hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
apoptosis誘導からみた肝不全発症の解明と治療的アプローチ

我々は平成7年度から肝切除周術期における外科侵襲を炎症という観点から解析する試みを続けており、IL-6、IL-8、TNF-α等の血中炎症性サイトカイン及びICAM-1及びE-selectin等の接着分子が合併肝障害の程度を反映し、手術侵襲の程度と、更に術後臓器不全の発症及び予後と極めて密接に関連していることを報告してきた。更に、肝切除中の肝組織及び末梢血単核球のこれらの炎症性サイトカインのmRNAをRT-PCR法にて測定及び定量した結果、IL-6関しては、末梢血単核球において術後約2時間から発現が認められ、出血量、合併肝障害の程度に応じて発現が増加し、術中採取した肝組織においも、肝切除操作によって末梢単核球に比しかなり強いmRNAの発現が認められた。TNE-αに関しても、肝切除によって肝組織中のmNRA発現が増加することが示された。一方、ICAM-1mRNAに関しては、肝組織中よりも末梢単核球における発現が高い傾向が認められ、血中可溶性接着分子の由来の主座は末梢単核球であろうという従来の報告と一致した。これらの結果より、肝切除中には、血中、肝組織、末梢単核球にける炎症性サイトカイン及び接着分子が、手術侵襲並びに合併肝障害に応じて変化することが解明された。平成11年度は肝細胞のapoptosisと手術侵襲の関連を遺伝子導入の手法を用いて解明するために、主として増殖性胆管炎の障害肝モデルにおいてHVJ-liposome及びadenovirusによる遺伝子導入法を確立し、肝障害における遺伝子治療的アプローチの基盤を築くことを主体とした。この結果、E2F decoyをHVJ-liposomeを用いて胆管内導入すると、増殖性胆管炎が抑制されることが判明し、胆管上皮のapoptosis誘導との関連を検索中であり、この結果を投稿準備予定である。我々は平成7年度から肝切除周術期における外科侵襲を炎症という観点から解析する試みを続けており、IL-6、IL-8、TNF-α等の血中炎症性サイト力イン及びICAM-1及びE-selectin等の接着分子が合併肝障害の程度を反映し、手術侵襲の程度と、更に術後臓器不全の発症及び予後と極めて密接に関連していることを報告してきた。更に、肝切除中の肝組織及び末梢血単核球のこれらの炎症性サイト力インのmRNAをRT-PCR法にて測定及び定量した結果、IL-6関しては、末梢血単核球において術後約2時間から発現が認められ、出血量、合併肝障害の程度に応じて発現が増加し、術中採取した肝組織においも、肝切除操作によって末梢単核球に比しかなり強いmRNAの発現が認められた。TNF-αに関しも、肝切除によって肝組織中のmNRA発現が増加することが示された。これらの結果より、肝切除中には、血中、肝組織、末梢単核球にける炎症性サイト力イン及び接着分子が、手術侵襲並びに合併肝障害に応じて変化することが解明され、現在この結果に基づいて、肝切除術中における肝組織、及び末梢血単核球におけるapoptosis誘導を検索中である。TNF-αmRNAが肝組織中において強く発現していることから恐らく

Kupffer細胞からTNF-αが分泌され、肝実質細胞においてapoptosisが誘導される可能性が示唆され、現在apoptosisの程度と手術侵襲の程度を比較検討中であり、apoptosisという現象自体が手術侵襲の新しい評価法となり得ることが示唆された。更に、最近NOとapoptosis誘導との関連が注目されているが、肝切除中にiNOSmRNAが発現することを確認している。我々は平成7年度から肝切除周術期における外科侵襲を炎症という観点から解析する試みを続けており、IL-6、IL-8、TNF-α等の血中炎症性サイトカイン及びICAM-1及びE-selectin等の接着分子が合併肝障害の程度を反映し、手術侵襲の程度と、更に術後臓器不全の発症及び予後と極めて密接に関連していることを報告してきた。更に、肝切除中の肝組織及び末梢血単核球のこれらの炎症性サイトカインのmRNAをRT-PCR法にて測定及び定量した結果、IL-6に関しては、末梢血単核球において術後約2時間から発現が認められ、出血量、合併肝障害の程度に応じて発現が増加し、術中採取した肝組織においても、肝切除操作によって末梢単核球に比しかなり強いmRNAの発現が認められた。TNF-αに関しても、肝切除によって肝組織中のmNRA発現が増加することが示された。一方、ICAM-1mRNAに関しては、肝組織中よりも末梢単核球における発現が高い傾向が認められ、血中可溶性接着分子の由来の主座は末梢単核球であろうという従来の報告と一致した。これらの結果より、肝切除中には、血中、肝組織、末梢単核球にける炎症性サイトカイン及び接着分子が、手術侵襲並びに合併肝障害に応じて変化することが解明された。平成11年度は肝細胞のapoptosisと手術侵襲の関連を遺伝子導入の手法を用いて解明するために、主として増殖性胆管炎の障害肝モデルにおいてHVJ-liposome及びadenovirusによる遺伝子導入法を確立し、肝障害における遺伝子治療的アプローチの基盤を築くことを主体とした。
ヒト型完全マクロファージ寛容導入免疫不全マウスによる新規がん幹細胞アッセイの確立

がん幹細胞研究には、がん幹細胞同定のためのアッセイ系の確立が必須である。これまで、T、B細胞を欠損したNOD-scidマウスを基本として、さらに免疫不全のための修飾を加えたマウスが開発され、異種移植を用いたがん幹細胞研究にも応用されてきたが、造血系腫瘍の一部や固形癌では生着効率が低く、がん幹細胞研究には、さらなる改良が必要であった。我々は、免疫不全マウスへのヒト細胞の生着には、リンパ球欠損に加えて、マクロファージ寛容が必要であることを見出し、より強化されたマクロファージ寛容を導入したBRGhSラインを樹立した。このマウスは、ヒト細胞の生着効率が著しく改善し、今後のがん細胞研究に有用である。がん幹細胞とは、自己複製能力と未分化性の維持能力を新たに獲得した悪性の幹細胞であり、腫瘍の源である。難治性悪性腫瘍の治療成績の向上には、がん幹細胞自身を標的とした新規治療法の開発が求められている。がん幹細胞を標的とする治療法の開発には、1)がん幹細胞の純化、2)その純化したがん幹細胞の生体内での機能、を知る必要がある。これらを明らかにするために必須の基本技術が、高度免疫不全マウスを用いた異種移植アッセイシステムである。本課題では、高効率な癌幹細胞アッセイのための次世代異種移植モデルを確立する。我々は、繁殖能力の高いC57/BL6ストレインに、Rag2欠損、Il2rg欠損によってマウスT細胞分化を完全遮断し、ヒト型SIRPA遺伝子をノックインし、完全ヒトCD47-ヒトSIRPA結合可能による完全マクロファージ寛容を導入したマウスラインを目指す。我々は、すでに、B6バックグランドでRag2およびIL2Rγを欠損したマウスに、NOD型SIRPA変異を導入した免疫不全マウスB6.Rag2(null)Il2rg(nul)lSIRPA(NOD/NOD)ライン(BRGS)を樹立し、現存するラインで最高の生着効率を持つNOG/NSGラインと同等の生着効率を持つこと明らかにし、Blood誌に報告した。この結果は、マクロファージ寛容の強化によって、マウスバックグラウンドによらず、新規免疫不全マウスラインの樹立が可能であることを示している。さらに、完全マクロファージ寛容導入を目的としてヒト型SIRPAをノックインしたラインの樹立した。このラインをBRGSラインと交配し、最終マウスラインの樹立を行った。現在、新型マウスラインのヒト細胞の生着効率を検証中である。国民の死因の約半分を占める難治性悪性腫瘍の治療成績の向上には、がん幹細胞自身を標的とした新規治療法の開発が求められている。我々は、すでに、B6バックグランドでRag2およびIL2Rγを欠損したマウスに、NOD型SIRPA変異を導入した免疫不全マウスB6.Rag2(null)Il2rg(nul)lSIRPA(NOD/NOD)ライン(BRGS)を樹立しており、当該年度では、現存するラインで最高の生着効率を持つNOG/NSGラインと同等の生着効率を持つこと明らかにし、Blood誌に報告した。次年度でBRGSラインと交配し、最終ラインを樹立し、新型マウスラインのヒト細胞の生着効率を検証するとともに、がん幹細胞のアッセイを進める予定である。

