hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
太陽系外惑星の直接検出に向けた宇宙望遠鏡搭載中間赤外線コロナグラフの開発

私の研究課題は、太陽系外惑星の直接観測という重要で挑戦的な課題に向けた「瞳マスクコロナグラフ観測装置」の開発である。本研究で用いているコロナグラフの方式は、バイナリ瞳マスク方式である。バイナリ瞳マスクコロナグラフは、原理的には波長によらずコントラスト改善する能力を発揮するという利点がある。21年度には世界で初めて広帯域・多波長域化することに成功し、原理的には波長によらず機能するという瞳マスクコロナグラフの利点を実証した。本年度はこれまでの実証実験を可視光波長域から(より惑星観測に適した)赤外波長域に拡張したコロナグラフの性能評価に挑むための極低温実験チャンバーおよび赤外線用バイナリ瞳マスクの開発をおこなった。実験系全体を極低温環境にする中間赤外コロナグラフテストベッドの開発では、真空チャンバー内にラディエーションシールドと温度モニターを導入し、機械式GM冷凍機を用いて冷却試験を行なった結果、約二日で内部の最終平衡温度が5K以下に到達する極低温環境を実現した。また、これまでの可視光実験で用いていた瞳マスクはガラス基板を使用していたが、赤外線波長はガラスを透過しないので、中間赤外線実験では,金属薄板による基板を用いない自立型マスクを用いる必要がある。そのため銅製自立型マスク(大きさ:10mm,設計コントラスト:10^<-10>)を製作し、常温大気中での可視光コロナグラフ実験を行なった。その結果、1.0×10^<-7>のコントラスト性能に到達した。合わせて、顕微鏡で形状精度を評価し、数値シミュレーションを併用して、コロナグラフ性能を制限する要因を評価した。このことから自立型マスクは高コントラスト赤外実験に最適なマスクの一つであることを実証した。これらの成果は最終的に装置を衛星搭載望遠鏡にとりつけて系外惑星を観測するために不可欠のマイルストーンである。以上は、単体の研究成果として査読論文、学位論文やコンファレンスにて発表した。以前には出来る限り単純化した装置を用いた原理検証に留まっていた実験を、21年度には世界で初めて広帯域・多波長域化することに成功した。従来のHe-Neレーザー光源から4つの波長をもつSLED(Super luminescent Light Emitting Diode)光源に変え、それぞれの中心光とその周りの暗領域(惑星光が検出できるほど中心の光を低減させた領域)のコントラストを求めた結果、650nmでは3.1×10^<-7>、750nmでは1.1×10^<-6>、800nmでは1.6×10^<-6>、そして850nmでは2.5×10^<-6>に到達し、すべての帯域でバイナリ瞳マスクコロナグラフによるコントラスト改善が確認された。これは最終的に装置を衛星搭載望遠鏡にとりつけて系外惑星を観測するために不可欠のマイルストーンである。また、コロナグラフ観測装置の性能を大きく向上させる星像差分法の実証、実験を行なった。光学系の熱歪みを従来よりも低減することに成功した結果、星像差分法を使用した後のコントラストは差分前のコントラストより2桁も改善され、1.8×10^<-9>に到達した。現段階までに得られた成果をもとに、2本目の査読論文を執筆中である。さらに実証実験を可視光波長域から(より惑星観測に適した)赤外波長域に拡張するための極低温実験チャンバーの開発でも進捗を得た。具体的には、中間赤外コロナグラフの性能を評価するための汎用性のある極低温真空テストベッドの開発を行なった。真空チャンバーの冷却試験に向けて、まず排気試験を行ない、チャンバーにリークがないことを確かめた。チャンバー内部にはワークサーフェスとラディエーションシールドを設置し、これらに断熱材を張り付け、放射による熱流入を抑えた環境を実現した。今後冷却試験を行ない、準備を完了したMILC-Tを用いて、高コントラスト中間赤外線コロナグラフの世界初の実証に挑む。私は太陽系外惑星の直接観測という重要で挑戦的なゴールを目指しており、そのために赤外線宇宙望遠鏡SPICAに搭載することを想定した、「バイナリ瞳マスクコロナグラフ」という高コントラスト観測蔵置の原理検証実験を行なっている。これまで単色レーザー光源による原理検証実験に留まっていた実験を、世界で初めて広帯域・多波長域化することに成功し、原理的には波長によらず機能するという瞳マスクコロナグラフの利点を実証した。光学系の熱歪みを従来よりも低減することに成功した結果、星像差分法を使用した後の中心光とその周りの暗領域(惑星光が検出できるほど中心の光を低減させた領域)のコントラストは差分前のコントラストより2桁も改善され、世界最高レベルである1.8×10^<-9>に到達した。これらの可視光原理検証実験の成果をまとめ、2本目の査読論文を投稿し、国内外の研究会でも発表した。さらに実証実験をこれまでの可視光波長域から(より惑星観測に適した)赤外波長域に拡張するための極低温実験チャンバーおよび赤外線用バイナリ瞳マスクの開発でも進捗を得た。

熱輻射による赤外バックグラウンドを大幅に低減するために、具体的にはチャンバー内部にはワークサーフェスとラディエーションシールド(2重)を設置し、これらに断熱材を張り付け、放射による熱流入を抑えた環境を実現し、機械式GM冷凍機(住友重機製SRD208)を2台利用することで液体ヘリウムなどの冷媒を用いることなく冷却した。冷却試験を行なった結果、実験系全体を設置する場所の温度が目標温度である10K以下に到達した。また赤外線実験用に、基盤を用いない金属薄板による自立型のマスクおよびSiやGeの赤外線透過材を基盤に用いた新しいバイナリ瞳マスクを開発した。これらを用いて、来年度は高コントラスト中間赤外線コロナグラフの世界初の実証に挑む。私の研究課題は、太陽系外惑星の直接観測という重要で挑戦的な課題に向けた「瞳マスクコロナグラフ観測装置」の開発である。本研究で用いているコロナグラフの方式は、バイナリ瞳マスク方式である。バイナリ瞳マスクコロナグラフは、原理的には波長によらずコントラスト改善する能力を発揮するという利点がある。21年度には世界で初めて広帯域・多波長域化することに成功し、原理的には波長によらず機能するという瞳マスクコロナグラフの利点を実証した。本年度はこれまでの実証実験を可視光波長域から(より惑星観測に適した)赤外波長域に拡張したコロナグラフの性能評価に挑むための極低温実験チャンバーおよび赤外線用バイナリ瞳マスクの開発をおこなった。実験系全体を極低温環境にする中間赤外コロナグラフテストベッドの開発では、真空チャンバー内にラディエーションシールドと温度モニターを導入し、機械式GM冷凍機を用いて冷却試験を行なった結果、約二日で内部の最終平衡温度が5K以下に到達する極低温環境を実現した。また、これまでの可視光実験で用いていた瞳マスクはガラス基板を使用していたが、赤外線波長はガラスを透過しないので、中間赤外線実験では,金属薄板による基板を用いない自立型マスクを用いる必要がある。そのため銅製自立型マスク(大きさ:10mm,設計コントラスト:10^<-10>)を製作し、常温大気中での可視光コロナグラフ実験を行なった。その結果、1.0×10^<-7>のコントラスト性能に到達した。合わせて、顕微鏡で形状精度を評価し、数値シミュレーションを併用して、コロナグラフ性能を制限する要因を評価した。このことから自立型マスクは高コントラスト赤外実験に最適なマスクの一つであることを実証した。これらの成果は最終的に装置を衛星搭載望遠鏡にとりつけて系外惑星を観測するために不可欠のマイルストーンである。以上は、単体の研究成果として査読論文、学位論文やコンファレンスにて発表した。
肺ホスホリパーゼDのcDNAクローニングと増殖・癌化シグナル伝達機構

