hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
外来遺伝子導入によるシュワン細胞分化制御とこれを用いた人工神経の開発についての研

末梢神経損傷の治療において培養シュワン細胞と人工チューブ併用した人工神経が注目されている。我々は人工神経に組み込まれるシュワン細胞に遺伝子導入することで、より高い軸索支持、髄鞘形成能を有する人工神経の開発を目指している。本年度はシュワン細胞の機能をin vitroで評価するための実験系の確立と、アデノウィルスベクターを用いた遺伝子導入の機能解析を行なった。1細胞培養実験系の確立:ラット坐骨神経よりシュワン細胞を分離・初代培養を行なう実験系を確立した。またin vitroにて髄鞘形成を観察するためラット後根神経節からニューロンを分離し、前述のシュワン細胞と共存培養することで髄鞘形成を定量的に評価する系を確立した。2シュワン細胞のサイトカインに対する反応:シュワン細胞の分化・増殖に影響すると思われるサイトカインの中で特に組織修復の過程で重要になる炎症性のサイトカインに注目し、シュワン細胞の分化マーカー;MAGを用いその影響を観察した。その結果、TGF-βはシュワン細胞の分化を濃度依存性に抑制したが、その他のIL-1,IFN-γ,TNF-αはシュワン細胞分化に影響を示さなかった。また、TGF-βの分化抑制効果の細胞内シグナルを明らかにするためTGF-β刺激の下流で細胞内で活性化されるSmad系路の遺伝子をアデノウイルスベクターによってシュワン細胞に導入しその効果を観察した。そしてSmad系路を抑制するSmad7を導入するとTGF-βによる分化抑制の効果がブロックされることが明らかとなった。以上のことからシュワン細胞の分化に対しTGF-βは抑制的に働き、そのシグナルはSmad系路を介している事が明らかとなった。またシュワン細胞にSmad系路を遮断する機能を持つSmad7を強制発現させることによりTGF-βの抑制効果を逃れることが可能であった。この知見は現在検討されているシュワン細胞を用いた人工神経においてシュワン細胞に対するTGF-βのシグナルをブロックする必要があることを示唆している。
Clostridium difficileの産生する毒素活性の細菌生態学的制御機構

S.parvulusあるいはP.magnusとC.difficileとを連続流動培養(CF培養)系ならびに無菌マウスを用いて共存させた場合に, C.difficileの毒素活性が共存菌によってどのような修飾をうけるかについて細菌生態学的立場から検討を企てた. CF培養条件下で得られた結果を総合すると,毒素産生性C.difficileの総菌数と細胞毒素活性値との間では積極的に有意の相関はみられないようであった.そして細胞毒素活性値は, S.parvulus共存群において最も低値を示す結果が示され,更に又細胞毒素活性値の上昇と芽胞形成比の低下という現象が観察され,相互に逆相関の関係がみられた.以上の様なCF培養条件下で得られた結果は,無菌マウスを用いた実験においても再現された.芽胞形成比が高値あるいは低値を示すということは, 3群間で芽胞産生数に著明な差がみとめられないので,それは総菌数に依存して発現される様に思われる.しかしながら細胞毒素活性値は総菌数に依存しないで発現されるという成績から,両者間に相関性がみとめられないということが示唆された.このことから考えると, C.difficileの毒素の合成が促進される時期は,栄養型細胞からの芽胞形成過程の中でのあるステージにあるのではないかということが推論される.S.parvulusとC.difficileとの共存システムの中で, C.difficileの細胞毒素活性作用が修飾され,その活性が低下するという成績は,細菌生態学的観点から,そして又芽胞形成という現象と関連して将来への魅力的研究課題を提供している.S.parvulusあるいはP.magnusとC.difficileとを連続流動培養(CF培養)系ならびに無菌マウスを用いて共存させた場合に, C.difficileの毒素活性が共存菌によってどのような修飾をうけるかについて細菌生態学的立場から検討を企てた. CF培養条件下で得られた結果を総合すると,毒素産生性C.difficileの総菌数と細胞毒素活性値との間では積極的に有意の相関はみられないようであった.そして細胞毒素活性値は, S.parvulus共存群において最も低値を示す結果が示され,更に又細胞毒素活性値の上昇と芽胞形成比の低下という現象が観察され,相互に逆相関の関係がみられた.以上の様なCF培養条件下で得られた結果は,無菌マウスを用いた実験においても再現された.芽胞形成比が高値あるいは低値を示すということは, 3群間で芽胞産生数に著明な差がみとめられないので,それは総菌数に依存して発現される様に思われる.しかしながら細胞毒素活性値は総菌数に依存しないで発現されるという成績から,両者間に相関性がみとめられないということが示唆された.このことから考えると, C.difficileの毒素の合成が促進される時期は,栄養型細胞からの芽胞形成過程の中でのあるステージにあるのではないかということが推論される.S.parvulusとC.difficileとの共存システムの中で, C.difficileの細胞毒素活性作用が修飾され,その活性が低下するという成績は,細菌生態学的観点から,そして又芽胞形成という現象と関連して将来への魅力的研究課題を提供している.合成ペニシリン投与後に生じた下痢患者の大便内細菌叢の解析の結果では、C.difficileは分離されることなく嫌気性グラム陽性球菌の分離頻度が高く且つ量的優位性を示したという成績が得られた。この事実に着目し、PeptostreptococcusmagnusあるいはStreptococcus parvulusとC.difficileとを連続流動培養(CF培養)系を用いて混合培養した場合に、C.difficileの細胞毒活性作用が共存菌によってどのような修飾をうけるかについて検討した。C.difficileを単独CF培養系に接種した場合、24時間後に定常状態に達し、約【10^7】/ml生菌単位の菌数で観察期間中推移し、芽胞数は接種後3日目で約【10^5】のレベルに達し、その後慚次減少の傾向がみられた。また細胞毒活性作用は接種後34日目に高値に達し、以後著明な変動はみられなかった。P.magnusを先住菌として接種してのちC.difficileを接種した場合、両菌は共存し、芽胞数の変動,細胞毒活性作用の変動のパターンは、C.difficile単独の場合と比較しほとんど差がみられなかった。更にS.parvulusを接種してのち、C.difficileをCF培養系に加えた場合は、細胞毒活性作用の発現が遅く、且つこの時期に芽胞数の低下傾向が見られ、前2者と比べて赴を異にする様相が観察された。以上の結果を総括すると、CF培養系において発現した細胞毒活性作用は、S.parvulus共存下ではC.difficile単独群,P.magnus共存群と比し有意に低い価を示した。C.difficileの総菌数と細胞毒活性作用との関係においては、これらの間に積極的な相関性はみられなかった。そして細胞毒活性作用はC.difficileの芽胞数と平行的関係がみられる傾向にあったが有意な相関はみられなかった。然しながら、C.difficileの総菌数に対する芽胞数の比の低下と細胞毒活性上昇という現象は逆相関性を示す成績が得られた。一方Gnotobioticマウスを用いる実験系においても、S.parvulusとC.difficile共存群において細胞毒活性作用の低下が見られた。
非収縮性パターン材と加熱膨張型鋳型材によるチタン製上部構造

