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FGF2含浸ゼラチンハイドロゲルによる歯槽骨再生現像と分子生物学的機序の解明

平成16年度に確立したrhFGF-2の骨膜中徐放による歯槽骨再生モデルを用いてその組織学的・分子生物学的機序を解析した。rhFGF2徐放開始後714日目にかけてrhFGF-2徐放群の骨膜は対照群に比して有意に高い細胞増殖活性(PCNA index)を示し、既存骨と連続した仮骨の形成を伴う骨膜の多層化をみとめた。また、増殖している骨膜細胞のアルカリホスファターゼ酵素活性は陽性であることが示された。すなわちin vivoにおいてrhFGF-2は骨膜中の骨芽細胞を増殖させ、数を増した骨芽細胞が活発に仮骨形成を形成し、その結果として再生骨が形成されることが組織学的に示された。次に、骨形成過程にあるrhFGF-2徐放開始7日目の骨膜におけるAlP,Osp,Ocn,Fgfr-13およびRunx2の遺伝子発現分布を検出するために、それぞれのmRNAに対するDIG標識cRNAプローブを作製し、in situハイブリダイゼーションを行った。その結果、仮骨表層の細胞のみOpnが、骨膜内層にOpnが、骨膜全層にAlpが発現し、成熟した骨芽細胞が仮骨の最表層に配列し、骨膜外層に向かって骨芽細胞の成熟度が低下していくことが示された。Fgfr-1,-2,-3はこの成熟した骨芽細胞に強く発現するとともに線維性骨膜層の紡錐形細胞にもFgfr-1,-2陽性細胞の点在をみとめた。Runx2はFgfrの発現と一致した発現傾向を示した。これらの結果より、rhFGF2の直接の作用である細胞分裂励起活性が成熟した骨芽細胞と紡錐形細胞により強く及ぼされることが示唆された。次に、この骨膜よりlaser microdissection法を用いて組織特異的なRNAの抽出を行い、リアルタイムRT-PCR法によりこれら遺伝子の発現を定量した。対照として、ゼラチンキャリアのみを埋入した群(対照群)の骨膜および同週齢(正常群)の正常骨膜より同様の手法でRNAを抽出し、同じくリアルタイムRT-PCRを行った。その結果、rhFGF2徐放群のRunx2発現は対照群に対して有意に高値を示し、Alp,Osp,Ocnの発現も高値を示した。また、Fgfr-13の発現も有意に高値を示した。対照群と正常群の間には解析した全ての遺伝子で有意な違いをみとめなかった。このことからin vivoの環境においてはrhFGF2の骨膜内徐放は骨膜組織の骨形成活性を高めることが遺伝子発現の観点からも示された。1.マウス(5週齢ddY)歯槽骨骨膜下でゼラチンハイドロゲル徐放システムを用い、rhFGF2の局所濃度を保つことで歯槽骨が再生することを実証した。

rhFGF2の徐放期間を14日とし、その総量を変化させることで、効果的に歯槽骨が再生する条件を組織学的に検討した。その結果、rhFGF2の徐放量が20μg以上であるとき、安定した骨の再生が生じたが、徐放量を100μgとした群では脂肪組織の増生を伴うことが分かった。これらの実験から、20μgのrhFGF2を14日かけて徐放することで、効果的な歯槽骨再生が得られると仮定した。加えて、この条件下でマイクロCTと画像解析機器を用い、徐放開始後4週目の(歯槽骨を含む)rhFGF2徐放側片顎上顎骨体積を測定した。その結果、ゼラチンハイドロゲル単独をインプラントした群(コントロール群)に比べてゼラチンハイドロゲルを用いてrhFGF2を徐放した群では、その体積が平均160%(1.6倍)となり、統計分析からもP=0.01水準で有意に歯槽骨が再生することが示された。2.組織学的・分子生物学的解析を開始した。1.で示したrhFGF2 20μg,徐放期間14日間を標準プロトコルとし、歯槽骨の組織学的な形成機序を経時的に観察した。その結果、徐放開始後714日目に骨膜様細胞が一時的に増加し、その後急速な骨の再生をみとめた。骨模様細胞は28日目にかけてその数を減少させていった。我々はこの骨模様細胞に着目し、この細胞が骨形成活性を持つことを証明し、また、rhFGF2を発端とする分子機構の動きを解明するために、増殖活性や骨芽細胞系細胞マーカーの検出およびFGF関連遺伝子の発現定量分析を行っているところである。平成16年度に確立したrhFGF-2徐放による歯槽骨再生モデルを用いてその組織学的・分子生物学的機序を解析した。rhFGF-2徐放開始後714日目にかけてrhFGF-2徐放群の骨膜は対照群に比して有意に高い細胞増殖活性(PCNA index)を示し、既存骨と連続した仮骨の形成を伴う骨膜の多層化をみとめた。また、増殖している骨膜細胞のアルカリホスファターゼ酵素活性は陽性であることが示された。すなわちin vivoにおいてrhFGF-2は骨膜中の骨芽細胞を増殖させ、数を増した骨芽細胞が活発に仮骨形成を形成し、その結果として再生骨が形成されることを組織学的に示した。次に、骨形成過程にあるrhFGF-2徐放開始7日目の骨膜におけるALP,OSP,OCN,FGFR-13およびRunx2の遺伝子発現分布を検出するために、それぞれのmRNAに対するDIG標識cRNAプローブを作製し、in situハイブリダイゼーションを行った。その結果、仮骨表層の細胞のみOCNが、骨膜内層にOPNが、骨膜全層にALPが発現し、成熟した骨芽細胞が仮骨の最表層に配列し、骨膜外層に向かって骨芽細胞の成熟度が低下していくことが示された。FGFR1-3はこの成熟した骨芽細胞に強く発現するとともに線維性骨膜層の紡錐形細胞にもFGFR-1,-2陽性細胞の点在をみとめた。Runx2はFGFRの発現と一致した発現傾向を示した。これらの結果より、rhFGF-2の直接の作用である細胞分裂励起活性が成熟した骨芽細胞と一部の紡錐形細胞により強く及ぼされることが示唆された。次に、この骨膜よりlaser microdissection法を用いて組織特異的なRNAの抽出を行い、リアルタイムRT-PCR法によりこれら遺伝子の発現を定量した。対照として、ゼラチンキャリアのみを埋入した群(対照群)の骨膜および同週齢(正常群)の正常骨膜より同様の手法でRNAを抽出し、同じくリアルタイムRT-PCRを行った。その結果、rhFGF-2徐放群のRunx
チタン酸ナノシートの毒性機序および免疫機能影響の探索的研究

