hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
一本鎖ＲＮＡを認識する自然免疫受容体ＴＬＲの構造生物学的研究

一本鎖RNAを認識しウィルス感染や自己免疫疾患に関与する自然免疫系受容体TLR8について、その活性化を抑制するアンタゴニストとの複合体のX線結晶構造解析に成功した。本研究に用いたアンタゴニストは、コロラド大学ボルダー校のHang Yin教授らが開発したCU-CPT8m、CU-CPT9bと呼ばれる2種類であり、以下ではまとめてCU-CPT化合物と表記する。構造解析を行った結果、アンタゴニスト結合型TLR8はリガンド非結合型構造と同様の不活性化型2量体を形成しており、アンタゴニストがTLR8の2量体界面の2箇所に結合していることが明らかになった。アンタゴニストは不活性化型2量体にのみ存在するポケットに結合しており、2量体を構成する各TLR8分子と複数の相互作用(水素結合、疎水性相互作用、スタッキング相互作用)を形成し、不活性化型2量体を安定化していた。アンタゴニストがTLR8の不活性化型2量体に結合し安定化することで、アゴニストの結合とそれに伴う活性化型2量体への構造変化を阻害すると考えられる。実際に、アンタゴニスト存在下ではTLR8にアゴニストが結合しなくなることを、等温滴定カロリメトリーを用いて示した。以上から、CU-CPT化合物に代表されるアンタゴニストは、TLR8の不活性化型2量体構造を安定化してTLR8の活性化を阻害していると結論付けた。本知見は構造解析によって初めて得られたものであり、TLR8を標的とした自己免疫疾患治療薬の開発に寄与すると考えられる。29年度が最終年度であるため、記入しない。TLR8/ssRNA複合体の構造解析を行った結果、TLR8は活性化型の2量体を形成しており、2量体界面に存在する合成低分子リガンド結合部位(1st site)にウリジンが、リング型構造の内側に存在する結合部位(2nd site)にUGの配列を有するジヌクレオチドが、それぞれ結合していることが明らかになった。先行研究より、1st siteにリガンドが結合するとTLR8の活性化型2量体への構造変化を引き起こすことが示されており、TLR8のssRNA認識における真のリガンドはウリジンだと考えた。実際に、TLR8/ウリジン複合体の結晶構造解析の結果、TLR8は活性化型2量体を形成していることが明らかになった。さらに、等温滴定カロリメトリー法を用いて、グアノシン、アデノシン、シチジン、ウリジン、チミジンの各モノヌクレオシドの中でウリジンが最も強くTLR8に結合することを示した。また、ssRNAの存在下では、TLR8に対するウリジンの結合が増強することを明らかにした。これまではRNAがTLR8を活性化すると考えられていたが、本研究結果によって、実際はRNAの分解産物であるウリジンとssRNAを同時に認識して活性化されるという新規機構が解明された。現在までに、TLR8とssRNAの結晶構造解析に成功しており、論文として発表した。さらに、TLR8と種々のリガンドとの複合体構造解析に成功しており、共著者として論文を発表している。TLR7/8/9の活性化には、分子内の挿入ループ(Z-loop)の切断が必要であることが先行研究により示されている。これまで構造解析が達成されたTLR8は野生型であり、S2細胞で発現させた後に既にZ-loopが切断されていたため、Z-loopの機能は不明だった。そこでアミノ酸残基の変異を導入することでZ-loop未切断型TLR8を作成し、構造解析を行った(Tanji et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2016)。その結果、Z-loop未切断型TLR8は単量体であり、2量体界面に未切断のZ-loopが観察された。本研究により、未切断のZ-loopがTLR8の2量体化を阻害していることを構造生物学的に明らかにした。また、Z-loop未切断型TLR8は溶液中でも単量体であり、低分子リガンドはZ-loop未切断型TLR8に結合せず活性化型2量体への構造変化が起こらないこと、つまりZ-loop未切断型TLR8では2量体界面のリガンド結合部位(1st site)が機能せず生体内ではシグナルが伝達しないであろうことを見出した。一方で、Z-loop未切断型TLR8に対してRNAは結合することから、Z-loopとリング型構造の間のRNA結合部位(2nd site)は機能していることを見出した。本研究は、Z-loopの切断によるTLR7/8/9の活性化機構の解明に寄与し、生物学的に意義があると考えられる。現在までに、TLR8のZ-loop未切断体の結晶構造解析に成功しており、論文として発表した。

構造解析を行った結果、アンタゴニスト結合型TLR8はリガンド非結合型構造と同様の不活性化型2量体を形成しており、アンタゴニストがTLR8の2量体界面の2箇所に結合していることが明らかになった。アンタゴニストは不活性化型2量体にのみ存在するポケットに結合しており、2量体を構成する各TLR8分子と複数の相互作用(水素結合、疎水性相互作用、スタッキング相互作用)を形成し、不活性化型2量体を安定化していた。アンタゴニストがTLR8の不活性化型2量体に結合し安定化することで、アゴニストの結合とそれに伴う活性化型2量体への構造変化を阻害すると考えられる。実際に、アンタゴニスト存在下ではTLR8にアゴニストが結合しなくなることを、等温滴定カロリメトリーを用いて示した。以上から、CU-CPT化合物に代表されるアンタゴニストは、TLR8の不活性化型2量体構造を安定化してTLR8の活性化を阻害していると結論付けた。本知見は構造解析によって初めて得られたものであり、TLR8を標的とした自己免疫疾患治療薬の開発に寄与すると考えられる。TLR8には、活性化に関わっているとされる挿入ループが存在する。今後は、この挿入ループによる活性化制御について構造生物学的な知見を得ることを目指し、挿入ループ部位の変異体を作成してX線結晶構造解析および性状解析を行う。これまで構造が明らかになったTLRはほとんどが細胞外ドメインであり、TLR全長体の構造はほとんど明らかになっていない。今後はTLR全長体の構造解析に取り組み、実際の活性化機構を明らかにする。29年度が最終年度であるため、記入しない。
「海の人事録」にみる近代オスマン帝国社会の変容

