hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
アンドロゲンによる老年疾患抑制機構の解明:細胞老化から虚弱化まで

老化および老年疾患におけるアンドロゲンの意義と作用機序を解明する目的で研究を行った。臨床研究では、中年男性のメタボリックシンドロームや心血管疾患、虚弱高齢男女の認知機能やADL、生命予後とアンドロゲンの低下が関連することを報告した。細胞および老化動物を用いた検討では、老化形質に対してアンドロゲンが保護的に作用し、NO、SIRT1が重要な役割を果たすことを明らかにした。今年度は、(1)老化のプロセスに対するアンドロゲンの作用とその機序の解明、(2)について基礎・臨床研究を行った。血管平滑筋細胞を用いた検討により、アンドロゲン受容体が増殖因子Gas6のプロモーターに直接結合して転写を活性化し、さらに生存シグナルの活性化を介して血管石灰化を抑制することを報告した(J Biol Chem 2010)。血管内皮細胞を用いた検討では、アンドロゲン受容体を介した細胞膜レベルでのPI3キナーゼ/Akt経路によるeNOS活性化機構が存在することを明らかにした(Endocrinology 2010)。虚弱高齢者のコホート208名で得られたデータを解析し、男性では血清テストステロンが、女性ではDHEAが日常生活機能と関連することを報告した(Geriatr Gerontol Int 2009)。また、171名の中高年男性生活習慣病患者を平均6.4年間追跡調査し、血清テストステロンの低下が独立した心血管疾患の発症リスクであることを報告した(Atherosclerosis 2009)。一方、中年男性会社員172名の追跡調査では、5年間に性ホルモン濃度の明らかな変化はみられず、生活習慣病指標との関連もほとんど認めなかった(Geriatr Gerontol Int 2010)。来年度以降、基礎研究では長寿遺伝子Sirt1との関係、老化マウスを用いた検討、臨床的には認知症やサルコペニアといった老化疾患との関係を検討する予定である。老年病の病態形成におけるアンドロゲンの役割と老化プロセスに対するアンドロゲンの作用を解明する目的で、昨年に引き続き臨床研究、基礎研究を行った。中年男性生活習慣病患者194名を対象に、メタボリックシンドロームと血清性ホルモン濃度との関連を解析し、テストステロン低値がメタボリックシンドロームの診断ならびに各構成要素、特に内蔵肥満と関連することを示した(Hypertens Res 2010)。さらに、中高年男性生活習慣病患者171名を追跡調査し、血清テストステロンの低下が独立した心血管疾患の発症リスクであることを報告した(Atherosclerosis 2010)。血管内皮細胞では、アンドロゲン受容体が細胞膜レベルでPI3キナーゼ/Akt経路を活性化してeNOS活性化/NO産生に寄与することを報告したが(Endocrinology 2010)、今年度はさらにアンドロゲン受容体がCaveolin-1と共存し、ERK活性化や細胞内Ca2+の増加を促し、さらにeNOS活性化につながることを見出した。来年度は、老化マウス、認知症モデルマウスの解析を中心に行い、特に長寿遺伝子Sirt1とアンドロゲン、アンドロゲン受容体との関係について基礎検討を行う。また、サルコペニアにおけるアンドロゲンの役割について、基礎的、臨床的検討を行う。これらの研究結果から、細胞老化から老年疾患、特に虚弱化の過程にアンドロゲンが深く関わることがわかり、この成果は治療法にも応用できると期待される。老年病の病態形成におけるアンドロゲンの役割と老化プロセスに対するアンドロゲンの作用を解明する目的で、昨年度に引き続き臨床研究、基礎研究を行った。70-96歳の軽度要介護高齢者214名(男性117名、女性97名)を平均32か月間追跡調査し、開始時の血清性ホルモン濃度と死亡との関連を解析した。多変量解析の結果、男性ではテストステロンが3分位で下位の群が、女性ではdehydroepiandrosterone-sulfate(DHEA-S)が下位の群が、上位群に比べて3-4倍死亡リスクが高かった(Geriatr Gerontol Int 2011)。培養血管内皮細胞を用いた研究では、アンドロゲン受容体が細胞膜レベルでc-SrcおよびCaveolin-1と共存し、eNOS活性化につながることを見出し(論文投稿中)、関連する成果を英文総説として報告した(Hypertens Res 2012)。また、アンドロゲンは酸化ストレス誘導性の内皮細胞老化を抑制し、神経細胞との共培養系では内皮細胞老化が神経細胞老化を誘導したが、内皮細胞をアンドロゲンで処理することで神経細胞の老化も抑制された(PLoS One 2012)。認知症を呈する老化促進マウスSAMP8を用いた検討では、学習機能と血清テストステロンの低下、精巣のLeydig細胞と脳の海馬の顕著な老化形質を認めたが、テストステロンの補充によりこれらはすべて改善し、抗老化遺伝子Sirt1の発現回復もみられた(PLoS One 2012)。同マウスを用いて引き続きサルコペニアの解析を行っている。

これらの研究結果から、細胞老化から老年疾患、特に虚弱化の過程にアンドロゲンが深く関わることがわかり、今後の成果も含めて治療法にも応用できると期待される。
ソボレフ関数のポテンシャル論的研究

実解析学だけでなく、偏微分方程式論、電気流動学などへの応用を念頭に、ソボレフ関数を利用して、さまざまな関数空間におけるソボレフ型定理を発展させたり、楕円型偏微分方程式を考察したりするポテンシャル論的研究を行った。例えば、変動指数をもつ関数空間における極大関数の有界性を導き、その応用として、ソボレフの不等式やTrudinger指数積分不等式について新しい知見を得るなど、ソボレフの定理を発展させることができた。楕円型偏微分方程式の解について、存在と一意性、正則性などの解析的な性質を研究する方法はいくつかあるが、ペロンの方法に代表されるポテンシャル論的方法はその有力なものの一つである。特に、楕円型偏微分方程式の解の研究において、ソボレフ関数は非常に有用な道具となる。本研究では、ポテンシャル論的方法により、ソボレフ関数を利用して、楕円型偏微分方程式の解がもつ解析的な性質を調べることを目的とし、本年度の研究は次のように行った。楕円型偏微分方程式であるラプラス方程式に関連して、近年、電気流動学や弾性学において、p-ラプラス方程式の指数であるpを変化させて考えると効果的であることがわかり、変動指数をもつ偏微分方程式の考察とそのための関数空間の理論の重要性がわかってきた。そこで、一般的な変動指数の条件のもとで、極大関数の有界性に関する一般的な結果を導くことを目指した。応用として、ソボレフの不等式について新しい知見を得ることができ、ソボレフの定理を発展させることができた。上記の結果は、国内の研究集会はもとより、ヘルシンキ大での専門家向きのセミナーで発表された。また、研究集会等を通じて、新しい研究の方向を知ることができた。特に、ポテンシャル論研究が盛んなフィンランドの数学者達との研究交流を積極的に行い深めることができた。本研究では、ポテンシャル論的方法により、ソボレフ関数を利用して、楕円型偏微分方程式の解がもつ解析的な性質を調べることを目的とし、本年度は次のような研究を行った。変動指数をもつ関数空間において、極大関数などにおける従前の理論がどのような形で成立するかについて論じた。その応用として、変動指数をもつソボレフ型空間において、ソボレフの定理が成立することを調べた。重調和関数は弾性学などの物理的問題ばかりでなく、調和解析などでも重要である。穴あき単位球で定義された優重調和関数について、球面平均の振る舞いによって、リースポテンシャルと重調和関数の和として表されることを示した。その応用として、原点の除去可能性を論じた。任意の領域において大域的な境界Harnack原理が成立することと、大域的なCarleson評価が成立することが同値であることを示した。左辺がp-Laplace作用素に低階項を加えたタイプで、右辺に符号付きRadon測度を含むタイプの2階楕円型非線形偏微分方程式の解の正則性、解の勾配の可積性について調べた。
次世代シーケンサーによる小児骨髄異形成症候群と若年性骨髄単球性白血病の解析

