hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
多発性骨髄腫における新規治療標的としてのヒストンメチル化異常の解析

ポリコーム群複合体PRC2を構成するEZH2はヒストンメチル化転移酵素活性を持ち、H3K27me3を介して標的遺伝子の転写抑制に関わる。骨髄腫ではEZH2の発現亢進が報告され、またH3K27me3の脱メチル化酵素であるUTXの不活性型変異も報告されており、H3K27me3の亢進が骨髄腫の発症や進展に関わる可能性が示唆されている。本研究では、EZH2/EZH1阻害剤であるUNC1999のin vitro及びin vivoでの単剤での抗骨髄腫効果とボルテゾミブとの相乗効果を明らかとした。EZH2/EZH1阻害剤は骨髄腫の新たな治療戦略として有望であり、プロテアソーム阻害剤との併用療法が期待されるポリコーム群複合体PRC2を構成するEZH2はヒストンメチル化転移酵素活性を持ち、ヒストンH3のリジン27番のトリメチル化(H3K27me3)を介して標的遺伝子の転写抑制に関わり、固形がんやリンパ腫などにおいて腫瘍増殖を促進する。患者骨髄腫細胞にて、EZH2の高発現やH3K27の脱メチル化酵素であるUTXの機能喪失型変異が報告されており、骨髄腫においてEZH2が治療標的になる可能性を示唆している。本研究にて我々は、EZH2の骨髄腫における生物学的意義と、EZH2阻害による抗骨髄腫効果を解析中である。まずshRNA法を用いたEZH2ノックダウンにより骨髄腫細胞株は増殖抑制を来し、EZH2が骨髄腫細胞においてoncogenicな機能を持つ事を示した。そこで我々は、新規EZH2阻害剤UNC1999の抗骨髄腫効果を検討した。UNC1999は複数の骨髄腫細胞株において、時間・濃度依存性に増殖抑制効果を示し、細胞内のH3K27me3を抑制した。またマイクロアレイによるgene set enrichment analysis (GSEA)によって、ポリコームの標的遺伝子が脱抑制されている事を見出した。そしてNOGマウスを用いたヒト骨髄腫細胞株(MM.1S)皮下腫瘍モデルにおいて、UNC1999の腹腔内投与により、in vivoにおいても有意な腫瘍増殖の抑制が示された。更にUNC1999はプロテアソーム阻害剤ボルテゾミブとの併用療法において相加・相乗効果を示し、ボルテゾミブが誘導するアポトーシスを増幅した。以上の結果より、EZH2阻害は骨髄腫治療の新たな治療戦略になりうると考えている。また、UTXコンディショナルノックアウトマウスの作製と、BRAF変異マウスとのコンパウンドマウスの作製が進行中であり、骨髄腫のモデルマウスになりうるか解析を予定している。本研究では、多発性骨髄腫においてヒストンH3K27トリメチル化(H3K27me3)の異常が発症や進展にどのような影響を与えるか明らかにする事を目的とし、、H3K27me3メチル化酵素であるポリコーム群遺伝子EZH2の骨髄腫細胞における生物学的意義の解析とともに、H3K27脱メチル化酵素UTXのコンディショナルノックアウトマウスの解析を行った。また、in vitroおよびin vivoの前臨床モデルにおけるEZH2阻害剤の抗骨髄腫効果と、プロテアソーム阻害剤との併用療法が有効である事を示し、そのメカニズム解析を行った。特にH27年度は、EZH2阻害剤UNC1999とプロテアソーム阻害剤ボルテゾミブとの併用療法のin vivoでの抗骨髄腫効果の解析を行った。また、UNC1999単剤あるいはボルテゾミブとの併用療法のメカニズム解析を、ChIPシークエンスとRNAシークエンスを併用して行い、骨髄腫におけるEZH2の標的遺伝子や、本併用療法における重要な分子を明らかにしつつある。またUTXコンディショナルノックアウトマウスはその一部がB細胞性腫瘍を発症しており、現在解析を進めている。EZH2/EZH1阻害剤は骨髄腫の新たな治療戦略として有望であり、プロテアソーム阻害剤との併用療法が期待される平成26年度の研究計画内容(EZH2ノックダウン骨髄腫細胞の解析、EZH2阻害剤のin vitroでの抗骨髄腫効果の解析、EZH2阻害剤と既存の薬剤との併用療法による抗骨髄腫効果の解析、UTXコンディショナルノックアウトマウスの作製と、BRAF変異マウスとのコンパウンドマウスの作製)がおおむね計画通りに進行しているため。血液内科Xenograftモデルを用いて、EZH2阻害剤とボルテゾミブの併用療法の抗骨髄腫効果をin vivoでも明らかにする。また、EZH2阻害剤単独あるいはプロテアソーム阻害剤との併用療法における抗骨髄腫効果の詳細なメカニズムを、特にH3K27me3の修飾による遺伝子発現の面から詳細に解析する予定である。具体的には、RNAシークエンスやChIPシークエンスにより、骨髄腫細胞におけるEZH2の標的分子を解明したい。

更にUTXコンディショナルノックアウトマウスあるいはBRAF変異マウスとのコンパウンドマウスの解析を行い、骨髄腫を発症すれば、EZH2阻害剤あるいはボルテゾミブとの併用療法による治療を試みる。
化石資源保全を目指したエミッションレスなプラスチックの化学的リサイクルシステム編成

廃プラの再資源化は、近い将来に枯渇する石油資源を延命する取り組みであり、廃プラ問題を解決すれば済む問題ではない。将来社会へ向けた全産業界の姿勢、政治使命と指導性、科学技術者の使命と倫理観、飽くことなき欲望と生活スタイルの縮小への取り組みの小さな一環として、比較的容易な廃プラ問題を解決する技術的・システム的研究を行った。本研究は、エネルギー資源よりも深刻で緊急性の大きい有機資源の有限性を基本理念として行った。国が政策的に実施している廃プラの油化、高炉コークス代替物、ゴミ発電などエネルギー回収対象のゴミ政策をやめさせ、石油資源枯渇が人間社会にもたらす深刻な問題を社会に気づかせる必要がある。技術的には輝かしい科学技術の産物である合成高分子を、廃プラに少しのエネルギーを加えて再びプラスチックとして繰返し使用し、廃プラを原油に代わる素材原料に蘇生させることが必要である。その仕組が働かない理由は(1)コスト経済が環境資源のコスト化に切り替わっていない。(2)産業界の未来展望が欠如しているかあるいは臆病である。(3)金銭的効率を優先させる社会と行政が、プラスチック資源再生システムの再編成を忌避している。廃プラ問題の解決法はリサイクルシステムに適合したエミッションレスな解重合技術の確立にある。分別回収された廃プラを全国小地域毎に設置可能な簡便装置を使って原料モノマーへ戻し、それを重合施設へ運搬する技術がそれである。我々の研究では廃PETの加アルカリ分解解重合法に引き続いて、廃ポリカーボネート(PC)をビスフェノールAと炭酸誘導体に解重合して精製し、再び新品の高分子材料へ重合させる簡便でエネルギー消費の少ないモノマーリサイクル法の開発に成功した。
三次元培養法を用いた新たな抗癌剤感受性試験法の開発-新規抗癌剤への臨床応用とその実用化を目指して-

