hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ニューロン集団数理モデルの深化による短期記憶におけるガンマ波の機能解明

Hopf分岐によってガンマ波が発生している際には遅いリズムへの引き込み同期は確認できなかった一方で、Torus分岐によってガンマ波振幅が遅いリズムで変調されている際にはその変調の周波数が周期外力に対して引き込まれることによって、遅い周期外力への引き込み同期が生じることを数値的に明らかにした。この引き込みについては、生じる条件の解析や生理学的な意味について今後も研究を続けていく予定である。これまでに述べた遅延結合した神経モジュールの解析に加えて、多くのクラスタ化した集団が存在する系において、双安定性やマクロなリズムといったダイナミクスが生じるメカニズムについても今年度は解析を行った。局所回路にとどまらず、皮質間のような大規模ネットワークにおけるガンマ波の同期について解明していく。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
震災を語る方言談話資料の作成　―福島方言の記述と震災記録にむけて―

福島県伊達市方言について80代の話者による195分の談話を談話資料として整備した。また、その談話資料をもとに福島方言の文法分析をおこなった。それと並行して、基礎的な語彙の調査や民話資料の整理もおこなった。これらの取り組みは、福島方言の言語的な記述にむけて基盤となる。この談話資料は、震災後の福島の暮らしを、標準語でなく、福島のことばで記録している。震災後の福島の日常生活の記録としても有効に活用できる。福島県内において、方言による自然談話を対象に、録音収集と文字化整備の作業をおこなった。新規談話の収集については、科研事業以前から協力を得ていた伊達市保原町80代話者を対象に、総計で約210分の録音をおこなった。録音にあたっては、震災に関する語りだけではなく、戦前・戦後の昔語りや、その他の日常の語りも多く集めた。また、峯岸真琴の『言語調査票2000年版』(http://www.aa.tufs.ac.jp/mmine/kiki_gen/query/aaquery-1.htm)を参考に、当該方言における基礎語彙について、120語ほどの収集をおこなった。これは、談話の話題として方言語彙に関する質問をおこなったものだが、副次的に基礎語彙の収集にもつながったものである。談話の文字化整備については、すでに収集済みであった伊達市月舘町90代話者と家族の談話約45分、および郡山市高校生話者による学校での談話約90分を、業者に委託することで文字化した。これらの資料は、日常の何気ない会話をそのまま収集整備することを目指したもので、震災に関することも話題になっているが、それ以外の日常的な話題も多い。震災被害そのものではなく、震災後の福島の日常風景を切り取った記録として、マスメディアや他の震災関連研究の記録にはない価値を持たせたい。また、方言研究のための基礎資料として活用できるものである。新規談話の収集については、伊達市保原町の80代話者を対象に、総計で約240分の録音をおこなった。この話者からは、前年度から継続して多くのデータを収集しており、特定話者の使用言語のありかたを分析するために有用なものとなる。本研究は、社会的なバリエーションではなく、文法面の記述を目指しているため、特定話者のデータを豊富に集めることができたことは、今後の展開に資すると考える。震災から時間が経過しているので、震災関連の話よりも普段の生活の話題が多くなったが、そのこと自体、現在の福島の日常をあらわしており、メディアなどのバイアスのかからない、ありのままの福島の姿を映し出していると考える。また、これも前年度と同様、『言語調査票2000年版』にもとづいて、516語の基礎語彙の収集をおこなった。これまで、「標準語と語形の違う単語」を集めた俚言集は数多く編まれているが、「標準語と語形の似ている単語」をふくめて方言の基礎語彙を網羅的に集める試みは、福島をふくめた日本語諸方言で、ほとんど見られない。これは、一個別言語体系の記述として、必要なことと考える。談話の整備については、福島市内の業者に委託することで、約280分の録音談話を文字化した。今後、研究代表者の白岩自身によるチェックの必要があるが、地元の業者に委託したこともあり、文字化の精度は高いため、文字化整備の作業と並行しておこなう文法面の分析に使用してゆけるものと考える。このほか、特定話者以外の多くの話者からも談話を収集したいが、実際には調査に多くの労力がかかるため、既刊の民話資料などで話者の語りをそのまま文字化したものを利用できないか検討した。民話資料は方言記述にあたって有用なデータであるにもかかわらず、これまで十分有効に活用されていない。どのような民話資料が有効活用できるか整理すれば、今後の方言記述に大いに資することになる。科研事業開始以前から収集していたものをふくめ、現在までに約460分の談話を録音している。また、そのうち、業者委託によって約540分は文字化を済ませている。当初から目標にしている7時間(420分)の談話の文字化にむけて、十分に文字化資料の整備が進んでいると判断した。ただし、実際に資料を完成させるためには、研究者の白岩自身による文字化資料のチェックが必要であり、業者委託で文字化した分の中から適切な談話を選び、文字化資料として刊行する作業が残っている。平成28年度はこの作業に注力しつつ、文法面の分析もあわせておこないたい。なお、当初は、整備できた談話から先に、順次、中間報告書の形で談話資料を刊行し、談話資料の配布で新たに調査協力者を募る予定だったが、すでに相応の量の録音ができているため、中間報告書の刊行は見合わせた。むしろ、文字化の方法や書式などを統一させた形で、最終年度に全ての談話をあわせて刊行するのが適切と判断している。新規談話の録音収集のほか、文字化整備作業を進め、談話資料報告書を完成させた。また、談話資料をもとにした文法面の分析をおこない、学会発表等をおこなったほか、談話資料報告書の別冊としてその成果をまとめた。基礎語彙調査の結果、および、福島県内の民話資料一覧もこの別冊に収めている。談話録音については、伊達市保原町80代女性話者を対象に230分の新規談話の録音をおこなった。また、これまで録音したうち、この話者による総計176分の談話について、業者委託による文字化をおこなった。