がん幹細胞を標的とする治療法の開発には、1)がん幹細胞の純化、2)その純化したがん幹細胞の生体内での機能、を知る必要がある。これらを明らかにするために必須の基本技術が、高度免疫不全マウスを用いた異種移植アッセイシステムである。本課題では、高効率な癌幹細胞アッセイのための次世代異種移植モデルを確立する。我々は、繁殖能力の高いC57/BL6ストレインに、Rag2欠損、Il2rg欠損によってマウスT細胞分化を完全遮断し、ヒト型SIRPA遺伝子をノックインし、完全ヒトCD47-ヒトSIRPA結合可能による完全マクロファージ寛容導入マウスライン樹立を目指した。我々は、すでに、B6バックグランドでRag2欠損IL2Rγを欠損したマウスに、NOD型SIRPA変異を導入した免疫不全マウスB6.Rag2(null)Il2rg(nul)lSIRPA(NOD/NOD)ライン(BRGS)を樹立し、現存するラインで最高の生着効率を持つNOG/NSGラインと同等の生着効率を持つこと明らかにし、Blood誌に報告した。この結果は、マクロファージ寛容の強化によって、マウスバックグラウンドによらず、新規免疫不全マウスラインの樹立が可能であることを示している。さらに、完全マクロファージ寛容導入を目的としてヒト型SIRPAをノックインしたラインの樹立した。次にBRGSラインと交配し、最終ラインを樹立した。新型マウスラインのヒト細胞の生着効率は、BRGSと比較して改善し、骨髄球系のみならず、赤芽球系の造血も支持可能となった。現在、を検証するとともに、がん幹細胞のアッセイを進める予定である。血液内科本課題では、高効率な癌幹細胞アッセイのための次世代異種移植モデルを確立する。我々は、繁殖能力の高いC57/BL6ストレインに、Rag2欠損、Il2rg欠損によってマウスT細胞分化を完全遮断し、ヒト型SIRPA遺伝子をノックインし、完全ヒトCD47-ヒトSIRPA結合可能による完全マクロファージ寛容を導入したマウスラインBRGhSを樹立した。このBRGhSマウスにおいては、T細胞のリークがなく、ヒト型SIRPを持つために、マクロファージの貪食による移植片拒絶を回避可能で、NOD型SIRPAをもつBRGSラインと比べても良好なヒト造血細胞生着がみられることが予想される。当該年度では、ヒト型SIRPAノックインライン最終ラインが得られているが、ラインの維持や今後の実験のためには、マウスコロニーの拡大、安定が必須であり、現在、交配を繰り返している。同時に、現在は、ヒト正常造血幹細胞分画を移植し、ヒト細胞の生着能を検証中である。さらに、その後は、各種がん幹細胞のアッセイ系の開始を予定している。最終ラインが得られ、マウスコロニーは順調に拡大しており、研究計画はおおむね順調に進展している。我々は、繁殖能力の高いC57/BL6ストレインに、Rag2欠損、Il2rg欠損によってマウスT細胞分化を完全遮断し、ヒト型SIRPA遺伝子をノックインし、完全ヒトCD47-ヒトSIRPA結合可能による完全マクロファージ寛容を導入したマウスラインを樹立する。我々は既に、C57/BL6バックグランドでRag2およびIL2Rγを欠損したマウスに、NOD型SIRPA変異を導入した免疫不全マウスB6.Rag2(null)Il2rg(null)SIRPA(NOD/NOD)ライン(BRGS)を樹立している。
チャンネル遺伝子を用いた胚性幹細胞由来バイオペースメーカーの確立と治療への応用

