hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
摂食と情動反応におけるPrRPニューロンの働き

プロラクチン放出ペプチドは延髄弧束核のノルアドレナリンニューロンで合成され、ノルアドレナリンと伴に刺激により脳内に放出されると考えられている。一方、摂食すると、満腹になり摂食が終了するとともに、不安行動が減少する。本研究の目的は、「摂食すると、プロラクチン放出因子(PrRP)が脳内で放出され、摂食を生理的に終了させると同時に、不安を減弱させている」という仮説を証明することであった。このため、まず、PrRPが脳内において生理的に摂食を終了させる満腹シグナルとして働いているという仮説を検証する実験を行った。摂食に伴いPrRPニューロンが活性化されるかをFos蛋白質発現あるいはpCREBの発現検討実験により検証したところ、摂食に伴い延髄孤束核のPrRPニューロンが活性化することが明らかになった。次に、摂食時に活性化されるPrRPニューロンの生理的働きを検討する目的で、摂食時にPrRP中和抗体を投与し内因性のPrRP機能を阻害した時の摂食に対する影響を検討した。PrRP中和抗体を投与すると、総摂食量が増加した。さらに、摂食パターンを検討したところ、一回摂食量が有意に増えたが、摂食頻度は有意には変化しなかった。これらのデータは、延髄孤束核ニューロンが産生するPrRPが摂食終了シグナル、即ち、満腹シグナルとして重要であるという仮説を支持している。さらに、PrRPを脳内に投与すると、不安行動が減少し、逆に中和抗体を投与すると不安行動が増大することを見出した。従って、内因性PrRPが抗不安に作用していることが示唆された。これらのデータは、「摂食すると、PrRPが脳内で放出され、食を生理的に終了させると同時に、不安を減弱させている」という仮説を支持している。摂食すると、満腹になり摂食が終了するとともに、不安行動が減少する。本研究の目的は、「摂食すると、プロラクチン放出因子(PrRP)が脳内で放出され、摂食を生理的に終了させると同時に、不安を減弱させている」という仮説を証明することである。本年度はまず、PrRPが脳内において生理的に摂食を終了させる満腹シグナルとして働いているという仮説を検証する実験を行った。この目的のために、まず、摂食に伴いPrRPニューロンが活性化されるかを検証し、次に、PrRPの中和抗体を用いて内因性のPrRPを機能阻害した時の摂食パターンの詳細な解析、摂食時のPrRPニューロンの活動をモニターする実験を行った。PrRPニューロンが摂食により活性化されるかをFos蛋白質発現あるいはpCREBの発現を観察した。動物はラットを用いた。摂食に伴い、延髄孤束路核のPrRPニューロンが活性化することが明らかになった。PrRPに対する中和抗体を投与しておいた動物において、摂食パターンを1分間隔で24時間連続自動記録し一回摂食量と摂食頻度を計測した。総摂食量は一回摂食量と摂食頻度の掛け算で表わされる。中和抗体を投与すると、一回摂食量が有意に増えたが、摂食頻度は有意には変化しなかった。

この摂食により延髄孤束路核のPrRPニューロンが活性化され、内因性のPrRPを阻害すると一回摂食量が増加するという今回のデータは、延髄孤束路核ニューロンが産生するPrRPが摂食終了シグナル、即ち、満腹シグナルとして重要であるという仮説を支持している。プロラクチン放出ペプチドは延髄弧束路核のノルアドレナリンニューロンで合成され、ノルアドレナリンと伴に刺激により視床下部に放出されると考えられている。末梢の満腹信号であるコレシストキニンを末梢に投与すると弧束路核のノルアドレナリンニューロンが活性化されることを申請者は見出している。本研究の目的は、生理的な刺激である摂食することにより、弧束路核のプロラクチン放出ペプチドニューロンが活性化されるかどうかを明らかにし、プロラクチン放出ペプチドが脳内の満腹シグナルとして働いているという仮説を証明することであった。延髄のプロラクチン放出ペプチドニューロンが摂食することにより活性化されることを見出した。また、プロラクチン放出ペプチドに対する中和抗体を脳室内投与すると、一回摂食量が増え摂食頻度は不変であること、その結果、摂食量が増加することを見出した。さらに、プロラクチン放出ペプチド遺伝子が欠損した動物でも、同様に、一回摂食量が増え摂食頻度は不変であること、その結果、摂食量が増加し、肥満することが見出された。正常動物では、末梢の満腹シグナルであるコレシストキニンを投与すると、摂食抑制作用が観察されるが、プロラクチン放出ペプチドの遺伝子が欠損した動物ではこのコレシストキニンの摂食抑制効果が阻害されていることを明らかにした。従ってプロラクチン放出ペプチドニューロンは脳内の満腹シグナルを伝えていることが示唆された。さらに、プロラクチン放出ペプチド投与で不安行動が減少し、中和抗体投与で不安行動が増大することを見出した。従って、内因性プロラクチン放出ペプチドが抗不安に作用していることが示唆された。
全天ガンマ線データの統計的解析による暗黒物質粒子の探査

