hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
網羅的エピゲノム解析技術システムを用いた卵巣癌化機構の解明について

また、エストロゲン関連遺伝子とインプリント制御領域に着目し、DNAメチル化と遺伝子の発現パターンと異常の頻度、程度について卵巣癌検体を用いて解析した。さらに(食)生活習慣との関連性について評価、解析した。【具体的内容】1)卵巣癌患者の登録:症例142例、対照229例。平均年齢は症例56.1歳、対照群49.5歳。2)高危険因子の解析:BMIは、統計学的に有意に増加。授乳歴は、有意にリスク低下。野菜摂取頻度の上昇は、卵巣癌のリスク低下。しかし、摂取総カロリーやBMIなどの交絡因子を考慮し解析すると有意差は消失。栄養素ではレチノール摂取量が腫瘍のリスク上昇と関連。統計学的有意差はなかったものの、ビタミンA摂取量がリスク上昇、ビタミンCはリスク低下傾向。【意義】エピジェネティックな修飾は発生プログラムに従って確立され細胞の記憶として働くが、その破綻が細胞癌化に繋がると考えられ注目されている。よってエピジェネティックスの解明は、今後の医療に新しい展開をもたらし得る大いなる可能性を秘めている。本研究は、卵巣癌の病態解明に貢献する。しかし本研究のような前方視的な研究にあっては、中途での解析は研究結果に影響する恐れがある。現在のサンプルサイズでは十分な統計学的パワー(検出力)が得られないため、腫瘍の病因について結論を導き出すことはできない。【重要性】未だ早期診断法がなく、予後不良な卵巣癌の分子機構の解明は、疾患の予防、新しい診断マーカーや創薬治療開発に新たな癌治療戦略を拓くことが可能である。DNAメチル化の変異は、栄養や環境で変化しうる可塑性を有するため、将来治療できる可能性が十分期待される。
ジョセフソンプラズマ共鳴による超伝導体の混合状態の研究

本研究は主として高温超伝導体と有機超伝導体に対してマイクロ波による「ジョセフソン・プラズマ共鳴」の実験を行うことにより超伝導層間の量子位相コヒーレンスの強さを定量的かつ直接的に決定することである。本年度は主として高温超伝導体Bi_2Sr_2CaCu_2O_8+δに対してジョセフソン・プラズマ共鳴の実験を行った。この物質は低磁場で渦糸格子が融解することが知られていたがその詳細は理解されていなかった。我々は渦糸格子の融解線の直上と直下でジョセフソン・プラズマ共鳴の実験を行い渦糸格子の融解転移にともないジョセフソン接合の強さも大きく変化することを発見した。さらに渦糸融解線直上の共鳴磁場の温度変化の結果からこの物質の渦糸液体状態では渦糸間の面間結合の強さは熱揺らぎに対してほぼ無視でき「デカップルした渦糸液体」になっていることを示すことができた。さらにBi_2Sr_2CaCu_2O_8+δに重イオン加速器を用いてコヒーレンス長程度の柱状欠陥をつくった試料に対しても同様の実験を行った。この系ではボ-ズグラス転移を起こすことが知られていたがどのようにしてボ-ズグラスが融解するかは良く解っていなかった。我々はコラムナ-欠陥中の渦糸液体には2種類の液体、すなわち「カップルした液体」と「デカップルした液体」、が存在し磁場をかけると渦糸はカップルする傾向にあることを明らかにした。これは従来の渦糸系では見ることのできなかった現象である。平成8年度は本科研費で購入したクライオスタット用、回転機構を用いて、我々が発見した高温超伝導体におけるジョセフソン・プラズマ共鳴の実験を行った。ジョセフソン・プラズマ共鳴の実験は超伝導層間の位相コヒーレンスの強さの直接的な導出を可能にする。我々はこの実験から高温超伝導体の渦糸状態についての様々な知見を得た。まずプラズマ共鳴の温度と周波数依存性から渦糸液体状態では広い温度と磁場領域にわたって渦糸はほとんどc-軸方向にデカップルしていることが明らかになった。つぎに不可逆線以下の温度ではプラズマ共鳴磁場が温度下降とともに急速にゼロになる。これは温度下降にともない渦糸の配置のランダムネスが増加することを意味している。我々はこの理由が試料のab面内の磁場勾配を反映して流れるBean臨界電流が渦糸の配置をランダムにすることを明らかにした。またBi_2Sr_2CaCu_2O_<8+δ>では低磁場で一次相転移が観測される。この相転移線以下では3次元渦糸格子状態が実現されることは分かっていたが、転移の詳細は良く分かっていなかった。本研究により転移線の直上でパンケーキ渦のガス状態になっていることがミクロな立場から明らかになった。このことから一次相転移線において渦糸格子の融解と気化(デカップリング)が同時に起こっている(昇華)ことが明らにかなった。
幼稚園から小学校への協同性の発達と教師の援助-縦断的観察による活動ごとの発話分析-

