hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
エストロゲン受容体による細胞骨格蛋白および神経ペプチド発現調節機構の解明

視床下部内側視束前野においては、雌ラットにおいて、胎生17日目よりエストロゲン受容体陽性ニューロンが観察されたが、雄ラットにおいては、胎生19日目以降に陽性ニューロンが観察された。また胎生19日目では雌ラットにおいて、雄に比べて強陽性にエストロゲン受容体陽性ニューロンが観察され、生後0日目では雌雄に差は認められなかった。以上より、胎生期において、既にエストロゲン受容体の発現に性差が存在し、性的二型核形成の基盤をなしているものと考えられた。次いで、胎生18日目の雌ラットの視床下部内側視束前野を摘出し、0.25%トリプシン処理後、1cm_2あたり、5000個の密度で初代分散培養を行い、エストロゲンの培養ニューロンに対する作用を走査電顕を用いて観察した。培地には10%牛胎仔血清を含むEagle MEMを用い、エストロゲン投与群にはエストラシオール17βを100ng/mlの濃度で投与し、コントロール群と比較した。細胞を培養開始後6,12,24,48,72時間後に固定し、走査電顕により観察を行った。培養開始後12時間以内では細胞周囲にラメリポディアおよび成長円錐を有する微小な突起が観察されたが、エストロゲン投与群およびコントロール群とで差は認められなかった。培養開始後24時間以降、エストロゲン投与群で、1本の突起の伸長およびバリコシティーの増加が観察された。以上の結果より、エストロゲンは視床下部ニューロンの極性の確立やバリコシティーの形成に影響を与える可能性が示唆された。
水素転位を介するsp3C-H結合活性化を利用した多環骨格構築法の開発

これまでの同形式の反応では転位水素の隣接位にヘテロ原子を有することが必須であったが、求電子部位としてバルビツール酸を選択することで、ヘテロ原子を持たない基質においても反応が進行することを見出した。さらに、比較的反応が進行しやすいと考えられるベンジル位だけでなく、脂肪族部位からでも望みの反応が進行することを明らかにした。また、比較的反応性の高い窒素原子を有する基質を用いるものの、同形式の反応の不斉化をも達成することができた。【研究目的】C-H結合活性化を利用する反応は、原子効率の高い、極めて有用な合成手法である。これまでに様々な研究が行われ、触媒的な手法を達成するまでに至っている。しかし、その多くはC(sp^2)-H結合に関するものであり、C(sp^3)-H結合の効率的な活性化は、有機合成化学の洗練された現在においても困難であり、新たな方法論の開拓が求められている。このような背景のもと、本研究では、効率の高いC(sp^3)-H結合活性化反応の開発を目的とする。研究遂行にあたり、申請者は、自身が近年見出した水素転位を鍵とするC-H結合活性化法に注目した。本手法は、遷移金属や酸化剤を必要としない簡素な反応条件で達成できる有用な手法である。この形式の反応は窒素原子をもつ基質での報告例があるものの、対応する酸素や炭素誘導体に関する知見はほとんどない。本研究は、本反応の適用限界を探索し、その合成的な有用性を示すとともに、それをさらに発展させた手法の開発を目指すものである。【研究結果】まずは比較的容易と考えられる酸素誘導体の反応開発に取り組んだ結果、適切な触媒を作用させることで効率よく反応が進行することを見出した。すなわち、オルト位にベンジルオキシ基を持つベンジリデンマロナート誘導体に対しSnCl_4を作用させると、対応するベンゾピランを良好な収率で与えた。研究を進めていく過程で、酸素原子のオルト位置換基が反応性に大きく影響するという興味深い知見を得た。さらに検討を進めた結果、求電子部位として活性の高いバルビツール酸を選択することで、酸素原子すらない基質でも同形式の反応が進行することを見出した。これまで、ヘテロ原子のない基質において望みの水素転位が進行した例はほとんどなく、本研究で得られた成果は有機合成化学分野における本形式の反応の有効性をしめす意義深いものであると考えている。