hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
PASドメインタンパク質の多様な情報伝達は共通の機構で駆動しているか?

PASドメインタンパク質の駆動原理を解析するため、2つの異なるPYPタンパク質をモデルとして、PASドメイン共通構造に内在するタンパク質構造変化様式を検証した。その結果、(1)両者において機能上重要な部位がN末端部位に存在していること。(2)補欠分子の結合部位は基本的に相同であるが、微小な差異によってその性質を変化させていること、(3)構造の土台となるC末端領域が個々のPYPの性質を大きく決定づけ、その他の領域はこのC末端部位との関係においては同様の性質を制御していることが示された。PASドメインタンパク質の機能発現機構の駆動原理の提示を行うため、青色光受容タンパク質のPYPタンパク質をモデルとして、PASドメイン共通構造に内在するタンパク質構造変化様式を明らかすることを目的に、平成21年度は、性質の異なる2種類のPYP(Hh-PYP : Halorhodospira halophila由来PYP、Rc-PYP : Rhodobacter capsulatus由来PYP)のうち、Rc-PYPを材料に、1)情報伝達における相互作用タンパク質との結合に必要な部位の抽出と、2) 2種類のPYPの特徴的な吸収スペクトルの違いをうむ機構について検証した。その結果、1) Hh-PYPにおいて構造変化等重要な機構を担う、N末端部位の欠損変異体をRc-PYPに導入したところ、相互作用能の著しい低下を確認した。しかし、相互作用自体は保持されており、N末端部位が効率的な結合に必須な領域であることが示された。このことは、N末端配列が直接的な結合部位の一部を形成しているか、結合構造の保持に必須であることを示す。Hh-PYPと同様にN末端部位に機能発現の制御部位が存在していることが考えられる。また、2)吸収スペクトルの違いに関しては、発色団の分子内プロトン移動によって実現されていることが示された。2つのPYPは発色団環境の微細な変化を利用して、同じ発色団、補欠分子を用いて、異なる性質を獲得していることが示された。PASドメインタンパク質の機能発現機構の駆動原理の提示を行うため、青色光受容タンパク質のPYPタンパク質をモデルとして、PASドメイン共通構造に内在するタンパク質構造変化様式を明らかすることを目的にした。平成22年度は、1)PYPの種類による補欠分子の吸収スペクトルの違いを生む、タンパク質部位の同定を、2種類のPYP(Halorhodospira halophila由来PYPとRhodobacter capsulatus由来PYP)のキメラ配列変異体を用いて行った。さらに、2)PYP活性化状態の構造学的解析のための、複合体状態の溶液構造解析の基盤として、相互作用タンパク質自身の溶液構造解析を行った。その結果、PYPの種類による補欠分子の性質の制御は、構造的基盤を形成する、C末端部位ベータシート構造が主に担っており、この部位とN末端領域の配列によって、補欠分子の吸収スペクトルや、光反応サイクルの寿命を制御していることが明らかになった。また、相互作用タンパク質自身は、溶液中で異方性の強い2量体構造で存在していることが明らかになった。この相互作用タンパク質については、相同タンパク質は現在のところ存在せず、さらなる構造解析へ向けた結晶化の取り組みを行い、微小結晶を得ることができた。相互作用においても、N末端領域の重要性は前年度に明らかになっている。以上のことから、異なるPYP種における補欠分子の性質の違いは、補欠分子の結合部位のみに依存するのではなく、タンパク質全体の構造に由来している。個々のタンパク質領域の機能的役割には相同性が見られ、共通の分子基盤の上に成り立っていることが考えられる。
網膜虚血におけるミトコンドリアの役割とその調節因子の分子機構の解明

本研究は、網膜虚血におげる、神経細胞死の機構の解明および、その制御を目的としており、特に神経細胞死におけるミトコンドリアの役割に注目して研究を行っている。網膜虚血における神経細胞死の本質はNMDA受容体を介したグルタミン酸毒性であることが知られているが、我々はラット胎児の網膜初代培養細胞におけるグルタミン酸毒性のモデルを用いて、以下に示すような結果を得た(Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.2002 43:s746)。以前に我々が報告したように、プラジキニンは網膜培養細胞におけるグルタミン酸毒性に対して保護効果を持つが、この保護効果がミトコンドリアのATP依存性カリウムチャンネル(以下Mit K(ATP))のブロッカーとして知られる5HDを同時に投与することにより阻害された。また、ブラジキニンはグルタミン酸投与に伴うミトコンドリア膜脱分極を抑制し、この抑制効果は5HDを同時に投与することにより阻害された。さらに、PKCの阻害剤であるセレリスリンにより、ブラジキニンのグルタミン酸毒性に対する保護効果が阻害された。これらの結果よりブラジキニンのグルタミン酸毒性に対する保護作用が、PKCやMit K(ATP)を介した系であることがあきらかになり、またグルタミン酸投与に伴うミトコンドリア膜脱分極はミトコンドリア内へのカルシウム流入の結果と考えられることから、このメカニズムとしてカルシウム流入の抑制があることが示唆された.これらのことから、神経細胞のグルタミン酸毒性に対するミトコンドリアを介した新しい神経保護の可能性を示すこととなった。本研究は、網膜虚血における、神経細胞死の機構の解明および、その制御を目的としとおり、特に神経細胞死におけるミトコンドリアの役割に注目して研究を行っている。網膜虚血における神経細胞死にはNMDA受容体を介したグルタミン酸毒性の関与が知られているが、我々はラット胎児の網膜初代培養細胞におけるグルタミン酸毒性のモデルを用いて、以下に示すような結果を得た(Invest Ophtalmol Vis Sci. 42:s750,2001)。ミトコンドリアのATP依存性カリウムチャンネル(以下Mit K (ATP))のオープナーとして知られるディアゾキシドが、グルタミン酸毒性に対して容量依存性に保護効果を示し、この保護効果はMit K(ATP)のブロッカーである5HDより阻害された。また神経細胞のグルタミン酸毒性において重要な働きを持つことが知られる、一酸化窒素(NO)による神経細胞毒性に対してもディアゾキシドは保護効果を示した。このNOに対する保護効果の実験では、ディアゾキシドはNOによる神経細胞毒性に対しては保護効果を示す一方、NOと活性酸素が同時に存在すると保護効果を発揮できず、ディアゾキシドの保護効果が、NMDA受容体刺激によりミトコンドリアで生成されることが知られている、活性酸素の生成を抑えることであることが示唆された。さらに我々は、グルタミン酸投与に伴う、ミトコンドリア膜電位の変化を調べ、ディアゾキシドがグルタミン酸投与に伴うミトコンドリア膜電位の脱分極を抑制することを、明らかにした。これら一連の結果により、神経細胞のグルタミン酸毒性におけるミトコンドリア、特にMit K(ATP)の関与が明らかになり、新たな神経保護の可能性が見い出された。
水循環の素過程に関する基礎的研究