CSF3R変異はMDSとJMMLではみられず、AMLでは534例中10例にみられ、Exon 17の変異10例中7例が生存中であった。CALR遺伝子の変異は血小板増多症21例中1例にみられ、MDSとJMMLではみられなかった。非ダウン症候群急性巨核芽球性白血病(non-DS-AMKL) 43例中CBFA2T3-GLIS2を12例、NUP98- JARID1Aを4例、OTT-MALを10例認め、OTT-MAL以外は予後不良であった。またTAMは21トリソミーとGATA1変異のみで発症し、MDS/AML移行はコヒーシン複合体、エピゲノム制御因子、シグナル伝達系分子が関与していた。今年度はGCSF受容体であるCSF3R遺伝子のエクソン14、17と最近成人の骨髄増殖性疾患(MPD)で話題になっているCALR遺伝子のエクソン9の解析を行った。CSF3R遺伝子の変異はMDSとJMMLではみられなかった。CALR遺伝子の変異は血小板増多症(ET) 21例中1例にみられたが、MDSとJMMLではみられなかった。小児ETでのCALR遺伝子の変異は本邦では初めての症例である。またダウン症候群のTAMからAMLへの移行につきエクソーム解析とターゲットリシーケンスを行った。TAMは21トリソミーとGATA1変異のみで発症すること、白血病への移行にはコヒーシン複合体(RAD21, STAG2, NIF, SMC1A, SML3)が53%、EZなどのエピゲノムの制御因子が45%、RAS/チロシンキナーゼなどのシグナル伝達系分子が47%の遺伝子の変異が関与することを明らかにした。またTAM細胞を移植したNGOマウスの作整とiPS細胞樹立の基盤整備によりTAMから白血病への移行の機序の解明に貢献できた。これらによりTAMの診断の精度の向上と重症度の判定および治療薬の開発の基盤の確立を推進することができた。今年度はGCSF受容体であるCSF3R遺伝子のエクソン14、17とCALR遺伝子のエクソン9の解析を行った。CSF3R遺伝子の変異はMDSとJMMLではみられなかったがAMLでは534例中10例(1.87%)に変異がみられた。小児ETでのCALR遺伝子の変異は本邦では初症例である。またダウン症候群のTAMからMDS/AMLへの移行につきエクソーム解析とターゲットリシーケンスを行った。TAMは21トリソミーとGATA1変異のみで発症すること、MDS/AMLへの移行にはコヒーシン複合体が53%、EZなどのエピゲノムの制御因子が45%、RAS/チロシンキナーゼなどのシグナル伝達系分子が47%の遺伝子の変異が関与することを明らかにした。またTAM細胞を移植したNGOマウスの作整とiPS細胞樹立によりTAMからMDS/AMLへの移行の機序の解明に貢献できた。またダウン症候群のTAMからMDS/AMLへの移行につきエクソーム解析とターゲットリシーケンスを行い、TAMは21トリソミーとGATA1変異のみで発症すること、MDS/AMLへの移行にはコヒーシン複合体が53%、EZなどのエピゲノムの制御因子が45%、RAS/チロシンキナーゼなどのシグナル伝達系分子が47%の遺伝子の変異が関与することを明らかにした。網羅的メチル化解析についても検討予定である。これまでCSF3R遺伝子解析の詳細な検討では、変異はMDSとJMMLではみられなかったが、AMLでは534例中10例(1.87%)にがみられ、エクソン14では2例が(PoT618I)、エクソン17では8変異(3例がframe shift変異、5例がミスセンス変異)であった。エクソン17の変異症例はすべてt(8;21) 5例を含む転座がみられ、10例中7例が生存中であった。CALR遺伝子の小児骨髄性疾患での意義の解明に貢献した。小児MDSとJMMLの発症分子機構を解明するために,これまで小児MDS 40例とJMML40例で既知の遺伝子異常の解析と全エクソン解析を行ってきた。

今年度はGCSF受容体であるCSF3R遺伝子のエクソン14、17とCALR遺伝子のエクソン9の解析を行った。CSF3R遺伝子の変異はMDSとJMMLではみられなかった。AMLでは534例中10例(1.87%)に変異がみられた。エクソン14では2例が(PoT618I)、エクソン17では8変異(3例がframe shift変異、5例がミスセンス変異)であった。エクソン17に変異がみられた症例はすべてt(8;21) 5例を含む転座がみられ、10例中7例が生存中であった。CALR遺伝子の変異は血小板増多症(ET) 21例中1例にみられたが、MDSとJMMLではみられなかった。小児ETでのCALR遺伝子の変異は本邦では初めての症例である。またダウン症候群のTAMからMDS/AMLへの移行につきエクソーム解析とターゲットリシーケンスを行った。TAMは21トリソミーとGATA1変異のみで発症すること、MDS/AMLへの移行にはコヒーシン複合体が53%、EZなどのエピゲノムの制御因子が45%、RAS/チロシンキナーゼなどのシグナル伝達系分子が47%の遺伝子の変異が関与することを明らかにした。またiPS細胞樹立の基盤整備によりTAMからMDS/AMLへの移行の機序の解明に貢献できた。小児血液・腫瘍学、分子細胞遺伝学エクソーム解析とターゲットリシーケンスについては、おおむね順調に進んだが、さらに多数例での新規に報告された遺伝子について検証を行い、臨床像との関係と機能解析を検討する。1)標的遺伝子の同定と遺伝子性状の解析解析した小児MDSとJMMLにおいてみい出された変異につき、次世代シーケンサーを用いて多数例でターゲットリシーケンスを行う。またheterodyplex mobility assay法、コロニーアッセイなどにより、腫瘍化との関連性のさらなる検証を行い、標的遺伝子の同定を試みる。並行して網羅的メチル化解析の結果より抽出した候補標的遺伝子に関しても同様の遺伝子の性状解析を行う。2)メチル化の網羅的解析メチル化の有無に関して網羅的に検討し、エピジェネティックな転写抑制機構の解明を試みる。検出されたメチル化領域に関しては、発現解析およびbisulfate sequencingによりvalidationを行い、さらに有用なものに関しては5-aza-deoxythidineによるin vitro assayも行う。小児MDSとJMMLの発症分子機構を解明するために,これまで小児MDS 40例とJMML40例で既知の遺伝子異常の解析および次世代シーケンサーを用いたターゲットリシーケンスによりRNAスプライシング関連遺伝子の解析を行ってきた。今年度はGCSF受容体であるCSF3R遺伝子のエクソン14、17と最近成人のMPDで話題になっているCALR遺伝子のエクソン9の解析を行った。またダウン症候群のTAMからAMLへの移行につきエクソーム解析とターゲットリシーケンスを行った。TAMは21トリソミーとGATA1変異のみで発症すること、白血病への移行にはコヒーシン複合体(RAD21, STAG2, NIF, SMC1A, SML3)が53%、EZなどのエピゲノムの制御因子が45%、RAS/チロシンキナーゼなどのシグナル伝達系分子が47%の遺伝子の変異が関与することを明らかにした。
胎生致死マウスを利用する新しい造血解析法

