hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ケミカルジェネティクスに基づく酸およびアルミニウムシグナル伝達の解明

リンゴ酸トランスポーター遺伝子AtALMT1は、酸(低pH)及びアルミニウム(Al)応答性遺伝子であり、根部リンゴ酸分泌を制御する。本研究では、創薬研究で使用される低分子化合物ライブラリーのスクリーニングから、リンゴ酸分泌とAtALMT1遺伝子発現を抑制する化合物を複数同定した。このうち、シグナル伝達脂質のリン酸化酵素阻害剤はSTOP1核局在及び、複数のAl応答性遺伝子発現も抑制した。また、in silicoドッキングによりシロイヌナズナ推定標的タンパク質と同阻害剤との結合が予測された。以上の結果から、Alシグナル伝達にはリン脂質によるシグナル伝達が重要な役割を果たすことが強く示唆された。植物の酸性土壌ストレス(アルミニウム,酸ストレス)耐性の主要な転写制御は,タンパク質リン酸化を介したシグナル伝達系が関与すること,また,動物の低酸素ストレス応答や自然免疫応答に一部共通することが示唆されている.そこで,本研究ではがん研究などで使用される低分子化合物のシロイヌナズナでの標的分子の同定を通じて,アルミニウム及び,酸ストレスのシグナル伝達に関わる遺伝子や機構を同定することを目的とした.本研究では,酸性土壌耐性機構であるリンゴ酸分泌量や,それを担うリンゴ酸トランスポーターALMT1の遺伝子発現に影響をおよぼす化合物のライブラリースクリーニングを実施した.具体的には,創薬研究に使用されるリン酸化酵素阻害剤,ヒートショックプロテイン阻害剤など約600種以上の化合物をそれぞれ添加した溶液でシロイヌナズナを短時間培養し,リンゴ酸分泌及び遺伝子発現量をALMT1プロモーターGFP蛍光観察または定量した.一次スクリーニングでリンゴ酸分泌を20%低下させた化合物について,二次スクリーニングを行い,リンゴ酸分泌及びALMT1遺伝子発現量を抑制する化合物を数種類同定した.その中には,ALMT1過剰発現組換え体のリンゴ酸分泌量を抑制する,すなわちALMT1活性化に影響を及ぼす化合物も含まれていた.ヒット化合物には,有機アニオントランスポーター活性を特異的に阻害する化合物やMAPキナーゼ,ユビキチン阻害剤などが含まれていた.ヒット化合物から,MAPKカスケード,タンパク翻訳,DNA損傷,細胞の分化などの機構がALMT1活性化機構に関与していることが推察された.それら化合物のヒトにおけるターゲット因子とシロイヌナズナで相同性が高い遺伝子について,遺伝子破壊株の耐性評価や化合物-タンパク質ドッキングモデル計算予測を試みている.化合物ライブラリーのスクリーニングはほぼ終了し,ヒット化合物を選抜することができた.また,それらから新しいAlストレス応答の機構が示唆された.ヒット化合物の影響については,再現性の確認も終えており,ターゲット因子の相同性遺伝子の評価に進んでいる.ただし,AtALMT1とは別のSTOP1遺伝子のストレス応答をモニターしたスクリーニングや,遺伝子破壊株評価ができない場合,化合物-タンパク質ドッキングモデルの計算予測には検討が必要であった.酸性土壌での主要なストレスであるアルミニウム(Al)のシグナル伝達はAl耐性遺伝子の発現に重要である。これまでに、Al耐性遺伝子の転写制御へのタンパク質リン酸化を介したシグナル伝達系の関与が示されていた。そこで本研究では、がん研究などで使用される低分子化合物のシロイヌナズナでの標的分子の特定によりAlシグナル伝達分子の同定を行った。本年度はkinase阻害化合物ライブラリーのスクリーニング、ヒット化合物と標的タンパク質の相互作用モデル予測を行った。その結果、Al応答遺伝子AtALMT1の発現やAtALMT1を介したAl応答性リンゴ酸分泌を阻害する主要なヒット化合物3つを特定した。またそのうち1つはAtALMT1転写因子STOP1の活性抑制にも働いた。さらに、それらの阻害剤はAtALMT1以外にもいくつかのAl応答遺伝子の発現に影響を及ぼした。次に、それら阻害剤のヒトでの既知標的タンパク質と相同性の高いナズナタンパク質をデータベース検索し、それらのシロイヌナズナ遺伝子破壊株における評価を行った。遺伝子破壊株ではWTに比べてわずかながらAtALMT1遺伝子発現の低下が確認された。一方、ホモロジーモデリングによるナズナタンパクのモデリングを行い、その結果、両者のKinaseドメインの立体構造は非常に似通っていることが分かった。次に、その候補タンパクのkinaseドメインと阻害剤のドッキング解析を試みたところ、実際に化合物がナズナタンパクのATP結合部位に結合することが強く示唆された。以上の結果から、Alシグナル伝達を阻害する化合物とナズナ標的タンパク質が同定されたと考えている。低酸素応答を担う重要分子であるHIF転写因子の阻害剤化合物ライブラリーについてもスクリーニングを試みる.今年度得た化合物も含め,Al応答に影響を与えた化合物の植物の標的分子の選抜には,遺伝子や作用機序について動植物間の相同性をインフォマティクスで考察し,化合物-タンパク質ドッキングモデルを計算予測する.また,これまでに行った酸及びAlストレスに関するゲノムワイド関連解析による関連遺伝子座情報,マイクロアレイ解析による網羅的遺伝子発現情報を利用し,シロイヌナズナにおけるターゲットを絞りこみたい.植物栄養学産前産後の休暇,育児休業を約半年間取得

その間研究を一時中断し,一部の化合物ライブラリースクリーニング,候補遺伝子が絞り込めなかった遺伝子破壊株の評価等は来年度に実施することになったため.研究後半においては,比較的高価な分子生物学実験(RNA実験,分子相互作用実験など)やマイクロアレイ解析に関わる消耗品,またスクリーニング時に必要なプラスチック消耗品などを購入する必要がある.また,未評価である遺伝子破壊株シロイヌナズナ種子をリソースセンターより購入し,栽培に必要な消耗品が必要である.その他には,研究成果を学会で発表するための出張旅費及び,国際科学誌に学術論文を投稿するための経費に充当する.
魚類アディポネクチンの性状および脂質・糖質代謝制御機構に関する研究