自然流域の直接流出過程の解明とそのモデル化はかなり進展した。しかし、雨水の表面流出成分と土中浸透成分の分離、地表面からの蒸発損失,土壌水分の再配分及び地下水流出等のいわゆる水循環の素過程についてはほとんど未解明の状態にあり、水文学上の盲点となっている。この盲点を解決するためには、蒸発散過程、土壌水分の消長及びそれらの相互関係などを究明することが先決である。本研究では、二連の小型傾斜ライシメータを設置するとともに既存の大型ライシメータの観測機器を整備充実して、自然の降雨・蒸発条件下で水文観測を行い、裸地斜面域の雨水流出過程について基礎的な研究を行った。とくに、気象学で研究が進められている蒸発散の計測法を導入して、裸地斜面よりの蒸発量を測定したのち、蒸発量と土壌水分量との関係、土壌水流動解析への適用上の問題点及びその簡易法について検討を加えた。また傾斜ライシメータの充填土について土壌物理試験、不飽和浸透流理論における諸係数の測定を行ったのち、土壌水流動解析を行い土壌水分と表面流発生機構及び土壌水分の再配分と地下水流出機構との関連性などを理論的に究明した。次に、竹林において人工降雨型式の浸透能試験を行うとともに、土壌中の間隙調査を行い、自然丘陵地の雨水浸透現象の実態を明らかにすることを試みた。加えて、これらの現地調査結果に基づいて、土層中に大間隙がある場合の雨水浸透モデルについて検討を加えた。その結果より、自然丘陵地斜面の浸透能は現地の土壌特性から判断して過大な値を示し、またそれが土壌中に存在する大間隙に起因する現象であることが明らかになった。また、土壌中の大間隙はfine-macroporesとcoarse macroporesに分けられ、前者は透水係数を1桁程度大きくし、後者は浸透量を増大させ、地下水流出を速めることなどが明らかになった。自然流域における蒸発散損失・雨水の表面流下成分と土中浸透成分の分離・土壌水分の再配分と地下水流出などのいわゆる水循環の素過程についてはほとんど末解明であり、水文学上の旨点となっている。本研究では、水文学的に有意な蒸発散モデルを提示するとともに、降雨・蒸発条件下で土壌水分流動モデルを案出し、雨水の再配分・地下水流出過程を物理的・数理的に明らかにしようとしている。1.観測・調査初年度に設定した試験地での全観測を継続するとともに、既設の傾斜ライシメータに熱収支法にもとづく蒸発散計測装置を設置し、観測網の整備を行った。2.蒸発散量の定量的表示式傾斜ライシメータの水収支を測定するとともに、地表面付近の放射収支量・地中伝熱流量・乾湿球温度差・平均風速を測定して、大気と地表面とのエネルギー交換過程及び熱収支を明らかにしたのち、蒸発量の定量的表示式を検討した。その結果、地中伝熱流量の測定法について検討すべき点はあるが、熱収支式を用いてかなりの精度で蒸発量が測定できることが明らかになった。計器蒸発量と上記推定式により得られた蒸発量との関連性については、土壌水分や気候条件によって傾向が異なり結論を得るまでには至らなかった。さらに観測資料を集積する必要がある。3.土壌水分の再配分過程と流出モデル京都市南部の丘陵試験地において、浸透能試験・土壌調査を行い雨水浸透機構を検討した。その結果、丘陵斜面域には大小様々なmacroporesが分布しており、浸透能に直接的に影響するほか、土壌の不飽和・飽和透水係数を大きく変えていることが明らかになった。

また、macroporesを含む土壌体中の浸透流を、Richards式と毛細管中の粘性流動で表し、F.E.M.を用いて解析した。このモデル化は丘陵地斜面の雨水浸透・地下水流出過程の表示に役立てられる。
近世護法論の思想史的展開

本研究は、僧侶普寂の思想を通して、日本近世思想史上における仏教思想の内実と展開を追い、近世から近代にかけての思想的水脈の一つを示した。3年間の研究成果は、単著『近世仏教思想の独創-僧侶普寂の思想と実践』(トランスビュー社)として、本年(平成20年)5月に出版された。初年度は、受入教授である末木文美士教授の指導により、近世思想史における大乗非仏説論への応えである、普寂の華厳思想を解明した。初年度後半から第2年度前半には、プリンストン大学宗教研究センターに一年間留学して、宇宙像をめぐる近世護法論の発表を行うことにより、日本国内では得難い、時代と地域にまたがる広い思想史的知見を得た。第2年度後半から第3年度前半には、近世的宗派意識の分析という視点から、普寂の伝記と近世浄土教団の戒律観を明らかにした。同時に末木教授の指導によって、丸山眞男に始まる日本近世思想史が政治思想史のみで推移してきたことを批判し、宗教思想史を組み込んだ全体的な思想史像を提言した。第3年度後半からは、博士論文と任期3年間に発表した論文原稿をもとにして、それらに大幅な加筆と修正を加える出版作業を行った。3年間で学問的視野が広がり、従来の日本一国政治思想史に対して、東アジア全域を視野に入れた宗教思想史を対象化するに至った。従来の日本思想史の空隙であった、仏教を中心とする宗教思想を思想史に組み込む研究の視点を得た。本年度は、4月から8月までは、これまでの研究をふまえて、近世仏教の思想家である普寂の華厳思想について研究を進め、学会発表と論文発表を行った(学会発表「普寂の華厳理解」第56回日本印度学仏教学会学術大会、平成17年7月29日。論文「普寂の華厳理解」『印度学仏教学研究』54-1)。この発表によって、18世紀の思想家であった普寂が、江戸から明治にかけて仏教近代化の大問題となった「大乗仏教は、歴史的な釈迦の説ではない」という大乗非仏説の問題を、華厳の教理思想と実践行によって、思想的に解決していることを明らかにした。9月からは、アメリカのプリンストン大学のJacqueline Stone教授のもとへ、研究留学を行い、近世から近代にかけての日本仏教の思想的推移について、国際意見交換を行った。その成果として、Workshop「18世紀の日本仏教と西洋科学-最初期の須弥山説論争」(Princeton University Buddhist Studies Workshop Spring 2006、平成18年2月22日)を発表した。この発表では、仏教の宇宙観をめぐる18世紀の論争を対象として、仏教者と世俗的知識人の双方の思想を明らかにすることにより、すでに18世紀において仏教思想近代化の萌芽があることを述べた。日本の伝統仏教において、近世から近代にかけての思想史的な問題は、仏教の信仰と科学的合理性の矛盾(具体的には、上記の大乗非仏説と仏教の宇宙観について)であった。従来の研究では、仏教思想における信仰と科学の矛盾の解決は、明治30年代になってようやく可能であった、とされてきた。しかし本年度の研究により、明治近代における仏教思想の近代化・信仰と科学の矛盾の解決は、近世からの思想的営為を引き継いだものであり、伝統的思想の水脈上にあることを示した。本研究は、これまで等閑視されてきた、伝統仏教における近代化の研究の端緒をひらくものである。今年度は、これまでの研究にもとづいて近世仏教思想家であった普寂の思想をまとめると共に、丸山真男にはじまる従来の近世思想史像を見直す作業を開始した。本研究は、仏教思想から近世思想史における仏教思想に着目することにより、冷戦時の政治史的視点とは異なる、哲学・宗教的な新しい視点からの思想史の構築に寄与するものである。2006年4月8月には、昨年度に引き続きアメリカのプリンストン大学宗教学部に在籍し、研究活動を行った。具体的には、同時代の浄土宗僧侶と比較しつつ、これまで未詳だった普寂の伝記(論文「徳門普寂」『インド哲学仏教学研究』14号)と、普寂思想の根幹である華厳思想と大乗仏説論(口頭発表・紀要「普寂の大乗仏説論」日本宗教学会)を明らかにした。9月帰国後には、新たに論文を二本書き下ろし(「近世思想史における仏教の意義」「近世浄土宗団の保守化」)、博士論文をもとに新たな著作としてまとめた。その結果として、日本学術振興会・研究成果公開促進費・学術図書部門に出版助成を申し込んだ。本研究は、戦後の丸山真男にはじまる政治思想史を越えて、従来排除されてきた仏教思想を組み込む新しい日本近世思想史を構築することを目指している。著書では、近世後期の思想史的課題である近代的な合理性について考察し、仏教における内なる近代化の起点を論じる。近世後期の護法論から、宗教と科学の相克についての仏教側の答えを提出し、それが近代に引き継がれていくことを示すと同時に、その思想を支えた実践行について論じ、近世仏教の宗教性を論証するものである。12月2007年3月末まで、現在の近世思想史の基礎となっている丸山真男の近世思想史を見直す作業を本格的に開始し、来年度にはこの研究成果を学会で発表した後に、論文発表することを予定している。

