hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
完全合成培地を用いたブタ体外成熟卵子の成熟機構の解明と胚の体外生産技術の向上

また、FSHとTGF-αを含むPOMへのHAPLN-1あるいはVCANの添加は、卵丘・卵子複合体(COCs)における卵丘細胞の膨化を促進することを示した。そこで、FSHとTGF-αを含むPOMにHAPLN-1、VCANおよび血清由来ヒアルロナン結合タンパク質(ITI)を単独あるいは組み合わせて添加してCOCsを培養(体外成熟)した後、体外受精・発生培養を行い、体外受精および胚の発生成績を調べた。HAPLN-1、VCANおよびITIを単独あるいは組み合わせて添加して成熟培養したところ、体外受精率、胚盤胞への発生率および胚盤胞の細胞数は、すべての組み合わせ間で差を認めなかった。しかし、VCANを添加した場合では、添加しない場合に比べ、多精子受精率が有意に高く、胚盤胞の細胞数が少なかった。以上より、FSHおよびTGF-αはブタ卵子体外成熟培養において卵子成熟を促進し、卵丘細胞膨化関連因子の遺伝子発現に影響を及ぼして完全合成培地によるブタ胚の体外生産効率を向上させるとともに、卵丘細胞膨化関連因子は、体外成熟卵子の体外受精能や胚発生能に影響を及ぼすことが判明した。本年度計画の通り、HAPLN-1およびVCANを用いて、成分既知完全合成培地によるブタ卵子の体外成熟培養における卵丘細胞の膨化、体外受精後の受精率、胚発生率に及ぼす効果について検討し、それらがFSHおよびTGF-αにより誘導され、卵丘細胞の膨化に関与することを明らかにした。24年度が最終年度であるため、記入しない。HAPLN-1およびVCAN単独では体外受精能や胚発生能に明らかな効果は認められなかったため、これら因子間あるいは他の因子を含めた因子間の相乗効果について検討することで、ブタ体外成熟卵子の成熟機構を精査し、ブタ胚の体外生産技術の改善を図る。
損益相殺的な調整の法的意義―重複てん補の調整原理に対する損害論からのアプローチ

本研究課題は、損益相殺的な調整に関する総合的な理論構築を目指すため、具体的には、1不法行為に基づく損害賠償請求権の遅延損害金発生時と損益相殺的な調整の基準時の関係、2損益相殺の意義及び損益相殺的な調整との関係、3損益相殺的な調整とアメリカ法の副次的給付非控除原則の比較、4損益相殺的な調整と過失相殺の先後関係を分析・研究するものである。研究期間の2年目にあたる本年度は、まず、課題3に関し、アメリカ法の文献・資料の調査に当たった。アメリカ法における副次的給付非控除原則を理解する前提として、アメリカにおける医療システム、保険制度などの理解が必要であったため、これに関する文献や資料(webを含む)を収集し、理解をすすめた。そのうえで、連邦法における副次的給付非控除原則が修正されている様々な州法(NY州やCA州など)の内容とその背景、さらに、オバマケアによる医療制度の改革が副次的給付非控除原則に与える影響を指摘する文献などを読みすすめた。これらについてはプライベートな研究会で報告し、それを踏まえて、日本法との比較研究を進めている。また、課題2および4に関係し、最判平成30年9月27日民集72巻4号132頁を契機に、代位制度の趣旨を改めて検討している。損益相殺と表裏にある代位に関し最高裁が新たに示した判断の背景を検討することで、重複てん補をどのように調整するのかという点について、そもそも民法はどのように考えているのか、また、保険制度ではどのように考えているのかということを明らかにしたい。この点もすでに研究会で報告しており、そこでの議論を踏まえ、さらに発展させたうえで、論文の形で公刊したいと考えている。本研究課題は、4つの具体的な課題を検討することで損益相殺的な調整の法的意義を明らかにすることを目的とするものであるが、それぞれの課題を検討するなかで新たな課題がいくつも見つかっている。それに加えて、新たな判例や文献が出されることにより、研究素材が広がっているという状況にはあるが、5年の研究期間のうちの2年目という時期にあり、研究課題や視点については、必要に応じて拡大し、また修正を加えながら、最終的な研究課題に向かって研究を進めることができていると考える。もっとも、研究成果の公刊ができずにいるので、部分的に分けることができるものについては、研究成果として今後公刊できるよう努力していきたい。英語文献の収集や読み解きに時間がかかるなど思い通りにいかない部分もあるが、個別の研究課題は最新の議論や判例を踏まえて修正をしつつ、ある程度順調に研究を進めることができていると考える。平成31年度は研究期間5年間の中間の年となるので、これまでの研究の過程で出された成果をいったん整理し、今後の課題を改めて確認し、計画を練り直したいと考えている。また、可能であれば、部分的な成果を論文として公刊したいと考えている。様々な論点が重なり合っている研究課題のため、部分的な成果をまとめることに課題があるが、研究会などに参加することで諸先輩からのアドバイスを受けたいと考えている。また、外国語文献の読み解きに時間を要している点についても、文献の取捨選択・優先順位付けを行いながら、他分野の専門家にも助言を得ながら、時間を短縮できるよう努力したいと考えている。新しい判例や文献にも目を配り、必要に応じて研究計画を修正しながら、本研究課題の目的を達成するために、研究を推進したいと考えている。本研究課題は、損益相殺的な調整に関する総合的な理論構築を目指すため、具体的には、1不法行為に基づく損害賠償請求権の遅延損害金発生時と損益相殺的な調整の基準時の関係、2損益相殺の意義及び損益相殺的な調整との関係、3損益相殺的な調整とアメリカ法の副次的給付非控除原則の比較、4損益相殺的な調整と過失相殺の先後関係を分析・研究するを予定している。研究期間初年度の本年度は、研究計画全体の準備を行い、上記課題3及び1の研究に着手した。研究計画全体において、課題3がアメリカ法との比較を行うことから、資料収集等に時間を要すると判断し、特に、現在、手元にあるアメリカ不法行為法の概説書やケースブック等の確認及び所属機関で使用できるアメリカ法判例データベース内に関係資料がどのくらいあるのかの確認を行い、今後、必要となる文献等のリストアップを行った。そして、その調査の中で得た資料を元に、課題3の導入の研究として、アメリカ法における副次的給付非控除原則(Collateral Source Rule)は今でも原則として認められているものの、州法ではその修正がなされている州が多いことが明らかになったため、まずは、その代表的な州としてNY州法を検討課題として、その内容・判例を検討している。この点については、現在、研究ノートを執筆中である。今後、リストアップした文献等を手に入れたうえで執筆をすすめ、公刊する意義があると判断すれば、次年度に公刊する予定である。また、課題1については、研究をすすめ、会員となっている研究会で報告をし、そこで得られた知見や疑問に答えるため、さらに研究をすすめている。当初は、上記研究実績の概要に示した1から4の具体的課題について、その順序で検討する予定で課題1より研究を始めたが、課題3のアメリカ法との比較について、アメリカにおける議論が予想よりかなり多く、そして広くなされていることから、その資料や論文を収集し、検討することに時間を要すると判断し、初年度から課題3にも着手することにした。そのため、当初の予定とは異なる進捗状況とはなったが、初年度としてはおおむね順調に進展しているといえる。今後は、課題3のみならず他の課題

