hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
光で細胞内ミオシンIIをダイレクトに操作する新規力学的制御ツールの開発

前者では、光照射で蛍光発色団から活性酸素種を発生させ標的タンパク質を不活化するCALI (発色団補助光不活化)法に基づき、ミオシンII調節軽鎖とCALIに最適化された傾向タンパク質SuperNovaを融合したノックインショウジョウバエを作出し、局所的にショウジョウバエミオシンIIを不活化するツールを獲得した。後者では、ミオシンII調節軽鎖の恒常活性変異体に、LOVドメインやpdDronpaなど特定波長の光照射でコンフォメーション変化を起こすタンパク質を付加し、光照射時のみ恒常活性型が解放され定常時では機能しないようなコンストラクトを培養細胞で検討した。ミオシンII不活化について、作出した調節軽鎖-SuperNova融合ノックインショウジョウバエを用いて個体内で活性操作を試みた。ショウジョウバエのオスは変態期に外生殖器を一回転させ、当研究室はこの組織動態を支持する細胞移動が、アクトミオシンの収縮力を介した細胞接着辺の繋ぎかえ(収縮と新規伸長)により駆動されることを見出していた。本発生モデルを利用し、細胞移動中の組織に継続的に光照射したところ、繋ぎかえの頻度が減少するとともに、細胞接着辺にかかる張力が低下することを確認した。また、接着辺の収縮はそこに集積するアクトミオシンの収縮力により進行することが広く知られているが、接着辺特異的に光照射を行い、その収縮を局所一過的に阻害することに成功した。さらに、細胞接着辺伸長の力学的メカニズムは未だ不明な点が残っていたが、本ツールを用いた局所的光照射実験により、接着辺両端のミオシンIIが伸長に寄与していることを新規に見出した。ミオシンII活性化について、ミオシンII調節軽鎖の恒常活性変異体にLOVドメインを結合し、その連結部位に変異を加え、ミオシンII重鎖と共にショウジョウバエ培養細胞に発現させた。免疫沈降実験により、定常時はLOVドメインの立体障害により重鎖と調節軽鎖の結合が阻害されるが、光照射時はLOVドメインのコンフォメーション変化で重鎖と調節軽鎖の複合体形成が回復するようなコンストラクトを網羅的に探索した。しかし、調節軽鎖を適切にマスクするコンストラクトは得られなかった。そこで最近報告された、特定の波長照射で蛍光と多量体化を制御できるタンパク質pdDronpaを検討することとした。これを調節軽鎖に結合し培養細胞に発現させ、調節軽鎖が近傍に存在することが、pdDronpaの光照射による多量体化を阻害しないことを確認した。調節軽鎖-SuperNova融合ノックインショウジョウバエについて、雄外生殖器回転運動以外の発生イベントでもミオシンIIを不活化できるか検討する。例えばショウジョウバエ腹部上皮形成では、幼虫細胞が上皮層からアクトミオシンを介した頂端収縮により排除されるが、調節軽鎖-SuperNovaがこれを阻害できるか、いつ・どこに局在するアクトミオシンが責任因子であるのかを、これまでの解析で確立された照射方法を基に検討する。ミオシンII活性化コンストラクトについては、LOVドメインが適切ではなかったことから、光感受性タンパク質であるpdDronpaに変更し検討する。ミオシンII調節軽鎖の恒常活性変異体のN、C両末端に本タンパク質を結合し、pdDronpaの二量体化が立体障害となり、ミオシンII調節軽鎖と重鎖の相互作用を阻害するようなコンストラクトをスクリーニングする。
太古代―原生代の海洋底断面の復元：海底環境・生物活動・地球外物質混入変遷史の解読

本研究は32-30億年前の太古代中期海底堆積物と22億年前の原生代堆積物をターゲットにし,地球の歴史上最も変化が大きいとされる環境変化の記録を地層から紐解いた。1.ピルバラにて地層掘削を行い200mの32億年前の縞状鉄鉱層の掘削に成功した.世界初,この時代の新鮮で連続性の良いコアを獲得した.2.同地区の縞状鉄鉱層の掘削現場の側方層序比較し,比較的浅い海の堆積物であることがわかった.3.掘削コアの化学分析:当時の海の硫黄同位体が現在と類似し,すでに酸素を供給するシステムの可動が確認できた.4.ガーナ,ベリミアン帯において,原生代の海底の証拠地層を復元し,海洋性島弧近傍環境を復元した.本研究は32-30億年前の太古代中期海底堆積物と22億年前の原生代堆積物をターゲットにし,地球の歴史上最も変化が大きいとされる環境変化の記録を地層から紐解いた。1.ピルバラにて地層掘削を行い200mの32億年前の縞状鉄鉱層の掘削に成功した.世界初,この時代の新鮮で連続性の良いコアを獲得した.2.同地区の縞状鉄鉱層の掘削現場の側方層序比較し,比較的浅い海の堆積物であることがわかった.3.掘削コアの化学分析:当時の海の硫黄同位体が現在と類似し,すでに酸素を供給するシステムの可動が確認できた.4.ガーナ,ベリミアン帯において,原生代の海底の証拠地層を復元し,海洋性島弧近傍環境を復元した.本研究は32億年前の海底堆積物をターゲットにしており,22年度は1.アフリカバーバートン帯のフィクツリー層層序調査,2.西オーストラリア,ピルバラ海岸グリーンストーン帯,デキソンアイランド層,クリバービル層において調査および掘削準備を行った.3.2007年に行ったDXCLの3本の掘削コアについて詳細な化学分析,硫黄同位体比の測定を行った.今まで風化が著しく,白色-小豆色の泥岩はすべて黒色頁岩であり,炭素濃度は著しく高い,同位体的には軽い(28‰)のシアノバクテリアの堆積したものであることが明らかになってきた.このシアノバクテリアの影響により,酸素濃度が上昇しその上部には縞状鉄鉱層が沈殿することになる.これは地層の堆積場が浅くなるか,もしくは酸素濃度が高くなり酸化的海が下に下がって来たことを示している可能性がある1.フィクツリー層では150mの連続層について,詳細な記載および帯磁率測定を行い,帯磁率上昇部はブーディンを形成する初期続成部分でマグネタイト化が起こっていることが明らかになった.ICDP掘削についても,2011年にサンプリングパーティーが行われる事になっている2.DXCL2掘削においては,掘削地の選定,オーストラリアとの業者・地質調査所との連携を確認し,2011年10月に掘削開始することになっている3.DXCLについて,コアの詳細な観察および分析が行われ,特に硫黄同位体が非常に重い値を持つことが明らかになった.このことは,32億年前の海底は嫌気的であるが硫酸還元菌の活動が活発であり,海水中に硫酸が豊富にあったこと,つまり酸化的状態の大気があった可能性を示唆している今後,DXCL2では,DXCLよりも上位の,黒色頁岩層から縞状鉄鉱層へ移り変わる部分の掘削を予定しており,酸化鉄沈殿作用がどのような順序で,またどのような生物活動の影響を受けて行われていくかを明らかにしていく本研究は32-30億年前の太古代中期海底堆積物をターゲットにしており,23年度は1.アフリカバーバートン帯のフィクツリー層層序調査,2.西オーストラリア,ピルバラ海岸グリーンストーン帯,クリバービル層において縞状鉄鉱層の掘削.3.2007年に行ったDXCLの3本の掘削コアについて詳細な化学分析,硫黄同位体比の測定,を行った.今まで風化が著しく,白色-小豆色の泥岩はすべて黒色頁岩であり,炭素濃度は著しく高い,同位体的には軽い(28‰)のシアノバクテリアの堆積したものであることが明らかであり,その有機物が多い地層からどのように縞状鉄鉱層が重なっていくかが重要な課題である.アフリカバーバートン帯(フィクツリー層)とピルバラを比較することで広域で一般的な鉄沈殿物の堆積作用を明らかにする.鉄沈殿作用時の表層環境(酸化的or還元的,温度状態)を明らかにすることが需要になる.1.フィクツリー層層序調査では,1昨年のコマチセクションに関して,より詳細な記載とサンプリングを行った.酸化鉄層の上方への増加がみられ,黒色頁岩から上位にむかって酸化鉄の量が徐々に増えることがわかった.2.DXCL2として31億年前のクリバービル層中のマグネタイト層の掘削を行った.200mの連続コアをほり,約20mのマグネタイト層を含む縞状鉄鉱層を掘り抜いた.予想に反して鉄鉱層の下位にはチャート層が50mほど存在しており,特に淡緑色チャート層もコマチアイト火山灰起源の可能性がある.3.DXCL掘削時の硫黄同位体は,初期に形成したものは分別が大きく,とくに+20‰を超える試料が多く出てきた.ナノシムス分析でも数ミクロンの幅で変動が見られた.本研究は32-

