hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
アスパラガスにおける両性花および単性花形成に関わる分子機構の解明

アスパラガスの同型接合雄性は超雄とも呼ばれ、全雄種子生産の花粉親として用いられている。しかし、同型接合雄性(YY)と異型接合雄性(XY)を短期間に判別する方法は確立されていない。そこで、雄性両性同体性アスパラガスの自殖種子から、同型接合雄性および異型接合雄性の遺伝子型をもつ植物体を育成し、両者を識別する方法を検討した。その結果、雄性判別DNAマーカー(AspTaq1)の定量値をもとに判別することが可能であることがわかった。アスパラガスの自殖系統を用いて雌性,雄性,超雄性(YY)ならびに雄性両性同株性個体を育成し,それぞれに着生した花について形態的特徴を検討した。その結果,雄性両性同株性個体,雄性固体,超雄性個体に着生した花の形態に顕著な違いは見られなかった。従来から雌性花と雄性花の花柱の長さに違いがあるとの指摘があったが,性を特徴づける明瞭な差異は見つけられなかった。性発現に関連する遺伝子とそれと強く連鎖するDNA配列を特定するため,既知雄性PCRマーカー周辺の塩基配列をインバースPCR法により単離し,塩基配列を決定した。既知雄性マーカーを含むDNA領域での塩基配列の決定は, PCRによる性判別をより広範囲な種に利用するためのマーカー作製に利用できる。雌性両性同株性個体から生じた次世代個体では,雄性を支配する遺伝因子の相対量が0, 1, 2の存在比で変異すると推定される。本研究によって決定された雄性マーカー周辺の塩基配列は雄性因子の変異をin situで検出するのにも有用である。アスパラガス'Gold Schatz#2'のホメオティック変異はBクラスーMADS-Box遺伝子の発現障害に起因すると推定された。そこで'Gold Schatz#2'に生じた変異の遺伝様式を調べるため,次世代個体における早期開花の方法を検討した。その結果,胚をアルギン酸ナトリウムのゲルに封入し、薬剤処理することにより,発芽後4週間で開花させることに成功した。この技術は,組織培養や遺伝子改変によって生じた花の形態変異を早期に見出す手法としても有用である。現在,花器官の変異を超雄製作出に利用する方法を模索している。食用アスパラガスの維持系統を用い,雄性発現に関連する遺伝子を検索し,それと強く連鎖するゲノムDNAの塩基配列を特定するため,既知雄性PCRマーカー周辺の塩基配列をインバースPCR法などの方法で増幅し,得られたDNA断片について塩基配列を決定した。その結果,既知の雄性PCRマーカーを含む約1kbpの領域を決定した。しかし,BLASTによる検索では,この領域に既知タンパク質遺伝子に関連する塩基配列は見いだせなかった。現在,この領域のさらなる拡張を試みているところである。一方,既存のESTデータベースからアスパラガス雄花の発達段階で発現する遺伝子を選び,ゲノムを鋳型としてPCRにより増幅したところ,そのうちの1つが増幅した。今後,この断片をクローニングし,塩基配列を決定することによって性判別マーカーとの関連について調べる予定である。雄性マーカーの新品種育成への利用に関しては以下の成果を得た。雄性両性同株アスパラガスの自殖により生じた個体では,雄性を支配する遺伝因子の存在量比が0,1,2で変異すると推定される。これまでに得られた定量PCRによる相対値を実際のコピー数に換算するために,雄性PCRマーカーAspTaq,と単一コピーであることがわかっているAODEFの部分配列をプラスミド上に作成し,それを鋳型とした増幅量を基準に,自殖により生じた個体の雄性PCRマーカーコピー数を算出した。その結果,雄性マーカーは性染色体に単一コピーとして存在すること,自殖により同型接合および異型接合の雄個体が生じることが明らかとなった。雄性PCRマーカーによる同型接合および異型接合雄性個体の判別法が確立したので,栽培特性の優れた品種(系統)を用い,全雄種子生産のための超雄性系統育成に着手した。アスパラガスの全雄性種子は,超雄性系統(YY)と雌性系統(XX)との交雑によって得られる。超雄性系統は,雄性両性同株性アスパラガスの株に着生した果実種子から植物体を育成し,選抜によって分離するのが一般的である。しかし、雄性両性同株性アスパラガスはまれにしか存在せず,実際に利用されている系統は、特定の品種から派生したものに限られている。そこで,より広範な品種における超雄性系統を育成することを目的として,超雄性アスパラガスが、次世代においてどのような仕組みで雄性を発現するのか、実験的根拠に基づいて検討した。全雄性種子が生産される仕組みは、すべての次世代植物がXY型のゲノム組成を持つからであると説明されている。そこで、品種ガインリムを用い、雄性両性同株性系統の自殖によって得た個体のなかから超雄性を示す個体を選抜し,ゲノムあたりの雄性判別DNAマーカーのコピー数を、定量PCRによって測定した。

その結果,ほとんどの超雄性個体は,雄性決定因子について同型接合性を示したが,そのなかに通常の雄のゲノム組成,すなわち,異型接合雄性(XY)と推定される個体が見いだされた。この個体は、ほかの品種の雌性個体を用いた場合にも超雄性を示すことがわかった。アスパラガスの性発現は優劣のある対立遺伝子Mとmによって決定されると考えられている。性決定遺伝子に関して異型接合である雄性個体が超雄性を示す事例は、これまでの説明による雄性発現の伝達様式と矛盾する。現時点ではまだ、その仕組みの解明には至ってはいないが、それが明らかになれば、雄性同型接合体(YY)を利用しない新たな全雄性種子生産の方法として利用されるものと期待される。
イスラエル国ガリラヤ湖周辺地域の宗教文化に関する総合研究

