hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
走査トンネル顕微鏡による超伝導強磁性体界面での近接効果に関する研究

観察された多重アンドレーフ反射による解析から、接触時の伝導チャネルに関する情報も極めて精度良く測定することができ、点接触形成過程における伝導チャネル形成プロセスに関する詳細を解明することができた。常伝導金属を超伝導体に接触させると、超伝導ライクな性質が接触界面近傍に現れる。走査トンネル顕微鏡による局所トンネル分光の機能を生かして、誘起された超伝導特性およびその空間分布を評価し、欠陥構造や電子状態による影響を明らかにした。2次元金属層における近接効果による研究では、原子層ステップ構造が超伝導特性に大いに影響を与えること見出された。超伝導の拡がりを遮断するとともに、ステップと界面間では増強させることが明らかとなった。強磁性体との近接効果では、超伝導特性が界面近傍において破壊される逆近接効果が観察された。破壊の拡がりに異方性が見出され、フェルミ面形状によるものと結論された。前年度に進めた近接効果観測のための手法開発や、試料作製のためのシステムを用いて、今年度は、実際にさまざまな系における近接効果観察に応用し、種々の新規な知見を得ることができた。次年度予定の強磁性体との近接効果に関しても、今年度に既にいくつかの系で試みており、今後の研究に対する重要な指針を得ることができている。27年度が最終年度であるため、記入しない。理工系次年度は、Mn3Ge5、クロム酸化物などの強磁性体材料やPb/Geなどの表面ラシュバ系での近接効果による超伝導特性注入を利用した新奇超伝導特性の実空間観察を推進する。また当初の計画では、こうした系における磁場下での特性や渦糸構造に関してはあまり着目していないが、これまでの研究を通じて、興味深い振る舞いも観察されていることから、次年度は、磁場をパラメータとした実験にも注力する計画である。当年度の目的である近接効果観測のための手法開発や、試料作製のためのシステム整備を順調に進めることができた。次年度予定であった強磁性体との近接効果に関しても試みることができ、必ずしも所望の結果が得られなかったが、問題点が明らかとなり、次年度以降の研究に対する重要な指針を得ることができている。学内での年度内限りの研究費から、物品購入がある程度可能となったことから、その分の残金を次年度に繰り越すこととした。次年度は、初年度に試みたMn3Ge5/Pb界面において更なる測定を行い、特に逆近接効果領域における特異な超伝導特性の探索を行う予定である。さらに、Mn3Ge5薄膜中への近接効果が現れなかった原因として、同物質の電気伝導度が高すぎる点が挙げられることから、より電気伝導度の低い強磁性体としてクロム酸化物を系として考えており、その表面作製方法の検討、表面作製、Pb薄膜との界面の作成、界面領域における超伝導特性の観察を進め、特異な超伝導の観測を実現する予定である。これまでの研究遂行により、装置・測定系の整備が済んだことから、次年度は、実際の測定が中心となる。効率良く測定および解析を進めるために研究補助を依頼する予定であり、そのための人件費として支弁する計画である。
生体心筋拍動のスターリング則を実現する組織工学的3次元心筋構築に関する革新的研究

本研究では、従来の細胞組織工学的な手法による構築したコラーゲンゲル足場での心筋再生組織を基づいて、新しい技法・改進を開発・実現し、生体心筋組織拍動特性を有する心筋再生組織を作った。3年間の研究活動によって、以下の成果を得た。1.体外培養ラット胎児心筋細胞の遺伝子発現の比較実験によって、培養心筋細胞における心筋細胞の分化・成熟に係る重要な伝写因子であるSRFとmyocardinおよび心筋組織介在板の構成を司るN-cadherinとconnexin43の発現低下を示した。この知見に基づき、遺伝子転移技法によって、N-cadherinの強化発現を促す、心筋細胞間の相互作用を強化することを試みた。2.3次元コラーゲンゲル足場の添加物による高浸透性化、並びに培養液供給と老廃物代謝の改善を実現した。4種類の添加物に対して、それぞれの混入実験を行い、その内heparinとalbuminが足場のglucose透過係数を約2倍に上がることから高浸透性に最も有効であることを判明した。3.心筋再生組織構築の各々の過程により詳細な検討・最適化を行った。その内二つ重要な処理は:i)心筋採取および組織構築におけるコラーゲンナーゼの残留効果を無くすために培養液にcysteineの添加が有効である;ii)ゲル形成の過程に、ゲルに埋め込む心筋細胞の沈殿による不均等性を防ぐためにゲル形成直後のゲル反転が必要である。4.新型電気一応カバイオリアクタを開発した。従来のバイオリアクタと違って、新型における応力の印加は外部から能動的な方式ではなく電気刺激による再生組織の収縮に伴う収縮応力と収縮ひずみの自然登生である。これによって、より実際の心筋組織収縮に模擬することができ、電気刺激と応力印加の協調も自然に解決された。5.再生心筋組織の拍動特性を解明するために、独自の拍動変位一拍動力解析法を開発した。6.以上の方法によって、構築した3次元心筋再生組織はその拍動力が約16倍に向上させ、最大収縮ひずみ速度と最大収縮力が対応する生体内の心筋組織拍動特性と似た特性を有している。本研究は研究実施計画に従って、順調に進んでいる。今年度の研究成果は以下のように要約される。(1)心筋細胞膜上にある足場との相互作用を強化する機能分子の発現促進について、選定された4つの粘着分子と2つのTranscription factorのラット胎児心筋、新生児心筋、体外培養心筋における発現を調べた。その結果、ラット心筋の成長とともに選定された粘着分子・Transcription factorの発現は多くになる一方、体外培養心筋では細胞間粘着分子と2つのTranscription factorとの発現は減少する傾向が分かった。これにより、来年度の研究方向は心筋細胞N-CadherinとSRF(Serum Response Factor)の発現を促進することに決まった。(2)3次元コラーゲンゲル足場に添加物を与えることによって、3次元構造内への高培養液浸透性を得、培養液の供給と老廃物の代謝を改善する。コラーゲンを主成分とし、さらに細胞-細胞外マトリックス間の相互作用をin vivoに近づけるため、ヘパリンやアルブミン・フィブリノーゲン・フィブロネクチンを加えた。ヘパリン・アルブミンを加えたシートは、培養液浸透性は高くなった。

