hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
準安定な分子認識解明のためのテザー係留法の開発と細胞内仕分けシグナル識別への応用

大きな運動性を残した相互作用をしている複合体から原子レベルの構造情報や動的情報を得るためには,解離会合平衡を適切な方法で会合側へシフトすることが必要である.平衡をシフトする技術として,共有結合を分子間に導入する方法(テザー係留技術)とリガンド内に共有結合を導入する方法(分子内架橋係留技術)の2つを開発した.また,結晶コンタクトがない空間をタンパク質を結晶格子内に創りだし,そこにタンパク質の一部分やリガンドを意図的に配置して動的情報を得るための新しい結晶解析方法の開発を行った.ミトコンドリアプレ配列受容体Tom20-プレ配列複合体とオリゴ糖転移酵素-基質ペプチド複合体の2つの系に適用した.大きな運動性を残した相互作用をしている複合体から原子レベルの構造情報や動的情報を得るためには,解離会合平衡を適切な方法で会合側へシフトすることが必要である.平衡をシフトする技術として,共有結合を分子間に導入する方法(テザー係留技術)とリガンド内に共有結合を導入する方法(分子内架橋係留技術)の2つを開発した.また,結晶コンタクトがない空間をタンパク質を結晶格子内に創りだし,そこにタンパク質の一部分やリガンドを意図的に配置して動的情報を得るための新しい結晶解析方法の開発を行った.ミトコンドリアプレ配列受容体Tom20-プレ配列複合体とオリゴ糖転移酵素-基質ペプチド複合体の2つの系に適用した.ミトコンドリアのマトリクスへ輸送されるタンパク質はN末端に余分な配列(プレ配列)が付加された前駆体として合成される.我々の研究で,プレ配列レセプターであるTom20タンパク質がプレ配列を認識する時には,結合状態において従来想定されているより大きな運動性を保持していることが示唆されている.このような大きな運動性を残した相互作用をしている複合体から原子レベルの構造情報や動的情報を得るためには,結合状態を適切な方法で安定化することが必要である.分子間のジスルフィド結合導入によるMolecular Tetheringと,プレ配列の分子内にジスルフィド結合を導入するMolecular Stiffeningの手法を適用し,Tom20によるプレ配列認識は「動的平衡認識メカニズム」であることを提唱している.今年度は,さらに最適な複合体安定化を行うために,結合状態における運動において,不動点となっている位置で,プレ配列とTom20タンパク質の間に分子間ジスルフィド結合を導入する第2世代のデザインを行った.分子間ジスルフィド結合を形成させた複合体を調製し,2つの異なる条件で結晶を得た.結晶構造を決定したところ,両者ともにプレ配列は期待した位置に結合しているものの,分子間リンカーの長さが少し短く,結合状態における運動性を妨げている可能性あることが判明した.溶液中の運動性を観測するために,Tom20を安定同位体標識し,複合体の^<15>N NMR緩和解析を行ったが,やはり運動性の束縛傾向が見られた.そこで,今後は分子間リンカーの長さをさらに伸ばした複合体デザインを行う.ミトコンドリアを構成するタンパク質の大部分は細胞質においてプレ配列がN末端に付加された前駆体タンパク質として合成される。ミトコンドリア外膜に存在するTom20がプレ配列を最初に認識する。過去の研究で、Tom20が持つプレ配列に対する広い選択性の構造基盤を明らかにするために、リンカーを介した分子間SS結合を利用してTom20とプレ配列ペプチドの複合体を安定化した。この結果から、Tom20は複数の結合状態を用いてプレ配列を動的に認識していることを提唱した。本年度は,異なる安定化技術を用いて,より自然な複合体のデザインを行った.まず,プレ配列に導入した分子内SS結合を利用して複合体を安定化した。その結果、異なる結晶条件下で新たに2つの新規複合体構造を得た。一方はこれまでの複合体構造と同一の相互作用様式であり、固定化方法の違いによるバイアスが無視できることを示唆する。もう一方の複合体構造は新規の相互作用様式であり、動的平衡状態が少なくとも3種類存在することを意味する。2番目の方法として,Tom20とプレ配列をスペーサーなしに直接分子間SS結合でつないだデザインを試した。動的状態の不動点となる疎水性アミノ酸の位置に含硫非天然アミノ酸を導入し,Tom20V109C変異体と分子間SS結合を形成させた。昨年度はホモシステインを用いたが,側鎖が短いことがわかったので,さらにメチレン基が1個分および2個分長い含硫非天然アミノ酸AMP,およびAMHを導入したプレ配列ペプチドを合成した.その結果AMPを導入した複合体において単結晶が得られ、高分解能でのX線結晶構造解析が進行中である.最後に複合体の予備的な水溶液中のMD計算を行い,複合体状態は500nsにわたってリンカー無しに安定であること,相互に変換する場合があることなどがわかった.ミトコンドリアを構成するタンパク質の大部分は細胞質においてプレ配列がN末端に付加された前駆体タンパク質として合成される.ミトコンドリア外膜に存在するTom20がプレ配列を最初に認識する.Tom20が持つプレ配列に対する広い選択性の構造基盤を明らかにするために、リンカーを介した分子間SS結合を導入(テザー係留技術)あるいはプレ配列内に分子内SS結合を導入(分子内架橋係留技術)して,プレ配列の解離会合平衡を複合体側にシフトする方法の適用を行ってきた.

