hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
条件/事象ネットに基づく離散事象システムの階層設計

本研究では、離散事象システムの階層設計手法を開発するために、平成9年度にまず設計仕様を記述するいくつかの記述法を提案した。一つは半言語(事象の発生順序を表す形式的な言語)を頂点とする一つのグラフであり、これによって仕様を階層的に記述することができる。もう一つは半言語の集合上に逐次結合や並列結合などを表すいくつかの演算を定め、それらを用いて仕様を記述するものである。これによって仕様をいくつかのモジュールに分解して記述することができる。また、これらの記述法によって記述された仕様を満たすシステムの条件/事象ネットモデル(ペトリネットの一つのサブクラス)を構成する方法を示した。平成10年度は、これらの結果を実システムの設計に適用するために、実システムとしてシーケンス制御系を取りあげ、次のことを行った。1.シーケンス制御系を次のような手順で設計することを提案した。まず、平成9年度の結果を用いて、シーケンス制御系の動作仕様を記述し、その仕様を満たす条件/事象ネットを構成する。次に、構成した条件/事象ネットのコントローラ部分を取り出し、それに時間情報、条件情報、接点情報などを追加し、コントローラを実現する。2.シーケンス制御系設計支援ツールをコンピュータ上に構築した。これは、コントローラ部分を表す条件/事象ネットと時間、条件、接点に関する情報を入力すると、プラントの実際のコントローラとして運用できるものであり、プラントの状態や履歴データを出力する機能を備えている。そして、このツールを用いて、現有設備のミニ選別搬送装置(ユニー社製)、組み換え自在型パイロットプラント(東洋エンジニアリング社製)の制御を試み、提案する設計法の妥当性を確認した。本研究では、システムの階層設計を考慮した離散事象システムの設計手法を開発するために、離散事象システムのモデルとしてペトリネットの一つのサブクラスである条件/事象ネットを用い、次のことを行った。1.まず、設計仕様を階層的に記述する一つの方法を定めた。これは半言語(事象の発生順序を表す形式的な言語)を頂点とする一つのグラフであり、全体の動作が詳細化する順序に依存しないという性質をもつ。次に、この表現法によって記述された仕様に対して、仕様に含まれる各半言語が表す動作を行う条件/事象ネット(サブシステムに対応する)が存在すれば、仕様を満たす条件/事象ネット(システム全体に対応する)が存在することを明らかにした。そして、サブシステムに対応する条件/事象ネットを組み合わせていってシステム全体を表す条件/事象ネットを構成するという一つの構成法を示した。2.設計仕様を記述するための1.とは別の記述法を提案した。これは半言語の集合上に逐次結合や並列結合などを表すいくつかの演算を定め、それらを用いて記述するものである。1.で定めた記述法がトップダウン式に仕様を記述するのに対して、この記述法はボトムアップ式に仕様を記述するものであり、これら2つの記述法を適宜用いることによって、システムの仕様記述が容易になるものと思われる。次に、仕様に含まれる各半言語が表す動作を行う条件/事象ネットから、仕様に記述された演算順序に従ってネットを組み合わせていき、システム全体を表す条件/事象ネットを構成するという一つの構成法を示した。来年度は、現在コンピュータ上で構築中である条件/事象ネットを生成するシステムを、実システムの設計に適用し、開発した設計手法を評価する予定である。
幹細胞マーカーCD133の固形癌における発現意義と機能解析

がん細胞の幹細胞マーカーCD133の発現は、mTORシグナル阻害により発現が誘導され、低酸素およびHIF-1A誘導剤により発現が著明に抑制されることを見出した.本研究によりCD133発現制御メカニズムは、HIF-1Aを介して抑制的に制御されていることを初めて明らかにした.この研究はがん幹細胞の発生初期のシグナル伝達およびがん幹細胞機能維持の原因解明につながる手がかりになると考えられる.がん細胞の幹細胞マーカーCD133の発現は、mTORシグナル阻害により発現が誘導され、低酸素およびHIF-1A誘導剤により発現が著明に抑制されることを見出した.本研究によりCD133発現制御メカニズムは、HIF-1Aを介して抑制的に制御されていることを初めて明らかにした.この研究はがん幹細胞の発生初期のシグナル伝達およびがん幹細胞機能維持の原因解明につながる手がかりになると考えられる.本研究は、予定通り順調に進行している。(1)固形癌のCD133発現と遺伝子変異の検出がん細胞20株に対してrealtime RT-PCRでCD133のmRNA発現レベルを検討したところ、胃癌、大腸癌の4細胞株において正常細胞の数万倍以上の強発現が確認された。Flowcytometryによっても細胞株の表面に発現が確認された。また、胃癌細胞株に対してCD133の癌化に伴う遺伝子変異の可能性を調べたところ、5株の胃癌細胞株で後者のexon skipによるsplicing variantが優位であることを明らかにした。以上から、CD133は正常幹細胞のみならず、消化器癌においても広く発現していることを明らかにした。(2)CD133の機能解析CD133強発現胃癌細胞株を対象に、siRNAによってCD133の発現抑制を行った。それらのサンプルに対してマイクロアレイを用いて全遺伝子を網羅する遺伝子発現解析を実施した。CD133の遣伝子発現抑制を行うことにより、23遺伝子が2倍以上の発現亢進を示し、8遺伝子が2倍以下の発現抑制を示した。また、上皮分化マーカーであるケラチン、L1CAMタンパクなどが誘導され、一方神経細胞の未分化幹細胞マーカーであるMSI2の発現抑制が観察された。これらのCD133に関連して変動する遺伝子発現情報から、CD133は癌細胞でも「細胞分化」に関与していることが強く示唆された。今後は今回得られたCD133に関連して変動する遺伝子の解析を更に進めること、CD133の発現抑制系により癌細胞における細胞増殖、薬剤感受性の変化、migration, adhesionなどの細胞形質変化を検出すること、CD133結合タンパクを探索することなどを予定しており、消化器癌におけるCD133の機能を明らかにしたい。消化器癌のCD133発現と制御機構mTOR阻害薬(Rapamycin)によりがん幹細胞マーカーであるCD133の発現が用量・時間依存的に誘導される現象を見出し、mTORシグナルの下流分子であるHIF-1Aの誘導とCD133発現について検討した。HIF-1A誘導条件である低酸素下の細胞培養において、HIF-1Aの発現亢進に伴いCD133の著明な発現抑制が観察された。これらの現象はWiDr,IM95,SNU-16の複数のがん細胞株で確認された。がん細胞におけるHIF-1Aを介した強力なCD133発現抑制効果は、HIF-1A誘導剤のDFOを用いても同様に示された。HIF-1Aを介したCD133発現抑制効果が実際の臨床検体でも認められるかどうかを胃癌臨床検体において検討した。CD133のmRNA発現と、HIF-1A、HIF-1B、HIF-2Aとの相関を解析したところ、CD133発現とHIF-1A発現との間に強い逆相関(R=-0.68)が認められた。本研究においてがん細胞ではmTORシグナル伝達経路がCD133の発現を制御すること、低酸素などのHIF-1A誘導がCD133の発現を抑制することを初めて明らかにした。がん細胞におけるCD133の発現制御メカニズムは不明であったが、本研究によりHIF-1Aを介した発現制御機構が明らかになった。この研究はがん幹細胞の発生初期のシグナル伝達研究およびがん幹細胞機能維持の原因解明につながる重要な手がかりになると考えられる。(論文投稿準備中)
非アルコール性脂肪性肝炎におけるマクロファージ遊走阻止因子(MIF)の役割

