hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
高温で強靭化するアイソコリックゲルの創製

当研究室で偶然発見された「温度に応答して力学物性が可逆的かつ劇的に変化する体積変化を示さない(アイソコリック性)ハイドロゲル」について、前年度までに種々の組成からなるゲルを作製し、相分離温度や力学物性転移比のチューニングを行った。さらに、ポリマーと塩が相互作用することで相分離現象を発現している点に着目し、塩の疎水性度を変えることで相分離挙動を制御できることを見出した。これらの新奇性を鑑みて、国内特許出願及びJST権利化支援を受けてPCT出願を行った。本年度では、水中や生理環境下でも使用できるような塩を用いないアイソコリックゲル、及び架橋剤を用いない物理架橋型のゲルの創成を行った。前者について、これまでに多くの報告がある相分離を示すポリマーであるポリ(イソプロピルアクリルアミド)(PNIPAm)と、PNIPAmと水素結合を形成するポリメタクリル酸から成る共重合ゲルを作製した。本ゲルは水素結合の形成により水中で収縮し、比較的高い高分子体積分率を維持できる。また、PNIPAmの性質により熱で相分離し弾性率が上昇することが示された。後者について、高いモノマー濃度で重合したポリアクリル酸ゲルを高濃度の酢酸カルシウム水溶液に浸漬することで、完全物理架橋型のゲルの作製に成功した。ナイフで本材料を切断し、切断面を合わせて静置すれば、再度接着することが示された。また、本材料は物理結合ゲルのため、硬いハードマテリアルとの複合材料用マトリックスとしても使用できる。ガラス繊維布との複合材料は、低温では柔らかく、高温では硬くなる温度応答性プロテクターとして利用できる。本材料は、アスファルトに対する摩擦熱で瞬時に硬くなり、ほとんど構造が壊れないことが示された。これらの成果をまとめ、現在論文を投稿中である。基礎的な原理の理解だけでなく、その理解に基づいて発展的な材料の創製も進んでいる。また、極めて実用的なアプリケーションの検討も並行して行っており、いくつかの企業と実用の検討を行っている。最終年度に向けた総まとめの論文を投稿中であり、総じて、おおむね順調な進捗状況にあると考えられる。本ゲルの強い相分離現象の原理を応用して、無溶媒のゴム・エラストマーへの発展を試みる。ハイドロゲルは水溶媒があるため、利用が制限される。産業的には、構造がゲルとほとんど同じだが乾燥を気にしないゴム・エラストマーの方が、利用価値が高い。エラストマーを高温で強く相分離させる機構を導入する。また、本相分離は強い吸熱反応を伴うため、それを利用した熱吸収材の検討を行う。当研究室で偶然発見された「温度に応答して力学物性が可逆的かつ劇的に変化する体積変化を示さない(アイソコリック性)ハイドロゲル」について、初年度では発現条件の探索と構造評価を行い、その新奇性を踏まえて特許出願まで行った。本ゲルは汎用的で毒性の低いポリアクリル酸(PAAc)ゲルを酢酸カルシウム(CaAc)水溶液に平衡まで浸すことで簡単に作成可能である。様々な濃度のPAAc及びCaAc水溶液で本ゲルを作製し、アイソコリック相分離を評価したところ、PAAcの濃度が低いほど、またCaAc水溶液の濃度が高いほど、相分離は低温シフトし、約2090°Cの広い範囲で制御することができた。また相分離前後で体積変化がほぼ認められなかった。相分離前後のゲルを液体窒素で瞬時に凍結、乾燥させたサンプルの断面を電子顕微鏡で観察したところ、相分離前では見られない無数の空孔が相分離後のゲルに観察された。これは凍結乾燥前においてこの空孔に水が非局在化していた事を示している。即ち、アイソコリック性は相分離後において水をゲルの系外に排出するのではなく、ゲル内部に水クラスターを形成することで達成していることが示された。PAAcゲルは本来高温で相分離を示さないが、ポリマー側鎖カルボキシル基がCaAcとイオンコンプレックスを形成し、トータルで疎水性を形成していることが示唆される。それを踏まえて、塩の疎水性が相分離に及ぼす影響を評価した。CaAcより親水的なギ酸Ca、疎水的なプロピオン酸Caを用いて作製したところ、プロピオン酸<酢酸<ギ酸の順に相分離しやすく、確かに塩の疎水性が影響していることが示された。種々の温度で本ゲルの力学特性を評価したところ、相分離前後で1000倍以上硬くなることが示され、劇的に物性を変化させることがわかった。本新奇性を鑑みて、国内特許出願及びJST権利化支援を受けてPCT出願を行った。初年度の目標であるアイソコリック性に関わる条件や、構造の評価は概ね終了し、本現象の理解が進んでいる。また、平成30年度の計画の一部である「塩の疎水性度の影響」についても既に完了している。また、本材料のアプリケーションについて、耐摩擦熱試験等を平行して行い、特許出願の後押しも進めている。総じて、当初の計画を上回る進捗状況にあると考えられる。

これらの新奇性を鑑みて、国内特許出願及びJST権利化支援を受けてPCT出願を行った。本年度では、水中や生理環境下でも使用できるような塩を用いないアイソコリックゲル、及び架橋剤を用いない物理架橋型のゲルの創成を行った。前者について、これまでに多くの報告がある相分離を示すポリマーであるポリ(イソプロピルアクリルアミド)(PNIPAm)と、PNIPAmと水素結合を形成するポリメタクリル酸から成る共重合ゲルを作製した。本ゲルは水素結合の形成により水中で収縮し、比較的高い高分子体積分率を維持できる。また、PNIPAmの性質により熱で相分離し弾性率が上昇することが示された。後者について、高いモノマー濃度で重合したポリアクリル酸ゲルを高濃度の酢酸カルシウム水溶液に浸漬することで、完全物理架橋型のゲルの作製に成功した。ナイフで本材料を切断し、切断面を合わせて静置すれば、再度接着することが示された。また、本材料は物理結合ゲルのため、硬いハードマテリアルとの複合材料用マトリックスとしても使用できる。ガラス繊維布との複合材料は、低温では柔らかく、高温では硬くなる温度応答性プロテクターとして利用できる。本材料は、アスファルトに対する摩擦熱で瞬時に硬くなり、ほとんど構造が壊れないことが示された。これらの成果をまとめ、現在論文を投稿中である。基礎的な原理の理解だけでなく、その理解に基づいて発展的な材料の創製も進んでいる。また、極めて実用的なアプリケーションの検討も並行して行っており、いくつかの企業と実用の検討を行っている。最終年度に向けた総まとめの論文を投稿中であり、総じて、おおむね順調な進捗状況にあると考えられる。得られた知見を基に「塩を用いないアイソコリックゲル」及び「架橋剤を用いない物理架橋型アイソコリックゲル」の作製を行う。前者について、本ゲルは純水中及び生理環境下では相分離を発現できない欠点があった。一般的な環境または医療環境を考慮すると、塩フリーで作製できるメリットは極めて大きい。本現象に必要な条件は概ね把握しているため、純水中でアイソコリック相分離を示すゲルの作製を行う。後者について、架橋剤を極力用いずにゲルを作製することで物理結合だけから成るアイソコリックゲルを作製できると考えられる。物理結合は、一度切れても再結合できるため、破壊されても治る自然治癒能を有するアイソコリックゲルの作製が可能となると考えられる。本ゲルの強い相分離現象の原理を応用して、無溶媒のゴム・エラストマーへの発展を試みる。ハイドロゲルは水溶媒があるため、利用が制限される。産業的には、構造がゲルとほとんど同じだが乾燥を気にしないゴム・エラストマーの方が、利用価値が高い。エラストマーを高温で強く相分離させる機構を導入する。また、本相分離は強い吸熱反応を伴うため、それを利用した熱吸収材の検討を行う。初年度に購入した装置が想定より安く購入できたため。特許出願手数料(国際)について、JSTの権利化支援を受けたことにより、必要経費が削減できたため。本財源で出張予定であった複数の旅費が別財源に回された。物品購入、旅費及び英文校正料に当てる。
食事性高コレステロール血症ラットは認知症モデル動物になりうるか？

