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システムマシン用二層主軸構造の熱変形抑制方法

本研究では,次世代生産システムを指向する工作機械への搭載が有効であると考えられる「二層主軸構造」を対象として,本構造の特徴的な熱的挙動を解明するとともに,その熱的挙動を考慮した熱変形抑制方法を提示することを目的としている.本年度は最終年度であることから,熱変形抑制のための具体的な冷却システムを構築し,その効果を実験的に検討した.本研究により得られた新たな知見は以下の通りである.1.二層主軸構造のモデル実験により,当該構造における特徴的な温度挙動として,内主軸が回転している条件で外主軸の回転数を増加した際に,ある回転数で内主軸の温度が極小となることを明らかにした.2.二層主軸構造における特徴的な変位挙動として,内主軸の軸方向変位が,内側軸受を介して内主軸を支持するクイルの軸方向変位挙動により抑制されることを指摘した.具体的には,外主軸後端の軸方向変位が顕著な場合に,外主軸とボルト締結されたクイルを介して幾何学的拘束が生じ,内主軸前端の軸方向変位を抑制することを明らかにした.3.これまでに明らかにした熱的挙動に基づき,二層主軸構造における効果的な熱変形抑制方法について,「外主軸を回転させることにより内側軸受での発熱を外側軸受側へ等価的に移動させたうえで,外側軸受を冷却する」との方針を立て,外側軸受を支持する軸受ハウジングに対して温度制御されたシリコンオイルを循環させるジャケット冷却システムを構築し,その冷却効果を検討した.実験結果からは,内主軸を格納した場合には内主軸の温度上昇が抑制されるものの,内主軸を繰り出した場合には逆に温度・変位とも増加することが明らかになった.この原因として,二層主軸構造特有と考えられる各構成要素の変位挙動の影響を指摘し,内主軸の熱変位を抑制するためには,軸受予圧を大きく変えない範囲でクイル側からの拘束力を利用する方法が有効であることを明らかにした.本研究では,次世代生産システムに高度に適合する工作機械,すなわちシステムマシンには,その主軸構造として,複合加工機能をはじめ多くの機能を実現することのできる「二層主軸」が有効であるとの観点に立ち,これまでにほとんど明らかにされていない,二層主軸構造の合理的な熱変形抑制方法を提示するとともに,その有効性を明らかにすることを目的としている.平成9年度においては,この研究目的を達成するために以下のような基本的かつ重要な要素研究を実施し,平成10年度に予定している具体的な熱変形抑制システムの構築へ向けて準備を整えた.(1)二層主軸構造モデルを用いて,各種運転条件における構造各部の熱的・力学的挙動を明らかにした.その結果,本構造の熱的・力学的特性に大きく影響する因子として,内・外主軸回転数や軸受予圧,内主軸の軸方向繰り出し量のような基本的運転条件の他に,主軸系内に存在する空隙部の温度及び内外主軸系間の接触圧力分布が挙げられることを明らかにした.(2)二層主軸構造の熱的・力学的特性は,基本的に,内主軸系熱システムと外主軸系熱システムとの間の熱的バランスにより決定されることを明らかにした.また,この熱的バランスの形成には空隙部の温度挙動が重要な役割を果たすことを,二層主軸構造の構成要素間の熱移動を記述した熱的相関モデルを用いて示すことができた.(3)これまでほとんど行われていない,内主軸(最内層の主軸)の熱変形抑制を実現することを目的として,軸心から通風冷却を行った結果,当該部分の空冷が有効であるとともに,主軸系全体の熱変形挙動を基本的に制御することが可能であることを明らかにした.以上のような一連の研究結果から,内外主軸系の熱システム間の熱的相互干渉効果を念頭に置いた対策が必要であることなど,最終年度で予定している熱変形抑制システムの構築に必要な情報を獲得することができた.本研究では,次世代生産システムを指向する工作機械への搭載が有効であると考えられる「二層主軸構造」を対象として,本構造の特徴的な熱的挙動を解明するとともに,その熱的挙動を考慮した熱変形抑制方法を提示することを目的としている.本年度は最終年度であることから,熱変形抑制のための具体的な冷却システムを構築し,その効果を実験的に検討した.本研究により得られた新たな知見は以下の通りである.1.二層主軸構造のモデル実験により,当該構造における特徴的な温度挙動として,内主軸が回転している条件で外主軸の回転数を増加した際に,ある回転数で内主軸の温度が極小となることを明らかにした.2.二層主軸構造における特徴的な変位挙動として,内主軸の軸方向変位が,内側軸受を介して内主軸を支持するクイルの軸方向変位挙動により抑制されることを指摘した.具体的には,外主軸後端の軸方向変位が顕著な場合に,外主軸とボルト締結されたクイルを介して幾何学的拘束が生じ,内主軸前端の軸方向変位を抑制することを明らかにした.3.これまでに明らかにした熱的挙動に基づき,二層主軸構造における効果的な熱変形抑制方法について,「外主軸を回転させることにより内側軸受での発熱を外側軸受側へ等価的に移動させたうえで,外側軸受を冷却する」との方針を立て,外側軸受を支持する軸受

ハウジングに対して温度制御されたシリコンオイルを循環させるジャケット冷却システムを構築し,その冷却効果を検討した.実験結果からは,内主軸を格納した場合には内主軸の温度上昇が抑制されるものの,内主軸を繰り出した場合には逆に温度・変位とも増加することが明らかになった.この原因として,二層主軸構造特有と考えられる各構成要素の変位挙動の影響を指摘し,内主軸の熱変位を抑制するためには,軸受予圧を大きく変えない範囲でクイル側からの拘束力を利用する方法が有効であることを明らかにした.
吸入麻酔薬の脊髄レベルでの鎮痛作用

除脳し麻酔を中止したラットから脊髄後角細胞の単一活動電位を記録した。その細胞に触刺激、ピンチ刺激、熱刺激などの刺激を加えその細胞が低域値細胞(Low Threshold Cell;LT cell)か広作動域細胞(Wide Dynamic Range Cell;WDR cell)かを区別した。それぞれの細胞の触刺激に対する受容野(Receptive Field;RF)を麻酔薬を投与する前に調べ、その面積をコントロール値とした。その後吸入麻酔薬(ハロセン)を低濃度から与え、15分後に再びそのRFを調べそれぞれの面積を計算し、比較した。これまでに10個のLT cellおよび3個のWDR cellからデータが得られた。LT cellではRFの面積は0.5,1.0%のハロセン濃度でそれぞれコントロール値の約60%、95%に減少していた。WDR cellでも同様の傾向が得られた。これまでの結果から除脳したラットにおいて脊髄後角細胞の発射活動は吸入麻酔薬の濃度依存性に抑制されることが判明した。
フェノールのp-位酸化反応の開発とフレデリカマイシンAの不斉全合成への応用

