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脳内GABA機構に関する薬理学的研究

脳内に広く分布するγ-aminobutylic acid(GABA)は、中枢神経系における抑制性の神経伝達物質として考えられている。従来より、神経組識内GABAの検出法としては、組織をhomogenateして生化学的、酵素的に微量測定する方法と、^3H-GABAの取り込み、GABAの合成酵素であるglutamic acid decarboxylase(GAD)のRIA及び免疫組織化学などの手法により同定する方法が用いられていた。近年,GABAに対する抗体が得られたことから、これを用いて脊髄並びに脳内GABAneuronの局在及び分布を間接蛍光抗体法により免疫組織化学的に検索し、併せて脳組織内GABA含量を高速液体クロマトグラフィ-(HPLC)を用いて定量を行ない、組織内GABAの検出法について総合的に検討を行なった。1.GABAの免疫組織化学(1)脊髄内GABAneuronの検索:ラット脊髄内におけるGABAneuronは、黄緑色のFITCの特異蛍光を発し、脊髄前角及び後角において、GABA陽性細胞とGABA陽性線維の局在を示す特異蛍光が認められた。(2)脳内GABAneuronの検索:ラット線条体一黒質系GABA路について免疫組織化学的に検索し、GADの局在と比較検討した。その結果、線条体においてはGABA陽性細胞及び陽性線維が、黒質においては緻密層でGABA陽性線維がび慢性に緑色の蛍光を発して認められた。同一レベルにおけるGAD陽性細胞及び陽性線維は、GABAの分布とほぼ一致して認められた。2.脳組織内GABA含量の生化学的測定脳内に広く分布するγ-aminobutylic acid(GABA)は、中枢神経系における抑制性の神経伝達物質として考えられている。2.脳組織内GABA含量の生化学的測定1.脳内GABAの蛍光法による免疫組織化学的検索:GABAneuronに対する免疫組織化学は, GABAの合成酵素であるグルタミン酸脱炭酸酵素(GAD)を精製しGADの抗体を作成して行っているが,抗GABA抗体の精製により,ラットを使用して脳内GABAの蛍光法による免疫組織標本を作成し, GABAの局在を蛍光顕微鏡下で観察し解析を行った.(1)基礎実験として, GAD抗体による免疫組織化学的検索を行い,線条体・淡蒼球-黒質GABA路,側坐核-黒質GABA,及び黒質出力GABA路における局在を検出し,同一部位におけるGABAの局在を比較した結果, GADはGABAの局在と一致して認められた.(2)上記の基礎実験結果に基づいて, Benzodiazepine系薬物のラット脳GABA系に及ぼす影響について実験を推進している.2.脳組織内GABA含量の生化学的定量:脳組織内GABA含量の測定は,ラットの脳組織を摘出シ,ホモジネートした後,オルトフタールアルデヒドで反応し,高速液体クロマトグラフに注入した.現在,検出器は蛍光分光光度計と電気化学検出器を用いて, GABA検出精度について検討した.(1)分離条件としては,移動相にアセトニトリルと水の混合液を使用し,カラムはBondapak C18を用いて好結果が得られた.(2)電気化学検出器では,分離条件として水,メタノール及びPIC-B7を移動相とし,カラムはBondapak C18又はphenylを用いているが検出器電極が安定するまでの時間が問題になるが,検出精度は高いものと思われる.(3)脳内GABAの測定で,酵素を失活する必要があり,実験動物(ラット及びマウス)に短時間に多量のマイクロ波を照射し,脳を摘出する方法を検討中である.現在マイクロ波出力は, 35KWとし,照射時間を0.510秒について基礎実験を行っている.1.脳内GABAneuronの蛍光法による免疫組織化学的検索:従来GABA抗体の作製が困難であったため、GABAの合成酵素であるグルタミン酸脱炭酸酵素(GAD)をマーカーとして検索が行われてきた。今年度GABAに対する抗体が得られたことから、脳及び脊髄内GABAの局在と分布を免疫組織化学的に検索し、GABA合成酵素であるGADの局在と比較検討した。

実験にはWistar系雄性ラットを用い、ウレタン麻酔下で脳及び脊髄を摘出し、4%パラホルムアルデヒド含有の0.1Mリン酸バッファーで12時間(4°C)で固定した後、クリオスタットで10μmの切片を作成し、5001,000倍希釈のGABA抗体(第1抗体)と湿箱中で37°C,60分間インキュベートした。反応終了後リン酸バッファー食塩水(PBS)中で10分間、1%Triton X-100 PBS中で10分間、さらにPBS中で10分間洗浄した。次に、500倍希釈のfluorescin isothiocyanate(FITC)と結合させた抗IgG(Sheep:第2抗体)と湿箱中で37°C,60分間インキュベートし、PBS中で10分毎に3回洗浄した後、グリセリン:PBS(1:1)で封入し、蛍光顕微鏡(Zeiss:励起波長495nm,蛍光波長520nm)で観察記録した。なお、GAD抗体についても同様の方法で組織標本を作成した。GABAneuronは、黄緑色のFITCの特異蛍光を発し、脊髄及び線条体ー黒質系において、GABAの局在を示す陽性細胞並びに陽性線雑が認められた。一方、GADの分布についてGABAの蛍光強度及び分布密度と比較した。2.脳内GABAの生化学的測定:脳組織内GABAの測定は、マイクロウェーブ照射後直ちに脳組織を摘出し、ホモジネートした後、オルトフタールアルデヒドで反応させ、HPLCにより定量した。分離条件は、移動相にアセトニトリルと水の混合液を使用し、カラムはμ-Bondapack C18、検出器は蛍光分光光度計を使用し、好結果が得られた。1.GABAの免疫組織化学:(1)脊髄内GABAneuronの検索.ラット脊髄内におけるGABAneuronは、黄緑色のFITCの特異蛍光を発し、背髄前角及び後角において、GABA陽性細胞とGABA陽性線維の局在を示す特異蛍光が認められた。一方、背髄内におけるGABAの分布と合成酵素の分布を比較するため、GAD抗体を用いて問接蛍光抗体法により標本を作成して、同一レベルでの分布状態を検索した。その結果、GADの分布についてはGABAの局在と一致して認められたが、その蛍光強度及び分布密度はGABAの特異蛍光に比較して少ないように思われた。従って、GABA陽性細胞並びに陽性線維の組織化学的検索には、直接GABA抗体を用いる方法がより正確であるものと思われる。(2)脳内GABAneuronの検索、ラット線条体一黒質系GABA路について免疫組織化学的に検索し、GADの局在とも比較検討を行った。その結果、線条体においてはGABA陽性細胞及び陽性線維が緑色の蛍光を発して認められた。同一レベルでのGAD陽性細胞及び陽性線維についての検索結果は、GABAの分布とほぼ一致して認められた。黒質においては緻密層でGABA陽性線維がび慢性に緑色の蛍光を発して認められた。同一レベルにおけるGAD陽性細胞は、GABAの分布と一致した。2.脳組織内GABA含量の生化学的測定:ラット脳組織は前処理後、反応試薬を加えた試料を1025μlHPLCに注入した。
小胞体関連タンパク質による選択的ミトコンドリア分解の制御機構の解明

