hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
記述知識の段階的定量化によるソースコードの困難度推定と適応的学習課題提示法の検討

申請者らはこれまで,ソースコード自身の内的な情報であるデータ依存関係のみに基づいた読解学習教材を対象とし,それを用いてプログラム読解力を養成するための読解学習支援システムの開発を進めている.読解学習は,トレース・デバッグ学習の基礎力向上に対しての有効性,プログラミングの基本である読解の反復学習の有効性を踏まえたものである.既存成果は代入文のみに留まり,記述単位の決定,単位ごとの知識量の定量化までには至っていない.更なる学習支援に向けては,読解学習の対象を制御文や配列までに広げることが望まれている.そこで,平成30年度の取り組みの中では,開発を進めている読解学習支援システムの機能拡張に取り組んだ.具体的には,制御文や配列への対応,プログラム内的構造とソースコードの生成条件を入力データとすることで,読解学習教材としてのソースコードを自動生成できる機能を設計・開発・実装した.その他,多様な読解学習方法を実現した.提示されたプログラムを読解し,「ある変数の値がxである時の,別の変数の値」や「ソースコード実行後のある変数の最終的な値」,「入出力の変数セットと一部欠落したソースコードが与えられた時,欠落部分に入力する適切な命令」などを回答できるようにした.次に,コード記述の知識量(困難度)を段階的に定量化することを試みた.具体的には,潜在ランク理論によりソースコード記述自体が有する困難度をプログラム依存関係に照合しながら解析し,ソースコード個々の読解に必要とされる困難度を段階的に定量化した.実際の授業から得た百人規模の学習者のログを用いた分析の結果,「反復」と「インクリメント・デクリメント」の読解における高い困難度が示唆された.「反復」の困難度については,先行研究の指摘を支持するものであり,従来定性的な観点でのみ議論されてきた困難度を定量的な観点から裏付けた点で意義のある成果である.まず,ソースコード読解学習システムのユーザインタフェース,ユーザエクスペリエンスの見直しを行った.従来システムの中でPHPのみを用いて外観を構築していた点について,JavaScriptを活用して非同期的な画面更新を可能とした.また,レスポンシブデザインを導入し,スマートフォンなど携帯端末に最適化されたユーザインタフェースを提供できるようにした.その他として,基本機能の見直し,機能の拡張を計画通りに進めた.特に今回重要となった見直しは,多様な学習を実現するためにデータベース構造を一から見直したことである.従来は読解教材を提示して,実行後のある変数の値を答えるのみの学習しかできなった.今回の機能拡張により,「ある変数の値がxである時の別の変数の値を答えなさい」といった形式や,「入出力の変数セットと一部欠落したソースコードが与えられた時,欠落部分に入る適切な命令を答えなさい」といった形式の問題を可能とした.以上に加えて,学習の狙いに応じて教材を自動生成する機能の洗練化を行った.これは,データ依存関係を意識した読解能力を身に付けるという意図で学習を実践する際,データ依存関係を入力データとして,ソースコードを自動生成する機能である.従来はデータ依存関係を入力する際に隣接行列を手動で生成する必要があったが,今回はWeb上でネットワーク図を編集することでデータ依存関係を定義できるようにした.以上により教員の作業負担の軽減を実現させた.この拡張システムを利用して実験を行った.データ依存関係を意識させることで認知資源をソースコード内の本質的箇所に集中できるようになること,それにより,ソースコード読解速度の向上やミスの減少に繋がるという仮説を得た.実験と共に,コード記述の知識量(困難度)を潜在ランク理論により段階的に定量化した.教材の困難度は,プログラム行数の程度x1,変数の数の程度x2,プログラム構造の形状に直接的に関係するデータ・制御の依存関係の数の程度x3,知識の程度x4の4つの要素の組合せ(x1×x2×x3×x4通り)から構成されるものと仮定する.よって,潜在ランク理論適用後,x4の推定を試みる.知識とは,制御・依存関係といった構造の観点では同一であるが,記述方法が異なる場合,知識が存在していると考える.C言語の「加算代入」や「3項以上の演算」を例にあげると,変数aにbとcの変数の値を加算する「a=a+b; a=a+c;」という記述は,「a=a+b+c;」と書いても良く,また「a+=b+c;」や「a+=b; a+=c;」といった書き方も可能である.この知識単位を決定するために,潜在ランク理論で推定された各グレートの項目に対して多変量解析法やベイジアンネットワークなどを適用する.説明変数は各教材の生成条件であり,インクリメントや複合代入演算,if文の複合条件,breakやcontinueの繰り返し制御,などが該当する.この分析により,記述単位と知識量(読解に必要となる技能)を明確にする.ここで得られた知識単位と知識量から,学力進度表を構築する.学力進度表の各行はプログラム記述の知識とし,ランクは,プログラム知識の高度さ(困難さ)を意味する構造とする.加えて,学習者の技量に応じて適切な難易度で記述されたプログラム読解学習教材を提示可能な学習者適応の機能を開発する.すなわち,学習者の理解度に応じた適切な問題提示機能である.AtcoderやAizu Online Judgeなどオンラインで公開されているソースコードを取得し,データ・制御依存関係を抽出して,知識量を推定することも有用であると考えられる.知識量に応じた教材の自動的再構成機能についても検討し,適応学習システム実現に向けて足掛かりとする.