フレデリカマイシンA(1)は、制癌活性が強く、変異原性が無く、また、合成化学的にも極めて興味深い化合物でその全合成が競って行われているが、絶対配置は未だ不明である。申請者らはこれまでに不斉全合成に有効な分子内[4+2]環化付加反応によって、1の各半分の構造(ABCD環及びDEF環構造)の優れた合成法を開発したが、B環フェノールのp-位への水酸基導入が問題点として残った。本研究では、この点の解決と1の不斉全合成を目指して、研究計画に基づき研究を行った。1.フェノール類のp-位へスルフィニル基を導入し、次いでトリフルオロ酢酸無水物で処理すると、プメラ-型転位反応と脱硫酸反応が一挙に進行してキノン類を与えることを見出し、本法を種々の官能基が共存できる簡便で一般的な新規キノン合成法として確立した。一方、p-スルフィニルフェノールエーテル類からは、トリフルオロ酢酸無水物にスチレンを共存させる条件下にスルフィニル基がアシロキシ基に定量的にipso-置換し、一挙に保護されたジヒドロキノンを与える新反応を見出した。2.1.のipso-置換反応をp-位にスルフィニル基を有するペリヒドロキシ多環式芳香環化合物に応用したところ、ペリヒドロキシ部分のシリレン保護が重要で、そのことにより本ipso-置換反応が高収率で進行してペリヒドロキシ-ジヒドロキノンを高収率で与えることが分かり、冒頭の問題点の解決策を見出した。現在、本法を用いて、まず1のABCD環部分を完成し、更に1の不斉全合成を達成すべく検討中である。3.p-スルフィニルフェノール類のプメラ-型転位反応は、置換様式や反応条件によってキノン類の生成以外にも、o-またはm-位への求核的官能基導入反応が進行することが分かり、現在これらの反応の一般化を図っている。
エビデンスの視点からみたスポーツ・イベントによる地域活性化の評価研究

本研究は、マラソン大会を通じての地域活性化の現状と課題を総合的に評価し、問題点を明らかにする事を目的とした。全国の100(回収率は40%)のマラソン大会組織委員会への質問紙調査と4つの組織委員会へのインタビュー調査を実施した。結果は、大会の開催は平均で18回であった。また平均で約9,000人の参加者であった。次に、インタビュー調査の結果、各大会において、マラソン大会を通じたスポーツ振興と観光振興が進められていた。また、今後に向けて、持続可能なマラソン大会の運営を進めていた。そして、マラソン大会によるスポーツ振興・観光振興という視点で地域活性化がさらに進む可能性が示された。本研究は、エビデンスの視点からスポーツ・イベント開催における地域活性化の評価を目的とする。特に当該年度は、マラソン大会の開催に着目し、スポーツ振興と観光振興の視点から評価指標を作成し、現状の把握を行った。調査は、100のマラソンイベントに対して郵送法によって質問紙調査を行った。回答は、41のイベント事務局より得る事が出来た。質問紙調査の結果、昨年度の参加人数に関しては、平均約9,000人であった。その中で地元参加者数は、平均約2,200人であった。また運営スタッフについては、平均約300人が関わっているとの事であった。ボランティアについては、平均約1,400人であった。次に、大会参加においてどのような点を重視して、その目的が達成されていると評価するかについてである。これについては、5つの項目を設定して、全く重要ではないから大変重要であるの5段階のリッカート尺度によって質問を行った。結果は、大会開催における重要度としては、「健康づくり」、「シティーセール」、「良好なコミュニティ形成」が上位であった。またどのような事が大会開催によって達成されたかについては、「観光関連産業の振興」、「シティーセール」、「良好なコミュニティ形成」が上位であった。最後に、自由記述で質問項目を設定した。まず地域のどのような変化に期待するかという事に関しては、地域の活性化や健康増進やイメージアップ、さらにスポーツ振興などであった。次に、マラソン大会の開催が地域のスポーツ振興にどのような貢献ができるかという質問に関しては、スポーツ(マラソン)振興や健康促進という事が多く挙げられた。さらにマラソン大会の開催が観光振興という視点での貢献に関しては、知名度アップやPRという事や大会参加者の観光活動という事が多く挙げられた。本年度は、4つのマラソン大会組織委員会の担当者へのインタビュー調査を実施した。調査内容は、4つ設定した。まずは、スポーツ振興としてのイベント(マラソン大会)の意義・効果である。次に、観光振興としてのイベントの意義・効果である。3つ目には、スポーツ振興、観光振興の視点からのイベントの課題・問題点である。最後に、今後のスポーツ振興や観光振興におけるイベントの展望・方向性である。インタビュー調査の結果を、スポーツ振興と観光振興の視点でまとめた。まず、スポーツ振興としての意義や効果としては、マラソン大会が地域住民のスポーツへの参加のきっかけや目標となっていることがあった。また、ささえるスポーツという視点を踏まえながら、ランナーの応援やスポーツボランティアとして活動への参加などもあり、地域におけるスポーツ文化の醸成に貢献していることが明確になった。次に、観光振興としてのマラソン大会に関する視点である。遠方から参加するランナーも多く、各大会共にリピーターにも満足度の高いイベント運営を念頭においていた。その中では、地域の人たちが大会も盛り上げるホスピタリティが重要であり、それが自然に地域全体で実行されていた。本研究をまとめると、各大会において、各地域の状況等を考慮しながら、特徴のあるイベントを開催していた。大会の主体となる組織がそれぞれ行政や民間企業など異なるが、地域全体で大会を盛り上げながら、それぞれの地域の特徴をいかした大会運営が行われていた。また今後に向けて、大会の発展とともに、いかにして現在の大会運営の状態を維持するかという、持続可能なマラソン大会のあり方が求められていた。スポーツ社会学本研究の目的は、おおむね順調に進展している。平成24年度は、1)関連文献の考証、2)質問紙調査の実施、を行った。近年の研究動向を調べ、さらにマラソン大会の組織委員会を対象とした郵送法による質問紙調査の実施により、大会の現状、およびスポーツ振興・観光振興の視点での現状と課題を把握する事が出来た。平成26年度は、質問紙調査の結果を踏まえ、マラソン大会組織委員会へのインタビュー調査を行い、より詳細にスポーツ振興・観光振興の現状と課題などについて検証を行う。そして、近年、全国各地で開催されるマラソン大会について、スポーツ振興と観光振興の二つの視点で、どれほど目的とする部分が達成されているのかを把握し、これまでの研究では見出せなかった新たな知見を提示する事が出来ると考える。

謝金の経費が、予定よりも少額で済んだため、次年度使用額が生じた。スポーツ振興や観光振興等に関する書籍や論文の購入、またインタビュー調査における旅費交通費としての使用を計画している。
創傷治癒における細胞集団の協調メカニズムの探索

