hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ポプラ培養細胞の再分化に関わる特異的蛋白質とその遺伝子の解析

本研究は、ポプラ培養細胞(以下カルスという)再分化過程での蛋白質、遺伝子の変化を調べ、再分化制御機構を分子レベルで明らかにし、再分化の早期検定を目的とした。本年度を最終年度とする2年にわたる研究期間で得られた研究成果はつぎの通りである。1.本研究申請時に抗体を得ていたR-プロテインI(分子量40000、等電点8.5)は、ポプラカルスの分化、器官形成過程で消失する高マンノ-ス型糖鎖を有する可溶性糖蛋白質であった。したがって、その抗体は多くの他の糖蛋白質も認識し、この蛋白質をコ-ドする遺伝子の同定は困難であり、分化検定の分子指標としては不適当であった。2.ポプラのカルス状態で合成されている分子量31000、等電点8.0の可溶性蛋白質は、苗条原基へと分化すると合成しなくなる蛋白質であり、この蛋白質は、分子指標として、ポプラカルスの器官形成開始を検定しうることが判明した。3.ポプラカルスが苗条原基へと分化し始めると蓄積し、かつ盛んに合成される分子量33000、等電点6.9の可溶性蛋白質は、原基よりさらに分化の進んだ芽や葉などには存在せず、また、他の雑種ポプラの苗条原基にも存在し、カルスへの脱分化過程で消失した。さらに、この蛋白質はユ-カリの苗条原基、原基誘導過程のヒノキアスナロ苗条先端部には存在しなかった。したがって、この蛋白質はポプラ苗条原基に特異的であり、ポプラカルスの原基形成の早期検定に分子指標として用いられることが明らかとなった。4.2および3でのべた蛋白質をコ-ドする遺伝子は、種々の試みにかかわらず、同定はいちじるしく困難であり、こんごの問題として残された。本研究はポプラ培養細胞再分化過程における蛋白質、DNAの変化を調べ、再分化制御機構を分子レベルで明らかにするとともに再分化効率の早期検定を目的として、昭和64年度で完了する。昭和63年度で得られた成果はつぎの通りである。1.ポプラ培養細胞より不定芽分化を生ぜしめる処理により変化する蛋白質は、再分化処理におけるオーキシン濃度に反応し早い時期(1週間以内)に変化するものと、不定芽発生に関連して処理後23週間目に変化するものに分けられた。前者に属する蛋白質は7種(すでに抗体を得ていたRープロテインIを含む)、後者に属する蛋白質は3種であることが確認された。2.再分化過程で変化する特異的蛋白質の動的変化を明らかにするため、^<35>Sーメチオニンを培養細胞に、再分化処理後14週間に渡り、毎週パルス的に与えたところ、RープロテインIと分子量的に同一のポリペプチドが特異的に変化することを確認した。3.RープロテインIの抗体は多くの糖蛋白質を認識し、非特異的であったので、糖蛋白質のアフィニティカラムでRープロテインIに特異的に反応する抗体を精製し、再分化過程ポプラカルスより単離したpoly A^+ RNAよりのin vitro翻訳産物を同定したが、数種のRープロテインI抗体反応産物が存在した。4.RープロテインIの抗体を用いる方法ではこの蛋白質をコードする遺伝子の同定が困難であったので、RープロテインIのアミノ酸部分配列をマイクロシークエンサー法で決定した。現在その配列に基く合成プローブによるこの蛋白質をコードする遺伝子の同定を試みている。5.不定芽発生直前に変化する蛋白質の抗体を作製し、RープロテインIと同様の方法でそれらをコードする遺伝子の同定を行っている。

本研究はポプラ培養細胞(以下カルスという)再分化過程における蛋白質、遺伝子の変化を調べ、再分化制御機構を分子レベルで明らかにするとともに再分化の早期検定を目的として平成元年度で終了した。本年度で得られた成果はつぎの通りである。ポプラカルスに存在する分子量31000、等電点8.0の可溶性蛋白質は、カルスとして分裂、増殖している時に合成され、苗条原基状態へと分化すると合成を止める蛋白質であることが確認された。したがって、この蛋白質を分子指標として、ポプラカルスの器官形成開始を検定しうることが判明した。一方、ポプラカルスが苗条原基状態へと分化するとカルスに蓄積し、かつ盛んに合成される分子量33000、等電点6.9の可溶性蛋白質は、原基状態よりさらに分化の進んだ器官(芽、葉柄、葉)には存在せず、また、他の雑種ポプラの苗条原基には存在し、この原基のカルスへの脱分化過程で消失した。さらに、この蛋白質はユ-カリ苗条原基、原基誘導過程のヒノキアスナロ苗条先端部には存在しなかった。これらのことより、この蛋白質はポプラ苗条原基に特異的に存在する蛋白質であり、この蛋白質を分子指標として、ポプラカルスの原基形成を検定しうることが判明した。以上のように、ポプラカルスにおける脱分化状態特異的蛋白質および原基形成特異的蛋白質を見い出し、ポプラカルスの再分化を早期検定しうることを明らかにしたが、これら蛋白質に関わる遺伝子の同定は困難であり、今後の問題として残された。
ネパールにおける障害・人的資本と経済 : ミクロ計量経済学アプローチ

