hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
アルギニンメチル化酵素による癌抑制因子ＲＡＳＳＦ１Ａの機能制御

RASSF1AおよびPRMT5を安定発現させたHEK293細胞を作製し、微小管形成阻害・安定化の各種薬剤を用いて、中心体周期、微小管形成(星状体形成)などの微小管動態とRASSF1Aの細胞内局在変化との関連を解析した。抗γチューブリン抗体、抗βチューブリン抗体を用いた免疫組織化学的解析により、RASSF1Aは微小管と共局在する事が示された。特に、細胞分裂期における紡錘糸形成との共局在が顕著に認められ微小管の安定性に関与するという従来の報告と一致する結果が得られた。以上より、微小管動態変化とRASSF1Aの細胞内局在変化との関連は、Hippo-Salvador-Warts情報伝達の新たな活性制御機構である可能性が示唆された。平成23年8月にはPRMT5が抗Flag抗体に特異的に結合する抗原認識部位を有している可能性が示され、PRMT5とRASSF1Aとの相互作用が想定より一過性かつ弱い結合である可能性が示唆された。したがってRASSF1AとPRMT5との相互作用は免疫学的手法のみの解析では困難であると判断し、当初の実験計画を修正した。これらの検討および解析におよそ6ヶ月を要したため、研究計画はやや遅れている。今後の研究の推進方策としては、前年度に見出した新たな知見に基づき研究計画を加速させる予定である。我々はRASSF1AがPRMT5と複合体を形成する事を明らかとしたが、RASSF1AがPRMT5により直接メチル化されているかどうか詳細に解析中である。また、当初の予定通り、1 shRNA発現レンチウィルスを用いて、RASSF1AあるいはPRMT5遺伝子のノックダウン細胞を作製し、PRMT5の細胞内局在変化、細胞増殖、アポトーシス誘導などの細胞生理機能との関連を解析する。2電子顕微鏡を用いて細胞内局在の詳細を観察する。3ドメイン構造に基づき、RASSF1AならびにPRMT5の各種変異体を作製し、結合ドメインを決定する。4 RASSF1Aノックダウン細胞をヌードマウスに移植し、腫瘍形成能および転移能を個体レベルで解析する。本研究ではRASSF1A-PRMT5複合体形成の分子メカニズムならびに、中心体・微小管ネットワーク制御における意義を明らかとする事を第一の目的としている。これらの検討および解析におよそ6ヶ月を要したため、年度内に当初の研究計画を完了することが困難となった。今後の研究の推進方策としては、平成23年度に予定していた実験計画も含めて以下のように計画している。(1)新たにHAのみのタグを有したHA-PRMT5を作製し免疫沈降法にてRASSF1Aとの相互作用を解析する。(2)GST-PRMT5融合蛋白の発現構築を作製し、RASSF1Aとの物理的相互作用の解析を行う。(3)shRNA発現レンチウィルスを用いて、RASSF1Aノックダウン細胞を作製し、PRMT5の細胞内局在変化との関連を解析する。
居住者参加型の公営住宅更新計画に関する研究

公営住宅の建替事業では、従前居住者が存在し、長期居住者とりわけ高齢者には、新たな環境への移行において、様々なストレスが生じる。そのような問題に対し、生活の継承に有効な手法として居住者参加型の計画が考えられるが、本研究では、建替手法が建替後の生活に及ぼす影響を明らかにすることで計画手法の評価を行うことを目的とする。住戸近傍は、居住者の生活が表れやすい空間であり、また、近隣コミュニティに深く関わる空間であるため、本年度は特に、住戸近隣近傍空間の使われ方に着目して分析を行った。調査対象としては、近年行われた参加型計画での建替事例として、又住戸近傍空間の特徴的な事例として、高知県営若草南団地を選定し、従前及び現在の生活に関するヒヤリング調査を行った。考察の結果、参加型計画の有効性として、計画プロセスにおけるコミュニティの活性化が建替後のコミュニティの継承・向上に結びつくという状況が見られた。しかしながら、空間に触発された状況も数多くあり、非参加の計画であってもある程度のコミュニティの継承は可能と考えられる。但し、非接地南入りのタイプにおいて、新たな行為の発生、コミュニティの継承・向上が見られたように、空間からの誘発力、居住者の働きかけ、参加型計画の効果が重なることで、それらの相互作用により効果は増殖する可能性が指摘できる。さらには、従前の生活を深く読み込んだ計画の提案は、計画への直接的な参加、非参加の如何を問わず、環境移行においては重要であると言え、参加型の計画は、そのような読み込みにより、従前の生活を新環境に活かすことができるという点で、有効な手法となることが明らかになった。公営住宅建替における居住者参加型という設計手法が、建替後の居住者の生活にどのような影響を及ぼすのか。とりわけ、近年、阪神・淡路大震災後の高齢者の仮設住宅居住、その後の公営住宅への転居等における様々な問題点の指摘に見られるように、高齢期における住環境の激変への対応が課題となっている。そこで、本年度は、建替公営住宅に多く居住している高齢者の生活に着目し、建替事業におけるスムーズな環境移行と活性化という視点から、参加型計画手法の有効性について考察を行った。熊本市営花園団地の建替前から居住している高齢者に対して、住戸内、住戸近傍の住まい方、集団生活の様子等に関するヒヤリング調査を実施した。まず、個人的生活では、従前の接地型住戸の生活が継承されている点としては、・窓の開放性、・ダイニングからの出入り、・住戸内外における趣味的空間の維持、・玄関前空間の隣戸との共有性、・2、3階住戸のアクセスの多様性が挙げられる。新たな生活への展開としては、・ユカ座からイス座への移行、・床面積の増加に伴う接客空間の分離、・バリアフリー化による安心感の生成が見られる。一方、課題としては、・使われない部屋の存在、・手すりの位置等の個別的状況へのバリアフリーの未対応、・2、3階居住者の庭空間の使い難さというような参加型手法の効果が得られていない面が指摘される。共同生活においては、計画過程に積極的に関与した居住者は人間関係の継承もスムーズに行われているが、全体としてみた場合、従前の人間関係は部分的にしか継承されていない。加えて、新規居住者との関係の構築が難しい状況が見られ、団地内における近隣関係の衰退、また、それに起因して共同生活のマナーの問題等、維持管理面におけるトラブルが生じている。一方で、建替を期に管理組合が組織され、建替後の共同生活を従前とは全く異なる方法でコントロールしようとしている側面が見られた。
時系列解析統合ソフトウェアの研究

