hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
地下圏内メタン生成・消費活動に関わる未知微生物群の分離培養と動態解析ツールの開発

本研究では地下圏微生物群集において実体が明らかになっていないメタン生成古細菌ならびにメタン酸化微生物の動態解析を行った。その結果(1)天然ガス胚胎地下圏に優占するMethanothermobacter類縁のメタン生成古細菌を実環境濃度に近い低濃度ガス供給を基本とした共生培養法により完全純粋培養に成功した。(2)深部地下油層環境におけるメタン生成においては酢酸が重要な中間体であることを明らかにした。(3)陸地地下圏試料において顕著な嫌気的メタン酸化活性を認めた。(4)好気的メタン酸化をおこなう共生系を得ることができた。本研究はこれまで実体が明らかになっていないメタン生成古細菌ならびにメタン酸化微生物の集積、それに続く分離培養ならびに動態解析にある。集積・分離培養にあたっては、実環境試料に必ずと言ってよいほど混在する生育の速いメタン生成古細菌やメタン酸化細菌を排除するために、実環境濃度に近い低濃度ガス供給を基本とした新規集積・分離培養手法を確立する必要がある。本研究では地下圏におけるメタン生成活動に係わるメタン生成古細菌の分離培養を目的のひとつとして掲げ多くの地下圏試料からメタン生成古細菌の集積手法の確立(分離培養の前の段階)、続いて分離培養方法の開発を目指し研究を計画・実行してきた。その結果、実環境に近い水素濃度供給を行うことができる酢酸酸化水素発生型発酵細菌として実施者が以前分離した微生物Thermacetogenium phauemを生物学的水素発生源として、天然ガス胚胎地下圏試料を限界希釈培養することによって、当該地下圏に優占的に存在することがあらかじめ知られていたMethanothermobacterに近縁なメタン生成古細菌を選択的に集積培養することに成功した。さらにこの集積培養から各種培養手法を用いて、最終的に当該メタン生成古細菌の完全純粋培養に成功した。そこで当該微生物の基本特性を明らかにするための生理学的ならびに遺伝的特性を調べた。後者については当該菌株から全DNAを抽出し、DNAシークエンサーを用いて全ゲノム配列を決定した。その結果、通常のMethanothermobacterが持っているメチルコエンザイムMリダクターゼのアイソザイムが存在しないことが明らかとなり、このことと、低水素濃度親和性に何らかの連関性があることが強く示唆された。本研究はこれまで実体が明らかになっていないメタン生成古細菌ならびにメタン酸化微生物の分離培養ならびに動態解析にある。集積・分離培養にあたっては、実環境濃度に近い低濃度ガス供給を基本とした新規集積・分離培養手法(共生培養法)を確立し、天然ガス胚胎地下圏試料から、当該地下圏に優占的に存在することがあらかじめ知られていたMethanothermobacterに近縁なメタン生成古細菌の完全純粋培養に成功した。また当該メタン生成古細菌の完全長ゲノム配列を決定した。現在ゲノムにコードされる種々の構造遺伝子を解析中である。当該菌株はMethanothermobacter(中度高温菌)とMethanothermus(超高温菌)の中間的温度特性を示すこと、さらにはメタン生成経路の基幹酵素(メチルコエンザイムMリダクターゼ)の遺伝子配列や16SrRNA遺伝子配列の解析から当該微生物の分子系等学的モザイク特性(Methanobacteriumのような中温性メタン生成古細菌、Methanothermobacterに代表される中度高温ならびに超高温菌Methanothermusの特性を併せ持つ系統的位置)が明らかになった。また、同じく天然ガス胚胎地下圏試料から、メタノール資化性メタン生成菌の分離にも成功した。地下圏においてメタノール資化性メタン生成古細菌が存在することは、地下根源物質にメタノールを遊離するような物質が存在していることを強く示唆するものである。これらの研究と並行して、メタン酸化菌の集積培養系を確立した。当該メタン酸化菌は他の複数の有機物資化性微生物の存在が必須であり、ある種の未知因子を介した共生関係が存在することを明らかにした。本研究ではこれまで実体が明らかになっていないメタン生成古細菌ならびにメタン酸化微生物の分離培養ならびに動態解析を目標とした。集積・分離培養にあたっては、実環境濃度に近い低濃度ガス供給を基本とした新規集積・分離培養手法(共生培養法)を確立し、昨年度、陸圏天然ガス胚胎地下圏試料から、当該地下圏に優占的に存在することがあらかじめ知られていたMethanothermobacterに近縁なメタン生成古細菌の完全純粋培養に成功した。当該菌株はMethanothermobacter(中度高温菌)とMethanothermus(超高温菌)の中間的温度特性を示すこと、さらにはメタン生成経路の基幹酵素(MCR1)の遺伝子配列や16S rRNA遺伝子配列の解析から当該微生物の分子系等学的モザイク特性を明らかにした(Int. J.Syst.Evol.Microbiol.,投稿中)。当該菌株には高温性のメタン生成古細菌が通常持っているはずのMCR2を欠いており、低濃度水素環境に馴化し進化した微生物であることがゲノム構造から明らかになった。

また、地下環境にあっては酢酸からの酸化的メタン生成が極めて重要であることをトレーサー実験によって明らかにした(Environ.Microbiol.,published online)。さらに陸域地下圏には通常海底地下圏に存在する絶対嫌気性メタン酸化微生物群(ANME)とは異なるタイプのメタン酸化古細菌の存在が示唆された(Envhon.Microbiol.,accepted)。嫌気的なメタン酸化には酸化にあたって生ずる水素消費微生物の存在が必須であるが、その実態を明らかにするまでには至らなかった。
船舶流体力学におけるマルチスケールシミュレーションの研究

