hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
島弧における最上部マントルの散乱特性と形成過程の解明

このことから,このモデルでは広範囲にPmP後続波が見られる観測事実を説明できないことがわかった.一方,2)のモホ面下の最上部マントルが層状構造をしているモデルや,3)のモホ面下の最上部マントルに散乱体が存在するモデルをもちいると観測事実を説明することがわかった.このことは,日本の最上部マントルが層構造をしているか,もしくは散乱体が存在している可能性を示唆する.そのため,日本の最上部マントルは,大陸地域で見られるような「透明な最上部マントル」のモデルでは説明できないこととなり,島弧の最上部マントルは不均質な構造をしており,均質で「透明な」大陸の最上部マントルと大きく異なることがわかった.日本においては,爆破地震動研究グループによって,日本全国で地殻や最上部マントルの構造を調べるために構造探査が行われてきた。本研究では,これらの波形記録を集めてデータベースを作成した。これらの測線のうち,測線長が130kmをこえる5つの測線について詳細に調べた.多くの測線において顕著なモホ面からの反射波(PmP波)とそのコーダ波が検出された.次に,その検出されたPmPコーダ波の特性について調べた.これまでの研究からPmPコーダ波の原因として考えられている、3つのモデル:1)モホ面に顕著な凹凸があるモデル、2)モホ面下の最上部マントルが層状構造をしているモデル、3)モホ面下の最上部マントルに散乱体が存在するモデル、について検討をおこない,その生成原因を調べた.その結果,1)のモホ面に顕著な凹凸があるモデルや2)のモホ面下の最上部マントルが層状構造をしているモデルでは,観測事実を説明できないことがわかった。そのため,日本の最上部マントルには散乱体が存在している可能性が示唆された.散乱体の分布を定量的に評価するため,散乱係数の推定を行った。その結果,上部地殻で0.01km^<-1>,下部地殻で0.02km^<-1>,最上部マントルで0,025km^<-1>,の値が求められた。このことは,最上部マントルには,反射的構造をしていると考えられている下部地殻より散乱体が多く存在することを示すことになる。本研究から,日本の最上部マントルは,大陸地域で見られるような「透明な最上部マントル」のモデルでは説明できないこととなり,島弧の最上部マントルは不均質な構造をしており,均質で「透明な」大陸の最上部マントルと大きく異なることがわかった.また,その成因としてマントルウェッジで形成されたマグマが上昇し,モホ面下で結晶分離作用をおこし,その結果最上部マントルに散乱体が形成された可能性を示した。
ラクタムのリビングアニオン重合による末端反応性単分散ポリアミドの合成

双環ラクタム1__の速度論的アニオン重合能を、対応する単環ラクタム、ε-カプロラクタム、および2-ピロリドンの場合と比較するため、それらの生長鎖末端モデルであるN-アシル化物の加アミン分解を同一条件下で行った。単環ラクタムの場合は環外カルボニル基のみが反応するのに対し、双環ラクタムの場合は環内カルボニル基も反応した。双環構造に由来する環歪みと、ラクタムのカルボニル基に隣接する炭素原子上のエ-テル基の電子的効果とが、1__の速度論的反応性を高めているのであろう。環内カルボニル基の反応性が最も高い1__のアニオン重合を、ジメチルスルホキシド中、25°Cで行うと、活性化モノマ-機構で副反応を伴うことなく進行した。その結果、片末端が活性化剤残基、他の末端がアシルラクタム型生長鎖末端である、構造の明確なポリアミドが単離できた。得られたポリアミドのアシルラクタム末端基を、種々の反応性末端基に化学変換して、多成分系高分子の成分として有用なポリアミドを得た。また、1__のアニオン重合の際、2551°Cで残存モノマ-と生成ポリマ-との間に平衡が成立することを確認した。そこで、触媒のピロリドンカリウム塩及びモノマ-の初濃度を低くして、1__のアニオン重合を行うことにより、M_W/M_nが1.1以下の、分子量分布が狭いポリアミドを得た。双環オキサラクタム(1__)、εーカプロラクタム(2__)、および2ーピロリドン(3__)のアニオン重合能を比較するため、それらの生長末端モデルであるNーアシル化物(4__)とnーブチルアミンとをDMF中、25°Cで反応させた。単環ラクタムの場合は環外カルボニル基のみが反応するのに対し、双環ラクタムの場合は環内のラクタムカルボニル基も反応した。ラクタムの結晶構造解析により得られた結合角の比較から、双環構造のもつ環歪みが、双環ラクタムの開環反応性を増加させているものと推測した。カルボニル基のαーメチン炭素原子上のエーテル基もカルボニル基の反応性をかなり高めるものと思われる。環内カルボニル基の反応性が最も高い1__のアニオン重合を、触媒のピロリドンカリウム塩及びモノマー初濃度を低くして、窒素雰囲気下、ジメチルスルワキシド中、25°Cで行い、生成したポリアミドを定量的に単離した。活性化剤として1__アシル化物を2mol%用いた場合、ほぼ20分で平衡重合率84%(モノマー濃度、0.36mol/l)に達した。最も注目すべき点は重合率60%以内で分子量分散がM_w/M_n=1.1前後の単分散性ポリアミド5__が得られたことである。その末端基濃度をNMRスペクトルのピーク強度比から求めて評価した数平均分子量は、重合率が増加するにつれてほぼ直線的に増加した。しかもそれらは重合反応で消費された活性化剤とモノマーの量からの計算値と一致した。以上の結果から、活性化剤が重合初期にすべて消費され、生成した生長連鎖末端が重合途中で失活しなかったと推測した。前年度に引き続き、双環ラクタム1の溶液アニオン重合を室温で行い、片末端が活性化剤残基、他の末端がアシルラクタム型生長鎮末端である、構造の明確なポリアミド2を得た。得られたポリアミド2を多成分系高分子の成分として用いるため、アシルラクタム型末端基を種々の反応性末端基に化学変換した。p-ビニルベンジルアミンとの反応の場合は、片末端にビニルベンジル基をもつポリアミドマクロモノマ-3を得た。3と2-ビニルピリジンとのラジカル共重合をDMF中で行って、ポリ(2-ビニルピリジン)を幹とし、ポリアミドを枝にもつグラフト共重合体を得た。

1のアニオン重合において、2551°Cで残存モノマ-と生成ポリアミドとの間に平衡が成立することを確認した。平衡モノマ-濃度の温度依存性を調べて、1の重合の熱力学定数を算出し、他の単環ラクタムの場合と比較考察した。1のアニオン重合では活性化剤が重合初期にすべて消費され、生成した生長鎮末端が重合途中で失活しないので、得られたポリアミド2の数平均分子量は、重合率が増加するにつれてほぼ直線的に増加した。しかもそられは重合反応で消費された活性化剤とモノマ-の量からの計算値と一致した。一方、その分子量分布は重合初期では狭く、重合時間が長くなるほど、また重合系中のアニオン濃度が高いほど拡がることがわかった。結局、本研究で用いた双環ラクタム1のように開環反応性が高いラクタムから単分散性ポリアミドを調整するには、触媒濃度を低くし、重合を初期で停止することにより、アミド交換反応及び重合一解重合平衡による繰り返し単位の再配列を抑制することが肝要であると言える。
マクロファージの腫瘍内浸潤機序の解明と単球遊走因子(MCP-1)の治療への応用