銀河分布や重力レンズマップとガンマ線とのクロス相関を議論する上で、暗黒物質サブハローの存在を無視することはできない。前年度より構築を行なっていた解析的なサブハローのモデルがひとまず暫定的ではあるが完成したので、まずは最初の論文をPhysical Review D誌に出版。さらにGalaxies誌の特別号のためのレビュー記事を依頼を受けて投稿した。また同モデルを用いることで、最新のガイア衛星データの解析結果に独自の解釈を与えることを試みた。具体的にはフェルミの未同定天体、特に暗黒物質サブハローの候補と先行研究で考えられている領域におけるガイアデータの解析を行い、サブハローの兆候を探した。その結果いずれにおいてもサブハローの証拠は見つからず、自身のサブハローモデルを用いることにより、全てのフェルミ未同定天体が暗黒物質サブハローであることを棄却することに成功した。様々な銀河カタログや重力レンズマップとのクロス相関の解析を進めるため、まずはフェルミ衛星の検出ガンマ線データ解析を行った。とりわけ角パワースペクトルを計算し、その結果が先行研究と一致することを確認した。さらには1点確率分布関数をより精度よく求めるため、スキューネスと呼ばれる分布関数の3次のモーメントを計算することに着手した。それと同時にクロス相関を取るための銀河カタログの選定を行い、データの抽出を行なっているところである。他方で重力レンズマップに関してはDark Energy Survey Collaborationとの共同研究を取る形で進めており、成果を論文にまとめているところである。さらには本研究計画で得られた知見を生かし、高エネルギーニュートリノのデータ解析に適用した。これはこの分野にとっては新たな試みであり、分野を超えたあらたな視点の提供に一役買ったいうことができる。角パワースペクトルによってガンマ線源の空間情報、銀河や重力レンズカタログとのクロス相関によって距離情報が得られる。これらをエネルギーのビンに区切って同時に用いることで、エネルギー、位置、距離の情報をすべて活用した解析が可能となる。この課題に取り組み、暗黒物質探査にとって最高感度の達成をめざす。エネルギースペクトルと角パワースペクトルは、フラックス確率分布関数の平均と分散にそれぞれ対応する物理量である。分布関数が正規分布であると知られている場合は、このふたつの量を研究することですべての情報が得られる。しかしながらほぼ全てのガンマ線源の場合、フラックス確率分布は冪則にしたがうテイルを持つことが、本研究代表者らによって理論的に示されている。Nicolao Fornengo教授(トリノ大学)のグループと共同で確率分布関数の解析に当たる。Fornengo教授らのデータ解析の経験(Zechlin et al. 2016, Astrophys. J. 826, L31)と研究代表者のグループで構築した理論的計算の経験を組み合わせることで、確率分布関数のデータを暗黒物質モデルに照らし合わせて解釈していくことを計画している。これらのデータによって得られた結果を理論的に解釈するにあたって、暗黒物質サブストラクチャーによる対消滅ブーストを適正に計算しておく必要がある。この対消滅ブーストの計算を、構築済みの解析的モデルに対してさらなる精密化を施していくことで、進めていくことを計画している。さらに銀河ハローの形成史に対する依存性を詳細に研究していく。暗黒物質サブハローによる対消滅ブーストの計算について、過去の研究を総括したレビュー記事を、エディターの依頼をうけ、Galaxies誌へと投稿。現在査読中である。こちらのレビュー論文は"Halo substructureboosts to the signatures of dark matter annihilation", Shin'ichiro Ando etal.,arXiv:1903.11427として公開済みである。本計画により開始した解析的なサブハローのモデルがひとまず暫定的ではあるが完成したので、最初の論文をPhysical Review D誌に出版。

また同モデルを用いることで、最新のガイア衛星データの解析結果に独自の解釈を与えることを試みた。具体的にはフェルミの未同定天体、特に暗黒物質サブハローの候補と先行研究で考えられている領域におけるガイアデータの解析を行い、サブハローの兆候を探した。その結果いずれにおいてもサブハローの証拠は見つからず、自身のサブハローモデルを用いることにより、全てのフェルミ未同定天体が暗黒物質サブハローであることを棄却することに成功した。様々な銀河カタログや重力レンズマップとのクロス相関の解析を進めるため、まずはフェルミ衛星の検出ガンマ線データ解析を行った。とりわけ角パワースペクトルを計算し、その結果が先行研究と一致することを確認した。さらには1点確率分布関数をより精度よく求めるため、スキューネスと呼ばれる分布関数の3次のモーメントを計算することに着手した。それと同時にクロス相関を取るための銀河カタログの選定を行い、データの抽出を行なっているところである。他方で重力レンズマップに関してはDark Energy Survey Collaborationとの共同研究を取る形で進めており、成果を論文にまとめているところである。さらには本研究計画で得られた知見を生かし、高エネルギーニュートリノのデータ解析に適用した。これはこの分野にとっては新たな試みであり、分野を超えたあらたな視点の提供に一役買ったいうことができる。角パワースペクトルによってガンマ線源の空間情報、銀河や重力レンズカタログとのクロス相関によって距離情報が得られる。これらをエネルギーのビンに区切って同時に用いることで、エネルギー、位置、距離の情報をすべて活用した解析が可能となる。この課題に取り組み、暗黒物質探査にとって最高感度の達成をめざす。エネルギースペクトルと角パワースペクトルは、フラックス確率分布関数の平均と分散にそれぞれ対応する物理量である。分布関数が正規分布であると知られている場合は、このふたつの量を研究することですべての情報が得られる。しかしながらほぼ全てのガンマ線源の場合、フラックス確率分布は冪則にしたがうテイルを持つことが、本研究代表者らによって理論的に示されている。Nicolao Fornengo教授(トリノ大学)のグループと共同で確率分布関数の解析に当たる。
ヒト白血球抗原半合致造血幹細胞移植療法の安全性確立に向けての研究

