hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
生きたマウスでｐ５３からＡＴＭへのフィードバックループの動態を解析する

p53遺伝子は、ヒトの悪性腫瘍において最も高頻度に異常が認められている。野生型p53遺伝子はがん抑制作用を有するのに対し、変異型p53は発がん性に作用する。しかし、数多くの変異がどのように、野生型p53を全く逆の作用をもつ分子へと転換するのかはあまりよくわかっていない。申請者らはArg273His変異を有するp53が野生型よりも多くのp53アイソフォームを発現すること、そしてその中には最近同定されたデルタ160p53アイソフォームが含まれることを示した。肺がん細胞株であるA549細胞にArg273His変異を有するp53を発現させると、細胞が密集状態になっても増殖を続けた。このがん細胞の特徴ともいえる性質は、Arg273His変異を有するp53のみならずデルタ160p53アイソフォームでも観察された。一方、Arg273His変異を有するp53遺伝子にデルタ160p53アイソフォームの発現に必要な開始コドンの変異を入れると、細胞増殖を誘導することができなくなった。さらに、ストレス環境下での細胞生存、細胞接着、三次元構造形成能、浸潤能など様々な性質についても解析を行ったところ、変異p53が有する性質のほとんどは、60p53アイソフォームの発現によって説明できることが分かった。この結果は、Arg273His変異を有するp53の性質は、デルタ160p53アイソフォームを始めとする短いp53アイソフォームにより説明できることを示す。26年度が最終年度であるため、記入しない。ATMバイオセンサーを発現するトランスジェニックマウスがATM活性を検出するのに十分な系であるかを確認するのが本年の研究目的である。まず、ATMバイオセンサー発現トランスジェニックマウス(ATM-FRETマウス)から腹腔マクロファージを単離した。試験管内でエトポシドによるDNA損傷を与え、ATM活性化を検出した。比較的ゆっくりしたタイムコースであったがATM活性化が観察できた。従って、バイオセンサーの発現量は十分であり、実験に用いることができることが確認できた。次に、intravital imagingの系をセットアップし、生きたマウスの筋肉細胞でのATM活性化を二光子顕微鏡を用いて観察した。放射線傷害を与えたのちにATM活性化が起きないかを調べたが、ATM活性化は検出限界以下であった。放射線傷害の条件等をさらに検討する必要があると思われる。一方、ATMとp53の関係を調べるために、試験管内で予備実験を行った。すなわち、p53野生型細胞とp53欠損細胞に対し、エトポシドによるDNA損傷を与え、ATM活性がどのように変化するかを解析した。この目的のために、数日にわたる観察系を作成し、ATMが数日のタイムコースで活性変化を起こしていることが確認できた。さらにこの系にp53の様々な変異体を導入するために、発現ベクターを準備した。これらは臨床検体にて観察される変異でる。また、今後の実験に供するためにATMバイオセンサー発現トランスジェニックマウスをC57/B6にバッククロスを続け、5代を経過した。今後、さまざまなC57/B6系統の変異マウスと交配してATMの意義を解析する予定である。p53遺伝子は、初めて同定された癌抑制遺伝子であり、ヒトの悪性腫瘍において最も高頻度に異常が認められている。p53遺伝子のタンパク質産物であるp53は、細胞が遺伝子損傷を受けると、細胞周期の停止や、アポトーシスを引き起こす。p53は、ATMやATRのようなDNA損傷を感知するキナーゼにより、直接的に、あるいはchk2を介して間接的に活性化される。近年、放射線ストレスによってp53の活性が周期的に振動していること、また周期的なp53の活性化が細胞の運命決定と関連していることが報告された。またp53の周期的な活性化サイクルには、p53-ATM間のネガティブフィードバックが関与していることも示されている。しかし、p53-P53-ATMのフィードバックの分子機構は未だ明らかになっていない点が多い。そこで本研究では、FRETバイオセンサーとライブイメージング技術を用いp53によるP53-ATMのフィードバック制御の分子機構を明らかにすることを目的とした。まず、ATMバイオセンサーを安定的に発現する癌由来培養細胞A549細胞(野生型p53を保持)とA549細胞におけるp53ノックダウン細胞、H1299細胞(p53を欠失)を樹立した。これらの細胞株のATM活性の周期的な時間変化を測定することで、p53-P53-ATMのフィードバックの影響を検討した。その結果、EtoposideによるDNA損傷後、A549細胞ではATMが一過的に活性化された後に基底状態近くまで減少する適応現象が観察されたのに対し、p53ノックダウン細胞、またはH1299細胞ではATMの持続的な活性化が観察された。また、A549細胞で観察された適応現象は、Etoposide濃度に依存することが示された。以上の結果から、p53遺伝子を保持する癌由来培養細胞において、p53-ATMのフィードバック機構が機能していることが示唆された。また、ATM活性の振動の持続時間は細胞密度の影響を受けることが確認された。そして、持続時間を短縮させる因子はPTP1Bであることが示唆された。

野生型p53遺伝子はがん抑制作用を有するのに対し、変異型p53は発がん性に作用する。しかし、数多くの変異がどのように、野生型p53を全く逆の作用をもつ分子へと転換するのかはあまりよくわかっていない。申請者らはArg273His変異を有するp53が野生型よりも多くのp53アイソフォームを発現すること、そしてその中には最近同定されたデルタ160p53アイソフォームが含まれることを示した。肺がん細胞株であるA549細胞にArg273His変異を有するp53を発現させると、細胞が密集状態になっても増殖を続けた。このがん細胞の特徴ともいえる性質は、Arg273His変異を有するp53のみならずデルタ160p53アイソフォームでも観察された。一方、Arg273His変異を有するp53遺伝子にデルタ160p53アイソフォームの発現に必要な開始コドンの変異を入れると、細胞増殖を誘導することができなくなった。さらに、ストレス環境下での細胞生存、細胞接着、三次元構造形成能、浸潤能など様々な性質についても解析を行ったところ、変異p53が有する性質のほとんどは、60p53アイソフォームの発現によって説明できることが分かった。この結果は、Arg273His変異を有するp53の性質は、デルタ160p53アイソフォームを始めとする短いp53アイソフォームにより説明できることを示す。26年度が最終年度であるため、記入しない。計画に予定していたATMバイオセンサー発現トランスジェニックマウス(ATM-FRETマウス)から腹腔マクロファージを単離し、試験管内でエトポシドによるDNA損傷を与え、ATM活性化を検出する実験は、ぼぼ想定した通りに進んだ。また、この実験を通して本トランスジェニックマウスが使えることも確認でき、これも計画した通りである。intravital imagingの系のセットアップしと生きたマウスの筋肉細胞でのATM活性化を二光子顕微鏡を用いて観察する系はうまくできたが、放射線傷害によるATM活性化は検出できていない。これは、今後、条件検討が必要であるが、概ね順調に進んだと言える。また、今後の実験に供するためのバッククロス等も着実に進んでいる。計画書に記載の研究はほぼすべて行うことができた。トランスジェニックマウスを用いた研究は現在遂行中であり、プロジェクト終了までには終わらせることができる見込みである。個体レベルでのATM活性のオシレーション機構を解析する。1.上記、intravital imagingシステムを使ってATMの活性変動機構を解析する。まず、エトポシド等のDNA損傷を与える薬剤を静脈あるいは腹腔経由で投与し、ATM活性化が観察できるかを調べる。2.同様の実験を、ガンマ線照射により行う。3.ATM活性化に及ぼすp53遺伝子の役割を明らかにするために、p53欠損マウスと交配し、同様の実験を行う。今後はPTP1Bがどのようなシグナル伝達経路を介し、ATM-chk2-p53経路を制御しているのか検証していく方針である。
高秩序化C＿＜60＞超薄膜を用いた高性能光機能素子の構築

