hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
金属錯体液晶の磁場応答性を利用した核磁気共鳴画像診断における多機能医薬品の開発

本研究は,液晶化合物の生物学的作用とその磁場・電場配向性に着目し,新規金属錯体液晶を創製し,磁気共鳴画像(Magnetic Resonance Imaging, MRI)診断における新規造影剤の開発を目的とした.2年間の研究の結果,以下の点を明らかにした.2. Phenylpyrimidine及びcyanobiphenyl誘導体は,非小細胞肺癌A549細胞をA549細胞のG1期停止させて細胞増殖抑制作用を示した.このうちphenylpyrimidine誘導体の1つは,正常繊維芽細胞への毒性は示さなかった.3. 16種類の液晶関連化合物の薬理作用を慢性骨髄性白血病細胞K562で検討した結果,2つの化合物にμMレベルでの強い細胞増殖抑制作用が認められた.このうちの1つは,p38及びc-Junを活性化し,K562をアポトーシスへと誘導する.5.現在将来の臨床応用を目指して,引き続き磁場及び電場配向特性を有する新たな金属錯体液晶化合物の開発に取り組んでいる.本研究は,液晶化合物の生物学的作用とその磁場・電場配向性に着目し,新規金属錯体液晶を創製し,磁気共鳴画像(Magnetic Resonance Imaging, MRI)診断における新規造影剤の開発を目的とした.2年間の研究の結果,以下の点を明らかにした.2. Phenylpyrimidine及びcyanobiphenyl誘導体は,非小細胞肺癌A549細胞をA549細胞のG1期停止させて細胞増殖抑制作用を示した.このうちphenylpyrimidine誘導体の1つは,正常繊維芽細胞への毒性は示さなかった.3. 16種類の液晶関連化合物の薬理作用を慢性骨髄性白血病細胞K562で検討した結果,2つの化合物にμMレベルでの強い細胞増殖抑制作用が認められた.このうちの1つは,p38及びc-Junを活性化し,K562をアポトーシスへと誘導する.5.現在将来の臨床応用を目指して,引き続き磁場及び電場配向特性を有する新たな金属錯体液晶化合物の開発に取り組んでいる.研究代表者のグループは,表示媒体に利用されている液晶材料のうち両親媒性液晶化合物の細胞膜への親和性と集積性に着目し,これら化合物にヒト腫瘍細胞抑制活性を見い出し,現在その作用機構並びに腫瘍特異性の高い化合物探索を行っている.本研究では,これら液晶化合物の生物学的作用に加え,その磁場・電場配向性に着目し,規則的な金属の集合体からなる新規金属錯体液晶を創製し,磁気共鳴画像(Magnetic Resonance Imaging,MRI)診断における新規造影剤の開発を目的とする.更に,MRI診断において抗腫瘍作用と配向特性を利用した多機能医薬品への応用発展性の可能性を探索する.平成22年度の研究の結果,以下の点を明らかにし,報告した.(1)ヒト肺がん細胞A549の増殖を両親媒性液晶化合物が抑制効果を示し,その作用は液晶性と相関性が認められた.さらに正常細胞WI-38の増殖には影響しなかったことから,腫瘍細胞特異性が示唆された.平成23年度は,これら成果を踏まえ新規金属錯体液晶の創製に向けさらなる検討を行う.研究代表者のグループは,表示媒体に利用されている液晶材料のうち両親媒性液晶化合物の細胞膜への親和性と集積性に着目し,これら化合物にヒト腫瘍細胞抑制活性を見い出し,現在その作用機構並びに腫瘍特異性の高い化合物探索を行っている.本研究では,これら液晶化合物の生物学的作用に加え,その磁場・電揚配向性に着目し,規則的な金属の集合体からなる新規金属錯体液晶を創製し,磁気共鳴画像(Magnetic Resonance Imaging,MRI)診断における新規造影剤の開発を目的とする.更に,MRI診断において抗腫瘍作用と配向特性を利用した多機能医薬品への応用発展性の可能性を探索する.平成23年度の研究の結果,以下の点を明らかにした.1.14種類の液晶化合物,末端に水酸基を有するD-glucamineを持つphenylpyrimidine及びcyanobiphenyl誘導体,の生物及び薬理作用について,ヒト単球系白血病細胞U937を用いて検討したところ,幾つかの化合物にアポトーシスではないS期停止を介した増殖抑制を示した.この時細胞内タンパクのうちMCM2,cyclinA,cyclinB,CDK2,phospho-CDK1 and Cdc25C発現の低下が観察された.また,活性化合物は可動域を有する棒状構造が効果的である事が示された.2.新規に合成された液晶関連化合物の抗腫瘍活性を,非小細胞肺癌A549細胞を用いて検討した.数種類の化合物の増殖抑制作用を検討したところ,そのうちの1化合物12μM添加3日後の生細胞数は非添加対照群の10%以下であった.この化合物の抑制作用は,活性化型Casapase-3を強く発現させる事からアポトーシスを誘導によることが示された.併せてこの化合物の放射線増感作用を検討したところ増感作用は認められなかったが,放射線と相加的に作用することが示唆された.
チーズホエーからのラクトフォリンの簡易分離法の開発とその製品の機能評価

ラクトフォリン(LP)は、牛乳のホエータンパク質の約10%を占め、主に27kDaと17kDaの糖ペプチドの分子間結合による糖タンパク質複合体(約150kDa)で、その一次構造における疎水性アミノ酸残基の含量と局在性から高い乳化機能をもつことが期待される機能性糖タンパク質である。本研究では、1)LPをチーズ製造における副産物であるホエーから分離するための簡易な方法をまず研究室レベルで試験し、これをパイロットプラントスケールで追試し、簡易に分離できる方法を開発すること、2)得られた分離品の乳化機能及びリポプロテインリパーゼに対する抑制効果の試験を行ってその機能を評価することを目的とし、次の結果が得られた。1.チーズ酸ホエーからLPに富む画分を分離精製する方法を研究室スケールでの研究成果を基盤にパイロットプラントスケールにおいて確立した。すなわち、363kgのチーズ製造で生じた酸性ホエーを限外濾過装置(分画分子量50万)で濃縮し、加水による膜透析、逆浸透膜装置での濃縮後、pHを4.0に調整し、95100°Cで30分間加熱処理し、上清を凍結乾燥してLPに富む画分を54g得ることができた。本研究によって、ホエー中のLPを主要成分とする画分をpH調整用試薬等を用いただけで、物理的な方法のみで高度に精製できる実用的な方法を初めて開発した。2.より高い純度のLPは、分離したLPに富む濃縮画分をゲルろ過クロマトグラフィーによって分離精製することができた。3.LPに富む画分と乳脂肪からなるエマルションを、タンパク質濃度、乳脂肪濃度及びpHを変えて調製し、その乳化活性、粘度、粒子のメジアン径、比表面積、乳化安定性等の乳化特性を測定し、LPに富む画分の乳化能が高いことを確認した。4.LPに富む画分は、リポプロテインリパーゼによるリポリシスの52%の阻害効果を示したのに対して、高純度に精製したLPは約70%の阻害を示し、LP量を増大すと90%阻害した。ラクトフォリン(LP)は、牛乳ホエーの耐熱性プロテオースペプトン画分の主要な糖タンパク質で、主要な2つの糖ペプチドから構成されている(27と17kDa)。チーズホエー(pH45、タンパク質含量0.05%)約10lを、分子量1万の限外ろ過膜による限外ろ過装置を用いることによって、乳糖・無機塩類等の低分子物質(<1万)を効果的に除去することができ、同時にLPに富むホエータンパク質を濃縮することができた。乳糖・無機塩類等の低分子物質及びLPよりも低分子の除去とLPを含むホエータンパク質の濃縮に対する限外ろ過膜の有効性を検討した結果、分子量10万の限外ろ過膜が最も適していた。LPに富むホエータンパク質濃縮物に含まれるLP以外のタンパク質を加熱して変性・凝固させ、遠心分離によって除去するには、70100°Cで1060分間の加熱がLPの回収率が高いことを電気泳動で明らかにした。さらに、濃縮耐熱性画分に含まれるLP以外の高分子量のタンパク質を除去するために、限外ろ過膜の種類とLPの保持含量の関係を試験した結果、分子量20万あるいは50万の限外ろ過膜が効果的であった。また、これらの限外ろ過膜を用いることによって、LPに富むホエータンパク質濃縮物を加熱する必要なく、LPを簡易に濃縮できることが明らかになった。LPに富む濃縮画分から高純度のLPを調製するために、今年度購入したのHPLCを用いたイオン交換クロマトグラフィーによるLPの分離性に及ぼすカラム担体の種類及び緩衝液とそのpHの関連の研究を進めているところである。

