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東南アジア島嶼部の高地社会におけるコーヒー栽培と生活様式に関する人類学的研究

予定していたインドネシアにおけるコーヒー・チェリー生産農家の調査を次年度に延期し、本年度はコーヒー・チェリー栽培の歴史の長い、中米コスタリカにおける農園の調査を8月に実施した。コスタリカのコーヒー生産協同組合を訪問し、聞き取り調査を実施した。生産者協同組合の一つである、COOPEATENAS(コペアテナス)は1969年8月10日、教区司祭であったルイス・ビジェガス(Luis Villegas)神父の発案により、93名の組合員(asociados/ associates)により誕生した。各組合員は10,000コロネスずつ出資し、現在の組合員数は1300名、主に北米やヨーロッパ向けに輸出している。1520%は中間業者を通じてスターバックスに売っている。認証ラベルは、I SO140001(2015年)、フェアトレード認証(2006年)を取得している。コスタリカのコーヒー栽培では、フェアトレードなど認証制度の浸透、成熟した協同組合による生産と加工、エコツーリズムとの連携など、東南アジアの生産地ではみられない発展がみられた。限定的な貨幣経済への依存が東南アジア島嶼地域の特有の可能性が高まったことも今年度の調査の成果であった。2017年11月には、大阪大学にて開催された国際会議で研究成果の報告を実施した。また2018年7月にブラジルで開催される予定の国際会議での報告を申請し、許諾を得ている。本研究の延長申請をおこなったため、次年度も継続的に調査を実施する。次年度は延期されていたインドネシア共和国南スラウェシ州トラジャ地方におけるコーヒー栽培と経済に関する調査を実施する予定である。所属研究期間内の共同研究事業の分担者となり他の研究課題に取り組む時間の確保が必要になったこと、また未就学の子がおり、同様に研究職に従事している妻との出張時期の調整などがら、計画どおりに調査研究を実行することが困難になった。本研究は、東南アジア島嶼部において、コーヒー豆栽培をおこなう高地社会の人々の暮らしについて、1)コーヒー豆栽培導入の歴史的経緯と貨幣経済の浸透、2)贈与交換経済の機能と貨幣経済との関係、3)コーヒー栽培に関わる労働以外の時間の使途など生活様式に関して、現地調査と文献調査から明らかにするにあった。本年度は、インドネシア人研究者であり、インドネシアにおけるプランテーション栽培の調査を行なってきたRudo Wibowo氏の協力を経て、スラウェシ島トラジャ社会(インドネシア共和国南スラウェシ州タナトラジャ県)、スマトラ島バタック社会(インドネシア共和国北スマトラ州)において、現地調査を実施した。両地域は、東南アジア島嶼部のコーヒーベルト(南北回帰線のあいだの地域)に位置する標高800メートル以上の高地であり、良質のアラビカ種で名高い。欧米や日本のNGO、企業が参入し、「トラジャ」「マンデリン」などスペシャルティ・コーヒーとして、またフェアトレード・コーヒーの付加価値をつけて流通している。いずれも19世紀後半に導入され、基本的に数ヘクタールの土地を所有する小規模生産者による栽培が一般的である。スマトラ島は、インドネシアのコーヒー生産のおよそ70パーセントを占める。
炭酸塩岩の深部沈み込みに伴うダイアモンドの形成と流体の果たす役割

表層炭酸塩岩が大陸衝突に伴いマントルへ深部沈み込みをした例として、世界で最も深いところまで沈み込み地表に上昇してきたとされているカザフ共和国のコクチェタフ超高圧変成帯のマーブルを用いて標記テーマの研究を行い、以下のような成果を得た。1.ドロマイトマーブル中で多量のマイクロダイヤモンドが生成していること。また、その含有量には試料ごとにきわめて大きな差異があること。ダイヤモンドの最高含有量部分では岩石1トンに換算すると2800カラットとなる。ダイヤモンドを最も多く含有するガーネット粒子の一部に累帯構造を示すものが発見されダイヤモンドの分布との関係が考察された。2.ドロマイトマーブル中のマイクロダイヤモンドは光学顕微鏡下の詳細な観察から、R,S,Tの3つのタイプに区分された。これらのマイクロダイヤモンドは2つのステージで成長していることが、放射光を用いたマイクロラウエX線回折、レーザーラマン分光、マイクロカソードルミネッセンスなどの実験データから明らかにされた。3.典型的なマイクロダイヤモンドは"星型"(S-type)をしており、核部と周縁部に区分される。マイクロラウエX線回折により、核部が単結晶であること、また周縁部は透明度の高い半自形結晶で、核部と異なる方位を有することがわかった。またマイクロカソードルミネッセンスのスペクトルとイメージでは明瞭に各部と周縁部の差異が検出された。周縁部で520nm付近のスペクトルが顕著であり、各部はきわめて微弱である。4.以上の結果を総合し、マイクロダイヤモンドは第2ステージで流体から成長した可能性が高いことが示唆された。ドロマイトマーブル中でのダイヤモンドの形成は流体環境(その化学組成と不均質さ)に密接にかかわっていることが決定的になった。5.ダイヤモンドの形成プロセスと深部沈み込み炭酸塩岩とその進化プロセスの一端が解明された。カザフ共和国産の超高圧変成炭酸塩岩試料を用いて表題の研究を行った。その結果以下のことが明らかになった。1.ドロマイトマーブルを用いてダイアモンド含有率測定を行い、最高濃度2800carat/tonを得た。ダイアモンド含有量について、mmスケールで不均質であることが確認された。このマーブルに含まれるガーネット中にダイアモンドとフェンジャイト、炭酸塩鉱物の複合包有物が多数発見された。これらは、炭酸塩系におけるダイアモンドの形成とCO_2-H_2O系流体との密接な関係を示している。2.超高圧方解石マーブルの研究では、世界で初めて離溶相としてのコース石を発見した。約20μmの針状結晶としてチタン石中に連晶するもので、超高圧ユニット上昇時においてコース石が析出していることから、本岩石がきわめて圧力の高い条件下に置かれていたことの直接的証拠となった。また、コース石析出前の化学組成は化学量論的組成よりもSiO_2が過剰になる。過剰SiO_2量から見積もられる圧力条件は6GPaよりも大きい。同一試料のチタン石中に気液2相の流体包有物を発見した。この包有物は最終末期とは考えにくく、圧力が高い時の包有物の可能性がある。超高圧変成作用時の流体の存在とその挙動を解明する上で貴重なデータである。3.超高圧方解石マーブル中の単斜輝石について、顕微FT-IRを用いてOH基の検出を試みた。その結果、離溶K-長石周辺の単斜輝石中にH_2Oが最も多く残存していることがわかった。

