hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
シリコン-炭素共有結合を起点とする3次元分子組織体の構築

ここ数年、分子スケールの電子素子の開発に向けた研究に興味が持たれ、電極-分子-電極システムの構築とその電気特性の測定が盛んに行われている。電極と分子の接合様式が電気特性に与える影響は極めて大きく、安定な接合界面の形成の重要性が認識されている。有機分子を組織化し、その電気特性を計測する「素材」として、金基板上でのチオール分子の自己組織化膜(SAM)が最も精力的に研究されてきた。金と硫黄原子の親和性のよさを利用したものであり、分子スケールエレクトロニクス素子の構成要素を設計する上での重要な指針となっている。しかしながら、このいわゆる金-チオール系は,界面の結合様式が不確かであり,また分子を特定の場所に選択的に固定することが難しいなどの問題がある。金-チオール系の電気的特性に関して、再現性のある実験結果を得るためには、安定な界面の構築が不可欠であることが指摘されている。安定な界面の構築法のひとつとして、半導体と分子を共有結合で結ぶ方法が考えられる。特に炭素と同じIV族のシリコンやゲルマニウム結晶表面と炭素の結合生成は表面科学やナノサイエンスの観点だけでなく、新しい有機化学の展開としても興味がもたれている。本研究では、水素終端シリコン(111)面を基板とし、末端に2重結合を有する分子をウェットプロセスで反応させ、その配向や熱的安定性を、内部多重反射赤外分光法により明らかにした。まず、分子は、全トランス型の梱フォーメーションを基本とし、約400°C程度までは、その構造を維持することがわかった。また、フッ化アンモニウムをはじめとする薬品に浸しても、劣化を見ないことが明らかとなった。現在、シリコン上の分子組織体に対して、走査プローブ顕微鏡を用いた電気特性の計測を行っている。分子エレクトロニクスにおいて、分子と電極の接合界面は、信号の入出力を担い特性を決める上で重要な役割を果たす。我々は、シリコン表面上に共有結合で分子を固定化し、信号の入出力インターフェースとして利用することを提案し、シリコン上の共有結合性自己組織化膜の作製技術の確立、2次元ナノパターニング技術の確立、3次元分子システムの構築手法を確立してきた。本研究課題では、これらの技術ノウハウをさらに発展させて、シリコン基板上に機能を有する分子組織体の構築を図ることを最終目標とし、(1)シリコン-炭素共有結合性インターフェースの電子状態を明らかにし、信号の入出力の特性を知る、(2)3次元の組織体の構築手法を確立するとともに、適切な分子設計・合成を行う、(3)SOI(Silicon-on-insulator)基板をパターニングして、機能性分子を固定することにより、3端子素子を構築する、ことを中心に研究を進めた。(1)に関しては、走査トンネル顕微鏡を用いた電流-電圧計測により、シリコン上に固定された分子が、帯電または構造変化により微分負性抵抗を示す可能性があることを見いだした。(2)に関しては、シリコン上の分子組織体が、熱的・化学的に極めて安定であることを、多重反射赤外分光法により明らかにした。さらに、成膜過程に関する研究を進めている。(3)に関しては、SOIを用いて、サブミクロン程度の間隙をもった電極の作製方法を確立し、分子の固定化方法の検討を行っている。
糖尿病性細小血管症早期診断, 予防における赤血球変形能測定の意義

前年度の科研一般研究C61570402の成果を踏まえて更に糖尿病における赤血球変形能の低下と組織低酸素および細小血管発症との関連について検討を進めた.今回特に赤血球変形能低下の機序について検討すると共に,この変化が組織低酸素に実際どの程度寄与しているのか,あるいは寄与し得るのかに関して数値シミュレーションによる定量的検討を進めた.糖尿病において進行が速まる蛋白質の非酸素的糖化が近年重視され,種々の糖尿病性変化に関与している可能性が指摘されて来ている.赤血球変形能の低下にも何らかの関係があると予想される.そこでヘモグロビン分子の糖化された分画の増加との相関を検討したが,一定の相関が認められたもののその程度は空腹時血糖値との相関より低かった.本研究代表者らはこれまで,赤血球表面に吸着された血漿蛋白質が赤血球変形能に大きな影響を及ぼすことを示してきたが,糖尿病の場合も赤血球内の蛋白質の糖化よりも血漿蛋白質の糖化の影響の方が大きいことが考えられる.両者の糖化の程度に時間的なずれがあれば上記のような相関の結果もあり得ると思われる.また糖尿病患者の赤血球を生理食塩水に浮遊した場合,変形能に健常者との差がほとんど見られなくなることが示された.この結果からも赤血球表面と血漿蛋白質との相互作用の重要性が示唆される.またこれまで報告が分かれていたのもこのような測定条件の差によっていたことが考えられる.本研究では更にKroghの組織円筒モデルによる数値シミュレーション解析を進め,各患者の組織円筒の半径あるいは毛細血管の密度を見積ることを試みた.健常者と比較して組織円筒半径の増加あるいは毛細血管密度の減少が得られ,この指標が糖尿病性細小血管症早期診断の有力な手掛かりになることが期待された.前年度の科研一般研究C61570402の成果を踏まえて更に糖尿病における赤血球変形能の低下と組織低酸素および細小血管発症との関連について検討を進めた.今回特に赤血球変形能低下の機序について検討すると共に,この変化が組織低酸素に実際どの程度寄与しているのか,あるいは寄与し得るのかに関して数値シミュレーションによる定量的検討を進めた.糖尿病において進行が速まる蛋白質の非酸素的糖化が近年重視され,種々の糖尿病性変化に関与している可能性が指摘されて来ている.赤血球変形能の低下にも何らかの関係があると予想される.そこでヘモグロビン分子の糖化された分画の増加との相関を検討したが,一定の相関が認められたもののその程度は空腹時血糖値との相関より低かった.本研究代表者らはこれまで,赤血球表面に吸着された血漿蛋白質が赤血球変形能に大きな影響を及ぼすことを示してきたが,糖尿病の場合も赤血球内の蛋白質の糖化よりも血漿蛋白質の糖化の影響の方が大きいことが考えられる.両者の糖化の程度に時間的なずれがあれば上記のような相関の結果もあり得ると思われる.また糖尿病患者の赤血球を生理食塩水に浮遊した場合,変形能に健常者との差がほとんど見られなくなることが示された.この結果からも赤血球表面と血漿蛋白質との相互作用の重要性が示唆される.またこれまで報告が分かれていたのもこのような測定条件の差によっていたことが考えられる.本研究では更にKroghの組織円筒モデルによる数値シミュレーション解析を進め,各患者の組織円筒の半径あるいは毛細血管の密度を見積ることを試みた.健常者と比較して組織円筒半径の増加あるいは毛細血管密度の減少が得られ,この指標が糖尿病性細小血管症早期診断の有力な手掛かりになることが期待された.
生体分子間相互作用を網羅する新型１分子蛍光イメージング法の開発