従来より、自身が視覚障害を持ちながら教師として雇用されている者は、特殊学級においてやはり視覚障害を持つ生徒に対して教育に従事すると思われている。しかし、ネパールではそのような教師が通常の学校において視覚障害を持たない生徒に対して教育を行っている割合が高く、また奨励されていることが判明している。視覚障害を持つ教師に安定した収入を得させ、障害への恥じらいを減じることにより、教育の現場ではそのような教師の存在が障害を持たない生徒の視覚障害者に対する理解を増進することになるのである。視覚障害を持つ教師から教育を受けることが生徒にどのような経験を及ぼすか、またそのような経験の有無が生徒の能力に影響を与えるのか否かを測定するため、本研究の調査実施計画を策定した。この調査の目的は、視覚障害を持つ教師がそうでない教師と同等のパフォーマンスを有するのかを観察することにあり、昨年度より引き続いてネパールにおいて、異なる地域の学校において約3,600人の生徒と約200人の教師に対してアンケート調査を行った。また"囚人のジレンマ"等のゲーム理論に関わる実験も実施した。今年度は主に、その調査結果をいくつかの論文に取りまとめることに集中した。economics of education reviewに投稿した論文は、レフェリーのコメントを受けて改訂中である。Disability and Societyに投稿した論文はオンライン版に掲載された。Scandinavian Journal of Disability Researchに投稿した論文は、現在最終の審査中である。また、ハワイ大学で開催されたAnnual pacrim conference on disabilitiesにおいては、プレゼンテーションを行った。計画した実験やデータ収集を順調に行い、成果を論文として投稿した。ネパールでは、障害者の教師が非障害者の教師と同様に一般の学校で教鞭をとっている。2010年には、カマル・ラミチャネが数校の学校において、障害者および非障害者の生徒が障害者および非障害者の教師に教えられた際の学力に関する調査を行った。本調査の目的は、第一に障害者の教師が非障害者の教師と同様に教鞭をとることができるかを調査すること、第二に障害者と非障害者の教師の教える学生の学力の差があるのかを調査すること、である。2010年には、ラミチャネはネパールに3度訪問し、調査と経済実験をネパールのさまざまな地域にある9校の学校で行った。第一の訪問は6月末に行い、研究課題についての理解を深めた。その後、学校で行ったアンケートと実験をデザインした。2010年10月には再度ネパールを訪問し、アンケートのプレテストを2校の統合学校で行い、ネパール語に翻訳されたアンケートや質問の順番に問題がないかを確認した。プレテストにより修正したアンケートを用い、1月のはじめから2011年2月の第二週まで、実際の調査を行った。アンケートに加え、統合学校の生徒の障害者に対する態度を調べるために、トラストゲーム、公共財ゲーム、独裁者ゲームなどの経済実験も行った。最終的なデータとして、7校に所属する、計4000人ほどの障害者・非障害者の学生及び教師からのアンケートを得た。現在、データエントリーを行っているところである。2011年には、同様な調査に加え、データの分析を行う予定である。本研究の成果は、学術雑誌に投稿すると同時に、日本国内および国外において研究発表として報告する予定である。また、ネパールにおける障害、教育及び賃金に関しての研究報告を、「学術創成総合社会科学としての社会・経済における障害の研究」プロジェクトが主催したセミナーにおいて、2011年3月5日に発表した。
芸予諸島方言におけるアクセントの研究

平成30年度は,5地域10地点(大三島・上浦・大下島・小大下島・岡村島・岩城島・佐島・生名島・弓削島・魚島)において、インタビュー調査をおこなうことができた。大下島・小大下島など一部の島では、若年層・中年層がいない、あるいは都合がつかないことから、老年層のみの調査となったが、他の地点では、若年層・中年層・老年層の3世代の調査をおこなった。調査においては、話者の負担等を考慮し、当初予定していた漢語・外来語については最小限度にとどめ、和語を中心とした調査をおこなった。昨年度の調査した結果をもとに、とくに漢語アクセントに注目して分析・考察をおこない、論文(「愛媛県東中予方言の2字漢語アクセントの世代差」『愛媛大学法文学部論集人文学編』第45号、1-22、2018年9月)として著した。この論文では、松山市・今治市の若年層、松山市・今治市の老年層、京都方言、共通語において、下げ核の有無(位置)が、基本的に同じであることを明らかにした。また、<下げ核>の有無(位置)について、従来指摘されていた、後部要素の拍数によるのではなく、音節構造が関与している可能性が考えられることを指摘した。今年度の調査によって、中央式(京阪系アクセント)と、いわゆる東京式アクセントとの境界が、従来の報告等と同じであることを明らかにした。また、東京式アクセントの地域において、とくに老年層に古いタイプが残っていることを確認した。調査で得られたデータについては、データベース化(「芸予諸島方言アクセントデータベース」)を進めている。当初計画していた調査地点について、おおむね計画通りに調査をおこなうことができており、順調に研究が進んでいる。次年度年度以降予定している地域での調査をおこなうとともに、これまで調査した地点のなかから、いくつかの地点(年代)に対して、さらに詳細な調査を実施する。これらの調査結果をもとに、芸予諸島のアクセントの実態を解明するとともに、「しまなみ海道」開通による影響について考察する。調査で得られた結果について、データベース化(「芸予諸島方言アクセントデータベース」)し、公開できるように進めていく。さらに、いわゆる「京阪式アクセント」から「東京式アクセント」が誕生したという仮説の検証をおこなう。平成29年度は3地域5地点(今治・吉海・宮窪・津島・鵜島)において、インタビュー調査をおこなうことができた。津島・鵜島には、島に若年層・中年層がいないことから、老年層のみの調査となったが、他の今治・吉海・宮窪の3地点では、若年層・中年層・老年層の3世代の調査をおこなった。今治での老年層の調査結果については、同じ中央式の愛媛県松山の調査結果もとりあげ、これらの地点において、とくに漢語アクセントに注目して分析・考察をおこなった。分析・考察した結果については、1日本音声学会第31回全国大会(2017年9月)で口頭発表(「漢語類別語彙の検討」)をおこなうとともに、2論文(「愛媛県東中予方言の2字漢語のアクセント」『愛媛大学法文学部論集人文学編』第44号、105-134、2018年2月)として著した。1では、他地域の漢語アクセントとの比較を通して、先行研究で提唱されている漢語類別語彙について、すべての類・語を類別語彙として認定することができない可能性があることを指摘した。2では、今治・松山は、京都よりも古い漢語アクセントであること、また2字漢語のアクセントに、前部要素の音節構造、とくに促音が関与していることを指摘した。今治周辺域の調査によって、これまで中央式と思われていた地域に、中央式以外の類別体系をもつ地域(今治市津島)があることが明らかになった。平成29年度に調査を予定していた伯方島・大三島の調査をおこなうことができなかった。

調査で得られたデータについては、データベース化(「芸予諸島方言アクセントデータベース」)を進めている。当初計画していた調査地点について、おおむね計画通りに調査をおこなうことができており、順調に研究が進んでいる。平成29年度に調査をおこなうことができなかった伯方島・大三島の調査をおこなうとともに、平成30年度以降予定している地域での調査をおこなう。これらの調査結果をもとに、芸予諸島のアクセントの実態を解明するとともに、「しまなみ海道」開通による影響について考察する。調査で得られた結果について、データベース化(「芸予諸島方言アクセントデータベース」)し、公開できるように進めていく。さらに、いわゆる「京阪式アクセント」から「東京式アクセント」が誕生したという仮説の検証をおこなう。次年度年度以降予定している地域での調査をおこなうとともに、これまで調査した地点のなかから、いくつかの地点(年代)に対して、さらに詳細な調査を実施する。
咬合不全による海馬での神経細胞新生プログラム抑制機構の神経科学的解明