ES細胞由来心臓ペースメーカー細胞の作製を目的として、ペースメーカー活性に重要なイオンチャネルであるHCN4の遺伝子座にEGFP遺伝子を相同組換えによってノックインしたマウスES細胞株の樹立を確認した。得られたクローン株に分化誘導を施すと収縮部位ではGFPを発現しており、GFP陽性細胞を0.1%-3.0%で分取することができ、回収した細胞のおよそ70-90%が収縮するのを観察した。細胞同士で結合、連動して収縮しており、電気的結合を形成していることが示唆された。パッチクランプ解析からも、自動能やIf電流などの心臓ペースメーカー細胞に必要な電気的性質を有していることが確認された。これらの結果から、心臓ペースメーカー細胞に関する研究を行うのに適した細胞株であることが確認された。マウスES細胞のNkx2.5遺伝子アリルにNkx2.5-GFPをノックインしたES細胞を用いて、これを分化誘導し、その過程で発現するイオンチャネルや転写因子を網羅的に解析した結果、ペースメーカ活性が生じる時期にHCN遺伝子の発現が増加することを見出した。さらにペースメーカ細胞にはHCN1ならびにHCN4の発現が優位であった、そこで、HCN4のアリルのエクソン1にGFP遺伝子をノックインしたES細胞を作製した。1)ノックインしたES細胞の樹立:マウスのHCN4イオンチャネルのプロモーター領域を含む5kbの5'-側と3kbの3'-側をPCRで増幅した後、GFPのcDNAを持ちNeomycine耐性遣伝子とジフテリア毒素遺伝子を有する真核細胞発現ベクターのmulti-cloning siteに挿入したノックインベクターを作成した。制限酵素でベクターをIinearizeしたのち電気穿孔法でマウスES細胞に遺伝子導入し、Neomycinにより耐性クローンを選択する。クローンをPCR法とサザーンプロット法により片アリルに相同遺伝子組み換えを起こしたノックインES細胞を樹立した。2)ペースメーカー細胞の特性の評価:既報のhanging drop culture法により心臓分化を誘導し、安定してGFPを発現するクローンを選び出す。分化誘導6、8、10、14日のGFP陽性細胞をセルソーターにより採取した。チャンネル特性をRT-PCR法、免疫染色法ならびにウェスタンブロット法により解析したところ発現する心筋特異的転写因子やイオンチャネルの特徴は野生型と差がない。GFPシグナルの強い部位で自律拍動を認め、セルソーターによりGFP陽性細胞を分取すると80%の確率で自律拍動し、パッチクランプによる電気的な性質はペースメーカ細胞に一致し、イオンチャンネルを解析すると、Ifに加えてNa,Ca,I_kurならびにHERGチャネルを発現しているがI_k1チャネルは発現していなことが判明した。前年度にマウスES細胞のHCN4遺伝子アリルにGFP-Neo-DT遺伝子をノックインしたES細胞を樹立し、これを分化誘導し、GFP陽性細胞をセルソーターにより選別採取し、洞結節細胞に発現するイオンチャネルと同等のチャネル遺伝子・蛋白ならびに自動能を有することを確認した。そこで、本年度は以下の項目を検討した。1)徐脈性不整脈モデルとしての房室ブロックモデル作成:徐脈性不整脈のモデルとして房室ブロックモデルを選んだ。ラットを全身麻酔ならびに人工呼吸器下に開胸し、肺動脈を目安に右房と右室の間にグリセロールを注入し、心電図にて心拍数が1/2となる徐脈を伴う完全房室ブロックモデルの作成を確認した。さらにテレメーターを用いて房室ブロックのモニターに成功した。2)ペースメーカ細胞の組織化とモデル動物への移植:HCN4-GFP陽性細胞を20・1に700個のペースメーカ細胞塊を作成し、in vitroの状態で一ケ月間ペースメーカ活性を持続することを確認した。本ES細胞にX-gal遺伝子を導入し、安定にX-galを発現する株をクローニングして、移植後にX-gal染色でその細胞の運命を追跡できることを確認hした。本ES細胞からペースメーカ細胞へ分化誘導し、GFP陽性細胞を採取してペースメーカ細胞塊をラット心臓に移植し、その生着を確認した。今後、房室ブロックモデルへの移植とその後のペースメーカ活性の獲得を検討する予定である。平成2021年度ににマウスES細胞のHCN4遺伝子アリルにGFP-Neo-DT遺伝子をノックインしたES細胞を樹立し、これを分化誘導し、GFP陽性細胞をセルソーターにより選別採取し、洞結節細胞に発現するイオンチャネルと同等のチャネル遺伝子・蛋白ならびに自動能を有することを確認した。また房室ブロックモデルラットを作成することに成功した。本年度は以下の項目を検討した。

ラットを全身麻酔ならびに入工呼吸器下に開胸し、肺動脈を目安に右房と右室の間にグリセロールを注入し、心電図にて心拍数が1/2となる徐脈を伴う完全房室ブロックモデルの作成を確認した。さらにテレメーターを用いて房室ブロックのモニターに成功した。2)ペースメーカ細胞の組織化とモデル動物への移植:HCN4-GFP陽性細胞を20μlに700個のペースメーカ細胞塊を作成し、in vitroの状態で一ヶ月間ペースメーカ活性を持続することを確認した。本ES細胞にX-gal遺伝子を導入し、安定にX-galを発現する株をクローニングして、移植後にX-gal染色でその細胞の運命を追跡できることを確認した。3)房室ブロックモデルへのペースメーカ細胞の移植効果:房室ブロックモデルへの移植とその後のペースメーカ活性の獲得を心電図によりモニターした.結果は30万個の細胞でラットの心室を駆動出来た。
各種下顎運動時の顎関節部における生体力学的研究

1.下顎頭と下顎窩の位置関係について顎関節の同時多層断層X線写真を用いて、コンピュ-タ上で顎関節部の三次元構築を行い、さらに下顎頭と下顎窩の最短距離を解析し、両者の位置関係の評価を行った。その結果、本解析法は臨床的にも矯正患者における下顎頭と下顎窩の三次元的位置関係を検討する上で、きわめて有効な手法であることが明らかとなった。2.顎関節円板の生体力学的性状について成犬8頭より摘出した顎関節円板を試料として、引張り試験を行った。その越果、関節円板は応力の大きさに応じて異なる弾性を有すること、その弾性係数は低荷重域で約3.5Kgf/mm^2であること、生体力学的性状は部位によってわずかに異なること、などの所見が明らかとなった。3.ヒト顎関節の三次元有限要素モデルの構築ヒト乾燥頭蓋骨をフランクフルト平面に平行に分割し、これの等倍大の写真を基にして同部の外形を作り、モデル作製の基本図形とした。次に、二次元的な要素分割を行った後、すべての平面図をフランクフルト平面に直交する方向に積み上げることにより、モデルの講築を進めた。その結果、本解析モデルは、2082個の節点と1340個の固体要素より構成された。4.顎関節における応力解析解析に先立ち、下顎骨ならびに周囲の顎骨に付着する筋の走行と相対的な筋力をモデルに組み込んだ、次いで、下顎骨を上顎部と咬合させた状態でわずかに下顎骨を後方へ変位させるような力を負荷した場合について顎関節部の応力解析を行った。その結果、1)顎関節円板の応力特性は部位によって異なること、2)顎関節部の各構成要素の正し位置関係が維持されている場合には、顎関節内部での応力は外力と比較してきわめて小さい値であること、3)下顎頭を後上方へ変位させるような力系が加わった場合、関節円板の前内方への転位が惹起される可能性があること、などが明らかとなった。本年度においては、1)顎関節における下顎田頭と下顎窩の三次元的位置関係の評価法の開発と検討、2)顎関節円板の生体力学的性状の検討、3)顎関節部の三次元モデルの構築、を行った。1.下顎頭と下顎窩の位置関係について顎関節の同時多層断面X線写真を用いてコンピュ-タ上にて下顎頭と下顎窩からなる顎関節部の三次元構築を行った。これをもとに、両者の最短距離を解析し、位置関係評価の指標とした。また、本解析法の精度検定も行い、十分な精度を有することが示された。そこで、矯正患者について顎関節症を伴う者を被験者として、同距離の分析を試みた。その結果、関節部における痛み、雑音などの徴候と下顎頭の後方位とが関連性を有することが明らかとなった。また、本解析法は下顎骨と下顎窩の位置関係の評価にきわめて有効であることが示された。2.顎関節円板の生体力学的症状について成犬より得た関節円板の性状を引張り試験により検討した。その結果、弾性係数はほぼ3.5Kgf/mm^2であることが明らかとなった。また、その性状は内側、中央部、外側において異なることが示された。3.三次元モデルの作製ヒト乾燥頭蓋骨をもとに、顎関節部の有限要素のモデルの作製に着手した。

