hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
神経細胞に発現するTRPファミリー分子の表現型と機能に関する研究

神経細胞に特異的に発現するTRPチャネルについて,以下のような新知見を得た。(1)ラット大脳皮質初代培養ニューロンに過酸化水素を適用するとカルシウムイオンの流入に続いて細胞死が惹起された。この初代培養ニューロンにおいてTRPM2分子が発現していることを免疫染色によって確認し,公開されているラットゲノム部分塩基配列とマウスおよびヒトTRPM2遺伝子情報を元にして,ラットTRPM2遺伝子をクローニングした。クローニングしたラットTRPM2を動物細胞ないしXenopus卵母細胞に強制発現させたところ,過酸化水素適用によるカルシウムイオンの流入と細胞死に加えて,ADPリボースの細胞内適用によるカチオン電流が観察された。培養ニューロンにおけるTRPM2の発現をsiRNAによって抑制したところ,過酸化水素によるカルシウムイオンの流入と細胞死はいずれも抑制された。また,ADPリボースポリメラーゼ阻害薬の適用によって過酸化水素誘発ニューロン死は抑制された。以上の結果から,TRPM2は過酸化水素による神経細胞死において決定的な役割を果たしていることが明らかになった。(2)脳組織に特異的に発現しているTRPC4およびTRPC5の開口機構についてXenopus卵母細胞発現系を用いて検討した。TRPC5がGq共役受容体の刺激に連関したカルシウム流入を起こすチャネルとして機能するのに対して,アミノ酸一次配列が極めてよく似ているTRPC4はチャネルとして機能しなかった。GFPタグをつけた融合チャネルを用いて共焦点顕微鏡で細胞内局在を調べたところ,TRPC4,5いずれのチャネルも細胞内分布と膜の局在に差異は見られなかった。そこでアミノ酸配列を部分的にすげ替えるキメラチャネルを作成して,TRPC5のみが開口するドメインの特定を試みたところ,N末端領域から最初の細胞膜貫通部位までの間が開口に必要であることが明らかになった。現在,点変異チャネルを作成して,アミノ酸の特定を急いでいる。過酸化水素(H_2O_2)やヒドロキシラジカルなどの活性酸素種が神経細胞死を引き起こす過程には,種々のメカニズムが関与していると考えられる。種々の脳変性疾患時には,脳内で活性酸素種を除去する酵素活性が減弱しており,その結果生じるラジカルストレスが神経細胞の生存を増悪させていると考えられている。本研究計画の初年度は,ラット胎仔由来初代培養大脳皮質ニューロンに発現しているTRPファミリー遺伝子をRT-PCRと免疫染色によって検索し,それによって存在が認められたTRPMC3/4/5およびTRPM2/7の5種類のうち,特にH_2O_2によって開口することが報告されたTRPM2に焦点を当てて,ニューロンにおける発現と機能を,ことに細胞死に注目して検討した。まず,公開されているラットゲノム部分塩基配列とマウスおよびヒトTRPM2遺伝子情報を元にして,ラットTRPM2遺伝子をクローニングした。このTRPM2をXenopus卵母細胞や培養動物細胞に発現させると,H_2O_2適用によって細胞内へのCa^<2+>流入と細胞死が観察された。一方,ラット胎仔由来培養大脳皮質ニューロンには内在性TRPM2が多数の神経細胞の細胞体に存在し,siRNAあるいはヘアピンRNA発現ベクターの導入によってTRPM2をノックダウンさせると,H_2O_2誘発Ca^<2+>流入および神経細胞死がともに有意に抑制された。これらの結果から,H_2O_2の細胞毒性には,従来考えられているヒドロキシラジカルの作用のみならず,TRPM2を介するCa^<2+>流入が決定的な役割を果たしていることが明らかになった。

(1)ラット大脳皮質初代培養ニューロンに過酸化水素を適用するとカルシウムイオンの流入に続いて細胞死が惹起された。この初代培養ニューロンにおいてTRPM2分子が発現していることを免疫染色によって確認し,その遺伝子をRT-PCRによってクローニングした。クローニングしたラットTRPM2を動物細胞に強制発現させたところ,過酸化水素適用によるカルシウムイオンの流入と細胞死に加えて,ADPリボースの細胞内適用によるカチオン電流が観察された。培養ニューロンにおけるTRPM2の発現をsiRNAによって抑制したところ,過酸化水素によるカルシウムイオンの流入と細胞死はいずれも抑制された。また,ADPリボースポリメラーゼ阻害薬の適用によって過酸化水素誘発ニューロン死は抑制された。以上の結果から,TRPM2は過酸化水素による神経細胞死において決定的な役割を果たしていることが明らかになった。(2)脳組織に特異的に発現しているTRPC4およびTRPC5の開口機構についてXenopus卵母細胞発現系を用いて検討した。TRPC5がGq共役受容体の刺激に連関したカルシウム流入を起こすチャネルとして機能するのに対して,アミノ酸一次配列が極めてよく似ているTRPC4はチャネルとして機能しなかった。GFPタグをつけた融合チャネルを用いて共焦点顕微鏡で細胞内局在を調べたところ,TRPC4,5いずれのチャネルも細胞内分布と膜の局在に差異は見られなかった。そこでアミノ酸配列を部分的にすげ替えるキメラチャネルを作成して,TRPC5のみが開口するドメインの特定を試みたところ,N末端領域から最初の細胞膜貫通部位までの間が開口に必要であることが明らかになった。現在,点変異チャネルを作成して,アミノ酸の特定を急いでいる。
株主重視の経営という認識の広がりと企業合併公表時の株式価値の変化に関する実証研究

