hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
エトリンガイト生成量に着目した複合リサイクル材料の開発とその学際的意義

現在わが国では、廃棄物処分の問題が社会問題化し廃棄物の有効利用が急務となっている。本研究では、産業廃棄物(廃石膏、石炭灰、高炉スラグ)からなる複合リサイクル材料の地盤改良材としての有効性を検討している。その結果、複合リサイクル材料の添加率の増加に伴って土の強度変形特性が大幅に改良され。エトリンガイト生成量や形状がその内部構造や強度発現過程と密接な関係があることを解明している。一方、地盤環境工学観点から重金属類(フッ素、六価クロム、カドミウム、鉛等)の溶出量が環境基準値を満足していることも確認し、本複合リサイクル材料のケ袁節材料としての有効性を学際的な面から実証している。本研究では超軟弱粘性土地盤を想定し、高含水比140%程度の粘性土に対して代表者が提案している新複合リサイクル材料を異なる添加率で添加した安定処理土を作製し、その複合リサイクル材の添加率の違いが強度変形特性に及ぼす影響を明らかにした。また,走査型電子顕微鏡によりその内部の可視化を試み、その内部構造と強度発現過程の関係を解明を試みた。その結果,複合リサイクル材料の添加率とエトリンガイト生成量の発現が密接な関係があり、かつその安定処理土の強度特性に大きな影響を及ぼしている可能性を見出した。また、エトリンガイトの形状からその成長過程についても考察した。さらに複合リサイクル材料を添加した試料の耐久性を検討するため、乾湿繰り返し作用と凍結融解作用が各試料の強度変形特性に及ぼう影響について基礎的な実験を行い、その効果が認められており、現在それら実験結果を取りまとめている。また上記複合リサイクル材料の締固め材料としての適用性を検討するため、標準砂試料に土の乾燥重量に対して複合リサイクル材料を異なる添加率で混入した試料を締固めることによって、その改良効果を検証した。これにより、まず複合リサイクル材料の添加率がその締固め特性に及ぼす影響を明らかにした。また、得られた試料に対して、28日養生した後で一軸圧縮試験を実施し、複合リサイクル材料の添加率の違いがその一軸圧縮特性に及ぼす影響を解明した。具体的には、複合理細工材料の添加率増加に伴って強度が増加した。一方、本複合リサイクル材料が地盤環境工学観点からも重金属類(フッ素、ホウ素、六価クロム、カドミウム、ヒ素等)の溶出量提低減に十分な効果があることをを各試料に対して実施した溶出試験結果により確認し、その溶出量が環境基準値を満足する基準についても検討した。本研究では超軟弱粘性土地盤の地盤改良材として,リサイクル材料のみから成る代表者が提案している新複合リサイクル材料の工学的有意性を実証している.具体的にはエトリンガイトが最も効率よく生成される割合で半水石膏,石炭灰,および高炉スラグを混合した複合リサイクル材料を種々の異なる条件でセメント安定処理土へ混入し,各供試体に対して一軸圧縮試験を実施した.また,同試験を乾湿繰返しや凍結融解繰返し作用を与えた供試体に対しても実施し,複合リサイクル材料を添加したセメント安定処理土の耐久性について調査した.その結果,複合リサイクル材料添加率の増加に伴って,一軸圧縮強さと耐久性が向上することを明らかにした.さらに,走査型電子顕微鏡(SEM)を用いて供試体内部の観察を行い,複合リサイクル材料の添加率の増加に伴ってエトリンガイトが長く成長し,内部構造が緻密になる過程を視覚的な観点から明らかにしている.また上記複合リサイクル材料の締固め材料としての適用性も検討した.その結果,複合リサイクル材料添加率が締固め曲線と強度特性に及ぼす影響を明らかにし,新複合リサイクル材料の添加に伴う地盤改良効果を解明した.さらに本複合リサイクル材料が地盤環境工学の観点からも有意であることを溶出試験結果から解明している.本研究は研究計画に沿って順調に進行しており,来年度はさらに優れた研究成果が表れるものと考えられる.本研究ではエトリンガイト生成量に着目したリサイクル材料のみの複合材料を開発し、その地盤改良材としての適用性を実証するため、種々の添加率で作製した供試体に対して地盤工学と地盤環境工学との両観点から解明している。具体的には上記新複合リサイクル材料の土試料への適用性を検討するため、種々の添加率で作製した供試体に対して一連の土質試験による強度変形特性の評価、SEMによるエトリンガイトに代表される内部構造の可視化と大きさの定量化、さらには上記供試体の凍結融解作用や乾湿繰り返し作用に対する耐久性も検討し、十分な耐久性があることも実証した。また複合リサイクル材料の添加率が砂や粘土の締固め特性に及ぼす影響も明らかし、その締固め特性と強度の関係さらには短期養生期間の影響も解明した。一方、複合リサイクル材料の土への添加が地盤環境に及ぼす観点から溶出試験による重金属量の評価に関しては、フッ素・六価クロム・カドミウム・鉛などの重金属化合物を蒸留水に溶解させて任意の濃度に調整した模擬汚染水を複合リサイクル材料に添加混合して供試体を作製した。そして,その養生時間とこれら重金属類の溶出濃度との関係を検討し,複合リサイクル材料の重金属類の不溶化に関する地盤環境工学的有効性を実証している。

本研究で提案している複合リサイクル材料(半水石膏、石炭灰、高炉スラグ、微量の高炉セメントB種)を混入した地盤材料の力学的特性やその材料の環境へ及ぼす影響の把握およびその環境負荷低減法等の一連の研究成果は、最終処分場不足の解消や廃石膏ボード等に代表される産業廃棄物の建設材料としての再資源化に繋がることから、我が国のみならずグローバルな観点からも現代社会が解決しなければならない資源循環型の社会・産業構造を構築する上において、その社会的意義は、極めて大きいものと考えられる。現在わが国では、廃棄物処分の問題が社会問題化し廃棄物の有効利用が急務となっている。本研究では、産業廃棄物(廃石膏、石炭灰、高炉スラグ)からなる複合リサイクル材料の地盤改良材としての有効性を検討している。その結果、複合リサイクル材料の添加率の増加に伴って土の強度変形特性が大幅に改良され。エトリンガイト生成量や形状がその内部構造や強度発現過程と密接な関係があることを解明している。一方、地盤環境工学観点から重金属類(フッ素、六価クロム、カドミウム、鉛等)の溶出量が環境基準値を満足していることも確認し、本複合リサイクル材料のケ袁節材料としての有効性を学際的な面から実証している。研究計画に沿って順調に進んでおり、来年度はさらに研究成果あらわれるものと考えられる。実地盤への本複合リサイクル材料の適用を考えると,本材料を添加した供試体の耐久性を種々の観点から明らかにする必要がある.そこで本年度はこれまで得られた結果を詳細に検討し,工学的に優位な図表を作成する.また本複合リサイクル材料の広範な有効性を検討するため,短期養生期間の諸特性を検討し施工時のトラフィカビリティーの改善効果も解明する予定である.工学実地盤への本材料の適用を考慮した場合、複合リサイクル材料を添加した改良土の強度に関する耐久性の検討が必要不可欠である。そこで、新地盤改良材を有効利用した供試体に対して、乾湿繰り返しおよび凍結融解作用を与えた後一軸圧縮試験を実施し、乾湿繰り返しおよび凍結融解作用に対する強度変形特性に関する抵抗性を検討する予定である。また走査型電子顕微鏡を用いて、上記作用を受けた供試体の内部構造の変化傾向を解明する。本年度では先述した新複合リサイクル材の添加率が実際の土試料の諸特性に及ぼす影響を実証するため、走査型電子顕微鏡を用いてその内部構造の可視化を詳細に検討する。また、内部において化学反応によって生成された物質(例えば、エトリンガイト)を定量的に評価するために、X線回折試験を実施する予定である。
異種移植における超急性拒絶反応を抑制する遺伝子ダブルノックアウトブタの開発

