hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
T細胞分化抗原CD7の発現機構と機能の解析

2.トランスフェクタントの作製及び抗体の作製:マウスCD7cDNAをラット細胞3Y1に導入したトランスフェクタントを作製し、ラットに免疫したが、マウス胸腺細胞にのみ反応する抗血清は得られなかった。また本抗原の細胞外ドメイン部分のアミノ酸配列のうち21アミノ酸の合成ペプチドを作製し、家兎に免疫を行った結果、ELISAで20万倍希釈まで反応性を示す抗血清を得た。しかしこの抗血清でマウス胸腺細胞を染色することは出来なかった。そこでエクソンを全て含む染色体遺伝子のトランスフェクタントの作製を行っている。さらにヒスチジンTagとの融合蛋白を大腸菌で作製しており、これらを抗原として抗体作製を実施する予定である。3.マウス染色体遺伝子の単離:cDNAをプローブとして、染色体遺伝子ライブラリーより4個の陽性クローンを得た。これらクローンの制限酵素地図の比較より、それぞれのクローンは部分的に共通な部分を持ち、これらを結合すると全長27kbとなった。また塩基配列の検索の結果、本遺伝子は4つのエクソンから構成され、それぞれリーダー、細胞外、膜貫通、細胞内の分子構造に対応しており、ヒトCD7を極めて類似していた。またエクソンの染色体遺伝子上の分布は、第2-4については明らかとなったが、現在第1エクソンについて検索中である。また全てのエクソンを含む染色体遺伝子が得られたことから、本遺伝子を破壊し、発現を阻止したマウスの作製を始める予定である。1.マウス染色体遺伝子の単離:マウス7cDNAをプローブとして、ES細胞、及びBALB/cマウス腎臓細胞由来の染色体遺伝子ライブラリーをスクリーニングし、これまでに4個の陽性クローンを得た。これらクローンの制限酵素地図を作製したところ、それぞれのクローン間で部分的に共通な部分を持ち、これらを結合すると全長24.4kbとなった。またこの遺伝子のエクソン、イントロン構造について検索したところ、本遺伝子は4つのエクソンから構成され、およそ2.5kbに分布していた。また各エクソンはそれぞれリーダー、細胞外、膜貫通、細胞内の分子構造に対応しており、ヒトCD7と極めて類似していることが明かとなった。この遺伝子のプロモーター領域900bpについてヒトCD7と比較したところ、8bp以上一致する配列が10カ所認められた。またマウスのThy1あるいはT細胞レセプターV遺伝子と一致する配列が2カ所、GC boxが1カ所認められた。CD7抗原の機能を検索することを目的に、本遺伝子を破壊した遺伝子欠失マウスの作製を初めている。2.抗マウスCD7抗体の作製:これまでに本抗原の細胞外ドメイン部分の2カ所に相当する21および19アミノ酸の合成ペプチドを作製し、家兎に免疫し、ELISAでは20万倍希釈まで反応する抗体を得た。これら抗体の反応性についてマウスcDNAおよび染色体遺伝子を導入して得られたトランスフェクタントを標的抗原として免疫染色、ウエスタンブロッティング法により検索したが、残念ながら反応性は認められなかった。そこで現在合成ペプタイドとして細胞外ドメイン、細胞内ドメインのアミノ酸配列より各一カ所を選択、合成し、新たに抗体の作製を始めている。
クエン酸回路と遺伝子発現系のクロストークによる炎症と発癌の制御機構

NF-κBやHIF-1αなどの転写因子とクエン酸回路のクロストークによる細胞応答制御の分子機構の解明を目的として、培養細胞系におけるHIF-1αの活性制御機構を解析した。HIF-1αの発現量はユビキチン・プロテアソーム系によるタンパク質分解による制御を受ける。ところがクエン酸は肝細胞において翻訳制御によりHIF-1αの活性化を抑制することが判明した。代謝系とHIF-1αの相互作用によるあらたな細胞応答制御機構が見いだされた。HIF1-αは遺伝子発現制御を介して代謝制御に重要な役割をになう転写因子である。HIF1-αの発現は酸素濃度による制御を受容しており、この制御機構にはプロリン残基の水酸化とユビキチンプロテアソーム系による分解が主要な役割を果たしている。さらにHIF1-αは炎症や発がんに連関した転写因子であるNF-κBとの間で密接なクロストークを行っており、この結果として細胞内での代謝機構の改変を介して細胞応答を制御することが知られている。本研究ではHIF1-αの細胞内動態について、炎症に連関した転写因子であるNF-κBとの相互作用とユビキチンプロテアソーム系を介した制御機構についての解析を行った。HIF1-αの細胞内の発現レベルは酸素濃度による制御を受容しており、この制御は転写レベルや翻訳レベルでの制御に依存せずにユビキチンプロテアソーム系を介したタンパク質分解系が主要な役割を担うことが確認された。ところが興味深いことにクエン酸を細胞に負荷すると、細胞種特異的にHIF1-αの細胞内発現レベルを変化するという新規の現象が見いだされた。この現象は当初はクエン酸によるαケトグルタル酸の細胞内濃度上昇にともなうHIF1-αのプロリン水酸化の亢進と、ユビキチンプロテアソーム系を介した分解が関与する可能性が想定された。しかし詳細な解析の結果、HIF1-αのプロリン水酸化の亢進は認めらず、さらにユビキチンプロテアソーム系を介したHIF1-αの分解の亢進も認められなかった。さらに遺伝子発現レベルにも変化が認められなかったことから翻訳レベルでの制御を受容している可能性が想定された。実際に発現系を用いた解析により転写レベルやタンパク分解レベルの制御ではなく、翻訳機構が改変されることが判明した。HIF-1αは細胞内の酸素濃度に応答して活性化される転写因子であり、解糖系やミトコンドリアのクエン酸回路を介してエネルギー代謝や活性酸素(ROS)の制御を行う。クエン酸回路で機能するコハク酸脱水素酵素(SDH)遺伝子やフマラーゼ(FH)遺伝子は癌抑制遺伝子であり、イソクエン酸脱水素酵素(IDH1)遺伝子は原癌遺伝子であるが、この発癌には2-オキソグルタル酸(2-OG)によるプロリン水酸化酵素(PHD)を介したHIF-1αのプロリン水酸化が関与すると考えられている。2-OGはクエン酸回路の主要な代謝産物であり、細胞内に取り込まれたクエン酸からイソクエン酸を介して生成することから、HIF-1αの活性がクエン酸回路との相互作用により規定される。今回、我々はクエン酸回路を介した炎症応答や発がんとの連関を解明するために、HIF-1αおよびNF-κBとクエン酸回路の相互作用についての解析を行った。細胞に対して低酸素刺激やPHD阻害を行うとHIF-1αのユビキチン化とプロテアソームによる分解が抑制されることによりHIF-1αの活性化が誘導される。ところが肝細胞を高濃度のクエン酸存在下で培養すると低酸素刺激やPHD阻害によるHIF-1αの活性化が顕著に阻害された。クエン酸存在下ではHIF-1αのプロリン水酸化を介在する2-OGの細胞内濃度は上昇することから、HIF-1αのユビキチン化とプロテアソームによる分解の亢進がこの抑制に関与する可能性が考えられた。しかしプロテアソームやPHDが阻害された状況下においてもHIF-1αの活性化の抑制が観察されたことから、この制御には未解明の新規制御機構が関与することが判明した。HIF1-αは酸素に応答して駆動される転写因子であり、VEGFなどの細胞増殖因子の遺伝子発現などを介して血管新生を制御するほか解糖系やクエン酸回路などの代謝系を制御する。HIF1-αの制御には、HIF1-αの遺伝子の転写による制御と、HIF1-αタンパク質のプロリン水酸化に共役したユビキチン化とプロテアソームによる分解が関与する。これに対してHIF1-αの翻訳制御が重要な役割を果たすことを我々は見いだした。低酸素に応答してHIF1-αの発現は増大してHIF1-αタンパクが蓄積される。ところが細胞培養の培地中にクエン酸などの代謝産物を添加すると、この発現誘導が阻害されることが見いだされた。さらにHIF1-αを発現ベクターに構築して細胞内に発現させた場合でも発現誘導の阻害が見いだされた。

