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中国古医籍が日・韓・越の伝統医学形成史に与えた影響の書誌学的研究

今年度も個別に得た成果は多数にのぼり、とりわけ『傷寒論』と『金匱要略』の書誌について画期的新知見を得た。これらについては次年度以降の調査研究と並行して報文の作成、および新出原本の日中同時出版を準備している。今年度、真柳は韓国および日本に所蔵される韓国・日本・中国・ベトナムの古医籍を調査し、データの集計・分析・報文作成を担当した。また今年度の海外共同研究者として、韓国・慶煕大学校韓医科大学の車雄碩助教授に韓国所蔵情報の事前調査と集計を担当いただいた。以上について各蔵書機関の目録より韓・日・中・越の古医籍を抽出、版本書誌等の嫌疑点は実地調査で解決した。このため真柳は国内3回、中国2回(2008年6月10日同14日、2008年11月2日同8日)、台湾(2008年7月14日同16日)・韓国(2008年8月7日同9月26日)各1回の調査旅行を行い、京都大学図書館・杏雨書屋・慶應義塾大学斯道文庫・北京大学図書館・上海図書館・成都中医薬大学図書館・台北故宮博物院・ソウル国立中央図書館にて古医籍の書誌を収集した。車氏は日本に1回(2009年1月2日同31日)の研究打ち合わせ旅行を実施した。真柳と車氏は収集した書誌データを解析し、中国古医籍が各国伝統医学体系の形成に及ぼした影響を、各々の歴史・地理・社会背景もふまえ、客観的に解明する研究を継続した。真柳がこれまで収集した資料と史料を整理した古医籍の書誌データは日本め月刊学術誌に今年度10回、学部紀要に1回に分けて連載報告し、それらを解析した研究論文1篇が台北故宮の学術誌に掲載された。また日本・中国・韓国で開催された学会で新知見を計6回発表した。車氏も日韓古医籍の比較論文1篇を韓国の学術誌に投稿した。真柳はさらに研究成果に関する講演を日本で11回行った。今年度も個別に得た成果は多数にのぼり、とりわけ新発見の『傷寒論』と『金匱要略』の版本は従来の知見を覆す最善本につき、次年度に日本東洋医学会から全文の影印・釈読に解題・索引を付して出版する予定で、すでに使用権を北京大学・上海図書館・台北故宮より取得し、中国で同様の出版も計画している。今年度、真柳はベトナムおよび日本に所蔵される古医籍を調査し、データの集計・分析・報文作成を担当した。また今年度の海外共同研究者として、中国・山西省中医薬研究院中医基礎理論研究所の趙懐舟副教授に各国目録情報の調査集計を担当いただいた。以上について各蔵書機関の目録より越・中・日・韓の古医籍を抽出し、版本書誌等の嫌疑点は実地調査で解決した。このため真柳は国内4回、ベトナム1回(2009年8月3日同9月24日)の調査旅行を行い、古医籍の書誌を収集した。趙氏は日本に1回(2009年11月7日2010年2月4日)の研究打ち合わせ旅行を実施した。真柳と趙氏は収集した書誌データを解析し、中国古医籍が各国伝統医学体系の形成に及ぼした影響を客観的に解明する研究を継続した。真柳がこれまで収集した資料と史料を整理した古医籍の書誌データは月刊学術誌に今年度11回、学部紀要に2回に分けて連載報告し、それらを解析した研究論文3篇が中国・日本・ベトナムの学術誌に各々掲載された。また研究成果の図書3件を出版し、各々に論文を掲載した。学会では新知見を2回、研究成果に関する他の講演を4回行った。趙氏も来日中に研究会で2回発表し、日中古医籍の比較論文2篇を日本と中国の学術誌に掲載した。今年度は当該研究の最終年のため、4年間の研究成果を検討する国際シンポジウムを2010年6月11日に開催し、真柳ほか日中韓越10名の報告論文を日中韓英の4言語で出版する翻訳作業も開始した。また同6月12・13日に真柳が会長として勤務校で開催する第111回日本医史学会学術大会でも、会長講演「日韓越の医学と中国医書」を行い、当該研究の第一次総括とする。
咀嚼障害による脳内メタロチオネイン-III発現変動の解析

平成11年度咀嚼障害による脳組織変化と脳内メタロチオネイン(MT)-III発現量の解析についてddYマウス♂を(1)固型飼料を与えた無処置群:対照群(2)粉末飼料を与えた無処置群:(粉末)-(無)群(3)固型飼料を与え,4週齢で下顎臼歯を左右1本ずつ抜歯した群:(固形)-(抜歯)群(4)粉末飼料を与え,4週齢で下顎臼歯を左右1本ずつ抜歯した群:(粉末)-(抜歯)群,以上4群(各46匹)に分けて3ヶ月および6ヶ月間飼育した。各群の脳内MT-III mRNAの発現量を解析するため,大脳皮質,線状体,海馬よりそれぞれRNAを抽出し,マウスMT-III mRNA特異的に認識するプライマーを用いたRT-PCR法にて定量的に解析を行った。大脳皮質,線状体,海馬それぞれのMT-III mRNA発現量は,3ヶ月飼育後,6ヶ月飼育後ともに大脳皮質>海馬>線状体の順に高かった。3ヶ月飼育後,大脳皮質において対照群と比較して他のいずれの群も有意にMT-III mRNA発現量が減少していた。線状体では対照群と比較して他のいずれの群も発現量が減少する傾向にあったが,有為に減少していたのは(粉末)-(無)群のみであった。海馬ではいずれの群にも有意な差はみられなかった。一方,6ヶ月飼育後では,大脳皮質においてのみMT-III mRNA発現量が3ヶ月時と比較していずれの群も減少していた。また対照群と比較して(粉末)-(抜歯)群にのみ有意な減少がみられた。マウス脳におけるMT-IIIの発現は老化に伴って大脳皮質において著しい減少がみられたが,粉末飼料を与えたマウスや臼歯を抜歯したマウスではその減少が対処群よりも早い時期からみられるということが本研究で明らかになった。MT-IIIはアルツハイマー病患者脳において大脳皮質第26層で発現量が減少しているという報告があることから,粉末飼料での飼育や,臼歯を抜歯することにより起こる咀嚼機能への影響が大脳皮質におけるMT-III mRNA発現量の減少を加速化する要因となっていることは非常に興味深い結果である。1.咀嚼障害による脳組織変化と脳内メタロチオネイン(MT)-III発現量の解析について(1) 34週齢マウス(ddY,♂)の下顎臼歯を左右1本ずつ抜歯した群(2)無処置群(1)(2)それぞれを固型飼料を与える群と,粉末飼料を与える群の4群のマウスを用意し,6ヶ月飼育後X線撮影にて骨格の変化を調べたが,どの群も骨格に違いは見られなかった。また,各群を3ヶ月,6ヶ月飼育後,海馬,線状体,大脳皮質よりRNAを抽出し,MT-IIImRNA量について解析中である。2.各種神経伝達物質によるMT-III発現量の変動についての解析培養グリア細胞株(VR-2g,マウス由来)を用い,ドパミン(DA)添加時のMT-IIImRNA発現量の変動をRT-PCR法にて解析した結果,100μM添加時に,無添加時の約2倍量発現が増加していた。そこで,MT-IIImRNAの誘導がDAレセプターを介するものであるかを検討するため,D1,D2レセプターアゴニストおよびアンタゴニストを用いた。アゴニストによるMT-IIImRNAの誘導,およびMT-IIImRNA誘導へのアンタゴニストによる制御効果はみられなかったので,MT-IIImRNAの発現はDAレセプターを介するのではないと考えられた。また,DΔの他にノルアドレナリン,DAの前駆物質であるL-DOPA,神経毒性が強いと言われているDAの誘導体6-ヒドロキシドパミン(6-OHDA)添加時(0200μM)においても,MT-IIImRNAの発現量の変動を調べたところ,6一OHDA(50μM添加時に誘導がみられた。さらに,抗酸化物質であるグルタチオン,ア不コルビン酸,ビタミンEをDA添加時に同時に添加すると,MT-IIImRNAの発現誘導が抑制きれた。以上のことから,DAや6-OHDAにより発生する活性酸素によってMT-IIImRNA発現が調節されていることが示唆され,本研究において,MT-IIIの抗酸化的役割が期待できる結果を得たといえる。

