hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
アンドロゲン低下によるサルコペニア惹起機構の解明

糖尿病合併症としての骨格筋萎縮・サルコペニアの重要性が注目されている。男性更年期障害は糖尿病の危険因子の一つであるがアンドロゲン低下とサルコペニア発症の機序が未解明である。本研究では睾丸摘出処置を行い、アンドロゲンシグナル遮断による骨格筋萎縮を再現し、Transcriptome解析を実施した。これによりscd1およびsmoxの発現低下を認めた。また、microRNAとしてmir23b-3pの発現上昇を認めた。mir23b-3pの発現上昇はpten抑制を介して筋管細胞の筋タンパク質合成を促進させていることが明らかとなった。サルコペニア(筋萎縮)は、糖・脂質代謝異常や日常生活動作(ADL)の低下を来たし、生命予後も規定する重要な病態である。血清アンドロゲン濃度と筋肉量および筋力は相関を認めることが知られているが、詳細な分子機序は明らかでない。我々は、9週齢のC57BL6/J雄マウスを去勢し、1週間後に安楽死させ、骨格筋を採取した。非去勢マウスを対象群とし、real time PCRにて各種遺伝子の発現を評価したところ、去勢マウスの足底筋(速筋)においてmyostatinの発現上昇が観察された。myostatinは骨格筋から分泌されるTGFβファミリーの一員で筋肥大を抑制する作用を持つため、対象群と比較し筋断面積が縮小することが予想されたが、去勢後1週間の時点では変化は見られなかった。平成27年度研究計画は、1.去勢マウスにおける筋萎縮・脂肪化の至適条件検討とモデルの生物学的評価、および、2.睾丸摘出により筋萎縮・脂肪化したヒラメ筋でのTranscriptome解析を行うことであった。このうち、1に関しては、去勢1週間の時点では一部の遺伝子変化は検出されるものの、骨格筋萎縮が生じるまでには長期間の経過観察を要すると考えられた。2に関しては、精巣摘出を実施したマウス骨格筋の網羅的遺伝子解析を行った既報(Haren MT, et al. Int J Androl. 2010)の生データを入手し、我々の研究室内にて解析することが出来たため、予算をmiRNAの網羅的解析に充てることとした。研究代表者は筋萎縮・サルコペニアの分子レベルでの病態解明を目指している。本研究ではサルコペニア動物モデルを用いて、筋組織におけるmicro RNA(mi R)の発現変化に注目した。8週齢オスBl/6マウスに睾丸摘出(Orchiectomy)を実施すると、4週後にヒラメ筋が萎縮することを確認し、サルコペニア動物モデルとして用いることとした。研究代表者はこの萎縮したヒラメ筋とコントロールのヒラメ筋からRNAを抽出することで筋特異的mRNAの発現変化が起きることを確認した。筋特異的mRNAについては文献的検討に加え、GSE16486およびE-MEXP-2192を再解析することでテストステロンシグナルの遮断による筋萎縮時のmRNA変化について網羅的検討を実施した。研究代表者は、コントロール群として偽手術を実施した群、評価群として睾丸摘出を実施した群、さらに比較群として睾丸摘出を実施し、テストステロンの補充を実施した群の3群を設定し、比較検討した。研究代表者はこのサルコペニア動物モデルを用いて、ヒラメ筋から全RNAを抽出しmiRNAアレイを実施した。アレイにより得られた結果は生物統計学的に検討し、サルコペニア特異的miRを数種類同定した。今後は、この同定したサルコペニア特異的miRの機能について、マウス骨格筋細胞株C2C12を用いて明らかにする。本研究からサルコペニアで特異的に発現異常をきたすmiRNAが同定されること、その生物学的特性が明らかとなることは、サルコペニアの早期診断・新規治療開発の上で重要である。すわなち、サルコペニアで特異的に発現異常をきたしたmiRNAを阻害・補充し、その発言を正常化させることが、現在治療法のないサルコペニアの画期的治療となりうる。平成27年度の予定は睾丸摘出マウスにおける筋萎縮・脂肪化の至適条件検討とモデルの生物学的評価と睾丸摘出により筋萎縮・脂肪化したヒラメ筋でのTranscriptome解析であった。8週齢オスBl/6マウスに睾丸摘出(Orchiectomy)を実施し、4週後にヒラメ筋を評価した。ヒラメ筋重量は睾丸摘出により増加が抑制されるがテストステロンの補充により改善した。睾丸摘出後4週経過時点で、組織学的にヒラメ筋の筋繊維が萎縮していることも確認、テストステロンの補充により改善することも確認した。Transcriptome解析については、GSE16486およびE-MEXP-2192よりテストステロンシグナルの遮断による筋萎縮時のmRNA変化について網羅的検討を実施した。この結果、irs1が萎縮したマウスヒラメ筋で発現が上昇することを検出、実際我々のサルコペニアマウスモデルのヒラメ筋でも筋萎縮時にirs1の発現が上昇していることを確認した。平成28年度の予定はテストステロンシグナル遮断により有意に発現上昇、もしくは低下がみられ、筋萎縮・脂肪化と関連するmRNA, microRNA, long non coding RNAの同定であった。GeneChipのスキャンにより得られた蛍光強度は、正規化・対数化を実施、2群ごとに発現強度の変化と変動のばらつきを検討し、サルコペニア時に有意に発現上昇・低下するmiRの候補を選出した。