LangmuirーBlodgett(LB)法を利用した、水面上におけるC_<60>単分子膜の構築法を考案した。C_<60>は分子凝集カが極めて大きいため、一般的な製膜法では分子が容易に3次元に凝集してしまい、分子レベルでの構造制御が困難である。本研究では、脂肪酸を用いたLB法において水面上における構造緩和現象が単分子膜の構造制御に有効であるという知見に基づき、多段階クリープ法によるC_<60>単分子膜の構築について検討を行った。C_<60>単分子膜は展開時には分子1個の膜厚を有する円形の結晶性ドメインを形成し、圧縮によりドメインが寄せ集められ、高表面圧への圧縮によりドメインの破砕・崩壊が生じる。C_<60>単分子膜について、種々の表面圧にて面積クリープによる構造緩和挙動を解析を行った結果、表面圧15mN・mX^<-1>での面積クリープが崩壊を生じない構造緩和を行うための最適条件であることが明らかとなった。以上の結果に基づき、多段階クリープ法を利用して、表面圧15mN・m^<-1>から20mN・m^<-1>まで段階的に圧縮を行うことにより、C_<60>単分子膜を構築した。調製された単分子膜は均一な形態を示し、その膜厚はC_<60>分子の直径と一致した。また、その分子配列は極めて高秩序に配列していることが明らかとなった。以上の結果から、多段階クリープ法を用いることで分子レベルで構造制御されたC_<60>超薄膜膜の構築が可能であることが明らかとなった。このC_<60>単分子膜を基板上に積層して構築した高秩序化C_<60>超薄膜素子を用いることにより、高機能性の発現が期待される。
歯科矯正時の骨リモデリングに関する細胞レベルでの生体力学的研究

生体組織の適応現象の中でも,歯科矯正時の歯槽骨のリモデリングは,特に顕著であり,かつ力学条件を明確に設定できるため,骨リモデリングの機序を解明する最適な研究対象のひとつである.本研究は,歯科矯正における歯槽骨リモデリングと力学的刺激との因果関係を,歯根部力学条件・血流・破骨細胞出現の相互関係から,生体力学的に明らかにすることを目標とした.歯周組織内の応力解析には歯根膜の材料定数が必須であるが、実測値は皆無に近い。そこでまず,ネコ歯根膜を対象に,歯根膜の材料定数を測定した.微小組織を実体顕微鏡下で測定の可能な小型の圧縮・引張試験機を開発し,応力・ひずみ特性を求めたところ,引張では速度依存性が見られないのに対し,圧縮では大きく速度に依存することが明らかになった.応力・ひずみ特性から求めた準静的状態での歯根膜の弾性率は,引張では0.37±0.11MPa,圧縮では0.079±0.017MPaであった.歯科矯正圧迫側で生じる変性組織の圧縮弾性率は,0.143±0.035MPaと有意に高値を示した.また,荷重試験中の歯根膜の体積変化からポアソン比を測定したところ,圧縮では引張に比し有意に低値を示した.次に,ネコ犬歯を対象に実験的歯科矯正を実施し,各組織切片に対応する有限要素モデルを作成して,破骨細胞出現部位の応力値を求めた.その結果,破骨細胞は,固体,矯正条件によらず,歯根膜内の最小主応力値が-4kPa(30mmHg)程度で最も多く出現することが明らかとなった.破骨細胞は造血幹細胞に由来する細胞であり,破骨細胞は歯根膜内の血流が阻害されない程度の最適な圧縮応力部位に選択的に出現することを,細胞レベルの計測と解析で初めて実証することができた.生体組織の適応現象の中でも,歯科矯正時の歯槽骨のリモデリングは,特に顕著であり,かつ力学条件を明確に設定できるため,骨リモデリングの機序を解明する最適な研究対象のひとつである.本研究は,歯科矯正における歯槽骨リモデリングと力学的刺激との因果関係を,歯根部力学条件・血流・破骨細胞出現の相互関係から,生体力学的に明らかにすることを目標とした.歯周組織内の応力解析には歯根膜の材料定数が必須であるが、実測値は皆無に近い。そこでまず,ネコ歯根膜を対象に,歯根膜の材料定数を測定した.微小組織を実体顕微鏡下で測定の可能な小型の圧縮・引張試験機を開発し,応力・ひずみ特性を求めたところ,引張では速度依存性が見られないのに対し,圧縮では大きく速度に依存することが明らかになった.応力・ひずみ特性から求めた準静的状態での歯根膜の弾性率は,引張では0.37±0.11MPa,圧縮では0.079±0.017MPaであった.歯科矯正圧迫側で生じる変性組織の圧縮弾性率は,0.143±0.035MPaと有意に高値を示した.また,荷重試験中の歯根膜の体積変化からポアソン比を測定したところ,圧縮では引張に比し有意に低値を示した.次に,ネコ犬歯を対象に実験的歯科矯正を実施し,各組織切片に対応する有限要素モデルを作成して,破骨細胞出現部位の応力値を求めた.その結果,破骨細胞は,固体,矯正条件によらず,歯根膜内の最小主応力値が-4kPa(30mmHg)程度で最も多く出現することが明らかとなった.破骨細胞は造血幹細胞に由来する細胞であり,破骨細胞は歯根膜内の血流が阻害されない程度の最適な圧縮応力部位に選択的に出現することを,細胞レベルの計測と解析で初めて実証することができた.本研究では,歯科矯正における歯槽骨のリモデリングと力学的刺激との因果関係を,歯根部力学条件-血流-破骨細胞出現の相互関係から生体力学的に明らかにすることを目標としている.本年度では,まず歯根膜の物性値を測定し,その結果に基づいて組織切片対応の有限要素解析を実施し,破骨細胞出現部位の応力値を信頼し得る精度で推定することを目的した.歯根膜の物性値は,歯,歯槽骨などの硬組織に比較して,厚さ約0.2mmの軟組織であるため実測値が極めて少なく,また、応力解析において重要な値となるため,弾性率測定装置を新たに作成し,ヤング率を実測により求めた.生体軟組織の力学試験は引張試験を行うのが一般的であるが,本研究の解析条件に対応できるよう,引張および圧縮の両試験法で試験可能な装置とした.その結果,歯根膜の力学特性は試験法によって大きく異なり,ヤング率は引張で0.37±0.11 MPa,圧縮で0.079±0.017 MPaであること,また,弾性特性のひずみ速度依存性は圧縮試験において顕著であることが明らかとなった.従来,生体軟組織の力学特性はひずみ速度にほとんど依存しないとされてきたが,本研究によって,圧縮試験においては依存性があることが示唆された.次に測定により得られたヤング率を用いて,組織切片に詳細に対応する有限要素モデルを作成し,破骨細胞の出現部位の応力値を求めた.その結果,破骨細胞は-45 kPa程度で最も多く出現することが明らかとなった.