ラットに化学発癌物質であるDMBAを投与して作製した悪性線維性組織球腫や、グリオーマ、乳癌等のラット由来培養癌細胞の移植腫瘍を用い、マクロファージ亜群を認識する種々の抗体を用いてマクロファージの浸潤を免疫組織化学的に検索した結果、浸潤マイクロファージはRM-1,RM-4などの汎マクロファージ抗体と共に、TRPM-3に陽性を示し、単球由来の滲出マクロファージが主体と考えられた。これに対し、ED2,Ki-M2Rに反応する組織在住マクロファージの浸潤は、少数であった。次に、これらのラット腫瘍細胞培養上清や担癌ラット血清を用いて、サンドイッチELISAを行うと共に、腫瘍組織のNorthern blottingを施行すると、TRPM-3陽性の単球由来のマクロファージの浸潤がMCP-1の産生量と密接に関連することが明らかとなった。また、免疫染色やin situ hybridizationでは、腫瘍細胞や浸潤マクロファージからのMCP-1の産生が認められた。そこで、MCP-1とTRPM-3陽性マクロファージの浸潤との相関を見るため、リコンビナントラットMCP-1をラット皮下に投与して、浸潤マクロファージ亜群を解析すると、その多くがTRPM-3に陽性で、MCP-1によって主にTRPM-3陽性マクロファージが誘導されることが確認された。更に、TRPM-3陽性の単球由来のマクロファージの浸潤と腫瘍増殖との関連を明らかにするため、MCP-1産生量の異なる種々のラット悪性線維性組織球腫細胞株を背部皮下に移植し、腫瘍増殖とマクロファージ浸潤の程度を検索した。その結果、MCP-1の産生量が多く多数の単球由来マクロファージの浸潤を伴う腫瘍ほど、増殖速度が遅く、TRPM-3陽性マクロファージが腫瘍増殖に抑制的に働くことが示唆された。
精神病への認知行動療法フィデリティ測定法の開発と研修プログラムの効果検討

精神病への認知行動療法(Cognitive Behavioral Therapy for Psychosis:CBTp)は,海外で有効性が実証されている科学的な心理療法である.しかし,我が国で効果研究を行い,実践で提供されるCBTpの質を確保するためには, CBTpの有効な要素が提供されていることを確認するフィデリティ評価が必要である.本研究では, 1) CBTpフィデリティ測定ツールの開発, 2)研修プログラムの効果検討を目的とした.研究期間内では, 1)日本語版CTS-Psyを作成し, 2)国内外の専門家によCBTp研修ワークショップを実施,3)専門家・実践家によるスキル評価とスーパービジョン体制を整備した.精神病への認知行動療法(Cognitive Behavioral Therapy for Psychosis:CBTp)は,海外で有効性が実証されている科学的な心理療法である.しかし,我が国で効果研究を行い,実践で提供されるCBTpの質を確保するためには, CBTpの有効な要素が提供されていることを確認するフィデリティ評価が必要である.本研究では, 1) CBTpフィデリティ測定ツールの開発, 2)研修プログラムの効果検討を目的とした.研究期間内では, 1)日本語版CTS-Psyを作成し, 2)国内外の専門家によCBTp研修ワークショップを実施,3)専門家・実践家によるスキル評価とスーパービジョン体制を整備した.本研究の目的は,1)精神病への認知行動療法の客観的なフィデリティ(忠実性)測定法の開発.2)フィデリティ測定法を利用してた日本における認知行動療法フィデリティの実態調査,3)認知行動療法研修プログラムの効果評価を行い,認知行動療法において「何が」「どのように」精神病の回復に寄与しているのかを明らかにすることである本研究では,日本語版CTS-Psyを開発し,以下の3点を明らかにする.1)精神科臨床に携わる医師・臨床心理士・コメディカルスタッフに対して,日本版CTS-Psyを施行し,現状での日本の精神科臨床におけるCBTpフィデリティを測定する.現状の日本の精神科臨床へCBTpを導入するために,セラピストが強化すべき点を明らかにする.2)1)の結果に基づいてCBTp研修プログラムを作成し,研修ワークショップを実施したうえで研修プログラムの効果を評価する.3)CBTpフィデリティの改善が,実際に精神病を持つ患者の治療アウトカムの改善につながっていることを明らかにする.本年度は,研究計画の遂行に向けて,以下を実施した.・我が国のエキスパートによる精神病への認知行動療法ワークショップを実施した.・日本国内における精神病への認知行動療法エキスパートによるネットワーク(CBTpネットワーク)に参加し,情報収集を行った.・精神病への認知行動療法フィデリティ尺度(CTS-PSY)を翻訳し,国内学会におけるワークショップにて発表した.・海外のエキスパートと精神病への認知行動療法フィデリティ尺度の施行方法についてディスカッションを行い,情報収集した.今後は日本語に翻訳した精神病への認知行動療法フィデリティ尺度を実施し,実態調査と研修プログラムの効果評価を順次行い,学会発表・論文投稿を行う予定である.本研究の目的は,1)精神病への認知行動療法の客観的なフィデリティ(忠実性)測定法の開発.2)フィデリティ測定法を利用してた日本における認知行動療法フィデリティの実態調査,3)認知行動療法研修プログラムの効果評価を行い,認知行動療法において「何が」「どのように」精神病の回復に寄与しているのかを明らかにすることである.本研究では,日本語版CTS-Psyを開発し,以下の3点を明らかにする.1)精神科臨床に携わる医師・臨床心理士・コメディカルスタッフに対して,日本版CTS-Psyを施行し,現状での日本の精神科臨床におけるCBTpフィデリティを測定する.現状の日本の精神科臨床へCBTpを導入するために,セラピストが強化すべき点を明らかにする.2)1)の結果に基づいてCBTp研修プログラムを作成し,研修ワークショップを実施したうえで研修プログラムの効果を評価する.3)CBTpフィデリティの改善が,実際に精神病を持つ患者の治療アウトカムの改善につながっていることを明らかにする.本年度は,研究計画の遂行に向けて,以下を実施した.・海外のエキスパート(Paul French)による精神病への認知行動療法ワークショップを集中的に実施した.・海外のエキスパートによる精神病への認知行動療法ケーススーパービジョンを実施し,フィデリティについて確認した.また,インターネット動画通信を利用した継続的なスーパービジョン体制について協力を依頼した.・精神病への認知行動療法フィデリティ尺度(CTS-PSY)日本語版を使用し,面接録音データを基にパイロット評価を行った.・精神病への認知行動療法の施行者を育成し,東京大学医学部附属病院にて継続的に施行する体制を整備した.以上について,精神保健予防学会,統合失調症学会で発表し,雑誌論文に成果を公表した.今後は,平成24年度より,組織的に面接の録音データを収集し,ワークショップ・スーパービジョンを継続しつつ,フィデリティ評価ツールを改訂する予定である.
血管柄付同種骨移植において骨癒合後に免疫抑制を中止できるか?

