hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
陰影アニメーションによる立体提示の実用化に向けた動的なプロジェクタカメラ系の較正

プロジェクタカメラフィードバック処理では,ピクセルマップと実際の画素対応にずれが発生しているとフィードバックが破綻して投影画像に波状の反応拡散波が発生する.B2では,この投影のずれによって発生する反射率推定の誤りを評価することでずれ量を推定し,閉ループ処理においてピクセルマップのずれを修正する動的な幾何学較正を実現した.また,無印刷状態の印刷媒体の白色と撮影画像の色彩との齟齬をオンライン処理により較正する方法,印刷媒体の蛍光成分を考慮したより高度な反射率推定手法についても提案した.B3については,Shading Illusion技術の応用として符号化印刷を用いた表情の変化する顔写真を提案した.また,DLP方式の小型プロジェクタと小型カメラを組み合わせたモバイルのプロジェクタカメラ系を試作し,この成果をSIGGRAPH ASIA 2016のE-Techにて展示した.その他には,富士通ソーシャルサイエンスラボラトリ他の協力により,日本橋三越本店に鎮座するまごころ像(1960年,佐藤玄々作)への演出を行い,本研究に関連する研究成果の評価を行った.この様子は,日刊工業新聞,日本経済新聞,朝日新聞などの紙面やNIKKEI NET,産経ニュース,朝日新聞デジタル,日本橋経済新聞などの50以上のニュースサイト,MXテレビなどで紹介された.プロジェクタカメラ系を実用化するためには,コストの低減,扱いやすさと制御の頑強性の改善が重要である.本研究課題では,Shading Illusion技術の実用化を目標として,プロジェクタカメラ系の幾何学較正と光学較正を動的に実現する方法を明らかにした.また,デモ機を作製してSiggraph AsiaのE-techにてShading Illusionを応用した表情が変化する顔写真(Coded Facial Expression)の展示を行った.さらに,動的な較正の研究で得られた知見から演出技術を確立し,展示会での工芸品の演出を行った.また彫像へのプロジェクションマッピングのイベントを実施した.本研究では,研究代表者が提案しているShading Illusionの実用化を目指し,「S1.制御対象の移動に対して動的にプロジェクタカメラ系の幾何学較正を行う方法を明らかにする」ことと,「S2.環境照明や制御対象の位置変化に対して動的に光学較正を行う方法を明らかにする」ことを研究の目標としており,平成26年度はこのうちS1について取り組んできた.研究実績の概要で述べたように,計画に従って手法の検討を実施した.最終的に見出したP2Cマップの動的な校正方法は,当初想定していた方法とは異なるが,逐次処理により連続的にP2Cマップのズレを検出することができる手法である.この方法は,ピクセルマップによる制約を持たない画期的な方法であり,プロジェクタカメラ系の新たな手法として大きな成果が得られた.また,平成28年度には実用化に協力してくれる企業・団体を探すことを計画として述べていたが,既に1社と商品化もしくはサービス化を目指して共同研究・開発を開始している.以上の状況から,概ね良好に進展していると評価する.今後は研究項目B1,B2,B3を完成させて研究成果をまとめる.B1に関しては,新たに考案した手法について研究を進めるとともに,当初計画していた方法の応答性の改善についても検討する.B2に関しては,反射率推定結果の評価によりC2Pマップを補償する方法を推し進め,実機による実験より提案手法の有効性を評価する.B3に関しては,提案手法全体の評価を行う.
脳防御機構における低分子量生体内機能分子の役割の解明

様々な脳疾患の防御に重要な生体内機能分子の役割を解明するため、研究を遂行し下記の成果を得た。胎仔由来神経保護物質であるセロフェンド酸が作用を発現する際に重要な直接のターゲット分子の候補タンパクが見出された。また、セロフェンド酸は末梢投与においてもin vivoにおける虚血障害に対して保護的に働くことが明らかとなった。ニコチン受容体関連では、アストロサイトにおけるα7受容体発現にはニューロンとの接触によるシグナルが重要な役割を果たしていることを見出した。1)セロフェンド酸の作用スペクトルの解析セロフェンド酸は、申請者らがウシ胎仔血清のエーテル抽出物中より発見した分子量382のユニークな構造をもつ環状ジテルペノイドである。セロフェンド酸の直接のターゲット分子が不明であったため結合タンパクの探索を行った。培養大脳皮質細胞およびPC12細胞を用いた検討により、セロフェンド酸と特異的に結合するタンパクがいくつか得られた。また、セロフェンド酸の定量法の確立を目指し、蒸発型光散乱検出器(ELSD)を用いて検討したところ、比較的高感度にセロフェンド酸の検出が可能となった。2)胎仔組織由来新規神経保護物質の探索胎仔組織にはセロフェンド酸のみならず胎仔期特有の化合物が存在すると推定されるので、未同定の神経保護活性化合物の探索を行ったところ、ウシ胎盤のエーテル抽出物にcaspase-3阻害浩性を見出した。さらに逆相HPLCを用いて分画を行い、活性測定を行ったところ、いくつかのフラクションに強い活性をもった画分が得られた。3)ニコチン性アセチルコリンの神経保護メカニズムの解析ニコチン受容体刺激のニューロン保護効果の詳細な機序について解析したところ、ニコチン受容体刺激によるα7ニコチン受容体アップレギュレーションおよび神経保護作用の増強作用にはnAChR-PI3K-Akt系のシグナル伝達が重要な役割を果たすことが明らかとなった。さらにアストロサイトにおけるα7受容体発現にはニューロンとの接触によるシグナルが重要な役割を果たしていることを見出した。1)セロフェンド酸の作用スペクトルの解析セロフェンド酸が神経保護作用を発現する際に重要な直接のターゲット分子について検討を行った。培養大脳皮質細胞、心筋細胞のホモジネートを用いてセロフェンド酸に特異的に結合するタンパクをプルダウン法にて検討したところ、複数のタンパクがセロフェンド酸結合タンパクの候補として見出された。またin vivoにおけるラット中大脳動脈閉塞モデルを用いた検討において、セロフェンド酸は尾静脈からの末梢投与においても虚血障害に対して保護的に働くことが明らかとなった。2)ニコチン性アセチルコリンの神経保護メカニズムの解析神経型ニコチン性アセチルコリン受容体がグリア細胞にも発現していることが近年報告されている。グリア細胞における長期間刺激による受容体の機能変化を解析するために、アストロサイトにおける神経型ニコチン受容体(nAChR)の発現調節機構について検討した。培養アストロサイトを用いた検討において、ニコチンを48時間処置することによりα7-nAChRの発現量が増加する傾向がみられた。培養アストロサイトにおけるα7-nAChRの発現調節機構を検討する目的で、培養ニューロン、アストロサイトに発現するα7-nAChRを検討したところ、両培養系においてほぼ全ての細胞においてα7-nAChRの発現していた。一方、培養ニューロンと共存するアストロサイトにおいてはα7-nAChRの発現は見られなかった。ニューロンとアストロサイトが接触する条件においては、アストロサイトのα7-nAChRの発現が観察されないが、接触がない条件においては、α7-nAChRの発現抑制は観察されなかった。以上の結果により、グリア細胞の1つであるアストロサイトにおけるα7-nAChRの発現は、ニューロンとの接触により抑制的な制御を受けることが示唆された。
日本発アイドル養成と中国青少年の主体形成に関する実証的研究

