hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
Warburg効果調節新規がん遺伝子PTBP1の機能解析による胆膵腫瘍病態の解明

膵癌細胞株2種(MIA PaCa-2、PANC-1)でPTBP1をノックダウンし、RNAシーケンスを施行した。解析結果より、PTBP1ノックダウンにより共通の挙動を示すmRNAを網羅的に解析した。同定した標的遺伝子に関して蛋白発現をウェスタンブロッティングで解析した。また、バイオインフォマティクスを用いて、PTBP1及び、標的遺伝子の正常組織における発現プロファイルや全がん種における発現変化を解析した。また、CRISPRーCas9でノックアウトした際の致死率などを解析した。膵がん手術サンプルから癌部、非癌部の検体を採取し蛋白を抽出した。Western blotting法(WB法)を用いて、PKM2、PTBP1、KRASの蛋白発現を解析した。多くの症例でPTBP1、PKM2、KRASの発現が亢進していることを確認した。更に免疫組織学的染色にてPTBP1、PKM2の発現を解析した。PTBP1はスプライサー遺伝子であり、非癌部に比して癌部の核において特に発現が亢進していた。PKM2は主に癌部の細胞質で発現が亢進していること見出した。更に、PTBP1をsiRNAによりサイレンシングし細胞増殖に与える影響を確認した。PANC1、MiaPaCa2、BxPC3など数種の膵がん細胞株にsiR-PTBP1を導入し、PTBP1のGene Silencingに成功した。全ての細胞株で、細胞増殖抑制効果を認めた。またこれまで他の癌種で認めていたのと同様に、PKMアイソフォームの発現が癌で優位なPKM2からPKM1へと移行していることが確認された。更にオートファジーのマーカーである、LC3の発現が、LC3IからLC3IIへ移行していた。PTBP1のサイレンシングによりPKMアイソフォームの移行が生じ、短期間での急激な代謝経路の変化により一部オートファジーを誘導する可能性が示唆された。現在、PTBP1の発現が上昇する機構をmicroRNA(miRNA)の観点から解析している。具体的なmiRNAの選定はこれまでPTBP1の発現を調節することが明らかとなっていた、miR-124, -133bに焦点を当て、研究を進めている。膵がんの手術症例数が律速の要因である。進行がんに関しては、術前の放射線化学療法を実施するため手術サンプルが採取しにくいことが挙げられる。またIPMNなどの嚢胞性疾患からは、検体の採取が困難であることが改めて明らかになった。前年度に引き続き、膵癌細胞株でPTBP1をノックダウンした際の遺伝子発現を中心に実験を施行した。膵癌の発癌に大きく寄与するKRASに着目し解析を進めた。PTBP1ノックダウンにおけるKRAS蛋白発現をウェスタンブロッティング法で検討した。一部の細胞株でKRAS発現が抑制されたが細胞株間で異なり、一貫した現象を得ることはできなかった。PTBP1は選択的スプライシング以外にもRNAの安定化などにも関わるため、PTBP1ノックダウンによるKRASのmRNAレベルをRT-PCR法で解析した。しかし、タンパク発現と同様に細胞株間で一貫した有意な発現低下を得ることが出来なかった。各種miRNAの導入実験ではPTBP1を調節するmiRNAとしてMIR124が有望であることが示唆された。また他のプロジェクト研究からPTBP1を調節するある種のmiRNAが膵臓に高発現している可能性が示唆され、膵臓特異的microRNAを同定することを目標に現在検証を進めている。一方で、臨床検体からのサンプリングが術前より集学的治療が施行されており思い通りに進まなかった。次年度はCancer Studyのデータセットを用いて多くの症例のデータを解析し、膵臓癌におけるPTBP1、PKM2の関連性をより明らかにすることでWarburg効果への影響を明らかにする。現在既に、一部検討を開始している。また、PTBP1をノックダウンした場合の効果をmRNAアレイ解析により網羅的に検証することを計画し一部開始している状況である。最も大きな要因は、臨床検体で進行癌に対しては術前化学療法などが施行されており臨床検体が採取しにくいことが挙げられる。嚢胞性病変お臨床検体獲得は性質上困難であることが実行し改めて明らかとなった。また、本年度は研究時間を捻出することがやや困難であった。また実験結果も予測通りには出ず、方針の再考が必要である。先ずは、疾患の焦点を膵がんに絞って深く追及する。手術検体の収集が困難な際は、細胞株での実験を中心に施行していく。IPMNやIPMCに関しては疾患の主病態である粘液中の遺伝子産物にも着目する。臨床検体数を補完するためにTCGAなどのCancer Studyデータセットを用いる。またこれまで報告してきたPTBP1標的遺伝子であるピルビン酸キナーゼ以外の遺伝子(特にアイソフォームを取る遺伝子)に対する影響をmRNAアレイを用いて網羅的に解析する計画である。

また、膵嚢胞性腫瘍に関しては臨床検体が採取困難であるため、病理薄切組織を使用し免疫染色で検討を進めることを計画している。また嚢胞液体成分中のマイクロベジクルやエキソソームなどに研究を展開出来ないかを模索する。また時間の捻出に関しては本年度より1名大学院生を確保した。実験を集中的に施行し本年度の遅れをカバーする。また次年度、これまでの成果をまとめ論文として発信する計画である。本年度随時更新予定である。実験の進行が計画と比して少し遅れているため今年度及び次年度に研究費の投入が予想されるため。また、PTBP1の調節機構をmicroRNAの観点からも解析していくため本年度を中心に試薬の投入が必要になると考えられる。実験の進行が計画と比して遅れており、次年度に研究費を集中的に投与して結果を出すため消耗品を中心に次年度に研究資金がかかる。また、論文化を目標とするため、英文校正費用や、論文掲載料も次年度発生すると考えられる。具体的な資金の比較的必要な追加実験としてはmRNAのアレイ解析が挙げられる。本年度は細胞株の実験を中心に遂行していく。更にPTBP1の発現制御機構を明らかにしていく。ワーバーグ効果関連遺伝子と膵がん発がん遺伝子(KRASなど)との関連にも着目し、より深く病態を明らかにしていく。
トモグラフィー計測による非沈降性スラリー撹拌槽における固気複合分散相状態の解明

