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グローバル化時代における文化的アイデンティティと新たな世界文学カノンの形成

平成22年度は、「グローバル化時代の世界文学の多様性と多言語性」を主要課題とし、広域英語圏、広域スペイン語圏、ロシア東欧圏の三つの分野を主要な領域としつつ、現代日本も常に視野に入れて研究活動を行なった。まず、広域英語圏については、非英語圏出身作家の英語文体の研究に重点をおき、ジョゼフ・コンラッドやヴラジーミル・ナボコフ、カズオ・イシグロなどの例を取り上げ、彼らの文体の比較検討を中心に、テーマ、世界観などを考察した。代表者沼野によるナボコフ『賜物』、分担者柴田によるコンラッド『ロード・ジム』の新訳と詳細な解説もこの分野での成果である。広域スペイン語圏では、ヒスパニックあるいはラティーノ文学と呼ばれる北米の文学を視野に入れながら、キューバ、コロンビアなどのカリブ海圏の文学に重点を置き、この地域の言語と文学の多様性を研究した。分担者野谷によるエステバン、バニチェリ『絆と権力-ガルシア=マルケスとカストロ』の翻訳および解説もこの分野の成果である。ロシア東欧圏では、この地域における多民族性・多言語性に重点を置き、民族・言語・文化的アイデンティティの関係を研究した。対象となる主な作家は、アブハジア系作家イスカンデル、チュヴァシ系詩人アイギ、ポーランドのユダヤ系作家シュルツなど。また代表者沼野はストックホルム、韓国、モスクワなどの学会で、ロシア東欧文学とアジア・翻訳などのテーマで発表し、この分野における国際的交流を推進した。分担者加藤はドロホビチの国際学会でシュルツについて報告を行なった。上記の様々な分野における研究を統合・発展させる契機として、ゲスト講師を招いての研究集会・セミナーなども積極的に開催した。そのうち特に重要な三つの国際シンポジウム等については、それぞれ報告集をまとめて2011年3月に刊行した(「本郷の春-ナボコフ亡命ロシア作家たちをめぐる連続講義の記録」、「ロシア文学と東アジア」(英語)、「社会制度としてのロシア文学」(ロシア語))。平成23年度は、「現代世界文学と翻訳」を主要課題とし、広域英語圏、広域スペイン語圏、ロシア東欧圏の三つの分野を主要な領域としつつ、世界における日本文学の受容の広がりも視野に入れて研究活動を行なった。具体的には研究代表者・分担者のそれぞれの地域に即して研究を進め、成果を持ち寄って世界的な視野を得るようにつとめた。また、日本文学が各国語にどのように訳され、受容されているか、あるいは外国文学が日本語にどのように訳され、受容されているかを視野にいれ、その際生ずる言語・文化的問題点も検討した。野谷のラテンアメリカ文学と日本の関係についての研究成果、および沼野のロシア文学の日本への影響などが、この方向での主たる成果である。今年度は研究の進展と海外の研究者との交流の深まりにともない、欧米だけでなく、東アジアとの関係も重視しながら、研究活動を行い、予期していたよりも大きな成果を挙げた。柴田の翻訳を主題としたPESETO会議の組織と報告、沼野の第3回東アジア・ロシアユーラシア研究学会におけるパネル「近代日本文学とロシア」の組織などがその主な成果である。また加藤はヨーロッパ辺境地域における多言語的文化のあり方の研究を進め、翻訳によらないマイナー言語のネットワークの可能性という新たな方向の探究も視野に入れて成果をあげつつある。
１分子ＤＮＡの高次構造制御と環境ストレス応答

1.フラボノイド類の抗酸化作用に注目し、ガンマ線照射や光誘起による長鎖DNAの二重鎖切断がどの程度抑制されるかを比較した。2.in vivoで顕著な抗がん活性を有するテトラゾラト架橋白金(II)二核錯体は、DNAに対して特異的な高次構造変化と二次構造変化を引き起こすことを明らかにした。3.南極由来極限環境微生物からメガ塩基対サイズの巨大ゲノムDNAを抽出することに成功し、DNAサイズに応じた折り畳み転移特性を比較検討した。4.キラルな4価のポリアミンの立体異性体(4種類)を合成し、長鎖DNAに作用させたときの凝縮能を比較した。本研究では、100キロ塩基対を越えるDNAを対象として、1分子レベルでDNAの高次構造変化を計測することを中核的な方法論としている。各種抗がん剤や環境変異原物質等の環境ストレスによって引き起こされるDNAの高次構造変化を計測し、その結果を、二次構造変化とも対比させて解析を進める。さらに、各種放射線など、様々な環境因子によって引き起こされるDNA損傷の中でも最も重篤であると考えられる二重鎖切断反応の効率を、その高次構造との関連で定量的に解析することも、重要な課題として位置づけている。平成22年度は、以下の成果が得られた。1.蕎麦の実に多く含まれるルチンや柑橘類の皮に多く含まれるヘスペリジンのグルコース誘導体であるαGルチンとαGヘスペリジンの抗酸化作用に注目し、ガンマ線照射や光誘起による長鎖DNAの二重鎖切断がどの程度抑制されるのかを、蛍光顕微鏡による単一分子観察法を活用して調べた。その結果、光照射に対しては、αGルチンは、αGヘスペリジンの2倍の二重鎖切断抑制作用を示したが、ガンマ線照射においては、両化合物による抑制作用は同程度であることが明らかとなった。線源が違えば抗酸化能の程度も異なることを示した。2.既に、精子核タンパク質であるプロタミンによって高度に凝縮したDNAでは、放射線による二重鎖切断が著しく抑制されていることを明らかにしているが、平成22年度は、塩濃度に依存した、プロタミンによるDNAの高次構造変化の特性をを実験・理論両面から考察した。平成23年度は、以下の成果が得られた。1.in vivoで高抗がん活性を有する新規テトラゾラト架橋白金(II)二核錯体を長鎖DNAに作用させると、不可逆的、かつ特徴的なDNA凝縮を誘起することが明らかとなった。さらにCDスペルトル解析から、二次構造変化(B型→C型)も引き起こされることが明らかとなった。これらの高次構造変化の特性を、生体ポリアミンによる作用と比較した。2.既に生体ポリアミンであるスペルミジンによって高度に凝縮したDNAでは、放射線による二重鎖切断が著しく抑制されていることを明らかにしているが、平成23年度は、メガ塩基対サイズのDNAを南極由来微生物から抽出し、スペルミジンを作用させたときのDNAの折り畳み転移特性を実験・理論両面から考察した。本結果を、これまで明らかにしてきた100キロ塩基対サイズのDNAでの折り畳み転移と比較したところ、DNAのサイズが大きくなる程、ポリアミンに対する感受性が高くなることが明らかとなった。各種抗がん剤や環境変異原物質等の環境ストレスによって引き起こされるDNAの高次構造変化を計測し、その結果を二次構造変化とも対比させて解析を進めた。平成24年度は、以下の成果が得られた。1.in vivoで抗腫瘍活性を有する新規アゾラト架橋白金(II)二核錯体によって引き起こされるDNAの二次構造変化を、経時的にCDスペクトルにより測定し、二段階反応からなる相互作用機構を提唱した。2.キラルな4価のポリアミンの立体異性体4種類(RS-RS, SR-SR, RS-SR, SR-RS)を合成し、長鎖DNAに作用させたときの凝縮能を比較した。DNAはキラルな分子であることから、凝縮剤のキラリティーがDNAの折りたたみ転移に重要な影響を与えることが期待される。蛍光顕微鏡を用いたDNA分子の高次構造変化の直接観察により、凝縮能は、RS-RSが他の異性体に比べて4倍程度高いことが明らかになった。