幼稚園から小学校への移行において「協同性(共通の課題目的に対して試行錯誤しながら協力して実現しようとすること)」の発達とそれに向けた教師の援助について,年長児クラスから小学校1年生までの横断的・縦断的観察を行った。幼稚園での自由遊び・集団活動と小学校でのグループ活動・一斉授業の活動タイプによる特徴を検討した結果,活動の構造は異なるが,幼稚園での経験が小学校での学習のベースになっていた。本研究では,幼稚園から小学校への移行時において,授業の成立や教科の学習の前提となる「協同性(共通の課題目的に対して試行錯誤しながら協力して実現しようとすること)」の発達とそれに向けた教師の援助について,幼稚園から小学校への縦断的観察により,具体的な活動タイプによる特徴を検討する。1年次である平成20年度は,幼稚園の年長児クラスにおいてビデオを用いた観察調査を行った。分析においては,特に自由遊びの活動に焦点を当て,協同的な遊びに向けて小集団での遊びがどのように展開し,教師がどのように援助しているのかについて検討した。エピソードごとにデータを区切り,遊びの様子を分類し,協同に向かう子どもの表現や共有の仕方を明らかにした。その結果,目の前の対象に関わる面白さを通して,子どもが互いに知識・知恵・身体・声を交わして遊びが展開する過程や,一つの目標に向けて,その手立てについて子どもが意見を出し合っていく過程,目標に向けて問題が出現する中で,教師の援助により,問題の明確化や解決策の可視化,共有化が行われていく過程や,子どもがそれぞれに小さな役割を背負い,補い合いつつ様々な方法を模索していく過程が明らかになった。幼稚園段階においては,まずは小集団の中でこのような体験を積み重ねていく必要性があることが明らかになり,教師が子どもの遊びを援助していくにあたって気をつけるべきことについて示唆を得ることができた。2年次には小学校での観察調査を行い,このような幼稚園段階での子どもの協同性が小学校にどのようにつながっていくのかを検討していく予定である。1年次には,主に幼稚園の年長児クラスの自由遊びに焦点を当ててビデオによる観察調査を行い,小集団で育成される協同性について明らかにすると共に,小学校1年生のクラスでの観察により比較検討も行い,幼小の連続性を確認した。これらを踏まえて2年次である今年度は,主に幼稚園の年長児クラスの集団活動に焦点を当てビデオによる観察調査を行い,教師が自由遊びと集団活動をつなぎ,子どもたちの時間と空間と関係をつなぐことで協同性を育成していく過程を明らかにした。特に一斉活動の前半に行われている,自由遊びの報告や相談等の話し合い場面の分析を行った結果,次の3点が明らかになった。遊びの共有場面においても問題解決場面においても,第1に一つの物や事柄を具体的な物や体験を媒介に課題や問題を共有し,第2にクラス全体で同じ体験(擬似的な追体験や未来のより良い状況の体験を含めて)を持ってみんなのものにし,第3に次回の遊び場面につながる形で話し合いを終えるという構造になっていた。日々の保育の中で,遊びの課題や問題を共有しながら次の遊びに向けてみんなで考えていくということが重ねられることで,協同性が形成されていくことが示唆された。前年度,幼稚園の年長児クラスに焦点を当て、活動における相互作用をより丁寧に分析した結果,教師が自由遊びと集団活動をつなぐことで,子どもたちの時間と空間と関係をつなぎ,協同性を育成していることが明らかになった。これを踏まえて今年度はこれらの幼児が小学校でどのように協同性を高めていくのか,フィールドワークにより検討を行った。その結果,第1に,班活動においては,幼稚園の自由遊びと異なり,メンバーを選択できず,内容も考えや製作物の交流やゲームなど決められており一定の制約があった。幼稚園においては自由遊びを集団活動につないでいくのに対して,小学校では一斉での学習活動を構成するものとして班活動が位置づけられていた。しかし子どもの経験としては,幼稚園での自由遊びで少人数でのやりとりをしてきた経験がベースになっており,私的に発話しあうことが学習の展開につながっていた。第2に,一斉授業の場面では,個々の子どもの発話をつなぐという点で,幼稚園と小学校とに共通する構造が見られた。子どもの経験としてもみんなに向けて話すよう指向ざれるという点で共通していたが,小学校では他者の話を聴いて自覚的に自分の学習活動につなぐレベルになっていた。第3に,協同性の発達を支える教師の専門性の向上として,幼稚園教諭と小学校教諭が互いの実践を知ることは幼児期から児童期への子どもの発達やそれに相応しい活動の連続性を意識することにつながっていた。またそれぞれに長期的な実践を記録として書き記して省察することが子どもの育ちや自身のあり方を見直し転換を図るという意味で専門性の向上に結びついていた。
大脳皮質における層特異的な細胞分化・神経回路形成を担う分子機構に関する研究

発生期の大脳皮質では、神経細胞が様々なタイプへと分化し、それに伴って各細胞の特徴となる遺伝子を発現する。我々はこれまでに、ネトリン受容体ファミリーメンバーの一つであるunc5h4遺伝子が皮質第4層特異的に発現することを見出した(Zhong, et. al.,2004)。Unc5h受容体は、netrin-1依存的に軸索ガイダンスおよび細胞生存を制御することが知られている。しかし、unc5h4についてはその役割が明らかにされていない上、それに対するリガンド分子も分かっていない。本研究では、まずin situハイブリダイゼーション法を用いて、発生期マウス大脳皮質におけるunc5h4遺伝子の詳細な発現パターンを解析した。その結果、unc5h4は大脳皮質一次感覚野の第4層に特異的に発現することが明らかになった。次に、リガンドの候補となるnetrin-1、netrin-3、netrin-4の脳における遺伝子発現パターンを解析したところ、netrin-4が大脳皮質においてunc5h4の発現パターンに類似しているだけでなく、視床においても強く発現することが明らかになった。さらに、結合解析により、unc5h4にはnetrin-4タンパク質が結合することが判明し、netrin-4はunc5h4のリガンドであることが示唆された。netrin-4がunc5h4を発現した皮質神経細胞に及ぼす効果を調べるため、in uteroエレクトロポレーション法を用いてunc5h4発現用プラスミドを導入した皮質神経細胞を分散培養下で観察した。その結果、netrin-4非存在下に比べてnetrin-4存在下では、unc5h4を発現させた細胞における細胞死が有意に減少した。以上より、発生期大脳ではunc5h4とそのリガンドnetrin-4が発現し、皮質細胞の生存に関与することが示唆された。大脳皮質の層構造に基づく神経回路は哺乳類を通して共通な側面を有し、脳形成の原理を内包している。中でも視床皮質投射はその結合様式や発生過程の知見が豊富で、層特異的な回路形成の分子機構を解明する上で有用な系である。これまでの研究から、視床軸索が主たる標的である第4層に投射する機構として、標的層を含む上層に軸索伸長を抑制する要因のあることが示されている。しかしながら、その分子機構については不明である。この問題を解明するために、層特異的に発現する遺伝子の探索を行い、皮質内で視床軸索の成長を制御し得る候補因子として、軸索反発因子として知られるセマホリンファミリーの一つSemaphorin-7a(Sema7a)やSema3A、接着分子であるCadherin6(Cad6)、あるいはKit ligand(KL)、Ephrin-A5が挙げられた。まず、これらのタンパク質の機能を知るために、それぞれのタンパク質を塗布した培養皿上で分散培養した視床細胞の軸索の長さを定量的に計測した。これらの内、Sema7a、KL、Ephrin-A5は濃度依存的な突起伸長活性を示した。次に、これらタンパク質の空間的な配置を模倣し、視床軸索の成長をin vitroでシミュレートすることにより、層特異的な視床皮質投射の形成機構を明らかにすることを目指した。その結果、Ephrin-A5は深層の成長活性を追加した後では、軸索伸長というよりは抑制活性を有すること、並びに、その抑制活性はin vivoで共発現するSema7a、KLによって増強されることが判明した。以上の結果は、特徴的な視床皮質投射が、層特異的に発現する複数分子の空間的な発現様式によって制御されていることを示唆している。
沖縄での長期入院精神障害者の地域移行と課題