認知症は,糖尿病の合併症と考えられている。しかし,適切な自然発症型モデル動物がおらず,認知症の治療法は確立されていない。一方で,外因性高コレステロール血症(ExHC)ラットは糖代謝異常を呈し,学習能力が低いことが明らかとなっている。本研究ではExHCラットが認知症のモデル動物となるか起源系統であるSDラットとの比較実験を行った。高齢ラットは2型糖尿病を発症し、高齢ExHCラットの大脳皮質中Aβ(1-42)濃度は有意な高値を示した。これより高齢ExHCラットはインスリン分泌不足による糖代謝異常を呈し,脳内でAβ(1-42)が蓄積したことから認知症を発症していることが示唆された。アルツハイマー型認知症(AD)は2型糖尿病や高コレステロールといった様々な生活習慣病との関連が報告されている。ExHCラットは、食事コレステロールに応答して速やかに高コレステロール血症を発症する病態モデル動物である。この原因遺伝子であるSmek2の欠損変異は肝臓において糖・脂質・アミノ酸代謝異常に影響を与えており、糖代謝異常の結果、2型糖尿病様の症状を発症することが明らかとなっている。また、受動的回避学習試験での成績からExHCラットは他の糖尿病モデルラットより学習能が低いことが報告されている。本研究ではExHCラットがADを発症していると仮定し、AD患者の脳で見られる老人斑の構成成分であるアミロイドβタンパク質(Aβ)の蓄積を評価した。Aβ分解作用が報告されているS-allyl-L-cysteine (SAC)を用いて前処理を行うことで定量した。また、脳内の酸化コレステロール状態の異常は神経変性を誘導すること、特に24-OHや27-OHがADの進展に寄与することが報告されていることからGC-MSによりこれらの分子の脳中の存在量を測定した。脳ホモジナイズ液のSAC処理により、各群において3つの低分子量のAβが検出された。しかし、Aβが検出されない個体もあり、バンド強度の比較で群間に有意な差は見られなかった。このことから今回の飼育条件下ではAβ蓄積の点でExHCラットがADを発症していないことが考えられる。しかし、AD発症と負の相関がある24-OHと正の相関のある27-OHの定量を行ったところ、ExHCラットにおいて24-OH/27-OH比が低下傾向を示し、脳内の総酸化コレステロールに占める27-OHは有意に高値を示したことから、ADのリスクを高めていると考えられる。また脳内で神経伝達の発達に不可欠のコレステロール量が減少したことは学習能の低下に寄与していると考えられる。認知症は高齢期に見られる神経変性疾患であり,特にアルツハイマー病は脳内にアミロイドβ(Aβ)が蓄積し,認知障害や行動能力の低下を引き起こす。認知症の患者数は年々増加しており,糖尿病の合併症と考えられている。しかし,現在適切な自然発症型のモデル動物がおらず,認知症の治療法は確立されていない。22週齢ExHC/TaおよびSD/JclラットをAIN-76組成に準じた食餌で2週間飼育し,飼育8日目に経口糖負荷試験(OGTT)を行った。飼育終了後,血清,血漿及び各臓器を摘出した。大脳皮質中のAβ(1-42)濃度をELISA法で測定し,認知症状態を確認した。また,認知症発症メカニズムを探るため,4週齢のラットを2週間飼育し,脳の糖代謝および脂質代謝を評価した。高齢ラットへのOGTTにおいて,ExHCラットでは有意な高血糖状態を示した一方で,血清インスリン濃度は有意な低値を示した。高齢ExHCラットの大脳皮質中Aβ(1-42)濃度は有意な高値を示した。若齢ラットへのOGTTにおいて,ExHCラットの血糖値は0分時で有意な高値を示し,血清インスリン濃度も有意な高値を示した。これよりExHCラットは加齢に伴い2型から1型糖尿病へ移行することが示唆された。若齢ExHCラットの脳内のグルコース濃度は有意な低値を示し,脳内へのグルコースの取り込み悪化が認知症の進展に影響を及ぼすことが示唆された。

高齢ラットは2型糖尿病を発症し、高齢ExHCラットの大脳皮質中Aβ(1-42)濃度は有意な高値を示した。これより高齢ExHCラットはインスリン分泌不足による糖代謝異常を呈し,脳内でAβ(1-42)が蓄積したことから認知症を発症していることが示唆された。ホモジナイズ液のSAC処理により、各群において3つの低分子量のAβが検出された。しかし、Aβが検出されない個体もあり、バンド強度の比較で群間に有意な差は見られなかった。このことから今回の飼育条件下ではAβ蓄積の点でExHCラットがADを発症していないことが考えられる。しかし、AD発症と負の相関がある24-OHと正の相関のある27-OHの定量を行ったところ、ExHCラットにおいて24-OH/27-OH比が低下傾向を示し、脳内の総酸化コレステロールに占める27-OHは有意に高値を示したことから、ADのリスクを高めていると考えられる。また脳内で神経伝達の発達に不可欠のコレステロール量が減少したことは学習能の低下に寄与していると考えられる。したがってExHCラットはAβの蓄積は確認できなかったもののAD発症リスクを上げている。飼育期間を延長することで、ADを誘導するか検討する。栄養化学
世紀転換期の英仏米におけるロシア研究―対露認識をめぐる比較文学比較文化史的考察