30億年前の太古代中期海底堆積物と22億年前の原生代堆積物をターゲットにしていた。1:南アフリカ,バーバートン帯のフィクツリー層層序調査,2:西豪州,クリバービル層において縞状鉄鉱層の掘削現場の側方層序比較.3:DXCLの4本の掘削コアについて詳細な化学分析,硫黄同位体比の測定,4:ガーナ22億年前の島弧断面調査を行った.フィクツリー層層序調査では,150mの層状頁岩・鉄鉱層から酸化鉄層の上方への増加がみられ,黒色頁岩から上位にむかって酸化鉄の量が徐々に増え,炭素同位体の軽くなるシグナルが見えた.ベリミアン帯では,海岸線の断面図・柱状図を行い,地層に切れ目がなく連続した地層であることが判明した.非常に分厚い堆積相は島弧的な火山弧の堆積物であると考えられ,島弧付加でできたと考えた.DXCLで31億年前のクリバービル層中の掘削コアの炭素・硫黄の化学分析を行った.炭素は約-30‰で5%以上の有機炭素を含んだ.硫黄同位体は,初期形成物を識別し,それらが+20‰を超える重い値を示した.ナノシムス分析でも数ミクロンの幅で変動が見られた.また石英の酸素同位体より,80ー70度ほどの海水温度であったことが見積もられた.年代測定:U-Pb SHRIMP年代,クリバービル層の地層が31.08億年と当初の予想より若い年代がでた. Rb/Sr年代によると,20億年頃に広域変成作用を被っていた.BIFの堆積場はその側方変化が50mぐらいで起こっているために,水深約約100mの波浪限界よりは深いが,側方変化が変動する比較的浅海部分である.バーバートン帯とピルバラを比較することで広域な一般的な鉄沈殿物の堆積作用について,その地層形成場に違いがある。火山岩上に堆積物が乗る場合と、堆積物上に鉄鉱層が重なる場合があり,熱水活動の強弱および生物活動の有無が原因であると考えられる.本研究は32-30億年前の太古代中期海底堆積物をターゲットにしており,24年度は1.アフリカバーバートン帯のフィクツリー層層序調査,2.西オーストラリア,ピルバラ海岸グリーンストーン帯,クリバービル層において縞状鉄鉱層の掘削現場の側方層序比較.3.2007/2011年に行ったDXCLの4本の掘削コアについて詳細な化学分析,硫黄同位体比の測定,4,ガーナ22億年前のベリミアングリーンストーン帯の調査を行った.アフリカバーバートン帯(フィグツリー層)とピルバラを比較することで広域な一般的な鉄沈殿物の堆積作用を明らかにする.鉄沈殿作用時の表層環境(酸化的or還元的,温度状態)を明らかにすることが需要になる.フィクツリー層層序調査では,1昨年のコマチセクションに関して,より詳細な記載・分析を行った.酸化鉄層の上方への増加がみられ,黒色頁岩から上位にむかって酸化鉄の量が徐々に増え,炭素同位体の軽くなるシグナルが見えた.DXCL1,2として31億年前のクリバービル層中の掘削コアの炭素・硫黄の化学分析を行い,炭素はほとんど変化せず,同位体はプラスに非常に重い値をしめした.特に,硫黄同位体は,初期に形成したものは分別が大きく,とくに+20‰を超える試料が多く出てきた.ナノシムス分析でも数ミクロンの幅で変動が見られた.ピルバラ,クリバービル海岸での側方変化は,約100mぐらいで地層の層厚が変化するもので,ウエーブベースよりは深いが,側方変化が変動する比較的浅海部分で鉄鉱層は沈殿していると考えられる.ベリミアングリーンストーン帯では,ケープスリーポイントの海岸線ルートマップおよびサンプリングを行い,地層に切れ目がすくなく連続していることが明らかになった.島弧的な火山弧の堆積物が付加していると考えられる.当初の計画どおり,DXCL2が2011年度行われ200mの掘削が成功した.
ＲＮＡ修飾の欠損と自己免疫疾患：ＳＬＥ発症の新たな分子機構