当研究室においては、生体内と同様の三次元構築を維持した組織片培養を用いた感受性試験法(Histoculture drug response assay:HDRA法)を開発し、その実用性につき検討してきた。現在までに当院およびその関連施設において手術を施行した卵巣癌183例につきHDRAを施行したところ96%という高率の判定可能率が得られた。そのうち術後に測定可能病変を有し、かつCDDPを含む化学療法を施行した17例についてHDRA法の結果と臨床効果を比較したところ、真陽性率は89%、正診率は82%と高値を示し、十分実用に耐えうる値であることが示された。しかし、HDRA法は腫瘍塊が材料として必要であり、手術が不可能な胸・腹水の大量に貯留した卵巣癌症例では実施不可能であるため、コラーゲン・ゲル・ドロップ内に腫瘍細胞を包埋し、生体内と類似の構築を保ちつつ培養を行う新たな方法(Collagen gel droplet embedded culture drug sensitivity test:CDDST法)を導入し、胸・腹水中の細胞検体に対して施行した。胸・腹水中の腫瘍細胞はコラーゲンゲルドロップ内で培養7日後でも増殖が認められた。腹水17例、胸水5例に対して施行したところ判定可能率は77%であった。感受性の評価はCDDPのみならずTaxolやSN-38といった新規抗癌剤に対しても可能であった。CDDST法による感受性と臨床効果に関連性が認められた症例もあり、本法が手術不可能な胸・腹水貯留例においても各症例ごとに有効な化学療法の選択を可能ならしめる方法であることが示唆された。当研究室においては、生体内と同様の三次元構築を維持した組織片培養を用いた感受性試験法(Histoculture drug response assay=HDRA法)を開発し、その実用性につき検討してきた。現在までに当院およびその関連施設において手術を施行した卵巣癌159例につきHDRA参施行したところ判定可能率は96%と高率を示した。そのうち術後に測定可能病変を有し、かつCDDPを含む化学療法を施行した16例について臨床効果予測に関わる各種パラメータを求めたところ、真陽性率は88%、正診率は96%と高値を示した。しかし、HDRA法では着色薬剤には適用に難があること、臨床奏効度よりカットオフ濃度を求めることから新規薬剤には適用できないことが問題となってきた。そこで、コラーゲン・ゲル・ドロップ内に腫瘍細胞を包埋し、生体内と類似の構築を保ちつつ培養を行う新たな方法(Conagen gel droplet embedded culture drug sensitivitytest:CDDST法)を導入し、より有効な方法の確立をめざし、感受性試験を行った。現在、卵巣癌18例、子宮体癌10例につき本法を施行し、CDDPのみならずTaxolやSN-38などの新規抗癌剤も含めて感受性試験を施行している。また、卵巣癌は、発見時には進行癌であることが多く、胸・腹水の大量貯留や全身状態不良により腫瘍減量手術が不可能で、組織診断が得られず、抗癌剤の選択に苦慮する例も少なくない。そこで、かかる症例に対し、胸・腹水の癌細胞を用いてCDDST法を試みた。胸水2例、腹水6例施行したところ、癌細胞の増殖がみられ、感受性の測定が可能であった。今後はCDDST法を胸・腹水中の細胞検体に対しても施行し、基礎データを蓄積していく予定である。
接触型過敏症におけるIL-17ファミリーサイトカインIL-25の役割

アクセサリーや化粧品などに含まれる金属や化学物質との接触によって起きる接触型過敏症の発症には、様々な炎症誘導因子が関与する。本研究では、炎症誘導因子であるインターロイキン25(IL-25)に注目し、接触型過敏症におけるIL-25の役割の解明を目的とした。このために作製したIL-25遺伝子を破壊したマウス(IL-25欠損マウス)では接触型過敏症が顕著に抑制されたため、IL-25の阻害剤は接触型過敏症の抑制に寄与すると期待された。フルオレセインイソチオシアネート(fluorescein isothiocyanate ; FITC)の塗布によりアレルギー性接触型過敏症(contact hypersensitivity ; CHS)を誘導したマウスの皮膚ではIL-25mRNAの発現が増強しており、CHSの発症及び病態の形成にIL-25の関与が示唆された。実際に、IL-25欠横マウスではFITCによるCHSが顕著に抑制され、CHSの誘導へのIL-25の関与が明らかになった。FITCで感作後、皮膚の樹状細胞のリンパ節への遊走やFITC特異的なメモリーT細胞の分化は、IL-25欠損マウスでは正常であった。また、FITCで感作した野生型マウス及びIL-25欠損マウスのT細胞を、未感作の野生型マウスに移植した後、FITCを塗布してCHSを誘導したところ、両群での炎症の程度に差はみられなかった。したがって、IL-25は、CHSの感作の成立(ハプテン特異的なメモリーT細胞の分化および活性化)には大きな寄与は有していないことが明らかになった。一方、FITCで感作した野生型マウスのT細胞を移植した未感作のIL-25欠損マウスにFITCを塗布してCHSを誘導した場合は、対照群(FITCで感作した野生型マウス0)T細胞を移植した末感作の野生型マウス)に比べて炎症は抑制され、IL-25は感作が成立した後の局所の炎症の誘導に重要であることが明らかになった。また、その際、T細胞ではなく、マスト細胞が産生するIL-25がCHSの炎症誘導に関わっていることが明らかになった。以上より、CHSの発症および病態形成にIL-25が深く関与していることが明らかになった。接触型過敏症は、従来、Th1・Tc1細胞依存的なアレルギー疾患と見なされていたが、遺伝子欠損マウスを用いた解析から、Th1・Tc1細胞よりも、Th17細胞とTh2細胞の関与が強いことが明らかにされている。IL-25(別名IL-17E)は、IL-4、IL-5やIL-13といったTh2サイトカインの産生増強を誘導し、Th2タイプの免疫応答に関与する。方で、IL-25は、Th17細胞の機能を抑制する働きをもつことが示されている。したがって、IL-25は、CHSにおいても、Th2細胞および/あるいはTh17細胞の機能に何らかの影響を与え、その発症に重要な役割を持っている可能性が示唆されているが明確になっていない。そこで、本研究では接触型過敏症におけるIL-25の役割を明確にすることを目的とした。ハプテンの塗布による接触型過敏症はIL-25欠損マウスで抑制され、IL-25は、接触型過敏症の発症何らかの関わりを持つことが明らかになった。IL-25は、ハプテンの感作時における皮膚樹状細胞の遊走やハプテン特異的なTh1、Th2およびTh17細胞の分化には必須ではなく、炎症誘導期の炎症の誘導に重要であることが明らかになった。また、Th2細胞ではなく、皮膚におけるマスト細胞が産生するIL-25が接触型過敏症の発症に関与していることが明らかになった。マウスの皮膚にIL-25を投与すると、Th2サイトカインの発現は変動しないのに対し、Th17関連サイトカインの発現亢進が認められた。また、接触型過敏症を誘導したIL-25欠損マウスの皮膚炎局所ではTh17関連サイトカインの発現の減少が認められた。したがって、IL-25は、Th17細胞の機能に何らかの影響を与え、接触型過敏症の誘導に関わっていることが示唆された。
化合物半導体ALE成長プロセスのその場観察

