hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
機能性バイオ融合ナノ粒子の創製とその医療への応用

以下の項目について検討した。【二酸化チタンナノ粒子の創製】表面にポリアクリル酸によりカルボキシル基を修飾し,分散性に優れかつ生体分子配向に適した機能性二酸化チタンナノ粒子(50nm80nm)を作製した。【生体物質の二酸化チタンナノ粒子への配向】ナノ粒子表面にはポリアクリル酸によりカルボキシル基が配向されていることより,N-ヒドロキシスクシンイミド活性化エステル法により緑色蛍光タンパク質(GFP)を容易に修飾できることを確認できた。従ってがん細胞を特異認識する抗体なども二酸化チタンナノ粒子表面に容易に固定化可能となった。【がん細胞への高効率取込み機能の付与】二酸化チタンナノ粒子を内包した膜融合性リポソームを作製した。リポソームはエンドサイトーシスによって細胞内に取り込まれ多くはリソソームで分解される。これを回避するため,センダイウイルス(hemaggutinating virus of Japan ; HVJ)の膜融合能を付与した二酸化チタンナノ粒子を内包したリポソームを作製した。HVJは紫外線照射によりウイルス自身の遺伝子(RNA)を完全に断片化しているため感染の心配はなく,またHVJはヒトに対して病原性を有していないため危険性はない。FITCで蛍光標識したポリスチレン粒子(200nm)を前述の方法でHVJ膜融合リポソームに封入し,細胞内へのナノ粒子導入について検討した。蛍光ビーズ内包リポソームをマウスリンパ腫由来細胞L1210に作用させ,蛍光ビーズ取り込み細胞を共焦点レーザースキャン顕微鏡にて観察した。さらにHVJ膜融合リポソームと未修飾リポソームの細胞との親和性に関してフローサイトメトリー法を用いて調べた。以上の実験結果から,膜融合リポソームを用いることにより内包したナノ粒子を効率よく細胞内に導入できることが示された。【磁性二酸化チタンナノ粒子の創製】Fe_3O_4を核とし,その周囲を二酸化チタンで被覆した磁性二酸化チタン粒子の作製をナノスケールサイズで行った。ゾル・ゲル法にて作製し,透過型電子顕微鏡にて合成ナノ粒子の表面構造の確認を行った。また二酸化チタン表面への生体分子の配向を考慮して,表面にポリアクリル酸によりカルボキシル基を修飾し,分散性に優れかつ生体分子配向に適した機能性二酸化チタンナノ粒子を作製することができた。【生体物質の磁性酸化チタンナノ粒子への配向】ポリアクリル酸によりカルボキシル基を配向した微粒子表面に,N-ヒドロキシスクシンイミド活性化エステル法により,がん細胞を特異的に認識するタンパク質の固定化を検討した。固定化の成否を緑色蛍光を発するGFPの固定化によっても確認した。【がん細胞への高効率取込み機能の付与】二酸化チタンナノ粒子を内包するリポソームを作製した。この表面に紫外線によって不活性化したセンダイウイルス膜融合タンパク質を融合することにより,二酸化チタンナノ粒子が短時間でがん細胞内に集積可能となった。さらに二酸化チタンへの超音波照射によってOHラジカルが生成することにより,対照と比較して有意に短時間で細胞死をひき起こすことを確認した。これと並行して,がん細胞に高親和性を有する内因性の化学物質である5-アミノルブリン酸(5-ALA)の固定化も検討した。5-ALAはがん細胞に取り込まれるとプロトポルフィリンIX(PpIX)に生合成され,がん細胞内に高濃度で蓄積する特性を有している。PpIXは波長405nmの励起光を照射すると630nmの赤色蛍光を発することから有力ながん診断法として利用可能である。またPpIXに超音波を照射するとOHラジカルを生成することから細胞の壊死を誘導する事も可能である。
加齢が術後認知機能に与える経時的変化の解明とその予防についての研究

術後認知機能障害は高齢者に多く、社会的問題であるが、その機序、脳内の病理的変化、機能的変化についてはいまだ不明な点が多い。手術中の血圧低下はその誘因の一つと考えられている。しかし、単なる相対的虚血以外に、手術そのものによって生じる全身性の炎症反応が、脳内の海馬に持続性神経炎症を引き起こす事もその一因であると推測されている。また、この炎症反応は加齢に伴い増強すると考えられている。本研究の目的の第一段階は、加齢が術後認知機能障害に与える影響を、腹部手術後に生じる海馬の炎症反応、形態学的変化、機能的変化について、経時的に観察することである。目的の第二段階は脳の炎症反応を抑制し、神経保護作用があるといわれているフラボノイドの一種であるルテオリンを術前から投与することで、これらの反応が抑制可能かどうか、術後認知機能障害の予防効果の有無について確認することである。ルテオリンは一般的な食物の中に含まれており、血液脳関門を通過することで、脳内での抗炎症作用を有すると考えられている。初年度、次年度にわたり、腹部施術の施行に関して、目的に適した安定した実施を行うことが可能となった。しかし高齢マウスの育成、行動学的評価方法の施行に難渋した。本年度はマウスの育成に関する問題を軽減するため、高齢マウスの対象週齢を64週から32週に変更し実験を継続した。しかし、行動学的評価を安定して施行するに至っていない。脳内の炎症反応の評価についても現在続行中である。高齢マウスの対象週齢を64から32週に変更することで、育成の問題は軽減した。しかし、行動機能評価に難渋し、安定した結果を得るには至らなかった。行動学的機能評価について、再度実験条件を検討し、評価方法の安定化を目指す。本研究の目的の第一段階は、加齢が術後認知機能障害に与える影響を、腹部手術後に生じる海馬の炎症反応、形態学変化、機能的変化について経時的に観察することである。目的の第二段階は、脳の炎症反応を抑制し、神経保護作用があるといわれているフラボノイドの一種であるルテオリンを術前から予防投与することで、これらの変化が抑制可能か、術後認知機能障害の予防効果の有無について確認することである。本年度は腹部の手術によって引き起こされる脳の機能的、器質的変化を若齢(32週)と高齢(64週)のマウスを対象として観察する事が目的であった。まず実験系を確立するため、熟練が必要と考えられる手技に関して練習を行った。特に脳の機能評価として行動学的検査のうち、受動的回避試験と新奇物質検索試験の施行は、場所や時間が限定される検査である。本年度は耐震工事に伴う実験室の移転があったため、行動学的検査は移転後に開始しなければならず、時間を費やした。また模擬手術侵襲としての腹部手術の施行には安定した手技の習得が要求されるため、予想外に時間を費やした。また、高齢群として必要なマウスをすべて購入した場合、予想以上に高額となることが判明した。そのため若齢マウスを自家で育成する方針としたため、本実験(若齢と高齢マウスの比較実験)は施行することが出来なかった。29年度には育成したマウスが使用可能となるので、順次本実験を進めていく予定である。耐震工事による実験室の移転があったため、安定した実験条件が確保できず、一部移転終了まで延期した計画があった。また、高齢群として、週齢64週のマウスを使用する計画である。実験に必要なマウスをすべて購入した場合、予想以上に高額となることが判明した。若齢マウスを自家で育成する方針としたため予定より遅れている。術後認知機能障害は高齢者に多く、その機序、脳内の病理的変化、機能的変化について、未だ不明な点が多い。手術によって生じる全身性の炎症反応が、特に海馬に続発性神経炎症を生じさせることが、その一因であると推測されている。また、この反応は加齢に伴い増強する。目的の第二段階は、脳の炎症反応を抑制し、神経保護作用があるといわれているフラボノイドの一種であるルテオリンを術前から投与することで、これらの変化が抑制可能か、術後認知機能障害の予防効果の有無について確認することである。初年度は実験系の確立を行った。脳の機能評価として、行動学的検査のうち受動的回避試験と新規物質検索試験についての練習したが、安定した評価を行うには不十分であった。また、模擬手術侵襲としての腹部手術の施行について練習を行った。また、老齢(64週)マウスを安定して確保するため、マウスを自家で育成する方針とした。このため、育成時間を費やした。本年度は老齢マウスを育成が完了した段階で本実験を行う予定であった。育成期間中に機能評価について、再度練習を行い、安定した評価が行えるよう工夫した。しかし研究代表者の一身上の都合で実験予定が大幅に遅れ、実験対象時期を迎えたマウスに対し実験を行うことができなかった。老齢マウスを育成しつつ実験系を確立するという当初の予定はマウスの成熟と実験者の個人的な都合が合わず本年度は断念せざる負えなかった。

