hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
固相イオン交換機構を利用した絶縁／導電化スイッチングの実現と、分子素子への展開

今年度は、化合物のリチウムイオン伝導度制御、固相イオン交換機構の解明、化合物内の溶媒分子の脱吸着に伴う磁気スイッチングに取り組んだ。まず、リチウムイオン伝導制御に関して、イオン伝導経路の歪み率や伝導経路の径の拡張に重点を置いて取り組んだ。その結果、伝導経路の径と歪みが小さな試料で、よりリチウムイオン伝導度が増加することが明らかとなった。このことから、イオン伝導経路の拡張よりも、歪みの抑制がイオン伝導度の向上に効果的であると結論付けられた。続いて、結晶中でリチウムイオン伝導が観測されている試料を塩化カリウム水溶液に浸すことで、結晶中のリチウムイオンをカリウムイオンと交換し、このときのイオン交換機構を解明することに取り組んだ。実験後の結晶について、電子線プローブマイクロアナライザ分析や誘導結合プラズマ発光分光分析、IRスペクトル測定などを行い、イオン交換に関する考察を行った。その結果、結晶を水溶液に浸す条件によっては、水溶液中のカリウムイオンと交換された領域と、されなかった領域が共存することが明らかとなった。このことから、イオン交換平衡やイオン拡散速度に従う従来のイオン交換剤とは、異なる気候で結晶状態でのイオン交換が起こっていることが明らかとなった。さらに、結晶中の有機溶媒分子を加熱により脱離させ、結晶の磁気特性の変化を追跡した。元素分析やIRスペクトル測定、熱重量分析、粉末X線回折測定などから、結晶中の有機溶媒分子の脱離の前後で結晶性が失われないこと、溶媒脱離後の試料を溶媒の蒸気にさらすことで再度溶媒分子が戻ってくることが明らかとなった。このような試料について磁気特性を調査したところ、溶媒の脱離に伴って強磁性的な相互作用が強まり、溶媒分子が戻ってくることで元の磁気挙動に戻ることが確認された。以上のことから、溶媒分子の脱吸着に伴った磁気スイッチングが達成されたと考えられる。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。今年度は、化合物のリチウムイオン伝導度の温度依存性評価、電子供与性コバルトイオンへの固相イオン交換、イオンの繰り返し交換に取り組んだ。まず、リチウムイオン伝導性に関して、脱水後の試料を測定したところ、低周波数側に線形的な挙動が観測された。これはイオン伝導に由来して現れるものであり、測定結果からイオン伝導度は348 Kで4.1E-6 Ωcm、活性化エネルギーは460 meVと見積もられた。また、固体Li-NMRでも半値全幅の温度依存性が観測されたことから、この化合物は熱活性型のリチウムイオン伝導体であることが示唆された。さらに、軸依存性も観測されており、イオン伝導の異方性も確認された。次に、電子供与性イオンとしてコバルトイオンの導入を試みた。結晶中のリチウムイオンを水溶液中のコバルトイオンと交換すると、電荷移動に由来するCTバンドがUV領域からIR領域にシフトすることが示唆された。実際、コバルトイオン交換体の直流比抵抗を測定したところ、室温での比抵抗が7桁低下していた。また、磁化率測定の結果から、ワイス温度は9.4 Kと見積もられた。交流磁化率測定の結果と合わせると、コバルトイオン交換体が強磁性体であることが示唆された。さらに、コバルトイオン交換体の粉末X線回折測定から、イオン交換による結晶構造の変化は起こっていないことが示唆された。この結果を基に、コバルトイオンに交換した試料に銅イオンを導入し、結晶の導電性と絶縁性をスイッチングすることを試みた。実験では、電子供与性コバルトイオンを導入した結晶に、電子受容性銅イオンを再度導入した。この結晶について直流比抵抗の温度依存性を測定したところ、室温での比抵抗がコバルトイオン交換体に対して1桁増加していた。この結果は、電気伝導性のスイッチングに成功したことを示唆している。私が上記のように考えた理由は、当初の研究計画以上に研究が進展を見せたからである。当初の研究計画では、結晶中への電子受容性/供与性イオンの導入によるホール/電子ドーピングの達成と、イオン交換条件の精密検討を挙げていた。それに対して、実際には、化合物群のリチウムイオン伝導度の温度依存性をインピーダンス測定、固体Li-NMR測定を用いて詳細に評価した。これにより、従来まで明らかになっていなかった電子・イオン混合伝導メカニズムを解明する足掛かりを得た。また、電子供与性コバルトイオンへの固相イオン交換を達成しており、「イオンスイッチトランジスタ」開発の前段階である電子供与性イオンの導入に成功した。実際、コバルトイオンの後に銅イオンを導入することで、電気伝導性をスイッチングすることに成功した。ここで、コバルトイオンを導入した系について、IRスペクトル測定、ICP発光分光分析、電子線プローブマイクロアナライザ測定、電気伝導度測定、磁化率測定などを用いて、物性を評価した。これらの結果から、当初の研究計画以上に発展を見せたと考えている。

続いて、結晶中でリチウムイオン伝導が観測されている試料を塩化カリウム水溶液に浸すことで、結晶中のリチウムイオンをカリウムイオンと交換し、このときのイオン交換機構を解明することに取り組んだ。実験後の結晶について、電子線プローブマイクロアナライザ分析や誘導結合プラズマ発光分光分析、IRスペクトル測定などを行い、イオン交換に関する考察を行った。その結果、結晶を水溶液に浸す条件によっては、水溶液中のカリウムイオンと交換された領域と、されなかった領域が共存することが明らかとなった。このことから、イオン交換平衡やイオン拡散速度に従う従来のイオン交換剤とは、異なる気候で結晶状態でのイオン交換が起こっていることが明らかとなった。さらに、結晶中の有機溶媒分子を加熱により脱離させ、結晶の磁気特性の変化を追跡した。元素分析やIRスペクトル測定、熱重量分析、粉末X線回折測定などから、結晶中の有機溶媒分子の脱離の前後で結晶性が失われないこと、溶媒脱離後の試料を溶媒の蒸気にさらすことで再度溶媒分子が戻ってくることが明らかとなった。このような試料について磁気特性を調査したところ、溶媒の脱離に伴って強磁性的な相互作用が強まり、溶媒分子が戻ってくることで元の磁気挙動に戻ることが確認された。以上のことから、溶媒分子の脱吸着に伴った磁気スイッチングが達成されたと考えられる。今後は、平成29年度までに発見したホール/電子ドーピング可能なイオン種以外のものについて探索する。この時、マンガンイオンや鉄イオンなどが新たな候補となり得る遷移金属イオンである。また、拡張したイオン種の組み合わせを検討することで、イオンスイッチトランジスタ開発に繋げる。具体的には、イオン交換によりホール/電子ドーピングを繰り返し行う。この時、注入されたキャリア量を評価するためにICP発光分光分析で組成を精密に決定する。また、イオンの繰り返し導入による構造劣化を評価するために、高輝度X線を用いて精密構造解析を試みる。さらに、導入したイオン種と電気伝導度の相関を利用して、「イオンセンサー」の開発も目指す。この時、交換実験において水溶液のpHや温度を正確にモニタリングすることで、センサーとして駆動する条件を厳密に決定する。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
嚥下メカニズムの解明による喉ごしの定量評価法の開発

