hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
母子の心身両側面から評価するベビーマッサージの効果の検証

1.マッサージを実施する母親およびマッサージを受ける児にとって、ベビーマッサージの効果を母児の心身両側面から検証する。2.ベビーマッサージが母子相互作用に及ぼす効果を客観的指標を用いて検証することを目的に、生後3ヶ月児とその母親を対象に研究を行った。その結果、以下の成果が得られた。(1)母親にとって児にマッサージを行うことは、心身のストレス軽減を促すことが示唆された。(2)児にとって母親から受ける触覚刺激は、ストレスを軽減し、身体を動かす、話すなどの乳児の言語野の発達、運動機能の発達を促す可能性が示唆された。【意義】ベビーマッサージが母児の心身両側面に与える効果を検証し、育児支援の1つとして母児に提供する。【目的】本研究の目的は1マッサージを実施する母親およびマッサージを受ける児にとって、ベビーマッサージの効果を母児の心身両側面から検証する。2ベビーマッサージが母子相互作用に及ぼす効果を客観的指標を用いて検証することである。本年度は、以下の準備を行い調査を実施した。心電計の探求:振動、体動に強く装着・測定時間が母児に負担にならない、マッサージ中の心拍変動を正確に評価できることを確認し、精練した。心理尺度の選定:母子相互作用に及ぼす効果を評価するため、母親に対する心理尺度を選定した。調査の実施:【対象】正期産、単胎、出生時体重2500g以上の児を分娩し、産後3ヶ月時点で経過が順調な母子のペア。【方法】調査時期:マッサージ群は初回マッサージ時と1ヶ月後のマッサージ時の計2回。抱っこ群は生後3ヶ月時と通常の生活を送った生後5ヶ月時の計2回。データ収集時期:マッサージ群は15分間のマッサージ前・後の2地点で測定した。抱っこ群は15分間の抱っこ前・後の2地点で測定した。心拍データは15分間のマッサージの最中、抱っこの最中に測定した。測定項目:母児の心拍データ、唾液コルチゾール値。児の体温、体重。母親に乳幼児をもつ母親の育児に対する自己効力感尺度(Parenting Self-efficacy Scale: PSE尺度)、乳幼児発達スケール(KINDER INFANT DEVELOPMENT SCALE:KIDS)を実施した。介入内容:マッサージ群の母親は毎日、15分間のマッサージを1ヶ月間行う。【進捗状況】今年度は、マッサージ群9組、抱っこ群12組の調査を実施し、調査を継続中である。【研究意義】ベビーマッサージが母児の心身両側面に与える効果を検証し、育児支援の1つとして母児に提供する。【目的】本研究の目的は以下の2つである。1マッサージを実施する母親およびマッサージを受ける児にとって、ベビーマッサージの効果を母児の心身両側面から検証する。2ベビーマッサージが母子相互作用に及ぼす効果を客観的指標を用いて検証する。【対象】マッサージ群は生後3ヶ月の児とその母親とし、母親が児に1ヶ月間15分間のマッサージを1日1回以上自宅で実施した25組。抱っこ群はマッサージを行わない通常の生活を送った12組。【結果】目的1:1回マッサージで母親のLF/HF比はマッサージ後に比べてマッサージ中に有意に低下した。唾液コルチゾール値はマッサージ前に比べてマッサージ後に有意に低下した。1ヶ月行ったマッッサージは心拍変動、唾液コルチゾール値ともに有意差はみられなかった。一方、1回、1ヶ月受けたマッサージで児のLF/HF比はマッサージ前に比べてマッサージ中に有意に低下した。唾液コルチゾール値は1回、1ヶ月受けたマッサージ前後に有意差はみられなかった。目的2:POMSの怒り得点は、1ヶ月前に比べて1ヶ月後に有意に低下し、活気得点は有意に上昇した。一方、5ヶ月時の発達年齢は、抱っこに比べて運動領域が2ヶ月、表出言語領域が1ヶ月高かった。母児のマッサージ中の心拍変動値の相関は見られなかった。【考察】母親にとって児にマッサージを行うことは、心身のストレス軽減を促すことが示唆された。児にとって母親から受ける触覚刺激は、ストレスを軽減し、身体を動かす、話すなどの乳児の言語野の発達、運動機能の発達を促す可能性が示唆された。今後は、マッサージ最中の快情動を自律神経活動活動だけでなく、大脳皮質活動も含めて包括的に評価することの重要性が示唆された。ベビーマッサージ教室参加者の減少による対象者の確保が困難となり、計画に遅れが生じた。25年度が最終年度であるため、記入しない。研究計画の変更計画の遅れを受け研究プロジェクトメンバーである研究者間でプロトコールを再検討した結果、当初計画していた対象者のリクルート方法を初回マッサージ後1週間以内に変更し人数を確保する予定である。今後は、マッサージの効果を母児の心拍変動、唾液コルチゾールから分析する。また、POMSを用いてマッサージが母子相互作用に及ぼす効果を検証していく。

研究費の使用計画次年度は研究の最終年度であるため、唾液採取物品、心電計物品として230,000円、データ収集、学会参加旅費として100,000円、人件費、謝金として110,000円、検体検査料として750,000円の使用を予定している。25年度が最終年度であるため、記入しない。
装置不完全性を考慮した量子鍵配送理論

本研究課題では、なるべく性能を犠牲にせずに量子鍵配送の装置モデルをより現実に即するよう拡張し、実験によって確認できるデータを用いて安全性を保証することを目的とする。本研究課題で行うことは、現実との乖離が大きいモデルの仮定を乖離の少ない仮定に置き換えていくという作業であり、完全な解をいきなり目指すというよりは影響の大きなものから順次対処していくというものになる。本研究では、特に媒体として光を用いる場合における送信機と受信機に集中して研究を進める。2018年度はパルス光源の光子数分布の問題を取り扱った。現状のデコイ法の解析ではレーザーパルスの光子数分布が厳密にコヒーレント状態になっていることが重要な仮定となっている。しかし、実際の量子鍵配送の送信機ではゲインスイッチを用いたパルス生成をしていることが多く、そのような場合に生成されるパルスはコヒーレント状態とは程遠いことが懸念されている。この課題に関してノイズのない閾値型光子検出器を用いて光子数分布を厳密に推定する手法を確立したので、その結果をまとめ査読付き論文として出版した。2018年度には受信機の動作速度の問題についても取り扱った。量子鍵配送の実際の装置では1GHzを越える繰り返しレートでパルスの送受信が行われているが、それを取り扱う現状の理論では、あらゆる素子がこの動作速度で動くことが仮定されている。受動的な素子を使いつつ光検出器の数を増やすことによって、この条件を満たすことができるが、これは実験に使える素子の種類を大幅に制限することになる。一方で、量子鍵配送では送信する光がそもそも弱く、通信路で減衰したあとで検出される信号のレートは繰り返しレートよりずっと低い。よって、受信側の動作速度は送信側より遅くできる余地がある。現在、その構造がかなり一般的に成立することがわかっており、その結果を論文にまとめている。計画のうち光源の光子数分布の問題については論文として出版した。残りの計画である、受信機の動作速度の問題については現在論文を執筆中である。受信機の動作速度の問題について論文執筆を進める。時間相関の問題についても見通しがついているので、論文化を進める。物品費に関して少ないのは、研究室に導入された計算資源を流用したため。
世代間交流が高齢者の健康へ及ぼす影響および機序の解明