【目的】CーH結合活性化を利用する反応は、原子効率の高い、極めて有用な合成手法である。しかし、その多くはC(sp2)ーH結合に関するものであり、C(sp3)ーH結合の効率的な活性化は、有機合成化学の洗練された現在においても困難であり、新たな方法論の開拓が求められている。このような背景のもと、本研究では、効率の高いC(sp3)ーH結合活性化反応の開発を目的とする。研究遂行にあたり、申請者は、自身が近年見出した水素転位を鍵とするCーH結合活性化法に注目した。本研究では、本反応の適用限界を探索し、その合成的な有用性を示すとともに、さらに発展させた手法の開発を目指した。【結果】これまでは転位水素の隣接位にヘテロ原子(窒素および酸素原子)を有することが本反応の必須要件であったが、求電子部位として極めて活性の高いバルビツール酸を選択することで、ヘテロ原子を持たない基質においても同形式の反応が進行することを見出した。さらに検討を進めた結果、比較的反応が進行しやすいと考えられるベンジル位だけでなく、単純な脂肪族部位からでも望みの反応が進行することを明らかにした。また、反応性の高い窒素原子を有する基質を用いるものの、近年大きな注目を集めている有機分子触媒を用いることで、同形式の反応の不斉化をも達成することができた。有機分子触媒的なCーH結合官能基化の報告例は極めて少なく、本研究で得られた成果は有機合成化学分野における新たなCーH結合官能基化法の指針となりうる、意義深いものであると考えている。24年度が最終年度であるため、記入しない。
環境汚染物質分解酵素系転写制御分子機構の解明と改変

環境汚染物質ポリ塩化ビフェニル(PCB)の分解酵素がPCB自体で誘導される分解菌の開発をめざし、強力分解菌ロドコッカス・ジョスティーRHA1株で分解酵素誘導にかかわる2組の二成分制御系転写制御因子BphS1T1とBphS2T2について転写制御機構の解明を行い、誘導基質存在下でのBphSによるBphTのリン酸化、分解酵素遺伝子群プロモータ領域に保存される24塩基の新たな共通配列を見いだした。更に24塩基配列が転写誘導に必須かつ十分な機能を有していることを明らかにし、BphTを含む転写複合体が結合する配列であると推定した。環境汚染物質であるポリ塩化ビフェニルとジクロロジフェニルトリクロロエタンの分解酵素系の誘導性改良をめざし、分解菌Rhodococcus jostii RHA1における転写制御機構解明と転写制御因子改変を目的とし、以下の成果を得た。(1)BphSTのシグナル伝達機構の解明:培養菌体の粗精製タンパク質をフォスタグ電気泳動後、ウェスターンブロットによりBphTを検出したところ、ビフェニルで培養した場合にのみBphTのリン酸化が認められた。また、BphSを欠失した株ではリン酸化は見られず、BphTがBphSと誘導基質に依存してリン酸化されて転写を活性化することを明らかにした。(2)BphTと相互作用する転写複合体の解明:シグマ因子候補遺伝子のライブラリーをRHA1に導入して、ビフェニル分解酵素遺伝子の転写に関わるシグマ因子の同定を試みたが、成果は得られていない。そこで、bphAa遺伝子プロモーターと相互作用する転写複合体からシグマ因子を同定するため、BphT抗体を用いた免疫沈降による転写複合体の回収する系を構築した。今後はこの系をスケールアップしてシグマ因子の同定をめざす。(3)誘導基質特異性にかかわるアミノ酸残基の同定:N末領域のアミノ酸配列の置換により、基質特異性決定にかかわるアミノ酸残基を12残基に絞り込んだ。また、BphTが相互作用するDNA結合配列についての検討を前倒ししておこない、配列比較により決定した18塩基ではなく24塩基が相互作用することを明らかにした。以上の結果により、転写複合体の解明はこれからであるが、BphSTのリン酸化によるシグナル伝達とDNA配列への結合を含む転写活性化機構を明瞭に解明することができた。