hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
船体構造の座屈後の亀裂強度に関する研究

船舶においては,荒天回避に失敗した場合や,腐食・経年劣化によって板厚衰耗が生じた場合などには,船体を構成している部材に,過大な荷重による座屈崩壊が発生することがある。座屈崩壊が発生した部材の圧縮側,すなわち大きな圧縮歪を受けた部分では,鋼材が脆化し,破壊靱性値が低下するために,亀裂が早期に発生する可能性が大きくなる。すなわち,大破壊事故の引き金になることが多い。現に,このような原因で大破壊事故を引き起こした大型船舶の例が報告されている。本研究では,平成7年度平成9年度の3年間で,4種類の鋼板を供試して実施した各種の試験結果と,有限要素法による弾塑性大変形解析結果とを統合して,概略以下の成果を得た。1.軸力圧縮予歪が,鋼材の機械的性質および切欠靱性に及ぼす影響を把握した。2.1回の座屈崩壊により圧縮側から発生する亀裂を対象に,帯板平滑部材の座屈崩壊後の亀裂発生強度,すなわち,微小亀裂発生限界条件を定量的に把握した。3.座屈崩壊後,引き続いて負荷されることによる大きな繰り返し圧縮歪により発生する亀裂を対象に,帯板平滑部材およびスチフナ隅肉溶接止端部の繰り返し曲げ荷重下での亀裂発生強度,すなわち,微小亀裂発生強度・破断強度を把握した。以上により,座屈崩壊部から亀裂が発生・進展し,さらに不安定亀裂に移行して,大破壊事故へと発展することを防止する,破壊管理制御設計法確立の基礎技術が蓄積出来たといえよう。なお,圧縮歪による鋼材材質の劣化(脆化)に関しては,これまでに多くの研究が行なわれてきたが,亀裂発生強度を定量的に把握した本研究成果は画期的であるといえよう。荒天回避に失敗した場合などには,船体には過大な荷重が作用し,船体を構成している部材に座屈が発生することがある。引き続き変動荷重が負荷されると,圧縮塑性歪を受けて靱性が低下している座屈変形の内側から,早期に亀裂が発生し,部材を切断する危険がある。座屈によって大きな圧縮塑性歪を受けた箇所から発生する亀裂を対象に,亀裂発生・進展現象に関しての定量的な評価を可能ならしめることが,本研究の目的である。平成7年度の研究では,JIS一般構造用圧延鋼材SS400(一船体用軟鋼板と同等)を供試して,概略以下の成果が得られた。1.円柱試験体による軸圧縮予歪材の引張試験を実施し,予歪量と引張強さ・真破断応力との関係を把握した。2.帯板試験体による軸圧縮座屈後,さらに大変形曲げを与え,圧縮側からの亀裂発生/非発生の限界歪量を実験的に把握した。3.有限要素法を使用した3次元弾塑性大変形解析により,上記2.の帯状曲げ試験による圧縮歪量と,除荷後曲げ圧縮部に発生する残留応力との関係を把握し,上記1.の成果を踏まえて,上記2.の亀裂発生/非発生限界条件を確認した。平成8・9年度で,座屈後の大変形曲げによる亀裂発生現象をさらに詳細に把握する。さらに,座屈損傷した箇所の引張・圧縮の繰り返し荷重による亀裂発生現象を定量的に把握する。荒天回避に失敗した場合などには,船体に過大な荷重が作用し,船体を構成している部材に座屈・塑性崩壊が発生することがある。

平成8年度の研究では,JIS一般構造用圧延鋼材SS400およびJIS溶接構造用圧延鋼材SM490Cを供試して,概略以下の成果が得られた。1.円柱試験体による圧縮予歪材の引張試験を実施し,予歪量と引張強さ・真破断応力との関係を把握した。2.帯板試験体を用いた軸圧縮座屈後の曲げ変形による亀裂発生試験により,圧縮側からの亀裂発生/非発生の限界歪量を実験的に把握した。3.上記1.および2.の結果を踏まえて,座屈後に圧縮側から発生する亀裂の発生/非発生限界に及ぼす材質(降伏比)および試験片形状態(板幅)の影響を把握した。平成9年度で,座屈損傷した箇所の引張・圧縮の繰返し荷重による亀裂発生現象,および溶接構造部材の座屈後の亀裂発生現象を定量的に把握する。荒天回避の失敗などによる過大な荷重が作用した場合や,十分な保守・点検が行なわれず腐食・経年劣化によって板厚衰耗が生じた場合などには,船体を構成している部材に座屈・塑性崩壊が発生することがある。引き続き変動荷重が負荷されると,圧縮塑性歪を受けて延性・靱性が低下している座屈撓みの内側(圧縮側)から早期に亀裂が発生・進展し,部材を切断または不安定亀裂化する危険がある。このように構造部材の座屈崩壊後に発生する亀裂が,大破壊事故の引き金となった損傷例が実際の大型船舶などで確認されている。本研究の目的は,座屈によって大きな圧縮塑性歪を受けた箇所から発生する亀裂を対象に,亀裂発生・進展現象に関しての定量的な評価を可能ならしめることである。平成9年度研究では,JIS一般構造用圧延鋼材SS400,JIS溶接構造用圧延鋼材SM490CおよびSM490Aを供試しての各種経験,および有限要素法による弾塑性大変形解析を実施し,概略以下の成果が得られた。1.軸力圧縮予歪材のV-ノッチシャルピー衝撃試験を実施し,圧縮予歪が鋼材の切欠靱性〔吸収エネルギー遷移温度(vTrE)など〕に及ぼす影響を定量的に把握した。2.小型平滑帯板試験体を用いた繰り返し曲げ荷重下での亀裂発生試験により,座屈撓みの内側(圧縮側)からの亀裂発生・破壊強度を実験的に把握した。3.小型スチフナ隅肉溶接試験体を用いた繰り返し曲げ荷重下での亀裂発生試験により,スチフナ隅肉溶接止端部からの亀裂発生・破壊強度を実験的に把握した。4.上記2,3の試験対を対象とした有限要素法解析により,亀裂発生部の応力・歪分布などを詳細に把握した。5.上記2,3,4の結果を総合して,鋼構造部材の座屈崩壊後に圧縮側から発生する亀裂の,発生・破断強度を定量的に評価した。
幹細胞からの腎臓３次元構造の再構築