本研究では、世代間交流が高齢者の健康に及ぼす影響とその機序の解明にむけて地域高齢者に対する世代間交流に関する標準的な尺度「世代間のふれ合いにともなう感情尺度」を作成し、コホート研究により、個人レベルと地域レベルの世代間交流が高齢者の健康アウトカムに及ぼす影響とその心理・社会・医学的機序を明らかにすることを目的とした。結果として、地域の子どもとの世代間交流を通してポジティブな感情体験を経験することが地域高齢者の健康の向上に寄与するとともに地域全体のソーシャルキャピタルの醸成につながる可能性が示唆された。本研究は、高齢者からしばしば聞かれる「子どもや若い人から元気をもらえる」との慣用句をリサーチクエスチョンに設定としてその解明を目的としており、2014年度は以下の研究を行った。(1) 2013年11月に東京都板橋区在住65歳以上高齢者2475人を対象に実施した質問紙調査について、世代間交流のふれ合い感情のネガティブな側面である"話しづらさ"と心理社会的変数との関連を明らかにする目的で順序回帰分析による再分析を行った。その結果、高齢者が子どもに対して感じる"話しづらさ"には、身体的健康とともにボランティア活動参加や社会的活動能力が関連していることが明らかにされた。(2) 2014年7月に群馬県草津町在住の65歳以上の高齢者550人余りを対象に質問紙調査を実施した。本調査では、既存の「世代間のふれ合いにともなう感情尺度」の各項目の妥当性について再検証をすることを目的に、本調査対象者の中から数人を対象にして、本尺度項目に関する聞き取り調査を実施した。また、回収後のデータについて項目分析および因子分析を行った。これらの結果をもとに、数名の研究者で議論をして最終的に「改訂版世代間のふれ合いにともなう感情尺度」を開発した。(3)世代間交流と健康アウトカムとの関連を明らかにすることを目的として、新たに開発した「改訂版世代間のふれ合いにともなう感情尺度」を用いて、2014年8月に東京都大山地区の対象者1,500人余りを対象に質問紙調査を実施した。本調査に関しては、9月にデータを回収し、現在はデータ分析作業を行っている。本研究は、高齢者からしばしば聞かれる「子どもや若い人から元気をもらえる」との慣用句をリサーチクエスチョンに設定し、その解明を目的としており、2015年度は以下の研究を行った。(1) 2014年度に東京都板橋区大山地区で実施した調査データ解析を行い、「改訂版世代間のふれ合いにともなう感情尺度」について信頼性と妥当性を検証した。(2) 2015年10月に東京都板橋区大山地区在住の高齢者1,000人余りを対象に質問紙調査を実施した。本調査は、前年に実施した第1回調査の追跡調査として実施した。本調査に関しては、データは回収し、現在はデータ分析作業を行っている。当初の予定通り、東京都板橋区大山地区での調査を実施しているため、(2)おおむね順調に進展している。と判断した本研究は、高齢者からしばしば聞かれる「子どもや若い人から元気をもらえる」との慣用句をリサーチクエスチョンに設定し、その解明を目的としている。本年度は東京都板橋区および群馬県草津町で実施したパネル調査データについて、多母集団(65-74歳/75歳以上)の交差遅れ効果モデルを用いて、世代間交流と健康アウトカムの因果関係を検証した。その結果、地域の子どもとの世代間交流を通してポジティブな感情体験を経験することが高齢者の健康の向上に寄与するとともに地域全体のソーシャル・キャピタルの醸成につながる可能性が明らかにされた。当初の予定通り、世代間交流と健康アウトカムに関する第二回調査を実施した。ただし、分析作業が少し遅れている。こうしたことから、本研究は(3)やや遅れていると判断した。群馬県草津町在住の第1回・第2回調査と同一の対象者1,000人余りを対象に追跡調査を実施する。そのうえで、パネルデータを解析して世代間交流が高齢者の健康アウトカムに及ぼす影響とその心理・社会・医学的機序について明らかにする。28年度が最終年度であるため、記入しない。社会学東京都板橋区大山地区および群馬県草津町在住の第1回・第2回調査と同一の対象者1,500名余りを対象に1年後追跡調査を実施し、3年間の調査結果をもとに世代間交流と健康アウトカムとの因果関係について検証する。また、東京都大田区在住の第1回調査(H25年度)と同一の対象者1000名余りを対象にアンケート調査を実施し、世代間交流の変化に及ぼす要因について明らかにする。H25年度に産前産後の休暇取得により繰越金が発生した。H28年度は計画通り執行する予定である。
尋常性乾癬における角層バリア機能異常の解明とその制御

尋常性乾癬の病態に大きく関わるTNF-αとadiponectinについて角層バリア機能に対する作用を検討した。培養表皮細胞に対するTNF-α刺激では、表皮に特徴的な極長鎖脂肪酸のセラミド合成が減少し、また角化マーカーも減少することにより角層バリア機能が障害されると考えられた。また、adiponectin刺激では、ELOVL7が増加しており、これはC18→C20に伸長する酵素であることから、それより下流の長鎖脂肪酸も増加させ全体として、総セラミド量が増える可能性があり角層バリア機能に影響することが示唆された。研究は全体としておおむね順調に計画通り進行している。現在、培養表皮細胞系を用いて乾癬の発症、誘因に関与するadipokineおよびTNF-αを用いたセラミド解析を行っており、一定の結果が出ている。乾癬モデルマウスは作成準備中である。さらに他のadipokineについても検討中である。また、乾癬モデルマウスの作成準備中であり、準備が整い次第、マウス実験を主体としたい。さらに乾癬の病態に大きく関与する因子としてadipokineがあるが、その中でadiponectinは乾癬患者血清で有意に低下し、TNF-α阻害薬投与後に正常化することが知られており、われわれの症例でも確認している。そこで、adiponectinおよびIFN-γを種々の濃度で表皮細胞の培養液中に添加した。一定時間後、細胞を回収し、ELOVL 1-7, CerS 1-6やバリア機能に関与するcytochrome P450, family 4, subfamily F, polypeptide 22 (CYP4F22)の発現量の変化について、これらのmRNA発現量を検討した。その結果、adiponectin存在下の表皮細胞ではELOVL 1-7の中でELOVL1とELOVL5が, CerS1-6ではCerS2、CerS6とCerS 5が優位に分布した。adiponection添加によりIFN-γ誘導性のELOVLおよびCerSに有意な変化はなかった。現在、培養表皮細胞系を用いて乾癬の発症、誘因となる因子を用いたセラミド解析を行っている。また、乾癬モデルマウスの作成準備中であり、作成後はセラミド解析、角化マーカー、サイトカイン・プロファイルを検討する計画である。他のadipokineについて同様の実験を行うとともに、乾癬モデルマウスの作成準備中であり、作成後はセラミド解析、角化マーカー、サイトカイン・プロファイルを検討予定である。皮膚科学試薬購入に際して研究費の節約に努めたため、使用計画よりも使用額を減じることができた。PCRのための試薬購入に使用する計画である。
ブタにおけるニパウイルス病原性発現機序の解析と予防法の開発