血管柄付同種骨移植において,確実な骨癒合が得られた後にシクロスポリンによる免疫抑制を中止することにより骨格の支持性を獲得した後に同種移植骨の拒絶が起こった場合の移植骨の動態を検討する目的で,inbred ratを用いて実験を行った。術後8週にて移植骨と宿主骨の骨癒合が良好であることを確認した後シクロスポリンの投与を中止し,麻酔下に無菌的に大腿骨大転子部から髄内釘を抜釘した。以後移植後32週目まで骨癒合状態と移植骨の形態変化につき観察したところ、移植骨のうち脛骨は一部骨硬化・吸収像を呈する部も認めるものの骨癒合は保たれ移植側下肢の骨格の支持性は保たれた。ただし腓骨は徐々に吸収され消失した。この移植腓骨の変化は力学的要請に基ずくものと考えられた。力学的強度の評価としての破断強度は現在検討中である。血管柄付同種骨移植において,確実な骨癒合が得られた後にシクロスポリンによる免疫抑制を中止することにより骨格の支持性を獲得した後に同種移植骨の拒絶が起こった場合の移植骨の動態を検討する目的で,inbred ratを用いて以下の実験を行った.麻酔下に無菌的にDA ratの右下腿骨2cmを大腿動静脈を血管柄として採取し,同様に麻酔消毒したLewis ratの右膝部を中心として作成した2cmの骨欠損部に移植し骨をキルシュナー鋼線を用いて髄内固定する.移植骨の血管柄を宿主であるLewis ratの膝窩動静脈と吻合する.移植前日から術後8週間毎日宿主であるLewis ratの臀部にシクロスポリン10mg/Kg/dayを筋肉内注射する.術後8週にて骨癒合が良好であることを確認した後,麻酔下に無菌的に大腿骨大転子部から髄内釘を抜釘する.移植後10週目から移植後32週目まで2週ごとにLewis ratの右下肢を軟X線撮影し骨癒合状態と移植骨の形態変化につき検討した.移植骨は一部骨硬化・吸収像を呈する部も認めるものの骨癒合は保たれ移植側下肢の骨格の支持性は保たれていた.力学的強度の評価としての破断強度測定は今後行う予定である.血管柄付同種骨移植において,確実な骨癒合が得られた後にシクロスポリンによる免疫抑制を中止することにより骨格の支持性を獲得した後に同種移植骨の拒絶が起こった場合の移植骨の動態を検討する目的で,inbred ratを用いて実験を行った。
不均一磁化プラズマにおける渦の多体問題:自己組織化の機構

秩序構造の形成で特徴づけられるマクロな力学系の輸送問題は、系の構成要素である粒子の運動法則から決まるのではなく、構造のダイナミックスと相互作用から決まるはずのものである。ここにマクロ力学系の新しい物理がある。プラズマにおける渦は、それが巨視的な秩序構造になっているばかりでなく、閉じ込めという現実の課題と結び付いて輸送現象の担い手としても極めて重要である。本研究では、自己組織化のダイナミックスを明らかにすることを目的として、不均一磁化プラズマにおけるドリフト渦について次のことが調べられた。(1)渦の構造安定性渦の多体系の発展問題が数値的に調べられ、サイクロンは有限時間で壊れてしまうが、反サイクロンは長い寿命を持って生き続けることが観測された。これは反サイクロンは、渦全体の回転の方向と、構成要素の渦糸の運動方向が一致しているのに対して、サイクロンでは、外殻の渦糸が反対方向に運動するために取り残されて、壊れてしまうものである。Antipov,Nezlin,Rodrmov,Rylovたちの実験の結果とのよい一致を見た。初期にランダムに置かれた渦糸に対して、渦度が大きく、その広がりの中にすべての渦糸を飲み込むような系では、渦の再配置がおこり、格子上にきれに整列することが示されたが、理論的な解釈はなされないまま残されている。(2)渦の融合過程パリティの同じいくつかの渦糸のクラスターは、渦度が大きければ相互作用によって一つの巨大な渦へと融合していくが、あまり大きくない渦度に対しては全部の渦糸を相互作用のなかに巻き込むことが出来ないので、それぞれの単なる足し算となるに過ぎない。一方、渦度がかなり小さくなると、サイクロンはその核が融合するかわりに、外殻の渦糸をはぎ取られてしまう。これはGriffithsとHopfingerの実験の結果をよく再現している。、パリティが異なると、渦構造は不安定で壊れていく。
ソラフェニブ耐性株の樹立とその機序の解析

今回我々はソラフェニブ耐性細胞を樹立し、耐性のメカニズムを解析した。ソラフェニブ耐性細胞は、PLC/PRF5細胞を用いて作成した。シグナル伝達系のウェスタンブロット分析を行ったところ、AKT / pAKT、mTOR / pmTOR、またはERK / pERKの発現に有意差を示さなかった。しかしながら、耐性クローンにおけるABCトランスポーターMRP3の発現レベルは、親細胞と比較し有意に高かった。また耐性クローンのMRP3をsiRNAによりノックダウンした際に、ソラフェニブに対するの感受性が回復した。我々のデータは、MRP3がソラフェニブ耐性において重要な役割を果たすことを実証している。ソラフェニブは肝細胞癌の増殖や血管新生に関わるmultikinase inhibitorであり、大規模臨床試験により生存率を有意に延長することが示されたが、その奏功率はきわめて低く(23%)、耐性機序の解明と効果を予測するバイオマーカーの開発が求められている。本研究では、まず申請者がこれまでに樹立したソラフェニブ耐性株のクローニングを行い、各耐性クローンと親株を用いてヒト全遺伝子をマイクロアレイにより網羅的に解析するとともに、miRNAアレイを用いてmiRNA発現を網羅的に解析する。次いで、mRNAアレイとmiRNAアレイの結果を統合解析することにより、ソラフェニブ耐性に関わる遺伝子を同定し、その発現調節機序を明らかにする。さらに、これらの解析結果を基にソラフェニブ耐性に関わる新しいバイオマーカーを開発することを目的とした。まず肝癌細胞株PLC/PRF5をソラフェニブに持続的に暴露することによりソラフェニブに高い耐性を示す細胞株を樹立した。その後、ソラフェニブ耐性細胞の培地を除去し、PBSで洗浄し、0.2%trypsin/0.02%EDTAを添加し培養表面全体にいきわたらせ、馴化培地を添加しピペッティングにより細胞を分散し単一細胞率の高い細胞浮遊液を調整した。細胞浮遊液を馴化培地で希釈し、10cells/mlの濃度に調製し、細胞浮遊液をピペッティングしよく分散させたあと、浮遊液100μlをとって96well plateに移した。位相差顕微鏡下で、細胞が一個だけ入っているwellをマークして培養し、マークした細胞が増殖したら順次大きなwellに移し替えて継代培養を繰り返した。その結果、親株に比べてIC50が1.8倍の低耐性クローン(PLC/PRF5-R1)及び4.6倍の高耐性クローン(PLC/PRF5-R2)を樹立することに成功した。ソラフェニブ耐性クローンの樹立にやや時間を要したが、その他はおおむね順調に進展している。Preliminaryな結果ではあるがWestern blot法を用いて細胞膜トランスポーターの遺伝子発現を検討したところ親株と比較し、耐性細胞ではMRP3が過剰発現してることを確認した。今後siRNAを用いてMRP3のknock downを行い、耐性細胞のcell viabilityに変化がないか確認する予定である。肝細胞癌の悪性腫瘍に占める死亡率は全世界で第5位であり、とくに本邦をはじめとするアジアにおいて高く、有効な治療法の確立が急務である。肝細胞癌はほとんどの抗癌剤に自然耐性を示すことから、経動脈的化学塞栓療法やラジオ波焼灼療法などの局所治療を中心に行われている。一方、近年、肝癌細胞の増殖や血管新生に関わる複数のキナーゼを阻害する分子標的薬ソラフェニブが開発され、大規模臨床試験(SHARP study)により進行肝細胞癌患者の生存期間を有意に延長することが示されたがその奏効率は極めて低く(23%)で耐性機序の解明とそのバイオマーカーの開発が求められている。申請者らは、これまで肝細胞癌細胞株であるPLC/PRF5細胞をソラフェニブに持続的に暴露することによりソラフェニブに高い耐性を示す細胞株を樹立した。すなわち、親株に比べてIC50が1.8倍の低耐性クローン(PLC/PRF/5-R1)及び4.6倍の高耐性クローンを樹立した。これらのソラフェニブ耐性クローンを用いて、トランスポーターであるMRP3が過剰発現していること、MRP3をノックダウンすると感受性が回復することを示し、MRP3が耐性因子であることを明らかにした。さらに、ソラフェニブ治療を行った9例の進行肝癌症例の臨床検体を用いてMRP3の発現を調べたところ、ソラフェニブが無効であった症例ではMRP3蛋白の発現が高いことを見出した。つまり、申請者らは肝細胞癌のソラフェニブに対する獲得耐性および、自然耐性にMRP3蛋白が関与していることを見出した。耐性の機序解析を行うために必要な低耐性クローン(PLC/PRF5-R1)と高耐性クローン(PLC/PRF5-R2)の樹立に成功した。