哺乳類では,血中アディポネクチンレベルの上昇によって脂肪,筋および肝細胞における脂質代謝が促進されることが明らかになってきた.また,哺乳類脂肪細胞の分化や代謝調節において核内受容体PPAR・が重要な働きを担う.一方,魚類におけるこれらの存在についてはゼブラフィッシュなどのcDNAおよびESTデータベースによって確認しうるが,現時点では機能性を有した脂質代謝関連タンパク質が存在するかどうかについては全く情報が得られていない.そこで本研究では,魚類においても脂質代謝に関与すると考えられるアディポネクチンなどの発現頻度を明らかにし,脂質代謝調節経路を推定することを目的とした.ニジマスEST配列より,ニジマスアディポネクチンおよび受容体の全配列をin silicoクローニングし,その演繹アミノ酸配列に従って,ニジマスアディポネクチンペプチドを固相合成した.本ペプチドを用いてウサギ抗血清を作製し,ニジマス肝臓,血漿等を採取してSDS-PAGEに付し,ウェスタンブロッティングを行った.ウエスタンブロッティングの結果,認識エピトープの異なる数種類の抗体で交差性が認められるアディポネクチン様成分がニジマス脂肪組織, RTG-2細胞,血漿に認められることが明らかとなった.抗ニジマスアディポネクチン抗体が認識するタンパク質は,哺乳類アディポネクチンに相当する約30k成分以外に高分子成分が認められた.還元条件下でも同様な傾向を示すことから,ニジマスアディポネクチンはジスルフィド結合以外の相互作用力によって多量体化するものと考えられた.これは,哺乳類アディポネクチン多量体が還元条件下によって容易に単量体化することと大きく異なった.これらのことから,ニジマスにおけるアディポネクチンの作用メカニズムは哺乳類の多量体アディポネクチンシステムと類似しているものと推定された.ニジマスアディポネクチン受容体には1a, 1bおよび2の3種のアイソフォームが存在するものと推定されたが, 1aは膜貫通回数が少なく,生理的に機能しないものと推定された.哺乳類では,血中アディポネクチンレベルの上昇によって脂肪,筋および肝細胞における脂質代謝が促進されることが明らかになってきた.また,哺乳類脂肪細胞の分化や代謝調節において核内受容体PPAR・が重要な働きを担う.一方,魚類におけるこれらの存在についてはゼブラフィッシュなどのcDNAおよびESTデータベースによって確認しうるが,現時点では機能性を有した脂質代謝関連タンパク質が存在するかどうかについては全く情報が得られていない.そこで本研究では,魚類においても脂質代謝に関与すると考えられるアディポネクチンなどの発現頻度を明らかにし,脂質代謝調節経路を推定することを目的とした.ニジマスEST配列より,ニジマスアディポネクチンおよび受容体の全配列をin silicoクローニングし,その演繹アミノ酸配列に従って,ニジマスアディポネクチンペプチドを固相合成した.本ペプチドを用いてウサギ抗血清を作製し,ニジマス肝臓,血漿等を採取してSDS-PAGEに付し,ウェスタンブロッティングを行った.ウエスタンブロッティングの結果,認識エピトープの異なる数種類の抗体で交差性が認められるアディポネクチン様成分がニジマス脂肪組織, RTG-2細胞,血漿に認められることが明らかとなった.抗ニジマスアディポネクチン抗体が認識するタンパク質は,哺乳類アディポネクチンに相当する約30k成分以外に高分子成分が認められた.還元条件下でも同様な傾向を示すことから,ニジマスアディポネクチンはジスルフィド結合以外の相互作用力によって多量体化するものと考えられた.これは,哺乳類アディポネクチン多量体が還元条件下によって容易に単量体化することと大きく異なった.これらのことから,ニジマスにおけるアディポネクチンの作用メカニズムは哺乳類の多量体アディポネクチンシステムと類似しているものと推定された.ニジマスアディポネクチン受容体には1a, 1bおよび2の3種のアイソフォームが存在するものと推定されたが, 1aは膜貫通回数が少なく,生理的に機能しないものと推定された.哺乳類では,血中アディポネクチンレベルの上昇によって脂肪,筋および肝細胞における脂質代謝が促進されることが明らかになってきた.また,哺乳類脂肪細胞の分化や代謝調節において核内受容体PPARγが重要な働きを担う.一方,魚類におけるこれらの存在についてはゼブラフィッシュなどのcDNAおよびESTデータベースによって確認しうるが,現時点では機能性を有した脂質代謝関連タンパク質が存在するかどうかについては全く情報が得られていない.そこで本研究では,魚類においても脂質代謝に関与すると考えられるアディポネクチンなどの発現頻度を明らかにし,脂質代謝調節経路を推定することを目的とした.タンパク質レベルでの脂質代謝関連タンパク質の発現頻度を明らかにするために,ニジマス脂肪組織,血漿等を採取してSDS-PAGEに付し,ウェスタンブロッティングを行った.アディボネクチンについては,アトランティックサーモンからヒトまで保存性の非常に高いC末端配列に対する市販抗体などを用い,その他の脂質代謝関連タンパク質様成分についても同様に複数の市販抗体を用いて探索を行った.ウエスタンブロッティングの結果,認識エピトープの異なる数種類の抗体で交差性が認められるアディポネクチン様成分がニジマス脂肪組織,RTG-2細胞に認められることが明らかとなった.また,RTG-2には複数の抗PPARγ抗体で強く認識される成分が存在することが明らかとなった.これにより,魚類においても哺乳類と同様の核受容体や転写因子が存在し,現在哺乳類において明らかになりつつある脂質代謝調節経路の存在が示唆された.哺乳類では,血中アディポネクチンレベルの上昇によって脂肪,筋および肝細胞における脂質代謝が促進されることが明らかになってきた.

また,哺乳類脂肪細胞の分化や代謝調節において核内受容体PPARγが重要な働きを担う.一方,魚類におけるこれらの存在についてはゼブラフィッシュなどのcDNAおよびESTデータベースによって確認しうるが,現時点では機能性を有した脂質代謝関連タンパク質が存在するかどうかについては全く情報が得られていない.そこで本研究では,魚類においても脂質代謝に関与すると考えられるアディポネクチンなどの発現頻度を明らかにし,脂質代謝調節経路を推定することを目的とした.ニジマスEST配列より,ニジマスアディポネクチンの全配列をin silicoクローニングし,その演繹アミノ酸配列に従って,ニジマスアディポネクチンペプチドを固相合成した.本ペプチドを用いてウサギ抗血清を作製し,ニジマス肝臓,血漿等を採取してSDS-PAGEに付し,ウェスタンブロッティングを行った.その結果,認識エピトープの異なる数種類の抗体で交差性が認められるアディポネクチン様成分がニジマス脂肪組織,RTG-2細胞,血漿に認められることが明らかとなった.抗ニジマスアディポネクチン抗体が認識するタンパク質は,哺乳類アディポネクチンに相当する約30k成分以外に高分子成分が認められた.還元条件下でも同様な傾向を示すことから,ニジマスアディポネクチンはジスルフィド結合以外の相互作用力によって多量体化するものと考えられた.これは,哺乳類アディポネクチン多量体が還元条件下によって容易に単量体化することと大きく異なった.哺乳類でアディポネクチンを介してAMPKを活性化することが明らかになっているγオリザノールをニジマスに投与するとAMPKの活性化が認められた.これらのことから,ニジマスにおけるアディポネクチンの作用メカニズムは哺乳類の多量体アディポネクチンシステムと類似しているものと推定された.
触媒抗体による新しい感染制御手法の開発