3年間の研究成果は、単著『近世仏教思想の独創-僧侶普寂の思想と実践』(トランスビュー社)として、本年(平成20年)5月に出版された。初年度は、受入教授である末木文美士教授の指導により、近世思想史における大乗非仏説論への応えである、普寂の華厳思想を解明した。初年度後半から第2年度前半には、プリンストン大学宗教研究センターに一年間留学して、宇宙像をめぐる近世護法論の発表を行うことにより、日本国内では得難い、時代と地域にまたがる広い思想史的知見を得た。第2年度後半から第3年度前半には、近世的宗派意識の分析という視点から、普寂の伝記と近世浄土教団の戒律観を明らかにした。同時に末木教授の指導によって、丸山眞男に始まる日本近世思想史が政治思想史のみで推移してきたことを批判し、宗教思想史を組み込んだ全体的な思想史像を提言した。第3年度後半からは、博士論文と任期3年間に発表した論文原稿をもとにして、それらに大幅な加筆と修正を加える出版作業を行った。3年間で学問的視野が広がり、従来の日本一国政治思想史に対して、東アジア全域を視野に入れた宗教思想史を対象化するに至った。従来の日本思想史の空隙であった、仏教を中心とする宗教思想を思想史に組み込む研究の視点を得た。
伝説・神話・物語の文化資源化についての研究―「所縁の地」形成の視点から

文化遺産・文化資源のパターンとして、伝説・神話・物語、つまりフィクションで言及される場所(「所縁の地」)が、あたかも実在のものとして認識され、ときに人の手が加わって「物質化」し、そして「文化資源化」されて保存・活用(あるいは消費)の対象となっていくことがある。本研究は具体的な諸事例を比較検討することで、このプロセスを明らかにしようと試みるものであった。この研究目的を達成するため、2016年5月には奈良県内の神武天皇陵の聖蹟関連地、8月には北海道平取町および積丹半島の義経北行伝説関連地、2017年1月には天孫降臨神話に関する高千穂峰の天之逆鉾、2月には千葉県南房総市・館山市の南総里見八犬伝伏姫物語関連地をそれぞれ実際に訪れ、各事例の文化資源化の状況を調査した。各事例の比較検討は本年度中に完遂することができず、今後の継続課題となったが、このうち、とくに北海道平取町の義経神社と義経北行伝説をめぐっては、実地調査と先行研究の精査から、義経北行伝説そのものの成立過程、それが北海道開拓においてアイヌ懐柔・支配のために利用された可能性、さらにアイヌや朝鮮系労働者との関係など、現状に至る文化資源化のプロセスが重層的な構造をもっていることが明らかとなった。さらに、義経北行伝説と資源化された関連地は、中世史、アイヌ史、近代の開拓史、現代の朝鮮系労働者問題など、多様なテーマに発展可能なもので、かつ資料としても、鍬形金属製品、絵馬など物質資料を含んで多様であることから、中学社会科、あるいは高等学校地理歴史科の教材としても極めて有用であることが判明した。そこで、今年度においても、中学校1年生対象の社会(歴史分野)において、本テーマを用いた授業を実践した。この実践結果をもとに、さらに授業プランを精緻化していくべく教科教育の観点からも研究を継続する。
含窒素シクロファンの設計と合成

最初に、各種シクロベラトリレンオリゴマーの選択的合成の合成素子として有用であるジプロモ非環状3量体[ビス(6-ブロモベラトリル)ベラトロール]に一級アミンを反応させることによるアザシクロトリベラトリレン骨格の構築を検討した。種々パラジウム触媒存在下ジブロモ非環状3量体とベンジルアミンとを各種条件にて反応させたが、目的のN-アルキル-5-アザシクロトリベラトリレンの生成は見られなかった。これは芳香環にメトキシ基が存在することにより、ブロモ基が不活性化しているからだと考えられる。次に、もう一つの合成ルートとして、2、2'-(ジヒドロキシメチル)ジアリールアミンを閉環前駆体とするアザシクロファンの大量合成を検討した。抗リウマチ薬であるロベンザリト{2[2-(カルボキシルフェニル)アミノ]-4-クロロ安息香酸}のボラン還元により得られるジオールを、ベラトロールとトリフルオロエタノール中、硫酸触媒下反応させ目的の10-アザ-8-クロロシクロトリベンジレン化合物(1)を中程度の収率で得ることが出来、最初の本骨格構築を達成することができた。過剰のベラトロールを用いた時には、非環状のビス(ベラトリルフェニル)アミン(2)が生成した。2をホルマリンと酸存在下、シクロテトラベンジレン骨格への閉環を試みたところ、ビシクロ化合物が得られた。本生成物の構造は明らかでない。これは窒素原子と芳香環との間にもメチレン架橋が起っているためである。2をメチル化した後、シクロテトラベンジレン骨格へ閉環することを現在検討中である。次に、(1)のN-メチル化を試みた。ホルマリンを用いての還元的アミネーションを試みたが、失敗に終わった。これはこの窒素原子の塩基性が極めて弱いことによるものと考えられる。そこで、DMF中、NaHを反応させた後、アルキル化することにより、N-メチル体を収率60%で得ることができた。各種脱クロル化による対称性の高い10-アザシクロトリベラトリレンへの誘導を試みたが現在まで成功していない。アザシクロファン(1)について薬理作用の検討を行った。Irwin法でマウスの行動に対する影響を観察したところ、ライジング反応が見られた。また、5種類の菌を用いて、ディスク法による抗菌活性を調べたが、活性は観察されなかった。既に、我々は、5-シラシクロトリベラトリレンがC_2対称性のキラル構造を有することを明らかにしているので、アザ誘導体についても4級化によりキラリティーの発現を試みた。しかし、種々メチル化による4級化を試みたが、先と同じく、塩基性の弱さからか、現在にいたるまでアンモニウム塩を得ることに成功していない。現在、別ルートによるアザシクロトリベラトリレン骨格の構築を検討している。