HLA半合致ミニ移植の多施設共同前方向試験を行い、第I相の10例全例で生着が得られた。ステロイド抵抗性GVHDに対して、再移植を行うことによって、GVHDを救済する「graft-versus-GVHD療法」を独自に開発し、難治性GVHDに対する治療への道を開いた。MHC半合致移植のマウスモデルを用いて、前処置の強度を軽減することで、GVHDが軽くなることを示し、この系を用いて、ホスト由来の制御性T細胞が、移植後も残存し、GVHDの制御に関与していることを示した。同種造血幹細胞移植は、化学療法などの通常の治療で治癒が得られない難治性悪性血液疾患を治せる唯一の治療である。ヒト白血球抗原半合致ドナーからの移植の安全性が確立すれば、移植においてドナーの問題が解消する。厚生労働省の班研究として臨床研究を進め、2009年度は、第II相試験を遂行した。ヒト白血球抗原半半合致移植の臨床研究の成果は、ウイーンで開催された第36回ヨーロッパ造血幹細胞移植学会で発表した。マウスの移植の系において、2種類の主要組織適合抗原半合致移植のモデル(ヘテロからヘテロへ移植するモデルとホモからヘテロへ移植するモデル)を作成した。両者の移植モデルの比較解析の結果、ヘテロからヘテロの系で、移植片対宿主病が軽くなる一方、移植片対白血病効果が高くなるという結果を得た。その機序を解析した結果、レシピエント由来のナチュラルキラー細胞やT細胞が、移植後のマウスの脾臓に大量に動員され、インターフェロンガンマを産生することによって、上記のような結果がもたらされることが明らかになった。この系において、インターフェロンガンマは、移植片対宿主病に対して抑制的に作用する。腸管移植片対宿主病の制御を目的としたベクロメサゾン(局所作用型ステロイド剤)の臨床研究を行い、現在までのところ、期待した効果が得られつつある。さらに、完成した移植片対宿主病を再移植によって治そうずる治療法に関して、我々は、マウスの移植の系で、第3のマウスから再移植することで、重症GVHDを惹起しているドナーリンパ球を駆逐し、移植片対宿主病を救済できることを証明している。この結果を受けて、臨床試験を行った結果、この再移植療法は、極めて有効性が高いことが判明した。マウスの移植実験と同様に、再移植ドナーの移植片の生着が得られなければ、十分な抗移植片対宿主病効果が得られないということを確認した。現在、論文執筆を行っている。厚生労働省の班研究として臨床研究を進め、2010年度は、第II相試験を遂行した。ヒト白血球抗原半合致移植の臨床研究の成果は、ハワイで開催されたBMT Tandem Meetingsで発表した。MHC半合致移植のマウスモデルにおいて、前処置の全身放射線照射の量を変えることによって、フル移植(13Gy)とミニ移植(5Gy)の2つの系を作成した。いずれの系でも、速やかにドナー由来の生着が得られた。フル移植の系では、移植後60日までに、全てのマウスがGVHDで死亡したのに対して、ミニ移植の系では、GVHDの徴候はほとんどなく、全て60日以上生存した、移植14日目の大腸の病理像を比較したところ、フル移植では、多数のドナーT細胞の浸潤とともに組織の破壊が認められたのに対して、ミニ移植では、ドナーT細胞の浸潤は少なく、病理組織学的にもほぼ正常であった。現在、その機序を解析中であるが、腸間膜リンパ節の免疫組織染色では、フル移植はミニ移植に比べて、移植早期の段階で、有意に大量のドナーT細胞がhomingし、その後急速に増殖することが判明した。さらに、フル移植では、浸潤したドナーT細胞は、CXCR3、CCR5など、炎症性chemokine receptorの発現が、ミニ移植に比べて有意に高いことが判った。また、移植早期に、ホスト由来のregulatoryT細胞(Treg)が、ミニ移植の系で、腸間膜リンパ節に、有意に大量にrecruitされることが判明した。これは、早期のアロ免疫の抑制効果に寄与すると考えられた。これらのデータをまとめて、論文発表する予定である。同種造血幹細胞移植は、化学療法などの通常の治療で治癒が得られない難治性悪性血液疾患を治すことができる唯一の治療である。移植を行うには、ヒト白血球抗原(HLA)が適合したドナーを必要とするが、昨今の少子化の影響もあって、移植を必要としていても、血縁ドナーが見つかる確率は20%と低い。

これを補完するために作られた骨髄バンクや臍帯血バンクからの移植も、それぞれドナー/レシピエントのコーディネートに時間がかかる、生着不全率が高いなどの欠点がある。一方、血縁で、HLA半合致ドナーから移植ができるとなると、骨髄移植において、ドナーの問題が解消される。しかし、HLA半合致移植の最大の問題点は、移植時に造血幹細胞とともに、患者に輸注されるドナーT細胞が、患者の正常の組織を攻撃する反応、すなわち移植片対宿主病(graft-versus-host disease=GVHD)である。とりわけ、ステロイド抵抗性のGVHDは、致死率が高い。このGVHDを惹起しているドナー由来の病的に活性化したリンパ球を、second donorから再移植を行うことで、駆逐することができれば、GVHDは治癒に至ると考えられる。我々は、この理論の正当性を、マウスのGVHDモデルで証明し、この治療法を"graft-versus-GVHD"と名付けた(Experimental Hematology,2008:36:1216-1225)。次に、ステロイド抵抗性難治性重症GVHD患者16名に対して、17回のgraft-versus-GVHD療法を実施した(Experimental Hematology,2011:39:880-890)。評価可能な15例中11例でsecond donorの移植片が生着し、4例は拒絶に至った。生着例では、81.8%という高いresponse rate(8例で完全寛解、2例で部分寛解)が得られた。拒絶例では、50%のresponse rate(いずれも部分寛解)にとどまった。graft-versus-GVHD療法を成功させるためには、second donorの生着が必要であることが証明された。
基板微細加工を援用した選択的結晶成長によるグラフェンのナノ物性制御