研究成果として以下の3つを研究成果報告書としてまとめた。1.日本社会における株主重視への意識変化と合併公表時の株式価値上昇1990年のバブル崩壊後、日本企業はかつてない厳しい経済環境を体験してきた。この結果、徐々に株式価値の毀損が企業存続の危機につながることを日本企業がようやく実感したと考えられる。本研究では、株主重視の考え方が1998年以降に急速に普及したことを、「企業価値」「株主価値」を含む新聞記事の件数の急上昇から確認した。また1998年と2004年について、企業合併公表日における株式価値の上昇を比較した。結果として、1998年には市場全体に対して相対的に3.2%下落したのに対し、2004年には市場に対する相対変化が3.6%の上昇となった。2004年には企業経営が株主価値の上昇を考慮してM&Aを実行するように変化してきたと考えられる。2.日本企業の統治構造と企業パフォーマンス本研究は、「もの言う」投資家の存在が企業パフォーマンスに与える影響を調査している。調査年度は1996年と2000年の2年である。東証1部上場企業を対象として機関投資家(外国人投資家と投資信託を管理する信託銀行)の持ち分比率と企業パフォーマンスとの関係を調べた。企業パフォーマンスは、トービンのqとROAで計測した。結果として、機関投資家の持ち分比率が大きい企業ほど企業パフォーマンスがよいこと、そしてその傾向が1996年から2000年にかけて強くなったことを確認した。3.企業資産の部分売却の公表が株式価値におよぼす影響について1.の研究が企業買収を対象としたのに対して、本研究では資産売却(ダイベストメント)公表時の株式価値変化を調べた。1998年以前を調べた先行研究では、株式価値の上昇が認められなかったのに対して、本研究では1998年から2004年までの62件のケースから資産売却公表日に市場全体に対して相対的に2.7%の株式価値上昇があったことを確認した。また、財務危機にある会社の方が株式価値の上昇が大きいことも明らかにした。1.文献サーベイ日本と外国の学会誌に発表された企業合併と株価の関係を実証的に調査した文献を調べ、整理した。この結果、日本企業の合併に関する研究は比較的少ないこと、1980年代に数件の研究がなされた後、理由は不明であるが、1990年代にはほとんど実証研究はなされていないこと、2000年代に入ってから数件の研究がなされていることがわかった。2.企業合併事例の調査1990年代の合併事例に関して『会社四季報』、『日経会社情報』で調査を行った。3.予備的な分析1999年に合併を公表した事例について予備的な分析を行った。合併公表20日前から合併公表20日後までの株価の累積異常収益率(CAR)は、合併企業が13%であり、被合併企業が4%であった。合併企業も被合併企業も公表の2日前から1日後までの異常収益率がきわめて高いという特徴があった。4.株主価値を重視するMBOの調査近年、子会社の独立や売却が多数行われるようになった。そうした中で子会社独立の一つの手法として、子会社の経営陣がMBOファンドの助けを借りて親会社から子会社を買い取るMBOという手法が注目されている。わが国におけるMBOの特徴を探るためにMBOファンドに関する調査を行った。

その目標および特徴から株主重視の経営の現れとしてMBOの動向を解釈することができることがわかった。5.年金資産の投資先としてのMBOファンドの調査わが国の年金資産運用はここ数年、株式市場の低迷からよい運用成果が得られていない。このような環境下において、ヘッジ・ファンドなどを代表とする従来の資産分類には当てはまらないオルタナティブと呼ばれる資産が注目されている。MBOファンドへの投資もオルタナティブ投資の一つであり、年金資産の投資先としてどのようなリスク・リターンの特徴があるか調査を開始した。1.株式市場全体のパフォーマンスに関する予備的な研究本年度は、株式市場全体に焦点を当て、株式市場全体のパフォーマンスに関する文献展望と実証研究を行った。この研究は、合併公表時の企業価値変化を見る際に株式市場全体に対する相対評価を行うので、株式市場全体の動きを知る必要性から行った。本来目指している研究成果に対して予備的研究の位置づけとなる。(1)株式市場の期待リスクプレミアムに関する文献展望最近の株式リスクプレミアム推定に関する重要な文献[1]-[3]の比較、考察を行った。これら新しい推定法の特徴は、過去の株価データではなく、経済の実体に重点を置き、株主が受け取る配当利回りと配当成長率に基礎を置く接近法にある。いずれの文献も過去75年間の株式リスクプレミアム約8.5%には上方バイアスを認めている。これらの文献が主張する期待株式リスクプレミアムは約4%から約7.5%である。(2)新しいアプローチによる日本株式のリスクプレミアム推定配当利回りと配当成長率からリスクプレミアムを推定する接近法により日本の株式市場について、1952年からのデータを用いて株式リスクプレミアムを推定した。この結果得られた推定値は約4%であり、過去の平均約5.6%より低かった。2.ダイベストメント公表が企業価値に及ぼす影響の分析企業の合併・買収とは逆の意思決定として、企業資産の売却がある。その公表が企業価値に及ぼす影響を調査する準備を行った。部門・子会社売却のデータおよび新聞における公表日の調査を行った。「ダイベストメント(企業の資産または事業の売却)が株式価値に及ぼす影響の研究」本年度は、企業合併・買収とはちょうど逆の経営意思決定である企業資産の部分売却について、その公表が株式価値にどのような影響を及ぼしたかの調査を行った。近年、日本において企業が不採算事業からの撤退やコア事業への資源の集中を通じて株主価値を向上させることが活発に行われている。このような事業再編は、(a)株式持ち合いの解消、(b)年金基金などの機関投資家が「もの言う」株主へ変化していること、(c)外人投資家比率の増加といった株主構造の変化がもたらした企業へのリストラクチャリング圧力が、その一因と考えられる。したがって、予想される結論としては、企業がダイベストメントを公表すると平均的には株価が上昇するというものである。
皮膚線条はケロイドの対極の病態である！～膠原線維とエストロゲンの知られざる関係