しかし、種々メチル化による4級化を試みたが、先と同じく、塩基性の弱さからか、現在にいたるまでアンモニウム塩を得ることに成功していない。現在、別ルートによるアザシクロトリベラトリレン骨格の構築を検討している。各種シクロトリベラトリレン類の選択的合成にジブロモ非環状3量体[ビス(6-ブロモベラトリル)ベラトロール]が鍵化合物として有用であったので、それに一級アミンを反応させ閉環させることによるアザシクロトリベラトリレン骨格の構築をまず試みた。バラジウム触媒存在下ジブロモ非環状3量体とベンジルアミンとを各種条件にて反応させたが、目的のN-ベンジル-5-アザシクロトリベラトリレンの生成は見られなかった。そこで、2、2'-(ジヒドロキシメチル)ジアリールアミンを閉環前駆体とする骨格合成を検討した。坑リウマチ薬であるロベンザリト{2[2-(カルボキシルフェニル)アミノ]-4-クロロ安息香酸}をボランで還元し対応するジオールに導いた後、これと酸触媒下ベラトロールを縮合させることを試みた。その結果、トリフルオロエタノール中硫酸を酸触媒に用いた時に、最も良い収率(41%)で目的の10-アザ-8-クロロシクロトリベンジレンを得ることが出来た。各種脱クロル化による対称性の高い10-アザシクトロトリベラトリレンへの誘導を試みたが成功しなかった。そこでN-メチル化した後に、グリニャー化合物を経由して、脱クロル化を行うことにした。ホルマリンを用いての還元的アミネーションを試みたが、失敗に終わった。そこで、DMF中、NaHとメチルイオダイドと反応させ、N-メチル体を収率60%で得た。現在、グリニャー化合物への誘導を検討中である。10-アザ-8-クロロシクロトリベンジレンについては薬理作用の検討も行った。Irwin法でマウスの行動に対する影響を観察したところ、ライジング反応が見られた。現在その溶血作用について調べている。昨年度に続いて、ジブロモ非環状3量体[ビス(6-ブロモベラトリル)ベラトロール]に一級アミンを反応させ、アザシクロトリベラトリレン骨格の構築を検討した。種々パラジウム触媒存在下ジブロモ非環状3量体とベンジルアミンとを各種条件にて反応させたが、やはり、目的のN-アルキル-5-アザシクロトリベラトリレンの生成は見られなかった。そこで、もう一つの合成ルートである2、2'-(ジヒドロキシメチル)ジアリールアミンを閉環前駆体とするアザシクロファンの大量合成を検討した。抗リウマチ薬であるロベンザリト{2[2-(カルボキシルフェニル)アミノ]-4-クロロ安息香酸}のボラン還元により得られるジオールを、ベラトロールとトリフルオロエタノール中、硫酸触媒下反応させ目的の10-アザ-8-クロロシクロトリベンジレン化合物(1)を中程度の収率で得ることが出来、最初の本骨格構築を達成することができた。本化合物について薬理作用の検討を行った。また、5種類の菌を用いて、ディスク法による抗菌活性を調べたが、活性は観察されなかった。次に、本化合物のN-メチル化を試みた。これはこの窒素原子の塩基性が極めて弱いことによるものと考えられる。
電子スピン共鳴法によるグアニリルシクラーゼの活性部位の構造と活性化機構解析

一酸化窒素(NO)は高等生物における情報伝達物質として多面的な機能を有する。生体内におけるNOの生合成はNO合成酵素(NOS)によって分子状酸素とL-アルギニンより作られる。NOの標的分子として最も重要なものは可溶性グアニル酸シクラーゼ(GC)である。GCは感知器部位にヘムを持ち、NOが結合するとシクラーゼ活性が劇的に上昇する。NOがヘムに結合した情報がGTP結合部位に伝えられて、細胞内仲介物質サイクリックGMP(cGMP)が合成される。感知器から効果器部位への情報伝達機構はほとんど解明されていなかった。本研究では、可溶性グアニル酸シクラーゼのNOあるいは外来性配位子であるアジド(N_3^-)による活性化機構を電子スピン共鳴(EPR)分光法を用い、(1)還元型ヘム-NO反応中間体の解析からヘム-NOの配位構造、相互作用の解析、(2)酸化型ヘムに結合する外来性配位子(N_3^-)の電子状態、配位子とヘム近傍アミノ酸の相互作用の詳細な解析を行なった。これらの実験結果より、ヘム鉄と内在性アミノ酸軸配位子間の結合が切断された5配位型構造のヘム形成とシクラーゼ活性上昇との相関が明らかになった。更に、GTP結合による配位子分子の結合(親和)性が顕著に上昇する事、ヘムの電子状態が変化する事をを初めて見い出した。これらの変化はシクラーゼ部位にGTPが結合して構造変化が引き起こされ、その変化がヘム部位に伝わったと解釈できる。本課題研究の遂行は立教大学牧野龍教授の全面的な協力によって行なわれ、現在論文を製作中である。
微小循環レベルにおける歯根膜機能 -共焦点レーザー顕微鏡を用いた3次元的観察-

外力に対する歯根膜の応答を解明するため,歯根膜に豊富に存在し、組織の機能維持に必須の構造物である微小循環系に着目し検討を行った。まず、既存のハムスター頬袋のモデル実験系を用いて、様々な外力に対する微小循環系の応答性を生体顕微鏡下で検討した。次にラット上顎臼歯を近遠心に相反移動する実験系を開発し、血流を止めない弱い持続的な力と弱い減衰する力を負荷した際の歯根膜の応答性を酵素組織学的に比較検討した。さらに、この実験系において、蛍光標識された歯槽骨を共焦点レーザー走査顕微鏡により観察し、外力に対する歯根膜の応答性を比較検討した。その結果、ハムスター頬袋の単一細静脈内を観察したところ、血流を止めない持続的な力に対しては、白血球の転がりと粘膜が多く観察されたが、間欠的な力に対してはあまり観察されなかった。この白血球の応答は、外来刺激を受けた細静脈において必須の初期反応であることから、外力を受けた歯根膜における改造現象の引き金として注目される。この結果を踏まえて、弱い持続的な力と弱い減衰する力を用いてラット上顎臼歯を近遠心に相反移動したところ、歯の移動初期では弱い持続的な力を負荷した歯根膜において圧迫側での直接性骨吸収と牽引側での活発な骨添加が認められた。一方弱い減衰する力を負荷した歯根膜では圧迫側での穿下性骨吸収が観察され牽引側での骨添加も少なかった。また、歯の移動後期における共焦点レーザー走査顕微鏡による観察から、弱い持続的な力による牽引側歯根膜において、骨添加が旺盛であった。以上より、外力の種類により歯根膜の応答性に差が認められることが示唆された。なお、本研究の一部を、第55回日本矯正歯科学会大会(福岡)にて発表した。
単一蛍光分子の液液界面おける吸脱着測定