マクロファージ遊走阻止因子(MIF)は炎症反応やマクロファージの凝集/活性化にかかわる重要なサイトカインである。しかし、MIFの脂肪性肝炎における役割は明らかでない。本研究では、MIFは高脂肪食負荷で肝の脂質沈着、線維化に重要な役割を担うことを明らかにした。これらの結果はMIFが非アルコール性脂肪性肝炎治療のターゲットとなることを示すものである。非アルコール性脂肪肝(NAFLD)は、日本や米国などの先進国における肝障害の原因として最も頻度の高いものであり、その中でも、脂肪肝に慢性炎症を伴い、肝硬変への経過をたどる非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)が大きな問題となっている。我々はメタボリック症候群の発症におけるMIFの役割を検討するためにWT(野生型マウス)およびMIFーKO(MIFノックアウトマウス)に24週間、72週間の普通食、高脂肪食負荷を行い解析を行った。24週間の時点で、高脂肪食負荷MIFーKOでは、メタボリック症候群に類似したインスリン抵抗性に起因する、体重の増加、肝臓/体重比の増加、肝臓組織中における中性脂肪濃度の上昇、肝臓の脂肪沈着(steatosis)、肝線維化が促進されること(米国肝臓学会2013、unpublish data)という知見得て、現在、その分子メカニズムの解析を進めている。72週間の時点で、野生型マウスと比較してMIF-KOでは肝脂質沈着および肝線維化が促進されることが著明になった一方で、肝腫瘍の発生が野生型マウスにおいて抑制されるという知見を得て、MIFの肝腫瘍抑制メカニズムの解析を進めている。非アルコール性脂肪性肝炎(NAFLD)は、日本や米国のなどの先進国における肝障害の原因としてもっとも頻度の高いものであり、その中でも、脂肪肝には慢性炎症を伴い、肝硬変への経過をたどる非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)が大きな問題となっている。今回、我々は、マクロファージの集積/活性化)に関与し、自然免疫と獲得免疫の両免疫系に関与するマクロファージ遊走阻止因子(MIF: Macrophage Migration Inhibitory Factor)のNASH/NAFLDにおける役割について解析した。我々はメタボリック症候群の発症におけるMIFの役割を明らかにするためにWT(野生型マウス)およびMIF-KO(MIFノックアウトマウス)に24週間、72週間の普通食、高脂肪食負荷を行い解析を行った。24週間の時点で、高脂肪食負荷MIF-KOでは、メタボリック症候群に類似したインスリン抵抗性に起因する、体重の増加、肝臓/体重比の増加、肝組織中における中性脂肪濃度の上昇、病理学的に肝臓の脂肪沈着(steatosis),肝線維化が促進されること(米国肝臓学会2013、unpublished data)という知見をえて、このメカニズムにAMPKのシグナルが関与していることを明らかにした。さらに、その下流のターゲットの解析を進めている。72週間の時点で、野生型マウスと比較してMIF-KOでは肝脂質沈着および肝線維化が促進されることが著明になった一方で、肝腫瘍の発生は野生型マウスにおいて抑制されるという知見を得て、腫瘍細胞と炎症細胞の相互作用に着目して、MIFの肝腫瘍抑制メカニズムの解析を進めている。今回、我々は、マクロファージの集積/活性化に関与し、自然免疫と獲得免疫の両免疫系に関与するマクロファージ遊走阻止因子(MIF: Macrophage Migration Inhibitory Factor)のNASH/NAFLDにおける役割について解析した。72週間の時点で、野生型マウスと比較してMIF-KOでは肝脂質沈着および肝線維化が促進されることが著明になった一方で、肝腫瘍の発生は野生型マウスにおいて抑制されるという知見を得て、腫瘍細胞と炎症細胞の相互作用に着目して、MIFの肝腫瘍抑制メカニズムの解析を行った。以上の結果を論文投稿/投稿準備中である。

24週間の時点で、高脂肪食負荷MIF-KOでは、メタボリック症候群に類似したインスリン抵抗性に起因する、体重の増加、肝臓/体重比の増加、肝組織中における中性脂肪濃度の上昇、病理学的に肝臓の脂肪沈着(steatosis),肝線維化が促進されること(米国肝臓学会2013、unpublished data)という知見をえて、このメカニズムにAMPKのシグナルが関与していることを明らかにした。さらに、その下流のターゲットの解析を行った。72週間の時点で、野生型マウスと比較してMIF-KOでは肝脂質沈着および肝線維化が促進されることが著明になった一方で、肝腫瘍の発生は野生型マウスにおいて抑制されるという知見を得て、腫瘍細胞と炎症細胞の相互作用に着目して、MIFの肝腫瘍抑制メカニズムの解析を行った。さらに、臨床検体(肝生検)を用い、NASH/NAFLDの肝細胞組織におけるMIF/CD74(MIFレセプター)の発現、血清中のMIF値と、メタボリック症候群の検査所見、肝炎症、肝脂質沈着、肝線維化との相関を解析している。以上の結果を一部論文発表済み、また論文投稿中/投稿準備中である。メタボリック症候群の発症に重要なマクロファージ活性化のメカニズムを解明するため、マクロファージの集積/活性化に関与し、自然免疫と獲得免疫の両免疫に作用、また、ヒトのメタボリック症候群で血中濃度が上昇することが報告されている“マクロファージ遊走阻止因子(MIF: macrophage migration inhibitory factor)"に着目し、高脂肪食負荷(24週間)でMIF-KOでは、肝臓の炎症が軽度にあるにもかかわらず肝線維化が亢進されること、肝脂質沈着は増悪することを明らかにした。(米国消化器病学会週間(DDW)2012、第48回日本肝臓学会総会の口演発表(演者)、データの一部を論文化、残りのデータを投稿準備中)今回の解析で、MIF-CD74(MIFレセプター)系の、マウスおよびヒトでの非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)の進行、肝線維化への関与、肝発癌への関与、またそのメカニズムとしてのサイトカイン制御、アデイポカイン制御機構を明らかにし、MIF- CD74(MIFレセプター)系の活性化もしくは抑制によるメタボリック症候群からの肝発癌の治療の可能性を検討した。今後、さらに研究をすすめ、NASHの病態におけるMIF-CD74(MIFレセプター)の関与やそのメカニズムを明らかにすることは、NASHからの発癌機構の解明だけでなく、MIF、CD74(MIFレセプター)の生物学的意義の解明であり、臨床医学上非常に意義のある研究と考える。マクロファージ遊走阻止因子(MIF)は炎症反応やマクロファージの凝集/活性化にかかわる重要なサイトカインである。しかし、MIFの脂肪性肝炎における役割は明らかでない。本研究では、MIFは高脂肪食負荷で肝の脂質沈着、線維化に重要な役割を担うことを明らかにした。これらの結果はMIFが非アルコール性脂肪性肝炎治療のターゲットとなることを示すものである。
介護保険施設の経口摂取・口腔衛生管理のトータルコスト・ベネフィットに関する研究

