hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
インフラマソームとは独立したアダプター分子ASCの役割の解明

3インフラマームと呼ばれる細胞内の分子複合体の役割について一貫して研究を進めてきた。その過程で、NLRP3インフラマームを構成する分子の一つであるASCがNLRP3インフラマームとは独立した働きを持ち、動脈硬化モデルや静脈血栓モデルではASC欠損マウスでのみ病態が増悪することを見いだした。本研究では、これらの病態におけるインフラマームとは独立したASCの役割の解明を目的に研究を行い、ASC制御による新規の治療戦略の構築を目指し、本年度においては疾患動物モデルにおけるASCの関与の解明を目指し、動脈硬化、動脈血栓、静脈血栓、脂肪肝の各病態モデルを作製し、ASCの関与を明らかとすることを目的に研究を行った。その結果、各病態モデルの中で特に深部静脈血栓症モデルでASC欠損で病態が増悪する結果が再現よく得られた。詳細な検討を行った結果、これらの原因となる細胞が血小板にあることが突き止められた。血小板においてはNLRP3インフラマソームの各構成分子はASCしか発現していないことも判明したため、ASCにはインフラマソームとは独立した別の結合パートナーが存在すると現在考えており、今後免疫沈降法を会した新規のパートナー分子の探索を行う予定である。29年度より富山県立大学に新設された医薬品工学科に着任し、新たに研究室を立ち上げることとなった。実験室の構築などこれまでと同様の実験環境を作るために、研究実施時間が思うように取れなかった。その中で深部静脈血栓症モデルでは血小板のASC欠損が病態を増悪させる原因であることを示唆する結果が得られたが、まだメカニズムの完全解明には至っていない。平成29年度より富山県立大学医薬品工学科に転属し、本研究課題遂行にエフォートを50%以上割くことができる。これにより昨年度の遅れを取り戻せると期待される。また富山県立大学に移る前に所属していた自治医科大学炎症・免疫研究部の高橋将文教授、木村博昭講師、唐澤直義助教、渡邊幸子助教を研究分担者とすることでこれまでと変わらない研究体制を維持できるものと考えている。これまでと同様の実験環境が構築されつつある。これにより平成30年度はこれまでよりも実験実施時間の確保が可能となると思われ、昨年度までの遅れを取り戻すことができると期待される。本来の計画より1年延長することで、当初計画していた範囲までの研究および成果が期待できる。所属が変わり、当初の予定よりもエフォートを割くことができず研究実施時間が限られていたため。研究室立ち上げのための機材費を本資金外から捻出ができたため、予定よりも支出が抑えられた。研究実施環境は整えつつあるので、次年度からは研究実施時間が増え、消耗品費として使用額が増える予定である。実験室の構築などこれまでと同様の実験環境を作るために時間を要しため、本研究計画を1年延長している。次年度使用額のうち1,021,312円を消耗品費として使用し、200,000円を学会参加のための旅費として使用する計画である。
耐力低下を伴う二次壁付きSRC造およびRC造骨組の耐震性状改善に関する研究

袖壁・たれ壁・腰壁が設けられたSRC造およびRC造骨組部分に地震時の応力が生じる状態を対象にして、耐力低下を抑制するために梁の曲げ降伏ヒンジ位置を固定する設計方法を明らかにすることを目的にし,主に梁の曲げ降伏ヒンジ位置が固定される場合の弾塑性性状と破壊性状を破壊実験により明らかにした。そして、特に曲げ降伏ヒンジ位置、剛性、最大耐力以降の壁の破壊の進展に伴う耐力低下、梁の曲げ降伏ヒンジ位置を固定する壁のディテールの設計方法等について検討した。実験では試験体を5体製作し加力を行った。そして、2年間の最終的なまとめとして、設計方法を検討した。研究成果は以下のとおりである。(1)壁厚や、梁への入力せん断力や入力モーメントを制御することにより壁の局部的な破壊を抑制でき、最大耐力以降の耐力低下を防止できる。(2)壁と骨組の接合部である部分だけを局部的に壁厚を大きくすることにより、壁の局部的な破壊を抑制できる。(3)最大耐力以降の変形の増加に伴う耐力低下量を定量的に評価できる方法を提案した。(4)設計式を提案した。本研究は研究期間が2年で、平成9年度では交付申請書に記した項目に関する実験資料が得られた。以下に研究の概要を記す。1.破壊実験概要耐力低下が生じやすい腰壁・たれ壁・袖壁付き骨組において,耐力低下を抑制するために梁の曲げ降伏ヒンジ位置を固定する設計方法を明らかにすることを目的にし,鉄骨鉄筋コンクリート造袖壁付き骨組部分をモデル化した試験体を9体製作し加力破壊実験を行った。試験体については柱断面と梁断面は一定とし壁長さと壁厚およびコンクリート強度を変化させた。2.研究成果(1)袖壁付き柱とそれに取り付く梁からなるSRC造骨組部分に地震時の応力が生じる場合の弾塑性性状と破壊性状が明らかになった。(2)コンクリート強度が高強度(600kg/cm^2)になると、普通強度(240kg/cm^2)のSRC骨組ものに較べ強度変形性能が全く異なることが明らかになった。高強度コンクリートを用いる場合の設計資料が得られた。(3)袖壁付き梁が曲げ降伏しても、梁の変形の増加に伴い耐力低下が生じるタイプと耐力低下が生じずに耐力が安定するタイプに分かれることが確認され、耐力低下の評価方法とそれらのタイプの判別方法を明らかにした。これにより、腰壁・たれ壁・袖壁付き骨組において,耐力低下を抑制するために梁の曲げ降伏ヒンジ位置を固定する設計方法の手がかりが得られた。
心臓における生体ストレス分子ＴＲＰチャネルの役割