現在、解析プログラムANSYSを用いて、下顎窩を除く下顎骨体部ならびに下顎頭の三次元有限要素モデルが完成した。本年度に行われた研究の成果は、次年度の検討課題であるヒト顎関節部における生体力学的変化を明らかとするために用いられる予定である。本年度においては、昨年度の研究成績に基づき顎関節部における生体力学的変化を明らかにすべく、ヒト顎関節の三次元有限要素モデルの構築とこれを用いた応力の解析を行った。1.ヒト顎関節の三次元有限要素モデルの構築ヒト乾燥頭蓋骨をフランクフルト平面に平行に分割し、側頭骨、下顎骨を含む水平分割片を作製した。次に、これの等倍大の写真を基にして同部の外形を作り、これをモデル作製の基本図形とした。下蓋骨から側頭骨までの基本図形上で二次元的な要素分割を行った後にすべての平面図をフランクフルト平面に直交する方向に積み上げることによりモデルの構築を完了した。この時点で、モデルの幾何学的等価性を検討するとともに、すべての要素について要素形態のチェックを行った。その結果、構築されたモデルは十分な精度を有することが確認された。なお、本解析モデルは、2082個の節点と1340個の固体要素より構成されることとなった。2顎関節における応力解析解析に先立ち、下顎骨ならびに周囲の顎骨に付着する筋の走行と相対的な筋力をモデルに組み込んだ。次いで、下顎骨を上顎部と咬合させた状態で、わずかに下顎骨を後方へ変位させるような力を負荷した場合について顎関節部の応力解析を行った。その結果、1)下顎頭方向への単一の力を負荷した場合でも、顎関節円板の応力特性は部位にって異なること、2)顎関節部の各構成要素の正し位置関係が保持されている場合には、顎関節内部での応力は外力と比較してきわめて小さな値であること、3)下顎頭を後上方へ変位させるような力系が加わった場合、関節円板の前内方への転位が惹起される可能性があること、などが明らかとなった。
新素材を用いた緩衝構造の落石覆工構造物への応用に関する研究

本研究は山岳急峻な地域での各種交通施設の整備に必要となる落石覆工構造物に対して、これの衝撃挙動を検討するとともに、効果的な緩衝構造を開発することを目的としたものである。研究では、まず各種緩衝構造の緩衝特性を検討するため、敷砂や発泡スチロール単体を緩衝材として用いた場合及び砂、RC床板、発泡スチロールを組合わせた三層緩衝構造を用いた場合について、重錘自由落下による緩衝実験を行い、落錘の衝撃力や緩衝材を伝播して構造物に作用する伝達衝撃力について詳細に検討した。また、三層緩衝構造をはじめ各種の緩衝構造の緩衝特性を理論的に検証するために、緩衝構造および覆工構造物をモデル化し、衝撃応答解析を行っている。これらの研究より得られた成果を列挙すれば、次のようである。1)緩衝構造を介して構造物本体に伝えられる伝達衝撃力は新たに開発された衝撃圧力計によりかなりの精度で測定することが出来た。2)敷砂緩衝構造では基礎に伝播する伝達衝撃力は重錘加速度から得られる重錘衝撃力の1.5倍以上大きく、分散効果も少ない。3)発泡スチロールを緩衝材とする場合、スチロール厚を相当とらないと緩衝効果を期待出来ず、また分散性はほとんど期待出来ない。4)三層緩衝構造では、伝達衝撃力の最大値は重錘衝撃力の最大値の約1/2であり分散効果も大きい。5)DYNA-3Dによる緩衝構造の解析では、構造のモデル化や材料物性の評価を適確に行うことにより、実験結果をかなり正確にシミュレートできる。6)落石覆工構造物のより実用的な解析は設計が許容応力により行われるとすれば折板理論による解析で十分対応できる。以上の成果より、三層緩衝構造を用いる場合の衝撃力の算定方法を提案し、また構造形式についても現行形式の特性を検討した。最近社会産業活動の発展に伴い,悪条件下での産業基盤整備が要求されるようになり,その一つとして山岳急峻な地域での各種交通施設の整備に必要となる落石覆工構造物があるが,本研究はこれの衝撃挙動を検討するとともに,効果的な緩衝構造を開発することを目的としたものである。本年度は,まず各種緩衝構造の緩衝特性を検討するため,敷砂や発泡スチロ-ルを緩衝材として用い,重錘自由落下による衝撃実験を行ない,落錘の衝撃力や緩衝材を伝播して構造物に作用する伝達衝撃力について詳細に検討した。実験は,基礎的なものとして広さ1.5m×1.5m規模の剛基礎上又はRC,DC床板上の緩衝構造の性能実験及び,実証実験として4.0m×4.0m規模の屋外実験を行なった。これらの実験をもとに,合理的な緩衝構造として開発した,砂,RC床板,発泡スチロ-ルを組せた三層緩衝構造の性能実験も行なっている。また,三層緩衝構造の緩衝特性を理論的に検証するために,緩衝構造及び覆工構造物をモデル化し,衝撃応答解析を行なっている。これらの研究により本年度得られた成果を列挙すれば次のようである。2)敷砂を緩衝材としたときの伝達衝撃圧力は,落石便覧式に近い。3)敷砂による衝撃力分散効果はあまり期待出来ない。4)発泡スチロ-

ルを緩衝材とする場合,スチロ-ル厚を相当とらないと緩衝効果を期待出来ず,また分散性はほとんど期待出来ない。5)砂,RC床板と発泡スチロ-ルなどの新素材を組合せた三層緩衝構造は,衝撃力を原材のRC床板で受けこの剛性により衝撃力を広く分散させるとともにスチロ-ル等で吸収し伝達圧力をかなり減少させる。本年度は、昨年度に引き続き砂、コンクリート床板、発泡スチロールを組み合わせた三層緩衝構造の緩衝特性を明らかにするため、実規模に近い構造模型による衝撃実験を行った。また実験に用いた構造をモデルとして衝撃応答解析を汎用解伏コード(DYNA3-D)を用いて行った。実験は、剛基礎上に緩衝構造を設置した場合と、覆工構造物のモデルとしてPC床板やPC多主桁上に設置した場についても行った。さらに本研究で対象とした新素材を用いた三層緩衝構造の性能を確認するために、北海道開発局開発土木研究所が使用開始前の実覆道で行った衝撃実験についても検討を行った。これらの結果、本年度の研究から得られた成果は、1)敷砂緩衝構造では基礎に伝播する伝達衝撃力は重錘加速度から得られる重錘衝撃力の1.5倍以上大きく、分散効果を少ない。2)三層緩衝構造では、伝達衝撃力の最大値は重錘衝撃力の最大値の約1/2であり分散効果も大きい。3)PC多主桁上へ設置した場の実験では敷砂緩衝構造では衝撃力が集中し、桁の荷重分散率は約5060%である。4)三層緩衝構造では衝撃力が分散するため桁の荷重分散率は約3040%となり経済的に断面設計が可能である。5)DYNA-3Dによる緩衝構造の解析では、構造のモデル化や材料物性の評価を適確に行うことにより、実験結果をかなり正確にシミュレートできる。6)落石覆工構造物のより実用的な解析は設計が許容応力により行われるとすれば折板理論による解析で十分対応できる。以上の成果より、三層緩衝構造を用いる場合の衝撃力の算定方法を提案している。また構造形式についても現行形式の特性を検討している。
クワなど数種植物の重金属耐性機構に関する研究