老化促進モデルマウス(SAMP8)を用い,咬合挙上による慢性ストレスが海馬歯状回に及ぼす影響を解明した.咬合挙上が老齢マウスにおいて海馬歯状回での脳由来栄養因子(BDNF)のmRNAを減少させ,BDNFの供給を傷害することをinsituhybridization法とELIZA法を用いてそれぞれ定量的に検出し,有意な減少を認めた.また咬合挙上の影響により海馬におけるアポトーシスの増加をTdT-mediateddUTPnickendlabeling染色によって定量的に測定した.これらの結果は高齢マウスにおいて咬合挙上によって引き起こされる海馬での器質的な障害とその要因について明らかにするものである.老化促進モデルマウス(SAMP8)を用い,咬合挙上による慢性ストレスが海馬歯状回に及ぼす影響を解明した.咬合挙上が老齢マウスにおいて海馬歯状回での脳由来栄養因子(BDNF)のmRNAを減少させ,BDNFの供給を傷害することをinsituhybridization法とELIZA法を用いてそれぞれ定量的に検出し,有意な減少を認めた.また咬合挙上の影響により海馬におけるアポトーシスの増加をTdT-mediateddUTPnickendlabeling染色によって定量的に測定した.これらの結果は高齢マウスにおいて咬合挙上によって引き起こされる海馬での器質的な障害とその要因について明らかにするものである.これまでに、咬合不全が慢性ストレスとして作用し、海馬の器質的変化を引き起こし、学習認知機能を障害することが報告されており、また咬合不全が海馬での細胞新生機構を障害し、海馬への神経細胞供給量を減少させる結果、海馬の学習認知機能を著しく低下させることを明らかにしてきた。最近の研究により、ストレス条件下に置かれたマウスでは、神経細胞の成長に関与する脳由来神経栄養因子の発現状況が海馬での神経細胞新生機構に大きく関与していることが分ってきた。そこで、海馬歯状回における新生細胞の生存期間や細胞分化に影響を与えると言われている脳由来神経栄養因子にスポットをあて、その発現状態から咬合不全による海馬での細胞新生機構の障害機序を解明し、高齢期の咬合、咀嚼の維持が海馬機能維持に与える影響を明らかにしたいと考えている。具体的な計画として、(1)9ヶ月齢雄性マウスに2週間咬合挙上処置を施した老齢咬合挙上マウスと、同齢のコントロールマウスとを使用し、脳由来神経成長因子のmessenger RNA発現をin situ hybridization法により検索し、咬合不全ストレスが脳由来神経栄養因子の発現に与える影響を定性的に解析する。(2)上記マウスの脳由来神経栄養因子のタンパク量をELISA法により測定し、咬合不全ストレスが脳由来神経栄養因子のタンパク発現量に与える影響を定量的に解析する。(3)血中カテコールアミン濃度を測定し、血中カテコールアミン濃度と脳由来神経栄養因子の動態との相関を調べる。以上の3実験を計画しており、申請時の予定では本年度は実験(1)および実験(2)の準備を計画していたが、(1)および(2)の実験はデータ抽出まで終了した。実験結果から咬合挙上ストレスが脳由来神経栄養因子の発現を抑制し海馬における神経細胞の生存や分化に影響を与えていることが解明できた。これまでに、咬合不全が慢性ストレスとして作用し、海馬の器質的変化を引き起こし、学習認知機能を障害することが報告されており、また咬合不全が海馬での細胞新生機構を障害し、海馬への神経細胞供給量を減少させる結果、海馬の学習認知機能を著しく低下させることを明らかにしてきた。具体的な計画として、(1)9ヶ月齡雄性マウスに2週間咬合挙上処置を施した老齢咬合挙上マウスと、同齢のコントロールマウスとを使用し、脳由来神経成長因子のmessenger RNA発現をin situ hybridization法により検索し、咬合不全ストレスが脳由来神経栄養因子の発現に与える影響を定性的に解析する。当初の計画では、来年度までかかる予定であったELISA分析まで終了しており、結果も伴っているため、計画以上に進行していると考えている。24年度が最終年度であるため、記入しない。今後はストレス反応としての血中カテコールアミン濃度上昇が脳由来神経栄養因子の動態に影響を与えているといわれていることから、血液採取を行い血中カテコールアミン濃度の解析を行う予定である。
スリランカ共和国における口腔がん発生機序の分子疫学的調査

我々は、4年前より東南アジア地域、特に受け入れ体制の整い、かつ症例の多いスリランカに注目し、同国唯一の国立ペラデニア大学歯学部と共同で、前癌病変(白板症、粘膜下線維症)および癌病変の検体(病変組織、血球DNA)採取(約300症例)を行って来た。その結果、#1:噛みタバコによる口腔癌では癌抑制遺伝子p53の変異がExon 7に集中すること、また、その変異も他に類を見ない変異(従来報告されているp53変異のData baseと対照して)が見出され、この変異がBetel chewingに起因する特徴的変異である可能性が見出されてきている。しかし、一方で白板症の中には同じ変異を持つものが見出されず(今の所)、単純なワンヒットでがん化する可能性は低いことが明かとなって来ている。(Oncogene 1998,Int.J.Cancer 1999)即ち、前がん病変が生じた後も幾度となく障害が口腔粘膜に及び変異が生じ続け、最終的に上記の変異に到った場合にがん化する可能性が示された。#2:血球DNAの解析により前癌・癌病変患者ではニトロソアミン類活性化酵素CYP2A6欠失型の頻度は少なく、活性化ニトロソアミン類代謝酵素GSTM1欠損型の頻度が高いことが示され、口腔癌発症にこのGenetic Back Groundが重要な背景因子となっていることが明かとなった(carcinogenesis 2002)。即ちBetel chewingの習慣に対して抵抗性のグループと感受性のグループがあり、これによって病変発症に大きな違いのあることが示された。#3:本研究において分子疫学調査を行なうのと同時に、クルクミンによる口腔がん予防効果について検討したところ、有意に前がん病変の抑制効果が認められ、クルクミンが口腔がんの化学予防剤として有用であることが示された(JJCR 2003)。周知の如く、東南アジア地域の国々では、噛みタバコの習慣(Betel chewing)により、口腔癌が多発し、全癌の2030%を占め大きな社会問題となっている。一方、この発癌機序については、現地の経済情勢もあり疫学・病理組織学的研究にとどまり、原因物質の特定を含めた背景因子などの分子生物学的検討は皆無となっている。これまでに、我々は、噛みタバコによる口腔癌では癌抑制遺伝子p53の変異がExon7に集中すること(Oncogene1998,Int.J.Cancer1999)、また、血球DNAの解析により前癌・癌病変患者ではニトロソアミン類活性化酵素CYP2A6と、活性化ニトロソアミン類代謝酵素GSTM1が、口腔癌発症にGenetic Back Groundとして深く関与していることが示唆されている。(AACR1999,JACR1999)。そこで、本年度は、口腔前癌病変患者に注目し、口腔前癌患者44人、健常人21人(計65人)の遺伝型を解析した。この結果、口腔前癌病変患者ではCYP2A6 Wild type、GSTM1 null typeに30人(30/44)が既当し、健常人の分布(11/21)に比べ、高い結果を示した。このことは、口腔病変の分子疫学が成立し得ることを示唆し、今後、更に母集団の拡大と長期follow結果を検証する意義が高いと考えられる。また、本年度は、上記結果を明確にするために、計約200人の検体の採取も同時に行った。