本研究課題では、心臓における生体ストレス分子TRPM2チャネルの役割の解明を目指した。TRPM2を強制発現させた細胞を用いて、TRPM2の機能の定量的測定を行った。まず、TRPM2発現HEK293細胞を用いてTRPM2の活性化剤であるADPリボース刺激および過酸化水素刺激に対する活性をパッチクランプ法で定量的な測定を行った。TRPM2の性質を調べる過程で2種類のTRPM2の活性制御に関わる相互作用タンパク質を見つけた。一つ目は、てんかん原因遺伝子EFHC1がTRPM2と相互作用をすることを見つけた。EFHC1の相互作用は、過酸化水素およびADPリボースに対するTRPM2の感受性を増強し、細胞死を増大させることが分かった(Katano et al. Cell Calcium 2012)。二つ目は、リンパ球の増殖に関与するCD38が相互作用することを見つけた。CD38の相互作用は、高浸透圧刺激でTRPM2と協働することにより活性化し、細胞増殖に関わることを報告した(Numata et al. J Physiol. 2012)。これらの相互作用タンパク質は、心臓にも発現が認められるために心臓において虚血再灌流時の酸化ストレスが大量に産生される病態時においても浸透圧変化のような生理的条件においてもTRPM2が心機能に関与している可能性を示した。実際に摘出した心臓において、虚血再灌流刺激を行なうと、野生型マウスに比べてTRPM2欠損マウスの方が心拍数、心室圧の回復が優位に早くなる結果を得た。これらの結果より、生体ストレスの基質となり得るTRPM2の抑制は、虚血再灌流障害を軽減する可能性を示した。24年度が最終年度であるため、記入しない。TRPM2は、TRPM2のC末およびN末を介して全体的にEFHC1と相互作用をし、脳、海馬において共局在をすることが分かった。また、カルシウムイメージングおよびパッチクランプ法を用いた機能解析では、過酸化水素およびADPリボースに対するTRPM2の感受性を増強することが酸化ストレス条件下において細胞死を増大させることが分かった(Katano et al. Cell Calcium 2012)。I.単離心筋細胞におけるTRPM2の発現確認と定量的測定によるデータ取得・心臓の部位ごとにTRPM2の発現を定量的に解析するためにリアルタイムPCR法を用いてmRNA量を、ウェスタンブロット法を用いてタンパク量の評価を行なった。・1.と同様に心臓の部位ごとで、パッチクランプ法を用いて電流密度を求めた。

この際、TRPM2チャネルの活性化には、TRPM2の活性化剤であるADPリボースを用いて検討を行なった。その結果、心房筋細胞においては、TRPM2様の直線的なIV曲線を示す電流が記録された。II.発現系におけるTRPM2の定量的測定によるデータ取得・シミュレーションで用いるためのデータとしてTRPM2チャネルそのものの性質を知るためには、動物細胞を用いた発現系で定量的測定を行うことが必要と考え、発現系でパッチクランプ法を用いて検討を行った。TRPM2チャネルの活性の評価を行なう過程で、2種類のTRPM2の活性制御に関わる相互作用タンパク質を見つけた。一つ目は、てんかん原因遺伝子EFHC1がTRPM2と相互作用をすることを見つけた。EFHC1がTRPM2んい相互作用をすることで、酸化ストレスに対するTRPM2の感受性を増強し、細胞死を増大させることが分かった(Katano et al. Cell Calcium 2012)。二つ目は、リンパ球の増殖に関与するCD38が相互作用することを見つけた。CD38の相互作用は、高浸透圧刺激でTRPM2と協働することにより活性化し、細胞増殖に関わることを報告した(Numata et al. J Physiol. 2012)。これらの相互作用タンパク質は、心臓にも発現が認められるために心臓において虚血再灌流時の酸化ストレスが大量に産生される病態時においても浸透圧変化のような生理的条件においてもTRPM2が心機能に関与している可能性を示した。24年度が最終年度であるため、記入しない。今後、ランゲルドルフシステムを用いて、心臓における虚血、再灌流実験を行ない、この際の変化を野生型マウスおよびTRPM2欠損マウスを用いて比較し、TRPM2の役割を見出す。また、単離心筋細胞でTRPM2の正常時、虚血、再灌流時における役割についてもパッチクランプ法を用いて、検討を行なう。
光受容体-G蛋白質βγサブユニット複合体の構造解析

本研究では、多くの生体内情報伝達反応系で機能している、受容体-三量体G蛋白質間の分子認識機構を構造的に明らかにすることを目的としている。具体的には、網膜内視細胞に存在するロドプシン(活性中間体)-トランスデューシン(αβγ)の結合状態での三次元結晶化・X線構造解析を行うための精製・安定化の条件検索を行ってきた。その際に、脂質環境を極力保持するために、バクテリオロドプシンで見い出された球殻状多面体構造の応用を試みることも含めて研究を行い、現在までに以下のような成果が得られている。1)視細胞円盤膜上に存在するほぼ全てのロドプシンに対して光依存的にトランスデューシンを結合させた試料から、どの成分も失うことなく可溶化する条件が得られた。この条件下では、円盤膜にわずかに存在する不純物は可溶化されないことから、複合体として非常に純度の高いものが得られることがわかった。2)上記の試料における各成分の結合状態を評価したところ、トランスデューシンのαサブユニットのみが非常に高分子量の成分として分離されやすいことが明らかになった。このことは、円盤膜上での実際の結合形態を反映している可能性があり、非常に興味深いと思われる。またこのことを利用して、ロドプシン-βγサブユニット複合体の大量精製をより簡便に行うことが可能となった。3)バクテリオロドプシンの球殻構造を作成するために最適な界面活性剤、pH、温度設定に非常に近い条件化において、円盤膜からのロドプシンの選択的な可溶化が起こることが明らかになった。この方法により、高精度の精製ロドプシン試料が非常に容易に得られるようになり、結晶化の条件検索効率が大幅に向上した。
幼若マウスの一過性卵胞成熟を用いた卵子成熟及び胚発生能関与遺伝子の検索

卵子形成時には胚発生能が獲得されるが,卵子成熟培養系の向上にはその獲得機構の解明は非常に重要な課題である。既にBDF1雌マウス17日齢由来卵子と24日齢由来卵子を体外成熟させ,体外受精,体外培養を行なうと胚発生能(具体的には胚盤胞形成能)に有意な差があることを見いだしていたので,この発生能の差異を利用して,卵子形成時における胚発生能関連遺伝子の検索を行なった。卵子RNAからcDNAライブラリを作成し,遺伝子発現パターンの違いをSubtraction法により調べた。14年度には,24日齢由来成熟卵子に特異的に発現する遺伝子のクローンを20個単離し,DNA配列を決定出来たものは15個であった。BLAST検索によるとそれらのほとんどは未同定配列であったが,レプチンレセプター遺伝子が24日齢由来卵子に多く発現していることがわかった。胚培養時にレプチンの添加が胚発生を促進する報告もあることから,卵子の発生能獲得とレプチン・レセプターの発現に何らかの関連があることを示唆している。15年度も引き続き,卵子形成時における胚発生能関連遺伝子の検索を行なった。24日齢由来成熟卵子に特異的に発現する可能性の高い遺伝子クローン5l3個についてDNA配列を決定した。BLAST検索によりspindlin,bmi-1,cyclin B1,E330034G19Rik,Jagged1,Ndfip2などが同定された。その中でもspindlin遺伝子が24日齢由来卵子で多く発現していることがわかり,定量的リアルタイムPCRによりその差次的発現も確認した。spindlinは細胞分裂に関与する遺伝子として発見された蛋白質で,まさに卵子の発生能獲得と関連性が高いと思われる。卵子形成時には胚発生能が獲得されるが、卵子成熟培養系の向上にはその獲得機構の解明は非常に重要な課題である。既にBDF1雌マウス17日齢由来卵子と24日齢由来卵子を体外成熟させ、体外受精、体外培養を行なうと胚発生能(具体的には胚盤胞形成能)に有意な差があることを見いだしている。そこで、この発生能の差異を利用して、卵子形成時における胚発生能関連遺伝子の検索を行なった。17および24日齢のBDF1雌マウスから得られた体外成熟卵子より得たRNAからcDNAライブラリを作成し、遺伝子発現パターンの違いをSubtraction法(正確にはSuppressive subtracted hybiridization法)により調べた。条件設定に手間取ったため、いまだ多くは検索できていないが、現在までに24日齢由来成熟卵子に特異的に発現する遺伝子のクローンを20個単離し、サンガー法によってDNA配列を決定出来たものは15個であった(現在も配列決定を継続中)。その内、BLAST検索により既知の配列は10個であったが、ほとんどは未同定配列(ESTなど配列は決定されているが遺伝子の性質は未知)であった。ただし、その中で興味深いものとして既に卵子で発現していることが知られているレプチンレセプター遺伝子が17日齢由来卵子よりも24日齢由来卵子で多く発現していることがわかった。胚培養時にレプチンの添加が胚発生を促進する報告もあることから、卵子の発生能獲得とレプチン・レセプターの発現に何らかの関連があることを示唆しており、さらに詳しく調べる予定である。また、次年度はさらに差次的発現遺伝子の検索を行う予定である。