チタン酸ナノシート(TiNS)は極薄のチタン酸化物であり産業利用が期待されているが毒性影響は調べられていなかった。我々は、TiNS曝露がヒト単球に著明な空胞形成を伴うカスパーゼ依存性アポトーシスを誘導すること、TiNSは空胞内部に存在し、リソソーム量が著増することを明らかにしてきた。そこで、ヒトCD14+単球を磁気分離し、合成したTiNS(菱形:縦横軸約20 x 30 nm)またはTiO2-P25(日本アエロジル社,粒子:粒径約25 nm)曝露下で単球を2または7日間培養し、オートファゴゾームのnucleationおよびelongationに働く26遺伝子およびmTORの遺伝子発現量をRealtime RT-PCRにより調べた。TiNS曝露によりATG101, Beclin-1, ATG12, ATG3を含み2日後で12遺伝子、7日後で10遺伝子発現量が増加しており、オートファジー機能の亢進を示した。オートファジーはオートファゴゾームのリソソームとの融合で完了し、従ってオートファジー機能の亢進がアポトーシスの原因であれば、オートファジー阻害はアポトーシスを抑制し、リソソーム阻害はアポトーシスを更に増加すると予想された。しかし、アポトーシスはオートファジーを抑制するPI3K阻害剤wormanninでは抑制されず、寧ろリソソーム機能低下に働くv-ATPase阻害剤bafilomycin A1により抑制された。また、bafilomycin A1添加はTiNS曝露時の空胞形成も抑制した。以上の結果はTiNS曝露により単球のオートファジーは亢進するが毒性によるアポトーシス誘導には関与せず、寧ろv-ATPase依存性のリソソームの異常な増大がTiNSが持つナノ毒性の機序であることを示す。TiNS曝露によるオートファジー機能亢進を広範な遺伝子についての転写産物解析により捉えることができた。予想とは異なり、オートファジー阻害はTiNS曝露によるアポトーシスを抑制しなかったが、リソソーム過剰に着目し阻害剤を検討することで、TiNS毒性機序の一端を捉えることが出来た。それらの知見は、TiNSが既存のTiO2とは異なる毒性影響を持つこと、およびその機序の一端を明示している。以上のように、現在までに計画どおりに研究成果を得ることができており、本研究課題はおおむね順調に進展していると言える。これまでの知見に基づき、現在、2種類のヒト単球系細胞株を用いてTiNS曝露影響の解析を進めており、準備が完了しだいそれらの細胞を被検体とした網羅的解析の実施を予定している。それにより、未知の影響を含むTiNS毒性機序に関わる遺伝子クラスターが明らかになる可能性がある。また、同時にリンパ球へのTiNS曝露影響の解析も進める予定であり、これについても単球への機能解析に倣い実施を計画する。それらのin vitroの実験計画、および続く動物実験を計画し、それらによってTiNS毒性影響の解明を進める。また、進展が順調であれば、TiNS毒性機序を応用した標的細胞の細胞死を誘導する創薬シーズ探索への基盤となるアッセイ系の構築を試みる。

以上のように、現在までに計画どおりに研究成果を得ることができており、本研究課題はおおむね順調に進展していると言える。これまでの知見に基づき、現在、2種類のヒト単球系細胞株を用いてTiNS曝露影響の解析を進めており、準備が完了しだいそれらの細胞を被検体とした網羅的解析の実施を予定している。それにより、未知の影響を含むTiNS毒性機序に関わる遺伝子クラスターが明らかになる可能性がある。また、同時にリンパ球へのTiNS曝露影響の解析も進める予定であり、これについても単球への機能解析に倣い実施を計画する。それらのin vitroの実験計画、および続く動物実験を計画し、それらによってTiNS毒性影響の解明を進める。また、進展が順調であれば、TiNS毒性機序を応用した標的細胞の細胞死を誘導する創薬シーズ探索への基盤となるアッセイ系の構築を試みる。年度途中で実験補助者が退職することとなり、新規に実験補助者が決まるまで人件費の支出が滞り、また関わる実験に多少の停滞が生じたため。
新規バイオファクター、D-アミノ酸の生合成機構と分子機能:哺乳動物への展開

本研究では、Saccharomyces cerevisiaeに新奇D-セリンデヒドラターゼを見出し、その酵素学的性質を解明した。また同酵素の高い基質特異性を利用したD-セリンの新規酵素定量法を構築した。一方、BSEのモデル動物であるスクレイピー感染ハムスターで、病状の進行と各種臓器におけるD-アミノ酸濃度の変化を検討した。さらにD-アミノ酸と発生の関係を明らかにするため、単細胞から多細胞へと生活環を変化させる細胞性粘菌、Dictyostellium discoidiumをとりあげ、同菌が3種のD-セリン代謝酵素、すなわち動物型セリンラセマーゼ、D-セリンデヒドラターゼ、D-アミノ酸オキシダーゼを有することを明らかにした。さらに、細菌のアラニンラセマーゼや酵母のD-セリンデヒドラターゼと一次構造上の相同性を持ち、細菌から哺乳動物まで広く分布する機能未知タンパク質(UPF0001)のE.coliホモログであるYggSの機能解析を行った。本年は次の課題について以下の結果を得た。細胞性粘菌、D.discoideumのゲノム上に存在する哺乳動物様のセリンラセマーゼとD-アミノ酸オキシダーゼ、および酵母など真核微生物が持つD-セリンデヒドラターゼホモログの3遺伝子のクローニングを行うと共に、その遺伝子産物の酵素学的諸性質を解明した。カイコのセリンラセマーゼの物性解明と遺伝子のクローニングセリンのラセミ化とともにその分解活性を有する既報の動物型セリンラセマーゼとは異なり、カイコのセリンラセマーゼはセリン分解活性を示さない。またカイコセリンラセマーゼの動態はカイコ体内D-Serの濃度と明白な相関を示す。本年度の研究では、クローニングのためのタンパク情報を得るため、カイコ踊よりセリンラセマーゼを3000倍近くまで精製し、そのタンパク質のN-末端構造を明らかにした。酵母D-セリンデヒドラターゼの酵素学的解析とD-セリン酵素定量法の構築出芽酵母が有する新奇D-セリンデヒドラターゼの酵素学的性質、すなわちサブユニット構造や、亜鉛による活性化機構、セリンの2位水素引き抜きとデヒドラーゼ反応の動力学比較などを行い、その反応機構を検討した。また同酵素のD-セリンに対する高い基質特異性を利用し、乳酸脱水素酵素との共役によるD-セリンの酵素定量法を構築し、この方法がヒト尿中のD-セリン定量に応用可能であることを示した。細胞性粘菌の有する3種のD-アミノ酸代謝関連酵素、すなわち動物型セリンラセマーゼ、D-アミノ酸オキシダーゼ、および真核細胞型D-セリンデヒドラターゼ遺伝子が実際に転写されていること、ただし後二者の転写は多細胞期に減少することを明らかにした。また細胞性粘菌では、D-セリンの分解が主としてD-セリンデヒドラターゼによって行われていることを見いだした。2カイコのセリンラセマーゼの物性解明と遺伝子のクローニングカイコの変態時に一過的な増減を示すD-セリンの生理的意義を明らかにするため、その生体内分布を検討した。D-セリン抗体を用いた組織染色の結果、D-セリンは幼虫の脂肪体や囲心細胞に局在することが明らかとなった3酵母D-セリンデヒドラターゼをいたD-セリン酵素定量法の立と哺乳動物におけるD-セリン動態の解析。申請者らが見いだした極めて高い基質特異性を有する酵母のD-セリンデヒドラターゼを用いて、D-セリンの微量定量法の構築を試みた。同酵素によってD-セリンから生成するピルビン酸をピルビン酸酸化酵素によって酸化し、その際生成する過酸化水素を蛍光的に定量する方法で、1 μMオーダーのD-セリンの定量が可能となった。これを用いてハムスター脳内D-セリンの定量を試みた。4哺乳動物の機能未知タンパク質、PROSCの機能解明細菌アラニンラセマーゼのN末端ドメインに酷似した構造を有する哺乳動物の機能未知タンパク質、PROSCの機能と役割を解明することを目的に、その大腸菌のホモログであるYggSの機能解析を行った。YggS遺伝子を欠失させた場合には、大腸菌のアミノ酸代謝系に変化が表れた。本年は次の課題について研究を行った。1.細胞性粘菌(Dictyosterium. discoideum)D-セリンデヒドラターゼの酵素学的研究細胞性粘菌の有する真核細胞型D-セリンデヒドラターゼの酵素学的研究を行った。同酵素が亜鉛に対する依存性において、酵母由来の酵素とは異なる特性を示すこと等を明らかにした。