ミトコンドリアは細胞の発電所としての役割を果たす細胞小器官である。ミトコンドリアが正常に働き、恒常性を維持するには、不良または余剰なミトコンドリアを適切に処理することが重要である。これはマイトファジーと呼ばれる仕組みにより行われるが、その詳細な分子機構はほとんど不明であった。本研究では出芽酵母を用い、マイトファジーに関与する因子の機能解析を行うことで、マイトファジーの分子基盤の確立を目指す。
超重元素Ｒｆの水酸化物沈殿生成

超重元素の新規化学実験手法として、迅速な水酸化サマリウム共沈試料の作成とその高分解能α線測定の手法開発を行った。また、104番元素Rfの共沈の実験を目指して、同じ4族元素のZr, Hfおよび擬4族元素のThについての基礎研究、および迅速な加速器オンライン実験のための半自動沈殿作成装置の開発を行った。その後、Zr, Hfに対して加速器オンライン共沈実験を行い、Rf実験の条件を決定した。そして、実際に理化学研究所の加速器を用いて261Rfを合成し、アンモニア水中及び水酸化ナトリウム水溶液中でのサマリウム共沈挙動を調べることができ、超重元素に対して初めて沈殿に関する化学挙動を観測することに成功した。平成25年度は、実際に理化学研究所のAVFサイクロトロンを利用して、104番元素であるRf-261を合成し、その水酸化物サマリウム共沈挙動を調べることができた。生成率が非常に低く、半減期も短いため、化学的性質がほとんどわかっておらず、共沈挙動は報告例もなかった超重元素の水酸化サマリウム共沈挙動を調べるために、これまでは、104番元素ラザホージウム(Rf)の軽い同族元素を用いた基礎化学実験と加速器オンラインの迅速反復実験のための装置開発、およびその性能評価を行ってきた。これまでに同族元素の共沈挙動の観測とRfの実験を行うための装置開発を完了し、溶液濃度や加速器オンライン実験操作等の条件決定を終え、理化学研究所に加速器使用の申請が認められるまでに至っていた。平成25年度は、開発した装置を理化学研究所に持ち込み、加速器で合成した生成物を継続的に化学室へ迅速搬送するHeガスジェットのチューブを装置に連結し、実際にRfの同族元素であるZrとHfの放射性核種を核反応で合成して、Rfと同様の操作で共沈実験を行った。さらに、Rfはα線測定をする必要があるため、理化学研究所の連続自動α線計測装置との連結も行った。最初の実験(24時間)では、ZrとHfの実験を行った後に、そのままターゲットをCm-248に変更し、Cm-248(O-18,5n)反応によりRf-261を合成して、薄いアンモニア水を加えた条件での共沈挙動を観測した。Rfの実験としては7時間の実験で、約43カウントのイベントを観測することができ、沈殿収率を得ることができた。その後、さらに塩基性溶液の条件を変更してRfの共沈挙動の溶液濃度依存性を観測し、その挙動の同族元素との比較から、Rfの水酸化物共沈挙動が同族元素よりも擬同族元素であるThに近いことがわかった。これまでに104番元素RfのSm共沈実験を実現を目指し、その実験手法の確立と条件の決定のために同族元素であるZrとHfおよび擬同族元素であるThの放射性トレーサーを加速器などを用いて製造し基礎的な共沈実験を進めてきた。また、加速器での元素製造とオンラインで沈殿実験を行うための装置開発を同時に進めてきた。同族元素を用いたSmとの共沈実験では、アンモニア水と水酸化ナトリウム水溶液の濃度を変化させて沈殿収率の変化を観測し、アンモニウムイオンや水酸化物イオンとの錯形成の強さを調べてきた。各同族元素間に違いが確認され、Rfとの比較が非常に興味深い。同時に化学平衡に到達するまでの時間も調べてきた。これらの結果を2013年度の国際学会で発表することが確定している。また、同時に共沈挙動で本当に各元素固有の沈殿挙動を確認できるのかを確かめるために様々な元素を含むマルチトレーサーを用いた共沈実験も理化学研究所で行った。この結果を2013年度の国際ワークショップで発表する。装置の開発に関しては、よりRfの実際の実験に向けて溶液量の軽減などを目的として濾過部分の形状の変更やそのための基礎実験などを行ってきた。また装置を自動で制御できるようにLabVIEWの回路をくんで動作テストを行ってきた。いよいよ加速器オンライン実験の準備が整ってきたと判断できたため、理化学研究所に加速器利用の申請を行い、4日間のビームタイムを取得することができた。2013年度からはいよいよ理化学研究所での加速器を利用した元素合成とオンライン実験のテストを行っていく。申請時の研究計画のまさにその通りに現在は研究が進んでいる。そのため、現在は特に大きな変更等は予定しておらず、このまま計画通りに研究を進め、目的を達成したいと考えている。具体的には、24年度の計画は大きく2つに分けられ、基礎的な化学実験と、装置開発における濾過部分等の形状の検討を含めた条件の最適化であった。