通気撹拌操作による槽内の気泡通過経路と液流動状態から撹拌槽におけるスラリー系塑性流体の混合促進機構ついて検討した。操作条件とくに翼回転数によって気泡通過経路は大きく3つに分けられることがわかった。トレーサを槽に注入し、これを経時的にサンプリングした実験データを元に混合数理モデルを用いて気泡同伴液流量を算出し、液流動状態を定量的に明らかにした。混合指標を定義し、気泡同伴液流量とカバーン体積から混合時間を算出する見通しを得た。また電気抵抗方式トモグラフィを用いて計測・算定した気泡通過径路は、目視観測による結果と良く合致した。電気抵抗方式トモグラフィー計測システムを英国ITS社から導入した。槽径0.2mの撹拌槽における降伏応力を有する光透過性カルボキシビニルポリマー水溶液を対象に、槽底からリングスパージャーを用いて通気したさいの槽内の気泡分散状態を同システムを用いて計測した。翼には、通気系に汎用される直径0.1mの6枚コーンケーブ翼を用いた。翼回転数の違いによる気泡分散・上昇状態の相違を検討し、ビデを観測の結果と良好に一致することを確認した。ついで、翼を直径0.1mの6枚垂直パドルに変え、同撹拌槽内における水酸化ナトリウム水溶液を対象とし、槽底に堆積させた平均直径1.2mmのポリスチレン粒子が、撹拌翼の回転とともに槽中心部翼下付近の上昇流とともに浮遊していく過程を翼下水平断面でトモグラフィー計測し、ビデオ観察の結果とほぼ良好に一致することを確認した。英国ITS社から導入した電気抵抗方式トモグラフィー計測システムの稼働テストを引き続き遂行している。ITS社の計測システムの中身がブラックボックスに近いため、分散相の画像を再構成するために必要となる感度行列を自前で構成することに注力している。これとは別に、光透過性の降伏応力流体であるカルボキシビニルポリマー水溶液に通気をした際の混合促進効果につき、槽外部からの観察と塩化カリウム水溶液をトレーサとして槽内カバーン領域に注入し、カバーンの内外で経時的にサンプリングをすることにより検討した。通気気泡によりカバーン外へ持ち出される流体の状況(流量と循環方向)を数学的モデルを用いて定量化したところ、回転数の増大に伴い3パターンに変化することを明らかにした。またカバーン外での流体循環時間と混合達成時間とを定義し、後者は前者の約3倍となることを明らかにした。これらの研究成果は、この9月に英国マンチェスターで開催されるIWPI2016にて発表する予定である。さらに同降伏応力流体の撹拌槽におけるカバーン形成状況を2点電極法により簡便に定量化することを試み、可視化実験の結果と照合することで同計測法の妥当性を検証した。この研究成果は、この8月に京都で開催予定の日本混相流学会年会で報告する予定である。市販の計測システムの立ち上げに時間を要している。同システムは電位差データを取得することのみに使用し、画像の再構成は、自前で遂行することを視野に入れ始めた。撹拌槽において、小型翼を用い降伏応力を有する塑性流体を撹拌するとき、翼廻りにのみ流動領域が生じ、その外側は静止したままの混合不良な状況が発生する。この流動領域は、その形状からカバーン(洞穴)と呼ばれている。平成27年度に、撹拌槽における塑性流体の通気操作による混合効果の促進機構につき、槽内に電解質溶液を注入し、これをトレーサとして追跡する手法を用いて検討した。通気量を一定として翼回転数を変えて、槽内液をサンプリングし、槽内におけるカバーン内外の3つの部位でのトレーサ濃度の経時変化を得た。この結果を基に、数学モデルを立てることにより、通気された気泡の通過経路ならびにその量に付き、定量化を行った。これより、低回転数では、気泡は、主にカバーンの外側をそのまま通過すること、中回転数では、気泡は一旦、カバーン内の翼に捕捉され、その後、軸廻りを上昇し、これによって生じる槽縦断面における液循環流は、槽の中心側から槽壁側の向きであること、さらに高回転数になると、一旦翼に捕捉された気泡は、翼から水平方向に吐出され、これによって生じる液循環流液は、中回転数領域とは逆に、槽壁側から槽中心への向きとなることを明らかにした。平成28年度は、同じ装置系を用い、電気抵抗方式トモグラフィー計測手法により、回転数の違いによる各水平断面での気泡含有率(ボイド率)を算定した。その結果、前年度のサンプリング手法による回転数の違いによる気泡の通過経路の相違を裏付けることに成功した。トモグラフィー計測システムを立ち上げ、腑に落ちるデータを取得するまでに、種々の校正を試みる必要があり、時間を取られたために遅れを生じた。撹拌槽において、小型翼を用いて降伏応力を有するスラリー系流体を撹拌するとき、翼廻りにのみ流動が生じ、翼から離れた領域では、静止状態となる淀み領域が発生し、流動・混合不良の状態となる。槽底部から通気をすることにより、この状態を改善する操作を検討し、一昨年度は、電解質溶液をトレーサとしたサンプリング手法により、翼回転数や通気量等の操作条件と混合促進の関係を定量的に検討した。また昨年度は、電気抵抗方式トモグラフィー計測法を用いて、同系における気泡の通過経路につき混合促進メカニズムの観点から検討を行った。

本年度は、研究の方向性を少し変えて、撹拌槽内における遷移域から層流場までの流動状態につき、PIV(Particle Image Velocimetry)とCFD(Computational Fluid Dynamics)を用いての計測ならびに解析を行った。両手法による半径方向速度の結果を照合したり、動力値の両結果ならびに既存の相関式から算定した結果と照合したりして、両手法の信頼性・妥当性を検証した。流動状態に関しては、層流から遷移域に移るに従い、流体の吐出が、羽前面から背面にシフトすることを明らかにした。遷移域においてもCFDにより動力値は、既存の相関式の値を良く再現するできることを明らかにした。一方、PIVの結果は。翼先端から離れた位置での吐出流量が算出不可となるため、実測値と比較して、過大な値となった。これらのことは、今後、スラリー流体のレオロジー特性である非ュートン塑性流体を流動解析していく上での素地となるものであり、その前段階を整えることができた。通気撹拌操作による槽内の気泡通過経路と液流動状態から撹拌槽におけるスラリー系塑性流体の混合促進機構ついて検討した。操作条件とくに翼回転数によって気泡通過経路は大きく3つに分けられることがわかった。トレーサを槽に注入し、これを経時的にサンプリングした実験データを元に混合数理モデルを用いて気泡同伴液流量を算出し、液流動状態を定量的に明らかにした。混合指標を定義し、気泡同伴液流量とカバーン体積から混合時間を算出する見通しを得た。また電気抵抗方式トモグラフィを用いて計測・算定した気泡通過径路は、目視観測による結果と良く合致した。市販のトモグラフィー計測システムを導入したが、画像再構成等の具体的な計算手法やプログラムが開示されていないため、基本的な校正実験から始めたため。光透過性の降伏応力流体から、光不透過性のスラリー系流体への展開を成し遂げたい。スラリー系では、光学的可視化法は、適用不可となるため、多点電極法や、電気抵抗トモグラフィー計測法を掌中に収め、検討していきたい。平成28年度は、光透過性塑性流体への通気で終了したが、平成29年度は、光不透過性スラリーへの展開や、液ー液2相流における分散・混合過程への展開を試み、次の研究に繋がる成果を上げることに注力したい。29年度が最終年度であるため、記入しない。化学工学校正実験を進め、トモグラフィー計測結果を定量的なデータとして取得する方法を確立する。前年度に実施した実験系をアドヴァンスさせて光不透過性のスラリーを対象として実施する。検証実験としては、2点電極法によるものを検討する。X線トモグラフィー計測に関しては、予算的に実施が困難であるため、平成27年度から開始の挑戦的・萌芽研究の中で行う。年度末の大阪・関西大学への出張旅費で使い切ることができず、4万円弱の繰越金が生じた。平成28年度末の装置改良の発注が間に合わず、17万円弱の繰越金が生じた。次年度に(株)大菜技研からレオメータを購入する予定であるが、予算の大半をこれに充てねばならず、次年度、研究を遂行するための経費が逼迫すると予想されるためため、次年度の使用に繰り越した方が良いと判断したから。平成28年度の物品費もしくは旅費に加算して使用する。平成29年度の物品費もしくは旅費に加算して使用する。次年度、研究を遂行するための試薬等の消耗品代として使用する計画である。
NMRを用いたタンパク質分子に内在するダイナミックスと機能発現の研究