2.スクレイピー感染ハムスターでのD-アミノ酸の動態BSEのモデル動物であるスクレイピー感染ハムスターにおいて、病態の進行とD-アスパラギン酸およびD-セリン動態との関連を、脳、血清、肝臓、腎臓、および脾臓において検討した。その結果、腎臓でのD-セリンとL-セリンの量比が、正常のハムスターでは週令に伴い増加するのに対し、スクレイピー感染ハムスターでは変化しないことを見出した。3.D-アミノ酸オキシダーゼを用いたD-アミノ酸の新奇酵素定量法の確立現在、D-アミノ酸は、蛍光を有するジアステレオマーに誘導体化した後、HPLCにより分離定量している。本定量法は、D-アミノ酸とL-アミノ酸を同時に検出するため、D-アミノ酸に対し大量のL-アミノ酸が存在する生体試料などでは、L-アミノ酸のシグナルに隠れるためD-アミノ酸の検出が困難となる。そこで、D-アミノ酸オキシダーゼによってD-アミノ酸から生成するα-ケト酸をα-ケト酸特異的な蛍光試薬によって修飾し、これをHPLCにより分離定量する方法を開発した。修飾試薬との反応を有機溶媒中で行うことにより、L-アミノ酸の加水分解を押さえるなどの改善の結果、D-アラニンを初めとする8種類のD-アミノ酸を1μMの感度で定量することが可能となった。本研究ではまた、この定量法に使う分裂酵母のD-アミノ酸オキシダーゼのシステイン残基の修飾による安定化も行った。
発生構造に着目した交通事故分析と事故防止対策に関する研究

交通事故は,自動車や船舶,航空機を取り巻く交通環境(道路・海域・空域特性,周辺の交通状況,気象,海象・日照といった自然条件等)および操縦行動(操縦者の情報収集・判断・操縦特性等)と密接に関係している.道路,航空,海上を問わず,従来の交通事故分析は事故発生率と個々の要因の関連を統計的に整理したものが多く,事故と諸要因との「相関関係」を見出しこそすれ,「因果関係」を抽出するものではなかった.そこで,本研究では,事故発生の因果関係に基づく効果的な事故防止対策の策定に資するため,海上交通や航空交通等に関する過去の事故記録を収集し,これに基づいて交通事故の発生構造を同定する方法論を提案することを目的として検討を行った.本研究では,分析の基本となる枠組みを危険度解析手法のひとつであるFTA(Fault Tree Analysis)に求めている.FTAを実施するに当たっては,従来からFTそのものを構築することの困難性が指摘されてきたが,その解決を図るため,まず,過去の事故調査記録からシステマティックにFTを作成する手法を提案した.提案した手法を用いて海上衝突事故および航空機地上衝突事故の比較的包括的な事故発生構造を同定することができた.しかし,その適用に際して,ある種の事象の生起の有無を識別することの困難性が指摘されたため,FTのファジィ化を図ると共に,構造重要度の概念を拡張した.これらの新たな提案を上述のFTに適用し事例分析を行い,事故防止対策の組み合わせ効果や単純な操縦ミスが事故につながらないためのシステム整備等,今後の事故防止対策に有用となる種々の知見を得ることができた.交通事故は,自動車や船舶,航空機を取り巻く交通環境(道路・海域・空域特性,周辺の交通状況,気象,海象・日照といった自然条件等)および操縦行動(操縦者の情報収集・判断・操縦特性等)と密接に関係している.道路,航空,海上を問わず,従来の交通事故分析は事故発生率と個々の要因の関連を統計的に整理したものが多く,事故と諸要因との「相関関係」を見出しこそすれ,「因果関係」を抽出するものではなかった.そこで,本研究では,事故発生の因果関係に基づく効果的な事故防止対策の策定に資するため,海上交通や航空交通等に関する過去の事故記録を収集し,これに基づいて交通事故の発生構造を同定する方法論を提案することを目的として検討を行った.本研究では,分析の基本となる枠組みを危険度解析手法のひとつであるFTA(Fault Tree Analysis)に求めている.FTAを実施するに当たっては,従来からFTそのものを構築することの困難性が指摘されてきたが,その解決を図るため,まず,過去の事故調査記録からシステマティックにFTを作成する手法を提案した.提案した手法を用いて海上衝突事故および航空機地上衝突事故の比較的包括的な事故発生構造を同定することができた.しかし,その適用に際して,ある種の事象の生起の有無を識別することの困難性が指摘されたため,FTのファジィ化を図ると共に,構造重要度の概念を拡張した.これらの新たな提案を上述のFTに適用し事例分析を行い,事故防止対策の組み合わせ効果や単純な操縦ミスが事故につながらないためのシステム整備等,今後の事故防止対策に有用となる種々の知見を得ることができた.道路,航空,海上を問わず,従来の交通事故分析は事故発生率と個々の要因の関連を統計的に整理したものが多く,事故と諸要因との「相関関係」を見出しこそすれ,「因果関係」を抽出するものではなかった。本研究は,このような認識に立ち,事故発生の因果関係に基づく効果的な事故防止対策の策定に資するため,交通事故の発生構造を同定する方法論を開発すべく実施したものである。本研究では,実際に発生した交通事故を事故の発生構造の一部が発露したものとみなし,個々の事故記録を整理することにより,発生構造を把握することができるものと考えた。分析の基礎となる事故記録が備えるべき要件は,事故に至る種々の時点における当事者の認知内容や判断,事故回避操作が,交通環境,気象条件等と対応づけて詳細に記述されていることである。そして,これらを「事象」としてとらえ,時間の経過に沿って事象の関連を整理することにより同定法を構築した。この方法は,(1)事象系列の抽出,(2)論理ゲートによる事象間の因果関係の記述,(3)部分構造の重ね合わせによる統合化,の3つのプロセスから構成されている。今年度は,船舶の海上衝突事故記録と航空機の地上滑走時衝突事故記録を収集した。前者については,既に収集済みの海難審判庁採決録に加えて同庁事故事例検討会がとりまとめた詳細記録を収集し,後者については,連邦航空宇宙局のデータベースに収められている滑走路進入事故記録を収集した。これらを基に上述の方法に沿って原因事象の抽出を行ったところ,事故当事者,周辺交通状況,自然環境,関連機器といった帰属主体別,あるいは情報交換ミス,バックアップ体制の不備といった機能別の比較的少数のグループが認められ,事故防止対策に結びつくいくつかの有用な知見が得られた。交通事故は,自動車や船舶,航空機を取り巻く交通環境(道路・海域・空域特性,周辺の交通状況,気象・海象・日照といった自然条件等)および操縦行動(操縦者の情報収集・判断・操縦特性等)と密接に関係している。道路,航空,海上を問わず,従来の交通事故分析は事故発生率と個々の要因の関連を統計的に整理したものが多く,事故と諸要因との「相関関係」を見出しこそすれ,「因果関係」を抽出するものではなかった。