(1)重金属耐性ヘビノネコザと耐性の比較的弱いクワとヘビノネコザを用い、水耕液中にCd10^<-6>10^<-3>,Zn10^<-5>10^<-2>Mを添加して3日間培養して養分吸収量を測定し、さらに植物体の約半分を用いて重金属濃度を測定し、残りの半分は0.25Mのショ糖をふくむpH7.8のトリス塩酸バッファーを加えて氷上で磨砕し、さらに200xg,700xgおよび10,000xgで30分遠心分離して沈殿部分をF_1,F_2,F_3,残りの上澄みをF_4画分としてそれぞれに含まれるCdおよびZn量を測定した。〔結果〕:ヘビノネコザではCd添加濃度の上昇に伴って養分吸収速度は急落しないが、インゲンとクワでは急落した。ヘビノネコザではCdの低濃度添加区では根中Cd濃度はインゲンやクワより低いが、高濃度では3者の間には差は認められなかった。各画分中のCd含有量を計ると、ヘビノネコザではF_1画分中に90%以上がみとめられるのに対して、インゲンでは5570%、77では3050%で、耐性の強いヘビノネコザではCdが根の細胞壁に補提された結果、障害を弱めていると考えられた。(2)クワ品種剣持の2倍体とその2倍体からユルヒチン処理によって誘導された同質4倍体と2倍体の未受精胚から育成した半数体を生長点培養法で個体を育成し、さらに水耕液で1カ月育てた新鮮重約15gの個体をCd5,10,20MMを添加して乾物生長の阻害率を測定して各倍数体間の耐性を観察した。また、Cd10MM3日間育成した各倍体の器官別に上記の分画法で、各画分に含まれるCd量を測定した。〔結果〕:倍数性とCd耐性との関係をみると、耐性の大きさは半数体>2倍体>4倍体となっていた。また、植物体中のCdを分画すると、細胞壁成分を多く含む画分中のCdの割合は半数体>2倍体>4倍体となり、耐性の強さと一致することが明らかになった。クワはさし木後2週間目に,またトウモロコシは播種後20日目に,また里部産ヘビノネコザ採取後ただちに乾土1g当り添加して1ヵ月間培養した。各植物から葉を新鮮重で5gに採取し,室温で80%エタノール4回抽出し,さらにその残さを純水で抽出し,また,その残さを1N NaClで抽出した。残さはさらに1N HClで抽出した。各抽出画分はF EtoH,F H_2O,F NaCl,F HClで最後の残さはFRである。クワとトウモロコシでは葉の中のCdの80%以上がF H_2Oで残りがFRである。

これに対してヘビノネコザではF EtoH,F NaCl,F HClにもともと多く存在し,しかもCdを添加すると3画分のCd量は増加した。ZnについてはクワでF EtoHが4045%,ついでF HCl(約30%),F H_2O(約20%)の順に多くなっていたが,ヘビノネコザではF HClが約6070%で圧倒的に多かった。以上の結果などから,クワのCdやZnの存在形態は無機塩類の形が支配的であるのに対してヘビノネコザでは細胞壁や蛋白質に吸着または結合した形が支配的で,ヘビノネコザの重金属に対する耐性の原因の一つに考えられた。ヘビノネコザについては重金属汚染地の富山県里部市で植物を採取して、現地の土壌でそのまま栽培したものと乾土1g当りCdを10Mg添加したものとの2区を設け2カ月間生育させた。また、クワとトウモロコシは発芽後10日目から本学農場の土で10日間培養したのち、Cdを乾土1g当り10μgを添加して2カ月間生育させた。その後、植物を採取して、ただちに脱イオン水で軽く洗浄し、ついで氷上で0.25Mトリス塩酸バッファーを加えてホモゲナイズし、200×gで15分、600×gで10分さらに10,000×gで30分と順次遠心分離し、各残さ画分をそれぞれF_1、F_2、F_3とし、10,000×gの上澄をF_4とした。また、F_4の一部はさらにセファディックスG-10とG-50を用いてゲルロ過を行った。クワおよびトウモロコシ葉中のCd濃度は低いので、各画分中の分布傾向は検討できなかったが、ヘビノネコザではCd添加区も無添加区も、その5060%がF_1画分に分布し、F_2画分と合わせると実に80%にも達していた。Znについてはクワにおいても各画分毎に分布割合が検索でき、その5060%が可溶性成分のF_4画分に分布していた。これに対して、ヘビノネコザではCdと同様ZnでもF_1画分に5060%分布し、F_2画分と合わせて実に80%に達していた。この結果から重金属耐性の強いヘビノネコザではまず細胞壁成分にCdやZnが捕捉されると考えられ、前年度どの溶媒抽出の結果と一致していた。また、ゲルロ過による分析では、可溶性成分のうち分子量700以下の分画と分子量約15,000の分画にピークがみられ、これらの物質について分析を行っている。重金属耐性ヘビノネコザと耐性の比較的弱いクワとベビノネコザを用い,水耕中にCd 10^<-6>10^<-3>M,Zn10^<-5>10^<-2>Mを添加して3日間培養して養分吸収量を測定し、さらに植物体の約半分を重金属濃度を測定し、後りの半分は0.25Mのショ糖をふくむpH7.8のトリス塩酸バツファーを加えて氷上で磨碑し、さらに200×g、700×g、10,000×gで30分遠心分離して沈殿部分をF_1、F_2、F_3、残りの上澄をF_4画分としてそれぞれに含まれるCdおよびZnを測定した。結果:ヘビノネコザではCd添加濃度の上昇に伴って養分吸収速度は急落しないが、インゲンとクワでは急落した。ヘビノネコザではCdの低濃度添加区では根中Cd濃度はいんげんやワクより低いが、高濃度3者の間には認められなかった。各画分中のCd含有量をみると、ヘビノネコザではF_1画分中に90%以上がみとめられるのに対して、インゲンでは5570%,クワでは3050%で耐性の強いヘビノネコザではCdが根の細胞壁に捕捉されて障害を弱めると考えられた。
抗体産生不全症の発症機構とその責任遺伝子の解析