最終年度はフィールドワーク、関連文書・文献の調査及び論文執筆を中心に以下のとおり実績が得られた。(1)FWにおける聞き取り調査が実現した点。夏・冬・春の休業期間に上海におけるFWを実施、ファンコミュニティの参与観察及びインタビューを試みた。断続的に実施したものであったが、育成系アイドル団体のメンバーを支えることで同時代を生き成長するファンの姿を描写でき、得られた知見を論文執筆に生かすことができた。(2)劇場周辺の踏査により、13年の劇場オープン以来「門前町」として徐々に賑わいを取り戻した地域の状況を定点観察的に把握することができた点。劇場周辺には今や多数の飲食店、果物店、理美容室、雑貨店等が展開しており、地域消費者の利便性が向上したのみならず、多くのファンの居場所となっている。店主等との会話から売り上げは向上しており、劇場とウィン・ウィンの関係が構築されていることが伺えた。(3)最終年度においても、前年度までと同様に、音楽・娯楽産業における周辺的知見の蓄積のために数十冊の研究書・一般書を渉猟した。得られた知見はFWや論文執筆に寄与した他、研究の今後の展望を開くこととなった。(4)論文の完成をみた点。これまで継続したFW及び文献調査の成果を論文にまとめることができた。その際、学会発表での質問及び批判を踏み台に論理的枠組みを再考することに繋がったのが進歩であったと考えられる。なお、研究実績そのものからは外れるが、以上の研究活動によって得られた成果の一部は研究代表者が担当する授業(教職課程関連科目、基礎科目の教育学及び中国語)において授業コンテンツの一部となり、受講生のアップ・トゥ・デートな中国理解と同世代の若者に対する興味・理解の促進に寄与することとなった。研究と教育は車の両輪であることを考えれば、今次研究テーマは現場での教学と確実に結びつくものであったことも申し添えたい。アイドル観をめぐって社会一般の側或いは大人の側と若者との間に共通する部分もあったが、多くのギャップがあることが明らかになった。前者は客観的・理性的ではあるがステレオタイプで硬直した眼差しでアイドル文化を解釈しているように認識される。それは日本の大人社会に比して顕著であるように感じられる。それに対し日本発アイドルグループのファンとなり、応援活動に身を投じたことのある青少年自身は柔軟に固定観念を超越し、種々の応援活動を通じ自由闊達にファンやアイドルとのインタラクションを実現していたのである。ファンにとってアイドルグループのメンバーとは「自分は本当はこうありたい」と願う理想の姿でもある。と同時に、弱さを持つ自分の生き写しでもあり、さらにはファンの支えがなければ羽ばたくことのできない雛鳥でさえある。こうした見方は、一部において大人の側の考え方と共通する部分もあるが、その理性の枠に留まらないチャレンジ性と自己実現への欲求及び実行力を有するのが大きな違いであった。ファンにとって応援活動とは自己の居場所を確保しアイデンティティを確立する重要な行為である。劇場公演やコンサートの入場券を欠かさず購入してメンバーの歌やダンスを鑑賞し声援を送ること。周辺グッズ及び握手券や総選挙の投票権が入ったCDを大量購入して特定のメンバーを支援すること。握手会や誕生日の食事会等様々な行事を通じてアイドルに直接声をかけること。ブログへの書き込みを通じてアイドル及びファン相互の忌憚のないやり取りをすること。これらを通じて相互交流を実現し、そこから学び成長していく学習主体であるとも考えられるのである。その中には一歩進んで自ら若者文化の担い手になろうと当該団体のオーディションに応募し、実際に入団する青少年も多く存在する。メンバーの回顧に耳を傾けることでアイドル団体の持つ意外な社会教育的意義が一層見えてきた。【主な原因と対策】1)校務繁忙のため中国におけるフィールドワークに十分な時間を割くことができなかった点。これについては学科長及び同僚の理解を得つつ、事前に学内業務の調整を行い、現地に滞在する十分な時間を確保する。2)現地研究協力者や関係者との調整が進まなかった点。前項と関連して、現地と調整するための時間的余裕がなく、現地に着いてから始めるしかなく、効率の点で問題があった。渡航前から十分な調整を行う必要性を痛感した。3)文献研究の遅れ。第1項に関連して、ネットアーカイブを含む文字資料の読解が進まなかった点。これについては現地ファンの協力も仰ぎつつ、有用な文献資料の収集及び読解に努めたい。本研究の当初の目的は、「クール・ジャパン」の一翼を担う芸能界に注目し、その受容・消費国の一つである中国社会における影響を、上海に展開するアイドル養成団体を具体事例として微視的・実証的に分析することであった。研究者の興味は商業活動としてのアイドル集団の輸出や営業活動のプロセス及び経営・運営の方法論にあるのではなく、アイドルを志願し懸命に修練する少女たちや、それを応援するファンの成長過程、つまり芸能活動への関わりを通じて主体形成する中国青少年の内面であった。そこから、1日本発アイドル集団及び養成システムの持つ教育的機能、2民族的差異やイデオロギーに関わりなく人々の共感を育む芸能の持つヒューマニティ、321世紀における国際共生実現の一つのヒント、等を見出すことであった。これらについては1年目に発表した論文及びそれを土台に新しい視点と資料を盛り込んでまとめ、2年目に行った学会報告において、未だ実証は不十分であるとはいえその一端を公表することができた。