3ヶ月飼育後,大脳皮質において対照群と比較して他のいずれの群も有意にMT-III mRNA発現量が減少していた。線状体では対照群と比較して他のいずれの群も発現量が減少する傾向にあったが,有為に減少していたのは(粉末)-(無)群のみであった。海馬ではいずれの群にも有意な差はみられなかった。一方,6ヶ月飼育後では,大脳皮質においてのみMT-III mRNA発現量が3ヶ月時と比較していずれの群も減少していた。また対照群と比較して(粉末)-(抜歯)群にのみ有意な減少がみられた。マウス脳におけるMT-IIIの発現は老化に伴って大脳皮質において著しい減少がみられたが,粉末飼料を与えたマウスや臼歯を抜歯したマウスではその減少が対処群よりも早い時期からみられるということが本研究で明らかになった。MT-IIIはアルツハイマー病患者脳において大脳皮質第26層で発現量が減少しているという報告があることから,粉末飼料での飼育や,臼歯を抜歯することにより起こる咀嚼機能への影響が大脳皮質におけるMT-III mRNA発現量の減少を加速化する要因となっていることは非常に興味深い結果である。
CYP2Bファミリーの性依存的発現を制御するホルモン間相互作用とその変動効果

CYP2B9は、マウス肝臓で常在的にメス特異的に発現しているP450である。オスでは脳下垂体摘出により、CYP2B9発現はメスレベルまで亢進した。しかし、メスマウスの脳下垂体摘出術後では、それ以上の発現亢進はなかった。成長ホルモンの分泌プロファイルは、雌雄で異なる。オス型の分泌プロファイルに似せて朝夕2回投与すると、オスの脳下垂体摘出マウスのCYP2B9発現亢進を抑えた。また、脳下垂体非摘出メスに成長ホルモンをオス型で投与すると、完全に発現を抑えた。合成副腎皮質ホルモンであるデキサメタゾンは、脳下垂体非摘出メスのCYP2B9発現を完全に抑えたが、脳下垂体摘出メスマウスに対しては、抑制効果を示さなかった。従って、メスでの発現抑制には副腎皮質ホルモンと脳下垂体分泌因子の協調作用が必要であることが示唆された。肝細胞培養系では、デキサメタゾンや内在性のホルモンであるハイドロコルチゾン、またはコルチコステロンを添加すると、濃度依存的にCYP2B9mRNA発現を抑えた。またデキサメタゾンによる抑制効果は、強力な抗グルココルチロイドである、RU486存在下には減少した。これらの観察結果は、CYP2B9の性特異的な発現の原因には,オス型分泌プロファイルを示す成長ホルモンと副腎皮質ホルモンによる抑制効果が協調的に係わっていることが示唆された。さらに副腎皮質ホルモンによる抑制は、グルココルチコイド・レセプターを介して行われると考えられた。医薬品の薬理作用や副作用発現には、代謝過程が関わる例が多く、テーラーメイド医療推進には薬物代謝酵素関係の情報が必要である。薬物代謝酵素の発現には様々な因子が係わっている。その一つとして、臨床薬の代謝に男女差を認めた報告がある。従って,性差が何に起因するかを考える上で、実験動物を使った基礎データの集積が必要である。マウス肝臓においては、Cyp2b9は雌特異的に発現するP450分子種である。出生直後ではCyp2b9発現が雌雄とも認められるが、思春期頃から雄で発現抑制が起こり始め、成長すると雌雄差が現れてくる。このような雌雄差をもたらす要因について、各種ホルモンの関与を検討した。雌マウスにテストステロン処置すると発現が抑制され、雄マウスの精巣を摘出すると雌並みの発現することから、Cyp2b9遺伝子の転写抑制に雄性ホルモンが関与していることが示唆された。しかし、肝細胞初代培養系においては雄性ホルモン添加によりCyp2b9発現を抑制しないことから、肝細胞に直接働きかけるためではないことが分かった。また、脳下垂体摘出雄マウスではCyp2b9発現が雌と同レベルに亢進し、そこに雄性ホルモンを投与しても発現を抑制しなかったため、脳下垂体分泌因子が抑制に係わっていることが示唆された。候補の一つとして成長ホルモンが考えられた。成長ホルモンの分泌パターンは雌雄で異なっているため、それぞれの分泌パターンに類似した投与をしたところ、雄型のパターンで雌雄の脳下垂体摘出マウスで発現抑制が認められた。従って雄マウスに観察されるCyp2b9発現の抑制は、雄性ホルモンが視床下部に働き、視床下部から脳下垂体に対して雄型に成長ホルモンを分泌するように指令が行く経路が考えられた。しかし、雄性ホルモンによって完全にCyp2b9発現が抑制されないので、別の抑制経路の存在を考慮する必要がある。

しかし、メスマウスの脳下垂体摘出術後では、それ以上の発現亢進はなかった。成長ホルモンの分泌プロファイルは、雌雄で異なる。オス型の分泌プロファィルに似せて朝夕2回投与すると、オスの脳下垂体摘出マウスのCYP2B9発現亢進を抑えた。また、脳下垂体非摘出メスに成長ホルモンをオス型で投与すると、完全に発現を抑えた。合成副腎皮質ホルモンであるデキサメタゾンは、脳下垂体非摘出メスのCYP2B9発現を完全に抑えたが、脳下垂体摘出メスマウスに対しては、抑制効果を示さなかった。従って、メスでの発現抑制には副腎皮質ホルモンと脳下垂体分泌因子の協調作用が必要であることが示唆された。肝細胞培養系では、デキサメタゾンや内在性のホルモンであるハイドロコルチゾン、またはコルチコステロンを添加すると、濃度依存的にCYP2B9mRNA発現を抑えた。またデキサメタゾンによる抑制効果は、強力な抗グルココルチコイドである、RU486存在下には減少した。これらの観察結果は、CYP2B9の性特異的な発現の原因には、オス型分泌プロファイルを示す成長ホルモンと副腎皮質ホルモンによる抑制効果が協調的に係わっていることが示唆された。さらに副腎皮質ホルモンによる抑制は、グルココルチコイド・レセプターを介して行われると考えられた。
収益管理手法に基づく交通施策評価方法論の研究