胎生致死となる遺伝子欠損をもつマウス細胞からiPS細胞を樹立し、造血細胞に分化誘導して造血を解析する目的で本研究をすすめた。本研究では、まず野生型マウス由来の線維芽細胞からiPS細胞を樹立し造血細胞の分化誘導を試みたところ、T細胞への分化は効率よくみられたものの、B細胞への分化に抵抗性を示した。iPS細胞からの正常な造血が観察されなかった原因として、不完全なリプログラミングや、導入遺伝子の再活性化などが原因として考えられた。iPS細胞化に使用する遺伝子がゲノムに挿入されない方法によりiPS細胞を作製し分化解析に使用する必要性があると考えられた。1.マウス免疫系細胞のiPS細胞化:マウスCD3^+T細胞、CD19^+B細胞の各細胞に山中4因子をレトロウイルスで導入しiPS細胞化を試みた。1×10^7個のB細胞から30個のiPS細胞コロニーが得られた(頻度:36.2×10^<-4>)のに対し、T細胞ではiPS細胞は得られなかった。B細胞由来iPS細胞(B-iPS細胞)のB細胞受容体遺伝子は再構成されており、確かにB細胞由来であった。B-iPS細胞は3胚葉から構成される奇形腫の形成能を有し、多分化能をもつiPS細胞であった。2.iPS細胞からの免疫系細胞への分化誘導:MEF由来iPS細胞およびB-iPS細胞から、胚様体形成法、OP9系細胞との共培養法にて免疫系細胞への分化誘導を試みた。MEF-iPS細胞、B-iPS細胞ともに分化誘導後5日目にはFlk-1^+、CD34^+細胞が生成した。OP9-DL1との共培養系では27日目にCD4^+CD8^+、CD8^+、αβ^+、γδ^+のT細胞が生成した。生成したT細胞は抗原刺激によりIFN-・を産生し、TGF-・添加によりFoxP3^+制御性T細胞へ分化した。B-iPS細胞およびMEF-iPS細胞から生成したT細胞のT細胞受容体は多様であった。よってiPS細胞から各種effector細胞へ分化可能な多様なT細胞の分化誘導が可能であることが明らかとなった。一方でOP9との共培養系では、MEF-iPS細胞およびB-iPS細胞のいずれからでもB細胞は生成しなかった。分化誘導時の遺伝子発現解析によるとB細胞分化に重要なPax5の発現が誘導されていなかった。私たちは同培養系で正常造血前駆細胞からのCD19^+B細胞の生成を確認しており、iPS細胞からのB細胞分化誘導にはiPS細胞自体または分化誘導系に何らかの障害がある可能性が考えられた。造血の分子機構解析において、遺伝子欠損マウスの解析から得られる情報は非常に多い。一方で、欠損/変異させた遺伝子が生命維持に不可欠である場合も多く、造血機構の解析が可能となる前の段階で死亡してしまう例も少なくない。そこで、近年開発されたiPS細胞化技術を利用し、胎生致死マウスの細胞からiPS細胞を誘導し、in vitroあるいはin vivoにおいて血液細胞へと分化誘導し、欠損/変異遺伝子が造血へおよぼす影響について解析する方法論を着想した。本研究では、まず野生型マウス胎仔より得られた線維芽細胞からiPS細胞を樹立した。レトロウイルスにより胎仔線維芽細胞に山中4因子の導入し、iPS細胞を樹立した。樹立したiPS細胞から造血細胞の分化誘導を試みたところ、T細胞への分化は効率よくみられたものの、B細胞への分化に抵抗性を示した。別個に樹立したB細胞由来iPS細胞でも同様の傾向が見られた。iPS細胞由来造血前駆細胞を精査したところ、B細胞分化のマスター転写因子の一つであるPax5の発現が認められなかった。Pax5の不発現は不完全なリプログラミングによるPax5プロモーター領域のメチル化が原因として考えられたが、Pax5プロモーター領域は低メチル化状態にあり、Pax5の不発現はPax5プロモーターの不活化によるものではないことが明らかとなった。一方で、iPS細胞由来造血前駆細胞において、iPS細胞化の際に導入したOct4の異所性発現がみられ、iPS細胞からの造血細胞分化に何らかの影響を及ぼしている可能性が考えられた。iPS細胞を医療応用しようとした際、iPS細胞化時に使用した因子、例えばc-Mycの再活性化はがん化の危険をはらんでいるとして問題となっている。iPS細胞から胎生致死となる欠損/変異遺伝子をもつ細胞からiPS細胞を作製し、その分化を解析したい場合においても導入遺伝子の再活性化によりiPS細胞の「本来の分化」が阻害されるなどの問題が生じる可能性があり、iPS細胞化の際の導入
近世中後期における幕領支配と地域社会―畿内・近国代官支配地を対象に―

