hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
歯周病原細菌刺激による細胞内クロストークがＷｎｔ５ａ発現に及ぼす影響

Wntは組織の分化・発生と深く関わっているタンパクとして知られている。近年、Wntは炎症の組織破壊において重要な役割を果たすことが報告された。そこで我々は、歯周炎の発症過程を解明する為にWnt5aに焦点をおき、P.gingivalis LPS誘導のWnt5a遺伝子の発現メカニズムを検討した。歯周炎はグラム陰性細菌感染による慢性炎症性疾患であり、支持組織の喪失と歯槽骨吸収を引き起こす。Wntは組織の分化・発生と深く関わっている糖タンパクとして基礎研究が発展してきた。近年、心臓血管疾患・リウマチ・敗血症などの研究において炎症性の組織破壊にもWntシグナルが重要な働きを担っていることが明らかとなった。過去に歯周炎とWnt5a遺伝子発現の関与について示した報告はなく、また単球におけるLPS誘導のWnt5a遺伝子発現の分子メカニズムについて報告したグループは少ない。我々はこれまでに歯周炎組織におけるWnt5a mRNA発現を示し、さらにヒト単球系細胞THP-1におけるP. gingivalis LPS刺激によりNF-κBシグナルを介してWnt5a mRNAが発現し、STAT1との相乗作用により増強することを報告した。P. gingivalis LPSはTLR2リガンドとして作用し、Wnt5a発現にはNF-κBの他MAPK・PI3Kなど多岐にわたる分子メカニズムが存在していることが考えられる。そこで本研究では、歯周病原細菌P. gingivalisによるWnt5a遺伝子の発現調節分子メカニズムを詳細に検討し、さらに発現されたWnt5aが他の歯周組織細胞にどのような影響を与えているのかを検討することにより、歯周炎疾患進行における新たな炎症メカニズムの解析を目指すことを目的とした。【目的】Wntは組織の分化・発生と深く関わっている糖タンパクとして知られている。近年、canonical Wntシグナルは間葉系幹細胞の骨芽細胞への分化を促進することが報告された。一方、non-canonical Wntシグナルは炎症の組織破壊において重要な役割を果たすことが知られている。そこで我々は組織の破壊と再生の双方を統合する分子としてWntシグナルに着目し、特に歯周炎の発症過程を解明する為にnon-canonicalシグナルを介するWnt5aに焦点をおいた。本研究ではヒト単球系細胞THP-1を用いてP.gingivalis LPS誘導のWnt5a遺伝子の発現メカニズムを検討する。P. gingivalis LPS刺激によるTLR下流のシグナル伝達は相互作用を行うことによりWnt5aを発現させるという仮説を立て、平成24年度の実験計画を以下のように提案した。2各阻害剤によりシグナル伝達を抑制し、P. gingivlais LPSにて刺激培養後、細胞内タンパク質を抽出する。ウエスタンブロッティングによりMyD88・TRAF6・IKKα/β・IκBαの細胞内タンパク量を測定、ソフトウェアを用いて定量し、その変化量を解析することにより、各シグナルがNF-κB経路に及ぼす影響を検討する。以上の実験から得られた結果を基にして、THP-1細胞におけるNF-κB経路と他のシグナル伝達経路とのクロストークを解析し、PI3K/Akt/mTORシグナルがNF-κB経路に影響をおよぼすことを示すことができた。さらに、得られた結果を取りまとめ近日中に学会発表を行う予定である。25年度が最終年度であるため、記入しない。Wnt5aはnon-canonical pathwayを刺激し、IL-6、IL-8、IL-1β、MIP-1βのような炎症性サイトカイン産生を増強する。Tリンパ球および単球/マクロファージ細胞表面上にはWnt5a受容体であるFz5およびROR2が発現していることが報告されており、細菌刺激により産生されたWnt5aやサイトカインはT細胞を含む単核球に作用すると考えられる。以上のことより、歯周炎局所で発現したWnt5aは単球/マクロファージおよびTリンパ球に作用し、炎症の持続や歯槽骨を含む組織破壊を誘発するという仮説を立てた。本研究では、歯周病原細菌刺激により産生されたWnt5aの歯周組織への影響について明らかにする為に、歯周組織構成細胞(単球/マクロファージ・Tリンパ球など)へのWnt5aの影響をサイトカイン産生の変化をELISA法およびReal-time RT-PCR法を用いて比較検討し、解析する。これにより、Wnt5aによるオートクライン/パラクラインの炎症関与経路を明らかとする。
尿中バイオマーカーによる糖尿病リスクプロファイリングと運動・栄養指導評価への応用

前糖尿病予備群の早期検出および生活変容のために、尿や乾燥濾紙血を試料とした新しい検査法を開発し、それを応用した運動・栄養指導法の開発を行った。その結果、尿中の遊離インスリン受容体α、レジスチンおよびインスリンは糖尿病患者で有意に高値を示し、尿中のこれらのバイオマーカーを組み合わせることにより、糖尿病リスクが推察できる様になった。また、運動と食物繊維を強化することにより、これらのバイオマーカーが改善されることを示した。前糖尿病者の発症を防ぎ、糖尿病予備軍を増加させないことが急務である。そのためには予備軍を早期に検出し、現状を認識させ、適切な運動・栄養指導により、生活を変容させ、発症を防ぐことが重要である。しかし、糖尿病の診断には採血や来院の必要があり、これらのことが検診率に影響し、予備軍の早期検出の障害となっていた。本研究は、家庭での採取が容易な尿を用いた新しい検査法(糖尿病リスク・プロファイリング法)を導入し、まず、1)糖尿病予備軍の積極的な検診への参加を促し、現状のリスクを認識させること、さらに2)運動・栄養指導により意識と行動の変容を促し、その効果を新しい検査法により評価し、指導にフィードバックさせること、そして3)生活の変容を定着させ、糖尿病の発症を予防することを目的とする。本年度は、血管障害性や炎症性に関与する尿中バイオマーカー(TNF-αやPAI-1、CRP)の高感度測定法を開発し、その糖尿病リスク指標としての有用性を検討した。その結果、CRPは糖尿病患者で有意に高値を示し、糖尿病の評価指標としての有効性が示された。そして、これまでのインスリンやsIRα、レジスチン、レプチンと合わせることにより、新しい糖尿病リスクアセスメントを行える見通しが得られた。また、ほんの最近、尿中アディポネクチンが糖尿病性腎症の早期診断マーカーになりうる可能性も示された。今後、さらに詳細な検討を行って行かなければならない。本研究は、家庭での採取が容易な尿を用いた新しい検査法(糖尿病リスク・プロファイリング法)を導入し、まず、1)糖尿病予備軍の積極的な検診への参加を促し、現状のリスクを認識させること、さらに2)運動・栄養指導により意識と行動の変容を促し、その効果を新しい検査法により評価し、指導にフィードバックさせること、そして3)生活の変容を定着させ、糖尿病の発症を予防することを目的とした。22年度は、21年度に引き続き、尿中アディポネクチン(AN)による糖尿病性腎症の早期診断法の開発を行った。その結果、1)尿中には血中と同じ高分子ANが存在していること、2)糖尿病患者では、血中濃度は健常者より低値を示していたにも係わらず、尿中濃度は有意に高値を示した。3)非糖尿病者でかつ微量蛋白尿出現以前であっても、eGFRが低値を示す場合は、尿中ANは有意に高値を示した。また、尿中ANは尿中アルブミンと有意に強く相関しており、これまで報告して来たレプチン、インスリン、遊離インスリン受容体、レジスチンなどとは異なる関係を示していた。これらの結果から、尿中ANの糖尿病性腎症の早期診断指標としての可能性は強く指示された。前糖尿病者の発症を防ぎ、糖尿病予備群を増加させないことが急務である。そのためには予備群を早期に検出し、現状を認識させ、その後の適切な運動・栄養指導により発症を防ぐことが重要である。そこで、報告者らは、家庭で自ら採取し提供できる尿や郵送可能な濾紙血を試料とした新しい検査法(数種類のバイオマーカー濃度を点数化した糖尿病リスク・プロファイリング法)を導入し、前病者の積極的な参加を促すユニークな糖尿病リスクの早期検出法を一部開発し、試験的に実践している。バイオマーカーの中で、特に、糖尿病リスク指標として、遊離インスリン受容体α、レジスチン、インスリン、レプチン及びアディポネクチンの尿中及び血液ろ紙中の測定の有効性を証明した。一方、血中のアディポネクチンは糖尿病患者で低下するにも関わらず、尿中アディポネクチンは有意に増加していた。そこで、健常者、肥満者および糖尿病患者の内、尿中にアルブミンが検出されない(微量アルブミン値も除く)対象者中の尿中アディポネクチンを測定した所、糖尿病患者尿中で有意に高値を示した。この尿中アディポネクチンは高分子重合体(500KD)であった。