本研究は、オスマン帝国において海洋活動にたずさわった人々のパーソナルヒストリーを、人事関係等の史料を分析することにより集積し、近代オスマン帝国の社会構造を見直そうと試みたものである。結果、オスマン帝国末期に海事に関わった人々の出自(民族、宗教、出身地、社会階層等)、キャリアパターンについて、一定の法則性を見出し、海事における黒海沿岸出身者の重要性が明らかとなった。本研究は、オスマン帝国において海洋活動にたずさわった人々の出自(民族、宗教、出身地、社会階層等)を新たに発掘した人事関係等の史料を分析することにより明らかにし、近代オスマン帝国の社会構造を「ヒト」を核として見直そうと試みるものである。この目的を達成するために、(1)トルコ共和国総理府オスマン朝文書館所蔵の『船舶通行許可台帳』、(2)イスタンブル海軍博物館所蔵の『人事記録台帳』、(3)トルコ海運公社文書館所蔵の『給与台帳』や人事・年金支給関係書類という3つの異なるカテゴリーに属する史料群をとりあげ、それぞれについて「ヒト」の記録を出来るだけ丁寧に掘り起こす作業を行っている。この目的を達成するために、3つの異なるカテゴリーに属する史料群をとりあげ、それぞれについて「ヒト」の記録を出来るだけ丁寧に掘り起こす作業を行う。その3つとは、(1)トルコ共和国総理府オスマン朝文書館所蔵の『船舶通行許可台帳』、(2)イスタンブル海軍博物館所蔵の『人事記録台帳』、(3)トルコ海運公社文書館所蔵の『給与台帳』や人事・年金支給関係書類である。本年度は夏期トルコ共和国イスタンブル海外調査を実施した。(1)に関しては全10冊のうち予備調査で重要と思われた9,10巻のデータを集中的に収集した。また、(3)については、『給与台帳』に関してこれまでに構築したデータ・ベースを補完することを目的とした調査を行ない、その成果にもとづき日本オリエント学会第50回大会において研究発表を行なった。また、人事記録であらたに注目すべき史料として、19世紀末から20世紀初頭にかけての職員録を数冊発見したため、その内容をデジタルカメラで撮影した。現在その解読・分析作業を行なっている。本年度も昨年に引き続き現地調査を行った。主な調査場所はイスタンブルのトルコ共和国総理府オスマン朝文書館、海軍博物館付属歴史文書館、トルコ海運公社資料室である。(1)については特に非ムスリムに関する台帳を閲覧した。(2)では前年度の調査を補完する作業を行った。(3)では人事記録簿の全容を把握するとともに、2冊分のデータをデジタルカメラによって撮影することにより相当数のサンプルを抽出することができた。これらのデータを過去に収集した史料と合わせて整理し、出身地別の統計などをとって分析を行った。以上の研究成果にもとづき、トルコ海運公社の史料のデータを解析した結果をトルコの学術雑誌に、海軍と海運双方の史料を比較検討した結果を『歴史人類』誌に学術論文として発表した。イスタンブルのトルコ共和国総理府オスマン朝文書館では『船舶通行許可台帳』の他海軍の人材徴用に関する史料を収集した。トルコ海運公社資料室では『人事記録台帳』全5冊のデータについてデジタルカメラによる撮影を完了した。アタテユルク図書館では19世紀末20世紀初頭の海運関係の新聞記事の収集を行った。5月26日、イスラーム地域研究機構定第11回例研究会において「オスマン帝国末期の海洋活動と黒海沿岸民-人事記録関係史料を手がかりに-」というテーマで中間報告を行った。

また、11月24日、イスタンブル工科大学で行われた国際学会において、オスマン海運とナショナリズムについて基調講演を行った。本研究は、オスマン帝国において海洋活動にたずさわった人々の出自(民族、宗教、出身地、社会階層等)を新たに発掘した人事関係等の資料を分析することにより明らかにし、近代オスマン帝国の社会構造を「ヒト」を核として見直そうと試みるものである。この目的を達成するために、(1)トルコ共和国総理府オスマン朝文書館所蔵の『船舶通航許可台帳』、(2)イスタンブル海軍博物館所蔵の『人事記録台帳』、(3)トルコ海運公社文書館所蔵の『給与台帳』や人事・年金支給関係書類という3つの異なるカテゴリーに属する史料群をとりあげ、それぞれについて「ヒト」の記録を出来るだけ丁寧に掘り起こす作業を行っている。昨年に引き続き現地調査を行った。本年度はイスタンブルのトルコ海運公社資料室における資料に重点を置いた。特に『人事記録台帳』全5冊について、昨年デジタルカメラによる撮影を行ったが、かなりの不備があったため、あらためて撮影し直した。トルコ共和国総理府オスマン朝文書館では『船舶通航許可台帳』の調査は昨年度にほぼ終了しているため、海軍の人材徴用に関する史料の収集を中心とした。アタテュルク図書館では19世紀末20世紀初頭のオスマン語、欧米語の新聞の中から、海運関係の記事の収集を行った。収集した史料の中からトルコ海運の『人事記録台帳』の解読を行い、データ・ベース化のための基本資料の作成に着手したが、サンプル数が予想以上に多いため、現段階では進捗状況は30%程度にとどまっている。また解読の結果、統計を取ることを期待していた項目をすべてのサンプルから採取することが難しいことがわかったため、分析の項目を変更することを検討中である。本研究は、オスマン帝国において海洋活動にたずさわった人々の出自(民族、宗教、出身地、社会階層等)を新たに発掘した人事関係等の史料を分析することにより明らかにし、近代オスマン帝国の社会構造を「ヒト」を核として見直そうと試みたものである。この目的を達成するために、トルコ共和国首相府オスマン朝文書館所蔵の公文書、イスタンブル海軍博物館所蔵の「人事記録台帳」、トルコ海運公社文書館所蔵の「給与台帳」や個人記録文書といった史料群をとりあげ、それぞれについて「ヒト」の記録を出来るだけ丁寧に掘り起こす作業を行った。本年度もトルコ共和国において現地調査を実施した。本研究の最終年度であるため、これまでに収集したデータの不備を補うことに重点を置き、史料の収集作業を終えることをめざした。その結果、トルコ海運の人事関係文書に関しては、オスマン帝国末期(一部トルコ共和国初期を含む)のほぼすべての文書にあたることができた。ただし、収集したデータが多岐にわたり情報量が膨大なため、すべての史料をデータ・ベース化するこには至らなかった。構築したデータ・ベースにもとづき、オスマン帝国末期に海事に関わった人々の出自、キャリアパターンについて、一定の法則性を見出すに至った。
ポリエステルフィルムの分子運動に及ぼす染料および水分の影響

