hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
チューナブルフィルターを利用する高速、高精細ラマン直接イメージング装置の開発

チューナブルバンドパスフィルターを利用した新しいラマンイメージングシステムを設計開発した。この方法では、2枚のチューナブルバンドパスフィルターを組み合わせ、特定波数の光だけを透過するフィルターシステムを構築、顕微ラマン分光系に組み込んだ。このシステムを用いることにより、任意波数、波数幅のラマンイメージを取得できた。開発したシステムの基本性能をテスト、金属表面の異物微粒子などの試料について測定を行い、化学種の分別イメージを簡便に取得できることを示した。また透過波数域を変化させ、連続的にラマンイメージを取得することにより、高精細、高分解能、高速でのラマンイメージングが可能となった。顕微ラマンイメージング分析は対象試料の2次元ケミカルイメージを観測する方法として注目されているが、広く用いられているマッピング方式ではデータの取得に多大な時間がかかる。本研究では、チューナブルバンドパスフィルターと高感度CCD検出器を用い、簡便にかつ高速で試料の観察領域全体の高精細な直接ラマンイメージを取得可能な装置を開発することを目的として以下の研究を行った。現有の自作顕微ラマン分光システムに以下の改良を加えた。2枚の高性能チューナブルバンドパスフィルターをラマン散乱光の検出系に導入し、任意のラマン波数範囲のみを透過する光学系を構築、これに冷却型の16bit高感度CCD検出器を組み合わせて、顕微ラマン直接イメージング画像を取得できる装置を試作した。ラマン励起レーザーとしては、現有の532nm高出力2Wレーザーを用いた。顕微鏡視野全体に均一に励起光を照射するため、デフォーカシングレンズを照射系に導入した。本手法では集光を行わないため、高出力レーザーをそのまま利用でき、これにより高速イメージングが可能となる。ラマン光検出系に組み込んだ2枚のバンドパスフィルターの入射角度を微動回転ステージによりそれぞれ調節することにより、任意の波数、任意の分解能で目的のラマンピークのみを透過する光学系を構築できた。フィルターの透過特性は、現有のCCD分光器システムを用いてモニターし、入射角度を調整した。試作した装置を用いて、ニオブ金属上に分散したイオウ、酸化ニオブ、硝酸カリウムなどの微粒子を280万画素の高精細分別イメージング、スペクトルイメージングすることができた。しかし、一枚のラマン画像を得るために1から10秒程度の時間がかかることがわかり、さらなる高感度化のために検出光学系の見直し、イメージインテンシファイアの導入を行い、0.1秒以内でのラマンイメージ取得が可能となった。顕微ラマンイメージング分析は試料の2次元ケミカルイメージを観測する方法として注目されているが、広く用いられているマッピング方式ではデータの取得に時間がかかるという大きな欠点を持っている。本研究では、チューナブルバンドパスフィルターと高感度CCD検出器を用い、簡便にかつ高速で試料の観察領域全体の高精細な直接ラマンイメージを取得可能な装置を開発することを目的とした。H25年度に構築した手動制御の直接ラマンイメージングシステムに、チューナブルバンドパスフィルター入射角度調整用の自動回転ステージを導入した。これをPCにて制御することにより、ラマン画像の取得タイミングと2枚のチューナブルフィルターの角度調整を同期するよう自動制御し、波数分解能を一定に保ったまま、異なる波数領域のラマンイメージを順次取得し、ハイパーラマンイメージを収集できるシステムを構築した。また、より高速なイメージングを可能にするため、イメージインテンシファイアをイメージ検出系に導入した。これらの改良により、当初の目標に近い10画像/秒の速度で画像取得を行うことができた。波数分解能30cm-1の条件で200-2000cm-1の波数領域のメガピクセル画素数のハイパーラマンスペクトルイメージングが測定時間200秒で可能となった。しかし、本研究で構築した光学系では試料の位置によりバンドパスフィルターへの入射角が異なるため、結像イメージ上でバンドパス波数のシフトが起こることがわかった。この波数シフトは、ハイパーイメージの取得後に解析的に補正可能であるが、特定ラマン波数の時間変化を追うための高速イメージングは困難であることが判明した。この問題を解決するため、スリットを試料上部に配置することにより顕微光学系をテレセントリック光学系とすることを試みた。この改良によりイメージ上での波数シフトの問題を解決することができた。分析化学現有の装置を改良し、チューナブルフィルターを利用したラマン直接イメージング装置を開発することができた。メガピクセルの画素数でビデオレート(30画像/秒)でのメガピクセルラマンイメージ観測を目標としたが、冷却型の16bit高感度CCD検出器を用いても1画像/秒程度の速度しか達成できなかった。この問題に対し、イメージインテンシファイアを導入することにより、ラマン散乱強度の大きな試料については、当初の目標である30画像/秒の速度で画像取得を行うことができた。

このように試料ダメージを抑えた高速のイメージ取得の可能性を示すことができた。また、チューナブルフィルターの優れた特性のため、高分解能でのハイパースペクトルイメージングが可能であることがわかった。ラマン画像の取得タイミングと2枚のチューナブルフィルターの角度調整を同期するよう自動制御し、透過波数の異なる複数のラマンイメージデータから2次元の各点でのラマンスペクトルを測定、高速、高精細なケミカルイメージングが可能なシステムを試作し、その性能を評価する。具体的には、構築した直接ラマンイメージングシステムにチューナブルバンドパスフィルター入射角度調整用の自動回転ステージを導入し、これをPCにて制御することにより、透過波長(波数)分解能を一定に保ったまま、異なる波数領域のラマンイメージを順次得ることができるシステムを構築する。この目的のためPCによる自動制御用のソフトウェアを購入、これを用いて制御を行う。制御プログラムは申請者が設計、製作する。このデータ収集の自動化により、より短時間でハイパースペクトルデータの取得が可能となる。このシステムで得られるデータの解析は以下のとおりである。各波数において得られるラマンイメージデータを並べて、任意の測定点におけるラマン光強度をプロットするとその測定点におけるラマンスペクトルが得られることになる。フィルター回転ステージの制御による波数分解能とイメージの取得速度を最適化し、200枚程度のメガピクセルのラマンイメージデータを100秒以内に取得することを目標とする。光学部品として高性能フィルターを購入予定であったが、残予算では購入できなかったため。光学部品として26年度予算と合わせて高性能フィルターを購入する。
汎用的データベースの解析処理に基づいた英語構文指導用教材作成システムの開発

