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パーキンソン病の発症・薬剤感受性に関連するSNPの探索と機能解析

孤発性パーキンソン病(PD)の発症には、複数の遺伝子および環境因子が関与すると考えられている。これまで我々は121個の候補遺伝子上の268個のSNP_s(一塩基多型)を用いた大規模な関連解析により、α-synuclein (P=5.1x10^<-14>,オッズ比OR = 2.23)を確実なパーキンソン病感受性遺伝子として同定し、報告した。また、白人でPDとの関連が報告されていたFGF20 (P =0.0053, OR = 1.24)の日本人での再現性も確認した。本研究では、新たなPD遺伝子同定のために、さらに候補遺伝子を増やして合計137個の候補遺伝子上の302個のSNP_sの関連解析を行った。遺伝子型タイピングは患者1403人、対照1938人を対象にTaqMan法で行った。その結果、新たなPD感受性遺伝子calbindin1を同定した(P = 7.1x10^<-5>, OR = 1.34)。さらに、α-synuclein,calbindin1, FGF20の3個のPD遺伝子のうち、最も強くPDと関連するα-synucleinを中心にして、統計学的組み合わせ解析を行った。calbindin1はα-synucleinのリスクを持たない群でPDと強く相関し(OR = 1.70)、逆にFGF20はα-synucleinのリスクアレルを持つ群でPDとより強く関連した(OR = 1.76)。Calbindin1はカルシウム結合蛋白であり、PD患者の黒質でcalbindin1陰性神経の脱落が陽性神経の脱落よりも強いことから、神経保護作用を持つと考えられている。組み合わせ解析から、calbindin1はα-synucleinとは独立に、一方、FGF20はα-synucleinと相乗的に、PD発症に関与していることが示唆される。我々は121個の候補遺伝子上の268個のSNPsを用いた大規模な関連解析により、α-synuclein(P=5.1×10^<-14>,OR=2.23)を確実なパーキンソン病(PD)感受性遺伝子として同定し、報告した。また、白人でPDとの関連が報告されていたFGF20(P=0.0053,OR=1.24)の日本人での再現性も確認した。今回、新たなPD遺伝子同定のために、さらに候補遺伝子を増やして合計137個の候補遺伝子上の302個のSNPsの関連解析を行った。孤発性パーキンソン病(PD)はアルツハイマー病についで高齢者に多い神経変性疾患である。多因子遺伝疾患のひとつであり、発症には複数の遺伝子・環境因子が関与する。本研究においては、大規模な候補遺伝子SNPsの関連解析により、これまでにαシヌクレインとcalbindin1の2つの確実なパーキンソン病(PD)感受性遺伝子を同定し、報告した(Hum Mol Genet,2006; Hum Genet,2008)。

特にαシヌクレインの複数のSNPsはこれまで報告されたPD感受性遺伝子のなかで最も強い関連をもち、日本人のみならず白人でも同様の関連が報告されている。通説としてαシヌクレインの過剰な発現・凝集がPDの発症に関与すると考えられている。我々はこの多型のリスクアレルを持つ人では、剖検脳でのαシヌクレイン遺伝子発現レベルが増加する傾向も見出し、αシヌクレインのSNPが何らかの機構で遺伝子発現レベルに影響する可能性があると考えている。この機構を解明することにより、αシヌクレイン発現レベルを抑えるような治療法・予防法の開発が期待される。この解析のために、まず、日本人・白人で共通してPDと強く関連するSNPを同定した。報告された論文、SNPデータベースを詳細に調べて連鎖不平衡の情報も加味し、追加タイピングも行った結果、共通SNPを複数同定できた。
前向きコホートによる「飲み放題」の利用が飲酒量に与える影響に関する研究

日本では24時間アルコール飲料の購入が可能であったり、多くの飲食店において飲み放題サービスが提供されるなど、未だにアルコールに対して寛容な環境がある。本研究は前向きコホートによって飲み放題システムの1回飲酒量に与える影響を明らかにする。本研究によって、アルコールと上手に付き合いながら社会で活躍するための大学生への教育や、大学生自身の飲み放題の利用が自分たちの飲酒量に与える影響を知り、自己選択を行うことが可能となる。また、飲み放題サービス提供者に対する提供方法等についての議論にも発展する可能性がある。
日本古代の予言（讖）と皇位継承

7-13世紀の東アジアの讖(予言)を分析し、讖が日本の皇位継承に果たした役割等を明らかにした。8世紀の立太子か即位には、必ず瑞亀や文字の奇瑞など図讖が出現している。それらが出現する方法と論理からみて、道鏡即位の託宣は図讖だが、道鏡法王就任の契機となった舎利出現は図讖ではない。それゆえ法王を皇位継承者とみることはできない。その後、天皇権威の変化により、8世紀末には図讖の皇位継承に果たす実質的役割は失われる。11世紀以降には、宋皇帝の正当性を示す宝誌和尚讖の影響を受け、石製聖徳太子讖が出現するが、当初は寺院の興隆を目的としていた。13世紀には戦乱・政権交代など再び政治史と結びつく讖が登場する。〔研究のおもな内容〕讖と皇位継承の研究成果の一部は、8世紀を中心に史学会大会で報告した。報告した内容は、史学会とは別に企画刊行予定の論文集に入稿した。関連して、以下の調査等を実施した。1平安前期の漢詩文における讖に関わる資料収集、2東アジアの讖との関係を調査するため、中国や朝鮮に関する資料調査・収集、3昨年度に引き続き、日本の皇位継承に関わる讖出現の背景にある祖先観を明らかにするため、朝鮮の祖先祭祀に関わる韓国語論文の翻訳、以上三点である。当該年度から本格的に進展させた讖と聖徳太子信仰の研究成果の一部は、中国仏教史研究会で要旨を報告した。関連して、以下の調査を実施している。1聖徳太子と予言に関する資料収集・整理と論文収集、2叡福寺宝物館が収蔵する伝平安後期出土・聖徳太子未来記の調査と東京大学史料編纂所所蔵の南北朝期の未来記の調査、3東アジアからの影響を考えるため、宝誌信仰や僧侶の往来について資料調査収集、以上の三点である。〔研究の意義及び重要性〕東アジアの王位継承と讖の関係を比較するなかで、昨年度に引き続き、日本の特色を明確にすることができた。第一に、皇位継承に関わる日本の讖の出現は、おおむね8世紀に限定されるのであり、それは皇位継承を支える祖先霊や神仏のあり方に対応していること。第二に、孝謙・称徳天皇期の讖文出現における仏教の影響は限定的であること。第三に、中国では頻繁に出現する石の讖文だが、日本では11世紀に出現する聖徳太子未来記になって初めて石製讖文が出現すること。それは、入唐僧・入宋僧などを媒介に、中国文化の影響を受けている可能性が高いことが明らかになってきた。東アジアの讖文の検討を踏まえつつ、讖文およびその出現主体でもある祖先霊の検討を行った。また、とくに聖徳太子讖(聖徳太子未来記)の解明に重点を置いた。(1)一昨年度、途中まで翻訳していた祖先祭祀の論文(韓国語)の翻訳を継続し、新羅宗廟制の形成が、外交政策や唐礼受容と一体の現象であるとする研究成果を学んだ。(2)桓武期の祖先祭祀における唐礼受容と、祥瑞・讖文の出現の関連について検討・報告した。(3)伝宝誌撰「邪馬台詩」の初見史料ともいわれる『延暦寺護国縁起』掲載「邪馬台詩延暦九年注」の写本調査を実施した。延暦九年成立に確証は得られないが、文字の校訂に問題はなく、従来の研究で指摘される点に問題がないことを確認した。(4)聖徳太子と宝誌はともに観音の化身とされるなど共通点が多く、宝誌の信仰は8世紀末には日本に伝わっていた。その点を踏まえ、両者の讖文を通時的に検討し、とくに11世紀に聖徳太子墓から出土した石製聖徳太子未来記と、宋代に皇帝から重視される宝誌讖の間に関係があることを明らかにした。あわせて論文としてしてまとめており、刊行が確定している。〔研究のおもな内容〕1.研究成果の一部を論文としてほぼまとめることができた。2.東アジアにおける讖の資料の収集をさらに実施した。『古今図書集成』や漢籍のデータベース、あるいは朝鮮史のデータベースを活用して調査をすすめるとともに、朝鮮の金石文の調査も実施した。3.予算の関係で、わずか1つではあったが、韓国語の朝鮮古代の祖先祭祀に関わる論文を翻訳した。日本の霊的権威と比較することが目的である。4.中国や日本近世の祥瑞に関わる資料を閲覧し、讖に関する資料収集を実施した。

