hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ヒト細胞の老化機構の解析-特に寿命関連遺伝子の他段階変異について-

ヒト不死化細胞のテロメア伸長機構に関わる制御遺伝子を検索する目的で、自然不死化、化学がん原物質による処理、放射線照射、がん遺伝子の移入等で不死化したヒト細胞株を対象に、すべての常染色体とX染色体についてヘテロ接合性の消長(LOH)解析を行った。1)テロメラーゼ活性陰性の不死化細胞、13株では、8番染色体の50領域中19領域(38.0%)でLOHが認められた。テロメラーゼ活性陽性の不死化細胞、9株では32領域中LOHは認められなかった。この8番染色体上のLOHの有無と代替テロメア伸長(Alternative Lengthening of Telomere : ALT)機構との間には関連が認められた。2)Li-Fraumeni患者(MDAH087)由来の不死化細胞、5株では、6番染色体の40領域中15領域(37.5%)、17番染色体の7領域中5領域(70.4%)でLOHが認められた。これら染色体上のLOHの有無とALT機構との間には関連が認められたが、この現象はこの不死化細胞にのみ特異的であった。3)ヒト歯肉(HGF/KK)由来の不死化細胞、4株では、7番および18番染色体に、またMDAH087由来の不死化細胞、5株では、9番染色体にそれぞれ共通のLOHを認めたが、テロメラーゼ活性の有無との関連は認められなかった。これらのことから、ALT機構を制御する遺伝子[ALT repressor(s)(ALTR)]が8番染色体上に存在し、これらの欠失あるいは機能消失がALT機構の制御に関与している新たな可能性が示された。老化関連遺伝子を不活性化すると,細胞に寿命の延長や不死化が誘導されるかどうかを調べた。ヒト胎児由来線維芽細胞(WHE-7細胞)にヒトパピローマウィルス(HPV)16型のE6,E7,E6/E7遺伝子を単独あるいは併用導入して,老化関連遺伝子のp53とRb遺伝子機能をノックアウトした。遺伝子導入後クロー二ングを行い,得られたクローンの分裂寿命を調べた。その結果,1)HPVがん遺伝子を含まないベクターのみを導入したWHE-7 neo細胞では,得られた4クローンすべてが33-43PDで寿命を迎えた。なお,対照群のWHE-7細胞は70PDで寿命となった。2)E6遺伝子を導入したWHE-7 E6細胞では,得られた7クローン中4クローンは55-63PDで寿命を迎えたが,残りの3クローンは70PDを超え,寿命の延長が認められたもののそのうち2クローンは,最終的には72PDと78PDで寿命を迎えた。残りの1クローンは100PDを超えた現在も増殖中である。3)E7遺伝子を導入したWHE-7 E7細胞では,得られた4クローンすべてが150PDを超え,不死化した。これらのクローンは現在も増殖中である。4)E6とE7の両遺伝子を導入したWHE-7 E6/E7細胞では,得られた5クローン中2クローンに寿命の延長が認められたものの最終的には106PDと123PDで寿命を迎えた。しかし,残りの3クローンはいずれも220PDを超え,不死化した。5)導入したがん遺伝子が細胞DNAに組み込まれているかどうかをPCR法で調べたところ,WHE-7 E6細胞の7クローン中3クローンで,E6遺伝子が検出されなかったが,他のすべてのクローンで導入遺伝子の存在が認められた。6)E6,E7遺伝子の導入によって寿命の延長した細胞や不死化した細胞では,G_2/M監視機構は正常であったが,G_0/G_1監視機構の崩壊が認められた。

7)ウエスタンブロッティング法によるRbタンパクの検出により,E7遺伝子を導入したWHE-7 E7細胞や,E6/E7遺伝子を導入したWHE-7 E6/E7細胞ではRbタンパクの高リン酸化が認められた。HPV16型E6、7EおよびE6/E7遺伝子の移入によって不死化したヒト線維芽細胞の不死化過程におけるテロメ7長とテロメラーゼ活性について研究した。その結果、1) E6遺伝子の単独移入により不死化した1クローンでは,テロメラーゼ活性はPD83以後陽性になった。テロメ7長はPD88まで漸次減少したが、テロメラーゼ活性陽性後,約3Kbで維持された。2) E7遺伝子の単独移入により不死化した4クローンでは、テロメラーゼ活性はいずれもPDが250を超えても陰性であった。テロメア長は1クローンではPD56以後、約5Kbで維持されたが、残り3クローンではそれぞれPD88、92、162以後、1217Kbで維持された。3) E6/E7遺伝子の移入により不死化した3クローンのうち2クローンでは、テロメラーゼ活性はそれぞれPD85と133以後陽性になった。これらのクローンのテロメラーゼ活性陽性前のテロメア長はPDの増加に伴い減少したが、陽性後は約3Kbで維持された。他の1クローンのテロメラーゼ活性はPDが300を超えても陰性であった。このクローンのテロメア長はPDが135までは減少したが、それ以後、約10Kbで維持された。4)テロメラーゼ構成遺伝子のhTERCとhTEP1の発現はすべての不死化クローンで認められたが、hTERTの発現はテロメラーゼ活性陰性クローンでは認められず、E6遺伝子単独移入で不死化した1クローンを除いたすべてのテロメラーゼ活性陽性クローンで認められた。5) p53遺伝子(エクソン58)の突然変異はE7遺伝子単独移入で不死化した1クローンでは認められたが、他の不死化クローンでは認められなかった。6)すべての不死化クローンに染色体不安定性やミニサテライト不安定性が認められたが、マイクロサテライト不安定性は認められなかった。これらのことから、テロメラーゼ活性陽性のクローンでは短いテロメア長(約3Kb)が、陰性の不死化クローンでは1クローンを除いてすべて長いテロメア長(1017Kb)が維持され、両者間でテロメア長の制御機構が異なることがわかった。また、すべての不死化クローンに染色体不安定性やミニサテライト不安定性が認められたことから、不死化細胞のテロメア維持機構にゲノム不安定性が関与していることが示された。ヒト不死化細胞5株のテロメア長とゲノム不安定性を調べた。いずれの細胞株ともテロメラーゼ活性は陰性であった。各細胞株から得られた各5クローンとも、全てテロメラーゼ活性は陰性であった。テロメラーゼの構成遺伝子であるhTEP1とhTERCはすべての細胞株で発現していたが、hTERTはすべて陰性であった。5細胞株のテロメア長は各細胞株でそれぞれ異なっていた。テロメア長は各細胞株から得られた各5クローン、各クローンから得られた各5サブクローンのいずれにおいても異なっていた。各細胞株、そのクローン、その再クローンのいずれにも高頻度に染色体異常が認められ、切断やdouble minute染色体、二動原体染色体がその主な異常であった。テロメア長や染色体異常解析を行ったクローンや再クローンのクローニング後の細胞集団倍加数は22から24であった。
時際法(intertemporal law)と国際立憲主義