今年度まで業者委託等で文字化した談話のうち、195分の談話を白岩自身が聞き直してチェックし、誤りを修正したり個人情報を伏せたりという処理をしたうえで談話資料報告書として完成させた。文法面の分析については、受身関連表現に関する分析結果を日本語文法学会等で発表するととともに、文法項目全般にわたる簡易文法書を作成した。基礎語彙調査については、昨年度までの分とあわせて総計800語の語彙を収集した。そのほか、談話資料に準ずる既刊の資料として、福島県内の民話資料を収集し、言語資料としての有用性を検討したうえで、民話資料一覧としてまとめた。これら、文法面の分析、基礎語彙、民話資料一覧の成果については、談話資料の別冊としてまとめた。なお、談話資料報告書には「話題さくいん」をつけて、震災後の日常でどのようなことが話題になっているか一目でわかるように工夫した。この「話題さくいん」は従来の方言談話資料にはないもので、単に言語資料としてだけでなく、震災後の福島の日常の記録としても資料を活用できるように意図したものである。日常の話しことばによる震災記録として、報道や書籍などの書きことばによる記録とは別の価値を持つことを期している。福島県伊達市方言について80代の話者による195分の談話を談話資料として整備した。また、その談話資料をもとに福島方言の文法分析をおこなった。それと並行して、基礎的な語彙の調査や民話資料の整理もおこなった。これらの取り組みは、福島方言の言語的な記述にむけて基盤となる。この談話資料は、震災後の福島の暮らしを、標準語でなく、福島のことばで記録している。震災後の福島の日常生活の記録としても有効に活用できる。新規に210分の談話を録音し、約135分の談話を文字化整備している。科研事業収集前に収集・文字化済の談話をふくめ、3時間分程度は文字化整備が進んでいるので、本事業の目的である7時間分の自然談話資料の整備にむけて、研究は順調に進展していると考える。平成28年度はこの科研費事業の最終年度にあたるため、すでに業者委託で文字化済の談話を研究代表者の白岩自身でチェックし、総計7時間(420分)の談話の整備を完成させ、この科研費事業の報告書を兼ねた談話資料として刊行する。これが最大の目的であるから、この作業を最優先に考え、注力して取り組みたい。また、これと並行して、談話資料をもとにした文法面の分析もおこなう。本事業は、文字化資料という基礎データの作成自体を主眼としているため、それ自体は、研究発表や論文のテーマにはしにくい。しかし、談話資料をもとに分析できる文法事項は無数にあるから、いくつかのテーマに的をしぼって分析をおこない、整備中の談話資料をもとにして文法記述を進めてゆくことはできる。特に、話者の心情を解釈するのに有効な授受表現などの文法項目が分析の視野に入っている。また、逆使役表現(自発表現)についても、白岩が分担者として参画する別の科研費事業「通言語的観点から分析する逆使役化関連形態法の広がり」(代表者:佐々木冠(札幌学院大))と連携しつつ、分析をおこなう予定である。そのほか、「研究実績の概要」に示したとおり、当初の予定から加えた研究内容として、基礎語彙の収集と民話資料の整理がある。いずれも、従来の方言研究では十分に考えられてこなかった取り組みである。
深刻な森林被害の見られる亜高山域でのオゾンの観測

奥日光の白根山周辺においては以前のより深刻な森林被害が見られる。被害を受けている樹木は特定の樹種に限らず、ダケカンバ等の広葉樹も、オオシラビソ等の針葉樹も広範囲に被害を受けている。この原因が光化学オゾンや、これと植物が放出するテルペン類等の天然炭化水素の反応で生成する過酸化物に由来するのではないかと考え、実際に深刻な被害を受けている高山、亜高山地域でのオゾン濃度の測定を行った。また奥日光にある国立環境研究所奥日光環境観測所において過酸化物の測定を行った。山の上では一般の電源が利用できないため、電池で駆動できる、定電位電解セルを用いた小型オゾンセンサーを利用して山上でのオゾン観測を実施した。また、電池を用いて、短いインターバルでデータを記憶できる小型データロガーをデータの保存に用いた。観測地点は標高2300m付近の山間部であり、当該地には無人の小屋しかないため、観測にあたっては、観測器材や食料を含め一切を人が担いで上がらなければならない。この点に関しては、3年間、自然保護に関心を持つボランティアーの方々の協力を得ることができた。以上のように高山地帯での観測の条件を整えた上で、平成9,10,11年の8月初旬の約10日間、奥日光前白根山頂上直下の鞍部稜線上においてオゾン、気温、風速風向、湿度の測定を行った。9,10年度は悪天候で解析に足るデータが得られなかったが、11年度は90ppb程度の高濃度オゾンが観測された。同時に国立環境研究所奥日光環境観測所で行った観測では日中の過酸化水素とオゾンや日射、イソプレン濃度の間に良い相関が見られた。奥日光の白根山周辺においては以前より深刻な森林被害が見られる。この原因が光化学オゾンや、これと植物が放出するテルペン類等の天然炭化水素の反応で生成する過酸化物に由来するのではないかと考え、まず手始めに、実際に深刻な被害を受けている高山、亜高山地域でのオゾン濃度の測定を行った。高濃度のオゾンが到達していなければ、過酸化物の生成もあり得ないと考えたからである。通常のオゾン測定と異なり、山の上では一般の電源が利用できないため、電池で駆動できるオゾン測定装置の開発が必要である。これには定電位電解セルを用いた小型オゾンセンサーを利用できることを見いだし、また、電池を用いて、短いインターバルでデータを記憶できる小型のデータロガーを入手出来たので、これをデータの保存に用いた。また、観測地点は標高2000m付近の山間部であり、当該地には無人の小屋しかないため、観測にあたっては、観測器材や食料を含め一切を人が担いで上がらなければならない。この点に関しては、自然保護に関心を持つボランティアーの方々の協力を得ることができた。以上のように高山地帯での観測の条件を整えた上で、平成9年8月1日10日に、奥日光前白根山頂上直下の鞍部稜線上においてオゾン、気温、風速風向、湿度の測定を行った。平成9年度の八月上旬は夏型の気圧配置が安定せず、比較的低温で、風向も首都圏とは反対側の北西からの風が多かった。このため、100ppbを越えるような高濃度のオゾンは観測できなかったが、首都圏方向からの風が続くときにはオゾン濃度が高くなる傾向が見られた。また直前の6月末に環境庁が近傍で行った観測では100ppbを越える高濃度オゾンが観測されており、今後さらに観測を続ける必要がある。

被害を受けている樹木は特定の樹種に限らず、ダケカンバ等の広葉樹も、オオシラビソ等の針葉樹も広範囲に被害を受けている。この原因が光化学オゾンや、これと植物が放出するテルペン類等の天然炭化水素の反応で生成する過酸化物に由来するのではないかと考え、まず手始めに、実際に深刻な被害を受けている高山、亜高山地域でのオゾン濃度の測定を行った。高濃度のオゾンが到達していなければ、過酸化物の生成もあり得ないと考えたからである。通常のオゾン測定と異なり、山の上では一般の電源が利用できないため、電池で駆動できるオゾン測定装置の開発が必要である。昨年度より、定電位電解セルを用いた小型オゾンセンサーを利用して山上でのオゾン観測を開始した。また、電池を用いて、短いインターバルでデータを記憶できる小型のデータロガーをデータの保存に用いた。観測地点は標高2000m付近の山間部であり、当該地には無人の小屋しかないため、観測にあたっては、観測器材や食料を含め一切を人が担いで上がらなければならない。この点に関しては、今年度も自然保護に関心を持つボランティアーの方々の協力を得ることができた。以上のように高山地帯での観測の条件を整えた上で、平成10年8月1日9日に、奥日光前白根山頂上直下の鞍部稜線上においてオゾン、気温、風速風向、湿度の測定を行った。平成10年度の八月上旬は雨の日が多く、比較的低温で、風向も首都圏とは反対側の北西からの風が多かった。このため、100ppbを越えるような高濃度のオゾンは観測できなかった。同時に国立環境研究所奥日光環境観測所で行った観測では日中の過酸化水素とオゾンや日射、イソプレン濃度の間に良い相関が見られた。奥日光の白根山周辺においては以前より深刻な森林被害が見られる。この原因が光化学オゾンや、これと植物が放出するテルペン類等の天然炭化水素の反応で生成する過酸化物に由来するのではないかと考え、実際に深刻な被害を受けている高山、亜高山地域でのオゾン濃度の測定を行った。また奥日光にある国立環境研究所奥日光環境観測所において過酸化物の測定を行った。山の上では一般の電源が利用できないため、電池で駆動できる、定電位電解セルを用いた小型オゾンセンサーを利用して山上でのオゾン観測を実施した。観測地点は標高2300m付近の山間部であり、当該地には無人の小屋しかないため、観測にあたっては、観測器材や食料を含め一切を人が担いで上がらなければならない。以上のように高山地帯での観測の条件を整えた上で、平成11年7月31日8月8日に、奥日光前白根山頂上直下の鞍部稜線上においてオゾン、気温、風速風向、湿度の測定を行った。観測の前半には晴天が持続し、90ppbを程度の高濃度のオゾンが観測された。
ラテックス コロイド懸濁液の電気流体特性