本研究では、嚥下における喉ごしを工学的アプローチによって解明するため、嚥下音計測システムと筋電計を用い、試料を単一嚥下で摂取したときの筋活動および嚥下音の計測を行った。そして、嚥下メカニズムを説明するモデルとして、解剖学的知見から咽頭期に作用する筋骨格モデルを構築した。さらに、嚥下音に時間周波数変換と統計処理を適用することで、試料の刺激強度に対して、喉ごしが上に凸の特性を持つことを明らかにし、嚥下時間・刺激強度・喉ごしの関係を説明するモデルを構築した。最後に、嚥下音より嚥下時間を算出するシステムを開発し、嚥下音による喉ごしの評価システムの検討を行った。平成25年度は、飲料物の嚥下時の嚥下音および筋電データを用い、嚥下モデルと主観的評価である喉ごしの関係の解明を目指し、特に、以下の2点に重点を置いて研究を進めた。(1)嚥下方法の推定方法の構築:平成24年度に計測した舌骨上筋群、舌骨下筋群および咬筋の筋電と甲状軟骨の側部の嚥下音に関するデータを用い、嚥下方法の推定方法を検討した。まず、嚥下音に対してWavelet変換による時間・周波数解析を適用し、特徴量として同係数が閾値以上となる部分の時間(嚥下音発生時間)と面積(ハイパワー部面積)を求めた。また、筋電に関する特徴量として閾値以上の筋電が出力された時間(筋電活動時間)を求めた。得られた特徴量に対して統計処理を行った結果、嚥下音発生時間、ハイパワー部面積、筋電活動時間には、試料間に統計的有意差があり、同指標を計測することで、嚥下方法の違い、特に嚥下に要する時間の違いを計測できることが分かった。さらに、嚥下音発生時間、ハイパワー部面積と筋電活動時間の間には類似した傾向があることが示唆された。数学的に記述するには至らなかったが、今後、オトガイ舌骨筋、舌骨胸骨筋の活動時間の傾向を嚥下音より推定できるようになると考える。(2)嚥下における主観的評価である喉ごしと嚥下方法の関係の解明:(1)で得られた特徴量を用い、炭酸強度の違い(強・弱・なし)と嚥下方法の関係を解析した。被験者の主観は水<弱炭酸水<強炭酸水の順で刺激感および炭酸強度が強くなったが、嚥下音発生時間は強炭酸水<水<弱炭酸水の順で大きくなり、強炭酸水ー弱炭酸水間で統計的有意差を確認できた。本結果より、ヒトの嚥下感覚は摂取する試料の刺激強度に対して上に凸の特性を持ち、試料が持つ刺激強度と喉ごしの情報から喉ごしが快の場合は嚥下時間が長く、喉ごしが不快の場合は嚥下時間が短くなるよう、嚥下方法の選択に無意識的な介入が働くことが示唆された。平成24年度は、食品や飲料物の特性を変更しながら嚥下における筋活動および嚥下音の計測を行い、嚥下時の口腔、咽頭の筋活動のモデル化や嚥下と筋活動、嚥下音と関係のモデル化を目指した。特に、以下の3点に重点を置いて研究を進めた。(1)嚥下における筋電・嚥下音の計測:合計で25名の被験者に対し、嚥下における筋電、嚥下音の同時計測実験を実施した。実験試料として、炭酸強度の異なる2種類の炭酸水と水を被験者に摂取してもらった。このときの舌骨上筋群、舌骨下筋群および咬筋の筋電と甲状軟骨の側部の嚥下音を同時計測した。嚥下音の計測には研究代表者らが開発した体内音センサを嚥下音計測用に改良して用いた。得られた嚥下音にはWavelet変換による時間・周波数解析を適用し、特徴量としてハイパワーを持つ部分を抽出した。一方、筋電には絶対値化,ローパスフィルタを適用し、活動時間等の筋活動に関する特徴量を抽出した。また、これらを半自動的に処理するソフトウェアを構築した。(2)嚥下における筋活動のモデル化:解剖学や既存の嚥下における筋活動に関する既存研究に基づき、オトガイ舌骨筋、甲状舌骨筋、胸骨舌骨筋、胸骨甲状筋、舌骨、甲状軟骨から構成され、嚥下における各筋肉の動きを記した嚥下モデルを構築した。(3)筋活動に対応した嚥下音のモデル化:

(1)の計測によって得られた筋電および嚥下音について(2)で構築したモデルを考慮しながら統計的手法で分析した。その結果、嚥下における筋活動として舌骨上筋群、舌骨下筋群および嚥下音の活動順序とその時間差が得られた。また、炭酸強度によって嚥下活動が確認された時間が統計的に有意に異なることが確認された。平成26年度は、飲料物の嚥下時の嚥下音および筋電データを用い、嚥下モデルと主観的評価である喉ごしの関係の解明とこれまでの成果の統合による嚥下音による喉ごし評価システムの開発を目指し、特に、以下の2点に重点を置いて研究を進めた。(1)喉ごし推定方法の構築:合計で12名の被験者に対し、嚥下における筋電、嚥下音の同時計測実験を実施した。実験試料として、これまでに実験してきた炭酸水(強弱の2種類)、水にとろみ付き水を加えた4種類の試料を用い、舌骨上筋群、舌骨下筋群および咬筋の筋電と甲状軟骨の側部の嚥下音を同時計測した。計測結果に対し、昨年度までに開発したWavelet変換を用いた分析手法を適用し、嚥下音発生時間、ハイパワー部面積、筋電活動時間と、そのタイミングの位相差を求めた。その結果、一部の被験者において、不快と感じる強炭酸水、とろみ付き水の2種類で特徴量に類似した傾向が確認された。また、強い刺激が筋活動を惹起していることが示唆された。以上より、数学的記述には至らなかったが、飲料品の嚥下による快・不快の推定に向けた基礎的知見を固めることができた。(2)嚥下音計測システムの開発:これまでの研究成果を統合し、嚥下音を含む音データから嚥下音を自動的に抽出するシステムを開発した。本システムでは、被験者が飲料品を単独嚥下で摂取したときの嚥下音を研究代表者らが開発した体内音センサを用いて計測すると、自動的にWavelet変換を適用し、嚥下音の抽出と、嚥下音発生時間の算出を自動的に実行する。評価実験として、従来の目視による計測との比較実験を行った結果、両者の一致率は87.0%と高く、開発したシステムの有効性を確認できた。本システムによる嚥下音発生時間の計測とこれまでの研究成果を組み合わせることで、嚥下音による喉ごしの評価の達成が示唆された。人間情報学平成25年度の計画では、嚥下方法の推定方法の構築、嚥下における主観的評価である喉ごしと嚥下方法の関係の解明の2つの課題について重点的に取り組む計画であった。この計画に対し、それぞれの項目について計画とほぼ同程度の進捗と成果を得ることできた。以上より、「おおむね順調に進展している」と判断した。平成24年度の計画では、嚥下における筋電・嚥下音の計測、嚥下における筋活動のモデル化、筋活動に対応した嚥下音のモデル化の3つの課題について重点的に取り組む計画であった。最終年度にあたる平成26年度は、これまでに得られた成果を統合し、嚥下音による喉ごし評価システムを開発することを目的とする。また、嚥下における筋活動・嚥下音の計測については継続的に実施し、計測ノウハウと知見の蓄積を行う。平成25年度は、嚥下モデルを用いた嚥下と主観的評価である喉ごしの関係の解明を目指し、(1)嚥下方法の推定方法の構築、(2)嚥下における主観的評価である喉ごしと嚥下方法の関係の解明に重点を置いて研究を遂行する。最終年度にあたる平成26年度は得られた成果をを統合し、(3)嚥下音による喉ごし評価システムを開発する。当初、国際会議での成果発表を計画していたが、投稿を見送ったため、旅費を大幅に圧縮することができた。また、計画よりも少ない実験被験者数で本年度の成果が得られたため、実験に関わる費用(消耗品費、謝金等)を圧縮することができた。本研究で実施する嚥下時の筋活動・嚥下音計測実験では筋電計測・嚥下音計測システムおよび解析ソフトウェアが必須となる。平成26年度は筋電および嚥下音の分析に使用する数値解析ソフトウェア
Pseudo-Hapticsを利用した視触力覚ディスプレイ

本研究の目的は,視覚を利用して擬似触力覚を生成できるPseudo-Hapticsの効果を利用して,簡易な機構で多様な形状を触っている感覚を提示可能な視触力覚システムを実現することにある.本研究課題では,ユーザが物体に触る手の動きや姿勢を空間的に変調して視覚提示することでPseudo-Haptics効果を生起させ,物体形状に対する知覚を操作する手法を提案・実証し,本手法を用いることで物理的に複雑な機構を用いることなくインタラクティブな形状提示が可能なディスプレイを構築した.本研究の目的は, Pseudo-Hapticsを利用した視触力覚ディスプレイの構築である.提案システムは,単純な触力覚を物理的に提示する触力覚提示部と,Pseudo-Hapticsを誘発する視覚提示部より構成される.本研究は(1) Pseudo-Hapticsによる引き込み可能範囲の評価,(2)インタラクティブな視触力覚ディスプレイ手法の確立,(3)最終的なシステム構築と評価・最適化の3テーマからなる.(1)について,本年度はPseudo-Hapitcsを用いた不連続面(角面)の物体内における配置位置・角度の知覚操作能力を検証すると共に,その性能限界を割り出した.角面の配置位置に関しては視覚提示形状が実際の角間距離の0.7倍から1.4倍の範囲内で,配置角度に関しては実際の角度に対し-35度から+30度の範囲内で操作できることを明らかにした.また,手の姿勢を変調して提示する把持物体の大きさ知覚操作手法に関しても検討を行ない,母指と示指で把持した物体の大きさについて,実際の大きさの0.6倍から1.4倍の範囲で操作できることが示された.(2),(3)については,(1)で検証した手法を統合し,形状知覚をインタラクティブに変化させるシステム「MagicPot」を制作した.ユーザが触りたい形状をタッチパネル上に描く事で,システムがPseudo-Hapticsを生起させるための空間歪みを自動生成する.これによりユーザは実際には形状変形しない円筒物体を触っているにもかかわらず,あたかも様々な物体を触っているような体験が可能になる.このシステムをSIGGRAPHやCEATECで展示し,のべ3000人を超える人々に体験させた.また,本システムの形状知覚操作能力や,視覚フィードバックにより受ける違和感について被験者実験を行い,システムの性能が当初目標を達成していることが示された.本研究の目的は,視覚を利用して擬似触力覚を生成できるPseudo-Hapticsの効果を利用して,簡易な機構で多様な形状を触っている感覚を提示可能な視触力覚システムを実現することにある.本研究課題では,ユーザが物体に触る手の動きや姿勢を空間的に変調して視覚提示することでPseudo-Haptics効果を生起させ,物体形状に対する知覚を操作する手法を提案・実証し,本手法を用いることで物理的に複雑な機構を用いることなくインタラクティブな形状提示が可能なディスプレイを構築した.本研究の目的は, Pseudo-Haptics効果を利用した視触力覚ディスプレイの構築である.Pseudo-Haptics効果とは視覚を利用して疑似触力覚を生成できる効果であり,物理的なデバイスを用いることなくある程度の触力覚が提示できる可能性が近年の研究で明らかになっている.本研究ではこの効果を汎用的な触力覚提示手法と,従来手法では不可能な複雑形状を触った際の触力覚を合成・提示可能なシステムの構築を目指す.提案システムは,単純な触力覚を物理的に提示する触力覚提示部と,Pseudo-Haptics効果を誘発する視覚提示部より構成される.本研究は(1) Pseudo-Haptics効果による引き込み可能範囲の評価,(2)インタラクティブな視触力覚ディスプレイ手法の確立,(3)最終的なシステム構築と評価・最適化の3テーマからなる.本年度は,(1)Pseudo-Haptics効果による引き込み可能範囲の評価として,物体との接触方法をなめらかな面と角という二つの要素にわけ,それぞれについて物理的に提示される触力覚刺激に対し,ユーザの知覚をどの程度変化させることが可能かを検討した.まずPseudo-Haptics効果を誘発するための実験システムを構築した.このシステムでは,実際の物体をなぞっているユーザの手の動きを時間的・空間的に変換し,任意の形状のバーチャルなオブジェクトを触っているかのようなフィードバックを与えることができる.このシステムを用いて,なめらかな面については二次元および三次元曲面の曲率,角については角の位置および角度をPseudo-Haptics効果によってどの程度操作可能であるかを実験によって明らかにした.この成果をもとに,局面と角という要素を組み合わせて複雑な形状が提示できる視触力覚ディスプレイの基本設計を検討した.計画通り順調に研究が進展しているため.これまでに最終的な視触力覚ディスプレイを構成するための基本要素は順調に進んでいるため,引き続き同じ体制で研究を推進し,基本要素を組み合わせた複雑な形状提示が可能な視触力覚ディスプレイの構築を目指す.次年度はこれまでの成果を統合した視触力覚ディスプレイの構築のために物品費を使用するほか,得られた成果を発表するための旅費や学会参加費,論文等校費等に研究費を使用する計画である.
多機能性蛋白質レギュカルチン遺伝子の臓器特異的発現を調節する転写因子の解析