国際立憲主義の新たな地平を開拓すべく、国際法における「時間」の意味を洗い直すための研究を行った。その手始めとして、これまでの国際法史の研究を体系的に研究し直し、それら先行研究において「正義」の要素が十分に取り込まれていないとの認識が得られた。それはまた、国際立憲主義においても欠落している要素であり、「時間」の意味と「正義」の要素とを結節させることにより、国際法史研究と国際立憲主義とを有機的に関連づけられることが確認された。資料文献研究が中心となったが、とくに平成28年後半からは、ハイデルベルクのマックス・プランク研究所に2度滞在し、有意義な共同研究を実施できた。研究は順調に開始された。初年度であり、文献および資料の収集ならびに読解・分析、さらに国内外の研究者との学術交流が中心に行われたが、前回科研費(課題「国際法の哲学的基盤」)との接続も円滑で、すでに研究の最大の眼目も見え始めている。すなわち、国際法の発展における「時間」の問題であり、それが国際法の歴史にどのような影響を及ぼしているか、過去の奴隷貿易や植民地支配に対する補償の問題が澎湃として起きつつあるのは国際法の史的構造のいかなる特性によるものなのか、等々である。いわゆるGlobal History研究の潮流が社会科学各分野で推力を得つつあるが、本研究もそれとの結節点を持って進めることになると思われる。その際、前回科研費研究においても根幹となった国際立憲主義が、今回研究においても理論的な基盤となり大きな示唆を提供することになる。これは単に理論的基盤を反復して使用しているのではなく、国際立憲主義自体がまだ内容的に不確定な部分を持ち、部分的にはすでに批判の対象にもなりつつある(発表項目2に記載した、最上「国際立憲主義の普遍化可能性について」など)ことを踏まえている。国際立憲主義の全貌解明のためにはまた、国際立憲主義と集団安全保障の関係、国際立憲主義とマルティラテラリズムとの関係など、これまで結びつけられなかった領域に拡張して論ずることになる。これらのすべてが時際法への問題意識に端を発したものであり、着眼は有効であったとの確信を深めている。(なお、以下に記載する研究成果の一部は、平成2326年度科研費「国際法の哲学的基盤」の平成26年度への繰り越し分業績として記載したものと重複している。テーマに連続性があるためである。)研究は着実に進行している。現在進行形のプラクティスとして大きな研究素材になりうべき、カリブ共同体(CARICOM)によるヨーロッパ諸国への奴隷貿易賠償請求がなかなか進展しないため、その部分は現実の展開待ちとなっているが、国際法史の原論的な部分では各種研究書の体系的な読破を重ね、その面では収穫の多い一年となった。すぐには成果の現れない作業工程であり、したがって当該年度は著作を数多くまとめることができずに終わったが、こうした蓄積がじきに大きな成果を生むことを確信している。秋に事故で負傷したため、一時期は出張等の活動を大きく制約されたが、平成27年5月にはフランス・ストラスブールにおいて開催された「各国国際法学会代表者会議」(フランス国際法学会主催)にアジア国際法学会を代表して出席し、各国の代表的研究者と意見交換することができた。またその機会を利用してヨーロッパ人権裁判所判事に面談を申し入れ、同裁判所の最近の動向を聞き取るほか、今後の研究協力を協議した。なおその際、引き続き開かれたフランス国際法学会年次研究大会にも出席を招待され、現地研究者と交流を深めることができた。前年度(平成27年2月)にベルギー・ルーヴァンで開催された国際ワークショップも、その共同研究の成果が英国から出版されることが決まり、平成27年中はそのメンバーと意見交換しながら作業を深化させ、平成28年中には刊行を予定している(それまで再度会合することもありうる)。理論的には報告者のテーマに最も関係の深い共同研究であり、作夏以降、この作業に最も大きな力を注いできた。秋の事故による負傷のために研究活動、特に海外研究者との交流がさまざまに制約されたが、理論構築に関しては構想がかなり進んだ。国際法における時間の問題を考えるということは、国際法史を組み立て直すことであり、ひいては国際法学の欧米中心的なパラダイムを変えて行くことにつながる。その構想を熟成させる作業は、事故にもかかわらず非常に順調に進めている。自己評価を「おおむね順調」としたのは、昨年同様、こうして基礎理論構築とパラダイムシフトの理論的作業に没頭したため、著作の発表には容易に結びついていないことによる。だがこれはこの最終年度の課題であり、これまでの蓄積を一気に結実させる態勢は整っている。最終年度は大学の特別研究期間に重なり、用意の整った平成28年12月からハイデルベルク(ドイツ)のマックス・プランク研究所に客員研究員として断続的に滞在し、そこで十分に研究に従事できた。とくに同研究所所長のアンネ・ペータース教授は国際立憲主義研究の国際的権威であり、同教授との共同研究・意見交換は大いに裨益するものがあった。また、バーゼル(スイス)のヨーロッパ研究所とも交流を開始し、国際機構史の共同研究開始の土台を構築できた。自身の業績としては、6月にハノイ(ヴェトナム)におけるアジア国際法学会でセッションのモデレータを務め、また日本平和学会において特別講演を行った。その間、概説書である「国際機構論講義」を執筆し、12月に上梓した(岩波書店刊)。

同書は概説書ではあるものの、国際立憲主義を土台に据えて議論の体系を再構築したものであり、これまでの研究の成果を反映したものと言える。とりわけ、国際立憲主義に照らした場合、現在の国連体制はどう評価できるか、国連中心的な研究態勢に問題はないかなど、根本的な洗い直しにつながった。同時に28年より引き続き、ケンブリッジ大学出版会からの共著(分担執筆)およびオクスフォード大学からの共著(分担執筆)のための論文も執筆を続けている。いずれも29年度中に刊行予定だが、前者の論文はとくに時際法と国際立憲主義というテーマを正面から論ずるもので、科研費による研究支援の直截的な成果と言うべきものである。国際立憲主義の新たな地平を開拓すべく、国際法における「時間」の意味を洗い直すための研究を行った。その手始めとして、これまでの国際法史の研究を体系的に研究し直し、それら先行研究において「正義」の要素が十分に取り込まれていないとの認識が得られた。それはまた、国際立憲主義においても欠落している要素であり、「時間」の意味と「正義」の要素とを結節させることにより、国際法史研究と国際立憲主義とを有機的に関連づけられることが確認された。資料文献研究が中心となったが、とくに平成28年後半からは、ハイデルベルクのマックス・プランク研究所に2度滞在し、有意義な共同研究を実施できた。研究実績の概要に記載のとおり、予定どおりの進捗をしている。とりわけ、物理的な作業だけにとどまらず、研究の新展開のための理論的契機を把握できたことの意味が大きい。さらに、科研費ゆえに海外出張が容易になった分、海外の研究者との研究交流も恒常的に行われるようになり、その面での恩恵は非常に大きい。その恩恵を最大限に活用している。自己評価を「おおむね順調」としたのは、過去1年、基礎研究に没頭して論文執筆の機会があまりなく、成果発表が十分ではないと自戒するためである。ただ、理論的に全く新しいところに取り組む研究であるので、一定の時間の後にまとめて成果を出す予定であるとご理解いただきたい。平成28年度は勤務先大学から特別研究期間を与えられているため、折々の海外滞在を含め、存分に研究に打ち込むことができる。とりわけ、ドイツのマックス・プランク研究所からはすでに客員研究員としての滞在が許可されており、かねてから研究上の最も強力な協力者であるアンネ・ペータース同研究所所長と共同研究の機会を多く持つことになる。テーマはいうまでもなく、国際法史研究と国際立憲主義の結節点を見出し、それによってこれまでの国際法学が見落としてきた理論的転換の契機を探ることである。この両者の結びつけは報告者のオリジナルであるが、ヨーロッパでは次第に同じ側面に着目する研究者が現れつつあり、今後の進展の推力になると思われる。国際法、国際機構論研究実績の概要にも記載したとおり、本研究は国際法史の根本問題にわたるものとなりつつある。国際法の、いわば「正史」として語られてきた先行研究をそのままなぞるのではなく、それが見落としてきたものが何であるか、とくに見落としてきた「事実」が何であるか以上に、掘り起こさずにきた「視座」が何であるかの解明に力点を置く。それにより国際法および国際法学が抱えてきた問題が全く新しい視角から明らかにされる可能性があり、それを懸命に追求したい。
培養血管内皮細胞膜辺縁部の波動様運動の観察-ビデオ強化型顕微鏡によるアプローチ