標記の研究課題に関する平成9年度の研究実績の概要は次項のごとくである。[1]数ミクロンの粒径のラテックス・コロイド粒子を超純水に分散させた試料を用い、金属電極を付着させたカラス板の電極間隙(1mm)に試料液を滴下して、電極に種々な電圧と周波数の交流電場を印加したときの粒子の運動を顕微鏡で観察し、電場を印加してからの時間変化をビデオ録画した。その画像から、電場によって種々なサイズの粒子集合体が形成される様子を定量的にグラフ化した。電場印加により各孤立粒子に電気双極子モーメントが誘起され、粒子間に異方的な相互作用(双極子・双極子相互作用)が働く。それに伴って、最初は少数個の粒子が電場に平行方向に連結した集合体が生じるが、時間経過とともに集合体の連結により永い鎖状構造に発展する。その際のダイナミクスを、粒径、濃度、電場強度、電場周波数を変化させて、定量的にグラフ化し、電気流体としてのラテックスコロイド懸濁液の基本的特性を実験的に解明した。[2]2次元三角格子モデルに基づき、有限の温度で双極子・双極子相互作用を及ぼし合っている粒子系のダイナミクスを、モンテ・カルロ法による計算機シミュレーションにより調べた。その結果は、半定量的に上記の実験結果と一致することを明らかにした。本研究での本年度の目的は、粒径のよくそろった球状の誘電体コロイド微粒子であるラテックスの希薄懸濁液で、その電気流体特性に関する基礎的性質を実験的に検証することにある。種々な粒径のラテックスを高純度の水相に分散させ、これに外部から電場を加えて粒子に同じ方向の電気双極子モーメントを誘起させることができる。分極粒子の間の静電的相互作用により、電場と平行な方向の引力的相互作用が働き、多数の粒子が鎖状構造が形成され、さらに複数の鎖状構造の集合した束状構造を作ることが予想された。これを実験的に確認し、その生成過程を詳細に調べることが本年度の中心的な目的とされた。実験では、直径数μmの単分散ラテックスの希薄懸濁液(約0.1%)を透明な2枚のガラス板の間の約1mmの電極間隙に入れ、これに数10Vの交流電圧を加えながら、粒子の挙動を顕微鏡下で観察するとともにビデオ録画して、その挙動を解析した。この結果、適当な条件(電圧、周波数、温度)のもとで、予想どおり鎖状構造が生成することが確認された。この鎖状構造は、分散した粒子をその両端に吸引しながらその長さを増す。さらに時間が経過すると、鎖間に生じる弱い結合性相互作用によって、複数本の束となり、さらにそれらの束構造が自己組織的に集合して、複雑な3次元的秩序構造を形成する。電場のもとで、この構造は全体として流動し、きわめてダイナミックな状態をもたらす。ラテックス粒子系でのこのような電気流体の特性は、電圧、周波数、温度、水中イオン濃度などに依存することが、実験的に明らかにされた。次年度では、この特徴的な挙動を理論的に解析するとともに粘性などの流体特性の測定を予定している。
ライプツィヒ大学と初期日本人ゲルマニストに関する研究

研究対象とした藤代禎輔、山口小太郎、尺秀三郎、北里闌、沢井要一、上田整次については藤代と上田が少し研究されていた程度で他の4人に関しては従来全く研究されていなかった。それで彼らの生涯を先ず明らかにする必要があったが、それは大体達成された。特に留学に至る経緯と、留学中の亊蹟について重点的に調査した。ライプツイヒ大学の公文書館に所蔵されている資料により在学期間や住所、それに特に聴講した講義題目を明らかに出来たのは最大の成果だった。彼らが好んで聴講したのは世界的音声学者のジ-フエルス(Sievers)、審美学者のフォルケルト(Volkelt),キョステル(Koster),ヴィトコスキー(Witkowski)それに心理学者ヴント(Wundt)などであった。だが、彼らは自分たちが聞いた講義について感想等をほとんど書き記していない。当時ドイツではW.シェーラー、キョステル等の歴史的、文献学的研究が主流だったが日本の水準からはそれを直ちに導入することは困難だった。それでも上田整次の沙翁劇舞台の変遷に関する研究はそうした方法に依った先駆的な業績と言える。藤代禎輔そうした方法では研究しなかったが、その長所は認め、またドイツ学者の人物に私淑した。山口小太郎と沢井要一の場合は実際のドイツ語を観察することにより意義があったのではないか。科学研究費により本課題研究だけでなく、その周辺の研究にもかなりの成果をあげることが出来た。初期ゲルマニストのうち藤代禎輔,山口小太郎,北里闌については3回の東京出張により著作や伝記資料の調査・収集をほぼ終えることができた。目下それらを解読・分析しつつある。そのほかの尺秀三郎,沢井要一,上田整次についても調査は順調に進んでいる。また厳密にはゲルマニストではないが,調査の副産物として,日本人としてライプツィヒ大学に最初に留学した木下周一(ドイツ法律・政治書の翻訳家,独逸学協会会員,佐賀県出身)に関する資料を収集できたのは本研究のためにも有益である。一方,購入した図書・雑誌(主に古書)によって上記ゲルマニストたちの伝記資料等を補うことができたほか,周辺資料も充実した。これらは将来筆者の他の研究に際しても活用できるものである。ライプツィヒ大学の文書館(アルヒ-フ)に保存されている関連資料は学位論文も含めほぼ収集し終えたので,目下それらを整理・分析している段階である。ドイツにおけるゲルマニステイクの歴史とドイツ人学者の学風については,まだ十分調査研究していないので,今後力をいれて研究したい。研究成果の一部は,紀要その他に発表したほか,本研究の序文も執筆中である。ライプツィヒ大学に留学した初期の邦人ゲルマニストのうち山口小太郎と藤代禎輔についての研究がもっとも進み,ドイツ語修業時代と留学時代を中心とした生涯を執筆中であるが,本年度は京都大学教授時代の藤代の講義題目や伝記資料を現地へ出張して蒐集した。尺秀三郎については訳書「政治小説・出生の間道」(シラ-)の訳文の検討やライプツィヒ大学提出のドクトル論文に目を通したほか,上京して彼のドイツ語教授法に関する文献を調査し,また青山霊園にある墓を調査した。北里闌については,留学中に発表した独文劇「フミオ」「佐倉宗吾」を読み,独文を検討し,ドイツでの書評を調べた。また非常勤先の大学の講義で北里を取り上げた。上田整次については「上田先生の思出」を古書店を通じて入手したので,伝記資料もかなり充実した。彼等の周辺のゲルマニストにも目を向け,本年度はシラ-の「群盗」の初訳者・堀田正次と「独逸国民文学史」の著者・葉山万次郎に関する論文を雑誌発表したほか,山口と藤代の友人である巌谷小波(秀雄)が講師を勤めたベルリン東洋語学校に関する研究も発表した。

