hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ペルオキシソームのプリン塩基分解系の進化ー動物進化にともなう尿酸分解酵素群の脱落機構

1.ウリカーゼ、アラントイナーゼ(ALN)、アラントイカーゼ(ALC)のような尿酸分解酵素群がある種の海棲魚類の肝臓のペルオキシソームに存在することはすでに報告した。今回は、肝臓ALCのペルオキシソーム内存在様式に基づいて、13種類の魚類が2種のグループ、即ちサバのグループ(サバ、イサキ、ブルーギル、オオグチバス)とイワシのグループ(イワシ、カツオ、ハマチ、トビウオ、アジ、ボラ、コイ、オイカワ)に分類されることがわかった。サバグループではALCはペルオキシソーム膜の外表面に分布しており、イワシグループではペルオキシソームの可溶性マトリックスに分布している。ペルオキシソームの膜と可溶性マトリックスのALCは、分子量、サブユニット数は同じだが、pI及び電気泳動による易動度が異っていた。魚類のALCのサブユニットの分子量は両棲類のALNーALC複合体の小サブユニット(ALCサブユニット)と同じであった。これは、魚類のALCのサブユニットが、進化の過程で、両棲類の複合体の小サブユニットに変化したことを示唆している。2.魚類肝臓のアラントイナーゼ(ALN)の細胞内及びペルオキシソーム内分布を蔗糖密度勾配遠心法で調べた。ALNの分布に基づいて、魚類ガス種のグループに分類されることがわかった。即ち、海棲魚類(イワシ、カツオ、ハマチ、トビウオ、アジ、サバ、イサキ)ではALNがペルオキシソームの可溶性マトリックスとシトソールに分布しているのに対し、淡水魚類(コイ、フナ、ブルーギル、オオグチバス、オイカワ)では、シトソールにのみ分布している。
単純ヘルペスウイルスベクター(G47Δ)を用いた抗腫瘍免疫増強法の確立

ウイルス療法では、がん治療用ウイルスの直接的な殺細胞効果によりがんが駆逐される。口唇ヘルペスの原因である単純ヘルペスウイルス1型の第3世代がん治療用ウイルスであるG47Δの臨床試験から得られたデータをもとに、G47Δが惹起する抗腫瘍免疫効果を増強する新たな治療法の開発を目指した。50項目以上のサイトカインについて検討し、G47Δ投与後に主にNK細胞が放出するIFN-γや樹状細胞が放出するIL-12が上昇し、Th1活性化が誘導され、抗腫瘍免疫が誘導されることが確認された。ウイルス療法は、今後のがん治療において標準的な治療法として確立されるものと思われる。世界初の第3世代がん治療用HSV-1であるG47Δの臨床試験から得られたデータをもとに、共分散構造分析などの工学的手法を用いてサイトカイン相互作用ネットワークを検討し、G47Δの抗腫瘍免疫を更に増強する新たな治療法の開発を目指している。G47Δの臨床試験被験者から得られた末梢血中にあるサイトカインの経時的変化を解析し、同時に病理検体を用いてCD3およびCD4、CD8、CD57陽性細胞の同定やHSV免疫染色などを行っている。まず、臨床試験被験者血清のCytometric Bead Array (CBA)フローサイトメータによる蛋白の多項目同時定量解析では、ヒトサイトカインアッセイキット(Group I、Group II)を用いて、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12p40、TNF-α, IFN-γなど50項目のサイトカインについて解析を行った。G47Δ投与後にIL-12、IFN-γが誘導され、G47ΔによるTh1の活性化が確認され、同時にTh2サイトカインであるIL-4やIL-6は抑制されていることも確認された。病理検体においても腫瘍の局所にCD8陽性T細胞や組織球、HSV陽性細胞が認められ、サイトカインの所見と一致した組織像を呈している。今後は因子分析モデルを用いて免疫寛容に対する抗PD-1抗体などの免疫チェックポイント阻害薬の最適な投与時期を検討し、Neuro2aの皮下腫瘍動物モデルを用いて最適モデルの実効性を検討する。現在、膠芽腫に対する第II相臨床試験(医師主導治験)が進行中であり、同様にサイトカインの経時的変化を解析して抗腫瘍免疫増強のための治療戦略を検討する予定である。臨床試験から得られる資料(採血、生検組織)は確保されており、腫瘍免疫学の最新の知見も考慮しながら解析するサイトカインを検討し、解析を進めている。検体数の割に検討すべきサイトカインの項目が多く、最適化した因子分析モデルの選定に時間を要しているが、ここまでは順調に進展している。第3世代がん治療用HSV-1であるG47Δの臨床試験から得られた情報から共分散構造分析などを用いてサイトカイン相互作用ネットワークを検討し、G47Δの抗腫瘍効果増強のための新たな治療法の開発を目指している。まず、G47Δの第1相臨床試験の被験者血清を用いてCytometric Bead Array (CBA)フローサイトメーターによる蛋白の多項目同時定量解析を行った。これまでにヒトサイトカインアッセイキットを用いてIL-1、IL-2、IL-4, IL-6、IL-12、IFN-γ、TNF-α、RANTESなど50項目について解析した結果、G47Δ投与後にIL-12、IFN-γ等のTh1サイトカインが活性化され、IL-4、IL-5、IL-9、IL-13等のTh2サイトカインは抑制されることを示した。また、G47Δ投与前後の病理検体を比較すると、腫瘍局所ではCD3陽性細胞の浸潤が優位でCD20陽性Bリンパ球は少ないが、CD3陽性T細胞(CD4陽性細胞、CD8陽性細胞)の構成には変化がみられ、ヒトサイトカインの変化との関連を検討している。また、Th17細胞についても検討するためIL-17、IL-21、IL-23、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3などの項目を追加している。これらサイトカインの解析を基に最適モデルの構築を試みており、治療初期に生存期間の延長に寄与する因子が特定されつつある。現在、特定した因子の影響下にある他のサイトカインがどのように変化していたかについても検討しており、免疫チェックポイント阻害剤導入のタイミングを模索している。構築した最適モデルの実効性については、Neuro 2aの皮下腫瘍モデル等を用いて今後検討していく。当初の予定よりサイトカインの検討項目を増やして再解析しているため、多少時間を要した。因子分析項目が多く、またサイトカイン間の関連性が強いものも多いため、最適なモデル構築には特に慎重さが要求される。しかし、ようやく生存に影響すると思われる因子が特定されつつある。単純ヘルペスウイルス1型(HSV-1)の第3世代がん治療用ウイルスであるG47Δの臨床試験から得られたデータをもとに、サイトカイン相互作用ネットワークを検討し、共分散構造解析などの工学的手法を用いてG47Δが惹起する抗腫瘍免疫の効果をさらに増強する新たな治療法の開発を目指した。最終年度では第I相臨床試験のみならず、現在進行中の第II相臨床試験(医師主導治験)の被験者から得られた検体も用いてサイトカインの経時的変化をより詳細に検討した。