本研究では、ニパウイルスのアクセサリータンパクと相互作用する宿主因子の探索を行った。ニパウイルスの病原性発現に強く関与するVタンパクは微小管構成タンパクと結合し、細胞内を輸送されることを見出した。また、Cタンパクについても解析し、相互作用する候補因子を複数見出したが、それらをそれぞれノックダウンした細胞においてウイルス増殖能を比較したが、ウイルスの増殖には影響がなかった。また、ブタ細胞でのニパウイルス増殖において、V、Wタンパクの影響を調べた。VまたはWタンパクを欠損させたウイルスをブタ培養細胞やPBMCに感染させたところ、W欠損ウイルスは野外株と同等の増殖を示したものの、V欠損ウイルスはその増殖が抑えられることが明らかとなった。また、Vタンパクはブタの細胞において1型インターフェロンの誘導を阻害することも明らかとなった。また、ブタヘルペスウイルスを用いた2価ワクチンを作出した。PRV自体の病原性を減弱するために、PRV遺伝子中のチミジンキナーゼ(TK)遺伝子領域を相同組換えにより欠損させたrRPVを作出し、免疫誘導抗原としての有用性を確認しているNiVのG蛋白を発現する組換えPRV(rPRV-NiVG)を用いて、これをブタに接種した。このワクチンを摂取したブタでは、ニパウイルスGタンパクに対する血中抗体価の上昇が確認された。そこでさらにニパウイルスを用いた攻撃試験を行ったところ、ワクチンを接種したブタでは非免疫群と比較して、体重や体温変化などの臨床症状が軽減し、さらに鼻スワブ中のウイルス排出量の低下も認められた。これらの結果から、本ワクチンの有効性が示唆された。平成29年度が最終年度であるため、記入しない。ニパウイルスのアクセサリータンパクであるV、C、Wタンパクと相互作用する宿主因子の探索を、GST-pull downおよびyeast-two-hybrid法を用いて行った。その結果それぞれに候補因子が得られ、直接結合の確認を行った。特に、C、Wタンパクについては、宿主の抗ウイルス免疫応答に対する新規の機能についを示唆する結果を得られた。ブタとヒトではニパウイルス感染による病態が異なるが、その差異が何によるのかを明らかにするために、ブタ胎児初代培養細胞の作出を試みた。これまでに脳、腎臓、腸管、肺、リンパ球等の初代培養細胞を樹立することができた。ブタでのニパウイルス感染症に対するワクチンとして、ニパウイルスGタンパクを発現する組換えブタヘルペスウイルスワクチンを作出した。BSL4施設で行う必要のある感染性ウイルスを用いたin vitroおよび動物感染実験は、相手施設の利用状況等により当初計画より遅れることもあった。その他、ウイルスタンパクを用いたP2レベルの実験は計画通りに進展している。ニパウイルス病原性を規定するアクセサリータンパクと相互作用する宿主因子の解析を行った結果、Vタンパクがある宿主と相互作用し、宿主細胞内でのウイルス複製効率を上げていることが明らかとなった。これは、同属のウイルスにおいて初めての知見である。また、豚ヘルペスウイルスベクターにニパウイルスの膜タンパクであるGタンパクを組み込んだ組換えワクチンの効果の検討を行った。本組換えワクチンを摂取した豚では、ニパウイルスGタンパクに対する血中抗体価の有為な上昇が確認された。そこでさらにニパウイルスを用いた攻撃試験も行い、感染あるいは発症防御能の検討を行った。このワクチンを摂取した豚では、非免疫群と比較して、体重や体温変化などの臨床症状が軽減し、さらに鼻スワブ中のウイルス排出量の低下も認められた。このことから本ワクチンの有効性が示唆された。ニパウイルスの病原性に関与するアクセサリータンパクの機能解析を進め、これまで知られていないVタンパクの細胞内での挙動および機能を明らかにすることができた。また我々が作出した組換えワクチンについても、その効果を検討し有用であると考えられる結果を得た。本ワクチンの免疫惹起能について、細胞性免疫の解析が少し遅れているが、そのためのツールは概ね揃えられた。

ニパウイルスアクセサリータンパクの機能解析については、相互作用する候補因子が複数見出されているので、それぞれの解析を進める。また、アクセサリータンパク欠損ウイルスのブタ細胞での病原性についての解析も行う。ブタヘルペスウイルスベクターを用いた組換えワクチンについては、その有効性の検討を続ける。アクセサリータンパクの機能解析については、V以外のタンパクについてもさらに進める。特にCタンパクについては、in vitroの実験で相互作用する宿主因子が複数見つかっているので、それらについての詳細な機能解析を進める。組換えワクチンの効果の検討については、今後、呼吸器を中心とした各臓器でのウイルス増殖量の比較や、病理組織学的解析も行う。平成29年度が最終年度であるため、記入しない。
対数的Calabi-Yau多様体の変形と分類

Fano多様体, Calabi-Yau多様体は代数多様体の分類において核となる対象である.代数多様体の変形は分類を考える上での基本的操作である.本研究の目的はCY多様体,およびFano多様体の分類に進展をもたらすことである.具体的には,重要な未解決問題``3次元CY多様体の有界性問題", ``Q-Fano 3-foldの数値的不変量の明示的評価", ``4次元Fano多様体の分類"などに取り組む.Fano多様体, Calabi-Yau多様体は代数多様体の分類において核となる対象である.代数多様体の変形は分類を考える上での基本的操作である.本研究の目的はCY多様体,およびFano多様体の分類に進展をもたらすことである.具体的には,重要な未解決問題``3次元CY多様体の有界性問題", ``Q-Fano 3-foldの数値的不変量の明示的評価", ``4次元Fano多様体の分類"などに取り組む.
ハロゲン架橋一次元M(II)-M(IV)混合原子価錯体における熱膨脹係数の異常