昨年度までの研究では、極めて一般的な時系列モデルに適用可能な非線形・非ガウス型状態空間モデルに対する逐次形フィルター、平滑化アルゴリズムの導出や、それらの公式を実現するための数値計算法、モデル近似法に関する研究を行ない、関連する計算プログラムの開発を行なった。これに引続き本年度の研究では、試作したソフトウェアをさまざまな実データに適用し問題点の検討にもとづいて改良を行なうと共に新しいモデルの追加、計算法の関発なども行なった。この結果、状態空間モデルを用いることにより、非線形性、非定常性、非ガウス性、異常値、欠測値などをともなうさまざまな時系列を解析するための統一的方法が確立された。またグラフ表現によって解析結果を表示するための方法を検討し、そのためのプログラムを新たに開発した。とくに、CALCOMP系のグラフィックライブラリーを利用することにより大型計算機からパソコンまで利用可能であることがわかった。以上のように本研究の成果により、さまざまな性質を持つ時系列を統一的に取り扱うための統計モデルが確立し、しかも大型計算機からパソコンまでカバーできるソフトが開発できることがわかった。したがって、本研究が目的とした統合化はいろいろな意味で一応達成できたと考えられる。ただし、利用者にとって使いやすい実用的なソフトとして完成させるためにはさらに今後の研究が必要である。本研究の過程で得られた研究論文等は研究成果報告書に収録した。また、試作したソフトウェアの関連資料は別冊に収録した。時系列解析のための汎用システムを作るために、さまざまな時系列モデルを統一的に取り扱うことができる状態空間表現を利用することにした。線形・ガウス型の状態空間モデルに対しては既存のカルマンフィルタおよび固定区間平滑化アルゴリズムが確立されているが、非線形・非ガウス型のモデルについては未解決な問題が残されていた。そこでまず、平滑化公式の理論的検討を行なった結果、研究代表者により提案されていた非ガウス型システムに対する公式は、非線形および離散システムを含むより一般のシステムに対しても適用可能であり、かつ従来の公式よりも、数値的に優れた公式が導けることが判明した。さらに、従来の状態空間表現よりも柔軟なモデル構成の可能性が見出され、現在、理論的な問題を検討中である。この状態空間表現にもとづく時系列解析ソフトウエアを作成するために、基本的なモデルに対してはすべてテストプログラム作成し、実用性の検討、改良の可能性の検討などを行なった。現在までに作成したおもなプログラムは、非定常時系列の長期予測、欠測値の補間、トレンド推定、季節調整、時変スペクトルの推定、信号抽出(以上、線形ガウス型モデルによる)、トレンドのジャンプの検出、ピリオドグラムの平滑化、非ガウス型季節調整、離散系列の平滑化、非線形モデルの推定および状態推定(以上、一般型モデルによる)などである。これらのテストプログラムは、経済学、地球科学、宇宙科学、振動工学、などに関連したデータの解析に有効であることが確認されており、今後の主な課題はこれらのプログラムを統合するシステムを構成することである。昨年度までの研究で、極めて一般的な条件のもとでも状態空間モデルに対する逐次型のフィルタおよび平滑化のアルゴリズムが導出できることがわかった。昨年度はこの結果にもとづき、時系列解析のための汎用的ソフトウェアを開発するために、数値積分などの数値的方法によってこのアルゴリズムを実現する基本的なプログラムの作成を行った。本年度の研究では、種々の問題への適用のために必要なプログラムを作成し実用上の問題点の検討を行ない、アルゴリズムやプログラムの改良を行なった。さらに、数値計算法では実行できない高次元の問題への適用を可能とするため、ガウス和形の平滑化アルゴリズムを開発した。この方法により、非ガウス型の季節調整、時系列中の欠測値や異常値の自動処理が可能となった。また、ワークステーションのグラフィック機能を利用したデータ表示、解析の会話処理の方法の検討を行なった。現在までの研究により作成したプログラムは次の様なものである:

非定常時系列の長期予測、欠測値の補間、異常値の処理、トレンド推定、季節調整、事変スペクトルの推定、地震到着時刻の推定、地下水位変動の検出、信号抽出(以上線形ガウス型モデル)、トレンドのジャンプの検出、ピリオドグラムの自動平滑化、非ガウス型季節調整、離散系列の平滑化、非線形平滑化(以上、非ガウス型モデル)など。来年度の研究では、これまでに開発した個別プログラムを有機的に統合して、時系列解析のための汎用ソフトウェアを作成することを目標とする。昨年度までの研究では、極めて一般的な時系列モデルに適用可能な非線形・非ガウス型状態空間モデルに対する逐次形フィルター、平滑化アルゴリズムの導出や、それらの公式を実現するための数値計算法、モデル近似法に関する研究を行ない、関連する計算プログラムの開発を行なった。これに引続き本年度の研究では、試作したソフトウェアをさまざまな実データに適用し問題点の検討にもとづいて改良を行なうと共に新しいモデルの追加、計算法の開発なども行なった。この結果、状態空間モデルを用いることにより、非線形性、非定常性、非ガウス性、異常値、欠測値などをともなうさまざまな時系列を解析するための統一的方法が確立された。またグラフ表現によって解析結果を表示するための方法を検討し、そのためのプログラムを新たに開発した。とくに、CALCOMP系のグラフィックライブラリーを利用することにより大型計算機からパソコンまで利用可能であることがわかった。以上のように本研究の成果により、さまざまな性質を持つ時系列を統一的に取り扱うための統計モデルが確立し、しかも大型計算機からパソコンまでカバーできるソフトが開発できることがわかった。したがって、本研究が目的とした統合化はいろいろな意味で一応達成できたと考えられる。ただし、利用者にとって使いやすい実用的なソフトとして完成させるためにはさらに今後の研究が必要である。本研究の過程で得られた研究論文等は研究成果報告書に収録した。また、試作したソフトウェアの関連資料は別冊に収録した。
クォーク多体系原子核理論の研究

ハドロンがクォークからなる複合体であるという認識が確立した現在、核子の構造から原子核、高密度核物質、ハイパー核など広い意味での原子核を、クォーク描像と量子色力学にもとづいて理解すべきであり、従来から具体的記述に成功しているハドロン多体系としての原子核描像と融合させながら統一理論を作るステップとすることを研究の目的とした。そのため従来のハドロン多体系としての記述をさらに押し進め、実験との比較検討を重ねて矛盾点を明らかにすると共に、クォーク自由度の抽出を試み、両者の相互関連を明らかにして原子核の本質についてより深い理解を得るように心掛けた。また一方、ハドロン物理では説明のできないクオーク模型特有の現象を探求し、その特性について研究を進めることとした。本年度はこの目的のため下記の8つの個別課題を選定し、それぞれの専門家と関心のある研究者をもって研究会・ワークショップを適宜開催し、かつ連絡をとりながら研究を進めた。成果の一部は学術雑誌に論文として発表され、また一部は国際会議で口頭発表された。1.ハドロンの構造2.核力とクォーク・グルオンの自由度3.核構造とクォークの自由度4.ストレンジネスをもつハイパー核およびH粒子の構造5.ハドロンおよびクォーク物質の状態方程式と相転位6.クォーク・グルオンプラズマの生成とそのハドロニゼーション7.高エネルギー核衝突による中間子・ハイパー核・H粒子・反原子核生成確率の計算8.高エネルギー核反応を記述するための計算機プクグラム・コード開発3年間を通しての研究成果は報告書の形にまとめられた。
金属プロテア-ゼの構造と機能

