hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
サルモネラエフェクターによるカスパーゼ－８の非アポトーシス活性制御の解明

カスパーゼー8はアポトーシスの実行因子である一方、NFκB活性化を介した炎症反応惹起に関わる。我々は新規サルモネラエフェクターGogAが感染マクロファージにおいてカスパーゼー8活性化に関わることを見出した。GogAは感染初期におけるNFκB活性化、それに続く炎症性サイトカインIL-1β発現制御に関与した。GogAによるカスパーゼー8活性化にはLSm8が必要であった。一方、カスパーゼー8活性化はGogAの過剰発現だけでは変化しないことから、他の因子の関与が示唆された。サルモネラはGogAの分泌量を制御することによりNFκBカスケードを制御し、感染を成立させていると考えられる。サルモネラをマクロファージに感染させるとSPI1依存的にカスパーゼ-8を活性化することを見出し、その活性化に必要な因子としてGogA、GtgA2を同定している。2つのタンパク質は7アミノ酸だけが異なる非常に相同性の高いタンパク質であるにも関わらず、カスパーゼ-8活性化能はGogAのほうが著しく高い。この活性について検討するため、GogA-CyaおよびGtgA2-Cyaを発現するプラスミドを構築し、サルモネラに導入しマクロファージ内への移行についてcAMP量を指標に比較した。その結果、GogAのほう移行量がGtgA2と比較して多いことが示されたことから、細胞内移行量によりカスパーゼ-8活性が調節されることが示唆された。またGogA、GtgA2の宿主内局在を調べるため、GogA-3FLAGおよびGtgA2-2HAを発現するプラスミドを構築し、感染細胞をFLAG抗体またはHA抗体で染色し共焦点レーザー顕微鏡により観察した。その結果、GogA、GtgA2ともにマクロファージ細胞質に局在することが明らかとなった。さらに、サルモネラSPI1およびSPI2欠損株を用いた実験から、GogA、GtgA2はSPI1に加えてSPI2でも分泌されることが明らかとなった。以上の結果よりGogA、GtgA2はSPI1、SPI2両方から移行される新規サルモネラエフェクターであることが明らかとなった。また、GogA-3FLAG、GtgA2-2HA発現サルモネラをマクロファージに感染させてもカスパーゼ^-8活性は見られなかった。このことから、C末端領域の構造がカスパーゼ^-8活性化に必要であることが示唆された。GogAが直接カスパーゼ^-8を活性化する可能性について、RAW264.7細胞にHalo-GogAをトランスフェクションにより検討したが、カスパーゼ^-8活性は見られなかった。N末端配列はGogAの分泌に必要であると同時にGogAの活性にも起用する可能性が示唆された。サルモネラ感染戦略の一つに、病原因子Salmonella pathogenicity island 1 (SPI1)依存的な炎症反応惹起がある。近年細菌による炎症反応惹起は共通の病原戦略であることが示唆されていることから、この分子機構解明はサルモネラ病原性発現理解だけでなく、細菌感染症理解の一助になると考えられる。これまでに我々は、SPI1エフェクターGogAがカスパーゼー8を活性化することにより、炎症反応惹起に関与することを見出した。この分子機構を明らかにするため、GogAのターゲット候補であるU6 snRNA-associated Sm-like proteinであるLSm8の関与について検討した。まずsiRNAにより検討したところ、LSm8がカスパーゼー8活性化に関与することが示唆された。そこで、GogA-GFP及びRFP-LSm8を発現するプラスミドを構築しFRET法により相互作用を検討したところ、GogAとLSm8が相互作用することが示唆された。一方で、GogAとLSm8の過剰発現ではカスパーゼー8活性化はみられなかった。このことから、サルモネラによるカスパーゼー8活性化にはGogA以外のSPI1エフェクターの関与が示唆された。我々が開発したバイオインファマティクスツールを用いて新たなSPI1エフェクターを探索し、新たにSTM1239を同定したが、カスパーゼー8活性化への関与は認められなかった。又、in vivoにおいてターゲットとなる細胞を同定するため、SPI1過剰発現であるLon欠損株をマウスに腹腔内感染したところ、感染4日目において骨髄における細胞の顕著な減少が認められたにも関わらず、脾臓においては非感染マウスと同等であった。このことは、SPI1がターゲットとする細胞は骨髄に存在することが強く示唆している。以上の結果より、サルモネラはSPI1依存的に骨髄の細胞と相互作用することにより、感染を拡大している可能性が考えられる。

サルモネラの病原性発現機構において、染色体上のSalmonella pathogenicity island 1(SPI1)にコードされる3型タンパク質分泌装置から直接宿主細胞に移行されるエフェクターによる、上皮細胞侵入、炎症反応、宿主細胞死等の誘導が必須である。我々はこれまでに、サルモネラ新規SPI1エフェクターGogA、GtgA2を同定し、カスパーゼー8活性化誘導及びNFκB活性化に関与することを明らかにしている。GogAによるカスパーゼー8活性化経路を明らかにするため、GogA発現プラスミドをRAW264.7細胞にトランスフェクションしてみたところ、カスパーゼー8は活性化されなかった。さらに、IPTG濃度依存的にGogA発現量が制御できるプラスミドをサルモネラ野生株及びSPI1過剰発現株に導入し、GogA量依存的にカスパーゼー8活性化が変わるか検討したところ、GogA量とカスパーゼー3活性化量に相関性はなかった。一方、カスパーゼー8活性化量はSPI1量に依存した。以上の結果から、サルモネラはGogAと協同して機能するSPI1タンパク質を有しており、複数のタンパク質の効果により、カスパーゼー8の活性化を誘導することが明らかとなった。これまでにYeast-2-hybridにより候補タンパク質のひとつとして、RNA helicaseのDdx50が同定されいる。しかしながら、Ddx50の局在は核である。そこで、GogA過剰発現株感染細胞を分画し作成したGogA抗体を用いて局在を調べたところ、宿主細胞の細胞質に局在していた。また、RNA helicaseのひとつRIG-Iとの相互作用をGogA抗体による共免疫沈降により検討したが、相互作用は確認できなかった。このことから、GogAのターゲットがDdx50、RIG-Iでないことが示唆された。初年度に計画した実験はおおむね順調に行えた。研究遂行に必要な共焦点レーザー顕微鏡が年度末に納入されたので、細胞内動態の研究が次年度以降に行う。また、タンパク質の構造解析のためのGogAを精製できた。今後は結晶化条件について検討する。25年度が最終年度であるため、記入しない。RNAヘリカーゼのひとつであるRIG-IはRNAウィルス感染においてカスパーゼー8活性化に関与することが知られているそこで、GogAのターゲット因子の候補としてRNAヘリカーゼDdx50・RIG-Iを考えていたが、今年度の実験結果からこれらはターゲットでない可能性が強く示唆された。しかしながら、Yeast-2-hybridで他に3種の候補因子があることから、RNAiによってこれらの関与を検討してる。RNAiの結果から、有力な候補があることからこの因子について実験を進めることで、ターゲットを同定できる可能性が考えられる。また、GogA、GtgA2はカスパーゼー8活性化を介してNFκB活性化及び炎症性サイトカインIL1β産生誘導に関与することがin vitro感染実験では示唆されている。in vivoにおける効果を検討する際、宿主免疫との関連を検討することを考えている。この研究を進めるために共同研究を新たに始めるべく、準備を進めているところである。
糖ペプチド型分子プローブを用いた細胞内PNGaseのリアルタイム解析