術後認知機能障害は高齢者に多く、社会的問題であるが、その機序、脳内の病理的変化、機能的変化についてはいまだ不明な点が多い。手術中の血圧低下はその誘因の一つと考えられている。しかし、単なる相対的虚血以外に、手術そのものによって生じる全身性の炎症反応が、脳内の海馬に持続性神経炎症を引き起こす事もその一因であると推測されている。また、この炎症反応は加齢に伴い増強すると考えられている。本研究の目的の第一段階は、加齢が術後認知機能障害に与える影響を、腹部手術後に生じる海馬の炎症反応、形態学的変化、機能的変化について、経時的に観察することである。目的の第二段階は脳の炎症反応を抑制し、神経保護作用があるといわれているフラボノイドの一種であるルテオリンを術前から投与することで、これらの反応が抑制可能かどうか、術後認知機能障害の予防効果の有無について確認することである。ルテオリンは一般的な食物の中に含まれており、血液脳関門を通過することで、脳内での抗炎症作用を有すると考えられている。初年度、次年度にわたり、腹部施術の施行に関して、目的に適した安定した実施を行うことが可能となった。しかし高齢マウスの育成、行動学的評価方法の施行に難渋した。本年度はマウスの育成に関する問題を軽減するため、高齢マウスの対象週齢を64週から32週に変更し実験を継続した。しかし、行動学的評価を安定して施行するに至っていない。脳内の炎症反応の評価についても現在続行中である。高齢マウスの対象週齢を64から32週に変更することで、育成の問題は軽減した。しかし、行動機能評価に難渋し、安定した結果を得るには至らなかった。実験室の移転も終了し、今年度には高齢マウスを使用可能になるため、予定の実験を施行する。老齢マウス(64週)に関しては、育成に費用、時間がかかりすぎ、実験の遂行が困難と判断した。今後は32週のマウスと若齢マウスの比較を行うこととした。高齢マウス(64週)についてはその後検討できれば追加実験を行うこととする。行動学的機能評価について、再度実験条件を検討し、評価方法の安定化を目指す。マウスの育成に時間を費やしたので、28年度は実験系の準備、マウスの育成を行い、本実験に着手出来なかった老齢マウスの育成、行動評価の準備について時間を費やした。また研究実施者の一身上の都合で予定通りの実験が施行できなかった。今後は32週のマウスと若齢マウスの比較を行うこととし、実験時期を調整するため、マウスの育成期間を短縮する方法を検討する。実験の進行が遅れたため、結果として使用額も少額となった。研究期間の延長に伴い、実験の継続のために次年度使用額を使用する予定である。29年度は高齢マウスの準備が整うので、予定より実験回数、実験動物数を増やすなどして使用する予定である。
高温用広帯域超音波発振器の開発

静磁界と交流磁場との斥力および引力を利用した新規な広帯域超音波スピーカーを試作し、基本動作を確認し、装置構造や電源条件が発振超音波の音圧に及ぼす影響に関して検討した。実験では、発信機の正弦波信号をアンプにより増幅させた後、40W80W程度の電力で電磁石に印加した。電磁石の鉄心の一方の極を、正方形の鉄板(一辺の長さ7mm)の中央に固定したネオジウム希土類磁石(端面の中心磁束0.4T)と対抗させた。静磁石による静磁場とコイルより発生する交流磁場との吸引および反抗磁場で鉄板を振動させた。超音波の周波数と音圧分布は、超音波メーターまたは超音波マイクロフォンを用いて計測した。FFTによる波形解析の結果、気相内または液相内に印加した周波数と同一の周波数を持つ音波が観測され、本法により任意の周波数の超音波が発信可能であることが判明した。また、発信音圧に及ぼすコイル電流の周波数、電流値、振動板の板厚、ポール-磁石間距離等の効果を検討した。さらに、増幅器付の高周波発信器から発生した交番磁場で電磁振動板を直接に加振し、それに接した溶湯内に超音波を伝播させる方法についても検討した。発信コイルから一定距離の位置に設置した矩形鉄板の空気中での加熱速度をサーモビュアーで測定し、電磁振動板周りの磁場分布、発熱速度と密接な関連をもつ加振強度を考察した。水冷した容器内の鉄板の電磁振動によって、水中に20kPa程度の強力超音波が発信されること等を確認した。実用化に際しては、電磁振動板の冷却システムの検討も重要であり、現在、それを含めた超音波発信システムおよび構成材料の選定を検討している。さらに、超音波の放射圧を利用した泡沫抑制または分散相の分離プロセスや、キャビテーション作用を利用した2液相のエマルション化や脱ガスプロセス等、革新的超音波プロセシングの操作設計についても検討した。1)本研究で開発を目指す超音波発振器回路の基本設計を行った。原理は、現有の発振器(DC1MHz)、および、本年度に特注した広帯域電力増幅器(1Hz220kHz)から出力した正弦波信号をその電力増幅器で増幅させた後、電磁石に印加し、電磁石の鉄心の一方の極を、強磁性体薄板(鉄板等)に固定した円板状のネオジウム希土類磁石(端面の中心磁束0.4T)と対向させ、交互の吸引及び反抗磁場で薄板を振動させて任意の周波数(<1MHz)の音波を発信させるものである。原理の確認実験とあわせて、LCZメータを用いて、交流磁場発生用コイルを含む電気回路のインダクタンス(L)、キャパシタンス(C)、インピーダンス(Z)を測定し、回路の共振周波数を調査した。2)この超音波スピーカーを高温系に適用する場合には、磁石及び薄板の表面を冷却して、キューリー点(鉄の場合は770°C)の温度以下に保持する必要がある。積層型発振体の冷却系の伝熱計算を行ない、また、現有の熱画像解析装置を用いて電磁振動鉄板の発熱速度及びその分布を調査し、適正な冷却条件について検討した。3)機械振動で発生させた超音波を振動板上方に設置した容器内の液体または気体媒質に照射する実験を行ない、音波の周波数、音圧及び音圧分布を、液相に関しては超音波メーター、気相に関しては超音波センサーユニットによって測定した。発振超音波を構成する周波数成分を購入したスペクトラムアナライザーを用いて調査し、電気振動と機械的振動との関係を調査した。