しかし,得られた応力値に関しては従来の仮説との対応が取れない点も認められた.応力の算出に関してはシミュレーション的手法を用いているため,実験的に妥当性を検証する必要性を認識するに至った.この点に関しては,次年度に計画している歯根膜内血流分布観察との比較により,歯根部力学条件-血流-破骨細胞出現の相互関係を実験的に検証することを目指す.生体組織の適応現象の中でも,歯科矯正時の歯槽骨のリモデリングは,特に顕著であり,かつ力学条件を明確に設定できるめ,骨リモデリングの機序を解明する最適な研究対象のひとつである.本研究は,歯科矯正における歯槽骨リモデリングと力学的刺激との因果関係を,歯根部力学条件-血流-破骨細胞出現の交互関係から,生体力学的に明らかにすることを目標とした.歯周組織内の応力解析には歯根膜の材料定数が必須であるが,実測値は皆無に近い.そこでまず,ネコ歯根膜を対象に,歯根膜の材料を測定した.微小組織を実体顕微鏡下で測定の可能な小型の圧縮・引張試験機を開発し,応力-ひずみ特性を求めたところ,引張では速度依存性が見られないのに対し,圧縮では大きく速度に依存することが明らかになった.応力-ひずみ特性から求めた準静的状態での歯根膜の弾性率は,引張では0.37±0.11MPa,圧縮では0.079±0.017MPaであった.歯科矯正圧迫側で生じる変性組織の圧縮弾性率は,0.143±0.035MPaと有意に高値を示した.また,荷重試験中の歯根膜の体積変化からポアソン比を想定したところ,圧縮では引張に比し有意に低値を示した.次に、ネコ犬歯を対象に実験的歯科矯正を実施し,各組織切片に対応する有限要素モデルを作成して,破骨細胞出現部位の応力値を求めた.その結果,破骨細胞は,固体,矯正条件によらず,歯根膜内の最小主応力値が-4kPa(30mmHg)程度で最も多く出現することが明らかとなった.破骨細胞は造血幹細胞に由来する細胞であり、破骨細胞は歯根膜内の血流が阻害されない程度の最適な圧縮応力部位に選択的に出現することを,細胞レベルの計測と解析で初めて実証することができた.
スーパー抗原性細菌外毒素に対する免疫応答機構の解析

<目的>黄色ブドウ球菌等から産生される外毒素は、スーパー抗原(SAg)としてMHCの拘束性無しにTCRVβ鎖に結合して、特定Vβ鎖を発現する多クローンT細胞を刺激する。その結果、免疫応答の異常-大量サイトカイン産生とそれに続く免疫反応の不応答性-をもたらす。本研究では、SAgに刺激されたTh細胞の免疫記憶誘導の有無とその機序を明らかにすることを目的とする。<結果>上記目的遂行のために、SAgと通常抗原が同一或いは同数のT細胞をin vivoで刺激・活性化する系として、OVAペプチド特定的であると同時にSAg、TSST-1反応性のVβ15保持TCR-Tgを用いた。一方では、TSST-1がSAgとして結合するTCRVβレパートリーを欠如したマウス(LD)を作製して(BBRC298:420,2002)、TSST-1がSAgとして反応できない対照モデルとした。TSST-1を免疫したTCR-Tgマウスでは、OVA免疫に比較して記憶T細胞の絶対数が著減した。この細胞増殖抑制は、免疫後短時間内でのT細胞の不応答性に由来することが、IL-2産生能が数時間後より減少することから示唆された。一方、アジュヴァントと共に同一TCR-Tgを免疫すると、OVA免疫と同程度に抗原特異的IgG1が検出され、Vβを介してTSST-1と反応したT細胞は部は不応答性誘導を回避して記憶細胞に分化する可能性が示唆された。来年度は記憶細胞の存在と寿命を移植実験により確認し、その機能の詳細な解析検討を進めたい。
新生児NaiveT細胞の機能的特異性とMemoryT細胞への分化・成熟

平成2、3年の本研究で得られた結果の概要は以下の通りである。1.新生児T細胞はCD45RO陰性、CD45RA陽性のnaiveT細胞の形質及び機能的性状をもつが、強いサプレッサ-活性、刺激培養の結果CD45RA陽性からCD45RO陽性に形質転換したmemory様細胞にあっても、ヘルパ-活性はなお不良であるなど、成人naiveT細胞と異なる。2.Tγδ細胞の比率は加齢につれ増し、これは主としてCD45RO抗原陽性、抗原応答性をもつBB3陽性サブセットの増加による。が、末梢血の小集団のδTCSー1陽性細胞はCD45RO陰性のnaiveT細胞の性状を示す。3.抗CD2抗体によるmemory CD4^+T細胞の増殖反応は単球非存在下でも良好で、ILー2のみならずILー6を産生。他方、naive CD4^+T細胞の抗CD2抗体反応性は微弱であり、ILー6産生欠如が要因である。4.伝染性単核症では、CD8^+のみならずCD4^+T細胞がCD45RO抗原を強く発現、CD45RO発現は本症における両T細胞サブセットのEBウイルス感染による活性化状態を示唆する。5.抗原応答性というmemoryT細胞の本来の機能に関連して、末梢血memoryT細胞はILー2Rを構成する2つのサブユニット(α、β鎖)を発現。つまり、memory CD4^+T細胞はILー2Rα鎖を、memory CD8^+T細胞はILー2Rβ鎖を発現、ILー2Rサブユニット発現に対応して、memoryT細胞サブセットはILー2添加に強く反応、増殖する。6.新生児、小児末梢血CD4^+T細胞の中に、naive形質をもつが、ILー2Rα鎖を発現、memory細胞としてのサイトカイン遺伝子発現能を有する、naiveからmemoryT細胞へ分化途上の小細胞集団が存在する。7.全血法により、成熟新生児ではILー6産生能は成人に匹敵するが、未熟児のILー6産生能は未成熟であり、ことに細菌刺激に対するILー6産生が不良であることを明かとした。平成2年の研究にて以下の結果が得られた。1.CD45RO発現を指標として、MemoryT細胞の頻度が月齢の推移に伴い増加し成人値に近づくこと、新生児でみられるNaiveT細胞は機能的にレクチン、抗CD3、抗CD2抗体に対する反応性、Ig産生に対するヘルパ-活性などの点で成人でみられるCD45RA陽性のNaive細胞に似ているが、サプレッサ-活性が極めて強く、PHAとILー2で誘導したCD45RO陽性のMemory様の細胞にあってもヘルパ-能は不良であるなどの違いが観察された。2.T細胞のうち抗原レセプタ-γδ鎖を有する細胞は生下時少なく成長と共に増加し、ことにこれはBB3陽性細胞の増加と関係があり、興味あることにはBB3陽性サブセットはすでにCD45ROを発現しており抗原にも反応しMemoryT細胞の性状を示し、δTCSー1陽性サブセットがCD45RO陰性であるのと対照的である。