最もポピュラーな免疫不全症である無ガンマグロブリン血症(XLA)の責任遺伝子BtkのB細胞における機能解析をさらに進めた.これまでに我々はB細胞におけるBtkの主要な役割はホスホリパーゼCγ2(PLCγ2)を活性化することによってB細胞抗原レセプター(BCR)刺激後に細胞内カルシウムの動員を生じさせることであることを明らかにしてきた.さらに,Btkがアダプター分子BLNKを介して,もうひとつのチロシンキナーゼSykと協調してPLCγ2を活性化することを示してきた.しかしながら実際にPLCγ2がBtkあるいはSykによってどのような分子メカニズムで活性化されるのかは明らかではなかった.今回我々はBtkによるPLCγ2のリン酸化部位を決定し,その各々のチロシン残基のリン酸化がB細胞内におけるPLCγ2の活性化におよぼす効果を検討した.そしてBtkはPLCγ2の4つのチロシン残基をリン酸化し,PLCγ2の活性化はそれらのリン酸化が協調的にはたらいて生じることを明らかにした.さらに,本邦のXLA患者総計百数十名のBtkの変異の同定およびその蛋白質の解析を行い,一方ではB細胞の著減と低ガンマグロブリン血症を呈する男子症例の80%以上がBtkの変異を有することを明らかにした.最もポピュラーな免疫不全症である無ガンマグロブリン血症(XLA)の責任遺伝子BtkのB細胞における機能解析をさらに進めた.これまでに我々はB細胞におけるBtkの主要な役割はホスホリパーゼCγ2(PLCγ2)を活性化することによってB細胞抗原レセプター(BCR)刺激後に細胞内カルシウムの動員を生じさせることであることを明らかにしてきた.さらに,Btkがアダプター分子BLNKを介して,もうひとつのチロシンキナーゼSykと協調してPLCγ2を活性化することを示してきた.しかしながら実際にPLCγ2がBtkあるいはSykによってどのような分子メカニズムで活性化されるのかは明らかではなかった.今回我々はBtkによるPLCγ2のリン酸化部位を決定し,その各々のチロシン残基のリン酸化がB細胞内におけるPLCγ2の活性化におよぼす効果を検討した.そしてBtkはPLCγ2の4つのチロシン残基をリン酸化し,PLCγ2の活性化はそれらのリン酸化が協調的にはたらいて生じることを明らかにした.さらに,本邦のXLA患者総計百数十名のBtkの変異の同定およびその蛋白質の解析を行い,一方ではB細胞の著減と低ガンマグロブリン血症を呈する男子症例の80%以上がBtkの変異を有することを明らかにした.無ガンマグロブリシ血症の責任分子Btkの活性化機構、BtkによるB細胞内のカルシウムシグナルのスイッチオンの機構の解析を行なった。すなわち、我々はB細胞内でのSyk依存的なBtkの活性化がB細胞特異的アダプター分子BLNKを介していることを明らかにした。SykはBLNKをチロシンリン酸化するがそのリン酸化BLNKにBtkが会合し、SykはBLNK上でBtkの活性化に重要な551番のチロシン残基をリン酸化し、それによってBtkが活性化されることを明らかにした。また、Btkの主要な下流経路はホスホリパーゼ(PLC)γ2を活性化させ、カルシウムの動員をおこすことであるが、BtkによるPLCγ2の活性化機構を明らかにした。BLNK上でBtk、SykはPLCγ2と会合し、両キナーゼによってPLCγ2は活性化されるが、Btkによって実際にリン酸化されるPLCγ2のチロシン残基を決定し、それらの残基がB細胞レセプターの刺激後に実際にB細胞内でチロシンリン酸化されることを示した。さらにこれらの残基のリン酸化がPLCγ2の活性化に必須であることを明らかにした。一方、実際のXLA患者検体の解析によって、Btkの欠損によって生じるB細胞の分化停止点がプレB細胞レセプターを高発現している初期プレB細胞の段階であることを見い出した。このことはBtkがプレB細胞レセプターのシグナル伝達に関与していることを強く示唆していた。また本邦の100名以上の低ガンマグロブリン血症例のBtkの蛋白質および遺伝子レベルの解析を行ない、その90%以上にBtkの異常が存在することを明らかにした。最もポピュラーな免疫不全症である無ガンマグロブリン血症(XLA)の責任遺伝子BtkのB細胞における機能解析をさらに進めた。これまでに我々はB細胞におけるBtkの主要な役割はホスホリパーゼCγ2(PLCγ2)を活性化することによってB細胞抗原レセプター(BCR)刺激後に細胞内カルシウムの動員を生じさせることであることを明らかにしてきた、さらに,Btkがアダプター分子BLNKを介して、もうひとつのチロシンキナーゼSykと協調してPLCγ2を活性化することを示してきた.しかしながら実際にPLCγ2がBtkあるいはSykによってどのような分子メカニズムで活性化されるのかは明らかではなかった.今回我々はBtkによるPLCγ2のリン酸化部位を決定し,その各々のチロシン残基のリン酸化がB細胞内におけるPLCγ2の活性化におよぼす効果を検討した.そしてBtkはPLCγ2の4つのチロシン残基をリン酸化し,PLCγ2の活性化はそれらのリン酸化が協調的にはたらいて生じることを明らかにした.

さらに,本邦のXLA患者総計百数十名のBtkの変異の同定およびその蛋白質の解析を行い、一方ではB細胞の著減と低ガンマグロブリン血症を呈する男子症例の80%以上がBtkの変異を有することを明らかにした.
基準化切断値を用いたＴＰＰ加盟国グルーピングの環境経済的な妥当性評価