さらにCDスペクトル測定によりDNAの二次構造変化を調べたところ、RS-RSが他の異性体と比べて顕著に高い活性を示した。また、電子顕微鏡による凝縮DNAの微細構造観察から、4価のスペルミンを用いた場合とは異なる特徴的なミニトロイド構造をとることが明らかとなった。ヒストンタンパク質に代表されるような核タンパク質は、全てキラルな分子であることを考えると、今後ゲノムDNAの構造や機能がキラル相互作用とどのように関連しているかを明らかにしていくことは興味ある研究課題と思われる。平成23年度は、本研究課題の重要な柱であるである「各種抗がん剤や環境変異原物質等の環境ストレスによて引き起こされる長鎖DNAの高次構造変化」について新たな知見を得て、研究を一歩前進させることができた。24年度が最終年度であるため、記入しない。平成23年度に引き続き、上記課題を遂行すると共に、現在、重粒子線によるDNA損傷についても、研究を進めているため、成果に結び付けたいと思っている。
ヒトパピロ-マウイルスによる発がんの解析

ヒトパピロ-マウイルス(HPV)のヒト癌(特に子宮頸癌)発生への関与を明らかにすることを目的とし、本年度は主として以下の結果を得た。1.HPV遺伝子機能についてi)子宮頸癌組織から分離されたHPV16型の癌遺伝子E6E7(ORF)はNIH3T3やNo7(ラット由来)など株化細胞を容易に癌化することが可能である。しかし、初代培養細胞では細胞の不死化が確認されるのみで直ちに癌化は認められない。我々はE6E7遺伝子によって不死化したラット初代培養細胞は長期間継代培養を続けることによって、癌化能を獲得(progression)することを確認し、同progression過程にHPVの遺伝子側に変化なく、細胞側のc-Ki-ras遺伝子が活性化されていることを明らかにした。現在同遺伝子の活性化とprogressionとの関係を検討中である。また雑種細胞作成実験で初代培養細胞にE6E7遺伝子による株化細胞の癌化形質を抑制する働きがあることを認め、同抑制過程がE6E7遺伝子の転写以後であることを明らかにした。ii)HPV16型E6E7(ORF)よってtransformしたラット株細胞から正常復帰細胞を複数株分離した。このうち性状解析を行った一株はHPV遺伝子の癌化機能発現に必要な細胞側因子に変異を起こした細胞と考えられる。2.HPV16のE6E7ORFを持つキメラレトロウイルスによるin vivo子宮頸癌発癌実験、現在までにE6E7遺伝子と低濃度のmethylcholanthrene処理で早期に頸癌が発生する傾向があることを確認している。
東京裁判の国際関係と戦後日本外交

本研究は、東京裁判および戦犯裁判をめぐる国際関係を分析するものである。その研究計画実施過程において米国務省文書、陸軍省法務総監文書、GHQ文書、スティムソン文書ほか多数の一次資料を調査収集し、分析を加えた。この過程において、それまで研究代表者が十分に注目しなかったニュルンベルクと東京の両国際軍事裁判成立にいたる政治過程ーすなわち両世界大戦における戦争犯罪問題ーを実証的に分析することが、第二次大戦後の大規模な戦犯裁判の理解に不可欠であることが判明した。こうして本研究は、具体的な対象時期を1914年から1945年に絞り込んだうえ、特にパリ講和会議における連合国とドイツの対応、第二次大戦中における連合国の政策決定過程を検討することとなった。従来、この問題は、個別の政治過程として欧米研究者によって対象とされてきた。しかし、それらに対日政策への影響という観点を加えて、統一的に検討した研究は存在していなかった。その結果、以下の分析結果が示された。戦犯裁判の基本的論点が第一次大戦後の戦争責任問題においてすでに提起されていたこと、第二次大戦中における米英の対独政策決定が東京裁判にきわめて重要な影響を及ぼしていること、そしてアメリカの政府内政治を契機として1944年秋以降の極めて短期間で国際法が革新されたこと、である。そして今後の研究方向として、東京裁判分析には戦犯裁判全般を見る必要があり、その関連で米陸軍省、イギリス政府の役割にも多大な関心を払う必要があることも示された。こうして本研究成果は、研究代表者の総合的な東京裁判論において極めて重要な前提的理論を提供するものとなっている。まず本年度は、集中的な資料調査を行なった。その結果、かなりの情報が蓄積されたが、なお不十分な部分は来年度および再来年度において継続して補う予定である。本年度の作業において調査収集しえた具体的資料は、国立国会図書館(東京都)所蔵の国務省文書複製版、憲政資料室所蔵の鮎川義介文書複製版、GHQ記録における民政局文書・外交局文書、外務省外交史料館所蔵の戦後外交記録(「日華平和条約一件」)等であり、また立教大学法学部図書室ではForeign Relations of the United Statesを調査した。こうした調査作業と並行して分析作業も行なった。特に東京裁判進行中の諸国の行動を検討した結果、言葉の壁、訴因と関係国の数、証拠の量、日本政治の特異性といった要因から裁判が甚だしく長期化するにつれ、連合国検察官の間には深刻な危機意識と裁判に対する嫌悪感が生じ、こうした感情がいわば第二の東京裁判を阻止する作用を果たしたことが解明された。また、アメリカの外交官ジョージ・ケナンが戦犯裁判の帰趨に対して大きな役割を果していた。この関連で、戦犯裁判の終結過程が裁判の全体的評価にとって極めて重要な問題であることが分析過程で判明したため、来年度以降、裁判終結問題を重視しながら資料の収集分析を進めようと考えている。なお本年度の研究成果の一部については、第4回近現代史フォーラム(平成8年11月31日12月1日、於横浜市)のシンポジウム「東京裁判を考える」において「検察の論理と裁判の展開」と題する報告を行なう機会を得た。この報告内容の子細は平成9年に五十嵐武士東大教授および北岡伸一立大教授の編纂で刊行されるので、その際に上記の研究成果を広く一般にも公表できることになる。第一に、平成8年度に引き続き、多数の未公刊一次資料を調査収集した。来年度の調査活動では、なお洩れる部分を補足することとなろう。本年度は、国立国会図書館憲政資料室所蔵の文書を調査したほか、アメリカ研究資料センターのForeign Relations of the United States、学習院大学所蔵のHenry L.Stimson Diaries複製版を調査し、戦中期におけるアメリカの対独戦犯処罰計画の形成過程に注目した点に特徴がある。第二に、本年度は、調査活動よりも分析作業に重点が置かれた。