さらに、推察糸球体濾過量(eGFR)が低値を示す対象者では、尿中/血中アディポネクチン比は、健常者の数十倍を示し、早期腎障害指標としての可能性も示唆された。まや、これらのことから、尿中アディポネクチンの増加は、単に糸球体の濾過障害に起因するとは考えがたく、アディポネクチンのこれまでの機能から考え、初期障害が起こった腎による糖尿病予防ホルモンとしてのアディポネクチン分泌の可能性も考えられる。
フラクタル磁性体のダイナミクス

パ-コレ-ション磁性体はフラクタル構造をとる典型物質である。希釈反強磁性体の相転移及び励起状態を、スピン間結合形態のフラクタル性の概念で新しい展開を試みることは重要かつ緊急の課題である。本研究では、パ-コレ-ション近点傍の希釈反強磁性体の動的性質の実験研究を,次の2点に焦点をしぼって、中性子散乱法及び磁化測定によって行なった。はじめに、パ-コレションネットワ-ク上において、混沌とした無秩序状態から秩序が形成されていく過程,また,その逆の過程を中性子散乱及び磁化の実時間測定によって観測することに初めて成功した(実験試料は希釈2次元イジング反強磁性体Rb_2Co_<0.6>Mg_<0.4>F_4)。この研究で,有限な大きさをもつミクロなドメインのサイズとマクロな磁化との間の関係式を、フラクタル格子の自己相似性を用いて導いた上で、磁化の時間変化の精密測定によってドメインサイズの時間変化則を詳細に検討した。ランダム磁場効果を利用して行なったこの研究により、秩序形成過程におけるパ-コレ-ション.クラスタ-のドメイン反転に伴うダイナミクスは熱活性化エネルギ-によって支配されることを明らかにした。次に、パ-コレ-ション点近傍のハイゼンベルグ磁性体における磁気集団励起を明らかにする目的で中性子非弾性散乱実験を行なった。RbMnF_3を非磁性Mg原子で希釈し、かつ、磁性原子濃度を系統的に変えた試料による中性子散乱エネルギ-スペクトルの波数依存性の群細な検討を行なった。これによって、希釈ハイゼルベルグ磁性体の長波長領域のスピン波は、短波長領域では過減衰型の振動に連続的に移行すること、さらにまた、中間波長領域では波長依存性のない局在モ-ドが新たに出現すること、等を見い出した。後者の新しい局在モ-ドの物理的起源については今ところ明らかではなく、さらに詳細な実験を継続中である。
モービルマッピングシステムに関する研究

本研究では、Mobie Mapping System(MMS)を用いた道路付帯設備管理の効率化や、次世代DRM(Digital Road Map)作成の効率化などMMSの応用利用を目的としている。研究最終年度である本年度は、以下に挙げる2点について研究を行なった。1.平成20年度に開発してきたDRM作成支援システムの改良を行なうことで、システム全体の完成度を高める。2.MMSにより取得される膨大な点群データの取り扱い手法の構築。まず1の次世代DRMデータ作成では、作成されたデータの信頼性が重要であることから、最終的には人手によるデータのチェックが必要となる。そこで、DRMデータをMMSの三次元計測点群上に重ねて、結果を確認、修正することが可能なツールの開発も行なった。これらにより、自動認識によるDRMデータ作成が困難な地域においても、簡単にデータ修正やDRMデータ作成を行なうことを可能にした。つぎにMMSはレーザスキャナにより1秒間に最大27500点の計測を行なうため、MMSを用いて1時間の計測を行なうと計測点数は1億点に上る。そのため、MMSのデータはそのままでは広範囲にわたる道路設備管理やDRMデータ生成のための計算コストが高く取り扱いが難しい。そこでMMSの膨大なデータを取り扱うため、MMSの点群データをラスター化すると同時に、高さ情報を1[mm]の分解能でラスターデータに埋め込むことによって、MMSの特徴である高精度な高さ情報を付加したオルソ画像を自動生成する機能の開発を行った。これによりMMSのデータの取り扱いが容易となり、さらに高さ情報を持つオルソ画像を用いることで、従来の道路管理台帳付図の図郭間の歪みや航空オルソ画像の歪みを修正することが可能となった。2008年度は,次世代高度交通システム(ITS)における高効率な道路管理手法の構築を目的とし,モービルマッピングシステム(MMS)を用いた道路周辺情報収集および収集した情報をGISへ登録する機能の構築および,デジタル道路地図(DRM)の更新頻度を高めるため情報収集・整理の効率化に関する研究を行った.道路管理において本年度は,道路舗装面,トンネル,堤防を対象とし機能の作成を行った.具体的には,MMSにより取得された,高精度高密度三次元点群情報および画像情報から,トンネル壁面の性状図作成アルゴリズムの構築および,路面平坦性,わだち掘れ量といった路面性状の自動算出を行い,路面状況に応じて,GISに時系列的に自動で登録する手法の構築を行った.これにより,管理者が簡単に道路状況を確認することを可能にした.また,構築した手法の有効性を確認するため,従来手法との比較試験を行った.その結果,計測精度は劣らないことを確認し,計測時間は,より短時間で計測することが可能であることを確認した.さらにDRMデータ収集・整理では,停止線,横断歩道の自動認識,および車線ごとの中心線の自動算出アルゴリズムの開発を行い,さらに車線中心線から直線,円弧,クロソイド曲線で構成される道路線形を作成するアルゴリズムの検討を行った.これにより,DRMデータ収集・整備の効率化への見通しを得た.これらの結果を受け,2009年度においては,性能評価試験を広範囲に行い,ロバスト性の向上を目指し,さらに問題点の洗い出しを行い,上記技術を確立することを目指す.本研究では、Mobie Mapping System(MMS)を用いた道路付帯設備管理の効率化や、次世代DRM(Digital Road Map)作成の効率化などMMSの応用利用を目的としている。
悪性中皮腫に対する新規治療分子標的の探索と診断マーカーの開発