生体内のRNAはすべてなんらかの修飾を受けている。しかし、修飾の生理的役割はほとんど解明されていない。一方、自己免疫疾患の患者からRNAに結合する抗体が検出された。RNA修飾が自己・非自己を識別する目印になっている可能性がある。これを明らかにするために、RNA修飾を特異的に認識する人工抗体の開発と、RNA修飾が欠損したゼブラフィッシュモデルの作製・解析を行った。その結果、脊椎動物の初期発生においてRNA修飾が必須であること、また多数の遺伝子の発現が修飾に呼応して変動していることを明らかにした。RNA修飾と自己免疫疾患発症の関連を明らかにするために、平成25年度は、RNA抗体単離法の検討およびRNA修飾欠損ゼブラフィッシュモデルの解析を行った。1.抗RNA抗体の単離法の検討前年度に単離した抗RNA抗体が十分な特異性を示さなかったため、ファージディスプレイ型人工抗体ライブラリーのスクリーニング条件を再検討した。SLE患者のエピトープであるU1snRNAのステムループII領域(51G90C)を合成し、3'末端をビオチン標識した。これを抗原として用いライブラリーのスクリーニングを行い、24個のファージクローンを単離した。これらのクローンの特異性を今回改良したELISA法にて検討した結果、8個のクローンで特異性を確認できた。2. RNA修飾欠損モデルの解析ディスケリン(RNAの修飾酵素、先天性角化不全症で変異)またはU26 snoRNA(RNA修飾をガイドする低分子核小体RNA)遺伝子の発現を阻害したゼブラフィッシュを作製し、初期発生における形態形成や造血の異常を解析するとともに、欠損モデルにおけるポリソームmRNAのプロファイルの変動を次世代シーケンサーで解析した。その結果、欠損モデルにおいて翻訳効率が大きく変動(2倍または1/2)した遺伝子を、ディスケリンの発現阻害で176個、U26 snoRNAの発現阻害で252個同定した。これらのデータはRNA修飾と疾患との関連を明らかにするための重要な基盤となる。RNA修飾とSLEとの関連を明らかにするために、本年度はRNA修飾を認識する人工抗体の作製とRNA修飾に異常のあるゼブラフィッシュの作製を行った。1.RNA修飾を認識する人工抗体の作製ファージディスプレイ型の人工抗体ライブラリーを用い、RNA修飾を特異的に認識する抗体(抗RNA抗体)の作製を試みた。非修飾型RNAに結合する抗体の単離にはすでに成功していたことから、この系を用いて修飾型RNAに特異的に結合するファージ抗体の単離を目指した。まず、非修飾または修飾ヌクレオチドを取込ませたU1 RNAを作製し、これを抗原としてファージディスプレイ型人工抗体ライブラリーのスクリーニングを行った。次に、同定したクローンの特異性をELISA法で検討した。しかし、ELISAの解析において非特異的なシグナルが検出されたため、コントロール抗原と抗体を用いてアッセイ系の検討を行った。2.RNA修飾欠損モデル動物の作製免疫の活性化とRNA修飾との関わりを個体レベルで調べるために、ゼブラフィッシュを用いて修飾酵素のフィブリラリン(メチル化)とディスケリン(ウリジンの異性化)の遺伝子をノックダウンした。ノックダウンは、これらタンパク質のmRNAに結合するモルフォリノアンチセンスオリゴ(MO)を、受精卵に注入することで行った。また同様に、snoRNA(修飾部位を特定するガイドRNA)に対するMOの注入により、snoRNAの発現を抑制し部位特異的に修飾を阻害すことにも成功した。RNA修飾の低下は、質量分析計を用いて定量した。今年度はRNA修飾欠損モデルの解析に重点を置いて研究を進めた。RNA修飾を認識する抗RNA抗体については、得られたクローンの結合力に問題があること、新たなライブラリーの取得が困難になったことから、研究の継続を断念した。1.RNA修飾欠損モデルの解析前年度に引き続き、rRNAの修飾酵素であるディスケリンをノックダウンした先天性角化不全症モデル、U26 snoRNAの発現を阻害したRNA修飾欠損モデルのポリソームmNA解析を行い、得られたデータの情報解析を進めた。翻訳効率の変動が大きい遺伝子を解析したところ、特に、U26 snoRNAの発現阻害で脳および神経系、眼の形成に関わる遺伝子が多数同定された。2. snoRNAデータの整備RNA修飾に関わる核小体低分子RNA(snoRNA)のデータを収集し、データベースに整備した(http://snoopy.med.miyazaki-u.ac.jp)。また、EMBLの支援を受けて新たに設立されたノンコーディングRNAの統合サイトRNAcentral(http://rnacentral.org)と連携し、一部のデータの移管を行った。これにより、より広くRNA修飾に関わる情報の共有が実現した。分子遺伝学RNA修飾を認識する抗RNA抗体の同定については、得られたクローンの特異性は確認できたものの、結合力が低いため、現在再検討を進めている。

修飾欠損モデルの作製・解析については、モデルの作製に成功しポリソームmRNAの解析も順調に進んでいるが、自己免疫の活性化に関わるサイトカインやマクロファージなどの解析が行われていない。当初の計画通り、RNA修飾を認識する人工抗体の作製およびRNA修飾欠損モデル動物の作製に取り組んだ。抗体の作製に関しては、今後特異性の確認が必要であるものの概ね順調に進んでいる。欠損モデル動物の作製に関しては問題なく進展している。今後はRNA修飾欠損モデルの解析に重点を置いて研究を進めていく。RNA修飾を認識する抗RNA抗体については、得られたクローンの結合力に問題があること、新たにライブラリーを取得することが困難になったことから研究の進展は難しいと考えられる。1.RNA修飾を認識する人工抗体の作製昨年度に引き続き、非修飾または修飾RNAを識別できる抗体の取得を試みる。SLE患者の自己抗体のエピトープ内にあるRNA修飾を標的として、ファージディスプレイ型人工抗体ライブラリーから抗体を単離する。その際、ディファレンシャルスクリーニングにより、修飾を持つRNAだけに結合する抗体の取得を目指す。RNA修飾に特異的な抗体が得られた場合、生体試料中のRNA修飾を同定する方法を検討し、SLE患者のRNA修飾の動態を解析する手法を確立する。2.RNA修飾欠損ゼブラフィッシュモデルの解析昨年度に作製したゼブラフィッシュモデルを用いて、(1)自然免疫の活性化によるサイトカインの放出を調べるために、ノックダウン胚と正常胚からタンパク質を抽出して、ELISA法でIL12、TNF α、INFαを定量する。(2)マクロファージの活性化が誘導されているかどうかをマーカー(L-plastin、mpx)のホールマウントin situハイブリダイゼーションにより検出する。(3)ゼブラフィッシュですでに同定されているToll様受容体17個の遺伝子の発現をRT-PCRで解析し、非修飾RNAによる免疫活性化の経路を調べる。さらに、(4)ノックダウン胚と正常胚からRNAを抽出し、このRNAをゼブラフィッシュのDNAチップ(Affymetrix社)および次世代シーケンサーにて解析し、発現に変動が見られた遺伝子群を同定する。類似の研究を行っていたため消耗品費などの経費が抑制され、当初見込額との間に差額が生じた。物品費は、一般的な試薬・器具の他、ゼブラフィッシュの飼育費用などに使用する。旅費は、国際RNA学会(カナダ)および分子生物学会(横浜)などの国内の関連学会へ参加するために使用する。人件費・謝金は、ゼブラフィッシュの飼育・管理のための実験補助員の経費として使用する。その他の経費は、論文発表するための投稿料、学会の参加費などに使用する。消耗品費については、すでに実験を開始していたことから初期費用が抑制され、当初所要額との間に差額が発生した。また、謝金については、予定していたライブラリーのスクリーニングを学生と行ったため経費が抑制された。物品費は、一般的な試薬・器具類の他、アレイ解析のためのDNAチップや合成RNAなどの消耗品を購入する。
FT-ICRMS分析を用いた森林の溶存有機物の構成種とその変動メカニズムの解明