生物の体内の組織・器官形態の形成、維持、および修復は、組織・器官を構成している細胞集団が制御され、適切に移動することでなされており、そのメカニズム解明は生物学的に重要な課題である。本研究ではモデル動物の胚性表皮における創傷治癒機構に着目し、創傷を閉鎖する細胞集団を制御するメカニズムを探索した。胚性表皮の創傷は創傷辺縁に蓄積する細胞骨格アクチンとミオシンにより成体よりも迅速に閉鎖される。今回、アクチン・ミオシンの機能には細胞骨格セプチンが必要であることが新たに判明した。セプチンはアクチン・ミオシンの動態を介して各細胞の形態変化や移動を制御し、細胞集団の協調的な動態に貢献していると考えられる。1.研究成果の内容:本研究では組織形態の基盤となる細胞集団運動の協調メカニズムの解明を目指した。細胞骨格アクチン、ミオシン、セプチンに着目し、アフリカツメガエル尾芽胚を用いて細胞集団運動の1つである胚性表皮の創傷閉鎖過程のライブイメージングを撮影することで上記目的の達成を目指した。創傷閉鎖にはアクチン・ミオシンの機能が必須であるが、セプチンの機能を阻害すると、創傷閉鎖の遅延が見られた。このことはセプチンが創傷閉鎖においてアクチン・ミオシンの機能に必要であることを示唆している。一方、正常な胚発生においても、セプチンがアクチン・ミオシンの機能に重要である事が示されていたが、今回の結果は細胞集団運動におけるセプチンの普遍的な機能を示唆しておりその意義は大きい。現在、電子顕微鏡を用いたアクチン線維構造の観察も開始しておりセプチンの詳細な機能に関する分子メカニズムを探索している。2.現在までの達成度:研究代表者は本研究が開始した当初、現在の所属先に異動した直後であった。本計画は実験に必要な機器や試薬を揃える段階から開始し、新たな環境でのライブイメージング手法の確立と改善、さらにはこれまで行ってこなかった新たな実験手法の習得を含み、これまでのところこれらは全て計画通りに行った。今後はより多くのデータを蓄積し、その解析に進む予定である。3.今後の研究の推進方策:今後は創傷閉鎖におけるセプチンとアクチンの相互作用に関する詳細なメカニズムを探索するために、セプチンと共同して機能する他の蛋白質の同定を試みる。また、セプチンやアクチンを制御する分子シグナルの同定も試みる。現在、いくつかの候補があるが、それら候補の機能阻害やイメージングを通して、セプチンの創傷閉鎖における機能を明らかにしていく。これにより、組織形態の維持や修復機構の解明に貢献していく。26年度が最終年度であるため、記入しない。細胞生物学、発生生物学26年度が最終年度であるため、記入しない。
植物エストロゲンによる神経系の分化・発達過程におけるリスク評価のための基礎解析

植物性エストロゲンが神経系の機能タンパク質に影響を及ぼす発現濃度ついて交感神経系のモデルとして薬物の影響の解析に広く用いられている培養ウシ副腎髄質細胞を用いて生化学的に検討した。ダイゼイン、レスベラトロール(10100μM)はニコチン性アセチルコリン受容体・電位依存性Naチャネル、電位依存性CaチャネルからのNa^+,Ca^<2+>流入を抑制することによりカテコールアミン(CA)分泌を抑制した。神経由来のニコチン性アセチルコリン受容体(α3β4)を発現させたアフリカツメガエル卵母細胞でもアセチルコリンにより誘発されるNa電流(IC_<50>=25.9mM)を抑制した。エストロゲンと同様に比較的高濃度ではイオンチャネル等に直接作用している可能性が示唆された。CA生合成とチロシン水酸化酵素(TH)活性をダイゼインはアジア系の人々の血中濃度として検出されうる濃度(10nM1μM)で促進した。この作用はエストロゲン受容体の阻害剤であるICI182,780では抑制されなかったが、PKA阻害剤(H-89)やMEK阻害剤(U0126)では抑制が認められた。細胞膜にはエストロゲンや植物性エストロゲンの結合する受容体が存在し、ダイゼインはこの受容体を介してCA生合成を促進している可能性が示唆された。現在、この受容体の同定を検討している。ゲニステインやケルセチン(100nM10mM)はノルエピネフリントランスポーター(NET)機能を促進し、この作用は膜へのNETの発現を増加させた結果であった。以上の結果より植物性エストロゲンが神経系の機能タンパク質に対して生体内で検出されうる濃度で影響を与えることが明らかになったので、THやNETの機能を指標としてCA神経系の分化・発達過程での植物性エストロゲンの影響・リスクについてマウスを用いて検討している。植物エストロゲンとして知られているイソフラボン類のゲニステイン(大豆)、ダイゼイン(大豆)、クメストロール(レッドクローバー)、フラボノール類のケルセチン(柑橘類、タマネギ)とトランススチルベン骨格を有するレスベラトロール(赤ワインポリフェノール)に関して交感神経系のモデルとして薬物の影響の解析に広く用いられている培養ウシ副腎髄質細胞を用いて、神経系の機能タンパク質への影響とその発現濃度ついて生化学的に検討した。ダイゼイン、クメストロール、ケルセチン、レスベラトロール(10100μM)はニコチン性アセチルコリン受容体・電位依存性Naチャネル・電位依存性CaチャネルからのNa^+,Ca^<2+>流入を抑制することによりカテコールアミン分泌を抑制した。神経由来のニコチン性アセチルコリン受容体(α3β4)を発現させたアフリカツメガエル卵母細胞でもレスベラトロール(3100μM)はアセチルコリンにより誘発されるNa電流を抑制した。このような比較的高濃度でのイオンチャネル等への抑制作用はエストロゲンにおいても認められたものである。チロシン水酸化酵素(TH)活性とカテコールアミン生合成をダイゼイン(10nM1μM)は促進した。この濃度はアジア系の人々において検出されうる血中濃度であった。ノルエピネフリントランスポーター(NET)機能をチロシンキナーゼ阻害作用のあるゲニステインやケルセチン(100nM10μM)は促進し、この作用は膜へのNETの発現を増加させた結果であった。植物性エストロゲンが神経系の機能タンパク質に対して生体内で検出されうる濃度で影響を与えることが明らかになったので、THやNETの機能を指標としてカテコールアミン神経系の分化・発達過程でのリスク・影響について検討している。

植物性エストロゲンが神経系の機能タンパク質に影響を及ぼす発現濃度ついて交感神経系のモデルとして薬物の影響の解析に広く用いられている培養ウシ副腎髄質細胞を用いて生化学的に検討した。カテコールアミン生合成とチロシン水酸化酵素(TH)活性をイソフラポン類のダイゼインはアジア系の人々の血中濃度として検出されうる濃度(10nM1μM)で促進した。この作用はエストロゲン受容体の阻害剤であるICI182,780では抑制されなかったが,PKA阻害剤のH-89やMEK阻害剤のUOI26では抑制が認められた。細胞膜にはダイゼイン等の植物性エストロゲンやエストロゲンの結合する受容体が存在し,ダイゼインはこの受容体を介してカテコールアミン生合成を促進している可能性が示唆された。現在,この受容体の同定を検討している。レスベラトロール(100μM)は電位依存性Naチャネルα-subunitsのsite4に,電位依存性CaチャネルのN-typeに作用してカテコールアミン分泌を抑制した。神経由来のニコチン性アセチルコリン受容体(α3β4)を発現させたアフリカツメガエル卵母細胞でもアセチルコリンにより誘発されるNa電流(IC_<50>=25.9μM)を抑制した。このような比較的高濃度ではイオンチャネル等に直接作用している可能性が示唆された。ノルエピネフリントランスポーター(NET)機能はイソフラボン類のゲニステインやフラボノール類のケルセチン(100nM10□M)によって作用時間依存性(2472h)に促進されたが,ダイゼイン,クメストロール,トランススチルベン骨格を有するレスベラトロール(100□M)は影響しなかった。この作用は細胞膜へのNETの発現量を増加させた結果であった。以上の結果を基にしてカテコールアミンミ神経系の分化、発達過程での植物性エストロゲンの影響についてマウスを用いて検討中である。
中枢神経系で働くマウス新規摂食行動制御遺伝子の機能解明

