクルやモニュメントとして「所有」されるのではなく、多く市民の慣習や記憶のなかで「領有」されるという立場が求められることになる。
前庭性脳幹誘発反応検査法の確立への基礎的研究

ネンブタール麻酔をしたラビットを脳定位固定装置に固定して、震盪装置(刺激周期、0.5H_Z)の上に載せてガラス電極で前庭神経核、小脳片葉、上丘、動眼神経核、外転神経核、滑車神経核、視床、大脳皮質の頭頂葉での細胞外電位記録を行った。前庭神経核では刺激の周波数と同期した同じ周期の反応(phasic response)と全く規則性を持たない反応(tonic response)が得られた。また刺激周期を速くするとそれに伴いtonic responseは反応が強くなった。前庭神経核より上位の外転神経核では、この実験系では震盪装置の振動が多少電位記録に影響するためか、反応はtonic responseのみであった。しかし、眼球運動は水平性振動周期に同期した運動であった。ラットでの前庭性脳幹誘発反応は同じくネンブタール麻酔した状態で脳定位固定装置に頭部が水平になるように固定したまま震盪装置の上に載せ、関電極を頭頂部に、不関電極を頸部に装着し0.5hzの刺激で100msecの解析時間で100回加算した。これによって得られた波形は3個のピークを持つ陰性波であり、約5,10,20,msecでピークが見られた。また、これらのピークの潜時は刺激する周期を速くすると短縮する傾向が見られた。2HZ以上の刺激ではこれ以上の潜時の短縮は見られなかった。この実験系の刺激様式としては、主に振子用の直線加速度になるため、刺激されている受容体は耳右器管にあたる。確かに、遠隔電位を加算して前庭性と考えられる反応が得られたが、さらに破壊実験を追加して確実な前庭性の反応であることを調べるために現在追加実験中である。
骨髄由来細胞が分泌する神経再生因子の解析ー脊髄損傷の治療に向けてー

我々は、これまでに骨髄間質細胞を脊髄損傷モデルラットに移植すると、形態学的および行動学的に著名に回復することを明らかにしてきた。移植した骨髄間質細胞は脊髄内で最初は生着するが、23週間後には消失することから、骨髄間質細胞は宿主に組み込まれて効果を発揮するのではなく、細胞から分泌された液性因子によって効果をもたらすと考えられる。また、細胞調製がより簡便である骨髄単核球細胞を用いた移植も有効であることがわかってきた。そこで、我々は、骨髄間質細胞および骨髄単核球細胞が分泌する因子の網羅的解析が必要と考え、両者が分泌する神経再生因子の比較および分離精製を進めている。まず、4週齢Sprague-Dawley (SD)ラットの大腿骨および脛骨の骨髄液から採取したラット骨髄間質細胞を継代培養し、無血清培養上清を回収した。これらの培養上清を新生仔ラットの海馬由来神経細胞に添加したところ、神経細胞の生存維持と突起伸長の促進がみられた。そこで、培養上清から、神経突起伸長能を指標にして、ヘパリンアフィニティー、イオン交換、ゲルろ過、逆相などの液体クロマトグラフィーを組み合わせて、神経突起伸長活性の有する分画の分離精製を行った。一連のカラムワークにより得られた精製標品は、質量分析計を用いて同定を行っている。これまでの解析を通して、培養上清には神経再生に関わる因子が複数存在し、これらが協調して神経再生に携わっていると考えられる。これらの因子の性質について解析を進めている。平成30年6月の大阪北部地震で本学は多大な被害を受け、培養室や液体クロマトグラフィーが数ヶ月にわたり使用できなかった。復旧したところから実験を再開している。地震で被害を受けた機器類はほぼ復旧した。復旧に伴い機器が新しい型になったことならびにこれまで得られたデータの蓄積を利用することにより、今後は効率よく研究が進むものと考えている。平成30年6月に起きた大阪北部地震で多大な被害を受けて、研究が数ヶ月にわたって中断した。次年度は、昨年度未実施である研究計画とともに、もともとの研究計画も行えるようになお一層注力していきたい。
注意制御機構の認知神経科学的研究：課題非関連情報の能動的な抑制