腎臓はネフロン前駆細胞、尿管芽、間質前駆細胞という3つの前駆細胞集団の相互作用によって形成される。本計画は、幹細胞からこの3系統を誘導し、腎臓の3次元構造を再構築することを目的とした。マウスを用いて尿管芽の発生過程で働く遺伝子群を明らかにし、3系統の前駆細胞を混合して腎臓の3次元構造を再構築する検定系を構築した。またヒトiPS細胞由来のネフロン前駆細胞をマウスに移植することによって、ヒト糸球体がホストの血管とつながることを示した。腎臓はネフロン前駆細胞(後腎間葉)、尿管芽、そしてその間を埋める間質の、主に3つの細胞集団の相互作用によって形成される。我々は発生過程を完全に模倣した5ステップの処理によって、マウスES細胞及びヒトiPS細胞からネフロン前駆細胞を誘導し、そこから立体構造をもった糸球体と尿細管を誘導することに成功した。そこで本計画は、幹細胞からさらに間質と尿管芽を誘導し、ネフロン前駆細胞と組みあわせて、腎臓の3次元構造を試験管内で再構築することを目的とする。1.間質前駆細胞のマーカー遺伝子の探索:間質は発生期腎臓の外縁部に位置するFoxd1陽性の前駆細胞から派生する。そこでFoxd1の遺伝子座にGFPをノックインしたマウスから、GFP陽性細胞をFACSで集め、マイクロアレイ解析を行った。また同時に前駆細胞以外の間質細胞も集めて解析を行った。これによって既知の間質前駆細胞マーカーを濃縮できていることを確認した。未知の候補遺伝子群に関してはin situ hybridizationを行ったが、発現が前駆細胞に限局せず、信頼できる新たなマーカーは単離できていない。2.ポドサイトが蛍光発色するヒト糸球体の構築:本計画ではあくまでもマウスを先行させて誘導法の開発と3次元構造構築を目指すが、ヒトiPS細胞を使った道具立ては進めておく。TALENを使った相同組換えによって、糸球体ポドサイトで発現するネフリン遺伝子座にGFPをノックインしたヒトiPS細胞を樹立した。そこから腎臓方向へと誘導して、ポドサイトが光るヒト腎臓組織の作成に成功した。in situ hybridization装置の故障によって、間質前駆細胞のマーカー探索に遅れがでた。幸い数ヶ月でより感度の高い状態に回復させることができたものの、マイクロアレイから抽出した候補遺伝子の多くが前駆細胞に限局しておらず、信頼できる新規前駆細胞マーカーを単離できていない。1.間質前駆細胞の機能と発現遺伝子の解析:間質は発生期腎臓の外縁部に位置するFoxd1陽性の前駆細胞から派生する。既知の間質前駆細胞マーカーの一つとしてSall1を再確認し、Sall1の間質細胞特異的なノックアウトマウスを作成した。これによって間質がネフロン細胞の過剰な増幅を抑制していることが明らかとなり、間質でのSall1の標的を同定した。しかしノックアウトマウスの間質のマイクロアレイから、間質が予想以上に不均一な集団であること、発生時期によって前駆細胞の遺伝子発現プロファイルがかなり異なることが判明した。2.ポドサイトが蛍光発色するヒト糸球体の構築:糸球体ポドサイトで発現するネフリン遺伝子座にGFPをノックインしたヒトiPS細胞を樹立し、そこからポドサイトが光るヒト腎臓組織を作成した。誘導したヒトポドサイトはネフローゼ症候群の原因遺伝子などポドサイトに特徴的な遺伝子群を発現し、複雑な細胞突起を持っていた。さらにマウスへの移植によって、糸球体が血管につながり、足突起が複雑化した。ヒトiPS細胞由来の腎臓組織が血管と接続し、さらに成熟した初めての報告である。誘導すべき間質前駆細胞の時期と遺伝子発現がまだ確定していないため、ES細胞からの誘導が進んでいない。一方で尿管芽の誘導やヒトiPS細胞を用いた実験は順調に進んでいる。我々は発生過程を模倣した複数ステップの処理によって、マウスES細胞及びヒトiPS細胞からネフロン前駆細胞を誘導し、そこから糸球体と尿細管を誘導することに成功した。そこで本計画は、幹細胞からさらに間質と尿管芽を誘導し、ネフロン前駆細胞と組みあわせて、腎臓の3次元構造を再構築することを目的とする。1.腎臓を構成する前駆細胞の誘導と3次元構造の再構築:腎臓を構成する前駆細胞の一つである尿管芽の発生過程を時間を追って追跡し、各発生段階で働く遺伝子群を明らかにした。またマウス胎児由来の3系統の前駆細胞(尿管芽、ネフロン前駆細胞、間質前駆細胞)を混合して腎臓の3次元構造を再構築する検定系も構築した。これらを指標にして、胎生初期の細胞集団を尿管芽まで誘導する条件を決定した。

現在マウスES細胞から尿管芽に向けた誘導法を構築中である。また間質に関しても、遺伝子発現と再構成系を使って誘導を進めている。最終的には3系統すべてをマウスES細胞から誘導し、腎臓の高次構造を再構築することを目指している。2.ヒトiPS細胞を用いた糸球体の解析:糸球体ポドサイトで発現するネフリン遺伝子座にGFPをノックインしたヒトiPS細胞を樹立した。誘導したヒトポドサイトはネフローゼ症候群の原因遺伝子などポドサイトに特徴的な遺伝子群を発現していた。さらにマウスへの移植によって、糸球体が血管につながり、足突起が複雑化した。ヒトiPS細胞由来の腎臓組織が血管と接続し、さらに成熟したことになる。またネフロン前駆細胞の増幅法も開発した。腎臓はネフロン前駆細胞、尿管芽、間質前駆細胞という3つの前駆細胞集団の相互作用によって形成される。本計画は、幹細胞からこの3系統を誘導し、腎臓の3次元構造を再構築することを目的とした。マウスを用いて尿管芽の発生過程で働く遺伝子群を明らかにし、3系統の前駆細胞を混合して腎臓の3次元構造を再構築する検定系を構築した。またヒトiPS細胞由来のネフロン前駆細胞をマウスに移植することによって、ヒト糸球体がホストの血管とつながることを示した。ES細胞から間質の誘導を目指すに際して、どの遺伝子発現を目安とするかが今後の課題である。複数の発生時期において発現解析を行い、指標とすべきマーカーを抽出する。ネフリンGFP-iPS細胞に関しては、足突起の形態、マイクロアレイによるポドサイトの遺伝子発現解析、そして移植を計画している。不均一な間質の中のどれをES細胞から誘導するのかを決めるために、間質の起源をより正確に同定する必要がある。遺伝子改変マウスを使った詳細な解析を計画している。ヒトiPS細胞の方は移植実験を進めて、腎臓組織のさらなる成熟を目指す。28年度が最終年度であるため、記入しない。腎臓発生28年度が最終年度であるため、記入しない。
先天性トキソプラズマ性網脈絡膜炎における原虫の網膜血管内皮細胞侵入機構の解析