このときのHIF1-αのmRNAレベルに変化はなく、またHIF1-αのユビキチン化もプロテアソームによる分解にも差異はなかった。阻害剤等を用いた解析の結果、HIF1-αの翻訳が抑制されることによりHIF1-αが減少することが判明した。他の遺伝子の翻訳には差異を認めなかったことから、HIF1-α遺伝子特異的な翻訳制御機構が機能していると考えられた。医化学本研究では興味深い結果として翻訳レベルでのHIF1-αタンパク質の発現制御という極めて興味深い現象が見いだされた。この現象は代謝制御機構の解明で新規のものであり、極めて興味深いものである。クエン酸回路代謝物はさまざまなタンパク質の修飾を介して転写因子の活性を制御するが、この代謝経路を介した遺伝子発現や活性酸素産生の制御が炎症や発がんで重要な役割を担うことが想定されてきた。本研究の目的は炎症と発がんで中心的な役割を果たすHIF-1αなどの転写因子とクエン酸回路の相互作用の解析を通じて、炎症と発がんに連関した新たな分子機構を解明することである。本研究で我々はHIF-1αがクエン酸回路の代謝産物によりこれまでに知られていない全く新たな機構の活性制御を受容していることを見いだした。クエン酸回路により活性制御を受容する転写因子としてNF-κBやNrf2が知られているが、いずれもユビキチン化やプロテアソーム系での分解などの既知の分子機構を介するものであることから、今回の我々の発見はこれまでにないユニークな細胞制御機構の発見の端緒であると考えている。本発見は萌芽研究にふさわしいあらたな研究分野の開拓につながるものであり、この分子機構の解明により該当研究分野の研究を大きく発展させることができると期待している。また酸化ストレスの発生はミトコンドリアと密接に連関するが、この過程にはクエン酸回路を介したROSの制御が関与すると考えられる。本発見をもとに生体内でのROS産生の新たな制御機構の解明につなげたい。当初の計画通りに、培養細胞を用いた分子生物学的解析と、マウスと用いた研究を遂行する。とくにHIF1-αタンパク質の発現制御機構に関して、転写システムと翻訳システムを用いた実験系を構築し、細胞レベルで認められる代謝物によるHIF1-αタンパク質発現制御のin vitro系における再構成系を構築する。さらにこの再構成系を用いた解析によりHIF1-αタンパク質の翻訳が代謝物により制御される分子機構を解明する。この成果をもとに細胞レベルにおいて、HIF1-αの翻訳制御と細胞応答の関連を解析する。またと個体レベルにおいてもHIF1-αの制御が代謝や炎症や発がんに及ぼす効果について解析する。前年度に見いだしたクエン酸回路によるHIF-1αの活性制御の分子機構を解明する。これまでの解析により既知のPHDによるプロリンの水酸化を介したユビキチン化や、プロテアソームによる分解制御とは独立した新たな制御機構が機能していることが判明しているので、この機構の解明を目的として解析を遂行する。とくに可能性が高いのが細胞種特異的に機能する翻訳制御機構である。興味深いことにプロテアソームを阻害した条件化でHIF-1αを外来性に細胞内に導入して発現させた場合でもHIF-1αはクエン酸により発現が抑制され、さらにこのときのHIF-1α遺伝子の転写レベルは抑制されないことが判明している。invitroにおける転写・翻訳系と、細胞抽出液を用いたHIF-1α発現制御の再構成系を確立して、クエン回路代謝産物によるHIF-1α特異的な翻訳制御の分子機構を解明する。
脳損傷後の学習能力や運動機能改善と神経栄養因子や神経伝達物質の変化に関する研究