我々は抗ダンシル抗体を酵素消化することにより得られるFvフラグメントを用いて,抗原認識機構の高次構造解析を行ってきた.昨年までのNMR,および速度論的手法を中心とする解析により,抗ダンシルFvの抗原結合部位を形成しているH3ループは,ハプテン非存在下において2種類のコンホメーションをとり,16(s^<-1>)の平均交換速度で移り変わっているが,ハプテン存在下では1種類のコンホメーションに収束することを明らかにしてきた.本年度は,抗原結合部位の示す動的構造と機能の相関について,より深い理解を得るために,抗ダンシルFvの大腸菌発現系の構築・部位特異変異体の作成を行い,それらの安定同位体標識NMRおよび蛍光測定法による解析を進めた.抗ダンシル抗体産生ハイブリドーマからRT-PCR法によりV_H,V_Lドメインをそれぞれコードする遺伝子を合成した.その遺伝子を個別に発現用ベクターに組み込み大腸菌発現系を構築し,V_H,V_Lを封入体として得た.次いでこれらの封入体蛋白質を変性剤存在下で等量混合し,段階的に変性剤濃度を低下させることにより,Fvを再構成した.その結果,V_H,V_Lドメイン各々1Lの培養から約3mgのへテロダイマーFvが得られた.また,ハプテンの認識に主要な役割を果たすH3ループに存在するTyr残基の部位特異変異体を作成した.蛍光測定により,得られたリコンビナントFv(WT)は,酵素消化により得られたFvと同様の結合能を有することが判明した.また,H鎖Y96F変異体(Y96F)の結合定数は,WTと比較し1/5に低下していた.Y96FのNMR解析の結果,WTで観測されていた2種類のコンホメーションに対応するNMRシグナルが,Y96Fでは観測されなかった.したがって,Tyr96の両親媒性が,抗原結合部位に存在する構造多形現象および結合能に関与していることが示唆された.我々は抗ダンシル抗体を酵素消化することにより得られるFvフラグメントを用いて,抗原認識機構の高次構造解析を行ってきた.昨年までのNMR,および速度論的手法を中心とする解析により,抗ダンシルFvの抗原結合部位を形成しているH3ループは,ハプテン非存在下において2種類のコンホメーションをとり,16(s^<-1>)の平均交換速度で移り変わっているが,ハプテン存在下では1種類のコンホメーションに収束することを明らかにしてきた.本年度は,抗原結合部位の示す動的構造と機能の相関について,より深い理解を得るために,抗ダンシルFvの大腸菌発現系の構築・部位特異変異体の作成を行い,それらの安定同位体標識NMRおよび蛍光測定法による解析を進めた.抗ダンシル抗体産生ハイブリドーマからRT-PCR法によりV_H,V_Lドメインをそれぞれコードする遺伝子を合成した.その遺伝子を個別に発現用ベクターに組み込み大腸菌発現系を構築し,V_H,V_Lを封入体として得た.次いでこれらの封入体蛋白質を変性剤存在下で等量混合し,段階的に変性剤濃度を低下させることにより,Fvを再構成した.その結果,V_H,V_Lドメイン各々1Lの培養から約3mgのへテロダイマーFvが得られた.また,ハプテンの認識に主要な役割を果たすH3ループに存在するTyr残基の部位特異変異体を作成した.蛍光測定により,得られたリコンビナントFv(WT)は,酵素消化により得られたFvと同様の結合能を有することが判明した.また,H鎖Y96F変異体(Y96F)の結合定数は,WTと比較し1/5に低下していた.Y96FのNMR解析の結果,WTで観測されていた2種類のコンホメーションに対応するNMRシグナルが,Y96Fでは観測されなかった.したがって,Tyr96の両親媒性が,抗原結合部位に存在する構造多形現象および結合能に関与していることが示唆された.
量子揺らぎを伴うサンプリングを駆使した革新的機械学習アルゴリズムの創出

量子揺らぎを用いて,組合せ最適化問題を近似的に解く手法として,量子アニーリングという手法がある.組合せ最適化問題は我々の身の回りに多く存在し,トラックの配送問題などがあげられる.近年,横磁場以外の量子揺らぎを導入することで,局所最適解から抜け出し量子アニーリングの性能が向上することが報告されている.本研究課題では量子アニーリングの次なる応用先として,機械学習における組合せ最適化問題に着目する.横磁場を超えた量子揺らぎを利用することでモデルの汎化性能の向上が見込まれる.量子揺らぎを用いて,組合せ最適化問題を近似的に解く手法として,量子アニーリングという手法がある.組合せ最適化問題は我々の身の回りに多く存在し,トラックの配送問題などがあげられる.近年,横磁場以外の量子揺らぎを導入することで,局所最適解から抜け出し量子アニーリングの性能が向上することが報告されている.本研究課題では量子アニーリングの次なる応用先として,機械学習における組合せ最適化問題に着目する.横磁場を超えた量子揺らぎを利用することでモデルの汎化性能の向上が見込まれる.
金属内包フラーレンの分子物性の分光学的研究