2、4についても可能なかぎり並行して行うことにより、さらに研究を深めていくことができると考えている。本研究課題は、損益相殺的な調整に関する総合的な理論構築を目指すため、具体的には、1不法行為に基づく損害賠償請求権の遅延損害金発生時と損益相殺的な調整の基準時の関係、2損益相殺の意義及び損益相殺的な調整との関係、3損益相殺的な調整とアメリカ法の副次的給付非控除原則の比較、4損益相殺的な調整と過失相殺の先後関係を分析・研究するものである。研究期間の2年目にあたる本年度は、まず、課題3に関し、アメリカ法の文献・資料の調査に当たった。アメリカ法における副次的給付非控除原則を理解する前提として、アメリカにおける医療システム、保険制度などの理解が必要であったため、これに関する文献や資料(webを含む)を収集し、理解をすすめた。そのうえで、連邦法における副次的給付非控除原則が修正されている様々な州法(NY州やCA州など)の内容とその背景、さらに、オバマケアによる医療制度の改革が副次的給付非控除原則に与える影響を指摘する文献などを読みすすめた。これらについてはプライベートな研究会で報告し、それを踏まえて、日本法との比較研究を進めている。また、課題2および4に関係し、最判平成30年9月27日民集72巻4号132頁を契機に、代位制度の趣旨を改めて検討している。損益相殺と表裏にある代位に関し最高裁が新たに示した判断の背景を検討することで、重複てん補をどのように調整するのかという点について、そもそも民法はどのように考えているのか、また、保険制度ではどのように考えているのかということを明らかにしたい。この点もすでに研究会で報告しており、そこでの議論を踏まえ、さらに発展させたうえで、論文の形で公刊したいと考えている。本研究課題は、4つの具体的な課題を検討することで損益相殺的な調整の法的意義を明らかにすることを目的とするものであるが、それぞれの課題を検討するなかで新たな課題がいくつも見つかっている。それに加えて、新たな判例や文献が出されることにより、研究素材が広がっているという状況にはあるが、5年の研究期間のうちの2年目という時期にあり、研究課題や視点については、必要に応じて拡大し、また修正を加えながら、最終的な研究課題に向かって研究を進めることができていると考える。もっとも、研究成果の公刊ができずにいるので、部分的に分けることができるものについては、研究成果として今後公刊できるよう努力していきたい。英語文献の収集や読み解きに時間がかかるなど思い通りにいかない部分もあるが、個別の研究課題は最新の議論や判例を踏まえて修正をしつつ、ある程度順調に研究を進めることができていると考える。次年度は、引き続き、時間を要すると思われる課題3に取り組むとともに、他の課題についても準備を始めていきたいと考えている。課題3については、データベース上で見つからない資料や文献などを集める必要があるが、研究機関の会計ルールが煩瑣であるため、洋書を含む文献の購入には時間がかかる。その時間も利用して、課題2や4にも取り組むこととしたい。
神経保護・再生関連因子の眼内インプラントを用いた緑内障に対する新規治療法の開発

緑内障は我が国で最大の失明原因であるが、現状では眼圧を低下させる点眼薬の使用や手術以外には治療法がない。一方、神経栄養因子の産生細胞をデバイス内に封入し、眼内に留置することによって視機能を改善するという画期的な治療法が米国で検討されている。そこで本研究では同治療法の開発者と共同研究を行い、日本における導入を目標に検討を行う。
無限ラムゼイ理論と実数の組合せ論