ハロゲン架橋一次元【M^(II)】-【M^(IV)】混合原子価錯体は、強い電子格子結合をもつ一次元化合物として発光スペクトルなどの興味深い光物性を示す。我々はこの種の混合原子価錯体の一つ、〔Pt【(NH-3)-4】〕〔【PtX_2】【(NH-3)-4】〕【(HSO-4)-4】(X=Cl,Br)において一次元鎖方向で負の熱膨脹を示す現象をすでに報告した。この現象がどのような原因によって起るのか、特に電子格子相互作用との関連を究明するために、一連の〔M【(en-2)】〕〔【MX_2】【(en-2)】〕【(ClO-4)-4】(X=Cl,Br,I;M=Pt,Pd)の単結晶を作成し格子定数の温度変化、DSCの測定を行った。この結果、I架橋を除く混合原子価錯体において、一次元鎖方向の負の熱膨脹を伴う一次相転移が-5°C30°Cの温度範囲で観測された。これらの結晶は同型であるため、〔Pt【(en-2)】〕-〔Pt【Br_2】【(en-2)】〕【(ClO-4)-4】について相転移前後のX線結晶解析を行い構造変化を詳細に検討した。この結果、一次元方向の【Pt^(IV)】-BKおよび【Pt^(II)】...Br結合距離は、低温相で、2.487(1)、3.006(1)【A!°】、高温相で2.473(1)、2.997(1)【A!°】であり、両者とも負の熱膨脹を示すことが明らかとなった。この結果は、一次元方向の負の熱膨脹が【Pt^(II)】...【Pt^(IV)】間の電荷移動相互作用の変化だけでは説明しきれないことを示している。相転移に伴う結晶構造変化を詳しく検討した結果、Pt【(en-2)】部分のエチレンジアミンキレート環のコンホメーションが高温相でδδ(λλ)、低温相でδλ(λδ)と変化すること、さらにこの変化に伴い一次元鎖状構造を保持しているCl【O(^-4)】とPt【(en-2)】間の水素結合系が大きく変化していることが判明した。【Pt^(IV)】-Brおよび【Pt^#】...Br距離の変化は、水素結合系の変化に伴う配位子場の変化によるものとして説明できる。これらの実験事実から、一次元方向の負の熱膨脹は、電子格子相を作用に起因するものではなく、水素結合系の変化に由来するものであり、またこの種の化合物では水素結合系が一次元鎖状構造の保持だけではなく、その構造パラメータの決定に重要な役割を果していることが結論された。

これらの実験事実から、一次元方向の負の熱膨脹は、電子格子相を作用に起因するものではなく、水素結合系の変化に由来するものであり、またこの種の化合物では水素結合系が一次元鎖状構造の保持だけではなく、その構造パラメータの決定に重要な役割を果していることが結論された。
金属製錬との結合による廃木材の総合利用システムの基礎研究

1.研究の基本的な考え方製鉄プロセスを、他の産業分野で問題になっている発生物を処理する場として用いると考えると、その量的、設備的ポテンシャルは魅力のあるものとして映ってくる。これまでに、『廃プラステックの高炉で利用』など、『アルミ灰など金属精錬過程発生物の利用』などが研究、実用化された例があるが、産業全体の中で考えると、数多くの可能性が残されている。2.廃木材の実態調査今後、廃棄物として問題が深刻化すると思われるものとして、廃木材に着目し調査を行った。リサイクルされているのは(熱利用も含めて)30%であり、多くは野焼き、埋め立てに用いられている。特にCCA処理した廃木材が出て来始めると、野焼き(Asの揮散)、埋め立て(腐らない)問題になる。したがって、CCA処理材も含む廃木材を処理して、燃料よりも付加価値の大きいものとして吸着性能の大きい木炭を製造・利用するプロセスの研究に着眼した。3.廃木材の炭化試験、利用方法の検討従来法では、2段処理のために高価な活性炭の製造法を、経済的にするための処理条件を見いだすために、加熱温度、雰囲気組成、時間を変えた炭化基礎実験を30水準行い、吸着性能を調査した所、適正な処理条件を選ぶと、活性炭の1/2程度の性能を持ったものが得られることがわかった。これらは、製鉄の廃ガス処理の過程などで吸着材として有効に用いられる。
完全水中での構造制御されたらせん高分子の合成と応用

側鎖にホスホン酸モノエチルエステル部位を有するポリフェニルアセチレン誘導体(poly-1-H)は、様々の光学活性なアミン存在下、そのキラリティーに応答して一方向巻きのらせん構造を形成し、長波長領域に誘起円二色性(誘起CD)を示す。さらに、誘起された一方向巻きのらせん構造は、光学活性なアミンをエチレンジアミンのようなアキラルなジアミンで置換後も記憶として保持される。そこで、poly-1-Hの側鎖のホスホン酸モノエチルエステル部位がプロキラルであることに着目し、poly-1-Hに誘起された一方向巻きのらせん構造を不斉場とした側鎖のエナンチオ選択的エステル化を行い、生成する側鎖のリン-キラリティーにより主鎖のらせんキラリティーを半永久的に保存可能かどうかについて検討を行った。以下にその概要を示す。光学活性なアミン((R)-2)存在下、らせん構造が誘起されたpoly-1-HのDMSO溶液に室温でCH_2N_2を加えることにより、側鎖のエステル化を行った。反応は均一に進行し、ほぼ定量的にメチルエステル化されたポリマー(poly-3)を得た。Poly-3のCDスペクトルをmethanol中で測定したところ、(R)-2を全く含まないにもかかわらず、長波長領域に明確な誘起CDが観測された。この結果より、側鎖のエステル化により生成した不斉なリン-キラリティーによってpoly-3が一方向巻きに片寄ったらせん構造を形成している、すなわち、誘起されたらせんキラリティーが保存可能であることが明らかになった。また、らせん構造を記憶として保持したpoly-1-Hについても同様のエステル化を行ったところ、得られたポリマーは弱いながらも明確な誘起CDを示した。これは、poly-1-Hの主鎖に記憶されたらせんキラリティーのみでも、側鎖のエステル化がエナンチオ選択的に進行可能であることを示している。代表的な高分子電解質である核酸のリン酸エステル残基に着目して設計したパラ位にホスホン酸モノエステル部位を有するフェニルアセチレン誘導体を合成し、水中での立体特異性重合を試みた。重合反応は、窒素下、脱気水中、水酸化ナトリウム存在下、水溶性のロジウム錯体を用いて30°Cで24時間行った。重合は均一に進行し、エタノール不溶部として黄色い繊維状のポリマーが得られた。得られたナトリウム塩型のポリマーを1Nの塩酸水溶液で処理することにより酸型のポリマー(poly-1-H)に変換した。得られたポリマーの^1H NMRの測定を行ったところ、5.8ppm付近に主鎖のメチンプロトンに由来するシャープな吸収が観測されたことから、poly-1-Hはほぼ完全にシス-トランソイド構造を有しているがわかった。また、得られたポリマーの分子量は、poly-1-Hをメチルエステルに変換し、サイズ排除クロマトグラフィーにより約2万と求められた。そして、グリシンを除く19種類の標準アミノ酸存在下、poly-1-Hの円二色性(CD)スペクトルを水中で測定したところ、poly-1-Hはすべての標準L-アミノ酸存在下、ポリマー主鎖の共役二重結合領域に誘起CDを発現した。これは、poly-1-Hが水中でもアミノ酸と相互作用して、一方向巻きのダイナミックならせん構造を形成可能であることを示している。さらに、poly-1-Hはアミノ酸だけでなく、オリゴペプチドやポリペプチド、アミノ糖や抗生物質、糖類など極めて広範囲の光学活性な生体分子のキラリティーに応答して誘起CDを示すことがわかった。また、抗生物質であるストレプトマイシンやバンコマイシンの検出限界をCDを検知器として用いて求めたところ、わずか数十ナノグラムでも十分検知可能な誘起CDが観測された。これらの結果より、poly-1-Hは様々の光学活性体の水中でのキラリティー検出のための高感度プローブとして有用であることが明らかになった。光学活性なアミン存在下、側鎖にホスホノ基およびその水酸基の片方をエチル基で保護したホスホン酸モノエステル部位を有するポリフェニルアセチレン誘導体(poly-1およびpoly-2)に誘起された一方向巻きのらせん構造が、光学活性なアミンをアキラルなアミンで置換後も、らせん構造を記憶として保持可能かどうか検討した。Poly-1やpoly-2は、DMSO中、光学活性なアミン((R)-3)存在下、ポリマー主鎖の共役二重結合領域に、一方向巻きに片寄ったらせん構造に由来する誘起円二色性(誘起CD)を示した。誘起CDの強度に及ばす光学活性体の濃度の影響について調べたところ、モノマーに対してほぼ当量の(R)-3を加えただけで、これらポリマーの誘起CDの強度は飽和に達した。そこで、アキラルなアミンを含むDMSO溶液を溶離液に用いたサイズ排除クロマトグラフィーによって、ポリマーと(R)-3のDMSO溶液からポリマー部分のみを分取し、そのCDスペクトルを測定した。アキラルなアミンとしてn-butylamine(4)や2-aminoethanol(5)を用いたところ、(R)-3を4や5で完全に置換後、ポリマーには明確な誘起CDが観測されなかった。すなわち、モノアミンである4や5を用いた場合、らせんの反転が起こっていることが明らかになった。そこで、アキラルなジアミンであるethylenediamine (6)を用いて同様の実験を行ったところ、分取したポリマーは(R)-3を全く含まないにも関わらずポリマー主鎖の共役二重結合領域に比較的強い誘起CDを示した。(R)-

