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非球面レプリカ光学素子の超精密加工

本研究は、超精密な非球面を創成し、これを金型として別の基板に押し付けて形状を転写し、離型することにより超精密なレプリカ光学素子を製作する技術を開発するものであり、2010年に打上げを予定している斜入射宇宙X線望遠鏡の基盤製作技術となるものである。また、本研究はナノバイオX線顕微鏡システムの反射鏡製作の基盤技術となるものである。研究成果の概要は以下のようである。1.US&A社のS.F.Soares博士に4回来日を願い、50μm角の測定範囲で数nmの分解能で超精密ダイヤモンド工具のノーズ半径を測定できる走査型レーザー散乱顕微鏡を開発した。本装置は非接触で、透明で極めて鋭いダイヤモンド工具の刃先輪郭を高精度に形状計測可能であり、走査型電子顕微鏡やレーザー顕微鏡を越える分解能での測定を可能とした。2.X線望遠鏡では、形状誤差100nm以下、表面粗さ0.5nm rms以下の非球面形状の反射鏡が必要とされる。無電解ニッケルは超精密ダイヤモンド切削ができ、しかも光学研磨が可能な唯一の材料である。現在レプリカミラーに使用しているガラスマンドレルに替わる、無電解ニッケルマンドレルの製作を目指して、平面切削の最適加工条件を求めた結果、切削のみで表面粗さ0.344nm rmsが得られた。3.次世代の硬X線望遠鏡を目指し、無電解ニッケル金型表面にPt-C多層膜を生成し、これをガラス基板に転写し、レプリカミラーを創成することを試みた結果、Pt単層膜は無電解ニッケルから完全に剥離が可能となった。しかし、Pt-C多層膜を無電解ニッケル金型から剥がすことは、現状では出来ていない。本件については今後の研究が待たれる。本研究は、金型表面を転写する成型法で超精密な非球面レプリカ光学素子を製作するための基盤技術を確立することを目的とするもので、これまでの超精密機械加工技術を集大成するものであり、最も仕様の厳しいX線望遠鏡用非球面レプリカX線反射鏡を対象とする。X線望遠鏡は、表面すれすれに入射したX線が円筒内面で全反射する現象を利用するもので、集光力・結像性能・重量の点から今後は高精度な非球面レプリカ反射鏡がX線望遠鏡の主流になり、これを実現するための加工技術の開発が必須となる。そこで、超精密非球面加工装置並びに超高精度三次元形状計測器の高精度化、工具のノーズ半径の超精密計測法の確立、最適加工条件の導出、レプリカ作成時の形状転写性・表面微細構造転写性の解析、成型性・離型性の検討等を行って、非球面レプリカX線反射鏡基板を作成する。本年度は、アルミニウム合金製非球面金型を1nmの位置決め分解能を有する超精密非球面加工装置で製作し、超高精度三次元形状計測器により形状精度を測定すると共に、アルミニウム合金に無電解ニッケルをめっき施し、これを超精密非球面加工装置でダイヤモンド平面切削し、表面粗さに及ぼす加工条件の影響を実験的に明らかにし、最適加工条件を見出した。その結果、表面粗さ0.272nm Raと言う世界で最も滑らかな切削面を得た。また、超精密平面切削面のレプリカを製作する基礎的な研究を実施した。超精密ダイヤモンド工具のノーズ半径を正確に測る計測システムを構築するため、カリフォルニア工科大学のS.F.Soares博士と超精密工具形状計測システムの設計・製作を行った。これは、光ファイバーと超安定レーザを使用する0.5nmの分解能を有する位置検出センサーを用いて、非接触でダイヤモンド工具先端の形状を計測するものである。

本研究は、金型表面を転写する成型法で超精密な非球面レプリカ光学素子を製作するための基盤技術を確立することを目的とするもので、これまでの超精密機械加工技術を集大成するものであり、最も仕様の厳しいX線望遠鏡用非球面レプリカ反射鏡を対象とする。本年度の研究実績は以下のようである。1.1nmの位置決め分解能を有する超精密非球面加工装置で無電解ニッケル製非球面金型を製作する場合に工具として使用する超精密ダイヤモンド工具のノーズ半径を正確に知る必要がある。そのため、分解能1nmを目指す超精密工具形状計測システムを米国のUS&A社のS. F. Soares博士と共同開発した。本システムは光ファイバー、超安定化半導体レーザ、シリコン光センサー、超精密ピエゾ駆動装置を有し、工具のエッジを正確に捉え、光学顕微鏡を越える検出分解能があることが確かめられた。2.超精密非球面加工装置の走り誤差を調整し、かつソフト的に補正して加工することにより、直径100mmの無電解ニッケル金型を0.12μmの平面度で加工することができた。その表面粗さを数段階に変えた金型モデルを製作し、これに表面を軟化したアクリル樹脂を押し付け、離型することによりレプリカ光学面を製作した。無電解ニッケル金型とアクリル樹脂レプリカ成型品の表面粗さを光学的に測定し、両者を比較した結果、アクリル樹脂表面に金型の形状がほぼ完全に転写することが判明した。3.シリコン単結晶平面金型モデルにPt-C多層膜をコーティングし、表面粗さと超高圧透過電子顕微鏡観察を行なった結果、Pt膜の表面粗さはその元素の有する理想表面粗さの2倍の粗さであることを明らかにした。また、表面粗さの悪化の原因が膜の多結晶化にあることを電子顕微鏡観察から明らかにした。本研究は、超精密な非球面を創成し、これを金型として別の基板に押し付けて形状を転写し、離型することにより超精密なレプリカ光学素子を製作する技術を開発するものであり、2010年に打上げを予定している斜入射宇宙X線望遠鏡の基盤製作技術となるものである。また、本研究はナノバイオX線顕微鏡システムの反射鏡製作の基盤技術となるものである。1.US&A社のS.F.Soares博士に2回来日を願い、50μm角の測定範囲で数nmの分解能で超精密ダイヤモンド工具のノーズ半径を測定できる走査型レーザー散乱顕微鏡を開発した。本装置は非接触で、透明で極めて鋭いダイヤモンド工具の刃先輪郭を高精度に形状計測可能であり、走査型電子顕微鏡やレーザー顕微鏡を越える分解能での測定を可能とした。2.X線望遠鏡では、形状誤差100nm以下、表面粗さ0.5nm rms以下の非球面形状の反射鏡が必要とされる。無電解ニッケルは超精密ダイヤモンド切削ができ、しかも光学研磨が可能な唯一の材料である。現在レプリカミラーに使用しているガラスマンドレルに替わる、無電解ニッケルマンドレルの製作を目指して、平面切削の最適加工条件を求めた結果、切削のみで表面粗さ0.344nm rmsが得られた。3.次世代の硬X線望遠鏡を目指し、無電解ニツケル金型表面にPt-C多層膜を生成し、これをガラス基板に転写し、レプリカミラーを創成することを試みた結果、Pt単層膜は無電解ニッケルから完全に剥離が可能となった。しかし、Pt-C多層膜を無電解ニッケル金型から剥がすことは、現状では出来ていない。本件については今後の研究が待たれる。
小学校体育科ボールゲーム・ゴール型ゲームにおける空間認知力の育成に関する研究