船舶流体力学におけるマルチスケールシミュレーションにおいて、複数の長さスケールと時間スケールを扱うための領域分割方法を開発した。領域分割法では、複数の格子ブロックを生成する、マルチブロック格子法を適用し、ブロック間のインターフェースでは、互いに変数を補間することにより、格子ブロック間の情報交換を行う。空間領域については内挿を、時間領域においては、領域全体の時間精度を維持するために、内挿と外挿の組み合わせを用いる。以上の開発により、空間マルチスケールシミュレーション法と時間マルチスケールシミュレーションを統合して、時空間マルチスケールシミュレーション法を構成することが可能となった。船舶流体力学におけるマルチスケールシミュレーションの概念を確立するために、船体まわりの流れについて、関連する流体現象とその現象の長さスケールと時間スケールを整理した。これによってシミュレーションにおけるスケールレンジの設定が可能となった。さらに、これらのスケールレンジをカバーするための、マルチスケールシミュレーション基盤技術として、平成25年度は長さスケールに対応した空間領域の分割方法を開発した。長さスケールの異なる領域毎に格子ブロックを生成するので、マルチブロック格子法を適用することになる。また、格子の大きさが領域毎に異なることを想定するので、ブロック間のインターフェースでは、格子点の共有を仮定せず、格子を重ね合わせて、互いに変数を補間することにより、格子ブロック間の情報交換を行う。この補間において、格子ブロック間で格子サイズの著しい不均衡があると、計算精度が損なわれることが判明したので、格子ブロックの重なり合う場所では、大きな長さスケールに対応する粗い格子のブロックでは、ブロック境界付近で、格子を局所的に細かくする、局所細密化を行うことにした。この細密化によって、格子間の補間を精度良く行うことができることを確認した。さらにこの細密化を自動的に行うアルゴリズムを開発し、マルチブロック格子生成の労力を大きく低減することができた。いくつかの計算例によって、領域分割法を用いた空間マルチスケールの取扱いにおける要素技術の確立を確認した。船舶流体力学におけるマルチスケールシミュレーション法の基板技術開発として、昨年度はは長さスケールに対応した空間領域の分割方法を開発した。分割された領域のそれぞれの代表的な長さスケールに対応した空間格子を使用するので、マルチブロック格子法を適用した。また、ブロック配置の自由度を優先し、格子ブロック間の情報交換には重合格子法を採用し、局所細密化処理によって変数補間の精度を向上させた。今年度は、局所細密化法の改良として、物体表面のような自由曲面上に配置された格子の細密化の際に、新たに追加する格子点を自由曲面上に配置する技法を開発した。実際の計算例により、自由曲面を有する領域における格子細密化の精度が向上することを確認し、空間におけるマルチスケールシミュレーション法を確立した。さらに時間領域におけるマルチスケールシミュレーション手法の基礎的検討を行った。空間スケールの場合と同様に空間をいくつかの領域に分割し、各領域の時間スケールに対応して異なる時間刻み幅を設定する。各領域毎に設定した時間刻みを用いて時間積分を行うが、領域全体の時間精度を維持するために域間で同期をとる必要がある。そのため、空間方向の領域間の情報交換の場合と同様に、時間方向にも変数補間を行う。CFD計算における計算効率を考慮すると、時間積分には陰的方法を用いることが必須であるため、領域間の変数補間においては、内挿と外挿の組み合わせを用いる。以上のような時間スキームの定式化を行い、簡単な問題について適用可能性を検討した。船舶流体力学におけるマルチスケールシミュレーション法の基盤技術として、長さに関するマルチスケールに対応した空間領域の分割方法、および時間に関するマルチスケールに対応する時間積分法を開発した。空間分割については、領域ごとの代表的な長さスケールに対応した空間格子を使用するために、マルチブロック格子法を適用した。また、ブロック配置の自由度を考慮して、格子ブロック間の情報交換には重合格子法を採用し、局所細密化処理によって変数補間の精度を向上させた。さらに、局所細密化法の改良として、物体表面のような自由曲面上に配置された格子の細密化の際に、新たに追加する格子点を格子線上の内挿ではなく、オリジナルの自由曲面上に配置する技法を開発した。実際の計算例により、自由曲面を有する領域における格子細密化の精度が向上することを確認し、空間におけるマルチスケールシミュレーション法として確立した。また、時間領域におけるマルチスケールシミュレーション手法について検討を行った。各領域毎に設定した時間刻みを用いて時間積分を行うが、領域全体の時間精度を維持するためには領域間で同期をとる必要がある。そこで空間方向の領域間の情報交換の場合と同様に、時間方向にも変数補間を行う。このような時間積分スキームの定式化を行った。空間領域のマルチスケールシミュレーションについての応用計算を行い、手法の有効性を検証した。また、時間領域のマルチスケールシミュレーション法についての検討を進め、実際の流れ計算における時間積分のマルチスケール定式化を行い、試計算を行った。以上により、船舶流体力学におけるマルチスケールシミュレーション法の基礎技術を確立することができた。

研究計画では、初年度において長さスケールにおけるマルチスケール解析の要素技術を開発し、2年目の今年度は時間スケールの扱いを検討して新たな時間進行スキームを開発し、最終年度において、時間スケールと空間スケールの解析法の統合を行い、シミュレーション法として完成させる予定としている。計画に従い、平成26年度は時間方向のマルチスケールに対応する新たな時間進行スキームを定式化し、その適用可能性を検討した。空間領域における領域分割法をベースにして、領域間の情報交換における空間方向の変数補間に時間方向の補間を組み合わせることで、異なる時間スケールに対応する時間進行スキームを開発した。手法開発は概ね計画通りに進捗し、時間マルチスケール解析手法の要素技術を確立した。以上により、研究は当初の計画通り進捗していると言える。27年度が最終年度であるため、記入しない。船舶流体力学最終年度である平成27年度は、これまでに開発した、空間マルチスケール解析法と時間マルチスケールに対応した時間進行スキームを統合して、マルチスケール解析法として完成させる。合わせて、並列化処理による計算の効率化の検討を行う。計算手法を完成させた後、試計算に適用して、有効性を確認する。計算結果および計算効率を吟味することで、改善の要素を抽出し、必要な場合はさらに精度と効率の向上を図る。最終的に、船舶流体力学における実際的な問題に適用して、マルチスケールシミュレーション法の有効性を示す。本研究の目的は、船舶流体力学におけるマルチスケール現象の解析のための数値シミュレーション技術の開発である。流体現象のスケールは、長さスケールに関わるものと時間スケールに関わるものの2つがあるので、マルチスケール解析もその両者に対応する必要がある。研究計画では、初年度において長さスケールにおけるマルチスケール解析の要素技術を開発することとしている。また、次年度は時間スケールの扱いを検討して新たな時間振興スキームを開発し、最終年度において、時間スケールと空間スケールの解析法の統合を行い、シミュレーション法として完成させる予定である。計画に従い、平成25年度は空間方向に領域分割を行うことで、異なる長さスケールの現象を扱う手法を開発した。領域分割に伴う領域間の補間を高精度に行うための手法を導入することで、実用性の向上を図った。手法開発は概ね計画通りに進捗し、空間マルチスケール解析手法の要素技術を確立し、いくつかの計算例によりその基本的な性能を確認した。
多光子レーザー顕微鏡を用いた吸入麻酔薬による神経細胞死の機序の解明と予防法の開発