現在、介護報酬上、介護保険施設の入所者に対しては栄養管理(栄養マネジメント加算)における加算として経口移行・経口維持加算が設定され、口腔衛生管理(体制)加算も評価されている。研究代表者はこれまでの調査により、これら経口移行・経口維持加算や口腔衛生管理加算の算定施設割合が939%に留まり、歯科専門職との連携も十分進んでいない現状を明らかにし、歯科専門職の独自雇用がこれら加算算定に有意な関連を示すものの、その増収額は1施設平均月額62,000円程度に留まり、これら加算の直接的な増収額のみでは歯科専門職の直接雇用や連携の拡大には十分なインセンティブとなり得ないこと等を明らかにした。そこで、本研究では介護保険施設入所者を対象として、歯科専門職の栄養管理関連の加算の算定への参画や口腔衛生管理の実施などの介入研究を実施し、発熱・肺炎等による診療・投薬経費や入院にともなう施設サービス費減額等を含めた収支状況や調理・食事介助時間の変化の状況を調査することにより、歯科専門職との連携や参画によるトータルコスト・ベネフィットを明らかにすることを目的としている。平成29年度は介入研究の実施に向けて、説明・同意書や調査票の作成、倫理審査委員会の承認(承認番号:2017-0219)、協力介護保険施設や歯科医師会・歯科衛生士会等の関係者への説明・協力依頼を行った。しかし、厚生労働省介護保険給付費分科会における平成30年度介護報酬改定の議論のなかで、栄養マネジメント加算や口腔衛生管理加算に係る要件や報酬額の見直しが行われることが明らかになり、これらの変更が介入期間中に生じた場合には、研究結果やその分析に大きく影響することになることから、介護報酬改定後の平成30年度を待って、実際の介入をスタートすることとなり、平成30年10月から2施設での介入を開始している。しかし、厚生労働省介護保険給付費分科会における平成30年度介護報酬改定の議論のなかで、栄養マネジメント加算や口腔衛生管理加算に係る要件や報酬額の見直しが行われることが明らかになり、これらの変更が介入期間中に生じた場合には、研究結果やその分析に大きく影響することになることから、介護報酬改定後の平成30年度を待って、実際の介入をスタートすることとし、平成30年10月から2施設での介入を開始した。その他、4施設から調査協力の内諾は得られているものの、介入期間の終了後も、継続的に歯科衛生士による口腔衛生管理等の実施継続を希望されており、このためには、各施設の協力歯科医療機関の歯科衛生士だけでは実施不可能なため、これが可能な歯科衛生士の確保に手間取っている。必要な介護保険施設の内諾は得られており、また、各施設の協力歯科医療機関の協力も得られている。そのため、2施設での介入研究はスタートしているものの、残り4施設設から調査協力の内諾自体は得られているものの、介入期間の終了後も、継続的に歯科衛生士による口腔衛生管理等の実施継続を希望されている。このためには、各施設の協力歯科医療機関の歯科衛生士だけでは実施不可能なため、歯科衛生士会に依頼して、施設近隣に在住する在宅歯科衛生士を探してもらっているほか、各郡市歯科医師会に依頼して、各施設の協力歯科医療機関の近隣の歯科医療機関との共同実施に向けて、調整をお願いしているところであり、今年度中にはすべての施設で介入が開始出来る予定である。このため、1年程度の研究機関の延長が必要となる予定である。しかし、厚生労働省介護保険給付費分科会における平成30年度介護報酬改定の議論のなかで、栄養マネジメント加算や口腔衛生管理加算に係る要件や報酬額の見直しが行われることが明らかになり、これらの変更が介入期間中に生じた場合には、研究結果やその分析に大きく影響することになることから、介護報酬改定後の平成30年度を待って、実際の介入をスタートすることとなった。

平成29年度は介入研究の実施に向けて、説明・同意書や調査票の作成、倫理審査委員会の承認(承認番号:2017-0219)、協力介護保険施設や歯科医師会・歯科衛生士会等の関係者への説明・協力依頼を行った。しかし、厚生労働省介護保険給付費分科会における平成30年度介護報酬改定の議論のなかで、栄養マネジメント加算や口腔衛生管理加算に係る要件や報酬額の見直しが行われることが明らかになり、これらの変更が介入期間中に生じた場合には、研究結果やその分析に大きく影響することになることから、介護報酬改定後の平成30年度を待って、実際の介入をスタートすることとした。現在、介護報酬上、介護保険施設の入所者に対しては栄養管理(栄養マネジメント加算)における加算として経口移行・経口維持加算が設定され、口腔衛生管理(体制)加算も評価されている。研究代表者はこれまでの調査により、これら経口移行・経口維持加算や口腔衛生管理加算の算定施設割合が939%に留まり、歯科専門職との連携も十分進んでいない現状を明らかにし、歯科専門職の独自雇用がこれら加算算定に有意な関連を示すものの、その増収額は1施設平均月額62,000円程度に留まり、これら加算の直接的な増収額のみでは歯科専門職の直接雇用や連携の拡大には十分なインセンティブとなり得ないこと等を明らかにした。そこで、本研究では介護保険施設入所者を対象として、歯科専門職の栄養管理関連の加算の算定への参画や口腔衛生管理の実施などの介入研究を実施し、発熱・肺炎等による診療・投薬経費や入院にともなう施設サービス費減額等を含めた収支状況や調理・食事介助時間の変化の状況を調査することにより、歯科専門職との連携や参画によるトータルコスト・ベネフィットを明らかにすることを目的としている。しかし、厚生労働省介護保険給付費分科会における平成30年度介護報酬改定の議論のなかで、栄養マネジメント加算や口腔衛生管理加算に係る要件や報酬額の見直しが行われることが明らかになり、これらの変更が介入期間中に生じた場合には、研究結果やその分析に大きく影響することになることから、介護報酬改定後の平成30年度を待って、実際の介入をスタートすることとなり、平成30年10月から2施設での介入を開始している。しかし、厚生労働省介護保険給付費分科会における平成30年度介護報酬改定の議論のなかで、栄養マネジメント加算や口腔衛生管理加算に係る要件や報酬額の見直しが行われることが明らかになり、これらの変更が介入期間中に生じた場合には、研究結果やその分析に大きく影響することになることから、介護報酬改定後の平成30年度を待って、実際の介入をスタートすることとし、平成30年10月から2施設での介入を開始した。その他、4施設から調査協力の内諾は得られているものの、介入期間の終了後も、継続的に歯科衛生士による口腔衛生管理等の実施継続を希望されており、このためには、各施設の協力歯科医療機関の歯科衛生士だけでは実施不可能なため、これが可能な歯科衛生士の確保に手間取っている。
東南アジア熱帯雨林におけるフタバガキ科樹木の開花・結実機構の解明