グラフェンは、優れた物性を有する有望なデバイス材料となっている。このグラフェンの実用化に向けて、他のデバイス材料には無い特徴を活かすことが重要である。このことを鑑み、グラフェンの物性が構造に敏感であることを活かした「基板微細加工を援用した選択的成長によるグラフェンの構造・物性のナノ制御」を目的とした研究を行った。申請者らは、微視的に(111)・(100)が露出した微細加工Si(100)基板へSiC薄膜を介してグラフェンを成長させた。その結果、微視的な面方位による界面構造が変化した。これによりグラフェン積層が変調され、グラフェンのバンド構造を微視的に制御出来ることが明らかとなった。。前年度に行なったSi(100)基板微細加工を援用したグラフェンの位置選択的エピタキシャル成長に関する研究結果を基に、「位置選択的にエピ成長させたグラフェンのナノ構造制御」を目的とした研究を行なった。この目的を達成するために、次の二つの項目、(項目1)グラフェンの積層構造の低速電子顕微鏡(LEEM)・原子間力顕微鏡観察、及び、(項目2)グラフェン/SiC界面化学構造の光電子顕微鏡(PEEM)による観察、を実施した。(項目1)微細加工基板上に露出した微視的なSi(100)及びSi(111)面上に作成した、グラフェン/SiC(100)/Si(111)及びグラフェン/SiC(111)/Si(111)の積層構造を、LEEMを用いた顕微低速電子回折(micro-LEED)により調べた。その結果、(111)上ではグラフェンはBernal積層をとることが明らかとなった。これに対して、(100)上では、グラフェンは非Bernal積層を取ることが明らかとなった。このような微視的な面上での積層構造は、対応するベタ膜(微細加工無し基板)での積層構造と同じである。(項目2)微細加工基板上に露出した微視的なグラフェンの界面化学構造を、光電子顕微鏡を持ちいて、微視的に(空間分解能:70nm程度)調べた。その結果、グラフェン/SiC(111)界面には、バッファー層が形成されることが明らかとなった。それに対して、グラフェン/SiC(100)界面にはバッファー層が形成されないことが明らかとなった。このような微視的な面上での界面化学構造は、対応するベタ膜(微細加工無し基板)での界面化学構造と同じである。このバッファー層がグラフェンのエピ成長のテンプレートして働くと考えると、この界面化学結合の変調が、上で述べた積層構造の変調をもたらすと考えることが出来る。本研究では、「基板微細加工を援用した選択的結晶成長によるグラフェンのナノ物性制御」を目的として研究を遂行した。この目的遂行のために、三つの細目を実施した;1)Si(100)基板微細加工を援用したグラフェンの位置選択的エピタキシャル成長、2)Si(100)基板微細加工の援用による選択エピ成長させたグラフェンのナノ構造制御3)Si(100)基板微細加工の援用による選択エピ成長させたグラフェンのナノ物性制御。23年度には細目1)Si(100)基板微細加工を援用したグラフェンの位置選択的エピタキシャル成長を実施し、24年度には細目2)Si(100)基板微細加工の援用による選択エピ成長させたグラフェンのナノ構造制御を実施した。これら二つの細目を滞りなく実施することが出来た。その上で、平成25年度に細目3)Si(100)基板微細加工の援用による選択エピ成長させたグラフェンのナノ物性制御を行った。本細目の実施においては、主として顕微Raman分光光電子顕微鏡及びを用いて実施した。顕微Raman分光により、(100)面上のグラフェンが光デバイス応用に適した金属性グラフェンであること、一方、(111)面上グラフェンが電子デバイス応用に適した半導体性グラフェンであることを明らかにした。光電子顕微鏡観察結果から、グラフェンの仕事関数(フェルミ準位)は、(100)面と(111)面の境界領域で変化することを明らかにした。このことは、この境界領域で電荷移動、すなわち、ドーピングが起こっていることを新たに発見した。以上のこれまでの結果から、基板微細加工の援用により応用デバイスの種別に適切な構造・物性を有するグラフェンの作り分け法を確立した。このような結果は、グラフェンの電子・光集積デバイスへの応用における根幹技術となることが期待される。。本年度は、三つの研究細目を実施した。

一つ目の細目は、Si(100)の基板の微細加工である。電子ビームリソグラフィーと異方性エッチングの組み合わせにより、微視的なSi(100)面及びSi(111)面を、Si(100)基板上に露出させることに成功した。このことにより、Si(100)の基板の微細加工という一つ目の細目の目標が達成されたと結論される。二つ目の細目は、微細加工Si基板上へのSiC薄膜形成技術の確立である。本細目においては、一つ目の細目において作製した微細加工Si基板上にSiC薄膜を形成することを行なった。このSiC成膜は、有機シランガス(モノメチルシラン)を原料ガスとして用いたガスソース分子線エピタキシー法を用いて行なった。このSiC成膜は、X線光電子分光及び顕微Raman分光を用いて分光学的に実証した。具体的には、X線光電子分光によるC1s内殻準位スペクトル測定によるC-Si化学結合種の検出、及び、顕微Raman分光によるSi-C結合の縦波光学(TO)フォノンモードの検出である。三つ目が、微細加工Si基板上に成膜したSiC表面のグラフェン化である。このグラフェン化は、微細加工Si基板上に、モノメチルシランを原料ガスとして用いたガスソース分子線エピタキシー法により成膜したSiC薄膜上に、表面熱改質により行う。この表面熱改質を施した表面の評価は、顕微低速電子回折(micro-LEED)及び顕微Raman分光により行なった。Micro-LEEDにより、SiC及びグラフェンの六角形状のスポットが確認された。これらのスポットの形状及び強弱から、微細加工Si基板上に成膜したSiC表面の上にグラフェンが形成されていることが明らかとなった。このグラフェン形成は、顕微Raman分光によっても確認された。本繰越課題においては、基板微細加工を援用して選択的に結晶成長されたグラフェンのナノ物性を解析することが主目的であった。その為に、私は、SPring-8東京大学アウトステーションに設置されている三次元走査型光電子顕微鏡(3D nano-ESCA)を用いて、選択的に結晶成長したグラフェンの炭素1s内殻光電子分光をこ70nmという高空間分解能で測定した。その結果、グラフェン/SiC界面が、SiC薄膜の微視的な面方位により変調されることが明らかとなった。具体的には、グラフェンとSiC(111)微斜面の界面にはグラフェンの前駆体となるバッファー層が形成されるのに対して、グラフェンとSiC(100)微視面にはバッファー層が形成されないことが明らかとなった。この選択的なバッファー層形成は、断面透過型電子顕微鏡によっても確かめられている。このバッファー層の形成は、グラフェンへのキャリア・ドーピング、具体的には電子のドーピングの有無を決めることが明らかとなった。高空間分解能な炭素1s内殻光電子分光スペクトルにおけるグラフェン・ピークの詳細な解析により、SiC(111)微斜面上のグラフェンは、バッファー層を通じて、SiC(111)薄膜から電子ドーピングが10^12/cm2程度なされていることが明らかとなった。この電子ドーピングの有無は、共鳴Raman散乱分光顕微鏡によるグラフェンの電子-格子相互作用の解析によっても確かめられている。以上のようにして、繰越課題として狙ったグラフェン物性のナノ解析を実施することに成功した。表面界面物性(平成23年度)Si(100)
トマトにおける高効率なゲノム編集・エピゲノム編集の構築

