hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
内耳有毛細胞ときこえを守る支持細胞の働き

感覚上皮は、機能の異なる感覚細胞と支持細胞の2種類の細胞から構成され、感覚細胞は支持細胞に囲まれて互いに接することなく並ぶ。申請者らは、感覚上皮においてこれら2種類の細胞が正しく配列する機序を報告したが(Katsunuma, et al. 2016. Togashi, et al. 2011)、この配列が機能に果たす役割は分かっていない。申請者らは、きこえを担う聴覚上皮で、異常に接した有毛細胞(感覚細胞)がみられるネクチンノックアウト(以下KO)マウスを報告しており、このKOマウスが難聴を示し、異常に接した有毛細胞のみが成長とともにアポトーシスにより失われていくことを明らかにしている(未発表)。ネクチンは主要な接着分子のひとつで、有毛細胞と支持細胞に各々異なるネクチンが発現することによって、両細胞間に接着親和性と接着力の違いが生じて細胞配列が形成される。このため、ネクチンKOマウス聴覚上皮において、有毛細胞どうしの異常な接着自体がアポトーシスを惹起していると仮定した。そこで、聴覚上皮細胞間における接着分子およびその構成分子の集積を、成長を追って観察したところ、野生型ではこれら分子の細胞間における濃縮が変化するのに対し、KOマウスでは有毛細胞と支持細胞間における濃縮に変化がみられなかった。野生型でこれら分子の細胞間濃縮が変化する時期と、KOマウスにおける有毛細胞がアポトーシスを生じる時期を照らし合わせた結果、有毛細胞どうしの異常な接着自体がアポトーシスを惹起し、聴覚上皮の細胞配列自体が有毛細胞の生存に重要である可能性が考えられた。聴覚上皮細胞配列における、支持細胞のはたらきをとおした有毛細胞の維持ときこえのしくみを解明することは、感覚器共通の感覚受容機構を解明するとともに、聴覚障害治療に対する新しい治療戦略を提供できる可能性があり、本研究をすすめていく意義があると考える。これまで申請者らは、きこえを担う聴覚上皮で、異常に接した有毛細胞が観察されるネクチンKOマウスを報告しており(Togashi, et al. 2011)、このマウスが難聴を示し、異常に接した有毛細胞のみが生後成長とともにアポトーシスにより失われていくことを明らかにしている(未発表)。ネクチンKOマウス聴覚上皮において、有毛細胞どうしの異常な接着自体がアポトーシスの契機となるのではないかと仮定し、聴覚上皮の細胞間接着におけるTight junction形成分子ZO-1の集積を観察したところ、野生型と比較してネクチンKOマウスでは、有毛細胞と支持細胞間のZO-1の濃縮が成長しても強いまま変化しないことがわかった。続いて、野生型マウス聴覚上皮において、成長のどの段階で、有毛細胞と支持細胞の間のZO-1の集積が変化するのかを蛍光免疫染色で観察した。さらに、野生型マウス及びネクチンKOマウス聴覚上皮の成長過程において、接着分子の細胞内結合蛋白であるアファディン、カテニンの細胞境界における濃縮がどのように変化するのかを蛍光免疫染色で観察した。以上の観察で得られた、野生型マウス聴覚上皮で細胞間接着構成分子の細胞間濃縮に変化が生じる時期と、これまで観察してきたネクチンKOマウス聴覚上皮において異常に接着した有毛細胞がアポトーシスをおこす時期を照らし合わせたところ、有毛細胞どうしの異常な接着自体がアポトーシスの契機となることが示唆された。以上より、聴覚上皮の細胞配列自体が有毛細胞の生存に重要である可能性が考えられ、今後、次に述べる実験を計画している。これまで申請者らは、異常に接した有毛細胞が観察される接着分子ネクチンKOマウスを報告しており(Togashi, et al. 2011)、このマウスが難聴を示し、異常に接した有毛細胞のみが生後成長とともにアポトーシスにより失われていくことを明らかにしている(未発表)。ネクチンKOマウスにおいて、有毛細胞どうしの異常な接着自体がアポトーシスの契機となるのではないかと仮定し、野生型マウス及びネクチンKOマウス聴覚上皮の成長過程を比較したところ、細胞間接着構成分子の細胞境界における濃縮の経時的変化が異なっており、有毛細胞どうしの異常な接着自体がアポトーシスの契機となる可能性が考えられた。そこで現在、KOマウス聴覚上皮における異常に接した有毛細胞がどのようなアポトーシス経路をたどるのか明らかにするために、聴覚上皮からmRNAを抽出しリアルタイムPCRでアポトーシス経路の候補を探索している。候補を同定したのちは、蛍光免疫染色及び蛋白発現解析にてアポトーシス経路を明らかにする。続いて、KOマウス有毛細胞間の異常な接着がアポトーシスを惹起している可能性をさらに検証するために、マウス聴覚上皮を摘出、トリプシン処理にて細胞を単離培養することで、有毛細胞どうしの接着を解消し、支持細胞との接触の有無が関与しない環境下において、KOマウス有毛細胞の細胞死が抑制されるかを観察する。また、単離有毛細胞に音響を与えてその機能(音響で電気的興奮が生じると有毛細胞が収縮する)を測定する。さらに有毛細胞のみを培養した場合と、支持細胞と共培養した場合を比較検討し、支持細胞の有毛細胞の生存と機能に対する効果を解析する。以上の実験検証より、ネクチンKOマウス有毛細胞がアポトーシスにて脱落する原因を特定し、聴覚上皮細胞配列における、有毛細胞の維持ときこえのしくみを解明する。