K-長石とフェンジャイト離溶前の単斜輝石中のH_2O含有量は1000ppm以上である。単斜輝石のこのようなH_2O含有量は数GPa以上で可能である。表層炭酸塩岩が大陸衝突に伴いマントルへ深部沈み込みをした例として、世界で最も深いところまで沈み込み地表に上昇してきたとされているカザフ共和国のコクチェタフ超高圧変成帯のマーブルを用いて標記テーマの研究を行い、以下のような成果を得た。1.ドロマイトマーブル中で多量のマイクロダイヤモンドが生成していること。また、その含有量には試料ごとにきわめて大きな差異があること。ダイヤモンドの最高含有量部分では岩石1トンに換算すると2800カラットとなる。ダイヤモンドを最も多く含有するガーネット粒子の一部に累帯構造を示すものが発見されダイヤモンドの分布との関係が考察された。2.ドロマイトマーブル中のマイクロダイヤモンドは光学顕微鏡下の詳細な観察から、R, S, Tの3つのタイプに区分された。これらのマイクロダイヤモンドは2つのステージで成長していることが、放射光を用いたマイクロラウエX線回折、レーザーラマン分光、マイクロカソードルミネッセンスなどの実験データから明らかにされた。3.典型的なマイクロダイヤモンドは"星型"(S-type)をしており、核部と周縁部に区分される。マイクロラウエX線回折により、核部が単結晶であること、また周縁部は透明度の高い半自形結晶で、核部と異なる方位を有することがわかった。またマイクロカソードルミネッセンスのスペクトルとイメージでは明瞭に各部と周縁部の差異が検出された。周縁部で520nm付近のスペクトルが顕著であり、各部はきわめて微弱である。4.以上の結果を総合し、マイクロダイヤモンドは第2ステージで流体から成長した可能性が高いことが示唆された。ドロマイトマーブル中でのダイヤモンドの形成は流体環境(その化学組成と不均質さ)に密接にかかわっていることが決定的になった。5.ダイヤモンドの形成プロセスと深部沈み込み炭酸塩岩とその進化プロセスの一端が解明された。
微分光電子ホログラフィーによる熱電子放出材料等の表面構造と高温物性に関する研究

X線光電子回折(XPED)法は、薄膜等における表面化学状態分析や結晶構造の解析に非常に有効な手法である。現在XPED法による構造解析には、予想される構造モデルに対しシミュレーション実験を行う必要があり、計算や試行錯誤のために時間が費やされている。一方、光電子回折パターンをホログラムとみなし直接的に結晶の三次元原子像を得る光電子ホログラフィー(PH)による解析が提案された。しかし、PHを用いて再生した三次元原子像には、光電子波の特性のために虚像や歪みが多く、改良が必要とされている。そこで以前の研究では、PHを応用し二つの光電子回折パターンの差分をとることによって、光電子波の特性を軽減し、三次元像再生を行う微分光電子ホログラフィー(DPH)を提案した。DPHは二種の特性X線を必要とし、放射光を用いない実験室系での適用報告は未だされていない。本研究では実験室系でのDPHを想定し検討されてきた三次元原子像精度や最適条件に関し、光電子運動エネルギーの面から検討した。一方、光電子回折パターンをホログラムとみなし、直接的に結晶の三次元原子像を得る光電子ホログラフィー(PH)による解析は構造モデルを同定することを必要としない究極の構造解析法である。そこで、PHを応用し二つの光電子回折パターンの差分をとることによって、光電子波の特性を軽減し、三次元像再生を行う微分光電子ホログラフィー(DPH)を提案した。DPHは二種のエネルギーのX線を必要とするが、放射光を用いない実験室系での適用報告は未だされていない。本研究では、実験室系でのDPHを想定し検討されてきた三次元原子像精度や最適条件に関し、光電子運動エネルギーの面から検討する。
粒子シミュレーションを用いた樹枝状結晶成長における異方性転移現象の研究

樹枝状結晶の成長形態は非線形・非平衡現象に基づくものであり、特に拡散場の造る形態形成の代表例である。塩化アンモニウム水溶液から成長する4回対称性をもつ樹枝状結晶は過飽和度の増加に伴い、先端成長方向が〈100〉から〈110〉へ転移し、その遷移領域で複雑な先端分岐成長形態を示す。〈110〉成長を混在させながら全体として〈100〉方向に成長する遷移領域の最も低過飽和度側では、通常の〈100〉樹枝状結晶形態から形態転移した規則的先端分岐成長が観察される。塩化アンモニウムの実験結果から、規則的先端分岐成長の成長速度はパルス的に変化し、通常〈100〉成長領域の81μm/sと、〈110〉成長が支配する分岐成長の49μm/s領域とに2分される。また、規則先端分岐成長の平均的な成長速度はこの2つの領域の比率に依存して変化し、過飽和度の上昇とともに成長速度が減少する負性成長特性を示している。一方、結晶界面におけるミクロな粒子運動が形態に与える影響を調べたラプラス場の2次元モデルシミュレーションでは、実験結果に対応する〈10〉成長、〈11〉成長、DBM成長、フラクタル成長形態は再現されたが、規則先端分岐形態は見られなかった。〈10〉成長から規則先端分岐成長への形態転移を調べるため、結晶をとりまく拡散場と、結晶界面上のミクロな粒子運動を考慮した粒子シミュレーションを用いて樹枝状結晶成長の計算を行った。〈100〉方向に成長する結晶先端が濃度勾配の上昇によって〈110〉異方性転移が生じ、これが種となって左右対称の横枝が形成される。横枝の成長が拡散場に影響を与え、結晶先端の濃度勾配を減少させ〈100〉方向に先端が成長する。横枝の影響が無視できるまで成長すると、濃度勾配が上昇して再び〈110〉方向の異方性転移が起こり、これを周期的に繰り返すのが規則先端分岐成長の成長機構である。
形状選択性を有する新規半導体光触媒反応系の構築

光触媒反応にひろく用いられる酸化チタン(IV)(TiO_2)の多くは、細孔をもたない球状の一次粒子から構成されているので、基質の大きさや形状に基づく選択性をもとめることは困難である。本研究では、光触媒能と立体選択性の両方を備えた触媒の開発をめざして、トンネルや層状構造をもつTiO_2(B)あるいはチタン酸化物を調整し、水溶液懸濁系における光触媒活性を検討した。この光触媒反応系におけるメタノールと2-プロパノールの水素生成初速度の比を見ると、市販品は1-2程度の比でメタノール水溶液系の方が大きいにすぎないが、層状構造をもつウロコ鉄鉱状チタン酸(HLe)は、いずれの白金原料を用いた場合でもきわめて大きい速度比を示した。この場合、2-プロパノールはほとんど反応しないことがわかった。この系で、メタノール分子だけがこの触媒の層間に取り込まれるかどうかはまだ確認していないが、内部に侵入する分子の大きさが制限される層状構造により、反応基質の選択が行われている可能性が高い。TIB(TiO_2(B))は市販品と比べて速度が同程度であるうえに、水素生成速度比が若干大きく、アルコールの種類による選択が起こっている可能性が示された。また、HLeと同じような層状の結晶構造をもつ四チタン酸(TTA ; H_2Ti_4O_9)の場合には、塩化白金酸を用いた場合にのみ大きな選択性が得られた。ただ、市販品でも大きな選択性を示す場合がある(Mcrck)ので、その再現性についての確認が必要である。
翻訳後修飾ペプチドを介した植物形態形成の分子機構