申請者は、実験動物「マウス」のC57BL/6J (B6)系統と、日本産近交系のMSM/Ms (MSM)系統の交配により樹立されたコンソミック(染色体置換)系統群を利用して、肥満表現型を対象にした順遺伝学的解析を行い、脳で発現する機能未知の関連遺伝子Aobs1(オーブ1)を同定した。Aobs1の機能を喪失させたマウスは、B6の遺伝的背景で過食による肥満を惹起する。なお、ヒトではAobs1の相同遺伝子近傍に、肥満・脂質代謝異常のQTLが検出されている。本申請研究は、中枢神経系におけるマウスAobs1の機能を解明すること、ならびにAobs1の機能不全が、実験用マウスの遺伝的背景に依存して過食と肥満を惹起するメカニズムを明らかにすることを目的としている。また、Aobs1変異マウスを過食と肥満の実験動物として確立することも目的とした。本年度は、前年度に引き続きAobs1が機能する神経回路の同定と、Aobs1の相互作用因子の探索を行った。また、Aobs1遺伝子改変マウスを利活用して以下の解析を行った。肥満やエネルギー代謝に関連した表現型データの統合解析。レポータ遺伝子の脳内発現部位を参考にした、各種染色法による詳細な神経細胞の組織学的観察。コンディショナルノックアウトを利用した表現型の解析。新学術領域研究「先進ゲノム支援」により支援を受けて情報を得た、脳組織でコントロールと比較した際に発現差のある遺伝子の検証実験。コントロールを用いた、レプチン投与による各種神経核の活性化の違いの比較。一連の解析によりAobs1の機能を総合的に検討したところ、マウスのAobs1は中枢で機能して、摂食行動における脳内のレプチンシグナルの伝達に関わる可能性が高いことが示唆された。また、我々が使用したマウスコンソミック系統で確認された肥満表現型は、Aobs1のB6の遺伝的背景におけるMSMアレルの影響により惹起されたものであると考えられた。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。申請者らはこれまでに、汎用マウスのC57BL/6J (B6)系統と日本産近交系のMSM/Ms (MSM)系統を利用した交配系による順遺伝学的解析を行い、中枢の神経細胞で発現する機能未知の遺伝子Aobs1(オーブ1)を同定した。Aobs1の自然突然変異は、B6の遺伝的背景で過食による肥満を惹起する。ヒト相同遺伝子の近傍には、GWASにより肥満・脂質代謝異常のQTLが検出されている。本年度はまず、Aobs1が発現する神経細胞、神経核、神経回路を同定するところから実験を開始した。現在使用している抗Aobs1抗体は、組織免疫学的観察には向かないので、新たな抗体の作製を試みた。しかしながら、新たに作製した抗体もうまく機能しなかったので、現在in situハイブリダイゼーションによる遺伝子発現の検討を行うことを想定している。神経核に発現する因子群との共局在を免疫組織学的に解析するため、これまでに報告されている複数の摂食関連遺伝子の発現動態をAobs1破壊動物等で検討し、幾つかの遺伝子で、野生型との発現差を検出している。タンパク質タグをCRISPR-Cas9によるゲノム編集技術によりAobs1の任意の部位にノックインした系統については、Aobs1の末端部に1種類のタグを挿入した系統の作製に成功した。Aobs1機能の作用点と既知の制御系の関連を明らかにするため、脳を使用した網羅的な遺伝子発現解析を計画していたが、これについては、平成28年度新学術領域「先進ゲノム支援」による支援を受けることができ、B6、MSM、およびコンソミック13番置換系統の通常餌および高脂肪餌で飼育した場合の脳サンプルに関して、次世代シーケンサーによる遺伝子発現解析情報を得ることが出来た。情報解析は分担研究者である新潟大学阿部氏と共同で行っており、次年度をめどにデータのまとめと各種の検証を行う。研究開始の本年度は、Aobs1が発現する神経細胞、神経核、神経回路を同定するための抗Aobs1抗体の作製から開始したが、残念ながら満足のいく抗体は得られなかった。神経核に発現する因子群との共局在を免疫組織学的に解析するため、タンパク質タグをCRISPR-Cas9によるゲノム編集技術によりAobs1の任意の部位にノックインした系統の作製を試みた。これについては、Aobs1の末端部に1種類のタグを挿入した系統の作製に成功した。タグが挿入された個体を用いて、交配によりホモライン化して、恒常的なホモ個体が得られるか検討している。Aobs1機能の作用点と既知の制御系の関連を明らかにするため、脳を使用した網羅的な遺伝子発現解析を計画していたが、これについては、平成28年度新学術領域「先進ゲノム支援」による支援を受けることができ、B6、MSM、およびコンソミック13番置換系統の通常餌および高脂肪餌による飼育下において、脳で発現差のある遺伝子群の情報を次世代シーケンサーにより解析することが出来た。全体としては、当初計画通りに順調に進行しているが、これに加えて良質の抗体が作製できれば、さらに着実な進展が図れるものと期待している。