また、シート耐圧強度の変化も見られ、シート成分を変えることでシートの性質と細胞との相互作用を制御する可能性を考えられる。以上の2点については、今までの研究報告には見当たらず、本研究での新知見であることと考えられる。(3)組織工学的3次元心筋構築方法について、コラーゲン支持体に基づく3次元リング状の培養心筋再生組織を作製した。作製した培養心筋再生組織に電気刺激と応力を与え、その拍動能の向上を図った。また、リング状培養心筋再生組織の拍動力を測定するために、オリジナルな微小拍動力の測定方法を開発し、異なる条件下の培養心筋再生組織の拍動力の比較を成功した。来年度は、これらの成果に基づき、3次元コラーゲンゲル支持体内多細胞培養系の構築、胎児心筋細胞の遺伝表現型の調節、電気-応力バイオリアクタの改良及び最適な培養パラメーターの解明を解決していぐ予定である。本研究は17年度の成果を踏まえて、研究実施計画に従って、順調に進んでいる。今年度の研究成果は以下のように要約される。(1)心筋細胞膜上にある足場との相互作用を強化する機能分子の発現促進について、構築した心筋培養組織の介在盤におけるN-cadherin, Connexin 43の発現の不足を示した上に、更に4つのTranscription factorの発現を調べた。その結果、ラット心筋の成長に極めて重要であるNkx2.5とMyocardinの発現減少することが分かった。これにより、3次元コラーゲンゲル支持体内多細胞培養系を構築し、胎児心筋細胞の遺伝表現型を調節して、生体内に近い成長・分化を促している。(2)電気-応力バイオリアクタを改良し、上記の構築された心筋組織を電気・応力負荷下に培養した。構築した心筋培養組織の自発的な拍動を利用して、心筋拍動に適合した動的応力を印加し、より生体と近い応力環境下の組織培養を実現した。(3)心筋培養組織の構築方法に於いて、各ステップの最適化を検討しました、また、リング状培養心筋再生組織の拍動力を測定するオリジナルな微小拍動力の測定方法を用いて、構築した培養心筋再生組織の拍動力特性を解明した。以上の3点については、今までの研究報告には見当たらず、本研究での新知見であることと考えられる。(4)また、3次元コラーゲンゲル足場に添加物を与えることによって、3次元構造内への高培養液浸透性を得る方法に関して、更なる改進を行った。来年度は、これらの成果に基づき、3次元コラーゲンゲル支持体内多細胞培養系の構築、以上の技術により構築した3次元心筋構造をラット心臓に移植し、この方法の先進性を確かめる。終年度としてこれまでの成果や技術を統合・改善し、本研究の目標、すなわち構築された心筋再生組織が生体内の心筋組織が持つ拍動特性を実現させた。更に初代培養心筋細胞への遺伝子導入率の低下問題を解決するため、遺伝子組み換え動物を利用して、心筋細胞における標的遺伝子(N-cadherin)の強化発現研究も踏み出した。以上の研究過程を経て今年度の研究成果は以下のように要約される。(1)心筋細胞膜上にある細胞間相互作用を負う機能分子の発現について、構築した心筋再生組織の介在盤におけるN-cadherin, Connexin43の発現の不足をタンパク質レベルで示した。
風波界面におけるガス交換機構の解明と海面物質移動シミュレータの構築

本研究は,風波界面の砕波・乱流過程とそれらがガス交換機構に果たす役割について検討し,ガス交換速度のモデル化および海面物質移動のシミュレーション手法の構築を試みたものである.風応力が乱流過程や界面スカラー輸送機構に及ぼす影響を明らかにするために,水表面にせん断応力が作用する開水路乱流場の直接数値シミュレーションの結果を詳細に分析した.その結果,界面スカラー輸送機構はせん断応力の大きさ・主流に対する向きに大きな影響を受けることを明らかにした.また,様々な風速条件下で行った風洞水槽実験の結果に基づいて風波界面の遷移過程について検討した結果,風波クーリガン数や風波レイノルズ数が風波界面の微小砕波の発生を記述する上で有用なパラメータになりうることを示した.また,PIVを用いた流速計測によって風波界面下の吹送流速分布を測定し,吹送流速と摩擦速度との関係を明らかにした.さらに,吹送流速と風波のストークスドリフト流速に基づく海面境界過程のパラメタリゼーションの可能性について検討した.風波界面における乱流と砕波の寄与を分離評価するハイブリッドタイプのガス交換速度のモデル化手法の改良とその変動特性について整理・検討を進めた.ハイブリッドタイプのモデルは,風速のみで表示された経験式とは,その変動特性が定性的・定量的に異なることを確認した.また,ハイブリッドタイプのガス交換モデルの現地観測データへの適用性について検討した.モデル定数やパラメタリゼーションの妥当性・適用限界についてはさらに検討が必要であるが,波浪特性を組み込んだガス交換機構のモデル化の有効性・発展性について重要な知見を得ることができた.さらに,波浪モデルによる波浪推算結果と海上風速値からGISを用いて評価されたガス交換速度に基づく海面物質移動シミュレーションの解析フローを検討・構築した.本研究では,風波界面における砕波・乱流過程とガス交換機構を反映した精度の高いガス交換速度モデルを確立し,そのモデルを気象場と波浪場の結合計算に実装した海面物質移動シミュレータの構築を目指している.初年度においては,モデルの高精度化の指針を得ることを目的として,水表面における乱流とガス交換機構の関係性について研究を行った.先行研究における乱流力学とハイブリッドモデルに関する知見に基づいて,ガス交換速度モデルの数理表現について再検討した.その結果,ハイブリッド型ガス交換速度モデルの風波特性量への応答およびモデルパラメータ依存性に関する新たな知見を得ることができた.また,温度成層と水表面の風応力の両方の効果を取り込んだ直接数値シミュレーション(DNS)を実行し,それらの効果が水表面のスカラー輸送にどのような影響を及ぼすかについて検討した.水表面に作用する風応力は,風波界面近傍の乱流構造を規定する重要な因子であり,その知見はガス交換速度のモデル化において重要である.本計算では水表面を有する最も単純な流れ系の一つである側方境界のない開水路乱流場の熱輸送を対象とした.温度成層と風応力の効果によって生じる水表面近傍の高速ストリーク構造と熱フラックスの空間構造の関係を解析した.水表面での流速場の発散(界面発散)は,風応力作用下の熱輸送においても重要な物理量であり,その影響は風応力と成層効果の相対的な大きさによって変化することがわかった.従って,温度成層効果は風波界面のガス交換速度のモデル化において重要である可能性が示唆された.さらに,水表面近傍の乱流およびガス交換速度の水槽実験での評価法に関する知見を整理して,室内実験研究の方法論およびデータ解析法について検討を行った.本年度は,当初予定していた室内実験研究に優先して,ガス交換速度モデルの改良に資する知見を得るために数理表現および数値シミュレーションによる乱流構造やスカラー輸送に関する検討を行った.その結果,ガス交換機構に影響を及ぼす物理過程とガス交換速度のモデル化の知見について良好な成果を得ることができた.結果的に,室内実験研究を次年度にスライドさせることになったが,実験研究のための方法論やデータ解析法についても概ね準備ができていることから,次年度に実験研究を実施することが可能である.以上のように,研究計画全体として見た場合,研究目的の達成度は概ね順調に進展していると見なすことができる.本研究は,風波界面の砕波・乱流過程とガス交換の流体力学的機構を解明し,それらのメカニズムが考慮されたガス交換速度モデルを気象場と波浪場の結合数値シミュレーションに組み込んだ海面物質移動シミュレータの構築を目指すものである.今年度においては,初年度の結果を基礎として,水表面にせん断応力(風応力)が作用する開水路乱流場の直接数値シミュレーション(DNS)を実施し,風応力の作用方向や大きさが,乱流構造や水表面のスカラー輸送(ガス交換)に及ぼす影響について検討を行った.水表面に風応力が作用する場合,水表面の水平流速発散(界面発散)とスカラーフラックスの空間パターンは風応力の正・負で定性的には類似しているように見えるが,風応力が負の条件では,界面発散とスカラーフラックスは大きく減少し,スカラー輸送は定量的に大きく変化することを見出した.また,水表面上に送風することで風波乱流場を再現する風洞水槽実験を実施した.種々の風速条件の下で風波界面の様相の遷移過程について詳細に観察し,どのような風波特性量が砕波発生の記述に有効であるかについて検討を行った.風波界面下の水側に生じる吹送流量と気流側摩擦速度の関係の検討から,断面平均された吹送流速は,風波界面の微小砕波の発生時に顕著に挙動が変化することがわかった.