レギュカルチン(regucalcin)は多機能性を有する細胞内情報伝達系の制御蛋白質である。本蛋白質は臓器特異的発現を示し、特に肝臓及び腎臓に高発現しており、心臓並びに大脳においても僅かであるが発現している。本研究は、レギュカルチン遺伝子の臓器発現を調節する転写因子を同定し、その機能を解析することにより、臓器特異的遺伝子発現の仕組みを解明することを目的としている。これまでの研究で、レギュカルチンプロモーター領域(-710+157)のTTGGC配列(-512付近)に結合する転写因子NF-A1とRGPR-P117(新規)を見出した。本年度においては、クローン化ラット近位尿細管NRKS2E細胞培養系において、これらの蛋白質のcDNAを遺伝子導入し、レギュカルチンmRNAの発現が増進されるのかを、TTGGC配列欠失ムュータントを用いて、レポータージーン(ルシフェラーゼ)アッセイ法で調べた。NF-A1あるいはRGPR-P117遺伝子導入細胞培養系において、レギュカルチンmRNAが有意に増加し、TTGGC配列を欠失したミュータントにおいてはその発現増加がみられず、レギュカルチン遺伝子発現を高める転写因子としてのNF-A1とRGPR-P117の役割が明らかになった。さらに、神経細胞に分化する未分化胚性腫瘍細胞株P19細胞の培養系において、神経細胞への分化にともなって、レギュカルチンプロモーター領域(-710+157)のどの部分に転写活性を高める領域が存在するのかを調べた。プロモーター領域(-81-69)に転写活性を増進する因子が作用し、-102-81の領域にその治性増加を制御(折制)する因子が存在することを見出した。分化した神経細胞においても、転写促進と折制に関与する因子が見出された。本蛋白質は臓器特異的発現を示し,特に肝臓及び腎臓に高発現しており,他の臓器においても僅かに発現している。本研究は,レギュカルチン遺伝子の臓器特異的発現を調節する転写因子の解明を目的とした。すでに,レギュカルチンが高発現する肝臓及び腎臓において,レギュカルチンプロモーター領域に関与する転写調節因子の可能性のあるNF1-A1とRGPR-p117(regucalcin promoter region-related protein;筆者らにより発見・命名された)が同定されている。本年度の研究では,RGPR-p117について,特に,生物種におけるそのcDNAの同定と構造を比較し,転写因子に特有なロイシンジッパー構造がヒト,マウス,ラット,ウシ,ウサギ,ニワトリに高く保存されていることを明らかにした。腎近位尿細管細胞NRK52E細胞培養系において,RGPR-p117を発現増加したトランスフェリタントを作出し,その発現増加がレギュカルチンmRNAとその蛋白質レベルを増進させることを見出した。RGPR-p117は細胞質から細胞核に移行することが明らかとなり,この移行はホルモン(副甲状腺ホルモン;PTH)刺激により高められることが示された。RGPR-p117 mRNAの発現変動をRT-PCR法で調べると,PTH刺激した細胞で有意に増加することが見出された。RGPR-p117の発現増加がレギュカルチンmRNAレベルを上昇することは各種細胞内シグナル伝達系に関与するプロテインキナーゼ及びプロテインホスファターゼの活性阻害剤に存在下で培養したときにほぼ完全に抑制された。これらの知見から,RGPR-p117はレギュカルチン遺伝子発現を調節する転写因子であると考察された。
発達性協調運動障害を対象とした，運動機能評価尺度および運動プログラム開発

本研究では,「発達性協調運動障害」を対象として,個別性を重視した,評価・運動指導のためのマニュアル開発を行う.「発達性協調運動障害」は,感覚入力,姿勢制御,空間認知,運動イメージ等,様々な要因が,複雑に関連した障害構造を有している.このために,多面的な評価なくしては,個別性に適切に対応した運動指導プログラムは不可能である.「発達性協調運動障害」たいする,運動指導プログラムは,標準となる方法は確立していない.我々は,2016-2018年基盤研究(C)の成果の結果を発展させ,「発達性協調運動障害」に焦点を当てた,個々の障害特性を把握し,適切な運動指導プログラム立案のマニュアルを開発する.本研究では,「発達性協調運動障害」を対象として,個別性を重視した,評価・運動指導のためのマニュアル開発を行う.「発達性協調運動障害」は,感覚入力,姿勢制御,空間認知,運動イメージ等,様々な要因が,複雑に関連した障害構造を有している.このために,多面的な評価なくしては,個別性に適切に対応した運動指導プログラムは不可能である.「発達性協調運動障害」たいする,運動指導プログラムは,標準となる方法は確立していない.我々は,2016-2018年基盤研究(C)の成果の結果を発展させ,「発達性協調運動障害」に焦点を当てた,個々の障害特性を把握し,適切な運動指導プログラム立案のマニュアルを開発する.
『英語能・リア王』創作に関する研究

所期の計画の約8割を実施することができた。以下にその概要を記す。1.『英語能・リア王』台本創作に必要な調査研究および資料収集を国立能楽堂その他で行なった。また何人ものシェイクスピア研究者・能楽研究者・プロの能狂言演者たちと意見交換を行なった。2.上記研究や資料収集に並行して、計画通り二種の台本を構想した。すなわち、(1)シェイクスピア原作の雄大なスケールを移した大作、(2)公演し易い形に短縮したものである。3.執筆のためのさまざまな資料収集を続けながら、上記二種のうち(1)の台本の初稿を執筆した。4.アメリカ人の能楽研究者ダン・ケニ-、リチャード・エマート、スティーヴン・コ-ミ-の三氏に上記英文台本を提示し意見を求めた。5.三氏の意見を尊重して台本を推敲した。また(1)ではなく(2)の短縮台本を差しあたり公演用台本として脱稿した。6.上記台本により、学生や「シェイクスピア能研究会」会員で稽古を重ね、能舞台で二回試演を行なった。経費と時間の関係から、能楽の専門家による校閲を受けるところまでゆかなかった。以上がこれまでの実施概要である。すなわち所期の計画のうち実行出来なかったのは、本格的な舞台発表である。幸い上記アメリカ人能楽研究者たちも、この台本による英語能の公演を自らも演者として願っているので、囃子方などプロの演者による台本校閲・出演協力を得て、近い将来ぜひ公演を実現したい。まだ外国語による能の可能性は疑問視されているが、この公演を成功させて、その可能性を証明したいと願っている。
自己組織化強誘電ポリマー球体内への二次高調波の閉じ込めと増幅