3.LPに富む画分と乳脂肪からなるエマルションを、タンパク質濃度、乳脂肪濃度及びpHを変えて調製し、その乳化活性、粘度、粒子のメジアン径、比表面積、乳化安定性等の乳化特性を測定し、LPに富む画分の乳化能が高いことを確認した。4.LPに富む画分は、リポプロテインリパーゼによるリポリシスの52%の阻害効果を示したのに対して、高純度に精製したLPは約70%の阻害を示し、LP量を増大すと90%阻害した。ラクトフォリン(LP)は、牛乳ホエーの耐熱性プロテオースペプトン画分の主要な糖タンパク質で、主要な2つの糖ペプチド(27と17kDa)から構成されている。パイロットプラントスケールにおいて、チーズホエー(pH45、タンパク質含量0.05%)約200lを、95°Cで20分間加熱後、分子量20万の限外ろ過膜による限外ろ過装置を用いることによって、LPに富むホエータンパク質を濃縮できることをポリアクリルアミド電気泳動で確認した。同時に乳糖、無機塩類等の低分子物質を効果的に除去することができた。次に、LPに富む濃縮画分から高純度のLPを調製するために、購入したHPLCを用いたゲルろ過クロマトグラフィー(セファアクリルS300)によってLPを他のホエータンパク質から高い純度で分離することができた。未分画のLPあるいは精製LPと乳脂肪を、pHを変えてエマルションを調製した。その乳化活性、粘度、粒子のメジアン径、比表面積等の乳化特性はpHの影響を受け、特に、LPの等電点であるpH4で、LPの乳化活性は顕著に減少した。それに対してpH7以上のアルカリ側では安定な乳化特性が認められた。LPはリポプロテインリパーゼ(LPL)に対して、未分画のLPが52%阻害効果を示したのに対して、約70%の阻害を示した。LP量を増大することによって、90%のリポリシスが阻害された。LPのLPLに対する阻害作用は、LPのすぐれた乳化機能によって露出した脂肪を被覆してLPLの基質への結合を肪ぐことによるものと考えられる。ラクトフォリン(LP)は、牛乳ホエーの耐熱性プロテオースペプトン画分の主要な糖タンパク質である。最終的に、チーズ製造時の酸ホエーからラクトフォリンに富む画分を精製する方法をパイロットプラントスケールにおいて確立した。すなわち、363kgのクワルクチーズ製造で生じた酸性ホエー(pH4.3)を5055°Cに加温し、これを限外濾過装置(フォローファイバーPM500、分画分子量50万)で濃縮し、加水による膜透析を再度行い、総量22kgまで(ホエーの1/16)濃縮した。続いて、逆浸透膜装置で5kg(ホエーの1/7080)まで濃縮した後、pHを4.0に調整し、95100°C(煮沸)で30分間加熱処理し、3000rpmで15分間遠心分離して沈殿物を除去した。得られた上清を凍結乾燥してラクトフォリンに富む画分を54g得ることができた。本研究によって、ホエー中のラクトフォリンを主要成分とする画分をpH調整用試薬等を用いただけで、物理的な方法のみで高度に精製する実用的な方法を開発した。ラクトフォリンは非常に高い乳化性があることがすでに分かっているが、本研究によってラクトフォリンを主要成分とする画分を初めて経済的に製造することが可能となった。
アデノウイルスベクターによる免疫寛容誘導法の確立と食物アレルギー治療への応用