ビデオ強化型顕微鏡により培養血管内皮細胞膜辺縁部にみられた波動様運動"ruffling"について報告する。培養細胞は、ラットの脳血管内皮細胞(RBEC)およびヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)を用いた。内皮細胞をカバーグラス上に培養し、スライドグラス正方形窓の後部よりカバーグラスを内皮細胞が底になるように貼りつけ、DMEM(Dulbecco's modified Eagle's media)にて持続灌流した。超微細構造の連続観察には、微分干渉顕微鏡およびCCDカメラ-画像解析装置-ビデオシステムからなるビデオ強化型顕微鏡を用いた。50%希釈DMEMまたは蒸留水の低張液を灌流、また多核白血球はヒト静脈血より分画採取し、そのサスペンジョンを灌流することにより白血球-内皮細胞の相互作用を起こさせ、その際の変化を超微細観察した。また窒素飽和液灌流により、細胞を低酸素状態下におき観察した。内皮細胞の変化をビデオに録画し、play-backしつつ画像解析装置(Excel、日本アビオニクス)により解析した。内皮細胞は培養2-5日後にカバーグラス上に平坦に密着し、約1週間で敷石状に配列した。波動様運動"ruffling"は、HUVECあるいはRBECともに、低張液の灌流初期あるいは多核白血球の接着初期において多発した。また、ときにコントロール時にも観察された。それは細胞膜辺縁部のうねりを伴う波動様運動であり、捲れ上がった先端部が細胞膜の他の部位に融合するような現象も認められた。細胞膜の捲れたロールの直径は0.4-0.8μm、その全長は5-15μmであった。低酸素状態としたHUVECでは、細胞間が緩徐に解離し、いわゆるdiaphragmed fenestraeに移行した。培養血管内皮細胞の膜辺縁部波動様運動"ruffling"は細胞間結合部解離過程の一部分現象で、血液から組織への物質移動調節に関連するものと思われた。
地震性断層運動による摩擦熱パルス検出の試み

断層沿いの摩擦加熱は断層の性質に大きな影響を与えることが,研究代表者らの過去10年間の研究で明らかになった.摩擦加熱は断層が高速で動くほど重要になるから,大地震の発生直前から発生に至る過程を考える上で極めて重要である.一方,天然の断層では,シュードタキライトが産出することによって,時には岩石が熔融するほど著しい摩擦加熱が起こることがわかるが,大部分の断層ではどの程度摩擦加熱があったかを判断する方法がない.本研究の目的は,熱に敏感な熱ルミネッセンス法・ESR法・FT法を用いて,地震時に断層が高速で動く時に発生したパルス的摩擦発熱量を定量的に推定する方法を開発することである.主な研究成果と今後の見通しは以下の通りである.1.断層破砕帯のESR信号変化と摩擦加熱回転式高速摩擦試験機の試料ホールダを工夫して,断層ガウジを用いて高速摩擦実験(最大変位速度=1.6m/s)をすることが可能になった.その結果,断層ガウジのESR信号は,変位速度が大きいほど,また総変位が大きいほど顕著に減少しており,概算では250-500°Cの加熱が起きていた可能性があることが示された.ESRは,現状では断層帯内部の発熱を検出する方法として最も有望である.2.摩擦加熱と熱ルミネッセンス(TL)温度上昇値はまだ見積もることはできていないが,断層の高速摩擦にともなって,TL信号強度も顕著に減少することが実験的に確認された.TLによっても温度上昇が決定できる可能性がある.3.摩擦加熱とジルコンのフィッショントラック(FT)長の変化野島断層沿いに産するシュードタキライトとすぐ横の断層ガウジの間で,大きなFT長の違いが確認された.著しい摩擦加熱はFT長を用いても検出できる可能性がある.断層沿いの摩擦加熱は断層そのものの性質に大きな影響を与えること,摩擦加熱の影響は大地震の発生過程を考える上で極めて重要であることなどが,研究代表者らの過去10年間の研究で明らかになった.一方,天然の断層では,岩石が熔融するほど著しい摩擦過熱が認められる場合もあるが,大部分の断層ではどの程度摩擦加熱があったかを判断する方法がない.本研究の目的は,熱に敏感な熱ルミネッセンス法・ESR法・FT法を用いて,地震時に断層が高速で動く時に発生したパルス的摩擦発熱量を定量的に推定する方法を開発することである.初年度の成果と課題は以下の通りである.1.断層破砕帯の形成過程の実験的研究回転式高速摩擦試験機を調整して,高速摩擦条件下で断層破砕帯が形成する過程を実験的に調べ,破砕帯の形成過程が新しい磨耗則で記述できること,磨耗則が摩擦加熱の度合いによって大きく変わることを明らかにした.この結果は,破砕帯の形成過程と内部の変形状態を知る上で重要である.2.剪断変形が石英の熱ルミネッセンス(TL)に与える影響の解析二軸摩擦試験機を用いて断層沿いの低速剪断変形が石英ガウジの熱ルミネッセンスに与える影響について調べた.その結果,顕著な摩擦発熱が起こらない場合でも,TL信号強度は変形とともに一旦増加して減少に転じること,この変化は破砕物の粒径に依存することが判明した.この結果は今まで知られていなかったことであり,今後は,熱過程に加えて,破壊過程の影響をも考慮する必要がある.3.次年度の課題TLとESRの測定を高速で変形させた試料を用いておこなうこと,測定結果を天然の断層破砕物の測定結果と対比して,熱パルス検出の方法を開発することが次年度(最終年度)の課題である.断層沿いの摩擦加熱は断層の性質に大きな影響を与えることが,研究代表者らの過去10年間の研究で明らかになった.摩擦加熱は断層が高速で動くほど重要になるから,大地震の発生直前から発生に至る過程を考える上で極めて重要である.一方,天然の断層では,シュードタキライトが産出することによって,時には岩石が熔融するほど著しい摩擦加熱が起こることがわかるが,大部分の断層ではどの程度摩擦加熱があったかを判断する方法がない.本研究の目的は,熱に敏感な熱ルミネッセンス法・ESR法・FT法を用いて,地震時に断層が高速で動く時に発生したパルス的摩擦発熱量を定量的に推定する方法を開発することである.主な研究成果と今後の見通しは以下の通りである.1.断層破砕帯のESR信号変化と摩擦加熱回転式高速摩擦試験機の試料ホールダを工夫して,断層ガウジを用いて高速摩擦実験(最大変位速度=1.6m/s)をすることが可能になった.その結果,断層ガウジのESR信号は,変位速度が大きいほど,また総変位が大きいほど顕著に減少しており,概算では250-500°Cの加熱が起きていた可能性があることが示された.ESRは,現状では断層帯内部の発熱を検出する方法として最も有望である.2.摩擦加熱と熱ルミネッセンス(TL)温度上昇値はまだ見積もることはできていないが,断層の高速摩擦にともなって,TL信号強度も顕著に減少することが実験的に確認された.TLによっても温度上昇が決定できる可能性がある.3.摩擦加熱とジルコンのフィッショントラック(FT)長の変化野島断層沿いに産するシュードタキライトとすぐ横の断層ガウジの間で,大きなFT長の違いが確認された.著しい摩擦加熱はFT長を用いても検出できる可能性がある.
シロイヌナズナ根端分裂組織における幹細胞維持機能の解析