具体的には、被験者血清を用いてCytometric Bead Array (CBA)フローサイトメータによる蛋白の多項目同時定量解析を行った。ヒトサイトカインアッセイキットGroup I、Group II等)によりIL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-10、IL-12p40、TNF-α、TGF-β、IFN-γなど50項目以上のサイトカインについて検討し、共分散構造解析にはIBM SPSS version22 Amosを用いて最適モデルを模索した。また病理検体を用いてCD4、CD8、CD3、CD57等の免疫染色を行い、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)を構成する各陽性細胞の経時的な変化を検討した。その結果、G47Δ投与後に主にNK細胞が放出するIFN-γや樹状細胞が放出するIL-12が上昇し、Th1活性化が誘導されるが、IL-4、IL-6は上昇せずTh2は抑制されていることが再度確認され、組織学的にもG47Δの投与後にTILが増加し、CD4陽性細胞やCD8陽性細胞の構成が経時的に変化していくことも確認された。最終年度では制御性T細胞(Treg)が誘導される時期について検討するためTregの発生・分化、機能を制御する転写因子であるFoxp3の免疫染色を追加して検討した。Foxp3のみでは誘導性Treg細胞の同定は困難であるが、G47Δ投与後にFoxp3陽性細胞の割合が増加する例は存在した。今後ウイルス療法を行った後に免疫チェックポイント阻害剤を併用することはウイルス療法の抗腫瘍効果をさらに高める可能性がある。ウイルス療法では、がん治療用ウイルスの直接的な殺細胞効果によりがんが駆逐される。口唇ヘルペスの原因である単純ヘルペスウイルス1型の第3世代がん治療用ウイルスであるG47Δの臨床試験から得られたデータをもとに、G47Δが惹起する抗腫瘍免疫効果を増強する新たな治療法の開発を目指した。50項目以上のサイトカインについて検討し、G47Δ投与後に主にNK細胞が放出するIFN-γや樹状細胞が放出するIL-12が上昇し、Th1活性化が誘導され、抗腫瘍免疫が誘導されることが確認された。ウイルス療法は、今後のがん治療において標準的な治療法として確立されるものと思われる。サイトカイン相互作用ネットワークの構築による最適モデルを確定し、適切なサイトカインの付加が必要であるとか免疫チェックポイント阻害薬の投与すべき時期がわかれば、それらを組み込んだ皮下腫瘍モデルを作成し、有効性を検討していく。また感染した腫瘍細胞近傍にのみIL-12等を分泌する“機能付加型"ウイルスを用いた皮下腫瘍モデルも行う予定である。予後に影響を及ぼす因子についてはほぼ特定されたが、特定した因子と他のサイトカインの変動との関連性を検討する必要がある。また、免疫チェックポイントの投与のタイミングについても検討した上で、構築したモデルの実効性について皮下腫瘍モデルで検証する予定である。悪性脳腫瘍臨床の血液検体を用いてサイトカイン50項目の検討を行っている。しかし、まだ若干の追加項目が必要と思われたため、全体の検討が終了してから追加項目を決定する予定である。実験自体は計画通り順調に進展しており問題はなかった。サイトカインの検討項目を増やし、これまでに59項目について検討した。最適モデルの構築には試行錯誤のため時間を要したが、生存期間の延長に寄与する因子が特定されつつある。最適モデルの実効性についての検証を今後行っていく予定である。
ヒトSOD遺伝子挿入細胞を用いた呼吸器疾患治療法の薬剤学的研究

近年、小児や成人における呼吸窮迫症候群に活性酸素消去酵素であるヒトスーパーオキサイドジスムターゼ(SOD)を投与することにより肺組織傷害が軽減されることが報告されているが、それほど大きな効果が得られていない。これはSOD自体の体内半減期が著しく短く、加えて、肺に特異的に分布させることが困難なためと考えられる。また様々な遺伝子を導入した細胞を移植または直接遺伝子を投与することで遺伝子疾患や癌などを治療しようとする試みが近年活発に行われ、その有効性が証明されつつある。そこで本研究はヒトSOD遺伝子をラット細胞に組み込み、これまでほとんど検討されていない高濃度SOD発現ラット細胞を実験動物に直接経肺投与することにより、肺組織局所部位でのSODを濃度を高め、SOD遺伝子治療の有用生を明らかにすることを目的として実験を行った。このためには細胞内蛋白であるSODを分泌型蛋白とすることが必要とされる。そこで、IL2シグナル配列とヒトSOD cDNAからILSOD cDNAsを構築することにより、異種蛋白質の分泌シグナルをDNAレベルで付加することによる非分泌性蛋白質の分泌化の可能性が明らかとなった。また、得られたILSOD cDNAsを導入した皮膚線維芽細胞ならびに肺上皮細胞は、顕著な活性酸素毒性防御作用を示すことがin vitro実験において明らかとなった。さらに、in vivo実験、すなわち寒冷浮腫ならびにカラゲニン誘発足浮腫に対してILSOD(1)cDNA導入線維芽細胞を移植する事により、顕著な浮腫抑制効果が得られるとともに、ヒトSOD蛋白質の静脈内投与または皮下投与に比較して、その作用が顕著に持続化することを認めた。さらにILSOD(1)cDNA導入肺上皮細胞を胸腔に移植することによりパラコートにより惹起される肺組織傷害の改善されることが明らかとなった。従って、このようなex vivo遺伝子治療法を応用した細胞性製剤の開発が、ペプチドならびに蛋白質のDDSとして有用であるという結論を得た。これらの結果は、今後ますます注目される生理活性ペプチドならびに蛋白質医薬品を、持続的かつ効率よく体内標的部位へe嵐BするためのDDSの開発に対して有益な知見を与えるものと考えられる。研究成果としては、親細胞並びにヒトSOD蛋白発現ラット細胞をラット皮下に移植し、移植後1、2、3日目に液体窒素により、移植部位に皮膚組織の局所虚血状態を作成した。その後エバンスブルーを静脈内投与し、このエバンスブルーの血管からの漏出量を測定することで、炎症の重症度を決定した。その結果、ヒトSOD蛋白発現ラット細胞皮下移植局所においては、エバンスブルーの漏出量は非移植部位並びに親細胞移植部位に比較して有意に少なく、ヒトSOD蛋白発現ラット細胞の移植が虚血再還流時における活性酸素発生による組織障害に対して極めて有用であることが明らかになった。さらに現在、移植皮下組織内でのSOD蛋白発現量、SOD蛋白発現ラット細胞ならびに皮下組織のの生化学的、組織学的変化について検討中である。研究成果の評価として、SOD蛋白発現ラット細胞の移植を行うことによって、虚血再還流時における活性酸素発生による組織障害に対して極めて有用であることが証明できた。しかしながら今回モデルとして用いたFR細胞はラット皮膚線維芽細胞由来の継代培養細胞である。このため、移植用に使用したWistarラットにおいては、移植後長期間経ることにより、SOD蛋白発現ラット細胞の拒絶反応の起こる可能性がある。その結果、移植したSOD蛋白発現細胞からのSOD蛋白の分泌は低下し、作用減弱をきたすものと考えられる。従って、この移植後の拒絶反応を回避するためには、Wistarラット皮膚より採取培養した初代培養細胞を用いる必要があるものと考えられる。今度は初代培養細胞を用いたSOD蛋白発現ラット細胞を作製し、その有用性についても検討する。