選出されたmiRについてWAD法により、優先順位を算出した。研究代表者は筋萎縮・サルコペニアの分子レベルでの病態解明を目指している。本研究ではサルコペニア動物モデルを用いて、筋組織におけるmicro RNA(mi R)の発現変化に注目した。8週齢オスBl/6マウスに睾丸摘出(Orchiectomy)を実施すると、4週後にヒラメ筋が萎縮することを確認し、サルコペニア動物モデルとして用いることとした。研究代表者はこの萎縮したヒラメ筋とコントロールのヒラメ筋からRNAを抽出することで筋特異的mRNAの発現変化が起きることを確認した。筋特異的mRNAについて、GSE16486およびE-MEXP-2192を再解析することでテストステロンシグナルの遮断によるスペルミンオキシダーゼSmoxの発現低下に着目した。テストステロンシグナル遮断によるSMOXが発現低下の代償として、スペルミジンを含むポリアミン投与の抗サルコペニア効果を検討した。この結果、ポリアミンの投与により骨格筋スペルミジン量がテストステロンシグナル遮断においても維持されることを確認した。さらにヒラメ筋から全RNAを抽出しmicro RNA(mi R)の網羅的解析を実施した。この結果、miR-1, miR-133, miR-266をはじめとする骨格筋特異的miRの発現低下に加え、miR-23クラスターの発現亢進、let-7ファミリーの発現低下を確認した。miR-23クラスター、let-7ファミリーの骨格筋での機能解析はマウス骨格筋細胞株C2C12を用いて実施した。糖尿病合併症としての骨格筋萎縮・サルコペニアの重要性が注目されている。男性更年期障害は糖尿病の危険因子の一つであるがアンドロゲン低下とサルコペニア発症の機序が未解明である。本研究では睾丸摘出処置を行い、アンドロゲンシグナル遮断による骨格筋萎縮を再現し、Transcriptome解析を実施した。これによりscd1およびsmoxの発現低下を認めた。また、microRNAとしてmir23b-3pの発現上昇を認めた。mir23b-3pの発現上昇はpten抑制を介して筋管細胞の筋タンパク質合成を促進させていることが明らかとなった。上記成果を踏襲し、本年度は、1.去勢後の観察期間を延長し、遺伝子発現の変化及び骨格筋断面積の変化の推移を観察する、2.採取した骨格筋よりmiRNAを抽出し、去勢マウス特異的なmiRNAを検索する、3.テストステロン補充による骨格筋保護効果を検討する予定である。上記成果を踏襲し、本年度は新規に発見したmi R-Xの機能解明を実施、またmi R-X及びアンチセンスを合成し、マウス骨格筋細胞株C2C12に導入し、C2C12の細胞分裂能、アポトーシスを評価する。次いでC2C12を筋管細胞に分化させることで、分化能、分化後の筋管細胞における機能発現にmi Rが与える影響を評価する。また、同定したmi R-Xがヒトのサルコペニアのバイオマーカーとなるか、についても研究代表者が実施しているコホートを用いて評価する。糖尿病学研究計画どおり実験をすすめておりますが、物品費が予算を下回ったため。またその一部を学会旅費に充当しています。平成27年度の残額26,680円を平成28年度の物品費として使用させていただきます。
良性・悪性組織におけるAKTを介した放射線抵抗性のメカニズムの解析

放射線感受性に関するAKTの役割を解析し、その中で放射線照射の主たる殺細胞効果であるフリーラジカルが細胞のシグナルに深く関与していることが判明した。それらの研究成果をPelicanoと分担者である佐々木等は、共同研究の中でミトコンドリアの呼吸機能がAktによって深く制御されており、それが癌の悪性度や抗がん剤の反応に深く関与するという実験結果を得ており、その研究成果がJ Cell Biolに掲載された。出水と申請者である岡本等は、上咽頭癌の放射線化学療法における治療効果をJapanese Journal of Clinical Oncologyに報告した。一連の検討成果の中で第一段階として治療成績に関して報告したが、更に上咽頭癌においても予後不良群が存在することを発見し、それらに関してAKTやNF-KB, p53など放射線感受性を制御する分子について発現の程度を現在更に探求している。江島と申請者である岡本等は、眼窩発生のMALTリンパ腫の放射線療法における治療効果をRadiotherapy and Oncologyに報告した。同様に一連の検討成果の中で第一段階として治療成績に関して報告したが、更に本疾患ではp53,Bcl10などミトコンドリアのアポトーシス制御に深くする分子が放射線治療効果に深く関与する可能性を見出し、NK-KBとの関連も含めて、現在その成果を更に探求している。以上のようにAKTと放射線抵抗性は基礎実験結果と臨床結果より互いに深い結びつきを示していることが今回の検討結果より判明した。研究計画ではA.腫瘍細胞を用いた培養系での放射線抵抗性獲得とAKTの活性化の確認。B.ヌードマウスに植皮した腫瘍組織での放射線抵抗性獲得とAKTの活性化の確認。C.臨床検体を用いたAKTの活性化の評価。術前放射線療法を施行した肺癌/食道癌症例,放射線治療施行後に再発し,救済手術を施行した喉頭癌症例。E.野生型マウスにおける各臓器の放射線感受性とAKT発現レベルの比較。の5つの目標を掲げたが、H17年度は、A及びCの2課題を中心に検討を施行した。悪性腫瘍細胞と臨床検体におけるAKTの役割に関して研究を施行した。臨床検体の中で、頭頚部癌に焦点を絞り、喉頭がんにおける放射線治療症例でのAKTの役割を検討した。その中でも再発例における分子メカニズムの検討を中心に行い、1995-2003年における放射線照射後の再発症例の再発時の腫瘍組織標本と放射線治療前の組織標本を作製し、AKTの発現を比較した。同一患者での比較においてAKTは再発腫瘍において有意に発現が増強しており、放射線抵抗性とAKTの関連が示唆された。一方でH17年度の培養細胞系を用いた研究成果は、5種類の頭頚部癌腫瘍細胞株を用いて、20Gy40Gyの放射線照射を施行することにより、放射線抵抗性を獲得したcloneの樹立を行っている。これらは臨床での放射線治療後の再発形式の良い実験も出るとなると予想される。一連の検討成果の中で第一段階として治療成績に関して報告したが、更に上咽頭癌においても予後不良群が存在することを発見し、それらに関してAKTやNF-KB,p53など放射線感受性を制御する分子について発現の程度を現在更に探求している。

同様に一連の検討成果の中で第一段階として治療成績に関して報告したが、更に本疾患ではp53,Bcl10などミトコンドリアのアポトーシス制御に深くする分子が放射線治療効果に深く関与する可能性を見出し、NK-KBとの関連も含めて、現在その成果を更に探求している。以上のようにAKTと放射線抵抗性は基礎実験結果と臨床結果より互いに深い結びつきを示していることが今回の検討結果より判明した。
新規サイトカイン受容体WSX-1によるTh1誘導機構の解析

寄生虫などの細胞内寄生病原体に対する防御にはTh1型細胞によるインターフェロンγ産生を介した細胞性免疫が重要な役割を果たす。Th1反応の誘導にはIL-12が重要とされている。WSX-1(TCCR1)は、IL-12受容体と相同性を持つサイトカイン受容体で近年IL-27がそのリガンドである可能性が報告された。WSX-1の生体内における役割を解析する目的で遺伝子改変マウスを作成し、WSX-1が、活性化初期のインターフェロンγ産生に重要な役割を果たしていると考えられること、またWSX-1欠損マウスがリーシュマニア(L.major)に易感染性を示し、感染初期のインターフェロンγ産生の低下がみられることなどを報告した。本年度の解析では、WSX-1欠損マウスが、リーシュマニアと同じく細胞内寄生原虫で、その排除にTh1型サイトカインが重要とされるトリパノゾーマ感染に対しても高感受性を示すことを明らかにし、野生型と比較して肝障害がより著しいこと、感染後Th2型にサイトカイン産生がシフトすることなどを見出した。現在、リンパ球サブセットの変化やサイトカイン産生、肝組織像などの詳細な検討を行っている。一方、WSX-1のシグナル伝達経路は不明であったが、WSX-1強発現細胞や、キメラ受容体を用いた解析によりJAK1/STAT1がWSX-1の下流で活性化することを見出した。現在、STAT1の下流で発現し、Th1型細胞群の誘導に関与する遺伝子の解析を行っている。
心機能を支える臓器間連関の解明による新しい心不全治療の開発