申請者らは、感覚上皮においてこれら2種類の細胞が正しく配列する機序を報告したが(Katsunuma, et al. 2016. Togashi, et al. 2011)、この配列が機能に果たす役割は分かっていない。申請者らは、きこえを担う聴覚上皮で、異常に接した有毛細胞(感覚細胞)がみられるネクチンノックアウト(以下KO)マウスを報告しており、このKOマウスが難聴を示し、異常に接した有毛細胞のみが成長とともにアポトーシスにより失われていくことを明らかにしている(未発表)。ネクチンは主要な接着分子のひとつで、有毛細胞と支持細胞に各々異なるネクチンが発現することによって、両細胞間に接着親和性と接着力の違いが生じて細胞配列が形成される。このため、ネクチンKOマウス聴覚上皮において、有毛細胞どうしの異常な接着自体がアポトーシスを惹起していると仮定した。そこで、聴覚上皮細胞間における接着分子およびその構成分子の集積を、成長を追って観察したところ、野生型ではこれら分子の細胞間における濃縮が変化するのに対し、KOマウスでは有毛細胞と支持細胞間における濃縮に変化がみられなかった。野生型でこれら分子の細胞間濃縮が変化する時期と、KOマウスにおける有毛細胞がアポトーシスを生じる時期を照らし合わせた結果、有毛細胞どうしの異常な接着自体がアポトーシスを惹起し、聴覚上皮の細胞配列自体が有毛細胞の生存に重要である可能性が考えられた。聴覚上皮細胞配列における、支持細胞のはたらきをとおした有毛細胞の維持ときこえのしくみを解明することは、感覚器共通の感覚受容機構を解明するとともに、聴覚障害治療に対する新しい治療戦略を提供できる可能性があり、本研究をすすめていく意義があると考える。これまで申請者らは、きこえを担う聴覚上皮で、異常に接した有毛細胞が観察されるネクチンKOマウスを報告しており(Togashi, et al. 2011)、このマウスが難聴を示し、異常に接した有毛細胞のみが生後成長とともにアポトーシスにより失われていくことを明らかにしている(未発表)。ネクチンKOマウス聴覚上皮において、有毛細胞どうしの異常な接着自体がアポトーシスの契機となるのではないかと仮定し、聴覚上皮の細胞間接着におけるTight junction形成分子ZO-1の集積を観察したところ、野生型と比較してネクチンKOマウスでは、有毛細胞と支持細胞間のZO-1の濃縮が成長しても強いまま変化しないことがわかった。続いて、野生型マウス聴覚上皮において、成長のどの段階で、有毛細胞と支持細胞の間のZO-1の集積が変化するのかを蛍光免疫染色で観察した。さらに、野生型マウス及びネクチンKOマウス聴覚上皮の成長過程において、接着分子の細胞内結合蛋白であるアファディン、カテニンの細胞境界における濃縮がどのように変化するのかを蛍光免疫染色で観察した。以上の観察で得られた、野生型マウス聴覚上皮で細胞間接着構成分子の細胞間濃縮に変化が生じる時期と、これまで観察してきたネクチンKOマウス聴覚上皮において異常に接着した有毛細胞がアポトーシスをおこす時期を照らし合わせたところ、有毛細胞どうしの異常な接着自体がアポトーシスの契機となることが示唆された。以上より、聴覚上皮の細胞配列自体が有毛細胞の生存に重要である可能性が考えられ、今後、次に述べる実験を計画している。
企業内工程に於ける物質流から見たゼロエミッション化へ向けてのしくみ構築

企業内工程に於ける物質流の実体調査を行った。ゼロエミッション化へ向けての研究において企業内での実データを把握することは、研究の基本であるけれどもこれの実現には多くの困難が伴うものである。今回は幸いにも或食品メーカーの全面的な協力を得ることができた。この食品メーカー以外にも食品メーカーを調査を実施したけれども、細かい工程に入り込んだ実データ入手までには至らなかった。調査方法としては大きくエネルギー系と物質系とに分けて把握した。これについても、多くの場合は物質系のみに終わることが多いけれども、今回はエネルギー系と物質系との同時の流れの把握を行うことができた。更に新工場建設に関する物質の品目および量を把握した。これによって物質流の初期条件の把握を試みた。これに関係する品目は極めて多種なものとなった。ゼロエミッション化へ向けての取り組みにおいて多くの場合では定常状態での物質流に限られるけれども、製品を生み出す設備等に関する考察がなければ片手落ちであるとの認識から、工場建設に関わる資材等の物質の把握を試みた。定常状態での工場各工程でのエネルギー系および物質系の調査を行った。工程は細かく分類するとかなりの数になるので、データが把握できることの観点から数工程に絞り込んでデータ解析を行った。データの分布を調べる過程で、既存の分布では記述しにくい場面があり、母集団分布として仮定されるべき新しい分布の検討を行った。
稀少淡水二枚貝カワシンジュガイの遺伝的・生態的多様性と保全施策

本研究は、希少種カワシンジュガイの保護・保全を図るための生物学的知見を得るとともに、その保全施策を確立するために、本種の地域個体群の遺伝的多様性、本種の河川個体群の生息に好適な物理的環境要因、本種幼生のサケ科魚類への寄生成功度を明らかにすることを主要な目的として調査を行い、以下の貴重な研究成果を得た。1.遺伝的に高度に分化し、同所的生息地で生殖的隔離が認めらた2グループ(ブループA、グループB)の遺伝的多様性については、グループAではいずれの河川集団もほぼ同等の変異性を示した。グループBではすべての集団で全く遺伝的変異性が認められなかった。2.遺伝子マーカーを用いて魚類の鯉に寄生していた幼生の種判別を行った結果、グループAはサクラマスと、グループBはアメマス・オショロコマと特異的な宿主-寄生関係を示した。3.カワシンジュガイ2グループの河川における生息条件として、流速と底質が重要な規制要因であることが明らかになった。いずれの生息河川でも殼長2cm未満の小型個体の生息が認められなかったことから、最近の十数年間においてカワシンジュガイ2グループは健全な再生産が行われていないと示唆された。4.これら2グループの健全な個体群を保全。再生させるには、稚貝のリクルートにとって重要な宿主-寄生関係の健全さを回復させると共に、稚貝の河床への着底条件としての河川の物理的。生物的環境要素を河川環境に復元させる施策が必要である。稀少淡水二枚貝カワシンジュガイのAタイプとBタイプを対象に、その遺伝的集団構造と遺伝的多様性、および各タイプの個体群構造、生息環境条件、本種グロキジウム幼生の宿主特異性に関する調査を行い、以下の興味ある研究成果を得た。1)アロザイム遺伝子マーカー(14酵素16遺伝子座)を用いて遺伝的集団構造を解析した結果、Aタイプでは個体群間に分化が認められたのに対し、Bタイプでは集団間に遺伝的差異がまったく認められず、遺伝的に均質であることが示された。2)遺伝的多様性指数(A, AP, P_<95>,Ho, Heを算出して、集団内の遺伝的変異性を2タイプ間で比較した結果、Aタイプでは高い変異性を示したのに対し、Bタイプではすべての遺伝子座が同一の対立遺伝子に固定されており、集団内の遺伝的変異性がまったく認められなかった。3)本2タイプが同所的に生息する河川が多く存在する北海道東部において、いずれのタイプの個体群でも体サイズ組成において中・大型個体は比較的に多数生息していたが、殻長2cm以下の個体をまったく欠いていることが示された。このことは、最近の十数年間に渡って本種2タイプの再生産が健全に行われていないことを示唆する。4)北海道東部の標津川水系において、カワシンジュガイの生息の有無および生息密度を規定している環境要因を河床型と底質組成との関係で解析した結果、特に本種の幼貝が河床で固定しうる条件としての基質(砂礫、礫石、バイカモなどの水生植物)の存在が重要であることが示唆された。5)カワシンジュガイ幼生の健全なリクルートを図るための基盤となるグロキジウム幼生期における宿主-寄生関係を、幼生の種特異的判別DNA法を用いて解析した結果、Aタイプの幼生はサクラマスに、Bタイプの幼生はアメマスとオショロコマに寄生するという、種特異的な宿主-寄生関係があることが判明した。この宿主の違いから、彼らのリクルートにはAタイプではサクラマス個体群が、またBタイプではイワナ属の個体群が生息河川内で安定した個体群サイズを維持することが重要であると示唆された。