選択的エストロゲン受容体調節薬(SERM、selective estrogen receptor modulator)はエストロゲン受容体に結合し作用するが、受容体の存在する組織によって作動薬または拮抗薬として作用する。SERMのケロイド線維芽細胞に対する効果を検討した。ケロイド線維芽細胞にエストロゲン受容体が存在することを確認し、ケロイド線維芽細胞をSERMで刺激した。SERMは薬剤の種類や濃度によってケロイド線維芽細胞の細胞増殖を抑制する可能性があった。エストロゲン、選択的エストロゲン受容体調節薬(selective estrogen receptor modulator、SERM)のケロイド線維芽細胞、正常皮膚線維芽細胞に対する細胞増殖抑制効果、細胞毒性について検討した。代表的なエストロゲンであり生体内で最も多く、生理活性の高い17β-estradior、SERMとして代表的な乳癌治療薬のtamoxifen、骨粗鬆症治療薬のraloxifeneの3つを対象とした。ケロイド線維芽細胞、正常皮膚線維芽細胞に対して0 nM、1 nM、10 nM、100 nM、1 μM、10 μM(tamoxifenは1 μMまで)と10倍段階希釈した各薬剤を投与した。一定時間後の細胞増殖率をMTSアッセイにて評価し、顕微鏡像と併せて細胞毒性に対する評価も行った。17β-estradiorは正常皮膚線維芽細胞に対して低濃度投与で細胞増殖効果を示す可能性があったが、10 μMでは正常皮膚線維芽細胞ならびにケロイド線維芽細胞に対して細胞毒性を示した。tamoxifenは100 nMでは正常皮膚線維芽細胞ならびにケロイド線維芽細胞に対して細胞増殖効果を示す可能性があったが、1 μMではケロイド線維芽細胞に対して細胞毒性を示した。raloxifeneは正常皮膚線維芽細胞に対して1 μMで細胞増殖抑制効果を示す可能性があったが、10 μMでは正常皮膚線維芽細胞ならびにケロイド線維芽細胞に対して細胞毒性を示した。各々の薬剤は濃度によってケロイド線維芽細胞、正常皮膚線維芽細胞に対する効果が異なる可能性が示された。また、ケロイド線維芽細胞、正常皮膚線維芽細胞によって各薬剤に対する感受性が異なる可能性が示された。選択的エストロゲン受容体調節薬(selective estrogen receptor modulator、SERM)は乳癌や骨粗鬆症等に既に臨床応用されている薬剤であるが、コラーゲン合成やTGF-β発現にも関与することが明らかとなっており、ケロイド抑制作用を有する可能性がある。本研究ではSERMがケロイド線維芽細胞においてコラーゲン合成抑制やTGF-β発現抑制作用を有することを証明し、ケロイド治療への臨床応用の可能性を探る。SERMの作用のターゲットであるエストロゲン受容体のケロイド内または真皮内での発現は明確ではないため、当該年度ではエストロゲン受容体のケロイド内発現を検討した。ケロイド組織、正常皮膚組織を採取し、ケロイドおよび正常線維芽細胞を培養した。細胞染色により培養ケロイド線維芽細胞にエストロゲン受容体α、エストロゲン受容体βの発現を確認した。また、培養ケロイド線維芽細胞および正常線維芽細胞からタンパクを抽出し、ウェスタンブロットによりエストロゲン受容体α、エストロゲン受容体βの発現をタンパクレベルで検証した。ケロイド、正常線維芽細胞ともに、エストロゲン受容体α、βの発現を認めた。ケロイド、正常線維芽細胞間でのエストロゲン受容体の発現量の差は明確ではなかった。当該期間においてケロイド線維芽細胞においてもエストロゲン受容体が発現することを確認できた。エストロゲン受容体の正常線維芽細胞とケロイド線維芽細胞とにおける発現量の差の有無については引き続き検証が必要である。本研究の目的は、SERMがケロイド線維芽細胞においてもコラーゲン合成抑制やTGF-β発現抑制作用を有することを証明し、ケロイド治療への臨床応用の可能性を探ることである。SERMの作用のターゲットとなるエストロゲン受容体は、正常皮膚では表皮角化細胞に多く発現するとされるが、真皮線維芽細胞での発現や、ケロイド組織内での発現の有無については未だ明らかとなっていない。したがって、本研究では初年度にケロイド内にエストロゲン受容体が存在することを証明し、次年度にSERMのケロイド線維芽細胞や角化細胞に対する細胞増殖抑制、コラーゲン合成抑制やTGF-β発現抑制作用を証明することを目標とし研究計画を立案している。初年度の成果としてケロイド線維芽細胞においてもエストロゲン受容体が発現することを、細胞染色およびタンパクレベルで示すことできた。SERMがケロイドに作用する前提を示すことができたと考えられ、次年度の研究計画に向け大きな利点を得ることができた。よって、現在までの研究の達成度は概ね順調に進展していると言える。SERMのケロイドに対する作用を検証する。ケロイド線維

芽細胞や角化細胞をraloxifeneやtamoxifenなどのSERMや17β-estradiolなどのエストロゲンで刺激する。刺激後の細胞増殖率、アポトーシスの有無をMTSアッセイ、トリパンブルー染色、ヘキスト染色で検証する。また、I型コラーゲン産生量、MMP、TGF-β、α-SMA発現量、エストロゲン受容体発現量などを、ELISA法、Western Blot法やreal time RT-PCR法によりタンパクおよびmRNAレベルでそれぞれ解析し比較する。我々は以前に線維芽細胞と角化細胞との共培養モデルを確立し、ケロイド組織における両細胞の相互作用を示し、in vitroでのケロイド病態の再現に成功した。共培養モデルを用いて、ケロイド線維芽細胞や角化細胞をraloxifeneやtamoxifen、17β-estradiolなどで刺激する。刺激後の細胞増殖率、アポトーシスの有無、I型コラーゲン産生量、MMP、TGF-β、α-SMA発現量、エストロゲン受容体発現量などを前述の方法で検証する。本研究を遂行するに当たって具体的に必要な手技は、細胞培養、免疫染色、ウェスタンブロット、リアルタイムPCR等である。よって、各種抗体の購入または作成費用、細胞培養ための培地、生化学試薬、エストロゲンやSERMなどの製剤、ウェスタンブロットやリアルタイムPCRの試薬、その他のシャーレ、ピペット等の実験器材の各種物品の購入のため研究費を使用する予定である。また、研究の成果は順次国内、海外の学会、研究会で発表を行い、論文として投稿する予定であり、学会発表に関する旅費、論文に関する印刷費、投稿費用等としても研究費を使用する予定である。尚、平成25年3月に購入した分について平成25年4月に支払いがなされるので未使用額が生じている。
近赤外線偏光撮像観測による銀河系中心領域の磁場構造の解明

本研究の目的は、銀河系中心領域の近赤外線偏光観測により磁場構造を解明することにある。この領域の観測が可視光ではなく赤外線でなければならない理由は、銀河円盤にある星間塵による減光により可視光が届かないからである。本研究の基礎的な段階として、可視光に比べて赤外線ではどれくらい減光が小さくなるのか、という値を正確に知る必要がある。銀河系中心方向の可視光と近赤外線の星のカタログを用い、両方で検出された星の明るさを比較することで減光の大きさの比を得ることができた。(論文はThe Astrophysical Journalに受理された。)さらに、南アフリカ天文台にあるIRSF望遠鏡を用いて、本題である近赤外線偏光観測を行った。晴天率が例年より低かったため、当初の目標である5平方度には届かなかったものの、4.5平方度にわたる領域を観測することができた。これらの観測データの中から、まず中心20分角の領域を用いて、銀河系中心部の磁場構造を取り出すことができるかを検討し、成功した。(成果は2007年秋の天文学会で発表し、投稿論文としてまとめている。)解析では、銀河系バルジに存在する星をその色によって手前の星と奥とに分類し、その偏光の差を取り出す、という手法を用いた。この差は、銀河系の中心部での偏光によって生じるものである。結果は、銀河面に平行な磁場構造が銀河系中心部において支配的である、というものであった。近赤外線の偏光を用いて銀河系中心部の磁場構造を調べた世界で初めての研究である。
高齢者歩行運動能力の加齢変化の縦断的研究