本研究では、我々の作製した組織特異的メカノセンサーKOマウスを用いて、心臓におけるメカノセンサー分子の役割と、心臓以外の組織が心機能を支える臓器間連関の分子基盤を解明することを通して、新しい心不全治療ターゲットを確立することを目的とした。この結果、このメカノセンサー分子は、心臓の構造や機能の維持に必須の分子であることが明らかとなった。また、心臓の機能や形は、他の臓器の機械受容能に大きく影響を受けることが明らかとなった。生体内では至るところで、伸展や剪断応力といった物理的な機械刺激(メカニカルストレス)が生じている。細胞の機械受容システムを介して伝達されるこのような刺激は、単に生体にとって不利益なストレスではなく、発生過程や臓器機能発現に不可欠な生体情報であることが次第に明らかになってきた。しかしながら、機械受容システムの分子的基盤は未だ解明されておらず、その生理的意義や病態発症における役割については、全く不明である。この問題の解決には生体内環境を再現・評価する医工学的方法論の開発と、機械受容チャネル分子を標的とした分子細胞生物学的解析ならびに遺伝子改変動物を用いた生理学的解析が必須である。本研究では、これまでに我々が細胞実験レベルで同定したメカノセンサー分子をターゲットとして、各種の組織特異的ノックアウトマウスを作製した。このうち、心臓で特異的にメカノセンサー分子をノックアウトしたマウスの実験から、このメカノセンサーは、心臓が生理機能や正しい構造を保つために必須の分子であることを明らかにした(Katanosaka et al., Nature Communications, 2014)。さらに、現在は、心臓以外の多臓器で特異的にこのメカノセンサー分子をノックアウトした場合の、生理レベルでの表現型変化、または病態発症機構等を解析している。得られた結果は、大変ユニークで意義深いものであり、今後の発展が期待される。現在、これらの結果を論文として纏め、投稿準備をしている段階である。これらの実験結果から得られた知見をもとに、心機能を支える臓器間連関の分子基盤を解明することを通して、新しい心不全治療ターゲットを確立する予定である。我々の体を構成するほぼすべての細胞は、重力、血流・血圧の変動や臓器の動き、細胞分裂で生じる自らの動き等、様々な機械刺激に応答して生体機能へと反映させているが、体の各組織での機械応答機構は未だ不明な点が多い。本研究では、我々の作製した心臓以外の組織特異的メカノセンサーKOマウスを用いて、新しい心不全治療ターゲットを確立することを目的として、心機能を支える臓器間連関の分子基盤を解明する研究をおこなった。その結果、心臓以外の組織でのメカノセンサー機能の有無によって、心臓の形態や機能が大きくかわることが明らかとなってきた。これまで、心形態や心機能は、心筋細胞自身の変容に支えられていると考えられていたために、多臓器における機械受容応答が、心機能に大きな影響を与えるという実験的証拠は、大変インパクトが大きく画期的な治療法の開発も期待ができると言える。心臓でのみメカノセンサー分子の発現を抑制したノックアウトマウスについて、論文が出版されたこと、心臓以外の多臓器でのメカノセンサーノックアウトマウスを作製し、その表現型を解析したこと、さらに得られた成果から、臓器のメカニカル応答が多臓器機能を調節しているという実験事実を得たことから、大変順調に進展している。分子細胞生理本研究で明らかになった心循環システムの各臓器における機械刺激受容機構が、生体の中では、空間・時間を超えてどのように干渉・補完しあうのか、詳細な多階層解析を行い、生体でのメカニカルシグナルを基盤として多臓器連関を明らかにする。動物の繁殖数が予定より少なく、動物飼育に関わる費用が少し減ったため。予定通り、動物飼育に関わる費用として使用する。
蛋白質ナノブロック複合体の合理的超四次構造形成による機能性超分子結晶ナノ材料開発

これまでの科研費基課題では、独自の新奇なヌンチャク型二量体人工蛋白質WA20を応用した蛋白質ナノブロック(Protein Nanobuilding Block: PN-Block)戦略の高度化として、温度変化プログラミングによる蛋白質ナノブロックの逐次的自己組織化によって超分子複合体構造を構築する研究を進めてきた。その成果を基に本課題の国際共同研究では、計算科学的アプローチも取り入れて研究を発展させ、蛋白質ナノブロック自己組織化超分子複合体構造をさらに規則正しく整列させた物質群、つまり合理的に結晶化させた多孔質結晶性の機能性超分子ソフトナノマテリアルを開発することを目的としている。そこで、予定通りに当該年度末の2019年3月31日に渡米し、2019年4月1日からUniversity of Washington, Institute for Protein Design, Baker研究室で、国際共同研究を開始したばかりであるが、計算機や実験の設備、サポートスタッフの充実、また世界から優れた研究者・学生が集っている世界最高レベルの研究環境を活かして、今後の研究の発展が期待される。当初の計画通りに当年度末の2019年3月31日に渡米し、2019年4月1日からUniversity of Washington, Institute for Protein Design, Baker研究室で、国際共同研究を開始したところである。ここでは、高度な計算機や実験の設備、サポートスタッフの充実、また世界から優れた研究者・学生が集っている世界最高レベルの研究環境であり、日本にいるときよりも、自分自身が研究に集中できる状況で順調に研究を進めているところである。本研究では、研究代表者が得意とする蛋白質工学を駆使した実験的アプローチのみならず、海外共同研究者のDavid Baker教授(University of Washington)らが開発したRosetta Design蛋白質デザインソフトウェアやデータマイニングを駆使した計算科学的アプローチを効果的に組み合わせることにより、人工蛋白質超分子複合体の合理的自己組織化・結晶化デザイン戦略により、多孔質結晶性の機能性超分子ソフトナノマテリアルを新たに開発を目指している。そのために、2019年度前半の4月9月には、渡航先のUniversity of WashingtonにおいてBaker研で開発したRosetta分子デザインソフトウェアや計算機クラスターを駆使し、必要に応じて解析プログラムも共同開発しながら約半年間集中的に研究を実施する。その後、2019年9月末に、帰国後、これらの計算によるデザイン結果を基にして、残りの期間(2019年度後半2020年度)に、国内で研究協力者の学生とも連携しながら主に蛋白質工学分野の実験を進める予定である。内定年度:2017これまでの科研費基課題では、独自の新奇なヌンチャク型二量体人工蛋白質WA20を応用した蛋白質ナノブロック(Protein Nanobuilding Block: PN-Block)戦略の高度化として、温度変化プログラミングによる蛋白質ナノブロックの逐次的自己組織化によって超分子複合体構造を構築する研究を進めてきた。
反復配列としてのリボゾームRNA遺伝子の遺伝的不安定性