スリランカ共和国・ペラデニア大学歯学部・附属病院を基点に国内18使節の口腔外科で、前癌病変(白板症、粘膜下線維症)および癌病変の検体(病変組織、血球DNA)採取を行い、前癌病変および癌病変のp53遺伝子解析、ならびに、ニトロソアミン類活性化酵素CYP2A6ならびに活性化ニトロソアミン類代謝酵素GSTM1のSNPsを病変と対照して検討した。その結果、噛みタバコによる口腔癌では癌抑制遺伝子p53の変異がExon7に集中すること、また、白板症の中に同じ変異を持つもの、即ち、Exon7のPoint mutationの存在することが明らかとなって来た。さらに、血球DNAの解析により前癌・癌病変患者ではニトロソアミン類活性化酵素CYP2A6欠失型の頻度は少なく、活性化ニトロソアミン類代謝酵素GSTM1欠損型の頻度が高いことが示され、口腔癌発症にこのGenetic Back Groundが重要な背景因子となっていることが明らかになりつつある。次年度以降は、この現像を明確にするために、母集団の数的・質的充実を計る予定としている。最近の分子生物学的知見は、発がん過程における遺伝子異常の蓄積において、個々のGenetic Back Groundの相違が、重要な役割を演じていることを明らかとしている。しかしながら、口腔・消化器領域では前癌病変としての白板症、口腔がんと上部消化器がんとの関連が臨床病理学的に示されて来ているものの、これら相互の分子生物学的解析は不十分なままとなっている。また、アジア地域(主として東南アジア)では、Areca Nutsを用いたbetel chewing(噛みタバコの一種)の習慣があり、これに起因して白板症を経て口腔・上部消化器がんが多発(全体のがんの約40%を占める)していることが知られている。しかし、これら諸国では人的、経済的理由により、その解析・予防は手付かずのままとなっており、多くのがん患者が発生し続けている。そこで、噛みタバコ(betel chewing)の習慣により口腔・上部消化器がんの多発するこの地域に注目し、1)口腔白板症・がん病変、また、これに随伴する消化器病変の分子生物学的なトランスロケーショナル解析を行ない、その関連性を明らかとする。2)患者血球DNAより遺伝子多型(SNPs)の解析を行ない、がんの発生におけるGenetic Back Groundの有無および差違を明らかとする。を目的とし検討を行なってきた。その結果、これらの地域で発生する口腔がんでは日本、欧米とは異なる特異的な遺伝子変異(p53遺伝子)がみられること、前がん病変と考えられる白板症にみられる遺伝子変異とがん病変での変異に乖離があり、多段階に病変が形成されることが示唆されている。また、同じ噛みタバコの習慣を持つ集団の中に前がん病変を生じるグループと全く生じないグループがあり、この違いがCYP2A6とGSTM1のSNPsにより支配されていることが示されている。さらに、グルタミンによる口腔がん予防効果について検討したところ、有意に前がん病変の抑制効果が認められ、グルタミンが口腔がんの化学予防剤として有用であることが示されつつある。我々は、4年前より東南アジア地域、特に受け入れ体制の整い、かつ症例の多いスリランカに注目し、同国唯一の国立ペラデニア大学歯学部と共同で、前癌病変(白板症、粘膜下線維症)および癌病変の検体,(病変組織、血球DNA)採取(約300症例)を行って来た。
栄養状態に応じて個体発生と行動を制御する神経基盤の研究

(1)栄養依存的な生殖幹細胞の制御を担う神経ペプチドの解析:ショウジョウバエのメス成虫の生殖幹細胞の増殖制御において、腸から分泌されるNeuropeptide Fと呼ばれる神経ペプチドが必須の役割を担うことを解明し、記載論文を出版した。この成果は、動物の生殖機能に腸が直接的な影響を及ぼすことを示すはじめての成果である。さらに我々は、Neuropeptide Fは栄養状態に応答して分泌が制御されていること、そしてこれが栄養依存的な生殖幹細胞増殖に関与することを見出したが、この点についてはまだ様々な研究課題が残されていると判断し、論文公表までには至らなかった。(2)栄養依存的なステロイドホルモン生合成調節を担う口胃セロトニン産生神経経路の機能解析:口胃セロトニン産生神経(SE0神経)で活性を持つプロモーター系統を利用し、SE0神経のみで膜受容体や栄養代謝関連制御因子をコードする遺伝子をノックダウンするトランスジェニックRNAi実験を進めてきた。最終年度までに、アセチルコリン受容体を含む複数の遺伝子が有力候補として同定することができた。我々は、個々の遺伝子の変異体の分離と表現型解析も進めたが、研究期間内の完了には至らなかった。(3)ステロイドホルモン生合成器官に投射するコラゾニン神経細胞の機能解析:SE0神経以外にもステロイドホルモン生合成器官に投射する神経経路を同定し、特にコラゾニンと呼ばれる神経ペプチドを産生する神経が蛹化タイミングに重要な役割を担うことを見出した。そして、コラゾニンの役割は、個体が蛹化に至る前のまだ栄養を十分に得ていない発育段階において、ショウジョウバエの発育を抑制的に調節することにあることを見出した。本成果をまとめた論文の投稿準備を進めた。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。研究初年度は、特に以下の2点に注力したが、いずれも期待どおりの結果を得るに至らなかった。1. 3対からなるSE0神経細胞群で活性を持つプロモーターを元にして、さらに1対ずつの細胞で活性を持つ領域を探るためのエンハンサー解析実験を行った。元のプロモーター領域を細分化したDNA領域を、基本プロモーターおよびGAL4転写因子のコーディング配列と融合させたコンストラクトを作出し、それぞれについてトランスジェニック系統を得た。しかしながら、作製したいずれのコンストラクトにおいても、3対の神経細胞よりも少ない細胞をラベルする系統を得ることはできなかった。2. SE0神経のステロイドホルモン生合成器官(前胸腺)への投射は、酵母の量に応じて変化することが知られている。酵母の主要な栄養素はタンパク質であることを踏まえ、神経投射パターンの変化にとって重要なアミノ酸が何であるのかを検討した。個別のアミノ酸のみを主成分とする餌を20種類のアミノ酸毎にそれぞれ作製し、それを摂食したショウジョウバエの幼虫におけるSE0神経の投射と発育タイミングを計測した。しかしながら、変化の起因となる特定のアミノ酸に絞り込むことはできなかった。一方で、SE0神経以外に前胸腺でのステロイドホルモン生合成を調節する神経が存在するか、またその役割が何であるかを追究する実験を実施した。現在までに、ある種の神経ペプチドを産生する神経細胞が前胸腺に投射すること、そしてこれがPTTH神経細胞と物理的な相互作用を示すことを見出した。また、この神経細胞の活動を活性化させた際に、ショウジョウバエの蛹化のタイミングが遅れることを見出した。すなわち、この神経は、従来発見されてきた神経とは異なり、前胸腺でのステロイドホルモン生合成を負に調節する役割を持つことが期待される。SE0神経の反応に本質的な特定の栄養素を同定できなかったこと、またSE0神経細胞群の活性を細胞毎に操作できるプロモーターを得られなかったことは、当初の期待通りには成果を得ることはできなかったため。