地域在住高齢者の普通速度歩行運動を同一個体において夏と冬の半年ごとに7年間繰り返し縦断的に調べ、若年成人との比較もあわせて高齢者歩行の特徴と加齢変化の実態を把握した。体力と運動測定値に季節変動のある項目が認められた。同一季節の比較では、加齢により握力と股関節可動域に有意の減少、骨密度と体脂肪率に減少傾向が認められた。一方歩行速度は繰り返し調査群で速くなる傾向があり、訓練による機能向上が示唆された。高齢化社会の到来により、健康で質の高い生活を維持し続けることが緊急の課題となってきている。高齢者が歩行運動機能を維持することは、自立したQOLを保つために重要な要因である。本研究では、高齢者の運動能力とくに歩行運動の加齢現象につき、個体追跡を長期にわたり継続することにより解明しようとするものである。対象を地域の自宅に居住している健康な高齢者とする。これらを対象とすることにより、地域に密着した生活の場における加齢を観察できる。このような観点の研究はこれまで例を見ない。高齢者(ここでは65歳以上)の歩行運動能力を個体追跡を用いた縦断的方法により研究し、高齢者の健康福祉へ寄与することを目的とする。ロコモーションとくに歩行の能力は基礎体力の指標であり、自立したQOLの基本要因である。少子高齢化社会が進みつつある日本において、詳細な研究が必要である。被験者として、66歳から80歳までの地域在住で健康な高齢者21名(うち女性11名、男性10名)を夏冬半年ごとに縦断的に調べた。これらのうち大部分は2年から4年にわたって調査に協力して下さる方々である。対象群として若年成人7名に対して夏季に調査を行い、既存の若年群25名を32名に増員した。被験者には調査の目的を説明し、書面で同意を得た。測定項目は身長、体重、体脂肪量、骨密度の生体計測、握力、開眼片足立ち時間、開眼両足立ち重心動揺の生理機能計測、歩行時の体節移動、同角度変化、重心位置加速度の運動学・運動力学解析、問診票による日常生活調査、歩度計貸し出しによる日常歩数記録、などである。これらの研究により以下の三つの課題が検討された。1)健康な高齢者の若年成人とのちがい。日常生活動作能力(ADL)の低下、筋力の低下、平衡能の低下と、これらと関係すると考えられる一歩距離の低下、歩行速度の低下、両脚支持期の延長などがみられた。また加速度の周波数分析、体の横揺れの程度、胴のねじれの程度、などの新しい知見もえられた。2)高齢者群個体追跡で、加齢とともに両脚支持期が長くなるなどの傾向が認められた。3)季節変動の徴候をみとめた。夏と冬における活動量のちがいが体力と歩行に影響している可能性がある。これらのうち、とくに加齢と季節変動についてはさらに縦断的研究を続けて確認の必要がある。高齢者の歩行運動能力を個体追跡を用いた(縦断的)方法により研究し、高齢者の特徴を明確にして健康福祉へ寄与することを目的とする。高齢化社会へ進みつつある日本において、詳細な研究が必要である。被験者として、本年度は66歳から78歳までの自宅在住の健康な高齢者19名(うち女性10名、男性9名)を夏冬半年ごとに縦断的に調べた。対象群として若年成人18名に対して新規に調査を行い、既存の若年群32名を50名に増員した。測定項目は身長、体重、体脂肪率、骨密度の生体計測、握力、開眼片足立ち時間、開眼両足立ち重心動揺、ファンクショナルリーチの生理機能計測、歩行時の体節移動、同角度変化、重心位置加速度の運動学・運動力学解析、問診票による日常生活調査、歩度計貸し出しによる日常歩数記録、である。これらの研究により以下二つの課題が検討された。本年度新たに判明した特徴として、高齢者は肩と腰の間の捻りが少ないこと、体軸の傾きの大きいこと、足首の蹴り出しの小さいこと、などがある。2)これまでにみつかっている高齢者の歩行特徴である、歩幅の短い、遅い速度、長い両脚支持期、大きな歩隔などは、安全な歩行を続けるための要素という見方ができることがわかってきた。筋力と平衡能が若年成人より低くなっている高齢者において、安全な歩行を続けることは-つの重要な課題である。歩行は、身体機能訓練に役立つものであるが、そこで安全性が失われては意味が無くなる。安全と訓練のかねあいをどうするが高齢者歩行の-つの問題点であることが抽出できた。

高齢者の歩行運動能力を個体追跡を用いた(縦断的)方法により研究し、高齢者の特徴を明確にして健康福祉へ寄与することを目的とする。ロコモーションとくに歩行の能力は基礎体力の指標であり、自立したQOLの基本要因である。高齢化社会へ進みつつある日本において、詳細な研究が必要である。被験者として、本年度は67歳から79歳までの自宅在住の健康な高齢者24名(うち女性14名、男性10名)を夏冬半年ごとに縦断的に調べた。これらのうち大部分は2年から5年にわたって調査に協力して下さる方々である。被験者には調査の目的を説明し、書面で同意を得た。測定項目は身長、体重、体脂肪率、骨密度の生体計測、握力、開眼片足立ち時間、開眼両足立ち重心動揺、ファンクショナルリーチの生理機能計測、歩行時の体節移動、同角度変化、重心位置加速度の運動学・運動力学的測定、問診票による生活習慣・主観的幸福度・ADLの調査、歩度計貸し出しによる日常歩数記録、である。これらの研究により本年度は主に以下二つの課題が検討された。1. 4年ないしら年の長期にわたり資料の得られた個人において、季節変動を考慮して夏期についての縦断的検討を行うと、身長、握力、相対接地期間、股関節可動域において有意な変化が見られた。これらは若年成人と高齢者との間で差が見られる項目であるが、コホート差ではなく個体追跡によっても確認できた。相対接地期間の延長と股関節可動域の減少は運動能力の減少とも見られるが、昨年度検討したように安全な歩き方を選択した結果とも見られる。2.高齢者の中でもより高齢な群の方が、同じ年数の間により大きな変化がある傾向がある。ただし、群わけした際に例数が少なくなるため、この検証は今後の課題である。高齢社会に世界で最も早く進みつつある日本において、高齢者の健康福祉に寄与することを目的に、高齢者の歩行運動能力を個体ごとの追跡調査(縦断的調査)により調べ、その特徴を明らかにした。歩行運動能力は自立したQOLの基本要因である。本年度は被験者として自宅在住の健康な高齢者27名(うち女性16名、男性11名)について夏と冬の2回、半年ごとに調べた。被験者には調査の目的を説明し同意を得ている。調査項目は、身長、体重、体脂肪量、骨密度などの生体計測、握力、片足立ち時間、両足立ち重心動揺の生理機能計測、歩行時の体節運動、関節角度、重心位置加速度などの運動学・運動力学測定、生活習慣、主観的幸福度、ADLなどの問診と歩数計による日常歩数調査、である。本年度の成果は以下の通りである。1.本調査地における夏期と冬期の季節差による変動の実態を明らかにした。2.性別、年齢別の特徴が明らかな項目を示した。3.5年ないし6年継続した個人追跡から、加齢による変化を抽出した。一方で、訓練による機能維持とみられる点が見つけられ、高齢者の生活改善に示唆を与えるものである。4.最終年度であるため、これまでの調査をまとめ、報告書を作成した。
色素性乾皮症の修復欠損に関わる遺伝子とタンパクの異常