本研究では、外来抗原に対して免疫寛容を誘導しやすいという肝臓の特徴的な性質に着目し、Adベクターによる肝臓特異的な遺伝子導入を行うことで搭載遺伝子産物に対する免疫応答を抑制、ひいては免疫寛容を積極的に誘導することで、長期的な遺伝子発現を実現可能なAdベクターを開発することを目指している。昨年度までの検討により、Adベクターの搭載遺伝子(β-gal)をAHAプロモーターにより肝臓特異的に発現させることでβ-galに対する免疫応答が誘導されないことが明らかとなった。これが、β-galに対する免疫寛容の成立によるものかどうかを確認するため、追加免疫実験により確認を行ったところ、Ad-AHA-LacZ投与群ではβ-galに対してナイーブ状態に保たれていただけであり、免疫寛容が成立していたわけではないことが明らかとなった。次に、Adベクターの搭載遺伝子を肝臓特異的プロモーター制御下で発現させることにより、搭載遺伝子産物に対する免疫応答が抑制されるメカニズムを明らかとするため、各種免疫シグナルノックアウトマウスに本Adベクターを投与し、搭載遺伝子に対する免疫応答に変化が見られるか検討を行った。その結果、ある自然免疫シグナルノックアウトマウスにAd-AHA-LacZを投与した場合において、野生型マウスと同様に搭載遺伝子産物に対する抗体産生が認められた。したがって、本シグナル分子は肝臓において搭載遺伝子産物に対する抗体産生を負に制御している可能性が考えられる。さらに本シグナルノックアウトマウスにおいては、肝臓における搭載遺伝子の発現が野生型マウスと比較して高い傾向にあることも明らかとなった。今後は、本ノックアウトマウスにおける搭載遺伝子発現制御機構の詳細な解析をもとにし、Adベクターの搭載遺伝子産物に対する獲得免疫誘導について検討を進めていく予定である。27年度が最終年度であるため、記入しない。Adベクターを生体に投与すると、搭載遺伝子産物に対する抗体の産生によりAdベクターの組織へのデリバリーが阻害され、細胞傷害性T細胞(CTL)の誘導により搭載遺伝子発現細胞が排除されることで搭載遺伝子産物の持続的な発現が得られなくなってしまう。本研究では、外来抗原に対する免疫寛容を誘導しやすいという肝臓の特徴的な性質に着目し、Adベクターによる肝臓への遺伝子導入を行うことで搭載遺伝子産物に対する免疫応答を抑制、ひいては免疫寛容を積極的に誘導することで、長期的な遺伝子発現を実現可能なAdベクターを開発することを目指している。肝臓での搭載遺伝子の発現を維持しつつ、免疫担当細胞が多く存在する脾臓における発現を抑制するために、搭載遺伝子を肝臓特異的プロモーター(AHAプロモーター)制御下で発現するAdベクターを用いることとした。また対照としてユビキタスなプロモーター(CMVプロモーター)を用い、モデル抗原としてLacZ遺伝子を発現するそれぞれのAdベクター(Ad-AHA-LacZ, Ad-CMV-LacZ)を作製し、検討に用いた。これら2種類のAdベクターをマウスに投与後、β-galに対する免疫応答について評価したところ、脾臓および肝臓のリンパ球においてAd-CMV-LacZ投与群ではIFN-γ+の表現型を示すβ-gal特異的なCTLの誘導が認められたが、Ad-AHA-LacZ投与群ではβ-gal特異的なCTLの誘導がほとんど認められず、PBS投与群と同程度であった。また抗β-gal抗体の産生についてもAd-CMV-LacZ投与群では認められたが、Ad-AHA-LacZ投与群では全く認められなかった。一方で、Adベクター自身に対するCTLおよび抗体についても同様の検討を行ったが、これらはプロモーターの種類に関わらず誘導されていた。以上の検討により、肝臓特異的プロモーターによって搭載遺伝子を発現するAdベクターを生体に投与した際には、搭載遺伝子産物特異的な細胞性および液性免疫応答が誘導されないことが示された。一方で、抗原提示細胞での搭載遺伝子発現を抑制するストラテジーとして、microRNAによる遺伝子発現制御システムを利用した検討を行った。血球細胞で高発現しているmicroRNAであるmicroRNA-142.3pの完全相補配列を、搭載遺伝子の3'非翻訳領域に挿入したAdベクター(Ad-CMV-LacZ-miR142.3pT)を用いた検討も行ったところ、Ad-CMV-LacZと比較し、本ベクター投与による脾臓におけるβ-gal発現量の抑制が認められず、抗β-gal抗体の産生も抑制できなかった。本研究では、外来抗原に対する免疫寛容を誘導しやすいという肝臓の特徴的な性質に着目し、Adベクターによる肝臓特異的な遺伝子導入を行うことで搭載遺伝子産物に対する免疫応答を抑制、ひいては免疫寛容を積極的に誘導することで、長期的な遺伝子発現を実現可能なAdベクターを開発することを目指している。昨年度までの検討により、Adベクターの搭載遺伝子(β-gal)をAHAプロモーターにより肝臓特異的に発現させるとβ-galに対する免疫応答が誘導されないことが明らかとなった。これが、β-galに対する免疫寛容の成立によるものかどうかを確認するため、追加免疫実験を行った。すなわち、Ad-AHA-LacZを生体に投与することによりβ-galに対する免疫寛容が誘導されていれば、追加免疫を行っても抗β-gal免疫応答は誘導されないと考えられる。初回免疫としてこれまで用いてきたAdベクターを投与し、その後追加免疫としてβ-galタンパク質をフロイントの完全アジュバントとともに背部皮下投与した。マウスから経時的に血清を回収し、ELISA法にてβ-gal特異的な抗体産生を評価したところ、Ad-AHA-LacZ投与群では、Adベクター投与

4週間後までは抗β-gal抗体の産生は認められなかったが、追加免疫の2週間後からわずかながら抗β-gal抗体の産生が認められ、その2週間後にはさらに抗β-gal抗体価が上昇した。また、β-galに対してnaiveな状態であったPBS投与群においてもβ-galタンパク免疫によりAd-AHA-LacZ投与群と同程度の抗体産生が認められたため、Ad-AHA-LacZ投与群ではβ-galに対してnaiveな状態に保たれていただけであり、免疫寛容が成立していたわけではないことが明らかとなった。本研究では、外来抗原に対して免疫寛容を誘導しやすいという肝臓の特徴的な性質に着目し、Adベクターによる肝臓特異的な遺伝子導入を行うことで搭載遺伝子産物に対する免疫応答を抑制、ひいては免疫寛容を積極的に誘導することで、長期的な遺伝子発現を実現可能なAdベクターを開発することを目指している。昨年度までの検討により、Adベクターの搭載遺伝子(β-gal)をAHAプロモーターにより肝臓特異的に発現させることでβ-galに対する免疫応答が誘導されないことが明らかとなった。これが、β-galに対する免疫寛容の成立によるものかどうかを確認するため、追加免疫実験により確認を行ったところ、Ad-AHA-LacZ投与群ではβ-galに対してナイーブ状態に保たれていただけであり、免疫寛容が成立していたわけではないことが明らかとなった。次に、Adベクターの搭載遺伝子を肝臓特異的プロモーター制御下で発現させることにより、搭載遺伝子産物に対する免疫応答が抑制されるメカニズムを明らかとするため、各種免疫シグナルノックアウトマウスに本Adベクターを投与し、搭載遺伝子に対する免疫応答に変化が見られるか検討を行った。その結果、ある自然免疫シグナルノックアウトマウスにAd-AHA-LacZを投与した場合において、野生型マウスと同様に搭載遺伝子産物に対する抗体産生が認められた。したがって、本シグナル分子は肝臓において搭載遺伝子産物に対する抗体産生を負に制御している可能性が考えられる。さらに本シグナルノックアウトマウスにおいては、肝臓における搭載遺伝子の発現が野生型マウスと比較して高い傾向にあることも明らかとなった。今後は、本ノックアウトマウスにおける搭載遺伝子発現制御機構の詳細な解析をもとにし、Adベクターの搭載遺伝子産物に対する獲得免疫誘導について検討を進めていく予定である。昨年度に得られた結果を元に、目的の事象の解明のために複数のアプローチ方法を考えた。条件検討として基礎となるデータの取得も十分に行った上で新たな実験系の構築を行うことができた。検討の結果は研究課題を達成するためには理想的なものではなかったが、新たな知見として、今後別の観点からの発展が期待できると考えている。27年度が最終年度であるため、記入しない。本年度の検討により、Ad-AHA-LacZ投与では、β-galに対する免疫応答が抑制されていただけであり、β-galに対する免疫寛容が成立していたわけではないことが明らかとなった。
嚥下機能再建のための随意筋電制御型経皮的電気刺激装置の開発