今年度は、19世紀後半から20世紀初頭の英米で活躍したロシア研究者たちの活動やその対露認識の趨勢を実証的に明らかにすることを目指した。平成29年4月、5月に、日本大学経済学部図書館で、英国の総合的なロシア研究雑誌The Russian Review (1912-14)の調査を実施した。本誌の総目次を作成し、各記事の分析を行う過程で、短期間ながら、当時の英国のロシア研究をリードした文学者やジャーナリスト、研究者たちが集い、様々な分野のロシア事情を論じた重要な雑誌であった可能性が高いことが分かった。平成29年6月から7月にかけて、以下の二本の査読付き投稿論文を執筆した。まず日本の評論家・随筆家の内田魯庵(1868-1929)が随筆「労農政府の承認問題」(1923)で引用し紹介したリース・ウィリアムズ(Albert Rhys Williams, 1883-1962)のロシア革命関連の著作Through the Russian Revolution. New York: Boni and Liveright, 1921の特徴や概要、テクストの内容を考察した。その結果、ロシア革命直後の米国におけるロシア研究が、同時代の日本のロシア研究に少なからぬ影響を及ぼしていたことが判明した。次に20世紀初頭の英仏におけるロシア文化研究との比較対照のため、明治昭和期のロシア文学者昇曙夢(1878-1958)による大正末期の総合的なロシア研究の一例『新ロシヤ・パンフレット』シリーズ(全八巻、1924-1927)を総体的に調査した。英仏におけるロシア文化の紹介は、昇によるロシア経由の紹介よりも10年から15年ほど早く、情報や知識の水準も英仏の方が高かったと考えられる。8月以降は、19世紀後半から20世紀初頭の英国のロシア研究者の著書や英露関係史の書籍を調査し、当時の情勢の把握や分析を行った。国内の大学図書館で所蔵されているリプリント版資料を精査し、英国のロシア研究事情とその水準を見極めるための膨大な作業を開始し、現在も継続中である。本件については、来年度にはしかるべき成果として公表することができる見通しである。また今年度に交付された科学研究費を活用することで、19世紀後半から20世紀初頭の英国のロシア研究者たちの著書、特に主要なロシア研究書の初版のほか、英露関係史関係の英語書籍を効率よく入手することができ、スムーズな調査や分析、原典研究に着手することができた。現在もこの作業を継続している。そして査読付学会誌への複数論文の投稿と掲載決定というかたちで十分な成果発表を行うことができた。英米のロシア研究の水準の高さや、それらが同時代の日本のロシア研究に与えたインパクトを、部分的ではあるが、実証することができたと考えられる。19世紀後半から20世紀初頭の英国におけるロシア研究については、平成29年度の研究経過と成果を引き継ぎ、調査や分析を継続することで、概ね十分に研究を遂行することができると考える。平成30年度に学会口頭発表等でしかるべき成果として公表することを目指す。同時代の米国と仏国のロシア研究については、平成30年度の科学研究費を活用し、関連文献・書籍、特に米国と仏国のロシア研究者たちの著書を早期に入手し、原典研究に着手し、調査する予定である。さらに同時代に英米仏に渡った亡命ロシア人やロシア人革命家たちの回想録や著書、雑誌・新聞記事の調査を通じて、これらの英米仏のロシア研究者たちとの知的交流や人的交流を実証的に裏付ける作業も並行することで、三か国におけるロシア研究の実態やその情報源をより具体的に比較していきたいと考えている。

国内の大学図書館で所蔵されているリプリント版資料を精査し、英国のロシア研究事情とその水準を見極めるための膨大な作業を開始し、現在も継続中である。本件については、来年度にはしかるべき成果として公表することができる見通しである。また今年度に交付された科学研究費を活用することで、19世紀後半から20世紀初頭の英国のロシア研究者たちの著書、特に主要なロシア研究書の初版のほか、英露関係史関係の英語書籍を効率よく入手することができ、スムーズな調査や分析、原典研究に着手することができた。現在もこの作業を継続している。そして査読付学会誌への複数論文の投稿と掲載決定というかたちで十分な成果発表を行うことができた。英米のロシア研究の水準の高さや、それらが同時代の日本のロシア研究に与えたインパクトを、部分的ではあるが、実証することができたと考えられる。19世紀後半から20世紀初頭の英国におけるロシア研究については、平成29年度の研究経過と成果を引き継ぎ、調査や分析を継続することで、概ね十分に研究を遂行することができると考える。平成30年度に学会口頭発表等でしかるべき成果として公表することを目指す。同時代の米国と仏国のロシア研究については、平成30年度の科学研究費を活用し、関連文献・書籍、特に米国と仏国のロシア研究者たちの著書を早期に入手し、原典研究に着手し、調査する予定である。さらに同時代に英米仏に渡った亡命ロシア人やロシア人革命家たちの回想録や著書、雑誌・新聞記事の調査を通じて、これらの英米仏のロシア研究者たちとの知的交流や人的交流を実証的に裏付ける作業も並行することで、三か国におけるロシア研究の実態やその情報源をより具体的に比較していきたいと考えている。
溶液中の温度勾配生成を利用する液液光導波路の構築とその化学分析への応用

本研究では、層流中に温度勾配(屈折率勾配)を形成させ、GI型光ファイバーのような屈折率分布を持つ、コア・クラッドともに液体である液液光導波路を構築し、その性質を調べた。ステンレス管(内径800μm)にLCポンプを用いて純水を送液し、アクリルパイプ内に恒温器で温度を調節した温水(30°C70°C)を流すことによって、ステンレス管を外部から加熱し、管内を流れる純水に温度勾配(屈折率勾配)を形成させた。光源光は光ファイバーを介してステンレス管内に導入し、さらに、管内を導波した光を、検出器側の光ファイバーを介して検出した。まず、検出器側の光ファイバーの位置(導波距離)を固定して、加熱温度・流速の影響による導波光の強度変化を観察した。また、その結果を、数値流体力学ソフト(COMSOL MULTIPHYSICS)を用いて管内を流れる純水の温度分布シミュレーション(CFDシミュレーション)を行い、それぞれの実験結果と比較した。実験では、導波光強度は流速を遅くすると低下し、速くすると上昇した。また、各流速において加熱温度を高くすると強度が上昇した。これらの結果は、管内の温度勾配の大きさに関するCFDシミュレーションの結果によって説明されることが分かった。また、検出器側の光ファイバーを、ステンレス管内をスライドさせて導波距離を変化させて強度を測定したところ、強度は距離に対して周期的に変化し、加熱温度が高いほどその周期が短くなることがわかった。この現象はGI型光ファイバーの理論により説明される。ステンレス管(内径800 μm)にLCポンプを用いて純水を送液し、アクリルパイプ内に恒温器で温度を調節した温水(30 °C70 °C)を流すことによって、ステンレス管を外部から加熱し、管内を流れる純水に温度勾配(屈折率勾配)を形成させた。また、その結果を、数値流体力学ソフト(COMSOL)を用いて管内を流れる純水の温度分布シミュレーション(CFDシミュレーション)を行い、それぞれの実験結果と比較した。また、検出器側の光ファイバーを、ステンレス管内をスライドさせて導波距離を変化させて強度を測定したところ、強度は距離に対して振動し、加熱温度が高いほどその周期が短くなることがわかった。温度勾配生成による以下の二つの形式の液液光導波路(Liquid-core/Liquid-cladding Waveguide)の構築とその分析化学的応用を目的に研究を行っている。タイプ1)ステンレスキャピラリー管などに溶液を送液して層流をつくり、外部から加熱することにより、流体中に管中心部から周辺への温度勾配を形成させて液液光導波路を構築する。(目的:1.セルや溶媒の屈折率が問題とならない長光路セルへの応用、2.化学チップにおける新しい光操作法の開拓)タイプ2)シースフローの中心流(コア)と周辺流(クラッド)の界面で、たとえば、酸塩基中和反応などの発熱反応を起こさせ、その熱により温度勾配を形成させ液液光導波路を構築する。(目的:1.界面反応における微小発熱の検出とそれを用いた新たな化学計測法の提案)1)タイプ1の液液光導波路:ガスクロマトグラフ用のカラムオーブンをステンレス管の加熱に用いる実験装置の基本的な設計と製作を行った。