「研究実績の概要」に記載した通り、基礎実験として同族元素の放射性トレーサーを製造し、様々に条件を変更させてることで各元素のアンミン錯体と水酸化物錯体の強さを調べることに成功しており、国際学会での発表を申請するに至っている。装置開発に関しても、溶液量の減量のための濾過部分の形状の変更と、それを用いた基礎実験を行ってきた。特に大きな問題等は発生しておらず、このままRf実験条件の最適化を達成したいと考えている。個々の機器の動作は順調に動いており、今後の加速器実験を行った際の他の装置や測定器との連結が課題となっている。これまでは、申請書の計画通りに進んでいるので、今後もその通りに進めていけるようにしていきたいと考えている。基礎化学実験に関しては、同族元素を用いた研究は今後は装置を用いた実験を進め、装置を用いても同様の結果を得られるかのテストをしていく。また、同時に安定な核種を多量に用いて共沈ではなく沈殿の挙動を確認し、共沈との差がないかを確認して化学的性質の考察を進めたいと考えている。その一環として、作成した沈殿の化学種を推定できるような分析法を探し、それに挑戦していきたいとも考えている。マルチトレーサーを用いた研究も解析を進め、成果として論文等の形にまとめたいと考えている。装置開発については、同族元素を用いた基礎的な共沈実験から信頼できるデータが得られる装置となるように沈殿作成に関する部分を開発していく。その後に理化学研究所に移しての加速器オンライン実験を行っていく。まずは、動作テストから始め、実際に加速器でZrやHfの短寿命の放射性トレーサーを製造し、製造しながら連続してガスジェットで搬送して、装置に吹き付け、オンラインでの共沈実験行う。この結果が基礎実験で得られたものと一致するように、また、動作が安定して動くように装置を改良する。さらに、実際にRfを実験するために、理化学研究所に設置されている自動連続α線側的装置に沈殿装置を連結できるように回路等含めて開発し、2013年度の後期にはRfの沈殿挙動を観測する実験を実現する予定である。これだけでも超重元素に対しては世界で初の成果となる。さらに、溶液濃度を変更し、錯形成の様子を議論していきたいと考えている。引き続き、基礎化学実験等を進めるための消耗品等は購入していく予定であるが、これらは少額である。申請時の予定では、主に備品として理化学研究所でのオンライン実験時に沈殿装置を他の装置や測定系と連結するための装置とポンプ、それと理化学研究所で実験行うための旅費が主な使用用途である。予算は計画時よりも少額であるため、備品としては装置開発をやめ、各回路等を個別に購入し、自分で手作りで組んで、テストしていくことを計画している。これにより計画は少し遅くなることは予想される。旅費に関しては、実際に加速器オンラインでの実験には多くの人員が必要であり、何度も理化学研究所で実験をしつつ、装置を改良していく予定なので、2013年度は旅費として多くを利用したいと考えている。学会やワークショップにおいて予想よりも多くの発表を行えそうであるので、そちらにも使用していきたいと考えている。
バベシア原虫の増殖および薬剤耐性獲得における熱ショックタンパク質９０の役割の解明

本研究では犬の住血寄生原虫であるBabesia gibsoniの熱ショック蛋白質90(BgHsp90)に関する基礎的研究を実施した。BgHsp90の遺伝子をクローニング、塩基配列の解析を行い、抗BgHsp90抗体の作成を行った。これらを用いて遺伝し発現量の測定を行い、BgHsp90が原虫の増殖に貢献していること、原虫が熱ショックを受けたときに発現量が増加することを明らかにした。また、熱ショックタンパク質90阻害薬により、B. gibsoniの増殖を抑制することが可能であり、BgHsp90は治療のターゲットとなることが明らかになった。平成24年度には、組み替えhsp90蛋白質の作成のためにプラスミドを作成したが、これを大腸菌内に取り込ませ、大腸菌を用いた組み替えBabesia gibsoni hsp90 (Bghsp90)の発現を実施し、組み替えBghsp90蛋白質の作成に成功した。大腸菌の大量培養を実施することでこれを大量に発現させ、組み替え蛋白質に結合させたHisタグを利用して組み替えBghsp90蛋白質を精製した。さらに、組み替えBghsp90蛋白質をウサギに免疫し、ウサギの体内でこの蛋白質に対する抗血清を作成、さらに抗血清から組み替えBghsp90蛋白質を用いてアフィニティー精製を行ってウサギ抗組み替えBghsp90ポリクローナル抗体を作成した。この抗体がB. gibsoniのhsp90に特異的に結合することを確認した後に、これを用いてウェスタンブロッティングおよび免疫染色を行い、B. gibsoniの持つBghsp90蛋白質を検出、定量することに成功した。そこで、これらの技術を用いて、B. gibsoniの野生株、ならびに抗原虫薬であるジミナゼン製剤に耐性を持つ耐性株のhsp90量を比較し、耐性株ではhsp90発現量が減少していることを明らかにした。この結果は、昨年実施したリアルタイムPCR法を用いた遺伝子発現量の定量を行った実験とよく相関したことから、B. gibsoniのジミナゼン耐性株ではBghsp90の発現量が低下していることが明らかになった。1.B. gibsoniのHsp90(BgHsp90)の遺伝子のクローニングを行い、解析を行ったところ、この遺伝子は二つのイントロンを持っていることが明らかになった。また、近縁の原虫との塩基配列の相同性が高く、原虫の間で機能が類似していることが予想された。さらに、系統樹解析を行ったところ、BgHsp90はHsp90ファミリーのうち哺乳動物のHsp90アルファのオルソログであることが明らかになった。以上の成果は、平成25年3月29日から31日に開催された日本寄生虫学会において発表を行った。2.解析を行ったBgHsp90の遺伝子の塩基配列を基に、リアルタイムPCRを用いた遺伝子発現量を測定する系を作成した。この系の確立のため、購入したリアルタイムPCRシステム(LightCyclerNano)を使用した。この系を利用し、通常38°Cの環境で培養しているB. gibsoniを低温と高温環境に曝した状態でのBgHsp90遺伝子発現量を観察したところ、4°Cおよび32°Cでは遺伝子発現量に変化は認められなかったが、42°Cに曝したところ、BgHsp90遺伝子の発現量の増加を認めた。3.BgHsp90の発現量の変化をタンパク質レベルで解析するためのツールとして、抗BgHsp90抗体が必要であるため、これを作成するために組み替えBgHsp90タンパク質を作成することとし、平成24年度は、1.で解析したBgHsp90遺伝子を基に発現実験用のプラスミドを作成した。平成25年度には、これを用いて組み替えBgHsp90タンパク質を作成する予定である。1.B. gibsoniのhsp90(BgHsp90)が、原虫増殖に関係するかを観察するために、まず平成25年度に作成した抗BgHsp90抗体の培養液中への添加が原虫増殖に与える影響を観察したところ、原虫の増殖は変化せず、BgHsp90に対する抗体はBgHsp90を阻害しないことが明らかになった。このことから、BgHsp90は原虫の膜表面は存在しないことが示唆された。2.Hsp90阻害薬であるゲルダナマイシン(GA)と17-AAGを原虫培養液中に添加したところ、GA、17-AAGの両方により原虫の増殖は低下した。このことより、BgHsp90は原虫増殖に関与していることが示唆された。両者のうち、GAの方がより強い効果を発揮した。3.ストレス環境におけるBgHsp