その際、勤務先図書館が所蔵する漢籍を利用するとともに、名古屋市の図書館においても調査を実施して、関連資料の収集に努めた。5.日本古代の神判に関する資料の収集を実施した。日本古代の讖出現に、神判の要素が見受けられるためである。〔研究の意義及び重要性〕東アジア世界における讖出現の具体的様相が明らかになり、日本古代に出現した讖文の歴史的位置が明確になってきた。一つは、王位継承や王朝の正当性を示すために、讖が利用されることは一般的であり、唐代前期や武則天期には顕著であったことから、日本の讖もこの影響を受けていることは間違いない。もう一つは、大陸では材質が石であることが多いが、日本の8世紀前後にはそうした例はなく、素材の面では大きく異にしていることが明らかになった。さらに、日本古代の讖文が孝謙・称徳天皇期に集中して出現する理由も、唐や武則天などの影響だけでなく、当時の皇位継承の構造的特質である点が明らかになってきた。「研究目的」において、8世紀日本で出現する文字の奇瑞が、祥瑞ではなく皇位継承と関わる讖文であるということの意味を追求するため、とくに4点の課題を示した。そのなかでも、(1)唐の讖文の影響と在来の思想の顕現との関わりを示すことと、(2)道鏡即位と讖との関係を提示すること、(4)9世紀との相違から、8世紀と9世紀の皇位観の変化を明らかにするという点は、おおむね達成することができた。(なお、番号は「研究目的」作成時のものである)一方で、「研究目的」の(3)日本と唐等の皇位継承観の相違を考える上で抑えるべき、祖先観については、なお十分な成果を得ていない。この点を踏まえ、研究計画でも示していたように、讖と聖徳太子信仰との関係について研究を進めることで、9世紀以降の東アジアとの交流を踏まえた日本の讖の展開を明らかにしてきた。当該年度においては、学会等における研究報告を実施するとともに、論文1本を成稿することができたのは、上記の活動の結果である。以上の点から、おおむね順調に進展していると評価するものである。順調に進展している点は、(1)研究成果の一部を論文としてまとめることができつつあることと、(2)東アジアの讖の用例を多く収集することができたこと。不十分であった点は、当初予定していた9世紀以降の説話集や漢詩文・和歌集などの調査が実施できなかった点があげられる。第一に、聖徳太子による讖文(聖徳太子未来記)の出現が、東アジアのどのような影響を受けているのかを明確にすることを通して、天皇権威の変化を示す。そのため、日本と唐・宋、新羅・高麗における人と物の交流を具体的に調査していく。とくに、宝誌と聖徳太子に注目する。なぜならば、中国における宝誌信仰は、皇帝権力とも関わるほどの影響をもつことが明らかにされているだけでなく、聖徳太子と宝誌はともに観音の化身とされ、予言も行うなど共通点が多い。また、日本の僧侶はしばしば宝誌関連の物や情報を請来されていることが知られる資料的にも豊富である。第二に、課題としている東アジアにおける祖先祭祀、とくに祖先神の比較検討も並行して進める。「研究目的」でも示したように、祖先祭祀のあり方は、皇位継承や王権に関わる讖文出現に関係すると予測されるからである。以上二つの点を中心に研究をすすめ、その成果をすみやかに公表する。1.論文を研究成果の一部として発表すること。2.9世紀以降の日本古代の讖文を調査・収集する。その際、皇位継承だけでなく、当初の研究計画にも記載されたように、広く政治史と関わる讖や、聖徳太子信仰・弘法大師信仰などと関わる讖文を検討する。3.東アジアの讖の収集を継続するとともに、とくに9世紀以降における人物の往来を検討することで、讖の伝播と受容についての理解を深めることができると考える。
対話を活性化する比較鑑賞題材の開発と授業モデルの確立