本研究は、希少種カワシンジュガイの保護・保全を図るための生物学的知見を得るとともに、その保全施策を確立するために、本種の地域個体群の遺伝的多様性、本種の河川個体群の生息に好適な物理的環境要因、本種幼生のサケ科魚類への寄生成功度を明らかにすることを主要な目的として調査を行い、以下の貴重な研究成果を得た。1.遺伝的に高度に分化し、同所的生息地で生殖的隔離が認めらた2グループ(グループA、グループB)の遺伝的多様性については、グループAではいずれの河川集団もほぼ同等の変異性を示した。グループBではすべての集団で全く遺伝的変異性が認められなかった。2.遺伝子マーカーを用いて魚類の鯉に寄生していた幼生の種判別を行った結果、グループAはサクラマスと、グループBはアメマス・オショロコマと特異的な宿主-寄生関係を示した。3.カワシンジュガイ2グループの河川における生息条件として、流速と底質が重要な規制要因であることが明らかになった。いずれの生息河川でも殻長2cm未満の小型個体の生息が認められなかったことから、最近の十数年間においてカワシンジュガイ2グループは健全な再生産が行われていないと示唆された。4.これら2グループの健全な個体群を保全・再生させるには、稚貝のリクルートにとって重要な宿主-寄生関係の健全さを回復させると共に、稚貝の河床への着底条件としての河川の物理的・生物的環境要素を河川環境に復元させる施策が必要である。
肝細胞癌血管内皮の多様性と新規分子標的薬への応用

われわれはこれまで腫瘍血管に多様性があることを見出してきた。今回の研究目的は癌の悪性度の違いによる血管の多様性の有無とその機序を解明し、肝がんの血管を特異的に標的とする新しい分子標的薬の開発につなぐこととした。具体的には分化型の異なる癌における血管内皮の遺伝子発現を比較した。悪性度の高い低分化型のがんにおいて発現の高かった分子を同定し、それががん細胞の転移を促進していることを見出した。高分化型のヒトがん細胞株と低分化型のヒトがん細胞株をヌードマウスに皮下移植し、それぞれの腫瘍塊から磁気ビーズ細胞分離法により腫瘍血管内皮細胞を分離し培養した.それぞれの血管内皮細胞の性質について,PCR法およびフローサイトメトリーにより血管内皮細胞マーカーの発現を確認し,管腔形成能アッセイにより管腔を形成することを確認した.高分化型腫瘍由来血管内皮細胞と低分化型腫瘍由来血管内皮細胞の生物学的機能を比較検討した.細胞増殖能をMTSアッセイにより,運動能およびVEGFに対する遊走能をBoyden chamberにより解析した.低分化型腫瘍由来血管内皮細胞よりも高分化型腫瘍由来血管内皮細胞において増殖能,運動能,遊走能が亢進していた.さらに,いくつかの特異遺伝子について発現量の違いが見られた.これらの結果から,がん細胞株の悪性度により腫瘍組織内の血管内皮細胞の性質が変化することが示唆された.次に,マウス臓器内への同所移植を行い,その腫瘍の生着をin vivo imaging装置を用いて経時的に確認することを目的として,高分化型がん細胞株と低分化型がん細胞株について,蛍光タンパクtdtomatoおよび発光タンパクLuciferaseを発現する細胞株を作製した.tdtomato-luciferaseレンチウィルスベクターを遺伝子組み換えにより作製し,遺伝子導入を行い樹立した.Tdtomato陽性細胞をフローサイトメトリーによりソーティングし,遺伝子導入された腫瘍細胞の純度を上げた.今後,これらの細胞をマウス臓器内へ移植する予定である.まず,高分化型および低分化型腫瘍由来血管内皮細胞の遺伝子発現を比較検討した.腫瘍血管内皮に特異的に発現が亢進している遺伝子として報告がある遺伝子について,定量的リアルタイムPCR法で発現比較したところ,多くの腫瘍血管内皮マーカーの発現が悪性度の高い低分化型腫瘍由来血管内皮において亢進していることがわかった.その中で同定された分子のうち,Gene X,Gene YについてはsiRNAを用いて遺伝子発現を抑制し,in vitroで生物学的な機能解析を行った.具体的には,細胞増殖能をMTS assayにより,血管内皮増殖因子VEGFに対する細胞遊走能をBoyden chambermigration assayにより解析し,Matrigel上での管腔形成能をTube formation assayにより評価した.その結果,Gene X,Gene Y共に腫瘍血管内皮細胞の遊走能および管腔形成能に関与していることが示唆された.さらに市販されているそれらの阻害剤を用いて細胞遊走能を評価したところ,RNAi実験と同様に遊走能が阻害された.腫瘍血管内皮細胞のGene XおよびGene Yのin vivoにおける機能を評価するため,担癌マウスにそれらの阻害剤を投与した.現在,それらの薬剤投与による抗腫瘍効果を評価している.さらに,血管新生阻害効果を抗CD31抗体を用いた組織学的検索によりMicroVessel Density (MVD)として評価し,転移抑制効果をLuciferaseシグナルを指標にin vivo imaging装置IVIS Spectrumにより解析中である.昨年度より解析を進めてきた,腫瘍血管内皮細胞のGene Xのin vivoにおける機能評価を行った.担癌マウスにGene Xの阻害剤を投与し,経時的に抗腫瘍効果を観察したところ,Vehicle群と比べて治療群で腫瘍増殖抑制効果が見られた.腫瘍血管への影響を解析するため,血管内皮マーカーCD31に対する抗体を用いて,原発腫瘍を免疫組織学的に評価した.その結果,CD31陽性血管が治療群において減少しており,血管新生阻害効果が認められた.さらに,in vivoイメージング装置IVIS Spectrumを用いて,肺を含む遠隔臓器への転移を検討した.治療群において肺転移抑制効果が認められ,腫瘍血管内皮マーカーXの阻害が,血管新生阻害効果・抗腫瘍効果をもたらすことが示唆された.がん組織内で血管にマーカーXが発現するメカニズムの解析をin vitroで行った.がん微小環境には,がん細胞由来の液性因子やVEGFが豊富にあり,また低酸素環境になっていることが知られている.血管内皮細胞にがん細胞培養上清を処理したところ,マーカーXの発現亢進が認められた.またVEGF処理によってもマーカー発現亢進が認められた.さらに血管内皮細胞を低酸素(1%酸素)環境下で培養したところ,マーカーXの発現が正常酸素(20%酸素)よりも亢進し,がん微小環境の様々な因子が血管内皮細胞のマーカーX発現亢進に関与していることが示唆された.現在,臨床検体を用いてマーカーの発現とがんの悪性度など臨床病理学的因子との関連を検討している.われわれはこれまで腫瘍血管に多様性があることを見出してきた。