本研究では高精度質量分析器FT-ICRMSを用いて、森林生態系におけるDOMの組成とその変遷を明らかにすることを目的とした。その結果、FT-ICR MSの分析のためのフィールドサンプルの取得、サンプルの前処理、スペクトル解析、分子の絞り込み、同一分子の抽出についての一連の作業をマニュアル化及び一部をプログラム化し、より精度の高い分析手法を確立した。確立した手法を用いて、まずフィンランドのドイツトウヒ林における水循環に伴うDOMの変遷プロセスを明らかにした。その後、日本のスギ人工林及び広葉樹二次林において、降雨と林内雨の水質組成の違い、スギと広葉樹の林内雨の水質組成の違いをそれぞれ明らかにした。森林生態系における水循環は、渓流水の水質を調節する重要な役割を果たしている。しかし水質を決定付ける重要な因子である溶存有機物(DOM)は、複雑な生成メカニズムで生じる多様な炭素化合物の集合体であり、その分子組成や、組成変化に影響をもたらす要因を明らかにすることは技術的に困難であった。本研究では、森林生態系におけるDOMの組成とその変遷を明らかにするため、天然水の分析には殆ど用いられてこなかったフーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴型質量分析器(FT-ICRMS)など、化学分析を用いたDOMの分子種の推定によって、森林生態系の水質形成過程を明らかにすることを目的とする。ここでは、森林流域を流れる降雨、林内雨、樹幹流、土壌水、渓流水など森林生態系の水循環に関わる複数種の水に着目し、1) DOM構成種の変動パターン、2) DOM構成種の変動プロセス、について水質分析を実施する。本年度は、兵庫県の中西部に位置する宍粟市一宮町東河内針広混交林整備事業地で採取された降雨、林内雨、樹幹流、土壌水、渓流水をFT-ICRMSを用いて分析し、分子式の予測を試みた。その結果、降雨・林内雨から樹幹流・A層中部、A層下部以深で植物遺骸由来のDOMの酸化や、土壌における官能基を多く含む分子の除去などが生じていることが推定された。これらの結果から、FT-ICRMSは天然水においても溶存有機物の分子種を決定する高度な分析技術であることが示された。しかし一方でこの手法は、溶存している分子の一部しか分析できないこと、各分子種の量的評価が困難であること、などの限界を有していることも明らかとなった。したがって今後は、サンプル間の比較を可能とするために、スペクトル解析及びデータ解析の手法を検討していく必要があることや、FT-ICRMS以外の水質分析との併用が重要であると考えられた。本年度は、本研究では、フィンランド東部の北方林を対象に、溶存有機物(DOM)の分子化合物が森林内の水移動を通してどのように変化するかを検討した。対象試験流域において採取した林外雨、林内雨、土壌水、地下水、河川水を、FT-ICR MSを用いて、試料水中のDOM分子化合物の同定を試みた。FT-ICR MSで同定できたDOM分子化合物の種類の数は865-2194の範囲に及んだ。この結果は各試料水中に多種多様なDOM分子化合物が含まれていることを示す。一方、試料水間で共通するDOM分子化合物はほとんど存在しないことがわかった。このことは、雨水が樹冠や森林土壌、地下水を通過し河川に到達する過程で雨水中のDOM分子化合物の構成が様々に変化することを示唆する。さらに、同一採取場所で得られた試料水であっても採取時期が異なると、共通するDOM分子化合物はほとんど存在しないことがわかった。以上より、北方林におけるDOMの分子構成は時間的・空間的に変化することが考えられた。本年度は、FT-ICR MSで得られるマススペクトルからノイズを除去するための条件を検討し、取り出した分子ピークについて、分子式の候補を算出したのちに、分子の条件を設定して候補を絞っていくための計算プログラムの開発を行った。同一サンプルをFT-ICR MSの同一条件下で繰り返し測定したときのエラーについて検討したところ、最大30%のエラーが生じることが明らかとなった。

したがってサンプルの代表値を得るためには、一回の測定では不十分であり、測定を複数回繰り返して、その結果得られる分子種の総数を求めるなどの工夫が必要となることが明らかとなった。またwordとion accumulationの2つのパラメータを変更してその結果を比較、検討することで、天然水を分析する際のFT-ICR MSの最適なパラメータを決定した。さらにサンプルの前処理、スペクトル解析、分子データの処理、分子の絞り込み、同一分子の抽出についての一連の作業をマニュアル化及び一部をプログラム化し、より精度の高い分析手法を確立した。今年度は、以下の要領でFT-ICR MS分析で起こり得るエラーの評価、及び分析パラメータの検討と一連の作業のマニュアル化を行った。1)同一サンプルを同一条件下でFT-ICR MS分析した場合の誤差の定量:純水、降雨、フィンランド土壌水を用いて、同一サンプルを同じパラメータ設定で繰り返しFT-ICR MS分析を行った。その結果、純水については、550分子中の200分子が、降雨については4000分子中の500分子が、フィンランド土壌水については3000分子中の1000分子が互いに異なっており、同一サンプルであっても測定結果にエラーが生じることから、サンプルの代表値を得るには繰り返しサンプルを分析する必要があることが示された。2)FT-ICR MSの各種パラメータを変更した場合の結果の違い:FR-ICR MS分析で必要なwordとion accumulationの4つのパラメータを変更して結果を比較した。これらのパラメータの変更によって補足される分子数がどの程度変化するかを検討し、最適なパラメータを決定した。3)水サンプル及びFT-ICR MSスペクトルデータの処理のマニュアル化、データ解析のプログラム化:フィールドで取得した水サンプルは、その後、ろ過、pH調整、固相抽出、エタノール抽出といった処理を行った後に分析にかけることとなる。ここではこれら一連の作業のマニュアル化を行い、実施手順の確立とヒューマンエラーの防止を図った。また、FR-ICR MS分析で得られたスペクトルデータは、その後、分子ピークの抽出と分子構造の特定、共通分子の抜き出しなど一連の処理を行っていく。そのために必要なプログラムの作成や作業のマニュアル化を行った。森林生態系における水循環は、渓流水の水質を調節する重要な役割を果たしている。しかし水質を決定付ける重要な因子である溶存有機物(DOM)は、複雑な生成メカニズムで生じる多様な炭素化合物の集合体であり、その分子組成や、組成変化に影響をもたらす要因を明らかにすることは技術的に困難であった。本研究では、森林生態系におけるDOMの組成とその変遷を明らかにするため、天然水の分析には殆ど用いられてこなかったフーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴型質量分析器(FT-ICRMS)など、化学分析を用いたDOMの分子種の推定によって、森林生態系の水質形成過程を明らかにすることを目的としている。本年度は、昨年度までに作られたFT-ICR MSのマススペクトル解析のプロトコルを用いて、実際に兵庫県内の林内雨とフィンランドの森林水の分析を用いた。
プラズマ窒化プロセスに及ぼすイオン化と発熱効果に関する研究

窒化させる材料表面近傍のプラズマ状態(イオンシース状態,電位傾度等)と材料の発熱状態がプラズマ窒化プロセスに与える影響を検討するために,発光分光法とプロープ法及び熱電対温度計測法を適応し、プラズマ状態を診断した。試料近傍のプラズマ中には,イオン種として,N^+N^+_2,F^+e(試料のステンレス鋼から生じたものと考えられる),励起種としてN原子(N^*と一般に記している)が分光された。購入したコンピュータと絶縁アンプにより,インプロセスの分光計測が可能になったので,発光強度の時間的変化も測定した。プローブ計測から電位分布,電子密度等を計測した結果,プラズマによってステンレス鋼を窒化させる必要条件として,ある程度以上試料近傍における電位傾度を高めることが明らかとなった。すなわち,試料は陰極側に位置させ,直流グロー放電を印加し,すくなくとも,400V/cm程度の電位傾度(試料表面近傍)が必要であることを明らかにした。この値は,ステンレス鋼表面に存在する強固な酸化皮膜をスパッタリングして除去させるに必要な敷居値として理解できることを実験結果を基に明らかにした。この条件を満たすと,イオン種,励起種がCrやFeと窒化物を形成し窒化膜として成長していく。その際,窒素原子が母材へ拡散することにより窒化膜は成長するので,拡散を助長する発熱の効果が重要となる。プラズマの発熱効果により試料は加熱されるが,本研究で実施したグロー放電域では,試料は高々300400°Cにしか加熱されず,膜の成長速度は非常におそいことが分った。そこで,試料を抵抗加熱する必要があることが判明した。これによって試料温度を600700°Cにすると約2時間3時間で,30μm程度の良質な窒化膜が形成されることがわかった。以上のように,プラズマ窒化におけるイオン化・電位傾度,発熱の効果を系統的に明らかになった。
縮流ノズル内壁面境界層の再層流化と液体噴流自由界面波との関連性