最終年度は、新たに那覇市内1施設と中部1施設において研究協力が得られた。昨年度に加えて、地域移行の実践状況については4施設、地域移行がすすまない長期入院精神障害者9名、家族8組、受け持ち看護師等13名から質問紙及びインタビューによるデータを収集した。全施設が長期入院精神障害者の地域移行に積極的に取り組んでいると回答した。地域移行がすすまない事例は、全員が統合失調症で、年齢は65歳未満が15名、65歳以上が5名であった。在院期間は1年以上5年未満が10名と最も多く、次いで5年以上10年未満と20年以上がそれぞれ4名であった。19名が歩行などの移動能力は自立していた。11名が自宅退院を希望し、このうち9名は家族が退院を拒否していた。キーパーソンは両親が4組、兄弟が15組であった。4施設6事例の詳細な分析から、次のことがわかった。1退院を拒否する家族は、過去の本人との関係性の他に、離島などの地理的問題、高齢化に伴う介護や健康問題、経済的問題等のさまざまな事情を抱えていた。2多くの家族が治療関係者とのやり取りのなかで精神疾患や治療方針に関する情報を求めようとせず、再発におびえていた。3看護師は症状への対応について患者と話し合い、患者も努力していた。しかし、4そのような努力は社会的入院により行き場を失い、投げやりな態度へと患者を変容させていた。5患者の投げやりな態度を地域移行の好機とみて家族カンファレンスを設ける事例もあった。6かかわり方の特徴として、患者では面、家族では点という違いがあった。7面をつくっていくことが患者との治療関係の地盤固めに貢献していた。8家族との関係は別建てで進めることが可能でありそこにチーム支援の意義がある。9本人にも家族にも意識的な情報提供が求められる。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。初年度は北部、那覇近郊、島嶼の3施設において、地域移行の実践状況について1施設、地域移行がすすまない長期入院精神障害者の事例として11名、家族3組、受け持ち看護師8名から質問紙及びインタビューによるデータを収集した。3施設では長期入院精神障害者の地域移行に積極的であった。地域移行がすすまない事例は全員が統合失調症で、年齢は65歳未満が8名、65歳以上が3名であった。在院期間は1年以上5年未満が6名、5年以上10年未満が2名、20年以上が3名であった。全員が歩行などの移動能力は自立していた。11名のうち8名が退院を希望していた。このうち2名が自宅と施設に退院した。退院希望の6名のうち3名は家族の退院拒否があり、うち1名の家族が連絡がとれない状況であった。また、3名は退院先が自宅から施設へと変更となり、うち1名は自宅への退院に固執して退院がすすまない状況であった。3組の家族は両親が2組、兄弟が1組であった。各家族には過去の本人との関係性や、介護・健康問題、経済的問題などさまざまな事情を抱えていた。また、治療関係者とのやり取りから精神疾患や治療方針に関する情報を必要としていた。受け持ち看護師は、退院しない、あるいはできない理由について長期入院精神障害者と話し合い、共感的理解を伝え、本人の意向を明確化、支持するように努めていた。しかしながら、地域移行という段階では、家族との関係性がネックとなり本人との治療的関係において行き詰まり感を経験していた。沖縄県下5施設のうち、これまで3施設でのデータ収集をほぼ終えている。ただし、家族へのインタビューは、日程調整などに時間を要するほか、治療的な関係性にも影響するため、病棟管理者、受け持ち看護師等と相談を密にして慎重に進めている。地域移行の実践状況を把握するための基本的項目についてはデータがそろい次第、統計的処理をする。長期入院精神障害者と受け持ち看護師へのインタビュー内容については関連文献等をもとに分析中である。

3看護師は症状への対応について患者と話し合い、患者も努力していた。しかし、4そのような努力は社会的入院により行き場を失い、投げやりな態度へと患者を変容させていた。5患者の投げやりな態度を地域移行の好機とみて家族カンファレンスを設ける事例もあった。6かかわり方の特徴として、患者では面、家族では点という違いがあった。7面をつくっていくことが患者との治療関係の地盤固めに貢献していた。8家族との関係は別建てで進めることが可能でありそこにチーム支援の意義がある。9本人にも家族にも意識的な情報提供が求められる。最終年度は、中南部および島嶼の2施設でのデータ収集を行い、合計5施設のデータをもとに、長期入院精神障害者の地域移行における課題を明らかにしていく予定である。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
核磁気共鳴(NMR)による局所脳循環・代謝測定法の開発と実験モデルへの応用

まず、ウサギにてH_2^<17>O(水-17)と^<17>O NMRspectroscopyによる全脳血流量の測定に成功した。続いて、^2H_2O(重水)と^2H chemical shift imagingによるlCBFの測定を試み、これもほぼ成功した。まず、ウサギにて^<17>O_2(酸素-17)ガスと^<17>O NMRspectroscopyによる全脳酸素消費量の測定に成功した。続いて、酸素-17ガスと^<17>0 chemical shift imagingによるlCMRO_2の測定を試み、これもほぼ成功した。NMRにて脳グルコース代謝率を測定するため、^<13>Cで標識したグルコースをトレーサとしてラットに投与し、その脳内代謝産物を、検出感度の低い^<13>C NMRではなく、感度の高い^1H NMRにて検出する方法を開発した。グルコース代謝や酸素代謝と密接に関係しているエネルギー代謝を評価すべく、^<31>P NMRを用いて、主に肝臓での内因性ATPの増減と、それに対する麻酔薬や血圧効果薬等の薬物効果を、ウサギを用いて検討した。5.その他、本研究に関連して、以下の2つの研究を行った。(1)MRI検査時の麻酔管理臨床で行われるMRI検査時の麻酔管理の方法を、特にモニターを中心にして考察した。ラット中大脳動脈閉塞モデルを作成し、閉塞部分の血流に及ぼす血管拡張薬の影響を検討した。以上の研究により得られた知見は、脳循環・代謝の研究を発展させていく上で非常に有益であり、3年間の研究成果として十分な物であると確信する。酸素ー17核磁気共鳴(^<17>O NMR)による脳血流量ならびに脳酸素消費量の測定法を開発するとともに、^<17>O NMRの二次元画像化をも試みた。1.脳血流量の測定:磁場強度2万ガウス(2テスラ)の動物実験用NMR装置内に留置したウサギに、その頚動脈より20%H_2^<17>O(水ー17)1mlを注入し、注入前後で4秒毎に連続100回、直径3.5cmの表面コイルを用いて、ウサギ頭部からの^<17>OのNMR信号を採取した。脳血流量は、採取した信号の減衰曲線より水ー17の脳内クリアランスを求め、算出した。結果は、0.62ml/min/gで、これまで報告されてきた値にほぼ一致し、^<17>ONMRによる脳血流量測定法の妥当性が示された。2.脳酸素消費量の測定:脳血流量の測定の場合と同様の準備を行った後、人工呼吸器と閉鎖回路を用いて、酸素ー17ガスをウサギに5分間吸入させ、吸入前後で、脳血流量測定の場合と同様、ウサギ頭部からの^<17>ONMR信号(酸素ー17ガスが脳組織で代謝を受けて変化した水ー17の信号)を採取した。脳酸素消費量は、採取した信号の増加曲線より脳組織での増加分を求め、算出した。結果は、2.9micromole/min/gで、これまで報告されてきた値にほぼ一致し、^<17>O NMRによる脳酸素消費量測定法の妥当性が示された。3.^<17>O NMRの二次元画像化:脳血流量の測定ならびに脳酸素消費量の測定の場合と同様の準備を行った後、ウサギに20%H_2^<17>O(水ー17)3mlを注入し、注入前後で化学シフトイメ-ジング法によるウサギ頭部の^<17>O NMRイメ-ジングを試みた。注入前後とも、約1時間かけて画像を採取した結果、注入前では不鮮明な頭部画像しか得られなかったが、注入後では鮮度を増した画像が得られた。

