hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
建築材料のランダム入射吸音率の実用的評価法の開発

本研究は,建築材料のランダム入射吸音率の実用的評価法の開発を目的とする.具体的には,アンサンブル平均による建築材料の吸音特性測定法(EA法)による吸音特性,すなわち,EA法によるランダム入射時のノーマル音響インピーダンスを用いたランダム入射吸音率の評価手法を構築し,従来法としてJISやISOで規格化されている残響室法や音響管法による吸音率との比較を通して,適用範囲を明らかにすることを目標とする.平成30年度は,研究初年度として以下を実施した.1.各種吸音測定に関する実験環境の整備と測定:まず,EA法に関し,受音センサとして使用する音圧-粒子速度センサ(puセンサ)の校正法を確認し,両研究機関において,同センサを用いる吸音測定の実施環境を構築した.また,音響管法について,広帯域の測定を行うため,直径の異なる音響管として,太管および細管を製作した.多孔質材であるグラスウールを対象とした既往の研究による回帰式と音響管法による吸音率との比較により,製作した音響管の基本性能を明らかにした.残響室法吸音率の測定で使用する残響時間の計測のため,インパルス応答の測定システムを整備した.さらに,これらの3種の吸音測定法を用い,岩綿吸音板,化粧石膏ボード,カーペットといった一般に使用される建築材料の吸音率を求めた.2. EA法による吸音率と音響管法による垂直入射吸音率の比較:上記の検討と並行して,試行的に4種の材料を対象に,EA法による吸音率と音響管法による垂直入射吸音率を比較した.両者の測定値に差は認められるものの,広帯域に渡り,それぞれの材料の特徴に応じて同様に測定値が変化することを確認した.研究体制も機能しており,改良の余地はあるものの,研究の基本となる各種吸音測定の実験環境の基礎を構築できているため.今後,引き継き,以下の検討を実施する予定である.1.音響管法・残響室法による吸音率とEAによる吸音率の比較(令和元年度)前年度に検討した建築材料からさらに対象を増やし,音響管法,残響室法,EA法によりそれぞれ吸音特性の測定を行う.EA法による吸音率を,音響管法による垂直入射吸音率ならびにランダム入射吸音率の近似値である残響室法吸音率と比較し,差異を定量化する.その際,それぞれの吸音測定法で生じうる測定誤差に関する考察も行い,誤差を最小限に抑えられるような対応策も検討する.なお,EA法による吸音率には,暫定的に,垂直入射時のノーマルインピーダンスから吸音率を求める手法と統計的処理を施す方法の2種を用いる.2.ランダム入射吸音率の算出式の適用範囲の明確化(令和元年度・2年度)1.での差異の定量化の結果をもとに,EA法によるランダム入射吸音率の算出式を検討し,評価法を構築する.一つの式で代表できない可能性もあることから,建築材料を局所作用性の材料とそれ以外に分類するなどし,材料の特性に応じた場合分け等を行い,設計者が使いやすいように適用範囲を整理する.さらに,1.以外の材料を用いた,算出式の精度検証も行う.本研究は,建築材料のランダム入射吸音率の実用的評価法の開発を目的とする.具体的には,アンサンブル平均による建築材料の吸音特性測定法(EA法)による吸音特性,すなわち,EA法によるランダム入射時のノーマル音響インピーダンスを用いたランダム入射吸音率の評価手法を構築し,従来法としてJISやISOで規格化されている残響室法や音響管法による吸音率との比較を通して,適用範囲を明らかにすることを目標とする.平成30年度は,研究初年度として以下を実施した.1.各種吸音測定に関する実験環境の整備と測定:まず,EA法に関し,受音センサとして使用する音圧-粒子速度センサ(puセンサ)の校正法を確認し,両研究機関において,同センサを用いる吸音測定の実施環境を構築した.また,音響管法について,広帯域の測定を行うため,直径の異なる音響管として,太管および細管を製作した.多孔質材であるグラスウールを対象とした既往の研究による回帰式と音響管法による吸音率との比較により,製作した音響管の基本性能を明らかにした.残響室法吸音率の測定で使用する残響時間の計測のため,インパルス応答の測定システムを整備した.さらに,これらの3種の吸音測定法を用い,岩綿吸音板,化粧石膏ボード,カーペットといった一般に使用される建築材料の吸音率を求めた.2. EA法による吸音率と音響管法による垂直入射吸音率の比較:上記の検討と並行して,試行的に4種の材料を対象に,EA法による吸音率と音響管法による垂直入射吸音率を比較した.両者の測定値に差は認められるものの,広帯域に渡り,それぞれの材料の特徴に応じて同様に測定値が変化することを確認した.研究体制も機能しており,改良の余地はあるものの,研究の基本となる各種吸音測定の実験環境の基礎を構築できているため.今後,引き継き,以下の検討を実施する予定である.1.音響管法・残響室法による吸音率とEAによる吸音率の比較(令和元年度)前年度に検討した建築材料からさらに対象を増やし,音響管法,残響室法,EA法によりそれぞれ吸音特性の測定を行う.EA法による吸音率を,音響管法による垂直入射吸音率ならびにランダム入射吸音率の近似値である残響室法吸音率と比較し,差異を定量化する.

その際,それぞれの吸音測定法で生じうる測定誤差に関する考察も行い,誤差を最小限に抑えられるような対応策も検討する.なお,EA法による吸音率には,暫定的に,垂直入射時のノーマルインピーダンスから吸音率を求める手法と統計的処理を施す方法の2種を用いる.2.ランダム入射吸音率の算出式の適用範囲の明確化(令和元年度・2年度)1.での差異の定量化の結果をもとに,EA法によるランダム入射吸音率の算出式を検討し,評価法を構築する.一つの式で代表できない可能性もあることから,建築材料を局所作用性の材料とそれ以外に分類するなどし,材料の特性に応じた場合分け等を行い,設計者が使いやすいように適用範囲を整理する.さらに,1.以外の材料を用いた,算出式の精度検証も行う.
乳癌検診デジタルマンモグラフィの被曝低減にむけた低線量化の検討