従来、原子層エピタキシャル(ALE)成長の成長速度(1分子層/1サイクル)の確認は数百数千分子層を成長した成長膜厚の測定から推定していた。このため、この値は数百数千サイクルの平均値にすぎず、ALE成長の基本である原料分子の成長表面への吸着に起因する自己停止機能が1分子層単位で起こっているかどうかは確認不可能であった。また、成長表面上での原料分子のダイナミックな振る舞いのリアルタイムなその場観察システムの構築はALE成長メカニズムの解明に必要不可欠である。以下、我々が本重点領域研究で行った(1)マイクロバランスを用いた成長速度のその場測定、(2)表面光吸収法を用いた吸着分子のダイナミックなその場観察の結果を述べる。(1)マイクロバランスを用いたその場測定流量、系内圧力を高安定に保つことが可能なALE成長装置を作成し、これに超高感度のマイクロバランスを組み合わせた。外部からの振動や電気的なノイズの進入を極力減少させる工夫を施すことにより、基板結晶重量をALE成長サイクル中0.05μg以下の精度で測定可能なその場測定システムを完成させた。この装置を用いGaAsのALE成長を行った。その結果、従来平均値でしか得られなかった1サイクル当たりの成長速度をリアルタイムに測定することに成功した。(2)表面光吸収法を用いた表面吸着分子のその場観察アルゴンイオンレ-ザを用いた表面光吸収測定装置を組み込んだALE成長装置を完成させた。本システムによりGaAs ALE成長時のGaAs基板結晶表面の光吸収の観察を行った結果、III族原料であるGaCl分子の成長表面への吸着は、従来考えられていたGaCl分子のラングミュア-型の吸着平衡では説明できない複雑な挙動が観測された。この観測結果とマイクロバランスによるその場測定の結果より、1サイクル当たり1分子層の成長を可能とする自己停止機能は、吸着複合体が成長表面に生成されることに起因していることを明らかにした。
磁気分離法と電気修復法の組み合せによる重金属汚染土の浄化技術

本研究では,水質改善に適用されている磁気分離法と汚染土壌に適用されている電気修復法に着目し,それらの組み合せによって効果的に汚染物質を除去するための新しい技術を開発することを目的に実験的検討を行った。その結果,以下のことが明らかとなった。(1)フェライト法による重金属汚染土の不溶化効果・汚染水にフェライト処理を施すことにより,鉛に対して大きな不溶化効果が得られた。・鉛を含む重金属汚染土にフェライト法を適用して溶出試験を行った結果,生成過程で生じる鉄と鉛の複合水酸化物やフェライト処理土からの重金属イオンの溶出がかなり低減されることが明らかとなった。・フェライト法にアルカリ添加材として製鋼スラグを添加することにより,通常のフェライト法と同等以上の鉛の不溶化効果が得られた。(2)電気浸透法とフェライト法の組み合せに関する基礎的考察・第一鉄イオンを添加した状態で電気浸透実験を行い,陰極側のセクションにおいて,Pb2+はFe2+とOH-の存在によって複合水酸化物を生成することができた。・濃縮されたセクションで溶出試験を行った結果,弱酸性域からアルカリ性域において効果的に鉛の溶出を抑制させることができた。(3)磁気分離法による重金属汚染土の浄化技術・磁気分離の核となるマグネタイトを加えず,土中でフェライト処理を行ったものは,生成したフェライトと粘土粒子が非常に強く吸着しており,磁気分離の前と後ではあまり色の変化が見られなかった。・フェライト処理の前にマグネタイトを添加すると,その量が多いほど,磁気分離の前後で水溶液の色が白色に近くなり,磁気分離の効果が期待できる。汚染土壌の浄化対策には,拡散防止技術と分離・除去技術に分けられる。これまでは,封じ込め法や固化不溶化法による拡散防止技術が中心であったが,分離・除去技術は,土壌環境基準だけでなく汚染物質の含有量基準を満たさない場合にも効果がある手法として注目されている。本研究では,水質改善に適用されている磁気分離法に着目し,さらに,汚染土壌に適用されている電気修復法との組み合せによって,短期間で汚染物質を除去するための新しい技術を開発することを目的としている。すなわち,磁気分離法と電磁修復法のお互いのメリットと相乗効果を実験的に明らかにする。(1)磁気力による重金属イオンの移動とローレンツ力によるイオンの移動についての基礎的実験を行った。今回は両者とも界面動電現象による影響を上回るほどの結果は得られなかったが、ローレンツ力が粘土地盤内でもわずかながら作用することが示された。(2)磁気分離を行いやすくするための磁気種付けとして用いられるフェライト法を重金属汚染土に用いると、重金属イオンの溶出がかなり低減されることがわかった。また,フェライトだけでなく,それを生成する前の鉄との複合水酸化物は不溶化技術としても利用できる可能性があることを示した。さらに、フェライトの不溶化効果は、加えるFe^<2+>イオンの量が多いほど優れた効果を示した。(3)土中で生成されたフェライトは超伝導マグネットを用いた磁気分離によって除去が可能であった。しかしながらフェライト形成時に土粒子を化学的に吸着し、土粒子を含んだ形でフェライト化していると考えられ、それを防ぐ操作が必要である。
生体および人工分子配列システムにおける連鎖型光化学過程