電極刺入可能な筋肉を解剖学的に選定し、健常者において、選定した筋肉に電極刺入を行い、嚥下造影を行いながら運動点を探索した。USB経由刺激波形調整型小型電気刺激装置を製作し、脳卒中患者のオトガイ舌骨筋、甲状舌骨筋の筋力増強を行った。脳卒中患者において、電極を刺入し、嚥下造影を行いながら、運動点を探索し、製作した刺激装置による喉頭挙上が確認された。検討結果から筋電制御電気刺激装置の回路を設計・製作し、動作確認を行った。本研究では,主に中等度から重度の誤嚥を伴う嚥下障害(ワレンベルグ症候群など)患者を対象として,喉頭挙上を適切なタイミングと強さで行わせる経皮的電気刺激装置の開発を目的としている.電気刺激装置としては,村岡が開発した筋電導出兼電気刺激装置を改変し応用する.本装置は,患者自身の随意的な筋活動を検出し,それに呼応して電気刺激を行うことが可能であり,より自然に近いスムーズな嚥下動作再建が期待できる.また,本装置は,刺激電極を記録電極としても兼用していることから、埋め込む電極数を半分にすることができ、埋め込み時間の短縮と、侵襲の低減化が可能である.初年度である平成18年度は,少ないチャンネル数で効率的に喉頭挙上可能で,かつ,電極刺入可能な筋肉の選定を解剖学的に検討した,その結果,オトガイ舌骨筋,甲状舌骨筋を対象筋として選定した.健常者2名において,電気刺激を行いながら,電極を刺入し(医師の研究協力者に依頼),電気刺激値に対し,最も効率よく収縮が発現する位置(運動点)を探索した.嚥下造影を行いながら,探索した位置において電気刺激を行い,喉頭が十分に挙上可能であることを確認した.さらに,各筋肉の運動点に刺入した電極から,正常嚥下時の筋電波形を導出できることを確認した.筋萎縮の生じている脳卒中患者のオトガイ舌骨筋,甲状舌骨筋の筋力を増強するために,刺激波形,持続時間,極性,train数,パルス周波数等各種パラメータをPCからUSB経由で設定できる電池駆動の小型電気刺激装置を製作した.脳卒中患者2名において,10分間の電気刺激を1日に3回のペースで2週間行った.その結果,舌骨上筋群の収縮が視覚的にも認められようになり,嚥下造影検査において,舌骨位置の移動量の増大が認められた.本研究は,主に中等度から重度の誤嚥を伴う嚥下障害(ワレンベルグ症候群など)患者を対象として,喉頭挙上を適切なタイミングと強さで行わせる経皮的電気刺激装置の開発を目的としている.電気刺激装置は,村岡が開発した筋電導出兼電気刺激装置を改変し応用する.本装置は,患者自身の随意的な筋活動を検出し,それに呼応して電気刺激を行うことが可能であり,より自然に近いスムーズな嚥下動作再建が期待できる.また,本装置は,刺激電極を記録電極としても兼用していることから、埋め込む電極数を半分にすることができ、埋め込み時間の短縮と、侵襲の低減化が可能である.2年目となる平成19年度では,脳卒中患者2名において,電気刺激を行いながら,電極を刺入し(医師の研究協力者に依頼),電気刺激値に対し,最も効率よく収縮が発現する位置(運動点)を探索した.電気刺激による筋力増強後,嚥下造影を行いながら,探索した位置への電気刺激により,喉頭の挙上が可能であることを確認された.さらに,各筋肉の運動点に刺入した電極から,嚥下時の筋電波形を導出できることを確認した.ただし,表面電極による筋電波形の周波数成分と異なったため,アンプの再設計が必要と判断された.本装置の適応および,効果判定のために,舌骨上筋群の筋張力を評価する装置を製作した.頸部屈曲トルクとして,舌骨上筋群の筋張力を評価するもので,固定用板と,頭部(額)固定用バンドをワイヤにて接続し,ワイヤの張力をロードセルにて測定することにより,頸部屈曲トルクを測定する.ワイヤとロードセル間に,ばねを差込可能なものを設計し,屈曲伸展運動中のトルクも測定可能なものを設計した.また,座位でも測定できるよう,本装置を車椅子に取り付けられるものとした.本研究は,主に中等度から重度の誤嚥を伴う嚥下障害(ワレンベルグ症候群など)患者を対象として,咽頭挙上を適切なタイミングと強さで行わせる経皮的電気刺激装置の開発を目的としている.

電気刺激装置は,村岡が開発した筋電導出兼電気刺激装置を改変し応用する.本装置は,患者自身の随意的な筋活動を検出し,それに呼応して電気刺激を行うことが可能であり,より自然に近いスムーズな嚥下動作再建が期待できる.また,本装置は,刺激電極を記録電極としても兼用していることから,埋め込む電極数を半分にすることができ,埋め込み時間の短縮と,侵襲の低減化が可能である.最終年度となる平成20年度では,研究代表者が年度途中で転職となったため,当初予定していた脳卒中患者2名における試作装置の検討はできなかった.しかし,平成19年度に脳卒中患者2名において得られた針筋電図による筋電波形をもとに,それに対応した周波数帯域のアンプを再設計し,施策を行った.試作装置のサイズは,75×56×18mm(電池部は含まない)であり,名刺小のポケットサイズとなった.研究代表者自らが被験者となり,局所麻酔の皮下注射を用いて顔面神経麻痺を作成した.さらに,非麻痺側の前頭筋の筋電位を検出し,それに比例した強度の電気刺激を麻痺側同名筋に対して行い,眉毛挙上動作の左右対称性により,本装置の動作確認を行った.その結果,最大で,50ms程度の収縮に遅れがあるものの,ほぼ左右対称の動作が実現された.嚥下使用時においては,この遅延は,影響があることが想定されることから,許容できる遅延時間を明確にするとともに,刺激パルス間隔短縮化や,電気刺激を行う筋肉に対して先行して収縮する筋電検出筋の選定などをさらに検討する必要があることが明らかになった.
現代中国における「中間階級」の生成に関する共同研究