申請者らはこれまで,ソースコード自身の内的な情報であるデータ依存関係のみに基づいた読解学習教材を対象とし,それを用いてプログラム読解力を養成するための読解学習支援システムの開発を進めている.この学習ログを分析した結果,プログラミング初学者にとって理解を阻害する可能性のある要因として,複合代入演算,インクリメント・デクリメント,整数同士の除算の困難さ・技量の高さを明らかにした.このことと類似の傾向は,読解過程中の視線の動きからも確認した.しかし,既存成果は代入文にのみに留まり,記述単位の決定,単位ごとの知識量の定量化までには至っていない.更なる学習支援に向けては,読解学習の対象を制御文や配列までに広げることが望まれている.なお,プログラミングを不得意とする学習者層を対象として,ソースコード記述の知識を定義する目的で読解学習に着目した研究は,調査の限りでは確認されていない.以上背景を踏まえ,これまでの研究実績として,開発を進めている読解学習支援システムの機能拡張に取り組んだ.具体的には,プログラム内的構造とソースコードの生成条件を入力データとすることで,読解学習教材としてのソースコードを自動生成できる機能を設計・開発・実装した.読解学習は,トレース・デバッグ学習の基礎力向上に対しての有効性,プログラミングの基本である読解の反復学習の有効性を踏まえたものである.外的構造の意味に頼らない,プログラムソース自身が保持する内的な構造(データ依存関係)にのみに基づいた読解学習教材をプログラミング指導に導入し,スライシングの観点からプログラム記述の困難度を定量化し,コード記述の知識量(困難度)を段階的に定量化することを試みた.学習者は,提示されたプログラムを読解し,「ある変数の値がxである時の,別の変数の値」や「ソースコード実行後のある変数の最終的な値」などを回答できるようにした.まず,ソースコード読解学習システムのバグ修復,基本機能の見直し,機能の拡張を計画通りに進めた.従来の読解学習支援システムでは,教材であるC言語のソースコードを自動的に生成できるが,ランダムな規則でだけしかソースコードを自動生成できなかった.たとえば,教授者が意図した何らかの学習を行わせる場合,ソースコード生成後,教授者が生成されたソースコードを事後的に編集しなければならなかった.この点に関して,本年度の取り組みでは,学習の狙いに応じて教材を自動生成できるようにした.具体的には,データ依存関係を意識した読解能力を身に付けるという意図で学習を実践する際,データ依存関係を入力データとして,ソースコードを自動生成できるようになった.他,学習者がソースコードを読む際にデータ依存関係などのプログラム構造を意識することは,ソースコード読解の効率を高めることに対して有効に働くということを小規模実験から明らかにした.データ依存関係を意識することで,認知資源をソースコード内の本質的箇所に集中できるようになり,その結果として,ソースコード読解速度の向上や,ミスの減少に繋がるという仮説を得た.プログラムスライシングは,従来からデバッグなどの作業に重要であると報告されている.本研究での成果は,過去の先行研究の知見を支持する結果であり,妥当であると考えられる.他,プログラムが持つ各知識要素の定量化に取り組んだ.
破歯細胞の歯根面接着阻害による歯根吸収予防法の開発

目的.抗歯根自己抗体は存在することは確認されているが,歯根吸収を促進させているのかあるいは抑制しているのか明らかでない.歯根吸収は前駆細胞が分化により歯根面に接着し,吸収が活性化されるものと思われる.そこで,まず歯根面への破歯細胞の接着に対する抗歯根抗体の及ぼす影響を調べるために抗歯根抗体を作製し,その抗体が歯根吸収の抑制に応用することが可能かどうかを検討した.実験1.抜去歯牙を粉末にし,マウスに皮下注射した.全血を採取し,遠心分離した上清を抗歯根抗体とした.出生直後のウィスター系ラットの大腿骨より骨髄を採取し,象牙切片上(A,無処理;B,抗歯根抗体で処理したもの)に播種した.37°C1時間保温した後,TRAP染色を行って接着した細胞数を計測した.その結果,予想に反してBの象牙切片上にはAの2倍以上のTRAP陽性細胞が接着していた.これは,抗歯根抗体が歯根吸収を抑制するのではなく,むしろ促進させることを示唆している.この接着細胞の促進は抗体のFc部分がマクロファージに結合し,サイトカイン(恐らくはIL-1,IL-6,及びTNF-α)が産生されTRAP陽性細胞が誘導されたものと思われる.そこで,実験2を延期し,まず抗歯根抗体のFc部分を除去して,再度,上述の実験を行うことにした.Fc断片を除くために抗歯根抗体をペプシンで消化した.象牙切片(A,無処理;B,抗歯根抗体で処理したもの;C,抗歯根抗体のFab断片で処理したもの)上に骨髄細胞を播種した.その結果,接着したTRAP陽性細胞数は,Aが9【plus-minus】2個であったのに対し,Bは15【plus-minus】4個であり,Cは2【plus-minus】2個であった.抗歯根抗体は接着を阻害することはできなかったが,抗歯根抗体Fab断片は接着を阻害した.このことはFab断片は歯根吸収を抑制できる可能性を示唆している.実験2は現在,進目的.抗歯根自己抗体は存在することは確認されているが,歯根吸収を促進させているのかあるいは抑制しているのか明らかでない.歯根吸収は前駆細胞が分化により歯根面に接着し,吸収が活性化されるものと思われる.そこで,まず歯根面への破歯細胞の接着に対する抗歯根抗体の及ぼす影響を調べるために抗歯根抗体を作製し,その抗体が歯根吸収の抑制に応用することが可能かどうかを検討した.実験1.抜去歯牙を粉末にし,マウスに皮下注射した.全血を採取し,遠心分離した上清を抗歯根抗体とした.出生直後のウィスター系ラットの大腿骨より骨髄を採取し,象牙切片上(A,無処理;B,抗歯根抗体で処理したもの)に播種した.37°C1時間保温した後,TRAP染色を行って接着した細胞数を計測した.その結果,予想に反してBの象牙切片上にはAの2倍以上のTRAP陽性細胞が接着していた.これは,抗歯根抗体が歯根吸収を抑制するのではなく,むしろ促進させることを示唆している.この接着細胞の促進は抗体のFc部分がマクロファージに結合し,サイトカイン(恐らくはIL-1,IL-6,及びTNF-α)が産生されTRAP陽性細胞が誘導されたものと思われる.そこで,実験2を延期し,まず抗歯根抗体のFc部分を除去して,再度,上述の実験を行うことにした.Fc断片を除くために抗歯根抗体をペプシンで消化した.象牙切片(A,無処理;B,抗歯根抗体で処理したもの;C,抗歯根抗体のFab断片で処理したもの)上に骨髄細胞を播種した.その結果,接着したTRAP陽性細胞数は,Aが9【plus-minus】2個であったのに対し,Bは15【plus-minus】4個であり,Cは2【plus-minus】2個であった.抗歯根抗体は接着を阻害することはできなかったが,抗歯根抗体Fab断片は接着を阻害した.このことはFab断片は歯根吸収を抑制できる可能性を示唆している.実験2は現在,進
血中胆汁酸測定による「吸収不良」及び「腸内細菌過剰増殖」の鑑別診断法の確立