その結果,Tom20は複数の結合状態を用いてプレ配列を動的に認識していることを提唱した.今年度はテザー係留技術法に関して第2世代デザインの検討を引き続き行った.プレ配列側にSS結合の起点として非天然アミノ酸であるAMP(システインより側鎖が2つのメチレン基分長い)を導入した複合体の結晶化を行い,新たに2つの結晶構造決定を行った.さらに溶液中で^<15>N緩和時間測定を行った.残念なことにプレ配列ペプチドは結晶パッキングの影響を受けて変形していること,溶液中において運動性が大きく制限されていることがわかった.AMH(AMPよりさらにメチレン基が1つ分長い)では結晶は得られなかった.したがって,新しいデザインは適当ではない可能性がある.D型システインを用いた分子内架橋係留技術を適用したプレ配列はTom20に対する親和性が100倍以上向上する.これを任意のパッセンジャータンパク質とSortaseAを用いたプロテインライゲーションを用いて共有結合させる反応条件を確立した.今後,ラットのミトコンドリアを用いてインポート効率を調べる.単細胞紅藻葉緑体の受容体Toc34を小麦胚芽試験管内蛋白質合成系を用いて調製を試みた.タンパク質は合成できたが,濃縮操作をすると失われてしまった.詳細な条件検討を行ったが良い結果が得られなかった.タンパク質の結晶構造は結晶中の分子間の接触の影響を受けて,取りうる状態の1つに固定されている.これを結晶スナップショットと呼ぶ.問題はスナップショットを多数集めても,リガンドの結合状態の運動性を正しく表現できないことにあり,これを「サンプリング問題」と呼ぶ.この問題を実験的に解決するために,リガンドの周囲に結晶コンタクト効果フリーな“隙間"を結晶格子中につくる新技術の開発を行っている.具体的な課題として,Tom20タンパク質に結合した状態のプレ配列ペプチドの大きな運動性を定量的に解析することを設定した.タグタンパク質としてマルトース結合タンパク質(MBP)を用いる.MBPのC末端部分はヘリックス構造をとっていて,Tom20のN末端ヘリックスと直接つなげることで一続きのヘリックスとなるようにデザインした.プレ配列は分子間ジスルフィド結合を用いてTom20にテザリングする.ラットALDH由来のプレ配列を用いてMBP-Tom20-SS-pALDH複合体を作製し,結晶を得て構造解析を行った.モデルバイアスを避けるために,分子置換の際にはプレ配列に対応するモデルは置かなかった.差フーリエ電子密度マップをつくると,結合サイト付近にプレ配列ペプチド由来と思われる棒状の電子密度を得ることができることを昨年度に報告した.今年度はさらに明瞭な電子密度を得るためのX線回折測定とデータ処理の条件を検討した.電子密度の可視化にはフーリエ変換の際にローパスフィルターを用いることが必要であった.また,理由は今のところ不明であるが,電子密度の可視化には長波長のX線(1.6A;,通常は0.91Aを用いる)を用いた回折測定が有効であった.タンパク質の結晶構造は結晶中の分子間の接触の影響を受けて,取りうる状態の1つに固定されている.これを結晶スナップショットと呼ぶ.問題はスナップショットを多数集めても,リガンドの結合状態の運動性を正しく表現できないことにあり,これを「サンプリング問題」と呼ぶ.
自己組織化ナノテクノロジー技術を用いた細胞外マトリックスによる肥満細胞の制御

ハニカムフィルム(Honeycomb film: HCF)上で培養すると,肥満細胞の増殖と機能が制御されるか検討した.用いた肥満細胞は,非腫瘍性の新規肥満細胞NCL-2 cellと,疑似肥満細胞であるラット好塩基球性白血病細胞RBL-2H3 cellである.同じ材質のフィルムでもハニカム構造があると肥満細胞の増殖の仕方・形態・分泌顆粒に変化が起こった.また,細胞の違いにより,HCFによる制御に違いが見られた.ヒト粘膜型肥満細胞に近いNCL-2 cellは, HCF上では細胞分裂が増えるものの,de novoに合成されるTNF-αやロイコトリエンB4の分泌は減少することがわかった.ハニカムフィルム(Honeycomb film: HCF)上で培養すると,肥満細胞の増殖と機能が制御されるか検討した.用いた肥満細胞は,非腫瘍性の新規肥満細胞NCL-2 cellと,疑似肥満細胞であるラット好塩基球性白血病細胞RBL-2H3 cellである.同じ材質のフィルムでもハニカム構造があると肥満細胞の増殖の仕方・形態・分泌顆粒に変化が起こった.また,細胞の違いにより,HCFによる制御に違いが見られた.ヒト粘膜型肥満細胞に近いNCL-2 cellは, HCF上では細胞分裂が増えるものの,de novoに合成されるTNF-αやロイコトリエンB4の分泌は減少することがわかった.今年度は、腫瘍細胞でない肥満細胞株NCL-2(広島大学より分譲された細胞特許第3876314号)の培養方法を確立しているところである。まずはNCL-2細胞が培養環境で十分に増殖できるような条件を探してきたが、試行錯誤の末、血清と細胞播種密度、培養容器を変更することにより、次年度からの実験に耐えうるような細胞数を確保することができた。すなわち、血清はHyClone社(USA)のDefine Fetal Bovine Serum(Cat# SH30070.03E, Lot# ATF32349)を使用、播種密度は10*5個から10*6個に増量、培養容器は直径6cmシャーレから75ml Tフラスコに変更し、細胞を増殖させることに成功した。3・5・10μmの3次元孔を持つHoneycomb film(HCF)上で、NCL-2細胞を培養し生育状況を観察した。肥満細胞はガラスとの接触によって壊れやすく、HCFを押さえるガラスリングでNCL-2細胞の23割が壊れた可能性があった。そこで、ガラスリングの影響を避けるために、HCFの基盤を強くして、溶液中でHCFを押さえなくても浮かないようなHCFを作製し(PET film支持体のポリスチレン製HCF)、実験を進めるところである。また、NCL-2細胞から分泌されたヒスタミン量は、Control(wellに直接播種)に比べて、Cover glass、Flat film(孔のないHCF)、3・5・10μmのHCF上で培養した上清中のヒスタミン量に変化がなかった。今年度は、Honeycomb film(HCF)の基盤を強くして、溶液中で押さえなくても浮かないようなHCF(PET film支持体のポリスチレン製HCF)を作製し、実験を進めた。3・5・10μmの3次元孔を持つHCF上で、NCL-2肥満細胞(腫瘍細胞でない肥満細胞株)を培養し生育状況を観察したところ、孔のないflat filmに比べて、10μm HCF上では、細胞は増殖し、小さくなることが観察された。また、3・5μm HCF上では、細胞数や大きさに変化ないものの、HCFに沿ってNCL-2肥満細胞が突起を伸ばし、細胞分裂をおこすという特異な形態が観察された。DAPI核染色により明らかに細胞は分裂しており、HCFと接触することで細胞分裂が促進されることが判明した。また、肥満細胞から分泌される顯粒物質について、ヒスタミンやインターロイキンなどの分泌量を、NCL-2とRat Basophile Leukemia(RBL)(好塩基性のラット白血病細胞で、肥満細胞に特徴が類似)の培養細胞を用いて、細胞外マトリックスであるHCFの孔の違いによる影響を検討したところ、ヒスタミンとインターロイキンの分泌量は、HCFの孔の大きさと、NCL-2とRBLの細胞の違いにより分泌に相違があることがわかった。一方、心身症との関連で捕らえると、肥満細胞は痛みなどの身体的・機械的ストレッサーのみならず、心理・情動的なストレッサーによっても活性化し、アレルギーや炎症性疾患、胃潰瘍などを悪化させることが知られている。培養細胞だけでなく、in vivoの肥満細胞を使って実験することも次の段階で必要になり、in vitroのNCL-2肥満細胞との比較実験が意味を成してくる。1)PET-HCF上で1週間培養したところ、NCL-2細胞の増殖は、1Flat filmに比較しHCF上では、total細胞数が有意に増加し、10 micro m HCFにおいて最も増加した。23および5 micro mHCF上では浮遊細胞が主に増加し、10 micro m HCF上では接着細胞が主に増加した。これは、10 micro mより孔径が小さいNCL-2細胞は、10 micro m HCFにおいては、NCL-2細胞は孔の中に入り込み、接着細胞としてカウントされるためと思われる。3)SEMと共焦点レーザー顕微鏡による観察では、多くのNCL-2細胞が、13および5 micro m HCF上で、数個に細胞分裂し、抗vinculin抗体(接着因子)と抗Phalloidin抗体(アクチン)が細胞質で陽性であった。しかし中には、陰性の細胞も観察された。210 micro m