3.新生児や成人のNaiveCD4細胞の抗CD2抗体に対する反応性はMemoryCD4細胞に比べ極めて少なく、ILー6の添加により修復されることより、反応の不良性は自らのILー6産生の欠如に基因することを明らかにした。4.CD45RO抗原発現は生体内で抗原暴露に会い活性化されたT細胞に表現されること、成人ではILー2R(CD25)発現は主としてMemoryCD4細胞にみられ、Memory細胞機能と深く関わっている様であるが、新児臍帯血に見いだされる少数のILー2R陽性CD4細胞はCD45R抗原陽性のNaive細胞の形質を有し、機能的にはILー4、ILー5、IFNーγなどのサイトカイン遺伝子発現やIg産生に対するヘルパ-能をもち、Memory細胞へと成熟する過渡期にあるユニ-クな細胞集団であることを示した。平成3年の研究にて以下の結果が得られた。1.EBウイルス感染により引き起こされる伝染性単核症では、活性化CD8^+T細胞の増加がみらるが、その大部分はその活性化状態を反映してCD45RO抗原を発現、しかも比率の上では増加のみられないCD4^+T細胞もまたCD45RO抗原を強く発現、CD45RO発現は的症における両T細胞サブセットのEBウイルス感染による活性化状態を示唆する。興味あることに、このようなCD45RO抗原陽性T細胞サブセットは病理学的に、アポト-シスというメカニズムで容易に細胞死に陥ることを観察した。2.抗CD3抗体によるmemory及びnaiveCD4^+ T細胞の活性化様式の相違をセルソ-タ-に単離した細胞を用い検討した。抗CD3抗体によるT細胞の活性化には、従来固相化した抗CD3抗体では単球非存在下で起きるとされてきたが、より事化した細胞を用いると、固相化の条件でも、memory CD4^+ T細胞もまた単球の存在が必要であることを明かにした。重要な点は、一般に反応の微弱とされるnaiveCD4^+ T細胞の抗CD3抗体反応性は、一定の条件(単球、ILー6、ILー2、ILー4などのサイトカインの供与)が整えばmemory CD4^+ T細胞に匹敵することである。naive CD4^+ T細胞の反応性の不良の背景に、これらサイトカインの産生の未熟性があると考えられた。3.ILー2Rα鎖陽性、かつCD45RA陽性のnaive形質をもつが、memory細胞として機能を有する小細胞集団が、新生児臍帯血に存在する。この小細胞群のnaive CD4^+ T細胞の成熟過程での意義を明かにするために、新生児CD4^+ T細胞をin vitroで刺激培養、刺激後24時間にすでに、ILー2Rα鎖陽性かつCD45RA陽性の状態で、memory細胞様のサイトカイン産生能をもつ細胞を誘導可能であることを明かにした。
HSP32を標的とする高分子型制癌剤PEG化亜鉛プロトポルフィリン(ZnP)

(1)目的とする高分子化ZnPP(Hsp-32/HO-1の阻害剤)のPEG化ZnPP結合物およびSMA-ZnPPミセル剤を再現性よく合成することができた。とくにPEG-ZnPPの合成はZnPPにスペーサーのNH_2-CH_2CH_2-NH_2を導入して、そのアミノ基にPEGを結合させた。両者ともEPR効果を示したが、PEGの方が腫瘍組織への集積性は高かった。(2)しかし、SMA-ZnPPミセルの細胞への取り込みはPEG-ZnPPよりも4-8倍効率がよかった。(3)SMA-ZnPPミセルは細胞内に取り込まれた後は、レシチンなど細胞膜成分との接触により崩壊し、freeのZnPPを放出した。(4)PEG-ZnPPは腫瘍組織によく集積し、その後、その局所のプロテアーゼ(セリン型およびチオール型)により次第にアミド結合が切断され、freeのZnPPを放出した。(2)LED光の420nmの照射により、in vitroの食道癌細胞Kyse510、ATL細胞のMT-2、CML細胞のK562、乳癌細胞のSW30などに対し、殺細胞効果は増強された。本研究の目的は、毒性がなく、腫瘍に集中し、多くの癌腫にユビキタスに有効な画期的制癌剤を開発することである。そのため、HSP-32(HO-1、ヘムオキシゲナーゼ)阻害剤のZn化プロトポルフィリン(ZnPP)をPEG化して行うことである。本年度は所定のPEG化ZnPPの合成法の最適化を行い、Key stepとして98%程度のprotoporphyrin-bis(ethylene-diamine)の作成に成功した。また、内視鏡光源(xenon光)の照射とPEG-ZnPPとの併用によるDMBAによるラットの化学発がん(乳がん)モデルを用い、より詳細な治療効果を検討した。その結果、PEG-5000と同様、PEG-2000からもT/B比510%の高い腫瘍集積能力を示すPEG-ZnPPを得た。また、腫瘍細胞(腫瘍化リンパ球(K562)および乳がん細胞SW480)へのuptakeをin vitroで、PEG-ZnPPおよびZnPPのもつ自家蛍光をもとに定量した。PEG-ZnPPの細胞へのuptakeはコンフォーカル顕微鏡を使用し、タイムプラス法により解析を行った。同時に比較のためにSMA-ZnPPのとり込みを比べた。1、水可溶化亜鉛プロトポルフィリン(ZnPP)の高分子型制癌剤として、PEG結合型亜鉛プロトポルフィリン(PEG-ZnPP)およびスチレンマレイン酸コポリマー(SMA)ミセル抱合型ZnPP(SMA-ZnPP)ミセルを合成した。2、次にPEG-ZnPPおよびSMA-ZnPPの培養腫瘍細胞に対する増殖抑制効果とあわせ、内視鏡Xenon光源光およびLEDの420nmのモノクロマチックの両光照射下での抗腫瘍効果を検討した結果、強い相乗効果がみられた。ヒト白血病CML、細胞K562、ALL、バーキットリンパ腫系、Raji細胞、ATLのMT-2細胞、ヒト食道癌Kyse510、大腸癌SW40、乳癌MCF-7細胞の何れもIC50値が110μMであった。3、In vivoの化学発癌剤DMBA誘発ラット乳癌、マウスS-180およびColon 38に対して、Xenon光(スライドプロジェクター用)および単3乾電池4本のLED光源の420nm附近の光照射(30分)による照射でもPEG-ZnPPおよびSMA-ZnPPの単独i.v.投与に加え、光照射併用群では最も著名な抗腫瘍効果を示した。4、細胞への取り込みはSMA-ZnPPはPEG-ZnPPの数倍速かった。また、これらはendocytosisにより取り込まれた。PEG-ZnPPのcellへの取り込みが低いことは、いわゆるPEG-dilemmaで説明できる。5、PEG-ZnPPのアミド結合はセリン型およびチオール型プロテアーゼにより切断され、freeのZnPPの遊離がみられた。
オオタバコガの体眠性の地理的変異と遺伝子発現に関する生態遺伝学的研究