東南アジア熱帯雨林で優占するフタバガキ科樹種の開花・結実メカニズムに焦点を当てて研究を行った。フタバガキ科の巨大高木Dryobalanops aromaticaは、開花・結実時に樹体内リン濃度が有意に低下した。また、開花・非開花個体の間で樹体内リン濃度に有意な違いがあった。リンは熱帯雨林の土壌で最も制限要因となりやすい栄養塩であるため、樹体内へのリンの蓄積具合がフタバガキ科樹種の繁殖参加を左右する可能性が高い。さらに、人工的に開花誘導因子である乾燥を与える操作実験を行い、D. aromaticaの1個体について開花誘導に成功した。東南アジア熱帯雨林で起こる一斉開花現象の象徴種であり、地域の優占種でもあるフタバガキ科樹木の繁殖メカニズムに注目し、資源と環境の双方の観点から調査を行っている。今年度は、2001年度から継続して行っている、フタバガキ科樹木数種の樹体内貯蔵物質の蓄積過程に関する調査を行うとともに、これまで採取した試料について、窒素・リン・カリウム・炭水化物などお栄養素の濃度変化を調べ、種子生産量との関係を解析した。その結果、樹体内に貯蔵した栄養塩類の濃度が種子生産の豊凶現象と関係性が強く、樹体内への栄養塩の蓄積が一斉開花への参加に関与している可能性が高いことを明らかにした。また、開花・結実の際に最も多量に必要となる炭水化物資源に注目し、フタバガキ科樹木の光合成能力や、光合成に影響を与える生理的・形態的パラメーターに関する調査も行った。その結果、フタバガキ科樹木は実生から成木にいたるまで、樹高の増大に伴って、樹種に関係なくほぼ直線的に最大光合成能力が増加すること、また最大光合成能力は葉の柵上組織厚と最も相関が高く、密接な関係があることを明らかにした。さらに、それらの光合成に関するパラメーターや各種気象データを基に、東南アジア熱帯雨林の二酸化炭素のフラックスモデルを構築し、国際誌に発表した。その他、一斉開花の誘導因子となる可能性の高い環境因子を特定するための基礎研究として、マレーシア・サラワク州やサバ州といった広範囲の地域の長期気象データを解析し、地域ごとの気象の特徴や一斉開花の発生状況との関係性について考察し、この結果を国内誌に発表した。東南アジア熱帯雨林の優占種で、この地域の生態系修復・再生の鍵を握るフタバガキ科の樹木について、その繁殖メカニズムに及ぼす資源と環境の影響を調査している。平成19年度は、平成13年度から継続して行っているフタバガキ科樹木数種の樹体内貯蔵物質の蓄積過程に関する調査を行うとともに、フタバガキ科樹種の同調的な開花の誘導因子として考えられている短期的な乾燥条件を操作実験によって人工的に再現し、開花を誘導する実験を行った。また、樹木の開花・結実の際に最も多量に必要となる炭水化物資源に注目し、フタバガキ科樹木の光合成や蒸散量の季節変動や樹種特性、さらに光合成に影響を与える生理的・形態的パラメーターに関する調査を行い、その結果を国際誌にまとめた。主な結果としては、フタバガキ科樹木を含めた熱帯雨林の林冠層や突出木層を形成する樹種は、そのほとんどが葉を透かせば明瞭な葉脈網が見える異圧葉型の葉の形態を持つことが明らかとなった。これは、葉内を網目状の葉脈によって仕切り、それぞれのコンパートメントごとに独立して気孔の開閉を調整することにより熱帯の林冠に特徴的な強光・乾燥条件下でも効率よく光合成生産を行うためであると思われるまた、光合成器官である葉の被食防衛戦略にも注目して、樹種毎の窒素利用と植食生昆虫の関係性についても調査を行い、その結果を国際誌に発表した。東南アジア熱帯雨林の優占種で、この地域の生態系修復・再生の鍵を握るフタバガキ科の樹木について、その繁殖メカニズムに及ぼす資源と環境の影響を調べた。平成20年度は、これまで継続して行ってきたフタバガキ科樹木数種の樹体内貯蔵物質の蓄積過程に関する調査についてデータ解析を行った。まず、フタバガキ科の巨大高木Dryobalanops aromaticaの開花・結実期間中の樹体内での濃度変化を調べたところ、リンの顕著な濃度減少が確認された。そこで、D.aromatica 30個体(直径30cm以上)について、2002年から2005年の間の樹体内へのリンの蓄積具合と、開花や結実状況を調べた。その結果、各個体の結実量と幹のリン濃度の減少量との間には、有意な正の相関関係が見られた。つまり、D. aromaticaの繁殖には、樹体内へのリンの蓄積が重要で、開花・結実に必要なリンが蓄積できていない状態では種内での同調的な繁殖イベントには参加できない可能性が示唆された。

この結果は、土壌が貧栄養な熱帯雨林の環境では、特に制限因子となりやすいリンの獲得が、フタバガキ科巨大高木の繁殖に大きな影響を及ぼす可能性を示唆している。また、フタバガキ科巨大高木の炭水化物資源の蓄積に直接的に影響する樹冠部の葉の生理生態的特性にも注目して調査を行った。その結果、フタバガキ科の巨大高木D. aromaticaとShorea beccarianaでは、同じような光環境においても、樹冠の位置で異なった水利用を行っており、樹冠上部では樹冠下部に比べて日中の水ストレスは大きいものの、高い水利用効率を示すことがわかった。さらに、階層構造が発達した熱帯雨林の垂直的な光環境に注目し、林冠クレーンシステムを活用して詳細な調査を行い、その結果を学術論文にまとめた。
日本における乳歯形態の時代変化に関する研究