胆汁酸は極めて閉鎖的な腸肝循環を行っている。胆汁中より腸管へ排泄された胆汁酸は空腸から回腸までの広汎な部位より再吸収される。更に肝細胞では効率よく摂取される。腸管内においては嫌気性菌により胆汁酸脱抱合,7α-脱水酸化が行われ,遊離型胆汁酸(F),2次胆汁酸の生成が起こる。これらの事象を利用し,血液生科学的に腸管内諸種病態の診断を試みた。即ち経口胆汁酸負荷試験を行い腸管からの吸収動態を知り,血清胆汁酸分画測定により腸内細菌過剰増殖を診断することを目的とした。また両方法を併用し,「吸収不良」「腸内細菌過剰増殖」の両病態の鑑別を試みた。[方法]UDCA300mg経口負荷時の血清総胆汁酸は酵素蛍光法,血清胆汁酸分画は高速液クロにて測定した。[成績]:(1)腸疾患16例中10例において負荷後30,60,120分後の前値に対するUDCA増加量は有意に低下していた。外因性UDCAの吸収障害が推測された。(2)胆汁酸負荷試験とシリング試験はr=0.46と相関を認めた。(3)諸種胃腸疾患52例中23例にFの増加を認めた。その内1例においては嫌気性菌過剰発育を認め,手術時採取し得た2例の腸液では,血中と同様にFの増加を認めた。(4)Fの増加を認めた2例に抗生剤投与した所,血中Fの低下を認め,血中総蛋白値の改善を認めた。(5)分画測定と負荷試験を20例の腸疾患に施行した。その結果I型:分画異常群(F,DC増加:細菌過剰増殖),II型:負荷試験異常(吸収不良),III型:分画,負荷試験共に異常群,IV型:正常群の4群に分類できた。[総括]胆汁酸負荷試験は吸収不良の病態診断に,血清胆汁酸分画測定は腸内細菌過剰増殖の病態診断に有用と考えられた。また両者を併用することで両病態の鑑別が可能になると考えられた。血液中(末梢血)胆汁酸の濃度と分画プロフィルは腸管からの胆汁酸再吸収と門脉経由胆汁酸の肝における摂取という二つの因子によって決定される。したがって腸疾患の病態は血清胆汁酸のプロフィルに反映される。従来、諸種腸疾患の病態を血液生化学的に判断する検査法はなかった。そこで私たちは次の仮説をたてた。「もし腸内細菌過剰症候群が存在すれば腸管内において胆汁酸の脱抱合、脱7α-OHのため、血中に遊離型、および二次胆汁酸が増加する。一方、吸収不良症候群が存在すればUrso-deoxycholic acid経口負荷時の血中胆汁酸曲線は平低になる。」(1)血中胆汁酸分画:血清0.5mlをSep-PakC18にて抽出、リポ親和性カラムにより各分画に別け、HPLCにて測定した。健常12例、諸種腸疾患50例。

健常例に比しstagnant loos syndrome(5例)。大量腸切除(4例)などでいずれも遊離型が最高82%(正常29.3±5.3%)にまで上昇していた。また分画では主としてdeoxycholic acid(タウリン、グリシン、遊離型)が62%に及ぶ増加を示していた。(2)胆汁酸経口負荷試験:8例(広汎腸管切除、クローン病、他)において、ursodeoxycholic acid 300mg経口負荷后の血中曲線のAUCは健常例に比較して減少していた。UDCA負荷試験はシリングテストと平行したので、本試験は吸収試験として利用できる。以上1)2)の成績を分析した結果、諸種腸疾患は次の4型に分類できた。〈一〉型は1)2)ともに正常な例(細菌過剰発育なく、吸収不良ない)〈2〉型、1)異常で2)正常な例(過剰発育あり、吸収不良なし)〈3〉型は1)正常で2)異常例(過剰発育なく、吸収不良あるもの)〈4〉型は1)2)ともに異常な例(過剰発育、吸収不良ともにあり)、〈1〉型2例、〈2〉型3例、〈3〉型5例、〈4〉型3例であった。結論として血中胆汁酸分画測定とUDCA負荷試験の組み合わせによって、細菌過剰発育症候群と吸収不良症候群は鑑別診断出来る。胆汁酸は極めて閉鎖的な腸肝循環を行っている。胆汁中より腸管へ排泄された胆汁酸は空腸から回腸までの広汎な部位より再吸収される。更に肝細胞では効率よく摂取される。腸管内においては嫌気性菌により胆汁酸脱抱合、7α-脱水酸化が行われ、遊離型胆汁酸(F),2次胆汁酸の生成が起こる。これらの事象を利用し、血液生化学的に腸管内諸種病態の診断を試みた。即ち経口胆汁酸負荷試験を行い腸管からの吸収動態を知り、血清胆汁酸分画測定により腸内細菌過剰増殖を診断することを目的とした。また両方法を併用し、「吸収不良」「腸内細菌過剰増殖」の両病態の鑑別を試みた。〔方法〕UDCA300mg経口負荷時の血清総胆汁酸は酵素蛍光法、血清胆汁酸分画は高速液クロにて測定した。〔成績〕:(1)腸疾患16例中10例において負荷後30、60、120分後の前値に対するUDCA増加量は有意に低下していた。外因性UDCAの吸収障害が推測された。(2)胆汁酸負荷試験とシリング試験はr=0.46と相関を認めた。(3)諸種胃腸疾患52例中23例にFの増加を認めた。その内1例においては嫌気性菌過剰発育を認め、手術時採取し得た2例の腸液では、血中と同様にFの増加を認めた。(4)Fの増加を認めた2例に抗生剤投与した所、血中Fの低下を認め、血中総蛋白値の改善を認めた。(5)分画測定と負荷試験を20例の腸疾患に施行した。その結果I型:分画異常群(F、DC増加:細菌過剰増殖)、II型:負荷試験異常(吸収不良)、III型:分画、負荷試験共に異常群、IV型:正常群の4群に分類できた。〔総括〕胆汁酸負荷試験は吸収不良の病態診断に、血清胆汁酸分画測定は腸内細菌過剰増殖の病態診断に有用と考えられた。また両者を併用することで両病態の鑑別が可能になると考えられた。
GISAXS-CT法による機能性高分子薄膜材料の表面・界面の可視化