申請者らは、実験動物「マウス」のC57BL/6J (B6)系統と、日本産近交系のMSM/Ms (MSM)系統を利用した順遺伝学的解析を行い、中枢の神経細胞で発現することが予測され、機能も未知の遺伝子Aobs1(オーブ1)を同定した。Aobs1の自然突然変異は、B6の遺伝的背景で過食による肥満を惹起する。Aobs1のヒト相同遺伝子の近傍には、肥満・脂質代謝異常のQTLが検出されている。本研究の目的は、まずAobs1を発現する神経細胞や神経細胞核、神経回路を同定することである。次に、生化学的、組織学的観察で、Aobs1が相互作用するタンパク質などを探索する。これらの解析を通して、Aobs1が摂食行動や肥満に関連した活動を行う遺伝回路を解明し、Aobs1の中枢における機能を明らかにする。最後に、中枢でのAobs1機能不全が遺伝的背景に依存して過食・肥満を発症するメカニズムを解明して、Aobs1変異マウスを実験動物として確立する。本申請研究のこれまでの成果により、Aobs1転写産物が中枢神経系で機能することが強く示唆された。また、中枢神経系特異的Aobs1機能喪失マウスのエネルギー代謝関連表現型を収集した。さらに、Aobs1を発現する詳細な神経細胞を同定するため、複数の抗体を作製したが、いずれもうまく機能しないことが判明した。新学術領域研究「先進ゲノム支援」により支援を受けた遺伝子発現情報の解析を行い、B6、MSM、コンソミック系統の通常餌ならびに高脂肪食負荷時における脳遺伝子発現リストを作成した。Aobs1の相互作用因子を探索するため、タンパク質タグをAobs1のにノックインしたマウス系統を樹立できた。上記に加えて、Aobs1機能の作用点と既知の制御系の関連を明らかにするため、各種のデータベース情報を利用して、相互作用因子候補の情報収集を継続して行った。これまでの成果により、Aobs1転写産物が中枢神経系で機能することが強く示唆されたので、Aobs1の機能を中枢神経系特異的に喪失することが可能なマウスを作製して、Aobs1の中枢神経系での機能類推のための実験的検証を行った。また、中枢神経系特異的Aobs1機能喪失マウスについては、我々が構築したプラットフォームによるエネルギー代謝関連表現型の収集を行った。Aobs1の発現する神経細胞、神経核、神経回路の同定研究に使用するため、複数の抗体を作製したが、未だ1種類の抗体のみしか機能せず、機能している抗体も、組織免疫学的観察には向かないので、今後はin situハイブリダイゼーションによる検討に切り替えるべく準備を進めている。新学術領域研究「先進ゲノム支援」の支援により得られた遺伝子発現情報から、通常餌ならびに高脂肪食負荷時において脳で発現差のある遺伝子のリストを作成したが、これ以外のISO-Seq等のデータも活用した有用な情報を得るべく当該データの2次、3次解析を行った。タンパク質タグをAobs1のC末端側にノックインした系統を樹立できたので、この脳組織を利用した相互作用因子の探索を進めたが、生体組織でのタンパク質の発現量が少ないため、タグ抗体による免疫沈降が非常に困難であることが判明した。このため、培養細胞に切り替えて解析を行うための準備を開始した。Aobs1機能の作用点と既知の制御系の関連を明らかにするため既知の摂食制御遺伝子の発現動態や各種のデータベース情報を相互作用因子探索の参考情報とした情報解析を継続して進めた。
神経伝達物質の歯周炎病巣成立への関与(とくにリンパ球と歯肉線維芽細胞との接着)

前年度の研究結果から,各種神経伝達物質サブスタンスP,VIP,SOM,CGRPがリンパ球がヒト由来歯肉線維芽細胞の接着に対する影響について蛍光二重染色法を用いて検討した。その結果,サブスタンスP,VIP,CGRPを各種濃度で添加したところ歯肉線維芽細胞とリンパ球との接着細胞数が増加した。しかし,SOM刺激では検討したすべての濃度において歯肉線維芽細胞との接着細胞数に変化が認められなかった。本年度は上記の結果をもとに,ELISA法によって接着細胞数の割合をマイクロプレートリーダーを用いて計測した。サブスタンスP,VIP,CGRP刺激によって接着細胞数は,上記の結果と同様に増加した。しかし,SOM刺激では検討したすべての濃度において細胞接着数に変化は認められなかった。また接着のメカニズムを解明するために,リンパ球の接着分子である,抗VLA-4,抗VLA-5抗体の添加による接着細胞数の抑制効果を検討した。抗VLA-4,抗VLA-5抗体の添加によって,サブスタンP,VIP,CGRP刺激によるリンパ球と歯肉線維芽細胞との接着は抑制された。以上のことから神経伝達物質であるサブスタンP,VIP,CGRPは炎症巣においてリンパ球と宿主細胞である歯肉線維芽細胞との接着に影響を与えることが明らかとなった。つまり,局所に浸潤したリンパ球と神経伝達物質を介した反応が歯周炎の病巣の形成に関与していることが示唆された。今回,各種神経伝達物質サブスタンスP,VIP,SOM,CGRPがリンパ球に対しヒト由来歯肉線維芽細胞への接着に与える影響についてJoncs,Deguchiらの方法に準じ,蛍光二重染色法を用いて検討した。その結果,サブスタンスP(10^<-12>10^<-7>M),VIP(10^<-12>10^<-8>M),SOM(10^<-12>10^<-8>M),CGRP(10^<-12>10^<-8>M)を各種濃度で添加したところ歯肉線維芽細胞との接着が増加した。また,そのメカニズムを検討するため抗CD11a,抗VLA-4,抗VLA-5抗体を添加したところ,接着細胞数が減少した。以上のことから,局所に浸潤したリンパ球と神経伝達物質を介した反応が歯周炎の病巣の形成に関与していることが示唆された。来年度はさらにELISA法を用いて検討していく所存である。
生物活性物質のハイスループット活性予測法の開発と応用

キノン、フラボノイド、リグナン、アルカロイド等の抗発がんプロモーター活性、抗菌活性、抗炎症活性ならびに抗アレルギー活性を測定し、それらの活性とサイクリックボルタンメトリーによって得た酸化還元電位との間によい相関を認めた。この相関の一般性を明らかにすることは、簡単な物理的測定により、in vitroでの活性実験をすることなく、化合物の生物活性の有無の予測を可能にすると考えられる。結果として、酸化還元電位はよいパラメーターであることが示唆された。数種のキノン化合物についてRaji細胞を用いたEpstein-Barr virus early antigen(EBV-EA)活性化抑制試験を行い、その活性とサイクリックボルタンメトリー法によって測定した還元電位との間に良好な相関関係が有することをこれまでに確認している。この相関の一般性を明らかにすることは、簡単な物理的測定により、in vitroでの活性実験をすることなく、キノン化合物の抗発癌プロモーション効果の有無の予測を可能にすると考えられる。この関係がキノン化合物だけではなく、アルカロイド、フラボノイド、リグナンなど天然由来化合物の生物活性、特にEBV-EA活性化抑制効果、抗菌活性、抗炎症活性ならびに抗アレルギー活性などとも成立することが判明すれば、in vitroでの活性実験をすることなく簡単な物理的測定により種々の化合物の生物活性の有無の予測が可能となる。そのための解析用基礎パラメーターの開発と評価を目的とし、種々の化合物の生物活性と酸化還元電位を測定することにした。初年度である今年は、イソキノリンアルカロイドであるプロトベルベリン類について酸化還元電位の測定を行うと同時に電子的諸性質をCAChe MOPACプログラムを用いて計算し、EBV-EA活性化抑制効果、38 Human Cancer Cellへの細胞毒性、抗菌活性に対する相関関係をそれぞれ検討した。その結果、3つともプロトベルベリン類の第1還元電位との間に相関が認められ、電子的諸性質のstericエネルギー、LUMO、HOMOエネルギーなどをパラメーターとして重回帰分析に加えるとさらに良い相関が得られた。このことより、キノン類だけでなくプロトベルベリン類においても還元電位が生物活性効果の有無を予測するためのパラメーターとして有用であることが示唆された。また、EBV-EA活性化抑制試験を行うため、2種のフラノナフトキノンをTabebuia impetiginosaから単離した。昨年は、イソキノリンアルカロイドであるプロトベルベリン類について検討した。今年は、KU812細胞から遊離されるケミカルメディエーターのヒスタミンとPGD_2の両者を一度に測定することにより抗アレルギー活性を評価しようという新しい試みをLC-ESI-MS/MS法を用いて行い、フラボノイドの抗アレルギー活性試験を行った。その結果、幾つかのフラボノイドに市販の抗アレルギー薬であるクロモグリク酸ナトリウムより強い活性を示すものがあった。さらにフラボノイドの第1酸化電位との間に相関が認められた。このことより、キノン類だけでなくフラボノイドにおいても酸化還元電位のうちの酸化電位が生物活性効果の有無を予測するためのパラメーターとして有用であることが示唆された。また、強いEBV-EA活性化抑制効果を有するアントラキノンのエモジンについて更に強い活性を持つ化合物をみつけるため、Raji細胞内における活性代謝物をLC-APCI-MS/MSを用いて検索した。その結果、エモジンより強い活性を持つ酸化体が代謝産物の中に存在することがわかった。