選択的注意は,ヒトが行動に関連する情報を取捨選択するうえで重要な認知機能である。ヒトの注意制御機構を検証することは,なぜヒトがときに重大なエラーを起こすのかを理解する一助となる。本研究は,ヒトが視覚環境の特定の情報に意図的に注意を向けるときと,意図的に注意をそらすときにはたらく認知制御メカニズムを解明することを目的とする。そのために,行動実験と脳波計測を組み合わせ,注意の促進と抑制が協調してはたらく認知機能がどのように脳内で表現されているのかを検証する。本年度は,申請者らが確立した行動実験の手法(Kawashima & Matsumoto, 2018 Acta Psychologica)を拡張した脳波計測実験を行い,課題非関連な情報の抑制メカニズムを検討した。ヒトがある行動目的を達成するためには,目下の課題とは関連のない情報の処理を抑制することが必要である。このときにはたらく選択的注意は,ヒトが行動に関連する情報を取捨選択するうえで重要な認知機能である。このヒトの注意制御機構を検証することは,なぜヒトがときに重大なエラーを起こすのかを理解する一助となる。本研究では,ヒトが視覚環境の特定の情報に意図的に注意を向けるときと,意図的に注意をそらすときにはたらく認知制御メカニズムを解明することを目的とする。この研究目的を達成するために,本年度は脳波測定と行動実験を組み合わせ,課題関連情報への注意の促進と課題非関連情報への注意の抑制のメカニズムを検討した。具体的には,特定の標的刺激を複数の妨害刺激から検出する視覚探索課題を行ってもらう前に,標的刺激の色(注目手がかり)または妨害刺激の色(無視手がかり)を教示するパラダイムを採用した。このとき,手がかり条件のあいだで実験参加者が観察する課題画面が同様になるように操作を与えた。無視すべき刺激に誘発される電位に着目した脳波解析の結果,注目手がかり条件に比べ,無視手がかり条件ではより大きなPd成分とより小さなN2pc成分が観察された。これは,事前に無視すべき特徴を知っていると,無視すべき刺激が能動的に抑制されうることを示している。この結果は,近年の無視手がかりがどのように使用されているのかという議論に基礎的な資料を提供するものであると考えられる。本年度は,当初の計画通り脳波計測実験を行うことができ,申請者らの行動実験から議論を展開できる結果を得ることができた。現在,この成果を報告する準備をしている。そのため「おおむね順調に進展している」と判断した。本年度の脳波計測実験により,課題非関連情報の能動的な抑制が脳の視覚情報処理の初期段階からはたらくことを示唆する知見を得た。今年度は,この成果の報告を行うとともに,この知見をもとに実験パラダイムの吟味を行い,さらなる心理学実験や脳機能計測によって視覚的注意の制御機構の解明を進展させる。
ｍｉｃｒｏＲＮＡのターゲット捕捉機構を狙い撃つ新規核酸素子の開発

昨今、microRNAの発現異常が、ガンなどの重篤な疾患を引き起こす原因となることが明らかとなり、microRNAの機能を特異的に制御する機能性分子の開発が希求されている。microRNAは、RISC (RNA-induced silencing complex)と呼ばれるリボヌクレオプロテインとなった後、遺伝子発現を制御する。RISCは、RISC中のmicroRNAと相補的なmRNAへ結合するため、microRNAはRISCのターゲット捕捉機構の要となっている。本申請課題では、RISCの標的鎖認識過程に焦点を絞り、その機能を特異的に制御する新規核酸素子の開発を目的とした。本年度は、RISCからmicroRNAを解離させるペプチドコンジュゲート核酸(RINDA)の分子設計の最適化、microRNA解離能の評価、レポーター遺伝子を用いた迅速アッセイ系によるRISC機能阻害効果の評価を行った。Gluの連続配列(EEE)を持つRINDA (E3)は、ペプチドを持たないオリゴ核酸(ASO)と比較し、RISCからのmicroRNA解離能ならびに生細胞中におけるRISC機能阻害効果が顕著に向上することが明らかとなった。一方、Lysの連続配列を有するRINDA(K3)-asのRISC機能阻害効果はASOより低下することが確認された。RISCにはmicroRNAの5'末端を保持する塩基性ポケットが存在することが知られているが、そのポケットとRINDAのペプチド配列との相互作用がRISCの機能を阻害する上で重要であると考えられる。今後、ガン細胞亢進性のmicroRNAを標的としたRINDAを種々設計し、その効果を網羅的に評価する予定である。昨今、microRNAの発現異常が、重篤な疾患を引き起こす原因となることが明らかとなっている。microRNAは、RISCと呼ばれるリボヌクレオプロテインとなった後、mRNAのGキャップ構造を認識して結合し、遺伝子発現を制御する。本研究課題では、microRNAのGキャップ認識過程を狙い撃ち、その機能を特異的に制御する新規核酸素子の開発を目的とした。今年度はRISCからmicroRNAを剥離する機能性核酸Antago(piwi)-Asの、オリゴRNAとペプチド間のリンカー構造の検討、ならびにペプチド配列の最適化を行った。これまでは、オリゴRNAとペプチド間をS-S結合により架橋していた(design I)が、S-S結合は細胞内のグルタチオンによって切断される可能性がある。