環境汚染物質であるポリ塩化ビフェニル(PCB)分解酵素がPCB自体で誘導される分解菌の開発をめざし、分解菌Rhodococcus jostii RHA1における分解酵素誘導にかかわる転写制御機構解明と転写制御因子改変を目的とし、以下の成果を得た。(1)転写制御配列の解析:BphTが作用すると予想される24塩基のDNA配列に点変異を導入して転写活性の変化を調べたところ、誘導基質存在下での転写活性だけでなく、誘導基質やBphTがない場合の転写活性にも著しい変化が観察された。この24塩基のDNA配列が誘導基質存在下でのBphTによる転写誘導だけでなく、誘導基質非存在下でのBphTによる基礎レベルの転写活性化やBphTに依存しない転写活性にも関与していることを明らかにした。さらに、24塩基配列の外側の変異では転写活性に変化が見られなかったことから、BphTの相互作用が24塩基配列に限られることを明らかにした。(2)細胞内におけるBphT結合状態の解析:細胞内におけるBphTと24塩基配列との結合状態を解析するためin vivoフットプリンティングを行った。BphTを保持する細胞とBphTを欠失した細胞とで誘導基質非存在下での24塩基配列におけるフットプリンティングのパターンが明確に変化し、誘導基質存在下ではさらに異なるパターンとなった。この結果より、BphTは誘導基質非存在下でも24塩基配列に結合して基礎レベルの転写活性化をもたらし、誘導基質存在下では結合のパターンが変化して更に高い転写活性を誘導することが示唆された。以上の結果より、24塩基のDNA配列へのBphTの結合性が変化することにより転写活性が調節される転写機構を解明することができた。(1)転写制御配列の解析:プロモーター領域を欠失した安息香酸ジオキシゲナーゼ遺伝子上流にBphTが作用すると予想される24塩基のDNA配列を連結し、bphS1T1遺伝子を共存させたRhodococcus宿主株の組換え体で転写活性を調べたところ、誘導物質(ビフェニル)存在下でBphSTに依存した明確な転写誘導が見られた。誘導基質非存在下ではBphTによる基礎レベルの転写活性化が観察され、24塩基配列がBphTを介した転写活性化に必要十分であることが示唆された。

点変異を導入したところ、誘導基質やBphTがない場合の転写活性にも著しい変化が観察され、24塩基配列自体が独立のプロモーターとして機能し得ることが示唆された。(2)BphTと相互作用する転写複合体の解明:抗BphT抗体を用いた免疫沈降によりBphTを含む転写複合体を回収する試みを既に行ったが、果たせなかった。そこで、24塩基配列を含むDNA断片をプローブとして結合した磁気ビーズを用いたところ、細胞抽出液から多くのタンパク質が回収できた。回収したタンパク質を二次元SDS-PAGEで分離し、MALDI-TOF/MSで分析した結果、転写に関連すると思われるWhiA様転写因子やCRP-FNR型転写因子が同定された。回収したタンパク質の同定を進めることにより、転写複合体を構成するタンパク質を解明出来ると期待される。以上の結果より、BphSTによる24塩基配列を介した分解酵素遺伝子オペロンの転写制御機構を明らかにすることができた。目標とする3つのプロジェクトは、(1)BphSTのシグナル伝達機構の解明、(2)BphTと相互作用する転写複合体の解明、(3)誘導基質認識機構の解析と基質特異性の改変である。(1)はほぼ完了したが、(2)と(3)においては結果を得るに至らなかった。24年度が最終年度であるため、記入しない。目標とする3つのプロジェクトは、(1)BphSTのシグナル伝達機構の解明、(2)BphTと相互作用する転写複合体の解明、(3)誘導基質認識機構の解析と基質特異性の改変であり、(1)がほぼ完了したので、(2)と(3)に集中して結果を出す。(2)についてはBphT抗体を用いた免疫沈降と同時に(1)で明らかにした24塩基のDNA配列を用いたアフィニティークロマトグラフィーも検討する。RHA1株のゲノムシーケンスが完了しているので、回収したタンパク質のアミノ酸配列をTOF-MSで決めれば、その遺伝子を特定できる。、(3)については、従来の短いDNAプライマーを用いた部位特異的変異手法を止めて、長い合成DNA配列を用いて調製したDNA断片を置換して変異酵素遺伝子を一気に作成する手法を検討して時間を節約したい。