これまで収集した資料の大部分についてに眼を通し、その重要文書を分析して総合的に位置づける作業を行なったのである。その結果、戦中期の連合国の対独戦犯処罰計画について注目することの重要性が確認された。これは上記の資料調査によるものだが、ドイツに対する政策決定が基本的に対日戦犯政策に転用されたこと、東京裁判をめぐる争点や議論のかなりの部分が原初的な形ですでに戦時中のワシントンやロンドンに現われていたことが判明したのである。そして、これらの問題については、英米のいくつかのニュルンベルク裁判研究があるものの、対日政策への影響という観点から体系的に検討を加えたものは内外でもほとんど見当たらない。それゆえ極めて大きな検討意義を有しており、この点を重点的に今後研究することを決定した。これは平成8年度の実績報告書に見通しとして予告した終結過程の分析--それ自体もいずれ検討するけれども--に先んじるべき課題であるから、その点で昨年度の予定とは異なる結果となったが、むしろ課題の合理的な修正だと考える。なお平成八年度の研究成果については、平成9年10月、東京大学教授の五十嵐武士、北岡伸一両先生編纂による『[争論]東京裁判とは何だったのか』(菊地書館)において「検察の論理と裁判の展開」との題目で広く一般に公刊することができた。本研究は、東京裁判および戦犯裁判をめぐる国際関係を分析するものである。その研究計画実施過程において米国務省文書、陸軍省法務総監文書、GHQ文書、スティムソン文書ほか多数の一次資料を調査収集し、分析を加えた。この過程において、それまで研究代表者が十分に注目しなかったニュルンベルクと東京の両国際軍事裁判成立にいたる政治過程--すなわち両世界大戦における戦争犯罪問題--を実証的に分析することが、第二次大戦後の大規模な戦犯裁判の理解に不可欠であることが判明した。こうして本研究は、具体的な対象時期を1914年から1945年に絞り込んだうえ、特にパリ講和会議における連合国とドイツの対応、第二次大戦中における連合国の政策決定過程を検討することとなった。従来、この問題は、個別の政治過程として欧米研究者によって対象とされてきた。しかし、それらに対日政策への影響という観点を加えて、統一的に検討した研究は存在していなかった。その結果、以下の分析結果が示された。戦犯裁判の基本的論点が第一次大戦後の戦争責任問題においてすでに提起されていたこと、第二次大戦中における米英の対独政策決定が東京裁判にきわめて重要な影響を及ぼしていること、そしてアメリカの政府内政治を契機として1944年秋以降の極めて短期間で国際法が革新されたこと、である。そして今後の研究方向として、東京裁判分析には戦犯裁判全般を見る必要があり、その関連で米陸軍省、イギリス政府の役割にも多大な関心を払う必要があることも示された。こうして本研究成果は、研究代表者の総合的な東京裁判論において極めて重要な前提的理論を提供するものとなっている。
森林ガス交換系における根系呼吸の生態的非破壊計測

本研究では、掘りとりなどをおこなわず土壌中にある自然状態の根の呼吸量を間接的に測定すること目的とし、鉱質土層表面から放出されるCO_2フラックスから根の呼吸の分離について検討した。まず、鉱質土層表面から放出されるCO_2フラックスの水平的なプロファイルを検討するため、スギ人工林において、2×5mのプロット内の30点において鉱質土層表面からのCO2フラックスを9月12月にかけて定期的に調べた。各測定点の鉱質土層表面からのCO_2フラックスの平均値は地温と高い相関を示し、温度係数Q10の値は2.23であった。各測定点間のバラツキは大きく、また、立木位置に近い測定点ほど、CO_2フラックス量が大きくなる傾向がみられた。次に調査地内の根の現存量の分布を掘りとり調査によって調べた。根の現存量も場所により異なっていた。根を直径1mm以下のスギ細根、1mm以上のスギの小中径根、スギ以外の根の3種類に分類し、それぞれの乾燥重量(w_1、w_2、w_3)を説明変数にとり、鉱質土層表面から放出されるCO_2フラックス(R)についてR=a_0+a_1w_1+a_2w_2+a_3w_3という重回帰モデル式を設定した。各測定日について分析した結果、全測定日14日のうち、9日の測定日において危険率5%で有意な結果となった。このモデル式の係数をもちいて鉱質土層表面からのCO_2フラックスのうち根の呼吸によるものは61%と推定された。この値は、従来のコンパートメントモデルをもちいた研究例によって得られた値に近かった。本研究によって、本方法による根の呼吸速度の推定の可能性が示唆されたが、土壌構造、水分環境が及ぼす影響、根そのものの呼吸活性の季節変化など更に今後の検討が必要である。
インターネットにおける自律型Webサービスの研究