重水素核磁気共鳴( ^2H NMR)による脳梗塞モデルでの血流分布の評価、リン核磁気共鳴( ^<31>P NMR)と^2H NMRによる人為的低血圧施行時の肝血流量の測定と肝エネルギー代謝の評価ならびに超高速NMR画像(EPI)による脳梗塞モデルでの薬物効果の判定を行った。1. ^2H NMRによる脳梗塞モデルでの血流分布の評価:ウサギ脳梗塞モデル作成し、磁場強度2テスラの動物実験用NMR装置内に留置した。99.8% ^2H_2O(重水)10mlを静脈注入し、注入前後での脳内重水分布の変化を、化学シフトイメージング法(CSI)を用いて画像化し、評価した。結果は、健常部に比し梗塞部での重水の分布が著明に低下しており、この方法による局所脳血流量測定の可能性が示唆された。2. ^<31>P NMRと^2 NMRによる人為的低血圧施行時の肝血流量の測定と肝エネルギー代謝の評価:ウサギにプロスタグランディン(PG)またはニカルジピン(NC)を用いた人為的低血圧を施し、その間の肝血流量の変化を重水と^2H NMRを用いて測定し、一方で肝エネルギー代謝の評価を^<31>P NMRを用いて行った。結果は、PG、NCともに低血圧時の肝血流量の低下は見られたが、PGではNCと異なり、この間の肝エネルギー代謝の悪化は見られなかった。この方法は、脳エネルギー代謝の評価にも応用可能と考えられた。3.EPIによる脳梗塞モデルでの薬物効果の判定:ラット中大脳動脈閉塞モデルを作成し、梗塞発生より4日目に実験を行った。ラットを動物実験用NMR装置内に留置し、PGまたはplacebo投与前後でEPIによる頭部撮影を行い、薬物効果を判定した。結果は、PG投与により梗塞部での血流低下が著明に改善し、PGが梗塞巣の血流改善に有効であることが分かった。この方法は、臨床応用も可能と考えられた。1.重水素(^2H)CSI法によるlCBFの測定:ウサギに動静脈カニュレーションを施し、磁場強度2テスラの動物実験用核磁気共鳴(NMR)画像診断装置内に留置した。まず、^2H CSI法にて約2分をかけてウサギ頭部の重水素画像を撮影した。次に、99.8%重水5mlを約40秒かけて静脈注入し、注入開始とともに再び^2H CSI法にて約2分かけて頭部画像を撮影すると同時に、この間10秒毎に12回動脈血を採血した。採血した動脈血サンプルは、画像診断装置とは別の高分解能NMR装置を用いて、その中に含まれる重水濃度を測定した。重水注入による頭部画像の信号強度の変化と、重水注入中の動脈血重水濃度の変化からオートラジオグラフィー法にてlCBFを算出した。この方法により求めたlCBFは、過換気、低換気等によるlCBFの変化を良く反映した。2.酸素-17(^<17>O)CSI法によるlCMRO_2の測定:まず、上記の方法にて予めlCBFを算出したウサギを用い、約20分かけて頭部の酸素-17画像を撮影した。次に、45%酸素-17ガスを約20分吸入させ、吸入開始とともに再び^<17>O CSI法にて約20分かけて頭部画像を撮影すると同時に、この間1分毎に20回動脈血を採血した。採血した動脈血サンプルは、再び高分解能NMR装置を用いて、その中に含まれる水-17濃度を測定した。酸素-17ガス吸入による頭部画像の信号強度の変化と、酸素17ガス吸入中の動脈血水-17濃度の変化
俳句の類似度判定を支援するデータベースシステムの開発

本研究は、俳句データベースに蓄積されたデータと、エキスパート(選者)の評価基準を駆使して、新たな俳句が既存の俳句に類似している度合いを自動判定するシステムを開発することが最終目的である。そのため、(1)既存の俳句をデータベース化するためのデータベース構造を究明し、入手可能なできるだけ多くの俳句をデータベース化すること、(2)個々の俳句の特徴(たとえば季語)に照らしての分類や真贋判定する選者(エキスパート)の知識をルール化すること、及び(3)それらを一体化したシステムを開発することを目指している。本年度は次のように研究を進めた。1.季語データベースによる俳句の季語の特定季語データベースに登録された季語により適当に選んだ俳句の季語をどれくらいの割合で特定できるか、実際にマッチングテストを行った。マッチング方法の検討からはじめ、2つの歳時記に共通の季語1,542語で448句のサンプル俳句の訳65%の季語を特定できるという結果を得た。同時に、季語が特定できた時にどのような研究が可能となるか、一例として、俳句選者による季節及び事項の嗜好に関する分析結果を示した。2.季語データベースの増補次に、季語データベースを用いて俳句の季語を特定する場合の、特定率の向上について、季語を追加することによる特定率の変化を調べた。その結果、季語を増やせば、俳句の季語の特定率が上昇することを明らかにできた。ただし、約10,000語で90%の俳句を特定できた後、季語数の増加は特定率の向上にそれほど寄与しないであろうことを見いだした。つまり、特定率を90%で十分とするならば、1万語以上の季語データベースは必要ないという結論を得た。以上の一連の研究については、情報処理学会の人文科学とコンピュータ研究会において発表した。1.季語データベースの構築俳句は必ず季語あるいは季題と言われる語を1語含んでいる。その言葉があることにより、その文章(五七五文)が俳句であるかどうか、何の季節を読んだ俳句であるかを判定できる。つまり、その句が季語を含んでいるかどうかは重要なポイントであり、研究の前段階として、季語のデータベースを構築しておくことは必要不可欠である。ここでは、角川書店の『季寄せ』を材料として季語データベースを構築した。2.俳句データベースの構築本研究では、毎年三重県上野市で開催される芭蕉祭に献句される児童・生徒及び一般の入選句のうち過去12ヶ年分のデータの提供を受け、データベース化を行った。データベース化に際しては上の句、中の句、下の句に分割し、かつ、漢字には読み仮名を振った。
超臨界二酸化炭素による飛灰中のダイオキシン類の抽出除去に関する研究