本研究の目的は、畿内・近国に設置された代官および代官役所の支配替の分析を通じて、近世中後期における幕領支配の変質過程を解明することである。本年度(平成28年度)は、1昨年度に引き続き、代官役所下僚史料の収集と代官役所機能の分析のほか、2幕領配置政策の構造を考察するため、全国の幕領や藩領の支配替関連史料の収集(私領差障有無調査書、転封など配置替の際の領主側史料)を主な課題とした。1については、長州戦争時における大坂代官管轄地域の史料収集を継続するとともに、(1)戦時の人足の動向や代官役所の機能については文章化の上、学術雑誌に投稿し、(2)長州戦争時において臨時的に採用された雇手代の機能については、長州戦争時以外にも近世中後期において雇手代が用いられる事例が複数発見されたため、戦時に限らず、中後期の幕領支配の一形態として分析を進めている。2については、「江戸城多聞櫓文書」など国立公文書館所蔵の領主側史料および、大坂代官の「支配村々高附帳」(代官の全支配村・高リスト)などの地方史料の収集を継続した。これにより当該期の幕領支配政策の動向を動態的に把握するとともに、代官役所の管轄地域の変遷を推定した。また幕府から幕領に対して支配替の是非を事前に調査した際の回答書である私領差障有無調査書を全国の地方文書の中から収集し、中後期における幕府の支配政策と地域側の認識について検討した。検討結果は、「近世中後期における幕領支配の変質過程」として歴史学研究会日本近世史部会にて口頭報告を行い、天保期頃を画期とした大坂代官管轄地域における幕領配置政策の変化から幕領支配の変質過程を論じた。本年度の調査により、想定していた以上の史料発掘があったが、その分分析に時間がかかり、多少検討課題を残した。残された課題の分析を続け、報告をもとに、近日中に論文化する予定である。28年度が最終年度であるため、記入しない。本研究の目的は、畿内・近国に設置された代官および代官役所の支配替えの分析を通して、近世中後期にける領主ー領民関係の変化を読み取り、その政治的・社会的背景を解明することである。本年度は、1代官役所下僚の史料の収集、分析、2大坂代官支配替忌避歎願書の集積・代官役所の支配地分布図作成のための史料収集を主な課題とした。1については、まず大坂代官支配地の長州出兵時の村方史料の収集を行うとともに、村方に残された手代史料(長州出兵時)の分析を完了し、分析結果は(1)代官所機能の変化の前提となる幕末期の地域の変容についてアジア世界史学会(AAWH)第3回国際会議にて報告したほか、(2)代官役所の機能については第54回近世史サマーセミナー全体会報告にて報告を行い、また(3)幕末期において代官役所機能の肩代わりをした雇手代の機能と人足徴発については大阪歴史学会近世史部会にて報告を行った。また(1)は“Local Officials of the EdoShogunate during the Late Early-Modern Period"と題して正文化した。(2) (3)については分析を継続し、来年度に正文化する予定である。2については、「江戸城多聞櫓文書」などの領主側史料、摂河泉播の地方文書に残る代官の「支配村々高附帳」(代官の全支配村・高リスト)などの史料を収集した。これにより当該期の幕府支配の動向、代官所の位置づけについて分析し、代官役所支配地分布の変遷を推定した。史料が散在していることに加え、分析に時間がかかるため、来年度も引き続き史料収集につとめるとともに、分析を進め、来年度末までの正文化を目指したい。以上1・2の分析をふまえ、日本史研究会にて研究者がフィールドとする畿内・近国地域の支配論・地域論に関する先行研究を整理した後、今後の研究課題や展望を示した。今年度は、1代官役所下僚の史料の収集、分析、2大坂代官支配替忌避歎願書の収集・代官役所の支配地分布図作成のための史料収集を行った。1については長州戦争時に手代として取り立てられた家の史料の分析をほぼ完了したほか、長州出兵時の村方史料や勘定所の記録、また手代のマニュアル本の中から大坂代官の史料を新しく発見し、収集した。後者についての分析は次年度の課題として残された。また、2歎願書については今年度新たに天保期の支配替忌避の動向がみうけられる史料を発見したほか、東京大学や国立公文書館、九州大学などで代官役所の支配地・高を網羅的に記した史料を集中的に調査した。調査結果の一部は“Local Officials of the Edo Shogunate during the Late Early-Modern Period"と題して正文化したほか、アジア世界史学会(AAWH)第3回国際会議、第54回近世史サマーセミナー全体会報告、大阪歴史学会近世史部会にてそれぞれ報告を行なった。今年度は1、2ともに新たな史料発見があり、史料の収集が順調に進んだが、その分、分析については当初の予定よりも長期間を要することとなり、一部は次年度の課題となった。

本年度(平成28年度)は、1昨年度に引き続き、代官役所下僚史料の収集と代官役所機能の分析のほか、2幕領配置政策の構造を考察するため、全国の幕領や藩領の支配替関連史料の収集(私領差障有無調査書、転封など配置替の際の領主側史料)を主な課題とした。1については、長州戦争時における大坂代官管轄地域の史料収集を継続するとともに、(1)戦時の人足の動向や代官役所の機能については文章化の上、学術雑誌に投稿し、(2)長州戦争時において臨時的に採用された雇手代の機能については、長州戦争時以外にも近世中後期において雇手代が用いられる事例が複数発見されたため、戦時に限らず、中後期の幕領支配の一形態として分析を進めている。2については、「江戸城多聞櫓文書」など国立公文書館所蔵の領主側史料および、大坂代官の「支配村々高附帳」(代官の全支配村・高リスト)などの地方史料の収集を継続した。これにより当該期の幕領支配政策の動向を動態的に把握するとともに、代官役所の管轄地域の変遷を推定した。また幕府から幕領に対して支配替の是非を事前に調査した際の回答書である私領差障有無調査書を全国の地方文書の中から収集し、中後期における幕府の支配政策と地域側の認識について検討した。検討結果は、「近世中後期における幕領支配の変質過程」として歴史学研究会日本近世史部会にて口頭報告を行い、天保期頃を画期とした大坂代官管轄地域における幕領配置政策の変化から幕領支配の変質過程を論じた。本年度の調査により、想定していた以上の史料発掘があったが、その分分析に時間がかかり、多少検討課題を残した。残された課題の分析を続け、報告をもとに、近日中に論文化する予定である。今後は、まず今年度すでに収集した幕府や代官史料の翻刻、史料分析を通して1、2の分析結果をそれぞれ正文化することが目標である。また国立公文書館、国会図書館、また東北大学狩野文庫の調査など、引続き幕府史料、代官史料の収集を並行して進めていく。また2年目の課題として、3村落構造分析を進めていく必要がある。特に領主ー領民関係を探るために村や地域における「救済」に注目し、年貢にかかわる救済や地域的入用の検討を進めたい。分析対象としては、年貢にかかわる廻米資料や村・郡中などの入用帳がメインとなる。また天保期頃を画期に展開していく「郡中(非常)備銀」の検討によって、地域の広域的救済制度の展開と領主的枠組みの関係の変化を解明することで、1、2で検討した領主的枠組みや支配制度と3村落構造の変化を関連付けて解明することが次年度の目標である。「郡中(非常)備銀」については大坂周辺の村文書の収集のほかに、一部手代史料の中にも関連資料が発見されたため、次年度は各種史料の総合的な分析をもとに、正文化を目指したい。28年度が最終年度であるため、記入しない。
2次元速度分布計測によるプラズマ推進機の加速機構の解明