これらの結果は、今後ますます注目される生理活性ペプチドならびに蛋白質医薬品を、持続的かつ効率よく体内標的部位へe嵐BするためのDDSの開発に対して有益な知見を与えるものと考えられる。我々は既に、親細胞並びにヒト分泌型SOD蛋白発現ラット皮膚線維芽細胞をラット皮下に移植後、移植部位に皮膚組織の局所虚血状態を作成し、炎症の重症度を測定した。その結果、ヒトSOD蛋白発現ラット細胞の移植が虚血再還流時における活性酸素発生による組織障害に対して極めて有用であることを平成7年度研究報告実績として報告した。今年度はさらにカラゲニン誘発足浮腫モデルを用いて同様の検討を行った。すなわち、親細胞、ヒト非分泌型SOD蛋白またはヒト分泌型SOD蛋白発現ラット皮膚線維芽細胞をラット後肢足蹠皮下に移植後、1、2、3、または7日後に2%カラゲニンを後肢足蹠皮下に投与し、経時的に後肢足体積を測定した。その結果、ヒトSOD蛋白発現ラット皮膚線維芽細胞を移植した場合、すべての日において浮腫は顕著に抑制された。しかしながら、親細胞やヒト非分泌型SOD蛋白発現ラット皮膚線維芽細胞は、これらの効果は認められなかった。以上、ヒトSOD蛋白発現ラット皮膚線維芽細胞を移植した場合、ヒトSOD蛋白を静注あるいは皮下注した場合と同等であるいはそれ以上の浮腫抑制効果を持続的に得られることが明らかになった。さらにヒト分泌型SOD蛋白発現ラット肺上皮細胞を胸腔に移植することにより、パラコートにより惹起される肺障害を軽減することを明らかとなった。従って、SOD分泌型蛋白発現ラット細胞の移植を行うことは、虚血再還流時あるいは炎症時における活性酸素発生による組織障害に対して極めて有用であることが証明できた。
細胞膜機能と血管内分泌因子代謝動態からみたメタボリックシンドロームの病態生理

メタボリックシンドロームの基盤には内臓脂肪の蓄積があり、高血圧や心血管病変の成因となるが、その機序は明らかではない。本研究では高血圧を主体としたメタボリックシンドローム患者の細胞膜流動性(fluidity)を電子スピン共鳴法にて測定し、肥満に関連した血管内分泌因子の膜機能に対する作用や治療による影響を検討した。血漿nitricoxide(NO)代謝産物濃度が低く、内因性NO合成阻害物質(asymmetric dimethylarginine:ADMA)濃度が高いほど膜fluidityは低下していた。さらに、血中総ホモシステイン濃度が高値であるほど血中NO代謝産物濃度は低値であり、赤血球膜fluidityの低下と有意に相関した。また、これらの細胞膜機能異常は高齢女性において、エストロゲン作用を持つselective estrogen receptor modulator (SERM)、tamoxifenにより有意に改善した。以上より、肥満に関連した血管内分泌因子が高血圧の細胞膜機能に重要な影響を及ぼし、それらの調和破綻がメタボリックシンドロームの心血管病の成因に一部関与する可能性が示唆された。本研究においては、細胞膜の物理的性質の検討として、電子スピン共鳴ならびにスピンラベル法を用いて高血圧患者の細胞膜fluidityを測定し、その調節を各種血管内分泌因子との関連から考察を加えた。高血圧患者の赤血球膜fluidityは正常血圧者に比し有意に減少していた。Nitric oxide(NO)は本態性高血圧患者の赤血球膜fluidityを上昇(microviscosityを改善)させた。一方、血中総ホモシスティン濃度が高値であるほど血中NO代謝産物濃度は低値であり、赤血球膜fluidityの低下と有意に相関した。以上より、種々の内分泌因子が高血圧の細胞膜機能調節に重要な役割を果たし、その調和異常がメタボリックシンドロームの心血管病の成因に一部関与するものと考えられる。本研究においては、細胞膜の物理的性質の検討として、電子スピン共鳴ならびにスピンラベル法を用いて高血圧患者の細胞膜流動性(fluidity)を測定し、その調節を各種血管内分泌因子との関連から考察を加えた。高血圧患者の赤血球膜fluidityは正常血圧者に比し有意に減少し、高血圧における微小循環障害が示唆された。また、Nitric oxide (NO)は本態性高血圧患者の赤血球膜fluidityを上昇(microviscosityを改善)させた。一方、炎症の指標である血中high-sensitivity C-reactive protein(hs-CRP)は高血圧群で正常血圧者に比し高値であり、さらに赤血球膜fluidityや血中NO代謝産物の低下と有意に相関することから、炎症反応の亢進が高血圧の膜機能ならびに微小循環調節に重要な役割を果たすと考えられた。本研究においては、細胞膜の物理的性質の検討として、電子スピン共鳴ならびにスピンラベル法を用いて高血圧患者の細胞膜fluidityを測定し、その調節機序を各種血管内分泌因子との関連から考察した。高血圧患者の赤血球膜fluidityは正常血圧者に比し有意に低下していた。次にselective estrogenreceptor modulator (SERM)、tamoxifenの赤血球膜fluidityに対する影響を検討した。Tamoxifenはin vitroで濃度依存性に膜fluidityを改善させた。また、その作用は一部NOを介することが明らかとなった。さらに、膜fluidity改善作用は閉経後高血圧女性群で閉経後正常血圧女性群に比し有意に大であった。これらの成績はtamoxifenが膜microviscosityの悪化を防ぐひとつのdefense mechanismとして作用し、高血圧の細胞膜機能を改善し得る可能性を示唆するものと考えられた。
カンキツ'無核紀州'由来の無核性発現機構の解明と無核性カンキツ育種技術の開発