色素性乾皮症(XP)の遺伝子とタンパクの異常や修復欠損機構について研究し,(1)A群XP遺伝子の遺伝性突然変異はイントロン3のスプライシング変異,エクソン6のArg^<238>のノンセンス変異,エクソン3のTyr^<116>のノンセンス変異がそれぞれ85%,13%,4%に見られ,遺伝子診断が可能となった。(2)正常XPACタンパクは40,38Kの核蛋白で,DNA結合性タンパクであるが,XPA細胞では異常なmRNAと欠損もしくは異常タンパクが見られ,人工改変したXPAC遺伝子(3'側の改変)は導入したXPA細胞で修復欠損を示した。(3)C群XPについて,FPLCモノQカラムによるDNA依存性ATPase活性を分離定量する系を用いると,XPC細胞に共通した,核局在性の75K ATP^<ase> Q1の溶出位置の異常が見られ,その酵素もしくは複合する蛋白の異常が示唆された。微小核融合法でXPCを相補する染色体のマッピングを行い,1,2,6,7,8,10,11が現在除外され,染色体同定実験が続行している。(4)ヒト正常cDNAライブラリ-の導入によって,現在XPOを相補するcDNAクロ-ンが得られつつあり,PCR増巾断片を用いてneo発現をするpCD2から再クロ-ニングされつつある。(5)XPの修復欠損や修復因子を解析するために,UV損傷の2量体と(6ー4)産物に対する特異的単クロ-ン抗体を樹立し,XP各群の修復欠損やXPAC遺伝子導入細胞における修復の回復が定量できた。(6)細胞修復因子とプラスミドDNAを用いたin vitroDNA修復系が確立され,再構成系を用いて除去修復の機構や因子の作用が研究できるようになった。(7)日本人XPの中で欧米よりも頻度の高いE群XPには,UV損傷DNAに特異的に結合する蛋白を正常にもつものともたないものが分別され,前者が圧倒的に多い。(8)UV誘発遺伝子突然変異が分子解析され,G:C→A:T変異が主で,塩基配列や損に依存し,変異ホットスポットが検出された.色素性乾皮症(XP)の遺伝子とタンパクの異常や修復欠損機構について研究し,(1)A群XP遺伝子の遺伝性突然変異はイントロン3のスプライシング変異,エクソン6のArg^<238>のノンセンス変異,エクソン3のTyr^<116>のノンセンス変異がそれぞれ85%,13%,4%に見られ,遺伝子診断が可能となった。(8)UV誘発遺伝子突然変異が分子解析され,G:C→A:T変異が主で,塩基配列や損に依存し,変異ホットスポットが検出された.
矯正力による歯の移動と三叉神経節での神経ペプチド遺伝子発現の変動

本研究では、臨床上認められる歯の移動開始初期の痛みの発現機序、ならびに歯の移動に付随した諸現象と支配神経との関連性を考察するべく以下の実験を行った。まずラット上顎臼命を実験的に移動させ、移動に伴う歯根膜内カルシトニン遺伝子関連ペプチド(CGRP)含有神経線維と三叉神経節内CGRP陽性ニューロンとの変化について、同一個体を用いて免疫組織化学的に検討した。また、歯牙移動により歯根膜内に加わるストレスと三叉神経節内に存在する神経ぺプチドの動態との関連性を考察するために、歯根膜内細胞におけるHeat Shock Protein(HSP)の発現様相についても検索を試みた。さらに、歯牙移動の中枢神経系への影響の一端を知ることを目的に、ストレスに反応して二次ニューロンに発現するとされるFOS蛋白の三叉神経脊髄路核における発現、消失過程についても免疫組織化学的に検討した。その結果、以下に示す知見が得られた。1.三叉神経節におけるCGRP陽性ニューロンは歯牙移動開始1時間後からその数が減少し、3時間後に最小値を示したが、以後12時間後にほぼもとの状態にまで回復した。これに対して、歯根膜内CGRP含有神経線維は移動開始後6時間後から僅かな上昇を示した。2.一部の歯根膜線維芽細胞は、歯牙移動開始1時間後からHSP60陽性を示しはじめ、その後陽性細胞は移動開始12時間後まで増加しつづけた後徐々に減少した。3. Fos蛋白陽性ニューロンは、歯牙移動開始後1,2,4時間で三叉神経脊髄路核尾側亜社においてその数が増加したが、特に移動開始2時間後に最大値を示した。以上の所見から、歯の移動という刺激によって歯根膜にストレスが生じていることがわかり、その刺激は支配神経を介して三叉神経節、さらにはより中枢にまで影響を及ぼしていることが明らかとなった。しかしながら、当初予定していた歯の移動に伴う三叉神経節の神経細胞体におけるCGRPm-RNAの発現の変化については、個体差が大きかったことから今後例数を増やしてさらに検討を続けていく所存である。歯牙移動に伴う三叉神経節での神経ペプチド発現の変化を知ることを目的として、今年度はまず50日齢の雄性ラットを用いて上顎臼歯を実験的に移動させ、歯根膜内におけるカルシトニン遺伝子関連ペプチド(CGRP)含有神経線維の変化ならびに三叉神経節におけるCGRP陽性ニューロンの変化について免疫組織化学的に検討した。また、歯の移動により歯根膜に加わるストレスと三叉神経節における各種神経ペプチドの動態との関係について調べるために、歯根膜内の細胞におけるHeat Shoch Protein(HSP)の発現についてもノモクローナル抗HSP 60,70,90の各抗体を用いて検索した。その結果、歯牙移動開始1時間後より三叉神経節におけるCGRP陽性ニューロンの数が減少し、3時間後に最小となったが、以後12時間後にほぼもとの状態にまで回復していた。これに対して、歯根膜内のCGRP含有神経線維は移動開始後、6時間後から僅かな上昇を示していた。一方、歯牙移動に伴って移動開始1時間後から一部の線維芽細胞がHSP60陽性を示し、12時間後までHSP陽性細胞はその数を増し、その後徐々に低下していった。