本研究では、飛灰からの超臨界二酸化炭素による有機塩素化合物の抽出除去を目的とした基礎的な実験を行った。今回は安全性の観点からダイオキシン類の前駆物質であるクロロベンゼンをモデル化合物に選び、マトリックスしてシリカゲルにクロロベンゼンを添加したものを固体試料として準備し、抽出実験を行った。抽出条件として温度、圧力、エントレーナーなど抽出に有利な条件を検討し、さらに実際の飛灰への適用も試みた。また対照として同じ飛灰をソックスレ-抽出し、超臨界二酸化炭素による抽出結果と比較した。これらの実験により、次のような知見が得られた。(1)捕集溶媒としたトルエンにクロロベンゼンを捕集する際、二酸化炭素の気化により曝気状態となるが、それにともなうクロロベンゼンの揮散は認められなかった。(2)シリカゲルからのクロロベンゼンの回収実験に関しては、圧力が高いほど、温度が低いほど、クロロベンゼンの回収量は多くなる傾向にあり、300atm、50°C、45分のときに最もクロロベンゼンの回収量が多かった。(3)シリカゲルのような吸着力の弱い固体試料からはクロロベンゼンを抽出できた。しかし飛灰からはまったくクロロベンゼンを抽出できなかった。(4)今回の実験条件ではエントレーナー添加によるシロロベンゼンの回収量の増加は認められなかった。
リポ蛋白リパーゼトランスジェニックウサギを用いた抗肥満・抗糖尿病のメタボロミクス

リポ蛋白リパーゼトランスジェニックウサギ(LPL-Tg)は、肥満・糖尿病になりにくい特徴をもつ。LPL-Tg群とコントロール群の骨格筋の代謝物質を網羅的に測定した結果、40種類の濃度の異なる代謝物質が見つかった。これらは、TCAサイクル、尿素サイクル、アミノ酸代謝、カルニチン代謝等に関与するものであった。特に、N-Acetylneuraminic acid濃度の増加はエネルギー消費の亢進と関連し、一方、シスタチオンの増加はエネルギー消費の抑制と関連した。加えて、メチオニンの増加はインスリン抵抗性の改善と関連した。これらの代謝物質の増加または低下が抗肥満・抗糖尿病の重要なメカニズムと考えられた。リポタンパク質リパーゼトランスジェニックウサギは、高脂肪食誘発性の肥満や糖尿病になりにくい性質をもっている。さまざまな器官の中でも骨格筋は、エネルギー消費と血中からの糖取り込みの両者において中心的な役割を果たす器官であり、研究代表者は、リポタンパク質リパーゼトランスジェニックウサギの抗肥満・抗糖尿病という好ましい特徴は骨格筋に起因すると考えている。本年度は、リポタンパク質リパーゼトランスジェニックウサギ(n=9)とコントロールウサギ(n=9)に高脂肪食(16週間)を与えた後、骨格筋(腓腹筋の赤色部分)を採取し、骨格筋サンプルに前処理を行った後、Capillary Electrophoresis Time-Of-Flight Mass Spectrometry (CE-TOFMS)を用いてメタボローム解析を実施した。検出されたピークから165種類の代謝物濃度をリポタンパク質リパーゼトランスジェニックウサギとコントロールウサギで比較した結果、38種類の代謝物がリポタンパク質リパーゼトランスジェニックウサギでアップレギュレートまたはダウンレギュレートしていることを見出した。同定された38種類の代謝物の多くは、アミノ酸代謝、糖代謝、TCAサイクルに関係するものであった。それらの代謝物を産生する代謝経路が抗肥満・抗糖尿病という特徴を発揮するために重要な役割を果たしている可能性や、加えて、同定された代謝物の中に、代謝物自体がエネルギー消費の増大させたり、または血中からの糖取り込みを促進するはたらきをもつものがある可能性などについて考察し、なぜ、リポタンパク質リパーゼトランスジェニックウサギが高脂肪食誘発性の肥満や糖尿病に対して抵抗性を示すのかを追求したい。平成25年度に、CE-TOFMS(Capillary Electrophoresis Time-Of-Flight Mass Spectrometry)を用いて、リポ蛋白リパーゼトランスジェニックウサギ(n=9)とコントロールウサギ(n=9)の骨格筋組織(腓腹筋の赤筋部位)のメタボローム解析を終了した(165種類の骨格筋代謝物質の濃度レベルを測定[165種類のうち、98種類はカチオンモード、67種類はアニオンモード])。その次のステップとして平成26年度は、リポ蛋白リパーゼトランスジェニックウサギが有する好ましい糖代謝・エネルギー代謝に関与する可能性がある骨格筋代謝物質を同定することを目的として、骨格筋メタボロームとそれと同時に測定された糖代謝指標とエネルギー代謝指標について相関解析を行った。HOMA(Homeostatic Model Assessment:空腹時の血糖値とインスリン濃度の積)や静注糖負荷テストにより評価されたインスリン抵抗性(血糖曲線下面積とインスリン曲線下面積の積)を糖代謝指標とし、二重標識水法(水を構成する水素と酸素を安定同位体で標識)により測定されたエネルギー消費量をエネルギー代謝の指標とした。統計解析ソフトSASを用いて統計解析を行った結果、クエン酸やリンゴ酸などTCAサイクルに係る骨格筋代謝物質のレベルは一貫してインスリン抵抗性指数との間に統計的に有意な負の相関が認められた。一方、NADHレベルはインスリン抵抗性指数と正に相関し、逆にエネルギー消費量とは負に相関することが分かった。加えて、グリセロール等、エネルギー消費量と有意な相関関係が認められる12種類の骨格筋代謝物質を見出すことが出来た。骨格筋代謝物質とフェノタイプ(静注糖負荷テストにより評価された糖代謝指標と二重標識水法により測定されたエネルギー消費量)の関連についての検討を行った。リポ蛋白リパーゼトランスジェニックウサギとコントロールウサギの横断的な比較(Welchの検討を使用)で有意な差が認められた40種類の骨格筋代謝物質を対象として、上述のフェノタイプとの相関(スピアマンの順位相関係数を使用)を調べた結果、糖代謝指標とエネルギー消費量の両者と相関が認められた骨格筋代謝物質が11種類(メチオニン等)、糖代謝指標と相関が認められた代謝物質が9種類(クエン酸等)、エネルギー消費量と相関が認められた代謝物質が7種類(ロイシン等)見出された。これら27種類の骨格筋代謝物には、単に良好な代謝(すなわち、抗糖尿病・抗肥満)の結果を反映しているものもあるが、良好な代謝の原因となっているものも含まれている可能性がある。今後は、同定された27種類の骨格筋代謝物質の中から、抗糖尿病・抗肥満の原因となる骨格筋代謝物の発見を目指したい。当初の計画通りに進んでいるから。リポタンパク質遺伝子を全身で高発現するリポタンパク質トランスジェニック(LPL-TG)ウサギは、高脂肪食により誘発される肥満・糖尿病になりにくい代謝的特長をもっている。LPL-TGウサギ(n=9)とコントロールウサギ(n=9)に高脂肪食(16週間)を与えた後、骨格筋(腓腹筋)を採取し、CE-TOFMS質量分析装置を用いて骨格筋メタボローム解析を実施した(165種類の骨格筋代謝物質の検体間の相対濃度を測定)。