当初の計画通り,低分化型腫瘍細胞由来血管内皮細胞で特異的に発現が亢進している遺伝子を同定し,その分子の阻害実験をin vitroおよびin vivoで進めているが,当初予定していたよりもsiRNAの選別に時間を要したため.消化器外科学阻害剤投与を行った担癌マウスの組織を用いて,血管新生阻害効果,遠隔臓器への転移を組織学的に評価する.次にそれらの腫瘍血管内皮マーカーの発現亢進メカニズムについて,in vitroで低酸素および腫瘍細胞由来液性因子の影響を検討する.さらに,臨床検体を用いてこれらのマーカーの発現とがんの悪性度など臨床病理学的因子との関連を検討する.平成25年度の計画においてはxenograftから腫瘍血管内皮細胞を分離する予定であったが、遺伝子導入細胞株の樹立に時間を要したため同定された分子の遺伝子発現をsiRNAによりノックダウンし,血管新生阻害効果を検討する予定だったが,siRNAの選別に時間がかかったため次年度に繰り越すことになった.高分化型腫瘍由来血管内皮細胞と低分化型腫瘍由来血管内皮細胞において,発現量の違いが見られた遺伝子について,siRNAを用いてノックダウンし,血管内皮細胞における機能を増殖能,運動能,管腔形成能などについてin vitroで解析する.さらにこれらの特異マーカーにおける発現を,臨床検体を用いて組織免疫染色により解析し,がんの悪性度や予後との関連を探索する.当初予定していた通り,組織学的解析に必要な試薬や抗体に充てる予定である.本年度の実験計画では皮下移植腫瘍から血管内皮を分離培養し、特性解析を行う予定であったが、遺伝子導入に難渋したため施行できなかったそのため、分離・培養や特性解析に使用予定であった費用が持ち越しとなった血管内皮の分離・培養における消耗品の購入や解析に用いる予定
小学校体育授業における学習者の素朴概念を修正するための学習指導方略の検討

本研究では,小学生の素朴概念を修正する学習指導方略であるとされる仲間学習を用いて素朴概念の修正可能性について実証的に明らかにすることを目的とした.上記目的に照らし,平成30年度は1平成29年度に実施した小学校体育授業におけるオーバーハンドパスの素朴概念に関する実態調査の成果発表,2小学校高学年児童における仲間学習を適用した素朴概念を修正するための学習指導方略に関する介入検証授業を引き続き行った.2平成30年10月から12月にかけて,素朴概念を修正するための仲間学習を適用した10時間のネット型ゲーム単元の授業を実施し,児童のオーバーハンドパスに関する素朴概念とパフォーマンスがどのように変化するのかを検証した.調査対象者は、千葉県I小学校6年生2クラス(57名)であった.申請者が開発した小学生用のオーバーハンドパスに関する素朴概念調査票を用いて単元前後に調査を実施した.その際、仲間学習の効果を検討するため,仲間学習を実施するクラスと,教師からのフィードバックを中心とした学習を実施するクラスに分けて検討を行った.オーバーハンドパスのパフォーマンス評価については,技能の定着度の観点から行った.結果については,現在分析中である.これまで体育授業における素朴概念の研究は,児童・生徒が特定の運動技能の素朴概念を所持しており,それが学習の阻害となっていることが証明されている.この素朴概念は,学習者が経験的に身につけている知識であり,誤った素朴概念は学習の阻害要因となるため,その修正のための方法として,仲間学習(Peer teaching)という学習指導方略として有効であることが報告されている.しかし,その有効性は中学生を対象に検証したものが多く,小学生での実践は少ない.そのため,本研究では,小学生の素朴概念を修正する学習指導方略であるとされる仲間学習を用いて素朴概念の修正可能性について実証的に明らかにすることを目的とした.上記目的に照らし,平成28年度は1これまでの小学校体育授業におけるオーバーハンドポパスの素朴概念に関する研究成果の発表,2小学校高学年児童における仲間学習を適用した素朴概念を修正するための学習指導方略に関する実態調査を行った.1平成28年10月2930日に和歌山大学で行われた第36回日本スポーツ教育学会において,「小学校高学年児童が持つ素朴概念の変容可能性とパフォーマンスに関する検討ーオーバーハンドパス技能に着目してー」の題目で口頭発表を行った.2平成29年1月から2月にかけて,素朴概念を修正するための仲間学習を適用した10時間のネット型ゲーム単元の授業を実施し,児童のオーバーハンドパスに関する素朴概念とパフォーマンスがどのように変化するのかを検証した.調査対象者は、千葉県M小学校5,6年生(14名)であった.申請者が開発した小学生用のオーバーハンドパスに関する素朴概念調査票を用いて単元前後に調査を実施した.オーバーハンドパスについて,技能の定着度の観点から行った.結果については,現在分析中である.平成28年度は,小学校高学年児童における仲間学習を適用した素朴概念の修正を試みた.授業レベルでの素朴概念の変容可能性の乏しさは,授業の方法論に起因しているとも考えられる.そのため,素朴概念の変容を促すための授業方法論を工夫した検証授業の積み重ねが必要であることから,仲間学習を適用した単元における児童の教え合いの内容を明らかにするため,児童にマイクを付け,どのような言語活動が行われているかを検証した.その結果については,現在分析中であり,今年度の学会で発表予定である.1年目において,検証授業を1単元実施できたことにより,次の課題が明確になった.検証授業の分析を進める中で,児童の素朴概念やパフォーマンスを検証し,素朴概念を修正するための学習指導方略の課題を抽出することが可能になると考える.本研究では,小学生の素朴概念を修正する学習指導方略であるとされる仲間学習を用いて素朴概念の修正可能性について実証的に明らかにすることを目的とした.上記目的に照らし,平成29年度は1平成28年度に実施した小学校体育授業におけるオーバーハンドパスの素朴概念に関する実態調査の成果発表,2小学校高学年児童における仲間学習を適用した素朴概念を修正するための学習指導方略に関する介入検証授業を行った.2平成29年10月から12月にかけて,素朴概念を修正するための仲間学習を適用した10時間のネット型単元の授業を実施し,児童のオーバーハンドパスに関する素朴概念とパフォーマンスがどのように変化するのかを検証した.調査対象者は、千葉県I小学校6年生(32名)であった.申請者が開発した小学生用のオーバーハンドパスに関する素朴概念調査票を用いて単元前後に調査を実施した.また、オーバーハンドパスの素朴概念を持つ児童の授業中における言語活動を検討するため,抽出児童にマイクを付けて記録した.オーバーハンドパスのパフォーマンス評価については,技能の定着度の観点から行った.結果については,現在分析中である.平成28年度は,小学校高学年児童における仲間学習を適用した素朴概念の修正を試み,仲間学習を適用した単元における児童の教え合いの内容を明らかにするため,児童にマイクを付け,どのような言語活動が行われているかを検証しようとした.その結果,音声が聞き取りにくい等の問題から,検証することが困難な状況がみられた.一方で,仲間学習における児童の学習カードの記述と実際のパフォーマンス評価についての一致率を検討したところ,素朴概念を持っている児童やパフォーマンスが低い児童においても,そうでないペアの児童も60%70%程度であることが示唆された.つまり,仲間学習を実施することで,教師から支持されたポイントについて理解し,仲間の動きを評価することができていたことが明らかになった.