新生仔マウスにおける神経細胞死の原因が呼吸と循環の破綻によるものではなく、麻酔薬そのものによるものであることを確認し、セボフルランとプロポフォール併用麻酔がセボフルラン単独麻酔よりも危険な麻酔法であり、かつ、セボフルランとチオペンタール併用麻酔はそうではないことを証明した。これにより、小児麻酔においてセボフルランとプロポフォール併用はセボフルラン単独に比較して危険な麻酔法である可能性を提示することができた。この結果は論文で発表した。また、多光子レーザー顕微鏡を用いて、新生仔マウスの大脳皮質の神経細胞内Ca2+の可視化に成功した。しかし、新生仔マウスの生存が維持できず機序の解明には至っていない。年間数億人近い人が、イソフルラン、セボフルラン、チオペンタール、プロポフォールなどの麻酔薬を用いた全身麻酔によって手術を受けているが、特に、小児に対する出術件数は年々増加している一方、麻酔薬の副作用による神経細胞死とそれに引き続く学習障害が問題となってきている。近年、動物実験により麻酔による発達段階の脳での広汎な神経細胞死とそれに引き続く行動障害が示されている。現在の小児麻酔においては、吸入麻酔薬のセボフルランをベースにした麻酔が主流である。すなわち、セボフルラン単独か、これにチオペンタールかプロポフォールの併用が最も頻度の高い麻酔法である。これらの麻酔法のうち、生後7日目マウスにおいて、セボフルラン単独に比較して、チオペンタール併用では有意差はないが、プロポフォールを併用すると、海馬と脳梁膨大後部皮質において神経細胞死が有意に増加することをアポトーシスによる細胞死の指標であるcaspase-3を蛍光抗体法で検出することにより確認した。しかし、この神経細胞死が麻酔薬自体によるものか、麻酔薬による血行動態の破綻によるものか区別できなかった。そこで、ドップラー血流計を用いて脳血流量を測定することにより、これらの麻酔法では脳血流は減少しないことを確認し、神経細胞死は血行動態の破綻ではなく、麻酔薬自体によるものであることを証明した。この結果、現在の通常の麻酔法では、新生児の脳において麻酔薬の副作用として神経細胞死が誘発される危険性を示し、さらに、セボフルランとプロポフォールの併用が最も危険な麻酔法であることを論文で発表することができた。まず、実験を進めるに当たって、新生仔マウスにおける神経細胞死の原因が麻酔薬による呼吸抑制からの低酸素血症及び循環抑制である可能性を排除する必要性が生じた。そこで、パルスオキシメーターによる経皮的動脈血酸素飽和度を測定することとした。麻酔薬による新生仔マウスの経皮的動脈血酸素飽和度の低下は認められず、また、ドップラー血流計による脳血流の測定においても脳血流量の低下も認めなかった。これにより、神経細胞死の原因が麻酔薬そのものによるものであることを確認し、プロポフォールとセボフルラン併用の麻酔がセボフルラン単独の麻酔よりも危険な麻酔法であり、かつ、チオペンターとセボフルラン併用の麻酔はそうではないことを証明し論文で発表することができた(J Anesth. 2014; 28 :815-820)。次に、多光子レーザー顕微鏡を用いた、吸入麻酔薬による全身麻酔下の生きた新生仔マウスにおける神経細胞内でのCa2+濃度変化'の生体内イメージングであるが、神経細胞を同定し細胞内Ca2+のリアルタイムイメージングは成功した。しかし、実験時間中の新生仔マウスの生存維持が困難を極めた。大脳皮質へのOregongreen BAPTA-AMの注入のための開頭作業の侵襲がその原因と推測された。そこで、開頭せずに経頭蓋骨的にOregongreen BAPTA-AMを注入して実験したが、おそらく頭蓋内圧の上昇により、生存時間の延長には至らなかった。現在、Oregongreen BAPTA-AMに代わって、経皮的または腹腔内投与により大脳皮質神経細胞内Ca2+を標識できる物質を探索及び開発中である。麻酔学生後7日目のマウスの大脳皮質神経細胞内のCa2+濃度変化と細胞死の過程を多光子レーザー顕微鏡により可視化するには、神経細胞死が麻酔薬自体によるものであることが前提となる。このため、神経細胞死が麻酔薬自体によるものか、麻酔薬による血行動態の破綻によるものか区別する必要性が生じた。生後7日目のマウスの大脳皮質神経細胞内のCa2+濃度変化と細胞死の過程を多光子レーザー顕微鏡によりリアルタイムに可視化するのと同時に、ドップラー血流計を用いて脳血流量をリアルタイムにモニターしていく。これにより多光子レーザー顕微鏡によって観察される事象が麻酔薬自体によるものであることを保証することができる。
改良イメージング法による環状型プラズマ閉込め装置内の密度揺動分布計測法の開発

本研究は、磁場閉じ込めプラズマの中の揺動伝搬方向が空間的に変化していることを利用し、レーザーイメージング法を密度揺動の伝搬角対する分解能を持つ計測法に改良して、その空間分布計測が行えるシステムに発展させようとするものである。本年度は、計測角を決めている位相板付属のスリットを高速回転することにより、密度揺動の計測位置を高速掃引し、1ショット間(50ms)で掃引可能なシステムとするための検討を進め、以下の結果を得た。1.スリットを高速掃引できる高速回転スキャナーシステムを試作し、得られる掃引速度や幅について性能評価を行った。その結果、スリットの掃引全幅は30度で、掃引速度として計算値の1/2の性能であるがステップ角3度を50ms間で掃引できる性能を得た。得られた性能は、ヘリオトロン等のピッチ角の変化が大きい装置では数回の掃引で、トカマク等のピッチ角の変化が小さい装置では1回の掃引で空間分布が得られる。2.He-Neレーザーシステムで上記スリットを用いたイメージング光学系を設定し、超音波をプラズマの密度揺動のシミュレータとして実験を行い、変更したスリットの揺動計測性能ついて調べた。それにより、スリットの厚さ方向の側面によりレーザービームの一部が削られたものの、スリットの高速回転システムでも、従来通り1%程度の誤差で揺動のパラメータが計測できることがわかった。さらに、本システムの実用化に際して必要となる光ファイバーを用いた検出システムも導入し、伝送効率80%程度が得られた。これにより、光ファイバーを用いた多チャネルシステムの有効性を示すことができた。
病態下及び発育時における心筋Kチャネル発現の制御について