平成18年度は,収益管理に関わる具体事例について,(1)コインパーキング,(2)国内航空,(3)高速道路などを中心に幅広くレビューをした.(1)については,過去の実績データから,収益最大化の弾力的な料金施策の効果を,一般的なRevenue Management(RM)手法で計測することを試みた.(2)は,航空動態調査(国土交通省)を用いた「券種選択モデル」を構築し,交通行動分析手法をRM手法に組み合わせる方法論を開発した.(3)は,ここ数年全国各地で実施されている高速道路料金割引に関する社会実験に着目した.まず,同社会実験の実施状況についてネットなどを用いた検索を行い,その結果や問題点について整理を行った.平成19年度は高速道路の料金施策に関する社会実験結果を用いて,料金変数を組み込んだ高速道路選択モデルを構築した.具体的には,業務データより,社会実験前後の車種別交通量を集計し,「交通量差-料金差」から集計ロジットモデルを推定した.一般道も含めた実績値との比較から,同方法が実用上,問題のない結果であることを確認した.本方法は全区間の高速道路実績が把握可能な業務データを用いているため,あらゆる社会実験の結果を同様の方法でチェック可能であり,実用性や,広範な適用性から十分な意義を有すると考えている.また,推定されたモデルを用いて,道路料金体系を変化させたときの需要量変化,すなわち高速道路に関するレベニュー・マネジメント分析を行い,車種別,距離帯別料金の影響を感度分析することができた.平成18年度は,収益管理に関わる具体事例について,(1)コインパーキング,(2)国内航空,(3)高速道路などを中心に幅広くレビューをした.(1)については,過去の実績データから,収益最大化の弾力的な料金施策の効果を,一般的なRevenue Management(RM)手法で計測することを試みた.(2)は,航空動態調査(国土交通省)を用いた「券種選択モデル」を構築し,交通行動分析手法をRM手法に組み合わせる方法論を開発した.(3)は,ここ数年全国各地で実施されている高速道路料金割引に関する社会実験に着目した.まず,同社会実験の実施状況についてネットなどを用いた検索を行い,その結果や問題点について整理を行った.平成19年度は高速道路の料金施策に関する社会実験結果を用いて,料金変数を組み込んだ高速道路選択モデルを構築した.具体的には,業務データより,社会実験前後の車種別交通量を集計し,「交通量差-料金差」から集計ロジットモデルを推定した.一般道も含めた実績値との比較から,同方法が実用上,問題のない結果であることを確認した.本方法は全区間の高速道路実績が把握可能な業務データを用いているため,あらゆる社会実験の結果を同様の方法でチェック可能であり,実用性や,広範な適用性から十分な意義を有すると考えている.また,推定されたモデルを用いて,道路料金体系を変化させたときの需要量変化,すなわち高速道路に関するレベニュー・マネジメント分析を行い,車種別,距離帯別料金の影響を感度分析することができた.平成18年度は,収益管理に関わる具体事例について,(1)コインパーキング,(2)国内航空,(3)高速道路などを中心に幅広くレビューをした.(1)については,過去の実績データから,収益最大化の弾力的な料金施策の効果を,一般的なRevenue Management(RM)手法で計測することを試みた.しかし,行動分析を援用するデータが不十分であるため,実用化に向けた改善の余地があることが確認された.(2)は,航空動態調査(国土交通省)を用いた「券種選択モデル」を構築し,交通行動分析手法をRM手法に組み合わせる方法論を開発した,各種の航空政策や需要条件変化に対応するエアラインのRM施策について簡単な考察を行い得た.(3)は,ここ数年全国各地で実施されている高速道路料金割引に関する社会実験に着目した.まず,同社会実験の実施状況についてネットなどを用いた検索を行い,その結果や問題点について整理を行った.その結果,ほとんど効果が発現しなかった実験も,大きな交通量変動を伴った実験もあり,料金(RM)施策を考慮する上で示唆に富む報告がなされていることが分かった.それらの知見をふまえ,数カ所の実験に関わる高速道路の利用実績データを用いることにより,料金変化に対応する交通行動変化(利用インターチェンジの変更など)を集計分析で明らかにした,平成19年度には,非集計行動モデルを適用するデータ解析の方法論を検討する予定である.平成18年度成果を概観すると,当初の予定通り,幅広いRM適用対象を実データにより明らかにする目標は概ね達成することができたと考える.(3)の高速道路利用については,本来,平成19年度に実績データを収集する予定であったが,18年度より,その作業に着手することができた.(1),(2)は,一定の成果を得ることができたので,平成19年度は高速道路実績データの解析による料金RM施策について深く追求していきたい.平成19年度は高速道路の料金施策に関する社会実験結果を用いて,料金変数を組み込んだ高速道路選択モデルを構築した.用いたデータは,全国全ての高速道路区間の実績値が把握可能な業務データである.具体的には,業務データより,社会実験前後の車種別交通量を集計し,「交通量差-料金差」から集計ロジットモデルを推定した.推定結果より,パラメータ値は妥当な範囲に収まることを確認した.さらに,推定モデルを「一般道-高速道路」選択モデルとして用いることより,一般道も含めたOD交通量を逆推定する方法を提案した.一般道も含めた実績値との比較から,同方法が実用上,問題のない結果であることを確認した.

本方法は全区間の高速道路実績が把握可能な業務データを用いているため,あらゆる社会実験の結果を同様の方法でチェック可能であり,実用性や,広範な適用性から十分な意義を有すると考えている.また,推定されたモデルを用いて,道路料金体系を変化させたときの需要量変化,すなわち高速道路に関するレベニュー・マネジメント分析を行い,車種別,距離帯別料金の影響を感度分析することができた.データ取得から,モデル構築,そして施策分析と,一連の解析手順を,適用性や応用性の高い方法論として提示できたと判断できる.平成19年度は,研究の最終年度でもあり,平成18年度の航空を例にしたレベニュー・マネジメント分析もあわせて,交通分野における同方法の適用性や,今後の展開についてまとめた.
宇宙機システムの多様な故障モードに対して大域的にロバストな最適軌道設計手法の確立

