hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
生物学的特性を備えた新たな人工血管の開発

生体材料のみで作成する小口径人工血管の埋め込み実験を行った。まずイヌの外頚静脈を採取し酵素法により内皮細胞、平滑筋細胞を採取した。37°C、5%CO2の培養器内にて静置培養を行い細胞数を増やした後、トリプシン処理にて細胞浮遊液を作成した。ヒト臍帯静脈グラフトを抗生物質を加えた生理食塩水内で約2週間保存し、周囲のメッシュを切除、グラフト本体のみとした。組成の主成分はコラーゲンである。まずこのコラーゲン管の壁内に平滑筋細胞浮遊液を注射器を用い注入した。次いで内皮細胞浮遊液をグラフト内に誘導し両端を閉鎖、培養器内に水平に留置し10分ごとに90度づつ2時間の間回転させた。翌日内皮細胞浮遊液を回収し、その後1週間培養を続けた後に1部を組織検査に用い、残りの部分を同じイヌの腹部大動脈に移植した。移植後1週間で回収し検査を加えた。イヌへの移植まで培養を行えたものは3例で、うち1例は感染し、2例は閉塞した。組織学的検討では、移植前のグラフトには内腔に内皮細胞、壁内に平滑筋細胞が確認されたが、イヌより回収したグラフトには細胞の生着は確認されなかった。今回の実験の問題点として、1)臨床材料のヒト臍帯静脈グラフトはアルコール液内で保存されているため、細胞毒性を完全に除去できなかった。2)それによりグラフトへの細胞の生着が不完全であった。3)イヌへの移植実験で感染を来すような不備があった。等が考えられた。今後は使用するグラフト材料、実験に供する動物種、細胞付着の方法等の改善を行い実験を続けて行くつもりである。等が考えられた。小口径人工血管では、自家静脈に匹敵する開存率を持つものがなく、その開発が急務とされている。自家静脈自身は、心臓手術に使用される場合も多いため、バイパス可能でもそれに適した静脈が既に使用されているために無く、手術をあきらめる場合もある。人工血管開発の方向として、現在最も優れている自家静脈に近づける方法がある。いわゆるハイブリッド型人工血管がそれである。それを、更に生体血管に近づけるために、血管壁細胞、細胞外マトリックスも生体材料で作成することを発想した。ヒト臍帯静脈グラフトを利用することで、in vitroでの作成は可能となったが、in vivoでの検討が未だ成されていない。それ故、生体材料のみを用いた人工血管を作成し、それを動物に移植して生体内での組織変化を検討することを目的として実験を行った。イヌを用い、静脈を無菌的に採取することにより内皮細胞、平滑筋細胞を得た。細胞培養を続けることで充分量の細胞数を得た後、ヒト臍帯静脈グラフトに移植し、それを更に同じイヌに移植する。移植手術後一定時期にイヌよりグラフトを切除し、その組織変化を検索することとした。現在細胞移植に関する最適な方法を(1)細胞数(2)培養期間(3)移植方法に関してin vitroで検索中である。特に組織学的検討によりその経時的変化を観察している。現時点の問題としては(1)イヌの入手が困難であること(2)グラフト壁内に移植した平滑筋細胞が静置培養によって充分な拡散、増殖が得られないことが挙げられる。37°C、5%CO_2の培養器内にて静置培養を行い細胞数を増やした後、トリプシン処理にて細胞浮遊液を作成した。

ヒト臍帯静脈グラフトを抗生物質を加えた生理食塩水内で約2週間保存し、周囲のメッシュを切除、グラフト本体のみとした。組成の主成分はコラーゲンである。まずこのコラーゲン管の壁内に平滑筋細胞浮遊液を注射器を用い注入した。次いで内皮細胞浮遊液をグラフト内に誘導し両端を閉鎖、培養器内に水平に留置し10分ごとに90度づつ2時間の間回転させた。翌日内皮細胞浮遊液を回収し、その後1週間培養を続けた後に1部を組織検査に用い、残りの部分を同じイヌの腹部大動脈に移植した。移植後1週間で回収し検討を加えた。イヌへの移植まで培養を行えたものは3例で、うち1例は感染し、2例は閉塞した。組織学的検討では、移植前のグラフトには内腔に内皮細胞、壁内に平滑筋細胞が確認されたが、イヌより回収したグラフトには細胞の生着は確認されなかった。今回の実験の問題点として、1)臨床材料のヒト臍帯静脈グラフトはアルコール液内で保存されているため、細胞毒性を完全に除去できなかった。2)それによりグラフトヘの細胞の生着が不完全であった。3)イヌへの移植実験で感染を来すような不備があった。等が考えられた。今後は使用するグラフト材料、実験に供する動物種、細胞付着の方法等の改善を行い実験を続けて行くつもりである。
神経可塑性における低分子量G蛋白質Ralと蛋白質リン酸化酵素GSKの役割

神経可塑性における低分子量G蛋白質Ralと蛋白質リン酸化酵素GSKの役割を明らかにするために、RalとGSKの活性制御機構を解析して、以下の点を明らかにした。RalGDSはRalの活性化蛋白質であるが、私共はRalGDSがRasの標的蛋白質であることをすでに見い出している。そこで、Rasの活性化によって引き起こされるRalGDSの細胞内局在の変化を解析した。RalGDSはCOS細胞内では細胞質画分に存在しており、膜画分には認められなかった。しかし、RalGDSをRasと共に発現させるとその半分が膜画分に認められた。これらの結果は細胞膜に存在するRasがRalGDSを細胞質から細胞膜ヘトランスロケ-トさせることを示している。Ralの翻訳後修飾はRalGDSのRalに対するGDP/GTP交換反応促進活性を増強した。Rasの標的蛋白質結合部位の変異体を用いて、RalGDSを介するシグナル伝達系がRafとは異なることが明らかになった。さらに、RalGDSはRafと相乗的に作用してc-fos遺伝子の発現を促進した。一方GSKはp90rskによりセリンがリン酸化されると不活性化されることがこれまでに知られていた。細胞をinsulinやEGFで刺激すると、GSKのチロシン脱リン酸化が引き起こされた。この際、セリンのリン酸化が起こらないような変異体でもチロシン脱リン酸化が認められた。したがって、細胞外シグナルによるGSKの活性制御にチロシン脱リン酸化が関与していることが明らかになった。さらに、このチロシン脱リン酸化にはCキナーゼが関与している伝達系と関与していない伝達系が存在することが明らかになった。以上、本年度の研究は予定通り進行し、RalとGSKの活性制御機構が明らかとなったと判断しているが、今後はこれらのシグナル伝達系の神経の可塑性における役割を解明したい。
エポキシ樹脂成形撹拌槽内における充填材粒子分散状態の数値シミュレーション