パターンレジン(ジーシー社)のモノマーに,3種の化学物質を添加し、重合収縮率の低下を試みた。添加剤としては、OXO(界面活性剤)、ACMO(水溶性モノマー)、ESCOURON(クマロンインデン樹脂)を使用した。その結果、OXOの2wt%添加により、パターン用レジンの重合収縮率を約1/3の0.04%まで減少させることができた。鋳造床用外埋没材セレベストDに種々の金属化合物粉を添加し、加熱膨張率を検討した。その結果、添加剤をZrCとZrNに絞り、添加量の影響を検討した。添加量は、鋳型材に対してZrCは3.0、3.5、4.0、5.Owt%、ZrNは5.0、5.5、6.0、7.0wt%とした。すべての試料で0.5%程度の硬化時収縮がみられた。加熱膨張率は、添加量および加熱温度が高くなると大きくなり、室温冷却後も膨張は残留した。圧縮強度は添加量および焼成温度が高くなると低下した。次に、チタンを室温鋳型(高温焼成後冷却)に鋳造して板状試料表面、冠の精度を検討した。表面状態は、焼成温度が高いほど良好であった。表面粗さは添加量が増すほど大きくなる傾向にあった。鋳造冠精度は、焼成温度700°C-ZrC3.5wt%で0.21%、焼成温度700°C-ZrN5.5wt%で0.25%、焼成温度900°C-ZrN5.0wt%で0.14%の値を示した。ZrC5.0wt%添加では、鋳造冠の内面にバリが発生し寸法変化率は算出できなかった。以上の結果から、Zr化合物粉の添加量の変化により、鋳造冠の精度をコントロールできることがわかった。このことは、室温鋳型でも純チタンの鋳造収縮率約1.8%を補償できる新しいチタン専用加熱膨張型鋳型材の開発が可能であることを示唆する。非収縮性パターン材については、パターンレジン(ジーシー社)のモノマーに種々の化学物質を添加し、重合収縮率の低下を試みた。添加剤としては、界面活性剤(OXO、日産化学)、水溶性モノマー(ACMO、興人)、クマロンインデン樹脂(ESCOURON、新日鐵化学)を使用した。粉液比は2.0:1.0とし、硬化時間、発熱温度、重合収縮率の測定を行った。その結果、OXOの2wt%添加により、パターン用レジンの重合収縮率を未添加パターンレジンの約1/3の0.04%まで減少させることができ、操作時間、発熱温度、最少有効濃度の点でも満足できる結果を得た。加熱膨張型鋳型材については、鋳型の膨張材として金属化合物粉の加熱による酸化膨張に着目し、珪化物(TiSi_2、ZrSi_2)、炭化物(TiC、ZrC)、窒化物(AlN、TiN、ZrN)等の金属化合物粉を市販MgO系鋳型材セレベストD(W/P=0.18、セレック)に添加して熱膨張試験を行った。その結果、ZrC添加では、550-700°Cで、ZrN添加では、600-900°Cで大きな膨張を示した。それ以外の金属化合物添加による膨張は僅かであった。そこで実際にZrC、ZrNを添加した鋳型材で、チタン鋳造冠の精度について検討した。

鋳型は埋没2時間後、昇温速度2°C/minで700°Cまで加熱、2時間係留後炉内で室温まで放冷した。鋳造機はキャストマチック(岩谷産業)を用い、アルゴン雰囲気にて純チタンを鋳造した。その結果、鋳造冠の浮き上がりから求めた鋳造精度は、無添加セレベストDでは1.87%収縮、ZrC3wt%で0.52%収縮、ZrN5wt%で0.29%収縮を、ZrC4wt%で0.37%膨張、ZrN6wt%で0.45%膨張を示した。これらの結果は、金属化合物粉の添加量により、鋳造冠の精度をコントロールできることを示唆した。これらのことより、1)重合収縮の小さいパターン用レジンの開発によりパターン変形が減少できること、2)パターン材としてレジンを使うことによって生じる鋳型材の硬化膨張抑制の心配を、硬化膨張がほとんどゼロで加熱膨張だけで金属の鋳造収縮を補償できること、3)純チタンのように高温鋳型に鋳造することによる、純チタンの酸化や鋳型との反応性の増大の心配も室温鋳型により軽減できること、となり新しいチタン専用加熱膨張型鋳型材の開発の可能性が高まった。前年度において、金属化合物粉ZrC、ZrN粉の添加により、金属の鋳造収縮を鋳型材の加熱膨張のみで補償できることを報告した。そこで、本研究では、市販チタン鋳造用鋳型材に金属化合物粉ZrC、ZrNを添加して、鋳型材の諸性質およびチタン鋳造冠の精度について検討した。母鋳型材として、鋳造床用外埋没材であるセレベストD(セレック)を選択した。セレベストDは加熱膨張率の小さいチタン用MgO系鋳型材として知られている。金属化合物粉の添加量は、鋳型材に対してZrCは3、3.5、4、5wt%、ZrNは5、5.5、6、7wt%とした。金属化合物を添加した鋳型材を、W/P=0.18にて30秒間機械練和し実験に供した。試作鋳型材の硬化膨張率は、レーザー変位計にて高さ方向の膨張量を測定し算出した。その結果、すべての条件で硬化時収縮がみられ、その値は0.5%前後であった。加熱膨張率は、円柱状試料(φ5×20mm)を作製し、高温型熱機械分析装置(TMA-50A、島津製作所)を用い、昇温速度10°C/分、荷重1gfの条件で加熱温度は700、800、900°Cで、2時間係留後室温まで冷却した。その結果、ZrC、ZrNの添加量および加熱温度が高くなると膨張量は大きくなり、室温冷却後も膨張は残留した。試作鋳型材の圧縮強度は、金属化合物の添加量および加熱温度が高くなると低下した。チタン鋳造体(室温鋳型による)の表面状態は、鋳型温度が高いほど良好であった。また、表面粗さは金属化合物粉の添加量が増すと大きくなる傾向にあった。チタン鋳造冠の精度測定は、クラウン型の金型に溶融したインレーワックスを流し込み加圧してワックスパターンを作製した。スプルーはφ2.5mmとし、埋没は硬化膨張測定と同一の条件とし、練和開始2時間後電気炉に投入した。鋳型温度は700、800、900°C、昇温速度は2°C/分、係留は2時間とし、その後炉内放冷した。アルゴンガスアーク融解加圧鋳造機(キャストマチック、岩谷産業)を使用し、純チタン(チタン100、松風)を鋳造した。鋳造体はサンドブラスト処理後、金型に復してマージン部の間隙を読み取り顕微鏡にて計測した。ZrC5wt%添加では、鋳造冠の内面にバリが発生し寸法変化率は算出できなかった。これはZrCの添加量が多いと、鋳型の横方向の加熱膨張量が裏層材の緩衝能以上に大きくなり、支台付近が不均一膨張したためと考えられる。鋳型の加熱温度および金属化合物の添加率から鋳造冠の精度を検討した結果、加熱温度700°C、ZrC3.5wt%で0.21%、ZrN5.5wt%で0.25%の値を示し、良好な鋳造精度が得られた。また、加熱温度900°C、ZrN5wt%が0.14%と最も良好な値を示した。
造血幹細胞の分化とアクチビンのシグナル伝達機構の解析