細胞内ペプチドN-グリカナーゼ(PNGase)は不要糖タンパク質からN-型糖鎖を遊離させる酵素であり、タンパク質の品質管理機構に関わる分子として注目されている。本研究ではPNGase活性を高感度に検出するために、還元末端にクロロアセタミド基を、非還元末端側の4位にプロパルギル基を有するキトビオース誘導体をデザイン、合成した。クリック反応により蛍光性置換基を導入、得られたプローブはPNGaseの脱糖鎖活性をμMオーダーで阻害した。PNGaseは糖タンパク質や糖ペプチドからN-型糖鎖を遊離させる酵素であり、糖鎖の構造および機能研究の際の有用な試薬として用いられている。一方、真核細胞の細胞質に広く存在するPNGaseは、異常糖タンパク質の品質管理機構(ERAD)に関わる分子として注目されている。しかしながら、PNGaseの特異な基質特異性から酵素活性を簡便かつ定量的に解析可能な合成基質はなかった。そこで本研究では、PNGase活性を定量的に解析するための合成基質を化学的に調製することを目的とした。また、PNGase活性を細胞内でモニターするための分子プローブとして、FRETをベースとした糖ペプチド型蛍光プローブの開発も合わせて検討した。本年は、1)糖鎖構造の最適化と2)最適ペプチド配列を決定するためにオキシム樹脂によるペプチド固相合成法の検討ならびに、3)蛍光性置換基の導入法の検討を行った。1)糖鎖構造の最適化を行うために、GlcNAc、キトビオースおよびコア5糖の合成を検討した。得られた糖鎖の還元末端にアジト基を導入し、還元後、クロロアセチル化することにより共有結合型PNGase阻害剤へと導いた。酵素阻害活性をもとにPNGaseの認識糖鎖構造の検証を進めている。2)PNGaseの認識するペプチド配列の最適化を行うためにオキシム樹脂によるペプチド固相合成を検討した。オキシム樹脂の調製およびアスパラギン酸の導入を完了した。現在、ペプチド鎖の伸長と糖ペプチドの合成を検討している。3)クリックケミストリーをベースに蛍光性置換基による糖鎖修飾を検討した。プロパルギル基を有するGlcNAcの合成が完了し、アジト基を有するダンシル誘導体と反応した結果、収率よく蛍光標識されることを確認した。現在、オリゴ糖レベルでの標識化を検討中である。PNGaseは糖タンパク質からN-型糖鎖を遊離させる酵素であり,異常糖タンパク質の品質管理機構(ERAD)に関わる分子として注目されている。しかしながら,酵素活性を簡便かつ定量的に解析可能な合成基質はなかった。本研究ではPNGase活性を定量的に解析するための合成基質を化学的に調製することを目的としている。本年は,キトビオース構造をベースとしてPNGaseによる糖鎖認識能を失うことなく蛍光標識可能な部位を決定するために,還元末端にアジド基を,非還元末端の4位にプロパルギル基を有するキトビオース誘導体の合成を実施した。1)単糖グルコサミン誘導体の4位に対するプロパルギル基の導入を検討したところ,TIPS基でアルキンを保護することで目的物が収率よく得られることを見いだした。得られたプロパルギル基を有する単糖を糖供与体とし,グルコサミン誘導体とのカップリング条件を種々検討した結果,目的とするキトビオース構造の構築に成功した。一方,キトビオース構造を先に構築後,4位に対するプロパルギル化を行うことにより,目的とした2糖の合成が可能であることを確認した。2)2糖キトビオース誘導体の脱保護反応および官能基変換を検討した結果,DDQによる酸化的脱ベンジル化反応により,アジド基およびプロパルギル基を傷めることなく目的物が得られることを明らかにした。3)還元末端部分へのアスパラギン酸の導入は,Bu_3Pを用いたシュタウディンガー反応により,目的物が得られることを確認した。4)キトビオース誘導体の4位に対して,アジド基を有するDansyl基の導入を行った結果,2糖誘導体でもクリック反応により,蛍光性置換基の導入が可能であることを確認した。以上の検討により,キトビオース誘導体をベースとして,糖アミノ酸のグラムスケールでの合成が可能であること,および蛍光標識が可能であることを明らかにした。PNGaseは,異常糖タンパク質の品質管理機構に関わる分子として注目されていが,酵素活性を簡便かつ定量的に解析可能な合成基質はない。本研究ではPNGase活性を定量的に解析するための合成基質の調製を目的としている。昨年度,キトビオース構造をベースとし,還元末端にクロロアセタミド基を,非還元末端側の4位にプロパルギル基を有するキトビオース誘導体の合成をおこなった。本年度は,プローブの大量合成法と,得られたプローブを用いたPNGase阻害実験および活性検出を試みた。グルコサミン供与体150gを合成後、うち20gを用いて還元末端にアジド基を導入,糖受容体とした。得られたアジド誘導体とグルコサミン供与体をカップリング,キトビオース誘導体を20g合成した。

TIPS基で保護したプロパルギル基を導入,プロパルギル基を有するキトビオース誘導体を1g合成した。酸化的脱ベンジル化反応を検討し,MnO_2を添加することで,DDQの使用量を大幅に減らすことができた。クロロアセチル基を還元末端に導入,目的のプローブを100mg合成した。得られたプローブを用いて阻害実験をおこなった結果,RNaseBを基質としたPNGaseの脱糖鎖活性をμMオーダーで阻害することを確認した。一方,PNGaseとプローブを反応させた後に,クリック反応により蛍光性置換基を導入した。この結果より,タンパク質上のアルキンに対しても蛍光性置換基を導入,酵素活性を有するPNGaseのみを選択的に検出できることを示した。また,あらかじめクリック反応によりダンシル基を導入したプローブもPNGaseを阻害することを確認した。また,糖アミノ酸ユニットの合成は,還元末端のアジド基を還元,アミノ基とした後にアスパラギン酸無水物と反応することで,縮合剤を用いることなく,目的物が得られることを確認した。
遺伝子解析情報に基づいた検査診断支援データベースの構築とシステム化に関する研究