さらに,PIVを用いた風波界面下の水側流速計測を行い,風波界面の遷移と吹送流の形成との関係を正確に検討するための実験を実施した.これらの実験結果は,引き続き検討中であり,風波砕波過程の記述に有効なパラメータを同定する上で有用な成果であると考えられる.本年度は,昨年度に引き続き,まずガス交換速度のモデル化の基盤となる精緻な知見を得るために,乱流構造やスカラー輸送に関する直接数値シミュレーションを行った.その結果,風応力がガス交換機構に及ぼす影響について貴重な成果を得ることができた.また,風洞水槽を用いた風波界面の遷移に関する室内実験研究を実施し,砕波過程と吹送流形成の関係性について有用な結果を得ることができた.最終年度に向けて,ガス交換機構の実験計測と現地観測に関する準備を進めており,研究計画全体として見た場合,研究目的の達成度は概ね順調に進展していると見なすことができる.本研究は,風波界面の砕波・乱流過程とそれらがガス交換機構に果たす役割について検討し,ガス交換速度のモデル化および海面物質移動のシミュレーション手法の構築を試みたものである.風応力が乱流過程や界面スカラー輸送機構に及ぼす影響を明らかにするために,水表面にせん断応力が作用する開水路乱流場の直接数値シミュレーションの結果を詳細に分析した.その結果,界面スカラー輸送機構はせん断応力の大きさ・主流に対する向きに大きな影響を受けることを明らかにした.また,様々な風速条件下で行った風洞水槽実験の結果に基づいて風波界面の遷移過程について検討した結果,風波クーリガン数や風波レイノルズ数が風波界面の微小砕波の発生を記述する上で有用なパラメータになりうることを示した.また,PIVを用いた流速計測によって風波界面下の吹送流速分布を測定し,吹送流速と摩擦速度との関係を明らかにした.さらに,吹送流速と風波のストークスドリフト流速に基づく海面境界過程のパラメタリゼーションの可能性について検討した.風波界面における乱流と砕波の寄与を分離評価するハイブリッドタイプのガス交換速度のモデル化手法の改良とその変動特性について整理・検討を進めた.ハイブリッドタイプのモデルは,風速のみで表示された経験式とは,その変動特性が定性的・定量的に異なることを確認した.また,ハイブリッドタイプのガス交換モデルの現地観測データへの適用性について検討した.モデル定数やパラメタリゼーションの妥当性・適用限界についてはさらに検討が必要であるが,波浪特性を組み込んだガス交換機構のモデル化の有効性・発展性について重要な知見を得ることができた.さらに,波浪モデルによる波浪推算結果と海上風速値からGISを用いて評価されたガス交換速度に基づく海面物質移動シミュレーションの解析フローを検討・構築した.
東アジアにおける銅鏡拡散・受容システムからみる弥生時代社会の変動過程に関する研究

本年度は日本列島および中国において銅鏡の実見調査を中心に研究を行った。日本列島における調査成果として特筆されるのは韓半島製小形彷製鏡の中に破鏡として扱われているものがあることを明らかにした点である。これまでの研究では破鏡は権威の象徴であった漢鏡を割って使用していたと考えられていたが、今年度の研究により韓半島製小形彷製鏡は日本列島で製作された小形彷製鏡とは価値が異なり、漢鏡同様の扱いがなされていたことを実証的に証明することができた。これにより弥生時代の銅鏡の社会的価値を再構築し、弥生時代の対外交渉とそれによって得られた物資を媒介とした弥生時代の地域間関係創出の過程を描くことができた。また中国での銅鏡の実見調査によっても非常に重要な成果を得ることができた。今年度は河南省安陽・河南省洛陽・陜西省西安・山東省済南・湖南省長沙・浙江省紹興において調査を行った。調査においてはデジタルマイクロスコープを使用し、銅鏡表面に残存する鋳造痕跡や使用痕跡の観察を行った。その結果、銅鏡には長期間使用した痕跡は見いだせないこと、そして銅鏡の製作には漢代前葉から踏み返しによる銅鏡生産が行われていたことも明らかとなった。また後漢の都が置かれた洛陽における銅鏡の副葬状況を検討したが、洛陽においては銅鏡の面径や数量が社会的地位を表していないことを明らかにすることができた。このことから漢鏡はその故地においては銅鏡は実際に姿を映す道具であり、価値の高かったものではなかったことを明らかにした。また鋳造技術の検討から、日本列島で出土する漢鏡が都である西安や洛陽以外の知で製作された可能性も見出すことができたこのように本年度は銅鏡の社会的意義を再構築することができ、対外交渉によってたらされた銅鏡や自らが鋳造した小形彷製鏡の戦略的な分配によって地域間関係や序列を形成していくという弥生社会像を示すことができた。本年度は銅鏡の資料調査を中心に研究を行った。調査ではこれまでの銅鏡研究で行われてきた文様の観察や実測図作成に加え、ルーペ(10倍)や実体顕微鏡(20倍)での観察を行った。ルーペや実体顕微鏡での観察を行うことによって銅鏡の表面に残存する鋳肌(鋳造直後の銅鏡に残存する凹凸)の観察が可能となり、鋳肌の状態によって銅鏡がどの程度使用されていたのかを検討した。またこれによって、前期古墳から出土する銅鏡で弥生時代から長期間保有されてきたとされたとされる文様不鮮明な銅鏡が伝世したのか、それとも鋳造技術上の問題から文様が不鮮明になったのかを検討した。上記の方法で九州を中心として四国、関西、東海、関東での調査を行い、韓国においても資料の実験調査を行った。調査は中国で製作された漢鏡、漢鏡の再加工品である破鏡、日本列島で製作された小形彷製鏡について行った。この結果、まず九州の前期古墳から出土した銅鏡は伝世の痕跡がみられないことが明らかとなり、伝世鏡が存在していなかったことを明らかにした。しかし破鏡については伝世の痕跡が確認され、銅鏡すべてが同様な扱いではなかったことが鮮明となり、その拡散形態や時期も異なっていたことを実証的に証明することができた。また九州外で出土する小形彷製鏡の中に製作技術からみて明らかに九州外で製作されているものが存在し、九州外における銅鏡生産の変遷を明らかにすることができた。このような検討に加え、銅鏡の日本列島における時間的・空間的変遷の検討を行い、弥生時代においてはその洋総が一様ではなく、地域間関係の変動が各時期においてみられることを明らかにした。最後に本年度はこれまでの研究成果をまとめ、熊本大学に博士論文を提出した。