従って、以上の知見から、歯牙移動により歯根膜にストレスが生じていることがわかり、そのストレスによって三叉神経節におけるCGRP陽性ニューロンの数に変化が生じることが明らかになった。また、三叉神経節におけるCGRP陽性ニューロン数の時間経過と歯根膜内CGRP陽性神経線維の時間経過との間に差があったことは、三叉神経節の神経細胞体で合成されたCGRPがprimary neuronのみならずsecondary meuronへも輸送されているためであると考えられ、歯の移動という刺激が三叉神経節を経てより上位の中枢にまで影響を及ぼしていることが示された。本研究では、臨床上認められる歯の移動開始初期の痛みの発現機序、ならびに歯の移動に附随した諸現象と支配神経との関連性を考察するべく以下の実験を行った。まずラット上顎臼歯を実験的に移動させ、移動に伴う歯根膜内カルシトニン遺伝子関連ペプチド(CGRP)含有神経線維と三叉神経節内CGRP陽性ニューロンとの変化について、同一個体を用いて免疫組織化学的に検討した。また、歯牙移動により歯根膜内に加わるストレスと三叉神経節内に存在する神経ペプチドの動態との関連性を考察するために、歯根膜内細胞におけるHeat Shock Protein(HSP)の発現様相についても検索を試みた。さらに歯牙移動の中枢神経系への影響の一端を知ることを目的に、ストレスに反応して二次ニューロンに発現するとされるFos蛋白の三叉神経脊髄路核における発現、消失過程についても免疫組織化学的に検討した。その結果、以下に示す知見が得られた。1.三叉神経節におけるCGRP陽性ニューロンは、歯牙移動開始1時間後からその数が減少し、3時間後に最小値を示したが、以後12時間後にほぼもとの状態にまで回復した。これに対して、歯根膜内CGRP含有神経線維は移動開始6時間後から僅かな上昇を示した。2.一部の歯根膜線維芽細胞は、歯牙移動開始1時間後からHSP60陽性を示しはじめ、その後陽性細胞は移動開始12時間後まで増加しつづけた後徐々に減少した。3. Fos蛋白陽性ニューロンは、歯牙移動開始後1,2,4時間で三叉神経脊髄路核尾側亜核においてその数が増加したが、特に移動開始2時間後に最大値を示した。以上の所見から、歯の移動という刺激によって歯根膜にストレスが生じていることがわかり、その刺激は支配神経を介して、三叉神経節、さらにはより中枢にまで影響を及ぼしていることが明らかとなった。しかしながら、当初予定していた歯の移動に伴う三叉神経節の神経細胞体におけるCGRPm-RNAの発現の変化については、個体差が大きかったことから今後例数を増やしてさらに検討を続けていく所存である。
絶対強度測定が可能なテラヘルツ帯発光分光法の開発

本研究はヘテロダイン検波技術を利用したテラヘルツ領域の発光分光法を気相分子に適用し、従来の吸収分光法が持つ周波数分解能を維持したまま、広帯域のスペクトルを正確な強度情報と共に測定する手段を確立しようとするものである。ここでは、1.幅の広がったスペクトル形状の定量的な議論、2.複雑なスペクトルパターンを示す分子の量子状態の容易な帰属、そして3.広帯域にわたる絶対強度の測定の特性を活かした複数の量子状態の同時観測、の三点について、本研究で新たに開発した分光法が有用であることを示した。実験は茨城県つくば市の宇宙航空研究開発機構に設置されているテラヘルツ帯受信機を用い、主として0.6THz帯で行った。まず1.については最初に塩化水素の二種類の塩素同位体のJ=1-0回転遷移について、0.3-200hPaという極めて広い圧力範囲のスペクトル測定に成功した。得られたスペクトル形状を解析することにより酸素及び窒素に対する塩化水素分子の圧力幅および圧力シフト係数を、精密に決定した。同様の測定は対流圏化学で重要な役割を果たすアセトニトリルについても行いJ=34-33回転遷移のK=0-7副準位について係数を決定した。2.についてはジフルオロメタンの0.6THz帯における発光スペクトルを測定し、スペクトル線の周波数及び強度情報からカタログデータの比較が容易に行えることを示した。これは未知の分子のスペクトル線の帰属を行うに当たり、広帯域で正確な強度情報が得られることの優位性を示唆するものである。3.についてはアセトニトリル/ヘリウム混合気体の放電プラズマからの反応性生物の発光スペクトル観測を試みた。シアン化水素の振動励起状態の強度から、振動温度として410Kが得られた。これは化学反応の速度論的研究を進める上で重要な情報であると考えている。以上の成果はJournal of Molecular Spectroscopyに投稿準備中である。本年度は計画初年度であり、まず発光スペクトルを観測するためのガラスセルの設計および製作を行った。スペクトルの輝度温度そのものの絶対値は常温および低温較正源を用いることにより比較的正確に求めることができるが、この値を用いて、各種分光定数の絶対値を決定するためには、発光測定に用いるセルに封じ込める測定対象気体の圧力、および希釈濃度が正確にわかっている必要がある。また、強度較正測定にあたってガラスセルのブランクスペクトルを測定する必要があるが、測定対象気体の封入作業を測定コンフィギュレーションを変化させずにできるような構造にすることが安定した発光スペクトルの取得のために重要であると考えた。よって、以上の諸条件を満たすガラスセルを何種類か製作し、実際の測定に用いた。今年度は測定対象気体として、塩化水素、およびアセトニトリルといった安定分子を選んだ。両者とも成層圏大気化学において重要な役割を果たしており、電波を用いた大気分光リモートセンシングの観測対象である。しかし、観測データからこれらの気体の大気中の高度分布を導き出すのに必要な正確な圧力幅係数や圧力シフト係数が求められていない。本手法ではスペクトルの正確な形状が絶対強度とともに取得可能であるために、本研究の初期テーマとしては格好であると考えた。塩化水素およびアセトニトリルの希釈ガスとして窒素および酸素を選び、1%程度に希釈したガスを測定に用いた。そしてガラスセルへの封入圧力を0.1hPaから100hPa程度まで変化させ。発光スペクトル測定を行った。取得したスペクトルに対し、放射伝達を考慮したVoigt関数で非線形最小二乗fittingを行い、圧力幅および遷移周波数を求めた。その結果、例えば25°Cにおける空気に対するH^<35>Cl(N=1-0)の圧力幅係数として2.663

(3)MHz/hPa、圧力シフト係数として93.9(26)kHz/hPaという値を得た。アセトニトリルについては現在解析中である。これらの結果は、Journal of Molecular Spectroscopyに投稿予定である。本年度は二年間の研究の最終年度である。まず昨年に引き続き、圧力幅で拡がったスペクトルの形状と強度が、本研究で確立した受動分光法により、定量性を持って測定できることを示す実験を周波数0.6THz帯で行った。アセトニトリルの回転スペクトルの形状パラメーター(圧力幅パラメーターγと圧力シフトパラメーターδ)を副回転量子数毎に初めて決定することができた。これらの実験から得られる形状パラメーターの精度は、より広範な圧力範囲で測定を行うことで、より向上することが期待される。本研究では0.3hPa30hPaという圧力範囲で測定ができた。これは従来の分光法では望めなかった測定範囲である。同様の測定を、塩化水素に対しても行ったが、これについては0.3hPa200hPaという広い圧力範囲のスペクトル形状を測定することができた。これらの成果については現在、Journal of Molecular Spectroscopyに投稿準備中である。次に本手法の実効的な感度を調べるための実験を行った。十分な放射強度(数十ケルビン以上)を持つ試料気体のスペクトル形状測定には、テラヘルツ放射の受信時間(いわゆるONソース時間)として、1秒もあれば十分であるが、これを長くすればするほど微弱な放射スペクトルの観測まで可能になり、分光法としての応用範囲が広がっていくことが期待される。そこで、合計のONソース時間を10秒から徐々に長くしていき最長で数分程度まで試みたが、この積分時間を長くしていくとともに、実験に用いたテラヘルツ受信機システムの安定度の影響がスペクトルに現れることが判明した。現時点での最適条件は積分時間として数十秒であり、0.5ケルビン程度の信号まで検出可能であることが確認できた。以上の実験は、全て茨城県つくば市の宇宙航空研究開発機構に設置されているテラヘルツ帯受信機システムを用いて行った。
免疫細胞特異的PTEN欠損マウスにおける免疫反応と感染防御

