hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
糖尿病による骨／骨髄相互連関の幹細胞分化誘導障害における線溶系因子の役割の解明

そこで、研究計画を少し変更し、そのPlgの骨髄造血幹細胞に関与する機構解明を先行させた。その結果、骨損傷により誘導される骨髄造血幹細胞数変化に対して、PlgとSDF-1発現が連動していることを見出した。また、該当年度計画していた骨修復過程における骨髄幹細胞の挙動に対する糖尿病病態の影響についても検討した。その結果、マウスにおける糖尿病病態は骨髄幹細胞の異常を引き起こすことを示唆した。また、該当年度計画予定していた線溶活性調節による骨軟骨再生促進効果の解析に対する実験条件設定は、次年度に行うことに変更した。研究実績の概要のように、一部計画変更があったが、ほぼ計画通り進み、予測されうる結果が得られた。平成29年度は、線溶系因子のプラスミノーゲン(Plg)遺伝子欠損(KO)マウスと糖尿病病態マウスを用いて骨損傷後の修復過程での骨髄幹細胞の分化誘導機構に対する線溶系因子の役割と糖尿病の影響を解明する目的で行った。1.骨損傷で誘導される骨髄幹細胞変化に対するPlgとSDF-1発現の連動機構の解明1).マウスの骨損傷後の骨組織におけるSDF-1発現と他の因子の遺伝子およびタンパク質発現の解析:PlgKOマウスでは、PlgWTマウスに比べ、骨損傷後の骨組織でSDF-1発現の低下を示し、さらにtransforming growthfactor-b(TGF-b)の発現低下と連動していた。2).細胞培養系によるSDF-1発現と他の因子の遺伝子発現解析:マウスの骨髄細胞から分化した骨芽細胞と頭蓋骨の骨芽細胞では、PlgKOマウスでPlgKOマウスに比べSDF-1mRNAとTGF-bの発現が低下していた。以上の結果より、骨損傷で誘導される骨髄幹細胞変化に対する組織線溶系の関与は、SDF-1とTGF-bの発現連動機構が関わることを示唆した。2.糖尿病病態で誘導される骨髄幹細胞異常における骨修復過程の解析糖尿病誘発マウスは、FACS解析により骨髄幹細胞異常がみられた。また、骨損傷で引き起こされる骨髄造血幹細胞の誘導は、抑制されていた。一方、糖尿病誘発マウスの骨損傷後の修復過程で骨形成能が抑制されていた。さらに、糖尿病誘発マウスの骨損傷後のマクロファージの動員が抑制されていた。以上の結果より、糖尿病は骨髄幹細胞異常を誘導し、骨損傷後の修復障害に関与することが示唆された。骨損傷後の修復過程で線溶系因子であるプラスミノーゲン(Plg)の関与が考えられる。本研究は、骨損傷早期の骨髄造血幹細胞の誘導における組織線溶系の関与について検討した。Plg欠損は、骨損傷後の修復を遅延させ、SDF-1とTGF-β発現増加を阻害した。さらに、野生型マウスに対するTGF-βシグナル阻害剤投与は、骨損傷で誘導される骨髄HSC数の低下を阻害した。さらに、骨損傷により誘導されるSDF-1発現増加を抑制した。以上より、骨損傷後の骨修復早期における骨局所への骨髄からのHSC誘導に、組織線溶系により誘導されるTGF-βとそれに続く骨損傷部のSDF-1が関与することが示唆された。平成28年度以降は、当初予定していた計画通りに進める。まず、線溶系因子遺伝子欠損(KO)マウスの糖尿病病態における骨損傷モデルを用いて、骨軟骨再生過程での骨髄幹細胞の分化誘導機構に対する線溶系因子の役割を解明する。
サイトカイン受容体を介する細胞内シグナル伝達機構の解析

T細胞の細胞増殖は、活性化T細胞から産生されるインターロイキン2(IL-2)が、T細胞表面に存在する特異的IL-2受容体(IL-2R)に結合することにより誘起される。IL-2Rを構成する受容体サブユニットであるα,β及びγ鎖の構造に関しては多くの知見が得られていたが、IL-2Rが如何にして細胞内に細胞増殖性シグナルを伝達するかについては不明な点が多かった。IL-2Rを介する細胞内シグナル伝達においては、IL-2Rβ及びγ鎖が重要な役割を担っているが、本研究によりSrc-ファミリーチロシンキナーゼに加え、Syk及びJak1,Jak3といった一連の非受容体型チロシンキナーゼが、β及びγ鎖と共役しIL-2シグナル伝達において重要な役割を担っていることが明らかとなった。また、これらのチロシンキナーゼに加え、SH2領域を有するチロシンフォスファターゼであるSHP-2、及びβ鎖に会合する新規セリン/スレオニンキナーゼが、IL-2Rを介するシグナル伝達において重要な役割を担う可能性が示唆された。さらに本研究において、IL-2シグナルの標的遺伝子の検索を行ったところ、新たにbcl-2プロトオンコジーン、チロシンフォスファターゼLC-PTP及びBAG-1遺伝子を同定することが出来た。bcl-2,BAG-1遺伝子の誘導には、β鎖の細胞内serine-rich領域が、LC-PTP遺伝子の誘導には、β鎖の細胞内serine-rich,acidic両領域が必須であることが明らかとなった。Bcl-2の機能に関しては細胞死の抑制が知られていたが、今回Bcl-2が細胞周期進展においても重要な役割を担うことが明らかとなった。即ち、Bcl-2は、G1サイクリンの中でサイクリンD3のmRNAを安定化することにより、細胞周期の進展、特にG1からS期へ移行を制御していることが示された。本年度の研究により、(1)IL-2シグナル伝達において、IL-2Rβ鎖の細胞内領域に加え、IL-2Rγ鎖の細胞内領域が必須の役割を担うこと、特にIL-2のIL-2Rへの結合後これらIL-2Rサブユニットの細胞内領域が協調的に働くことが、増殖性シグナル伝達に重要であることが明らかとなった。また、IL-2Rγ鎖の細胞内領域は、IL-2シグナル伝達のみならず、IL-4,IL-7シグナル伝達においても重要な役割を担うことが示された。また、(2)IL-2シグナル伝達においてIL-2Rと物理的、機能的に共役しているチロシンキナーゼ(PTK)として、これまでにSrcファミリーPTKであるLck,Fynを同定していたが、今回新たにSykPTK及びJak1,Jak3PTKsを同定することに成功した。SykPTKは、IL-2Rβ鎖のセリン残基に富む細胞内“serine-rich"領域と共役していること、またJak1,Jak3PTKsはそれぞれIL-2Rβ鎖の細胞内“serine-rich"領域、IL-2Rγ鎖細胞内領域と共役していることが明らかとなった。加えて、SykPTKがIL-2刺激に伴うc-myc遺伝子の発現誘導に重要な役割を担うこと、またJak3(そしておそらくはJak1も)がIL-2刺激に伴うG1期からS期への細胞周期の進展に重要な役割を担うことを示唆する知見を得ることに成功した。