しかし、故障などもあり、期待通り動かず、現在までに評価に耐えうる測定結果の収集には至っていない。現在、管用マントルヒーターに加熱方式を変えて、早急に実験装置を整備してデータ収集を行う予定である。しかし、当初計画を変更する必要性は今のところないと考えている。2)タイプ2の液液光導波路:現在、これまでの液液光導波路実験装置を用いて予備的な実験を行っている。しかし、コア溶液とクラッド溶液の屈折率差を調整するのが困難、出口での光強度測定が迷光の影響を受ける、などの問題により、実験は難航している。迷光を防ぐ方策などを強化し、引き続き実験を行う予定である。上記タイプ1)の液液光導波路に関しては、使用予定であった加熱装置の故障などにより、製作に遅れが生じている。当初計画では23年度で基本的なデータの取得まで行う予定であったが、現在はその段階に至っていない。また、タイプ2)に関しては、予備的な実験を行っている段階だが、予期しなかった技術的な問題もあり、進捗に遅れが生じている。このように、総じて研究に遅れが生じているが、現段階で大きな目的や計画の変更が必要とは考えていないため、本評価とした。23年度においては、加熱装置の故障などにより研究に遅れが生じ、23年度に購入予定であった測定装置用部品の一部の取得を24年度に行う計画に変更したために、24年度使用する予定の研究費が生じた。しかしながら、現段階では、全体的には、大きな計画の変更が必要はないと判断しており、当初の計画に従って、特に、タイプ1)の液液光導波路の構築に力を入れて研究を遂行する予定である。本年度使用予定であった研究費(繰り越し分)は、主にタイプ1)の光導波路測定装置の完成および改良に使用する。特に測定系の整備に使用する。さらに次年度(当初計画)の研究費は、特に、タイプ2)の導波路の改良およびタイプ1)、2)を用いる実験を遂行するための消耗品を中心とする物品費に用いる。
近接場光を導入したマルチ・モード光学顕微鏡システムの試作研究

光の全反射にともなって全反射面の裏側に発生する近接場光を利用して生体シグナル分子やイオン、さらに機能性分子を可視化・観測するマルチ・モード装置を試作・改良した。観察に用いた生体標本は、幼若ラットの脊髄後根神経節や三叉神経節及び上頸神経節から分離培養したニューロンである。1.直角プリズムをカバーグラスに貼り付け、プリズムからレーザー光線を射入する。この直角プリズム付きのカバーグラスを倒立型微分干渉顕微鏡の架台に置いて、カバーグラスの上・下両面でレーザー光線が全反射しながら進行し、カバーグラス上面に近接場光を発生するように光路を構成した。2.上述の直角プリズム方式では、観察部位が限定されるという難点があるので、この点を解決するために、グラスファイバーを用いて倒立型顕微鏡の落射光源入射部にレーザー光線を導入して対物レンズを通してカバーグラス上面に近接場光を発生させる光路を組み立てた。3.両方式を比較検討するために、カバーグラス上面に置いた蛍光ビーズ(直径0.1μm)の蛍光像を冷却CCDカメラで撮影・画像処理し、両方式ともにカバーグラス上面に近接場光が発生していることを確認した。対物レンズ方式ではカバーグラスを移動させて細胞の任意の部分を近接場光内に置くことができるが、全反射面を形成するためにレーザー光線の平行性を得るための光学的調整や蛍光褪色を起こさないよう留意すべきである。両方示式を目的に応じて使い分けることが得策である。4.直角プリズム付きカバーグラス上に培養したニューロンを蛍光Ca指爪薬fluo-3で負荷してレーザー光による励起蛍光を観察すると、落射蛍光像よりも限局した像が得られ、近接場光内(膜直下)のCa濃度を計測できると考えられ、今後ホールセルパッチ法の併用を試みる。一方、対物レンズ方式では、カバーグラス上の培養ニューロンの細胞体や成長円錐の培養面との接触部分のインテグリン(integrin α1β1とintegrin α6β1)を蛍光免疫染色法によって可視化すると、前者は接触部分に広範囲に、後者は点状に、それぞれ認められ、分布状態に差異があることが分かった。近接場光を利用して、生きた細胞における生体機能性分子などの存在や動態をオンライン・リアルタイムで観測・解析できるシステムを試作するために、下記のような検討を行った。1.直角プリズムをカバーグラスに貼り付け、プリズムからクリプトン・アルゴンレーザー・ビームを射入する。この時レーザー・ビームの入射角を変えながらカバーグラスの上・下両面で全反射が起こることを確認した。この直角プリズム付きのカバーグラスを倒立型微分干渉顕微鏡の架台に置いて、プリズム付きカバーグラスの上・下両面でビームが全反射しながらカバーグラス内を進行するようにレーザー・ビームを導入する光路を構成した。2.次いで、カバーグラスの上面に近接場光が発生していることを蛍光ビーズを用いて確認した。すなわち、カバーグラス上面に直径0.1μmの蛍光ビーズを置いて、レーザー・ビーム照射による蛍光像とキセノン落射光照射による蛍光像を冷却CCDカメラで撮像して画像処理を施して比較検討した。後者のキセノン落射光照射では全視野に蛍光ビーズが観察されたが、前者ではレーザー・ビームの全反射スポットに対応した部位に限局してビーズが観察された。3.各種伝達物質やレセプターを免疫化学的に蛍光標識することや組織化学的に標識することを試み、その状況を共焦点顕微鏡を用いて確認し、NPYなどのペプチドやアドレナリン受容体の存在、AChEの分布などの解析に近接場光を適用できる可能性を検討した。4.幼若ラットの脊髄後根神経節細胞を急性単離して、直角プリズム付きカバーグラス上で培養した。この細胞に蛍光Ca指示薬fluo-3を負荷してレーザー・ビームで照射し、fluo-3蛍光を観測した。落射蛍光像に比べて、レーザー・ビーム照射では限局した蛍光像が得られ、近接場光内に入った(恐らく膜直下の)領域のCa濃度を計測できると考えられる。