この関係がキノン化合物だけではなく、アルカロイド、フラボノイド、リグナンなど天然由来化合物の生物活性、特にEBV-EA活性化抑制効果、抗菌活性、抗炎症活性ならびに抗アレルギー活性などに成立することが判明すれば、in vitroでの活性実験をすることなく簡単な物理的測定により種々の化合物の生物活性の有無の予測が可能となる。そのための解析用基礎パラメーターの開発と評価を目的とし、種々の化合物の生物活性と酸化還元電位を測定することにした。本年度は、ヒト由来慢性骨髄性白血病細胞株KU812細胞から放出され臨床マーカーとなりうるヒスタミン、プロスタグランジンD_2を選び、それらの放出抑制率を指標とした新しい抗アレルギー評価法を用いて、フラボノイド類、リグナン類の抗アレルギー活性試験を行った。フラボノイド類、リグナン類の酸化還元電位を測定し、その第1酸化電位と抗アレルギー活性との間の相関を検討したところ、相関が認められた。さらに、合成したイオウ、チッソ、酸素原子をもつヘテロキノンの38 HumanCancerCellへの細胞毒性を測定した。その活性値と還元電位との相関を検討した結果、良い相関が得られた。さらに、LUMOエネルギーやlog Pを重回帰分析に加えることによりさらに良い相関が認められた。我々が行ってきた研究より、ポリフェノール類やイソキノリン類の活性を予測するためのパラメーターとして、酸化還元電位が有用であることが示唆されたと考える。
LMIR3/4/5の生体内における役割の解析

マスト細胞において、LMIR3はFcεRIシグナルを抑制すること、TLR4シグナルに対しては協調的に働くこと、およびその機序を明らかにした。また、in vitroの結果と一致して、LMIR3ノックアウトマウスではアレルギー反応が顕著に亢進することを明らかにした。一方、LMIR3ノックアウトマウスは腹膜炎モデルに代表される敗血症に対しては抵抗性を示すこと、局所におけるケモカインの上昇とそれに伴う好中球の集積によって大腸菌の増殖が抑制されることを明らかにした。また、LMIR5のリガンド候補としてT cell immunoglobulin mucin 1(TIM1)を同定した。腎虚血モデル(虚血腎尿細管ではTIM1の発現が上昇する)を施行して結果、LMIR5ノックアウトマウスでは虚血腎に集積する好中球(LMIR5を発現する)が減少して腎尿細管壊死が軽減された。この結果から、TIM1がLMIR5の生理的なリガンドであること、LMIR5が虚血腎における炎症を増悪させることが明らかとなった。当該年度に実施した研究の主な成果は、LMIR3/4/5のin vitro解析により得られた。LMIR3は細胞内にITIMを2個、ITSMを1個有するが、他に2個のチロシン残基(ITSMを含む)を有する。各チロシン残基の役割を明らかにするため、各チロシン残基をフェニルアラニンに置換したLMIR3変異体を作製した。レトロウイルス感染により骨髄由来マスト細胞(BMMC)に発現させて、FceRIとの共架橋によるサイトカイン産生能を調べた結果、LMIR3の抑制型レセプターとしての機能はリン酸化されたITM(2個)とITSMがSHPI1/2と結合することによることが判明した。一方で、他の2個のチロシン残基はPI3Kのp85やGrb2と結合して活性化シグナルを伝達することが証明された。さらに、興味深いことに、抑制型レセプターLMIR3はITAMを有するアダプター分子であるFcRgと結合すうことも証明され、LPSの刺激下ではLMIR3の架橋刺激はサイトカイン産生を増強させることが明らかになった。ITIMを有する抑制型レセプターがFcRgと結合して活性化レセプターとしても機能するという例はなく、ペア型レセプターLMIRの生理的役割を考える上で意義深い。また、好中球に発現するLMIR5はPMAやLPSの刺激により細胞外領域で切り出されることが特異抗体を使用したELISAにより明らかとなった。LMIR5-Fc(LMIR5の細胞外領域とFcの融合蛋白)は、可溶性LMIR5に近似しているが、このLMIR5-Fcを腹腔マクロファージに作用させると顕著なサイトカイン産生が認められた。これらの結果は、活性化した好中球などが放出するか可溶性LMIR5がさらに他の免疫担当細胞に作用して炎症を増幅させる可能性を示唆している。LMIR5の炎症における役割を考える上で、重要な結果が得られたと考えられる。In vitroにおけるマスト細胞の解析により、LMIR3の架橋刺激はIgEレセプターのシグナルを負に制御する一方、TLR4のシグナルを正に制御することを明らかにした。また、そのメカニズムとして、LMIR3は細胞内領域のITIMやITSMを介して負のシグナルを、また、ITAMを有するFcRgammaとの会合により正のシグナルを伝達することを明らかにした。次に、抑制型レセプターでありながらLPSの刺激に対しては活性化型レセプターのような作用も有するLMIR3が、生体内でどのように働くかを明らかにするために、LMIR3ノックアウトマウスの解析を開始した。LMIR3欠損マウスの成長発達や組織形態などは正常であり、また、末梢組織(骨髄、脾臓、胸腺、リンパ節など)における血球系細胞の分化や数に明らかな異常を認められなかった。そこで、次に、自然免疫に関与するいくつかのin vivo実験を施行した。マウス敗血症モデル(CLP)の結果は、LMIR3欠損マウスの生存率が野生型マウスと比較して有意に改善することを示した。LMIR3欠損マウスの腹腔組織では好中球の集積が顕著であり、大腸菌などの殺菌が効果的に行われていることが明らかとなった。また、マウスの背中に形成したエアパウチ(Dorsal air pouch)にLPS(TLR4 agonist)やZymosan(TLR5 agonist)を投与する実験を施行した結果、LMIR3ノックアウトマウスにおいて著明な好中球の集積が認められた。