オオタバコガの蛹休眠性において、誘起要因、地理的変異、低温耐性、日長反応の分子機構などが調べられた。その結果、以下のようなことが明らかとなった。1.18°Cという低温条件下において日長反応が調べられたが、短日で休眠が誘導され、その傾向は雌より雄で強いことが分かった。2.半野外条件下においてオオタバコガとタバコガの休眠性が比較された。オオタバコガは秋に一部の個体で蛹休眠が誘導され、越冬可能であった。しかし、秋の進行に伴い、多くの個体が低温により蛹化前に死亡した。一方、タバコガは、夏の高温条件下でも短日により蛹休眠が誘導された。これらの結果は、オオタバコガの温帯における気候適応は不完全であることを示唆した。3.休眠性において明確な地理的クラインは検出されなかったが、温帯個体群と違って、亜熱帯個体群では温度日長の変化に反応して休眠が誘導されるのではなく、低温が長く続いたときに休眠を誘導されることが予測された。4.オオタバコガの蛹休眠の日長感受期は5齢期であると推定された。5.オオタバコガの休眠蛹は平均気温が0°Cより高い地域では越冬可能であるが、非休眠蛹は越冬できないと思われた。また、休眠蛹の低温耐性にはトレハロースが関係していると考えられた。6.複数の遺伝子座とその非相加的相互作用が休眠率に影響していることが示唆された。また、幼虫期間と休眠との間には遺伝相関があることが分かった。上記の結果から、亜熱帯性昆虫のオオタバコガは、その休眠特性において温帯の昆虫とはかなり異なっているものの、今後地球温暖化の進行に伴いわが国でも十分に発生を拡大することが可能であると考えられた。今年度に得られた研究実績は以下のように要約される。(1)これまで実験室で見られた休眠率の雌雄差が野外においても発現するかどうか、および休眠反応が有効に機能しているか否かを野外網室における飼育実験により調べた。その結果、休眠誘導時期における雌雄差は見られなかったものの、第二世代成虫の産下卵では8月下旬から9月上旬に産下されたもののみが休眠蛹になった。秋の第四世代の幼虫生存率は季節が進行するにつれて急速に低下したが、蛹化したものはすべて休眠した。(2)幼虫の発育期における日長や温度を変化させる実験を行ったが、温度を高温から低温に、また日長を長日から短日に変化させた場合に、より顕著な休眠誘導がなされることが分かった。また、亜熱帯性のオオタバコガと比較するために温帯性のタバコガにおいても日長反応を調べたが、日長に対してより鋭敏に反応して休眠が誘導されることが分かった。(3)休眠覚醒の環境要因を明らかにするために、とりあえず冷却(5°C)の効果を調べたが、恒温・一定日長で誘導された休眠は、冷却期間の有無や長短にかかわらず、25°C条件下に移すとすぐに覚醒した。(4)三重県、滋賀県、長野県、新潟県、および沖縄県においてオオタバコガ幼虫を採集し、そのうち沖縄県を除く4個体群の系統を作成したが、それらで休眠性における明確な地理的勾配は検出されなかった。(5)トレハロースの含有量を測定した結果、休眠蛹でより増加することが分かった。

したがって、本種の蛹の低温耐性は他の昆虫でよく知られているグリセロールではなく、トレハロースの蓄積によると考えられた。(6)同じ個体群の中でも休眠率には大きな変異性が見られた。選抜実験の結果、休眠率の高いグループからは高い次世代、逆に低いグループからは低い次世代が得られたことから、それは遺伝的要因によるものと考えられた。今年度に得られた研究実績は以下のように要約される。(1)オオタバコガの亜熱帯個体群(沖縄個体群)と温帯個体群(新潟個体群)の休眠性を比較した結果、亜熱帯個体群では変温変日長条件下で休眠がほとんど誘導されなかったのに対して、恒温一定日長条件下では高い割合で誘導されることが分かった。このことは、本種の亜熱帯個体群が休眠機構そのものを有していないことではなく、変温変日長条件下での休眠誘導が温帯特有のものであることを示唆した。また、休眠の深度は変温変日長条件下で誘導される場合の方で深いことも分かった。これらのことから、オオタバコガの休眠性においては明確な地理的変異が存在し、温帯個体における休眠は、気温の低下が急速な温帯の秋季に対応したものであることが示唆された。(2)短日から長日への変更実験の結果、日長の主要な感受期は5齢前半(摂食期間)であり、3齢と4齢にも日長に対して応答性を持つことが明らかとなった。また、長日から短日への変更実験の結果からも、蛹の休眠は5齢前半までに決定され、5齢後半(摂食をやめた後)の日長は影響がないことが示唆された。(3)オオタバコガの休眠蛹と非休眠蛹の低温順化実験の結果、非休眠蛹は冬季の気温が低い地域では越冬できないと思われたが、休眠蛹は冬季の低温によく耐えて少なくとも東北地方の南部までは越冬可能と推定された。(4)本種蛹の低温耐性には、他の昆虫でよく知られているグリセロールではなくトレハロースの蓄積によると考えられた。また、グルコースは、耐寒性に直接関与していないと考えられた。(5)タバコガの温帯個体群(滋賀個体群)は比較的高温でも短日処理により休眠が誘導されたが、亜熱帯個体群(沖縄個体群)は変温変日長条件下でもほとんど休眠が誘導されなかった。(6)温帯への気侯適応に関して、オオタバコガはタバコガには劣るが、明確な地理的変異が検出されたことから、ある程度の適応がなされているものと考えられた。地球温暖化にともない南方からの亜熱帯性害虫の侵入が危倶されている。こうした現状を背景に、世界的な農業害虫オオタバコガHelicoverpa armigeraが温帯日本へ侵入、定着する可能性について、それに関わる休眠性に着目し、表現型発現や遺伝子発現の地理的変異を探索しようと試みた。既に温帯個体群が定着しているならば国内で採集される個体群間に休眠発現の地理的傾向が検出されるはずである。短日条件下で休眠反応がより強く誘導されるという傾向が昆虫全般において知られている。実験室内で各地のオオタバコガ個体群を休眠させ、その休眠臨界日長(休眠率50%を示す日長)を比較したが、その反応が雌雄で異なるという結果が観察され、単純な日長反応からは本種の定着の可能性が議論できないことが示唆された(Shimizu & Fujisaki,2002)。しかし、本種温帯個体群が有する休眠は越冬の際には有効で、体内代謝産物のトレハロースの蓄積が低温耐性に重要な役割を果たすことが明らかとなった(Izumi et al.,2005)。温帯起源の近縁種タバコガとの比較により、オオタバコガの休眠誘導には日長が短縮していく過程や温度が低下していく過程がより重要な刺激となっている可能性が示唆されたため、変温変日長刺激に対する休眠反応を調べた。その結果、変温変日長に反応して休眠を誘導する特性は温帯個体群でのみ観察され、沖縄の亜熱帯個体群では短日条件下で低温が長く続いたときに休眠することが分かった。温帯特有の厳冬に対する休眠誘導が進化していることが明らかとなった。
あらゆる臓器に対応した呼吸同期照射を実現する四次元的最適照射法の確立