今年度の実施結果1.従来のカラムクロマトグラフィーに蛋白連続分取用電気泳動装置を導入して精製過程を簡略化し、ブタ肺からホスフォリパーゼDを繰り返し精製した。2.得られた精製標品の一部をニワトリ、家兎に免疫し抗体産生を試みた。残念ながら抗血清はウエスタンブロティングで精製標品を認識できず、またホスフォリパーゼD活性を免疫沈降できなかった。3.残りの精製標品をアミノ酸配列決定に回したが、N末端はブロックされていた。そのためペプチダーゼで限定分解した後、気相シークエンサーにより内部アミノ酸配列を決定した。得られた部分アミノ酸配列のホモロジー検索を行なったところ、これらの配列を含むシグナル伝達因子がホスフォリパーゼDの候補としてヒットした。4.このシグナル伝達因子のヒトcDNAクローンは既にKazusa DNA Research Instituteで得られていたため、そのクローンを分与して頂き、発現実験を行なった。まず大腸菌で発現を試みたが、ホスフォリパーゼDの活性は発現しなかった。次に動物細胞、バキュロウイルスによる昆虫細胞を用いた発現実験を行なったが、やはり活性の発現は認められなかった。5.そのため、従来のホスフォリパーゼDの精製方法を見直して、現在再精製を試みている。
老齢個体における生体防御機構の解明

平成13年度は、BALB/c老齢マウスのリンパ節由来自己細胞反応性γδT細胞を中心に解析を行った。これまでの研究結果より、特にVδ5陽性T細胞株を用いて研究を行った。自己細胞に反応するVδ5陽性T細胞の生体における機能解析:Vδ5陽性T細胞株はBALB/c由来線維肉腫細胞であるMeth Aに対しても応答性を示す。そこで、若齢BALB/cマウスの右側背部皮下に、Vδ5陽性T細胞株とMeth Aを等量同時に接種し、腫瘍の生着度について検討した。実験対照にはBALB/c老齢マウス由来γδT細胞亜集団を用いた。実験対照群では、Meth A単独接種と同様に100%近い腫瘍の生着が認められたのに対し、Vδ5陽性T細胞株移入群では腫瘍の生着率は20%以下であった。また、これらの反応は、宿主のCD8細胞を除去することにより、著しく生着率が増加した。Vδ5陽性T細胞株が直接Meth Aに対して障害活性を示すか否かについて検討したところ、CTL活性ならびにNK活性は認められなかった。一方、ケモタクティクスチャンバーを用いた実験において、上段にMeth AとVδ5陽性T細胞株、下段にMMC処理したMeth Aと若齢BALB/cマウス由来LN細胞とを入れて共培養した。下段より生細胞を回収し、CTL活性ならびにNK活性について測定したところ、上段にBALB/c老齢マウス由来γδT細胞亜集団を入れた実験対照群に対して、Vδ5陽性T細胞株を上段に用いた方では著名なCTL活性およびNK活性が認められた。以上の結果より、自己細胞反応性Vδ5陽性T細胞は、直接的な腫瘍障害活性は持たないものの、間接的に宿主のCTL活性を誘導し、自己腫瘍に対して抑制的に働くことが証明された。今までの研究成果より、自己細胞反応性Vδ5陽性T細胞は、腫瘍細胞上の共通自己抗原を認識し、Th1型サイトカインを産生することにより、宿主の生体防御機構を担っていることが推察される。平成12年度は、BALB/c老齢マウスのリンパ節由来自己細胞反応性γδT細胞を中心に解析を行った。これまでの研究結果より、自己細胞反応性γδT細胞集団のなかでもVδ5陽性T細胞は、顕著に自己脾臓細胞に対して抗原応答性を示すことより、特にVδ5陽性T細胞ハイブリドーマを用いて研究を行った。自己細胞に反応するVδ5陽性T細胞の抗原認識の特徴(MHC拘束性):BALB/cマウスは、H-2ハプロタイプがH-2^dに属する。そこで、BALB/cマウスB細胞由来かつMHCclassII陰性のcell lineであるM12C3細胞を用いて解析を行った。M12C3細胞にMHC dass IIであるIA^d分子を発現したトランスフェクタントであるTAβd細胞を抗原刺激細胞として、4種類のVδ5陽性T細胞ハイブリドーマと5日間混合培養(MLC)を行った。4種類のVδ5陽性T細胞ハイブリドーマは、M12C3細胞およびTAβd細胞のいずれにも反応しなかった。また、4種類のVδ5陽性T細胞ハイブリドーマと刺激細胞として自己脾臓細胞とでsyngeneicMLCを行ったところ、抗MHC class I抗体および抗MHC class II抗体存在下において自己細胞応答性は抑制されなかった。以上の結果より、自己細胞反応性Vδ5陽性T細胞は、MHC非拘束性に抗原認識する事が示唆された。一方、BALB/cマウスのNon-classicalなMHC class I様抗原であるTLa^c分子に対する抗体存在下で同様にsyngeneic MLCを行ったところ、Vδ5陽性T細胞ハイブリドーマの自己脾臓細胞に対する応答性が著しく抑制された。以上のことより、自己細胞反応性Vδ5陽性T細胞は、自己のMHC class I様抗原(TLa^c)もしくはこのTLa^c分子に発現した自己抗原を認識している可能性が推測された。自己細胞に反応するVδ5陽性T細胞により認識された自己抗原:自己細胞反応性Vδ5陽性T細胞の抗原認識においてMHC class I様抗原であるTLa^c分子に何らかの関係があることより、BALB/cマウスと同じH-2ハプロタイプ(H-2^d,TLa^c)を有するB10.D2マウスを用いて解析を行った。抗原刺激細胞として、B10.D2マウスの脾臓細胞を用いてVδ5陽性T細胞ハイブリドーマとMLCを行ったところ、Vδ5陽性T細胞ハイブリドーマは、BALB/cマウスと同じハプロタイプを有するB10.D2マウスの脾臓細胞には全く反応しなかった。さらに、BALB/cマウス脾細胞由来可溶化蛋白抗原とB10.D2マウスの脾臓細胞を抗原提示細胞として用いたVδ5陽性T細胞ハイブリドーマとのMLCにおいて、Vδ5陽性T細胞ハイブリドーマの自己脾細胞由来可溶化抗原に対する抗原応答性が認められた。以上の結果より、自己細胞反応性Vδ5陽性T細胞は、MHC class I様分子であるTLa^c分子に結合した自己抗原を認識している可能性が示唆された。今後、この自己脾細胞可溶化抗原を詳細に解析することにより、自己細胞反応性Vδ5陽性T細胞によって認識される自己抗原が明らかになるものと思われる。