アクチビン-ホリスタン系による造血幹細胞分化の制御機構を理解するために、造血系細胞におけるアクチビンのシグナル伝達系の全容を解明することを目的として以下のような研究を実施した。1,ヒト前赤芽球系細胞K562にはアクチビン受容体IA、IBおよびIIBが発現しているが、IIAの発現は認められないことがノーザン法によりわかった。また、アクチビンにより分化される際に高分子IIB受容体の発現量が有意に増加した。これは、アクチビンによるK562細胞の分化過程において、アクチビンシグナルの質的、量的変換が必要であることを示唆している。2,ホリスタチンの存在下で、アクチビン受容体IAおよびIIAを強制発現させたCOS細胞と^<125>I-アクチビンを反応させたところ、アクチビンは全く受容体に結合しなかった。ホリスタチンはアクチビンの受容体への結合を阻害することでアクチビンの作用を抑制することがわかった。3,ヘパラン硫酸プロテオグリカンに高親和性を示すホリスタチンFS-288はアクチビンと結合したまま、COS細胞やマウス下垂体細胞表層に強く結合し、短時間のうちに細胞内へ取り込まれることがわかった。さらに、取り込まれたアクチビンはリソゾーム酵素に低分子ペプチドにまで分解されて細胞外に放出されることが判明した。この結果は、ホリスタチンには、アクチビンとその受容体間の相互作用を阻害してシグナル伝達系を遮断する役割(2,の結果)以外に、アクチビンを積極的に分解・代謝してしまう役割のあることを示唆している。細胞増殖・分化因子のプロテオグリカンを介した新しい活性調節機構を提案するものである。
定量的分析による条件異音存立基盤の再検討：音韻論スリム化の試み

音韻論の基本概念である条件異音の存立基盤を定量的に再検討し、従来音韻論の守備範囲に属するとされてきた現象の多くが、実は音声学レベルの物理的現象であることを示す。その結果、現在教科書類に記載されている条件異音の多くが条件異音ではないことが判明し、定説を書き直す必要性が明らかになる。これは本来の守備範囲を超えて肥大化した音韻論をスリム化する試みであり、そこに本研究の挑戦的意義がある。この目的を達成するために、大規模音声コーパスによる韻律特徴の統計モデリングとMRIによる調音運動可視化データの分析を行う。
ハイブリッド手術における医療従事者の水晶体被曝線量評価に関する多施設共同研究

ICRP 2011年声明で眼の水晶体に対する線量限度が大幅に引き下げられた。本邦ではX線透視下での画像下治療と外科手術を併用したハイブリッド手術が普及しつつあるが、ハイブリッド手術に従事する医療従事者の水晶体線量について基礎的なデータが存在しない。応募者の過去の研究データをあてはめると、ハイブリッド手術に従事する多くの医療従事者が、容易に水晶体の等価線量限度に到達する可能性がある。本研究では、X線透視を併用した手術に従事した医療従事者の水晶体被曝線量の実態を明らかにすることで、ハイブリッド手術における適切な水晶体防護手法を提唱し、医療従事者の被曝防護への啓蒙を深め、将来の放射線性白内障の発生を予防する。ハイブリッド手術室の設備は手術台としての汎用性を担保するために、放射線防護カーテンや天吊り防護板などの放射線防護装備の使用に制約が加わる。しかしながら、我が国の一般的な病院組織では、ハイブリッド手術室は手術部の管理下に置かれ、放射線部による管理は補助的なものに留まることが多い。ハイブリッド手術は心臓血管外科医などの非放射線科医によって施行されることが一般的であり、スキルを重視する意識が強い一方で、術者の放射線防護に対する認識は必ずしも十分ではない。このような背景から、ハイブリッド手術では手技自体の利便性が最優先され、医療従事者の被曝防護が軽視されている可能性がある。本年では、既に9名の医療従事者の水晶体線量の測定を行った。現在、各参加予定施設と研究の詳細について打ち合わせを進めている。研究代表者の生活環境が平成28年4月より大きく変化した。このため、研究に対して充分なエフォートを確保することが出来なかった。平成28年度より研究代表者の生活環境が大きく変化し、その対応のために研究の進捗が遅れていた。平成29年度以降に、徐々に進捗の後れを取り戻すことができつつある。応募者の過去の研究データ(5-8)をあてはめると、ハイブリッド手術に従事する多くの医療従事者が、容易に水晶体の等価線量限度に到達する可能性がある。ハイブリッド手術に従事する医療従事者の中には、スキルを重視する意識が強い一方で、術者の放射線防護に対する認識は必ずしも十分ではない場合がある。本邦のハイブリッド手術における医療従事者の被曝量については、まとまった調査が存在せず、その実態は不明であった。本研究により、ハイブリッド手術に従事する医療従事者に対する、適切な水晶体の防護方法を提唱する基礎データを得ることができる。大量の術者の被曝を前提とした手術手技に対して、その被曝量を具体的に呈示することにより、医療従事者の被曝防護に対する啓蒙を深め、将来の放射線性白内障の発生を予防する。本年度には、既に研究に必要な防護メガネを手配し、関連研究分野の最新動勢について情報収集を行った。現在、参加予定施設と研究の詳細について打ち合わせを進めている。このため、平成28年度はその対応のため、研究に対して充分なエフォートを確保することができなかった。ICRP2011年声明で眼の水晶体に対する線量限度が大幅に引き下げられた。近年、X線透視を用いた画像下治療と外科的手技を併用したハイブリッド手術が普及し始めている。このように過量な被曝の危険性があるにもかかわらず、ハイブリッド手術に従事する医療従事者の水晶体線量について充分な基礎的データが存在しないのが現状である。本年度は、いわゆる臨床研究法案の施行に伴う倫理申請の厳格化に対する情報を収集。研究代表者の施設における倫理審査基準に適合した研究申請書を作成し、現在、倫理審査中である。いわゆる臨床研究法案の施行に伴い、倫理審査のルールが厳格化した。