これまでほとんど明らかにされていない日本列島住民の乳歯の形態の時代変化を、歯冠計測値、非計測的形質の2つの面から調査した。1.歯冠計測値乳歯歯冠の全体的な大きさは在来系弥生>渡来系弥生>縄文>古墳>江戸>現代>中世の順だった。永久歯では縄文人は現代人に比べて歯が小さいことが指摘されており(Brace and Nagai 1982)、乳歯では逆に縄文人の方が現代人より大きいことが明らかになった。現代人の乳歯と永久歯の大きさを基準として比較すると、縄文と在来系弥生は他の集団に比べ大きい乳歯と小さい永久歯を持つことが明らかである。縄文系は渡来系に比べ、永久歯においても形成が早い歯(I,M1)はあまり大きさに差がなく、遅い歯(C,P,M2)ほど小さい(Matsumura 1994)。縄文系と渡来系で乳幼児期の成長パターンに差があるのかもしれない。2.非計測的形質16形質の出現頻度をスミスのMMDで分析したところ、頭蓋骨や永久歯の非計測的形質の分析と同様に、縄文・在来系弥生と渡来系弥生・古墳・中世・江戸・現代日本人の2つのクラスターの差が明らかであった。個々の形質では、縄文系に高頻度な形質はMiddle trigonid crest(dm_2)とCusp 6(dm_2)、渡来系弥生現代日本人に高頻度な形質はShovel shape(di^1),Enamel extension(dm^2),Delta shape(dm_1),Distal trigonid crest(dm_2),Distolingual root(dm_2)であった。渡来系弥生現代日本人に高頻度な形質は、永久歯でもシノドントに高頻度にみられる形質だが、縄文系に多くみられた形質は必ずしも永久歯でスンダドントに高頻度にみられるわけではない。なぜ乳歯でのみ高頻度にみられるのかは現状では不明である。
機能分子を標的とした注意欠如多動性障害の診断法・治療法の開発

ADHDモデル動物を用いた機能分子を標的とした新規治療薬の開発を行った。国立台湾大学との共同研究より、イボタクサギClerodendrum inerme (L.)Gaertn.の有効成分の一つであるHispidulinがフェンサイクリジン連続投与により誘発されるADHD様の行動障害に有効かどうか検討を行った。Hispidulinはフェンサイクリジン連続投与により認められる社会性行動の低下を改善した。フェンサイクリジン連続投与マウスの前頭皮質に認められるNMDA受容体NR1サブユニットのリン酸化の低下に対して、Hispidulinは改善作用を示した。また、Hispidulinはフェンサイクリジン連続投与マウスの前頭皮質のドパミン量を有意に増加させ、Hispidulinによるフェンサイクリジン連続投与マウスの社会性行動の低下・NR1サブユニットのリン酸化の低下に対する改善効果はドパミンD1受容体拮抗薬の併用投与により拮抗された。これら結果より、Hispidulinは前頭皮質におけるドパミン細胞外遊離量を増加させることにより、ドパミンD1受容体を介して、NR1リン酸化率の低下を改善させることでフェンサイクリジン連続投与マウスに認められるADHD様の行動障害に対する緩解作用を示すことが示唆された。すなわち、機能分子(NR1サブユニットのリン酸化)を標的としたADHD新規治療薬としてHispidulinを開発することができた。注意欠陥・多動性障害(AD/HD:Attention Deficit/Hyperactivity Disorder)は注意欠損、多動性、衝動性、社会性行動の低下を中核症状とする。一方、その行動妥当性の高いAD/HDの動物モデルは少ない。そこで本研究では、NMDA受容体拮抗薬であるフェンサイクリジン(PCP)連続投与マウス、およびプロスタグランジン受容体の一つであるEP1遺伝子欠損マウスの行動異常がADHDに関連していることに注目し、これらマウスに一連の行動試験を行い、ADHDに類似した行動異常を示すかどうか検討を行った。PCP連続投与動物およびEP1遺伝子欠損マウスにおいて、断崖回避試験における衝動性の亢進、および社会性行動試験における社会性行動の低下などの情動障害とともに、AD/HDの中核症状の一つである認知機能の障害が新奇物体認知試験における物体認知障害および水探索試験における潜在学習障害として認められた。それらの行動異常に対してADHD治療薬(メチルフェニデート・アトモキセチン)が有効かどうかについて検討を行ったところ、これら行動障害は有意に改善が認められた。PCP連続投与動物およびEP1遺伝子欠損マウスがADHDモデル動物としての有用性が認められたため、NMDA受容体およびプロスタグランジンがADHDの機能分子として期待される。次にこれらモデル動物において共通したADHDの発症から回復までの機能分子の解析を細胞内シグナル分子に注目して検討を行ったところ、前頭皮質において細胞外シグナル調節キナーゼ(Extracellular Signal-regulated Kinase、ERK)1/2のリン酸が有意に低下し、それらがADHD治療薬により有意に回復することを明らかにすることができた。本年度の研究目標は1ADHDの発症から回復までの中枢・末梢での機能分子の発現解析および2精神機能における機能分子の役割の解明、それに基づく新しいADHDモデル動物の開発である。NMDA受容体拮抗薬であるフェンサイクリジン(PCP)連続投与マウスおよびプロスタグランジン受容体の一つであるEP1遺伝子欠損マウスのADHDモデル動物の有用性を明らかにすることができたため、2であるADHDモデル動物の開発が達成できている。また、NMDA受容体およびプロスタグランジンがADHDの機能分子として期待されるとともに、それらの共通分子として細胞外シグナル調節キナーゼ(Extracellular Signal-regulated Kinase、ERK)1/2のリン酸の低下および、それに対するADHD治療薬による回復が認められたため、1ADHDの発症から回復までの中枢・末梢での機能分子の発現解析についても達成できた。これまでの成果より、PCP連続投与動物がAD/HDモデル動物としての有用性が認められたため、NMDA受容体がAD/HDの機能分子として期待される。AD/HDの病態としてドパミン・ノルアドレナリン神経伝達の低下が知られている。そこで、PCP連続投与動物におけるそれら神経系の機能変化がNMDA受容体にどのような影響を与えるか検討を行った。PCP連続投与マウスの前頭皮質における高カリウム刺激によるドパミンおよびノルアドレナリン細胞外遊離量は有意な減少が認められた。さらに、メチルフェニデートおよびアトモキセチンの投与によりPCP連続投与マウスの前頭皮質におけるドパミンおよびノルアドレナリン細胞外遊離量の有意な増加が認められた。PCP連続投与によるAD/HD様の行動障害に対するメチルフェニデートの緩解作用はドパミンD1受容体拮抗薬およびノルアドレナリンβ1受容体拮抗薬の併用投与により拮抗された。PCP連続投与マウスの前頭皮質のNMDA受容体のNR1サブユニットのリン酸化の低下が認められ,メチルフェニデーによりそのNR1のリン酸化率の低下は改善され、それはドパミンD1受容体拮抗薬およびノルアドレナリンβ1受容体拮抗薬の併用投与により拮抗された。これらの結果より,メチルフェニデートは前頭皮質におけるドパミンおよびノルアドレナリン細胞外遊離量を増加させることにより、メチルフェニデートはドパミンD1受容体およびノルアドレナリンβ1受容体の両方を介して,NR1リン酸化率の低下を改善させることでPCP連続投与マウスに認められるAD/HD様の行動障害に対する緩解作用を示すことが示唆された。本年度の研究目標はドパミン・ノルアドレナリン神経伝達の関連タンパクへの機能分子の作用を明らかにすることである。