そこで,本研究では,事故発生の因果関係に基づく効果的な事故防止対策の策定に資するため,海上交通や航空交通等に関する過去の事故記録を収集し,これに基づいて交通事故の発生構造を同定する方法論を提案することを目的として検討を行った。本研究では,分析の基本となる枠組みを危険度解析手法のひとつであるFTA(Fault Tree Analysis)に求めている。FTAを実施するに当たっては,従来からFTそのものを構築することの困難性が指摘されてきたが,その解決を図るため,まず,過去の事故調査記録からシステマティックにFTを作成する手法を提案した。提案した手法を用いて海上衝突事故および航空機地上衝突事故の比較的包括的な事故発生構造を同定することができた。しかし,その適用に際して,ある種の事象の生起の有無を識別することの困難性が指摘されたため,FTのファジィ化を図ると共に,構造重要度の概念を拡張した。これらの新たな提案を上述のFTに適用し事例分析を行い,事故防止対策の組み合わせ効果や単純な操縦ミスが事故につながらないためのシステム整備等,今後の事故防止対策に有用となる種々の知見を得ることができた。
入院児への心理的支援における非侵襲生理計測を用いたストレス評価に関する研究

本研究は、小児がんなどの長期入院治療が必要な小児の心理的支援を行う際、非侵襲的かつ客観的な生理計測法を用い、そのストレスを評価するために、唾液中の生理物質(バイオマーカー)に焦点をあて、その有用性を検討したものである。その結果、小児がんの治療により長期入院している小児で、造形活動による介入により、急性ストレスの指標である唾液アミラーゼ活性が有意に低下し、入院児の急性ストレス改善に造形活動が有効なことを明らかにした。また、長期の慢性ストレスを評価するため、唾液アミラーゼ活性の日内変動を測定し、その日内変動のパターンの異常から、長期入院児の慢性ストレスを把握しうることを明らかにした。病気療養中の児童・生徒(以下,病気療養児)のQOLの向上においては,心身ストレスの客観的評価方法の開発やストレッサーの同定が課題とされる.したがって,本研究では,入院している児童・生徒(以下,入院児)の心理的支援において,ストレス評価に際する唾液バイオマーカーの活用可能性を検討することを目的としている.唾液バイオマーカーの内,唾液アミラーゼ活性値は,交感神経系の活動高進にともない上昇するため,ストレス研究において頻繁に用いられる唾液バイオマーカーの一つである.さらに,唾液アミラーゼ活性値は,近年,携帯型の簡易測定機器の開発により,簡便かつ即時的に測定値が得られるため,様々な臨床場面における活用の試みも広がりつつある.そこで,本年度は,入院児が病棟内あるいは院内学級などで,余暇活動や学習活動として行っている,図画工作等の造形活動が心理面にもたらす影響を唾液アミラーゼ活性値を用いて評価した.対象は小児がんに罹患した小学校1年生から6年生までの入院児で,造形活動の前と後に唾液アミラーゼ活性値の測定を行なった.造形活動前後の唾液アミラーゼ活性値を比較した結果,活動前値に比べて活動後値は有意に低いことが認められた.これらの結果から,造形活動による交感神経系の活動低下を唾液アミラーゼ活性値が反映したことが推測され,造形活動はeustressとして作用し,一時的な快状態をもたらす可能性があることが示唆された.造形活動は,ストレスマネジメント効果や,心理安定の促進効果があることが臨床的に報告されてきたが,本研究の結果からは,唾液アミラーゼ活性値を用いることで,それらの活動の効果を客観的,定量的に評価できる可能性が示された.今後は急性ストレスに関与する交感神経系の活動だけではなく,入院に伴う慢性ストレスなどへの心理的支援に活用可能な唾液バイオマーカーをさらに探索する必要がある。小児がんなどの長期入院児は、病院内に隔離された生活に伴う慢性的な心理的ストレス、種々の医療処置などに伴う急性ストレスなどに曝露されている。本研究の目的は、多様なストレス状況下にある入院児に対する心理的支援を行う場合に、非侵襲的な方法を用いて、ストレスの程度を客観的に把握する上での唾液バイオマーカーの有用性の検討である。本年度は、特に小児がん患児における唾液バイオマーカーを用いた慢性ストレス評価に関する研究を実施した。具体的には、ステロイド剤が投与されている小児がん患児の慢性ストレス評価における唾液アミラーゼ活性値(sAA)および唾液中コルチゾール濃度(sCORT)の特性を明らかにすることを目的とした。方法は小児がん患児5名を対象とし、健常者で急性ストレス指標とされているsAA、慢性ストレス指標とされているsCORTの測定を行い、あわせてPOMSで対象児の気分を保護者の観察により評価した。各マーカーの日内変動を分析し、健康な児童のデータと比較し、主観的な心理的評価との関連も分析した、その結果、ステロイド投与下の患児においてもsCORTには日内変動が認められたが、健常児でみられるようなsAAの明らかな日内変動は認められなかった。さらにどちらの唾液バイオマーカーもPOMSとの間に関連は認められなかった。以上より、ステロイドを投与されている小児がん患児においても、sCORTの日内変動をモニタリングすることにより、慢性ストレス評価が可能であることが示された。また、小児がん患児ではsAAの日内変動が認められず健常児に比べ慢性的なストレス状態にあることが推測された。さらに小児の慢性ストレスはPOMSなどを用いた保護者による評価は難しいことが明らかとなった。発達途上における病気療養中の児童・生徒(以下,病気療養児)の心身ストレスは,心理面だけではなく,治療経過や,完治した後の社会適応にも悪影響を及ぼすとされ,治療過程における生活の質(QOL)の向上が重視されている。そのため、QOLの低下要因である,疾患や入院加療に伴うストレスの正確な客観的評価法の開発やストレッサーの同定が,特に慢性疾患による治療を必要とする小児においては重要な課題とされている。