リボゾームRNA遺伝子は共調的進化をする多重族遺伝子である.その分子的材構は定かではないが,頻回に起こる不等交又または遺伝子変換によると考えられている.そこで本研究はBALB/Cマウスの種々の亜株を用いて,その組み換えの頻度を測定しようとした.同時にBALB/CマウスはリボゾームDNAのスペーサー部のみから構成されているゴースト・リボゾームDNAが存在するが,そのDNAの染色体番号及び組み換え頻度の測定を行った.組み換えを検出する方法として, Vrプローブを用いたサザン・ブロット法を用いた.リボゾームDNAの転写の開始の5′末端側に130塩基を1反復単位とする縦列型反復配列Vrが存在し,しかもそのコピー数が染色体毎に異っている.従ってサザンブロット上のバンドとして2.7Kb, 1.2Kbは染色体12番, 1.7Kbは15番, 1.4Kbは18番染色体というように区別しうる.この時,バンドの濃さをデンシトメーターで測定するとその染色体上でのrDNAのコピー数が分かる.さて,ゴーストrDNAはinsituハイブリダイゼーションの結果から19番染色体上に存在することが分かった.BALB/Cマウスは1920年に純系化され,その後適当な時期にアメリカ各地の研究所で別個に兄妹交配され維持されている.約100代から400代の世代の差がある.この間にリボゾームDNA中で何回ぐらい組み換えが起っているかを測定した. Vrで測定した各染色体上でのコピー数の差は大きく,世代数の差のおおきいものも,小さいものもほとんどその差は見られず,組み換え頻度の高いことを示唆していた.一方,ゴーストでは各亜株でコピー数の差に変化がなく,組み換えを起していない.これはrDNAの転写の活性が高いことと,組み換え頻度の高さとが関係していることを示唆しており,酵母でいわれていることと一致する.リボゾームRNA遺伝子は共調的進化をする多重族遺伝子である.その分子的材構は定かではないが,頻回に起こる不等交又または遺伝子変換によると考えられている.そこで本研究はBALB/Cマウスの種々の亜株を用いて,その組み換えの頻度を測定しようとした.同時にBALB/CマウスはリボゾームDNAのスペーサー部のみから構成されているゴースト・リボゾームDNAが存在するが,そのDNAの染色体番号及び組み換え頻度の測定を行った.組み換えを検出する方法として, Vrプローブを用いたサザン・ブロット法を用いた.リボゾームDNAの転写の開始の5′末端側に130塩基を1反復単位とする縦列型反復配列Vrが存在し,しかもそのコピー数が染色体毎に異っている.従ってサザンブロット上のバンドとして2.7Kb, 1.2Kbは染色体12番, 1.7Kbは15番, 1.4Kbは18番染色体というように区別しうる.この時,バンドの濃さをデンシトメーターで測定するとその染色体上でのrDNAのコピー数が分かる.さて,ゴーストrDNAはinsituハイブリダイゼーションの結果から19番染色体上に存在することが分かった.BALB/Cマウスは1920年に純系化され,その後適当な時期にアメリカ各地の研究所で別個に兄妹交配され維持されている.約100代から400代の世代の差がある.この間にリボゾームDNA中で何回ぐらい組み換えが起っているかを測定した. Vrで測定した各染色体上でのコピー数の差は大きく,世代数の差のおおきいものも,小さいものもほとんどその差は見られず,組み換え頻度の高いことを示唆していた.一方,ゴーストでは各亜株でコピー数の差に変化がなく,組み換えを起していない.これはrDNAの転写の活性が高いことと,組み換え頻度の高さとが関係していることを示唆しており,酵母でいわれていることと一致する.
SecMの翻訳アレスト配列:分子機構と生物学的意義

大腸菌におけるタンパク質分泌モニターSecMは、自身、分泌タンパク質であり、細胞のタンパク質分泌活性を自身の分泌状態としてモニターし、同一オペロン下流にコードされる膜透過駆動因子SecAの発現を制御している。私は、これまでに、SecMの翻訳は、C末端領域に存在する特異なアミノ酸配列がリボソームのトンネル内壁と相互作用することで、一旦停止(アレスト)することを示した。このアレストは、SecMの分泌が妨げられると安定に持続する。停止したリボソームにより、secM-secA mRNAの二次構造に変化が生じて、secAの翻訳開始頻度が制御される。本年度は、この発現制御機構の生理学的重要性について研究した。SecMの翻訳アレスト欠損変異は、SecAの発現量を低下させ、激しい分泌欠損を引き起こして致死となることを示した。さらに、アレストに部分的な欠損を持つ株では、分泌欠損条件下でもSecAが十分に発現誘導されず、分泌及び生育にさらなる支障を来すことを示し、SecMによるSecAの発現上昇が、実際に分泌欠損状態の緩和に重要であることを示した(研究発表欄、一報目)。一方、上記アレスト欠損株におけるタンパク質の分泌異常は、SecAのみをプラスミドから補っても回復しきれないことを発見した。この欠損は上流にsecMを持つsecAプラスミドを用いると完全に補える。すなわち、SecMには、SecAの量の調節だけでなく、その機能補助の働きもあると考えられた。このような働きには、secMがsecAと同一mRNA上にあることが必要であることを示し、SecMはSecAに対するcis-chaperonとして機能することを提唱した。さらに、cis-chaperonとして働くためには、SecMのアレスト配列およびシグナル配列が重要であることを示した。これらの結果から、SecMは、翻訳アレストを起こし合成途上で膜透過装置にターゲティングされることで、secM-secA mRNAをSecAの働く場所である膜表面に運び、そこでSecAを合成させることでその機能発現を助けている、というモデルを提唱した(研究発表欄、二報目)。一方、基礎生物学研究所において、大隅良典教授指導のもと、酵母におけるオートファジー(自食作用)の分子メカニズムの解明を目指して研究を開始した。ホスファチジルエタノールアミン(PE)という脂質分子と結合するAtg8という自食作用に必須のユビキチン様タンパク質の機能解析を、相互作用分子の探索、および、PEと結合したAtg8が試験管内で引き起こす人工膜小胞凝集作用の分子機構とオートファジーにおける重要性の解明という観点から進めており、興味深い結果を得つつある。(目的)これまでの研究から、大腸菌のタンパク質分泌モニターSecMは、その終止コドンよりやや上流で自身の翻訳伸長を停止(アレスト)させる能力を持つことが明らかとなった。SecMはN末端にシグナル配列を持つ分泌タンパク質であるが、SecMにおける翻訳アレストは、合成途上にあるSecM分子のN末端領域がタンパク質分泌装置により「引っ張られる」と解除される。SecMは、このようにして、細胞のタンパク質分泌活性に応じて自身の翻訳アレスト状態を変化させ、同一オペロン内下流にあるタンパク質分泌駆動因子SecAの翻訳を制御している。本年度は、このSecMにおける翻訳アレストの分子機構の解明を目指した。(成果)系統的かつ徹底した変異解析から、SecMの翻訳は、C末端から5残基上流の166番目のProで停止すること、また、この翻訳アレストには、Pro166を含むC末端領域に存在するアミノ酸配列(アレスト配列)"FXXXXWIXXXXGIRAGP"が必要充分であることを示した。さらに、アレスト配列を翻訳しても伸長を続けられるリボソームの変異体を複数分離し、その変異部位を同定し、立体構造上に位置付けた結果、変異は全て、リボソームのトンネルの狭窄部位(ゲート様構造)内壁を取り囲むように集中することが明らかとなった。以上の結果から、SecMの翻訳アレストには、アレスト配列とリボソームのトンネルのゲート様構造との相互作用が重要であることが明らかとなった。これらの発見は、リボソームのトンネルが単なる翻訳産物のための通路ではなく、翻訳産物と相互作用し、そのアミノ酸配列を識別しうること、そのような機能が遺伝情報の発現制御に関わることを世界で初めて実験的に示すものとなった。(目的)大腸菌分泌タンパク質SecMは、タンパク質膜透過装置の活性を自身の分泌としてモニターし、それに応じて同一オペロン下流にあるタンパク質膜透過駆動因子SecAの発現を制御している。これまでの研究により、SecMは、そのC末端領域に存在するアミノ酸配列「FXXXXWIXXXXGIRAGP(アレスト配列)」で、合成途上にリボソームのトンネルの内壁と相互作用することにより、自身の翻訳伸長を停止させることを示した。この翻訳伸長停止(アレスト)は、リボソーム外部に露出したSecMのN末端領域が、細胞膜のタンパク質膜透過装置により「引っ張られる」と解除される。このように、SecMの翻訳アレストは、タンパク質膜透過装置の活性に応じて持続性が変化する。停止したリボソームにより、secM-secA mRNAの遺伝子間領域の二次構造が変化し、SD配列が露出して、SecAの発現が上昇する。本年度は、以上のような翻訳アレストの分子機構と、それによるSecAの発現量制御に加え、SecAの機能発現に対するSecMの役割について研究した。(成果)プラスミドからsecM、secA両遺伝子を補いつつ、染色体上のsecM-secA遺伝子を欠失させた株を作成し、調べることにより、上流にsecMを伴わずにSecAを発現している細胞では、タンパク質の分泌活性が低いことを見いだした。