1.染料濃度の異なるPETフィルムのTgおよび動的粘弾性を測定することにより、PETの分子運動に及ぼす染料濃度の影響を検討した。Tgは、染料濃度、水分率の増加とともに低下することが認められた。alpha、beta分散いずれも染料濃度が高くなると低温側にシフトし、活性化エネルギーは低下した。得られた結果から、染料は基質の分子運動に関与し、alpha分散よりもbeta分散により強く影響することが明らかになった。beta分散における緩和強度および単位面積当たりのセグメント数は染料濃度依存性を示すとともに、高濃度の染色では、染料の染着状態に変化が生じることが認められた。また、分子運動に及ぼす水分の影響をalpha分散の活性化エネルギーにより検討したところ、水分の存在により活性化エネルギーが著しく低下し、染料による可塑効果以上に主鎖の分子運動は水の影響を受けることが明かとなった。2.種々の方法によって得られた結晶化度や長周期のようなPETの結晶状態を特徴づけるパラメーターと非晶領域の分子運動とを比較することにより、乾熱、湿熱処理によるPETの非晶構造変化を検討した。熱処理による結晶化の進行とともに非晶密度が減少し、湿式処理の場合にその減少程度が大きくなった。小角X線散乱の積分回折強度の変化も、結晶密度と非晶密度の差が結晶化の進行とともに大きくなることを示唆した。ガラス転移温度に相当する損失弾性率のalpha分散ピーク温度は熱処理温度の上昇にともなって減少した。結晶化の進行とともにTgは減少した。活性化エネルギーも同様に変化した。以上のことは、熱処理によって結晶化後期では非晶密度が減少し、非晶領域の運動が起こりやすくなることを示している。
竜巻通過時に急変する風速と気圧降下との相乗効果による建物の破損プロセス

急変する大気圧降下を再現する新たな実験システムを構築し,建物内外の差圧力が竜巻被害のメカニズムに及ぼす影響の解明に取り組んだ。突風による風力のオーバーシュートは建物との風向で変化するが,気圧急降下による建物差圧力とともに数値流体解析での再現が可能になった。その手順を実際の竜巻被害に適用して建物破損メカニズムを追跡し,推定した竜巻風速の評価値がこれまでより低い値になることを示した。さらに強風観測記録の統計分析から,オーバーシュート風力の発生の確率モデルを論証した。1突風風洞装置を利用して,無風時環境での気圧の急変を実現するシステムを完成した。突風風洞内に建物模型を覆う防風囲いを作成して,この内部での気圧急変の性状と突風風洞との関係を明らかにした。2立ち上がり時間の短い突風を受ける物体(楕円断面物体,切妻屋根建物)周りの非定常流れの数値計算を行い,k-epsilonモデルあるいはLESモデルを用いた計算結果と風洞実験結果と比較し,数値流体計算による非定常風力の再現性を確認すると共に,流れの発達の様子を調べ,非定常風力の発生メカニズムの解明を行った。3LES解析によって,移動状態の竜巻状流れを最大接線風速,コア半径,スワール比に注目して検討した結果,流れ場に強く影響するパラメータが上昇流孔半径であること,上昇流孔半径の違いが1セル型と2セル型の竜巻状流れの発現を左右していることを確認した。4大気の温度層分布を考慮した数値流体解析で,佐賀県小城市周辺での突風の発生の可能性を検討した。また,九州に配置されたNeWMeKでの,2009年から2013年までの1秒観測記録を用いて立ち上がり時間の短い突風を選出し,その統計的特徴の分析を行うと同時に,同期間の気象官署,アメダスでの10分間観測記録の特徴を整理し,NeWMeKでの観測値との比較を行った。比較結果をもとに1秒記録と10分間記録との対応付けを行い,観測点が全国にある気象官署等での10分観測記録から突風を選出する方法を検討した。1.前年度構築した「無風下で建物模型周りに急激な気圧降下を発生させる実験装置」を使用して,建物模型内側の気圧変化に及ぼす「模型容積の大きさと模型開口量(隙間)との関係」について実験データを収集し,外気圧変化の伝達特性を明らかにした。また変動する模型内圧を再現する数値計算法が実験結果を十分に再現する精度を有することがわかった。2.建物に対する風向角を変えて突風を作用させ,風向角が建物模型表面の風圧力の増大効果(オーバーシュート現象)に及ぼす影響を検討し,主として屋根の棟方向に対する45°の風向の時にオーバーシュート現象が顕著になることがわかった。さらに屋根小屋組部材への応力にもオーバーシュート現象が見られることがわかった。3.LESモデルを用いた建物周りの流れシミュレーションから算定した模型表面の圧力分布が上記2の実験結果によく対応し,実験条件以外の建物の屋根形状や突風の風向角についても,建物の非定常風圧力を検討できる可能性を示した。4.九州の広域高密度風観測システムの風速記録から、車輌形状物体にオーバーシュート現象を発生させる可能性がある突風を選出し,その突風の発生頻度がFechet分布で最も良く近似できることを確認した。この確率密度分布からオーバーシュート風力を求め,同じ風速であっても突風時には定常風力の1.1倍となる非定常風力が発生することがわかった。5.移動する竜巻状流れを発生できるように新たに工夫した装置を用いて,移動中の竜巻状流れ場の時空間構造を調査した結果,地表付近の渦中心が竜巻の移動方向の反対方向に移動し,台風時の危険半円に相当する「静止竜巻の風速場+移動速度以上の風速域」が形成されることを明らかにした。併せて竜巻風洞の数値流体解析を実施し,実験と同様の傾向を確認した。・建物の密閉度(隙間)を再現する模型の工夫により,実際の建物に対応した状況での気圧伝達特性の評価が可能になった。また新たな工夫を加えた「空気塊の運動方程式」による,急激な外気圧降下による室内圧の伝達状況の数値解析の結果が予想以上に実験結果によく対応し,実スケールの建物への展開が可能になった。・突風の風向角による風圧力のオーバーシュート現象の特異性が新たに明らかになり,この突風風力を受ける小屋組構成部材の応力計算がより実際の状況に対応できるようになった。・これまでの確率モデルよりFechet分布のほうが実際の突風発生状況によく対応していることの発見は突風発生頻度の予測モデルなど,新たな展開が期待できる。・移動式竜巻風洞による実験および数値流体解析により,移動中の竜巻状流れ場が台風時に見られる危険半円に類似の分布を有することの発見は,台風通過経路と建物の位置関係による突風被害予測に重要な情報になると期待できる。1期間内の風洞実験で得られた,周辺の急変する気圧降下に起因する建物模型内外の気圧差圧力の時系列情報を再整理して,建物への気圧差力と周辺気圧降下との位相情報に及ぼす建物密閉度の影響は,建物容積と壁面隙間(開口面積)の比率が支配的であることがわかった。2突風を受ける建物模型の風圧分布に及ぼす風向の影響に着目した実験と数値流体解析の比較検討を行い,模型各部位の風圧力分布の増大現象(オーバーシュート風圧力)を数値流体シミュレーションで十分に再現できることがわかった。またパラメータスタディにより建物に対する突風の風向角特性を明らかにした。