本研究課題は、生体および人工の分子連鎖配列系における超高速光化学反応とそこで起こる非平衡過程を明かにすることを目的としている。(1)LB単分子膜、LB多層膜における励起エネルギー移動単分子膜面内および層間励起移動は、10Kでは室温と比較して移動速度が著しく遅くなり、理論的な解析の結果、分子の熱揺らぎが励起移動に与える影響が明かとなった。(2)合成組織化分子における励起子伝搬と電子移動亜鉛ポルフィリンの環状多量体、線形多量体および交差型多量体について、第2励起状態からの蛍光減衰を観測し、励起子伝搬が第2励起状態から、非平衡状態として直接的に起こっていることがわかった。これは従来のKashaの法則として知られた光化学の原理と相反する挙動であり、分子配列系を特徴付ける特性として位置付けた。(3)電子移動反応に対する外部電場効果LB膜中に配列した電子供与体と受容体の間の電子移動では、印加電場にによって電子移動速度が変化すること、その特性は光励起によって生成した電子状態に依存しており、上記の特性と併せて、分子配列系の光化学の特徴が明かとなった。(4)光合成反応中心における励起移動光合成反応中心蛋白におけるカロテノイド分子の電子緩和について、8種類の異性体についてその全容が明かとなった。カルボニル基をもつカロテノイドでは内部転換が速く、クロロフィルヘの励起移動が第1励起状態から起こるのに対して、カルボニル基を持たないものでは、励起移動が第2励起状態から起こるという一般的な特性が明かとなった。種々の機能分子が接近して反応経路に沿って並べられた分子配列システムでは、反応に関与する分子が接近しているために分子間に比較的強い相互作用が生まれ、励起エネルギー移動や電子移動反応が超高速で連鎖的に起こる。本研究の目的は、光合成反応系および合成組織化分子とそのLB多層膜を用いて、分子配列系で起こる量子化連鎖反応について系統的に実験を進め、非平衡励起移動・電子移動について解明し、新しい物理化学を展開することが目的である。(1)フェムト秒時間分解蛍光分光法-蛍光アップコンバージョン装置の製作分子連鎖の各分子から発する蛍光の変化をフェムト秒時間スケールで測定するために蛍光アップコンバージョン法による装置を完成させた。この装置はチタンサファイアレーザー(設備備品として購入)から成る。(2)人工励起エネルギー移動系LB多層膜を用いて、光励起されたドナー分子N1の励起が次々とアクセプター分子N2,N3・・を移動する67層系の積層機造を作成し、室温と10K(設備備品として購入した極低温クライオスタットを使用)におけるピコ秒時間分解蛍光の挙動を比較し、分子の熱揺らぎの効果を明かにした。(3)人工電子移動系ポルフィリン(D)とピロメリットイミド(A)を連結した2元系分子およびポルフィリン2量体を含む3元系を合成し、これらの連鎖型電子伝達を蛍光アップコンバージョン法によって調べ、200-400フェムト秒の超高速電子移動が観測された。(4)生体励起移動・電子移動系緑色光合成細菌の光合成反応中心およびアンテナ色素蛋白をそれぞれの生体系から単離し分子量が異なるいくつかのレベルの蛋白について、蛍光アップコンバージョン法により時間分解蛍光を測定し、連鎖型励起移動と電子移動についてその動力学特性について明かにした。種々の機能分子が接近して反応経路に沿って並べられた分子配列システムでは、分子が接近しているために比較的強い相互作用が生まれ励起エネルギー移動や電子移動反応が超高速で連鎖的に起こる。その反応機構を考えるとき、分子が均一ランダムに分散し個々の平衡系反応に対して組立てられた従来の物理化学理論から一歩進んだ新しい理論が必要となる。本研究の目的は、生体および人工分子配列系として光合成反応系および合成組織化分子とそのLB多層膜を用いて、そこで起こる量子化連鎖反応、非平衡励起移動・電子移動について解明し、新しい物理化学を展開することが目的である。

(1)連鎖型励起移動・電子移動のフェムト秒時間分解蛍光の実験本研究で作製したフェムト秒時間分解蛍光分光測定装置によって、種々の色素分子が積層したLB多層膜において、励起移動が高速で起こり、特別な反応チャンネルの存在とその反応速度が分子配列の連鎖が長くなるとともに速くなること、が明かになったなった。また環状および線形ポルフィリン多量体においては、励起移動がフェムト秒時間で波動の伝搬として起こることが明かにされ、新しい励起移動機構を提出し、ポーランドにて開催された国際会議および論文において発表した。(2)極低温下における非平衡励起移動・電子移動のフェムト秒時間分解蛍光の実験本研究計画において購入した極低温クライオスタットを用いて、励起移動のドナーとアクセプターが化学的に結合した分子系では、10Kでは励起移動が1ピコ秒前後で非平衡反応過程として起こり、この種の現象が連結分子系、LB多層膜など広い範囲の分子配列系において起こる普遍的な現象であるとともに、媒体の熱揺らぎと密接に関係していること、さらに生体系の光化学初期過程がこの機構で起こっていることを明かにした。(3)連鎖型電子移動における外部電場・ミクロ電場効果電子移動反応が、外部電場によって促進することのみならず、反応分子鎖の周囲に光誘起電荷移動錯体を配することにより、ミクロ電場を発生させ外部電場効果と同様な効果を生み出すことが明かとなった。つまり電子移動反応がミクロ電場および外部電場印加によって制御され得ることが示され、光合成反応中心の超高速電子移動との関連、光機能分子素子の構築に対して新しい展開を生み出すことができた。本年度は最終年度であり、分子配列系の光化学の系統的な特性をまとめた。(1)LB単分子膜、LB多層膜における励起エネルギー移動単分子膜面内および層間励起移動は、10Kでは室温と比較して移動速度が著しく遅くなり、理論的な解析の結果、分子の熱揺らぎが、励起移動に与える影響が明かとなった。(2)合成組織化分子における励起子伝搬と電子移動亜鉛ポリフィリンの環状多量体、線形多量体および交差型多様体について、第2励起状態からの蛍光減衰を観測し、励起子伝搬が第2励起状態から、非平衡状態として直接的に起こっていることがわかった。これは従来のKashaの法則として知られた光化学の原理と相反する挙動であり、分子配列系を特徴付ける特性として位置付けた。(3)電子移動反応に対する外部電場効果LB膜中に配列した電子供与体と受容体の間の電子移動では、印加電場によって電子移動速度が変化すること、その特性は光励起によって生成した電子状態に依存しており、上記の特性と併せて、分子配列系の光化学の特徴が明かとなった。(4)光合成反応中心における励起移動光合成反応中心蛋白におけるカロテノイド分子の電子緩和について、8種類の異性体についてその全容が明かとなった。カルボニル基をもつカロテノイドでは内部転換が速く、クロロフィルへの励起移動が第1励起状態から起こるのに対して、カルボニル基を持たないものでは、励起移動が第2励起状態から起こるという一般的な特性が明かとなった。
新たなHIV融合阻害薬耐性化メカニズムの解明と臨床的意義の検討