自律型Webサービス(AWS)は、関連サイトにまたがる全体的なビジネスプロセスモデル(BPM)を前提とせずに、各サイトが独自に持つBPMを動的に協調させることで、自由に作られたサイト間でもビジネスプロセスが実行できることを狙いとしている。本研究では、AWSを実現するための基盤ソフトウェアであるAWSミドルウェアについて、その実装方式に関する各種の課題を解決し、全体プロトタイプを実装・評価した。これを通してAWSミドルウェアの基本技術が確立できたとともに、AWSの実現可能性、妥当性、有用性が確認できた。インターネット上での商取引等のビジネストランザクション交換について、従来のWebサービスでは、関連システムすべてが事前に定められたジネスプロセス定義に従うことが前提である。これに対し本研究の究極の目的は、インターネット内のシステムが互いに遭遇した時点で両者のビジネスプロセスモデルを動的に整合化させることで、自由に開発され独自のビジネスプロセスモデルを持つシステム間でも、ベストエフォートでビジネストランザクション処理を実行できる技術(自律型Webサービス;AWS)の創出することである。本研究では特に、AWS実現の基盤となるミドルウェアの基本技術を確立させることを目的としている。ミドルウェアを構成する3つのソフトウェア層について、3層を横断した実装方式、ビジネスプロセスモデルの表現、アプリケーション制御方式、超長期トランザクションの扱いなどの課題を解決し、プロトタイプを開発し、方式の評価を行う。昨年度に関しては先行研究で判明した問題点・課題を整理するとともに、各層ごとに次の点から方式改良を行いプロトタイプを作成し検証した。(1)フレームワーク層:制御方式の改良、APセグメント選択のAPIの整備、(2)モデル協調層:ビジネスプロセスモデル表現の拡張、DMHアルゴリズム実装の改良、(3)メッセージング層:非対称型(Pull型)プロトコルの追加。またミドルウェア全体制御方式の改良などを目的に実応用を想定したベンチマークを作成開始した。昨年度に関しては、AWSミドルウェアの実装方式の理論的整理を行い国際学会に報告するとともに、多数の取引スレッドが同時発生した場合のフレームワーク層アプリケーションインタフェースの改良、3個以上のシステム間での動的モデル協調アルゴリズムの考案、実アプリケーションを想定したベンチマークの作成と評価、そして、セマンティックWebを適用したフォーマットマッチング方式の検討を行った。これに対し本研究の究極の目的は、インターネット内のシステムが互いに遭遇した時点で両者のビジネスプロセスモデルを動的に整合化させることで、自由に開発され独自のビジネスプロセスモデルを持つシステム間でも、ベストエフォートでビジネストランザクション処理を実行できる技術(自律型Webサービス;AWS)を創出することである。昨年度は、動的モデル協調層に関してビジネスプロセスモデルをインターネット内で実行時に交換し協調させる機能を含め実装を完成した。フレームワーク層を継承方式から委譲方式に変更するなどこれまでに判明した問題点を解決した。またWeb上の情報を用いてフォーマットマッチングを決定する基本方式を考案した。さらに実応用を想定した実験を行い、完成したAWSミドルウェアプロトタイプの妥当性と適用性を評価した。更に、3年間の研究成果をまとめ、今後の研究課題を整理した。
安定なRNA干渉を可能にするステーブル細胞株作製技術の開発

本研究ではCre-lox遺伝子挿入系を用い、ゲノム上の特定部位(前もって導入したlox部位)に二本鎖のsiRNAを発現するコンストラクトを正確に単一コピー挿入することによって、確実にRNA干渉をおこなう細胞株の作製を目的とした。本年度は、Ltk-細胞に単一コピーのlox位を含む細胞株、73-14を用い、マウスRet finger protein (RFP)に対するRNA干渉コンストラクトをCre-lox遺伝子挿入系により導入したステーブル細胞株を作製し、その効果を解析した。まず、73-14にRFPのRNA干渉コンストラクトを含むloxターゲティングベクターとCre発現プラスミドをトランスフェクションし、G418での薬剤選択により14個の組換え体を得た。これらの組換え体からゲノムDNAを抽出し、種々のPCRで組換え部位、RNA干渉コンストラクトの存在を確認した。次に、ネオマイシン耐性遺伝子をプローブとしてサザンハイブリダイゼーションをおこない、14クローンすべてがゲノム中のlox部位に正確にRFPのRNA干渉コンストラクトをもつことを確認した。さらに、ターゲティングベクター中のCMVプロモーターをプローブとしサザンハイブリダイゼーションをおこない、14クローン中、11クローンが単一コピーの組換え体であり、残り3クローンは2コピー以上の組換え体であることが判明した。ウエスタンブロティング法により14クローンのRFP干渉による蛋白レベルでの変化を解析した結果、どのクローンでも親株に比べ約50%のノックダウンが観察された。興味深いことにRNA干渉コンストラクトを2コピー以上もつ3個の組換え体でも単一コピーをもつ残り11個の組換え体とノックダウン率に大きな違いが見出せなかった。このことは、コピー数よりもRNA干渉を引き起こすshRNAの塩基配列を変える方がより効果的にRNA干渉をおこなえる可能性を示すと考えられる。本研究ではCre-lox遺伝子挿入系を用い、ゲノム上の特定部位(前もって導入したlox部位)に二本鎖のsiRNAを発現する構築を正確に単一コピー挿入することによって、確実にRNA干渉をおこなう細胞株の作製を目的とする。また、この系ではloxターゲティングプラスミドに2個以上のRNA干渉コンストラクトを挿入することができるため、同時に複数の遺伝子のノックダウンをすることも目指す。本年度は、当初、ヒト子宮頸部がん細胞株HeLaを用いてCre-lox遺伝子挿入系を作製する予定であったが、HeLa細胞のゲノム不安定性のため、自然発生的に薬剤(ネオマイシン)耐性株が生じ、Cre-lox遺伝子挿入系によって得られたクローンの選択が困難であることが判明した。そのため、この系を改良し、HeLa細胞等、ゲノム不安定性を示す細胞でも使用が可能となるようにする一方、すでにCre-lox系が安定に働くマウスのL細胞を用いて本研究を進めることとした。L細胞では単一コピーのlox部位を含む4細胞株(73-14、73-19、73-21、73-28)を用い、マウスRet finger protein(RFP)に対するRNA干渉コンストラクトをCre-lox遺伝子挿入系により導入したステーブル細胞株を作製した。今後、リアルタイムPCR法、ノザンブロッティング法によりRNAレベルでのRFPの変化を解析する一方、ウエスタンブロッティング法により蛋白レベルでの変化についても検討を加える。また、HeLa細胞では初めにlox部位と共にプロモーター、N末の翻訳開始領域を欠く不活性なネオマイシン耐性遺伝子を導入したが、低い頻度でネオマイシン耐性株が生じることが問題であった。そのため、今回は単一のlox部位のみを含む細胞株を作製した。この系についても今後、解析を加えていく。
核小体によるエネルギー代謝制御機構の解析