先天性トキソプラズマ性網脈絡膜炎のモデルマウスを確立し、サイトカインやケモカイン、接着因子の発現をreal-time PCR法で解析した結果、IFN-γ、各種ケモカイン、各種接着因子の発現が著明に増加したことから、この発症には、IFN-γが重要な働きをし、かつ、IFN-γに関連するケモカインや接着因子が関与することが示された。さらに、網膜にトキソプラズマが確認され、血管周囲に細胞浸潤が認められ、蛍光色素の漏出が見られ、機能的にも血管炎が存在していることが証明された。(1)トキソプラズマの感受性野生型(WT)C57BL/6マウス、抵抗性WT Balb/cマウス、及びそれらと同じ遺伝背景のインターフェロンガンマノックアウト(GKO)マウスを妊娠させ、妊娠後7日または11日にトキソプラズマFukaya弱毒株のシストを経口感染させ、先天性トキソプラズマ症の動物モデルを確立させた。WTマウスにおいてはトキソプラズマ感染により流産するマウスが多かったが、GKOマウスでは流産しなかった。トキソプラズマによる流産因子にはインターフェロンガンマが関与していることを再確認した(Shiono Y. et al. ParasitoI Int. 2007, 56:141-8. )。(2)感染後、経時的に胎児あるいは仔マウスから脳、眼球を摘出し、定量的競合的PCR法でトキソプラズマDNAを定量解析したところ、GKO C57BL/6マウスでは脳及び眼球に高濃度にトキソプラズマDNAが認められたが、WTマウスでは低濃度であった。(3)感染後各時期の胎児、仔マウスの眼球を摘出し、HE染色及び各種免疫組織染色をおこない、光学顕微鏡あるいは蛍光顕微鏡で網脈絡膜炎を病理学的に解析したところ、各種炎症性細胞の網膜内浸潤が認められた。さらに各種接着分子の発現が上昇していた。以上、先天性トキソプラズマ性網脈絡膜炎の動物モデルの確立に成功し、上述した結果より先天性トキソプラズマ性網脈絡膜炎の発症にはインターフェロンガンマが重要な働きをしかつ、接着分子の関与が示唆された。(1)昨年度は、細胞内寄生原虫トキソプラズマの感受性野生型(WT)C57BL/6マウス、抵抗性WTBALB/cマウス、及びそれらと同じ遺伝背景のインターフェロンガンマノックアウト(GKO)マウスを妊娠させ、妊娠後7日または11日にトキソプラズマFukaya弱毒株のシストを蛍光感染させ、先天性トキソプラズマ性網脈絡膜炎(本症)の動物モデルを確立した。今年度はその動物モデルを使用し、感染後、経時的に胎児或いは仔マウスから脳、眼球を摘出し、RNAを抽出しcDNAを作製し、各種サイトカインやケモカインの発現をreal-time PCR法で解析した。その結果、C57BL/6 WTマウスにおいては、インターフェロンガンマの発現が著名に増加したが、BALB/cマウスでは増加の程度は少なかった。また、CXCL10、CXCL9、CXCR3の発現が著明に増加した。これらのことから、先天性トキソプラズマ性網脈絡膜炎の発症には、インターフェロンガンマが重要な働きをし、かつ、インターフェロンガンマに関連するケモカインも関与することが示された。(2)感染後、各時期の胎児、仔マウスの眼球を摘出し、原虫トキソプラズマを免疫染色法で解析した。その結果、網膜にトキソプラズマが確認され、血管炎も伴い、各種免疫担当細胞の浸潤が見られた。以上の結果から、本症の発症には、血管炎を伴い、各種免疫担当細胞が関与することが示された。一昨年度及び昨年度に確立した先天性トキソプラズマ性網脈絡膜炎のモデルマウスから、経時的に胎児或いは仔マウスの脳及び眼球を摘出し、各種サイトカインやケモカインの発現をreal-time PCR法で解析した結果、易感染性のC57BL/6WTマウスにおいてはインターフェロンガンマ(IFN-γ)の発現が著名に増加したが、感染抵抗性のBALB/cマウスでは増加の程度は少なく、CXCL10、CXCL9、CXCR3の発現が著明に増加したことから、先天性トキソプラズマ性網脈絡膜炎の発症には、IFN-γが重要な働きをし、かつ、IFN-γに関連するケモカインも関与することが示された。また、脳と眼球を比較した場合、脳における炎症の方が、眼球における炎症よりも先立って起こり、接着分子であるICAM1やCCl5の発現が増加していた。さらに感染後、各時期の胎児及び仔マウスの眼球を摘出し、原虫トキソプラズマを免疫染色法で解析した。その結果、網膜にトキソプラズマが確認され、血管周囲に細胞浸潤が認められ、血管炎を伴うことが示された。

また、エバンスブルー染色液を仔マウスの眼窩から静注し、網膜のフラットマウントを作製し、共焦点蛍光顕微鏡で観察したところ、蛍光色素の漏出が見られ、機能的にも血管炎が存在していることが証明された。これらの結果から、先天性トキソプラズマ性網膜炎の発症において、血管炎が引き起こされ、IFN-γが密接に関与し、かつ、種々のケモカイン、接着分子が大きな役割を担っていることが示唆された。
魚類網膜におけるグリア細胞の生理的意義ー酸化的ストレス負荷時の挙動について

グルタチオン(γ-グルタミルシステニルグリシン=GSH)は生体内の主要なSH還元物質であり,活性酸素やフリーラジカルの消去のための低分子抗酸化物質として重要な役割を果たしていると考えられている。中枢神経系におけるGSHの役割を考察するに,最近培養系において,神経細胞よりグリア細胞の方が有意にその濃度が高いことが報告されている。他方,その生合成に対する律速過程は生体外からのシステイン(シスチン)の取り込みに大きく依っていると云われている。そこで我々は中枢神経系に属する神経網膜を用い,^<35>Sシスチンの取り込み(30分間)を施行し,そのオートラジオグラフィーを観察したところ,唯一ミューラー細胞(網膜グリア細胞)のみがポジティブであり,又^<35>SシスチンよりGSHの有意の生成が確認された。更にこのシスチン取り込みのイオン依存性を検索したところ,明らかにCl^-依存性であった。このことはミューラー細胞のシスチン/グルタミン酸対向輸送系(X〓)が局在して発現していることが強く示唆される。次いで網膜にストレス負荷をかける目的でグリア毒として知られている,α-アミノアジピン酸(α-AAA)を眼球内注射したところ有意にGSHが減少し,ERGb波、グルタミンシンセターゼ(いずれもグリアマーカー)が有意に減弱した。同様にGSH合成阻害剤の眠球内注射により,GSHの減少とERGb波の消失ないし減弱が見られ,GSH濃度とグリア細胞の機能との間に強い相関が見られた。以上の結果は,種々の酸化的ストレス負荷に際し,まずグリア細胞内のGSHが大きく関与し神経細胞への波及を未然に防いでいるのではないかという極めて魅惑的な仮説が提出され,今後実証にむけての更なる検索を進めているところである。
IL-12による弱毒化マラリア原虫のワクチン効果増強に関する基礎的研究

本研究は、マラリア感染防御に関わる免疫機構を解析し、防御免疫能を高めるための免疫制御の方法を検索することを目標としている。今年度は、マラリアのマウスモデルとして脇らが作製した自然治癒する弱毒株P.berghei XATを用い、マラリアの感染防御におけるIL-12の役割について検討した。P.berghei XAT感染赤血球をCBA/Jマウスに投与すると、Parasitemiaの増悪後原虫は血中から除去されるが、この時Splenectomyを施したマウスに同様に投与するとParasitemiaが増悪し続け原虫を除去できず死亡した。従って以後感染防御にかかわる臓器として脾臓を中心に検討を行った。まずXATの感染により脾臓においてIL-12p40及びIFN-γmRNA発現が誘導され、抗IL-12抗体の投与によりIFN-γ産生が著名に抑えられ感染防御能が低下しParasitemiaが増悪し死亡したことから、IL-12産生を介したIFN-γ産生増強が防御免疫に重要であることが明かとなった。次に、IL-12投与による感染防御能を調べると、IFN-γ産生を増強し顕著なParasitemiaの抑制が観察された。さらに、その1ヶ月後強毒株P.berghei NK65感染赤血球を投与すると、XAT単独でも100%の生存率が得られたが、IL-12との併用によりさらにParasitemiaの軽減が観察され、IL-12によるXATのワクチン作用の増強が見られた。以上のように、XATの感染赤血球投与による感染においてIL-12産生を介したIFN-γ産生がマラリア感染防御に強く働いていることが明かとなった。
浚渫ヘドロを用いた沿岸域ヨシ湿地生態系の創出とその機能評価

