hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
がん細胞の生存に必須な遺伝子を探索する

ここで増幅されたものの中には、アドリアマイシン耐性に関連する遺伝子に対応するガイドRNA配列が含まれていると考えられる。本年度の研究により、ゲノム編集による網羅的な遺伝子破壊を誘導したA2780ADR細胞の集団から死細胞を回収し、それに含まれるDNAからガイドRNA配列を含む領域の増幅に成功した。この中にはアドリアマイシン耐性に関与する遺伝子に対するガイドRNA配列が含まれているはずであり、後は次世代シーケンサーを用いた解析を行うことで、本研究の有用性に対する判断ができると考えている。研究が遅延している原因として、昨年度に確立したスモールスケールでのDNA精製法がラージスケールに適用できなかったことが大きい。セルフリーDNAの精製方法を基盤として実験系の構築を検討したが、多量の培養上清からDNAを回収することは困難であった。また個別の遺伝子に対するゲノム編集実験から、ガイドRNAの導入からゲノム編集が起きるまでの時間にかなりの幅があることが分かってきた。それを考慮した場合、長期間にわたって死細胞を回収する必要が生じ、ライブラリースケールの細胞を維持するための培養環境を確保することが困難であった。これらの点を考慮し、細胞培養の規模を抑えつつ分子標的候補遺伝子の検出が可能な条件を探るために時間を要した。また、医学部生の自主的な研究活動(授業時間外)に対する支援を行ったことで業務が多忙となったことも研究計画が遅延した原因としてある。ゲノム編集技術を利用してがん細胞の遺伝子を網羅的に破壊し、その結果として機能を失った遺伝子の中から、特定の状況下でがん細胞が生き残るために必須な遺伝子群を探索する方法を確立した。まず、抗がん剤であるアドリアマイシンに抵抗性のある卵巣癌細胞株A2780ADRに対してゲノムワイドな遺伝子破壊を行った。ゲノム編集用のレンチウイルスライブラリーを感染させたA2780ADR細胞を2週間培養することで、ゲノム編集が起こる時間を十分に確保し、その後にアドリアマイシンを添加した。この状況下でアドリアマイシン耐性であるA2780ADRは生存可能であるが、ゲノム編集によってアドリアマイシン耐性遺伝子を破壊された細胞は死んで培養容器から脱落する。この死細胞を遠心分離によって回収し、ゲノムDNAを抽出・精製した。死細胞のゲノムDNAには遺伝子破壊に用いられたベクターの配列が挿入されているため、その配列を解読することでアドリアマイシン耐性に関与する遺伝子を同定できる。実際に精製した死細胞のゲノムDNAを鋳型としてPCRを行い、次世代シーケンサーを用いて挿入されているライブラリーの配列を解読したところ、複数の候補遺伝子がリストアップされた。そこで、候補遺伝子を4種類に絞り込み、それらの発現を抑制した状況下でのアドリアマイシン感受性を評価した。結果として、4種類の候補遺伝子のうち、3種類については遺伝子発現抑制下でアドリアマイシン感受性が高くなった。(2種類のsiRNAで効果が見られたものと、1種類のsiRNAのみで効果が見られたものが存在する。)
老化遺伝子の統合的解析による加齢関連疾患の病態解明

ウェルナー症候群(WS)はWRN遺伝子に変異を持つ常染色体劣性の遺伝性早老症であり、テロメア短縮との関連が示唆されている。本研究では、WRNとテロメラーゼ逆転写酵素TERTの2重欠損マウスを作製し、テロメア短縮による病態形成を解析した。同世代間交配を繰り返し、第4世代のWrn/Tert 2重欠損マウス(TertG4/G4)を作出した。Wrn-/-, TertG4/G4マウスは、ほとんどの臓器で組織学的な変化を示さなかったが、精巣組織でのみ、TertG4/G4マウスに比べて有意な精細管の不整が認められた。WSの早老病態におけるテロメア長短縮の寄与は低い可能性が示唆された。代表的な遺伝的早老症Werner症候群(以下、WS)は、思春期以降全身性に老化徴候を示し、糖尿病や動脈硬化、がんを好発し、40歳代で死亡する。1996年にWSの原因遺伝子としてDNAヘリケース(WRN)が同定されたが、個体・細胞レベルで早老をきたすメカニズムの解明は国内外を通じて進んでいない。理由の一つとして、WRN遺伝子のノックアウトマウス(KO)が早老の表現型を示さず、健常に生育するため、有用な動物モデルが無い点にある。またWSの皮膚由来線維芽細胞は、通常、数代の継代培養により老化関連βガラクトシダーゼ活性上昇などの細胞老化形質を示し、分裂を停止する。そのため、患者由来細胞を用いた発症メカニズムの解明も容易ではない。病態メカニズム解明のため、早老症病態を呈するモデルマウスの開発が望まれている。本研究では、テロメラーゼ(Tert)欠損マウスとWrn欠損マウスを自然交配で繁殖し、2重欠損マウス(G1世代)を作出した。兄弟間の世代交配により、2重欠損マウスをG4世代まで作出した。G0, G2, G4世代のマウス尾からDNAを抽出し、PCR法により、テロメア長を解析し、テロメラーゼ活性欠失によるテロメア長短縮を確認した。また、G0, G2, G4世代のマウス個体を解剖し、肝臓、脾臓、下腿三頭筋、脳、精巣の臓器重量測定、および病理組織を作成した。病態生理学的な解析により、WS様早老症状を呈するかどうか調べた。また過去に同様なモデルマウス作製の論文との表現型を詳細に比較して、モデルマウスとしての有用性を考察した。ウェルナー症候群(Werner syndrome, WS)はRecQヘリカーゼファミリーWRNを原因遺伝子とする常染色体劣性の遺伝性早老症である。20歳代から毛髪変化や白内障を生じ、骨粗鬆症、筋萎縮、脂肪肝などを併発、悪性腫瘍や冠動脈疾患により50歳代で死に至ることが多い。幼少期から発症する他の早老症と異なり、WSは成人以降に発症し、最もヒトの個体老化に近い疾患である。WS患者のテロメア長は同年代の正常人のテロメア長よりも短いことが報告されており、テロメア短縮と早老症の関連が示唆されている。また、テロメラーゼRNA構成要素TERC欠損マウスは交配世代を経るにつれてテロメア長が短縮し、低身長や骨量減少、寿命短縮などの老化症状を呈すること、加えてWrn遺伝子を欠損させると一部の個体で表現型を悪化させることが報告されている。本研究では、テロメアの不安定性とWRN機能の関連を再確認するために、WRNとテロメラーゼ逆転写酵素TERTの2重欠損マウスを作製し、表現型を解析した。Wrn欠損マウスとTert欠損マウスを交配してWrn/Tert 2重欠損マウスを作製した。さらに同世代間で交配して第4世代(TertG4/G4)まで作製し表現型を解析した。Wrn-/-, TertG4/G4マウスは正常に生まれ、体重の差もなく正常に発育した。さらにWrn遺伝子の有無に関わらずTertG4/G4マウスはテロメア長も有意に短縮し、テロメラーゼ活性低下の確証を得た。皮膚の組織学的解析によりWrn+/+, TertG4/G4マウスとWrn-/-, TertG4/G4マウスともに皮膚萎縮を示したため、Wrn欠損の影響は全く認められなかった。さらに、ウェルナー症候群で顕著な病態が現れる臓器や、その臓器のミトコンドリアDNAコピー数にWrn欠損による有意な変化は認められなかった。以上の結果から、WSの早老病態におけるテロメア長短縮の寄与は低い可能性が示唆された。WRN機能の詳細な解析にはWS病態を模する新たなモデルマウスの作出が必要である。WS病態メカニズム解明のため、テロメラーゼ(Tert)欠損マウスとWrn欠損マウスの2重欠損マウスを作出し、世代交配を重ね、WS症状を呈するかどうか形態学的・組織学的な解析を行った。Tert遺伝子の欠損世代を軸に、世代交配によりG0-G4世代の2重欠損マウスの作出に成功した。これらのマウスからゲノムDNAを抽出し、相対的テロメア長をPCR法で測定したところ、世代を経る毎にテロメア長の短縮が認められ、テロメラーゼ活性の消失による生殖細胞系列でのテロメア短縮を確認した。組織学的な解析を行った結果、Tert欠損の世代間で、またWrn欠損による目立った病理学的変化は認められなかった。しかし、精巣や皮膚厚において、Tert欠損の世代間とWrn欠損による増悪組織像が観察された。