高エネルギービームのターゲットを模擬した高速液体噴流の自由界面現象について,縮流ノズル内壁面境界層の発達過程との関連性を調査した。ノズル壁面境界層をレーザー流速計で測定するとともに,噴流自由界面に照射した細いレーザー光の屈折角を光位置検出素子で計測することにより,自由界面変動の周波数特性を測定した。ノズル出口境界層が層流となる低流速の場合,噴流自由界面には周期性の高い縞状波が観察され,自由界面変動のパワースペクトル分布は明瞭なピーク(卓越周波数)を持つ。また,流速の増加により出口境界層が乱流へと変化すると,自由界面は乱れ,スペクトルのピークは消失した。よって,本測定法により,ノズル出口境界層の性状に依存した噴流自由界面の変化を,スペクトルの分布形状から定量的に扱うことが可能となった。比較的高流速の条件では,ノズル内部の圧力勾配下においても境界層内層の乱れは減少しないことが示された。内層の乱れの残留によって,ノズル出口付近における乱流境界層への再遷移が速やかとなり,自由界面の乱れが増加する。よって,ノズル設計において,出口付近の乱流再遷移への配慮が重要であることが示された。一方,再層流化された境界層が剥離して生ずる縞状波は,自由界面下せん断層の安定性理論により予測される。非粘性オア・ゾンマーフェルト方程式を,チェビシェフ多項式展開を用いて固有値問題に帰着させ,噴流自由界面の線形安定性を評価した。空間増幅率が最大となる最不安定擾乱の周波数は,測定された卓越周波数と良好に一致した。また,本解析で対象とした噴流は,全てのウェーバ数に対して不安定解を持つ。しかし,ウェーバ数が小さくなるほど擾乱の増幅率は減少するため,せん断層厚さが薄いなどの低ウェーバ数条件では,表面張力により噴流自由界面波が抑制されることが明らかとなった。高エネルギービームの液体金属ターゲット流を模擬した水噴流実験を行い,縮流ノズル出口の壁面境界層と自由界面性状の関連性を調査した。また,壁面境界層が剥離することにより生ずる自由界面下せん断層の安定解析を行い,自由界面波を予測するとともに,せん断層内の擾乱が減衰し,自由界面波の発生が抑制される安定条件を評価した。レーザー流速計による速度分布計測から,比較的噴流速度の低い条件におけるノズル出口境界層は,縮流ノズル内部における境界層の再層流化により層流となるが,流速の増加に伴って再層流化が不完全となり,噴出時の境界層は乱流へと遷移することを確認した。再層流化が不完全となる流速条件は,加速パラメータによる予測とほぼ一致する。また,噴流自由界面には,ノズル出口直下流に可視的な波の生じない平滑領域が現れ,その下流から,自由界面下せん断層の不安定性に起因した周期性の高い2次元波が発生する。平滑領域および2次元波領域は,噴流平均流速の増加につれて減少した後,やがて消失し,自由界面は3次元的に乱れた波に覆われる。境界層測定との比較から,平滑領域の消失は,ノズル内部の再層流化が不完全となる流速条件よりもやや高流速側となることが明らかとなった。本領域の消失は,壁面境界層内のせん断力が増加することによる,せん断層内の乱れの増加が原因と考えられる。自由界面下せん断層の安定解析から,せん断層内の最も増幅される擾乱を評価することにより,水噴流実験およびターゲット流を模擬したリチウム噴流実験に現れる2次元波を予測できることが明らかとなった。また,不安定解が対流不安定性を示すことから,理論解析が実験事実を模擬し得ることを確認した。安定領域は,せん断層厚さにもとづくウェーバ数が1.8以下となる条件に生じ,これを満たすようにせん断層厚さを薄くするなど,自由界面波の発生を抑制するノズル設計への指標を得た。

また,本解析で対象とした噴流は,全てのウェーバ数に対して不安定解を持つ。しかし,ウェーバ数が小さくなるほど擾乱の増幅率は減少するため,せん断層厚さが薄いなどの低ウェーバ数条件では,表面張力により噴流自由界面波が抑制されることが明らかとなった。
機能性多核金属錯体を単位とする電極表面多層集積系の構築とその化学機能

本研究では、溶液内酸化還元挙動をはじめ諸物性が明らかとされているオキソ架橋二核錯体および三核錯体を金電極表面へ自己組織化法により固定化し、得られた単分子膜の基礎的酸化還元特性と界面反応性を調べた。さらに配位結合生成を利用した酸化還元活性金属クラスターの膜界面への多層化を行なった。金電極表面ヘオキソ架橋ルテニウム三核錯体を自己組織化するため、種々の長さを持つアルキルージスルフィド配位子を導入した錯体を合成し、次いでその錯体を含む溶液へ金電極を一定時間浸漬することにより、Au-S結合で固定化された単分子膜を合成した。末端にピリジン配位子を持つルテニウム三核錯体の自己組織化単分子膜は、水溶液中、広範なpH領域において固定化錯体に由来する1電子酸化還元過程を示した。サイクリックボルタモグラム(CV)の電気量から三核錯体は金電極表面に単分子層として密に配列しており、CVの多重掃引によっても電極表面からの錯体の剥離はなかった。さらに酸化還元電位やCV波形には顕著な支持電解質依存性があり、界面配列錯体と電解質アニオンとの相互作用の大きさの違いやアニオン種に依存した膜構造変化が示唆された。クラスター末端にカルボニル配位子を持つルテニウム三核錯体の単分子膜では、三核骨格の1電子酸化に伴うカルボニル/アクア配位子置換反応が観察された。そのアクア配位子の占有するサイトへ4,4′-ビピリジン配位子を持つ三核錯体の導入を試みたところ、錯体ユニットの二量化が観測された。以上の操作をさらに繰り返すことにより三量化反応も進行した。その他、オキソ架橋ルテニウム二核および鉄二核錯体の自己組織化単分子膜を作製し、金電極界面におけるプロトン共役酸化還元挙動についても詳細な知見を得た。多電子移動過程を示すオキソ架橋多核錯体を自己組織化法により電極表面上へ単分子層化し、その酸化還元挙動を調べた。本研究では申請者らが合成、構造、酸化還元挙動、配位子置換反応性などを詳細に調べてきたオキソ架橋ルテニウム(III)二核錯体やルテニウム(III)三核錯体などの多核金属錯体、オキソ架橋鉄(III)二核錯体などの生体金属酵素の活性中心モデル錯体を対象とした。金電極界面へこれら金属クラスター錯体を組織化し、その酸化還元挙動やプロトン共役電子移動反応、さらに光応答性を調べ、以下に示す研究成果を公表した。1.Ru三核錯体の金電極表面での酸化還元応答:ピリジンおよびイミダゾール誘導体配位錯体では可逆な1電子酸化還元波が観測された。酸化還元電位は配位子の種類や支持電解質に用いたアニオンの種類に大きく依存した。2.カルボニル錯体の金電極表面光応答性:三核錯体へカルボニル基を導入した錯体を自己組織化した金電極では、光照射に伴いCO配位子が脱離する現象が観測された。それに伴い三核錯体の酸化還元電位は大きく負電位側へシフトした。またCO脱離反応は錯体の1電子酸化によっても進行することが確認された。さらに酸化還元に伴う電極上の三核錯体の電子状態の変化を赤外スペクトルのCO伸縮振動をプローブとして調べた。3.鉄およびルテニウム二核錯体:架橋オキソイオンへのプロトン化に伴う酸化還元電位の変化を追跡した。均一有機溶媒中における酸化還元挙動との比較を基に、表面固定された錯体の酸化還元挙動の詳細を明らかにすることができた。
好塩基球を標的とした慢性痒疹・痒疹反応の機序の解析と新規治療の開発