ところが研究を深めていくと、当該国の政治・経済当局の指導とその下で展開される経営・運営の在り様が実は青少年の心の状態に相当影響を与えているという現実に直面することとなった。つまり出自は同くするグループであっても、一国の政治・経済の教育的機能によって文化を作る者たちとそれを消費する若者の心は変容していくという一面である。その原因の一つがこれまでの論考でも取り上げた中国当局の「本土化」政策である。これにより当初考えていた日中間の文化交流がもたらす共通認識が揺らぎ、若者たちの相互交流が分断されているという現実がある。国家や経済の思惑により青少年の気持ちがないがしろにされているとしたら、これは日中間の文化交流に内在するネガティブな側面であり、一つのリスクとしても認識され研究されなければならないだろう。研究が遅れたのは以下の理由による。1)遠因の一つに学部の配置換えがあり、それに伴う学内業務の繁忙化があった。当面新旧双方の学務をこなす必要があり、落ち着いて研究をすることが困難となった。校務及び教育に時間にことのほか時間を費やし、研究時間が確保できなかったというのが理由である。これは当初予期したエフォートが実現できなかったということであり、大きな反省点となる。一人で行う人文系の研究の弱点が露呈したということだろう。ただし如何に時間がなくとも、当初の研究計画を遂行するのが研究者の使命だと考えると慙愧に耐えない。2)健康上の理由。昨年夏以来、体調を崩し、多忙のため本来2回予定していたフィールドワークが1回しか実施できず、しかもそのわずか1回の機会にも思い通り所期の研究項目を実施することが困難となったため。それに伴い予算の執行も満足にできない状況であった。3)現地調査実施のための環境醸成はすでに現地にできているものの、上記(1)(2)の理由により、調査に必要な質問票調査及びインタビュー調査等の倫理委員会への申請書作成もままならず、2年目に計画していた現地調査が実施できなかったこと、その結果、1年目と同様の文献調査のみを行うしかなかったことが研究の遅延に繋がった。最大の成果は上海でSNH48のファンに対するインタビューを実施し、そこから重要な知見を得たことである。典型的事例として日本のAKBファンを経て後にSNHファンになったAさん(20代女性)のケースを紹介する。Aさんは高校生の頃(2009年頃)AKBの板野友美のファンとなった。きっかけはネットでAKB48の人気番組「AKBINGO」視聴したことであった(著作権上問題だが、中国では「字幕組」と呼ばれるボランティアが日本の人気テレビ番組を録画したものに素早く中国語字幕を付し次の日にはネット上にアップする)。アイドルに魅了されてからというもの彼女はCD(中に握手券や総選挙の投票券が封入されている)やグッズを買ったり、総選挙の投票のための募金活動(応援会が投票券入りCDを大量購入するため資金調達活動を行う)に身を投じることとなる。SNHには既に約10万元(≒170万円)を消費した。
神経芽腫で活性化したＡＬＫの下流シグナルの解析

神経芽腫において同定された新規のALK結合リン酸化蛋白質Flotillin-1(FLOT1)は、ALKと選択的に結合しエンドサイトーシスを介してALK蛋白質の分解に関わることを示した。また、神経芽腫で見られる変異型ALKとFLOT1との結合能が野生型に比べ著明に減少しているのが確認された。一方で神経芽腫でFLIOT1の発現を抑制すると、細胞運動能、足場非依存性増殖、造腫瘍能などが増加するという結果も得られた。以上のことからFLOT1の発現低下やFLOT1との結合能が低いALK変異によりALK蛋白質の安定性が増すことが神経芽腫のがん化シグナルの増強に関わる可能性が示唆された。神経芽腫細胞の発生にALK(Anaplastic Lymphoma Kinase)の遺伝子増幅や遺伝子変異による活性化が関わることが示され、新しい治療の標的として注目されているが、ALKがどのようなシグナル分子を介して神経芽腫の特徴的な病態を引き起こすのか詳細はわかっていない。この研究では神経芽腫においてALKと結合してチロシンリン酸化を受ける基質分子を質量分析により同定して、その中で神経芽腫の発生や性質に関わる分子を機能解析から明らかにすることを目的に研究を開始した。TNB-1神経芽腫細胞に、野生型および2種類の変異型ALKをタグ付きで発現させ、タグと抗リン酸化チロシン抗体で精製した後、質量分析で同定した。得られた約20の候補分子のうち、実際に特異的抗体を用いてALKとの結合が認められ、ALKの阻害剤に寄ってチロシンリン酸化が阻害されることが確認できた2つの分子について先行して解析を進めた。そのうちFlotillin-1(FLOT1)は細胞膜上のラフトに局在し、エンドサイトーシスに関わることが知られていたため、ALK蛋白質の分解に関わる可能性を考えた。蛍光染色でFLOT1はラフトおよびエンドソームと考えられる細胞質内の顆粒においてALKとの共局在が認められた。神経芽腫細胞においてFLOT1の発現をRNAiで抑制すると膜上のALK蛋白質の量が著明に増加し、同時に細胞の運動能・浸潤能が上昇した。神経芽腫で見られるALKの変異のうちF1174Lなど幾つかにおいて、変異型ALKとFLOT1との結合能が野生型に比べ著明に減少しているのが確認され、このような変異によりALK蛋白質の安定性が増すことでがん化シグナルの活性化につながっている可能性が示唆された。マウスを用いたin vivoのモデルを用いて、FLOT1によるALKの分解の程度が神経芽腫の造腫瘍能、転移能に与える影響を解析している。神経芽腫では約1割においてALK受容体キナーゼの遺伝子変異や遺伝子増幅による活性化が見られ、その発生や進展に関わることが明らかになっている。ALK活性化の神経芽腫特異的なシグナル経路を明らかにするため、TNB-1細胞にFLAGタグ付きの野生型、F1174LおよびK1062M変異体を発現させた細胞株を樹立して、野生型及び変異型ALKに結合するチロシンリン酸化蛋白質を解析した。同定された約30の蛋白質のうちIRS1、SOS1、Grb2、ZO-1など幾つかについては、ALKとの結合がリンパ腫など他の系でも報告されており、この手法でALK結合蛋白質が確かに同定されていることが示唆された。新たにALKに結合するリン酸化蛋白質として同定したFlotillin-1(FLOT1)はその発現量の低いことが神経芽腫の予後不良と関わることから、ALKとの関わりで機能解析を進めた。その結果、ラフトに局在するFLOT1はALKと選択的に結合しエンドサイトーシスを介してALK蛋白質の分解に関わることを示した。また、神経芽腫で見られるF1174Lなど幾つかの変異に関して、変異型ALKとFLOT1との結合能が野生型に比べ著明に減少しているのが確認された。一方で神経芽腫でFLIOT1の発現をノックダウンにより抑制すると、細胞運動能、足場非依存性増殖、ヌードマウスにおける造腫瘍能などが増加するという結果も得られた。この結果は、ALK蛋白質の発現量が遺伝子変異の有無にかかわらず神経芽腫の予後不良に関わるという解析結果とも整合性が有り、今後FLOT1低値の神経芽腫においてALK阻害剤が治療に有効であるかを検証する必要がある。