デジタルマンモグラフィを低線量化することを目標としているが、それを表示する画像処理法についても検討する必要があると考えらる。コンピュータラジオグラフィ(CR)マンモグラフィには、日本仕様とアメリカ仕様の画像処理方法が存在し、肉眼的印象はかなり異なる。これらの乳癌診断に対する診断能への影響を調べた。100例200枚のCRマンモグラフィを使用した。マンモグラフィ所見の内訳は、腫瘤14例、微細石灰化13例、腫瘤および微細石灰化1例、その他の所見17例(局所的非対称性陰影11例、構築の乱れ5例、局所的非対称性陰影および構築の乱れ1例)である。読影参加医師は、精度管理中央委員会の読影テストでAあるいはB判定を受け、乳がん検診の2次読影に従事している医師11名。読影モニタは、5Mモノクロ液晶モニタ(10bitグレースケール)2面で、輝度は450cd/cm2に設定した。読影時の条件として、読影環境は20lux以下の暗室、時間は無制限である。読影医師を日本仕様からアメリカ仕様、アメリカ仕様から日本仕様の順番に読影する2つのグループに無作為に分け、各々の読影の時期を3ヶ月以上あけた。所見の悪性確信度につきカテゴリー分類(カテゴリー15)、7段階確信度(1.確実に悪性ではない2.悪性でない可能性が高い3.おそらく悪性ではない4.悪性が疑われる5.おそらく悪性である6.悪性である可能性が高い7.確実に悪性である)、連続確信度(0100%)の3種類を記録した。感度・特異度は日本仕様81.0%、93.8%、アメリカ仕様81.6%、92.1%であり、両者には差は見られなかった。ROC解析でも曲線下面積は、日本仕様vs.アメリカ仕様=0.9519±0.0169vs.0.9382±0.0245(7段階)、0.9279±0.0203vs.0.9330±0.0213(連続確信度)と統計学的有意差は認められなかった。本研究の意義および重要性は、異なる画像処理でも乳癌診断の診断能は保たれることが示され、デジタルマンモグラフィを低線量化した際に表示する方法は、いずれでも問題ないことが示された。
真核細胞のDNA複製とチェックポイント制御の分子機構に関する共同研究

本研究課題においては、真核細胞のDNA複製の開始と制御について広い視点から研究を行ってきた結果、以下の成果を得た。1動物細胞のCdc7類似キナーゼ複合体の機能が、その複製と増殖に必須であることを、マウスES細胞を用いた遺伝学的実験により証明した。2 Cdc7キナーゼ複合体の特異的基質がMCM複合体であることを生化学的、遺伝学的に示し、そのリン酸化が、サリクリン依存性キナーゼと共役して起こることを示した。3 Dbf4/ASK活性制御サブユニットに保存された3つのモチーフ(N, M, C)を同定しこのうちMとCがそれぞれ独立に触媒サブユニットに結合し、キナーゼ活性化に必要であることが明かになった。Nはクロマチンとの相互作用に関与することが示唆された。モチーフNの変異はDNA複製チェックポイント、DNA損傷からの回復に損傷を示すことがしめされた。4分裂酵母の新規複製開始欠損変異体を単離したところ、Cdc45であることがあきらかとなった。Chc45タンパク質は、細胞周期を通じてDNAポリメラーゼaと結合していること、G1初期にCdc10非依存的にクロマチンに結合し、G1-S境界に、MCMに結合する。その結果DNAポリメラーゼを複製複合体に導入すると考えられる。5ヒト染色体5qに存在するIL-3/GM-CSF領域を対象にcompetitive PCR法を用いて複製起点マッピングを行った結果、GM-CSFの下流に複製起点を見い出した。また、その極めて近傍にORC ; MCMの結合部位があることを示した。また、この領域とすでに同定されているヒト染色体複製起点の配列を比較した結果、保存された配列を見い出した。6マウス染色体11qのIL4/IL-13領域においても同様に複製起点マッピングを行った結果、IL13遺伝子の近傍に、複製起点活性を見い出した。分裂酵母とヒトのCdc7類似キナーゼ複合体である、Hsk1/Him1およびhuCdc7/H37の転写とタンパク質の細胞周期における変動を検討した結果、いずれの生物種においても、触媒サブユニットは細胞周期を通じてほぼ一定のレベルで発現されること、制御サブユニットの発現はG1期で低下しG1後期からS期にかけて上昇しS期を通じて高く保たれることが示された。muCdc7遺伝子の2つのalleleを欠損したマウスは胎生3.5日から6.5日の間に死亡した。さらに、muCdc7遺伝子の不活性化を誘導できる変異E S株を作製し、muCdc7の機能が動物細胞のDNA複製に必須であることを証明した。一方ヒトCdc7/H37複合体を精製し、in vitroリン酸化反応による解析を行った結果、MCM複合体の中のMCM2サブユニットが特異的にリン酸化されin vivoで観察されるリン酸化パターンと類似したリン酸化パターンが得られた。また、MCM2上のリン酸化部位の詳細な解析から重要なリン酸化部位をほぼ同定し、Cdc7はMCM2のリン酸化を通じてその複合体の組成を変化することによりヘリカーゼ活性を制御する可能性を指摘した。competitivePCR法を用いてヒト5番染色体上GMCSF-IL3領域(5q)に複製起点が存在することを示した。興味深いことに、その複製起点の活性化のパターンはT細胞と、サイトカイン遺伝子発現を行っていない非T細胞においてて異なっている可能性が示唆された。

1動物細胞のCdc7類似キナーゼ複合体の機能が、その複製と増殖に必須であることを、マウスES細胞を用いた遺伝学的実験により証明した。2 Cdc7キナーゼ複合体の特異的基質がMCM複合体であることを生化学的、遺伝学的に示し、そのリン酸化が、サリクリン依存性キナーゼと共役して起こることを示した。3 Dbf4/ASK活性制御サブユニットに保存された3つのモチーフ(N,M,C)を同定しこのうちMとCがそれぞれ独立に触媒サブユニットに結合し、キナーゼ活性化に必要であることが明かになった。Nはクロマチンとの相互作用に関与することが示唆された。モチーフNの変異はDNA複製チェックポイント、DNA損傷からの回復に損傷を示すことがしめされた。4分裂酵母の新規複製開始欠損変異体を単離したところ、Cdc45であることがあきらかとなった。Cdc45タンパク質は、細胞周期を通じてDNAポリメラーゼαと結合していること、G1初期にCdc10非依存的にクロマチンに結合し、G1-S境界に、MCMに結合する。その結果DNAポリメラーゼを複製複合体に導入すると考えられる。5ヒト染色体5qに存在するIL-3/GM-CSF領域を対象にcompetitive PCR法を用いて複製起点マッピングを行った結果、GM-CSFの下流に複製起点を見い出した。また、そのきわめて近傍に、ORC、MCMの結合部位があることを示した。また、この領域とすでに同定されているヒト染色体複製起点の配列を比較した結果、保存された配列を見い出した。6マウス染色体11qのIL-4/IL-13領域においても同様に複製起点マッピングを行った結果、IL13遺伝子の近傍に、複製起点活性を見い出した。
低酸素反応性・可溶性VEGFレセプターを用いた悪性グリオーマの抗血管新生療法