マイクロダイアリシスを使用して、モノアミンの変化を線条体、海馬、皮質、皮質後肢領域、腹側被蓋野で測定した。それぞれの部位におけるモノアミンの細胞外濃度の違いを確認した。また、これまでの研究で強制的に運動させることで、モノアミンの細胞外濃度が高くなることを確認している。しかし、強制的に運動させることは神経活動が活発になっても、機能回復にとって効率的とは考えにくい。そこで今後、我々は報酬物質としてのドーパミンの変化に着目して、効率的に機能を回復させる方法を検討する。本研究の目的は、脳損傷後の学習能力や運動機能回復のプロセスに関わる脳内物質を明らかにし、その変化を効果的に促進する最適な運動刺激や薬物治療の開発を目指すものである。我々はこれまでに、トレッドミル運動中や運動前後にマイクロダイアリシス法を使用してモノアミン(NE:ノルエピネフリン、DA:ドーパミン、5-HT:セロトニン)の細胞外濃度変化を測定しきた。また、1週間のトレッドミル運動トレーニング前後の比較も検討を行ってきた。今後は、再吸収阻害薬を投与して行動変化を観察したり、脳梗塞モデルを使用して機能回復と神経伝達物質の関係や、それらが運動させることによりどの様に変化するかを検討する予定である。本研究は運動を視点として行われる基礎研究であり、根拠に基づいたリハビリテーション医療を実現することが可能となり、介護の領域でも重要な位置を占める脳卒中後遺症の予後改善に貢献することが期待できる。前年度は、ガイドカニューレの固定法など実験の基本的な部分の再検討が中心となった。当該年度は実際に測定した結果の分析や解釈、他の文献との比較を行い、さらに必要な分析方法の検討を行った。免疫組織科学的な分析に加えて、より客観的な指標が得られるリアルタイムRT-PCR法やELISA法の検討を試みたが、データのばらつきなどがあり十分な結果は得られていない。今後、引き続き検討を行いながら、神経伝達物質の受容体作動薬や拮抗薬の投与なども組み合わせて実験を発展させていきたい。我々はこれまでに、トレッドミル運動中や運動前後にマイクロダイアリシス法を使用してモノアミン(NE:ノルエピネフリン、DA:ドーパミン、5-HT:セロトニン)の細胞外濃度変化を測定してきた。これまでの研究で、ガイドカニューレの固定法などの条件を見直すことにより、長期間の観察が可能となった。また、トレッドミル運動による影響等を確認してきたが、より臨床的な条件を加えるために、強制的な運動ではなく自発的な運動が与える影響も確認する必要があると考えている。そのため、今年度は24時間行動を監視しながらモノアミンの変化を測定できるシステムを構築してきた。行動量の変化とモノアミンの変化を連動させる分析方法や自発的な行動量をコントロールする方法など、今後の検討課題もあるが先行研究を参考にしながら実験を発展させていきたい。また、神経栄養因子やその受容体の変化などを組織学的に確認するだけでなく、血中濃度の変化をELISA法で分析するなど、よりリアルタイムな変化を観察できるように継続していく予定である。脳梗塞の回復過程を検討するには、少なくとも1ヶ月間はモノアミンを測定できる状態を保つ必要がある。しかし、これまでの実験プロトコールでは2週間程度しか状態を保てない。そこで今年度は、この実験プロトコールを再検討することを中心に実験を行った。具体的には、プローブを挿入するためのガイドカニューレを固定する、デンタルセメントの配合量を変えたり、アンカービスの位置や本数を変えたり、飼育ケージにガイドカニューレがあたりにくいように工夫したりと条件を変えてガイドカニューレの状況観察を行った。結果的に34週間程度は状況を保てるようになった。その後、トレッドミル以外の運動課題について試みたが、運動の選択や客観的な評価方法など解決しなければならない問題が多く、今後の検討課題である。

マイクロダイアリシスのデータを他者の論文と比較してみると、濃度変化の傾向に違いが見られる。動物種や運動の強度、飼育環境等どこに違いの原因があるかを比較検討する必要がある。また、リアルタイムRT-PCR法やELISA法の条件設定にも工夫が必要である。また、ラットの運動機能評価にも問題が残っており、現在の状況はやや遅れていると考えられる。脳損傷後の機能回復を検討する目的で、現在はその基礎的な部分を行っている。今後脳梗塞モデルで実験を行う予定にしているが、脳梗塞モデルでは組織液の滲出なども有りデンタルセメントの固定が弱くなり、実験のプロトコールに更なる工夫が必要である。また、ラットの運動機能を客観的に評価する方法は先行研究も少なく、確立できておらず、現在の状況はやや遅れていると考えられる。今後は、実験条件の影響を比較検討して他者との違いを確認し、リアルタイムRT-PCR法やELISA法等の客観的なデータを安定して収集できるように条件設定を引き続き行う。その後、脳梗塞モデルを使用して機能回復と神経伝達物質の関係や、それらが運動させることによりどの様に変化するかを検討する予定である。また、神経伝達物質の受容体作動薬や拮抗薬の投与なども組み合わせて実験を発展させていきたい。今後は、実験のプロトコールを再度確認して、安定したデータ収集を実現する。その後、再吸収阻害薬を投与して行動変化を観察したり、脳梗塞モデルを使用して機能回復と神経伝達物質の関係や、それらが運動させることによりどの様に変化するかを検討する予定である。申請書の計画通り、プローブや試薬、実験動物の費用などの物品費と学会参加などの旅費を中心に使用する予定である。申請書の計画通り、今年度と同様に物品費と旅費を中心に使用する予定である。
高精度・低副作用な放射線治療計画を可能とする経時的な線量分布参照システムの開発

がんの局所再発のため近接部位に複数回放射線治療を行う場合、放射線障害のリスク低減のため、過去に計画した線量分布となるべく重複しない治療計画を行う必要がある。本研究では、複数回放射線治療を行う患者の過去の線量分布を、現在の治療計画CT画像と3次元的に非線形位置合わせし融合表示することで、新たな治療計画を行う際に、過去の線量分布の正確な位置を把握できる方法を開発する。同一患者の異なる時期に撮影した腹部CT画像を対象に非線形位置合わせを3次元的に行い、エキスパートによる目視で評価した結果、良好な精度が確認できた。また、演算時間は数分十数分と実用的だった。平成25年度の研究実施計画として以下の2項目があり、それぞれの研究実績の概要を示す。●体表外の物体除去による位置合わせの精度向上同一被検者の時期の異なる腹部CT画像を対象に非線形の位置合わせを行う際、体表外に描出される寝台や衣服などが位置合わせの精度低下の原因となる。本研究では、前処理として行う体表外の物体除去が、腹部CT画像の非線形位置合わせの精度改善にどの程度効果があるか評価した。まず、統計的に作成した3次元人体バイナリ画像を被検者の腹部CT画像にマッチングし、さらに、体表付近の凹凸部分をモルフォロジカル演算によって整形することで体表形状を抽出した。次に、抽出した体表形状でCT画像をマスク処理し、体表外の物体除去を行った。その後、ITK(Insight Toolkit)を用いて非線形位置合わせを行い、平均二乗誤差で精度を評価した。体表抽出は、体表に密着している一部の衣類を除き良好に行うことができた。また、前処理を行った場合、ほとんどの症例で平均二乗誤差が改善した。線量分布の位置合わせには,DICOM-RT形式で保存されたデータを線量分布画像に変換し、非線形画像位置合わせにより求められた変形パラメータを用いて位置合わせを行う手法を開発した。まず対象画像の治療計画CT画像に対応したDICOM-RTのPLAN/DOSE情報から、任意の座標における線量値を画素値に持つ線量分布画像を作成した。次に非線形画像位置合わせの変形パラメータを用いて線量分布画像を変形させ、基準となる治療計画CT画像に位置合わせを行った。最後に位置合わせした線量分布画像をDICOM-RT形式で保存するため、PLAN/DOSE情報に再度変換した。線量分布の位置合わせの精度評価の結果、変換前の最大線量に対する変換後の線量の差分は12%の範囲であった。平成24年度の研究実施計画として以下の3項目があり、それぞれの研究実績の概要を示す。●消化管、膀胱、腎臓、血管における位置合わせの精度向上:約20例の腹部CT画像を対象に位置合わせを行った結果、着衣による体表圧迫、尿蓄積による膀胱形状の変化、食事による管腔臓器の形状変化、およびそれらにともなう周辺臓器の形状変化が、位置合わせの精度を大きく劣化させていることが判明した。また、造影や呼吸同期などの撮像条件の違いも、位置合わせの精度に影響があった。実際に、被検者のコンディションやCTスキャナの撮像条件が近い画像では、位置合わせの精度が良好だった。今後、最適な条件を検討していく。●位置合わせ法の評価:位置合わせの精度を視覚的・解剖学的に評価するためのビューワおよび誤差計測ツールを開発し、それらを用いてエキスパートによる精度評価を行った結果、胃や腸などの消化管とその周辺臓器をのぞいて、良好な精度で位置合わせができていることがわかった。特に、体表、骨、肝臓、腎臓などの位置合わせの精度は平均して3mm以内だった。平成26年度の研究実績として以下の2点の概要を示す。●GPUを使った3次元非線形レジストレーションの精度および速度評価本研究では、複数回放射線治療の合成した線量分布を求めるために、同一患者の異なる時期に撮影した複数のCT画像を3次元非線形レジストレーションにより位置合わせをする方法の検討を行っているが、処理時間は課題の一つになっている。そこで、GPUを用いた3次元非線形レジストレーションを新規に実装し、速度及び精度の評価を行った。GPUの実装では、CPUに比較し約16倍の高速化を達成した。また、精度についてはCPUとGPUで大きな差は見られなかった。今後の課題は、システム全体での速度の評価、テクスチャメモリ等を使った計算の高速化の検討である。また、GPUにおいて倍精度浮動小数点で計算した場合の速度、精度の評価も課題の一つである。さらには今後、線量分布画像の変形・位置合わせの評価も行っていく予定である。●線量分布ファントム画像を用いた非線形変換の妥当性の検証CT画像および線量分布画像についてファントム画像を基に変形の妥当性の検証を行った。