さらに研究の過程で,明治20年代に留学,ライプツィヒその他に滞在し,ドイツ演劇書を大量に蒐集した毛利高範(佐伯藩主)という特異な人物に出会い,その資料の調査にも従事している。
代替的な規準のもとでの縮小推定量の比較

本研究では,主として縮小推定量および予備検定縮小推定量を考え,2次および非2次損失関数を仮定して代替的なリスク関数を定式化して,縮小推定量および予備検定縮小推定量のリスク・パフォーマンスを調べた。損失関数の厳密な公式を導出して,理論的・数値的に縮小推定量などの代替的な損失関数のもとでのリスク関数のもつ様々な特性を明らかにした。1.本研究では、Huang(1999)によって提唱された回帰係数を個別に推定するためのリッジ回帰推定量に、ゼロ制約に対する予備検定を導入した予備検定リッジ回帰推定量を考え、LINEX損失関数のもとでのリスク関数を導出した。LINEX損失関数では、通常使用される自乗誤差関数とは違い、過大推定と過小推定を等分に評価しないが、このように非対称な損失関数の場合でも、予備検定を行うことが推定効率を増加させることを示したことは、意義のあることである。2.本研究では、回帰モデルのいくつかの説明変数が誤って省略されるという特定化の誤りがある状況を仮定して、Pitmanの近さ(PN)規準のもとで決定係数(R^2)と自由度修正決定係数(AR^2)を比較した。PN基準を表す確率の精密な公式を導出し、精密な公式に基づいてPN規準を表す確率の数値計算を行い、モデルが正しく特定化されているときにはAR^2がR^2よりも優れているが、特定化の誤りがあるときには、R^2の方がパラメータ空間の広い範囲でAR^2よりも優れていることを示した。通常は、AR^2の方がR^2よりも信頼性が高いとされるが、特定化の誤りがあるときには必ずしもそうではないことを示したことは、意義のあることである。3.本研究では、Huang(1999)によって提唱されたリッジ回帰推定量と最小自乗推定量の一次結合で表される加重平均推定量を考え、LINEX損失関数のもとでの加重平均推定量のリスクを分析した。損失関数の非対称度が大きい場合、リッジ回帰推定量が加重平均推定量および最小自乗推定量よりもパラメータ空間の広い範囲で小さいリスクをもつことを示したことは、これからの研究に一定の方向性を与えるものである。1.本研究では、線形回帰モデルにおける最小平均自乗誤差推定量と自由度修正最小平均自乗誤差推定量で構成される混合型予備検定推定量を考え、この推定量のモーメントの厳密な公式を導出した。次に、導出されたモーメントの厳密な公式を利用して、2次の損失関数を仮定した平均自乗誤差の厳密な公式を導出し、数値計算によって平均自乗誤差のパフォーマンスを調べた。その結果、回帰係数の数が3以上で予備検定の有意水準が0.25以上であれば、混合型予備検定推定量が平均自乗誤差の意味で最小自乗推定量を優越することを示した。また、予備検定の適切な有意水準を選択するための規準を考え、この規準のもとで選択される有意水準を示した。この成果は、Ohtani(2011)として公表した.なお、LINEX損失関数のもとでのリスク分析は、継続課題としたい。2.線形回帰モデルにおけるもう一つの混合型予備検定推定量として、不等式制約付リッジ回帰推定量と最小自乗推定量で構成される混合型予備検定推定量を考え、この推定量のモーメントの厳密な公式を導出した.次に、導出されたモーメントの厳密な公式を利用して、平均自乗誤差の厳密な公式を導出し、数値計算によって平均自乗誤差のパフォーマンスを調べた.その結果、予備検定を導入することにより、平均自乗誤差のパフォーマンスはうまくコントロールされることを示した。この成果は、Namba and Ohtani(2012)として近く公表される予定である。3,平均自乗誤差と代替的な規準のもとでの推定量のリスク分析の一環として、決定係数と自由度修正決定係数をPitmanの近さ規準のもとで比較する研究を行い、大谷(2011)として公表した。1.本研究では,回帰係数を個別に推定する予備検定Stein型推定量を取り上げた。この予備検定Stein型推定量の平均自乗誤差の厳密な公式を導出し,数値計算によってMSEパフォーマンスを調べた。数値計算の結果は,予備検定の帰無仮説が回帰係数がすべてゼロであるときの方が,帰無仮説が推定される特定の回帰係数がゼロであるときよりも平均自乗誤差のパフォーマンスが良くなることを示している。この成果は,Namba and Ohtani (2012)として公表した。2.誤差項の分布が多変量t分布に従うと仮定して,最小平均自乗誤差推定量と自由度を修正した修正最小平均自乗誤差推定量を要素とする同質予備検定推定量(HO-PT推定量)を考え,このHO-PT推定量の平均自乗誤差の厳密な公式を導出し,数値計算によってHO-PT推定量の平均自乗誤差のパフォーマンスを調べた。数値計算の結果は,誤差項の裾が広くなればなる程,最小自乗推定量よりもHO-PT推定量を使用することが平均自乗誤差の意味で有利であることを示している。この成果は,大谷(2013)として公表した。

3.誤差項が多変量t分布に従うと仮定して,修正最小平均自乗誤差推定量とStein型推定量を要素とする異質予備検定推定量を考え,この異質予備検定推定量の平均自乗誤差の厳密な公式を導出し,数値計算によって平均自乗誤差のパフォーマンスを調べた。また,回帰係数の個数が3以上であるときは,予備検定の棄却点が適切に選択されると,異質予備検定推定量が正値Stein型推定量を平均自乗誤差の意味で優越することを解析的に示した。この成果は,Xu and Ohtani (2013)としてまとめられ,現在投稿中である。2つの混合型予備検定推定量のモーメントの厳密な公式を導出することができ、推定量の平均自乗誤差のパフォーマンスを調べ、予備検定を行うことが、平均自乗誤差のパフォーマンスを向上させることを示すことができた。24年度が最終年度であるため、記入しない。本年度では、主として2次の損失関数に基づく平均自乗誤差のもとでの推定量のリスクパフォーマンスについて調べた。次年度では、回帰係数を個別に推定するための混合型予備検定推定童を考え、この推定量のモーメントの厳密な公式を導出する。また、このモーメントの厳密な公式を使って、2次および非2次損失関数のもとでのリスクパフォーマンスについて調べる。
分裂酵母を生きた試験管として使用し動物細胞の高次制御機構を解析する方法の開発