本研究は,平成21年度科学研究において奨励研究として採用された「小学校体育科ボールゲーム・ボール運動における空間認知力の育成に関する研究」の2年次にあたる。「空間認知力」とは,「運動をする中で瞬時に空間を認知し,より有効な空間へ移動したりパスを出したりする力」としている。昨年度の研究で作成した「空間認知力」を育成するための系統表の修正ならびにその系統表に基づいて,本年度は第3学年の単元「ゲーム『ゴール型ゲーム』」において「トライアングルゲーム」の単元開発,授業研究を行った。授業は毎時間ビデオで録画した。「トライアングルゲーム」はラン攻撃とパス攻撃を基本とした攻守入り乱れ型のセストボールの学習を基本とし,三角形のゴールエリアで制限区域にいるDFをかわして放る投動作でのシュートをするゲームである。この運動には,空間を活用しノーマークでシュートをすることの有効性や,パスとシュートのコンビネーションプレーの重要性など,ボール系運動に必要な技能や戦術的な気づきを育むことが可能である教材と考えた。成果としては,空間認知力における認識目標に対する子どもたちの変容が見られた。ゲームにおける大切なポイントを問うアンケート結果から,86%の子どもが「パスの有効性」や「ノーマークを見つけて飛び込むことの有効性」「コートを広く使う有効性」について記述しており,ノーマークを生み出すための動き方に気づくことができたといえる。また,技能目標に対する変容を見るため,抽出児童を決定して「空間に飛び込む動き」及び「有効空間にパスを出す動き」に注目して分析した。どの子どもも単元が進むにつれてこれらの動きの回数が増えていることから,子どもたちの「空間認知力」が向上していることが分かった。以上,アンケートおよび抽出児童の動きの変容から,本単元は,小学校第3学年の「空間認知力」の育成に有効な単元であったと考えられる。
臨床応用実現化のためのヒト人工染色体ベクターの構築

ヒト人工染色体ベクター(Human artificial chromosome: HAC)は伴性劣勢遺伝病であるデュシェンヌ型筋ジストロフィーへの遺伝子・細胞移植療法の開発に向けて応用が期待されている。しかしながら、非ヒト細胞を用いない手法で作製し、目的細胞へ導入する新規技術の開発が必須である。本研究では、ゲノム編集技術CRISPR/Cas9を用いてモデル体細胞であるCHO/A9細胞においてヒト染色体改変法を開発した。一方で、ヒト細胞内での染色体改変法の開発やヒト細胞からの染色体導入法の開発について十分ではなく、さらなる検討が必要であると考えられた。本年度においては、以下に示す実験を「研究目的」、「研究実施計画」に沿って行った。一般培養細胞を用いての任意の不要染色体領域を全て除去するために、任意の複数の標的候補配列に対して切断可能なCRISPR/Cas9および、ターゲティングベクターを作製し、CelI assayにより切断可能かを検討した。また、CRISPR/Cas9に誘導される相同組換えにより、任意標的箇所にloxP配列もしくは人工テロメア配を挿入し、染色体改変を行い不要染色体領域を削除するための条件を検討した。本年度は、CRISPR/Cas9誘導性の遺伝子挿入および、不要染色体領域の削除が可能な条件を検討するため、CHO細胞内におけるHACの構築、ヒト染色体の改変を試みた。その結果、CHO細胞内にて、任意のヒト染色体上の標的配列にて切断活性をしめす、CRISPR/Cas9を作製することが出来た。また、CRISPR/Cas9により相同組換えを誘導することにより、任意の箇所に目的DNA配列を挿入する手法、および、テロメア配列を付加することにより、任意の箇所で染色体を切断することが出来る手法を確立した。また、改変された染色体については、CHO細胞内から、ヒト細胞株へと微小核細胞融合法にて移入することが出来た。一方で、ヒト細胞を染色体供与細胞とする微小核細胞融合法については、不死化間葉系幹細胞を用いて微小核形成法を検討したが、今後も薬剤処理方法検討の必要性があるという結果であった。目的箇所を切断するCRISPR/Cas9については、想定よりも簡便に作製、評価可能であることが分かった。CRISPR/Cas9に誘導される相同組換えにより、任意標的箇所にloxP配列もしくは人工テロメア配を挿入し、染色体改変を行い不要染色体領域を削除するための条件を計画に沿って検討し、達成することが出来た。一方で、ヒト細胞を染色体供与細胞とする微小核細胞融合法については、不死化間葉系幹細胞を用いて、コルセミド処理、ヘスペラジン処理、両薬剤併用処理を行ったが、コルセミド低濃度単独処理がもっとも形成率がよかったものの、細胞死が多く、今後も薬剤処理方法検討の必要性があるという結果であったが、想定の範囲内である。遺伝子導入効率の低い培養細胞株の改変条件検討として、電気的穿孔法による遺伝子導入法の効率検討する必要があった。例としてA9細胞中でのヒト8番染色体へのCRISPR/Cas9での切断、及び、組み換え効率向上が期待される化合物の効果を検討した。従来法では5%程度の遺伝子導入効率であったが、検討の結果60%程度にまで上昇した。このことから電気穿孔法には遺伝子導入困難細胞にも高効率で遺伝子導入可能であると示された。結果、従来法では改変ヒト8番染色体は作製できなかったが、電気的穿孔法と化合物の組み合わせにより、改変ヒト8番染色体を作製可能であった。今後はこの手法を採用することとした。また、ヒトX染色体の改変を改変可能な複数同時CRISPR/Cas9発現ベクターを作製した。複数のgRNA発現により、より高効率にヒト一般培養細胞株内、およびiPS細胞内でX染色体に対して切断活性を示すことが可能であった。得られた改変ヒトiPS細胞株について、染色体解析を実施した結果、いずれのクローンでも核型、X染色体ともに正常であることが示されれ、CRISPR/Cas9での切断後も目的通り正常なX染色体が得られると示された。次に、ヒトX染色体長腕ジストロフィン遺伝子上流に対して、人工テロメア付加により染色体切断を実施するためのCRISPR/Cas9ベクターの作製を行った。5か所の切断候補箇所を設定し、約8-4%の切断活性を示すCRISPR/Cas9ベクターの作製ができた。正常ヒト細胞株よりの染色体導入法については、十分な検討結果が得られていない。iPS細胞や不死化間葉系幹細胞のみならず、広範なヒト細胞株において染色体導入可能な細胞株の有無を探索する必要があると示唆された。hiPS細胞中での染色体改変については、当初計画より遅れている。早急に進める必要がある。臨床用ヒト人工染色体ベクターの構築を目指して、ヒト正常細胞内におけるゲノム編集技術(CRISPR/Cas9)を用いたヒト人工染色体ベクターの構築を試みた。前年度までの研究期間においてCRISPR/Cas9を用いたCHO細胞内での遺伝子挿入法に加え、テロメア付加による染色体切断法を実証した。またヒトiPS細胞内において、5-7%の切断活性を示すCRISPR/Cas9を作製した。本年度は、ヒトiPS細胞内でX染色体を切断するためのテロメア付加用ベクターとして、相同組換え配列1kbp、テロメア配列1kbp、陽性選択マーカーPuromysine耐性遺伝子、陰性選択マーカーFcy;;Furを持つベクターを作製した。先のCRISPR/Cas9とこのテロメア付加用ベクターをエレクトロポーレーション法にて、ヒトiPS細胞へと共導入した。