インターロイキン2受容体(IL-2R)を介する増殖性シグナル伝達において、Jak3チロシンキナーゼ(PTK)が必須の役割を担うことが明らかとなった。Jak3 PTKは、IL-2刺激に伴うc-myc及びc-fos遺伝子の発現誘導に重要な役割を担うことも明らかとなった。また、今回新たにIL-2シグナルの標的遺伝子としてチロシンフォスファターゼLC-PTPを同定することが出来た。IL-2Rβ鎖の構造と機能の連関解析により、IL-2Rβ鎖の細胞内′′serine-rich′′、′′acidic′′両領域がLC-PTPの発現誘導に必須であること、加えてIL-2Rβ鎖の細胞内C末端側半分の′′H′′領域がSTAT (Signal Transducer and Activator of Transcription)5の活性化に重要であることが明らかになった。STAT5の活性化に重要なIL-2Rβ鎖の′′H′′領域は、IL-2刺激に伴う細胞増殖には必須でないことから、STAT5は細胞増殖以外の細胞応答において重要な役割を担っている可能性が示唆される。さらに、キナーゼの自己リン酸化能を利用した′′in gelキナーゼ解析法′′により、IL-2Rβ鎖の細胞内領域と選択的に会合する新規セリン・スレオニンキナーゼ(分子量約80、85及び90kDa)を同定することが出来た。これら3つの異なる分子量を有するセリン・スレオニンキナーゼは、フォスフォペプチドマッピング解析から同一のキナーゼ分子が異なる修飾を受けたもの、あるいは類似のキナーゼであることが示された。本年度の研究においては、機能的IL-2受容体(IL-2R)を発現しているBAF-B03細胞を用いてIL-2刺激に伴うSH2領域を有するチロシンフォスファターゼSHP-1,SHP-2チロシンリン酸化の有無を検討した。その結果、IL-2刺激に伴いSHP-2が選択的にリン酸化を受けることが明らかとなった。また、そのチロシンリン酸化には、IL-2Rβ鎖のserine-rich,acidic両細胞内領域が必須であることが明らかとなった。今後IL-2シグナル伝達過程においてSHP-2チロシンリン酸化の担う機能の解析が待たれる。また、IL-2シグナルの新たな標的遺伝子の検索を野生型及び各種の変異体IL-2Rβ鎖を発現している細胞株を用いて試みたところ、Bcl-2に会合する蛋白質として同定されたBAG-1をコードしている遺伝子が誘導されること、ならびにその誘導にはIL-2Rβ鎖において細胞増殖に必須の細胞内serine-rich領域が重要であることが明らかとなった。さらに、Bcl2を恒常的に発現した細胞株において、増殖因子除去前後の各種G1cyclin蛋白質の量を比較したところ、cyclin D3が選択的に安定であることが明らかとなった。その制御機構を、各種の分子生物学的手法(nuclear run-on assay等)を用いて解析したところ、mRNAの安定性がBcl-2により亢進していることが明らかとなった。Bcl-2に関しては、これまで細胞死を抑制する機能が知られていたが、本年度の研究成果によりBcl-2が細胞周期進展においても重要な役割を担うことが明らかとなった。
アフリカにおける地方経済活性化と資源保全に関する実証研究－タンザニアの事例－

本研究では、タンザニアで2000年以降に顕著となってきた地方経済の成長のもとで、賦存する資源(天然資源あるいは人造資源である、木材、果樹、水資源)の持続的な利用が可能であるのかどうかを、数地点を研究対象として検討した。外発的な変容過程に対応しながら、各地域社会とその内部で活動する世帯は、異なる利用者・利用目的(生産者と商人、販売用と自給用、生活用と農業用等)の間で巧みな調整を行っていることが明らかになった。初年度である平成25年度には、5月と12月に研究打ち合わせの会を開催し、調査地選定に関わる意見交換を行った。研究代表者である池野がながらく調査対象地域として北東部タンザニアのキリマンジャロ州ムワンガ県と、研究分担者の上田がながらく調査を続けてきた北東部タンザニアのアルーシャ州アルメル県において、社会経済変容に関する調査を継続すること、また土壌、水利用、植生等に関して自然科学的な調査を開始することが合意された。さらに、上記の2箇所以外に、タンガ州ムヘザ県を新たな調査候補地として、事前調査することも合意された。国内においては、本調査研究課題に密接に関わっている地域経済振興についての文献を輪読する会も大学院生を交えて開催し、日本の地域経済振興の経験や問題点についての知識を深め、タンザニアへの応用の可能性について議論する機会を持った。海外調査に関しては、研究代表者が8月9月に予備的調査に出向き、年度末の3月に研究代表者、研究分担者全員で同時期にタンザニアに出かけた。タンザニアで学術調査するためには、中央政府からの調査許可が不可欠であり、また在留許可の取得も要請されている。さらに、中央政府からの調査許可を持参して、地方行政を担う州政府、県政府ならびに下位行政機関での調査の承認を必要としている。3月の出張時に新規の調査許可を取得でき、また在留許可については取得の見通しが立ち、調査対象予定の3州の州政府および県政府で調査の承認を取り付けられた。3月の出張時には、本調査研究の関係者全員が上記の調査予定地を訪問して、調査研究に関する具体的な検討課題をどのように設定しうるかについて、現地において意見交換することができたことも、大きな成果である。2年度目である平成26年度には、2014年8月9月と2015年2月3月に研究代表者と複数の研究分担者がタンザニアにおいて現地調査を行い、同時に現地で研究打ち合わせを行った。平成26年度の現地調査の主たる目的は、初年度の平成25年度に暫定的に選定した調査対象地において予備的な実態調査を実施して、その対象としての妥当性を再検討することと、それぞれの地域において今後掘り下げていくべき調査課題を絞り込んでいくことであった。調査対象ちとして現地調査を行ったのは、(1)北東部タンザニア最大の都市であるアルーシャ州アルーシャ市、(2)換金作物としてコーヒーを栽培し植林を実践している同州アルメル県山地村、(3)人口が急増しつつある地方中小都市であるキリマンジャロ州ムワンガ県ムワンガ町、(4)換金作物のコーヒー栽培から撤退し、それを代替するような有力な換金作物が見つかっていない同県山地村、(5)山地村と比べて農業生態条件に恵まれない中でオレンジを換金作物として多量に栽培しているタンガ州ムヘザ県平地村であり、さらに中部タンザニアのモロゴロ州モロゴロ農村県山地村を訪問し、新たな換金作物としてバニラが普及しつつあることに着目した調査課題の設定について打ち合わせた。上記の調査対象地のうち、(2)と(4)にはすでに平成25年度に気象観測装置を設置しており、平成26年度の現地調査において、蓄積データを回収し、機器が正常に機能していることを確認した。日本国内においては、本調査研究課題に密接に関わっている地域経済振興についての文献を輪読する会も大学院生を交えて開催し、日本の地域経済振興の経験や問題点についての知識を深め、タンザニアへの応用の可能性について議論する機会を持った。3年度目である平成27年度には、8月と3月に研究代表者と複数の研究分担者がタンザニアにおいて現地調査を行い、同時に現地で研究打ち合わせを行った。平成27年度の現地調査の主たる目的は、前年度の平成26年度に行った複数の調査対象地での実態調査の結果を踏まえて、それぞれの地域においてさらなる成果を蓄積していくことであった。調査対象地として現地調査を行ったのは、(1)アルーシャ州アルーシャ市、(2)アルーシャ州アルメル県ソンゴロ村、(3)キリマンジャロ州ムワンガ県ムワンガ町、(4)ムワンガ県ムクー村、(5)タンガ州ムヘザ県ムクズィ村、さらに(6)モロゴロ州モロゴロ農村県キボグァ村である。上記の調査対象地のうち、(2)と(4)にはすでに平成25年度に気象観測装置を設置しており、平成26年度、平成27年度の現地調査において、蓄積データを回収し、機器が正常に機能していることを確認した。