エポキシ樹脂は耐水性、耐薬品性、電気絶縁性等の特徴を有し、半導体分野における封止材として多用されている現状にあるが、このエポキシ樹脂の成型品においてその均一性に問題が生じる場合があり、同樹脂の品質管理の面から問題が指摘されている。そこで、本研究ではエポキシ樹脂の成型プロセス中における、撹拌による樹脂中への充填材粒子の分散過程および分散状態の影響について着目し、これらが成形樹脂の品質に多大の影響を及ぼすものと考え、工学的理論に基づき数値シミュレーションにより、樹脂および固体粒子の流動状態や分散状態について定量的に求め、表示する方法を確立することを目的として行った。研究の第一歩として、まず樹脂成形固液撹拌槽内における固液流動の数値シミュレーション手法の確立を行った。その結果、当初の計画通りの数値シミュレーション手法及び手順により、板型翼撹拌槽内における液相の流動状態として連続の式、運動方程式、流動モデル式を連立させて差分法によって離散化し、圧力速度同時過緩和法を用いて槽内の三次元速度分布を得、ついで、任意の粒径、密度を有する固体粒子を粒子濃度に応じた個数分、液相の三次元速度分布中に発生させ、粒子の運動方程式により複数の粒子の挙動の解析を行い、撹拌槽内の粒子の分散状態を求めることができた。ついで、撹拌槽内の充填材粒子分散状態の数値計算結果の妥当性を検証する可視化実験装置を作製し、可視化実験により本数値シミュレーション手法の妥当性を確認した。さらに今後、本研究で確立した数値シミュレーション手法を用いて、固体粒子濃度や翼回転数等の操作条件を変化させ、槽内における流動状態や粒子分散状態等を求め、この数値シミュレーションによる解析結果に基づき、粒子の分散状態を定量的に数値化し、表示する手法の研究へと拡張・応用して生きたい。
植物の土壌圏のリン有用性を高める戦略への土壌から細胞、ソースからシンクへの展開

土壌と植物との連繋体でPの挙動を概観した場合、土壌中で吸着されたリン酸イオンは、酸化物鉱物やアロフェンを含む土壌では植物による利用率が低い。しかし、有機酸イオンは、リン酸イオンと同様配位子交換により鉱物に吸着する能力をもち、植物根は特有の有機酸を分泌し、それらと交換して土壌溶液に出てきたリン酸を吸収する能力を持っている。この現象と仕組みを土壌中のP欠乏に耐性を持ち、少ないリン酸イオンを的確に植物体内で有効化するナタネ品種を用いて明らかにし、その特性を今後必ず生じるP欠乏時代に備えて、リン酸化学肥料等の施肥量を減少させる持続的な作物生産や土壌中のPの存在の維持管理に活用することが本研究の目的である。本年度は、P吸収・溶解性・利用効率、P再移動・再移行、相対的P耐性を解明するために、Ca_3(PO_4)_2及びリン鉱石の2種類の異なる可溶性リン源を培地として供試し、KH_2PO_4及びNH_4H_2PO_4処理区と比較しながら、遺伝的に異なるナタネ品種を育成した。得られた結果は下記の通りである。(1)品種間差異はバイオマス生産、P及びCa体内含有量、Pストレス要因、P利用効率に現れた。(2)水溶性Ca-Pを必須栄養素が含まれた寒天に浮かべて培養した結果、窒素源としてアンモニア態を用いると根圏における溶解が生じたが、硝酸態では溶解しなかった。(3)リゾボックスの実験から、一次根の伸長速度はP供給が増加するに伴い増加したが、一次根の分枝帯の伸長速度は減少した。また、P欠乏条件下では、側根の伸長は促進した。(4)P欠乏条件下の根部から滲出したカルボキシラートの量と型は、Pが豊富に供給された場合と異なることが確認された。(5)P添加により、バイオマス生産に品種間差異が認められたが、Zn供給は何ら影響を及ぼさず、P供給が増加するに伴い、Znの吸収を低下させた。リンは生体必須元素の一つであり、地殻中存在量が多い元素ではあるが、生物圏におけるリンの循環は生態系の中で閉鎖性のより強い生物学的循環を行っている。土壌と植物との連繋体でリンの挙動を概観した場合、土壌中でいったん吸着されたリン酸イオンは酸化物鉱物やアロフェンを含む土壌では肥料として加えたリン酸の植物による利用率が低い。しかし、有機酸イオンは、リン酸イオンと同様配位子交換により鉱物に吸着する能力をもつ。植物根はこのような有機酸あるいは植物種特有の有機酸を分泌し、それらと交換して土壌溶液に出てきたリン酸を吸収する能力を持つ。この現象と仕組みを土壌中のリン欠乏に耐性を持ち、少ないリン酸イオンを的確に植物体内で有効化するナタネ品種を用いて明らかにし、その特性を今後必ず生じるリン欠乏時代に備えて、リン酸化学肥料等の施肥量を減少させる持続的な作物生産や土壌中のリンの存在の維持管理に活用することが本研究の目的である。初年度は、ビニールハウス内または恒温室内にて、数種のナタネ品種を供試して、下記の実験を実施した。Ca_3(PO_4)_2及びリン鉱石の2種類の異なる可溶性リン源を培地として供試し、遺伝的に異なるナタネ品種の生育特性やバイオマス生産を調査した。そして、水耕並びに砂耕を行うことにより、リン酸塩欠乏条件下に順化させる根部の役割を、培地のpH変化、有機陰イオンの滲出物から検討すると共に、少ないリン酸塩を移動・獲得するよう根部構成を変化させる様相を調査した。(1)品種間差異はバイオマス生産、種々の生育特性およびS-R率に顕著に現れた。(2)PとCaの濃縮及び総吸収量、一定のP吸収速度、P移動速度、P利用効率は品種間で有意に異なり(P<0.1%)、また乾物生産とP吸収量は直線回帰を示した。(3)P欠乏条件下では、P耐性種は水素イオンの流出とカルボキシラートの滲出のために、低P感受性種より培地のpH値は低下した。(4)pH値が下がると、直線的にP吸収量は増加し、Caの吸収を促進する結果となった。(5)Pが十分に与えられた培地で育成した植物の根部から滲出した有機陰イオンの量と型は、P欠乏条件下で育成した場合と異なることが把握された。(6)リゾボックスの実験から、一次根の伸長速度はP欠乏条件下では減少したが、一次根の分枝帯の伸長速度及び側根の長さは増加することが認められた。(7)側根の原子配列を変化させ、P吸収・利用効率、Ca吸収、水素イオン流出と有機陰イオンの滲出を促進させることが重要な要因である。