〈背景・目的〉NMLはrDNAのエピジェネティックな制御を介してrRNA転写を抑制することが分かっている。特に、NMLは飢餓時に活性化し、細胞のエネルギー消費を抑制することが明らかとなっている。本研究では、NMLの個体における機能を明らかにし、それらの詳細な制御メカニズムを解明することを目的にしている。さらにNMLの活性制御技術を開発し、治療薬への応用を目指す。〈結果・考察〉1.個体におけるNMLの機能解析野生型マウスとNML欠損マウスの各臓器におけるrRNAの転写量を比較した結果、肝臓が最も顕著に差が表れていたことから、肝臓にターゲットを絞って解析を進めた。その結果、NML欠損マウスの肝臓では、ATP量が優位に減少していることが明らかになった。また、脂質を分解しエネルギーを作り出す代謝経路が亢進していることと、脂質を合成する代謝経路が抑制されていることも見出した。さらに、NML欠損マウスでは、野生型に比べ酸素消費量が増加しており、個体レベルにおいてもエネルギー代謝の活性が高くなっていることが明らかになった。その結果、NML欠損マウスは腹腔領域の脂肪量が減少し、体重が低くなることが分かった。そこで、肝臓特異的なNML欠損マウスを作製し解析を進めた結果、NML欠損マウスで見られた個体エネルギー代謝の亢進は、肝臓内のNMLが欠損することによって引き起こされることが明らかとなった。2. NML阻害剤のスクリーニングNMLの活性を制御する化合物をスクリーニングし、NMLの活性阻害剤を複数同定した。NML阻害剤を処理した培養細胞においては、rRNAの転写量が増加し、脂質を分解してエネルギーを産生する経路が亢進していることがわかった。つまり、NML阻害剤はNMLの機能を阻害することによって細胞内のエネルギーバランスを制御できることが分かった。〈今後の展望〉NMLによる代謝制御機構の破綻と、疾患との関係を明らかにし、NML阻害剤による治療への応用を目指す。(抄録なし)<背景・目的>NMLはrDNA領域のヘテロクロマチン化を誘導し、エピジェネティックな制御機構によりrRNA転写を抑制する。特に、NMLは栄養飢餓時に活性化し、細胞のエネルギー消費を抑制することでアポトーシスを遅延させることが明らかとなっている。<結果・考察>1.個体におけるNMLの機能解析1-1.肝臓におけるNMLの機能解析野生型マウスとNML欠損マウスの各臓器におけるrRNAの転写量を比較した結果、肝臓が最も顕著に差が表れていたことから、肝臓にターゲットを絞って解析を進めた。1-2.個体全体におけるNMLの機能解析NML欠損マウスでは、野生型に比べ、酸素消費量が増加しており、個体レベルにおいてもエネルギー代謝の活性が高くなっていることが明らかになった。その結果、NML欠損マウスは腹腔領域の脂肪量が減少し、体重が低くなることを見出した。2.NML阻害剤のスクリーニングNMLのSAM結合ポケットに結合しNMLの活性を制御しうる化合物をスクリーニングした。その結果、培養細胞において、rRNAの転写量を増加させる化合物を3つ同定した。<今後の予定>NMLによる代謝制御機構の破綻と、疾患との関係を明らかにし、NML阻害剤による治療への応用を目指す。

つまり、NML阻害剤はNMLの機能を阻害することによって細胞内のエネルギーバランスを制御できることが分かった。〈今後の展望〉NMLによる代謝制御機構の破綻と、疾患との関係を明らかにし、NML阻害剤による治療への応用を目指す。申請者は、NML遺伝子が、核小体におけるrRNA遺伝子の転写を抑制し、核小体によるATP消費系を制御することで、個体の脂質代謝を連動させ、個体のエネルギー代謝にまで影響を及ぼすことを明らかにした。また、2年目に行う予定であった、NMLと疾患との関係についても解析を進めている。さらに、NMLの阻害剤を3つ同定し、細胞のエネルギー代謝に与える影響についても、評価を進めている。NML遺伝子は、核小体におけるrRNA遺伝子の転写を抑制し、核小体によるATP消費系を制御することで、個体の脂質代謝を連動させ、個体のエネルギー代謝にまで影響を及ぼすことが明らかとなった。今後は、肝臓でNMLが脂質の分解代謝を制御する意義を明らかにし、NMLによるエネルギー代謝制御の破綻と、メタボリック症候群をはじめとする代謝疾患との関係を明らかにしていきたいと考えている。また、スクリーニングによりNMLの活性を制御する化合物を3つ同定した。今後は、これらの化合物とNMLの結合を検討し、細胞のエネルギー状態へ与える影響についても評価する。その結果、NML依存的に細胞のエネルギー状態を変化させることのできた化合物については疾患モデルマウスに投与し、マウス個体のエネルギー代謝に対する効果を評価する。(抄録なし)
エピジェネティック制御を介した多能性とゲノム安定性のクロストーク

複製依存的(RD)ヒストン遺伝子の発現制御は転写やmRNAといった遺伝子発現の各段階で特異的な因子によって制御されている。今年度はRDヒストンに特異的な転写因子の一つであるNpatに着目し、CRISPR/Cas9を用いてmCloverでタギングしたES細胞を樹立した。この細胞を用いて抗mClover抗体による免疫染色を行った結果、核内で複数のフォーサイが観察され、それらは抗gH2AX抗体の染色により見られる大きく明るいフォーサイと共局在することが確認された。このことから、gH2AXが転写が活性化しているRDヒストン遺伝子座に集積することが示唆された。また、H2AXのノックアウトES細胞にエキソジェナスなH2AXのcDNAの導入を行った。野生型のcDNAに加え、139番目のセリン(S139)をアラニンに置換したS139A変異体も並行して導入した。これらの細胞を抗gH2AX抗体で免疫染色したところ、S139A変異体でも野生型と同様のシグナルパターンが確認された。マウスではS139に加えS136もリン酸化を受けるとする報告があるため、さらにS136A、S136A/S139Aという変異体を用いて抗gH2AX抗体による免疫染色を行った。その結果S136AS139Aの二重変異体でのみgH2AXによるシグナルが消失し、マウスES細胞ではS136とS139の両方がリン酸化を受けていることが明らかとなった。これまで、マウスES細胞の多能性維持にはS139のリン酸化が必要であると報告されている。しかし、S136のリン酸化についてはゲノム安定性と多能性のどちらの観点からもほとんど解析が進んでおらず、今後その重要性が明らかになる可能性が示唆された。利用していた公開されたChIP-seqに用いられた抗体の特異性に問題が認められた。このため、本研究では当初予定していなかった抗gH2AXによるChIP-seqを行う必要性が生じた。また、研究代表者の雇用形態の変更に伴い、想定していたよりもエフォート率が低下した。これらの理由により、研究課題の進捗に遅れが生じた。本研究の期間は二年間を予定していたが、一年延長し三年間で当初の計画達成を目指す。今後はNpat以外にもRDヒストンの発現制御に関わる因子に関してもCRISPR/Cas9によりタギングを行い、gH2AXと共局在するものを確認する。さらに、RDヒストン遺伝子座を生細胞での可視化を試みる。RDヒストンmRNAの3'-UTRに共有されるStem-loop配列に対するsgRNAと同時にdCas9と蛍光タンパク質の融合タンパク質を発現するES細胞を樹立し、上記因子との共局在を細胞周期を通じて観察する。さらに、S139に加えてS136の機能についても解析を進める。現在、H2AXノックアウトES細胞にエクトピックなH2AXを導入しているが、発現制御などの点で内在性のH2AXの挙動を再現することが困難である可能性が考えられる。この問題を克服するため、CRISPR/Cas9による内在性のH2AXのアミノ酸置換を行う。また、抗gH2AX抗体によるChIP-seqを行い、RDヒストン以外にgH2AXの集積が見られる遺伝子領域を特定する。抗gH2A.X抗体を用いたChIP-qPCRにより、公開されたChIP-seqデータから得られた結合領域のなかで、複製依存的ヒストン遺伝子群の幾つかの遺伝子にgH2A.Xが実際に結合していることを確認した。また、複製依存的ヒストン遺伝子群の遺伝子座に局在し、ヒストンmRNAのプロセシングに機能することが報告されているLsm10とGFPの融合タンパク質をES細胞で発現させ、gH2A.Xとの共局在を免疫染色で検証した。その結果、予想通りGFP-Lsm10のシグナルは核内に12個のfocusを形成し、その近傍には高頻度にgH2A.Xのシグナルが存在することを確認した。これら二つの結果からgH2A.Xは複製依存的ヒストン遺伝子座に局在することが強く示唆された。また、ES細胞におけるgH2A.Xのリン酸化を担うキナーゼを明らかにするため、既知のキナーゼであるATMとATRの特異的阻害剤を用いて解析を行った。その結果ATR阻害剤によりgH2A.Xが顕著に減弱することから、ATRが責任キナーゼであることが確認された。ChIP-seqの結果から、gH2A.Xは転写活性の高い領域に集積する傾向が見られた。そこで、新規合成RNAを可視化し、gH2A.Xの免疫染色シグナルと比較したが、顕著な共局在は見られなかった。さらに、転写阻害剤処理によりgH2A.Xの総量と局在への影響を検証した。こちらも大きな変化は見られず、現在のところ転写はgH2A.Xの主要な発生源ではない可能性が示唆される。一方で、新規合成DNAとgH2A.Xの局在を比較したところ顕著な共局在が見られた。これらのことからgH2A.XはDNA複製に起因して生じることが示唆される。gH2A.XがChIP-seqの結果の示す通り複製依存的ヒストン遺伝子座へ局在することを示唆する結果をChIP-qPCRで得ることが出来た。これに加えて、免疫染色と蛍光タンパク質の強制発現による細胞内局在の解析という異なる方法からもこれを支持する結果を得ることが出来た。