生体分子間の結合・解離を時間軸上で解析できるゼロモード導波路(ZMW)を用いたリアルタイム1分子蛍光イメージング法を高度化するために,ZMWと蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)とを組み合わせた新しい1分子蛍光イメージング法が高い実行可能性を評価した。さらに本手法を拡張するための要素技術の開発ーDNAアプタマを用いたセンサ応用,DNA切断イベントの1分子計測,細胞の特定部位のアライメント法の開発ーにも取り組んだ。申請者らが開発した改良型のゼロモード導波路(ZMW)と、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)とを融合した新しいリアルタイム一分子蛍光イメージング法を開発することを目的として下記の実験に取り組んだ。(1) ZMW内での1分子MB-FRET系の構築: 3'末端をCy3、5'末端をCy5で標識したMBを設計し、このMBをビオチン-アビジン結合を介してZMWに固定した。濃度を調整したMB溶液にZMW基板を浸漬し、各ZMWに連続的に励起光(波長550 nm)を照射したところ、ほぼすべての蛍光スポットで量子退色が観察された。これは個々のZMWに固定されたMBの分子数が1分子であったことを意味する。なお、設計通りにFRETをCy3からの蛍光であればFRETが生じていないのでMBが開環状態であることを、Cy5からの蛍光であればMBは閉環状態であることを意味する。室温で固定したMBの75%はCy5のみの蛍光を示し、残りの25%がCy3からの蛍光を示した。このことは、75%のMBで1分子FRETが生じ、残りの25%ではFRETが生じなかったことを意味する。(2) FRET効率の測定:設計したMBではCy3およびCy5からのどちらか一方のみからの蛍光だけが観測され、他方からの蛍光強度はほぼゼロであり、どちらか一方の色素からの蛍光が明瞭に観測された。研究開始前に懸念していたZMWの金属部への電荷移動によるFRET効率の低下は見られなかった。(3)相補的DNAとのハイブリゼーションによるMBの開環制御: MBとMBのヘアピン部と相補的なDNAとをハイブリだゼーションさせたところ、48%の1分子MBが開環し、24%が閉環したままで、残りの28%が不安定な挙動を示した。ある程度の有意差をもって人為的に1分子MBを開環させることに成功したが、さらなる制御性の向上が求められる。ヒトの体内で重要な働きをするタンパク質の多くは、濃度をμMにまで高めないと、効果的にリガンドと結合して特異的な機能を発現することができない。しかしながら、従来の1分子蛍光イメージング法では、このような高濃度条件下で目的の1分子だけを可視化することは不可能であった。そこで、改良型ゼロモード導波路(ZMW)と蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)とを融合した新しいリアルタイム1分子蛍光イメージングを開発することを目的として以下の実験に取り組んだ。(1)DNAアプタマを用いたセンサ応用:光をZMW内部に閉じ込め、さらにFRETを活用することにより、高濃度条件下でZMWに固定したDNAアプタマが標的分子と結合(または解離)することを可視化できる。今回、グアニンカルテットと呼ばれる配列を含むDNAアプタマを設計した。このDNAアプタマは、Caイオンと結合すると折りたたまれる性質を有する。これを活用して、Ca濃度依存的にDNAアプタマが折りたたまれる様子を観察すること試みた。2015年度の設計と実験を通して、ZMW内に固定したDNAアプタマからの1分子蛍光は観察できているものの、設計に問題があることが判明したので、再設計を試みている。(2)インフルエンザ由来のエンドヌクレアーゼのDNA切断過程のリアルタイム1分子蛍光イメージング:インフルエンザ由来のエンドヌクレアーゼがDNAに結合する過程、DNAを切断する過程、およびDNAから解離する過程を1分子でリアルタイムに蛍光観察する系の構築に着手した。PANにはGFP蛍光タンパク質が修飾され、PANがZMWに固定されたDNAに結合・解離する瞬間も同時に捕捉することができる。2015年度には、静的な実験ではあるものの、濃度1μMのPAN-GFPがZMWに固定したDNAを切断することが確認でき、リアルタイム観察に向けた前準備が整いつつある。当研究グループは、半導体微細加工を活用してZMWを自作し、その構造を自在に改良することができる。ZMWを活用した1分子蛍光イメージングを研究している他の研究グループからの報告では、ZMWを用いると、ZMW内部に固定した分子のFRET効率が低下することが問題となっていた。FRETは近距離相互作用であるので、ZMWとFRETのとが融合できるようになれば、より高濃度で1分子蛍光イメージングを実行でき、観察できるタンパク質の種類や観察できる機能を拡張できる。2014年度に行った、モレキュラービーコンを用いたデモンストレーションでは、ZMWの構造を改良することによって、ZMW内でも十分なFRET効率を確保できることを見出した。これにより、2015年度には、DNAアプタマ(グアニンカルテット)を用いたCaイオンセンサへの応用やインフルエンザ由来のエンドヌクレアーゼ(PAN)のDNA切断素過程の1分子イメージングといった新しい実験へと展開することが可能となった。エンドヌクレアーゼの活性を高めるために、当初計画になかったサンプルステージの温度調整が必要となったが、これを自作することで完成し、なおかつ70°Cまで高温にしても1分子FRETが計測できることを確認した。