ウェルナー症候群(Werner syndrome, WS)はRecQヘリカーゼファミリーWRNを原因遺伝子とする常染色体劣性の遺伝性早老症である。WS患者のテロメア長は同年代の正常人のテロメア長よりも短いことが報告されており、テロメア短縮と早老症の関連が示唆されている。本研究では、テロメアの不安定性とWRN機能の関連を再確認するために、WRNとテロメラーゼ逆転写酵素TERTの2重欠損マウスを作製し、表現型を解析した。またWS患者由来細胞の特徴を細胞老化様の変化に着目して解析した。Wrn欠損マウスとTert欠損マウスを交配してWrn/Tert 2重欠損マウスを作製した。さらに同世代間で交配して第4世代(TertG4/G4)まで作製し表現型を解析した。Wrn-/-, TertG4/G4マウスは正常に生まれ、体重の差もなく正常に発育した。さらにWrn遺伝子の有無に関わらずTertG4/G4マウスはテロメア長も有意に短縮し、テロメラーゼ活性低下の確証を得た。Wrn-/-, TertG4/G4マウスは、ほとんどの臓器で組織学的な変化を示さなかったが、精巣組織で、有意な精細管の不整が認められた。皮膚組織はWrn-/-, TertG4/G4マウスで皮膚萎縮を示したが、Wrn+/+, TertG4/G4マウスでも同様な萎縮を示したため、Wrn欠損の影響は認められなかった。WSの早老病態におけるテロメア長短縮の寄与は低い可能性が示唆された。さらに、WS患者由来皮膚線維芽細胞を用いた細胞生物学的解析から、細胞内活性酸素の増加と細胞核の肥大化が共通して認められた。しかし、細胞老化関連分泌表現型に関連する遺伝子発現は、患者間のバラツキが大きく有意な差が得られなかった。WS患者細胞は、細胞核肥大など細胞老化の一部の特徴を再現することが明らかとなった。ウェルナー症候群(WS)はWRN遺伝子に変異を持つ常染色体劣性の遺伝性早老症であり、テロメア短縮との関連が示唆されている。本研究では、WRNとテロメラーゼ逆転写酵素TERTの2重欠損マウスを作製し、テロメア短縮による病態形成を解析した。同世代間交配を繰り返し、第4世代のWrn/Tert 2重欠損マウス(TertG4/G4)を作出した。Wrn-/-, TertG4/G4マウスは、ほとんどの臓器で組織学的な変化を示さなかったが、精巣組織でのみ、TertG4/G4マウスに比べて有意な精細管の不整が認められた。WS病態メカニズム解明のため、テロメラーゼ(Tert)欠損マウスとWrn欠損マウスの2重欠損マウスを作出し、世代交配を重ね、WS症状を呈するかどうか形態学的・組織学的な解析を行った。Tert遺伝子の欠損世代を軸に、世代交配によりG0-G4世代の2重欠損マウスの作出に成功した。これらのマウスからゲノムDNAを抽出し、相対的テロメア長をPCR法で測定したところ、世代を経る毎にテロメア長の短縮が認められ、テロメラーゼ活性の消失による生殖細胞系列でのテロメア短縮を確認した。しかし、個体レベル、組織学レベルでの解析では、Tert欠損の世代間で、またWrn欠損による目立った病理学的変化は認められなかった。ただ、精巣や皮膚厚において、Tert欠損の世代間で個体数が少なく有意差は認められていないが、形態学的な変化が観察された。
その場での血中薬物モニタリングに向けた涙液のラマン測定システムの開発