'無核紀州'由来の無核性発現には植物生長調節物質は直接的に関与していないことが明らかとなった。この無核性発現機構は、高温条件で解除され、種子が形成されることが明らかとなった。開花04週間後の高温が無核性発現機構の解除に関与することが示唆された。本研究は、キシュウミカンの突然変異により無核性を発現する'無核紀州'およびその後代の無核品種・系統における無核性発現機構を解明するために、種子および胚の形態形成過程における変異の発現を組織学的に明らかにするとともに、無核性発現に影響を及ぼす要因を明らかにする。また、'無核紀州'の種子形成過程で特異的に発現する遺伝子をサブトラクション法で解析し、無核性発現に関与する候補遺伝子を特定する。他方、'無核紀州'後代の交雑実生を育成し、種子形成を調査するとともに、簡易に無核性個体を判別する技術を開発し、無核性カンキツの育種における早期選抜技術を確立する。1.植物生長調節物質が`無核紀州'の種子発育に及ぼす影響:`無核紀州'および`平紀州'の受粉610週間後に、GA_3、ウニコナゾール、フィガロン、STS、スクロースを果実に塗布した結果、`無核紀州'ではAタイプ種子に及ぼす影響がみられず、`平紀州'ではいずれの処理でAタイプ種子が一部みられ、植物生長調節物質やスクロースはAタイプ種子形成に直接関係していないと考えられた。2.`サザンイエロー'の種子の発育に及ぼす温度処理の影響:ポット植え`サザンイエロー'の温室栽培と露地栽培における種子形成と胚の発育を調査した結果、露地栽培では胚の発育が接合子や前胚で発育停止しており、すべてAタイプ種子を形成して無核となるが、温室栽培では子葉型胚となり、Aタイプ種子が発育して完全種子を形成する有核果実が40%以上みられた。温室栽培は露地栽培に比べて最高気温が10°C以上高く、30°C以上になることが多いことから、高温がAタイプ種子の発育に影響をおよぼしていると考えられた。3.`無核紀州'と`平紀州'の種皮および子房表皮では授粉時間後に細胞が大きく、分裂活性が低い可能性が示唆された。自家蛍光観察によるクロロプラストの分布は、`無核紀州'が`平紀州'に比べて、子房表示では授粉4週間後から、種皮では授粉6週間後ころから少ない傾向がみられ、Aタイプ種子との関連が示唆された。4.果実培養:`無核紀州'の授粉1014週間後の果実を採取し、子皮培養と果芯培養を行った。1/2NのMS基本培地でスクロース添加量も検討した結果、3%スクロース添加の果芯培養で、コンタミ発生率は低下して胚の発育が観察され、Aタイプ種子形成に関する実験系として有効なことが認められた。1.植物生長調節物質処理がAタイプ種子形成に及ぼす影響:'無核紀州'と'平紀州'にエチレン誘発剤フィガロンとエチレン作用阻害剤のSTSを処理し、Aタイプ種子形成に及ぼす影響を調査した結果、'無核紀州'ではいずれもAタイプ種子形成に及ぼす影響はみられなかった。'平紀州'ではSTS 1.0mMの満開8週間後および8・10週間後2回処理でAタイプ種子形成が促進され、接合子や前胚の出現率が高く、胚の発育は抑制された。2.高温がAタイプ種子形成に及ぼす影響:'サザンイエロー'の加温栽培により種子形成の促進が認められ、前年の再現性を確認できた。'無核紀州'に高温処理を行い、約200果実の個々の果実表面温度を熱電対により測定した結果、満開04週間の高温処理で胚の発育が促進される傾向がみられ、30°C以上の高温が無核性発現を抑制する可能性が示唆された。3.果実培養:受粉6週間後と8週間後における露地栽培の'無核紀州'と'平紀州'を用い、30°Cと35°Cで果実培養を行ったが、すべてにコンタミが生じ、種子の発育は観察されなかった。4.Aタイプ種子における発現遺伝子の解析:'サザンイエロー'の温室栽培樹と露地栽培樹を用い、果実を受粉4,6週間後に採取し、種子を摘出して全RNAを抽出・精製し、サブトラクション法により特異的な約400クローンを選別して配列のシークエンスを行った。相同性検索の結果、ヒートショック関連遺伝子、胚の発育抑制に関する遺伝子、光合成関連遺伝子などと相同性の高い遺伝子が検出された。'無核紀州'の高温処理による約200果実の個々の果実表面温度を熱電対により測定し、それぞれの果実の種子形成を調査した結果、開花04週間後の高温処理で胚の発育と種子形成が促進された。それ以降の高温処理では、開花04週間後よりも果実表面温度は高かったにもかかわらず、胚の発育は認められなかった。開花04週間後の高温処理

果実のうち、胚が発育した果実と発育しなかった果実の温度を比較した結果、最高気温は胚が発育した果実で32°C、胚が発育しなかった果実で28°Cであり、3°C程度の違いが認められた。このことから、'無核紀州'型の無核性発現は、開花04週間後の高温によって胚の発育停止機構が解除され、種子が形成されると考えられた。無核紀州型無核性品種の栽培において、安定した無核果実生産のための温度管理の指標を明らかにするために、'サザンイエロー'において、果実表面温度と胚の発育との関係を調査したところ、開花04週間後に28°C以上の高温に3時間以上遭遇すると胚が発育して種子が形成される可能性が示された。一方、無核紀州型の無核性発現に及ぼすABA、エチレン誘発剤、エチレン合成阻害剤の影響を調査した結果、開花8週間後および10週間後にエチレン合成阻害剤処理によって有核の'平紀州'でAタイプ種子が多く形成された。これは、正常な胚の発育が発育過程で阻害された結果と考えられ、無核紀州型の遺伝的な無核性発現とは異なる可能性が考えられた。'サザンイエロー'において、無核となる露地栽培と有核となる加温栽培の発現遺伝子の違いをサブトラクション解析で調査した結果、露地栽培では胚の発育停止に関連するMEE遺伝子が、加温栽培ではクロロプラスト関連遺伝子などが特異的に発現した。広島県果樹試験場鉢植え'サザンイエロー'を用いて開花期に人工授粉を行い、(1)連続加温、(2)開花後04週間加温(0-4W)、(3)開花後02週間加温(0-2W)、(4)開花後48週間加温(4-8W)、(5)無加温の処理を行い、種子形成と温度との関係を調査した。その結果、無加温および4-8W加温処理では種子発育がみられず、いずれもAタイプ種子であった。これに対し、連続加温、0-4W加温、0-2W加温処理区ではAタイプ種子の発育がみられ、いずれも果実当たり10個程度の完全種子が認められた。開花後04週間の無加温における日平均遭遇時間は、28°C以上で1.5時間であったが、加温による日平均遭遇時間7時間であり、無加温に比べて顕著に長かった。一方、開花後48週間の無加温と加温における日平均遭遇時間は、28°C以上で5.3時間および5.9時間であり、無加温と加温による差は認められず、加温においては開花後04週間よりやや短い程度であった。また、'中間母本農5号'鉢植えをファイトトロンに搬入し、28°C、1日6時間遭遇処理および30°C、1日6時間遭遇処理を行ったが、いずれもほぼすべての果実が落果して、種子形成を調査することができなかった。これらのことから、無核紀州型の無核性発現は、開花後04週間の高温により胚の発育停止機構が解除され、胚や種子が発育することが明らかとなった。一方、'サザンイエロー'交雑後代の約350個体のうち、結実した85個体の果実調査を行った結果、不受精による無核の可能性がある個体を除く54個体で有核、無核の判別ができ、それらの分離比は1:1に適合した。無核性連鎖マーカーを開発するため、これらの個体について96プライマーを用いて多型解析を行った結果、組み換え価は14%ととなり、従来のFsマーカーよりも強く連鎖するマーカーは開発できなかった。
マウス腹膜線維症モデルにおける、合成レチノイドAm80の線維化抑制効果