本研究では、GISAXS法にCT法を組み合わせることで、面内方向におけるナノ界面構造を可視化することに成功した。GISAXS-CTシステムの構築のため、高精度並進(X)・回転(φ)機構を有した真空チャンバーの製作を行った。また、測定後の得られるデータは非常に膨大であるため、それらを解析するためのソフトウェアを開発した。実証実験として、パターンした金蒸着した試料上に、機能性高分子ブロック薄膜を2つの円上に塗布した試料を作製した。入射角を制御することで斜入射小角X線散乱を測定し、像を再構成したところ、金及び高分子材料を別々に再構成することに成功した。本研究課題では、放射光放射光を光源とする反射型の小角散乱法(GISAXS)とコンピュータトモグラフィー法(CT)を組み合わせることで、機能性薄膜材料の表面・界面ナノ構造を可視化する新たな手法(GISAXS-CT法)を開発することを目的としている。開発したGISAXS-CT法を用いて、代表的な有機薄膜太陽電池材料のナノ界面構造を、高空間分解能で可視化する。平成27年度では、高空間分解能GISAXS-CT測定及び解析システムの構築のための1.高精度並進・回転機構を有した真空チャンバーの製作。2.並進・回転機構と検出器を同期した全自動測定システムの構築。また、得られたデータの数は膨大になるため、データをイメージ像に再構成し、表示・解析するためのソフトウェアの構築を主として進めた。1のチャンバー開発においては、高輝度・低発散の放射光GISAXS測定を、高精度の並進(X)・回転(φ)スキャンによって行うことを進めている。現在、光のサイズが幅10μmで、10μm以下で駆動可能な並進(X)・1°以下で駆動可能な回転(φ)機構を有する真空チャンバーの製作を進めている。2の成果として、X,φ及び検出器をを同期するソフトウェアを開発し、全自動測定システムを構築した。また、大量のデータを解析するためのソフトウェアを開発した。開発した2のシステムを利用し、無機材料薄膜のナノ構造の可視化を行ったところ、像の再構成に成功した。当初の目的として、高空間分解能GISAXS-CT測定及び解析システムの構築を設定した。平成27年度では、高空間分解能GISAXS-CT測定及び解析システムの構築に成功した。但し、より高精度なシステムの構築のために、ステージなどの真空チャンバーの製作については現在進行している。測定及び解析システムを用いることで、分解能100ミクロンでのGISAXS-CT測定を行ったところ、無機材料薄膜の像の再構成に成功に加えて、高分子薄膜材料の像の再構成に成功した。当初の計画どおりに研究を進め、期待通りに結果・知見を得ることができた。研究成果の一部は論文一報として出版されており、学会においても発表済みである。また、現在論文一報として登校準備中である。以上の理由により、概ね順調に進展していると判断できる。本研究の目的は、放射光を光源とする反射型の小角散乱法(GISAXS)とコンピュータトモグラフィー法(CT)を組み合わせることで、機能性薄膜材料の表面・界面ナノ構造を可視化する新たな手法(GISAXS-CT法)を開発することである。高精度真空チャンバーの開発及び自動測定・解析システムを開発では、試料を回転する時に低面ブレのステージを用いた。これにより、放射光の光源サイズを小さくした時のGISAXS測定が可能になり、20μmの空間分解能でCT像を再構成することができた。実証実験では、無機材料薄膜試料を用いた。真空スパッタリング法で表面に金、金/白金、白金、白金/金をそれぞれ異なった文字形に蒸着したシリコン基板を作成した。試料位置でのビームサイズ横200 μm ×縦100 μmのX線を角度0.2°で入射し、散乱像を試料から1800 mmの距離にあるX-ray image intensifier witha cooled CCD (II + CCD)(Hamamatsu Photonics, V7739P+ORCA R2、ピクセルサイズ64 μm×64 μm、ピクセル数1344×1024 pixel)で測定した。得られるた二次元散乱像から各ピクセル位置で、CT像をした。例えば、金の微粒子が形成する相関ピーク位置においてCT像を再構成したところ、金蒸着部分が明確に再構成された。さらに、各ピクセル位置からCT像を再構成することで、各材料が形成するナノサイズの形状や相関距離に対応したCT像を個別に再構成することに成功した。また、有機物-無機物の多層試料の再構成を行った。X線に対する物質の全反射臨界角の違いは無機物と有機物の間では大きい。そのため、有機物-無機物の多層試料などでは、入射角を変えたGISAXS測定を行うことで、それぞれの物質からの構造情報を別々に得ることに成功した。

入射角を制御することで斜入射小角X線散乱を測定し、像を再構成したところ、金及び高分子材料を別々に再構成することに成功した。平成28年度では、引き続き高分子薄膜材料及び実材料の薄膜のナノ界面構造を、高空間分解能で可視化することを重点的に行う。現状では、分解能100ミクロンでのGISAXS-CT測定がか可能であるが、今後はさらなる分解能の向上を予定している。また、GISAXS測定の特徴の一つとして、X線の入射角を制御することでX線の侵入長を変えることができる。この特徴を利用して、薄膜の表面近傍と内部に分離してナノ構造の分布を可視化することを行う。対象の試料としては、代表的な有機薄膜太陽電池材料であるP3HT/PCBMブレンドを予定している。本試料を用いて表面と界面の深さ方向の空間的な構造の違いを得ることが難しい場合には、他の機能性高分子材料を用いて表面・界面の可視化を進めていく。斜入射小角X線散乱平成28年度への使用額の発生については、高分解能な測定が可能な仕様にするために、設計する真空チャンバーの設計、自動ステージの選定に時間を有したことから、生じた。平成29年度では、仕様を確定することで、真空チャンバーの制作及び自動ステージを購入する予定である。
尿路感染症成立機序の解明(分子生物学的アプローチによる)

細菌の線毛は大別するとマンノース感受性(MS)線毛とマンノース抵抗性(MR)線毛に分けられる。我々は、セラチアよりMR線毛及びMS線毛の遺伝子のクローニングを行い、ラットの腎盂腎炎モデルに於いてMS線毛保有菌がMR線毛保有菌より腎瘢痕形成能が強いことを示した。in vitroで、MS線毛保有菌は、MR線毛保有菌に比し、ヒト白血球に貧食され易くSuperoxideの産生刺激が強いことが判明した。以上よりMS線毛が感染部位で白血球のSuperoxideの産生を促し組織破壊が惹起されるものと思われる。MS線毛は、いくつかのsubunitより構成されているが、そのうち線毛の先端に存在するAdhesin蛋白が血球凝集に関わっていることが知られている。そこで大腸菌のMS線毛のAdhesin遺伝子の欠失mutantを作製した。このmutantは線毛を有するが血球凝集能を示さなかった。このAdhesinを欠くmutant線毛を有する菌とwild typeのMS線毛を有する菌をラットの腎に接種するとwild typeのMS線毛を有する菌は、腎瘢痕形成を強く惹起するが、mutantは殆ど腎瘢痕形成を惹起しなかった。このことより、MS線毛のAdhesinが腎盂腎炎におけるはん痕形成に重要な役割を果たしていることが示された。mutant線毛を有する菌はwild typeのMS線毛を有する菌と同程度ヒト白血球に貧食されやすいが、superoxideの産生刺激は低かった。以上より線毛のAdhesinが白血球のsuperoxide産生を強く刺激し、線毛を介する貧食は他のsubunitも関与していると考えられ、このことは新しい知見である。これまでの研究で腎瘢痕を引き起こす宿主側および細菌側の因子の解明がかなりの程度なされ、また細菌側の重要な因子であるAdhesinの同定ができた。遺伝子操作により大腸菌ふ及びセラチアの線毛遺伝子をクローニングした。毛線には、大別してMR線毛とMR線毛があるが、ラットの慢性腎盂腎炎モデルにおいて、MR線毛を有する菌が線毛をする菌に比べ有意に腎瘢痕を形成する事が判明した。その腎瘢痕は、スーパーオキサイドディスムターゼの投与により抑制された。このことより感染部位の白血球と、細胞がinterctし白血球にスーパーオキサイドを産生させ、それが組織破壊につながるものと考えられた。そこでln viroでMR線毛を有する菌とMR線毛を有する菌の白血球に対するスーパーオキサイド産生刺激を検討した。MR線毛を有する菌はMR線毛を有する菌に比し約2倍白血球のスーパーオキサイド産生を刺激する事が判明した。MR線毛の形成は、いくつかの遺伝子による遺伝子郡に支配されている。MR線毛は、magor Subuniといくつかのminor subumiより構成されている。minor subumltの内1つabhesin(定着素)は、赤血球の凝葉能を示す事が知られている。MR線毛のcletionmuttant作製し、線毛を有するが赤血球凝葉能を有しない、すなわちadhesin遺伝子を欠くmutantを発見した。このmutant線毛を有する菌でラット慢性腎感染実験を行うと、wild typeのMR線毛を有する菌に比べ腎瘢痕形成が有意に弱い事が判明した。この事よりMR線毛のadhesinが腎瘢痕形成に重要な役割を果たしていると考えられた。