secAとは別のプラスミドからsecMを補っても、この欠損を回復させることはできない。さらに、プラスミドからの発現をシャットオフして培養を続け、細胞内のSecAの存在量を低下させていきながらタンパク質分泌活性を測定したところ、上流にsecMが存在する場合でも、翻訳アレスト配列やシグナル配列に変異を持つような場合では、野生型secM-secAプラスミドからSecAを発現させた場合よりも、正常な分泌活性を示すためにより多くのSecAを必要とすることが明らかとなった。これらの結果から、SecAが効率よく機能するためには、上流のSecMが翻訳アレストを起こし、膜透過装置にターゲティングされることが必要であることが示唆された。SecMが合成途上に膜透過装置にターゲティングされることは、secM-secA mRNAが膜近傍まで運ばれることにつながり、それによって新規に合成されたSecAがリン脂質やSecYEG膜透過チャネルと速やかに相互作用できるため、このような機能促進が起こるものと考えている。実際、新規に合成されたSecAとSecYとの架橋産物が、シグナル配列欠失型secM-secAにおいて、野生型に比べて低下するという結果も得た。また、蛍光in situハイブリダイゼーション法により、secM-secA mRNAの細胞内局在について調べた結果、螺旋状の染色パターンも得られている。大腸菌におけるタンパク質分泌モニターSecMは、自身、分泌タンパク質であり、細胞のタンパク質分泌活性を自身の分泌状態としてモニターし、同一オペロン下流にコードされる膜透過駆動因子SecAの発現を制御している。私は、これまでに、SecMの翻訳は、C末端領域に存在する特異なアミノ酸配列がリボソームのトンネル内壁と相互作用することで、一旦停止(アレスト)することを示した。このアレストは、SecMの分泌が妨げられると安定に持続する。停止したリボソームにより、secM-secA mRNAの二次構造に変化が生じて、secAの翻訳開始頻度が制御される。本年度は、この発現制御機構の生理学的重要性について研究した。SecMの翻訳アレスト欠損変異は、SecAの発現量を低下させ、激しい分泌欠損を引き起こして致死となることを示した。さらに、アレストに部分的な欠損を持つ株では、分泌欠損条件下でもSecAが十分に発現誘導されず、分泌及び生育にさらなる支障を来すことを示し、SecMによるSecAの発現上昇が、実際に分泌欠損状態の緩和に重要であることを示した(研究発表欄、一報目)。一方、上記アレスト欠損株におけるタンパク質の分泌異常は、SecAのみをプラスミドから補っても回復しきれないことを発見した。この欠損は上流にsecMを持つsecAプラスミドを用いると完全に補える。すなわち、SecMには、SecAの量の調節だけでなく、その機能補助の働きもあると考えられた。
水溶媒中での新規ラジカル反応の開発

無水塩化インジウムに対して-78°Cでジイソブチルアルミニウムヒドリドを作用させ、クロロインジウムヒドリドを調製した。ここに1-ドデシンとラジカル開始剤として触媒量のトリエチルボランを加え反応させたところ、1-ドデセンが定量的に得られた。ラジカル捕捉剤共存下では収率が大きく低下したことから本反応はラジカル機構により進行していると考えられる。こうして得られたアルケニルインジウムはヨウ素で捕捉することによりZ体のヨードアルケンへと効率良く変換できた。この反応はケトンや水酸基、カルボキシル基など広範な官能基を有するアルキンに対して適用が可能である。また1,3-ジメチル-2-イミダゾリジノン共存下パラジウム触媒によるヨードベンゼンとの交差カップリング反応にも適用可能であり、対応するZ体のβ-アルキル置換スチレン誘導体を高収率で与えることも明らかとなった。また同様の反応が塩化インジウムの代わりに塩化ガリウムを用いても進行することが明らかとなった。重水素化化合物は、核磁気共鳴スペクトル測定や中性子散乱スペクトル測定における重要な溶媒である。そのため重水素化化合物の効率の良い合成法が求められている。この方法として重水の250°C50気圧という水熱条件下で遷移金属触媒を有機化合物に作用させることによりH-D交換反応が進行することを見いだした。重水20mL、シクロドデカン5mmol、5%パラジウム炭素0.1gを水熱条件下においたところ、6時間でほぼ完全に重水素化されたシクロドデカンが84%の収率で得られた。このほかに環状アルケン、鎖状アルカン、環状並びに鎖状ケトンや芳香族化合物についても重水素化反応が行えることが明らかとなった。1.亜リン酸を用いたラジカル反応と簡便なラジカル的重水素化反応の開発・・・o-ヨードフェノールのクロチルエーテルのエタノール溶液に次亜リン酸水溶液と炭酸水素ナトリウムならびにラジカル開始剤としてAIBNを加える。これを5時間加熱還流するとヨウ素の還元が高収率で進行することを見いだした。この反応を用いると、毒性の高い有機スズ系の還元剤を用いることなく、有機ハロゲン化合物の還元を効率よく行うことができることを明らかにした。一方ホスフィン酸ナトリウム一水和物を重水に溶かし、ここへ重塩酸を加え溶液を酸性にし3時間撹拌する。炭酸カリウムを加えて塩基性とした後、基質としてヨード安息香酸を加える。さらに開始剤としてラジカル開始剤を加え加熱すると、重水素化体が得られることが明らかとなった。高価な金属重水素化物を用いることなく安価な重水を用いて含重水素有機化合物を合成する方法を開発することができた。2.水中でのヨード酢酸アリルのラジカル環化反応に対する理論計算・・・有機溶媒中では困難なヨード酢酸アリルのラジカル環化が水を溶媒とすると効率よく進行する。この溶媒効果について詳しく考察するためab initio法による理論計算を行った。計算はGaussian98プログラムを用い、基底関数にはB3LYP/6-31G^*を用いた。溶媒効果についてはSCRF/CPCM法を適用した。真空中での(アリロキシカルボニル)メチルラジカルの環化について計算したところ5-exo閉環は不利となった。次に、水中での反応経路について考察したところ環化の活性化エネルギーが低くなることが明かとなった。また他の溶媒とくらべて水は強固な水素結合に由来する異常に大きな凝集エネルギー密度を有し、水の中に溶け込んだ分子の体積を小さくしようとする効果が極めて大きい。そこで(アリロキシカルボニル)メチルラジカルの環化における、水中での分子体積の計算を行った。その結果、閉環の際には大きな体積減少が見られた。