炭素数76から90までのランタニウム金属内包フラーレン異性体をHPLC法で分離・精製した。各異性体のESRスペクトルは多様で、g値、超微細結合定数(a値)、線幅がそれぞれ異なっている。そこで定量的な議論をするため、溶液ESRスペクトルの線幅の温度変化を測定・解析して、各ESRパラメータの異方性項を決定した。各異性体のESRパラメータ・g値・a値・核四重極相互作用定数・線幅は多様で、電子状態と分子内運動性を反映している。La@C_<82>を包摂したCuポルフィリンダイマー包摂錯体(La@C_<82>∈Cuポルフィリンダイマー)を合成し一般的なESR測定に加えてパルスESR測定(2D-Nutation測定)を行った。その結果3個の電子スピンが平行に結合して基底四重項状態が生成することが実験的に証明された。この結果は包摂錯体(M@C_<82>∈Mポルフィリンダイマー)が、フラーレン磁性超分子構築の基本構造となり得ることをはっきりと示している。ガドリウム金属イオン内包フラーレン(Gd@C_<82>)について2つのマイクロ波周波数(X-band:9.5GHz,W-band:95GHz)でESRスペクトルを観測し、典型的な高スピン状態のスペクトルを得た。これらのスペクトルは内包されるGdイオン^8S_<7/2>状態とC82ケージ^2II状態の重ね合わせで記述することができ、2つのラジカルサイトの結合は極めて弱いと結論できた。4f電子殻を持つランタノイド金属はフラーレン炭素ケージに内包される。4f殻電子物性の特異性と、新奇なフラーレンネットワークによる配位子場摂動が相まって全く新しい伝導性・磁性が期待される。そのような物性発現の根元である金属内包フラーレンの電子(スピン)構造を明らかにしてきた。この研究を通して、フラーレンネットワークに内包したランタノイド金属の新しいランタノイド化学・4f電子スピン化学への発展が強く期待できる。これまでに我々は金属内包フラーレンSc@C_<82>、Y@C_<82>、La@C_<82>、Gd@C_<82>、Pr@C_<82>、Sc_3@C_<82>を単離・精製して、電子吸収スペクトル、電子スピン共鳴スペクトル、サイクロボルタモグフを測定した。その結果それぞれの金属内包フラーレンの分子構造、電子状態、電子スピン状態、酸化・還元電位を決定した。以上の報告をまとめると、一連のランタナイド金属法内フラーレンが持つ電子(スピン)状態を系統的に予測・説明できる。この系統的な説明の上に新しい実測データを加えるため、電子スピン共鳴(ESR)測定特に高磁場測定やパルス測定を行った。金属内包フローレンLa@C_<82>の単離・精製システムを完成し、パルスESRでENDOR、HYSCORE測定を行い^<13>C核や^<139>La核の核双極子相互作用、核四重極子相互作用を決定した。フラーレンネットワークに内包したランタノイド金属の新しいランタノイド化学・4f電子スピン化学の基本となるランタニウム金属内包フラーレンの分子磁性を明らかにした。異なるフラーレンケージを持つ一連の金属内包フラーレンLa@Cn異性体を単離・精製して、電子吸収スペクトル、電子スピン共鳴スペクトルを測定した。また、電子スピン共鳴スペクトルの温度依存性から各異性体の電子スピンパラメータを決定し、スピンダイナミックスを考察できた。その結果それぞれの金属内包フラーレンの分子構造、電子状態、電子スピン状態を明らかにした。

決定された電子スピンパラメータの値から内包金属の6s軌道(フェルミコンタクト項・電気四重極項)と5d軌道(磁気ダイポール項)の上の不対電子密度が決定できた。その結果、ランタニウム金属内包フラーレンの電子状態は三個の電子が金属からフラーレンケージへ分子内電荷移動した電子状態と特徴付けられることが明らかになった。また、包摂するフラーレンケージの幾何学的対称性が異なると電子スピン共鳴スペクトル線幅に異常が認められる系が発見された。このスペクトル線幅の異常はケージの対称性が高いために生じたヤーンテラー効果に原因していると結論できた。
c-kit遺伝子の発現調節機構の解析

マウスc-kit遺伝子の組織特異的発現調節領域を固定するため、転写開始点より5′上流30kbから転写終了点の3′迄をEMBL3ゲノミックライブラリーより回収し、その内、細胞膜通過領域下流まで約100kbのSacI断片を、SV40あるいはc-kitのプロモーター/CATのベクターに組み込み、エンハンサー活性の有無を検討した。指標細胞として、c-kitを発現している精巣ライディツヒ細胞、巨核球、マスト細胞、赤芽球の細胞株を、陰性の細胞として細維芽細胞を用いた。その結果、5個の断片が転写を増強したが、増強の見られる細胞系譜は、各断片で異なっていた。その内、3個は線維芽細胞でも活性がみられるため、本来の調節領域とは考えにくい。残りの2カ所は、ともに膜通過部の付近で、ライディヒ細胞のみに活性がみられたので、この細胞系譜特異的調節領域の可能性がある。同時に検討してきたc-kitリガンド、S1の調節領域はトランスジエニックマウスを作成し、生体で発現を検討したところ、神経系をのぞき、培養系で見られたほど多くの細胞系譜では発現していなかった。そのため、この領域も生体内での機能を同様な方法で検討する予定である。転写伸展の際に制御がかかる可能性も考えプロモーター、第一、第二エクソンを含むミニ遺伝子を作成したが、陽性所見は見られなかった。最近、マスト細胞と色素細胞のc-kit発現異常W^<sh>とW^<57>マウスの変異が転写開始点の200kb以上上流に有りそうだという報告もある。私もさらにより広い範囲で探索し、血液細胞系譜特異的な領域を確認するつもりである。予想どうり、組織特異的に調節が行われているので、エンハンサー領域の単離は、c-kit陽性の幹細胞を人為的に、制御できる実験系を作り出す手だてとなる。
脂肪酸代謝経路の分子進化

本研究課題の目的は、脂肪酸代謝経路の生物進化の中における形成過程を、分子進化の手法を用いて明らかにしてゆく事である。本年度は、昨年度研究を行った脂肪酸合成酵素のまとめを行った。また、プロスタグランジンD合成酵素の分子進化について研究を行った。プロスタグランジン(PG)は脂肪酸に由来する生理活性物質である。哺乳類は、種々の刺激によって細胞膜からアラキドン酸を切り出し、それをもとに種々のPGを合成している。PGDはPGD合成酵素によってヒトやラットの脳内で主に産生され、睡眠、痛覚、嗅覚などの調節に関わっている。我々は以前PGD合成酵素の配列比較から、本酵素が疎水性低分子の輸送タンパク質で構成されるリポカリンファミリーに属す唯一の酵素であることを明らかにした。また、本酵素の活性中心を構成すると思われるCys残基の推測を行った。今回、リポカリンの既知の三次構造の座標データをもとにホモロジーモデリングによって、本酵素の立体構造モデルの構築し、先述のCys残基の立体構造上での位置の推測を行った。Cys残基は、2枚のβシートから構成される疎水ポケット中に、その側鎖を突き出す形で存在していた。また、疎水ポケットは基質のPGHを取り込むのに十分な大きさを有していた。モデル構造上、Lys残基がCys残基近傍に存在しており、これも本酵素の触媒反応に関わる可能性が示唆された。また、本酵素を含む既知のリポカリンのアミノ酸配列85本のアラインメントを作成し、その系統樹から本酵素と他のリポカリンとの分岐年代の推定を行った。その結果、本酵素は魚類と哺乳類の分岐以前、脊椎動物と脊索動物の分岐以降にgelatinase-associated lipocalinから遺伝子重複によって分岐したものと推測された。
英語における形容詞、名詞から構成される名詞句の修飾関係と、その意味拡張について