近年、ゲノム編集技術CRISPR/Cas9の活用は変異導入だけでなく、標的配列特異的結合能を利用した転写活性化にも用いられている。これは、Cas9ヌクレアーゼの切断活性を不活化させた不活性型dCas9に転写活性化ドメインを組み合わせ、遺伝子の転写活性化を可能とするシステムであるが、植物における報告例はシロイヌナズナやタバコなどのモデル植物のみであり、また生物種によってもそれぞれのシステムによる転写活性化の効果が異なることが示唆されている。そこで本研究では、トマトにおける高効率ゲノム編集・エピゲノム編集ベクターの構築、DNA修復過程におけるエピゲノム動態および遺伝子発現調節機構の解明、および有用形質トマトの分子育種の確立を研究目的とした。本年度は、不活性型dCas9を用いた遺伝子転写活性化システムの確立を行うことを目的とし、転写活性化因子VP64およびVP128との融合タンパク質dCas9-VP64/VP128発現ベクターを作製した。タバコPDSまたはトマトANT1をマーカー遺伝子として選択し、それぞれの標的箇所に対しgRNAを複数箇所設計した。設計したgRNAをdCas9-VP64/VP128に挿入し、ベンサミアナタバコおよびマイクロトムにおける標的遺伝子の転写活性化システム評価を行った。その結果、タバコにおいてはdCas9-VP128によって、dCas9コントロールやdCas9-VP64と比較して標的遺伝子の発現が約2倍に上昇することを示した。また、トマトにおいてはdCas9-VP64によって、コントロール植物と比較してSlANT1遺伝子およびSlANT1遺伝子の高発現により制御されるアントシアニン生合成関連遺伝子が発現上昇することが示された。以上より、植物の遺伝子発現制御の解明研究に今後用いることのできるdCas9転写活性化ベクターの構築が達成できたと考える。本年度では、植物におけるdCas9-転写活性化の発現解析を行うために、所属研究室にて構築された高効率CRISPR/Cas9ベクターのCas9をdCas9に変換し、転写活性化因子VP64およびVP128との融合タンパク質dCas9-VP64/VP128ベクターを作製した。まず、タバコPDS(NbPDS)をマーカー遺伝子として選択し、gRNAを複数設計した。gRNAをdCas9-VP64/VP128に挿入し、ベンサミアナタバコを用いた一過的発現解析を行った。qRT-PCRによってNbPDS遺伝子の発現レベルを解析した結果、dCas9-VP128はdCas9コントロールやdCas9-VP64と比較してNbPDS発現量が約2倍に上昇した。次に、トマトにおける標的遺伝子の発現解析を行うために、トマトANT1(SlANT1)におけるgRNAの標的配列への結合評価を行った。これまでにSlANT1遺伝子においてCRISPR/Cas9による変異導入が報告されたgRNAを2箇所設計し、CRISPR/Cas9ベクターに挿入した。リーフディスク法によってトマトに導入し、カルスにおいてCel-1 assayによる変異解析を行った。その結果、設計したgRNAにおいて変異導入できることが分かった。次に、dCas9-VP64にそれぞれのgRNAを挿入し、SlANT1遺伝子およびSlANT1の高発現により制御されるアントシアニン生合成関連遺伝子の発現量を解析した結果、それぞれ数倍程度の発現上昇が検出された。以上より、植物の遺伝子発現を制御することのできるdCas9転写活性化ベクター基盤を構築できたと言えるが、SlANT1遺伝子の発現レベルについてはアントシアニンの高蓄積をもたらすには至らず、さらに強い高発現を誘導する様なシステム構築が必要であると考えられた。以上より、本研究の進捗はやや遅れていると判断した。前年度で得られた形質転換カルスを形態観察したところ、紫色を呈するカルスは得られなかった。この結果は、SlANT1の発現レベルが数倍程度の増加では代謝産物であるアントシアニン蓄積量に変化が見られないことが考えられた。そこで本年度は、構築した転写活性化ベクターの活性をさらに向上させるため、Multiplex-dCas9-VP128(複数のgRNA発現ベクター)や、dCas9-SunTag-VP128(1つのdCas9に対し複数の転写活性化因子をリクルートする発現ベクター)を作製した。また、gRNA発現に用いるプロモーターを複数検討し、蛍光観察によって高発現細胞を選抜するシステムの構築を進め、ベクターの改良を行う。SlANT1プロモーター領域の活性化をモデル実験とし、複数の標的gRNAをさらに設計し、Cas9を用いた変異導入効率解析により、転写活性化ベクターの標的として最適なgRNAの選抜を行う。選抜したgRNAを挿入した転写活性化ベクターを導入したカルスにおいて、SlANT1および関連遺伝子の発現上昇をqRT-PCRにより解析する。dCas9の標的として最適なgRNAが明らかになれば、続いて、エピゲノム編集ベクターの構築を進める予定である。次に、構築した転写活性化ベクターを用いて、CLVなどの植物の茎頂分裂組織形成と維持に関与する複数の候補遺伝子のプロモーター領域を標的とするgRNAを複数箇所設計してCas9ベクターに挿入し、トマトに形質転換する。変異導入効率を解析することで最適なgRNAを選抜し、これらを用いた転写活性化ベクターおよびエピゲノム編集ベクターを構築する。ベクターを導入したカルスにおいて遺伝子発現レベルを解析し、遺伝子発現調節に関与するcis因子およびエピゲノム制御に関わるプロモーター領域の同定や、エピゲノム制御の有無、切断活性と発現制御の相関を明らかにする。

これは、Cas9ヌクレアーゼの切断活性を不活化させた不活性型dCas9に転写活性化ドメインを組み合わせ、遺伝子の転写活性化を可能とするシステムであるが、植物における報告例はシロイヌナズナやタバコなどのモデル植物のみであり、また生物種によってもそれぞれのシステムによる転写活性化の効果が異なることが示唆されている。そこで本研究では、トマトにおける高効率ゲノム編集・エピゲノム編集ベクターの構築、DNA修復過程におけるエピゲノム動態および遺伝子発現調節機構の解明、および有用形質トマトの分子育種の確立を研究目的とした。本年度は、不活性型dCas9を用いた遺伝子転写活性化システムの確立を行うことを目的とし、転写活性化因子VP64およびVP128との融合タンパク質dCas9-VP64/VP128発現ベクターを作製した。タバコPDSまたはトマトANT1をマーカー遺伝子として選択し、それぞれの標的箇所に対しgRNAを複数箇所設計した。設計したgRNAをdCas9-VP64/VP128に挿入し、ベンサミアナタバコおよびマイクロトムにおける標的遺伝子の転写活性化システム評価を行った。その結果、タバコにおいてはdCas9-VP128によって、dCas9コントロールやdCas9-VP64と比較して標的遺伝子の発現が約2倍に上昇することを示した。また、トマトにおいてはdCas9-VP64によって、コントロール植物と比較してSlANT1遺伝子およびSlANT1遺伝子の高発現により制御されるアントシアニン生合成関連遺伝子が発現上昇することが示された。以上より、植物の遺伝子発現制御の解明研究に今後用いることのできるdCas9転写活性化ベクターの構築が達成できたと考える。本年度では、植物におけるdCas9-転写活性化の発現解析を行うために、所属研究室にて構築された高効率CRISPR/Cas9ベクターのCas9をdCas9に変換し、転写活性化因子VP64およびVP128との融合タンパク質dCas9-VP64/VP128ベクターを作製した。まず、タバコPDS(NbPDS)をマーカー遺伝子として選択し、gRNAを複数設計した。gRNAをdCas9-VP64/VP128に挿入し、ベンサミアナタバコを用いた一過的発現解析を行った。qRT-PCRによってNbPDS遺伝子の発現レベルを解析した結果、dCas9-VP128はdCas9コントロールやdCas9-VP64と比較してNbPDS発現量が約2倍に上昇した。次に、トマトにおける標的遺伝子の発現解析を行うために、トマトANT1(SlANT1)におけるgRNAの標的配列への結合評価を行った。これまでにSlANT1遺伝子においてCRISPR/Cas9による変異導入が報告されたgRNAを2箇所設計し、CRISPR/Cas9ベクターに挿入した。リーフディスク法によってトマトに導入し、カルスにおいてCel-
Bリンパ球の終末分化機構と、その原発性免疫不全症における異常について