研究計画において強誘電ポリマーであるPVDF-TrFEを用いての実験を計画していた。実際、PVDF-TrFEからなるポリマー球体および内部色素添加、そこからの共振ピーク観測までは実現した。閉じ込められた光の第二次高調波への変換が観測されることを期待したが、それらは得られなかった。一つの問題として、PVDF-TrFEの第二次高調波変換率が非常に低いことがあげられた。そのため現在、その他の非線形光学色素に着目し、材料の模索を行っている。本年度は主に、有機材料からなる波長変調・光スイッチ特性有する光共振器開発に着目し実験を行った。第一にドナー・アクセプターの関係性にある異なるユニット数を持つ炭素架橋フェニレンビニレン分子(COPV)を用い、自己組織化および光学特性の評価を行った。COPV分子は、ドナー・アクセプターどちらの分子も集合化により非常に形の整った菱形の結晶を構築することを見出した。またこのドナー・アクセプター分子を混合して集合化することでドナー結晶中にアクセプター分子が分散した有機混晶が作成できることが明らかになった。これらの結晶は結晶自身が光増幅させる共振器として働き、レーザー発振特性が得られることが明らかになった。また混晶においては、アクセプター分子の存在により、ドナー分子の利得領域が変化し、発振波長をアクセプターの添加量によって変調できることを見出した。第二に、光スイッチ分子である蛍光性ジアリールエテン(DAE)分子を用いて、集合化および光スイッチ可能な共振器開発を行った。結果として、用いたDAE分子は集合化法により真球および偏平状の球状構造体が得られることが明らかになった。またこれらの構造の違いから、異なる光共振特性が得られることを見出した。形状の違いより誘発される共振特性の変化は、理論計算からも明らかとなった。また、これらの構造体アレイの構築にも成功した。研究計画に関する研究は、実現までに多くの改善点があり、今後実現のために試行錯誤していく必要がある。しかしながら、本年度は、有機低分子から得られた自己組織化構造体から非常に興味深い物性を見出すことに成功した。またそれらの現象に関する理解も深めることができた。炭素架橋フェニレンビニレン分子(COPV)に関する研究においては、有機混晶の作成及びそこからのレーザー発振の変調までを実現した。有機材料は、大きな格子定数故に分子結晶中に他分子を導入することが難しいことで知られる。しかしながら、類似の構造を持ち、またπ平面が巨大な側鎖によって囲まれたCOPVを用いることで有機混晶の作成に成功した。また、混晶中に含まれるアクセプター分子の量によりレーザー発振特性の変調に成功した。これまで、有機混晶を用いたレーザー発振波長変調に関する報告は無く、新しい波長変調材料を開発したと言える。また、光スイッチ分子であるジアリールエテン分子を用いた研究においては、共振発光の光スイッチングを可能とする光共振器の開発を行えた。また、自己集合法を制御することで得られる偏平状の球状構造体からは、共振ピークが分裂した特異な共振スペクトルを得ることに成功した。また親水・疎水のパターニング基板上での直接堆積法により、DAE構造体が疎水パターンに沿って綺麗に配列する現象も見出した。これらは光スイッチ共振器であるとともに、光ディスプレイとしての可能性を提唱する結果である。その他にもホウ素化合物結晶からの特異な発光特性も見出すことができた。これらのことを考慮すると、今年一年で大きく研究を発展させることができたと言える。これまで、強誘電ポリマーであるPVDF-TrFEからなる球状構造体の構築や、内部色素添加、そこからの共振発光の確認までは行えている。二次高調波の閉じ込めを実現するには、より強い光を内部に閉じ込める必要がある。また、二次高調波に変換された後の材料への吸収を抑制するため、発光の1/2倍波長が、PVDF-TrFEの吸収に重ならない蛍光色素を添加し、レーザー発振を実現させる。またPVDF-TrFEの非線形光学効果はあまり強くないため、他材料の検討も行う必要がある。また、最終年度であるため、論文執筆に向けた研究遂行を行う。光スイッチ共振器に関する物性は、親水・疎水のパターニングにより、構造体アレイの構築はできているので、自己集合化法をさらに検討することで、共振器として働く構造体のアレイ構築を目指す。ホウ素化合物から得られる特異な発光特性及び多色発光を示す有機結晶に関する研究についても積極的に進める。本研究は、なぜ特異な発光特性が得られるのか、また発光色の違いは何から生まれるのか、それらを明らかにするために、本ホウ素化合物の基礎的な物性から評価していき、その解決を目指す。また自己集合プロセスにも着目し、その集合化過程も明らかにしていく。そして、論文執筆を行う。有機材料からなる新規微小光共振器の開発を元に研究を行った。1年度目は、強誘電ポリマー球体内への第二次高調波の閉じ込めと増幅という目的に向け、強誘電ポリマーからの球体作成、蛍光色素添加、WGM発光の確認まで行った。強誘電ポリマー(PVDF-TrFE)は界面析出法を用いた溶液プロセスにて球状構造体を形成することが明らかになった。またその析出プロセス中に蛍光色素を加えることで、様々な蛍光色素のポリマー球体内への添加を行うことが可能であり、蛍光色素を含んだPVDF-TrFE球体を作成できることが明らかになった。