よって水の静電的な効果だけでなく水溶媒が分子体積を小さくしようとする効果も環化過程を加速していることが明らかとなった。1.オクテンと5当量のブロモ酢酸エチルの水懸濁液にラジカル開始剤として0.5当量のトリエチルボランを作用させる。系中に10mLの空気を30分おきに導入しながら室温で1.5時間攪拌する。濃縮の後、カラム精製を行うと対応する付加体が74%の収率で得られた。この反応はベンゼンや塩化メチレンなどの極性の低い有機溶媒中ではほとんど進行しない。メタノールやエタノールのようなプロトン性溶媒中では中程度の収率で付加体が得られた。またDMSO、DMFなどの非プロトン性極性溶媒や2,2,2-トリフルオロエタノールを用いたところ水を溶媒としたときと同様に収率よく付加体が生成した。この反応の溶媒効果についてab initio法による理論計算を用いて検討し、水分子と基質の水素結合が重要であることを明らかにした。2.パラジウム触媒を用いるアルキンやジエンのヒドロゲルミル化反応において、添加剤を一切加えずに水中での不均一系で反応を行うと反応が著しく加速されることを見いだした。しかも、反応は無溶媒系での反応よりも速い。さらに、水中で反応を行うことにより、パラジウム触媒を有機溶媒中の反応と比較して1000分の1以下にまで減らすことが可能である。この量の触媒では有機溶媒中や無溶媒条件下では反応は全く進行しない。面白いことに、均一化のため界面活性剤を添加したり、パラジウムの配位子として水溶性の配位子を用いたりすると、反応系は乳化して均一となるものの、反応速度は却って低下する。水中の不均一な反応場で反応を行ったほうが均一化するよりもずっと良い場合があることがことが明かとなった。1.パラジウム触媒を用いるヨウ化ペルフルオロアルキルのオレフィンへのラジカル付加反応において、水を溶媒として用いると収率よく反応が進行することを見いだした。ベンゼンなどの有機溶媒を用いた場合には加熱することが効率良く反応を行うためには必須であるが、水中では室温で反応が進行することが明かとなった。さらにアルキン類への付加反応では生成したヨウ化アルケニルをそのまま単離することなく、クロスカップリング反応によりエンインへと収率よく変換できることを明らかにした。この方法により、パラジウム触媒をもちいてフッ素化されたエンインを収率よくかつ短工程で合成することに成功した。2.ラジカル反応では、水素化トリブチルスズやアリルトリブチルスズなどの有機スズ化合物が広く用いられてきた。しかし、スズ化合物には強い毒性や後処理の困難さといった問題がありスズ化合物に代わる反応剤の開発が強く求められている。そこで、スズ化合物に代わりうる優れた反応剤を開発することを目的にこれまで余り注目されていなかった有機ガリウム化合物に焦点を当て、ラジカル反応について検討を行った。塩化ガリウムにアリルグリニャール反応剤やホモアリルグリニャール反応剤を加えて有機ガリウム反応剤を調製する。ここに、ヨード酢酸ベンジルとラジカル開始剤としてトリエチルボランを加え撹拌すると、対応する付加体が収率良く得られることを見出した。
ヒト胚細胞性腫瘍の分化関連糖鎖抗原の免疫学的並びに生化学的研究と臨床診断への応用

われわれは、卵巣悪性胚細胞性腫瘍の患者血清中に、マウスF9細胞に対する抗体を発見し、その抗原決定基が分化に伴ない減少するEmbryoglycanに存在する事実を報告して来た。本研究において、この坑原決定基のより詳細な解析を進めた。(1)Sephacryl S300を用いたゲル濾過により、Embryoglycan(平均分子量約25万)中の分子量の大きい分画(7万以上)にその決定基が最も多く存在した。(2)この7万以上の分画には、Embryoglycan上に存在し、分化に伴ない変化するマーカーであるFBP,DBA,PNA,GS-1のレクチン結合基が見い出された。(3)F9細胞の培養上澄中にも、患者抗体が反応するEmbryoglycanが検出された。(4)正常ヒト血清中にある、α-galacToseを末端にもつ糖鎖に対する抗体(抗ウサギ赤血球抗体,抗B血液型抗体,抗【P_1】血液型抗体)とは異なることを、血球凝集反応,B型三糖による吸収実験により確認した。(5)Ehrlich腹水癌細胞上のα-galac Tose糖鎖がこの患者抗体とEmbryoglycanの反応を強く阻害する事実より、α-D-Galp-(1-3)-〔α-D-Galp-(1-6)〕-β-D-Galp-糖鎖と同一または極めて類似した糖鎖が抗原構造を担っていると判明した。この研究と平行して、ヒト胚細胞性腫瘍の培養細胞株の細胞生物学的特性、インターフェロン感受性、ヌードマウス移植による分化能の検討を行なった。
Real-time, Best-effort Query Processing of Semantic Web data

分散RDF問合せ処理のリアルタイム検索において、固定時間制約の下でユーザ評価尺度が最適になるような解を求める新しい技術を開発した。RDFデータを含む文書を横断して固定時間間隔内において検索する上で、鮮度、多様性、または被覆率の3つの評価尺度を使うことが出来る。また、既存のリンクトオープンデータ知識ベースに対する構造化データの自動リンクのための技術を開発した。この技術では、SPARQLエンドポイントの挙動を予測する問題に対して、機械学習を適用することで、対象のエンドポイントに関するメタデータや統計情報などの事前情報を持つことなく、分散問合せ処理プランの最適化を支援することが出来る。
異業種間競争による新産業創出過程の基盤的研究