一方、DNAアプタマの設計に問題があることが判明したが、この取り組みは当初の計画で最終段階に位置付けられているので、当初予想していなかった問題が早い段階で明らかとなり、設計変更によって回避できると考えられるので、おおむね順調に進展している、と考えている。ヒトの体内で重要な働きをするタンパク質の多くは、濃度をμMにまで高めないと、効果的にリガンドと結合して特異的な機能を発現することができない。しかしながら、従来の1分子蛍光イメージング法では、このような高濃度条件下で目的の1分子だけを可視化することは不可能であった。そこで、改良型ゼロモード導波路(ZMW)と蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)とを融合した新しいリアルタイム1分子蛍光イメージングを開発することを目的として以下の実験を進めた。(1)モレキュラービーコン(MB)を用いたDNA折り畳みの1分子蛍光イメージング:平成26年度の成果(FRET効率が低下しないZMW構造設計)を基盤として問題点(MBの開閉制御性)の改良に取り組んだ。溶液を含ませたZMWの温度(室温100°C)を構築し、制御温度に対するMBの開閉とFRET計測を行った。温度上昇に伴うFRET効率の低下が知られているが、1分子計測の問題になるほどではなかった。温度によるMB開閉の制御性について、ハイブリダイゼーションによる開閉制御性(平成26年度実施)に比して優位性は見られなかった。(2)インフルエンザ由来のエンドヌクレアーゼがDNAに結合・DNAを切断・DNAから解離する素過程の1分子蛍光イメージング: ZMW内に固定した1本鎖DNAの末端とエンドヌクレアーゼとをそれぞれCy5とGFPとで蛍光標識し、2色の1分子蛍光イメージングを実施した。(1)で構築した温度制御系により、ZMWに固定されたDNAの切断に対する活性を1分子レベルで定量的に評価した。1本鎖DNA切断に伴い、GFP修飾エンドヌクレアーゼ由来の蛍光を検出することにも成功した。生体分子間の結合・解離を時間軸上で解析できるゼロモード導波路(ZMW)を用いたリアルタイム1分子蛍光イメージング法を高度化するために,ZMWと蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)とを組み合わせた新しい1分子蛍光イメージング法が高い実行可能性を評価した。さらに本手法を拡張するための要素技術の開発ーDNAアプタマを用いたセンサ応用,DNA切断イベントの1分子計測,細胞の特定部位のアライメント法の開発ーにも取り組んだ。・ZMW内への1分子MBの固定法を構築した。・ZMWでの1分子MBからのFRET計測系を構築した。・ZMWでの1分子MBからのFRET効率が高いことを実証した。・相補的DNAとのハイブリダイゼーションによって1分子MBを人為的に開環させることに成功した。・当初、平成27年度に実施を計画していた項目に前倒しで着手している。(1)DNAアプタマを用いたセンサ応用:課題は、DNAアプタマをZMWに固定する化学官能基と、FRETを生じさせるためのドナー/アクセプタ蛍光分子とを、グアニンカルテットによるDNAアプタマの折りたたみを阻害しないように、DNA配列に組み込むことである。
細胆管癌および肝内胆管癌の腫瘍発生に関わるインテグリンβ4,β6の発現と機能解析

肝内胆管癌および細胆管細胞癌は、その発生母地と発現形質の特徴から分類について国内外ともに議論されており、これらの腫瘍本態の性質を解明し分類することが必要とされている。本研究では肝内胆管癌の組織材料および株化培養細胞を用い、インテグリンα6β4(β4)およびαvβ6(β6)とその細胞外基質を介した腫瘍進展に関わる因子を解析し、進展機序を解明することを目的とした。昨年度までに、肝内胆管癌組織48症例を用いてインテグリンβ4, β6の発現を免疫組織化学的に解析した。その結果、β4は96%, β6は73%で発現がみられた。臨床病理学的所見との関連を比較すると、発生部位では傍肝門部型で末梢型よりも強く、肉眼型では胆管浸潤型および胆管内発育型で腫瘤形成型と比較して強い発現を示した。分化度は高分化型および中分化型と比較して低分化型で低い発現がみられた。また浸潤性発育で強い発現を示し、胆管侵襲の有無とも関連がみられた。細胞外基質との関連では、β4はラミニン5と、β6はテネイシンCとそれぞれ発現に相関がみられた。発現の局在は、β4, β6の発現が強い部位でラミニン5,テネイシンCも強い発現を示した。臨床病理学的所見との関連では、ラミニン5は胆管浸潤型および胆管内発育型、浸潤性発育で強くみられ、肝静脈侵襲、リンパ節転移、予後と関連がみられた。テネイシンCの発現は浸潤性発育と関連がみられた。さらにβ6により活性化されるTGF-β1と、TGF-β1により活性化し増生するα-SMA陽性癌関連筋線維芽細胞との関連を免疫組織化学的および培養細胞株を用いて調べた。TGF-β1は46%で陽性で、β6と正の相関を示した。臨床病理学的所見との関連では、門脈侵襲、肝内転移、予後と関連がみられた。α-SMAは85%で癌細胞の腺管周囲に陽性であった。最終年度は、学会発表および論文投稿を行い、成果を報告した。肝内胆管癌および細胆管細胞癌においては、その発生母地と発現形質の特徴から分類について国内外ともに未だ議論の余地があり、これらの腫瘍本態の性質を解明し分類することが必要とされている。本研究では、肝内胆管癌、細胆管細胞癌の組織材料および株化培養細胞を用いて、インテグリンβ4およびβ6とその細胞外基質を介した腫瘍形成に関連する因子を詳細に検討し、さらに両者の鑑別が困難な非典型例や混合型肝癌における発現を解析することにより、肝内胆管癌と細胆管細胞癌の腫瘍発生機序を解明することを目的としている。本年度は、肝内胆管癌組織においてβ4とそのリガンドであるLaminin-5、β6とそのリガンドであるTenascin Cの発現を免疫組織化学的に解析した。その結果、β4は96%、β6は73%で発現が見られ、臨床病理学的解析を行うと、発生部位別では傍肝門部型で末梢型より強い発現を示し(β4:70%vs32%, β6:50%vs18%)、肉眼型別では腫瘤形成型と比較して胆管浸潤型および胆管内発育型を含む例で強い発現を示した(β4:31%vs100%)。分化度では高分化型および中分化型と比較して低分化型で有意に低い発現がみられた(β4:51%vs8%、β6:34%vs0%)。さらに、膨張性発育と比較して浸潤性発育で強い発現を示し(β4:22%vs56%、β6:13%vs36%)、胆管侵襲の有無とも関連する可能性が示された(β4:58%vs18%、β6:35%vs14%)。β6の発現は、Tenascin Cの発現と相関がみられ、さらにEMAの細胞質型で強く、膜型で弱い発現がみられ、EMA発現パターンとの関連が示された。β4およびβ6の発現は共に、肝内胆管癌の発生部位、肉眼型、分化度、発育形式、胆管侵襲と関連することが明らかとなり、癌の浸潤や進展と関わる可能性が考えられた。さらに、大型胆管から発生する癌と末梢小型胆管から発生する癌では性質が異なる可能性が示された。本年度は、組織材料を用いた免疫組織化学的解析を実施予定であった。材料収集と免疫染色はすべて終了しており、少量の解析が残るのみである。混合型肝癌はWHO分類でclassical typeとsubtypes with stem-cell features 3亜型に分類されるが、診断基準が明確でなく不明な点が多い。これまでにインテグリンβ4およびβ6は肝内胆管癌で強い発現を示し細胆管細胞癌と肝細胞癌では有意に低い発現を示すこと、肝内胆管癌では発生部位、肉眼型、胆管侵襲、分化度、細胞外基質の発現と関連することを明らかにした。今年度は、混合型肝癌各亜型におけるインテグリンβ4, β6と細胞外基質の発現を解析し腫瘍の発生や進展との関連を調べた。その結果、混合型肝癌各亜型のstem cell featuresで、低頻度だが明瞭な発現を示した(β4: 3例, β6: 2例,ラミニン-5: 5例,テネイシンC: 6例)。