我々は、セラチアよりMR線毛及びMS線毛の遺伝子のクローニングを行い、ラットの腎孟腎炎モデルに於いてMS線毛保有菌がMR線毛保有薗より腎瘢痕形成能が強いことを示した。in vitroで、MS線毛保有菌は、MR線毛保有菌に比し、ヒト白血球に貪食され易くSuperoxideの産生刺激が強いことが判明した。以上よりMS線毛が感染部位で白血球のSuperoxideの産生を促し組織破壊が惹起されるものと思われる。MS線毛は、いくつかのsubunitより構成されているが、そのうち線毛の先端に存在するAdhesin蛋白が血球凝集に関わっていることが知られている。そこで大腸菌のMS線毛のAdhesin遺伝子の欠失mutantを作製した。このmutantは線毛を有するが血球凝集能を示さなかった。このAdhesinを欠くmutant線毛を有する菌とwild typeのMS線毛を有する菌をラットの腎に接種するとwild typeのMS線毛を有する菌は、腎瘢痕形成を強く惹起するが、mutantは殆ど腎瘢痕形成を惹起しなかった。このことより、MS線毛のAdhesinが腎孟腎炎におけるはん痕形成に重要な役割を果たしていることが示された。mutant線毛を有する菌はwild typeのMS線毛を有する菌と同程度ヒト白血球に貪食されやすいが、superoxideの産生刺激は低かった。以上より線毛のAdhesinが白血球のsuperoxide産生を強く刺激し、線毛を介する貪食は他のsubunitも関与していると考えられ、このことは新しい知見である。これまでの研究で腎瘢痕を引き起こす宿主側および細菌側の因子の解明がかなりの程度なされ、また細菌側の重要な因子であるAdhesinの同定ができた。
「マージュリー・ケンプの書」における神秘主義文学と図像学

二年間に亘る本研究で、構成上の一貫性が欠如していると指摘されているMargeryの黙想の流れを再考した。その結果、The Bookの中心的テーマであるキリストの生誕、受難、及び霊的婚姻の黙想がマリア崇敬、Virgin Saints崇拝を軸に展開し、The Bookが一貫した構造をもっていることが判明し、黙想がMargeryの霊的成長の鍵であることを確認した。
先端的がん治療に向けた全身投与型siRNAデリバリーシステムの開発

small interfering RNA(siRNA)を始めとする核酸医薬品シーズの実用化に期待が高まる中、最大の鍵となっているのがデリバリーシステムの開発である。本研究では、末端を化学修飾したsiRNAとポリカチオンリポソームから形成される安定なナノ粒子を開発し、がん治療研究への応用展開を試みた。インビボにおいて新規ナノ粒子を用いてsiRNAを腫瘍へ送達し、がんの進行に関与するmammalian target of rapamycin(mTOR)シグナルを抑制したところ、有意ながん治療効果が得られた。Small interfering RNA (siRNA)を用いたRNA干渉法は、核酸医薬の創薬において最も実用化に近い技術として注目を集めているが、その医療応用には核酸デリバリーシステムの開発が欠かせない。本研究課題では、siRNA全身投与によるがん治療を実現しうるデリバリーシステムの構築を目指し、ナノDDS技術とsiRNAの化学修飾技術の融合によって斬新なナノ粒子の開発を試みた。siRNAベクターとしては、dicetylphosphate-tetraethylenepentaamine (DCP-TEPA)を主成分とし、ポリエチレングリコール(PEG)およびArg-Gly-Asp (RGD)ペプチドでナノ粒子の表面を修飾した全身投与型のポリカチオンリポソーム(TEPA-PCL)を用いた。siRNAの化学修飾は、コレステロールをsiRNAのセンス鎖3'末端に共有結合によって付加した。TEPA-PCLとsiRNAの複合体形成状態をゲル電気泳動法で検討したところ、siRNAにコレステロールを付加することによってTEPA-PCLとsiRNAの複合体が安定化することを見出した。次にsiRNAの化学修飾がRNA干渉効果に与える影響について培養細胞を用いたin vitro試験において検討した。ルシフェラーゼを恒常的に発現するA549ヒト肺がん細胞を用い、ルシフェラーゼ遺伝子のノックダウンを指標にRNA干渉効率を評価した。TEPA-PCLを用いてsiRNAを導入した結果、末端の化学修飾によってノックダウン効率が低下しないこと、ならびに細胞毒性を示さないことが明らかとなった。そこでTEPA-PCLに搭載した^<18>Fポジトロン標識siRNA(コレステロール結合型)をマウスに尾静脈内投与し、その体内動態をポジトロン断層法で解析した。その結果、全身投与型ベクターに搭載したsiRNAでは全身からの強いシグナルが検出され、PEG修飾の特徴である長期血中滞留性を示すイメージデータが得られた。本年度の研究成果を基にし、次年度はin vivoにおけるRNA干渉効果について検討を実施する計画である。Small interfering RNA(siRNA)を用いたRNA干渉法は、核酸医薬の創薬において最も実用化に近い技術として注目を集めているが、その医療応用には核酸デリバリーシステムの開発が欠かせない。siRNAベクターとしては、dicetylphosphate-tetraethylenepentaamine(DCP-TEPA)を主成分とし、ポリエチレングリコール(PEG)およびArg-Gly-Asp(RGD)ペプチドでナノ粒子の表面を修飾した全身投与型のポリカチオンリポソーム(TEPA-PCL)を用いた。当該年度は、担がんマウスを用いたin vivoにおけるRNA干渉試験、同マウスを用いたポジトロン断層法による体内動態解析、off-target効果の一指標としてのサイトカイン応答に関する検討などについて研究を行った。その結果、ルシフェラーゼを恒常的に発現するA549ヒト肺がん細胞を移植したマウスの実験系において、配列特異的なRNA干渉効果が観察された。サイトカイン応答の実験結果からもin vivoにおけるノックダウン効果がRNA干渉による選択的な事象であることが示唆された。また、ポジトロン標識siRNAを用い、担がんマウスにおける体内動態を解析し、ナノ粒子のPEG化の効果およびRGDペプチドの標的化効果を検証した。検証結果をナノ粒子設計にフィードバックし、siRNAデリバリーシステムの改善を行った。本年度は、配列特異的なRNA干渉効果をin vivoで示すことに成功しており、次年度は治療効果に重点をおいて研究をすすめる計画である。昨年度までに化学修飾siRNAを用いた脂質ナノ粒子形成について実験を実施し、small interfering RNA(siRNA)の物理化学的性質を化学修飾によって改善することにより、優れたデリバリーシステムを構築可能なことを明らかにしてきた。本年度は、治療標的としてセリン・スレオニンキナーゼの一種であるmammaliantarget of rapamycin(mTOR)に着目し、申請者らが開発したデリバリーシステムのがん治療応用を図るための研究を中心に行った。mTORは細胞周期の進行、血管新生などに関与することが知られている。そこでmTORを標的とした腫瘍RNA干渉療法の開発を目的とし、mTORに対するsiRNA(simTOR)の腫瘍及び新生血管への選択的デリバリーを試みた。