さらに,建物表面に作用するオーバーシュート風圧力の屋根小屋組から梁柱骨組へと伝播する応力の伝達特性を数値計算で追跡して,風力のオーバーシュート現象の部材応力への伝達特性を整理し,部材応力の動特性の一例を示した。3九州地区の広域高密度風観測システム(NeWMeK)による突風の実観測記録情報をもとに,鉄道車輌を例に,定常風速場での風力係数と風圧係数を用いて実構造物のオーバーシュート風力を算定するための“相当風速"の統計的特性を明らかにした。4竜巻シミュレータおよびLES解析による突風風速の再現を行い,周辺気圧分布と突風風速成分を考慮した竜巻の内部構造のモデル化を検討した。また接近・通過する竜巻に対する送電鉄塔の時刻歴応答のパラメータスタディを行い,同じ最大風速を有していても,竜巻風速分布の数学モデルが鉄塔の変形量に強く影響することを示した。5期間内の研究成果を総括して,「気圧差力」を考慮した竜巻被害風速の算定例を,2012年のつくば市竜巻被害で見られた木造家屋の事例に適用し,急変する気圧降下が被害風速の評価値を下げ,竜巻の強さの判定(藤田スケール)に強く影響することを示した。急変する大気圧降下を再現する新たな実験システムを構築し,建物内外の差圧力が竜巻被害のメカニズムに及ぼす影響の解明に取り組んだ。突風による風力のオーバーシュートは建物との風向で変化するが,気圧急降下による建物差圧力とともに数値流体解析での再現が可能になった。その手順を実際の竜巻被害に適用して建物破損メカニズムを追跡し,推定した竜巻風速の評価値がこれまでより低い値になることを示した。さらに強風観測記録の統計分析から,オーバーシュート風力の発生の確率モデルを論証した。1突風生成時の風洞内気圧変化と防風箱内の気圧変化(建物外周辺の気圧場)との相関特性を検証する実験手法が確立できたのみならず,一部建物模型の室内への気圧効果の影響に関する実験を試行でき,次年度の実施内容を先取りしている。2建物に作用する非定常風力が,定常風による建物周りに生じる定常渦と時空間特性が大きく異なることに起因することを明らかにしたが,建物の屋根勾配や風向変化にも感度が高いことを定量的に示せたことは計画以上の成果である。3竜巻シミュレータおよびLES解析による竜巻流れの再現が順調に進んでおり,最大接線風速に及ぼす移動速度の影響など,計画以上に分析が進展した。4NeWMeKの強風観測記録の分析において,突風率と立ち上がり時間の短い突風の選出数との間に強い関連が見られることや大きな突風率が生じている地点では急激な風速変化を伴う突風が発生していることが明らかになるなど,計画時の項目が順調に遂行されている。以上の成果は,風工学に関する国際会議(CWE2014),国内会議(第23回風工学シンポジウム,建築学会大会,日本風工学会年次大会),大学紀要等にて公表済みであるが,引き続き公表を進める。・新たな工夫を取り入れた「空気塊の運動方程式」を実際の建物スケールと密閉度を有する建物モデルに適用して,竜巻通過時の急激な気圧変動による建物への負荷荷重の計算手順のルーチン化を目指す。・竜巻通過時の風力のオーバーシュート現象を風向変化を考慮することによって,建物への負荷荷重の経時変化を追跡できる。・AMeDASなど気象官署での突風記録を追加調査して,より広地域・公範囲での突風の発生状況をの確率モデルの視点で分析する。
GLUT1・胆汁酸吸収に着目したDJBの有用性に関する研究

肥満症に対する外科治療(Metabolic surgery)の効果について、特に今回は大腸に注目して検討を行った。肥満モデルラットに、外科手術Duodeno-jejunal bypass(DJB)を行うことで非アルコール性脂肪肝炎、糖尿病、肥満が改善し、腸内細菌叢にも変化を認めた。しかしながら、大腸バイパスの意義については、その有用性をみつけることができなかった。本研究の目的は、肥満、高コレステロール、高血糖を呈するZDFラットに代表的な消化吸収抑制術であるDuodeno-jejunal bypass (DJB)に大腸バイパス術を施行し、その効果およびmicrobiomeにおける影響を検討し、大腸の役割を明らかにする。16週齢OLETFラットを用いて1.DJB群2.DJB+大腸バイパスモデル3.回腸末端直腸吻合4.SHAM群を作成する。8週間MCD+HF dietを摂取させ犠死させる以上の群で、体重、adirpocytokineの推移、血液生化学検査、OGTT検査、胃・小腸・大腸・肝臓の組織検査、糞便のmicrobiomの検査を行い、Duodeno-jejunal bypass (DJB)+大腸バイパス術の効果およびmicrobiomeの変化について検討し、肥満外科手術における大腸の意義を明らかとする。平成28年度はDJBにおいてkey factorである胆汁酸のGLP-1を介した耐糖能改善効果において、大腸の役割を検討するため、DJBモデル、DJB+大腸バイパスモデルを作成し、糖尿病改善効果、incretin、NASHの変化を検討する。また、microbiotaに及ぼす影響を検討する。現在肥満モデルラットを作成と並行して、DJBモデル・大腸モデルの作成を行っている。これらの手術モデルは手技が煩雑で、手術が安定するまでに時間を要することもありDBBモデル、大腸モデルの確立にいたっていない。手技を安定化し、早急にDJBモデル、DJB+大腸バイパスモデルを確立する。その上で、申請書に記した検討項目について、急ぎ実験を進めていく。体重増加抑制効果はD>L>Sであった。D・L群におけるOGTT30、60、120分の血糖はS群と比較し有意に低値であり、insulin抵抗性の改善を認めた(D、L群はn.s.)。D群の胆汁酸は他2群に比し高値を示しており、GLP-1(15、30分)も高値を示していた。D群の回腸Lcell数は他2群と比較し有意に増加。また、D群のAST、FFA、ヒアルロン酸は他2群と比較し有意に低値を示し、NASH grading/stagingにおいても軽度であった。さらにD群microbiotaではGammaproteobacteriaの増加、Bacteroidiaの減少を認めた。大腸バイパスについては手術を施行したが、そのほとんどが下痢、脱水で死亡する結果となりマウスモデルにおいて有用性を実証で規定なかった。DJBにおいてkey factorである胆汁酸のGLP-1を介した耐糖能改善効果において、大腸の役割を検討するため、DJBモデル、DJB+大腸バイパスモデルを作成し、糖尿病改善効果、incretin、NASHの変化を検討する。DJBモデル、大腸バイパスモデルの確立をすすめ、各評価項目について検討を行う。医学薬学計画書作成時に購入予定であった消耗品の価格変動のため次年度への繰越額は消耗品に使用予定である。
林業用作業服の機能性および快適性の向上化に関する研究