このため、アンチセンス核酸とペプチド間の架橋構造を、アルキルリンカーによる架橋構造に変更し(design II)、リンカーの化学構造がRISC機能抑制効果に及ぼす影響について考察した。NH2基が修飾されたCPGを使用し、Fmoc固相合成法によりCPG上にアミノ酸配列を縮合した後に、microRNAと相補的な配列を有する2'-O-Methyl型RNAを固相ホスホロアミダイト法により伸長した。HeLa細胞中でRISC機能抑制効果を評価したところ、RISC機能阻害効果を確認することが出来た。しかし、design Iと比較してその効果の向上は認められなかった。この原因として、design IIは、リンカー長はdesign Iとほぼ同じであるが、リンカー部分にヒドロキシメチル基の分岐構造を有する。この高い構造が立体障害となり、アンチセンス核酸がRISC中のmicroRNAヘ結合するのを阻害している可能性が考えられる。よって今後は、分岐構造などを含まないリンカーの検討を行う予定である。昨今、microRNAの発現異常が、重篤な疾患を引き起こす原因となることが明らかとなっている、microRNAは、RISCと呼ばれるリボヌクレオプロテインを形成した後、標的遺伝子を補足しその発現を制御する。本研究課題では、microRNAの標的鎖補足機構を狙い撃つ新規核酸素子の開発を目的とした。本年度は、前年度までに開発した機能性核酸(RINDA)のRISC機能阻害効果を生細胞系で評価することに主眼を置いて研究を遂行した。前年度、Gluの連続配列を持つRINDA(E3)のRISC機能阻害効果が、ペプチドを持たないオリゴ核酸(ASO)と比較し、有意に向上することが明らかとなった。そこで、より高い効果を示すRISC機能阻害分子の開発を目指し、Gluの連続配列が異なる6種類のRINDAを合成した。合成したRINDAのRISC機能阻害効果を評価したところ、RINDA(E1)ならびにRINDA(E3)の効果が最も高いことが確認された。生細胞で観察された結果の作用機序を理解するため、細胞溶解液を用いた実験系の立ち上げにも着手した。今後、立ち上げた新たな実験系を用い、RINDAの作用機序を明らかにしていきたい。核酸化学今年度は開発したRINDA-OligoがRISCからどの程度microRNAを解離することが可能であるかを定量評価する実験系の構築に成功し、RINDAのペプチド配列について概ねの最適化が完了した。また、生細胞中におけるRINDA-OligoのRISC機能阻害効果についても評価することが出来た。RINDA-Oligoを用いることで、細胞内でのRISC機能阻害を行えるだけでなく、その後の作用機序解析まで達成出来るものと確信している。

よって、当初の研究計画通り、本研究課題の最終的な目的を実行するために十分な研究成果と知見を得られたと考えている。RISCのGキャップ認識能を認識する分子モチーフを探索することを今年度の課題の1つとしていたが、RISCをターゲッティングする機能性核酸の分子デザインについて、ペプチドとオリゴRNAとの間を架橋する化学構造が、現行のS-S結合タイプではグルタチオンによる切断を免れないため限界があり、このリンカー構造の検討を今年度まず検討することとした。現在、最初のデザインよりもやや効果は劣るものの、ペプチドとオリゴRNAとの間をアルキルリンカーで架橋することでRISC機能阻害効果を維持出来ていることを確認している。この機能性核酸を用いることで、細胞内でのRISC機能阻害を行えるだけでなく、その後の作用機序解析まで達成出来るものと確信している。よって、当初の研究計画と多少異なるものの、本研究課題の最終的な目的を実行するために十分な研究成果と知見を得られたと考えている。前年度、レポーター遺伝子を用いて分子構造の最適化されたRINDA-Oligoの標的を、ガン細胞で高発現しているmicroRNA (onco-miR)へ移行し、核酸医薬としての有効性を評価する。標的onco-miRとしては、ガン細胞で高発現していることが報告されているmiR-21およびmiR-10b、miR-133を選択する。対象としてヒト乳ガン細胞、ヒト子宮頸ガン細胞、ヒト白血病細胞を用い、合成したRINDA-Oligoの効果を評価する。コントロール分子と比較して、RINDA-Oligoがどの様な効果を発揮するかを、WST-1アッセイを用いた細胞増殖率評価、Migration Assayを用いた細胞遊走能評価を中心に検討する。可能であれば、担癌マウスを作成し、RINDA-Oligoを導入したガン細胞の造腫瘍性を検討し、in vivoでの有効性まで評価したい。