ほとんどのサイトカイン、T細胞・B細胞受容体、インスリンなどはPI3K(ホスホイノシチド3-キナーゼ)を活性化して細胞にシグナルを伝えることが報告されている。このPI3KはPIP2(ホスファチジルイノシトール-4,5-リン酸)をPIP3(ホスファチジルイノシトールー3,4,5-リン酸)に変換するキナーゼで、Aktなどを活性化し、、細胞増殖/アポトーシス抵抗性に働くことが知られている。癌抑制遺伝子PTENはこのPIP3を主な基質とするホスファターゼで、これらのシグナルを負に制御する。またPTENは様々なヒト悪性腫瘍で変異が報告されている。我々はこれまでPTEN欠損マウスを作成したが、胎生早期に致死であったことより、各樺臓器におけるPTENの役割の解析は困難であった。そこで、次にCre-loxPシステムを用いて、B細胞特異的にPTENを欠損するマウスを作成した(CD19CrePten^<flox/flox>mice)。このマウスでは、B1a細胞が著増し、自己抗体産生が増強していた。また、脾臓におけるB2細胞は、辺縁B細胞が著増し、濾胞B細胞は激減していた。PTEN欠損B細胞は、増殖が冗進し、アポトーシス抵抗性であり、さらに細胞遊走能も亢進していた。生化学的にはPKB/Aktが著しく亢進していた。その他、B細胞特異的PTEN欠損マウスでは、免疫グロブリンのクラススイッチが著しく障害されており、これは刺激後、クラススイッチに重要であるactivation-inducedcytidine deaminase(AID)の発現誘導の低下によるものと推定された。このようにPTENはB細胞分化の運命決定の役割を演じ、またB細胞のホメオスタシスになくてはならない分子であることを明らかにし、現在論文を投稿中である。
自己免疫性甲状腺疾患の成因の解明

TSH受容体(TSHR)に対する自己抗体(TSHRAb)が甲状腺機能異常に大きく関与すること、さらにTSHRの細胞外領域がTSHおよびTSHRAbと高親和性結合を示すことが推測されている。一方、TSHR蛋白が細胞性免疫を介して甲状腺炎発症に関与するかは不明である。本研究はTSHR蛋白で免疫した実験マウスを用いて、自己免疫性甲状腺疾患におけるTSH受容体蛋白の役割を検討した。TSHR細胞外領域をマルトース結合蛋白(MBP)との融合蛋白(TSHR-MBP)として大腸菌に発現させ、アフィニティーカラムと電気泳動法により融合蛋白を精製した。4種のH-2の系の違うマウス(BALB/C,C57BL/6,CBA/J,SJL)に精製した融合蛋白を免疫して、甲状腺の病理学的変化、血清の抗体価、甲状腺ホルモン(T4)、TSHRAb(TBIAb,TSAb)などを検索した。融合蛋白に対するマウスの血清抗体価は5,000倍希釈にてOD405で約1.0(対照は0.07)と高値であったが、血清中のTBIAb、TSAbは全て陰性、さらにTSHR-MBPはTSHおよびバセドウ病患者血清にいずれとも特異的結合を認めなかった。甲状腺組織ではC57BL/6マウスのみに巣状のリンパ球集落(異所性胸腺)を示したが、特異的な甲状腺炎の所見は認めなかった。T4値はMBPのみとTSHR-MBPを免疫したマウス双方とも低値であり、これは免疫による侵襲、ストレスが原因と考えた。今回の結果からは、動物モデルにおける自己免疫性甲状腺炎の病因として、TSH受容体細胞外領域の細胞性免疫への関与は強くないことが推測された。さらに自己抗原として認識されるためには、融合蛋白におけるTSH受容体の立体構造の保持が重要であることが再認識された。本研究は自己免疫性甲状腺疾患におけるTSH受容体蛋白の役割を追求し、自己免疫性甲状腺疾患の病態の本質に迫ることを目的とする。まず第一に、実験マウスにおいてTSH受容体蛋白で免疫し組織学的に甲状腺炎がおこるか否かを検討した。TSH受容体細胞外領域をmaltose binding protein(MBP)との融合蛋白(TSHR-MBP)として大腸菌に発現させ、アフィニティーカラムと電気泳動法を用いて融合蛋白を精製し、これを用いて4種のH-2の系の違うマウス(BALB/C、C57BL/6、CBA/J、SJL)に組み換えTSH受容体蛋白を免疫した。免疫後、甲状腺の病理学的変化、血清の抗体価、甲状腺ホルモン値(T4)、TSH受容体抗体(TSAb及びTBIAb)を測定し検討した。ELISAによるマウスの血清抗体価は5,000倍希釈にてOD405は約1.0(対照は0.07)と高値であった。甲状腺はC57BL/6マウスのみに巣状のリンパ球集落が認められ、当初は巣状甲状腺炎と考えたが、対照のマウスにも同様の所見を認め、異所性胸腺と結論し、結局いずれのマウスにも甲状腺炎は起こらなかった。また、TSAb及びTBIAbも全て陰性であった。T4値に関してはMBPのみの免疫とTSHR-MBPを免疫したマウス両方とも低値で、これは免疫による侵襲、ストレスが原因と考えた。大腸菌による組み換え蛋白による甲状腺炎の発症には、抗体が受容体の立体構造を認識することが原因の1つと考えられるため、今後、受容体の立体構造を保った組み換え蛋白を作製して免疫を行うことを検討している。

自己免疫性甲状腺疾患の自己抗原の1つとして考えられるTSH受容体の細胞外領域に対するTSH及びTSH受容体抗体(TSAb)の親和性をみる目的で、TSH受容体細胞外領域とLH/CG細胞内領域のキメラ受容体をCHO細胞に発現させて、TSHおよびTSAbの結合性およびcAMP刺激活性を測定した。キメラ受容体はwild typeのTSH受容体と同等のTSH結合能およびTSH、TSAbによる刺激活性を示し、この結果より、TSH受容体細胞外領域がTSHおよびTSAbの高親和性結合にもっとも重要であることが推測された。このTSH受容体細胞外領域の自己抗原としての免疫学的関与を検討する目的で、TSH受容体細胞外領域とマルトース結合蛋白(MBP)との融合蛋白を大腸菌内に発現させ、組み換えTSH受容体蛋白として精製した。精製した融合蛋白(TSHR-MBP)をH-2で系の異なる4種のマウスに免疫して、マウス甲状腺の病理学的変化、甲状腺機能、TSH受容体抗体価などを検索した結果、組織学的には特異的な甲状腺炎の所見は認めず、血中の甲状腺ホルモン(T4)値も軽度低下したが有意な変化ではなかった。さらにTSH受容体抗体(TBIAb,TSAb)も全て陰性であった。また、TSHR-MBPはTSHおよびバセドウ病患者血清いずれとも特異的結合は示さなかった。TSH受容体の細胞外領域は、TSHおよびTSH受容体抗体が高親和性結合を示すことは確かであるが、動物モデルにおける自己免疫性甲状腺炎の病因としてTSH受容体細胞外領域の細胞性免疫への関与は強くないことが推測される。さらに自己抗原として認識されるためには、融合蛋白におけるTSH受容体の立体構造の保持が肝要であることが再認識された。
成熟マウス肝に存在する造血幹細胞からの肝T細胞の胸腺外分化経路の解析