HIV-1と宿主細胞の膜融合反応を標的とした融合阻害薬enfuvirtide(fuzeon ; T-20)は優れた抗HIV-1活性を示すが、長期使用による耐性株の出現も報告されている。本研究課題ではT-20耐性株にも活性を示す次世代ペプチド性融合阻害剤であるSC34EKにより誘導されたgp41 cytoplasmic tail(CT)領域内の変異に着目し、薬剤感受性や感染性の変化を解析した。SC34EKを用いた耐性株誘導試験により、CT領域に5つのアミノ酸変異が導入され、これらの変異はT-20やSC34EKに約3倍から8倍の耐性を付与した。また、CT変異によるHIV-1感染性への影響を解析した結果、CT変異を組込んだウイルスでは、野生株の15%程度の感染性しか示さなかったため、CT変異がHIV-1エンベロープの機能不全を引き起こしていることが示唆された。以上の結果から、CT変異は膜融合反応を含めたHIV感染過程に影響を及ぼすことで、膜融合阻害薬の耐性に関与していることが推測された。HIV-1と標的細胞との膜融合反応を標的とした融合阻害剤enfuvirtide (T-20)は現在臨床において用いられているが、長期使用による耐性株の出現も報告されている。本研究課題ではT-20耐性株にも活性を示す次世代ペプチド性融合阻害剤であるSC34EKにより誘導されたgp41 cytoplasmic tail (CT)領域内の変異に着目し、薬剤感受性や感染性の変化を解析した。SC34EKを用いた耐性株誘導試験により、CT領域に5つのアミノ酸変異が同定された。これらの変異をHIV-1感染性クローンに導入し、ウイルスを作製して耐性度を解析した結果、5つのCT変異全てを組込んだウイルスは、T-20に約3倍の耐性を示した。また、CT変異に加えて,他のgp41変異(HR変異)を組込んだウイルスでは、HR変異単独のウイルスと比較してSC34EKに約3倍の耐性を示した。さらに、SC34EKにより誘導された全変異について、CT変異の有無による薬剤感受性の差を解析した結果、CT変異を有するウイルスでは、約8倍のT-20耐性が認められた。これらの結果は、CT変異が直接融合阻害剤の耐性に関与していることを示している。続いて、CT変異によるHIV-1感染性への影響を解析した結果、CT変異を組込んだウイルスでは、野生株の15%程度の感染性しか示さなかったため、CT変異がHIV-1エンベロープの機能不全を引き起こしていることが示唆された。以上の結果から、CT変異は膜融合反応を含めたHIV細胞侵入過程に影響を及ぼすことで、膜融合阻害剤の耐性に関与していることが推測された。
X線天文衛星Astro-D,ROSATによるX線天体の研究

ドイツのMax Planck研究所(以下MPIと略)では、1990年6月に打ち上げられたX線天文衛星ROSATを観測運用中である一方、宇宙科学研究所では1993年2月わが国4番目のX線天文衛星「あすか」(Astro-D)を打ち上げ、順調に観測運用を行っている。ROSAT「あすか」も共に高感度のX線反射望遠鏡を搭載し、微弱なX線天文を抑えることが出来る。「あすか」のX線望遠鏡は3keV以上のX線に対し、1分角程度の解像力ながら衛星としては、初めて撮像能力をもち、かつ、これまでにない感度をもつ。また、世界で初めてX線CCDを搭載し精密な分光をする能力を有している。一方、ドイツのX線天文衛星ROSATに搭載されたX線望遠鏡は、2keV以上のX線に対する感度はないが、数秒角というすぐれた解像力をもつ。また、「あすか」には0.5keV以下のX線に対する感度はないがROSATは0.2keVほどのエネルギーの低いX線にも感度がある。このように、「あすか」とROSATは互いに相補的な能力をもっており、打ち上げ以降、両者が同じX線源を観測する同時観測が何回か組まれている。また、ROSATは打ち上げ後数カ月かけて全天のサーベイ観測を行っており、「あすか」の観測する方向のさまざまな情報を提供してくれている。本研究は、両衛星のデータの比較交換を行い、同時観測、X線天文の光学観測等で両衛星の研究者グループが協力するとともに、それぞれの衛星の特徴を生かした観測を行い、宇宙の進化・構造や、ブラックホール天体を始めとする各種X線天体の観測的研究を共同して行うことを目的として行われた。また、「あすか」・ROSATの観測時間は、世界の研究者の利用に供せられており、日独の研究者を中心に広く世界の研究者と共同研究を進めてきた。平成6年度は、8月に国際天文連合総会、12月にテキサスシンポジウムという大きな国際研究会の場で、本国際学術研究の結果を含む研究発表を行うとともに、両者のデータ解析の結果を持ち寄っての打ち合わせを行った。特に、国際天文連合総会は世界の天文学者が一堂に集まりいくつかのシンポジウムが平行して開かれる大きな研究交流の場であり、わが国からも本研究の目的のために4名の研究者が参加した。平成7年度は、9月にドイツで、3月には日本で、それぞれROSATの打ち上げ5周年と「あすか」の打ち上げ3周年を記念して大規模な国際研究会が開かれ、それぞれ300名近い世界各国の研究者が集まり、「あすか」・ROSATの観測データを中心に多数の研究発表が行われ熱心な討議がかわされた。ドイツでの国際研究会には本研究の目的で3名が参加した。また、3月の日本の国際研究会を利用して多数の日独の研究者が集まり、これまでの共同研究の総括と今後の進め方について活発な議論がかわされた。6月と2月にもそれぞれ1名ずつ訪独、訪米し「あすか」の観測打ち合わせを行った。一方、ドイツのマックスプランク研究所に客員研究員として滞在中の田中が、日独の研究連絡のため4月と3月に帰国、種々の打ち合わせを行った。平成8年度は、4月に米国(1名)、7月に英国(1名)、8月に韓国(1名)、10月にイタリア(1名)で開かれた国際研究会において、「あすか」・ROSATの共同観測のデータをもとに発表を行った。また、7月には将来の共同研究の打ち合わせに2名が訪英、11月には、それぞれの検出器の相互の較正の打ち合わせに1名が訪独した。この3年間の相互交流・学術研究により、「あすか」・ROSAT両衛星の検出器の応答関数の相互較正も進み、それぞれの観測装置の特徴を生かした興味ある観測結果が得られてきている。そして、宇宙の進化・構造や、種々のX線天体の理解が多いに進みつつあり、多くの論文となって実を結んでいる。本科学研究費補助金による研究は平成8年度で終わりとなるが、来年度以降日独の研究協力をさらに発展させて行くべく、全体の組織の整備や種々の研究テーマごとの作業グループつくりも進んでおり、今後の研究協力の発展が期待される。