(1)イスラエル国エン・ゲヴ遺跡における発掘調査・平成13年度7月23日8月26日(第6次調査)列柱式建物の北側の発掘...石柱3点と石敷きの床を検出ケースメート式市壁の北端部の発掘...市壁の角は検出できず、北側への連続を確認ヘレニズム時代の階段つき遺構の検出ローマ時代の石灰窯の検出・平成15年度7月27日8月23日(第7次調査)列柱式建物の南西隅の発掘...下層の建物の石列上面の高さと床面との関係を確認ケースメート式市壁の北端部の発掘...5メートル拡張したが市壁の角は検出できず、北側へのさらなる連続を確認ヘレニズム時代の遺構(基礎石列=壁?)の検出ローマ時代の石灰窯(二基目)の検出(2)ヨルダン国における鉄器時代の諸遺跡の調査・調査期間:8月26日9月3日および12月26日1月3日・調査地域:ヨルダン北西部(トランスヨルダン)の鉄器時代のテルおよびデカポリス諸都市(ジェラシュ,アビラ,ウム=カイス,ペラ,アンマン,ベイト・ラス)・調査成果:ラモト・ギレアド,マハナイムなど鉄器時代の核となる遺跡の位置と発掘調査の現状を確認デカポリス諸都市の発掘調査の現状と都市相互の位置関係を確認(3)東地中海地域のユダヤ教会堂ならびにキリスト教会遺跡の踏査・平成13年度名取四郎・佐藤研・江添誠平成14年3月24日31日トルコ共和国ヨハネの黙示録七つの教会に関連するキリスト教遺跡調査・平成14年度名取四郎・益田朋幸(早稲田大学教授)平成15年3月14日29日トルコ共和国およびイタリア共和国におけるユダヤ教およびキリスト教遺跡踏査・平成15年度名取四郎・益田朋幸平成15年8月4日23日シリア共和国およびヨルダン・ハシミテ王国におけるキリスト教遺跡踏査佐藤研・高井啓介(日本学術振興会特別研究員)平成15年10月27日11月4日ギリシア共和国パウロの伝道に関連するキリスト教遺跡調査(1)イスラエル国エン・ゲヴ遺跡における発掘調査・平成13年度7月23日8月26日(第6次調査)列柱式建物の北側の発掘...石柱3点と石敷きの床を検出ケースメート式市壁の北端部の発掘...市壁の角は検出できず、北側への連続を確認ヘレニズム時代の階段つき遺構の検出ローマ時代の石灰窯の検出・平成15年度7月27日8月23日(第7次調査)列柱式建物の南西隅の発掘...下層の建物の石列上面の高さと床面との関係を確認ケースメート式市壁の北端部の発掘...5メートル拡張したが市壁の角は検出できず、北側へのさらなる連続を確認ヘレニズム時代の遺構(基礎石列=壁?)の検出ローマ時代の石灰窯(二基目)の検出(2)ヨルダン国における鉄器時代の諸遺跡の調査・調査期間:8月26日9月3日および12月26日1月3日・調査地域:ヨルダン北西部(トランスヨルダン)の鉄器時代のテルおよびデカポリス諸都市(ジェラシュ,アビラ,ウム=カイス,ペラ,アンマン,ベイト・ラス)・調査成果:ラモト・ギレアド,マハナイムなど鉄器時代の核となる遺跡の位置と発掘調査の現状を確認デカポリス諸都市の発掘調査の現状と都市相互の位置関係を確認(3)東地中海地域のユダヤ教会堂ならびにキリスト教会遺跡の踏査・平成13年度名取四郎・佐藤研・江添誠平成14年3月24日31日トルコ共和国ヨハネの黙示録七つの教会に関連するキリスト教遺跡調査・平成14年度名取四郎・益田朋幸(早稲田大学教授)平成15年3月14日29日トルコ共和国およびイタリア共和国におけるユダヤ教およびキリスト教遺跡踏査・平成15年度名取四郎・益田朋幸平成15年8月4日23日シリア共和国およびヨルダン・ハシミテ王国におけるキリスト教遺跡踏査佐藤研・高井啓介(日本学術振興会特別研究員)平成15年10月27日11月4日ギリシア共和国パウロの伝道に関連するキリスト教遺跡調査2001年度はガリラヤ湖東岸エン・ゲヴ遺跡の発掘調査と検討(1),ガリラヤ湖東・北岸の諸遺跡調査(2),トルコ国イズミール地方のユダヤ教およびキリスト教遺跡踏査(3)を行った。(1)では,既に,本遺跡のアクロポリス部分に二層にわたる鉄器時代の列柱式建造物の存在が確認されていたが,下層の列柱式建造物に連続すると思われるもう一棟の石列部分が出土し,加えて本建造物の年代決定に大きな意味をもつと思われる土器片が同建造物の床面から検出された。また,前回までの調査で確認されていた東側の直線的な二重城壁(ケースメート式城壁)は予想以上に北に延びていることが判明した。さらに,都市の北東部分には,壁の厚さ1mに及ぶ大規模な公共の複合建造物が城壁に接して存在していることも確かめられた。これらの発掘調査結果は成,古代イスラエル時代のこの都市が綿密に計画されて造営されていたことを明らかにしつつある。

ヘレニズム時代の遺構では,やはり前回までに知られていた建物の西の延長部分に石敷きの一続き二部屋が出土し,その南の部屋の床面に円形に並べられた礫が複数検出された。それはこの部屋がアンフォラを貯蔵する倉庫であったことを示している。この複数のアンフォラの貯蔵に加えて,東を向いた方位,石段を上った高い位置などは,ここが何らかの宗教的施設であった可能性を示唆するが,今回の調査では未だそれを確証できるには至らなかった。なお,本研究の枠内で,過去のエン・ゲヴ遺跡調査の記録写真類のデジタル化に着手した。(2)本年度は,夏期,ガリラヤ湖東岸から3kmの山上に築かれたヘレニズム都市ヒッポス(今年度よりハイファ大学とポーランド調査団が共同で発掘調査を開始した),ガリラヤ湖北岸の鉄器時代およびヘレニズム時代の遺跡ベトサイダ(アメリカ隊が発掘調査中)の三遺跡を視察し,エン・ゲヴ遺跡との比較研究のための資料を蒐集した。(3)パレスティナ情勢の緊迫化に伴う危険性を考慮し,当初の研究計画からトルコ国小アジア地方のシナゴグおよび教会遺跡の調査に変更した。ガリラヤで誕生したユダヤ・キリスト教が北シリアを経て,まずはこの地で開化したからである。その結果,ガリラヤに始まるユダヤ・キリスト教がヘレニズム・ローマ文化の内部に融合するかたちでこの地に流入したことがより明確化した、(1)ヨルダン国における鉄器時代の諸遺跡の調査本調査は二つの目的をもって行われた。ひとつは,2001年度に行ったガリラヤ湖東岸エン・ゲヴ遺跡の発掘調査結果を宗教文化史的に位置づけるために,ヨルダン国内の鉄器時代の諸遺跡を踏査し,各都市のヨルダン考古局より最新の発掘成果情報を入手することである。もうひとつは,ヨルダン国に残るデカポリスの諸都市の遺跡を視察し,各遺構の出土状況や最新の研究成果を確認することでヘレニズム時代からビザンティン時代にわたるガリラヤ湖周辺地域の宗教文化理解に役立てるためである。調査期間:8月26日9月3日および12月26日1月3日調査地域:ヨルダン北西部(トランスヨルダン)の鉄器時代のテルおよびデカポリス諸都市(ジェラシュ,アビラ,ウム=カイス,ペラ,アンマン,ベイト・ラス)調査成果:ラモト・ギレアド,マハナイムなど鉄器時代の核となる遺跡の位置と発掘調査の現状を確認。デカポリス諸都市の発掘調査の現状と都市相互の位置関係を確認。なお,本調査は,在イスラエル日本大使館による渡航自粛勧告により今年度実施不可能となった当初の研究計画(夏期休暇を利用したイスラエル国ガリラヤ湖東岸エン・ゲヴ遺跡の発掘調査)に代わって,研究課題の範囲内で計画変更したものである。当調査に関しては,ヨルダン大学文学部教授S・アッバディ氏の協力を得た。(2)聖書考古学研究会の開催2002年12月5日9日,イスラエル国テル・アヴィヴ大学M・コハヴィ教授を招聘し,12月6日に天理大学で,12月7日に立教大学において聖書考古学研究会を開催した。天理大学ではコハヴィ教授による聖書考古学研究の現状と課題と題する講義と討議を,立教大学では同教授および研究分担者名取四郎立教大学教授による発題をもとに討議を行い,ガリラヤ地域における宗教文化の理解を深めた。(3)昨年度までのガリラヤ湖東岸エン・ゲヴ遺跡の発掘調査の報告に向けた資料の検討
一流選手の素質に関連する遺伝的マーカーの検索:ミトコンドリア酵素及びビタミンD受容体遺伝子の多型性と競技能力

