hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
イネの超撥水性を発現する分子遺伝学的基盤の解明

これまで葉の撥水性が低下した日本型品種由来の多数の変異体から、ワックスの生合成に関わる複数の原因遺伝子を同定してきた。これらの遺伝子の欠損によって、変異体では葉のワックス量の低下、または化学的組成の変化によって撥水性が低下したものと考えられた。しかし、これらの遺伝子の生育過程における発現解析を行ったところ、いくつかの遺伝子では葉以外の様々な組織での発現が認められた。特に花器官での発現が見られるものが存在したことから、ワックスの生合成は花器官や種子の成長過程に何らかの機能を果たしていると考えられた。そこで、種子に対するワックスの生合成遺伝子の機能を明らかにする為に、変異体の種子表面の物理性を解析した。葉の撥水性が顕著に低下した複数系統の種子を水上に静置させたところ、野生型の種子は顕著に水を弾き、水面に浮かんだのに対して、いくつかの変異体系統では水に浮かぶことなく沈んだ。このことは、これらの系統では葉の撥水性に加えて、種子の撥水性も低下していると考えられた。これらの解析から、種子の撥水性という新たな形質に関わる変異体と遺伝子の情報を入手することが出来た。今後は種子の撥水性の生物学的役割を明らかにしていく予定である。イネにおける撥水性の多様性解析においては野生イネの中に撥水性の低下した系統を見いだしていた。これらの系統のゲノム構成と生育地との関係について考察した結果、撥水性の低下していた野生イネは栽培イネの祖先種とは遠縁の系統であり、生育地とも相関は認められなかった。このことから、栽培イネの起源種はすでに強い撥水性を保持しており、撥水性形質の変化はイネの栽培化において寄与していないものと推定された。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。環境条件と発生過程で撥水性が変化するのか明らかにするために、接触角と表面構造の解析を行った。異なる環境条件で栽培したイネ品種における第2葉と3葉の葉身向軸側の接触角を測定した結果、低照度条件下で栽培した葉はコントロール条件に比べて接触角は低かった。走査型電子顕微鏡を用いてこれらの表面構造を観察したところ、コントロール条件では、多くの乳頭状突起がありワックスの結晶で覆われていたのに対し、低照度条件では乳頭状突起は少なく表面のワックス結晶は薄かった。発生過程段階ごとに接触角を測定した結果、撥水性に大きな変化は見られなかったが、表面構造からは発生段階が上がるごとにワックス結晶が多くなっていた。このことから環境の変化に伴い、表面構造や撥水性は変化するものと考えられた。次に、撥水性を支配する遺伝因子を明らかにするために、原因遺伝子のマッピングを行った。低い撥水性を示し乳頭状突起に異常を示した9系統を用いて詳細な解析を行った結果、5つの系統において二つのクチクラワックス合成に関与する遺伝子に変異が認められた。さらに、品種間での撥水性の多様性を明らかにするため、世界のイネ・コアコレクション(WRC)61系統を用いて、撥水性の評価と表皮の微細構造の観察を行った。その結果、いくつかの系統において接触角が比較的低いことが明らかとなった。また、簡易走査型電子顕微鏡を用いてこれらの表面構造を観察したところ、乳頭状突起の形状が他と異なる系統が確認された。このことからイネ品種間で表面構造や撥水性に差があると考えられた。一部の計画については、進捗に遅れがあるが、全体的には順調に成果が出ているため。葉の撥水性が低下した日本型品種由来の多数の変異体から、複数の原因遺伝子を同定した。その結果これらの原因遺伝子は全てワックスの生合成に関わる遺伝子であった。しかし、変異体の葉表面においては、ワックス沈着の減少と共に表面の微細構造も異常になっていたことから、同定された遺伝子はワックスだけでなく、表面の微細構造の形成にも関与していると考えられた。本研究で同定された遺伝子の発現を、Real-time PCRとin situ hybridizationによって調査した。Real-time PCRの結果からは、ほとんどの遺伝子が葉原基を含む若い組織で高い発現がみられたが、in situ hybridizationの結果からは遺伝子間で発現パターンが異なり、機能する場所やタイミングは遺伝子によって異なることが示唆された。接触角計を用いて、世界の栽培イネコアコレクション(WRC)と野生イネにおける撥水性の評価と、電子顕微鏡による表皮の微細構造の観察を行った。その結果、WRCの55系統では接触角に大きな違いは見られず、全ての栽培イネ系統において高い撥水性をもつことがわかった。一方、水の散布によって葉の表面における水滴の付着程度が異なる野生イネをスクリーニングし、そのうちの25系統における葉の接触角を測定した結果、野生イネには接触角が低い系統が存在することが明らかとなった。さらに、これらの葉の表面構造を観察したところ、乳頭状突起の密度が異なる系統が確認された。このことから、野生イネにおける撥水性の低下には乳頭状突起の密度変化が関与している可能性が示唆された。個々の研究課題については、進捗状況にばらつきはあるが、総合的にみて順調に成果が出ている。

これらの遺伝子の欠損によって、変異体では葉のワックス量の低下、または化学的組成の変化によって撥水性が低下したものと考えられた。しかし、これらの遺伝子の生育過程における発現解析を行ったところ、いくつかの遺伝子では葉以外の様々な組織での発現が認められた。特に花器官での発現が見られるものが存在したことから、ワックスの生合成は花器官や種子の成長過程に何らかの機能を果たしていると考えられた。そこで、種子に対するワックスの生合成遺伝子の機能を明らかにする為に、変異体の種子表面の物理性を解析した。葉の撥水性が顕著に低下した複数系統の種子を水上に静置させたところ、野生型の種子は顕著に水を弾き、水面に浮かんだのに対して、いくつかの変異体系統では水に浮かぶことなく沈んだ。このことは、これらの系統では葉の撥水性に加えて、種子の撥水性も低下していると考えられた。これらの解析から、種子の撥水性という新たな形質に関わる変異体と遺伝子の情報を入手することが出来た。今後は種子の撥水性の生物学的役割を明らかにしていく予定である。イネにおける撥水性の多様性解析においては野生イネの中に撥水性の低下した系統を見いだしていた。これらの系統のゲノム構成と生育地との関係について考察した結果、撥水性の低下していた野生イネは栽培イネの祖先種とは遠縁の系統であり、生育地とも相関は認められなかった。このことから、栽培イネの起源種はすでに強い撥水性を保持しており、撥水性形質の変化はイネの栽培化において寄与していないものと推定された。今後も計画通りに研究を進める予定である。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
婦人科悪性腫瘍に対する新規治療法の開発：子宮間葉系腫瘍の生物学的応答性の解析