様々な病原体の感染を制御するための人工防御分子を実現するために、抗体ファージディスプレイ法を利用して、細胞表面抗原特異的な抗体とペプチダーゼ型触媒抗体を作製するための基礎的研究を行うことを目的として、以下の研究を行った。(1)HepG2細胞特異的なモノクロナール抗体の調製HepG2細胞で免疫したマウスから、抗体ファージディスプレイ法を用いてHepG2細胞表面に結合するファージクローン集団を得た。さらに単一クローンに分離して、ファージレベルで結合能をELISA等で詳細に調べた結果、単一クローンでも細胞表面に結合することが判明した。さらに、FAB断片として抗体分子を発現させるとともに、結合する抗原についても解析を進めている。(2)配列特異的プロテアーゼの創出配列特異的プロテアーゼ反応に対応した遷移状態類似体を合成した。具体的には、Ala残基のカルボキシル基をリン酸基に変換したアミノ酸誘導体をペプチド中に取り込ませた。現在、さらにこれを担体タンパク質であるKLHに結合させ、マウスを免疫することを計画している。これとは別に、基質ペプチドそのものでマウスを免疫し、抗体提示ファージライブラリーを構築している。また、活性に基づいて、抗体提示ファージライブラリーをスクリーニングするために、改変型ヘルパーファージを用いて、ファージpIIIタンパク質との融合体として、ファージ表面上に抗体ライブラリーを発現させた。ファージpIIIタンパク質の基質結合部位に基質ペプチド複合体を固定したのち、温度の上昇あるいは金属イオンの添加によって反応を開始させ、最終的に表面上で基質ペプチド切断反応が起きたファージを、固体ビーズからの溶出や生成物に特異的な抗体によって回収することを考えている。
津波被害予測のための詳細モデルによる超大規模流体‐構造連成解析手法の構築

本研究は,津波が建物に及ぼす力を評価可能な流体-構造の連成解析手法を構築するものである。津波伝播解析を行うためにVOF法に基づく3次元自由表面流れ解析手法を構築した。また、亀裂進展を考慮した構造解析手法として、PDS-FEMに基づく解析手法を構築し、流体解析より圧力分布データを受け取り、それを外力として入力することが可能なシステムを構築した。また、津波襲来以前の地震動による建物の部材劣化を考慮するため、地震動による構造物の地震応答解析手法を構築した。以上、本研究で構築されたシステムは、大規模計算機システムでの運用を想定しており、実際に理化学研究所所有の京コンピュータ上で良好な性能を出している。本年度は昨年度に引き続き,構造解析手法および,自由表面を考慮した流体解析手法の構築を行った.昨年度は,オープンソフトの構造解析ソフトであるADVENTURE_Solidをベースに亀裂といった不連続現象を取り扱うことが可能な粒子離散化手法(PDS)を導入し,構造物の亀裂進展解析を行うことを可能であることを確認した.PDS有限要素法の有効性が確認できたため,本年度はより大規模な地震動問題を高速に解くことに特化した地盤ー構造連成解析手法(GAMERA)による構造解析の開発を進めた.当手法はMulti-Grid法に基づく前処理に精度混合演算を組み合わせたもので,京コンピュータのような大規模システムでも高効率に解析を進めることが可能であるのはもちろんのこと,中規模,小規模システムにおいても演算を高速に行うことができる有効な手法である.今後はこの構造解析手法にPDS有限要素法を導入する予定である.通常,構造物は津波により被害を受ける前に,地震動による被害が生じ,耐久性が劣化している.このため,地震動による地震動応答解析により被害を評価し,これを考慮した津波被害解析を行うことにより,より現実に則した被害予測が可能となると考えられる.本年度は特に大規模解析手法の開発に注力し,京コンピュータ上で1億自由度を持つ重要構造物の地震動応答解析を行うことが可能となった.来年度はPDSを導入し,津波解析とのインターフェースの開発を行う.また流体解析ソースにおいては,昨年度から引き続き京コンピュータ上で,メモリキャッシュチューニングを施した.実行性能において,ピーク性能比2%から5%と効率的な計算を行う事ができるようになった.今後も高速化チューニング等を行っていく予定である.本研究は,津波が建物に及ぼす力を評価可能な流体-構造の連成解析手法を構築するものである。本年度は破壊現象を考慮した構造解析手法および,自由表面を考慮した流体解析手法の構築に着手した.前者については,オープンソフトの構造解析ソフトであるADVENTURE_Solidをベースに亀裂といった不連続現象を取り扱うことが可能な粒子離散化手法(PDS)を導入し,構造物の亀裂進展解析を行うことを可能とした.後者としては,津波現象を対象とするため,砕波や跳水といった鉛直流が卓越し,複雑な自由表面形状を有する現象にも適用可能なVOF(Volume of fluid)法を用いた.Navier-Stokes方程式の解法には安定化有限要素法を用いた.また,当初計画では平成25年度に予定されていた連成についても着手した.ただし,平成25年度の計画にあるような相互連成ではなく,構造と流体のそれぞれの手法の機能をチェックするために,流体解析で得られた圧力を構造解析の外力として入力する一方向の連成となっている.これらの手法の機能を検討するために,港湾航空技術研究所で行われた,津波力によるコンクリート版の破壊実験の再現計算を取り上げた.まず,自由表面流れ解析手法の妥当性を検討するために,水路内の津波伝搬解析を行い,圧力の時刻歴を実験値と解析結果と比較を行った.本手法により得られた結果は実験値と良い一致が得られた.次に,この得られた圧力よりコンクリート版に作用する外力を計算し,構造解析の入力条件とした.構造解析では,津波伝搬解析で得られた圧力により,コンクリート版に亀裂が進展する様子をとらえることができている.亀裂進展のパターンについては,今後,詳細を検討する必要がある.本年度は昨年度に引き続き,構造解析手法および自由表面を考慮した流体解析手法の構築を行った.昨年度は,大規模な地震動問題を高速に解くことに特化した地盤ー構造連成解析手法(GAMERA)による構造解析の開発を進めた.本年度は,これらの大規模全体系の結果を基に,詳細設計に耐えうる解像度の解析を行った.