2013年4月から7月にかけて、電気推進機の電磁加速機構解明に向けた研究を行った。6月末に8月から独立行政法人宇宙航空研究開発機構・宇宙科学研究所・宇宙飛翔工学研究系・助教への内定が急遽おたことで、わずか4ケ月の短い研究期間であったが、以下のように研究をおこなった。研究は、まず使用する真空槽の組立から始まった。直径1m長さ2.2mの真空容器に、ロータリーポンプ・ターボ分子ポンプを組み付け、作動試験を行った。流量ゼロで、10^<-5>Paの真空度を実現した。ホールスラスタで必要となる真空度は一般に10^<-3>Pa未満、MPDスラスタでも10^<-2>Paであるために、さらに排気速度を高める必要になった。上記真空環境実現のためゲートバルブとクライオポンプの追加し、理論排気速度3600L/sの真空槽とした。さらにスラスタの作動確認のため、電源ラックや必要部品を購入し、スラスタのプラズマの点火に成功した。引き続き加速試験を行い、真空度と流量から実行排気速度が理論値の4割程度であることを確認した。コンダクタンス等を考慮すれば、他の既存の真空槽とくらべて、極めて妥当であると判断した。7月には、当該分野の国際会議である49th AIAA/ASME/SAE/ASEE Joint Propulsion Conference & Exhibitに出席し、ホールスラスタの高比推力化と大電力化の取り組みを調査した。特に従来、セラミック部品を用いていたホールスラスタが磁場形状の最適化によりプラズマがセラミックと非接触になり、セラミックが導電体で伝熱効率が良いカーボンに置き換わったことが、大電力化にとって、画期的なイノベーションになりうるとの知見が発表され、大きなインパクトを受けた。8月より独立行政法人宇宙航空研究開発機構・宇宙科学研究所に移動するが、引き続き電磁加速機構の解明に向けて、MPDスラスタを中心に実験的研究を行なっていきたい。(抄録なし)2013年4月から7月にかけて、電気推進機の電磁加速機構解明に向けた研究を行った。(抄録なし)
DNA修復欠損DT40細胞を用いた抗がん剤の作用機序解明

DNA損傷欠損DT40細胞を用いた抗がん剤の作用機序解明のために、米国国立衛生研究所Dr. Menghang Xiaと共同研究を行った。抗がん剤は細胞のDNAに傷を入れることで細胞死を誘導する。野生型細胞は遣伝子に入った傷、すなわちDNA損傷を修復することができる。しかし、がん細胞は遺伝子に変異が入っているため、DNA損傷を修復することができない場合が多い。このため、抗がん剤に暴露された場合において、がん細胞は野生型細胞に比べて死にやすい。我々は、野生型DT40細胞とDNA損傷修復遺伝子が欠損したDT40細胞を薬剤に暴露し、両者の生存率を比較することで、薬剤のDNA毒性を評価した。以下に具体的な内容と成果を記す。我々は、昨年度に米国NIHの所有する薬剤ライブラリーの一次スクリーニングを実施した。一次スクリーニングでは野生型細胞と二種類のDNA損傷修復欠損細胞を使用した。本年度は昨年得られたデータを統計的に解析し、野生型細胞と比較してDNA損傷修復欠損細胞の生存率を優位に低下させる薬剤を選び出した。さらに得られた結果が正しいかを検証するために一次スクリーニングと同様の条件で二次スクリーニングを行った。二次スクリーニングの結果、一次スクリーニングで選ばれた薬剤のうち約半数で再現性が確認できた。これらの薬剤の中にはDNA毒性が既知のものだけでなく、過去にそのDNA毒性について報告がないものもいくつか含まれていた。また、これまでのスクリーニングで使用した二種類のDNA損傷修復欠損細胞以外に新たに六種類のDNA損傷修復欠損細胞でも同様の実験を行った。その結果、同じ薬剤に対して、すべてのDNA損傷修復欠損細胞が生存率の低下を示すわけではないことが明らかになった。このことから、薬剤が誘導したDNA損傷の種類を予測することが可能である。研究は順調に進み、新たなデータを得ることができた。我々が新たに同定した新規のDNA毒性を持つ薬剤についてさらなる検証を進める。このために小核テストを実施する予定である。その後、論文にまとめる予定である。毎年1000種類以上の化学物質が新たに市場に出ている。しかし、有害化学物質を検出するための有効な手法は存在していない。現在、薬物の毒性評価に用いられている手法(Amesテスト、小核テスト)では偽陽性が50%近くになることが大きな問題である。このため、より特異性の高い有害化学物質検出法の新たな開発が急務である。我々は、新たな有害化学物質検出法を開発することを目的に米国NIH(National Institute of Health)、NCGC(National Chemical Genomic Center)と共同研究を行っている。我々は、共同研究の第一段階として1,400種類の化学物質から構成されるPhaseI化学物質ライブラリーを使用した実験を行い、論文を発表した(Yamamoto et al,. 2011)。現在、私は米国NCGCに留学し、共同研究の第二段階として12,000種類の化学物質からなるPhaseIIライブラリーを使った実験を行っている。我々はこれまでにPhaseIIライブラリーを用いた一次スクリーニングを行い、データを統計的に解析した結果、約150種類の化学物質が毒性をもつことが示唆された。次の段階として、毒性を持つことが示唆された約150種類の化学物質の毒性を確実な手法で確認する必要がある。このために我々は、以下の三つの実験を実施する。1)細胞の化学物質への暴露時間を延長し、細胞生存率を比較する、2)DNA損傷時に誘導されるγH2AXを顕微鏡下で確認、3)染色体断裂を確認。申請者は、1)に挙げた試験を行うための実験条件の設定をこれまでに行い、最適な実験条件を見つけることに成功した。今後、一次スクリーニングの結果選ばれた約150種類の薬剤について妥当性試験をおこない、我々の開発した毒性試験の妥当性を評価する。

その結果、同じ薬剤に対して、すべてのDNA損傷修復欠損細胞が生存率の低下を示すわけではないことが明らかになった。このことから、薬剤が誘導したDNA損傷の種類を予測することが可能である。12000種類からなる化学物質ライブラリーの一次スクリーニングが終了し、結果を統計的に解析した。一次スクリーニングの結果を検討するための、妥当性試験に必要な実験条件の設定も完了した。予定通りに研究は進展している。研究は順調に進み、新たなデータを得ることができた。これまでに我々が行った一次スクリーニングの妥当性を検証するために、一次スクリーニングの結果、細胞毒性を持つことが示唆された薬剤を用いて以下の三つの実験を行う。1)細胞の化学物質への暴露時間を40時間から72時間に延長し、細胞生存率を比較する、2)DNA損傷時に誘導されるγH2AXを顕微鏡下で確認、3)染色体断裂を確認。これらの実験は、申請者が留学先であるアメリカNIH-NCGCにて行う。我々が新たに同定した新規のDNA毒性を持つ薬剤についてさらなる検証を進める。このために小核テストを実施する予定である。その後、論文にまとめる予定である。
みそ特有香気成分の酵母による形成と加熱分解による風味低下への影響