TNB-1細胞を用いて、Anaplastic lymphoma kinase (ALK)のFLAGタグ付きの野生型およびF1174LとK1062M変異体を発現させた細胞株を2ライン樹立した。M2-アガロースによってFLAGタグの着いた蛋白質をプルダウンして、野生型及び変異型ALKに結合する蛋白質を抗リン酸化チロシン抗体により精製後、質量分析により同定を進めたところShcC、IRS-1/2、SOS1/2、PI3K、ZO-1/2など他のALK活性化腫瘍で既知のALK結合分子群に加え、新たにCortactin、Drebrinなどのアクチン結合蛋白質、Flotillin-1やSH2Bなど蛋白質安定性や局在を制御する分子を見つけ、機能解析を開始した。そのうちALKの阻害剤によってチロシンリン酸化が阻害されることが確認できたFlotillin-1 (FLOT1)、SH2B、SHP2の3つの分子について先行して解析を進めた。FLOT1は細胞膜上のラフトに局在し、エンドサイトーシスに関わることが知られていたため、ALK蛋白質の分解に関わる可能性を考えた。蛍光染色でFLOT1はラフトおよびエンドソームと考えられる細胞質内の顆粒においてALKとの共局在が認められた。神経芽腫細胞においてFLOT1の発現をRNAiで抑制すると膜上のALK蛋白質の量が著明に増加し、同時に細胞の運動能・浸潤能が上昇した。また実際、神経芽腫におけるFLOT1の低発現群では高発現群に比べ有意に予後が悪いことが示された。神経芽腫で見られるALKの変異のうちF1174Lなど幾つかにおいて、変異型ALKとFLOT1との結合能が野生型に比べ著明に減少しているのが確認され、このような変異によりALK蛋白質の安定性が増すことでがん化シグナルの活性化につながっている可能性が示唆された。質量分析でALK結合タンパク質として同定された分子のうちFLOT1の機能が、ALKのがんにおける安定化やがん化シグナルと密接に関わることが明らかになった。このような重要な分子を見出し機能解析まで進められたことは計画より早いと考えられる。25年度が最終年度であるため、記入しない。質量分析で同定されたALK結合蛋白質のうちFlotillin1 (FLOT1)、SH2B、SHP2などについて機能解析を進め、特にFLOT1に関してはRNAiおよびイメージングの系を用いて神経芽腫における局在や機能についての解析を重点的に行い、ALK蛋白質のエンドサイトーシスを介した神経芽腫の悪性化との関わりを明らかにすることができた。FLOT1の発現が低い神経芽腫においては、ALK蛋白質の分解抑制が悪性化に関わる可能性があり、このような症例にALK阻害剤による治療の適用の範囲が広がる可能性が示唆された。FLOT1のin vivoでの神経芽腫形成に対する役割と、そのシグナル経路を介した治療モデルの作成に進めていくと同時に、ALKとの結合分子として同定されたSH2Bなど他の分子についても機能解析を行う。マウスによるin vivoのモデルを用いて、FLOT1によるALKの分解の程度が神経芽腫の造腫瘍能、転移能に与える影響を解析する。変異ALKおよび野生型ALKに対する結合能の差の解析を行い、またヒト神経芽腫の検体におけるこれらの蛋白質の発現量と予後との関係について解析をすすめる。現在解析中のSH2B、SHP2などのALK結合分子に関しても、神経芽腫の発生、進展における役割を明らかにしていく。
運動ニューロンの網羅的発現遺伝子解析によるリハビリテーション効率の定量化

これまでリハビリの効果判定とmolecular biologyを繋ぐ研究は数少なかった。我々は、核ソーティングやレーザーマイクロダイセクションによる運動ニューロン選択的な解析技術と、次世代シークエンサーによる網羅的解析を組み合わせることで、廃用あるいはリハビリがモーターニューロンに与える影響を遺伝子発現を指標として定量化することを試みた。その結果、廃用により運動ニューロン数や細胞サイズに変化はなく軸索輸送蛋白や神経伝達物質の発現は保たれていたが、興奮性シナプス蛋白の発現は遺伝子および蛋白レベルで低下していた。本解析法は将来的にリハビリの効率評価となりうる指標の同定に繋がると考えられた。本研究では、げっ歯類中枢神経損傷モデルとギガシークエンサーを用いて、リハビリ前後での大脳皮質運動神経における分子発現の網羅的な解析を行ない、リハビリ効果の数値化や中枢神経可塑性に関わる因子の同定を目指す。中枢神経損傷モデルは頭部外傷または脊髄損傷モデルを作成し、運動ニューロンの選択的な採取は我々の開発した核ソーティング法を用いる予定であった。しかし、今年度からレーザーマイクロダイセクションのシステムを導入し、核ソーティングよりもレーザーマイクロダイセクションによる選択的な運動ニューロン採取の方が効率が良く、かつ網羅的なトランスクリプトーム解析に適していることが明らかとなった。さらに、採取した運動ニューロン選択的に発現遺伝子解析を行うことに成功しており、特に神経活動性のマーカーや神経栄養因子、軸索輸送蛋白関連因子、神経伝達物質受容体などの定量化が可能となった。これらの遺伝子発現が、実際の下肢運動機能やリハビリテーションとどのように相関するのかを明らかにする予定である。本研究の目的は、リハビリテーションを代表とする四肢運動が中枢神経運動ニューロンの発現遺伝子変化に与える影響を解析し、将来的にリハビリテーションの効率評価となりうる指標の同定に繋げることである。そのため、まず特定の運動ニューロンに於ける発現遺伝子を選択的かつ網羅的に解析する系を立ち上げた。細胞質より核のみを抽出して運動ニューロン選択的な転写因子を指標としてFACSによる核ソーティングを立ち上げたが、本手法では核内からサイズの小さなmRNAが漏出するため正確な解析が困難であることが明らかとなり、代替手法として直接組織切片上からレーザーマイクロダイセクションで運動ニューロンのみを選択的に切り出し回収、発現遺伝子を次世代シークエンサーにより解析する手法に切り替えた。そのため、解析切片は脳ではなく、運動ニューロンが灰白質前角部に集中している脊髄での解析とした。回収細胞における発現遺伝子解析は約1000細胞で可能であり、ChATやGFAPの発現から選択的に運動ニューロンが回収できていることを確認した。脊髄前角部運動ニューロンに於ける遺伝子発現が下肢運動と相関しているかを調べるため、第9胸髄レベルで脊髄を完全切断し、第2腰髄レベルの運動ニューロンを選択的に採取、発現遺伝子の変化を解析した。その結果、切断モデルに於いても運動ニューロン数や細胞サイズに変化はないものの、Bassoonなどのプレシナプス蛋白やcGluT2などの興奮性シナプス蛋白の発現は有意に減少していることが明らかとなった。軸索輸送蛋白や神経伝達物質の発現はほぼ保たれていたため、これらの指標ではリハビリマーカーとならないことが判明した。ただし、c-fosやCamK2aなどの神経活動マーカーは運動ニューロンで得意的に減少した。下肢他動運動でのこれらの神経活動マーカーに変化がなければ、将来的にはリハビリ効率の定量化の標的となる可能性が考えられた。中枢神経運動ニューロンを選択的に解析するため、細胞質より核のみを抽出して運動ニューロン選択的な転写因子を指標としたFACS Aria2による核ソーティングを行なった。この結果、首尾よく運動ニューロンの核のみを抽出可能であったが、GAPDH含めた発現遺伝子解析を行なったところ核内の新生mRNA含有量が極端に少なく、リハビリ前後での発現遺伝子変化の検出は困難であると考えられた。そのため、細胞全体の回収が必要と考え、まずは選択的な細胞回収方法の確立と網羅的発現遺伝子解析を試みた。レンチウイルスにてGFPを発現させた神経細胞を中枢神経系に移植し、移植後7日後に生着細胞の回収を行なった。その結果、細胞のviabilityを保ったまま数万個オーダーの細胞が回収出来、バイオイメージングによる回収効率は90%以上であった。回収した細胞からmRNAライブラリーを作成し、ギガシークエンサーにて発現遺伝子の解析を行なったところ、2500万個以上のタグのリーディングと12000種類の発現遺伝子の定量化が可能であった。また、動物モデルのリハビリテーションに関しては、国立リハビリテーションセンターとの共同研究によりラット脊髄損傷モデルでの強制二足歩行モデルを立ち上げ、リハビリ訓練前後でのサンプル採取が可能となった。具体的な発現遺伝子からのリハビリを定量化する因子の絞り込みに関しては、まずリハビリ前後での発現遺伝子変化を転写因子結合部位解析等で行なう予定である。