さらに、自己抗原分子の詳細な解析を行うことにより、自己免疫疾患予防の手がかりになる可能性が推察される。平成13年度は、BALB/c老齢マウスのリンパ節由来自己細胞反応性γδT細胞を中心に解析を行った。これまでの研究結果より、特にVδ5陽性T細胞株を用いて研究を行った。自己細胞に反応するVδ5陽性T細胞の生体における機能解析:Vδ5陽性T細胞株はBALB/c由来線維肉腫細胞であるMeth Aに対しても応答性を示す。そこで、若齢BALB/cマウスの右側背部皮下に、Vδ5陽性T細胞株とMeth Aを等量同時に接種し、腫瘍の生着度について検討した。実験対照にはBALB/c老齢マウス由来γδT細胞亜集団を用いた。実験対照群では、Meth A単独接種と同様に100%近い腫瘍の生着が認められたのに対し、Vδ5陽性T細胞株移入群では腫瘍の生着率は20%以下であった。また、これらの反応は、宿主のCD8細胞を除去することにより、著しく生着率が増加した。Vδ5陽性T細胞株が直接Meth Aに対して障害活性を示すか否かについて検討したところ、CTL活性ならびにNK活性は認められなかった。一方、ケモタクティクスチャンバーを用いた実験において、上段にMeth AとVδ5陽性T細胞株、下段にMMC処理したMeth Aと若齢BALB/cマウス由来LN細胞とを入れて共培養した。下段より生細胞を回収し、CTL活性ならびにNK活性について測定したところ、上段にBALB/c老齢マウス由来γδT細胞亜集団を入れた実験対照群に対して、Vδ5陽性T細胞株を上段に用いた方では著名なCTL活性およびNK活性が認められた。以上の結果より、自己細胞反応性Vδ5陽性T細胞は、直接的な腫瘍障害活性は持たないものの、間接的に宿主のCTL活性を誘導し、自己腫瘍に対して抑制的に働くことが証明された。今までの研究成果より、自己細胞反応性Vδ5陽性T細胞は、腫瘍細胞上の共通自己抗原を認識し、Th1型サイトカインを産生することにより、宿主の生体防御機構を担っていることが推察される。
多層膜を用いた可とう性X線導波路の作成と評価

本研究は、中空管の内壁に多層膜を形成することにより伝送効率の高い可とう性X線導波路を開発することを目的とし、薄膜堆積の制御性に優れしかも多様な基板形状に対応できる熱CVD法によるプロセス技術の確立を目指している。本年度の目標は、熱CVD装置の改良と平板上への多層膜作成技術の確立にある。多層膜形成用の熱CVD装置の改良を行った。原料ガスとしてX線透過率の高い薄膜(Si、B)用にSi_2H_6およびB_2H_6、X線反射率の高い薄膜(Sn)用にSn(CH_3)_4を備えた。ただし、Sn(CH_3)_4は水素をキャリアガスとしてバブリングによって供給する。炉は赤外線イメ-ジ炉とし、基板ホルダ-も熱容量を小さくし、昇温降温を迅速に行えるようにした。ただし、反応管は石英製である。Si_2H_6およびSn(CH_3)_4のボンド解離エネルギ-は、それぞれ2.1eVおよび2.6eVであり、Snの成膜時により高い基板温度が必要となる。Siについては、水素流量100sccm、Si_2H_6流量13sccm、圧力2.0Torr、基板温度450480°Cの条件で、多層膜作成に適した成長速度0.51A/sで成膜できることがわかった。一方、Snについては、水素流量30130sccm、Sn(CH_3)_4流量1x10^<ー5>3x10^<ー5>mol/min、圧力2.0Torrの条件で、基板温度700°C付近で成膜できることを確認した。得られた薄膜は、金属的性質を持つβ相の白錫であった。膜質と成長速度の点からまだ条件を探しているところであるが、多層膜作成の目途がたった。
新規統計手法を用いた疾患の犬種差を生み出す原因遺伝子の同定

イヌの疾患発症リスクを高める遺伝子変異を同定することは獣医療の向上には非常に重要である。本研究では、網羅的にそのような遺伝子変異を同定するために、疾患発症率の犬種差に着目し、新規解析手法を開発した。続いて、40犬種についてゲノム全体にわたる17万個の遺伝子頻度情報を集積すると共に、80疾患についての各犬種の疾患率情報を入手し、その解析手法を適用した。その結果、これまでに疾患の発症リスクの犬種差とゲノムワイド有意に関連を示す遺伝子変異を8個同定した。イヌの疾患の罹患率には明確な犬種差が存在しており、遺伝的な影響が強く寄与していると想定される。しかしながら、犬種間において遺伝的背景が異なるため、各疾患の発症と関連する遺伝子変異を同定するためのゲノム解析では、犬種毎に解析を行う必要があった。本研究では、犬種の遺伝的背景の問題を新たに開発する統計手法により処理することで、疾患の罹患率の犬種差を生み出している遺伝子変異の同定を行った。所有する30犬種についての17万個の一塩基多型(SNP)情報に加えて、新たに10犬種130頭について血液のサンプリングを行った。抽出したゲノムDNAを用いてゲノム解析を実施し、17万個のSNP情報を新たに取得し計40犬種についてのSNPデータを作製した。また、動物の保険会社よりそれらの犬種の80疾患についての罹患率情報を入手した。これらの情報を組み合わせて、各疾患の罹患率の犬種差に関わる遺伝子変異をゲノム全体から明らかにするために、permutation法を組み合わせたゲノムワイド関連解析手法を構築した。これまで、疾患の罹患率の犬種差とゲノムワイドに有意な関連を示すSNPを8個同定している。そのうち1個については他の形質との関連も報告されていることから、イヌの犬種を作製する過程において、その形質の育種選抜に付随してその疾患の罹患率の上昇が引き起こされたことを強く示唆する結果であった。今後は、同定された疾患罹患率の犬種差に関わる遺伝子変異が、実際に特定の犬種においてどのように疾患のリスクと関係しているかについて解析を進めていく。また、本解析手法の有用性が示唆されたため、SNP情報の犬種数および疾患罹患率のデータを追加する予定である。動物遺伝学
特異な電子欠損型反応種の創成とその活用