また、gH2A.Xが外的なDNA損傷なしに生じる原因を明らかにするため、その責任キナーゼの同定を試みた。既知のH2A.XキナーゼであるATRとATMについてそれぞれの特異的阻害剤を用いて解析を行った。その結果、ATM阻害剤ではgH2A.Xのシグナルに変化は見られなかったが、ATR阻害剤によりgH2A.Xのシグナルが減弱することから、ATRが主要なキナーゼであることが示唆された。このことはES細胞では何らかの原因で外的なDNA損傷なしにATRがH2A.Xをリン酸化していることを意味しており、今後の解析を進めるうえで非常に有用な情報を得ることが出来たと言える。当初、gH2A.Xは転写と複製が衝突することにより生じるのではないかと予想していた。しかし、転写阻害剤によりgH2A.Xの総量と核内フォーサイに大きな変化は見られなかった。これに対して、新規合成DNAとgH2A.Xが共局在を示す結果を得ている。このことから、少なくともgH2A.Xの一部はDNA複製によって生じることが強く示唆されるため、今後研究の比重をDNA複製によるゲノム安定性の維持と多能性の関連性にシフトしていく予定である。複製依存的(RD)ヒストン遺伝子の発現制御は転写やmRNAといった遺伝子発現の各段階で特異的な因子によって制御されている。今年度はRDヒストンに特異的な転写因子の一つであるNpatに着目し、CRISPR/Cas9を用いてmCloverでタギングしたES細胞を樹立した。この細胞を用いて抗mClover抗体による免疫染色を行った結果、核内で複数のフォーサイが観察され、それらは抗gH2AX抗体の染色により見られる大きく明るいフォーサイと共局在することが確認された。このことから、gH2AXが転写が活性化しているRDヒストン遺伝子座に集積することが示唆された。また、H2AXのノックアウトES細胞にエキソジェナスなH2AXのcDNAの導入を行った。野生型のcDNAに加え、139番目のセリン(S139)をアラニンに置換したS139A変異体も並行して導入した。これらの細胞を抗gH2AX抗体で免疫染色したところ、S139A変異体でも野生型と同様のシグナルパターンが確認された。マウスではS139に加えS136もリン酸化を受けるとする報告があるため、さらにS136A、S136A/S139Aという変異体を用いて抗gH2AX抗体による免疫染色を行った。その結果S136AS139Aの二重変異体でのみgH2AXによるシグナルが消失し、マウスES細胞ではS136とS139の両方がリン酸化を受けていることが明らかとなった。これまで、マウスES細胞の多能性維持にはS139のリン酸化が必要であると報告されている。しかし、S136のリン酸化についてはゲノム安定性と多能性のどちらの観点からもほとんど解析が進んでおらず、今後その重要性が明らかになる可能性が示唆された。利用していた公開されたChIP-seqに用いられた抗体の特異性に問題が認められた。このため、本研究では当初予定していなかった抗gH2AXによるChIP-seqを行う必要性が生じた。また、研究代表者の雇用形態の変更に伴い、想定していたよりもエフォート率が低下した。これらの理由により、研究課題の進捗に遅れが生じた。本研究の期間は二年間を予定していたが、一年延長し三年間で当初の計画達成を目指す。今後、当初の計画通りgH2A.Xを介した多能性とゲノム安定性の協調的制御に関して明らかにしていく。
超高速分光法を用いた水和クラスターイオンの配向緩和と化学反応ダイナミクスの研究