前年度に、炎天下における下刈作業現場において、メモリ式温湿度データ収録装置を用いて、発汗量、皮膚温などの精細なデータを収集し、腹部、胸部の発汗、温度変化は個人差が大きいが、開口部を大きくすることにより改善しうること、背部は密閉されやすく直射日光の影響を大きく受けること等の知見を得た。今年度は、吸汗性の高い綿と、熱伝導性が高く、水分の吸収発散が速い麻を用いて夏用作業服の試作を4種類行い、野外試験、室内試験を行った。その結果、以下の成果が得られ、下刈作業の労働負担を改善しうる作業服が製作された。(1)襟を大きく開けた設計の効果により、胸部の温度が低く、安定していた。(2)高温時の強度作業では素材や衣服の構造に関係なく衣内湿度は100%に達するので、着心地の問題になる。麻シャツは綿シャツよりも汗によるべとつきが少なく、生地としても丈夫なので、下刈用作業服に適している。また、各種雨具について衣内気候を検討した結果、現行の雨合羽は、通気性、放熱性が悪く、気温が1718°C位でも汗が冷えて寒く感じられた。一方、北欧の既製林業用レインジャケットは、襟が高くて締まっていることと、刈払機の吊りバンドによる押さえつけのために、作業時は背部の通気性が阻害されていたが、適度な通気性による保温効果により、汗が冷えず、寒く感じられなかった。ただし、気温が12°Cまで下がると、寒く感じられた。雨天時や冬季集材作業の衣内温度は3031°Cにあり、季節や天候によって暖かくも寒くも感じられるが、この数値は今後、寒冷用作業服を設計するときの参考になるものと思われる。林業作業者を対象に行った作業服の機能に関するアンケート調査結果に基づいて、イメージスキャナを用いてデザイン的検討も行った。炎天下における下刈作業現場において、メモリ式温湿度データ収録装置を用いて、発汗量、皮膚温などの精細なデータを収集した。その結果、次の知見が得られた。(1)腹部、胸部の発汗、温度変化は個人差が大きく、それぞれの特徴がみられる。(2)背部は温度、湿度ともに高くなる傾向があり、背部の換気を良くするための工夫が必要である。(3)体熱発散を促進し、透気性にすぐれた新素材を用いる必要がある。(4)野外作業における衣内気象は、作業による生理的変化の他に、気流、日射の影響が大きい。今後、本研究を進めていく上で、外的気象に対しても総合的に検討していく必要がある。以上の成果は、今後の作業服設計のための基礎資料となるものである。また、北欧の既製冬用作業服の寒冷作業地での保温機能については、大腿部の被服の設計が重要であることが確かめられた。冬用作業服については、林業作業の内容、重軽度によって、設計を変えることが望ましい。北欧の各種作業服の素材の物性についても解析を行い、はっ水性が非常に高いことが明らかになった。林業作業者を対象に、森林内での目立つ色、ポケットの機能、携帯品等についてアンケート調査を行い、今後の作業服設計の指針を得た。

今年度は、吸汗性の高い綿と、熱伝導性が高く、水分の吸収発散が速い麻を用いて夏用作業服の試作を4種類行い、野外試験、室内試験を行った。その結果、以下の成果が得られ、下刈作業の労働負担を改善しうる作業服が製作された。(1)襟を大きく開けた設計の効果により、胸部の温度が低く、安定していた。(2)高温時の強度作業では素材や衣服の構造に関係なく衣内湿度は100%に達するので、着心地の問題になる。麻シャツは綿シャツよりも汗によるべとつきが少なく、生地としても丈夫なので、下刈用作業服に適している。また、各種雨具について衣内気候を検討した結果、現行の雨合羽は、通気性、放熱性が悪く、気温が1718°C位でも汗が冷えて寒く感じられた。一方、北欧の既製林業用レインジャケットは、襟が高くて締まっていることと、刈払機の吊りバンドによる押さえつけのために、作業時は背部の通気性が阻害されていたが、適度な通気性による保温効果により、汗が冷えず、寒く感じられなかった。ただし、気温が12°Cまで下がると、寒く感じられた。雨天時や冬季集材作業の衣内温度は3031°Cにあり、季節や天候によって暖かくも寒くも感じられるが、この数値は今後、寒冷用作業服を設計するときの参考になるものと思われる。林業作業者を対象に行った作業服の機能に関するアンケート調査結果に基づいて、イメージスキャナを用いてデザイン的検討も行った。
呼吸器悪性腫瘍の微小環境の特性を標的とした新規制御法の開発