当初の計画では、運動ニューロンの細胞核をソーティングし、トランスクリプトーム解析を行う計画であったが、採取核のmRNAレベルを測定したところ、ハウスキーピングジーン量でも訳1/3程度しか残存していないことが明らかとなった。すなわち、核膜孔からのactive transportや漏出機構により核内のトランスクリプトーム解析では不十分なことが示唆された。そこで、我々はレーザーマイクロダイセクションを用いた運動ニューロンの選択的解析を試みた。その結果、運動ニューロンを選択的に回収し、なおかつ神経細胞の活動性の指標であるcfosやZIFといった発現遺伝子の定量化に成功した。Single cell PCRや次世代シークエンサーの上位機種との組み合わせにより、より実践的に運動ニューロンでのトランスクリプトーム解析が可能となった。げっ歯類を用いた下肢運動麻痺モデルの作成も順調であり、リハビリテーションが運動ニューロンの遺伝子発現に与える影響を具体的に解析できるものと考えている。マウスならびにラット対麻痺モデルの強制二足歩行リハビリモデルを確立し、目的細胞の選択的回収法ならびにギガシークエンサーを用いた網羅的発現遺伝子解析に成功した。運動ニューロンに於ける遺伝子発現が下肢の運動機能と相関しているかを解析するために、脊髄完全切断モデルと鎮静剤投与による長期運動制限モデルを作成し、脊髄レベルでの運動ニューロンの発現遺伝子を比較する。運動活動性とどのような遺伝子群が相関するのか、また下肢リハビリテーションを行うことで、単純に運動と連動する遺伝子群と、神経回路形成に関わる遺伝子群の区別を行う。トランスクリプトーム解析では、特に生存や神経栄養因子反応性などのgene ontologyカテゴリーのみならず、1neurotransmitter、2シナプス伝達に関するマシナリー分子、3軸索輸送関連蛋白分子、4細胞膜受容体分子、5シグナル伝達分子を中心に網羅的な発現解析を行い、その機能を定量化する。細胞の回収法に加えて、より解剖学的に選択的な解析のために、レーザーマイクロダイセクションを導入した。そのため、特定の部位の運動ニューロンでの発現遺伝子解析が可能になるものと見込んでいる。網羅的遺伝子発現解析試薬とレーザーマイクロダイセクション用のプレパラートを消耗品として使用予定。旅費や人権費の計上は予定していない。
採餌行動計測・画像情報によるキタゾウアザラシの中深層回遊行動の研究

海洋の中深層への潜水(深度500-650 m、最大1700 m、約20分間)を回遊の全期間にわたり休むことなく繰り返すキタゾウアザラシの潜水行動を明らかにするため、顎加速度センサー、及び頭部装着のカメラを用いてこの動物の採餌行動の定量的解析を行った。このアザラシは2925-4178回の潜水の90%の潜水で23817-58766回、主としてハダカイワシなどの中深層の小型の餌(10-20 g)をサクションにより採餌し、採餌には明瞭な昼夜パターンがあることを明らかになった。平成21年度は以下準備と実験を行った。1)本研究の中心課題となる採餌エベント計測について、計測方法の検証として行ったドイツとの南極ウェッデルアザラシ予備実験のとりまとめを行った。採餌エベント法は既に飼育個体ではその有用性を確かめているが、野生アザラシにおいては検証が行われていなかった。データのとりまめにより、海氷や氷山周辺の複雑な餌環境下においても方法的に問題ないことが確認された。予備実験の成果は既に南極科学研究委員会(SCAR)の生物シンポジウムにおいて発表し、そのプロシーディングスに投稿した。2)本研究においては、さらに採餌計測法を発展させるために、数日間の計測時間である加速度計を、計測パラメータを工夫することにより100日間使用可能とするように準備を行った。3)本実験は21年度2月にカリフォルニア・アニョノエボ海岸の繁殖修了後の雌キタゾウアザラシにおいてカリフォルニア大学サンタクルスの海洋研究所コスタ教授の協力の基に計画通り実施した。顎採餌計測計を4頭に、内1頭には顎と頭の信号強度比較のため頭にも計測計を装着した。さらに1頭には餌生物の特定のため画像ロガーを装着した。さらに潜水中の行動の詳細を検証する目的で遊泳速度、3軸加速度ロガーを2頭に装着した。さらに移動回遊経路の計測のため人工衛星トラッキングシステムをアメリカ側の協力により装着した。善4個体は順調に回遊行動を行っていることを確認した。平成22年度は以下の研究実験と成果の一部のとりまとめを行った。1)現場実験の2年度目として、前年度同様2月にカリフォルニア大学の協力を得て、アニョノエボ繁殖場において、繁殖期終了後の雌5頭に長期顎採餌計(Kami Kami logger、長期遊泳ストローク計5台、深海型動物装着カメラ1台、さらに回遊路特定のためのアルゴス衛星送信機5台(カリフォルニア大学実施)を装着した。その後5個体の順調な回遊が衛星情報で確認されている。2)初年度に装着し、今年度5月に回収された5台の長期採餌計の解析を行った。長期採餌記録計は予想通りにこのアザラシの中深層での採餌の記録を収録した。一部データの欠測があったものの、前個体が400-700mの層で数万回におよぶ採餌活動を行っていることが明らかになった。採餌信号は明らかに本種が中深層のカリフォルニア大学の協力を得てハダカイワシ類のような小型の餌をサクションにより大量に行っていることが明らかになった。結果は第4回国際バイオロギングシンポジウムにおいて発表した。平成23年度は以下の研究実験と成果の一部のとりまとめを行った。初年度に装着し、回収された5台の長期採餌計の解析を行った。長期採餌記録計は計画通り、このアザラシの中深層での採餌を時系列記録した。全個体が400-700mの層で数万回におよぶ採餌活動を行っていることが明らかになった。採餌記録計の加速度波形から、1)このアザラシは小型の餌をサクションにより採餌していること、2)採餌回数、代謝量およびハダカイワシなどのカロリー量を用いての推定からこのアザラシは10-20gの餌を採っていること、3)採餌水深の明瞭な昼夜変動から、本種が中深層でハダカイワシ類のような小型の餌を大量に採っていることなどが判明した。このことは、記録量は少ないが、画像ロガーに記録されたハダカイワシの写真からも具体的に裏付けられた。1980年代から謎とされていたゾウアザラシの繰り返し連続深海潜水は、DSL層での小型の餌を採餌するためであることを明かにすることができた。また、中深層動物の海洋生態系において果たす役割の重要性を初めて定量的に示すことができた。今回海洋動物の採餌を長期にわたり計測できた意味は極めて大きく海洋生態系の直接計測による定量解析に道を開くものと考える。当初目的としていた採餌記録、画像記録からゾウアザラシの中深層回遊行動の解明の内、中深層潜水と採餌の関係を明らかにすることができたが、回遊と採餌の関係は解明されていない。