本研究は、超高速分光法を用いた水和クラスターイオンの配向緩和と化学反応ダイナミクスの理解を目標に、今年度は特に、マグネシウム原子に水が溶媒和しか、マグネシウム水和クラスターの構造及び、反応性について研究を進めた。中性マグネシウム水和クラスターを生成し、これらの赤外スペクトルを測定することによって、水和構造を調べ、また、水和だけでは説明できない構造の示唆から水分子と金属との反応の可能性について議論した。マグネシウム水和クラスター生成部の改造を行い、レーザーアブレーションで生成した金属蒸気をジェットに取り込むことで、安定かつ十分な量の中性マグネシウム金属クラスターを生成した。また、生成されたクラスターのイオン化光入射の前に赤外光を入射し、その吸収後に起こる解離による各サイズのクラスター量の増減を調べることで、赤外スペクトルを観測した。その結果、赤外スペクトルは、中心金属から溶媒分子側に電子が移動したイオン対状態を形成していると知られているNa(H_2O)_nクラスターと同様な赤外スペクトルを示したことから、マグネシウムの場合も溶媒分子側に電子が移動しているイオン対状態を形成していることが示唆された。加えて、水素結合していない水のOH伸縮振動領域よりも高波数側にバンドが観測されたことから、マグネシウム金属の周りに水が配位して溶媒和しているのではなく、水素脱離反応(Mg+H_2O→MgOH+H)によって生成したMgOHに溶媒和していることが明らかとなった。本研究は、超高速分光法を用いた水和クラスターイオンの配向緩和と化学反応ダイナミクスの理解を目標に、今年度は特に、アンモニア・メタノール混合クラスターの光励起後の超高速励起状態反応ダイナミクスの研究を行った。超音速分子線中に生成したアンモニア・メタノール混合クラスターをフェムト秒Ti:Sapphireレーザーの4倍波(197nm)で励起し、励起状態のダイナミクスを3倍波(263nm)によるイオン化を利用してプローブした。その結果、励起されたアンモニアクラスターは、非常に速い水素原子移動によってラジカル対([NH_4-NH_2])を生成し、その後ラジカル対の解離や溶媒脱離を伴って、NH_4(CH_3OH)_m(NH_3)_nクラスターが生成することがわかった。さらに、各ステップにおけるダイナミクスの速度の溶媒数依存性を、メタノールとアンモニアの溶媒数が異なるクラスターの時間発展から詳細に調べた。最初に起こる超高速水素原子移動反応はアンモニア同士でのみ起こり、一方、アンモニア-メタノール間では起こらず、[CH_3OH_2-NH_2]のラジカル対は生成しないことが分かった。この超高速反応の有無は、NH_4とCH_3OH_2ラジカルの安定性に由来し、また、水素原子移動反応で促進される互変異性化やECD(electron capture dissociation)における反応中間体として、アンモニウムラジカルが重要であることが示唆された。対して、メタノール分子は、これらの水素原子移動反応を阻害する可能性があることが分かった。これらのことから本研究は、水素原子移動によって誘起される様々な化学反応に関して、クラスターの溶媒分子の種類を変えることでその反応制御が可能であるという重要な情報を与えるものである。
ヒト血小板接着・凝集におけるインテグリンシグナルの解析

血小板の血管壁損傷部位への接着および凝集塊の形成は止血血栓の課程に重要であり、血小板表面のインテグリンが重要な役割を担っている。最近、Gqαの遺伝子欠損マウスの血小板では、すべてのアゴニストによる凝集が抑制されることが明らかにされ、Gqαを介するシグナル伝達経路の解明が重要である。また、Gqα欠損血小板では、shape changeには変化が見られず、GiあるいはG12/G13の関与が示唆された。shape changeは細胞骨格の変化を伴い、関連するシグナリングについて検討した。血小板をトロンビン刺激すると、凝集に伴い細胞骨格の再構築を生じ、多くのシグナル分子(Src,PKC,PLC,Gi,Gqなど)が細胞骨格に移行することを、各種抗体を用いたウエスタンブロッティングにより示した。血小板には数種のPLCアイソフォームが存在し、主なものとしてはβ2,β3,γ1,γ2があり、他に少量のβ1,δ1,β4が検出された。PLCβ3にはa(155kDa)とb(140kDa)が膜とサイトゾル画分にそれぞれ存在し、トロンビン刺激によりインテグリン依存的に再構築された細胞骨格に移行する。また、PLCβ3(a,b)は細胞骨格に移行後、カルパインにより限定分解をうけ100kDaになり、G蛋白質βγサブユニットにより活性が増強され、凝集に関係した後期のDG産生に関与していることが示唆された。血小板のGiとGqは同じβ1γ5であることを抗体を用いて明らかにした。以上の結果から血小板凝集には、アゴニスト刺激によるGqαを介するPLCβ2/3アイソフォームの活性化とインテグリンシグナルにおけるGiのβγによるPLCβ3の活性化の連係が重要であることが示唆された。血小板活性化におけるリガンドのGPIIb/IIIa結合により引き起こされる細胞骨格の再構築、血小板凝集、血餅退縮に至るoutside-inシグナルを明らかにするために、GPIIb/IIIaに対する特異抗体やリガンド結合部位に対するアンタゴニスト(RGDS)を用いて、チロシンリン酸化、イノシトールリン脂質代謝の影響を検討しoutside-inシグナルの実体を解明することを試みた。トロンビン刺激により血小板が凝集すると細胞骨格の再構築が起こり、PI-PLCが細胞骨格に移行する。この移行はGPIIb/IIIaのアンタゴニストRGDSの処理、および特異的抗体により阻害される。したがって、リガンドのGPIIb/IIIa結合によるインテグリンを介するシグナルにPI-PLCの活性化が関与することが示唆された。また、PLCβ3のサイトソル型が特異的に細胞骨格に移行し、このタイプはGβγによって活性化されることが確認された。フィブリノーゲンをコートしたプレートに血小板を蒔き、フィブリノーゲン結合による全チロシンリン酸化を検討したところ、FAKのチロシンリン酸化が増加していた。ヒト血小板のモデル細胞として巨核芽球性白血病細胞Meg-01を用い、血小板への分化過程における上記情報伝達因子の発現様態を検索し、接着凝集シグナル因子を同定することを試みた。まず、分化誘導因子としてPMAによる巨核球への分化誘導を検討した。分化マーカーとしてGPIIb/IIIaの発現増加を調べ、分化が誘導されていることを確認した。本細胞は血小板に存在するものと同じPLCアイソザイムを含み、分化誘導過程におけるPLC,PKCアイソザムの量的変動を検討したところ、PKCβIIとPLCγ2の発現増加が観察された。今後、これらの増加とGPIIb/IIIaシグナルの関連性を検討する。

血小板の血管壁損傷部位への接着および凝集塊の形成は止血血栓の課程に重要であり,血小板表面のインテグリンが重要な役割を担っている。最近、Gqαの遺伝子欠損マウスの血小板では、すべてのアゴニストによる凝集が抑制されることが明らかにされ、Gqαを介するシグナル伝達経路の解明が重要である。また、Gqα欠損血小板では、shape changeには変化が見られず、GiあるいはG12/G13の関与が示唆された。shape changeは細胞骨格の変化を伴い、関連するシグナリングについて検討した。血小板をトロンビン刺激すると、凝集に伴い細胞骨格の再構築を生じ、多くのシグナル分子(Src,PKC,PLC,Gi,Gqなど)が細胞骨格に移行することを、各種抗体を用いたウエスタンブロッティングにより示した。血小板には数種のPLCアイソフォームが存在し、主なものとしてはβ2,β3,γ1,γ2があり、他に少量のβ1,δ1,β4が検出された。PLCβ3にはa(155kDa)とb(140kDa)が膜とサイトゾル画分にそれぞれ存在し、トロンビン刺激によりインテグリン依存的に再構築された細胞骨格に移行する。また、PLCβ3(a,b)は細胞骨格に移行後、カルパインにより限定分解をうけ100kDaになり、G蛋白質βγサブユニットにより活性が増強され、凝集に関係した後期のDG産生に関与していることが示唆された。血小板のGiとGqは同じβ1γ5であることを抗体を用いて明らかにした。以上の結果から血小板凝集には、アゴニスト刺激によるGqαを介するPLCβ2/3アイソフォームの活性化とインテグリンシグナルにおけるGiのβγによるPLCβ3の活性化の連係が重要であることが示唆された。
神経伝達の新しい制御機構：活動依存的な細胞外イオン濃度の変化による制御機構の解明