本成果をまとめた論文の投稿準備を進めた。(1)栄養依存的な生殖幹細胞の制御を担う神経ペプチドの解析:ショウジョウバエのメス成虫の生殖幹細胞の増殖制御において、腸から分泌されるNeuropeptide Fと呼ばれる神経ペプチドが必須の役割を担うことを発見した。さらに、腸からのNeuropeptide Fの分泌が、個体の摂取する栄養状態に応答して調節されていることを分泌が制御されていること、そして予備的ながらこれが栄養依存的な生殖幹細胞増殖に関与することを示すデータを得た。(2)栄養依存的なステロイドホルモン生合成調節を担う口胃セロトニン産生神経経路の機能解析:口胃セロトニン産生神経(SE0神経)で活性を持つプロモーター系統を利用し、SE0神経のみで膜受容体や栄養代謝関連制御因子をコードする遺伝子をノックダウンするトランスジェニックRNAiスクリーニングを計画した。スクリーニングの安定的な実施のため、SE0神経を不活性化した個体の約1日の蛹化タイミングの遅れを捉えるための測定系を開発した。RNAiスクリーニングも開始したが、狙った遺伝子群すべてについて完了するには至らなかった。(3)ステロイドホルモン生合成器官に投射するコラゾニン神経細胞の機能解析:SE0神経以外にもステロイドホルモン生合成器官に投射する神経経路を同定し、特にコラゾニンと呼ばれる神経ペプチドを産生する神経が蛹化タイミングに重要な役割を担うことを見出した。コラゾニンが、個体を取り巻く栄養依存的なタイミング調節に関与するのかを検討したが、コラゾニンの作用する時期は終齢幼虫期のごく限定的な時期であることを示唆するデータを得た。腸由来ホルモンの役割とコラゾニンに関する解析は比較的順調に進んだが、トランスジェニックRNAIスクリーニングを完了することができなかった。その理由は、SE0神経を不活性化した個体の約1日の蛹化タイミングの遅れを捉えるための測定系の確立に思いの外時間がかかったためである。SE0神経依存的な発育タイミング制御メカニズムにせまるため、3対のSE0神経群で活性を持つプロモーターを利用したトランスジェニックRNAiスクリーニングを実施する予定である。このスクリーニングでは、膜受容体や栄養センシングに関わることが予想される遺伝子計300を対象として、それぞれの遺伝子機能をRNAiによって低下させた際の発育タイミングと神経突起形状を精査する予定である。また、SE0神経の活性を追尾するため、神経活動モニターのためのプローブ系統(GCamp系統など)を用いた実験も実施する。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。腸由来ホルモンの役割とコラゾニンに関する解析を進めて論文化を目指すのと並行して、トランスジェニックRNAIスクリーニングの最終年度での完了を目指す。測定系はすでに確立できたため、あとは多数の系統を用いた測定を実施すれば目的はスクリーニングは本研究課題実施期間に十分終了する算段である。
ErbB受容体システムによる細胞外情報の検出と統合

哺乳類細胞の細胞膜受容体ErbBfamily(ErbB1B4)とSH2, PTB蛋白質群(effector)の作る分子ネットワークが、蛋白質間の動的な相互作用を利用して、状況依存的に異なる情報を出力する機構を、生細胞での1分子可視化計測等と数理モデルによって解析することを目標として、以下の研究を行った。1.NRGとErbB3/B4の結合反応計測:1分子計測結果に基づいてNRGとErbB3/B4の結合・解離キネティクスおよび、結合親和性を説明する数理モデル構築を行った。B3/B4の2量体形成によってNRGに対する結合速度定数、解離速度定数の異なる結合部位がダイナミックに形成されること、このダイナミクスによって結合親和性が変化し、見かけの低親和性・高親和性の2種の結合部位が現れることを示唆する結果を得た。2.ErbBの活性化とエフェクター分子動態の計測:GFP標識したエフェクター分子(Grb2, Shc, PLCγ, PI3K等)をMCF-7に個々発現させ、細胞内の分子動態をFCS(蛍光相関スペクトル)で計測した。ほとんどのエフェクター分子は、自身の分子量より大きい見かけの分子量を持って細胞質中を拡散していることが分かったが、特にPI3Kでは真の分子量と見かけの分子量の解離が大きく、しかも、発現量が厳密に制御されていることが明らかになった。3.ErbBとエフェクター、エフェクター間の相互作用計測:GFPとTagRFPで標識された2種のエフェクターGrb2とShcの相互作用を、FCCS(蛍光相互相関スペクトル)と1分子可視化で計測した。従来、両者はErbB1によるShcのリン酸化後に複合体を形成し、したがって同時に1分子のErbB受容体と直接・間接に相互作用されていると考えられてきたが、我々の計測では、Grb2/Shcの共局在は細胞膜では見られなかった。哺乳類細胞の細胞膜受容体ErbBfamily(ErbBlB4)とSH2, PTB蛋白質群(effector)の作る分子ネットワークが、蛋白質問の動的な相互作用を利用して、状況依存的に異なる情報を出力する機構を、生細胞での1分子可視化計測等と数理モデルによって解析することを目標として、以下の研究を行った。1. EGF, NRGとErbBファミリーの結合反応計測:蛍光色素で標識したリガンド(EGFおよびNRG)とErbB familyの結合反応とリガンド/ErbB複合体の2量体化を、MCF-7細胞表面で1分子可視化計測し、反応キネティクスモデルを構築した。ErbB 2量体の構造変化による情報処理過程が予想された。2. ErbBの活性化とエフェクター分子動態の計測:GFP標識したエフェクター分子(Grb2, Shc, PLC_γ, PI3K等)をMCF-7に個々発現させ、細胞内の分子動態をFCS(蛍光相関スペクトル)で計測した。EGF, NGF依存的な分子動態変化が計測された。リガンド種に依存して動態変化の様子が異なるエフェクターが存在することが明らかになった。3. ErbBとエフェクター、エフェクター間の相互作用計測:GFPとTagRFPで標識された2種のリガンド、ErbBfamilyおよびエフェクター間の相互作用を、FCCS(蛍光相互相関スペクトル)で定量する方法を開発した。PI3K等では同一エフェクター分子に対する相互作用は、リガンド、ErbBの種依存的に異なり、生化学的に解析したエフェクターの活性化と相互作用量に正の相関があることが示された。
ナラティブ・ベースドな混合研究法による附属学校等の教育効果に関する調査研究