HCF上では、細胞は孔の中で小さく分裂している様子が観察された。4)SEMと共焦点レーザー顕微鏡による観察では、一部のNCL-2細胞が、13および5 micro m HCF上で、HCFを巻き込むように数十の核に分かれ、細胞分裂を伴わない核分裂(多核細胞)の様相を呈した。個々の核はHCFの構造を反映するように孔の中に入り込んでいた。NCL-2肥満細胞をHoneycomb Film(HCF)上で培養することに成功し、HCFの孔径を種々変えることで、その形態の特徴、増殖細胞数、増殖細胞の大きさなどが変化するという新しい知見を発見し、現在、国際学術雑誌に投稿準備中である。25年度が最終年度であるため、記入しない。国際学術雑誌に投稿するも、追実験を要求された。なぜHoneycomb Filmという細胞外マトリックスを使うと、肥満細胞の形態と増殖が変化するのか、細胞内メカニズムを分子レベルで検討しなければならない。肥満細胞の分裂細胞周期が早まっている可能性もある。肥満細胞に特異的な接着因子、顆粒分泌を制御する蛋白質、さらに、細胞周期を精査するための実験が必要になる。問題点としては、対照実験に用いるFlat filmが電子顕微鏡で見たところ、実はflatではなく、12μmの凹凸があることが判明した。これは接着している細胞に影響する恐れがあり、業者に再度作成してもらい、これから再実験しなければならない。今後、実験計画が遅れることが予想される。論文査読者の要求どおりに、追実験しないと論文が通らないので、急いで必要な消耗品を購入し、免疫組織染色、その他、必要な実験を行わなければならない。問題は本学に共通研究機器がないことであるが、共同研究者がいる施設の設備を使って実験を行なう予定である。とにかくこれまでの研究成果を国際学術論文に発表しないと、研究を遂行したとは言えないので、最優先で対応する。したがって、当初の予定とは違った予算執行になる。
内耳の領域化及び形態形成を制御する遺伝子の同定と機能解析

我々は分泌性因子DANがニワトリ胚の耳胞の背側に発現し、内リンパ管・嚢の形成を制御することを明らかにしてきた。耳胞の領域化には、耳胞背側のDlx5,Gbx2を介する経路と、耳胞腹側のOtx2を介する経路が関与すると考えられており、これらがDAN発現を制御する可能性がある。これを検証するため、Dlx5,Gbx2,Otx2を耳胞に導入し、DANの発現変動を検討した。その結果、Gbx2とOtx2がDANの発現を抑制することが判った。Gbx2とDANの発現領域は重複するため、DAN発現の活性化にはGbx2の効果を打ち消す作用をもつ因子が必要であることが示唆された我々は分泌性因子DANがニワトリ胚の耳胞の背側に発現し、内リンパ管・嚢の形成を制御することを明らかにしてきた。Gbx2とDANの発現領域は重複するため、DAN発現の活性化にはGbx2の効果を打ち消す作用をもつ因子が必要であることが示唆された1.耳胞背-内側領域におけるDANの発現制御耳胞背-内側領域のDAN発現調節機構を調べるため、外来遺伝子導入、リコンビナントタンパク質およびシグナル伝達阻害剤を用いた実験をおこなった。機能抑制型Lef1、SHHタンパク質および活性型Smoにより、DAN発現が抑制された。FGF受容体阻害剤SU5402、MEK阻害剤U0126、Notchシグナル阻害剤DAPT処理による影響は見られなかった。以上より、耳胞背-内側領域のDAN現は、Wntシグナルによって活性化され、Shhシグナルによって抑制されることが示唆された。またFGFシグナルやNotchシグナルはDAN発現に影響しないことが示唆された。DAN発現に関して、既存の耳胞領域化モデルと一致する結果が得られた。このモデルが生物種間で保存された機構であることを裏付ける結果となった。2.DANの下流因子の同定耳胞にDAN siRNAを電気穿孔法により導入し、耳胞に発現する既知遺伝子約20種に関して発現変動の有無をin situhybridizationにより確認した。現時点では、既に報告済みのMsx1, Nkx5.1以外に、発現が変動する遺伝子は得られていない。ニワトリのFoxil遺伝子を同定するため、データベースよりFoxilアイソフォーム2種とFoxilcの配列を検索し、これに基づいてPCRプライマーを設計した。3日目のニワトリ胚cDNAを鋳型としてPCRを行い、それぞれのDNA断片を得た。これらを用いて、複数の発生段階のニワトリ胚に対してin situ hybridizationをおこなったが、シグナルを検出することができなかった。Foxilはニワトリ胚の耳胞発生に関与しないことが示唆される結果となった。1.DANの発現制御機構耳胞の背-内側の領域化にはWnt-Dlx5経路が関与するため、この領域におけるDANの発現に対するDlx5の作用を調べた。Dlx5の発現ベクター(pCAGGS-Dlx5)を構築し、電気穿孔法により耳胞に遺伝子導入した。現時点ではDANの発現に影響はなかったため、抑制型Dlx5(pCAGGS-Dlx5-En)の使用を予定している。他にもGbx2,Pax2,Otx2の発現ベクターを構築しており、順次実験に用いる予定である。2.耳胞におけるDlx5,Msx1の機能解析DlxとMsxは、協調して細胞増殖・分化を制御することが示されており、両者のバランスの維持が内リンパ管・嚢形成に重要であると予想される。そこで、Dlx5とMsx1を過剰発現させ、耳胞細胞の形態変化・増殖・細胞死に対する効果を検討した。両遺伝子の発現ベクターを作製し(pCAGGS-Msx1)、ニワトリ胚の耳胞に電気穿孔法により導入した。現時点では、耳胞の形態に影響が見られていない。今後は両者の抑制型改変遺伝子を構築し、機能抑制実験を行い、その結果を元に、Dlx5-Msx1間相互作用の様式を考察したい。2.Aquaporin cDNAのクローニング前年度のFoxi1,1cに加え、ニワトリのAquaporinファミリー遺伝子、Aquaporin 1-5,7-9,11,12の10遺伝子についてPCRを行い、Aquaporin 2,5以外の8遺伝子のDNA断片を得た。ニワトリ胚に対しin situ hybridi zationを行い、発現パターンを調べた。このうち、Foxilcが耳胞発生に関して興味深い発現を示したため、その発現パターンの詳細な解析を進める予定である。1.耳胞におけるDANの発現制御機構耳胞の領域化には、背側神経管由来のシグナルからDlx5,Gbx2を介する経路と、腹側神経管や脊索由来のシグナルからPax2,Otx2を介する経路が関与すると考えられており、これら転写因子群がDAN発現を制御する可能性がある。これを検証するだめ、Dlx5,Gbx2,Pax2,Otx2の発現ベクターを構築して電気穿孔法により耳胞に導入し、DANの発現変動をin situ hybridizationにより検出した。