既にBDF1雌マウス17日齢由来卵子と24日齢由来卵子を体外成熟させ、体外受精、体外培養を行なうと胚発生能(具体的には胚盤胞形成能)に有意な差があることを見いだしている。そこで、本年度も引き続き,この発生能の差異を利用して、卵子形成時における胚発生能関連遺伝子の検索を行なった。17および24日齢のBDF1雌マウスから得られた体外成熟卵子より得たRNAからcDNAライブラリを作成し、遺伝子発現パターンの違いをSubtraction法(正確にはSuppressive subtracted hybiridization法)により調べた。昨年度の条件設定を活用し,現在までに24日齢由来成熟卵子に特異的に発現する可能性の高い遺伝子クローン513個について、サンガー法によってDNA配列を決定した。その内、BLAST検索により既知の配列との相同性検索を行なったところ,spindlin,bmi-1,cyclin B1,E330034G19Rik,Jagged1,Ndfip2などと一致するクローンが多く得られていることがわかった。その中で興味深いものとして既に卵子で発現していることが知られているspindlin遺伝子が17日齢由来卵子よりも24日齢由来卵子で多く発現していることがわかり,定量的リアルタイムPCRによりその差次的発現も確認した。spindlinは細胞分裂に関与する遺伝子として発見された蛋白質で,まさに卵子の発生能獲得と関連性が高いと思われる。
親のがん発症に起因する親子関係の再構築に向けた支援策の開発

本研究では親ががんを発症した子供への支援として、親、医療者・学校関係者の3側面からの支援の現状を明らかにすることで支援策を検討することを目的にしていた。がんを発症した親が、自身の病気について子供にどのように説明するかについては、母親と父親で違いがみられた。母親は、がんを発症した当事者の場合も、配偶者である場合も、子供の理解に合わせて説明しようとしていた。一方父親は、子供に対して説明すること自体躊躇する現状が明らかとなった。また、小児がんの病名告知と同様に、子供への説明方法は子どもの発達段階に応じて違いがみられていた。医療者によるがんを発症した親に対する支援は、主に緩和ケア病棟でその支援方法を検討されている。支援方法は、子供への対応や、子供への説明に対する親の不安の相談などを、当事者やその家族に対するケアの一つとして実施している。その支援方法は、現在も模索しながら実施している現状がある。緩和ケア病棟に在籍する成人看護を専門とする看護師が主として担っている。小児専門看護師が協働する動きもみられているが、小児の発達段階に応じた関わりの支援が中心であり、子供への説明に関わる機会は少ない。その他、チャイルドスペシャリストといった保育の専門家が、子供に対する支援の一環として親の病気についての説明などの活動を広げている。学校の場合、在籍児童の親ががんを発症した子供が家族からどのように説明を受けたかではなく、精神的に負担の大きい子供に対する配慮は実施されている。親・医療者・学校関係者の3側面からの、がんを発症した親をもつ子供に対する支援の現状を明らかにしたが、親が自身の病気について子供に説明することへの支援策を検討するほどの情報を明らかにすることはできなかった。これは研究者の異動や研究協力者の中途での不在などの要因が考えられる。今後、研究環境を整えながら、継続する必要性を示した。親ががんを発症した場合に子供にどのように説明するのかについては、緩和医療などと共に問題にされるようになっている。そのため日本のおいても、がん専門医や緩和医療専門医がこの問題に取り組んだ先行研究が発表されている。その多くが、闘病生活を子供も一緒に体験することの必要性を示唆している。ただし、先行研究の多くは、研究者が専門医を中心としたチャイルドライフスペシャリストなどであり、看護師が参加している研究は極めて少ない。本研究において、研究協力者やがんの経験者で構成される団体等に研究協力を依頼しているが、小児看護学を専門とする研究においては、対象者は研究協力の意義に懐疑的であり、研究協力を得ることは困難を極めている。本研究テーマは、親ががんを発症した場合の子供に対する支援の必要性を検討するものである。親ががんを発症した場合の親を支援する一環としての“子供への告知"であることから、子供を支援するための“子供への情報提供と協力依頼"となるための支援の検討は、これからであると考える。現状においては、看護学生を対象とした「がんを発症した場合の子供への説明」について質問紙調査を実施したが、子供への説明を必要としながらも時期や説明内容についてはばらつきが生じるなど、事前に検討することも難しいテーマであることを示した。米国においても、親ががんを発症した場合の“子供への告知"は、チャイルドライフスペシャリストがその役割を担っている。日本においては、がん専門看護師や小児看護専門看護師等の看護職が、その役割を担うための条件や役割分担についても検討する必要があると考える。当初計画では、初年度より対象者に対する調査を実施することとしてた。しかし、計画段階で了解を得ていた研究協力が得られない等、調査の実施が難しい状況になっている。そのため、先行研究として対象者を変更した研究を実施した。今後も継続して研究協力が得られるように依頼を継続していく親ががんを発症した場合、子どもに親の病気を伝えるかについては、テレビ番組や新聞などでも取り上げられ、体験談が示されてきているなど、世間の関心が高まってきている。ただし、この取り組みは、医師やチャイルドライフスペシャリストが中心であり、厚生労働省がHope treeプロジェクトとして指針を示している。看護では、成人看護を専門とする看護師が中心となって子どもに対する支援が検討されている。今回、自身の病気を我が子達に伝えた一事例について明らかにした。子どもにがん発症を伝えるかは、“協力してもらわないともたない"ため“言わないという選択肢自体がない"であった。実際の伝え方は、初発の時点では、小学生には検診の結果が出た時点で自身のみで“がんかもしれない"、高校生には診断が確定し入院する時点で両親そろって“がんだったよ。協力してね"であり、大学生には父親から伝えていた。子ども達の反応は、“何か実感がない"であった。再発の時点では、3人ともに“あんまり無理させないでね"と伝えるのみで、“転移は伝えても、詳しくは言っていない"であった。現在の子ども達の反応は、母親が元気で見えることから、特に親子関係に変化をきたしている様子はなかった。がんの発症に対する家族の反応については“当事者は最初がショックで徐々に平穏になるが、家族はステージが上がっていく毎にショック度が高くなっていく"と捉えていた。このことから、子どもの年齢によって伝え方や内容に違いがあることが示されたが、病状の変化に対する子どもへの支援も重要であるといえる。