VEGF receptor-1に対して結合性を示すペプチド(Ala-Pro-Arg-Pro-Gly)をsimTOR搭載TEPA-PCLに修飾し、マウス内皮細胞様細胞2H-11細胞、マウスメラノーマ細胞B16F10細胞に導入した。その結果、siRNA搭載TEPA-PCLはmTORのmRNAおよびタンパク質の発現を特異的に抑制し、さらには両細胞の増殖ならびに2H-11細胞の管腔形成を有意に阻害した。次に肺転移がんモデルマウスに放射標識TEPA-PCLを静脈内投与し、その体内動態を解析した。その結果、ペプチドを修飾したTEPA-PCLが肺転移巣に有意に集積することが明らかになった。さらに、肺転移がんモデルマウスを用いた治療実験において、ペプチド修飾TEPA-PCLを用いて全身投与したsimTORは有意な腫瘍増殖抑制効果を示した。以上よりsimTOR全身投与による腫瘍RNA干渉療法の有効性が示唆されるとともに、化学修飾siRNAを用いたナノ粒子設計の有用性がインビボにおいても証明された。交付申請書の研究計画通りに実験を行い、良好なデータが得られている。このまま当初の計画を遂行することにより、研究の目的を達成できる可能性は高いと考えられる。24年度が最終年度であるため、記入しない。今後の推進方策は、当初の研究計画に沿うものであり、変更はない。
高精度の診断を実現するペプチドを用いた腫瘍核医学画像診断薬剤の開発

【実験結果など】マウス血漿とのインキュベート実験:腎臓での非特異的な放射能集積の低減を目的としてスペーサーを導入した^<111>In標識octreotide誘導体(^<111>In-DTPA-spa-oct)をマウス血漿とインキュベートし、HPLCで分析した結果、血漿中で安定に存在することを確認できた。マウスにおける体内放射能分布と体外排泄経路の検討:^<111>In-DTPA-spa-octをマウスに投与したところ、スペーサーを導入していない化合物(^<111>In-DTPA-spa-oct)と同様に、放射能は主に尿中に排泄された一方で、腎臓に集積した放射能は^<111>In-DTPA-spa-octと比べて速やかに低減した。したがって、腎放射能の低減という目標を達成できたことが分かった。尿中排泄放射能の分析:尿をHPLCで分析した結果、尿中の主な放射性代謝物が、スペーサー部位の開裂で生成する代謝物であることを確認できた。腎細胞における細胞内放射能布:密度勾配遠心法により腎細胞内放射能分布を調べたところ、放射能はリソソーム画分に存在することが確認された。したがって、スペーサー部位での開裂はリソソームで起こっていると考えた。【まとめ】以上の結果から、本研究で検討した^<111>In-DTPA-spa-octでは、腎細胞内での作用ではあるが、スペーサー部位が設計通りに開裂され、生成した放射性代謝物が速やかに尿中に排泄されることにより、腎放射能が速やかに低減したことがわかった。このことは、スペーサーの開裂によって遊離させる化合物の選択が適切であったことを示している。従って、この化合物の結合方法を工夫することにより、腎細胞内に取り込まれることなく腎刷子縁膜酵素の作用によって腎放射能を低減する^<111>In-DTPA-spa-octを開発できるものと考えられる。キレーターであるDTPAの誘導体(mDTPA)を液相法により合成した。また,mDTPAとアミノ酸類似体の結合体も液相法にて合成した。これらと市販の側鎖保護^αN-Fmoc-アミノ酸を用いて,固相法にて樹脂上に保護DTPA結合ペプチド鎖を構築した。その後,酸処理と環化反応を経て,DTPA-spa-oct,および,スペーサーを含まない対照となる化合物を合成した。現時点において,2種類のDTPA-spa-octと対照化合物の合成が終了し,2種類の合成が終了間近である。なお,合成がより簡便であり,かつ,レセプター親和性がより高いという理由から,今回,ペプチド部分にはoctreotideの誘導体である[Tyr^3,Thr^8]-octreotideを用いた。mDTPAとアミノ酸,または,アミノ酸類似体とを縮合させた後,脱保護を行うことにより,DTPA-Xを合成した。現在,DTPA-Xを2種類合成し終えている。また,これまでに1種類の^<III>In標識体(^<III>In-DTPA-X)を合成し,その逆相HPLC,セルロースアセテート膜電気泳動,及び,TLCによる分析条件を検討し,決定した。
虚血性神経細胞障害におけるミトコンドリア膜透過性遷移の役割に関する研究