癌研有明病院で呼吸同期照射を行なった患者より呼吸波形を収集した。また、その波形を読み込んで、その波形を模擬する呼吸同期ファントムを作成した。精度の高い四次元治療を行なうために、患者の体位変化を監視するソフトウェアを開発した。呼吸同期ファントムの利用および健常ボランティア6名の協力により、そのソフトウェアを評価した。充分に臨床で許容できるソフトウェアであり、そのソフトウェアを利用することで呼吸同期照射の精度が高くなるということを示すことができた。平成20年度は「動体ファントムシステムの設計と構築および患者の呼吸波形データの収集」を行った。「動体ファントムシステムの設計と構築」では、現在患者個々の肺の動きを模擬した動体ファントムは一般の市場にはない。そのため、水等価および肺等価材質を選定し、さらにIMRTのQA/QCに利用するファントムと組み合わせ、胸部および肺腫瘍、肺野を模擬したファントムを設計し、作成した。また、肺腫瘍の動きを模擬するため、患者の呼吸と同じようにファントムが動作するようにロボットなどを組み合わせた動体ファントムを設計、作成した。これによって、来年度、呼吸同期照射における最適な照射決定をするため四次元的最適照射法を考案するための基礎データを取ることができると考えられる。また、これを利用し、フィルム測定および電離箱測定も可能になったため、最適照射を測定でも保証することが可能になった。また、動体ファントムの動作のユーザインターフェースソフトを作成した。これによって、動体ファントムが患者の呼吸波形情報をデジタル情報として取り込むことで、特定の患者の腫瘍の動きを模擬することが可能になった。「患者の呼吸波形データの収集」では、癌研有明病院における呼吸同期照射を行った患者の呼吸波形情報をデジタル情報として抽出した。これにより、これらの波形データを動体ファントムのユーザインターフェースに入力することで、患者の肺腫瘍の動きを模擬することができるようになった。平成21年度は動体ファントムシステムの改良を行なった。まず、平成20年度に動体ファントムシステムを作成した。平成21年度は(財)癌研究会有明病院放射線治療部にて実際呼吸同期照射を行なった患者さんの呼吸波形データを収集した。それらの呼吸波形を開発したファントムシステムのソフトウェアを利用して取り込むことを可能とした。その波形の情報を動体ファントムに送信し、波形通り動かすために離散化するアルゴリズムを開発した。アルゴリズムでの解析後、そのデータを動体ファントムに送信し、動作することを確認した。また、その動体ファントムを利用して、呼吸同期照射における不確かさの検討を行つた。すなわち、計画時は静的な画像での計画であるが、実際は呼吸によって腫瘍が動作する。それによって実際患者に投与されている線量が計画と異なる。そこで、癌研有明病院にて使用している一般的なファントムと本研究で開発したファントムを利用して、ファントム実験による実測線量と計画線量の比較を行なった。適切な呼吸同期ゲート幅を設定した場合、腫瘍を含むターゲット内は目的とする線量が投与されることが確認されたが、ゲート幅の設定が小さい場合や患者セットアップによってゲート幅の位置が間違った場合、腫瘍に十分の線量が投与されない可能性が示唆された。【呼吸同期ファントムを利用した測定】平成22年度は、平成21年度改良を行った動体ファントムシステムを利用し、呼吸同期システム無し、有りの両方でIMRT(Intensity Modulated Radiation Therapy,強度変調放射線治療)の測定を行なった。呼吸同期システム無しの場合に対し、有りの場合MLC(Multi-Leaf Collimator)の動きが細かい位置でのエラーが発生し、5%以上であった。ただし、線量投与を確保したいCTV(Clinical Target Volume)の範囲内では3%以内であった。したがって、CTV外での線量差が目立ち、肺野での線量差のエラーが大きくなる傾向であるが、呼吸同期照射無しでも5%以上異なる場合もあるので、十分呼吸同期照射の適応と考えられる。Intra-fractional errorの検出を可能とするシステムの開発を行なった。今年度購入したMacBookAirを利用して、動体ファントムを利用した実験および健常ボランティアを利用した実験を行なった。動体ファントムでの実験では、振幅は設定値(10mm)に対し、0.85±0.25mm、最大1.5mm異なった。カウチ移動量(Intra-fractional error)に対し、0.15±0.5mm、最大0.8mm(設定値3mm)異なった。周期(2200msec)に対し、-5.1±13msec、最大46.1msec異なった。処理時間は58.59±23.73msecであった。AAPMTG-142ガイドラインでは、Temporal accuracy : 100ms、Positional accuracy : 2mmであり、本開発システムはガイドラインに許容できるシステムであるといえる。次に健常ボランティアの協力を得て、本開発システムおよびVarian RPMシステムを利用してIntra-fractional errorの検出能を検討した。

その結果、本開発システムでは、Intra-fractional errorが1mm、2mm、3mm、5mm、10mmの時、それぞれ、67%、88%、97%、100%、100%であった。RPMでは、42%、79%、84%、96%、100%であった。本開発システムの方が検出能が高いという結果になったが、これはIntra-fractional errorの検出するためのマーカの設置位置によるものである。本開発システムは胸骨中央に、RPMでは腹部(臍と剣状突起の間)に設置したため、本開発システムのIntra-fractional errorが検出しやすくなったためであると考えられる。したがって、実際の4次元放射線治療では、本開発システムとRPMを組み合わせ、本開発システムはIntra-fractional errorの検出、RPMは実際の治療のゲートタイミングを計り、ゲート信号を送るものとして機能を分けることで、精度の高い4次元放射線治療ができるといえる。
理想的人格像からみた近現代の社会規範の変容と形成に関する比較社会論的研究