またインテグリンの発現よりも細胞外基質の発現が高頻度にみられた。これらの発現は臨床病理学的所見とは有意な関連はみられなかったが、ラミニン-5,テネイシンCがインテグリンβ4およびβ6を誘導する可能性と、これらの発現が混合型肝癌におけるstem cell featuresの性質の維持と関連する可能性が推測された。今年度は、多彩な特徴を示す混合型肝癌の免疫組織化学的解析に予定よりも少し時間がかかった。肝内胆管癌組織48症例についてβ4, β6インテグリンの発現と細胞外基質との関連を調べた結果、β4のリガンドであるラミニン5、β6のリガンドであるテネイシンCの発現とそれぞれ関連がみられた(P<0.001, P=0.016)。β4とラミニン5, β6とテネイシンCの発現を蛍光二重染色で解析すると、β4, β6の発現は細胞膜および基底膜様部位に局在し、ラミニン5,テネイシンCの発現は細胞質にみられた。β4, β6の発現が強い部位でラミニン5およびテネイシンCも強い発現を示していた。ラミニン5およびテネイシンCの免疫組織化学的発現と臨床病理学的所見との関連を調べた結果、ラミニン5の発現は肉眼型では胆管浸潤型および胆管内発育型で腫瘤形成型よりも強く(P=0.019)、発育様式では浸潤性発育で膨張性発育よりも強かった(P=0.045)。肝静脈侵襲(P=0.034)、リンパ節転移(P=0.029)との関連がみられ、ラミニン5の発現が強いほど生存率が低かった(P=0.015)。テネイシンCの発現は、浸潤性発育との関連がみられた(P=0.031)。インテグリンβ6により活性化するTGF-β1と、TGF-β1により活性化し増生するα-SMA陽性癌関連筋線維芽細胞を免疫組織化学的に解析しβ6の発現との関連を調べた。TGF-β1は細胞質に発現がみられ22例(46%)が陽性(>25%)で、β6と正の相関を示した。臨床病理学的所見との関連を比較すると、門脈侵襲、肝内転移、生存率と関連がみられた。α-SMAは41例(85%)で間質に陽性(>25%)でβ6との相関はみられなかった。以上より、β4, β6インテグリンは細胞外基質ラミニン5,テネイシンCおよびTGF-β1の発現と関わり、肝内胆管癌の亜分類と関連して異なる発現を示すこと、さらに臨床病理学的所見と関連することが明らかとなった。計画当初よりも免疫組織化学的解析の比重が高くなったが、結果をまとめて論文にすることができた。肝内胆管癌および細胆管細胞癌は、その発生母地と発現形質の特徴から分類について国内外ともに議論されており、これらの腫瘍本態の性質を解明し分類することが必要とされている。本研究では肝内胆管癌の組織材料および株化培養細胞を用い、インテグリンα6β4(β4)およびαvβ6(β6)とその細胞外基質を介した腫瘍進展に関わる因子を解析し、進展機序を解明することを目的とした。昨年度までに、肝内胆管癌組織48症例を用いてインテグリンβ4, β6の発現を免疫組織化学的に解析した。その結果、β4は96%, β6は73%で発現がみられた。臨床病理学的所見との関連を比較すると、発生部位では傍肝門部型で末梢型よりも強く、肉眼型では胆管浸潤型および胆管内発育型で腫瘤形成型と比較して強い発現を示した。分化度は高分化型および中分化型と比較して低分化型で低い発現がみられた。また浸潤性発育で強い発現を示し、胆管侵襲の有無とも関連がみられた。細胞外基質との関連では、β4はラミニン5と、β6はテネイシンCとそれぞれ発現に相関がみられた。発現の局在は、β4, β6の発現が強い部位でラミニン5,テネイシンCも強い発現を示した。臨床病理学的所見との関連では、ラミニン5は胆管浸潤型および胆管内発育型、浸潤性発育で強くみられ、肝静脈侵襲、リンパ節転移、予後と関連がみられた。テネイシンCの発現は浸潤性発育と関連がみられた。
高度好熱菌における動物細胞MDR類似輸送担体の機能解析

基質の検討を行う目的で、大腸菌のpETsystemにより、TmlpAおよびTmlpBの大腸菌における大量発現系の構築を試みた。これら蛋白は膜蛋白の10%発現していた。大腸菌膜蛋白のSDS電気泳動をPVDF膜にブロッティングし、N末アミノ酸シークエンスを行い、目的とする蛋白であることを確認している。この組み換え体蛋白は、dodecyl-maltosideには可溶化されず、pentadecafluorooctanoic acidに可溶化されることを見いだした。これら界面活性剤を組み合わせることにより、90%以上の部分精製が可能となった。また、native PAGEにより分離したTmlpはATPase活性を有していた。これより、これら界面活性剤用いてTmlpの活性を保持したまま膜から可溶化することが可能であることが明らかになった。更に、これら組み替え体にはHis Tag(ヒスチジン6個)付加してあり、Niカラムにより迅速に精製を行うことができるようにしてある。界面活性剤の組み合わせ可溶化及びNiカラム系を用いて、膜分画からの精製を試みる。精製後、リポソームへの再構成を行った。リポソーム再構成系を用いて、輸送基質の検索を行った。様々な脂溶性薬物(カチオン、アニオン、電気的中性)、水溶性薬物について検討したが、基質の同定にはいたらなかった。大腸菌での発現系では、活性を保持していない可能性も考えられる。そこで、高度好熱菌においての発現プラスミッドを用いて発現の構築を検討した。現在、その発現系を用いて、基質の同定を試みている。現在のところ、50種類の薬物を検討したが、どれも基質ではない結果となった。申請者は、高度好熱菌HB8から、動物細胞MDRに非常に相同性の高い、2つのABC輸送担体、TmlpA及びTmlpBが連なる遺伝子群をクローニングした。申請者は、カナマイシン耐性遺伝子(耐熱カナマイシン・デアミナーゼをコードする遺伝子(筑波大学・星野先生から提供していただいたもの))を用いてTmlpA,TmlpB遺伝子を欠損させた株を幾つか作成した。もともと、キノロン系抗生物質、砒素など様々な薬物に対して強い耐性を示めすことを確かめている。この耐性が先ほどの欠損株においてどの様に変化するかを検討した。欠損株は、キノロン系抗生物質をのぞいて、ほとんどの薬物に対する耐性度は変化しなかった。キノロン系抗生物質を運んでいることが示唆された。しかしながら、その耐性度の変化は2倍程度であった。この理由として、これら遺伝子の発現量そのものが低い可能性が推察された。そこで、RT-PCR及びNorthern blot解析を行い、これら輸送担体の発現量を検討した。その結果、これら遺伝子のうち、TmlpBの発現はみられたが、TmlpAの発現は確認出来なかった。また、TmlpA,TmlpBはそれぞれ別々のプロモータにより発現していることが明らかになった。そこで、基質の検討を行う目的で、大腸菌のpETsystemにより、TmlpAおよびTmlpBの大腸菌における大量発現系の構築を試みた。大腸菌膜蛋白のSDS電気泳動をPVDF膜にプロッティングし、N末アミノ酸シークエンスを行い、目的とする蛋白であることを確認している。また、nativePAGEにより分離したTmlpはATPase活性を有していた。今後、リポソームへの再構成を行い、この輸送輸送担体の基質の検討を行う。
高温超伝導薄膜の弱磁界下での電磁物性の解明および新しい磁気機能の開拓