絶対的なドナー臓器不足を解決する一つとして,ブタ臓器を用いる異種移植が提唱されている。異種移植では,免疫拒絶の克服が必須である。最初に起こる超急性拒絶の引き金としてαGal抗原があるが,我々はこの抗原を持たないGalTノックアウト(KO)ブタを作出している。本研究では,GalT-KOブタを基盤に,超急性拒絶の別要因とされるH-D抗原を除去したCMAH遺伝子KOブタの作出を目的とした。ゲノム編集技術を用いてCMAH遺伝子をKOした細胞の体細胞核移植を行い,クローン産仔を作出した。主要組織において抗原糖鎖の消失が確認できた。本研究により国内初のGalT/CMAH両遺伝子KOブタの作出に成功した。臓器移植医療においてはドナー臓器不足が世界的な問題である。一つの解決策としてブタの臓器を用いる異種移植が提唱されているが,免疫拒絶という障壁の克服が最重要課題となっている。異種臓器に対し最初に誘導される超急性拒絶は,α1,3ガラクトース(αGal)抗原が引き金となって起きることが知られている。我々はすでに,この抗原を発現しないα1,3ガラクトース転移酵素遺伝子ノックアウト(GalT-KO)ブタを体細胞核移植法によって作出,維持している。1. CMAH-KO核ドナー細胞の樹立:既存のGalT-KO細胞に対して,CMAH遺伝子を標的とするZFNあるいはTALENを構築し,それらのmRNAのエレクトロポレーションを行った。ZFN処理では,96コロニーのうちヘテロKOが6コロニー(6.3%)得られたが,ホモKO細胞を樹立することは出来なかった。TALEN処理では,166コロニー解析中ヘテロKOが40コロニー(24.1%),ホモKOが5コロニー(3.0%)得られた。2.核ドナー細胞の正常性・機能確認:得られたCMAH-KO細胞ラインの中から,増殖性に優れ,また正常な形態を維持したものを核ドナー細胞に用いた。染色体検査では,88%98%が正常染色体数(38本)を維持していた。さらにこれらのKO細胞を用いて作製した体細胞核移植胚は,高率に胚盤胞へと発生した。我々は既に,この抗原を発現しないα1,3ガラクトース転移酵素遺伝子ノックアウト(GalT-KO)ブタを体細胞核移植法によって作出,維持している。1. GalT/CMAH-KOクローンブタの作出:前年度に樹立したGalT/CMAH-KO細胞から作製した核移植胚を1頭の借腹豚に移植した結果,4頭のクローンブタが作出された。4頭のうち,2頭は母豚による圧死,1頭は虚弱であったため2日齢にて犠牲死し臓器のサンプリングを行った。残る1頭は生存し,育成した。得られた全ての個体は核ドナー細胞と同じ変異を有していることを確認した。2.作出したクローンブタの解析:犠牲死した産仔の臓器(心臓・肺・膵臓・腎臓)の組織標本を作製し,αGal抗原ならびにH-D抗原の免疫染色を行った。その結果,これらの臓器においてGalT/CMAH-KOクローンブタでは,両抗原ともに消失していることが確認された。さらに,育成中の産仔より血液を採取し,顆粒球における両抗原の有無をフローサイトメトリー解析したところ,同様に消失が確認された。当初の計画通り,GalT-KO細胞に対してCMAH遺伝子をゲノム編集技術を用いてノックアウトすることに成功した。さらに,これらの細胞を用いた体細胞核移植胚はin vitroでの発生効率が高く,クローン個体生産の実現の見通しが立ったため。発生工学平成26年度に樹立したGalT/CMAH-KO細胞を用いて体細胞核移植を実施し,ダブルノックアウトクローンブタの作出を行う。得られた個体については,α1,3-ガラクトース抗原及びH-D抗原が存在しないことを確認する。具体的には,個体のゲノムDNA解析,リンパ球や主要臓器などに対し,抗原糖鎖の消失を免疫染色及びフローサイトメトリーによって確認する。当該年度に予算を完全消化する必要がなかったため動物飼育経費として使用する予定である
新たなマウス肺高血圧モデルの作成とRNA干渉を利用した治療法の開発