さらに、別の科研費事業(基盤A、課題番号:2425-1005、研究代表者:田中樹(総合地球環境学研究所・准教授))と合同で、7月21日に国際研究集会、Livelihood and Landscape Management in Trans-Indian Ocean Perspective with Special Reference to Tanzania, Indonesia and Vietnamを京都大学で開催し、科研費メンバーに加えて、タンザニア、インドネシア、ヴェトナム人研究者にも発表してもらえた。第1に、平成27年7月渡航時にタンザニア中央政府からの調査許可を更新し、ついで在留許可の更新作業も順調に進めることができたため、調査許可に関わっている科学技術委員会ならびに出入国管理局の所在するダルエスサラーム市で時間を取られることなく、迅速に調査地での調査活動を開始することができた。第2に、前年度と同様に、タンザニアの現地において、研究代表者、研究分担者が一同に会して、複数の調査地の現状について意見交換することができ、一定の共通認識を持ち得たことは、今後の研究遂行上大きな意義があった。第3に、初年度に調査を開始した北東部タンザニア諸州諸県に加えて、中部タンザニアのモロゴロ州モロゴロ農村県での調査を継続し、地域間比較の視座を充実できるようになりつつある。第4に、日本国内においては、地域経済振興やタンザニアの最近の経済事情に関する読書会を開催し、知識の共有化を進められた。第5に、国際研究集会を開催し、タンザニア人研究者等と、問題意識を共有し、意見交換することができた。4年度目である平成28年度には、6月、8月、2月に研究代表者と複数の研究分担者がタンザニアにおいて現地調査を行い、同時に現地で研究打ち合わせを行った。平成28年度の現地調査の主たる目的は、前年度の平成27年度までに行った複数の調査対象地での実態調査の結果を踏まえて、それぞれの地域においてさらなる成果を蓄積していくことであった。調査対象地として現地調査を行ったのは、(1)アルーシャ州アルーシャ市、(2)アルーシャ州アルメル県ソンゴロ村、(3)キリマンジャロ州ムワンガ県ムワンガ町、(4)ムワンガ県ムクー村、(5)タンガ州ムヘザ県ムクズィ村、さらに(6)モロゴロ州モロゴロ農村県キボグァ村である。さらに、(2)、(4)、(6)との生態環境の比較を行うために、インド洋上のザンジバルにおいても短期の現地調査を行った。上記の調査対象地のうち、(2)と(4)にはすでに平成25年度に気象観測装置を設置しており、平成26年度平成28年度の現地調査において、蓄積データを回収し、機器が正常に機能していることを確認した。たとえば、平成28年10月からの小雨季には降雨が短期で中断してしまったという現地農家からの聞き取りと相応するデータが、観測装置で計測されていることを確認している。日本国内においては、本調査研究課題に密接に関わっている地域経済振興についての文献を輪読する会も大学院生を交えて開催し、日本の地域経済振興の経験や問題点についての知識を深め、タンザニアへの応用の可能性について議論する機会を持った。また、上記の(5)の現地調査においては、ソコイネ農業大学D.Mhando准教授と共同で調査を実施し、ザンジバルでの調査においてはザンジバル公立大学のM.Sheikh教授にアドバイスをいただき、意見交換にも務めた。このような現地での国際交流と成果の現地還元の準備を進められた。
神経ペプチドグレリンの新規受容体の同定と作用機構の解明

非修飾型グレリンを固定化したカラムを作成し、アフィニティ精製の手法によりブタ脳抽出液からグレリン結合たんぱく質を濃縮し、高塩濃度での溶出を行った後、SDSポリアクリルアミド電気泳動と質量分析を行って、グレリンに結合する蛋白質の同定を試みたが、有意なバンドを検出するには至らなかった。次に、マウス脳cDNAライブラリーを培養細胞に発現させ、標識グレリンを作用させ、グレリンを検出することにより、グレリンと結合するクローンのスクリーニングを行い、いくつかの陽性クローンを含む細胞集団があることを検出できたので、現在受容体のクローニングをさらに進めようとしている。グレリンは、胃から分泌される神経ペプチドで、受容体GHSRを介して食欲中枢の刺激などの生理作用を示す。血中グレリン濃度は神経性食思不振症などの病態での食欲と密接な関係を示すので、臨床的にも今後重要となる。グレリンは、そのアミノ末端側の脂質を介して受容体と結合することがわかっている。一方、アミノ末端側に脂質の修飾がない型(非修飾型)は受容体に結合しないため、当初特に生理的な作用はないと考えられてきた。しかし、血中には非修飾型が修飾型よりも多量に存在することや、非修飾型グレリンを投与すると修飾型グレリンによる食欲亢進を抑制することから、非修飾型グレリンが未知のグレリン受容体を介して修飾型グレリンのシグナルに干渉していると考えられる。連携研究者、乾が提供する非修飾型グレリンを固定化したカラムを作成し、界面活性剤で可溶化したブタ脳抽出液を材料として、アフィニティクロマトグラフィの手法でグレリン結合たんぱく質を濃縮し、抽出した。これをSDS電気泳動して、銀染色でたんぱく質を確認して切り出し、LC/MS装置を用いて質量分析で多数の候補分子の同定を試みた。しかしながら、バンドの数が予想以上に多かったため、同定には至らなかった。そこで、サブプール化されたマウスcDNAライブラリーをcos細胞に発現させ、標識グレリンを作用させ、陽性クローンを含むサブプールの分離と陽性細胞のピックアップを試み、現在はその解析を進めている。グレリンはそのアミノ末端側の脂質を介して受容体と結合することがわかっている。一方、アミノ末端側に脂質の修飾がない型(非修飾型)は受容体GHSRに結合しないため当初特に生理的な作用はないと考えられてきた。連携研究者、乾が提供する非修飾型グレリンを固定化したカラムを作成し、界面活性剤で可溶化したブタ脳抽出液を材料として、アフィニティクロマトグラフィの手法でグレリン結合たんぱく質を濃縮し、溶出した。これをSDS電気泳動して、銀染色でたんぱく質を確認して切り出し、LC/MS装置を用いて質量分析で多数の候補分子の同定を現在進めている。この実験は、目的分子がグレリンと結合できる活性を保ったまま可溶化されないと成立しないが、細胞膜を貫通している受容体は可溶化しにくいことが考えられる。そのため汎用されている界面活性剤を使った比較的温和な可溶化から、コール酸などの強力な可溶化まで検討する必要があり、これらも並行して現在進めている。デスアシルグレリンを固定化したカラムを作成し、界面活性剤で可溶化したブタ脳抽出液を材料として、アフィニティクロマトグラフィの手法でグレリン結合たんぱく質を濃縮、溶出した。その後、SDS電気泳動して、銀染色でたんぱく質を確認後に切り出し、LC/MS装置を用いて可能な限り多数の候補分子の同定を行った。しかしながら、多数のbandがあったため、まだ全ての同定には至っていない。引き続き、LC/MSによる受容体の候補となる分子の同定を進め、そのクローニングと、発現実験によるグレリンとの結合実験の系を確立する。さらに、アフィニティ精製による受容体同定の試みと並行して、パニング法を用いた方法でマウス脳のcDNAライブラリーを使った受容体スクリーニングの実験系を立ち上げる予定である。主として、消耗品購入に充てる予定である。例えば、サブプール化されたcDNAライブラリーのスクリーニングを効率的に行うため、DNA精製キット等を購入する予定である。
省資源低コストなリニアモータの実現を目指した基礎特性解明とドライブシステムの開発