研究代表者と研究分担者の研究室を仮想ネットワークで繋ぎ、分散型処理を実現したリレーショナルデータベースを基幹に据えた英語構文解析用システムを構築し、既存の大規模コーパスおよび研究者、教育者、学習者が独自に選定し構築したコーパスを統一的な形式で蓄積し、動詞の活用形に焦点を当てることから明らかになる日本人学習者に特徴的な英語構文の性格を抽出し、効果的な指導方法と教材の開発に寄与することを目指した。(1)中学校検定英語教科書(6種類18冊)全頁のコーパス化:(i)画像ファイル化、(ii)XML形式でのコーパス化へのデータ整備。写真やイラスト中の英文と画像の当該個所をハイパーリンクさせ、高度な検索に応え得るマルチメディアコーパスの構築を準備。(2)EFL教育用データベースに必要なデータ構造と付加されるべき属性種類の研究。(3)VPN(virtual private network)の構築と試験運用:東北大学岡田研究室と東北学院大学坂本研究室間において、外国語習得支援システムを開発するためのシームレスで安全なネットワークを構築(実稼働開始は平成20年5月上旬)。両研究室内のローカルエリアネットワーク間の通信をIPSecにより暗号化したVPNを構築して実現し、併せて安全性を確保。暗号化と複合化を行う際に予測される通信への負荷に関して、通信速度を測定し研究開発環境として適切であるかどうかを評価した。双方の研究室間で、VPNルータ(YAMAHA PTX1100:坂本研究室、YAMAHA RT107e:岡田研究室)を用いてVPNが構築され、その通信を安全な通信経路として確立した。VPN内の計算機同士は、暗号化された通信経路と非暗号化されたそれとを意識することなく通信することが可能である。通信速度に関して、IPSec使用時の通信と、未使用時の通信において速度比較を実施し、暗号化した際の通信速度の低下の程度を検証した(学会口頭発表)。(4)データ蓄積時の統一的フォーマッタプログラムの開発に関わる基礎的先行研究の精査:先行研究(岡田1995年)などでMS-DOS上で実現されている「1レコード1センテンス」形式のデータ整形を実現している処理系のUNIX上への移植可能性についての検討を行う。(5)データベース本体の設計に関わる英語統語・品詞情報の範疇化と一般化に向けた考察と研究(雑誌論文として公表)。今年度から運用を開始した研究代表者・研究分担者間のVPNによる連携ネットワークにはセキュリティ上の配慮を怠らず、EFL教材作成のための解析対象となるデータベースを、統一したフォーマットの下で構築するための基本的アルゴリズムを確立した。単にコーパスの量的な増加だけを目指すような方向を取るのではなく、それに付加するべき情報の質と種類を体系的に研究した。そのためには、既存の多くの英語母語話者コーパスなど)のデータ構造を精密に検証した。これらの多くはXML形式で記述されているが、バックボーンとしてのデータベース構造を整備しない限り、表層的な処理の限界がある。初期の解析で得られた結果を次段階の解析のキーとするためには、Webシステム上でのプロセス管理の問題が大きな障害となるが、この問題のデータベース構造の整備と統一及び付加情報の充実といった手法での克服を目指した。XML形式以外によるデータの記述に関しては、本研究で開発する英語教科書のマルチメディアコーパスの中に、教科書の当該頁の画像のみならず、音声や動画情報への関連付けを実装することの検討も行った。特に中学校の低学年の導入部分で用いられる慣用句や簡単な構文を用いた英語による挨拶などの初歩的表現等に関しては、独自に動画を撮影・編集し、日常表現に伴う母語話者の身振りや顔の表情といった非言語情報を的確に日本人学習者に伝えるための効果的な手段としてマルチメディア化したデータベースが注目される。岡田が東北大学大学院国際文化研究科文化研究科において担当している「マルチメディア運用論」の講義等においても研究の中間成果を題材として取り上げ、大学院の教育研究に供した。加えて3月中旬に東北大学において「コーパス研究に関する勉強会」を主催し、taggingの問題とRDBMSについての討論を重ねた。英語非母語話者である学習者に対する学習支援システム設計の基幹部分を成すRDBMSのテーブル設計を完成させた。コーパスの文書を、文書・文・単語・という3つの階層に分類し、この階層に対してシステム利用者が解析を行うことができ、3階層の各要素それぞれには、利用者の要求に応じた修飾情報を付加することが可能となるように設計されている。この結果、支援システムでは、利用者・文書・修飾情報という3種類の情報を学習柔軟にリンクすることが可能になる。例えば、英文という要素に対して、その英文の訳の難易度という修飾情報を付加することで、学習者の習熟度に応じた翻訳練習文を提供することが可能であるし、英単語に対して、その単語が出現する教科書と学年といった修飾情報を付加することで、利用者の学習年次に応じた単語練習問題等を提供することも可能である。このRDBMSの設計途上、前年度に開発した、プレインテキストを1行1文形式に成形するラインフォーマッタからの出力に、英単語の品詞を付与するtaggerの設計とプロトタイプ版の開発を行った。

このアプリケーション開発にはJava言語を利用し、その特長の一つである強力なクラスローディングのフレームワークを利用することで、内部の処理ルーチンをフィルターと呼ばれる概念で定義し、アプリケーションの実行中にtaggerの処理アルゴリズムを、利用者の要求に応じて自由に変更することが可能となっている。研究期間最終年度に当たり、国内の情報処理学会での発表に加え、RDBMSを中心に据えたコーパス解析システムの全容をICAME30世界大会で、データベースのテーブル設計に関する詳細な研究成果をCorpus Linguistics 2009で、解析の結果明らかになった日本人科学者の産出する英語論文における伝達動詞の特異性についての傾向をICLCE3世界大会で、それぞれ発表した。
放射音を用いたＣＦＲＰ構造の異物衝突・衝撃損傷モニタリング法の開発