その結果、Gbx2とOtx2がDANの発現を抑制することが判った。Gbx2とDANの発現領域は重複するため、DAN発現の活性化にはGbx2の効果を打ち消す作用をもつ因子が必要であることが示唆された。2.内リンパ管・嚢形成におけるD1x5,Msx1の機能解析D1xとMsxば、協同して細胞増植・分化を制御ることが示されており、両者のバランスの維持が内リンパ管・嚢形成に重要であると予想される。そこで、Dlx5.Msx1両遺伝子の発現ベクターを作製し、ニワトリ胚の耳胞に電気穿孔法により導入し、内耳の領域特異的な遺子現が変動するか否かを調べたが、Dlx5,Gbx2,Pax2,0tx2,DANの発現には影響を与えなかった。3.ニワトリ胚耳胞に発現する遺伝子の発現解析
火山周辺の応力および物性の推定と地震発生条件の解明

火山周辺の地下深部(30キロメートル付近)では、火山型深部長周期地震(火山型DLP)とよばれる、特殊な地震が発生している。この火山型DLPの物理的実体を明らかにすることは、地震活動と火山活動とを包括的に理解するという、自然科学の大テーマにおける重要な課題である。一般的に、地震の発生条件は、応力状態(局所的な力のかかり方)および物性情報(岩盤の柔らかさや断層面の滑りやすさ)に依存する。応力状態については、個々の地震の地震波解析により運動学的に地震を理解すること、物性状態については、地震波解析により地震波に含まれる地震波伝搬経路の情報を取り出すことが、有効な地震学的アプローチである。しかしながら、火山型DLPは深部で発生する小さな地震であるため、これらの解析には困難がたちはだかる。そこで本課題では基礎的研究として、応力状態の理解に結びつく「地震の運動学的特徴を抽出する新たな手法の開発」、および物性状態の理解に結びつく「雑微動に隠れた情報の抽出」に取り組んだ。具体的には、断層破壊の指向性(地震断層のずれが一方向にだけ進展すること)がドップラー効果で説明できることに着目し、破壊の時間関数と破壊の指向性とを同時に推定する手法を開発した。熊本地震を含む3つの地震に適用し、大規模・中規模地震の解析に有効であることを示した。今後は、より小さな地震へも適用できるような工夫が必要である。また、地下の速度構造を推定する手法として、雑微動解析が近年注目されている。本課題では、地震波源が限定され、速度構造が均質であると考えられる氷河に注目し、雑微動解析による地震波情報の抽出と地震波源の特定を行った。特に、地震波干渉法とバックプロジェクション法とを組み合わせることで、比較的少ない地震計のデータから雑微動源を特定することに成功した。雑微動源の分布は、雑微動を用いた地下構造推定に重要な情報となる。29年度が最終年度であるため、記入しない。
地域環境に適応した低コスト育林技術の体系化に関する研究

本研究は関東から九州までの6地方における施業集約度の異なるスギ、ヒノキ人工林の林分構造や生産力を多面的、総合的に解析し、多様な立地条件と生産目標に適した合自然的森林施業すなわち粗放施業の技術体系を確立しようとしたものである。なお本研究は類似の課題で、昭和60年と61年度に交付を受けた総合研究(A)の不足資料を補完し、新たな資料を加えて総括する目的もあったが、研究期間が単年度ということもあって年度末までにすべての成果をまとめるまでには至っていない。しかしこれまでえられた知見は以下のようである。目的樹種の自生する地域では、中部、近畿、中国、四国地方のヒノキ及び九州地方の海岸林のアカマツは天然更新が良好で、低コストの更新が可能である。またスギ及びヒノキ人工造林における下刈りは省略もしくは回数を著しく減少させても、ツル伐り、除伐を行なえば成林の可能性がある。近畿地方におけるスギ林では、若齢期の除間伐を行なわなくても優勢木は一様に分布し、その成長や形状比および幹の細り比に差は認められないことから、一般用材や大径木生産を目標とするならば粗放施業が有効である。また四国地方では、集約、粗放施業のいずれでも立木は規則分布する一方、粗放施業林は細長な個体が多く耐風性が弱いものの、材積では劣らないばかりか、直径上位木の比較では直径、樹高の変動係数が小さく、形質がよく揃うことがわかった。広葉樹林でも関東地方では手を加えずに高蓄積の有用広葉樹林を造る必要がある。一方、養分循環面から解析すると、粗放施業林に枯死葉量とその養分量が多く、手入れ不足の林分の特徴は顕著にみられる。このように極端な低コスト育林すなわち粗放施業も、生産目標によっては地域的に充分成り立ち、技術の体系化が可能であることがわかった。
琵琶湖と中国・太湖における水環境比較民俗論と成果展示の企画