日本の代表的な調味料であるみそ・醤油からは多くの香気成分が検出されているが、著者は赤色系辛口米味噌に代表される発酵型熟成味噌の特有香気成分としてHEMF(4-hydroxy-2(or 5)-ethyl-5(or 2)-methyl-3(2H)-furanone)を同定し、みその熟成過程で酵母が関与して生産することを明らかにした。また、酵母によるHEMFの形成機構を解明する目的で、炭素源や窒素源をかえた液体培地で耐塩性酵母Zygosaccharomyces rouxiiを培養し、ペントースであるリボースとアミノ酸を同時に加熱殺菌して調製された培地でHEMFが形成されることを確認した。従って、酵母はペントースとアミノ酸のアミノカルボニル反応によって生成されたHEMFの前駆物質にアセトアルデヒド様の化合物を提供すると推察している。本研究では培地調製時に、リボースとグリシンのアミノカルボニル反応によって生成するであろうHEMF前駆物質形成への、その他の培地成分の関与と、リボースの濃度によるHEMFの形成への影響を明らかにすることを試みた。その結果、リボースとグリシンから生成されるHEMF前駆物質は、培地中にリン酸緩衝液が含まれている場合に、安定して形成される可能性が高いことが明らかになった。また、HEMF形成に適した培地中のリボース濃度は20mmol300mmolの範囲にあると推測された。一方、一般的にみそ汁は加熱しすぎると風味の低下を招くことが指摘されている。そこで、匂いの評価用語を用いて、みそ汁の風味低下の現象をより具体的に表現することを試みた。さらに、GC-O分析とAEDA法を用い、FDファクターを求めることによってみそ汁の香気に重要な影響を及ぼす成分の特定を試みた。その結果、HEMFやmethionalが特定され、これら成分の加熱による分解や生成がみそ汁の風味低下に大きく影響することが確認された。また、匂いの評価用語を用いた加熟による風味低下の評価を、機器分析の結果からもほぼ確認することができた。みそから初めて同定されたHEMF(2(or5)-ethyl-4-hydroxy-5(or2)-methyl-3(2H)-furanone)は香気成分として以外にも重要な機能があるとして注目され、その形成機構の解明が急がれている。みそではHEMFは酵母により形成されており、その形成機構の解明を目的として、モデル培地でみそ、醤油の主発酵酵母であるZ.rouxiiを培養し、HEMF形成量等を測定した。モデル培地は酵母によるHEMFの形成に不可欠な五単糖としてリボース、窒素源としては形成量の多いグリシンに焦点をしぼり、両者の濃度比を変化させてアミノーカルボニル反応を起こさせ、HEMFの前駆物質と考えられる化合物を形成させることによって調製した。HEMF形成量は培地中のリボースの濃度に最も依存し、20mmolから200mmolで最大になることが示唆された。この時、グリシンはリボースと同じモル濃度であると効果的であった。また、上記のような培養条件を整えることによって、HEMFはZ.rouxii以外の酵母の培養によっても形成されることが明かとなった。一方、HEMFはみそや醤油のような弱酸性下では比較的安定であるが、単離、精製されると不安定であり、加熱によっても分解が促進され、濃度が減少するとともに、分解生成物が香気の官能評価に重大な影響を与えると想定された。

そこで、HEMFの分解に注目し、低沸点化合物の分析が可能であるヘッドスペース分析を用いて、みそ懸濁液の加熱による香気劣化のメカニズムの解明を試みた。その結果、数種の低分子のアルデヒドが検出され、これらが加熱によるみそ汁の風味低下に関与していると推定した。日本の代表的な調味料であるみそ・醤油からは多くの香気成分が検出されているが、著者は赤色系辛ロ米味噌に代表される発酵型熟成味噌の特有香気成分としてHEMF(4-hydroxy-2(or 5)-ethyl-5(or 2)-methy-3(2H)-furanone)を同定し、みその熟成過程で酵母が関与して生産することを明らかにした。また、酵母によHEMFの形成機構を解明する目的で、炭素源や窒素源をかえた液体培地で耐塩性酵母Zygosaccharomyces rouxiiを培養し、ペントースであるリボースとアミノ酸を同時に加熟殺菌して調製された培地でHEMFが形成されることを確認した。従って、酵母はペントースとアミノ酸のアミノカルボニル反応によって生成されたHEMFの前駆物質にアセトアルデヒド様の化合物を提供すると推察している。本研究では培地調製時に、リボースとグリシンのアミノカルポニル反応によって生成するであろうHEMF前駆物質形成への、その他の培地成分の関与と、リボースの濃度によるHEMFの形成への影響を明らかにすることを試みた。その結果、リボースとグリシンから生成されるHEMF前駆物質は、培地中にリン酸緩衝液が含まれている場合に、安定して形成される可能性が高いことが明らかになった。また、HEHF形成に適した培地中のリボース濃度は20mmol300mmolの範囲にあると推測された。一方、一般的にみそ汁は加熱しすぎると風味の低下を招くことが指摘されている。そこで、匂いの評価用語を用いて、みそ汁の風味低下の現象をより具体的に表現することを試みた。さらに、GC-O分析とAEDA法を用い、FDファクターを求めることによってみそ汁の香気に重要な影響を及ぼす成分の特定を試みた。その結果、HEMFやmethionalが特定され、これら成分の加熱による分解や生成がみそ汁の風味低下に大きく影響することが確認された。また、匂いの評価用語を用いた加熟による風味低下の評価を、機器分析の結果からもほぼ確認することができた。
高脂肪食摂取により生じるインスリン抵抗性とVLDLレセプターとの関連性

VLDLレセプターが筋肉において、中性脂肪の蓄積にどのように関与しているか、インスリン抵抗性の成因となり得るかを明らかにするため、VLDLレセプターcDNAと、筋肉組織に特異的に発現するGLUT4のエンハンサーを結合させたコンストラクトでトランスジェニックマウスを作成し、VLDLレセプターを筋肉組織に多量に発現させたトランスジェニックマウスで中性脂肪の蓄積やインスリン抵抗性が生じているか調べた。-3237のGLUT4遺伝子は筋肉と脂肪組織に特異的に発現することから、5'領域のプロモーター部分(-3237から+171まで)と、VLDL-レセプターcDNAを結合させたコンストラクトを作成し、トランスジェニックマウスを作成した。4種の異なったトランスジェニックマウスを分析したが、GLUT4-VLDL-レセプターコンストラクトを持つトランスジェニックマウスでは、VLDL-レセプターのmRNAは脂肪組織、及び筋肉組織両方とも発現が認められなかった。VLDL-レセプターmRNAが、GLUT4のプロモーター部分のみでは発現しないことから、筋肉、脂肪組織に必要なシスエレメントがイントロンや3'領域に存在する可能性を示した。現在、イントロン部分を含めたVLDL-レセプタートランスジェニックマウスを作成し、VLDL-レセプターの発現量を測定中である。
多段階発癌過程における癌関連遺伝子の変化