本研究では,運用中の航空機CFRP構造に小石等が衝突するときの荷重位置・荷重履歴を,異物衝突時の放射音を用いて非接触・実時間でモニターする手法を確立するとともに、同定した最大衝撃荷重および荷重時間関係より,CFRP構造の衝撃損傷の有無・大きさを実時間で評価する手法を開発することを目的とした。すなわち、異物衝突時のマイクロホンへの放射音到達時間から異物衝突の位置を判定し、音圧情報より荷重履歴を推定するとともに,同定した荷重履歴より衝撃損傷を評価する非接触・実時間の異物衝突・衝撃損傷モニタリング法を開発し,CFRP積層板およびCFRPサンドイッチ板により本手法の有効性を検証した。本研究では,運用中の航空機CFRP構造に小石・雹・鳥等が衝突するときの荷重位置・荷重履歴を,異物衝突時の放射音を用いて非接触・実時間でモニターする手法を確立し、同定した最大衝撃荷重および荷重時間関係より,CFRP構造の衝撃損傷の有無・大きさを実時間で評価する手法を開発することを目的とした。本研究における主要な研究成果は以下の2点である。(1)放射音計測によるCFRP構造の非接触・実時間異物衝突監視システムの構築:衝突時のマイクロフォンへの音波の到達時間差に基づく非接触の衝撃荷重位置同定法を開発し,本研究グループが開発した計測データのみを用いた実験的衝撃荷重同定法に基づき荷重履歴を実時間・高精度で同定する手法を確立した。本手法をCFRP積層板およびCFRP補強板に適用し、その妥当性を検証した。(2)同定した衝撃荷重によるCFRP構造の実時間衝撃損傷評価法の開発:同定された荷重情報より損傷の有無、および、損傷の大きさを評価する実時間損傷モニタリングシステムを開発した。同定した衝撃荷重履歴、および、接触時間より、損傷の有無および損傷の大きさを推定する手法を提案し、CFRP積層板およびCFRP補強板でその有効性を確認した。本研究で提案した放射音計測による異物衝突・衝撃損傷モニタリング法は,これまで開発されたことの無い独創的で新規の手法であり,CFRP構造の画期的な安全性の向上に繋がる。本研究では,運用中の航空機や風車ブレード等のCFRP構造に小石・雹・鳥等が衝突するときの荷重位置・荷重履歴を,異物衝突時の放射音を用いて非接触・実時間でモニターする手法を確立し、同定した最大衝撃荷重および荷重時間関係より,CFRP構造の衝撃損傷の有無・大きさを実時間で評価する手法を開発することを目的とした。本手法により,損傷位置・損傷有無の実時間判定が可能となりCFRP構造の安全性が格段に向上するとともに,現状の定期検査によるメンテナンスコストを大幅に削減可能となる。本研究では,異物衝突時のマイクロフォンへの放射音到達時間から,異物衝突を監視するとともに,衝撃損傷を評価する非接触・実時間のモニタリングシステムを開発し,CFRP積層板およびサンドイッチ板により本手法の有効性を検証する。本研究における主要な研究項目は以下の2点である。1放射音計測によるCFRP構造の非接触・実時間異物衝突監視システムの構築、2同定した衝撃荷重によるCFRP構造の実時間衝撃損傷評価法の開発異物衝突監視では,衝突時のマイクロフォンへの音波の到達時間差に基づく非接触の衝撃荷重位置同定法を開発し,本研究グループが開発した計測データのみを用いた実験的衝撃荷重同定法に基づき荷重履歴を実時間で同定した。一方,衝撃損傷評価法では,同定された荷重情報より損傷の有無・大きさを評価する実時間損傷モニタリングシステムを開発中である。本研究で提案する放射音計測による異物衝突・衝撃損傷モニタリング法は,これまで開発されたことの無い独創的で新規の手法であり,CFRP構造の画期的な安全性の向上に繋がる。(1)放射音計測によるCFRP積層板の非接触・実時間異物衝突監視システムの構築異物衝突監視システムの構築では,以下の手順で異物衝突時の荷重位置・荷重履歴を決定する。1インパルスハンマ打撃時の,衝撃荷重f(t)音圧p(t)の伝達関数を実験的に決定する。24個のマイクロフォンへの放射音の到達時間差より,衝撃荷重位置を同定する。32の衝撃荷重位置に対して,逆問題解析により音圧から衝撃荷重履歴を決定する。CFRP積層板および補強パネルの同定結果では、荷重位置が高精度(10mm以内の誤差)で同定されるとき,衝撃荷重履歴も10%以内の誤差の高精度同定が可能となっている。本研究では,CFRP積層板を対象に,周辺雑音等のノイズ環境下で荷重位置同定誤差10mm以内の手法を確立することを目標とした。そのためにバンドパスフィルターを用いて打撃衝撃音の周波数成分を抽出して荷重位置同定を行うことにより大幅な精度向上を図ることができた。(2)同定した衝撃荷重によるCFRP構造の衝撃損傷評価法の開発同定した衝撃荷重履歴を用いて,最大衝撃荷重より衝撃損傷の有無を判定する手法を確立した。

また,最大衝撃荷重損傷の大きさ(はく離面積等)の関係を実験的および損傷進展解析により求めることにより,同定した荷重履歴より損傷の大きさを評価する手法を開発中である。主要な研究項目は、・落錘衝撃試験機によるCFRP積層板の損傷を伴う衝撃試験、・同定した最大荷重からの損傷の有無の判定法の検討、・損傷進展解析および実験によるCFRP積層板の最大衝撃荷重損傷面積関係のデータ収集、であり、おおむね順調に研究が進展している。本研究「放射音を用いたCFRP構造の異物衝突・衝撃損傷モニタリング法の開発」では,二つの研究項目「放射音計測によるCFRP構造の非接触・実時間異物衝突監視システムの構築」および「同定した衝撃荷重によるCFRP構造の実時間衝撃損傷評価法の開発」を行う。次年度は以下の検討を行う。(1) CFRPサンドイッチ板の非接触・実時間異物衝突監視システムの構築前年度行った「CFRP積層板の非接触・実時間異物衝突監視システムの構築」を発展させ、CFRPサンドイッチ板について異物衝突時の衝撃荷重作用位置を同定し、実験的に決定された衝撃荷重音圧関係を用いて衝撃荷重を逆問題解析より決定する。主要な研究費の使用用途は、CFRPサンドイッチ板の製作費と計測用マイクロフォンの購入費である。(2)同定した衝撃荷重によるCFRPサンドイッチ板・積層板の衝撃損傷評価法の開発同定した最大衝撃荷重による衝撃損傷の有無の判定法を確立し、最大衝撃荷重損傷の大きさ(面積)の関係について実験結果を整理する。さらに、同定した衝撃荷重履歴による損傷の大きさの評価法を確立する。「前年度未使用額は、計測用マイクロフォンとCFRP積層板の納品遅れによって生じたものであり、延期したCFRP積層板およびサンドイッチ板の製作費、計測用マイクロフォンに必要な経費として平成25年度請求額と合わせて使用する予定である。」
テトラヒドロビオプテリン受容体の構造及び機能の解明

カテコ-ルアミンおよびセロトニンなどの神経伝達物質の遊離調節を行なっていると考えられる天然型6Rーテトラヒドロビオプテリン(6RーBH_4)の受容体が実際に脳に存在することを証明するために,[ ^3H]6RーBH_4を化学合成し,この放射性リガンドを用いて脳の膜分画に対する結合実験を行った。[ ^3H]6RーBH_4を得るために,まず,テトラヒドロ葉酸存在下に,ジヒドロビオプテリン(BH_2)と[ ^3H]NaBH_4を反応させ,[ ^3H]6RSーBH_4を合成し,この混合物を高速液体クロマトグラフィ-にて分離した。このようにして得た[ ^3H]6RーBH_4を用いて,脳の膜分画に対する結合実験を行ない,脳の膜分画には[ ^3H]6RーBH_4の特異的結合部位が存在することを明らかにした。Scatchard分析を行なったところ,特異的結合部位の[ ^3H]6RーBH_4に対する解離定数(Kd)は21nMであることがわかった。この特異的結合は,非放射性の6RーBH_4,BH_2,立体異性体である6SーBH_4の順に低濃度で置換された。一方,6RーBH_4のアナログである6ーMPH_4および酸化型のビオプテリンでは置換されなかった。また,特異的結合の脳の部位別分布を検討してみると,大脳皮質,線条体,間脳(視床+視床下部),海馬および脳幹部では,ほぼ同量で3040fmol/mg proteinであったが,小脳では特に高く95fmol/mg proteinであった。また,6RーBH_4の効果を培養牛副腎髄質細胞を用いて検討し,6RーBH_4が濃度依存性に膜を脱分極させることを発見した。この効果は,立体異性体である6SーBH_4では弱く,6RーBH_4に選択的であり,さらに,この脱分極は,Na_+およびCa_<2+>イオンチャンネルを介していることが明らかになった。以上の結果から,6RーBH_4の受容体の存在およびその機能を明らかにした。
皮膚温測定を用いた糖尿病性足潰瘍評価スケールの開発