非症候性であるが、状況によって重篤な臨床症状を呈するハイリスク性の遺伝性疾患を日常の診療で見いだすことは、検査医にとって重要な仕事である。詳細な日常検査データアの解析がこのような疾患の検出を可能とするが、確実な検出のためのルール、またはシステムは確立されていない。この研究課題は、これらの遺伝性変異の検出のアルゴリズムを確立し、日常検査における遺伝子異常に基ずく検査データの異常の診断・意志決定を支援するシステムを構築することである。血清コリンエステラーゼ(BCho)の遺伝性変異を検出するルールは、効率よく作動することが確認された。このシステムで40例を越える遺伝性変異が検出された。この中には、新たに見いだされた変異が3例含まれている。この中でL300I、G365Rの二つの変異は、ともに日本に多い変異であることが確認され、さらにk-変異も欧米と頻度で差がないことが確認された。乳酸脱水素酵素(LD)のサブユニット変異に対しては効率よいルールは、見いだされていないが、LDとクレアチンキナーゼ(CK)の関係を検索することで、変異が見いだされている。日本ではM-サブユニット変異で4種の遺伝子変異が我々を中心に解析されている。また、これに関連する国際会議で米国で2症例、イタリアで1症例が新たに報告された。これらの症例の日常検査のデータと遺伝子変異の部位は、浜松医科大学の医療情報システムに蓄積されている。将来これらの情報は、ネットワークを介して国際的に利用可能とすることを計画している。遺伝子解析情報として、まず血清コリンエステラーゼの遺伝性変異をとりあげて調査した。すなわち、その存在頻度を調べるために、血清コリンエステラーゼ活性が低値(正常値の平均値-3SD)である個体を集め、DNA診断を行った。遺伝子解析手法としては、Polymerase Chain Reaction-Single Strand ConformationPolymorphism(PCR-SSCP)、塩基配列決定法を施行したところ、コリンエステラーゼ遺伝子のコドン24、365、330、119、515、418にミッセンス変異もしくはナンセンス変異を見いだした。これらは低コリンエステラーゼ血症として発現するサイレント型遺伝子と考えられる。これら低コリンエステラーゼ血症を示した個体の内、約半数が上記のサイレント型遺伝子変異のヘテロ接合体であった。すなわち、低コリンエステラーゼ血症は全人口の約1.3%を占めていたので、その約半数に遺伝子変異が存在するとすれば、およそ150人に一人の割合となる。また、欧米の報告例とは異なった特異的な遺伝子変異も検出し、人類遺伝学的な知見も得られた。このような遺伝性変異のある個体では、先天的にコリンエステラーゼ活性が低いのにもかかわらず、肝機能障害と診断された例が実在する。同じく肝臓で合成されるアルブミンとの比率などで判別関数を作成し、コンピューター診断することを現在試みている。なお、遺伝性変異を検出する手法としてPCR-SSCP解析を用いたが、我々の検討の結果、変異の種類によっては、SDSを泳動用バッファーに加えた方が検出感度が上昇する場合があることをつきとめた。遺伝性変異のスクリーニングとしてさらに役立つ所見と考える。これまでの経過から、乳酸脱水素酵素(LDE)サブユニット欠損症、およびコリンエステラーゼ変異については、検診および病院患者群を対象として浜松医科大学附属病院に構築されている病院総合医療情報システムおよび検査システム内に現在までにえられている遺伝性変異の特徴を抽出し、遺伝性変異の検索抽出システムを作成した。コリンエステラーゼ変異の抽出論理は比較的効率よく作動し、現在までに40例以上の変異が抽出されており、PCR-SSCP法を中心に既知の変異に対してはRFLPを組合せ、新たな変異では直接シークエンシングすることにより新たに3種の変異を加え8種の変異を解析することが出来た。

このうち活性中心近傍のL330I変異と、G365R変異の2種の変異の頻度が比較的高く観察され、そのほかにk-変異も約17%と欧米に比して同等以上の頻度で観察されている。これらの変異はいずれも低活性を示す変異であり、臨床的に肝障害の指標として用いられる検査であることから、変異の存在を無視したコリンエステラーゼによる肝障害の評価は問題があることが示された。また、これらの検索システムを血栓症の遺伝的背景に高頻度に存在するプロテイン-Cの変異に対しても拡大していくことを試みている。遺伝性変異の存在は、それ自体が疾患と密接に関連するものの他に、検査のピットホールとして重要な変異も含まれる。これらの変異が日常検査のデータの解析からハイリスク群が抽出されるようなシスツム構築を更に発展し、より効率よいシステムを確立することを続けたい。これまでの2年間の経緯から、コリンエステラーゼ変異、乳酸脱水素酵素(LDH)-サブユニット変異、については、見いだされた症例について関連する一般検査のデータから判別式が作成され、一次スクリーニングの可能性が示された。一方、この判別式によるスクリーニングの効率も症例毎に明らかにされ、スクリーニングの困難な例も明らかにされた。また、これまでの例に加えて、血液凝固関連の検査データの異常から凝固因子、第XI因子変異、ATIII変異の家系が見いだされてきた。要約すれば、コリンエステラーゼ高活性のC5変異に関しては、基準範囲上限の2倍の活性値をカット値として症例を選択し、判別式にて85%推定値で効率よくスクリーニングされる。DNA検索をする前に判別式の選択を加えるべきである。低活性のサイレント変異に関しては、ヘテロ体を含めるには、基準範囲下限をカット値として選択し、肝機能に関連する日常検査のデータから判別式が作成できる。これを用いて肝障害者を排除し、残りをDNA検索で対応すべきである。また、ホモ体に関しては基準範囲の3SDIを利用して選択可能である。また、k-変異に関しては判別式の作成は困難であった。LDH-サブユニット変異に関しては、H-サブユニット変異に関しては、基準範囲の3SDIでふるい分け、赤血球のLDH検索で、効率よく選別され、DNA検索で確定診断が可能である。また、M-サブユニット変異では、現状では効率よい選別法はない。その他の変異に関しては、症例数が少なく日常検査からのスクリーニングについての検索は不可能であるが、今後の課題としたい。
国際会計基準のコンバージェンス・アドプションと業績報告に関する実証研究