ラムゼイ理論的性質や公理についてはまだ未解決なことが多く残されている.例えば,代表的な強制法の性質である可算鎖条件はラムゼイ理論的な性質のひとつであり,「S-spaceが存在しない」,「entangled set of realsが存在しない」,P-ideal Dichotomyなどはラムゼイ理論的な数学的命題だと考えられる.本研究では,(1)可算鎖条件を満たす強制法に関するPrikryの問題についての研究,(2) ideal-based強制法についての性質,(3)特殊でないAronszajn木が存在することと無矛盾な様々なラムゼイ理論的数学的命題,について研究した.Side condition methodは必ずしもCCC強制法では不可できそうにない不可算集合を有限近似で付加するproper強制法のひとつである。Todorcevicはこの手法を用いて「S-spaceが存在しないことが無矛盾である」ことを示し、この位相空間論における未解決問題を解決した。J. ZapletalはS-spaceが存在しないことが無矛盾であるときに用いられたside condition methodがルベーグ測度ゼロの集合族の加法性を保存することを証明し、「S-spaceが存在せず、ルベーグ測度ゼロの集合族の加法性がaleph_1である」ことが無矛盾であることを示した。本年度、これをさらに発展させ、「S-spaceが存在せず、ルベーグ測度ゼロの集合族の被覆性がaleph_1である」ことが無矛盾であることを証明した。証明の最も重要なステップは「S-spaceが存在しないことが無矛盾であるときに用いられたside condition methodがランダム実数を不可しない」ことの証明である。(2) 1980年代にTodorcevicにより導入され、E. Thuemmelにより再定義されたTodorcevic orderingについても研究した。Thuemmelは「あるTodorcevic orderingはsigma-finite chain conditionを持つがsigma-bounded chain conditionを持たない」ことを示し、Horn-Tarskiの問題に答えた。測度を備えたブール代数はsigma-bounded chain conditionを持つので、Thuemmelの与えたTodorcevic orderingは測度を持たない。Thuemmelの結果を発展させ、「多くのTodorcevic orderingは測度を備えた正則部分ブール代数を持たない」こと、つまり「多くのTodorcevic orderingはランダム実数を付加しない」ことを証明した。これは多くのTodorcevic orderingがランダム実数を付加しない新しいCCC強制法であることを示している。(2) Todorcevic orderingを用いて、「specialでないAronszajn treeが存在する」ことと無矛盾な新しいMartin's Axiomのfragmentを発見した。今年度は「specialでないAronszajn treeが存在する」こととの無矛盾結果について集中して研究した。「specialでないAronszajn treeが存在しない」ことはTodorcevicによるMartin's AxiomのfragmentsのひとつであるK_2'から導かれる。Martin's Axiomから「どんなccc半順序もproductive cccである」という公理C^2が導かれるが、C^2からMartin's Axiomが導かれるかはまだ未解決である。よって「C^2が成り立ち、specialでないAronszajn treeが存在する」ことが無矛盾であることを示すことができれば、この問題は解決する。さらに、この手法をほかの強制法にも応用できることを示し、上記の結果をさらに拡張している。これらの結果は論文The existence of a non-special Aronszajn tree and someconsequences of the Proper Forcing Axiomにまとめ、投稿している。当初の研究計画を順調に達成しているため。そこで,テストケースとして,fPFAの無限生成アーベル群への応用について研究した.具体的には,無限生成アーベル群に関するside-condition methodによる強制法を導入することで,「filtration-equivarentなふたつのaleph_1-separable aleph_1-sizeアーベル群はisomorphicである」ことと「aleph_1-separable aleph_1-sizeアーベル群はEklof-Meklerの標準型を持つ」ことはfPFAから導かれることを証明した.このことから,これらはどちらも連続体濃度がaleph_2よりお大きいことと無矛盾であることが示される.さらに,これらの強制法の性質についても研究した.これらはY-properを満たし,P(omega)上のtowerを保存することも示した.このことから,上記ふたつの命題はChodounsky-Zapletalが導入した強制公理YPFAから導かれ、さらにtower numberがaleph_1であることと無矛盾であることが分かる.上記の一部は2017年度日本数学会秋季総合分化会で発表した.ラムゼイ理論的性質や公理についてはまだ未解決なことが多く残されている.例えば,代表的な強制法の性質である可算鎖条件はラムゼイ理論的な性質のひとつであり,「S-spaceが存在しない」,「entangled set of realsが存在しない」,P-ideal Dichotomyなどはラムゼイ理論的な数学的命題だと考えられる.本研究では,(1)可算鎖条件を満たす強制法に関するPrikryの問題についての研究,(2) ideal-based強制法についての性質,(3)特殊でないAronszajn木が存在することと無矛盾な様々なラムゼイ理論的数学的命題,について研究した.去年に投稿したふたつの論文が掲載決定された。

そのふたつの論文で使われた手法はChodounskyとZapletalにより新しい強制公理へ発展された。Chodounskyとの議論により、ChodounskyとZapletalのこの研究をより強く押し進め、TodorcevicによるMartin's Axiomのfragmentsについての未解決問題へアプローチするきっかけを掴むことができた。この結果をさらに拡張することを考える。Bagaria-Shelahは最近の研究でTodorcevicによるMartin's Axiomのfragmentsに関する研究で新しいアプローチをとっている。彼らの手法をアレンジしてもっと強い結果を導くことを目指す。公理的集合論2015年2月にBagariaとShelahはMartin's Axiomのfragmentsについての論文をarXiveにポストした。この論文のアプローチはとても素朴で、より広い応用が可能だと考えている。まずは研究代表者の過去の研究で用いた手法との融合を考える。そのあとに、Y-ccなどの最近の手法を用いて新たな無矛盾結果を得ることを目指す。(1)では、「Zapletalのideal based forcingsがランダム実数を不可しない」ことを示し、それより「S-spaceが存在せず、なおかつthe Lbesgue measurezero idealのcovering numberがaleph_1であることが無矛盾である」ことを証明した。(2)では、「位相空間Xに対して、Xが強い意味でのhereditarily separable(例えばoperably metrizableなど)か、Balcar-Pazak-Thuemmelのcondition 1のどちらかを満たせば、XからなるTodorcevic orderingsがランダム実数を付加しない」ことを証明した。以上のことから、「おおむね順調に進展している」と判断した。Todorcevicはside condition methodを導入したほか、P-ideal Dichotomyという新しいラムゼイ理論的公理を導入し、「P-ideal Dichotomyが成り立ちなおかつtower numberがaleph_1より大きければ、S-spaceは存在しない」ことを証明した。
心筋増殖過程におけるHippoシグナル機能の解明