具体的には,大規模全体系の解析結果の一部から,詳細設計を行う部分の変位を取り出し(補間し),詳細設計を行う部分をモデル化し,外力として全体系の結果から生成された境界条件を課す.これにより,詳細設計により部材寸法や形状に変更があった場合でも,計算コストのかかる全体系の解析を再度計算する必要がない.また,今年度開発したシステムは,当プロジェクト初年度に開発した,流体-構造連成解析手法との親和性が高く,有効度が高い.これにより,PDS有限要素法による構造物の破壊解析も,部材レベルで行うことができ,より詳細な構造物設計に有効である.当初の計画では,実地形の大規模モデルを作成し,大規模シミュレーションを行う予定であったが,実作業での有用性を考え,本年は構造物の2段階解析手法の構築を行った.これにより,当研究では,構造物の多段階解析(広域から詳細へのズーミング)手法のが開発され,外力として津波波力も考慮可能であり,また,詳細な亀裂進展も考慮することのできる効率的なシステムが構築されたこととなる.また,1億自由度を越える大規模問題にも取組み,それ以上の自由度へも適応可能であることが分かった.計算力学当初の計画においては,当年度は25年度に開発を行った流体解析手法および構造解析手法の検討を継続して行うとともに,並列計算手法の高効率化を行ってきた.構造解析手法として,地震動による被害評価が行えるよう,地盤-構造連成の地震動応答解析手法の開発を行った.当初計画では,両手法の結びつける連成インターフェースを整備し,同一コードとして動作する連成解析手法を構築するものであったが,本年度はその準備段階に留まっている.この点においては,当初計画より若干の遅れがあるが,1億自由度を越える大規模問題に対して,高効率に解析を進めることが可能な手法の構築を行っており,総合的にみれば当初計画と遜色のない達成度であると判断する.当初の計画においては,当年度は破壊現象を考慮した構造解析手法および自由表面を考慮した流体解析手法の構築を行い,各手法の妥当性について検討する予定であった.本年度は,それらの開発を行い,データの入出力により一方向ではあるが連成解析を行う所まで,作業を進めることができた.また,効率的に研究を進めるため,並列計算手法の導入を先行して行った.並列化性能に関しては,系コンピュータ上で72ノード(576core)使用時で90%程度であったが,それ以上の台数を利用した場合では,十分な性能を得ることはできなかった.大規模システムにおける並列化性能はまだ不十分であるが,並列計算手法を導入に取りかかることができたことは,当初計画よリも進んでいると考えられる.平成26年度には,24,25年度に開発を行った流体解析手法および構造解析手法の検討を継続して行うとともに,両手法の結びつける連成インターフェースを整備し,同一コードとして動作する連成解析手法を構築することが急務である.連成解析手法としては,流体と構造の相関を交互に評価する弱連成手法,もしくは流体から構造へ力を受け渡すOne-way方式を採用する予定である.弱連成手法は,時に相関力を低く評価する事例もあるが,本研究でターゲットとする現象は,流体の変形量(自由表面移動量など)に比べ,構造物の変位は小さなものであるため,計算時間,記憶容量に有利な弱連成手法で対応可能であると考えられる.また,One-way方式では,構造物の変形が流体側に反映されないため,壁面に穴が開いたり,漂流物となったりするような問題には適用ができないが,構造物の被害推定において,十分に機能すると考えられる.また,これまでに作成された解析コードを用いて,実地形問題へ適用を行う.そのためのモデル作成を行う.構造物の幾何形状や詳細な地形を表現した精緻なモデルを作成する.
黄色ブドウ球菌肺炎の重症化に関わる病原因子の解明

本研究の目的は1黄色ブドウ球菌の重症肺炎と関連した病原因子の同定、2同定した病原因子を標的とした、黄色ブドウ球菌肺炎の新規予防・治療戦略の検討である。研究の方法は以下の通りである。1臨床情報の収集、2黄色ブドウ球菌株の収集・DNAの解析、3解析データと患者情報の比較から、重症肺炎と関連した病原因子をピックアップ。4その病原因子のin vitroでの発現量をReverse Transcription Polymerase Chain Reaction(RT-PCR)などで評価。5動物実験により病原因子の発現量と死亡率や肺の組織学的変化の関連を確認する。
配位不飽和活性種によるH-H,C-H,Si-H,C-C結合活性化の制御

配位不飽和な5配位ルテニウム錯体[RuH(P-P)_2]PF_6(P-P=各種ジホスフィン)の空の配位座に水素分子(H_2)が配位した分子状水素錯体[RuH(H_2)(P-P)_2]PF_6の溶液中での挙動をNMRを用いて検討した。この分子状水素錯体におけるH-Hσ結合の活性化は、Ru-HとRu-(H_2)との間の水素交換の速度論的パラメータにより比較することが可能であり、ジホスフィンのキレート環のflexibilityが大きいほど水素交換速度が大きくなることを、配位子としてdpbpとbinapを用い、両者の水素交換速度を比較することにより明らかにした。また、ジホスフィンとしてdiopを用いると、水素交換の中間体と考えられる錯体が存在することが^1HNMR測定にの結果から示された。一方、上記5配位錯体のうち、P-P=dppbおよびdiopについて、低温でジホスフィン配位子のアルキル鎖のC-H基がそのσ電子により中心Ruに配位する、いわゆるagostic相互作用を示すことを見出した。そして、これら錯体において、Ru-HとC-Hの交換が-3060°Cという低温においてもかなりの速度で進行すること、言い換えると、C-Hσ結合の活性化が容易に進行することを示した。このことは、agostic相互作用が金属によるC-H結合の活性化の中間状態というよりも、活性化の一つのパターンであることを意味する。さらに、P-P=dpppの5配位錯体とシランH-SiR_3との反応により、H-Si結合がσ結合により配位した[RuH(H-SiR_3)(P-P)_2]^+が生成すること、配位したシランが水分子やアルコールと容易に反応してシロキサンやシリルアルキルエーテル与えるとともに、錯体側は分子状水素錯体へと変化することを明らかにした。また、反応の詳細をNMRにより検討した。1. 5配位ルテニウム錯体による分子内および分子間CーH結合活性化各種2座ホスフィン(PーP)を配位子とするルテニウム錯体[RuH(PーP)_2]PF_6を合成し、その溶液中での挙動を^1Hおよび^<31>P NMRにより詳細に検討したところ、dppbおよびdiopのようなメチレン鎖を有する7員環キレ-トを形成するジホスフィンを配位子とする場合は、メチレンのCーHと配位子のフェニル基のオルト位の水素が速やかに交換していることが判明した。これは上記5配位ルテニウム錯体の優れたCーH結合活性化能を示している。そこで、この配位不飽和ルテニウム錯体のCーH活性化能を利用した反応として、アルコ-ルを水素源とする不飽和化合物の不斉水素移動水素化について調べた。不斉ジホスフィンbinapを配位子とする5配位ルテニウム錯体を触媒として、エタノ-ルあるいは2ープロパノ-ルを水素源とする各種不飽和カルボン酸の水素移動水素化を試みたところ、イタコン酸やデヒドロアミノ酸が高い不斉収率で不斉水素化された。アセトフェノンの不斉水素移動水素化についてもまずまずの結果が得られた。