本研究では、国際財務報告基準(IFRS)とのコンバージェンスおよびアドプションとそれによる影響、ならびに個別のトピックスとして業績報告について次の4つの課題を検討した。第一に、包括利益情報が投資家に有用であるかどうかを利益発表後の株価のドリフト(PEAD)に着目し、分析を行った。第二に、包括利益の算定に影響を及ぼす公正価値について、景気循環増幅効果をもたらすかどうかを検討した。第三に、国際会計基準審議会(IASB)と米国の財務会計基準審議会(FASB)でこれまで検討されてきている業績表示について、その論点を明らかにした。最後に、IFRSの導入が及ぼす影響を企業はどのようにとらえているのかについて、日本と韓国の上場企業に対してアンケート調査を行い、その結果を分析した。これらの4つの分析結果は、IFRSのアドプションによって、必ずしも投資家や企業にプラスの効果をもたらすとは期待されないことを示唆するものである。本研究では、会計基準のグローバル化の流れのなかで、2011年3月決算からわが国で導入が義務付けられる包括利益計算書に焦点を当てているが、開示情報が入手できるのは次年度以降になる。そのため、本年度は、今後、包括利益の質を検討する上で重要な追加情報を提供しうる公正価値に着目し、関連する論文を検討した。公正価値を重視するアプローチは、国際財務報告基準(International Financial Reporting Standards : IFRS)の特徴であり、公正価値による測定結果として生じる評価差額(いわゆる時価評価差額)の期中変化額が、純利益や新たなボトムラインである包括利益の算定に含まれる。特に、マイナスの評価差額(評価損)は、純資産(資本)に算入されることから、自己資本比率の算定に多大な影響を及ぼす点が問題視された。具体的には、金融危機において、公正価値測定による評価損が、銀行の自己資本比率を大きく引き下げ、銀行の破綻を引き起こしたとの批判を受けた。そして、銀行を中心とするロビー活動の結果、公正価値の見直しが政治問題にまで発展した。本年度は、公正価値会計が銀行の自己資本比率に負の影響をもたらすか、また景気循環を増幅させるのかといった課題に取り組む研究を調査した。その結果、現段階では、先行研究におけるアプローチや分析期間、分析モデルによって結果は異なり、首尾一貫した証拠は提供されていないことがわかった。しかし、公正価値情報が投資家の意思決定に役立つか否かという観点から分析を行った研究では、公正価値の開示レベルを3つ(レベル1,2,3)に分類することによって、追加的なリスク情報を取得できることや上位レベルほど価値関連性が高まることを例証している。さらに、経営者の裁量行動に着目すると、公正価値測定が経営者の裁量を反映することが明らかにされている。このように、先行研究の結果は、レベル1からレベル3に公正価値を分類・開示した情報は、投資家の意思決定に有用であることを示している。これらの情報に起因して、包括利益情報の質が異なるかどうかも、今後、重要な検討課題となる。本研究では、会計基準のグローバル化の流れのなかで、国際財務報告基準(lnternational Financial Reporting Standards: IFRS)とのコンバージェンス・アドプションによる影響が著しい、包括利益と公正価値の問題に焦点を当てている。本年度は、日経メディアマーケティング社の日経Financial Questから、包括利益情報とその他の包括利益(Other Comprehensive Income:OCI)の個別項目である為替換算調整勘定、その他有価証券の評価差額金、繰延ヘッジ損益に関するデータ・ベースの作成を行い、次年度の分析に備えた。さらに、包括利益の算定に大きな影響を与える公正価値について検討した。公正価値を重視するアプローチは、IFRSの特徴であり、公正価値による測定結果として生じる評価差額(いわゆる時価評価差額)の期中変化額が、純利益や新たなボトムラインである包括利益の算定に含まれる。特に、わが国では1999年に持合株式がその他有価証券に分類され、その公正価値評価(時価評価)が義務付けられた。そして、その評価差額が包括利益に算入されることになった。そのため、公正価値評価が義務付けられた1999年以降、持合の解消、すなわち有価証券の売却が進められた。このように、投資有価証券が公正価値で評価されることにより、投資有価証券に関する企業の売買行動が、景気循環を増幅させるかどうかに関する分析を行った。その結果、すべての企業が景気循環増幅効果をもたらすような有価証券の売買行動に従事しているわけではないが、有価証券の売買を積極的に行っている企業や業績のボラティリティが激しい企業については、そのような関連性を裏付ける証拠が得られた。

本年度は,国際会計基準とのコンバージェンスによって,現在,わが国においても開示が義務付けられている包括利益情報に焦点を当て,四半期ベースでの当該情報の有用性について検討した。具体的には,包括利益を純利益とその他の包括利益(OCI)に区分し,その情報内容について,長期と短期のアナウンスメント効果を分析した。分析から得られた主たる発見事項は次のとおりである。まず,純利益情報に対しては,決算発表日周辺だけでなく,決算発表後60日間にわたって,株価は強く反応することが明らかにされた。一方,OCI情報に対しては,短期のみならず,長期分析においても,統計的に有意な株価反応は観察されなかった。この結果については,日本会計研究学会第71回全国大会(一橋大学)で報告し,本年度出版予定(分担執筆)である。また,国際会計基準のこれまでの大きな特徴は公正価値を重視することであったが,公正価値評価は,包括利益の算定に大きな影響を及ぼす。そのため,公正価値がもたらす景気循環増幅効果について,第35回ヨーロッパ会計学会年次総会(スロベニア)と2012年アメリカ会計学会(ワシントンD.C.)において研究報告を行った。さらに,IASBは,業績計算書のフォーマットを見直しており,現在,純利益とOCIの区分のあり方について検討している。そこで,この業績計算書のフォーマットに関するIASBとFASBのこれまでの議論を中心に検討し,学内紀要で発表している。最後に,国際会計基準のアドプションについては,日本と韓国企業の財務担当役員(CFO)に対して,2011年10月12月にアンケート調査を実施した。その分析結果については,BI Annual Reportと学内紀要で報告している。さらに,企業のIFRSに対する適応能力と理解に焦点を当てた分析も行っており,この結果については,本年度の学内紀要に掲載予定である。国際会計基準のコンバージェンスとアドプションの影響の大きい、包括利益、業績報告、公正価値の問題について、データ整備、先行研究のレビュー、実証分析をそれぞれ行っているから。24年度が最終年度であるため、記入しない。今後は、包括利益についてデータ・ベースが完成したものについては、分析を行う予定である。業績報告に関する先行研究のレビューについては、論文として発表する予定である。公正価値の分析に関しては、モデルの改良や精緻化のために、海外の学会で報告する予定である。
New Word Grammar理論(NWG)による英文法研究