1.比較鑑賞のための図版資料としての大判複製画の収集を行い、活用した。2.教育学部の必修科目である『美術鑑賞』と一般教育科目である『美術鑑賞入門』とにおいて、様々な比較鑑賞授業の実践を試み、一応の成果を上げた。3.論文『比較鑑賞で読み解くフェルメールの造形性』を執筆し、岡山大学大学院教育学研究科研究集録第158号に投稿した。4.中学校向けに改定した授業モデルを使って、3人の現場の先生方に研究授業を行ってもらい、撮影してDVDに記録した。5.論文『中学校美術科の鑑賞教育における比較鑑賞題材の可能性』を執筆し、岡山大学大学院教育学研究科研究集録第162号に投稿した。1.比較鑑賞のための図版資料やデータの収集と作品調査大判複製画を39枚入手できたことで、今後複製画を用いた比較鑑賞授業の可能性が大きく広がった。今後も予算の許す範囲で収集を続けたい。また多数の文献資料も揃えることができたので、鑑賞授業のためのデータ作りがより充実した。作品調査に関しては東京を中心に5回行うことができ、自身の鑑賞体験としても極めて有効であった。2.作品理解と作品へのアプローチの視点の研究前期の『美術鑑賞』と後期の『美術鑑賞入門』の授業の準備段階で、主に新題材の開発の際に集中的に行った。中にはこちらの構想が上手く受講生に伝わらなかったものもあるが、おおむね授業に役立てることができた。3.比較鑑賞題材の開発・改訂と授業実践検証前期の『美術鑑賞』の授業において「江戸狩野VS京狩野」「鏡の迷宮」「ゴッホVSミレー、浮世絵、ラーション」の新題材を開発し、3つの旧題材を改訂した。後期の『美術鑑賞入門』でも「大友克洋VSスクイテン」と「日米絵本対決」の新題材を開発し、4つの旧題材を改訂した。いずれも授業実践では期待通りの成果を上げることができた。それらの一部は10月及び12月の「教員免許状行進講習」の場で、現場の教員を対象にして検証を試み、中学校での実践化に向けての自信を深めることができた。また旧題材の改訂の中では「ミュシャとアール・ヌーヴォーのポスター」が大変好評で、折りから岡山で開催された『ミュシャ展』では、同内容を一般対象の講演会でも実践し、大変好評で、追加講演を依頼されたほど強い反応を得ることができた。1.比較鑑賞のための図版資料やデータの収集と作品調査図版資料として活用可能な大判複製画の収集は順調に進んでいる。また図版データの収集と作品調査も順調で、それらをどう組み合わせて、どう生かすかを検討中である。2.比較鑑賞の題材開発大判複製画を使った比較鑑賞題材を4種開発することができた。それぞれカラヴァッジョ、ルーベンス、ラ・トゥール、ベックリンの代表作と同一作家によるその類似作を比較するものである。授業実践は平成27年度を予定している。3.大学における比較鑑賞の授業実践教育学部の必修専門科目である『美術鑑賞』において、ラ・トゥール、スーラ、マグリット、浮世絵美人画などの作品を題材に、様々な比較鑑賞を試みた。4.研究論文の執筆すでに何度も授業実践を重ねてきたフェルメール作品の比較鑑賞に関する論文を執筆し、岡山大学大学院教育学研究科の研究収録第158号に発表した。題目は『比較鑑賞で読み解くフェルメールの造形性』で、A4、18ページ。5.現場での実践依頼計画と研究協力者の決定年度末の時点で、中学校向けに改定した授業モデルを3種用意し、3人の現場の先生方に授業実践の依頼が済んでいる。1.比較鑑賞のための図版資料として活用可能な大判複製画の収集は順調に進んだ。また図版データの収集と作品調査も順調で、それらを組み合わせて、生かす方法も決定した。2.大判複製画を使った比較鑑賞題材を4種開発し、そのうちカラヴァッジョ、ルーベンス、ラ・トゥールで授業実践を行い、一応の成果を上げることができた。3.教育学部の必修専門科目である『美術鑑賞』において、応挙と若沖、北斎の「大波」、リクテンスタインなどの作品を題材に、様々な比較鑑賞を試みた。また一般教育科目である『美術鑑賞入門』において、レオナルドの《最後の晩餐》、ゴッホとラーション、浮世絵美人画、ロックウェル、アニメ背景美術などの作品を題材に、様々な比較鑑賞を試みた。4.中学校向けに改定した授業モデルを3種用意し、3人の現場の先生方に依頼して、それぞれ中1、中2、中3で授業実践を行った。合わせて書く授業の撮影をし、DVDに記録した。5.本研究に関するまとめとして論文『中学校美術科の鑑賞教育における比較鑑賞題材の可能性』を執筆し、岡山大学大学院教育学研究科の研究集録第162号に投稿した。

大判複製画が大幅に値上がりするという予定外の状況が生じ、予算繰りが厳しくなったため、予定の量には届かなかったが、比較鑑賞に使えそうな資料は一応揃いつつある。それらをもとにした比較鑑賞の題材開発・授業実践も順調に進んでいる。それらの中から3つの題材を取り出し、中学校向けの授業モデルに改訂できたことと、最終年度における現場の授業実践者が確定したことは大きな収穫である。また長年実施し、好評を得てきたフェルメールに関する比較鑑賞の授業実践を、1年遅れではあるが、学術論文としてまとめられたことで一区切りが着いた感がある。絵画鑑賞教育最終年度では中学校での授業実践を記録するとともに、その分析を行い、現場の研究協力者を交えた形で、当研究の目的である「比較鑑賞によって対話が活性化する」という仮説を検証していかなければならない。その後は学会での研究発表を計画しているが、発表予定の学会の開催次期が例年8月のため、1学期での授業実践をまとめて発表することは、時間的に厳しいので、次年度に発表がずれ込む可能性が出てきている。ただし比較鑑賞の理論、比較鑑賞の題材例、そして中学校での実践記録を合わせた形の冊子の作成は、最終年度中に行う予定である。平成25年度まで附属幼稚園長の職を兼任していたこともあり、研究成果の一部である『比較鑑賞で読み解くフェルメール』を論文にまとめる作業が予定よりも3ヶ月ほど遅れていて、現在執筆中である。しかし大判複製画や図版、データの収集及び作品調査はほぼ予定通り進めることができたので、今後の研究への準備は整いつつある。さらに合わせて7つの新題材を授業実践の場に乗せることができたこと、旧題材の改訂が順調に進んだことは、研究への意欲を高める効果があったように思われる。また検証の場として鑑賞教育に興味を持っている現場の教員が集まる「教員免許状行進講習」を2度にわたって活用し、題材内容と授業方法に関し大きな支持と意見を得たことは、今後の研究への自信を深めることとなった。同様に年度末の3月に2度にわたって行うこととなった『ミュシャ展講演会』も研究の方向性及び達成度を測るよい機会となった。残額が端数で小額であったため繰り越すことにした。平成26年度は以下の作業を進めていく予定である。1.研究論文「比較鑑賞で読み解くフェルメール」を夏までに完成させる。内容はクイズ形式を用いてフェルメールの造形の特色を直感的に掴ませようとするもので、ミレー、ミュシャ、ロックウェルなどと並んで、完成度が滝と思われる。2.前年度に引き続き「比較鑑賞のための図版資料やデータの収集と作品調査」「作品理解と作品へのアプーチの視点の研究」「比較鑑賞題材の開発・改訂と授業実践検証」を行い、研究を深めていく。3・夏以降は「現場での授業実践計画」を立案し、研究協力者を決定し、平成26年度1学期での実践を目指して準備していきたい。今のところ研究協力者としては、自身の指導学生で現在中学校に勤務している者を中心に考えているが、今年度の「教員免許状行進講習」での現場の先生方との出会いも考慮していきたい。消耗品を購入予定。残額が端数で少額であったため繰り越すことにした。消耗品を購入予定。
遷移金属イオン置換ハイドロキシアパタイトの水熱合成と浄化特性評価