作成した球状構造体1粒子に対し、集光したレーザーを照射し、その発光スペクトルを観測すると球体内全反射、Whispering Gallery Modeに由来する周期的な鋭い発光スペクトルを観測することに成功した。これは第二次高調波の閉じ込めに向けた目標への第一ステップでありそれを実現することに成功した。また、新規光共振器の開発を目指し、単一の蛍光色素を用い、その凝集状態を変化させるだけで多様な発光色を示す光共振器の開発にも成功した。これらの球体をマイクロマニピュレーターを用いて配列させると、共振器を介して接点における効率的なエネルギー移動が起き、長距離に渡るエネルギー移動を実現できることが明らかになった。また、その他の有機蛍光色素からなる共振器を開発することでも、新規な光現象を見出すことに成功した。今後はその現象解明にも取り組んでいく予定である。申請テーマ1年度目の研究計画は、強誘電ポリマー球体の作成、そこへの蛍光色素の添加、及び1粒子からのWGM発光の確認であった。実際の研究進捗状況としては、強誘電ポリマーからなる球状構造体形成のための自己組織化法を開拓することに成功し、そこへの様々な蛍光色素添加も行えることが明らかになった。またそこからのWGM発光を確認することにも成功しており1年度目の研究進捗状況としては、概ね順調に進んでいると考えられる。研究計画において強誘電ポリマーであるPVDF-TrFEを用いての実験を計画していた。実際、PVDF-TrFEからなるポリマー球体および内部色素添加、そこからの共振ピーク観測までは実現した。閉じ込められた光の第二次高調波への変換が観測されることを期待したが、それらは得られなかった。一つの問題として、PVDF-TrFEの第二次高調波変換率が非常に低いことがあげられた。そのため現在、その他の非線形光学色素に着目し、材料の模索を行っている。本年度は主に、有機材料からなる波長変調・光スイッチ特性有する光共振器開発に着目し実験を行った。第一にドナー・アクセプターの関係性にある異なるユニット数を持つ炭素架橋フェニレンビニレン分子(COPV)を用い、自己組織化および光学特性の評価を行った。COPV分子は、ドナー・アクセプターどちらの分子も集合化により非常に形の整った菱形の結晶を構築することを見出した。またこのドナー・アクセプター分子を混合して集合化することでドナー結晶中にアクセプター分子が分散した有機混晶が作成できることが明らかになった。これらの結晶は結晶自身が光増幅させる共振器として働き、レーザー発振特性が得られることが明らかになった。また混晶においては、アクセプター分子の存在により、ドナー分子の利得領域が変化し、発振波長をアクセプターの添加量によって変調できることを見出した。第二に、光スイッチ分子である蛍光性ジアリールエテン(DAE)分子を用いて、集合化および光スイッチ可能な共振器開発を行った。結果として、用いたDAE分子は集合化法により真球および偏平状の球状構造体が得られることが明らかになった。またこれらの構造の違いから、異なる光共振特性が得られることを見出した。形状の違いより誘発される共振特性の変化は、理論計算からも明らかとなった。
Ｓｃａｐｔｏｍｙｚａ属ショウジョウバエの系統進化

Scaptomyza属のショウジョウバエは約6割の種がハワイ固有で、残りが大陸に分布する。これらがハワイ起源でその一部が大陸に分散したのか、逆に大陸起源で一部がハワイで適応放散したのかが疑問である。本研究は、この問題を検証することを目的に、Scaptomyza属の5亜属11種について、11遺伝子の塩基配列を新たに決定した。そして、これに既知79種の配列情報を加えて分子系統樹を構築し、祖先系統の分布域と分岐年代を推定した。その結果、本属はハワイ起源ではなく、大陸種の一部がハワイに移住したという大陸起源説が支持された。さらに、大陸からハワイへの移住は1回のみならず、2回独立に生じたと推定された。Scaptomyza属のショウジョウバエは約6割の種がハワイ固有で、残りが世界中に広く分布するが、これらがハワイに起源を持ち、その一部が各大陸に分散したのか、あるいは大陸のどこかに起源を持ち、その一部がハワイで適応放散したのかが、ショウジョウバエ系統学における長年の疑問の一つである。本研究課題は、核およびミトコンドリアゲノムの両者を指標とした分子系統学的解析を行なうことで、ショウジョウバエ科におけるScaptomyza属の起源を推定するとともに、ハワイと大陸を介した、本属に特異的な適応放散の過程を明らかにしようと試みる。今年度は、大陸産のScaptomyza属11種に対して、n(l)tid、cad-r、marf、およびgstdの4遺伝子について配列決定を行ない、そのうち3つの遺伝子については、11種中710種の個体で塩基配列を決定することができた。また、今年度になり、ハワイ産Scaptomyza属数十種における複数遺伝子の塩基配列が海外の研究者によって決定され、データベース上に公開された。そこで、本研究で得られた配列情報にこれらの配列情報を加えてアライメントし、最尤法により分子系統樹を再構築した。その結果、得られた分子系統樹において、ハワイ産のScaptomyza属は単系統群を形成せず大きく2つの系統にわかれ、一方で、大陸産のScaptomyza属はハワイ産2系統のそれぞれに対して側系統的に枝分かれするという分岐関係を示した。これらの結果は、本属がハワイ起源ではなく、大陸のどこかに起源を持ち、その一部がハワイで適応放散したという大陸起源説を支持する。今年度は、大陸産のScaptomyza属11種に対して、アルコール脱水素酵素(Adh)、16S ribosomal RNA (16S)、cytochrome c oxidase I (COI)、cytochrome coxidase II (COII)、およびNADH dehydrogenase subunit 2 (ND2)の塩基配列を新たに決定し、既に報告されているショウジョウバエ種の塩基配列を併せて系統解析を行った。その結果、本属のハワイ固有種も大陸産種もそれぞれ複数のクレードに分かれ、何れも単系統群を形成しなかった。また、小笠原固有種のS. boninensisは、S. anomala、およびS. palmaeからなるハワイ固有の系統との近縁性が強く示唆された。これらの系統関係から、本属のハワイ固有種と大陸種の関係は今まで考えられていたよりも複雑であり、過去に移動が複数回起きた可能性や、ハワイー大陸間の相互で移動があった可能性が示唆された。本研究課題は、これまで、大陸産Scaptomyza属ショウジョウバエ11種について、延べ11遺伝子の塩基配列を新たに決定することができた。

そこで、これにデータベース上に公開されている既知の79種の塩基配列を併せてアライメントし、最尤法、ベイズ法を用いて分子系統樹の再構築するとともに、祖先分布および分岐年代の推定を行なった。その結果、得られた分子系統樹において、ハワイ産のScaptomyza属は大きく2つの系統にわかれ、大陸産のScaptomyza属はハワイ産2系統のそれぞれに対して側系統的に枝分かれするという分岐関係を示した。そして、この分子系統樹に基づく祖先分布の推定結果は、本属がハワイ起源ではなく、大陸種の一部がハワイに移住したという大陸起源説を強く支持した。さらに、大陸からハワイへの移住は1回のみならず、約一千万年前後に2回独立に起こったであろうことが示唆された。分子系統学今年度は、大陸産のScaptomyza属ショウジョウバエを中心に、さらに4つの核遺伝子について塩基配列の決定を行なった。また、最近得られたハワイ産Scaptomyzaの塩基配列データに、本研究で得られた塩基配列を加えて構築した系統樹は、本属の起源がハワイではなく大陸である可能性が高いという、従来はマイナーとされてきた仮説がむしろ支持されるという興味深い見解が得られた。従って、現在までの達成度については、おおむね順調に進展していると判断される。今年度は、大陸産のScaptomyza属ショウジョウバエを中心に、5つの遺伝子領域について塩基配列を決定することが出来た。そして、得られた結果は、本属の適応放散の過程が今まで考えられていたよりも複雑であるという興味深い見解を与える。ただし、今年度は既知のプライマーを用いた系統解析に終始し、新規プライマーを用いた解析までには至らなかったことが反省点として残される。平成26年度も、原則として平成25年度の作業を継続するが、下記の理由により、今後は核DNA領域の塩基配列決定と分子系統解析の作業に集中する。1.試料収集およびDNA抽出:初年度からの継続した解析により、いくつかの試料については、PCR反応のための鋳型DNAが不足しつつある。そこで、このような試料については、再度野外採集を行なって試料個体を確保し、解析のために必要なDNAを改めて抽出する。2.塩基配列決定:平成25年度に引き続き、新規プライマーを用いた塩基配列決定の作業に力を注ぐ。具体的には、ショウジョウバエゲノムのデータを利用して核DNA領域の塩基配列を決定するためのPCRプライマーを設計する。そして、設計できたものについては順次PCR反応を行なって塩基配列を決定し、アライメントを行なう。なお、これまでは核DNAのみならず、ミトコンドリアDNAの配列決定も継続的に行なってきたが、最近の他の研究によって、ミトコンドリアDNA領域については、かなりの配列情報がデータベース上で得られるようになった。従って、今後はとりわけ核DNA領域の塩基配列決定に集中する。3.分子系統樹構築および分岐年代と祖先分布の推定:上記作業で得られた新たな塩基配列データに、アライメント可能な全ての配列データを併せて分子系統樹を構築し、Scaptomyza属の系統学的位置、およびScaptomyza属内における大陸産種とハワイ固有種間の系統関係を推定する。
視床下部ミクログリアに焦点をあてた熱射病の病態生理解明と治療法の開発