心肥大や心不全などの病態下では、心筋の電気生理学的性質が変化して不整脈死や突然死の原因になることが知られている。また、成長にともなうイオンチャネルの性質の変化は、病態時の変性様式を理解する上で重要である。本研究では、心筋の活動電位再分極相を決定するイオンチャネルである心筋Kチャネルについて、病態もしくは発育に伴うイオンチャネルの性質の変化とその機序としての遺伝子発現を介した修飾・調節機構の関与を明らかにすることを目的とする。そのため、家兎やラットに各種薬物を長期間経口投与する系や心肥大動物モデル、そして培養心筋細胞を用いてチャネル遺伝子のmRNA量測定、生成される機能蛋白の検出、定量さらに組織内での局在、そしてパッチクランプ法でのイオン電流の観察までを一括して行うものである。予定した計画期間(2年間)で数多くの知見を得ることができた。例えば、1)甲状腺ホルモンは、イオンチャネル毎に異なる影響を遺伝子発現におよぼすこと、その作用はβアドレナリン受容体を介する細胞内情報伝達系によらないこと、2)心肥大初期の活動電位持続時間の延長にはカルシウム電流の増加、心肥大後期の活動電位持続時間の延長には一過性外向き電流の減少が寄与すること、3)心肥大の作成方法の違いにより心筋イオンチャネルは異なる調節作用を受けること、などである。それらは既に欧文雑誌に掲載されている。本研究で使用された研究方法は、チャネル遺伝子量の測定、免疫蛍光染色法によるチャネル蛋白発現の観察、パッチクランプ法によるイオン電流解析などいずれをとっても最近10年間で進歩を遂げた生命科学の手法である。これらを駆使した本研究は、心不全・心肥大のみならず、各種病態心筋でのイオンチャネル活動の解明に著しく貢献すると考えられる抗不整脈薬アミオダロン薬効には際だった特徴があり、臨床的効果が発現するのに径口投与を開始して数週を要することが知られている。数週をかけて生じるこのような薬理作用の細胞電気生理学的機序については、甲状腺ホルモンの心筋細胞に対する作用から説明する報告もある。甲状腺機能亢進症に不整脈が伴うことはよく知られている。その機序として、継続的な甲状腺ホルモン作用により心筋イオンチャネルが修飾され、活動電位再分極相の変化を生じることが考えられているが、チャネル遺伝子の形質発現を介する可能性については全く検討されていない。本年度の実験としては、甲状腺機能低下症ラットを作成してthyroxine(T4)を投与し、甲状腺ホルモンレベルと心筋K+チャネルクーロンの発現との対応について検討した。また、アミオダロンの急性作用と慢性作用を、遅延整流K電流(IK)の二つの成分であるIKrとIKsに分けて検討した。その結果、甲状腺ホルモンはK+チャネルクーロンKv1.2,Kv1.4のmRNAレベルを容量依存性に減少させ、Kv1.5,Kv2.1,Kv4.2,Kv4.3を逆に減少させることが明らかにされた。甲状腺ホルモンによる調節作用が、電位依存性Kチャネルのクローン毎に異なることから、甲状腺ホルモンによる心筋の電気生理学的性質の変化は、K+チャネルの数とチャネルを形成するクローン四量体の組成の変化が共に関与している可能性が示唆された。アミオダロン慢性投与によるK+チャネルクローンのmRNAレベルに対する影響については、現在検討中である。またアミオダロンは、急性投与ではIKrを慢性投与ではIKsをより選択的に抑制することがわかり、投与方法の違いより異なるチャネルに影響を及ぼすことが明らかとなった。今後、このような甲状腺ホルモンの作用とアミオダロンの薬理作用の関連についてさらに検討する予定である。これらを駆使した本研究は、心不全・心肥大のみならず、各種病態心筋でのイオンチャネル活動の解明に著しく貢献すると考えられる本研究では、心筋の活動電位再分極相を決定するイオンチャネルである心筋Kチャネルについて、病態もしくは発育に伴うイオンチャネルの性質の変化とその機序としての遺伝子発現を介した修飾・調節機構の関与を明らかにすることを目的とする。

そのため、病態心筋や培養・幼若心筋にいて、チャネル遺伝子のmRNA量測定、生成される機能蛋白の検出、定量さらに組織内での局在、そしてパッチクランプ法でのイオン電流の観察までを一括して行うものである。また、病態モデルとして家兎やラットに各種薬物を長期間経口投与する系や心肥大動物モデル、そして培養心筋細胞を用いた。本年度では、研究計画をほぼ予定どうりに遂行できた。その結果1)甲状腺ホルモンはイオンチャネル等に異なる影響を遺伝子発現におよぼし、βアドレナリン受容体を介する細胞内情報伝達系によらないこと、2)心肥大初期の活動電位持続時間の延長にはカルシウム電流の増加、心肥大後期の活動電位持続時間の延長には一過性外向き電流の減少が寄与すること、3)心肥大の作成方法の違いにより心筋イオンチャネルは異なる調節作用を受けること、などを明らかにし、既に欧文雑誌に掲載されている。本研究で使用された研究方法は、チャネル遺伝子量の測定、免疫蛍光染色法によるチャネル蛋白発現の観察、パッチクランプ法によるイオン電流解折などいずれをとっても最近10年間で進歩を遂げた生命科学の手法である。これらを駆使した本研究は、心不全・心肥大のみならずさまざまな病態下での心筋イオンチャネルの活動の解明に著しく貢献すると考えられる
iPS細胞とゲノム編集による脳発達機構の解明：重複遺伝子SRGAP2の視点から

霊長類やヒトに特異的な遺伝子・特異的コピー数を有する遺伝子について神経系への評価を行うため、ヒトiPS細胞からの神経分化誘導技術とゲノム編集技術を用いた実験方法の確立を目指した。本研究では神経分化誘導法として、二つの培養法を確立した。一つは均一種(興奮性神経)細胞を作出するものである。もう一方は、大脳皮質器官培養である。実際に対象遺伝子に変異が生じたiPS細胞株(CRISPR/Cas9法で作出)から大脳皮質培養を行うと、細胞塊の構成不全として表現型再現が出来た。本研究により、ヒト脳の種としての特異的な進化の一端を解明になるとともに、脳神経疾患の良い疾患表現型モデルとして活用できる可能性がある。これまで、ヒトiPS細胞からの神経細胞への分化誘導方法については様々な議論がなされてきた。しかしながら、興奮性神経細胞への分化誘導技術の開発は遅れていた。本研究においては、SRGAP2遺伝子変異を有する細胞からの神経細胞誘導を行うために、Tet-Onシステムを用いたNeurogenin2遺伝子の時期特異的過剰発現による、iPS細胞からの直接的神経細胞への誘導法を確立した。これによって比較的均一な細胞種(興奮性錐体細胞)を作出することが可能になった。この結果、SRGAP2遺伝子が神経細胞形態に与える影響を評価しやすくなると予想される。さらに、神経細胞移動の評価法として、大脳皮質の層構造を再現する脳オルガノイド形成技術がほぼ確立した。実際に、免疫染色で、脳の各層のマーカーとなるタンパク質の発現が認められた。今後、これらの新規技術を用いて、SRGAP2遺伝子変異細胞株が呈する、細胞形態および、細胞移動の表現型の評価を行う予定である。これまで、ヒトiPS細胞を用いた神経細胞の解析では、培養皿上に単層状態で細胞を播種・培養する方法が主流であった。しかし、単層培養では、細胞の自己組織化の進行が妨げられるなど、機能的な再現を試みている実験としては、不向きな点が多かった。そこで、本研究では、脳神経系の細胞の自己組織化が容易に進むように、細胞を浮遊培養することを試みた。この方法の困難とされている点は、Neurosphereのような、神経幹細胞の増殖を行うだけではなく、神経細胞としての成熟化が求められることであった。実際に、細胞の増殖と、分化・成熟を同時に再現するのは困難であり、様々な条件設定が必要とされた。しかしながら、細胞の培養条件をひとつひとつ検討して、浮遊培養として、細胞塊が肥大しつつも、一定の増殖を終えた細胞群の成熟化を再現することができた。すなわち、当該年度において、脳オルガノイド形成の一端に成功したと考えられる。一方で、均一な細胞種類から構成される培養系も必要であった。昨年度までに確立していたTet-OnシステムによるNeurogenin2遺伝子の時期特異的発現によるiPS細胞からの直接的、かつ高効率の神経細胞への分化誘導法をさらに効果的に応用して、細胞形態や移動を評価する実験系をほぼ確立させた。さらに、ゲノム編集技術応用については、TALENからCrspr/Cas9法に変更した。これにより、健常人iPS細胞からの、SLIT-ROBO Rho GTPase activating protein 2 (SRGAP2)遺伝子への変異導入アイソジェニック細胞株の作成を行うためのガイドRNA構築を行った。最終年度にむけて、ヒトと非ヒト霊長類との脳の構造の差異に迫るような、遺伝子(SRGAP2をはじめとした)、に着目して、ゲノム編集を施した細胞株群と対照群との比較を細胞形態や細胞移動といった視点に特に着目して、個々の遺伝子の機能という視点からヒトに特異的な機能の獲得の謎に迫りたいと考えている。まず、本研究で必要とされていた立体浮遊培養の構築を行うことができた。具体的には、iPS細胞から均質な胚様体(EB)様細胞塊を低接着well型プレートで培養して、その後、細胞外基質で細胞塊を表面コーティングした後に、低接着フラスコに移行して、浸透培養を行った。この結果、細胞塊のサイズが大きくなりつつも深部まで酸素透過性の高い立体培養が出来上がり、細胞深部は細胞増殖を行い、表面に向かってIn-sideout型の細胞移動を行うオルガノイド培養が完成した。この点は、当初予定していた培養方法と異なり、予想を大幅に超える技術的進歩があったと考えられる。また、均一細胞腫の分化誘導技術(Neurogenin2遺伝子の一過性強制発現)の技術により、細胞形態や移動を正確に評価できるようになった。また、この手法は均一ポピュレーション細胞集団を作り出すという観点から、トランスクリプトームやプロテオーム解析を行った場合でも非常に信頼性の高いことが予想される。一方、SRGAP2遺伝子のゲノム編集は一部難航していた。本研究においては、当初TALENを用いたゲノム編集iPS細胞株を考えていたが、編集効率の悪さが問題であった。しかしながら、Cripsr/Cas9システムに移行して、ゲノム編集を行うべく、ガイドRNAの構築を行うことにした。さらに、ヒトiPS細胞への遺伝子導入効率が悪いことが問題視されていたが、こちらも、エレクトロポレーション法を用いた、高効率の遺伝子導入を行うことに成功した。したがって、総合的におおむね順調に研究は進行したと考えられる。