両方示式を目的に応じて使い分けることが得策である。4.直角プリズム付きカバーグラス上に培養したニューロンを蛍光Ca指爪薬fluo-3で負荷してレーザー光による励起蛍光を観察すると、落射蛍光像よりも限局した像が得られ、近接場光内(膜直下)のCa濃度を計測できると考えられ、今後ホールセルパッチ法の併用を試みる。一方、対物レンズ方式では、カバーグラス上の培養ニューロンの細胞体や成長円錐の培養面との接触部分のインテグリン(integrin α1β1とintegrin α6β1)を蛍光免疫染色法によって可視化すると、前者は接触部分に広範囲に、後者は点状に、それぞれ認められ、分布状態に差異があることが分かった。生体シグナル分子やイオン、機能性分子を可視化してその存在を容易に観測できる装置を試作することを目的として、本年度の研究計画を実施した。今回の観察に利用した標本は主として、幼若ラットの脊髄後根神経節から分離・培養したニューロン(以下DRG細胞という)である。1.前年度はカバーグラスに貼り付けた直角プリズムを通してレーザー光線を射入するシステムを試みたが、この方法では観察部位が限定されるという難点がある。この点を解決するために、対物レンズを通してレーザー光線を導入してカバーグラス上面に近接場光を形成させる方式を検討した。2.グラスファイバーを用いて、倒立型微分干渉顕微鏡の落射光源入射部にレーザー光線を導入するための光路を組み立てた。カバーグラス上面に置いた蛍光ビーズにレーザーを照射し、その蛍光像を冷却CCDカメラで撮影・画像処理して観察した。3.対物レンズ経由でレーザー光線を導入する今回の方式では、カバーグラスの可動性を確保できるので、カバーグラス上に培養したDRG細胞を近接場光の形成部位に移動させることが比較的容易で、観察可能な標本面積を増加させることができ、実験の効率化を図る事ができた。4.ラミニンコートしたカバーグラス上にDRG細胞を培養し、細胞体から伸展した神経突起の先端に形成される成長円錐がカバーグラスと接着する状況について観察するために接着因子に着目し、種々の接着因子抗体で免疫染色を試みた。インテグリンで好結果が得られることを確認し、昨年度の直角プリズム付きカバーグラスを利用する方法と本年度試作した対物レンズを介する方式の観察範囲や操作性について比較検討している。5.シナプス以外の部分に存在しているアセチルコリンエステラーゼ活性を近接場光で観測できる可能性とそのために必要な実験系の構成について検討した。光の全反射にともなって発生する近接場光を利用して生体シグナル分子やイオン、機能性分子を可視化・観測する装置を試作することを目的として、本年度の研究計画を実施した。今回の観察に利用した標本は、幼若ラットの脊髄後根神経節や三叉神経節から分離・培養したニューロンである。1.カバークラスに貼り付けた直角プリズムを通してレーザー光線を射入する方式と、昨年度付加した対物レンズを通してレーザ光線を導入する方式の使い分ける事が出来るシステムを構成した。2.両方式を比較検討するために、カバーグラス上面に置いた蛍光ビーズの蛍光像を冷却CCDカメラを用いて観察し、近接場光が形成されていることを確認でき、目的によって両方式を適宜用いることとした。
神経膠細胞の分化および神経膠腫の発生増殖に関与する遺伝子の解析

近年、悪性神経膠腫の発生および増殖に関わる、癌遺伝子や癌抑制遺伝子、またその増殖因子が解明されてきている。これらの遺伝子群は、神経膠細胞の発生・分化の過程において、その増殖や分化を調節しているものと考えられる。しかし実際には、神経膠細胞の分化過程において、これらの遺伝子群がどのように関与しているかは未だ不明なことが多い。現在までに、我々は、神経膠腫の発生に関与する遺伝子を解明し、その発生機序を明らかにすること、および悪性神経膠腫の治療成績を向上するために、新たな治療法を確立することを目的として研究を遂行してきた。今研究課題においては、神経膠細胞の分化において発現し、神経膠細胞の分化を制御する遺伝子を単離しその機能を解析することを目的とし、differential display法により神経膠細胞の各分化段階に特異的に発現する遺伝子の単離を試みた。この方法により我々は、O-2A progenitorにより多く、Oligodendrocyteに少なく発現しており、また全脳組織では加齢に伴い減少する遺伝子を単離しRNB6と命名した。このRNB6はVASP(vasodilator-stimulated phosphoprotein)という蛋白に類似しており、VASP同様、神経膠細胞の細胞骨格や細胞の運動に関与する遺伝子と考えられ、その機能解析と神経膠腫での発現を解析している。このRNB6遺伝子の発現を解析するために、Northem blotおよび抗RNB6抗体による免疫染色を行った。抗RNB6抗体の作製においては、GST(glutathione S-transferase)cDNAとRNB6 cDNAを結合させたplasmid vectorを用いて、大腸菌にGST-RNB6融合蛋白を産生させ、それを精製した後ウサギに免疫し、抗RNB6抗血清を採取した。また、ペプチド合成装置を用いてRNB6のアミノ酸配列からオリゴペプチドを作製し、同様にウサギに免疫し、抗血清を採取した。また、RNB6の機能解析を行うために、RNB6遺伝子とGHP遺伝子とを結合させたplasmid vectorを作製し、これを、神経膠腫細胞株や正常線維芽細胞にtransfectし、RNB6の細胞内局在や、増殖能の変化を解析した。RNB6はnorthemblot解析により、中枢神経系では胎生期よりその発現が増加し、その後発現が減少していくことが判明した。また他の組織では、spleenやthymusおよびtestisisに多く発現していた。抗RNB6抗体による免疫染色では、中枢神経系では、神経細胞に多く発現していることが明らかとなった。また、神経膠腫における発現は低く、逆に神経芽細胞腫などの強く発現していた。このことより、RNB6は正常脳においては、神経細胞の軸索の慎重や接着に関与しており、神経由来の腫瘍ではその浸潤能に関与していることが考えられ、今後も解析していく予定である。