電解によるスルフィドのalpha-アセトキシ化とその有機合成への応用について検討し、新しい知見を得た。有機硫黄化合物は合成原料として用いられる他、生体中でも重要な働きをしている。今回の研究では、その中からスルフィドを取り上げ、その電気化学的な性質を明らかにし、さらに電気化学的な手法を用いて効率良く有用な化合物へ変換する方法を開発した。種々のスルフィドを酢酸中で酢酸ナトリウムを支持電解質として通電すると、他の多くの感応基は損なわれることなく極めて効率的にalpha-アセトキシスルフィドが得られることを見いだした。種々のスルフィドが容易に得られることから、この反応の合成的な利用価値は高い。例えば、従来その合成には多くの操作を必要とした、gamma-ヒドロキシ-alpha,beta-不飽和エステルやニトリルが短工程で合成できる。また、テトラヒドロチオフェン誘導体を短工程でチオヌクレオシドに誘導することも出来た。このチオヌクレオシド関連化合物は、抗HIV活性を持つことが明らかにされ、エイズ治療薬としての利用が期待されている。さらには、alpha-アセトキシスルフィドを種々の官能基に容易に変換できることから、合成原料の簡便な調製法として本電解反応を活用することが出来る。ビニルスルフィド、alpha-ケトエステル、などの各種誘導体が容易に得られる。現在、本反応を活用して、抗ウイルス剤などの有用物質の幅広い合成を行うと共に、本研究によって得た知見を基にした、電解反応による新規反応活性種の開発とその有用物質合成への応用研究を展開中である。
乳酸菌由来新規抗リステリア性ペプチドの作用機構解明とその応用

また,LImonocytogenesのPiscicocin CS526耐性獲得頻度について調べ,10^<-4>10^<-5>の割合でClass IIaバクテリオシンであるPiscicocin CS526耐性菌が出現することを明らかにした。一方・食品中でのPiscicocin CS526耐性L.monocytogenesの制御を考え,様々な抗菌物質に対するPiscicocin CS526耐性菌の交差耐性の有無を調べ,各種抗生物質や食品への添加が許可されている既存の抗菌物質約30種に対して交差耐性のないことを示した。また,耐性株では親株に比べてPiscicocinCS526の細胞吸着量が低下していることを明らかにし,耐性株での細胞膜表面の負電荷領域の減少が耐性獲得の原因のひとつであることを明らかにした。さらに,他の抗菌性物質との併用によりL.monocytogenesのregrowthを阻止できることから耐性獲得が抑制されることを示した。申請者が水産食品から見出した乳酸菌の産生する新規抗菌ペプチド、(Piscicocin CS526およびBetacin)のリステリア菌に対する抗菌メカニズムを詳細に検討し以下のような結果を得た。すなわち,Carnobacterium piscicola CS526株の産生するクラスIIaバクテリオシンであるPiscicocinCS526は,感受性菌の細胞膜に対して,K+が通過できる程度の極めて小さな穴を形成し,膜電位と細胞内外ΔpHを崩壊させ,プロトン駆動力(PMF)を保てなくすることで細胞内のATPの枯渇を導き,死に至らしめることで殺菌的作用を発揮することを明らかにした。また,Carnobacterium piscicola Sur 602株の産生する抗菌ペプチドBetacinは,バクテリオシンではないものの,感受性菌に対して短時間で殺菌作用を示し,その抗菌メカニズムがK^+漏洩および細胞内部ATPの消費・枯渇を引き起こすなど,クラスIIaバクテリオシンと類似することを明らかにした。一方,Betacinは感受性菌であるListeria属菌に対してのみ吸着され,吸着に関与するレセプターの存在が示唆されたが,感受性菌膜表面を各種酵素および界面活性剤で処理したところ,リパーゼやトリトンX-100の処理で吸着率の大幅な低下が認められ,抗菌ペプチドの吸着に関与するタンパク質性レセプターの存在は否定された。さらに,Betacinは脂質分解酵素によって失活することこら,分子内に何らかの修飾を受けていると予想され,また,Betacinアミノ酸配列と完全に一致する合成ペプチドに抗菌活性が見られかったことから,この修飾部位が抗菌活性に関与している可能性が強く示唆された。
下痢性貝毒原因プランクトンの栄養摂取動態に関する研究