本年度は、マウスやラットのさまざまな方法で誘導した肝癌のp53変化やLOHを精力的に解析したが、原発巣には変化がほとんど見出されないことが明らかになった。他方、ヒト肝癌でも、臨床癌にはp53変異やLOHが高頻度で見出されるにもかかわらず、早期癌には全く見い出されないことが示された。すなわち、実験肝癌の原発巣は、ヒトの早期肝癌に該当することも考えられ、これらを研究することが、ヒト癌の早期変化を解析することになる。また、HBVの組み込みをマーカーにして肝硬変の“再生"結節を多数解析したところ、その1/3に10^5ヶ以上の肝細胞のクローナルな増生があることが示された。これらの増生巣は、組織学的にはneoploskilesionとして把握されないが、前癌性病変として注目される。また、カドヘリンをよく発現しているにもかかわらず細胞接着性の低い肺癌細胞を調べ、細胞膜の裏打ちタンパクであるα-カテニン異常により、カドヘリンが細胞接着因子として機能しないことを明らかにした。また、肝発癌の前癌病変の最も鋭敏なマーカーであるGST-Pの活性化のメカニズムが更に調べられ、Jun/Fos以外の活性化因子も存在することが示された。
NMRによる精密病巣局在と知覚・認知障害との関連に関する実験心理学的研究

本研究の中心課題の一つである精密病巣局在は,限局された病巣が特定の機能障害と関係づけられた時,はじめて心理学的に意味を持つ.その機能と病巣部位との関係が,高い確率で考えられるからである.しかし現実の脳損傷者の大半は,広範な病巣と多方面に及ぶ複雑な機能障害を持っており,そうした事例を手がかりに特定の機能に関係する脳の部位を明らかにしていくには,非常に多数の資料の累積が必要となる.これに対して特定の機能が選択的に障害されている純粋例の場合は,機能と病巣との対応が比較的容易なために,少数例からでも貴重な知見を得ることができる.幸い研究代表者は,発話の運動機能の選択的障害にあたる発語失行が,長期間にわたってきわめて純粋な型で持続している症例を経験することができ,昭和61年度は,さまざまなテストによるその症例の臨床像の明確な把握と, NMRによる病巣部位の精密な分析を行った.臨床像は,身体はもとより構音器官に麻痺や失調はなく,知能は正常で,言語能力も書字の多少の低下をのぞいてすべての側面が高く保たれている一方で,発語の構音機能のみが障害されているという,典型的な発語失行にあたることが確認された.損傷部位は既にX線CTにより左半球シルヴィウス溝前部近辺の皮質から皮質Fにかけての領域,と診断されていたが, NMRにより皮質はほとんど含まず,尾状核頭部,内包前脚,レンズ核前部,放射冠と島皮質の一部,シルヴィウス溝付近の皮質の一部,と確定された.特にNMRの失状断面像から,中心前回中部からF部にかけての損傷が,皮質より深部白質にあることが確認されたのは貴重な知見であった. 61年度は文献例との比較も行われた.62年度は,類似自験例との比較が行われたが, NMRにより左放射冠に限局した損傷が確認された一例が,やや異ったタイプの発語失行をなすことが明らかにされた.本研究の中心課題の一つである精密病巣局在は,限局された病巣が特定の機能障害と関係づけられた時,はじめて心理学的に意味を持つ.その機能と病巣部位との関係が,高い確率で考えられるからである.しかし現実の脳損傷者の大半は,広範な病巣と多方面に及ぶ複雑な機能障害を持っており,そうした事例を手がかりに特定の機能に関係する脳の部位を明らかにしていくには,非常に多数の資料の累積が必要となる.これに対して特定の機能が選択的に障害されている純粋例の場合は,機能と病巣との対応が比較的容易なために,少数例からでも貴重な知見を得ることができる.幸い研究代表者は,発話の運動機能の選択的障害にあたる発語失行が,長期間にわたってきわめて純粋な型で持続している症例を経験することができ,昭和61年度は,さまざまなテストによるその症例の臨床像の明確な把握と, NMRによる病巣部位の精密な分析を行った.臨床像は,身体はもとより構音器官に麻痺や失調はなく,知能は正常で,言語能力も書字の多少の低下をのぞいてすべての側面が高く保たれている一方で,発語の構音機能のみが障害されているという,典型的な発語失行にあたることが確認された.損傷部位は既にX線CTにより左半球シルヴィウス溝前部近辺の皮質から皮質Fにかけての領域,と診断されていたが, NMRにより皮質はほとんど含まず,尾状核頭部,内包前脚,レンズ核前部,放射冠と島皮質の一部,シルヴィウス溝付近の皮質の一部,と確定された.特にNMRの失状断面像から,中心前回中部からF部にかけての損傷が,皮質より深部白質にあることが確認されたのは貴重な知見であった. 61年度は文献例との比較も行われた.62年度は,類似自験例との比較が行われたが, NMRにより左放射冠に限局した損傷が確認された一例が,やや異ったタイプの発語失行をなすことが明らかにされた.昭和61年度は、発症後17年を経過した発語失行例の現病像を精密に把握するとともに、X線CTとNMR撮影を行ない、損傷部位の確定と過去の類似例との比較を試みた。発症直後の無声症から発語失行へと変化し、発症後7ケ月の時点で診断が確定したこの症例は、手足の麻痺はもとより発声発語器官の麻痺もないにもかかわらず、発語における構音の誤りが発語運動の面に限定されていることから、きわめて純粋な発語失行例とみられている。現時点での発話は17年前と本質的な差違はなく、非流暢,努力性,などの点が目立つが、本人がゆっくり正確に話すように努めているので、構音の誤りはさほど多くはない。しかし数少い誤りの特徴としては、有声音の無声化,弾音の有声破裂音化,摩擦音の破擦音化,声門破裂音の無声化,再唇音と鼻音の混同,音節の付加や置換,初頭音の繰返し,などが認められた。X線CT,NMRでは、脳室や脳溝の拡大から72才の年令の割には脳萎縮の進行が目立つことと、左半球前頭葉深部を中心とした梗塞が認められた。梗塞は尾状核頭部,内包前脚,レンズ核前部,放線冠の一部を含むが、皮質への波及は凝問視された。

発語失行の文献例の多くで責任病巣とされている第3前頭回弁蓋部と中心前回下部の皮質は、本症例では明らかに残っておりその点は矢状断面のNMR像で確認された。以上から本症例は、過去の文献例とも異なる前頭葉の小さな皮質下梗塞により、重度の発語失行が長期間にわたり持続した特異な症例とみることができる。
急性肺傷害における薬物療法と人工換気様式を組み合わせた治療効果の検討