CT画像および線量分布画像のファントム画像を作成し、非線形位置合わせを行った結果、線量分布の変形について、CT画像の変形との不整合は見られなかった。しかしながら、ベースとなるCT画像の位置合わせの変形量が少ないため線量分布の変化も大きくなかった。処理時間については、先行研究の臨床画像処理より25-50%以上短い時間で処理を終了した。これは、生成されているファントム画像データの位置合わせに利用するための情報が均一であり、変形の収束条件に早く合致するためであると考えられる。今後、炭素イオン線のような急峻な線量分布における位置合わせでも問題ない処理が実現できているかどうか、ファントム画像のバリエーションを追加して試験を行う方針である。医用画像工学平成25年度の研究実施計画として以下の2項目があり、それぞれの達成度を示す。●体表外の物体除去による位置合わせの精度向上前処理として行う体表外の物体除去が、腹部CT画像の非線形位置合わせの精度改善にどの程度効果があるか評価した。体表抽出は、体表に密着している一部の衣類を除き良好に行うことができた。体表外の物体を除去した場合、ほとんどの症例で平均二乗誤差が改善し、平均9.2%減少した。本前処理を行うことで、体表面における位置合わせの精度が向上したと考えられる。DICOM規格では線量分布データは治療計画用CT画像の位置情報に関連付けられた形で保存されている。今回、線量分布画像の位置合わせを行うため、DICOM-RT形式の線量分布情報を疑似的に画像データに変換し、位置合わせのための変形を可能にする手法を開発した。また、線量画像の変形や、位置合わせ前後の線量の定量性を評価した結果、妥当であることが確認できた。その結果、複数回放射線治療を行った、同一被験者の治療計画を重ね合わせて表示することが可能になった。以上のことから、おおむね順調に研究は遂行できていると判断する。平成24年度の研究実施計画として以下の3項目があり、それぞれの達成度を示す。●最適な非線形位置合わせ手法の開発:先行研究で開発したツールと同程度の位置合わせ精度を有し、演算時間が大幅に改善された非線形位置合わせツールを開発した。●消化管、膀胱、腎臓、血管における位置合わせの精度向上:位置合わせ精度に大きな影響を及ぼす原因を調査した。その結果、被検者のコンディションやCTの撮像条件の違いに大きな原因があることがわかった。これらの原因を改善することで、位置合わせ精度の向上が期待できる。●位置合わせ法の評価:視覚的・解剖学的に位置合わせの精度評価を行った結果、上述したことに起因する消化管・膀胱などの位置ずれはあったが、それ以外の大部分の部位において、良好な精度で位置合わせが行われていた。放射線治療では一般的に3mm以内の精度を求められるが、本研究で得られた結果はほぼこれを満たしていた。したがって、我々が用いている位置合わせ手法は、おおむね妥当であると考えられる。以上より、全体的には、おおむね順調に目的が達成されていると判断する。平成26年度には、開発した手法の臨床的有用性の評価を行い、成果のまとめを行う。また、粒子線治療のデータにも対応できるよう、システムの開発を行う。具体的には、以下のように行う。
未解明一次代謝経路、非メバロン酸経路に関する遺伝子の機能解析

我々は、放線菌Streptomyces sp.CL190株からクローニングしたメバロン酸経路に関与する遺伝子クラスター中の機能未知ORFが、新しいタイプ(type2)のFMN/NADPH依存型isopentenyl diphosphate(IPP)isomeraseをコードしていることを明らかにしていた。type 2 IPP isomeraseは、IPP生合成経路としてメバロン酸経路を利用する真正細菌や古細菌に広く分布している。一方、枯草菌は非メバロン酸経路を利用するにも拘わらず、type 2 IPP isomeraseをコードしていると考えられる機能未知遺伝子ypgAを有している。そこで本研究では、ypgA遺伝子産物の機能、および非メバロン酸経路を利用する枯草菌における役割について検討した。ypgA遺伝子産物とCL190株由来のtype 2 IPP isomeraseのアミノ酸配列を比較したところ、ypgA遺伝子はN末端側が100アミノ酸残基以上欠損していた。そこで、ypgA遺伝子の上流に存在する開始コドンを検索したところ、138アミノ酸残基長いORF(ypgA2)を同定した。このypgA2遺伝子産物は、ypgA遺伝子産物と比べて他のtype2 IPP isomeraseに、より近いアミノ酸長であった。次に、ypgA遺伝子とypgA2遺伝子を大腸菌で大量発現させ、酵素の精製を試みたが、ypgA産物は不溶化し精製酵素を得ることができなかった。一方、可溶酵素として精製したypgA2産物は、CL190株由来の酵素と同等の活性を示した。また、枯草菌のypgA2遺伝子破壊株は、野生株と比較して生育や菌体の形態に変化はなかった。これらの結果から、ypgA遺伝子より138アミノ酸残基長いORFであるypgA2遺伝子が枯草菌のIPP isomeraseであり、枯草菌にとってIPP isomeraseは必須ではないことが確認された。さらには、枯草菌においても、非メバロン酸経路は、生合成中間体である2-C-methyl-D-erythritol 2,4-cyclodiphosphate(MECDP)以降で、IPP経路とDMAPP経路に分岐していることが示唆された。
低重力環境は次世代のゲノムと形態を変化させるか？