同時に、二重標識水を用いたエネルギー消費量の測定と静注糖負荷テストによるインスリン抵抗性の評価を行った。骨格筋代謝物質の濃度を2群間で比較した結果、LPL-TGで有意に高値あるいは低値を示す40種類の代謝物質を見出した。例えば、LPL-TGのではペントースサイクル、アミノ糖経路、TCAサイクル、尿素サイクル、プロリン/ヒスチジン経路にかかわる代謝物質の濃度が有意に高値を示し、一方、カルニチン関連の代謝物質、シスタチオニン、サルコシンの筋中濃度は低値を示した。従って、骨格筋のこれらの代謝経路が抗糖尿病・抗肥満に関与する可能性が示唆された。加えて、エネルギー消費量と有意な相関が認められた代謝物質が18種類、インスリン抵抗性指数と有意な相関が認められた代謝物質が21種類見つかり、エネルギー消費量・インスリン抵抗性の制御に関わる有力な候補代謝物質と考えられた。更に、LPL-TGの骨格筋細胞で特に高濃度で存在する代謝物質は、血中に放出され抗糖尿病・抗肥満効果を発揮する可能性があると考えられたので、これらの代謝物の絶対濃度についても検討を加え、セリン、リンゴ酸、アルギニン等の代謝物質がコントロールと比較してLPL-TGの方で相対的に濃度が高くかつ絶対濃度も高いことが分かった。これらの研究成果について国際学会(ラスベガス、米国)や2つの国内学会(京都大学、佐賀大学)で口演を行った。リポ蛋白リパーゼトランスジェニックウサギ(LPL-Tg)は、肥満・糖尿病になりにくい特徴をもつ。LPL-Tg群とコントロール群の骨格筋の代謝物質を網羅的に測定した結果、40種類の濃度の異なる代謝物質が見つかった。これらは、TCAサイクル、尿素サイクル、アミノ酸代謝、カルニチン代謝等に関与するものであった。特に、N-Acetylneuraminic acid濃度の増加はエネルギー消費の亢進と関連し、一方、シスタチオンの増加はエネルギー消費の抑制と関連した。加えて、メチオニンの増加はインスリン抵抗性の改善と関連した。これらの代謝物質の増加または低下が抗肥満・抗糖尿病の重要なメカニズムと考えられた。当初の計画通りに進んでいるから。骨格筋組織や血液サンプルの代謝物解析の追加、免疫染色実験等の追加、国際学会発表等での成果発表や論文投稿のために使用する予定である。運動生理学研究成果を国際学会で発表し、論文を作成する。必要に応じて骨格筋や血清の特定の代謝物質の測定を追加する。当初の計画どおりに進んでいるから。今年度は骨格筋代謝物とフェノタイプ(静注糖負荷テストにより測定されたインスリン感受性や二重標識水法により評価されたエネルギー消費量等)の関連について統計的な解析(統計ソフトSASを用いた解析)と解析結果の解釈を中心に行ったために、実験試薬などの物品費の支出が当初の予定より少なかったため。今年度は、これまでに行った実験の結果を一旦整理し、次年度に実施すべき追加実験について考察することを主に行ったので、実験に関する費用がかからなかった。
光の軌道角運動量を用いた巨視的量子相関ダイナミクス探索

本研究では、高温超伝導体(Bi2212)を主な測定対象とし、光渦パルス励起によって発生するキャリアの軌道角運動量(OAM)ダイナミクス観測の実現、および観測結果にもとづく高温超伝導の物性探索を目的として研究を進めてきた。昨年度までに光渦パルスの持つ光のOAMにより誘起されるキャリアのカイラリティ変化を時間分解ポンププローブ分光による過渡応答(OAM応答)として検出することに成功したが、本年度はOAM応答の起源解明を目的とした調査を進め、超伝導相転移温度(Tc)以上で発現する量子ゆらぎとの関係性を明らかにした。以下にその具体的内容をまとめる。光渦パルス励起で観測されるBi221の超伝導応答とOAM応答の緩和時間には顕著な違いが見られ、光渦パルス励起が超伝導状態に変化をもたらすことが示される。また超伝導応答はTc以上でクーパー対形成に起因する量子ゆらぎを反映した残留応答を示すのに対し、OAM応答はTc以上で消失する。このことは光渦パルス励起による量子ゆらぎの抑制を意味する。過渡応答における量子ゆらぎの寄与を明らかにするため、超伝導飽和強度(光照射領域全体のクーパー対を破壊する強度)で観測される過渡的常伝導相の対称性解析を行った。時間依存ギンツブルグ-ランダウモデルにもとづく秩序変数解析を実施し、その時間発展からクーパー対の初期形成時に特徴的な量子ゆらぎ応答が存在することを明らかにした。OAM応答に見られる量子ゆらぎの抑制は、この初期過程の抑制に対応すると考えられる。他方、この考察に基づけば、Tc以下で観測されるOAM応答は超伝導に誘起されるコヒーレントなカイラリティ変化を反映することになる。すなわち本研究手法を基盤としたユニークな光渦パルス誘起相制御への展開を開拓できた。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では、超短パルスポンププローブ分光で得られるキャリアダイナミクスを通して高温超伝導物性の主要課題である秩序形成機構および自発的対称性破れの起源と発現機構を明らかにする。従来のポンププローブ分光を上記目的に特化させるため、本研究では軌道角運動量を持つ光渦に着目し、光渦パルス励起によるキャリアの軌道角運動ダイナミクス観測を実現する。初年度は1)軌道角運動ダイナミクス励起・検出を目的としたポンププローブ分光測定系を典型的な高温超伝導試料であるBi2212に対して構築するとともに、キャリアダイナミクスに現れる対称性破れの本質解明のため、2)有機超伝導試料に対する偏光ポンププローブ分光を用いた系統的実験を実施した。1)に関して、キャリアの軌道角運動成分検出を実現するため、光渦パルスを用いたポンプ光の軌道角運動量変調を実現し、これに同期したプローブパルスの変化成分を軌道角運動量にもとづく横モード分解光学系を構築し、検出を行った。超伝導ギャップおよび擬ギャップ形成温度を含む過渡応答の温度特性および超伝導飽和に起因する励起強度依存性変化から、Bi2212試料では、主に偏光変調を反映した信号が支配的に得られることが明らかとなった。2)に関しては、電子相関の異なる4種類の試料を対象に、偏光応答を利用した対称性破れを各試料に対して検出し、主に温度特性を中心に解析・考察を実施した。重要な結果として臨界点から大きく離れた試料で著しい差異が温度依存性に確認され、電子相関との関連から考察を行った。銅酸化物試料とは異なり、電子相関が本質的な役割を果たす有機試料において、得られた結果は光誘起相分離が量子揺らぎの影響を反映することを示唆している。研究計画に従い、軌道角運動ダイナミクス励起・検出を目的としたポンププローブ分光測定系を典型的な高温超伝導試料であるBi2212に対して構築した。軌道角運動量にもとづくキャリアのダイナミクス変化は得られていないが、一般的なポンププローブ分光における過渡反射率応答とは明確に異なる応答信号が得られ、超伝導ギャップおよび擬ギャップ形成温度を含む温度特性から、対称性変化にもとづく偏光変調を反映した過渡応答と考えている。この結果を踏まえ、系統的探索を引き続き実施することにより、高温超伝導物性の主要課題である秩序形成機構および自発的対称性破れの起源と発現機構解明への展開が期待できる。本研究では、ビスマス(Bi)系高温超伝導体を主な測定対象とし、軌道角運動量を持つ光波である光渦パルス励起によって発生するキャリアの軌道角運動ダイナミクス観測を実現する。瞬時励起されたキャリアの軌道角運動が系の大域性を反映することに着目し、そのダイナミクスを通して高温超伝導物性の主要課題である秩序形成機構および自発的対称性破れの起源と発現機構を明らかにすることを目的としている。本年度(2年度)は初年度に構築したポンプ光の軌道角運動量変調によるポンププローブ分光測定系を改良することにより、Bi高温超伝導体試料に対してキャリアの軌道角運動を反映する過渡反射率変化の検出に成功した。軌道角運動量変調の際に重畳する偏光変調応答をキャンセルする機構(偏光変調を二重に行う機構)を導入し、軌道角運動応答成分のみを高感度に選択検出する分光光学系を構築した。これをBi高温超伝導体試料測定に適用し、超伝導転移温度以下の低温において、微弱ではあるが従来の超伝導ギャップを反映したキャリア緩和とは明らかに異なる反射率変化応答を得た。