新ルールに対応するための倫理申請に多大な時間を要した。ICRP 2011年声明で眼の水晶体に対する線量限度が大幅に引き下げられた。本邦ではX線透視下での画像下治療と外科手術を併用したハイブリッド手術が普及しつつあるが、ハイブリッド手術に従事する医療従事者の水晶体線量について基礎的なデータが存在しない。応募者の過去の研究データをあてはめると、ハイブリッド手術に従事する多くの医療従事者が、容易に水晶体の等価線量限度に到達する可能性がある。本研究では、X線透視を併用した手術に従事した医療従事者の水晶体被曝線量の実態を明らかにすることで、ハイブリッド手術における適切な水晶体防護手法を提唱し、医療従事者の被曝防護への啓蒙を深め、将来の放射線性白内障の発生を予防する。ハイブリッド手術室の設備は手術台としての汎用性を担保するために、放射線防護カーテンや天吊り防護板などの放射線防護装備の使用に制約が加わる。しかしながら、我が国の一般的な病院組織では、ハイブリッド手術室は手術部の管理下に置かれ、放射線部による管理は補助的なものに留まることが多い。ハイブリッド手術は心臓血管外科医などの非放射線科医によって施行されることが一般的であり、スキルを重視する意識が強い一方で、術者の放射線防護に対する認識は必ずしも十分ではない。このような背景から、ハイブリッド手術では手技自体の利便性が最優先され、医療従事者の被曝防護が軽視されている可能性がある。本年では、既に9名の医療従事者の水晶体線量の測定を行った。現在、各参加予定施設と研究の詳細について打ち合わせを進めている。研究代表者の生活環境が平成28年4月より大きく変化した。このため、研究に対して充分なエフォートを確保することが出来なかった。平成28年度には研究代表者の生活環境に大きな変化があり、その対応のために研究の進捗が遅れていたが、平成29年度にはその遅れを取り戻すことができる見込みである。現在、研究代表者の施設において、倫理審査中である。倫理審査員会の承認が得られれば、多施設における本格的なデータ収集を開始する。平成28年度より研究代表者の生活環境が大きく変化し、その対応のために研究の進捗が遅れていた。平成29年度以降に、徐々に進捗の後れを取り戻すことができつつある。平成28年度には研究代表者の生活環境に大きな変化があり、その対応のために研究の進捗が遅れた。いわゆる臨床研究法案へ対応するたも、倫理承認に時間が掛っている。研究進捗の遅れから、次年度使用額が生じた。本年には進捗の遅れを取り戻す見込みである。
テンサイの細胞質雄性不稔性に働く稔性回復核遺伝子の単離と機能解析

本研究ではテンサイの細胞質雄性不稔性(CMS)に働く稔性回復核遺伝子(Rf)を標的としたポジショナルクローニングを進めている。テンサイCMSの稔性回復には2つの独立な補足遺伝(XおよびZ)が働くことが知られているが、前年度までの研究により、X遺伝子座周辺のマッピング、およびBACクローンを用いたX遺伝子近傍領域の物理地図の作製が終了した。よってX遺伝子についてのポジショナルクローニングを本格的に進めることが可能である。これらの成果を基に本年度は以下の実験を実施した.1 X遺伝子座の絞り込みこれまでのところX遺伝子座は両側に位置する分子マーカーによって大凡600kb (遺伝距離3cM)の領域に限定されているが、今後の遺伝子同定を考えて更なる遺伝子座の絞り込みを計画した。新規育成した509個体からなる花粉稔性分離集団に分子マーカーを適用して、X遺伝子近傍領域での遺伝的組換えを生じた13個体を選抜した。これらの組換え個体について、計12種の分子マーカーを用いて遺伝子型を調査し、表現型と合わせて各々の交叉点を判別した結果、X遺伝子座は最終的に2種のBACクローン(33E19および9C23)によって完全にカバーされる約300kbの範囲に限定されることが明らかとなった。2 X遺伝子座のシーケンス解析300kbまで限定された候補領域にどのような発現領域が座乗するのか明らかにするため、全塩基配列の決定を進めている。33E19クローンについては全長(220kb)を対象としたショットガンシーケンスを計画し、これまでのところ約200kbの範囲についてシーケンスを決定した。現在、存在する8ヶ所のgap closingを行っている。9C23クローンについては、33E19クローンとの重複をさけるため、コスミドベクターを用いたサブライブラリーを作製し、選抜したコスミドクローン4F1についてのショットガンシーケンスを行った。36kbの塩基配列決定が終了し、残る1つのgapについてclosingを進めている。今後はシーケンスを完成させると共に、予測される発現領域についての特徴付けを進める必要がある。
初発AAV前向きコホートデータを用いた臨床病型・治療・バイオマーカーの多層的研究

1新規臨床サブセット同定:この研究では、クラスター解析という統計学的手法を用いて従来の疾患名(MPA, GPA, EGPA)とは別の新規臨床サブグループを同定する。この手法では、特定の研究仮説を設定せず、対象全集団の臨床的表現型と血清学的特徴から、探索的にサブグループを同定するため、RemIT-JAV、RemITJAV-RPGNに登録されたAAV患者のデータベースから解析に必要な情報を抽出し、解析用に整理した。2リスク・ベネフィットバランスを考慮した治療戦略の検討:RemIT-JAV、RemIT-JAV-RPGNに登録された日本人新規発症AAV患者における寛解導入療法別の患者背景、寛解導入率、再燃率、死亡率の違いを解析するため、解析用のデータベースを整理した。3異なるANCA測定法の診断能、治療による変動、再燃・臓器病変の種類との関連性検討による有用性比較: RemIT-JAV-RPGN研究等で得られたAAV患者血清及び対照検体中のANCAを、保険収載済の間接蛍光抗体法、ELISA、CLEIA、FEIA、及び開発中のラテックス凝集法で測定した。ラテックス凝集法を除いて、どのANCA測定法も、概ね従来報告通り、かつ良好な感度・特異度をもつことが示された。4新規臨床サブセットと関連するバイオマーカーの同定:AAVの治療成績をさらに向上させるために、AMED ANCA関連血管炎の新規治療薬開発を目指す戦略的シーズ探索と臨床的エビデンス構築研究で同定されたAAVのバイオマーカーについての情報を入手した。1新規臨床サブセット同定:EGPAを除く対象の解析でANCAの種類、耳鼻咽喉症状・皮膚・腎などを特徴とするサブグループが同定された。また、CRP・Crを追加して行ったクラスター解析ではCRPとCr値で4つのサブグループが同定され、生命予後・腎予後を明確に区別できた。2リスク・ベネフィットバランスを考慮した治療戦略の検討:シクロホスファミドの併用で、寛解・生存・腎生存・再燃などのアウトカムの改善は見られなかったが、併用群では併用ステロイド量が少なかった。このことから長期的な安全性の改善が期待される。3異なるANCA測定法の診断能、治療による変動、再燃・臓器病変の種類との関連性検討による有用性比較:開発中のラテックス凝集法を除いて、どの保険収載済のANCA測定法も、概ね従来報告通り、かつ良好な感度・特異度をもつことが示された。さらに、2017年に海外で開発・提案されたMPO-ANCAとPR3-ANCAの新しい標準品の測定結果も良好であった。4新規臨床サブセットと関連するバイオマーカーの同定:1でRemIT-JAV、RemITJAV-RPGNに登録されたAAV患者を4つのサブグループに分けることができたので、これらの患者のうち、「AMED ANCA関連血管炎の新規治療薬開発を目指す戦略的シーズ探索と臨床的エビデンス構築研究」で収集した血清を用いてバイオマーカー研究が行われた患者を同定した。1新規臨床サブセット同定:新たに同定した臨床徴候によるサブグループおよびCr・CRPによる予後を明確に区別できるサブグループを同定し、現在学術雑誌への論文投稿を行う。2リスク・ベネフィットバランスを考慮した治療戦略の検討:シクロホスファミドの併用で、ステロイド使用量が少なく長期的な安全性の改善が期待されることが明らかとなった。次期ガイドラインでの適用が可能となるよう学術雑誌への論文投稿を行う。3異なるANCA測定法の診断能、治療による変動、再燃・臓器病変の種類との関連性検討による有用性比較:異なる測定法によるANCA測定結果と、AAVの病像・臓器病変との関連、及び治療前後の検体が得られた症例についての、治療による変動や再燃等の転帰との関連を検討する。4新規臨床サブセットと関連するバイオマーカーの同定:1で同定された新規臨床的サブセットを含む様々な臨床的サブセットと関連性があるバイオマーカーを同定する。この手法では、特定の研究仮説を設定せず、対象全集団の臨床的表現型と血清学的特徴から、探索的にサブグループを同定するため、RemIT-JAV、RemIT-JAV-RPGNに登録されたAAV患者のデータベースから解析に必要な情報を抽出し、解析用に整理した。3異なるANCA測定法の診断能、治療による変動、再燃・臓器病変の種類との関連性検討による有用性比較:RemIT-JAV、RemIT-JAV-RPGNで得られた、AAV患者の血清を用いて、現在、本邦で実施されている複数の測定方法によりANCAを測定するため、複数の測定方法から適切を考えられる測定方法を選出し、測定に向けて検体の整理を行った。1新規臨床サブセット