悪性中皮腫の特徴的な遺伝子異常を同定するために網羅的なゲノム解析を行った。従来報告されている異常に加え、複数の新規の染色体・遺伝子異常を明らかにした。JUNやYAP遺伝子は中皮腫における重要ながん遺伝子であること、また染色体16番に新たながん抑制遺伝子が存在する可能性が示唆された。PTEN遺伝子は一部の中皮腫で不活化しており、細胞レベルにおいてがん抑制効果を確認した。本研究成果は悪性中皮腫の新規治療法や診断マーカーの開発への大きな基盤になるものと考えられた。中皮腫の腫瘍組織、細胞株を用い、アレイCGH法にて網羅的ゲノム解析を行った。22名の中皮腫患者由来の17腫瘍組織と9株の細胞株を解析し、2304個のBAC/PACクローンがスポットされたアレイを使用した。20%以上の中皮腫に検出された増幅領域は1q、5p、7p、8q24、20pであった。同様に欠失領域は1p36.33、1p36.1、1p21.3、3p21.3、4q22、4q34-qter、6q25、9p21.3、10p、13q33.2、14q32.13、18q、22qであった。1p32.1と11q22領域は、頻度は少なかったものの複数の中皮腫で高度増幅を示した。1p32.1領域には原がん遺伝子JUNが局在していることを明らかにし、JUNの遺伝子増幅をサザンプロット法にて確認し、さらにリアルタイムRT-PCR法にて遺伝子過剰発現が起きていることを明らかにした。中皮腫におけるJUNの遺伝子増幅は報告がなく、今回の研究にてJUNの関与が中皮腫発生に深く関与していることが示唆された。一方、9p21.3領域欠失は最も高頻度に検出されたゲノム異常であり、P16INK4a/pI4ARF遺伝子が局在している領域であった。検討した中皮腫細胞株のほぼ全例でP16INK4a/p14ARF遺伝子のホモザイガス欠失が検出され、その欠失領域は480kb程度のものから4Mbを超えるものも明らかにされた。同様に22q欠失とNF2腫瘍抑制遺伝子の高頻度不活性化も確認された。アレイCGH解析法により、今までに明らかとなっていなかった中皮腫の染色体異常領域が複数検出され、これらの領域に新たな中皮腫発がん関連遺伝子の存在が強く示唆された。悪性中皮腫細胞株15例から抽出したゲノムDNAを用いてアジレント社製244Kアレイで網羅的ゲノム解析を行った。昨年度行った2304個のBAC/PACクローンアレイに比し染色体の増幅および欠失領域をさらに高解像度に検出することが可能であった。新規のホモザイガス欠失領域として染色体13q12、14q22、16q13領域が同定された。特に13q12領域、16q13領域の欠失に関してはそれぞれ3株、4株の複数の細胞株で欠失が認められ、これらの欠失領域内に悪性中皮腫に関わる新規腫瘍抑制遺伝子が存在していることが強く示唆された。同時にアジレント社の44Kアレイで網羅的遺伝子発現解析を行ったが、これらの欠失領域内に存在する遺伝子群の中で発現が著しく低下している遺伝子が複数個明らかにされた。一方、昨年度明らかにした、2例の中皮腫腫瘍組織における染色体11q22の高度増幅領域について詳細に検討を行った。染色体増幅領域は最大3Mbであったため7個のプライマーセットを作成して定量的ゲノムPCR法にて検討したところ最も共通して高度増幅している領域は約1Mbの範囲であった。さらに、その領域内に存在する複数の遺伝子について定量RT-PCR法にて発現解析を行ったところ、YAP1遺伝子とBARC2遺伝子が共通して高発現しており中皮腫における11q22増幅領域の標的遺伝子である可能性が強く示唆された。また染色体10q23領域に存在する腫瘍抑制遺伝子PTENを解析したところ2例の中皮腫細胞株でホモザイガス欠失が存在していることを明らかにした。PCR法にて切断点のクローニングを試み、ホモザイガス欠失領域サイズは7.7kbおよび39.4kbであることを明らかにした。昨年度、アジレント社製244Kアレイで同定した悪性中皮腫細胞株の16p13ホモザイガス欠失領域についてさらに検討を加えた。ホモザイガス欠失領域内にMMTS1遺伝子(仮称)を同定し、予想アミノ酸配列がRNA結合モチーフを有していることを明らかにした。PCR法にて詳細に検討したところ、MMTS1遺伝子のエクソン3は4つの中皮腫細胞株において欠失し、欠失領域は互いにオーバーラップすることを確認した。

11q22増幅領域で同定されたYAP遺伝子を中皮腫細胞株でshRNAを用いてノックダウンしたところ、中皮腫細胞の増殖が抑制された。さらにYAP蛋白が制御を受ける、Hippoシグナル伝達経路の上流に位置するNF2(マーリン)を中皮腫細胞に導入したところ、YAPはリン酸化され、核内から核外に局在が変化し転写コアクチベーターとして不活化されることを明らかにした。YAP遺伝子が中皮腫細胞にとってがん遺伝子機能を有することを明らかにし、YAPを制御することが中皮腫に対する新たな分子標的治療法になりうる可能性が示唆された。また、中皮腫において染色体転座による遺伝子異常の有無を解明するためにFISH法を用いて肉腫等の固形癌で報告されている領域の染色体の解析を行った。さらに、アフィメトリックス社のDNAマイクロアレイを用い、中皮腫細胞株において発現異常を来している遺伝子を網羅的に解析した。中皮腫において発現異常が既に報告されている遺伝子の他に、共通して発現が亢進・低下している新規遺伝子を複数個同定し、新規のがん遺伝子・がん抑制遺伝子候補を明らかにした。
難治性慢性閉塞性肺疾患に対する肺再生治療法の開発