本研究では、浚渫ヘドロを利用して、沿岸域でヨシを中心とする湿地を創出する技術を確立すること並びに創出したヨシ湿地生態系が有する水質浄化機能及び利用したヘドロの改良機能を評価することを目的とする。これまでヨシの植栽に必要なヨシを大量に供給する技術並びに浚渫ヘドロヘのヨシ植栽及び育成方法に関する検討を行ってきた。本年度は、一旦創出したヨシ湿地の水質浄化機能を評価するために、(1)浚渫ヘドロを用いて創出したヨシ湿地を対象として、汚濁した自然の感潮河川やそれに一部下水処理水を加えた排水を流入させ、ヨシ湿地から流出する表面流れ方式とした。この流出水中の栄養塩やSS(懸濁物質)濃度を測定して水質浄化機能を評価した。(2)ヨシ湿地の水質浄化機能を強化したヨシフィルター(鉛直浸透流れ)を作成し、水質浄化機能を評価した。表面流れ系の実験装置での窒素除去能力は、自然のヨシ原や他の植採取法で創出したヨシ原と同程度であった。また、ヨシが十分に育った状態ならば、年間を通じてSSの除去能力が高いことが示唆された。一方、浸透流れ系では、2年以上にわたって、生活排水をヨシフィルターに流入させた。このときの窒素除去率は、年平均で89%と表面流れ系に比べて、非常に高いことがわかっている。そこで、窒素除去に占める脱窒の寄与率を求めるために、実験室規模のヨシフィルターを作成し、生活排水レベルの人工排水を流入させ、窒素除去速度の季節変化を求めると同時に、アセチレン阻害法を適用して、ヨシフィルターから大気への亞酸化窒素のフラックスを求めた。この結果から、少なくとも、窒素除去の27%は脱窒によると推定された。
トーリック多様体と交点理論

石田はトーリック多様体の交叉ホモロジー群が、対応する扇に含まれる錐体の生成する線形空間を集まりを使って得られた外積代数上の次数付き加群の複体によって表現されることを示した。これは有限集合である扇を空間と考えて、その上で層の理論を展開しているともいえる。重要な結果として対角線定理I,IIが得られた。対角線定理Iは非特異コンパクト・トーリック多様体のホッヂ数が対角線部分しか出ないことを、特異点を持つ場合に拡張した結果である。スタンレーは単体的凸多面体の面に関する上限予想を代数幾何学の重要な定理である強レフシェッツ定理をトーリック多様体に適用することにより証明した。対角線定理IIはこの証明における強レフシェッツ定理を不要にしている。板東はチアンが証明したアインシュタイン・ケーラー計量を許容する複素射影空間の複素部分多様体の安定性を一般論の観点から眺め直し、等質空間の場合にも拡張出来ることを確認した。西川は双曲型空間内の調和写像の存在問題と調和葉層構造のスペクトル幾何に関して研究し成果を得た。長谷川はヤン・バクスター方程式の楕円テータ関数解に付随して定義される双代数と、その表現の構成について研究を行なった。他の分担者も、それぞれの方面から研究を行ない成果を得ている。
新しい粉末冶金法による金属・セラミックス生体インプラントのオンデマンド複製

生体インプラントや人口歯として利用される一品ずつ形状と寸法が異なった製品をオンデマンドで複製する技術を,新しい粉末成形・焼結法と樹脂による転写型技術の組み合わせで実現した.粉末成形型を作製する途中で超臨界ガス含浸法により樹脂を発泡させ,これにより焼結中の寸法収縮を防ぐ方法を開発した.また薄肉のシェル型で型崩壊無く粉末成形が可能になる埋設成形法や,樹脂の熱分解によるストレスフリー脱型法などを適宜開発し,欠陥のないアルミナ質焼結体が得られるようになった.生体インプラントや人口歯として利用される一品ずつ形状と寸法が異なった製品をオンデマンドで複製する技術を,新しい粉末成形・焼結法と樹脂による転写型技術の組み合わせで実現した.粉末成形型を作製する途中で超臨界ガス含浸法により樹脂を発泡させ,これにより焼結中の寸法収縮を防ぐ方法を開発した.また薄肉のシェル型で型崩壊無く粉末成形が可能になる埋設成形法や,樹脂の熱分解によるストレスフリー脱型法などを適宜開発し,欠陥のないアルミナ質焼結体が得られるようになった.本年度の研究では,プロセス全体を俯瞰して,まず膨張雄型と成形型の樹脂の選定を行い,高純度アルミナ系の人工歯の成形・焼結を行った.以下に結果をまとめる.膨張型には,ポリスチレン樹脂を選定した.これを,新規導入した圧力容器中に設置して,窒素を150°C,15MPaまでの条件で含浸させ,その後圧力を開放することで樹脂をほぼ均一に発泡膨張させることに成功した.なお,膨張量は焼結収縮を補償するのに十分な量であった.上述の発泡樹脂を熱硬化系の樹脂中に埋設し,成型型を作製したところ,樹脂から余剰の窒素が溶け出し,表面が荒れてしまった.しかし.その後の選択溶解により発泡樹脂のみを溶かし出し,目的形状の空隙を持つ成形型を作製することができた.この成形型は,高速遠心成形に耐えるだけの強度を持っていた.上述の成形型にアルミナの水系泥しょうを充填し,高速遠心成形法により成形することで,粉末が密に充填した成形体を作製することができた。成形後は,型ごと真空中で加熱することで型を熱分解除去することができた.また,この成形体は,一応焼結が可能であった.しかし,クラックの発生と,焼結密度の低さ(約90%)に関しては,改善の余地がある.研究の当初,昨年度までに開発したプロセスに基づき,超臨界ガス含浸法で型(B型,ポリスチレン製)を膨張させ,これを成形型(C型)中に埋設した.しかし,このプロセス中にB型が再発泡してしまい正確に形状転写がなされなかった.また,成形後のC型の熱脱脂特性にも問題があり,さらに成形までのプロセスのステップ数が多いため,昨年度に構想していたプロセスは全体として合理的でないと考えられた.そこで本年度はプロセス全体の流れを改良し,元形から転写したメス型を発泡膨張させ,これをバックアップ型で支えて直接成形型とし,これに遠心力下で粉末を充填・成形する方法を構想した.これにより,プロセスのステップ数は4ステップに減少すると共に,上述の諸問題を回避できると思われる.ただし,新たな成形型には従来とは異なった諸特性が要求されるため,プロセス成立に関わる諸問題を洗い出し直して,型樹脂の選定と型作成条件の確立のための一連の研究を行った.元型の素材はパラフィンである.従って,成形型は常温で硬化するタイプのものが必要となる.ただし,常温で型転写が可能なエポキシやウレタンと言った反応硬化型の樹脂では,その後の発泡膨張が上手く行かないことが既に確認されている.そこで今回は,水溶系のPVA樹脂と,昨年度までの研究で発泡実績があるポリスチレン樹脂をスチレンモノマーで希釈した樹脂系を選択した.これらの液状樹脂中に元型をつけ込んで取り出し乾燥させることで,パラフィンの元型の周りにカプセル状にPVAやポリスチレン樹脂の被膜を生成することが出来た.ただし,PVA樹脂に関しては,超臨界ガス含浸法で発泡膨張させることが出来なかった.これは,従来の窒素に替えて,一般的に含心が進みやすいとされる二酸化炭素に含浸ガスを変更しても,同じ結果であった.一方で,ポリスチレン樹脂は,樹脂単体を射出成形により成形した場合に比べると発泡量が減少したが,ガスを含浸させて膨張させる事が可能であった.来年度以降は,以上の結果に基づいて,プロセス全体の成立を目指して,研究を行っていく予定である.本研究は,人工骨や人工歯といった,一品ごとに形が違う医療素材を,寸法と形状を保持しながら金属(例えばチタン)やセラミックス(例えばアルミナ)製品にオンデマンドで複製する技術の開発である.本研究室で開発した高速遠心成形法を中心に据え,これに樹脂型作成技術を組み合わせた粉末冶金プロセスにより目的を達成する.研究最終年度となったH23年度の研究では,前年度までの研究をさらに洗練することを主眼として,研究項目全般にわたって改めて研究開発を行い,最終的に下記の結果に至った.i)元形からHCP用成形型の作製:歯科技工士が行っている現有の技術をベースとし,印象型(ロウ)→石膏型(メス型,既存の歯科技術)→発泡型(オス型,射出成型)→超臨界ガス含浸発泡(オス型)→成形型(メス型,エポキシ樹脂)→成形型中の発泡型除去(溶剤法)の樹脂転写技術を完成した.ii)HCP成形に関して:

発泡型を成形型樹脂に浸けて取り出して乾燥し,その表面に薄いシェル状の型を生成するいわゆるディップ法により,薄膜のシェル型として成形型を得た.この方は強度が弱いため通常のHCPでは崩壊するので,シェル型自体をHCP中の泥漿中に埋設しながら成形する「埋設成形法」を開発し,成形中の静水圧を利用して,型の崩壊を防ぐことが出来るようになった.iii)ストレスフリー脱型:熱脱脂法を採用した.約10種類の樹脂の熱分解挙動をTG-DTAにより調査し,結果として出来るだけ熱分解温度が低く,また残留炭素分の少ない樹脂系を見出すことに成功した.さらに,成形型と粉末成形体の熱膨張差が大きいと成形体が割れることが分かったため,成形型樹脂にアルミナフィラーを混入し,これにより成形型と粉末成形体の熱膨張率を近づけ,製品の割れを防ぐ方法も合わせて開発した.結果として,ほぼ割れが無い形で,脱型が出来るようになった.iv)脱脂・焼結:前述のi)iii)までの技術を洗練することで,少なくともアルミナ質焼結体に関しては,ほぼ割れなく焼結製品が得られる段階まで開発は進んだ.
ホヤ胚単離割球およびマウス奇形腫細胞における神経型初期分化機構の比較解析

1.ホヤ胚単離割球における神経型分化の解析(1)ホヤ8細胞胚より単離した動物半球頭側割球は、植物半球頭側割球と接着して2細胞系として培養すると、細胞間誘導によりNaスパイクを発生し、神経型分化を示すことがわかった。(2)この神経誘導の細胞内機序を解析する目的で、誘導能を模倣する物質を検索し、セリンプロテア-ゼ、サブチリシンを見出した。その誘導能はサブチリシンに特異阻害活性のある蛋白SSIで阻害された。また、SSIにより接着誘導も阻害されたので、誘導現象にプロテオリシスが関与していることが示唆された。(3)頭側外胚葉割球を単離して培養すると、初期膜興奮性の変化として、異常整流性Kチャネルが嚢胚期から神経胚初期になる時点で急激に増加した。この増加は蛋白分解酵素処理によって神経型に誘導された割球では、無処理で表皮型に分化する割球に比べて、半分以下であった。これら割球において、特異的な転写阻害剤であるα-アマニチンを注入して異常整流性Kチャネルの転写開始時点を決定したところ、誘導の有無にかかわらず、誘導開始前の32細胞期にすでに転写が始まっていることが分った。しかし、神経型に分化する割球では誘導時点で転写が抑制され、その結果神経胚初期の増加が少ないと考えられた。2.マウス奇形腫細胞による神経型分化の解析(1)奇形腫細胞をレチノ-ル酸により神経分化させると、Naチャネル及び不活性化の速いT型Caチャネルが分化の初期に出現し、非興奮性の未分化の幹細胞とは明らかに区別される膜興奮性を示した。(2)マウス中胚葉由来の細胞株C3H10T1/2は未分化の幹細胞でCa依存性、ATP依存性の静止膜コンダクタンス、T型Ca電流を示した。DNA脱メチル化剤により筋細胞に分化させると、L型Ca電流、外向きK電流、ニコチン性応答、ミオシン等がそろって発現し、神経分化とは異なった特質を示した。1.ホヤ胚単離割球における神経型分化の解析:分裂抑制後,卵殻幹を除去してとりだしたマボヤあるいはアカボヤの8細胞胚から予定神経領域を含む頭側動物半球割球a4ー2を単離してサイトカラシンB含有海水で培養すると,すべて表皮型細胞に分化した.一方, a4ー2割球を単独でなく,予定脊索領域を含む頭側植物半球割球A4ー1と接着して培養すると,誘導によりa4ー2割球は高率に神経型細胞に分化することがわかった.また単独のa4ー2割球も正常胚の1632細胞期に相当するところで, pronase 2%海水で10°C・15分間処理すると100%近く神経型細胞に分化することがわかった.また神経型分化の最も確実な指標は分化型Naチャネルであって,このチャネルはホヤ未受精卵に存在するNaチャネルとは単一チャネルレべルでゲーティング機構が異なり,異なる分子種である可能性が示された.