肺高血圧症の病態は、肺血管のリモデリング(血管壁の肥大・内腔の狭窄)であるという理解のもと、マウスにおける実験モデルを作成することが本研究の目的であった。低酸素暴露(酸素濃度17%)3週間に植物毒モノクロタリンの同時投与で、血管リモデリングを伴う高度肺高血圧症を呈することがわかったが、肺動脈圧測定に耐えられないマウスが50%以上に及び、安定した実験モデルの作成には至らなかった。臨床において、高度の肺高血圧症は、妊娠経過における母体・新生児のリスクファクターであることを疫学研究にて明らかにした。3年の研究期間の初年度にあたるH20年度には以下のことを確立・検証した。1.マウスにおける肺動脈圧測定法を確立した。この実験系では、この技術が必須であるものの、測定技術の習得には難渋した。いろいろな方法を試みた結果、安定した実験が可能になった。麻酔下の開胸による測定では、平均動脈圧が95±5mmHg,平均肺動脈圧が18±3mmHgであった。これらの値は、これまで文献で報告されている値とほぼ同様であった。ただし、肺動脈圧測定技術の獲得に時間を要したため、当初予定したマウス肺高血圧モデルを確立するための実験は行えなかった。2.当実験室で確立したラット肺高血圧モデル(幼若ラットにMCT60mg/kg投与すると50-70%の肺高血圧に進展する)に対して、転写因子KLF5の活性を抑制するタミバロテンを投与し、肺血管リモデリングの進展を阻止できるかどうか検討した。KLF5は血管リモデリングに関与する重要な転写因子なので、KLF5を抑制するタミバロテンが血管リモデリングを抑制し、その結果肺高血圧への進展を防ぐと仮定した。しかし、タミバロテンを、0.1mg/kgから10mg/kgまでの範囲で投与したが、MCTによって誘発された肺高血圧への影響は認められなかった。この結果をもとに、マウス肺高血圧モデルにおいて、KLF5の関与を検証する研究には再考が必要であると推測した。3年の研究期間の2年度にあたるH21年度には以下のことを確立・検証した。1.核内転写因子EGR-1に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを不活化ウイルスのエンベロープに包埋し、IV投与により肺血管に取り込ませることで、ラット肺高血圧におけるリモデリングを抑制することを検証した。この結果を英文論文としてまとめ、American Journal of Respiratory and Critical Care誌に投稿した。査読の結果は、rejectであったが、多くの有益なコメントをもらった。現在、そのコメントに沿って、追加実験を行っている。2.マウスを17%の低酸素室で3週間管理しても肺高血圧にはほとんど進展しない。しかし、植物毒であるモノクロタリンを投与したのち、低酸素室に3週間管理すると、高度の肺高血圧(右室圧にして200%増し)に進展することがわかった。しかしながら、この方法では生存率が50%前後であり、マウスの肺高血圧モデルの安定化には条件設定に改善の余地があると結論した。現在、モノクロタリンの量を調整することを考慮中である。3.先天性心疾患を持った妊婦は、多くが肺高血圧の状態である。これらの患者は臨床における肺高血圧モデルととらえることができる。これらの患者は、時に、帝王切開を受けることがあり、麻酔が必要となる。これらの患者群を対象に、周産期における母子の予後についてchart reviewを行った。その結果を論文にして投稿した。Anesthesiology誌にはrejectされたが、International Journal of Obstetric Anesthesia誌には、一回目の査読で改訂を要求され、現在原稿の書き直しを行っている。3年の研究期間の最終年度にあたるH22年度には本研究のまとめとして以下のことを行った。その後追加実験を行い、論文を推敲し、新たな論文にまとめた。現在投稿待ちである。2.先天性心疾患を持った妊婦は、多くが肺高血圧の状態である。2回の改訂の結果、International Journal of Obstetric Anesthesia誌に受理された。この論文において、妊婦での肺高血圧の有無は母子の予後を決定するリスクファクターであることを示すことができた。

この論文は、先天性心疾患において肺高血圧を防ぐことが、患者の予後にとっていかに大事かを示している。3.先天性心疾患の中で、単心室の循環を持つ患者の場合、周術期の管理として肺血管抵抗を下げることが重要である。本研究を通して得られた所見は臨床の場においても非常に重要であると考え、単心室型循環を持つ患者の麻酔管理についてreview articleを執筆した。この論文はJournal of Anesthesiaに受理された。
新規カルコゲン-典型元素結合化合物群の系統的創製と物性の解明

以下のカルコゲノカルボン酸誘導体について、系統的に合成と構造を検討し、次の成果を得た。1.ジチオカルボン酸14族エステルの合成と構造一連のジチオカルボン酸14族エステル(RCSSMR'_3,M=C,Si,Ge,S,Pb)を60-90%の収率で合成・単離できた。熱および酸素に対し比較的安定な結晶または油状物質である。X線構造解析からチオカルボニル硫黄と中心14族金属間の距離から、硫黄の14元素への親和性(Sn>Pb>Ge>Si>C)を明らかにできた。2.チオおよびカルボン酸カリウム、ルビジウム、セシウム塩芳香族チオカルボン酸のカリウム、ルビジウム、セシウム塩は2つの金属カチオンを共有した二量体構造であり、チオカルボキシル基のC-OおよびC-S距離はそれぞれ二重結合と単結合を示し、陰電荷が硫黄上に局在化した構造をとっていると見られる。対応するジチオカルボン酸カリウム、ルビジウムおよびセシウム塩は2つの金属カチオンを共有した二量体である。ナトリウムとカリウム塩はジチオカルボキシル基の二つのC-S結合距離が異なり単結合と二重結合距離を示し、陰電荷は単結合で結ばれた硫黄上に片寄っていると見られる。一方、ルビジウムとセシウム塩のそれらはほぼ等距離で、単結合と二重結合の中間の値を示し、陰電荷はジチオカルボキシル基上に非局在化していると見られた。チオカルボン酸砒素エステルと二級アミンとの反応から対応するアンモニウムジアリールアルシンチオラートが高収率で合成できることを見いだした。X線構造解析からNH...S間で水素結合を作ることが見いだされた。
中緯度における台風の衰弱・再強化過程に関する数値的研究

日本付近にまで接近する台風の多くは中緯度擾乱の影響を受けることで、温帯低気圧化(温低化)の過程にある。本研究は、その「台風の温帯低気圧化」の際に生じる複雑な擾乱間の相互作用を定量化することを目的とする。事例として台風9918号の温低化事例を選び、メソ気象モデルPSU/NCARMM5を用いて再現実験を行った。これによる高精度な再現場を用いて、渦位部分的変換法(piecewise potential vorticity inversion)により、温低化時の擾乱(渦位偏差)間の相互作用を定量化した。本研究によって、中緯度帯に達した台風の強度変化に、台風上層の吹き出しの雲内で発達する負渦位偏差(低渦位)が重要な役割を果たすことが明らかとなった。この負渦位偏差は、急減衰期には、中心気圧を弱めるように作用していたが、再発達期には、逆に中心気圧を強めるように作用していた。急減衰期の台風直上には対流活動に伴い負渦位偏差が卓越することで、下層の正渦位偏差は背の低い構造となり、台風は強制的に弱められた。一方で、再発達期になると、台風上層にはトラフに伴う正渦位偏差が卓越するようになり、順圧的構造へと変化した。この際には、上層の負渦位偏差は、ジェットストリークの形成に貢献し、一転して、台風の再発達に不可欠な存在となっていた。以上の結果は、世界的に見ても、これまでにない新しい知見であると言える。日本において猛威を振るった温帯低気圧化過程(温低化)にある台風9918号を、領域メソ気象モデルMM5を用いて再現実験を行った。本年度においては、「温低化台風に伴うメソ気象災害(竜巻)に関する数値実験」と、「温低化台風の衰弱・再強化過程に関する数値実験」の2種類の観点から、台風の温低化現象の詳細なメカニズムを数値的に明らかにした。
無精子症に対する新規薬物療法確立のためのヒト精巣の網羅的遺伝子解析