形容詞、名詞から構成される英語の名詞句には、多様な修飾関係が見られる。例えば、動作の様態を表す形容詞が、普通名詞と修飾関係を結ぶことができる。本研究は、この多様な修飾関係について、意味的連続性から、統一的に説明することを目的とする。当該名詞から構成される、様々な構文の意味的特徴を考察する。本研究により、各事例内の意味拡張は、詳述性によって動機づけられていること、事例の意味拡張が進むにつれて、名詞句は、主動詞によって表される事象、動作の様態を表す傾向が強いことを示す。当該名詞句は、いずれの事例においても、英語の形容詞の限定用法の規則に従う中で、多様な修飾関係を構築していることを示す。本研究は、英語における名詞句[A-N]が、意味的には様々な修飾対象と修飾関係を結んでいることに注目し、各事例間にみられる連続性を明らかにすることを目的とする。1年目である平成25年度は、英語における名詞句[A-N]にみられる修飾関係を3つのパタン、1「メトミニー的に名詞を修飾する事例」と、2「主要部の反転がみられる事例」、3「形容詞が後続する名詞以外の要素と修飾関係を結ぶ事例」にそれぞれ分類し、各事例にみられる修飾関係を検証した。当初の計画通り、おおむね3つの事例に関する経験的事実の観察と検証を行うことができた。1に関して、形容詞quick, quiet, thoughtful, meditative, carefulと、事象名詞drink、飲み物を表す名詞との修飾関係をそれぞれ検証した。その結果、それぞれの名詞句の言語化の違いは、事象の詳述性(specificity)の違いに起因することを明らかにした。また、いずれの名詞句も修飾対象とされる名詞のクオリア構造内の形式役割と修飾関係を結ばなければならないことを明らかにした。また、2については、軽動詞haveを伴う構文との比較の中で、同族目的語構文にみられる多様性について検討した。とりわけ、[drink-a/an Adj-N]から構成される同族目的語構文のうち、He swigged aquick drink of gin straight from the bottle./She slurpeda noisy gulp of tea.のように主動詞の位置、目的語名詞の位置にそれぞれdrinkの類義語が生起する場合に主要部の反転がみられることを明らかにした。3については、Way構文、転移修飾表現にそれぞれみられる修飾関係を検証した。本研究成果の一部は、4編の研究論文と1件の学会発表にて発表されている。本研究の目的は、英語における名詞句[A-N]が、意味的に様々な修飾対象と修飾関係を結んでいることに注目し、各事例間にみられる連続性を明らかにすることにある。2年目である平成26年度は、COCA, COHAを用いて「メトニミー的に名詞を修飾する事例」の1つである、英語における形容詞が、a cup/glass of NPに代表される助数詞を伴う名詞句を修飾する際の意味的特徴について考察した。具体的には形容詞がcup, glassなどの入れ物を修飾する場合、of以下の名詞句の位置に生起する飲み物を表す修飾する場合にそれぞれみられる意味的特徴を検討した。その結果、形容詞が助数詞を伴う名詞句を修飾する際、1cup, glassに代表される、入れ物を表す名詞を修飾するパタン、2coffee, beerに代表される飲み物を表す名詞を修飾するパタン、3入れ物を表す名詞、飲み物を表す名詞どちらも修飾できる3つのパタンに分けられることを明らかにした。その上で、これら3つの修飾関係には、形容詞が当該名詞句を修飾する際、修飾対象に最も近い位置に生起するという類像性(iconicity)が関与すること、修飾対象とされる名詞のクオリア構造内の意味役割が共起する動詞と密接に結びつくことを明らかにした。また、形容詞が名詞によって表される実体の性質を表す事例から、名詞によって表される実体と関わる動作や事象を修飾する事例に至るまで連続体(continuity)を成すことを明らかにした。さらに、当該表現を通時的に検証した結果、形容詞が入れ物名詞を修飾するパタンが1820年代から1900年代までに多くみられるのに対し、形容詞が飲み物を表す名詞を修飾するパタンは、1950年代以降急激に多くみられることが明らかとなった。本研究の成果の一部は3件の研究発表にて行われている。本研究の3年目である平成27年度は、「主要部の反転がみられる事例」に分類される、形容詞+名詞sipから構成される名詞句が生起する、3つの構文(1軽動詞構文、2様態副詞構文、3同族目的語構文)を検討した。具体的には、「飲む」場面の詳述性の違いが、これら3つの構文の言語化の違いに反映されると仮定し、各構文に見られる意味的特徴と、各構文間の意味的連続性について考察した。その結果、各構文に見られる詳述性の違いは、形容詞と名詞sipとの間に見られる修飾関係と、各構文内に見られる、当該名詞句と動詞の意味的分業の違いの相互作用から生じることが明らかとなった。軽動詞構文は、詳述性が最も低い構文であり、3つの構文の中で最も頻度が高い。当該構文に生起する名詞句において、形容詞は、「飲む」事象や動作、動作主の心理状態、飲み物の状態や量を表すに至るまで、様々な対象と修飾関係を構築する。しかし、生起する動詞は、基本的には軽動詞takeに限られる。一方、同族目的語構文は、詳述性が最も高く、3つの構文の中で最も頻度が低い。

生起する形容詞の修飾対象は、飲む動作と飲み物の量に限られるが、生起する動詞は、drinkやsip, swallowなど、名詞sipと意味的に矛盾しない範囲内で様々な「飲む」動作を表す。様態副詞構文の場合、詳述性、頻度ともに先の2つの構文の中間に位置し、形容詞は、動作の様態や飲み物の量を表すことで、飲み物を「飲み切る」動作の過程を修飾する。また、当該構文には、drinkやdown, finishなどが生起する。なお、これまでの本研究の成果の一部は、論文2編、研究発表1件によって行われている。本研究で取り扱う予定にあった事例研究は、概ね分析を進めてきている。しかし、今年度当初予定していたよりも業務等が重なり、本研究で得られた研究成果を、論文としてまとめる時間が十分にとれなかった。この点において、やや遅れている状況にある。本研究の最終年度にあたる本年度は、これまで研究発表してきた名詞句の事例の意味的特徴に関して、詳述性(specificity)を用いて意味拡張を考察し、論文にまとめた。「形容詞がメトニミー的に名詞を修飾する事例」として、軽動詞haveを伴うa {quick/quiet} drinkから、主動詞haveを伴うa quick {beer/whiskey}への意味拡張について考察した。その結果、詳述性の粒度の違いが、各動詞句に見られる形容詞の分布の違いに反映されることを明らかにした。動詞句have a/an Adj drinkは、「飲む」事象を表す。それに対し、動詞句have a/an Adj {beer/whiskey}は、詳述性の粒度が高く、飲み物を「摂取する」動作を表す。この違いは、各動詞句に生起する、形容詞の分布の違いにも反映される。動詞句have a/an Adj drinkには、事象に関わる形容詞(事象の時間的推移、事象の様子、雰囲気を表す形容詞)が生起するのに対し、動詞句have a/an Adj {beer/whiskey}には、飲む動作の様態、参与者の様子を表す形容詞が生起することを明らかにした。「主要部の反転がみられる事例」として、名詞句a/an Adj sipが、takeを伴う軽動詞構文と、前置詞句in a/an Adj sipを伴う様態副詞構文、同族目的語構文にそれぞれ生起する場合に見られる意味的特徴と、当該名詞句の意味拡張を検討した。その結果、生起する構文の詳述性の粒度が高まるにつれて、当該名詞句が、「飲む」事象から、「飲む」動作の過程、飲み物の量を強調する例へと意味拡張が見られることを明らかにした。また、それに伴い、形容詞の分布の拡がりにも違いが見られることを示した。形容詞は、軽動詞構文の場合、事象や動作の様態を表すものが多く生起し、同族目的語構文の場合、飲み物の量を表すものが多く、様態副詞構文は、これら2構文の中間に位置することを明らかにした。なお、本研究の成果の一部は、2編の論文として発表されている。形容詞、名詞から構成される英語の名詞句には、多様な修飾関係が見られる。例えば、動作の様態を表す形容詞が、普通名詞と修飾関係を結ぶことができる。本研究は、この多様な修飾関係について、意味的連続性から、統一的に説明することを目的とする。当該名詞から構成される、様々な構文の意味的特徴を考察する。
細胞表面に見出される新しい酸性糖鎖の機能に関する共同研究