糖尿病性足潰瘍の治癒過程を明らかにするために、潰瘍の写真をスケッチし、言語化、概念化した結果、カテゴリ“深さ"“創縁"“壊死組織のタイプ"“壊死組織の割合"“炎症/感染"が抽出された。潰瘍は“深さ"が浅くなり“壊死組織の割合"と“創縁"の浸軟が減少し治癒した。このカテゴリを用いた評価スケールを作成した。肉眼的に同定困難な骨髄炎のスクリーニング法を開発するために、サーモグラフィ所見を検証した結果、足関節まで皮膚温が上昇している場合に有意に骨髄炎合併の割合が高かった。糖尿病足潰瘍の評価には、サーモグラフィで骨髄炎をスクリーニングし、評価スケールの“感染/炎症"の骨髄炎を採点することが提案された。本研究の目的は糖尿病足潰瘍に特化した創部を評価するためのスケールを開発することである。特に、皮膚温測定を組み入れることで、肉眼的にはとらえられなかった深部感染を反映させ、妥当性の向上を図ることが特徴である。しかし、これまでに糖尿病性足潰瘍の治癒過程および皮膚温の所見を明らかにした報告はなく、まずはこれらを明らかにした。糖尿病性足潰瘍の治癒過程は、19名26部位の潰瘍の経過をスケッチし、言語化した。その結果、深さ、創縁の性状、壊死組織のタイプ、壊死組織の範囲、感染/炎症の5つのカテゴリーが抽出された。特に、神経障害性の足潰瘍では、創縁の性状に角化の強い皮膚が出現し、上皮化すること、血管障害性の足潰瘍では、創縁に赤いリング状の変化を伴うことが明らかとなった。この結果を5月にEuropean Wound Management Associationにて発表した。現在、症例数を30名に増やし、カテゴリーの飽和化を検証している。皮膚温所見に関しては、糖尿病足病変(足部潰瘍8部位、足部壊疽3部位、蜂窩織炎3部位)を有する10名を対象にサーモグラフィを撮影した。MRIでは骨髄炎のみ合併3部位、軟部組織炎症のみ合併4部位、骨髄炎と軟部組織炎症の合併3部位、骨髄炎・軟部組織炎症合併なし4部位であった。骨髄炎症例では足関節まで皮膚温が上昇していた。骨髄炎を標的疾患、足関節までの皮膚温上昇を陽性とした場合の感度は66.7%、特異度100%、陽性適中率100%、陰性適中率80%であった。本結果は7月に日本下肢救済足病学会にて発表した。ケースレポートをJournal of Wound Care、感度や特異度をUlcersに投稿し、掲載された。本研究の目的は、糖尿病性足潰瘍に特化した創部を評価するためのスケールを開発することである。昨年度までに糖尿病性足潰瘍の治癒過程および皮膚温の所見を調査し、報告してきた。今年度は、症例数を追加し、糖尿病性足潰瘍の治癒過程を飽和化すること、深部感染以外に皮膚温に影響する要因として考えられた靴の影響を確認することを目的に調査を進めた。糖尿病性足潰瘍の治癒過程については、13部位を追加し、これまでに明らかとなった深さ、創縁の正常、壊死組織のタイプ、壊死組織の範囲、炎症/感染の5つのカテゴリの飽和化を確認し、皮膚科医によるスーパーバイズを受け、創部評価スケール案の提示に至った。本研究は、5月にオーストラリアで行われるthe 10th National Australian Wound Management Association Conference 2014の発表に採択されており、その後、論文投稿する予定である。皮膚温所見については、糖尿病患者30名を対象に足部皮膚温と靴との関係を検証した。非糖尿病者で検討した従来の報告と異なり、靴だけでなく非潰瘍性病変部の炎症と思われる所見や、靴の因果関係は不明であるが前足部のみ上昇するパターンが観察された。糖尿病患者の場合、靴以外の要因が皮膚温に影響している可能性があり、血管障害や神経障害など、糖尿病患者特有の要因を加えて分析し、論文発表する予定である。しかし、これまでに糖尿病性足潰瘍の治癒過程および皮膚温の所見を明らかにした報告はなく、今年度はこれらを明らかにした。

糖尿病性足潰瘍の治癒過程は、19名26部位の潰瘍の経過をスケッチし、言語化した。その結果、深さ、創縁の性状、壊死組織のタイプ、壊死組織の範囲、感染/炎症の5つのカテゴリーが抽出された。特に、神経障害性の足潰瘍では、創縁の性状に角化の強い皮膚が出現し、上皮化すること、血管障害性の足潰瘍では、創縁に赤いリング状の変化を伴うことが明らかとなった。これらについては、5月にEuropean Wound Management Associationにて発表する予定である。また、これらの知見をもとにスケール案を作成し、写真判定による妥当性の検証を行った。皮膚温所見に関しては、糖尿病足病変(足部潰瘍8部位、足部壊疽3部位、蜂窩織炎3部位)を有する10名を対象にサーモグラフィを撮影した。MRIでは骨髄炎のみ合併3部位、軟部組織炎症のみ合併4部位、骨髄炎と軟部組織炎症の合併3部位、骨髄炎・軟部組織炎症合併なし4部位であった。骨髄炎症例では足関節まで皮膚温が上昇していた。骨髄炎を標的疾患、足関節までの皮膚温上昇を陽性とした場合の感度は66.7%、特異度100%、陽性適中率100%、陰性適中率80.0%であった。本結果は7月に日本下肢救済足病学会にて発表する予定である。なお、骨髄炎所見に関するケースレポートをJournal of Wound Careに投稿した。糖尿病性足潰瘍の治癒過程の明確化について、症例数が予定より少なく、調査期間を延長していたが、今年度、目標の30例に達していることから、概ね順調に進展していると判断した。初年度は糖尿病性足潰瘍の治癒過程の明確化を目標としていた。症例数は予定より少なかったものの、カテゴリーの抽出までできており、初年度の目標は達成できたと考え、概ね順調に進展していると判断した。ただし、症例数が現時点で19名であることから、飽和化するまで症例数を増やし、コアカテゴリーを導く必要がある。糖尿病性足潰瘍の治癒過程のカテゴリーの飽和化を確認し、スケールを作成する。信頼性と妥当性を検証する。サーモグラフィ画像のスケールへの導入を検討する。初年度に得られたカテゴリーをもとに、症例数を増やして検討する。結果が飽和化した時点で、スケール案を見直し、信頼性と妥当性の検証を行う。皮膚温画像のスケールへの導入を検討する。スケールの信頼性と妥当性の検証には、専門家の協力が必要であり、謝礼を支払う必要がある。また、得られた知見を学術集会や投稿論文で発信するために、旅費や英文校正費を生じる予定である。また、得られた知見を学術集会や投稿論文を通して発信するために、旅費や英文校閲費が生じる予定である。
活性気液吸着交換材を充填した蒸留塔におけるトリチウム水濃縮分離の高効率化の研究