すなわち、ADHDにおいて機能低下が認められるドパミンやノルアドレナリン作動性神経系における機能分子の役割を明らかにする。PCP連続投与マウスでのドパミン・ノルアドレナリン神経伝達の機能変化を明らかにするとともに、その機能低下をAD/HD治療薬が改善することを明らかにした。さらに、それらの標的となる機能分子としてNMDA受容体のNR1サブユニットを同定することができた。ADHDモデル動物を用いた機能分子を標的とした新規治療薬の開発を行った。国立台湾大学との共同研究より、イボタクサギClerodendrum inerme (L.)Gaertn.の有効成分の一つであるHispidulinがフェンサイクリジン連続投与により誘発されるADHD様の行動障害に有効かどうか検討を行った。Hispidulinはフェンサイクリジン連続投与により認められる社会性行動の低下を改善した。フェンサイクリジン連続投与マウスの前頭皮質に認められるNMDA受容体NR1サブユニットのリン酸化の低下に対して、Hispidulinは改善作用を示した。また、Hispidulinはフェンサイクリジン連続投与マウスの前頭皮質のドパミン量を有意に増加させ、Hispidulinによるフェンサイクリジン連続投与マウスの社会性行動の低下・NR1サブユニットのリン酸化の低下に対する改善効果はドパミンD1受容体拮抗薬の併用投与により拮抗された。これら結果より、Hispidulinは前頭皮質におけるドパミン細胞外遊離量を増加させることにより、ドパミンD1受容体を介して、NR1リン酸化率の低下を改善させることでフェンサイクリジン連続投与マウスに認められるADHD様の行動障害に対する緩解作用を示すことが示唆された。すなわち、機能分子(NR1サブユニットのリン酸化)を標的としたADHD新規治療薬としてHispidulinを開発することができた。本年度はドパミン・ノルアドレナリン神経伝達の関連タンパクへの機能分子の作用について明らかにする。初代培養の前頭前皮質由来の神経細胞および株化細胞に、機能分子を培養上清に添加、もしくはその関連遺伝子を過剰発現もしくはノックダウンする。それによるドパミン・ノルアドレナリン神経伝達の関連タンパクの発現および機能変化(1トランスポーターなどのプレシナプス機能、2受容体などのポストシナプス機能、3転写因子やエピジェネティクスなどの遺伝子発現制御)の作用(図4)を検討し、機能分子の役割について明らかにする。今後はADHDモデル動物を用いた機能分子を標的とした新規治療薬もしくは予防薬の開発を行う。
階層型多孔質炭素材料による高効率エネルギー貯蔵の研究

二次電池や電気二重層キャパシタにおいては、イオン等の物質の貯蔵と輸送(移動)がキー過程になる。イオンの貯蔵にはイオンのサイズに近い小さな細孔ほど高容量を与えるが、高パワー密度(瞬発力)を得るには、短時間での充・放電に伴うイオンの迅速な輸送が不可欠になるため、より大きな通路(細孔)が必要である。このように貯蔵と輸送ではそれぞれ異なる最適な空間(サイズ、構造や機能)を必要とするが、物質貯蔵と輸送の双方に適したミクロ・メソ空間を兼ね備えた材料の合成は困難であった。貯蔵と輸送の両過程の効率を同時に最大化できる階層的ミクロ・メソ空間の構築法の確立は高効率エネルギー貯蔵の実現に重要な課題である。本研究では、超分子有機構造体を前駆体として用いて炭素化処理を行うことにより、構造と機能が精密に制御された多孔質炭素材料を創成し、二次電池やキャパシタ等における貯蔵と輸送の能力・効率の最大化を目的とする。超分子有機構造体前駆体と酸化グラフェンとの複合体の合成を行い、さらに、その複合体を不活性雰囲気下で高温で熱処理し、窒素ドープした多孔質グラフェン炭素材料を合成した。有機構造体前駆体と酸化グラフェンとの複合体及び窒素ドープ多孔質グラフェン炭素材料のキャラクタリゼーションを行い、細孔構造や窒素含有量など構造と特性を明らかにした。窒素ドープ多孔質酸化グラフェンのキャパシタの電極材料としての性能評価を行い、得られた炭素材料の多孔性構造、グラフェンの導電性及び表面にドープされた窒素(N)成分の効果によって、本材料は、優れた比電気容量及びサイクル特性を有することを明らかにした。28年度が最終年度であるため、記入しない。二次電池や電気二重層キャパシタ等においては、イオン等物質の貯蔵と輸送の双方に適したミクロ・メソ空間を兼ね備えた材料の合成法の確立は高効率エネルギー貯蔵の実現に重要な課題である。さらに、多孔質炭素材料を二次電池や電気二重層キャパシタ等のエネルギー貯蔵に用いる場合は、細孔の表面特性が重要であり、異種元素ドープによる細孔特性の精密制御も高効率エネルギー貯蔵の実現に極めて有効である。本研究では、有機構造体フレームワークを鋳型・前駆体として用いて炭素化処理を行うことにより、貯蔵に適したミクロ孔と輸送に適したメソ孔を合わせ持ち、構造と機能が精密に制御された階層型ミクロ・メソ多孔質炭素材料を創成し、さらに、異種元素のドープによる細孔特性の精密制御を行い、二次電池やキャパシタ等における貯蔵と輸送の能力・効率の最大化を目指している。まず、窒素成分を含有した有機系構造体フレームワークの微細な結晶をグラフェンのシート上に成長させ、窒素含有有機構造体微結晶と2次元炭素材料との複合体を形成させた。本複合体を前駆体として用いて、不活性雰囲気下で加熱処理を行うことにより、窒素ドープした多孔質炭素材料を合成した。得られた炭素材料の細孔構造や窒素ドープ量は、複合体前駆体における有機構造体フレームワーク微結晶の量やサイズ及び熱処理温度等の条件に依存した。現在、窒素含有有機構造体微結晶と2次元炭素材料との複合体前駆体の構造解析及び合成された炭素材料の構造解析とキャパシタ等の電極材料としての応用について研究を進めている。本年度は、研究計画に沿って、有機構造体フレームワーク微結晶を前駆体として用いて、階層型多孔質炭素材料を合成し、炭素材料の細孔構造と特性の精密制御を行っている。研究計画通り順調に進展している。次年度も、研究計画に沿って実験・研究を行い、有機構造体フレームワーク微結晶を前駆体として用いて、階層型多孔質炭素材料を合成し、細孔構造と特性の精密制御を行うとともに、キャパシタや二次電池等の電極材料としての特性評価を行い、エネルギー貯蔵効率の向上を図る予定である。
SIMSによる鉄隕石および石鉄隕石中の各種元素の同位体変動の研究