本研究は、両衛星のデータの比較交換を行い、同時観測、X線天文の光学観測等で両衛星の研究者グループが協力するとともに、それぞれの衛星の特徴を生かした観測を行い、宇宙の進化・構造や、ブラックホール天体を始めとする各種X線天体の観測的研究を共同して行うことを目的として行われた。また、「あすか」・ROSATの観測時間は、世界の研究者の利用に供せられており、日独の研究者を中心に広く世界の研究者と共同研究を進めてきた。平成6年度は、8月に国際天文連合総会、12月にテキサスシンポジウムという大きな国際研究会の場で、本国際学術研究の結果を含む研究発表を行うとともに、両者のデータ解析の結果を持ち寄っての打ち合わせを行った。特に、国際天文連合総会は世界の天文学者が一堂に集まりいくつかのシンポジウムが平行して開かれる大きな研究交流の場であり、わが国からも本研究の目的のために4名の研究者が参加した。平成7年度は、9月にドイツで、3月には日本で、それぞれROSATの打ち上げ5周年と「あすか」の打ち上げ3周年を記念して大規模な国際研究会が開かれ、それぞれ300名近い世界各国の研究者が集まり、「あすか」・ROSATの観測データを中心に多数の研究発表が行われ熱心な討議がかわされた。ドイツでの国際研究会には本研究の目的で3名が参加した。また、3月の日本の国際研究会を利用して多数の日独の研究者が集まり、これまでの共同研究の総括と今後の進め方について活発な議論がかわされた。6月と2月にもそれぞれ1名ずつ訪独、訪米し「あすか」の観測打ち合わせを行った。一方、ドイツのマックスプランク研究所に客員研究員として滞在中の田中が、日独の研究連絡のため4月と3月に帰国、種々の打ち合わせを行った。平成8年度は、4月に米国(1名)、7月に英国(1名)、8月に韓国(1名)、10月にイタリア(1名)で開かれた国際研究会において、「あすか」・ROSATの共同観測のデータをもとに発表を行った。また、7月には将来の共同研究の打ち合わせに2名が訪英、11月には、それぞれの検出器の相互の較正の打ち合わせに1名が訪独した。この3年間の相互交流・学術研究により、「あすか」・ROSAT両衛星の検出器の応答関数の相互較正も進み、それぞれの観測装置の特徴を生かした興味ある観測結果が得られてきている。そして、宇宙の進化・構造や、種々のX線天体の理解が多いに進みつつあり、多くの論文となって実を結んでいる。本科学研究費補助金による研究は平成8年度で終わりとなるが、来年度以降日独の研究協力をさらに発展させて行くべく、全体の組織の整備や種々の研究テーマごとの作業グループつくりも進んでおり、今後の研究協力の発展が期待される。わが国4番目のX線天文衛星「あすか」(Astro-D)は、打ち上げ後二年目に入り順調に観測を続けている。一方、ドイツのX線天文衛星ROSATも打ち上げ後五年目をむかえいぜんとして観測を続けている。「あすか」のX線望遠鏡は3keV以上のX線に対し、1分角程度の解像力ながら衛星としてははじめて撮像能力をもち、かつ、これまでにない感度をもつ。また、世界で初めてX線CCDを搭載し精密な分光をする能力を有している。一方、ドイツのX線天文衛星ROSATに搭載されたX線望遠鏡は、2keV以上のX線に対する感度はないが、数秒角というすぐれた解像力をもつ。また、「あすか」には0.5keV以下のX線に対する感度はないがROSATは0.2keVほどのエネルギーの低いX線にも感度がある。
江戸期における西欧医学知識の受容-宇田川玄真『医範提綱』を中心に-

本研究は宇田川玄真『医範提綱』およびその草稿である「遠西医範」を対象としている。本年度は、「遠西医範」のうち現存する五つの写本を分析し、各部分についてその典拠を同定確認した。また、内容比較分析の結果、純粋に解剖学的といえる記述部分には、主にパルフェイン(Johan Palfyn,1650-1730)『外科用解剖学』が、一方、生理学および思想的記述においてはもっぱらブランカールト(Steven Blankaart,1650-1704)『新訂解剖学』が利用されているということを解明した。特に、神経思想に関して、玄真は杉田玄白や大槻玄沢と同様にブランカールトの神経液説を受容していることを論証した。また、『医範堤綱』の銅版図の原図の確認および分析を行なった銅版図の原図擬調査の結果、フェルヘイエン(Philip Verheyen,1648-1710)がその主要な典拠であることを確認した。また、さらに、銅版図における玄真の受容態渡について、オランダ語版解剖書における新旧諸原図の間に選択の余地がある場合、玄真は古い図の方を選んでいることを解明した。次に、『医節提綱』の内容分析を行なった。その結果、『医範堤綱』における神経に関する思想的内容については、ブランカールトの神経液説が受容され、その受容過程において、ブランカールトの魂・身体元論を含む機械論的思想から内経医学思想への変容がみられることを論証した。一方、『医範提綱』における呼吸や血液循環、消化、受精などのほかの生理機能に関しては、内経医学的要素が少なく、オランダ語版解剖書における諸説がそのまま受容されていることを示した。最後に、『医範提綱』の普及状況を調査した。その調査結果として、『医範提綱』は蘭学塾などにおいて教科書として広く利用され、文化2年から幕末までの長い間、蘭学者たちの西洋医学の基礎知識を与えてくれる書物であったということを論証した。
FMCWレーダによる木造建築の構造と劣化の非破壊診断技術の開発

電磁波を用いて非接触・非破壊で住宅の壁体内の構造や劣化(腐朽や虫害)を診断する反射型の2次元イメージング装置を開発した。20GHzを中心周波数とし、数GHzの掃引幅を有するFMCW方式の反射型レーダ装置を試作した。装置はアンテナ、VNA、XYステージ、コントローラ、計測制御用のPCからなる。大壁モデルの内部構造(間柱、金物、筋違など)や劣化状態の検出性能を検討した。時間軸信号に現れる反射ピークの位置や強度から、壁の層構造や内部の部材の有無や種類が判定できた。また接合金具などの金属系部品、筋違や間柱が確認でき。さらに壁体内の木部腐朽を誘発する結露水や高含水率の木部の位置や範囲を特定できた。平成26年度は木造建築の非破壊診断に最も適していると考えられるサブミリ波帯の電磁波をもちいたFMCW方式のレーダ装置の開発と、その性能評価を進めた。検出方式の原理確認や開発装置の仕様決定のための基礎実験および調査として、各種木質・非木質建材の誘電特性の評価、各種壁構造の材料や仕様の調査を行ったうえで、汎用のアンテナやVNAを用いた検出実験を行い、レーダの方式を決定した。さらに実験に供試するための劣化材として、木質建材をモデル的および人工的に促進劣化させる作業(菌類や木材加害昆虫への暴露)を行った。さらに一般住宅などの調査を通じて木質の壁体の実態や劣化特性を把握した。さらにシロアリや甲虫類などの生態や木部加害特性を評価するとともに、劣化による強度性能の低下を検討した。壁体内部(構造と劣化)の非破壊評価のための電磁波検出方式を検討し、装置の基本設計を行い試験装置を試作した。特にアンテナの性能について、木質の壁体を適宜透過し、内部情報を反射波として検出できる条件を明らかにした。またリアルタイムで壁体内部からの反射波を分析および表示できるように検波および信号処理システムを構築した。試作した装置の基本性能を評価した上で、壁内部の構造および劣化の検出性能についてその基本的な能力を確認した。装置の小型化および実用化のために、アンテナ部分と信号処理部分を一体化した小型の装置を試作した。また実用化に際して課題となる電波の漏れの対策を検討し、数種の解決策の可能性を確認した。診断のための画像処理技術については、診断画像に現れるノイズ成分の除去を含めて、反射型装置での3次元構造解析や可視化のためのアルゴリズムを検討した。本研究では、主として木造建築物の内部で進行する腐朽や虫害などの生物劣化、劣化を誘発する結露や木部含水率の状態、さらには筋交いや金具などの構造の状態を、非破壊・非接触で、定性的および定量的に診断する小型の装置の開発を目的とし、周波数がサブミリ波帯の電磁波をもちいたFMCW方式レーダ技術の適用性を検証し、装置の試作を行った。開発に際しては、サブミリ波帯における木材の誘電特性の検討、3次元で高分解能の可視化のためのアンテナの性能、検波回路などのハードと信号分析と画像解析と自動診断のためのソフトを考究および試作した。特に平成26年度は、木造住宅の外壁・大壁の下地の木部の含水率(湿気)を検出する小型の装置を開発した。小型装置の試作と改良に関しては、既往の基礎研究及び試作で得た知見を用いて、10GHzを中心周波数とする帯域において、外壁用窯業系ボード、石膏ボード、モルタル層や木質建材における電磁波の透過および反射特性、および誘電率の測定などを行った。さらにこれらの建材で構成される一般的な木造住宅の外壁のモデルを試作し、これについても誘電特性を検討した。さらに外装材の下地の木部の含水率状態を変化させ、電磁波の反射特性を把握した。これらの知見を基に小型の装置開発で利用可能な周波数帯や電磁波の出力レベルを決定した。さらに既往の試作装置について、アンテナの小型化、検出感度の向上、検出データのの処理ソフトウェアを新たに設計し、試作し、その性能を把握した。さらに最終的には、装置に外壁の下地木部の含水率を選択的に測定できる機能と、木部の含水率を直接測定する機能を付与した。さらに表面状態の異なる外壁でも感度よく検出できるように、アンテナ部と対象との間に用いることのできるカップリング材についても検討した。本課題ではFMCWレーダ方式による木造建築の構造と劣化の非破壊診断技術について、その原理確認と実用化のための基礎的知見を獲得し、小型のレーダ装置を試作し、その性能を評価した。中心周波数20GHz、帯域10GHzのFMCW方式のレーダ装置を試作し、木造のモデル壁体への電波の透過や反射特性を検討した。その結果、2枚のボード(石膏ボードや合板、間隔95mm)からなる壁体については、その内部に配置されている各種金物について、壁体面内での位置、奥行き方向の位置を壁体の構造によらず認識することができた。またコーナ金具などについてはその形状を認識できたが、壁内の木部を貫通しているボルトについては検出が困難であった。また壁内の間柱や筋交いなどの木製の部材についても検出が可能であったが、金属材料に比べて認識は困難であった。一方、壁内の劣化の原因となる高含水率部位については、プラスチックフィルムに封入した湿潤単板によるモデル材を壁内に配置する実験を行ったところ、腐朽や虫害が急速に発生するとされている含水率30%以上の領域を概ね検出することができた。