近現代の日本ならびに酉欧の理想的人格像に関して、比較社会論的な観点から、理論的かつ実証的に解明した。その成果は、毎年度ごと、合計3冊の研究報告書にまとめられた。本年度は最終の研究成果報告書を発行した。そのなかで一方では、日本における実業家の人格イメージ、ノーベル賞受賞者のイメージ、近代日本人イメージ、韓国社会における教師イメージ、イギリスにおける医師のイメージ、ドイツにおける近代人のイメージ、ナチスにおける理想的人格像などを実証的に分析した。他方では、そこから理論的に、それら人格像の産出プロセスが社会秩序の形成と密接に結びついていることを明らかにした。とくに近代日本人のイメージに関する研究では、中根千枝の議論の批判的検討から、能力平等観のゆえに、日本人は「頑張りズム」を備えた人格が理想のイメージであったことが明らかにされている。また、韓国の教師イメージでは、一方で寸志を強要するイメージと他方であらゆる贈り物を拒否する教師イメージがあり、その両極の範囲でうまく振る舞える教師が理想とされた。近代ドイツ人の研究では、自伝の分析から、個人主義的生き方が理想であったことが明らかにされた。イギリスの医師研究では、サッチャー政権以来、医師という職業への威信が低下してきていることが明らかにされた。実業家研究で明治の資産家のプライバシーがますます大衆の関心をもたらすさまが明らかにされたり、ノーベル賞受賞者研究で、すでに社会にある価値観がその人格に付与されていく過程が示されたように、メディアの役割により、個人的人格が社会規範とつながっていることが明らかにされた。この点に関しては、ナチス研究においても彫刻や絵画というシンボリッグな視覚表現が社会秩序に大きな役割を与えていることが明らかにされた。まず、理想的人格イメージをその構成要素に分けた場合、行動様式や役割遂行に対してのみならず、外見的な容姿や身体性、さらには内的な性格などから成り立つ。また、特定の個人のみならず、集合的なカテゴリー全体に付与される人格イメージも存在する。このような「人格イメージ」の多様性は、日本と欧米のそれぞれのケーススタディにおいて、さまざまなかたちで現れていることが分かった。次に、「人格像」の現実化においても多様性があり、a、理想像にあわせたかたちでその該当者が言及される場合(「近代日本のガンバリズム」「近代イギリスの専門医」などの場合など)、b、ある人物の登場が「理想像」の規範そのものを覚醒し成立に至らしめる場合(「近代ドイツの男性像」など)、c、理想像の枠組みを決めるべくしてその保持者が捜し当てられる場合(「近代日本の企業家」など)がある。とくにcの過程は興味深く、これを「キャラクター付与」や「体現化の論理」と名付ける。他方でひとたび形成された理想的人格規範が、その体現者の乱行により崩れていく過程があることも分かった。これは秩序の揺らぎであるが、の揺らぎに対して、「揺り戻し」の過程も存在する。また逆に、体現者の乱行じたいが社会的に期待される場合もあり、この場合は社会的変革への意識とも関係している。さらに「人格化」されること自体は、権力の形成過程とも結びついている。このことは、「人格化」が「神格化」まで発展した際には顕著である(たとえば近代日本の「死者」像)。このことは、理想化されやすい個人や集団と、そうでないものとの差に関係する。この差は、それらが当該社会のなかで担っている機能と関係しており、つまりは権力構造と密接なつながりがあることがわかった。このほか、人格像がカテゴライズされる形式も、当該社会の秩序形成と関係していることが明らかにできた。なお上記成果は、本年度の「中間報告書1」としてまとめている。理想的人格像に関して、今年度はとくに方法論的な問題を考察した。小川はマスメディアと人格イメージの形成について、ノーベル賞受賞者のイメージ形成から考察した。

大川はヒトラーの映像を手がかりに、教育と人格イメージの形成について分析した。金子は専門家イメージの形成について問題点を挙げた。城は杜会調査でのクラスター分析によってつくられる人格イメージの形成の問題点について考察した。また、具体的なケーススタディでは、日本に関しては永谷が明治期の企業家イメージの形成について、山が近代日本の鬼神像を通した人格イメージについて分析した。またヨーロッパについては北垣がフランスの抑うつ病と近代人について、伊藤が日記に見るドイツのイメージについて考察した。このようなそれぞれ分析から、全体として、人格像は、各個人が客観的に持ちうる属性だけではなく、そこに社会によって与えられた像が付け加わることがわかった。そのあり方は、メディアでは、さまざまな言語表現と映像の繰り返しによって、もともとある社会規範に適合的なかたちで、理想的な人格像や、逆に反理想的な人格イメージが形惜成されるのだと言うことが分かった。この点は日本でもヨーロッパでも見られる。どちらも近代社会に特徴的な現象である。しかも日本もヨーロッパとともに、近代では個人主義的で、合理的な人格像がつくられていることがわかった。近現代の日本ならびに西欧の理想的人格像に関して、比較社会論的な観点から、理論的かつ実証的に解明した。その成果は、毎年度ごと、合計3冊の研究報告書にまとめられた。本年度は最終の研究成果報告書を発行した。そのなかで一方では、日本における実業家の人格イメージ、ノーベル賞受賞者のイメージ、近代日本人イメージ、韓国社会における教師イメージ、イギリスにおける医師のイメージ、ドイツにおける近代人のイメージ、ナチスにおける理想的人格像などを実証的に分析した。他方では、そこから理論的に、それら人格像の産出プロセスが社会秩序の形成と密接に結びついていることを明らかにした。とくに近代日本人のイメージに関する研究では、中根千枝の議論の批判的検討から、能力平等観のゆえに、日本人は「頑張りズム」を備えた人格が理想のイメージであったことが明らかにされている。また韓国の教師イメージでは、一方で寸志を強要するイメージと、他方であらゆる贈り物を拒否する教師イメージがあり、その両極の範囲でうまく振る舞える教師が理想とされた。近代ドイツ人の研究では、自伝の分析から、個人主義的生き方が理想であったことが明らかにされた。イギリスの医師研究では、サッチャー政権以来、医師という職業への威信が低下してきていることが明らかにされた。実業家研究で、明治の資産家のプライバシーがますます大衆の関心をもたらすさまが明らかにされたり、ノーベル賞受賞者研究で、すでに社会にある価値観がその人格に付与されていく過程が示されたように、メディアの役割により、個人的人格が社会規範とつながっていることが明らかにされた。この点に関しては、ナチス研究においても、彫刻や絵画というシンボリックな視覚表現が社会秩序に大きな役割を与えていることが明らかにされた。
サクラ類に発生する根株腐朽病害ベッコウタケの感染経路の解明