以上の背景から,本研究では,慢性疾患の治療のため長期入院している児童・生徒(以下,入院児)のストレスを非侵襲的に客観的・定量的に評価する指標として,唾液バイオマーカーに注目し,入院児に有効な唾液中ストレスマーカーを探索するとともに,入院児のストレスの実態を明らかにすることを目的とした。それに加えて,入院児に対する心理的支援におけるストレスの生理学的評価の活用可能性を明らかにすることも目的としている。本年度は,入院児に有効なストレスマーカーの探索に関する研究の開始に関連する準備および各種手続きを完了し,研究参加者を募り,生体試料(唾液と血液)のサンプリングを開始した。サンプリング件数は現在80検体程度であり,今後も継続してサンプリングを行っていく予定である。さらに,研究参加者のほとんどは小児がん患者であり,投与薬剤による唾液バイオマーカーへの影響,心理面への影響に関して,先行研究を中心に検討を行った。その結果,特にステロイド治療薬による抑うつ症状等の心理的側面への影響に関する報告が多くみられたことから,今後は,投与薬剤による差異も含めて,分析を行う予定である。また,今後の研究の展開に鑑み、小児がん以外で、疾患の臨床症状に心理的ストレスが大きく影響することが知られている気管支喘息児を対象に保護者のQOLの調査を含めた基礎的研究も併せて行い,学術学会などで研究成果の発表を行った。本研究は3年計画で行う予定であり、そのうち,本年度は2年目の調査実施を優先して行う期間であった。実際に,本年度は,2種類の唾液バイオマーカーを用いたサンプリングを行い,サンプリング自体はすでに完了に近い状態にあり,分析も進行しているため,研究の進捗状況はおおむね順調であると判断した。本年度は研究の開始に関連し,より詳細な研究計画の作成および研究開始に必要な各種手続き(対象児が入院する医療機関の倫理審査を通過)を終了し,研究への参加者を募り,サンプリングの開始に到達することができたことから,研究の進捗状況はおおむね順調と判断した。次年度は研究の最終年度であり,研究成果の公表を重点的に行い,社会的な還元に従事する予定である。したがって,分析をすすめ,知見の公表について,国内外の学会における発表,およびジャーナルへの投稿のための論文執筆を中心に行う。本研究は3年間で行う予定であり,1年目は研究の準備開始を,2年目は調査実施を,3年目は研究成果の公表を重点的に行う予定であり,次年度は調査実施を優先して行う期間にあたる。現在,研究はすでにサンプリングの開始に至っており,次年度は現在のペースでサンプリングを行い,件数を増加していく予定である。次年度は研究成果公表に従事するため,発表のための国内外の学会参加に係る旅費,研究共同者との打ち合わせ旅費,および論文執筆における英文校正等に係る費用を中心とした研究費の使用を計画している。次年度はサンプリングの実施を主に行うため,サンプリングに必要となる実験消耗品(唾液収集機器や衛生用品)の購入,および唾液成分の解析に必要な機器,データ分析に必要となる各種関連機器の購入を予定している。また,上記の3点に重点をおき,かつ,研究に関連する情報の収集,研究打ち合わせのための旅費に使用する予定である。
作業者の予測動作を考慮した自立動作型「杉の枝打ちロボット」の開発

○研究目的地球温暖化問題の解決にも寄与する森林の健全育成に関心をもち,森林組合とも話合いを設ける中で林業従事者のパワー不足を解消し,杉の枝打ち作業を適期に行うことで打開できるとの考えでロボットの開発を考え着手した。特に良質材の産出に大きく影響する樹齢III級(木は5年単位でI齢級)までの若齢級期での枝打ち用に限定し,熟練の作業員と同程度の仕事を行う軽量安価な機器の開発のため,前年度で未完成の枝打ち機構(幹周りの旋回機構,刃物の固定,枝打ち径方向への調整,昇降機構との合体)の開発を目的とした。○研究方法刃物を有する機器の操作は最悪の場合人命にも深く関わるため,設計段階より指導教員の確認検証を得てイノターロック機構やフェールセーフにも配慮して研究を進めた。併せて前年度資料収集の際に白神森林組合で得た,既存の枝打ちマシンが過負荷によるエンジン停止時の挙動,杉(木肌)の湿面状態でのマシンの滑落時における刃物の動きが,作業者の著しい想定外であるため極めて危険であるなどの報告を踏まえて制御機構に対策を講じた。ロボットの動作検証は,町の森林組合と連携して組合の管理している森林で実施を前提とした。○研究成果目標としたロボットの仕様(重量:20kg,7.2min/本,価格:20万円程度,動作:自動自立型)に対する開発品の完成度を数値で示すと(重量:19.5kg,25min/本,価格:15万円,動作:センサーの取付け調整中)であり製品としてみた場合,満足出来るものではない。特に全体の重量約20kgでの昇降スピード満足出来るものではなく,仕様を満たすには昇降モータの設計選択からやり直すことが必須である。また加速度センサーの稼働にも手間取っており,特別に専攻科生の応援を得て進めたが完成報告には至っていない。
2価の銅塩を用いる連続環化反応の開発と生理活性化合物の合成研究