2.ジルコニウムーアルケン錯体によるHーHおよびSiーH結合活性化Cp_2ZrCl_2とGrignard試薬またはアルキルリチウムの反応によりin situで得られる表記錯体は配位不飽和錯体であり、アルケンと反応することは既に明らかにした。本年度はこの錯体とアルデヒドとの反応を行い、その選択的反応様式を明らかにした。また、アルケンの水素化やヒドロシリル化に対して表記錯体が活性を有することを新たに見いだした。このことは、配位不飽和なジルコニウム錯体がHーH結合やSiーH結合を活性化する能力を持つことを示すものである。ヒドロシリル化の反応機構について詳しく検討した。1.5配位ルテニウム錯体によるH-H結合活性化2.5配位ルテニウム錯体によるジホスフィン配位子のC-H結合活性化と水素交換反応[RuH(dppb)_2]^+(dppb=1,4-bis(diphenylphosphino)butane)は、低温(-40°C以下)では配位子dppbのα-メチレン水素がagostic相互作用により空の配位座に配位していることをすでに明らかにしたが、さらに詳細に検討した結果、このagostic水素がRuに結合しているヒドリド配位子と交換していることを見いだした。交換速度は-60°Cでも数秒に1回とかなり速い。この交換では、C-Hの酸化的付加は起こっていないと考えている。また、上記錯体および類似のdiop錯体やdppp錯体(dppp=1,3-bis(diphenylphosphino)propane)と重水素ガスを接触させると、ジホスフィンのメチレン水素やフェニル基のオルト水素が重水素交換されることが見いだされ、錯体中の室温付近での活発なC-H結合活性化の証拠が得られた。3.5配位ルテニウム錯体によるSi-H結合活性化[RuH(dppp)_2]^+とフェニルジメチルシランとを反応させ、5配位錯体によるSi-H結合活性化について検討した。重水素ラベルしたシランとの反応では、Si-DとRu-Hの交換が確認された。また、錯体とシランの反応により系中に分子状水素錯体[RuH(H_2)(dppp)_2]^+が生成することを見いだした。いずれも5配位ルテニウム錯体がシランのSi-H結合を活性化する能力を有することを示している。引続き、系中に発生すると考えられるRu-Si結合をもつ錯体の確認と、その性質について検討している。配位不飽和な金属錯体の空の配位座に水素分子あるいはヒドロシランがH-H、Si-Hのσ結合を保持したまま配位して生成する分子状水素錯体(η^2-H_2錯体)、η^2-HSi錯体は、金属錯体の配位子のC-Hσ結合がやはり結合を切ることなく中心金属に配位するいわゆるagostic相互作用とともに、中心金属の空のd軌道とH-X(X=H,C,Si)結合とから形成される3中心2電子結合を有する系としての共通性を持つことが、最近広く認められてきた。本研究では、5配位ルテニウム錯体[RuH(P-P)_2]^+(P-P=各種ジホスフィン)におけるジホスフィン配位子のメチレン水素のagostic相互作用、[RuH(P-P)_2]^+と水素ガスとの反応により生成する分子状水素錯体[RuH(H_2)(P-P)_2]^+について、系統的に研究を進めるとともに、本年度は上記5配位錯体とヒドロシランの反応について詳しく検討し、興味ある結果を得た。すなわち、5配位錯体[RuH(dppp)_2]^+(dppp=1,3-bis(diphenylphosphino)propane)とフェニルジメチルシランの等モル混合物の^1HNMRスペクトルには、分子状水素錯体[RuH(H_2)(dppp)_2]^+、およびジヒドリド錯体Ru(H)_2(dppp)_2が見いだされ、さらに全く新しいヒドリド種の生成が確認された。この新錯体は、いくつかの証拠に基づいて、η^2-HSi錯体、[RuH(η^2-HSiR_3)(dppp)_2]^+と同定した。
生涯の変遷における幼少期の家庭環境の理解と高齢期までの影響に関する研究