Kruppel-like factor 5 (KLF5)は細胞増殖や血管新生を調節する転写因子である。合成レチノイン酸αの特異的アゴニストであるAm80はKLF5の発現を抑制する。今回我々はマウス腹膜線維症モデルでのKLF5の発現を調べ、Am80投与による腹膜線維化抑制効果について検討した。chlorhexidinegluconate (CG)の腹腔内投与により腹膜線維症モデルマウスを作成し、CG開始と同時にAm80の経口投与を連日行った。研究の結果、腹膜線維症モデルにおけるKLF5の関与が示唆され、Am80はKLF5の発現抑制を介して腹膜線維化の抑制に有用な可能性が示唆された。本研究は、Kruppel-like zincfinger transcription factor (KLF5)が腹膜線維化の進展に関与し、KLF5の転写活性阻害剤であるAm80投与により、腹膜線維化を抑制し得ることを証明することが目的である。マウスの腹腔内にchlorhexidine gluconate(CG)を投与することにより腹膜線維症を惹起し、Am80経口投与群と非投与群の形態を比較することで、その腹膜線維化抑制効果を検討した。内容は以下の通りである。1モデルの作成:ICRマウスに0.05% chlorhexidine gluconateを0.01ml/g、3週間隔日腹腔内投与(合計9回)した後(22日目)、屠殺し、腹膜組織を採取保存した。2薬剤の投与:Am80 (1mg/kg)を0.5%メチルセルロースに溶解し連日経口投与を行った。Am80非投与群には0.5%メチルセルロースのみを連日傾向投与を行い対照群とした。3腹膜組織におけるKLF5の発現の検討:免疫染色法により腹膜組織切片上でKLF5の発現を検討した。4Am80による腹膜線維化改善効果の検討:Am80の投与により腹膜線維化が軽減されるかを検討するため、Am80投与群と非投与群間で腹膜組織像を比較した。組織免疫染色を行い、Am80投与によるKLF5の発現抑制を確認した。形態学的な変化はHematoxylin & Eosin染色で観察した。腹膜肥厚の程度に関しては、Masson trichrome染色、免疫染色法を用いてIII型コラーゲンやコラーゲン発現に関連したheat shock protein 47の発現を調べた。免疫染色法を用いてTGF-βの発現やα-SMA陽性細胞の検討を行った。5Am80による腹膜機能改善効果の検討:Am80投与により腹膜線維症に伴う腹膜機能低下の抑制がみられるかどうかを検討した。CG投与開始後、3週目に腹膜機能検査を行った。16Gサーフロ針外筒を腹腔内に留置し、腹膜透析液を8ml注入し、1時間後にサーフロ針より回収し、回収液量とグルコース濃度を測定し評価した。正常マウスにも腹膜機能検査を行い比較対照した。平成27年度の計画通り、モデルの作成、薬剤の投与、腹膜組織におけるKLF5の発現の検討、Am80による腹膜線維化改善効果の検討、Am80による腹膜機能改善効果の検討を行った。平成28年度の計画通り、実験結果の解析を行った。【結果】正常マウスの腹膜組織ではKLF5の発現を認めなかった。CG投与群では肥厚した腹膜中皮下組織でKLF5の発現が亢進した。Am80投与により、KLF5の発現が減少し、腹膜肥厚とcollagen IIIの発現が、CG群と比べて有意に抑制された。TGF-β陽性細胞数やα-SMA陽性細胞数、浸潤マクロファージは、CG投与群と比較してAm80投与群で有意に減少した。腹膜平衡試験では、CG投与群で腹膜透過性が亢進し、Am80投与群では腹膜透過性亢進が有意に改善した。【結論】以上より、腹膜線維症モデルにおけるKLF5の関与が示唆された。Am80はKLF5の発現抑制を介して腹膜線維化の抑制に有用な可能性がある。腹膜組織におけるKLF5の発現や腹膜線維化の評価は各種免疫染色を用いてコンピュータ画像解析ソフトを用いて行う。また、面積あたりの各種染色陽性細胞数をカウントし評価する。解析結果の内容を検討し、論文にまとめる。腎臓内科
MFMと電子線ホログラフィーによる磁化分布の3次元精密解析

本研究の目的は、各種先端磁性材料の磁化分布をナノスケールで3次元的に評価できる解析システムを開発し、高密度磁気記録媒体やナノ結晶磁性材料の磁区構造評価に応用することである。具体的には、電子線ホログラフィーと、試料からの漏洩磁場の情報が得られる磁気力顕微鏡法(MFM)を組み合わせた解析システムを構築し、3次元での磁化分布を解析することにある。研究成果としては、まず、電子線ホログラフィーによって得られた磁束分布を示す位相再生像から、磁化分布を求めるコンピュータシミュレーションのソフトウェアーの開発を行った。さらに、MFMを用いて漏洩磁場分布の解析も並行して実施し、磁化分布の高精度での3次元解析を実現した。これにより、磁気記録媒体内の磁化分布がナノスケールで解析できることとなった。また、本研究を展開する中で、MFMのティップを用いた磁場印加実験を発展させ、微細な永久磁石からなる磁性針を作製し、ピエゾ駆動試料ホルダーに装着し、対象とする磁性体に接近させることにより、これまで電子顕微鏡内では実現不可能と考えられてきた1T(テスラ)に近い磁場を局所的に発生させることに成功し、Nd-Fe-β永久磁石の逆磁区発生過程のナノスケールでの観察を可能としている。これらの研究成果は、Phys.Rev.Lett., Appl.Phys.Lett., J.Appl.Phys.など国際誌に掲載し高い評価を得ている。今後、本研究課題で確立した観察手法が、広範な磁性材料の評価に広く応用されてゆくものと期待される。本年度は以下のような研究を実施した。電子線ホログラフィーとMFMの観察を同じ試料の、同じ視野に対して行うため、両装置と集束イオンビーム(FIB)装置のいずれにも装填可能な試料ホルダーを試作した。このホルダーにより、ホログラフィーによる薄膜面内での磁化分布観察、及びMFMによる試料外部の漏洩磁場成分の観察を、注目する微視的領域に対して正確に実施できるようになった。2.磁気記録媒体の薄膜試料作製FIB装置を利用して、磁気記録媒体として広く利用されているCo-CoO斜方蒸着テープの薄膜化を行った。通常、FIB法で薄膜化を行う場合、試料の表面にダメージ層が残留するが、本研究では低加速のアルゴンイオンミリングとの併用によって、このダメージ層を効果的に除去することができた。3.MFMとホログラフィーを用いたCo-CoO斜方蒸着テープの観察500nmの記録波長で書き込んだテープの磁化分布をMFMで観察し、記録パターンの概観を明らかにした。その上で注目する部分のホログラムを得て、テープ内外の磁束分布の観察に着手した。1.ハードディスクに対する観察条件の最適化大容量ハードディスクに対する、集束イオンビーム(FIB)を用いた薄膜作製技術の確立を図った。加工に伴うダメージを抑え、且つホログラフィーの実験を遂行できる100nm前後の膜厚を効率良く作製するために、Gaイオンビームの最適な電流密度や加工時間の決定を行った。本研究で蓄積したデータは、他の記録媒体の加工にも応用でき、汎用性は高い。