本研究は、水環境の変化が著しい琵琶湖と太湖周辺地域を対象として取り上げ、環境利用の普遍性と独自性を明らかにした。特に、人々の生活・生業世界から蓄積してきた「複合文化」の論理と実践性に焦点をあてることによって、水をめぐる環境づくりと地域活性化の論理に新たな視点を提示し、湖の保全対策についての比較的実証研究と成果展示の貢献可能性を提供した。1琵琶湖水系における農村水環境の調査琵琶湖集水域に位置する米原市大清水の泉神社湧水については、聞き取り調査・水路図作成等を行い、湧水をめぐる農村水環境の歴史的経緯からその保全について考察した論文をとりまとめた。これは、『生活文化史』に投稿し、査読を経て受理されて第58号に掲載された。その他、高島市針江町や野洲川下流域の水辺集落などにおいても水環境の実態調査を実施した。2太湖周辺における水利用の実態調査東アジア有数の稲作地帯であり淡水漁業も盛んな太湖地域は、周辺の都市化・工業化が進む中、伝統的な生活・生業が根強く残っている。琵琶湖との比較研究のため、水環境と水利用をめぐる調査を蘇州市東山や金墅港、無錫市西方の太湖湖岸および江南水郷地域において行い、現地での聞き取り調査や見取り図を作成した。また、航空写真を利用した新しい集落環境調査方法を考案し、家船、漁船、エリの分布図作成も行い、家船の歴史的機能をめぐる琵琶湖と太湖との比較研究論文を執筆した。今年度の調査研究の成果の一部は、国際会議や琵琶湖博物館共催ワークショップでの発表及び学術論文としての出版を行った。さらには太湖と琵琶湖とのつながりを考察するため、大陸と日本列島をつなぐ八重山諸島における水環境民俗調査も実施した。3比較的研究を行うための予備的調査琵琶湖と中国・太湖における水環境をめぐる利用の歴史的変遷に関するデータの収集・調査・研究に努め、翌年度以降の太湖周辺での調査地選定のための予備的調査を行い、太湖東岸を中心に江南水郷地域も含めて水田・井戸・家船等の悉皆調査を実施し、基礎資料収集も行ったところである。本年度は、琵琶湖集水域と太湖における水環境保全について、調査・情報収集・資料整理・比較研究を続行した。特に、「水をめぐる利用・資源管理における暮らしと村落保全」の課題のもとに、フィールド調査主体の地域学の立場から、琵琶湖を含むアジアの湖沼環境変化とその対応についての検討を進め、新たな考察を行った。その結果、水環境の「コモンズ」と利用の仕組みが暮らしの中から形成され、そこに成り立つ水利用と管理に関する社会的規制も村落共同体と密接に関わっていることを明らかにした。本年度の研究成果は、主として学会発表、論文発表等による公開を行った。その一部として、東近江市大塚集落の溜池をめぐる水利用及び高島市針江のカバタ湧水の利用については、「環境資源としての水を生かした村の実践」と題した査読論文として『日中社会学研究』に掲載された。そして、本の刊行(『東アジア内海文化圏の景観史と環境景観から未来へ』、昭和堂出版、分担執筆)、世界湖沼会議等の国際学会での研究成果の公表などを行った。また、研究成果の一般公開として、これまでの研究対象の中心としてきた琵琶湖と太湖における水利用をめぐる暮らしたついて、2012年7月から「東アジアの水田漁労と水」と題した企画展示を開催する予定である。琵琶湖地域においては、長浜市海老江、長浜市木之本町川合、長浜市高山町堂来をはじめ湖北地区を中心にして、一部、湖東の彦根市西今町、近江八幡市浅小井町などの湧水・井戸調査記録の取りまとめを総括的に行った。現地での作成図面・実測図の製図、撮影映像の整理と複写、聞き取り調査の記録整備などを行い、総括的な文章を取りまとめたところでもある。この過程で地域住民の生活・生業の中で利用されてきた水車・竜尾車・竜骨車・ゴイに代表される水利用民具についての使用状況調査も行い、琵琶湖博物館収蔵資料との比較検討も合わせて行った。特に、使用状況の聞き取りを詳細に行い、二次的な情報の確実な記録化に努めた。中国・太湖でも井戸・カワトその他、関係水利施設の分布調査、運河・水路の分布と構造記録化、水利用民具の実態把握と一部収集調査を行うこととして、太湖東岸・北岸から長江下流域の高郵湖周辺にかけて行い、長江中流域の洞庭湖周辺にも範囲を広げて比較調査を実施した。また、伝統木造船は、太湖東岸と北岸において、きわめて伝統的な生活と生業を守り続けている家船生活者を中心に引き続き聞き取り調査と映像資料の記録化を図ってきた。こうしたこれまでの調査情報を整理して、長江中流域、洞庭湖近くの湖南省長沙において年度末に開催された日中共同環境セミナーで発表し、琵琶湖の生活・生業における水環境の歴史的な普遍性と固有性の検討成果を公表した。

また、それに引き続き琵琶湖博物館において「魚米之郷」と題した日中共同講演会を開催し、琵琶湖と太湖・洞庭湖における水環境比較調査の概要を発表し、ホール前においては一部資料の展示会も開催した。次年度は、「魚米之郷ー太湖・洞庭湖と琵琶湖の水辺の暮らしー」と題した大規模な企画展示を開催する予定で、そこでこれまでの研究成果を総括的に公表する予定である。本年度は、稲作地帯であり淡水漁撈も盛んな琵琶湖及び太湖周辺村落の水環境における固有性と普遍性を明らかにするため、調査・情報収集・比較研究・成果発表を行った。特に「水環境をめぐる自然利用・管理と暮らし」について、湧水や井戸、カワトその他の水利施設の分布状況、水利用の実態調査を継続的に行った上で、自然保全と民俗技術との関係について新たな考察を行った。本年度の研究成果発表は、主に国際学会発表、企画展示等による公開を行った。その一部として、琵琶湖や太湖における水環境の利用については、中日新聞の連載コラム『湖岸より』及び毎日新聞連載コラム『ここだけの湖の話』に掲載された。また、研究成果の一般公開として、これまで琵琶湖と太湖における水文化と自然保全について、2012年7月に「東アジアの水田漁撈と水」及び2013年2月に「村の至宝湧水と井戸」と題した展示を開催した。本研究は、琵琶湖と太湖における水をめぐる環境利用と地域づくりを研究視野に入れ、資源としての水を活かした地域づくりをしようとする取組の実践を踏まえながら、水環境に関わる普遍性と独自性を明らかにしようとしたものである。人々が地域資源としての水環境をいかに保全し、それを支える社会的仕組みにはどのような普遍性と独自性が存続されているかを、琵琶湖と太湖周辺を中心にそれぞれの地域にフィールド調査に精力を注ぎ重点的に実施してきた。また、文献資料や民具資料等の蓄積や解析に加えた上で、学術論文等の研究公表、また講演会や企画展示、図録書の刊行等によって研究成果の一般公開にも努めることができた。これまでの研究成果の一般公開においては、特に本年度は当該研究にかかわるこれまでの調査結果に基づき、琵琶博物館第22回企画展示『魚米之郷ー琵琶湖・太湖と洞庭湖の水辺暮らしー』の開催と「魚米之郷を楽しむ」交流イベントを実施することができた。さらに、これらの成果を踏まえて、シンポジウムの開催および中国・河海大学において日中共同講演会を開催して、研究交流と成果公表を行った。26年度が最終年度であるため、記入しない。社会科学26年度が最終年度であるため、記入しない。琵琶湖及び太湖周辺においてのフィールド調査においては、多くの地元村落の協力と周辺研究者の助言溝得られ、順調に進んでいることと、基礎的な調査図面の作成において、館内熟練関係者による製図等が円滑に行われていることにより、基礎的資料の整備がはかられていることによる。現地調査においては、現地の河海大学や無錫市人民政府などの関係者・関係機関、中国駐大阪総領事館などの理解も得て、多くの地域の人びとの協力のもと、実物資料や情報資料の収集が円滑に行うことができている。そして、そうした調査活動の一部は、中国及び日本においてもセミナーと講演会で発表し、展示も行うなど成果公表も順調に行えているところである。現地調査においては、調査地の地理環境の熟知及び現地の研究協力者や多くの地元の方々の協力が得られ、日常的な連絡調整ができ、順調に進められたことと、民俗資料の収蔵ができる環境状況の有効活用及び調査情報や展示資料等の収集に努めているからである。今年度は、これまでの調査成果を具体的に企画展示のパネルや展示資料として早急に整備してとりまとめていく必要があり、7月までに多くの作業が残されている。
脂質代謝調節因子レジスチンによる骨代謝調節機構の解明