基礎実験として、GFPで標識した間葉系細胞を使用し、その細胞を全身麻酔したマウスに気管内投与し、肺の標本を凍結切片で作成し、蛍光顕微鏡で観察を行い、GFPで標識された細胞は、肺胞内に確認ができた。その後、肺のprogenitor cellと考えられているSca1陽性細胞をin vitroで培養し、肺気腫疾患モデルマウスであるSP-Dノックアウト(KO)マウスに対して、細胞移入を行った。その際、SP-D KOマウスに対しては、ガンマセルを用いて放射線照射を行い、その6時間後に細胞移入を行い、14日後、1ヶ月後に肺組織からRNA抽出後、遺伝子レベルでのSP-Dの発現を検討した。しかし、SP-D発現は認められなかった。そこで、ナフタレンによる肺胞上皮障害モデルを使用して、Sca1陽性細胞の移入を行い、同様の検討を行ったが、SP-Dの発現は認められなかった。同様に、umbilical cord mesenchymal stemcell(uMSC)を用いて検討を行ったが、SP-Dの発現は認められなかった。同時にSP-D KOマウスにナフタレンによる肺胞上皮障害モデルを作成し同様に細胞移入を行ったが、SP-Dの遺伝子レベルで発現は認められなかった。以上より、細胞移入によって肺組織のSP-Dの発現が見られなかったが、これらは気管内投与により肺胞内に細胞を移入することはできるが、肺内への生着が難しいことを示していると考え、次の段階として、移入細胞を介して産生されるサイトカインなどが肺胞構造を改善させる可能性を考え、HGFを気管内投与を行って、その後、uMSC細胞の移入を行い、SP-D遺伝子発現の検討を行ったが、遺伝子レベルでの発現は認められなかった。iPS細胞からの肺内の構成細胞への分化や肺組織から肺細胞を分離したのち培養を行い、それらを細胞移植を行う方法を検討中であった。
肝癌細胞-肝星細胞間のがん間質相互作用におけるADAMの役割と分子機構の解明

肝の線維化には、肝星細胞(hepatic stellate cell : HSC)が重要な役割を担っている。HSCは正常肝ではvitamin Aを貯蔵し、静止期と呼ばれる状態にある。肝臓に肝炎ウイルスやアルコールによる慢性的な障害が加わると、肝細胞、Kupffer細胞、リンパ球、類洞内皮といった周囲の細胞から分泌されるサイトカインの影響を受け、形質転換を起こし、増殖能の亢進や細胞外マトリックスを過剰発現する活性化した状態になる。また、活性化したHSC自体も様々なサイトカインを分泌し、オートクライン・パラクラインに肝臓の炎症および線維化を増悪させる。当該研究課題では、ADAM(A disintegrin metaloprotenase)familyのknock-down inducible cloneによる同所移植モデルを用いて、肝癌細胞-活性型肝星細胞間の「がん-間質相互作用」におけるADAM familyの役割についてin vivoで解析を試みた。テトラサイクリン添加時にADAM family(ADAM17)をknockdownすることが可能な、ヒト肝癌細胞(Tet-kADAM-HepG2)、ヒト活性型星細胞(Tet-kADAM-LI-90)の作製を試みた。当所,knockdown効率が不良でvectorの種類をInvitrogenからClonetechに変更して効率の良いクローンを選択した.Tet-kADAM-LI-90およびTet-kADAM-HepG2と親株であるLI-90/HepG2の相互co cultureでは,がん間質相互作用による,細胞運動能,増殖能の低下が確認された.ADAM17は肝癌-肝星細胞間の相互作用に重要な役割を果たし,分子標的治療薬のターゲットに成り得ることが示された.肝の線維化には、肝星細胞(hepatic stellate cell : HSC)が重要な役割を担っている。当所,knockdown効率が不良でvectorの種類をInvitrogenからClonetechに変更して効率の良いクローンを選択した.Tet-kADAM-LI-90およびTet-kADAM-HepG2と親株であるLI-90/HepG2の相互co cultureでは,がん間質相互作用による,細胞運動能,増殖能の低下が確認された.ADAM17は肝癌-肝星細胞間の相互作用に重要な役割を果たし,分子標的治療薬のターゲットに成り得ることが示された.本邦における肝炎ウイルスの汚染率は高く、肝炎・肝硬変などの肝線維症を経て肝癌を発症する例が多く、大きな社会的問題となっている。肝の線維化には、肝星細胞(hepatic stellate cell:HSC)が重要な役割を担っている。当該研究課題では、ADAM (A disintegrin metaloprotenase) familyのknock-down inducible cloneによる同所移植モデルを用いて、肝癌細胞-活性型肝星細胞間の「がん一間質相互作用」におけるADAM familyの役割についてin vivoで解析したい。本年度は以下の研究成果を得た.次年度以降は,これをdouble transfectした制御系を樹立する.当該年度での論文の作成結果の公表予定はなかった.本邦における肝炎ウイルスの汚染率は高く、肝炎・肝硬変などの肝線維症を経て肝癌を発症する例が多く、大きな社会的問題となっている。HSCは正常肝ではVitarnin Aを貯蔵し、静止期と呼ばれる状態にある。

当該研究課題では、ADAM (A disintegrin metaloprotenase) familyのknock-down inducible cloneによる同所移植モデルを用いて、肝癌細胞-活性型肝星細胞間の「がん-間質相互作用」におけるADAM familyの役割についてin vivoで解析したい。本年度は以下の研究成果を得た.ADAM17は肝癌-肝星細胞間の相互作用に重要な役割を果たし,分子標的治療薬のターゲットに成り得ることが示された.本邦における肝炎ウイルスの汚染率は高く、肝炎・肝硬変などの肝線維症を経て肝癌を発症する例が多く、大きな社会的問題となっている。肝の線維化には、肝星細胞(hepatic stellate cell : HSC)が重要な役割を担っている。HSCは正常肝ではvitamin Aを貯蔵し、静止期と呼ばれる状態にある。肝臓に肝炎ウイルスやアルコールによる慢性的な障害が加わると、肝細胞、Kupffer細胞、リンパ球、類洞内皮といった周囲の細胞から分泌されるサイトカインの影響を受け、形質転換を起こし、増殖能の亢進や細胞外マトリックスを過剰発現する活性化した状態になる。また、活性化したHSC自体も様々なサイトカインを分泌し、オートクライン・パラクラインに肝臓の炎症および線維化を増悪させる。3年間の研究成果で以下の研究成果を得た.ADAM17は肝癌-肝星細胞間の相互作用に重要な役割を果たし,分子標的治療薬のターゲットに成り得ることが示された.
甲虫の武器進化に関わる遺伝子の生態発生学的研究