子宮平滑筋腫(子宮筋腫)は、50歳以上の成人女性に罹患率7080%で発症する良性腫瘍で、女性に発生する腫瘍で最も頻度の高い腫瘍のうちの一つである。従来はその大きさを基準に手術が行われてきたが、女性の晩婚化・高齢初産婦の増加などライフスタイルの変化により、40歳代女性の妊孕性温存希望が強くなっている。故に、今日の子宮筋腫の治療方針ではこの社会的背景を考慮して、子宮を温存する方法が要求される。しかし、子宮筋腫に類似した悪性疾患である子宮肉腫がまれながら存在するため、多くの子宮筋腫患者の中で子宮温存の是非を決定する際、その除外診断が重要となる。残念ながら、現行の鑑別法は、手術摘出組織の外科病理診断であり客観性に欠けている。さらに、これまでに各国において臨床試験が行われているが、既存の抗癌剤では、子宮肉腫に対する顕著な延命効果が認められていない。そこで、子宮肉腫に対する新規治療法・診断法の確立に向け、子宮肉腫の生物学的特性を理解することが重要である。林らの研究グループは、蛋白分解酵素複合体プロテアソームの構成因子であるLMP2の欠損マウスにおいて、子宮肉腫が自然発症することを見出した(利根川進教授:米国マサチューセッツ工科大学の研究協力)。そこで、私達は、病理ファイルより選別された各種子宮間葉系腫瘍の生検組織でのLMP2の発現状況について免疫組織化学染色により検討し、特異的に子宮肉腫でLMP2の発現が著しく減弱することを報告した。提携の医療機関との連携の基、私達は、LMP2に着目したDNA MicroArrayの遺伝子プロファイリングを行い、子宮間葉系腫瘍の診断マーカーの候補分子の探索を行っている。本研究より、林らの研究グループは、カベオリン、LMP2、Cyclin Eなどの候補因子に対する子宮間葉系腫瘍の診断マーカーとしての可能性を検討した。子宮平滑筋肉腫(子宮肉腫)は、再発・転移を繰り返す難治性腫瘍である。人種を問わず成人女性の多くに発症する子宮平滑筋腫(子宮筋腫)と子宮肉腫の判別が極めて難しく、子宮肉腫への治療法は外科的手法に限定されている。そのため、延命効果が認められる分子標的治療法の確立が要望されている。私達の研究グループは、プロテアソーム構成因子LMP2の欠損マウスで、子宮肉腫が高頻度に自然発症することを報告した。そこで、私達の研究グループは、病理ファイルより選別された各種子宮間葉系腫瘍の生検組織でのLMP2の発現状況について免疫組織化学染色により検討し、特異的に子宮肉腫でLMP2の発現が著しく減弱することを報告した。提携医療機関との連携の基、私達の研究グループは、LMP2に着目したDNA MicroArrayの遺伝子プロファイリングを行い、子宮間葉系腫瘍に対する標的分子の探索を行っている。これまでの研究で、私達の研究グループは、カベオリン、サイクリンEの子宮間葉系腫瘍に対する標的分子としての可能性を報告した。現在、私達の研究グループは、これら標的因子の候補分子の臨床応用に向けて詳細な検討を行っている。現在、私達の研究グループは、これら標的因子の候補分子の血液あるいは尿中での検出について検討を行っている。私達の研究グループは、これら標的因子の候補分子カベオリン、サイクリンEなどの血液あるいは尿中での検出について検討を行っている。共同研究の連携

機関とともに、臨床検体の数を増やすことで、私達の研究グループは、標的因子の候補分子の検出感度や検出方法の確立を行いたい。子宮間葉系腫瘍、特に、再発・転移を繰り返す子宮肉腫に対する有効な治療法は外科的摘出手法以外に確立されておらず、既存の化学療法では延命効果が殆ど期待されない。子宮肉腫におけるLMP2とCalponin h1の生物学的応答性についてのさらなる研究成果は、子宮肉腫および子宮間葉系腫瘍に対する分子標的治療と新規診断法の開発へと還元されると思われる。研究は、おおむね研究計画に従って進行しています。子宮平滑筋肉腫に対する標的因子の同定が、当初計画していたよりもスムーズに行われたため、次年度使用額が生じた。提携医療機関とともに、私達の研究グループは、更に多くの臨床検体を用いてこれまで同定された子宮平滑筋肉腫に対する標的因子の信頼性と特異性について次年度使用額と平成28年度請求額を合わせた研究運営資金を用いて検討を行う。
モザイク卵の細胞分化における遺伝的制御機構

典型的なモザイク卵の一つとして知られているホヤ卵では,古くから,分化の決定に関与すると思われる卵細胞質決定因子の存在を示唆する実験的証拠が数多く得られている.本研究所では,ホヤ胚における筋肉細胞の分化に的をしぼり,筋分化決定因子の分子的背景を解析するとともに,そうした刺激にどのように応答して筋肉細胞分化に関わる遺伝子の発現が起こるかを明らかにすることを目的とした.1.筋肉細胞決定因子の解析:筋肉細胞決定因子はマイオプラズムと呼ばれる細胞質に含まれていると考えられている.コウレイボヤ卵のマイオプラズムが青白い自家螢光を発する特徴を利用してマイオプラズムを単離し,それを抗原としてモノクローナル抗体を作製したところ,マイオプラズムを特異的に認識するモノクローナル抗体が12クローン得られた.その中のIIG6B2抗体は,遠心によっては動かない卵表層細胞質構成成分を認識し,抗体を受精卵に顕微注射すると,実験胚の80%で筋特異的酵素アセチルコリンエステラーゼの発現が抑えられた.イミュノブロット法によりIIG6B2抗原を解析してみると,分子量約37Kd,pI50K単一の分子を認識していることが判った.現在,コウレイボヤ卵巣から得たポリ(A)^+RNAに対するcDNAライブラリーを作製し,抗体を利用してこの抗原蛋白質をコードする遺伝子の単離を試みている.2.筋肉細胞特異的遺伝子の解析:筋肉特異的遺伝子のうち,アセチルコリンエステラーゼ遺伝子,ミオシン重鎖遺伝子,アクチン遺伝子のcDNAプローブを得る努力を行っている.そのうちミオシン重鎖遺伝子断片を含むcDNAプローブを当研究室で,またアクチン遺伝子のcDNAが他の研究室で得ることができた.現在,様々な方法でこの遺伝子の発現パターンを解析している.典型的なモザイク卵の一つとして知られているホヤ卵では,古くから,分化の決定に関与すると思われる卵細胞質決定因子の存在を示唆する実験的証拠が数多く得られている.本研究所では,ホヤ胚における筋肉細胞の分化に的をしぼり,筋分化決定因子の分子的背景を解析するとともに,そうした刺激にどのように応答して筋肉細胞分化に関わる遺伝子の発現が起こるかを明らかにすることを目的とした.1.筋肉細胞決定因子の解析:筋肉細胞決定因子はマイオプラズムと呼ばれる細胞質に含まれていると考えられている.コウレイボヤ卵のマイオプラズムが青白い自家螢光を発する特徴を利用してマイオプラズムを単離し,それを抗原としてモノクローナル抗体を作製したところ,マイオプラズムを特異的に認識するモノクローナル抗体が12クローン得られた.その中のIIG6B2抗体は,遠心によっては動かない卵表層細胞質構成成分を認識し,抗体を受精卵に顕微注射すると,実験胚の80%で筋特異的酵素アセチルコリンエステラーゼの発現が抑えられた.イミュノブロット法によりIIG6B2抗原を解析してみると,分子量約37Kd,pI50K単一の分子を認識していることが判った.現在,コウレイボヤ卵巣から得たポリ(A)^+RNAに対するcDNAライブラリーを作製し,抗体を利用してこの抗原蛋白質をコードする遺伝子の単離を試みている.2.筋肉細胞特異的遺伝子の解析:筋肉特異的遺伝子のうち,アセチルコリンエステラーゼ遺伝子,ミオシン重鎖遺伝子,アクチン遺伝子のcDNAプローブを得る努力を行っている.そのうちミオシン重鎖遺伝子断片を含むcDNAプローブを当研究室で,またアクチン遺伝子のcDNAが他の研究室で得ることができた.現在,様々な方法でこの遺伝子の発現パターンを解析している.
多目的配置問題の解析的研究と商品開発システムへの応用