近年、わが国の景気の低迷もあり、各企業は、これら新規産業への進出を目指した新規事業展開をどのように行っていくかが、経営の最重要課題となっている。しかしながら、企業の新規事業戦略を考える上で基礎となる「新規産業の創出過程」については、ほとんど明らかになっていない。そこで、本研究では、「新産業の創出過程」に焦点をあてた分析を計画している。近年のイノベーション・プロセスは、古典的な線形プロセス(Linear Process)として議論することはできない程に多面性を持っており、非線形なプロセス(None-linear Process)として捉えることが必要である。この多面性を捉えるために、新産業の創出過程を異業種間競争という視点から分析し、従来の新産業分析に欠落していた要素を整理し、再統合することにより新たなイノベーションプロセスを提示することを目的とする。研究成果としては、二年度にわたる研究によって、多くの産業において、多角化が行われており、異業種間競争が進展していることが定量的に示された。また、特に新規産業とされている環境産業あるいはファインセラミックス産業においては、近年、異業種間の競争が進展していることが定量的に明らかになった。さらに、事例分析によって、多くの技術革新が異業種間競争というプロセスによって実現されていることを示した。すなわち、本研究の成果によって、異業種間競争という非線形的なプロセスによって、新産業を創出するような飛躍的な技術革新が起きていることを明示することができた。近年、わが国の企業にとって、新規事業展開が経営上の重要課題になっている。そこで、本研究では、「新産業の創出過程」を分析することを目的としている。近年のイノベーション・プロセスは、古典的な線形プロセス(Linear Process)として論議することはできない程に多面性を持っており、非線形プロセス(None-linear Process)として捉えることが必要である。この多面性を捉えるために、新産業の創出過程を異業種間競争という視点から分析し、従来の新産業分析に欠落していた要素を整理し、再統合することにより新たなイノベーションプロセスを提示する。本年度の主要な成果として、代表的な新規産業の一つであるファインセラミックス産業の分析がある。まず、事例分析によって、ファインセラミックス製品について、異業種間競争が著しいことを例示した。そして、これを異業種間競争度という指標により、定量的に確認した。ファインセラミックス原料及び部材の生産高のデータを業種別に集計して、分析データとして用いた。異業種間競争度はエントロピー値により測定した。分析の結果によれば、既存の産業分野よりも、ファインセラミックス部材及びファインセラミックス原料のエントロピー値が高いことが実証された。特に、ファインセラミックス部材については、バブル崩壊により、ファインセラミックスの売上高は一時的に減退したが、エントロピー値は上昇している。このことは、多くの産業でファインセラミックスに対する期待が大きく、様々な業種からの新規参入が盛んに行われていることを示すものである。以上の分析結果は、セラミックスデータブック99において、発表されている。
超高圧下におけるケイ酸塩ガラスの密度と構造のその場測定

放射光X線を利用した超高圧実験の技術開発を行うことで、地球マントル深部に相当する100万気圧領域まで、SiO_2ガラスの密度と構造の圧力変化を明らかにした。得られた知見は、コア・マントル境界領域に滞留する重いマグマの仮説には否定的なものであった。また、SiO_2ガラスの中距離ネットワーク構造の空隙にヘリウムが大量に溶解することや、非静水圧条件下における塑性変形によりSiO_2ガラスの構造に大きな異方性が残留することなどの興味深い現象が発見された。本研究は、超高圧実験技術の高度化により、SiO_2ガラスを初めとするケイ酸塩ガラスの密度と構造の圧力変化を100GPa領域まで詳細に測定し、その振る舞いを明らかにすることを目的としている。ケイ酸塩ガラスは、地球科学や材料科学における極めて重要な物質であり、その超高圧下における振る舞いについては、実験的にも理論的にも多種多様な研究が行われてきた。しかし、本研究で実現を目指している「放射光X線を用いてケイ酸塩ガラスの密度と構造の圧力変化をその場測定する」という直接的な試みは、実験技術的な困難から、比較的低い圧力領域に限られ、超高圧条件下において測定に成功したという報告は皆無である。本研究は、これを成功させ、超高圧領域におけるガラスの研究のブレークスルーを目指すものである。4年計画の初年度にあたる平成20年度は、ケイ酸塩ガラスの密度と構造を超高圧条件下で測定するための新しい実験技術の開発に重点的に取り組んだ。放射光とダイヤモンドアンビル装置の組み合わせを用い、X線吸収法とX線回折法により、密度と構造をその場測定するための技術を確立し、それを本研究で最も重要な物質と位置づけているSiO2ガラスに適用して、50万気圧領域までの測定を実施した。実験は、高エネルギー加速器研究機構・放射光科学研究施設のBL-18CおよびBL-14C2の各ステーションにおいて、放射光共同利用実験として実施された。実験の結果、SiO2ガラス中のSiの配位数が、20万気圧から40万気圧の圧力領域で、4から6に増加することが明らかになった。また、40万気圧以上の圧力領域で6配位の非晶質相として振る舞うことが明らかになった。当該年度中に、密度測定のための実験技術の詳細とSiO2ガラスの50万気圧領域までの振る舞いについて、論文にまとめて公表した。一方、構造測定については、速報的な報告を行うには十分であったものの、実験データの解析方法に関して、更なる検討を要する点が残ったため、論文にまとめることは見合わせ、次年度に十分な時間をかけて検討することとした。また、SiO2ガラスの4配位から6配位への変化の詳細を解明するため、当初計画を変更し、アニール実験を実施することとし、タイムスケジュール的な制約から繰越申請を行った。4年計画の2年目にあたる平成21年度は、超高圧条件下における非晶質物質の構造を正確に求めるためのX線回折データの解析方法を確立し、データの測定に関する実験方法と合わせて論文にまとめ公表した。また、前年度に得られたSiO2ガラスの密度と構造の圧力変化に関する知見やその他の超高圧実験からの知見をもとに、地球深部でのマグマ(ケイ酸塩メルト)の浮沈に関する考察を行い、マグマが負の浮力を持つためには、これまでの推定に比べ、FeO成分に富むかSiO2成分に乏しくなければならないとの結論が導かれた。平成21年度からの新しい取り組みとして、SiO2ガラスの4配位から6配位への変化の詳細を解明するため、CO2レーザーを導入して、アニール実験の準備を進めた。また、SiO2ガラスの降伏強度の圧力依存性に関する放射光実験を開始した。結晶の降伏強度の測定については、放射光X線を用いた先行研究が比較的多く報告されているが、ガラスについての研究としては初めてのものである可能性が高い。1980年代に実施された唯一の先行研究(別手法)とは異なる興味深い結果が測定され始めており、今後、相違の原因を検討し、真実を解明したいと考えている。ガラスの降伏強度はメルトの粘性と密接な関係があると考えられるため、得られた結果をもとに、地球深部でのマグマの粘性についての考察を行うことで、浮力についての考察の結果と合わせて、地球マントル深部のダイナミクスの理解に役立てたい。4年計画の3年目にあたる平成22年度は、1-2年目に実施した100GPa領域までのSiO2ガラスの密度と構造に関する測定結果を論文としてまとめて公表するとともに、それらの測定結果に基づく地球マントル深部におけるマグマ(ケイ酸塩メルト)の浮沈に関する考察を論文としてまとめて公表した。これらの研究成果は、高い評価を受け、4件の招待講演と2件の依頼原稿執筆などが年度内に行われた。また、当初、非晶質物質の降伏強度測定に関する実験データの解析方法を確立して、測定の完了しているSiO2ガラスの降伏強度の圧力依存性についての研究成果を論文としてまとめることを計画していた。