本研究は擬似的な低重力環境を作出し、地球上で理論上の0.58gを実現することで、脊椎動物に及ぼす低重力の影響を明らかにするものである。ICR雄マウスを低重力環境下で2週間飼育したところ、その体重は、実験群と対照群で異なり、実験群で減少する傾向にあった。実験群と対照群の精巣でクロマチン免疫沈降によるゲノムDNAメチル化の状態を比較したところ(次世代シーケンシング)、18個の遺伝子の近傍もしくは内部に対するcontig配列が検出された。そのうちのいくつかは類推される機能として、アルツハイマー関連遺伝子だった。本研究は、低重力環境が及ぼす体細胞への影響がどのようなものか、そしてそれが世代を越えて行く可能性があるのかどうかについて検討するものである。本年度には、0.58gの低重力環境と、同磁気力にさらした1g対照群との間で、精巣エピゲノムの比較を行った。エピゲノムとしてDNAのメチル化部位に着目した。低重力暴露は、共同研究者の所属する独立行政法人物質材料研究機構にて2週間行った。超電導磁石の中で充分な飼料と水を設置した後、1週間放置し、動物の観察、飼育装置の清掃後、さらに1週間の低重力暴露を行った。実験開始から2週間後に、超電導磁石からマウスを取り出し、名古屋大学へ持ち帰った。大学到着後、ただちにマウスを安楽死させ精巣を採材し、-80°Cにて保存した。低重力暴露群および対照群の精巣はそれぞれDNAを抽出し、物理的な断片化の後、抗メチル化シトシン抗体を用いたクロマチン免疫沈降により、メチル化DNAの回収を行った。回収したDNAは次世代シーケンシングに供した。シーケンシングの後、得られたcontig配列をaverage coverage値で選抜したところ、両者間で存在比が100倍以上のcontig配列は18個あり、そのうち6個は対照群には一切存在しなかった。また、対照群の存在比が高いものは1個だけ存在した。これらはすべて遺伝子内もしくは5'側もしくは3'側の第一もしくは最終エクソンから1kb以内の遺伝子近傍の配列だった。また18個中にはアルツハイマー関連遺伝子も含まれた。現時点では18個の遺伝子のうち、いくつが次世代でも引き継がれて修飾されるのかは不明であり、今後の調査が待たれる。本研究は、重力が及ぼすエピジェネティック効果を検証することを目的としている。現在は、超電導磁石を用いて大きな磁場勾配を作ることが可能であり、適切な位置に水分子を置くと重力と反対の向きに揚力を受けることが出来る。これを利用し、マウスを強磁場勾配中に晒すことでマウスにかかる見掛け上の重力を0.58gまで減じた。予備実験の結果、二週間の暴露でマウスはかなりの体重を減じたため、平成24年度には、低重力にさらしたマウスからのサンプルを作製するにあたり、性成熟に達した雄マウスを用いた。通常、内分泌かく乱物質等の世代を越えた作用を調査する際、妊娠期間中の胎子が生殖腺形成にある時期に物質の投与等を行うことが多いが、成雄マウスを用いることもある。従って、本研究では8週齢の雄マウスに対し、0.58g低重力暴露試験を行った。対象群は、同じ強さの磁場にさらしたマウスを用いた(揚力は受けないため、かかる重力は1g)。体重測定の結果では、低重力環境下のマウスが、実験前:1週間後:2週間後でそれぞれ23g:17g:16gと著しい体重の減少を伴ったのに対し、磁場対照群では、実験前:1週間後でそれぞれ22g:20gと大きな体重変化を伴わなかった。本実験群は、現在エピジェネティック効果をみるため、マウスの次世代の形成に供している。さらに、別の低重力暴露マウスおよび磁場対照群からの精巣を採集し、それをChIP-seq法により次世代シーケンサーを用いた網羅的エピゲノム解析を行う予定である。マウスへの低重力暴露により思わぬ体重減少を観たものの、別法により目的の材料採集が完了出来たため。現在、次世代シーケンサー解析を行う前段階にあり、予定通りに進展しているので特段の推進策は計画していない。次世代シーケンシングは外注により行う予定である。用途は、1.追加の低重力暴露試験のための名古屋-つくば間の旅費(1回の2週間暴露試験で、初回、1週間後、2週間後の調査のため3往復)、国内学会発表のための旅費2.次世代シーケンシングのための費用(1サンプル15万円)3.追加のChIP-seq用サンプル調整費を予定している。
櫓の原理を応用した新しい船舶推進装置の開発研究