クサリヘビRussell's viper毒より、血液凝固X因子及びIX因子を特異的に限定分解し活性型に変換する酵素のRVVーXを精製し、その全アミノ酸配列を決定した。RVVーXは二本鎖より成り、重鎖(59kDa)と軽鎖(LC1=18kDa/LC2=21kDa)がSーS結合していた。LC1は123残基のアミノ酸から成り、24位のアスパラキンには糖鎖を含んでいる。NBRFデ-タベ-スを用い相同性検索を行なった結果、意外なことに、LC1は肝臓のアシアロ糖蛋白受容体やセレクチンのいわゆるC型レクチンと相同性のあることが見い出された。LC1は半シスチンを7残基持つが、SーS結合が既に決定されているフジツボレクチンとの相同性よりCys4ーCys15、Cys32ーCys121、Cys98ーCys113の3組がSーS結合し、また、LC1に特異的なCys77は重鎖とのSーS結合に関与すると推定した。一方、重鎖はハブ毒の高分量出血因子HR1B(415残基)と酷似していた。すなわち、重鎖はN末端半分の領域に金属プロテア-ゼドメインを含み、亜鉛を配位するリガンドのHis145、His149及び活性残基の一部と考えられているGlu146も保存されていた。一方、C末側には強力な血小板凝集阻止因子であるdisintegrin様の構造ドメインを含んだ。したがって、RVVーXは、軽鎖にC型レクチン様ドメインを、重鎖に金属プロテア-ゼとdisintegrin様ドメインを含む新しいプロテア-ゼであることが明らかとなった。今後は蛇毒の金属プロテア-ゼの高次構造(目下、阪大タンパク研との共同研究でこの種のプロテア-ゼの結晶回析を進めている)をもとに、Zn^<2+>の配位した触媒基の同定及び反応機構、特異性に関連した構造要素などを明らかにしたい。
介護サービス部門における「疑似市場」の実証研究

介護サービス部門における「疑似市場」の実証研究を、介護保険の実施主体である市町村レベルでの取り組みを対象として行った。具体的には、広島市福祉サービス公社および京都福祉サービス協会によるホームヘルプ派遣事業、京都府向日市および滋賀県草津市における在宅介護支援センターのサービス調整機能、京都府丹後6町の在宅および施設サービスについて研究した。以上の研究から得られた新たな知見は、以下の点である。1.2000年の介護保険の施行以降、基礎的自治体である市町村が従来から行ってきた在宅部門における高齢者への介護サービス供給は、全国的に縮小・廃止の傾向にある。また市町村からの委託を受けほぼ独占的に在宅介護サービスを提供してきた、自治体出資のサービス公社や社会福祉協議会などの公的セクターの経営困難が見られる。しかし個別的には、京都福祉サービス協会のように経営改善により介護市場への適応に努めた経営体は事業を拡大している。2.介護保険は、わが国に新たに介護サービスの「疑似市場」を作り出した。その結果、介護保険が給付するサービスは、サービス提供事業者とサービス需要者との契約関係により処理されることになったが、他方で従来からの市町村が担う保健・福祉サービスとの調整が、とくに介護保険の非利用者について必要となった。この調整は、市町村と民間サービス事業者との情報交換・業務分担・相互理解を通じて進められるべきであるが、この課題はいまだ試行錯誤の過程にある。今後わが国における介護サービス部門の「疑似市場」は、さらに拡大すると考えられるが、その動向を自治体福祉政策との関連で研究する予定である。2000年4月より実施された介護保険制度は、在宅高齢者福祉サーピスの供給主体再編をもたらした。従来の措置制度の下で、市町村ないしそこから委託を受けた社会福祉協議会等の準公的機関が主たる供給主体であったが、介護保険制度の下で、営利・非営利を問わない民間企業の介護サービス市場への参入が開始されたのである。当初の混乱もようやく落ち着きを見せはじめた2002年現在の状況を、マクロ的には厚生労働省が主催した「全国介護保険担当課長会議」の資料等によって整理しつつ、ミクロ的状況について「広島市福祉サービス公社」を事例に分析した。同公社のような自治体福祉公社は、1980年代に「住民参加型福祉」のモデルとして注目を浴びたが、介護保険制度下では、総じて苦しい経営状況を余儀なくされている。同公社も例外ではなく、2000年度は約2億円の赤字を出した。介護保険導入以前からの同公社を巡る議論を、広島市議会での議員質問と市側の答弁をフォローしながら整理した。同公社に経営的自立を迫る議員と、その必要性を認め経営合理化に苦慮する理事者側の姿を明らかにした。さらに同公社および同公社労組への数度にわたる聴き取りにより、措置制度以来の同公社ホームヘルプ事業の歴史を洗い出し、生活困難ケースヘの公的機関によるホームヘルプ事業の必要性を指摘した。介護保険制度の下で、同公社のような自治体福祉公社が存続するためには、民間事業者では対応困難なケースに対しても福祉的サービスを提供する機関として市民からの認知を得る努力が必要である。また介護サービス市場は、完全な市場ではなく消費者に「自己責任」を100%求めることも不可能である。とりわけサービスの質を担保するには、保険者である市町村が直接サービス部門を持つか、あるいは公社のような準公的機関の存続も政策的選択肢としてあってよいと考える。本年度は、1)在宅介護支援センターの実証研究と、2)福祉サービス「準市場論」の理論的検討を行った。1)について。介護保険制度の開始と同時に、介護基盤整備の重点対策として「介護予防・生活支援事業」が創設された。その目的は、要介護認定で制度の対象外となる高齢者に対して、介護保険法とは別に市町村が地域の実状に応じて保健福祉サービスを提供することにより、介護保険事業では対応できないニーズ=「介護保険の隙間」を埋めることであった。その事業の実施事体として位置づけられた機関が、在宅介護支援センターである。