1)レジスチンの発現を、マウスの長管骨における発現を各成長段階で免疫組織化学染色で検討し、破骨細胞での発現を確認した。各成長段階での発現量については明らかな相違はなかった。2)生後4週齢、8週齢のレジスチンKOマウスと同胞WTマウスの長管骨、椎体において放射線学的、組織学的解析を行った。これまての12週24週齢のマウスでの検討と同様、レントゲン、マイクロCTおよびDEXAによる骨密度測定において明らかな有意差を認めず、組織学的にも骨芽細胞、破骨細胞とも明らかな機能異常を認めなかった。骨組織形態計測についても明らかな差は認めなかった。さらに、KOマウス、同胞WTマウス由来の骨芽細胞培養系において、増殖能、分化能、基質合成能、石灰化能の検討を行った。増殖能についてはMTTアッセイで評価したが、明らかな差はなく、各種分化マーカ一遺伝子、von Kossa,Alizarln Red染色などの染色性の比較検討においても明らかな差は認めなかった。3)性ホルモン欠乏状態でのレジスチンの影響の検討をすべく、卵巣摘出後のメスマウスの骨組織評価をレジスチンKO,同胞WTマウスで行ったが、放射線学的にも、組織学的にも明らかな差は認めず、骨形態計測による動的指標についても明らかな相違を見出せなかった。また、老化による骨組織への影響として52週齢のオスマウスについてKOマウス、WTマウスを上記卵巣摘出モデルと同様に放射線学的、組織学的評価を行ったが、明らかな差を認めなかった。また、血液中の骨代謝マーカーについても検討したが、明らかな同胞野生型と比べ明らかな差は認めなかった。以上、レジスチンは破骨細胞系において発現を認めるものの、ノックアウトマウスによるin vitroでの解析およびそれに付随するin vitoroの解析においては明らかな骨代謝への関与は認めなかった。初代培養骨芽細胞、骨芽細胞系細胞株MC3T3E1、C2C12、前破骨細胞系細胞株RAW264.7において、RT-PCR法によりレジスチン発現を検討した。この中で単球・マクロファージでの発現が確認されており(Biochem.Biophysi.Res.Com. 300:472,2003)、その発現が期待されていた前破骨細胞系細胞株のRAW264.7における発現が確認された。【培養骨髄細胞、骨芽細胞系細胞、破骨細胞系細胞に対するレジスチンの作用】レジスチンcDNAをプラスミドに組み込んで大腸菌増殖により精製して得られたリコンビナントレジスチンを用いて、骨芽細胞、骨髄細胞、破骨細胞培養系において、増殖に対するレジスチンの作用を検討したが、明らかな増殖能の変化は認められなかった。次に、骨芽細胞・骨髄細胞培養系における骨芽細胞分化能・脂肪細胞分化能の検討と、骨芽細胞/骨髄細胞共存培養系における破骨細胞分化能に対するレジスチン作用を検討した。これらにおいても骨芽細胞、脂肪細胞、破骨細胞分化において明らかな分化能の変化は認めなかった。【レジスチンKOマウスの骨組織のin vivoおよびex vivoにおける解析】生後12週齢におけるレジスチンKOマウスと、それぞれの同胞WTマウスの長管骨について、X線撮影、骨密度測定を行った。有意なものではないが、脛骨においてWTマウスと比べ骨密度が高い傾向があった。また、組織学的解析として、骨芽細胞、破骨細胞に特異的な組織染色法(ALP染色、TRAP染色)をおこなった。これら組織染色法においてKOマウス、WTマウス間での明らかな相違は認められなかった。現在、4週から24週齢まで他の週齢におけるマウスの骨組織のin vivoでの解析を進めている。骨組織におけるin vivo、in vitroでのレジスチン局在の検討については、骨芽細胞/骨髄細胞共存培養系において骨吸収因子(活性化VD_3、IL-11、PGE_2)刺激下で形成された破骨細胞を単離・精製し、そこからmRNAを精製しRT-PCR法によりレジスチンの発現を確認したが、破骨細胞ではレジスチンの発現を確認できなかった。また、レジスチンKOマウスの骨組織のin vivoおよびex vivoにおける解析においては16週齢から24週齢のレジスチンKOマウスとそれぞれの同胞WTマウスの長管骨および椎体について、X線撮影、骨密度測定、マイクロCTを行い、12週の際と同様、有意な差を認めることは無かった。また、組織学的解析として、ALP染色、TRAP染色、更にはカルセイン二重標識、Villanueva-Goldner染色を用いた骨組織形態計測を行ったが、やはりいずれの解析においても有意差を認めなかった。レジスチンKOマウスにおける関節炎の表現型の検討としてWTとレジスチンKOマウスに抗2型コラーゲン抗体カクテルを投与し、アジュバント関節炎を誘導し、骨梁の減少程度、関節破壊の程度を、X線学的、組織学的に比較検討した。これまでのところ、レジスチンノックアウトによる明らかな関節炎への影響は認めていない。

これまての12週24週齢のマウスでの検討と同様、レントゲン、マイクロCTおよびDEXAによる骨密度測定において明らかな有意差を認めず、組織学的にも骨芽細胞、破骨細胞とも明らかな機能異常を認めなかった。骨組織形態計測についても明らかな差は認めなかった。さらに、KOマウス、同胞WTマウス由来の骨芽細胞培養系において、増殖能、分化能、基質合成能、石灰化能の検討を行った。増殖能についてはMTTアッセイで評価したが、明らかな差はなく、各種分化マーカ一遺伝子、von Kossa,Alizarln Red染色などの染色性の比較検討においても明らかな差は認めなかった。3)性ホルモン欠乏状態でのレジスチンの影響の検討をすべく、卵巣摘出後のメスマウスの骨組織評価をレジスチンKO,同胞WTマウスで行ったが、放射線学的にも、組織学的にも明らかな差は認めず、骨形態計測による動的指標についても明らかな相違を見出せなかった。また、老化による骨組織への影響として52週齢のオスマウスについてKOマウス、WTマウスを上記卵巣摘出モデルと同様に放射線学的、組織学的評価を行ったが、明らかな差を認めなかった。また、血液中の骨代謝マーカーについても検討したが、明らかな同胞野生型と比べ明らかな差は認めなかった。以上、レジスチンは破骨細胞系において発現を認めるものの、ノックアウトマウスによるin vitroでの解析およびそれに付随するin vitoroの解析においては明らかな骨代謝への関与は認めなかった。
脳微小血管からの酸素放出速度の測定