平成28年度の検証授業では少人数クラスでの実践だったが,平成29年度の検証授業では32人クラスでの実践を行い,対象人数を増やすことができた.また,言語活動を観察するためのマイクを,単元前の調査において「手の形」に関する素朴概念を持つ児童4人に付け実践を行った.結果については,現在分析中である.検証授業の分析を進める中で,児童の素朴概念やパフォーマンスを検証し,素朴概念を修正するための学習指導方略の課題を明らかにすることが可能になると考える.本研究では,小学生の素朴概念を修正する学習指導方略であるとされる仲間学習を用いて素朴概念の修正可能性について実証的に明らかにすることを目的とした.上記目的に照らし,平成30年度は1平成29年度に実施した小学校体育授業におけるオーバーハンドパスの素朴概念に関する実態調査の成果発表,2小学校高学年児童における仲間学習を適用した素朴概念を修正するための学習指導方略に関する介入検証授業を引き続き行った.2平成30年10月から12月にかけて,素朴概念を修正するための仲間学習を適用した10時間のネット型ゲーム単元の授業を実施し,児童のオーバーハンドパスに関する素朴概念とパフォーマンスがどのように変化するのかを検証した.調査対象者は、千葉県I小学校6年生2クラス(57名)であった.申請者が開発した小学生用のオーバーハンドパスに関する素朴概念調査票を用いて単元前後に調査を実施した.その際、仲間学習の効果を検討するため,仲間学習を実施するクラスと,教師からのフィードバックを中心とした学習を実施するクラスに分けて検討を行った.オーバーハンドパスのパフォーマンス評価については,技能の定着度の観点から行った.結果については,現在分析中である.平成29年度は,これまでに実施した検証授業の分析を進めるために,映像分析ソフト及びPCを購入し,映像の分析を進める.素朴概念の修正のためには,様々な要因が関わっていると考えられる.それらを学習指導方略(仲間学習)の適用可能性と限界を探ることで,改めて検証してく必要がある.また,映像分析と平行して,素朴概念の修正を目的とした仲間学習に関しての検証授業の積み重ねていくことが必要である.素朴概念の修正を促すための授業方法論などについて明らかにしていくことが今年度の課題となる.平成29年度に映像分析ソフト及びPCを購入したため,今年度は映像の分析及び言語活動の分析を進める.素朴概念を修正するためには,様々な要因が関わっていると考えられる.それらを学習指導方略(仲間学習)の適用可能性と限界を探ることで,改めて検証していく必要がある.また,映像分析,言語活動の分析と平行して,素朴概念の修正を目的とした仲間学習に関しての検証授業の積み重ねていくことが必要である.
DNA凝縮を制御するためのパラメーター設定に関する基礎研究

遺伝子工学において、DNA凝縮はDNAのマニピュレーションや効率的な遺伝子導入をもたらす上で重要な構造体であると考えられる。そのためには、DNA凝縮に関する物理化学的なメカニズムを理解する必要がある。本研究では、2年の間に以下のような結果を報告したのでここに記す。1)酵母のゲノムサイズのDNAでも容易に安定なグロビュールを作成することが分かった。1本のDNA上に数個の凝縮ができたものと考えられるが、この構造は安定であり、応力をかけても電気泳動で長さの確認をした結果断片化されていないことが明かとなった。2)DNA凝縮体を1064nmの波長を持つレーザーでトラップすることが可能であることを明らかにした。3)様々な凝縮剤(PEG-MgCl2、スペルミジン、カチオン性界面活性剤)により形成されたDNAの凝縮体は、それぞれレーザーによるトラップ力が異なることが分かった。4)DNAの長さによってグロビュールの大きさが変わり、さらに、1064nmの波長を持つレーザーでトラップしたとき、長さとトラップ力の間には比例関係があることが分かった。5)溶液中の条件を調節すれば、短いDNAでも1つの凝縮体を形成したり、また何分子も集まって数珠状になることが分かった。主な原因は、水溶液中の塩濃度によるものであることが示唆される。6)レーザーにより2つのグロビュール(PEG-MgCl2、スペルミジンにより引き起こした)をいったん重ねるとレーザー光をカットした後も離れず溶液中を漂うことが分かった。このことから、グロビュール間には引き合う力があり、DNAの対イオンがDNAの電荷の遮蔽のために分散化する傾向があり、DNAの濃度を高めたときに生じる凝集の原因だと考えられる。本年度の研究計画では主に3つの内容を挙げていた1)イーストからDNAを抽出し、DNAをゲル電気泳動(共同利用)によって長さを選り分ける。2) (Liu,Y-G.,ら1994)の方法により、DNAをゲルから抽出する(温度コントロールをしながら)。3) PEG溶液と混ぜ合わせて、DNAを凝縮化する(温度コントロールをしながら。また、ここでのPEG溶液物理的パラメターを確認する)。以上のような方法でDNAを凝縮化した結果、DNAの長さによって凝縮物の大きさが比例して変わり、蛍光顕微鏡で観察される凝縮物の蛍光強度の強さが異なることから、数百塩基対あるDNAでもグロビュール化可能であることが分かった。また、温度による凝縮体形成への影響を調べた結果、温度に対する応答が遅く、通常グロビュール状態からコイル状態に移ると知られている温度においても、数分間くらいはほどけずに安定した凝縮構造をとることが分かった。ただ、今回問題にしていた、1本のDNA鎖上にできるグロビュールの数は明らかにできていない。来年度に引き続き検討を行う予定である。また、DNAの凝縮物を用いた応用として、レーザーによるトラップを試みた。レーザーによるトラップが可能であれば、顕微鏡上で非接触にDNAをマニピュレートすることかできる。凝縮剤としてPEG Mg系を用いて検討した結果、マイクロビーズのトラップ力に比べて小さいがレーザーによりトラップおよび輸送することが可能であることが分かった。さらに、凝縮剤の違いによるトラップ力が異なることが分かった。
雄豚精のう腺におけるリラキシン遺伝子の発現とその調節構構の解明

本研究では、まず、(1)雌豚卵巣リラキシン(RXN)の遺伝情報を基にPCR法でRXN cDNAプローブを作製し、次に、(2)このプローブを用いて雄豚精嚢腺におけるRXN遺伝子の発現を検索し、さらに、(3)雄豚精嚢腺におけるRXNの発現調節についても検討を加え、以下の成果を得た。1.RXN cDNAプローブの作製:Haleyら(1988)により、豚卵巣RXN遺伝子の塩基配列が明らかにされているので、申請者は、この情報を基に、豚ゲノムDNAを鋳型として、RNXペプチドをコードしているcDNA断片をPCR法で増幅させた後、組換えDNA実験操作を行い、クローン化プラスミドDNAを作製した。シーケンスの結果、その塩基配列は問違いなくRXNペプチドをコードしていることが確認された。制限酵素を用いて目的のcDNAをプラスミドから切り出した後、ランダムプライマー法で非放射性物質(ジゴキシゲニン)を取り込ませてプローブを作製した結果、RXN messenger RNA(mRNA)を高感度で検出できることが解った。2.雄豚精嚢腺におけるRXN遺伝子の発現:上記で作製した豚卵巣DNAプローブを用い、Northern blotハイブリダイゼーション法により、雄豚精嚢腺におけるRNXmRNAの検出を試みた。その結果、対照区の卵巣では約1.0kbpの位置に一本のRNX mRNAの発現を見た。しかし、実験区の精嚢腺にはシグナルが検出されず、雄豚精嚢腺では、卵巣型(雌型)RXNの転写が行われていないことが判明した。この実験結果から、精嚢腺RXNは卵巣RXNと同一の遺伝子産物ではなく、異なる遺伝子から発現した産物であることが明かとなった。3.雄豚精嚢腺におけるRXNの発現調節機構:去勢した雄豚にテストステロン投与を行い、免疫組織化学法により、精嚢腺RXNの発現調節を検討した。その結果、RXNはテストステロンの支配を受けて雄豚の精嚢腺で発現することが判明した。
メロテルペノイド生合成アセンブリーラインの解明と制御