悪性グリオーマの抗血管新生療法の標的としてVEGFレセプターFlt1のうち細胞外の可溶性成分であるsoluble Flt1(sFlt1)および低酸素のマーカーであるhypoxia inducible factor 1α(HIF)に注目し、これらを用いた血管新生療法の基礎的研究を行い、臨床応用への展開を目的とした。1.グリオーマにおけるsFlt1およびHIFの意義:グリオーマ組織のsFlt1,HIF,VEGFの発現量を定量した。VEGF/sFlt1が1以上、HIFの高発現は予後不良因子であった。2.sFlt-1過剰発現の効果:sFlt1の遺伝子導入でsFltを過剰発現したグリオーマ細胞のマウスでの腫瘍増殖は、遺伝子導入していない腫瘍に比べて30%の抑制効果がみられた。3.HIFを抑制するCPT-11の血管新生抑制効果:CPT-11は血管内皮細胞の増殖を選択的に抑制するとともに、グリオーマ細胞のHIFの遺伝子・蛋白発現それに続くVEGFの遺伝子・蛋白発現を著明に抑制した。4.CPT-11の血管新生抑制スケジュールの開発:マウス皮下腫瘍モデルでCPT-11の投与方法の検討を行った。中等量短期間投与として10mg/kg(1-5,8-12日、総量100mg/kg)および40mg/kg(1-5,8-12日、総量400mg/kg)に加えて、低用量持続長期間投与として1mg/kg(1-21,29-49,57-77日、総量66mg/kg)および4mg/kg(1-21,29-49,57-77日、総量264mg/kg)を行った。低用量持続長期間投与により腫瘍抑制効果は著明であり、VEGF発現が抑制され、副作用がみられなかった。5.漢方薬である十全大補湯の免疫賦活作用に加えて血管新生抑制作用をマウス皮下腫瘍モデルで明らかにした。グリオーマに対するCPT-11の低用量持続長期間投与、十全大補湯の長期間投与はグリオーマのVEGF・HIFの発現、内皮細胞の増殖・管腔形成を抑制する抗血管新生療法として臨床応用が可能と考えられた。VEGFレセプターであるFlt-1の細胞外領域部分は可溶性の形で生体内に存在し(sFlt-1)、内因性VEGF抑制因子として機能すると考えられている。VEGF特異性から悪性グリオーマに対する抗血管新生療法の標的分子となりうる。今回はグリオーマ組織におけるsFlt-1の役割を検討した。対象は52例のグリオーマ(GBM 24,AA 13,LGA 10,pilocytic 5)のパラフィン切片、凍結組織を用いた。凍結腫瘍組織のホモジネートでVEGFおよびsFlt-1の蛋白濃度をELISAで測定した。パラフィン切片ではMIB-1陽性率、CD34染色で腫瘍血管密度を形態計測し、VEGFおよびFlt-1染色でその分布を評価した。結果。sFlt

-1蛋白濃度はGBM 848.5±900.2,AA 465.4±232.5,LGA 410.3±207.2,Pilocytic 317.7±137.1 pg/mg proteinでGBMのばらつきが強く病理組織間での有意な差はみられなかった。しかし、VEGF/sFlt-1の蛋白濃度の比が1以上のグリオーマは1未満のものに比べて有意に(p<0.0001)生存率が低かった。悪性グリオーマ37例だけに限っても同様で、比が1以上の悪性グリオーマの平均生存期間は11ヶ月であるのに対し、1未満のものは29ヶ月で生存率に有意な(p<0.0001)違いがみられた。sFlt-1蛋白濃度は血管密度(r=0.427,p=0.0014)、腫瘍MIB-1値(r=0.349,p=0.0108)、VEGF蛋白濃度(r=0.304,P=0.0278)と有意な相関がみられた。Flt-1蛋白はグリオーマ組織の血管壁・腫瘍細胞に陽性であった。結論。sFlt-1はグリオーマ組織の血管密度に関係し、VEGF/sFlt-1濃度の比率が1未満でグリォーマの生存率は有意に高く、内因性血管新生抑制因子として機能している。また、sFlt-1は悪性グリオーマの分子標的となりうると考えられた。以上の結果に基づき1.sFlt-1 plasmidのグリオーマ細胞(U87)への遺伝子導入実験、2.低酸素反応のトリガーとなるhypoxia inducible factor(HIF-1α、HIF-2α)の発現を同一組織で検討中で、低酸素反応性のsFLT-1の遺伝子導入実験への準備を行なっている。1.HIF1αはGBM, AAではLGAに比べて腫瘍細胞の核に有意に高くみられ、VEGF濃度、MIB-11陽性率、p53陽性率、血管密度、血管面積と有意な相関がみられた。2.HIF2αは腫瘍細胞質、腫瘍血管内皮細胞にみられた。4.Ang2は腫瘍細胞質、腫瘍血管内皮細胞に発現がみられた。Ang2の腫瘍発現はVEGF濃度と逆相関があり、陽性例の生存期間は36ヶ月、陰性例は20ヶ月と予後良好因子であった。5.HIF1αとAng2はVEGF発現と関連してグリオーマの血管新生・臨床予後を調節し分子標的となりうる。・CPT-11の抗血管新生作用・グリオーマの増殖抑制の機序。1.CPT-11のグリオーマ細胞(GL261,U87,U251)でのIC_<50>は38,5,30μM、内皮細胞(TE1,CPAE)でのIC_<50>は0.001,0.041μMであり、腫瘍細胞に比べ強い内皮細胞増殖抑制効果がみられた。2.CPT-11は濃度、時間依存的にグリオーマ細胞のHIF-1αの蛋白、mRNA発現を抑制し、さらにVEGF蛋白発現を抑制した。3.CPT-11はU87グリオーマの皮下腫瘍の増殖を有意に抑制し、生存率を延長した。CPT-11治療群ではcontrol群に比べて腫瘍内血管数の低下、VEGF濃度低下を認めた。4.CPT-11は腫瘍細胞のHIF-1,VEGFの発現抑制および強力な血管内皮細胞増殖抑制効果によりグリオーマの血管新生・増殖を抑制する。以上の結果に基づきhypoxiaを標的とした悪性グリオーマの抗血管新生療法の基礎から臨床につながる計画を立てている。●悪性グリオーマに対するHIF-1およびVEGFを標的とした抗血管新生療法1.CPT-11の血管新生抑制効果:CPT-11がグリオーマ細胞のHIF-1およびVEGFの発現を抑制し、血管内皮細胞の増殖を選択的に抑制するという前年度の結果に加えて、in vitroでCPT-11は血管内皮細胞の管腔形成も0.01μMで抑制した。他の抗腫瘍剤(ACNU, etoposide, cisplatin)では管腔形成の抑制は100μMでもみられなかった。2.CPT-11のin vivoでの抗腫瘍
TGF-βおよびWntシグナル分子間相互作用によるシグナル制御機構