本研究の目的は、英国を代表する言語学者Richard A.Hudsonが新たに開発し、改良を重ねているWG理論(New Word Grammar,NWG)の枠組みを把握し、その認知文法的、あるいは構文文法的影響を探ることであった。3年間に亘って予定していた研究計画に従い、これをほぼ遂行し、NWGの修正点、改良点を明らかにし、言語理論として有望であると結論付けた。研究成果は、論文としても公刊したが、2011年中にはKyoto Working Papers in English and General Linguistics Vol.1、『ハドスンの英文法』として開拓社よりそれぞれ、論文集、書籍として刊行する。本研究の目的は、英国を代表する言語学者Richard A.Hudsonが新たに発表した、進化した形のWG理論(New Word Grammar,NWG)の枠組みを把握し、その認知文法的、あるいは構文文法的影響を探る。今年度予定していた研究計画に従い、これをほぼ予定通り遂行し、以下のような実績を上げた。2.今年度の研究成果の一部を、日本英語学会第1回国際Forum(2008年4月26-27日、東京外国語大学)で連携研究者と共同でworkshopを開催して公開、あわせて研究代表者個人の口頭発表も行った。本研究の目的は、英国を代表する言語学者Richard A. Hudsonが新たに発表した、進化した形のWG理論(New Word Grammar, NWG)の枠組みを把握し、その認知文法的、あるいは構文文法的影響を探る。また、研究成果は、論文としても公刊した。2.今年度の研究成果の一部を、日本英語学会第2回国際Fomm(2009年4月25-26日、奈良女子大学)で連携研究者と共同でworkshopを開催して公開した。有意義な質問が多数出て活発な討論が展開された。4.英語語法文法学会第5回英語語法文法セミナー(2009年8月7日、関西学院大学梅田キャンパス)に講師として招聘されて、今年度の研究成果の一部を講演した。本研究の目的は、英国を代表する言語学者Richard A. Hudsonが新たに開発し、改良を重ねているWG理論(New Word Grammar, NWG)の枠組みを把握し、その認知文法的、あるいは構文文法的影響を探ることである。また、研究成果は、論文としても公刊したが、2011年中にはKyoto Working Papers in English and General Linguistics、『ハドスンンの英文法』として開拓社よりそれぞれ、論文集、書籍として刊行する。1.今年度の研究成果の一部を、日本英語学会第3回国際Forum(2010年4月24-25日、青山学院大)で口頭発表して公開した。NWGに関心のある英語学者から有意義な質問が多数出て活発な討論を展開した。4.英語語法文法学会第18回大会(2010年10月16日、日本大学文理学部)のsymposium「英語の冠詞、限定詞をめぐって一言語事実を如何に説明するか?語法文法研究、言語事実、文法理論、英語教育のinterface」を主宰し、今年度の研究成果の一部を共同研究者とともに公開発表した。聴衆からの反響は大きかった。5.日本英語学会第28回大会(2010年11月13日、日本大学文理学部)においてworkshop "An Introductory Teach-in on New Word Grammar"を主宰し、共同研究者とともに、これまでの研究成果の一部を口頭発表した。発表内容について的を射た質問を受け、実りある議論を聴衆と行うことができた。6.電子情報通信学会「思考と言語研究会」『文型と意味』(2011年2月4日、東京、機械振興会館)に講師として参加し、研究成果の一部を講演した。
多点光ラベル解析による膜タンパク質機能構造のモニタリング

切断性および発蛍光性を含む光クロスリンカーの更なる多機能化によりラベル部位解析効率を向上し、従来法では限界であった1カ所のラベル解析から複数の微量ラベルの同時解析を達成した。結合ドメインにおける複数ラベル部位のラベル量変化から、基質や補因子等の結合によるタンパク質のアロステリック構造変化を詳細に追跡する新たな手法論を開発した。本研究では、X線結晶構造解析法等が適応困難なタンパク質について、その構造変化をモニターするための高性能な光ラベル解析基盤技術を確立する。具体的には、独自の光反応基(同位体を有する蛍光標識:IsoFT)の更なる高性能化を図ることで、リガンド結合ポケットにおいて1カ所のラベル解析が限界であった従来法を刷新し、複数の極微量ラベル部位の同時解析を可能にする。まず、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ(GDH)のアロステリック酵素機能調整における構造変化モニタリングを実施した。核酸系の調整因子であるADPやATPの末端リン酸基に光反応基を導入した光反応性プローブによるGDHラベルでは、主要ラベル以外に複数の微量ラベル産物が検出された。阻害実験等から、プローブが基質結合部位に特異的に相互作用すること、同じ結合ポケットの複数カ所ラベルであること、さらに別因子の添加によりラベル位置が異なることが明瞭に示された。以上のことから、本方法論により、機能ポケット構造変化を容易に追跡可能なことが示唆された。主要ラベル部位に関してはIsoFT法で容易に特定できたが、微量ラベル解析では操作が複雑化することが判明した。別途、プロテオミクスに対応するため反応基の機能化を進め、高度濃縮基ビオチン基及びクリック反応基であるエチニル基を導入した光反応基ユニットの開発に成功したことから、今後はこの反応基を取り入れた解析を進める。一方、現光反応基では反応/操作温度を厳密に制御する必要があるため、それを改良するために新たな機能性光反応基開発を進め、光誘起電子移動(PeT)機構に基づく光反応基のプロトタイプ作製に成功した。最終目的は膜タンパク質に適応可能なラベル構造解析法の確立である。初年度では、そのプロトタイプを装着した光反応性基質プローブを作製し、多点ラベル解析評価系を確立し、さらに目的を達成するための多機能性反応基ユニットの開発を目標とした。1.「アロステリック酵素を用いたドメイン構造解析」では、多点ラベル解析評価系としてグルタミン酸デヒドロゲナーゼのアロステリック構造変化を選択し、そのADT及びATPプローブを作製した。結果、結合ポケットの複数ラベルが確認され、本法により各種調整因子添加による複数ラベル挙動の追跡、つまり構造変化モニタリングが可能であることを示した。但し、蛍光特性と同位体効果によるLC-MS解析効率化では、膨大な夾雑物存在下での極微量ペプチドのラベル部位特定は難しいことが判明した。2.「プロテオームにおけるラベル解析効率の評価」では、高度精製機能を兼ねたビオチンプローブにより、細胞ライセートから直接、ビオチン結合酵素である複数のカルボキシラーゼの同定、及びラベルアミノ酸の特定に成功した。これにより、プロテオームなど微量ラベル物質の同定には、その濃縮操作が極めて有効であることが証明された。3.「多機能性反応ユニットの作成と最適化」では、プロテオミクスのための濃縮精製用タグ付き光反応基開発を目的とした。まず反応基のカルボン酸末端にビオシチンを導入した桂皮酸型光反応基を作製したが極めて溶解性が低かった。そこで親水性リンカーを導入したところ溶解性を大きく向上させることに成功した。別途、ビオチン基の替わりにクリック反応基質であるエチニル基を導入したジアジリン反応基を合成した。さらに、現反応基の反応性改善のため新たな機能性光反応基開発を進め、新しいコンセプトに基づく光反応制御型クロスリンカーのプロトタイプ作製に成功した。本研究では従来光アフィニティーラベル法を刷新し解析効率を向上させることで、リガンド結合ポケットにおいて複数ラベル部位の同時解析を可能にする。これにより微量発現タンパク質同定に限らず、タンパク質ーリガンド結合構造のモニタリングを可能とする光アフィニティー蛍光ラベル解析技術基盤を確立する。初年度の検討結果を受け、2年目は解析効率化のための微量ラベルタンパク質処理や反応基の改善を中心に進めた。以下、アロステリック酵素を用いたドメイン構造解析、プロテオームにおけるラベル解析効率の評価、多機能性反応ユニットの作製と最適化の開発項目別に記載する。1.「グルタミン酸デヒドロゲナーゼ機能構造解析」アロステリック調整部位に結合するATPプローブを用いてラベル解析を推進した。解析前処理操作の見直しを行い、さらに同位体を利用することで解析に必要な試料量の削減に成功し、主要ラベル以外の複数微小ラベルピークの解析に成功した。2.「プロテオームにおけるラベル解析評価」最も煩雑な膜タンパク質を対象にして、開発項目3で初年度に開発した高度濃縮用ビオチンタグを導入したプローブを用いてラベル解析を実施した。生細胞中の膨大な夾雑物存在下で極微量ラベルタンパク質を絞り込むための試料前処理条件を種々検討した結果、予備的ではあるがラベルペプチドを検出するまでに至った。3.「多機能性反応ユニットの作製と最適化」項目2で用いた反応基とは別に、濃縮タグをフェノール基に導入した反応基を作製したが不安定であり開発を断念した。初年度に開発した異なる切断機構を有する新規光反応基では、その誘導体を作製し反応性や物性を評価した結果、ラベルタンパク質の濃縮/選択的溶出に有用な光切断反応を光クロスリンク反応と明瞭に区別する条件を確立した。