水酸アパタイト(HAp)はリン酸カルシウムの一種であり、生体親和性、有機物やタンパク質の吸着特性、陽陰イオン交換特性を有する。これらの特性はHApの結晶形態や構造、露出する結晶面に依存すると考えられることから、結晶形態を制御することで更なる高機能化と選択性付与が期待できる。本研究では、浄化材料や触媒の担体としての応用を目的として、金属酸化物と水酸アパタイトを複合化した光触媒(TiO2修飾HAp)の水熱およびソルボサーマル法による合成と、触媒担体としての水酸アパタイトの吸着特性制御、および金属イオンを結晶構造へ導入したHApの水熱合成の合成条件の検討に取り組んでいる。平成30年度では、HAp単体の吸着特性について詳細に調べるため、昨年度と同様のアルコールを利用したソルボサーマル法により種々の結晶サイズを有するHAp針状結晶を合成し、メチレンブルーと酸性フクシンの色素を用いた吸着試験を行い吸着特性の評価と結晶形態、サイズやゼータ電位の関係について、ひきつづき調査した。その結果、針状のHAp結晶サイズが小さくなるほど、ゼータ電位は負から正へと変化することが分かった。また塩基性および酸性色素の吸着量は、このゼータ電位の違いによって変化する傾向が観察され、結晶サイズを制御することで色素の吸着量を制御できることが示唆された。これらの知見は金属酸化物との複合体および金属イオン含有HApを用いた材料合成の設計指針となると期待される。一方、HAp結晶形態・サイズ制御のためのソルボサーマル法の新たな合成手法の検討として、カルボン酸とアルコールを利用したプロセスにより繊維状HAp結晶の合成に成功した。平成30年度において、昨年度に引き続き水酸アパタイト(HAp)単体の吸着特性と結晶形態、サイズとの関係について詳細に明らかにできた。金属イオン含有HApの合成実験は途中段階であるものの、今回のHAp単体における成果は本研究の材料設計において基礎となるデータであり、今後の研究遂行に役立つと期待できる。今後は、水酸アパタイト(HAp)構造中への金属イオンの導入をひきつづき試みるとともに、構造制御のための水熱法およびソルボサーマル法による合成条件の検討についても継続する。さらに、これまで水熱およびソルボサーマル法による合成を報告しているTiO2ナノ粒子を担持した複合体試料(TiO2修飾HAp)の特性と比較することで、材料・構造設計の違いによる特性の差について考察する。骨の無機成分として知られる水酸アパタイトは、生体親和性、有機物吸着特性、イオン交換特性を有するとともに、種々の陽陰イオンを結晶構造に置換することで新たな機能を付与できると期待される。また、これらの特性は結晶構造や形態により変化すると考えられ、これらの構造を制御することが重要である。本研究では、まず光触媒特性を有する酸化チタンナノ粒子を表面に担持したスポンジ状および針状結晶を有する水酸アパタイトを水熱合成し、有機分子の吸着と分解特性を調べた。紫外光照射下での色素の退色試験を行った結果、塩基性色素であるメチレンブルーでは針状結晶から成る試料がわずかに早い退色速度を示した。一方、酸性色素である酸性フクシンを用いた場合では、スポンジ状結晶から成る試料の方が明らかに退色速度は早くなった。吸着試験の結果から、スポンジ状の形態をもつ水酸アパタイトは針状試料よりもゼータ電位が正に近い値を示し、比表面積も大きくなることから酸性フクシンが試料表面に吸着しやすくなったと考えられる。さらにチタンを水酸アパタイト構造中へ置換する合成手法の検討として、リン酸三カルシウムとイソプロピルアルコールを用いたソルボサーマル法による合成も検討した。その結果、チタンは水酸アパタイト構造中よりも水酸アパタイト表面に酸化チタンナノ粒子として析出し、結晶構造中への置換は見られなかった。生成する水酸アパタイトは針状の形態を示し、イソプロピルアルコールの濃度により針のアスペクト比を変化させられることがわかった。得られた試料は紫外光照射下でメチレンブルーに対して明らかな退色反応を示した。これらの知見は、今後の合成手法および特性制御を検討する上で、有用であると考えられる。今年度において、酸性色素の吸着特性における水酸アパタイトの結晶形態の効果について詳細に検討することができ、今後の特性制御のための材料設計の指針を得ることができた。リン酸カルシウムの一種である水酸アパタイトは、生体親和性、有機物吸着特性、イオン交換特性を有するとともに、酸化物との複合化や種々の陽陰イオンを結晶構造中に置換することで、新たな機能を付与できると期待される。特に、吸着特性を制御することができれば触媒や吸着剤など優れた浄化材料として応用できると期待される。本研究では、浄化材料としての応用を目的として、遷移金属および金属酸化物と水酸アパタイトを複合化した光触媒(TiO2修飾HAp)の合成と、触媒担体としての水酸アパタイトの特性制御に取り組んでいる。平成29年度では、水熱法およびソルボサーマル法により合成したTiO2修飾HApの吸着特性を、酸性および塩基性色素を用いて詳細に調べた。HApのゼータ電位は結晶形態およびサイズにより変化することがわかり、それにより吸着特性も変化することを明らかにした。特に、本実験で使用したアルコールを用いたソルボサーマル合成法は、HApのサイズを容易に制御できることから有用な合成手法であるといえる。一方、HApへTiO2ナノ粒子を担持させるとゼータ電位は負の値へと変化し、ナノ粒子の担持量がゼータ電位へ影響し、吸着特性も変化することもわかってきた。

このことから、複合体の場合は、吸着特性におけるナノ粒子の影響も考慮する必要があることが分かった。ゼータ電位をHApの形態や構造のみで制御するためには、遷移金属などのイオンを構造へ置換する手法がよいと考えられる。平成29年度において、水酸アパタイトの吸着試験の評価に焦点をあてて実験し、水酸アパタイト結晶の形態や構造が吸着特性に与える影響を明らかにできた。一方、これらの知見から材料設計の指針を得ることができたものの、目的とする水酸アパタイト結晶構造中へのイオン置換のための合成手法の検討が途中段階である。水酸アパタイト(HAp)はリン酸カルシウムの一種であり、生体親和性、有機物やタンパク質の吸着特性、陽陰イオン交換特性を有する。これらの特性はHApの結晶形態や構造、露出する結晶面に依存すると考えられることから、結晶形態を制御することで更なる高機能化と選択性付与が期待できる。本研究では、浄化材料や触媒の担体としての応用を目的として、金属酸化物と水酸アパタイトを複合化した光触媒(TiO2修飾HAp)の水熱およびソルボサーマル法による合成と、触媒担体としての水酸アパタイトの吸着特性制御、および金属イオンを結晶構造へ導入したHApの水熱合成の合成条件の検討に取り組んでいる。平成30年度では、HAp単体の吸着特性について詳細に調べるため、昨年度と同様のアルコールを利用したソルボサーマル法により種々の結晶サイズを有するHAp針状結晶を合成し、メチレンブルーと酸性フクシンの色素を用いた吸着試験を行い吸着特性の評価と結晶形態、サイズやゼータ電位の関係について、ひきつづき調査した。その結果、針状のHAp結晶サイズが小さくなるほど、ゼータ電位は負から正へと変化することが分かった。また塩基性および酸性色素の吸着量は、このゼータ電位の違いによって変化する傾向が観察され、結晶サイズを制御することで色素の吸着量を制御できることが示唆された。これらの知見は金属酸化物との複合体および金属イオン含有HApを用いた材料合成の設計指針となると期待される。一方、HAp結晶形態・サイズ制御のためのソルボサーマル法の新たな合成手法の検討として、カルボン酸とアルコールを利用したプロセスにより繊維状HAp結晶の合成に成功した。平成30年度において、昨年度に引き続き水酸アパタイト(HAp)単体の吸着特性と結晶形態、サイズとの関係について詳細に明らかにできた。金属イオン含有HApの合成実験は途中段階であるものの、今回のHAp単体における成果は本研究の材料設計において基礎となるデータであり、今後の研究遂行に役立つと期待できる。これまで得られた知見を参考としつつ、水酸アパタイト構造中へのチタンおよび他の金属イオンの置換を試みるとともに、構造制御のための水熱法およびソルボサーマル法による合成手法の検討を進める。さらに、特性と水酸アパタイトの結晶構造および形態の関係性について引き続き評価を進める。これまで得られた知見を参考としつつ、水酸アパタイト構造中へのチタンおよび他の金属イオンの置換をひきつづき試みるとともに、構造制御のための水熱法およびソルボサーマル法による合成手法の検討を進める。さらに得られた試料を、これまでのナノ粒子を担持した複合化試料の特性と比較することで材料設計の違いによる特性の差を明確にする。
消化器癌(口腔癌)の遺伝子的解析と臨床応用