患者のいるその場で行える治療薬物モニタリング(TDM)は,安全で効果的な薬物治療のために有用である.本研究では,採血不要で迅速なTDMを目指し,涙液のラマン分光によるTDMシステムを提案する.涙液採取とラマン散乱測定用の基板として紙を利用する.これにより,極めて低侵襲にサンプルを採取し,容易で安価にTDMを実現できる.紙へ金ナノロッドを吸着させた基板を作製した.これにより,人工涙液中の薬物のラマン散乱光が増強されることを確認した.基板の作成が簡易かつ安価であり,測定には複雑な前処理を必要としないことから,オンサイトでのTDMにおける有効性を示した.薬物治療において,薬効,副作用,服用状態などを正確に把握するために,血中薬物濃度が重要となる.低侵襲,迅速,安価な薬物分析手法があれば,手軽に,頻繁に,場所を選ぶことなく適宜血中薬物濃度レベルを確認でき,より安全かつ有効に薬物治療を進めることが可能と考えられる.本研究では,採血不要の迅速な薬物分析に向け,紙製基板を用いた涙液のラマン分光分析による手法の開発を行った.基礎的検討として,セルロース紙に金ナノロッドを吸着させ,紙製SERS基板(PSERS)を作製した.SEMによる観察から,セルロース上に均一に金ナノ粒子が吸着していることを確認にした.PSERSの増強効果と検出限界を明らかにするため,てんかん薬として利用されるフェノバルビタールナトリウム(PB)水溶液を測定した.紙のみによるラマン分光測定に比べ感度が向上することが示された(紙:≧100 mM,PSERS:≧1 mM).ヒト涙液には,タンパク質をはじめ様々な不純物が含まれており,それらと分離して薬物を検出することが必要となる.ヒト涙液に成分を模した擬似涙液を作製して溶媒とし,PSERSを用いてフェノバルビタールの測定を行ったところ,水溶液中と同様に1 mMまでPBのピークが観察され,涙液中薬物分析への適用可能性が示された.PSERSは低コストかつ簡易に作製でき,臨床における実用が期待できる.今後,励起波長や金ナノ粒子構造の設計やすることにより,臨床上必要な感度の達成を測る.血中薬物濃度モニタリングは,薬効や服用状況を精度よく把握する上で重要な指標である.本研究では,安全かつ特別な手技を必要としない薬物濃度確認手法の実現をめざし,紙製基板を用いた涙液のラマン分光分析による手法の開発をおこなった.セルロース紙により採取した溶液サンプルを,ラマン分光測定により同定できることを確認した.また,感度向上を図るために,金ナノ粒子を吸着させた紙ベース基板を作製し,ラマン散乱光の増強効果が得られることを確認した.これにより,簡易な操作での涙液採取,測定デバイスの実現可能性を示した.想定するヒト涙液には,たんぱく質をはじめ様々な不純物が含まれており,それらから,対象とする薬物のシグナルを分離する必要がある.そこで,ヒト涙液をもしたサンプルにより,本手法が適用可能出ることを確認した.涙液採取は,臨床利用されているシルマー試験紙と同様に,涙液採取部を結膜嚢へ入れて毛細管現象を利用して行うことを想定している.そこで,さらなる感度向上を実現する手法として,紙や紙へプリントした物質との相互作用の違いを利用し,ペーパークロマトグラフィー技術に基づく分画手法を検討した.その場測定の実現には,高価なラマン分光測定装置も,各現場において利用可能にしなければならない.ラマン分光測定には,波長分解能を得るために,分光部が大きくなる.そこで,回折光学素子や散乱物体を用いたラマン検出装置の小型化を検討した.患者のいるその場で行える治療薬物モニタリング(TDM)は,安全で効果的な薬物治療のために有用である.本研究では,採血不要で迅速なTDMを目指し,涙液のラマン分光によるTDMシステムを提案する.涙液採取とラマン散乱測定用の基板として紙を利用する.これにより,極めて低侵襲にサンプルを採取し,容易で安価にTDMを実現できる.紙へ金ナノロッドを吸着させた基板を作製した.これにより,人工涙液中の薬物のラマン散乱光が増強されることを確認した.基板の作成が簡易かつ安価であり,測定には複雑な前処理を必要としないことから,オンサイトでのTDMにおける有効性を示した.今年度の計画である,紙ベース基板を利用したSERSによる薬物同定・濃度定量を達成し,本手法の実現可能性を示した.ただし,臨床での治療薬物モニタリングへの利用には,さらなる感度向上が必要であるなど課題が明らかになったため,当初計画と比べ,やや遅れている.情報フォトニクス今回作製したPSERS基板による測定では,治療薬物モニタリングに必要とされる検出感度を達成できていない.SERS強度は対象分子の共鳴条件にも依存性を示すため,対象薬物の吸収波長に合わせて,励起レーザーの波長,金属ナノ粒子のサイズと形状を選択することで,より高感度な薬物測定をめざす.専用の測定光学系の構築が次年度に遅れているため.最適な照射波長が実現できる光源や測定光学系のための光学素子の購入に充てる.
視線と瞬目によるコミュニケーション支援システムの開発

近年、重度肢体不自由者のコミュニケーションを支援するために、視線によりコンピュータを操作したり、文字などを入力する視線入力システムについての研究が行なわれている。視線入力システムを使用するには、画面に表示されたアイコンを視線で選択するだけでなく入力を決定する必要がある。本研究課題では、ユーザの視線と意識的な瞬目(随意性瞬目)を自動検出することにより、視線と瞬目のみで一般的なパソコンを操作するシステムを開発した。このシステムは、市販のビデオカメラとパソコンから構成されており、汎用性が高く安価である。本研究では福祉分野での応用を目指し、家庭用ビデオカメラと一般的なパソコンのみで視線と瞬目を利用したコミュニケーション支援システムを開発することを目的としている。具体的には、ユーザの視線と意識的な瞬目の情報を捉え、パソコンのディスプレイ上に表示されているアイコンを注視し意識的に瞬目を行なうことにより、そのアイコンの選択と決定を行なうシステムの開発を目指す。このようなシステムの要素技術として、視線計測と瞬目種類の識別手法が必要となるが、これらのうち視線計測について、研究代表者は実用的な方法を既に開発しており、本研究では瞬目種類の識別について研究を進めている。意識的に生じさせる随意性瞬目と、無意識に生じる自発性瞬目を識別するには、その特徴パラメータを利用する。実験の結果、瞬目の持続時間、最大振幅値、閉眼および開眼時の速さを計測することができ、いずれのパラメータにおいても随意性瞬目および自発性瞬目での有意差を確認できた。これらのうち、瞬目の持続時間は瞬目の種類によって差が大きく、随意性瞬目および自発性瞬目の識別に適していることを確認した。また本研究では、実際にリアルタイムで瞬目種類を識別する手法を確立するため、個人ごとの瞬目の持続時間を得ることによってキャリブレーションを行なう手法を確立した。本研究の目標である、視線と瞬目を用いたコミュニケーション視線システムを開発するには、この随意性瞬目の識別法を研究代表者らが開発してきた視線計測システムに組み込む必要がある。いままでに開発してきた視線計測システムは、処理のサンプリング間隔が100ミリ秒程度(10フレーム/秒)であり、本年度開発をした瞬目識別法のサンプリング間隔に比べ大きい。このような低いサンプリングレートによる実験で計測される瞬目の特徴パラメータについて検討を進めている。瞬目は、数百ミリ秒で一連の動作を完了する比較的高速な生理現象である。そのため、高速ビデオカメラを使用し被験者の眼球画像を撮影し、その画像から意識的な瞬目(随意性瞬目)と無意識に生じる瞬目(自発性瞬目)を識別するためのパラメータを調査した。このとき本研究で開発した画像計測ソフトウェアを使用し、被験者の眼球開口部面積の時間的変化を捉えることにより、瞬目を波形として計測した。その波形から、瞬目の持続時間、最大振幅値、閉眼および開眼時の速さを計測することができ、いずれのパラメータにおいても随意性瞬目および自発性瞬目での有意差を確認できた。また本研究では、研究代表者らが既に開発した一般的な家庭用ビデオカメラ(1080iハイビジョン規格)の撮影画像を走査線の位置により分割し、計測の時間分解能を2倍にする手法(フレーム分割法)を用いる。上述の高速度ビデオカメラによる計測結果のうち、瞬目の持続時間をパラメータとすると、フレーム分割法でも実用的な精度で随意性瞬目の識別が可能であることを実験により確認した。本課題では福祉分野での応用を目指し、視線と瞬目を利用したコミュニケーション支援システムを開発することを目的としている。開発するシステムは、家庭用ビデオカメラとパソコンから構成されており、視線および瞬目を画像解析により計測する。これらのうち視線計測について、研究代表者は実用的な方法を既に開発している。