その業務として(1)ケアプランを作成する居宅介護支援事業を行いつつ、(2)市町村が行う要介護認定のための訪問調査の委託も受け、(3)総合相談や高齢者実態把握など介護保険外のサービスを行うことが求められた。本研究では、厚生労働省や全国在宅介護支援センター協議会の資料にもとづき在宅介護支援センターの全国レベルでの現状を整理し、それを踏まえたうえで京都府A市の在宅介護支援センターの活動について数回にわたって現地での聴き取り調査を行い、在宅介護支援センターの現状と課題を明らかにした。その要旨は、ケアマネージャーを兼務した在宅介護支援センター職員の奮闘が、支援センターの「福祉事務所化」をもたらしていること、厚生労働省が期待した「保健と福祉の連携」が、単に支援センター職員を保健職と福祉職の組み合わせで配置するだけでは十分に機能しないことなどである。2)について介護保険を制度設計するに際して、モデルの1つとなったイギリスの「コミュニティ改革」や「NHS改革」に関する実証研究の理論的枠組みである「準市場論」を理論的に整理し、わが国で進みつつある介護サービス分野における「準市場化」を分析するための批判的視点の提起を行った。本年度は、介護サービス部門における「疑似市場」の実証研究を、介護保険の実施主体である市町村レベルで進めることを課題とした。具体的には滋賀県草津市の介護保険事業、老人保健事業、介護予防・地域支え合い事業の進行状況を追跡した。草津市長寿福祉介護課(基幹型在宅介護支援センターを兼ねる)主催の地域ケア会議、在宅介護支援センター会議、高齢者保健福祉サービス調整会議、ケアマネジメント指導者研修会、ケアマネージャー連絡調整会議に参加し、介護保険の運営主体である草津市と介護保険事業者との連絡調整の具体的な動きを把握した。この過程で得られた知見を踏まえて、介護保険施行後5年目の見直しに向けて提起された社会保障審議会介護保険部会の「介護保険制度の見直しに関する意見」について検討した。この内容は、2004年10月16日に開催された社会政策学会で報告し、その後「介護保険制度の見直しと自治体福祉政策の課題」と題して『賃金と社会保障』(旬報社)1381号、2004年11月上旬に掲載した。「疑似市場」的視点から、今後市町村が取り組むべき高齢者保健福祉サービスのあり方として、第1に高齢者福祉と高齢者保健の組織と財政の一本化、担当者の課題の共有と専門職種としての力量発揮が可能な体制の構築、第2に民間事業者が提供するサービスが適切なものか判断ができる能力を行政担当者が維持するために、モニタリングの仕組み、苦情相談窓口の有効活用、第3に地域包括支援センターの民間委託がなされる場合の行政・事業者間の信頼関係の構築、を提言した。以上の課題とは相対的に区別される研究として、若年障害者への支援費支給制度の導入に伴う「疑似市場」の拡大という状況に対応して、広島市における市民レベルでの障害者プラン作成過程を追跡した。この研究は現在進行中である。
自然発生高血圧ラットの大腿骨頭壊死の画像化および大腿骨頭壊死動物実験モデルの作製

当初の研究目的である自然発生高血圧ラットの大腿骨頭壊死の画像化については、大腿骨頭の大きさが2mm直径程度と小さいことが主たる原因と思われるが、解像度の高い画像を得ることが困難であり、結局ラットの大腿骨頭の核磁気共鳴画像を得ることを断念せざるを得なかった。平成11年度末、当施設にマイクロCTと呼ばれる小組織用の高解像度CT装置が導入された為、この装置を用いて骨梁構造の3次元的解析を検討することに内容を変更したが、目的としたラット大腿骨頭については、期待したデータが得られなかった。そこで、最新の臨床用CTであるmulti-detector computedtomogaraphy (MDCT)の画像データを、マイクロCTのCT骨梁構造解析ソフトに読み込ませ、インビボにおいて3次元骨梁構造解析を行うことを考案し、そのシステムを構築した。ヒト屍体摘出腰椎を用いて、骨梁構造パラメータの再現性の検討を行った。3次元骨梁構造パラメータとして、骨体積(BV)、骨表面積(BS)、骨密度(BV/TV)、骨梁幅(Tb.Th)、骨梁間隙(Tb.Sp)、骨パターンファクター(TBPf)、Structure Model Index (SMI)、骨梁間結合点(N.Nd)を算出し、5回測定のcoefficientvariation(CV)を求めた。CV値はBV, BS, BV/TV, Tb.Th, Tb.Sp, TBPf, SMI, N.Ndの順に1.8,0.91,1.8,1.4,1.5,7.7,0.81,2.5%であった。臨床的に許容範囲の再現性と思われ、MDCTを用いたインビボ腰椎3次元骨梁構造解析は可能であることが示唆された。易脳卒中自然発生高血圧ラットの大腿骨頭壊死の画像化が本研究の第1段階である為、正常雌ラットを用いて小動物用核磁気共鳴装置におけるラット大腿骨頭の画像化の為の至適条件を検討した。ヒトでは大腿骨頭は通常スピンエコー法で、良好な画像が得られるが、ラットにおいてはスピンエコー法での大腿骨頭の描出はあまり良くなく、グレディエントエコー法による撮像の方が良く描出された。これはヒト骨髄とラット骨髄との脂肪含有率の違いがその一因ではないかと想像された。ラットの大腿骨頭の大きさは2mm程度であり、小動物用核磁気共鳴装置を用いても解像度の高い画像を得るのはやや困難であったが、至適撮像条件はTR=50,TE=5,flip angle=30,Matrix=512x512,FOV=4x4cm,slice thickness=0.5mmであった。正常雌ラットを用いた小動物用核磁気共鳴装置におけるラット大腿骨頭の画像化の至適条件をグレディエントエコー法によるTR=50,TE=5,flip angle=30,Matrix=512×512,FOV=4×4cm,slice thickness=0.5mmと決定していたが、解像度の高い画像を得るのはやや困難であった。これはラットの大腿骨頭の大きさは2mm直径程度とかなり小さいためと思われ、撮像領域であるFOVをさらに2×2cmないし1×1cmと小さくしたが、FOVを小さくするほど良好な信号ノイズ比を得ることが困難となり、かえって画像が悪化した。結局FOVを2×2cmとし、易脳卒中自然発生高血圧ラットの大腿骨頭の撮像を試みたが、ヒトで観察される典型的な大腿骨頭壊死の画像を得ることができなかった。その原因として推察されることは、ひとつはラットの大腿骨頭は小さく、現有する磁場強度2.0テスラの小動物用核磁気共鳴装置では撮像できる限界を超えている可能性が考えられる。