分裂酵母を実験的に再構成する生きた試験管として使用する標的細胞機能として、特に分化の開始機構の解明に力を入れている。これまでに、四種類の新規分化制御因子を分裂酵母で同定した。一つは、Phh1と名付けたストレスシグナルを伝達するMAPキナーゼで、この遺伝子は、分化誘導に必須な転写因子であるStel1の発現ないしその活性を制御する因子である。Phh1の哺乳動物のホモローグはすでに同定されているp38キナーゼで、リンパ球のストレス応答と増殖・分化に関与していることが知られている。第二は、Rcd1と名付けた遺伝子で、窒素源枯渇によって誘導される分化に必須である。解析の結果、分化開始に必須なStel1の転写に係わる因子で最も注目すべき点は、この遺伝子の構造ホモローグが、出芽酵母、線虫、植物、ヒトに存在する。第三は、Nrd1と名付けた遺伝子で、RNA結合蛋白をコードする。前二者と異なり、分化開始を抑制する制御因子である。解析の結果から、この因子の役割は、細胞が十分な栄養飢餓に達するまでStel1によって誘導され、接合と減数分裂に必須な遺伝子の発現制御を行うことによって分化の開始を阻止することと考えられた。興味深いことに、この因子にもRod1と名付けた哺乳動物の機能ホモローグが存在する。巨核球に分化するK562ヒト血球細胞株にRod1を高発現させると、酵母と同じように発現量依存的に巨核球への分化を阻止する活性を示す。成熟ラットの各臓器での発現量は、脾臓、腎臓で多い。第四は、Srw1と名付けた遺伝子で、WD反復配列を7個持つ蛋白をコードする。この遺伝子の破壊株は、完全な分化不能、栄養源飢餓時のG1、G2期停止不全等の多彩な形質を示す。分化不能は、Cyc17-Cdc2キナーゼ複合体がその標的であることが判った。G1、G2期停止不全は、細胞分裂開始サイクリンCdc13の分解が起こらないことによる。以上の結果から、Srw1は栄養源飢餓、すなわち分化刺激に応答してCdc13の分解を促進し、細胞周期を停止させると共に、Cyc17-Cdc2を抑制し分化開始の阻止を除去することによって、分化開始への切り換えを行うものと考えられる。以上述べたように、分裂酵母の分化開始制御機構の全貌が少しずつ見え始めた。さらに、今後高等動物のホモローグ遺伝子の機能同定が進めば、複雑な哺乳類の分化制御機構の解明に突破口が開かれるものと期待される。細胞の増殖と分化の調節機構を一つのモデルとして取り上げ、動物細胞の制御機構の解明に向けて異種生物間遺伝子相補クローニングとそのための変異宿主作り、並びに分裂酵母の制御系の解明する進めている.今年度は、以下に述べる成果を得た.1、G2期進行の制御に欠損のある分裂酵母変異株を機能相補する遺伝子としてヒト線維芽細胞cDNAバンクからWoslと名付けた新しいcDNAを単離した.この遺伝子からスプライシングの違いによって2種のmRNA(Wosl-A,Wosl-B)が作られる。いずれも、酵母のG2変異株を相補できる.Woslの発現は、細胞周期のG1期とS-G2期で起こる.Wosl-A,Wosl-B共に蛋白リン酸化酵素をコードする.Wosl-Bは、これまで知られたいるHRIと同一で、iF2αのリン酸化能を有するが、Wosl-Aにはこのような活性はない.2、同様のスクリーニングでWosl-Aと構造的にも機能的にも類似している分裂酵母のホモログ遺伝子の単離に成功した.この遺伝子の破壊株は、通常の増殖は野生株と変わりないが、熱ショックで増殖停止が起きないことが判明した.ホモログ遺伝子の発現が熱ショックによって一過性に誘導されることから、この遺伝子は、熱ショックによる細胞周期停止に重要な役割を果たしている因子であると考えられる.Wosl-Aの機能を解明するうえで極めて重要な手掛かりが得られたものと考えられる.3:分裂酵母の細胞周期開始に重要な役割を果たしている新しい因子を見いだした.Rep2と名付けたこの因子は、これまでに見いだしたRes2転写因子の活性化サブユニットであることが判明し、細胞周期の開始制御に極めて重要な役割を果たしていることが分かった.さらに、rep2遺伝子の破壊株を相補する2種類のヒトcDNAを単離した.現在これの遺伝子の構造と機能の解析を進めている.分裂酵母を実験的に再構成する生きた試験管として使用する標的細胞機能として、特に分化の開始機構の解明に力を入れている。

解析の結果から、この因子の役割は、細胞が十分な栄養飢餓に達するまでStel1によって誘導され、接合と減数分裂に必須な遺伝子の発現制御を行うことによって分化の開始を阻止することと考えられた。興味深いことに、この因子にもRod1と名付けた哺乳動物の機能ホモローグが存在する。巨核球に分化するK562ヒト血球細胞株にRod1を高発現させると、酵母と同じように発現量依存的に巨核球への分化を阻止する活性を示す。成熟ラットの各臓器での発現量は、脾臓、腎臓で多い。第四は、Srw1と名付けた遺伝子で、WD反復配列を7個持つ蛋白をコードする。この遺伝子の破壊株は、完全な分化不能、栄養源飢餓時のG1、G2期停止不全等の多彩な形質を示す。分化不能は、Cyc17-Cdc2キナーゼ複合体がその標的であることが判った。G1、G2期停止不全は、細胞分裂開始サイクリンCdc13の分解が起こらないことによる。以上の結果から、Srw1は栄養源飢餓、すなわち分化刺激に応答してCdc13の分解を促進し、細胞周期を停止させると共に、Cyc17-Cdc2を抑制し分化開始の阻止を除去することによって、分化開始への切り換えを行うものと考えられる。以上述べたように、分裂酵母の分化開始制御機構の全貌が少しずつ見え始めた。さらに、今後高等動物のホモローグ遺伝子の機能同定が進めば、複雑な哺乳類の分化制御機構の解明に突破口が開かれるものと期待される。分裂酵母の動物細胞の高次制御機構の解明のための生きた試験管として使用するために、遺伝子導入時の選択のためのマーカー遺伝子と酵母変異株を宿主とする異種間機能相補クローニングを進めてきた。200種に及ぶ分裂酵母cDNAの塩基配列を決定し、アミノ酸、糖、核酸、脂質代謝に関わる10数種の遺伝子を単離した。最終的には詳細な解析を待たなければならないが、これらの遺伝子を使って栄養要求性変異株を作成することができると期待される。一方、再構築をする宿主としてのみならず、高等動物の制御機構のモデル系として分裂酵母の有用性を検討した。その代表例として分化開始機構の解明を進めた。その結果、4種の新規制御因子を単離した。細胞分化には、高等生物まで広く保存されたHMGモチーフを持つSte11転写因子が必要である。この4種の新規分化制御因子は、Cyc17と名付けた細胞周期の開始制御にも関与したB型サイクリン、Phh1と名付けたストレスシグナルを伝達するMAPキナーゼ、窒素源枯渇のシグナルの伝達に必要なRcd1タンパク因子、Nrd1と名付けたRNA結合タンパクで、いずれもSte11の発現ないしその活性を制御する因子である。Phh1の哺乳動物のホモログはすでに同定されているp38キナーゼで、リンパ球のストレス応答と増殖・分化に関与していることが知られている。一方、Rcd1は、ゲノムプロジェクトによって構築されたデーターベース検索の結果、酵母からヒトまでアミノ酸レベルで70%以上のホモロジーがあるホモログが存在することが分かった。Nrd1に関しては、機能相補によってラットのホモログを単離した。以上の結果から分裂酵母で明らかになりつつある細胞分化の制御機構が哺乳動物まで広く保存されている可能性が浮かび上がった。分裂酵母を実験的に再構成する生きた試験管として使用する標的細胞機能として、特に分化の開始
13/15族高周期元素間に結合を有する化合物の合成と反応に関する研究