ヒト精巣組織から次世代シーケンサー(NGS)によるトランスクリプトーム解析を行った。23,616の遺伝子のmRNAについて解析を行ったところ、cell cycle, nucleic acid bindingなどの遺伝子群が高発現の上位を占めた。非閉塞性無精子症症例との比較においてその発現は特にヒストンH3.5などのエピジェネティック関連遺伝子に認められた。また精索静脈瘤症例においてcell cycle関連遺伝子の発現が低下し、精索静脈結紮術の効果と関連することが判明した。NGSによるトランスクリプトーム解析は造精機能障害の病態解明において有用な方法であることが示された。NOAの過半数を占めるSCOにおいて、精祖細胞やspermatogenic stem cell (SSC)は最初から存在しないのか、それとも途中から消失していくのか、SCOについての情報は極めて少ない。NGSによるヒト精巣組織のRNA-seqにより過半数のSCO症例において精祖細胞やSSCに発現する遺伝子の発現を認めた。NOA症例に対するvaricocele repairやサルベージ内分泌療法はearly MAよりも明らかにlate MAにおいて有効である。early MAとlate MAの大きな違いはmeiosisという劇的にクロマチン構造や細胞内代謝の変化が生じるステップであり遺伝子の発現量のみではその病態を説明することには限界がある。NGSによるRNA-seqにより新規ヒストンバリアントであるヒストンH3.5の存在を見出し、ヒト精巣内では主に精祖細胞および精母細胞に局在することが確認された。Early MAにおいては何らかのepigenetics異常の存在も主な病態の1つではないかと考えられる。一方でearly MAにおいても活発に細胞分裂を行っているgerm cellは、Sertoli cellによる貪食を受けると言われている。SCOの機能異常という観点からもearly MAやSCOにおける造精機能障害の説明ができる可能性もある。ヒト精巣組織を得られる機会が非常に限られているため解析のペースがやや遅れている。ヒト精巣組織を用いたトランスクリプトーム解析については過去に報告がなく、解析における技術的な点については問題なく行われている。非閉塞性無精子症(non-obstructive azoospermia: NOA)は男性不妊診療および研究における最重要課題の一つである。実臨床においてはSertoli cell only、maturation arrestおよびhypospermaotgenssisに分類されることが多い。次世代シーケンサー(NGS)によるヒト精巣組織の網羅的遺伝子解析(RNA-seq)を行なっている。精子形成過程における遺伝子の発現と機能を解析することにより、それらに作用しうる薬剤や様々な因子を見出すことによりNOA症例に対する新規治療法の開発を目的とする。ヒト精巣組織を用いたNGSによるRNA-seqにより新規ヒストンバリアントであるヒストンH3.5の存在を見出し、ヒト精巣内では主に精粗細胞および精母細胞に局在することが確認された。NOA患者においては有意にその発現が減少しており、maturation arrestにおいては何らかのepigenetics異常の存在も主な病態の1つではないかと考えられる。NOA症例においてはSertoli cell特異的な遺伝子の発現低下も認めており、Sertoli cellの機能異常という観点からも造精機能障害の説明ができる可能性もある。ヒト精巣組織を用いたH3.5に関する研究において、免疫組織化学染色(IHC)、構造解析、NGSを用いたChIP-sequenceにより、H3.5は主に精粗細胞や精母細胞などの精子形成の早い段階で発現し、疎水結合が弱く、transcription start siteの手前に結合するなど一般的なヒストンとは異なるパターンで結合することが判明した(Urahama T et al. Epigenetics & Chromatin 2016)。さまざまなヒト精巣サンプルを用いたIHCにてH3.5の発現は精上皮依存性の発現を認め、下垂体ホルモン(ゴナドトロピン)による制御を受けていることが判明した(投稿中)。解析症例数も順調に増え、またNGSを用いたランスクリプトーム解析についても技術的な点については問題なく行われている。精細胞が存在しないといわれているSertoli cell onlyからのサンプルにおいても精原幹細胞の存在を示す遺伝子の発現があることが判明し、IHCにて精原幹細胞のマーカータンパクの局在を解析している。実臨床においてはSertoli cell only (SCO)、maturation arrestおよびhypospermaotgenssisに分類される。次世代シーケンサー(NGS)によるヒト精巣組織の網羅的遺伝子解析(RNA-seq)を行なった。NOA患者においては有意にその発現が減少しており、maturation arrestにおいては何らかのepigenetics異常の存在も主な病態の1つではないかということを報告した(Andrology 2018)。さらに本来精細胞が存在しないと考えられていたSCOの症例においてもRNA-seqにて精細胞マーカーの発現を認め、RT-PCRや免疫染色を追加しSCOにおける精細胞の存在について検討を進めているところである。

23,616の遺伝子のmRNAについて解析を行ったところ、cell cycle, nucleic acid bindingなどの遺伝子群が高発現の上位を占めた。非閉塞性無精子症症例との比較においてその発現は特にヒストンH3.5などのエピジェネティック関連遺伝子に認められた。また精索静脈瘤症例においてcell cycle関連遺伝子の発現が低下し、精索静脈結紮術の効果と関連することが判明した。NGSによるトランスクリプトーム解析は造精機能障害の病態解明において有用な方法であることが示された。さらに症例数の増加や手術時の精巣組織採取の同意を積極的に得る。ターゲットする遺伝子として、cell cycle関連遺伝子に注目しており、proliferating cell nuclear antigen (PCNA)を用いた免疫組織化学染色を行っている。レーザーマイクロダイセクションを用い、精巣組織の限定された対象細胞のみの遺伝子解析も予定している。またSertoli cell only症において精原幹細胞の同定が行えれば、それらをisolationしsingle cell analysisによる機能解析を行う予定である。またisolationされた細胞の培養も考えている。アンドロロジー症例のエントリーがやや予定より少なかったため。網羅的遺伝子解析により研究対象とする候補分子の決定が早期になされたため、GSを用いたトランスクリプトーム解析は予定より少ない症例数で済んだため。次年度の次世代シーケンサー解析症例における費用とする。レーザーマイクロダイセクションやsingle cell analysisの準備に充てる予定であるが、これらは別のプロジェクトとして申請すべきであると考えている。また論文および学会発表の費用にも充てる予定である。
ＲＣＡＳ１をターゲットとした新たながん治療戦略の構築