NLKはMAPK様のセリン/スレオニンキナーゼで、TAK1の下流で転写因子であるTCF/LEFをリン酸化する事によりWnt/β-cateninシグナル伝達経路を負に制御する事が知られている。まず酵母Two-hybrid法を用いて単離されたNLK結合因子であるSTAT3の機能解析を行う事により、TGF-βシグナル伝達経路におけるNLKの新たな機能を解明した。我々はXenopus胚において、TAK1、NLK、STAT3がTGF-βファミリーリガンドが制御する中胚葉誘導に関与している事、その際NLKによるSTAT3のセリン残基が必要である事も証明した。これらの結果より、生体内においてTGF-βファミリーシグナル因子の下流でTAK1-NLK-STAT3というシグナル伝達経路が機能して中胚葉誘導を行っているという、TGF-βシグナル伝達経路におけるNLKの新たな機能を明らかにした。一方、我々はMAFbx/Atrogin1とTGF-βシグナルの関係を明らかにするため、その線虫相同遺伝子MFB-1を用いて遺伝学的機能解析を行った。線虫mfb-1変異体は単独では顕著な異常を示さなかったが、DAF-7経路においてシグナルを制御する遺伝子の変異体と二重変異にした際に、それらの変異体が単独で示す恒常的dauer形成(Daf-c)を顕著に増強させる表現型を示した。逆にDAF-7経路のDaf-c変異体内でmfb-1遺伝子を過剰発現させた場合には、表現型を部分的に抑制できることも確認できた。また、DAF-7経路の変異体との二重変異で見られたDaf-cの増強は二重変異株へのmfb-1 cDNAの導入により、完全にレスキューされた。これらの結果からMFB-1は、遺伝学的にDAF-7経路のシグナルを正に制御し、線虫のdauer形成を抑制していることが明らかとなった。本研究ではTGF-βおよびWntシグナルに関与する分子に相互作用する分子を単離し、個体レベルでの解析を目指し、研究を進めた。しかし、生体内におけるNLKの機能は依然不明な点が多く、Wntシグナル伝達経路以外のシグナル伝達経路にも関与する事が示唆されていた。本年度は酵母Two-hybrid法を用いて単離されたNLK結合因子であるSTAT3の機能解析を行う事により、TGF-βシグナル伝達経路におけるNLKの新たな機能を解明した。STAT3はJAK/STATシグナル伝達経路を構成する転写因子であり、JAKキナーゼによってチロシン残基がリン酸化されると核へ移行して標的遺伝子の発現を誘導する。一方、STAT3のC末端側領域に存在するセリン残基はそれ自身の転写活性能を制御しているという知見はあったものの、その生理的な意義は不明であった。今回我々は培養細胞においてNLKがTAK1の下流でSTAT3のセリン残基を直接リン酸化する事を示した。また、Xenopus胚において、TAK1、NLK、STAT3がTGF-βファミリーリガンドが制御する中胚葉誘導に関与している事、その際NLKによるSTAT3のセリン残基が必要である事も証明した。さらに、NLKがTGF-βファミリーリガンドであるactivinによって活性化される事もわかった。

これらの結果より、生体内においてTGF-βファミリーシグナル因子の下流でTAK1-NLK-STAT3というシグナル伝達経路が機能して中胚葉誘導を行っているという、TGF-βシグナル伝達経路におけるNLKの新たな機能を明らかにした。本研究でTGF-βおよびWntシグナル分子の制御機能を解明するため、TGF-βおよびWntシグナルに関与する分子に相互作用する分子を単離し、研究を進めた。MAFbx/Atrogin1は筋萎縮に関与するユビキチンE3リガーゼである。我々はMAFbx/Atrogin1とTGF-βシグナルの関係を明らかにするため、その線虫相同遺伝子MFB-1を用いて遺伝学的機能解析を行った。MFB-1の生体内における機能を解析するため線虫mfb-1変異株を分離した。この変異体は単独では顕著な異常を示さなかったが、DAF-7経路においてシグナルを制御する遺伝子の変異体と二重変異にした際に、それらの変異体が単独で示す恒常的dauer形成(Daf-c)を顕著に増強させる表現型を示した。これに対して、dauer形成を制御するもう一つの経路として知られるDAF-2/インシュリン受容体様シグナル伝達経路におけるDAF-2変異体との二重変異では、そのDaf-c表現型に変化は見られなかった。逆にDAF-7経路のDaf-c変異体内でmfb-1遺伝子を過剰発現させた場合には、表現型を部分的に抑制できることも確認できた。また、DAF-7経路の変異体との二重変異で見られたDaf-cの増強は二重変異株へのmfb-1c DNAの導入により、完全にレスキューされた。さらに、MFB-1におけるF-boxドメインを欠失させたmfb-1 cDNAについてレスキュー能を調べたところ、このcDNAはDAF-7経路の変異体との二重変異で見られるDaf-cの増強をレスキューできなかった。これはMFB-1のF-boxドメインが、機能上必須であることを示唆している。F-boxドメインはF-boxタンパク質がSCF複合体を形成する上で重要な領域と考えられており、MFB-1もユビキチンリガーゼとして機能していると考えられる。これらの結果からMFB-1は、遺伝学的にDAF-7経路のシグナルを正に制御し、線虫のdauer形成を抑制していることが明らかとなった。
19世紀中葉の日蘭交渉史