2価の銅塩を触媒とするインドール環化反応における基質と触媒との関連の解明を第一の目的として検討を行った.その結果,本反応はアセチレン末端の置換基には影響を受けず,特に電子求引性置換基が存在していても速やかに閉環すること,さらに芳香環上の置換基の性質にも影響を受けないことが明らかになった.窒素原子上の置換基に関しては,スルホニル基の場合にはCu(OTf)_2,Cu(OAc)_2,およびCu(OCHO)_2・xH_2Oが好結果を与えることが分かった.この間に触媒の銅-酸素結合の性質が反応に大きな影響を与えることも分かり,機構に関する情報を得ることが出来た.また,アルコキシカルボニル基の場合には,基質によっては好収率で生成物を与える触媒が存在するが,一般的に使用可能な触媒の発見には至っていない.一方,本反応は無置換アニリン誘導体にも適用でき,Cu(OCOCF_3)_2・xH_2Oが高い一般性を持つ触媒であることを見出した.次に,連続的環化反応の開発を検討し,窒素原子上にKHでアニオンを発生させた後に2価の銅塩と反応させることで,インドール環化反応後に連続的にもう一つの閉環反応を進行させることに成功した.続いて天然物合成への応用を検討し,hippadineの形式合成に成功した.Duocarmycin SAの合成研究では,ジヒドロピロール環の効率的合成法を開発できたが,この環を先に構築するルートでは以降の合成が困難であることが明らかになった.新ルート開発の過程で,Negishi等の反応条件を2-iodoaniline誘導体に適用するとカップリング反応と環化反応が連続的に進行することを見出し,duocarmycin SAの形式合成を達成した.最後に連続環化反応のarborescidine A合成への適用を計画したが,鍵反応の原料を効率よく行うことに成功しておらず,全合成は今後の研究課題である.2価の銅塩を触媒とするインドール環化反応における基質と触媒との関連の解明を第一の目的として検討を行った.その結果,本反応はアセチレン末端の置換基には影響を受けず,特に電子求引性置換基が存在していても速やかに閉環すること,さらに芳香環上の置換基の性質にも影響を受けないことが明らかになった.窒素原子上の置換基に関しては,スルホニル基の場合にはCu(OTf)_2,Cu(OAc)_2,およびCu(OCHO)_2・xH_2Oが好結果を与えることが分かった.この間に触媒の銅-酸素結合の性質が反応に大きな影響を与えることも分かり,機構に関する情報を得ることが出来た.また,アルコキシカルボニル基の場合には,基質によっては好収率で生成物を与える触媒が存在するが,一般的に使用可能な触媒の発見には至っていない.一方,本反応は無置換アニリン誘導体にも適用でき,Cu(OCOCF_3)_2・xH_2Oが高い一般性を持つ触媒であることを見出した.次に,連続的環化反応の開発を検討し,窒素原子上にKHでアニオンを発生させた後に2価の銅塩と反応させることで,インドール環化反応後に連続的にもう一つの閉環反応を進行させることに成功した.続いて天然物合成への応用を検討し,hippadineの形式合成に成功した.Duocarmycin SAの合成研究では,ジヒドロピロール環の効率的合成法を開発できたが,この環を先に構築するルートでは以降の合成が困難であることが明らかになった.新ルート開発の過程で,Negishi等の反応条件を2-iodoaniline誘導体に適用するとカップリング反応と環化反応が連続的に進行することを見出し,duocarmycin SAの形式合成を達成した.最後に連続環化反応のarborescidine A合成への適用を計画したが,鍵反応の原料を効率よく行うことに成功しておらず,全合成は今後の研究課題である.平成13年度は,申請者自身が開発した2価の銅塩を用いる2-ethynylaniline誘導体のインドールへの閉鎖反応の適応性の拡大を第一の目的として検討を行った.まず,カウンターアニオンの反応性に対する影響を調査するために,様々な2価の銅塩を用いて反応を試みた.この結果,copper triflate,copper acetate,およびcopper benzoateを用いた場合には良好な収率で閉環反応が進行したが,copper mesylateおよびcopper tosylateを用いた場合には全く反応が進行しない事が明らかになった.カウンターアニオンの酸性度が強いほど,銅原子と酸素原子のイオン結合性が強いことが既に知られている.このことから,円滑に反応が進行するためには一方のアニオンが銅原子から解離する事が必要であることが示唆され,反応機構に関する重要な知見を得る事ができた.続いて基質に関する検討を行った.スルホンアミドを用いた場合には,copper acetateが好結果を与え,アセチレン末端上の置換基が芳香環,アルキル基,および同一分子内に水酸基を持つ場合でも良好な収率で閉環体を得ることができた.カーバメートを基質とした場合にはcopper triflateが,本反応の特徴である無置換アニリンを基質とした場合にはcopper benzoateが,アセチレン末端上の置換基がアルキル基と芳香環である基質に対しては収率良く閉環体が得られたが,その他の基質では分解が競合する事が明らかになった.第二の目的として,連続的な環化反応の開発を検討した.

アセチレン末端に脱離基を持つ炭素鎖を結合させたスルホンアミドを基質として検討を行った結果,KHで窒素原子上の水素を引き抜いた後,copper triflateと処理する事で,期待通り連続的な環化反応が進行し,一挙に三環性化合物を構築することに成功した.平成13年度までの検討により,2-ethynylanilineのスルホンアミドおよびカーバメートを基質とする2価の銅塩触媒によるインドールへの閉環反応が良好な収率で進行すること,さらに反応が円滑に進行するための基質と触媒の間の関連を明らかにすることが出来た.平成14年度は,本反応の適用性のさらなる拡大を目指して検討を行った.これまでに2-ethynylaniline誘導体のインドールへの閉環反応は,パラジウムを初めとする様々な反応剤で進行することが明らかになっているが,アセチレン上に電子求引基が存在する基質での閉環反応の例はこれまでに報告がない.しかし,copper acetateを触媒として用い,アセチレン末端にカルボメトキシ基を持つスルホンアミドを基質とした反応は,円滑に進行し,対応するインドール誘導体を好収率で得ることに成功した.本反応は2-ethynylaniline誘導体から2位に電子求引基が存在するインドール誘導体の直接的な合成法の最初の例である.本反応では,スルホンアミドを用いた場合にはcopper acetateが,カーバメートを基質とした場合にはcopper triflateが好結果を与えることが分かっていたが,無置換アニリンを基質とした場合には,基質の構造によっては分解が競合する事が明らかになっていた.そこで,触媒を変えることでこの点の改良を検討した結果,copper trifluoroacetateが最も優れた触媒であることが分かり,芳香環上の置換基の種類に関わらず,好収率で閉環体を与えることが明らかになった.さらに,この検討の間に,これまでに報告例がない2級アミンでの閉環反応も進行することを明らかに出来た.続いて,本反応の生理活性化合物への応用を検討し,短工程で四環性インドールアルカロイドであるhippadineの形式合成を達成した.
企業システムの国際比較史的研究