この事例に基づくと、子どもへの伝え方は、小児がんの場合とあまり違いは認められなかったが、小児がんの場合の目的は「積極的治療参加」であり、親ががんの場合の目的は「入院への協力」と、親の身体状態と共に目的が違うことから、今後は親に対する支援について検討していくこととする。申請当初は、研究協力者が対象者を募る予定であったが、承認後、施設との関連で困難となった。そのため、第1段階である、親のがん発症についての親の子どもへの働き掛けの実際を明らかにするとの目的について、新たな研究協力者と検討している。現在1例についてデータ収集が可能となっているため、年度前半で親を対象としたデータ収集を行い、後半で学校を対象としたデータ収集を行う予定である。未成年の子どもを抱える親でがんを発症した親1名に対して、自身のがんについて、子どもにどのように話したのかについて面接調査を行った。その結果、小児がんの子どもの治療受け入れに向けた親のかかわりと同様に、子どもの発達段階に応じて、その目的や対応が違っていることが明らかとなった。年齢が小さい子どものほうが身近な話として、検査結果などを気軽に話す傾向が示された。しかし、親ががんを発症した場合には、様々な研究機関より調査依頼があり、さらなる調査協力を得ることが難しい状況にある。訪問看護師は、未成年の子どもを抱える親に対しても多くかかわっている。そこで訪問看護師を通じて親ががんを発症した場合の子どもへのかかわりについて明らかにすることとした。現在2名について、調査している段階であり、がんを発症した本人もその配偶者も、子どもにどのように説明するのかについて、苦悩しているが、深刻にならないように話をしていることが明らかとなっている。親ががんを発症した場合には、様々な研究機関より調査依頼があり、さらなる調査協力は難しい状況にある。訪問看護師は、未成年の子どもを抱える親に対しても多くかかわっていることから、訪問看護師を対象とすることとした。訪問看護を通じてがんを発症した親とのかかわりの中で、子どもへのかかわりについて、明らかにすることとした。本研究では親ががんを発症した子供への支援として、親、医療者・学校関係者の3側面からの支援の現状を明らかにすることで支援策を検討することを目的にしていた。がんを発症した親が、自身の病気について子供にどのように説明するかについては、母親と父親で違いがみられた。母親は、がんを発症した当事者の場合も、配偶者である場合も、子供の理解に合わせて説明しようとしていた。一方父親は、子供に対して説明すること自体躊躇する現状が明らかとなった。また、小児がんの病名告知と同様に、子供への説明方法は子どもの発達段階に応じて違いがみられていた。医療者によるがんを発症した親に対する支援は、主に緩和ケア病棟でその支援方法を検討されている。支援方法は、子供への対応や、子供への説明に対する親の不安の相談などを、当事者やその家族に対するケアの一つとして実施している。その支援方法は、現在も模索しながら実施している現状がある。緩和ケア病棟に在籍する成人看護を専門とする看護師が主として担っている。小児専門看護師が協働する動きもみられているが、小児の発達段階に応じた関わりの支援が中心であり、子供への説明に関わる機会は少ない。
Caチャネル、細胞内Ca濃度、NaーCa交換、NaーKポンプの相互関係の量的解明

周知のように、多くの神経細胞や筋の興奮また神経伝達物質の放出は膜の脱分極に伴うCaイオンの細胞内流入で起動される。このようにCa^<2+>は細胞内信号であり、その濃度は普段は極めて低い値に保たれる。この細胞内ホメオスタシスを維持するための重要な機構のひとつがNa/Ca交換であり、これによりCa^<2+>は細胞外へくみ出され、そのエネルギーはNa^+の受動的な細胞内流入で供給される。したがってNa^+も結局は排出される運命にあり、ここにNaーKポンプとの連係が生じる。また、Caイオンの制御系に関してはミトコンドリアやendoplasmic reticulumが細胞内貯蔵庫としてコンデンサ的役割を果たす。本研究では、このように関連しあった異種イオンの出入りの動態を主としてホメオスタシスの観点から視覚二次ニューロンである金魚網膜水平細胞を例に究明した。単離培養した水平細胞とパッチ電極使用の膜電位固定法を用いた。これまですでに、電位依存性のCa、Na、K電流、およびグルタミン酸などの薬物で惹起される陽イオン電流が同定され詳しく性質が調べられている(後者は視細胞から受ける興奮性シナプスを反映)。われわれは、これらの受動型電流系とは別のもの、つまり細胞内イオン調節に深く関係するが未開拓に近かった膜機構について調べた。すなわち、一連のイオン操作実験からNa/Ca交換機構が、ウワバイン実験からNaーKポンプが、そしてカフェイン実験から大容量のCa貯蔵庫が水平細胞に存在することを証明した。さらに、これらの新しい知見も考慮した上で水平細胞の視覚生理機能を総合的に解析し、光応答の機序や膜システムの安定について理解を深めることが出来た。なお、ザリガニ視細胞の明順応に関して行った別の一連の実験においてもCaチャンネル、Na/Ca交換、NaーKポンプの関与が主題となり様々なテストを行った。本初年度は先ず電気生理実験用の装置を製作完成させた.これを用いて金魚網膜から単離培養した水平細胞を対象に行った類種類の実験の内容,主成果意義は概略以下の通りである.1.電位依存性Ca透過性は完全には予活性化せず,最大20pA程度の定常Ca電流(Ica)が残る.これをグルタミン酸前処理による1時間以下の脱分極を含む特別に工夫した実験で確認した.これによると最大毎秒20μMの〔Ca〕〓上昇となってしまい,なんらかのCa^<2+>排出機構の存在が必要となる.2.Na→Li置換外液をベースで上記実験を行うとIcaは消出する.低Na高K液で脱分極前処理してもIcaは残らない. Na^+が重要であり,NaーCa交換によるCa排出が示唆される.低Naで交換は止まり〔Ca〕iが上昇して,Ca流入が阻害されると解釈出来る.3.上記見解を次の実験で強化した. Naーfrolにすると膜電流は徐々に外向きに動き,最終到着レベルはCo^<2+>でIcaを阻害した場合と一致した.4.ウワバインは膜電流に内向き変化を起こした. NaーKATPase存在の証拠であり,3種のNa流入(TTX感受性成分,視細胞からの興奮性伝達物質によるシナプス電流,NaーCa交換で生じる成分)を打ち消すと考えられる.以上,NaーCa交換とNaーKポナプの存在を立証したことにより,水平細胞内イオンホメオスタシスの基礎固めをした.さらに,上記実験から大容量の細胞内Ca貯蔵庫の存在を示唆するデータも得,目下カフェイン等を使ってこれを究明中である.