国立大学の附属学校を中心に、その教育効果を測定するために調査を行った。それは、いわゆる学力テストではなく、児童・生徒にインタビューを行い、得られた語り(学びのヒストリー)を解釈する方法によるものであった。明らかになったことは、児童・生徒の学びは多様で個性的であるが、学校や家庭等の状況に埋め込まれていることである。そのため、学校や家庭等の状況的圧力によって学びが制限されるが、それらからリソースを得て積極的に学びを拡張していることも大ある。そこで、学校や家庭の学習状況を重視した教育が強く求められると言えよう。本研究課題では、附属学校等の設置経緯と組織、教授・学習の方法、学力やパーソナリティ特性の関係性に注目し、附属学校等が果たす役割を総合的に理解し、適切に評価するための方法論、説明モデルの導出を目指している。そのため、インタビュー調査によって得られるナラティブ(語り)と定量データやドキュメント等を関連させて、対象を分析する混合研究法(ナラティヴ・ベースドな混合研究法)を採用し、研究課題に総合的にアプローチしたい。附属学校等の児童・生徒、及び卒業生(大学生・社会人)のナラティヴによれば、次のことが明らかになった。(1)附属学校は児童・生徒の自主性を重視する独自な教育が行われ、それに対する児童・生徒による理解は一定以上にあり、評価も高い。(2)附属学校の児童・生徒、あるいは卒業生としてのアイデンティティは強固であり、地域社会からもそのような評価を得ている。(3)不登校等の問題、多様な進路保障等については、必ずしも適切な対応ができていないことがある。キャリア形成が抱える課題を日本の社会的な文脈を考慮に入れて検討するため、『文部科学大臣所轄学校法人一覧』、『全国高等学校一覧』等の資料を収集し、系列校間のカリキュラムにいかなる連関が形成されているのかを実証的に分析した。その結果、概ね以下のような知見が得られた。(1)小学校以前の段階から大学・短大まで一貫して系列化されたインブリーディング機能は限定的にしか備わっていない。(2)学校間の系列化は、インブリーディングへの需要に支えられているばかりでなく、ローカル・トラックが成立するよう形成されている。(3)一部の系列校間で、教育課程を通したジェンダー・インブリーディングが生じている。研究活動2年目となる平成26年度は、初年度である25年度の研究成果を発展させるように、インタビュー調査によるナラティヴ・データの蓄積、及びその分析を中心として進めてきた。特に、附属学校の卒業生との比較研究のために、一般校、あるいは「困難校」と呼ばれる高等学校の卒業生のナラティヴ・データを得ることもできた。さらには、国際的な比較研究の足がかりとなるように、海外の場合のナラティヴ・データを得るようにもした。また、分析に先立って、インタビュー調査の概要の報告会を開催した。ところが、2年間の研究期間であり、研究成果をまとめなければならないのであるが、そこには至っていない。そのため、研究費の次年度使用額が発生し、その旨を申請した。その理由は、当初の目的である理論的枠組みについての検討が進んでいないことが大きい。統計データやドキュメント等を活用しての定量分析とナラティヴ・データを活用しての質的分析(定性分析)との接続、統合については、十分に新たな知見が得られていないのである。研究課題にあるように、「ナラティヴ・ベースドな混合研究法」なのであり、新たな研究パラダイムの確立を求めるものではない。それでも、ナラティヴ・データを中心にしながら、統計データやドキュメント等の効果的な活用による、一方だけのデータでは可能にならない分析について明らかにしなければならない。このことが、大きな理論的な課題であり、研究費使用の延長を求めた理由の1つであり、平成27年度研究活動の重点事項である。研究の目的は、国立大学の附属学校等の教育効果について、ナラティヴ・アプローチによって明らかにすることであった。附属学校等の卒業生である大学生、あるいは社会人を対処にインタビュー調査を実施した。そうすることによって、幼、小、中、高等学校における学びについて得られた語り(「学びのヒストリー」と呼ぶ)を解釈することによって、多様で個性的な学びを明らかにした。第1は、地方の附属学校における学びと都市部におけるそれとの比較である。それぞれの地域社会における、かなり異なる学校教育と生徒たちの学びを対照的に見出すことができよう。第2は、一般教育を行う附属学校と専門高等学校の場合との比較である。それぞれに生徒の学びは大きく異なり、形成された自己と世界の差異は明瞭である。さらには学びのための課題の異同をも具体的に見出すこともできよう。いずれにしても、生徒の課題に応じて教師が寄り添うことが求められる。第3は、卓越した専門家、あるいは海外の大学生の場合という、あまり触れることのない学びと身近な学校におけるそれとの比較である。ともすれば遠く離れた知らない世界の学びについては、想像も及ばないように思える。しかし、実際はそうでもなく、それらには身近な子どもたちの学びとの共通性や同様の課題を見出すことができる。こうして明らかになったことは、生徒たちの学びは学校や家庭等の状況に埋め込まれていることである。そのため、学校や家庭等の状況的圧力によって、学びが制限される。一方では、それらからリソースを得て積極的に学びを拡張していることもある。

それは、いわゆる学力テストではなく、児童・生徒にインタビューを行い、得られた語り(学びのヒストリー)を解釈する方法によるものであった。明らかになったことは、児童・生徒の学びは多様で個性的であるが、学校や家庭等の状況に埋め込まれていることである。そのため、学校や家庭等の状況的圧力によって学びが制限されるが、それらからリソースを得て積極的に学びを拡張していることも大ある。そこで、学校や家庭の学習状況を重視した教育が強く求められると言えよう。平成26年度では、さらに追加してインタビュー調査を行い、多様なナラティヴ・データを得ることができている。附属学校の卒業生と比較するために、「困難校」と呼ばれる高等学校の卒業生、海外の事例、あるいは附属学校における教育実習生のナラティヴ・データ等である。この点では、これまでの研究の発展を促すデータが蓄積されたと言えよう。一方、理論的枠組みについての検討を精力的に進めようとしているが、十分ではない。すなわち、統計データやドキュメント等を活用しての定量分析とナラティヴ・データを活用しての質的分析(定性分析)との接続、統合については、一部の試みがなされているにすぎないのである。たとえば、インタビュー調査において、ドキュメント資料を活用するような試みである。また、ナラティヴの分析において、も同様である。全国的な統計資料のようなデータと結びつけてのナラティヴの分析などを試みるようにしたい。学校教育学上述の達成度と課題からすれば、統計データやドキュメント等を活用しての定量分析とナラティヴ・データを活用しての質的分析(定性分析)との接続、統合についての検討が強く求められる。そのため、ナラティヴ・データの分析において、具体的に統計データやドキュメント等のデータを活用することをいくつか試みるようにしたい。もちろん、理論レベルで検討することも必要であるが、新たな理論的パラダイムを構想することは困難であろう。それには、相当の時間と多数の多様な研究者の参加による議論の蓄積が必要であり、1つのグループの数年の研究活動が可能にするはずはないからである。ただし、本研究では「ナラティヴ・ベースドな混合研究法」というように、限定している。すなわち、統計データやドキュメント等を活用しての定量分析とナラティヴ・データを活用しての質的分析(定性分析)との統合ではなく、後者を中心としながら前者をも補助的に活用しての研究なのである。このような限定のなかで、新たな研究手法の開発を求めるようにする。そこで、すでに行っているナラティヴ・データの分析も見直し、統計データやドキュメント等をも加えて、再度の分析を行うようにしたい。また、その結果についても、研究会を開催し、新たな研究手法の開発を論点として議論するようにしたい。初年度である平成25年度は、主として(1)理論的・方法論的枠組みの検討、(2)受験情報誌等調査の実施、(3)データベース構築と定量データ分析からなる3つの研究課題に取組む計画であった。理論的・方法論的枠組みの検討については、附属学校等に関する調査実施にむけた理論的・方法論的な枠組みを検討してきた。
アクトミオシン系細胞運動の試験管内再構成