維管束植物の根は、放射状に一定の組織パターンをもっており、幹細胞が存在する根端分裂組織(Root Meristem:RM)において、この放射パターンは形成される。この放射パターン形成の分子基盤は、これまでにほとんど明らかになっていない。本研究では、維管束植物のモデル生物であるシロイヌナズナを用いて、その分子基盤を明らかにすることを目的とした。本年度、本研究において、この正確な放射パターン形成に低分子RNAの一種であるMicroRNA(miRNA)による遺伝子発現制御の鍵制御因子であるARGONAUTE1(AGO1)遺伝子の機能が必須であることを明らかにした。agol変異体を用いた網羅的発現解析の結果から、miRNAの制御下にあり、実際に根の放射パターンに機能する遺伝子として、miR165/166ファミリーによって制御を受けるHD-zip型転写因子であるPHABULOSA(PHB)を同定した。PHB遺伝子は、miR165/166機能によって、その発現領域が根の中心部に存在する維管束組織に限定化され、またこの時、miR165をコードする遺伝子の一つであるMIR165A遺伝子は、PHB遺伝子の発現する維管束組織の外層に存在する内皮細胞層において発現していることを示した。さらに、MIR165Aの上流因子として、これまでに内皮形成に機能すると報告されていたSCR遺伝子が機能している事も同時に明らかにした。これら結果からと過去の内皮形成におけるGRAS型転写因子SHR/SCRの知見を合わせることで、低分子RNAとタンパク質の細胞間移行が介する組織間相互作用が、維管束植物における放射パターン形成における分子基盤の一旦を担っているという新規なモデルを示すことができた。高等植物の地下部組織である根は、すべて根端分裂組織に由来する細胞によって形成される。根端分裂組織内の幹細胞は、静止中心(Quiescent Center: QC)とよばれる分裂活性の低い細胞群に接して存在し、QCより基部側組織(中心柱、基本組織(皮層/内皮)、表皮)に細胞を供給する。本研究課題においては、シロイヌナズナの根端分裂組織における幹細胞の形成や維持に機能する因子を同定する事を目的とする。(1)根端部の横断面の細胞パターンの異常を指標に変異体スクリーニング根端部の横断面の細胞パターンの異常を指標に変異体スクリーニングを行った。通常、横断面細胞パターンは、中心柱組織が根の中心部に存在し、その周囲に基本組織と表皮が放射状に存在し、それら組織内では細胞が正確に同心円状に配置されている。スクリーニングの結果、細胞が同心円状に配置しない変異体(5gf32変異体)を単離し、その原因遺伝子がARGONAUTE1(ago1)であることを同定した。まず、既存の放射パターン形成変異体とのago1変異体の遺伝学的な関係を明らかにした。SCR遺伝子は内皮細胞形成に機能する。scr機能欠損型変異体では、野生型において皮層・内皮の2層からなる基本組織が、1層の細胞層となる。ago1機能欠損変異体は、内皮細胞層は形成しているが、同心円状に細胞が配置しない異常を示す。scr ago1二重変異体を作成したところ、基本組織様の細胞形態をもつ細胞層が観察されなくなった。つまり、SCR遺伝子とAGO1遺伝子は、根の幹細胞領域における放射パターン形成において、基本組織の形成を正に制御する鍵となる因子であると考えられる。本研究の結果から、シロイヌナズナの根端分裂組織における幹細胞の正常配置のための分子基盤の一端を明らかに出来ると考えている。
幼児の生活、親の育児変容の日韓比較と幼児教育・子育て支援施策への活用