最終目的は膜タンパク質に適応可能な高性能ラベル構造解析法の確立である。2年目は、反応基の改善を進め、プロテオミクスに対応した光反応基ユニットの機能付加、および初年度に開発した新規反応基の光反応制御に成功した。またラベル解析では諸条件の精査を行い、初年度に設定した評価系で複数の微量ラベルアミノ酸を同定し、複数ラベルの同時解析に成功した。また、生細胞を用いた解析効率評価では、細胞中の膨大な夾雑物存在下で極微量ラベルタンパク質を絞り込むための試料前処理条件を種々検討した結果、予備的ではあるが、膜画分から微量ラベルペプチドの解析に成功した。以上のことから最終目的に資する技術基盤に到達しつつある。本研究ではリガンド結合ポケットの複数ラベル部位を同時解析することでタンパク質ーリガンド結合構造をモニタリングする光アフィニティー蛍光ラベル解析技術基盤を確立する。最終年度は生細胞系ラベルを通して解析操作効率化を進めながら、多点ラベル解析によるタンパク質機能ドメインの3次元的解析法に展開した。以下、アロステリック酵素を用いたドメイン構造解析、プロテオームにおけるラベル解析効率の評価、多機能性反応ユニットの作製と最適化の開発項目別に記載する。1.「グルタミン酸デヒドロゲナーゼ機能構造解析」GDHアロステリック調整部位に結合するATPプローブを用いたラベル解析では、安定同位体による質量差を利用することで微小MSシグナルの判別効率向上に成功した。複数ラベルアミノ酸の位置情報と蛍光強度によるラベル量情報からGDH部分構造のダイナミックな動きを検出することに成功した。2.「プロテオーム系でのラベル解析評価」最も煩雑な系の膜タンパク質であるイオンチャネルを対象にして、ビオチンタグ導入型阻害剤プローブを用いた生細胞での微量ラベル解析を評価した。微量解析に必須である前処理条件の最適化を進めた結果、最近同定されたチャネル構成ユニットのファミリータンパク質など数種が検出されたが、一部はその機能解析に移行している。3.「多機能性反応ユニットの作製と最適化」本構造モニタリング技術をin situ解析など極微量系で展開するには、MS解析効率向上と共に、ラベル効率や蛍光特性の改善が必要であった。現反応基の機能化により切断効率の改善と微小MS同定効率の向上を達成した。一方、同様な機能を保持しつつ蛍光強度を100倍向上させた2種類の反応基開発に成功し、その1つはラベル収率も約10倍向上した。切断性および発蛍光性を含む光クロスリンカーの更なる多機能化によりラベル部位解析効率を向上し、従来法では限界であった1カ所のラベル解析から複数の微量ラベルの同時解析を達成した。結合ドメインにおける複数ラベル部位のラベル量変化から、基質や補因子等の結合によるタンパク質のアロステリック構造変化を詳細に追跡する新たな手法論を開発した。作製した濃縮タグを付与した多機能性反応基ユニットを基質あるいは阻害剤に導入し、光アフィニティーラベル解析用プローブを作製する。これらを用いてプロテオーム系でのラベル解析に移行する。1.アロステリック酵素を用いたドメイン構造解析
単一汗腺からみた運動時の人の発汗能力に関する研究

運動を実施すると体内に多量の熱が発生するが,ヒトの場合は汗などによって熱が体外に放散されるため,運動時の体温を一定範囲内に保つことができる.ヒトには汗分泌に関わる活動汗腺が約250万個あるが,これらの汗腺一個(単一汗腺)の活動を連続的に測定できると,運動時における発汗調節の仕組みをより詳細に検討することが可能となる.そこで,平成13と14年度の研究により,ヒトにおける単一汗腺の活動を多部位で測定する方法を確立し,これが運動時にも利用可能か,また,この活動と汗の塩分濃度との関係はどのようになっているのかを検討した.安静時における下肢温浴時ならびに運動時において,単一汗腺の活動(伝導度)をアクリルで作成した単一汗腺測定用カプセルを用いた方法により前腕部と背部の多部位で連続的に測定することが可能となった.これらで測定した結果は,従来の方法で測定した汗の変化と類似していたが,ある値の発汗量から汗伝導度は急激に増加し,閾値が認められた.この閾値以降は発汗量と汗伝導度との間に直線関係が見られ,また,これらの対応関係は部位により異なっていた.さらに,この閾値は,汗腺での汗塩分濃度の再吸収量と関係しているのかどうかをイオンセンサーで検討したが,センサーの特性より十分な結果は得られなかった.しかし,先行研究を検討してみると,この閾値は汗腺での汗塩分濃度再吸収の最大値を示して可能性が明らかとなった.これらの結果から,汗伝導度を用いると運動時の発汗活動を単一汗腺レベルで検討できることが示された.運動を実施すると体内に多量の熱が発生するが,ヒトの場合は汗などによって熱が体外に放散されるため,運動時の体温を一定範囲内に保つことができる.ヒトには汗分泌に関わる活動汗腺が約250万個あるが,これらの汗腺一個(単一汗腺)の活動を連続的に測定できると,運動時における発汗調節の仕組みをより詳細に検討することが可能となる.そこで,平成13年度では,先ず,ヒトにおける単一汗腺の活動を多部位で測定する方法を確立するために,単一汗腺の活動を測定する方法の構築を,平成14年度では13年度の方法を用いて,運動時の単一汗腺活動を検討することを目的とした.平成13年度では,単一汗腺の活動を測定するカプセルを作成し,この変化を従来の方法での発汗活動と比較し,今回作成したカプセルで単一汗腺の活動を評価する方法を確立した.平成14年度では,運動時において単一汗腺活動がどのようになっているのかを検討するため,最大酸素摂取量の50%の自転車運動を環境温28°C(相対湿度50%)の環境下で40分間実施した.このとき,前腕部と胸部の発汗量ならびに同部位の単一汗腺活動を測定した.その他の測定項目は心拍数,食道温および4点法による平均皮膚温であった.運動時の発汗量と単一汗腺活動との間には密接な関係があった.また,今回用いた単一汗腺活動の測定方法により,汗に含まれるイオン濃度の変化を間接的に検討することが可能である.汗に含まれるイオン濃度の変化と発汗量の変化は異なり,発汗開始とイオン濃度が上昇する閾値(時間や食道温)は後者の方が大きかった(遅れていた).また,発汗量がある値に達すると汗のイオン濃度も急激に上昇し,それ以降は両者の間に対応関係が認められた.これらのことから,運動時における単一汗腺活動は従来測定した発汗活動と類似した関係にあり,また,汗のイオン濃度変化と発汗量の変化は発汗初期において違いが認められた.運動を実施すると体内に多量の熱が発生するが,ヒトの場合は汗などによって熱が体外に放散されるため,運動時の体温を一定範囲内に保つことができる.ヒトには汗分泌に関わる活動汗腺が約250万個あるが,これらの汗腺一個(単一汗腺)の活動を連続的に測定できると,運動時における発汗調節の仕組みをより詳細に検討することが可能となる.そこで,平成13と14年度の研究により,ヒトにおける単一汗腺の活動を多部位で測定する方法を確立し,これが運動時にも利用可能か,また,この活動と汗の塩分濃度との関係はどのようになっているのかを検討した.安静時における下肢温浴時ならびに運動時において,単一汗腺の活動(伝導度)をアクリルで作成した単一汗腺測定用カプセルを用いた方法により前腕部と背部の多部位で連続的に測定することが可能となった.これらで測定した結果は,従来の方法で測定した汗の変化と類似していたが,ある値の発汗量から汗伝導度は急激に増加し,閾値が認められた.この閾値以降は発汗量と汗伝導度との間に直線関係が見られ,また,これらの対応関係は部位により異なっていた.さらに,この閾値は,汗腺での汗塩分濃度の再吸収量と関係しているのかどうかをイオンセンサーで検討したが,センサーの特性より十分な結果は得られなかった.しかし,先行研究を検討してみると,この閾値は汗腺での汗塩分濃度再吸収の最大値を示して可能性が明らかとなった.これらの結果から,汗伝導度を用いると運動時の発汗活動を単一汗腺レベルで検討できることが示された.
波浪のような荷重を受ける構造物支持地盤の推積構造異方性の依存性