また鋳造技術の検討から、日本列島で出土する漢鏡が都である西安や洛陽以外の知で製作された可能性も見出すことができたこのように本年度は銅鏡の社会的意義を再構築することができ、対外交渉によってたらされた銅鏡や自らが鋳造した小形彷製鏡の戦略的な分配によって地域間関係や序列を形成していくという弥生社会像を示すことができた。
Disposable瞬間測定成分センサの開発

本研究はDisposableな成分センサの開発を目指すものであるから測定精度とともに応答性についても検討することが必要である。本研究では成分としてはZn、測定合金浴としては673773KにおけるZn-SnまたはZn-Pb合金を選定した。また5wt%のZnCl_2を含んだLiCl+KCl溶融塩と固体のKCl粉末を共存させたコンポジット型の電解質を採用し、参照極としては固体または液体のZnあるいは固体のZn-Cu合金を用いたZn濃淡電池を構成し、その起電力変化を測定することが実験原理である。本研究で明らかにされた研究成果の要点は次の通りである。1。測定値の精度に関しては文献値との比較から信頼できることが確認された。2。応答性についてはセンサを合金浴に浸漬してから約3060秒で一定値が得られた。然し乍ら工業規模での大量の合金浴の場合は数秒以内に短縮できると考える。その根拠は本研究で実験したと同じ量の合金浴にセンサと同じ大きさのパイレックスガラス管を保護管としたシース熱電対を挿入して温度の応答性を調べたところ、30秒程度の時間を経て、はじめて元の温度になる実験結果が得られたからである。3。参照極としては固体の方が望ましい。かかる点から773Kでの実験で液体Zn参照極の代わりに固体Zn-Cu極を用いた実験を行ったが、安定な測定値が得られなかった。これについては十分焼鈍したZn-Cu合金参照極を用いれば解決できるものと考えられる。固体参照極の場合はセンサ形状が単純化され、製作も簡略化できるので低コスト化ができる。4。センサへのコンポジット電解質の充填方法については種々検討を加えた結果最も簡便且つ完全な次のような方法に到達した。即ち実験温度で固体KClと溶融塩が1:1の比率で共存するコンポジット電解質は1073K1173Kに加熱すると均一溶液になるので、その中にセンサを浸漬することにより充填する方法である。5。応用例として大量の1473KのZn-Cu-Ni合金浴中の濃度を測定する実験を行ったが、高温度であることによる新しい問題点が数多くあり成功しなかった。これについては今後さらに研究を進める予定である。1。2。3。4。5。共晶組成のKC1-LiClに5%のZnCl_2を加えた溶融塩を電解質とし、Zn(1)を参照極、Zn合金浴(1)を測定極としたZn濃淡電池の起電力測定値から合金浴中のZn濃度が検出できるセンサを開発するための基礎研究を行った。センサとするためには単なる溶融塩ではなく適当な固体担体に溶融塩を浸み込ませたコンポジット型電解質を採用すべきであるので適当な固体担体と、それと溶融塩との混合比を選定することが必要である。

さらにZnの融点以下の温度で使用するならばZn棒を参照極にできるので簡単であるが、融点以上の温度でのニ一ズの方が多いものと考えられるので、Zn融体を内蔵した特殊な形状のセンサを開発することが必要となる.合金浴としてはZn-PbとZn-Sn合金系を選び、それらをタンマン管中で溶解し、その中にセンサを浸漬することにより次のようなZn濃淡電池を構成し、その起電力を測定する実験を行った。Zn(1)/Zncl_2(in KCl-LiCl)(1)KCl(s)/Zn-Pb(1):Zn(1)/ZnCl_2(in KCl-LiC1)(1)+KCl(s)/Zn-Sn(l)Zn-Pb系については773Kで0.1%Znおよび1.62%Znの合金浴で、Zn-Sn系については723Kで12.1%Znおよび23.6%Znの合金浴で実験した。センサの形状については各方面から検討し数種類のセンサについて実験した結果の結論として外径8mm長さ300mmの一端封じのパイレックスガラス管を用い、底から30mmの位置に10mm径の穴を開けたものを採用した。その底部に純Znを約1g入れヒートガンで溶解し、それが凝固した後、その上に約10mmKCl固体粉末を充填する。さらにその上に溶融塩粉末を載せ、その部分をバーナーで加熱して溶融塩をKCl中に浸みこませたものをセンサとした。リード線としては絶縁管で保護したタングステン線を底部まで挿入している。いずれの場合も2030秒程度で文献値から推定される正常値に近い値がえられることが確認された。溶融塩とKCl固体粉末からなるコンポジット型の電解質の構成には重量比で1:1に配合するのが望ましいことが明らかにされた。問題点としてはLiClの吸湿性によりセンサの製作、保存に特別の配慮が要求されることが大きな欠点である。研究実施計画に示した通りの次の3点の課題についての研究成果について述べる。1)センサの応答性について:センサの実験に用いた同じ量の合金浴中にセンサと同じ大きさのパイレックスガラス管を保護管としてシース熱電対を浸漬して温度の応答性について調査したところ、30秒程度で合金浴温度になることが確認された。このことから合金浴が大量の場合はセンサの応答性が本研究結果よりもっと早くなることが期待できることになる。2)センサ構造の簡略化対策:Zn-Sn合金浴を測定極とし、673Kの温度ではZnメッキしたFe線を固体参照極としたJ型センサを用い、773Kの温度では液体Zn参照極を用いた特殊タイプのセンサを用いて実験した。1.0,2.5,5.0,10.0,20.0mass%ZnのZn-Sn合金浴について実験した。センサの製作に関しては材料、工数ともに固体参照極の方が有利であることが明らかにされた。3)コンポジット電解質の作成について:実験温度で固体のKCl粉末とZnCl_2+LiCl+KCl溶融塩が1:1の比率で共存するコンポジット電解質となるようにするために、次ぎに示す2つの方法を採用した。上記のコンポジット電解質を10731173K加熱すれば均一溶液となるので、一つは石英管内で均一溶融塩を作成し、それを水冷して作成した固体粉末を充填する方法である。もう一つはタンマン管内で溶解した均一溶融塩中にセンサ用パイレックスガラス管を浸漬してセンサ内にコンポジット電解質を充填する方法である。いずれも平成11年度より優れた結果が得られ、特に後者の方法によって作成したセンサでは良い測定値が得られた。以上はZnセンサの開発に関する基礎研究の研究成果であるが、応用例として工業的規模でのZn-Cu-Ni合金浴に同様の原理に基ずくZnセンサを適用してみた。
糖尿病性腎症におけるミトコンドリア異常とオートファジー