本研究は、高周期13/15族元素であるアルミニウム/リンとの間に単結合を有する化合物「ホスフィノアルマン」を合成し、その反応性について実験的・理論的に明らかにしていくことで、小分子変換反応を基軸とする多成分変換への展開を目指すものである。本研究の第一目標は、ホスフィノアルマンの反応性の解明である。これは、未だほとんど検証がなされていないAl-P結合の反応性をはじめて明らかにするという点で意義深く、第二周期元素であるホウ素を含む化学種や、元素間に結合を持たない化学種との差異を明確にすることができると予想される。さらに、ホスフィノアルマンを利用した新規反応開発や新規材料への展開を試みる。
高次脳機能におけるニューロナルロイシンリッチリピート4の機能解析

まず、高次脳機能におけるNLRR4遺伝子の機能を解析するためNLRR4の発現の解析を行った。ノーザンブロット法を用いて解析行ったところ海馬、視床下部、脊髄や後根神経節に発現が弱いながら認められた。海馬の発生に伴って発現解析を行ったところ出生後0日、7日、14日、成体のすべてで発現が認められ、出生後7日から強い発現が認められ、生後14日で最も強く成体では発現量は半分以下に減少しることが明らかとなった。そこで次ぎにどの細胞がNLRR4遺伝子を発現しているか調べるためin situhybridization法による解析を行った。NLRR4遺伝子は海馬の一部の神経細胞に発現が認められた。生後7日においての神経細胞はシナプス形成が最も盛んな時期であり、NLRR4遺伝子が出生後の時期に海馬の神経細胞のシナプス形成に関わっている可能性を示唆している。さらにNLRR4遺伝子欠損マウスの海馬をシナプスのマーカーであるsynapophysinで免疫染色したところ野生型に比べ顕著な発現の減少が認められた。よって、NLRR4は海馬のシナプス形成に関わる接着因子であることが明らかとなった。まず、高次脳機能におけるNeuronal leucine-rich repeat 4(NLRR4)遺伝子の機能を解析するためNLRR4の発現の解析を行った。ノーザンブロット法を用いて解析行ったところ海馬、視床下部、脊髄や後根神経節に発現が認められた。最も強い発現が認められた後根神経節において、発生に伴って発現解析を行ったところ出生後0日、7日、14日、成体のすべてで発現が認められた。特に、出生後0日から強い発現が認められ、生後7日で最も強く出生後14日では発現量は半分以下に減少し、成体においてはさらに弱い発現が認められた。そこで、どの細胞がNLRR4遺伝子を発現しているか検討するためin situ hybridization法による解析を行った。NLRR4遺伝子は1部の小型の神経細胞に発現が認められた。小型神経は外因性の熱刺激、機械刺激や化学刺激を受容し中枢へとシグナルを伝えることが知られており、NLRR4遺伝子が1次感覚神経で機能している可能性を示唆している。また、生後0日から7日においての神経細胞はシナプス形成が最も盛んな時期であり、NLRR4遺伝子が出生後の時期に後根神経節の小型神経細胞のシナプス形成に関わっている可敵性示唆している。現在、その発現細胞中詳細についてTrkAやRetとの2重染色により解析を行っている。また、NLRR4遺伝子欠損マウスの小型神経細胞の挙動を免疫染色により検討しているところである。
モデル動物を用いたタウオパチーの病態解明と肝細胞増殖因子による治療効果の検討

タウオパチーの1つである家族性前頭側頭葉認知症(FTDP-17)に注目し、FTDP-17の原因となる変異タウ蛋白を発現するFTDP-17モデルマウスを作製して、病態解明を行った。FTDP-17モデルマウス海馬と大脳皮質から試料を調製し、プロテオーム解析を実施した。その結果、野生型と比較し、数種類の蛋白質とリン酸化蛋白質の変動が認められ、これらがFTDP-17の学習記憶障害の病態に寄与していることが示唆された。さらに、FTDP-17モデルマウスに、肝細胞増殖因子(HGF)を発現するマウスを交配してダブル発現マウスを作製し、HGFがFTDP-17の治療薬となる可能性を検討中である。タウ蛋白質は神経軸索内の微小管結合蛋白質の1つで、細胞骨格と神経軸索内の軸索輸送など重要な役割を担っている。何らかの原因でタウ蛋白質に異常(タウ蛋白質の変異、過剰なリン酸化反応など)が生じると、神経細胞内でタウ蛋白質が不溶化して凝集体(神経原線維変化)を形成・蓄積し、その結果、神経細胞死にともなう様々な臨床症状を呈する。この病態をタウオパチーといい、アルツハイマー病、進行性核上性麻痺、ピック病、前頭側頭葉変性症などが知られている。本研究では、タウオパチーの1つで、第17染色体遺伝子に連鎖し、前頭側頭型認知症、パーキンソニズムを示す家族性前頭側頭葉認知症(FTDP-17)に注目し、FTDP-17の病態解明と治療薬開発を目的とする。実験では、これまでに研究代表者らが作製したヒト変異タウ蛋白質を神経特異的に過剰発現するトランスジェニックマウスを用いて、行動学的解析、電気生理学的解析、生化学・組織学的解析を実施している。その際、ヒトでタウ蛋白質の変異部位により様々な表現型(病理所見や臨床所見など)が報告されていることから、2種類の変異タウ蛋白質(N279KとG272V)を過剰発現するトランスジェニックマウスで上記の解析を実施し、表現型の解析を継続している。また、これらのヒト変異タウ蛋白質トランスジェニックマウスに、神経保護作用、学習記憶機能亢進作用および神経新生(再生)作用を示す神経栄養因子である肝細胞増殖因子(HGF)を神経特異的に供給し、FTDP-17に対するHGFの治療効果を検討する。本研究で、これら2種類の過剰発現マウスがFTDP-17の疾患モデルとしての有用性が確認できれば、その病態解明と治療薬開発に結び付くものであると考えている。この病態をタウオパチーという。平成24年度は、これまでに研究代表者らが作製したヒト変異タウ蛋白質を神経特異的に過剰発現するマウスを用いて、行動学的解析、電気生理学的解析、生化学・組織学的解析を実施している。その際、ヒトでタウ蛋白の変異部位により様々な表現型(病理所見や臨床所見など)が報告されていることから、2種類の変異タウ蛋白質(N279KとG272V)過剰発現マウスで上記の解析を実施し、表現型の解析を継続している。本実験で、これら2種類の過剰発現マウスがFTDP-17の疾患モデルとしての有用性が確認できれば、その病態解明と治療薬開発に結び付くものであると考えている。本年度(平成26年度)は、昨年度(平成25年度)から引き続き、これまでに研究代表者らの研究グループが作製したヒト変異タウ蛋白質を神経特異的に過剰発現するマウスを用いて、行動学的解析、電気生理学的解析、生化学・組織学的解析を実施している。