本研究を実施し、以下の結果を得ている。(1)マイクロ二相シースフローセルの作製単一蛍光分子計測に利用可能な、二相シースフローセル法の検討を行った。すなわち、有機相を内側、水相を外側に流す二柑シースフローセル法を開発する上での諸条件を検討した。内側溶液を、外側の流れの中に連続的に流出させるための、先端直径30μmのガラスキャピラリーを、炭酸ガスレーザーを用いて作製した。そのキャピラリーを250μmx250μmのガラス製フローセルに挿入し、内液と外液を同じ速度で流すことに成功した。有機相と水相が安定な界面を形成するには、流速を30cm/s程度に上げる必要があることが分かった。(2)マイクロ二相シースフロー顕微蛍光測定装置の作製二相シースフローセルを、レーザーを励起光源とする蛍光顕微鏡にセットし、フローの状態で蛍光を測定するための測定装置を作成した。本装置を用い、単一分子の吸着系への適用性を検討した。
ヘルペスウイルスベクターを用いた口腔癌の遺伝子治療

複製可能型遺伝子組換えHSV-1ベクターを用いた癌治療は、病原性や増殖能を制限したHSV-1ベクターを腫瘍細胞に感染させ、感染の拡大によって腫瘍組織を破壊する方法である。HSV-1ベクターを口腔領域で使用するにあたっては、HSV-1感染細胞に加えられるストレスの影響を把握する必要がある。HSV-1感染細胞における細胞内カルシウムイオン濃度をイオノマイシンにて上昇させたところ、ウイルスの細胞外放出は顕著に増加した。さらに、H_2O_2で処理した場合もHSV-1細胞外放出は著明に増加し、あらかじめCa^<2+>キレーター薬で処理しておくとH_2O_2による効果はみられなくなった。したがって、HSV-1の細胞外放出において細胞内カルシウムイオンが重要な役割を果たすことが初めて明らかとなった。HSV-1ベクターの殺腫瘍細胞効果を増強させるため、分化誘導剤であるヘキサメチレンビスアセトミドのHSV-1ベクター感染に対する影響につき検討した。本薬剤で神経毒性遺伝子γ34.5遺伝子を欠損したHSV-1R849感染細胞を処理したところウイルス産生が増加し細胞傷害性も増強され、HSV-1ベクターによる治療効果の増強に有用であることが明らかとなった。新しいHSV-1ベクターに関する研究として、平滑筋細胞の特異的マーカーであるカルポニンに着目し、そのプロモーター領域を組み込んだ新規HSV-1ベクターd12.CALPを構築した。このd12.CALPは、カルポニン遺伝子を発現するヒト口腔MFH細胞で選択的に複製可能であり、感染細胞に対して細胞傷害性を示した。また、ヌードマウス腫瘍内に注入することで腫瘍増殖を有意に抑制した。さらに、静脈内投与したd12.CALPベクターが肺転移腫瘍に到達し選択的に複製する所見が得られた。したがって、本ベクターはMFHの原発病変だけでなく肺転移の治療にも有用であると考えられた。増殖型HSV-1ベクターを用いた遺伝子治療は、変異HSV-1を腫瘍細胞に感染させて破壊する方法である。増殖性HSV-1べクターを開発する上で、遺伝子欠損部位を増すと病原性だけでなく、殺腫瘍細胞能も低下することが問題となっている。そのため、HSV-1ベクターの毒性を軽減する一方で殺腫瘍細胞効果を増強させる必要がある。1)HSV-1ベクターの殺腫瘍細胞能の増強を目的として、リボヌクレオチド還元酵素ICP6を欠損したhrR3より細胞融合能を有する変異株を分離した。このhrR3fは、lacZ発現と多核巨細胞形成の2つのマーカーをもっており、ICP6に加えてHSV-1UL53遺伝子に変異を認める重複変異ウイルスであった。ヒト耳下腺腺癌細胞と舌癌細胞に親株ウイルスベクターであるhrR3の低い感染多重度で感染させても十分な細胞変性はみられなかったが、細胞癒合性hrR3f感染の場合、多核巨細胞が形成され急速に感染が拡大するため広範囲で殺腫瘍細胞効果が認められた。さらに、2)平滑筋細胞の特異的マーカーで唾液腺腫瘍でも発現すると報告されているカルポニンに着目し、そのプロモ-ター領域を組み込んだ新規HSV-1ベクターd12.CALPを構築し唾液腺腫瘍に対する抗腫瘍効果を検討した。ヒト顎下腺導管細胞、腺様嚢胞癌細胞、耳下腺腺癌細胞では、いずれもカルポニンの発現レベルが低く、d12CALPの増殖はみられなかった。しかしながら、上顎に発生した悪性組織球腫細胞はカルポニンを発現しており、本HSV-1ベクターが殺腫瘍細胞効果を発揮することが明らかとなった。今後、実験動物を用いて悪性組織球腫に対する抗腫瘍効果を明らかにする方針である。