同定:当初の計画では、新規臨床サブグループを同定する予定であったが、RemIT-JAV、RemIT-JAV-RPGN登録患者のデータべースから解析に必要な情報を抽出し、整理するために予想外に時間を要した。サブセット同定は次年度に速やかに実施する予定である。2リスク・ベネフィットバランスを考慮した治療戦略の検討:RemIT-JAV、RemIT-JAV-RPGNに登録された日本人新規発症AAV患者における寛解導入療法別の患者背景、寛解導入率、再燃率、死亡率の違いを解析するため、解析用のデータベースを整理した。3異なるANCA測定法の診断能、治療による変動、再燃・臓器病変の種類との関連性検討による有用性比較:RemIT-JAV、RemIT-JAV-RPGNで得られた、AAV患者の血清を用いて、現在、本邦で実施されている複数の測定方法によりANCAを測定するため、複数の測定方法から適切を考えられる測定方法を選出し、測定に向けて検体の整理を行った。4新規臨床サブセットと関連するバイオマーカーの同定:AAVの治療成績をさらに向上させるために、AMED ANCA関連血管炎の新規治療薬開発を目指す戦略的シーズ探索と臨床的エビデンス構築研究で同定されたAAVのバイオマーカーについての情報を入手した。1新規臨床サブセット同定:この研究では、クラスター解析という統計学的手法を用いて従来の疾患名(MPA, GPA, EGPA)とは別の新規臨床サブグループを同定する。この手法では、特定の研究仮説を設定せず、対象全集団の臨床的表現型と血清学的特徴から、探索的にサブグループを同定するため、RemIT-JAV、RemITJAV-RPGNに登録されたAAV患者のデータベースから解析に必要な情報を抽出し、解析用に整理した。3異なるANCA測定法の診断能、治療による変動、再燃・臓器病変の種類との関連性検討による有用性比較: RemIT-JAV-RPGN研究等で得られたAAV患者血清及び対照検体中のANCAを、保険収載済の間接蛍光抗体法、ELISA、CLEIA、FEIA、及び開発中のラテックス凝集法で測定した。ラテックス凝集法を除いて、どのANCA測定法も、概ね従来報告通り、かつ良好な感度・特異度をもつことが示された。1新規臨床サブセット同定:EGPAを除く対象の解析でANCAの種類、耳鼻咽喉症状・皮膚・腎などを特徴とするサブグループが同定された。また、CRP・Crを追加して行ったクラスター解析ではCRPとCr値で4つのサブグループが同定され、生命予後・腎予後を明確に区別できた。
青年期女子の健康阻害要因とならない最低体重と至適体脂肪量

本研究は、平均身長157.3cm(140.7168.1cm)、平均体重48.63kg(32.5863.04kg)、平均BMI19.7(14.724.9)の健康な女子短大生71名を対象に、A群(BMI<17.0)、B群(17.0≦BMI≦20.0)、C群(BMI>20.0)の3群に分け、身体組成、骨塩量、最大酸素摂取量、脚伸展筋力、女性ホルモン濃度、血中蛋白分画、免疫グロブリン等を比較し、低体重女性の健康阻害要因とならない最低体重と至適体脂肪量を検討した。このA、B、C群の平均身長には有意な差がないが、体重はそれぞれ38.8kg、44.9kg、57.2kgであり、各群間に有意な差が認められた。特に、A群は標準体重より27.3%も低く、完全な痩せであった。従って、このA群の体重と体脂肪量を分析し、身体機能や血液成分を他の2群と比較して健康状態を評価した。A群の体重を構成する総体脂肪量は10.6kgであり、他の2群に比較して有意に低い値を示し、除脂肪量も28.2kgで有意に低い値を示した。これらのことからも、A群が明らかな痩せであることがわかる。しかし、A群の体内深部脂肪はB群とは有意な差を示さなかったが、皮下脂肪量は明らかに他の2群より低い値を示した。身体機能の面では、最大酸素摂取量、脚筋力とも絶対値では小さなボディ・サイズの影響から他の2群より劣るものの、除脂肪量当たりの相対値では劣った結果を示さなかった。血液生化学分析の結果では、赤血球数や血清鉄にやや低く貧血傾向が認められた以外はA群の特徴は認められなかった。以上のことから、身長155.6cm、体重38.8kg、BMI16.0の低体重者にもそれほど大きな健康障害は認められなかった。従って、このような低体重、低脂肪、低除脂肪でも、6.9kg、体重の17.6%の体内深部脂肪を長期間維持している低体重者には、これらの身体組成は健康阻害要因とはならないことが明らかになった。今年度は、平均身長153.4cm、平均体重40.7kg、平均BMI17.3の18歳低体重女性10名について、同年齢で身長に差がなく体重がそれぞれ異なる3群の女性の身体組成、骨塩量、最大酸素摂取量、脚伸展筋力、女性ホルモン濃度、血中蛋白分画、免疫グロブリン等と比較しながら、低体重女性の健康阻害要因とならない最低体重と至適体脂肪量を検討した。今回対象にした低体重者、すなわちBMI17.3、体重40kg、体脂肪量12kgの青年期女子は、重水希釈法で測定した少ない体脂肪の中でも特に皮下脂肪量が少なく、除脂肪量が少ない「痩せ」であると判定された。非利き腕の橈骨遠位1/3をDEXA法で測定した骨塩量と骨密度はともに低体重群が低い値を示し、低体重者の栄養不足と運動不足が示唆された。