今年度は,大域的にロバストな最適軌道設計手法への拡張に関する初期検討を行った.特に,惑星周回ミッションにおいて重要である惑星軌道投入に焦点を当てて,研究を遂行した.惑星軌道投入は,惑星探査ミッションにおいて,最もクリティカルなイベントの一つである.2010年に打ち上げられたあかつきミッション(JAXA)では,この惑星軌道投入に一度失敗しており,ミッション全体に大きな損失を与えてしまった.本研究では,このようなクリティカルなイベントに対してロバストな惑星軌道投入則の確立を目的とする.本研究の提案手法を用いると,万が一,惑星軌道投入に失敗してしまったとしても,比較的短時間に惑星と再会合することが可能となる.先行研究では自由帰還軌道を用いてロバスト性を高めていたのに対して,本研究では深宇宙軌道制御マヌーバを行うことを前提としたロバスト軌道投入則を提案した.このような拡張によって,より忠実度の高い確率的な不確定性モデルを扱うことが可能となり,先行研究よりロバストで最適性の高い軌道が実現された.また,本研究結果を,JAXAが検討している火星衛星探査計画MMXの火星軌道投入に適用して,提案手法の実用性を示した.本研究成果は,日本航空宇宙学会JSASSのInternational Symposium on Space Technology and Scienceにて発表を予定している.また,上記の研究とは別に,博士研究で確立したTube Stochastic Optimal Controlに関する論理体系をまとめ,当該分野で権威的であるAAS/AIAA Space Flight Mechanics Meetingで発表し,アメリカ航空宇宙学会AIAAのJournal of Guidance, Control, and Dynamicsへ投稿・査読中である.翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。
タワー観測データと空間情報による生態系-大気間フラックスの広域評価に関する研究

本年度は、CO_2フラックスを面的に評価するための基礎となる土壌-植生-大気伝達(SVAT)モデルの改良と空間情報の整備を行った。つくば市近郊の水田地帯で得られた複数年のタワー観測データ(20042007年分)を解析し、生態系-大気間フラックスの年次変動について、総光合成量は日射量と日射の散乱成分の割合、生態系呼吸量は気温と地上部バイオマスの相違でほぼ説明できることを明らかにし、各々の関係を定式化した。この結果に基づいて、既存のSVATモデルを改良し、田面水が存在する期間についてはCO_2フラックスを精度良く推定できるようになった。しかし、田面水が存在しない中干しと落水の期間は、相対的に土壌微生物呼吸量(土壌有機物分解量)の影響が大きくなり、温度のみに依存して分解率が決まる従来のスキームでは対応できないことが明らかとなった。このため、多湿な水田土壌に適した有機物分解サブモデルの開発に着手した。このサブモデルの基本構造にはRoth-Cモデルを適用し、分解率の土壌水分依存性をより適切な関数型に置き換えた。一方、モデルを面的に適用するため、人工衛星・航空機リモートセンシングデータを用いてタワー周辺領域の植生指標と上地利用分布をデータベース化した。次年度は、これらを組み合わせ、タワー周辺領域のフラックスを連続的に推定し、タワー観測データの空間代表性を明らかにする。汎用性の高いSVATモデルがさらに多湿土壌にも適用可能となることで、水田を含む複雑な土地利用を持つ地表面の広域フラックスの評価において今後の発展が期待できる。
脂肪細胞の分化・小型化過程とアディポネクチン分泌に及ぼす運動頻度・持続期間の影響

本研究では,肥満ラットに17週齢から2週間の自発走運動(EX-2w群)と,15週齢から4週間に渡る2日に1回程度の自発走運動(EX-4w群)を行わせたところ,EX-2w群よりもEX-4w群で脂肪細胞サイズが小型化し,血中アディポネクチン濃度は有意に高値であったことから,短い期間で急速に体重を減少させる運動よりも,長い期間でゆっくりと体重を減少させる運動の方が脂肪細胞サイズを小型化し,血中アディポネクチン濃度を高値に維持できる可能性が示唆された.本研究では,肥満ラットに17週齢から2週間の自発走運動(EX-2w群)と,15週齢から4週間に渡る2日に1回程度の自発走運動(EX-4w群)を行わせたところ,EX-2w群よりもEX-4w群で脂肪細胞サイズが小型化し,血中アディポネクチン濃度は有意に高値であったことから,短い期間で急速に体重を減少させる運動よりも,長い期間でゆっくりと体重を減少させる運動の方が脂肪細胞サイズを小型化し,血中アディポネクチン濃度を高値に維持できる可能性が示唆された.本研究は,1運動療法および食事療法時の脂肪細胞の分化・小型化過程におけるアディポネクチン分泌抑制因子の遺伝子発現を解析すること,2脂肪細胞の組織像を病理学・免疫組織化学的手法を用いて観察し,アディポネクチン分泌抑制因子を分泌する異質な細胞像(マクロファージなど)の存在とその関与について考察すること,以上の2点を目的として検討を行う.平成20年度は以下のプロトコール(1),(2)を実施し,解析に必要な血液および各種の脂肪・骨格筋などの臓器サンプルを得ることが出来た.平成21年度以降に追加プロトコールを実施し,必要サンプル数を確保した後,下記の測定・評価を実施する.【プロトコール(1)】13週齢の過食性肥満モデルOLETFラットを対象に,個別ケージにて2週間の予備飼育後,併設された回転ケージを用いた自発走運動による運動療法を行った.飼育期間中,餌および水はad lib摂取とし,運動量は回転ホイールへのアクセスを毎日(週7日)可能にする群と,敷居板にて週4日に制限する群を設けることによって調節した.【プロトコール(2)】13週齢のOLETFラットを対象に,個別ケージにて2週間のad lib食での予備飼育の後,体重減少速度が各運動群(週7および4日運動群)のそれと一致する様に摂餌量を毎日調整した.【測定・評価項目】脂肪組織における遺伝子発現として,アディポネクチンとTNF-α,11β-HSD-1,MCP-1などのアディポネクチン分泌抑制因子をReal time-PCR法にて定量評価する.-20°Cで凍結保存した脂肪組織はヘマトキシリン-エオジンを用いた組織染色および抗マクロファージ抗体,抗MCP-1抗体などを用いた免疫組織化学染色を行い,組織形態学的観察を行う.血液成分はELISA法を用いて血中のアディポネクチン,コルチコステロン,TNF-α,テストステロン濃度を測定・評価する.本研究は,1.運動療法および食事療法時の脂肪細胞の分化・小型化過程におけるアディポネクチン分泌抑制因子の遺伝子発現を解析すること,2.脂肪細胞の組織像を病理学・免疫組織化学的手法を用いて観察し,アディポネクチン分泌抑制因子を分泌する異質な細胞像(マクロファージなど)の存在とその関与について考察すること,以上の2点を目的として検討を行う.平成21年度は以下のプロトコール(1),(2)を13クールまで実施し,解析に必要な血液および各種の脂肪・骨格筋などの臓器サンプルを得た.今後,追加プロトコールとして4クール目を実施し,必要サンプル数を確保した後に,下記項目の測定・評価を実施する.【プロトコール(1)】13週齢の過食性肥満モデルOLETFラットを対象に,個別ケージにて2週間の予備飼育後,併設された回転ケージを用いた自発走運動による運動療法を行った.飼育期間中,餌および水はad lib摂取とし,運動量は回転ホイールへのアクセスを毎日(週7日)許可する群と,敷居板にて週4日に制限する群を設けることによって調節した.【プロトコール(2)】13週齢のOLETFラットを対象に,個別ケージにて2週間のad lib食での予備飼育の後,体重減少速度が各運動群(週7および4日運動群)のそれと一致する様に摂餌量を毎日調整した.【測定・評価項目】脂肪組織における遺伝子発現として,アディポネクチンとTNF-α,11β-HSD-1,MCP-1などのアディポネクチン分泌抑制因子をReal time-PCR法にて定量評価する.-20°Cで凍結保存した脂肪組織はヘマトキシリン-エオジンを用いた組織染色および抗マクロファージ抗体,抗MCP-1抗体などを用いた免疫組織化学染色を行い,組織形態学的観察を行う.血液成分はELISA法を用いて血中のアディポネクチン,コルチコステロン,TNF-α,テストステロン濃度を測定・評価する.本研究は,1.運動療法および食事療法時の脂肪細胞の分化・小型化過程におけるアディポネクチン分泌抑制因子の遺伝子発現を解析すること,2.脂肪細胞の組織像を病理学・免疫組織化学的手法を用いて観察し,アディポネクチン分泌抑制因子を分泌する異質な細胞像(マクロファージなど)の存在とその関与について考察すること,以上の2点を目的として検討を行った.