顕微鏡とビデオカメラ、画像処理装置を組み合わせた装置で、微小血管内を流れる血液の酸素飽和度とヘモグロビン濃度を2次元の画像として観察した。ウサギの腸間膜の微小血管網を顕微鏡で観察し、波長の異なった6枚の干渉フィルター(中心波長:529,541,556,563,579,599nm)を通して6枚の顕微鏡画像をビデオカメラでとらえる。この画像を画像処理装置を用いてデジタル化し、512×480のサイズでコンピュータ内に取り込んだ。観察画像データをもとに6枚の吸光度2次元画像を作成した。6枚の吸光度の画像のそれぞれ対応する512×480の各点について、ヘモグロビン量と酸素飽和度を重回帰計算をおこなってもとめ、2次元画像を得た。なお、血管外に同じ計算を実行したときには、両者の値が予想値より大きく異なることを利用して血管網のみの画像とした。ウサギ腸間膜の微小血管床について実験をおこない1本の血管を連続した2次元画像として捕えた。脱酸素化にともなう酸素飽和度の変化から、1本の血管について酸素放出速度を得ることができた。また、ヘモグロビン濃度と血管内径の関係から各部位におけるヘマトクリットを計算し、微小環境におけるヘマトクリットの低下、いわゆるFahraeus効果を2次元画像として得ることができた。
脚・触角の分節形成から探る形態形成の協調的制御機構

ショウジョウバエのdefective proventriculus (dve)遺伝子は,形態形成因子Wingless (Wg), Decapentaplegic (Dpp)に依存して発現するホメオボックス遺伝子である。脚原ににおいてNotchシグナルは同心円状に活性化され,脚原基の増殖および分節化に関与する。蛹期の脚原基喧おいて,Notch活性化領域は脚分節様構造の遠位部側であり,Dveは分節構造をまたいで発現するため,両者は分節構造の遠位部側で部分的な重複を示す。発生の進行に伴ってこの重複部分でのDve発現が抑制されることが,成虫脚分節間をつなぐジョイントと呼ばれる構造を形成するために必要である。この過程において,NotchシグナルとEGFRシグナルの拮抗作用,細胞内平面極性(Planer Cell Polarity ; PCP)によるDve発現の維持も必要とされる。dve変異体やEGFR, PCPシグナル因子の変異体では,異所的なジョイント構造が形成されるが,dve変異モザイククローン内での異所的なNotch活性の上昇は認められなかったことから,dve遺伝子発現の抑制がジョイント形成のための十分条件であるか否かについて検討を行った。ジョイント形成領域におけるNotch活性の阻害によって誘導されるジョイント構造の欠失は,dve変異によって回復することはなかったため,ジョイント形成にはdve発現抑制とは独立にNotch活性が必要とされることが明らかとなった。触角と脚はともに明確な分節構造を有し,触角が脚に転換する変異体が存在することや遺伝子発現パターンの類似性などから,形成メカニズムの共通性が指摘されている。Dve発現領域は第3節よりも遠位部側で,二重または三重のリング状に発現していた。しかし,この発現は触角形成そのものには必要ではなく,dve変異モザイク個体においては,正常に形成された本来の触角構造の背側に異所触角が鏡像対称に出現した。変異体が同様の表現型を示すIroquois complexとdveとの関連を調べたところ,それぞれの変異体において明確な遺伝子発現の変化は観察されず,両者が独立の経路で協調的に作用しているという可能性が示唆された。形態形成因子(モルフォゲン)の拡散によって生じる濃度勾配は、個々の細胞に異なる位置情報を与える。ショウジョウバエのdefective proventriculus(dve)遺伝子は、形態形成因子Wingless(Wg)、Decapentaplegic(Dpp)に依存して発現するホメオボックス遺伝子である。脚原基においてNotchシグナルは同心円状に活性化され、脚原基の増殖および分節化に関与する。蛹期の脚原基において、Notch活性化領域は脚分節様構造の遠位部側で、Dveは分節様構造をまたいで発現するため、両者は分節様構造の遠位部側で部分的な重複を示す。発生の進行に伴ってこの重複部分でのDve発現が抑制されることが、成虫脚分節間をつなぐジョイントと呼ばれる構造を形成するために重要である。EGFRシグナルを活性化するリガンド分子Veinは、脚原基の遠位部で発現し、近遠軸に沿った活性勾配を作ることによって、脚の遠位部のパターン形成に関与する。Dve発現抑制領域にEGFRシグナルを活性化させると、Notchシグナルを阻害した時と同じようなジョイント構造の欠失が観察される。また、蛹期におけるEGFRシグナルの活性化領域は、Notch活性化領域ときれいに相補的なパターンを示す。両シグナルの強制発現クローン解析の結果から、両者の間に拮抗的なフィードバック制御機構が存在することを明らかにした。また、dve変異体においては、脚ジョイント構造が異所的に出現することを見出した。このような表現型は、dishevelled(dsh)など細胞内平面極性に関わる分子の変異体においても観察され、dsh変異体ではDve発現レベルが顕著に低下していることを明らかにした。触角と脚はともに明確な分節構造を有し,触角が脚に転換する変異体が存在することや遺伝子発現パターンの類似性などから,形成メカニズムの共通性が指摘されている.触角原基第1-2節(a1-a2)で発現するCut,第2節(a2)で発現するSpalt,第3節(a3)で発現するDacshundの発現領域との比較から,Dve発現領域は第3節よりも遠位部側で,二重または三重のリング状に発現していた.Notch活性化領域(E(spl)mβ)もリング状に観察され,Dve発現領域とほぼ相補的であったことから,翅や脚原基と同様の制御機構の存在が予想された.ショウジョウバエのdefective proventriculus (dve)遺伝子は,形態形成因子Wingless (Wg), Decapentaplegic (Dpp)に依存して発現するホメオボックス遺伝子である。

この過程において,NotchシグナルとEGFRシグナルの拮抗作用,細胞内平面極性(Planer Cell Polarity ; PCP)によるDve発現の維持も必要とされる。dve変異体やEGFR, PCPシグナル因子の変異体では,異所的なジョイント構造が形成されるが,dve変異モザイククローン内での異所的なNotch活性の上昇は認められなかったことから,dve遺伝子発現の抑制がジョイント形成のための十分条件であるか否かについて検討を行った。ジョイント形成領域におけるNotch活性の阻害によって誘導されるジョイント構造の欠失は,dve変異によって回復することはなかったため,ジョイント形成にはdve発現抑制とは独立にNotch活性が必要とされることが明らかとなった。触角と脚はともに明確な分節構造を有し,触角が脚に転換する変異体が存在することや遺伝子発現パターンの類似性などから,形成メカニズムの共通性が指摘されている。Dve発現領域は第3節よりも遠位部側で,二重または三重のリング状に発現していた。しかし,この発現は触角形成そのものには必要ではなく,dve変異モザイク個体においては,正常に形成された本来の触角構造の背側に異所触角が鏡像対称に出現した。変異体が同様の表現型を示すIroquois complexとdveとの関連を調べたところ,それぞれの変異体において明確な遺伝子発現の変化は観察されず,両者が独立の経路で協調的に作用しているという可能性が示唆された。
4-ヒドロキシノネナールエナンチオマーの細胞毒性と解毒代謝における立体選択性