植物成長を制御する新しい細胞間シグナルとして,翻訳後修飾を伴った短鎖分泌型ペプチドに注目が集まっている.本研究は,翻訳後修飾ペプチドホルモンのさらなる探索や,受容および細胞内情報伝達機構の解明を基軸として,翻訳後修飾ペプチドを介した植物形態形成や環境応答の分子機構を明らかにすることを目的としている.最終年度においては,ペプチドリガンドの構造および受容体を期間内に明らかにすることができたものの,受容体欠損株の見かけ上の表現型やリガンドを外的に与えた植物体のトランスクリプトームデータだけでは生理機能を知ることが未だ困難なリガンドー受容体ペアについて解析を進めた.その一環として,受容体下流の初期情報伝達に関わる分子群を同定するため,15Nを用いた安定同位体標識法によるリン酸化変動プロテオミクスの系を確立した.独自のアルゴリズムにより,安定同位体を15N硝酸として取り込ませた植物体由来のリン酸化ペプチドを検出し,比較定量することが可能となったため,機能未知および既知のそれぞれのリガンドー受容体ペアについて網羅的解析を進めたところ,一部のペアについてペプチド処理後10分以内にリン酸化されるタンパク質を検出した.その欠損株の表現型やペプチド感受性を引き続き解析している.また,これまでに生理機能を明らかにしたリガンドー受容体ペアについて,その社会実装を視野に入れ,ビーズ固相化受容体を用いてアンタゴニストまたはアゴニストを探索する系を確立した.茎頂メリステムの幹細胞数を制御するCLV3-CLV1/BAM1ペアに着目して,ビーズ固定化BAM1に対するリガンド結合を阻害する低分子化合物を探索したところ,NPD12704アンタゴニストとして同定することに成功した(Commun. Biol. 2019).NPD12704を植物体に与えるとBAM1の欠損と類似した効果を示すことが確かめられた.平成29年度が最終年度であるため、記入しない。平成29年度が最終年度であるため、記入しない。1マメ科植物の根粒数制御に関与するCLEペプチドの構造解明マメ科植物は根粒菌と共生して根粒を形成することにより空中窒素固定を行なっているが,根粒の数は厳密に調節されている.この調節に関わる遺伝子としてCLE-RS遺伝子が同定されていたが,成熟型構造が分かっていなかった.我々は,活性型CLE-RS2ペプチドは13アミノ酸からなるアラビノシル化されたグリコペプチドであることを明らかにし,受容体と考えられていたHAR1に直接結合することも証明した.根粒数の化学的制御につながる成果であり,Nature Commun.に掲載された.2ヒドロキシプロリン・アラビノシル化酵素の同定ヒドロキシプロリン(Hyp)のアラビノシル化は,細胞壁中に含まれる糖タンパク質や一部のペプチドシグナルに見出される植物特異的な糖鎖付加修飾である.しかし,Hypにアラビノースを付加する酵素,Hyp O-arabinosyltransferase(HPAT)は,未だ同定されていなかった.我々は,シロイヌナズナ培養細胞の膜画分からHPATをアフィニティー精製し,ゴルジ体に存在する膜タンパク質であることを突き止めた.シロイヌナズナに3種類あるHPAT遺伝子を破壊すると,胚軸の徒長,細胞壁厚の顕著な減少,花成の促進,葉の老化の促進,および花粉管伸長の異常などが観察された.この成果はNature Chem. Biol.に掲載された.3アラビノシル化ペプチドの化学合成1,2-cis型グリコシドの合成に有効な立体特異的反応であるIntramolecularaglycon deliveryを応用して,アラビノシル化糖鎖修飾を受けたペプチドシグナル群の化学合成経路を確立した.天然からはごく微量しか得られないアラビノシル化ペプチドの生理機能解析が可能になった.今年度の最大の成果は,全身的な窒素吸収制御に関わる長距離移行ペプチドシグナルCEPとその受容体CEPRの発見であり,Science誌に掲載された.植物は地中から窒素を主に硝酸イオンとして吸収しているが,自然界での硝酸イオンの地中分布は,極めて不均一である.そのため,植物は根の一部が局所的な窒素欠乏になった時に,その情報を他の根に伝え,相補的に硝酸イオン取り込みを促進させるしくみを持っている.しかし,systemic N-demand signalingと呼ばれるこの巧妙なしくみの分子メカニズムは解明されていなかった.我々は,様々な構造的特徴を指標に,シロイヌナズナにおいて複数の新規短鎖翻訳後修飾ペプチドシグナル候補群を見出していた.そのひとつであるCEP(C-terminally encoded peptide)ファミリーについて,本研究で確立した受容体発現ライブラリーを用いて直接結合を指標に受容体を探索した結果,2個のCEP受容体が見出され,これらの受容体を欠損させるとsystemic N-demand signalingが失われることを明らかにした.すなわち,根の一部が局所的な窒素欠乏を感知すると分泌型ペプチドCEPが生産され,道管を移行して地上部の受容体CEPRに認識される.受容体が活性化されるとその下流で未知の2次シグナルがつくられ,師管を介して根に移行し,離れた根での硝酸イオン取り込みを促進して,窒素不足を補填している.この発見は,変動する環境に対する植物の巧みな適応能力の一端を分子レベルで明らかにしたものとして大きく注目された.新しいシグナルの同定という研究は,同定できるかできないかの2者択一であるが,今年度は全身的な窒素吸収制御に関わる長距離移行ペプチドシグナルCEPとその受容体CEPRの同定という予想を超える成果に結びついた.

2014年10月にScience誌に掲載された論文は,現時点での被引用件数が既に26件に達し,被引用件数上位0.1 %にランクされるホットペーパーとなっている.また,本論文は,Science誌のPERSPECTIVEに解説記事,Science Signaling誌のEDITORS' CHOICEに紹介記事が掲載され,特にインパクトの大きい論文をとりあげるF1000Primeにも選出されるなど,国際的に高く評価された.これまでペプチドシグナルの研究は形態形成の視点を中心に行なわれてきたが,環境応答における長距離移行ペプチドシグナルの重要性が明らかになったことで,アメリカ植物生物学会で長距離シグナリングのシンポジウムが開かれたり,環境応答における長距離シグナリングを研究の柱のひとつとした新学術領域研究が発足しており,世界の環境応答研究に新しい潮流が生まれつつある.植物成長を制御する新しい細胞間シグナルとして,翻訳後修飾を伴った短鎖分泌型ペプチドに注目が集まっている.本研究は,翻訳後修飾ペプチドホルモンのさらなる探索や,既知因子の受容および細胞内情報伝達機構の解明を基軸としながら,翻訳後修飾のメカニズム,細胞外での分子動態などを解析し,翻訳後修飾ペプチドホルモンを介した植物形態形成や環境応答の分子機構を明らかにすることを目的としている.今年度は,ゲノム情報に基づいたペプチドホルモン候補のスクリーニングとLC-MSによる成熟型構造解析により,21アミノ酸のチロシン硫酸化ペプチドを新たに同定した.このペプチドは根の中心柱で発現し,欠損株では土壌イオン環境応答に異常が見られることが明らかになりつつある.また,ほぼ整備が完了した受容体キナーゼ発現ライブラリを用いて,茎頂メリステム形成に関わるペプチドホルモンであるCLV3がダイレクトに結合する受容体群の解析を行なった結果,従来から知られているCLV1に加えそのホモログであるBAM1に結合したが,もうひとつの受容体としてCLV3シグナリングに関与すると考えられていたCLV2には結合しないことが明らかとなった.これらの結果から,CLV1とBAM1が真のCLV3受容体であり,CLV2は間接的にCLV3シグナリングに関与する補助因子である可能性が示された(Plant J. 2015).さらにこの受容体キナーゼ発現ライブラリを用いて,根端メリステム形成に関わるペプチドホルモンRGFの受容体探索を進めた結果,RGFが直接結合する3つの受容体キナーゼを同定し,これらが重複してRGFの受容に関わることを明らかにした(PNAS in press).新しいシグナルの同定という研究は,同定できるかできないかの2者択一であるが,今年度は,ゲノム情報に基づいたペプチドホルモン候補のスクリーニングとLC-MSによる成熟型構造解析により,21アミノ酸のチロシン硫酸化ペプチドを新たに同定した.
金属-窒素共ドープグラフェンベース酸素還元触媒の高活性化