われわれは、神経膠細胞の分化増殖に関連する遺伝子の同定方法として、Liangらによるdifferential display法を用いている。この方法は従来の方法と比較して、比較的簡単に、複数種の組織間において発現の異なる遺伝子を同定することができ、すでにいくつかの遺伝子が報告されている。また、われわれはラット脳から、阿相らの方法により、oligodendrocyteとtype-2 astrocyteの前駆細胞であるO-2Aprogenitor細胞を、McCarthyらの方法によりoligodendrocyteを分離培養した。このO-2A progenitor細胞とoligodendrocyteの間で発現の異なる遺伝子を、differential display法を用いて検索したところ、数種の遺伝子が得られた。その内の一種はO-2A progenitorに多く、oligodendrocyteに少なく発現しており、また全脳組織では加齢に伴い減少していた。すでにわれわれは、この遺伝子(RNB6)のアミノ酸コード領域全長を含むcDNAをクローニングしている。GenBankデータベースによるホモロジー検索では、RNB6はこれまでに報告されていない遺伝子であり、そのコードするアミノ酸配列は、VASP(vasodilator-stimulated phosphoprotein)という蛋白に類似していることを確認した。VASPはリン酸化されて、profilin(アクチンフィラメントの重合シグナルを伝達し、細胞骨格や接着斑の形成および細胞の運動を制御する蛋白)に結合することが確認されており、VASPの存在下でアクチンの重合が促進されるという報告もある。このため、RNB6も細胞骨格や細胞の運動性に関与することが推測される。またRNB6はある種の神経膠種ではその発現を欠いており、腫瘍細胞の接着性の低下や転移機構に関わっている可能性も考えられ、現在その詳細な機能を解析中であり、今後も主にこの遺伝子について解析していく予定である。平成9年度は、RNB6の発現を組織内または細胞内での分布を調べた。方法としては、(1)Northern blot、(2)抗RNB6抗体による免疫染色、を行った。(1)では、RNB6はラット新生児脳で加齢とともに発現が低下することが確認され、また正常組織では脳以外に免疫系の細胞に発現していることが確認された。(2)では、はじめに抗RNB6抗体を作製し、GST(glutathione S-transferase)cDNAとRB610 cDNAを結合したインサートを持つプラスミドベクターを大腸菌にトランスフォームし、GST-RNB6融合蛋白を産生させ、それを精製した後、ウサギに免疫し、抗RNB6抗血清を採取した。また、ペプチド合成装置を用いてRNB6のアミノ酸配列からオリゴペプチドを作製し、同様にウサギに免疫し、抗血清を採取する。
有機合成化学的手法を用いた癌細胞転移阻害剤の開発とそれに関する生物学的研究

本研究億癌細胞転移阻害物質であるUTKO1の作用機構の解明を基に、標的であるアダプタータンパク質14-3-3ζの機能を解明すること、及び強力な癌細胞転移阻害剤や抗癌活性化合物を開発することを目的として行われた。これまでに合成されたUTKO1は4種類のジアステレオマー混合物であったため、ジヒドロ-α-イオノンを不斉合成し、それらを用いて別途調製したアルデヒドとのNHKカップリングを行い、生じた水酸基のジアステレオマーを分割してのUTKO1全ジアステレオマーを純粋に合成した。合成した各ジアステレオマーはそれぞれ生物活性試験に付され、4種類のジアステレオマーはそれぞれが同程度に癌細胞遊走阻害活性を有することが明らかになった。更にUTKO1の細胞内局在を観察することを目的に、蛍光標識体の合成も行った。UTKO1のアルデヒド部位に別途調製したヒドロキシアミノ基を有するリンカーを付加してオキシムとし、続いて蛍光体を連結して合成を完了した。これらのUTKO1ジァステレオマー及び蛍光標識体は共同研究者の手に渡っており、標的タンパク質14-3-3ζとの共結晶化研究、並びに14-3-3ζの機能解析研究が進行中である。現在UTKO1誘導体の合成も現在行っており、近いうちに数種類の誘導体が合成される予定である。一方、抗癌活性を有する新規天然物の合成にも着手している。cyclohexane-1,4-dioneのモノエチレングリコール保護体を出発原料に、エンダースの不斉アルキル化を二度行ってC2対称な重要中間体を不斉合成し、保護基を除去した後にモノカルボキシル化、メチル化、アリル化によって本中間体の脱対称化を行うと共に、不斉四級炭素の構築も行った。現在、全合成に向けた更なる検討が進行中である。癌細胞転移阻害活性を有するUTKO1の光学活性体全4種類の合成は達成され、それぞれの生物活性試験も行われた。その結果、UTKO1の有する立体化学と生物活性の関係が明らかにされた。なお、本光学活性体は共同研究者の手に渡っており、標的タンパク質である14-3-3ζとの共結晶化研究が進行中である。しかし、UTKO1の新たな誘導体の合成は完了していない。本化合物の蛍光標識体は合成され、14-3-3ζの機能解析も共同研究者の下で進行中である。また、癌細胞に対して毒性を示す新規化合物の合成にも着手したが、現在、半分程度までの合成完了であり。全合成は達成されていない。本年度は癌細胞転移阻害剤であるUTKO1の4つのジアステレオマー全てが癌細胞転移阻害活性を有することを明らかにした。UTKO1の標的タンパク質は既に我々の研究グループによって明らかにされているが、UTKO1の有する立体化学と癌細胞遊走阻害活性との関係は明らかにされていなかった。そこで、UTKO1の4種のジアステレオマーを光学的に純粋に作り分け、それらを生物活性試験に付すことによって、最も活性が強いものがどのジアステレオマーなのかを明らかにすることにした。また、光学的に純粋な化合物を用いれば、タンパク質との共結晶を得る検討にも用いることができるものと考え、それも視野に入れた。出発物質は文献既知の光学的に純粋な3,4-dihydro-α-iononeの両鏡像体とした。まずその出発原料を接触還元してtetrahydroiononeへと変換した。鏡像体過剰率はS体が99%eeでR体が96%eeだった。続いてこのtetrahydroiononeをエノールトリフラートへと導き、別途調製したアルデヒドとMHK反応を行ってカップリング体を得た。この時に新たに生じた2級水酸基の立体化学は約1:1であったが、続いて不斉補助基を導入することによってこの2級水酸基の分離を行い、光学的に純粋なUTKO1前駆体を得た。そして最後に保護基の除去を行い、得られた化合物に対して再結晶を行い光学的に純粋なUTKO1の全ての異性体を合成することに成功した。得られた4種の化合物はそれぞれの鏡像体間で比旋光度と融点が一致しており、光学的に純粋な化合物が得られていることを確認している。そして、これら4種の化合物を生物活性試験に付した結果、全ての異性体が同程度に癌細胞遊走阻害活性を有していることが明らかになった。現在は共同研究者と本化合物の共結晶を得る検討を進めている。

これらのUTKO1ジァステレオマー及び蛍光標識体は共同研究者の手に渡っており、標的タンパク質14-3-3ζとの共結晶化研究、並びに14-3-3ζの機能解析研究が進行中である。現在UTKO1誘導体の合成も現在行っており、近いうちに数種類の誘導体が合成される予定である。一方、抗癌活性を有する新規天然物の合成にも着手している。cyclohexane-1,4-dioneのモノエチレングリコール保護体を出発原料に、エンダースの不斉アルキル化を二度行ってC2対称な重要中間体を不斉合成し、保護基を除去した後にモノカルボキシル化、メチル化、アリル化によって本中間体の脱対称化を行うと共に、不斉四級炭素の構築も行った。現在、全合成に向けた更なる検討が進行中である。当初の計画通り、本年度においてUTKO1の4種の異性体を光学的に純粋に合成し、全ての異性体に活性があることを明らかにできたから。癌細胞転移阻害活性を有するUTKO1の光学活性体全4種類の合成は達成され、それぞれの生物活性試験も行われた。その結果、UTKO1の有する立体化学と生物活性の関係が明らかにされた。なお、本光学活性体は共同研究者の手に渡っており、標的タンパク質である14-3-3ζとの共結晶化研究が進行中である。しかし、UTKO1の新たな誘導体の合成は完了していない。本化合物の蛍光標識体は合成され、14-3-3ζの機能解析も共同研究者の下で進行中である。また、癌細胞に対して毒性を示す新規化合物の合成にも着手したが、現在、半分程度までの合成完了であり。全合成は達成されていない。現在、更に強力な転位阻害剤の開発を目的として研究を進めている.高活性と考えられる誘導体を効串的にデザインまたは合成するために、現在共同研究者とUTKO1と標的タンパク質の共結晶を得る検討を行っている。結合様式を明らかにするのをできるだけ容易にするため、ここでは光学的に純粋なUTKO1を用いている。そしてこの実験で得られる結合部位や結合様式の情報を基にして、更に高活性な化合物をデザインして合成する予定である。
二次元的な境界層剥離流れに潜在する初期の三次元渦構造に関する研究