平成22年度は以下のプロトコール(1),(2)の4クール目(追加実験)を実施し,解析に必要な血液および各種の脂肪・骨格筋などの臓器サンプルを得た.また,下記項目の測定・評価を実施した.【プロトコール(1)】13週齢の過食性肥満モデルOLETFラットを対象に,個別ケージにて2週間の予備飼育後,併設された回転ケージを用いた自発走運動による運動療法を行った.飼育期間中,餌および水はad lib摂取とし,運動量は回転ホイールへのアクセスを毎日(週7日)許可する群と,敷居板にて週4日に制限する群を設けることによって調節した.【プロトコール(2)】13週齢のOLETFラットを対象に,個別ケージにて2週間のad lib食での予備飼育の後,体重減少速度が各運動群(週7および4日運動群)のそれと一致する様に摂餌量を毎日調整した.【測定・評価項目】脂肪組織における遺伝子およびタンパク発現として,アディポネクチンをReal time-PCR法およびWestern-Blot法にて定量評価した.-20°Cで凍結保存した脂肪組織はヘマトキシリン-エオジンを用いた組織染色および抗マクロファージ抗体を用いた免疫組織化学染色を行い,組織形態学的観察を行った.血液成分はELISA法を用いて血中のアディポネクチン,コルチコステロン,TNF-α,テストステロン濃度を測定・評価した.
時計遺伝子変異によるメタボリックシンドローム発症機構の解明

申請者らはこれまで,体内時計を制御している時計遺伝子と糖・脂質代謝との関連性について,Clock遺伝子に着目して研究を行ってきた。当該研究においては,時計分子であり,同時に転写因子であるCLOCKの転写活性を抑制する時計分子PRERIOD2の役割と機能についての班究を行った。我々は,period2の過剰発現マウスを用いて,高脂肪食を負荷した際の糖・脂質代謝系への影響を調べ,PERIOD2が過剰に発現している場合においても,体重の増加や血中脂質濃度の増加には影響がなく,糖負荷試験による耐糖能にも野生型マウスとの差異は認められないことが判明した。その一方で,肥満に伴う血栓傾向については,PERIOD2の過剰発現によって有意に抑制されることが判明し,時計分子は,肥満に伴う血栓傾向に対して,代謝系への影響とは独立して,直接的に関与している可能性が示された。脂肪酸代謝系のマスターレギュレーターである核内受容体PPARaと体内時計との関連について解明する目的で,PPARaのリガンドであるフィブレートを慢性的にマウスに投与し,活動リズムに及ぼす影響についての検討を行った。その結果,フイブヒート投与による活動リズムの変化は,光周期依存的であり,明期が長い長日環境下においては,活動位相の前進が顕著であるのに対して,暗期が長い短日環境下においては,活動位相の前進がほとんど認められないことが判明した。体内時計には,外界の明暗周期の変化(季節)に同調する性質があることが知られていたが,われわれの研究結果より,PPARaが,体内時計の光周期への同調機構に関与している可能性が示された。申請者らはこれまで、時計遺伝子Clockが、肝臓での脂質代謝系(特に脂肪酸代謝)に関わっている可能性を報告してきた。当該研究では本年度、個体レベルでの脂質代謝系におけるClock左遺伝子の役割を明らかにする目的で、脂肪細胞から分泌される食欲抑制ホルモンであるレプチンの欠損したob/obマウスと時計遺伝子Clockの変異マウスを交配し、Clock遺伝子の変異した肥満モデルマウスを作成した。申請者らはこれまで、ICR系統のマウスでは、Clock遺伝子の変異によって、高脂肪食負荷に伴う肥満が抑制されることを報告してきたが、今回のob/obマウスとの交雑実験の結果、C57BL/6とICR系統の遺伝的背景を有するマウスでは、Clock遺伝子の変異によってレプチン欠損に伴う肥満が促進されることが判明した。さらにCTスキャンによる体脂肪分布の解析から、このClock変異マウスでは、皮下脂肪よりもむしろ、メタボリックシンドロームに特徴的な内臓脂肪の選択的蓄積が認められた。脂肪細胞の肥大化について調べたところ、個体レベルの肥満度を反映して、ICR系統ではClockの変異によって肥大化が抑制される一方、C57BL/6系統では、Clockの変異によって脂肪細胞の肥大化が促進されることが判明し、脂肪細胞のサイズの変化は、個体レベルでの脂質代謝を反映しているものと考えられる。メタボリックシンドロームや関連する肥満や糖尿病などの病態においては、血栓傾向となることが知られている。申請者らは、血液の凝固線溶系律速因子であり、その血中濃度に顕著な日内リズムが認められる線溶系阻害因子PAI-1に着目して、時計遺伝子との関連についての研究を行った。マウスにおける血液の凝固線溶因子の遺伝子発現、タンパク質発現、活性について日内変動を調べ、時計遺伝子Clock及びCry1/2の変異マウスとの比較を行った。その結果、線溶系因子の内、顕著な日内リズムを有しているのはPAI-1のみであり、その日内リズムは、遺伝子の転写レベルで時計分子によって制御されている可能性が示された。更に申請者らは、培養細胞を用いた研究により、時計分子CLOCKが直接結合してPAI-1遺伝子の発現を制御している領域の同定に成功した。さらに前述のob/obマウスとClock遺伝子変異マウスとの交配実験により、肥満に起因した血栓傾向には、時計分子CLOCKが重要な役割を担っており、CLOCKの変異したマウスでは、レプチン欠損による肥満が促進されたのにもかかわらず、血液中のPAI-1抗原量は低値を示し、血栓傾向が認められないことが判明した。

体内時計には,外界の明暗周期の変化(季節)に同調する性質があることが知られていたが,われわれの研究結果より,PPARaが,体内時計の光周期への同調機構に関与している可能性が示された。
光散乱による乱れた液晶の構造と秩序回復過程