まず、ファジィ多目的配置問題の安定性を調べた。次に、メンバーシップ関数の集計関数に基づいた準凹性の一般化を提案し、その性質を調べた。次に、レベル集合を用いてファジィ集合列の極限およびファジィ集合値写像の極限と導写像を定義し、それら性質を調べた。これにより、解がファジィ集合として得られるファジィ数理計画問題のモデル構築や安定性や感度分析を考える場合に必要になるファジィ集合値解析の基礎理論が構築された。1まず、ファジィ多目的配置問題を考え、需要点および2点間の距離を測る距離測度および満足度を測るメンバーシップ関数の変化に対するパレート最適解および弱パレート最適解の安定性を調べた。これにより、ファジィ多目的配置問題のパレート最適解および弱パレート最適解の頑健性が保障された。2次に、メンバーシップ関数の集計関数に基づいた準凹性の一般化を提案し、その性質を調べた。集計関数の加法的生成元も導入し、その加法的生成元を用いて、提案した一般化された準凹性を特徴付けた。また、提案した一般化された準凹性がどのような特徴をもつのかをいくつかの例を通して考察した。これにより、提案した一般化された準凹関数をファジィ数理計画問題へ応用した場合の有用性が示唆された。3最後に、レベル集合を用いてファジィ集合列の極限およびファジィ集合値写像の極限と導写像を定義し、それら性質を調べた。これにより、解がファジィ集合として得られるファジィ数理計画問題のモデル構築や安定性や感度分析を考える場合に必要になるファジィ概念の基礎理論が構築された。4ファジィ概念を導入した配置問題は実際の問題により適合し広く適用できることが期待され、商品開発支援システムに非常に有用である。得られた一連の研究成果は、ファジィ概念を配置問題に導入する際の基礎理論を体系的に整理し新たに構築したものである。今後は、得られた研究成果を基に、ファジィ配置問題の効率的な解法の開発および商品開発支援システムの構築を目指す予定である。1前年度に、メンバーシップ関数の集計関数に基づいた準凹性の一般化を提案し、その性質を調べ、集計関数の加法的生成元も導入し、その加法的生成元を用いて、提案した一般化された準凹性を特徴付け、提案した一般化された準凹性がどのような特徴をもつのかをいくつかの例を通して考察した。本年度は、これらの結果を精緻化し発展させた。これにより、一般のファジィ数理モデルに広く適用可能なった。2前年度に、レベル集合を用いてファジィ集合列の極限およびファジィ集合値写像の極限と導写像を定義し、それら性質を調べた。3ファジィ概念を導入した配置問題は実際の問題により適合し広く適用できることが期待され、商品開発支援システムに非常に有用である。今後は、得られた研究成果を基に、いくつかの新たな数理モデルとしての、ファジィ配置問題の構築とそれらの効率的な解法の開発および商品開発支援システムの構築を目指す予定である。4なお、本年度実施計画記載の「国際会議を誘致し、本研究に関連する研究補助や専門的知識の提供を受ける」は東日本大震災の影響により誘致決定後キャンセルになった。ただし、中止ではなく、韓国釜慶大学校において開催され、今年度の研究成果の一部を発表した。1前年度に、メンバーシップ関数の集計関数に基づいた準凹性の一般化を提案し、その性質を調べた。まず、それをファジィ数理計画問題へ応用した。次に、集計関数の加法的生成元も導入し、その加法的生成元を用いて、集計関数に基づいて一般化された準凹性を特徴付けた。次に、、一般化された準凹性の性質を調べ、一般化された準凹性の応用としてメンバーシップ関数の準凹からの違い(ズレ)の程度を表す指標である乖離度を提案した。次に、ファジィ集合の凸性を合接的集計関数を用いて一般化し、その一般化された凸性の応用としてファジィ集合の非凸度を考えた。そして、ファジィ集合の演算に関して、ファジィ集合の一般化された凸性およびファジィ集合の非凸度の性質を調べた。

レベル集合を用いてファジィ集合列の極限およびファジィ集合値写像の極限と導写像を定義し、それらの性質を調べた。通常の集合をファジィ集合と区別したい場合はクリスプ集合とよぶことにする。ファジィ集合列の極限およびファジィ集合値写像の極限と導写像は、クリスプ集合列の極限およびクリスプ集合値写像の極限と導写像のファジィ版である。3得られた一連の研究成果は、ファジィ概念を配置問題に導入する際の基礎理論を体系的に整理し新たに構築したものである。今後は、得られた研究成果を基に、いくつかの新たな数理モデルとしての、ファジィ配置問題の構築とそれらの効率的な解法の開発および商品開発支援システムの構築を目指す予定である。13.研究発表(平成23年度の研究成果)の雑誌論文により、ファジィ概念を配置問題に導入する際の基礎理論の体系的な整理と新たな構築が進んだ。さらに、本年度研究内容の雑誌論文2本が投稿中であり、それらの研究成果発表も今後予定している。これにより、商品開発支援システムの構築のための理論的な準備が十分整ったといえる。24年度が最終年度であるため、記入しない。さまざまなタイプの配置問題にファジィ概念を導入した新たなモデルの開発および解析を検討し、効率的な解法の開発および商品開発支援システムの構築を目指す。研究が計画どおり進まない時は、適宜、研究協力者,連携研究者やその他本研究に関連する研究者から助言を受け、研究方針を見直し検討する。研究協力者(海外共同研究者)陳小君(香港理工大学教授)より、数値解析の理論に関する助言を受ける。連携研究者田中環(新潟大学教授)より、ベクトル最適化理論に関する助言を受ける。連携研究者桑野裕昭(金沢学院大学教授)より、ファジィ理論に関する助言を受ける。
ケモカイン受容体を標的にした眼内血管新生制御機構の解明と新規治療法の開発