Puromysine、及び5-FCを用いて2週間選択培養の後、出現した薬剤耐性クローンの内24クローンを分取し、PCR解析を行った。いずれのクローンもPuromysine耐性遺伝子を保持していた。しかしながら、期待した染色体切断を示す組換えの発生は検出できなかった。また、ヒトiPS細胞を用いてうまくいかない場合の計画として、間葉系幹細胞における7番染色体に対する染色体切断も試みた。しかしながら、同様に24クローンのPuromysine耐性細胞株を得たが、PCR解析の結果ではPuromysine耐性遺伝子は保持していたが、目的通りの組換えを示すクローンは得られなかった。結果として、ヒト細胞内におけるヒト人工染色体ベクターの構築法は確立できていない。ヒト人工染色体ベクター(Human artificial chromosome: HAC)は伴性劣勢遺伝病であるデュシェンヌ型筋ジストロフィーへの遺伝子・細胞移植療法の開発に向けて応用が期待されている。しかしながら、非ヒト細胞を用いない手法で作製し、目的細胞へ導入する新規技術の開発が必須である。本研究では、ゲノム編集技術CRISPR/Cas9を用いてモデル体細胞であるCHO/A9細胞においてヒト染色体改変法を開発した。一方で、ヒト細胞内での染色体改変法の開発やヒト細胞からの染色体導入法の開発について十分ではなく、さらなる検討が必要であると考えられた。実験計画に沿って、ヒト細胞内でのCRISPR/Cas9を用いた、X染色体改変に着手する。また、ヒト細胞を染色体供与細胞とする、微小核細胞融合法の確立に向けて薬剤処理方法を中心に検討する。CRISPR/Cas9の作製・染色体改変について早急に着手する。複数種類のヒト細胞株を用いて、微小核細胞融合法が可能か検討する。染色体工学
海底遺跡の深度と分布を海水量荷重効果理論値と掘削法とに基いて探査する研究

1.西九州の海底遺跡分布域に研究の中心をおいた。特に熊本県有明海から長崎県五島列島にわたる範囲を重点的に調査した。2.長崎県下の海底遺跡図を作成した。3.熊本県有明海東岸から長崎県五島列島にわたる北緯33度線の4地点(東経130度40分,同130度,同129度20分,同128度40分)の4地点における6千年前の海面高度を氷河性海水準変動に基づく理論値を求めた。その結果、陸側に近い有明海側では4m,五島列島では-4m,大村湾南岸は0mと求められた。4.上の理論値を検証するとともに埋汲地形を復元するためのボーリング調査を長崎県北高来郡森山町海底低地,同諫早市津水町海岸,同彼杵郡多良見町伊木力海岸,同西彼杵郡三和町宮崎,同南松浦郡玉之浦町中須,同大宝浦,南松浦郡奈留町大串,同汐池,熊本県天草郡五和町で実施した。機械ボーリングによって延掘進長約50m,手動式ピストンコアラーによる調査では延掘進長約70mの掘削を行った。ボーリング調査は何れも不撹乱方式でオールコアリングのサンプルを採取した。採取したサンプルは海面高度を決定するために,イオウ化合物の定量分析、珪藻遺骸群集組成の解析を進め、海成層上限の認定作業中である。5.海面高度に年代値を入れるC14法年代測定は、平成5年34月に行う予定である。6.上記4と5の研究結果が出た段階で、3の理論値とのクロスチェツを行ない、真の海面高度を決定する。7.平成5年度は今年度の調査方法で佐賀県長崎県壱岐,対馬域を調査するとともに、埋没海底地形を復元し、その地形面上に出土している遺物をプロットして海底遺跡探査の資料としたい。
ヒトのエピゲノムの成立基盤

ヒトの細胞のDNAメチル化パターンを決める新規因子を同定し、メチル化が遺伝子の働きを調節する基盤を明らかにすることを目的とした。まず、DNAメチル化異常を伴う遺伝性免疫不全症の解析からZBTB24蛋白質を候補因子として同定し、遺伝子改変マウスを作成してこれがメチル化を調節することを証明した。また、ヒトとチンパンジーのメチル化比較により、CTCFという転写調節蛋白質、それが結合するDNA配列、及び直列型反復配列の塩基置換等の変化がメチル化パターンを決めることを明らかにした。以上の成果は、ヒトの進化、多様性、がん等の疾病の基盤の解明に役立つ。ヒトのエピジェネティック修飾による遺伝子発現制御の基盤を明らかにするため、当初の計画に沿って以下の研究を実施した。まず、(1)遺伝性DNAメチル化異常症であるICF症候群患者のうち既知の原因遺伝子DNMT3Bに変異のない症例4例について、全エクソン断片を濃縮して網羅的に配列を解読した(エキソーム解析)。その結果、4例中2例においてジンクフィンガータンパク質ZBTBの遺伝子に変異が見つかった(別の変異のホモ接合体)。このタンパク質がメチル化に関わることは知られておらず、新たなメチル化制御因子の可能性があるため、更に詳しい解析を行なっている。(2)がんのメチル化異常におけるpiRNA・siRNAの関与を明らかにするため、PIWIファミリーが高発現しており、かつメチル化異常を示す胃がん、大腸がんの細胞株5つを選び、小分子RNAの網羅的なシークエンス解析を行った。その結果、これらの細胞株においてpiRNA・siRNAは高発現しておらず、小分子RNAの大部分はmiRNAであった。これから、がんにおいてpiRNA・siRNAは必ずしもメチル化異常と関係しないことが分かった(投稿準備中)。(3)ヒト・チンパンジーのメチル化の違いを同定するため、成人女性4個体、チンパンジー雌4個体の末梢血白血球DNAをプールし、MeDIP-Chip法で解析した。その結果、21番、22番染色体において合計16領域のメチル化の違いを同定した。それらの多くは遺伝子の近傍にあり、メチル化の違いが遺伝子発現と相関している例も見つかった。さらに、種間のメチル化差異の多くが配列多型と相関することも明らかになり、メチル化状態を決めるシスの要因が明らかになった(投稿中)。また、この研究をゲノムワイドに展開するため、MBD-GST融合蛋白質を用いてメチル化されたDNA領域を濃縮し、網羅的に配列を決定して詳細な解析を行なっている(MBD-Seq)。本研究は、ヒトの細胞のDNAメチル化パターンを決定するトランスの因子とシスの因子を同定し、エピジェネティック修飾による遺伝子発現制御の基盤を明らかにすることを目的とした。最終年度は当初の計画に沿って以下の研究を実施した。まず、(1)遺伝性DNAメチル化異常症ICF症候群の原因遺伝子ZBTB24(ジンクフィンガータンパク質をコードする)で同定した3つの新規変異を論文として発表した(Nitta et al. 2013)。患者の細胞に正常ZBTB24遺伝子を導入して表現型の回復を試みる予定だったが、患者由来iPS細胞で低メチル化表現型が見られなかったため(未分化なため?血球では見られる)、ZBTB24ノックアウトマウスを作成し、サテライト配列が低メチル化となることを確かめた(卵黄嚢)。よって、この蛋白質がメチル化導入のトランス因子であることを確定した(未発表)。