難治性腎症に対する新たな病態解明として、糖尿病に特異的なmTORC1の上流ならびに下流分子機構の解明に着目して研究を進めた結果、飽和脂肪酸がmTORC1を活性化しうる新規栄養素であること、mTORC1には増殖や分化以外に、ある種の環境下では細胞死を引き起こす役割があることを報告した。また、糸球体上皮細胞におけるオートファジー活性の低下が、腎症における高度蛋白尿、糸球体上皮細胞障害の病態に寄与することが明らかとなった。この結果は、糸球体上皮細胞におけるオートファジーの活性化が、mTORC1抑制による副作用を示さない、新たな治療法の開発になりえる可能性を示すこととなった。2型糖尿病モデルマウスと同様に、1型糖尿病モデルマウスにおいても糸球体上皮細胞におけるオートファジー活性が低下しているかどうかを検討するため、GFP-LC3マウスにSTZ誘発1型糖尿病モデルを作成し、電子顕微鏡にて糸球体上皮細胞におけるオートファゴソームの観察を行ったところ、1型糖尿病モデルにおいても糸球体上皮細胞におけるオートファジー活性が低下していることを確認した。そこで、糖尿病状態における糸球体上皮細胞でのオートファジーの欠損が、糸球体上皮細胞の形態ならびに機能におよぼす影響を検討するため、オートファゴソーム形成に必須なオートファジー関連蛋白の一つであるAtg5の腎糸球体上皮細胞特異的欠損マウスを作製するため、Atg5 floxマウスならびにタモキシフェン誘導型糸球体上皮細胞特異的Cre発現マウスをそれぞれ交配中である。今後両マウスの交配により、タモキシフェン誘導型糸球体上皮細胞特異的Atg5ノックアウトマウスを作成予定である。培養マウス糸球体上皮細胞株を用いて糖尿病状態におけるどのような変化(高血糖、高脂肪酸血症、各種アディポサイトカイン分泌異常)がオートファジー活性の減弱に寄与しているかを検討したところ、高糖濃度刺激、飽和脂肪酸であるパルミチン酸刺激により、オートファジー活性が低下することをGFP-LC3アッセイならびにLC3-IIの蛋白発現量により確認した。現在、mTOR経路、AMPK経路、SIRT1経路といった各種栄養関連シグナルの活性化薬、阻害薬を用いて、各経路の関与を検討中である。糖尿病性腎症を有する患者において糸球体上皮細胞障害が尿蛋白出現に大きく寄与することが明らかとなっている。糸球体上皮細胞は分裂能を有さない高分化細胞であり、一度障害をうけると即座に機能障害や細胞死がもたらされ、尿蛋白の出現に繋がる。つまり、糸球体上皮細胞における恒常性の維持が尿蛋白発症抑制に不可欠である。近年、細胞内浄化機構の一つであるオートファジー・リソソーム系の異常が、各臓器でのオルガネラ異常を引き起こし、代謝性疾患や変性疾患など様々な疾患の原因となることが報告されている。しかしながら、これまで腎症発症・進展におけるオートファジー・リソソーム系の関与は明らかではない。そこで、当院で施行し同意の得られた糖尿病性腎症患者の腎生検サンプルを用いてオートファジー活性をオートファジー分解担蛋白であるP62蛋白の染色により評価した。その結果、同じ糖尿病腎症の患者でも微量アルブミン尿期の患者ではP62蛋白の蓄積を認めなかったが、高度蛋白尿患者では糸球体上皮細胞へのP62蛋白の蓄積を認めた。このことから、高度蛋白尿の状態では糸球体上皮細胞におけるオートファジー活性が低下している可能性が示唆された。そこで糖尿病状態での糸球体上皮細胞障害とオートファジーとの関連を検討するために、糸球体上皮細胞特異的オートファジー欠損マウス(Podo-Atg5-/-)を作製し、高脂肪食負荷により肥満2型糖尿病モデルを作製、糸球体構造の変化、蛋白尿の出現について検討を行った。その結果、オートファジー活性が保たれている場合には高脂肪食負荷により微量アルブミン尿を認めたが、オートファジー活性を欠損させたマウスにおいては蛋白尿の著しい増加を認めた。当研究室には、過去に研究実績のある優秀な研究者が多数在籍しており、研究を進める際の助言を得ることができ、実際の進捗状況に関して毎週開かれる研究カンファレンスにて適宜修正を加えながら実験を進めることが可能な環境が整っているため、本研究はおおむね順調に進展している。また、研究協力者として研究代表者の実験をサポート、補完する人員として実験助手が数名在籍しており、適宜助力を得ながら研究を進行中である。25年度が最終年度であるため、記入しない。Atg5 floxマウスとタモキシフェン誘導型糸球体上皮細胞特異的Cre発現マウスの交配によりタモキシフェン誘導型糸球体上皮細胞特異的Atg5ノックアウト

マウスを作製し、この遺伝子改変マウスならびにワイルドタイプマウスに対して、高脂肪食負荷2型糖尿病モデル、STZ誘発1型糖尿病モデルによる糸球体病変を誘発し、糸球体上皮細胞特異的なオートファジー抑制が糸球体病変に及ぼす影響を検討する。評価項目としては尿中アルブミン排泄量の定量、組織障害評価、単離糸球体での線維化・炎症マーカー、電子顕微鏡による上皮細胞形態異常・ミトコンドリア形態異常、小胞体ストレスの増加を検討する。さらに、培養マウス糸球体上皮細胞株を用いて糖尿病状態における各種条件下(高血糖、高脂肪酸血症、各種アディポサイトカイン分泌異常)においてオートファジー活性の減弱と糸球体上皮細胞障害(Slit膜関連蛋白発現異常、アポトーシス)との関わりを検討する。25年度が最終年度であるため、記入しない。
流場の計測ロボットおよびデータ処理に関する研究