δ2型グルタミン酸受容体(GluD2)は小脳平行線維シナプスに発現し、Dセリンと結合してシナプス可塑性を制御する。GluD2にはリガンド結合領域にCa2+結合部位があり、Dセリンとの親和性を制御していることがin vitro実験で既に報告されている(Hansen et al. 2009)。本研究課題では、DセリンーGluD2シグナリングが、活動依存的な細胞外Ca2+濃度変化によって生理的にどのような影響を受けるのかを解析し、新規シナプス制御機構の解明を目指した。本年度は、野生型マウス及び、昨年度作製したGluD2のCa2+結合能を阻害した変異型GluD2のノックインマウス(D782A KIマウス)を使って電気生理学的実験を行った。幼若期の野生型及びD782A KIマウスから小脳の急性スライス標本を作製してプルキンエ細胞にホールセルクランプ法を適用し、平行線維シナプスのDセリンーGluD2シグナリングによる長期抑圧応答(DセリンLTD)を記録した。DセリンLTDは、野生型マウスではDセリン投与時に細胞外Ca2+濃度を高くすると抑制される一方、低くすると亢進した。また、D782AKIマウスではCa2+濃度に依存せずDセリンLTDが亢進していることが分かった。生理的条件において、平行線維シナプスが亢進すると周囲を取り囲むバーグマングリアからDセリンが放出されてDセリンLTDが起きる。そこで平行線維シナプスに高頻度電気刺激を繰り返し与えたところ、DセリンLTDが誘発された。一方、細胞外にCa2+緩衝剤BAPTAを投与した条件下で同様の実験を行ったところ、DセリンLTDは抑制される傾向を示した。これらの結果から、DセリンーGluD2シグナリングは、平行線維シナプスの活動依存的な細胞外Ca2+濃度変化によって制御されるという、新規シナプス制御機構の存在が示唆された。中枢神経系において、シナプスは情報処理の基本単位であるが、神経活動に応じて様々な可塑性変化を受ける。Ca2+等の細胞外イオンは神経活動の亢進に伴って変化することが知られているが、シナプス伝達にどのような影響を及ぼすのかあまり解っていない。本研究課題では、DセリンーGluD2シグナリングが、細胞外Ca2+によって生理的にどのような影響を受けるのかを解析し、新規シナプス制御機構の解明を目指す。本年度は、まず先端モデル動物支援プラットフォームの支援を受け、GluD2のCa2+結合部位近傍に点変異を導入したノックイン(KI)マウスをCRISPR/Cas9システムによって作製に取り組んだ。Ca2+の結合を阻害する変異GluD2(D782A)と常時Ca2+が結合した状態を模倣する変異GluD2(D782C+E531C)の2種類を設計した。次年度はこれらを使って電気生理学実験、行動解析を行い、DセリンーGluD2シグナリングへの細胞外Ca2+の影響を明らかする予定である。また、野生型マウスを使った電気生理学実験も並行して行った。幼若期のマウス小脳から急性スライス標本を作成し、プルキンエ細胞にホールセルクランプ法を適用し、平行線維シナプスのDセリンーGluD2シグナリングによる長期抑圧応答(LTD)を記録した。Dセリン投与時に細胞外Ca2+濃度を低下させると、LTDが増大する可能性が示唆された。このことは、DセリンーGluD2シグナリングが細胞外Ca2+濃度によって制御されている可能性を示唆している。本年度は主に幼若期の野生型マウスから作成した急性スライス標本による電気生理学実験によって細胞外Ca2+濃度が、小脳平行線維シナプスにおけるDセリンーGluD2シグナリングに影響を及ぼす可能性について示唆を得た。また、2種類のKIマウス(GluD2のリガンド結合部位近傍におけるCa2+結合を模倣した変異GluD2とCa2+結合能を欠落させた変異GluD2をそれぞれ持つマウス)の作製にも取り組んだが、現在順調に進んでおり、次年度に計画している電気生理実験や行動解析に予定通り取り組める状況にある。

DセリンLTDは、野生型マウスではDセリン投与時に細胞外Ca2+濃度を高くすると抑制される一方、低くすると亢進した。また、D782AKIマウスではCa2+濃度に依存せずDセリンLTDが亢進していることが分かった。生理的条件において、平行線維シナプスが亢進すると周囲を取り囲むバーグマングリアからDセリンが放出されてDセリンLTDが起きる。そこで平行線維シナプスに高頻度電気刺激を繰り返し与えたところ、DセリンLTDが誘発された。一方、細胞外にCa2+緩衝剤BAPTAを投与した条件下で同様の実験を行ったところ、DセリンLTDは抑制される傾向を示した。これらの結果から、DセリンーGluD2シグナリングは、平行線維シナプスの活動依存的な細胞外Ca2+濃度変化によって制御されるという、新規シナプス制御機構の存在が示唆された。次年度は、引き続き1小脳急性スライス標本を使った電気生理学実験に取り組むことに加え、2ローターロッドテスト等の行動解析に取り組み、DセリンーGluD2シグナリングの細胞外Ca2+濃度依存性について、その機能的意義を神経回路レベルだけでなく、個体レベルでも明らかにしていく。1では、野生型マウス、現在作成中のKIマウスを使い、Dセリン投与、細胞外電気刺激などの手法を組み合わせて平行線維シナプスのLTDを指標に詳細に検討する。2については主としてKIマウスを使って実験を行い、細胞外Ca2+による調節機構が小脳性運動学習にどのような影響を及ぼすかを検討する。本年度購入したニコン製正立顕微鏡について、手持ちの部品を一部使いまわすことができたので、当初予定金額よりも安く購入することができた。そのため当該助成金が発生したが、次年度分として請求した助成金と合わせて、使用する予定である。具体的には、実験に必要な動物、その飼育資材、また実験に必要な試薬等の消耗品の費用を拡充する予定である。