本研究の端緒は6年前から始まり、まず櫓漕の流体力学的性能を明らかにするために、人間が漕ぐのと同じ様に模型の櫓を自動的に漕ぐロボットを製造する事から始めた。そのロボットの完成に3年かかったが、それを用いた水槽実験によって櫓が大変効率のよい優秀な推進器である事を実証することができた。そこで、この成果を活用するために新式の推進装置として横行式翼列推進器を考案し、水槽実験でその性能を調べたが、所期の高性能を発揮するには程遠く、最終年度の本年度は改良の目途をつける事を目標とした。本装置の最大の欠点は、左行と右行とで水を切る翼の角度,即ち前進方向に対する翼板の傾斜角(迎角に相当する)を反転する時に衝撃的に大きなトルクを必要とし、且つ翼板に過大な抵抗が作用する事である。この欠点の改良は容易でなく、順次改良を積み重ねて本年度はやっと流体力学的な性能のデータが収録できる所まで達した。解析の結果によると、まだまだ過大なトルクと抵抗の欠点は根本的に取り除く事はできず残っているが、20%程度の効率で漕げる事が分った。今後は、この過大なトルクと抵抗が開き角を反転する際に生じないようにするために、左行から右行又は右行から左行に転向する時に現状の半回転方式を改めてその場反転を可能にする方式のメカニズムを考慮する事を優先する。この点をクリアすると、次に翼板を多数並べるためには、一列一翼板で多列並にし、位相的にシフトさせて配置した装置に造りかえて、高性能推進器の開発を達成するつもりである。本年度は、本研究の初年度であるので、研究計画の基本構想を練るのに十分時間をかけた。本研究は、和船の櫓漕の原理を応用した新しい船舶推進器の開発がメインテーマであるから、その推進器の基本計画,理論的検討,設計,横型船用装置の製作を本年度の研究の内容とした。そのため、まず最初に、鉛直翼列の左右横行方式を取り入れることにし、その流体力学的作用について理論的考察を行った。その結果、鉛直翼を水平横方向に10本程前後2列に並べてそれらを回転するチェーン又はベルトで連結すれば、前列では左方に横移動した翼列は後列に回ったら右方に横移動する機構になる。このとき端点にて迎角の切換を行なえるようなメカニズムを取りつけて、前列と後列とで迎角がつねに一定に保持できるようにすれば、推力を得ることができることが明らかになった。このとき、横方向の力は前列と後列とで逆向きになるので、打消し合えるが、前列と後列との間隔に比例した鉛直軸まわりの偶力が発生するため船体を旋回させるモーメントが作用することが分った。この旋回モーメントに対する対策はこれからの課題とすることにして、装置の設計を行って製作にとりかかった。この方式は、複数の櫓を一台の装置にまとめたものと考えることができ、前進速度に応じた最適の横行速度と迎角の組合せが存在し、かなりの高い効率が期待できることが判明した。又、チェーンを逆転させるか、或いは迎角を負に設定できれば、後進方向の推力も得られることを確かめた。これらの検討の成果を踏まえて設計製作した装置は、複雑なメカニズムを有するため設計製作に時間がかかってしまい、本年度はやっとその形を見るだけに終った。試運転を行い、改良した上、本実験を行うのは、次年度からスタートすることになる。本装置を横行式翼列推進器と名づけた。和船の櫓という古来の伝統技術に着目して、その長所である負荷に応じて自由に出力をコントロールできる点を動力駆動の推進装置に活用して新しい船舶推進装置として、「横行式翼列推進器」を考慮して、設計製作を平成5年度に完了した。

本年度は、この「横行式翼列推進器」の性能を調べるとともに、その問題点を見つけ出すために、試験水槽にて、単独試験を実施した。その結果、チェーンドライブ方式の機械損失と、前列から後列へ、そして、又、前列へと、角を廻る時、開き角を反転する際、翼が水を掻き回すために生じる抵抗の大きさによる損失のため、ロスが大き過ぎて、20%未満の効率しか達成できない事が分った。そして、減速ギアのギア比が30分の1であったことから、横行速度が上がらず、従って前進速度も発生推力も上らなかった。これらの欠点を克服するためには、まず第一に、減速ギアのギア比を10対1に落して、横行速度の上昇を図る事が肝要である。次に、チェーンドライブ機構を改良して、機械的摩擦損失となる個所を徹底的に少なくする必要がある。このためには、悪くすると、本装置の根本的な設計変更がなされなければならない可能性も孕んでいる。第三に、開き角の反転機構も改造して、大きな抵抗を生じない反転方法を工夫するしなければならない。この為には、現在のカム機構による反転法を取りやめて、ソレノイドかトグルバネのように、瞬時に反転する方法に変更しなければならないであろう。いずれにせよ、可成りの大改造が必要な事は明らかである。本研究の端緒は6年前から始まり、まず、櫓漕の流体力学的性能を明らかにするために、模型の櫓を用いて、人間が漕ぐのと同じ様に自動的に漕ぐロボットを製造する事から始めた。そのロボットの完成に3年かゝたが、それを用いた水槽実験によって、櫓が大変効率のよい優秀な推進器である事を実証することができた。そこで、この成果を活用するために、新式の推進装置として横行式翼列推進器を考案し、水槽実験でその性能を調べたが、所期の高性能を発揮するには程遠く、最終年度の本年度は、改良の目途をつける事を目標とした。本装置の最大の欠点は、左行と右行とで、水を切る翼の角度、即ち、前進方向に対する翼板の傾斜角(迎角に相当する)を反転する時に衝撃的に大きなトルクを必要とし、且つ翼板に過大な抵抗が作用する事である。この欠点の改良は容易でなく、順次改良を積み重ねて本年度はやっと流体力学的な性能のデータが収録できる時まで達した。解析の結果によると、まだまだ過大なトルクと抵抗の欠点は根本的に取り除く事はできず残っているが、20%程度の効率で漕げる事が分かった。今後は、この過大なトルクと抵抗が開き角を反転する際に生じないように、装置を造りかえて、高性能推進器の開発を達成する所存である。
ストレス誘発性胃由来カルシウム調節因子の検索とその生理活性測定法の開発