性選択が角や大顎のような武器形質の進化の原動力にあることがわかってきた一方で"どのような遺伝子が武器形態の進化に関わっているのか"という形態発生や遺伝的メカニズムはブラックボックスのままである.本研究ではオオツノコクヌストモドキという甲虫を用いてオス特異的な大顎の巨大化や角の形成のメカニズムを探っている.高速シーケンサーによるmRNAの配列の決定およびRNAiによる遺伝子ノックダウンによって,広い生物群で栄養条件を形態形質に変換するインスリン経路や,細胞のレベルで遺伝子発現を調節するエピジェネティック因子の重要性が示唆されている.性選択が角や大顎のような武器形質の進化の原動力にあることがわかってきた一方で"どのような遺伝子が武器形態の進化に関わっているのか"という形態発生や遺伝的メカニズムはブラックボックスのままである.本研究ではオオツノコクヌストモドキという甲虫を用いてオス特異的な大顎の巨大化や角の形成のメカニズムを探っている.高速シーケンサーによるmRNAの配列の決定およびRNAiによる遺伝子ノックダウンによって,広い生物群で栄養条件を形態形質に変換するインスリン経路や,細胞のレベルで遺伝子発現を調節するエピジェネティック因子の重要性が示唆されている.これまでの研究で,幼虫から前蛹期に至る形態発生スケジュールがわかり,幼虫を単独飼育後4-8日齢の個体を用いてRNAseqを行い,武器遺伝子や形態形成遺伝子の発現プロファイルを取得する準備が整った.比較にはオス,メス,幼虫,前蛹の数ステージを予定している.また,予備実験により本種ではRNAi(RNA干渉)が有効であることを確認しており,候補遺伝子のRNAiによるノックダウンが可能となっている.また, DNAメチル化やヒストン修飾を薬理的に阻害することで,武器形質や変態過程への影響があることがわかってきた.特にメチル化の阻害では蛹になるタイミングが大きく影響をうけることが明らかになり,変態過程とDNAメチル化の関連性が示唆されている.幼虫,前蛹1日目,2日目において頭部で発現している(=頭部の成虫形態の形成に関わる)遺伝子群を特定するため,高速シーケンサーによるトランスクリプトームが進んでいる.現在までに約15万コンティグを得ており,主要なmRNAの配列が明らかになっている.この情報を利用し,RNAiによる形態形成関連遺伝子のノックダウン実験を行ったところ,複数のエピジェネテック因子のノックダウンによって大顎や頬の張り出しのサイズが増大・縮小することが明らかになった.これらは,去年の報告の薬理的作用ともおおむね整合性があり,エピジェネテック因子が武器サイズ可塑性に関連していることがわかってきた.また,既知因子(IISなどの成長因子)においても武器サイズへの明瞭な影響が見られており,本種の分子発生学的操作実験系が,生態発生学的解析に非常に有効であることが確認された.これらの結果は国内外の学会ですでに発表を行っており,現在国際誌への投稿を準備している段階である.上記に加え,共同研究として展開している昆虫の武器形質進化について数報の論文を発表している.これまで予定していた,幼虫から前蛹期に至る形態発生スケジュールを決定することができ, RNAseqによる武器遺伝子や形態形成遺伝子の発現プロファイルを取得する準備が整った点で順調に準備が進んでいる.また,本種でのRNAi(RNA干渉)の有効性を確認できたことで,候補遺伝子のRNAiによるノックダウンによる機能検証に道が開けた.さらに,DNAメチル化やヒストン修飾を薬理的に阻害することで,武器形質や変態過程への影響があることがわかってきたことから,本種の武器サイズや変態にゲノムレベルでのエピジェネティック機構の関与が暗示されており,過去になかった視点から武器形質や変態現象に迫ることができている.25年度が最終年度であるため、記入しない。これまで明らかにした幼虫から前蛹期に至る形態発生スケジュールを利用して,実際にRNAseqを行い,武器遺伝子や形態形成遺伝子の発現プロファイルを取得する.比較にはオス,メス,幼虫,前蛹の数ステージを用いる.またシーケンサは初期段階ではMiSeqでの長い配列の解読とつなぎ合わせ,発現比較段階ではGAIIを用いた,短い配列の発現レベル比較用のデータを取得し,効率的に手順を進める予定である.さらに,これまでに本種ではRNAi(RNA干渉)が有効であることを確認している.そこで,武器形成を司る候補遺伝子についてRNAiによるノックダウンを行い,表現型への影響を検証する.また, DNAメチル化やヒストン修飾を薬理的に阻害することで,武器形質や変態過程への影響があることがわかってきた.こうした因子が武器形質の発生過程に影響を与えていることが示唆されるため,DNAメチル化のレベルについてRNA-seqやbisulphate sequence法などを用いて明らかにする.これまでに変態過程や成長,細胞増殖に関わる因子の関与が先行研究から示唆されており,こうした因子の詳細な特定が進むとともに,新規の武器形成遺伝子,因子を特定できると考えている.25年度が最終年度であるため、記入しない。
ボツリヌス神経毒素による新しいGTP結合蛋白の発見とその生理機能の解析

我々は、ボツリヌス毒素中のADPリボシル化酵素が分子量21kの細胞蛋白質を特異的に修飾することを見出し、昨年度の本研究で気質蛋白を均一にまで精製、これがGTP結合蛋白質であることを見出した。本年度はこれらの成果を受け以下の研究を行った。1.ADPリボシル化基質蛋白質(Gb)のcDNAクロ-ニングとADPリボシル化部位の決定精製蛋白質の部分アミノ酸配列をもとに基質蛋白(Gb)のcDNAクロ-ニングを行い、これが193個のアミノ酸より成る分子量21,770の蛋白であることを明らかにした。また、配列の相同性よりこれがrhoA遺伝子の産物であることが明らかとなった。また、〔^<32>p〕NADによって修飾したGbを解析した結果、ボツリヌス毒素によるADPリボシル化がこの蛋白のアミノ末端より41番目に位置するアスパラギン残基に起っていることが明らかとなった。結合の安定性よりADPリボ-スはアスパラギン残基とN-グリコシド結合を成しているものと考えられる。2.ボツリヌス毒素中のADPリボシル化酵素の分離・同定C型ボツリヌス菌は、C_1,C_2という毒素成分とC_3という酵素成分を産生する。このうち、C_1毒素とC_3酵素は同様のADPリボシル化酵素活性を示すことよりその異同が問題となっていた。そこで我々は、これら各々に対する抗体を開発し、これを用いてC_1毒素中の酵素活性について検討した。この結果、C_1毒素中の酵素活性は毒素標品中に微量に含まれるC_3様蛋白によるものであること、これは主たる毒素成分より分離できるものであることを明らかにした。
中小企業経営者による戦略形成とビジョン伝達方略の地域間比較分析