もうひとつはヒトとラットでは種が異なるため、骨髄の脂肪含有率の違いなどによりヒトで観察される典型的な大腿骨頭壊死の画像は得にくい可能性である。さらに核磁気共鳴装置による実験を試みるが、平成11年度末に当施設に解像度26ミクロンを有するマイクロCTと呼ばれる小組織および小動物用の高解像度CT装置が設置されることになっており、これを用いた骨の微細構造の解析により大腿骨頭壊死を捉えることを計画している。正常雌ラットを用いた小動物用核磁気共鳴装置におけるラット大腿骨頭の画像化を、引き続き検討してきたが、解像度の高い画像を得るのはやはり困難であった。これはラットの大腿骨頭の大きさは2mm直径程度とかなり小さいことが主たる原因と思われた。これと並行して、平成11年度末に当施設導入された解像度26ミクロンを有するマイクロCTと呼ばれる小組織用の高解像度CT装置を用いて、骨梁構造の3次元的解析を開始した。まず、撮像至適条件の検討を行った。管電圧は40-60KV、電流0.1mAが良好であり、管電圧50KVを採用した。スライス厚は30ミクロンとした。骨梁構造の3次元構造は、同じ骨でも局所によりかなり異なることが判明し、例えば、栄養孔領域では骨梁は粗であり、皮質に近づくほど密となった。3次元パラメーターとして、mean intercept length(MIL),structure model index(SMI),trabecular bone pattern factor(TBPf)が用いられるが、SMIはサンプルによっても、同じサンプルであっても測定部位により、大きく異なった。どのパラメーターが骨頭の評価に適しているかが、今後の検討課題であると思われた。正常雌ラットを用いた小動物用核磁気共鳴装置におけるラット大腿骨頭の画像化については、大腿骨頭の大きさは2mm直径程度である為解像度の高い画像を得ることが困難であり、断念せざるを得ない結果となった。その為、平成11年度末に当施設に導入されたマイクロCTと呼ばれる解像度26ミクロンを有する小組織用の高解像度CT装置を用いた骨梁構造の3次元的解析により正常ラットとの差異を検討することに内容を変更した。撮像至適条件は、管電圧は40-60KV程度、電流0.1mAが良好であり管電圧50KVを採用した。3次元骨梁解析パラメーターとして、tissue volume(TV),bone volume(BV),bone surface(BS),bone surface density(BS/BV),bone volume fraction(BV/TV),trabecular thickness(Tb.Th),trabecular number(Tb.N),trabecular separation(Tb.Sp),meanintercept length(MIL)を算出することとした。まず、予備実験として正常雌ラットと骨粗鬆症モデルである卵巣摘出ラットにおいて、これらのパラメーターを検討した。両者に有意差がでることを期待していたが、例えばMILは、どちらも0.5前後であり差がなかった。腰椎の解析では差があることが報告されているが、大腿骨頭では有意差を見い出せなかった。原因については大腿骨頭は、元来骨構造が緻密な部分であり、骨粗鬆症モデルでも腰椎ほどには、骨粗鬆症化が顕れないことが考えられる。現在は、解剖体から摘出したヒト腰椎の解析を検討している。
可視・近赤外およびテラヘルツスペクトルによる植物葉の温度環境ストレス状態の把握

本研究は、植物葉が生育中にさらされるストレスによって併発する変化を分光学的手法を用いて、追究することで、ストレス評価マーカーを見出すことを目的としている。本年度は、乾燥と低温乾燥によって生じる植物体のスペクトル応答差異を見出すため、チャンバー内にシリカゲルいれて乾燥条件下に置かれた植物群落と低温過程にさらされた植物群落をそれぞれ0-24時間程度継続的に可視400-1100nmと赤外4000-100cm-1のスペクトルをそれぞれ測定した。測定は、群落と個葉それぞれに対して実施した。可視データは群落を中心に測定を実施したが、スペクトル解析によって、以前シフトが見られたレッドエッジ付近のピークシフトが確認されなかった。また強度変化もほとんど起こっておらず、より低温でのストレスを与えることで応答の明確化をはかる必要がある。赤外の指紋領域(1000cmー1)付近には、複数のピークが生じることが明らかとなったが、ストレスに対して敏感に変化するピークは認められず、また低温にした場合でもその変化は顕著とはいえなかった。また、特徴的なデータとして、3200cm-1付近に現れる水由来のテラヘルツ帯に近い、1000cm-1付近のスペクトルでは、低温環境下においてわずかなスペクトル変化を生じた。このピークは、水の束縛回転振動を反映している可能性があることから、より詳細な検討によってストレス応答のマーカーとなりえると考えられる。可視域400ー1100nmから、低振動数赤外帯(4000ー100cmー1)までの低温環境下での植物葉のスペクトル挙動を連続的に調査することで、温度環境ストレスと乾燥ストレスに関するスペクトル変化の差異が表せる可能性が見いだせたことから研究は順調に進行していると判断している。昨年度の研究において、部位によるストレス応答差異の可能性がみとめられたため、次年度は、イメージングによるストレス応答の表現について近赤外イメージングを中心に検討していく必要がある。イメージングについては、2014年から実施した乾燥ストレスのみに着目した実験において、研究者らによって新開発された装置D-NIRsを用いた研究の実績を有している。本装置の農業分野への利用は、本研究に対してのみでなく、他の農業工学関連の有効性を見出す可能性を秘めていることから、大規模な展示会等で紹介することで、情報収集を行っていく。本研究は、温度環境変化を与えた植物体では、乾燥ストレス、酸化ストレス等が併発することを念頭にして、マルチスペクトルから植物葉のストレスマーカーとなる波長やストレス評価法について検討することを最終的な目的として実施している。まず温度変化を与えた植物葉の基礎的なデータ取得を目的として、常温と高温をセッティングし、乾燥状態も加えた条件とした。植物葉温をサーモグラフィにて取得し、土壌部分を取り除くことで葉の部分の温度を抽出した。乾燥ストレスを2日程度加えた植物葉と通常栽培葉では、いずれも室温に比べて低い温度となり、さらに乾燥葉は対象に比べ0.3°C程度低くなった。この傾向は、栽培終了時まで持続した。暗室処理を施した植物葉のまた土壌温度のモニタリングにより葉温と土壌温度の差異がある程度一致していることを確かめた。またストレスとして、高圧を与えた植物葉の分光特性の検討も実施した。高圧レベルは200MPa、500MPaとそれぞれ変化させ、8日間、可視・近赤外モニタリングに加えて近赤外イメージングを実施した。イメージングは、10mm×10mmのエリアが100ピクセル以上になる分解能で実施した。近赤外分光スペクトルでは、主に葉内水分に由来する1400および1200nm付近のバンドが検出された。そこで、イメージングには水分吸収帯である1400nm付近のスペクトルを用いることとした。未処理区にくらべ、高圧処理区の水由来のピークは、試験期間中減少が緩慢であった。温度条件と乾燥条件を変えた植物葉の解析により、葉温変化の基礎的な把握ができたこと、さらに、圧力条件を変化させた場合の近赤外イメージングによって水分保持力が変化することを視覚的に表すことに成功したことから本研究の初年度としてはおおむね順調に進捗していると評価している。