90の役割を明らかにするために、原虫培養液に過酸化水素を添加し、酸化ストレスをB. gibsoniに与えてBgHsp90の発現量の変化を観察したところ、その発現量は変化せず、酸化ストレスに対する応答においてはBgHsp90は関与しないことが予想された。3年の研究期間では、まずBgHsp90遺伝子のクローニングと塩基配列の解析に成功した。次にこの遺伝子情報を利用して組み替えBgHsp90蛋白質を作成し、これをさらに利用して抗BgHsp90抗体の作成を行い、免疫染色やウェスタンブロットなどの解析を行うことに成功した。この技術を用いて、原虫におけるBgHsp90発現プロファイルの解析が可能になり、ジミナゼン耐性B. gibsoniに於いてはその発現量が減少していること、活性酸素に曝された原虫ではその発現量は変化しないことが明らかになり、BgHsp90の機能の一端が明らかになった。また、BgHsp90を阻害することで原虫の増殖は抑制され、BgHsp90は原虫増殖に関与していることが明らかになった。獣医内科学平成25年度には、抗組み替えBghsp90抗体抗体の作成を作成することを一番の目的としており、これを達成した。また、この抗体を利用して免疫学的にBghsp90蛋白質を検出することに成功したため、当初の計画通り研究は進展している。平成24年度は、リアルタイムPCRを利用して様々なストレス環境下におけるBgHsp90遺伝子発現量の変化を観察する予定であったが、ストレス環境としては温度変化に対する発現量の変化を見るにとどまったため、こちらはまだ研究を発展させる予定である。しかしながら、組み替えBgHsp90タンパク質の作製については、平成25年度から着手する予定であったが予定を前倒しして平成24年度から着手し、すでに組み替えタンパク質作製、ならにび抗BgHsp90抗体作製のめどは立っている。以上のことから、本研究はおおむね順調に進行していると考えられる。研究計画のとおり、平成26年度はこれまでに作成したリアルタイムPCRおよびウェスタンブロッティングの実験系を利用し、ストレス環境下におけるBghsp90蛋白質の発現量の変化を観察すると共に、hsp90の阻害剤であるゲルダナマイシンなどを利用して、hsp90を阻害した場合のBabesia gibsoniの増殖の変化を観察する。研究計画通り、リアルタイムPCRを用いてストレス環境下におけるBgHsp90遺伝子発現量の変化を網羅的に解析し、BgHsp90遺伝子発現量を変化させる環境の特定を行う。その上で、抗BgHsp90抗体を作製し、これを用いて免疫学的手法によってBgHsp90タンパク質発現量の変化を観察し、真に発現量が変化していることを確認の上、BgHsp90の機能について考察を行う。上記のストレス環境を作り出すために、専用のインキュベーターを利用するため、平成25年度に購入予定のCO2/O2マルチガスインキュベーターを利用する。当初、平成24年度に上記マルチガスインキュベーターを購入予定であったが、申請者らの所属する研究施設の改修のため、購入を見送り、平成25年度に購入の上研究を継続する予定である。このため、マルチガスインキュベーター購入費として620千円を繰り越した。また、109,717円は2013年3月に使用し、4月に支払われる予定である。
森林形成過程における樹木と土壌微生物の相互作用解析

土壌養分を宿主植物に供給する共生微生物は、荒廃地に樹木が定着し森林が形成されるプロセスにおいて重要と考えられるものの、その相互作用はよく分かっていない。本研究では、分子生物学的な手法により菌根菌の繁殖様式を解析し、先駆的な性質を持つキツネタケ属は胞子繁殖への異存が高いことなどを明らかにした。また、菌根に附随するバクテリア群集についても解析し、その組成が植生遷移の進展とともに変化することなどを明らかにした。火山荒原における森林形成初期段階においては,先駆樹木や後続樹種の定着に菌根菌が不可欠なことが明らかにされたが,その機構はまだ十分明らかにされていない。本研究課題では,菌根菌を中心とした土壌微生物の生理的・生態的多様性が樹木との相互作用にどのように影響するのかを明らかにすることを目的とする。本年度は以下の項目について研究を実施した。1.菌根菌の機能的多様性と植物への影響富士山火山荒原に発生した菌根性キノコの主要な菌種について炭素と窒素の安定同位体比を測定した。特に,菌種によって窒素の安定同位体比に大きな違いがあるという結果が得られた。これは菌種によって利用している窒素源が異なることを示唆しており,野外における菌根菌の機能的多様性に関する重要な指標となりうることを意味する。2.菌根菌の繁殖様式の多様性について火山荒原の最も主要な菌種であるキツネタケ,ウラムラサキ,ハマニセショウロについて,マイクロサテライトマーカーを用いた個体群解析を行った。ハマニセショウロについては,各ジェネットのサイズは大きく,10mを超えるものもあった。キツネタケとウラムラサキのジェネットは小さく,最大でも1m程度であることが明らかにされた。ジェネット構造の違いは繁殖様式の違いを示すものであり,得られた結果は菌根菌の繁殖様式の多様性を示唆している。3.菌根圏バクテリアの多様性について富士山火山荒原のミヤマヤナギと,富士山麓樹海のアカマツについて,菌根圏バクテリア群集を調べた。アカマツの菌根から分離された1バクテリア群集ではBurkholderia属が圧倒的に優占していた。一方,ミヤマヤナギからはRhizobiumやBradyrhizobiumの他,多数の異なるαおよびβプロテオバクテリアが分離された。火山荒原における森林形成初期段階においては、先駆樹木や後続樹種の定着に菌根菌が不可欠なことが明らかにされたが、その機構はまだ十分明らかにされていない。本研究課題では、菌根菌を中心とした土壌微生物の生理的・生態的多様性が樹木との相互作用にどのように影響するのかを明らかにすることを目的とする。1.菌根菌の機能的多様性と植物への影響菌根菌の培養実験を行い、重金属存在化での成長反応を調べた。比較的低濃度の重金属でも成長が阻害される菌種から、高濃度まで耐性を示すハマニセショウロやコツブタケなど、菌種によって大きな違いが見られた。2.菌根菌の繁殖様式の多様性について現地土壌中の胞子による感染実験を行った。裸地やミヤマヤナギの無いパッチから採集した土壌中には感染源が少ないものの、ミヤマヤナギの近くから採集した土壌中には胞子の存在が認められた。現在、菌種の同定作業を進めている。3.菌根圏バクテリアの多様性について富士山火山荒原のミヤマヤナギ菌根に生息するバクテリアの種組成を調べた。宿主の植物の葉緑体DNAが増幅しないバクテリア特異的プライマーを設計し、増幅産物のシーケンスを行ったところ、αおよびβプロテオバクテリアが優占していることが分かった。こうした非培養法によって得られたバクテリア組成は培養法によって得られていた知見と大旨一致する。1.菌根菌の繁殖様式の多様性について現地土壌中の胞子による感染実験を行った。ウラムラサキについては北海道の火山荒原でも個体群を採集し、SSR解析を進めており、富士山火山荒原との違いについて解析を継続したい。2.菌根圏バクテリアの多様性について富士山火山荒原の様々な場所から得られた菌根圏バクテリアを、培養法および非培養法によって群集構造を比較した。どちらの検出方法を用いても、植生遷移および菌根菌遷移とともにバクテリア群集構造も変化することが明らかとなった。バクテリアの遷移についてはほとんど知られていないため、新規性の高い知見となる。
中国の華僑政策と華僑教育に関する総合的調査研究