「天性の素質」つまり遺伝的要素がスポーツの成績を左右する因子であることは、競走馬においてその走行能力に基づいて選択交配を繰り返してサラブレットが完成されてきた例に端的に示されている。ヒトの運動能力についても遺伝因子の関与が考えられている。本研究は、分子遺伝学的分析法を用いて、その「天性の素質」の実態探究に着手するものである。制限酵素Bsm I、ApaI、及びTaq Iを用いての制限酵素断片長多型法による遺伝子多型の分析により、被検者の遺伝子型は主に4種類のハプロタイプ(bbaaTT、bbAaTT、BbAaTt、bbAATT)からなっていることが明らかとなった。ビタミンD受容体遺伝子ハプロタイプは骨密度と相関し、さらにlα・hydroxy vitaminD3投与による骨密度の上昇度とも相関していると報告されている。投擲選手には長距離走者や一般学生と異なり、高い骨密度と相関しているbbaaTTハプロタイプの出現比率が高く、低い骨密度と相関しているBbAaTt、bbAATTハプロタイプの出現比率が低い特徴がみとめられた。ミトコンドリア遺伝子については、酸化的リン酸化系の酵素群をコードするミトコンドリアDNAの転写調節部位(D-loop領域)について、その塩基配列の多型を調べ、一流長距離ランナーに特異な多型が存在するか否かを検討した。D-loop領域には多くの多型が存在し、個人間でばらつきのあることが確認され、興味深いことに、一流長距離ランナーで変異数が多い傾向が認められた。これらの結果は、特定の遺伝的要素を持った者が、特定のスポーツ競技において活躍している可能性を示唆する分子遺伝学的な証拠と考えられる。本研究は、「チャンピオンは、特定の遺伝子を受け継いだ者の中からのみ生まれるのかもしれない」という作業仮説に基づいて進められる。その第一歩として、平成7年度は、ビタミンD受容体遺伝子多型性の分布が、一流競技者と一般人の間で、また競技種目間においても異なっているか否かを検討する。陸上競技投擲種目(32名)、陸上競技長距離種目(49名)、一般学生(90名)の同意を得て、末梢血を0.5ml採取し、遺伝子(DNA)をSDS-フェノール法により抽出し、PCR増幅装置を用いてDNAを約100万倍に増幅した後に、遺伝子の型(多型性)をBsml,TaqlおよびApal酵素を用いた制限酵素断片長多型法により判定した。日本人のビタミンD受容体遺伝子多型は主にBbAATt,BbAaTT,bbAaTT,bbaaTTの4種類から構成されていおり、骨密度はBbAATt<BbAaTT<bbAaTT<bbaaTTの順に高くなっていると言われているが、本研究においても被検者の大部分がこの4種類のタイプに分類された。ビタミンD受容体遺伝子多型性の分布は陸上競技長距離走者と一般学生との間においては差が認められなかったが、陸上競技投擲選手は長距離走者や一般学生とは異なり、高骨密度と相関があるといわれているbbaaTT型が多い傾向が認められた(P<0.05)。特定の遺伝的要素を持った者が、特定のスポーツ競技において活躍している可能性があり、その一つとして投擲競技は骨密度を高くするビタミンD受容体遺伝子型をもつという関係が示唆されたと考えられる。今後の研究は、長距離種目のスタミナに特有な遺伝的マーカーの一つとして考えられるミトコンドリア遺伝子の多型分析の検討へと進めたい。なお、いままでの研究成果の一部を、第50回日本栄養・食糧学会において発表する予定である。「天性の素質」つまり遺伝的要素がスポーツの成績を左右する大きな因子であることは、競走馬においてその走行能力に基づいて選択交配を繰り返してサラブレットが完成されてきた例に端的に示されている。

本研究は、分子遺伝学的分析法を用いて、その「天性の素質」の実態探究に着手するものである。制限酵素Bsm I、Apa I、及びTaq Iを用いての制限酵素断片長多型法による遺伝子多型の分析により、被検者の遺伝子型は主に4種類のハプロタイプ(bbaaTT、bbAaTT、BbAaTt、bbAATT)からなっていることが明らかとなった。ビタミンD受容体遺伝子ハプロタイプは骨密度と相関し、さらに1α-hydroxy vitamin D3投与による骨密度の上昇度とも相関していると報告されている。投擲選手には長距離走者や一般学生と異なり、高い骨密度と相関しているbbaaTTハプロタイプの出現比率が高く、低い骨密度と相関しているBbAaTT、bbAATTハプロタイプの出現比率が低い特徴がみとめられた。ミトコンドリア遺伝子については、酸化的リン酸化系の酵素群をコードするミトコンドリアDNA転写調節部位(D-loop領域)について、その塩基配列の多型を調べ、一流長距離ランナーに特異な多型が存在するか否かを検討した。D-loop領域には多くの多型が存在し、個人間でばらつきのあることが確認され、興味深いことに、一流長距離ランナーで変異数が多い傾向が認められた。:これらの結果は、特定の遺伝的要素を持った者が、特定のスポーツ競技において活躍している可能性を示唆する分子遺伝学的な証拠と考えられる。
非弾性トンネルスペクトル及び変位電流法による有機2分子間の接合と電子移動の解析

本研究では、大きな自発分極を持つ分子のヘテロ2分子膜及び電子供与・受容性基を有する分子の2分子膜を分子配向制御が可能な交互積層LB法により作製した。そして、分子個々の接合を形成し非弾性トンネルスペクトル法(IETS)、変位電流法により、電気的に2分子膜の分子接合の状態評価を行った。1.自発分極を有する分子のヘテロ2分子膜のIETSによる評価自発分極を持つ分子として、アラキン酸(C20)とオクタデシルアミン(ODA)を用い、2分子接合膜を形成した。この分子接合の電子的接合状態を評価するために、ポリイミドLB膜をトンネル層として、単分子膜,2分子接合膜のIETSの測定を行った。その結果、2分子接合膜では、単分子膜とは異なったスペクトルを得る事ができ、分子膜界面での電荷の移動が示唆された。また、熱刺激変位電流法によってもこの接合を確認している。2.電子供与・受容性分子の2分子膜接合の電子移動現象の評価電子供与・受容性分子として、ポルフィリンポリイミド(PORPI)とカプトン型ポリイミド(PI)を選び、2分子接合膜を形成した。この2分子膜間の電子移動現象を調べるため、2分子膜間の光電位の測定を行った。その結果、2分子膜間の電子移動現象を検出する事ができた。また、分子膜内の電子移動現象に対して、その移動過程の評価・検討を行った。
内陸地震断層における基盤変動と地表変形の応答関係