本年度の前半では、Kanemoto et al. (2018)によって示唆された、基準化切断値を用いたグルーピングの問題に対し、新しい評価指標を提案するために、産業連関モデルにおけるネットワーク分析の再定義について論文を持つ土中哲秀氏(中央大学)とともに、ネットワーク分析における集塊度を示すクラスター係数を応用し、これまでの基準化切断値に代わる、産業連関モデルのクラスター係数を提案した。これによって国際貿易ネットワークにおけるグループの評価やボトムアップ型のグルーピングが行えるようになった。本研究は“Environmental burden reduction in the FTA framework usingnetwork analysis"のタイトルで、ローマで行われたThe 7th SETACで発表し、また、the 13th EcoBalance、第29回PAPAIOSにて発表を行った。本成果は産業連関分析の査読付き国際誌であるEconomic Systems Research誌に投稿予定である。本年度の後半では、産業連関モデルのネットワーク化の問題について、新しい産業連関ネットワークのモデリングの提案を行った。Liang et al. (2016); Hanaka et al. (2017);土中ら(2018)の研究成果を基に、複雑な産業連関ネットワークにおける辺の「重要さ」とその特性の定式化を行った。本研究によって、大きな間接効果を引き起こす直接的な産業間のつながり(例えば石油化学→電子機器の取引は上流下流への波及が大きい)が明確になり、また、その間接効果が上流に広がるのか下流に広がるのか明確になった。例えば電力から教育その他サービスへの取引は上流側に大きな波及をもたらすことがわかる。本年度は、Kanemoto et al. (2018)によって示唆された、本研究の課題の中心となる手法である産業連関モデルにおける基準化切断値を用いたグルーピングの問題点を認識・理解し、その解決案となる手法を提案することができた。産業連関モデルのネットワーク化において、本来産業連関分析で考えられるべき直接効果、一次波及、二次波及...(以降n次波及)はすべてまとめられてしまい、直接効果が小さく間接効果の大きなサプライチェーンの両端(例えば一次産業の鉱業と三次産業の小売り)が強い繋がりで結ばれ、グルーピングを行ってもその両端のみがグループとして出てきてしまう恐れがある。また、基準化切断値を用いたグルーピングは、トップダウン型に「分割」を行う手法であるため、あまりつながりが強くない多数の「その他」の産業群が「その他の余り産業グループ」として分けられてしまう上に、産業が多数であるため総産出量は大きいことから上位グループとして認識されてしまう危険がある。これらのことから、産業連関モデルを用いたネットワークにおいてはグラフ解析手法を再定義する必要があると言える。本年度の前半では、上記の基準化切断値を用いたグルーピングの問題に対し、新しい評価指標を提案するために、産業連関モデルにおけるネットワーク分析の再定義について論文を持つ土中哲秀氏(中央大学)とともに、ネットワーク分析における集塊度を示すクラスター係数を応用し、これまでの基準化切断値に代わる、産業連関モデルのクラスター係数を提案した。本年度の後半では、上記の産業連関モデルのネットワーク化の問題について、新しい産業連関ネットワークのモデリングの提案を行った。本年度は平成30年度に提案した、産業連関モデルにおける基準化切断値を用いたグルーピングにおける問題点を解決した、新しい産業連関ネットワークモデリング手法と新しいグルーピング指標を、Eora、EXIOBASEなどの大規模多地域産業連関表に適用し、枠組みも新しくなったTPPやRCEPなどのメガFTAの環境・経済的な効率と妥当性について議論していく。当該研究は、世界190地域の産業連関表データ(EORA)を単位構造モデルに適用することで、輸送機械産業の最終需要に付随するCO2排出に関するサプライチェーンネットワークグラフを作成し、これにスペクトラルクラスター分析、産業連関媒介中心性分析を用いて、CO2排出集約的かつ、影響力・感応度の大きいキーサプライチェーンを特定した。また主要な輸送機械産出国(日本、アメリカ、中国、フランス、ドイツ)についてそれぞれのキーサプライチェーンをネットワーク図として可視化し、各国の複雑なサプライチェーンの中での主要なチェーンにおける差異を明示的に示した。当該研究は、各国が自国の消費者ベース排出量を減らすためのキーセクター群の特定を、世界189カ国というグローバルなレベルで行えるように比較的シンプルな行列計算で算出できるような指標を組み合わせたことで、今後整備されていく巨大な産業連関ネットワークデータに対応した非常に有用な研究であると言える。また、多地域間FTAによる貿易ブロック構造について、環境経済的分析を行うための新たな指標として「産業連関クラスター係数」を定義した。これはTPPなどの多地域間FTAメンバー国によるネットワークの集塊性(クラスター性)を測ることができ、どの環境負荷についてクラスター性が強くなるのか分析する。クラスター性が大きくなるほど、ネットワークが相対的に密になっているため、波及による排出削減の効果が大きい。当該研究では、産業連関ネットワーク分析における波及レイヤーを考慮することで、従来のネットワーク分析から産業連関のネットワーク分析への発展の研究に寄与するものである。本研究計画について、当初の予定であるTPPグループとNon-TPPグループとの分割による環境・経済的な妥当性の分析は、基準化切断値を用いるという当初の計画は手法の妥当性という問題について討論した結果棄却されたが、今現在TPP以外のグループについても包括的に考えることができ、かつ、産業連関分析について重要な波及構造をより詳細に見ることができる新たな指標を開発しており、当初の計画よりもより発展した研究を行っていると言える。

また、当初の計画であった国際協力のフレームワークの策定についても、輸送機械をケーススタディに研究を行い、国内の学会で2度、国外の学会で1度発表を行っており、本成果を単著の英語論文『Environmentally-targeted sectors and linkages in the global supply-chain complexity of transport equipment』としてまとめた。この論文は環境経済学のリーディングジャーナルである査読付き英文誌のEcological Economics誌に掲載される。これらの理由より本研究は当初の計画以上に進展していると言える。本年度の前半では、Kanemoto et al. (2018)によって示唆された、基準化切断値を用いたグルーピングの問題に対し、新しい評価指標を提案するために、産業連関モデルにおけるネットワーク分析の再定義について論文を持つ土中哲秀氏(中央大学)とともに、ネットワーク分析における集塊度を示すクラスター係数を応用し、これまでの基準化切断値に代わる、産業連関モデルのクラスター係数を提案した。これによって国際貿易ネットワークにおけるグループの評価やボトムアップ型のグルーピングが行えるようになった。本研究は“Environmental burden reduction in the FTA framework usingnetwork analysis"のタイトルで、ローマで行われたThe 7th SETACで発表し、また、the 13th EcoBalance、第29回PAPAIOSにて発表を行った。本成果は産業連関分析の査読付き国際誌であるEconomic Systems Research誌に投稿予定である。本年度の後半では、産業連関モデルのネットワーク化の問題について、新しい産業連関ネットワークのモデリングの提案を行った。Liang et al. (2016); Hanaka et al. (2017);土中ら(2018)の研究成果を基に、複雑な産業連関ネットワークにおける辺の「重要さ」とその特性の定式化を行った。本研究によって、大きな間接効果を引き起こす直接的な産業間のつながり(例えば石油化学→電子機器の取引は上流下流への波及が大きい)が明確になり、また、その間接効果が上流に広がるのか下流に広がるのか明確になった。例えば電力から教育その他サービスへの取引は上流側に大きな波及をもたらすことがわかる。本年度は、Kanemoto et al. (2018)によって示唆された、本研究の課題の中心となる手法である産業連関モデルにおける基準化切断値を用いたグルーピングの問題点を認識・理解し、その解決案となる手法を提案することができた。
加齢黄斑変性症における異常凝集蛋白質の同定および新規治療薬・光線力学療法の開発