ガン細胞および実験動物を用いて得られた結果を、RINDA-Oligoのデザインに繰り返しフィードバックし、分子構造のさらなる最適化を行う。HEK293T細胞溶解液と、microRNAとを混合し、RISCを形成させる。その後、系中にGFPまたはルシフェラーゼmRNAを添加する。RISCが形成されていれば、mRNAからの遺伝子発現が抑制されるため、GFPおよびルシフェラーゼタンパク質は産生されず、発光しない。ここへ、前年度に設計した種々のAntago(piwi)-ASを添加する。An tago(piwi)-ASがRISC機能を制御出来れば、レポータータンパク質の産生が再開され、発光が回復する。
microRNA作用メカニズムの統合的理解

microRNAが、「翻訳の抑制」と「poly(A)鎖の分解」の2つの異なる経路を用いて標的遺伝子のサイレンシングを行う分子レベルのしくみに着目し、研究を展開した。その結果、microRNAがはたらくために必要な中核因子であるArgonauteタンパク質の品質を保証する、新しいE3ユビキチンリガーゼIrukaの同定に成功した。また、microRNAがCCR4-NOT脱アデニル化複合体を介してpoly(A)分解反応を促進する際の、各因子の特性やATPの要求性について生化学的に詳細な検証を行い、これまで知られていなかった新しい性質を明らかにすることに成功した。microRNAによる「翻訳の抑制」については、標的mRNAから翻訳開始因子eIF4Aの解離を引き起こすために必要であると想定されるFactor Xの同定を目指し、過去に実績のある4-thio-Uだけではなく、5-iodo-Uや5-bromo-Uなどの様々な架橋剤を標的RNAに導入し、クロスリンク実験を行った。その結果、4-thio-Uで検出されたバンドに加え、いくつかの新しいバンドの検出に成功した。種々の抗体を用いた免疫沈降実験を行い、それらのバンドの同定を目指したが、これまで4-thio-Uで検出していた因子群の他に新規因子の同定には至らなかった。一方で、Argonauteの野生型および翻訳抑制活性欠失変異体に対して結合するタンパク質を、免疫沈降と質量分析を用いて網羅的に解析したところ、野生型特異的に結合する一群の因子が同定された。これらの中にFactor Xに相当するものがあるかどうか、今後慎重に解析を進めたい。microRNAによる「mRNAの分解」に関しては、分解の第一段階である脱アデニル化を担うCCR4-NOT複合体に着目した解析を進めた。モデルとなる基質mRNAの検討を進めていたところ、CCR4-NOT複合体は、これまでに知られていた3'末端にpoly(A) tailを持つmRNAだけではなく、poly(A)のさらに下流にA以外の塩基が付加された様な基質に対しても作用しうるということが明らかになった。近年の網羅的解析から、このようなpoly(A)下流の修飾が生体内で高頻度で起きていることが報告されているため、今後の展開が期待できる。microRNAによる「翻訳の抑制」に関しては、Factor Xの同定には至っていないものの、その候補因子は複数取得できてきている。また、microRNAによる「mRNAの分解」についても、poly(A)下流の修飾も含めてmicroRNAが作用しうるという興味深い知見を得ている。従って、全体としてはおおむね順調に進展している。microRNAが標的mRNAのpoly(A)鎖の分解を行う際に誘導されるCCR4-NOT複合体に着目し、poly(A)分解反応の詳細な生化学的解析を行った。その結果、細胞内においても試験管内においても、poly(A)配列の下流にA以外の塩基配列が存在する場合には、CCR4-NOT複合体によるpoly(A)の分解は阻害されるが、上流のpoly(A)配列の長さをより長くすると、その阻害効果はキャンセルされた。また、CCR4-NOT複合体に含まれるCCR4とCAF1という2つの脱アデニル化酵素の両方が、このような性質を有することが確認された。つまり、CCR4とCAF1というmiRNAによる脱アデニル化反応を担う酵素群は、共にアデニン塩基を好むエクソヌクレアーゼであるにも関わらず、poly(A)配列の長さとその下流のA以外の塩基配列のバランスに依存して、その活性強度が変化するという性質を内在的に持ち合わせるという新たな知見を得るに至った。近年、生体内においても、poly(A)鎖はその下流にウラシルやグアニンなどの塩基が付加されているという報告が成されており、poly(A)配列の下流に存在するA以外の配列も除去できるというCCR4-NOT複合体の酵素学的性質は、poly(A)鎖およびその付加配列の制御を考える上で興味深い。