試験管内でアクチン線維1本とミオシン線維1本との滑りが、筋最大収縮速度と同じ速さで起る事を我々は見出し既に報告した。ミオシン頭部の首振りによる考えでは、この速い滑りを説明することが困難であり、現象論の集積と整理が急務となった。筋収縮の分子メカニズム解明は、またアクトミオシン系細胞運動の分子メカニズム解明に連る。幾つかの試みの中で、この2年間の主たる成果は、1)ミオシンと棒状部又はLMMとの共重合線維について運動特性に対する知見を得たこと、2)ミオシン尾部を欠いたHMMによるアクチン線維の運動を見出したこと、の二点である。共重合線維でミオシンモル比1/8迄減らしても滑走速度は低下しない。しかし、滑走線維数,滑走距離は共に激減する。この現象に対する説明方法がなく今後検討しなければならない。ミオシン量比減少に伴い熱運動が激しくなって、能動運動との区別が困難で、能動運動を起こすに必要なミオシン分子数についての知見は得られなかった。蛍光標識したアクチン線維の蛍光顕微観察から、HMMがミオシンとほゞ同等の力でアクチン線維を滑走させる能力を見出した。Hinge領域で酵素分解された産物のHMMが、充分な運動機能を保持している事実からHinge領域が力発生の源とは考えられない。アクチン線維長0.5μm7μm迄の変化に対し滑走速度は全く変らず3μm/sである。0.5μm以下の短い線維の運動に関心が持たれる。長さ零の外挿から速度3μm/sでミオシン1分子がアクチン線維を滑らせると推論される。同じ推論がミオシン線維の運動観察からもなされている。ミオシン頭部首振りの考えに代って、如何なる考えが筋収縮,細胞運動を説明するか。試験管内運動再構成と、動く分子の直接観察の方法は、新しい作業仮説探求に必要な知見を得るための一層有力な研究手段となるであろう。
多官能性有機配位子の開発と金属錯体の材料化

1.金属錯体の材料化を目指して、コバルト(III)のDHPTA(1,3-ジアミノ-2-ヒドロキシプロパンN,N,N',N'-4酢酸)単核錯体の非配位性水酸基に対するアシル化反応を検討し、この錯体を重合可能なモノマーとすることに成功した。すなわち、非水溶媒中で無水メタクリル酸と錯体とをクリプタンド包接可溶化法によって反応させ、重合禁止剤の存在下においてメタクリル基の導入を実現した。重合禁止剤を用いない反応系においては、すでに重合体を得ており、この重合体がハイドロゲルとなることを新たに見い出した。6配位八面体型の錯体をペンダントグループとするこの重合体の開発は、多数の6座配位子を側鎖に有する新しい多官能性有機配位子を与えたことに他ならず、その高度な利用をモノマーの重合反応と併せて今後も検討する。なお、上記ハイドロゲルについては、セラミックスを合成するためのゾル-ゲル法への応用をすでに検討している。2.上記の有機多座配位子DHPTAと鉄(III)との反応を、窒素酸化物のひとつである亜硝酸イオンの存在下で試みた。この反応系は、酸性雨などの原因となる空気中の窒素酸化物を硫黄酸化物と同時に処理する可能性を有するものである。本研究において、鉄(III)-DHPTA錯体上に亜硝酸イオンを架橋配位子として取り込んだ4核のオキソ錯体として単離可能なこと、重要なことに強い酸性条件下でも生成することをはじめて見い出した。すでに単結晶も合成し、そのX線結晶構造解析によって構造を決定した。この反応系と生成物は、上記の窒素酸化物の除去のみならず、、生体中における窒素酸化物の挙動や、4核錯体自身の磁気的な性質への興味、さらに鉄貯蔵タンパクのモデルとなるなど、今後多方面での成果を期待できるもので、本研究におけるきわめて大きな成果のひとつである。金属錯体の材料化を目的として、非配位性の水酸基を有するEDTA型錯体の設計・合成と化学修飾等についてアニオン性のコバルト(III)錯体を中心に研究を実施した。すでに錯体に対する芳香族および脂肪族カルボン酸無水物系との反応については基本的な化学修飾法を確立し、両系の代表的な化合物についてX線結晶構造解析を実施して構造を解明した(投稿予定)。これら錯体の分離材料化のために光学活性錯体の重合反応について本格的に検討する計画である。また長鎖脂肪族錯体については、バルクな金属錯体がアニオン性の親水基となった新規な界面活性剤としての機能を持つことが判明し、材料化にむけた本研究年度における大きな成果である。現在、臨界ミセル濃度の測定を検討しているが、金属錯体を含む界面活性剤は全く新規なもので、今後膜の形成やその電子移動反応などの検討も行い、新材料としての探索する計画である。またコバルト系と同様なEDTA型配位子の鉄(III)錯体系についても検討を行っている。この系はコバルト(III)錯体が単核であるのに対し、非配位性の水酸基の酸素が架橋配位原子となり、1分子中に鉄イオン2こを含む複核系である。この複核系でも、さらに錯体に対する化学修飾を可能とするため、EDTA型配位子の他に非配位性の官能基を有する芳香族カルボン酸を共存させて合成した。新たに合成した錯体について今年度結晶構造解析を実施したところ、芳香族カルボン酸のカルボキシル基も2この鉄イオンを架橋し、芳香族性の非配位性官能基がさらなる化学修飾を受け得ることが判明したので、現在検討を行っている。