心臓前駆細胞は左右側板中胚葉より発生・分化し、正中軸で融合したものが心臓原基となる。これまでに心臓前駆細胞移動にはスフィンゴシン1リン酸(S1P)とその受容体を介した経路が重要であることが知られていたが、どのようにこの移動を制御するのか不明であった。本研究から、hippoシグナル分子Yap1と下流で転写制御されるCtgfaがS1Pの下流で心臓前駆細胞を移動制御することを見出した。さらにこの制御機構は内胚葉細胞で機能し、内胚葉細胞の形態維持に働きかけることで、正常な前駆細胞移動に関与することが明らかとなった。本研究では心筋発生過程でのHippoシグナルの重要性を検証し新たな機能の解明することを目的として研究を行っている。まずHippoシグナルのエフェクターであるYap1の心臓発生過程での役割について検討するため、ゼブラフィッシュ初期胚に対してYap1発現抑制を行った。その結果、左右の側板中胚葉から分化した心臓前駆細胞が正中軸へ移動できず二股心臓の表現型を示すことを見出した。この移動制御はYap1-Tead転写活性依存的におこることを明らかにした。さらにYap1が心臓前駆細胞の背側に位置する内胚葉においてS1P-S1PR2シグナルの下流で機能することを明らかにした。Yap1を抑制した個体では内胚葉のアポトーシスが誘導され、内胚葉細胞の欠損がおこることを見出し、さらに内胚葉細胞を回収してRNA sequenceを行った結果からYap1抑制群ではCtgfaの発現が顕著に抑制されることを見出した。つまり内胚葉においてYap1は内胚葉形態の維持・生存に働き、Yap1-Teadによって転写調節されるCtgfaがこの制御機構に重要であることが明らかになった。これまでS1P-S1PR2シグナルが初期発生過程における心臓前駆細胞移動を制御することを我々を含めたグループが報告しているが、S1PR2受容体から下流で働く移動機構については全く不明であった。本研究により心臓初期発生過程におけるHippoシグナルの重要性が明らかとなり、またはじめてS1Pシグナル下流の移動制御機構が明らかとなったことから、本知見は心臓初期発生過程を理解する上で非常に重要であると考え、次年度も更なる検討を遂行中である。昨年度に続き、心臓発生過程でのHippoシグナルの機能解明を目的として検討した。これまでにHippoシグナルエフェクターであるYap1とその下流で転写制御をうける分子Ctgfaを抑制した個体では、心臓前駆細胞の背側に位置する内胚葉のシート形態が欠損し、正中軸へ向けた心臓前駆細胞移動が阻害されることを明らかにした。本年度は、全身でのYap1-Teadの転写活性化をモニターできるレポーターフィッシュを作成し、個体発生過程を観察したところ、内胚葉細胞においてレポーター活性が観察された。続いて、Yap1またはCtgfa発現抑制した細胞を内胚葉へ分化させたキメラ個体を観察したところ、内胚葉形態が欠損し、心臓前駆細胞の移動過程が阻害されることを明らかにした。一方で、Yap1またはCtgfa発現抑制した細胞を心筋前駆細胞へ分化させたキメラ個体を観察したところ、内胚葉形態・心臓前駆細胞移動ともに正常に発生することが明らかになった。以上の結果からYap1-Teadを介したCtgfa発現制御は内胚葉で細胞自律的に働き、内胚葉細胞の形態維持に働くことを明らかにした。発生生物学S1P-S1PR2シグナルが心臓前駆細胞の移動に関与することは15年程前に報告されたにも関わらず、その下流の機構はこれまで全く不明であった。本研究では心臓発生過程において、新たなHippoシグナルによる制御機構を明らかにし、S1P-S1PR2シグナルの下流で心臓前駆細胞の移動を制御することを見出した。さらに、Yap1-Teadを介して細胞外基質に局在する分子であるCtgfa発現を制御し、内胚葉の細胞生存を制御することを明らかにした。現在、より詳細な作用機構を明らかにしつつあり、計画以上に進展していると考える。当初の目的は心筋初期発生過程における心筋増殖の制御機構を明らかにすることであったが、Yap1が心筋初期発生に影響を及ぼし、正常な心臓形態形成に至る前の段階で作用することが明らかとなった。心筋増殖過程へのHippoシグナルの影響を検討すべく、Gal4-UASシステムによりYap1ドミナントネガティブ体を誘導できるトランスジェニック個体を作製中である。現在S1P-Yap1シグナルによる心臓前駆細胞移動の制御メカニズムの解明に取り組んでおり、より詳細かつ確立した作用機構を明らかにできると考えている。これまでに心筋前駆細胞と内胚葉細胞のそれぞれで特異的に遺伝子発現制御を可能とする敬を確立した。この系を用いてYap1とその下流で働く分子の発現を部位

特異的に抑制し、細胞自律性・非自律性の検討を行う。また当初の目的を遂行するため、Hippoシグナルのドミナントネガティブ体を心筋細胞で誘導できる個体の作製が完了しており、並行して解析を行う。さらに、前年度よりライトシート顕微鏡を用いた解析を行っており、拍動したままの生理的状態で蛍光イメージングを行う系を確立している。今後は、樹立したHippoシグナルを蛍光可視化できるレポーターラインの解析等を行う。
時空間解析法による化学コミュニケーション理解と生物活性リガンドの高次機能評価

本研究では、これまで開発してきた化学プローブを用いた時空間解析技術を統合し、天然・人工リガンドとなる化合物の動作原理を可視化して示すことを目的とする。測定したい分子との反応に着目して化学プローブをデザインするという発想を基に、時間を特定して標的となる生体分子に機能性蛍光分子を導入する原理を開発する。分子認識あるいは酵素反応といった生体内で起こる反応を分光情報(蛍光特性変化等)へ変換できる化学プローブをデザイン・合成する。開発した化学プローブを応用して、分子リガンドの機能を時空間的に解明するための技術プラットフォームを確立する。本プラットフォームを基盤として、本領域における分野融合研究を推進し、新規生物活性リガンドの高次機能評価・スクリーニングを行い、「化学コミュニケーション」の統合的理解を深める。具体的な例としては、破骨細胞の骨吸収活性をイメージングする化学プローブの開発、内在性膜タンパク質(GPCR)のリガンド結合に伴う構造変化をイメージングできる化学プローブの開発を中心に取り組む。本年度は、前年度に新たに開発した赤色蛍光プローブを用いて、破骨細胞活性のイメージングを行った。破骨細胞は骨組織を溶解し、骨組織の再構築を行っており、その異常な活性は骨粗しょう症や関節リウマチの原因になることが指摘されている。破骨細胞は酸を放出することで骨を溶解するため、低pHで光る蛍光色素によってその活性をイメージングすることが可能と考えられる。pH応答性、非応答性の赤色蛍光プローブを用いたイメージング結果により、骨溶解時に作られる低pH領域を選択的に検出、追跡できるかどうかを確かめた。前年度までに開発したローダミンスピロラクタム型の赤色蛍光色素を基にしたpH応答性蛍光プローブを用いて、マウス体内における骨組織の低pH領域の検出・追跡を行った。二光子励起顕微鏡を用いて、マウスの骨髄腔を観察したところ、骨組織表面の一部からプローブ由来の蛍光シグナルが見られた。一方で、pH非応答性の蛍光プローブを用いた観察では、骨組織表面から一様な蛍光シグナルが見られたため、低pH環境を選択的に可視化できていることが示された。さらに、プロトンポンプをGFPで標識したマウスを用いて、開発した赤色蛍光プローブとのマルチカラーイメージングを行ったところ、プロトンポンプの局在変化に伴い、酸性領域が広がっていく様子を捉えることに成功した。実際にプロトンポンプの機能を阻害する薬剤を投与したところ、投与後徐々に蛍光が減衰していく様子を観察することができ、時空間を制御して薬剤の効果をin vivoにおいて評価できる系を構築できた。また、同様のイメージング系により、破骨細胞の代謝系に作用し、骨吸収活性を抑える薬剤の評価にも適用できることが示された。今後は、内在性膜蛋白質のリガンド結合に伴う構造変化をイメージングできるプローブの開発に取り組む。これまでの蛍光標識抗体を用いた技術では達成できなかった、生きた細胞におけるGPCRなどの内在性膜蛋白質機能の可視化を行う。そのために、小分子・蛋白質ハイブリッドプローブを開発する。蛋白質は標的となる内在性膜蛋白質を特異的に認識するユニットにラクダ科動物由来抗体断片(13 kDa)であるNanobodyを選択する。一方で、標的結合時に蛍光強度を上昇させる蛍光スイッチ小分子として、細胞膜に結合する環境応答性蛍光色素であるNile redを用いる。両要素を当研究室で開発されたPYPタグを用いた蛋白質ラベル化技術と統合するため、PYPリガンド-Nile red連結ラベル化小分子を開発する。上記分子を用いて小分子・蛋白質ハイブリッドプローブを創製する。ハイブリッドプローブのNanobody部位が標的膜蛋白質に結合すると、Nile redが細胞膜に近接、結合し蛍光強度が上昇することが期待できる。ハイブリッドプローブの合成、評価を進め、β2-ARなどに代表されるGPCRの薬剤による機能発現をイメージングによって検出する系を確立する。