これまで、液晶の構造を力学的に乱すと白濁が強まり、どの液晶でも散乱強度の増加は通常のレイリー散乱や静置した液晶の光散乱とは異なり、光の波長が長いほど大きいという興味深い現象を見い出した。本年度はサーモトロピック液晶(ZLI-1132、MBBA)の他に、末端のアルキル基の長さだけが異なるMBBAとEBBAの混合液晶の構造を機械的に乱して紫外・可視・近赤外領域の濁度スペクトルを測定した。このスペクトルの解析結果は回折格子の切りかえによるバックグラウンドの変化に依存することが分かり、その修正を行った。一方、濁度の時間変化からまた緩和の時定数を測定した。入射光が液晶中の2点(2ケ所の回位)で散乱し、互いに干渉すると考え、2点間の間隔を一定として散乱強度の理論式を導いた。どの液晶でもこの式で全散乱断面積の波長依存性をよく説明することができた。次に、液晶の回位の距離の分布にガウス分布を仮定して、全散乱断面積の波長依存性から分布の中心位置(平均距離)と標準偏差を求めた。測定値は液晶に依存するので乱れた液晶の構造を反映していると考えられる。平均距離がドメインの大きさを表わすと考えて、平均距離と緩和の時定数とから、細分化したドメインの修復過程について検討した。実験データはドメイン中で細分化したドメインが時間とともに消滅していくと考えるとよく説明される。この結論は妥当であるので、平均距離とドメインの大きさとの関係の理論的導出を検討した。種々の有機物を混合して測定した濁度の変化は液晶分子と溶質分子の形状の類似性、官能基で分類することができた。3種類のサーモトロピック・ネマチック液晶(MBBA、E8、ZLI-1167)を用いて、平衡状態にある純粋液晶と力学的に構造を乱した液晶の紫外から近赤外領域のスペクトルを紫外・可視・近赤外分光光度計を用いて測定し、濁度(光の全散乱断面積)の波長依存性を調べた。液晶の散乱が強いため、この測定には主として光路長1mmの石英セルを用いた。液晶の構造を乱すために、空のセルに注射器より液晶を注ぐ、栓つきセルに液晶を入れて振る、撹拌するなどの手段を用いた。液晶の構造を力学的に乱すと白濁が強まったが、これは散乱強度の増加によるものである。どの液晶でも散乱強度の増加は光の波長が長いほど大きいことが観測された。この波長依存性は通常のレイリー散乱や静置した液晶の光散乱とは反対で興味深い現象である。最初に、入射光が液晶中の2点(2ケ所の回位)で散乱し、互いに干渉すると考え、2点間の間隔を一定として散乱強度の理論式を導いた。この式で全散乱断面積の波長依存性をかなりよく説明することができた。次に、液晶の回位の距離の分布にガウス分布を仮定して、MBBAの場合の全散乱断面積の波長依存性から分布の中心位置(平均距離)と標準偏差を求めたところ、標準偏差が小さいことがわかった。現在、この結果を細分化したドメインのサイズ分布に関連させる理論的方法を検討中である。MBBAについて、濁度の時間変化より構造緩和の時定数を求めたところ、時定数の異なる2つの緩和過程が見い出された。
３テスラＭＲＩを用いた子宮筋腫の術前シミュレーションモデルの作成

本研究は,3T-MRIで撮像された子宮筋腫を有する子宮MRI画像を用いて3D画像を作成し,子宮筋腫の術式選択や手術支援ナビゲーションを目的とした術前シミュレーションモデルを構築することを目的としている.はじめに子宮筋腫の精査目的で3T-MRIが施行された症例において3D-T2強調TSE像(VISTA)を取得した.現在までに30症例以上の画像データを取得済みであるが,この中で初期に取得した4症例の画像データをサンプルデータとして3D画像の作成を試みた.子宮の周囲には,膀胱・腸管・卵巣などの臓器が隣接しており,子宮筋腫と子宮筋層の境界を認識することが容易でない場合があるため,全自動で輪郭を抽出することは難しい.このため,まず子宮と子宮筋腫を合わせた全体の領域,子宮筋腫の領域,子宮内膜の領域を用手的に輪郭抽出した(Manual Segmentation).この中で子宮内膜は強い高信号を示して認識が容易であるため,Medial Representationを用いた子宮内膜を半自動で抽出できるプログラムを作成中である.取得したボリュームデータを用いて3D画像を作成した.抽出した子宮筋層,子宮筋腫,子宮内膜の領域にそれぞれ色付けして視認性を高めたが,子宮筋層は透過性の高いスケルトン表示することで,その中に存在する子宮筋腫と子宮内膜の位置関係が明瞭となった.3D画像はさまざまな角度から評価できるため,開腹手術,腹腔鏡手術,子宮鏡手術などのさまざまな手術に対応した視野を想定して,術者のニーズに応える画像を提供することができると思われる.【目的】我々は3テスラMRIを用いて子宮筋腫の3D画像を作成し,手術計画における3D画像の有用性を検討した。【対象と方法】子宮筋腫を有する10名の患者に3テスラMRIを用いて3D-T2強調TSE矢状断像(Volume ISotropic TSE Acquisition:VISTA)を撮像した(1,800/205msec [TR/TE], 512×512 matrix, slice thickness/gap:2/0mm)。撮像された2D画像(矢状断像)から,用手的に子宮全体,子宮筋腫,子宮内膜を輪郭抽出し,子宮筋層,子宮筋腫,子宮内膜を異なる色で表示した3D画像(surface rendering)を作成した。2名の産婦人科医(婦人科診療経験年数が12年と2年)が2D画像・3D画像を別々に見て,手術法・摘出筋腫数を評価し,手術計画に要した時間を記録した。別の産婦人科医(婦人科診療経験年数が29年)が全ての画像を見て決定した手術法・摘出筋腫数をゴールドスタンダードとし,3D画像による術前計画の正確性・迅速性を2D画像と比較した。【結果】手術計画に要した時間[観察者1:19.7±9.5 vs 10.4±5.1秒(p < 0.05),観察者2:47.5±12.3 vs 12.3±4.0秒(p < 0.01)(2D vs 3D)]は,2D画像に比べて3D画像で有意に短縮した。術式の正解率[観察者1:50% vs 70%,観察者2:70% vs 70%(2D vs 3D)],摘出個数の正解率[観察者1:70% vs 80%,観察者2:70% vs 80%(2D vs 3D)]は,いずれも2D画像に比べて3D画像で軽度上昇した。【結論】3D画像は手術計画の正確性を下げることなく,術前評価に要する時間を短縮できた。3D画像は産婦人科医の負担軽減に寄与することができる。医歯薬学我々は平成25年度中の達成目標に以下の2項目を設定していた.[1]画像データの取得(子宮筋腫術前の症例の骨盤部を3T-MRIで撮像して,3D画像を作成するためのボリュームデータと比較対象の2D画像の両者を取得する.)[2]画像データの処理(取得したボリュームデータを用いて3D画像を作成する.その際,正常の子宮筋層と子宮内膜,子宮筋腫を色分けして表示したり,手術中の視野に近い角度で表示したりする.また,子宮内膜と子宮筋腫の最短距離を自動的に計測,表示するプログラムを作成する予定である.)[1]の画像取得,[2]の3D表示は達成できており,「おおむね順調に進展している」と評価した.今後は輪郭抽出の半自動化(抽出の時間短縮),3D画像の精度向上が最大の課題となる.子宮以外にも骨盤を形成する骨や筋肉も同時に表示することで,骨盤内における子宮の位置認識が容易となることが予測される.またモニター上に3D画像を表示するだけでなく,3Dプリンターを用いて立体モデルを作成することで,より術者に役立つ情報を提供できる可能性がある.一方,子宮内膜と子宮筋腫の最短距離を自動的に計測,表示するプログラムの作成には挑戦中である.平成26年度中の達成目標である,[3]臨床的有用性の検討(3D画像を用いた術前シミュレーションモデルを子宮筋腫の術式選択や手術支援ナビゲーションを目的として利用した際の臨床的有用性を統計学的に立証する.)を最終目標として研究を進めていきたい.平成25年度中に本研究の初期結果を学会で報告する予定であったが,平成25年度の年度末に3D画像を作成する段階に至ったため,平成25年度中に学会で報告ができなかった.このため学会発表に関わる旅費などは平成26年度に持ち越すことにした.