Pax-5(BSAP)遺伝子はproB cellからmature Bまで発現し、終末分化を遂げた形質細胞では、その発現が停止する。我々はこれまで、BSAPがB細胞の細胞増殖を制御し、抗体遺伝子の3'エンハンサーに結合しその活性を抑制することを世界に先駆けて報告してきた。本年度は、これまでのin vitroの結果をin vivoで確認するための幾つかの基礎実験と発生工学的研究に結びつける為の準備を行った。(1)抗体遺伝子軽鎖のkappa promotorと重鎖のエンハンサー、マウスBSAPのcDNAを、用いて発現コンストラクトを作成した。(2)上記発現コンストラクトを形質細胞にトランスフェクトすることにより、形質細胞特異的遺伝子である、B-limp1遺伝子の発現が抑制されることを見いだした。(3)様々なoncogeneの発現が認められているような、形質細胞株あるいは、B細胞株でBSAPを強発現することにより、増殖反応の増加があることを確認した。(4)実際の抗体遺伝子の3'エンハンサー近傍には、様々な、プラスあるいはマイナスのシスエレメントが存在し、かつトランスのファクターの結合部位が存在する可能性があるため、BSAPの抗体産生の制御における役割は、vitroのリポーターを用いた系より、複雑である。これまで二種類の形質細胞株と、BSAPのDNA結合に充分な部位を発現させた実験系では、統計的に有意な抗体産生の抑制は認めなかった。(5)BSAPの発現を蛋白レベルで同定するため、ゲルシフトに加えウエスタンの系を確立した。(6)BSAPの発現停止が終末分化で起こることの意義をさぐるためBSAPのトランスジェニックマウスを制作中である。
マイクロ材料試験とマルチスケール破壊進展解析を融合した岩石材料試験イノベーション

本研究は、岩石破壊力学分野における新展開を目的とした基礎的研究である.本研究では,岩石の巨視的変形破壊特性および岩石を構成する鉱物粒子の微視的変形破壊特性を調査して,それらの結果と数値解析法を用いて,岩石の破壊メカニズムを検討した.具体的には,マイクロ材料試験により鉱物粒子単体,の微視的特性を評価して,その結果を考慮できる破壊進展シミュレーションを新たに開発して,その応答を検討した.最後に,微視的な物性と構造に伴う破壊挙動から巨視的な岩石の巨視的な破壊強度特性を導き,マルチスケールモデリングにおける今後の課題を明らかにした.初年度は,花崗岩を対象に微視構造の異方性と封圧に着目した岩石試験機を用いた三軸圧縮試験を実施するとともに,すでに得られているSCB試験結果をシミュレートする破壊進展解析を行った.三軸圧縮試験では,あらかじめ弾性波測定を実施して,花崗岩ブロックの異方性を確認して,微視構造の異方性によって得られる強度特性に変化が現れることを確認している.破壊進展シミュレーションでは,2つの作業において計画通りに遂行することができた.1つは,複数の鉱物粒子からなる花崗岩に対して,鉱物粒子の物性値や粒子境界の強度特性によって,岩石内部に生じるき裂進展経路が変化し,岩石の強度特性が大きく変化することを確認した.また,その結果は実験で観察されたき裂進展経路を再現できる可能性を示唆するものであり,マイクロ材料試験結果を反映できる環境を整備することができた.2つ目は,解析メッシュ作成において恣意的な判断が介する部分を低減するために,画像解析処理ソフトを利用して,直接,X線CT画像から解析メッシュを作成するツールの基本的な機能を構築し,その解析ツールを作成した.さらに改良を加えることで,目的とする解析メッシュ生成ツールを構築できる計画である.本研究の3本の柱のうち,岩石の異方性と巨視的変形破壊特性の実験的調査と破壊進展解析によるメカニズムの解明については,ある程度目標とする成果が順調に得られている.今後は実験例や比較検討を多く実施することで,当初の目的を達成できる環境を計画通りに整備できている.残る1つの柱であるマイクロ材料試験については,未だ数例の実験例にとどまっており,今後さらに注力して進めていく必要がある.これには熊本大学にある装置を利用する計画であり,綿密な相談を経て,復興状況を鑑みつつ遂行する必要がある.ただし,すでに数例の実験データを得ることができているので,状況に応じて計画の順序などを調整すれば研究遂行できると考えている.以上の理由から,現在までの進捗は,おおむね順調に進展していると判断できる.平成28年度は,初年度に得られた成果を国内外のシンポジウムで発表し,手法について意見交換・情報収集を進めた.現状の進捗状況としては,概ね良好な意見を得ることができた.研究遂行では,当初の計画に基づき,初年度に実施した花崗岩の三軸圧縮試験を引き続き実施してデータ数を増やすとともに,SCB試験結果と比較検討しつつ解析事例を増やし,不備な点の改善に努めた.三軸圧縮試験では,弾性波測定で異方性を示した花崗岩に対して,初年度とは異なる封圧を設定した試験を実施してデータ数を増やした.破壊進展シミュレーションでは,解析事例数が少なかったため,他の実験データについて数値計算を実施し,データ収集を行った.その中で,初年度に得た成果と同様の成果を得ることができ,手法の妥当性をさらに確認することができた.しかしながら,既往のSCB試験結果と比較検討を進めた結果,マイクロ材料試験結果で得られた鉱物粒子の材料定数を設定すると,シミュレートした巨視的な岩石の強度が実験値よりも大きな値を示すことが明らかになった.これについては,岩石内の鉱物配置といった微視構造を表現する解析モデルの精度が十分ではない点が考えられる.その課題を克服するために,X線CT画像から解析モデルを生成するツール開発を進め,構築することができた.最終年度は,解析モデル生成ツールに基づくSCB試験の破壊進展シミュレーションを進めることで,研究目標を達成できる計画である.本研究の3本の柱のうち,初年度に得た岩石の異方性と巨視的変形破壊特性の実験的調査結果と破壊進展シミュレーションによるメカニズム解明は,当初の計画に基づき,データ取集を実施することができた.その結果,研究目的の達成に向けて,手法が有用であることを確認することができた.一方で,マイクロ材料試験の結果を反映させると,実験結果よりも大きな巨視的破壊強度が得られるという新たな問題を確認した.この問題に対応するために,解析モデル生成ツールを構築して,次の研究計画を遂行する準備を進めることができた.ただし,この問題解決のためにマルチスケール解析法の枠組み構築や実装が計画よりも遅れているため,最終年度に実施する予定である.以上の理由から,現在までの進捗状況としては,やや計画と異なる課題が新たに生じているが,おおむね順調に進展していると判断できる.最終年度である平成29年度は,当初の研究計画通りに,これまでに実施した研究成果に加えて,破壊進展シミュレーションの解析事例を増やすとともに,検証のための追加実験を実施してSCB試験などの実験結果との比較を行った.その結果,手法の妥当性を高めることに成功するとともに今後の課題を見出すことができた.特に,複雑な岩石の微視的な幾何構造を取得する解析モデル生成ツールの構築をはじめとしたシステムを構築して実装した結果,実験結果における解析モデルの幾何形状に依存する影響を確認し,より有用な検証を実施することができた.