研究目的は、リーマンショックを契機とした戦略の転換と経営者の表象、経営者のビジョン伝達方略との関係を明らかにすることである。新潟県燕・三条地区では、戦略を継承していることが確認できた。長野県諏訪地方では、戦略を転換する企業が6社中5社存在した。転換企業では経営者の表象は多い。また、表象がアナロジーで利用され新たな戦略形成に利用されている。取引先や従業員から提供される情報も利用されていた。従業員へのコミュニケーションでは、長野県諏訪地方では、表象が話の中で積極的に利用され、またその場が多く設けられていた。逆に仕事の話が朝礼で話されるにとどまることが多いのが新潟県燕・三条地区であった。平成26年度研究では、新潟県燕市及び三条市のモノづくり中小企業9社と関東地区に立地するモノづくり中小企業2社の調査を行った。夏季と春季に集中的に調査を実施し、その違いを明らかにしている。対象企業選定は、経済産業省が選定する『元気なモノづくり企業300社』によっている。調査項目は、基本的な戦略、その戦略の基になる支配的論理、そしてコミュニケーション方法である。新潟の燕市と三条市のモノづくり中小企業9社についてインタビュー調査を行い、2つの仮説について検証している。新潟の調査結果について概要をまとめる。関東圏は2社のため追加した調査を行い検討する予定である。新潟県の燕市及び三条市の金属加工産業は長い歴史を持ち、独自の特徴を持つ産業に発展してきた。共通する第1の特徴は摺り合わせ技術の蓄積を進め、それを基礎とする製品開発・製造を行ってきた点である。製品は変化していても、その基礎となる技能は摺り合わせの技能を中心としていた。第2の特徴は、部品製造ではなく、完成品の製造が中心になっている点である。しかも対象市場は隙間市場であった。つまり独自の製品を持つ点が共通する特徴であった。第3の特徴は、地域経済への自社の影響を強く意識している点である。企業の社会的責任といってもよい。対象企業はリーマンショックでも解雇を行なっていない。また、障害者雇用にも積極的に取り組んでいる。第4の特徴は、海外への事業展開、特に製造拠点の移転は考えていない点があげられる。第5の特徴は、積極的に新製品の開発、もしくは独自技術の用途開発を進めている点が挙げられる。それによって積極的に市場の変化に対応している。支配的論理について、アナロジーが用いられ戦略の形成がされている点が9社について検証できた。また、コミュニケーション方法については、戦略の形成と実行に適する方法が形成されている事実が明らかにされている。平成27年度の研究では、長野県諏訪地方の6社と下伊那地方の2社のモノづくり中小企業の調査を行った。夏季と春季の休み期間に集中的に調査を行った。対象企業の選定は、経済産業省が選定する『元気なモノづくり中小企業300社』2008年版に選定されている企業である。今年度の調査にあたり、作業仮説を3つ設定している。いずれも、従来の研究成果に基づき検討した仮説である。第1の仮説は、経営者は自身の価値観と経験から支配的論理を形成する。第2の仮説は、支配的論理の利用では、アナロジーを利用して戦略を導き出している。第3の仮説は、支配的論理は、従業員へのコミュニケーションでも利用される。インタビュー調査から明らかになったのは以下の点である。第1に、第1の仮説に関して、経営者の経験から生まれていることが明らかになった。さらに、経営者もしくはそれに準ずる期間の長さに伴って、支配的論理の数と質は異なることが明らかになった。次に、第2の仮説である支配的論理について、アナロジー推論を利用して戦略が導き出されていた点が明らかになった。さらに、それぞれの経営者のアナロジー推論による支配的論理の利用には違いが存在していた。第3の仮説である支配的論理のコミュニケーションでの利用については、全ての方法がその支配的論理から生まれていることは確認できないが、一定の関係性があることは確認できた。その語られる内容について、確認することは困難である。しかし、コミュニケーションの方法の中に、計画形成におけるコミュニケーションの形態も含めて検討することが考えられる。支配的論理と計画形成上のコミュニケーション方法についてはインタビュー調査から確認することが可能である。以上、3つの仮説について、調査から検証できたのは第1と第2の仮説であった。しかし、3番目の仮説は十分な検証ができなかった。調査を予定通り進めることができた。また、背景となる理論的研究についても集中的に海外ジャーナルを中心に検討を行うことができた。本年度は、前年度の3月までの調査成果の整理と、先行研究の検討を合わせて実施した。特に、先行研究で中心的に検討されてきたのが、推論(reasoning)と表象(representation)である。この2つの先行研究を改めて検討している。まず、推論の研究では3者の理論を検討し、以下の3点に整理できた。第1に、アナロジーによる推論が新たな戦略を導出する有効な方法として理解できる。第2に、戦略を立案する担当者の価値観と直面する問題が推論に強く反映される。このことで、担当者の判断でアナロジーによる推論利用の際の対応付けが、大きく規定されている。

第3に、アナロジーだけでなく、アブダクションによる推論も組み合わせて利用されている。組み合わせることで、現状から飛躍する、新たな戦略立案が可能になる。従来の研究では、アナロジーによる推論が取り上げられてきたが、そのアナロジーを利用するだけでなく、実際にはアブダクションも利用されている。以上が明らかになった。課題としては、第1にアブダクションの重要性は指摘できるが、その具体的内容は明らかになっていない。戦略立案で具体的にどのように利用されているのかの分析の必要がある。第2に、アナロジーによる推論では表象の機能の認識が十分ではなかった点である。表象が推論で果たす機能の分析が必要である。次に、表象の先行研究では、3者の研究から以下2点が明らかになった。第1に、表象が認知活動において積極的な機能を果たしている。第2に、表象の形成プロセスでは、アナロジーによる推論と代理学習が重要な役割を果たしている。つまり表象形成が、戦略立案者を中心とした学習プロセスによって実現されている。そして、アナロジーによる推論は、その学習プロセスの1プロセスである。しかし、今後の課題として、表象形成プロセスの具体的状況分析が十分ではない点が指摘できる。昨年度夏季に、体調を崩し予定していた補足調査の実施ができなかったため、先行研究の理論的な分析枠組みの検討だけしかできなかった。そのため、先行研究に基づいた新たな仮説を利用した補足調査を実施できず、最終的な研究成果の取りまとめをできずに終わってしまった。課題に対応し地域間比較の対象地域として新潟県燕三条地域と長野県諏訪地域を選択した。この2地域は古くから中小企業が集積する地域であり2008年に発生したリーマンショックの影響を受けていた。具体的な研究目的は、リーマンショックを契機にした戦略形成と経営者の表象との因果関係、経営者の表象とビジョン伝達方略との因果関係を明らかにすることであった。認知的分析の先行研究から以下の作業仮説を導き出している。(1)経営者は自身の価値観と経験から表象を形成する。(2)表象を利用して戦略を導き出す。(3)表象は従業員へのコミュニケーションで利用される。以上の仮説を検証するために両地域の中小企業経営者にインタビュー調査を行い、聞き取りを行った。聞き取り結果から、戦略を大きく転換した企業と従来の戦略を継承・強化する企業が確認できた。この点は両地域とも共通し、地域間での相違は特に確認できなかった。戦略を大きく転換している企業では、経営者の表象は多くなっている。例外は若い経営者の場合であった。表象は積極的に利用され、新たな戦略形成に利用されている。多くの場合、表象が組み合わされて利用されていた。また、従業員へのコミュニケーションでは、表象は話の中で利用され、経営者の考えを伝える上で利用されていた。従来の戦略を継承・強化している企業では経営者の表象は少ない。戦略については従来の戦略を強化するのに留まり、表象利用は部分的であった。コミュニケーションでの利用はなく、その場も限られていた。
内因性神経活性物質の研究ー成果のとりまとめ