本研究の目的は、良質な酸化物超伝導体を用いて、電子材料としての高温超伝導薄膜の性能を決定づける弱磁界下での電磁パラメータの精密な評価を行い、パラメータ間の相互の関係を総合的に把握することにより、酸化物超伝導体薄膜の弱磁界下での電磁物性を解明すること、およびこれを更に進めて新しい磁気機能の探索を行うことである。本年度は、研究実施計画に基づき以下のような成果を得た。1.薄膜作製および磁気パラメータの評価に関しては、膜の電磁モデルとの詳細な比較を行った。2.薄膜のマイクロ波特性に関しては、コプレーナ線路を用いて、磁気進入長、表面抵抗の評価を行った。3.電流による磁気機能の探索を行った。
PKRによる骨石灰化調節機構の解明

PKRによる石灰化制御機構を転写因子STAT1に着目し分子レベルで追求した。骨芽細胞においてSTAT1蛋白質がSLIM依存的にユビキチン化され代謝されていることが判明した。また、このような正常なSTAT1蛋白質の代謝にPKRが必要であることが明らかとなった。しかし、PKRがどのような機序でSLIMの機能を調節して、STAT1の発現を制御するのかは、今回明らかに出来なかった。今後は、PKRがSLIMの機能を制御する機構を追及するとともに、そのようなSLIM制御が骨芽細胞の分化・石灰化にどの程度の影響を及ぼすかを判定していく必要がある。本研究では、PKRによるSTATI発現亢進機序について詳細に検討を行った。1.STATI発現亢進は蛋白質レベルであった。Real-time PCRによりSTATI mRNAの発境量を、PKR変異細胞と野生型細胞において比較した。PKR変異細胞においてSTATI mRNAの発現量は抑制されていた。また両細胞に翻訳阻害剤であるシクロヘキシミドを作用させ、蛋白質の新合成を阻害した後、STATI蛋白質の発現量を阻害した。シクロヘキシミド存在下で、STATI蛋白質は野生型細胞においては経時的に減少したのに対して、PKR変異細胞ではこのような減少は見られなかった。以上の結果よりPKR変異細胞におけるSTATI発現亢進は蛋白質レベルであると結論した。2.PKRはSTATI蛋白質のユビキチン化に関与していた。ユビキチンアッセイを行い、PKR変異細胞と野生型細胞におけるSTATI蛋白質プロテアソームのユビキチン化の状態を比較した。野生型細胞ではSTATI蛋白質の一定量がユビキチン化するのに対して、PKR変異細胞ではSTATI蛋白質のユビキチン化は見られなかった。以上よりPKRがユビ、キチン経路を介してSTATI蛋白質の安定化に関与することが明らかになった。本研究課題では、PKRの骨代謝調節機構を解明するために、転写因子STAT 1の発現及び機能に着目し解析を行った。前年度までに、石灰化を起こさないPKR変異細胞において見られるSTAT1発現亢進は蛋白質レベルで調節されていること、またPKR変異細胞においてSTAT1蛋白質のユビキチン化が起きないことが明らかとなっている。本年度は、PKRがSTAT 1蛋白質のユビキチン化を制御する機構を、STAT 1のユビキチンリガーゼであるSLIM(STAT-interacting LIM protein)に着目して解析し、以下の結果を得た。1. SLIMの発現について野生型とPKR変異型の骨芽細胞を5日間培養した後RNAを抽出し、リアルタイムPCR法を用いてSLIM mRNAの発現量を検出した。両群においてSLIM mRNAの発現量に差は無かった。2. SLIMの細胞内局在についてカバーガラスを入れたシャーレ上で、両細胞を野生型とPKR変異型の骨芽細胞を5日間培養した。培養5日後の細胞をホルマリンで固定し、メタノールによる透徹後、抗SLIM抗体を用いて免疫染色を行う。両細胞におけるSLIMの局在を蛍光顕微鏡下で観察した。SLIMは細胞骨格(F-actin)上に局在し、両細胞において差は無かった。
アミノ酸残基間ネットワーク比較によるタンパク質構造比較解析