中高齢者に多い難治性疾患である慢性痒疹・アトピー性皮膚炎の痒疹反応の発症機序を好塩基球の機能解析を主体としてまず痒疹の病変部、末梢血中の好塩基球の表面マーカーを解析、さらに皮膚の重症度との関連性を検討。一方、痒疹反応のモデルマウスとして抗原特異的IgE遺伝子導入マウスを用いて同一部位に大量の抗原投与による痒疹モデルマウスを作成して病態を解析する。In vitroでは好塩基球の活性化機序を解析するため亜鉛トランスポーター、メタロチオネイン(MT)の機能解析、プロスタグランデインD2の産生機序および抗原特異的IgE遺伝子導入マウスの第3相反応における役割も解析して好塩基球を標的とした痒疹の新規治療法の開発する。今年度は抗原特異的IgE遺伝子導入マウスを用いた痒疹の病態解析を行った。東京医科歯科大学烏山一教授のグループと共同研究で抗原特異的IgE導入マウスを用いて背部に高濃度のTNP-IgEを大量に皮下投与して痒疹モデルマウスを作製した。孤立性の角化性丘疹で好塩基球、好酸球、肥満細胞が密に浸潤。このモデルマウスを用いて発症機序、痒疹反応との相違などに関して検討する。好塩基球に特異的モノクローナル抗体を用いて新規治療法の開発。すでに当教室メデイカルフェローの宇賀神君が好塩基球特異的モノクローナル抗体を作成しているので、これらの抗体による治療法の可能性を検討した(Ugajin T, J LeukocBiol,2009)。慢性痒疹は、腎不全・肝不全・悪性腫瘍などの基礎疾患を有する患者などにおいて、著明な痒みを伴い比較的孤立性の強い丘疹が見られる疾患である。著明な痒みは患者のQOLや労働生産率を著しく低下させる。しかしこれまで、痒疹の病因・病態は依然明らかになっていない。痒疹結節部に好酸球が多数浸潤することから、痒疹の病態にはTh2反応が関与する可能性が考えられてきた。また近年、抗原特異的IgEで感作したマウスの耳介皮内に抗原を投与すると、即時型反応、遅延型反応に続き、好酸球が著明に浸潤する第3相反応が見られ、その反応のイニシエーターとして好塩基球が重要な役割を果すことが明らかとなっているが、この第3相反応の病理組織所見が痒疹に非常に酷似している。我々は現在、このマウスを痒疹のモデルマウスとして、病態の解析を行った。【目的】慢性痒疹マウスモデルを用いた解析にて現在まで好塩基球を同定することができなかった。今回、皮膚組織に浸潤している好塩基球を同定できる新たなモノクローナル抗体の樹立をめざした。【方法】マウス好塩基球の分泌顆粒に存在するプロテアーゼmMCP-8とmMCP-11のリコンビナント蛋白を大腸菌に発現させ、精製蛋白をラットに過免疫することで、それぞれに対するモノクローナル抗体を樹立した。【結果】ウエスタンブロット法ならびに免疫組織染色法によって、mMCP-8、mMCP-11のそれぞれに特異的なモノクローナル抗体を解析。抗mMCP-8抗体TUG8は好塩基球を特異的に検出し、抗mMCP-11抗体TUG11は好塩基球と一部のマスト細胞を認識した。【考察】抗mMCP-8抗体TUG8の樹立した。皮膚組織における好塩基球の同定が可能になり、今後、慢性痒疹モデルマウスを用いて好塩基球の解析する予定である。好塩基球は肥満細胞との類似点が多い細胞であり、高親和性IgE受容体を発現してヒスタミンなどを分泌する。最近になってIgE誘導性慢性皮膚炎症の成立に好塩基球が必須であることが示された。またTh2型免疫反応初期のIL-4産生源として、さらには抗原呈示細胞としても重要な役割を果たしうることが明らかになっている。

好塩基球は一般的な染色ではその存在を確認することが困難であったため、皮膚疾患の病変にどの程度浸潤しているのか全く明らかにされていない。種々の皮膚疾患における好塩基球の浸潤や活性化状態について検討した。B研究方法と結果24種類の皮膚疾患(136例)の生検皮膚を用いて好塩基球浸潤の有無とその程度を免疫組織学的に検討した。好塩基球特異抗体として抗basogranulin抗体(BB1抗体)を使用した。また一部の疾患については末梢血好塩基球のCD203C発現をフローサイトメトリー法で測定し、活性化状態を評価した。炎症反応における好塩基球の役割の重要性が近年注目されている。24疾患、136症例の皮膚疾患における好塩基球浸潤を検討した。痒疹、持続時間の長い蕁麻疹、水疱性類天疱瘡、好酸球性膿疱性毛包炎、アナフィラクトイド紫斑、虫刺症、疥癬、白癬などにおいて病変部への顕著な好塩基球浸潤が確認された。尋常性天疱瘡、乾癬、強皮症、全身性エリテマトーデス、肥満細胞症、腫瘍性病変にはみられなかった。また末梢血中の好塩基球におけるCD203c発現をフローサイトメトリー法で観察したところ、痒疹や蕁麻疹患者において発現上昇が確認され、好塩基球が活性化状態にあることがわかった。中高齢者に多い難治性疾患である慢性痒疹・アトピー性皮膚炎の痒疹反応の発症機序を好塩基球の機能解析を主体としてまず痒疹の病変部、末梢血中の好塩基球の表面マーカーを解析、さらに皮膚の重症度との関連性を検討。一方、痒疹反応のモデルマウスとして抗原特異的IgE遺伝子導入マウスを用いて同一部位に大量の抗原投与による痒疹モデルマウスを作成して病態を解析する。In vitroでは好塩基球の活性化機序を解析するため亜鉛トランスポーター、メタロチオネイン(MT)の機能解析、プロスタグランデインD2の産生機序および抗原特異的IgE遺伝子導入マウスの第3相反応における役割も解析して好塩基球を標的とした痒疹の新規治療法の開発する。今年度は抗原特異的IgE遺伝子導入マウスを用いた痒疹の病態解析を行った。東京医科歯科大学烏山一教授のグループと共同研究で抗原特異的IgE導入マウスを用いて背部に高濃度のTNP-IgEを大量に皮下投与して痒疹モデルマウスを作製した。孤立性の角化性丘疹で好塩基球、好酸球、肥満細胞が密に浸潤。このモデルマウスを用いて発症機序、痒疹反応との相違などに関して検討する。好塩基球に特異的モノクローナル抗体を用いて新規治療法の開発。すでに当教室メデイカルフェローの宇賀神君が好塩基球特異的モノクローナル抗体を作成しているので、これらの抗体による治療法の可能性を検討した(Ugajin T, J Leukoc Biol,2009)。痒疹の病態解析は人の病変部の解析により娃塩基球が重要な役割を果たすことが明らかにされさらに、痒疹マウスモデルも作成できた。また、好塩基球に特異的抗体も作成でき今後臨床応用へと発展できることが期待される。24年度が最終年度であるため、記入しない。痒疹モデルマウスを用いて好塩基球上のPSGL-1とL-セレクチンの結合が好塩基球皮膚浸潤において必須な過程であると推測された。今後、好塩基球特異的抗体のみならず接着因子に対する抗体なども作成して治療に役立てていきたい。
ニューロン型グルタミン酸輸送体の生理的役割：拡散依存性シナプス調節の制御