可視域400ー1100nmから、低振動数赤外帯(4000ー100cmー1)までの低温環境下での植物葉のスペクトル挙動を連続的に調査することで、温度環境ストレスと乾燥ストレスに関するスペクトル変化の差異が表せる可能性が見いだせたことから研究は順調に進行していると判断している。可視・近赤外によるストレス応答解析に加え、テラヘルツ近傍のスペクトル取得とその解析を実施する。特に極低温および高温のストレスを与えた場合のスペクトル変化について、イメージングを併用してさらに検討を行っていく。その他のストレスとして実施している高圧ストレスに関しても、各スペクトル取得から水分ストレス状態の併発化の観点から検討を実施する。昨年度の研究において、部位によるストレス応答差異の可能性がみとめられたため、次年度は、イメージングによるストレス応答の表現について近赤外イメージングを中心に検討していく必要がある。イメージングについては、2014年から実施した乾燥ストレスのみに着目した実験において、研究者らによって新開発された装置D-NIRsを用いた研究の実績を有している。本装置の農業分野への利用は、本研究に対してのみでなく、他の農業工学関連の有効性を見出す可能性を秘めていることから、大規模な展示会等で紹介することで、情報収集を行っていく。所属研究室より消耗品、試薬等の利用許可を得たことから繰り越し可能となった。次年度旅費利用として関連学会に加え、研究協力者である横河電機村山氏との打ち合わせを実施する予定である(東京)。所属研究室における使用機材を利用することで、消耗品費の利用が抑えられたことに加え、国際学会参加を最終年度にすることにしたことから旅費も次年度に使用可能となった。最終年度において、FACSS2019での研究成果報告と情報収集に利用し、またより正確な測定を実施するための精密天秤の購入に充てることとする。
波面符号化法による複合材料内部の音波物性値の画像化

1、高分子圧電材料を用いて、超音波アレイトランスデューサを作成、性能を評価した。サブミリ単位で電極を蒸着したアレイトランスデューサを作成し、信号処理技術と組み合わせることで音場の制御が可能であることを示した。このトランスデューサは2次元の音波物性マッピングに使用可能である。また、超音波顕微鏡用の、レーリー波・直接反射波分離型の高性能トランスデューサも同様の技術を用いて開発に成功した。これを用いると光学的には検出できない材料内部の欠陥を高分解能で探索できる。2、波面符号化開口法により、空間・時間的に高分解能が得られることを計算機シミュレーションで明らかにした。運動する物体の位置と速度を同時に測定できる処理システムを考案し、実際に作成・評価した。信号処理技術である、デルタシグマ変調とオーバーサンプリング技術を応用して、音波情報のノイズ軽減を行うことに成功した。3、複合材料の音波物性値と内部構造、および機能との関係を、様々な材料について調べた。この結果、従来知られていなかった高分子材料の高温・高圧下でのポアソン比、ヤング率を音速測定から導出することができた。また、レーザー超音波法を用いた高分子材料の非接触弾性異方性計測システムの開発に成功した。4、超音波場の定量計測と制御を行った。従来定量化されていなかった音波の強さの測定を、シュリーレン法を用いることで成功させた。これを基にして、様々なトランスデューサを組み合わせて複雑な音場を形成し、化学反応場との相関を調べた。1、シミュレーションにより、M系列の波面符号化開口の設計を行った。これにより、この波面符号化開口を用いることにより、瞬時で対象物の計測が可能であることを示した。2、シミュレーションにより設計した波面符号化開口の電極パターンを用いて、高分子アレイトランスデューサの設計・試作を行った。試作ではトランスミッタとレシ-バを別々に作製していたので、双方の位置精度が悪かった。しかし、本研究経費消耗品費で購入した電極マスクを用いることにより、トランスミッタとレシ-バを同時にアルミニウム蒸着によって作製することができ、位置精度を上げることができた。また、外部からの電磁波の影響によるノイズが問題になっていたが、トランスデューサ内をシールドするといった改良を施すことにより、トランスデューサのS/N比を向上することができた。3、作製した高分子アレイトランスデューサの性能をテストするために対象物(金属棒)を水中に置き、2次元断面の計測を行った。この結果、対象物は精度良く識別できたが、計測領域全体において虚像が生じた。これについて、像再生を行う画像化オペレータに疑似逆フィルターなどの改良を施すことにより、この虚像を低減することができた。1、昨年度に引き続き、作製した波面符号化開口の高分子アレイトランスデューサを用いて、水中の対象物(金属棒)に対して2次元断面の計測を行った。これについて、像再生を行う画像化オペレータに擬似逆フィルターの採用により画像の高画質化を行った。この結果、位置分解能の点では向上が見られたが、虚像レベルの低減については不十分であった。そこで、空間的に符号化開口を合成する手法である符号化合成開口法を用いることにより、2次元断面画像の虚像の低減と位置分解能の向上を行った。これより、他の合成開口法を用いた画像化の手法と比較して短い距離を走査するだけで平均虚像レベルは5dBの低減、位置分解能は40%の向上が行えた。2、昨年度に作製したシステムを用いて、シミュレーションにより音波物性値分布の画像化システムの設計と試作を行った。これにより、シミュレーションにおいて音波物性値分布の画像による評価が可能であることを示した。3、各種複合材料の内部の微細構造や分散構造の物性値データを蓄積し、得られた各種複合材料の基礎データを基に複合素材と微細構造との関係を解明した。4、以上の研究により得られた成果をまとめ、学会で発表した。本研究の目的は、i)

複合材料内部の音波物性値を、空間・時間的に高い分解能で計測すること,ii)得られた情報を画像化する超音波撮像システムを構築すること、の2点である。これらを実現するために、我々は高分子圧電材料を超音波トランスデューサに使用し,波面符号化開口法を信号処理技術として用いている。本年度は下記の研究を行った。1)レーザ超音波法により複合材料の音波物性値の測定を行った。高分子液晶を延伸した試料に関して、X線などと同様に材料の異方性を評価できた。また、非接触・非破壊で材料の弾性率を測定できた。2)超音波顕微鏡用レーリー波・直接反射波分離型高分子トランスデューサを作成した。これにより弾性表面波と直接反射波を分けて測定ができるようになり、従来のトランスデューサを用いた場合に比べて、材料内部の欠陥などを鮮明にとらえることができるようになった。3)超音波を用いて、高温・高圧下での材料の音波物性値を測定した。従来わかっていなかった、プラスチック材料の成形加工条件下でのポアソン比・ヤング率の挙動が明らかになった。4)シュリーレン法を持ちいて、音場の定量化を行った。比接触で絶対的な音圧を求めることが可能となった。
手洗いの除菌によりカルバペネム耐性緑膿菌を激減させる革新的手法の開発と基礎的研究