省資源型で低コスト化が実現できるリニアスイッチトリラクタンスモータ(LSRM)を用いた,短ストロークから長ストロークの搬送まで同一の装置で担うことができる搬送用リニアモータの開発を目指している。本研究では,研究期間全体を通じてLSRM実験機の作製と実験による特性評価および高効率,高出力な運転ができる駆動システムの提案,作製と実験による評価を行い,LSRMの特性と課題を明らかにすることができた。本年度は,前年度に引き続いてLSRM実験機による基礎特性の測定と評価,また高効率,高出力な運転ができる駆動システムで推力脈動を低減する制御法を適用するための新しい回路を提案し,実験により特性の評価を行った。得られた主な研究成果は以下のとおりである。1、実験による特性評価:昨年度作製した電力測定システムに加え,新たに静推力測定システムを作製し,LSRMのギャップ長や励磁切り換えのタイミングが推力,速度応答,電流,電圧,電力,損失特性に及ぼす影響を実験により明らかにした。また,LSRMの動推力の評価方法として,磁気随伴エネルギーを利用した推力算出法を検討し,本手法を用いてLSRM実験機の推力測定を行いこれまで評価が難しかった動推力を明らかにすることができた。2、新しい駆動システムの実験による評価:電流形インバータ(CSI)によって駆動されるLSRMのための推力脈動低減法を提案した。推力脈動低減のために力分布関数(FDF)を用いた制御方法を検討し,FDFをCSIによって駆動されるLSRMに適用するための新しい回路構成を提案した。提案した駆動システムによるLSRMの性能をシミュレーションと実験により調べた。その結果,FDFを用いた推力脈動低減法はCSI駆動のLSRMにも適用可能であることを確認できた。本研究では,LSRMの詳細な基礎特性の解明および効率,出力を向上する駆動システムの開発を目的とする。そのために,シミュレーションと実験によりLSRMの静特性,動特性を明らかにし,従来の搬送用リニアモータと特性を比較することでLSRMの利点や課題を解明する。また,高効率,高出力な運転ができる新たな駆動システムの研究開発を行い,従来の駆動システムに対する優位性と課題を検証する。本年度はLSRM実験機の設計,試作,およびその基礎特性を実験により測定することを目的とした。得られた主な成果は以下のとおりである。1、LSRM実験機の設計と作製:有限要素法解析を用いてLSRM実験機の設計を行った。実験で高速運転時の特性測定を可能とするためにモータの極ピッチを短くし,巻線を持たない二次側を固定子側に長く配置するよう工夫して解析を実施した。固定子長1m,定格速度1m/s,定格推力50Nをもつ実験機の設計を完了した。2、実験システムの作製:実験機の駆動用に,可動子位置に応じた電流を一次巻線に供給するインバータを設計,作製し,さらにDSPを用いた制御システムを作成した。3、有限要素法解析による特性評価:有限要素法解析により,LSRMを用いた物流搬送システムの推力,出力,損失,効率特性を算出し,従来の物流搬送用リニアモータと比較した。その結果,従来のリニアモータに比べて同等もしくはそれ以上の出力および効率を得るための設計法についての知見を得た。4、シミュレーションモデルの構築:高効率,高出力な運転ができる駆動システムを解析的に検討するために,磁場解析と回路解析を連成したシミュレーションモデルを構築した。(遅れている内容)1、LSRM実験機の設計と作製:有限要素法解析を用いてLSRM実験機の設計を実施しており,予定していた設計を完了した。しかし,実験機の作製に想定していた以上に時間がかかり,平成28年度中に納品できなかった。そのため,平成28年度に予定していた基礎特性の測定が当初計画よりも遅れた。以上ことが主な理由により,現在までの進捗状況を「やや遅れている」と判断した。(順調に進展している内容)1、実験システムの作製:インバータシステムおよびDSP制御システムからなる駆動システムを作製し,LSRM実験機を駆動する準備は完了した。2、解析による特性評価:有限要素法解析により,物流搬送装置用LSRMの解析を行い,リニア同期モータに比べ効率,出力は若干劣るが,従来のリニア誘導モータに比べ同体格で効率,出力が向上できること等を確認した。3、シミュレーションモデルの構築:LSRM実験機の作製が遅れていることから,平成29年度の後半以降で実施することを予定している,磁場解析と回路解析を連成するシミュレーションモデルの構築を前倒しして開始した。以上のように,平成28年度の研究計画のみでみた場合は「やや遅れている」と判断したが,3年間の研究計画期間全体で考えた場合は「おおむね順調に進展している」ともいえる。本年度はLSRM実験機による基礎特性の測定と評価,および高効率,高出力な運転ができる新しい駆動システムの提案と評価を目指して研究に取り組んだ。1、LSRM実験機による基礎特性の測定と評価:前年度に設計したLSRM実験機の作製を完了し,前年度に作製済みの駆動システムと組み合わせて実験システムを構築した。