口腔扁平上皮癌において、ヒト全遺伝子搭載マイクロアレイを用いて、多くの遺伝子の発現状態を調べ、さらに、多色素標識2次元電気泳動・MALDI-TOF-MS質量解析により口腔癌関連因子を網羅的に検索し、実際に役立つ分子腫瘍マーカーや分子標的治療の開発に応用することを目的とする。まず、口腔癌細胞株、正常角化細胞株に関してヒト全遺伝子が搭載されているaffymetrix社製GeneChipを使用し遺伝子発現パターンを調べた。さらに、ネットワーク形成をする遺伝子を調べたところ、5111遺伝子と200ネットワークを同定できた。現在、多くの臨床材料を用いて、RNAの発現量やタンパクの発現量をrealtimePCRや免疫組織染色により確認し臨床指標と比較を行い、各遺伝子の臨床応用の可能性検討する予定である口腔扁平上皮癌において、ヒト全遺伝子搭載マイクロアレイを用いて、多くの遺伝子の発現状態を調べ、さらに、多色素標識2次元電気泳動・MALDI-TOF-MS質量解析により口腔癌関連因子を網羅的に検索し、実際に役立つ分子腫瘍マーカーや分子標的治療の開発に応用することを目的とする。現在、多くの臨床材料を用いて、RNAの発現量やタンパクの発現量をrealtimePCRや免疫組織染色により確認し臨床指標と比較を行い、各遺伝子の臨床応用の可能性検討する予定である
エアロゾルデポジション法によるマルチファンクショナル磁性厚膜の創製

目的:本研究では、高速で厚膜成形が可能なエアロゾルデポジション(AD)法にてコンポジット膜の高速成形を試み、マルチファンクショナル磁性厚膜の開発を目的とする。本年度は、強磁性粉末として飽和磁化の高いFe系合金粉末、絶縁性粉末としてアルミナを選び、両粉末を単数または複数のエアロゾル室、ノズルを用いて両相から構成される複合膜、積層膜を形成し磁気特性、高周波特性、電気抵抗を調べた。実験方法:エアロゾルチャンバーを強磁性粉用、絶縁粉用の2つを用意し、デポジションチャンバー内にもそれぞれ独立したノズルを設け、同時成膜または交互成膜により複合膜と積層膜を作成した。基板のスキャン速度、ガス種、ガス流量による噴射速度を制御することによって積層膜における各層の厚さを変化させた。得られた膜の磁気特性、電気抵抗、高周波得性、さらには電磁ノイズ抑制効果を測定し、複合化、積層化による高周波特性向上の可能性について検討した。結果:得られた結果をまとめると以下のようになる。(1)搬送ガスにN2ガスを用いることにより、表面ラフネスが低下し、膜厚が均一、かつ層構造を有する厚膜が成膜できることがわかった。(2)Fe成膜と同時にノズル角度を傾けてアルミナを成膜することにより、薄いアルミナ層に隔たれた数μm以下のFe層から構成される10層以上からの積層膜を形成することに成功した。(3)結果的にこの積層膜では電気抵抗が高くなり、1GHz10GHzにおいて反射係数S11が-10dB以下となり、反射が抑えられた。(4)さらにこの積層膜では電磁ノイズ抑制効果を示すΔPloss/Pinが0.6以上の値を示す結果が得られ、フェライトめっき膜、グラニュラー膜に匹敵するような特性が得られた。本年度は、強磁性粉末として飽和磁化の高いFe系合金粉末、絶縁性粉末として希土類酸化物のY2O3粉末を選び、両相から構成される積層膜を形成させ、作製条件などと磁気特性、高周波特性、電気抵抗の関係について調べた。実験方法:積層膜を作製するため、エアロゾルチャンバーを強磁性粉用、絶縁粉用の2つを用意し、デポジションチャンバー内にもそれぞれ独立したノズルを設け成膜した。基板のスキャン速度、回転速度、ガス種、ガス流量による噴射速度を制御することによって積層膜における各層の厚さを変化させた。得られた膜の磁気特性、電気抵抗、高周波得性を測定し、組織を観察し、積層化による高周波特性向上の可能性について検討した。(1)搬送ガスにArガスを用いると表面ラフネスが大きくなるが、N2ガスを用いることにより膜厚が均一、かつ層構造を有する厚膜が成膜できることがわかった。(2) As-depo.状態の積層膜において、Fe層の充填率は低かったが、0.71.1Tなる飽和磁気分極Jsが得られ、従来のフェライトよりも高飽和磁気分極を示すことがわかった。(3) As-depo.状態の積層膜では700MHz程度あった共鳴周波数frも熱処理によって320MHzへと低下し、これに伴って透磁率の実部μ'も23程度上昇した。この上昇は熱処理により成膜時に導入された歪みが緩和されたためと考えられる。
リポソ-ム性強磁性体微粒子と,高周波誘導加熱による加温法の研究

癌の集学的治療法の一つである温熱療法は、腫瘍の選択的加温法の開発に関してより一層の検討が必要である。本研究では、強磁性体である四三酸化鉄(Fe_3O_4)微粒子を、リポソ-ム膜で覆い、腫瘍親和性物hematoporphyrinを結合させたリポソ-ム性強磁性体微粒子(HP-LM)を作製し、腫瘍内に取り込ませ、高周波誘導加温を施行し、その有用性につき検討を加えた。HP-LM作製法では、超音波照射条件、リポソ-ム膜の主材であるリン脂質の種類による差異、Fe_3O_4の形状による影響およびcholesterol添加量によるリポソ-ムの安定性について検討を加えた。egg PC 1g、cholesterol 210mg、hematoporphyrin 90mgをchroloform:methanolの混合溶媒で溶解し脂質分子膜を作製後、150ÅのFe_3O_4を添加し、30分超音波照射する方法がより安定なリポソ-ムを大量に作成可能であった。家兎加温実験では、高周波誘導加温装置は周波数400KHz、出力10kw、コイル径90mmとし、家兎下腿部にVX-2腫瘍細胞を1.5×10^7個移植し、腫瘍径3cmとなった時点で、(1)群HP-LM200mg/kg投与群、(2)群Fe_3O_4100mg/kg投与群、(3)群非投与群に分けて加温し、その効果を検討した。10分間加温で、腫瘍中心部において、(1)群では14.8°C、(2)群では10.6°C、(3)群では4.4°C上昇した。(1)群は、(2)群、(3)群に対し、温度上昇に有意差(P<0.05、P<0.001)を認めた。組織像では、HP-LM投与群で、腫瘍組織内および周辺部の毛細血管内に鉄の微粒子が多数染色され、さらに腫瘍の変性、壊死を認めた。本研究では、HP-LMの経動脈的投与により強磁性体微粒子を腫瘍に集積させ、高周波誘導加温を行うことで腫瘍の選択的加温が可能となり、有用な治療法になりうると考えられた。今後,至適加温域へのコントロ-ル、腫瘍へのより大なる集積を目的に、HP-LMの性状、投与法、加温法について、より良好な選択的加温を目標に研究中である。癌集学的治療法の一つとして、温熱療法は施行されているが、腫瘍の選択的加温法に関して、より一層の検討が必要である。本研究は、四三酸化鉄(Fe_3O_4)微粒子を、免疫原性および毒性はないリポソームの脂質分子膜で覆い、さらに腫瘍親和性物質であるヘマトポルフィリンを結合させリポソーム強磁性体微粒子(HP-LM)を作製し、高周波誘導加熱による腫瘍に対する選択的な加温法の開発を目的として検討を行った。