前年度までに開発したローダミンスピロラクタム型の赤色蛍光色素を基にしたpH応答性蛍光プローブを用いて、マウス体内における骨組織の低pH領域の検出・追跡を行った。二光子励起顕微鏡を用いて、マウスの骨髄腔を観察したところ、骨組織表面の一部からプローブ由来の蛍光シグナルが見られた。一方で、pH非応答性の蛍光プローブを用いた観察では、骨組織表面から一様な蛍光シグナルが見られたため、低pH環境を選択的に可視化できていることが示された。さらに、プロトンポンプをGFPで標識したマウスを用いて、開発した赤色蛍光プローブとのマルチカラーイメージングを行ったところ、プロトンポンプの局在変化に伴い、酸性領域が広がっていく様子を捉えることに成功した。実際にプロトンポンプの機能を阻害する薬剤を投与したところ、投与後徐々に蛍光が減衰していく様子を観察することができ、時空間を制御して薬剤の効果をin vivoにおいて評価できる系を構築できた。また、同様のイメージング系により、破骨細胞の代謝系に作用し、骨吸収活性を抑える薬剤の評価にも適用できることが示された。本研究では、これまで開発してきた化学プローブを用いた時空間解析技術を統合し、天然・人工リガンドとなる化合物の動作原理を可視化して示すことを目的とする。測定したい分子との反応に着目して化学プローブをデザインするという発想を基に、時間を特定して標的となる生体分子に機能性蛍光分子を導入する原理を開発する。分子認識あるいは酵素反応といった生体内で起こる反応を分光情報(蛍光特性変化等)へ変換できる化学プローブをデザイン・合成する。開発した化学プローブを応用して、分子リガンドの機能を時空間的に解明するための技術プラットフォームを確立する。本プラットフォームを基盤として、本領域における分野融合研究を推進し、新規生物活性リガンドの高次機能評価・スクリーニングを行い、「化学コミュニケーション」の統合的理解を深める。具体的な例としては、破骨細胞の骨吸収活性をイメージングする化学プローブの開発、内在性膜タンパク質(GPCR)のリガンド結合に伴う構造変化をイメージングできる化学プローブの開発を中心に取り組む。本年度は特に破骨細胞の活性をイメージングできる化学プローブの開発を行った。破骨細胞は骨組織を溶解し、骨組織の再構築を行っており、その異常な活性は骨粗しょう症や関節リウマチの原因になることが指摘されている。破骨細胞は酸を放出することで骨を溶解するため、低pHで光る蛍光色素によってその活性をイメージングすることが可能であると考えた。さらに、分子リガンドの吸収・蛍光波長と重なりにくい赤色蛍光で検出するため、新たなpH応答性色素をデザイン、合成し、その光学特性を評価した。低pHで応答する赤色蛍光色素の候補として、π拡張縮環型BODIPY色素に着目し、pH応答性を付与した分子の設計を行った。具体的にはπ拡張縮環型BODIPY色素においては光誘起電子移動の機構で、低pHに応答して蛍光強度が上昇する色素を設計した。
琉球八重山方言の言語地理学的な研究