低体重者の最大酸素摂取量と脚伸展筋力からみた体力はbody sizeそのものの小ささから体重の大きな者より劣る傾向はみられたが、除脂肪1kg当たりの値には差がなく、除脂肪組織の組成や活性には差がないと推察された。低体重者の月経周期異常は体重の重い群より高率にみられたが、estradiolやestrone、及びFSHやLHには特別な傾向はみられなかった。しかし、アルブミンとA/G比は体重の重い群に比べて有意に低い値を示した。すなわち、今回の低体重者は皮下脂肪量が極めて少なく、骨量、最大酸素摂取量、最大筋力、及びアルブミン等に低値を示したが、顕著な健康障害には至っていない。従って、今回のデータでは健康の維持に必要な最低体重を40kg、至適体脂肪量を12kgと設定することができた。次年度は、この最低体重と至適体脂肪量より低い「痩せ」を対象に、それらの身体組成や生理学的特性を明らかにすることによって、今回の最低体重40kg、至適体脂肪量12kgのもつ健康科学的意味をさらに明らかにする予定である。本研究は、平均身長157.3cm(140.7168.1cm)、平均体重48.63kg(32.5863.04kg)、平均BMI19.7(14.724.9)の健康な女子短大生71名を対象に、A群(BMI<17.0)、B群(17.0≦BMI≦20.0)、C群(BMI>20.0)の3群に分け、身体組成、骨塩量、最大酸素摂取量、脚伸展筋力、女性ホルモン濃度、血中蛋白分画、免疫グロブリン等を比較し、低体重女性の健康阻害要因とならない最低体重と至適体脂肪量を検討した。このA、B、C群の平均身長には有意な差がないが、体重はそれぞれ38.8kg、44.9kg、57.2kgであり、各群間に有意な差が認められた。特に、A群は標準体重より27.3%も低く、完全な痩せであった。従って、このA群の体重と体脂肪量を分析し、身体機能や血液成分を他の2群と比較して健康状態を評価した。A群の体重を構成する総体脂肪量は10.6kgであり、他の2群に比較して有意に低い値を示し、除脂肪量も28.2kgで有意に低い値を示した。これらのことからも、A群が明らかな痩せであることがわかる。しかし、A群の体内深部脂肪はB群とは有意な差を示さなかったが、皮下脂肪量は明らかに他の2群より低い値を示した。身体機能の面では、最大酸素摂取量、脚筋力とも絶対値では小さなボディ・サイズの影響から他の2群より劣るものの、除脂肪量当たりの相対値では劣った結果を示さなかった。血液生化学分析の結果では、赤血球数や血清鉄にやや低く貧血傾向が認められた以外はA群の特徴は認められなかった。以上のことから、身長155.6cm、体重38.8kg、BMI16.0の低体重者にもそれほど大きな健康障害は認められなかった。従って、このような低体重、低脂肪、低除脂肪でも、6.9kg、体重の17.6%の体内深部脂肪を長期間維持している低体重者には、これらの身体組成は健康阻害要因とはならないことが明らかになった。
インフルエンザウイルス感染を決定するプロテアーゼの発見と阻害剤による新治療薬開発

インフルエンザウイルスの活性化酵素(トリプターゼクララ)を見出し、その阻害物質を2種類ヒトの気道分泌液中に見出して精製し、構造決定を行いその有効性を検定した。阻害物質の1つは、気道分泌液に含まれる肺サーファクタントであった。肺サーファクタントはトリプターゼクララ活性を阻害し、抗インフルエンザ作用を示したがその作用は、プロテアーゼインヒビターとしてよりむしろトリプターゼクララの吸着物質として作用し、結果的にトリプターゼクララの阻害作用を示した。肺サーファクタントの抗インフルエンザ作用は動物実験モデルでも確かめられた。他の阻害物質は、肺サーファクタントとは異なる分子量約12kDaの強力な低分子インヒビターで、これを精製し構造を決定した。アミノ酸一次構造解析の結果、このインヒビターはこれまでにエラスターゼの阻害剤として報告のあったAnti-leukoprotease inhibitor (ALP)と同一物であることが判明した。ALPはアミノ末端領域とカルボキシ末端領域にそれぞれクリングル構造を持つインヒビターであるが、トリプターゼクララ阻害作用は、カルボキシル末端側のクリングル構造体にあることが判明した。ALPの遺伝子を分離し、C末端領域ペプチドの大腸菌での発現を試みトリプターゼクララに対する阻害物質を得た。このC末端領域ペプチドは、インフルエンザアジア株のMDCK細胞への感染を抑制し、ほぼ1μMの濃度で完全抑制した。一方幼弱ラットへのインフルエンザウイルスの感染に対して5μgのALPを8時間おきに15回投与することでほぼ完全な抑制効果を得た。今後C末端側のALPの各種誘導体を作成し、より強力なインヒビターの作成を試みる。以上これまでに気道分泌液よりインフルエンザの感染を抑制する生体防御物質を2種類同定し、その有効性について検討を進めた結果、トリプターゼクララを阻害する2種の阻害物の抗インフルエンザ作用を確認した。インフルエンザウイルスの細胞側レセプターはシアール酸であるが、ウイルスはシアール酸に結合しただけでは細胞に感染しない。感染するためには、インフルエンザウイルスの外膜蛋白前駆体のヘムアグルチニン(HA)がHA_1とHA_2の二つのサブユニットに限定分解されることが必要である。我々はこれまでにこの限定分解酵素としてトリプターゼクララをラットの気管支粘膜上皮に見出し、この阻害物質に強い抗インフルエンザ作用のあることを証明してきた。しかもこれまでに一次構造の解析されているほとんど全てのインフルエンザウイルスHAは、トリプターゼクララによって認識される。本年度の研究において我々は、トリプターゼクララの作用を抑制する生理活性物質群が気道分泌液中に含まれていることを見出した。その1つが肺サーファクタントである。モデル感染動物としてセンダイウイルスを感染させたラットに肺サーファクタントを経鼻投与すると、センダイウイルスの肺での増殖が95%以上抑制された。現在肺サーファクタントの中で抗ウイルス作用を示す最小活性単位を検索している。一方気道分泌液中には、肺サーファクタント以外にも低分子阻害物質のあることが最近見出された。本物質は蛋白性の阻害物質で、現在その一次構造の解析を行っている。これらの物質は、本来気道中に一定量常に分泌されており、分泌されるトリプターゼクララとの相対濃度でインフルエンザに対する感受性は決定される。そこで以上の結果を基に、今後人のトリプターゼクララを精製し、これに対する強力な抗オリプターゼ阻害剤を見出し、副作用の少ないインフルエンザ感染の予防法と治療薬の開発を進めてゆく。インフルエンザの感染予防は、従来ワクチンが主体であった。しかしウイルスが極めて変異性に富むことから、その予防効果に限界がある。