脳虚血におけるmPTの役割を詳細に検討する目的で、以下の実験を行なった。まず、げっ歯類では海馬CA1神経細胞が虚血に対してきわめて脆弱であるが、その機構にmPTが関与しているとの仮説を検証した。海馬と新皮質からミトコンドリアを単離し、カルシウム負荷によって生じるmPTを吸光度の変化として観察したが、両者のミトコンドリアのカルシウム感受性に明らかな差は認められなかった。そこで、カルシウム負荷にともなってミトコンドリアから放出されるcytochrome cをELISAを用いて定量的に測定したところ、海馬由来のミトコンドリアから有意に多量のcytoshrome cが放出されていることが判明した。その差がどこから生じるのかを明らかにするため、両者由来のミトコンドリアにおけるbcl-2関連蛋白の量をWestern blot法により解析した。その結果、海馬由来のミトコンドリアはbcl-XLの保有量が少ないことが判明した。この結果は現在、国際誌への投稿準備中である。以上の結果から、脳虚血による神経細胞死にはmPTそのものよりも、mPTにともなってミトコンドリアから放出される細胞死関連蛋白質やbcl-2関連蛋白が大きな役割を果たしていることが推測された。それをさらに検討する目的で、マウス中大脳動脈閉塞による脳梗塞モデルを確立し、calcineurin抑制剤であるFK506を投与した。その結果、脳梗塞は虚血周辺部で有意に縮小することが判明した。Calcineurinの抑制はbad蛋白の脱リン酸化・mPTの誘発を抑制することで、脳虚血による細胞死を抑制していると考えられ、その分子機構をWestern blot法、免疫染色にて解析中である。結果の一部は、米国脳卒中学会で発表した。近日中に誌上発表の予定である。ラット前脳から超遠心装置を用いて、迅速にミトコンドリアを単離する方法を確立した。この方法により、synaptosomal mitochondriaおよびfree mitochondriaいずれも単離することが可能となった。Clark型酸素電極を用いたミトコンドリア呼吸活性の測定や電子顕微鏡による形態の確認により、良好なミトコンドリアであることが確認された。単離されたミトコンドリアの浮遊液の吸光度を持続的に測定することにより、in vitroにおけるミトコンドリア膜透過性遷移(Mpt)を観察が可能となった。カルシウム負荷によるMptの発現には閾値が存在することが判明したが、肝や心ミトコンドリアとは異なり活性酸素によるMptの誘導は生じないことが判明した。免疫抑制剤のcyclosporin AはMptを強く抑制するが、FK506は無効であることが判明した。前脳虚血により海馬CA1細胞に遅発性神経細胞死が生じるモデルを確立した。Cyclosporin Aの大量投与により、これが著しく抑制されることを確認した。これらの結果は短報として大学院生により次頁のように発表予定である。新皮質と海馬からそれぞれのミトコンドリアを微量づつ単離する方法を確立した。これを用いてMptの誘導実験を行なった。両者からのミトコンドリアではMptを誘発するカルシウムの閾値に大きな差はないことが判明した。Western blot techniqueを用いて、Mptにともなうミトコンドリア蛋白の放出を観察するシステムをほぼ確立した。この結果、Mptによってcytochrome cがミトコンドリアから微量ではあるが、放出されることが確認された。前脳虚血モデルにおける海馬CA1細胞でもcytochrome cが細胞質に放出されるか否かを、現在、Western blotおよび免疫二重染色法により検討中である。

昨年度に引き続いて,in vitroおよびin vivoの実験を平行して実施した.昨年度にラット前脳からミトコンドリアを単離するシステムを用いて,以下の実験を行った.すなわち,虚血に対して強い耐性を有する新皮質,および,虚血に対して脆弱な海馬CAlを,ラット断頭後,氷上で分別して,それぞれのミトコンドリアを単離した.各部位におけるミトコンドリアにpermeability transition(PT)の来たしやすさに格差があるかどうか,確認する目的で,さまざまな濃度のカルシウムをミトコンドリア浮遊液に負荷して,吸光度の変化を持続的に測定した.しかしながら,PTを生じるカルシウム濃度の閾値には差がみられなかった.両者のミトコンドリアともcyclosporin AによってPTが抑制されたことより,虚血の脆弱性はPTよりも上流の現象によってコントロールされていることが推測された.さらに,PTによってミトコンドリアから細胞質へ放出されるcytochrome cは,肝ミトコンドリアに比べて微量であり,PTののちに生じるapoptosisのメカニズムに臓器間の相違があることがWestern blottingにより証明された.これは,ミトコンドリアからのcytochrome c放出を抑制するとされるcycloheximideは,ミトコンドリア浮遊液で観察されるPTを抑制しなかったこととも一致した.砂ネズミの前脳虚血モデルを用いた実験を今年度も実施した。昨年度の実験では,cyclosporin Aの虚血後投与が海馬CAlにおける遅発性神経細胞壊死を著明に抑制することが判明した.CyclosporinA(CsA)とともにPTを抑制することが知られているtrifluoperazine(TFP)を,単独に,あるいは,cyclosporin Aとともに砂ネズミに投与した.これにより,CsAとTFPの相乗的保護効果が認められた.二重免疫染色およびWestern blottingによって海馬CAlの神経細胞にcytochrome cの細胞質内への放出が生じるかどうかを調べたが,明らかなcytochorome cの経時的放出は認められられなかった.以上の結果の一部を北海道医学雑誌に報告した.現在,国際誌への投稿を準備中である.本年度は、脳虚血におけるmPTの役割を、昨年度よりもさらに詳細に検討する目的で、以下の実験を行った。まず、げっ歯類では海馬CA1神経細胞が虚血に対してきわめて脆弱であるが、その機構にmPTが関与しているとの仮説を検証した。海馬と新皮質からミトコンドリアを単離し、カルシウム負荷によって生じるmPTを吸光度の変化として観察したが、両者のミトコンドリアのカルシウム感受性に明らかな差は認められなかった。そこで、カルシウム負荷にともなってミトコンドリアから放出されるcytochrome cをELISAを用いて定量的に測定したところ、海馬由来のミトコンドリアから有意に多量のcytoshrome cが放出されていることが判明した。その差がどこから生じるのかを明らかにするため、両者由来のミトコンドリアにおけるbcl-2関連蛋白の量をWestern blot法により解析した。その結果、海馬由来のミトコンドリアはbcl-XLの保有量が少ないことが判明した。
ナノスケール構造化熱輸送の物理と工学