表面板が合板の場合に比べて石膏ボードの場合は、反射強度(検出感度)は低下するものの、木質の誘電率や多孔性の異方性に由来する変動は少ない、安定していた。さらにこの原理を用いて実用的な装置開発にむけ、装置の発信強度を低下させ、さらに検出感度をあげるため改良を、装置のハードとソフトの両方において行った。最後に、実際の木造住宅の外壁通気工法を想定して、サイディングボートを表層板、下地用合板を裏板、両者の間隔を15から25mmまで変化させた試験体で、下地の合板などの表面結露や水分浸潤による高含水率部位の検出の可能性を検討した。その結果、複雑で大きな起伏のある外装ボードでは表面での反射が大きく、さらに装置の検出性能の改良が必要であることがわかった。電磁波を用いて非接触・非破壊で住宅の壁体内の構造や劣化(腐朽や虫害)を診断する反射型の2次元イメージング装置を開発した。20GHzを中心周波数とし、数GHzの掃引幅を有するFMCW方式の反射型レーダ装置を試作した。装置はアンテナ、VNA、XYステージ、コントローラ、計測制御用のPCからなる。大壁モデルの内部構造(間柱、金物、筋違など)や劣化状態の検出性能を検討した。時間軸信号に現れる反射ピークの位置や強度から、壁の層構造や内部の部材の有無や種類が判定できた。また接合金具などの金属系部品、筋違や間柱が確認でき。さらに壁体内の木部腐朽を誘発する結露水や高含水率の木部の位置や範囲を特定できた。平成25年度・26年度は開発装置の希求条件、検出原理の検証や木材をはじめとする各種建材や構造体の誘電特性を検討し、開発に向けた基礎的内容について、実験や調査を行い、その結果を取りまとめ、関係学会などで公表した。同時に検出装置を試作し、そのハードウェアやソフトウェアの性能評価と改良を行った。同時に装置を実用化するために必要となる小型化、操作性、感度改良などについて検討を行った。その際もっとも重要となる電波法に準拠した装置の性能確保について様々な角度から取組み、平成26年度末には一定の成果が獲得でき、平成27年度に実用的な装置としての性能確保の道筋が明らかになる状況にある。同時に関連業界の動向調査から、特化した機能をもつ単能・小型の装置が求められていることが明らかになったため、平成26年度は、木造住宅の外壁の下地木部の水分を選択的に検出できる装置の開発に取り組みその性能を明らかにすることができた。同時に木造建築物における生物劣化(蟻害・甲虫害・腐朽)の発生特性、非破壊的な早期検出のための条件、維持管理上の技術的課題、劣化と材料強度特性の関係などに関して装置開発に資する実践的な知見を獲得することができた。本課題の装置を利用した木造建築の維持管理技術は今後さらに市場や社会の要請に応じて発展していくと考えられ、この状況に対応した装置開発を本研究では試行することができ、十分な成果を得つつある。また電磁波と各種建材との相互作用についての知見を獲得でき、今後の電磁波を用いた非破壊検査手法のための条件が明確になった。27年度が最終年度であるため、記入しない。木質科学平成27年度は、平成26年度に主として取り組んだ木造住宅の外壁の下地木部の水分を選択的に検出できる装置について、電波法に準拠しながらも高感度・高分解能の水分計測を可能にするハードとソフトの開発に取り組む。
フタル酸エステルの内分泌攪乱機構と脳下垂体、視床下部発現蛋白のプロテオーム解析

プラスチックの可塑剤に用いられるフタル酸エチルヘキシルDEHP[Di-(2-ethylhexyl)phthalate]は、内分泌撹乱作用に関して懸念される化学物質の1つであるが、作用メカニズムの解明には至っていない。本研究は、親ラットに投与したDEHPが胎盤、母乳を通し胎児期、乳児期の仔ラットの臓器や生殖機能に及ぼす影響に関して蛋白化学的検討を行うことを目的として遂行した。妊娠ラットF344(♀)をコントロール群、妊娠期間投与群、授乳期間投与群の3群に分け、妊娠期間投与群には妊娠日齢2日目から出産前日(約21日)までに15回DEHP(0.59/kg/day)をゴマ油に混合し親ラットに経口投与した。授乳期間投与群には、出産2日目から離乳(約21日)までに17回DEHP(0.5g/kg/day)を同様に親ラットに投与した。コントロール群にはゴマ油のみを親ラットに経口投与した。投与終了後、親ラットから隔離して飼育を始め、4ヶ月後に仔ラットを解剖し臓器を摘出した。実験の結果、それぞれの群から生まれた仔ラットの体重に有意な差は見られなかったが、妊娠期間投与群の親ラットから生まれた雄仔ラットの精巣重量はコントロール群と比較し有意な減少が見られた(P<0.05)。また、DEHPを投与した群の(妊娠期間、授乳期間)雄仔ラットの脳下垂体重量はコントロール群と比較し有意に増加した(P<0.05)。このことからDEHP投与は、雄仔ラットの精巣及び下垂体に何らかの影響を有していると推察されため、両組織から可溶性蛋白を抽出し、コントロール群、妊娠期間投与群、授乳期間投与群の三者間について、プロテオーム解析を行った。等電点電気泳動には、Immobiline DryStrip pI3-10NL 24cmを用い、二次元目には24.5×18cmゲルを用い、CBBにて染色を行った。脳下垂体について画像解析ソフトによる解析を行った結果、コントロール群に対して、それぞれの投与群の蛋白発現量に差が見られるスポット4種類が見出された。これらの蛋白スポットの増減は、DEHPの投与による内分泌系への影響を反映するものと考えられ、DEHPの内分泌撹乱作用のメカニズムの解明に役立つものと思われる。フタル酸エステル系可塑剤であるフタル酸ジエチルヘキシルDEHP[di-(2-ethylhexyl)phthalate]は内分泌撹乱作用が懸念される可塑剤である。これまでの研究により、雄ラットへの長期DEHP投与により脳下垂体のプロテオーム解析から小胞体輸送関連蛋白が減少することを発見し、結果として卵胞刺激ホルモン(FSH)、黄体刺激ホルモン(LH)の放出が抑制された内分泌が撹乱されるという新しい仮設を提唱しつつある。本研究では、親ラットに投与されたDEHPがラット胎盤、母乳を通じ胎児、乳児の臓器や生殖機能へ及ぼす影響を蛋白科学的に明らかにすることを目的としている。F344妊娠ラット(妊娠日齢2日)をコントロール群、妊娠期間DEHP投与群(15日間)、授乳期間