網膜病的血管新生をきたすoxygen-induced retinopathy(OIR)モデルマウスを用いてケモカイン受容体CCR3抗体投与による治療効果について検討した。CCR3抗体の投与により、病的な血管新生は有意に抑制されており、VEGF164mRNAも有意に抑制されていたが、VEGF120mRNAは有意な抑制はみられなかった。また炎症性サイトカインMCP-1も、CCR3抗体により抑制されていなかった。増殖糖尿病網膜症(PDR)症例と網膜前膜症例について手術時の摘出組織に対してCCR3の発現を免疫組織学的に検討したところ、PDR摘出組織では血管内皮にCCR3およびそのリガンドeotaxinが発現していた。CCR3のリガンドにはRANTESおよびeotaxinが知られているが、OIRモデルで検討したところ、RANTESは検出限界以下であり、eotaxinは、VEGFの変動と同じ発現上昇を認めた。今回の結果からCCR3を介した網膜血管新生のリガンドとして、eotaxinの関与が示された。また、糖尿病ではない絶対緑内障の摘出眼球の網膜血管内皮にはCCR3の発現は認めなかった。以上のことからCCR3は正常網膜血管内皮には存在していないが、血管新生をきたした血管内皮には発現していたことから、CCR3は正常網膜血管に対する副作用の恐れはなく、また、眼内のVEGFは生体の恒常性維持に必要であり、病的血管新生に関与するアイソフォームVEGF164のみを抑制できるCCR3を標的にした網膜血管新生治療の可能性があると考えられた。CCR3拮抗剤は、現在アメリカで滲出型加齢黄斑変性に対する内服薬として治験(第II相)が始まっており、我々の研究から、加齢黄斑変性以外の増殖糖尿病網膜症、未熟児網膜症といった眼内血管新生疾患にも有効な可能性が示された。網膜における病的新生血管を促すモデルとして、酸素誘導網膜症(OIR)モデルを作成し使用した。具体的には、新生児マウスを日齢7(p7)に、75%酸素ボックス内で5日間母マウスとともに保育し、日齢12(p12)に通常酸素濃度に戻し、血管新生が最も旺盛となる日齢17(p17)に眼球を摘出し評価を行い、通常酸素濃度の同日齢のマウスを対照とした。経時的に眼球から網膜を分離し、発現しているケモカインについてRT-PCRを用いて検討したところ、日齢12で、OIRマウスの網膜でCCR3 mRNAが有意に増加しており、日齢14で、病的血管新生に関与すると考えられているVEGF164 mRNAが有意に増加していた。いっぽうで、生理的血管新生に関与するといわれているVEGF120 mRNAについては日齢24でOIRマウスでやや増加傾向ではあったが、コントロールと比べてどの時点でも、有意な差はみられなかった。次に、CCR3のリガンドである、eotaxin(CCL11)と、RANTESについてELISAで検討したところ、RANTESはELISAの検出限界以下であった。VEGFタンパクとeotaxinは、ともに、日齢10-12ではOIRの網膜では有意に低下していたが、日齢14-17では逆に有意に増加しており、同じVEGFとeotaxinの発現動向は同じであり、同じ上流シグナルが関与していることが示唆された。OIRモデル作成が順調だったため増殖糖尿病網膜症症例8例と網膜前膜症例4例について手術時の摘出組織に対して以下の免疫組織化学的検討を行った。増殖糖尿病網膜症症例の手術時に摘出した線維血管増殖膜におけるCCR3の発現を免疫組織学的に検討したところ、血管内皮を染色するvon Willebrand factor (vWF)抗体と共染色性を8例全例示した。対象として網膜前膜で同様の検討をしたところCCR3の発現は4例ともみられなかった。次に糖尿病眼ではない対照眼として、絶対緑内障で眼球摘出を行った網膜でvWFおよびCCR3抗体で二重染色をしたところ、非糖尿病眼ではCCR3は網膜血管内皮に発現していなかった。Eotaxin-1 (CCL11)が、血管内皮のCCR3に結合して血管内皮増殖を促進させるという報告があるため、eotaxin-1 (CCL11)の発現も、同様に増殖糖尿病網膜症の線維血管増殖膜で検討したところ、血管内皮に認められた。以上のことからCCR3は正常網膜血管内皮には存在していないが、血管新生をきたした血管内皮には発現していたことから、CCR3は正常網膜血管に対する副作用の恐れはなく、網膜血管新生の治療ターゲットになると考えられた。CCR3の下流にあるシグナル解析が進んでおらずやや遅れている。

今回の結果からCCR3を介した網膜血管新生のリガンドとして、eotaxinの関与が示された。また、糖尿病ではない絶対緑内障の摘出眼球の網膜血管内皮にはCCR3の発現は認めなかった。以上のことからCCR3は正常網膜血管内皮には存在していないが、血管新生をきたした血管内皮には発現していたことから、CCR3は正常網膜血管に対する副作用の恐れはなく、また、眼内のVEGFは生体の恒常性維持に必要であり、病的血管新生に関与するアイソフォームVEGF164のみを抑制できるCCR3を標的にした網膜血管新生治療の可能性があると考えられた。CCR3拮抗剤は、現在アメリカで滲出型加齢黄斑変性に対する内服薬として治験(第II相)が始まっており、我々の研究から、加齢黄斑変性以外の増殖糖尿病網膜症、未熟児網膜症といった眼内血管新生疾患にも有効な可能性が示された。CCR3抗体による治療効果、さらにその下流にあるシグナルをあきらかにし、新たな創薬ターゲットを解明する。CCR3の下流にあるシグナル解析について研究分担者と協力してすすめる。物品費で端数が生じたため。(理由)物品費で端数が生じたため。(使用計画)物品費として使用する。物品費として使用する。
膵頭移植における生着期間延長に関する基礎的研究