(2)がんにおいてpiRNA・siRNAが異常メチル化のトランス因子であるとの仮説を立て、メチル化異常を示す胃がん、大腸がん、乳がんの細胞株を調べたが、ポジティブな結果は得られなかった。しかし、仮説を否定するには至っていないので、引き続き検討することとした。(3)ヒト・チンパンジーの21番、22番染色体について、MeDIP-Chip法により16領域の種間メチル化差異を末梢血白血球で同定し、その多くが転写因子(CTCFなど)結合配列やタンデムリピート内の塩基置換に起因することを明らかにした(Fukuda et al. 2013)。すなわち、新たなトランス因子(転写因子)とシス因子(その結合配列やリピート)を同定した。この結果をゲノムワイドなメチル化解析により確認した。以上により、ヒトの細胞のメチル化パターンを決定する2つ新規トランス因子と2つの新規シス因子を同定し、当初の目的を達成した。本研究課題は、ヒトのエピジェネティック修飾による遺伝子発現制御の基盤を明らかにするため、DNAメチル化パターンを決定するトランスの因子とシスの因子を同定することを目的としている。H24年度は当初の計画に沿って以下の研究を実施した。まず、(1)遺伝性DNAメチル化異常症ICF症候群の新規候補遺伝子ZBTB24(ジンクフィンガータンパク質をコードする)で同定した3つの変異を論文にまとめ投稿した。

患者の細胞に正常遺伝子を導入して真の原因遺伝子か確定する予定であったが、ICF症候群患者のiPS細胞の入手が遅れたため(共同研究期間の手続上の問題による)、次年度に確定実験を行なう予定である。また、このタンパク質(メチル化導入のトランス因子の候補)が動原体付近のヘテロクロマチンに局在することを発見し、相互作用するタンパク質の同定・解析を開始したほか、ZBTB24ノックアウトマウスの作成に着手した。(2)メチル化異常を示すいくつかの胃がん、大腸がんの細胞株で、piRNA・siRNAがメチル化導入のトランス因子ではないことを論文にまとめる予定であったが、その過程で乳がん細胞におけるpiRNA・siRNAを調べる必要が生じたため、乳がんの2細胞株で解析を開始した。(3)ヒト・チンパンジーの21番、22番染色体について、末梢血白血球のMeDIP-Chipにより合計16領域の種間メチル化差異を同定し、その幾つかが遺伝子発現と相関することを論文にまとめ投稿した。さらに、種間メチル化差異の多くがジンクフィンガータンパク質CTCF結合配列の塩基の違いに起因することが明らかになり、メチル化状態を決める新たなトランス因子(CTCF)とシス因子(結合配列)が明らかになった。この研究をゲノムワイドに展開するため、MBD-Seqやバイサルファイト-Seqによる解析を行なっている。ICF症候群の新たな原因遺伝子の候補を同定したこと、ヒト・チンパンジーにおいて独自にメチル化の違いを同定したこと等から、おおむね順調に計画が進展していると判断できる。25年度が最終年度であるため、記入しない。DNAメチル化パターンを決定するトランスの因子の候補としてZBTB24とCTCFという2つのジンクフィンガータンパク質を同定したこと、シスの因子としてCTCF結合配列を同定したことから、おおむね順調に計画が進展していると判断できる。現在2本の論文を投稿中である。PIWIファミリーが高発現しており、かつメチル化異常を示す複数のがん細胞株においてpiRNA・siRNAが高発現していなかったことから、がんにおけるメチル化異常にpiRNA・siRNAが関与している可能性は低いと考えられる。よって、得られた知見を論文にまとめ、このテーマに関する実験は終了する予定である。残りのふたつのテーマに集中することで(ICF症候群り解析とヒト・チンパンジー間のメチル化の違い)、当初の目的を達することができると考えられる。PIWIファミリーが高発現しており、かつメチル化異常を示す複数の胃がん、大腸がんの細胞株においてpiRNA・siRNAが高発現していなかったことから、がんにおけるメチル化異常にpiRNA・siRNAが関与する可能性は低いと考えられたが、乳がん細胞株のデータを加えることで、より一般性をもたせた結論で論文にまとめることとした。
近代日米における教育方法の「一斉化」と「個別化」に関する比較研究

本研究は、日本とアメリカにおいて関係史料を博捜し、比較教育史の手法を用いて、日米における教育方法の「一斉化」と「個別化」の展開に関する実証的な研究を行うことにより、その背景にある教育的・社会的効用との関連を明らかにした。具体的には(1)近代日本においてアメリカから移入された一斉教授法が成立する過程を、教育的・社会的効用との関連から明らかにした。(2)大正期日本において、どのような一斉教授法批判が展開され、アメリカのいかなる個別教授法を受容し、またその方法がいかに日本的に変容したのかについて検討した。(3)近代アメリカで個別教授法が普及する過程について、教育的・社会的効用という観点から解明した。平成24年度は、まず、明治中期から大正期にかけての日本の教育界において、一斉教授法の普及が擁護される一方で、いかなる一斉教授法批判が展開されたのか、さらに、どのような個別教授法の教育的・社会的効用が主張されたのかについて、『教育時論』、『教育報知』等の教育雑誌や、教授法書、小学校沿革史の分析を行った。また、同時期のアメリカにおいて、どのように教育方法の個別化が図られたのか、そうした教授法にはいかなる社会的・教育的効用があると主張されたのか、についても分析を行い、日米比較を行った。その結果、明治中期においては、1同一の科目を同一の方法で教授しても、生徒の心意は異なるため、それぞれ独自に発達していくという主張により、一斉教授法が擁護されたこと。2一斉教授法によって、生徒相互の競争心が芽生え、生徒がより勉強に励むようになるといった主張がなされたことを明らかにした。次に、明治後期において一斉教授法批判が展開され、個別教授法が提唱された背景には、1児童生徒の個人差を無視した画一的教授への批判2個性伸長という教育目的の提唱の他に、3独創の精神を発揮させて学力の向上を図ろうとする教育観があったことなどが明らかとなった。また、同時期のアメリカにおいて、一斉教授法が批判された背景には、一斉教授法が教育活動の画一化、形式化、機械化を招き、学校と子どもの生活との遊離を引き起こしているとする主張があったことなどを明らかにした。さらに、日米で教育方法の「個別化」が図られた共通の要因として、社会生活の諸問題の解決能力を形成する上での「効率性」の追求という教育的・社会的効用があったことを明らかにした。以上のように、本研究において、教育方法の「個別化」の教育的・社会的効用について、日米比較教育史という観点から研究成果が得られた点が独創的であると考える。平成25年度は、1900年代初頭のアメリカにおける教育方法の「個別化」の過程について検討した上で、こうしたアメリカの情報が大正期日本における教育方法の「個別化」に果たした役割を明らかにし、その研究成果を学会で発表した。研究の結果、新しく得られた知見は主に以下の4点である。1アメリカにおける進歩主義教育運動の指導者の一人であるJ.