加齢黄斑変性症の初期段階では,網膜色素上皮細胞下にアミロイドβを含む異常凝集蛋白質が沈着する.我々は加齢黄斑変性症患者の血清中に,右手型アミノ酸,あるいは蛋白糖化最終産物化した蛋白質に対する自己抗体の量が増えることを見出した.アミロイドβに含まれるアスパラギン酸を右手型にした合成ペプチドを作成し,異常凝集が促進され,オリゴマーあるいはポリマーに変換されることが速いことを見出した.さらに異常凝集蛋白質への親和性の高いチオフラビンTという光感受性物質を用いることで,凝集したアミロイドβを特異的に分解することが可能となった.このように加齢黄斑変性症に対する新しい光線力学療法の基礎を築くことができた.欧米における失明の最大の原因である加齢黄斑変性症は,日本においても患者が急増しているとともに,それに関わる医療費も膨大となり,社会にとって過剰な負担となりつつある.加齢黄斑変性症の病変にはドルーゼンと呼ばれるタンパク質の異常凝集が観察され,それを中心とした炎症反応が加齢黄斑変性症の病態の一つである.我々はタンパク質の異常凝集が疾患を引き起こすという概念に基づき,角膜ジストロフィのin vitroモデルの作成,分子病態の解明,および光線力学療法の基礎開発に成功した.本研究は,タンパク質の異常凝集が加齢黄斑変性症を引き起こすという概念に基づき,加齢黄斑変性症の早期診断・新規蛍光色素を用いた光線力学療法の開発・および天然の成分に基づく予防薬のスクリーニングと開発を目的としている.1.加齢黄斑変性症患者の血清ライブラリー(約100人分)を確立した.これは国内外でも最大規模の血清ライブラリーであり,その中から加齢黄斑変性症に関わる蛋白質の同定を行うことができる.蛋白質の同定には液体クロマトグラフィーと質量分析装置を用いる.2.血清中のD-アミノ酸含有蛋白質を同定し,加齢黄斑変性症の病勢を反映することを見出した.すなわち上記装置を用いて,生体内には本来存在し得ないDアミノ酸を含んだ異常な蛋白質が現れることを見出した.3.加齢黄斑変性症において沈着するアミロイドβを特異的に標識する蛍光色素により光線力学療法のin vitroモデルが確立された.加齢黄斑変性症患者の採血を行い,約100症例の血清バンクを確立することができた.血清蛋白質を液体クロマトグラフィーで分離し,トリプシン分解後に質量分析装置にかけることにより,生体内では本来存在しないはずのDアミノ酸含有蛋白質を複数発見することができた.そのうちの一つは補体の断片であり,かつ,加齢黄斑変性症の発症に必須なドルーゼンの構成要素でもあった.すなわち,加齢黄斑変性症においては,患者の血清中にドルーゼンの断片が流出して,かつ測定可能であることが明らかになった.このことは,血清を用いて加齢黄斑変性症の発症の同定および予測が可能となることを示唆している.さらに,血液中にDアミノ酸含有蛋白質が流出することにより,それらに対する自己抗体が産生され,Dアミノ酸含有蛋白質の沈着部位には炎症が惹起される.加齢黄斑変性症はドルーゼンの沈着に引き続いて血管新生をはじめとする炎症機転が生じることを考えると,血液中のDアミノ酸含有蛋白質の存在は,それをターゲットとする炎症反応のマーカーとなり得ることを示唆している.本研究は,加齢黄斑変性症の病変に補体や免疫グロブリンなどの免疫複合体が沈着することや,増殖性糸球体腎炎などの免疫反応が関わる血管病変を有する患者において加齢黄斑変性症の罹患率が高いという事実に着目し,加齢黄斑変性症と自己免疫の関係をあきらかにすることである.加齢黄斑変性症患者20症例分の血清およびコントロール患者の血清を採取し,加齢黄斑変性に関する血清バンクを確立した.血清中の総IgGはコントロールと有意差がないことを見いだしている.D-アミノ酸含有タンパク質を固着させることで,抗D-アミノ酸含有タンパク質抗体を測定することのできるELISAキットを作成することができた.Preliminaryな検査では,加齢黄斑変性症患者において抗D-アミノ酸抗体が上昇していることを確認することができた.さらに患者の血清中にはD-アミノ酸含有タンパク質の断片が遊離していることも観察することができ,現在同定を行っている.D-アミノ酸と同様に,加齢黄斑変性症に関わる変性タンパク質として,蛋白糖化最終産物がある.蛋白糖化最終産物の中でも生体における役割が明らかになりつつあるCML,ペントシジン,イミダゾロンについての濃度を測定することのできるELISAキットを作成し,加齢黄斑変性症患者における血清濃度を測定している.現在は糖尿病網膜症の硝子体液での蛋白糖化最終産物濃度の上昇を確認できている.硝子体中の蛋白糖化最終産物濃度は,糖尿病黄斑浮腫で高い傾向があり,血液中のHbA1c濃度とは特に有意な相関を見いだせなかった.さらに硝子体中の総Antioxidant Activityとは負の相関関係を見いだした.本研究は加齢黄斑変性症患者における血液中の自己抗体の同定を行うことを目的としている.すでに血液の血清バンクが完成し,本来の目的である自己抗体(抗D-アミノ酸タンパク質に対する自己抗体)の同定を終え,臨床所見との関連を検討中である.本研究のさらなる目的は,加齢黄斑変性症に対する新しい病態メカニズムの解明にある.すでにD-アミン含有タンパク質を可視化させる抗体を作成し終えただけではなく,D-アミノ酸含有タンパク質の同定,そして変異部位を網羅的に解析するための質量分析装置の開発を終えている.

この一年で,研究成果の公表を行うだけではなく,次のステップに移行する基礎を築くことが可能となるはずである.加齢黄斑変性症においては,網膜下にドルーゼンと呼ばれる異常凝集蛋白質が認められるようになる.我々は様々な年齢の患者の眼球を用いて,ドルーゼンには蛋白糖化最終産物や,生体には本来存在しないはずのD-アミノ酸含有蛋白質が集積していることを明らかにした.さらに加齢黄斑変性症だけではなく,他の黄斑疾患(黄斑円孔,黄斑前膜,黄斑浮腫)を有する患者の血液を解析した結果,活動性の高い加齢黄斑変性症の患者の血清中には,蛋白糖化最終産物やD-アミノ酸含有蛋白質に対する自己抗体が有意に高いことを見出した.このことは,加齢黄斑変性症は自己免疫反応が関与していることを示唆している.異常凝集蛋白質に対する自己免疫反応を止めるためには,異常凝集蛋白質自体を消失させるか,あるいは全身的な消炎が必要となる.我々は全身的に負荷のかからない,異常凝集蛋白質の選択的な分解法について開発を行った.ドルーゼンの構成要素の一部であるアミロイドβを凝集化させたものは,他の蛋白質と同等の吸光特性を有する.そのため,選択的な分解は難しい.そこで異常凝集蛋白質に特異的に結合して蛍光を発する色素であるチオフラビンTを用いることで,異常凝集をおこしたアミロイドβのみを選択的に分解することが可能となった.このことは,加齢黄斑変性症に対して新しい光線力学療法の開発に弾みをつけるものである.最後に,我々は加齢黄斑変性症に対する新しい画像診断装置の開発に着手している.非侵襲的に脂質・蛋白質・核酸などの生体分子の局在を明らかにすることができるラマン顕微鏡を用いて,異常凝集蛋白質に特異的なスペクトルを拾うことに成功している.現在は網膜の細胞レベルでの画像解析が可能となり,臨床応用を目指している.加齢黄斑変性症の初期段階では,網膜色素上皮細胞下にアミロイドβを含む異常凝集蛋白質が沈着する.我々は加齢黄斑変性症患者の血清中に,右手型アミノ酸,あるいは蛋白糖化最終産物化した蛋白質に対する自己抗体の量が増えることを見出した.アミロイドβに含まれるアスパラギン酸を右手型にした合成ペプチドを作成し,異常凝集が促進され,オリゴマーあるいはポリマーに変換されることが速いことを見出した.さらに異常凝集蛋白質への親和性の高いチオフラビンTという光感受性物質を用いることで,凝集したアミロイドβを特異的に分解することが可能となった.このように加齢黄斑変性症に対する新しい光線力学療法の基礎を築くことができた.1.加齢黄斑変性症患者における異常凝集蛋白質の同定.現在においても少数例の血清蛋白質の検査により,Dアミノ酸を含んだ異常凝集蛋白質が血液中に現れることを見出すことができた.本年度は症例を100症例以上に増やし,加齢黄斑変性症患者において見出される異常凝集蛋白質を網羅的に解析し,加齢黄斑変性症の血液マーカーとして確立する.2.加齢黄斑変性症における自己抗体の同定.加齢黄斑変性症患者の血液より,Dアミノ酸含有蛋白質に対する自己抗体をELISAを用いて定量する.同時にカルテ上の加齢黄斑変性症のタイプや病勢と比較し,自己抗体の存在が加齢黄斑変性症の血液マーカーとして有用であることを見出す.3.培養細胞を用いた光線力学療法の安全性の確立.