電気回路で強制的に電磁振動させた周波数の超音波の発振を確認し、音波強度に及ぼす電源電力、振動数、振動板板圧、電磁石と振動板距離等の効果を調査した。4)発振された超音波音場の理論設計法、および、超音波を利用した各種の溶湯超音波プロセシングの可能性についても低温モデル実験によって検討した。静磁界と交流磁場との斥力および引力を利用した新規な広帯域超音波スピーカーを試作し、基本動作を確認し、装置構造や電源条件が発振超音波の音圧に及ぼす影響に関して検討した。実験では、発信機の正弦波信号をアンプにより増幅させた後、40W80W程度の電力で電磁石に印加した。電磁石の鉄心の一方の極を、正方形の鉄板(一辺の長さ7mm)の中央に固定したネオジウム希土類磁石(端面の中心磁束0.4T)と対抗させた。静磁石による静磁場とコイルより発生する交流磁場との吸引および反抗磁場で鉄板を振動させた。超音波の周波数と音圧分布は、超音波メーターまたは超音波マイクロフォンを用いて計測した。FFTによる波形解析の結果、気相内または液相内に印加した周波数と同一の周波数を持つ音波が観測され、本法により任意の周波数の超音波が発信可能であることが判明した。また、発信音圧に及ぼすコイル電流の周波数、電流値、振動板の板厚、ポール-磁石間距離等の効果を検討した。さらに、増幅器付の高周波発信器から発生した交番磁場で電磁振動板を直接に加振し、それに接した溶湯内に超音波を伝播させる方法についても検討した。発信コイルから一定距離の位置に設置した矩形鉄板の空気中での加熱速度をサーモビュアーで測定し、電磁振動板周りの磁場分布、発熱速度と密接な関連をもつ加振強度を考察した。水冷した容器内の鉄板の電磁振動によって、水中に20kPa程度の強力超音波が発信されること等を確認した。実用化に際しては、電磁振動板の冷却システムの検討も重要であり、現在、それを含めた超音波発信システムおよび構成材料の選定を検討している。さらに、超音波の放射圧を利用した泡沫抑制または分散相の分離プロセスや、キャビテーション作用を利用した2液相のエマルション化や脱ガスプロセス等、革新的超音波プロセシングの操作設計についても検討した。
新規生理活性ペプチド、アペリンの脳における生理的役割について

我々は、脳におけるアペリンの生理的役割を検討するため、脳内投与によるアペリン12およびアペリン13の作用を測定した。アペリンの摂食行動に対する作用の検討には、脳室内にガイドステンレスチューブを挿入固定した雄性ラットを用い、自由運動下のもとでアペリンを投与し、摂食量を測定した。このモデルを用いてアペリン13を投与したところ、摂食促進効果が見られた。そこで、アペリン13をマウス腹腔内に投与し、その摂食行動を検討した結果、やはり摂食量を増加させる傾向が見られた。一方、循環呼吸中枢に密接な関連をもつ延髄腹外側領域におけるアペリンの作用をラットで測定したところ、アペリン12の投与により血圧上昇および心拍数の増加が見いだされた。これは、アペリン12が循環中枢ニューロンを刺激し、昇圧、頻脈応答を誘発したものと考えられた。アペリン抗体による免疫染色では、延髄腹側表面に顕著なアペリン染色が観察されたが、近傍のニューロンにはアペリン染色細胞があまり見当たらなかった。一方、アペリンは多くの臓器の血管内皮に局在し、ラットでは末梢投与により血圧を降下させる。我々は、このアペリンの血圧降下作用が一酸化窒素(NO)合成阻害剤の存在下でほぼ完全に阻害され、また、アペリン投与により血中NOx濃度が上昇することを見いだし、アペリンがNOを介してその作用を現す可能性を示唆した。NOは中枢神経系にも存在しているので、アペリンの神経性血圧調節作用に関与している可能性が指摘される。本研究の結果から、食欲中枢および循環中枢などに対するアペリンおよびAPJレセプターの関与が示唆された。本研究では、アペリンの組織における局在をラジオイムノアッセイ法、免疫組織化学的手法などを用いて検討し、また、アペリンの生理作用および薬理学的作用について研究した。アペリンに対するウサギ抗血清は、[Cys^0]-apelin-17をヘモシアニンに結合させた抗原を用いて作製した。ラジオイムノアッセイ(RIA)の標識ペプチドとして、[Tyr^0]-apelin-13をパーオキシダーゼ法で標識しHPLC法で精製したペプチドを用い、スタンダードにはapelin-13を用いた。RIAを用いてウシ各種組織におけるアペリンの含有量を測定した結果、アペリンは、脳のみならず肝臓、脾臓、膵臓、乳腺、肺、腎臓、脊髄、胃、腸、心臓などの広範囲な組織に分布していることが判明した。ラット脳における免疫染色実験でも、アペリンが広範囲な脳組織に分布していることが示された。また、脳内投与によるアペリンの摂食に及ぼす作用をラットを用いて検討したところ、アペリン投与によってラットの摂食量が増加する傾向にあることが示された。また我々は、アペリンがAPJ受容体の内因性リガンドであり、APJ受容体がエイズ感染におけるコレセプターの一つであることから、アペリンの抗エイズウィルス作用について検討した。その結果、アペリンがCD4とAPJを発現させたヒト脳由来神経膠腫細胞に対するエイズウィルスの感染を阻止することを見いだした。エイズウィルス感染阻止作用は、アペリン36が最も強く、アペリン12より低濃度で感染を阻止した。APJ受容体は脳に広く分布していることから、エイズ痴呆症などのような中枢系のエイズ感染におけるアペリン/APJ受容体系の関与が指摘された。
重金属汚染土壌の生物浄化