本研究は、従来さまざな理由から、関心は持たれていながらも必ずしも実証的なレベルで議論されることの少なかった、現代中国における中間階級を対象に調査研究を行うことを目的としている。できるだけ多様な視点から調査研究を行うために、日本側は中国研究を専門にしながらそれぞれの専門をもつ研究者を集め、中国大陸のみならず、台湾と香港で中間階級を専門にしている研究者を招聘した。また、一都市だとサンプルの代表性に問題が生じうるので、沿海部を代表する都市として天津市を、内陸部を代表する都市として重慶市をそれぞれ選び、比較研究を行うこととした。特に天津市では、一般サンプル以外に中間階級と思われる人々を重点的にサンプリングした上で、質問表調査を行った。研究初年度の1997年度は、調査研究の基本方針を確認するとともに質問票を作成することにエネルギーを傾けた。8月末にはこれがほぼ完成し、同年9月から潘允康氏を中心に天津市調査が行われた。天津市内の6つの市区から1200サンプル、中間階級から800サンプルが選ばれ、その回答パターンについての分析が進められた。また二年目にあたる1998年度は、同じ質問票を用いて重慶を対象に調査を行った。市の中心に位置する渝中区のみ2つの街道委員会が、他の4区からは1つの街道委員会が選び出され、結果的に1026サンプルが得られた。実査は1998年10月からほぼ1カ月をかけて行われ、すでに単純集計は完成している。現時点で天津調査と重慶調査の結果と比べてみると、重慶の方が1)平均収入が低く金銭指向が強い、2)政治的無関心が強く、国営企業の影響力が強い、といった特徴を見いだすことが出来そうであるが、詳細な分析は今後に期さなければならない。専門書を刊行することを目標にしながら、今後とも国内外の研究者と連絡を続けて行く予定である。2年間に跨る調査研究の一年目は、前半でまず、研究メンバー間でのブレインストーミングと問題点の洗いなおし、従来の研究動向のレビューを行った。そうすることによって、各自の問題意識が鮮明になるとともに、どのような研究を行えば現代中国の中間階級の特質を掴むことができるかが明確になると考えたからである。そして、これを踏まえて8月末に外国人研究者を招へいして合同研究会を開催し、基本的な仮説を明確にするとともに、1)調査地点を天津と重慶にすること、2)これに香港や台北のデータも踏まえた比較研究を進めること、3)質問票調査による中間階級の分析に専念すること、4)同時に、各自が行うフィールドワークによるデータを利用し、分析の深みを出すことなどが確認された。また、重要な論点としては、世代内・世代間の職業移動や地域移動がどの程度頻繁に起こっているか、移動が政治意識や価値観の変化にどのような影響を及ぼしているか、実態としての中間階級に果たして「中国的」特徴は見られるか、といった点が挙げられ、今後の分析の焦点とすることが確認された。1998年9月からは、天津社会科学院社会学研究所のメンバーを中心に、天津市調査グループが組織され、研究協力者である潘允康氏が調査の総指揮にあたった。潘氏の献身的な努力により、天津市区内の5つの区を対象に多段層化法によるランダムサンプリングによる質問票調査が実施され、その結果と比較するレファランスとしての中間階級サンプルを、経営者が集まる諸団体を通じて集め、前者は1200サンプル、後者は800サンプル、合計して2000サンプルが集まることになった。

現在、プロジェクトメンバーが、それぞれの関心に応じてデータ分析を行っている最中で、最終的なアウトプットは出ていない。来年度の重慶調査との比較軸も含め、各自が問題意識を暖めているところである。調査研究の2年目となる今年は、昨年苦労して作成した質問票をほぼそのまま利用して重慶で調査を行うことにエネルギーを集中した。現代中国の中間階級を理解するには、一都市での調査だけでなく、複数の都市を対象に質問票調査を行う必要があると判断したからである(この点も前年に確認済み)。沿海部で改革・開放が進んでいる天津市と、同様に直轄都市でありながら内陸部に属し、必ずしも思うとおりに発展していない重慶市を比較研究の対象とすることで、中国の現状を多面的に把握しようとしていることは指摘するまでもない。重慶で調査を実施するにあたり、研究代表者である園田が潘とともに重慶に赴き、重慶社会科学院の協力を得ることにした。調査を行うにあたり、比較可能性が保障されるようなサンプリングが可能かどうか(市区のみに限定し、街道委員会をユニットにサンプリングできるかどうか)、質問文に不明な部分がないかなど、詳細な検討を行った。実査は1998年10月からほぼ1カ月の時間をかけて行われた。サンプリングにあたっては、中間層が多く存在していると思われる渝中区から2つの調査地を選定し、残りの4区(沙坪土貝区、江北区、南岸区、九龍坡区)からは1つの調査地を選定した。すでにデータは入力され、現在はクリーニングを行っている段階である。現時点で天津調査の結果と比べてみると、1)平均収入が低く金銭指向が強い、2)政治的無関心が強く、国営企業の影響力が強い、といった特徴を見いだすことが出来そうであるが、詳細な分析は今後に期さなければならない。最終的には、他の調査プロジェクトとの結果を含め、現代中国における中間階級調査をめぐるワークショップを開催し、専門書を刊行する予定となっている。
平安中期私家集における表現と構成について

本研究では、平安中期家集の表現と配列方法の変遷と、それによる作品内世界構築の実態を明らかにするため、25年度は『忠見集』『馬内侍集』を調査対象として研究を進めた。『忠見集』は西本願寺本、歌仙家集本、書陵部本(510・12)の比較を行った。表現では、西本願寺本が代表的な伝本ではあるが、他本の方が助詞を伴って分かりやすい本文である場合や、具体的に書かれている箇所が見られた。それは他本が本文を改め、西本願寺本の方が古態を残している可能性も考えられるため、さらに精査する必要がある。配列では、西本願寺本と歌仙歌集本は前半には公的な歌が、後半には私的な歌が配列されていることに特徴がある。この配列方法は『中務集』とも類似し、私家集の配列方法の一つのパターンといえる点で注目される。書陵部本の配列は上記の二本とは大きく異なり、歌合歌や恋愛歌を意識的に抜いて、歌をグループ化して配列した編纂方法である。これは前年度に調査した『信明集』の三類本が、一類本の配列を改編し恋愛歌に注目した独自の物語家集を形作っていたことに類似した現象である。特定の内容を意図した配列によって、作者の人物像や人生に焦点を当て、新たに作品世界を作る編纂方法であり、同時代私家集への影響も含めて極めて重要である。『馬内侍集』は三手文庫本(契沖筆)系統、御所本、水野家旧蔵本がある。三手文庫本が諸本の中で書写年代が最も古く、原型に近い形を伝えていると考えられる。配列は、詠歌状況に関連性がない歌であっても言葉の繋がりを意識した類聚的な配列で、歌群や歌同士を円滑に繋げようという意図が見られる。『紫式部集』や『伊勢大輔』などの同時代の女性私家集にも共通する配列方法であり、年代順配列から独自の配列意図による連想や類聚による構成方法へと変遷する特徴の一つとして捉えられる点で重要である。(抄録なし)本研究の目的は、平安中期私家集の表現と配列方法の変遷と、それによる作品内世界構築の実態を明らかにすることである。24年度は『中務集』『信明集』『清正集』を調査対象として研究を進めた。『中務集』は一類本諸本と近年公開された資経本を中心に比較を行った。表現では、資経本は他本に比べて古い本文を残し得る可能性を見出した。配列では、資経本は特に中務の娘や娘婿、孫たちなど、家族間で交わされた贈答などを特有歌として持つ。親族の歌を残そうとする編纂方法は近親者の歌を集めた同様の家集への影響なども含め注目できるものである。『信明集』では、一類本から三類本の伝本5本を比較した。表現は一類本の北村家蔵本や資経本の本文が古態を残している箇所が見られる。また、一類本を改編して出来た三類本も古態が残る箇所があり注目される。配列は、一類本では中務という特定の人物を取り上げて42首という大きな歌群でその恋愛事情を語っていく構成が見られた。これは物語性を意図した独自の配列である。また、三類本では、一類本の歌の配列を改編してさらに物語的な家集を形作っている。より複雑な家集編纂方法の発達の一旦として重要視すべきものである。『清正集』は一類本から三類本の伝本3本を比較し、投稿を受理された論文「『清正集』試論一表現と配列から-」において、表現については一類本の詞書の中で示されていた具体的な場所や詠者の感情を表す表現が、二類本と三類本では簡略化や脱落している傾向があることを明らかにした。また配列については、一類本は勅撰集的配列という大枠の中で、季節歌ごとに時間の推移による配列や、冒頭歌と末尾歌の対応関係、歌語や景物、贈答相手によって小グループが形成された精緻な配列が見られることを確認した。他撰といわれている一類本が自撰の形を留めていることを明らかにした点で意義があると考えている。