本研究では、霊長類やヒトに特異的な遺伝子および、特異的なコピー数を有する遺伝子について、その脳神経系に与える特性をin vitroで評価するため、ヒトiPS細胞を用いた脳神経系への分化誘導技術とゲノム編集技術を用いた実験方法と解析方法の確立を目指した。ヒト多能性幹細胞からの神経分化誘導法として、二つの培養法を確立した。一つは培養皿内で単一種類細胞を作出すること。これは、興奮性神経細胞への分化誘導を強烈に誘導するプロニューラル因子を導入することで確立した。一方、抑制性神経細胞についても、複数の抑制性神経分化転換に必要と考えられている遺伝子群から2遺伝子を選りすぐり分化誘導に成功させた。これらはいずれも、Tet-onシステムで駆動する一過性の遺伝子発現技術であり、ドキシサイクリンの処理期間に依存して分化誘導が促される。これによって、神経の分化度合いを強制的に制御することができるため、培養皿内の細胞は神経サブタイプとしても、分化度合いとしても極めて均一に近いものとなった。この技術の開発により、遺伝子発現の生化学的な解析に高い再現性が伴うようになった。(実際にこの分化培養法を用いた遺伝子発現プロファイルは2016年7月、日本神経科学大会、横浜、で学会発表を行っている。)もう一方の神経系誘導は、大脳皮質オルガノイドである。この方法は培養条件や細胞容器の作出を行って確立した。実際に本実験で着目した複数の対象遺伝子(ゲノム編集であるCrspr/Cas9法で作出)に変異が生じたiPS細胞株からの大脳皮質器官培養を行うと、疾患表現型のひとつである小頭症状が、細胞塊の拡大不全というかたちで培養皿内において再現することができた。本研究により、ヒト脳の種としての特異的な進化の一端を解明したことになるとともに、脳神経疾患の良い疾患表現型モデルとして活用できる可能性がある。霊長類やヒトに特異的な遺伝子・特異的コピー数を有する遺伝子について神経系への評価を行うため、ヒトiPS細胞からの神経分化誘導技術とゲノム編集技術を用いた実験方法の確立を目指した。本研究では神経分化誘導法として、二つの培養法を確立した。一つは均一種(興奮性神経)細胞を作出するものである。もう一方は、大脳皮質器官培養である。実際に対象遺伝子に変異が生じたiPS細胞株(CRISPR/Cas9法で作出)から大脳皮質培養を行うと、細胞塊の構成不全として表現型再現が出来た。本研究により、ヒト脳の種としての特異的な進化の一端を解明になるとともに、脳神経疾患の良い疾患表現型モデルとして活用できる可能性がある。ヒトiPS細胞からの神経細胞への誘導方法として、PiggyBacベクターを用いたNeurogenin2遺伝子発現系を構築し、機能評価しやすい細胞の純化を行うことができた。さらに、大脳皮質の層構造の再現を行う脳オルガノイド形成の作出を行った。これらの技術開発を通して、格段にSRGAP2遺伝子機能が呈する表現型解析が簡便かつ的確になることが見込める。一方、SRGAP2遺伝子に変異を有する患者細胞iPS細胞の作成について、既に患者は死亡しており、患者T細胞からのiPS細胞の樹立は不可能であることが、本年度判明した。そのため、簡便にSRGAP2変異iPS細胞を作製することが困難になった。
ジェンダー、福祉、環境、および多元主義に関する公共性の社会学的総合研究