これは予期しなかった展開であり,その重要性を考慮して当初計画にあった発光プローブによる〔Ca〕i測定より優先させて成果をあげることを急いでいる.本研究の主目的は神経細胞におけるイオン・ホメオスタシスの理解であり、鯉網膜二次ニューロンである水平細胞とザリガニの視細胞の場合を例にCa、NaおよびKイオンについてこれまで調べてきた。即ち、ホメオスタシス系に含まれる要素として本研究で重点的に考慮したのは、膜電位依存性のCa、NaおよびKチャンネル、伝達物質の働きでシナプス電流を惹起するイオンゲート(水平細胞)およびcGMPの作用で光受容電流を発生させるチャンネル(ザリガニ視細胞)、そしてこれらを補償してイオン量調節の主役を演じるNa/Ca交換、Na-Kポンプさらに細胞内Ca貯蔵庫などである。Na/Ca交換、Na-KポンプならびにCa貯蔵庫の存在を単離水平細胞標本を使って前年度までにすでに立証したが、本年度は主に定量的側面からこれらを膜電位固定下で掘り下げ、以下の主要結果を得た。(ザリガニ視細胞についての成果報告は省略)。1.Na/Ca交換比は、Na:Ca=3:1である公算が大である。陰圧を利用した高速外液置換法を用いてCo^<2+>投与とLi置換による迅速なNa-free化を実現し、電流応答の初期振幅比を測って求めた。ジャンクション電流に悩まされて例数はまだ少ない。2.Co^<2+>はCaチャンネルだけでなく、恐らくNa/Ca交換をもブロックする。前出の実験におけるデータの時間依存性を調べて推察された。3.Ca貯蔵庫の容量は数mMと実に高いことが分かった。Na-freeでNa/Ca交換を止めた後、Caチャンネル不活性化が起こるまでに流入したCa電流の総積算量を求めることによって推算した。4.前年度に報告したカフェインで誘起される一過性の三角波状膜電流は、細胞内Ca^<2+>放出によるCaゲート不活性化とそれに続くNa/Ca交換の増強を反映している可能性が膜抵抗の測定から示唆された。
渦のつなぎかえとヘリシティ

我々が崎に「三葉型渦輪」の数値シミュレーションによって発見した渦の「橋渡し」減少は、渦のつなぎかえの機構が従来考えられていた渦の対消減のような単純なものではなく、渦線の三次元的ねじれ運動を伴う極めて複雑な過程であることを示唆している。この「三葉型渦輪」はヘリシティを持つ最も簡単な例であり、またその形の対称性から計算時間及び計算機容量の節約にもなるので採用されたものである。しかしそこで発見された「橋渡し」減少は複雑な三次元構造を持つので、その解析はひとまず置き、より簡単な形でつなぎかえの起こる並進二個円形渦輪の運動を主として調べることにした。ナビエ・ストークス方程式をモード数64^3のスペクトル法で解き、実験的に知られている二回のつなぎかえを数値計算で実現し、渦度線・速度線の数値データを3Dグラフィックスを用いて立体的に解析することによってつなぎかえの機構を明らかにすることを目標として計算を始めほぼ予定通りの結果を得た。実験と同じく2回のつなぎかえが観測され、とちらのつなぎかえも同じ「橋渡し」現象として理解されることが分かった。「橋渡し」現象は、渦線の対消減・渦拡散・渦伸張の組合わせとして起こり、相互作用している反平行渦営の進行方向前方にそれと垂直方向に「橋」がかかる。対消減は常に不完全に終わり、非消滅部分である「足」を残す。「橋渡し」現象のこれらの特徴は、三葉型渦輪のbridgesやねじれ直線渦営のfingersにも見られ、広く一般に起こる現象のように思われる。今後は、1.三輪型渦輪の「橋渡し」現象の解析、ヘリシティ変化の粘性依存性、ナビエ・ストークス(オイラー)方程式の解の特異性との関係、2.乱れた二円形渦輪の正面衝突の数値シミュレーションによる三次元安定性、乱流化、音源特性の研究(予備計算は既に完了)を中心に渦運動の研究を行う予定である。
SNPs探索分子素子(ミスマッチ結合分子リガンド)の開発

我々は従来のSNPs探索手法とは根本的に異なる、全く新しいSNPs検出コンセプトを創案し、G-Gミスマッチに結合するナフチリジン二量体を分子設計し、これを表面プラズモン共鳴センサーに固定した、「SNPs探索分子素子」を提案しこれを実証した。このナフチリジンダイマーの分子設計指針を拡張し、他のミスマッチ認識を高精度で認識する分子の創製を目指す。一方、ナフチリジン二量体が極めて強くG-Gミスマッチに結合することを利用して、全てのミスマッチをナフチリジンダイマーを用いて検出する手法を検討した。1)成果の内容(1)G-Gミスマッチ-ナフチリジンダイマー複合体の構造を明らかにした。GSC菊地博士との共同研究により、複合体の構造を我々が提案しているジグザグインターカレーションであることを明らかにした。これにより、次の分子設計指針を明確に出来た。アデニンを認識するナフチリドンとグアニンを認識するナフチリジンのハイブリッド分子を用いて、G-AミスマッチDNAを強く安定化することに成功した。A-Aミスマッチを極めて強く安定化することに成功した。複合体構造をNMRにより解析中である。全ての研究内容に関して、国内外を問わず我々が最先端の研究成果を挙げている。自前のコンセプトに基づく研究であり、他の追随を許していない。現時点では、T-Tミスマッチは、水素結合パターンがマッチする分子を用いているにもかかわらず、安定化出来ない。G-G、G-A、A-Aミスマッチは全てプリン塩基だけが関わるミスマッチであったので、ピリミジン塩基であるTの認識には根本的に何か考えが足りない可能性がある。
変異m-RNAの選択能破壊による水泡型先天性魚鱗癬様紅皮症の新しい治療法の開発