まず平成26年度の前半に画像データの処理(3D画像の作成)について学会で報告する予定である.学会報告と平行して研究を進め,平成26年度の後半に臨床的有用性の検討について学会で報告する予定である.
大腸菌増殖定常期および緊縮応答時に特異的なσ因子、σ^<38>の発現調節

(1)rpoS遺伝子の発現はこれまでに、転写、翻訳、翻訳後の蛋白質安定性の少なくとも3段階で制御されていることが知られている。ppGppを欠く大腸菌株(ΔrelA、ΔspoT)においては、菌体内にRpoS蛋白質が蓄積しないことが知られている。その分子機構を調べるため、rpoS遺伝子上流部分にlacZ遺伝子を連結し、転写および翻訳レベルでの融合遺伝子を作製、ラムダファージを利用したベクターを用いて1コピーで染色体上に導入した。その結果、ppGppを欠く株において、rpoS遺伝子の転写活性が90%程度低下していることが明かとなり、少なくともppGppがrpoS遺伝子の転写を正に制御していることが判明した。これはrpoS遺伝子の主要な転写を司るP2プロモーターが、ppGppにより正に制御されるヒスチジン合成系のプロモーターと相同性を示すこととよく一致した。(2)RpoS遺伝子産物を含むRNAポリメラーゼホロ酵素(Eσ^<38>)のプロモーター認識特異性について、様々な改変プロモーターを用いたin vitroにおける解析を行なった。その結果、Eσ^<38>がとEσ^<70>同様の-10コンセンサス配列を認識することが明らかになった。即ち、TATAATをコンセンサスとするプロモーター配列は、これら2種のホロ酵素により共通に認識される。
動脈硬化の見える化：血管内皮・平滑筋機能の独立計測による動脈硬化進行度の定量診断

動脈硬化の超早期診断を目的とし,血管内皮,平滑筋機能の健康度を独立で評価する方法を検討した.平滑筋は伸展させると収縮するという性質(ベイリス効果)があり,本研究ではこれを平滑筋の健康度と位置付けた.血管内皮機能計測は既存のFMD法を用い,平滑筋機能は試作した計測システムを用いてチョッパ陰圧負荷に対するヒト上腕動脈の能動収縮として計測した.その結果,従来法でのステップ陰圧負荷に比べ,より短時間で,またはより大きく血管収縮を引き起こせることが示唆された.またベイリス効果を詳細に検討するための動物モデルを構築した.提案した平滑筋機能評価法と動物モデルは動脈硬化の診断法の開発に有用であると考えられた.動脈硬化を超早期段階で発見するため血管の内皮細胞(以下EC)と平滑筋細胞(以下SMC)の機能を非侵襲で評価する新技術の開発を行った.既存のEC機能評価法であるFMD (Flow-mediated dilation)法に,本研究で提案するSMC機能評価法であるチョッパ圧負荷PMC (C-PMC, Chopped-pressure mediated contraction)法を組み合せ,ECとSMCの機能を独立に計測する.SMCは伸展させると収縮する性質(ベイリス効果)があり,C-PMC法ではこれをSMCの健康度と位置付けた.まずC-PMCシステムによりベイリス効果を効果的に惹起するチョッパ圧条件を検討した.また,動物モデルでFMDを再現し詳細に検討するための実験環境を構築した.C-PMCについては,血管拍動に同期したチョッパ陰圧を用いた.その結果,従来法でのステップ陰圧負荷時間である2分間に対し,チョッパ陰圧負荷30秒でも同程度の血管収縮が生じること,また従来法と同じ2分間のチョッパ陰圧負荷ではより大きな血管収縮が生じること等が確認された.さらにC-PMCでは圧除荷時の超音波画像取得により,従来法で問題とされた圧負荷時の血管移動とそれに伴う画質低下も解決できる可能性が示された.FMD再現の動物モデル構築については,麻酔下に家兎総頸動脈を露出してFMD応答を再現した.これを用いて観察されるFMD応答がEC機能によるものかを確認するために物理的ダメージとして圧平を施し,圧平前後のFMD応答を計測した.その結果,圧平後はFMD応答が減弱した.また計測後にこの血管を摘出し,走査型電子顕微鏡で血管内腔を観察した結果,ECの部分的な剥離や形態変化などが観察され,圧平後のFMD応答減弱がECの受けたダメージによる可能性が示唆された.今後,動物モデルでのC-PMCの検討が必要である.動脈硬化の超早期診断を目的とし,血管内皮,平滑筋機能の健康度を独立で評価する方法を検討した.平滑筋は伸展させると収縮するという性質(ベイリス効果)があり,本研究ではこれを平滑筋の健康度と位置付けた.血管内皮機能計測は既存のFMD法を用い,平滑筋機能は試作した計測システムを用いてチョッパ陰圧負荷に対するヒト上腕動脈の能動収縮として計測した.その結果,従来法でのステップ陰圧負荷に比べ,より短時間で,またはより大きく血管収縮を引き起こせることが示唆された.またベイリス効果を詳細に検討するための動物モデルを構築した.提案した平滑筋機能評価法と動物モデルは動脈硬化の診断法の開発に有用であると考えられた.本研究では動脈硬化の進行度を超早期段階から定量的に示す「動脈硬化の見える化」を目指し,血管内皮細胞と平滑筋細胞の機能を非侵襲で詳細に評価する新規技術の開発を行う.内皮機能の代表的評価法であるFMD (Flow-mediated dilation)法に,本研究で新規に提案する平滑筋機能評価法であるチョッパ圧負荷PMC (C-PMC, Chopped-pressure mediated contraction)法を組み合せることによって,内皮と平滑筋機能の両方をそれぞれ独立に計測可能とする.平滑筋は伸展させると収縮するという性質(ベイリス効果)があり,C-PMC法ではこれを平滑筋の健康度と位置付けて計測対象とする.そして,2つの方法で得られた測定結果を比較検討することで,FMDのみの検査に比べ,遙かに定量的な動脈硬化の超早期段階の診断を可能とするとともに,動脈硬化の発生・伸展プロセスに関する新たな知見を得ることを目的とする.本年度はベイリス効果を誘起するためのC-PMCシステムの設計・試作と,ベイリス効果やFMDを詳細に検討するための動物実験モデル構築を検討した.C-PMCシステムについては,ベイリス効果を効率的に誘発・測定することを設計指標として設計と試作を行った.ベイリス効果の効率的な刺激を検討するためには圧波形の立ち上がりや応答性の正確さが求められるので,実際の圧波形を測定・評価し,C-PMCシステムの性能を確認した.ベイリス効果を動物で再現するためのモデル構築については,ヒトと同様にベイリス効果やFMD応答を再現できるように実験環境を調整した.構築した動物実験モデルに対しFMD測定を行った結果,ヒトと同様のFMD応答を再現できる可能性が示唆された.本年度においては主な検討課題として以下の二点に取り組み,おおむね予定通りの達成度が得られたため.(1)C-PMCシステムの設計と試作および特性評価ベイリス効果を効率的に誘発する条件を探索することを設計指標とし,C-PMCシステムの設計と試作を行った.