計15種類の悪性腫瘍での臨床的予後因子であるRCAS1は正常組織から悪性腫瘍への悪性転化シークエンスにおいてその発現頻度が増加し、複数の悪性腫瘍における臨床病理因子と有意な相関を示す。臨床的に腫瘍マーカーとして有用でありアポトーシスを誘導するRCAS1はバイオマーカーであるが、生体免疫機構からの逃避と腫瘍間質リモデリングを介して腫瘍進展に寄与していると考えられる。RCAS1は悪性腫瘍の特性を表現する重要な分子でectodomain shedding機構により分泌型に変換されるが、悪性腫瘍に対する標的治療における新たなターゲットとなり得ることが示唆された。(1)RCAS1の発現調節機構に関する解析:RCAS1発現パターンの異なる細胞株を用いて、種々の遺伝子およびタンパク発現の変化をmicroarray法およびcomparative genomic hybridization (CGH) array法を用いて解析し、RCAS1発現に関与する分子解析を行いました。その結果複数の分子を抽出し、臨床検体における発現と臨床病理因子との相関について解析を行いました。(2)RCAS1の分泌機構の解析:RCAS1のectodomain shedding機構においてRCAS1を分泌させるproteaseを同定し、子宮頸癌および体癌症例から採取した臨床検体におけるRCAS1発現・分泌動態とprotease発現の相関解析を行いました。その結果、RCAS1のshedding機構においてはADAM9が切断酵素として重要な役割を担っていることが確認されたため、子宮頸癌および体癌各25例の末梢血RCAS1濃度および腫瘍組織でのRCAS1とprotease発現に関してELISAおよび免疫組織染色を用いて相関解析を行いました。子宮頸癌および体癌症例での末梢血RCAS1濃度と腫瘍組織でのRCAS1およびADAM9発現に有意な相関を認め、ADAM9はRCAS1のectodomain sheddingにおいて主要なproteaseであり、悪性腫瘍におけるRCAS1分子標的治療開発のターゲットとなり得ることが示唆されました。以上の研究成果は論文化し、現在投稿中です。(3)RCAS1受容体の単離と細胞内シグナル伝達機構の解析:RCAS1はK562細胞にアポトーシスを誘導することから、K562細胞とshort hairpin RNA(shRNA)ライブラリーを使用してRCAS1受容体単離を試みました。複数の受容体候補分子を同定し、現在は候補分子に対する特異的siRNAの導入による発現の人為的変化がRCAS1によって誘導されるアポトーシスの質的変化に及ぼす影響について解析を行っています。RCAS1は15種類の悪性腫瘍の独立した予後因子で、免疫担当細胞にアポトーシスを誘導し腫瘍周囲間質組織に質的変化を惹起することで腫瘍進展に有利な環境を形成する。当該研究ではRCAS1をターゲットとした新たな癌分子標的治療を構築することを目的とした。平成24年度の研究成果は以下のとおりである。2.RCAS1のectodomain shedding分泌機構に関する解析:RCAS1を発現かつ分泌するSiSo細胞株とRCAS1を発現するが分泌しないMCF-7細胞株をmicroarray法で比較したところ、RCAS1のshedding機構においてはADAM9が切断酵素として重要な役割を担っていることが確認された。細胞株でのADAM9発現を人為的に変調させることでRCAS1分泌能の変化が誘導されたが、RCAS1分泌能が高い腫瘍組織ではRCAS1とADAM9両分子の高発現が確認された。3.RCAS1受容体の単離と細胞内シグナル伝達機構の解析:RCAS1が赤白血病由来K562細胞にアポトーシスを誘導することから、short hairpin RNAライブラリーを用いた受容体単離を行った。複数の候補遺伝子が同定されたため、今後の受容体単離を円滑に遂行する目的でRNA干渉により候補分子発現を低下させた細胞株クローンを樹立した。RCAS1のectodomain shedding機構においてRCAS1を分泌させるproteaseを同定し、子宮頸癌および体癌症例から採取した臨床検体におけるRCAS1発現・分泌動態とprotease発現の相関解析を行いました。その結果、RCAS1のshedding機構においてはADAM9が切断酵素として重要な役割を担っていることが確認されたため、子宮頸癌47例および体癌48例の末梢血RCAS1濃度および腫瘍組織でのRCAS1とprotease発現に関してELISAおよび免疫組織染色を用いて相関解析を行いました。以上の研究成果はBioMed Research International誌に掲載されました。また、RCAS1により誘導されるアポトーシスについて口腔癌細胞株を使用して解析しました。

使用した計4種類の口腔癌細胞株は全てRCAS1を発現していましたが、高転移能を有するSQUU-B細胞は他細胞株に比しより強いアポトーシス誘導能を有していました。一方で、SQUU-B細胞のRCAS1発現をRNA干渉によりknock downすることによって、誘導されるアポトーシスは有意に低下しました。この結果から、RCAS1発現を人為的に減弱させることによって腫瘍の進展が抑制されることが理解され、トランスレーショナルに悪性腫瘍に対する治療戦略として臨床応用が期待できることが示唆されました。本研究成果はJournal of Translational Medicine誌に掲載されました。婦人科腫瘍学当該研究は(1)RCAS1の発現・分泌機構に関する研究、および(2)RCAS1受容体の単離と細胞内シグナル伝達機構の解析を基盤として、(3)RCAS1を標的とした治療の開発を行うことを目的としています。平成24および25年度では上記(1)・(2)に携わりました。その成果は「9.研究実績の概要」に記述しましたが、この成果を基盤として(3)RCAS1を標的とした治療の開発における実験システムを構築可能と考えます。このin vitroおよびin vivo実験システムを活用し、当該研究の最終目標である悪性腫瘍に対する新規分子標的治療の開発に必要な基礎データ収集を今後とも継続していきます。当該研究計画内で平成24年度に予定していた1.RCAS1の発現調節に関する解析ではRCAS1発現と相関する複数の分子が抽出され、2.RCAS1のectodomain shedding分泌機構に関する解析ではprotease候補分子の同定が進捗し、3.RCAS1受容体の単離と細胞内シグナル伝達機構の解析では受容体候補分子が複数抽出されたことから、これら3項目ともバランスよく進展していると判断する。最終目標である悪性腫瘍に対する新規分子標的治療の開発に必要な基礎データの収集については今後とも継続しなければならない。(1)RCAS1の発現調節機構に関する解析:本年度に施行したmicroarray法およびCGH array法によって抽出された分子特異的siRNAやcDNAの導入による発現の人為的変化がRCAS1発現やin vitro実験系での腫瘍細胞株の悪性形質変化に及ぼす影響について解析を行います。この研究をモデルとして特異的siRNAの効率良い組織デリバリーおよび発現システムの開発を行います。(2)RCAS1の分泌機構の解析:(3)RCAS
マクロファージ極性をM2へと導く新規転写因子の機能解明と生活習慣病創薬への展開

肥満によって誘導される慢性炎症は、インスリン抵抗性および生活習慣病に共通する病態基盤として注目されている。慢性炎症は、マクロファージ浸潤の増加だけでなく、炎症惹起性M1の増加と抗炎症性M2の減少というマクロファージの質が変化する極性変化が深く関与する。本研究では、なぜ肥満に伴いM1マクロファージが増加し、M2マクロファージが減少するのか、熱ショック転写因子HSF1におけるマクロファージのM1/M2極性の調節と、インスリン抵抗性や生活習慣病に与えるインパクトについて、遺伝子改変マウスを用いて検証する。
遠隔虚血プレコンディショニングのメカニズムを利用した心停止後症候群治療戦略の検討