3よりもポリマーに対する親和力が強いと思われるアキラルなジアミンを用いることにより、誘起された一方向巻きのらせん構造を記憶として保持可能であることがわかった。この際の誘起CDの強度をもとに算出した記憶効率は、poly-1とpoly-2でそれぞれ68.2%および93.2%であった。Poly-2の方が極めて高い記憶効率でらせん構造を記憶として保持できることがわかった。次に、溶離液であるDMSO溶液中に含まれるジアミンの濃度が記憶の効率にどのような影響を及ぼすかについて検討した。DMSO溶液中に含まれる6の濃度を0.8、0.08、0.008 Mと変化させて同様の実験を行ったところ、記憶の効率はpoly-1、poly-2ともに10%程度低下したが、ジアミンの濃度が希薄な条件でも十分らせん構造を記憶可能であることが明らかになった。側鎖にホスホン酸モノエチルエステル部位を有するポリフェニルアセチレン誘導体(poly-1-H)は、様々の光学活性なアミン存在下、そのキラリティーに応答して一方向巻きのらせん構造を形成し、長波長領域に誘起円二色性(誘起CD)を示す。さらに、誘起された一方向巻きのらせん構造は、光学活性なアミンをエチレンジアミンのようなアキラルなジアミンで置換後も記憶として保持される。そこで、poly-1-Hの側鎖のホスホン酸モノエチルエステル部位がプロキラルであることに着目し、poly-1-Hに誘起された一方向巻きのらせん構造を不斉場とした側鎖のエナンチオ選択的エステル化を行い、生成する側鎖のリン-キラリティーにより主鎖のらせんキラリティーを半永久的に保存可能かどうかについて検討を行った。以下にその概要を示す。光学活性なアミン((R)-2)存在下、らせん構造が誘起されたpoly-1-HのDMSO溶液に室温でCH_2N_2を加えることにより、側鎖のエステル化を行った。反応は均一に進行し、ほぼ定量的にメチルエステル化されたポリマー(poly-3)を得た。Poly-3のCDスペクトルをmethanol中で測定したところ、(R)-2を全く含まないにもかかわらず、長波長領域に明確な誘起CDが観測された。この結果より、側鎖のエステル化により生成した不斉なリン-キラリティーによってpoly-3が一方向巻きに片寄ったらせん構造を形成している、すなわち、誘起されたらせんキラリティーが保存可能であることが明らかになった。また、らせん構造を記憶として保持したpoly-1-Hについても同様のエステル化を行ったところ、得られたポリマーは弱いながらも明確な誘起CDを示した。これは、poly-1-Hの主鎖に記憶されたらせんキラリティーのみでも、側鎖のエステル化がエナンチオ選択的に進行可能であることを示している。
滑液及び滑膜由来間葉系幹細胞の関節内注射による軟骨再生治療試験