複製可能型変異HSV-1ベクターを用いた遺伝子治療は、変異HSV-1を腫瘍細胞に感染させて腫瘍細胞を破壊する方法で、現在臨床研究が進められている。HSV-1を口腔領域で使用するにあたっては、HSV-1感染細胞に加えられるストレスがウイルスベクターの感染にどのような影響を及ぼすか十分把握する必要がある。細胞死誘導物質である抗Fas抗体、TNFα、C2-セラミド、PKC阻害剤、イオノマイシンを用いてHSV-1KOS株感染細胞を処理した結果、イオノマイシン処理によって細胞内カルシウムイオン濃度の上昇と細胞死がみられ、ウイルスの細胞外放出は顕著に増加した。他の薬剤処理ではウイルス放出への影響はみられず、HSV-1の細胞外放出における細胞内カルシウムイオンの役割が初めて明らかとなった。新しいHSV-1ベクターに関する研究として、HSV-1のチミジンキナーゼ遺伝子部分にカルポニンのプロモーターを組み込んだHSV-1ベクターd12.CALPが口腔領域に発生する悪性唾液腺腫瘍、骨肉腫、悪性組織球腫(MFH)などに対して抗腫瘍効果を発揮するか否かを検討した。ヒト口腔MFH細胞株はカルポニン遺伝子を発現することがRT-PCRにて明らかとなったため、MFH由来細胞に対するd12.CALPベクターの抗腫瘍効果をin vitroとin vivoで検討した。その結果、このベクターは、カルポニン発現増殖細胞で選択的に複製可能で細胞傷害性を示し、ヌードマウス腫瘍内に注入することで有意に腫瘍増殖を抑制した。また静脈内投与したd12.CALPベクターが肺転移腫瘍に到達し選択的に複製する所見が得られた。したがって、本ベクターはMFHの原発病変だけでなく肺転移の治療にも有用であると考えられた。複製可能型遺伝子組換えHSV-1ベクターを用いた癌治療は、病原性や増殖能を制限した変異HSV-1を腫瘍細胞に感染させ、感染の拡大によって腫瘍組織を破壊する方法である。本年度の研究では、以下の3項目につき検討した。1)活性酸素がHSV-1感染に及ぼす影響を知るため、複製可能型組換えHSV-1ベクターであるR849株と野生型KOS株を感染させたロ腔癌紬胞をH202で処理した。その結果、HSV-1細胞外放出は著明に増加することが明らかとなった。あらかじめCa^<2+>キレーター薬で処理しておくとH2O2の効果はみられず、細胞内カルシウムの上昇がウイルス放出に強く関与することがわかった。細胞内Ca^<2+>が上昇する治療との併用で複製可能型組換えHSV-1の腫瘍内伝播が促進するものと思われる。2)ヌードマウスの皮下にロ腔悪性組織球腫細胞を移植することで、肺転移系を確立した。この系を用いて、HSV-1のチミジンキナーゼ遺伝子部分にカルポニンのプロモーターを組み込んだ新規HSV-1ベクターd12.CALPを尾静脈から投与した結果、肺転移に一致してウイルスの増殖を示すX-gal染色陽性の細胞が検出され、PCRにて1acZ遺伝子も確認された。したがって、本ベクターは肺転移病変を選択的に破壊できることが示唆された。
メタゲノム解析による種間伝播（スピルオーバー）する動物ウイルスの探索

本研究では動物ウイルスの進化を考察するため、家畜と野生動物との間でのウイルスのやり取りで発生する可能性がある種間伝播、すなわちスピルオーバーしたウイルスを網羅的に検索し、同時に新規ウイルスの探索も行う。2018年度は26年ぶりに豚コレラの発生があり、野生のイノシシと家畜の豚との間での流行が明らかとなったことからイノシシと豚に注目し、これらを中心に糞便の採材を実施した。なお、豚コレラウイルスについては限られた研究機関しか取り扱いが認められてないため、本研究では豚コレラウイルス以外のウイルスを対象としている。採取された糞便から直接核酸を抽出し、次世代シークエンサーによるメタゲノム解析でウイルスゲノムを網羅的に検索した結果、豚からは14種類、イノシシからも14種類のウイルスの遺伝子断片が検出された。豚から検出されたウイルスのうち1種はこれまでに報告がない遺伝子配列を示すことから、遺伝子ほぼ全長を決定してサペロライク豚ピコルナウイルスと命名し新種ウイルスとして報告した。また、遺伝子全長解析の報告が少ないサペロウイルスについては、遺伝子の多様性を明らかにして報告した。さらにポサウイルスは豚以外の昆虫を含む多様な動物からも検出されるため真の宿主が明らかになっていないウイルスであるが、本研究で発見したポサウイルス株を様々な宿主由来のポサウイルスと比較し、日本のポサウイルスは独自の進化を示すものもあり、真の宿主を探索するためにはさらに広い範囲の動物から採材する必要があることを考察した。イノシシからも豚のそれとは内訳が異なる14種類のウイルスが発見されたが、サペロウイルス以外はわが国において最初の発見であり、食物由来の可能性が否定できないウイルス種以外は豚と共通するウイルスであることから、今後更なる詳しい解析を実施する。イノシシは石川県、富山県、三重県及び茨城県でそれぞれ22、14、7及び5検体を採取し、豚は石川県、茨城県、鳥取県及び神奈川県で採取された12、2、18及び22検体の糞便を材料とした。その他、岩手県で採取された鹿の糞便3検体および三重県で採取された牛の糞便13検体も検査に供した。豚からはサペロライク豚ピコルナウイルス、サペロウイルス、ポサウイルス、エンテロウイルスG、テシオウイルス、コブウイルス、パシウイルス、トロウイルス、サポウイルス、アストロウイルス、A群ロタウイルス、C群ロタウイルス、H群ロタウイルス及びピコビルナウイルスの合計14種類のウイルス遺伝子断片が検出された。イノシシからはサペロウイルス、ポサウイルス、エンテロウイルスG、コブウイルス、サポウイルス、アストロウイルス、A群ロタウイルス、C群ロタウイルス、F群ロタウイルス、ピコビルナウイルス、オルソレオウイルス、糞便随伴環状ウイルス、ドロソフィラCウイルス、ディシストロウイルスの遺伝子断片が検出された。F群ロタウイルスは鳥類からの検出例しかなく、ドロソフィラCウイルス及びディシストロウイルスは昆虫ウイルスであることから、食物由来である可能性があるが、さらに詳しく遺伝子解析を続けていく。今回、2018年9月にイノシシ及び豚で豚コレラが発生し、野生動物と家畜とのウイルスのやり取りを考える良い機会となったが、その反面、豚コレラの影響で糞便の採材が困難となるケースも考えられた。幸い豚コレラ発生地では最初から採材を計画していなかったこともあり、ほぼ予定どおりの検体数を採材することができた。次年度も計画どおりの採材を行う予定である。現在、一部のウイルス株を除いて遺伝子断片のみの情報しか得られてない検体が殆どであり、遺伝子断片から得られる情報を基にプライマーを作成し、遺伝子増幅を試みる。できる限り幅広く遺伝子を比較する必要があるため、必要に応じてはRACE法を用いて遺伝子末端まで決定する予定である。今後、家畜飼養施設周辺に監視カメラを置き、畜舎に接近する野生動物の種類と頻度を調べる。近づく野生動物の種類が断定できたら、その動物の糞便も採取する。現在のところ、イノシシと豚を調べることで相当の量の有益なデータが得られると思われるが、優先順位を適切に決定し、本研究の目的である家畜、野生動物におけるウイルスのスピルオーバーの実態はどうなっているのか、そのウイルスはどのような遺伝子変異を持っているのかを明らかにすることができるよう、最大限の努力を払っていく。