今後、ヒト全遺伝子をマイクロアレイにより網羅的に解析するとともに、miRNAアレイを用いてmiRNA発現を網羅的に解析する予定である。肝臓学ソラフェニブ耐性クローンの樹立が予定よりやや遅延したためマイクロアレイやmiRNAアレイなどの網羅的解析を平成27年度内に行うことができなかったことが理由として挙げられる。今後は平成27年度内に行う予定であったマイクロアレイやmiRNAアレイといった網羅的解析を行い、次いで、mRNAアレイとmiRNAアレイの結果を統合解析することにより、ソラフェニブ耐性に関わる遺伝子を同定し、その発現調節機序を明らかにする。
新しいVHL結合蛋白(VBP-1)に対するモノクローナル抗体作製と機能解析

【目的背景】VBP-1遺伝子の機能解析の一つとして、VBP-1遺伝子を遺伝子操作でリコンビナント蛋白質として発現させ、それに対するモノクローナル抗体を作製し免疫分析を行い、体液中でのVBP-1遺伝子産物のレベルと疾患との関係から腎細胞癌の腫瘍マーカーとしての有用性について検討した。【方法】1;VBP-1遺伝子のリコンビナント蛋白質に対するモノクローナル抗体作製2:免疫組織学的染色3;RT-PCR 4:アフィニティカラム5;サンドイッチELISA法【結果】1;免疫組織学的染色腎細胞癌の組織学的細胞型別に淡明細胞型13例、混合型7例、顆粒細胞型3例、紡錘細胞型1例、Bellini管癌1例をABC法で染色した。染色陽性率は淡明細胞型が84.6%混合型が71.4%顆粒細胞型、紡錘細胞型、Bellini管癌は染色されなかった。2;RT-POR腎細胞癌部分ではVBP-1発現を認めるが、正常腎部分ではVBP-1の発現は見られなかった。3;アフィニティカラム健常人2人、腎細胞癌患者3人の血清より抗体アフィニティカラムで天然型の蛋白質VBP-1を抽出した。4;ELISA法腎癌患者12例の血清レベルは490nmで0.005から0.252平均0.090、正常人12例の血清レベルは0.002から0.084平均0.027と明らかに有意に腎癌患者血清で高いレベルであった。【考察】腎癌に対する腫瘍マーカーの研究は未だ摸索の域を脱しておらず、特異的な腫瘍マーカーの出現が腎癌においても要求されるところである。VBP-1を遺伝子操作リコンビナント蛋白質として発現させ、それに対するモノクローナル抗体を作製することができた。作製したモノクローナル抗体による免疫組織染色(ABC法)では淡明細胞型の腎細胞癌のみが染まった。次にRT-PCRではVBP-1のmRNAの発現が腎細胞癌組織にのみ見られた。これらのことより、VBP-1遺伝子産物は腎細胞癌とVHL遺伝子産物を介して深く関係があるようであり、VBP-1の存在を確認することが腎細胞癌を発見する一つの指標になる可能性がある。VBP-1の存在は腎臓組織からだけでなく、血清からもアフィニティカラムを用いて確認できた。3つのモノクローナル抗体が作製したサンドイッチELISAでVBP-1の血中濃度を測定できtたことから腎細胞癌の腫瘍マーカーに成りうると考えられた。【目的】VHL遺伝子は、孤発例の腎細胞癌(特にclear cell type)にも高率に変異を起こしていることが報告されている。VHL遺伝子産物に結合するヒト蛋白としElongin Cは、VHL遺伝子の機能とし転写伸展制御が注目されているが、我々も独自に2-hybrid systemにより未知の遺伝子VBP-1を単離、全構造を解析し報告した。今回、このVBP-1遺伝子の機能解析の1つとし、VBP-1遺伝子産物に対するモノクローナル抗体を作製した。【方法】VBP-1遺伝子をE.coliにトランスフェクトし得られたHis-VBP-1を抗原とした。His-VBP-1を完全フロインドアジュバンドと混合しエマルジョンを作製し、BALB/cマウスに免疫した。免疫マウスひ細胞とSP2/0を細胞融合し抗体産生ハイブリドーマを作製した。抗体精製後、腎細胞癌摘出標本を用い免疫組織学的検討(ABC法)行った。【結果】2種類の抗体産生ハイブリドーマを得た。免疫組織学的検討では、腎細胞癌特にclear cell typeの核部と一部細胞質と反応したが、他のcell typeとは、反応しなかった。【考察】腎細胞癌に対する腫瘍マーカーとして有用であると考えられた。今後、腎細胞癌患者血清を用い、サンドイッチELISA法により腫瘍マーカーとしての有用性を検討していく予定である。