波浪場のような種々の載荷条件下にある地盤の支持力-変形特性に与える堆積構造異方性の影響を定量的に評価するために、一連の模型実験を行った。特に、昨年度、制作した多方向荷重載荷装置を用いて、単調載荷場及び繰返し荷重場にある構造物-地盤系の支持力・変形特性の基礎資料を収集した。得られた結果は、以下のようである。(1)繰返し載荷場においても昨年度得られた単調載荷場の実験結果と同様、最大主応力方向と堆積面とのなす角ψは異方性を表すパラメータとして有効である。特に、ψ≒40°付近において支持力値の極小値がみられ、その後増加する傾向がみられた。また、強度特性と同様、この指標は地盤内側方変形挙動を表現できる土量比パラメータとも良い対応関係にある。(2)繰返し荷重を受けて構造物がロッキングするような異方性地盤では、載荷方向の相違によって強度に差が現れる可能性がある。それゆえ異方性地盤では、堆積構造異方性と載荷履歴の影響は重要である。(3)構造物支持地盤の完全塑性流動を生じる方向は、地盤の堆積方向に強く依存する。またその方向は構造物の左側と右側の載荷重によって生じる最大主応力方向αと堆積角βとのなす角ψの相違が影響している。(4)新たに提案した側壁工は、載荷方法、地盤密度と堆積条件の相違によってその地盤破壊防止効果は異なるが、有効である。特に、今年度は新たに制作した多方向荷重載荷装置を用いて、静的荷重場及び繰返し荷重場にある構造物-地盤系の支持力・変形特性の基礎資料を収集している。(1)最大主応力方向と堆積面とのなす角ψは、異方性を表すパラメータとして有効である。特に、本試験で行った静的中心、偏心載荷試験ではψ≒40°付近において支持力値の極小値がみられ、その後増加する傾向がみられた。(2)提案している土量比とψの関係は、異方性による支持力の変化傾向を良く説明する。この関係は、支持力機構を評価する上で有効なものとなりうる。(3)波浪のような繰返し載荷試験においても、静的試験と同様に異方性の影響による激しい繰返し強度の変化がみられた。(4)静的及び繰返し載荷条件の違いに起因する側方変形挙動の変化は認められないが、異方性の与える影響は大きい。また側方変形量と不同沈下量の関係において、一義的な関係が存在する。(5)堆積構造異方性を考慮した側方変位量推定法は、実際の海洋構造物-地盤系の側方変形挙動をある程度適切に推定できる。(6)波浪のような繰返し荷重条件下にある構造物-地盤系では、M-V空間の破壊基準を用いることによって、支持力を適切に評価できる。これらの破壊基準は、地盤の異方性や地盤の密度を考慮できる式としても有用である。
宗教上の宗派による犯罪行為の国際比較

本研究によって次の点が明らかとなった。1宗教と犯罪の関係:非常に宗教性の強い国民が多い国々では犯罪率が高く、日本のように比較的宗教性が弱い国々では犯罪率が低い。2犯罪の惹起要因:社会的な結びつきの弱さと歪んだ価値観が、犯罪行為の基本的な要素である。社会から隔絶された過激なカルト(オウム真理教、太陽の寺院、ワコ)では、信者は、両親、友人、同僚のような他のコントロール機関とのコンタクトを絶たれ、カリスマ的な宗教上の指導者による「真理の教え」という歪んだ価値観が教え込まれた。こうしたことが、信者の犯罪行為へとつながって行った。3日本の宗教シーンの特性:日本の宗教シーンの特徴として次の点を挙げうる。すなわち、(1)非常に多様な宗教団体があるということ、(2)欧州や米国の一神教とは異なり諸々の宗教が混然と融合している宗教観、(3)宗教的寛容さ、(4)宗教性の弱さ、である。日本においては、伝統的な信仰上の流派である神道や仏教は、多くの人々にとって精神的な支柱としての意味を失ってしまっている。精神的な指導を得たいという欲求を満たしているのは、多くの新興宗教であり、新興宗教は、とりわけ若く、精神的に不安定な人々の間で流行している。4国家によるカルトのコントロールのあり方:今後、カルトに対する国家のコントロールは強化されることになるになろう。しかし、宗教の自由は守られなければならないので、個々の信者が入信することを妨げることはできない。そこで、ヨーロッパやアメリカの例を参考に、当局が、布教の方法や信者の扱いを適切に審査し、国民に警告を発するシステムが検討されるべきである。5カルトの経済行為:カルトが企業を創設し、製品を製造している場合には、宗派は通常の企業と同様に扱われるべきである。この点では、税の減免措置は、廃止されるべきである。
複製因子Ctf4タンパク質が複製阻害に伴うDSBを正確に修復する分子機構の解明