作製した実験システムで,LSRM実験機を設計通りの速度で運転でき,また設計通りの静推力を得ることができた。次に,LSRM実験機の基礎特性を測定し,解析およびシミュレーション結果で誤差が生じる原因を追究した。この検討結果から,従来の手法に比べて実験結果の値との誤差が小さくなるような解析手法およびシミュレーションモデルを検討した。また,LSRM実験機の電力測定システムを自作し,LSRMの電流,電圧,電力,力率等の電気的特性を測定,評価した。2、高効率,高出力な運転ができる駆動システムの提案と評価:LSRMの特性向上を目指して,電流形インバータを用いた新しい駆動システムを検討した。まず,シミュレーションによる特性評価を行い,電流の制御性能の向上および効率が向上することを確認した。また,この新しい駆動システムを作製し,実験により特性の測定,評価を行った。さらに,LSRMのさらなる性能の向上を目指し,LSRMで問題となっている推力脈動を低減できる制御法を適用するための駆動システムを提案し,シミュレーションおよび実験によりその有用性を確認した。(遅れている内容)1、実験による特性評価:LSRM実験機の作製に想定していた以上に時間がかかり,当初予定していた平成28年度中に実験システムが完成できず,今年度の完成となった。そのため,実験による基礎特性の測定が当初計画よりも遅れた。以上のことが主な理由により,現在までの進捗状況を「やや遅れている」と判断した。ただし,実験による特性評価は随時行っており,その研究成果を今年度中旬の国際学会で発表予定であり,遅れは十分に取り戻すことができる。(順調に進展している内容)1、高効率,高出力な運転ができる駆動システムの検討:LSRM実験機の完成が遅れたことから,当初平成29年度の後半以降で実施することを予定していた磁場解析と回路解析を連成するシミュレーションモデルの構築を前倒しして実施した。このシミュレーションモデルを用いて新たな駆動システムの検討を実施できた。また,平成30年度に予定していた新しい駆動システムの作製と実験による評価の一部を前倒しして実施した。さらに,さらなる性能の向上を目指して推力脈動を低減できる制御手法を適用できる新たな駆動システムについても検討することができた。以上のように,平成29年度の研究計画のみでみた場合は「やや遅れている」と判断したが,3年間の研究計画期間全体で考えた場合は「おおむね順調に進展している」ともいえる。省資源型で低コスト化が実現できるリニアスイッチトリラクタンスモータ(LSRM)を用いた,短ストロークから長ストロークの搬送まで同一の装置で担うことができる搬送用リニアモータの開発を目指している。本研究では,研究期間全体を通じてLSRM実験機の作製と実験による特性評価および高効率,高出力な運転ができる駆動システムの提案,作製と実験による評価を行い,LSRMの特性と課題を明らかにすることができた。
外来放射線治療を受ける患者への治療開始前看護介入プログラムの開発と評価

本介入プログラムの最終目標は,外来で放射線治療を受ける患者が心理的に安定し,治療やその有害事象による心身の苦痛と生活の変化に対するセルフケア能力が高まるように支援することである。看護介入の方法は,放射線治療が生活に及ぼす影響を説明する,放射線治療中の生活の調整の仕方を患者と共に考える,客観的指標を用いて出現する有害事象の説明をする,有害事象の対処法を説明する,患者の生活スタイルに合わせたセルフケアの具体的方法を共に考える,放射線治療の流れを説明する,放射線治療の安全性と確実性について説明する,などである。生活の支援を職責とする看護師は,外来放射線治療に伴って生じる身体症状への対処や変化した生活を主体的に生きられるようセルフケアを促進する援助を行わなければならず,そのための手段としては,教育的側面と相談的側面の両者を用いる必要がある。そして,その援助は治療開始前,すなわち治療が決定した時点から治療終了後にわたって継続的で組織化されたもの,つまり一連の看護プログラムとして提供することが重要である。研究の全体構想は,外来放射線治療を受ける患者への教育・相談機能をもつ,治療開始前から終了後6カ月にかけて継続的で組織化された一連の看護プログラムを開発することである。本研究はその第1段階として,放射線療法を受けることが決定した時点から治療開始までの期間に,情報提供及び相談機能の併存した看護介入を実施し,それによる患者の対処能力や情緒的反応への効果を検証することを目的としている。看護介入は放射線科外来に放射線治療目的で受診した日に開始し,治療開始日に終了する。介入方法は,放射線治療が決定した日に,必要な情報提供を行い,同時に心理面に対する介入を実施し,治療開始までの期間に電話あるいは来院による看護相談に応じることを説明する。介入の効果は面接により評価する。20年度は,介入プログラムの作成に着手した。情報提供内容の精選および心理的介入方法の検討のために,学術論文の検討と並行して面接調査を実施した。面接調査は,初めて放射線治療を受ける患者20名を対象に,放射線治療を受けることが決定した時点から治療開始日の時期に,その間に必要とした情報および心理状態についてデータを得た。現在データの質的帰納的分析を実施している。研究の目的は,外来放射線治療開始前の患者への教育・相談機能をもつ看護プログラムを開発することである。外来放射線治療を受けるがん患者21名を対象に,治療開始前にインタビューを行った結果,この時期に必要とする情報として,有害事象の種類および出現時期・部位・程度,有害事象出現時の医療者および自分自身の対処法,抗腫瘍効果に関する客観的指標,照射回数・照射期間と抗腫瘍効果との関係,放射線治療と原爆の相違点,など12カテゴリー,心理状態として,病状の悪化や死の意識がもたらす脅威の知覚,がんがもたらす不確かさへの憂慮,他に選択肢はないという覚悟,放射線治療への期待がもたらす安堵,長期間を要する治療であることに由来する困惑,など16カテゴリーが明らかになった。この結果を基に,Johnson(1975)の看護モデルの構成要素を参考に看護介入プログラムを開発した。介入の最終目標:外来で放射線治療を受ける患者が心理的に安定し,治療やその有害事象による心身の苦痛と生活の変化に対するセルフケア能力が高まるように支援すること介入対象者:外来で放射線治療を受けるがん患者介入時期:外来放射線治療を受けるために放射線科外来を初めて受診した時から放射線治療開始日の照射前まで看護介入の意図する結果:(1)放射線治療中の生活の様相がわかる,(2)放射線治療がもたらす有害事象とその対処法がわかる,(3)納得して放射線治療を受ける(開始前治療中),(4)放射線治療に対する主体的な姿勢を維持する,(5)がん罹患や再発・転移がもたらす苦悩が緩和し,がんとの共存を前向きにとらえる,(6)放射線治療前に実施した他の治療がもたらす症状や不全感が緩和する看護介入の方法:(1)放射線治療が生活に及ぼす影響を説明するa.放射線治療がもたらす生活上の制約b.費用(2)放射線治療中の生活の調整の仕方を患者と共に考える,などである。
SNPs探索分子素子(ミスマッチ結合分子リガンド)の開発