この現象と仕組みを土壌中のP欠乏に耐性を持ち、少ないリン酸イオンを的確に植物体内で有効化するナタネ品種を用いて明らかにし、その特性を今後必ず生じるP欠乏時代に備えて、リン酸化学肥料等の施肥量を減少させる持続的な作物生産や土壌中のPの存在の維持管理に活用することが本研究の目的である。本年度は、P吸収・溶解性・利用効率、P再移動・再移行、相対的P耐性を解明するために、Ca_3(PO_4)_2及びリン鉱石の2種類の異なる可溶性リン源を培地として供試し、KH_2PO_4及びNH_4H_2PO_4処理区と比較しながら、遺伝的に異なるナタネ品種を育成した。得られた結果は下記の通りである。(1)品種間差異はバイオマス生産、P及びCa体内含有量、Pストレス要因、P利用効率に現れた。(2)水溶性Ca-Pを必須栄養素が含まれた寒天に浮かべて培養した結果、窒素源としてアンモニア態を用いると根圏における溶解が生じたが、硝酸態では溶解しなかった。(3)リゾボックスの実験から、一次根の伸長速度はP供給が増加するに伴い増加したが、一次根の分枝帯の伸長速度は減少した。また、P欠乏条件下では、側根の伸長は促進した。(4)P欠乏条件下の根部から滲出したカルボキシラートの量と型は、Pが豊富に供給された場合と異なることが確認された。(5)P添加により、バイオマス生産に品種間差異が認められたが、Zn供給は何ら影響を及ぼさず、P供給が増加するに伴い、Znの吸収を低下させた。
気中懸濁被覆法によるペプチド性医薬品の特殊放出制御型マイクロカプセル化製剤の開発

ペプチド医薬品の特殊放出制御による生体への送達効率の向上を目的として,その基礎となる下記3タイプの放出モードを考案し,特にペプチド医薬品の安定性確保や数千数万に達する高分子量薬物の透過を可能にするためのハイドロゲルを中心とした数種の新しい素材,特殊放出を可能にする粒子構造の基本設計コンセプトとその気中懸濁被覆法によるマイクロカプセル(MC)製造技術に関する研究を進めた。1)長時間遅延放出MC:乳糖核粒子・薬物被覆層・Poly(ethyl acrylate-methyl methacrylate-2-hydroxyethyl methacrylate)放出制御膜からなるMCは,分子量数万の高分子量水溶性薬物に対して,数時間にわたるラグタイムとその後の早い放出で特徴付けられる長時間遅延放出を可能とした。また,デリケートな物性を持つペプチド医薬品に対してもそれを安定に封入でき,かつ所望の機能を発揮する製剤処方と流動層プロセスを構築できた。さらに,in vitroでの放出特性とin vivoでの経口投与後の薬物吸収動態には比較的良好な相関が認められた。2)周期的パルス放出制御型MC:PEGをグラフト化したP(N-isopropylacrylamide(NIMAAm))ナノ粒子は,加熱・せん断操作を伴う流動層プロセスによるMC化に際して危惧されるペプチドの分解に対して,高含量のペプチドを安定に保持可能とする素材であった。Poly(ε-caprolactone(PCL))擬ラテックスは放出制御膜剤として使用可能なものとなるにはいたっていない。処方検討を継続し,最終的には,ペプチド含有PEGグラフト化P(NIMAAm)ナノ粒子とPCLの交互多層膜の構築などによって周期的パルス放出モードを有するMCの開発を目指したい。3)刺激応答性放出制御型MC:温度応答性P(NIPAAm)ナノゲル粒子を含む被膜の構築によって,分子量千数千の水溶性薬物に対して,高温で放出生起・低温で放出停止を示す温度応答性放出モードを実現できた。ミクロサイズのデバイスであるがゆえに,温度変化に伴う放出速度変化はわずか数秒レベルで起こり,従来のマクロデバイスに比べて,はるかに鋭敏な放出レスポンスであった。ペプチド性医薬品の効率的な生体内送達を実現すべく、申請者らが独自に開発した気中懸濁法微粒子被覆技術および刺激応答性高分子ゲルのナノサイズ化技術により、以下の素材および製剤化検討を実施した。1.長時間遅延放出型MC芯粒子に90-105μmの乳糖、モデル薬物に蛍光標識デキストラン(FITC-Dex)、放出制御膜に乳化重合法により合成したアクリル酸エチル(EA)-メタクリル酸メチル(MMA)-メタクリル酸2-ヒドロキシエチル(HEMA)3元共重合本を用いて初期のラグタイムとその後の急速な放出で特徴づけられる長時間遅延放出を示すMCの調製に成功した。ラグタイムは放出制御膜厚及びモノマー組成比により1-10時間にわたって調節できた。2.パルス放出制御型MCペプチドのMC化に際して、高含量のベプチドが安定に保持可能なpoly(ethylene glycol)(PEG)をグラフト化したpoly(N-isopropylacrylamide)ナノ粒子を分散重合法により合成した。低温での平衡分配法による本ナノ粒子への封入によりインスリンを最高65%の含量で保持でき、80°C、1時間の過酷条件での暴露によっても60%以上がインタクトな状態であることを明らかにした。3.刺激応答性放出制御型MCメタクリル酸-メタクリル酸PEG誘導本(P(MAA-g-EG))からなるpH応答性ナノ粒子および温度応答性P(NIPAAm)ナノ粒子を分散重合法により合成した。

P(NIPAAm)ナノ粒子とエチルセルロース(EC)ナノ粒子のブレンド膜からなるMCは、FITC-Dex(Mw4400)を高温で放出、低温で非放出するオン-オフ型の温度応答性放出を示した。一方、P(MMA-g-EG)ナノ粒子とECナノ粒子からなるMCは、pH応答性薬物放出を示したが、オン状態での放出速度が低く、今後、MC処方の最適化が必要と思われる。ペプチド性医薬品の効率的な生体内送達を実現すべく、申請者らが独自に開発した気中懸濁法微粒子被覆技術および機能性高分子および高分子ハイドロゲルのナノサイズ化技術により、以下の素材および製剤化検討を実施した。1.長時間遅延放出型MC:前年度試作したプロトタイプのMCを基本として,遅延放出特性に及ぼす薬物被覆造粒用結合剤の影響を詳細に調べた。数種の結合剤をスクリーニングした結果,メチルセルロースがラグタイム後の放出速度を著しく大きくする作用を示すことを見出した。この結果を踏まえ,低分子量の水溶性モデル薬物を封入したMCを試作し,ビーグル犬へのMCの経口投与後の薬物吸収挙動を評価した結果,in vivo薬物吸収挙動とin vitro薬物放出挙動には比較的良好な相関関係が認められた。2.パルス放出制御型MC:パルス放出用の生体内分解性マイクロカプセル膜剤として,新たにポリε-カプロラクトン(PCL, MW 65,000)の擬ラテックスの調製方法を検討した。エマルション-溶媒留去法により平均粒子径130nmのPCLラテックスの生成をみたが,高分子粒子の収率は10%程度と著しく低く,調製条件の改良と処方の最適化について今後の検討を要する。3.刺激応答性放出制御型MC:前年度試作したP(NIPAAm)ナノ粒子とエチルセルロース(EC)ナノ粒子のブレンド膜からなる温度応答性放出制御型MCについて,封入薬物の分子サイズと放出挙動の関係を調べた。モデル薬物としてシアノコバラミン(VB12,Mw1,355)と蛍光標識デキストラン(FITC-Dex,公称平均Mw4400)を用い,P(NIPAAm)ナノ粒子を10wt%含むブレンド膜を有するMCを調製した。30°C(20分間)-50°C(4分間)の温度サイクルにてカラム法放出試験を行った結果,VB12およびFITC-Dexともに高温で放出、低温で非放出するオン-オフ型放出を示し,少なくともMw数千程度の範囲内の薬物については当初意図した温度応答性放出制御が可能であった。ペプチド性医薬品の効率的な生体内送達を実現すべく,申請者らが独自に開発した気中懸濁法に粒子被覆技術および刺激応答性高分子ゲルのナノサイズ化技術により,以下の素材および製剤化検討を実施した。1.長時間遅延放出型マイクロカプセル(MC):前年度検討において有望視された製剤処方をベースにして,モデルペプチドとして選択したインスリンのMC化を行った。コーティング操作
グラスファイバー強化熱可塑性プラスチックのクラスプへの応用