昭和60年度より62年度まで3年間にわたり特定研究「内因性神経活性物質の研究」が約60名の班員により精力的に進められ、多くの新しい知見を得、その領域の研究の進歩にかなりの貢献をすることが出来た。本年度はその成果のとりまとめの年にあたり、総括班で慎重に検討した結果我々が見出した新しい知見をこの領域の研究者に広く知らせることが我々の社会的責任であるとの結論になった。そこで各班の班長の方と相談し、各研究領域の代表的研究者26名の執筆を得ることとなった。そして「内因性神経活性物質」と題した300頁あまりの本が出来上った。本書は1.神経活性物質とその作用2.神経活性物質の存在と生成3.神経活性物質の受容体とその活性化反応4.脳機能およびその異常と活性物質の4章からなる。内容はこの3年間に得られた新知見とともにこの領域に関心を持つ多くの人達に容易に理解できるよう総説的な面も含めた。出来上った本書を広く配布し、この領域での我国の多くの研究者に役立ち、この領域の研究を促進することが出来ればと期待している。
ポリアミン代謝に着目した子宮頸癌癌幹細胞の放射線抵抗性機序の解明

放射線や抗癌剤に抵抗性をもち、かつ造腫瘍性をもつ、癌細胞のうちの小集団「癌幹細胞」を撲滅する方法は癌治療に有効であると考えられる。しかしながら現在のところ癌幹細胞を標的とした有効な治療法は確立されていない。我々の研究グループではこれまでに子宮頸癌の癌幹細胞を同定し、それが放射線耐性をもつことを報告している。さらに我々は癌幹細胞と非癌幹細胞を比較するとポリアミン代謝に違いがあることを今回我々は突き止めている。本研究では、癌幹細胞と非癌幹細胞におけるポリアミン代謝の違いが、どのように癌幹細胞が治療抵抗性を発揮するのかを明らかにし、このポリアミン代謝関連分子を標的とした革新的な放射線増感剤の創薬を目指すことを目的としている。今年度は癌幹細胞と非癌幹細胞についてのマイクロアレイを用いた遺伝子発現の違いを確認し、いくつかの癌幹細胞特有の遺伝子に注目することにした。まず、ID1遺伝子について注目した。ID1は癌幹細胞に特異的に発現が高く、細胞株にポリアミンを暴露させることでもID1の発現亢進がみられた。ID1の発現が高いと若干の放射線抵抗性を示すことがわかった。ID1について解析を行うと、細胞内のポリアミン濃度が高いことで、ヒストン脱メチル化酵素であるLSD1を阻害し、ID1遺伝子プロモーター領域でのヒストンH3K4のメチル化を亢進させ、ID1の遺伝子発現促進に寄与していることが明らかとなった。以上を論文化して2018年にアクセプトされた。Tamari K et al. Polyamineflux suppresses histone lysinedemethylases and enhances ID1 expression in cancer stemcells. Cell Death Discov. 2018Nov 13;4:104.放射線や抗癌剤に抵抗性をもち、かつ造腫瘍性をもつ、癌細胞のうちの小集団「癌幹細胞」を撲滅する方法は癌治療に有効であると考えられる。平成28年度にポリアミン代謝の癌幹細胞における役割の解明と放射線抵抗性への寄与を明らかにし、平成29年度以降にはポリアミン代謝阻害が癌幹細胞や放射線抵抗性へどのように影響するかを明らかにすることを目標としている。今年度、我々はまず、癌細胞にODCを過剰発現させることで細胞内をポリアミン過剰にし、clonogenic survival assayを行い、ODC過剰発現株が親株より放射線抵抗性であるかを確認しようとしたが、ODCの強制発現株の作成に難渋した。具体的には、細胞株に遺伝子を導入し、薬剤選択を行なってもODC強制発現株がえられない。現在のところは、方針をかえ、ODCのノックダウンをして、細胞の放射線感受性が変化するかを調べたいと考えている。ODCの強制発現株の作成に難渋してしまったことで、予定していた研究ができていない。今年度は前年度にODCの強制発現株の作成に難渋したため、逆にODCのノックダウンをして、細胞の放射線感受性が変化するかを調べたいと考えたが、ODCの発現をノックダウンすることはとても細胞毒性が強く、これについても難渋することとなった。他には癌幹細胞と非癌幹細胞についてのマイクロアレイを用いた遺伝子発現の違いを確認し、いくつかの癌幹細胞特有の遺伝子に注目することにした。また、別に放射線耐性株と元の親株のマイクロアレイを用いた遺伝子発現の違いを確認するための外注検査に提出した。当初はODCの発現の上昇、低下が放射線耐性に関わると予想していたが、細胞株を用いてODCの恒常的な遺伝子発現制御をすることがとても難しかった。現在は方針を変えて、マイクロアレイを用いた癌幹細胞と放射線耐性に共通したメカニズムを解明することとした。

我々の研究グループではこれまでに子宮頸癌の癌幹細胞を同定し、それが放射線耐性をもつことを報告している。さらに我々は癌幹細胞と非癌幹細胞を比較するとポリアミン代謝に違いがあることを今回我々は突き止めている。本研究では、癌幹細胞と非癌幹細胞におけるポリアミン代謝の違いが、どのように癌幹細胞が治療抵抗性を発揮するのかを明らかにし、このポリアミン代謝関連分子を標的とした革新的な放射線増感剤の創薬を目指すことを目的としている。今年度は癌幹細胞と非癌幹細胞についてのマイクロアレイを用いた遺伝子発現の違いを確認し、いくつかの癌幹細胞特有の遺伝子に注目することにした。まず、ID1遺伝子について注目した。ID1は癌幹細胞に特異的に発現が高く、細胞株にポリアミンを暴露させることでもID1の発現亢進がみられた。ID1の発現が高いと若干の放射線抵抗性を示すことがわかった。ID1について解析を行うと、細胞内のポリアミン濃度が高いことで、ヒストン脱メチル化酵素であるLSD1を阻害し、ID1遺伝子プロモーター領域でのヒストンH3K4のメチル化を亢進させ、ID1の遺伝子発現促進に寄与していることが明らかとなった。以上を論文化して2018年にアクセプトされた。Tamari K et al. Polyamineflux suppresses histone lysinedemethylases and enhances ID1 expression in cancer stemcells. Cell Death Discov. 2018Nov 13;4:104.ODCのノックダウンを行うことで、放射線感受性に変化があるかを調べていくことにしている。今後は癌幹細胞と放射線耐性細胞株に共通した遺伝子の動きを解析し、ポリアミン代謝との関連について深く調べていきたいと考えている。実験が予定通りに進まず、予定していた消耗品の購入を来年度に延期することが適切と判断した。癌幹細胞と放射線耐性細胞の遺伝子発現をマイクロアレイ解析で分析し、ポリアミン代謝関連酵素等の過剰発現実験やノックダウン実験を予定している。このため、次年度に試薬の消耗品費を多く計上した方が研究がスムーズにいくと考えた。
卵巣癌の腫瘍幹細胞に発現する分子を標的にした新たな癌分子治療の確立に関する検討