[背景]東京大学大学院理学系研究科附属植物園日光分園(日光植物園)は、他の植物園では見ることが少ないサクラ類の野生種、雑種、品種の系統を保有している。しかし、近年それらが腐朽病害による倒伏などで枯死し、失われる危機が一層深刻化している。平成24年4月には日光で最大瞬間風速40mを超える暴風が吹き、園内で大規模な風倒被害が発生した。[研究目的]倒伏した被害木の根株腐朽被害の実態を明らかにするため、サクラ類を含めた全樹種の地際における腐朽の有無、腐朽断面積率、腐朽菌種の同定を行った。また、複数箇所で被害を及ぼしているベッコウタケの感染経路を実証するため、感染源としての菌の所在・量を把握することを目的に、サクラ材の捕捉杭を用いた菌の捕捉試験をおこなった。杭は長さ30cm、直径約10cmの健全な心材を含むオオヤマザクラ、カスミザクラの枝を用いた。まずベッコウタケ被害の出ている2箇所において、子実体が発生している対象木を中心として放射状8方向に等間隔で合計40本の杭を設置した。被害木の出ていない3地区においては、5m間隔の格子点上に、計55本の杭を設置した。[研究の成果]被害樹種で多かったサクラ類、クロベ、カラマツは根株腐朽が主要な倒伏要因となっていた(清水2013)。風倒木の中にはサクラ類以外の広葉樹にもベッコウタケによる根株腐朽が認められ、ベッコウタケが園内に広く存在し、被害をもたらしていることが明らかになった。被害木における地上高毎の腐朽断面積率は根元近く(地上高約0m)が最大であった。捕捉杭試験の結果、スエヒロタケ、チヂレタケなど数種の腐朽菌を確認した。今回の調査で得られた結果を元に植物園内における腐朽病害の防除対策を立案し、それをひとつのモデルケースとして同様の問題を抱える場所に適用することが可能と考えられる。
肺癌切除検体の肺静脈血に含まれるストローマ細胞の検出及び解析

本研究の目的は、肺癌切除検体の肺静脈血を採取しストローマ細胞の検出と解析を行うことである。そのためにマウス肺癌モデルで静脈血中に肺癌細胞とともに放出されるストローマ細胞を検出、解析するモデルを作成した。培養したマウス肺癌細胞株Lewis lung carcinoma(LLC)をマトリゲルに懸濁しマウス肺内に注入し生着させた。腫瘍は経時的に増大し、病理学的にも肺への生着が確認され、LLCの肺への移植法が確立できた。肺静脈血からセルブロックを作成し癌細胞の検出を試みたが、腫瘍細胞が少なく、目的とした細胞塊を得ることは困難であった。実験モデルのさらなる改良が必要である。平成25年度の目標は、マウスモデルで静脈血中に癌細胞とともに放出されるストローマ細胞を検出、解析する方法を確立することであった。具体的には、1,赤色蛍光蛋白DsRedに標識されたマウス肺癌細胞株をGFPマウスの肺或いは腎臓に移植し、ストローマ細胞が緑色蛍光蛋白に標識された腫瘍を発育させる、2,肺静脈或いは腎静脈にカニュレーションし、持続採血し、蛍光顕微鏡で癌細胞とストローマ細胞が収集されていることを確認する、3,セルブロック法を用いて静脈血中の細胞を効率よく収集してパラフィンに包埋する、4,ストローマ細胞のマーカーを用いて免疫染色し、収集された細胞の解析を行う、5,転移能の異なる癌細胞株で比較し、検討する、ことである。現在実験モデルの確立のため、1,3につき準備を行っている。1,マウス肺癌細胞株の培養を行った。肺に移植するため肺癌細胞株をマトリゲルに懸濁し肺内に注入する。生着率、癌細胞の成長を観察中である。3,マウスの静脈血を採取しセルブロックを作成する手技を試行している。マウスの頚動脈にカニュレーションし、採血する。遠心し上清を採取し、コロジオン法によりセルブロックを作成中である。研究の目標は、マウスモデルで静脈血中に癌細胞とともに放出されるストローマ細胞を検出、解析する方法を確立することであった。具体的には、1赤色蛍光蛋白DsRedに標識されたマウス肺癌細胞株をGFPマウスの肺或いは腎臓に移植し、ストローマ細胞が緑色蛍光蛋白に標識された腫瘍を発育させる、2肺静脈或いは腎静脈にカニュレーションし、持続採血し、蛍光顕微鏡で癌細胞とストローマ細胞が収集されていることを確認する、3セルブロック法を用いて静脈血中の細胞を効率よく収集してパラフィンに包埋する、4ストローマ細胞のマーカーを用いて免疫染色し、収集された細胞の解析を行う、5転移能の異なる癌細胞株で比較し、検討する、ことである。平成26年度、マウス肺癌細胞株Lewis lung carcinoma(LLC)の肺への移植法を確立した。培養したLLCをマトリゲルに懸濁し肺内に注入し、生着させた。平成27年度も引き続き実験モデルの確立の準備を行った。培養したLLCを肺内に注入し生着させる手技を安定するよう繰り返し行った。肺に移植したLLCが縦隔リンパ節に転移していることが確認できた。マウス肺癌細胞へのDsRedによる標識が確立できなかったことと、マウスの静脈血の量の少なさからセルブロックを作成することが困難であったため、目標とする解析まで至らなかった。研究期間中に達成できたことは、1に関しマウス肺癌細胞株を肺に移植し腫瘍を発育させる手技を確立したこと、2肺静脈にカニュレーションし持続採血する手技が安定したこと、である。今後も継続して手技の確立を目指す。呼吸器外科赤色蛍光蛋白に標識された癌細胞株の樹立を目指しているマウス肺癌細胞株Lewis lung carcinoma(LLC)を、レトロウィルスベクターを用いた方法にて赤色蛍光蛋白DsRedで遺伝子標識する。現在のところ標識が確認されていない。セルブロックの作製セルブロック作製法にはクライオバイアル法やコロジオンバック法など、いくつかの方法がある。また、採取された血液を無処理で標本作成すると、赤血球と有核細胞が重なり観察しづらい標本となり、癌細胞やストローマ細胞を見落とす危険性が高くなる。そこで有核細胞を効率よく集めるため、検体を一度遠心した後、沈渣の状態を確認し、必要に応じて適切な赤血球を除去するための検体処理法を選択する。遠心後、バフィーコート層が明瞭であれば、その部位より細胞を採取しセルブロックを作製する。バフィーコート層が不明瞭な場合は赤血球層以外の上清部を採取し、必要に応じて二重遠心法或いは溶血法を選択する。適切な方法につき検討中である。まずコロジオン法でセルブロックを作成している。

赤血球が重なり標本が観察しにくいため、遠心の方法等に改善を加えている。マウスを用いた実験では、静脈中に放出される癌細胞やストローマ細胞が寡少なため、蛍光色素で確認されたにも関わらず、収集出来なかったり、セルブロック作製の途中で失われる可能性がある。必要に応じて二重遠心法或いは溶血法を用いて血液中から確実に癌細胞とストローマ細胞を収集する。またセルブロック作製法にはナイロンメッシュ法やセルロース法などもあるので最適な方法を選択する。未使用学の発生は、効率的な物品調達を行った結果であり、翌年度の消耗品購入に充てる予定である。当初予定していたストローマ細胞関連抗体を用いた免疫細胞化学染色の実施が遅れたため、25年度の研究費に未使用が生じたが、26年度に行う予定の研究計画とあわせて実施する。