高効率かつ安価な酸素還元触媒の開発は燃料電池のさらなる普及拡大のために必要不可欠となっている。本研究では鉄と窒素をグラフェン面内に短時間熱処理によって導入した酸素還元触媒(Fe/N-graphene)のさらなる高活性化を目的としている。今年度は高活性化に向けて、Fe/N-grapheneの構造および酸素還元活性メカニズムを放射光を用いて明らかにした。まず広域X線吸収微細構造(EXAFS)によって鉄周りの配位構造を明らかにした。その結果、一般的な炭素触媒を作製するような30minを超えるような長時間の熱処理では容易に切断されてしまう鉄-窒素配位構造が、短時間熱処理によって作製する本触媒においては残存しており、その鉄-窒素配位構造が高密度にグラフェン面内にドープされていることが明らかになった。また、Fe/N-grapheneと窒素を加えずに作製したグラフェン(Fe-graphene)の鉄L端の軟X線吸収分光スペクトルを比較したところ、窒素から鉄への強い電子供与に基づき鉄の電子密度が向上していることが明らかとなった。これにより、鉄から酸素の反結合性π軌道に強いπ逆供与が生じ、その結果、酸素分子のO=O結合が活性化され、酸素還元反応が効率的に進行したと推察された。このように、短時間熱処理で作製した触媒は前駆体の触媒活性を決定する構造的本質(この場合は鉄-窒素配位結合)を残す形で炭素構造内に導入することが可能であることが示された。これは錯体触媒の活性と炭素材料の耐久性の両立した触媒の合成が可能であることを示している。(抄録なし)(抄録なし)高効率かつ安価な酸素還元触媒の開発は燃料電池のさらなる普及拡大のために必要不可欠となっている。(抄録なし)(抄録なし)
ブタ精液中に存在する膠様物の機能解析と応用

ブタ精液中の膠様物の諸特性を解析評価した。膠様物は、強酸性および強アルカリ性で溶解できたが、中性周辺では比較的安定していた。また、子宮内に多く存在する多核白血球の膠様物への走化性はなく、また、極めて高い保水性が認められた。粉末膠様物を精液と混和することで、精子カプセルを作成することが出来、そのカプセル中で一定時間精子が生存でき、また徐々に精子が放出されることを確認できた。化学的な解析により、膠様物はo-グリカンを多く含むことが明らかとなり、糖鎖解析とペプチド解析から特異的な糖鎖とタンパク質を含むことが明らかとなった。これらの知見は、医療分野を含む広い領域で有効活用できる可能性を含む。先ず、ブタ精液中に特徴的な膠様物の諸特性を評価し、精液カプセルとして応用可能か否を検討した。体外での膠様物への多核白血球の走化性を評価した。その結果、膠様物への多核白血球の走化性は認められなかった。次に、膠様物の吸水特性を調べるために、凍結乾燥膠様物粉末を種々の液中で1晩培養(39°C)後に、膠様物塊の吸水量を測定比較した。その結果、培養後の質量ベースで精漿と水間に、変化量ベースでも精漿と水間で有意差があり、精漿存在下で高い吸水量が認められた。膠様物が精子カプセルとして応用可能か否かを調べるために、凍結乾燥膠様物粉末50 mgを精子希釈液1.5 mLに添加後1時間混和し、精子含有膠様物塊を作製した。その後、TL-HEPES-PVA液で洗浄後、39°Cの同液中で1、3、6時間培養し、上澄み液中に含まれる精子の運動性、精子数、生存率を調べた。その結果、培養後に精子含有膠様物塊から培養液中に出た精子数は培養1、3、6時間で多くなる傾向があった(1.03.3 x 106 cells)が、有意差はなかった。精子の生存率(83.886.3%)および運動性(28.833.4%)は、培養時間を通じて差はなかった。以上の結果から、精液中に存在する膠様物は、雌ブタ生殖道内ではPMNsの標的とならず、精漿との吸水相性が良く、精子カプセル作成後も比較的効率的に精子を遊離させることから、ブタ人工授精の精子利用効率を高める精液カプセルとして利用が期待できる。また、凍結乾燥した精液由来膠様物がo-グリカンを多く含み、糖鎖解析およびペプチド解析により独特な糖鎖配列およびタンパク質を含むことを明らかにしている。今後は、これらの知見をさらに発展させ、膠様物特異的な糖鎖を人工合成することでその機能を解析するとともに、その応用活用についても検討を続ける予定である。平成24年度には、膠様物の化学的特性と主要ムチン蛋白質のアミノ酸組成に関する解析を実施した。先ず、pHが精液膠様物の溶解性に及ぼす影響を調べた結果、膠様物は強酸性(pH 1)および強アルカリ性(pH 1213)の条件下で完全に溶解したが、弱酸性中性(pH47)で白濁凝固した状態で安定していた。また、pH23およびpH7.5以上のアルカリ性条件下で膠様物の一部に溶解が認められた。次に、膠様物への多核白血球の走化性の有無について検討したところ、ブタ膠様物への走化性は認められなかった。また、異なる溶媒を用いた際の精液膠様物の保水量を調べたところ、精漿との親和性が高く、保水量が最も高いことが明らかになった。さらに、凍結乾燥したブタ膠様物粉末を精子を含む精液に混和したところゼリー状に凝固することが出来た。その後、膠様物精液を培養液中で培養することで運動精子が培養液中に出てくることを確認した。さらにまた、膠様物のクロマトグラムは、アルカリ処理の有無で大きく変化したことから膠様物に含まれるペプチドには非常に多くの糖鎖(O-グリカン)が結合していることが推察された。トリプシン処理した膠様物のHPLCのクロマトグラムに見られるピークを分取し、プロテインシーケンサーによって膠様物に含まれるアミノ酸のN末端残基について配列分析を行った結果、一部のアミノ酸を特定することができたが、このアミノ酸配列から特定されるタンパク質について、ネット上に公開されているデータベース(Basic Local Alignment Search Tool)で検索を行ってみたものの、この配列をもつタンパク質が未知であるためか、もしくは、既知のタンパク質ではあるが、特定するには情報量として不十分だったためか、具体的なタンパク質の特定には至らなかった。