【考察】腎癌に対する腫瘍マーカーの研究は未だ摸索の域を脱しておらず、特異的な腫瘍マーカーの出現が腎癌においても要求されるところである。VBP-1を遺伝子操作リコンビナント蛋白質として発現させ、それに対するモノクローナル抗体を作製することができた。作製したモノクローナル抗体による免疫組織染色(ABC法)では淡明細胞型の腎細胞癌のみが染まった。次にRT-PCRではVBP-1のmRNAの発現が腎細胞癌組織にのみ見られた。これらのことより、VBP-1遺伝子産物は腎細胞癌とVHL遺伝子産物を介して深く関係があるようであり、VBP-1の存在を確認することが腎細胞癌を発見する一つの指標になる可能性がある。VBP-1の存在は腎臓組織からだけでなく、血清からもアフィニティカラムを用いて確認できた。3つのモノクローナル抗体が作製したサンドイッチELISAでVBP-1の血中濃度を測定できtたことから腎細胞癌の腫瘍マーカーに成りうると考えられた。
懸濁物質の非球形性を考慮した沿岸域リモートセンシングアルゴリズムの開発

水中の懸濁物質の非球形性を考慮することで懸濁した沿岸域に適した植物プランクトンや懸濁物質濃度を衛星データから導出する水中アルゴリズムの開発を行うことを目的とし,タイ王国バンパコン川河口周辺海域において,無機粒子やその凝集体の粒径分布および非球形性の測定,および,海面反射率の測定を実施した.アルゴリズム開発の基礎データとして重要な非球形粒子の性状や新しい測定法により近紫外域や近赤外域を含めた海面射出輝度が得られた.水中の懸濁物質の非球形性を考慮することで懸濁した沿岸域に適した植物プランクトンや懸濁物質濃度を衛星データから導出する水中アルゴリズムの開発を行うことを目的とし,タイ王国バンパコン川河口周辺海域において,無機粒子やその凝集体の粒径分布および非球形性の測定,および,海面反射率の測定を実施した.アルゴリズム開発の基礎データとして重要な非球形粒子の性状や新しい測定法により近紫外域や近赤外域を含めた海面射出輝度が得られた.水中の懸濁物質の非球形性を考慮することで懸濁した沿岸域に適した植物プランクトンや土砂などの各懸濁物質濃度を衛星データから導出する水中アルゴリズムの開発を行うことを目的とし,下記の3項目について研究を実施した.1)無機粒子やその凝集体の粒径分布および形状の測定: 11000μm程度の大きさの無機粒子やその凝集体の粒径分布と形状を定量的に測定するため,トーマの血球計算盤を用いて,デジタルカメラを接続した光学顕微鏡で懸濁物質の画像を取得する予定であったが,この方法では一回に測定できる試料水量が限られ,多くの試料の測定を実施するには効率が悪い.そこでフローセルを用いて連続的に試料水を撮像し,自動的に画像処理を行う装置を開発することとし,試料水の導入装置,画像処理プログラムの開発を行った.2)懸濁物質の光学特性の推定:無機粒子の散乱特性を推定する際,その粒径分布をモデル化する必要がある.これまでべき関数と対数正規分布を組み合わせた関数を用いていたが,最小粒径の決定が大きく散乱特性に影響を与えていた.べき関数の代わりに一般化ガンマ関数を用いることで,最小粒径の影響を少なくすることが可能となった.3)近赤外域を含めた水中光学モデルの評価のための海面反射率の測定:近赤外域の海面反射率の測定はその波長域での海面射出放射輝度が低いことから従来の方法では困難である.そこでTanaka et.al. (2006)の方法をもとに大きさを変えたカバーを取り付けた2本の放射輝度計により海面射出放射輝度の測定を実施した.観測は有明海で実施した.従来の方法よりよい測定結果が得られたが,海面の条件が悪い場合は,データ処理が困難な場合もあった.今後,より安定した測定を実施するためにカバーへ浮体を装着するなど,改善が必要である.水中の懸濁物質の非球形性を考慮することで懸濁した沿岸域に適した植物プランクトンや土砂などの各懸濁物質濃度を衛星データから導出する水中アルゴリズムの開発を行うことを目的とし,下記の2項目について研究を実施した.1.無機粒子やその凝集体の粒径分布の測定:無機粒子やその凝集体の粒径分布を定量的に測定するため,CCDカメラを接続した光学顕微鏡でフローセルを用いて連続的に懸濁物質の画像を撮像し,自動的に画像処理を行う装置を開発を進めたが,CCDカメラのシャッタースピードに合わせて試料水の流速を決定した場合,流速が低下し試料導入のチューブ内で粒子が沈降してしまった.そのため,シャーレに試料水を入れ,静置して粒子を沈殿させた後,画像を取得するように方法を変更した.取得した画像より,自動的に画像処理を行い,粒径に関するデータを取得した.2.海面反射率(リモートセンシング反射率)の測定:近赤外域の海面反射率の測定はその波長域での海面射出放射輝度が低いことから従来の方法では困難である.そこで大きさの異なる3種類のカバーを用意し,そのうち2種類のカバーをそれぞれ取り付けた2本の放射輝度計により海面射出放射輝度の測定を実施した.カバーの大きさは用意した.船上観測を11月に有明海で,12月にタイ王国のバンパコン川河口周辺海域にて実施した.使用した2本の放射輝度計の相互補正を測定時に実施することにより,これまで測定精度が低かった近紫外域や近赤外域を含め,精度よく海面射出輝度を測定することができ,沿岸海域での海色リモートセンシングのアルゴリズム開発の基礎データとして重要なデータの取得が可能となった.
活断層上の土地利用規制をめぐる都市計画手法に関する基礎的研究:仙台都市圏の事例