本研究は三次元のタンパク質構造情報をアミノ酸残基間におけるネットワークと捉え、タンパク質間の構造類似性の検出方法を新たに提唱するものである。タンパク質構造は本質的に柔軟な構造を持つが、タンパク質の構造が変化してもアミノ酸残基間のネットワークの多くが保持されるという性質に着目した研究である。この研究により三次元座標の比較では検出できない構造類似性を新たに検出できるようにななった。本研究の成果であるコンピュータープログラムはhttp://www.pharm.kitasato-u.ac.jp/bmd/bmd/Download_files/CABalign/index.htmlで、公開されている。本研究の目的は、タンパク質間の構造類似性をアミノ酸残基間のネットワーク類似性から検出する方法の開発である。本研究より、従来検出することのできなかったタンパク質構造間の類似性を高精度に検出することが可能となるとなる。さらに、タンパク質構造内のアミノ酸残基の対応関係を構造アライメントとして計算することも可能となる。特に構造変化が大きく起こるタンパク質構造であっても、構造類似性と構造アライメントを高精度に検出できるという特徴を持つ。本研究代表者は平成26年度における研究計画の下、以下の内容を達成した。1.本研究の理論を実装したコンピュータープログラムの開発:一般的なコンピューターでも動作するC言語で記述されたプログラムの開発を行った。本研究で開発されたプログラムは論文出版時に一般に公開する予定である。2.本研究の検証を行う為の評価系の開発:パラメーターの最適化と精度を検証するための大規模な評価系の準備を行った。構築された評価系に基づき、プログラムの最適化計算を実行中である。3.平成26年度における研究結果の学会発表:2014年年会JSBi2014・第3回生命医薬情報学連合大会においてポスター発表を行った。さらに第42回構造活性相関シンポジウムにおいて口頭発表を行った。この発表により優秀発表賞(SAR Presentation Award)を受賞した。4.平成26年度における研究結果についての論文執筆および投稿:本研究で得られたデータについて論文を執筆し、欧文雑誌に投稿中である。この研究により三次元座標の比較では検出できない構造類似性を新たに検出できるようになると期待される。本研究代表者は平成27年度における研究計画の下、以下の内容を達成した。1.パラメーター最適化による精度の検証と計算速度の改善:平成26年度より行われていたプログラムの最適化計算を行った。約25万データにおける精度の検証も行った。2.研究成果の論文発表:欧文雑誌PlosOneで本研究の内容を発表した。3.本研究の理論を実装したコンピュータプログラムの公開:北里大学のWebサイトより本研究で開発されたコンピュータープログラムを公開した。4.平成27年度における研究成果の学会等における発表:国際学会GLBIO2015においてポスター発表を行った。また、発表した論文がIndiana Japan Chamberより2015 Outstanding Research Paper Awardを受賞し、受賞講演を行った。平成27年度の研究実施計画では、1.理論の実装とプログラミング、2.比較・検証、の2つを行う予定であった。この計画に従い、大規模な並列計算によるパラメーターの最適化、比較検討を行った。前年度平成26年に行われたアルゴリズムの改良により、計算速度の大幅な改善が見られた。その結果、当初予定していたデータ数の最大2.5倍(25万データ)の計算を実行した。同時に、従来法との比較を行い、その精度検証を実施した。比較検証のために用いた従来法はDali, TMalign, FATCAT, HHalignの4つである。当初の計画よりも比較検証に用いる従来手法の数を増やして検証を行った。本年度ではさらに平成27年度に得られた検証結果と開発された手法について論文執筆、投稿、公開を行うことができた。これは当初平成28年度に行われる予定であったため、当初の計画以上の研究が進展していると判断できる。本研究課題の平成28年度における研究計画では、(1)データの解析と(2)学会論文などでの研究成果の発表を行う計画であった。(1)データの解析(2)研究成果の発表学会発表とは別に、国内外の研究者と本研究成果を使用した共同研究の話し合いを行った。今後、公開されているプログラムを使用して国内外の研究者との共同研究を行う予定である。平成26年度の研究実施計画では、理論の実装・プログラミングを行う予定であった。研究実施計画に基づき予定されていた3つ項目について記述する。1.タンパク質残基間根とワーク

計算:タンパク質構造を三次元ポリゴンで表現し、アミノ酸残基間のネットワークを高速に計算するプログラムの開発を行った。2.アミノ酸残基間ネットワークに基づく構造アライメント:本研究の理論を実装したプログラムの開発を行った。研究開始当初に比べ大幅に高速化し、かつ高精度化されたプログラムが開発された。3.構造アライメントの精度評価:大規模な検証系を構築し、プログラムの精度評価が可能となった。平成26年度はこの検証系からパラメーターの最適化の実施も行われた。当初の計画以上に行われた研究内容:一般的に使用されている構造アライメントプログラムとの比較計算を行った。平成26年度に得られたデータに基づき、学会発表、および論文執筆を行った。論文は現在欧文雑誌に投稿中である。研究最終年度である平成28年度には、本研究の成果を学会発表などにより広く公開する予定である。さらに、本研究で開発されたコンピュータープログラムの改良を行い、さらなる計算効率の改善を図る予定である。また、本研究の手法を実際のタンパク質構造解析に適用し、適用例について、学会等で発表する予定である。バイオインフォマティクス研究実施計画に基づき、以下の3点を主に行う予定である。1.理論の実装・プログラミング:平成26年度に行われたパラメーターの最適化をさらに進める予定である。また、現在の手法をさらに発展させたアルゴリズムを加え、最適化・検証を行う予定である。2.比較検証:大規模検証データを使い、一般的に使用されている構造アライメントプログラムとの比較計算をさらに進める予定である。この内容は平成26年度にすでに一部が実行されている。3.平成26年度に投稿した論文の校正作業と追加データの計算研究計画当初、平成27年度に学会発表の旅費として10万円を使用する予定であった。しかしながら、当年度の前半に行われた国際学会GLBIO2015の参加には旅費が発生せず、当年度後半には論文執筆・投稿等を行っており予定していた学会への参加をすることができなかった。そのため、旅費の10万円に相当する額が次年度使用額として発生した。アルゴリズムの実装と評価系の整備が平成26年度の主な実施内容となっており、大規模計算クラスタ構築が困難となった。しかしながら、これらの研究により計算時間の大幅な高速化と精度向上が達成された。平成27年度に使用する予定であった旅費相当額については、平成28年度に学会に参加するための旅費とする予定である。また、当初予定したよりも大幅にデータ量が増えたため、データ保存用のハードディスクを追加購入する予定である。平成27年度の研究発表として論文投稿費用および英文校正費用が必要である。さらに国際学会での研究発表を行う予定である。
排尿の体位依存性に関する研究-超音波画像診断法を用いて-

本研究の目的は,よりよい看護技術を目指して,効率のよい快適な排尿体位を検討するための方法論を確立することにある。具体的には,体位と残尿量との関係を検討した。研究方法は,健常女性を対象としてベット上の5体位(0度,30度,45度,60度,90度)に対して床上排尿を行い,残尿量を測定した。結果は,以下の通りであった。1. 0度から30度程度の仰臥位,半座位では残尿が多い。2.座位(90度)では,腹部,臀部に便器があたり身体的苦痛があり,また不安定で上体を支えるのに疲れる。3. 45度から60度程度の半座位が身体的、精神的な苦痛も少なく残尿も少ない,より効果のよい排尿体位である。なお,この研究から超音波画像診断装置は対象に対して無痛性,非浸襲性,非感染症という点から,膀胱内残尿量測定に有用であることを示した。さらに、形態性超音波画像診断装置の看護臨床応用についても検討を試みた。その結果,排尿障害患者の看護アセスメント,ケアに有効であることが明らかになった。本研究は患者の負担が少なく、しかも膀胱内残尿量を減少させる姿勢を把握し、より自然でスムースな排尿支援のための具体的方法論の開発を目的としている。本年度は下記の2点に重点を置き以下の知見を得た。1.超音波画像装置を用いた床上排泄における体位依存性測定方法の検証超音波画像測定は画像処理解析プログラムを用いて、膀胱の超音波画像の断面積及びその積分である体積を求め、3次元立体像を構成し測定した。対象は30代から50代の健康な女性6人で、ベット上ので水平位(0度)から垂直位(90度)までの5段階の体位での信頼性、妥当性を検証した。その結果は以下の通りである。排泄体位は水平位あるいは上体30度挙上では、排尿しにくく残尿もみられる。上体を45度を中心に30度から60度挙上した体位が、安定しており残尿も少ない。年令が上がるにつれて体位に関係なく残尿が見られる。また、超音波画像による残尿量測定は、非侵襲的であり、比較的正確に残尿量が測定出来る事がわかった。2.排泄に関する調査表作成のための予備調査整形外科病棟入院中の患者50人を対象に、排泄方法、排泄にかかわる環境、身体状況や心理状況、入院前と後の排泄習慣の変化、意識を聞き取り調査した。調査結果を基にして調査表作成を行なう予定である。来年度は下記の点を課題として研究を進める。1.超音波画像装置を用いた床上排泄の体位依存性測定方法の確立中高年の女性に対象を絞りデーター数を増やし、データの信頼性を高める。2.携帯型超音波膀胱容量測定装置(ブラダースキャン)を用いて尿意のはっきりしない患者の排尿動態を把握し、尿失禁の予防など臨床看護においてブラダースキャンの有効利用について検討を行なう。本研究は患者の負担が少なく,しかも膀胱内残尿量を減少させる姿勢を把握し,よりスムーズな排尿支援のための具体的方法論の開発を目的としている。1.超音波画像診断による膀胱内尿量測定の検討尿量容積算出方法はこれまで楕円公式が用いられることが多かった。本研究では残尿量測定に積分方法を用いた。その結果その測定値と実測排尿量に良い相関がみられこの方法の有効性がわかった。2.携帯型超音波膀胱画像診断装置の検討超音波画像診断装置が,膀胱容量を測定するにあたって大変有効であることがあきらかになったが,それを臨床応用していくためには,携帯型画像診断装置(以下Bladder Scan)の活用が有効であろうと思われる。そこで,Bladder Scanの臨床応用の可能性を探るために,実際に使用している看護婦へのアンケート調査,および排尿障害に関する問題をもつ患者に対し,どのように使用できているのか,またそれによってどのように排泄障害が改善してきたかについて事例検討を行った。