本実験で、これら2種類の過剰発現マウスがFTDP-17の疾患モデルとしての有用性が確認できれば、その病態解明と治療薬開発に結び付くものであると考えている。タウ蛋白質は神経軸索内の微小管結合蛋白質の1つで、細胞骨格と神経軸索内の軸索輸送など重要な役割を担っている。何らかの原因でタウ蛋白質に異常(変異、過剰なリン酸化反応など)が生じると、神経細胞内でタウ蛋白質が不溶化して凝集体(神経原線維変化)を形成・蓄積し、その結果、神経細胞死にともなう様々な臨床症状を呈する。この病態をタウオパチーといい、アルツハイマー病、進行性核上性麻痺、ピック病、前頭側頭葉変性症などが知られている。本研究では、タウオパチーの1つで、第17染色体遺伝子に連鎖し、前頭側頭型認知症、パーキンソニズムを示す家族性前頭側頭葉認知症(FTDP-17)に注目し、これまでに研究代表者らが作製したヒト変異タウ蛋白質を神経特異的に過剰発現するマウスを用いて、行動学的解析、生化学・組織学的解析などを実施し、FTDP-17の病態解明を目的に研究を実施した。ヒト変異タウ蛋白質過剰発現マウスから学習記憶機能に重要な役割をもつ海馬および大脳皮質から蛋白質サンプルを調製し、二次元電気泳動により蛋白質を分離後、野生型マウスと比較して発現変動している蛋白質を質量分析器により同定した。その結果、発現レベルが変動した蛋白質が数種類同定された。また、リン酸化レベルが変動した蛋白質も同定された。従って、同定されたこれらの蛋白質がFTDP-17による学習記憶障害などの病態に寄与していることが示唆された。さらに、FTDP-17の治療薬開発を目的に、ヒト変異タウ蛋白質過剰発現マウスに神経栄養因子の1つである肝細胞増殖因子(HGF)を神経特異的に過剰発現するマウスを交配して作製したダブル過剰発現マウスを用いて、同様の解析を実施し、HGFがFTDP-17に対する有効な治療薬となる可能性を調べている。これが明らかになれば、HGFがFTDP-17をはじめとするタウオパチーの治療薬となる可能性を示唆することになる。タウオパチーの1つである家族性前頭側頭葉認知症(FTDP-17)に注目し、FTDP-17の原因となる変異タウ蛋白を発現するFTDP-17モデルマウスを作製して、病態解明を行った。FTDP-17モデルマウス海馬と大脳皮質から試料を調製し、プロテオーム解析を実施した。その結果、野生型と比較し、数種類の蛋白質とリン酸化蛋白質の変動が認められ、これらがFTDP-17の学習記憶障害の病態に寄与していることが示唆された。さらに、FTDP-17モデルマウスに、肝細胞増殖因子(HGF)を発現するマウスを交配してダブル発現マウスを作製し、HGFがFTDP-17の治療薬となる可能性を検討中である。本研究では、520か月齢までの疾患モデルマウス(2種類の変異タウ蛋白質過剰発現マウス)を用いて、タウオパチーの病態変化を経時的(5、10、15、20か月)に観察している。タウオパチーの病態変化は、行動学的解析、電気生理学的解析、生化学・組織化学的解析により解析しているため、数多くのマウスが必要となる。実験に使用するこれらの疾患モデルマウスは本学動物実験施設内で交配により自家繁殖しているため、本申請時からマウスの準備を進めていた。しかし、予想以上にマウスの産仔数が少なかったため、実験に必要なマウス数の確保が困難となり、現在に至っている。そのため、「補助事業期間延長承認申請書」を提出し、補助期間の延長を承認していただいた。神経薬理学今後の研究の推進方策として、研究計画を遂行する上で、疾患モデルマウス(2種類の変異タウ蛋白質過剰発現マウス)の確保は欠かせないため、これらのマウス数の確保を最優先とし、マウスが確保できしだい、研究計画調書「平成25年度以降」の研究計画にしたがって、速やかに種々の解析を実施していく。
神経突起形成とリモデリングにおけるセプチン細胞骨格の解析

哺乳類胎生期から生後発達期にかけての脳組織でみられる神経細胞の移動や突起伸展においては微小管およびアクチン細胞骨格系が中心的役割を果たす。これらの細胞現象には神経系に大量に発現するセプチン細胞骨格系の関与も示唆されているが、その詳細やメカニズムは不明である。そこで本研究では、マウス神経回路形成過程におけるセプチン機能を探索した。高密度分散培養した大脳皮質ニューロンから必須サブユニットSEPT7をRNAiで欠乏させたところ、軸索と樹状突起の伸展が同程度(約30%)阻害された。類似の所見は大脳皮質体性感覚野ニューロン軸索の対側への投射の阻害としてin vivoで再現された。以上から、軸索・樹状突起に共通するセプチン要求性の伸展機構の存在が示唆された。微小管は軸索や樹状突起を構成する重要な細胞骨格分子であることから、SEPT7欠乏ニューロンにおける微小管の状態を検討した。結果、SEPT7欠乏ニューロンにアセチル化されたalpha-チューブリンが過剰蓄積していることを見出した。本研究により、セプチンがチューブリンのアセチル化を制御して微小管再編成を保障するメカニズムを見出した(投稿中)。細胞骨格系は細胞分裂・細胞運動・形態形成・物質輸送などの生命現象を支える構造基盤である。細胞骨格系を構成する重合性蛋白質にはアクチン、チューブリン、中間径フィラメント、セプチンなどがある。進化的に保存された細胞骨格系自己集合性蛋白質の代表格はアクチンとチューブリンである。一方で、非コンベンショナルな自己集合性蛋白質に分類される細胞骨格系がセプチンである。昨年度より申請者が助教として所属する木下研究室はセプチン系を中心に細胞骨格系の研究を行っている(Curr Opin Cell Biol 2006, 2008など)。これまでに、マウスでは13種類の遺伝子に由来するセプチンが多様な組み合わせでヘテロオリゴマーを形成すること、微小管、アクトミオシンと相互作用して種々の細胞現象に関与することなどを示してきた。セプチンを最も大量に発現する組織は脳であり、神経やグリアでの機能が当該分野の焦点といえる。しかし、セプチン系の多機能性と機能重複のために、これまでに作製された遺伝子破壊マウスの多くは胎生初期に致死となるか軽微な異常しか示さず、神経系のセプチン細胞骨格の生理機能は不明である。そこで本研究では、神経突起伸展におけるセプチンの役割、微小管制御機構、微小管・アクチンとの協調作用を生理的なコンテクストで明らかにすることを目指した。本年度の研究により、大脳皮質形成の初期発達過程において、セプチンが軸索ならびに樹状突起発達に貢献することを複数の実験系で明らかにした(Ageta-Ishihara et al.投稿準備中)。細胞骨格系を構成する重合性蛋白質にはアクチン、チューブリン、中間径フィラメント、セプチンなどがある,進化的に保存された細胞骨格系自己集合性蛋白質の代表格はアクチンとチューブリンである。一昨年度より申請者が助教として所属する木下研究室はセプチン系を中心に細胞骨格系の研究を行っている(Curr Opin Cell Biol 2006, 2008など)。