放射性同位元素トリチウムを含む水の除染処理のため、活性気液吸着交換材を充填した蒸留塔による同位体分離操作を実験的かつ解析的に検討した。従来トリチウム水分離方法として、水蒸留法は触媒を使わず大量トリチウム分離に適しているが、同位体分離係数が小さく大規模分離に適用するには大量のエネルギーが必要であるとの認識が高かった。本研究では、メソ孔水分吸着時の同位体効果の高いゼオライトを蒸留塔金属充填材表面に被覆した全く新たな同位体分離方法を提案し、ヒートポンプ方式で放射性トリチウム分離を実施し、多数の査読つき英語論文とともに国際特許に出願し、核融合炉および福島1Fのトリチウム水濃縮分離に繋がる成果を得た。研究初年度、放射性トリチウムを含む水の蒸留装置を組み立て,今年度新たに整備された学内放射性同位元素取扱実験室にてトリチウム濃縮実験を行なった。本研究の特徴である触媒機能を有した充填材、粒子径2.8mmが同じで比表面積の異なるシリカゲル5種類とNaA型とNaX型ゼオライト粒子、比較のため吸着不活性のガラスビーズを用意し、充填高さ59cm塔形1.6cmに統一し蒸留操作を行ない,再沸器と凝縮器のトリチウム濃度を液体シンチレーションカウンターで一定時間おきに測定し、全段同位体分離係数を求め比較した。蒸留条件は全還流100oCで1気圧であり、Fenske式と比較し,ガラスビーズで平衡分離係数が1.028、NTUは加熱率に少し依存し4.25.6と上昇する事を見いだした。吸着性あるシリカゲルでは比表面積が大きくなるにつれ、またゼオライトではNaA型よりNaX型で最大の分離係数が得られた。このように吸着性がある吸着剤を充填すると、蒸留塔内でガラスビーズと同じHTUが維持され,塔内の平衡分離係数が,吸着同位体効果により増加できる事が分かり,蒸留塔の塔高さや還流量を減らせる事が分かり,汚染水のトリチウム除染に利用できる事が分かった。このことは、本研究者が最初に見いだした事であり,極めて大きな成果と考えます。現在対策が急がれている福島第1原子力発電所トリチウム汚染水処理に利用する事が有効であると考える。研究初年度であるにも拘らず,原子力学会で秋と春に2回発表し、中国や韓国、ロシアを含めたアジア全体及び米国のトリチウム関連の研究者が集まったAPSOT-1国際学会で口頭発表した。また関連研究成果を国際特許として申請した。萌芽研究の趣旨である、これまで世界で誰も試みなかった同位体分離法を新たに提案実証する事ができ、その成果を国内及び国際学会等で発表し、さらに特許申請にまで進める事ができ、今後の更なる研究成果が期待できる。研究初年度であり,日本原子力学会2015年秋と2016年春会に研究代表者が口頭発表するとともに2015年11月中国四川省綿陽市で開催されたAPSOT(Asia-Pacific Symposium on Tritium science)国際会議で英語口頭発表し、研究の趣旨と内容を説明した。萌芽研究で当初期待した吸着性能を有した充填材を使い、蒸留操作をおこなうことにより、塔内の平衡分離係数が増加する事が実験で明らかに証明された。国際特許2件を現在申請中であり,手続きを進めている。研究初年度として十分な結果を得る事ができ、また現在2016年4月米国サウスカロライナ州チャールストン市で開催されるトリチウム国際学会でも英語口頭発表を予定し,既に予稿を送り、口頭発表が学会の3日目に予定されている。査読付き論文も同時に投稿中であり,初年度としては非常に研究の進展が進んでいると考えている。研究二年度として、引き続いてトリチウム蒸留分離の実験をおこなった。初年度に比べて装置を大型化し,より対象とする汚染水処理の実状況に近い条件で吸着蒸留実験を行なった。前年度の広範囲な実験から対象を絞り,おもに二種類の充填材(1)Sulzer製の規則充填材に袋状に詰めたゼオライト吸着剤を充填したものと、(2)不規則充填材としてRaschig Ringにゼオライト被覆したものを充填し,トリチウム同位体分離性能について比較検討した。その結果,いずれの充填状態においても、不活性状態のガラスビーヅに比べて吸着性のある充填材を入れた方が,理想段分離係数が高くなる効果を再確認した。この効果をDanckwertsの表面更新説に従って解析し,蒸留充填槽内で上向きに上昇する蒸気と吸着剤間、下向きに流れる凝縮液間のトリチウム吸着/脱離の同位体効果が異なる事から,微視的時間的に変化する吸着脱離状態を表面更新時間と関連させて,蒸留塔内でH2O-HTO間の本来の揮発度比に等しい凝縮同位体分離係数に吸着脱離の効果が増強される効果を定性的に表す事ができた。実験結果と解析結果を米国原子力学会発行のFusion Science and Technologyや速報誌であるJournal of Power and Energy Engineering等の欧文誌に発表する事ができた。また初年度に発表した国際特許の内容も更新した。今後は,同位体分離係数の増強効果をさらに広く充填槽内の気液向流状態と関連させて定量的に理解する事に実験的解析的に研究を進め,最終年度において、研究成果を広く論文として発表したい。蒸留実験を継続して実験する事ができ,研究二年目に米国サウスカロライナ州チャールストン市で開催されたトリチウム国際学会で成果を発表するとともに,研究成果を英語査読付き論文として2報発表する事ができた。

トリチウム取扱に関する関連論文も3報発表する事ができた。研究最終年度3年目においても、同様のトリチウム関係の国際学会が米国カリフォルニア州リバモア市で開催される予定であり,そこで、本蒸留実験の成果発表し,広くトリチウム排水の減容化処理の成功に向けて研究を進めたい。3年計画の3年目(最終年度)のトリチウム水蒸留濃縮分離実験研究を実施した。同位体分離実験では、Sulzer規則充填物とラシヒリング不規則充填物の二つのタイプについて蒸留塔のトリチウム同位体分離係数を測定し、表面にゼオライト被覆を施した場合と施さない場合について、同位体分離係数の違い、HETPの違いについて検討した。その結果、表面をゼオライト被覆する事によって、蒸留塔内の蒸気上昇流と凝縮液下降流の同位体交換が速やかにすすみ、同位体分離が促進される事が定量的に明らかになった。この効果は、見かけ上同位体分離係数の増加として整理でき、規則充填物及び不規則充填物のいずれにおいてもトリチウム同位体分離効果が促進される事が初めて明らかになった。蒸留塔全体(塔頂部と塔底部)のトリチウム濃度比で約100の同位体分離、トリチウム減衰を達成させるための蒸留塔設計をおこない、必要な同位体分離装置の規模を見積もる事ができた。結果は、例えば、トリチウム汚染排水の処理に使用可能である事が実験的に明らかになった。特に充填物の塔半径が大きくなると、軸方向の分散効果が重要となり、同位体分離装置として機能するための効果を最大限に発揮させるための分散効果を可視化してみるため、ガラス製の気液分散装置を製作し、分散効果を別に定量化させる事ができた。結果は、学部学生の卒業研究論文に詳細に記載されている。3年間の研究成果として、査読つき英語論文を毎年発表する事ができ、また最終年度もAsian-Pacific-Symposium on Tritiumの国際会議で成果を発表し、英語論文を同時に投稿し、現在査読中である。また日本国内の化学工学学会誌および、核融合連合講演会に研究成果をまとめて発表準備中である。放射性同位元素トリチウムを含む水の除染処理のため、活性気液吸着交換材を充填した蒸留塔による同位体分離操作を実験的かつ解析的に検討した。従来トリチウム水分離方法として、水蒸留法は触媒を使わず大量トリチウム分離に適しているが、同位体分離係数が小さく大規模分離に適用するには大量のエネルギーが必要であるとの認識が高かった。本研究では、メソ孔水分吸着時の同位体効果の高いゼオライトを蒸留塔金属充填材表面に被覆した全く新たな同位体分離方法を提案し、ヒートポンプ方式で放射性トリチウム分離を実施し、多数の査読つき英語論文とともに国際特許に出願し、核融合炉および福島1Fのトリチウム水濃縮分離に繋がる成果を得た。2015年度に吸着剤の種類を変えて蒸留分離の有効性を検討したところメソポーラスシリカ部に高い吸着能と同位体効果が存在する事が分かり,それを多く内包するNaX型ゼオライトに注目して吸着蒸留法を検討している。しかし実際の工業規模の蒸留装置は大型化が必要であり,特に通常の充填材では圧力損失が大きくて,数十メートルの高さの蒸留等が必要となる。またフラッでイングが起こらない条件を明確にし,気液接触を有効に進めるための新規形状の充填材が必要となる。
日本人の循環器疾患に影響を及ぼす身体活動の把握方法の開発に関する基礎的研究