我々は従来のSNPs探索手法とは根本的に異なる、全く新しいSNPs検出コンセプトを創案し、G-Gミスマッチに結合するナフチリジン二量体を分子設計し、これを表面プラズモン共鳴センサーに固定した、「SNPs探索分子素子」を提案しこれを実証した。このナフチリジンダイマーの分子設計指針を発展拡張し、他のミスマッチ認識を高精度で認識する分子の創製を目指し研究を進めている。一方、ナフチリジン二量体が極めて強くG-Gミスマッチに結合することを利用して、全てのミスマッチをナフチリジンダイマーを用いて検出する手法を開発する。(1)G-Aミスマッチを検出する表面プラズモン共鳴(SPR)センサーを開発した。ナフチリジン-アザキノリンハイブリッド分子がG-Aミスマッチに強く結合することを昨年報告した。ナフチリジン-アザキノロンにリンカーを介してSPRセンサー表面に固定化したチップを作成した。ナフチリジン-アザキノロンは、ナフチリジンダイマーに比較してミスマッチへの結合強度が落ちるため、固定化する際にリンカーに工夫を凝らし、センサー表面のリガンド密度を上昇させることにした。作成したSPRセンサー表面は、16種類のG-Aミスマッチのうち8種類について、完全にマッチした二本鎖DNAから区別することが出来た。(2)A-Aミスマッチとナフチリジン-アザキノロン複合体の構造解析ナフチリジン-アザキノロンがG-AミスマッチだけでなくA-Aミスマッチに極めて強く結合することを先に見いだしている。A-Aミスマッチへの結合は前後の配列に極めて強く依存し、CAG/CAG繰り返し配列内に生じるA-Aミスマッチに最も強く締合する。CAG繰り返し配列はトリプレット病の原因であることが知られており、ナフチリジン-アザキノロンによる安定化機構に興味が持たれた。NMR解析の結果、CAG/CAG繰り返し配列に2分子のナフチリジン-アザキノロンが結合している極めて特異な構造であることを明らかにした。この結果は今後の分子設計に貴重な情報となった。(3)C-Cミスマッチの認識に成功した。これまでのミスマッチ認識はプリン塩基に限られていたが、今回初めてC-Cミスマッチを認識する分子の開発に成功した。
量子絡み合いにおける統計的普遍性の解明と量子推定・量子制御への応用

2自由度結合系において動力学的に形成される量子絡み合いの統計性を調べた。研究の主要な点は以下の2点である。(1)量子絡み合い状態のモデルとして、行列要素が確率変数となるランダム行列を採用し、その行列のランダム行列理論を独自の手法で構築した。(2)大規模な数値計算を行い、量子動力学的に形成された絡み合い状態のSchmidt固有値の一体分布関数を精密高く求めた。これを、(1)で導出したランダム行列のSchmidt固有値の一体分布関数と比較した。この比較により、量子カオス動力学によって作られた状態がランダム行列とみなせることを明らかにした。以下2点から研究を実施した。1.量子絡み合いの動的形成のシミュレーション解析量子動力学がよく調べられているKicked Topを2つ結合させた系をモデルとして量子絡み合いの動的形成の解析を行った。量子状態|Φ>_<12>ΣA_<ij>(t)|i>[○!×]|j>の動力学は、行列A_<ij>(t)の時間発展と見なすことができ、量子絡み合いの動的形成は、行列A_<ij>(t)のSchmidt固有値d_i(t)の時間発展として観測される。そこで、d_i(t)の時間サンプリングの統計的性質をランダム行列のものと比較した。現在1体分布関数の精密な比較を行い、ランダム行列の示す統計的普遍性を量子結合系が持つための必要条件を示しつつある。この結果は、量子カオス性とは何かという問いに対し量子絡み合いの動的形成の観点から定量的な指標を提供できることを示している。2.ランダム行列理論の構築行列A_<ij>の数理的モデルとしてのランダム行列理論を構築している。Selberg-Kaneko積分の被積分関数を拡張し、Schmidt固有値d_i(t)の1体分布関数を解析的に得た。さらに、その積分の満たすべき微分方程式系を得た。これにより、微分方程式系の性質から分布関数の性質を調べることを可能とした。この新しく開発されたランダム行列の解析方法は、Vandermonde行列式を直交多項式で表現し積分を実行する従来の方法に替わるものとして期待される。量子状態[numerical formula]の動力学は、行列A_ij(t)の時間発展と見なすことができ、量子絡み合いの動的形成は、行列A_ij(t)のSchmidt固有値d_i(t)の時間発展として観測される。そこで、d_i(t)の時間サンプリングの統計的性質をランダム行列のものと比較を1体分布関数によって行い、ランダム行列の示す統計的普遍性を量子結合系が持っための必要条件を求めることに成功した。さらに、量子絡み合いの統計性を量子カオスのランダム性の定量的な指標とみなす解析を進めている。2.ランダム行列理論の新しい表現形式の構築行列A_ijの数理的モデルとしてのランダム行列理論を構築している。この新しく開発されたランダム行列の解析方法は、Vandermonde行列式を直交多項式で表現しその直交性を利用し変数の積分を実行する従来の形式に替わるものである。この形式を用いることにより始めて漸近解を系統的に得ることができた。量子状態|Φ>\<12>=ΣA_<ij>(t)|i>〓|j>の動力学は、行列A_<ij>(t)の時間発展と見なすことができ、量子絡み合いの動的形成は、行列A_<ij>(t)のSchmidt固有値d_i(t)の時間発展として観測される。そこで、d_i(t)の時間サンプリングの統計的性質をランダム行列のものと比較を1体分布関数によって行い、ランダム行列の示す統計的普遍性を量子結合系が持つための必要条件を求めることに成功した。さらに、量子絡み合いの統計性を量子カオスのランダム性の定量的な指標とみなす解析を進めた。具体的には、ランダム行列理論からの一体分布関数のずれのL_1ノルムを指標とした。この指標が量子カオス系のパラメータ依存性から、ランダム行列への近づき方の法則性を見つけた。2.ランダム行列理論の新しい表現形式の構築行列

A_<ij>の数理的モデルとしてのランダム行列理論を構築している。Selberg-Kaneko積分の被積分関数を拡張し、Schmidt固有値d_i(t)の1体分布関数を解析的に得た。さらに、その積分の満たすべき微分方程式系を得た。これにより、微分方程式系の性質から分布関数の性質を調べることを可能とした。この新しく開発されたランダム行列の解析方法は、vandermonde行列式を直交多項式で表現しその直交性を利用し変数の積分を実行する従来の形式に替わるものである。この形式を用いることにより始めて一体分布関数の漸近解を系統的に求めることができた。さらに、最大固有値の分布や2体分布関数の解析表式を形式的に書き下すところまできた。
遺伝子治療の有効性を評価するためのジーンイメージングの開発