医薬資源として重要なメロテルペノイドは、テルペノイドとポリケタイドの構造を併せ持つ、ハイブリッド型化合物である。我々はピリピロペンA、テレトニン、アンジトミン、アンドラスチンなど、数種の糸状菌由来生物活性メロテルペノイドの生合成遺伝子クラスターを同定し、麹菌を宿主として、遺伝子異種発現・物質生産系を構築した。また、これら生合成アセンブリーラインに、メロテルペノイドの構造多様性を生み出す、新規膜結合性環化酵素や多機能型酸化酵素など、興味深い化学反応を触媒する一連のユニークな酵素群を見出し、その反応機構を明らかにした。本研究では、人為的な機能制御と分子多様性創出の格好のモデルともいえる、糸状菌由来メロテルペノイド生合成遺伝子クラスターをとりあげる。テルペノイドとポリケタイドのハイブリッド型化合物であるメロテルペノイドは、テルペノイドとポリケタイドそれぞれの多様性を相乗した分子構造多様性を有する可能性を秘めている。有機化学を基盤として、分子生物学や構造生物学、タンパク工学の技術などを駆使することにより、メロテルペノイド生合成マシナリーを酵素遺伝子レベルで解明し、複雑多様な分子構造の構築原理を明らかにすることを目的とした。初年度はまず、遺伝子異種発現系の構築と機能解析に着手した。糸状菌A.fumigatus由来ピリピロペンの生合成遺伝子クラスターを構成する各遺伝子の異種発現系を構築した。メロテルペノイド生合成において分子骨格構築の鍵となるのはポリケタイド部分の生合成を担うポリケタイド合成酵素(PKS)、テルペノイド部分を縮合するプレニル基転移酵素(PT)、末端二重結合に対するエポキシ化を触媒するフラビン要求性の酸化酵素(FMO)、そして閉環反応を担う環化酵素(CYC)である。これら4種の酵素が構造多様性を産み出す基盤となる。具体的には、酵母あるいは麹菌を宿主として、PKS、PT、FMO、CYCの4遺伝子を同時に導入した異種発現系、即ち、メロテルペノイド生合成アセンブリーラインを再構築した。また、同時に、酵母や大腸菌を用いてこれら4酵素を単独で異種発現させた組み替え酵素を用いて酵素の精密機能解析に着手した。有機化学を基盤として、分子生物学や構造生物学、タンパク工学の技術などを駆使することにより、メロテルペノイド生合成マシナリーを酵素遺伝子レベルで解明し、複雑多様な分子構造の構築原理を明らかにすることを目的とする。昨年度は、Aspergillus terreus由来のterretonin生合成経路の解明をめざした。数多くのterretonin類縁体が天然から単離されており、その中には医薬品資源として期待されるものも含まれる。これまで、A.terreusのゲノム情報を元にterretonin合成遺伝子クラスターが見出され、ポリケタイド合成酵素(Trt4)、プレニル基転移酵素(Trt2)によって、farnesyl-DMOAが合成されることが示されている。Trt4、Trt2に加えて、flavin依存型酸化酵素(Trt8)、環化酵素(Trt1)をAspergillus oryzae NSAR1株にて発現した。その結果、Trt8によって、farnesyl-DMOAが酸化され、epoxyfarnesyl-DMOAが生成した。一方、Trt1によって環化した化合物は検出されなかった。そこで、環化前にcarboxyl基がメチル化される可能性を考え、メチル化酵素(Trt5)を、Trt1,2,4,8発現系に加えて発現した。その結果、環化後の生成物であるpreterretoninが生成した。よって、Trt5によるcarboxyl基のメチルエステル化が、環化反応に必須であることが判明した。本研究では、人為的な機能制御と分子多様性創出の格好のモデルともいえる、糸状菌由来メロテルペノイド生合成遺伝子クラスターをとりあげた。これまでに我々は糸状菌Aspergillus fumigatus由来ピリピロペンおよびAspergillus terreus由来テレトニンの生合成遺伝子クラスターを同定し、その異種発現系の構築を完了した。さらに、各種生合成酵素の精密機能解析に着手し、テレトニン生合成においては、中間体のカルボキシル基のメチルエステル化が、環化反応に必須であることなどを明らかにした。

一方、3,5-ジメチルオルセリン酸を共通の生合成中間体とするメロテルペノイドには、テレトニン以外にもaustinol,andrastin Aなど、多様な骨格が知られており、テルペノイド部位の環化様式や環化後の種々の修飾反応の多様性により、これら化合物群の構造多様性が生み出される。昨年度は、テレトニンに加えて、austinolとandrastin Aについても、麹菌Aspergillus oryzaeを宿主として、遺伝子異種発現・物質生産系を構築し、メロテルペノイドの構造多様性を生み出す、閉環様式を異にする環化酵素や、閉環後の修飾反応に関わる酵素群の探索ならびに機能解析を行った。なかでもaustinol生合成においては、スピロ環形成と多段階の酸化反応を触媒する特異な新規多機能型ジオキシゲナーゼを見出し、その精密機能解析に成功した。さらに、andrastin A生合成に関しては、A. oryzaeにおける異種発現系を構築し、その生物的全合成を達成した。本研究では、人為的な機能制御と分子多様性創出の格好のモデルともいえる、糸状菌由来メロテルペノイド生合成遺伝子クラスターをとりあげた。テルペノイドとポリケタイドのハイブリッド型化合物であるメロテルペノイドは、テルペノイドとポリケタイドそれぞれの多様性を相乗した分子構造多様性を有する可能性を秘めている。有機化学を基盤として、分子生物学や構造生物学、タンパク工学の技術などを駆使することにより、メロテルペノイド生合成マシナリーを酵素遺伝子レベルで解明し、複雑多様な分子構造の構築原理を明らかにすることを目的とした。最終年度では、Aspergillus variecolorが産生するアンジトミンの生合成マシナリーの全容を解明し、アメリカ化学会誌に論文を公表した。単離・構造決定より三十余年を経て初めて、その生合成分子基盤を明らかにするとともに、自然界の巧みな合成戦略の一端を見出すことに成功した。当初生合成への関与が予想されたDiels-Alder反応は、実際にはアンジトミン生合成に関与しないことが判明したが、一方でジオキシゲナーゼAndAが特異な分子内架橋構造の形成を担うことを解明した。さらに、生合成の最終段階においても、異なるジオキシゲナーゼAndFが酸化的転位反応を触媒しアンジトミンを与えることを見出した。現在は、これら特異な反応を触媒する一連のジオキシゲナーゼの機能をより詳細に明らかにすべく、X線結晶構造解析が進行中である。一方、Aspergillus terreusが産生するテレトニンの後期生合成段階の解明にも成功し、同じくアメリカ化学会誌に論文を公表した。糸状菌Aspergillus fumigatus由来ピリピロペンの異種発現系を構築した。メロテルペノイド生合成において分子骨格構築の鍵となるのはポリケタイド部分の生合成を担うポリケタイド合成酵素(PKS)、テルペノイド部分を縮合するプレニル基転移酵素(PT)、末端二重結合に対するエポキシ化を触媒するフラビン要求性の酸化酵素(FMO)、そして閉環反応を担う環化酵素(CYC)である。そこで、麹菌Aspergillusoryzaeを宿主として、PKS、PT、FMO、CYCの4遺伝子を同時に導入した異種発現系を構築した。
戦後ドイツの連邦制形成における規範的・制度的言説空間と対抗的政治像