韓国の幼児を持つ親約500名を対象に、24年前に研究代表者が行った調査同一の設問を用いたアンケート調査を実施して24年前のデータおよび調査前年度に行った日本の変容との比較検討を行った。主な調査内容は,幼児の生活については,起床と就寝の時間及び方法,登園・降園時間,降園後及び休日の生活・遊びの様子,親子のかかわりであり,育児観・育児行動については,幼児への期待・幼児のしつけ方,育児の心配事,心配事の相談相手,少子高齢化への思い,幼児に関する社会問題についての意識である。次のような結果が見いだされた。子どものことに関する用務の遂行は依然として母親が行っていること、起床・就寝時間に改善が見られること、子どものことを親がやってしまう傾向が高まったこと、母親との触れ合いの時間は増加したが父親との触れ合いは2極化していること、希望する子どもの数は減少する一方子どもに過剰な期待をかけなくなったこと、子どもを甘やかす傾向が強くなったこと、子どもに対する心配は減少する一方で母親の就労に起因する悩みが増加し、誰かに相談する機会が少なくなったこと。これらはいずれも子どもの健やかな成長のために、また子育てしやすい環境づくりのために取り組むべき課題を含んでいる。なぜこのような変容が生じるのか、どのように課題の解決を図るのかについて次年度の調査で検討していきたい。今回見いだされた特徴や変容の多くは日本の特徴や変容と類似しており、今後は日本と韓国が共同で問題解決に取り組むことが効果的であると考えられることから、韓国の研究者との共同研究体制を構築する。2018年度は、日本及び韓国の幼児の生活と親の育児観の変容比較を行い、そこから両国の変容をもたらす要因分析のための調査内容を作成する予定であったが、ほぼ予定通り進行した。ある程度の予備調査を行うことができればより望ましかったがそれは次年度に持ち越した。日本と韓国の幼児の生活と親の育児観の変容のうち2018年度で明らかにされた変容、すなわち子どものことに関する用務の遂行は依然として母親が行っていること、起床・就寝時間に改善が見られること、子どものことを親がやってしまう傾向が高まったこと、母親との触れ合いの時間は増加したが父親との触れ合いは2極化していること、希望する子どもの数は減少する一方子どもに過剰な期待をかけなくなったこと、子どもを甘やかす傾向が強くなったこと、子どもに対する心配は減少する一方で母親の就労に起因する悩みが増加し、誰かに相談する機会が少なくなったことの背景(変容をもたらした要因)を明らかにする調査を日本と韓国で行う。交付決定後の2017年6月、研究分担者4名(九州女子短期大学・矢野洋子、安東綾子、田中ミサおよび鹿児島大学・金絹鏡)と九州女子短期大学において研究の打ち合わせを行い、韓国で実施する「幼児の生活と保護者の育児観・育児行動の実態調査」について、質問項目および調査方法を決定した。調査内容は、25年前に研究代表者らがおこなっている日本と韓国での調査に準じ、幼児の日常生活(起床と就寝、園生活、遊びの内容、親子の接触時間と内容)、育児観と育児行動(理想とする子供の数、子どもに希望する職業、しつけの方針、子どもに対する不安、育児の困難点、育児の相談相手、少子化の中で気をつけていること、理想とする老後の生活)とした。作成した日本語版調査用紙を研究分担者の鹿児島大学金教授が韓国語に翻訳し、韓国において海外研究協力者の韓国・モックォン大学姜教授と最終確認・修正を行い韓国での調査人数(500名程度)、調査地域(韓国ソウル市、プサン市、テグ市、京畿道、慶尚南道、全羅南道等)について決定した。2018年2月から3月にかけて調査を実施し、520人分の回答を得て現在集計分析中である。集計の結果をすでに行っている日本での調査、25年前に日本と韓国で行った調査と比較し、両国の特徴と変化の実態を明らかにして、日本保育学会で発表する予定である。また、調査と並行して、韓国において、調査結果を分析する手掛かりとなる韓国幼稚園の国家基準としての「ヌリ課程」の関連資料を収集した。平成29年度は、韓国の海外研究協力者とともに「幼児の生活と保護者の育児観・育児行動の実態調査」についてのアンケート用紙を作成し韓国において実施するとともに、収集したデータを集計・分析し25年前の同一の質問を用いた調査と比較することによって、変化を明らかにし、変化をもたらした原因を明らかにする平成30年度に予定している調査の基礎資料を得る事であった。調査は予定通り終了し、結果の分析も間もなく終わることからほぼ順調に進展している。

子どものことに関する用務の遂行は依然として母親が行っていること、起床・就寝時間に改善が見られること、子どものことを親がやってしまう傾向が高まったこと、母親との触れ合いの時間は増加したが父親との触れ合いは2極化していること、希望する子どもの数は減少する一方子どもに過剰な期待をかけなくなったこと、子どもを甘やかす傾向が強くなったこと、子どもに対する心配は減少する一方で母親の就労に起因する悩みが増加し、誰かに相談する機会が少なくなったこと。これらはいずれも子どもの健やかな成長のために、また子育てしやすい環境づくりのために取り組むべき課題を含んでいる。なぜこのような変容が生じるのか、どのように課題の解決を図るのかについて次年度の調査で検討していきたい。今回見いだされた特徴や変容の多くは日本の特徴や変容と類似しており、今後は日本と韓国が共同で問題解決に取り組むことが効果的であると考えられることから、韓国の研究者との共同研究体制を構築する。2018年度は、日本及び韓国の幼児の生活と親の育児観の変容比較を行い、そこから両国の変容をもたらす要因分析のための調査内容を作成する予定であったが、ほぼ予定通り進行した。ある程度の予備調査を行うことができればより望ましかったがそれは次年度に持ち越した。日本と韓国のの幼児の生活と保護者の育児観、育児行動の変容をもたらす原因調査を行う。すでに明らかにされた日本の変容(幼児が家庭で過ごす時間や睡眠時間、父親・母親と幼児がかかわる時間の両極化、かたづけなどの自立的行動の低下、遊びの室内化、遊びの内容の変化、子どもの進学や子どもへの期待感の低下、育児の心配事の減少、発達障害であること、その可能性への不安の増加、育児相談の場所として幼稚園・保育所が大きく減少)について、変容の詳細な実態と変容をもたらした原因を調査する。たとえば、親子が接触する時間の減少については、帰宅時間、帰宅までの生活様態、家庭での生活様態(平日・休日)、接触意欲、接触内容、接触状態に対する意識など)と今回調査した韓国の変容をもたらす要因について調査する。・調査地域日本:東京大阪福岡高知鹿児島の幼稚園・保育所韓国:ソウル市、プサン市、テグ市、京畿道、慶尚南道、全羅南道・調査対象幼稚園、保育所に在籍する3歳から6歳までの幼児を持つ保護者日本と韓国の幼児の生活と親の育児観の変容のうち2018年度で明らかにされた変容、すなわち子どものことに関する用務の遂行は依然として母親が行っていること、起床・就寝時間に改善が見られること、子どものことを親がやってしまう傾向が高まったこと、母親との触れ合いの時間は増加したが父親との触れ合いは2極化していること、希望する子どもの数は減少する一方子どもに過剰な期待をかけなくなったこと、子どもを甘やかす傾向が強くなったこと、子どもに対する心配は減少する一方で母親の就労に起因する悩みが増加し、誰かに相談する機会が少なくなったことの背景(変容をもたらした要因)を明らかにする調査を日本と韓国で行う。収集したデータの集計人件費が次年度扱いになったこと、韓国語への翻訳を研究分担者が行い、不要であったことによる。データの集計は現在進行中であり、そのための人件費を繰越金の中から使用する。韓国出張に予定していた費用のうち2名が出張できなくなったため。日本から韓国の主張及び韓国から日本への出張を増やし、より緻密な研究を行う
化合物半導体薄膜結晶のヘテロ成長における結晶性の制御