本研究は,北海道の在宅高年齢者を対象としたライフヒストリー調査,及びこれを基にした疫学的検証から,幼少期の家庭環境と高齢期の心身の健康との関連を明らかにすることを目的としている.今年度は,蓄積された高齢女性のインタビューデータの分析,都市部高齢男性の新規インタビューを加えた分析による発言特性に関する検討を行った.再インタビューおよび疫学調査に向けた予備調査も実施した.1.高齢女性の幼少期の遊びに関する語りの特性:80歳代女性27名(84.6±3.0歳)を分析焦点者とした幼少期の「遊び」の語に関連するテキスト定量分析により,298文章を抽出し定性的に検討した.関わる人や場所の語の検討から,高齢女性の幼少期の遊びについて,活発に遊ぶことを特別な気質と捉えていた,自然や日常活動の中に遊びを見出していた,手伝いが忙しく遊べなかった等の語りが特徴づけられた.2.高齢男性の仕事経験と退職後の社会参加の関連:都市部と過疎地域の80歳以上男性9名(85.6±4.7歳)のライフヒストリーについての定性的検討から,幼少期に親しんだ体験が退職後のボランティア活動につながった,幼少期から働きづめだったため退職後の余暇は自分や家族のねぎらいに使う等の語りや,仕事での充実感や達成感が大きい人で,退職後も地域の役職につき活動する特徴も見いだした.幼少期の体験や仕事との関わりが,退職後の社会参加において活動の選択に関わる可能性を示した.3.予備調査:ライフヒストリーインタビューを行った高年齢者94名に,約4年後の健康状態の確認を行った.回答率は60名(63.8%)であった.健康関連QOL(SF36)による主観的健康度は61.6±20.6であった.疫学調査に向けては,都市部と過疎地域の老人福祉センター利用者287名について健康状態や社会活動状況に関する調査を完了した.2年目に当たる今年度は,北海道A市在住の高齢者94名についてのライフヒストリーデータから高齢女性を分析焦点者として,家庭・家族に関するストーリーや用語の抽出をすすめるとともに,追加インタビュー調査の準備として,協力依頼と現在の健康・生活状況の確認を行うことを計画した.また疫学的検討にむけては,ライフヒストリー調査対象地域での継続的な健康状態・生活習慣調査および体力測定の実施と新規の地域での調査も開始した.昨年度男性を分析焦点者とした検討において,同意でも様々な表現のあること,他人の話との区別が容易でないことから,意味の確認にインタビュー全体のデータに戻る作業を繰り返した.本作業は,女性においても同様であり,テキスト分析には多大な時間が必要であった.女性の語りの特徴として,感性が豊かといえる表現があり,定性的分析での視点や表現の評価についてさらに丁寧な検討が必要と考えられた.テキスト分析では,分析・考察に時間を要し焦点の明確化を引き続き行っていく必要はあるが,予定の分析焦点者でのライフヒストリーデータ分析および追跡インタビュー調査の準備が進められたため,研究の進捗としては概ね計画通りと評価した.申請時の計画から変更なく研究を進める.2019年度は,これまでに行ったライフヒストリーインタビューの家庭・家族に関する基礎的検討をすすめ,本テキスト分析の結果と健康状態・生活状況追跡調査の結果に基づいて分析焦点者を選出し,追加インタビュー調査を行う.2020年度は,追加インタビューデータのテキスト化と家庭の役割の理解に向けた定性的検討,テキストデータマイニングを用いた要素の抽出と関係性の検討を行う.最終年度では,インタビューデータのテキスト分析を基に高齢期の健康を予測する因子としての幼少期の家庭・家族要因の質問項目作成し,本質問項目を用いた地域住民調査とその分析による検証を進める.本研究は,北海道の在宅高年齢者を対象に行うライフヒストリー調査,及びこれを基にした疫学的検証から,幼少期の家庭環境と高齢期の心身の健康との関連を明らかにすることを目的としている.今年度は,蓄積された高齢者のインタビューデータを再分析することにより,高齢男性の幼年期の家庭環境に関する発言特性について成果を得た.1.子ども時代の家庭環境に関する語りの特性ーテキスト定量分析からの検討:全対象者から60-89歳までの男性高齢者18名を分析焦点者とし60・70・80歳代の3群に分けて分析した結果,子ども時代の家庭環境に関わるキーワードの発言頻度はいずれの群も「家族」に分類される語の頻度が高かった.幼少期の家庭環境に関わる6キーワードにおいて,ほぼ全ての用語で高齢になるほど発言頻度の高い傾向がみとめられた.男性の60代では仕事を継続している,退職後の期間が短い状況からライフヒストリーの中で成人期の影響が強く,70-80代では人生全体に占める幼少期の相対的な割合は少なくなるが,語りの量の増えることが示唆された.2.子ども時代の困難な状況と身体活動・創作経験ー定性的コーディングによる検討:異なる対象者で複数上げられた内容として,「(親や兄弟との)死別」,「(家族や自分の)病弱さ」,「貧困」,「手伝い」,「歩いての移動」,「名のない遊び」,「(道具や楽しみを)作る」が特徴付けられた.幼少期について家族との死別や貧困の状況が語られる一方,家の手伝いや徒歩による長距離の移動を身体の基礎作りとなった捉える発言や北海道特有の手作りスキーでの遊び,友人と流行遊びを作る経験が誇らしく語られた.以上より,幼少期の語りは高齢群で多く,家族との関わりについての発言の多いことが示された.

幼少期の困難な状況にあって「よく動く」,「作り出す」等の活動があり,現在までの影響として自覚されていることが示唆された.初年度に当たる今年度は,北海道A市在住の高齢者94名についてのライフヒストリーデータを再分析し,家庭・家族に関するストーリーの抽出,テキストマイニングによる関連用語の抽出することを計画した.「幼少期の家庭環境」についての発言を抽出するために「思い出」,「昔」,「学校(小学校)」,「家族」,「家庭」,「炭鉱」のカテゴリ分類器を設定したが,キーワード抽出だけでも600語を越える抽出となった.語の多さは,テキスト化したインタビューデータにおいて言葉の揺らぎや同意でも様々な表現のあることに起因する.また,文脈により他人の話が語られるような場合も有り,単純な用語でも意味の確認にインタビュー全体のデータに戻る作業を繰り返す必要があった.このような分析作業に多大な時間を要したため,今年度の主な研究成果は男性のみの結果となった.しかし,これは申請時に想定しており,今年度の目的であった全対象者のデータについてのキーワード抽出は完了したため,研究の進捗としては概ね計画通りと評価した.本研究は,北海道の在宅高年齢者を対象としたライフヒストリー調査,及びこれを基にした疫学的検証から,幼少期の家庭環境と高齢期の心身の健康との関連を明らかにすることを目的としている.今年度は,蓄積された高齢女性のインタビューデータの分析,都市部高齢男性の新規インタビューを加えた分析による発言特性に関する検討を行った.再インタビューおよび疫学調査に向けた予備調査も実施した.1.高齢女性の幼少期の遊びに関する語りの特性:80歳代女性27名(84.6±3.0歳)を分析焦点者とした幼少期の「遊び」の語に関連するテキスト定量分析により,298文章を抽出し定性的に検討した.関わる人や場所の語の検討から,高齢女性の幼少期の遊びについて,活発に遊ぶことを特別な気質と捉えていた,自然や日常活動の中に遊びを見出していた,手伝いが忙しく遊べなかった等の語りが特徴づけられた.2.高齢男性の仕事経験と退職後の社会参加の関連:都市部と過疎地域の80歳以上男性9名(85.6±4.7歳)のライフヒストリーについての定性的検討から,幼少期に親しんだ体験が退職後のボランティア活動につながった,幼少期から働きづめだったため退職後の余暇は自分や家族のねぎらいに使う等の語りや,仕事での充実感や達成感が大きい人で,退職後も地域の役職につき活動する特徴も見いだした.幼少期の体験や仕事との関わりが,退職後の社会参加において活動の選択に関わる可能性を示した.3.予備調査:ライフヒストリーインタビューを行った高年齢者94名に,約4年後の健康状態の確認を行った.回答率は60名(63.8%)であった.健康関連QOL(SF36)による主観的健康度は61.6±20.6であった.疫学調査に向けては,都市部と過疎地域の老人福祉センター利用者287名について健康状態や社会活動状況に関する調査を完了した.2年目に当たる今年度は,北海道A市在住の高齢者94名についてのライフヒストリーデータから高齢女性を分析焦点者として,家庭・家族に関するストーリーや用語の抽出をすすめるとともに,追加インタビュー調査の準備として,協力依頼と現在の健康・生活状況の確認を行うことを計画した.また疫学的検討にむけては,ライフヒストリー調査対象地域での継続的な健康状態・生活習慣調査および体力測定の実施と新規の地域での調査も開始した.
脈波伝播速度法を用いた体位変換中の血圧モニタリングに関する研究