本研究の目的は、優れた審美性と機械的性質を有する新規ノンメタルクラスプデンチャー(NMCD)材料を開発することであった。本研究では、NMCDに応用するため、グラスファイバーとポリプロピレン樹脂から構成されるグラスファイバー強化熱可塑性プラスチック(GFRTP)を射出成形によって作製した。また、それらの曲げ特性や色調安定性などの特性が評価された。結果として、ファイバー含有量1020 mass%で顔料2 mass%添加のGFRTPは、NMCDとして十分な審美性と剛性を併せ持つことが示された。このことから、作製されたGFRTPはNMCDに適した素材となることが期待される。本研究の目的は優れた審美性と機械的性質を有するノンメタルクラスプデンチャー用材料を開発することである。本年度においては、グラスファイバー強化ポリプロピレン樹脂ペレットを基材として、射出成形によってグラスファイバー強化熱可塑性プラスチック(GFRTP)を作製した。またノンメタルクラスプデンチャー用材料としての最適設計を行うために、グラスファイバー含有率を段階的に変化させた試験体(0、5、10、20、30、40、50 wt%の計7種類)を作製し、機械的強度試験を行なった。さらに市販ノンメタルクラスプデンチャー材料(NMCD)およびアクリル系義歯床用材料(PMMA)の物性と比較することで、試作GFRTPにおけるファイバー補強効果について評価した。作製した各ファイバー含有率のGFRTPにおける密度の実測値は理論値と一致しており、ファイバーの含有量を変えても空隙等の大きな欠陥のない成形性の高い試験体を得ることができた。曲げ試験の結果、曲げ強さおよび弾性係数の値はファイバー含有率の増加に伴って大きくなった。またファイバー含有率10 wt%および20 wt%のGFRTPはPMMAと同等の曲げ挙動を示した。さらにグラスファイバー含有率20 wt%以下のGFRTPおよびNMCDはたわみ10 mmまで荷重を加えても破折せず、高い延性を示した。一方、グラスファイバー含有率30 wt%以上のGFRTPはNMCDおよびPMMAに比べて、著しく高い剛性を示し、試験後のサンプル下部に引張応力による破折が確認できた。一般にGFRTPのノンメタルクラスプデンチャーへの臨床応用を考えた場合、維持部が破折しないような高い延性と床が変形しない程度の剛性が要求されるため、本研究の結果からグラスファイバー含有率1020 wt%のGFRTPが新規ノンメタルクラスプデンチャー材料として最適であると考えられる。本研究では、審美性および機械的性質に優れる新規ノンメタルクラスプデンチャー材料の材料設計・開発を行うことが目的である。本年度(平成27年度)においては、グラスファイバー強化ポリプロピレン樹脂ペレットを出発材料とし、ノンメタルクラスプデンチャー用射出成形機を用いることで、熱可塑性樹脂をグラスファイバーで強化した、グラスファイバー強化熱可塑性プラスチック(GFRTP)を簡便に作製することに成功した。さらにGFRTPの最適な材料設計を行うために、マトリックスとして複数の熱可塑性樹脂を用い、またファイバー含有率を段階的に変化させたGFRTPを作製し、そのキャラクタリゼーションを行なった。その結果、GFRTPのノンメタルクラスプデンチャーへの応用を考えた場合、GFRTPのマトリックスにはポリプロピレンが非常に適していることが分かった。またグラスファイバー含有率1020 wt%のGFRTPが剛性と延性の両方を兼ね備えており、新規ノンメタルクラスプデンチャー材料として有効であることを見出した。これらの研究成果については、研究初年度にもかかわらず国内・国際学会において研究発表を行い、社会に報告することができた。以上のことから、研究遂行当初の目標を十分に達成しており、本研究は順調に進展しているものと考えている。本研究の目的は優れた機械的性質と審美性を併せ持つノンメタルクラスプデンチャー用材料を開発することである。本年度(平成28年度)においては、GFRTPに歯肉色を付与するため、顔料添加量(0、1、2、4 wt%)がGFRTPの色調変化および機械的性質に及ぼす影響について検討した。さらにGFRTPの口腔内での色調安定性について明らかにするため、コーヒー液を用いた浸漬試験を行ない、浸漬前後の色調の変化(色差)を色彩色差計により算出した。さらに得られた色差の値をNBSユニット(米国標準局単位)に換算して臨床的な評価基準により評価を行った。これらにより得られた結果を以下に示す。1)顔料添加量の違いによるGFRTPの色調変化を肉眼的に観察した結果、顔料2 wt%のGFRTPは義歯として適した歯肉色を有し、さらに樹脂とガラス繊維の両者の色彩の調和を図ることができ、最も審美的に優れていた。同様に色彩色差計を用いた色差評価の結果、顔料2 wt%のGFRTPがコントロールである市販ノンメタルクラスプデンチャー材料との色差が最も低い値となり、義歯として最適であることが判明した。その一方、GFRTPの曲げ強さおよび曲げ弾性係数ともに顔料添加(04 wt%)による明らかな変化は認められなかった。2)コーヒー液への浸漬試験の結果、4週間浸漬後のGFRTPは肉眼的に著しい変色や着色は認められなかった。またNBS単位による定量的な評価の結果、審美性に影響するような色調変化を認められず、臨床的許容範囲であることが分かった。以上の結果から、新規ノンメタルクラスプデンチャー材料として、顔料2 wt%添加したGFRTP(ファイバー含有量1020 wt%)が有用であることが示唆された。