MOCVD法の場合には原料が成長界面まで化合物として輸送され、堆積反応は基板面方位の影響を受ける。TMG、TMA、AsH_3各流量及び成長温度を変化させてGaAs(111)A面上にAlGaAsを成長させた時、成長温度を下げると、またAsH_3分圧を増加させると、表面形態は三角錐型、円錐型ヒロック、鏡面、微小ヒロックと変化する。成長温度を高くした場合、同じ表面形態を得るには高いAsH_3分圧を必要とし、また、表面形態はV/III比ではなくAsH_3分圧に依存することから、表面形態の変化には分解途中のAsH_x(X<3)の表面吸着状態が関与していると考えられる。またAl組成の増加により表面形態が低AsH_3分圧側にシフトすると共に、低V/III比でのAlGaAs成長速度の低下が小さいことは、TMAの添加によりAsH_3の分解速度が増加することを示している。In及びヨウ素を成長雰囲気に加えてGaP(111)A,B基板上にZnSを成長させると成長速度が変化するが、その取り込み率の基板面方位依存性をSIMSにより調べた。いずれの成長面においても適量のヨウ素添加(I/Znモル比≒0.1)により表面形態及び結晶性が改善される。(111)B面上成長層の方が(111)A面の場合より成長速度は大きく、X線回折ピ-ク幅は小さくなるが、ヨウ素の取込み量は約1桁大きい。ZnSe+H_2S+H_2系を用いたGaAs(100)基板上へのZnSSe混晶成長において、成長雰囲気へのヨウ素添加量を増加させるとSの固相への取込み量が抑制された。その結果、成長層S組成の気相S分圧依存性並びに成長温度依存性が小さくなり、S組成の制御性が向上した。これはZnS堆積反応のヨウ素添加による低温側へのシフトがZnSeの場合より顕著であるためと考えられる。また、100Torrでの減圧成長の場合には、ZnS及びZnSe成長速度の基板温度依存性が小さくなることにより、S組成の成長温度依存性は非常に小さくなる事が判った。
サイトカインストームを伴うインフルエンザ感染重症化機序の解明と効果的な治療戦略

「サイトカインストームを伴うインフルエンザ感染重症化機序の解明と効果的な治療戦略」の研究を促進するため、昨年に続いてこの発症機序の中核となる2っのサイクル、「インフルエンザーサイトカインープロテアーゼ」サイクルと「サイトカインー代謝不全」サイクルを焦点に解析を進めた。特に両サイクルの共通因子であるサイトカインは、生体防御の主役として抗体産生調節因子として働く。インフルエンザ感染重症化機序のネットワークの中で、効果的な治療に影響する因子として、昨年同様イムノモデュレータとして即効性作用のあるマクロライド抗菌薬のクラリスロマイシンと、長期投与を必要とする遅発性イムノモデュレータとしてのR-1乳酸菌の作用の検証を行った。感染重症化機序としては、これまではインフルエンザ強毒PR-8株を、10×LD50感染させる濃厚感染実験をおこなってきたが、ヒト感染ではこのような濃厚感染ケースは極めてまれなことから、2×LD50の感染系でクラリスロマイシンの即効性イムノモデュレータ効果と、R-1乳酸菌の遅発性イムノモデュレータ効果を検証した。その結果、クラリスロマイシンの即効性効果もR-1乳酸菌の遅発性効果も共に、生存率、体重減少において有意な効果を示した。現在これらの効果を「インフルエンザーサイトカインープロテアーゼ」サイクルを構成する各パラメーター量の変動を解析中であるが、血液中の抗インフィルエンザIgG抗体と、気管支肺胞洗浄液中の抗インフィルエンザIgA産生量では、コントロールとしたこれらの因子の無投与系に比較して、両投与系では有意な抗体産生量の増加が認められ、効果的な治療戦略に使用できることが示唆された。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。これまでの研究から、インフルエンザウイルスの気道感染時に増加が認められるサイトカインのTNF-alpha、IL-6、IL-1beta、IL-2,IFN-alpha,IFN-beta、IFN-ganmer、IL-12の相互作用、フードバック調節機構を確認した。さらに我々は、インフルエンザ感染における各サイトカインの重み付けを行い、司令塔に当たるサイトカインを検索した。その結果、IL-1betaが、これらのサイトカインの司令塔となっていることを、抗体による中和、RNAiによる発現抑制で証明することができた。しかし、IL-1beta以外の各種サイトカインもIL-1betaとの相乗的効果として影響を与えていることが確認することができた。以上の結果は、IL-1betaの発現抑制、抗体による中和によって、インフルエンザ感染が引き起こす各種代謝破綻を伴う重症化を抑制することを示唆した。特に、インフルエンザ感染の重症化に関与するインフルエンザーサイトカインーtrypsinサイクルが、IL-1betaの発現抑制、中和によってサイクルの回転が阻止でき、trypsinとウイルス発現を抑制できたことは、今後の治療薬開発の基盤になると推定している。一方、これまでの研究から、サイトカインストームによって生じた糖代謝と脂肪酸代謝破綻は、PDK4阻害剤で抑制されることを見出してきた。本年度の研究では、これまでに報告してきたPDK4阻害剤のDADAよりも、阻害効果がさらに20倍以上強力な新規化合物がスクリーニングから見いだされ、今後の研究が期待された。本研究では、1)インフルエンザ感染におけるサイトカインカスケードの司令塔検索と治療標的の同定、2)サイトカインストームによって生じた糖代謝と脂肪酸代謝破綻が導く多臓器不全のメタボローム解析による治療標的酵素の同定と治療薬の検証、3)インフルエンザーサイトカインーtrypsinサイクルが誘発するPAR1/2を介した急性浮腫の治療薬検討の3本の柱を設定して、研究を進めてきた。平成28年度の研究では、研究の中心を構成する1)の研究課題を明確にすることができて、今後IL-1betaの発現抑制、中和によって重症化の増悪サイクルの回転を阻止する主要な経路が明らかになったと考えている。また、2)の研究課題も、PDK4阻害剤として従来のDADAに比べてさらに20倍以上強力な新規化合物が同定されたことは、大きな研究成果と考えている。3)のPAR1/2を介した急性浮腫の治療薬検討については、現在進行中であり、引き続き検討を続けて行く。昨年に続いて、インフルエンザ感染重症化機序におけるサイトカインを中心とした体内因子の役割の解明に加え、これらのデータを基盤にした効果的な治療戦略の検索として、イムノモジュレーターの効果を検証した。現在使用可能なイムノモジュレーターの中から平成29年度は、マクロライドの効果と、抗インフルエンザ抗体の産生能に影響を与える乳酸菌についての検討を実施した。我々はこれまでに、14員環マクロライドのクラリスロマイシン(CM)のイムノモジュレーター作用として、抗インフルエンザ薬のタミフル服用による獲得免疫機能の低下と翌年の再感染率の増加を、CAMが抑制することを報告してきた。本年の研究ではこれに加えて、CAMは感染局所で産生されるケモカインのmonocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1)の発現を抑制して、浸潤する炎症性細胞が分泌するmatrix metalloproteinase-9 (MMP-9)量を低下させ、結果として血管内皮細胞の透過性亢進に係わる「インフルエンザーサイトカインープロテアーゼ」サイクルを抑制し、多臓器不全の発症を抑制することを明らかにすることができた。また、腸内細菌叢は体内の免疫系に影響を与えることが報告されているが、マウスに乳酸菌を服用させることで、抗インフルエンザ薬のタミフルの服用によって起きる獲得免疫機能の低下を回復させる作用のあることが明らかになった。