初年度の計画は、1ブタ膠様物の化学的・生物学的性質の解明と、2ブタ膠様物・類似物質が精子の生存性・受精機能、子宮内免疫機構に及ぼす影響の解明の研究を実施することであった。上記のとおり、これらの研究については概ね実施でき、膠様物の化学的特性と主要ムチン蛋白質のアミノ酸組成に関する解析で種々の知見を得て、膠様物を用いたブタ精液の腟栓および精子カプセル化の可能性が得られた。今後、ブタ膠様物またはその類似物質を用いた人工授精への応用にかかる解析を実施し、平成25年度の実施計画にある3ブタ膠様物およびその類似物の雌性生殖道内での消化機構の解明および人工授精への利用に繋げることができたことから、上記の評価とした。平成25年度以降は、引き続き、上記の平成24年度の研究計画の続きとブタ膠様物およびその類似物の雌性生殖道内での消化機構の解明および人工授精への利用を実施する。膠様物の化学的特性(組成、構造、機能)解析および類似物質の検索は、膠様物に含まれるタンパク質の同定を行うとともに、タンパク質に結合している糖鎖解析を行い、膠様物の特性を明らかにする。ブタ膠様物・類似物質が精子の生存性・受精機能に及ぼす影響の解明を引き続き実施する。また、ブタ膠様物・類似物質注入に対する子宮内膜炎症性サイトカインの遺伝子の発現について検討を行う。ブタ膠様物の代用類似物質または精製物質が、人工授精後に有効に膣栓の役割を果たすか否かについて体外モデル(人造管および屠畜場で得たブタ雌性生殖道系)を用いて明らかにするとともに、研究協力者の協力を得て、体内でも確認する。さらに、研究協力者の協力を得て、実際の人工授精後にブタ膠様物の類似物質または精製物質を子宮内に注入し、少量の精液でも精液の逆流漏出がなく、十分な人工授精成績を上げられるか否かについての試験を行う。平成25年度の必要経費は、初年度に引き続き、培養・解析用器材と膠様物の類似物質の検索および精液に及ぼす影響の解析に必要な免疫組織化学アッセイのための試薬(解析用抗体を含む)である。本研究に協力する大学院生の国内学会発表旅費(2名分)を含む成果発表旅費と、情報提供招聘謝金、学術雑誌での研究成果公表経費・別刷印刷費を計画している。
通性嫌気性細菌中におけるβ-メチルアスパルターゼの機能とその生理学的意義の解明

独自のスクリーニング手法を用いて自然界より選出された微生物をもとにして、近縁種等の保存菌株中や自然界よりさらに広くククリーニングを行ったところ、本酵素は腸内細菌のうちでも特にCitrobacter、Morganella、Klebsiella属の通性嫌気性細菌中に分布していることが判った。2)本酵素活性産生株の培養条件及び培地組成を種々検討したところ、本酵素活性はL-グルタミン酸もしくは3-メチルアスパラギン酸を含む培地を用い、静置もしくは嫌気的に培養した時に、誘導産生されることが判った。3)通性嫌気性細菌中における本酵素の機能を解明するために種々検討を加えたところ、静置もしくは嫌気的に培養した活性株は偏性嫌気性細菌中におけるL-グルタミン酸の嫌気代謝に関与する酵素である、グルタミン酸ムターゼおよびシトラマル酸ハイドロリアーゼ活性を顕著に示すことが判った。4)最適の培養条件下で菌株を大量培養し、得られた無細胞抽出液中より、各種のクロマトグラフィーや塩析等の手法を用いて目的の酵素を均一に精製した。5)精製された酵素の各種酵素学的諸性質を検討したところ、腸内細菌由来の本酵素は、至適温度・pH、安定温度・pH、阻害剤、補酵素の要求性や基質特異性、およびN-末端アミノ酸配列において高い相同性が見られた。以上のように従来、偏性嫌気性細菌中にしかその存在が知られていなかったβ-メチルアスパルターゼを、独自のスクリーニング法により、培養が容易な通性嫌気性細菌中に見いだすことに成功した。本酵素はL-グルタミン酸もしくは3-メチルアスパラギン酸を含む培地を用い、静置もしくは嫌気的に培養した時に、高く誘導産生された。代謝系の酵素活性を測定することにより、本酵素は偏性嫌気性細菌と同様に、L-グルタミン酸の嫌気代謝に関連して存在していことが判った。各種の活性株より本酵素を高度に精製したところ、通性嫌気性細菌由来の本酵素は物理・化学的な性質において、お互いに高い相同性を有するばかりでなく、偏性嫌気性細菌由来の本酵素とも類似点を多く有していることが判り、所期の目的を達成することができた。本研究を進めるにあたって、培地、試薬、ガラス器具等の各種の消耗品を購入するために、本補助金が大いに役立った。
Klein群のCollarについての研究

Gを非初等的Klein群とするとき、次の結果を得た。(1),Gの要素Xが0<1【trace^2】×-41=S<So=2(-1+【√!2】)のとき、Xの軸、g(X)はCollar Nk(s)(X)をもち、その大きさは、【sinh^2】k(S)=【S^(-1)】【(1-S)^(1/2)】-1/2である。(2),X,YはともにGの要素で、XとYで生成される群が非初等的であるとする。また、0<1【trace^2】×-41,1【trace^2】Y-41<So,とするとき、XとYのそれぞれのCollarが互いに素になるようにとれる。(3),JΦrgensenの不等式で等号を与える群を調べた。またその中のある群は(1)で評価されたCollarの大きさの式に対して、漸近的に精密な例を示すことを証明した。(4),(1)における仮定を省くと、Gの要素でCollarをもたないものも存在することを示した。(5),Watermanは任意のKlein群の基本多面体の中に、群に依存しない絶対定数を半経にもつ球がとれることを示した。これを受けて、Collarが存在すればこの意味の球がとれることを示し、この逆は成立しないことを具体例で示した。
環境年代法によるカルスト地形の侵食に関する比較地形学的研究