2.FIBを利用した微小探針の作製既存のFIB装置のソフトウエアを改良して、金属探針の先端をシャープに加工できる技術を構築した。永久磁石の探針の先端径を50100nmにまで先鋭化できる他、局所領域での導通評価に有用な高耐食性金属探針の微細加工も可能で、記録媒体の多面的計測に対する基盤技術を確立できた。3.ホログラフィーによる針状試料の磁場・電場計測MFMチップやFIB加工済み探針をTEM内に導入し、その磁束分布を精密評価した。特に、MFMチップを磁性体に徐々に近づけてゆく際に、両者間の磁束分布がどのように変化して行くかという基礎的な情報を得ることができた。平成18年度の研究成果を以下に要約する。1.探針の磁束分布の精密評価永久磁石製の微小探針(磁性針)や、汎用のMFMチップなど、TEM内での局所磁場印加に利用できる各種針状試料の磁束分布を高精度に解析した。具体的には、ホログラム撮影条件の改善、位相再生像に関するコンピュータシミュレーションの駆使等により、針状試料先端での磁束分布や磁束密度を詳しく評価できる技術を確立した。また、本年度は、TEM内での針状試料の位置制御についても、一層の技術的向上を果たすことができた。その結果、二本の磁性心を徐々に近づけて行った場合の磁束分布変化の様子を、ホログラフィーで事細かに観察できるようになり、磁気デバイスへの応用展開に向けた技術基盤を整備できたと考えている。2.磁気記録材料の磁化分布解析への応用上述したMFMチップ/磁性針に対する磁束観察技術と、TEM内での精緻な探針操作技術を用いて、新型ハードディスクに用いられる軟磁性下地層の磁束分布を評価した。具体的には、集束イオンビーム(FIB)法により薄膜化したハードディスクに、TEM内でMFMチップを徐々に近づけて行き、その際の磁束分布変化を詳細に観察した。MFMチップの接近に伴い、軟磁性下地層近傍での磁束密度が増大する様子が観察され、下地層の存在が磁気記録に重要な役割を果たすことを直接観察によって示した。3.3次元磁化分布解析法の確立本研究により、電子線ホログラフィーを用いた面内磁束成分の精密解析と、TEM内での磁性針操作による磁化過程の動的観察技術は目的通り達成できた。一方、TEMで観察した試料をMFMにより観察することで、膜面と垂直方向の漏洩磁場を探索し得ることもわかった。一連の実験を総括して、ホログラフィーとMFMの相補的な利用により、磁化分布の3次元的な解析を充分に実施できるものと考えている。
セルフクローニング技術を用いた根粒菌共生遺伝子利用のための基盤的研究