「企業システム」すなわち企業内外の構造的な関係は、現在日本の企業や経済が直面しているもっとも重要な国際的問題である。そこで、本研究は、経営史のアプローチに立脚して、アメリカ、イギリス、日本の三カ国について、国際比較に有効なデーターの作成と、これにもとづく各国の企業システムの解明を試みたものである。三カ国の国際比較のプロジェクトの実施のうえには、それぞれ各国の研究を専攻する研究者の共同作業が必要なので、この目的のために、アメリカとイギリスの調査・研究については、英米経営史の専攻の安部悦生、日本については東條由紀彦と橘川武郎、全体の統括は由井常彦が担当した。研究者4名は、計画にもとづき、まず分析のための大企業の成長とシステム関係のデーターの作成を実施した。日本の、アメリカ、イギリスについて、戦前の1918年、1930年、1940年、そして戦後について1945年、1973年における大会社のリストを作成し、これを業界団体、企業集団、政策特性によって分類する作業である。日本については、主として全国会社役員録を資料とし、1918(大正9)年、1930(昭和5)年については、主要企業をコンピューターの活用によって、ほぼ完全な大企業リストを作成することができた。戦後については予算の制約から、完成は将来にもちこしたが、ここに完成した戦前のリストは、網羅的かつ精度の高いもので、国際的にも利用されうるものである。本年度は、研究テーマ「企業システムの国際比較史研究」について、資料の収集、日本・イギリスおよびアメリカの大企業のリストなどデーターの作成および課題にたいする討議をすすめた。資料収集については,日本の企業の組織についての詳細なデーターが編集され、かつイギリスで世界の大企業とくに国際的な会社についての研究成果が編集・公刊されたので、これらを購入して、討論の材料とすることにした。本年度の計画としての日本の大企業についての歴史的な調査リストの作成については、データーの内容の充足は容易でなく、完成にはいたっていないが、大学院生などの助力をえて、作業を推進することができた。研究成果としては、再三の討議やデーターの検討を通じて、日本の場合は、政府と業果団体、あるいはグループ、そして企業の内部組織が、いわば人間と情報のネットワークを形成し、一つのシステム的関係が人間を基礎に発達しており、それは商品の流通と調整を基盤とするアメリカの大量生産、大量販売のシステムと相違している。またイギリスの場合は資金の調達と調整がシステムの基礎をなし、持株会社的なシステムの発展を生じたことが確認された。そこでこの仮設にもとづいており実証的な研究を深め、とくに日本について立入った研究をすすめることとした。本年度の成果の発表という点については、さしあたり戦後の日本の企業システムが代表的に見出される産業として石油化学工業の事例を検討し、研究者橘川が「日本の企業システムの発展、政府と業界団体を中心として、-石油化学工業の事例-」(仮題)の執筆にとりかかり、すでに完成をみたので、これの英文の翻訳の作業をすすめ、イギリスの国際的な学界誌「ビジネス・ヒストリィ」に発表すべく準備をすすめており、1993年末までには掲載が可能がとも思われる。研究者4名は、研究計画にもとづき、まず分析のためのデーターの作成を実施した。日本、アメリカ、イギリスについて、戦前の1910年、1920年、1935年、そして戦後について1960年、1980年にかける大会社のリストを作成し、これを業界団体、企業団体、政策特性によって分類する作業である。日本については、主として全国会社役員録を資料とし、1910(明治44)年、1920(大正9)年については、主要企業をコンピューターの活用によって、ほぼ完全な大企業リストを作成することができた。1935(昭和10)年は予算の制約から、将来にもちこしたが、ここに完成した戦前の二つのリストは、はじめての網羅的かつ精度の高いもので、国際的にも今後利用されうるものである。

アメリカ、イギリスについては、ハーバート大学(チャーンドラー教授)、ロンドン大学(ハナ教授)の協力をえて、同じ時期についてのデーターを入手することができた。そしてこれらの基礎データーにもとづいて、平成5年に検討と分析を重ねた。戦後については、完成度の高い包括的なデータの作成は、どの国についても非常に困難であるので、産業別の事例研究を行うこととし、石油化学工業、繊維工業、鉄鋼業などについて、それぞれ研究者の調査にもとづいてシステム的関係の比較研究を試みた。以上の調査研究の成果は、由井常彦「大企業体制の形成」(岩波書店、日本経営史講座III、平成7年)、橘川武郎「日本の企業システム-石油化学工業について-」(英文、Business History;Vol.35、1995、に投稿中)などに発表の予定である。
十五年戦争期における音楽・芸能を用いた文化宣伝--日本から《南方》へ

十五年戦争期の日本の文化的アイデンティティを探ることを目的に、(1)何が日本に固有で純粋な文化と考えられ、また海外に紹介されたか、(2)何が日本や大東亜共栄圏がもつべき音楽と考えられたか、(3)日本や大東亜共栄圏に新しい音楽文化を確立する際に日本の伝統楽と西洋由来の音楽はいかに利用されるべきと考えられたか、検討した。さらに、それぞれの結果をもとにして当時の日本人が自己と自文化をいかに表象したか考察した。本研究は、(1)十五年戦争期に日本政府や軍、外交・文化に関係する諸機関によって、いわゆる「南方」地域を対象として実施された、芸能・音楽を用いた文化宣伝の実態を明らかにすること、(2)それをもとに、「日本」「日本文化」「大東亜共栄圏」といった諸観念が文化的アイデンティティとしていかに構築されたか考察することを内容とする。初年度は次の研究をおこなった。(1)国際文化振興会(193472)による、芸能・音楽を用いた対外文化事業の実態を整理し、それらがナショナリズム、アイデンティティ、オリエンタリズムといった概念といかなる関係にあるか考察した。(2)日本少国民文化協会(194145)による音楽を用いた事業を整理・分析し、同協会による事業のなかでも行事「「ミンナウタへ」大会」や絵本『ウタノヱホン大東亜共栄唱歌集』は、音楽を用いて「日本国民」(あるいは「大東亜共栄圏民」)を統合することを目指した例であることを指摘した。(3)『音楽公論』(194143)誌に掲載された論説を対象にして、「大東亜共栄圏の音楽」がいかなるものとして構想されたか、そうした言説において音楽がひとびとの「生活」と密接な関係を持つものとして論じられたことに注目して分析した。いわゆる「南方」に向けられた芸能・音楽による文化宣伝が、「大東亜共栄圏」思想に則って実施されるとすると、それは「大東亜共栄圏民」の共同性を形成する試みであったと言い換えることができる。そこで、(4)音楽による共同性の構築について、英国ギルドホール音楽院の《コネクト》プロジェクトによる創造的ワークショップについて考察し、本ワークショップにおいては参加者の共同性の高まりが認められること、それは現代における新しい音楽創造の手法であると同時に、共同性が喪われた現代において新しい形の共同性を構築するよすがになりうることを指摘した。本研究は(1)十五年戦争期に、いわゆる「南方」地域を対象に日本政府、軍、外交・文化関係の諸機関によって実施された、文化事業・文化宣伝の実態とそれに関する思想を明らかにすること、(2)それをもとに「日本」「日本文化」「大東亜共栄圏」といった諸観念が文化的アイデンティティとしていかに構築されたか考察することを目的としている。平成21年度は次の研究をおこなった。(1)作曲家で戦後は音楽教育行政にも尽力した諸井三郎の思想に注目し、「近代の超克」シンポジウム(1942年夏)における彼の発言ならびにシンポジウムの事前に提出した論文、その他、雑誌・新聞等に掲載された諸論考を分析した。その結果をもとに、諸井の「近代」観念およびその超克に関する思想について考察し、論文にまとめた。(2)元外交官で、1940年代前半に日泰文化会館館長として日本・タイ間の文化関係においてきわめて重要な役割を果たした柳澤健に注目し、彼の諸論考を分析した。その結果をもとに、彼の思想における文化相対主義ならびに「大東亜共栄圏」観念について考察し、論文にまとめた。(3)1940年代前半の日本の音楽専門雑誌・新聞等に掲載された記事のうち、「国民音楽」について論じたものを対象に、論者が日本の伝統音楽ならびに西洋由来の近代的な音楽をどう扱うべきと論じたか分析した。その結果をもとに、当時の日本音楽界の文化的アイデンティティを考察し、論文にまとめた。本論文は2010年5月開催の国際会議にて発表される予定である。(4)タイ王国バンコクにて1940年代前半の日タイ文化交流事業に関する文献の所在について調査した。文献目録を用いた今回の簡易調査では、本研究に直接的に関係する文献の所在を明らかにできなかったが、目録化されていない文献で本研究に関係するものが所在する可能性のあることが判明した。この結果を踏まえて、平成22年度に第二次調査を実施する予定である。本研究は(1)アジア太平洋戦争期に、いわゆる「南方」地域を対象にした日本の文化事業・文化宣伝の実態とそれに関する思想を明らかにすること、(2)「日本」「日本文化」「大東亜共栄圏」といった諸観念が文化的アイデンティティとしていかに構築されたか考察することを目的としている。平成22年度は次の研究をおこなった。(1)1930年代に日本の対外文化事業に外務官僚として携わり、1940年代前半に日泰文化会館の初代館長を務めた柳澤健に注目した。柳澤の行動と思想ならびに日泰文化会館の事業に関する史料を収集・整理し、柳澤のタイにおける事績をまとめた論文を執筆した。