1.ラット膵より膵島を分離・精製してストレプトゾトシンの静注にて作成したラットに移植する同種移植を施行した.合わせて,移植膵島の生着期間を修飾する因子の発現解析を試みた.2.膵島の分離・精製に関しては手技的に安定しほぼ一定の数,viabilityの膵島を調製可能となった.3.ストレプトゾトシンによる糖尿病ラットの作成もほぼ安定して作成可能となった.4.当初予定していたマイクロカプセルの作成を断念し,膵島を門脈内へ直接注入する方式とした.しかし,門脈内への注入による同種移植は一定期間血糖値の改善が得られているが,その期間は極端に短く,データも安定しなかった.投与経路を脾内,腎皮膜下,腹腔内などに変更したが,いずれも安定した結果を得られなかった.5.膵島移植におけるアポトーシスの関与については実験の施行ごとに矛盾した結果が得られ,一定の結果を得られなかった.6.移植膵島の生着期間を延長させると期待されているReg proteinの発現解析を施行した.RT-PCRにて得られたReg protein geneのcDNAのDNA sequenceを確認してVectorに挿入した.複数の発現系を用いて発現解析を施行したが,Reg proteinの発現効率がきわめて低く,解析に必要な蛋白量を得られなかった.1.ラット膵より膵島を分離・精製してストレプトゾトシンの静注にて作成したラットに移植する同種移植を施行した.合わせて,移植膵島の生着期間を修飾する因子の発現解析を試みた.2.膵島の分離・精製に関しては手技的に安定しほぼ一定の数,viabilityの膵島を調製可能となった.3.ストレプトゾトシンによる糖尿病ラットの作成もほぼ安定して作成可能となった.4.当初予定していたマイクロカプセルの作成を断念し,膵島を門脈内へ直接注入する方式とした.しかし,門脈内への注入による同種移植は一定期間血糖値の改善が得られているが,その期間は極端に短く,データも安定しなかった.投与経路を脾内,腎皮膜下,腹腔内などに変更したが,いずれも安定した結果を得られなかった.5.膵島移植におけるアポトーシスの関与については実験の施行ごとに矛盾した結果が得られ,一定の結果を得られなかった.6.移植膵島の生着期間を延長させると期待されているReg proteinの発現解析を施行した.RT-PCRにて得られたReg protein geneのcDNAのDNA sequenceを確認してVectorに挿入した.複数の発現系を用いて発現解析を施行したが,Reg proteinの発現効率がきわめて低く,解析に必要な蛋白量を得られなかった.1.ラット膵より膵島を分離・精製しストレプトゾトシンの静注にて作成したラットに移植する同種移植を施行した.2.膵島の分離,純化に関しては手技的に安定しほぼ一定の数,viabilityの膵島を調製可能となった.3.移植部位に関しては門脈内への直接注入の他マイクロカプセルを作成し大網内,腎被膜下への移植を計画している.このうち,門脈内注入に関しては移植による血糖値の改善等の結果が得られているが,大網内および腎被膜下への移植に関してはマイクロカプセルの作成が安定しないためか生着率が悪く,若干の改良を必要とする段階にある.4.膵島移植におけるアポトーシスの関与についてDNA ladderやTune 1法など複数の検出法にて検討しているが,いまだ一定の結果は得られていない.移植の手技等を安定させ,さらなる検討を行っている.5.上記と平行して分離膵島から移植膵島の生着期間を修飾する因子と期待されているReg proteinの発現解析を施行している.現在Reg protein geneのcDNAをRT-PCR法により調製しDNAのSequenceを確認している.確認後Vectorに挿入し発現を行う予定である.また,発現系が安定すれば,mutationを導入しwild typeとの比較を行いReg proteinの生化学的な特徴を検討する予定である.6.本年度中に上記の問題点を改善し安定した移植法を確立するとともに,移植膵島の生着,機能不全に関与する分子生物学的な機序の解明に努めたいと考えている.1.ラット膵より膵島を分離・精製してストレプトゾトシンの静注にて作成したラットに移植する同種移植を施行した.合わせて,移植膵島の生着期間を修飾する因子の発現解析を進めている.2.膵島の分離・精製に関しては手技的に安定しほぼ一定の数,viabilityの膵島を調製可能となった.3.ストレプトゾトシンによる糖尿病ラットの作成もほぼ安定して作成可能となった.4.膵島移植の形態をマイクロカプセルに封入して施行する予定であったが,マイクロカプセルの作成が安定せず,門脈内への直接注入により施行することにした.マイクロカプセルの作成も引き続き継続している.門脈内への注入による同種膵島移植は一定期間血糖値の改善が得られているが,その期間は極端に短く,データも安定していないため,手技上の問題点がないか検討中である.5.膵島移植におけるアポトーシスの関与については一定の結果が得られず難航している.6.移植膵島の生着期間を延長させると期待されているReg proteinの発現解析を施行している.Reg protein geneのcDNAのDNA sequenceを確認してVectorに挿入した.現在発現解析を施行中であるが,発現率が低く,解析に必要な蛋白量はいまだ得られていない.発現効率を高める手技を検討中である.

発現系が安定すれば,mutationの導入等を行い機能解析を施行する予定である.7.本年度中に上記の問題点を改善し安定した移植系を確立する予定である.1.ラット膵より膵島を分離・精製してストレプトゾトシンの静注にて作成したラットに移植する同種移植を施行した.合わせて,移植膵島の生着期間を修飾する因子の発現解析を試みた.2.膵島の分離・精製に関しては手技的に安定しほぼ一定の数,viabilityの膵島を調製可能となった.3.ストレプトゾトシンによる糖尿病ラットの作成もほぼ安定して作成可能となった.4.当初予定していたマイクロカプセルの作成を断念し,膵島を門脈内へ直接注入する方式とした.しかし,門脈内への注入による同種膵島移植は一定期間血糖値の改善が得られているが,その期間は極端に短く,データも安定しなかった.投与経路を脾内,腎被膜下,腹腔内などに変更したが,いずれも安定した結果を得られなかった.5.膵島移植におけるアポトーシスの関与については実験の施行ごとに矛盾した結果が得られ,一定の結果を得られなかった.6.移植膵島の生着期間を延長させると期待されているReg proteinの発現解析を施行した.RT-PCRにて得られたReg protein geneのcDNAのDNA sequenceを確認してVectorに挿入した.複数の発現系を用いて発現解析を施行したが,Reg proteinの発現効率がきわめて低く,解析に必要な蛋白量を得られなかった.
高活性容積可変反応場での分子変換反応