本研究の深化のため、インドネシア、オランダ、アメリカ、イギリスにおける長期現地調査を行った。それにより非常に広範囲な研究が出来た。具体的には当該国における史料調査を十分行い、そこでその貴重な未公開史料から、多くの新知見を得ることができた。この成果は論文・エッセイとして公表した。更に本期間、多くの研究者との交流ができたことは、自らの研究上のみならず、国際化の視点においても、極めて意義深かった。本年度はインドネシア現地調査が主目的であった。この調査では、19世紀、特に幕末期オランダ対日外交政策に関する自身の研究を、今までとは異なる新しい視点から検討することにより、同研究をより具体的かつ動的にすることが期待された。19世紀蘭領東インドにおいて、日本問題を扱った部局は総務局である。この重要な文書としては、蘭領東インド総督決議文書、蘭領東インド評議会助言・考慮がある。これらはオランダ本国植民省にその複写が送られている。しかしながらその原本を直接検討し、より詳細な現地での考慮を理解するため、同文書を有するインドネシア国立文書館での調査を実施した。現地研究者との交流、またその協力を得られたことは、全く有り難く、素晴らしいことであった。しかしこの調査で、原本の保存状況が悪く、さらに当該文書は未だ編纂されておらず、文書の請求に極めて困難が伴うことが理解された。そこで計画を変更し、インドネシア再調査に代え、オランダ国立文書館における当該文書複写の検討を行った。まず1850-1863年間の同文書をデジタル撮影し、PDFファイル化した。その後最終年度の19世紀中葉のオランダ対日外交関係史料集出版の考慮から、分析・検討し、全て翻字した。インドネシア調査では蘭領東インド総督決議の一原本を検討できた。これをその複写と比べ合わせることが出来た。これは史料比較・分析の点で、意義深かった。この原本は状態が悪くコピー出来なかったが、この複写から原本では読めなかった箇所を確認できた。その後は現地滞在の意義を生かし、最終年度の史料集出版の考慮から、植民省本省文書に含まれるインドネシアから発送された全文書(1850-1864)を複写(総計約10000コマ)し、PDFファイル化した。大変実りある調査ができた。このような機会が与えられたことを、記して心から感謝します。本年度は、アメリカ現地調査が主目的であった。本調査では、19世紀中葉の、特に日本開国に決定的な役割を果たしたアメリカ合衆国ペリー司令官の日本遠征を焦点とし、当時のアメリカによる対日、ひいてはその対アジア政策の真相を、史料に基づき詳らかにすることが期待された。本年度夏は、主にワシントンDCとその近郊メリーランド州に存在する二カ所の国立公文書館と議会図書館で調査を行った。この主な文書は、国務省と海軍省のファイルに含まれる関係史料となった。文書はほぼマイクロフィルム化されていたが、オリジナルで閲覧するものも存在した。この調査から、ペリー日本遠征の真相を伺い知ることが出来た。この成果は拙稿「ペリー日本遠征の再検討とその真意-アメリカ合衆国国立公文書館国務省・海軍省ファイルに含まれる未公刊関係史料の検討から」として纏め、明治大学創立130周年記念懸賞論文に投稿し、最優秀賞を獲得した。そこで近くその日本語版と英訳版が出版される予定である。本来上述の研究を継続する計画であった。しかし前回の調査の際、関係史料が効率よく収集でき、また当時新史料の存在が確認できたため、冬にはニューヨーク・シティカレッジ図書館史料部が保有する『タウンゼント・ハリス個人文書』の検討を行った。この文書の存在は知られていたが、特に同文書に含まれる「ハリスの手紙」は、ファイル名から一見家族・友人等のものと考えられた。しかしこれが、ハリス日本滞在時の各国要人との外交書簡であると理解されたため、この文書の分析と、デジタルカメラによる収集を行った。この文書の検討は、当時のアジアにおける欧米列強ネットワーク形成の草創期を明らかにし、また当時の実相を生き生きと再現できるため、当時の歴史認識の深化に大きく貢献すると考えられる。本年度も、大変実りある調査ができました。本年度は、主にオランダで、幕末期日本関係オランダ語史料出版計画を終了させる計画であった。この元となる史料は既に翻字し、同国クリンゲンダール研究所ファン・デル・プッテン博士とライデン大学ブイケルス教授のチェックを受け、所見を受けていた。そこで当該箇所の諸問題について、直接面会し解決した。その後は、問題個所を史料のオリジナルと照合作業を行った。このオリジナルの大部分は、既にデジタルカメラで収集していたが、検討の結果、欠落文書も判明し、取り直す作業も行った。これは実際史料が正しい場所に保管されていなかったことから生じていた。ファイルを丁寧に調べ、ほとんど収集した。

史料数の膨大さから、関係文書・その当該個所を発見することは厄介であったが、当該個所全てを照合した。この作業のほかには、ブイケルス教授から、日本開国期のオランダ対日外交政策の変遷に関する論文執筆を勧められたため、国立中央文書館が所有する、日本問題に関する1850-70年間のオランダ外務省文書を分析・検討した。「日本」として纏められているこの史料を、全てデジタルカメラで撮影した。19世紀中葉、アメリカの日本遠征が行われたが、この点でオランダの、特にその積極的な対日政策を語るうえで、英蘭関係は見過ごせない。すなわちヨーロッパの領土的小国オランダは、同盟国であり大国のイギリスの支援をあてにし、対アメリカ対策が行えた。しかし実際英米関係は、いかなるものであったろうか。この点は本研究に極めて重要である。この問題を明らかにするため、イギリス国立文書館での現地調査も行った。実際本件における英米の緊密な関係を伺うことは出来なかったが、良い認識を得た。現在同文書館でもデジタルカメラの撮影が自由になっているため、貴重な関係文書を撮影・収集した。今回の調査でも、長期滞在による現地調査から、多くの知見や現地・海外研究者との交流等を得ることができ、大変実りのある調査が行えた。記して心より感謝いたします。
超臨界を利用した水素吸蔵ナノ物質の創製

ナノポーラス水素貯蔵材料を創製することにより、表面積を多くし水素吸蔵・放出特性を高めることを目的とした研究である。まず、表面の影響を明らかにするために、水素吸蔵放出によってナノ粒子の表面構造を中性子小角散乱で観察し、ナノ粒子に水素を吸蔵させると粒子表面の構造が平滑になることを明らかにした。また、軽水素よりも重水素を吸蔵させた方が平滑性の向上が見られ、この表面構造変化の違いは水素種の拡散速度の違いによることが明らかになった。これによって水素吸蔵による格子歪みをナノポーラス表面に分散させることにより細粒化を防ぐことも可能となる。さらにナノポーラス内に種々のアイディアで触媒剤を混入させ、さらなる水素吸蔵・放出特性を高めていくことができる。本研究において超臨界を用いて空孔率の極めて大きな多孔質体すなわちナノポーラスの形態を形成させることはナノ物質の「表面」がキーポイントとなる。表面の影響を明らかにするために、まずナノ粒子を化学的もしくは物理的に形成させる方法があるが、将来の材料の生産性を考慮して物理的にナノ粒子を形成させることを行った。物理的方法としてメカニカルミリング法を行い水素吸蔵材料のナノ化を行った。ナノ粒子の特性(水素吸蔵特性など)を調べるにあったって、水素の吸蔵・放出は必ず粒子の表面を経由して行われることからその粒子の表面近傍の構造が、水素吸蔵放出によってナノ粒子の表面構造がどの様に変わるかを調べることにした。その方法としてX線小角散乱ではなく、中性子小角散乱実験を行った。中性子小角散乱では軽水素(H)及び重水素(D)の中性子に対する散乱断面積が異なるという中性子の特徴を利用した研究が展開できる。それ故、本研究では、吸放出時の中性子小角散乱実験を行い表面構造を観察した。その結果、ナノ粒子に水素を吸蔵させると粒子表面の構造が平滑になることが明らかとなった。さらに軽水素と重水素で粒子表面の平滑さが異なることが明らかになった。軽水素よりも重水素を吸蔵させた方が平滑性の向上が見られた。この表面構造変化の違いは水素種の拡散速度の違いによることが明らかになった。ナノポーラス水素貯蔵材料を創製することにより、表面積を多くし水素吸蔵・放出特性を高める。さらに水素吸蔵による格子歪みをナノポーラス表面に分散させることにより細粒化を防ぐ。またナノポーラス内に種々のアイディアで触媒剤を混入させ、さらなる水素吸蔵・放出特性を高めていくことを目的としている。それ故、超臨界を用いて空孔率の極めて大きな多孔質体すなわちナノポーラスの形態を形成させる前に、ナノ物質の形成とそのナノ物質の水素吸蔵形態そして表面影響を明らかにする必要がある。まずナノ物質を化学的、物理的に形成させる方法があるが、将来の材料の生産性を考慮して物理的にナノ物質を形成させる方法を採用した。物理的方法としてメカニカルミリング法を行い水素吸蔵材料のナノ化を観察した。グラファイトも水素を吸蔵することはすでに報告されているので、グラファイトのナノ化がどこまで進かを調べた結果、直径約30Aのサイズになることが確かめられた。メカニカルミリングによるナノ化は異なっていると考えられるが、非常に有効であることが確認されるに至っている。ナノ物質の特性(水素吸蔵特性など)を調べるにあったって、水素の吸蔵・放出は必ず粒子の表面を経由して行われることからその粒子の表面近傍の構造が水素吸蔵放出によってナノ物質の表面構造がどの様に変わるかを調べることにした。現在、中性子の特徴を利用した軽水素(H)及び重水素(D)の吸放出時の中性子小角散乱実験を行っている。これによりナノ物質の水素吸蔵放出による表見構造変化を明らかにする。東日本大震災によりJ-PARCに設置されている中性子施設や研究用原子炉JRR3が大打撃を受け、約1年間、その修復のサポートに時間を割いたため、本来の研究やそれに関する中性子散乱実験が行えなかったことは大きな打撃であった。しかし、急遽外国の中性子施設の利用申請を行い、それを利用することにより、一部の実験を行った。その実験データの解析を行っているところであるので、今年の水素関係の国際会議(MH2012)には、これまでの研究報告を行う予定である。本研究は試料作製と水素吸放出特性を調べつつ、中性子散乱による原子レベルの基礎研究を行い、最終的にはナノポーラス水素吸蔵材料見いだしていく研究である。それ故、その研究ルーチンが動いていなかったため、達成度が昨年度は低かったかもしれないが、今後挽回していく予定である。