HP-LMはホスファチジルコリン、コレステロール、ヘマトポルフィリンジメチルエステルを溶解後、溶媒を除去し、平均粒径150〓の強磁性体微粒子と蒸溜水を加えて超音波照射し、作製した。HP-LMの透過型電子顕微鏡像では、強磁性体微粒子の周囲に、リポソーム膜が形成されていた。家兎加温実験では、高周波誘導加熱装置は、周波数400KHz、出力10Kw、コイル径90mmを使用した。家兎下腿部にVX-2腫瘍細胞を1.5×10^7個移植し、腫瘍径3cmとなった時点で動注群では、HP-LM、Fe_3O_4を、それぞれ200mg/kg大腿動脈より投与し直後に加温した。静注群は同様に耳静脈より投与し24時間後に加温した。対照群は非投与とし、温度計測は腫瘍中心部と腫瘍辺縁部で施行した。HP-LM投与動注群では、10分間加温で、腫瘍中心部で16.13°C、腫瘍辺縁部で19.45°C上昇、Fe_3O_4投与動注群と対照群の両群に対して有意差を認めた。静注群では、10分間加温で、腫瘍中心部で、5.65°C、腫瘍辺縁部で6.40°C上昇を認めるものの、Fe_3O_4投与静注群と対照群の両群と対比しても有意差はなかった。組織像では鉄染色で、動注群において、腫瘍中心部、および辺縁部の毛細血管内、さらに腫瘍細胞内にも鉄の微粒子が染色されていた。現在、動注群では腫瘍に高率に集積し有効な加温が得られたが、静注群では網内系への取込みも多く腫瘍への集積は十分でない。投与法、加温法についてさらに検討中である。癌の集学的治療法の一つである温熱療法は、腫瘍の選択的加温法の開発に関してより一層の検討が必要である。本研究では、強磁性体である四三酸化鉄(Fe_3O_4)微粒子をリポソ-ム膜で覆い、さらに腫瘍親和性物質であるhematoporphyrinを結合させたリポソ-ム性強磁性体微粒子(HP-LM)を作製し、腫瘍内に取り込ませ、高周波誘導加温を施行し、その有用性につき検討を加えた。HP-LM作製法では、超音波照射条件およびリポソ-ム膜の主材であるリン脂質の種類による差異、Fe_3O_4の形状による影響およびcholesterol添加量の有無によるリポソ-ムの安定性について検討を加えた。egg PC 1g、cholesterol 210mg、hematoporphyrin 90mgをchroloform:methanolの混合溶媒で溶解し脂質分子膜を作製後、150ÅのFe_3O_4を添加し、30分照射する方法がより安定なリポソ-ムを大量に作成可能であった。家兎加温実験では、高周波誘導加温装置は周波数400KHz、出力10kw、コイル径90mmとし、家兎下腿部にVX-2腫瘍細胞を1.5×10^7個移植し、腫瘍径3cmとなった時点で、(1)群HP-LM200mg/kg投与群、(2)群Fe_3O_4100mg/kg投与群、(3)群非投与大腿動脈結紮群、(4)非投与群に分けて加温し、その効果を検討した。10分間加温で、腫瘍中心部において、(1)群HP-LM投与群では14.8°C、(2)群Fe_3O_4投与群では10.6°C、(3)群非投与大腿動脈結紮群では6.5°C、(4)群非投与群では4.4°C上昇した。(1)群は、(2)群、(3)群、(4)群に対し、温度上昇に有意差(P<0.05、P<0.001、P<0.001)を認めた。組織像では、HP-LM投与群で、腫瘍組織内および周辺部の毛細血管内に鉄の微粒子が多数染色され、さらに腫瘍の変性、壊死を認めた。本研究では、HP-LMの経動脈的投与により強磁性体微粒子を腫瘍に集積させ、高周波誘導加温を行うことで、腫瘍のより選択的加温が可能となり、有用な治療法になりうると考えられた。
血管内皮細胞障害に対する抗心不全薬の保護効果解明に関する細胞生物学的研究

心不全の長期予後に対する強心薬の有効性の差異を解明するため、心不全患者血清中で上昇することが知られている腫瘍懐死因子(TNF-α)による細胞傷害に対する各種強心薬の効果につきin vitroの系で検討した。^<51>Crで標識したマウス線維芽細胞L929細胞を、マウスTNF-α(1ng/ml)、各種強心薬(10^<-5>-10^<-4>M)とともに12時間培養後上清中の^<51>CRを測定し、細胞傷害に対する強心薬の保護効果を定量的に評価した。VesnarinoneとPimobendanは濃度依存的にTNF-αによる細胞傷害を軽減し、細胞保護効果を有することが判明した。Amrinoneに対するVesnarinoneの有効性は、臨床試験、並びにウイルス性心筋炎による心不全モデルでも既に確認されており、今回の結果と一致する。Vesnarinoneによる心不全の長期予後の改善機序として、TNF-αによる細胞傷害に対する保護効果の関与が示唆されるとともに、このin vitroの実験系は抗心不全薬の作用機序解明、及びそのスクリーニングに有用であると考えられた。
細胞外微小環境を介した体軸形成原理の解明