NHCの電子的および立体的な特徴はNi(CO)n(NHC)におけるCO伸縮振動や分子構造から評価される。そこで、PoxImを用いたニッケルカルボニル錯体Ni(CO)n(PoxIm) (n = 2, 3)を合成した。窒素上にPh基を有する1とNi(cod)2のTHF溶液に対して、N-ホルミルサッカリンとトリエチルアミンとの反応により系中発生させた3当量のCOを反応させた。その結果、Niに対して1がカルベンとホスホリル基で配位した錯体2が収率98%にて生成した。錯体2のIRを固体状態にて測定したところ、1882.5, 1975.1 cm-1にCO伸縮振動が観測された。錯体2の31P NMR (C6D6, 22 °C)を測定した結果、68.1 ppmにホスホリル基由来のケミカルシフトが観測された。これは遊離状態の1 (31P 62.0)に比べ低磁場シフトして観測されていることから、ホスホリル基のNiに対する配位が示唆される。一方、1とNi(cod)2のトルエン溶液に対して、過剰量のCOを加えた結果、カルベンのみが配位した錯体3が収率96%にて生成した。錯体3におけるCO伸縮振動は1944.2, 1969.3, 2046.5 cm-1に観測された。また、ホスホリル基由来のケミカルシフトは31P 59.2であり、1に比べて顕著な変化が観測されないことから、ホスホリル基はNiに対して配位していないと考えられる。以上の結果より、適切な反応条件(COの圧力、溶媒)を選択することで、PoxImの配位形式を変えながらNi(CO)2(PoxIm)およびNi(CO)3(PoxIm)の両方が合成できることを見出した。N-ヘテロ環状カルベン(NHC)は有機金属錯体の配位子や有機分子触媒として広く利用されており、有機合成化学における重要なツールの1つである。当研究室では、窒素上にホスフィンオキシドを導入したN-phosphine oxide-substituted imidazolylidene (PoxIm)を合成し、ホスホリル基の回転による反応空間の変化を鍵としたルイス酸-ルイス塩基付加体からのFrustrated Lewis Pair (FLP)の自在発生や、求核的なカルベンと求電子的なリンを活用した二酸化炭素の非対称ケトンへのワンポット変換へと利用してきた。一方、PoxImは分子内にカルベンとホスホリル基という反応性の異なる二つのルイス塩基部位を有しているため、遷移金属に対して単座または二座の配位子として作用することが期待される。本研究では、PoxImの配位子としての電子的および立体的な特徴を明らかにするため、種々のNi錯体を合成した。今回合成したNi錯体は、溶液中だけではなく、固体状態においても一酸化炭素の配位、脱離を可逆的に進行させる。このような例は非常に珍しい例であり、本研究において設計した配位子による新しい機能である。また、これまでの研究成果のまとめを積極的に進める。平成27年度においては、新しいN-Hetero Cyclic Carbene(NHC)配位子として作用するN-Phosphine oxidesubstituted imidazolylidenes (PoxIm)の合成を行った。本配位子は、ニッケルに対して容易にする事を確認した。また、一酸化炭素雰囲気下においては、Ni(CO)3(Poxlm)錯体がほぼ定量的に生成した。溶液中の構造はNMR、固体状態での構造はX線結晶構造解析にて決定した。いずれも同じ構造である事が明らかとなった。本錯体を低温下にて再結晶を行ったところ。一分子の一酸化炭素の解離が進行しNi(CO)2(k2-Poxlm)が定量的に生成した。この錯体についても溶液中の構造はNMR、固体状態での構造はX線結晶構造解析にて決定し、どちらも同じ構造であった。明らかとなった分子構造においては、PoxImのリンオキシド部分の酸素がニッケル中心に配位していた。この事実は、窒素に結合したリンオキシド部分の回転により配位している一酸化炭素の解離が低温においても進行する事を示しており、N-P結合を軸とするリンオキシド部分の回転により有効配位容積に大きな変化が生じると共に、酸素の配位により18電子錯体として安定化しているものと考察される。また、PoxImとB(C6F5)3との反応により生じるルイス酸・塩基対(BPox)が熱刺激により解離し、フラストレイト-ルイス酸・ルイス塩基対を再生し水素分子を分裂させることも明らかとなった。本反応の反応機構を明らかにするために、速度論解析を行った。その結果、反応は水素の圧力に対して速度論的飽和現象を示す事があきらかとなった。さらに計算化学による解析により詳細な機構を明らかにするための検討を開始した。目的としていた、熱刺激によるフラストレイトルイスペアの発生温度の制御を達成し、これについての論文を学術誌に発表した(Angew. Chem. Int. Ed. 2015, 54, 11666-11671.)。またその成果は、当該学術誌のフロントカバーピクチャとして採用された。さらには、MITが開始した化学情報発信サイトや現代化学にも紹介された。また、反応機構の解析に関しては速度論的飽和現象が観測された。

これは、機構解析において重要な知見で有り、この現象を説明出来る反応機構を見いだすよていである。平成28年度においては、PoxImの容積可変配位子としての可能性を探るためにニッケルや銅への配位が可能であるかの検討を行った。ニッケルにおいては、一酸化炭素が三分子配位した錯体の単離が可能であった。その後、溶液中では錯体上の一酸化炭素が解離し一酸化炭素が二分子配位した錯体が単離された。この際には、リンオキシド部分の酸素がニッケルに配位することで、ニッケル18電子錯体として存在している。しかしながら、これらの錯体を用いての環化カルボニル化反応を検討したが目的とする生成物は得られなかった。PoxImと銅との反応についても検討した。この際にも期待された錯体が得られる事が明らかとなった。反応性に関しては、まだ検討していない。一方、予期されなかった研究成果としては、二酸化炭素とPoxImの反応が挙げられる。通常、N-ヘテロサイクリックカルベン(NHC)は二酸化炭素と反応して安定な付加体を与える。そのために、不活性な化学種として認識されている。PoxImもNHCの一種であり二酸化炭素との反応により不活性な化学種が得られると予想し反応を行った。しかしながら、実際にはカルベンにより捕捉された二酸化炭素に対してリンオキシド部分が転位することでカルボン酸とホスフィン酸との混合酸無水物が得られた。反応は室温にて速やかに進行する。また、得られた混合酸無水物は種々の求核剤と反応し非対称ケトンを与える。混合酸無水物は、このように非対称ケトン類を与える化学種として広く利用されているが、このように市販品から三段階で二酸化炭素を利用する反応は報告例がない。二酸化炭素との反応経路に関して密度汎関数法にて検討したところ二酸化炭素は、カルベンに捕捉されたのちにリンオキシド部分が二酸化炭素に転位して生成物を与える事が分かった。PoxIm高活性であることを想定して、設計した配位子であったが、反応場を制御する事が期待されたリンオキシド部分がニッケルに対しては有効に作用しなかった。これは、反応条件下でのリンオキシド部分の配位力が有効に作用しなかったことに起因しているものと考えられる。しかし、その一方で、二酸化炭素との反応が室温に速やかに進行しカルボン酸とホスフィン酸との混合酸無水物が得られた。これは、全くの想定外の反応結果であった。これは、二酸化炭素に対してリンオキシド部分が転位することで反応は室温にて速やかに進行すると考えられる。混合酸無水物は、このように非対称ケトン類を与える化学種として広く利用されているが、このように市販品から三段階で二酸化炭素を利用する反応は報告例がなく非常に意義深い研究成果であると考えられる。NHCの電子的および立体的な特徴はNi(CO)n(NHC)におけるCO伸縮振動や分子構造から評価される。そこで、PoxImを用いたニッケルカルボニル錯体Ni(CO)n(PoxIm) (n = 2, 3)を合成した。窒素上にPh基を有する1とNi(cod)2のTHF溶液に対して、N-ホルミルサッカリンとトリエチルアミンとの反応により系中発生させた3当量のCOを反応させた。その結果、Niに対して1がカルベンとホスホリル基で配位した錯体2が収率98%にて生成した。
擬2元系アモルファス透明導電膜の開発と透明電極への応用に関する研究