本研究の成果は、大別して以下の3点である。まず、防災型土地利用規制の社会的・技術的課題の検討として、第1章では、用途地域や容積率指定等の現行都市計画制度を、防災目的に拡張適用する際の課題を整理した。また第3章では、活断層を巡る防災型土地利用規制の導入の是非について、活断層研究者を中心に行政法学者や都市計画研究者を含めた議論の展開状況を整理し、意見の対立点や導入する場合に解決すべき前提条件を検討した。第2の成果として、仙台都市圏における活断層の諸特性の把握を行うため、第2章を構成している長町-利府線の位置と活動度の地形学的検討を行い、被害推定の制度を高める際に不可欠な基礎的知見が得られた。第3の成果は、断層活動による被害と土地利用規制の検討を進めるため、防災型土地利用規制のあり方とその諸特性を、震災のリスク管理・社会的規制論との関わりから第3章・第4章で整理し、第8章の防災型土地利用計画の試案としてとりまとめた。その過程では、防災シンポジウムの参加者(280サンプル)と一般の地域住民(7地区から計564サンプル)を対象とする2種類の市民意識調査を行い、居住形態や災害経験などの防災型土地利用規制の社会的な受容可能性を左右する要因の抽出と評価を試みた。さらに補論として、ライフライン(上水道システム)が断層活動により被る被害の予測と対策の効果を解析した。なお、研究期間中に阪神大震災が発生し、仙台市の地域防災計画の改訂が進められ、当初計画していた断層活動に伴う被害予想は、行政サイドで実施されることとなり、このテーマについては割愛した。代わりに、住民意識の把握を加え、防災型土地利用規制の可能性を検討した。第一に、現行の防災型土地利用規制について、その計画技術と社会的影響を調べるため、文献・資料の収集と検討を行った。まず国内では、災害危険区域等の地域指定の事例や地区計画による土地利用規制(横須賀市の事例)の検討から、混乱している地域指定の状況と、地区計画制度による合意形成の過程が明らかになった。次に海外事例では、カリフォルニア州の活断層法(Alquist-Priolo SpecialStudies Zones Act)を中心に検討を進め、住宅市場・地価等に及ぼす防災型ゾーニングの影響を把握した。次に、ボーリングデータや、近年の考古学的発掘調査による液状化跡をも含む長町-利府線に関する資料の収集・整理を進め、仙台都市圏の詳細活断層線図の作成作業をほぼ完了した。さらに現在は、地形学的な実地調査による本断層系の次期の活動予測に着手している。最後に、地理情報システムによるデータベース化とシミュレーションを通じて断層活動による被害想定を行うため、住宅地図(別経費にて購入)と都市計画基礎調査を併用した土地利用・建物利用現況データを作成した。現在は、地盤条件と、活断層からの距離と土地利用・建物利用の相関性の分析方法の検討(バッファリングと判別分析等)と試行を行っている。なお、平成7年1月に発生した阪神・淡路大震災は、大都市直下の断層活動による地震災害であるため、本研究を進める際の重要な比較・分析対象となる。そこで、被害実態や地盤条件の影響等を調べる目的で現地調査を行うとともに、地理情報システム学会・都市計画学会等を通じて、被害状況に関するデータ収集を行っている。本年度は以下の調査研究を行ったが、平成7年1月に発生した阪神・淡路大震災は、本研究で取り上げた都市直下型震災であったため、一部研究項目を追加し、現地調査及び地理情報システム学会・都市計画学会等の研究知見の収集を合わせて行った。2.仙台都市圏における活断層の諸特性の把握2.2当該断層系の活動予測

平成6年度作業を継続し、ボーリングデータや、近年の考古学的発掘調査によって明らかになった液状化跡をも含めて、資料の組織的収集・整理とともに、地形学的観点に基づく実地調査によって、長町・利府断層系の次期の活動予測を行った。3.断層活動による被害想定と土地利用規制の検討3.1対象地域の土地利用現況等の物的環境調査平成6年度に収集した仙台市作成の土地利用現況データを利用し、仙台都市圏内の活断層とその近接地帯における土地利用現況とライフラインの敷設状況、都市施設の分布状況の物的環境を調査し、地理情報システム内のデータベースを作成した。3.2対象地域の社会経済指標の把握上記データベースに、町丁目単位の人工分布とその構成、産業構造等の社会経済属性データを付加し、対照地域の社会経済指標の分布を行った。仙台市の中でも、戦災にあっていない活断層周辺地域において、建物老朽度、道路整備率等の問題を抱える地区が多いことが確認された。3.3断層活動(直下型地震)に伴う被害想定と土地利用規制効果の予測被害発生メカニズムを検討した上で、地理情報システムが有するシミュレーション機能や、地盤条件、活断層からの距離と土地利用・建物利用の相関性の分析方法(バッファリングと判別分析等)の手法の適用可能性を検討した。尚ライフラインについては、上水道ネットワークを事例として被害推定(信頼度予測)を試みた。
HBV転写制御領域を標的とする抗HBV薬開発の為の海洋生物由来シード化合物の探索

昨年度は、HBVコアプロモーターレポーター細胞を用いてカイメン由来の抗HBV化合物metachromin Aを同定し、その抑制機序も解明した。今年度はファーストスクリーニングをHepG2.215.7細胞をスクリーニング系として用い、海洋生物由来の化合物ライブラリーから抗HBV活性を有する化合物のスクリーニングを行った。その結果、カイメン由来の化合物アレナロールがHBVの増殖を抑制することを見出した。しかし、アレナロールはあまり強い抗HBV活性が無かったため、アレナロールの誘導体20種を合成して、アレナロールより高い抗HBV活性を有する化合物の探索を行った。その結果、化合物HYTO-20がアレナロールより高い抗HBV活性を有し、更に、HBVコアプロモーターの転写活性を抑制することによりHBVの増殖を抑制することを見出した。また、HYTO-20とHBVコアプロモーターの転写抑制活性との構造活性相関を確認するために、HYTO-20の誘導体を作製し検討を行った。その結果、HYTO-20の水酸基が重要であることが判った。次に、HYTO-20のHBVコアプロモーターの転写活性抑制の機序について検討を行った。その結果、MG132を一緒にHYTO-20を処理した際に、HYTO-20のHBVコアプロモーターの転写活性抑制がキャンセルされることから、HYTO-20はHBVの転写を制御している転写因子のタンパクを分解することにより、HBVコアプロモーターの転写活性を抑制する可能性が示唆された。更に、metachromin AはHBVコアプロモーターHNF4αのタンパクの分解を促進しHBVコアプロモーターの転写活性を抑制したため、同様の機序を考えHNF4αについて検討を行ったが、HYTO-20を処理することにより細胞内のHNF4αタンパクの低下は見られなかった。研究代表者らは、HBVエンハンサーI阻害化合物の探索に必要なHBVエンハンサーIレポーター細胞を樹立するため、まず、HBVエンハンサーIレポータープラスミドの構築を行った。構築した幾つかのプラスミドについて、それぞれのエンハンサー活性を確認したところ、プラスミドpGL4.18 HBV EnhI X-Proが最も高い活性値を示した。そこで、このプラスミドをHuh7細胞に導入し、HBVエンハンサーIレポーター細胞の樹立を試みた。プラスミドpGL4.18 HBV EnhI X-ProをHuh7細胞に導入し、G418によってプラスミド導入細胞を選択した。G418耐性細胞の中で最もエンハンサー活性の高い細胞をHuh7GL4.18EnhIX-Pro AeUS細胞とし、以後、この細胞をHBVエンハンサーI阻害化合物の探索に用いた。次に、樹立したHuh7GL4.18 EnhIX-Pro AeUS細胞を用いて、エンハンサー活性を抑制する化合物の探索を試みた。化合物探索のスクリーニングソースについては、沖縄近海に生息する海洋生物の抽出物および精製化合物を用いた。沖縄近海に生息する海洋生物の抽出物100種類についてスクリーニングを行った結果、1つの海洋生物抽出物にエンハンサーIを抑制する活性があることを見出した。また、この海洋生物抽出物はHBVエンハンサーIのみならず、HBVコアプロモーターの活性も抑制した。現在、ヒットした海洋抽出物よりHBVエンハンサーI活性を抑制する化合物の分離・同定を行っている。更に、20種類の海洋生物由来の精製化合物についても検討を行ったが、HBVエンハンサーI活性を抑制するものはなかった。HBVエンハンサーIレポーター細胞を樹立し、海洋生物抽出物をスクリーニングした結果、HBVエンハンサーI活性を抑制する海洋生物抽出物を見出し、スクリーニング系としての有用性を示すことが出来た。この結果は、申請書の実験計画通りに進んでいる。今年度はHBVコアプロモーターレポーター細胞を用いて海洋生物由来テルペン系化合物15種類についてHBVコアプロモーターの転写抑制活性を検討した。その結果、沖縄県近海に生息するカイメンDactylospongia metachromia由来化合物のmetachromin Aおよび沖縄県近海に生息する未同定のカイメン由来化合物のKalihinol Eがヒット化合物として得られた。更に、これらの2つの化合物のHBV増殖抑制活性について検討したところ、metachromin AはHBVの増殖を強く抑制したが、Kalihinol Eは細胞毒性が強くHBVの増殖抑制活性は弱かった。そこで、以後、metachromin Aについて解析を進めた。次に、5種類の類縁化合物を使って構造活性相関を検討したところhydroquinone基および5位、9位の2重結合が転写抑制活性に重要な部位であることがわかった。また、metachromin AのHBVコアプロモーターの転写抑制活性の作用機序を検討したところ、metachromin AはHNF4αの転写レベルを抑制するのではなく、HNF4αのタンパクの分解を促進しHBVコアプロモーターの転写活性を抑制することを見出した。更に、metachromin AはHBVコアプロモーターのみならずHBVエンハンサーIの抑制活性もあることを見出した。沖縄近海に生息する海洋生物の抽出物100種からエンハンサーIを抑制活性するものをsクリーニングした結果、一つの海洋生物抽出物でエンハンサーIの抑制活性が見られたことを昨年度報告した。この海洋生物抽出物から抑制化合物の分画・精製を行っているが、これまでのところその単離には至っていない。海洋生物由来の化合物の中からHBVコアプロモーターを抑制しHBVの増殖を抑える化合物を見出し、更に、その抑制機序についても確認することが出来た。