ほとんどの鉄隕石は,地球様天体の核として形成されたものと考えられている。鉄隕石の冷却速度は,Woodらにより,その研磨して酸で腐食した表面に見られるウィドマンシュテッテン構造のテ-ナイト中のニッケル元素の分布から,110°C/10^6年と推定されている。この冷却期間中には,ニッケル原子の拡散が起こる。鉄隕石オデッサの場合をモデルとした,計算機を用いたシミュレ-ション実験によると,この拡散の過程で同位体の分別が生じることが考えられるという結果が得られた。これを実験的に確かめるために,実際の鉄隕石オデッサ試料について,カマサイトーテ-ナイトの境界を横切って,SIMSによるニッケル同位体比線分析を行った。鳴門教育大学において製作中のSIMSは現在性能改善中であるため,大阪大学のSIMSを用いて実験を行った。一次イオンとして8keVのO_2^+を用い,試料表面上のイオンビ-ム直径と電流はそれぞれ200μmおよび2×10^<-7>Aとした。同位体比^<58>Ni/ ^<60>Niおよび^<58>Ni/^<62>Niを測定した。またニッケル濃度の指標として^<58>Ni/ ^<56>Feも同時に測定した。この結果,一次イオンビ-ムが,いわゆるテ-ナイト中のニッケルのM型分布を再現できるほど細く絞れていないため,位置の分解能は不十分ながら, ^<58>Ni/ ^<60>Niがカマサイト中よりもテ-ナイト中で高い値を示す傾向をもつことが観測された。即ち,テ-ナイト中でのニッケル原子の拡散に伴い,軽い同位体^<58>Niが重い同位体^<60>Niよりもテ-ナイト結晶の中心部に偏析していることが知られた。今後は,各種の鉄隕石および石鉄隕石について,同位体比測定を行い,同様な傾向が認められるかどうかを確認する実験を続ける。
低酸素状態にある正常脳細胞・悪性脳腫瘍細胞の放射線感受性の修飾に関する研究

低酸素および正常酸素状態における、一酸化窒素(NO)と放射線の効果との関連について、肺癌(EGFR野生型と変異型)、悪性黒色腫、および神経謬芽腫細胞を用い、細胞運動能、浸潤能、細胞死の誘導について、NO合成抑制剤と放射線を併用し比較検討した。結果、NO合成抑制が、放射線照射後の、細胞運動性・浸潤能の減少、および細胞死の増加に重要な働きをしていることが、明らかとなった。NO合成抑制と放射線感受性の変化が関連する理由としては、(1)放射線によるDNA障害に重要な働きをする活性酸素種(ROS)の産生の増加がNOにより調節される、(2)放射線による、HIF-1a、PDK1、PDPK1、GLUT1、EGFR、iNOS、およびVEGFのmRNA発現レベル低下するが、それらの調節にもNOが関与している、(3)低酸素状況下においてはNO合成がもとより低下しており、放射線の酸素効果以外にも、低酸素状況下における放射線抵抗性と関連がある可能性があること、が明らかとなった。現在、In vivo条件化で、NO合成抑制剤併用の有無における、放射線照射後の腫瘍癌増殖・マウス生存期間などについて検討中である。当研究者は、本年度11月に採用され、実験を開始した。これまでに、(1)実験プロトコールを作成し、実験準備(試薬・機器・等の購入)を行った。(2)本研究に必要な実験テクニック(低酸素照射機の取り扱い,フローサイトメーターの取り扱い,ウェスタンブロットの練習,実験動物の取り扱い・腫瘍継代、など)の習得・練習を行った。今後は独力で実験の遂行が可能であると考えている。(3)常酸素下で(低酸素状態に対するコントロールとして)、正常脳神経細胞を培養し、放射線に対する反応を観察(アポトーシス、Drebrin・Actin、等の発現量変化の解析)した。結果、放射線により、神経細胞でもアポトーシスが誘導され、また、発達の指標と考えられるDrebrin・Actinの発現低下が認められた。(4)C3Hマウス皮下移植モデル(FM3A:乳癌細胞)の腫瘍を用い、常酸素下で(低酸素状態に対するコントロールとして)放射線に対する反応を観察(アポトーシス、細胞周期の変化、等の解析)した。線量不足のためか、放射線によるアポトーシスの誘導は起こらなかったが、細胞周期の分布に変化をきたした。プロトコールの改訂が必要であると考えられた。今年度は5ヶ月のみであり、これまでのところ、研究は順調に進行していると考えている。低酸素及び常酸素状態における、一酸化窒素(NO)の肺癌(EGFR発現の異なる2種)、悪性黒色腫、脳神経膠腫における影響について検討した。NOは、腫瘍細胞の遊走能、浸潤能、細胞死に関連していた。NO合成阻害薬と放射線照射併用の有無による、これらの生物学的活性の変化を詳しく調べたところ、全ての細胞で、NO合成阻害薬により、遊走能、浸潤能は減少し、細胞死は増加した。また、放射線と併用時には、放射線の効果を増強した。次に、EGFR発現の異なる2種の肺癌細胞で、VEGF阻害剤(YC-1)併用における、NO量と放射線の効果を比較したところ、VEGF阻害剤(YC-1)によりNOの効果は変化しており、NOの放射線照射時の効果はVEGFと関連していることが示唆された。また、In vivoで、血中のNO量を測定しながら同様の実験を行い、これらの効果を確認する予定である。
沖縄多良間島の古謡の構造・機能論的研究