本研究では、審美性および機械的性質に優れる新規ノンメタルクラスプデンチャー材料の材料設計・開発を行うことが目的である。去年度(平成27年度)においては、グラスファイバー強化ポリプロピレン樹脂ペレットを出発材料とし、ノンメタルクラスプデンチャー用射出成形機を用いることで、熱可塑性樹脂をグラスファイバーで強化した、グラスファイバー強化熱可塑性プラスチック(GFRTP)を簡便に作製するためのシステムを開発した。またGFRTPにおけるグラスファイバー含有量の影響を検討した結果、グラスファイバー含有率1020 wt%のGFRTPが剛性と延性の両方を兼ね備えており、新規ノンメタルクラスプデンチャー材料として有効であることを見出した。本年度(平成28年度)においては、前年度の機械的性質に加え、GFRTPの義歯としての審美的要素についての検討を行った。その結果、顔料2 wt%添加したGFRTPは義歯として適した歯肉色を有していることが確認できた。さらにGFRTPの口腔内装着時の飲食物などによる着色性および色調安定性を明らかにするため、コーヒー液への浸漬試験を実施した。その結果、GFRTPの色調変化は臨床的許容範囲であり、色調安定性に優れていることが示された。以上の事より、現在までに機械的性質および審美性を考慮したノンメタルクラスプデンチャーの開発に関するGFRTPの最適材料設計を実施することができた。またこれらの研究成果については、国内・国際学会において研究発表を行い、さらには国際学術誌においても発表するなど、社会に報告することができた。以上のことから、研究遂行当初の目標を十分に達成しており、本研究は順調に進展しているものと考えている。本研究の目的は、優れた機械的性質と審美性を併せ持つノンメタルクラスプデンチャー(NMCD)用材料を開発することである。昨年度までに、新規NMCD用材料として、グラスファイバー強化熱可塑性プラスチック(GFRTP)を開発し、その曲げ特性や色調安定性について明らかにしてきた。本年度(最終年度)においては、NMCDにおけるクラスプ部の構造設計を目的とした、GFRTPの片持ち梁試験および有限要素解析(FEA)を実施し、実験および解析の両面からクラスプ部の維持力について評価・検討した。また、GFRTPの摩擦摩耗特性を明らかにするために、GFRTPの摩擦摩耗試験を行い、その摩擦係数の値を算出するとともに、試験後の摩耗量の測定を行い、市販NMCD用材料およびアクリル系義歯床用材料と比較・検討した。これらにより得られた結果を以下に示す。1)片持ち梁試験の結果、0.75mmのたわみ量を与えた際の荷重値について、GFRTPは市販NMCDに比べて有意に大きかった。また、FEAの結果、GFRTPの荷重値は試験片厚およびたわみ量の増加に伴い大きくなった。実験と解析の結果から、アンダーカット量の設定やクラスプ厚を調整することでクラスプの維持力をコントロールでき、適切な維持力を得られることが分かった。2)GFRTP材料および市販NMCD用材料の摩擦係数は、アクリル系義歯床用材料と比較して、有意に低かった。
医療機関における感染管理教育プログラムの構築

中小規模病院における感染予防教育プログラムを考案し,臨床での活用を通しその効果を検証した。教育プログラムは,教育担当者への院内教育を展開するための導入研修,病院の看護職・介護職対象とした,手指衛生と個人防護具に関する集合研修および6か月間のOJT(On-the-Job Training)で構成した。成果として,教育担当者の活動の拡大や自信の獲得,看護職・介護職の意識と実践の向上,副次的効果として病院内の感染対策物品の充足等がみられた。以上のことから,考案した教育プロクラムの有用性が示され,中小規模病院への本プログラムの導入可能性が示唆された。感染管理の専門的教育を受けた看護職が不在の病院において、看護職者への感染防止院内教育の現状、感染管理担当看護師が感染防止院内教育プログラムを展開する上で担っている役割と遂行状況、役割を遂行する上での困難感、および必要な支援内容をあきかにすることを目的に、中小規模病院に勤務する感染管理担当看護師6名を対象に半構造的面接法による調査を実施した。対象者の看護師経験年数は平均26年(範囲1140年)、感染管理担当看護師としての経験年数は平均6.7年(49年)であった。対象者の職位は、主任(副看護師長)、看護師長、看護部長であった。対象者は、全員、他の業務と兼任で感染管理を担っており、その活動時間は、全業務の1割未満3割程度あった。看護職を対象とした院内教育は、5病院で1年に12回集合教育として実施されていた。研修内容は、手指衛生や標準予防策、感染経路別予防策、季節性の感染症対策が大半を占め、教育方法は講義と演習が取り入れられていた。感染管理担当者看護師が院内教育を展開するうえで抱いている困難館として【スタッグの感染対策への関心の低さと意識の違い】、【リンクナースの関心の低さと意識の違い】、【感染対策に関わる人材の理解や協力不足】、【院内研修に必要な最新情報の入手困難】、【自施設に適用できない外部の研修内容の導入】、【スタッフの研修会への関心の低さ】、【研修担当者の力不足による不確かな研修計画と実施】、【研修内容が実施・定着されないこと】の8カテゴリーと24のサブカテゴリーが抽出された。院内教育を展開する上で支援を受けたいと思うこととして、困難感と関連する7つのカテゴリーと12のサブカテゴリーが抽出された。平成24年度に実施した調査結果と文献検討をもとに、平成25年度では、東北6県512病院の感染管理担当看護師を対象に、質問紙調査を実施した。調査は、認定看護師や専門看護師などの感染管理の専門的教育を受けていない感染管理担当看護師が感染予防院内教育を展開する上で担っている役割とその遂行状況、役割遂上の困難感、必要と感じている支援内容をあきらかにし、感染管理教育プログラムの開発のための基礎資料とすることを目的とした。質問紙の回収数(回収率)は、215(42.0%)であった。対象者が所属する病院は、9割近くが300床未満の病院であり、全病院でICCあるいはICTが設置されていた。対象者の看護師経験年数は平均27.6年、感染管理経験年数は平均5.8年であった。対象者の8割以上は管理職であり、対象者のほとんどは、他の業務と兼任で感染管理活動を展開していた。7割以上の対象者は、主に新採用者研修と全職員対象研修を担当しており、部門別研修を担当している対象者は、5割程度あった。研修は、対象者自身が中心となって展開していることがうかがわれ、主要な教育内容は、手指衛生・個人防護具の着脱・呼吸器衛生/咳エチケットであった。研修の展開においては、目標設定や評価が十分に行われていないことがうかがわれた。対象者が困難と感じる項目として、集合研修・部門別研修の展開、対象者のレディネス把握や教材の検討、受講者への確かな知識と技術の提供、研修の評価、自己のモチベーションの維持などがあげられた。平成23年度は、研究課題1の医療機関における感染管理教育の現状と課題、教育プログラムに関し、国内を中心とした文献検討を実施した。その結果、職員への感染防止教育に関しては、感染管理の専門的教育を受けた看護職とリンクナースによる報告が多数を占めていた。教育対象となる職員には、医療従事者、看護助手、清掃・リネン業者、事務職員などが含まれていたが、その中でも看護職を対象とした教育に関する報告が多かった。感染防止教育の内容としては、手指衛生、標準予防策、感染経路別予防策、医療廃棄物の処理、針刺し事故防止、排泄物(便・尿)を扱う際の看護援助技術、インフルエンザやノロウイルス感染症への対応など、感染防止の基本的な内容が報告されている。教育方法としては、講義や視聴覚教材による集合教育と、基本的な感染防止技術の演習、具体的な場面を想定した演習方法などが取り入れられている。研修の種類としては、全体研修(入職者研修、スタッフ研修)、病棟・外来での研修、リンクナースの研修が行われている。教育効果や教育内容の評価に関する報告は、数少なかった。感染管理の専門的教育を受けた看護職が不在の病院における感染防止教育の報告は数少なく、それらの病院において、どのような感染防止教育が展開されているか、あきらかになっていないことが判明した。