サル細胞を用いた血液脳関門(BBB)in vitro 再構成モデルの開発

血液脳関門(Blood-Brain Barrier、BBB)は、脳毛細血管内皮細胞、アストロサイトおよびペリサイトの3種類の細胞が機能的に一体となって構築している。また、BBBは、単なる脳内と血液の間で物質の移動を調節するだけではなく、機能的なneurovascular unitを形成し、今まで考えられていた以上に、ニューロン機能と一体化されていることが理解され始めている。BBB機能解析に有用なツールであるBBBin vitro再構成モデルの構築には、これらの細胞間クロストークを可能にする微小環境を再現することが重要で、我々は、サル脳毛細血管内皮細胞とラットアストロサイトおよびラットペリサイトの3種類の細胞を立体的に共培養することで、サル型BBB in vitro再構成モデルを構築した(BBBキットTM)。BBBキットは、生体内環境に近似した実験ツールで、薬物候補の脳内移行性を開発の早期段階で予測する創薬支援ツールとして有用である。我々の考案した血液脳関門再構成モデル(BBBキット)(特開2007-166915、特開2008-212062)を霊長類細胞で実現するために、サル脳からの効率的な脳毛細血管内皮細胞、脳ペリサイトおよびアストロサイトの分離抽出法を試み、これまでに我々が確立してきたラット初代培養細胞用の細胞採取方法を改変して内皮細胞の初代分離培養方法を確立した。典型例であるが、雄性3歳カニクイザルの摘出脳(湿重量62g)より原材料分として脳組織42gを得て、35gから脳毛細血管内皮細胞(5gは脳ペリサイトおよび2gはアストロサイト用)を抽出採取して初代培養を行ったところ、培養4日目で21.6x10^6の細胞数が得られた。2腔培養装置の単層培養で、培養1日目より血液脳関門(BBB)の機能的指標の1つであるタイトジャンクション(TJs)形成能を反映する径内皮電気抵抗(TEER)は、培養1日目で既に良質なTJs形成を示す148Ω・cm^2と高値で、以降順調に上昇し培養3日目で250Ω・cm^2に達した。サルとラット脳ペリサイトおよびアストロサイトの脳毛細血管内皮細胞へのBBB機能誘導作用の受容能力も十分に効率的で、2腔培養装置を用いた共培養系(BBBキット)でのTEER(培養4日目)は900Ω・cm^2を達成した。P-gp機能のTJsタンパクのであるclaudin-5とZO-1の内皮細胞にける細胞組織化学的発現も、強固なTJs機能を示す様相であった。サル細胞BBBキットで得られた薬剤のBBB透過性係数も、in vivoの脳内移行性と一致していた。本研究初年度の成果として、サル脳毛細血管内皮細胞の初代培養法を確立し、ラット脳ペリサイトおよびアストロサイトとの共培養で機能的なBBBキットを構築した。次年度は、サル型BBBキットの機能検定データをより深化させる。幼若サル脳毛細血管内皮細胞の初代培養法を確立し、ラット脳ペリサイトおよびラット脳アストロサイトとの共培養で機能的なサル型I vitro BBB再構成モデル(BBBキット)を構築した初年度の成果を引き継ぎ、BBBキットとしての機能検定と薬物の脳内移行性検定を行った。高いタイトジャンクソン(Tjs)機能(経内皮膜電気抵抗で200Ω・cm^2以上)と、良好なTjsタンパク質(claudin-5, occludin、ZO-1)、トランスポーター(p-glycoprotein)の発現が得られた。トレーサー(sodium fruorescein, ^<14>C-sucrose)を用いた細胞間隙輸送、^3H-3-methyl-D-glucoseを用いた糖輸送担体機能、rhodamine123によるP-糖タンパクの機能と極性、およびスカベンジャー受容体の確認(Dil-acetyl-LDLの取込み)について、ラット型BBBキットと比較検討し、概ね同等の機能を検出した。