秋吉台・平尾台の温帯カルストと沖縄諸島の亜熱帯カルストにおける侵食地形の地域差の究明を目的とし、主として層位学的年代法にESR年代法等を採用してカルスト地形の発達過程を明らかにしようとした。(1)温帯カルストは高原性のドリ-ネカルストを特徴とするが、亜熱帯カルストでは沈水カルストと円錐カルストの共存やカルスト谷の発達などきわめて特色ある侵食地形が存在することが明らかとなった。(2)カルスト地域特有の景観としてのカレンフェルト地形の比較研究では、すでに海外で研究されている「カレンの分類」が日本のカルストにも大部分適用できるが、蛇行カレンや石灰岩ペイブメントも稀な例として秋吉台、平尾台にも形成されていることがわかった。また南北大東島のカレンフェルトを秋吉台などの比較すると、明らかに礁性石灰岩の特質と亜熱帯性気候環境下に発達した諸特徴を認めることができた。(3)溶食作用によって形成されるカルスト地形は地表地形と地下の石灰洞地形とが深い関連をもっているし、石灰洞内の鍾乳石の成長は気候環境の変遷と密接な対応関係にある。そこで鍾乳石の成長輪の年代分析によって、第四紀の気候変化と石灰洞の形成年代とを考究し、くわしくは鍾乳石の成長輪のESR年代法による分析、さらにLLMZAによる成長線の解析によって、鍾乳石の成長速度とその時代決定を10^210^4年のオ-ダ-で解明でき、さらに古環境の復元が相当の精度で可能となった。こうした観点から、気候地形としてのカルスト地形の発達過程を明らかにするための基礎研究が方法論的にも実践的にも確立できる見通しを得た。なお一方ではマイクロメ-タ-の設置によって各地の石灰岩の侵食量(溶解量)の測定は継続中であり、また沖縄諸島に特有の沈水カルスト(ドリ-ネ・ウバ-レ・ポリエ)地形は気候変化や地殻変動との関連という新しい観点からさらに精査を必要とする重要な課題である。1.西表島,石垣島,宮古島,南北大東島において,新期サンゴ石灰岩のとところに形成されたカルスト地形とくに石灰岩堤などと沈水カルスト地形とくに沈水凹地形の分布状態が明らかになりつつあり,またこれらの島には同時に円錐カルストが高度100m前後に,散在的に分布していることも,わかってきた.今後の精査によって,その分布範囲を確定し,気候地形学的考察を加えることに,地殻変動の地域差を明らかにしなければならない.2.石垣島,南北大東島,与論島において,隆起した新期サンゴ石灰岩の露頭に形成されるカレンフェルトの地形について精査した結果,秋吉台や帝〓台などの温帯カルストの古期石灰岩の場合と類似した溶食微地形をあらしていると同時に,さらに亜熱帯的環境下に形成されたものとみなされる新しい溶食微地形(ラピエ)の数種を加えることができた.3.石垣島,宮古島,伊良部島,徳之島において,新期サンゴ石灰岩によって形成された数段の海成段丘を切って,きわめて顕著なカルストバレーと石灰洞,凹地形の発達していることが認められ,これらの分布範囲をさらに確定するための調査が必要であり,気候変化や地殻変動と溶食地形の形成過程を考察するための重要な地形の存在することが明らかになった.4石垣島,波照間島,与論島,沖永良部島において採集した鍾乳石の年輪ごとの形成年代をESR年代法によって測定した結果,過去3万年の間におけるその生長過程の変化が,ほとんどそのまま気温や降水量などの気候環境の変化と対応している可能が強いことがわかり,さらに採集資料を増加して再検討し実証性を深め,過去の環境変化を年代的に明らかにしうるならば,さらに石灰岩の侵食量との関係,気候の地域差や地殻変動を十分考慮したカルスト地形の発達過程を地域ごとに比較地形学的にくみ立てる研究へと展開するものと考えられる.秋吉台・平尾台の温帯カルストと沖縄諸島の亜熱帯カルストにおける侵食地形の地域差の究明を目的とし、主として層位学的年代法にESR年代法等を採用してカルスト地形の発達過程を明らかにしようとした。

なお一方ではマイクロメ-タ-の設置によって各地の石灰岩の侵食量(溶解量)の測定は継続中であり、また沖縄諸島に特有の沈水カルスト(ドリ-ネ・ウバ-レ・ポリエ)地形は気候変化や地殻変動との関連という新しい観点からさらに精査を必要とする重要な課題である。琉球列島のサンゴ石灰岩地および秋吉台、平尾台などにおける2年度の調査によって次のような新しい研究成果がえられた。1.平尾台・秋吉台におけるカレンフェルト地形の調査の結果、日本の温帯カルストに発達しにくいと考えられていたメアンダーカレンやカルストペイブメントが新しく発見され、その形成過程の究明が必要となった。(1989年11月日本地理学会発表予定)2.琉球列島の新期サンゴ石灰岩の段丘地形上に形成されているドライバレーの一種として、久米島においてはとくに境界性ウバーレとしての特徴を示す地形が発達しており、カルスト地形の発生機構を解く有力な鍵地形となる可能性がある。さらに究明を必要とするであろう。3.与那国島のカルスト地形は、断層運動による変位の多いポリエ地形が複雑に分布することがわかったが、とくにポリエ湖の存在がはっきりみとられ、小面積の島嶼カルスト地域における地殼運動と関連した凹地形の発生やポリエ湖の形成メカニズムを研究しうる好個のフィールドである事がわかった。4.この研究の成果として特筆できるのは、カルスト石灰洞において採集した多くの鐘乳石の調査の結果、その成長輪の個々のリングのESR年代法による分析によって、第四紀後半の気候変動ー古気候環境の変化ーを推定する方法が確立できると考えられることである。鐘乳石の形成過程は層状構造をなし、その横断面に見られる年輪のリング模様を"成長輪"と呼ぶが、これは明らかに不整合状態で断続的に成長し、その変化曲線は古気候の変動と対応し、さらに石灰岩地のカルスト侵食量の変化と対応関係をあらわしている。本研究法は世界中に広く分布す石灰岩地の環境変遷を明らかにできる一つの有効な手法となりうると考えられる。(1989年4月日本地理学会発表予定)秋吉台・平尾台の温帯カルストと沖縄諸島の亜熱帯カルストの比較地形学的観点からの継続研究の結果、新しい知見と問題の展開を見た。(1)平尾台において、新しく蛇行カレン(日本には稀な例)と石灰岩ペイブメントの存在が確認された。ヨ-ロッパ温帯カルストにおけるものとの比較によって、その成因・形態の特徴が明らかになった。秋吉台にも限られた場所に蛇行カレンが形成されていることも発見された。また結晶質石灰岩の平尾台の円頂型カレンについての成因を精査した結果、石灰岩表面下数cmに層状に生息する藻類が発見され、これによる剥離風化が進行しているためであり、従来の定説とは異なったバイオカルストの観点から新しい研究対象となることがわかった。(この結果は1989年日本地理学会で発表した)(2)前年度新しい展開をみた鐘乳石の成長輪の年代分析によって、第四紀後期の気候変遷の復元が可能であることを示した(これはブダペストおよびフランクフルトの国際学会で報告した)が、さらにLLMZA(Laser Luminescence Mycro Zonal Analysis)によって、鐘乳石の成長輪の詳細な成長線の分析ができ、過去10^210^4間の気候変化が推定できることがわかってきた。すなわちLLMZAから得られたスペクトラムのカ-ブを統計的に処理することによって、鐘乳石の成長速度が求められ、これが気候変化と対応関係にあることが明らかになってきた。(この研究にはソフィア大学のショポフ博士の国際協力を得た)
独自開発のm-CRAベクターによる多能性幹細胞由来の腫瘍細胞治療技術の開発