職員への感染防止教育には、専門的知識と技術が必要とされるため、専門的教育を受けていない感染管理担当看護師が職員への感染防止教育を展開していくことは困難な状況にあることが推察された。医療関連感染を防止いていくためには、1人ひとりの医療従事者が感染防止に関する確かな知識と技術を習得し、実践していくこと必要とされ、感染防止教育はその基盤となるものである。そのため、特に、感染管理の専門家が不在の病院において柔軟に活用できる教育プログラムとその運用システムが必要となると考える。平成25年度に,東北6県512病院の感染管理担当看護師(認定看護師,専門看護師除く)を対象に実施した質問紙調査結果から,対象者が感染予防院内研修を展開していく上で困難と感じることとして,多職種合同の集合研修の内容・方法の検討,集合研修を受ける職員のレディネスの把握や教材の検討,受講者への確かな知識と技術の提供,研修の評価,自己のモチベーションの維持などがあげられた。平成26年度は,平成25年度の調査結果をふまえ,感染管理の専門的教育を受けた看護職が不在の中小規模病院等において活用可能な感染予防院内研修プログラムの考案に着手した。院内研修プログラムは,手指衛生・標準予防策・感染経路別予防策を中心とした内容とし,介護職や清掃の職種も含む多職種の集合研修に対応できる内容を検討した。さらに,これまでの調査から研修を展開していく上で,実践的な演習が不足していること,研修内容が実践に定着しないこと,中小規模病院ではマンパワー不足が示唆されたため,事前学習,DVDを活用した演習,研修後の現場での振り返りシートを作成している過程である。愛知県内中小規模病院において感染防止院内研修プログラムの検証を実施した。第1段階:感染管理担当看護師50名を対象に,「感染防止院内教育を展開するための導入研修」を実施した。研修は,院内教育プログラム展開に関する基礎的知識と感染防止院内教育の重要性と特徴等の講義,手指衛生・個人防護具着脱の演習,今後の院内教育の方向性を考えるグループワークとした。研修終了後,自記式質問紙調査により,各施設の感染防止院内教育の現状と対象者の担っている役割及び研修内容・効果の評価を実施した。第2段階:看護職・介護職を対象とした手指衛生・標準予防策の集合研修およびそれに続く6ヶ月間のOJT(On-the-Job Training)のプログラムの検証を開始した。このプログラムには,第1段階の研究協力者が所属する15施設から参加協力が得られた。集合研修は,研究者ら作製した事前学習用教材とDVD教材を活用した講義・演習,個人・グループワークで構成した。講義・演習では,手指衛生・個人防護具着脱の基礎的知識と確かなスキルの習得をねらいとした。個人・グループワークでは,受講者各自のスキルや看護・介護場面での実践状況を振り返り,アクションプランをたてることをねらいとした。OJTは,集合研修終了後,受講者が所属部署でアクションプランを実施し,1・3・6か月後に目標の達成状況を振り返り,今後の取り組みを記入するものとした。この研修プログラムの評価は,プログラム活用者の感染管理担当看護師および研修受講者を対象に調査を実施した。前者には,院内教育の役割に関する質問紙調査と研修内容・方法等に関する半構成的面接調査を実施した。受講者には,集合研修終了後の研修内容に関する質問紙調査を実施し,アクションプランシートからはその実施状況を分析した。平成28年度においても,数施設で感染防止院内研修プログラムの検証を継続していく。中小規模病院における感染予防教育プログラムを考案し,臨床での活用を通しその効果を検証した。
ニワトリ始原生殖細胞の自己複製機構解明と培養系への応用に関する研究

始原生殖細胞(PGC)の培養技術は、配偶子の凍結保存や遺伝子操作が困難なニワトリにおいて、遺伝資源の保全や遺伝子改変のための強力なツールを提供する。しかし、従来のPGC培養法は増殖効率が低く、未だ安定的な技術とはなりえていない。本研究はニワトリ始原生殖細胞(PGC)の増殖に必要な因子とその作用メカニズムを解明し、より効率的なニワトリPGC培養技術の確立を目指したものである。申請者は、ニワトリ幹細胞因子の膜結合型アイソフォーム(chSCF2)を発現するバッファローラット肝臓(BRL)細胞をフィーダー細胞として使用することによりPGCの増殖効率を従来法の5倍以上改善できること、chSCF2によってPGCにおけるAktのリン酸化が亢進されることを明らかにしている。本年度において低分子阻害剤を用いてその分子機構を詳細に調べたところ、chSCF2はPI3K依存的なAktのリン酸化を誘導することによりPGCの増殖効果を発揮していることが分かった。さらに、chSCF2によって刺激したPGCではCyclin D1およびD2の発現上昇およびCaspase3やp53の発現抑制が起こっていた。すなわち、PI3K/Aktシグナルの活性化は、細胞周期の促進と抗アポトーシスを介してニワトリPGCの増殖に貢献していることが示唆された。続いて、chSCF2によって増殖したPGCを宿主胚へと移植した際に配偶子形成を完遂するか調べるために、生殖系列キメラを作出した。後代検定の結果、培養PGCに由来する後代を59個体中2個体得ることに成功した(3.39%)。したがって、chSCF2によって増殖したPGCは配偶子形成能を維持した状態で増殖していたことが明らかとなった。一連の知見は、chSCF2を用いたニワトリPGCの培養系が鳥類遺伝資源の保全や遺伝子導入ニワトリ作出などに極めて有用であることを示している。27年度が最終年度であるため、記入しない。本研究は、ニワトリ始原生殖細胞(PGC)の増殖機構を解明し、その知見を培養系に応用することにより、効率的なニワトリPGCの培養系を構築することを目的として行なった。1)初年度は、ニワトリPGCが増殖するために必要とする因子の探索を行い、ニワトリ幹細胞因子(chSCF)を同定した。ニワトリPGCにおいてchSCFの受容体であるKitをノックダウンするとPGCの増殖効率が大きく低下したことから、chSCFの下流シグナルはニワトリPGCの増殖に極めて重要であることが明らかとなった。また、Kitのノックダウンによって、PGCにおけるAktのリン酸化が阻害されていることも分かった。このことから、ニワトリPGCにおけるchSCF/Kitの相互作用は、PI3K/Aktシグナルを介した増殖系に寄与していることが示唆された。現在は、低分子阻害剤を用いた詳細なシグナル経路の解析を進めている。2)続いて、chSCFの使用によるPGC培養系の改良を試みた。chSCFには哺乳類と同様に分泌型(chSCF1)と膜結合型(chSCF2)のアイソフォームが存在する。よって、それぞれのアイソフォームがニワトリPGCに与える効果を検証するために、chSCF1またはchSCF2を安定発現するフィーダー細胞を樹立し、これを用いてPGCを培養した。その結果、いずれのアイソフォームも単独で使用した場合にはPGCの増殖効果が見られなかったものの、ニワトリPGCの増殖に極めて重要とされるFGF2と併用することでPGCの増殖効果を改善することができた。特に、chSCF2を用いた場合にPGCの増殖効果が最も高くなり、従来法に比べて5倍以上の増殖効果を示した。また、chSCF2によって増殖したPGCではAktのリン酸化状態が亢進していることが明らかになったため、1)の実験結果を裏付けるデータを得ることができた。