ドイツの戦後連邦制は1949年の基本法の制定によって形成され、その基本的特質は基本法の中に制度化された。本研究は、第一に、ドイツ連邦制がいかなる理念と考え方でもって構築されたかに関して言説分析を行い、第二に、占領軍政府と州首相の連邦制建設をめぐる対立・妥協のプロセスを1948年8月のヘーレンキムゼー憲法会議の時点まで明らかにした。戦後ドイツの連邦国家の枠組みを形成したのは1949年の基本法である。本研究は連邦国家形成過程を明らかにする目的で、同時代人や基本法制定に関ねった政党政治家の連邦主義言説を解明した。分析の焦点は連邦制そのものを正当化する規範言説であり、制度言説については次の研究課題とした。本研究の研究成果は以下の通りである。(1)基本法の審議・決定を行った議会評議会の議長アデナウアーは、個人の自由と尊厳を守る立場からキリスト教民主主義と西欧文化への確信に立脚して連邦制の正当性を主張した。(2)連邦主義は、単なるナチス批判としてのみならず、ドイツ史入の批判的視点を踏まえて提起され、国家全能主義、集権主義、分立主義、分離主義、コレクティビズムへの対抗概念として提示された。(3)連邦主義は、ドイツの地域的多様性を保持する狙いとドイツの統一性を確保する意図を結び付けて提起された。この意味で戦後連邦主義は多様性の中の統一を志向したものと捉えうる。(4)戦後創出されるべき連邦制をめぐつては、社会民主党の連邦優位型連邦制、キリスト教社会同盟の州優位型連邦制、そしてキリスト教民主同盟の連邦・州均衡型連邦制という三つの対抗的言説が展開された。社会民主党はドイツの経済的統一性の確保と国家による経済操縦という綱領的立場から、キリスト教社会同盟は州のアイデンティティと州の国家性を維持する観点から、キリスト教民主同盟は連邦と州の間のバランスを図る狙いからそれぞれの連邦制コンセプトを提示した。(5)連邦制をめぐる言説にはヨーロッパ的視点が明確に現れた。ヨーロッパ的視点とは、連邦制の構築がドイツのヨーロッパへの統合の前提とする考え方、そしてドイツの連邦国家形成がヨーロッパの連邦化に寄与するという立場である。こうした連邦主義のヨーロッパ的視点はすべての党派に共通するものであった。以上の研究成果を論文として公表した後、引き続いて連邦主義の制度言説の研究に着手した。その際、連邦と州の権限関係に焦点を定め、ヘーレンキムゼー憲法会議や議会評議会の議事録などに基づいて作業を行っているところである。2年間にわたる本研究では、昨年度の研究成果論文「戦後ドイツ国家形成と運邦主義言説」を受け、本年度は引き読きドイツ戦後連邦制の成立過程を解明するため、(1)連邦と州の権限関係の制度化をめぐる政党間の論議、(2)占領統治機構の形成過程、(3)州の設置と州の政治体形成、(4)「連邦制と政党の関係」および「比較連邦制」に関する研究動向の把握といった諸課題の解明を行った。(1)については、連邦制形成過程の最も主要な争点の一つが権限関係問題であること、権限関係をめぐっては社会民主党の連邦優位論、キリスト教民主同盟の連邦・州均衡論、キリスト教社会同盟の州優位論が対抗関係にあったこと、アメリカは自国の連邦制をドイツのモデルにしたこと、政党間およびドイツ・連合国間の妥協の産物として「協調の連邦制」が創出さけたという仮説を考えた。(2)については、アメリカ占領地区とイギリス占領地区の統合により、占領統合機構が整備再編された結果、1949年後の連邦国家の原型が構築されたこと、こうしたプロト連邦制的枠組みの形成があってはじめて、そして同時代の連邦主義言説と相まって西ドイツにおける連邦体制が構築されたとの見通しを得た。(3)に関しては、ドイツ連邦国家が構築される以前に、その構成単位である州が事実上主権的単位として形成されたこと、こうした構成単位の結集体として戦後連邦制ができあがったこと、この意味ではドイツ連邦国家形成はも、ステパンやリンスの連邦国家形成の二つの型(結集型と統合型)のうち、前者に近似の過程であったことを明らかにした。本年度の研究はまずは(1)から着手したが、単独の論文を書くには資料不足のため、(2)と(3)の作業に移り、また(4)の理論問題に取り組んだことから、本年度は論文を完成できなかった。なお、総合政策学部の国際シンポジウムにあわせ、ドイツの連邦国家に関する研究者H.Wilms(ツェペリン大学)を招聘し、研究上の意見交換を行い、示唆を得た。
細胞内脂肪滴形成の分子機構に関する研究