新しい「公共性」の概念をめぐって、公共社会学の理論的な構想を提示し、「自由」や「感情公共性」その応用や展開の可能性を示した。福祉とジェンダーについては定量および定性のふたつの調査を実施し、報告書を刊行した。その調査結果にもとづいて、福祉多元社会における公共性の価値意識を比較検討し、さらた具体的な実践の可能性を求めて、地域福祉、住民参加、協セクターの役割、福祉経営、ケアワークとジェンダー等について、経験データにもとづく分析をおこなった。ジェンダーと階層をめぐって、少子高齢社会と格差問題について、高齢者の格差、若年世代の格差、少子化対策とジェンダー公正の関係等についても、経験データにもとづいて、比較と検証をおこなった。福祉社会については、「自立」と「支援」のその理念をめぐって、その原理的な検討と歴史的な起源についても検討を加えた。文化と多元性の主題では、多文化主義と英語使用の問題、文化資源学における公共性、公共的な文化政策の実態と問題点について、研究を行ったほか、近代における宗教と政治の位置についてもアプローチした。また営利企業における公共性とは何かというテーマにも切り込んだ。環境については地球環境問題における「環境にやさしい」技術の関連を社会学的に分析し、新しい知見をもたらした。詳細は、科研費報告書『ジェンダー・福祉、環境、および多元主義に関する公共性の社会学的総合研究』を参照されたい。チームでとりくんだ4年間の成果にもとづき、現在東京大学出版会から『公共社会学の視座(仮題)』(全3巻)をシリーズで年内に刊行するよう準備中である。合わせて5つのサブ・テーマ「ジェンダー・家族・労働」「福祉・高齢化・公共政策」「環境・科学技術」「多元主義・ナショナリズム」「公共性の社会理論」にもとづいて、相互の配置を考えながら公共性の概念の構築をめざすべく、関連分野のゲストを招いたりしながら、月1回のペースで研究会を開催し、各サブ・テーマの研究を進展させるとともに、分野間の連携を深めた。また前年度より継続している日韓の交流プロジェクトの一環として、平成16年10月30日にはソウル大学の社会学研究室とジョイント・フォーラムを開催した。ソウルでの研究集会には研究分担者のみならず研究協力者として大学院生も多数参加し、次年度以降の展開に結びつく成果があった。次回のジョイント・フォーラムは東京大学で開催の予定である。また平成17年3月19-20日に東京大学で実施された日韓福祉国家研究会による研究集会にも、研究分担者が関与している。日韓にとどまらず東アジア圏の公共政策、福祉制度、人口と家族の動向等をめぐって情報の交換と蓄積が達成されつつある。多元主義・ナショナリズムの分野では、高等教育における多言語使用について、国内外の先進事例の現地調査を実施した。また次年度に公共性および地域福祉をめぐる量的調査と質的調査を同時並行して実施するにあたり、担当者を決定し予備調査等の準備を進めてきた。すでに先行研究のフォローや事例についての情報収集、ラポールの形成、予備的なヒヤリング等は終わっている。昨年にひきつづき5つのサブ・テーマ「ジェンダー・家族・労働」「福祉・高齢化・公共政策」「環境・科学技術」「多元主義・ナショナリズム」「公共性の社会理論」にもとづいて、月1回のペースで研究会を開催してきた。本年度は3年次に入り、昨年来準備を進めてきた、ふたつの調査を実施したことが大きな成果である。ひとつは、公共社会学の重要なテーマの一つである社会的公正を明らかにするため,「福祉と公平感に関するアンケート調査」というタイトルで2005年11月,全国の20歳以上の男女3,000名を対象に,現代日本の状況認識,高齢者福祉のありかた,政府の役割,環境問題と科学技術のありかた,経済活動と企業のありかた,公平感,家族とジェンダーなどの質問紙調査を実施した。今年度はデータクリーニングと一次分析を行った。

もうひとつは新しい公共性を切り開くための官/民/協の協同をさぐるべく、住民参加型地域福祉の比較研究のために4つの先進事例を選び、2005年7月に現地調査を実施した。事例データの分析と比較に入っている。継続的に実施している日韓の交流プロジェクトでは、2005年10月29日にソウル大学の社会学研究室とジョイント・フォーラムを今回は東京大学で開催した。またそれぞれのプロジェクトでは、若年者の雇用機会にかんする研究を進め、これまでの調査データをもちいた分析を行ったり、阪神・淡路大震災被災者の生活支援についての理論的・実証的研究、グローバル化のもとでのナショナルな多元主義とトランスナショナルな多元主義の連動についてマレーシアの高等教育をめぐる新しい動きの現地調査など、複数の理論的・実証的研究が進行中である。また公共社会学の観点からの社会調査データベースの設計構想の基礎作業として、日本における社会調査史資料の収集と整理を進めた。とりわけ、今年度に関しては、もっとも包括的な地域社会調査に焦点をあて、「公共」という概念との接点を探った。本年度は、昨年度に実施した二つの調査の分析を継続して進めるとともに、外部、それも社会学以外の専門分野の研究者を招いて研究会を開くなどにより、公共性について多角的な検討を進めた。まず、2005年に実施した「福祉と公平感に関するアンケート調査」の分析に関しては、本調査と共通する調査項目が含まれる「福祉と生活に関する意識調査」(2000年、福祉社会のあり方に関する研究会)との比較を行った結果、子育て支援、失業対策、学費援助に対する政府役割を期待する割合の上昇が確認された。2000年から2005年にかけて格差議論が活発化し、人々の不平等感も上昇した社会的背景とも連動して、子育て、雇用、教育、を社会的に支援し、環境整備することへのニーズの高さが確認された。ジェンダーとケアに関する地域福祉の事例調査においては、分析を進める中で、ケアという社会的課題を公平性と共同性の観点から体系的に組み立て直す必要性がますます明らかとなり、その方向にむけての理論的作業に着手した。さらに、環境と科学技術の問題に関しては、不確実性下における社会的意志決定の公共性をいかにして担保するかという問題への探求を進め、少子高齢化と不平等の問題に関しては、年齢別、世帯類型別等における不平等格差の詳細な分析を通じて、分配の公共性問題への探求を深めていった。理論的・学説史的な観点からは、日本の地域社会学の展開過程における社会調査の実践性を分析して、その公共性のあり方を検討するとともに、理論社会学一般における経験主義と規範性との関係を学説史的に考察して、社会学として公共性をどう位置づけるべきかを検討した。以上の研究作業は、各種研究会のほか、ソウル大との国際研究集会など国内外の場での発表と研究交流を通じて進められ、研究成果はさまざまな媒体において発表された。新しい「公共性」の概念をめぐって,公共社会学の理論的な構想を提示し,「自由」や「感情公共性」その応用や展開の可能性を示した。福祉とジェンダーについては定量および定性のふたつの調査を実施し,報告書を刊行した。
里山生態系における放射性セシウム動態の将来予測と放射線防護に配慮した土地利用検討