メリアム(Junius L. Meriam, 1872-19600)は、ミズーリ大学附属小学校において、「観察」、「手仕事」、「物語」、「遊び」という4領域からなる生活単元学習を考案し、教育方法の「個別化」を図ったが、その目的は、仕事と余暇という生活全体を通して、市民社会の諸問題を解決する能力を形成することにあり、より「効率性」の高い教育を実践しようとしていたこと。2大正新教育運動の指導者のうち、もっとも重要な役割を果たしたとされる奈良女子高等師範学校附属小学校主事の木下竹次が、J.メリアムの著書、Child Life and the Curriculumを参考にして合科学習を構想し、教育方法の「個別化」を実践したこと。3メリアムの学校では、最終学年まで一貫して4領域の生活単元でカリキュラムが編成されたが、木下は中合科学習のみに導入したため、カリキュラムに一貫性がなく、試行錯誤が続いたこと。4メリアムが重視したのは、個性の相違の原理に基づく個人学習と多様なグループ学習であり、学習形態は状況によって変化していくと考えられていたが、木下は、学級学習の集団思考を評価し、個人学習の後に学級学習を挿入した。この点に教育方法の「個別化」の日本的変容がみられること。以上のように、本研究において、アメリカで考案された教育方法の「個別化」が日本の教育現場に移入され、変容する過程について、日米比較教育史という観点から研究成果が得られた点が独創的であると考える。本年度は、明治期日本における一斉教授法成立史の研究を中心に行った。具体的な内容は、以下の2点にまとめられる。(1)土浦小学校(茨城県)や藤沢小学校(神奈川県)等の各小学校沿革史や、学校管理法書、小学校教師が用いていた『多級教授法』等の教授法書を収集し、明治期の日本において一斉教授法が定着する過程を検討した。とりわけ、アメリカで軍隊の管理方式にヒントを得て考案された「教場指令法」が、1870年代の日本に一斉教授法のモデルとして移入され、それが1890年代の学級制への移行によって、「学校管理規則」として継承され、画一的で教師中心の一斉教授法が成立する過程を考察した。(2)『教育時論』、『教育報知』や、各地の教育会雑誌などの雑誌分析により、一斉教授法の成立過程を教育的・社会的効用という新たな観点から検討した。

具体的には、一斉教授法が成立する過程において、一斉教授の徹底化の背景には、生徒間の競争力の強化や、生徒の行為や品格を画一的に陶冶しようとする政策的意図があったことなど、一斉教授法の教育的・社会的効用を考察した。今年度は、1900年代前半の日本とアメリカにおける教育方法の「一斉化」と「個別化」の過程について実証的に明らかにするため、以下の史料調査を実施し、教育的・社会的効用という観点から分析を行った。1.アメリカにおける教育方法の「個別化」の過程について、以下の2つの事例から研究を進めた。11900年代前半のニューヨーク全市の小学校において採用されたThe ActivityProgramという、個別学習と共同学習を融合させた経験中心プログラムの展開や評価に関する資料調査と分析を行った。具体的には、一斉教授を主としていたニューヨーク市において、児童の自発的活動に基づく学習指導要領が新たに全市の小学校で採用された結果、どのような教育的効用がみられたのかについて分析を行った。2アメリカにおける進歩主義教育運動の指導者の一人であるJ.メリアム(Junius L. Meriam)が、ミズーリ大学附属小学校において展開した学習の「個別化」と生活単元学習の実践について検討した。2.日本における教育方法の「一斉化」と「個別化」の過程について、以下の3つの事項に関する調査と分析を行った。1明治期における等級制から学級制への移行期に、学級編制や一斉教授法の意義について、どのように論じられて学級制一斉教授法の定着につながったのかについて、明治期の教育雑誌記事の分析を行い、その研究成果を学会で発表し、論文にまとめた。2各地の小学校で明治期に定められた「学校管理規則」を収集し、学校管理の視点から一斉教授法が画一化する過程を検討した。その結果、各学校で定められた「学校管理規則」が、一斉教授法の画一化、形式化に一定の役割を果たしていたことを明らかにした。3大正期の奈良女子高等師範学校附属小学校において、アメリカから移入された個別学習を重視する生活単位学習が変容していく過程について、史料調査と分析を行った。今年度は、近代日米における教育方法の「個別化」に関する研究成果をまとめ、学会発表を行った。詳細は以下の通りである。1.193040年代のニューヨーク市において、市教育委員会が中心となって市内69の小学校で実施されたActivity Programというアメリカ最大の進歩主義教育の実験の内実やその成果について分析を行った。主に明らかになったのは以下の3点である。(1)ActivityProgramの具体的カリキュラムについて各学年で共通していたのは、1毎日児童自身が個別に一日の活動計画の作成や振り返り、および評価を行っていた点2各教科が学年ごとに設定された中心単元と関連付けられていた点3個人あるいはグループでの協同的活動による討論や劇、研究発表など、子どもの言語表現を重視した主体的活動を中心に展開されていたこと。(2)ActivityProgramの成果に関する学力調査の結果、伝統的な授業を行う対照校の方が、Activity校よりも特に算術計算と算術的論証で高い得点を得て、両者の差が拡大したこと。包括的学力テストでは、対照校がやや高い得点を得たが、両者の差は僅差であったこと。(3)Activity
広域津波被害の連鎖・複合性解明と国難災害に備える減災策の立案

平成28年度は,巨大地震津波により発生する津波複合被害について,防災対策の現状を整理したほか,南海トラフ地震津波の多数断層シナリオ作成について検討した.具体的には,下記の技術課題に取り組んだ.【課題1:南海トラフ地震津波に対する被害想定の現状と課題の整理】南海トラフ域における発生可能性の高いシナリオは多数考えられるが,防災対策を策定するためには,指針となる想定シナリオを絞り込んで地方自治体に提示することが望ましい.したがって,最大規模のケースに限らず,発生頻度が高くかつインパクトも大きいシナリオを明らかにすることが重要である.中央防災会議は,国内外における巨大地震から得られたデータを含む最新の科学的知見に基づいて,発生しうる地震動ケースと津波ケースを推定した.特に,「最大クラスの地震・津波」である11ケースはL2津波と呼ばれ,これらに対する被害想定(建物・人的被害などの量的予想,各種被害の様相,経済的被害)が行われた結果,断層シナリオの違いによって推定被害量が大きく乖離することが明らかになった.したがって,発生しうる全ての断層シナリオに対する被害想定の実施,すなわち多様な被災シナリオの作成により,各シナリオが持つ被災ポテンシャルの傾向と特徴を把握することが,今後の防災対策に有効であると考えられる.【課題2:南海トラフ地震津波の多数断層シナリオ作成に関する検討】南海トラフ地震津波の被災傾向を把握するため,該当領域で発生しうる多様な被災シナリオの作成について検討した.