1.文献・資料の収集と分析を継続し、数扁の研究報告を完成した。2.国内については、沖縄、長崎、大阪、横浜、東京、函館の実地調査を行った。3.国外については、中国・台湾の関係機関を訪問調査し、研究協力関係を構築した。4.全体研究会及び班別研究会で研究の調整を図り、日本比較教育学会大会等で中間報告を試みた。5.東アジア比較研究の他の班との研究交流を行った。
日本列島の古代国家形成過程における銅鏡生産の変遷と社会動態

申請者の研究目的は,日本列島における古代国家形成過程を,物質文化の生産・流通から明らかにすることである。特に,古墳時代に政治的目的をもって生産・流通が行われたとされる銅鏡(倭製鏡)を分析の対象とし,物質文化のコントロールによる近畿中央政権の政治戦略・志向性の解明を目的とする。平成27年度は以下の項目を中心に研究を行った。1.小型鏡の生産と流通。昨年度に引き続き重圏文鏡と,新たに珠文鏡を対象に分析を行った。その結果,古墳時代前期の倭製鏡の生産開始が重圏文鏡や珠文鏡のような小型鏡の製作を経て成立・完成したという変遷過程を提示した。この成果は12月に平成27年度九州史学会にて発表した。今後は今回明らかとなった銅鏡生産の成立過程を踏まえ,古墳時代開始期における物質文化のコントロールの成立やその評価から,当時の社会動態を考察していくことを課題とする。2.資料の実見。九州・中四国・関西・関東など全国各地から出土した銅鏡の調査を,熟覧・写真撮影・断面実測を中心に行った。文様が単純な小型鏡において製作技術の肉眼観察は有効な手法であり,遠隔地から出土する小型鏡の技術的共通性を確認することができた。3.関連遺跡の調査。福岡県桂川町所在の天神山古墳の発掘・測量調査に参加した。本古墳の範囲確認や構築方法の解明は,当地域の古代国家形成過程を考えるうえで重要な調査である。倭製鏡の生産・流通は汎列島的な視野が必要であるが,同時にそれが授与された地域社会の状況も重要な課題である。27年度が最終年度であるため、記入しない。本研究の目的は,日本列島における古代国家形成過程を,物質文化の生産・流通から明らかにすることである。特に,政治的目的をもって日本列島において生産・流通が行われた銅鏡(倭製鏡)を分析の対象とし,物質文化のコントロールによる近畿中央政権の政治戦略・志向性の解明を目的とする。目的達成のため,銅鏡のデザイン・製作技術・流通と消費の分析および原材料の化学分析を進めている。平成25年度は以下の項目を中心に研究を行った。1.資料の実見。鳥取市教育委員会,鳥取県埋蔵文化財センター,新穂歴史民俗資料館,高松市埋蔵文化財センター,香川県立ミュージアム,香川県埋蔵文化財センター,坂出市教育委員会,丸亀市教育委員会が所蔵する銅鏡の資料調査を行った。方法は,熟覧・写真撮影・断面実測が中心である。その結果,古墳時代前期における銅鏡生産の変化について,特に銅質や製作技術の点から確認することができた。2.製作実験および化学分析。8月に,東大阪市の上田合金にて,銅鏡の製作実験を行った。製作工程を見学,一部を実践することで,銅鏡製作の実態を学んだ。この際に製作した2面の銅鏡は,「同じ湯で同じ場所・同じ時期」に作られた製品のサンプルとして,今後化学分析を行う予定である。また,日本文化財科学会への参加により,鏡を含む青銅製品の化学分析に関する発表を聞き,研究者と方法や解釈について議論し,多くの知見を得ることができた。3.前方後円墳の発掘調査。9月に福岡県桂川町所在の金比羅山古墳の発掘調査に参加した。本古墳は九州地方に造営された,全長約80mの大型前方後円墳であり,古代国家形成過程における地域間関係を考えるうえで重要である。墳丘範囲・構築方法の解明を目的とした発掘調査であり,多くの知見を得ることができた。平成26年度は以下の項目を中心に研究を行った。古墳時代において近畿中央政権は大小の鏡を配り分けることで,授与される側の序列化を図ったと考えられている。一方で,一部の小型鏡は各地で独立した生産を想定する見解もあり,問題の整理・解決が必要である。申請者は小型鏡のなかでも「重圏文鏡」という鏡群の分析を行い,その生産と流通が同時期のほかの鏡群とは異なる可能性を指摘した。重圏文鏡は古墳時代以前の弥生時代における銅鏡生産とも関連が指摘されており,弥生時代終末から古墳時代前期における,銅鏡の生産と流通の変遷に言及することが出来た。また,このような成果から,両鏡群における原材料や鋳造技術の相違が想定され,今後の化学分析を展開するうえで重要な成果であると考える。2.資料の実見。関東・関西・四国・九州など,全国各地から出土した銅鏡の調査を,熟覧・写真撮影・断面実測を中心に行った。実見によって製作技術や銅質の観察をすることができ,その成果の一部は上記の小型鏡の生産と流通を明らかにする結果となった。3.関連遺物や遺跡の調査・分析。福岡県山の神古墳出土鉄鏃の整理および考察を行った。鉄鏃は,銅鏡と同様に近畿中央政権によって生産・流通が管理されていたと考えられている。一方で,一部には強く地域性が反映されており,当該期の物質文化の動向を考えるうえで重要である。さらに,金属製品という点でも銅鏡との共通性は高く,鉄鏃の報告を通して,本研究を進めるうえでの知見を広げることが出来た。また,福岡県桂川町所在の金比羅山古墳・天神山古墳の発掘・測量調査に参加した。