現在、J-PARCの中性子施設の中性子源が動き始め、その中性子源の周りに設置されている装置(NOVA装置など)が動き始め、さらに新たな装置も動き始めたことから、ナノポーラス水素貯蔵材料の水素収蔵放出特性と原子構造(原子配列、表面構造、水素原子の存在位置、水素原子の動き、水素原子と周りの原子との相互作用など)との関係を明らかにする。中性子散乱・回折により水素原子が存在する周りの格子の歪度を解明し、ナノ化による歪みの解放度を定量的に明らかにする。さらに水素吸放出によるナノ物質の表面構造、表面形態がどの様に変化するか調べ、それが吸放出特性に与える影響を定性かつ定量的に解明する。特に水素吸放出時のin-situ中性子散乱実験を行い、母相の原子配列(原子構造)の変化を調べ、その時の水素原子の位置を明らかにする。特に水素が動くことによる母相の原子配列の歪み度の変位を定量的に明らかにすることは重要である。かつその母相の歪み度がナノ化によってどのように軽減されるかを明らかにすることは、今後、ナノポーラス水素貯蔵材料を開発するための原点情報となる。さらに水素吸放出における重要要因となるナノ物質表面の構造変化をin-situ中性子散乱実験(in-situ中性子小角散乱実験)から明らかにすることも重要である。水素原子の動き、特に吸放出を短時間で行わせる必要性からナノ化による水素の拡散度の向上性を中性子準弾性散乱実験によって解明していきたいと考えている。試料作製のための原料の購入とJ-PARC/MLF(中性子)施設への実験旅費に使用したいと考えている。
精子分化における新規パラクリン因子ニューレギュリンの機能

イモリ精巣と生後マウス精巣の培養系を用いてneuregulin(NRG)1やretinoic acid(RA)の減数分裂開始に対する作用を解析した。NRG1やRAはイモリやマウス精原細胞の増殖を直接促進する一方、セルトリ細胞を介して間接的に減数分裂を開始させること、NRG1はRAの下流で働くことが分かった。またプロラクチンによるイモリ精原細胞のアポトーシス誘起機構は、RNA結合タンパク質を介することによる。精子分化過程において、体細胞分裂を行う精原細胞が減数分裂を開始する機構は未解決である。我々はこれまでにイモリ精巣培養系を用いて解析した結果、減数分裂開始のチェックポイントが精原細胞の第7世代にあり、FSHとプロラクチンの濃度比によって調節されるという仮説を構築した。減数分裂に入るためには、FSHによって活性化されたセルトリ細胞から分泌される因子が精原細胞に働くことが必要であると考えられたため、我々はcDNAマイクロアレイを行い、FSHで発現が上昇するイモリ精巣由来クローンの1つとして、分泌因子をコードするneuregulin (NRG)を同定した。NRGの機能ドメインであるEGF-like domainの組み換えタンパク質を作成し、イモリ精巣の再凝集培養系や精原細胞のみの培養系に添加した結果、精原細胞の増殖を促進することが明らかになった。しかし、長期培養しても精母細胞らしい像は観察されなかった。そこで現在、膜型SCFをtransfectしたセルトリ細胞と精原細胞との再凝集培養培養を試みている。マウス精巣でもNRG1、NRG3のEGF様ドメインだけの組換えタンパク質を作製し、A型精原細胞しか存在していない生後6日目のマウス精巣を器官培養して精原細胞の増殖、分化に対する効果を調べた。その結果、NRG1、NRG3は精原細胞の増殖を促進させたことに加え、減数分裂を開始する精母細胞に特異的なSPO11 mRNAに加え、REC8タンパク質の発現を活性化した。これらの結果は、NRGsがマウス精子形成過程において精巣内でセルトリ細胞から分泌されて働く因子として減数分裂の開始に重要な役割を果たしていることを示唆した。また、NRG1のconditional knockout mouseを作成するためのconstructを作成した。減数分裂に入るためには、FSHによって活性化されたセルトリ細胞から分泌される因子が精原細胞に働くことが必要であると考えられたため、我々はcDNAマイクロアレイを行い、FSHで発現が上昇するイモリ精巣由来クローンの1つとして、分泌因子をコードするneuregulin(NRG)を同定した。NRGの機能ドメインであるEGF-like domainの組み換えタンパク質をイモリ精巣の再凝集培養系や精原細胞のみの培養系に添加した結果、精原細胞の増殖を促進することが明らかになった。器官培養にerbB1阻害剤(AG1478)、erbB2阻害剤(AG879)、erbB1、4阻害剤(PD153035)を添加した結果、いずれもFSHによる精原細胞の増殖促進効果を阻害したことが、PD153035が最も効果が高かった。イモリNRG-EGF domainの抗体を作成し、精巣の再凝集培養系に加えた結果、有意に阻害したことから、FSHのシグナルの下流にNRGが働いていることが強く示唆された。in vivoでNRG1の働きを調べるたあに、その遺伝子を任意の日齢にセルトリ細胞だけで欠損させるノックアウトマウスを作製中である。当該年度は、NRG1の遺伝子座を抗生物質耐性遺伝子で置換するためのターゲティングベクター、特定の細胞と時期に遺伝子を破壊するための組み換え酵素のトランスジーンをそれぞれ構築した。ErbB4のdominant negative変異マウスも作成中である。我々は、これまでにFSHがイモリ及びマウス精巣でneuregulin(NRG)1という分泌性の増殖因子の発現を促進することを見出した。NRG1の組み換えタンパク質を精原細胞のみの培養系や器官培養に加えたところ、どちらにおいても増殖を促進したが、器官培養では精母細胞特異的なマーカーであるSpo11やScp3の発現も検出された。NRG1は精原細胞への直接的作用とセルトリ細胞を介した間接的作用とともに減数分裂を開始させることが示唆された。最近マウス卵巣及び精巣においてretinoic acid(RA)が減数分裂の開始因子であり、RA分解酵素であるCyp26が減数分裂阻害因子であることが報告された。我々は、NRG1がRAの下流にあることを示唆する結果を得た。減数分裂開始におけるNRG1の役割を明らかにするために、セルトリ細胞で発現するNRG1を欠損させるノックアウトマウスを作製した。現在解析中である。