これまでに解析してきたインフルエンザ感染重症化に伴う体内代謝破綻改善薬に加え、これらのイムノモジュレーターの作用を評価して、インフルエンザ感染重症化の効果的な治療戦略を検討する。インフルエンザ感染重症化機序におけるサイトカインを中心とした昨年の体内因子の役割の解明に加え、本年度の研究ではこれらのデータを基盤に、さらに効果的な治療戦略の検索としてイムノモジュレーターの効果を検証して、ポジティブな成果を得ている。このように、「サイトカインストームを伴うインフルエンザ感染重症化機序の解明と効果的な治療戦略」課題を、多面的に解析・検証して、最終目標とする効果的な治療戦略の構築に迫る研究は評価に値する。「サイトカインストームを伴うインフルエンザ感染重症化機序の解明と効果的な治療戦略」の研究を促進するため、昨年に続いてこの発症機序の中核となる2っのサイクル、「インフルエンザーサイトカインープロテアーゼ」サイクルと「サイトカインー代謝不全」サイクルを焦点に解析を進めた。特に両サイクルの共通因子であるサイトカインは、生体防御の主役として抗体産生調節因子として働く。インフルエンザ感染重症化機序のネットワークの中で、効果的な治療に影響する因子として、昨年同様イムノモデュレータとして即効性作用のあるマクロライド抗菌薬のクラリスロマイシンと、長期投与を必要とする遅発性イムノモデュレータとしてのR-1乳酸菌の作用の検証を行った。感染重症化機序としては、これまではインフルエンザ強毒PR-8株を、10×LD50感染させる濃厚感染実験をおこなってきたが、ヒト感染ではこのような濃厚感染ケースは極めてまれなことから、2×LD50の感染系でクラリスロマイシンの即効性イムノモデュレータ効果と、R-1乳酸菌の遅発性イムノモデュレータ効果を検証した。その結果、クラリスロマイシンの即効性効果もR-1乳酸菌の遅発性効果も共に、生存率、体重減少において有意な効果を示した。現在これらの効果を「インフルエンザーサイトカインープロテアーゼ」サイクルを構成する各パラメーター量の変動を解析中であるが、血液中の抗インフィルエンザIgG抗体と、気管支肺胞洗浄液中の抗インフィルエンザIgA産生量では、コントロールとしたこれらの因子の無投与系に比較して、両投与系では有意な抗体産生量の増加が認められ、効果的な治療戦略に使用できることが示唆された。研究計画の変更は無い。今後も、1)インフルエンザ感染におけるサイトカインカスケードの司令塔検索と治療標的の同定、2)サイトカインストームによって生じた糖代謝と脂肪酸代謝破綻が導く多臓器不全のメタボローム解析による治療標的酵素の同定と治療薬の検証、3)インフルエンザーサイトカインーtrypsinサイクルが誘発するPAR1/2を介した急性浮腫の治療薬検討の3本の柱を中心に、研究を進めて行く。今後に繋がるサイトカインカスケードの司令塔としてのIL-1betaの同定、糖代謝と脂肪酸代謝破綻に有効な強力なPDK4阻害剤がスクリーニングされたことから、今後の研究成果が期待される。
アルカリ土類金属で修飾した担体表面と白金の結合状態に関する研究

担体には,SiO_2 (JRC-SIO-4:触媒学会参照触媒),シリカライトおよびZSM-5(いずれも自家製)を用いた.アルカリ土類金属による担体の修飾は,Mg, Caなどの硝酸塩を水溶液から含浸担持し調整した.Ptは陽イオン型としてPt (NH_2)_6Cl_3を,陰イオン型としてH_2PtCl_6を用いイオン交換法および含浸法にて調整した.X線回析,赤外線分光法,X線光電子法などを用いて1)で調整した触媒のキャラクタリゼーションを行った.アルカリ土類金属は,それ自体は塩基性を示すが,上記多孔質担体に担持すると塩基性が失われ逆に酸性が発現することがわかった.赤外線分光法を用いてMg^<2+>で修飾したSiO_2およびシリカライト上の吸着ピリジンの振動スペクトルを測定した.SiO_2およびシリカライト自身には酸性点は存在しないが,Mg^<2+>を添加することでLewis酸性点が生成した.X線光電子分光法からSiO_2などに添加したMg^<2+>は比較的表面に高分散に担持されることがわかった.X線回析からもMg^<2+>の分散が示唆された.これにPtを担持するとMg^<2+>で修飾していないSiO_2およびシリカライトに比べPtの分散度が高くなることが水素吸着量測定から明らかになった.Mg^<2+>による修飾で生成した酸性点がPtの分散に有効であることがわかった.これは,修飾担体上の酸性点がPtと強く相互作用し微分散したPt粒子を安定化しているためと考察した.Ca^<2+>についても検討し同様な効果を得ている.X線光電子スペクトルからPtの電子状態には変化がないことがわかった.上記のMg^<2+>およびCa^<2+>で修飾したSiO_2およびシリカライト,ZSM-5にPtを担持した触媒を用いてn-hexaneの転化反応および脱水素反応を行った.Mg^<2+>およびCa^<2+>の添加によって担持Pt触媒のn-hexaneおよびシクロヘキサンの脱水素反応の活性が増大した.Pt分散度と活性の間には正の相関が得られた.Mg^<2+>およびCa^<2+>による修飾は,Ptの分散を助け活性表面積を高くすることにあることがわかった.担体には,SiO_2 (JRC-SIO-4:触媒学会参照触媒),シリカライトおよびZSM-5(いずれも自家製)を用いた.アルカリ土類金属による担体の修飾は,Mg, Caなどの硝酸塩を水溶液から含浸担持し調整した.Ptは陽イオン型としてPt (NH_2)_6Cl_3を,陰イオン型としてH_2PtCl_6を用いイオン交換法および含浸法にて調整した.X線回析,赤外線分光法,X線光電子法などを用いて1)で調整した触媒のキャラクタリゼーションを行った.アルカリ土類金属は,それ自体は塩基性を示すが,上記多孔質担体に担持すると塩基性が失われ逆に酸性が発現することがわかった.赤外線分光法を用いてMg^<2+>で修飾したSiO_2およびシリカライト上の吸着ピリジンの振動スペクトルを測定した.SiO_2およびシリカライト自身には酸性点は存在しないが,Mg^<2+>を添加することでLewis酸性点が生成した.X線光電子分光法からSiO_2などに添加したMg^<2+>は比較的表面に高分散に担持されることがわかった.X線回析からもMg^<2+>の分散が示唆された.これにPtを担持するとMg^<2+>で修飾していないSiO_2およびシリカライトに比べPtの分散度が高くなることが水素吸着量測定から明らかになった.Mg^<2+>による修飾で生成した酸性点がPtの分散に有効であることがわかった.これは,修飾担体上の酸性点がPtと強く相互作用し微分散したPt粒子を安定化しているためと考察した.Ca^<2+>についても検討し同様な効果を得ている.X線光電子スペクトルからPtの電子状態には変化がないことがわかった.上記のMg^<2+>およびCa^<2+>で修飾したSiO_2およびシリカライト,ZSM-5にPtを担持した触媒を用いてn-hexaneの転化反応および脱水素反応を行った.Mg^<2+>およびCa^<2+>の添加によって担持Pt触媒のn-hexaneおよびシクロヘキサンの脱水素反応の活性が増大した.Pt分散度と活性の間には正の相関が得られた.Mg^<2+>およびCa^<2+>による修飾は,Ptの分散を助け活性表面積を高くすることにあることがわかった.
脂肪肝発生における肝細胞膜〜骨格系の役割