平成16,17年度においてスパッタ法でIn_2O_3-ZnO系とSnO_2-ZnO系での透明導電膜について膜作製をおこない,Al_2O_3やGa_2O_3を不純物として添加し、それらの電気的、光学的特性やアニーリング特性について調べた。ターゲットにZnO(またはSnO_2)とIn_2O_3のセラミックターゲットを時に対向ターゲット式スパッタ法で、Arガス中でスパッタした。ターゲットに流す電流を080mの範囲で変化させ、その時の電流比δをδ=I_<zn>/(I_<zn>+I_<In>)と定義した。まず、In_2O_3-ZnO系についてδ値とZnとIn/(Zn+In)組成比はほぼ一致している。膜構造はδ=00.2でIn_2O_3結晶構造、δ=0.20.6でアモルファス構造、δ=0.60.8でホモロガス結晶構造、δ=0.81.0でZnO構造を示す。Ga_2O_3の影響はAl_2O_3と同様なものであり,Ga_2O_3の添加量が増えるとIn_2O_3が現れるδ値が0.2より増大し,ホモロガス結晶相出現もδ=0.62から0.67へと増大する。電気的特性はGa_2O_3が7.5wt%添加でアモルファス相膜の抵抗率が2.68x10^<-4>Ωcmと,Al_2O_3添加の膜の最小抵抗にくらべて少々高いものの,やはり低抵抗率のアモルファス膜が得られる。ターゲット中のGa_2O_3の量を,4.5,6,7.5wt%と変化したとき抵抗率への影響はあまりなく,キャリア密度の増大や,移動度の低下も見られなかった。このことはアモルファス中ではGaが通常のドナーや散乱中心として働いていないことを示す。この傾向もAl_2O_3の添加と同様であった。δ=0.27wt%でのGa_2O_3依存性はGaの添加とともに吸収端の波長が短波長側にシフトする傾向を示した。透過率はGa_2O_3量とともにわずかに減少傾向である。アモルファス領域でのGaは電気的にはあまり悪影響を及ぼさず,格子中に歪みを誘起するこで光学的バンドギャップの増大傾向を引き起こすことが確認された。いずれの膜も表面平坦で,低抵抗アモルファス透明電極として有望であることがわかった。In_2O_3-ZnO系とSnO_2-ZnO系での透明導電膜についてスパッタ法で膜作製をおこない、それらの電気的、光学的特性やアニーリング特性について調べた。ターゲットにZnO(またはSnO_2)とIn_2O_3のセラミックターゲットを同時に対向ターゲット式スパッタ法で、Arガス中でスパッタした。

ターゲットに流す電流を080mAの範囲で変化させ、その時の電流比δをδ=I_<Zn>/(I_<Zn>+I_<In>)と定義した。まず、In_2O_3-ZnO系についてδ値とZnとIn/(Zn+In)組成比はほぼ一致している。膜構造はδ=00.2でIn_2O_3結晶構造、δ=0.20.7でアモルファス構造、δ=0.70.8でホモロガス結晶構造、δ=0.81.0でZnO構造を示す。Al_2O_3を不純物としてZnO:Alの形で添加してスパッタ添加したときのAl_2O_3の影響について調べた。Al_2O_3の影響はあまりなく、Al_2O_3の添加量が増えるとIn_2O_3が現れるδ値が0.2より増大する。電気的特性は2wt%添加でアモルファス相膜のキャリア密度がかなり上昇したが、34wt%添加した場合キャリアの増大はあまりない。このことはアモルファス中ではAlが通常のドナーとして働いていないことを示す。Al_2O_3の2wt%添加膜では光学的バンドギャップの収縮が見られるが、34wt%添加すると逆に光学的バンドギャップの上昇が見られ、膜は短波長側での透明度が上昇した。また、N_2+H_2(5%)中で短時間アニールによりアモルファス膜の表面が極端に平坦になった。これらの現象は応用上重要な結果を含むと考えられる。SnO_2-ZnO系膜も同様に作製された。SnO_2-ZnO系もアモルファス相が存在した。アモルファス相は350°Cでも存在した。低コストであるSnO_2-ZnO系において、ドーパントであるSbの添加量を増加したり、スパッタガスに酸素ガスを導入するなどして、抵抗率の減少を試みたが、抵抗率は4×10^<-2>Ωcmにとどまっており、最適条件に達していないものの、透明性は良好で、In_2O_3-ZnO系と同様に表面の平坦な膜が得られることがわかった。平成17年度においてスパッタ法でIn_2O_3-ZnO系とSnO_2-ZnO系での透明導電膜について特膜作製をおこない,とくにGa_2O_3を不純物として添加し、それらの電気的、光学的特性やアニーリング特性について調べた。前年度のAl_2O_3添加した膜との比較をおこなった。ターゲットにZnO(またはSnO_2)とIn_2O_3のセラミックターゲットを同時に対向ターゲット式スパッタ法で、Arガス中でスパッタした。膜構造はδ=00.2でIn_2O_3結晶構造、δ=0.20.6でアモルファス構造、δ=0.60.8でホモロガス結晶構造、δ=0.81.0でZnO構造を示す。Ga_2O_3の影響はAl_2O_3と同様なものであり,Ga_2O_3の添加量が増えるとIn_2O_3が現れるδ値が0.2より増大し,ホモロガス結晶相出現もδ=0.62から0.67へと増大する。電気的特性はGa2O3が7.5wt%添加でアモルファス相膜の抵抗率が2.68x10^<-4>Ωcmと,Al_2O_3添加の膜の最低抵抗率にくらべて少々高いものの,やはり低抵抗率のアモルファス膜が得られる。ターゲット中のGa_2O_3の量を,4.5,6,7.5wt%と変化したとき抵抗率への影響はあまりなく,キャリア密度の増大や,移動度の低下も見られなかった。このことはアモルファス中ではGaが通常のドナーや散乱中心として働いていないことを示す。この傾向AもAl_2O_3の添加と同様であった。δ=0.27wt%でのGa_2O_3依存性はがの添加とともに吸収端の波長が短波長側にシフトする傾向を示した。
舌・食道上皮幹細胞由来正常・異常オルガノイドの単一細胞４D動態・遺伝子発現解析

昨年度の研究において、私たちはあらたに舌上皮に存在する味蕾幹細胞の存在を証明した。味蕾とは舌上皮茸状乳頭に存在する味覚感知器官であり、甘味、塩味、苦味、酸味、旨味の基本5味覚に加えて、カルシウム、鉄味等のマイナーな味覚を含めすべての味覚を感知する、少なくとも4種類の味覚感知細胞を内包している器官である。これらの細胞は聴覚、嗅覚等の感知細胞とは異なり、食物から来る物理的、化学的障害に曝されていることから、成体幹細胞によって維持されていると考えられていた。従来説によると味覚感知細胞の幹細胞は味蕾底部に存在するとされてきたが、私達の研究により、傍味蕾乳頭間窩底部に存在することが明らかとなった。多色細胞系譜追跡法と単一細胞RNAseq法を用いて、食道上皮幹細胞、味蕾幹細胞、舌上皮幹細胞の新規幹細胞マーカー遺伝子のリストアップおよび、それに基づいた多色細胞系譜追跡法にて、これらが私達の過去の研究にて同定した幹細胞マーカーよりも特異的であることを示すことができた。また、同領域由来のオルガノイド培養法を確立、多色細胞系譜追跡法、3dタイムラプス動画解析による成体幹細胞の動態解析を行っている。また、同領域の4NQO発がんモデルによる腫瘍由来、がんオルガノイド(舌がんオルガノイド、および食道がんオルガノイド)に適応し、正常オルガノイドにおける成体幹細胞の挙動とがんオルガノイドにおけるがん幹細胞の挙動の比較を行い、悪性腫瘍における細胞社会の乱れの意義について解析する。舌、食道オルガノイドの単一細胞RNAseqの結果から幹細胞マーカーの同定には成功し、またオルガイドの多色3dタイムラプスイメージングに取り組んでいる。がんオルガノイドの解析はまだ準備中である。4NQO発がんモデルによる腫瘍由来、がんオルガノイド(舌がんオルガノイド、および食道がんオルガノイド)に適応し、正常オルガノイドにおける成体幹細胞の挙動とがんオルガノイドにおけるがん幹細胞の挙動の比較を行い、悪性腫瘍における細胞社会の乱れの意義について解析する。
伊東細胞(Fat-storing cell)の収縮能における形態学的な検討