活動性が特に大きいと考えられている下記断層について、各断層の特性に応じた研究法を用い研究課題の解明を多角的に行なった。上韮生川断層/跡津川断層:前者は現位置より深部で形成された断層で、基盤の変位過程を知る上で重要である。解析の結果変位累積は転移モデルで説明されることが明かとなった。一方跡津川断層はほぼ同規模の右横すべり活断層で、地下15kmから地表にかけて動いている。前者との対比により基盤と表層での変位の相違と対応関係を知ることができる。中央構造線:紀伊半島西部で同断層の深部構造を、即存の地震波反射法断面図を用いて解析し、地表調査と対比して、深部と表層の変位の関連を求めた。深部では低角逆断層であるものが表層では高角断層となり、変位も水平成分をも伴う複雑な動きを示すことが分かってきた。温見断層:濃尾地震に伴って変位した部分を含めその延長部を調査した。破砕帯の幅、破砕様式、地形への表現を調査し、本断層が南西側上昇成分をもった左横すべり断層であることを明かにすると共に、地震時の変位センスがこれと調和的であるとの結論を得た。深溝断層:東南海及び三河地震に伴い変位した地点を調査し、花崗岩質基盤、固結堆積層、未固結堆積層における変位と変形様式の相違を検討した。三者の相違は変位様式、被害状況に顕著に反映されている。山梨県東部断層群:空中写真判読によるマイクロニアメントと露頭の対比を広域にわたって実施し、その分布、実在断層との関連を求め、深部では一本の断層が表層においては多数の小断層として広範囲に分布して現れることが分かった。これに基づいて推定震度分布図を作成した。富士川断層:富士宮地区において空中写真解析、現地調査を行なうと共にその延長部駿河湾断層を「しんかい2000」により探査し、両者の関連を求めた。
固液界面での分子ダイナミクスに基づく電気化学的な自己報告型遺伝子検出デバイス

遺伝子発現に基づく新規環境診断技術の開発のため、簡便・迅速・高感度な遺伝子検出技術が求められている。本研究では、遺伝子検出後に信号が増加する"signal-on"型の遺伝子検出用電気化学デバイスの開発を目指した。そのため、電気化学信号発生団としてフェロセン、信号抑制団としてβ-シクロデキストリンを両端に有するプローブを開発した。このプローブは、ターゲット認識前はプローブ構造が柔軟なため両団が弱い内包錯体を形成して信号が抑制されており、認識後は二重らせんが形成されプローブ構造の剛直化による錯体解離が起こり、その結果信号が回復して認識の有無を知らせる。このプローブを用いて、バルク溶液中でのターゲットDNAとのハイブリッド形成によるフェロセン酸化還元信号の増加が観測された。また本年度は、耐熱・耐薬品性に優れたセラミックス基板を用いて、マイクロ電極アレイを作製した。本研究では、当初使用を検討していたガラス基板よりも耐熱・耐薬品性に優れたセラミックス基板を使用した。このアレイの金電極表面上に、20nLの遺伝子プローブ溶液を塗布してプローブの固定化を行った。この際の塗布は、本研究を通じて開発したピッチ可変型アレイスポッタを用いて行った。セラミックス基板は従来電極表面に分子を固定化するのに向いておらず、従ってセンサ用電極として利用されて来なかったため、電極表面のセンサ用電極としての最適化に技術的課題があった。本研究を通じてこれを克服し、その結果、複数の異なる微小遺伝子センサを高集積アレイ状に有する遺伝子センサアレイの構築に成功した。また、特定の遺伝子に対する電気化学的応答の観測にも成功した。このようにして、"signal-on"型の遺伝子検出システムの構築と、セラミックスデバイスに基づく簡便・迅速な一次スクリーニング技術としての遺伝子センサアレイチップの開発を推進することができた。電気化学信号発生団としてフェロセン、信号抑制団としてβ-シクロデキストリンを両端に有するプローブを開発した。このプローブは、ターゲット認識前はプローブ構造が柔軟なため両団が弱い内包錯体を形成して信号が抑制されており、認識後は二重らせんが形成されプローブ構造の剛直化による錯体解離が起こった結果信号が回復することで、認識の有無を知らせる。このプローブを用いて、バルク溶液中でのターゲットDNAとのハイブリッド形成によるフェロセン酸化還元信号の変化を電気化学的に観測した。プローブDNAのみを含む測定溶液では、0.3V付近から電流値の上昇が見られ0.4V付近で定常電流値に達するS字曲線が得られた。一方で、プローブDNAとターゲットDNAとを含む溶液では、0.25V付近から電流値の上昇が見られた。これは、内包錯体を形成し酸化還元反応が抑制されていたフェロセンでは酸化還元電位が正にシフトしていたところ、ハイブリッド形成後は錯体が解離したためにシフト前の電位に戻ったためと考えられる。ハイブリッド形成前後で電流値上昇(0.3Vでは約5倍上昇)が観測され、今回開発したプローブDNAにより、従来課題であった"signal-on"型の自己報告型センシングが可能となったと言える。同時に遺伝子センサのデバイス化の基礎検討も行った。蒸着した金薄膜をエッチングして作製したガラス基板および配線パターンを同時焼成して作製したセラミックス基板に関して、遺伝子センサアレイに向けた微小電極アレイチップ化を検討した。ガラス基板においてセンサアレイチップを作製し、配列選択的な遺伝子検出が可能であることを明らかにした。一方で、ガラス基板と比較して、セラミックス基板は耐熱性・耐薬品性に優れており、また集積化にも適していることが分かった。この成果を踏まえることで、複数遺伝子の迅速・簡便な同時検出が可能となると期待される。
プロテオミクスによるタンパク質翻訳後修飾解析を用いた肝癌の治療抵抗性の解明