本研究は、回流水槽における流場計測を自動的に行うロボットシステムを開発することを主な目的として行われたもので、その成果は大別して3つに分類できる。1.流場計測ロボットの開発ロボットアームの制御理論を使って、流速計測用のセンサーの位置および角度の6自由度を制御するトラバーサシステムを開発した。またセンサーからのアナログ信号をディジタル信号に変換し、流速値を求めるデータ解析システムを開発し、これらを統括するネットワークシステムを構築した。その結果、大量データの計測を短時間で行うことが可能となり、実験室と研究室のネットワークも整備された。2.流場計測実験3孔管、5孔管を使って、斜航する船体まわりの流場を詳細に計測した。その結果、拘束痩せ型船の場合は、肥大船型の場合とは異なって、船首付近で剥離した渦が境界層の外へ出るため、さほどその強さが減衰しないまま船尾付近に達すること、中央部付近では渦が船底に位置していることなどがわかった。本計測システムは、乱流計測を具体的目標に定めて開発されたが、乱流計測実験については基礎実験が行われた。3.流場計測に不随する基礎研究一つは、回流水槽の性能に関する問題で、観測部自由表面付近の流速分布を均一にする試みを行ったもの、他の一つは将来の流場計測には必ず画像計測が必要であるとの観点に立ち、画像計測を利用した流場計測に関する基礎的な研究を行った。回流水槽で行われる種々の流場計測について,主に実験手順およびデータ処理の観点から整理して,データ処理については8チャンネル程度のデータを収集して時系列解析が行えること,またセンサー支持装置は6自由度制御可能なシステムが必要であることが分った.ロボットアームの制御理論を使って,6自由度すべて制御するロボットアームの機構および制御システムを開発した.本システムは6つのステップモータを制御することにより3つの並進運動と3つの回転運動を行い,流速センサーを任意の位置に移動するばかりでなく,任意の角度で挿入することができる.これによって,5孔管や3孔管による流速ベクトルの計測が容易になり,X型ホットフイルムによる乱流計測が出来るよすになった.また,これとは別にA/D変換器を装備したマイクロコンピューターによるデータ処理システムを開発し,アーム制御システムや他の複数台のコンピューターと通信を行えるようにした.これによって,実験データの収集,解析,トラバーサーの制御などを複数台の計算機で分散処理することが可能となり,実験能率は非常に高上した.さらに,画像データ処理に関しては,基礎実験を行い,レーザ光を利用した流れの可視化,そのデータ解析を試みた.昨年までに開発した流場計測システムを使った流場計測実験を実施すると共に、流場計測に伴ういくつかの問題に関する研究を行った。その成果の主なものは次の通りである。1.斜航する船体まわりの流場を3孔管および5孔管を使って計測した。その結果、船首船底付近の境界層の様子、船首から剥離して流出する渦の挙動を詳細に把握することができた。2.本計測ロボットの開発により、大量の流場データを手軽に得ることが可能となった。3.計測精度向上のために、回流水槽の性能を上げること、ならびに不確かさ解析が重要である。4.乱流計測を行うための基礎的調査を行った。5.複数のコンピュータをネットワークし、実験室における計測、研究室におけるモニタ、解析を統一的に行うシステムを開発した。このシステムは無人化システムとしても有用である。6.画像計測に関する基礎研究を実施し、流場計測システムに取り入れるための調査を行った。
超臨界水酸化を利用した食品中の安定炭素同位体比計測手法の開発

本研究は、超臨界水酸化によって食品をCO2にまで酸化し、得られたCO2の炭素同位体比を近赤外波長変調レーザー吸収分光法によって測定する新規手法を提案した。精米由来の炭素は99.72 %以上がCO2にまで酸化され、その炭素同位体比は、従来法での測定値と差異なく、超臨界水酸化は前処理法として有用であることが示された。以上、本提案の新規分析手法が、原産地推定手法として応用され得る展望が実験的に示された。反応条件等の最適化及び反応後の気体を分析装置に導入する手法の確立を行った。はじめに、メタノールを用いて回分式装置により超臨界水酸化反応を行い、気体を回収し、温度・圧力等の反応条件依存性を調べることにより、完全酸化に必要な反応時間等の条件最適化を行った。サンプル中の同位体比を精度よく測定するためには空気中のCO2の汚染を防ぐことが重要になる。反応後のガスを安定炭素同位体比測定装置に導入する際の汚染を防ぐための装置上の工夫が必要になる。耐熱性の高圧バルブを導入し、生成したガスを回収する際の汚染を防ぐ方法を検討した。超臨界水酸化装置と波長変調近赤外レーザー吸収分光装置のオンライン部の設計・製作を行い、近赤外レーザー吸収分光装置へのガス導入条件の最適化を行った。初年度の結果を踏まえ、異なる組成の分析対象物についての検討を行うとともに、実プロセスへ向けた装置設計を行った。いくつかの分析対象物について、同様の手法により反応条件の検討を行い、本手法の適用範囲について検討した。反応時間の短縮や処理温度の低温化のため、触媒の導入について考察した。過酸化水素水を分析対象物を仕込んだ半回分式装置に送液ポンプで送り込み、溶解した反応物を後段に固定床の触媒管によって完全酸化させることによる回分式と半回分式についての比較検討を行い、最適なプロセスの設計を行った。これらのデータを総合的に検討し、本炭素安定同位体比計測手法の優位性について考察した。小型多重反射セルを用いた炭素同位体計測装置の設計・製作を行い完成させ、測定精度及び検出限界の確認を行った。同位体分析の前処理として超臨界水酸化法を用いる手法の確立をめざし、精米をサンプルとした検討を行った。500 °C, 25 MPa,反応時間120 minの条件において、SUS製の回分式反応器を用いて超臨界水酸化反応を行った。反応器には過酸化水素水を封入し、熱分解により生じる酸素を酸化剤とした。酸素量は、処理した精米の全成分が炭水化物であると仮定し、H2OとCO2にまで完全酸化する反応に要する酸素量の3倍を用いた。また、大気中のCO2の混入を防ぐため、反応溶媒として用いる蒸留水は窒素バブリングによる脱気をして用い、反応器へサンプル等を封入する作業等はすべて窒素雰囲気下で行った。生成した気体を窒素雰囲気下で真空容器に回収し、GC-TCDにより成分の定量分析を行うとともに、同位体比質量分析計によりCO2の炭素の安定同位体比分析を行った。また、液体成分についてはTOC計により液中の炭素の残存量を測定した。魚沼産コシヒカリをサンプルとして用いた場合、この処理によって生成した気体中にCO2以外の炭素由来成分は含まれず、99.72 %(Cベース)以上の炭素がCO2にまで酸化された。この気体中の炭素同位体比を実際に測定したところ炭素安定同位体比は-28.8±0.10 ‰であり、従来の燃焼法による同位体比の測定結果に、本法での反応管内の気液平衡を考慮した値(-28.7 ‰)とほぼ一致した。以上のことから、大気中のCO2を混入することなく前処理を行う手法を確立でき、超臨界水酸化法が食品の炭素同位体計測の前処理として適用可能であることが実験的に示されたと考えられる。各プロセスでの反応時間や、過酸化水素の濃度、仕込みのサンプル量などのさらなる検討が必要であるため。環境分析条件の最適化を図ることにより、酸化効率の向上を目指す。コメによる最適な条件出しが行われておらず、次年度の課題として残っている。酸化効率の向上を目指す実験を次年度に行う必要が生じたため。コメ以外の対象物質として、脂質をより多く含む牛肉などについて、同様の手法により反応条件の検討を行い、本手法の適用範囲を明らかにする。反応時間の短縮や処理温度の低温化のため、触媒の導入を検討する。過酸化水素水を、分析対象物を仕込んだ半回分式装置に送液ポンプで送り込み、溶解した反応物を後段に固定床の触媒管によって完全酸化させる。回分式と半回分式についての比較検討を行い、最適なプロセスの設計を行う。これらのデータを総合的に検討し、本安定炭素同位体比計測手法の優位性を明らかにする。触媒、配管部品の購入、学会参加費に充てる。
中世から近代インドへの韻文の流れ-マートラー韻律の構造の解明-