以上の結果により、LMIR3は好中球の遊走に関与する分子であり、自然免疫において重要な働きをすることが示唆された。また、われわれはLMIR5がミエロイド系細胞に発現する活性化型レセプターであることをすでに証明したが、in vivoにおける働きを明らかにするためにLMIR5欠損マウスの解析も開始した。LMIR5欠損マウスもLMIR3欠損マウスと同様に定常状態において異常を認めなかった。一方、レトロウイルスを利用した発現クローニング法によりlMIR5のリガンド候補としてTIM1を同定した。さらに、上記のDorsal air pouchの実験でTIM1-Fcを投与した結果、野生型マウスで認められる好中球の集積がLMIR5欠損マウスでは消失することを証明した。この結果は、LMIR5がTIM1を認識するレセプターである可能性を強く示唆した。LMIR3ノックアウトマウスは、CLP(腹膜炎モデル)による敗血症に対して強い抵抗性(致死率の改善)を示した。LMIR3ノックアウトマウスでは炎症局所におけるケモカイン産生が亢進して好中球が著名に集積した。その結果、生体内における大腸菌の排除が促進されて致死率が改善すると考えられた。また、アレルギーモデルの実験を行った結果、LMIR3ノックアウトマウスではIgEとマスト細胞が関与するアナフィラキシーが増悪(直腸温の低下や血管透過性の亢進)した。今後、LMIR3のリガンドが同定されれば、敗血症やアレルギーに対する新しい治療法の手がかりとなる可能性がある。一方、レトロウイルスを利用した発現クローニング法によりLMIR5のリガンド候補としてTIM1を同定した。TIM1は虚血腎において発現が上昇するので、LMIR5ノックアウトマウスに対して腎虚血還流モデルを施行した。その結果、野生型マウスでは虚血腎の尿細管(TIM1を高発現する)に好中球(LMIR5を発現する)が集積して炎症が増悪するのに対して、LMIR5ノックアウトマウスでは虚血腎における好中球の集積が少なく、尿細管壊死も抑制された。この結果からTIM1が田IR5の生理的なリガンドであることが証明された。また、LMIR5は細胞表面上で(LPsにより活性化したMMP8により)切断されて可溶性フォーム(sMIR5)となり放出されることを証明した。sLMIR5を検出するELISA法の確立によりLPSを投与したマウスではsLMIR5の産生が認められた。また、sLMIR5の代替物であるLMIR5-Fc(細胞外領域のLMIR5とヒトFcの融合蛋白)はマクロファージを活性化してサイトカインを産生させた。以上から、sLMIR5はLPS刺激による炎症の増悪機構として機能することが示唆されたが、sLMIR5が結合する分子は不明であり今後の解明が期待される。このように、脱IR5は自然免疫や虚血に伴う炎症に深く関与すると考えられる。LMIR4ノックアウトマウスはCLPによる敗血盧に対して抵抗性を示した。LMIR4は好中球に限局的に発現するので、自然免疫に深く関与することが示唆された。
地下流水音による斜面崩壊発生場所の予測手法の開発

地下流水音から水みち位置を探すことで,崩壊の発生位置を精度よく予測する可能性か見出されている。本研究課題では崩壊発生位置と地下流水音の関係を明らかにし,崩壊の発生する危険な斜面を予測する手法を開発することにある。3年計画の最終年に当たる本年は,データの蓄積・分析を行い,これまでの成果をとりまとめ,次のような結論を得ることができた。多数数の自然斜面崩壊地,法面崩壊地で地下流水音を測定し,崩壊と地下流水音の関連性を検討した。結果として,地質の種類に関わらず,崩壊は非崩壊地に比較し地下流水音が強い場所で発生することが明らかとなった。また,地下流水音の強い場所の地形変化をモニタリングしたところ,その後の豪雨で実際に崩壊が発生した。地下流水音探査が崩壊の発生する危険な斜面を予測するのに有効であることを確認した。地下水流音の強い揚所と弱い場所で地下水位の変動を観測し,地下流水音が強い場所の意味を検討した。結果として,平常時に地下流水音の大きい場所では,豪雨時に地下水が発生しやすいことが明らかとなった。また,斜面では平常時に地下流水音が大きいところから崩壊に有害な飽和帯が拡大することが明らかとなった。以上のことから,地下流水音の強い場所は,豪雨時に地下水位の上昇しやすい崩壊が発生する危険性の高い場所を特定するのに有効であることが明らかとなった。斜面崩壊が毎年多く発生するわが国では,危険な斜面を事前に知る必要がある。しかし、現状の技術では危険な斜面を精度よく予測できていない。危険地判定の精度向上に有力な手法を開発する必要がある。斜面崩壊の前兆現象や現地調査では湧水が多く確認される。危険地判定の精度向上には斜面土層中の水みち経路の特定が有効と考えられる。まず,山腹斜面で簡便に水みち位置を特定する手法を開発した。すなわち,地下水流音を聞いて水みち位置を特定する方法である。実験・現地調査から本手法は簡便かつ高精度で水みち位置を特定できることを確認した。崩壊発生位置と水みちの位置関係を知るために,自然斜面・林道法面の崩壊発生地で地下流水音を測定した。崩壊発生位置では地下水流音が大きいことが調査した全ての斜面において確認された。この傾向を確認するため,来年度以降もデータの積み重ねが必要である。また,崩壊の発生していない斜面でも崩壊地と同様の強い地下流水音分布が得られた斜面が複数ある。これらの斜面が豪雨で崩壊するかを今後の調査で明らかにする必要がある。地下流水音調査は天候の良い日に実施する。しかし,晴天時に大きな地下流水音が検知され場所が,豪雨時にも崩壊の発生するような地下水流が発生するのかは不明である。そこで,崩壊を有する斜面で水文観測を開始した。調査斜面で地下流水音探査を実施し,音圧分布を根拠に斜面の約100箇所に井戸を設けた。今年度は,台風が通過せず累加雨量150mmのデータが1回しか観測できなかった。複数の豪雨イベントから両者の関係は議論されなければならないが,地下流水音の大きいところでは,豪雨時に地下水流が集中する結果を得ている。来年度の豪雨イベントを期待したい。しかし,現状の技術では危険な斜面を精度よく予測できていない。本年は,3年計画の2年目に当たる。1年目に開発した地下流水音測定器を用いて自然斜面・林道法面の崩壊発生地で地下流水音を測定した。崩壊発生位置では周囲に比較して地下水流音が大きいことが調査した全ての斜面において確認された。また,崩壊の発生していない斜面でも崩壊地と同様の強い地下流水音分布が得られた斜面が複数確認された。これらの斜面が豪雨で崩壊するかを検討するため,台風後など大きな降雨イベントの度に調査した崩壊・林道法面を点検した。結果として,崩壊法面と同様の強い地下流水音分布が得られた林道法面で新たに崩壊が発生した。日常的に地下水の集中する場所に,豪雨で多量の地下水が供給されることが原因で崩壊が発生すると考えられた。また,本手法は事前に危険な斜面を抽出するのに有効であることが示された。ところで,地下流水音探査は天候の良い日に実施するが,晴天時に大きな地下水流音が検知された場所が,豪雨時にも崩壊の発生するような地下水流が発生するのかは明らかでない。そこで,崩壊を有する斜面で水文観測を実施した。