薬剤耐性菌が世界的に増加する一方、新たな抗菌薬の開発は減少傾向にあり、国際的に大きな課題となっている。2016年4月、厚生労働省により薬剤耐性(AMR)アクションプランが決定された。その成果指標の一つに「緑膿菌のカルバペネム耐性率を2020年までに10%以下(2014年には20%)にする」ことが挙げられている。申請者は「手洗いの除菌を行い、手洗いを介した耐性緑膿菌伝播のサイクルを断ち切ることで、緑膿菌のカルバペネム耐性率を低下させることができる」と考え、これを検証すると同時に、その実現のための具体的な対策を提示することが本研究の目的である。北海道大学病院の特定の病棟では、過去にカルバペネム系、キノロン系、アミノグリコシド系の3剤に耐性を示す多剤耐性緑膿菌(MDRP)のアウトブレイクを経験したが、2007年7月以降、該当病棟の手洗いを第4級アンモニウム塩をベースとする除菌薬を用いて除菌を行うことで、アウトブレイクを鎮静化させた実績がある。初年度はこれを検証することを目的とした。2005-2017年に該当病棟の入院患者から検出されたカルバペネム耐性緑膿菌の保存菌株335株を対象として、PCR-based ORF Typing (POT)法を用いた遺伝子タイピングを行ったところ、POT法で207-13型を示すMDRP菌株の検出は(手洗いの除菌を開始した)2007年を境に激減し、2012年後半以降は検出されなくなった。これにより、手洗いの除菌を行うことが、アウトブレイクを鎮静化させる一助になったことが検証された。当初の計画通り、保存されている緑膿菌株335株全てのPCR-based ORF Typing (POT)法検査を終了させることが出来た。POT法で207-13型を示すMDRP菌株の検出は(手洗いの除菌を開始した)2007年を境に激減し、2012年後半以降は検出されなくなったのは予想通りの成果である。その他に、カルバペネム系とキノロン系に耐性を示す203-32型(POT法)の緑膿菌株も2010年を境に検出されなくなった。その一方で、カルバペネム系に耐性を示す28-16型(POT法)の緑膿菌株は2005年から2017年に至るまで継続的に検出されている。これは予想外の事実であり、その理由を探る必要がある。緑膿菌株のなかには、第4級アンモニウム塩をベースとする除菌薬に感受性を示す株と抵抗性を示す株とが存在することが知られている。203-32型(POT法)の緑膿菌株が第4級アンモニウム塩をベースとする除菌薬に感受性を示し、28-16型(POT法)の緑膿菌株が第4級アンモニウム塩をベースとする除菌薬に抵抗性を示すことを示すことが出来れば、「現在までの進捗状況」の最後の段落に記載した事実を説明可能である。

これは予想外の事実であり、その理由を探る必要がある。緑膿菌株のなかには、第4級アンモニウム塩をベースとする除菌薬に感受性を示す株と抵抗性を示す株とが存在することが知られている。203-32型(POT法)の緑膿菌株が第4級アンモニウム塩をベースとする除菌薬に感受性を示し、28-16型(POT法)の緑膿菌株が第4級アンモニウム塩をベースとする除菌薬に抵抗性を示すことを示すことが出来れば、「現在までの進捗状況」の最後の段落に記載した事実を説明可能である。
全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）のトリガーとしてのアデノシン３リン酸（ＡＴＰ）

様々な全身性炎症反応症候群(SIRS)で、血中にATPが放出されていることを明らかにした。虚血再灌流障害である心肺蘇生後患者では、死亡群では、生存群に比べ、明らかに血中ATP値が高値を示し、重症度スコアであるAPACHE II scoreと正の相関関係を示した。また、敗血症では、血中ATPが、好中球機能活性の指標であるCD11bと相関した。SIRS患者では、血中に放出されたATPが好中球を活性化し、炎症の惹起に寄与している事が示唆された。本研究は、臨床症例において、敗血症を代表とした全身性炎症反応症候群の炎症トリガーとして、ATPがどのような役割を示しているのかを明らかにすることを目的としている。1.ダメージをうけた細胞からATPが血液中に放出され、そのATPが好中球を刺激することで過剰な好中球活性に働くという仮説をもとに、HPLCを用いて敗血症患者における血漿中のadenylates(ATP,ADP,AMP, adenosine)を測定した。その結果、敗血症患者では、健常者に比し、炎症を惹起するATPが高値であるだけでなく、抗炎症作用をもつadenosineが有意に低値であることが明らかになってきた。重症度の相関は、現時点では明らかではないが、最重症例ではATPが低値を示すことが示唆され、敗血症におけるミトコンドリア機能不全との関与が考察される。2.全身性虚血再灌流障害である心肺停止後患者では、明らかにATPが高値を示し、血中Lactateや心肺停止時間との相関が認められた。今後、症例を重ねることで、心拍再開後のATPが予後予測に使える可能性が考察される。3.ATP高値を示す急性期に白血球の活性化の指標であるCD11bが高値をしめし、その後速やかに低下することがわかり、臨床症例でもATPが好中球機能活性に寄与していることが明らかになってきた。本研究は、SIRS患者において、炎症を惹起するメカニズムにいかにATPが関与しているのかを明らかにすることを目的としている。1.ATPの絶対値には患者個人や病態によって違うものの、健常人に比べSIRS患者では、明らかに高値を示すことが明らかとなった。クラッシュ症候群や、重症急性膵炎などでは、異常高値をしめすことがわかったが、APACHE scoreやSOFA scoreなどの重症度スコアとは関連を認めなかった。2.心肺停止後蘇生後脳症の患者では、心肺停止時間とATPに相関関係を認め、神経学的予後および生命予後とも関連していることが明らかとなった。3.敗血症におけるミトコンドリア機能不全については、注目されており、症例がまだ少ないものの、ATPの産生ができない病態が関わっていることが示唆された。また、好中球のATPを染色する色素を用いて、その動態を調べる方法を模索中である。1.初年度として、まずATPの測定系を確立した。採血法としては、静脈採血、動脈穿刺採血、留置された動脈ラインからの動脈血採血によるATP値を比較し、動脈ラインからの採血が安定した値が得られることを明らかにした。ATP迅速測定器(ルミテスター)による測定と同時に血漿を保存し、アメリカの研究室に検体を送り、ルミテスターによるATP値と、従来の高速液体クロマトグラフィーによるATP値で整合性があることを明らかにした。ただし、ATPが並はずれて高値の場合、クロマトグラフィーでは検出できるが、ルミテスターでは感知できないという限界もあることが分かった。2.健常人では、ATP値が30nM前後であるのに対し、敗血症では110nM(入院初日)と上昇し、その後臨床症状の改善と共に低下していくことがわかった。超急性期に上昇しその後すみやかに低下していく傾向がみうけられ、炎症の急性期に関与していることが示唆されている。3.重症度スコアや、白血球数CRPなどの炎症の指標となる検査結果との統計学的な相関関係は現在のところ認められず、さらに症例の積み重ねが必要である。4.好中球の活性化指標としてのCD11b発現は、敗血症において健常人より明らかに高値であることを示すことができたが、血漿中ATP濃度との相関関係は現在検討中である。今後、さらに症例を重ねて、採血のタイミングなどを工夫し、経時的変化にも注目して検討していく予定である。全身性炎症反応症候群を引き起こすさまざまな病態において、ダメージをうけた細胞からATPが血中にでている事が明らかになってきた。重症度や患者の予後との相関については、まだ症例数を増やす必要があり、今後も症例を重ねていく予定である。健常ボランテイアを集めるために、ホームページや院内掲示板を使って啓蒙しているものの、なかなか集まらないこと。