全年度までに、下痢性貝毒原因渦鞭毛藻のDinophysis fortiiの葉緑体はある種のクリプト藻に由来することをつきとめ、そのクリプト藻を検出するための蛍光核酸プローブの開発に成功した。本年度は三陸・越喜来湾においてD.fortiiの出現と、同クリプト藻の消長の関係を調べた。その結果、同クリプト藻はD.fortiiの出現の初期、2004年5月26日に大量出現し、それとともにD.fortiiの出現のピークが見られた。また、5月26日以降、D.fortiiの葉緑体含量の増加が見られた。このことからD.fortiiは同クリプト藻を取り込むことによって葉緑体を得、それとともに大量増殖していると思われた。D.fortiiは沖合水と沿岸水の混合水塊で増殖することがわかっているが、同クリプト藻の分布域は沿岸水側であることが水塊分析から判明した。なお、この様なクリプト藻は遺伝子解析の結果からTeleaulaxの一種であると思われ、通年の調査からごく限られた時期(5月もに)にしか出現しないことが判明した。このことから同クリプト藻のモニターによってD.fortiiの出現予知が可能であると思われた。これとは別に、同じく下痢性貝毒原因種のD.mitraの葉緑体の起源の解明も果たした。葉緑体遺伝子解析から、本種の場合その葉緑体はクリプト藻ではなく、ハプト藻に由来することが判明した。D.mitraの場合、葉緑体遺伝子の塩基配列には多様性が見られることから、複数種のハプト藻を取り込んでいることが示唆された。岩手県越喜来湾において週一回のサンプリングを行い、Dinophysis fortii天然細胞を集めた。それに対して、備品として購入したマルチチャンネル分光測光装置により細胞内蛍光スペクトルを測定し、その情報をもとに透過型電子顕微鏡(TEM)試料の作成、葉緑体DNAの抽出を行った。蛍光スペクトル分析の結果、D.fortiiにはクリプト藻類の葉緑体に特有の色素(フィコエリスリン;以下PE)が常に含まれるが、その量は著しく変動することが判明した。PE含量が異なる時々のD.fortiiから、葉緑体小サブユニットrDNA(以下SSU rDNA)を増幅・精製し、その塩基配列を調べたが、時期を問わずゲミニゲラ科のクリプト藻に近似する配列を示した。当年はD.fortii以外にD.triposも多く出現したため、その葉緑体SSU rDNAの塩基配列も調べた。その結果D.triposにも全く同じ葉緑体が含まれていた。将来的にこれらDinophysis spp.葉緑体の遺伝子マーカーによる検出を目指すため、SSU rDNAよりも変異が大きいとされるリブロース二リン酸脱炭酸酵素の大サブユニット遺伝子(rbcL)の塩基配列の情報も得た。これらDinophysis spp.の葉緑体遺伝子解析結果から、その葉緑体の起源と近縁と思われるクリプト藻培養株をいくつか手に入れて、それらをDinophysisに与える実験も行ったが、活発なDinophysis細胞の入手が困難な時期となったため、その観察は来年度に期待したい。なお、当年はD.mitraも大量に出現し、その蛍光スペクトルの分析の結果、本種はD.fortii、D.triposとは異なる葉緑体を持つことが示唆された。このためTEMによりその形態を観察したところ、ハプト藻類のそれに酷似していた。現在葉緑体遺伝子の解析の最中である。D.fortiiの捕食生態の面に関しては、食胞内のミトコンドリアDNAの増幅はかなわず、現在、核SSU rDNAのユニバーサル増幅産物の多数のクローニングを行い、塩基配列の情報より、その餌生物の同定を実施している。下痢性貝毒の原因渦鞭毛藻であるDinophysis spp.の葉緑体起源生物の出現を調査することを目的とし、本年度は蛍光核酸プローブの開発およびその特異性の検討を行った。Dinophysis葉緑体小サブユニットrRNA遺伝子(pSSU rDNA)およびリブロース2リン酸脱炭酸酵素大サブユニット遺伝子(rbcL)の塩基配列と、近縁のクリプト藻培養株のそれらを比較し、Dinophysis葉緑体に特異的な蛍光核酸プローブを作製した。本プローブの特異性を検討した結果、Dinophysis spp.の葉緑体のみに極めて感度良く結合すること,を確認した。本プローブを用いたfluorescent in situ hybridization(FISH)法により、越喜来湾内外におけるプローブ結合性のナノプランクトンの出現を調査した。同時にD.fortiiのin vivo蛍光スペクトルから葉緑体補助色素であるフィコエリスリンの相対含量を求め、プローブ結合性のクリプト藻類の消長とD.fortii葉緑体量の増減との関係を考察した。その結果、葉緑体領域にプローブが結合するクリプト藻類の出現が現場海水において認められた。このクリプト藻類の細胞数と相関して、D.fortiiのフィコエリスリン含量が増減する傾向や、このクリプト藻類が高密度に出現した後に、D.fortiiの細胞数が増加する傾向が確認された。水系分析の結果、このクリプト藻類は津軽暖水と、それと沿岸表層水の混合水塊に出現することが明らかとなった。

本年度は三陸・越喜来湾においてD.fortiiの出現と、同クリプト藻の消長の関係を調べた。その結果、同クリプト藻はD.fortiiの出現の初期、2004年5月26日に大量出現し、それとともにD.fortiiの出現のピークが見られた。また、5月26日以降、D.fortiiの葉緑体含量の増加が見られた。このことからD.fortiiは同クリプト藻を取り込むことによって葉緑体を得、それとともに大量増殖していると思われた。D.fortiiは沖合水と沿岸水の混合水塊で増殖することがわかっているが、同クリプト藻の分布域は沿岸水側であることが水塊分析から判明した。なお、この様なクリプト藻は遺伝子解析の結果からTeleaulaxの一種であると思われ、通年の調査からごく限られた時期(5月もに)にしか出現しないことが判明した。このことから同クリプト藻のモニターによってD.fortiiの出現予知が可能であると思われた。これとは別に、同じく下痢性貝毒原因種のD.mitraの葉緑体の起源の解明も果たした。葉緑体遺伝子解析から、本種の場合その葉緑体はクリプト藻ではなく、ハプト藻に由来することが判明した。D.mitraの場合、葉緑体遺伝子の塩基配列には多様性が見られることから、複数種のハプト藻を取り込んでいることが示唆された。
脱分化軟骨細胞Lineage tracing法開発による軟骨細胞脱分化過程の解析