心停止後の予後は依然として不良であり、その原因は全身性の虚血再灌流障害とされる。我々は先行研究において、CPRと酸素濃度との関係について『酸素濃度と自己心拍再開率・生存率が比例関係にあり、心停止時間が長くなるほど蘇生成功に高濃度酸素吸入が必須条件である』ことを明らかにした。しかし、その一方で心肺蘇生(CPR)から自己心拍再開後の高酸素血症が活性酸素種(ROS: reactive oxygen species)の産生を助長し、死亡率の増加や神経学的予後の悪化に関与することが明らかになりつつある。以上から、我々は活性酸素種の発生を阻害または除去することが、心停止後症候群(PCAS: post cardiac arrest syndrome)の予後改善につながるのではないかと考えた。近年、キヌレン酸が虚血再灌流障害に対して臓器保護的に働くことが様々な臓器で明らかになりつつある。そこで、我々は『キヌレン酸は心停止後症候群を改善するのではないか』との予想のもと、マウスの心停止・心肺蘇生モデルを用いて実験を行った。心肺蘇生開始1分前にキヌレン酸を投与した群とvehicle群で、CPRを要した時間やCPR開始5分後の血圧・心拍数・pH・PaO2・PaCO2・血清過酸化水素濃度を比較した。CPR時間、心拍数、pH、PaCO2に差はなかったものの、キヌレン酸を投与した群では血圧は有意に高く、キヌレン酸による心収縮力の増強が示唆された。しかし、血清過酸化水素濃度もキヌレン酸を投与した群で有意に高く、予想とは逆の結果となった。これはキヌレン酸によって血圧が上昇し、より広範囲の虚血領域に、より高い酸素分圧の血液が再灌流したことがその一因かもしれない。当初の計画では、研究開始から2年以内に心肺蘇生成功後にキヌレン酸を投与する実験系について、キヌレン酸の至適投与量や投与時期などの条件を確率している予定であったが、残念ながら達成できていない。以上より、進捗状況としては遅れていると言わざるを得ない状況である。今後も引き続き心停止後症候群とキヌレン酸産生との関連について研究を進めながら、心停止後症候群改善に対するキヌレン酸投与の至適条件を検索し、鋭意研究を続けていく予定である。マウスに塩化カリウムによる心停止を惹起し、体温38度で9分間維持した。まず、酸素濃度cardiopulmonary resuscitation (CPR)に及ぼす影響を調べるため、100%または21%酸素を用いてCPRを行った。CPRからROSCまでの時間は、21%群:119±27秒(n=6)、50%群:91±8秒(n=7)、100%群:63±4秒(n=6)であり、100%酸素吸入群で有意に短かった。次に、キヌレン酸のに及ぼす影響を調べるため、心停止から8分後(CPR開始1分前)にキヌレン酸40mg/kgまたはVehicleを静注し、21%酸素を用いてCPRを行った。その結果、自己心拍再開率はVehicle群で57%であったのに対し、キヌレン酸投与群では87%と、差はなかった。しかし、キヌレン酸投与群ではCPR所要時間や自己心拍再開までの時間が有意に短かった。キヌレン酸は低濃度酸素を用いたCPRの欠点(CPR時間や自己心拍再開時間の延長)を改善し、CPR成功率を上げることが分かった。

以上より、進捗状況としては遅れていると言わざるを得ない状況である。キヌレン酸が心肺蘇生の予後に与える影響やキヌレン酸の有効性のメカニズムについて、さらなる研究が必要である。今後も引き続き心停止後症候群とキヌレン酸産生との関連について研究を進めながら、心停止後症候群改善に対するキヌレン酸投与の至適条件を検索し、鋭意研究を続けていく予定である。消耗品が計上した予算より安く購入できたため。今後、キヌレン酸の効果解析に必要な消耗品の購入に使用する予定である。購入予定であった解析のための試薬などについては、実験がやや遅れているため翌年度以降に購入することになったため。
胃癌細胞の生存・増殖・浸潤・脂肪滴沈着における脂肪組織の役割とその制御機構

胃癌の発症と内臓、皮下脂肪組織の増加を基盤とする肥満との関連が示唆されている。胃癌は粘膜内で発生し、粘膜下層→筋層→漿膜下層へと浸潤し、癌性腹膜炎に進展する。一方、胃粘膜下層、漿膜下層、腹腔内には脂肪組織が存在する。さらに、脂肪組織由来脂質が癌細胞に脂肪滴として取り込まれ、癌細胞の細胞動態に影響することが示唆されている。それ故に、脂肪組織が胃癌の細胞動態に活発に影響していると予想される。しかし、内臓及び皮下脂肪組織が胃癌細胞に与える影響を解析した研究は国内外にはなく、その詳細は不明である。本研究では、胃癌細胞の生存、増殖、浸潤、脂肪滴沈着における脂肪組織の役割とその制御機構を解明する。胃癌細胞ー脂肪組織解析モデル用いて、免疫組織化学、電顕、Western blot、real-time RT-PCR、ELISA等を用いて解析し、癌細胞の生存、増殖、浸潤、脂肪滴沈着における内臓、皮下脂肪組織の影響を検討した。脂肪組織は、癌細胞の脂肪滴沈着、細胞肥大、増殖を促進し、アポトーシスを抑制した。癌細胞は脂肪組織誘導性の脂肪滴沈着とともに、脂肪酸輸送・合成分子(FATP-1, -4, -6, CD36; FAS)、脂肪滴形成・輸送分子(Perilipin-1, 2, 3)、脂質情報伝達分子(PAF, S1P, LPA)、MAPK, STAT3 pathway, IGF-1/PI3K/ AKT/mTOR/AMPKpathway, COX-2の発現亢進が見られた。さらに、小胞体ストレス分子の中でも、アポトーシス促進シグナル:IRE1α、JNKの発現が抑制され、小胞体ストレス防御シグナル:PERK、eIF2α、ATF6α、β)の発現が促進された。以上より、脂肪組織は胃癌細胞に、lipotoxicityではなく、lipotrophic effectsを誘導することが示唆された。脂肪組織が、癌細胞の生存、増殖、浸潤、脂肪滴沈着にあたえる影響には、酸化ストレス分子、小胞体ストレス分子のあるものが、関与することが判明した。しかし、癌細胞の種類により、その分子が異なる。すなわち、脂肪組織が癌細胞に与える影響のキー分子が癌細胞の種類により異なり、統一的な分子が同定されていない。平成28年度は、癌細胞の種類を増やして、実験し、統一分子を同定する。その後、これまでの実験から予想される癌細胞のアポトーシス、増殖、浸潤や脂肪滴沈着の促進因子や防御因子を癌細胞単独培養系、癌細胞ー脂肪組織混合培養系や癌細胞移植マウスに投与し、上記現象の促進及び阻害効果を比較検討し、胃癌の新規分子標的治療薬としての可能性を追求する。以下の論文を発表した。胃癌細胞の種類により、脂肪滴沈着に伴う、癌細胞の生存、増殖に異なる影響が見られる。ある癌細胞株では生存と増殖が抑制されるが、他の癌細胞株では生存と増殖が促進される。その分子基盤に、酸化ストレス分子、小胞体ストレス分子のあるものが、関与していると思われるが、確実な分子をいまだ同定していない。確実な分子を同定して、次の研究につなげる予定である。脂肪組織と癌細胞の混合培養系で、培養液中のIGF-1,レプチン、アディポネクチン、レジスチン濃度が減少した。さらに、これらの因子を癌細胞単独培養系に投与すると、IGF-1が癌細胞の増殖を促進し、アポトーシスを抑制する抑制傾向が見られた。他の因子については、明瞭な結果は得られなかった。また、混合培養系では、脂肪組織が癌細胞のpERK-1/2, pAKT, p4E-BP1(インスリン受容体)発現を促進した。以上より、脂肪組織は、IGF-1/IR, MAPK/AKT pathwayを介して癌細胞の生存、増殖に影響を与えると考えられた。興味深いことに、一部の癌細胞は脂肪滴沈着と共に、現在分子標的であるHER2の発現を減少させた。このことは、HER2を標的とした治療において、脂肪組織がその治療抵抗性に関与することを示唆している。今後は、これらの知見を動物実験で検討予定である。本研究期間に、以下の論文を発表した。脂肪組織の胃癌細胞に対する影響とその分子基盤の一端が明らかになり、おおむね研究は計画通りに進行していると思われる。癌細胞ー脂肪組織混合培養系や癌細胞移植マウスを用いて、胃癌の新規分子標的治療薬の開発につなげたい。実験病理学