肝細胞癌(HCC、以下、肝癌)は、たとえ肝切除やRFAなどの根治的治療を行っても、年率15-20%と高率に再発し、依然として予後不良の癌腫である。そこで肝癌細胞の治療抵抗性に焦点を当て責任分子群を同定し、新たな治療戦略を構築することを目的とした。具体的には、ヒト肝癌細胞株を用いて遺伝子・蛋白質発現解析に加え、翻訳後修飾の評価による蛋白質機能解析を行い、細胞骨格や分子シャぺロンに分類される蛋白質群が治療死抵抗性を担う可能性を示した。その中でも核小体に豊富に存在する燐酸化蛋白質であるNucleophosmin (NPM)が燐酸化を介して治療抵抗性に関与する可能性を、肝癌細胞株やヒト肝癌組織を用いた解析から明らかにした。本研究では、肝癌細胞の有する「治療抵抗性」の分子基盤の一つである"細胞死抵抗性"を担う責任分子群を同定することを目的とする。ここで強調すべき点は、責任分子群の同定には、遺伝子・蛋白質発現に加え、蛋白質機能解析が不可欠であることである。その意味から、機能を制御する翻訳後修飾、とりわけ燐酸化の解析は重要である。そこでヒト肝癌細胞株に細胞死を誘導するために酸化ストレス刺激を加え、刺激前後でcell lysateを調整して2次元デイファレンシャル電気泳動を施行した。さらに蛋白質発現や燐酸化を解析するために特殊染色を行い、蛋白質スポットから質量分析装置にて燐酸化蛋白質を同定した。複数の細胞株では酸化ストレス刺激に対する感受性が異なっていたが、最も抵抗性を示すHepG2細胞において刺激後に燐酸化スポットが約30個認められた。燐酸化が有意に変動する蛋白質の内訳は、転写因子、細胞骨格や分子シャペロン関連蛋白質であり、2次元電気泳動+ウエスタンブロットにてそれらの変化を確認した。また、刺激前後で遺伝子発現の網羅的解析を行ったところ、刺激後1時間、3時間で1.5倍以上の発現亢進を認めた遺伝子数はそれぞれ約600個、約700個であり、それらには細胞増殖、細胞死、IFN作用を担うシグナル伝達分子が含まれていた。さらにネットワーク解析から、酸化ストレスにより燐酸化が変化することで機能が変化した蛋白質が、細胞死関連遺伝子を誘導することが示された。一方、ヒト肝癌組織とその非癌部組織を対象に同様の解析を行ったところ、癌部で非癌部に比べて燐酸化が増強あるいは減弱する蛋白質が約30種類同定された。肝癌細胞株での結果との対比から、共通した複数個の蛋白質が、肝癌細胞の細胞死抵抗性の候補責任分子として絞り込まれた。現在、siRNAを用いてこれら候補責任分子の機能的重要性を検討している。本研究では、肝癌細胞の治療抵抗性の分子基盤の一つである"細胞死抵抗性"を担う責任分子群を同定することを目標としている。責任分子群の同定には、遺伝子・蛋白質発現に加え、蛋白質機能解析が不可欠であるが、我々は機能を制御する翻訳後修飾、とりわけ燐酸化に注目した。具体的には、肝癌細胞株に細胞死を誘導する酸化ストレスを加え、刺激前後のcell lysateを持ち2次元デイファレンシャル電気泳動を施行し、蛋白質スポットから質量分析装置にて燐酸化蛋白質を同定している。酸化ストレスに最も抵抗性を示したHepG2細胞では、刺激後に有意に変動する燐酸化スポットが約30個認められ、多くは細胞骨格や分子シャペロン関連蛋白質であった。その中でnucleophosmin(NPM)に注目した。NPMは核小体に豊富に存在する燐酸化蛋白質で、細胞増殖、アポトーシスに関与するとされている。我々はネットワーク解析から、NPMが細胞死誘導遺伝子の発現を抑制していることを明らかにした。そこでHepG2細胞でsiRNAにより発現を低下させると、細胞死抵抗性が減弱した。また、強制発現系クローンでは野生型に比べて細胞死刺激に"より"抵抗性を示した。一方、ヒト肝癌組織では、NPMならびにp-NPM(燐酸化NPM)は非癌部に比べ発現が有意に亢進し、p-NPMは腫瘍径の大きい例、多結節例、単結節周囲増殖型/多結節癒合型で癌部の発現が高い傾向にあった。さらにp-NPM高発現症例では、再発までの期間が有意に短縮されていた。このようにNPM、p-NPMとヒト肝癌組織の形質との間に密接な関連が示唆された。今後、NPM以外で燐酸化が有意に変動している蛋白質を対象とし、機能制御や肝癌組織における発現動態を解析し、細胞死抵抗性を担う候補責任分子の更なる絞り込みを行い、それら分子群の階層性を明らかにしていく予定である。

本研究では、肝癌細胞の治療抵抗性の分子基盤の一つである"細胞死抵抗性"を担う責任分子群を同定することを目標としている。責任分子群の同定には機能解析が不可欠であるが、我々は機能を制御する翻訳後修飾、とりわけ燐酸化に注目した。そこで、肝癌細胞株に細胞死を誘導する酸化ストレスを加え、刺激前後のcell lysateを持ち2D-DIGEを施行し、蛋白質スポットから質量分析装置にて燐酸化蛋白質を同定した。酸化ストレスに最も抵抗性を示したHepG2細胞では、刺激後に有意に変動する燐酸化スポットが約30個認められ、多くは細胞骨格や分子シャペロン関連蛋白質であったが、その中でnucleophosmin(NPM)に注目した。NPMは核小体に豊富に存在する37kDaの燐酸化蛋白質で、(1)細胞周期関連分子の抑制を介して細胞増殖の亢進する、(2)p53の活性化を抑えアポトーシスを抑制する、(3)癌細胞には高発現で癌遺伝子としての働きが示唆されている等の報告がある。さらにネットワーク解析から、NPMが細胞死誘導遺伝子の発現を抑制することを明らかにした。そこでHepG2細胞にsiRNAを導入してNPMの発現を抑制すると、細胞死刺激であるH2O2に対する抵抗性が減弱した。次に内因性のNPMの発現が低い肝癌細胞株Hep3B細胞を見出し、ヒトNPM発現ベクターを導入することでNPM強制発現Hep3B細胞株(以下Hep3B-NPM)を樹立した。H2O2以外の細胞死刺激として、肝癌の分子標的治療薬であるsorafenibにて刺激すると、Hep3B-NPM細胞ではNPMの燐酸化は抑制され、生細胞は減少した。NPMの燐酸化が細胞死抵抗性を担うか否かを解析するために、現在NPMの燐酸化部位を変異させた非燐酸化型NPMベクターを作成し、非燐酸化型NPMを恒常的に発現するHep3B細胞株の樹立を行っている。一方、Hep3B-NPM細胞は親株Hep3B細胞に比べて増殖が早く、NPMが細胞増殖にも関与していることが確認された。そこでHep3B細胞とHep3B-NPM細胞をNOD/SKIDマウスの皮下に注射すると、40日後、親株であるHep3B細胞に比べて、Hep3B-NPM細胞は有意に大きな腫瘍塊を形成した。本研究では、「肝癌細胞の治療抵抗性の分子基盤」の1つである細胞死抵抗性を担う責任分子(群)を同定することを目標としている。責任分子の同定には機能解析が不可欠であるため、機能を制御する翻訳後修飾、特に燐酸化に焦点を当て、網羅的プロテオミクス分子差異解析から、細胞死誘導刺激下の肝癌細胞株で有意に燐酸化が変化する蛋白質を約30種類同定した。その中で、核小体に豊富に存在する37kDaの燐酸化蛋白質nucleophosmin(NPM)に注目し、1)発現を減弱させると細胞死抵抗性が低下すること、2)分子標的治療薬により燐酸化は低下し、肝癌細胞はアポトーシスに陥ること、3)強制発現により増殖速度が亢進することなどを明らかにした。今回、ヒト肝癌組織23症例(HBV 5例、HCV13例、非B非C 5例)でNPMの発現を検討した。NPMならびにp-NPM(燐酸化NPM)は、癌部において非癌部より発現が有意に亢進しており、なかでもp-NPMは、腫瘍径の大きい例、多結節例、単結節周囲増殖型/多結節癒合型で癌部での発現が高い傾向があった。加えてNPMは、非癌部肝組織の活動性の高い例において有意に高値であり、p-NPM高値例は、再発までの期間が有意に短縮されていた。このようにNPM、とりわけp-NPMはヒト肝癌組織の形質と密接な関連があることが示唆された。
力覚を伴う操作が可能な実体験追求型MRの開発と実験教育への応用