血圧は循環動態を観察する指標の1つであり,血圧変動のモニタリングは大きな意義を持つ.本研究では,体位変換中に連続的に血圧モニタリングが可能なシステムの開発を目的とし,2点の光電容積脈波信号から血圧のリアルタイム推定を行うことを目指している.今年度は,体位変換による影響を含めた血管系のモデル構築を目指し,実験システムの構築および健常者に対する実験および解析により,体位変換が脈波伝播時間と血圧の関係へ及ぼす影響について検討を行った.単純な腕の上げ下ろしによる脈波伝播時間の変化を検討するために,上腕部を対象部位として選択し,光電脈波センサの設置位置について検討を行った.候補としたいくつかの部位において光電脈波信号の強度および安定性について検討を行い,脈波信号を取得する部位として,人差し指及び手首を選定した.はじめに,安静状態で腕を上げ下ろししたときの脈波伝播速度について検討を行い,腕の上げ下ろしを行うだけでも脈波伝播速度が変化することを確認した.次に,各体位での脈波伝播速度と血圧の関係を検討するために,仰臥位及び45度背上げした状態で実験を行った.実験により,同一被験者であっても,仰臥位及び45度背上げした状態では市販の血圧計で計測した拡張期血圧と光電脈波センサより算出した脈波伝播速度の関係が異なることを確認した.また,別の被験者に対して同様の実験を行い,体位による脈波伝播速度と血圧の関係変化は同様の傾向を示すことを確認した.26年度が最終年度であるため、記入しない。26年度が最終年度であるため、記入しない。
韓国国立中央図書館所蔵日本古典籍の日韓共同研究

1)韓国国立中央図書館所蔵の朝鮮総督府旧蔵和古書のうち、国文学研究資料館による従来の調査に漏れた国文学関係資料について、カード調査を完了した。また、調査を終えた資料のうち、中央図書館のデータベースから公開されているもの583点について、国文研のデータベースから公開することの許可を得た(現在公開中)。2)研究期間中に、5回の「日韓古典籍研究交流会」を行った(中央図書館で4回、国文研で1回実施した)。3)研究報告を兼ね、研究成果を『日韓の書誌学と古典籍』(2015年5月)として刊行した。1.国際研究集会inSEOUL「SEOUL発日本学」への参加。2011年7月18日、高麗大学校日本研究センターにおいて実施された(主管:高麗大学校日本研究センター、主催:九州大学韓国研究センター・国文学研究資料館・高麗大学校日本研究センター、後援:高麗大学校・韓国研究財団)。本研究のメンバー(研究代表者・連携研究者・研究協力者・海外共同研究者)は標記集会に参加し、本研究に関連する発表・コメントを担当した。2.「第2回日韓古典籍研究交流会」の共同開催。2011年7月19日、韓国国立中央図書館Digital図書館大会議室において実施した。本研究のメンバー(研究代表者・連携研究者5名・研究協力者5名・海外共同研究者2名)及び国立中央図書館古典運営室の関係者5名が参加し、「善本調査報告」(2名)及び日本書誌学・韓国の金属活字に関する発表と、通訳を介した質疑応答を行った。3.韓国国立中央図書館所蔵和古書資料の共同調査(第1回)。2011年7月20・21日、研究代表者・連携研究者5名・研究協力者4名・高麗大学校大学院生2名によって実施し、閲覧書目91点中から善本を選定した。4.韓国国立中央図書館所蔵和古書資料の共同調査(第2回)。2011年11月1617日、研究代表者・連携研究者3名・研究協力者3名・研究補助者1名・高麗大学校大学院生2名によって実施し、閲覧書目71点中から善本を選定した。5.韓国国立中央図書館所蔵初期朝鮮活字本・ソウル大学所蔵和古書資料の共同調査2012年3月1921日、研究代表者・連携研究者2名・海外共同研究者1名・高麗大学校大学院生2名によって実施し、前者については27点を閲覧した。1.第4回日韓古典籍交流会の実施。日時・場所:2013年7月31日(水)14:0017:30、韓国国立中央図書館地図資料室内容:中央図書館所蔵日本古典籍の善本報告(入口敦志「仮名草子に見る和様化の諸相」、大高洋司「『夢想兵衛胡蝶物語後編』」、金田房子「『おくの細道』等」、黒石陽子「初期草双紙三種」)、韓国古典籍研究報告(鄭陳雄「韓国の文集について」)。韓国語・日本語による通訳付き。参加者37名。2.韓国国立中央図書館における日本古典籍善本選定作業の実施(2013年7月30日・31日午前・8月1日午後・8月2日)。3.第5回日韓古典籍交流会の実施(国文学研究資料館特定研究「日本古典籍の書型に関する研究」との共同開催)。日時・場所:2014年1月2425日(金・土)、国文学研究資料館オリエンテーション室内容:1月24日13:3017:45研究報告(奉成奇「韓国の古活字に対する小考」、柳富鉉「高麗大蔵経の新たな理解」)。参加者32名。1月25日10:3017:30講演(藤本幸夫「日本現存朝鮮本とその研究」)、研究報告(佐々木孝浩「日本古典籍における中世末期の表紙の変化についてー朝鮮本と和本をつなぐもう一つの視座ー」、海野圭介「手鑑の中の高麗写経」、入口敦志「古活字版の黎明」、金永昊「『三綱行実図』の伝来と影響」)。参加者31名。4.印刷博物館(凸版印刷)における関連資料調査(2014年1月26日(日)13:3015:30、説明:同館学芸員中西保仁氏)。参加者17名。具体的内容:昨年度に引き続き、韓国国立中央図書館において、日本古典籍善本調査と、その成果に基づく交流会を行った。