本課題の初期段階では、ビデオカメラによって撮影された各フィールド画像に対し解析を行ない、60fpsのサンプリングレートで詳細に瞬目を計測し特徴パラメータを抽出していた。しかしながら、視線入力は処理コストが高く、パソコンによる処理ではたかだか10ps程度のサンプリングレートしか実現できていない。そのため、低サンプリングレートにおいても良好に抽出のできる、瞬目特徴パラメータを実験により求めた。その結果、瞬目の持続時間は瞬目の種類によって差が大きく、随意性瞬目および自発性瞬目の識別に適していることを確認した。この結果をもとに、持続時間による瞬目種類識別アルゴリズムを視線入力インタフェースに実装した。これにより、随意性瞬目で入力決定を行なう視線入力インタフェースを完成させることができた。福祉工学平成24年度の研究で得られた知見をもとに、高速度ビデオカメラを用いて複数の被験者による瞬目の特徴パラメータの計測実験を行なった。これにより、瞬目の持続時間を用いた、瞬目種類の識別法の確実性を検証することができた。これは、計測システムのうちソフトウェアの部分を研究代表者が開発および改良をしているため、短期間のうちに多くのデータを処理するシステムを構築できたためである。高速度ビデオカメラでの実験結果をもとに、一般的な家庭用ビデオカメラ(1080iハイビジョン規格)を用いた瞬目種類の識別におけるキャリブレーション法を開発した。これにより、リアルタイムで随意性瞬目の識別を行なう手法を確立することができた。また、視線と瞬目を用いたコミュニケーション視線システムの実現に向けて、低サンプリングレートにおける計測実験を開始し、その際に瞬目の特徴パラメータがどのように計測されるか検討を開始した。研究課題で計測をした瞬目についての実験データはすべて電子的にライブラリ化し、今後の研究での基礎資料として再利用できるように環境を整えた。来年度以降の研究においても、本年度に計測した実験データを活用する予定である。当初の計画では、高速ビデオカメラにより瞬目の特徴パラメータについて計測および調査を行なう予定であったが、さらに一般的なビデオカメラを用いて瞬目の種類を識別する手法について提案することができた。これは、研究代表者らが開発をしてきた各種計測ソフトウェアやシステムを最大限活用し、短期間のうちに高速度ビデオカメラを用いた高度な画像解析システムを実現できたためである。このことにより、実用的な視線と瞬目によるコミュニケーションシステムの開発のために、多くの資料とノウハウを蓄積することができた。また、本研究課題で計測をした瞬目についての実験データはすべて電子的にライブラリ化し、今後の研究での基礎資料として再利用できるように環境を整えた。本年度の研究成果として、一般的な家庭用ビデオカメラ(1080iハイビジョン規格)によりリアルタイムに瞬目種類を識別できるようになった。次年度はこの手法をもとに、実際にリアルタイム随意性瞬目の生起を検出するソフトウェアを開発する。
高解像度シミュレーションを用いた周惑星円盤の形成・進化モデルの構築と衛星形成

本研究では、木星のガリレオ衛星のようなガス惑星の衛星系の起源を調べるために、その形成環境であると考えられている周惑星円盤について調べた。木星は、太陽が生まれた際にその残りのガスによって太陽の周りに形成された原始太陽系円盤の中で生まれたと考えられている。原始太陽系円盤のガスが木星に流入し、その大気を形成する際には、角運動量の保存から円盤状のガスの流れができる。この円盤は周惑星円盤と呼ばれ、ガリレオ衛星はその中で形成されたと考えられている。よって、ガス惑星の大気や衛星の形成を議論するには、周惑星円盤の理解が必要不可欠である。従来の研究では、惑星近傍が60008000K以上の高温になると、円盤が形成せずに、ガスが球核状に惑星の周りに分布すると報告されていた。我々は、輻射流体力学シミュレーションを用いて、原始太陽系円盤の中に置いた木星質量の惑星の重力圏へのガスの流れを調べた。ガスの流入の様子や衛星形成過程を研究するためには、周惑星円盤の温度構造を明らかにする必要がある。本研究では、水素分子の解離や水素・ヘリウム原子の電離を考慮したガスの状態方程式を用いた。シミュレーションの結果、惑星近傍のピーク温度は10,000Kを超えたものの、ケプラー回転に近い周惑星円盤が形成された。この結果から、円盤が形成されるかどうかは、惑星近傍の温度によって単純に決まるものではないということが明らかになった。今後は、さらにシミュレーション結果の解析を進め、周惑星円盤の形成・進化に関する知見を深めるとともに、衛星形成についても議論していく予定である。当該年度に計画されていた通り、原始惑星系円盤のグローバル輻射流体力学シミュレーションを行い、円盤内でどのようにガスが木星の重力圏に流れ込むのかを調べた。計算には計画通り、NIRVANA 3.5コードを用いた。流れ込んだガスの温度分布について調べるために、水素やヘリウムの解離や電離を考慮した状態方程式を用いた。これにより、断熱係数を1.4に固定した断熱近似計算よりも、正しく温度を計算することができた。そして、従来の研究結果に反して、惑星近傍が高温になっても周惑星円盤が形成可能であることを示した。今後は、輻射流体力学シミュレーションで得られた円盤構造から、周惑星円盤のモデル化を行う。そして、その円盤モデルを用いた衛星形成理論を構築する。実際の太陽系内の衛星系のデータと照らし合わせ、理論に制限を与える。本研究の手法である数値計算を行う際のテスト計算及び解析用に中規模の計算機を購入する予定であったが、滞在先のデンマークの計算機が使用可能だったため、購入は次年度に見送った。また、留学費用として所属先から旅費の支援を受けたため、主な出張先であったデンマークでの滞在費を本経費から支出する必要がなかったので、次年度の旅費として有効利用することにした。
個体の寒冷適応に伴う心ペースメーカー細胞のG蛋白依存性膜電流変化