腫瘍微小環境の線維芽細胞が産生するHGFなどの増殖因子が、EGFR変異肺がんやALK融合遺伝子陽性肺がん細胞において、分子標的薬耐性を惹起することを明らかにした。さらに、これらの増殖因子受容体の活性化を阻害すれば、微小環境による分子標的薬耐性が解除できることを示した。一方、胸膜中皮腫の同所移植モデルにおいて、胸膜中皮腫細胞と線維芽細胞は、悪性サイトカインネットワークを形成することで腫瘍進展を促進しており、このサイトカインネットワークの構成因子が治療標的となることを明らかにした。肺がんと胸膜中皮腫(以下中皮腫)は極めて予後不良の呼吸器悪性腫瘍であり、その死亡率減少はわが国のがん医療の急務の命題である。肺がんにおいては上皮成長因子受容体チロシンキナーゼ阻害薬(EGFR-TKI)であるゲフィチニブやエルロチニブが特定の症例群に著効するが、ほぼ例外なく獲得耐性により再燃することが臨床上最大の問題となっている。本研究では、腫瘍微小環境としての線維芽細胞や血管内皮に着目し、その特性を分子生物学的に理解し、画期的な治療効果が得られる新規治療法の開発を目指している。今年度は、腫瘍微小環境の線維芽細胞が産生する肝細胞増殖因子(HGF)が、ゲフィチニブ耐性克服薬として期待されている不可逆型EGFR-TKIに対しても耐性を誘導することを明らかにした。さらに、抗HGF抗体などでHGFの活性を阻害することによりHGFによる耐性が解除されることを示した。また、HGFは受容体であるMetに結合し下流シグナルを活性化しEGFR-TKI耐性を誘導することを既に報告しているが、Met下流のPI3Kを短時間でも強力に阻害することによって、HGFによる耐性を解除できることを明らかにした。線維芽細胞が産生するHGFがEGFR-TKI耐性を誘導する肺がんの皮下移植モデルにおいても、ゲフィチニブとPI3K阻害薬を併用することでPI3Kを強力に阻害し、耐性を克服できることを示した。これらの研究成果は、微小環境が産生するHGFがさまざまなEGFR-TKIに対して耐性を誘導することや、HGF-Met経路を遮断することで耐性を解除できることを示したものであり、今後の耐性克服治療の臨床開発において有用なエビデンスである。癌をとりまく微小環境は腫瘍の増殖や薬剤感受性に深く関与しており、癌と微小環境の相互作用を断ち切れば画期的な抗悪性腫瘍薬の開発が可能であると考えられる。胸膜中皮腫には様々な細胞が微小環境を構成する因子として存在する。今回、線維芽細胞に着目し中皮腫細胞との相互作用を検討し、相互作用を阻害するマルチキナーゼ阻害薬の治療効果を同所移植モデルにおいて検討した。さらに、胸膜中皮腫51症例の腫瘍検体を用い腫瘍内線維芽細胞数および標的因子発現を検討した。ヒト胸膜中皮腫細胞株MSTO-211HをSCIDマウス胸腔に同所移植すると、線維芽細胞が多数集積した胸腔内腫瘍が形成された。MSTO-211HはFGF-2やPDGF-AAなどの線維芽細胞遊走因子を発現し、線維芽細胞株MRC-5の増殖、運動能、HGF産生能を増強した。MRC-5が産生するHGFはMSTO-211Hの増殖および運動能を増強した。よって、中皮腫細胞と線維芽細胞は悪性サイトカインネットワークを形成し進展を制御していると考えられた。悪性サイトカインネットワークを断ち切るために、FGFR1およびPDGFR阻害活性を有するTSU-68やE7080に着目した。TSU-68やE7080は上記同所移植モデルにおいて、胸腔内腫瘍への線維芽細胞集積を抑制し腫瘍増大を著明に阻害した。さらに、胸膜中皮腫症例の腫瘍の53%に線維芽細胞が集積しており、FGF-2,PDGF-AA,およびHGFを高頻度で強発現していた。以上より、胸膜中皮腫は臓器微小環境と悪性サイトカインネットワークを形成し腫瘍進展を促進しており、このサイトカインネットワークが胸膜中皮腫の新しい治療標的となることが示唆された。一方、肺がんの浸潤線維芽細胞もHGFを産生し分子標的薬感受性を制御している。HGFの受容体であるMetの阻害薬により分子標的薬の感受性をあげられることも明らかにした。来年度には、Met阻害薬の血管新生に及ぼす影響も検討する予定である。

本研究では、腫瘍微小環境としての線維芽細胞や血管内皮に着目し、その特性を分子生物学的に理解し、画期的な治療効果が得られる新規治療法の開発を目指している。今年度は、腫瘍微小環境の線維芽細胞が産生する肝細胞増殖因子(HGF)が惹起するEGFR-TKI耐性に着目し、次世代型EGFR-TKIとMet阻害活性を有するALK阻害薬(クリゾチニブ)を併用することで耐性を解除できることを明らかにした。しかし、マウスモデルにおいて長期にわたり高用量の阻害薬を併用した治療を行った場合には、小腸大腸粘膜に障害が発生し重篤な下痢が出現したことから、慎重に用量設定をする必要があると思われた。さらに、ヒストン脱メチル化酵素KDM5BがマイクロRNA200発現を低下し上皮間葉移行(EMT)を誘導することを見出し、KDM5Bが転移を含む腫瘍進展や分子標的薬耐性の標的分子であることを示した。本研究では、腫瘍微小環境としての線維芽細胞や血管内皮細胞に着目し、その特性を分子生物学的に理解し、画期的な治療効果が得られる新規治療法の開発を目指している。今年度は、腫瘍微小環境の線維芽細胞や血管内皮細胞が産生する肝細胞増殖因子(HGF)や上皮成長因子受容体(EGFR)のリガンドに着目し、EML4-ALK肺がん細胞株において選択的ALK阻害薬(アレクチニブ)の耐性をHGFやEGFRリガンド(EGF, TGF-αなど)が惹起することを明らかにした。HGFによるアレクチニブ耐性は、MET阻害活性も併せ持つALK阻害薬(クリゾチニブ)によって解除できること、EGFRリガンドによる耐性はEGFR阻害薬とALK阻害薬の併用で解除できることを見出した。したがって、微小環境因子によりALK阻害薬耐性が惹起された場合には、耐性因子を同定することが重要で、既存のALK阻害薬あるいは既存のEGFR阻害薬併用などで克服できる可能性を示した。また、中皮腫細胞が糖脂質であるガングリオシドGM2を高発現していることを見出した。ADCC活性を高めるポテリジェンと技術を用いて作成された抗GM2抗体が、ヒト末梢血単核球(MNC)の存在下で、GM2を高発現する中皮腫細胞をADCCにより死滅させた。SCIDマウスの胸腔に中皮腫細胞とMNCを移植する同所移植モデルにおいて、抗GM2抗体とMNCによる治療が中皮腫の胸腔内進展を有意に抑制した。さらに、中皮腫患者検体(26検体)を用いた検討で、約60%の中皮腫でGM2を発現しており、そのうち約40%がGM2を高発現していることを明らかにした。以上より、高いADCC活性を有する抗GM2抗体がGM2を高発現した中皮腫に対し有効である可能性を示した。EGFR活性型遺伝子変異やEML4-ALK融合遺伝子を有する肺がんは、EGFRチロシンキナーゼ阻害薬(TKI)やALK-TKIがそれぞれ著効する。しかし、耐性の獲得により数年以内にほぼ全例が再発するため、獲得耐性は臨床的に克服すべき次なる課題になっている。私たちは微小環境を構成する線維芽細胞から産生されうる肝細胞増殖因子(HGF)がEGFR変異肺がん細胞においてゲフィチニブの耐性を誘導することを既に報告している。今年度は、HGFがMetをリン酸化し下流のPI3K/Akt経路を活性化することでEGFR-TKI耐性のみならず血管新生も誘導し、EGFR変異肺がんの進展を促進していることを明らかにした。
ＥＧＦＲ天然変性ドメインの構造変化ダイナミクスの１分子ＦＲＥＴ計測