さらにポサウイルスは豚以外の昆虫を含む多様な動物からも検出されるため真の宿主が明らかになっていないウイルスであるが、本研究で発見したポサウイルス株を様々な宿主由来のポサウイルスと比較し、日本のポサウイルスは独自の進化を示すものもあり、真の宿主を探索するためにはさらに広い範囲の動物から採材する必要があることを考察した。イノシシからも豚のそれとは内訳が異なる14種類のウイルスが発見されたが、サペロウイルス以外はわが国において最初の発見であり、食物由来の可能性が否定できないウイルス種以外は豚と共通するウイルスであることから、今後更なる詳しい解析を実施する。イノシシは石川県、富山県、三重県及び茨城県でそれぞれ22、14、7及び5検体を採取し、豚は石川県、茨城県、鳥取県及び神奈川県で採取された12、2、18及び22検体の糞便を材料とした。その他、岩手県で採取された鹿の糞便3検体および三重県で採取された牛の糞便13検体も検査に供した。豚からはサペロライク豚ピコルナウイルス、サペロウイルス、ポサウイルス、エンテロウイルスG、テシオウイルス、コブウイルス、パシウイルス、トロウイルス、サポウイルス、アストロウイルス、A群ロタウイルス、C群ロタウイルス、H群ロタウイルス及びピコビルナウイルスの合計14種類のウイルス遺伝子断片が検出された。イノシシからはサペロウイルス、ポサウイルス、エンテロウイルスG、コブウイルス、サポウイルス、アストロウイルス、A群ロタウイルス、C群ロタウイルス、F群ロタウイルス、ピコビルナウイルス、オルソレオウイルス、糞便随伴環状ウイルス、ドロソフィラCウイルス、ディシストロウイルスの遺伝子断片が検出された。F群ロタウイルスは鳥類からの検出例しかなく、ドロソフィラCウイルス及びディシストロウイルスは昆虫ウイルスであることから、食物由来である可能性があるが、さらに詳しく遺伝子解析を続けていく。今回、2018年9月にイノシシ及び豚で豚コレラが発生し、野生動物と家畜とのウイルスのやり取りを考える良い機会となったが、その反面、豚コレラの影響で糞便の採材が困難となるケースも考えられた。幸い豚コレラ発生地では最初から採材を計画していなかったこともあり、ほぼ予定どおりの検体数を採材することができた。次年度も計画どおりの採材を行う予定である。現在、一部のウイルス株を除いて遺伝子断片のみの情報しか得られてない検体が殆どであり、遺伝子断片から得られる情報を基にプライマーを作成し、遺伝子増幅を試みる。できる限り幅広く遺伝子を比較する必要があるため、必要に応じてはRACE法を用いて遺伝子末端まで決定する予定である。今後、家畜飼養施設周辺に監視カメラを置き、畜舎に接近する野生動物の種類と頻度を調べる。近づく野生動物の種類が断定できたら、その動物の糞便も採取する。現在のところ、イノシシと豚を調べることで相当の量の有益なデータが得られると思われるが、優先順位を適切に決定し、本研究の目的である家畜、野生動物におけるウイルスのスピルオーバーの実態はどうなっているのか、そのウイルスはどのような遺伝子変異を持っているのかを明らかにすることができるよう、最大限の努力を払っていく。論文作成の遅れにより、1報分の英文校正料が保留となって繰り越すことになった。
不安定核ビームを用いた(p,2p)陽子knockout反応実験の高分解能化

不安定核ビームと陽子標的を逆運動学で用いた(p,2p)陽子ノックアウト反応を用いると、軌道角運動量、分離エネルギーなどの不安定核中を動いている核子の単一粒子軌道に関する情報を得る事ができる。実験的には、約100AMeVの不安定核ビームを陽子標的に当て、ノックアウト反応で放出される50MeV-100MeVのエネルギーを持つ2個の陽子のエネルギーと運動量を測定する。これまでの測定は、陽子検出器にNaI(Tl)検出器を用いていた為、核子分離エネルギーの分解能は約1.5MeV(rms)程度であった。この分解能は一般的には反応でできる残留核の状態を分離できない為、本研究では分離エネルギー分解能を改善するの為の種々の改良/開発を行った。その中でもっとも重要なのが、陽子エネルギーを測定する高純度Ge半導体検出器の開発である。小さな結晶はこれまでにも原子核実験で使われていたが、今回製作したのは直径70mm、厚さ30mmという非常に大きな平板型高純度Ge結晶を用いた検出器である。この結晶は使用の便利さの為に、薄いBe入射膜付きのクライオスタットに組み込まれ、約105MeVまでの陽子の全エネルギーを測定する事ができる。実際の測定に、2次ビームエネルギーを高精度で測定する為の低圧MWPC、陽子の方向を測定する為のガスを用いた位置検出器(Drift Chamber)、エネルギー損失を測定し粒子識別を行うsi-strip検出器等の開発やプロトタイプ試験等を平行して行った。これらの検出器の完成後、加速器施設からの陽子/^<12>Cビームを用いて検出器系の総合試験を行った。データは解析途中であるが、分離エネルギー分解能として約0.5MeV(rms)程度が得られている。これは、目標とした値より約3倍程度悪い値であり、現在は検出器の一部を改良後、再度ビーム試験を行う事を予定している。ドリップライン付近の原子核(不安定核)の単一粒子軌道の情報を得る為、陽子標的による不安定核ビームからの核子ノックアウト反応を高分解能で測定する検出器系の開発を行っている。その為には、2次ビームの運動量を高精度で測定する低圧MWPC、反応から放出される高エネルギー陽子の方向と全エネルギーを高精度で測定する位置検出器(Si-Strip)とHP-Ge半導体検出器等の開発/試験が必要になる。低圧MWPCに関しては、試作器としての2mm間隔のMWPC、ガス混合系、低圧ガス処理系を製作した。1気圧で検出器が安定に動作するマジックガスから出発し、圧力を0。5、0。25、0。05気圧と下げた時に検出器が安定に動作するガスの混合比の最適化を行った。現在、0。25気圧程度までは安定に動作する条件を見い出した。又同時に、MWPCの動作に必要ではあるが、オゾン層破壊の為に使用禁止になっているフロンの代替品の選択と試験を行い、良い代替品を見つけ出した。陽子の位置を測定する位置検出器に関しては、半導体Si-Strip検出器を想定し、読出回路の内の前置増幅器の小型化を行いつつある。陽子の全エネルギーを測定する半導体検出器に関しては、荷電粒子の測定に適している平板型の高純度ゲルマニウム(HP-Ge)を結晶として選び、大型(直径70mm、厚さ30mm)結晶を小型のクライオスタットに収めた検出器系を設計/発注した。不安定核ビームと陽子標的を逆運動学で用いた(p,2p)

陽子ノックアウト反応を用いると、軌道角運動量、分離エネルギーなどの不安定核中を動いている核子の単一粒子軌道に関する情報を得る事ができる。実験的には、約100AMeVの不安定核ビームを陽子標的に当て、ノックアウト反応で放出される50MeV-100MeVのエネルギーを持つ2個の陽子のエネルギーと運動量を測定する。これまでの測定は、陽子検出器にNaI(T1)検出器を用いていた為、核子分離エネルギーの分解能は約1.5MeV(rms)程度であった。この分解能は一般的には反応でできる残留核の状態を分離できない為、本研究では分離エネルギー分解能を改善するの為の種々の改良/開発を行った。その中でもっとも重要なのが、陽子エネルギーを測定する高純度Ge半導体検出器の開発である。小さな結晶はこれまでにも原子核実験で使われていたが、今回製作したのは直径70mm、厚さ30mmという非常に大きな平板型高純度Ge結晶を用いた検出器である。この結晶は使用の便利さの為に、薄いBe入射膜付きのクライオスタットに組み込まれ、約105MeVまでの陽子の全エネルギーを測定する事ができる。実際の測定に、2次ビームエネルギーを高精度で測定する為の低圧MWPC、陽子の方向を測定する為のガスを用いた位置検出器(Drift Chamber)、エネルギー損失を測定し粒子識別を行うSi-strip検出器等の開発やプロトタイプ試験等を平行して行った。これらの検出器の完成後、加速器施設からの陽子/^<12>Cビームを用いて検出器系の総合試験を行った。データは解析途中であるが、分離エネルギー分解能として約0.5MeV(rms)程度が得られている。これは、目標とした値より約3倍程度悪い値であり、現在は検出器の一部を改良後、再度ビーム試験を行う事を予定している。
制振材の効果的使用法に関する研究