全能性幹細胞での再生医学の最重要の克服課題は「腫瘍化の阻止」である。特に既に染色体が傷ついた成熟細胞をリプログラミングするiPS細胞においてはこの点が懸念されるが、最新の研究でも「iPS作製時の発癌リスクの軽減」にしか視点がない。よって本研究は「腫瘍化は完全には阻止できない」と考え、「全能性幹細胞から腫瘍化する細胞を除去する新技術を開発する」という、全く違った方向性からこの問題を解決するため、癌遺伝子治療用に独自開発したm-CRAベクターを用いて全能性幹細胞からの腫瘍化細胞を除去する技術を開発する研究を以下のように行なった。1. iPS細胞の未分化、分化段階での内因性発現レベルとプロモーター活性の解析として、ヒトiPS細胞で未分化、ならびに目的(マーカー)遺伝子の内因性発現レベルを調べた。2. m-CRAベクターをヒトiPS細胞に種々の条件で感染させ、未分化、分化状態での、ウイルス増殖の動態や、効率的な感染方法を検証した。条件として、iPS細胞塊での感染、あるいは孤立細胞状態での感染、あるいはウイルス量/細胞量の比(Multiplicity of infection)を様々に変え、目的の高効率の遺伝子導入、ならびに細胞傷害効果が得られる条件などを検証した。種々の新しい結果が得られた。全く新しい試みであり、上記の検証による研究成果は、本挑戦的萌芽研究の目的を達成している。特にm-CRAの新しい有用性にも、iPS細胞の今後の研究の展開についても、大きな示唆を与える重要な成果が得られた。また具体的な結果は特許申請前であることから現時点では発表が難しい段階であるが、現在さらなる発展研究を行なっているのでその成果を待って、特許/論文発表する予定である。
減数分裂期におけるDNA損傷チェックポイント修飾機構の解明

減数分裂期は、減数分裂期特異的な機構と体細胞分裂期システムの修飾を土台として成立すると考えられるが、その詳細は不明である。本研究では、体細胞分裂期のDNA損傷に応答するDNA損傷チェックポイントキナーゼRad53が、減数分裂期に計画的に形成されるDNA二重鎖切断に応答しない生物学的意義について検討した。その結果、減数分裂細胞は、Rad53が促進する体細胞期型の組換え修復を抑えることによって、配偶子形成に必須である減数分裂期組換えを促進する可能性を示した。減数分裂期におけるRad9-Rad53経路の抑制機構とその生物学的意義を理解する目的で研究を行った。課題A-1とA-2では、Rad9の減数分裂期のDNA二重鎖切断(DSB)部位への局在を調べた。Rad9-HAあるいはRad9-YFP融合蛋白を発現する株で、それぞれ染色体免疫沈降と蛍光蛋白局在観察により検討したが、Rad9のDSB部位への結合は観察されなかった。従って、可能性(X)、すなわち減数分裂期にはRad9がDSB部位に局在する事を阻害する因子のあることが示唆された。課題A-3では、Rad9結合蛋白として単離されたp150が、mass spec解析によりSum1であることを明らかにした。Sum1は、減数分裂期中期に誘導される遺伝子群の転写抑制因子であり、減数分裂期特異的な転写活性因子であるNdt80が活性化される時期に不活化される。興味深いことに、Ndt80が活性化されるとRad53活性化の抑制が解除される結果を得つつあり、Sum1の不活化時期と一致することから、Sum1がRad9のDSB局在阻害因子である可能性が考えられる。今後、Sum1とRad9の相互作用の詳細な解析やsum1Δ変異株の解析を行う。課題B-1では、Rad53を減数分裂期特異的DMC1プロモーター下に配置して過剰発現することによって、減数分裂期にRad53を強制的に活性化する系を構築できた。その結果、胞子生存率の低下、減数分裂期細胞周期の遅延が観察された。従ってRad53の活性化の抑制は、減数分裂期の進行に重要である事が示唆された。さらに細胞周期の遅延は、DSBの存在に依存することから、Rad53がDSB形成後の組換え過程に影響を与えることが示唆された。今後、仮説の直接検討となるRad53が姉妹染色体間組換えを促進する可能性をDSBの状態、組換え体の解析により調べる。ゲノムの重篤な傷となるDNA二重鎖切断(DSB)の組換え修復については、DNAレベルの素過程の理解が進んできたが、生体内では、DSBを修復するために組換えの鋳型として姉妹染色体あるいは相同染色体を使うという「染色体の選択問題」が加わる。体細胞期の組換え修復では姉妹染色体間が優位なのに対して、相同染色体の正確な分配を確実にする減数分裂期組換えは相同染色体間で起きる必要がある。しかし、生物学的に重要なこの組換え修復の違いを作る仕組みはよくわかっていない。本年度では、課題AとB共に大きな進展があった。DNA損傷チェックポイントキナーゼRad53(Chk2ホモログ)は、体細胞期では1個のDSBでも活性化されるが、減数分裂期組換えを開始するために計画的に200個近く形成されるDSBに対して活性化されない。そこで課題BではRad53が減数分裂期の計画的DSBに応答しない生理的意義を検討するために、Rad53を減数分裂期で強制的に活性化する系を構築し、その影響を調べた。結果、Rad53は減数分裂期組換え(相同染色体間組換え)を阻害した。さらに減数分裂期組換えに欠損を示すdmc1Δ株では、Rad53の活性化は、体細胞期型の組換え修復(姉妹染色体間組換え)を促進することが示唆された。これはRad53と組換え制御を関連づけた世界で初めての結果であり、「減数分裂細胞はRad53に制御される体細胞期型の組換え修復を抑えることで減数分裂期組換えを促進する」可能性が示唆された。次に減数分裂期のRad53抑制の機構を調べる手がかりとしてRad53を活性化している減数分裂期特異的変異を検索した結果、rec8Δ変異株を得た。よって減数分裂期特異的コヒーシンで染色体構造の要であるRec8ΔがRad53抑制に関与することが示唆された。さらに重要なことに、rec8ΔではRad53活性化が異常な組換えを起こすことを見つけた。従ってRad53抑制制御の異常が減数分裂期組換えエラーの原因となる可能性を示した。
インスリン産生膵β細胞の発生・分化、機能における糖転移酵EXTL3の関与