平成2・3年の両年度にわたり、多良間島の歌謡を収集し、それらを機能と構造の観点から分析した結果、以下の知見をえることができた。1歌詞資料...ヴァリアントをふくめ65曲を収集することができた。それらを国際音声記号と仮名文字によって記録・保存した。2内容...歌詞の内容は、(1)神や英雄の讃美、(2)生産生活、(3)祝祭、(4)人間関係、(5)家庭生活などを主題にしている。個々の歌謡は、このような主題への分化を通して、みずからの宗教的な機能あるいは世俗的な機能を実現している。3構造...歌詞の構造は、社会的な人間関係や家庭生活を主題としたごく一部の歌謡だけが抒情的であるが、その他の多くは叙事的であり、多良間島の歌謡の古い性格を特徴づけている。4歌唱主体...歌謡を実現する主体は、叙事的歌謡が集団、抒情的歌謡が個人という一般的傾向がある。しかし集団によって歌謡が実現される際には、その組織形態は(1)男性老人、(2)女性、(3)男女のグル-プにわかれることが多い。さらにこれらは、ムトゥバ-リとよばれる前唱者とウティガ-リとよばれる後唱者にわかれる。5歌唱法...歌唱法には、(1)復唱法、(2)分担歌唱法、(3)分担・復唱法、(4)復唱・斉唱法などがあり、復唱法を基本にしていることがわかるが、このことは、歌詞の内容の宗教性や構造の叙事性と関連していて、この島の歌謡の古い性格を特徴づけている。宗教的な歌謡ばかりではなく、世俗的な歌謡においても、この歌唱法が一貫していることもそのことをうらづけている。沖縄・多良間島に伝承されている古謡を収集し,構造分析的な観点からその内容分析を行うことと,古謡がそれをとりまく外的な諸要素とのかかわりのもとにはたす機能との二点について明らかにするために、次のような作業手順を採用した。1.古謡に関する既刊の文献・音声資料を収集する。2.臨地調査を実施して,映像・音声資料を収集する。3.歌詞資料を国際音声記号およびかな文字により翻字する。4.歌詞を歌形論的に分析する。5.歌詞の内容を構造・主題論的な観点から分析する。6.歌唱主体の資格・条件,組織形態,役割および歌唱法を調査する。7.古謡をうたうことにともなう行動形態を調査する。以上の収集・分析の結果,現段階において,多良間島の古謡は神々や英雄を主題にする宗教的な古謡と,人々の社会的な関係を描く世俗的な古謡との,二つの大きなタイプに分類することができるだろうという見通しをえた。このことは歌謡をとりまく歌謡をとりまく歌唱主体やその他の諸要素とも関連していて,歌謡の社会的な機能にも二つのタイプが存在することをしめしている。平成3年度は、多良間島現地において、前年度の調査資料にもとづいた聞き取りと、あらたな歌謡を収集し、それらを機能と構造の観点から分析した結果、以下の知見をえることができた。1歌詞資料...ヴァリアントをふくめ20曲を収集することができた。

3構造...歌詞の構造は、社会的な人間関係や家庭生活を主題としたごく一部の歌謡だけが抒情的であるが、その他の多くは叙事的であり、多良間島の歌謡の古い性格を特徴づけている。4歌唱主体...歌謡を実現する主体は、叙事的歌謡が集団、抒情的歌謡が個人という一般的傾向がある。しかし集団によって歌謡が実現される際には、その組識形態は(1)男性老人、(2)女性、(2)男女のグル-プにわかれることが多い。さらにこれらは、ムトゥバ-リとよばれる前唱者とウティガ-リとよばれる後唱者にわかれる。5歌唱法...歌唱法には、(1)復唱法、(2)分担歌唱法、(3)分担・復唱法、(4)復唱・斉唱法などがあり、復唱法を基本にしていることがわかるが、このことは、歌詞の内容の宗教性や構造の叙事性と関連していて、この島の歌謡の古い性格を特徴づけている。宗教的な歌謡ばかりではなく、世俗的な歌謡においても、この歌唱法が一貫していることもそのことをうらづけている。
合成小分子プローブを用いたレーザー分子機能不活化

本研究は標的分子を認識する分子不活化プローブを作製してレーザー分子不活化を行うことを目的とする.分子不活化プローブは最初の標的としてイノシトール3リン酸(IP_3)受容体を標的として作製するが,疎水性相互作用を用いることにより強い親和性を持たせることができる.この手法開発の成功により,生きた状態での細胞内分子の作用解明が初めて可能となる.具体的には,IP_3受容体をターゲットと、したレーザー分子機能不活化(CALI,Chromophore-assisted Laser Inactivation)実験を,シングルセルレベル行う.CALIは,それまで正常に機能していた分子を細胞が生きたまま壊すことができるため,機能解析に有用であると注目を集めている.本年度は,培養細胞系あるいは組織標本の培養液に混ぜるだけで,標的蛋白質に特異的に標識化できる技術を開発した.この場合,不活化プローブを標的蛋白質に導入できる手法開発につながりCALlを汎用的手法に改良できると考えた.蛋白質には修飾標的となる末端残基を導入する.この残基にはポリヒスチジンあるいはセリンプロテアーゼの活性部位のシステインへの改変体を含むオリゴペプチドを用いる.これらの残基と細胞内の環境でそのまま特異的に反応する反応基を設計・合成する.次に,ポリヒスチジンを標的とした反応基として,多価認識できる金属錯体(Ni^<2+>)をデザインする.既存のNi^<2+>錯体と蛍光色素を用いると消光することが報告されている.しかし,既にこのメカニズムが蛍光共鳴エネルギー移動に基づくことを発見した.そこで,Forsterの関係式の重なり積分(J)をNi^<2+>錯体との間に有さない蛍光色素の開発を行った.本研究は標的分子を認識する分子不活化プローブを作製してレーザー分子不活化を行うことを目的とする.分子不活化プローブは最初の標的としてイノシトール3リン酸(IP_3)受容体を標的として作製するが,疎水性相互作用を用いることにより強い親和性を持たせることができる.この手法開発の成功により,生きた状態での細胞内分子の作用解明が初めて可能となる.具体的には,IP_3受容体をターゲットと、したレーザー分子機能不活化(CALI,Chromophore-assisted Laser Inactivation)実験を,シングルセルレベル行う.CALIは,それまで正常に機能していた分子を細胞が生きたまま壊すことができるため,機能解析に有用であると注目を集めている.本年度は,培養細胞系あるいは組織標本の培養液に混ぜるだけで,標的蛋白質に特異的に標識化できる技術を開発した.この場合,不活化プローブを標的蛋白質に導入できる手法開発につながりCALlを汎用的手法に改良できると考えた.蛋白質には修飾標的となる末端残基を導入する.この残基にはポリヒスチジンあるいはセリンプロテアーゼの活性部位のシステインへの改変体を含むオリゴペプチドを用いる.これらの残基と細胞内の環境でそのまま特異的に反応する反応基を設計・合成する.次に,ポリヒスチジンを標的とした反応基として,多価認識できる金属錯体(Ni^<2+>)をデザインする.既存のNi^<2+>錯体と蛍光色素を用いると消光することが報告されている.しかし,既にこのメカニズムが蛍光共鳴エネルギー移動に基づくことを発見した.そこで,Forsterの関係式の重なり積分(J)をNi^<2+>錯体との間に有さない蛍光色素の開発を行った.