両古墳は大型前方後円墳であり,古代国家形成過程における地域間関係を考えるうえで重要な古墳である。申請者の研究目的は,日本列島における古代国家形成過程を,物質文化の生産・流通から明らかにすることである。特に,古墳時代に政治的目的をもって生産・流通が行われたとされる銅鏡(倭製鏡)を分析の対象とし,物質文化のコントロールによる近畿中央政権の政治戦略・志向性の解明を目的とする。平成27年度は以下の項目を中心に研究を行った。1.小型鏡の生産と流通。昨年度に引き続き重圏文鏡と,新たに珠文鏡を対象に分析を行った。その結果,古墳時代前期の倭製鏡の生産開始が重圏文鏡や珠文鏡のような小型鏡の製作を経て成立・完成したという変遷過程を提示した。この成果は12月に平成27年度九州史学会にて発表した。今後は今回明らかとなった銅鏡生産の成立過程を踏まえ,古墳時代開始期における物質文化のコントロールの成立やその評価から,当時の社会動態を考察していくことを課題とする。2.資料の実見。九州・中四国・関西・関東など全国各地から出土した銅鏡の調査を,熟覧・写真撮影・断面実測を中心に行った。文様が単純な小型鏡において製作技術の肉眼観察は有効な手法であり,遠隔地から出土する小型鏡の技術的共通性を確認することができた。3.関連遺跡の調査。福岡県桂川町所在の天神山古墳の発掘・測量調査に参加した。本古墳の範囲確認や構築方法の解明は,当地域の古代国家形成過程を考えるうえで重要な調査である。倭製鏡の生産・流通は汎列島的な視野が必要であるが,同時にそれが授与された地域社会の状況も重要な課題である。昨年度の課題であった小型鏡の生産と流通について,一定の成果を発表することができた。この課題は,古墳時代開始期の日本列島における銅鏡の生産と流通を考えるうえで重要であり,当時の社会像とも関連する問題である。さらに,当該期の銅鏡の原材料分析を展開するために,考古学的事象から仮説を構築することができた。27年度が最終年度であるため、記入しない。当初の予定通り,銅鏡のデザイン・製作技術・流通と消費の分析および原材料の化学分析を軸に,古代国家形成過程の各時期(古墳時代前期・古墳時代中期・古墳時代後期)ごとに分析を進めていく。また,平成25年度から課題としている小型鏡の生産と流通について,さらに通時的な検討を進める予定である。目標としていた,考古学的成果の一部についての発表・論文執筆ができなかった。また,化学分析について,本格的な実践に至ることができなかった。しかしながら,両者とも,基礎的な準備は終えており,平成26年度には実行可能であると考えている。基本としては,当初の予定通り,銅鏡のデザイン・製作技術・流通と消費の分析および原材料の化学分析を軸に,古代国家形成過程の各時期(古墳時代前期・古墳時代中期・古墳時代後期)ごとに分析を進めていく予定である。一方,平成25年度に研究を進めていくなかで,小型の鏡の生産・流通の問題に関心を持った。当該期に日本列島で生産・流通していた銅鏡の面径は一定ではない。近畿中央政権は大小の鏡を配り分けることによって,授与される側の序列化を図っていたと考えられている。つまり,小型鏡の生産・流通は,近畿中央政権による下位首長の把握や,両者の関係性の形成を考えるうえで重要な課題である。
高解像観測による南極対流圏界面の精密研究

南極の対流圏界面領域(高度10km付近)は、温室効果気体の増加で温暖化する対流圏(高度010km)と、オゾンホールの拡大・縮小で寒冷化・温暖化する成層圏(高度1050km)に挟まれている。この領域では温度や化学成分(オゾン、水蒸気など)の分布が高度とともに急激に変化するため、その研究には高鉛直分解能なデータが必要とされるが、気象条件が過酷で物資や人員の輸送も制限される南極域ではこれまで十分な観測が行われてこなかった。本研究では、南極昭和基地において水蒸気ゾンデを用いた集中観測を実施し、そのデータと人工衛星や気象再解析データを組みあわせ、南極対流圏界面近傍の鉛直微細構造の生成メカニズムと対流圏界面を横切る物質交換過程を明らかにする。1.南極での水蒸気ゾンデ観測平成29年11月出発の第59次南極観測隊越冬期間中に、南極昭和基地において計14回(秋:1回、冬:6回、春:1回、夏:6回)の水蒸気ゾンデ観測を予定していた。秋、冬、春については予定通り観測を実施したが、夏については観測を実施する隊員の他業務による負荷が大きかったことと、想定以上の悪天が続いたことにより、予定していた観測のうち1回しか実施することができなかった。2.上部対流圏湿潤化プロセスの研究南極昭和基地における冬季の水蒸気ゾンデ集中観測により抽出された上部対流圏湿潤化イベントについて、流跡線解析と気象再解析データを用いた検証により、海洋上で発達した低気圧に伴う上昇流と極向きの流れにより、下層の湿った大気が輸送されてきたことが明らかとなった。現在、投稿論文化を進めている。本研究計画では、平成30年度に南極昭和基地での大規模な水蒸気ゾンデ集中観測を実施し、そのデータと人工衛星や気象再解析データを組みあわせ、南極対流圏界面近傍の鉛直微細構造の生成メカニズムと対流圏界面を横切る物質交換過程を明らかにすることを目的としていた。しかし、南極で活動する隊員に対する他業務の負荷が大きかったことと、悪天が続いたことにより、夏季に予定していた水蒸気ゾンデ集中観測6回のうち、1回しか実施することができず、通年のデータ取得は予定の6割程度にとどまった。平成31年度の研究実施計画は以下の通りである。1南極昭和基地での集中観測で得られた気温、水蒸気、オゾンのデータをもとに、対流圏界面逆転層(TIL)消滅期、発達期、最盛期の昭和基地上空のTILの鉛直構造や、安定度と水蒸気・オゾン分布の関係、それらの時間変化を記述する。その際、Tomikawa et al. [2009]で用いたオゾン濃度で決定する対流圏界面を基準とした座標系を使用することで、対流圏界面近傍の温度構造と化学成分の濃度変化を明瞭に捉えられるようにする。さらに、南極昭和基地大型大気レーダー(PANSY)で得られた3次元風速データを用いて、TILの形成・消滅と風速場との関係、あるいは鉛直風による断熱加熱との関係を調べ、TILの時間発展に風速場が果たす役割を明らかにする。その結果を、3次元残差循環と衛星観測のデータと比較し、検証する。2これまでに行った南極昭和基地での水蒸気ゾンデ観測データを基に、南極域の衛星水蒸気観測データの評価を行う。これは南極対流圏界面領域では初めての評価となる。3それまでの研究成果をもとに、南極対流圏界面領域における対流圏界面逆転層の形成・消滅メカニズムと成層圏ー対流圏大気交換について取りまとめ、国内外の学会や論文誌で発表する。また、本研究計画は南極昭和基地1点での集中同時観測を基礎にしているが、将来的には対流圏界面逆転層の構造や成層圏ー対流圏大気交換の東西非一様性や緯度依存性を詳細に議論するため、南極上空を長期間(数十日)にわたって周回可能な気球を用いた南極対流圏界面領域の水平構造の観測とそれに基づく研究について検討を開始する。1.観測の国内準備・南極昭和基地への移動と観測実施平成29年11月出発の第59次南極観測隊越冬期間中に集中観測を実施するため、必要な水蒸気ゾンデを本申請予算により調達し、観測隊出発までに、59次越冬隊に参加する研究分担者の平沢氏および観測に協力する隊員に対して、水蒸気ゾンデ観測の国内訓練をつくばで実施した。第59次南極観測隊は、平成29年12月に南極昭和基地に到着した後、平成30年2月に第1回の水蒸気ゾンデ観測を実施し、高度25km以高までの高精度な水蒸気濃度データの取得に成功した。2.データの取得・整備