本研究対象地のズリ鉱堆積場では高濃度かつ可溶性のCuが植物の活着を抑制していると考えられる。この土壌に腐葉土を混合しCuを有機態にして安定化させたり、土壌のpHを上昇させてCuを沈殿させたりすることで、Cu毒性を緩和し、植物の生育を促進できるのではないかと考えた。今年度はスギ苗木を供試植物として用い、これを確かめた。まず、根箱を用いたポット実験では、現場で採取したズリ鉱を乳鉢で粉砕し粉末にしたものに腐葉土、赤玉土、砂とCaCO_3を改良資材として施用した。その結果、どの改良資材によってもズリ鉱のみの区に比べて土壌試料中の水溶性Cu濃度を低下させることができた。スギ苗木中のCu濃度は、砂混合区ではズリ鉱のみの区より増加したが、他の処理区では減少した。また、生育状態は、ズリ鉱のみの区とCaCO_3区では悪かったが、他の処理区では大幅な改善が見られた。CaCO_3区では水溶性Cu濃度はほとんど検出されないレベルであり、またスギ苗木中のCu濃度も低いのに対し、生育状態が悪かったことは、Cu以外が生育阻害要因であることを示唆している。本研究ではズリ鉱のみの区として、粉末状のズリ鉱を用いたが、このため土壌孔隙に乏しくなった。本研究における主な生育阻害要因はこのような土壌の物理性に由来すると考えられる。すなはち、腐葉土、赤玉土や砂によって土壌孔隙が増加し、スギ苗木の生育も改善されたが、CaCO_3区では物理性が改善されなかったため、生育が悪かったと考えられる。また、砂区ではスギ苗木中のCu濃度が高かったが、これはこの処理区では根のはたらきが活発になり、可溶性でないCuを積極的に吸収したためと考えられる。可能性のひとつとして、低分子の根分泌物が増加し、これが固相のCuを可溶化したことが考えられた。このことから植物のCu吸収において、土壌中の可溶性のCuだけでなく、植物の機能も大きく関与している可能性が示唆された。・森林土壌の溶存有機物によるCuのキレート形成が、Cu(10ppm水溶液)の植物に対する毒性、移動性、bioavailabilityを変化させるかどうかをレタスの発芽実験で調べた(現在も続行中)。また、EDTAや低分子有機酸などによる同様の効果についても調べた。この結果、森林土壌B層抽出液(TOC20ppm)ではCu弱毒化効果はほとんどみられなかったが、A層土壌抽出液(TOC200ppm)では根の褐色化や、葉の褐色斑点を減少させる効果が確認された。Cu水溶液のみを与えた時に比べ、A層土壊抽出液を加えた時は、レタス発芽種子中のCu含有量が地上部、根部ともに半分以下に抑えられていたことから、種子外でCuが土壌抽出液中の(高分子有機酸と推測される)成分とキレート形成し、種子体内中に吸収されにくい形態になったと考えられる。有機酸を調製してCn水溶液に加えた実験では、クエン酸やリンゴ酸、シュウ酸によるCu吸収抑制や弱毒化効果はほとんどみられなかった。むしろこれらの低分子有機酸は高濃度になると低濃度の時よりレタス種子の成長を抑制した。EDTAを加えるとCuはほとんど吸収されなかったが、EDTAによる成長阻害がみられた。Cu水溶液に腐植酸(市販)を加えた場合、Cuの弱毒化効果が最も良好であった(Cu濃度は未分析)。夏に学会発表、論文投稿予定。・東大樹芸研究所内の銅ズリ鉱堆積場におけるCuの存在状態を分析し、同研究所の研究発表会で発表した。土壌中に高濃度のCuが存在する場所があったが、水系への流出はみられず、現在深刻な問題はないと思われる。1.水溶性有機物が水溶液中に共存することで水溶性重金属の毒性や可給性に影響がみられるかをレタス種子の発芽実験で明らかにした。最終濃度10ppmのCuに水溶性有機物としてクエン酸、リンゴ酸、シュウ酸の低分子有機酸、EDTA、DTPAのキレート剤、市販の腐植酸、森林土壌A、B層からの抽出水の計8種を3段階の濃度に調製して混合した。これら水溶液をろ紙を敷いたシャーレに5ml与え、レタス種子を10粒ずつまき人工気象室に設置し1週間後回収、発芽した種子の根長測定を行った後、葉と根に切断し80°Cで48時間乾燥後硝酸分解し、各部位のCu濃度をICP-AESで測定した。結果、低分子有機酸はCuによる根の褐色化をCuだけのときよりさらに激化、根の伸長を抑制し、根へのCu吸収量を増加させた。また、低分子有機酸の混合濃度が高いほど褐色化の程度やCu吸収量が高まることが明らかとなった。EDTAなどキレート剤は低濃度のときは根の褐色化もCu吸収も防ぎ、根の伸長も改善されるなどキレート形成によると思われる毒性緩和効果が見られたが、高濃度になるとキレート剤固有の毒性が現れた。腐植酸も褐色化を防ぎ、根の伸長も改善させ、またCu吸収も減少させた。森林土壌抽出水の効果は他の物質のように明らかではなかったがCu毒性緩和の傾向が見られた。

2.東大附属演習林樹芸研究所内の銅ズリ鉱堆積場で採取したズリ鉱と森林土壌A、B層を混合した試料、または硫酸酸性であるズリ鉱をCaCO_3、NaOHでpH6.4に中和した試料を用意し、これらをシャーレに詰め、上記同様にレタスの発芽実験を行った。また土壌試料の溶出実験を行い、レタスが吸収する可能性のあるCuの量を測定した。結果、森林土壌を混合したものはズリ鉱に対する混合割合が高いほど、レタスの根の褐色化緩和、根の伸長改善が見られた。また、A層の方がより高いズリ鉱由来毒性の緩和効果が見られた。土壌試料の溶出実験の結果から、これら土壌との混合によるズリ鉱の希釈だけではなく、有機物などCuと親和性の高い吸着サイトへの結合によりCuが試料中で安定な形態なっているため土壌水中に溶出するCuが顕著に減少していることが明らかになった。中和試料では、両試料からのcu溶出量はほとんど変わらないのに、レタスの根の褐色化や根長には明らかな違いが見られた。CaCO_3施用区ではズリ鉱由来の毒性がほとんど相殺されたのに対し、NaOH施用区ではズリ鉱のみでレタス種子を発芽させた場合よりわずかに根が伸長しただけであった。この違いはCaによるCuとの競合によりCaCO_3施用区でCu吸収が阻害されたか、NaOH施用区ではNaOHにより試料中のSiO_2などの構造が破壊され、Alなどの元素が多量に溶出したためではないかと考えられる。回収したレタス発芽種子中のCu含有量を分析し、さらにCuの挙動を明らかにする予定である。本研究対象地のズリ鉱堆積場では高濃度かつ可溶性のCuが植物の活着を抑制していると考えられる。この土壌に腐葉土を混合しCuを有機態にして安定化させたり、土壌のpHを上昇させてCuを沈殿させたりすることで、Cu毒性を緩和し、植物の生育を促進できるのではないかと考えた。今年度はスギ苗木を供試植物として用い、これを確かめた。まず、根箱を用いたポット実験では、現場で採取したズリ鉱を乳鉢で粉砕し粉末にしたものに腐葉土、赤玉土、砂とCaCO_3を改良資材として施用した。その結果、どの改良資材によってもズリ鉱のみの区に比べて土壌試料中の水溶性Cu濃度を低下させることができた。スギ苗木中のCu濃度は、砂混合区ではズリ鉱のみの区より増加したが、他の処理区では減少した。また、生育状態は、ズリ鉱のみの区とCaCO_3区では悪かったが、他の処理区では大幅な改善が見られた。CaCO_3区では水溶性Cu濃度はほとんど検出されないレベルであり、またスギ苗木中のCu濃度も低いのに対し、生育状態が悪かったことは、Cu以外が生育阻害要因であることを示唆している。本研究ではズリ鉱のみの区として、粉末状のズリ鉱を用いたが、このため土壌孔隙に乏しくなった。本研究における主な生育阻害要因はこのような土壌の物理性に由来すると考えられる。すなはち、腐葉土、赤玉土や砂によって土壌孔隙が増加し、スギ苗木の生育も改善されたが、CaCO_3区では物理性が改善されなかったため、生育が悪かったと考えられる。また、砂区ではスギ苗木中のCu濃度が高かったが、これはこの処理区では根のはたらきが活発になり、可溶性でないCuを積極的に吸収したためと考えられる。可能性のひとつとして、低分子の根分泌物が増加し、これが固相のCuを可溶化したことが考えられた。このことから植物のCu吸収において、土壌中の可溶性のCuだけでなく、植物の機能も大きく関与している可能性が示唆された。
100TeV超領域ガンマ線天文学の開拓