ウマ関節由来の滑液(SF)に含まれる間葉系幹細胞(MSC)の起源と多分化能を検討し,損傷軟骨の再生のための新たな治療法を提案した。関節内骨折及び離断性骨軟骨炎のある関節のSF中には,正常関節と比較して豊富なMSCが含まれており,それらは多分化能を有し,特に軟骨分化では特殊染色で強染されるゼラチン様シートを形成することを認めた。SF-MSCの特徴は滑膜(SM)由来のMSCと一致しており,実験用ブタによるSM-MSCの骨軟骨損傷関節内への自家移植では,損傷部への滑膜誘導と軟骨再生が組織学的に確認された。臨床応用に向けて,ウマ由来のSM-MSCを他家移植(関節注射)し,副反応や安全性を確認した。関節症の関節から採取した滑液(SF-)や滑膜組織(SM-)中の間葉系幹細胞(MSC)を体外で増幅し,高密度な浮遊液として骨軟骨欠損部に滴下・移植して欠損部に硝子軟骨の再生を図ることが目的である。【実験1】滑液由来幹細胞(SF-MSC)について,増殖率,細胞老化に伴う特性変化,骨髄(BM-MSC)や脂肪由来幹細胞(AT-MSC)との相違点を検討した。45週間の培養後,1,000万個以上のSF-MSCが得られた。この間のSF-MSCの細胞倍化率は,BM-及びAT-MSCと比較して遅かった。SF-MSCの表面抗原特性(CD44,CD90,MHC-I抗体陽性,CD34、CD45抗体陰性)及び特異遺伝子発現(NanogとSox2陽性)は,BM-及びAT-MSCの結果と一致した。SF-MSCの骨・軟骨・腱・脂肪細胞への分化誘導能については,BM-及びAT-MSCに比べて,特に軟骨細胞誘導における軟骨基質の産生量が豊富であった。SF-MSCの平板培養下における軟骨分化誘導ではゲル状シートが形成される一方で,BM-及びAT-MSCでは形成されなかった。この特性は,10継代したSF-MSCでは低下していた。正常滑液は,関節症由来の滑液よりも最初得られる幹細胞の数が少なく,目標数に達するまで長い培養期間を要した。【実験2】ブタでは滑液の採取量が限られるため,同じ細胞群の分離培養が容易かつ効率的な滑膜組織を細胞源とした。ミニブタを使用して,滑膜組織を外科的に切除し,SM-MSCを分離培養した。特異抗体を用いてCD44およびCD90陽性,特異な上記遺伝子の発現,骨・軟骨・脂肪への誘導分化を確認した。SM-MSCは34継代して3,000万個に達し,それを300μlのPBSで浮遊液とした。肩関節の上腕骨頭に作成した骨軟骨欠損部(外径6mm,深さ3mm)に細胞を滴下・移植し,1頭を術後2ヵ月で安楽殺としたところである。【最終年度に実施した研究の成果】ウマの滑液(SF)由来間葉系幹細胞(MSCs)について,骨髄(BM)や脂肪(AT)由来幹細胞と比較して増殖速度がゆっくりしていること,継代を繰り返す(細胞老化)ことによって軟骨分化誘導時に見られるゼラチンシート形成能が低下することを確認し,H25年度の実績に加えて,学会発表と国際誌への論文発表を行った。骨軟骨欠損を作成した実験用ブタへのMSCsの関節内投与試験では,病理学的検索を完了し,MSCsを移植した関節において欠損部への滑膜誘導が促されて軟骨基質が再生することが確認された。最終目標である自然発生性の関節疾患症例への適用を進めるために,幹細胞移植の安全性をウマにおいても確認する必要があった。健康なウマを用いて,正常関節に他家の幹細胞を注射・移植した後の副反応を確認したところ,投与後3日目の病理解剖において軟骨変性や滑膜炎等の合併症の発現は認められなかった。研究期間を終了したが,平成27年6月,他機関との共同研究によって臨床応用を念頭においた実験用ウマ(サラブレッド)2頭を使った移植試験を継続して行う運びとなった。【研究期間全体を通じて実施した研究の成果】ウマ関節由来のSF-MSCsの起源と多分化能を検討し,損傷軟骨の再生のための新たな治療法を提案した。関節内骨折及び離断性骨軟骨炎のある関節のSF中には,正常関節と比較して豊富なMSCsが含まれており,それらは多分化能を有し,特に軟骨分化では特殊染色で強染されるゼラチン様シートを形成することを認めた。SF-MSCsの特徴は滑膜(SM)由来のMSCと一致しており,実験用ブタによるSM-MSCsの骨軟骨損傷関節内への自家移植では,損傷部への滑膜誘導と軟骨再生が組織学的に確認された。

臨床応用に向けて,ウマ由来のSM-MSCを他家移植(関節注射)し,副反応を認めないことや安全性を確認できた。獣医外科学本研究は,ウマの滑液・滑膜幹細胞を軟骨欠損部に適用して軟骨再生を促す治療法の開発を目的としている。平成25年度には,ミニブタを使用して,その滑膜由来間葉系幹細胞(SM-MSC)の分離と培養を可能とし,細胞浮遊液として骨軟骨欠損部に滴下して,軟骨による再被覆を評価する計画となっている。まずブタのSM-MSCの特性を確認するために,予備実験で行ったウマのSF-MSC及びSM-MSCの特性をより詳細に解析する必要があった。関節症由来の滑液からは回収されるが,正常関節由来の滑液からも分離が可能なのか,あるいはすでに詳細な解析が進んでいる骨髄(BM-)や脂肪由来(AT-)の間葉系幹細胞(MSC)との類似性や相違点,SF-MSCの細胞老化に伴う特性変化について検討する必要があった。年度の半分は,このような観点からSF-MSCの特性解析に時間を費やした。その結果,SF-MSCを定義づける基礎的なデータ(正常滑液にも少ないが存在すること,他の幹細胞と同様な多分化能を有すること,老化に伴い分化能は低下すること)が出揃い,これらの内容は,平成26年度に国際学会へのエントリーを行い,国際誌への公表も間近にしているところである。上記の基礎データを基に,ブタでは,SF-MSCの細胞起源と考える滑膜(SM-)からのMSCを分離し,幹細胞としての機能特性を確認した。移植に必要な細胞数(3,000万個)をPBS300 μlに浮遊させ,上腕骨頭に外形6mmの骨軟骨欠損に移植する実験を予定通り実施することができ,すでに2か月後に安楽死して移植関節の肉眼所見を得ている。細胞を移植しなかった対照肢と明らかに異なる肉厚の軟骨用組織によって表層が被覆されていたことから,組織学的評価が待たれるところである。以上のように,来年度予定のブタによる追加試験の実施,あるいはウマにおける試験を行うための準備は整ったと考えている。平成26年度は,ミニブタを用いた滑膜由来間葉系幹細胞(SM-MSC)の骨軟骨欠損部への移植,あるいはウマを用いた滑液(SF-)または滑膜(SM-)由来MSCの骨軟骨欠損への移植手術を行い,経過観察後,病理組織学的評価までを行いたいと考えている。しかしながら,実験動物の購入・飼育には高額を要するので,どちらかの動物種を用いた移植実験ができればよいと考えている。実験を遂行する上で,技術的な障害・課題はすでに解決していると考えているが,いずれの動物を飼育するにしても,長期的な観察実験になるため,実施可能な頭数,及飼育期間で行いたい。将来的には,SF-あるいはSM-MSCを用いてより広範で深部に及ぶ骨軟骨欠損の再生へと進めていければと考えている。
A New Expression of Three-dimensional Light Flow in Architectural Spaces and its Visual Interpretation in the Context of Human-centric Lighting Design

本研究では、持続可能性と建築環境快適性の両立を目指した次世代の昼光照明設計手法の提案に向けて、昼光照明設計におけるPhoton Mapアルゴリズムの活用では世界トップの実績を持つHochschule Luzernとの共同研究によって、以下の3項目の研究・開発を進める:1)Volume Photon Mapアルゴリズムを用いて光環境を3次元的に可視化する手法を確立すること、2)本手法により人が認識する光の場を従来よりも正しく予測できることを被験者実験を通して明らかにすること、3)最新の昼光導入装置を備えた空間での検証を通して新たな昼光照明設計のためのツールとしての有効性を立証すること。
ささやき母音の知覚におけるピッチとホルマントの役割