小脳皮質における拡散性異種シナプス抑制が、エタノール(EtOH)によって用量依存的(25-50 mM:酩酊泥酔時の血中濃度に相当)に阻害されることを発見した。EtOHの阻害作用は、プルキンエ細胞に発現するグルタミン酸輸送体EAAT4の特異的阻害薬により著しく減弱した。またEtOHの作用は、プロテインキナーゼC(PKC)ならびにPI3キナーゼ(PI3K)の阻害薬により完全に消失した。こうした結果に基づきEtOHには、PKC/PI3Kが担うタンパク質リン酸化カスケードを介してEAAT4の機能を亢進させることにより、神経伝達物質グルタミン酸のシナプス外拡散を減弱させる作用があると結論した。脳幹(下オリーブ核)から小脳プルキンエ細胞に投射する登上線維の軸索終末から放出された興奮性伝達物質(グルタミン酸と推定)は、プルキンエ細胞を強力に興奮させるとともにシナプス外領域にも拡散する。拡散した登上線維グルタミン酸は、分子層介在ニューロン(籠細胞)軸索終末のAMPA受容体(GluA2/3)を活性化することにより、籠細胞-プルキンエ細胞間のGABA作動性伝達にシナプス前抑制(即ち、脱抑制)を引き起こす。昨年、この異種シナプス抑制が、エタノールにより用量依存的(25-100 mM:酩酊泥酔時の血中濃度に相当)に阻害されることを発見した。またこれまでに、エタノールの阻害作用は1プルキンエ細胞特異的に発現するグルタミン酸輸送体EAAT4の選択的阻害薬threo-3-methylglutamic acidにより減弱すること、2protein kinase C(PKC)とphosphatidylinositol-3 kinase(PI3K)の阻害に伴い消失することなどを見出している。エタノールの作用メカニズムを追究するため、登上線維からシナプス外に拡散したグルタミン酸の動態をグルタミン酸輸送体電流を利用して観察した。エタノール(50 mM)は、登上線維を刺激してプルキンエ細胞に誘発したシナプス性輸送体電流(synaptic transporter current)を不可逆的に減弱させた。また、エタノールがグルタミン酸輸送体電流を減弱させる作用は、PKC阻害薬GF109203Xにより完全に消失した。こうした結果から、エタノールの異種シナプス抑制阻害作用には1PKCを介したタンパク質リン酸化カスケードと2EAAT4の機能亢進に伴う登上線維伝達物質のシナプス外拡散の減弱という2つのプロセスが関与していると結論した。細胞膜型のグルタミン酸輸送体(excitatory amino acid transporter, EAAT)は、1分子のグルタミン酸(Glu)を輸送するにあたり、3つのNa+と1つのH+を共輸送するとともに1つのK+を逆輸送する。このためEAATは、Glu輸送と共役した起電性を示す。これまでに、シナプス放出されたGluによって誘発されるEAAT電流(シナプス性輸送体電流:synaptic transporter current, STC)を記録する方法を確立し、シナプス外Gluの動態解析に利用してきた。しかし、この方法で観察できるのはシナプス近傍に局在するEAATに由来する一部の電流に限られており、1個の細胞が担うGlu回収の総量を検討することは不可能であった。そこでこの問題を解決するため、caged Gluを用いたEAAT電流誘発・記録システムの構築を試みた。幼若ラットから小脳スライスを作成し、Glu/GABA受容体阻害薬(NBQX, AIDA, bicuculline)とともにcaged Glu(RuBi-glutamate)を灌流投与した。光パルスを照射してGluを遊離させることにより、電位固定したプルキンエ細胞ならびにバーグマングリアから内向き電流を記録することに成功した。この内向き電流は、EAAT阻害薬(TBOA)により著しく減弱したことから、EAAT電流であると結論した。今後は、この方法に薬理学的手法を適用するなどにより、ニューロンやグリア細胞におけるGlu輸送・回収系の制御機構について検討を進めたいと考えている。脳幹(下オリーブ核)から小脳皮質のプルキンエ細胞に投射する登上線維の神経終末から放出された興奮性伝達物質グルタミン酸は、プルキンエ細胞に強力な興奮を誘発させると同時にシナプス外領域にも拡散する。拡散したグルタミン酸は、籠細胞(分子層の介在ニューロン)軸索終末のAMPA受容体を活性化することにより、籠細胞-プルキンエ細胞間GABA作動性伝達のシナプス前抑制を引き起こす。ラット小脳スライスにパッチクランプ法を適用することにより、この異種シナプス抑制がエタノールによって用量依存的に阻害されることを発見した(25-50 mM:酩酊泥酔時の血中濃度に相当)。