中国チベット自治区の羊八井宇宙線観測所では、シンチレーション検出器を7.5 m間隔に配置した、広視野宇宙線望遠鏡チベット空気シャワー観測装置が平成2年から稼働している。この装置と平成25年に完成した世界最大(3,200平方メートル)の地下水チェレンコフ型ミューオン検出装置を連動し、空気シャワー中の電子数とミューオン数を同時観測することにより、100 TeV超領域の宇宙ガンマ線を超低雑音で観測する研究計画である。宇宙ガンマ線観測の雑音となる原子核宇宙線が空気中で生成する空気シャワーにはミューオンが多数含まれるが、宇宙ガンマ線が空気中で生成する空気シャワーにはミューオンがほとんど含まれない。従って、ミューオン観測装置によりミューオンの数を計測することにより、原子核宇宙線による雑音と宇宙ガンマ線を効率的に弁別することが可能となる。この装置による宇宙ガンマ線の検出感度は、数10 TeV以上のエネルギー領域では世界最高感度となる。本研究ではこの装置を使って、世界で初めて100 TeVを超えるガンマ線が「かに星雲」から到来していることを有意に検出した。また、MGRO J1908+06からの100 TeV超ガンマ線も有意に捉えた。これら2天体とG106.3+2.7の3天体からの数10 TeVから数100 TeV領域ガンマ線のエネルギースペクトルを観測した。これらの観測結果は100 TeV超領域宇宙ガンマ線の新しい重要な知見であり、100 TeV超領域ガンマ線天文学を切り開くことに成功した。これらの成果は2019年3月の日本物理学会第74回年会で発表し、論文は現在投稿中である。平成29年度が最終年度であるため、記入しない。この装置と平成25年に完成し、現在最終調整段階にある世界最大(3,200 m2)の地下水チェレンコフ型ミューオン検出装置を連動し、空気シャワー中の電子数とミューオン数を同時観測することにより、100 TeV超領域の宇宙ガンマ線を超低雑音で観測する研究計画である。本研究で使用する水チェレンコフ検出器の1単位の面積は約50 m2であり、水深1.5 mの水の中に20インチの光電子増倍管(PMT)を2本下向きに取り付け、荷電粒子から放出され床や壁で反射するチェレンコフ光を検出する。この検出器は地下2.5 mに作られている。これにより約1 GeV以上のミューオンを効率よく検出できる。水チェレンコフ検出器の総数は64単位であり、空気シャワー観測装置の中心部に4クラスターに分けて設置されている。本年度は1.データ解析に必須のモンテカルロシミュレーションを行い、データ解析用ソフトウェアを開発した。2.連携研究者、研究協力者とともに空気シャワー観測装置と地下ミューオン観測装置のエネルギー及び時間情報の較正を行った。3.両装置のトリガータイミングの調整を行い、4.連続観測を開始した。5.収集された観測データは東京大学宇宙線研究所に送られ、6.東京大学宇宙線研究所の計算機システムを使用して、連携研究者、研究協力者とともに解析した。ここまでの進捗はおおむね計画通りである。本年度は1.昨年度に引き続き、連携研究者、研究協力者とともに空気シャワー観測装置と地下ミューオン観測装置のエネルギー及び時間情報の較正を行った。

2.両装置のトリガータイミングの再調整とトリガー統合を行い、3.観測を再開した。4.収集された観測データは東京大学宇宙線研究所に送られ、5.東京大学宇宙線研究所の計算機システムを使用して、連携研究者、研究協力者とともに、データが所定の精度を持っているか確認し、データを解析した。6.ここまでの研究成果をとりまとめ、日本物理学会第72回年次大会(2017年)で発表した。ここまでの進捗はおおむね計画通りである。中国チベット自治区の羊八井宇宙線観測所では、シンチレーション検出器を7.5 m間隔に配置した、広視野宇宙線望遠鏡チベット空気シャワー観測装置が平成2年から稼働している。この装置と平成25年に完成した世界最大(3,200平方メートル)の地下水チェレンコフ型ミューオン検出装置を連動し、空気シャワー中の電子数とミューオン数を同時観測することにより、100 TeV超領域の宇宙ガンマ線を超低雑音で観測する研究計画である。宇宙ガンマ線観測の雑音となる原子核宇宙線が空気中で生成する空気シャワーにはミューオンが多数含まれるが、宇宙ガンマ線が空気中で生成する空気シャワーにはミューオンがほとんど含まれない。従って、ミューオン観測装置によりミューオンの数を計測することにより、原子核宇宙線による雑音と宇宙ガンマ線を効率的に弁別することが可能となる。この装置による宇宙ガンマ線の検出感度は、数10 TeV以上のエネルギー領域では世界最高感度となる。本研究ではこの装置を使って、世界で初めて100 TeVを超えるガンマ線が「かに星雲」から到来していることを有意に検出した。また、MGRO J1908+06からの100 TeV超ガンマ線も有意に捉えた。これら2天体とG106.3+2.7の3天体からの数10 TeVから数100 TeV領域ガンマ線のエネルギースペクトルを観測した。これらの観測結果は100 TeV超領域宇宙ガンマ線の新しい重要な知見であり、100 TeV超領域ガンマ線天文学を切り開くことに成功した。これらの成果は2019年3月の日本物理学会第74回年会で発表し、論文は現在投稿中である。1.本年度に引き続き、連携研究者、研究協力者とともに空気シャワー観測装置と地下ミューオン観測装置のエネルギー及び時間情報の較正を行う。2.両装置のトリガータイミングの再調整とトリガー統合を行い、3.観測を再開する。4.収集された観測データは東京大学宇宙線研究所に送られ、5.東京大学宇宙線研究所の計算機システムを使用して、連携研究者、研究協力者とともに、データが所定の精度を持っているか確認し、データを解析する。6.ここまでの研究成果をとりまとめる。2.観測データは東京大学宇宙線研究所に送られる。3.さらに標高の高いボリビア・チャカルタヤ観測所(標高5,200 m)に滞在し、比較データを取得する。5.東京大学宇宙線研究所の計算機システムを使用して、連携研究者、研究協力者とともに、チベットでのデータとチャカルタヤ観測所で取得したデータを比較、解析する。
腸管バリア破綻に関与する新規因子　Ｆｏｃａｌ　Ａｄｈｅｓｉｏｎ　Ｋｉｎａｓｅ