イモリ精巣では、脳下垂体から分泌されるprolactin(PRL)が第7世代精原細胞にアポトーシスを誘導するが、この過程でPRLに応答してmRNAの発現が減少するRNA結合タンパク質を見出した。さらに、これが結合するmRNAとしてprogrammed cell death4(Pdcd4)を単離した。イモリ精原細胞にPRLによりアポトーシスを誘導すると、Pdcd4タンパク質の発現が減少した。さらに、Pdcd4を欠損させた細胞では、アポトーシスを誘導しなくてもPARPが分解され、カスパーゼ3タンパク質の発現とその活性化も亢進した。これらの結果から、Pdcd4はカスパーゼ3の翻訳を阻害しているが、アポトーシス誘導によって分解されると、カスパーゼ3が翻訳され、さらには自己活性化でアポトーシスを昂進させるものと示唆された。
芳香族化合物分解好熱菌の代謝酵素群のネットワーク形成に関する研究

芳香族化合物を分解する微生物は、その能力を進化の過程で獲得してきたものと考えられている。本研究では、これまで解析された例が少ない好熱性細菌に着目し、ナフタレン代謝酵素遺伝子群の解析を行うことを目的とした。その結果、遺伝子の単離とナフタレンによる誘導性を見出すことが出来た。しかし、ナフタレンを代謝する過程で生理活性が著しく低下することが分かり、酵素機能と代謝ネットワークの詳細を解析するにはいたらなかった。本研究は、コンポストから単離されたビフェニル/ナフタレン分解好熱性細菌、Bacillus sp.JF8株の解析を目的とした。ナフタレン/ビフェニルを分解できる好熱菌は単離された例がなく、分解酵素遺伝子群の進化と分解酵素の耐熱性に新たな知見が見いだされるものと期待される。まず、ナフタレン分解上流経路酵素遺伝子群を詳細に解析するため、ナフタ・レン分解酵素の一つであるcis-naphthalene dihydrodiol dehydrogenase (NahB)を精製し、NahBをコードする遺伝子断片を単離した。相同性解析の結果、NahBは、既知の芳香族化合物代謝オペロン中の脱水素酵素とは異なる種類の脱水素酵素であることを明らかにした。RT-PCR解析より、nahBの上流にある初発酸化酵素をコードするnahAcがナフタレン誘導性であることが明らかになった。ナフタレン分解に関与すると考えられる遺伝子群が単離されたが、メタ開裂以降の代謝経路は明らかではない。そこで、ナフタレン分解下流経路酵素遺伝子群nahC、bphD-like (nahE)、dhyD (nahF)、mocA (nahH or nahG)を導入した大腸菌に、メタ開裂の基質である中間代謝産物1,2-dihydroxy naphthaleneを基質として与え、生成する代謝産物をGC/MSで追跡した。しかし、代謝産物を見出すには至らなかった。また、ナフタレンにより発現誘導されるタンパク質を解析するため、二次元電気泳動を用いたプロテオミクス解析を試みた。その結果、ナフタレンを与えた菌体で特異的に誘導されるタンパク質のスポットを得ることが出来た。得られたタンパク質を用いてMALDI TOF/MS解析を行ったが、ナフタレン分解関連酵素の同定には至らなかった。これは、得られたアミノ酸配列の情報が既知の情報と異なるためであると考えられた。本研究は、コンポストから単離されたナフタレン/ビフェニル分解好熱性細菌Bacillus sp. JF8株の解析を目的とした。前年度は、ナフタレン代謝のメタ開裂以降の代謝経路が明らかではないため代謝産物を追跡したが、代謝産物を見出すには至らなかった。そこで、メタ開裂を受ける中間代謝産物である1,2-dihydroxy naphthaleneを基質として生育を調べたところ、ほとんど生育が認められなかった。また、前年度はプロテオミクス解析を試みたが、ナフタレンの有無で明確な違いを見出すことができなかった。そこで代謝系の働きを調べるため、ナフタレン/ビフェニル存在下での微生物の生理活性の変化を、生細胞と死細胞を特異的に染色する蛍光試薬を用いて観察し、代謝系のネットワークが細胞に与える影響を調べた。まず、代謝による細胞増殖の変化を調べたところ、JF8株はビフェニルとナフタレンを唯一の炭素源として生育することができるが、これらの基質を与えると、コロニーの生育速度の低下と、コロニー中の死細胞の増加が観察された。特に、ナフタレンを基質とした場合、コロニー形成初期におけるコロニー中の細胞は、ほとんどが死細胞であった。以上の結果から、JF8株は、これまでナフタレンやビフェニルを分解する中温菌で観察された、基質の分解に伴う生理活性の変化より、強い感受性を示すことが示唆された。これらの結果から、JF8株は、ナフタレンを分解資化するが、それにより生理活性が著しく影響を受け、遺伝子の発現や代謝産物の同定が困難である可能性が考えられた。本研究の結果、Bacillus sp.JF8のナフタレン代謝酵素遺伝子群は、上流経路に必要な酵素遺伝子がオペロン上に全てそろっておらず(NahAc、NahAd、NahBのみ)、下流経路においても必要な酵素遺伝子がそろっていないことが分かった(2-hydroxymuconic semialdehydeの変換酵素)。また、下流経路関連酵素遺伝子群に上流経路の酵素遺伝子であるnahCが含まれるなど、配置に未完成なところがあり、オペロン中の遺伝子の配置がまだ完了していない可能性が考えられた。現在の芳香族化合物の代謝経路は、少なくとも三つのコンポーネントのmodular fusionによって進化してきたと考えられている。