マウスを低温環境下(15°C)で飼育し、寒冷ストレスが心臓の心室筋細胞、ペースメーカ細胞のL型カルシウムチャネルにどのような変化をもたらすかをパッチクランプ法を用いて解析した。マウスではGタンパク依存性の遅い不活性化機構は、一週間で発現した。寒冷順化後にのみ観察されるL型カルシウムチャネルの遅い不活性化機構パッチ細胞内還流法でGDP-γSを還流しても抑制されなかった。温暖な環境下(30°C)で飼育したマウスから単離した心筋細胞をGTP-γSで還流しても遅い不活性化が観察されることはなかった。以上の結果は遅い不活性化に関与するGタンパクが低分子量Gタンパクである可能性を示唆している。個体レベルでの心筋細胞変化のタイムコースを解析し、遅い不活性化の原因となっている因子をあきらかにするために、心電図RR間隔を測定して寒冷の自律神経調節に及ぼす影響を解析した。寒冷負荷は心拍数を上昇させると共に、心拍変動をほぼ完全に消失させた。このことから、寒冷ストレス下のマウスでは通常行われている心拍数調節による機械的な負荷の解除が行われず、心臓は絶えず機械的なストレスにさらされていることが示唆された。さらに、この研究を効率よく進めるために、呼吸と心拍の関係を解析するためのシステムを開発した.マウスを低温環境下(15°C)で飼育し、寒冷ストレスが心臓の心室筋細胞、ペースメーカ細胞のL型カルシウムチャネルにどのような変化をもたらすかをパッチクランプ法を用いて解析した。さらに、この研究を効率よく進めるために、呼吸と心拍の関係を解析するためのシステムを開発した.マウスを寒冷で2週間飼育し寒冷馴化させると、体温は一定に保たれるが、自律神経遮断下での固有心拍数が著しく減少した。心室筋を用いた実験では動物の寒冷順化でL型Caチャネルが低分子量G蛋白の関与で遅い不活性化機構が出現し、不活性化曲線が20-40mV負電位側にシフトすることを報告した(Am.J.Physiol.1998.274:R348-R356,Am.J.Physiol.276: R923-R928),そこでペースメーカー細胞を標的に寒冷馴化にともなう心機能変化のメカニズムを解析し、単離洞房結節ペースメーカー細胞をパッチ膜電位固定して電流を記録し、個体レベルで観察される固有心拍数、心拍神経調節との関連で明らかにした。マウスを種々の温度環境下で2週間飼育した。コントロール群の動物は同様の期間20-25度Cの環境下で飼育した。マウス心電図記録によりin vivo条件下での心ペースメーカー細胞の機能を解析する手法を開発できた。平成14年度は個体レベルの実験を中心におこない、寒冷による心拍数増大・心拍変動消失とその後約1週間後に徐々に起こる回復の過程をRR間隔の測定および周波数解析で解析した。同時に腹腔内チューブから自律神経遮断薬を投与して交感神経レベル、およぶ固有のRR間隔を測定した。以上の結果、マウスでは数日から一週間の寒冷負荷で固有心拍数が減少すること、その回復には2ヶ月以上の期間を要することを明らかにした。マウスを種々の温度環境下で2週間飼育した.コントロール群の動物は同様の期間20-25度Cの環境下で飼育した。マウスを寒冷で2週間飼育し寒冷馴化させると、体温は一定に保たれるが、自律神経遮断下での固有心拍数が著しく減少した。パッチクランプの実験でGタンパク依存性のカルシウムチャネルの遅い不活性化が発現することを明らかにした。これらの原因を個体レベルでのメカニズムを解析するために、マウス心電図記録によりin vivo条件下での心ペースメーカー細胞の機能を解析した。その過程で心拍調節と呼吸との関係について従来考えられてきた以上に、心拍自律神経調節が呼吸に依存していることを発見し、その原因を数理的に解明した。そこで、ヒトでの自律神経調節機能定量化のための装置を開発した。自由に活動している状態で呼吸を測定するためにインピーダンス測定法を用い、肺気量測定ができる高精度のスパイロメーターを開発した。また、胸郭内の血液量もインピーダンスによって測定する万法を開発した。定量的な解析にもとづいて、心拍調節は呼吸に起因することをあきらかにし、長時間の心拍数を計算で予測することが可能となった。また、被験者はこの装置を用いて短時間に心拍数をコントロールできる方法を学習できる。

このあたらしい理論に基づいた測定装置・治療装置が家庭レベルで普及可能となるように、装置や解析プログラムを使いやすいものにした。新理論は健康度の測定のみならず、心ペースメーカー制御、バイオフィードバックなど広い分野に応用できる。現在特許の申請を準備中である。
組織損傷時に放出される細胞内タンパク質群の“細胞外機能”と単球表面への結合機序