BBBモデルのインサート内側(血管腔側)に化合物を入れ、一定時間内に内皮細胞及びペリサイトの層を通過し、プレートのウェル内(脳実質側)に漏れ出てきた薬物濃度を測定して脳内移行性を検定した。caffein、antipyrin、L-phenylalanine、verapamil、cyclosporin A、digoxin、sucroseのBBB透過係数(Papp)は、ラット型BBBキットで得られたPappと良く相関していた。以上、BBBキットとして良好なin vitroBBB再現系が構築できた事が確認できた。サルおよびラット脳ペリサイトとサルおよびラットアストロサイトの3細胞共培養によるヒト脳毛細血管細胞株

hCMEC/D3細胞へのBBB機能誘導効果を検討したが、いずれも有意なBBB誘導効果は観察されなかった。サル型in vitroBBB再構成モデル(BBBキット)の機能検定と薬物の脳内移行性検定を行った。機能は、既に確立されているタイトジャンクソン機能(経内皮膜電気抵抗TEER)、タイトジャンクションタンパク質、トランスポーターなどのBBB特異的タンパク質の発現などで検定した。BBBキットとして良好なサル型in vitroBBB再現系が構築できた事が確認できた。P-糖タンパクに関与する薬物ではサル型BBBキットでより高値なPappが得られたことから、P-糖タンパクのタンパク発現が齧歯類とヒトでは異なる事が明らかになった。さらに、個別病態特異的プローベを用いて病態環境下におけるBBB機能障害モデルとしても有用であることを確認した。遅発性神経細胞死(虚血再灌流障害)では、93% N2, 5% CO2, 2%O2インキュベーターとインキュベーター中でガス交換をした培養液を用いて作成した虚血環境を作り(低酸素キットAnaerocult)、95% air-5%CO2に変換して再潅流条件を作ることが可能であった。アミロイドβ1-40および-β1-43を作用させて、脳内アミロイドβ1-40および-β1-43のクリアンランスに関与しているBBB内皮細胞に発現したLDL受容体関連タンパク(LRP)を解析することでAlzheimer病BBB障害モデルを作成できた。放射性標識(125I)および蛍光標識amyloid-ß(1-40)と125I-後期糖化反応生成物(advanced glycation endoproduct, AGE)-BSAを利用してRAGEなど糖尿病関連病態としても解析できる。また、BBBキットの機能的な精度を確保したままBBBを構成する3種類の細胞を立体培養装置内で凍結保存する方法を確立し、検査キットとしての利便性を飛躍的に亢進させた。初代培養サル脳毛細血管内皮細胞、ラット脳ペリサイトおよびラット脳アストロサイトで構成されるBBBキットは、in vitro BBB再構成モデルとして、機能的にBBB機能を再現されていることが検証できた。しかし、未だサル脳ペリサイトとサル脳アストロサイトとサル脳毛細血管内皮細胞とのサル純系細胞によるBBBキットの完成に至っていない。24年度が最終年度であるため、記入しない。今後の問題点としては、幼若サル脳からのペリサイトとアストロサイトの分離抽出法と培養法が完全に成功していない点である。in vitro BBB再構成モデルとしての機能に関しては、ラットペリサイトとラットアストロサイトで対償できることを証明したが、種差の解明の観点からも、培地の組成の問題など培養条件の詳細の検討を、今後、行って行く。
可換環論における代数幾何学の方法