2013年から行なっている福島県川俣町山木屋地区の里山の空間線量分布調査、放射性セシウム動態調査から森林の放射性Csの現存量に対して各フラックス要素の配分がどのように決定されているのか分析した。以下にt年における不動化量It(kBq/m2)、循環量Yt(kBq/m2)、洗脱量At(kBq/m2)、落枝による樹体付着成分の林地供給量Lt(kBq/m2)の関係式を示す。なお、以下で用いられる数値は全て2011年3月基準で半減期補正したものである。137Cs循環量Ytは、2014年から2016年までほぼ一定の割合で減少した。この結果から放射性137Cs循環量は、不動化によって毎年徐々に減少するが、今後も長期にわたって森林内を循環することが考えられる。なお、137Cs洗脱量Atは循環量に比べ急速に減少したが、137Cs不動化量Itは緩やかに減少した。除染処理区では、林床処理後の2014年に林内雨137Cs量、リターフォール137Cs量ともに対照区に比べて大幅に減少し、林内雨137 Cs量はその後も減少したのに対し、リターフォールの広葉の137Cs濃度が2015年から2017年にかけて増加し、全体として137Cs循環量は増加した。その原因として、いったん除染された林床に再び汚染されたリターが集積して有機物層が次第に再形成され、有機物層を通して放射性セシウムの吸収量が増加し、不動化量を上回っていったためと推察される。このほか、農耕地除染による肥沃度低下の状況、緑肥投入による土壌炭素蓄積、窒素循環および土壌養分に対する効果、緑肥の分解特性などについて研究が進展した。里山の放射性セシウム動態に関する生態系モデルによる将来予測の検討ができたため。除染農耕地の肥沃度回復についても研究が進展した。2018年まで継続した空間線量とリターフォールと林内雨の放射性セシウム放射能調査に加えて、2015年と2016年に測定した土壌の放射性セシウム分布、樹幹樹皮と木部の放射能、樹幹流の放射性セシウムの測定を2019年は行い、3か年間の変化を把握し、作成した放射性セシウム動態モデルのパラメーターを正確に算出し、予測を可能にするとともに、森林の対策について提案し試行する予定である。農耕地についても、緑肥投入による肥沃度および微生物相の回復状況を把握し、対策を提案する予定である。2013年から行なっている福島県川俣町山木屋地区の里山の放射性セシウム動態の調査を継続し、以下のようなことが明らかになった。一年の間に森林から林外へ流出する放射性セシウム量は、全体の0.2%程度と見積もられた。その半分以上は落葉による飛散によるものだった。里山の森林にある放射性セシウムは、現在、ほとんどが林床表面に留まっている。新鮮な落葉に含まれるセシウム量は少ないが、時間がたつと次第に濃度が上昇していき、特に秋の長雨期には、急速に上昇する。林床の放射性セシウムは、有機物が分解して下層に移行しようとするが、菌類の働きによって表層に留められていると考えられる。大部分林床にあるセシウムをコナラやミズナラなどの広葉樹は吸収しており、生育のよい樹木ほどたくさん吸っている。樹木に吸収されたセシウムは、葉に運ばれて落葉及び林内雨によって林床に還元されるものと、樹木の体内に留まるものに大別されるが、林床にある放射性セシウムの1%弱が吸収され、循環していた。このうち木材に留まるものが、総吸収量の約20%だった。事故当時1000kBq/m2の放射性セシウムが降下沈着した林では、2016年春のコナラの辺材の放射能密度が400920Bq/kgだったが、晩秋には平均で1.23倍増加した。山菜・キノコを調理することによって放射性セシウムをどの程度除去できるか実験的に検討した。コウタケを茹でることによって放射性セシウムを22%に、味付け煮によって14%に、塩漬けによって3%に、塩漬けして塩抜きすると1%に減少できた。他のキノコも同様に減セシウムできた。タラノキの芽は、茹でることによって50%、塩漬けによって10%に減セシウムできた。H28年度計画1に関しては、2つの対象区域の放射線量分布を測定し、山木屋GISを更新した。計画2に関しては、森林の放射性セシウム動態が把握され、畑の概要が把握された。水田、草原については、今後行う予定である。計画3については、目的とする生態系モデル構築のための基盤が整った。計画4については、山菜・キノコの調理による放射性セシウム減少効果も把握され、住民にとって有用なデータが得られた。以上のように順調にデータが取得できたため。2013年から行なっている福島県川俣町山木屋地区の里山の空間線量分布調査、放射性セシウム動態調査から次のようなことが明らかとなった。

林床に設置したリターバックの放射能の季節変化調査から、リターバック内リターの放射能濃度は時間を経るに従い増加し、5月当初可給態が多く、不可給態が17%なのが、10月には76%に増加した。リターの分解を行う糸状菌に吸収され、放射性セシウムのリフトアップが起きるとともに、有機態として取り込まれたと考えられる。森林内での循環しやすい形態のCs137と、樹木木部や土壌に不動化されるCs137の今後の動きを予測するモデルを作成した。いずれの予測でも、今後約30年は樹木木部におけるCs137の不動化=蓄積が進行し、その後は137Csは物理的半減期に従って減少するという結果となった。今回の結果からは、今後約30年は材の汚染が進むため、椎茸原木等として木材を利用するのは当分厳しいと考えられる。現在の行動パターンで山菜類を年に一回以下しか摂取しない生活において、追加被ばく線量は、長期目標とされている年間1mSv前後の値と推定された。震災前のように森林に頻繁に出入りしたり、山菜・キノコ類を日常的に摂取する場合は1mSvを上回る可能性がある。外部被ばく線量は追加被ばく線量の7割以上であり、被ばく線量は外部被ばくによってより左右される。震災前のように個人で採取をする山菜やキノコ類を摂取する場合、内部被ばくのリスクも高まる。しかし、山菜・キノコ類をふくめた食事を一食分取り入れた場合の内部被ばく線量の増加は、全く食べない場合に比べ、約5μSvと微増であるため、催事などで旬を楽しむために、年に数回程度取り入れるのであれは、被ばくリスクに大きな変化はないと考えられる。里山の放射性セシウム動態に関する生態系モデルが作成できたため。空間線量マップと質問票調査からの外部被ばく量評価、陰膳調査と質問票調査からの内部被ばく量評価を行うことができ、それらの成果をもとに住民説明会を行うことができたため。2013年から行なっている福島県川俣町山木屋地区の里山の空間線量分布調査、放射性セシウム動態調査から森林の放射性Csの現存量に対して各フラックス要素の配分がどのように決定されているのか分析した。以下にt年における不動化量It(kBq/m2)、循環量Yt(kBq/m2)、洗脱量At(kBq/m2)、落枝による樹体付着成分の林地供給量Lt(kBq/m2)の関係式を示す。なお、以下で用いられる数値は全て2011年3月基準で半減期補正したものである。137Cs循環量Ytは、2014年から2016年までほぼ一定の割合で減少した。この結果から放射性137Cs循環量は、不動化によって毎年徐々に減少するが、今後も長期にわたって森林内を循環することが考えられる。なお、137Cs洗脱量Atは循環量に比べ急速に減少したが、137Cs不動化量Itは緩やかに減少した。除染処理区では、林床処理後の2014年に林内雨137Cs量、リターフォール137Cs量ともに対照区に比べて大幅に減少し、林内雨137 Cs量はその後も減少したのに対し、リターフォールの広葉の137Cs濃度が2015年から2017年にかけて増加し、全体として137Cs循環量は増加した。その原因として、いったん除染された林床に再び汚染されたリターが集積して有機物層が次第に再形成され、有機物層を通して放射性セシウムの吸収量が増加し、不動化量を上回っていったためと推察される。このほか、農耕地除染による肥沃度低下の状況、緑肥投入による土壌炭素蓄積、窒素循環および土壌養分に対する効果、緑肥の分解特性などについて研究が進展した。里山の放射性セシウム動態に関する生態系モデルによる将来予測の検討ができたため。除染農耕地の肥沃度回復についても研究が進展した。設定した里山小流域の空間線量の面的把握を継続し、「山木屋GIS」の情報を更新する。モデル試験地の観測を継続し、放射性セシウムの動態を監視する。
脊髄・神経根血流に関する研究