我々は根粒菌のプロテオーム解析、RNAseq解析から共生組織形成、窒素固定活性を制御する根粒菌、マメ科植物遺伝子群を同定し、根粒窒素固定活性を維持する代謝系、更に根粒老化についての機能解析を行ってきた。その結果、根粒菌GS1遺伝子は根粒形成時には影響がないにもかかわらず根粒老化に大きな影響を与える事を示した。またミヤコグサ根粒老化時の遺伝子発現の実態をマイクロアレーによって解析した。希少な植物糖の代謝解析も当研究室では進めている。この共生維持に関与する遺伝子群を発現制御し、根粒菌セルフクローニング技術を開発することによって環境中へ放出するための技術開発を行った。平成25年度においては、交付申請書に記載した「研究の目的」「研究実施計画」のとおり、窒素固定共生菌であるミヤコグサ菌(Mesorhizobium loti)に7つ、ダイズ菌(B. japonicum USDA110)に8つ存在するGS遺伝子について発現解析をおこなった。根粒菌ゲノムに存在するGS I、II、III遺伝子のSTM変異体をミヤコグサ菌、ダイズ菌で入手し、感染処理後レオナルドジャーを用い人工気象室で栽培することによって、種子形成までの生育表現型を調査した。その結果、GSIが根粒特異的に発現増幅する遺伝子であることを明らかにし、更にミヤコグサ菌での詳細な解析により、GSI遺伝子を欠損させると根粒老化が促進され、着生根粒の中での無効根粒の割合が増大し、結果的に窒素固定活性も減少することを明らかにした。この結果はJournal of Plant Physiology誌に発表した。NAD-、NADP-malic enzymeのバクテロイド化に伴う遺伝子発現、M. loti銅メタロシャペロン遺伝子についての、遺伝子発現解析及び根粒活性への影響についての生化学的解析についても解析を継続した。根粒菌ゲノムDNA配列データ及び我々がプロテオーム解析で得た根粒発育時期別遺伝子発現データの結果を利用して、上記遺伝子プロモーター領域を解析し、セルフクローニング手法で組換え体を作成するためのプロトコールを開発する研究もプロトコール開発を継続した。平成26年度においては、交付申請書に記載した「研究の目的」「研究実施計画」に記載したとおり、ミヤコグサ菌、ダイズ菌に存在するGS1遺伝子、及び他の共生特異的遺伝子が、根粒の形態形成、特に根粒形成後期の根粒形態、機能に与える影響を解析した。特に本年度はGS1遺伝子欠損の影響が根粒の老化現象に与える影響を、老化組織が顕著に確認できる以前の現象から遺伝子レベルで解析しようとした。そこでミヤコグサ根粒組織特異的に発現する遺伝子群をRNAseq実験によって大規模に解析し、そこで確認できた遺伝子データを用いて、発現しているすべての遺伝子について、遺伝子特異的塩基配列デザインを作成した。このデータを用いて約20,000遺伝子を貼り付けたオリゴヌクレオチドマイクロアレーを作成し、トランスクリプトーム解析実験を行った。その結果、従来の報告にない、発現レベルの差が少ない遺伝子についても遺伝子発現の差を確認できた。根粒老化に伴って発現が増幅する遺伝子は642個、減少する遺伝子は415個であった。これらの遺伝子発現をクラスター解析し、発現パターンを4つに分けた。これらの遺伝子群の性質を検討したところ、植物防除系遺伝子、代謝系遺伝子、器官形成系遺伝子などがあり、従来報告されている典型的老化関連遺伝子も含まれていた。この結果は、Plant Biotechnology誌に発表した。また関連学会でも発表した。根粒菌の効率的なセルフクローニング技術についてはプロトコールを改良中であり、根粒菌側のGS1やcatalase遺伝子の欠損などが、マイクロアレーで解析した植物側老化関連遺伝子群の、どの遺伝子発現を制御するのかも含めて解析していく予定である。我々は、根粒菌遺伝子欠損が根粒形成、初期根粒活性に影響しないにもかかわらず、根粒老化を強く誘導する遺伝子群があることを明らかにした。特にGS1は生物において炭素代謝・窒素代謝を統合する酵素分子として知られているが、根粒菌内でも根粒活性維持の鍵分子であることが示唆された。根粒菌GS1が何故老化を引き起こすのか、不明であるが我々はGS1遺伝子欠損が根粒内活性酸素濃度を増大させる結果を得ている。共生現象は共生成立機構と主に、その維持機構が今後の研究課題となっており、根粒は着生しても窒素固定を行わないFixマイナス変異体があるように、根粒活性維持は根粒着生と独立の機構を持つ。また着生後窒素固定活性はタンパクあたりでは短時間で減少を始める。植物体が持つ免疫機能、抵抗線反応誘導機能を押さえ、根粒菌が植物体の中で比較的安定的に存在している機構はきわめて興味深く、農業上も重要な現象である。本研究では、根粒老化を誘導する根粒菌GS1遺伝子欠損の影響を根粒菌・植物体マイクロアレー、メタボローム解析を用いて行うが、植物体が根粒を必要としなくなった時点で、どのような分子機構で共生をキャンセルするのか、を根粒菌側から解析する事は独創的な視点である。本研究の特色の二つ目はセルフクローニング技術を根粒菌に適用し、環境放出に備えた技術開発を行うことである。マメ科のモデル生物であるミヤコグサと根粒共生を営むミヤコグサ根粒菌においては、人為的に制御可能なプロモーターや温度感受性のプラスミドベクターは使えず、ゲノムを自由に操作する条件が整っているとは言い難い状態であったが、ミヤコグサ根粒菌のMAFF303099

株に適用可能な2種のツールを確立した。我々は根粒菌のプロテオーム解析、RNAseq解析から共生組織形成、窒素固定活性を制御する根粒菌、マメ科植物遺伝子群を同定し、根粒窒素固定活性を維持する代謝系、更に根粒老化についての機能解析を行ってきた。その結果、根粒菌GS1遺伝子は根粒形成時には影響がないにもかかわらず根粒老化に大きな影響を与える事を示した。またミヤコグサ根粒老化時の遺伝子発現の実態をマイクロアレーによって解析した。希少な植物糖の代謝解析も当研究室では進めている。この共生維持に関与する遺伝子群を発現制御し、根粒菌セルフクローニング技術を開発することによって環境中へ放出するための技術開発を行った。平成25年度においては、交付申請書に記載した「研究の目的」「研究実施計画」に記載したとおり、根粒菌(ミヤコグサ菌、ダイズ菌)に存在するGS1遺伝子、及び他の共生特異的遺伝子が、根粒の形態形成、特に根粒形成後期の根粒形態、機能に与える影響を解析した。平成26年度は根粒菌遺伝子の影響が根粒の老化現象に与える影響を、老化組織が顕著に確認できる以前の現象から遺伝子レベルで解析しようとした。そこでミヤコグサ根粒組織特異的に発現する遺伝子群をRNAseq実験によって大規模に解析し、そこで確認できた遺伝子データを用いて、効率的なマイクロアレー実験に成功した。この結果は新規であり、根粒菌の窒素固定活性維持のための代謝系を明らかにする上で重要な貢献である。研究は順調に進展していると考える。植物栄養学平成25, 26年度の研究においては、根粒形成後期の根粒形態、機能に与えるGS1などの根粒菌側遺伝子の影響を解析するとともに、RNAseq、マイクロアレーの技術を用いて根粒老化に関与すると思われる植物側遺伝子群を網羅的に解析した。平成27年度は作成したマイクロアレーを用いて、GS1根粒菌遺伝子欠損及び大量発現の影響が根粒の老化現象に与える影響を、根粒組織形成初期から遺伝子レベルで解析する。重要と考えられる遺伝子群については、根粒菌をセルフクローニング手法で形質転換し、ミヤコグサ生育時期全般にわたる効果を検討する。平成25年度においては、交付申請書に記載した「研究の目的」「研究実施計画」のとおり、窒素固定共生菌であるミヤコグサ菌(Mesorhizobium loti)のGS遺伝子について発現解析をおこない、根粒菌ゲノムに存在するGS I、II、III遺伝子のうちGSIが根粒特異的に発現増幅する遺伝子であることを明らかにし、更にミヤコグサ菌での詳細な解析により、GSI遺伝子を欠損させると根粒老化が促進され、着生根粒の中での無効根粒の割合が増大し、結果的に窒素固定活性も減少することを明らかにした。この結果はJournal of Plant Physiology誌に発表した。遺伝子発現解析のために各種分子生物学試薬を購入予定であり、それを次年度に延期した。交付申請書に記載した「研究の目的」「研究実施計画」のとおり、おおむね順調に進行している。今後は、実施計画書に記載した方策を実施するとともに、根粒菌遺伝子セルフクローニングに結びつく方向を検討する。根粒菌及び植物側遺伝子発現解析を購入予定の分子生物学試薬を用いて行う。
介護老人保健施設の多職種を対象にした倫理教育プログラムの開発と縦断的評価