エタノールの阻害作用は、プルキンエ細胞に特異的に発現するグルタミン酸輸送体EAAT4の選択的阻害薬threo-3-methylglutamic acidにより有意に減弱した。一方、シナプスを被覆するバーグマングリアに発現するグルタミン酸輸送体GLASTとGLT-1の阻害薬(PMB-TBOA, dihydrokainate)は、エタノールの異種シナプス抑制阻害作用に無効であった。また、エタノールの阻害作用は、protein kinase C(PKC)とphosphatidylinositol-3 kinase(PI3K)の阻害薬により完全に消失した。こうした結果から、エタノールにはPKC/PI3Kカスケードを介してプルキンエ細胞のEAAT4機能(グルタミン酸回収能)を亢進することにより、登上線維伝達物質のシナプス外拡散を阻害する作用があると結論した。計画していた課題に予定通り取り組み、エタノールにはPKC/PI3Kカスケードを介してグルタミン酸輸送体EAAT4の機能を亢進させる作用があることを明らかにした。グルタミン酸輸送体とその駆動に関わるNa+/K+イオン勾配を作出するNa+ポンプの共役関係を検討するため、Na+ポンプα3サブユニットタンパク質(ATP1A3)の遺伝子ノックアウトマウスを導入した。また、ニューロン軸索Ca2+スパイクのキネティクス変化を正確に記録するため、低親和性Ca2+指示薬を用いた時間分解能が高いイメージングシステムを構築した。これにより、ニューロン型グルタミン酸輸送体の制御機構ならびにAMPA受容体が籠細胞のGABA放出を抑制する分子メカニズムを検討するための実験設備を整えることができた。エタノールが小脳異種シナプス抑制を阻害する作用は、プルキンエ細胞に特異的に発現するグルタミン酸輸送体EAAT4の機能亢進によって仲介されていることを示唆する結果を得た。また、PKC/PI3Kカスケードの関与など、エタノールの作用メカニズムの一端を明らかにすることができた。今年度計画していた全ての課題に取り組み、エタノール作用の基礎データを取得するとともに分子基盤の解明を進めるなど、目標を十分に達成できたと考えている。野生型マウスとAtp1a3遺伝子ノックアウトマウスの間で表現型(シナプス特性、異種シナプス抑制、長期抑圧など)の比較を行う(この課題は、自治医科大学・川上潔教授、兵庫医科大学・池田啓子教授らとの共同研究として実施する)。Ca2+イメージングシステムを分子層介在ニューロンの軸索終末に適用するとともに薬理学的手法を併用して、AMPA受容体がGABA放出を抑制するメカニズムの解明を目指す。また併行して、カルシウムチャネルの機能を亢進する作用が報告されているロスコビチン(roscovitine)がニューロン軸索のCa2+動態におよぼす影響を観察する。光分解性ケージ化合物を利用した、グルタミン酸輸送体電流の記録システムを構築する。エタノールがプルキンエ細胞のEAAT4機能を亢進させるメカニズムの追究ならびに登上線維-プルキンエ細胞間シナプスにおけるグルタミン酸輸送体長期増強の観察に適用したい。EAAT4機能の制御機構をさらに追究するため、電気生理学的/薬理学的手法を用いて2次メッセンジャー系の関与について重点的に検討を行う。
野生チンパンジーの遊びの多様性と環境

遊びに注目してチンパンジーとヒトの比較をおこなった。環境に関心を持って主体的に働きかけることで多様な遊びと学びが見られる点は両種に共通していたが、協同遊びや遊びの支援などはヒトにのみ見られた。また、年下の遊び相手への配慮や、相手を笑わせる働きかけなど、遊びにおける利他性・共感性にも共通点があった。以上を踏まえ、遊びを通した学びや発達を保育者はどう援助すべきかを考察した。また、チンパンジーの遊び研究で得られた知見を踏まえて、自然体験を重視する「森のようちえん」の保育の課題と展望をまとめた。さらに、ショーやテレビに出演する飼育チンパンジーの遊びと笑いについて動物福祉の観点から分析した。本研究の目的は、1)チンパンジーがどのように周囲の環境と関わり行動できるようになるかを多様な遊びの観察を通して明らかにすることと、2)ヒトとの比較によってヒト・チンパンジーそれぞれの発達過程の特徴を明らかにすることである。当初の予定では、平成27年度にタンザニア・マハレ山塊国立公園での野生チンパンジーの野外調査をおこなう計画であったが、大学業務の都合により調査は実施せず、これまでの調査で得られた遊びのデータをもとに分析を進めた。平成27年度には、2本の論文を執筆した。まず、チンパンジーの遊びの多様性を整理しながら、遊びを通した学びの意義を捉えなおすという論考を執筆した。豊かな自然環境や社会的環境によって、チンパンジーの多様な遊びが生まれ、それが様々な行動の発達や学びにつながっていることを論じた。さらに、ヒト乳幼児とも比較しながら、遊びを通した豊かな学びが得られる環境とはどのようなものかを考察した。国内の学術誌に投稿予定である。もうひとつは、笑いに関する論考である。チンパンジーとの比較によって、ヒトの笑いの意味の多様性や笑いの用いられ方など、ヒトの笑いの発達や機能の特徴を明らかにしてきたが、それらを踏まえながら保育における笑いの諸問題についての考察をおこなった。この領域の先行研究が限られていることから、まず、保育において笑いが持つ意義について整理した。そのうえで、攻撃性を帯びた笑いなど、ヒトの笑いの負の側面について取り上げて、保育現場でどのように笑いと向き合えば良いかを論じた。この論文については、国内の学術誌への掲載が決まっている。本研究課題の開始のタイミングで保育者養成課程への異動があったこともあり、平成27年度には本研究課題の2つの目的のうち「ヒト乳幼児との比較」により重点をおいた研究活動をおこなった。そのため、チンパンジーの多様な遊び(水遊び、物遊び、オトナ個体の遊びなど)に関する詳細な分析についてはやや遅れているが、全体としてはおおむね順調に進展している。本研究の目的は、(1)チンパンジーがどのように周囲の環境と関わり行動できるようになるかを、多様な遊びの観察を通して明らかにすることと、(2)ヒトの遊びとの比較によって、ヒトとチンパンジーそれぞれの発達過程の特徴を明らかにすることである。当初の予定では、平成28年度にタンザニア・マハレ山塊国立公園での野外調査をおこなう計画であったが、大学業務の都合により調査は実施せず、これまでの調査で得られた遊びのデータを元に研究・分析を進めた。平成28年度には2本の論文を完成させた。1本は過年度に投稿したもので、平成28年度に改稿をおこない、『子ども学』(萌文書林)に掲載された。野生チンパンジーの遊びの多様性についてまとめ、ヒトと比較した論文である。環境に関心を持ち、主体的に働きかけることで多様な遊びとそれに伴う学びが見られるところに、両種の1つの共通点があった。一方、協同遊びや三項関係的な遊びと、遊びに関する教示や支援がチンパンジーには見られなかった。これらより、ヒトの遊びを支える人的・物的な環境の役割について考察し、遊び環境はいかにあるべきかをとくに保育との関連で議論した。もうひとつは、チンパンジーの遊びにおける利他性と共感性の発達に注目し、ヒトと比較したものである。年下の遊び相手への配慮や、遊び相手を笑わせる・楽しませる働きかけなどは、両種に共通して見られた。一方、ヒトはより積極的に援助や物の分与をおこない、自発的な協力・教示や間接互恵性も見られる。人類は、共感的で協力的な性質をより発達させ、協同的な社会を築いてきたと考えられる。以上を踏まえて、遊びを通した思いやりの発達を保育や育児においてどのように援助すべきかについて考察した。この論文は『西山学苑研究紀要』に掲載される予定である。本研究課題の開始のタイミングで保育者養成課程に異動したため、本研究課題の2つの目的のうち「ヒト乳幼児との比較」により重点をおいた研究をおこなった。そのため、チンパンジーの多様な遊び(水遊び、物遊び、オトナ個体の遊びなど)に関する個々の分析については遅れることとなったが、ヒト乳幼児との比較や、それを基にした保育に関する考察については進展した。全体としてはおおむね順調に進展しているといえる。