DEHP投与群(21日間)の3群に分け、親ラットにDEHPをゴマ油に溶解し0.5mg/kg/day投与した。コントロール群には全期間を通じてゴマ油のみを同様に投与した。その結果、妊娠期間の親ラットの体重変化は各群間において有意差は見られず、他群と同様の重量増加が観察された。また授乳期間においても各群間に有意差は見られなかったが、授乳期間終了後の28日目において授乳期間投与群において減少傾向が観察され、雄ラット(P<0.1)、雌ラット(P<0.05)ともに有意差が見られた。各群から生まれた仔ラットの個体数、性比率に差は見られなかった。また各群の雌仔ラットの腔開口日齢に有意差は見られなかったが、授乳期間投与群の発情期日齢は、コントロール群と比較して遅れ、有意差(P<0.05)が見られた。また、妊娠期間と授乳期間投与の仔ラットの母体(胎盤・母乳)を通してDEHPの曝露による影響が、仔ラットの両性においても観察された。さらに現在、脳下垂体をはじめ臓器に変化の見られた生体試料から蛋白解析を行っている。プラスチックの可塑剤に用いられるフタル酸エチルヘキシルDEHP[Di-(2-ethylhexyl)phthalate]は、内分泌撹乱作用が懸念されているが、その作用メカニズムは解明されていない。また、DEHPの代謝産物である、MEHP[Mono-ethylhexyl-phthalate]は、精巣毒性を持ち、精巣を萎縮させることが知られている。性ホルモンであるテストステロンのほとんどは、精巣のライディッヒ細胞で産生され、その後血中に放出される。その一方でセルトリ細胞の機能維持や生殖細胞の成熟と分化に関与していることが知られている。本研究では、親ラットに投与したDEHPが胎盤、母乳を通し胎児、乳児の仔ラットの臓器や生殖機能に及ぼす影響を蛋白科学的に明らかにすることを目的として行った。16年度に行った投与実験の結果、妊娠期間の親ラットにDEHPを0.5g/kg/day投与した群から生まれた雄の仔ラットの精巣重量に減少が見られた(P<0.05)。また、DEHPを投与した群の(妊娠期間、授乳期間)雄の仔ラットの脳下垂体に増加が見られた(P<0.05)。このことから、雄の仔ラットの精巣及び下垂体に何らかの影響を及ぼしていることが推察され、両組織から可溶性蛋白を抽出し、コントロール群、妊娠期間投与群、授乳期間投与群の三者間について、二次元電気泳動によるプロテオーム解析を行った。等電点電気泳動には、pI3-10NL24cmのドライストリップを用い、二次元目には24.5×18cmの大型ゲルを用いた高解像度の解析を行った。画像解析ソフトによる解析の結果、精巣から抽出した蛋白の二次元電気泳動画像においてコントロール群に対して、それぞれの投与群の蛋白発現量に差が見られるスポットが見つかった。さらに、脳下垂体についても、二次元電気泳動による解析を行った結果、精巣と同様にコントロール群に対して、それぞれの投与群の蛋白発現量に差が見られるスポットが見つかった。これらの蛋白スポットの増減は、DEHPの投与による内分泌系への影響を反映するものと考えられ、DEHPの内分泌撹乱作用のメカニズムの解明に役立つものと思われる。
哺乳類人工染色体の構築

研究の目的人工染色体は、遺伝子治療や遺伝学的研究のよい基礎技術となることが期待されながら、今日に至るまで、ヒト人工染色体が成功したとの報告は非常に限られている。その理由は、ヒト染色体の機能構造が巨大であるゆえに、それらを試験管内でつなぎ合わせる技術が不足しているためである。染色体は、セントロメア、テロメアおよびDNA複製開始領域の三者の構造体を必須としている。我々は、これまでにヒトテロメレースの純化精製と遺伝子クローニングを行ってきた。テロメレースはテロメア機能をDNA末端にde novoで付加する酵素であり、本酵素を用いることで、染色体をin vitroで構築することが容易になると期待される。本研究では、テロメレースを応用した人工染色体の構築系の開発を目指す。本年度の研究成果酵母テロメレースを遺伝子操作により改変し、ヒト型テロメア配列を付加する酵母ストレインHTM(Human Telomere Maker)を作成し、変異酵母in vivoにおいてYACクローンにヒトテロメア機能を持たせることをこころみた。テロメレースは一般に付加するDNA配列を指定するRNA鋳型部分とDNA合成反応の触媒部位である蛋白質部分よりなる。酵母では、すでにRNA鋳型をコードする遺伝子TLClが同定されているので、in vitro DNA変異導入法により、鋳型配列をヒト型テロメア配列を指定するように変異させたhTLClを作成した。これをマルチコピープラスミッドにより酵母内で過剰発現させると、蛋白質部分はhTLClと結合して、ヒト型テロメア配列を合成するハイブリッド型テロメレースがin vivoにおいてできることが期待された。サザンハイブリダイゼーションとテロメア領域のクローニング、及びその塩基配列決定により、このようにして作成された酵母株HTM(Human Telomere Maker)は、その染色体末端にヒト型テロメア配列TTAGGGを持つことが確認された。このようにして染色体テロメアが全くヒト型である酵母株を作成することができたので、これに既に2.で作成したネオマイシン耐性遺伝子を含む882C10 YACクローンを導入したところ、その末端もヒト型テロメア配列を持つことが分かった。このことから、酵母細胞内でヒトセントロメア配列とテロメア配列を持ち、複製開始領域をも持つことが期待される改変YACクローンを作成することに成功した。