本研究は,電子回路やロボット製作などの「ものづくり」の能力を育てるための実験教育を,高能率かつ安全に遂行することを可能にする新しい複合現実(MR)技術となる適応的実体験追求型MR (adaptive and experience-oriented mixed reality; AXMR)を開発することを目的とする。開発する技術は,次の(1)ー(4)を実現し,理工系分野の教育で必須となる実験学習に必要な専門的かつ幅広い用途に活用できる点で,新規制と有用性を有している:(1)装着する機器がほとんどなく,学習や実験を妨げない;(2)裸眼で見た立体映像に対して,実際に操作することと同等の体験ができる;(3)利用者(学習者)の実験環境に適応することができる;(4)利用者の要望に応じて,発展学習が可能となる。前年度までの研究では,主に(1)及び(2)の開発研究を行った。本年度においては,これらの技術に(3),(4)を組み込むことによって,システム全体を完成させて,実験教育支援システムとしての実用性を向上させる研究を行った。具体的には,前年度までに構築したシステムに,3Dスキャナによる立体データの取得する機能,及び3Dプリンタにより立体コンテンツから実体モデルを造形する機能を組み込むことによって,立体映像と実体モデルを組み合わせた「ものづくり」実験教育を可能とするMRを構築した。また,(2)の技術として開発した筋電センサ付端末による無線通信によって,他の機器の制御を試み,本システムの使いやすさを向上させる研究を行った。さらに,本システムをネットワーク化し,実験教育の遠隔化や多人数の実験学習への対応を検証する実験を継続して行っている。本研究は,電子回路やロボット製作などの「ものづくり」の能力を育てるための実験教育を,高能率に遂行することを可能にする新しい複合現実(mixed reality; MR)の技術となる適応的実体験追求型MR (adaptive and experience-oriented MR; AXMR)を開発することを目的とする。提案する技術は,以下(1)ー(4)の全てを可能にする点において,これからの理工系分野の実験教育に必要な幅広い用途に活用できる点で,これまでにない新しいものである;(1)準無装着型の実現ー装着する機器がほとんどなく学習や実験を妨げない。(2)生体情報に基づく力覚提示ー裸眼で見た立体映像に対して実際に操作する体験ができる。(3)利用環境への適応ー利用者(学習者)の実験環境に適応することができる。(4)利用者の要望への適応ー利用者の要望に応じて発展学習が可能となる。平成28年度の研究では,提案するAXMRを用いた「ものづくり」実験教育の支援システムを効率良く開発するために,上記(1)及び(2)の技術要素に含まれる動作認識と実時間立体映像処理に関する研究を行った。そのために,裸眼立体ディスプレイで表示する映像コンテンツの作成を行うと共に,手の動作認識を可能にするシステムの開発を行った。この研究では,汎用のモーション・センサを導入し,ソフトウェア開発することによって,高性能の無装着型の動作認識装置を製作した。この技術により,3次元空間中において動作を行っている手と立体映像コンテンツの動きを同期させ,かつ位置合わせを可能にするための実時間立体映像処理を可能となった。さらに,力覚入力デバイスを導入して,対象物の力覚のデータベースを作成した。これらの研究成果は,次年度の研究で上記(1)及び(2)を完成させるために必要となる。提案するAXMRにおける技術要素のうち,平成28年度に研究開発することを目的としていた「(1)準無装着型の実現」及び「(2)生体情報に基づく力覚提示」に関わるハードウェアおよびソフトウェアの開発をほぼ予定どおりに完成できている。また,裸眼立体ディスプレイに関しては,当初の計画で導入予定であった機種の入手が困難になるという問題が生じたが,機種変更とソフトウェアの自作により設計仕様を満たすことができ,ほぼ計画通りの成果が得られた。さらに高性能なグラフィックワークステーションを組み合わせることにより,性能面で当初の仕様を上回るシステムを構築することができた。本研究は,電子回路やロボット製作などの「ものづくり」の能力を育てるための実験教育を,高能率に遂行することを可能にする新しい複合現実(MR)技術となる適応的実体験追求型MR (adaptive and experience-oriented mixed reality; AXMR)を開発することを目的とする。本研究で提案する技術は,以下(1)ー(4)の全てを可能にする点において,将来の理工系分野の実験教育に必要な幅広い用途に活用できる点で,新規性と有用性を有している;(1)準無装着型の実現ー装着する機器がほとんどなく学習や実験を妨げない。平成29年度の研究では,前年度の実時間立体映像処理の技術と力覚データベースの開発研究を発展させて,「(2)生体情報に基づく力覚提示」の開発を行った。具体的には,筋電センサ付端末を,汎用の小型マイクロ・コントローラ(マイコン)に銀板電極を接続することにより,準無装着型の力覚提示デバイスを製作した。

この力覚提示デバイスを,前年度の研究で開発したシステムに組み込むことによって,実験教育において利用者の妨げとなるような従来型の装置を装着することなく,手に力覚を伴う動作と同等の体験ができるシステムを構築した。以上の研究により,「(1)準無装着型の実現」及び「(2)生体情報の力覚提示」を実現するシステムを構築することができ,さらにその有用性を確認するための評価実験を行っている。前術の「(2)生体情報に基づく力覚提示」の開発研究において,準無装着型の力覚提示システムを製作し,さらにソフトウェア開発を行うことにより,その有用性を確認するための実験をほぼ計画どおりに進めることができている。また,構築したシステムの強度や安全性に関する問題が生じることが予想されていたが,回路基板や配線の固定方法を改善するなどの改良を行うことによりこれら問題点をほぼ解決しており,実用性の向上のための研究を順調に進めることができた。本研究は,電子回路やロボット製作などの「ものづくり」の能力を育てるための実験教育を,高能率かつ安全に遂行することを可能にする新しい複合現実(MR)技術となる適応的実体験追求型MR (adaptive and experience-oriented mixed reality; AXMR)を開発することを目的とする。開発する技術は,次の(1)ー(4)を実現し,理工系分野の教育で必須となる実験学習に必要な専門的かつ幅広い用途に活用できる点で,新規制と有用性を有している:(1)装着する機器がほとんどなく,学習や実験を妨げない;(2)裸眼で見た立体映像に対して,実際に操作することと同等の体験ができる;(3)利用者(学習者)の実験環境に適応することができる;(4)利用者の要望に応じて,発展学習が可能となる。前年度までの研究では,主に(1)及び(2)の開発研究を行った。本年度においては,これらの技術に(3),(4)を組み込むことによって,システム全体を完成させて,実験教育支援システムとしての実用性を向上させる研究を行った。具体的には,前年度までに構築したシステムに,3Dスキャナによる立体データの取得する機能,及び3Dプリンタにより立体コンテンツから実体モデルを造形する機能を組み込むことによって,立体映像と実体モデルを組み合わせた「ものづくり」実験教育を可能とするMRを構築した。また,(2)の技術として開発した筋電センサ付端末による無線通信によって,他の機器の制御を試み,本システムの使いやすさを向上させる研究を行った。さらに,本システムをネットワーク化し,実験教育の遠隔化や多人数の実験学習への対応を検証する実験を継続して行っている。これまでの研究で開発した実時間立体映像処理の技術と力覚データベースを用いて,「(1)準無装着型の実現」及び「(2)生体情報に基づく力覚提示」に関する技術を発展させる。具体的には,実験の妨げとなる装置を装着することがなく,手に力覚を伴う動作と同等の体験ができるシステムを開発する。これにより,力覚を伴い対象物を動かしたり操作することと同等のリアルな体験ができるシステムを構築し,上記(1)及び(2)を完成させる。
有機単結晶エレクトロニクス