肝のDisse腔に存在する伊東細胞(Fat-storing cell)は、毛細血管周囲に存在し収縮、弛緩を行ない毛細血管の血流調節を行なっている周細胞と非常に類似し、機能的に周細胞と同時に収縮、弛緩する可能性がある。そこで私共は伊東細胞の収縮能について検討を行なった。その結果、1.強い血管作動性物質であるエンドセリン-1(ET-1)、サブスタンスP(SP)の伊東細胞における結合部位を^<125>I-ET-1,^<125>I-SPを用いたオートラジオグラフィーにより検討し、ヒトやラットの伊東細胞にはその他の肝内細胞に比較し、より多くの^<125>I-ET-1,^<125>I-SPのグレインを認め、ヒトやラットの伊東細胞にそれらのリセプターが存在していることが示された。2.収縮性蛋白であるアクチン、ミオシンおよびCa^<2+>担体のカルモジュリンの正常ヒトの伊東細胞における局在について免疫組織化学を用いて検討し、アクチン、ミオシン、カルモジュリンがヒトの伊東細胞内に局在し、伊東細胞が収縮能をもつことが示唆された。3.ラットの分離培養伊東細胞に種々の濃度のET-1やSPを加え、伊東細胞の収縮について検討し、伊東細胞が濃度依存的に縮小した。しかし、ET-1とSPに対する収縮動態は異なっていた。4.肝内におけるET-1の産生細胞を培養肝内細胞を用いて検討し、培養類洞内皮細胞によるET-1の産生が示唆された。5.非肝疾患、肝硬変症患者の門脈、未梢血中のET-1濃度を測定し門脈、末梢血中共に肝硬変症患者の方が非肝疾患患者より高値を示し、ET-1が肝硬変症の肝類洞微小循環に何らかの影響を与えていることが示唆された。肝類洞の構造は毛細血管の構造に非常に類似している。毛細血管周囲に存在するpericyteは収縮,弛緩を行ない毛細血管の血流調節に関与している。ところで、Disse腔に存在する伊東細胞(Fatーstoring cell)は形態学的にpericyteと類似し、機能的にも類似していることが推測され、伊東細胞が収縮する可能性がありえる。そこで、強い血管作動性をもつsubstance P(SP)やendothelinー1(ETー1)と伊東細胞との関わりについて研究し、伊東細胞の収縮の可能性について検討中である。伊東細胞の収縮能に関する私共の平成2年度における研究成果として1. ^<125>IーSPを用いたオ-トラジオグラフィ-によるヒト肝の伊東細胞におけるSP receptorの局在の検討では、伊東細胞の細胞膜を中心に^<125>IーSPのgrainの局在を認め、伊東細胞にSP receptorが存在していることが示唆された。2. ^<125>IーETー1を用いたオ-トラジオグラフィ-によるラット伊東細胞におけるETー1 receptorの局在について検討した。ラット伊東細胞に関してはin vivoおよび分離,培養伊東細胞を用いたin vitroによる検討を行なった。その結果、in vivo,in vitroにおいてラット伊東細胞には数多くの^<125>IーETー1のgrainを認め、ラット伊東細胞にETー1 receptorが存在していることが示唆された。3.ラットの分離,培養伊東細胞に種々の濃度のETー1を加え、伊東細胞の収縮能を検討した。その結果、伊東細胞はETー1により濃度依存性に収縮率が増加し、さらにETー1を除去することにより伊東細胞の収縮率が減少し、1時間後にはETー

1投与前の面積まで回復したことより、伊東細胞がETー1により明らかに収縮することが示された。Disse腔に存在する伊東細胞(Fatーstoring cell)は、毛細血管周囲に存在し自ら収縮、弛緩を行ない毛細血管の血流調節を行なっているpericyteと非常に類似し、機能的にもpericyteと同様に収縮、弛緩する可能性がある。そこで私共は昨年度より伊東細胞の収縮能について検討を行なっている。平成3年度における研究成果として1.強い血管作動性物質であるエンドセリンー1(ETー1)の伊東細胞における結合部位を^<125>IーETー1を用いたオ-トラジオグラフィにより検討を行った。その結果、ラット伊東細胞にはその他の肝内細胞に比較し数多くの^<125>IーETー1のgrainを認め、ラット伊東細胞にETー1リセプタ-の存在が示唆された。2.収縮性蛋白であるアクチン、ミオシンおよびCa^<2+>の担体であるカルモジュリンの正常ヒトおよびラットの伊東細胞における局在について免疫組織化学を用いて検討した。その結果、アクチン、ミオシンおよびカルモジュリンがヒトやラットの伊東細胞内に局在していることが明らかとなり、伊東細胞が収縮能をもつことが示唆された。3ラットの分離・培養伊東細胞に種々の濃度のETー1や血管作動性物質であるサブスタンスーP(SP)を加え、伊東細胞の収縮について検討した。その結果、濃度依存的に伊東細胞の縮小を認めた。しかしSPとETー1に対する伊東細胞に収縮動態は異なっていた。4.肝内におけるETー1の産生細胞の検討を培養肝内細胞を用いて行ない、培養類洞内皮細胞によるETー1の産生が示唆された。私共は、ヒト及びラットの伊東細胞が収縮、弛緩する機能を有するか否かについて形態学的に観察し、肝類洞の微小循環における伊東細胞の関与について検討した。研究実績として1.強い血管作動性物質であるエンドセリン-1のラット肝小葉内結合部位について光顕オートラジオグラフィーにより検討した。その結果、肝小葉内における^<125>I-エンドセリン-1のグレインの局在の程度は門脈域、小葉中間帯、中心静脈域の順に認められ、肝類洞の血流ならびに伊東細胞の局在の特徴、すなわち門脈域、小葉中間帯、中心静脈域の順に分布するとされるこれまでの報告と関連していることが示唆された。2.収縮性蛋白であるアクチン、ミオシン、カルモジュリンがヒト伊東細胞に局在することを免疫電顕にて明らかにした。3.伊東細胞に含まれる中間径フィラメントであるデスミンに対する抗体に陽性となる細胞が、肝硬変症の偽小葉内に増加していることが光顕的観察により明らかとなった。4.非肝疾患、肝硬変疾患者の門脈、末梢血中のエンドセリン-1濃度を測定した結果、門脈、末梢血中共に肝硬変症患者の方が非肝疾患患者より高値を示し、エンドセリン-1が肝硬変症の肝微小循環に何らかの影響を与えていることが示唆された。さらに、非肝疾患、肝硬変症患者共に門脈血中エンドセリン-1濃度が未梢血中のエンドセリン-1濃度より高値を示したことより、エンドセリン-1が肝内にて代謝されることが示唆された。