従って、申請書の実験計画通りに進んでいる。昨年度は、HBVコアプロモーターレポーター細胞を用いてカイメン由来の抗HBV化合物metachromin Aを同定し、その抑制機序も解明した。今年度はファーストスクリーニングをHepG2.215.7細胞をスクリーニング系として用い、海洋生物由来の化合物ライブラリーから抗HBV活性を有する化合物のスクリーニングを行った。その結果、カイメン由来の化合物アレナロールがHBVの増殖を抑制することを見出した。しかし、アレナロールはあまり強い抗HBV活性が無かったため、アレナロールの誘導体20種を合成して、アレナロールより高い抗HBV活性を有する化合物の探索を行った。その結果、化合物HYTO-20がアレナロールより高い抗HBV活性を有し、更に、HBVコアプロモーターの転写活性を抑制することによりHBVの増殖を抑制することを見出した。また、HYTO-20とHBVコアプロモーターの転写抑制活性との構造活性相関を確認するために、HYTO-20の誘導体を作製し検討を行った。その結果、HYTO-20の水酸基が重要であることが判った。次に、HYTO-20のHBVコアプロモーターの転写活性抑制の機序について検討を行った。その結果、MG132を一緒にHYTO-20を処理した際に、HYTO-20のHBVコアプロモーターの転写活性抑制がキャンセルされることから、HYTO-20はHBVの転写を制御している転写因子のタンパクを分解することにより、HBVコアプロモーターの転写活性を抑制する可能性が示唆された。更に、metachromin AはHBVコアプロモーターHNF4αのタンパクの分解を促進しHBVコアプロモーターの転写活性を抑制したため、同様の機序を考えHNF4αについて検討を行ったが、HYTO-20を処理することにより細胞内のHNF4αタンパクの低下は見られなかった。160種の新たな海洋生物の抽出物を入手することが出来たので、今後はこれらの海洋生物抽出物について、Huh7GL4.18EnhI X-Pro_AeUS細胞を用いてHBVエンハンサーI抑制活性があるものを探索する予定である。更に、海洋生物抽出物から精製した化合物については、新たなものを入手することが出来たので、こちらについても検討する予定である。新たな海洋生物由来の化合物を入手出来たので、HBVコアプロモーターおよびエンハンサーIの活性を抑制する化合物を探索する。
北方野生果実の機能性食品成分の解明

本研究ではこれまで、北海道産野生果実の果汁試料約40種類について、血圧降下作用をアンギオテンシン転換酵素阻害を指標としてスクリーニングし、数種の果実で有望な結果を得た。また、ヒト前骨髄性白血病細胞HL-60に対する分化誘導活性試験では、上記約40種類の野生果実果汁のなかから、分化誘導率60%以上の強活性を持つ果実6種類を見出した。これらの正常細胞およびがん細胞に対する選択性を検討したところ、4種類が選択性を示し、がん予防のための食品としての可能性を示唆した。さらに、食生活の工夫によって改善が期待できる疾患としてアレルギーを取り上げ、マウス大腿骨骨髄より採取したマスト細胞の培養を試み、これに対する脱顆粒反応を、細胞外に遊離するβ-ヘキソサミニダーゼ活性によって測定した。秋田県産の海藻及び山菜計40種を試験したところ、それぞれ数種で興味ある活性が見出された。平成12年度は、海藻の中の2種類がコントロールに対して異なる値を示したことに着目した。一種類は脱顆粒反応による酵素遊離を阻害すなわち抗アレルギー効果の可能性を示し、もう一方は逆に酵素遊離が増加して、むしろアレルギー反応を促進すると解釈されるデータが得られた。これらの試料の確保を検討したところ、2種類はともに必ずしも多く食用に供されているわけではなく養殖等もなされていないが、片方は10キロ単位で入手することができた。水抽出物およびメタノール抽出物を調製し、各々の活性を確認した。有効成分の単離・構造決定を目的に、溶媒分画および各種クロマトグラフィー分画を調製し、現在それらの活性について検討中である。もう一方については現在大量入手の目途が立っていないが、今後検討して二種類の活性やメカニズムを対比する実験系として検討していく予定である。平成9年度はマタタビ果実の高血圧改善効果について、アンギオテンシン転換酵素(ACE)の阻害活性を指標として活性化合物の単離を試みた。まず、マタタビの関連植物の抽出物のACE阻害活性を測定した結果、同じマタタビ科でも、コクワ果実は活性が低く、マタタビ葉とキウイ果実にはほとんど活性がなかった。マタタビ果実の抽出物では、水抽出物が最も高い活性を示したので、ここから分離を進めた。Sephadex LH-20によるゲルろ過、続いてCM Sepharose CL-6Bによるイオン交換クロマトグラフィー、さらにNH_2系および逆相系の高速液体クロマトグラフィー(HPLC)を用いて示差屈折計検出器で分析・分離し、ほぼ純粋な活性物質を得た。現在、各種機器分析によりその構造の解明を試みているが、クロマトグラフィーでの挙動あるいは過去にACE阻害物質として報告されている化合物から類推して、低分子量のペプチド様物質ではないかと考えている。また、ゲルろ過とイオン交換クロマトグラフィーによる分離で活性が2カ所に分散したので、活性化合物が複数存在していると考えられ、現在それらについても探索中である。マタタビは加工品として食用に供されることが多いので、加工品のACE阻害活性を調査し、果実酒や砂糖漬においても活性を確認した。また熱に対しての安定性も調査し、ジャム作りにも適していると結論した。北海道産の野生果実のスクリーニングの結果から、マタタビ以外にも高血圧改善効果を示す果実エキスがあり、これらについて、マタタビの場合と同様にして活性物質の分離精製を開始した。平成10年度は、マタタビ果実の高血圧改善効果について、アンギオテンシン転換酵素(ACE)の阻害活性を指標として、水抽出物から得た活性化合物の構造決定を試みた。各種機器分析を行なったが、その構造の解明に十分な情報が得られなかった。そこで、いくつかの化学反応をして構造解析する必要が生じた。