今後は、平成26年度に同定した制御因子に加えて、cDNA microarrayによる網羅的遺伝子解析と癌細胞への候補遺伝子産物の蛋白やその阻害剤(抗体、siRNA, shRNAなど)、アディポカイン、脂肪酸、アディポゾームの投与実験により、脂肪組織誘導性の胃癌の細胞動態仲介因子を同定する予定である。試薬、動物代金の使用量が少なかったため。抗体などの試薬の供与を受けたため、試薬の購入費が少なくなったため。今年度は、試薬、動物代金の使用量が多くなる見込みでる。今後の研究で、試薬などの購入費に使用予定である。
共鳴トンネル素子を用いたサブTHzサンプリングΔΣA/D変換器の研究

本研究は共鳴トンネル論理ゲートMOBILEを用いて、高性能なADCの実現を目指したものである。高感度で高速サンプリングが可能というMOBILEの特徴を活かすために、FM中間信号を用いた新しいΔΣ変調方式を採用した。この方式は動作速度を制限するフィードバックDACが存在しないため、高速化に適している。まず、サンプリング周波数の向上を狙い、対称型MOBILE(SMOBILE)を提案した。これは従来のMOBILEを高周波クロックで動作させたときに問題となっていた、出力電流の影響を抑制し、高い周波数まで安定した動作を可能とするものである。シミュレーションの後、試作回路を測定し、100GS/sが可能であることを実証した。次に出力がRZモードであり、従来回路との整合性が劣るというMOBILEの問題点を解決するためにNRZモードMOBILEを提案した。その基本動作を回路シミュレーションで確認した後、FMDSMへの応用を検討した。パワースペクトルを計算し、良好なノイズシェーピングが確認できた。また、HEMTのしきい値ばらつきによる影響を調べ、しきい値から±0.1Vの閾値余裕が確認した。この値はこれまでに報告されているしきい値ばらつきの値より十分大きく、本回路構成の有効性が確認できた。なお、ここで提案したNRZ-MOBILEはSMOBILEに応用することも可能であり、これにより従来にない高いサンプリングレートが期待できる。また、NRZモードMOBILEの応用例として並列型周波数ΔΣ変調器についてのシミュレーションを行った。簡単な回路を用いた並列化によりさらに高いSNDRを得られることを示した。最後に、FMDSMの問題点である、VCOの線形性について検討した。二つのVCOを相補型の信号で駆動し、サンプリング、エッジ検出の後、その信号の差をとることで2次の高調波を低減でき、高いSFDRを得られることを実証した。本年度は最終目標である100GHzサンプリングΔΣADC実現の鍵となる共鳴トンネル識別器について検討を進めるとともに、周波数変調方式ΔΣADC高性能化のキーとなる線形性の確保に関する新しい提案を行った。具体的な検討項目と成果の概要を以下に示す。1.100GHzサンプリングの実現には高精度の超高周波クロックが必要という問題がある。ここではそれを解決するために共鳴トンネル論理ゲートMOBILEを用いた新しい構造の識別器を提案した。この方式は相補型のクロックを用いて、クロックの立ち上がり、立下り、両エッジで動作するものであり、実効的に2倍のクロックを加えたのと同じサンプリングレートが得られる。また、出力はNRZとなるため、従来回路との接続も容易である。その基本動作をシミュレーションにより確認した後、設計を行い、現在、回路の試作中である。2.周波数変調型ΔΣ変調器において最も問題となるのは入力信号を線形性良く、周波数変調信号に変える電圧制御発振器(VCO)の実現である。これまで、我々は高周波のVCOを用い、ミキサーによりダウンコンバージョンすることによってこの問題を緩和できることを示してきた。今年度はこれをさらに拡張し、相補型の入力信号と2つのVCOを用いることにより、偶数時の非線形性をキャンセルする新しい方式を提案した。本方式について回路シミュレーションで検討した後、VDECを用いた試作によりその効果を確認した。高感度で高速サンプリングが可能というMOBILEの特徴を活かすために、FM中問信号を用いた新しいΔΣ変調方式を採用した。

これは従来のMOBILEを高周波クロックで動作させたときに問題となっていた、出力電流の影響を抑制し、高い周波数まで安定した動作を可能とするものである。シミュレーションの後、試作回路を測定し、100GS/sが可能であることを実証した。次に出力がRZモードであり、従来回路との整合性が劣るというMOBILEの問題点を解決するためにNRZモードMOBILEを提案した。その基本動作を回路シミュレーションで確認した後、FMDSMへの応用を検討した。パワースペクトルを計算し、良好なノイズシェーピングが確認できた。また、HEMTのしきい値ばらつきによる影響を調べ、しきい値から±0.1Vの閾値余裕が確認した。この値はこれまでに報告されているしきい値ばらつきの値より十分大きく、本回路構成の有効性が確認できた。なお、ここで提案したNRZ-MOBILEはSMOBILEに応用することも可能であり、これにより従来にない高いサンプリングレートが期待できる。また、NRZモードMOBILEの応用例として並列型周波数ΔΣ変調器についてのシミュレーションを行った。簡単な回路を用いた並列化によりさらに高いSNDRを得られることを示した。最後に、FMDSMの問題点である、VCOの線形性について検討した。二つのVCOを相補型の信号で駆動し、サンプリング、エッジ検出の後、その信号の差をとることで2次の高調波を低減でき、高いSFDRを得られることを実証した。
移植後レシピエントにおける末梢血活性化T細胞内カルシウム濃度の測定意義