近年の日本人の身体活動量の変化は著しいが、それが循環器疾患の発生に及ぼす影響に関しては、疫学的には未だ解明されていない。この原因は、多様化しつつある日本人の生活様式の中で労働や余暇時間、その他日常生活の諸活動での身体活動量を総合的に把握する方法、また、スポ-ツ医学とは異なる観点に立った身体活動予備力の調査方法が、ともに未開発であることによる。本研究は長期にわたり疫学調査を継続し、過去からの栄養摂取状況や労働条件等の生活の背景を熟知し、かつ、脳卒中や虚血性心疾患の発生率等を把握し得ている茨城、秋田、高知の農村住民と、大阪の事務職、現業職の計5集団の男子、4059才、15,000人を対象として、身体活動の実態調査ならびに身体活動の予備力を把握するための調査方法、検査方法の検討、開発を目的として行った。成績は以下の通りである。各集団の代表的な数職種ごとに約30人ずつの無作為抽出を行い、ある1日の行動記録より消費エネルギ-の算出、自転車エルゴメ-タ-による運動負荷試験よりの最大酸素摂取量の測定を行った。その結果、身体活動量は職種により大きな差があり、都市の事務職、現業職、農村でも事務職は身体活動量の不足するものが多いが、農業や農村の現業従事者は一般に消費エネルギ-は大である。また、都市では通勤、スポ-ツの占める消費エネルギ-が比較的大きいが、農村では労働によるものが圧倒的に多くを占める。以上より、都市、農村の集団特性に応じた身体活動に関する簡易問診表を作成して、同一対象についてこれによる調査を実施した結果、行動日記による消費エネルギ-、最大酸素摂取量よりみた身体活動予備力と良好な一致を得た。さらに、これをもとに簡易問診を対象15,000人に実施し、これより個人の身体活動量を把握するためのパソコンソフトウエアを作成した。
運動ニューロン特異的遺伝子発現・ノックアウトシステムの確立

本研究で我々は、発生工学的手法により運動ニューロン特異的遺伝子発現・ノックアウトシステムを確立する。家族性筋萎縮性側索硬化症(Familial Amyotrophic Lateral Sclerosis,FALS)の病因遺伝子を過剰発現し、FALSの良い疾患モデルとなる変異SODトランスジェニック(TG)マウスと運動ニューロン特異的にグルタミン酸受容体を発現するTGマウスを掛け合わせ、疾患への影響をみることによって、変性の分子機構へのグルタミン酸毒性の関与を明らかにする計画である。変異SODの毒性に対し運動ニューロンのみが脆弱である理由として、グルタミン酸毒性の関与の可能性がある。運動ニューロン死に関与する主なグルタミン酸受容体はカルシウムを透過するAMPA受容体である。AMPA受容体はGluR1-4のサブユニットの複合体で構成され、GluR2サブユニットを持たない受容体がカルシウム透過型となる。運動ニューロンではGluR2の発現量が低いために、カルシウム透過型AMPA受容体の発現が他のニューロンに比べて高い可能性が指摘されている^<1)>。そこで我々はコリンアセチル転移酵素(ChAT)のプロモータを用いてGluR2遺伝子を運動ニューロンで過剰発現し、AMPA受容体がカルシウム不透過型となるマウスを作製する。このマウスを変異SODTgマウスとかけ合わせて、運動ニューロン特異的変性への関与を評価する。本年度はコリン作動性ニューロン特異的発現を決定する6.4kbのChATプロモータ領域^<2)>の下流に目的の遺伝子とレポーター遺伝子EGFPを発現するコンストラクトを作製した。さらに目的の遺伝子としてラットGluR2を挿入し、TGマウスを作製した(ChAT-GluR2)。ChAT-GluR2マウス2ラインでレポーター遺伝子GFPの脊髄運動ニューロンでの発現を確認した。
化合物半導体の格子欠陥の評価と制御

IIーVI族及びIーIIIーVI_2族化合物半導体のうち、いわゆるワイド.ギャップ半導体といわれるZnS、ZnSe及びAgGaS_2などは青色発光素子用材料として期待されている。しかし、実用化のためには多くの解決すべき課題があり、研究の進んでいるZnS、ZnSeにおいてさえ、ホモ及びヘテロエピタキシャル薄膜における格子欠陥や添加不純物の電子状態並びに成長薄膜と基板の界面における歪場の解明が不可欠となっている。本年度はuV光照射の下にMOCVD法により作成したNa添加ZnS薄膜において、そのフォトルミネッセンス(PL)を調べ、添加NaがZnと置換しアクセプタ-となることを見い出した。また、ZnSxSe_<1-x>のGaAs基板上へのヘテロエピタキシャル成長膜中の深い欠陥による発光の強度測定により、格子不整合によるヘテロ界面歪がこのZnSxSe_<1-x>膜における欠陥形成に関与していることを確認するとともに、熱膨張の差による熱応力歪と格子不整合歪との相関を明らかにした。更に、これらの界面から発生する格子欠陥等に関連する局在モ-ドをレ-ザラマン分光法によって観測することに成功した。一方、AgGaS_2に関してはブリッジマン法及びI_2を輸送剤とするCVD法によって単結晶作成を検討してきたが、成長条件をより詳細に検討することにより、比較的大型で良質な単結晶を成長させることができるようになった。さらに、得られた単結晶をGa溶媒中あるいはAgGaS_2の2成分の活量制御下で熱処理した後、そのPL及び光伝導度を測定することにより、光電的性質に体し支配的な格子欠陥種の同定を行い、例えば4.2KにおけるPLに見られる2.63及び2.67eVの各ピ-クが、Ag空孔に、また2.40eV付近のブロ-ドなピ-クがGaの空孔に関連することを明らかにした。今後、これらの化合物において、格子欠陥制御下でド-ピングを行うことによる界面状態及び格子欠陥の評価の研究がきわめて重要である。
３’から５’方向への鋳型依存ＲＮＡ伸長反応を行う酵素Ｔｈｇ１の分子機構解明