臨地調査によって得られた資料を基に八重山方言の言語地図を作成して分析した結果、与那国方言が他の八重山諸方言と対立する方言であること、西表島西部方言が、八重山諸方言の下位方言グループとして位置づけられること、石垣島の諸方言が一つの下位方言としてまとめられること、竹富島、小浜島、新城島、鳩間島、黒島、波照間島の各方言が個性的な特徴を有していて、一つのグループにまとめることができないことなどが分かった。初年度の平成19年度は、研究代表者、研究分担者、研究協力者が石垣市真栄里、川平、白保、伊原間、竹富町(西表島)、干立、舟浮に赴いて聞き取り調査を行なった。石垣島の安良集落は明治45年に廃村になり最後の話者も数年まえに亡くなられたが、調査済データの存在を確認し、言語地図に反映できることとなった。川平、伊原間、黒島、網取は話者の健康、多忙、その他の理由で調査が終了できず、20年度に持ち越されることになった。また、調査済地点の方言データのパソコンへの入力を行ない、言語地理学的研究の基礎となる言語地図350枚の試作を分担して行なった。形容詞語尾の形式に焦点をあてて試作した言語地図から、ku連用形を要素にもつhaN語尾系形容詞を有する地点と、sa連用形を要素にもつsaN語尾系の形容詞を有する地点とがあり、そのことによって八重山方言を下位区分できる可能性のあることが指摘された。また、「一昨日」にオトツイ系の語形とオトトイ系の語形があり、その語形の分布からも従来の八重山方言の下位区分とはことなる分布がみられ、新たな下位区分が可能なのではないかという指摘もあった。しかし、他の言語現象との整合性なども加味しつつ総合的、かつ全体的に検討すべきことが確認された。広い海域に島が点在する一方で、石垣島南側の地域で集落が混みあっていて、記号を地図上に効果的に表示するうえで支障になっていることが言語地図を試作したことによってわかった。その解決も20年度に持ち越された。平成20年度も、平成19年度に引き続き、八重山方言の言語地図を作成するという目的のために、沖縄言語研究センター発行の「全集落調査票」に基づき、未調査地点や、調査済みであるものの項目がすべて調べられていない地点について、臨地調査を行った。実際に現地に赴き、方言話者の協力のもと、八重山方言の語形をそれぞれ調べた。前年度は、石垣市川平、竹富町黒島東筋、竹富町西表島舟浮、竹富町新城島上地、与那国町祖納における調査項目の聞き取りを最後まで一通り終えることができた。これら地点の調査項目は、速やかにパソコン入力され、動詞の項目部分が一部未入力ではあるが、データベースとして着実に加えられている。また、竹富町波照間島、竹富町西表島祖納、竹富町西表島干立における調査項目の聞き取りも、未調査の項目がいくつか残ってはいるものの、かなりの部分を終えることができた。竹富町竹富島の再調査も行うことができた。さらに、これまで方言話者の存在が確認されず、調査できるかどうか危ぶまれていた竹富町西表島網取および崎山の方言話者が見つかり、数十の項目について調査することができた。このように、臨地調査が着々と進みつつあり、それらのデータ入力も着実に進めているといった状況である。データが順調に加えられていけば、平成19年度の段階で試験的に作成された言語地図の精度がいっそう高まることになり、八重山諸方言についての全容および形成過程や下位区分、地域ごとの特性などがより明らかになると期待される。平成21年度も、平成20年度に引き続き、いくつかの項目が未調査の地点、すなわち、竹富町波照間島、竹富町西表島祖納、竹富町西表島干立、石垣市平得、竹富町西表島網取、竹富町西表島崎山の臨地調査を行った。網取と崎山の両地点に関しては、話者が石垣市内にいるため、石垣市内にて聞き取り調査を行った。調査で得た語形は、随時パソコン入力され、データベース化・言語地図化された。また、調査者が過去に行っていた石垣市伊原間、与那国町祖納などの調査結果のデータ入力を行い、今回の言語地図のデータとして使用するため資料に加えた。平成21年度は、本科研の最終年度であったため、本科研に関わった研究者が調査結果について沖縄言語研究センター定例発表会で口頭発表を行い、さらには3年の調査のまとめとして研究成果報告書を作成した。口頭発表では、八重山諸方言の言語区画や地域的特徴、あるいは、無声化、有声化、摩擦音化、鼻母音化、閉鎖音化、喉頭音化といった音変化の特徴、個々の語彙における意味的分析、動詞の活用および過去形にまつわる問題について採り上げ、発表用に書き改められた言語地図をもとに、活発な議論が行われた。これら議論をふまえた上で、今回の調査に関わった全研究者による研究成果報告書がまとめられた。

研究成果報告書は、200頁以上にわたるもので、八重山方言が話されている各集落の特徴をはじめ、琉球における言語地図作成の歴史などについても整理されている。今回の調査研究で作成された多くの言語地図を含み、それらに対して各研究者が詳しい解説を施している。また、今回の調査をもとにした研究論文も掲載している。2010年4月末現在、報告書は完全原稿が印刷会社に入稿済みで、出来上がり次第、関係者に配布する予定である。
イスラム思想の総合的研究ークルア-ン注釈(タフスィ-ル)を中心としてー

1.補助金交付の連絡を受けて6月に研究方針を話し合う会合をもち、前半は各自が個別研究を行い、後半でそれを発表しあい、共同討議を行うこととした。2.各自が研究を行っている期間を利用して、7月には東京外国語大学のムハンマド・オデイマ氏(外国人教師)に「ニッファリ-の生涯と思想ス-フィズム史に占める位置」という研究発表をしていただいた。ここではニッファリ-の思想の源泉として、キリスト教、ユダヤ教、先行する神秘家の思想とならんでクルア-ン(コ-ラン)がとりあげられ、それを神智にもとづいて解釈した彼の思想が、後代に大きな影響を及ぼしたことが指摘された。3.6月に決定した方針に基づき、秋から以下のような研究発表が順次行われた。まず中村は、現代イスラム思想のなかで、クルア-ンに厳格に従うことを求めるイスラム原理主義者の立場を、より柔軟で現実的な対応を見せるモダニストの立場と対比し、後者がこれから果たすべき役割を高く評価した。ついで竹下は、アッラ-を愛の神とするクルア-ン中の記述に対する神秘主義哲学者の注釈を調べることによって、「愛」の思想の系譜をたどった。鎌田はアッラ-マ・ヒッリ-というシ-ア派の学者によるクルア-ン注釈をとりあげ、クルア-ン5章55節にシ-ア派的な再解釈がどのように施されたかを明らかにした。また東長はイブン・アタ-イッラ-という神秘家の著作をもとに、修行の際「アッラ-」という一語だけを唱えるのが許されることをクルア-ンを根拠として主張する見解を紹介した。4.以上のように多様なクルア-ン解釈に関する研究発表がなされたが、一年間ではそれらを十分に統合的に理解するところまで到達しなかったので、今後は私的にイスラム思想研究会を設けてこの研究を続け、23年後をめどにその成果を公表したいと考えている。
転位組織制御による電子セラミックデバイスの試作