哺乳動物初期胚においては、周辺の細胞表面や基底膜などに存在する細胞外マトリックス分子と分泌性シグナル因子が細胞外微小環境を構成する。特に前後軸形成過程では、短時間で細胞の配列や胚内での位置がダイナミックに変化しているが、細胞外マトリックスの分子的実体や細胞外マトリックス分子が担う細胞非自律的な機能は不明な点が多い。本研究では、マウス前後軸形成過程で、細胞外マトリックス分子などによって構成される微小環境が、細胞動態にどのような影響を与えるのか解明することを目的に研究をすすめている。平成28年度については、着床前後の胚(4.55.5日目胚)を対象に下記の内容を明らかにした。Lama1遺伝子欠損マウス胚(ラミニンα1欠損胚)は、胚性致死を示すが、細胞動態の詳細は明らかにされていない。そこで、着床前後の胚を用いて、光学顕微鏡レベル及び電子顕微鏡レベルでの組織学的解析、in situハイブリダイゼーションや免疫染色による分子マーカーを用いた発現解析を行った。その結果、Lama1欠損胚では、着床後ライヘルト膜がほとんど形成されないこと、受精後5.5日目まで(着床後1日目)はほぼ正常に発生するが、6.5日目では胚全体の形状が大きく変形し、多くの形態的異常を示すことが分かった。Lama1欠損胚においてライヘルト膜を構成する他の細胞外マトリックス分子の発現を解析したところ、原始内胚葉や壁側内胚葉において、コラーゲンIVを始めとする他の細胞外マトリックス分子の沈着がほとんど観察されなかった。これらの結果は、マウス着床期におけるライヘルト膜(基底膜)の沈着にlama1遺伝子が必須であることを示唆している。4年間の研究計画の3年間を終えた時点ではあるが、概ね研究計画に沿って研究は進んでいる。細胞外マトリックス分子がどのような細胞動態を制御しているのかについては、まだ明確な解答が得られる段階までには至っていない。しかし、本研究計画の最大の焦点である細胞外マトリックス分子の分布とマウス胚形態との関係性については上述したような大きな進展があった。今後も当初の目的に沿って着実に進めていきたい。現在までに、マウス初期体軸形成過程における細胞外マトリックス分子の局在分布については、ほぼ明らかにすることに成功した。更に、Lama1欠損マウス胚の表現型解析を行うことで、ライヘルト膜(基底膜)の機能について明らかにしつつある。来年度以降も継続してLama1欠損マウス胚の表現型を詳細に解析することで、細胞外マトリックス分子による細胞動態制御機構を明らかにしたい。特に、着床胚期において、ラミニンが壁側内胚葉で発現すること、ノックアウト胚では初期胚性致死を示すことから、マウス体軸形成期におけるラミニン分子の機能を詳細に解析することを計画している。当初の予定通り物品費・旅費・動物導入費などとして計画的に使用する。哺乳動物初期胚においては、周辺の細胞表面や基底膜などに存在する細胞外マトリックス(ECM)分子と分泌性シグナル因子が構成する細胞外微小環境を介して細胞の挙動や運命が支配されている。特に前後軸形成過程では、短時間で細胞の配列や胚内での位置がダイナミックに変化しているが、ECMの分子的実体やECMが担っている細胞非自律的な機能は不明な点が多い。本研究では、マウス前後軸形成過程で、ECM分子などによって構成される微小環境が、細胞動態にどのような影響を与えるのか解明することを目的に研究を行っている。平成26年度については、下記の内容を明らかにした。1)既知の細胞外マトリックス(ECM)タンパク質である、Collagen IV、Laminin, Perlecan, Nidogenなどに対する特異的抗体を用いて免疫染色法を行ったところ、前後軸形成過程でこれらのECM分子が特徴的な発現変動と局在を示すことが分かった。2)免疫染色法にて同定できたECM分子の転写産物の発現を解析するため、antisense cDNA probeを作製し、in situ hybridizationを行った。その結果Collagen IVやLamininは胚体外領域で発現し、胚体領域ではほとんど発現していないことが分かった。3) ECM分子の分解に関するMmp関連分子群についてRT-PCR法にて前後軸形成期に発現しているか検討したところ、多くのMmp関連遺伝子がRNAレベルで発現していることが分かった。実際、顕著に発現するMmp関連分子についてantisense cDNA probeを作製し、in situ hybridizationを行った結果、原条周辺で強く発現することが分かった。以上の結果は、マウス前後軸形成過程における細胞動態が、ECM分子によって制御されている可能性を強く示唆している。特に前後軸形成過程では、短時間で細胞の配列や胚内での位置がダイナミックに変化しているが、ECMの分子的実体やECMが担う細胞非自律的な機能は不明な点が多い。平成27年度については、より早い発生段階の着床前胚(4.5日目胚)を対象に下記の内容を明らかにした。

1、ECMタンパク質である、市販のCollagen IV、Laminin, Perlecan, Nidogenなどに対する特異的抗体の特異性を選別・確認後、免疫染色法を行ったところ、これらのECM分子が原始内胚葉、壁側内胚葉、栄養外胚葉で発現し、最初の基底膜様構造を形成し始めることが分かった。2、上述の免疫染色法にて同定できたECM分子の転写産物の発現を解析するため、antisense cDNA probeを作製し、in situ hybridizationを行った。その結果Collagen IVやLamininの遺伝子産物は胚体外領域となる原始内胚葉や壁側内胚葉で発現し、栄養外胚葉や将来胚体領域となる内部細胞塊やエピブラストやではほとんど発現していないことが分かった。3、Collagen IV遺伝子欠損マウス胚ではマウス胚の初期発生に大きな異常が観察されていないことから、初期胚性致死を示すその他のECM分子について遺伝子欠損変異マウスの表現型を解析する準備を進めた。4年間の研究計画の2年間を終えた時点ではあるが、概ね研究計画に沿って研究を進めている。細胞外マトリックス(ECM)分子分子がどのような細胞動態やシグナル活性を制御しているかについては、まだ明確な解答が得られる段階までには至っていないが、本研究計画の最大の焦点であるECM分子の分布とマウス胚の体軸形成期の細胞動態との関係性については上述したような知見が得られた。今後も当初の目的に沿って着実に進めていきたい。哺乳動物初期胚においては、周辺の細胞表面や基底膜などに存在する細胞外マトリックス分子と分泌性シグナル因子が細胞外微小環境を構成する。特に前後軸形成過程では、短時間で細胞の配列や胚内での位置がダイナミックに変化しているが、細胞外マトリックスの分子的実体や細胞外マトリックス分子が担う細胞非自律的な機能は不明な点が多い。本研究では、マウス前後軸形成過程で、細胞外マトリックス分子などによって構成される微小環境が、細胞動態にどのような影響を与えるのか解明することを目的に研究をすすめている。平成28年度については、着床前後の胚(4.55.5日目胚)を対象に下記の内容を明らかにした。Lama1遺伝子欠損マウス胚(ラミニンα1欠損胚)は、胚性致死を示すが、細胞動態の詳細は明らかにされていない。そこで、着床前後の胚を用いて、光学顕微鏡レベル及び電子顕微鏡レベルでの組織学的解析、in situハイブリダイゼーションや免疫染色による分子マーカーを用いた発現解析を行った。その結果、Lama1欠損胚では、着床後ライヘルト膜がほとんど形成されないこと、受精後5.5日目まで(着床後1日目)はほぼ正常に発生するが、6.5日目では胚全体の形状が大きく変形し、多くの形態的異常を示すことが分かった。Lama1欠損胚においてライヘルト膜を構成する他の細胞外マトリックス分子の発現を解析したところ、原始内胚葉や壁側内胚葉において、コラーゲンIVを始めとする他の細胞外マトリックス分子の沈着がほとんど観察されなかった。これらの結果は、マウス着床期におけるライヘルト膜(基底膜)の沈着にlama1遺伝子が必須であることを示唆している。4年間の研究計画の3年間を終えた時点ではあるが、概ね研究計画に沿って研究は進んでいる。細胞外マトリックス分子がどのような細胞動態を制御しているのかについては、まだ明確な解答が得られる段階までには至っていない。
エンドサイトーシスによる植物の高次形態形成制御の解析