今年度は、まず第1および第2ホルマントを直交する軸とする平面上の格子点に対して与えられた音韻同定率から、平面上の母音境界を推定する手法について検討した。これにより、公表されている基本周波数の変化に伴う通常母音の母音境界の移動と、実際に実験で得た通常母音からささやき母音への変化に伴う母音境界の移動の類似性を示し、有声母音の基本周波数に代えてささやき母音のピッチ(知覚的な音の高さ)がその音韻性に関与している可能性を示した。ささやき母音のスペクトルには調波構造が存在せず、ピッチに対応する物理量は明らかではない。しかし、ささやき母音のような雑音性の音のピッチにはスペクトル全体の構造が影響すると考えられる。そこで、ピッチに影響を及ぼすと予想され、かつ母音の音韻性に係わる重要な特徴であるホルマント周波数を変化させない物理量としてスペクトルの傾斜を採用し、これを変化させた/i/-/e/刺激連続体上の種々の合成ささやき母音と、基本周波数が異なる2種類の合成通常母音を用いて、ピッチ測定と音韻同定実験を同一被験者に対して行なった。ピッチ測定は、被験者のピッチの判断が容易であると考えられる一対比較法により行い、高周波成分が相対的に大きいスペクトルの傾斜をもつものほどピッチが高いことを明らかにした。また、スペクトルの高周波成分の大きなものの母音境界ほど/e/の方向に移動することから、ピッチ測定の結果を考慮して、ピッチの高いささやき母音ほど/i/としての音韻性を強くもつことが間接的に明らかとなった。母音の音韻性に及ぼすピッチの影響を、ささやき母音と通常の母音について統一的に説明するには到らなかったものの、通常の母音のみについても同様の結果が得られた。
子宮内膜癌における新規癌遺伝子lipocalin2を標的とした治療法の開発

HHUA細胞のLCN2発現にはNFκBや鉄イオンは影響していないと考えられた。HHUA、RL95-2、HEC1B細胞では、LCN2はシスプラチン(CDDP)耐性を増強するが、その作用には鉄イオンが関与するもののPI3K経路やMAPK経路は関与しないと考えられた。またLCN2は足場非依存性コロニー形成能を亢進し、癌幹細胞マーカーであるCD44v9やCD133を増強した。このことはLCN2が癌幹細胞性の維持・増強に関与し、それにより抗癌剤耐性を増強している可能性が考えられた。また、これらのLCN2作用における下流因子の候補として、マイクロアレイ解析によりNUPR1を見出した。まず、LCN2高発現子宮内膜癌細胞株HHUA(HHUA-C)を用いて、4種類の長さのLCN2プロモーター配列のルシフェラーゼレポーターアッセイを行ったところ、NF-kB結合配列の有るものでは転写活性が高かったが、NF-kB阻害薬添加により、転写活性は殆ど変化しなかった。このことからHHUA細胞においては、LCN2発現はNF-kB非依存性と考えられた。次にLCN2の癌幹細胞性への影響について、癌幹細胞マーカーとして知られるCD133, CD44 variant isoform 8-10 (CD44v)の発現に注目した。これらのmRNA発現はLCN2受容体SLC22A17発現と相関を認め、HHUA-Cに比較し、LCN2発現抑制HHUA細胞(HHUA-sh)で発現が低下するが、組み換えLCN2 (rLCN2)添加で48時間後には増加し、さらにrLCN2と抗癌剤シスプラチン添加48時間後では5倍以上発現が増強した。これらの分子について、子宮内膜癌の癌幹細胞マーカーとしての意義は現時点で明確ではないが、酸化ストレス耐性や抗癌剤耐性に関与することが知られており、LCN2による抗癌剤耐性や酸化ストレス耐性増強作用に影響している可能性が考えられた。次に、ヌードマウス腰背部筋膜下にHHUA細胞を移植すると形成された腫瘍は腹壁に浸潤して腹腔内に達し、4週後には腹膜播種を形成する。HHUA-Cでは80%(8/10)のマウスで腹膜播種形成を認め、平均5か所以上の播種を形成したが、HHUA-shでは形成された腹壁腫瘍は小さく、腹膜播種形成したものは20%(2/10)のみであり、播種数も12個と少数であった。この播種病変でのLCN2 mRNA発現をRT-PCRで確認すると、HHUA-shから形成された腹膜播種腫瘍は全てLCN2発現がHHUA-Cと同レベルまで回復していた。このことは、腫瘍の浸潤・腹膜播種形成において、LCN2が重要な役割を持つことを示唆する。我々はこれまでの研究でlipocalin2 (LCN2)が子宮内膜癌の抗癌剤などの細胞死を誘導するストレスに対し、生存能を亢進させることを見出してきたが、この作用にPI3K経路の関与は見いだせず、機序が不明である。我々は癌幹細胞が抗癌剤耐性を示すこと、癌幹細胞マーカーCD133, CD44 variant(CD44v)等は子宮内膜癌の癌幹細胞を示すものではないが抗癌剤耐性に関与する可能性があることに注目した。子宮内膜癌細胞株HHUA, RL-95-2にともにshRNA法で90%以上LCN2発現を抑制した細胞(HHUA-sh, RL95-2-sh)ではコントロール細胞(HHUA-C, RL95-2-C)に比較して、CD44v, CD133ともに発現が低下し、組み換えLCN2 (rLCN2)添加により発現が回復した。またFlowcytometryでHoechst33342染色により癌幹細胞が含まれるとされるside population(SP)の細胞率について検討した。HHUA-shのSP細胞は2%でHHUA-Cの4%より減少していた。また、rLCN2添加により、HHUA-shのSP細胞の増加が観察された。LCN2はCD133やCD44vの発現増加やSP細胞の増加を介して、抗癌剤耐性を増強している可能性が考えられた。次にLCN2によるシスプラチン(CDDP)耐性増強の下流分子を検討するために、HHUA-CとHHUA-shでCDDP投与による発現変化率に差のある遺伝子を、マイクロアレイを用いて網羅的に検討した。その結果、HHUA-CでHHUA-shに比較して発現変化率が2倍以上増強している13遺伝子、同じくHHUA-shで発現変化率が2倍以上増強している79遺伝子が見出された。今後、これらの遺伝子について実際にlipocalin2との関連について検証していく予定である。LCN2によるシスプラチン(CDDP)耐性増強作用は鉄キレート剤deferoxamine(DFO)投与でほぼ完全に相殺されたが(WST-1 assay)、その際にもPI3K経路の中心をなす、リン酸化Akt発現に差はみられず、PI3K経路には依存していないと考えられた。そこでCDDP耐性増強に関連して我々はがん幹細胞性や酸化ストレス耐性の変化に注目した。