さらに,接着が非特異的にNaスパイクを誘導している可能性を否定するために,頭側動物半球a4ー2割球を尾側動物半球割球あるいは尾側植物半球割球と接着して培養したが,いづれの場合もa4ー2割球は表皮型細胞に分化した.すなわち接着によるNaスパイクの誘導能力は植物半球前方割球に特有であり,非特異的な細胞間接着による作用でないことがわかった.2.マウス奇形腫細胞における神経型分化の解析:マウス奇形腫細胞のレチノール酸による神経型分化の誘導の実験をおこない,初期分化過程にある細胞のホールセル記録による解析により, Naチャネル, Caチャネルの膜への出現を調べた. Caチャネルについては,不活性化の速いtypeと不活性化の遅いtypeでは出現の時期が異なり,不活性化の速いものが初期に現われることが明らかとなった.1.ホヤ胚単離割球における初経型分化の解析昭和62年度の研究により、ホヤ8細胞胚より単離した動物半球頭側割球a4ー2は、植物半球頭側割球A4ー1と接着して2細胞系として培養する。細胞間誘導により、神経型分化を示すことがわかっている。一方、単離したa4ー2割球を初期の8細胞期から110細胞期の間でプロネースにより10°C15分間処理すると同型な神経型分化を示すことがわかった。このプロネース処理による神経型分化と接着にする神経誘導が同一の現象であるかどうかを確かめるために、神経誘導に有効な接着時点を解析した。この有効時点は32細胞期よりの嚢胚中期までにあり、とくにa4ー2割球の接着による分化能の低下はプロネース処理による分化能の低下と同一時期に起こることがわかった。一方、植物半球頭側割球A4ー1の誘導能はこの時期には低下せず神経胚期まで続いていることがわかった。この結果、プロネースによる神経分化は細胞間接着による神経誘導をよく模倣していることがわかった。また、プロネースは細菌が産出する複合酵素であるので、神経型分化に有効な成分をクロマトグラム・特異的酵素抑制剤等をもちいて調べたところ、少なくともサブテイリシン型のセリンプロテアーゼが有効であることがわかった。また純粋なトリプシンは2%でも無効であった。今後は、接着による神経型分化に際しても蛋白分解酵素活性が、何らかの役割をもつか否かを調べる必要がある。2.マウス奇形腫細胞による神経型分化の解析62年度の成果により、奇形腫細胞のレチナール酸による神経分化誘導時には、不活性化の速いT型Caチャネルが分化の初期に出現することがわかった。今年度、未分化の幹細胞について調べたところ、Naチャネル・Caチャネルとも出現せず、不活性化の傾向を示すKチャネルのみが認められ、分化したものとは明らかに区別される膜興奮性を示すことがわかった。1.ホヤ8細胞胚頭側外胚葉割球および予定脊索割球2細胞系における神経誘導の細胞内機序を明らかにする目的で、この誘導能を模倣する物質を検索し、セリンプロテア-ゼ、サブチリシンを見出した。その誘導能はサブチリシンに特異阻害活性のある蛋白SSIで阻害されることがわかった。また2割球間神経誘導現象にプロテオリシスが関与していることを検証するために、割球が接着している時に、種々のプロテア-ゼインヒビタ-を作用させ、誘導の阻害を調べたところ、このSSIがよく阻害し、神経誘導にプロテオリシスの関与が示唆された。2.頭側外胚葉割球を単離して培養した際、初期膜興奮性の変化として、異常整流性Kチャネルが襄胚期から神経胚初期になる時点で急激に増加することがわかった。この増加は蛋白分解酵素処理によって神経型に誘導された割球では明らかに少なく、無処理で表皮型に分化決定した割球に比べて、半分以下であることが分った。さらに、これら割球において、特異的な転写阻害剤であるalphaーアマニチンを注入して異常整流性Kチャネルの転写開始時点を決定したところ、誘導のあるなしにかかわらず、誘導開始前の32細胞期にすでに転写が始まっていることが分った。しかし、神経型に誘導された割球においては誘導時点で異常整流性Kチャネルの転写が抑制され、その結果神経胚初期の増加が少ないことが推測された。
チャームバリオン分光実験のための高速応答高精度飛跡検出器の開発

J-PARCで行うチャームバリオン分光実験のための、高速応答高精度飛跡検出器として、シンチレーティングファイバー検出器の製作を進めた。シンチレーティングファイバーには直径500ミクロンのものを採用し、物質量を小さくすることで、実験のバックグラウンドとなり得る二次反応が検出器上で起こる確率を小さくしている。昨年度問題となっていた、シンチレーティングファイバーを固定するための治具の工作精度については、治具の作り直しを行い、無事シンチレーティングファイバーの配置精度を向上させることができた。これにより、5ミクロン間隔で2層構造になるようにシンチレーティングファイバーを配置することができた。しかしながら、こうして出来上がったファイバーアレイとMPPCアレイを接続する際に、両者の幾何学的な形状の違いから、ファイバーアレイ側の一部に強いストレスがかかってしまうことが発見された。現在シンチレーティングファイバーは間にエポキシ樹脂を充填させることによって固定しているが、エポキシ樹脂層に亀裂が走っていることが認められ、このストレスは許容できる範囲を超えていた。そこで、ファイバーアレイへのストレスが低減されるようにファイバーの取り回しの変更を行った。また、飛跡検出アルゴリズム及び、飛跡検出効率、トリガーレスデータ収集システムの検証のために、直径1mmのシンチレーティングファイバーで製作した小型試作機の試験を電子光理学研究センターで行った。ファイバーアレイとMPPCアレイを接続する際に、両者の幾何学的な形状の違いから、ファイバーアレイ側の一部に強いストレスがかかってしまう問題が見つかり、ファイバーアレイを一度分解して再配置するのに時間を要したため試作したファイバーアレイとMPPCを接続し、実際に宇宙線ないしビームテストで信号の読み出しを行う。その上で光量、検出効率、時間分解能、クラスターサイズについての評価を行う。本研究では、J-PARCで計画しているチャームバリオン分光実験のための、高速応答高精度飛跡検出器の開発を行っている。30 MHzで飛来する荷電粒子の飛跡を効率よくとらえ、飛跡検出による運動量解析を行うために、物質量の小さい直径500ミクロンの極細シンチレーティングファイバーを選定した。光量の減衰長や、放射線損傷を負った際に見込まれる光量を考慮しつつファイバーの長さを決定した。また、信号読み出しに使用するMPPCアレイを、コストを考慮しつつ選択した。ファイバー間にはエポキシ樹脂を充填させることで固定すると同時に、ファイバー間に5 μm程度の間隔を持たせることで、ファイバーの径の不均一性が配置精度に伝播しないように制御する。チャームバリオン分光実験では、X方向、U方向(30°傾いた面)、V方向(-30°傾いた面)、の3方向において荷電粒子の位置を検出する必要があるが、本研究では当初の計画通り、まずX方向のみ検出する装置を開発し、期待どおりの性能が発揮されるかを検証する。その試作機の製作を開始した。この試作機は、ファイバーの層をA,B,Cに三分割することで、メンテナンス性を向上させている。また、本実験で用いられるドリフトチェンバーや水素標的との干渉が起きないように考慮しながら、検出器フレームのデザインを行った。シンチレーティングファイバーのフレームへの固定方法、MPPCとファイバーの取り付け用基板のデザインに関しては、既存の直径1 mmのファイバーを用いたビーム位置検出器のデザインを基礎として流用することで、設計と製作期間を圧縮する。また、ファイバー検出器の飛跡検出アルゴリズム及び、飛跡検出効率、トリガーレスDAQの検証のために、直径1mmのファイバー検出器の試験を電子光理学研究センターで行った。直径500ミクロンの極細シンチレーティングファイバーを選定した後、5ミクロン間隔で2層構造になるようにファイバーを並べたが、ファイバーの固定するための治具の工作精度が足りず、期待通りの配置精度が出なかった。そのため、治具を作り直し、シンチレーティングファイバーの配置を修正する必要が生じたので、MPPC取り付け部を含む製作を年度内に完了させることができなくなったから。ファイバーアレイとMPPCアレイを接続する際に、両者の幾何学的な形状の違いから、ファイバーアレイ側の一部に強いストレスがかかってしまう問題が見つかり、ファイバーアレイを一度分解して再配置するのに時間を要したため業者と連絡を取りつつ、シンチレーティングファイバー検出器の製作を進める。また、信号読み出し用回路とそのケーブルの製作も開始する。