これまでの研究結果から,液胞膜およびエンドソームに局在するQ-SNAREであるVAM3について,エンドソームに局在するR-SNAREであるVAMP727とSNARE複合体を形成し,胚発生における液胞への輸送という,種子植物にとって重要な輸送経路の制御を行っていることを明らかにしている.これに加え,遺伝学的,および生化学的解析から,液胞膜に局在するR-SNAREであるVAMP71もVAM3とSNARE複合体を形成すること,種子においてVAMP71が貯蔵型液胞膜の形成を制御することを明らかにした.VAMP727とVAMP71は細胞内において異なる局在パターンを示すことから,この2つは異なる場所においてVAM3とSNARE複合体形成していると考えられる.これは,液胞膜の膜融合に2つの異なる経路があることを意味している.現在,これらのSNARE複合体による膜融合制御について,その上流で機能する分子の詳細,およびそれぞれのSNARE複合体による膜融合が様々な液胞機能の発現にどのように寄与しているのかを明らかにするべく,特にSNARE複合体の上流で膜融合を制御するRABに注目して研究を行っている.一方で,植物固有のRAB5であるARA6は,主にエンドソームに局在することから,エンドサイトーシスに重要な機能を担っていることが考えられる.ARA6についての変異体を用いた解析から,これが保存型のRAB5と拮抗的な機能をもつことを明らかにしている.このARA6による細胞内輸送制御の機能に関して,下流で機能するSNARE複合体に注目して解析を行った結果,ARA6がVAMP727を介してエンドソームから細胞膜への輸送を制御していることが明らかになった.これまでの研究結果から、エンドサイトーシスの制御因子であるRab5との遺伝学的解析から、液胞膜およびエンドソームに局在するSNAREの変異体であるvam3に関して、その表現型がエンドサイトーシスの異常に起因するものであることを明らかにしていた。これに加え、さらにエンドサソームに局在するSNAREであるVAMP727との遺伝学的解析から、vam3の表現型がエンドサイトーシスの異常にあること、VAM3とVAMP727がSNARE complexを形成していることを明らかにした。さらに、各変異体におけるエンドサイトーシスを観察した結果から、植物固有のRab5であるARA6が、BOR1の細胞膜から液胞への輸送において、これを負に制御していることが明らかになった.このARA6による細胞内輸送制御の機能に関してさらに詳細を明らかにするために、まずARA6の局在するエンドソームとその他のSNARE,Rabに関して、植物体における局在の比較を行った、その結果、ARA6の局在するエンドソームがconventionaltypeのRab5であるARA7,RHA1とは一部異なること、SYP43(TGN)とは異なること、VAM3とエンドソーム上において一部共局在することが明らかになった。さらに、エンドサイトーシス制御と植物形態形成制御の間の因子の探索のために、vam3の抑圧変異体の選抜と解析を行っている。現在までに、EMS処理を行ったvam3のM2世代の中から、ara6同様表現型を抑圧するもの21ライン、花成および葉の形態にのみ表現型の抑圧が見られるものを各5ライン選抜している。これらの解析から、エンドサイトーシスと植物の形態形成、とくにFLCの発現制御経路を明らかにしていく予定である。これまでの研究結果から,液胞膜およびエンドソームに局在するSNAEEの変異体であるvam3に関して,遺伝学的解析により,その表現型がエンドサイトーシスの異常に起因するものであることを明らかにしていた.特に,エンドソームに局在するSNAREであるVAMP727に関してさらに詳細な解析を行い,VAM3とVAMP727が液胞膜とエンドソームの接する場所で複合体を形成し,種子植物にとって重要な輸送経路の制御を行っていることを明らかにした.現在,その融合制御機構を明らかにするべく研究を行っている.さらに,各変異体におけるエンドサイトーシスを観察し,植物固有のRAB5であるARA6が,一部のエンドサイトーシスを負に制御していることが明らかにしている.このAEA6と保存型Rab5であるARA7に関して,詳細な観察を行った,その結果,ARA6の局在するエンドソームがARA7異なる挙動を示すことを明らかにした.現在,さらに詳細な観察を行うとともに,これらのオルガネラ間の輸送を可視化するために,積み荷のマーカーとしてBOR1を用い,エンドサイトーシスにおける各オルガネラの役割を明らかにしていく予定である.この他に,エンドサイトーシス制御と植物形態形成制御の間の因子探索のために,vam3の抑圧変異体の選抜と解析を行っている.現在ara6同様表現型を抑圧するもの21ライン,花成および葉の形態にのみ表現型の抑圧が見られるものを各5ライン選抜し,ラフマッピングの結果から,ara6様の抑圧をみせる3ラインに関して,原因遺伝子が1番染色体上腕部,2番染色体上腕部,2番染色体中部にあることが明らかになった.さらに,ファインマッピング,sequenceによる原因遺伝子の特定を行っているが,現在までに変異は特定されていない.また,特に花成遅延の表現型に注目して解析を行っており,既知のFLC制御遺伝子に加え,近年エンドソームに局在することが報告されたTFL1についても解析を行っている.これまでの研究結果から,液胞膜およびエンドソームに局在するQ-

SNAREであるVAM3について,エンドソームに局在するR-SNAREであるVAMP727とSNARE複合体を形成し,胚発生における液胞への輸送という,種子植物にとって重要な輸送経路の制御を行っていることを明らかにしている.これに加え,遺伝学的,および生化学的解析から,液胞膜に局在するR-SNAREであるVAMP71もVAM3とSNARE複合体を形成すること,種子においてVAMP71が貯蔵型液胞膜の形成を制御することを明らかにした.VAMP727とVAMP71は細胞内において異なる局在パターンを示すことから,この2つは異なる場所においてVAM3とSNARE複合体形成していると考えられる.これは,液胞膜の膜融合に2つの異なる経路があることを意味している.現在,これらのSNARE複合体による膜融合制御について,その上流で機能する分子の詳細,およびそれぞれのSNARE複合体による膜融合が様々な液胞機能の発現にどのように寄与しているのかを明らかにするべく,特にSNARE複合体の上流で膜融合を制御するRABに注目して研究を行っている.一方で,植物固有のRAB5であるARA6は,主にエンドソームに局在することから,エンドサイトーシスに重要な機能を担っていることが考えられる.ARA6についての変異体を用いた解析から,これが保存型のRAB5と拮抗的な機能をもつことを明らかにしている.このARA6による細胞内輸送制御の機能に関して,下流で機能するSNARE複合体に注目して解析を行った結果,ARA6がVAMP727を介してエンドソームから細胞膜への輸送を制御していることが明らかになった.