モデル材であるSrTiO3中に導入した転位の電気特性、ならびに、ドーパント添加実験、および、研究成果のとりまとめを行った。転位導入については2個の単結晶の回転角度(傾角)を10度以下に設定した小傾角粒界を用いた。市販のNb添加SrTiO3単結晶を用い、隣接する単結晶の傾角が6度、10度となるよう方位を規定した後に、ダイヤモンドブレードにより切断、研磨加工処理を施し、接合面の調整を行い、接合面同士を重ね合わせた後、1500°Cx10hの熱処理により単結晶の接合を行った。いずれの試料も粒界部にはアモルファス層や第二層などが含まれておらず、固相状態での接合が得られていることから本研究で用いた接合条件が適切であるものと判断できた。粒界部にはある一定の周期で配列した粒界転位が認められ、いずれの粒界においてもその基本的な原子構造に差異は認められなかった。しかしながら、各粒界転位の間隔は傾角に依存して変化し、傾角の大きな10°粒界では、6°粒界と比較し、その間隔は約2/3となっていた。また、6°粒界においては、各粒界転位の多くが同一原子面上に配列していることが確認されたが、その一部については、隣接する粒界転位がそれぞれ1原子面づつ粒界垂直方向に配列する事実が見出された。一般に、このような粒界転位は応力場を低減させるために、同一原子面上に配列するが、この粒界では互いに異なる原子面上に配列する。この配列により、粒界部には高応力が作用しているものと判断できた。この傾向は、10°粒界においてより一層顕著となり粒界転位のほぼすべてにこの傾向が確認された。一方、各粒界の電気特性はいずれも電流-電圧特性に非線形性が認められ、その非線形指数は傾角の大きな粒界においてより大きな値を示した。これは粒界転位の密度と密接に関係しているものと考えられる。代表的電子セラミック材料である半導性チタン酸ストロンチウム(SrTiO_3)や酸化亜鉛(ZnO)は、粒界に形成された静電ポテンシャル障壁(二重ショットキー障壁)に起因した特異な電気特性を示す。この障壁は、バンドギャップ中に形成された捕獲準位に、キャリアである電子が捕獲されることにより形成されると考えられており、この捕獲準位は一般に界面準位と呼ばれている。本研究では界面準位として転位を利用し、その組織を制御することにより二重ショットキー障壁を形成させることを試みた。モデル粒界として、ドナー剤であるNbを添加したSrTiO_3およびPr-Co添加ZnO双結晶を用いた。隣接する結晶の傾角成分が小さい場合には粒界部に粒界転位が形成される。今回、傾角が26°の双結晶試料を作成し、その粒界構造と粒界電気特性の相関性を調べた。いずれの粒界もバーガースベクトルを[001]とする刃状転位から構成されることが見出され、その粒界転位密度は、粒界の傾角に依存し、傾角が増大するに従い粒界転位密度が増加することが明らかとなった。また、高分解能観察からこの粒界転位配列は傾角成分が増大するとともにin-line配置から一原子面シフトした特異な配列に変化することが見出された。一方、粒界電気特性で認められる電圧-電流特性における非線形特性は、いずれの傾角粒界においても認められ、粒界転位により二重ショットキー障壁が形成されることが分かった。この非線形特性は、粒界転位密度に依存して増大することが明らかとなった。さらに、電気特性は粒界転位のバーガースベクトルにも依存することが見出された。転位のバーガースベクトルが刃状成分から構成される場合には、ねじり粒界で認められるらせん転位よりも大きな非線形特性を発現する。これらの結果から、粒界転位の構造を制御することで粒界電気特性を制御できることが明らかとなった。

一般に、このような粒界転位は応力場を低減させるために、同一原子面上に配列するが、この粒界では互いに異なる原子面上に配列する。この配列により、粒界部には高応力が作用しているものと判断できた。この傾向は、10°粒界においてより一層顕著となり粒界転位のほぼすべてにこの傾向が確認された。一方、各粒界の電気特性はいずれも電流-電圧特性に非線形性が認められ、その非線形指数は傾角の大きな粒界においてより大きな値を示した。これは粒界転位の密度と密接に関係しているものと考えられる。
細胞増殖と癌化におけるポリアミン代謝律速酵素の役割

ウラシル投与によって誘発された結石の機械的刺激によって発生したラット膀胱の乳頭腫症において、上皮組織ではポリアミン代謝の律速酵素であるornithine decarboxylase(ODC)およびspermidine/spermine N^1-acetyltransferase(SAT)は非常に高い活性を示し、それに伴いポリアミン(putrescine、spermidine、spermine)含量も増加していた。PCNA陽性細胞は上皮層の主に基底中間層に認められ、免疫組織学的にそれらの酵素蛋白はほぼ上皮全層に存在し、特にSATは表層に多く存在した。ODCおよびSATのmRNAレベルはウラシル投与期間中正常粘膜に比較して常に増加しており、in situハイブリダイゼーション法でODCmRNAは上皮全層にわたって細胞質にその発現が強く認められた。しかしウラシル投与を中止すると、結石の消失に伴い乳頭腫症も直ちに消退し、ODC・SAT活性およびPCNA陽性細胞率も有意に減少した。以上、ウラシルによって誘発された膀胱乳頭腫症は高い細胞増殖能をもち、それとポリアミン代謝の関連が強く示唆された。またODCmRNAは全層の細胞に強く発現しており、上皮全体でODCが合成されていることが遺伝子レベルで明らかとなった。
大腸癌の発育進展に関与する常在微生物F.nucleatumの解析と予防法の探索

近年、網羅的遺伝子解析技術の進歩によりヒトの体内に膨大に存在するmicrobiomeと各疾患の関連についての研究が急速に発展している。ヒトの腸管内には100兆にものぼる微生物が存在し、腸内細菌叢を形成している。この細菌叢の異常が炎症のみならず、代謝、免疫そして発癌にも重要な役割を担っていることが明らかになってきており注目を集めている。Fusobacterium属はヒトの口腔や消化管の腸内常在細菌群の一つであり、これまでの研究では大腸癌でFusobacteriumが存在することは現象であり、単に腫瘍発生のプロセスで引きおこされる局所の変化に過ぎないと考えられていた。しかしながら最近の研究ではFusobacteriumのような正常腸内常在微生物の一部は大腸腫瘍発生に関与する可能性があるという新たな知見が報告され、注目されている。そこで我々はFusobacteriumとMSI status、T細胞リンパ球の腫瘍組織内浸潤との関連について多症例の大腸癌臨床検体を用いた検討を行った。対象は日本人(511例)と米国白人(598例)の大腸癌1109症例でF. nucleatumの発現を解析し、臨床病理学的因子に加え、ゲノム・エピゲノム異常との相関についても検討。またImage analyzerを用いて腫瘍組織内へ浸潤した特異的なリンパ球(CD3+、CD8+、CD45RO+、FOXP3+ T細胞)の密度を自動カウントし、F. nucleatumとの関連についても解析を行った。その結果、大腸癌症例の13%(米国人)、9%(日本人)でF. nucleatumは陽性であった。MSI陽性は米国人大腸癌の16%、日本人大腸癌の8%で認められた。また人種に関わらずF. nucleatum陽性例はMSI陽性と有意な正の相関を認めた。臨床病理学的・分子生物学的因子を変数として加えた多変量解析ではF. nucleatum陽性大腸癌の群は陰性群と比較して腫瘍組織内のCD3+T細胞の密度が有意に少ないことも明らかとなった。大腸腺腫発生遺伝子変異マウスを用いたF. nucleatumの増殖、発癌を抑制する食餌、Probioticsなどの解析が今のところうまく進んでいないため。臨床検体を用いて大腸前がん病変、早期大腸癌、正常粘膜におけるF. nucleatumの分布と存在量の同定し、組織を細かく分類した上で解析を行うことにより、F. nucleatumに関連性の高い発がん経路の特定を目指す。そのために大腸前がん病変、早期大腸癌、正常粘膜におけるF. nucleatumの分布をFISH法を用いて同定し、digital PCR法を用いて定量する方法を確立する。Apc遺伝子に変異を持つApcMinマウスを使用し、F. nucleatumを食餌として与えることにより腫瘍の発生(個数、サイズ、浸潤)に関して評価を行い、食物繊維量、Probioticsの併用によるF. nucleatumと腸内細菌叢の変化、腫瘍発生頻度の変化を検討する。