秋以降にビーム照射試験を行って、検出効率、位置分解能、高レート耐性についての性能評価を行う予定である。試作したファイバーアレイとMPPCを接続し、実際に宇宙線ないしビームテストで信号の読み出しを行う。その上で光量、検出効率、時間分解能、クラスターサイズについての評価を行う。シンチレーションファイバー検出器の制作代を比較しつつ業者を選定した結果、若干コストダウンすることができたから。その分は、完成した検出器を直立させるために必要なフレームの製作に充てる。シンチレーティングファイバー検出器の製作に遅延が生じたため。次年度使用額はファイバーアレイを固定するためのフレーム製作と有感領域の遮光に充てる。
フラボノイド類の抗酸化活性による歯根吸収抑制効果の検討

本研究の目的は、フラボノイドの持つ抗酸化作用による歯の移動時の歯根吸収への影響について検討することである。矯正装置を装着したマウスの歯の移動開始時より各種フラボノイドを口腔内に局所投与し、臼歯を12日間移動させた後、歯の移動と歯根吸収率の評価を行った。対象としたフラボノイドで、対照群と比較してマウスの歯の移動量および歯根吸収量に有意差を認めなかった。また至適投与量を探るため投与量を変化させた実験においても、歯の移動および歯根吸収に影響を与えることは確認できず、フラボノイドの口腔内への局所投与によるフラボノイドの歯根吸収に対する抑制効果は低い可能性が示唆された。歯根吸収は、矯正治療中に生じる重篤な副作用である。本研究は、近年生体内における酸化ストレスを低減させることが多数報告されている植物代謝産物であるフラボノイドに着目し、マウスの歯の移動実験モデルを用いてフラボノイドの抗酸化作用による歯根吸収抑制効果を検証することを目的としている。フラボノイドは植物が合成する二次代謝産物で、近年、その構造の特性による抗酸化作用や抗炎症作用などの多彩な作用が注目されており、強化栄養補助食品なども多々開発されてきた。本研究では、フラボノイドの持つ抗酸化作用および骨代謝への影響に着目し、薬剤を用いない歯根吸収予防法の確立を最終目標とした、至適矯正力を考慮に入れた歯根吸収予防について検討している。これまで各種フラボノイドを、矯正力を加えた歯の移動モデルマウスに投与し、歯の移動への影響を検証してきた。矯正装置を装着したマウスを実験群とコントロール群に分け、歯の移動開始時に左側第一臼歯頬側粘膜下に、1)フラバン; 2)フラバノン; 3)フラボノ-ル; 4)アントシアニジン; 5)カルコン計5種のフラボノイドを注射した。12日後に歯の移動量をμCT、歯根吸収の面積、深さ及び容積を走査型レーザー顕微鏡で測定した。これまで、対象としている各種フラボノイドで、対照群と比較して歯の移動量および歯根吸収量に有意差が認められておらず、至適量および至適矯正力との関連性との更なる検討が必要である。今年度は、各種フラボノイドを矯正力を加えた歯の移動モデルマウスに投与し、歯根吸収及び歯の移動への影響を調べて、歯根吸収抑制効果のあるフラボノイドを同定することを目標としてきたが、対照群と比較して歯の移動量および歯根吸収量に有意な差が認められるフラボノイドを未だ確認できていないため進捗状況がやや遅れている。矯正治療中に生じる重篤な副作用である歯根吸収には、いまだ適切な予防法がない。本研究は、生体内における酸化ストレスを低減させることが近年多数報告されている植物代謝産物であるフラボノイドに着目し、マウスの歯の移動実験モデルを用いてフラボノイドの抗酸化作用による歯根吸収抑制効果を検証することを目的としている。これまで、各種フラボノイドを矯正力を加えた歯の移動モデルマウスに投与し、歯の移動への影響を検証してきた。矯正装置を装着したマウスを、実験群とコントロール群に分けて歯の移動開始時に左側第一大臼歯頬側皮下に、1)フラバン; 2)フラバノン; 3)フラバノール;4)アントシアニジン; 5)カルコン計5種のフラボノイドを投与した。装置装着12日後に歯の移動量をμCT、歯根吸収の面積、深さおよび容積を走査型レーザー顕微鏡で測定した。これまで対象としている各種フラボノイドで、対照群と比較して歯の移動量および歯根吸収量に有意差を認めておらず、投与方法、至適量および至適矯正力との関連性との更なる検討が必要である。また歯根吸収抑制に対する効果的なフラボノイドが同定できない場合、他種フラボノイドについても歯の移動量および歯根吸収量における検証を行わなければならない。歯根吸収抑制効果のあるフラボノイド同定後は、フラボノイドの影響を組織学的および細胞生物学的に検証する予定である。今年度は、歯根吸収抑制効果のあるフラボノイドを同定するため、各種フラボノイドを歯の移動モデルマウスに投与し、至適量および至適矯正力、また投与法も検証してきたが、歯の移動量および歯根吸収量に対照群と比較して有意な差が認められるフラボノイドを未だ確認できていない。現在までの達成度はやや遅れている。本研究では、フラボノイドの持つ抗酸化作用および骨代謝への影響に着目し薬剤を用いない歯根吸収予防法の確立を最終目標とした、至適矯正力を考慮に入れた歯根吸収予防について検討している。これまで、各種フラボノイドを矯正力に加えた歯の移動モデルマウスに投与し、マウスの歯の移動および歯根吸収への影響を検証をしてきた。矯正装置を装着したマウスを、実験群とコントロール群に分けて歯の移動開始時に左側第一大臼歯頬側皮下に、1)フラバン; 2)フラバノン; 3)フラバノール;