本研究の目的は、二次元柱状物体の剥離位置近傍に生じる三次元的な境界層剥離流れや後流渦列中の三次元的渦構造の発生機構を明らかにするとともに、そのスパン方向の三次元性の特性を数値計算条件に補正的に導入を行い、比較的簡単な二次元計算で三次元的な非定常剥離流れの様子を表現しようとするものである。本年度の研究実施結果として、円柱や角柱などの二次元断面を有する柱状物体スパン方向の三次元性や不安定性について断面形状や設置姿勢を変えて曳航水槽を用いた曳航実験観測を行った結果、剥離剪断層は最初の巻き上がりが行われるまで柱状物体の断面形状および設置姿勢に依存せず、二次元的に発達しているが、二次元的な剥離剪断層の崩壊時刻や渦放出におけるスパン方向三次元性と渦構造の複雑さは、柱状物体の断面形状や設置姿勢により異なる。また渦放出において、柱状物体に対して平行に放出される状態と斜めに放出される状態があり、それらふたつの渦放出状態の出現は、スパンあたりの広がり部の出現個数によって支配されていることが明らかとなった。また実験観測により得られたスパン方向三次元性を総括した、境界要素・渦法併用の二次元円柱まわりの流れ解析計算手法の構築や試験開発プログラムの作成をおこない、三次元性を考慮した二次元計算結果と実験結果、二次元計算結果などとの比較検討を行った結果、本手法による計算結果は二次元計算結果と比較して実験値に近い値が得られた。今後の研究の展開として、より系統的で綿密な実験の遂行と計算の精度向上を図り、本計算手法の有効性を検討する。
軟質裏装材を使用した義歯装着者の咀嚼機能の向上に関する研究

軟質裏装材には、弾性の喪失、細菌の繁殖、色調の安定性、レジン床との接着強さなどに問題が残っている。軟質裏装材の劣化に関しては、長期にわたる水中や着色液への浸漬やサーマルサイクルなどを行って評価されていることが多い。しかし、口腔内ではさらに咀嚼中に咬合力が作用し、軟質裏装材の劣化を促進している可能性が考えられるが、このような荷重の影響を考慮した研究は少ない。そこで本研究では、Coe-soft、Super-soft、Molloplast-B、Sofreliner、Clearfitの5つの軟質裏装材について咬合力を模した繰り返し荷重をかけ、繰り返し荷重の粘弾性、吸収性および溶解性への影響に関する調査を行った。作製した各材料の試料を、電磁力式試験機(MMT-101 NB-10)を用い、37°C水中にて片振りサイン波、最大圧力196kPa、最小圧力19.6kPa、周期2Hzとした繰り返し荷重をかけた。荷重時間は、1.75、3.5、7.5、16.5時間とした。繰り返し荷重は主に軟質裏装材の高さの変化と遅延変形に影響を与えた。また、繰り返し荷重により吸収量および溶解量は増加した。繰り返し荷重中、試料は圧縮と回復を繰り返している。圧縮の過程において未重合モノマーや可塑剤が排除され、回復の過程では水が吸収されたり、その過程中に分子構造が変化している可能性もある。これらの過程が軟質裏装材の劣化を促進し、粘弾性的性質、特に遅延変形に影響を与えたと考えられる。繰り返し荷重により遅延変形が減少し、表面積当たりの吸水量も増加している。このことから咬合力により劣化が進み、応力分散による機能の低下が示唆された。従って、繰り返し荷重試験は軟質裏装材の粘弾性的性質の耐久性試験として有用であると言える。しかし、繰り返しと荷重時間のどちらの影響なのか今後の研究で明らかにする必要がある。軟質裏装材の劣化は長期にわたる水中や着色液への浸漬やサーマルサイクルなどを行って評価されている。しかし口腔内ではさらに咀囑中に咬合力が作用し・軟質裏装材の劣化を促進している可能性が考えられるがこのような荷重の影響を考慮した研究は少ない。そこで、Coe-soA(GCS)、Super-soft(GCS)、Molloplast-B(DMB)、Sofreliner(TSR)、Clearfit(KCF)の5つの軟質裏装材について咬合力を模した繰り返し荷重の粘弾性への影響に関する調査を行った。作製した各材料40個の試料から。20個を無作為に抽出し、電磁力式試験機(MMT-101 NB-10)を使用し37°C水中にて片振りサイン波、最大圧力196kPa、最小圧力19.6kPa、周期2Hzとした繰り返し荷重をかけた。残りの20個はそれぞれ同じ水槽中に荷重をかけずに同じ時間だけ浸漬した。各条件においてクリープメーター(Rheoner RE3305)を用いて粘弾性的性質を測定した。クリープテストはVoightの4要素モデル用い、瞬間弾性変形、遅延弾性変形、純粘性流動の3つに分け記録した。得られた結果を繰り返し荷重の有無と浸漬期間を因子として2元配置分散分析、Tukey'sHSD。テストを行った。