Apc遺伝子に変異を持つApcMinマウスを使用し、F. nucleatumを食餌として与えることにより腫瘍の発生(個数、サイズ、浸潤)に関して評価を行い、食物繊維量、Probioticsの併用によるF. nucleatumと腸内細菌叢の変化、腫瘍発生頻度の変化を検討する。マウスを用いた実験が滞っており、それによってその実験に関わる試薬を購入しなかったことから使用額に変更が生じた。よって次年度は動物実験として大腸腺腫発生モ伝子変異マウスなどを用いたF. nucleatumの増殖、発癌を抑制する食餌、Probioticsを探求し、その抑制機序の解明もために本助成金を使用する予定。また散発性の大腸がんでは80%以上においてApc遺伝子に変異が見られることから、Apc遺伝子に変異を持つApcMinマウスを使用し、F. nucleatumを食餌として与えることにより腫瘍の発生に関して評価を行い、食物繊維量、Probioticsの併用によるF. nucleatumと腸内細菌叢の変化、腫瘍発生頻度の変化を検討する。そのために16S rRNAシークエンス、またメタゲノム解析としてはショットガンシークエンスも使用する予定であり、これらの費用も本助成金で賄う予定。
治療前後の統合失調症の血液を用いた網羅的ＤＮＡメチル化修飾解析研究

抗精神病薬を内服していない統合失調症患者と健常者のセットならびに一方のみが統合失調症を発症した一卵性双生児ペアのセットを用いて、ゲノム網羅的にDNAメチル化修飾解析を行った(485,764CpGサイト)。ファーストセットでは10,747CpGサイトで、セカンドセットでは15,872CpGサイトで、2群間のDNAメチル化修飾の差異を認め、共通するDNAメチル化修飾の変化を234CpGサイトで認めた。これらのサイトは、CpGアイランドだけでなく近傍のCpGアイランドショーやシェルフにも位置し、遺伝子のプロモータ領域だけでなくGene bodyや3'-非翻訳領域など遺伝子の広範囲に位置していた。抗精神病薬を内服している慢性期の統合失調症患者63名と健常者の血液から抽出したDNAを用いて網羅的DNAメチル化修飾解析を行い、約1000のCpGサイトで統合失調症でメチル化異常を示すサイトを同定した。統合失調症で高メチル化を示したサイトは約50%であり、この傾向は、前年度に明らかにした薬を内服していない急性期の統合失調症患者と健常者を比較した結果から得られた傾向とは異なるものであり、この差異には抗精神病薬が関与している可能性が示唆された。DNAメチル化は、SAM (S-adenosylmethionine)をドナー基質としてDNMT (DNA methltransferase)の作用で付加され行われる。SAMは脱メチル化体としてSAH (S-adenosylhomocystein)を生じ、これが加水分解されてホモシステインができる。これらのDNAメチル化に関わるone-carbon metabolism経路に注目し、血漿ホモシステイン濃度が末梢血のDNAメチル化レベルに影響するかどうかを検証を行い、特定の遺伝子のメチル化レベルがホモシステイン濃度に関係することを明らかにした。この結果により、統合失調症の独立したリスクであると報告されてきた高ホモシステイン血症の統合失調症における新たな分子メカニズム解明に関与する可能性が示唆された。上記の結果の一部は、国際学会と論文で報告を行った。薬を内服していない急性期の統合失調症患者24名と性・年齢の一致した健常者の血液から抽出したDNAを用いて網羅的DNAメチル化修飾解析研究を行い、多くのメチル化異常を示すCpGサイトを同定した。またこれらのCpGサイトは、これまで研究・報告されてきた遺伝子プロモータ領域のCpGアイランドに限定されたものではなく、遺伝子のgene-bodyや3`-UTRにも異常を認めること、また、CpGアイランド近傍のCpGアイランドshoreやshelfにも異常を認めることを見出した。さらに一卵性双生児統合失調症不一致症例3組の血液から抽出したDNAを用いて網羅的DNAメチル化修飾解析研究を行い、薬を内服していない急性期の統合失調症から得たデータと比較し、共通の変化を示すCpGサイトの同定も行った。現在は抗精神病薬による治療開始後の血液の収集を継続して行いながら、これらのデータを用いての診断マーカーの可能性の詳細な検討を行っている。上記の研究成果は、国際学会と論文で報告を行った。治療前の統合失調症サンプルの収集を終え、それらのサンプルを用いて解析を行い、これまでにない新たな知見を得て、論文として報告した。研究の後半は、治療後のサンプルが必要であり、現在これらの作業を継続して行っている。この状況は本研究を開始時に予定していたことであり、本研究はおおむね順調に進展していると考えている。抗精神病薬で治療後の統合失調症患者の血液から抽出したDNAを用いて追加の網羅的DNAメチル化修飾解析研究を行い、治療前後のメチル化の違い・変化を調べる予定にしている。また、統合失調症のメチル化を利用した診断マーカーについても治療前だけでなく、治療後を含めての検討が必要であると考えている。さらに、臨床状の治療経過を見ることによって、治療予後因子の検討も考えている。該当なし