上皮成長因子受容体の天然変性C-末端ドメインのみ断片化した分子(EGFR-CT)を用いて試験管中1分子FRET計測実験をおこない、構造変化ダイナミクスの測定を試みた。イメージング実験では天然変性の構造揺らぎを直接捉えることができなかったが、FRET分布が溶液条件(イオン強度)に依存して変化することが分かった。そこで拡散分子のバースト計測により溶液条件への依存性を調べたところ、イオン強度より変性剤濃度に強く依存してFRETが変化する結果を得た。天然変性蛋白質では一般的に電荷相互作用が構造に影響すると考えられるが、EGFR-CTではむしろ局所的な2次構造形成が重要であることが明らかになった。平成26年度の研究計画に従ってEGFR分子の構造変化ダイナミクスの計測を進めていく中で、試料処理に関する問題点が明らかになった。これまで採用していた1分子計測データの中に、ガラス基板表面との非特異吸着により構造変化ダイナミクスに影響を受けている分子が含まれている可能性があることが分かった。そこで、ガラス基板の表面処理法を改善することとした。これまでの吸着性のブロッキング剤によるブロッキングに替え、ポリエチレングリコール(PEG)を化学結合させる方法を用いることにした。同時に、分子のガラス基板への固定法を、2次抗体を基板表面に吸着させる方式から、PEGの一部(1%程度)にビオチン修飾されたものを混在させ、ビオチン付きのHis-タグ1次抗体とアビジンを介して固定する方式へと変更した。PEGを用いた基板表面修飾法にはすでにさまざまな方式が提案されているが、ブロッキング効率の高い方式を選定するために複数のプロトコルや試薬を試み、コンタミを減らすためのプロトコル最適化などをおこなってきた。その結果として、新たな表面処理法についてほぼ完成に至ることができた。それと並行して、フォトンカウンティング検出器を備えたコンフォーカル顕微鏡装置と変分ベイズ-隠れマルコフモデル解析法を用いた1分子FRET実験をおこなってきた。これらの手法は、研究計画で予定されていた高精度のダイナミクス計測を実現するためのものであるが、世界的にも実績が少ない手法であり、性能評価と経験の蓄積が必要であった。ホリデー・ジャンクションDNAを対象として1分子FRET計測実験をおこない、離散的な分子状態を識別し、エネルギー地形図を再構成することに成功した。これらの手法がEGFRの構造変化ダイナミクス計測においても有効であることが確認できた。平成26年度以降の研究計画に従って実験を進めていく中で、試料処理に関して問題が明らかになり、ガラス基板の表面処理法を改善したが、引き続き、条件の最適化等をおこなった。ガラス基板表面にポリエチレングリコール(PEG)を化学結合させて非特異吸着を抑えると同時に、PEGの中に1%程度ビオチン修飾されたものを混在さることで、ガラス基板表面への分散固定を実現する。実験に用いるEGFR-CT断片分子やGrb2分子を用いて、非特異吸着の抑制や特異的な固定が十分な性能で実現されていることを確認した。上記の処理を施したガラス基板を用い、in vitroで固定されたEGFR-CT天然変性ドメイン断片分子の1分子計測実験をおこなった。Grb2の結合-解離キネティクスの計測をおこなったところ、従来はEGFRとGrb2が自発的に結合-解離の平衡状態に至り、Grb2結合サイトのチロシン残基がリン酸化されることで結合反応が促進されると考えられていたが、結合反応を有意に検出することができなかった。結合反応には、従来は考えられていなかった条件が必要とされる可能性が明らかになった。またそれらと並行して、フォトンカウンティング検出と変分ベイズ-隠れマルコフモデル解析法を用いた1分子FRET実験をおこなってきた。ホリデー・ジャンクションDNAを対象として1分子FRET計測実験をおこない、離散的な分子状態を識別し、状態遷移ネットワークを再構成することに成功した。この成果をBiophysical Chemistry誌に発表した。これらの手法は、研究計画で予定されていた高精度のダイナミクス計測を実現するものであり、EGFRの構造変化ダイナミクス計測においても有効であることが確認できた。平成26年度以降の研究計画に従ってEGFR分子の構造変化ダイナミクスの計測を進めていく中で、試料処理に関する問題点が明らかになっていた。この問題を放置することは長期的な視野からも研究計画に与える影響が大きいと判断し、ダイナミクス計測実験より優先して、ガラス基板の表面処理法を改善することとした。平成27年度も引き続きプロトコルの最適化などをおこなう必要があった。また、改善したガラス基板を用いておこなったEGFR-CT分子の1分子計測実験の結果、Grb2の結合反応について、従来の知見から予想されていたのとは異なる結果が得られた。EGFR-CT分子のGrb2結合サイトであるチロシン残基に自発的に結合するものと考えられていたが、1分子イメージング実験の結果、有意な結合が観察されなかった。EGFR-Grb2の結合反応には、これまで未知の条件があった可能性がある。Grb2結合状態とEGFR分子の構造状態との関係を調べることは、本研究の重大なポイントであり、結合条件を明らかにすることが優先されるため、現在はその条件について検討している。上記の理由のため、本来予定していた実験を計画通りに進めることができず、やや遅れが生じる結果となった。

平成26年度以降の研究計画に従って実験を進めていく中で、試料処理に関して問題が明らかになり、ガラス基板の表面処理法を改善したが、引き続き、条件の最適化等をおこなった。ガラス基板表面にポリエチレングリコール(PEG)を化学結合させて非特異吸着を抑えると同時に、PEGの中に1%程度ビオチン修飾されたものを混在させることで、ガラス基板表面への分散固定を実現した。実験に用いるEGFR-CT断片分子やGrb2分子を用いて、非特異吸着の抑制や特異的な固定が十分な性能で実現されていることを確認した。高感度のsCMOSカメラ、および、カメラの半分ずつの視野に2色の蛍光像を分割して投影するW-viewシステムを装備した顕微鏡システムを用いて、in vitroで上記の処理を施したガラス基板に固定されたEGFR-CT天然変性ドメイン断片分子の1分子FRET計測実験をおこなった。得られたFRET分布は、一見すると単一のピークで構成されているように見えたが、詳細な解析により、2つのピークが重なり合っていることが分かった。すなわち、EGFR-CT分子は、2種類の構造状態で混在すると考えられる。天然型分子と擬似リン酸化分子との比較では、FRET分布に明確な違いは見られなかった。また、FRETの時間変化の軌跡を調べたが、2つの状態間での遷移ダイナミクスは確認されなった。これば、構造状態の遷移が起きていないか、または観察の時間スケールが遷移レートとずれているために検出できていない可能性が考えられる。平成26年度以降の研究計画に従ってEGFR分子の構造変化ダイナミクスの計測を進めていく中で、試料処理に関する問題点が明らかになっていた。これまで採用していた1分子計測データの中に、ガラス基板表面との非特異吸着により構造変化ダイナミクスに影響を受けている分子が含まれている可能性があることが分かった。この問題を放置することは長期的な視野からも研究計画に与える影響が大きいと判断し、ダイナミクス計測実験より優先して、ガラス基板の表面処理法を改善することとした。平成28年度も引き続きプロトコルの最適化などをおこなう必要があった。EGFR-CT分子の1分子FRETイメージング計測によりダイナミクスの計測をおこなう予定であったが、FRET分布情報は得ることができたものの、ダイナミクスを確認することができなかった。ダイナミクス自体が存在していないか、計測の時間スケールがダイナミクスのものとずれていた可能性がある。また、Grb2結合による影響も調べる予定であったが、1分子イメージング実験や生化学的手法などではGrb2の結合を検出することができていない。EGFR-Grb2の結合反応には、これまで未知の条件があった可能性がある。Grb2結合状態とEGFR分子の構造状態との関係を調べることは、本研究の重大なポイントであり、結合条件を明らかにすることが優先されるため、現在はその条件について検討している。上記の理由のため、本来想定していた実験結果を計画通りに得ることができず、遅れが生じる結果となった。
サイトカインによるNF-κB活性化制御とアポトーシスの誘導