我々は、肝臓が胸腺外T細胞分化の重要な臓器であることを見いだし、そこで分化・成熟するT細胞の性状と機能について報告してきた。また、骨髄に存在するc-kit^+、Lin^-多機能性造血幹細胞が成体の肝臓にも存在することをSCIDマウスを用いた細胞移入実験で明らかにした。本研究では、成熟肝に存在する造血幹細胞からの肝臓内でのT細胞分化の過程を明らかにすることを目的とした。4Gy放射線照射B6-SCID(Ly5.2)マウスヘB6-Ly5.1マウス肝および骨髄のc-kit^+Lin^-の造血幹細胞を移入し、各リンパ系器官に出現するリンパ系細胞、顆粒球系細胞、赤芽球系細胞をフローサイトメトリーで検索した。この系ではLy5.1とLy5.2というB6系マウスを用いることにより、Hostの再構成能、特に胸腺外分化T細胞であるNK1.1^+T細胞の再構成を検討できた。その結果、再構成された肝の胸腺外分化T細胞はIL-2Rβ^+細胞が多くNK1.1^+細胞は少ないものの、そのVβのレパートアーは正常であった。肝の造血幹細胞にはT細胞にcommitmenntしたものが多いことも分かってきた。このことは、胎児胸腺の器官培養(HOSculture)系を用い確かめられ、in vivoの結果と同様に胸腺を早く再構成した。さらに成体肝の初代培養細胞および我々が樹立した肝ストローマ細胞株を用いて、サイトカインの添加なしに肝造血幹細胞の培養が可能となった。その結果、肝造血幹細胞は肝ストローマ細胞の支持のもとにのみNK1.1^+T細胞を分化誘導できた。一方、骨髄の造血幹細胞からは分化が見られなかった。この肝ストローマ細胞は、胸腺や骨髄由来のストローマ細胞と同様にSCFやIL-7などの造血に関与するサイト力インを産性することが、RT-PCR法を用いて確かめられた。以上の結果より、肝造血幹細胞は胸腺の関与なしに独自で肝ストローマ細胞の支持のもとに、胸腺外分化T細胞であるNK1.1^+T細胞を分化誘導できることが明らかとなった。このことから、造血臓器としての肝臓の独自性がより強く示唆された。4Gy放射線照射B6-SCID(Ly5.2)マウスへB6-Ly5.1マウス肝および骨髄のc-kit^+、Lin^-の造血幹細胞を移入し、各リンパ系器官に出現するリンパ系細胞、顆粒球系細胞、赤芽球系細胞をフローサイトメトリーで検索した。この系ではLy5.1とLy5.2というB6系マウスを用いることにより、Hostの再構成能、特に胸腺外分化T細胞であるNK1.1^;T細胞の再構成を検討できる。

その結果、再構成された肝の胸腺外分化T細胞はIL-2Rβ^+細胞が多くNK1.1^+細胞は少ないものの、そのVβのレパートア-は正常であった。我々は、成熟マウス肝臓内の多機能性造血幹細胞は、SCIDマウスの胸腺を骨髄細胞中のそれよりも早く再構成することを見いだしている。このことから、肝造血幹細胞にはT細胞にcommitmenntしたものが多いことが考えられた。肝のc-kit^+細胞にはCD25^+の細胞が骨髄より多く存在することから、この細胞群がT細胞前駆細胞と思われる。肝のc-kit^+CD25^+、c-kit^+CD25^-細胞および骨髄のc-kit^+CD25^-細胞をセルソーターにより分離し、SCIDマウスへ移入したところ、c-kit^+CD25^+細胞の胸腺及び肝リンパ球の再構成能が良い傾向が見られた。以上の結果より、肝造血幹細胞にはT細胞にcommitmenntしたものが多く、しかも肝の胸腺外分化T細胞を分化させる能力を有することが示唆された。我々は、肝臓が胸腺外T細胞分化の重要な臓器であることを見いだし、そこで分化・成熟するT細胞の性状と機能について報告してきた。また、骨髄に存在するc-kit^+、Lin^-多機能性造血幹細胞が成体の肝臓にも存在することをSCIDマウスを用いた細胞移入実験で明らかにした。本研究では、成熟肝に存在する造血幹細胞からの肝臓内でのT細胞分化の過程を明らかにすることを目的とした4Gy放射線照射B6-SCID(Ly5.2)マウスヘB6-Ly5.1マウス肝および骨髄のc.kit^+ Lin^-の造血幹細胞を移入し、各リンパ系器官に出現するリンパ系細胞、顆粒球系細胞、赤芽球系細胞をフローサイトメトリーで検索した。この系ではLy5.1とLy5.2というB6系マウスを用いることにより、Hostの再構成能、特に胸腺外分化T細胞であるNK1.1^+T細胞の再構成を検討できた。その結果、再構成された肝の胸腺外分化T細胞はIL-2Rβ^+細胞が多くNK1.1^+細胞は少ないものの、そのVβのレパートアーは正常であった。肝の造血幹細胞にはT細胞にcommitmentしたものが多いことも分かってきた。このことは、胎児胸腺の器官培養(HOS culture)系を用い確かめられ、in vivoの結果と同様に胸腺を早く再構成した。さらに成体肝の初代培養細胞および我々が樹立した肝ストローマ細胞株を用いて、サイトカインの添加なしに肝造血幹細胞の培養が可能となった。その結果、肝造血幹細胞は肝ストローマ細胞の支持のもとにのみNK1.1^+T細胞を分化誘導できた。一方、骨髄の造血幹細胞からは分化が見られなかった。この肝ストローマ細胞は、胸腺や骨髄由来のストローマ細胞と同様にSCFやIL-7などの造血に関与するサイトカインを産性することが、RT-PCR法を用いて確かめられた。以上の結果より、肝造血幹細胞は胸腺の関与なしに独自で肝ストローマ細胞の支持のもとに、胸腺外分化T細胞であるNK1.1^+T細胞を分化誘導できることが明らかとなった。このことから、造血臓器としての肝臓の独自性がより強く示唆された。