1)in vitroの系でリボザイムによるm-RNAの切断の検討ケラチンK1のmRNAにおけるリボザイムの最適切断部位を二次構造予測プログラムを用いて予想した。そこを切断するリボザイム発現ベクターを作成し、そのリボザイム発現ベクターを正常培養表皮細胞に導入し、m-RNAや蛋白レベルでのケラチン1の発現量の抑制を確認した。次に、患者m-RNAの変異部位のみ認識するようリボザイムを設計し、リボザイム発現ベクターを作成した。患者由来の表皮細胞にリボザイム発現ベクターを導入した後、m-RNAレベルでmutant alleleとwild type allele由来のm-RNA量を測定し、mutant alleleと由来のもののみ抑制されるのを確認した。2)in vivoの系でリボザイムによるm-RNAの切断作用の検討in vivoでのリボザイムによるK1 wild type mRNA切断効果を検討する目的で、ラットのK1mRNAを切断するようなリボザイム発現ベクターを同様の方法で設計した。リボザイム発現ベクターを、マーダージェットを用いたnaked DNA法でラットの皮膚に遺伝子導入した。導入部位の皮膚を生検し、K1のm-RNA及び蛋白の発現量の低下を確認した。3)ヒト皮膚におけるリボザイムの効果の検討ヌードラットにBCIE患者の皮膚を移植した。患者の変異をターゲットとしたリボザイムを発現するベクターをマーダージェットを用いたnaked DNA法にて遺伝子導入した。次に、mutant all eleとwild type allele由来のm-RNA量を測定し、また、移植皮膚の表現型の変化を観察した。
超対称標準模型及びその拡張における現象論的研究

ボゾンとフェルミオンを入れ替える超対称性を導入した模型が素粒子標準模型を超えた物理として大きく期待されている。しかし、現在のところ超対称性粒子は未発見であり超対称性は破れている必要がある。従ってその破れのスケールや、その破れによって生じた超対称性粒子の質量構造を明らかにする事が大きな問題となっている。今年度の研究においては、電気双極子能率(EDM)の測定実験からスクォークのフレーバー構造を探る研究を進め、また宇宙論的に望ましい模型の解析を進めた。超対称性模型ではフレーバーを保存する項とフレーバーを破る項の両方において、CP対称性を破る位相が存在しうる。しかしEDMの測定実験は前者の位相を厳しく制限し、また後者についてもフレーバーを破る過程の探索実験と伴って強い制限を与える。今年度の研究で我々は、フレーバーの破れから生じるEDMについてCPを破る位相ごとに系統的な解析を進め、高次のダイアグラムから来る輻射補正の寄与が重要となることを初めて指摘した。これらの寄与は従来考えられていた寄与より容易に大きくなりえるため、フレーバーの破れを起源とするEDMを議論する際にはこれら寄与を含める事が必須であることがわかった。これによりEDMの実験から超対称性粒子のフレーバー構造を議論する基礎ができたといえる。宇宙論的な考察を進めると、グラビティーノの質量に対して示唆を与える事ができる。特に非常に軽い質量を持つグラビティーノを与える模型は、宇宙論的な問題を引き起こさないため、現象論的に魅力的な模型の一つとなっている。一方で、超対称性理論の真空構造の理解の進展により、準安定真空で超対称性を破る模型が盛んに議論されるようになった。こうした模型で非常に軽いグラビティーノを実現しようとすると、超対称性不変な真空が準安定真空の近くに現れるためにその真空間の相転移が問題となる。そこで我々は、現在の宇宙年齢まで量子的な遷移をせずに準安定真空が存在できるパラメータを求め、こうした準安定真空を用いた模型で軽いグラビティーノが実現できる可能性がある事を示した。もう一つ宇宙論的に望ましい模型として、数百TeV程度の重いグラビティーノを持つ模型が挙げられる。そうした模型の一つとして近年、超弦理論に動機付けられた軽いモジュライ場のある模型が活発に議論されている。こうした模型においてはモジュライ場の存在により、標準的な宇宙の熱史に変更が加えられ、特に暗黒物質の残存量を説明できるかが問題となる。そこで我々は、モジュライ場の崩壊によって暗黒物質が非熱的に作られ、観測にあう残存量を予言できる事を示した。素粒子標準模型を超えた物理としてボゾンとフェルミオンを入れ替える超対称性を導入した超対称標準模型が期待されている。加速器実験による超対称性粒子の直接的な発見がなされていない現状では、この模型探索には標準模型で禁止されている稀事象探索や天文学的観測が重要となる。今年度の研究においては、電気双極子能率(Eum)の測定実験及び宇宙に存在する暗黒物質の残存量の観点から超対称標準模型を調べた。超対称性模型では様々なCP対称性を破る位相が存在しうるが、EDMの測定実験によりこれらは厳しく制限されている。今年度の研究において我々はゲージ粒子の超対称性粒子であるゲージーノ粒子がディラック型の質量項を持つ模型においてEDMを抑制できることを示した。また超対称性粒子によるEDMへの寄与は輻射補正を通じて生じるが、超対称性粒子のフレーバー混合を通じても大きなEDMが生じる。今回我々は電荷をもったヒッグス粒子による2ループの輻射補正の寄与が非常に重要となることを初めて指摘した。この寄与は従来考えられていた寄与より大きくなりえて、将来実験において超対称性模型によるEDMへの寄与が発見された際にはこの寄与を考慮する事が必須となる。近年のWMAP等の天文学的観測により冷たい暗黒物質の存在が確立されたが、超対称性模型はその有力な候補を与える。従って標準的な宇宙論を想定した時にその残存最が、現在観測されている残存量と一致するかを調べる事が重要となる。我々は超対称性模型が予言する暗黒物質候補の1つであるウィーノの残存量が非摂動論的な効果により大きく減少する事を指摘した。この発見により標準的なシナリオで作られたウィーノの残存量がWMAPの観測と一致するには、従来のおよそ1.5倍の質量が必要な事が明らかになった。

これによりEDMの実験から超対称性粒子のフレーバー構造を議論する基礎ができたといえる。宇宙論的な考察を進めると、グラビティーノの質量に対して示唆を与える事ができる。特に非常に軽い質量を持つグラビティーノを与える模型は、宇宙論的な問題を引き起こさないため、現象論的に魅力的な模型の一つとなっている。一方で、超対称性理論の真空構造の理解の進展により、準安定真空で超対称性を破る模型が盛んに議論されるようになった。こうした模型で非常に軽いグラビティーノを実現しようとすると、超対称性不変な真空が準安定真空の近くに現れるためにその真空間の相転移が問題となる。そこで我々は、現在の宇宙年齢まで量子的な遷移をせずに準安定真空が存在できるパラメータを求め、こうした準安定真空を用いた模型で軽いグラビティーノが実現できる可能性がある事を示した。もう一つ宇宙論的に望ましい模型として、数百TeV程度の重いグラビティーノを持つ模型が挙げられる。そうした模型の一つとして近年、超弦理論に動機付けられた軽いモジュライ場のある模型が活発に議論されている。こうした模型においてはモジュライ場の存在により、標準的な宇宙の熱史に変更が加えられ、特に暗黒物質の残存量を説明できるかが問題となる。そこで我々は、モジュライ場の崩壊によって暗黒物質が非熱的に作られ、観測にあう残存量を予言できる事を示した。
抗悪性腫瘍薬散剤の安全な調剤方法確立に向けたモデル散剤を用いた検討