生体の軟骨組織から採取された軟骨細胞の初代単層培養を行うと線維芽細胞様の細胞が増殖することが知られている。この細胞は軟骨細胞が脱分化することで生じたものと考えられているが、実際その起源は明らかではなかった。我々はこの軟骨培養時に出現する線維芽細胞様細胞の起源を探求するために脱分化した軟骨細胞を可視化する新規のlineage tracing法を開発した。この手法を用いることで軟骨細胞の脱分化する過程を解析した。また脱分化には細胞増殖は必須ではないことを明らかにした。ES細胞やiPS細胞からの各種臓器細胞の分化誘導やダイレクトリプログラミングによる線維芽細胞からの分化など近年のtissue engineeringの技術の進歩は大きい。軟骨細胞においては変形性膝関節症や小耳症の分野で臨床応用が期待される。細胞数を増やすために初代軟骨細胞培養を行うと増殖の過程で脱分化を起こしてしまうことが知られており、本研究では軟骨細胞脱分化の過程をlineage tracingの手法を用いて観察し、脱分化のメカニズムの解析を行う。今まさに軟骨細胞である細胞がGFP陽性となるCol11a2-EGFPマウスと今まさに軟骨細胞である細胞とかつて軟骨細胞であった細胞がYFP陽性となるCol11a2-EYFP; Rosa-stop flox-EYFPマウスの2種類のマウスから採取した初代培養軟骨細胞の培養過程における蛍光性の差異から軟骨細胞から脱分化した細胞を割り出すことが可能となる。軟骨細胞ではその培養法や添加薬物により軟骨としての性質維持や脱分化が繊細に起こるため本年度の研究ではまず野生型マウスの関節から軟骨細胞を高純度で分離する手法を確立した。分離した軟骨細胞は初代培養を行い、1週間かけて細胞増殖するにつれて、細胞形態の変化を起こしていく培養条件の検討を行った。これによりCol11a2-EGFPマウスとCol11a2-EYFP; Rosa-stop flox-EYFPマウスの軟骨細胞を使用したtime-lapse撮影での蛍光性の変化を観察するための最適培養環境を決定した。今後は初代軟骨細胞培養過程における線維化マーカーや軟骨マーカーを追跡することで軟骨細胞脱分化のメカニズムの解析をreal time PCR、マイクロアレイを行って解明していく。ES細胞やiPS細胞からの各種臓器の細胞への分化誘導やダイレクトリプログラミングによる線維芽細胞からの分化など近年のtissue engineeringの技術進歩には目覚ましいものがある。軟骨細胞の再生医療では変形性膝関節症における膝関節軟骨の修復や小耳症における耳介軟骨のブロック作成での臨床応用が期待されている。また軟骨疾患の病態解明のツールとしても大いに注目を集めている。細胞数を増加させるために初代軟骨細胞培養を行うと増殖の過程で線維芽細胞様細胞に脱分化することが広く知られている。in Vivoにおいても軟骨変性疾患では軟骨細胞が軟骨としての形質を消失し、線維化する。本研究ではこのことに着目し、軟骨細胞線維化のプロセスを解明していくことを目的としている。そのための解析方法として、ある種の状態で蛍光性を持たせた軟骨細胞の状態を比較することで脱分化軟骨細胞を明瞭化させるための手法を開発する。今まさに軟骨細胞である細胞がGFP陽性となるCol11a2-EGFPマウスと今まさに軟骨細胞である、もしくはかつて軟骨細胞であった細胞がYFP陽性となるCol11a2-cre; Rosa-stop flox-EYFPマウスの2種類のマウスから採取した初代培養軟骨細胞の蛍光性の差異から脱分化した軟骨細胞を描出することが可能になる。軟骨細胞が脱分化していく過程をlineage tracingの手法を用いて経時的に観察し、脱分化のメカニズムの解析を行う。また軟骨細胞の脱分化を規定している因子についての探索を行う。昨年度に検討した野生型マウスの初代軟骨細胞培養で脱分化を観察するための培養条件(単層培養、培養液、播種細胞数、添加化合物)を用いて、Col11a2-EGFPマウスとCol11a2-cre; Rosa-stop flox-EYFPマウスの肋軟骨、大腿骨頭、膝関節の軟骨細胞の培養をおこなった。その培養過程をBioStation CTを用いて4時間毎に蛍光撮影することで培養軟骨細胞の脱分化の様子を捉えた。それに加えて軟骨細胞の単層培養時の培養初期と培養終期の細胞を回収しmRNAを抽出してreal time PCRを行い、軟骨マーカー、線維化マーカーについての検討を行い、蛍光性とRNA発現の相関性を明らかにした。近年のtissue engineering技術の進歩により、ES細胞やiPS細胞からの各種臓器細胞への分化誘導は目覚ましい進歩を続けている。また線維芽細胞をダイレクトリプログラミングにより幹細胞の形態を経ずにさまざまな細胞へと性質変化させる研究も数多く報告されている。軟骨細胞の再生医療分野においては変形性膝関節症での軟骨修復や小耳症での軟骨ブロックの作成において臨床応用が期待されている。軟骨細胞を臨床に用いるためにはたくさんの細胞数が必要になるが、分離した軟骨細胞を培養すると容易に脱分化をおこし、軟骨としての性質を失うことが知られている。また生体内でも軟骨組織は損傷をうけると特徴的な弾性を失い、線維化軟骨となる。本研究では軟骨細胞の脱分化過程を観察するためのツールとしてlineage tracingの手法に着目した。いままさに軟骨細胞である細胞がGFP陽性となるCol11a2-EGFPマウスと、いま軟骨細胞であるもしくはかつて軟骨細胞であった(脱分化し線維化を起こした)細胞がYFP陽性となるCol11a2-Cre; Rosa-stop flox-EYFPマウスを作成した。

それらから採取した軟骨細胞の初代培養を行い、タイムラプス撮影で観察し、その差異を抽出することで脱分化をおこした軟骨細胞を明らかにするシステムを開発した。軟骨細胞が脱分化する際に起こる形態の変化を解析し、脱分化を制御している遺伝子に関して探索を行いおよび軟骨細胞の脱分化抑制方法の可能性について検討した。生体の軟骨組織から採取された軟骨細胞の初代単層培養を行うと線維芽細胞様の細胞が増殖することが知られている。この細胞は軟骨細胞が脱分化することで生じたものと考えられているが、実際その起源は明らかではなかった。我々はこの軟骨培養時に出現する線維芽細胞様細胞の起源を探求するために脱分化した軟骨細胞を可視化する新規のlineage tracing法を開発した。この手法を用いることで軟骨細胞の脱分化する過程を解析した。また脱分化には細胞増殖は必須ではないことを明らかにした。また生後5日齢の野生型マウスの肋軟骨および大腿骨頭、膝関節軟骨から軟骨細胞を採取する方法を確立した。そこから単離した初代軟骨細胞の単層培養下での培養液、播種細胞数、添加薬剤の種類・濃度などの培養条件の検討を行った。time-lapse観察を行う上で軟骨細胞がconfluentにならずに細胞増殖していく期間を調整することとその間の細胞形態変化を捉えることができる条件を見出すことに当初の予定より日程を要した。上記で検討した初代軟骨細胞培養条件下でCol11a2-EGFPマウスおよびCol11a2-EYFP; Rosa-stop flox-EYFPマウスの大腿骨頭、膝関節軟骨から採取した軟骨細胞を用いて脱分化の過程が追跡できるかを検討しているところである。平成26年度、27年度の研究で得られたデータをもとに軟骨細胞の脱分化を制御している遺伝子をマイクロアレイを用いて、その候補を探し出す。適当な候補遺伝子が見つかれば培養軟骨細胞の系でその遺伝子の強制発現、強制抑制の実験を行い、軟骨細胞の形態にどのような変化がおきるかをBiostation CTを用いて経時的に観察することで、その軟骨脱分化制御の候補遺伝子の新規役割を明らかにしていく。ここまでの研究で得られた知見を検討し、国内外の学会に参加して発表を行っていく。まとめた内容を論文執筆し、その校正作業および学術誌への投稿を行っていく。軟骨細胞平成27年度および平成28年度の今研究の推進方策としては、まずCol11a2-EGFPマウスおよびCol11a2-EYFP; Rosa-stop flox-EYFPマウスの系統維持・繁殖を引き続き行う。Col11a2-EGFPマウスは今まさに軟骨細胞である細胞がGFP陽性に、Col11a2-EYFP; Rosa-stop flox-EYFPマウスは今まさに軟骨細胞である、もしくはかつて軟骨細胞であった細胞がYFP陽性になると考えられる。
真珠腫の光免疫学的研究-紫外線の真珠腫上皮に及ぼす影響-