子宮内膜癌細胞株HHUA、RL-95-2、卵巣明細胞癌細胞株RMG1ではいずれもLCN2発現抑制で癌幹細胞マーカーとして知られるCD44 variant8-10 (CD44v)およびシスチントランスポーターxCT発現が減弱し、組み換えLCN2(rLCN2)添加でこれらの発現の回復が認められた。さらに、軟寒天培地での足場非依存性コロニー形成アッセイやSphere formationアッセイで検討したところ、LCN2発現抑制により、有意にコロニー数およびSphere数が減少した。これらのことからLCN2は、癌幹細胞様細胞の増加に寄与している可能性が考えられた。LCN2の下流因子を見いだすため、HHUA細胞とLCN2発現抑制細胞でマイクロアレイ解析を行い、さらに同時に施行した卵巣癌細胞株ES2(LCN2発現増強)、RMG1細胞(LCN2発現抑制)の結果とも比較検討したところ、共通して2倍以上発現が変化する遺伝子としてNUPR1(Nuclear Protein1)を見いだした。しかしながら、RT-PCRによる確認実験でも発現差を認めたが、今のところWestern blotでは発現差が確認できておらず、今後、さらなる検討が必要である。HHUA細胞のLCN2発現にはNFκBや鉄イオンは影響していないと考えられた。HHUA、RL95-2、HEC1B細胞では、LCN2はシスプラチン(CDDP)耐性を増強するが、その作用には鉄イオンが関与するもののPI3K経路やMAPK経路は関与しないと考えられた。またLCN2は足場非依存性コロニー形成能を亢進し、癌幹細胞マーカーであるCD44v9やCD133を増強した。このことはLCN2が癌幹細胞性の維持・増強に関与し、それにより抗癌剤耐性を増強している可能性が考えられた。また、これらのLCN2作用における下流因子の候補として、マイクロアレイ解析によりNUPR1を見出した。(理由)LCN2の癌幹細胞マーカーCD133やCD44v発現との関連が示されてきている。これらのマーカー発現との関連はこれまでに報告がなく、我々が初めて示したものである。またSP細胞分画の増加等、幹細胞様細胞の増加の可能性についても新しい知見が得られている。我々は卵巣癌細胞株でも同様の変化を確認しており、LCN2の子宮内膜癌における機能が、徐々に明らかになってきており、分子標的として有望であると考えられる。また、マイクロアレイによりLCN2の作用分子の候補も絞られつつある。27年度が最終年度であるため、記入しない。外科系臨床医学・産婦人科学基本的に当初の研究計画の通りに遂行する。マイクロアレイ解析結果から抽出された、LCN2の下流の標的候補因子について、LCN2発現や作用との関係をさらに検討する。またSP細胞とCD44vやCD133発現との関連をflowcytometryで検討する。これまでLCN2の免疫共沈はうまくいっていなかったが、キットを変更するなどの対策により改善され、実験遂行の目途がたった。cDNA配列から蛋白合成する実験系を用いて、LCN2の鉄分子結合部位のアミノ酸配列を欠失もしくは変異させたタンパクを合成し、機能変化を観察する。LCN2の子宮内膜癌における機能が、徐々に明らかになってきており、分子標的として有望であると考えられる。当初の予定にあった、マイクロアレイ解析は、既に外部委託の準備が進行している。基本的に当初の研究計画の通りに遂行する。
ゼノマウス応用による歯科疾患受動免疫療法用ヒト型抗体の作製

受動免疫療法は、抗血清や精製抗体を用いて病原体の病原性を中和する方法である。歯周病が全身疾患の重要なリスク因子であることが明らかになりつつある現在、全身の健康維持を達成する医療の一つとして、歯周病の受動免疫療法の開発は重要と考えつぎの研究を行った。口腔領域の受動免疫に用いる標的抗原に関する研究として、P.gingivalisの赤血球凝集因子・共凝集因子の分子機能解析、S.sobrinus GTFsの活性機能部位の解析(グルカン結合部位、蔗糖結合部位)を行った。また、大量精製標品作製法の改良と開発について、浸透性電気泳動による大量精製法を開発した。受動免疫用ヒト型モノクローナル抗体は、1)EB virusを用いたヒトリンパ球不死化法、2)Xenomouseを用いた方法、3)Transchromomouseを用いた方法について検討し、これらを用いて作製した。さらに、マウスモノクローナル抗体産生細胞を用いたリコンビナントScFvを大量産生株に改良し、一方でニワトリ免疫による鶏卵IgY抗体の作製を行った。抗体産生能力が高く、より結合力の強い抗体産生株の選択は、本補助金で購入したBiaCore2000を用いて行った。各病原因子に対する中和能は、それぞれの標的抗原とした分子機能の中和をもって効力とした。本研究によって、ゼノマウスを用いて、P.gingivalisの赤血球凝集活性を抑制するヒト型モノクローナル抗体、S.sobrinus GTF-I、GTF-S認識抗体の作製にそれぞれ成功した。また、Transchromo mouseを用いて、P.gingivalis共凝集活性を抑制し、白血球貪食能を活性化するヒト型モノクローナル抗体の作製に成功した。さらに、P.gingivalisの赤血球凝集活性抑制作用をもつニワトリ鶏卵IgY抗体の作製に成功した。本年度は、口腔感染症(歯周病およびう蝕をターゲットとした)の制御に有用なヒト型モノクローナル抗体の作製を行った。1.P.gingivalisの赤血球凝集因子に対するヒト型抗体の作製:すでにクローニングを行い諸性質について解明した130 kDa hemagglutinin domain;130k-HMGDを大腸菌に発現させ、プレパラティブ電気泳動ゲルによって高度に精製した組換え標品を得た。これをヒト型抗体遺伝子トランスジェニックマウスに免疫(2週間)し、脾臓を採取し、ミエローマ細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を作製した。ELISAにより一次スクリーニングを行い、続けて、limited dilution法によって単一クローンを分離した。ELISAおよびWestern-blot解析により、抗原を認識するクローン19個を選択し、Low IgGウシ胎児血清を含む培養液にて培養を行った。これらのクローンは全て、P.gingivalis hemgglutinin domain認識抗体に特徴的な43,49 kDaバンドを認識していた。さらに、P.gingivalis vesicleの赤血球凝集活性の抑制実験を行った結旺、本活性を強く抑制する1クローンを得ることに成功した。このヒト型抗体は、P.gingivalis感染の歯周病制御に有用であると考えられる。2.Mutans Streptococciグルコシルトランスフェラーゼ(GTF)を抑制するヒト型抗体の作製:本菌には不溶性グルカンを産生するGTF-Iおよび、水溶性グルカンを産生する数種のGTF(GTF-3S,GTF-S6,GTF-4S))の存在が知られていることから、ヒト型抗体作製のために本菌の膜画分を抗原としてトランスジェニックマウスに免疫を行った。1.の実験と同様の手順でハイブリドーマを作製した結旺、抗原標品である膜画分を認識する