今回用いた軟質裏装材はその粘弾性的性質により粘性のほとんどなく弾性的なDMB、わずかに粘性要素を持つTSRとKCF、大きな粘性要素を持つGCSとGCSの3つに分けられた。瞬間弾性変形はGSSでは有意に増加し、GCS、TSR、KCFでほ減少したが、繰り返し荷重による影響はGCS以外では有意ではなかった。GCS、GSS、TSRでは浸潰期間による影響も見られた。遅延弾性変形は浸漬期間の増加によりGCSとTSRでは有意に減少していたが、GSSでは増加した。TSRにおいては、交互作用もみられ繰り返し回数が増加するに従い大きな減少がみられた。純粘性流動では、GCS、TSRでは繰り返し荷重および浸漬期間、それらの交互作用により有意に影響を受けていた。GCSでは繰り返し荷重をかけた初期から大きく減少し、かけていないものにおいては徐々に減少した。軟質裏装材は、歯槽骨が高度に吸収し被覆粘膜か非常に薄く弾性に乏しい症例に対して有用性が報告されているが、耐久性において問題が残されている。軟質裏装材の劣化に関しては、長期にわたる水中や着色液への浸漬やサーマルサイクルなどを行って評価されていることが多い。しかし、口腔内てはさらに咀嚼中に咬合力が作用し、軟質裏装材の劣化を促進している可能性が考えられるが、このような荷重の影響を考慮した研究は少ない。そこで本研究では、Coe-soft(GCS)、Super-soft(GSS)、Molloplast-B(DMB)、Sofreliner(TSR)、Clearfit(KCF)の5つの2軟質裏装材について咬合力を模した繰り返し荷重をかけ、繰り返し加重の吸収性およひ溶解性への影響に関する調査を行った。作製した各材料40個の試料から20個を無作為に抽出し、電磁力式試験機(MMT-101 NB-10)を用い、37°C水中にて片振りサイン波、最大圧力196kpa、最小圧力19.6kPa、周期2Hzとした繰り返し荷重をかけた。繰り返し荷重は水中浸漬中続けて負荷され、1.75、3.5、7.5、16.5時間の4つの条件に5つずつの試料を使用した。残りの20個はそれぞれ同じ水槽中に荷重をかけずに同じ時間だけ浸漬した。各条件の前後においてに試料の重さと高さを測定し、吸収量および溶解量を求めた。得られた結果を繰り返し荷重の有無と浸漬期間を因子として2元配置分散分析、Tukey's HSDテストを行った。統計解析の結果、換り返し荷重は、GCS、GSS、KCFの高さの変化に有意に影響し、高さの差は大きくなっていた。さらに、浸漬期間と交互作用はGCS、GSS、TSR、KCFで有意差が認められた。また、繰り返し荷重により吸水量と溶解量はすべての材料においてわずかに増加していた。浸漬期間の影響によりGCSとTSRの吸水量が増加していた。溶解量はTSRを除いて吸水量と同程度の値を示、GCS、GSSにおいては有意差が認められた。軟質裏装材には、弾性の喪失、細菌の繁殖、色調の安定性、レジン床との接着強さなどに問題が残っている。しかし、口腔内ではさらに咀嚼中に咬合力が作用し、軟質裏装材の劣化を促進している可能性が考えられるが、このような荷重の影響を考慮した研究は少ない。そこで本研究では、Coe-soft、Super-soft、Molloplast-B、Sofreliner、Clearfitの5つの軟質裏装材について咬合力を模した繰り返し荷重をかけ、繰り返し荷重の粘弾性、吸収性および溶解性への影響に関する調査を行った。
高等植物における標的遺伝子特異的な変異導入技術の開発

高等植物における標的変異技術の高度化を目指し、以下の実験を行った。植物病原細菌のエフェクタータンパク質を利用した人工制限酵素であるTALENsをイネに形質転換し、変異スペクトラムを解析したところ、導入される変異は欠失が多いこと、非相同末端結合因子を欠損したイネでは切断部位の削り込みが大きくなることが明らかとなった。TALENsによる標的変異では、変異のバリエーションが大きく、新たな遺伝子アリルの創出法として極めて有用な技術であることが示された。CRISPR/Casシステムについてもイネへの適応を試み、TALENsに比べて小さい変異が多い、塩基置換が生じ易い等の特徴があることが明らかとなった。[汎用性の高い標的遺伝子への変異の導入技術の開発]イネの内在性遺伝子を切断する人工制限酵素を誘導的に発現させるため、βエストラジオールによって人工制限酵素の発現を誘導する形質転換用ベクターを構築した。このベクターをイネ品種日本晴に導入し、形質転換カルスを複数系統得ることに成功した。この形質転換カルスをβエストラジオールを含む培地に置床し、人工制限酵素の発現を誘導した。内在性の標的遺伝子が切断された際、修復の過程でエラーが生じることがあり、変異が導入されることがある。そこで、標的遺伝子の塩基配列を確認したところ、標的遺伝子に変異が導入されていることを確認した。また、人工制限酵素の活性と特異性を迅速に評価することを目的に、イネのプロトプラストを利用した形質転換系における各種条件検討を行ったが、現在のところ、効率的かつ安定な形質転換系を構築するには至っていない。[標的遺伝子改変における変異のスペクトルを拡大する研究]非相同末端結合に関わるLigase4(Lig4)の欠損シロイヌナズナ変異体において、人工制限酵素による切断を行い、導入される変異の頻度とスペクトルを解析したいと考えた。既に人工制限酵素の発現が高温条件下で誘導される形質転換シロイヌナズナを作出していたため、それとシロイヌナズナlig4変異体との交配を計画した。しかし、人工制限酵素発現シロイヌナズナのT3種子が発芽しなかった。そこで、lig4変異体に人工制限酵素を誘導的に発現させるベクターを形質転換した。人工制限酵素はゲノム上の標的配列を特異的に切断することができる酵素である。切断されたDNAは相同組換えや非相同末端結合などのDNA二重鎖切断修復機構により修復され、その過程で標的配列に変異が導入される。このような人工制限酵素を利用した標的遺伝子の変異導入技術を標的変異と呼び、新たな変異導入技術として注目されている。本研究では、高等植物における標的変異技術の高度化を目的とし、以下の実験を行った。植物病原細菌のTALエフェクタータンパク質を利用した人工制限酵素であるTALENsおよび、その発現ベクターの改良により、イネカルスに標的変異を導入することに成功している。その変異スペクトラムを解析したところ、導入される変異は欠失が多いことが分かった。また、昨年度に非相同末端結合を欠損したイネ変異体のカルスにおいて切断部位の削り込みが大きくなる傾向が確認されたが、今年度はその再分化個体において標的遺伝子に変異が導入されていることを確認した。興味深いことに、単純な欠失変異だけではなく、複雑な変異が生じている系統もわずかであるが確認することができた。例えば、大きな欠失変異が生じているがその内部に小さな由来不明の塩基が挿入されたような入れ子状の変異や、標的配列の欠失に加えてその近傍に小さな挿入が生じているような変異などが確認された。以上の結果から、TALENによる標的変異技術は、変異スペクトラムにバリエーションがあるため、新たな遺伝子アリルを創出するために極めて有用な技術であることが示された。またTALENsとは原理の異なる人工制限酵素であるCRISPR/Casシステムについてもイネにおける適応を試み、TALENsに比べて変異の大きさは小さい傾向にあるが、塩基置換が生じ易い等の特徴を明らかにした。近年ゲノム上の標的遺伝子を特異的に切断する人工制限酵素の開発が盛んに行われており、これを利用すれば標的遺伝子を切断し、その修復過程において、標的遺伝子に変異を導入できる。我々はこれまでシロイヌナズナを材料に、植物において初めて、人工制限酵素を用いた標的遺伝子の変異導入に成功した。本研究では、植物に普遍的に適用可能な、標的遺伝子への変異導入技術を開発する。また、標的遺伝子切断後どのような変異が導入されるかは、切断部位へリクルートされる修復因子によって決まることがわかってきた。そこで修復因子欠損変異体において標的遺伝子の切断を行い、変異のスペクトルを広げる研究を行う。まず、平成23年度に作出した人工制限酵素発現イネカルスから再分化個体を獲得した。しかしながら、その後代の個体においては標的配列に変異が導入されていないことが分かった。