細胞間相互作用の素過程において、細胞表面の複合糖質糖鎖が果たす制御的役割は重要である。本研究は、これら機能性糖鎖による細胞間相互作用の制御の分子機構の解明と、その人為的制御を目指している。本年度は、以下のことを行った。1.細胞表層オリゴ・ポリシアル酸鎖の形成機構の解明:(1)細胞表面にポリシアル酸鎖を発現する種々の細胞株および形質転換細胞に対して、ポリシアル酸鎖をもつ魚卵ポリシアロ糖タンパク質のcDNAを形質導入して、生合成の分子機構を調べた;(2)ニジマス卵ポリシアロ糖タンパク質のポリシアル酸鎖生合成に関与するシアル酸転移酵素のクローニングを行って、数種類の酵素cDNAクローンが得られた;(3)オリゴシアル酸特異的なモノクローナル抗体を用いて、哺乳類血中および脳に検出されるオリゴ・ポリシアル酸鎖をもつ担体タンパク質の同定を行った;(4)ラットおよびブタの調べた数種の臓器すべてにおいて新規なN-グリコリルノイラミン酸オリゴマー構造をもつ糖タンパク質の存在が化学的、組織免疫化学的に示された。2.受精のおける酸性糖鎖を介する配偶子間相互作用:(1)ニジマス精子に存在するKDN糖鎖が、ニジマス卵細胞膜状の糖タンパク質を同定するための結合アッセイ法を開発した;(2)既に知られている哺乳類透明帯タンパク質のホモログをニワトリ卵膜中にみいだして、これらの分子のcDNAクローニングを行った。3.がん細胞系におけるポリシアル酸鎖、KDN糖鎖による転移、増殖制御:KDN糖鎖が、胎仔期の肺形成過程に一時的に発現され、肺がん細胞にも再び出現するがん胎児性抗原として、糖脂質性、糖タンパク質性の両者の存在を明らかにした。天然には見出されていないKDNα2,6-Gal結合に対する単クローン抗体の調製を行うために、免疫源とするKDN複合糖質をα2,6-シアル酸転移酵素を用いて合成する方法を確立した。2.受精のおける酸性糖鎖を介する配偶子間相互作用:(1)ニジマス精子に存在するKDN糖鎖が、ニジマス卵細胞膜状の糖タンパク質を同定するための結合アッセイ法を開発した;

(2)既に知られている哺乳類透明帯タンパク質のホモログをニワトリ卵膜中にみいだして、これらの分子のcDNAクローニングを行った。3.がん細胞系におけるポリシアル酸鎖、KDN糖鎖による転移、増殖制御:KDN糖鎖が、胎仔期の肺形成過程に一時的に発現され、肺がん細胞にも再び出現するがん胎児性抗原として、糖脂質性、糖タンパク質性の両者の存在を明らかにした。天然には見出されていないKDNα2,6-Gal結合に対する単クローン抗体の調製を行うために、免疫源とするKDN複合糖質をα2,6-シアル酸転移酵素を用いて合成する方法を確立した。
カイロの墓地区「死者の街」のデータベース化による歴史研究

まず第1に、エジプト死者の街や、その『参詣の書』に関連する史料・研究書について調査し、蒐集することが出来た。特にエジプトでは、国立図書館などにおいて貴重な資料のマイクロ複写を行った。次いで、イスラーム初期以来、エジプトの広大な墓地区「死者の街」に埋葬されてきた人々に関するデータベース作成に従事した。特に死者の街『参詣書』のデータを、情報の項目を整理したシートへ被葬者・参詣所ごとに入力した。項目としては、参詣所名、被葬者氏名(通称、尊称、添え名など)、性別、生没年、家系・家族全般の情報、身体的特徴、職業、空間移動、知的背景(ハディースの系譜、法学派、神学派、師弟、学歴、著作、スーフィーか、所属教団他)、被葬者の奇蹟譚、逸話、墓に関する情報(位置、形状・素材、縁起、参詣対象か、参詣慣行、祈願内容他)などが挙げられる。総数や全体の輪郭を把握すると共にかなりのデータを蓄積出来たため、今後につながる基礎的な作業はほぼ終了した。第3にデータベース化された資料をもとに分析を行い、その中の特にスーフィズム関連の情報を事例研究として検討した。それによって、中世エジプト社会におけるスーフィズムの展開と呼応する、史料上に現れたスーフィー関連の呼称の増加や、スーフィー関連の修道施設の激増とその意味などが具体的に詳らかにされた。第4に、参詣の書に示された墓と参詣路路を、現地踏査した。加えて、墓地居住者などからも聞き取りを行うことが出来た。そして、墓地のトポグラフィーの再構成や変遷過程を跡づける作業を通じて、史料と歴史的な空間構成との対応を問う論文の作成が可能となった。さらに、本研究の成果は2004年春にカイロより出版予定のLe developpement du soufisme en Egypte a l'epoque mameloukeにも英文論文として収録される。本年度は、まず申請テーマに関する基本的文献を再度リストアップした後、網羅的に蒐集しようと努めた。それらは、日本にあって蒐集したアラビア語、欧米語文献や、現地エジプトで購入したアラビア語資料、さらにカイロのエジプト国立図書館(Dar al-Kutub)、同アラブ連盟大学写本研究所などで閲覧・複写した貴重なアラビア語写本、文書類を含むものである。その上で、エジプトの広大な墓地区「死者の街」に埋葬された人々のデータベースの作成に取りかかった。最初に、基本となるシートの項目を選択し、その枠を設定した。それらは被葬者氏名(尊称、通り名、性別、生没年など)、家系全般の情報(結婚歴、家族情報)、身体的特徴、職業、空間移動(生没地を含む)、学識に関する情報(法学派、神学派、師弟、学歴、著作、所属教団など)、墓に関する情報(位置、形状・素材、参詣慣行、祈願内容)、カラーマ(奇蹟/美質縹)、事蹟と逸話、出典元などから構成することとした。また当初、アラビア語と他言語との併用環境に秀でていることから、マッキントッシュ社のパソコンによりファイルメーカー・プロのソフトを使用すべく構想していたが、その後、WindowsもXPの登場によりアラビア語使用状況が変化し、地図・図表などと連動した加工の可能性が増した。そのため、試行錯誤の末、Windowsによって、Word、Excell、Accessのソフトを連動させる方向へと転換した。すでに百点以上のシートに入力を行っている。さらに昨年12月本年1月、現地エジプトの「死者の街」においてフィールドワークを行い、史料上に示された墓と参詣順路を実地に踏査した。