これは前年度に調査した『信明集』の三類本が、一類本の配列を改編し恋愛歌に注目した独自の物語家集を形作っていたことに類似した現象である。特定の内容を意図した配列によって、作者の人物像や人生に焦点を当て、新たに作品世界を作る編纂方法であり、同時代私家集への影響も含めて極めて重要である。『馬内侍集』は三手文庫本(契沖筆)系統、御所本、水野家旧蔵本がある。三手文庫本が諸本の中で書写年代が最も古く、原型に近い形を伝えていると考えられる。配列は、詠歌状況に関連性がない歌であっても言葉の繋がりを意識した類聚的な配列で、歌群や歌同士を円滑に繋げようという意図が見られる。『紫式部集』や『伊勢大輔』などの同時代の女性私家集にも共通する配列方法であり、年代順配列から独自の配列意図による連想や類聚による構成方法へと変遷する特徴の一つとして捉えられる点で重要である。研究対象とした家集について、,各諸本の本文と配列を比較して調査分析を行い、調査結果が出た家集については論文にして公表している。今後は、調査をさらに進めている『信明集』『中務集』について、その成果を論文もしくは学会発表にて報告することと、今年度の研究対象である『忠見集』『馬内侍集』についての調査を進め、成果を公表する。(抄録なし)
日本語音声の韻律的特徴に関する言語学的理論の研究

上野善道は前に引き続き、複合語のアクセント形成について各地の方言調査を行ない、複合語のアクセントの決まり方に3つの型があることを明らかにした。(1)前部要素決定型(X型):九州南部の二型アクセント方言。(2)後部要素決定型(Y型):東京方言、萩市見島方言、金沢方言。(3)前後部関与型(XY型):京都方言。「高中」の下降音調の存在を確認し、これを有する方言を新たに鹿児島県に幾つか発見した。また、句音調について各地の方言を調べ、全体で16種の型が認められることを明らかにした。荻野綱男は、丁寧さが音声にどのように現われるかとうい問題について実験的研究を進め、本年度は発言のし方を変えて作った見本文を学生に聴取させて、その受け取り方を調べた。(〉の左辺が丁寧度が高い)(男)「ゆっくり」〈「早く」。(女)「平坦音調」〉「起伏音調」(男)「高くゆっくり」〉「低くゆっくり」(女)「低くゆっくり」〉「高くゆっくり」井上史雄は大学院生の協力を得て、前に続けて「尻上がり」音調を合成音声を用いて調査した。音調の開始部のF。の高さ、全体の長さを変えた音声を作り、学生に聞かせた。その結果、音調の落差が大きいほど尻上がり度が高く感じられ、全体の半分にした音では尻上がりは感じられなかった。なお調査法は整正して続ける必要がある。C3班全員に他班から応援も求めて、公開のパネル・ディスカッションを行った。テーマは「言語における韻律の機能」。討論に十分な時間をかけたために、かなり細かい議論を展開することができ、大きな収穫を得ることができた。音調の開始部のF。
続発性不妊、分娩後の月経発来、次子妊娠希望の背景因子に関する研究

分娩1、2、3年後の調査結果(毎年約700人)で、分娩後の月経発来が従来の報告よりも遅れている可能性が示唆された。また続発性不妊は分娩3年後の非妊婦の11%に存在し、その60%は原因不明であった。分娩13年後に16%が育児の大変さを理由に次子の妊娠希望が無く、19%は経済的理由で諦めており、育児負担の軽減や経済的支援の重要性が示された。また分娩13年後、挙児希望が無いのに23%が避妊しておらず家族計画指導の重要性も明らかとなった。本研究結果と「子どもの健康と環境に関する全国調査」結果とを連結し、続発性不妊患者の発症予防、少子化対策と望まない妊娠の予防対策への重要な情報提供を行う予定である。長野県上伊那地区で実施されているエコチル調査について、十分な説明の上で調査協力していただける妊婦をリクルートしている医療機関へ出向き、本研究への協力を依頼した。各医療機関で妊婦へエコチル調査の説明を行っているリサーチコーディネーターに対し、今回我々が独自に行う本研究の目的と内容を十分に説明し、エコチル調査の説明時に、本研究の説明も行っていただき、妊婦さん用に作成した説明書と同意書を配布していただいた。また、上伊那地区で今後妊娠する可能性がある女性やその家族にも、エコチル調査と本研究への協力を呼びかけるためのイベントを企画して、平成25年11月9日に実施した。さらに、FM長野からの取材を通じて、本研究に参加していただくことへの協力を呼びかけるメッセージを伝えて放送していただくことができた。以上のような活動の結果、平成26年3月末までに本研究への参加について847人から文書による同意が得られており、分娩1年後のアンケートを郵送するためのデータ入力作業を行っている。また、本研究の目的の一つである望まない妊娠の予防対策としては、本研究の成果を待つまでもなく、中学生の段階からの性教育の重要性は明白であるため、養護教員と協力して『性感染症と望まない妊娠』というタイトルでの性教育講演会を中学3年生と教員を対象に3校の中学校で実施した結果、受講した生徒および教員から、「非常にわかりやすい、有意義な講演会であった」との高い評価を得た。以上のような活動の結果、平成27年3月末までに、エコチル調査への参加について2705人から、その内本研究への参加について979人から文書による同意が得られており、分娩1年後のアンケートを409人へ郵送し、311人から返答を得ている。また、不妊外来受診者が、外来受診時にどの程度の精神的ストレスを感じているかを調査するため、唾液中アミラーゼの測定によるストレス強度の測定を開始するよう準備を始めている。ストレスの大きい方と小さい方で群分け可能であれば、どのような属性の方達がストレスが大きいかを調査する予定である。長野県上伊那地区で実施されているエコチル調査に協力していただける妊婦をリクルートしている医療機関へ出向き、今回我々が独自に行う本研究の目的と内容を十分に説明し、エコチル調査の説明時に、本研究の説明も行っていただき、妊婦さん用に作成した説明書と同意書を配布していただいた。さらに、上伊那地区で今後妊娠する可能性がある女性やその家族にも、エコチル調査と本研究への協力を呼びかけるための企画として、FM長野からの取材を通じて、本研究に参加していただくことへの協力を呼びかけるメッセージを伝えて放送していただいている。このような活動の結果、エコチル調査へ参加した2705人の内、本研究への参加について847人から文書による同意が得られた。平成27年11月に分娩1年後のアンケートの郵送が完了し、740人から返答を得ており(回収率:87.3%)、データ入力作業と回答結果のまとめに取り組んでいる。また、分娩2年後のアンケートの郵送も開始しており、平成28年3月末までに、412人へ郵送し、304人から返答を得ている(回収率:73.8%)。現在、分娩2年後のアンケートを郵送するための準備を継続的に行っている。また、本研究の目的の一つである望まない妊娠の予防対策としては、本研究の成果を待つまでもなく、中学生の段階からの性教育の重要性は明白であるため、養護教員と協力して『性感染症と望まない妊娠』というタイトルでの性教育講演会を中学3年生と教員を対象に4校の中学校で実施した結果、受講した生徒および教員から、「非常にわかりやすい、有意義な講演会であった」との高い評価を得た。