1)胃由来カルシウム低下因子検索のため、胃抽出物フラクションの血液カルシウム濃度に及ぼす効果をラットを用いて調べた。粗抽出物で血液カルシウム低下作用を示す分画の精製を進めたが、精製を進めると作用を示さなくなった。別のフラクションでも検索を進めたが現在までに新しくカルシウム低下作用を示す分画は見い出されていない。再度胃から抽出し、活性フラクションの同定を目指したが、新しい標本から活性フラクションは検出できなかった。現在、ヒスタミン投与後の胃静脈血から活性フラグメントを抽出しようとしている。2)ヒスタミンのカルシウム低下作用は胃切除で消失することから、ヒスタミンは胃に作用して胃由来血液カルシウム低下因子の分泌を促すことが推測できる。ヒスタミン標的細胞として胃免疫系細胞が有望視され、腹腔マクロファージに比べ、胃マクロファージの方がヒスタミン応答性が高いことを見い出したが、反応率は20%を越えることはなく、反応自体も弱かった。エンドトキシンによる増強効果を調べたが、ごく一部の細胞を除いて効果は認められなかった。3)血小板活性化因子(PAF)がヒスタミン系とは独立した血液カルシウム濃度低下機構のメディエーターであることを見い出した。PAFの胃および腹腔マクロファージの細胞内カルシウム上昇作用をヒスタミンと比較すると、ヒスタミンのカルシウム上昇作用が20%以下の細胞でしか認められないのに対してPAFは大半の細胞でカルシウム上昇作用を示し、PAFの方ががより強力な作用を示すことが明らかになった。本年度は、1)血液カルシウム低下作用をもつ胃抽出物の分離精製、2)胃由来カルシウム低下因子産生細胞としてのヒスタミン応答細胞の検索、3)胃由来カルシウム低下因子の候補のひとつである血小板活性化因子(PAF)の血液カルシウム調節作用の検討を行った。1.血液カルシウム低下作用をもつ胃抽出物の分離精製胃抽出物をラットに静脈内投与し、血液イオン化カルシウム濃度を低下させる分画を検索し、その精製作業を行った。粗抽出物のうち1分画に0.05mg-0.25mgの用量で投与30-60分後に血液イオン化カルシウム濃度を約0.05mM低下させる分画を見い出した。しかし、精製を進めるとともに効果の再現性が乏しくなり、最終的に活性分画が消失した。その原因を現在検討中である。2.胃粘膜固有層ヒスタミン応答細胞の検索胃由来カルシウム低下因子はヒスタミンで分泌が促されることが示唆されている。ヒスタミンの標的細胞を検索するため、本年度は、コラゲナーゼ処理したラット胃粘膜固有層から付着性細胞を単離し、ヒスタミン(1または5mM)に対する一酸化窒素(NO)産生能を酸化還元電位(ボルタメトリー)によるNO測定装置で測定したところ、一酸化窒素の産生が促された。この反応はヒスタミンH2受容体遮断薬やNO合成酵素阻害薬で抑制された。またヒスタミン投与時の細胞内カルシウム濃度をFura-2AMを用いて細胞内カルシウム濃度画像解析装置で測定したところ、ヒスタミンは胃粘膜固有層の付着性細胞の約20%に作用して細胞内Ca2+濃度を軽度上昇させた。粘膜上皮細胞でも調べる必要がある。3.血小板活性化因子(PAF)の血液カルシウム低下作用PAF(0.4,1.0,2.0,4.0mg/kg,I.V.)投与前後のラット血液中のイオン化カルシウム濃度をカルシウムイオンメータで経時的に測定した。血小板活性化因子(PAF)の静脈内投与はヒスタミンH2受容体を介さずに低Ca血症を誘発した。一方、ヒスタミンはPAF受容体を介さずに低カルシウム血症を誘発した。ガストリンやヒスタミンで分泌が促される胃由来カルシウム低下因子はPAFではないと考えられる。

粗抽出物で血液カルシウム低下作用を示す分画の精製を進めたが、精製が進むにつれて安定した作用を示さなくなった。別のフラクションでも検索を進めているが現在までに新しくカルシウム低下作用を示す分画は見い出されていない。現在、再度胃から抽出し、invivoのアッセイ系に加えて、骨組織を用いたin vivoのアッセイ系の確立して測定感度の向上をめざしている。2)ヒスタミンはストレス時に胃において血液カルシウム低下因子として作動する。その作用は胃切除で消失することから、ヒスタミンの標的細胞が胃に存在していると考えられる。胃粘膜上皮の壁細胞や粘膜固有層の免疫細胞にヒスタミン受容体あるいはそのmRNAが発現することから、胃底部付着性細胞(主としてマクロファージ)および腹腔マクロファージを採取し、細胞内カルシウム濃度のヒスタミンに対する反応を調べた。その結果、腹腔マクロファージに比べ、胃マクロファージの方がヒスタミン応答性が高い傾向が示唆された。3)ストレス時に潰瘍誘発因子として作動している血小板活性化因子(PAF)にも強力な低カルシウム血症誘発作用があることを見い出した。PAFおよびヒスタミンの血液カルシウム低下作用はそれぞれの受容体遮断薬で消失するが他方の受容体遮断薬で抑制されず、両者が互いに独立してストレス時に作動していることが明らかになった。1)胃由来カルシウム低下因子検索のため、胃抽出物フラクションの血液カルシウム濃度に及ぼす効果をラットを用いて調べた。粗抽出物で血液カルシウム低下作用を示す分画の精製を進めたが,精製を進めると作用を示さなくなった。別のフラクションでも検索を進めたが現在までに新しくカルシウム低下作用を示す分画は見い出されていない。再度胃から抽出し、活性フラクションの同定を目指したが、新しい標本から活性フラクションは検出できなかった。現在、ヒスタミン投与後の胃静脈血から活性フラグメントを抽出しようとしている。2)ヒスタミンのカルシウム低下作用は胃切除で消失することから、ヒスタミンは胃に作用して胃由来血液カルシウム低下因子の分泌を促すことが推測できる。ヒスタミンは標的細胞として胃免疫系細胞が有望視され、腹腔マクロファージに比べ、胃マクロファージの方がヒスタミン応答性が高いことを見い出したが、反応率は20%を越えることなく、反応自体も弱かった。エンドトキシンによる増強効果を調べたが、ごく一部の細胞を除いては効果は認められなかった。3)血小板活性化因子(PAF)がヒスタミン系とは独立した血液カルシウム濃度低下機構のメディエーターであることを見い出した。PAFの胃および腹腔マクロファージの細胞内カルシウム上昇作用をヒスタミンと比較すると、ヒスタミンのカルシウム上昇作用が20%以下の細胞でしか認められないのに対してPAFは大半の細胞でカルシウム上昇作用を示し、PAFの方ががより強力な作用を示すことが明らかになった。
バリウムの血管内皮細胞への流入機構と一酸化窒素生成に関する研究

申請者は一酸化窒素(NO)の薬理学研究と冠動脈の特殊性に関する研究を進めてきたが、近年CaとBaがイヌの冠動脈を弛緩させることを薬理学的手法を用いて報告し、内皮依存性弛緩因子(EDRF)/Noの合成遊離機構を介することや種や部位によって反応の違いが生じることが明らかにした(Yamazaki et al., 1995 ; Ohashi et al., 1995)。ここで明らかになったBaによる内皮依存性の弛緩反応はこれまでに例を見ない。申請者はBaがカルモジュリン依存性のNO合成系を直接活性化させ、弛緩反応を惹起するという仮説を考えた。そして、その作用機序を証明するために(1)摘出血管標本を用いてCaとBaによる弛緩反応と血管内皮への各イオン流入の対応と、(2)CaとBaによるNO合成酵素活性に対する作用を調べた。まず(1)のために、2価イオンの蛍光プローブであるFura 2の蛍光強度比が、試験管内でBa濃度依存性に代わることを確かめた。さらにCaの場合と区別する方法としてCaの励起スペクトルの不変点で測定することが有効であることを示した。結果として、イヌ冠動脈のらせん標本で内皮由来のFura 2蛍光比と血管張力を同時に測定して、CaやBaによる弛緩と蛍光比の増加が内皮細胞依存的に起こることを明らかにした。次に(2)のために、NO合成酵素が豊富なラット小脳から酵素を粗精製し、[^3H]arginineから[^3H]citrullineへの変換を指標にして、BaによるNOの産生を調べた。その結果、Caに比較してBaは高濃度を必要とするが、カルモジュリン依存的にNO合成酵素を活性化することを明らかにした。以上の成績から、イヌの冠動脈に見られたCaとBaによる弛緩反応の作用機序は内皮細胞への各イオンの流入とNO合成酵素の活性化としてほぼ説明できると考えられた。
放射光光電子顕微鏡による反強磁性を示す基板と強磁性、反強磁性薄膜の界面の研究