腫瘍壊死因子α(TNF)を培地に添加して炎症状態を再現した所、添加8時間後から腸上皮バリア機能が低下し、この低下はアセチルコリンまたはカルバコールの添加により緩和され、更にこの低下の緩和はアトロピンの追加によって消失した。この時、NF-kBの活性化および複数の炎症関連遺伝子の発現がムスカリンシグナルによって抑制されており、TNFによって誘導されるIL-8の分泌も抑制されていた。以上の結果から、炎症時の腸上皮バリア障害に対して、腸上皮に存在するムスカリン受容体はバリア機能を補強すると同時に炎症の進展/拡散を抑制している可能性が示唆された。申請の前後で米国のグループから論文が発表され、我々が計画していたfocal adhesion kinase (FAK)の腸上皮特異的なノックアウトのデータが含まれていた。ノックアウトにより、我々の予想していた通り、腸上皮バリア機能の低下がもたらされ、腸炎誘発薬剤に対する感受性の亢進が報告されていた。そこで、当初の目的のトランスジェニックマウスの作成に代えて、腸管の機能調節における重要な分子であるアセチルコリンに着目し、その受容体、特にムスカリン性受容体について、FAKとの関連を追究することとした。ムスカリン受容体にはM1からM5までの5種類のサブタイプがあり、いずれもGタンパク質に結合して機能していることが知られている。これまで、腸上皮においてはM3が主要なサブタイプであると信じられて来たが、今回我々が行った薬理学的結合実験の結果、マウス結腸の腸上皮においてはM1が80%、M3が20%を占めていた。Ussing chamberを用いた腸粘膜の分泌機能解析において、アセチルコリン刺激によるClイオン分泌はM3によって促進的に、M1によって抑制的に調節されていることが明らかとなった。さらに、ムスカリン受容体からの細胞内情報伝達系において重要な分子であるMAPキナーゼについて検討した所、Erk1/2およびp38はいずれもM1の刺激に応じて活性化し、M3の下流ではないことが明らかとなった。最後に、trinitrobenzene sulfonic acid (TNBS)を注腸して得られる腸炎モデルで検討した所、ムスカリン受容体の密度は炎症によって低下し、この低下は主にM1の減少によるものであった。またアセチルコリン刺激によるMAPキナーゼの反応性も低下し、ムスカリン受容体の病態との関連が示唆された。これらの結果をJ Gastroenterol誌に論文として発表した。腸上皮機能調節におけるアセチルコリン受容体/MAPキナーゼ/FAKらの役割を検討するため細胞培養系を構築した。大腸がん由来の腸上皮細胞株、T84において、先ずムスカリン受容体の薬理学的特性を検討した所、T84においてはM1が35%、M3が65%を占めていた。この細胞を用いて腸上皮バリア機能の評価を行った。MAPキナーゼおよびFAKのそれぞれの特異的な阻害剤は、何れもバリア機能を低下させた。また、エタノールによる腸上皮バリア障害モデルを用いて検討した所、これらの阻害剤はバリア機能の回復を抑制した。同時に、前者においてはMAPキナーゼ/FAKとも、後者においてはFAKのみ、リン酸化の抑制がみられた。そこでアセチルコリン受容体刺激との関連を検討した所、前年度までに明らかにしたアセチルコリン受容体/MAPキナーゼ/FAKの情報伝達の経路の存在を確認することが出来た。炎症性腸疾患の際に炎症促進因子として機能しているINFγを培地に添加し擬似炎症状態として観察した所、バリア機能の低下と同時にM1密度の減少とこれに引き続くMAPキナーゼ/FAK系の反応性の減弱が観察された。ヒト炎症性腸疾患患者の組織標本において、免疫組織化学的な解析を行い、腸上皮において炎症に伴うM1アセチルコリン受容体の減少を認めた。これらの結果をBBA Molecular Basis of Disease誌に論文として発表した。ヒト大腸がん由来のT84細胞を用いて、アセチルコリン刺激によるMAPキナーゼやFAKの活性化を観察すると同時に、単層の培養細胞を介する電気抵抗を計測することにより、腸上皮バリア機能を評価する実験系を構築した。

前年度マウスで行った実験結果を踏まえ、ムスカリン性アセチルコリン受容体/MAPキナーゼ/FAKの経路の存在を確認し、これがバリア機能の調節において機能していることを明らかにした。さらに、炎症の進展に深く関わっているサイトカイン、INFγを用いて炎症状態を再現し、M1アセチルコリン受容体密度の減少とこれに引き続くMAPキナーゼ/FAK系の反応性の減弱が生じることを示し、この系のバリア機能における重要性ならびに炎症性腸疾患の病態との関わりを示唆した。ヒト組織については、兵庫医科大学炎症性腸疾患センターに依頼して炎症性腸疾患患者の手術摘出組織のパラフィン包埋ブロックの供与を受け、本学倫理規定に基づいて(旭川医科大学倫理委員会承認番号1637)解析を行った。免疫組織学的な手法でアセチルコリン受容体/MAPキナーゼ/FAKらの局在を観察し、正常部位と炎症部位での差についてマウスや培養細胞での結果と矛盾しないデータを得て、研究成果をBBA Molecular Basis of Disease誌に論文として発表した。腫瘍生化学腸上皮バリア機能調節におけるアセチルコリン受容体/MAPキナーゼ/FAKらの役割を引き続き検討する方向で研究を継続している。特に、MAPキナーゼに着目し、3つの主要なサブタイプ(Erk、Jnk、p38)の役割分担を中心に検討を進めている。さらに、腫瘍壊死因子などのサイトカインを培養系に加えて炎症状態を作成することが出来るので、炎症の腸上皮機能に与える影響をアセチルコリン受容体/MAPキナーゼ/FAKらの挙動との関連で検討して行く予定である。Ussing chamberを用いた腸粘膜の分泌機能解析についても、培養細胞系における解析結果を見ながら、併せて検討を進めて行く予定である。細胞培養系における検討についても、腸上皮特異的なFAKノックアウトの結果を踏まえ、アセチルコリンによるバリア機能調節に目標を切替え、FAKとの関連を検討できる細胞系の構築を目指すこととした。探索の結果、ヒト大腸がん由来のT84細胞及びHT-29/B6細胞において、アセチルコリン刺激によるMAPキナーゼやFAKの活性化が観察された。この系を使い、単層の培養細胞を介する電気抵抗を計測することにより、腸上皮バリア機能を評価し、アセチルコリン/MAPキナーゼ/FAKらの役割を解析している。トランスジェニックマウス作成については、概要で述べたように方針を変更し、腸上皮におけるアセチルコリン/MAPキナーゼ/FAKらの役割に関して検討することとし、研究成果をJ Gastroenterol誌に論文として発表した。ヒト組織については、兵庫医科大学炎症性腸疾患センターに依頼して炎症性腸疾患患者の手術摘出組織のパラフィン包埋ブロックの供与を受けることとし、本学倫理規定に基づいて申請し承認を受けている(旭川医科大学倫理委員会承認番号1637)。免疫組織学的な手法でアセチルコリン受容体/MAPキナーゼ/FAKらの局在を観察し、正常部位と炎症部位での差について検討を行っている。概要にも述べたように、我々が計画していたFAKの腸上皮特異的なノックアウトの結果が公表されたため、これを踏まえて申請計画を前倒しし、腸上皮機能調節におけるアセチルコリン受容体/MAPキナーゼ/FAKらの役割を検討する方向で研究を継続している。
生体試科中半導体金属類の原子吸光分析法に関する研究