後代検定の結果、培養PGCに由来する後代を59個体中2個体得ることに成功した(3.39%)。したがって、chSCF2によって増殖したPGCは配偶子形成能を維持した状態で増殖していたことが明らかとなった。一連の知見は、chSCF2を用いたニワトリPGCの培養系が鳥類遺伝資源の保全や遺伝子導入ニワトリ作出などに極めて有用であることを示している。ニワトリPGCにおけるRNAi法の確立や低分子阻害剤の選定などに予想以上に時間がかかったものの、結果的にchSCFとKitの相互作用とPI3K/Aktの関係性を推定することができ、これらがニワトリPGCの増殖に関与している可能性を提案するに至った。また、膜結合型であるchSCF2はニワトリPGCの増殖に極めて有効であることを見出すことができ、従来の培養系に比してPGCの増殖効率を大幅に改善することができた。従来の培養系には哺乳類のSCFが使用されていたが、哺乳類のSCFとchSCFとの相同性は50%程度であり、ニワトリPGCにはあまり顕著な効果を及ぼさないことが知られていた。今回の実験で、ニワトリに由来するSCFを用いた解析を行なったことにより、ニワトリPGCに対するSCFの効果を直接的に検証できた。このことは、ニワトリPGCの培養に有用な知見をもたらすと思われる。27年度が最終年度であるため、記入しない。ニワトリPGCにおける遺伝子発現解析ならびに公共データベースの活用により、PGCの増殖に関連する分子がchSCF以外にも複数同定されている。したがって、次年度はこれらのスクリーニングを行い、ニワトリPGCにおける効果を引き続き検証する予定である。その際、本年度で開発したRNAiによる受容体のノックダウン、低分子阻害剤を用いたシグナルの阻害などを活用し、PGCの増殖機構をより詳細に理解することを目指した実験を行なう。また、chSCF2を発現するフィーダー細胞によって培養されたPGCが、正常なPGCと同様に宿主生殖巣内で配偶子分化を完遂するかどうか調べる必要があるため、生殖系列キメラを作出して後代検定を行なう予定である。
がん関連酵素の活性化に関わる亜鉛トランスポーターに着目したがん抑制に関する研究

亜鉛は生体にとって必須の微量金属であり、ヒトでは1,000種類近くもの亜鉛含有酵素が、細胞内外において生命活動に関わる種々の酵素反応を司っている。亜鉛含有酵素の中でも、がんの発症や進行に深く関わるマトリックスメタロプロテアーゼ2 (MMP2)やMMP9、オートタキシン(ATX)、カルボニックアンヒドラーゼIX (CAIX)といった酵素は、亜鉛が酵素の活性中心に配位することで初めて酵素活性を発揮する「亜鉛要求性酵素」である。申請者は本研究で、ニワトリDT40細胞を用いた標的遺伝子欠損ー発現解析を実施し、ゴルジ体内腔へと亜鉛を輸送する亜鉛トランスポーター(ZnT)が、上記がん促進性酵素の活性獲得に重要な役割を果たしていることを明らかにした。具体的に、ZnT5-ZnT6ヘテロ複合体及びZnT7ホモ複合体が、ATXの活性獲得に必須の役割を果たしていること、ZnT5-ZnT6、ZnT7両複合体が、MMP2及びMMP9の活性獲得ならびに細胞外への分泌に重要な役割を果たしていることを明らかにした。加えて、CAIXが活性を獲得するためには、ZnT5-ZnT6及びZnT7複合体に加えて、ZnT4ホモ複合体が必要であることを新規に見出した。これらの成果は、亜鉛輸送体であるZnTが、がん促進性亜鉛要求性酵素の活性獲得に重要な役割を果たすことを示した初めての知見であり、ZnTが、がん治療の潜在的な標的因子となる可能性を新たに提示したものである。申請者はH28年度、以上の成果を1報の論文にまとめ、国際誌に投稿した。28年度が最終年度であるため、記入しない。亜鉛を必須の活性補因子とする亜鉛要求性酵素の中には、がん細胞の生存・増殖・浸潤能の亢進に寄与するものが多く存在する。これまでのニワトリDT40細胞を用いた解析から、悪性度の高いがん細胞に高発現するマトリックスメタロプロテアーゼ2 (MMP2)や、カルボニックアンヒドラーゼIX (CAIX)といった亜鉛要求性酵素の活性化には、ZnT5-ZnT6ヘテロ複合体、ZnT7ホモ複合体に加え、ZnT4ホモ複合体が関与することを明らかにしている。本知見が、ヒトがん細胞においても適応されることを示すことができれば、酵素タンパク質そのものではなく、ZnT複合体や、ZnT複合体から酵素タンパク質への亜鉛の受け渡し過程を標的とするような新しい視点からのがん阻害剤の開発に繋がる可能性が考えられる。がん関連性の亜鉛要求性酵素を標的としたがんの治療や抑制を目指す上で、標的酵素の亜鉛獲得メカニズムを明らかにすることは解決すべき重要な課題の一つである。しかしながら、MMP2やCAIXをはじめ両酵素をはじめ、数多くあるがん関連性亜鉛要求性酵素の亜鉛獲機構はほとんど明らかになっていないのが現状である。そこで本研究では、まずDT40細胞で得られた知見がヒトがん細胞においても適応されるか否かを検討するための解析を実施した。加えて、MMP2やCAIX以外のがん関連性亜鉛要求性酵素にも着目し、DT40細胞を用いて上記ZnT複合体が新規に着目した酵素の活性化に寄与するか否かを検討するための解析を実施した。本研究では複数種類のヒトがん細胞を用いて、内因性のMMP2ならびにCAIXを高発現し、shRNAを用いた標的ZnTのノックダウンによって酵素活性の評価が簡便に行えるようなヒトがん細胞株のスクリーニングを実施した。しかし、内因性酵素の発現量や標的ZnTのノックダウン効率の面から、条件を満たすような細胞株を見出すことができなかった。従って、ヒトがん細胞を用いた新規の酵素活性評価系を構築する必要がある。上記解析に加え、MMP2やCAIX以外のがん関連性亜鉛要求性酵素にも新規に着目し、DT40細胞を用いてZnT4、ZnT5-ZnT6、ZnT7複合体が着目したがん関連性酵素の活性化に寄与するか否かを検討するための解析を実施した。複数のがん関連性酵素を用いて網羅的な解析実施した結果、ZnT5, ZnT6, ZnT7三重欠損株において、がん遊走因子として知られるオートタキシンの活性がほぼ完全に消失すること、酸性条件下におけるがん細胞の生存能亢進に寄与するCAXIIの活性がわずかに低下すること、そしてがん細胞の浸潤能亢進に寄与するゼラチナーゼであるMMP9の活性が低下することが明らかとなった。さらに、MMP9に関して詳細な解析を実施した結果、MMP9活性低下は、ZnTの欠損によって前駆型酵素から活性型酵素への成熟過程が阻害され、活性型酵素の発現量が低下することに起因する可能性が示唆された。また本結果を受け、MMP2に関しても再度詳細な解析を実施した結果、MMP2に関してもZnT5, ZnT6, ZnT7三重欠損DT40株において活性型酵素の発現量が低下している可能性が示唆された。すなわちZnT5-ZnT6、ZnT7複合体がMMP2、MMP9両酵素の成熟過程に寄与する共通の経路である可能性が示唆された。