また、血圧調節は動物の複雑な体内反応の結果なので、アンギオテンシン転換酵素の阻害のみに由来するものではなく、したがって試験管内の酵素阻害試験ばかりでなく動物実験も行なって、効果を確認する必要がある。このため活性化合物の量を確保する目的で、マタタビ果実の大量抽出と活性物質の精製を行なった。マタタビ加工品のACE阻害活性をさらに調査したが、北海道や秋田県で生産されているマタタビワインや、新潟県で生産されている塩漬では高い活性は見られなかった。ジャムや砂糖漬などの果肉を多く含む加工品に高い活性が見いだされた。北海道産の野生果実のスクリーニングの結果から、マタタビ以外にも高血圧改善効果を示す果実エキスがあり、特にコマガタケスグリ、エゾスグリなどについて、ACE阻害活性を指標として活性成分をほぼ純粋な形で得た。北海道産の数十種類の野生果実の水抽出エキスに対し、ヒト前骨髄性白血病細胞HL-60に対する分化誘導能のスクリーニングを行なったところ、いくつかの果実で活性が見いだされ、がん予防効果を持つことが示唆された。本研究ではこれまで、北海道産野生果実の果汁試料約40種類について、血圧降下作用をアンギオテンシン転換酵素阻害を指標としてスクリーニングし、数種の果実で有望な結果を得た。なかでもマタタビについては活性成分の単離精製を行い、その化学構造の解析を進めている。一方、平成10年度に行ったヒト前骨髄性白血病細胞HL-60に対する分化誘導活性試験では、上記約40種類の野生果実果汁のなかから、分化誘導率60%以上の強活性を持つ果実6種類を見出した。一般に抗がん剤の投薬治療において副作用は大きな問題で、抗がん剤のがん細胞に対する選択性が低いと、正常な細胞に対しても影響を及ぼす。そこで平成11年度には、正常ヒト臍帯静脈内皮細胞など2種の正常細胞とヒト肺がん細胞など4種のがん細胞に対する果汁試料の増殖抑制効果を比較し、がん細胞に対する選択性を調べた。結果は、HL-60への分化誘導活性を持つ6種類の果汁の中で4種類が選択性を示し、がん予防のための食品としての可能性を示唆した。食生活の工夫によって改善が期待できる疾患としてアレルギーを取り上げ、マウス大腿骨骨髄より採取したマスト細胞の培養を試み、これに対する脱顆粒反応を、細胞外に遊離するβ-ヘキソサミニダーゼ活性によって測定した。予備試験的に用いた試料は海藻エキスであるが、試験した約30種類の海藻のうち数種類に阻害活性があり、今後は果実果汁について精査していく予定である。また、ヒト前骨髄性白血病細胞HL-60に対する分化誘導活性試験では、上記約40種類の野生果実果汁のなかから、分化誘導率60%以上の強活性を持つ果実6種類を見出した。これらの正常細胞およびがん細胞に対する選択性を検討したところ、4種類が選択性を示し、がん予防のための食品としての可能性を示唆した。さらに、食生活の工夫によって改善が期待できる疾患としてアレルギーを取り上げ、マウス大腿骨骨髄より採取したマスト細胞の培養を試み、これに対する脱顆粒反応を、細胞外に遊離するβ-ヘキソサミニダーゼ活性によって測定した。
C型肝炎ウイルスNS5A蛋白質のインターフェロン抵抗性、発癌性との関連

C型肝炎ウイルス(HCV)のインターフェロン(IFN)抵抗性のメカニズムとして,我々はこれまでにHCVの非構造蛋白質NS5Aによる二本鎖RNA依存性プロテインキナーゼ(PKR)の阻害について研究を行い,以下の結果を得た。1.PKR遺伝子がGAL1プロモーターの下流にクローニングしてあるRY1-1酵母株を用いて,NS5A蛋白質のPKR活性への効果を調べた。この酵母株は,培地にガラクトースがあるとPKRが大量発現され,その結果酵母の生育が著しく阻害されるが,PKR阻害蛋白質を同時発現させると生育阻害がおこらないことが知られている。そこで,この酵母にIFN抵抗性HCV由来のNS5A遺伝子発現プラスミドを導入し,ガラクトース培地での生育を見たところ,他のPKR阻害蛋白質の場合と同様,生育が見られた。このことから,HCV NS5A蛋白質が酵母細胞において,PKR活性を阻害することが明らかになった。2.PKRは動物細胞において,蛋白質合成を負に調節する働きがある。したがって,細胞内PKRの機能を阻害すると蛋白質合成が促進される。この性質を利用して,ルシフェラーゼ遺伝子の発現を指標にしたレポーターアッセイを行い,NS5A蛋白質の効果を調べたところ,NS5A遺伝子を導入した細胞でのルシフェラーゼの合成は,他のPKR阻害蛋白質と同様に著しく促進した。以上の結果から,HCV NS5A蛋白質が動物細胞においてもPKR活性を阻害することが示唆された。C型肝炎ウイルス(HCV)のインターフェロン(IFN)抵抗性とNS5A蛋白質との関連性を調べるため以下のような実験を行い、結果を得た。1.IFN治療後もHCV陽性であった(IFN抵抗性)患者2例と、IFN治療に著効を示した(INF感受性)患者2例、合計4例のIFN投与前に採取した血清よりHCVゲノムRNAを抽出し、RT-PCRによりNS5A領域を増幅した後、塩基配列を決定した。その結果、IFN抵抗性HCV由来のNS5AではIFN感受性決定領域(ISDR)中にそれぞれ0、1個、IFN感受性HCV由来のNS5Aではそれぞれ6、7個の変異が認められ、ISDR中の変異がIFN治療の効果を決定しているという従来の説を支持する知見が得られた。2.IFN抵抗性HCV、およびIFN感受性HCV由来のNS5A遺伝子をグルタチオン-S-トランスフエラーゼ(GST)融合蛋白質発現プラスミドpGEX-2Tにクローニングし、発現プラスミドを作製した。これを用いて大腸菌内で融合蛋白質(GST-NS5A)を生産し、アフィニティー精製により部分精製標品を得た。3.2で作製したGST-NS5Aを用いて、in vitroでの二本鎖RNA依存性プロテインキナーゼ(PKR)の活性に対する効果を調べたところ、IFN抵抗性HCV由来のものではPKRの活性に対して阻害効果を示したが、IFN感受性HCV由来のものでは全く効果を示さなかった。以上より、HCVのIFNに対する抵抗性とNS5A蛋白質によるPKRの阻害との間に相関があることが明らかになった。