特に,多数断層シナリオに関しては大すべり域・超大すべり域の不確実性を考慮した決定手法に基づいてパラメータを設定したほか,被害推定手法として適用する津波被害関数に関しても,計算領域である高知県の地理的特徴に基づいて検討を行った.28年度が最終年度であるため、記入しない。28年度が最終年度であるため、記入しない。平成26年度は,巨大地震津波が臨界都市を襲う際に発生する津波複合被害について,そのメカニズムの解明に着手した.具体的には,下記の技術課題に取り組んだ.【課題1:複合的・連鎖的に発生する津波被害の全容把握】課題(1)では,主に2011年東北津波によって,沿岸部を中心に生じた津波被害の全容を把握した.まず,今次津波にて発生した津波複合被害の一覧を作成したところ,その特徴として,「発災直後に発生して人的・物的被害をさらに拡大させたもの」および「発災後しばらくして顕在化した被害」に分類されることが分かった.前者に含まれる複合被害としては,「海岸構造物の破壊」「海岸林被害」「家屋破壊」「漂流物被害」「道路・交通障害」「可燃物流出」「津波火災」「水産被害」「ライフライン寸断」「地形変化」が挙げられる.本研究では,発災直後から浸水終息(火災鎮火)までの期間が最も危険であり,また複合被害の抑制において特に重要であると考えたため,今後はこれらの被害に着目することとした.【課題2:複合・連鎖パスの構築と被害拡大要因の分析】課題(2)では,個別被害から複合的津波被害に至るまでの過程・機構を整理した.特に,被災沿岸部で発生した津波火災について各地の被害状況を整理し,その発生・連鎖パスを作成した.その結果,いずれの地域においても,「家屋倒壊」「車(船舶)の漂流物化」「がれきの大量発生」「可燃物流出」の個別被害が連鎖したために,出火・延焼が促進されたことが明らかになった.また,津波火災が発生することにより,現地の状況把握や水利確保が困難となって消火活動が妨害され,さらなる大規模延焼を引き起こした地域も少なくない.したがって,津波火災を減少させるためには,主な被害拡大要因である「家屋倒壊」「車(船舶)の漂流物化」「がれきの大量発生」「可燃物流出」を予測・抑制することが重要と考えられる.平成27年度は,巨大地震津波により発生する津波複合被害について,想定のための数値解析手法を検討したほか,防災対策の現状を整理した.具体的には,下記の技術課題に取り組んだ.【課題1:建物破壊を考慮した津波数値解析手法の検討】まず,2011年東北津波の空撮映像から,仙台・名取海岸における津波氾濫流況および建物被害の発生状況を整理したところ,第一波襲来後10分程度の間に建物が流失していることが分かった.また,第一波遡上と同時に大量の家屋瓦礫が陸域へ浸入し,建物破壊の主要因のひとつとなったことが確認された.次に,津波の浸水状況に応じて建物を流失させ,被害状況を合成等価粗度係数として反映する時間発展型合成等価粗度モデルの検証を行った.その結果,内陸部において推定された流失建物分布は実現象と概ね整合する一方,沿岸部の密集住宅街における流失建物数は過小評価されることが明らかになった.これは,密集市街地における津波氾濫流況の特性,および倒壊家屋から発生した漂流瓦礫の影響を考慮する必要性を示している.【課題2:南海トラフ地震津波に対する被害想定の現状の整理】内閣府と地方自治体が進めている南海トラフ地震津波対策の経緯と現状,課題について整理したところ,L2津波発生時の被害想定結果から,地震動および津波シナリオの違いにより推定被害量に大きな差が生じることが分かった.各地の最小被害ケースと最大被害ケースの差は,平均で3倍,最大で10倍となっており,想定被害量のばらつきは大きくなっている.以上から,L2津波の各シナリオが有する被害量が大きく乖離するように,L1津波の各シナリオが持つ被害量にも大きな差異が生じると推測できる.したがって,発生しうる全ての想定シナリオに対して多様な被災シナリオを作成し,被災ポテンシャルの傾向と特徴を把握することが今後の防災対策に有効である.

平成27年度の目標のひとつであった「建物破壊を考慮した津波数値解析手法の検討」については,既往研究や現地調査による知見,および各地の津波氾濫特性を踏まえて適切な建物破壊条件を検討したほか,時間発展型合成等価粗度モデルの検証と改良を重ねたことにより達成できた.また,南海トラフ地震発生域における高頻度かつインパクトが大きい発災パターンの把握を最終目標として,まずは「南海トラフ地震津波に対する被害想定の現状整理」に取り組み,これを概ね達成できた.したがって,本研究課題は概ね順調に進展していると評価した.平成28年度は,巨大地震津波により発生する津波複合被害について,防災対策の現状を整理したほか,南海トラフ地震津波の多数断層シナリオ作成について検討した.具体的には,下記の技術課題に取り組んだ.【課題1:南海トラフ地震津波に対する被害想定の現状と課題の整理】南海トラフ域における発生可能性の高いシナリオは多数考えられるが,防災対策を策定するためには,指針となる想定シナリオを絞り込んで地方自治体に提示することが望ましい.したがって,最大規模のケースに限らず,発生頻度が高くかつインパクトも大きいシナリオを明らかにすることが重要である.中央防災会議は,国内外における巨大地震から得られたデータを含む最新の科学的知見に基づいて,発生しうる地震動ケースと津波ケースを推定した.特に,「最大クラスの地震・津波」である11ケースはL2津波と呼ばれ,これらに対する被害想定(建物・人的被害などの量的予想,各種被害の様相,経済的被害)が行われた結果,断層シナリオの違いによって推定被害量が大きく乖離することが明らかになった.したがって,発生しうる全ての断層シナリオに対する被害想定の実施,すなわち多様な被災シナリオの作成により,各シナリオが持つ被災ポテンシャルの傾向と特徴を把握することが,今後の防災対策に有効であると考えられる.【課題2:南海トラフ地震津波の多数断層シナリオ作成に関する検討】南海トラフ地震津波の被災傾向を把握するため,該当領域で発生しうる多様な被災シナリオの作成について検討した.特に,多数断層シナリオに関しては大すべり域・超大すべり域の不確実性を考慮した決定手法に基づいてパラメータを設定したほか,被害推定手法として適用する津波被害関数に関しても,計算領域である高知県の地理的特徴に基づいて検討を行った.平成26年度の目標のひとつであった「津波複合被害の全容把握」については,2011年東北津波の被害状況を調査・整理したことにより,概ね達成できた.また,「津波複合被害の発生・連鎖パスの作成」および「被害拡大要因の解明」に関しては,津波火災に対する分析を行うことができた.したがって,本研究課題は概ね順調に進展していると評価した.平成27年度は,巨大地震津波により発生する津波複合被害の想定方法,特に建物被害関数を組み込んだ数値解析手法の検証を行った.また,将来の国難災害に対する被害想定の現状を整理した.平成28年度は,南海トラフ地震津波において発生しうる全ての津波シナリオに対して多様な被災シナリオを作成し,各シナリオが有する被害量(被災ポテンシャル)の傾向と特徴を明らかにする予定である.