組織損傷にともない、様々な細胞内タンパク質が漏出するが、細胞外での機能的影響の多くは不明である。急性期の炎症における役割を明らかにするために、これまでに同定した単球表面結合能を有する細胞内タンパク質について、細胞影響を解析し、その受容体を探索した。潜在的機能分子のひとつは、U937細胞培養系への添加によりMAPキナーゼカスケードのリン酸化を増強した。プロテオーム解析により同定された潜在的機能分子の受容体は、接着・運動に関わる細胞膜タンパク質であった。これらの結果は、漏出した細胞内タンパク質が、損傷部位へ単球が集積し、細胞断片を除去する過程において重要な役割を果たしている可能性を示している。本研究課題では、申請者らがこれまでに特定した“細胞表面結合能を有する一群の細胞内タンパク質"について、細胞膜上での新たな分子機能を解析する。H26年度は、潜在的機能分子の選択、およびタンパク質調製、さらにU937細胞に対する影響解析を行った。はじめに、既に同定した単球表面結合能を持つ168種類の細胞内タンパク質リストより、結合・漏出実験での質量分析データ、および既知の分子機能や疾患との関連に基づき、6種類の核酸結合タンパク質、5種類の代謝酵素、1種類のシャペロン、1種類の翻訳関連タンパク質、および2種類の疾患マーカーを含む15種類の潜在的機能分子を選択した。さらに、疾患プロテオーム解析データ(蘇生後脳症脳脊髄液)を精査し、これらのタンパク質が神経学的健常群において検出限界以下であることを確認した。15種類のタンパク質について市販の精製標品の購入を進めるとともに、5種類については、cDNAクローニングを終え、作製したタグ付発現ベクターへ組み込んだ。細胞影響解析は、100 nMのPMAで24時間刺激したU937細胞にLPS 10 ng/ml、および各タンパク質(0.1 mg/ml)を添加し、さらに24時間培養後、培地を回収し、培地中のサイトカイン(IL-6, TNF alpha)濃度を測定した。潜在的機能分子の細胞表面との相互作用に関しては、血清存在/非存在下で培養したU937細胞にタグ付きタンパク質(0.1 mg/ml)を添加し、4°Cで15分間インキュベーション後、細胞、および上清を回収し、細胞表面に結合したタンパク質量をウエスタンブロットにより解析した。解析ごとに影響の有無を判定し、想定される分子機能の分類を行うとともに、引き続き、残りの潜在的機能分子についての活性測定実験を進めている。H27年度は、これまでの実験で単球表面結合能が示されたタンパク質リストより選択した潜在的機能分子について、引き続きHEK293細胞を利用したタグ付き組換えタンパク質の発現とU937細胞に対する影響解析を行うとともに、細胞表面受容体の単離と質量分析によるタンパク質同定実験を行った。潜在的機能分子の精製標品をNHS-activated Sepharose4FFに共有結合させたアフィニティーカラムを作製し、U937細胞より調製した細胞膜タンパク質画分を負荷した。非結合画分を洗浄後、常法により溶出し、得られた結合画分について、変性、還元・アルキル化、トリプシン消化を行い、Direct nanoLC-QTOF質量分析システムにより解析した。ケラチン類や消化酵素のトリプシンを除外後、コントロール実験での同定タンパク質と比較を行い、最終的に4種類のタンパク質が潜在的機能分子の結合パートナーとして同定された。同定されたタンパク質には、アポトーシス関連分子、代謝酵素、細胞骨格関連分子、および細胞膜貫通型受容体が含まれていた。この膜貫通型受容体は、細胞骨格の再構成と通じて細胞接着や移動、貪食に関与することが報告されており、今回検討した潜在的機能分子の新たなターゲットである可能性が高い。H27年度は、当初の研究計画に沿って、1)前年度からの継続実験、および2)単球表面における潜在的機能分子の相互作用解析、以上2項目を実施計画書に記載した。1)に関しては、各種活性測定データを着実に集積しつつある。2)に関しては、潜在的機能分子の単球側ターゲットを明らかにした。最も解析が困難であると予想された細胞膜受容体の同定に現時点で成功しており、これらを裏付ける細胞影響に関する情報が蓄積しつつあることから、おおむね計画通りに研究が進展している状況と言える。本研究課題では、申請者がこれまでに特定した"細胞表面結合能を有する一群の細胞内タンパク質"について、細胞膜上での新たな分子機能を解析する。H28年度は、潜在的機能分子に対する細胞膜受容体候補について、個別の相互作用確認実験と想定される機能を解析した。潜在的機能分子、およびその受容体候補として組換えタンパク質を使用し、生理的リン酸緩衝液中で混合後、室温で一定時間インキュベーションした。SDSを含まない非変性条件下でのゲル電気泳動により分離し、銀染色によりタンパク質を検出した。潜在的機能分子と受容体候補の相互作用は比較的弱く、その細胞影響は、損傷組織周辺に限局されると考えられた。研究期間全体を通じて明らかになったことを以下にまとめる。潜在的機能分子は、組織損傷時に細胞内から漏出し、単球表面に結合する。結合した潜在的機能分子は、単球の細胞内シグナルのリン酸化を増強する。一方、単球表面の受容体は、膜貫通型タンパク質で、細胞接着に関わる細胞外ドメインと細胞骨格調節に関わる細胞内ドメインを有する。

潜在的機能分子の受容体は、内皮上にも発現し、その相互作用が損傷組織周辺に限局されることから、この潜在的機能分子は、単球を損傷部位に誘導し、血管内皮表面への接着、および組織内部への遊走を調節していることが想定される。今回、組織の損傷・修復という観点から、急性期病態、とりわけ炎症反応における機能的意義が明らかになってきた細胞内からの漏出タンパク質は、病態モニターのためのバイオマーカーとしてのみならず、新しい治療ターゲットとして有用である。組織損傷にともない、様々な細胞内タンパク質が漏出するが、細胞外での機能的影響の多くは不明である。急性期の炎症における役割を明らかにするために、これまでに同定した単球表面結合能を有する細胞内タンパク質について、細胞影響を解析し、その受容体を探索した。潜在的機能分子のひとつは、U937細胞培養系への添加によりMAPキナーゼカスケードのリン酸化を増強した。プロテオーム解析により同定された潜在的機能分子の受容体は、接着・運動に関わる細胞膜タンパク質であった。これらの結果は、漏出した細胞内タンパク質が、損傷部位へ単球が集積し、細胞断片を除去する過程において重要な役割を果たしている可能性を示している。本年度は、1)潜在的機能分子の選択とタンパク質調製、2)潜在的機能分子の細胞影響解析(サイトカイン産生)、3)潜在的機能分子の細胞影響解析(細胞運動)、4)単球表面における相互作用解析、以上4項目を実施計画に記載した。培養実験に必要なスペースの問題から、1)、2)、4)を先に開始し、3)についてはH27年度に開始することとした。いずれの項目も27年度までの継続実験を予定しており、活性測定データも着実に集積しつつあることから、おおむね計画通りの実施状況と言える。これまでの成果は、1)損傷細胞から放出され、単球表面に結合する一群のタンパク質の同定、2)特定のタンパク質による、MAPキナーゼのリン酸化増強の確認、および、3)その細胞膜受容体の同定、以上3点にまとめることができる。H28年度は、当初の研究計画に沿って、1)潜在的機能分子の単球表面への結合から炎症関連応答にいたるこれらの経路を分子レベルで確認するとともに、創薬ターゲットとしての中和抗体の利用やシグナル伝達経路に対する阻害の可能性を探る。医歯薬学H27年度は、当初の研究計画に沿って、1)H26年度からの継続実験を進めるとともに、2)単球表面の相互作用分子の同定実験を行う。物品購入の当初計画額からの値引きにより最終的に生じた残額であり、H28年度の研究費使用計画は、当初の研究計画から大きな変更はない。物品購入の当初計画額からの値引きにより最終的に生じた残額(約3万円)であり、H26年度の研究費使用計画は、当初の研究計画から大きな変更はない。H28年度の予算と合算し、試薬・消耗品の購入に使用する。H27年度の予算と合算し、試薬・消耗品の購入に使用する。
タンパク質工学的手法による酵素の有機溶媒安定性の解明と有機溶媒に安定な酵素の開発