今回は、12世紀の参詣手引書(Murshid al-Zuwwar)に従って参詣したが、大きな環境変化を被っていることを具体的に跡づけられた。加えて、調査の過程で、墓掘人や墓管理者、墓地居住者らからも聞き取り調査することが出来た。本年度は昨年度に引き続き、まず関連資料の追加蒐集に努めた。特にエジプト・カイロの国立文書館(Dar al-Kutub)に於いて、申請テーマに密接に関連する写本(『Mikhtasar Ighathat』)を調査・閲覧し、複写することが出来た。同じくカイロのアラブ連盟写本研究所、及びアラブ連盟大学付属図書館においては、他の写本史料を閲覧した。また、日本から関連の図書資料を蒐集しただけでなく、カイロ市内でも申請テーマに関連する図書資料を集めた。同時に、エジプト「死者の街」に埋葬された人々のデータベース入力作業を本格化させた。昨年度すでに基本となる枠設定・項目選択を行っていたが、入力作業の進行とともに不備が目立って来たため、入力項目を全面的に見直し、修正を施した。その結果、項目は、参詣所名、被葬者氏名(通称、尊称、添え名など)、性別、生没年、家系全般の情報(結婚歴、配偶者、家族情報)、アフル・アル・バイトか、身体的特徴、職業、空間移動(生没地、遍歴地など)、知的背景(教友・後継世代か、ムハッディスか、ハディースの系譜、法学派、神学派、師弟、交友関係、学歴、著作、スーフィーか、所属教団、スーフィーとしての系譜)、被葬者の形容、被葬者のカラーマ(奇蹟/美質譚)(生前・没後)、被葬者の逸話、墓に関する情報(位置、形状・素材、縁起、参詣対象か、参詣慣行、祈願成就の有無、祈願内容)、その他、出典元などから構成されることとなった。その上で、入力作業を継行したが、データ自身が膨大であることに加え、各データの含む逸話も長大で、難解なものを含むため、若干難航した。しかし、入力補助も得て、参詣書『Murshid al-Zuwwar』の基本データは漸く入力を終え、さらに現在『Kawakib』を入力中で、これ迄の入力項目総数は400余りに上る。さらに、昨年12月から本年1月にかけて、やはり現地エジプト死者の街に於いてフィールドワークを行い、史料中に示された墓地のトポグラフィーと死者の街の現況を比較踏査した。今回は昨年用いた参詣書より後代に著された参詣書『Tuhfa al-Ahbab』とその校訂本註釈に基づき、墓地の変遷を後づけることが出来た。また、カイロ大学のM.アフィーフィー教授から助言を得たほか、現地に於ける欧米研究者との交流から、来年度、カイロ開催の国際学会で本研究の成果を口頭発表することが決定している。本年度もまず、研究課題にそった史料・研究書を調査・募集した。とくに、エジプト・カイロの国立図書館(Dar al-Kutub)やアラブ連盟大学付属写本研究所における写本調査において、従来看過されてきた参詣書写本を再点検することによって、参詣書の記述年代などにこれまでの学界定説を覆す新知見を得ることが出来た。そして、本年もエジプト・カイロの「死者の街」に埋葬された人々のデータベース入力作業を進めていった。
Roles of spinal dorsal horn TRP channels in neuropathic pain

Sパルミトイル化は可逆的な翻訳後修飾の一つで、蛋白質の形質膜発現、空間的分布、相互作用や機能的活性を調節する。そこで、様々な細胞機能に関与するTRPチャネルのSパルミトイル化を検討した。パルミトイル化酵素阻害剤2BPはHEK293T細胞に発現させたTRPM8, TRPA1, TRPV2のチャネル活性を変化させた。また、パルミトイル化酵素DHHC7を共発現させると、TRPM8, TRPA1のチャネル活性が増大した。一方、脱パルミトイル化剤NtBHAと2BP処置でマウス感覚神経のTRPM8, TRPA1活性は減弱した。Sパルミトイル化は複数のTRPチャネル発現を制御することが分かった。Sパルミトイル化は可逆的な蛋白質の翻訳後修飾の一つで、蛋白質の細胞膜発現・細胞内発現分布・蛋白質蛋白質連関等に関わっている。TRPチャネルは、非選択性陽イオンチャネルで様々な細胞内外刺激によって活性化され、多くの細胞機能に関わっているが、Sパルミトイル化修飾についてはほとんど報告がない。そこで、感覚神経に発現して侵害刺激受容や侵害刺激の軽減に関わることが知られている3つのTRPチャネル、TRPV1, TRPM8, TRPA1がSパルミトイル化で機能修飾を受けるかどうかを検討した。TRPM8, TRPA1はパルミトイル化酵素阻害剤でそれぞれの刺激剤による活性化電流が有意に抑制された。また、広範なパルミトイル化酵素DHHC7はTRPVM8, TRPA1の活性化電流を増大させたが、TRPV1電流には影響を及ぼさなかった。さらに、脱パルミトイル化剤によってマウス感覚神経細胞でのTRPM8, TRPA1活性が有意に抑制された。Sパルミトイル化されたTRPM8, TRPA1は細胞膜への移行が促進されて活性増強につながっているものと考えられたので、細胞膜ビオチン化法によってマウス感覚神経細胞形質膜のTRPチャネル発現を検討したところ、パルミトイル化酵素阻害剤や脱パルミトイル化剤はTRPM8, TRPA1の細胞膜発現を有意に減少させたが、TRPV1の発現量には影響を与えなかった。加えて、マウス個体を用いて疼痛関連行動の解析を行ったところ、TRPA1刺激剤AITCによる疼痛関連行動は、同じく足底に投与したパルミトイル化酵素阻害剤ではなく脱パルミトイル化剤で有意に抑制されたが、カプサイシンによる疼痛関連行動はパルミトイル化酵素阻害剤にも脱パルミトイル化剤にも影響を受けなかった。これは、足の感覚神経終末細胞膜に発現するTRPA1の発現量が脱パルミトイル化によって減少したからであろうと考えられた。分子細胞生理学
イネの成長、開花、およびストレス応答におけるジャスモン酸と生合成酵素AOSの役割