単層カーボンナノチューブは,その優れた物性から幅広い応用が見込まれている.特にその熱物性については,高い熱伝導率が予測されているため,次世代の熱伝導媒体として期待されている.これまでに,アルコール触媒CVD法により,垂直配向単層カーボンナノチューブ膜の合成方法が開発されており,特異な方向依存性を有するバルク材料としての応用が注目されている.本研究では単層カーボンナノチューブを用いた新しい複合体材料の開発を目指し,垂直配向単層カーボンナノチューブ膜を樹脂に混合した複合材料を作成し,その伝熱性能を評価した.複合材料は個々の単層カーボンナノチューブの高い伝熱特性を反映して,優れた性能を有することが期待される.さらに,垂直配向単層カーボンナノチューブ膜の配向性を維持したまま複合材の作成ができれば,強い方向依存性を有する熱デバイスの開発にも繋がる.前年度作成した垂直配向単層カーボンナノチューブ膜とポリマーの複合材料の伝熱性能評価を行った.まず,走査型電子顕微鏡によって複合材中の垂直配向カーボンナノチューブ膜が配向を維持しているかを検証した.作成後の複合材を単層カーボンナノチューブの配向方向と平衡に切断し,イオンビームを用いて研磨することで切断面を平滑化した.切断面の電子顕微鏡観察を行ったところ,複合材料中においても単層カーボンナノチューブはおおよそ配向を留めていることが確認された.またこれらの測定によって,熱伝導計測に必要となる,複合材料内の垂直配向膜及び複合材料表面の金属蒸着膜の膜厚を測定した.次に,フォトサーマル赤外検知法を用いて,複合材料の熱伝導率測定を行った.レーザ照射によって資料に周期的な温度変動を与え,放射される熱放射エネルギーの周期的変動との位相差を検出した.加熱光を適当な周波数領域で変調させ,各周波数における位相差を測定し,得られた周波数-位相差曲線を解析することによって熱伝導率を測定した.その結果,複合体が非等方性熱伝導を示すことが示唆された.近年のSWNTに関する研究の著しい発展により,SWNTの基礎的性質が明らかになると同時に,多岐に渡る応用への期待が高まっている.その中で,本研究ではSWNTを用いた新しいバルク材料を開発し,その性能を評価することを目的とし,対象としてSWNTを編むことによって作られるSWNT糸,及びSWNTを樹脂に混合した複合材料を取り扱った.これらのバルク材料は個々のSWNTの高い機械,電気伝導,及び伝熱特性を反映して,優れた性能を有することが期待される.VA-SWNTを編むことによってSWNT糸を作り,それらの特性評価を行うための実験装置を開発した.VA-SWNTの側面(水平方向)に接触させたモーターの軸をVA-SWNTから除々に離すことによって,複数のSWNTより一本のSWNT糸を編むことを試みた.軸の回転を調整することで高い摩擦抱合力が達成できる.一方,ポリメタクリルイミド,ポリエチレン,及びポリスチレン等の樹脂に高純度のSWNTを混合して複合材料を作り,それらのVA-SWNTへの浸透の度合いや熱的安定性の詳細を調べた.単層カーボンナノチューブは,その優れた物性から幅広い応用が見込まれている.特にその熱物性については,高い熱伝導率が予測されているため,次世代の熱伝導媒体として期待されている.これまでに,アルコール触媒CVD法により,垂直配向単層カーボンナノチューブ膜の合成方法が開発されており,特異な方向依存性を有するバルク材料としての応用が注目されている.本研究では単層カーボンナノチューブを用いた新しい複合体材料の開発を目指し,垂直配向単層カーボンナノチューブ膜を樹脂に混合した複合材料を作成し,その伝熱性能を評価した.複合材料は個々の単層カーボンナノチューブの高い伝熱特性を反映して,優れた性能を有することが期待される.さらに,垂直配向単層カーボンナノチューブ膜の配向性を維持したまま複合材の作成ができれば,強い方向依存性を有する熱デバイスの開発にも繋がる.前年度作成した垂直配向単層カーボンナノチューブ膜とポリマーの複合材料の伝熱性能評価を行った.まず,走査型電子顕微鏡によって複合材中の垂直配向カーボンナノチューブ膜が配向を維持しているかを検証した.作成後の複合材を単層カーボンナノチューブの配向方向と平衡に切断し,イオンビームを用いて研磨することで切断面を平滑化した.切断面の電子顕微鏡観察を行ったところ,複合材料中においても単層カーボンナノチューブはおおよそ配向を留めていることが確認された.またこれらの測定によって,熱伝導計測に必要となる,複合材料内の垂直配向膜及び複合材料表面の金属蒸着膜の膜厚を測定した.次に,フォトサーマル赤外検知法を用いて,複合材料の熱伝導率測定を行った.レーザ照射によって資料に周期的な温度変動を与え,放射される熱放射エネルギーの周期的変動との位相差を検出した.加熱光を適当な周波数領域で変調させ,各周波数における位相差を測定し,得られた周波数-位相差曲線を解析することによって熱伝導率を測定した.その結果,複合体が非等方性熱伝導を示すことが示唆された.
ミニ蛋白質に共通するフォールディング機構の解明

本年度は、20残基のミニ蛋白質Trp-cage(配列はNLYIQWLKDGGPSSGRPPPS)を研究対象として選定した。この蛋白質は水溶液中でTrp6を囲むかご状の構造をとる。4残基異なる変異体TC3b(配列はNLFIEWLKNGGPSSGAPPPS)はこのかご状の構造をとる確率が低くなることが知られている。そこで、マルチカノニカル分子動力学シミュレーションを用いて野生型、変異体について自由エネルギー地形を計算し、立体構造形成能を比較した。この結果、天然構造からのCα原子のRMSDが2A以下となるポピュレーションは、野生型で56.9%であるのに対し、この変異体では12.1%と大きく減少していることが明らかとなった。この結果は、実験結果とよく一致しており、本研究で使用したシミュレーション手法が十分な信頼性を持っていることを示している。野生型とTC3bでは4つの残基が異なっていることから、どの残基が立体構造形成に重要な役割を果たしているかを明らかにするために、野生型にTC3bの残基を導入した変異体について、同様にシミュレーションを行った。現在までにTrp-cageのArg16をAlaに置換したR16A変異体について計算を終了した。この残基は野生型の天然構造においてAsp9と塩橋を形成していることから、TC3bの立体構造形成能が低い原因はこの塩橋が形成されないためとされてきた。しかし、野生型の天然構造からのCαRMSDが2A以下のポピュレーションは45.5%と、野生型に匹敵するレベルであった。従って、この塩橋の形成は、立体構造形成に必須ではないといえる。今後は他の残基についても同様に立体構造形成能への影響を精査し、立体構造形成における各残基の役割を明らかにしていく予定である。研究代表者らは、水溶液中で特定の構造をとらないペプチドGPM12(配列はGYDDATKTFG)にβヘアピン構造を形成するミニ蛋白質chignolin (GYDPETGTWG)の残基を導入したキメラペプチドについて、マルチカノニカル分子動力学シミュレーションを用いて自由エネルギー地形の計算を行い、Asp4をProに、Lys7をGlyに置換したGPM12(D4P/K7G)変異体はchignolinと同様なβヘアピン構造をとることを明らかにしている。また、NMRを用いた立体構造決定によって、この計算機による予測が正しいことを確認している。当該年度は、D4P/K7G変異によってβヘアピン構造をとるようになるメカニズムを明らかにするために、部分ペプチドAce-Asp-Pro-NMeについて自由エネルギー地形の計算を行った。この結果、50%以上の確率でこのペプチドはchignolinの該当部分に非常に近い構造をとることが明らかとなった。この構造分布の偏りは、Aspの側鎖がNMeのアミド基と形成する水素結合、およびProの5員環とAspとの間の立体障害によって引き起こされると考えられ、ヘアピン構造の開始に有利である。一方、Gly7は左巻きαヘリックス構造をとることで、ヘアピン構造を完成させる役割を担っていると考えられる。従って、ミニ蛋白質においても、通常の大きさの蛋白質と同様に、短距離相互作用と長距離相互作用が矛盾なく形成されることが立体構造形成に重要であると言える。また、本研究において溶媒和自由エネルギーを近似的に求めるために用いているgeneralized Bornモデルについて精度の比較を行い、OBC GB法が、自由エネルギー地形を高い精度で効率良く求める上で、最も有用であることを明らかにした。