本研究では、様々な粒度分布を有するモデル散剤を調製し、各々調剤時の飛散状況を比較することで、抗悪性腫瘍薬散剤調製時における適切な被曝防止対策と安全な調剤方法を確立することを目的として検討を行った。まず、メチレンブルーを乳糖に練り込んで作成した着色乳糖を850、500、150および75μmの篩を通してそれぞれの粒度を有する散剤に分球し、ロイケリン散の粒度分布に合わせたモデル散剤Aおよびマブリン散の粒度分布に合わせたモデル散剤Bを調製した。モデル散剤Aの安息角は45.0±0.9度、逃避率は16.3±1.0%であり、モデル散剤Bの安息角は40.8±0.4度、逃避率は36.1±3.7%であった。これらの値はロイケリン散およびマブリン散とほぼ同様であり、〓れらの薬剤のモデル散剤として利用可能であることが示唆された。これらのモデル散剤を用いて、実際の散剤と同様に計量調剤を行ったときの飛散状況について検討を行った。その結果、秤量に使用する天秤の周辺や分割・包装に使用するパイルパッカー付近と調剤者の指付近にメチレンブルーの発色が認められた。また、乳鉢・乳棒による混合操作を行った場合には、周辺の調剤環境に加え、調剤者の胸付近にもメチレンブルーによる強い発色が認められた。この混合操作による調剤者への散剤の飛散は、注射薬混合調製時に使用する安全キャビネットと同様の機能を有する抗悪性腫瘍剤調剤ユニットを利用することにより最小限にすることが可能であった。以上のことから、市販されている抗悪性腫瘍薬の散剤と同じ粒度分布を有するモデル散剤を用いた計量調剤により、散剤調剤時に調剤者が曝露する可能性があることから、抗悪性腫瘍薬の注射剤を混合調製する時と同様の被曝防止対策が必要であると考えられた。
凝固中の電流印加による合金組織の不安定性とその制御

材料電磁プロセシングの分野では、電流や磁場の印加された状態での凝固現象の解明が急務となっている。また、従来の凝固工学の分野においても、共晶組織や初晶形態に及ぼす電流と磁場の効果については、非常に興味のある研究対象となっている。本研究は、厚さ1mm程度の非常に薄いPb-Sn合金試料を一方向凝固させ、対流の存在しない条件下で電流印加および磁場印加の効果を確認した。電流印加による効果についてはジュール発熱により共晶、初晶とも粗大化し、それは試料内の温度分布が変化し、凝固全面における温度勾配の低下という観点で従来の凝固理論により定性的説明できる。また、固相内の電気伝導度の分布あるいは固相と液層の電気伝導度の相異により凝固全面のミクロ的な温度分布が変化し、凝固組織を変化させることが判明した。特に、共晶組織では、Pb層とSn層の厚さの比が電流印加により変化し、より電気伝導度の高いSn層が肥大化する傾向にある。電流と磁場を同時に印加し、電磁気力を作用させると初晶が傾斜して配向することがわかった。これは対流によるものではなく、電磁気力そのものあるいは電気伝導度の差異によって生じた電磁浮力によるものである。全く同等の電磁気力であっても、電流が大きく磁場が小さい(電磁浮力が大きい)場合にはPb初晶は浮力の方向に傾斜し、電流が小さく磁場が大きい(電磁浮力が小さい)場合には電磁気力の方向に傾斜する。さらに、電磁気力を増加させることにより、初晶の分断が観察された。本研究により、対流を介さない電流および磁場印加の凝固組織に及ぼす効果が明らかになったと同時に、凝固組織制御や傾斜機能材料創製の可能性が示された。
骨補填材用キトサンフィルムへの^<60>Coγ線照射による材質変化及び生体反応に

実験に用いた脱アセチル化度70%(D70)、85%(D85)と99%(D99)のキトサンの分子量は照射前がD70は2.4×10^6、D85は1.9×10^6、そしてD99の分子量は1.1×10^6であった。^<60>Coγ線を照射した分子量は、D70が3.4×10^5、D85は3.0×10^5、そしてD99は2.5×10^5であった。γ線を照射することによって、キトサンの分子量は減少する傾向であった。色彩変化においては、すべてのキトサンが黄色味を呈する傾向を示すものであった。引張強さについては、D70の照射前では126gf/mm^2であり、照射後は28gf/mm^2であった。D85の照射前の引張強さは83gf/mm^2であり、照射後は102gf/mm^2であった。ついで、D99の照射前の引張強さは、67gf/mm^2であり、照射後は68gf/mm^2と照射前後の引張強さは差が認められなかった。しかし、D70は大きく引張強さは減少する傾向を示した。D85とD99はD70とは逆に、照射後の引張強さは大きくなる傾向を示した。伸びは、D70は大きく減少し、D85とD99は、わずかに減少する傾向であった。フイルムに^<60>Coγ線を照射することによって、引張強さは、脱アセチル化度が低いと、大きく減少する傾向を示し、脱アセチル化度が高いと、引張強さは大きくなる傾向を示した。しかし、伸びはすべて減少し、もろくなる傾向であった。それぞれのキトサンを用いてラット頭蓋骨に骨膜を剥離し押入した。その結果、γ線照射前のキトサンではD99が最も分解が遅く、骨との反応が認められなかった。一方、D75とD85は分解が早く、骨との反応が認められ、骨吸収が著しく認められた。一方、γ線を照射した後の反応はD99、D85、D75ともに著しく骨吸収が確認された。したがって、本処理によって得たキトサンは他の骨伝導物質と併用することによって骨形成が効果的に行えると考えられた。したがって、今後、本研究を継続したいと考えています。実験に用いた脱アセチル化度70%(D70)、85%(D85)と99%(D99)のキトサンの分子量は、照射前がD70は2.4×10^6、D85は1.9×10^6、そしてD99の分子量は1.1×10^6であった。