実験結果は瞬時励起されたキャリアの軌道角運動が異なるカイラリティを持つ超伝導状態を増強、もしくは同符号の超伝導状態を抑圧することを示唆している。また並行して光の軌道角運動量を活用した物質制御応用を目的とし、微小共振器半導体レーザーを対象とした発振モードの軌道角運動量制御にも取り組んだ。外部共振器に含まれる空間位相変調により、レーザーからの軌道角運動量を持つ光波(光渦)の発振制御を実現した。異なるカイラリティを持つ発振制御は空間位相変調のカイラリティに追随することが確認され、光渦を制御光波とするコヒーレント相関制御への展開を示すことができた。研究計画に従い、光渦パルスによるポンププローブ分光測定を巨視的量子相関が物性の本質的役割を担う高温超伝導試料(Bi2212)に対して実施し、本研究の主要課題であるキャリアの軌道角運動を反映する過渡反射率変化の検出に成功した。さらに光の軌道角運動量を活用した展開研究として、微小共振器半導体レーザーを対象とした発振モードの軌道角運動量制御にも成功した。以上の実績を踏まえ、本研究課題は順調に進んでいると考える。本研究では、高温超伝導体(Bi2212)を主な測定対象とし、光渦パルス励起によって発生するキャリアの軌道角運動量(OAM)ダイナミクス観測の実現、および観測結果にもとづく高温超伝導の物性探索を目的として研究を進めてきた。昨年度までに光渦パルスの持つ光のOAMにより誘起されるキャリアのカイラリティ変化を時間分解ポンププローブ分光による過渡応答(OAM応答)として検出することに成功したが、本年度はOAM応答の起源解明を目的とした調査を進め、超伝導相転移温度(Tc)以上で発現する量子ゆらぎとの関係性を明らかにした。以下にその具体的内容をまとめる。光渦パルス励起で観測されるBi221の超伝導応答とOAM応答の緩和時間には顕著な違いが見られ、光渦パルス励起が超伝導状態に変化をもたらすことが示される。また超伝導応答はTc以上でクーパー対形成に起因する量子ゆらぎを反映した残留応答を示すのに対し、OAM応答はTc以上で消失する。このことは光渦パルス励起による量子ゆらぎの抑制を意味する。過渡応答における量子ゆらぎの寄与を明らかにするため、超伝導飽和強度(光照射領域全体のクーパー対を破壊する強度)で観測される過渡的常伝導相の対称性解析を行った。時間依存ギンツブルグ-ランダウモデルにもとづく秩序変数解析を実施し、その時間発展からクーパー対の初期形成時に特徴的な量子ゆらぎ応答が存在することを明らかにした。OAM応答に見られる量子ゆらぎの抑制は、この初期過程の抑制に対応すると考えられる。他方、この考察に基づけば、Tc以下で観測されるOAM応答は超伝導に誘起されるコヒーレントなカイラリティ変化を反映することになる。すなわち本研究手法を基盤としたユニークな光渦パルス誘起相制御への展開を開拓できた。キャリアの軌道角運動ダイナミクス観測をポンププローブ分光に対して実現するため、初年度は光渦を用いた軌道角運動ダイナミクス励起・検出測定系をBi2212試料に対して構築し、基礎的な測定結果を得た。超伝導ギャップおよび擬ギャップ形成温度を含むキャリアダイナミクスの温度特性から、主に偏光変調を反映した過渡応答が得られることが明らかとなり、本年度は引き続き1)偏光変調測定を系統的試料に対して実施するとともに、高温超伝導の秩序形成機構および自発的対称性破れとの関連性を明らかにする。
小胞体における輸送小胞形成部位の構築と制御機構の解析