今後得られたストローク記録や衛星トラッキング記録なども用いて解析を行い、中深層海洋構造と回遊の関係、ホットスポット解析、従来の一般採餌モデルの検証を行う。
新たな老化神経再生促進因子肝細胞分泌タンパク質の作用機序と体外免疫法による因定

コラーゲンゲル培養法を導入することにより成熟・老化マウス及びラットから末梢中枢神経組織を摘出し培養することに成功した。中枢神経組織として網膜を、末梢神経組織としては脊髄後根神経節を用い神経再生を促進する肝細胞分泌因子の活性、作用機序、因子の同定について検討した。成熟ラットの視神経を予め切断し、7日間飼育後眼球を摘出し網膜を細断してコラーゲンゲル内で培養した。培養24時間後より網膜片から突起が再生してきた。これらの突起は神経に特異的な抗体である抗neurofilament抗体、網膜神経節細胞に対して特異的な抗Thy-1.2抗体に陽性で網膜神経節細胞からの再生神経突起であることが明かとなった。この培養網膜片に,成熟ラットをコラゲナーゼ灌流して分離し、精製後肝実質細胞をWilliam's Eを基本培地とする無血清液で培養しその培養上清(HCM)を作用させた。培養3日目ではHCMにより再生神経突起数は2.6培に達した。HCMには中枢神経の神経再生を促進する因子が含まれていることが判明した。この因子は膜による分画で5k<<100kに存在し、95°C・5分の熱処理で変性するタンパク質であることが明かとなった。一方成熟・老化した動物の末梢神経系においても同一の分画の因子が、神経線維をともなった脊髄後根神経節の神経線維切断端からの神経細再生を促進することが明確となった。用いた培養系は生体中ときわめて近い器官培養なので、肝細胞から分泌されている因子が成熟・老化した動物の生体内で中枢・末梢神経系の神経再生・生存維持効果を発揮することが出来ると期待される。現在まで神経再生促進作用があると考えられている20種類の物質を検討したがこの因子と同様な作用を発現する因子はなく、新たな物質である可能性が高い。現在この因子の分離精製を行っており、単一のタンパク質として単離し、そのアミノ酸配列が決定出来るのも間近である。コラーゲンゲル培養法を導入することにより成熟・老化マウス及びラットから末梢・中枢神経組織を摘出し培養することに成功した。中枢神経組織として網膜を,末梢神経組織としては脊髄後根神経節を用い神経再生を促進する肝細胞分泌因子の活性・作用機序・因子の同定について検討した。成熟ラットの視神経を予め切断し,7日間飼育後眼球を摘出し網膜を細断してコラーゲンゲル内で培養した。これらの突起は神経に特異的な抗体である抗Neurofilamt抗体,網膜神経節細胞に対して特異的な抗Thy-1,2抗体に陽性で,網膜神経節細胞からの再生神経突起であることが明かとなった。この培養網膜片に,成熟ラットをコラゲナーゼ潅流して分離し,精製後肝実質細胞をWilliam's Eを基本培地とする無血清液で培養し,その培養上清(HCM)を作用させた。培養3日目でHCMにより再生神経突起数は2.6倍に達した。HCM中には中枢神経の神経再生を促進する因子が含まれていることが判明した。この因子は膜による分画でSK<<100Kに存在し,95°C・5分の熱処理で変性するタンパク質であることが明かとなった。一方成熟・老化した動物の末梢神経系においても同一の分画の因子が,神経線維をともなった脊髄後根神経節の神経線維切断端からの神経再生を促進することが明確となった。