その際、柳澤研究には史学的な意義のみならず現代的な意義があることを指摘した。(2)タイ王国の国立図書館にて、日系英字紙“Bangkok Chronicle"やタイ字誌『〓〓(日本-サヤーム)』(日本サヤーム協会発行)等の史料を閲覧し、1940年前後の日本-タイ間の文化交流の実態に関する記録を収集した。これらの史料の分析は今後の課題である。(3)1940年代前半の日本の音楽専門雑誌・新聞等のうち「国民音楽」について論じた記事を、日本の伝統的な楽「邦楽」と西洋由来の近代的な音楽「洋楽」とをいかに扱うべきと主張したかという視点から分析した。その結果、当時の音楽関係者が「日本人が古来より外国由来の文化を同化して新しい文化を創造してきたこと、またそうする能力を持っていること」を重視し、それがいわば日本音楽界の文化的アイデンティティとして機能したと考えられることを指摘した。この成果は国際会議にて発表し、これをもとに当時の楽壇の文化的アイデンティティのありようを考察する論考を執筆した。なお、ナショナリズムに関する研究は多いが、ナショナリズム観念の土台を形成するアイデンティティについての考察は少ない。研究の深化が求められよう。
1分子的手法を用いた酵母プリオン線維の成長と分裂の解析

タンパク質が自己触媒的に構造異常化することを根本原理とするプリオン現象は、哺乳類における伝達性海綿状脳症の感染因子としてだけでなく、酵母のいくつかの表現型の伝播因子としても存在する。近年の研究で、プリオン現象には(1)構造異常化に伴うアミロイド線維形成(2)アミロイド線維の断片化という要素が必要であることが分かってきた。筆者は、酵母プリオンタンパク質Sup35を用いて、これらの現象を分子レベルで追跡することを目的として研究を行った。まず、アミロイド線維末端におけるSup35の構造変換をモニターすることを試みた。Sup35のN末123残基(Sup35N)のプリオンドメインの2か所をCys置換し、それぞれFRETドナーとアクセプターとなる蛍光分子で修飾した。修飾位置は、昨年度までの研究で得られた、最もFRET効率変化の大きいものを選択した。これを用いて、アミロイド線維末端におけるSup35Nの構造変換の全反射蛍光顕微鏡における検出に取り組んだ。しかし、線維末端だけでなく、線維側面との相互作用が大きく、両者を見分けることが困難であった。そこで、用いるサンプルを、N末253残基断片のSup35NMにしたところ、線維側面との相互作用が改善された。ただし、まだ線維末端へのモノマー結合を見分けるところまでは至っておらず、更なる条件検討を要する。酵母プリオン線維の断片化には分子シャペロンHsp104が必要であることが分かっていたが、補因子が必要であるらしいことも知られていた。最近、Hsp40の一種Sis1がその補因子の1つであることが細胞レベルの研究からわかってきた。筆者は、自ら開発したin vitro線維断片化検出系を用いて、Sis1の作用を調べた結果、Sis1がHsp104とともに酵母線維を断片化することを確認した。タンパク質性の伝播因子であるプリオンは、異常構造に変換されたタンパク質分子が集合してアミロイド線維を作り、それがさらに周囲の正常型タンパク質の構造変換を誘発することにより増殖・伝播する。その過程には、大きく分けて1.タンパク質の構造変換を伴った線維成長と、2.線維の分裂という2つの機構が存在していると考えられている。この2つの機構を詳細に解析するため、1分子観察の手法を用いて研究を進めている。1.「タンパク質の構造変換を伴った線維成長」の解析に関して、最終的には全反射蛍光顕微鏡上で、線維末端における構造変換を1分子FRET(蛍光共鳴エネルギー移動)という手法で直接観察する計画であるが、それに適した材料を調製する必要がある。筆者は酵母由来のタンパク質Sup35NMを用いて、構造変換を起こすと考えられている領域内の2残基をシステインに置換し、それぞれ「ドナー」および「アクセプター」となる2種類の蛍光標識を導入した。この2残基を選択するに当たっては、正常型・異常型ともに詳細な構造が不明であるため、可能性のある組み合わせの標品を複数作製することにした。現在、作製したタンパク質を多分子系で測定し、野生型と同様のアミロイド線維形成能を持ち、かつ構造変換に伴うFRET効率の変化が大きいものを選択しようと試みている。2.「線維の分裂」の解析に関して、筆者は酵母抽出物の中から効率よくSupNM線維を切断するタンパク質因子を同定し、その性質を解析した(論文投稿準備中)。この因子は、ATP加水分解エネルギーを利用してSup35NM線維を切断し、他のタンパク質因子の助けを必要としない。今後、蛍光標識したSup35NM線維を固定し、線維切断因子の作用を顕微鏡下で直接観察することや、原子間力顕微鏡などを用いて線維に張力を及ぼし、線維切断因子を加えたときの強度の変化を解析することを試みたいと考えている。これらの機構について詳細を明らかにするため、筆者は1分子FRETと呼ばれる実験系を用いて研究を進めている。まず、酵母プリオンタンパク質Sup35のプリオンドメインSup35N内の2残基をシステインに置換し、それぞれを「ドナー」および「アクセプター」と呼ばれる2種類の蛍光色素で標識する。構造の決定されていないタンパク質であるため、蛍光標識を導入する2残基については多くの組み合わせの変異体を作製し、その中から多分子系での実測によって構造変換前後のエネルギー移動効率の変化が大きく、かつ野生型と同様の線維形成ができるものから選択する方法をとった。多分子実験では2種類の蛍光色素をランダムに標識する方法であったが、1分子実験に進むにあたって、1分子の中に確実に2種類の蛍光色素が標識されるように標識方法を改良している。現在のところ、1種類の蛍光色素で標識反応を行った後、1か所だけに標識されたものだけを逆相クロマトグラフィーによって分離し、さらにもう1種類の蛍光色素で残りを標識するという方法が最良であった。今後、1分子解析に進む予定である。