我々は卵巣癌幹細胞に発現する分子を解析し、より卵巣癌幹細胞に特異な分子を見出し、これを標的とした新しい選択的がん治療法を確立すれば期待できる治療成績を得ることが出来るのではという考えから検討を行った。まず細胞周期の休止期GO期を検出する方法にて、癌幹細胞のGO期の細胞では抗癌剤排泄に関与するABCG2とフォークヘッド型転写因子でGO期を制御する遺伝子FOXO3a、ユビキチンリガーゼサブユニットFBw 7の特異発現とABCG2遺伝子を調節するmicroRNAの強発現を見出した。一方、sp細胞の検出法では高頻度のsp細胞を有する明細胞線癌株を見出した。本細胞は臨床像と似た脂肪細胞様の形態を呈し、脂肪細胞に特異的遺伝子PPARγ遺伝子が強発現しており、抗癌剤が効きにくいことおよび未分化維持に関連するのではと推測された。マイクロアレーにてもこの関連の遺伝子が得られた。本研究テーマの卵巣癌(上皮細胞系癌細胞)からの幹細胞の採取を実施すべく、本学に私学助成金にて設置されたFACSAriaを使用してHoecbstで染色した細胞の蛍光強度で検出するという方法を相当な回数、条件を変えて繰り返し検討をしたが、メーカー(ベクトンデッキンソン社)が保証したにもかかわらずこの装置では目的の細胞の同定が全く出来きず、この装置では上皮細胞系癌細胞の解析は出来ないという結論(要因:本装置は励起波長がバイオレット光のためHoechstで染色した上皮系細胞を励起する能力が極めて弱いために検出が不可能である)を判断し、実験は一時中断せざるを得なかった。本研究は分画採取した細胞からメッセージ、蛋白質などを採取するために未固定で生存状態の細胞が解析に必要となるため、これを可能にする新たな方法の検討が必要となった。最近骨髄造血幹細胞の大部分が細胞周期G0とG1期に存在し、殆どの造血幹細胞は細胞周期上で静止期のG0期の状態に有ると言われていることより、細胞周期G0期(静止期)の上皮系癌細胞の生細胞に使用が可能な色素Pyronin Y、7-Aminoactinomysin D、Acrigin Orange、rhoda-min123などを用いてかなりの頻度で解析を検討した結果、ようやく目的の腫瘍幹細胞が同定できるところまでに至った。また、これらの細胞が目的のものであるかを確認するため、これとは別のマーカーによる法でもあわせて検討を行っている。腫瘍集団中に数パーセント、微少存在する腫瘍幹細胞(SP細胞)は本学に設置装置FACSAria(BD社)では本体機能が弱いためヘキスト色素を用いる方法に対して使用できなかった。かなりの検討の後に本学の装置に適合できる新しい色素を見出し、この色素による方法にてSP細胞(腫瘍幹細胞)の同定がようやく確認することができた。しかしこの色素も細胞毒性のため、この色素を取り込んだ細胞non-SP(MP)細胞は殆どが死滅してしまいRNAを得ることができず計画しているマイクロアレイの対象が取れないことが判明して使用が不能であった。困っていたところベックマン・コールタ社の協力が得られることになり同社のセルソーターによりヘキスト色素によるSP・MP細胞を同定・採取した。SP細胞は多くの腫瘍細胞中に数パーセントの微少な集団であるとことが知られているが、検討した腫瘍細胞株中に高頻度の本細胞を有するものを見出し、この細胞株からRNA抽出してマイクロアレイを実施した。解析の結果、細胞周期、転写因子とエネルギーに関連する分子が得られた。これらのいくつは卵巣癌抗癌剤の効きにくい要因を司っている可能性を示唆しているように思われ、新しい標的に出来るのではと考えられた。腫瘍集団中に数パーセントの微少に存在する腫瘍幹細胞の内、非白血球系の卵巣癌細胞株などの細胞径の大きな細胞に関しては、本学に設置装置FACS Aria(BD社)では機能が弱くヘキスト色素を用いる方法は使用できなかったのでかなりの検討を重ね、生細胞中の静止細胞による腫瘍幹細胞を得る方法を用いることで本細胞と思われる細胞分画をセルソーターにて採取して、これらの細胞が癌幹細胞であるかについては直接細胞を用いたc DNAをテンプレットにした癌幹細胞・細胞周期に関与する指標遺伝子にしたRT-PCRにて検討して確認した。またこの方鰍線スフエロイド形成培養液中で培養するとスフェロイドの形成を認めた。癌幹細胞の標的分子を検索するために、抽出したRNAを使用して本細胞に発現するマイクロRNA(miRNA)の検討をmiRNA RT-PCRにて実施した。miRNAの選択したことについてはこの分子が21塩基の小さなRNAでありながら多く疾患へ.関与すると考えており、癌幹細胞においても関与が考えられた。

多くのmiRNAについて検討した結果、抗癌剤の排泄に関与するABCトランスポーターのABCG2遺伝子を調節するhas-miRNA-519が強発現していることを発見した。これはmiRNA-519が癌幹細胞の新しい標的としてABCG2を制御して卵巣癌抗癌剤の耐性の要因を司っている可能性を示唆していることが考えられた。
キラルな固体表面によるエナンチオ面区別反応

有機化合物と無機試薬との不均一反応において、アルミナやゼオライトなどの固体表面を担体あるいは反応の場として用いると著しく反応性を高めることが知られている。このような反応促進剤に不斉な場をもつ固体を用いてカルボニル化合物やイミンヘのエナンチオ面区別付加を試み、新しい不斉合成法を開発することがこの研究の目的である。すでに、シアン化物イオンによるイミンへの付加反応においてキラルな生体高分子であるキチンが存在すると、反応が著しく促進され、しかもエナンチオ面区別付加が起こることを見いだしている。今回、担体として、キチン(I)やその脱アセチル体であるキトサンの他に、キトサンのアミノ基に種々の芳香族アルデヒドを縮合させたアリリデンキトサン(II)、さらにそのイミノ基を還元して調製したNーアリ-ルメチルキトサン(III)などキトサン誘導体を試みた。反応はNーメチルベンズアルジミン(IV,1mmol)に対し、固体シアン化カリウム(4mmol)、無水酢酸(1.6ー2.6mmol)および担体(10mmol/n)を用い、ベンゼン溶媒中、25°Cで撹拌して行った。その結果いずれの担体を用いた場合にも反応は容易に進行し、得られたαーアミノニトリル誘導体Vは光学活性を示した。興味あることに、担体がIやIIIの場合には基質イミンIVのsi面からシアン化物イオンが付加したRー(ー)体が優先して生成したのに対して、担体IIの場合には逆にIVのre面から付加したSー(+)体が優先した。従って、これらの担体の不斉な環境の場、特にヘキソサミン残基の2位の窒素に結合した置換基が不斉誘導を起こす重要な鍵となることが明らかとなった。光学収率はこれらキトサン誘導体のアリ-ル基の種類によって大きく変化した。現在のところ最も良い結果が得られたのは、mートリフルオロメチルベンゼンメチルキトサンを用いた場合で、52%eeに達した。キトサンを修飾する置換基にさらに適切なものを選べば、今後光学収率の向上が期待できる。