イネのcpm1突然変異体は、フィトクロムを光受容体とする幼葉鞘の光成長阻害反応が大幅に低下し、部分的な雄性不稔の表現型を示す突然変異体として分離された。マップベースクローニングと相補性検定により、その原因遺伝子は、ジャスモン酸生合成に関与するアレンオキシド合成酵素(AOS : allene oxide synthase)のホモログ(OsAOS1)をコードしていることが明らかになった。大腸菌に発現させたタンパク質を用いて、OsAOS1はAOS活性をもつこと、ジャスモン酸(JA)をLC-MS/MSで定量することにより、cpm1はJA生合成の突然変異体であることも証明された。さらに、より強い表現型を示すcpm2突然変異体の原因遺伝子も、マップベースクローニングと相補性検定により、JA生合成に関与するアレンオキシドシクラーゼ(AOC : allene oxide cyclase)のホモログ遺伝子(OsAOC:イネに存在する唯一のAOCホモログ遺伝子)であることが判明した。本研究により、傷害応答のシグナル因子であるJAは、イネでは光形態形成にも関与していることが明らかになった。マイクロアレイを用いた網羅的な遺伝子発現解析、およびリアルタイムPCRを用いた遺伝子発現の経時的定量解析から、JA生合成に関与する酵素遺伝子の多くが傷害と赤色光の両刺激により発現が上昇すること、発現がOsAOS1に依存し、傷害で制御される遺伝子の多くは、赤色光によっても制御されていることが示された。さらに、発現がOsAOS1に依存する遺伝子には、赤色光に特異的に反応するものも多く存在し、そのような遺伝子のうち、発現が赤色光によって抑制されるものには、成長に関係するものが多く含まれていることが明らかになった。フィトクロム依存の光形態形成反応(幼葉鞘の光成長阻害)が欠損したイネ突然変異体(cpm1)を分離し(Biswas et al.2004)、その原因遺伝子をマップベースクローニングによって解析したところ、ジャスモン酸生成合成酵素AOS(allene oxide synthase)をコードする遺伝子(OsAOS1と命名)であることが判明した。本研究はこの突然変異体を用いて、イネの光形態形成、開花プロセス、傷害・ストレス耐性におけるジャスモン酸の役割を明らかにする目的で計画された。本年度は次の成果を得た。(1)正常なOsAOS1遺伝子でcpm1突然変異体を組み換えて、稔性および光成長反応が回復することを確認した。これによって、cpm1突然変異体の原因遺伝子はOsAOS1であることが確定した。(2)cpm1変異はOsAOS1遺伝子の点突然変異であり、RT-PCRなどを用いた発現解析から、変異体においても変異したOsAOS1遺伝子のmRNAが作られていることがわかった。現在、酵素活性に対するcpm1変異の影響を調べるために、大腸菌の系を利用してOsAOS1遺伝子を発現させ、OsAOS1タンパクを精製して、酵素活性を測定する研究を進めている。(3)開花プロセスのおけるAOS遺伝子の役割を明らかにするために、GFP遺伝子と融合させたOsAOS1キメラ遺伝子でcpm1変異体を組み換えた。現在、組み換え個体が再分化し始めたので、表現型の回復を確認してから純系統の作出に取り掛かる。(4)cpm1突然変異体の病害耐性を試験するために、いもち病菌を野生型品種とcpm1突然変異体の葉に接種し、病斑を調べたが、優位な差は見られなかった。今後、その他の病原菌(白葉枯れ病菌など)を用いて検定を進める予定である。

近年の研究によって、ジャスモン酸は傷害などのストレスに対する防御反応において重要な役割を担っていること、シロイヌナズナでは稔性にも関与していることが明らかにされている。私たちのイネ突然変異体を用いた研究から、ジャスモン酸は、これらの生理現象に加えて、芽ばえの光形態形成(幼葉鞘の光成長阻害)にも関与していることが浮き彫りになった。本研究は、私たちが分離した突然変異体を活用することによって、イネにおけるジャスモン酸シグナル伝達系の役割を明らかにすることを目的とする。本年度は次の成果を得た。(1)光形態形成の欠損をもたらすcpm1突然変異はジャスモン酸生成合成酵素遺伝子(OsAOS1)の点突然変異に起因し、突然変異遺伝子(cpm1)は正常なOsAOS1遺伝子と同様に転写されている。大腸菌を用いてcpm1タンパク質およびOsAOS1タンパク質を発現させ、精製した組み換えタンパク質の酵素活性を比較したところ、cpm1の酵素活性は顕著に減少していることが明らかになった。(2)幼葉鞘に含まれるジャスモン酸を定量して、cpm1突然変異体のジャスモン酸レベルは野生型品種よりも低いこと、また、赤色光処理によって野生型品種ではジャスモン酸の顕著な増加が起こるが、突然変異体ではこの反応が弱まっていることを明らかにした。(3)cpm1突然変異体よりも強い表現型を示すcpm2突然変異体の原因遺伝子をマップベースクローニングで明らかにする研究を進めた。その結果、CPM2遺伝子を含む領域を第3染色体の約3,000kbの範囲に絞り込むことができた。現在、この領域の塩基配列をもとに分子マーカーを作り、遺伝子領域を更に絞り込む研究を進めている。フィトクロムを光受容体とする光形態形成反応(光成長阻害反応)のイネ突然変異体を用いた研究を進展させ、本年度は次の成果を得た。(1)cpm1突然変異体を用いた研究。この突然変異体はallene oxide synthase遺伝子(OsAOS1)の点突然変異に起因することをすでに明らかにしている。cpm1突然変異体、およびフィトクロムA・B欠損突然変異体を用いてイネ・マイクロアレイ解析を行い、傷害に応答するジャスモン酸依存遺伝子の多くはフィトクロムの制御も受けていることを明らかにした。(2)cpm2突然変異体を用いた研究。マップベースクローニングにより、cpm2突然変異の原因遺伝子はジャスモン酸生合成に働くallene oxide cyclase遺伝子(OsAOC)であることを明らかにした。現在、相補性検定のため、正常なOsAOC遺伝子を導入したcpm2突然変異体の形質転換体を作成している。本研究により、イネ光形態形成反応の2つの突然変異体が、ジャスモン酸生合成酵素の突然変異体であることが判明し、ジャスモン酸はイネの光形態形成で中心的な役割を果たしていることがより明確になった。傷害に応答する防御遺伝子の多くがフィトクロムにも応答することも明らかになった。さらに、両突然変異体とも稔性に異常があり、より強い表現型を示すcpm2突然変異体はほとんど不稔(雄性不稔)である。本研究によって、ジャスモン酸はイネの稔性でも重要な働きをしていることが示された。