酵素は、穏和な条件下で触媒機能を発揮し、高い基質特異性および反応特異性を示す。そのため、酵素反応をファインケミカル製品等の合成プロセスに適用すると副生成物の生成がなく、しかも反応工程数の削減が可能となるので、溶媒やエネルギーの大幅な低減および原材料の高効率利用が達成でき、省資源・省エネルギーの次世代環境調和型合成プロセスの構築が可能になる。本研究では、自然界から探索した有機溶媒に安定な酵素の有機溶媒安定性の原因をタンパク質工学あるいは分子進化論的手法を用いて究明し、その研究成果をもとに、より一層高い有機溶媒耐性を有する酵素を開発するために必要な基礎的研究を行った。本研究で検討した項目は以下の通りである。1.有機溶媒耐性微生物Pseudomonasaeruginosa LST-03株の有機溶媒存在下での生育と有機溶媒に安定な酵素の生産2.有機溶媒耐性LST-03リパーゼの精製と諸性質3.LST-03リパーゼ遺伝子のクローニングとシーケンス4.LST-03株のLST-03リパーゼ以外のリパーゼ遺伝子のクローニングとシーケンス5.有機溶媒耐性PST-01プロテアーゼの精製と諸性質6.PST-01プロテアーゼを用いたペプチド合成7.有機溶媒存在下での酵素の立体構造変化の測定8.PST-01プロテアーゼの遺伝子のクローニングとシーケンス9.PST-01プロテアーゼの分子内に存在するジスルフィド結合の役割10.分子進化工学的手法による酵素の有機溶媒耐性の原因解明本研究では、非水系のバイオプロセスに必須となる有機溶媒耐性酵素をタンパク質工学的に作製するのに必要な基礎的研究を行った。本研究により得られた有機溶媒耐性酵素に関する知見は、将来、タンパク質工学的な有機溶媒耐性酵素の開発の基礎となるものである。一般に酵素は水溶液中で反応を行うが、基質が水難溶性の場合や、加水分解酵素を用いて加水分解の逆反応である合成反応を行う場合には、反応溶液中に有機溶媒を添加して反応を行う方が望ましい。しかしながら、一般に酵素は有機溶媒存在下では不安定であり、容易に失活する。そのため、有機溶媒存在下で安定な酵素が求められている。申請者らは、先に、有機溶媒に安定なリパーゼを産生する有機溶媒耐性微生物Pseudomonas aeruginosa LST-03株の取得に成功している。本研究では、P.aeruginosa LST-03株が産生する有機溶媒に安定なリパーゼの有機溶媒安定性を分子生物学的手法により解明することを目的とする。本年度は、まず、P.aeruginosa LST-03株の有機溶媒耐性を検討し、有機溶媒存在下で培養した場合の酵素生産について検討した。さらに、P.aeruginosa LST-03株が産生する有機溶媒に安定なリパーゼ(LST-03リパーゼ)の精製を行い、その酵素の性質を詳細に検討した。P.aeruginosa LST-03株は種々の有機溶媒存在下でも生育し、有機溶媒存在下でも有機溶媒に安定なリパーゼを産生することがわかった。また、精製したLST-03リパーゼの種々の性質を検討したところ、分子量は約27,000であり、トリグリセリドのエステル結合に対し非特異的に作用する酵素であることがわかった。さらに、LST-03リパーゼは種々の有機溶媒存在下でも非常に安定であることが明らかとなった。一般に酵素は水溶液中で反応を行うが、基質が水難溶性の場合や、加水分解酵素を用いて加水分解の逆反応である合成反応を行う場合には、反応溶液中に有機溶媒を添加することが望ましい。

しかしながら、一般に酵素は有機溶媒存在下では不安定であり、容易に失活する。そのため、有機溶媒存在下で安定な酵素が求められている。申請者らは、先に、有機溶媒に安定なリパーゼを産生する有機溶媒耐性微生物Pseudomonas aeruginosa LST-03株の取得に成功している。本研究では、P.aeruginosa LST-03株が産生する有機溶媒に安定なLST-03リパーゼの有機溶媒安定性をタンパク質工学的手法により解明することを目的とする。本年度は、P.aeruginosa LST-03株の染色体DNAからショットガン法によりリパーゼ遺伝子のクローニングを行った。リパーゼ活性を有する8個の形質転換体が得られ、5.3、3.1、3.1、6.3、5.3、6.3、5.3、および10.2キロ塩基対のLST-03株の染色体DNA断片がクローニングされていることがわかった。それらのDNA断片を解析したところ、異なる4つのリパーゼ遺伝子(lip3、lip5、lip6、およびlip8)がクローニングされていることがわかった。このことからLST-03株は少なくとも4種以上のリパーゼ遺伝子を有していることがわかった。また、リパーゼ遺伝子を含むDNA断片の塩基配列を決定した。しかしながら、これらの遺伝子配列には、有機溶媒に安定なLST-03リパーゼのN-末端アミノ酸配列に相当する配列は見出されなかった。一般に酵素は水溶液中で反応を行うが、基質が水難溶性の場合や、加水分解酵素を用いて加水分解の逆反応である合成反応を行う場合には、反応溶液中に有機溶媒を添加することが望ましい。しかしながら、一般に酵素は有機溶媒存在下やは不安定であり、容易に失活する。これまで、P.aeruginosa LST-03株の染色体DNAからショットガン法によりリパーゼ遺伝子のクローニングを行ったところ、異なる4つのリパーゼ遺伝子がクローニングされたが、いずれも有機溶媒に安定なLST-03リパーゼの遺伝子ではなかった。そこで、LST-03リパーゼのN-末端アミノ酸配列から推測される遺伝子の塩基配列と同じ塩基配列を遺伝子のデータバンクで検索した。検索で見つかった遺伝子を参考にして、種々のPCRプライマーを合成し、P.aeruginosa LST-03株の染色体DNAを鋳型としてPCRを行ったところ、約2.6キロ塩基対のPCR産物が得られた。このDNA断片をクローニングしたところ、その遺伝子を保持した大腸菌はリパーゼ活性を発現した。
軽度身体障害者における援助要請の特性と諸要因の検討および促進に向けた提案