真核生物型Thg1とtRNA(His)との複合体の構造解析を行い,Thg1がtRNAのCCA末端とアンチコドンを認識して結合すること,DNA/RNAポリメレースと類似した活性部位に対し,tRNA鎖はDNA/RNAと逆の方向から結合することを明らかにした.また鋳型依存的に付加反応を行う原核生物型Thg1の解析では,Thg1はtRNA(Phe)の肩部分を認識して結合すること, GTPホモログ(GDPNP)を反応部位に挿入すると,tRNAとワトソン・クリック型の塩基対を形成し,5'末端の鎖が動いて伸長反応可能な構造に至ることを明らかにした.真核生物型Thg1とtRNA(His)との複合体の構造解析を行い,Thg1がtRNAのCCA末端とアンチコドンを認識して結合すること,DNA/RNAポリメレースと類似した活性部位に対し,tRNA鎖はDNA/RNAと逆の方向から結合することを明らかにした.また鋳型依存的に付加反応を行う原核生物型Thg1の解析では,Thg1はtRNA(Phe)の肩部分を認識して結合すること, GTPホモログ(GDPNP)を反応部位に挿入すると,tRNAとワトソン・クリック型の塩基対を形成し,5'末端の鎖が動いて伸長反応可能な構造に至ることを明らかにした.Thg1は,tRNA^<His>の5'端にG塩基を付加する酵素であり,通常のDNA/RNAポリメラーゼと逆向きにRNAを伸長する能力を持つ.本研究ではThg1とtRNA^<His>複合体のX線構造解析を行い,その構造をもとにThg1による逆向きの塩基伸長反応の分子機構の詳細を解明するとともに,通常の鋳型依存DNA/RNA伸長反応と本酵素の関係を明らかにして,鋳型依存DNA/RNA伸長反応の分子進化の謎に迫ることを目的としている.このために,真核生物型Thg1とtRNA^<His>複合体(euThg1-tRNA^<His>複合体)の立体構造解析を第一目標としながら,同時に原核生物型Thg1の単体およびtRNA^<His>複合体の構造解析にも取り組み,最終的には両酵素の構造と反応機構を明らかにし,DNA/RNAポリメラーゼと比較することで,鋳型依存DNA/RNA合成の分子生物学の新しい展開を図ることを計画した.計画に基づき,初年度にはeuThg1-tRNA^<His>複合体の構造解析を重点的に行った.その結果,Thg1-tRNA_<His>複合体の構造を3.6A分解能で解明する事に成功し,同時にATPとの複合体の構造を2.4Å分解能で明らかにした.得られた構造では,2分子のtRNAが4量体のThg1と結合しており,1分子のtRNAは3分子のThg1と相互作用をしている.このサブユニットにまたがる結合が,小さなThg1分子がアンチコドンとCCA端というtRNA分子の両端を認識することを可能にしている.またThg1の活性部位の構造は,通常の鋳型依存DNA/RNAと類似しているが,tRNAは鋳型DNA/RNAと比べて反対の方向から活性部位に近づいている.これにより類似の活性部位を用いながら,逆向きの伸長が可能になる.また,原核生物型Thg1についても,発現,精製,結晶化に成功し,その構造を3.1Å分解能で解明した.Thg1は,tRNA(His)の5'末端にG塩基を付加する酵素であり,通常のDNA/RNAポリメラーゼと逆向きにRNAを伸長する能力を持つ.本研究ではThg1とtRNA(His)複合体のX線構造解析を行い,その構造をもとにThg1による逆向きの塩基伸長反応の分子機構の詳細を解明するとともに,通常の鋳型依存DNA/RNA伸長反応と本酵素の関係を明らかにして,鋳型依存DNA/RNA伸長反応の分子進化の謎に迫ることを目的としている.このために,真核生物型Thg1とtRNA(His)複合体の構造解析,および原核生物型Thg1の単体およびtRNA(His)複合体の構造解析を行い,DNA/RNAポリメラーゼと比較することで,鋳型依存DNA/RNA合成の分子生物学の新しい展開を図ることを計画した.平成25年度は,3.1Å分解能で解析した原核生物型Thg1(proThg1)の構造の精密化を終了させ,得られたproThg1の構造を,euThg1-tRNA複合体の構造と重ね合わせて構造比較を行った.proThg1では,euThg1においてtRNAのアクセプターステムを認識するヘリックスα5が,活性部位に向かって4.8Å内側に配置していた.このヘリックスα5により,tRNAのアクセプターステムがThg1内部により深く押し込まれ,5'末端の+3位まで欠失したtRNAに対するヌクレオチド付加が可能になると考えられる.さらに,tRNA(His)複合体(proThg1-tRNA(His)複合体)の結晶化にも成功,構造解析を進めている.Thg1は,tRNA(His)の5'端にG塩基を付加する酵素であり,通常のDNA/RNAポリメラーゼと逆向きにRNAを伸長する能力を持つ.本研究ではThg1とtRNA(His)複合体のX線構造解析を行い,その構造をもとにThg1による逆向きの塩基伸長反応の分子機構の詳細を解明するとともに,通常の鋳型依存DNA/RNA伸長反応と本酵素の関係を明らかにして,鋳型依存DNA/RNA伸長反応の分子進化の謎に迫ることを目的としている.