横穴墓からみた古代国家成立期における集団関係の研究

本年度は前年度に引き続き、横穴式石室・横穴墓の現地踏査に基づく遺跡の立地・遺構の形態等の観察・記録と、発掘調査報告書を用いたデータ集成を行った。そして、これに基づく各地域の墓の比較分析を行い、その構造等の類似関係の検討から墓に関する情報がどのように伝達されたのかを明らかにした。検討の結果、1古代国家成立期の日本列島には、横穴墓の被葬者同士の情報伝達ネットワークのみでなく、上位層を含めた階層間の情報共有がなされる場合があったということ、2地域間の情報伝達に関しては、2-1.比較的近距離の場合は墓そのものの細部構造まで共有されることから、人の行き来があったと考えられるが、2-2.遠距離間では伝達の過程で情報の変容が認められることから、地域間で直接の人の行き来があったとは考えにくいということが明らかになった。総合すると、当該期の全国的な墓構造の類似現象は、それぞれ異なる背景をもつ複雑なネットワークの存在によって生じていたといえる。さらに、これらの考古資料から得られたモデルを、文献史研究から明らかにされている当該期の政治組織等や文献に記載されている氏の名称の分布と対比し、前述のネットワークの具体像について考察した。その結果、前出1では、大型古墳に埋葬された「国造」あるいは「伴造」といった地方の上位層から、横穴墓などの群集墳に埋葬された「部民」あるいはその集団を束ねる「トモ」などへという情報の伝達が存在していたこと、2のうち特に2-2では、地方から中央に「トモ」という形で出仕した人物が「ウジ」ごとに編成され実際の職務にあたるという機会を通じてウジ(氏)内で共有された葬送儀礼や造墓に関する情報が地方に持ち帰られて情報が共有されたと考えた。このように、当該期の墓の構造等の類似現象の背景には、地域間・階層間にわたって多元的かつ複雑にめぐらされたネットワークが存在しており、かつ、それは当該期のヤマト政権による地方支配体制を反映したものであったことが解明された。(抄録なし)本研究の目的は、古代国家成立期に列島各地で築造された墓のひとつである横穴墓の形態・出土した副葬品・人骨の分析を通じて情報・もの・人間の移動を明らかにし、当該期の社会における集団間のネットワークとその形成の歴史的背景について解明することである。この目的達成のために本年度は、横穴墓の形態と出土した副葬品の分析に的を絞り、主に1.東海地方と、2.東北地方東南部・関東地方東北部について検討を行った。具体的には、横穴墓の現地踏査に基づく遺跡の立地・遺構の形態等の観察・記録を行い、この成果と出版された発掘調査報告書を用いたデータベースの作成とこれに基づく分析を行った。1の地域では、各地域の横穴墓にそれぞれ異なる形態が採用されていること、これが横穴墓導入時あるいはそれ以降の「影響」の多元性とその受容のされ方の多様性に起因することが明らかとなった。また、2については当該地域の横穴墓の展開の中で現れる多様な系譜のうちのひとつである「肥後型横穴墓」の出現の歴史的背景について検討を行った。その結果、各地域での「肥後型横穴墓」の採用のされ方には差異があり、これが築造時に得られた墓の構造に関する情報の程度や在地化の程度の差異に起因することを明らかにした。そしてこのような現象は、情報伝達のネットワークの多様性を表していること、特に後者のうち東北地方においては当該期の対蝦夷政策と関連した集団の移住や物流など、ヤマト政権による支配政策の一端を示しているということを考察した。このことは、文献資料のみでは明らかになってこなかった国家の周辺地域をどのように国家に取り込んでいったのかということを解明する上で重要であると考えられる。

このように、当該期の墓の構造等の類似現象の背景には、地域間・階層間にわたって多元的かつ複雑にめぐらされたネットワークが存在しており、かつ、それは当該期のヤマト政権による地方支配体制を反映したものであったことが解明された。本年度は、1.発掘調査報告書を基にした分析対象資料のデータベースの作成、2.分析に用いる資料の実見、3.各地域における横穴墓の展開に関する分析を行う予定であった。1については、予定していた東海・関東地方と北陸地方の一部のデータベースを作成することができた。2についても同地域の現存する横穴墓遺跡について踏査を行い、資料の観察と写真記録を行うことができた。3については、東海地方における横穴墓の展開と東北地方南部・関東地方におけるいわゆる「肥後型横穴墓」の出現の歴史的背景について重点的に検討を行った。今後は引き続きデータの集成と資料調査・分析を行う。特に、列島の広域を視野に入れたマクロな分析と、各地域や各遺跡における横穴墓の展開というミクロな分析を並行して行い、各地域のパターンの抽出とモデル化を行う必要がある。これに加えて、人骨の歯牙エナメル質のストロンチウム同位体比分析による集団の移動に関する検討と、古代史学のデータの収集・考古学的モデルとの対比を予定通り行っていく方針である。(抄録なし)
エキソソームは、細胞間コミュニケーションツールとして機能し、癌の転移や免疫応答等にも関与する。その分子機構の解明は、疾患診断バイオマーカーや革新的ドラッグデリバリーシステム開発に繋がると期待されている。一方で、エキソソーム研究は黎明期にあり、信頼のおける調製方法が確立・普及しておらず、回収率が極めて低い等、エキソソームの本質を解明する上で解決すべき多様な技術的課題を抱えている。本研究では、エキソソームがナノコロイド粒子であることに留意し、その生物機能特性を根底から理解するためには避けては通れない“インタクト"なエキソソームの調製方法の開発・確立にフォーカスし、物理化学的評価基準から調製条件の適正化を進めた。具体的には、ヒト胎児腎細胞293(HEK-293)の培養上清から密度勾配超遠心分離法により、エキソソームのバイオマーカーとされるテトラスパニンCD63等を指標に免疫生化学的にエキソソーム含有分画を同定し、免疫電子顕微鏡法による評価や、動作原理を異にする動的光散乱法と電子顕微鏡画像解析から粒径を計測し分布様式等を比較検討した。既報を含む種々の条件で分画調製を試み、電子顕微鏡法による直接観察を系統的に行ったところ、標準的精製法に内在する根本的な問題が明らかとなった。鋭意検討した結果、その大半をセレンディピティとも思えるかたちで克服でき、細胞から分泌された直後のインタクトな物理化学的性質を保持した状態にある膜小胞(エキソソーム)の分画調製に成功した。従来、エキソソームは粒径100 nmにピークをもつ単純なガウス分布を示すとされているが、本調製分画では粒径50 nmの集団も確認された。これは、細胞の超薄切片の電子顕微鏡画像に見られるマルチベシキュラーボディ内のエキソソームの粒径と整合した。引き続き、真正なエキソソームのクライオ電子顕微鏡解析に向け、条件検討を進めている。