昭和62年、63年の2ヶ年にわたって、生体試科中半導体金属類の原子吸光分析法について加えたが、無炎原子吸光法による測定では湿式灰化液を直接装置に導入する場合、燃焼点などの影響もあって、分析条件を確立するまでにはいたっていない。とくに、テルル、セレンなど低波長領域に共鳴線を持つ金属類にその影響が大きい。血液、尿、毛髪、いずれの場合もさらに検討の余地があり、分析条件を決定するには、有機溶媒抽出などの前処理がさらに必要のようである。テルルの標準液については、硫酸酸性下、ヨウ化カリウム添加、3mlMIBK抽出後にその10ulを無炎原子吸光法で分析する条件を確立することができた。しかし、サンプル量はどうしても多くなるため、問題は残る。還元気化原子吸光法によるこれら金属の定量は、可能である。生体試科を湿式灰化して定容量とした後、試科液について水素化ホウ素ナトリウムおよび塩酸存在下で還元気化し、アセチレンフレーム上に設置した石英セルに導入するが、テルル、セレン、アンチモン、ひ素の測定が可能となる。ただし、問題はサンプル使用量が多いことで、少なくともペリスタルポンプに改良の余地があると考える。63年度に実施した毛髪中テルルおよびセレンの測定結果では、テルルの量はほとんど検出されないレベルであった。1.無炎原子吸光法によるテルル(Te)の定量条件Te(1.0μg/ml)標準液02.0mlを50ml分液ロードに採り精製水で30mlにしたのち, 20N-硫酸6ml, 5-Mヨウ化カリウム2mlを加えて混合後15分間放置. 15分後MIBK3mlで撹拌抽出し,その10ulを原子吸光分析する.原子吸光分析条件は,ランプ液長214.3nm,ランプ電流10mA,乾燥18A30秒,灰化50A, 70秒,原子化230A, 5秒で定量を行う.2.尿中テルルおよびセレンの定量還元気化原子吸光法による尿中てテルルよびセレンの定量条件を以下に示す.尿試料50mlをキールダールフラスコに採取し,硝酸1520ml,硫酸0.5ml過塩素酸0.5mlで湿式灰化した.灰化終了後精製水で50ml定容とした試料液について水素化ホウ素ナトリウム(0.6%NaBH4, 0.5%NaOH1液)および塩酸(12N)存在下で還元気化し,アセチレンフレーム上に設置した石英セルに導入して定量する.ランプ液長214.3nm,ランプ電流10mA,空気流量13.5l/min,アセチレン流量2l/min.3.血液中テルルの定量使用する血液量を少なくするため無炎原子吸光分析法を利用することを検討した.血液0.5mlを5ml共栓試験管に採取し,濃硝酸0.5ml,精製水0.1mlを加え, 8090°C温浴で試量液が透明になるまで加温する.透明となったのち,さらに,ホットプレート上に移して加熱し,液量が0.5ml程度になるまで継続して灰化を終了する.試験管目盛りで2ml(精製水使用)に調整し供試液とする.無炎原子吸光には10mlを供試するが,定量条件は前項1の条件を利用する.ただし,血液前処理条件ならびに原子吸光分析条件については,標準液(水溶液)定量条件とは若干異なるようであり,現在さらに検討をすすめている段階にある.本年度は毛髪中のテルルおよびセレンの正常値レベルの変化を、1名を被験者として測定した。毛髪試料は約1ヶ月毎に散髪して得た34検体を利用した。毛髪の一部を有機溶剤洗浄-中性洗剤洗浄-精製水洗浄-有機溶剤洗浄-乾燥の順で処理した後、その0.5gを正確に秤量し、キールダールフラスコに移す。混酸(硝酸・硫酸)を加えて一夜放置後マントルヒーター上で湿式灰化する。終点近くに過塩素酸を加え、灰化を完了する。冷却後25ml定客とした。

テルルおよびセレンの分析には、還元-気化原子吸光法を利用した。金属水酸化物の発生には、0.6%水素化ホウ素ナトリウム(0.5%NaOHSol)を用い、塩酸(10M)および試料液とともに,ペリスタルポンプで水素化物発生装置(VGA-76バリアン社製)に導入し、金属水素化物を分離後、アセチレン-空気フレーム上のセルに導入し、吸光度を測定する。なお、この方法による検出下限は、テルルについて、1.5ng/ml、セレンについて、1.0ng/mlであった。毛髪中にテルルがどの程度存在するかについてのデータはほとんどない。被験者の値も大部分が不検出のレベルであった。テルルの一日摂取量が100ugとする報告もあって、毛髪が排泄経路のひとつのルートと考えられないこともないであろう。セレンについては、正常値を0.33ug/gとする基礎データもあって、十分曝露の評価に毛髪の利用が適切か否かはさらにデータを積むことが必要になる。
受精のメカニズムと受精前後における生殖細胞のエピゲノム調節