本研究は、ドーピングによるpn制御のバンド伝導有機半導体単結晶への適用を世界で初めて行ない、ドーピング有機単結晶太陽電池等の、新しい有機単結晶デバイスの動作を実証し、「有機単結晶エレクトロニクス」の基礎を構築することを目的とする。昨年度、正孔に対してバンド伝導を示すルブレン単結晶に、アクセプターとして働く、酸化モリブデンと塩化鉄のドーピングを行い、ホール効果によって、ドーピングによって発生したキャリア濃度、移動度を測定して、ドーピングイオン化率がそれぞれ37%、24%の非常に高い値を示すこと、および、ドーピングによってルブレン単結晶にキャリアトラップやキャリア散乱の原因となる欠陥が発生することを明らかにした。また、ルブレン単結晶の表面のみに酸化モリブデンをドーピングした場合、ドーピングに伴う欠陥が発生しないことを確認し、ホール効果の温度依存性から、ドーパントのイオン化エネルギーを約30 meVと決定できた。これは、室温ではほぼ100%のアクセプタードーパントが正孔を発生していることを意味し、シリコンと同等の100%のドーピング効率が、有機単結晶においても可能なことを示している。さらに、ルブレン単結晶基板にドーピングによってpnホモ接合を作り込み、太陽電池として動作させることに、世界で初めて成功した。ルブレン単結晶の励起子の拡散距離は2.7マイクロメーターと非常に長く、47%の励起子をpn接合に収集できることを意味している。また、超高速移動度をもつ有機半導体単結晶膜の水平交互多層膜接合を作製し、キャリアを0.14 mmの長距離で水平方向に取り出すことによって、太陽電池として動作させることに世界で初めて成功した。これらの太陽電池は、これまで有機太陽電池に必須であったバルクヘテロ接合が不要な、新コンセプト有機太陽電池と位置づけることができる。バンド伝導性ルブレン単結晶にアクセプタードーピングして、キャリア濃度、移動度をホール効果によって観測することに成功し、アクセプタードーパントのイオン化エネルギーが約30meVで、室温でドーピング効率100%を達成する可能性を示すことができた。これは、有機単結晶エレクトロニクスを構築するために、非常に重要な結果である。また、有機単結晶太陽電池、水平交互有機結晶多層接合が、太陽電池として動作することを確認できた。これらの太陽電池は、これまで有機太陽電池に必須であったバルクヘテロ接合が不要な、新しいコンセプトに基づく有機太陽電池で、有機単結晶エレクトロニクスの具体的デバイス例とみなせる。以上の結果が得られているため、当初の計画以上に進展していると判断した。これまでの結果を踏まえて、今後、以下の研究を推進する。正孔、電子双方に対してバンド伝導を示す可能性のある、フッ素化ルブレンを合成し、ドーピングによって単独のバンド伝導性有機単結晶がp型、n型両極性となることをホール効果から実証する。ホール効果の温度依存性から、ドーパントの本質的なイオン化エネルギーを決定し、ドーピングによって発生する欠陥の濃度をポストアニール等によって減少できることを示す。ドーピング勇気単結晶基板を結晶成長技術によって作製する方法を確立する。さらに、フッ素化ルブレン単結晶基板が、長距離励起子拡散、単結晶基板上に作り込んだpnホモ接合による高効率励起子解離を示すことを実証し、実用的な効率を示す有機単結晶太陽電池を実現する。また、ドーピングした有機半導体単結晶膜の交互多層膜接合を作製し、キャリアを水平方向に取り出すことによって、実用的な効率を示す有機太陽電池を実現する。これらの太陽電池は、これまで有機太陽電池に必須であったバルクヘテロ接合が不必要なため、新コンセプト有機太陽電池と位置づけることができる。最終的に、「有機単結晶エレクトロニクス」の基礎を構築することを目指す。

これは、有機単結晶エレクトロニクスを構築するために、非常に重要な結果である。また、有機単結晶太陽電池、水平交互有機結晶多層接合が、太陽電池として動作することを確認できた。これらの太陽電池は、これまで有機太陽電池に必須であったバルクヘテロ接合が不要な、新しいコンセプトに基づく有機太陽電池で、有機単結晶エレクトロニクスの具体的デバイス例とみなせる。以上の結果が得られているため、当初の計画以上に進展していると判断した。本研究は、ドーピングによるpn制御のバンド伝導有機半導体単結晶への適用を世界で初めて行ない、ドーピング有機単結晶太陽電池等の、新しい有機単結晶デバイスの動作を実証し、「有機単結晶エレクトロニクス」の基礎を構築することを目的とする。昨年度、電子輸送性のナフタレン誘導体(NTCDA)単結晶において、単結晶基板に平行な横方向に、光生成した電子を数十マイクロメーターに達する距離を輸送して取り出すことに成功した。単結晶表面の電極間距離を変化させた際に、電子の飛程を越えた距離で光電流が急減する実験結果から、電子輸送可能距離である飛程を30マイクロメーターと決定できた。さらに、NTCDAの電子移動度が10-2 cm2/Vsであることから、1 cm2/Vs程度の高移動度有機半導体結晶を用いれば、1 mm程度の飛程が可能であると予測できた。この予想に基づき、電子移動度(1.7 cm2/Vs)とホール移動度(43 cm2/Vs)を示す2種の有機半導体結晶性薄膜を用い、ミリメータオーダーに達する電子飛程0.2 mm、ホール飛程0.4 mmを実測できた。この結果は、本研究の目標である水平交互積層型有機単結晶太陽電池が実際に作製可能であることを強く示唆している。また、正孔に対してバンド伝導を示すルブレン単結晶に、アクセプターとして働く塩化鉄を、超低速共蒸着法によって1 ppmの超低濃度でドーピングすることに成功し、ドーピング有機単結晶作製の基本技術を確立した。以上の結果は、「有機単結晶エレクトロニクス」の基盤となる成果である。バンド伝導性ルブレン単結晶にアクセプタードーピングできる結果は、ドーピング有機単結晶における、キャリア濃度、移動度をホール効果によって実測できることを強く示唆しており、これまで未開拓であった、ドーピング有機単結晶の性質を、次年度から詳細に探索できる。また、有機半導体単結晶膜において、マクロなミリメーターオーダーの飛程が、電子、ホール両方で観測できたことは、水平交互有機結晶を持つ多層接合有機単結晶太陽電池の実現に、大きく近づいたことを意味する。これまでの結果を踏まえて、今後、以下の研究を推進する。正孔、電子双方に対してバンド伝導を示す可能性のある、フッ素化
神経変性を伴うリソソーム蓄積症におけるシナプス病態の解明と治療への応用