用いた培養系は生体中ときわめて近い器官培養なので,肝細胞から分泌されている因子が成熟・老化した動物の生体内で中枢・末梢神経系の神経再生・生存維持効果を発揮することが出来ると期待される。現在まで神経再生促進作用があると考えられている20種類の物質を検討したが,この因子と同様な作用を発現する因子はなく,新たな物質である可能性が高い。現在この因子の分離精製を行っており,単一のタンパク質として単離し,そのアミノ酸配列を決定出来るのも間近である。コラーゲンゲルを用いたる次元培養法を導入することにより成熟ラット・マウスの神経再生系を確立するのに成功した。次の5種類の培養系を用いることにより各種神経栄養因子の作用機序を明らかにすることが可能となった。(1)神経線維を伴った脊髄後根神経節(DRG)、(2)神経線維を切除したDRG、(3)コラゲナーゼ・トリプシン処理により被膜を除去したDRG、(4)単離された感覚神経細胞、(5)神経細胞だけを3次元的に集合した系。NGF(神経成長因子)は単一の神経細胞には際だった再生促進効果を示さなかったが、その集合した系に対し胎生期と同様の著しい再生促進効果を示した。肝細胞分泌神経再生促進因子は、神経線維を伴った系の神経再生を強く促進するが、酵素処理したDRG、単一の神経細胞、3次元的に集合した神経細胞に対し再生促進効果を示さなかった。肝細胞分泌因子は神経細胞に直接作用することなく、神経系を取り巻く細胞系(シュワン細胞・線維芽細胞・神経周膜細胞)を刺激し神経に直接働く因子を分泌させ神経再生を促進すると考えられる。in vivoでは神経被膜により外部から神経細胞への物質の流入が制限されておりNGFも直接神経細胞に作用出来ない。しかし肝分泌因子は外部より傍神経細胞系の細胞を刺激することにより神経細胞を活性化し、神経再生を促進でき、in vivoでの適用の可能性が示唆される。現在シュワン細胞の培養法は確立し、線維芽細胞・神経周膜細胞の培養系も完成しつつある。この系に肝細胞分泌因子を作用させ、その培養上清により神経再生促進効果を検討する。こうした研究と平行して各種クロマトを用いてこの因子の精製・同定を進めている。その結果SDS PAGEで分子量17、000のタンパク質であることが判明した。今後この分子のアミノ酸シークエンスを決定すると同時にその作用機序の解明を進めていく計画である。
フォトニック結晶ファイバ解析設計支援環境の構築とファイバ形光デバイス開発への応用

フォトニック結晶ファイバの高精度高信頼度解析設計理論を開発し,デバイス化に必要な基本特性,具体的には,分散特性,損失特性,偏波特性,結合特性,非線形特性などを明らかにしたうえで,フォトニック結晶ファイバ形の新規光デバイスの構成法を案出することを目的として研究を進め,下記の成果を得た.1.フォトニック結晶ファイバの高精度高信頼度解析設計理論をフルベクトル有限要素法に基づいて開発し,フォトニック結晶ファイバの単一モード伝送帯域,波長分散特性,実効コア断面積,モードフィールド径,ビーム広がり角,閉じ込め損失,曲げ損失,接続損失,偏波依存損失などを明らかにした.また,実際に製造されたフォトニック結晶ファイバの特性評価を可能とするための実モデルシミュレーションの方法もあわせて開発した.2.ホーリーファイバに関しては,広帯域低分散フラットファイバの新しい設計法を開発し,波長分散特性,閉じ込め損失,実効コア断面積の間の関係を明らかにした.また,マルチコアホーリーファイバを用いた方向性結合器,波長フィルタ,偏波スプリッタの構成法を考案し,所望の特性を実現するために必要な構造パラメータ,具体的には,格子定数,空孔径,コア間隔などを明らかにした.3.フォトニックバンドギャップファイバに関しては,空孔の形状を忠実にモデリングすることが波長分散特性や伝送損失特性の実験結果を説明することに不可欠であることを初めて実証し,フォトニックバンドギャップファイバの極限的性能を明らかにした.また,伝送帯域内に発生する特異な損失の要因が,空気コアを取り囲む最内側シリカ薄膜に局在する表面波モードとの結合によるものであること突き止めた.フォトニック結晶ファイバの高精度高信頼度解析設計理論を開発し,デバイス化に必要な基本特性,具体的には,分散特性,損失特性,偏波特性,結合特性,非線形特性などを明らかにしたうえで,フォトニック結晶ファイバ形の新規光デバイスの構成法を案出することを目的として研究を進め,下記の成果を得た.1.フォトニック結晶ファイバの高精度高信頼度解析設計理論をフルベクトル有限要素法に基づいて開発し,フォトニック結晶ファイバの単一モード伝送帯域,波長分散特性,実効コア断面積,モードフィールド径,ビーム広がり角,閉じ込め損失,曲げ損失,接続損失,偏波依存損失などを明らかにした.また,実際に製造されたフォトニック結晶ファイバの特性評価を可能とするための実モデルシミュレーションの方法もあわせて開発した.2.ホーリーファイバに関しては,広帯域低分散フラットファイバの新しい設計法を開発し,波長分散特性,閉じ込め損失,実効コア断面積の間の関係を明らかにした.また,マルチコアホーリーファイバを用いた方向性結合器,波長フィルタ,偏波スプリッタの構成法を考案し,所望の特性を実現するために必要な構造パラメータ,具体的には,格子定数,空孔径,コア間隔などを明らかにした.3.フォトニックバンドギャップファイバに関しては,空孔の形状を忠実にモデリングすることが波長分散特性や伝送損失特性の実験結果を説明することに不可欠であることを初めて実証し,フォトニックバンドギャップファイバの極限的性能を明らかにした.また,伝送帯域内に発生する特異な損失の要因が,空気コアを取り囲む最内側シリカ薄膜に局在する表面波モードとの結合によるものであること突き止めた.フォトニック結晶ファイバ(photonic crystal fiber : PCF)の特異な性質を駆使して,従来の光ファイバでは実現し得ない特性を備えたファイバ形光デバイス創成のための基盤技術を確立することを目的として研究を進め,下記の成果を得た.(1)研究代表者のグループが独自に開発を進めてきたベクトル型の有限要素法の高精度化,汎用化を図り,PCFの単一モード伝送帯域,実効コア断面積,波長分散特性,ビーム広がり角,伝送損失,曲げ損失,接続損失,偏波依存損失(PDL)などの基本特性を明らかにした.(2)ファイバ形光デバイスを構成するうえで重要な非線形屈折率や温度がPCFの伝送特性に与える影響については,まだ解明されておらず,本研究で開発を進めている計算アルゴリズムを非線形屈折率変化や温度変化にも対応できるように高性能化した.(3)PCF解析設計支援環境の構築に向けて,解析システムと測定システムを整備した.解析システムについては,設計作業能率の向上のため,本研究で開発を進めている解析設計技術に適合したプリ/ポストプロセッサを整備するとともに,実際に作成されたPCF形光デバイスの特性評価結果を詳細設計に反映させるため,PCF断面構造の画像処理技術を開発し,実モデルシミュレーションを可能とした.フォトニック結晶ファイバの高精度高信頼度解析設計理論を開発し,デバイス化に必要な基本特性,具体的には,分散特性,損失特性,偏波特性,結合特性,非線形特性などを明らかにしたうえで,フォトニック結晶ファイバ形の新規光デバイスの構成法を案出することを目的として研究を進め,下記の成果を得た.1.フォトニック結晶ファイバの高精度高信頼度解析設計理論をフルベクトル有限要素法に基づいて開発し,フォトニック結晶ファイバの単一モード伝送帯域,波長分散特性,実効コア断面積,モードフィールド径,ビーム広がり角,閉じ込め損失,曲げ損失,接続損失,偏波依存損失などを明らかにした.また,実際に製造されたフォトニック結晶ファイバの特性評価を可能とするための実モデルシミュレーションの方法もあわせて開発した.2.ホーリーファイバに関しては,広帯域低分散フラットファイバの新しい設計法を開発し,波長分散特性,閉じ込め損失,実効コア断面積の間の関係を明らかにした,また,マルチコアホーリーファイバを用いた方向性結合器,波長フィルタ,偏波スプリッタの構成法を考案し,所望の特性を実現するために必要な構造パラメータ,具体的には,格子定数,空孔径,コア間隔などを明らかにした.