精子の受精能形成にSpesp1, Calsperin, Pdilt, Pmis2, Tex101をなどが必須であることをこれらの遺伝子改変マウスを新たに作製することにより証明した。受精不全となるマウスを観察することにより精子が雌性生殖路内において受精に至る様子をライブイメージングなどにより明らかにすることができた。また、ノンコーディングRNAの一種であるマイクロRNAのmiR-200bとmiR-429が排卵に至る必須の因子であることも遺伝子改変マウスを用いて明らかすることができた。生殖系列細胞は、精子と卵子へ分化・成熟し、受精していったん消滅するが、胚から個体へと発生していく過程で新たに誕生する。この新たな生殖系列細胞も生理的、エピジェネティック的に受精能を有し個体として発生できる「機能する配偶子」へと分化していく。本研究では、この連綿と続く生殖系列の世代サイクルを分子生物学的に明らかにするために、受精現象とその前後のエピゲノム調節に焦点を当て、試験管内では再現できない現象について遺伝子操作動物をもちい解き明かす。生殖細胞が成熟し"機能する配偶子"を形成させるためには、様々なエピジェネティックな機構により遺伝子の発現が調節されていることが明らかになりつつある。エピジェネティックな機構は主にゲノムDNAやピストンの修飾を中心に転写レベルでの制御としてとらえられ研究がなされてきたが、近年タンパク質をコードしないRNA(ノンコーディングRNA)が翻訳のレベルをエピジェネティックに制御している分子群として注目されている。そこで、われわれはノンコーディングRNAであるマイクロRNA(miRNA)に着目し研究を行った。まず精巣内で発現するmiRNAの中でmiR-200bが減数分裂を開始する頃に発現のピークを示すことを見出し、ついでそのノックアウトマウスを作製した。miR200bの発現の様子から雄性不妊や精子形成異常などの表現型が期待されたが、雄の配偶子形成に異常は全く認められなかった。しかしmiR-200bノックアウトマウスの雌は排卵不全により不妊になることがわかった。排卵は視床下部-下垂体-卵巣系のホルモンにより巧妙に制御されているが、miR-200bはその中でも下垂体で強く発現している。排卵不全の表現型が下垂体ホルモンの投与(補充)により回復することから、下垂体の機能不全による雌の不妊であることが疑われた。そこでmiR-200bにより翻訳が制御されているターゲットをコンピュータ解析により絞り込んだあと、個体レベルで解析し、miR-200bが転写調節因子の量を制御することにより下垂体ホルモンであるLHの発現を正常に保っていることを明らかにした。平成20年度の研究では遺伝子ノックアウト法を用い、20数塩基という短いRNA分子の存在が雌の妊孕性の維持に不可欠な要素であることを明らかにできた。性染色体の組合せが、XY型であれば雄、XX型であれば雌になる。しかし、人工的に雄と雌の細胞が入り混じった雌雄キメラを作ることができる。我々はこういった雌雄キメラマウスの研究を通して、XX型で雌である生殖細胞も精巣内では雄の生殖細胞に分化して、父型のゲノム・インプリントを獲得できることを示してきた。しかし、XX型の雄性生殖細胞は、誕生後には消失する。このため、性染色体の組合せは生殖細胞の性決定やゲノム・インプリントの獲得には関与しないが、雄性生殖細胞の生存・分化には必須であることを証明してきた。一方で、精巣内の体細胞の性染色体がXX型である場合、精子幹細胞から精子への分化に影響するのかどうかについては、ほとんど知られていなかった。そこで、我々は生殖細胞がなくなるXX型性転換マウス(XX-Sryマウス)の精細管内に野生型(XY型)の精子幹細胞を移植して、体細胞環境がもつ性染色体の役割を明らかにしようと試みた。まず、我々は移植細胞の中に野生型の体細胞が混入するのを防ぐために、培養可能な精子幹細胞株であるGS細胞を樹立した。この樹立したGS細胞を幼若期のXX-Sry精巣に移植し、2-3ヵ月後に解剖したところ、移植したほぼ全ての精巣で精子形成が観察されることを確認した。さらに、我々はXX型精巣内で分化した半数体の精子細胞から顕微授精技術によって、産子を得ることを示し、精子細胞への分化が正常であることを示した。ところが、GS細胞を移植したXX-Sryマウスから自然交配により誕生した仔は少数にとどまった。そこで、9か月齢を超えたマウスを解剖したところ、精巣から生殖細胞は、完全に消失していることが判明した。これらの結果は、雄性生殖細胞を取り囲む精巣内の体細胞の性染色体が雌型であっても、精子幹細胞から精子への分化に支障はないが、生殖幹細胞の幹細胞性を維持して精子形成を繰り返し行うためにはY染色体が関与していることがあきらかになった。

本研究課題では、生殖系列細胞の世代サイクルを分子生物学的に明らかにするために、受精過程や、生殖細胞の分化・成熟、相互認識に焦点を当て研究を進めた。我々は精子が卵子に融合するために必須な分子としてIZUMOを同定していたが、卵子との融合機構について直接的な証拠が得られていなかった。そこで、IZUMOと結合している分子が重要ではないかと考え、IZUMO結合因子としてAce3を同定し、ノックアウトマウスを作製し、その影響を見た。しかしながら、Ace3ノックアウトマウスは妊孕性があり、受精に必須の分子ではなかった。また、我々はこれまでに分子シャペロンであるCanxと相同性の高い精巣特異的分子シャペロンであるClgnが受精に重要な分子であることを報告してきた。同様に分子シャペロンとして知られているCalrと相同性の高い分子で、Clgnよりも精子形成後期で精巣特異的に発現するCalr3に着目し、ノックアウトマウスを作製し解析した。その結果、Calr3ノックアウトマウスの表現形は、Clgnノックアウトマウスと同様に、精子の輸卵管への移行能と透明帯への結合能が欠損していることが分かった。さらに詳しく調べてみると、ClgnとCalr3のノックアウト精子で共通してADAM3が欠損していることが分かり、輸卵管への移行能と透明帯への結合能獲得に、ADAM3の成熟が重要であることを見出した。また、我々は、生殖系列に寄与するラットES細胞の樹立に成功したので、個体発生スピードが速いマウスとの異種キメラを作製することによって、ラット由来の生殖細胞が異種キメラ環境で発生できるのかどうかを検討した。その結果、マウス⇔ラットESキメラの精巣内で、ラット特有の精子頭部をもつ精子への分化が確かめられた。すなわち、精原細胞の移植と異なり、発生の段階から異なった種の環境にさらされても、精子形成が起りえることを示した。本研究課題では、生殖系列細胞の世代サイクルを分子生物学的に明らかにするために、受精過程や、生殖細胞の分化・成熟、相互認識に焦点を当て研究を進めている。精子は透明帯に結合して先体反応が誘発された後、透明帯を通過して受精するので、透明帯との結合因子を明らかにすることにより精子が透明帯を通過する仕組みが明らかになると考えられている。そこで、我々は、精子先体内にあり透明帯のZP3を結合すると考えられてきたZP3R/sp56という分子に注目し、ノックアウトマウスを作製し、解析した。その結果、ノックアウトマウスには、妊孕性があり、ZP3R/sp56は受精に必須の分子のリストから除外できることを明らかにした。我々はこれまでに精巣特異的分子シャペロンであるClgn、Calr3のノックアウトマウスを作製し受精に必須の分子であることを証明してきた。平成23年度の研究において新たに精巣特異的分子シャペロン関連分子としてPDILTを同定し、そのノックアウトマウスを作製し、解析した。その結果、この分子シャペロン関連タンパク質は受精の成立に必須であり、欠損マウスは雄性不妊の表現形を示した。その作用機作を検討するとこのマウスからの精子は輸卵管への移行能や透明帯への結合能を欠損していることが分かった。さらに詳しく調べてみると、精子から受精に必須の因子とされるADAM3が欠損していることが分かった。ADAM3を成熟させるために少なくとも3種の精巣特異的分子シャペロンあるいはその関連分子が必要であることが示された。