エキソソームは身体を構成するほぼすべての細胞から分泌される膜小胞の一種であり、かつては細胞の老廃物排出機構の一つと考えられていたが、体循環に乗って他の細胞へと送達され、細胞間コミュニケーションツールとして機能することが明らかとなった。癌の転移等にも関与することから、その分子機構の解明は、革新的なドラッグデリバリーシステム開発に繋がる可能性が高い。一方で、エキソソーム研究は黎明期にあるため、「玉石混淆」、「エキソソームが取れない」等々、多くの技術的な課題も抱えている。細胞が分泌する膜小胞には、エキソソーム(一般的に直径30150 nmとされている)の他に、形成過程や内包物の異なる、マイクロベシクル(501,000 nm)、アポトーシス小体(8005,000 nm)等があり、現状それぞれを完全に分離・精製することは極めて困難と考えられている。さらに分泌由来細胞によりエキソソームの性質が顕著に異なるため、“エキソソーム"を明確に定義することすらできていない。エキソソームに秘められた可能性を、早期に医療診断や治療等に社会実装し利活用するためには、生物・医学的知見の蓄積を急ぐ必要はあるが、分析・解析対象の“エキソソーム"が信頼に足るものでなければ意味をなさない。当該研究領域の現状を正しく理解した上で広く世界から発信される論文や実験データ・解析結果等を冷静に評価・検討することが肝要といえる。本研究において得られた実験データ等に依れば、従来法(現行法)により調製されたエキソソームは、分泌直後の状態(形状や性質等)を保持していないケースが多く、すなわち、変性(凝集や融合等)している可能性を強く示唆しており、根本的な点において我々の開発した調製法の優位性を支持する結果となっている。これらを含めて慎重に検証を進めており、「おおむね順調に進展している」と判断した。電子顕微鏡法による直接観察により、広く医学系領域において採用されている標準的な分離・精製条件では、細胞外膜小胞は容易に変性や融合、凝集等してしまうことが明らかになった。我々の開発した調製技術を用いれば、細胞から分泌された直後の性状を保持した状態にあるエキソソームとして分画調製することができる。エキソソーム研究において、今後、この技術が基盤技術として広く普及することが極めて重要と考えている。今後は、引き続き「生物物理学的解析に適した膜小胞の調製方法」(PCT/JP2017/013999、特願2018-510600)を共通基盤技術として活用し、疾患モデル細胞株等の培養上清からエキソソームを分画・調製する過程で、クライオ電子顕微鏡解析に適した調製条件の検討を進める。併行して、細胞の生育条件等の影響を分析すると共に、当該調製法の一般化・普及を進める。本研究助成により導入した電子顕微鏡画像解析装置の解析ソフトウェア環境の整備を急ぎ、エキソソームの生物物理学的特性の解明および評価手法の開発を進める。その際、相補的に動的光散乱法によるナノ粒子径分布解析を行い、電子顕微鏡法による解析データとの整合性を確認する。また、前例のないナノスケール領域(100 nm近傍)における分離分画手法に新たなアイディアを試行し、粒子径指標による画分の均質化に挑戦する。
適宜、電子顕微鏡法の要素技術開発を進め、クライオ電子顕微鏡法による膜小胞の形状、三次元構成の解析および“真正な"エキソソームに特徴的な生物物理化学的特性の抽出を急ぐ。エキソソームがナノスケールのコロイド粒子であることに留意し、所内外の研究協力者と連携して、ナノ物性、コロイド化学、量子力学等、物理化学的基盤からの解析を進める。“真正な"細胞外膜小胞(エキソソーム等)について得られた成果は順次、論文誌や学会等で発表して行く。細胞外膜小胞は、すべての細胞から放出される小胞であり、エキソソームやマイクロベシクル、さらに不均質な粒子群を含み、正常な発生や生理的プロセスならびに全身の病理的プロセスに関与し、局所および遠方の微小環境において細胞間情報伝達を担っている。エキソソームがナノコロイド粒子であることに留意し、物理化学的視点に立った解析を進めた。具体的には、がん細胞や疾病モデル等の種類の異なった細胞株の培養上清に我々の開発した分画調製法を適用し、当該調製法の一般化、高度化を進めると共に、ショ糖密度勾配超遠心分画の各画分について、免疫生化学分析、動的光散乱(DLS)法によるナノ粒子径計測、電子顕微鏡解析等を実施した。細胞種は、PC12、NG1O8-15、C6Bu-1、N18TG-2、SH-SY5Y、SK-N-SH、NIH/3T3、COS7、HCT116、HEK293を用いた。我々の開発した新規調製法により分画したHEK293由来のCD63陽性膜小胞画分ついて、試行的にX線溶液散乱(SAXS)実験を行い、脂質膜の構造が反映される高q領域の解析を行った。また、DLS計測や電子顕微鏡解析から、各画分の小胞の構成比は必ずしも均質とは言えないが、HEK293やC6Bu-1由来の膜小胞画分について、平均的ゼータ電位を計測し、興味深い荷電状態が確認された。エキソソームは、多様性に富む生体由来のナノスケールの複雑系であり、その生物物理学的解析には、クライオ電子顕微鏡法によるアプローチは最適と考えている。近年、クライオ電子顕微鏡解析に起きた飛躍的な技術革新について、ハード、ソフト両面から調査・分析等を行い、今後、本課題を遂行する上で有益な連携基盤の構築を進めた。引き続き、クライオ電子顕微鏡解析をも視野に入れ、形体、粒径とその分布様式、荷電(ゼータ電位)等のデータを集積し、物理化学的特性の全容解明を進める。国内外で広く知られている標準的プロトコールに沿って調製されたエキソソーム群は、何れも100 nm付近に単一ピークをもつガウス様の粒径分布を示す。ところが、近年報告された細胞超薄切片の電子顕微鏡観察によると、細胞から分泌される直前のマルチベシキュラーボディー(MVB)中や、分泌直後のエキソソームは、粒径約50 nmであるらしい。我々の開発した分離調製法によるエキソソーム画分の電子顕微鏡解析や、金ナノ粒子で標識した免疫電子顕微鏡法による解析は、これを支持する結果であった。このことは、従来法(現行法)により調製された膜小胞は、分泌直後の状態(形状や性質等)を保持していない、すなわち、変性(凝集や融合等)している可能性を強く示唆しており、我々の開発した調製法の優位性を示している。これらを含めて検証を進めており、「おおむね順調に進展している」と判断した。エキソソームは、細胞間コミュニケーションツールとして機能し、癌の転移や免疫応答等にも関与する。その分子機構の解明は、疾患診断バイオマーカーや革新的ドラッグデリバリーシステム開発に繋がると期待されている。一方で、エキソソーム研究は黎明期にあり、信頼のおける調製方法が確立・普及しておらず、回収率が極めて低い等、エキソソームの本質を解明する上で解決すべき多様な技術的課題を抱えている。