主モジュールはメタ開裂経路オペロンで、これが二つ目の遺伝子モジュール(サリチル酸やフェノールをカテコールに変換する)と融合し、いまでは下流経路を形成している。上流経路オペロンは、より後の段階で獲得された第三のモジュールと予想されている。最後に制御因子がゲノムから移動して、正しい発現ができるように修飾されたと考えられている。しかし、単離したナフタレン分解遺伝子群は、オペロン構造が不完全であり、これまでに報告されているものに比べ、未整理の状態であると考えられた。不完全なメタ開裂経路オペロンと不完全な上流経路オペロンであるが、これらはナフタレンで発現が誘導されることが確認されたため、制御因子もすでに存在していると考えられた。また、ナフタレンを炭素源として生育することができることから、ナフタレン代謝に必要な遺伝子は菌体内には揃っていることが示唆された。以上のことから、Bacillus sp.JF8のナフタレン代謝酵素遺伝子群は、これまで提唱されている代謝経路遺伝子群とは異なる進化の仕方をしてきた可能性が考えられた。
生体認識機構と移動現象を考慮したクロマトグラフィープロセスの構築

クロマトグラフィー分離プロセスにおける生体認識機構と移動現象を同時に解析した。尿素やポリエチレングリコール(PEG)を移動相に添加することにより、溶出位置は変化したが結合サイト数はほぼ一定であった。イオン交換モノリスdiskを固定化した96穴マイクロプレートによりハイスループットシステムを構築することができた。カラム実験と併用することにより、希望する分離性能が達成できる移動相組成を迅速かつ容易に決定できることを明らかとしたクロマトグラフィー分離プロセスにおける生体認識機構と移動現象を同時に解析した。カラム実験と併用することにより、希望する分離性能が達成できる移動相組成を迅速かつ容易に決定できることを明らかとしたクロマトグラフィーは、組換タンパク質医薬品製造において非常に重要な分離プロセスであるにもかかわらず、依然として経験に基づいた設計と操作が中心である。その分離原理は生体認識に基づく移動速度差であるが生体認識と物質移動は独立ではなくリガンド結合力やその分布、溶質、細孔構造も溶質の吸脱着拡散速度に大きく影響する。複数の相互作用が協調的に働いたり、構造変化が生じたりすると一層複雑となる。本研究では、生体認識機構と移動現象を同時に解析し、種々の精密な相互作用解析とともに、その結果を反映するモデルを開発する。また最適分離プロセスを設計するためのデータを迅速に大量に取得できる方法についても検討する。これらのモデルから最適なformatや新規充填剤の設計も可能になる。本年度の研究成果は、下記のとおりである。1)構造変化をともなうタンパク質の分離特性unfold状態のタンパク質のイオン交換クロマトグラフィーの結合状態について既に開発したモデルで解析した。Nativeタンパク質との溶出の順序は一定ではなかったが、結合サイト数はnativeよりは大きな値であった。サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)による分析結果ではunfoldは大きな構造となっていた。Polyethylene glycolによる修飾により、電荷遮蔽効果が顕著となり、保持は非常に弱くなった。SEC分析ではみかけ分子量は増大した。2)モノリス型クロマトグラフィー充填剤を固定化した96wellマイクロプレートによる、ハイスループットシステムを構築した。カラムデータとほぼ対応するデータを取得することができた。クロマトグラフィーは組換タンパク質やDNAなどの医薬品製造において非常に重要な分離プロセスであるが、経験に基づいた設計と操作が中心である。本研究では、クロマト分離に重要な役割を果たしている生体認識機構と移動現象を同時に解析し、その結果を反映するモデルを開発する。これらのモデルから最適なクロマトプロセスのみならず新規充填剤の設計も可能になる。1)DNAのイオン交換クロマトグラフィー分離溶出挙動DNAの塩基数が10以下の単一鎖では結合サイト数はほぼDNAの荷電と対応していた。また溶出塩濃度も直線的に増加した。さらに塩基数が大きくなると結合サイト数も溶出塩濃度もじょじょに頭打ちになった。非常に巨大な二重鎖DNAの分離は困難であるがモノリスの特性である流速に依存しない分離性能を利用することにより非常に緩い塩濃度勾配溶出により分離できることを明らかとした。2)構造変化をともなうタンパク質の分離特性尿素変性したンパク質は未変性タンパク質よりイオン交換クロマトで早く溶出された。これは誘電率の上昇と電荷クラスターが消失したことによる。Polyethylene glycolによる修飾は電荷遮蔽効果を引き起こし保持が弱くなり結合サイトも減少した3)モノリスクロマトdiskを固定化した96wellマイクロプレートによる、ハイスループットシステムを構築した。クロマトグラフィーはバイオ医薬品製造において非常に重要な分離プロセスであるが、経験に基づいた設計と操作が中心である。本研究ではクロマト分離に重要な役割を果たしている生体認識機構と移動現象を同時に解析し、その結果を反映するモデルを開発する。これらのモデルから最適なプロセスのみならず新規充填剤の設計も可能になる。本年度の研究成果は下記のとおりである。勾配溶出実験からの段階溶出の設計方法勾配溶出におけるピーク位置の塩濃度あるいは移動相濃度と規格化した勾配の関係を実験的に作成した。この曲線から分配係数を移動相組成の関数として決定し、それに基づき段階溶出を設計実施した。水系のタンパク質のイオン交換クロマトグラフィー分離および水-エタノール系のポリフェノールの吸着クロマトグラフィー分離のどちらについても予測した結果が得られた。これらの結果から、本方法の有用性が示された。イオン交換モノリスdiskを固定化した96wellマイクロプレートによる、ハイスループットシステムを構築した。タンパク質分離のカラムデータとほぼ対応する勾配溶出データを取得することができた。また動的吸着量についてのデータも取得できた。このシステムでは流速依存性を考慮しなくてよいという利点が明らかとなった。PEG化タンパク質のイオン交換クロマトグラフィー分離では、PEGの結合量が増えると早く溶出されたが、モノPEGでも結合位置が異なると複数ピークに分離することが可能であった。

これらのモデルから最適なプロセスのみならず新規充填剤の設計も可能になる。本年度の研究成果は下記のとおりである。イオン交換モノリスdiskを固定化した、あるいはイオン交換粒子を充填した96wellマイクロプレートによるハイスループットシステムを構築した。タンパク質分離のカラムデータとほぼ対応する勾配溶出データを取得することができた。また動的吸着量についてのデータも取得できた。モノリスのみならず、貫通孔が主体のシステムでは流速依存性を考慮しなくてよいのでハイスループット法は、プロセス設計手法として有用であることが示された。移動相への添加物の効果としてアルギニンを添加したときは特にDNAで顕著な溶出が早くなる現象が観察されたが、吸着サイト数はほとんど変化しなかった。方、PEGを添加すると溶出は遅くなり、その程度は分子量の大きさと対応していた、また吸着サイト数の大きな変化は確認されなかった。これらの知見は、不純物としてのDNAや凝集体の分離精製に重要である。また、医薬品としてのDNA精製に対しても有用な情報となる。