本研究はRI標識した遺伝子、RI標識したキャリアー物質、遺伝子発現のたんぱく質を核医学検査的に追跡して、遺伝子治療の評価を行う「ジーンイメージング」を確立する事を目的としている。前年度の研究結果を受けて、引き続き研究を続行し、以下の結果を得た。1.ヒト類上皮癌細胞KB-31と、これに多剤耐性遺伝子mdr-1をトランスフェクトしたKB-G2をmdr-1に対するアンチセンスのオリゴヌクレオチド[a-o]、または、センスのオリゴヌクレオチド[s-o]とインキュベートして、mdr-1の発現たんぱく質であるP-糖たんぱく質の<機能>を、その基質であるTc-99m-MIBIを用いて検討した結果;(1)KB-G2の<機能>は[a-o]によって抑制され、この程度は[a-o]の投与量に依存した。また、[s-o]の効果は全く認められなかった。(2)KB-31の<機能>は[a-o]、[s-o]に対して、いずれの効果も認められなかった。(3)(1)、(2)より[a-o]のアンチセンス効果としての特異性が証明された。2.上記の[a-o]と[s-o]とをMAG3のリガンドを用いて、Tc-99mにて標識し、双方の細胞とインキュベートした結果;(1)KB-G2にはTc-99m-[a-o]が取り込まれ、Tc-99m-[s-o]は取り込まれなかった。(2)KB-31にはTc-99m-[a-o]、Tc-99m-[s-o]のいずれも取り込まれなかった。(3)(1)、(2)より[a-o]がmdr-1に特異的に結合して取り込まれることが示唆された。これらの結果は目的とするDNAの局在をRI標識アンチセンス法によって、世界で初めて証明したものである。本研究はRI標識した遺伝子、RI標識したキャリヤー物質、遺伝子発現の蛋白質を核医学検査的に追跡して、遺伝子治療の評価を行う「ジーンイメージング」を確立する事を目的としている。初年度は遺伝子の安定な標識方法、遺伝子を発現して生じる蛋白質のイメージング方法を開発することを計画し、以下の結果を得た。1.多剤耐性に関する遺伝子mdrをヒト類上皮癌KB-31に導入して、KB-G2細胞を作成し、KB-G2がmdrの発現蛋白質、P-糖蛋白質を発現している事を抗P-糖蛋白質モノクローナル抗体を用いて確認した。2.KB-G2が発現しているP-糖蛋白質が機能を有しているかを抗癌剤存在下での細胞毒性とTc-99m-MIBIを用いて検討し、高い濃度での抗癌剤でもKB-G2細胞が死なない事(親株のKB-31と比較して)、Tc-99m-MIBIが細胞内部から流出する事で確認した。3.KB-31とKB-G2細胞とをそれぞれ、片方の大腿部に植え付けたヌードマウスにTc-99m-MIBIを投与した結果、Tc-99mはKB-31に集積して、KB-G2には集積しなかった事から、mdrの発現をin vivoで検討できる事を確認した。4.mdrに対するアンチセンス効果を期待して、オリゴヌクレオチドを委託合成し、KB-G2細胞への導入を試みた。導入細胞のP-糖蛋白質発現を上記の方法にて検討した結果、30%程度の回復が認められた。5.KB-G2細胞を大腿部に植え付けたヌードマウスの腫瘍部位に直接上記のオリゴヌクレオチドを投与した後、Tc-99m-MIBIを投与した結果、10%程度の回復が認められた。以上の事から、投入したオリゴヌクレオチドのアンチセンス効果は認められたが、その効果は小さく、効率の高い導入方法、または、他のオリゴヌクレオチドが今後の検討事項と考えている。本研究はRI標識した遺伝子、RI標識したキャリヤー物質、遺伝子発現のたんぱく質を核医学検査的に追跡して、遺伝子治療の評価を行う「ジーンイメージング」を確立する事を目的としている。前年度の研究結果を受けて、引き続き研究を続行して。以下の結果を得た。1.多剤耐性に関する遺伝子mdr-1をヒト類上皮癌細胞KB-31に導入して作成したKB-G2(P-糖たんぱく質を過剰発現していることを昨年度の研究で確認)とmdr-1に対するアンチセンスのいくつかのオリゴヌクレオチドとをインキュベートした結果:(1)KB-G2の多剤耐性は修飾オリゴを用いた場合、最も回復率が高かった。(2)KB-G2の薬剤耐性の克服は使用する薬剤の間に差が認められた。(3)アンチセンス効果は使用するオリゴに特異的であり、修飾オリゴを用いた場合の安定性が最も高かった。2.修飾オリゴのTc-99m標識を試みた結果:(1)MAG3、HYNICのいずれのリガンドを用いても高い標識率にてTc-99mを標識することができた。(2)mdr-1に関連したオリゴヌクレオチドをいくつか選択して、同様の方法でTc-99m標識を遂行した。標識率に関してオリゴの種類は関係しなかった。(3)修飾オリゴのcomplementにビオチン-磁性体をコンジュゲートさせたものとTc-99m

-標識オリゴとをインキュベートしてHPLCにて解析したところ、Tc-99m-標識オリゴの特異結合性が失われていないことが確認された。3.Tc-99m-標識オリゴとKB-G2細胞とをインキュベートした結果:(1)nativeのオリゴの場合は、細胞内への変性がおこり、取り込み率が低いのに対し、修飾体は高く取り込まれた。(2)取り込みの結果は、上記(1)のアンチセンス効果とほぼ一致していた。以上の結果から、アンチセンスの修飾体をリガンドを用いてTc-99m標識を行い、KB-31とKB-G2との比較、生体内での動態の検討を今後考えている。本研究はRI標識した遺伝子、RI標識したキャリアー物質、遺伝子発現のたんぱく質を核医学検査的に追跡して、遺伝子治療の評価を行う「ジーンイメージング」を確立する事を目的としている。前年度の研究結果を受けて、引き続き研究を続行し、以下の結果を得た。1.ヒト類上皮癌細胞KB-31と、これに多剤耐性遺伝子mdr-1をトランスフェクトしたKB-G2をmdr-1に対するアンチセンスのオリゴヌクレオチド[a-o]、または、センスのオリゴヌクレオチド[s-o]とインキュベートして、mdr-1の発現たんぱく質であるP-糖たんぱく質の<機能>を、その基質であるTc-99m-MIBIを用いて検討した結果;(1)KB-G2の<機能>は[a-o]によって抑制され、この程度は[a-o]の投与量に依存した。また、[s-o]の効果は全く認められなかった。(2)KB-31の<機能>は[a-o]、[s-o]に対して、いずれの効果も認められなかった。(3)(1)、(2)より[a-o]のアンチセンス効果としての特異性が証明された。2.上記の[a-o]と[s-o]とをMAG3のリガンドを用いて、Tc-99mにて標識し、双方の細胞とインキュベートした結果;(1)KB-G2にはTc-99m-[a-o]が取り込まれ、Tc-99m-[s-o]は取り込まれなかった。(2)KB-31にはTc-99m-[a-o]、Tc-99m-[s-o]のいずれも取り込まれなかった。(3)(1)、(2)より[a-o]がmdr-1に特異的に結合して取り込まれることが示唆された。これらの結果は目的とするDNAの局在をRI標識アンチセンス法によって、世界で初めて証明したものである。
遺伝子組換えニワトリを用いたインフルエンザワクチン製造の効率化に向けた研究