我々はインフルエンザウイルスが人の気道に感染するさいに、宿主側のプロテアーゼでウイルスの外膜蛋白が限定分解されることがウイルスの細胞内への侵入を決定する中心的な役割を果すことに注目してきた。我々は最近このプロテアーゼ(トリプターゼクララ)の同定に成功した。本研究はこのトリプターゼクララの内在性インヒビターを見出し、インフルエンザ感染の予防および治療薬を開発することを目的としている。これまでにヒトの気道分泌液中にトリプターゼクララの活性を阻害する2種類の成分を見出した。その1つは肺サーファクタントで、肺サーファクタントは気道中に分泌されたトリプターゼクララを吸着することによって活性を阻害することが判明した。肺サーファクタントは種々のリン脂質と4種の蛋白質からなる複合体で、それぞれの成分単独ではトリプターゼクララの活性を阻害できなかった。インフルエンザウイルス感染は類似したモデル動物実験として、ラットを用いたセンダイウイルスの感染系では、気道に投与した肺サーファクタントは濃度に依存して著しい感染抑制効果を示した。一方気道分泌液中には、肺サーファタントとは異なる蛋白性のトリプターゼクララ阻害物質があることが判明した。この蛋白質は微量でトリプターゼクララの活性を阻害し、インフルエンザウイルスやセンダイウイルスの細胞への感染を抑制した。MDCK細胞やLLCMK2細胞を用いた培養システムでは10nM1μMの範囲内で十分の感染抑制効果が認められた。今後後者の物質の構造決定を行う。インフルエンザウイルスの活性化酵素(トリプターゼクララ)の阻害剤を、ヒトの気道分泌液中に見出し、これを精製して構造決定を行いその有効性を検定した。これまでの研究から気道分泌液中の肺サーファクタントは、トリプターゼクララ活性を阻害し、抗インフルエンザ作用のあることを示してきたがその作用は、プロテアーゼインヒビターとしてよりむしろトリプターゼクララの吸着物質として作用し、結果的にトリプターゼクララの阻害作用を表す。本年度の研究において、肺サーファクタントとは異なる分子量約12kDaの強力な低分子インヒビターをヒトの気道分泌液中に見出し、その構造を決定した。アミノ酸一次構造解析の結果、このインヒビターはこれまでにエラスターゼの阻害剤として報告のあったAnti-leukoprotease inhibitor (ALP)と同一物であることが判明した。ALPはアミノ末端領域とカルボキシ末端領域にそれぞれクリングル構造を持つインヒビターであるが、トリプターゼクララ阻害作用は、カルボキシル末端側のクリングル構造体にあることを見出した。ALPの遺伝子を分離し、C末端領域ペプチドの大腸菌での発現を試みトリプターゼクララに対する阻害物質を得た。このC末端領域ペプチドは、インフルエンザアジア株のMDCK細胞への感染を抑制し、ほぼ1μMの濃度で完全抑制した。一方幼弱ラットへのインフルエンザウイルスの感染に対して5μgのALPを8時間おきに15回投与することでほぼ完全な抑制効果を得た。
多重散乱質中での光の揺らぎの相関とその応用

多重散乱媒質中を伝播した光にはさまざまな相関が存在する。多重散乱媒質を伝播する光を対象とし、[1]多重散乱媒質中での光の揺らぎの相関を解明し、その応用として[2]多重散乱媒質での永続的ホールバーニングについて実験を展開した。(1)第二高調波発生法による揺らぎの相関実験多重散乱媒質の「内部」の揺らぎの相関を実験的に調べる方法として、新しく2光束相関法による第二高調波発生法による揺らぎの相関測定をおこなった。(2)多重散乱媒質でのホールバーニング多重散乱媒質が散乱とあわせて光反応性を有している系でのホールバーニングの実験を展開した。このホールバーニングは、空間的なスペックルを光反応によって書き込むことによって形成されるものである。[1]媒質の厚さなど幾何学的条件、[2]媒質の平均自由行程、[3]吸収、[4]サンプルの境界条件、などを系統的に変化させホール形状への影響を調べた。この結果、[1]媒質の厚さが拡散吸収長よりも薄くなるにしたがって、ホールの幅が広くなると同時に、形状が丸みをおびてくること、[2]媒質の平均自由行程が短くなるとホールの裾が急速に広がること、[3]吸収が強くなるにしたがってホールの幅が広くなること、などを実験で捕らえることに成功した。これらの成果をもとに、平均自由行程が小さく、吸収の少ない理想的なサンプルを用意し、世界で最も狭い室温周波数ホールバーニングの実現を進めた。現在までに、500MHz程度の超狭帯域ホールの観測に成功している。多重散乱媒質を伝播した光は、極めて長い経路を伝播しており、このことが入射周波数に対してホールが高い周波数選択性を持っていることのメカニズムになっている。この効果は周波数多重光メモリー等への応用の可能性を持っている。本研究の目的は、多重散乱媒質を伝播する光を対象とし、[1]多重散乱媒質中での光の揺らぎの相関を解明し、その応用として[2]多重散乱媒質での永続的ホールバーニングについて実験を展開する、ことである。平成16年度は、具体的に以下の研究を行った。1)第二高調波発生法による揺らぎの相関実験多重散乱媒質の「内部」の揺らぎの相関を実験的に調べる方法として、新しく2光束相関法による第二高調波発生法による揺らぎの相関測定をおこなった。LiNbO_3からなる多重散乱媒質に、波長1.06μmの2本のコヒーレントなレーザー光を励起光として入射させ、媒質から発生する第二高調波の強度を観測した。第二高調波強度を入射角度の関数として観測し、波数ベクトル領域での相関関数が得られることを実験的に実証した。2)多重散乱媒質でのホールバーニング多重散乱媒質中の揺らぎの「内部」相関を利用し多重散乱媒質が散乱とあわせて光反応性を有している系でのホールバーニングの実験を展開した。平成16年度は、特に、ホールの時間発展を実験的に捕らえることに成功した。平成17年度は、上記に実験結果の解析を進めるとともに、引き続き、[1]媒質の平均自由行程、[2]吸収、[3]幾何学的特性、[4]サンプルの境界条件、などを系統的に変化させホール形状への影響を調べる予定である。