加えて、不妊外来受診者が、外来受診時にどの程度の精神的ストレスを感じているかを調査するため、唾液中アミラーゼの測定によるストレス強度の測定を開始しているが、現時点では、どのような属性でストレスが大きいか同定するには至っていない。今回我々が独自に行う本研究の目的と内容を説明した結果、847人の妊婦から文書による研究参加の同意が得られており、分娩1年後のアンケートは740人から返答を得て解析を始めている(回収率:87.3%)。分娩2年後のアンケート回収率が70%としても600人程度のデータ解析が可能となる予定であり、本研究の目的が達成される見通しがついてきている。エコチル調査へ参加協力の同意を得た2601人の分娩者の内、我々の独自研究への参加について859人から文書による同意が得られた。分娩1年後アンケートは847人に郵送(12名は全体調査協力中止)し、743人から返答を得た(回収率:87.3%)。平成28年11月に分娩2年後のアンケートの郵送が完了した。分娩2年後アンケートは841人に郵送(6人は全体調査協力中止)し、700人から返答を得た(回収率:83.2%)。現在、分娩3年後アンケートを412人に発送し317人から返答を得ている(回収率:76.9%)。それぞれのデータ入力作業と回答結果のまとめに取り組んでいるが、分娩後の月経発来時期に関しては、従来から一般的に言われている期間よりも幅がある可能性があり、夫婦生活における避妊に関する回答も、今後の避妊指導の重要性を認識させられる結果が得られている。また、本研究の目的の一つである望まない妊娠の予防対策としては、本研究の成果を待つまでもなく、中学生の段階からの性教育の重要性は明白であるため、養護教員と協力して『性感染症と望まない妊娠』というタイトルでの性教育講演会を中学3年生と教員を対象に5校の中学校で実施した結果、受講した生徒および教員から、「非常にわかりやすい、有意義な講演会であった」との高い評価を得た。加えて、不妊外来受診者が、外来受診時にどの程度の精神的ストレスを感じているかを調査するため、唾液中アミラーゼの測定によるストレス強度の測定を実施したが、どのような属性でストレスが大きいかの同定には至らなかった。分娩後3年以降も、エコチル調査と本研究への継続的な協力を呼びかけるための企画として、FM長野からの取材を通じて、本研究に参加していただくことの重要性を伝えて放送していただいている。本研究の目的と内容を説明した結果、847人の妊婦から文書による研究参加の同意が得られており、分娩1年後アンケートは743人から返答を得た(回収率:87.3%)。分娩2年後アンケートは700人から返答を得た(回収率:83.2%)。分娩3年後のアンケート回収率が70%としても600人程度のデータ解析が可能となる予定であり、本研究の目的が達成される見通しがついている。また、分娩1年後アンケートと分娩2年後アンケートから、分娩後の月経発来時期に関する基礎データが取れている。本研究協力者への分娩1、2、3年後アンケートに、各742人(回収率:87.6%)、702人(同:83.5%)、692人(同:83.1%)の回答を得た。平成30年4月時点では分娩4年後アンケートを郵送中である。月経再開は分娩後6ヶ月以内33%、712ヶ月35%、1318ヶ月21%、1924ヶ月4%、2年後無月経1%、1年後以降の詳細不明6%であった。従来の産後8ヶ月頃で約7080%が再開するとの報告に対し、本調査では産後8ヶ月41%、10ヶ月56%、1年後でも68%しか再開されておらず、従来よりも月経再開が遅れている可能性が示唆された。
住血吸虫DNAに存在するレトロウイルス関連配列とその発現・機能の解析

昭和63年度から平成2年度までの研究で,われわれは住血吸虫DNAに存在するレトロウイルス関連配列について次のような事実を明らかにした。1.マウスtype C xenotropic及びecotropicウイルスのenv領域,ecotropicウイルスのgag領域及びpol領域と相同性を持つ配列が,その存在様式は異なるけれども日本住血吸虫・マンソン住血吸虫の成虫や虫卵に存在した。2.マウスtype A及びendogenous type Cレトロウイルスと強い相同性を持つ配列が日本住血吸虫成虫とマンソン住血吸虫虫卵DNAに存在したが,マンソン住血吸虫成虫DNAでは欠落していた。3.外来性ウシ白血病ウイルス・内在性ブタレトロウイルスの配列に類似する配列が日本住血吸虫・マンソン住血吸虫の成虫及び虫卵に存在した。4.マウスxenotropicレトロウイルス(Bv2)のenv及びgag遺伝子で免疫したヤギ血清を用いた酵素免疫測定法で検索した結果,抗Bv2 gp70(env遺伝子産物であるウイルス外被膜蛋白質)抗体で住血吸虫雄成虫のtegument下層と雌成虫の卵黄腺に特異的反応が認められた。ウェスタンブロット法でも各々に特異的なバンドが検出されたが,そのパタ-ンは種や性差によって異なった。5.日本住血吸虫・マンソン住血吸虫の虫卵及び成虫のゲノムDNAをサザンブロット法により比較検討した結果,マンソン住血吸虫成虫では発育に伴うDNAの再編成と欠失が認められた。6.PCR法による検索では,レトロウイルスのpol領域関連配列が両種住血吸虫DNAで増幅されたが,その程度はマンソン住血吸虫成虫で低く,gag領域は日本住血吸虫雄成虫とマンソン住血吸虫虫卵DNAでのみ,env領域はマンソン住血吸虫雄成虫DNAで増幅が認められた。7.両種住血吸虫DNAにはレトロウイルス関連配列の他に,B1・B2・moー2など各種の宿主(マウス)関連反複配列が検出された。今後さらに,これらの配列の住血吸虫DNA中における在存様式と機能の解析を進める予定である。昭和63年度までの研究で、われわれはxenotropicおよびecotropicマウスtypeCウイルスのenv領域と相同性のある配列が、日本住血吸虫、マンソン住血吸虫成虫および虫卵DNAに存在し、かつマンソン住血吸虫ではその存在様式が異なることを明らかにした。マウスecotropicウイルスのgagおよびpol領域に強い相同性を持つ配列が日本住血吸虫およびマンソン住血吸虫虫卵のDNAにのみ存在すること、さらに日本住血吸虫成虫およびマンソン住血吸虫虫卵DNAにはマウスtypeAレトロウイルスと強い相同性を持つ配列が存在するが、マンソン住血吸虫成虫DNAではこの配列が欠落していることを解明した。また、外来性ウシ白血病ウイルスおよび内在型ブタレトロウイルスの配列に類似する配列が、日本住血吸虫、マンソン住血吸虫成虫および虫卵に検出された。他方、マウスxenotropicレトロウイルス(Bv_2)、ecotropicレトロウイルス(R-MuLV)のenvgag遺伝子で免疫したヤギ血清を用いて酵素免疫測定法(ABC法)およびウエステタンブロット法で検索した結果、抗Bv_2gp70(env遺伝子産物であるウイルス外被膜糖蛋白質)抗体で日本住血吸虫およびマンソン住血吸虫の雄虫の外被下層と雌虫の卵黄腺に特異的反応が認められた。ウエスタンブロット法でも各々に特異的なバンドが検出されたが、そのパターンは種や性差によって異なることが判った。