ところが、それを進める過程で、SiO2ガラスにヘリウム分子が大量溶解するという思いがけない発見があったため、当初計画を変更して、その発見を論文としてまとめることを最優先に研究を進めた。ダイヤモンドアンビル装置を用いて、光学顕微鏡観察、ラマン散乱測定、放射光X線回折測定を実施することで、10万気圧程度まで加圧しても、構造中の空隙にヘリウムが入り込むためにSiO2ガラスの体積がほとんど減少しないことや、その時のヘリウムの溶解量がSiO2ガラス1モルに対して12モル程度であることなどが明らかになった。ヘリウムは、地球進化過程のトレーサーとしても活用されており、今回の発見は地球化学的にも重要である。現在、すでに論文としてまとめられ、学術雑誌に投稿中である。4年計画の最終年度にあたる平成23年度は、前年度までに得られたSiO2ガラスに関する研究成果を発展させる形での研究を行った。前年度に、高圧下においてSiO2ガラス中の空隙にヘリウムが大量溶解することを発見したことを受けて、ガラスに近い構造を持つとされるクリストバライト(SiO2の結晶相)に対する実験を行い、この結晶相にもヘリウムが大量溶解することで新しい構造への相転移が起こることを見出した(学術雑誌に投稿中)。また、平成2122年度に実施したSiO2を一軸加圧した際の偏差歪の測定について、解析方法と解析結果についての検討を進めることで、4配位から6配位への構造変化に伴う急激な降伏強度の低下は起こらないこと、空隙の変形が極めて大きいこと、さらに、それが巨大残留異方性として減圧後の試料に残ることなどを明らかにした(学術雑誌への投稿準備中)。また、永久高密度化させたSiO2ガラスについての実験を行い、高密度化ガラスが弾性的に振る舞うこと、その圧縮は通常のガラスと同様に空隙の収縮によって支配されることを明らかにし、状態方程式の決定を行った。高密度化ガラスに関する研究の成果は、すでに論文として公表されている。これを受けて、上部マントル深部におけるケイ酸塩メルトの状態方程式についての考察を行い、中距離構造(ネットワーク構造)が高密度化した状態にあると仮定して求めた状態方程式が、これまでに報告されている橄欖岩質や玄武岩質などのマグマの高温高圧下における全ての密度データを極めて良く説明することを明らかにした(学術雑誌への投稿準備中)。
老化に伴う造血幹細胞のリンパ球産生機能低下を制御する方法の開発

これまでの研究で我々は、造血幹細胞がリンパ球を生み出す初期過程において、核クロマチン構造調節蛋白Special AT-rich sequence binding protein 1 (SATB1)が重要な役割を果たしていること、SATB1の発現量の低下が造血幹細胞の老化に関与していることを見出している。これらの知見を基盤として研究を展開し、独自に作製した遺伝子改変マウス(SATB1レポーターマウス)を用いて解析を行った。SATB1レポーターマウスは、SATB1の片アリルに蛍光色素tomato遺伝子を導入して作製し、生体内のSATB1の発現を正確にモニタリングできることを確認した。このマウスにおいて造血幹細胞分画をSATB1の発現量に基づいて細分化し、単細胞レベルでの移植実験を行った結果、SATB1を高く発現する造血幹細胞の方が、リンパ球系細胞の産生能力のみならず長期造血再構築能力も高いことが分かった。その一方、SATB1陽性・陰性どちらの造血幹細胞も、二次移植後のレシピエントの造血を同等に回復させることができ、SATB1の発現レベルに関して不均一な造血幹細胞集団を再構築した。このことから、SATB1は造血幹細胞の自己複製能力とリンパ球への分化能力の両方に重要であるが、その発現量は造血幹細胞の状態によって変容することが示された。次にこのマウスを1年以上飼育し、加齢とともにSATB1-tomatoの発現がどのように変化していくかを、他の細胞表面抗原の発現量とともに、FACSを用いて評価した。現在生後1年半までのマウスのデーターを集積中である。本年度の計画として、SATB1の発現を生理的条件下でモニタリングできるマウスを作製し、個体の老化とともに造血幹細胞においてSATB1の発現がどのように変化していくかを評価できる実験系の確立を目指した。この計画において、成獣マウス骨髄の造血幹細胞分画をSATB1の発現量に基づいて細分化し、in vitroでの機能解析のみならず、単一の造血幹細胞を致死量の放射線照射を行ったマウスに移植し、長期的な造血・免疫系の再構築を評価する実験も行うことができた。以上の状況から、本研究はおおむね当初の計画通りに研究が進んでいると考える。今後の研究では、SATB1レポーターマウスを用いて、加齢に伴う造血幹細胞の機能的変化を解析するとともに、SATB1の生理的な機能をより詳細に解析するため、近年報告された生体内での目標蛋白質のビオチン化方法を応用して、SATB1蛋白のN末端にビオチン化領域とFlagタグ領域を付加したノックインマウスを用いた検討を計画している。このマウスでは、ある特定のペプチド配列を選択的にビオチン化する大腸菌由来ビオチン化酵素BirAを過剰発現するマウスとの交配によって、研究対象のSATB1蛋白質が生体内において特異的にビオチン化される。作製したビオチン化SATB1マウスから造血幹細胞を分離し、ストレプトアビジンビーズを用い、造血幹細胞の核内においてSATB1と結合している蛋白を同定する。このモデルでは、抗SATB1抗体を用いた手法では極めて困難な高濃度SDSでの洗浄が可能となるため、夾雑物が少なく信頼性の高いchip-sequence assayを行える。さらにアビジンとビオチンの結合と抗Flag抗体による沈降を応用して、造血幹細胞やリンパ球前駆細胞の核内でSATB1と相補的に機能している蛋白が解析可能である。SATB1の標的遺伝子および共役蛋白が、造血幹細胞からリンパ球系への初期分化に伴ってどのように変化していくかを解析し、さらに若年マウスと老年マウスから得られるデーターの比較を行って、SATB1の加齢に伴う機能変化を明らかにする。