小胞体からゴルジ体への物質輸送を担うCOPII小胞は小胞体膜上のERESと呼ばれる領域で形成される。小胞形成反応ではSar1 GTPaseの調節が重要である。また、この輸送系の必須因子であるSec16がERES構築に働くことが示唆されている。本研究ではSec16の機能解析を行った。Sec16 N末端領域がGTPaseを活性化することを発見した。また、同定したGTPase活性化領域はERESの構築といった機能に重要であった。さらにそのN末端領域の働きにより小胞形成反応が促進された。以上の結果からSec16によるERESの構築また小胞形成反応の調節に関わる新たなメカニズムについての知見を得た。本研究課題では小胞体膜上におけるコートタンパク質による輸送小胞形成の場であるER exitsites (ERES)の形成ならびにその調節メカニズムを解明するためにSec16の機能解析を行うことを目的としている。平成26年度における研究計画に従い、先行研究により明らかとなったSec16のN末端領域の機能的重要性の解析を試験管内再構成実験系を用いて詳細に行うため、Sec16 N末端領域を高純度かつ高収量での精製を試みた。目的としたSec16のN末端全長領域は991アミノ酸残基から構成されるが、その構造的な不安定性により非常に高いプロテアーゼ感受性を示した。そこで安定な精製タンパク質を得るために、種々の短い断片のデザインを行い、そして様々なタグならびに発現させる大腸菌の株についての検討を同時に行った。その結果、735アミノ酸残基から構成されるN末端断片(Sec16 N735)を非常に高純度かつ出芽酵母発現系から得られる数十倍の高収量で精製ことに成功した。このSec16 N735の機能解析を行うためにまず、精製されたコートタンパク質との相互作用をin vitro binding assayにより調べた。しかし、この実験系においてはSec16 N735が凝集しやすい性質を持つことが原因であるためか、Sec23/24ならびにSec13/31の両方のコートタンパク質との相互作用は検出されなかった。この問題の解決ならびに、また申請書の研究計画に記載された通り、さらなる詳細な機能領域の探索のためにSec16 N735の更なる断片化を行いその精製を試みた。その結果、数種類の短い断片を精製に成功した。平成26年度に精製が成功したSec16を用いた試験管内完全再構成実験を行うことにより、輸送小胞形成反応におけるコートタンパク質との相互作用様式やその調節機構が今後明らかになることが考えられる。真核細胞において、小胞体-ゴルジ体間の物質輸送を担うCOPII小胞は小胞体膜上のER Exit Sites(ERES)と呼ばれる特異的な領域からCOPIIタンパク質の働きにより形成される。本研究課題では、ERESにおけるCOPIIタンパク質の調節メカニズムの解析を、COPII小胞形成反応に必須な因子であるSec16に焦点を当てその機能解析を行う。平成27年度は、前年度までに高純度かつ高収量で精製に成功しているSec16 N末端領域(Sec16 N735)断片について、試験管内再構成実験系を用いその機能の解析を試みた。1. COPII低分子量GTP結合タンパク質Sar1とリポソームならびにSec16 N735の混合液に、GTPを添加しSar1のGDP-GTP交換反応を調べるとその反応が阻害された。一方、非加水分解性アナローグGMP-PNPを用い同様の実験を行った場合にはこのような反応阻害は見られなかったことから、Sec16 N735はSar1のGTP加水分解活性の促進が考えられた。この可能性を調べるためにGTP結合型に変換させたSar1を含む反応液にSec16 N735を加えた。予想通り、GTP加水分解活性の促進が確認された。2. Sec16 N735はSar1とそのグアニンヌクレオチド結合型依存的に相互作用するのかを調べた。GDP結合型Sar1変異体Sar1 D32GとGTP結合型Sar1変異体Sar1 H77Lを大腸菌から精製しSec16 N735と共にプルダウン実験により相互作用の解析を行った。Sec16 N735はSar1 H77Lと顕著に直接相互作用することが明らかとなった。以上の結果から、Sec16はそのN末端領域でSar1のGTP結合型と特異的に結合し、またSar1のGTP加水分解活性の促進因子として働くという新たな調節メカニズムを示すことがきた。平成27年度までに、バッファーや反応条件等について検討を行った結果、Sec16のN末端領域Sec16 N735精製断片を用いた試験管内再構成実験系の構築とその機能解析に成功した。そして研究実績の概要に述べた通り次年度の研究につながる結果も得られた。小胞体からの物質輸送を担うCOPII小胞は小胞体膜から形成される。平成27年度までにCOPII小胞形成反応に必須な因子であるSec16のN末端領域735アミノ酸残基断片(Sec16N735)を用いた試験管内再構成実験系により、small GTPase Sar1のGTP加水分解活性の活性化因子として働くことを明らかにした。平成28年度はその活性化機構をさらに詳細に調べた。またその結果をもとにin vivoにおける機能的役割についても調べた。1. Sec16N735をさらに断片化し4種類の短い断片を精製した。

この4種類の断片をそれぞれGTP結合型に変換したSar1とリポソームの混合液に加えGTP加水分解活性の測定を行なった。Sec16N735のN末端部分の断片では活性化は見られなかったが、C末端部分の566-735アミノ酸残基断片で活性化が見られた。2. in vivoでのSec16の機能において566-735アミノ酸残基領域の役割を調べるために、この領域を欠損した変異体Sec16Δ566-735を作成した。まずGFP融合タンパク質を用い蛍光顕微鏡観察により細胞内局在を調べたが、野生型のものと比較して大きな変化は見られなかった。一方、細胞抽出液の遠心分離を行うと野生型Sec16は小胞体膜に強く結合しているため沈殿に分画されるのに対し、Sec16Δ566-735は上清画分に顕著に検出された。さらにSec16の膜結合機能に必要なCCD領域を欠損させたSec16Δ566-735ΔCCDでは、蛍光顕微鏡観察により細胞質への局在が見られ、また細胞分画においても上清画分にさらに強く検出された。以上の結果からSec16 N末端の566-735アミノ酸残基領域は、Sar1 GTPaseの活性を調節に働き、またSec16の膜結合またはその安定化に働くことを新たに明らかにすることができた。小胞体からゴルジ体への物質輸送を担うCOPII小胞は小胞体膜上のERESと呼ばれる領域で形成される。小胞形成反応ではSar1 GTPaseの調節が重要である。また、この輸送系の必須因子であるSec16がERES構築に働くことが示唆されている。本研究ではSec16の機能解析を行った。Sec16 N末端領域がGTPaseを活性化することを発見した。また、同定したGTPase活性化領域はERESの構築といった機能に重要であった。さらにそのN末端領域の働きにより小胞形成反応が促進された。以上の結果からSec16によるERESの構築また小胞形成反応の調節に関わる新たなメカニズムについての知見を得た。平成26年度までに、試験管内完全再構成実験系で用いることができる水準の高純度かつ高収量のSec16のN末端領域Sec16 N735の精製に成功している。またその機能領域を更に探索するために更なる短い断片の精製にも成功している。一方、再構成実験系を成功させるためにそのバッファー条件等についてはさらに検討を行っていく必要があるが、本研究課題は申請書に記載した通りにおおむね順調に進展していると考えられる。平成26年度にSec16 N735はCOPIIコートとの相互作用が見られなかった。このため、Sec16 N735によるSar1のGTP加水分解活性の促進機能に焦点を当て研究を行う。平成26年度においてSec16 N735由来の短い断片の精製に成功しているので、この断片のGTP加水分解活性の促進能の有無を調べることにより、Sec16 N末端領域によるSar1の機能調節メカニズムの解析を行う。細胞生物学平成27年度以降には、まず試験管内完全再構成実験系の実験条件の最適化を行い、平成26年度に得られたSec16のN末端領域の精製タンパク質を用いコートタンパク質の制御機構の解析に関わる実験系を行っていく。