脂肪滴は中性脂肪などの中性脂質の貯蔵庫として重要な細胞内オルガネラであり、膜脂質代謝・エネルギー産生など様々な細胞機能に関与している。また、脂肪蓄積は様々な病態とも密接に関与している。しかし、脂肪滴形成に関わる分子・メカニズムについては不明の点が多い。本研究により、まず脂肪滴に存在する蛋白質を網羅的に同定した。また、アセチルCoAカルボキシラーゼ1が脂肪滴形成に必須であることを遺伝学的・細胞生物学的に明らかとした。脂肪滴はほぼ全ての体細胞に認められる一種のオルガネラで、中性脂肪貯蔵・膜脂質代謝・エネルギー産生などに密接に関与すると考えられている。細胞内において脂肪滴量は極めてダイナミックに変動するが、その生成・消失機構及びその制御についてほとんどわかっていない。医学薬学的見地からも脂肪滴は肥満・脂肪肝等の本因であり、その形成メカニズムを知ることは、これらに付随した病態の解析・治療にも有用である。そこで、細胞内脂肪滴の形成メカニズムを明らかにすることを本研究の目的とする。研究計画としては、体細胞変異株を用いた遺伝学的な手法とプロテオミクスを用いた生化学的な手法を用い細胞内脂肪滴の形成メカニズムに重要な因子を同定し、その関与機構を解析することである。さらに、脂肪滴形成を制御する薬剤の開発を試みることである。脂肪滴はほぼ全ての体細胞に認められるオルガネラで、中性脂質貯蔵・膜脂質代謝・エネルギー産生などに密接に関与すると考えられているがその形成過程については不明な点が多い。医学薬学的見地からも脂肪滴は肥満・脂肪肝等の本因であり、その形成メカニズムを知ることは、これらに付随した病態の解析・治療に有用である。そこで、本研究は主に体細胞変異株を用い細胞内脂肪滴の形成メカニズムに重要な因子ついて明らかにすることを目的としている。本年度(平成18年度)はまず、ヒト肝培養細胞より分離した脂肪滴のプロテオーム解析結果を報告した。37種のタンパク質を同定し、脂肪滴には構造蛋白(ADRP、TIP47など)、膜輸送蛋白(Rab蛋白など)、脂質代謝酵素などが多く存在するだけでなく、機能未知のタンパク質も多く同定された。これらの分子が脂肪滴形成に関わっているかもしれない。今後さらに検討していきたい。また、樹立した脂肪滴の形成不全細胞株LDD-1(アセチルCoAカルボキシラーゼ1に欠損を有する)の性状解析も行った。LDD-1株では、diacylglycerol acyltransferaseなどの中性脂質合成に関わる酵素のin vitro活性については変動がみられなかった。このことから、これら酵素の細胞内活性調節機構あるいは細胞内脂肪酸輸送過程等に変動が生じているのかもしれない。加えて、脂肪滴過剰形成変異株の分離も試みた。変異株分離法は、チャイニーズハムスター卵巣由来のCHO細胞を用い、通常の10%血清(あるいはリポタンパク質除去血清)存在下で行った。脂肪滴はNile Redで蛍光標識し、その脂肪滴量が多い細胞集団をFACS(セルソーター)で分離した。このスクリーニング操作を繰り返すことで脂肪滴形成が過剰な変異株を濃縮し、クローン化した。現在1株得られている。しかし、その形成過程については不明な点が多い。そこで、本研究は主に体細胞変異株を用い細胞内脂肪滴の形成メカニズムに重要な因子ついて明らかにすることを第一の目的としている。樹立に成功した脂肪滴の形成不全細胞株LDD-1の解析から、昨年度(平成18年度)までにアセチルCoAカルボキシラーゼ1(活性)が脂肪滴形成に必須であることを示した。そこで今年度は、アセチルCoAカルボキシラーゼ活性を阻害する薬剤のスクリーニングを行った。放射性炭酸のアセチルCOAへの取り込み活性に対する阻害能を指標に、試験管内アセチルCoAカルボキシラーゼ阻害活性の測定を行った。天然物由来ライブラリーよりスクリーニングを行い、キサントン誘導体の一つが有意にアセチルCoAカルボキシラーゼ活性の阻害を示した。さらに、CHO細胞を用いたバイオアッセイにおいても、本薬剤は脂肪滴蓄積を有意に阻害することがわかった。これらの結果は、これまでの変異株を用いた解析と合致した。本薬剤を用いることで様々な細胞で広くアセチルCoAカルボキシラーゼ活性を阻害することが可能となり、細胞内脂質蓄積阻止の観点からも非常に有用と考えられた。細胞内脂肪滴はほぼ全ての体細胞に存在する細胞内小器官であり、中性脂肪貯蔵・膜脂質代謝・エネルギー産生等に重要な役割を果たしていると考えられている。しかし、その形成機構については不明な点が多く残されている。医学薬学的見地からも脂肪滴は肥満・脂肪肝等の本因であり、その形成機構を知ることは、これらに付随した病態の解析・治療にも有用である。

本研究では、脂肪滴形成に重要な因子を明らかにする方法として、細胞内脂肪滴の形成メカニズムに変異を有する体細胞変異株の樹立・解析を行う手法、および脂肪滴構成タンパク質を網羅的解析により同定・機能解析する手法、の2つの方法から取り組んでいる。本年度(平成20年度)は、ヒト培養肝細胞(Huh7細胞)から遠心法により脂肪滴画分を精製・分離し、脱脂後画分をLC-MS/MSを用いたプロテオーム解析にかけ、タンパク質の同定をさらに進めた。以前同定できた40種近くのタンパク質に加えさらに100種類近い新規脂肪滴タンパク質を同定できた。脂肪滴構造タンパク質(ADRP、TIP47など)、膜輸送タンパク質(Rab蛋白など)、脂質代謝酵素が比較的多く検出されたものの、それ以外にも広範にわたる各種機能を有するタンパク質が同定された。また、機能未知のタンパク質も多数同定された。これらの分子が細胞内脂肪滴形成に関わっているかを検討することは非常に興味深く、siRNA、遺伝子過剰発現の系を用いてこれら分子の関与を今後検討していく予定である。細胞内脂肪滴はほぼ全ての体細胞に存在する球形のユニークな細胞内小器官であり、生理的には中性脂肪貯蔵・膜脂質代謝・エネルギー産生等に重要な役割を果たしていると考えられている。しかし、その形成機構については不明な点が多い。医学薬学的見地からも脂肪滴は肥満・脂肪肝等の本因であり、その形成機構を知ることは、これらに付随した病態の解析・治療にも有用である。また、C型肝炎ウイルス感染と脂肪滴の関連も近年注目されており、これらの解析を通じて脂肪滴の新たな機能・形成機構が明らかになってくる可能性が考えられる。本年度(平成21年度)は、ヒト培養肝細胞(Huh7細胞)を用いて、C型肝炎ウイルス増殖と脂肪滴の関連について検討を行った。まず、C型肝炎ウイルス感染により脂肪滴蛋白質に変動が見られるかプロテオーム解析を行った。脂質代謝に関連する分子を含め従来脂肪滴に分布していた分子は全て感染細胞由来の脂肪滴にも存在しており、ほとんど変化が見られなかった。一方、感染細胞の脂肪滴の特徴として、RNA結合能を有する分子が複数同定されるという結果が得られた。脂肪滴近傍ででウイルスが増殖する可能性が示唆されており、このこととの関連を踏まえ、今後この分布変動の原因を明らかにすることは非常に重要と考えている。また、様々中性脂質代謝(生合成)に関与する酵素の阻害剤で細胞を処理しウイルス増殖への影響を見たところ、コレステロール生合成阻害剤によりウイルス増殖が強く抑制されることが見いだされた。当該阻害剤処理により細胞内コレステロール量はほとんど変化しなかったが、脂肪滴の主要成分である細胞内コレステロールエステル量は有意に低下した。脂肪滴を構成するもうひとつの主要な中性脂質であるトリグリセリド量も変化が見られなかったことから、脂肪滴中のコレステロールエステル含量がウイルス増殖に重要な役割を果たしている可能性が考えられた。
高次脳機能障害の症状を呈する子どもに対する急性期からの生活支援

平成26年度より、挑戦的萌芽研究「高次脳機能障害のある子どもの学校生活の多職種協働支援」、基盤研究C「高次脳機能障害のある子どもの学校生活への看護援助ガイドライン」を継続して行い、回復期の看護援助ガイドライン、および、多職種連携モデル案を提案し看護師への普及を図ってきた。また、急性期の看護を検討してきた。本研究は、急性期の看護を具体的に提示し、回復期、およびそれ以降を見据えて活用されるよう活動する。また、急性期医療後の子どもの急激な生活の変化に対する高次脳機能障害支援コーディネーターを中心とした専門職や支援機関による有機的な支援体制の検討を行い、急性期からの多職種による生活支援の普及を目指す。