その結果,看護婦からは,簡便さ,患者への非侵襲性などにおいて高い評価が得られ,臨床において活用できると評価された。実際に,臨床使用を行った事例を検討した結果は,導尿時期の判断の指標,頻尿の原因探索,自己導尿の導入時の患者の認識を高めるといったことなどに活用され,排尿障害の改善に役立っていた。しかし,測定者,測定時の体位などによる誤差がみられ,この誤差が臨床上,許容範囲のものなのか今後検討する必要があると思われ,今後さらに臨床応用していくためには,多くの課題が残されていることが指摘された。次年度の課題2)臨床応用に向けての検討3)研究成果のまとめ本研究の目的は,よりよい看護技術を目指して,効率のよい快適な排尿体位を検討するための方法論を確立することにある。具体的には.体位と残尿量との関係を検討した。研究方法は,健常女性を対象としてベット上の5体位(0度,30度,45度,60度,90度)に対して床上排尿を行い,残尿量を測定した。結果は,以下の通りであった。1.0度から30度程度の仰臥位,半座位では残尿が多い。2.座位(90度)では,腹部,臀部に便器があたり身体的苦痛があり,また不安定で上体を支えるのに疲れる。3.45度から60度程度の半座位が身体的,精神的な苦痛も少なく残尿も少ない,より効果のよい排尿体位である。なお,この研究から超音波画像診断装置は対象に対して無痛性,非侵襲性,非感染性という点から,膀胱内尿量測定に有用であることを示した。さらに,携帯性超音波画像診断装置の看護臨床応用についても検討を試みた。その結果,排尿障害患者の看護アセスメント,ケアに有効であることが明らかとなった。
多種脳画像による認知症の精神症状とQOLに関する神経ネットワーク障害の解明

背景と目的:認知症に併発する精神症状により、介護者と患者の生活の質(Quality of life:QOL)が低下するので、その神経基盤の解明は重要な課題である。しかしながら、精神症状は多彩であり、認知症の疾患別にその出現パターンは異なる。そこで、本研究では多種類の脳画像を用いて、1認知症に併発する精神症状の神経基盤、2精神症状と密接な関連のあるQOLの神経基盤の二点を明らかにし、認知症の精神症状とQOLに関連する神経ネットワーク障害の差異を、認知症の疾患別に比較検討するのが目的である。方法:認知症患者をリクルートし、検査を施行する。目標症例数は、各疾患で40例程度に設定する(Probable AD 40例、レビー小体型認知症40例、前頭側頭型認知症40例)。以下の検査を実施する。1臨床症状と高次脳機能の評価認知症臨床に熟練した専門医がNPI(精神症状の評価)やQOL-AD(QOLの評価)を施行。MMSEと前頭葉検査Frontal Assessment Battery (FAB)などの高次脳機能検査は心理士が施行する。2頭部MRIの画像頭部MRIのデータ収集には、3テスラのMRIを用いて、安静仰臥の状態で、全脳をカバーする三次元収集T1強調画像、相異なる25方向から拡散強調傾斜磁場(motion probing gradient: MPG)をかけた詳細な拡散テンソル画像を行う。3患者及び介護者の状況心理社会的背景の把握のために、患者の背後情報と主介護者の役割、介護状況なども把握しておく。結果:QOLの因子分析を行い「心理的幸福感」「対人関係」「身体と生活環境」の3因子を同定し、それぞれの脳血流による脳基盤を明らかにした。またアルツハイマー病の妄想の認知基盤も明らかにした。MRIによる妄想やQOLの神経基盤は解析中である。画像の解析状況は一部遅れている。2019年以後もひきつづき調査を継続し、データベース構築による解析を行う予定。2頭部MRIの画像とNIRS頭部MRIのデータ収集には、3テスラのMRIを用いて、安静仰臥の状態で、全脳をカバーする三次元収集T1強調画像、相異なる25方向から拡散強調傾斜磁場(motion probing gradient: MPG)をかけた詳細な拡散テンソル画像を行う。撮影画像は、DICOM画像ファイルとしてハードディスクに保存し、ワークステーションで解析を行う。結果:名古屋市立大学医学部倫理委員会及び八事病院の倫理委員会にて研究計画書を申請し承認を得た。双方での患者リクルートができるような体制を構築した。研究責任者が所属研究機関を移動(慶応義塾大学医学部→名古屋市立大学医学研究科)したので、研究組織を再構成する必要性があったため、研究準備が遅れている。3患者及び介護者の状況