1.移植モデルDAラットをドナー,Lewisラットをレシピエントとする肝移植モデルの作製手技を確立した。さらに移植後2日目,5日目,7日目のそれぞれの移植片をH.E染色したのち病理組織学的に検討し,本移植モデルの病理組織学的な拒絶時期を考察した。これにより2日目には拒絶反応は起こっておらず,5日目には拒絶反応が完成されていることがわかった。2.リンパ球の観察レシピエントの脾臓を摘出し,ナイロンウールカラム法などを用いてTリンパ球を分離した。これに蛍光色素であるFura-2を添加し,ハロゲンランプを用いた蛍光顕微鏡下でTリンパ球の発色を確認した。さらに移植後2日目,5日目,7日目のそれぞれのラットTリンパ球を分離し,これに抗原物質(抗TCR抗体)を反応させ,340mnと380mnの2つの条件下でTリンパ球の発色を確認したのちこれをビデオテープに録画し,濃度解析の準備を行った。3.カルシウム濃度の測定既知の濃度のカルシウム溶液にFura-2を添加し,上記と同様に340mnと380mnの2つの条件下で発色させ,蛍光解析装置を用いてカルシウム濃度の検量線を作成した。ビデオテープに録画しておいたTリンパ球の発色をこの検量線を用いて解析し,カルシウム濃度の測定を行った。4.結果現在検体数を増やしている段階であり,具体的な解析は行えていない。5.今後の予定結果の解析ののちそれに対する考察を行い,日本小児外科学会総会やその他各種の学会・研究会にて発表し,英文誌に投稿する。移植の拒絶反応を見る実験として、ラットの皮膚移植モデルを用いている。方法:雌性BNラットをドナー、雄性Lewisラットをレシピエントとする皮膚移植モデルを作製した。1:基礎実験手技の確認レシピエントの背部に移植したドナーの皮膚片が、移植後平均8日で肉眼的に拒絶されることが確認できた。2:拒絶反応の確認肉眼的な拒絶反応と病理組織学的な拒絶反応との違いを確認するために、移植後3日、6日、9日、12日に移植皮膚片を採取し、Hematoxylin and eosin染色下に光学顕微鏡で観察した。その際に、Tatsuya Fujitaらのグレード分類を用いて評価した。これより病理組織学的な拒絶反応は、肉眼的な拒絶反応よりも早期に起こっていることが確認できた。3:Tリンパ球の分離現在、ラット末梢血からFicoll-Paque法を用いてリンパ球を、そこからさらにナイロンウールカラム法を用いてTリンパ球を分離する手技の確立を行っている。4:必要薬品・器材の購入リンパ球分離に使用するT細胞分離カラムや、今後使用するカルシウム染色蛍光色素(Fura-2)などの実験に必要な薬品・器材を購入した。
新規のレーザー衝撃波液体ジェットメスを用いた食道癌に対する粘膜下層剥離術の開発

「本研究の目的」第一に内視鏡に導入可能なレーザー衝撃波液体ジェットメスを試作し、食道粘膜下層剥離(endoscopic submucosal dissection:ESD)のためのパラメータと装置形状の最適化を摘出動物(ブタ)臓器を用いて明らかにすることである。第二に試作した装置を全身麻酔・内視鏡下に術中画像モニタリング下に使用し、食道粘膜下層における組織深達度を含めた切開特性、血管温存性を組織学的に検討し臨床応用に向けた知見を蓄積することである。「本年度研究実績」平成21年度に明らかにされたレーザーエネルギー、装置形状など流体生成に関するパラメータ、データを基に、消化管内視鏡に導入可能なカテーテルタイプのレーザー衝撃波液体ジェットメスを試作した。昨年度の検討で、臨床応用に向け、生成されるジェットの客観的な「つよさ(衝撃力)」に関するデータの必要性が示唆されたため、これまでの高速度撮影によるジェットの初速測定に加えて、フォースメータを用いた衝撃力の測定を行った。その結果、前年度最適化された条件(レーザー照射エネルギーを1.0-1.5J/pulse、周波数3Hz、ノズル径21G)は0.5-1.5 N/pulseの衝撃力に相当することが明らかとなった。ブタ動物モデルにおいてESDを行った結果、(1)既存の機器と比較して十分な剥離能力を有する、(2)周囲組織の損傷は生じない、(3)200μm程度の細血管は温存される、(4)視野を含めた操作性は良好であることが確認された。いずれも従来の内視鏡用のデバイス、あるいはウォータージェットデバイスの欠点を克服し得る知見であり今後臨床応用に向け、さらに開発を進める予定である。[研究の目的]本研究では早期食道がんに対する食道粘膜下層剥離術(ESD)をより安全に行うための新しい機器の開発と臨床応用に主眼をおいている。カテーテルに導入可能なレーザー衝撃波液体ジェットメスを作成し、食道粘膜下層剥離に至適なレーザー条件と装置形状を明らかにするための検討を行った。[本年度の研究実施状況](1)レーザー衝撃波液体ジェットメスを用いて、豚の摘出食道を用いて食道粘膜下層剥離実験を行った。(1)レーザー照射エネルギーと周波数による食道粘膜下層の剥離しやすさを検討した。照射エネルギーと周波数を変えて検討したところ、剥離に必要なエネルギーは1.0から1.5Jであることが明らかになった。(2)ノズル形状、吸引装置形状の至適条件を検討した。ノズル径と吸引管径を変え、組み合わせた試作品を作成し、組織切開能を評価したところ、剥離に適切な条件はノズル径21Gで吸引管径12Gであることが明らかになった。(3)最大エネルギー1.5Jにおける深達度を検討した。1.5Jで粘膜下層剥離を行い、組織学的に評価したところ、粘膜下層で剥離されており、筋層の変性、損傷を認めなかった。これらのことより、レーザーエネルギー1.0から1.5J、3Hzで安全に粘膜下層剥離を行えることが示唆された。(2)軟性鏡で使用するためのカテーテルタイプを試作し豚摘出食道で粘膜下層剥離実験を行った。組織学的に筋層の損傷を認めず、上記同様の条件で粘膜下層剥離を安全に行える可能性が示唆された。(3)パルス液体ジェットを豚食道粘膜下層に射出し、高速度カメラで撮影すると同時にパワーメーターでエネルギーを測定した。これにより剥離に必要なエネルギーとメカニズムを評価できる実験系を確立でき、各種組織に適合した液体ジェットメスの設計に反映できる可能性が示唆された。