30年度は、A)グループインタビュー、B)当事者研究を援用した先天性四肢障害当事者向けワークショップ(以下、WS)の設計、C)WSの試行と評価を行った。A)先天性四肢障害当事者を対象としたグループインタビューを実施した。対象者はいずれも重度上肢障害であったが、公的な介助サービスの利用経験はなく、日常生活上の困難や工夫について容易には思いつかなかった。しかし対話を繰り返すことで、生活環境への工夫やインフォーマルな援助の例が複数挙げられた。また、社会生活の範囲を限定することで困難が生じそうな事項を避ける傾向や、幼少期から援助が得やすいよう他者への気遣いを続けてきたことなどが共通して語られた。B)先天性四肢障害当事者5名が参加し、全4回の対話および調査と、オンライン上でのやりとりを通じてWSの設計と運営の準備を行った。WSの特徴として、モノ(便利グッズ)とワザ(身体技法)の両方をバランスよく共有する、「安く」「手軽に」できる工夫に焦点化する、事前に複数の当事者に動画の撮影を依頼し映像でワザを紹介する等を取り入れた。WS設計の最終段階では、安価に購入できる道具を実際に探し、試用しながらさまざまなアイディアを交換した。C)当事者10名とその家族9名を対象に、B)で設計したWSを試行し、実施後にアンケートを実施した。その結果、WSを「楽しめた」「ためになった」「ピアグループに今後も参加したい」と評価した者はいずれも100%であった。実施前後の変化では、物・他者・制度への援助要請指向性が全般的に高まり、自己理解・自己の障害に対する嫌悪感・自己の個性を尊重する気持ちに改善が見られた。また、WSの設計と実施に携わった当事者へのヒアリングでは、当事者活動に参加することで、仲間や居場所が得られ、次世代のピアに対する効力感を得られた等の変化が語られた。27年度は「軽度身体障害者における援助要請の特徴と関連要因の検討」を行うため、下記の研究を行った。1)アンケート調査|幼児期から青年期までに援助要請が必要な要素を把握するために、軽度身体障害児を養育した経験のある親に予備的なアンケート調査を行い、82名から回答を得た。特に、入園入学や学校生活における課題が多いことが明らかになった。学校では、入学や進学時の相談が「あった」47%、「時々あった」40%、「なかった」13%であり、相談を持ちかけたのは「学校」13%、「親」68%、「同程度」21%であった。通常学級に通学することの多い軽度身体障害では、親や本人による援助要請が困難な場合に必要な支援につながりにくい可能性が示された。2)手記の分析|障害開示や援助要請について軽度身体障害当事者がもつ考えや経験を明らかにするため、当事者が書いた手記の分析を行った。対象となる障害者団体の機関紙(2004ー2015)から、当事者が著した記事109件を抽出した。3)インタビュー|先天性上肢欠損の障害当事者1名に、複数回のライフストーリー・インタビューを行った。対象者は、幼少期に親や同様の障害児の親から、援助要請をせずに独力で生活動作を行うことを求められていた。そのため、他人の手を借りずに生活することが自立の目標と考えており、支援機器や自助具、義手等の使用にも否定的な印象を持っていた。さらに一方的に援助を受ける立場であったため、クラスメイトとの関係性にも課題を抱えていた。しかし思春期以降、援助要請を促す友人の働きかけと二次障害の発症をきっかけとして、積極的に援助要請を行うようになっていた。こうした変化は、親子関係や他者との関係性の変化にもつながっていた。本事例から、援助要請意図は環境調整や心理教育によって変容可能であることが示唆された。おおむね計画通りに進めている。グループインタビューは実施できなかったが、援助要請において興味深い経験をもつ1事例に複数回のライフストーリー・インタビューを行った。また、当初計画になかった親対象のアンケートでは、困難事例と被援助経験の有無についてデータを得た。28年度は「軽度身体障害者における援助要請の特徴と関連要因の検討」および「援助要請行動の促進に向けた実践方法の検討」を行った。1)アンケート調査の分析|27年度に引き続き、アンケート調査結果の分析を行った。困難事例に対して家族以外からサポートを得られたのは約半数で、サポート源は教育関係・自助団体・障害児の親が多かった。また、支援の内容は道具的サポートが多く、情緒的サポートや評価的サポートを得ることが課題と考えられた。2)手記の分析|27年度に抽出した軽度身体障害当事者による手記の分析を行った。まず、当事者による手記のテーマを分類し、さらに援助要請と障害開示、障害に対する支援ニーズとサポートに関する記述を抽出した。これにより個別具体的な事例を収集することはできたが、量的検討は困難で、具体的事例を援助者側を対象とした調査に活用することとした。3)グループインタビュー|当事者を対象に座談会形式で情報収集を行った。学校生活においては、友人や教師との間で、過剰にならない程度に、必要な場合のみ援助が提供される関係性が求められていた。また、援助要請については、就労場面で特に意識化されていた。これは、障害への“適度な"配慮がなされるかどうかが、就労先を選択する要因のひとつとなるためであった。以上の結果から、援助要請行動の促進に向けた実践方法として、次の2点が見出された。

1)軽度身体障害者の被援助経験について情報を共有するしくみの構築。2)援助要請および障害開示を考えるワークショップの実施アンケート調査結果の集計と分析に時間を要したため、座談会形式での情報収集は行ったものの、すべてのグループ・インタビューをすべて計画通りに進めることができなかった。29年度はグループインタビューとワークショップの設計を行った。A)グループインタビュー|28年度に課題として見いだされた1軽度身体障害者の被援助経験について情報を共有するしくみの構築、2援助要請および障害開示を考えるワークショップの実施の方法、について検討するため、当事者を対象にグループインタビューを行った。その結果、「援助要請行動の促進に向けた実践方法」として、次の2点が見出された。1)他者の被援助経験の情報共有|インタビューでは、日常生活の工夫や他者とのコミュニケーションの方法が多く語られた。一方で、軽度身体障害者は公的支援につながりにくい、あるいはその必要性がないため、地域では当事者と出会うことが少なく、体験や情報が共有されにくい。そのため、軽度身体障害に関する情報のプラットフォームを作ることが資源の利活用に役立つと考えられた。2)援助要請および障害開示を考えるワークショップの実施|学校生活や就労、子育てなど、障害開示や援助要請において課題が生じやすい場面が明らかになった。こうした場面を想定し、当事者同士でロールプレイングやディスカッションを行うことで、援助要請場面への心理的負担を軽減することができると考えられた。また、障害が軽度であるほど自身に必要な支援を見出しにくいことが明らかになった。B)ワークショップの設計|調査結果を踏まえ、ピアサポートの場をつくり、当事者が参加しやすいプログラムを設計することが援助資源の利活用に繋がると考えた。そこでまず、軽度身体障害者のさまざまな資源への援助要請に繋がるピアサポート・プログラムの一環として、モノ資源と身体技法に焦点化したワークショップの設計を行った。設計は当事者4名と研究者が話し合いを繰り返すことで行った。30年度にワークショップを試行する計画である。調査計画全体がやや遅れたため、研究のとりまとめまで行うことができなかった。30年度は、A)グループインタビュー、B)当事者研究を援用した先天性四肢障害当事者向けワークショップ(以下、WS)の設計、C)WSの試行と評価を行った。A)先天性四肢障害当事者を対象としたグループインタビューを実施した。対象者はいずれも重度上肢障害であったが、公的な介助サービスの利用経験はなく、日常生活上の困難や工夫について容易には思いつかなかった。しかし対話を繰り返すことで、生活環境への工夫やインフォーマルな援助の例が複数挙げられた。また、社会生活の範囲を限定することで困難が生じそうな事項を避ける傾向や、幼少期から援助が得やすいよう他者への気遣いを続けてきたことなどが共通して語られた。B)先天性四肢障害当事者5名が参加し、全4回の対話および調査と、オンライン上でのやりとりを通じてWSの設計と運営の準備を行った。WSの特徴として、モノ(便利グッズ)とワザ(身体技法)の両方をバランスよく共有する、「安く」「手軽に」