この研究は、熱射病時の中枢神経系でのミクログリアの関与を検討し、その制御法を開発することである。マウス熱射病モデルを用いて、熱曝露による中枢神経のミクログリア活性化、炎症メディエーター発現の解析を行った。炎症メディエーターの脳内濃度は熱曝露により上昇した。microglia inhibitorであるminocyclineでマウスを処置すると、脳内炎症メディエーター濃度の上昇は抑制された。microgliaの活性化と炎症メディエーター濃度上昇の関連が示唆された。Minocyclineはmicroglia活性による炎症反応を抑制することで、熱射病の治療に有用である可能性が示唆された。1.熱曝露により中枢神経系(視床下部)障害が発生するか評価する。2.中枢神経系(視床下部)障害発生におけるミクログリア活性化と炎症メディエーター、vasopressinの関与を評価する。3.中枢神経系(視床下部)の炎症活性制御を行なうことで熱射病の治療効果が上がるか、予防効果があるかについて評価を行ない、熱射病戦略を開発する。以上3項目について検討し、熱射病発生における中枢神経異常(視床下部ミクログリア活性化)の関与について解明し、それを制御する戦略を開発、熱射病の発生、死亡率の低下を図ることがこの研究の目的である。平成25年度は以下の研究を行った。研究1:熱曝露により発生する中枢神経(視床下部)障害の評価。研究2:熱暴露による中枢神経(視床下部)のミクログリア活性化、炎症メディエーターとvasopressin発現の解析。熱曝露により脳虚血・低酸素マーカーであるglutamateの脳内濃度は上昇した。また神経障害マーカーであるglycerol濃度も上昇した。中枢神経内での炎症メディエーターであるHMGB1, IL-1beta, IL-6, TNF-alphaの濃度も上昇した。microglia inhibitorであるminocyclineでマウスを処置(腹腔内投与)した場合、炎症メディエーター濃度の上昇は抑制された。これによりmicrogliaの活性化と炎症メディエーター濃度上昇の関連が示唆された。近年、異常高温環境が人体に影響を及ぼすことが社会問題になっている。熱射病は現在でも非常に高い死亡率を示しているが、病態生理はいまだ不明な点が多い。本研究の目的は、1.異常高体温時に発生する中枢神経系の障害を評価する。2.中枢神経系の障害における炎症活性の関与を確認する。3.炎症活性制御による熱射病の治療戦略を開発する。以上について検討し、熱射病発生における中枢神経障害(視床下部ミクログリア活性化)の関与について解明し、それを制御する戦略を開発、熱射病の発生、死亡率の低下を図ることである。C3H/HeN(male, 8-10 weeks old、weighing 20-25g)マウスを人工気象室で暑熱環境下、熱曝露を4時間行い、熱射病モデルを作成した。熱曝露後は室温環境(25°C)に戻した。熱曝露後、イソフルラン麻酔下に血液、臓器採取(脳:視床下部)を行った。血液はEDTA添加シリンジに心臓穿刺で採取後、遠心を行い血清分離し測定まで-80°Cで保存した。平成24年度は炎症メディエーターであるHMGB1, IL-1beta, IL-6, TNF-alphaの中枢神経内濃度をELISAで測定した。熱曝露2時間で中枢神経内のHMGB1, IL-6濃度は上昇していた。血中の炎症メディエーター濃度も著明に上昇した。次にmicroglia inhibitorであるminocyclineでマウスを処置(腹腔内投与)した場合の炎症メディエーター濃度の変化を評価し、microgliaの活性化と炎症メディエーター濃度上昇の関連を検討した。minocycline処理マウスの血中炎症性メディエーター濃度は非処理マウスと比べ有意差はなかったが、中枢神経内濃度は有意に抑制された。ミクログリア活性化が熱射病による中枢神経炎症性メディエーター濃度増加に関与していることが示唆された。