現在使用可能な3種の最新気象再解析データ(ERA-Interim、JRA-55、MERRA2)をダウンロードし、共通の解析プログラム等を利用できるよう、同じフォーマットに変換した。極域をカバーし、なおかつ高鉛直分解能(<2km)を持つ人工衛星データ(AURA/MLS)を取得し、解析に適した共通フォーマットで整備・保存した。本研究計画では、計画2年目の平成30年度に南極昭和基地での大規模な水蒸気ゾンデ集中観測を実施し、そのデータと人工衛星や気象再解析データを組みあわせ、南極対流圏界面近傍の鉛直微細構造の生成メカニズムと対流圏界面を横切る物質交換過程を明らかにすることを目的としている。初年度は、そのための物資調達や観測準備、データの取得・整備を概ね予定通りに実施した。南極の対流圏界面領域(高度10km付近)は、温室効果気体の増加で温暖化する対流圏(高度010km)と、オゾンホールの拡大・縮小で寒冷化・温暖化する成層圏(高度1050km)に挟まれている。この領域では温度や化学成分(オゾン、水蒸気など)の分布が高度とともに急激に変化するため、その研究には高鉛直分解能なデータが必要とされるが、気象条件が過酷で物資や人員の輸送も制限される南極域ではこれまで十分な観測が行われてこなかった。本研究では、南極昭和基地において水蒸気ゾンデを用いた集中観測を実施し、そのデータと人工衛星や気象再解析データを組みあわせ、南極対流圏界面近傍の鉛直微細構造の生成メカニズムと対流圏界面を横切る物質交換過程を明らかにする。1.南極での水蒸気ゾンデ観測平成29年11月出発の第59次南極観測隊越冬期間中に、南極昭和基地において計14回(秋:1回、冬:6回、春:1回、夏:6回)の水蒸気ゾンデ観測を予定していた。秋、冬、春については予定通り観測を実施したが、夏については観測を実施する隊員の他業務による負荷が大きかったことと、想定以上の悪天が続いたことにより、予定していた観測のうち1回しか実施することができなかった。2.上部対流圏湿潤化プロセスの研究南極昭和基地における冬季の水蒸気ゾンデ集中観測により抽出された上部対流圏湿潤化イベントについて、流跡線解析と気象再解析データを用いた検証により、海洋上で発達した低気圧に伴う上昇流と極向きの流れにより、下層の湿った大気が輸送されてきたことが明らかとなった。現在、投稿論文化を進めている。本研究計画では、平成30年度に南極昭和基地での大規模な水蒸気ゾンデ集中観測を実施し、そのデータと人工衛星や気象再解析データを組みあわせ、南極対流圏界面近傍の鉛直微細構造の生成メカニズムと対流圏界面を横切る物質交換過程を明らかにすることを目的としていた。しかし、南極で活動する隊員に対する他業務の負荷が大きかったことと、悪天が続いたことにより、夏季に予定していた水蒸気ゾンデ集中観測6回のうち、1回しか実施することができず、通年のデータ取得は予定の6割程度にとどまった。平成30年度の研究実施計画は以下の通りである。1.南極昭和基地での水蒸気ゾンデ集中観測南極昭和基地での水蒸気ゾンデ集中観測を、平成29年11月出発の第59次南極観測隊により対流圏界面逆転層消滅期の平成30年7月および対流圏界面逆転層最盛期の平成31年1月に実施する。観測は1日に1回とし、移動性高低気圧による変化を2周期分程度捉えられるよう、それぞれ約2週間にわたり実施する。上記期間中、研究分担者の佐藤氏を代表とする南極昭和基地大型大気レーダー(PANSY)による対流圏・成層圏の3次元風速の連続観測が南極観測事業費により実施される。PANSYレーダー観測で得られるデータも本研究に用いる。
光周波数コムを利用した周波数＆時間分解近接場磁気光学顕微鏡の研究開発