EXTL3はヘパラン硫酸の生合成に関与する糖転移酵素である。本研究では膵β細胞特異的にEXTL3を欠失したマウスを作製した。このマウスでは膵β細胞の増殖能が低下しており,ランゲルハンス島に特徴的なマントル・コア構造が認められなかった。またインスリン分泌が低下しており,耐糖能異常が認められた。以上の結果から, EXTL3が合成するヘパラン硫酸が,膵β細胞の増殖,インスリン分泌機能において重要な役割を果たしていることが明らかとなった。本研究計画では、ヘパラン硫酸の生合成に関与する糖転移酵素EXTL3遺伝子を膵β細胞特異的に欠失したマウスを作製し、膵β細胞の発生・分化、機能におけるEXTL3の役割を明らかにするとともに、膵β細胞特異的EXTL3欠損マウスを糖尿病モデル動物として開発・利用する。当該年度では以下の成果が得られた。1.膵β細胞特異的にEXTL3遺伝子を欠失したマウスの作製申請者らが作製した膵β細胞特異的にCreレコンビナーゼを発現するマウスを、EXTL3遺伝子の一方の対立遺伝子にloxP配列を有するヘテロ変異マウスと交配していくことにより、EXTL3遺伝子内にloxP配列が挿入された変異遺伝子をホモに持ち、膵β細胞でCreレコンビナーゼを発現するマウスを得た。このマウスでは膵β細胞特異的にEXTL3が欠失することになる。膵β細胞の免疫組織染色、単離膵β細胞のSouthern blot, RT-PCR, Wegtern blot解析によりEXTL3の欠失を確認した。2.膵β細胞特異的EXTL3欠損マウスの膵ランゲルハンス島の形態の解析膵β細胞特異的にEXTL3を欠失したマウスでは、膵ランゲルハンス島の形成過程で異常を生じる可能性が考えられる。そこでEXTL3欠損マウスの膵ランゲルハンス島の形態を、ヘマトキシリン・エオジン染色、抗インスリン抗体を用いた免疫染色により胎児期から成獣になるまで時期を追って観察したところ、2-8週齢のEXTL3欠損マウスではランゲルハンス島あたりのβ細胞の比率が有意に減少しており、ランゲルハンス島に特徴的なマントル・コア構造も認められなかった。また2週齢のEXTL3欠損マウスでは膵β細胞の増殖能がコントロールマウスの29%に低下していた。以上の結果から、EXTL3が出生後のβ細胞増殖に重要な役割を果たしていることが示唆された。1.膵β細胞特異的EXTL3欠損マウス膵ランゲルハンス島の抗ヘパラン硫酸抗体による免疫染色膵β細胞特異的EXTL3欠損マウスの膵ランゲルハンス島を抗ヘパラン硫酸抗体と抗Cre-recombinase抗体により二重染色したところ、抗Cre-recombinase抗体で染色される細胞は抗ヘパラン硫酸抗体で染色されなかった。また,Cre-recombinase(+)/ヘパラン硫酸(-)の細胞は抗インスリン抗体で染色されたことから,EXTL3が欠失した膵β細胞ではヘパラン硫酸が合成されていないことが確認された。2.膵β細胞特異的EXTL3欠損マウスの膵β細胞機能の解析膵β細胞特異的EXTL3欠損マウスの血糖値、血中インスリン値を週齢を追って調べたところ,随時血糖値・インスリン値,空腹時血糖値・インスリン値ともにコントロールのマウスと比較して有意な差は認められなかった。以上の結果を踏まえ,現在膵β細胞特異的EXTL3欠損マウスの耐糖能,膵β細胞特異的EXTL3欠損マウスから分離したランゲルハンス島のインスリン合成能・分泌能,インスリン産生細胞の増殖能について解析を進めている。本研究計画では,ヘパラン硫酸の生合成に関与する糖転移酵素EXTL3遺伝子を膵β細胞特異的に欠失したマウスを作製し,膵β細胞の発生・分化,機能におけるEXTL3の役割を明らかにするとともに、膵β細胞特異的EXTL3欠損マウスを糖尿病モデル動物として開発・利用する。・膵β細胞特異的EXTL3欠損マウスの膵β細胞機能の解析膵β細胞特異的EXTL3欠損マウスの血糖値,血中インスリン値について週齢を追って調べたところ,随時血糖値・インスリン値,空腹時血糖値・インスリン値ともにコントロールのマウスと比較して有意な差は認められなかった。

一方,8-9週齢のマウスを用いて耐糖能試験を行ったところ,膵β細胞特異的EXTL3欠損マウスではインスリン抵抗性については異常が認められなかったが,インスリン分泌が低下しており,耐糖能異常が認められた。また膵β細胞特異的EXTL3欠損マウスから単離したランゲルハンス島では,グルコース刺激,KCl刺激のどちらにおいても,インスリン分泌の低下が認められた。平成21年度までの研究で,膵β細胞特異的EXTL3欠損マウスでは膵β細胞の増殖能の低下によりランゲルハンス島あたりのβ細胞の比率が有意に減少しており,ランゲルハンス島に特徴的なマントル・コア構造が認められなかったことから,EXTL3が出生後のβ細胞増殖に重要な役割を果たしていることが示唆されている。今年度の結果から,さらにEXTL3が膵β細胞のインスリン分泌機能においても重要な役割を果たしていることが明らかとなった。
アイソザイム多型の解析によるマムシグサ群の系統分類学的研究

マムシグサ群の分類学的取り扱いを再検討する目的で、従来からマムシグサ群に含められていた11種類13集団、およびマムシグサ節には含められていたがマムシグサ群としては認められたことがなかったアオテンナンショウ1集団、ツクシマムシグサ2集団、及びオモゴテンナンショウ、ヒガンマムシグサ、ユモトマムシグサ各1集団についてデンプンゲル電気泳動法を用いて同位酵素の解析をおこなった。またその分化のパタ-ンを他のグル-プと比較するため、アマミテンナンショウ、ウラシマソウ、マイヅルテンナンショウ、A.tortuosumおよび熱帯地域に分布するArisaema filiforme(カリマンタン島およびジャワ島から各1集団)A.inclusum(ジャワ島産1集団)A.Iaminatum(カリマンタン島産1集団)A.grapsospadix(台湾産1集団)についても解析しその結果を日本の集団間と比較した。11酵素17遺伝子について解析して集団間の遺伝的近距離を求めた結果、マムシグサ群内の集団間ばかりでなく、アオテンナンショウ、ツクシマムシグサ及びオモゴテンナンショウとそれらの間でも遺伝的距離は0.1以下であり、形態上では明かな分化が認められるにもかかわらず、これらがきわめて近縁であることを示唆した。種内集団間の遺伝的距離はArisaemafiliformeで最大0.14、ウラシマソウで最大0.44であった、これら2種は広い分布域を持っているにもかかわらず、形態的には単型的である。日本産のマムシグサ節においては逆に、遺伝的な分化の程度にくらべ形態上の分化が著しく進んでいることが示された。この結果は、日本産のマムシグサ節が比較的新しい時期に、おそらくは第4紀の氷期と間氷期によって様々な小集団が隔離された結果、形態上の多様化が起こったとする仮説によく一致する。マムシグサ群で認められる形態群は種分化がまだ十分ではなく、変種として扱うのがよいと考えられる。Ohashi&Murata(1980)により、マムシグサ節のマムシグサとしてまとめられた7種類8集団、および同じくマムシグサ節に属しマムシグサに近縁と考えられるオモゴテンナンショウ(1集団)、ヒガンマムシグサ(1)ツクシマムシグサ(2)、ムロウテンナンショウ(1)について、デンプンゲル電気泳動法によりアイソザイムの分離を調べた。12酵素18遺伝子座について明瞭なバンドが検出されたので、これに基づいて遺伝的近縁度を算出した。また比較のため、アマミテンナンショウ節に属するアマミテンナンショウ、ヘンゴダマ、およびマイヅルテンナンショウ節に属するマイヅルテンナンショウとウラシマソウについても同様に調べた。この結果、マムシグサ内の8集団およびオモゴテンナンショウ、ヒガンマムシグサ、ツクシマムシグサ、ムロウテンナンショウの各集団間の遺伝的近縁度はいずれも0.88以上であった。この値は一般に知られる種内集団間レベルの近縁度0.85を上回っており、相互にきわめて近縁であることが明らかとなった。一方、アマミテンナンショウ節、マイヅルテンナンショウ節の調べた種間では遺伝的近縁度が0.65以下であり、一般の種間レベルで知られる分化の程度に達している。これらのことから、マムシグサ群では遺伝的分化が小さいにもかかわらず、外部形態的には明らかな分化が起っていると考えられる。