心理社会的背景の把握のために、患者の背後情報と主介護者の役割、介護状況なども把握しておく。結果:QOLの因子分析を行い、3因子を同定した。脳画像に関しては、脳血流SPECTやMRIにより、妄想やQOLの神経基盤の解析を行うためリクルートを行い、一部は解析を行った。患者のリクルート状況が一部進んでいない。背景と目的:認知症に併発する精神症状により、介護者と患者の生活の質(Quality of life:QOL)が低下するので、その神経基盤の解明は重要な課題である。しかしながら、精神症状は多彩であり、認知症の疾患別にその出現パターンは異なる。そこで、本研究では多種類の脳画像を用いて、1認知症に併発する精神症状の神経基盤、2精神症状と密接な関連のあるQOLの神経基盤の二点を明らかにし、認知症の精神症状とQOLに関連する神経ネットワーク障害の差異を、認知症の疾患別に比較検討するのが目的である。方法:認知症患者をリクルートし、検査を施行する。目標症例数は、各疾患で40例程度に設定する(Probable AD 40例、レビー小体型認知症40例、前頭側頭型認知症40例)。以下の検査を実施する。1臨床症状と高次脳機能の評価認知症臨床に熟練した専門医がNPI(精神症状の評価)やQOL-AD(QOLの評価)を施行。MMSEと前頭葉検査Frontal Assessment Battery (FAB)などの高次脳機能検査は心理士が施行する。2頭部MRIの画像頭部MRIのデータ収集には、3テスラのMRIを用いて、安静仰臥の状態で、全脳をカバーする三次元収集T1強調画像、相異なる25方向から拡散強調傾斜磁場(motion probing gradient: MPG)をかけた詳細な拡散テンソル画像を行う。3患者及び介護者の状況心理社会的背景の把握のために、患者の背後情報と主介護者の役割、介護状況なども把握しておく。結果:QOLの因子分析を行い「心理的幸福感」「対人関係」「身体と生活環境」の3因子を同定し、それぞれの脳血流による脳基盤を明らかにした。またアルツハイマー病の妄想の認知基盤も明らかにした。MRIによる妄想やQOLの神経基盤は解析中である。画像の解析状況は一部遅れている。平成29年度以降もひきつづき調査を継続し、患者リクルートを進めていき、データベースを構築する。2019年以後もひきつづき調査を継続し、データベース構築による解析を行う予定。患者リクルートに遅れが生じているので、資料準備・整理等のための人件費や消耗品、研究に関する打ち合わせの旅費や学会参加費などを翌年度に繰り越すことにした。
細胞外に放出される膜小胞エクソソームを介したＰＬＳＣＲ３の脂肪細胞分化制御機構

我々はヒト胎児腎由来HEK293細胞に過剰発現させたphospholipid scramblase 3 (PLSCR3)が細胞外に膜小胞(エクソソーム)として分泌されることを既に報告したが、本研究により、マウス脂肪前駆細胞3T3-L1において、細胞内のPLSCR3量は分化に伴い減少するが、細胞外に膜小胞に含まれて放出される量は増加することを明らかにした。また、3T3-L1細胞に恒常的にPLSCR3を発現させると脂肪細胞分化が抑制されること、また、転写カスケードにおいて後期分化因子の発現誘導を抑制することが判明し、PLSCR3が脂肪細胞分化における負の制御因子として作用することが示唆された。PLSCR (phospholipid scramblase)は膜リン脂質の外葉と内葉の間でフリップ・フロップを行う因子として報告されたが、そののち本来のリン脂質混合因子は別に存在することが明らかとなり、生理的機能は不明となっている。そのアイソフォームのひとつ、PLSCR3のノックアウトマウスは腹部に脂肪が蓄積することが報告されている。我々はPLSCR3がヒト胚性腎細胞HEK293に過剰発現させると細胞外に膜小胞(エクソソーム)として分泌されることを報告していた。本研究では、マウス脂肪前駆細胞においてPLSCR3が細胞外にエクソソームとして分泌されていることを明らかにした。また、常法に従いDexamethasone, 3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX), insulin添加により分化誘導を行うと、ウェスタンブロッティングによるPLSCR3の細胞内存在量は著しく低下していた。また、定量的RT-PCRによりPLSCR3のmRNA量を測定したところ、分化の指標となるトリグリセリド蓄積やPPARγなど転写因子mRNAの増加にともないPLSCR3 mRNAは減少していたものの、タンパク質レベルでのPLSCR3減少量を説明することはできなかった。一方、エクソソーム画分のPLSCR3は増加しており、分化誘導による分泌亢進が、結果として細胞内のPLSCR3タンパク質の量的減少にも関わっていることが判明した。HEK293細胞で発現させたPLSCR3を含むエクソソーム画分の脂肪細胞分化に対する影響を調べたが、顕著な効果は得られず、エクソソーム中のPLSCR3が生理機能をもつかどうかは不明である。むしろ細胞内のPLSCR3が分化を抑制していると解釈する方が正しい可能性があり、今後の研究の方向性が得られた。Phospholipidscramblase 3 (PLSCR3)はリン脂質二重膜における脂質不均等分配を解消する因子ファミリーの一員として報告されたが、その生理機能の詳細は不明である。我々はヒト胎児腎由来HEK293細胞に過剰発現させたPLSCR3が細胞外に膜小胞(exosome、エクソソーム)として分泌されることを既に報告した。本研究により、マウス脂肪前駆細胞3T3-L1において、内在性のPLSCR3発現を免疫ブロット法により検出が可能であること、細胞内のPLSCR3量は分化に伴い減少するが、細胞外に膜小胞に含まれて放出される量は増加することを明らかにした。また、3T3-L1細胞に恒常的にPLSCR3を発現させるとトリグリセリド蓄積を指標にした脂肪細胞分化が抑制されること、また、定量リアルタイムPCRにより特異的mRNAを測定したところ、転写カスケードにおいて前期分化転写因子C/EBPβおよびC/EBPδの発現誘導には影響を与えないが、後期分化転写因子PPARγおよびC/EBPαの発現誘導を抑制することが判明し、PLSCR3が脂肪細胞分化における負の制御因子として作用することが示唆された。農芸化学・応用生物化学これまで内在性のPLSCR3がエクソソームとして分泌される細胞株がなかったため研究に制約があったが、脂肪前駆細胞3T3-L1がPLSCR3を分泌していることが判明し、当初の目的を達することができた。PLSCR3が脂肪細胞分化に伴って減少することの生理的意義について明らかにする必要がある。PLSCR3のRNA干渉法によるノックダウンや強制的過剰発現によるPLSCR3の発現レベルの人為的調節が脂肪細胞分化に与える影響を調べることにより一定の回答が得られると期待される。また、脂肪細胞分化過程には転写カスケードが知られており、個々の分化マーカーのRT-qPCRによる解析を行い、PLSCR3の作用点を明らかにする必要がある。脂肪細胞分化の定量的解析に必要なRT-qPCRを行うための各種プライマー設計を行ったが、試行錯誤のため時間がかかり、本格的な解析にまでは至らなかった。脂肪細胞分化の統計的な定量解析をする必要があり、培養ディッシュ、培地、分化誘導剤、トリグリセリド定量キット、RNA抽出キット、抗体など多量の各種試薬・消耗品の使用が見込まれる。