脊髄・神経根割害の病態を解明すべく、雑種成犬を用いて脊髄と神経根の微細構造,血管形態,血流動態、更に髄液との関係などにつき、走査型及び透過型電子顕微鏡,連続写真撮影装置,組織血流計,脊髄波測定装置等を用いて検討し、以下の成果を得た。(1)神経根栄養血管である根静動脈は髄液中に浮遊し、根被膜とは極めてゆるく結合するのみである。(2)神経根被膜は菲薄で容易に髄液を透過させ、神経根内膜はくも膜下腔と交通している。(3)神経根の血流は髄液の遮断あるいは排除により約20%低下する。(4)神経根内毛細血管は連続型で血液神経関門が強固ではあるが、30g以下の神経根圧迫で関門の破綻により浮腫を生ずる。(5)塩酸エペリゾンは適量(3mg5mg/kg)で神経根の血流増加作用がある。(6)胸部大動脈の遮断は腰髄部血流を直ちに著明に低下させ、脊髄誘発電位の振巾を著明に減少させ、潜時に延長させる。(7)大動脈遮断30分で解除すると、脊髄誘発電位が比較的速やかに元に復するのに対し、脊髄特に灰白質の血流量はもどりが悪い。(8)脊髄軟膜は髄液透過性で、髄内に侵入する脊髄栄養血管周囲腔は髄内深部の終動静脈にまで達しており、脊髄も神経根同様に髄液に浸っている。(9)脊髄の血流は髄液の遮断あるいは排除により約15%低下する。(10)髄液の酸素分圧は脊髄実質の酸素分圧より数段高く、髄液の遮断あるいは排除により、脊髄の酸素分圧は約15%低下する。以上脊髄・神経根に関する一連の実験結果から、両者とも髄液と密接な関係を有し、髄液状態の変化は脊髄・神経根に少なからぬ影響を及ぼすことが実証された。腰仙部神経根障害の病態を解明すべく、雑種成犬の神経根につき、根の血管形態と血流動態、髄液流との関係、圧迫による血流量変化を微細血管造影法、走査型及び透過型電子顕微鏡、連続写真撮影装置、組織血流計(電解式水素クリアランス法)等を用いて検討し以下の成果を得た。1.根栄養血管である根動静脈はクモ膜下腔にあって根被膜とは極めてゆるく結合するのみで髄液中に浮遊していることから、根内への血行維持には正常な髄液状態の必要性が示唆された。また根内血管は根の全長にわたりT字型分岐を繰り返す血管網からなり、神経根血流に分水界があるとする考えは否定された。2.髄液は薄い神経根鞘を容易に透過して膠原線維の希薄な神経内膜にまで浸透し根内血流に参加しているという極めて重要な事実がクモ膜下腔への墨汁注入実験により証明された。3.硬膜外神経根圧迫実験では圧迫開始後に近位側根内血流量と遠位側根内血流量が共に低下するが、その低下の程度は近位側で大きく、また強い圧迫ほど低下がより顕著であった。圧迫解除後は近位側血流量が直ちに回復するのに対し、強い圧迫後の遠位側血流量は圧迫解除後1時間たっても有意の回復を示さなかった。神経根圧迫により中枢側血流がより低下することは硬膜外根血管の血流方向から理解しうるものの、強い圧迫の解除後にみられる遠位側血流量の回復不良は説明できず、髄液が根内血行に参加している事実からみて、圧迫解除後も遷延する髄液停滞が原因と考えられた。

以上の研究結果から神経根障害の病態解明には機械的圧迫とその結果生ずる血行障害のほかに髄液流の障害をも考慮せねばならないという新知見を得た。神経根と同様に髄液に浸っている脊髄の障害についても今後更に研究を発展させる予定である。脊髄・神経根障害の病態を解明すべく雑種成犬を用いて実験的研究を行い以下の成果を得た。(1)腰神経根:他領域にて末梢循環改善作用の認められる塩酸エペリゾンが適量(3ng/kg)で神経根の血流増加作用のあることを電解式水素クリアランス法により実験した。(2)腰神経後根神経節:神経根のみならず後根神経節も髄液の支配下にあることを形態学的に示めし、後根神経節の中枢側及び末梢側の圧迫による後根神経内血流量の変化を電解式水素クリアランス法で検討し、後根神経節が髄液の支配下にあることを実証した。また後根神経細胞内Substornce Pが中枢側神経根の長時間圧迫により増加するという興味ある結果を得た。仮に後根神経節自体の圧迫がなくとも神経節障害の生じうる可能性を示した。(3)骨髄:骨髄及び髄膜の微細構造を一般組織、走査型及び透過型電顕を用いて明らかにし、骨髄が髄液により浸潤されていることを形態的に示した。又上位での骨髄停滞実験と硬膜終のう部からの髄液排除実験による脊髄血流量が約15%減少することを電解式水素クリアランス法により示し、髄液が脊髄の正常血行維持のために重要な役割を果していることを実証した。更に大動脈遮断が脊髄に及ぼす影響を水素クリアランス法による髄内血流量測定と脊髄誘発電位測定の同時記録により検討し、動脈遮断後血流量は直ちに著明な低下を示すが、脊髄誘発電位の変化はやや遅れて出現し、動脈遮断解除後の回復は血流量が60%にとどまったのに対し、脊髄誘発電位は比較的早期に元に復するという事実を認め、血流量低下と脊髄機能障害の関係につき興味ある結果を得た。(1)脊髄栄養血管が髄内に侵入するVirchowーRobinSpaceには軟膜深層組織に由来する粗な膠原線維綱があり、これが髄内深部の終動静脈にまで達していることが形態的に明らかにされ、脊髄実質が髄液に浸されていることが証明された。(2)脊髄の酸素分圧は灰白質が白質の2倍と高く、髄液の酸素分圧は更に高値を示すことが解った。(3)上位で硬膜絞扼を施し、髄液停滞を生ぜしめると、髄液停滞域にある脊髄と髄液の酸素分圧は低下を示すが、髄液の酸素分圧が除々に低下するのに対して髄内酸素分圧は停滞直後から低下し、停滞中不変で、その下降の程度は灰白質でより顕著であった。髄液停滞1時間後に硬膜絞扼を解除すると、白質の酸素分圧は比較的すみやかに元に復したのに対し、灰白質では回復をみず、髄液の酸素分圧はその後も終了時間にわたって低下しつづけ、灰白質と髄液の酸素分圧が元に復するのには5時間を要した。(4)胸部大動脈遮断により腰髄部血流は直ちに著明な低下を来たし、上行性及び下行性の脊髄誘発電位は著明な振巾の減少と潜時の延長を生じ、30分で遮断を解除すると脊髄誘発電位が比較的速やかに元に復したのに対し、脊髄特に灰白質の血流量は解除後1時間経過しても低値にとどまった。(5)神経根被膜は菲薄で容易に髄液を透過させ、神経根内膜はくも膜下腔と交通していることが証明された。また神経根内毛細血管は連続型で血管神経関門がしっかりしているものの、30g以上の神経根圧迫でこの関門は破綻し、浮腫を生ずることがEvans blue albuminとhorse radishの注入実験で明らかになった。(6)末梢血流改善作用があるとされる塩酸エペリゾンは、1mg/kg投与では神経根血流に変化なく、3mg5mg/kgの投与で明らかに神経根血流の増加、10mg/kgで逆に低下が生ずることが水素クリアランス法を用いて証明された。