平成14年度では、生活習慣病との因果関係が注目され酸化ストレス時にその生成が促進される強毒性物質4-HNEの細胞毒性効果に、4(S)>4(R)の立体選択性が存在することを初めてラット正常肝細胞(Clone 9)を用い検証した。さらにこの立体選択性は4-HNEの解毒代謝反応の立体選択性ではなく、4(S)-HNEの直接的な細胞毒性作用に起因することを明らかとした。平成15年度では、4-HNEの標的組織の一つである神経様細胞(PC12)においても細胞毒性効果に、4(S)>4(R)の立体選択性が認められることを明らかとした。平成16年度では、上記で明らかにされた4-HNEの解毒代謝とその立体選択性について、ヒト肝組織ならびに発現ヒトGST(hGST)分子種を用い検討し、ヒト肝における4-HNEの主解毒代謝反応もヒトオルトログであるhGSTA4-4によるGSH抱合であり、その立体選択性が(S)>(R)((S)/(R)=1.73.1)であることを明らかとした。また、同酵素によるGSH抱合反応の4(S)-HNE優先性が、同酵素サブユニットの基質結合ドメイン中のArg-15のアミノイミノ基と4(S)-HNEの4位水酸基との相互作用に起因することを、hGST A4-4の部位変異体(hGSTA4のArg-15をLysに置換)を用いて明らかとした。本年度の研究計画に従い、4-hydroxy-2(E)-nonenal(4-HNE)エナンチオマーの細胞毒性の立体選択性ならびにその解毒代謝について検討し、下記の1)および2)の研究成果をあげることができた。1)Clone 9細胞に対する細胞毒性は、4(S)-体が4(R)-体より強力であり、この差がアポトーシス誘導効果の差(4(S)>4(R)-体)に起因することを明らかにした。2)Clone 9細胞は、ラット肝とは異なり4-HNEの主要解毒酵素であるrGSTA4-4を発現しない細胞株であることが、同細胞中のGST分子種組成をimmunoblot法を用い検索する事により初めて明らかとなった。以上の結果は、生体における酸化ストレス下で生成する過酸化脂質由来の4-HNEの細胞毒性効果に、4(S)>4(R)の立体選択性が存在することを初めて細胞レベルで検証したものである。また、この立体選択性は、4-HNEの解毒代謝反応の立体選択性に起因するものではなく、4(S)-HNEの直接的な細胞毒性作用に起因することが明らかとなった。生体膜脂質過酸化反応の二次分解産物としてラセミ体として生成する4-hydroxy-2(E)-nonenal(4-HNE)は、アテローム性動脈硬化、アルツハイマー病、ならびにパーキンソン病患者の病態組織中よりHNE蛋白質付加体とともに高濃度に検出され、4-HNE生成とこれら疾病との因果関係が最近注目されている。前年度著者は、ラット正常肝細胞(Clone9)に対する4(S)-ならびに4(R)-HNEエナンチオマーの毒性作用と同細胞における解毒代謝反応の立体選択性を検討し、4HNEの細胞毒性としては初めて4(S)>4(R)の立体選択性を明らかにした。本年度は当初の研究計画に従い、4-HNEの標的組織の一つである神経細胞における4-HNEエナンチオマーの毒性作用とその解毒代謝反応の立体選択性について検討し、下記の1)3)の研究成果を挙げることができた。1)ラット神経様細胞PC12に対する4-HNEエナンチオマーの細胞毒性作用は,25μMを境にして低濃度領域ではアポトーシスが、高濃度領域では主にネクローシスが誘導され、また両細胞毒性作用には4(S)>4(R)の立体選択性が認められた。2)PC12細胞における4-HNEの解毒代謝はGSH抱合が最大で、ついでNADH依存的な還元、NAD^+依存的な酸化の順に低下した。

また、このGSH抱合反応には、(S)>(R)の立体選択性が認められた。3)PC12細胞中のGST分子種組成を初めて明らかにし、上記2)の抱合反応の立体選択性がrGSTA4-4分子種に起因することを解明した。生体膜脂質過酸化反応の二次分解産物としてラセミ体として生成する4-hydroxy-2(E)-nonenal (4-HNE)は、アテローム性動脈硬化、アルツハイマー病、ならびにパーキンソン病患者の病態組織中よりHNE-蛋白質付加体とともに高濃度に検出され、4-HNE生成とこれら疾病との因果関係が最近注目されている。本年度は当初の研究計画に従い、4-HNEのヒト肝組織における解毒代謝とその立体選択性について検討し、下記の1)-3)の研究成果を挙げることができた。1)日本人女性5名、男性3名、白人女性3名のそれぞれ11名の肝組織より調製した可溶性画分における4-HNEの主解毒代謝反応はGSH抱合であり、また同反応の動力学的解析(Vmax/Km)からその立体選択性が(S)>(R)((S)/(R)=1.73.1)であることが明らかとなった。また同反応がヒトGSTA4-4抗体によって完全に阻害されたことより、ヒト肝の4-HNEのGSH抱合がhGSTA4-4により触媒されることが明らかとなった。2)hGSTA4-4のX線構造解析より解明された基質結合ドメイン中のArg-15をLysに置換した部位変異体を調製し、4-HNEエナンチオマーのGSH抱合反応の立体選択性を検討したところ、4(R)-HNEのKm値(野生型の約1.2倍)に比べ4(S)-HNEのそれが顕著に上昇(野生型の約13倍)したことから、同酵素の4(S)-選択性は、このArg-15のアミノイミノ基と4(S)-HNEの4位水酸基の相互作用に起因することが強く示唆された。3)上記肝可溶性画分における4-HNEエナンチオマーのNADH依存的な還元反応は、日本人で(S)>(R)の選択性が認められたが白人では認められず、また同反応の動力学的解析により白人のVmax/Kmは、日本人のそれの1/4-1/5と顕著に低いことが分かった。本年度は下記の研究実施計画1)3)に基づき、4-HNEエナンチオマーの生成メカニズム研究を実施し、下記に記述した結果が得られた。2)1)で合成された両ヒドロペルオキシドから、Fe^<2+>、アスコルビン酸あるいはヘマチン共存下、生理的条件下(pH7.4緩衝液)、非酵素的分解によって4-HNEが生成するか否か、そしてそのエナンチマー比と生成量を明らかにする。3)ヒト肝がん細胞HepG2あるいは肺胞マクロファージに、COX-2あるいは15-lipoxygenaseを誘導し、その際の4-HNEの生成の有無とエナンチオマーの生成比を明らかにする。上記の研究実施計画に従って研究を実施したところ、1)では目的とする両ヒドロペルオキシド体を合成することができた。ついで、両ヒドロペルオキシド体をそれぞれ単独に基質として用い2)の検討を行った。その結果、Fe^<2+>(5mM)存在下で両基質を2hrインキュベートすると、予想通り主分解生成物として4(S)-HNEの生成が確認されたが、Fe^<2+>とアスコルビン酸あるいはヘマチン存在下では、主分解物として4(S)-HNEの生成は確認されなかった。また、3)を実施する予備実験として、HepG2細胞に対し13-HPODE(50-100μM)を2hr作用させた後、培養液中の4-HNEの生成の有無を検討した結果、その生成量は検出限界以下であった。