Co^<60>γ線を照射した分子量は、D70が3.4×10^5、D85は、3.0×10^5、そしてD99は2.5×10^5であった。γ線を照射することによって、キトサンの分子量は減少する傾向であった。色彩変化においては、L^*はγ線を照射すると、D70、D85とD99はすべて大きくなる傾向であり、これは明るくなることを示していた。a^*については、D99の照射前後の差が大きく、緑色を帯びる傾向を示していた。一方、照射前のD70のb^*は5.8であり、D85は4.6、そしてD99のb^*は6.1であった。照射後のD70のb^*は25.3、D85は18.8、そしてD99のb^*は12.6であった。これの結果は、すべてのキトサンが黄色味を呈する傾向を示すものであった。引張強さについては、D70の照射前では126gf/mm^2であり、照射後は28gf/mm^2であった。D85の照射前の引張強さは83gf/mm^2であり、照射後は102gf/mm^2であった。ついで、D99の照射前の引張強さは、67gf/mm^2であり、照射後は68gf/mm^2と照射前後の引張強さは差が認められなかった。しかし、D70は大きく引張強さは減少する傾向を示した。D85とD99はD70とは逆に、照射後の引張強さは大きくなる傾向を示した。伸びは、D70は大きく減少し、D85とD99は、わずかに減少する傾向であった。フィルムにCo^<60>γ線を照射することによって、引張強さは、脱アセチル化度が低いと、大きく減少する傾向を示し脱アセチル化度が高いと、引張強さは大きくなる傾向を示した。しかし、伸びはすべて減少し、もろくなる傾向であった。今後、動物実験をする予定である。脱アセチル化度70%、分子量2.4×10^6(D70)、脱アセチル化度85%、分子量1.9×10^6(D85)、と脱アセチル化度99%分子量、1.1×10^6(D99)を用い、^<60>Coγ線を照射した。γ線を照射することによって、キトサンの色彩の変化と分子量の減少が認められた。分子量はD70、D85、D99ともにすべて10^6から10^5に減少した。また、脱アセチル化度が低いキトサンの引張強さは減少する傾向が得られた。伸びについてはすべてのキトサンで減少した。その減少が著しかったのはD70であった。フィルムの硬さが大きくなることは、軟組織に対して機械的刺激をあたえ、炎症等の原因となることは重要な問題であると考えられた。D70、D85とD99の処理前と処理後のキトサンをそれぞれに用いてフィルムを作製し、pH7.2に中和滴を行った。その後、ラット頭蓋骨に骨膜を剥離後押入した。その結果、γ線照射前のD99は分解が遅く骨との顕著な反応は認められなかった。しかし、D70とD85に関しては分解が早く、骨吸収が著しく認められた。一方、γ線照射した後の反応は、D99においてもD70とD85と同様に著しく骨吸収が確認された。D99を用いて、骨吸収が生じた1週間後には骨形成が確認された。分子量が低くなり、脱アセチル化度が低いキトサンほど骨吸収が著しく、骨吸収後の骨形成は遅くなる傾向が確認された。したがって、分子量が低く、脱アセチル化度の低いキトサンは他の骨伝導物質と併用することが必要であることが本研究で示唆された。
食品成分による膜マイクロドメインの構成・構造変化と脂肪蓄積コントロール

膜マイクロドメインを構成する要素の組成変化やインスリンシグナル伝達の修飾を誘導する食品成分を同定し、その機能を明らかにした。具体的には、インスリンシグナル伝達を修飾する食品成分として、benzyl isothiocyanate(BITC)を同定した。BITCはインスリン非依存的にphosphatidylinositol 3-kinase及びAktのリン酸化を誘導し、大腸がん細胞の生存経路、オートファジー、脂肪細胞のグルコース取込みを活性化することを見出した。また、膜マイクロドメイン修飾成分やPI3K阻害剤はBITCの抗がん作用を増強することを見出した。本研究は「難吸収性食品成分が有する機能性の統合的理解を目指した評価モデルシステム」を構築し、その有用性を確証すること目標として、膜マイクロドメインを構成する要素の組成変化を誘導する食品成分を探索し、同定膜マイクロドメインを修飾する食品成分がインスリンシグナル伝達に与える影響明らかにしようとした。本年度の成果を以下に示す。1)膜マイクロドメイン構成要素の組成変化を誘導するmethyl-β-cyclodextrin(MβCD)を処理した大腸がん細胞を用いて、密度勾配遠心分離法による膜マイクロドメインの分画、脂質画分のTLC分析により、膜マイクロドメインからのコレステロール低下作用を確認できたことから、膜マイクロドメイン脂質組成分析法を確立した。2)インスリンシグナル伝達を修飾する食品成分として、アブラナ科野菜に由来するbenzylisothiocyanate(BITC)を同定し、BITCがインスリン非依存的にphosphatidylinositol 3-kinase及びAktのリン酸化を誘導し、大腸がん細胞の生存経路を活性化することを見出した。3)膜マイクロドメイン修飾成分のインスリンシグナル伝達への影響を、MβCDを用いて評価した。その結果、MβCDは、BITCが誘導するAktのリン酸化を、膜マイクロドメインのコレステロール低下作用を介して抑制することを明らかにした。4)インスリンシグナル伝達を修飾する食品成分として、ケルセチン配糖体代謝物を同定し、それらの生体内抗酸化作用を評価した。平成28年度の交付申請書に記載した計画のうち、1)膜マイクロドメイン脂質組成分析法の確立、2)BITCが大腸がん細胞のインスリンシグナル伝達経路を活性化することを見出した、3)MβCDが膜マイクロドメインのコレステロール低下作用を介してインスリンシグナルを抑制することを見出した、などの成果を得ている。1)昨年度、インスリンシグナル伝達を修飾する食品成分として同定したbenzyl isothiocyanate(BITC)がインスリン誘導性のphosphatidylinositol 3-kinase(PI3K)及びAktのリン酸化を増強し、大腸がん細胞の生存経路を活性化するだけでなく、脂肪細胞のグルコース取込みを増加させることを見出した。2) PI3K阻害剤はBITCの細胞増殖抑制作用、アポトーシス誘導作用を増強するだけでなく、オートファジー関連分子の活性化やp62依存的なNrf2活性化を抑制した。PI3K阻害剤はBITCが誘導する薬剤耐性機構を阻害することで、BITCの抗がん作用を増強することが示唆された。4)膜マイクロドメイン構成要素の組成変化を誘導するmethyl-β-cyclodextrin(MβCD)は、BITCが誘導するAktのリン酸化を、膜マイクロドメインのコレステロール低下作用を介して抑制するが、Aktの膜移行には影響を与えないことを明らかにした。また、MβCDはBITCの細胞増殖抑制作用、アポトーシス誘導作用を増強することを見出した。平成29年度は次の二点を中心に進める。1)膜マイクロドメイン脂質組成及び構造修飾の分子機構:膜マイクロドメインの可視化をfilipinを用いて行い、食品成分単独による膜マイクロドメイン修飾、或いは薬剤誘導破綻に対する抑制効果について直接的な確証を得る。また、膜マイクロドメインと相互作用する食品成分は、HPLCまたはLC-MSを用いて検出・定量を試みる。本法で検出が困難な場合は、表面プラズモン共鳴または等温滴定型カロリメーターを用いて、食品成分と膜マイクロドメインとの相互作用を確認する。2)膜マイクロドメインタンパク質修飾機構:食品成分によるタンパク質修飾は、SDS-PAGEで分離したタンパク質を各種プロテアーゼ消化後、LC-TOF-MSに供し、得られた質量情報をMascot databaseなどを用いて同定する。機能性食品成分のケミカルバイオロジー(化学に基づいた生物学的研究)