ARDSの治療に関する報告は、数多くみられるが、殊に薬物療法に関しては、少なくとも現在のところ有効な治療法を報告したものはない。そしてこれから検討、評価されていくべき有効な可能性のある薬物としてβ刺激剤があげられる。そこで急性肺傷害をおこした生体に対しての効果的な薬物療法と肺に保護的な換気様式を組み合わせた急性呼吸不全モデルにおける治療効果についての検討をおこなった。平成16年度は、傷害肺における酸素化能、炎症所見、メカニクスに関して以下のことを明らかにした。1.酸吸引性肺傷害ラットモデルを用い、β刺激剤であるTerbutaline投与群で傷害後の酸素化能の改善効果を認めた。2.肺傷害後の気管支肺胞洗浄液中の白血球数とタンパク濃度は、Terbutaline投与群、非投与群ともに上昇を認め、これらの数値から炎症の程度は同様に発生していると考えられた。3.傷害肺における静的コンプライアンスの低下は非投与群と比較してTerbutaline投与群のほうが軽度であった。4.傷害後の肺の組織学的検討で、Terbutaline投与群において肺胞内の浸出液が少なかった。5.傷害後の肺の浮腫の程度の指標としての湿乾重量比においてTerbutaline投与群において非投与群と比べ浮腫の程度が軽減されていた。平成1718年度は、平成16年度の結果をもとに、奏功する薬物投与下に傷害肺にとって保護的となる最適な人工呼吸器設定について検討、評価した。その結果、かつてのように血液ガス分析データを正常化するような人工呼吸器の設定ではむしろ、医原性の肺損傷を助長することが判明した。そこで最高気道内圧を制限し、かつ低一回換気量で人工呼吸をおこない、ある程度の低酸素血症、高炭酸ガス血症は許容すると肺傷害の進展を防ぐことができ予後改善効果がのぞめることが明らかとなり、今後の呼吸不全に対する新しい人工呼吸器管理法となりえることがわかった。平成17年度は、平成16年度の結果をもとに、奏功する薬物投与下に傷害肺にとって保護的となる最適な人工呼吸器設定について検討、評価した。

平成16年度は、傷害肺における酸素化能、炎症所見、メカニクスに関して以下のことを明らかにした。1.酸吸引性肺傷害ラットモデルを用い、β刺激剤であるTerbutaline投与群で傷害後の酸素化能の改善効果を認めた。2.肺傷害後の気管支肺胞洗浄液中の白血球数とタンパク濃度は、Terbutaline投与群、非投与群ともに上昇を認め、これらの数値から炎症の程度は同様に発生していると考えられた。3.傷害肺における静的コンプライアンスの低下は非投与群と比較してTerbutaline投与群のほうが軽度であった。4.傷害後の肺の組織学的検討で、Terbutaline投与群において肺胞内の浸出液が少なかった。5.傷害後の肺の浮腫の程度の指標としての湿乾重量比においてTerbutaline投与群において非投与群と比べ浮腫の程度が軽減されていた。平成1718年度は、平成16年度の結果をもとに、奏功する薬物投与下に傷害肺にとって保護的となる最適な人工呼吸器設定について検討、評価した。その結果、かつてのように血液ガス分析データを正常化するような人工呼吸器の設定ではむしろ、医原性の肺損傷を助長することが判明した。そこで最高気道内圧を制限し、かつ低一回換気量で人工呼吸をおこない、ある程度の低酸素血症、高炭酸ガス血症は許容すると肺傷害の進展を防ぐことができ予後改善効果がのぞめることが明らかとなり、今後の呼吸不全に対する新しい人工呼吸器管理法となりえることがわかった。
ナチュラルバリエーションを利用した植物の耐塩性メカニズムの解明

Thellungiella salsugineaは、シロイヌナズナと近縁種にも関わらず、海水程度の塩濃度下でも生育可能な他、凍結や高温にも高い耐性を示すことから、植物のストレス耐性を研究する上で非常に優れた遺伝子資源である。本研究では、Thellungiella由来の完全長cDNAsを用い、機能獲得型スクリーニングとして開発されたFOX huntingにより、耐塩性あるいは高温耐性を付与する遺伝子の同定を試みた。塩・高温ストレス関連遺伝子群、転写因子、トランスポーターの計450遺伝子について耐性評価を行った結果、3個の耐性付与遺伝子の単離に成功した。本研究では、自然界で高い耐性を示す植物がどのようにして耐性を獲得しているのかを遺伝学的に明らかにすると同時に、その遺伝子資源を用いて、耐性付与遺伝子の網羅的な探索、および耐塩性作物の作出を試みることを目的として研究を進めている。本年度においては、塩生植物Thellungiella完全長cDNAを用いた耐性付与遺伝子の探索において進展が見られた。完全長cDNAライブラリーに含まれる「転写因子(374遺伝子)」および、「高温ストレス関連遺伝子(264遺伝子)」を対象にスクリーニングしたところ、それぞれそれぞれ1つずつ、シロイヌナズナに顕著な塩ストレス耐性あるいは高温耐性を付与することの出来る遺伝子を見出すことに成功した。どちらの遺伝子も複数のトランスジェニック植物ラインで耐性が認められること、野生型の植物と比較して高発現していることを確認した。また、両遺伝子とも過剰発現することによって耐塩性や高温耐性が向上するという報告例はなく、耐性を付与できる新規の遺伝子であった。来年度の課題としては、これらの遺伝子が野生型の植物において、どのような遺伝子発現を示すのか、ストレス応答あるいは組織別の発現解析を行うこと、またシロイヌナズナのオーソログ遺伝子を過剰発現させても、Thellungiellaの遺伝子と同様に耐性を付与できるのかを調べる必要がある。シロイヌナズナのオーソログ遺伝子については本年度内に、シロイヌナズナへの形質転換を行い、トランスジェニック植物を取得した。Thellungiella salsugineaは、シロイヌナズナと近縁種にも関わらず、海水程度の塩濃度下でも生育可能で、遺伝学的な解析に向いた特徴を持つほか、近くゲノムシークエンスも公開される予定であり、モデル塩生植物として注目されている。これまでの研究において、Thellungiella由来の完全長cDNAライブラリーを作製し、これらcDNAsを用いた機能獲得型スクリーニング、FOX huntingにより耐塩性あるいは高温耐性を付与する遺伝子の同定を進めてきた。本年度は昨年度までのスクリーニングで得られた耐塩性・高温耐性付与遺伝子の機能解析を行った。昨年度までに、耐塩性付与遺伝子と高温耐性付与遺伝子を1個ずつ、FOX huntingにより同定することに成功した。1個の高温耐性付与遺伝子については、転写因子をコードしており、マイクロアレイ解析の結果、高温誘導生遺伝子群が顕著に発現誘導されていることが明らかとなった。乾燥耐性に関わることが知られている遺伝子が顕著に高発現していたことから、乾燥耐性に供したところ、顕著な乾燥耐性も示すことが明らかとなった。論文に必要なデータが出そろったため、現在投稿準備中である。耐塩性付与遺伝子についても、転写因子であったことから、本遺伝子が遺伝子発現制御している下流遺伝子群を明らかにするために、マイクロアレイ解析を行った。しかしながら、非ストレス条件の野生型植物とトランスジェニック植物を比較したところ、大きな違いは認められなかったことから、ストレス処理により活性化される転写因子であることが示唆された。実際にいくつかの遺伝子についてストレス条件下における野生型とトランスジェニック植物の発現解析を行ったところ、違いが認められた。さらに本年度のスクリーニングにより、耐塩性および高温耐性の両方を付与する遺伝子を1個見いだすことに成功した。