本研究の目的は、多重散乱媒質を伝播する光を対象とし、(1)多重散乱媒質中での光の揺らぎの相関を解明し、その応用として(2)多重散乱媒質での永続的ホールバーニングについて実験を展開する、ことである。平成17年度は、具体的に、多重散乱媒質中の揺らぎの「内部」相関を利用し多重散乱媒質が散乱とあわせて光反応性を有している系でのホールバーニングの実験を展開した。このホールバーニングは、空間的なスペックルを光反応によって書き込むことによって形成されるものである。平成17年度は、(1)媒質の厚さなど幾何学的条件、(2)媒質の平均自由行程、(3)吸収、(4)サンプルの境界条件、などを系統的に変化させホール形状への影響を調べた。この結果、(1)媒質の厚さが拡散吸収長よりも薄くなるにしたがって、ホールの幅が広くなると同時に、形状が丸みをおびてくること、(2)媒質の平均自由行程が短くなるとホールの裾が急速に広がること、(3)吸収が強くなるにしたがってホールの幅が広くなること、などを実験で捕らえることに成功した。平成18年度は、これらの実験結果の理論解析を進め、また、これまでの研究成果を基盤にして、世界で最も狭い室温周波数ホールバーニングの実現を進める。これらの効果は周波数多重光メモリー等への応用の可能性を持っている。多重散乱媒質中を伝播した光にはさまざまな相関が存在する。本研究の目的は、多重散乱媒質を伝播する光に現れる揺らぎの相関を解明し、その応用として永続的ホールバーニングについて実験を展開することである。平成18年度は、これまでの実験結果について先行している理論解析との比較を行った。すなわち、光反応物質としてスピラピロン系のフォトクロミック色素を含んだ多重散乱媒質において、[1]媒質の平均自由行程、[2]吸収、[3]幾何学的特性(反射型観測、透過型観測など)、[4]サンプルの境界条件、などを系統的に変化させた実験結果と拡散近似に基づいた理論と比較し、よい一致を得た。また、これらの成果をもとに、酸化チタンの微粒子をセラミック状に焼結した試料に光反応性薄膜をコーティングした試料を作製し、平均自由行程が小さく、吸収の少ない理想的なサンプルを用意し、世界で最も狭い室温周波数ホールバーニングの実現を進めた。このとき、科研費にて購入したNd3+YAG DPSS (Diode Pumped Solid State)単一モード波長可変レーザーを使用した。現在までに、500MHz程度の超狭帯域ホールの観測に成功している。多重散乱媒質を伝播した光は、極めて長い経路を伝播しており、このことが入射周波数に対してホールが高い周波数選択性を持っていることのメカニズムになっている。この効果は周波数多重光メモリー等への応用の可能性を持っている。
極限環境耐性動物クマムシの持つ高い放射線耐性を支える分子機構の解析

クマムシは高い放射線耐性を持つ動物として知られるが、その耐性を可能にする分子基盤はまったく分かっていなかった。本研究課題では、クマムシのクロマチン分画から同定された新規タンパク質Dsupに着目し、同タンパク質がC末端側領域を介してDNAに直接結合し、動物細胞の核DNA全体と共局在することを示した。さらに、Dsupを導入したヒト培養細胞では、X線照射によるDNA傷害の発生が約半分に抑制され、放射線耐性が向上することを明らかにした。本研究は、クマムシの放射線耐性に寄与するタンパク質を同定した初めての例であるとともに、クマムシの耐性が他生物に移転可能であることを明示した成果である。高線量の放射線への曝露は多くの生物にとって致死的であるが、いくつかの生物種はこうした放射線に高い耐性を持つ。なかでもクマムシは高い放射線耐性を持つ動物として知られているが、その分子機構はまったく明らかになっていない。本年度は、クマムシの高い放射線耐性を支える候補分子としてクマムシに固有な新規クロマチンタンパク質S261に着目し、その性状および機能の解析を行った。まず、リコンビナントタンパク質を用いたゲルシフトアッセイにより、S261がDNAに直接結合する活性を持つことを明らかにした。さらに、様々な領域を欠失したS261バリアントについてDNA結合活性を調べた結果、C末端側の領域がDNA結合に必要かつ充分な領域であることを明らかにした。また、これらのバリアントをGFP融合タンパク質として培養細胞に発現させた結果、核およびDNAとの共局在に必要な領域はDNA結合能を持つC末端側領域と一致することが分かった。S261のC末端領域は新規なDNA結合ドメインと考えられる。in silicoの配列解析の結果、DNA結合領域のN末側に両親媒性のアルファヘリックスを形成する領域が存在することがわかった。この領域はタンパク質間相互作用に関わっている可能性が考えられる。さらに、S261の放射線耐性への寄与を解析するために、哺乳類培養細胞からS261の定常発現株を作出し、放射線障害に与える影響を解析した。放射線照射後、DNA二本鎖切断のマーカーであるγ-H2AXのFoci数を計数した結果、S261発現株で有意に減少していることが分かった。また、二本鎖切断によって生じる断片化DNAの量を中性コメットアッセイにより解析した結果、S261発現株では親株と比較して半分程度に抑制されることがわかった。以上の結果から、S261は核DNAに直接結合しS261同士もしくは他のタンパク質と相互作用することで、放射線障害からDNAを保護しているというモデルが示唆された。本研究課題は極限環境耐性動物であるクマムシの高い放射線耐性を支える分子機構の解明を目的としている。昨年度までに放射線耐性を支える候補分子としてクマムシに固有な新規クロマチンタンパク質S261を同定し、その生化学的性状を明らかにするとともに、S261を定常発現する哺乳類培養細胞株を作出し、同細胞株において放射線照射によるDNA断片化が親株に比べて有意に抑制されることを示してきた。本年度は、これまで観察されたDNA断片化の抑制がS261に依存していることを検証するために、S261発現細胞株にさらにS261を標的としたshRNA発現コンストラクトを導入し、S261の発現を選択的に抑制した。その結果、S261転写産物量は約75%低下し、放射線照射後のDNA二本鎖切断数はS261を導入していない親株とほぼ同等まで増加し、S261発現細胞で見られた切断の抑制効果はほほ完全に消失した。これらの結果は、哺乳類培養細胞に導入したS261遺伝子産物がDNAの放射線からの保護を担っていることを示唆している。さらに、放射線照射後(4GyのX線)の細胞の挙動を観測した結果、8-12日後においてS261非導入細胞株や発現抑制株は増殖能を完全に失っていたのに対し、S261発現細胞のみは一部の細胞が正常な形態を示し増殖能も保持していることを明らかにした。この結果はS261の導入によって哺乳類細胞に放射線耐性を部分的に付与できたことを示唆している。このほか、クマムシのアルビノ変異株について紫外線耐性・ガンマ線耐性を定量的に評価し野生型と比較して耐性が有意に低下していることを検証するとともに、動物界においてクマムシ固有の修復遺伝子がガンマ線照射によって発現誘導されることを初めて見出した。昨年度までにクマムシに固有な新規DNA結合タンパク質Dsup (S261)を同定し、Dsupを安定発現するヒト培養細胞は放射線によるDNA損傷が半減し、放射線への耐性が著明に改善することを見出してきた。DNA結合タンパク質は、generalに環境ストレスからのDNA保護に寄与する可能性が想定されたことから、本年度はまず、DsupによるDNAの防護に、DNAとの結合が重要であるかを解析した。DsupのDNA結合活性はC末端側領域が担うことを本課題において明らかにしていたことから、C末端を欠失したDsupを発現する定常細胞株を樹立し、放射線照射後のDNA損傷、生存率、増殖能を解析した。その結果、C末端側DNA結合領域の欠失により、Dsupの損傷抑制活性が顕著に失われることが判明し、DsupによるDNAの保護にはDNAとの結合が重要であることが分かった。そこで次に、DNAとの結合が保護活性に十分であるかを調べるためにDNA結合領域のみを発現する細胞株の樹立を複数回試みたが、いずれも安定的に増殖する系統を確立することはできなかった。