空圧回路部分のハードウェアとして真空ポンプ兼コンプレッサ,タンク,3方向ソレノイドバルブ,デジタルレギュレータ等を用い,これらをプログラムにて制御を行うことにより,陽圧,陰圧負荷によるチョッパ圧負荷を可能とした.ベイリス効果を効果的に誘起する条件を検討するためには,圧波形の立ち上がりや応答性の正確さが求められるので,実際の圧波形を測定したところ,十分な性能であることを確認した.今後,計測を行いつつハードウェア・ソフトウェアの問題点を明らかにし,システムの改良を継続的に行ってゆく.(2)ベイリス効果を効率的に誘発するチョッパ圧負荷条件の最適化ベイリス効果を動物で再現するため,実験モデルについて検討した.家兎(体重2kg程度)の頸動脈を対象とし,麻酔下で血管を周辺組織から剥離・露出させ,血管周囲の温度維持や希薄濃度のノルアドレナリンを用いる等の実験環境を整えることにより,ベイリス効果を再現できる可能性が示唆された.また,この露出した血管を対象に圧力負荷を行う小型デバイスを試作した.基礎実験として本動物実験モデルの血管に対し,圧力負荷デバイスを用いて血管を駆血してFMD測定を行った結果,ヒトと同様のFMD応答を再現出来たと考えられた.また,内皮細胞へ物理的なダメージを与えた血管においてはFMD応答が消失することが観察され,本モデルが内皮細胞の健康度を計測できる可能性が示唆された.(1)上腕密閉用チャンバの試作被験者の上腕動脈にチョップ圧刺激を負荷をするための密閉用チャンバを試作する.試作したチャンバをC-PMCシステムに接続し,内部の圧力を制御することでチョップ圧負荷を実現する.また,チャンバ内部に多次元アクチュエータを実装し,これに超音波プローブを固定することによって気密を維持したまま,高い自由度でプローブの位置調整を可能とする.この超音波画像より血管径を求め,C-PMC/FMD測定を行う.(2)健常者でのC-PMC/FMD測定(基礎データ蓄積)ベイリス効果を効率的に誘発する圧負荷条件を最適化しつつ,健常者ボランティアに対するC-PMC測定を行い測定データを蓄積し,解析を行う.また内皮機能検査として広く用いられているFMD測定も行い,C-PMC測定値と比較することにより内皮機能と平滑筋機能の関係について検討する.さらに,それぞれのデータに対し,個人差,年齢差,性差や日/週/月内変動等に関して解析を行うことにより,健常者のC-PMC/FMD測定における標準値に関して考察を行う.(3)ベイリス効果を効率的に誘発するチョッパ圧負荷条件の最適化検討してきた動物実験モデルと圧負荷デバイスを用い,効率的な圧負荷条件を探索する.家兎の総頸動脈を麻酔下に露出し血管外部から圧負荷デバイスを用いてチョッパ圧刺激を負荷し,血管径変化を光学的に計測することにより刺激パターンとベイリス効果について検討する.さらにFMD測定も行い,C-PMC測定値との関連性を検討し,動脈健康度の検証に有用なモデルの開発とデータ蓄積を進めてゆく.次年度の研究計画に則り設備備品として,上腕密閉用チャンバ試作費用を計上し,このチャンバ内へ超音波プローブを装着するための多次元駆動用アクチュエータ・サーボモータ一式を購入予定である.また,消耗品として,実験動物,動物実験用試薬類,空圧回路部品,電子回路部品等を購入予定である.
大腸菌シャペロニンの機能発現の速度論

分子シャペロンの作用の分子機構の研究は、物理化学的な試験管内蛋白質フォールディングと細胞内での生命現象との関連を解き明かす鍵となる基礎生物科学の重要な課題である。本研究では、ストップトフロー蛍光スペクトルとストップトフローX線小角散乱の速度論的手法を用いて、(1)シャペロニンGroELのATPによるアロステリックな構造転移を構造学的に検証する、(2)プロリンを含まぬ疑似野生型スタフィロコッカル・ヌクレアーゼ(SNase(pro-))の変異体を標的として用いて、標的蛋白質の巻き戻り速度過程に及ぼすGroELの影響を解析する。以下の結果が得られた。(1)ストップトフローX線散乱法によりGroELのアロステリック転移(T状態よりR状態値の転移)の速度過程を直接観測することに初めて成功した。反応速度定数は5°Cで3-5 s^<-1>であり、これはストップトフロー蛍光スペクトルにより観測したトリプトファンTrp挿入変異体(Y485W)の第二相の速度定数と同じであった。(2)上の結果より、蛍光スペクトルで観測された第一相はT状態への非協同的なATPの結合、第二相がT⇔Rのアロステリック転移であることがわかった。速度論的アロステリックモデルを用いてすべての結果を合理的に説明することができた。T状態、R状態、及び、アロステリック転移の遷移状態におけるATPの結合定数や速度論的パラメータが定量的に明らかになり、遷移状態の構造がR状態の構造に近いことがわかった。(3)ストップトフロー蛍光スペクトルを用いて、SNase(pro-)にA69Tの変異を導入した変異体の酸変性状態からの巻き戻り反応をGroEL非存在下と存在下で行い、両者を比較した。GroEL存在下では巻き戻り反応がGroELと結合したまま進行し、SNaseのフォールディングのエネルギー地形そのものがGroELとの結合により変わることが明らかとなった。この結果は分子シャペロンであるGroELが標的蛋白質のフォールディングエネルギー地形を変えることを直接示した最初の例である。