1.制振材の評価法のための基礎的実験を行った。加振方法として打撃加振とランダム加振について検討し、減衰率の算出方法として半値幅法、カーブフィット法、ヒルベルト変換による方法について検討した。その結果、ズ-ム処理等を行うことにより3方法とも同様の結果を得ることができた。ただし、加速度計を対象物に取付ける場合にはその質量の影響があり、注意が必要である。また、制振材の温度、構造物の振動数、変位振幅についても測定値に変化があり、これらを考慮した評価が必要である。2.制振材を種々の場所に貼付し、振動特性を求める実験を行い、貼付位置に対する制振効果の検討を行った。また、制振材の貼付位置における制振材の歪エネルギ分担率を実験値から求め、この実験値と制振効果との間の関係を検討し、両者の間に相関があることを求めた。3.有限要素法を用いて数値モデルを構成し、ノモグラムで表された制振材の振動特性を考慮し、構造物の損失係数を予測できることを確認した。4.振動インテンシティの計測を行い、制振材での振動エネルギの消費の傾向を得ることができた。ただし、振動インテンシティの測定精度に問題があり、定量的な検討を行うことはできなかった。制振材の効果の評価のためには、更に振動インテンシティの計測精度の向上を図る必要がある。5.本補助金は、主にチャージアンプ、非接触式変位計、加速度計、温度計マルチメータの購入のために使用した。これらの装置は、モデルの振動応答および制振材の温度を測定するためのものである。
癌幹細胞の自己複製と未分化性維持の分子メカニズムの解明

急性骨髄性白血病の幹細胞の維持に必要な経路として、HoxA9、M-CSFR、c-Kitの3つの経路を見出し、これらの発現はそれぞれBRPF1, PU.1及びc-MYBにより制御されることを明らかにした。これらの経路を遮断することにより、白血病が治癒した。これらの発見は、これらの経路が治療の良い標的となることを示している。癌幹細胞は、自己複製能を有すると共にしばしば治療抵抗性を示して治療後に残存し、再び癌細胞を供給して再発の原因となる。急性白血病の治療には化学療法が広く用いられが、再発がしばしば見られ、5年生存率は30%程度と低い。その原因として考えられるのは化学療法に抵抗性を示す白血病幹細胞で、再発のない根治療法の確立には白血病幹細胞を完全に除去することが必要である。我々は急性骨髄白血病のがん幹細胞にはM-CSFRの発現が特異的に高いことを見出した。M-CSFRプロモーター下流に条件的アポトーシス誘導遺伝子を連結した人工遺伝子を導入したトランスジェニックマウスに白血病関連遺伝子MOZ-TIF2を導入し白血病を誘導した後、がん幹細胞を含むM-CSFR高発現細胞にアポトーシスを誘導すると白血病が治癒することを明らかにした。この結果は、白血病マウスから白血病幹細胞を除去すると白血病が完全に治癒することを示している。MOZ-TIF2融合遺伝子によるM-CSFRの発現誘導は、MOZ-TIF2が転写因子PU.1と複合体を形成し、この複合体がM-CSFR遺伝子プロモーター領域に結合して転写を活性化するためであることを明らかにした。MOZ-TIF2による白血病は、PU.1遺伝子欠損マウスでは誘導されないこと、条件的にPU.1遺伝子欠損を誘導すると白血病が維持されないことから、PU.1を介した経路が白血病の誘導や維持に必須であることが明らかとなった。M-CSFR特異的なチロチンキナーゼ阻害剤を白血病モデルマウスに投与する顕著に発症が遅れることから、M-CSFR特異的チロチンキナーゼ阻害剤が治療に有効であることが示唆された。マウス骨髄細胞にMOZ-TIF2を導入して移植することにより白血病を誘導したモデル実験系を用いて、急性骨髄性白血病の幹細胞ではHoxA9、M-CSFR、C-Kitの発現が亢進していることを見いだした。HoxA9の発現は、MOZ-TIF2がクロマチン結合因子BRPF1との結合を介してHoxA9遺伝子の修飾クロマチンを認識することにより活性化することを明らかにした。BRPF1はMOZ-TIF2と共にHoxA9遺伝子に局在し、BRPF1の発現をshRNAにより抑制するとHoxA9の発現や細胞のコロニー形成能が顕著に低下した。M-CSFRの発現は、MOZ-TIF2が転写因子PU.1と結合を介してM-CSFR遺伝子の特異的DNA配列を認識することにより活性化することを明らかにした。PU.1遺伝子をコンディショナルノックアウトマウスを用いてPU.1遺伝子を欠損させるとM-CSFRの発現が著しく低下し、白血病誘導が完全に阻害された。これらの結果から、BRPF1/HoxA9経路やPU.1/M-CSFRが急性骨髄性白血病の幹細胞の維持に必須であることが証明された。また、ポリコーム複合体を形成するRing1A/Ring1Bが急性骨髄性白血病の幹細胞の維持に必須であることを明らかにした。Ring1A/Ring1B遺伝子の欠損により、発現の変化する遺伝子を網羅的に解析し、急性骨髄性白血病の幹細胞の維持に関わる因子を同定した。イソクエン酸デヒドロゲナーゼ(IDH)1/2の変異は、急性骨髄性白血病(AML)やグリオーマ、軟骨肉腫や胆管癌等のさまざまながんにおいて高頻度に生じている。AMLにおいては、IDH変異はNucleophosmin(NPM)、DNMT3A、FLT3の変異と高い頻度で同時に起こる。変異型IDHだけではAMLを発症するには十分ではないため、変異型IDHと共に複数の変異を同時に持つことがAML発症に必要であると考えられた。我々は、NPM+/-の造血系前駆細胞に変異型IDH2と共にNPM, DNMT3A, FLT3の変異体を同時に発現させてAMLを発症するモデルマウスを作製した。このとき、INDF4変異遺伝子のうちどれか一つを欠いた3遺伝子の組み合わせではAMLの発症が著しく遅延したことから、INDF4変異遺伝子全ての発現が速やかにAMLを発症させるためには必要であることが明らかになった。変異型IDH2がAMLの維持に必要であるかを調べるために、IDH2/R140Qをloxp配列で挟み込み、tamoxifenによりCreの発現を誘導してIDH2/R140Qをノックアウト出来る系を作製した。このfloxed-IDH2/R140QをNPMc, DNMT3A/R882H, FLT3-ITDと共にNPM+/-