アポトーシスはTNF-αの抗腫瘍効果の主要メカニズムと考えられているが、TNF-αによるNF-κBの活性化はアポトーシスに対し抑制的と言われている。我々はTNF-αの抗腫瘍効果は、IFN-αにより増強され、それはアポトーシスの増強によりもたらされていることをヒト大腸癌細胞株RPMI4788を用いて示してきた。そこで、TNF-αとIFN-αの併用によりもたらされるアポトーシスの増強とNF-κBの活性化の関係について検討した。抗NF-κB抗体を用いた免疫組織染色および、EMSAによる研究の結果、NF-κBの活性化は増強しており、TNF-αとIFN-αの併用によるアポトーシスの増強が、それぞれ単独の刺激よりも早期に、強いNF-κBの核内移行を伴っている事を見出した。また、NF-κBのDNA結合部位への結合を阻害するおとり型核酸医薬NF-κBデコイを用いて、NF-κBの活性化を抑制したところ、TNF-αとIFN-αの併用によりもたらされるアポトーシスの増強をも抑制し、殺細胞効果を減弱しうることを証明した。すなわち、これらのサイトカインクロストークにより誘導されたNF-κBの活性化はアポトーシスに対しpro-apoptoticに働いていると考えられた。一方、TNF-αとIFN-αの併用によりFasの発現増強がみられ、NF-κBデコイを用いてこのFasの発現増強が抑制されること、抗FasL抗体によりTNF-αとIFN-αの併用によるアポトーシスが抑制され、殺細胞効果も減弱することが示された。これは、FasLを併用することにより、さらに抗腫瘍効果が増強される可能性を示していた。本研究より、サイトカインクロストークによって、従来想定し得なかったむしろ逆の生体反応が示されることが証明され、これらの反応についての理解を深めることが癌治療において重要であると考えられた。TNF-αとIFN-αに感受性のあるヒト大腸癌細胞株RPMI4788において、TNF-αとIFN-αの併用というサイトカインクロストークによりアポトーシスが増強するメカニズムを解析した。抗NF-kB抗体を用いた免疫組織染色によるNF-kBの核内移行を、TNF-α単独、IFN-α単独、及び両者併用群において検討したところ、意外にもTNF-αとIFN-αの併用により、最も強くNF-kBが核内移行していることが分かった。また、同様のサイトカインにて刺激した後、核蛋白質を抽出し、NF-kBに対するターゲット・オリゴを用いたElectrophoretic Mobility Shift Assey(EMSA)によるNF-kB活性化の検討をおこなったところ、TNF-αとIFN-αの併用により、最も強くNF-kBが活性化されていることが分かった。TNF-αによるNF-kBの活性化はアポトーシスに対し抑制的と言われているが、我々の研究では、NF-kBの活性化とアポトーシスの増強が同じ刺激(併用刺激)で見られるという新しい知見が得られた。このNF-kBの活性化が、実際、アポトーシスに対しどのように作用しているのか検討するため、NF-kBのDNA結合部位と同じ配列を持つ短い核酸を合成し、デコイ(おとり)型核酸医薬としてHVJ-liposome法にてRPMI4788細胞に導入し、NF-kBの活性化を抑制した。

サイトカイン刺激後の変化を検討したところ、TNF-α単独刺激では、NF-kB活性化抑制によりアポトーシスが増強、すなわちNF-kBはanti-apoptoticに働いていたが、TNF-αとIFN-αの併用刺激では、NF-kB活性化抑制によりアポトーシスが減弱、すなわちNF-kBはpro-apoptoticに働いていることが示された。つまり、TNF-α刺激ではanti-apoptoticに働いていたNF-kBが、IFN-αとの併用というサイトカインクロストークにより全く逆のpro-apoptoticな方向に転じるという新しい知見が得られた。さらに、このアポトーシスの増強にFas/FasLのシステムが関与していることが見出された。現在、IFN-αがNF-kBの活性化を増強する経路について、解析をすすめている。アポトーシスはTNF-αの抗腫瘍効果の主要メカニズムと考えられているが、TNF-αによるNFkBの活性化はアポトーシスに対し抑制的と言われている。我々はTNF-αの抗腫瘍効果は、IFN-αにより増強され、それはアポトーシスの増強によりもたらされていることをヒト大腸癌細胞株RPMI4788を用いて示してきた。そこで、TNF-αとIFN-αの併用によりNFkBの活性化が抑制されアポトーシスの増強が見られているのではないかとの仮説をたて、アポトーシスの増強とNFkBの活性化の関係について検討した。抗NFkB抗体を用いた免疫組織染色およぴ、EMSAによる研究の結果、仮説に反しNFkBの活性化は増強しており、生体内で複雑に影響しあい効果を発現する生理活性物質の相互作用、つまりサイトカインクロストークによる(TNF-αとIFN-αの併用による)アポトーシスの増強が、それぞれ単独の刺激よりも早期に、強いNFkBの核内移行を伴っている事が確認された。また、NFkBのDNA結合部位への結合を阻害するおとり型核酸医薬NFkBデコイを用いて、この実験系におけるNFkBの活性化をNFkBの核内移行に影響を与えずに抑え、ひいてはTNF-αとIFN-αの併用によりもたらされるアポトーシスの増強をも抑制し、殺細胞効果を減弱しうることを証明した。また、このTNF-αとIFN-αの併用によるアポトーシスの増強にFasが関与しており、NFkBデコイを用いてFasの発現が抑制されること、抗FasL抗体によりTNF-αとIFN-αの併用によるアポトーシスが抑制され殺細胞効果も減弱することが示された。結果は現在投稿中である。