3年計画の最終年に当たる本年は,データの蓄積・分析を行い,これまでの成果をとりまとめ,次のような結論を得ることができた。多数数の自然斜面崩壊地,法面崩壊地で地下流水音を測定し,崩壊と地下流水音の関連性を検討した。結果として,地質の種類に関わらず,崩壊は非崩壊地に比較し地下流水音が強い場所で発生することが明らかとなった。また,地下流水音の強い場所の地形変化をモニタリングしたところ,その後の豪雨で実際に崩壊が発生した。地下流水音探査が崩壊の発生する危険な斜面を予測するのに有効であることを確認した。地下水流音の強い揚所と弱い場所で地下水位の変動を観測し,地下流水音が強い場所の意味を検討した。結果として,平常時に地下流水音の大きい場所では,豪雨時に地下水が発生しやすいことが明らかとなった。また,斜面では平常時に地下流水音が大きいところから崩壊に有害な飽和帯が拡大することが明らかとなった。以上のことから,地下流水音の強い場所は,豪雨時に地下水位の上昇しやすい崩壊が発生する危険性の高い場所を特定するのに有効であることが明らかとなった。
移植後膵島の生存率向上のための膵島表面修飾

組織工学や再生医療は新しい治療法を開いた。最も成功した例として膵ランゲルハンス島(膵島)移植によるI型糖尿病の治療がある。ただ、未だ各種の問題を抱えている。例えば移植膵島が、血液凝固や補体の活性化を引き起こす、また、それに伴って炎症反応や拒絶反応を引き起こし、これにより膵島の多くを失ってしまうと報告されている。われわれは、この問題を解決するために、新たに合成したssDNA-PEG-lipidを用いた膵島表面の修飾法を開発した。まず膵島をssDNA-PEG-lipidで処理する。一方、ssDNAの相補の配列を有するssDNA'を膵島表面に固定したいタンパクや細胞に固定する。この両者を混合することで、相補対形成で膵島表面にタンパクや細胞を固定することができた。その効果をマウス間の同種移植で調べたところ、良好な結果を得た。I型糖尿病の治療を目的として膵島移植が行われている。本研究では膵島の表面処理により膵島移植の成績を向上させる試みを行っている。平成21年度に行った研究の概要を以下に記す。1.膵島表面への抗血栓性の付与:膵島は門脈から肝臓内に移植する。このとき膵島表面に血栓が形成され、これが引き金となって炎症反応が起き、炎症反応に巻き込まれて多くの移植膵島が死滅すると報告されている。本研究では膵島表面にウロキナーゼまたトモンボモジュリンを固定化して移植膵島表面上で血液凝固が起きないようにした。修飾膵島のウロキナーゼとトモンボモジュリンの活性を測定したところ十分血液凝固形成を抑制する活性を保持していた。また、修飾膵島はグルコース濃度変化に応じてインスリン分泌を制御する活性を保持していた。2.膵島移植によるfragileな血糖値変動を安定化:最近の研究で確立したカプセル化法を用いて膵島をカプセル化する。まず、ラットをレシピエントに用いて、bFGF+ハイドロゲルからなるDDSを用いて皮下に毛細血管床を誘導し、カプセル化膵島の移植を行った。皮下への毛細血管床の誘導が可能にし、また、コントロール群の同種同系膵島移植系では皮下毛細血管床誘導部位に1000個の膵島を移植することで血糖値を正常化できた。一方、1000個のカプセル化膵島移植では血糖値は正常化できず、現在、移植カプセル化膵島の数を増やして検討中である。3.免疫反応の制御:拒絶反応を抑制する能力があるセルトリ細胞を膵島表面に固定化することを試みている。マウス新生児の精巣からのセルトリ細胞の分離と培養を行い、これを膵島表面に固定できた。現在、in vitroとin vivoでの機能評価を開始したところである。インスリン依存型糖尿病の糖尿病を治療するために、ドナー膵臓から単離した膵ランゲルハンス氏島(膵島)を経門脈的に肝臓に移植することが行われている。移植直後に起こる膵島表面での血液凝固、それに引き続き起こる炎症反応により多くの膵島が失われる。また、この時期を生き延びた膵島もレシピエントの免疫系に異物として認められ、拒絶されてしまう。本研究では膵島細胞表面で起こる種々の反応をコントロールするために、膵島細胞の表面修飾法を開発している。今年は、リン脂質-ポリエチレングリコール-オリゴDNA(Lipid-PEG-DNA)を用いて膵島表面に線溶系酵素であるウロキナーゼや補体制御因子sCR1を固定化することを試みた。Lipid-PEG-oligo(dT)の溶液を膵島のサスペンジョンに添加するとLipid部分が疎水性相互作用により細胞膜の脂質二重膜に突き刺さり、細胞表面にoligo(dT)が提示される。これにoligo(dA)で修飾したウロキナーゼやsCR1を加えるとoligo(dT)とoligo(dA)の相互作用で膵島表面にウロキナーゼやsCR1を固定化できた。現在、移植実験で移植後初期の反応で失われる膵島数を少なく出来るかを評価している。また、拒絶反応をコントロールするために、Lipid-PEG-DNAを用いて膵島表面を患者の血管内皮細胞覆うことを計画し、その予備実験を行った。膵島をLipid-PEG-oligo(dT)で処理し、一方、HEK細胞をLipid-PEG-oligo(dA)で処理し、膵島表面にHEK細胞を固定化さらに被覆した。昨年度までに研究・開発してきた手法を糖尿病マウスをレシピエントとしてその有効性を評価した。異種移植:精製補体制御因子

sCR-1を固定化したアガロースマイクロカプセルに封入したラット膵島を糖尿病マウスに異種移植したところ、血糖値が30-60日と顕著に延長した。これを受けて、遺伝子組換えの技術を用いてsCR-1を分泌するレシピエントマウス由来の繊維芽細胞の作成を行っている。sCR-1分泌細胞と膵島との細胞凝集体を作り、異種移植での拒絶反応の有効性を評価する予定である。同種移植:免疫抑制効果のある物質を分泌するセルトリ細胞(精上皮の基底側から管腔側に向かって伸びる柱状の細胞)と膵島細胞から複合細胞凝集体を作成し、これを移植することでマウス間の同種移植(Balb/cとBlack-6間)で免疫抑制剤の投与を必要としない膵島移植を実現することを試みた。複合細胞凝集体はハンギングドロップ法で作成し、400個膵島分の細胞を含む凝集体を経門脈的に肝臓内に移植した。移植後血糖値の変動を計測したところ、8匹のレシピエントのうち7匹までが100日以上血糖値が正常化し、セルトリ細胞の免疫抑制効果は著明であった。また、移植膵島の組織学的検討を行ったところ、移植膵島の周囲に若干の炎症性細胞の集積が見られるものの、移植後100日以上経過後にも肝臓内にインスリン陽性の細胞が存在していた。