われわれは平成元年度までの研究で、マウスtype C xenotropic及びecotropicウイルスのenv領域、ecotropicウイルスのgag及びpol領域と相同性を持つ配列が、その存在様式は異なるけれども、日本住血吸虫・マンソン住血吸虫の成虫あるいは虫卵に存在し、また、抗BV2gp70抗体(env遺伝子産物であるウイルス外被膜糖蛋白質)で住血吸虫雄成虫の外被下層と雌成虫の卵黄腺に特異的反応が見られることを明らかにした。内在性xenotropicレトロウイルスの外被膜糖蛋白質に対して自己抗体を産生する(NZBxNZW)F1マウスに日本住血吸虫とマンソン住血吸虫のセルカリアを各々感染させて、そのレトロウイルス抗原の発現を寄生率(成虫回収率)の変動を指標として検討したが、著明な因果関係は認められなかった。両種住血吸虫虫卵にBLVとMCFを各々感染させ、その虫卵及び成虫DNA中のレトロウイルス関連配列の存在をサザンブロット法で検索したが、現在までのところ明確な感染成立の証拠は得られていない。PCR法を用いて住血吸虫遺伝子中のマウスレトロウイルス関連配列の検出を試みた。この場合、用いるプライマ-の配列が限定できないので、アニ-リングの温度・時間及びPCRのサイクル数に種々の検討を加えた。プライマ-としてはMo-MuLVのgag、polそしてenv領域について作成し、検出にはF-MuLVプロウイルスDNAをプロ-ブとして用いた。polのプライマ-を用いた反応では住血吸虫や肺吸虫DNAからその関連配列が増幅される条件を設定でき、これによりダイレクトシ-クエンシングによる解析の可能性も考えられた。それに対してgagのプライマ-を用いたPCRでは現在まで日本住血吸虫とマンソン住血吸虫でのみ配列の増幅が見られた。また、envのプライマ-を用いたPCRについては検討中であるが、マンソン住血吸虫成虫で増幅される場合があり、これらの各DNA中での存在様式に差のあることが示唆された。われわれはこれまでの研究で,マウスtype C xenotropic及びecotropicウイルスの<env>___ー領域,ecotropicウイルスの<gag>___ー領域及び<pol>___ー領域と相同性を持つ配列が,その存在様式は異なるけれども日本住血吸虫・マンソン住血吸虫の成虫あるいは虫卵に存在し,また,抗Bv2 gp70抗体で住血吸虫雄成虫のtegument下層と雌成虫の卵黄腺に特異的反応が見られることを明らかにした.さらに,Polymerase chain reaction法(PCR)を用いて住血吸虫遺伝子中のマウスレトロウイルス関連配列の検出を試みた.プライマ-セットにはMoーMuLVの<gag>___ー,<pol>___ー及び<env>___ー領域の20マ-を作成し,検出にはFーMuLVプロウイルスDNAをプロ-ブとして用いた.
細胞内酵素活性のin situ real time観測法の開発

本研究では、「生きた細胞」を「非破壊的」に用いて、細胞内酵素の分布と活性の変化を観察し測定する手法(観測法)を開発した。そのためのモデル系として、主にヒトデ卵母細胞内のプロテアーゼ活性を測定してきた。これまでの問題点として、酵素基質が一般に疎水性であり、水に溶け難いことがあげられる。本研究で開発された細胞膜不透過性の蛍光物質(7-アミノクマリン-4-メタンスルフォン酸)にSuc-Phe-Leu-Argを結合したプロテアーゼ基質を合成したところ、高濃度(5mM)でも水溶液になった。これをヒトデ卵にマイクロインジェクションしたところ、蛍光量が経時的に増加した。プロテアソーム特異的な阻害剤であるMG115またはZ-leu-leu-leu-Hで卵を処理したところ、蛍光量に変化がなくなった。さらに、この基質の分解は、カルパインの阻害剤であるE-64では阻害されなかった。これらの結果から、本基質によってプロテアソーム活性がin vivoで測定できることが示された。ヒトデ未成熟卵は、1-メチルアデニン(1-MA)で処理すると成熟する。卵成熟過程における、本基質の分解初速度を求めたところ、1-MA処理以降、上昇し始め、約一時間後に活性が最大になることが明らかになった。すなわち成熟卵と未成熟卵のVmaxは、それぞれ2.3と0.84(mM/min)だった。一方Kmについては、それぞれ60と30(mM)であった。よって本観測法によって、「生きた細胞」の酵素活性の変化が、リアルタイムで測定できることが示された(特許出願準備中)。天然に存在する新規発光基質の探索を目的として、群体ホヤの一種であるクラベリ-ナの発光機構についても解析し、発光細胞を同定した。生命の基本単位である細胞は、様々な内在性酵素の活性と局在性を厳密に制御することによって、その複雑で精緻な生命活動を実現している。現在までの研究手法は基本的に破壊検査によるものであり、実時間(real time)での酵素活性測定とその分布の動的変化の観察はほとんど不可能であった。本研究では、「生きた細胞」を「非破壊的」に用いて、細胞内酵素の分布と活性の変化を観察し測定する手法(観測法)を開発する。本年度は、分解されると発蛍光となる酵素基質を開発し、これを細胞内に注入し、顕微測光することにより酵素活性を測定した。細胞膜不透過性の蛍光物質、7-アミノクマリン-4-メタンスルフォン酸のアミノ基に種々のペプチドを結合し、プロテアーゼ基質(Bz-Arg-CAMS,Z-Phe-Arg-CAMS,Z-Phe-Leu-CAMS)を合成した。これらをヒトデ卵内にマイクロインジェクションしたところ、それぞれの分解速度は、0.033、0.23、1.3(10^<-18>mole/min/oocyte)であった。またピラニン誘導体として、フォスファターゼ、フコシダーゼ基質を合成した。これらの合成基質を、ヒトデ卵にマイクロインジェクションして、一次元測光における基質の分解速度を定量中である。細胞内外の酵素活性を別々に測定する手法(vectorial assay)を確立するために、ホヤの精子を用いて上記のプロテアーゼ基質を投与したところ、精子活性化に伴って基質分解量が増加することを見出した。このことは精子活性化に伴って細胞外に活性型プロテアーゼが分泌されることを示唆しており、現在検討中である。疎水性の高いアミノ酸配列を持つプロテアーゼ基質は、水溶液になり難いことが明らかになった。これを避けるために、さらに親水性の蛍光物質の合成を検討している。