平成29年度に実施した看護職の倫理的感受性に関する文献検討の結果を踏まえて、平成30年度より本研究の目的を以下のように修正した。修正後の本研究の目的は、1.介護保険施設で働く看護職の倫理的問題に対する感受性を高め、かつ倫理的問題を解決へと導く倫理教育プログラムを開発すること、2.当該プログラムを実施して、その効果を縦断的に評価すること、である。この目的を達成するために、平成30年度は、介護保険施設の看護職の倫理的問題解決思考尺度の開発を目的とした質問紙調査を計画した。質問紙調査を計画するにあたり、まず尺度の原案となる項目を平成29年度に実施した看護職の倫理的感受性に関する文献検討および介護保険施設の看護職に対するインタビューでの語りから作成した。つぎに尺度の原案となる項目、基本属性等で構成される質問紙を作成し、全国の介護保険施設の看護職を対象とした質問紙調査を行った。なお、質問紙調査は所属機関の研究倫理審査委員会の審査および承認を受けて実施した。質問紙調査では、571名(回収率:25.7%)の看護職からから回答を得られた。そのうち本研究への同意を示す「本研究の主旨を理解し、研究への参加に同意します」にチェックがあった513件(有効回答率:89.8%)を有効回答とした。基本統計量の算出、尺度の原案項目の精選、因子分析、信頼性の検討、妥当性の検討を行い、4因子20項目で構成される介護保険施設の看護職の倫理的問題解決思考尺度を開発した。介護保険施設の看護職を対象とした倫理教育プログラムが作成段階であり、まだ当該教育プログラムを実施できていないため。介護保険施設の看護職を対象とした倫理教育プログラムを研究分担者とともに完成させ、実施する。その際、平成30年度に作成した介護保険施設の看護職の倫理的問題解決思考尺度を倫理教育プログラムの効果を測定するための指標として用いる。本研究の目的は、介護保険施設で働く多職種の道徳的感受性を高め、多職種で倫理的課題に対する最善の選択肢を見出して実行する倫理教育プログラムを開発すること、および当該プログラムを実施して効果を縦断的に評価することである。上記の目標を達成するために、本研究では研究分担者らとともに3段階構成の研究計画を立案した。第1段階では介護保険施設のスタッフを対象にしたインタビューを、第2段階では介護保険施設のスタッフを対象にした質問紙調査を、第3段階では倫理教育プログラムの開発・実施・評価を行う計画である。本研究の研究開始初年度(平成28年度)は、3段階構成の研究計画のうち、第1段階目の介護保険施設の看護職を対象とした「施設において高齢者の尊厳が脅かされていると感じた場面」等に関するインタビューを行う計画を立案した。所属研究機関の研究倫理審査委員会の審査・承認を得て、介護保険施設の看護職を対象としたインタビューを行った。インタビューでは、看護師から他の利用者に暴力をふるう認知症の利用者に対して、落ち着きを取り戻せるように対応するが、それでも暴力が止まらない場合、施設での集団生活を続けるために薬物投与をせざるを得ないこと、その状況に対して当該高齢者の尊厳を傷つけているのではないかと葛藤していること等が語られた。第1段階のインタビューについては次年度も引き続き実施し、インタビューの分析結果から第2段階の質問紙調査の計画立案を行う予定である。第1段階の介護保険施設の看護職を対象にしたインタビューを実施しているが、次年度も引き続きインタビューを行う必要があるため。本研究の目的は、介護保険施設で働く多職種の道徳的感受性を高め、多職種で倫理的問題に対する最善の選択肢を見出して実行する倫理教育プログラムを開発すること、および当該プログラムを実施して、その効果を縦断的に評価することである。平成29年度は、介護保険施設だけではなく、医療施設の看護職も含めた看護職の道徳的感受性について文献検討をした。分析の視点としては、道徳的感受性と倫理的感受性との比較(定義、測定尺度等)、および今後、求められる研究課題について検討した。その結果、介護保険施設の看護職が倫理的問題に対する最善の選択肢を見出して実行するためには、看護職の感受性を高めるだけではなく、倫理的問題の解決にも焦点を当てることが必要と考えるに至った。そこで、本研究の目的を「介護保険施設で働く看護職の倫理的問題に対する感受性を高め、かつ倫理的問題を解決へと導く倫理教育プログラムを開発・実施して、その効果を縦断的に評価する」に修正した。また、平成29年度は、前年度に引き続き本研究の第1段階の研究計画であるインタビュー調査を実施した。具体的には、介護保険施設の看護職を対象に「施設において高齢者の尊厳が脅かされていると感じた場面等の倫理的問題とその対応」についてインタビューを実施し、質的に分析した。インタビューの分析結果は、本研究の第2段階の研究計画である介護保険施設の看護職を対象とした尺度開発の原案項目として用い、平成30年度に質問紙調査を実施する予定である。平成29年度の研究計画では、インタビュー調査の実施と質問紙調査の研究計画の立案・実施の予定であったが、インタビュー調査は終了したものの、質問紙調査は研究計画の立案にとどまり、調査がまだ実施できていないため。

この目的を達成するために、平成30年度は、介護保険施設の看護職の倫理的問題解決思考尺度の開発を目的とした質問紙調査を計画した。質問紙調査を計画するにあたり、まず尺度の原案となる項目を平成29年度に実施した看護職の倫理的感受性に関する文献検討および介護保険施設の看護職に対するインタビューでの語りから作成した。つぎに尺度の原案となる項目、基本属性等で構成される質問紙を作成し、全国の介護保険施設の看護職を対象とした質問紙調査を行った。なお、質問紙調査は所属機関の研究倫理審査委員会の審査および承認を受けて実施した。質問紙調査では、571名(回収率:25.7%)の看護職からから回答を得られた。そのうち本研究への同意を示す「本研究の主旨を理解し、研究への参加に同意します」にチェックがあった513件(有効回答率:89.8%)を有効回答とした。基本統計量の算出、尺度の原案項目の精選、因子分析、信頼性の検討、妥当性の検討を行い、4因子20項目で構成される介護保険施設の看護職の倫理的問題解決思考尺度を開発した。介護保険施設の看護職を対象とした倫理教育プログラムが作成段階であり、まだ当該教育プログラムを実施できていないため。第1段階のインタビューについては次年度も引き続き実施し、インタビューの分析結果から第2段階の質問紙調査の計画立案を行う予定である。平成30年度に本研究課題の第2段階の研究計画である介護保険施設の看護職を対象とした質問紙調査を行う予定で、現在、研究分担者と共に尺度の原案項目を作成している。今後、所属機関の研究倫理審査委員会による審査を受け、プレテストおよび本調査を実施する予定である。介護保険施設の看護職を対象とした倫理教育プログラムを研究分担者とともに完成させ、実施する。その際、平成30年度に作成した介護保険施設の看護職の倫理的問題解決思考尺度を倫理教育プログラムの効果を測定するための指標として用いる。第1段階のインタビューの実施が予定人数を終了していないため。平成29年度に実施予定の質問紙調査を実施していないため、平成30年に質問紙調査を実施する予定である。介護保険施設の看護職を対象とした倫理教育プログラムを令和元年に実施する計画に修正したため。第1段階のインタビューを継続的に実施するために、インタビュー実施に伴う交通費、インタビューデータのテープ起こし費用として使用する計画である。