本年度の研究により、大脳皮質形成の初期発達過程において、セプチンが軸索ならびに樹状突起発達に貢献することを複数の実験系で明らかにした(Ageta-Ishihara et al.投稿中)。また、セプチンがチューブリンの脱アセチル化反応を促進し、微小管ダイナミクスを保障することを見出した(Ageta-lshiha raet al.投稿中)。
遺伝子導入によるヒトiPS細胞から視細胞への分化誘導促進

ES/iPS細胞から視細胞への分化誘導期間を短縮することを目的とし、遺伝子導入による視細胞の分化促進の可能性を検討した。種々の検討にも関わらず当初目的は未解決であるが、その検討過程において、遺伝子導入の効果を検出する方法として視細胞特異的にEGFPを発現するNrl-EGFPマウスiPS細胞を作製し、またレチノイン酸シグナル阻害剤を用いた網膜前駆細胞の誘導効率上昇効果を見つけた。これらの成果は別の網膜再生研究において強力なツールとして働くことが期待される。われわれはこれまでにヒトES/iPS細胞より種々の網膜細胞への分化誘導に成功していたが、視細胞への分化誘導に関しては45ヶ月という長期間の培養が必要であり、より短期間で視細胞取得ができる新しい分化誘導法が望まれていた。視細胞への分化誘導は、ES/iPS細胞から網膜前駆細胞(以下、前駆細胞)への分化誘導と前駆細胞から視細胞への分化誘導の大きく2つのステップに分けることができるが、本年度はまず分化誘導促進を目指した遺伝子導入がそのどちらのステップに効果的であるかを調べるため、マウスES/iPS細胞を用いて種々の分化誘導法による前駆細胞及び視細胞が出現するまでのタイムコースを調べた。前駆細胞の検出は主にRx-GFPノックインES細胞を用い、視細胞(杆体)の検出にはNrl-GFPトランスジェニックマウスよりiPS細胞を新たに作製して用いた。その結果、前駆細胞の出現は分化誘導開始から78日めといずれの分化誘導法でも大差はなかったが、視細胞(杆体)の出現時期は分化誘導開始から1529日と分化誘導条件により大きく変化した。このことから分化誘導前半の前駆細胞誘導は条件にかかわらずある程度の誘導期間が必要であるのに対し、後半部の前駆細胞から視細胞への分化誘導ステップは条件次第で期間短縮が可能であり、適切な転写因子群の遺伝子導入による分化誘導促進も可能性があると考えられた。長期間を要する視細胞誘導条件の際に発現が遅れる転写因子が分化誘導の律速段階と考えられ、導入遺伝子の候補となり得る。われわれはこれまでにヒトES/iPS細胞より種々の網膜細胞への分化誘導に成功していたが、視細胞への分化誘導に関しては45ヶ月という長期間の培養が必要であったため、より短期間で視細胞取得ができる新しい分化誘導法の検討をおこなっている。前年度の結果において、分化誘導前半の前駆細胞誘導は条件にかかわらずある程度の誘導期間が必要であるのに対し、後半部の前駆細胞から視細胞への分化誘導ステップは条件次第で期間短縮が可能であり、適切な転写因子群の遺伝子導入による分化誘導促進の可能性があることが示唆された。しかし従来の培養条件では網膜前駆細胞誘導効率が高くなく、遺伝子導入効率等を考慮するとその後の視細胞誘導条件を検討するには不十分であると考えたため、まず網膜前駆細胞誘導効率のさらなる改善を検討した。様々な基礎培地や添加物を検討した結果、基礎培地をGMEMからNeurobasal培地に変更し、さらにRARアンタゴニストを添加することで網膜前駆細胞の誘導効率が30%以上となり、十分に遺伝子導入検討実験に使用できる量の網膜前駆細胞の調製が可能になった。視細胞誘導への外来遺伝子導入に関してはレンチウイルスベクター系を採用し、ベクター構築からおこなった。前年度にNrlプロモーター下にEGFPを発現するマウスiPS細胞を作製していたため、導入遺伝子の下流にIRESでmCherryを発現するレンチウイルスベクターを構築し、またその外来遺伝子の発現量を調整可能なようにドキシサイクリン誘導性のプロモーターを上流に置いている。これまでにCrxやOtx2等約20の候補遺伝子群についてベクター構築をほぼ完了している。われわれはこれまでにヒトES/iPS細胞より種々の網膜細胞への分化誘導に成功していたが、視細胞への分化誘導に関しては45ヶ月という長期間の培養が必要であったため、より短期間で視細胞取得ができる新しい分化誘導法の検討をおこなってきた。前年度までの結果において、網膜前駆細胞(以下、前駆細胞)から視細胞への分化誘導ステップが条件次第で期間短縮の可能性があることを示し、また前駆細胞への遺伝子導入による視細胞誘導を検討するにあたって問題となっていた、前駆細胞の収率の低さを至適培地の検討とRARアンタゴニストの添加により克服したことを報告した。これらの結果をベースに、本年度は遺伝子導入による視細胞誘導検討を行なった。具体的には、Nrl-EGFPマウスiPS細胞からの視細胞誘導培養を行ない、前駆細胞の出現するステージ(誘導開始後7-10日)でRax, Crx, Neurod1等のcDNAを発現するレンチウイルスを感染させ、EGFPの蛍光発現を指標に視細胞(杆体)の産生を調べた。その結果、EGFPの発現は20日目以降で出現したが、これまでの検討より遺伝子導入を行なわない種々の分化誘導条件での視細胞出現時期が誘導開始後1529日目であったことから、遺伝子導入による分化誘導促進効果は認められなかった。