真珠腫上皮は重層扁平上皮基底層の乳頭状の内築性増成とランゲルハンス細胞を含む免疫担当細胞の活性化および周辺の炎症性肉芽組織の増殖、また免疫組織、薬理学的には種々のサイトカインやプロスタグランヂンなどの活性物質が増加していることが報告されている。一方皮膚科領域で行われている光化学療法(PUVA療法)は、エトレチネート剤と紫外線照射により皮膚に存在する免疫担当細胞(ランゲルハンス細胞、リンパ球)や角化細胞、肥満細胞などがさまざま影響を受け局所免疫抑制が生じ、表皮細胞の増殖が抑えられる。今回はエトレチネート剤であるチガソン単独の効果を動物モデルを用いて行った。真珠腫実験モデルは、モルモットの中耳骨胞内に表皮を移植し、カラニゲンを局所に投与することで2週間で100%作成することができる。これに5mgのチガソンを注入し、1週後に観察すると4匹中2匹で真珠腫は消失し、2週後では全例で真珠腫は消失した。一方免疫組織学的にPCNA陽性細胞ならびにS-100蛋白陽性のランゲルハンス細胞の数は、コントロールに比較し実験群では明らかに減少していた。尚紫外線照射の群については現在観察中であるが、以上の結果よりPUVA療法に用いられるエトレチネート剤単独でも真珠種上皮の増殖抑制がみられることがわかった。
大腸がんにおける核内レセプターの機能解析と核内レセプターを標的とする治療法の開発

コレステロールは細胞膜の構成成分であり、胆汁酸やステロイドホルモンの原料として重要な化合物である。核内レセプターLXRは生体内のコレステロールバランスを調節する因子の一つとして知られている。LXRは肝臓、小腸やマクロファージにおいてオキシステロール受容体として、コレステロール代謝・排泄に関連する遺伝子発現を調節する。最近の研究により炎症・免疫反応に関連する遺伝子発現の調節を行うことも明らかになり、脂質代謝と様々な細胞機能を結びつける因子として注目されている。細胞膜構成成分であるコレステロールは、細胞増殖においても重要な化合物であり、コレステロール代謝と増殖シグナルとの何らかの相互作用が予測される。本研究では、LXRと細胞増殖シグナルとの関連性を明らかにするために、APC、p53やβ-cateninなどの遺伝子異常が明らかとなっている大腸がん細胞におけるLXRとこれらの細胞増殖シグナルとの相互作用を解析した。細胞トランスフェクションアッセイによりLXRがリガンド依存性にβ-cateninの活性を抑制することを見いだした。β-カテニン変異を有する大腸がん由来HCT116細胞の増殖はLXRアゴニストにより抑制された。HCT116細胞においてWntシグナル下流遺伝子であるc-myc, BMP4のmRNA発現がLXRアゴニストによって抑制された。LXRによるβ-catenin活性抑制作用はAF-2ドメイン依存性であるが、in vitroにおいてLXRとβ-cateninはリガンド非依存性に直接結合していた。LXRとβ-cateninとの相互作用については、他のコファクターなどとの相互作用を含めたコンフォメーションの変化が関与することが示唆された。本研究結果は、脂質代謝系と増殖シグナルとを関連づけるものとして重要であり、細胞のダイナミックな機能の解明へと発展できる。大腸がんの発がん過程で異常の起こりうる遺伝子変異のうち、APCとK-Rasの変異が重要であるといわれている。特にAPCの変異は、β-cateninの脱抑制によりWntシグナルの活性化を引き起こる。本年度は大腸がんの発がんとの関連が考えられる核内レセプターについて、Wntシグナルとの相互作用を解析した。β-catenin/TCFの応答配列をつなげたレポータープラスミドとβ-catenin、オキシステロール受容体であるLXRa又はβをヒト胎児腎臓由来の細胞株HEK293細胞にトランスフェクションした。その結果β-catenin/TCFの転写活性化はLXRリガンド依存的に抑制された。この抑制がβ-cateninとLXR間の相互作用によるものかを調べるために、mammalian two hybrid法を行った。その結果β-catenin全長とβ-catenin分子内の転写活性化領域であるC末端にLXRとの相互作用が確認された。またN末端にも弱くではあるが相互作用が見られた。現在、GST pull-down法または免疫沈降法によってin vitro及びin vivoにおける2つの分子の相互作用を解析中である。LXR、PXR、VDR、FXR、RARなどの脂質応答性核内レセプターや野生型または分解を受けない変異β-cateninの発現ベクターを、レトロウイルスを用いてラット腸管由来細胞株IEC-6に組み込み、各種核内レセプター安定発現細胞株を作成した。今後は、これらの細胞や大腸がん由来細胞株にリガンド(二次胆汁酸などのコレステロール代謝産物、合成化合物、各種抗癌剤)を処理することによる細胞の変化や応答性を解析し、核内レセプターの標的遺伝子(P450酵素系やABCトランスポーターなど、薬剤代謝関連遺伝子も含む)やがん関連遺伝子の発現変化をリアルタイムPCR法にて、細胞の増殖能を細胞計数分析装置にて、形態の変化を組織化学的方法にて検討する予定である。【目的】コレステロールは細胞膜の構成成分として重要な化合物である。生体内のコレステロールバランスを調節する因子の一つとして核内レセプターLXRが知られている。LXRはオキシステロール受容体として、コレステロール代謝に関連する遺伝子発現を調節するが、最近の研究により炎症・免疫反応に関連する遺伝子発現の調節を行うことも明らかになり、脂質代謝と様々な細胞機能を結びつける因子として注目されている。【結果】細胞トランスフェクションアッセイによりLXRαおよびLXRβがリガンド依存性にβ-cateninのTCF応答性レポーター活性化作用を抑制することを見いだした。β-カテニン変異を有する大腸がん由来HCT116細胞の増殖は、LXRアゴニストにより抑制された。HCT116細胞においてWntシグナル下流遺伝子のひとつであるc-myc, BMP4のmRNA発現がLXRアゴニストによって抑制された。【総括】LXRとβ-cateninとの相互作用については、他のコファクターなどとの相互作用を含めたコンフォメーションの変化が関与することが示唆された。

LXRは肝臓、小腸やマクロファージにおいてオキシステロール受容体として、コレステロール代謝・排泄に関連する遺伝子発現を調節する。最近の研究により炎症・免疫反応に関連する遺伝子発現の調節を行うことも明らかになり、脂質代謝と様々な細胞機能を結びつける因子として注目されている。細胞膜構成成分であるコレステロールは、細胞増殖においても重要な化合物であり、コレステロール代謝と増殖シグナルとの何らかの相互作用が予測される。本研究では、LXRと細胞増殖シグナルとの関連性を明らかにするために、APC、p53やβ-cateninなどの遺伝子異常が明らかとなっている大腸がん細胞におけるLXRとこれらの細胞増殖シグナルとの相互作用を解析した。細胞トランスフェクションアッセイによりLXRがリガンド依存性にβ-cateninの活性を抑制することを見いだした。β-カテニン変異を有する大腸がん由来HCT116細胞の増殖はLXRアゴニストにより抑制された。HCT116細胞においてWntシグナル下流遺伝子であるc-myc, BMP4のmRNA発現がLXRアゴニストによって抑制された。LXRによるβ-catenin活性抑制作用はAF-2ドメイン依存性であるが、in vitroにおいてLXRとβ-cateninはリガンド非依存性に直接結合していた。LXRとβ-cateninとの相互作用については、他のコファクターなどとの相互作用を含めたコンフォメーションの変化が関与することが示唆された。本研究結果は、脂質代謝系と増殖シグナルとを関連づけるものとして重要であり、細胞のダイナミックな機能の解明へと発展できる。
テキストの結束関係と語彙概念拡張