亜鉛含有酵素の中でも、がんの発症や進行に深く関わるマトリックスメタロプロテアーゼ2 (MMP2)やMMP9、オートタキシン(ATX)、カルボニックアンヒドラーゼIX (CAIX)といった酵素は、亜鉛が酵素の活性中心に配位することで初めて酵素活性を発揮する「亜鉛要求性酵素」である。申請者は本研究で、ニワトリDT40細胞を用いた標的遺伝子欠損ー発現解析を実施し、ゴルジ体内腔へと亜鉛を輸送する亜鉛トランスポーター(ZnT)が、上記がん促進性酵素の活性獲得に重要な役割を果たしていることを明らかにした。具体的に、ZnT5-ZnT6ヘテロ複合体及びZnT7ホモ複合体が、ATXの活性獲得に必須の役割を果たしていること、ZnT5-ZnT6、ZnT7両複合体が、MMP2及びMMP9の活性獲得ならびに細胞外への分泌に重要な役割を果たしていることを明らかにした。加えて、CAIXが活性を獲得するためには、ZnT5-ZnT6及びZnT7複合体に加えて、ZnT4ホモ複合体が必要であることを新規に見出した。これらの成果は、亜鉛輸送体であるZnTが、がん促進性亜鉛要求性酵素の活性獲得に重要な役割を果たすことを示した初めての知見であり、ZnTが、がん治療の潜在的な標的因子となる可能性を新たに提示したものである。申請者はH28年度、以上の成果を1報の論文にまとめ、国際誌に投稿した。本研究では、解析に適したヒトがん細胞を見出すことができなかった。加えて、これまでの解析からZnT4, ZnT5, ZnT6, ZnT7をノックアウトさせた四重欠損DT40細胞株においてもMMP2、CAIX両酵素にある程度の残存活性が認められており、これを考慮すると、ZnT複合体をノックダウンしてもヒトがん細胞における顕著な標的酵素活性の低下とそれに伴う細胞生存能・浸潤能の低下が認められない可能性が考えられた。そこで本研究員は、ZnTが、がん関連性酵素の活性に与える影響をヒトがん細胞において正確に評価するためにはヒトがん細胞に発現するZnTを直接ノックアウトするアプローチが有効であると考え、今後、CRISPR/Cas9システムによるヒトがん細胞を用いた標的遺伝子欠損ー再発現実験系の新規構築を計画・実施予定である。加えて、両酵素の残存活性に寄与する因子を見出すため、DT40細胞に発現が認められる上記ZnT以外の亜鉛輸送体に着目した解析も実施する。加えて、がん関連性酵素の中で、がん遊走因子として知られるオートタキシンは、その活性がZnT5, ZnT6, ZnT7三重欠損株でほぼ完全に消失すること、マトリックスメタロプロテアーゼMMP2、MMP9は、亜鉛トランスポーターZnTの欠損によって前駆型酵素から活性型酵素への成熟過程が阻害され、活性型酵素の発現量が低下することを明らかとした。今後は、各酵素のZnTを介した活性化機構の詳細な分子メカニズムを明らかにするため解析を実施していく。またMMP2、MMP9に関しては、両酵素をそれぞれ安定発現させたDT40野生株、ならびにZnT5, ZnT6, ZnT7三重欠損株を用いてヌードマウスへの移植実験を検討、実施し、活性型酵素量の低下による腫瘍形成能の低下が認められるか否かの検討を実施する。28年度が最終年度であるため、記入しない。
単結晶刀具の為のSiC結晶成長の研究

本年度は1:単結晶材料の非劈開性の史なる向上、2:曲面形状刃先のCMP手法の確立、3:高反応性材料(主にチタン(Ti))との低接触抵抗加工の実現を目的とした。1:及び2:非劈開性と曲面形状研磨研究を進めていく間に、刃先のチッピングとCMP研磨仕上がり状態とに強い相関関係があることを見出した。単結晶材の被加工性をダイヤモンド砥石による加工抵抗により観察した結果、ドーピングによって加工抵抗が2倍以上高くなる事を見出した。しかし、チッピング特性は向上しなかった。新規に開発した曲面CMP手法によってすくい面のみではなく逃げ面のCMP加工が可能となった。その結果、チッピング耐性が劇的に向上し、3:に示すTi材の薄線加工が可能となった。3:Ti材の低接触抵抗加工の実現上記研究成果により、純Ti並びにβTiを切削速度80m/min、切り込み量0.3mmで切り屑排出量382cc/minを実現出来た。刃先の鋭利化のみではなく、刃先まで単結晶性状となっていることが最も重要であった。Ti用として市販されている超硬チップとの比較では、刃先が欠けるまでの比較において、平均で1.5倍以上の耐力を得ている。本研究期間内においては化学反応性を評価する手法の開発までには至らなかったが、切り込み深さ3μm、切削速度20m/minにおいて全く切断しない切り屑を排出することが出来た。被切削材表面は、加工直後の体感によれば室温を維持しており、薄片状の切り子が加工硬化を生じていないことから、切削抵抗を極めて小さい状態にすることが出来ていると考える。今後は更に研究を進め、切削加工における刀具と材料との化学反応状態を定量評価したい。本年度は刀具用にSiC単結晶の成長に成功し、試験切削を行うことが出来た。結果を示す。1)昇華法により、直径2インチまでの結晶成長に成功した。2)種結晶の面方位を変えて成長を行うことが出来た。基準となる(0001)面成長が最も早く、均質な結晶を得るためには種結晶の周囲にグラファイト製のガイドを設置し、一方向に優先的に成長させることが必要であることを見出した。3)切削時に生じる結晶の劈開を止めていくため、成長時にある種の元素を添加していった。その結果、添加する元素によって結晶の成長具合が異なること、成長結晶の硬度が異なること、劈開性を低下させることが出来ることを見出した。4)電気伝導度を変化させて結晶成長させることに成功した。しかし、完全に刃面を単結晶化させて電気的特性を表出させないと、電気的特性と加工特性との相関を明確にすることが出来ないことが解った。こで現在、曲面を有する単結晶刃先をCMP研磨仕上げする装置の作製に着手した。5)上述のように成長時に結晶硬度を変化させるドーピングを行うことに成功した。現在、成長後の結晶に結晶欠陥相への不純物拡散を実現するため、科学研究費補助金により購入した高温炉を用いたシステムの構築に着手している。