これらの成果を国際シンポジウム等で発表した.シンポジウムで得た意見に基づいて改良を加えた成果を国内シンポジウムへ順次発表する予定である.しかしながら,これまでに確認しているマイクロ材料試験結果で得られた鉱物の材料物性値を用いると,シミュレートした巨視的な岩石の強度が実験値よりも過大となる要因については解析モデルの精度を上げても克服には至っておらず,その結果として,実験の前提状況の見直しの必要性が明らかとなった.これは岩石の強度発現メカニズムの解明を目指している本研究の成果としては前進であると言える.今後は,明らかとなった課題の克服を目指して,本研究で構築したシステムを利活用しつつ改良を続けることで,本研究の大きな目標である岩石の強度発現メカニズムの解明と新しい岩石材料試験の開発に目指す.本研究は、岩石破壊力学分野における新展開を目的とした基礎的研究である.本研究では,岩石の巨視的変形破壊特性および岩石を構成する鉱物粒子の微視的変形破壊特性を調査して,それらの結果と数値解析法を用いて,岩石の破壊メカニズムを検討した.具体的には,マイクロ材料試験により鉱物粒子単体,の微視的特性を評価して,その結果を考慮できる破壊進展シミュレーションを新たに開発して,その応答を検討した.最後に,微視的な物性と構造に伴う破壊挙動から巨視的な岩石の巨視的な破壊強度特性を導き,マルチスケールモデリングにおける今後の課題を明らかにした.今後は,不足している実験データをさらに蓄積するとともに,新たに開発した解析メッシュ生成ツールを用いて,岩石の微視構造をより詳細に反映した数値実験を実施する予定である.その結果,実験結果と異なるなどの不具合が判明した場合には,それらを改善してさらに信頼性の高い成果を得ることで,岩石の破壊メカニズムを解明していく予定である.また,微視構造から岩石の巨視的な変形破壊特性を明らかにするために,マルチスケール解析法なども整備して,岩石の新しい材料試験方法の枠組みを構築したいと考えている.今後は,新たに構築した解析モデル生成ツールを用いた破壊進展シミュレーションを実施して,改良した手法でのデータ蓄積を進めるとともに,マイクロ材料試験で得た物性値を用いつつSCB試験の再現を試みて,岩石の破壊メカニズムを試行錯誤によって解明していく予定である.最終的には,整備した破壊進展シミュレーションを導入して,微視構造を反映したマルチスケール解析手法も整備を進め,得られた成果をまとめたいと考えている.計算力学,岩盤工学購入予定物品費用(破壊進展解析用ワークステーションおよび解析ソフトウェア)の価格変更と,年度途中から人員配置に変更が生じたことで謝金利用を変更する必要があり,当初計画の前後を入れ替えて研究環境の整備を進めた.そのため,物品や実験消耗品購入の物品費のみの使用となった.不足した旅費については別予算から捻出して対応した.次年度使用額は,研究環境整備と研究遂行に必要な物品購入における残金である.物品費用(破壊進展解析および画像解析用ワークステーションおよび解析ソフトウェアおよびライセンス料)の価格変更と,計画時点からの人員配置変更により謝金利用を変更した.旅費については,登録した国際会議開催が次年度のため,当初計画を入れ替えた.そのため,登録料および旅費は次年度使用額に計上する.次年度使用額は,それらの変更に伴う残金である.次年度使用額は次年度予算と合わせて,実験実施や研究成果発表に必要な旅費や投稿料,実験実施に必要な消耗品購入に当てる計画である.
ニューラルネットワークを利用した非線形構造解析プログラムの開発