microRNAによる翻訳抑制については、その生体内における意義を明らかにするため、個体内においてpoly(A)分解と翻訳抑制を切り分けることを目的として、poly(A)分解に必須の遺伝子であるgw182のノックアウトショウジョウバエ個体の作成を開始した。poly(A)の分解反応の主体であるCCR4-NOT複合体の酵素学的解析を行い、poly(A)配列の長さとのバランスに依存してその下流のA以外の塩基配列も分解できるという新規な活性をとらえることができた。これは、microRNAによるpoly(A)分解を考える上でも、CCR4-NOT複合体を利用する様々なRNA結合タンパク質の働きを考える上でも、重要な知見であると考えられる。またmicroRNAによる翻訳抑制についても、ショウジョウバエを用いた個体解析に向けて準備を進めており、全体としては順調に進展していると考えられる。これまでに、細胞抽出液を用いた試験管内反応の結果から、CCR4-NOT複合体を介したmicroRNAによるpoly(A)の分解はATPを必須とするという知見を得ていた。microRNAと同様にCCR4-NOT複合体を用いるSmaugなどのRNA結合タンパク質によるpoly(A)分解反応についても、細胞抽出液を用いた実験から、やはりATPが必要であるということが報告されていた。しかし、CCR4-NOT複合体に含まれるCCR4とCAF1という2つの脱アデニル化酵素は、どちらも共に単体ではその脱アデニル化反応にATPを必要としない。従って、microRNAやSmaugによる脱アデニル化にATPがなぜ、どこの段階で必要なのかは大きな謎として残されていた。

そこで、ADPをATPに再生するクレアチンキナーゼ、ATPをADPに分解するヘキソキナーゼ、さらにAMPをアデノシンとリン酸に分解する5'ヌクレオチダーゼなどを組み合わせ、様々な脱アデニル化反応条件におけるATP, ADP, AMPの存在比と脱アデニル化反応効率を詳細に比較して検討したところ、細胞抽出液を用いた実験系では、ATPの再生系非存在下において、ATPはすみやかにAMPに分解され、その蓄積したAMPこそが脱アデニル化反応を強力に阻害しているということが明らかとなった。つまり、microRNAやSmaugによる脱アデニル化反応においては、「ATPの枯渇」ではなく「AMPの蓄積」が反応を阻害を阻害していたということが示された。これはmicroRNAだけではなくSmaugなど脱アデニル化反応を誘導するRNA結合タンパク質の動作原理を考える上で重要な知見である。またmicroRNAによる翻訳抑制についても、培養細胞やハエ個体を用いた解析を進め、脱アデニル化反応と切り分けて解析できる目処を付けることができた。microRNAが、「翻訳の抑制」と「poly(A)鎖の分解」の2つの異なる経路を用いて標的遺伝子のサイレンシングを行う分子レベルのしくみに着目し、研究を展開した。その結果、microRNAがはたらくために必要な中核因子であるArgonauteタンパク質の品質を保証する、新しいE3ユビキチンリガーゼIrukaの同定に成功した。また、microRNAがCCR4-NOT脱アデニル化複合体を介してpoly(A)分解反応を促進する際の、各因子の特性やATPの要求性について生化学的に詳細な検証を行い、これまで知られていなかった新しい性質を明らかにすることに成功した。microRNAによる「翻訳の抑制」に関しては、これまでに試行した光架橋剤だけではなく、標的mRNAのキャップ構造末端にあるm7Gのリボースを過ヨウ素酸で酸化・開環してシスアルデヒドとし、シアノ水素化ホウ素ナトリウムを用いて結合したタンパク質の遊離アミノ基と還元・架橋するという化学的架橋法も検討し、microRNA依存的に標的mRNAのキャップ構造近傍に呼び込まれ、翻訳開始複合体を解離させる責任因子Factor Xを同定する。microRNAによる「mRNAの分解」については、CCR4-NOT複合体がpoly(A)下流のA以外の塩基が存在する場合でも脱アデニル化を誘導できるという知見に基づき、その分子メカニズムの解析を行う。また、microRNAによる脱アデニル化反応におけるATPの役割についても、慎重に解析を進める。microRNAによるpoly(A)の分解反応については、引き続きCCR4-NOT複合体に含まれるCCR4とCAF1という2つの脱アデニル化酵素に着目し、生化学的な解析を進める。特に、microRNAによる脱アデニル化反応はATPを必要とするという予備データに基づき、ATPがどの段階で役割を果たしているのかを詳細に解析する。