1.SDモデルマウス発症前後の脳のトランスクリプトーム解析を行い、免疫・炎症及びファゴサイトーシス関連遺伝子群の発現亢進と、発症前からの末端GlcNAcを認識する補体経路活性化レクチンmRNAの発現増大を見出した。2.TSDとSDに対する新規脳内酵素補充療法を開発する目的で、Hexβ鎖の一部のアミノ酸をα鎖型に置換し、GM2分解能をもつ改変型HexBを作製し、SDマウス(10週齢)の脳室内補充(1mg/kg体重1回投与)を行い、投与1週後に各脳組織における新規人工蛍光基質HMDER-β-GlcNAcの分解活性と、蓄積糖脂質の質量顕微鏡によるin situイメージングに成功した。また脳内プロテアーゼ抵抗性を示す改変型HexBの脳室内投与により、寿命の延長と運動機能低下発症の遅延などの有効性が認められた。3.TSD患者iPS細胞株から、京都大iPS細胞研の井上治久教授らが開発した方法に従い、大脳皮質ニューロンの分化誘導系を確立し、同ニューロンにおけるGM2蓄積と、改変型HexB補充による欠損酵素活性回復と蓄積GM2の減少などの治療効果が確認された。またヒトCathepsin A(CTSA)の欠損に基づき、末端シアル酸分解活性をもつNeuraminidase-1(NEU1)との同時活性低下、末端シアル酸含有糖鎖の脳内蓄積及びミオクローヌスなどの中枢神経症状を示すGalactosialidosisについても、患者iPS細胞由来神経細胞への分化誘導系の構築と新規CTSA欠損症モデルマウスの作製に成功しており、進行性ミオクローヌスの発症機構の解明や治療法開発における有用性が示された。26年度が最終年度であるため、記入しない。神経変性と中枢神経症状を伴うリソソーム蓄積症として、リソソーム性β-ヘキソサミニダーゼA(HexA, αβヘテロ二量体)の遺伝的欠損により、GM2ガングリオシド(GM2)の脳内過剰蓄積を伴うTay-Sachs病(TSD)とSandhoff病(SD)、またカテプシンA(CTSA)の遺伝子変異が原因で、ノイラミニダーゼ-1(NEU1)の同時欠損と末端シアル酸含有糖鎖蓄積を伴うガラクトシアリドーシス(GS)を対象とし、これらの疾患におけるシナプス病態の解明と新規治療法開発への応用を目的として研究を進めた。H25年度は、GM2分解能とプロテアーゼ耐性を示す改良型HexB(ββホモ二量体)を高発現するCHO細胞株を樹立し、その培養上清から精製したマンノース-6-リン酸(M6P)含有糖鎖付加型HexBをSDモデルマウスの脳室内投与することにより、脳実質内に移行し、歩行障害発症の遅延と寿命を延長させることに成功した。また連携研究者が開発した新規人工蛍光基質(Rhodol β-GlcNAc)及び酸性pH活性化プローブ(RhPM)を用い、投与酵素の組織内イメージングと、質量顕微鏡を用いるイメージングMSによる蓄積基質の分布・変動解システムを構築した。さらにTSD患者iPS細胞から、Neurosphereを経る神経系細胞の分化誘導培養系を構築し、接着培養開始2週後に神経前駆細胞及び成熟神経細胞における顕著なGM2の蓄積を明らかにし、高M6P付加型組換えヒトHexAの補充時に、カチオン非依存M6Pレセプター(CI-M6PR)を介した細胞内取り込みとリソソームへの輸送及び蓄積GM2の減少を評価できた。一方、日本人GS症例で同定されているスプラシング異常誘導型変異をコンディショナルに誘導できる変異ノックインマウスを作製し、ホモ接合体を獲得した。今後、病態モデルとしての妥当性と組換えCTSAによる治療効果の評価に用いる予定である。

従来有効な治療法がない、脳内GM2ガングリオシド蓄積と中枢神経症状を伴うβ-ヘキソサミニダーゼA(HexA,αβヘテロ二量体)欠損症(Tay-Sachs病及びSandhoff病)に対する新規治療薬候補として、本来GM2分解能を持たないβ鎖遺伝子を改変し、その分解能とプロテアーゼ耐性の改良型HexB(ββホモ二量体)の創製と精製に成功し、Sandhoff病モデルマウスの脳室内に一回投与することにより、運動障害発症の遅延と寿命を延長させることに成功した。また連携研究者が開発した、Hexに対する新規人工蛍光基質や酸性pH活性化蛍光プローブによる改変型HexBの標識体を用いて、補充した酵素の脳内分布イメージングに成功した。また質量顕微鏡を用いてモデルマウスの脳内に蓄積するGM2及びasialoGM2のイメージングシステムを構築できた。日本人種に多いカテプシンA(CTSA)欠損症患者で同定されている第7エキソンスキッピング誘導する塩基置換をコンディショナルに導入したマウスを作製し、病態モデルの候補となる劣性ホモ接合体を獲得できたため。1)H25年度に創製できた、HexA欠損に基くGM2蓄積症(Tay-Sachs病とSandhoff病)治療用の改良型HexBをモデルマウスの脳室内や、患者iPS細胞から分化誘導した神経系細胞に投与する前後で、補充酵素の各脳領域や神経系細胞内での分布や蓄積基質の変動をイメージングシステムにより解析するとともに、シナプス形成因子や神経炎症関連遺伝子の発現変動との相関を解析する。得られる知見から、基質蓄積から神経変性に至る要因を、リソソーム機能、シグナル伝達経路や細胞間相互作用等の観点から解析し、新たな治療ターゲットを解明する。2)日本人カテプシンA患者の90%以上に認められる第7エキソンスキッピングを誘発する塩基置換をコンディショナルに導入した変異ノックインマウスを作製できたので、本マウスの劣性ホモ接合体が、中枢神経症状の発症を含め、日本人症例の病態モデルとしての有用性を評価するとともに、治療用組換え酵素の有効性を検討する。