絶食メスラット腹腔内へエチオニン(E)を投与すると数時間内で脂肪肝が発現し始め,肝細胞内脂肪滴生成機序を解明するには極めて有力な実験方法である.我々が開発した電顕微細胞化学的中性脂肪検出法では,生化学的に有意の中性脂肪増加がみいだしえないE投与後3時間で,既に肝細胞小胞体内に中性脂肪を主とする微小な脂肪顆粒を多数みいだす. E投与5時間以後時間の経過と共に,大小の原形質内脂肪滴が増える.我々が開発中のenbloc鉛染色手技を用いる電顕的検索法でこの発現過程の肝組織を観察し,肝細胞小胞体内脂肪顆粒から原形質内脂肪滴への直接移行像を追求した.各自それぞれの融合像はみられるが,両者の移行像と考えられるものはみいだしえなかった.なお,いわゆるホスホリパーゼ消化法で処理された上記実験動物肝細胞の若干の生体膜に脂肪肝発現と無関係に反応産物を含む微小な電子密沈着物を認めるが,それは生体膜隣脂質の一部がホスホリパーゼで消化された結果であると推論できた.次に,体重300g余の終夜絶食メスラットで,絶食開始11時間後にE(1g/kg)を,ついで14及び17時間後とコルヒチン(2.5mg/kg)を2回投与し,絶食20時間後で全例屠殺検索したが, E投与のみ,コルヒチン投与のみなどの絶食対照群も設定した.これら肝小葉周辺帯肝細胞内に発現する脂質構造物を電顕的に検索すると共に,肝脂質をも生化学的に定量した. E投与をうけた両群に生化学的ないし光顕組織化学的に脂肪肝発現をみるが, E単独投与群に比べて,両者併用群では生体膜に包まれた中等大脂肪顆粒が極めて多く,逆に原形質内脂肪滴はすくない.このことは,コルヒチンがエチオニン脂肪肝にみられる原形質内脂肪滴の生成を強く抑制することを示唆し,それはコルヒチンの細胞骨格傷害効果によるものか,直接的な代謝作用によるものかを現在研究中で,その形態学的方法論を検討している.絶食メスラット腹腔内へエチオニン(E)を投与すると数時間内で脂肪肝が発現し始め,肝細胞内脂肪滴生成機序を解明するには極めて有力な実験方法である.我々が開発した電顕微細胞化学的中性脂肪検出法では,生化学的に有意の中性脂肪増加がみいだしえないE投与後3時間で,既に肝細胞小胞体内に中性脂肪を主とする微小な脂肪顆粒を多数みいだす. E投与5時間以後時間の経過と共に,大小の原形質内脂肪滴が増える.我々が開発中のenbloc鉛染色手技を用いる電顕的検索法でこの発現過程の肝組織を観察し,肝細胞小胞体内脂肪顆粒から原形質内脂肪滴への直接移行像を追求した.各自それぞれの融合像はみられるが,両者の移行像と考えられるものはみいだしえなかった.なお,いわゆるホスホリパーゼ消化法で処理された上記実験動物肝細胞の若干の生体膜に脂肪肝発現と無関係に反応産物を含む微小な電子密沈着物を認めるが,それは生体膜隣脂質の一部がホスホリパーゼで消化された結果であると推論できた.次に,体重300g余の終夜絶食メスラットで,絶食開始11時間後にE(1g/kg)を,ついで14及び17時間後とコルヒチン(2.5mg/kg)を2回投与し,絶食20時間後で全例屠殺検索したが, E投与のみ,コルヒチン投与のみなどの絶食対照群も設定した.これら肝小葉周辺帯肝細胞内に発現する脂質構造物を電顕的に検索すると共に,肝脂質をも生化学的に定量した. E投与をうけた両群に生化学的ないし光顕組織化学的に脂肪肝発現をみるが, E単独投与群に比べて,両者併用群では生体膜に包まれた中等大脂肪顆粒が極めて多く,逆に原形質内脂肪滴はすくない.このことは,コルヒチンがエチオニン脂肪肝にみられる原形質内脂肪滴の生成を強く抑制することを示唆し,それはコルヒチンの細胞骨格傷害効果によるものか,直接的な代謝作用によるものかを現在研究中で,その形態学的方法論を検討している.1518時間飢餓の成熟メスラットを対照群とし、飢餓12時間でエチオニン1g/kgを腹腔内に注入し、注入後3,6,9及び12時間のものを実験群とした。これらラットのアルデヒド灌流肝の肝細胞内に認められる脂肪顆粒に対して、リパーゼ,ホスホリパーゼ及びリポプロテンリパーゼを利用する酵素消化法、さらにpH9のクエン酸鉛液に浸漬後4%四酸化オスミウムで後固定するen bloc染色法を試み、脂肪肝発生過程を電顕細胞化学的に詳細に追求した。その成果は、6月の日米合同組織細胞化学会総会、8月の国際電顕学会及び9月の国際病理アカデミー総会で発表した。これら発表を要約すると次の通りである。対照群では、ゴルヂ領域にVLDL顆粒を認めるが、エチオニン投与36時間後では、VLDL顆粒は減少し、小胞体腔内に中性脂肪と燐脂質を主成分とするリポソームが、急激にかつ多数出現する。69時間後には大小の細胞質内脂肪顆粒が著増するが、これらが前記の小胞体内のリポソームから直接移行したと推定しうる電顕像をまだ認めていない。

細胞質内脂肪顆粒は中性脂肪を主成分とし、界面に燐脂質の膜を認めるが二重構造を示す生体膜で包まれておらず、胞体内に分散したこれら顆粒はお互いに融合して大きくなる傾向を示す。ホスホリパーゼ消化法によってのみ電顕的に検出される小胞体腔内微小顆粒は上記実験条件下で殆んど変動せず、別に試みた肝細胞マイクロソーム画分に対する酵素消化法から、この微小顆粒は小胞体膜の消化産物で、人工的な燐脂質顆粒と推定するに至った。次に、エチオニン注入後3時間でコルヒチン2.5mg/kgを腹腔内に注入すると、エチオニン単独注入69時間後にみられる細胞質内脂肪顆粒の増数粗大化現象がそれ程顕著に発現していないことを知った。その成果の一部を4月の日本病理学会総会で発表予定である。この脂肪肝発生過程に細胞骨格傷害が関連するか否かを目下検討中である。