このために,真核生物型Thg1とtRNA(His)複合体(euThg1-tRNA(His)複合体)の立体構造解析を第一目標としながら,同時に原核生物型Thg1の単体およびtRNA(His)複合体の構造解析にも取り組み,最終的には両酵素の構造と反応機構を明らかにし,DNA/RNAポリメラーゼと比較することで,鋳型依存DNA/RNA合成の分子生物学の新しい展開を図ることを計画した.原核生物型Thg1とtRNA(Phe)の複合体(proThg1-tRNA(Phe)複合体)の立体構造を分解能2.21Åで決定し,proThg1はtRNA(Phe)のアンチコドン部を認識せずに結合すること,アンチコドンをHisのものに変えたtRNA変異体に対しては,G-1付加型の結合に変わることを明らかにした.さらに活性部位にGTPホモログ(GDPNP)を挿入した反応中間体の構造も2.70Åの分解能で決定し,塩基部分はタンパク質と相互作用をしておらず,tRNAとワトソン・クリック型の塩基対を形成していることを明らかにした.これによりproThg1によるtRNA鋳型依存ヌクレオチド伸長機構を構造に基づいて説明することに成功した.3'-5'方向の合成反応の詳細を含め,現在,本研究で得られた成果を取りまとめた論文の準備中である.26年度が最終年度であるため、記入しない。X線結晶学,構造生物学26年度が最終年度であるため、記入しない。初年度の計画のすべてを達成するとともに,次年度以降に予定していた原核生物型Thg1の構造解析にも成功した.予定通り,原核生物型Thg1の構造解析に成功し,真核生物型Thg1との構造比較を可能にした.さらに,原核生物型Thg1とtRNAとの複合体の構造解析も進めている.26年度が最終年度であるため、記入しない。proThg1-tRNA^<His>複合体の構造解析を行うために,複合体の結晶を得ることに注力する.同時に,活性に関与すると思われる残基を変異させた変異体を作成し,その活性を測定することで反応機構を解析する.一方,既に構造解析に成功した,euThg1とproThg1の立体構造の比較を行い,また,両者のGTP,ATP複合体の構造の比較から,認識機構ならびに反応機構の違いを説明する.最終的にはThg1が持つ3'-5'方向RNA伸長反応機構を明らかにし,鋳型依存DNA/RNA伸長反応の分子進化の構造基盤を確立する.平成25年度の研究に引き続き,proThg1(-tRNA(His)複合体)の構造解析を行う.構造が決定できたら,euThg1-tRNA(His)との立体構造比較を行い,3'-5'方向RNA伸長反応の違いを考察する.構造比較は,euThg1-rRNA(His)複合体の構造機能解析により明らかにしたG(-1)付加反応部位を中心に行い,それによって3'-5'RNA伸長反応に関与すると考えられるアミノ酸残基を同定する.立体構造比較から見出した,3'-5'方向RNA伸長反応に関与すると考えられるアミノ酸残基に変異を導入し,3'-5'方向RNA伸長反応活性測定を行い,仮説の検証を行う.また,euThg1はGまたはCのみを基質とし,proThg1はすべての塩基を基質に利用できる.この基質特異性の違いも両者の立体構造比較から推測する.最終的に,Thg1が有する3'-5'方向RNA伸長反応機構の全体像を明らかにし,Thg1の試験管内進化を行うための構造基盤を確立する.また,本研究で得られた結果を取りまとめ,成果の発表を行う.26年度が最終年度であるため、記入しない。
生活習慣病を想定した過食肥満マウス開発とNASHへの進展を規定する病態因子の探索

非アルコール性脂肪性肝炎(Nonalcoholic steatohepatitis: NASH)は脂肪肝から肝硬変,肝癌に至る進行性の慢性肝疾患である.有効な予防と治療法が強く要望されている.代表者らはヒトNASHを想定したSqstm1/Nrf2遺伝子二重欠失マウスを作製した.肝のみならず腸管や脂肪組織由来の生物学的因子が,NASHへの進展に中心的役割を果たすことが推測されている.本マウスでは,過食肥満下における腸内環境変化によるLPS産生増加,腸管バリア機能障害による腸管透過性の亢進,肝のLPSに対する異物排除機構の障害,これに関連した自然免疫反応の亢進が重要であると考えられた.p62:Nrf2-DKONASH自然発症モデルマウスを用いて、Kupffer細胞の貪食能についてSPIO-MRIにて評価検証した。マウスを8、25週齢まで飼育しNASHマウスを作成、マウス用1テスラーMRIを用いてSPIO-MRI撮影を行ない、シグナル低下量を評価した。マウスは、WT、Nrf2-null、p62-null、p62:Nrf2-DKOの4系統のマウスを用いた。また、p62:Nrf2-DKOに摂餌制限を行い、同様の実験を行った。さらに、25週齢の肝臓中LPS binding protein発現量の測定を行った。8週齢でのSPIO-MRIのシグナル低下量は、WTに比べp62-null、p62:Nrf2-DKOは有意に低下した(P < 0.01)。また、Nrf2-nullマウスも有意に低下した。さらに、25週齢のSPIO-MRIのシグナル低下量は、WTに比べp62-null、p62:Nrf2-DKOは有意に低下した。p62:Nrf2-DKO NASH自然発症モデルマウスでは、8週齢NASH発症前、25週齢NASH発症時ともに、T2値の低下量の減少がみられた。また、摂餌制限を行ったp62:Nrf2-DKOマウスにおいても、自由摂食p62:Nrf2-DKOと同様にWTに比べ有意に減少した。さらに、25週齢の肝臓中のLPS binding protein発現量が、WTマウスに比べ、p62-null、DKOマウスで有意に増加していた。このことより、p62:Nrf2-DKOマウスでは、肥満症とは独立してKupffer細胞の貪食能が低下していると考えられる。本年度の研究成果として、p62:Nrf2-DKOマウスにおいてKupffer細胞の貪食能の低下による肝臓内LPSの増加はNASHの発症と進展に重要な因子であると考えられる。p62:Nrf2-DKO NASH自然発症モデルマウスを用いて,腸内環境に主眼をおき,NASHの発症メカニズムについて探索した.野生型,p62-KO,Nrf2-KO,DKOマウスの肝,腸管を解析した.各系統のマウスにおいてNASH発症前後の糞便中LPS含有量を測定した.また,糞便中より16sRNAを抽出し,T-RFLP法により腸内細菌叢を測定した. FITCデキストラン経口投与により腸管透過性を評価した.さらに血清中LPS含有量を測定した.動物用小型MRIによる肝SPIO-MRIでKupffer細胞の貪食能を評価した.フローサイトメトリーによりKupffer細胞を単離し細胞機能を解析した.NASH発症前:DKOマウスは,糞便中LPS含量と腸内細菌叢の解析において,野生型に比べ有意な差が認められなかった.しかし,FITCデキストランの腸管透過性の亢進が観察された.また,Kupffer細胞におけるSPIOの取り込み能が,野生型に比べ減弱していた.さらにフローサイトメトリーにより詳細な解析を行ったところ,野生型と比べ,Kupffer細胞における貪食陽性率が低下していた.NASH発症後:DKOマウスでは,野生型に比べ,糞便中LPS含量が有意に増加しており,腸内細菌叢の解析ではグラム陰性菌であるPrevotellaが増加していた.血清中LPS含有量も増加していた.なおp62-KOおよびNrf2-KOにおけるこれら表現型の変化はDKOマウスに比較して軽微であった.DKOマウスにおけるNASH発症メカニズムには,過食肥満の病態下における腸内環境変化によるLPS産生増加,肝のLPSに対する異物排除機構の障害,これに関連した自然免疫反応の亢進が重要であると考えられた.食生活の欧米化と慢性的運動不足によってわが国の肥満人口は増加しており、顕著な増加を示しているが非アルコール性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis; NASH)である。NASHは明らかな飲酒歴が無いにも関わらずアルコール性肝炎に類似した大滴性の脂肪沈着を特徴とする肝炎である。NASHは肝硬変,肝癌に至る慢性肝疾患であることより、予防や治療に関する医療対応が重要である。しかしながら、その詳細な発症機構は未だ明らかになっていない。その理由には、適切なNASH動物モデルの欠如である。従来のモデルマウスは、ヒトNASHと全身状態と病態の進展速度が異なっており、ヒトとは乖離していることがあげられる。