因果関係を表す副詞句のbecause ofに関して、because X型の表現(ofが脱落し、後続要素が名詞句に限らず他の品詞要素も認める)が近年ブログなどで広がってきている。これと類似の状況が、in case ofにも認められ始めているのではないかというパイロットスタディーの結果を検証することをこの年度では行った。GloWbEやNOWといったブログやネットニュースなどの表現を集めたコーパスを利用することで、in caseが直接名詞や動詞、形容詞、副詞類などを後続させている用例を確認していった。結果として、名詞類(動名詞を含む)で50件以上、動詞(分詞形を含む)と副詞(yes/no/notなどの極性表現を含む)ではそれぞれ20件以上、形容詞で10件以上の用例がこれらのコーパス内に存在することがわかった。まだまだ数として多いとは決して言えないものの、becauseに類似する状況はこの表現に関しても認められ始めていると考えられる。これに対して、他の因果関係の副詞句(as a result of, in spite of, on account of, by virtue of, owing to)には、このような状況は認められにくいようである。いずれの表現に関しても、前置詞が脱落するという現象はブログなどで生じているものの、後続する要素は名詞類に基本的に限られていて、他の品詞の要素が補部として後続するという形はほとんど認められない。(ブログなどの表現を調査対象としているので、打ち間違いや文法的に明らかに間違えている表現なども散見されるため、全く該当例がない、というわけではないが、他品詞が後続しているような用例に関しては、周囲の表現にも不自然なところが多い。周りの表現がほとんど問題なく、唯一問題なのが補部要素の品詞選択であるような用例はほぼ見当たらなかった。)使用したコーパスに関しては、少なくとも当初想定していた検証結果が概ね認められたと思われる。もちろん使用したコーパスは2つのみであり、今後も調査を継続していく必要があるが、ある程度の大規模コーパスでなければ調査は進められないので、検証にはかなりの時間と労力を必要とすることも事実である。昨年は前期にサバティカルを認められたこともあり、調査に集中することが可能であったため、かなりの調査結果を得ることができたが、今後は調査のペースが落ちていくことになるため、調査結果を得ていくために必要となる時間はこれまでよりも長くなることが予想される。今後、さらに他のネット英語表現を集積したiWebコーパスなどの調査や、他言語での調査を計画しており、日本語における状況なども考察対象としていく予定である。可能であればフランス語などでも同様の状況が認められるのか、といったことも調査していきたいと考えている。その上で、結果をまとめて論文投稿することを目標としていることには変わりはない。

ほぼ当初予定していた形での執行になったので、端数が残金として残ったものである。今年も旅費や論文執筆の校正代金、図書購入費その他に支出を行うことになると考えられる。ただし、国際学会での研究発表については日本国内で開催される国際学会で採択されたために、当初ほど旅費に多くの経費が必要とされることはなくなった。このため、多言語に関する調査のために事前に必要となる書籍類などの購入に当初の予定よりは多くの支出を行うことになると思われる。
くも膜下出血後白質障害の機序の解明

本研究は、くも膜下出血後早期脳損傷における白質障害の機序とその保護機構を解明することが目的であり、特にグルタミン酸、アデノシン三リン酸および酸化ストレスの関与に注目して検討を行っている。くも膜下出血モデルは、雄性SDラット(8-12週齢)およびC57Bl/6マウス(10-12週齢)を用い、フローセン麻酔下に頚部右内頚動脈から挿入した5-0ナイロン糸で前大脳動脈を穿刺し、作成した。出血後24時間に4%パラホルムアルデヒドで灌流固定を行い、脳を摘出した。脳底部の出血状況は4段階で判定した。ビブラトームで30マイクロメートルの薄切切片を作成した。白質障害の組織学的評価は、ルクソールファーストブルー染色、および抗SMI-32抗体(軸索損傷)や抗degraded myelin basic protein抗体(ミエリン変性)を用いた免疫染色で行った。本年度は、ハイドロエチジン法を用いて、主に酸化ストレスマーカーとの関係を検討した。くも膜下出血後24時間では、脳梁などの白質にsuper oxideのマーカーであるエチジウムシグナルを認め、軸索損傷やミエリン変性などの白質障害との関与が示唆された。くも膜下出血白質障害モデルでのグルタミン酸受容体やアデノシン三リン酸受容体の役割の解明が遅れているため。ラットくも膜下出血モデルを用い、白質障害におけるグルタミン酸受容体やアデノシン三リン酸受容体の発現を解析する。また、これらの阻害が白質障害に及ぼす効果も検討する。破裂脳動脈瘤によるくも膜下出血は極めて重篤な疾患であり、早期脳損傷は、その予後に関与する最大の因子である。一方、大脳白質は哺乳類の脳の過半を占め、この障害は急性期脳虚血をはじめ多くの疾患で重要な役割を果たす。近年になり、くも膜下出血早期脳損傷においても白質障害が重要な役割を果たすことが示唆されてきている。本研究の目的は、本病態の機序とその保護機構を解明することであり、特に虚血性白質障害で重要な因子であるグルタミン酸、アデノシン三リン酸および酸化ストレスに注目して検討する。くも膜下出血モデルは、雄性SDラット(8-12週齢)またはC57Bl/6マウス(10-12週齢)を用い、フローセン麻酔下に頚部右内頚動脈から挿入した5-0ナイロン糸で前大脳動脈を穿刺し、作成する。白質障害の組織学的評価は、ルクソールファーストブルー染色や、抗SMI-32抗体(軸索損傷)および抗degraded myelin basic protein抗体(ミエリン変性)を用いた免疫染色で行う。本年度は、これら組織学的評価を行い、くも膜下出血後24時間の時点で脳梁などの白質に軸索損傷やミエリン変性などの組織学的変化がみられることを確認した。くも膜下出血白質障害モデルでの機序の解明の解析が遅れているため。くも膜下出血白質障害モデルでの機序の解明の解析がやや遅れ、本年度の試薬に使用する使用額を次年度に持ち越したため。本年度は既存の試薬等での実験が可能であった。次年度の研究では新規の試薬や抗体を要する予定であり、これに助成金を使用する予定である。