C3H/HeNまたはC3H/HeJ mice (male, 8-10 weeks old、weighing 20-25g)を人工気象室で暑熱環境下(4243°C,湿度50%、水分制限なし)、熱曝露を4時間行い熱射病モデルを作成した。熱曝露後、イソフルラン麻酔下に血液、臓器採取(脳:視床下部)を行った。血液はEDTA添加シリンジに心臓穿刺で採取後、遠心を行い血清分離し測定まで-80°Cで保存した。研究1:熱曝露により発生する中枢神経(視床下部)障害の評価中枢神経障害を評価するため、脳虚血・低酸素マーカーであるglutamate, lactate-to-pyruvate ratio, nitrite, dihydroxybenzoic acidの視床下部内濃度を測定した。研究2:熱曝露による中枢神経(視床下部)のミクログリア活性化、炎症メディエーターとvasopressin発現の解析中枢神経内でのmicroglia活性化を調べるため、炎症メディエーターであるHMGB1,IL-1beta,IL-6,TNF-alphaの中枢神経内濃度をELISAで測定した。さらvasopressin濃度変化検討も行った。次にmicroglia inhibitorであるminocycline、resveratolでマウスを処置(腹腔内投与)した場合の炎症メディエーター濃度の変化を評価し、microgliaの活性化と炎症メディエーター濃度上昇の関連を確認した。麻酔科学動物実験を行う予定が様々な問題で少なくなり、サンプリングに遅れが生じている。熱射病による中枢神経障害発生の機序として炎症性メディエーター(HMGB1,炎症性サイトカイン)を介した機序が今までの研究で明らかにされた。われわれの今までの研究から、熱暴露による死亡率は暴露時間が一定の時間を超えると急激に上昇することが明らかになっており、この死亡率の上昇は臓器障害だけでは説明できず、中枢神経系の障害が関与している可能性が示唆される。マウスモデルにおいても臨床でみられるような異常高体温の持続が認められ、体温調節の破錠が考えられる。本研究は、中枢神経系、特に体温調節中枢であり体浸透圧調節に重要なvasopressinを産生する細胞が集まっている視床下部に焦点を当て、免疫細胞であるmicroglia活性の面から熱射病発生機序への関与を検討することを目的としている。平成24年度研究で中枢神経microglia活性化が熱射病発生機序へ関与している可能性も明らかになった。今後、中枢神経障害とミクログリア活性化、炎症メディエーター、vasopressin発現との関連解析を行う予定である。ミクログリア活性化、炎症メディエーター、vasopressin濃度と中枢神経障害の程度を比較検討し、ミクログリア活性化、炎症メディエーター、vasopressinが中枢神経障害に関与していることを確認する。また、トロンボモジュリンによる中枢神経障害、致死率制御の評価を行う。トロンボモジュリンによる中枢神経でのミクログリア活性化、炎症メディエーターとvasopressin発現制御、トロンボモジュリン投与タイミングの検討を行う予定である。
Siglec-Hの新規ミクログリアマーカーとしての可能性とその機能に関する研究

Sialic acid binding Ig-like lectin (Siglec)-Hがミクログリア特異的マーカー分子となる可能性を検討した。免疫組織化学やRT-PCRにより、Siglec-Hは、神経系でミクログリアには発現するが、脳内の常在性マクロファージや末梢のマクロファージには発現しないことを示した。さらに、Siglec-H遺伝子座へのノックインマウスを用いた解析から、Siglec-H遺伝子座のミクログリア特異的遺伝子改変への有用性を示した。また、Siglec-H欠失マウスの解析から、Siglec-Hがミクログリアの炎症性反応を抑制する可能性が示唆された。脳に存在するミクログリアは“脳内マクロファージ"と呼ばれることもあるように、マクロファージと類似点が多い。共通の発現分子が多く、それら二種の細胞を組織学的に区別するミクログリア特異的なマーカーは発見されていない。本研究では、Siglec-Hのミクログリア特異的マーカーとしての検討とその機能解明を目標とする。本年度、まず免疫組織化学に使用できる抗体の作成を試みた。Siglec-H細胞外ドメインのFc融合タンパク(Siglec-H-Fc)を恒常的に発現するCOS-7細胞株を作成し、その培養上清からリコンビナントタンパクを精製した。Siglec-H-Fc、またはSiglec-H細胞内ドメインの合成ペプチドを免疫したラットから、リンパ節法により、免疫組織化学でミクログリアが染色されるモノクローナル抗体を得た。次に、それらの抗体を用い、ミクログリアとマクロファージにおけるSiglec-Hの発現を比較した。運動神経切断モデルマウスにおいて、損傷ニューロンの細胞体周辺で活性化したミクログリアには明確なシグナルが見られたが、損傷軸索周辺に浸潤したマクロファージではシグナルが見られなかったため、Siglec-Hはミクログリア特異的分子であることが示唆された。また、本年度、Siglec-Hのミクログリアにおける機能解析のため、Siglec-Hノックアウトマウスを搬入した。主に初代培養ミクログリアを用いたin vitroの実験系で、Siglec-Hの欠損がミクログリアの形態や分子発現に及ぼす影響を現在解析している。前年度に作成した抗体は、特殊な方法による切片の固定が必要であったため、今年度さらに有用な抗体の取得を試みた。パラホルムアルデヒド固定切片で染色可能な抗体が得られたため、その抗体を用いて舌下神経損傷モデルマウスを解析した。その結果、Siglec-Hは損傷神経細胞周囲で活性化するミクログリアに発現するが、神経切断端に集積するマクロファージには発現していないことを明確に示すことができた。さらにRT-PCR解析からmRNAレベルでも同様の結果を得た。前年度搬入したSiglec-Hノックアウトマウスを用いて、運動神経損傷時におけるSiglec-Hの機能解析を行った。ミクログリアの数と形態は野生型マウスと同様であったが、一部のミクログリアに発現する炎症性分子について発現変動が見られたため、in vivoでもSiglec-Hがミクログリアの炎症性反応に関わる可能性が考えられた。また、Siglec-Hのリガンド探索を、前年度に作成したSiglec-H-Fcリコンビナントタンパクを用い生化学的手法で行ったが、同定はできなかった。前述のSiglec-HノックアウトマウスはSiglec-Hの遺伝子座にジフテリア毒素受容体がノックインされているため、ジフテリア毒素の投与により、Siglec-H発現細胞のみが死に至る。ジフテリア毒素を腹腔内投与した結果、脳内からミクログリアのみが除去された。それに対し、マクロファージには効果がなかった。よって、Siglec-H遺伝子座はミクログリア特異的な遺伝子改変に有用である可能性が示唆された。前年度に有効性を確認したヒツジポリクローナル抗体を用い、Siglec-Hのミクログリア発現特異性についてさらに実験を行った。脳内には、髄膜、血管周囲や脳室周囲にCD163とCD206陽性の特殊なマクロファージが常在することが知られている。それらの脳内マクロファージは、ミクログリアと同様にIba1、CD11b、F4/80といった単球類似細胞マーカー陽性である一方で、Siglec-Hは陰性であることを免疫組織化学により示した。また、前年度に取り掛かったSiglec-Hノックアウトマウス(ジフテリア毒素受容体ノックインマウス)を用いたミクログリア除去実験系の確立を進めた。この遺伝子改変マウスへのジフテリア毒素の投与により、脳内マクロファージには影響を与えることなくミクログリアのみが脳内から除去された。前年度の結果(ジフテリア毒素の投与は末梢マクロファージには影響しないこと)と併せて、Siglec-Hの遺伝子座は、脳内マクロファージや末梢マクロファージには影響を与えず、ミクログリア特異的に遺伝子改変を行うために有用であることが示された。さらに、神経因性疼痛モデルを用いたSiglec-Hの機能解析を行った。Siglec-Hノックアウトマウスではミクログリアにおける神経損傷後の炎症性サイトカインの発現上昇が促進されていたため、Siglec-Hを介したシグナルは神経損傷後のミクログリア活性化のブレーキとなる可能性が示唆された。Sialic acid bindingIg-like lectin (Siglec)-Hがミクログリア特異的マーカー分子となる可能性を検討した。免疫組織