3.フォトニックバンドギャップファイバに関しては,空孔の形状を忠実にモデリングすることが波長分散特性や伝送損失特性の実験結果を説明することに不可欠であることを初めて実証し,フォトニックバンドギャップファイバの極限的性能を明らかにした.また,伝送帯域内に発生する特異な損失の要因が,空気コアを取り囲む最内側シリカ薄膜に局在する表面波モードとの結合によるものであること突き止めた.
免疫応答のバランスを調節する核内受容体PXRの新規な生理機能の解明

核内受容体PXRは、様々な化学物質に応答して多様な生理機能の調節に関わる。近年、薬物によるPXRの活性化を介した免疫応答調節作用の知見が集積されつつある。本研究では、コンカナバリンA自己免疫性肝炎モデルとPxr欠損マウスを用いたin vivo実験系及び培養細胞を用いたin vitro実験系を用いて、PXRによる免疫応答の調節機序を解析した。今後、本研究より得られた知見及び解析系を基に、PXRによる免疫応答の調節機序の解明の進展が期待される。近年、核内受容体PXRの免疫応答の調節作用を示す知見が集積されつつある。本研究課題はPXRによる免疫応答調節の分子機序の解明を目指す。最近、申請者はコンカナバリンA(Con A)自己免疫性肝炎モデルマウスを用いて、PXR特異的活性化物質プレグネノロン16α-カルボニトリル(PCN)を野生型マウスへ投与した場合、肝へのCon A誘導性の好中球浸潤を抑制することを見出した。本年度は、先ず、PXR欠損マウスを用い、PCN前投与によるCon A誘発性肝障害への軽減作用がPXR依存性であるのかを検討した。予想に反して、PXR欠損マウスにおいてもPCN前投与により肝障害症状が軽減され、とりわけ、炎症初期段階における白血球走化性に関わるケモカインの肝特異的な発現上昇の抑制と好中球浸潤の減少を確認した。従って、PCNはPXRに依存しない免疫応答調節作用を有することを見出した。肝常在性マクロファージはケモカインの主な産生分泌の場として炎症増悪化に関わる。マウス由来マクロファージ様細胞を用いてPCNの免疫応答調節作用をケモカインの発現変動を指標に検討を試みたが有意な差異は認められず、肝構成細胞間の相互作用を考慮した解析の必要性が考えられた。一方、予備検討結果として、野生型とPXR欠損マウスの間で炎症初期における一部の炎症関連遺伝子の発現変動に差異が認められたことから、PCNはPXRに依存した作用を有するが、PXRに依存しない作用で十分にCon A誘発性肝障害が抑えられたと推測された。次いで、他の炎症誘発物質を用いた実験モデルの検討を進め、ヒト単球由来細胞では複数のPXR活性化物質がLPS刺激に応答した炎症関連遺伝子発現を抑制することを見出した。今後、培養細胞系を軸にin vivo及びex vivoマウスモデルを組み合わせて解析を進める予定である。本年度は、平成26年度に引き続いて培養細胞系を軸に、実験モデルの検討と解析に取り組んだ。前年度、マクロファージ様細胞へ分化させたヒト単球由来細胞株では、複数のヒトPXR活性化物質がLPS刺激に応答した炎症関連遺伝子の発現を抑制することを見出した。そこで、LPS刺激に応答したNF-κBシグナル経路の活性化を調べたところ、処理したヒトPXR活性化物質によってリン酸化レベルが異なることを見出した。次いで、ヒト大腸癌由来細胞株とマウス由来マクロファージ様細胞株を用い、同様にヒト及びマウスPXR活性化物質処理による炎症関連遺伝子発現への効果を検討した。その結果、それぞれの細胞株で、PXR活性化物質の種類及び処理のタイミングに依存して、LPSもしくはTNFα刺激に応答した炎症関連遺伝子発現が抑制される場合とされない場合が確認された。従って、解析に用いた培養細胞系では、1PXRの発現量が少ない、2PXRは個々の活性化物質に依存して異なる作用点で調節作用を示す、或いは、3活性化物質によってはPXR非依存的に作用する、可能性が示唆された。並行して、論文報告に基づき、新たにマウス初代培養肝細胞を用いて、マウスPXR活性化薬処理下におけるLPS及びTNFα刺激に応答した炎症関連遺伝子の発現変動を検討したが、再現性が乏しく、非実質細胞の有無等の培養・処理諸条件を検討する必要性が示唆された。さらに、ヒトPXRを安定発現するヒト大腸癌由来細胞株を作製すると共に、転写制御の解析が進展している複数の炎症関連遺伝子のプロモーター領域を単離してレポータープラスミドを構築した。今後、ヒトPXR安定発現細胞株やマウス初代培養肝細胞、siRNA遺伝子ノックダウン法を用いた内在性PXRの発現抑制やレポーター解析等の手法を用い、これまでに得た解析結果を基にPXRによる炎症関連遺伝子の発現調節の分子機序を明らかにしていく予定である。本年度は、最終的な目的であるPXRによる免疫応答調節の分子機序の解明に向けて、引き続いて平成26年度に変更した培養細胞系を軸とする実験モデルの検討と解析に取り組んだ。ヒト単球由来細胞株に加え、新たにヒト大腸癌由来細胞株、マウス由来マクロファージ細胞株、さらにマウス初代培養肝細胞を用いて、ヒト及びマウスPXR活性化物質をそれぞれ処理した条件での炎症誘発物質の刺激に応答した炎症関連遺伝子の発現変動やNF-κBシグナル経路の活性化状態を解析した。それらの結果より、解析に用いた実験モデルにおいて、内在性PXRの低発現やPXR活性化物質のPXR非依存性の可能性及び培養条件の検討の必要性などの課題が示唆された。そこで、新たにヒトPXRを安定発現するヒト大腸癌由来細胞株の作製やマウス初代培養肝細胞の培養・処理諸条件の検討を実施した。これらとレポーター解析やsiRNA