Phic31依存的にSia-alpha2,6-Gal糖鎖の合成を行うニワトリST6-1遺伝子を発現する遺伝子組換えニワトリを作製にむけ、レトロウイルスベクターの感染により前年度に作製した遺伝子組換え初代キメラニワトリを交配することで、全身に組換え遺伝子を1コピーで有する遺伝子組換えニワトリの取得を試みた。しかし100羽以上のスクリーニングを行っても、目的の遺伝子組換えニワトリを取得することはできなかった。これは、レトロウイルスベクターによる生殖細胞への遺伝子導入効率が低いことが原因の一つであると考えられた。そこで生殖細胞に対して直接遺伝子導入を行うことで遺伝子組換えニワトリの取得効率増加を試みた。生殖細胞系列のもっとも上流に位置する幹細胞である始原生殖細胞(PGC)をドナー胚より単離し、これに対して目的遺伝子を有するレンチウイルスベクターを感染させ、これをレシピエント胚に移植することで生殖系キメラニワトリを作製した。これまでにPhic31発現用レンチウイルスベクターは7回、計77胚の受精卵に対して、ST6-1発現用レンチウイルスベクターは5回、計61胚の受精卵に対して遺伝子導入を行った。これらにより作製した生殖系列細胞キメラニワトリについても現在交配・スクリーニングを行うことで目的の遺伝子組換えニワトリの取得を試みている。さらに、遺伝子組換えニワトリの取得向上を目指し、PGCのin vitro培養法の構築も同時に試みた。その結果、ニワトリ2.5日胚より採取した血液中のPGCを半年以上の長期間にわたり増殖および培養し続けることに成功した。これらのPGCは、生体内で生殖腺への定着能を持つことが胚への移植実験により確認された。現在、培養PGCへの効率的な遺伝子導入・改変手法の開発を行っており、本手法により効率的にこれらの遺伝子組換えニワトリが取得できるようになると考えている。28年度が最終年度であるため、記入しない。Phic31依存的にsia-alpha2,6-Gal糖鎖の合成を行うニワトリsialyltransferase6-1(ST6-1)を発現する遺伝子組換えニワトリの作製を試みた。遺伝子組換えニワトリを取得する方法としては、転卵2.5日胚の心臓にレトロウイルスベクターをインジェクションし、作製した初代キメラニワトリを交配しスクリーニングする方法を採用した。インジェクションには高濃度のレトロウイルスベクターが必要であるため、初めにこれを生産するパッケージング細胞の取得を試みた。その結果Phic31発現レトロウイルスベクターについては>1x10の10乗cfu/ml、誘導型ST6-1発現レトロウイルスベクターについては>1x10の9乗cfu/mlの力価でウイルスを産生するパッケージング細胞の取得に成功した。これらパッケージング細胞を用いて作製した高力価ウイルスベクターを、ニワトリ2.5日胚の心臓に遺伝子導入し、遺伝子組換え初代キメラニワトリを作製した。作製した初代キメラニワトリは孵化後すぐに血液中の組換え遺伝子のコピー数を定量PCRにより測定した。これにより血中組換え遺伝子コピー数がおおよそ0.5コピー以上で、生殖細胞へのウイルスの感染が期待できる個体について性成熟するまで飼育を行った。次いで、性成熟した雄鶏については精子中の組換え遺伝子コピー数を測定した。その結果、Phic31遺伝子組換えニワトリについては最高で0.1コピー程度、誘導型ST6-1発現遺伝子組換えニワトリについては最高で0.01コピー程度の組換え遺伝子コピー数を持つ遺伝子組換えニワトリを作製することに成功した。現在これら遺伝子組換えニワトリを交配し、孵化したヒヨコをスクリーニングすることで、目的とする遺伝子組換えニワトリ後代の取得を試みている。遺伝子組換えニワトリを取得するためには高濃度のレトロウイルスベクターが必要である。本年度においてはPhic31発現レトロウイルスベクターをについては>1x10の10乗cfu/ml、誘導型ST6-1発現レトロウイルスベクターについては>1x10の9乗cfu/mlの力価と、非常に高濃度でレトロウイルスを産生するパッケージング細胞を取得することができた。これらウイルスを用いて作製した初代キメラニワトリは血中の組換え遺伝子コピー数で0.54程度のコピー数を有し、また雄鶏の精子中では最大で、Phic31遺伝子組換えニワトリについては0.1コピー程度、誘導型ST6-1発現遺伝子組換えニワトリについては0.01コピー程度の組換え遺伝子の導入が確認できている。現在これら遺伝子組換えニワトリの交配・スクリーニングを行っている。このまま継続して交配・スクリーニングを行うことで目的とする全身で1コピーずつ組換え遺伝子を持つ遺伝子組換えニワトリの作製が可能であると予測され、研究はおおむね順調に進行していると考えられる。

そこで生殖細胞に対して直接遺伝子導入を行うことで遺伝子組換えニワトリの取得効率増加を試みた。生殖細胞系列のもっとも上流に位置する幹細胞である始原生殖細胞(PGC)をドナー胚より単離し、これに対して目的遺伝子を有するレンチウイルスベクターを感染させ、これをレシピエント胚に移植することで生殖系キメラニワトリを作製した。これまでにPhic31発現用レンチウイルスベクターは7回、計77胚の受精卵に対して、ST6-1発現用レンチウイルスベクターは5回、計61胚の受精卵に対して遺伝子導入を行った。これらにより作製した生殖系列細胞キメラニワトリについても現在交配・スクリーニングを行うことで目的の遺伝子組換えニワトリの取得を試みている。さらに、遺伝子組換えニワトリの取得向上を目指し、PGCのin vitro培養法の構築も同時に試みた。その結果、ニワトリ2.5日胚より採取した血液中のPGCを半年以上の長期間にわたり増殖および培養し続けることに成功した。これらのPGCは、生体内で生殖腺への定着能を持つことが胚への移植実験により確認された。現在、培養PGCへの効率的な遺伝子導入・改変手法の開発を行っており、本手法により効率的にこれらの遺伝子組換えニワトリが取得できるようになると考えている。2015年度に作製したPhic31、誘導型ST6-1の各組換え遺伝子を持つ遺伝子組換え初代キメラニワトリについて、それぞれ交配・スクリーニングを行い、目的とする遺伝子組換えニワトリを取得する。また、目的とする遺伝子組換えニワトリの取得効率を上げるために、追加で転卵2.5日胚の心臓にレトロウイルスベクターをインジェクションし、初代キメラニワトリの母数を増やす。またこれとは別に、始原生殖細胞に対してもPhic31、誘導型ST6-1遺伝子の遺伝子導入を行い、初代生殖キメラニワトリを作製する。これらについても同様に交配・スクリーニングを行い、目的とする遺伝子組換えニワトリの取得を目指す。取得できた遺伝子組換えニワトリは性成熟するまで飼育した後、Phic31,誘導型ST6-1遺伝子組換えニワトリ間でそれぞれ交配を行う。これによりST6-1の発現が誘導された受精卵を用いて、インフルエンザウイルスの感染実験およびインフルエンザワクチンの生産実験を行う。28年度が最終年度であるため、記入しない。