本補助金で購入した高速液体クロマトグラフ装置は、有機化合物の分離同定に活用している。なお本装置は、錯体を高分子量化して合成する分離材料の機能評価にも利用する予定である。また基本的な装置であるpHメ-タは、錯体の合成などに頻用している。1.金属錯体の材料化を目指して、コバルト(III)のDHPTA(1,3-ジアミノ-2-ヒドロキシプロパン.N,N,N',N'-4酢酸)単核錯体の非配位性水酸基に対するアシル化反応を検討し、この錯体を重合可能なモノマーとすることに成功した。すなわち、非水溶媒中で無水メタクリル酸と錯体とをクリプタンド包接可溶化法によって反応させ、重合禁止剤の存在下においてメタクリル基の導入を実現した。重合禁止剤を用いない反応系においては、すでに重合体を得ており、この重合体がハイドロゲルとなることを新たに見い出した。6配位八面体型の錯体をペンダントグループとするこの重合体の開発は、多数の6座配位子を側鎖に有する新しい多官能性有機配位子を与えたことに他ならず、その高度な利用をモノマーの重合反応と併せて今後も検討する。なお、上記ハイドロゲルについては、セラミックスを合成するためのゾル-ゲル法への応用をすでに検討している。2.上記の有機多座配位子DHPTAと鉄(III)との反応を、窒素酸化物のひとつである亜硝酸イオンの存在下で試みた。この反応系は、酸性雨などの原因となる空気中の窒素酸化物を硫黄酸化物と同時に処理する可能性を有するものである。本研究において、鉄(III)-DHPTA錯体上に亜硝酸イオン架橋配位子として取り込んだ4核のオキソ錯体として単離可能なこと、重要なことに強い酸性条件下でも生成することをはじめて見い出した。すでに単結晶も合成し、そのX線結晶構造解析によって構造を決定した。この反応系と生成物は、上記の窒素酸化物の除去のみならず、生体中における窒素酸化物の挙動や、4核錯体自身の磁気的な性質への興味、さらに鉄貯蔵タンパクのモデルとなるなど、今後多方面での成果を期待できるもので、本研究におけるきわめて大きな成果のひとつである。
単球と血管内皮の相互作用における細胞内シグナル伝達機序

動脈硬化の発症仮説である障害反応説(response to injury hypothesis)によれば単球と血管内皮の相互作用はその発症初期における最も重要な段階である.今回、我々は、この単球と血管内皮の相互作用により細胞外マトリックスの消化に重要なマトリックスメタロプロテナーゼ-1(MMP-1)と強力な血管拡張物質であるアドレノメデュリン(AM)が産生されることを見いだし、その産生機序について検討した.ヒト単球とヒト臍帯静脈由来血管内皮細胞(HUVEC)の共培養により、単球とHUVECの両細胞においてMMP-1の発現、産生が誘導された.このMMP-1産生は炎症性サイトカインであるIL-1βおよびTNFαの中和抗体、あるいはチロシンキナーゼ阻害剤であるherbimycinAやMEK阻害剤であるPD98059によって有意に抑制された.また、この相互作用によりチロシンキナーゼc-SrcとMAPキナーゼ(ERK1/2)の活性化が認められた.これらよりこのMMP-1産生はIL-1βおよびTNFαといった液性因子と、細胞内シグナル伝達経路としてチロシンキナーゼおよびMAPキナーゼを介していることが示された.一方、この相互作用はAMの発現、産生も誘導するが、ルシフェラーゼアッセイおよび細胞の膜分画を抽出しての検討から、このAMは主としてHUVECから産生されることを明らかとした.また、このAM産生はMMP-1と同様に一部炎症性サイトカインであるIL-1を介していた.今後、さらに詳細なシグナル伝達経路や、以前より報告してきたこの相互作用による接着分子やサイトカインの発現が同様のシグナル伝達経路を介しているかどうかを検討し、実際にこのシグナル経路を阻害することにより動脈硬化の形成を抑制することができるかを検討する予定である.単球と血管内皮の相互作用は動脈硬化の発症、進展において重要である。現在まで我々は、この相互作用が種々の接着分子や動脈硬化性サイトカインの発現を誘導することを報告してきた。今回、我々は、細胞外マトリックスの消化に重要な働きをしているmatrix metalloproteinase-1(MMP-1)がこの相互作用によって産生されることを見いだした。単球と血管内皮との共培養によりMMP-1は時間依存性に産生され、免疫染色によりその産生細胞が単球と血管内皮の両方であることが示された。このMMP-1の産生は、IL-1βおよびTNFαの中和抗体によりそれぞれ約30%および40%抑制された。また、細胞内シグナル分子の阻害剤による検討では、このMMP-1産生はPKC阻害剤であるCalphostin CやH-7およびPKA阻害剤であるKT5720により影響を受けなかったが、Srcチロシンキナーゼ阻害剤であるherbimycin AおよびMEK阻害剤であるPD98059により有意に抑制された。そこで実際にc-SrcおよびMAPキナーゼ(ERK1/2)の活性化を検討したところ、単球と内皮細胞の共培養によりc-ScrとERK1/2は、それぞれ約20分と30分をピークとして活性化された。以上の結果により、単球と血管内皮の相互作用によりc-SrcとERK1/2が活性化され、これらシグナル分子を介してMMP-1の産生が誘導されることが示唆された。今後、さらに詳細なシグナル伝達経路や、以前より報告してきたこの相互作用による接着分子やサイトカインの発現が同様のシグナル伝達経路を介しているかどうかを検討し、実際にこのシグナル経路を阻害することにより動脈硬化の形成を抑制することができるかを検討する予定である。動脈硬化の発症仮説である障害反応説(response to injury hypothesis)によれば単球と血管内皮の相互作用はその発症初期における最も重要な段階である.今回、我々は、この単球と血管内皮の相互作用により細胞外マトリックスの消化に重要なマトリックスメタロプロテナーゼ-1(MMP-1)と強力な血管拡張物質であるアドレノメデュリン(AM)が産生されることを見いだし、その産生機序について検討した.ヒト単球とヒト臍帯静脈由来血管内皮細胞(HUVEC)の共培養により、単球とHUVECの両細胞においてMMP-1の発現、産生が誘導された.このMMP-1産生は炎症性サイトカインであるIL-1βおよびTNFαの中和抗体、あるいはチロシンキナーゼ阻害剤であるherbimycinAやMEK阻害剤であるPD98059によって有意に抑制された.また、この相互作用によりチロシンキナーゼc-SrcとMAPキナーゼ(ERK1/2)の活性化が認められた.これらよりこのMMP-1産生はIL-1βおよびTNFαといった液性因子と、細胞内シグナル伝達経路としてチロシンキナーゼおよびMAPキナーゼを介していることが示された.一方、この相互作用はAMの発現、産生も誘導するが、ルシフェラーゼアッセイおよび細胞の膜分画を抽出しての検討から、このAMは主としてHUVECから産生されることを明らかとした.また、このAM産生はMMP-1と同様に一部炎症性サイトカインであるIL-1を介していた.今後、さらに詳細なシグナル伝達経路や、以前より報告してきたこの相互作用による接着分子やサイトカインの発現が同様のシグナル伝達経路を介しているかどうかを検討し、実際にこのシグナル経路を阻害することにより動脈硬化の形成を抑制することができるかを検討する予定である.