善本調査は、平成24年7月2425日午前及び平成25年3月1823日の二度にわたって実施した(加えて、平成24年7月26日、清州古印刷博物館における現地調査を行い、韓国の古印刷文化に関する知見を深めた)。交流会(「第3回日韓古典籍研究交流会」)は、平成24年7月25日14:0017:00、中央図書館地図資料室において実施し、日本側3名、韓国側1名が報告を行った。日本側の報告内容の一部は、平成24年度内に論文として刊行されている。意義・重要性:本研究の特徴は、代表者の勤務先である国文学研究資料館を中心とする日本側研究者と、中央図書館古典運営室を中心とする韓国側研究者が協力し合って、研究・交流を進めていることである。善本調査には、高麗大学校をはじめ、韓国において日本古典文学の研究を目指す若手研究者・大学院生が常に参加している。また、最も重要な行事である「日韓古典籍研究交流会」を通じて、双方の研究者は、和古書・韓国古典籍に関する知識を吸収しあっており、それぞれの報告については、主として韓国語の通訳を、専門の近い優秀な研究者に依頼し、一般来聴者にも公開している。その結果、本交流会の認知度は年々高まり、24年度には、参加者が、発足当初の倍となる34名を数えた。旧植民地時代の遺物とはいえ、韓国で今日まで大切に保存されてきた和古書を中心とする古典籍類が、研究交流のための格好の素材となっており、本研究は、徐々に、中国を含めた東アジア書物文化研究への拠点に成長しつつある。本研究の最終年度にあたる平成26年度は、韓国において日韓の合同による1・2の研究交流を実施し、報告書を兼ねて3を出版した。1第6回日韓古典籍研究交流会の実施(平成26年7月29日14:0017:30、韓国国立中央図書館5F地図資料室セミナー室、日本側発表者3名、韓国側発表者1名、参加者約35名〈日本人10名、韓国人25名〉)。2韓国国立中央博物館における資料調査(7月30日)。国立大邱博物館における資料調査(7月31日)。伽耶山海印寺・海印寺聖宝博物館における資料調査(8月1日)。以上に約15名(日本人10名、韓国人5名)が参加。ソウル大学校図書館における資料調査(8月2日9日、韓国人1名が従事)。3『【アジア遊学184】日韓の書誌学と古典籍』の出版(大高洋司・陳捷編、勉誠出版、200頁、2015年5月10日)。26年度が最終年度であるため、記入しない。日本近世文学26年度が最終年度であるため、記入しない。当初計画では研究交流会を年2回開催の予定であったが、双方の事情により年1回開催(7月下旬)となった。それ以外については順調に進行しており、24年度の交流会に向けての善本選定作業も完了している。また、韓国国立中央図書館の格別の配慮により、和古書ばかりでなく貴重な初期朝鮮活字本についても実見が可能となり、今後漢籍を含めた東アジアの書物について広い視点で検討を進めるための足がかりが得られた。中央図書館所蔵の善本調査は、当初の目標だった文学関係についてはほぼ終了し、夏の交流会におけるメンバーの調査報告も、残り3名で全員が担当分の報告を果たすところまで来た。調査中、直接本研究の対象とした「日本語・日本文学」以外の目録に搭載された和古書についてもメンバーの関心が広がり、その一部については調査対象に加えたが、全貌の把握については次の機会に託さざるを得ないと判断した。こうした新たな調査対象は、当初の計画が滞りなく実行され、また中央図書館当局の好意的な対応によって見えてきたものであり、今後の調査研究の可能性が一層拡大したと言って良い。それと同時に、中央図書館図書館研究所との交流が深まり、韓国の古典籍書誌学について教示を受ける機会が増えた。
腎癌における血液中バイオマーカーとなるmiRNA網羅的探索と新規核酸治療薬の開発

腎癌における血液中バイオマーカーとなるmiRNA網羅的探索と新規核酸治療薬の開発のために、まず癌特異的エクソソームに着目し、研究を開始した。特に患者血清から癌特異的エクソソームを抽出、濃縮する方法として腎癌に高発現し、またエクソソームの膜上に存在するタンパクによって免疫沈降を行うことを予定したが、この手法による腎癌特異的エクソソームの濃縮は期待したほどの効果はなかった。そこで、腎癌組織および正常腎組織から分泌されるエクソソーム別々に得る方法を新規に開発し、知財の確保を行うことができた。マイクロアレイ解析にて、腎癌組織特異的に高発現を認めた22種類のmiRNAに注目し、腎癌予後との関連を検討した。まず、Training cohortとして、腎癌臨床検体24例からRNAを抽出し、癌なし生存群(n=13)と再発または癌死群(n=11)の2群に分け、real-time PCRにてmiRNAの発現を比較した。次に、2群間で差を認めたmiRNAに対し、validation cohortとして腎癌臨床検体159例を用いて腎癌特異的生存率をまた、転移性腎癌を除いた140例を用いて腎癌非再発率をretrospectiveに検討したTraining cohortでは、癌なし生存群と比較し、再発または癌死群でmiR-21-3p、miR-193a-3p、miR-34a-5p、miR-193b-5p、miR-27a-3pが高発現していた。次に、この5種類のmiRNAについて、腎癌臨床検体159例を用いてvalidationした結果、miR-21-3pとmiR-193b-5pの発現が腎癌特異的生存率と関連していた(p<0.05)。また、転移性腎癌を除いた140例を用いてvalidationした結果、miR-27a-3pとmiR-193a-3pの発現が腎癌非再発率と関連していた(p<0.05)。Cox比例ハザード解析の結果、miR27a-3 p [ low vs high; HR, 4.86; 95%CI, 1.44-20.3; p <0.01]は腎癌再発に関する有意な予後予測因子であった。miR-27a-3pが独立した腎癌再発の予測因子となり得ることを見出した。癌細胞から放出される細胞外小胞はタンパク質やmiRNAを内包し、周辺細胞とのコミュニケーションの手段として癌微小環境を制御すると考えられ、重要な役割を担っている。これら癌特異的細胞外小胞は血液バイオマーカーとして着目され、治療標的としても注目を浴びている。腎癌における特異的血液バイオマーカーの探索および新規治療の創成に臨床応用できる革新的な手法の開発に着手した。手術により得た腎癌組織および正常腎組織を特殊な環境でそれぞれを培養し直接放出される細胞外小胞を超遠心法により抽出した。癌及び正常組織から得られた細胞外小胞がエクソソームであることがナノ粒子トラッキング解析および透過電子顕微鏡を用いて形態学的に確認された。またウェスタンブロットによりエクソソーム特異的タンパクの発現を確認した。われわれが開発した手法によって、組織特異的に由来するエクソソームが抽出できることが示された。血液バイオマーカー探索の有用な手法となり得るだけでなく、他の癌腫にも応用できる革新的な技術であり、新規治療の開発も期待される。新規開発手法が確立しえた研究開始当初は腎がん特異的エクソソームをわれわれが腎がん組織で高発現し、予後と関連を認めることを発見したタンパクがエクソソームにも高発現していることを利用し、このタンパクによって免疫沈降を行うことにより、腎がん特異的エクソソームの濃縮および抽出を想定していた。しかしながら、首尾よく抽出することは困難であることが判明し、実験方法を変更し、腎がん組織から直接分泌されたエクソソームを回収し、正常腎組織由来のものと比較解析し得る方法を考案した。われわれが開発した手法によって、組織特異的に由来するエクソソームが抽出できることが示され、質量分析による網羅的解析によって多くの癌由来特異的タンパク質も同定された。マイクロアレイ解析の技術が十分であることが確認された。また組織の発現の評価は終了したため、今後は血清でのバイオマーカーに取り組むことができる。

タンパクを含めマイクロRNAの発現を網羅的解析に進む分子生物学エクソソームを単離するための方法を確立したので、これらを有機的に統合していく。