われわれがつくばの放射光施設(PF)に所有している光電子顕微鏡(PEEM)に設置する温度可変マニピュレータの整備をすすめることで、反強磁性体、磁性薄膜の研究に適した実験環境を実現することに努めている。製作しているマニピュレータは、面内回転、チルト調整機構を備えたもので、PEEMによる磁区観察には不可欠な機能である。実際の研究に関しては、Cr薄膜をNiOに蒸着したり、鉄薄膜をNiOに蒸着したときの磁区ドメイン観察を行ったりした。Crの系に関しては、膜厚に応じて下地NiOの反強磁性磁区にコントラストのモジュレーションが現れることを見出した。Cr奇数層の領域には正味のスピンモーメントが存在し、それと下地NiOのモーメントの交換相互作用が磁区コントラストの変化を生み出していることがわかった。また、Crの膜は、大きな磁区ドメインを持たないため、Crについてのドメインが観察できないばかりではなく、下地のNiOのドメイン構造を小さく引きちぎっていることがわかった。鉄を蒸着した系に関しては、膜厚の薄いところでは、Crの場合と同様、下地との交換相互作用により、鉄のドメイン自身、NiOの反強磁性磁区ドメインを反映したものなるのに対し、厚い領域では、鉄自身がドメインを形成しようとするエネルギーと、交換相互作用との競合関係によって複雑なドメインが現れることがわかった。また、これまでに観測されてきた、NiのL吸収端における磁気2色性ばかりでなく、酸素のK吸収端においても磁区ドメイン観測が可能なことに関しても上述の実験結果から詳細な知見を得ることができた。即ち、酸素のK吸収端では、結晶の反強磁性歪に由来するT-domainが観測されているのに対し、NiのL吸収端では、スピン容易化軸に由来するS-domainとT-domainの双方が観測されたことである。そのほか、SPring-8に導入された高分解能光電子顕微鏡装置を用い、NiOや、その上に鉄を蒸着したサンプルに関し、高精度実験を行った。つくばの放射光施設では、蒸着の影響を詳細に検討することで、T-domainとS-domainの区別がついていたものが、蒸着しない状況でも詳細なコントラストを得ることができた。しかも、12個存在するドメインのうち、7種を確定したほか、磁壁の様子も観測できた。さらに、これまでに信じられてきたX線吸収スペクトルの形状よりも微細な形状を見出すことにも成功した。これらの結果は、裏面に記したいくつかの論文で報告したほか、数報の論文を準備中である。又、4件の国際会議で成果報告を行ったほか(うち2件は招待講演)、国内の会議でも数件の報告を行った(1件は招待講演、来年度も1件の招待講演が予定)。

平成15年度は、反強磁性を示す基盤のNiO(100)表面上に、反強磁性金属として知られているCr薄膜を形成し、界面に生じる磁気構造の変化について研究を行った。これまでは、スピンバルブへの応用の観点から、NiO基板上への強磁性Co薄膜を成長させた例が有名である。今回のCrの場合には、Crの磁気モーメントが1層成長するごとに反転することが予想され、それに伴った、界面での磁気構造に対する興味から研究を進めた。放射光の直線偏光、及び円偏光を利用して、そこで生じる磁気2色性を利用して、反強磁性、強磁性磁区構造の観察を元素選択的に行った。その結果、Crの膜厚が増えるにつれて、下地のNiO基板における磁気モーメントの大きさがCr1層ごとに変化することを見いだした。Crの膜厚が奇数層の場合には、Cr膜に正味の磁気モーメントが存在する。一方、偶数層の場合には、1層ごとの磁化反転により、正味のモーメントはゼロである。下地基板の磁気モーメントの変化は、Crに生じた正味のモーメントとの相互作用であることが分かった。これらの結果については、Cr自身の磁区構造の観察に成功していないため、まだデータの分析中であるが、いくつかの研究会、学会において報告したほか、物性研究所附属軌道放射物性研究施設のActivity reportにも報告した。今後、国際誌に論文提出予定である。一方、このような研究を進めていく上で、サンプルの温度変化に伴う磁区観察は非常に重要である。しかしながら、光電子顕微鏡においては温度ドリフトによってサンプルの場所が変わることは、実験上大きな害になる。本年度予算では、できるだけ、温度安定化が可能な、冷却用マニピュレータの設計、構築を行い、現在それを使った予備実験を開始している。次年度は、温度変化とともに、蒸着物質、基板など、いくつかの可能性を探りながら、研究対象を広げていく予定である。今年度は、前年度に引き続き、光電子顕微鏡に設置する温度可変マニピュレータの整備をすすめた。製作したマニピュレータの動作が、やや荒すぎたため、顕微鏡の観察には適さないことがわかり、パルスモータを使って微調駆動が可能なように改造を行った。実際の研究に関しては、昨年度行った、Cr薄膜をNiOに蒸着した系に関する詳細な検討を行ったり、鉄薄膜をNiOに蒸着したときの磁区ドメイン観察を行ったりした。Crの件に関しては、当初得られた見解の通り、Cr奇数層の領域には正味のスピンモーメントが存在し、それと下地NiOのモーメントの交換相互作用が磁区コントラストの変化を生み出していることがわかった。また、Crの膜は、大きな磁区ドメインを持たないため、Crについてのドメインが観察できないばかりではなく、下地のNiOのドメイン構造を小さく引きちぎっていることがわかった。鉄を蒸着した系に関しては、膜厚の薄いところでは、Crの場合と同様、下地との交換相互作用により、鉄のドメイン自身、NiOの反強磁性磁区ドメインを反映したものなるのに対し、厚い領域では、鉄自身がドメインを形成しようとするエネルギーと、交換相互作用との競合関係によって複雑なドメインが現れることがわかった。また、これまでに観測されてきた、NiのL吸収端における磁気2色性ばかりでなく、酸素のK吸収端においても磁区ドメイン観測が可能なことに関しても上述の実験結果から詳細な知見を得ることができた。