4)アントシアニジン; 5)カルコン計5種のフラボノイドを投与した。装置装着12日後に歯の移動量をμCT、歯根吸収の面積、深さおよび容積を走査型レーザー顕微鏡で測定した。対象とした各種フラボノイドで、対照群と比較してマウスの歯の移動量および歯根吸収量に有意差を認めなかった。またフラボノイドの至適投与量を探るための各種フラボノイドの投与量を変化させた実験においても、対照群と投与群で歯の移動および歯根吸収抑制効果について有意な差を認めなかった。本研究の目的は、フラボノイドの持つ抗酸化作用による歯の移動時の歯根吸収への影響について検討することである。矯正装置を装着したマウスの歯の移動開始時より各種フラボノイドを口腔内に局所投与し、臼歯を12日間移動させた後、歯の移動と歯根吸収率の評価を行った。対象としたフラボノイドで、対照群と比較してマウスの歯の移動量および歯根吸収量に有意差を認めなかった。また至適投与量を探るため投与量を変化させた実験においても、歯の移動および歯根吸収に影響を与えることは確認できず、フラボノイドの口腔内への局所投与によるフラボノイドの歯根吸収に対する抑制効果は低い可能性が示唆された。今後の研究として、マウスの歯の移動モデルを用いて、これまで投与してきた各種フラボノイドについて、至適投与量,また至適矯正力との関連性を更に検証する必要がある。また同時に細胞培養実験を行い、歯の移動と歯根吸収に関与する破歯細胞・破骨細胞・骨芽細胞への各種フラボノイドの影響を検証する。今後の研究として、マウスの歯の移動モデルを用いて、これまで投与してきた各種フラボノイドについて、投与方法、至適投与量、また至適矯正力との関連性をさらに検証する必要がある。歯根吸収抑制に対する効果的なフラボノイドが同定できない場合、他種フラボノイドについても歯の移動量および歯根吸収量における検証を行わなければならない。また歯根吸収抑制効果のあるフラボノイドの同定後は、フラボノイドの影響を組織学的および細胞生物学的に検証する予定である。歯科矯正学本研究は、これまで歯根吸収抑制効果のあるフラボノイドを同定するため、各種フラボノイドを歯の移動モデルマウスに投与し、至適量および至適矯正力を検証してきたが、歯の移動量および歯根吸収量に対照群と比較して有意な差が認められるフラボノイドを同定するに至らず、その後の研究計画に遅れをきたし次年度使用額が発生した。次年度、マウスにおける歯の移動モデルを用いて,これまで対象とした以外の他種フラボノイドについても歯の移動量と歯根吸収量について検証を行う予定である。また歯根吸収抑制効果のあるフラボノイドの同定後、フラボノイドの影響を組織学的および細胞生物学的に検証する予定である。上記実験を遂行するために試薬および動物実験の購入と飼育費として次年度使用額を使用する。
ヒト血液脳関門有機カチオン-プロトン交換輸送系の薬物認識性と実体の解明

本研究の目的は「ヒト血液脳関門(BBB)のプロトンー有機カチオン(H+/OC)交換輸送系の薬物分子認識性および実体を解明すること」であった。昨年度は異なるBBB細胞(ヒトiPS細胞由来脳毛細血管内皮細胞(hiPS-BMECs)とヒト不死化脳毛細血管内皮細胞(hCMEC/D3))におけるトランスポーター遺伝子の発現解析とH+/OC交換輸送系の活性について検討した。その結果、hiPS-BMECsとhCMEC/D3細胞では既知トランスポーター分子の発現に差異がみられたものの、両細胞でH+/OC交換輸送系の輸送能は保持していることがわかった。本プロジェクトと平行して、我々の研究グループはfunctional based molecular cloning (FBMC)法を開発し、H+/OC交換輸送系の輸送活性が大きく異なるクローンを選別した。このクローン細胞を用いて、差分解析によりH+/OC交換輸送系の分子実体の解明を試みた。まず、FBMC法で得られた31の候補分子の遺伝子をsiRNAでノックダウンし、H+/OC交換輸送系の基質であるバレニクリンの取り込みを測定した。その結果、9種のノックダウン細胞でバレニクリンの取り込みがコントロールに比べて有意に減少した。次に、この中の6種の遺伝子の過剰発現細胞をHEK293細胞で作製し、バレニクリンの取り込みを測定した。導入した遺伝子はいずれも1000倍以上過剰発現していることが確かめられたが、バレニクリンの取り込みについては有意な上昇はみられなかった。以上、本研究の最終目標であるH+/OC交換輸送系の分子同定には至らなかったものの、基質認識性、FBMC法の開発など多くの重要な知見が得られた。本研究の目的は、ヒト血液脳関門(BBB)の有機カチオン-プロトン交換輸送系の薬物認識性および輸送分子の実体を解明することである。平成28年度は市販中枢作動薬27種のBBB細胞(hMEC/D3)への取込みクリアランスを測定すると共に、ジフェンヒドラミン(有機カチオン-プロトン交換輸送系の典型的基質)に対する感受性を調べた。ジフェンヒドラミンによる阻害実験の結果から、70%以上阻害がかかる薬物群をジフェンヒドラミン感受性、それ以外の薬物群をジフェンヒドラミン非感受性の2群に分類した。ジフェンヒドラミン非感受性群では、取込みクリアランスと脂溶性の間に有意な正の相関関係がみられた。一方、位相幾何学的極性表面積(tPSA)との間には負の相関関係がみられた。この結果は、単純拡散機構で脂質膜を透過する薬物によく見られることから、ジフェンヒドラミン非感受性群に分類される薬物は主に単純拡散機構でBBBを透過することが推定された。一方、ジフェンヒドラミン感受性薬物の取込みクリアランスと物性(脂溶性およびtPSA)の間には有意な相関関係は見られなかった。さらにジフェンヒドラミン感受性の薬物群にはKpuu値(脳内非結合形濃度/血漿中非結合形濃度の比)の高い薬物が50%以上あり、その中には、ピリラミン、ベラパミル、クロニジン、トラマドール、オキシコドン、バレニクリンなどの有機カチオン-プロトン交換輸送系の基質となる薬物が含まれていた。以上の結果から、有機カチオン-プロトン交換輸送系の基質認識に薬物の脂溶性およびtPSAの関与は少ないことが示唆された。また、有機カチオン-プロトン交換輸送系の基質薬物のファーストスクリーニングにジフェンヒドラミンによる阻害実験が有用であることが示唆された。本年度はhCMEC/D3細胞を用いて市販中枢薬27種の輸送活性を測定し、主に薬物の物性と輸送活性との関連性について検討した。当初は有機カチオン-プロトン交換輸送系の基質となる薬物の構造上の共通性をLigand-Basedファーマコフォア解析で明らかにする予定であったが、結論を得るまでには至らなかった。しかし、有機カチオン-プロトン交換輸送系に認識性の高い薬物の物性との関係、阻害剤に対する効果についてある程度の解答を得ることができた。一方、この研究に中で有機カチオン-プロトン交換輸送系に対する新たな基質薬物を見つけることができ、その詳細な機能解析を投稿論文として投稿することができた。本研究の目的は「ヒト血液脳関門(BBB)のプロトン-有機カチオン交換輸送系の薬物分子認識性および実体を解明すること」であった。昨年度はヒトBBB細胞の1つhCMEC/D3細胞を用いて、プロトン-有機カチオン交換輸送系の特異的基質探索および認識性の解明に取り組んできた。27種の市販中枢疾患治療薬を対象にhCMEC/D3細胞への取り込みクリアランスを解析したところ、薬物の化学構造や物性からプロトン-有機カチオン交換輸送系に対する認識性を推定することは容易でないことがわかった。一方、基質薬物のファーストスクリーニングにジフェンヒドラミンによる阻害実験が有用であり、そこから新たにバレニクリンがプロトン-有機カチオン交換輸送系の基質であることを明らかにすることができた(Kurosawa T. J Pharm Sci, 106, 2576(2017)).本年度は異なるヒトBBB細胞を用いたトランスポーターの発現解析と輸送活性の変動解析を目的とした。BBB細胞としてiPS由来ヒト脳毛細血管内皮細胞(hiPS-BMEC)を用いた。ヒトiPS(IMR 90-4)をLippmannらの方法に従って脳毛細血管内皮細胞(hiPS-BMEC)へと分化誘導したところ、強固な細胞間密着性を有する細胞を得ることができた。