本研究では非線形履歴挙動の認識に対して構築された階層型ニューラルネットワークの入力層に与える情報の一般化を図り汎用性の高い非線形履歴挙動認識プログラムの開発を行った.具体的には階層型のネットワーク構造の決定,情報として与える入力層ユニットの選定,教師データの作成プログラムの検討を行った.開発した非線形履歴挙動認識プログラムを用いて複数の非線形性が顕著な数学モデルを選定し,解析的に得られた教師データに基づく履歴挙動の認識テストを行った.大地震時の橋梁の挙動を想定して,顕著な非線形挙動を示す免震支承の模型を用いて静的および動的な正弦波載荷実験およびランダム波載荷実験を行った.試験より得られた非線形の荷重-変位関係等のデータを教師データおよび検証用のデータとして活用した,この実験の実施にたって本研究で導入した20kNハイブリッドアクチュエータを使用した.また,それらの結果に基づき教師データ数,正規化の幅,接線剛性評価法の改善により,学習の高度化を図った.本研究で得られた成果は一般的な非線形挙動の履歴認識に適用可能な階層型ニューラルネットワークを構築しネットワークの学習に関して,誤差の収束状況に関してデータ数の多いケースが良好な学習効果が得られるわけではなく.適度な教師データ数により,精度のよい学習が行われることが明らかにしたこと.正規化幅の改善に関しては,正規化幅を調整することにより学習精度が向上することが明らかにしたこと.学習における接線剛性評価に関しては,速度の正負が変化する折れ点において,剛性が急変する場合があるため教師データ作成時に検討が必要なことを明らかにした,また,実験結果の模擬に関しては速度の正負が変化する折れ点において荷重変動が少ない荷重出力については良好な学習が行われたが,速度の正負が変化する折れ点において剛性変動が大きい剛性出力型については推定が良好に行われなかった.本研究では非線形履歴挙動の認識に対して構築された階層型ニューラルネットワークの入力層に与える情報の一般化を図り汎用性の高い非線形履歴挙動認識プログラムの開発を行った.具体的には階層型のネットワーク構造の決定,情報として与える入力層ユニットの選定,教師データの作成プログラムの検討を行った.開発した非線形履歴挙動認識プログラムを用いて複数の非線形性が顕著な数学モデルを選定し,解析的に得られた教師データに基づく履歴挙動の認識テストを行った.大地震時の橋梁の挙動を想定して,顕著な非線形挙動を示す免震支承の模型を用いて静的および動的な正弦波載荷実験およびランダム波載荷実験を行った.試験より得られた非線形の荷重-変位関係等のデータを教師データおよび検証用のデータとして活用した,この実験の実施にたって本研究で導入した20kNハイブリッドアクチュエータを使用した.また,それらの結果に基づき教師データ数,正規化の幅,接線剛性評価法の改善により,学習の高度化を図った.本研究で得られた成果は一般的な非線形挙動の履歴認識に適用可能な階層型ニューラルネットワークを構築しネットワークの学習に関して,誤差の収束状況に関してデータ数の多いケースが良好な学習効果が得られるわけではなく.適度な教師データ数により,精度のよい学習が行われることが明らかにしたこと.正規化幅の改善に関しては,正規化幅を調整することにより学習精度が向上することが明らかにしたこと.学習における接線剛性評価に関しては,速度の正負が変化する折れ点において,剛性が急変する場合があるため教師データ作成時に検討が必要なことを明らかにした,また,実験結果の模擬に関しては速度の正負が変化する折れ点において荷重変動が少ない荷重出力については良好な学習が行われたが,速度の正負が変化する折れ点において剛性変動が大きい剛性出力型については推定が良好に行われなかった.本年度の研究実績(1)既往研究において非線形履歴挙動の認識に対して構築されたニューラルネットワークを整理して,特に入力層に与える情報の一般化を図った。また,ニューラルネットワークの学習アルゴリズムに関する最新の文献等の調査研究を実施した。これらの結果に基づき非線形履歴挙動認識プログラムの開発を行った。具体的には階層型のネットワーク構造の決定,情報として与える入力層ユニットの選定,教師データの作成プログラムの検討を行った.(2)開発した非線形履歴挙動認識プログラムの適用性を検証した。具体的には,複数の非線形性が顕著な数学モデルを選定し,解析的に得られた教師データに基づく履歴挙動の認識テストを行った。これらの結果に基づきプログラムの適用性を解析的に検証した。(3)開発した非線形履歴挙動認識プログラムの実現象に対する適用性を検証した。このため,ネットワークの学習に際して必要となる教師データを取得するための試験計画を立案して予備実験を実施した。具体的には大地震時の橋梁の挙動を想定して,顕著な非線形挙動を示す免震支承の模型を用いて静的および動的な正弦波載荷実験およびランダム波載荷実験を行った。試験より得られた非線形の荷重-変位関係等のデータを教師データおよび検証用のデータとして利用する。この実験の実施にあたって今年度の予算で導入した20kNハイブリッドアクチュエータを使用した.平成13年度に行った研究のうちネットワークの構築および評価を松田,大塚,山本が分担して行い,正弦波載荷実験計画の立案・実施およびランダム波載荷実験計画の立案・実施を松田,矢葺が分担して行った。本年度の研究実績(1)平成13年度に引き続き開発中の非線形履歴挙動認識プログラムの実現象に対する適用性を検証した。このため,ネットワークの学習に際して必要となる教師データを取得するための実験を実施した。

静的および動的な正弦波載荷実験およびランダム波載荷実験等の基礎実験を行った。試験より得られた非線形の荷重一変位関係等のデータを教師データおよび検証用のデータとして利用した(2)ニューラルネットワークの学習方法の改良を行った.具体的には,教師データ数,正規化幅,接線剛性評価法について検討を行った.(3)平成15年度に実施する実験の計画立案を行った.平成14年度に行った研究のうちネットワークの評価を松田,大塚,山本で分担して行い,実験計画の立案・実施を松田,矢葺が分担して行った。(1)平成14年度に引き続き開発中の非線形履歴挙動認識プログラムの実現象に対する適用性を検証した。このため,ネットワークの学習に際して必要となる教師データを取得するための実験を実施した。試験より得られた非線形の荷重-変位関係等のデータを教師データおよび検証用のデータとして利用した(2)ニューラルレネットワークの学習方法の改良を行った.具体的には,教師データ数,正規化幅,接線剛性評価法について検討を行った.(3)3カ年の研究成果のとりまとめを行った.平成15年度に行った研究のうちネットワークの評価を松田,大塚,山本で分担して行い,実験計画の立案・実施を松田,矢葺が分担して行った.研究成果のとりまとめは松田,大塚で分担して行った.