院内の倫理委員会の許可を得るのに、時間がかかったことなどが、原因に挙げられるが、ATPがSIRS患者の血中においてあがっているという結果が得られ始めており、積極的に進めていく予定である。1.症例を重ねて、ATPの経時的変化と、各種臨床マーカーとの相関関係を見出す。2.徐々に明らかになってきた最重症症例(急性期死亡例)に関するミトコンドリア機能不全にも注目し、ATP値低値がどのように病態にかかわっているか研究をすすめる。3.SIRS患者で、ATPが高値であるだけでなく、adenosineが低値であることに注目し、患者のATP分解能の低下が、病態にかかわっている可能性について、患者血液にATPを添加し、どれぐらいの速さで分解できるか実験を行う。症例を重ねて、採血タイミングを検討しATPの経時的変化と、各種臨床マーカーとの相関関係を見出す。敗血症以外のどのようなSIRS症例でATP高値を示すのかも検討する。国際ショック学会およびアジア救急医学会、日本救急医学会に、抄録を提出済みであり、積極的に学会発表を行うための参加費や、ボランテイアへの協力費、海外の研究協力者へ検体を送る費用そして白血球機能の評価に使う抗体や各種試薬の購入などに研究費を使用予定である。国際ショック学会および日本炎症再生学会に、抄録を提出済みであり、積極的に学会発表を行うための参加費や、ボランテイアへの協力費、海外の研究協力者へ検体を送る費用そして白血球機能の評価に使う抗体の購入などに研究費を使用予定である。
ワイドレンジ時間領域における二酸化チタンの光励起キャリアダイナミクスの観測

本研究では、光触媒材料のほとんどを占める二酸化チタンの光励起キャリアの挙動を明らかにする。二酸化チタンが光触媒として優れている理由や、その光触媒活性が結晶構造によって異なる原因について、これまで数多くの研究がなされてきた。しかし、いまだ明快な説明はされていない。本研究では、従来の化学反応に焦点を当てた研究とは異なる「光物性」的な見方、すなわち結晶構造によって光励起キャリアのふるまいが異なる点に着目する。幅広い時間レンジでポンプ・プローブ測定を行い、同時に時間分解発光を行うことで光励起キャリアの再結合やトラップ過程を明らかにする。
乳牛の子宮内膜炎における感染細菌由来エンドトキシンによる卵巣機能障害の解明

H26年度は,子宮内膜炎罹患牛の感染細菌から放出される内毒素であるリポポリサッカライド(LPS)が卵母細胞の成熟過程および胚発生能に及ぼす影響を解析するために,以下の2つの実験を行った。【実験1】H25年度より継続していた卵母細胞の成熟過程に及ぼすLPSの影響についてさらに詳細に検証するために,H26年度は成熟培養に供する卵母細胞の数を増やすとともに,卵胞液中のLPS濃度と同様のレベルのLPSを添加し,より生理的な状態に近い条件での解析を行った。食肉処理場で採取したウシ卵巣から卵丘細胞ー卵母細胞複合体を吸引採取し,LPSを添加した培地を用いて23時間体外成熟培養を行った。その結果、LPSはMII期に進行する卵母細胞の数を減少させた(核成熟の阻害)。また,LPSはミトコンドリアのコピー数には影響しなかったが,ミトコンドリアが細胞質全体に拡散している卵母細胞の割合を減少させ,ミトコンドリアの相対膜電位活性を低下させた(細胞質成熟の阻害)。【実験2】LPSによる核成熟および細胞質成熟の阻害作用が受精や胚発生に及ぼす影響について明らかにするために,LPS存在下で成熟させた卵母細胞を体外受精に供し,LPSを含まない発生培地に受精卵を移して8日間培養した。その結果,LPSは受精卵の卵割率には影響を及ぼさなかったが,胚盤胞期胚への発生率を低下させた。また,LPS存在下で成熟した卵母細胞より発生した胚盤胞の栄養膜細胞の細胞数は減少した。LPSは卵母細胞の成熟機構を阻害することにより,胚発生能を低下させることが明らかになった。また,胚盤胞を構成する栄養膜細胞の細胞数が減少したことで胚の質が低下し,着床が起こりにくくなる可能性が考えられた。以上のことから,卵胞液中に存在するLPSによる卵母細胞の成熟機構阻害が,子宮内膜炎における卵巣機能障害の一因となっている可能性が考えられた。26年度が最終年度であるため、記入しない。本研究は,乳牛の子宮内膜炎における卵巣機能障害のメカニズムを解明することを目的とした。H25年度においては,子宮内膜炎罹患牛の感染細菌から放出される内毒素であるリポポリサッカライド(LPS)が卵胞構成細胞および卵子に与える影響を解析するために,以下の2つの実験を行った。【実験1】食肉処理場で採取したウシ子宮より組織切片を作製し,子宮内膜への炎症細胞の浸潤を調べた。また子宮に付随する卵巣を採取して卵胞液中のLPS濃度を測定するとともに,卵胞液中のステロイドホルモン濃度や卵胞構成細胞におけるステロイドホルモン産生関連酵素の遺伝子発現を解析した。その結果,卵胞液中に高い濃度のLPSが存在する卵胞では,卵胞を構成する卵胞膜細胞および顆粒細胞でのステロイドホルモン産生が減少していることが明らかとなった。一方,卵胞液中のLPS濃度および卵胞でのステロイドホルモン産生と,子宮内膜への炎症細胞の浸潤数に関連性は見られなかった。以上より,子宮の炎症度合に関係なくLPSが卵胞液中に存在し,卵胞構成細胞のステロイドホルモン産生を阻害していることが示された。【実験2】LPSが生殖細胞である卵子に与える影響を調べるために,食肉処理場由来の卵巣より卵丘細胞ー卵母細胞複合体を吸引し, LPSを含む培地で体外成熟培養を行った。その結果, LPSは卵子の減数分裂を阻害し, M2期へと進行する卵子の割合を減少させた(核成熟の阻害)。また,卵子の細胞質に存在する主要な細胞小器官であるミトコンドリアへの影響を解析したところ, LPS処理によるミトコンドリアのコピー数の変化は見られなかった。一方で, LPSはミトコンドリアの膜電位差を低下させ,さらに成熟に伴うミトコンドリアの細胞質への拡散を阻害する可能性が示された(細胞質成熟の阻害)。以上のことから, LPSは卵子の核成熟および細胞質成熟を阻害することで,受精およびその後の胚発生に影響を与える可能性が示唆された。