本年度もインドで二週間の現地調査を実施した。ベナレスのナーガリー・プラチャーリニー・サバーとガヤのマガダ大学が所蔵するヒンディー詩論書の4写本(Ram Sahay,Sukhdev Mishra(2作品),Jani Biharilal)のマートラー韻律の定義の部分の書きおこしの作業を完成させた。これらの写本はSivanandana Prasadaによってヒンディー韻律の歴史上重要とされながらもこれまで出版されておらず、この作業のヒンディー韻律研究における意義はきわめて大きいといえる。今回の科学研究費内ではできなかったが、今後の課題として、書きおこしたテキストを校訂して出版したい。ヒンディー韻律のそれぞれの詩形の法則をプログラミング処理用に符号化する作業を完成させた。三年間に蓄積したヒンディーのマートラー韻律の主要詩形の朗読をAudio Archiveとして、また主要なヒンディー作品の電子テキストをText Archiveとして専用サーバー上で公開した。国立インド文学協会主催のInternational Symposium on Indian Poeticsで招待講演として口頭発表した。発表では、ヒンディーのマートラー韻律の発展を論じたうえで、中世ヒンディー文学作品『ラームチャリットマーナス』を例に上げ、そのマートラー韻律の特徴を今回の科学研究費補助金を用いて蓄積した電子テキストのデータの分析から明らかにし、このような電子テキストのデータ分析による韻律研究がテキストの校訂においても重要な意味をもたらすことを指摘した。中世ヒンディー文学のマートラー韻律を扱った詩論書の写本と資料の収集のため、インド(ベナレスのナーガリープラチャーリニーサバー)で現地調査を実施した。また、現地調査で伝承者によるマートラー韻律の詩形(sama-chanda)の朗誦を録音し、大学内のサーバ(http://hin.osaka-gaidai.ac.jp/)で公開した。詩形の朗唱の録音は現地調査のたびに行い、引き続きできるだけ多くのサンプルを集める。中世ヒンドゥー教の宗教詩の中で主要な作品を電子テキスト化し、それを校正したものを上記のウェブ上で公開する計画の中で、本年度は、Dohavali by Tulsidasを公開した。なお、電子テキストの韻律を分析しやすくするため、韻律構造を計算するとともに視覚化して表示するアプリケーションを開発する作業は今年度行う予定であったが、次年度も引き続き行うこととする。ヒンディーの詩形の起源を探るために、プラークリットの詩論書『プラークリット・パインガラム』に記述があるヒンディーのマートラー韻律の詩形を調べ、ヒンディーの詩論書("Kavya prabhakara" by Jagannathaprasada `Bhanu')との比較分析を行った。昨年度に引き続き、インド(ベナレスのナーガリープラチャーリニーサバー)で現地調査を行い、写本と古い資料を閲覧した。また、現地調査では朗唱者による韻律の朗唱を録音し、マートラー韻律のそれぞれの詩形の定義と朗唱のサンプルを大学の公開用サーバーで公開した。マートラー韻律の標準的な詩論書の規定方法の違いに注目しながら、それぞれの詩形の法則をプログラミング処理用に定式化する作業を行い、韻律構造を計算するとともに視覚化して表示するアプリケーションを開発する作業を行った。本研究に協力する意図で、オランダのライデン大学Arlo Griffiths教授から提供された、"Mrigavati"(1531) by Kutubanの電子テキストを、ヒンディーのマートラー韻律の特徴のひとつである脚韻の起源についてペルシャ詩の影響を検討するための資料として、同サーバー上で公開した。また、ヴィシュヌ派クリシュナ信仰の韻律の特徴を検討するための資料として、"Sursagar" by Surdasを電子テキスト化する作業を行い、ほぼ完成させた。公開は来年度の予定。本研究で得られたこれまでの成果をインドのヴリンダーヴァンで開催されるバクティ学会で発表する予定であったが、学会が延期されたため詳細については発表できなかった。なお、日本南アジア学会大会前日企画(南アジア関係科研プロジェクト)にて、これまでの経過報告を行った。
１６Ｓ　ｒＲＮＡ置換変異に基づくリボソーム機能改変と大腸菌宿主改良

本研究は、大腸菌の翻訳装置リボソームの改変による大腸菌宿主創成技術に関する。遺伝子の発現過程は、転写、翻訳、たんぱく質フォールディングの3段階に分けられるが、中でも複雑な反応機構である翻訳に着目した。大腸菌のリボソームは、大小2つのサブユニットから構成された大変複雑なRNA-たんぱく質複合体である。この構造物の中心骨格は、16SリボソーマルRNAおよび23SリボソーマルRNAが担っている。16SリボソーマルRNAは、微生物の分子系統分類の指標として頻用させている通り、生物種固有の分子であると広く認識されてきた。しかし、当研究室では16SリボソーマルRNAの改変法を確立しており、私はその方法を用い大腸菌のリボソーム、ひいては宿主機能の改変を試みた。昨年度は、16SリボソーマルRNAの改変により、大腸菌の異種遺伝子発現効率化や高温適応などを機能向上が観察された変異株の獲得に成功した。本年は、リボソームの改変が及ぼす影響を明らかにするために、それらの優良大腸菌変異株の表現型観察を行った。具体的には、各変異株に対しBiologシステムを用い、90の様々な試験(様々な炭素源、抗生物質、ストレスなど)を行った。その結果、大半の試験項目に関しては変異株間および野生株との比較においても大きな変化は認められなかったが、抗生物質の一種であるNalidixic acidやAztreonam、糖の一種であるD-Raffinoseなどにおいて優位な差が認められた。それゆえに、16SリボソーマルRNAの改変が、確かに大腸菌の表現型にまで影響しうることが明らかとなった。しかし、この新知見の一方で、16SリボソーマルRNAの改変が及ぼす表現型変化の過程はまだ未知である。今後、トランスクリプトーム解析などの手法により、リボソーム改変のより詳細な影響が明らかになっていくことが期待される。27年度が最終年度であるため、記入しない。微生物は「酵素」の宝庫である。環境微生物の大半が実験室で培養困難であるため、メタゲノムの利用が注目されている。この方法では、大腸菌などの宿主でメタゲノム遺伝子を「異宿主発現」し、活性スクリーニングすることによって目的酵素を取得するという手順を踏む。しかし、異宿主発現の効率が低い場合も少なくない。そこで私は「翻訳」に着目し、翻訳装置であるリボソームの改良を試みた。リボソームは、RNAとタンパク質からなる極めて精緻な構造物であるが、その触媒活性はRNAが担っている。私は、翻訳の初期段階に中心的に働く16S rRNAに着目した。当研究室で開発した「16S rRNA遺伝子の置換実験法(Nat commun, 2011; PNAS, 2012)」は、大腸菌rRNAオペロン完全欠損株において、生育を相補するために発現している大腸菌rRNAオペロンがコードされたプラスミドを、異種16S rRNAと大腸菌5S, 23S rRNAで構成されるオペロンがコードされたプラスミドで交換するというものである。私は、その方法で使用されてきた薬剤耐性マーカー遺伝子をゼオシンからトリメトプリムに変更することで、16S rRNA遺伝子置換変異大腸菌株の形質の安定性の向上に成功した(Tsukuda & Miyazaki, JBB, 2013)。また、置換実験に用いた異種16S rRNA遺伝子の給源として、土壌や哺乳類動物の糞便、海水などの環境サンプル由来のメタゲノムを利用した。その多様な16S rRNA遺伝子ライブラリーを用いて、大規模な置換実験を行い、結果的に多種多様な16S rRNA遺伝子を機能する大腸菌株を獲得することに成功した。その中には大腸菌野生株より1.7倍程度翻訳効率が向上した変異体も存在し、本手法によるリボソーム改変が大腸菌の宿主創成技術になりうつことが明らかとなった。