ナノ領域での磁気特性を評価するため、アパーチャーレスプローブを用いたSNOMの構築と、偏光特性の調査をおこなった。その結果、約10 nmの空間分解能と良好な偏光特性を実現するとともに、アパーチャーレスSNOMにおいて問題であった背景光と信号光の分離に成功した。FDTDシミュレーションでは、実験で得られた偏光特性をほぼ正確に再現することに成功し、プローブ周辺の電場分布を理解することができた。さらに、時間分解測定を実現するための装置の構築を行った。本研究で、アパーチャーレスMO-SNOM顕微鏡の開発を行った。初年度はまず初めに、プローブ先端付近にレーザー光を照射することでプローブ先端近傍に近接場を形成し、近接場と試料の相互作用によって発生する伝搬光を、FDTD法によるシミュレーションによって計算した。計算では、カンチレバーにシリコン、試料にクロムを用いて、カンチレバーの斜め上方から光を入射し、カンチレバー先端の試料から散乱されてくる光からの散乱光を求めた。その結果、入射光を直線偏光とした場合には、S偏光、P偏光ともに、散乱光において偏光状態が保たれることを明らかにした。次に、実際にアパーチャーレスMO-SNOM顕微鏡を構築した。光源に波長408nmの半導体レーザーを用い、光路上に偏光子、1/2波長板を導入し偏光状態を変化できるようにした。測定では、カンチレバーにシリコンを用い、ガラス基板上に形成されたクロム膜のパターンを使い、反射光学像および偏光特性の評価を行った。空間分解能の評価では、13nmという高い値を得ることに成功した。さらに、偏光特性の評価では、直線偏光を入射させたときに計測した散乱光においても、偏光状態が保たれているというシミュレーションとよい一致を示す結果が得られた。さらに、得られた消光比は、磁気光学像を得るために十分な値である100以上の高い値を達成した。以上の結果より、高い空間分解能で磁気信号を得るためのアパーチャーレス反射型MO-SNOMの基本特性を確認できたといえる。本研究では、スピントロニック素子のナノ領域での磁気特性を評価するため、50 nm以下の空間分解能とピコ秒スケールの磁化反転特性の測定が可能な、2波長同時ヘテロダイン検波法を近接場磁気光学顕微鏡(MOーSNOM)に組み合わせた新しい磁気イメージング技術を開発することを目的としている。今年度は、開発中のアパーチャーレスMOーSNOMの偏光特性の解析と高分子試料の偏光像の測定を行った。計測されたSNOM信号の偏光特性を解析した結果、散乱光が生じるプローブ先端とその近傍の試料は、偏光特性を保存し、波長板として機能していることをシミュレーション及び実験によって明らかにした。さらに、セルロースが原料となっているセロハンテープの表面のSNOM測定を行った結果、表面の凹凸の形状を反映した光学像と表面の硬さなどを反映した位相像の測定に成功した。一方、s偏光およびp偏光の光を入射した場合には、コントラストがそれぞれ反対になる結果が得られた。これらの結果は、試料表面の分極状態を反映したものであると考えられる。このことから、SNOMを用いた偏光測定によって、光照射による試料表面の分極状態を約10nmの空間分解能で計測できることに成功したといえる。さらに、2波長同時ヘテロダイン検波法とMOーSNOMを組み合わせたシステムの構築を行ったほか、計測用回路の設計を行った。これにより、ピコ秒スケールでの新しい磁気イメージング技術への進展が期待できる。今年度は、開発中のアパーチャーレスMOーSNOMの空間分解能及び偏光特性の評価を行った。ガラス基板上に作製されたクロムパターンを使った測定により、14 nmの空間分解能を得られることを明らかにした。また、磁気光学効果の計測に重要である偏光特性を詳細に調べた。その結果、s偏光およびp偏光の光を入射させた時にが反射測定において偏光特性が良く保存されていることを明らかにした。さらに、SNOM像の測定において、偏光面の回転角が1度の場合でも検出することに成功した。一方、s偏光、p偏光以外の偏光状態の場合には、2種類以上の偏光状態が重ね合わさっていることも明らかにした。FDTD法を用いたシミュレーションでは、実験とほぼ同じモデルを構築し、アパーチャーレスプローブ周辺の電場分布および散乱光の偏光特性について調査を行った。計算の結果、s偏光およびp偏光の光を入射させた場合、プローブ先端付近から生じる散乱光は入射光と同じ偏光状態を保持することが明らかになり、実験で得られた結果をよく説明する結果が得られた。

以上の結果は、アパーチャーレスプローブを用いることによって、10 nmという高い空間分解能を有する磁気光学イメージングの可能性を示すものである。計画していたFDTD法によるシミュレーションによる偏光特性の解析と、アパーチャーレスMO-SNOMの構築が予定通り行うことができた。また、反射光学像の観察とその偏光特性が得られたことも予定通りである。25年度が最終年度であるため、記入しない。近接場磁気光学顕微鏡の偏光特性の調査に時間を要したため、2波長同時ヘテロダイン検波法のための回路の設計および作製が遅れた。今後は、磁性体の磁区構造を10nmの空間分解能で観察することを目指す。また、光周波数コムを用いた時間分解測定の基本原理の検証を行い、MO-SNOMと組み合わせることを検討する。今後の重要な課題は次の二点である。近接場磁気光学顕微鏡による磁区観察を実現することと、2波長同時ヘテロダイン検波法による原理実験の検証を行うことである。
受容体より、アダプター分子Shcを介する増殖及びアポトーシスシグナル伝達の解析

本年度の大きな成果のひとつは、Shcの主要なチロシンリン酸化部位として、Grb2結合部位であるY317の他に、Grb2と結合しないY239/240を新たに同定し、Ras-independentなShe-Myc pathwayが、この部位のリン酸化から発することを明らかとしたことである。Shc-Myc pathwayは未知のシグナル伝達系であり、さらに解明していくことが今後の課題である。1 IL-3によるアポトーシス抑制シグナル伝達Shcのチロシンリン酸化部位の変異体をBa/F3細胞に発現させた。She-Ras pathwayをなくしたY317F Shc発現細胞は、アポトーシス抵抗性であったが、Y239/240F Shc発現細胞は、c-myc mRNAが減少し、アポトーシスに陥りやすかった。アポトーシスの抑制には、Y239/240-myc pathwayが重要であった。このpathwayの下流として、bcl family, ICE family, P53等の発現について、さらに詳細な検討を加えたい。2. EGFによる細胞増殖シグナル伝達(2) Shc変異体をEGR-R高発現細胞へ発現させた。Y317F ShcまたY239/240F She発現細胞は、EGFによる増殖刺激を抑制しなかった一方、Y239/240/317F Shc発現細胞は、抑制した。EGFによる増殖シグナル上では、Shc-Ras pathwayとShc-Myc pathwayが、相補的に関与していることを示唆した。3. Shc下流因子のクローニングEGF-Rの自己リン酸化部位を欠失したcDNAとShcのチロシンリン酸化部位を含むcDNA断片とをつないだキメラcDNAを作製し、バクロウイルス発現系により、大量に発現させ、精製した。これを[32P]-γATPを用いて高い比活性でチロシンリン酸化させ、ヒト胎盤より作ったλgt11発現ライブラリーをwest-western法によりスクリーニングし、ポジティブクローンを得ている。これらの核酸配列を決定し、全長cDNAをクローニングし、Shc-Myc pathwayを直接つなぐ分子としての可能性を含め、詳細に解析したい。