DNA二重鎖切断(DNA double-strand break, DSB)はDNA複製が阻害された際に生じるが、その修復機構は十分に理解されていない。申請者は先行研究において、複製装置の構成因子であるCtf4タンパク質が、ゲノム再編成を引き起こしやすい相同組換え経路によるDSB修復を抑制するために必要であることを明らかにした(Sasaki and Kobayashi, Molecular Cell 2017)。本研究では、以下の2つの研究目標を達成することによりCtf4タンパク質の作用機構を明らかにすることを目指し当該年度は以下の実績をあげた。研究目標1:野生型とctf4変異体においてDSB部位に結合している複製因子及び相同組換え因子の量をクロマチン免疫沈降法によって比較するCtf4タンパク質は、複製因子をDSB部位につなぎとめることにより相同組換え因子がDSB末端に結合することを防ぐという仮説をたてた。この仮説を検証するために、クロマチン免疫沈降法を用いて3つの複製因子と3つの相同組換え因子のDSB部位への結合量を野生型とctf4変異体において比較した。研究目標2: DSB修復に関与するCtf4タンパク質の相互作用因子を同定するCtf4タンパク質は、DNA代謝の様々な過程で作用する因子と結合する。そこでCtf4結合因子欠損株を構築しその変異体解析を行った結果、ctf4変異体と同様の複製阻害時のDSB修復欠損を示す変異体を同定した。研究目標1:野生型とctf4変異体においてDSB部位に結合している複製因子及び相同組換え因子の量をクロマチン免疫沈降法によって比較する先行研究においてCtf4タンパク質は、複製因子をDSB部位につなぎとめることにより相同組換え因子がDSB末端にアクセスすることを防ぐというモデルを提唱した(Sasaki and Kobayashi, Molecular Cell 2017)。このモデルを検証するために、クロマチン免疫沈降法を用いて複製因子や相同組換え因子のDSB部位への結合量を野生型とctf4変異体で比較する。そのために当該年度は、複製因子および相同組換え因子にエピトープタグを付加した株を構築し、クロマチン免疫沈降法の条件検討を行った。研究目標2:DSB修復に関与するCtf4タンパク質の相互作用因子を同定するCtf4タンパク質は、DNA代謝の様々な過程で作用する因子と結合することが知られている。どのパートナーとの相互作用が複製阻害時のDSB修復に重要かを調べるため、Ctf4タンパク質の結合パートナー欠損株を構築した。研究目標1では、クロマチン免疫沈降法を用いて複製因子や相同組換え因子の結合量を野生型とctf4変異体で比較するための実験準備を行った。3つの複製因子および2つの相同組換え因子にエピトープタグを付加した株を構築した。さらに、これらの株においてクロマチン免疫沈降法を行うための条件検討を行った。その結果、最適な培養条件、免疫沈降法条件を見つけることができた。研究目標2では、Ctf4タンパク質が結合する因子を欠損させた時にctf4変異体と同様のDSB修復異常が起こるかどうかを調べる。そのため、Ctf4の結合パートナーを欠損させた株を構築した。そして、このいくつかの変異体において、DSBアッセイを開始した。研究目標1については、野生型とctf4変異体において、タイムコース実験を行いクロマチン免疫沈降を行う予定である。研究目標2については、Ctf4と相互作用すると報告されている因子を欠損させた全ての株においてDSB解析を行う予定である。そしてこれらの結果をまとめて、論文発表を目指す。クロマチン免疫沈降法の条件検討によって、様々な実験過程において使用する試薬の節約を図ることに成功したため、申請額よりも低コストで実験を行うことに成功した。さらに、国際学会に参加する予定であったが、産休育休期間とかさなったため参加をとりやめた。以上の理由から未使用額が生じた。
アポトーシス抑制遺伝子EATのコンディショナルノックアウト法による生体内機能

EAT遺伝子は、ヒト胎児性癌細胞(EC細胞)の分化初期に発現が上昇する遺伝子として単離され、bcl-2関連遺伝子に属する。培養細胞において抗癌剤によって誘導されるアポトーシスを抑制することが示されている。本遺伝子のノックアウト・マウスは胚性致死であることが知られている。本研究では、さらにEATの発生段階および個体レベルでの機能を詳細にするために、マウスEC、ES細胞においてEATを欠損させ、アポトーシス、細胞増殖、分化に対する機能解析を行なうこと、コンディショナル・ノックアウトマウス作製により個体レベルでの機能解析を行なうことを目的とする。1.EATをコンディショナルにノックアウトするためのターゲッティング・ベクターを作製した。EATは、3ヶのexonからなるが、(1)exon1の両端にloxP配列を挿入したベクターおよび、(2)exon2の両端にloxP配列を挿入したベクターの2種類のターゲッティングベクターの作製を終了した。2.上記ターゲッティング・ベクターをF9細胞、ES細胞に導入し、一方の対立遺伝子でexon1を挟むようloxP配列が挿入されたES細胞を10クローンを得た。現在これらのクローンを用いてマウスを作製している。EATは初期胚発生過程のみならず、成獣の多くの臓器(主に上皮)で発現している。コンディショナル・ノックアウトマウスを作製し、成獣でEAT遺伝子をノックアウトすることにより、EATが機能している臓器やEATが果たしている機能が解明されると期待される。培養細胞において抗癌剤によって誘導されるアポトーシスを抑制すること、本遺伝子を過剰発現するトランスジェニック・マウス(Tg)では、膵ラ氏島の過形成が生じることが知られている。本研究では、EATの発生段階および個体レベルでの機能を更に詳細にするために、マウスEC細胞、胚性幹細胞(ES細胞)においてEATを欠損させ、アポトーシス、細胞増殖、分化に対する機能解析を行なうこと、ノックアウトマウス作製により個体レベルでの機能解析を行なうことを目的とする。1.初期胚のモデルであるEC細胞において、本遺伝子を含むBcl-2関連分子群の発現パターンをRNA protection assayにて検討したところ、EATとbaxの発現が高値であり、アポトーシス抑制分子では、EATが、アポトーシス促進分子では、baxが重要と考えられた。2.EATをコンディショナルにノックアウトするためのターゲッティングベクターを作製した。EATは、3ケのexonからなるが、a)exon1の両端にloxP配列を挿入したベクターおよびb)exon2の両端にloxP配列を挿入したベクターの2種類のターゲッティングベクターの作製を終了した。これらのベクターをF9細胞、ES細胞に導入することにより、本遺伝子の細胞死、細胞増殖、分化に対する機能が解明されることが期待される。