それゆえに、16SリボソーマルRNAの改変が、確かに大腸菌の表現型にまで影響しうることが明らかとなった。しかし、この新知見の一方で、16SリボソーマルRNAの改変が及ぼす表現型変化の過程はまだ未知である。今後、トランスクリプトーム解析などの手法により、リボソーム改変のより詳細な影響が明らかになっていくことが期待される。「年次計画」にて、26年度に予定していた研究内容を計画的に進めることができたため。27年度が最終年度であるため、記入しない。27年度は、16S rRNA遺伝子の置換実験によって得られた優良な16S rRNA遺伝子に対し、「進化工学的手法」を適用し定方向進化させていく。そのための予備実験として、16S rRNA遺伝子へのDNAシャッフリングを行い、最適化条件をすでに決定している。そのため、16S rRNAの定方向進化について問題なく進行すると予想される。一方、プロテオームや、トランスクリプトームなどのオミックス解析は経験がないため、丁寧に進めていきたいと考えている。
遺伝子導入メダカを用いた環境水汚染物質の可視化

本研究では、水環境中の内分泌かく乱物質(特に、女性ホルモン様物質)の存在を可視化できる遺伝子導入メダカの開発を行った。内分泌かく乱物質の存在をメダカの体色が緑色に変化する事で可視化するものであり、そのシステムは、1)物質の感知、2)メダカ体内でのシグナル化、3)シグナルの変換、4)シグナルの増幅、5)発色からなる。これまでに、1)感知、および2)シグナル化に関わるメダカ卵膜タンパク質コリオゲニンH遺伝子(ChgH)発現制御領域に制御されたメダカメラニン凝集ホルモン遺伝子(MCH)を導入したメダカを作出し、シグナルであるMCHの有効性を確信した。また、内因性のMCH遺伝子の影響をなくすためTILLING法によるメダカMCH遺伝子の破壊を始めた。3)変換にかかわるMCHで誘導される遺伝子の探索を行い、候補となる2種の遺伝子を得、解析を始めた。4)増幅に関わる3種の遺伝子導入メダカを作出した。(βアクチン遺伝子プロモーターに制御されたloxP:RFP:loxP:GFP遺伝子、または、loxP:X:loxP:GFP。骨格筋アクチンプロモーターに制御されたloxP:GFP:loxP:RFP遺伝子)また、メダカ個体内でのCre recombinaseの有効性についても検討し、骨格筋および生殖細胞で働きうる事を示した。本研究では、迅速・簡便で、未知および既知の水質汚染物質の検出、並びに生物濃縮の影響をリアルタイムで評価する、全くユニークなバイオモニター系の遺伝子導入メダカ系統作出を目的とする。この系では、1)感知:センサー遺伝子が汚染物質を感知する。2)シグナル化:そのシグナルを血流を介して骨格筋細胞に伝達する、3)変換:シグナルの受容体を介して骨格筋で上昇発現が誘導される遺伝子(GeneX)の発現調節領域に制御されたCre遺伝子を発現させる、4)増幅:Creが既に導入してある遺伝子構造を変化させる(この過程で汚染物質のシグナルの増幅を行うことになる)、5)発色:変化した遺伝子産物がメダカの体色を緑色に劇的に変化させる、という構成になっている。しかし、実験開始後、下記の問題が生じたため、当初の計画に加えて、下記の研究を優先した。1)シグナルとして用いるMCHの内因性のものが、本系においてノイズ(誤った汚染シグナル)となる可能性が懸念された。そこで、Tilling法を用いてメダカ本来のMCH遺伝子を破壊したメダカ系との作出を行っている。2)メダカ個体内でCre遺伝子が均一に一斉に発現されない事が判った。そこで、この問題を解決するために、本来のCre遺伝子のコドン使用頻度をメダカ型の物に変換したメダカ化Cre遺伝子を構築し、この遺伝子のメダカ固体内での発現様式を検討することにした。現在、骨格筋アクチンプロモーターおよびvasaプロモーターにメダカ化Cre遺伝子を連結したベクターを作製し、メダカ卵への注入を行っている。1)ティリング法を用いメラニン凝集ホルモン遺伝子欠失メダカ系統作出の試み:京都大学放射線生物研究センター、藤堂教授の所有するENU突然変異誘導メダカ遺伝子ライブラリーからメラニン凝集ホルモン遺伝子に変異が導入された個体をスクリーニングするプライマーを設計した。プライマーは、翻訳開始点を含む500塩基ほどを増幅する様に設計した。現在、PCRの条件を検討し、ライブラリースクリーニングを実施中である。2)骨格筋アクチン遺伝子のプロモーターを用い、筋肉にCreを発現刺さる系を確立した。Cre遺伝子が骨格筋で発現され、正しい機能を有するCreタンパク質の存在を確認するため、βアクチンプロモーターに制御された、LoxPで挟まれたナンセンス遺伝子の下流にGFP遺伝子を有する遺伝子導入メダカ系統にOlMA1-Cre系統を交配し、骨格筋にのみGFPが発現することを確認した。OlMA1-Cre系統が有効であることが判明し、'今後の交配に使用する。3)メラニン凝集ホルモン(MCH)遺伝子により誘導される遺伝子Xの探索のために、まず、MCHの有効濃度を検討した。

メダカゲノムデータベースよりサケMCH遺伝子と相同性の高い配列を検索し、そのアミノ酸配列を得た(DTMRCMVGRVYRPCWEV)このアミノ酸配列通りに合成したMCHを山本リンガーに各種濃度になるように溶解した。現在、野生型(黒色)メダカ成魚の腹腔にツベルクリンシリンジを用いて注入を試みている。1)Tilling法を用いたメラニン凝集ホルモン(MCH)遺伝子欠失メダカ系統作出の試み:昨年ど設計したプライマーでは、ライプラリー作製に用いたcab系統でのSNPのため特異的なPCR産物が得られなかった。18年度は、プライマーを設計し直し、コーディング領域にプライマーを作成した。グラジエントPCRにより、反応条件を検討した後、約2800サンプルをスクリーニングした結果、約20の候補個体が得られた。これら候補のPCR産物をダイレクトシークエンス法により塩基配列を決定中である。今後、これらの個体から、真にMCH遺伝子を欠失した個体を決定する。3)MCHを腹腔に注入した個体と注入していない個体からRNAを抽出後、サブトラクション法により、MCH刺激に応答して誘導される遺伝子を単離した。得られた2種の候補遺伝子のいずれもBLASTサーチでは、一致する遺伝子が見当たらないため、現在、それらを解析中である。