研究代表者・原伸生は研究分担者・渡辺敬一,吉田健一との共同研究において,正標数の可換環論における密着閉包の理論を特異点論や双有理幾何の見地から捉え直すことにより,密着閉包とF-特異点の概念の一般化と理論の基礎付けを行い,これを可換環論,代数幾何の幾つかの問題に対して応用した.本研究で得られた主な結果は以下の通りである.1.Rees環のF-特異点の研究:Rees環は,その"Proj"がブロー・アップという幾何的対象であるにも拘らず,環そのものの幾何的な観点からの研究は余りなされていなかった.この点に鑑み,正規局所環(R,m)のm-準素イデアルIに関するRees環R[It]のもつ環論的及び幾何的な性質をSpec Rのブロー・アップProj R[It]と特異点解消等の手段を用いて,主としてF-特異点の立場から考察した.2.密着閉包の一般化:正標数の環Rにおけるイデアルの密着閉包の概念を,環RとSpec R上の有理係数因子Dの組(R,D)或いは,与えられたイデアルI⊆Rに対して定まる"D-密着閉包"或いは"I-密着閉包"の概念に一般化した.とくに,I-密着閉包とこれを用いて定義される一般化された判定イデアルτ(I)の種々の性質(τ(I)と乗数イデアルΤ(I)の対応,イデアルτ(I)に対するSkodaの定理,制限定理,subadditivity)等を証明し,理論の基礎付けを行った.3.I-密着閉包の応用:イデアルτ(I)に対するSkodaの定理の類似を偏極多様体(X,L)の斉次次数環の標準加群の部分加群に対して適用することにより,随伴束K_x+nLの大域生成性の問題を考察し,とくに,豊富な直線束Lの大域生成性を仮定した藤田予想のごく特別な場合に対するK.E.Smithによる正標数の証明の別証明を与えた.研究代表者・原伸生は研究分担者・渡辺敬一,吉田健一との共同研究において,正標数の可換環論における密着閉包の理論を特異点論や双有理幾何の見地から捉え直すことにより,密着閉包とF-特異点の概念の一般化と理論の基礎付けを行い,これを可換環論,代数幾何の幾つかの問題に対して応用した.本研究で得られた主な結果は以下の通りである.1.Rees環のF-特異点の研究:Rees環は,その"Proj"がブロー・アップという幾何的対象であるにも拘らず,環そのものの幾何的な観点からの研究は余りなされていなかった.この点に鑑み,正規局所環(R,m)のm-準素イデアルIに関するRees環R[It]のもつ環論的及び幾何的な性質をSpec Rのブロー・アップProj R[It]と特異点解消等の手段を用いて,主としてF-特異点の立場から考察した.2.密着閉包の一般化:正標数の環Rにおけるイデアルの密着閉包の概念を,環RとSpec R上の有理係数因子Dの組(R,D)或いは,与えられたイデアルI⊆Rに対して定まる"D-密着閉包"或いは"I-密着閉包"の概念に一般化した.とくに,I-密着閉包とこれを用いて定義される一般化された判定イデアルτ(I)の種々の性質(τ(I)と乗数イデアルΤ(I)の対応,イデアルτ(I)に対するSkodaの定理,制限定理,subadditivity)等を証明し,理論の基礎付けを行った.3.I-密着閉包の応用:イデアルτ(I)に対するSkodaの定理の類似を偏極多様体(X,L)の斉次次数環の標準加群の部分加群に対して適用することにより,随伴束K_x+nLの大域生成性の問題を考察し,とくに,豊富な直線束Lの大域生成性を仮定した藤田予想のごく特別な場合に対するK.E.Smithによる正標数の証明の別証明を与えた.本研究は,代数幾何学の方法を可換環論に応用し,両分野の有機的な相互作用を図っていくことを目的としている.本年度においては,正標数の可換環におけるtight closure及びこれを用いて定義されるF-有理性,F-正則性を,代数多様体の特異点との対応を踏まえつつ,Rees環の場合を中心に研究した.1.Rees環は,その"Proj"がブロー・アップという幾何的対象であるにもかかわらず,環そのものの幾何的な観点からの研究はあまりなされていない.この点に鑑み,研究分担者の吉田健一,渡辺敬一両氏との共同研究で,正規局所環(A,m)のm-準素イデアルIに関するRees環R(I)=

A[It]のもつ環論的及び幾何的な性質をSpecAのブロー・アップProj R(I)と特異点解消を用いて考察した.論文"F-rationality of Rees algebras"では,正標数においてRees環R(I)がF-有理となるための条件をHochsterによるtight integral closureの概念を用いて記述し,また,特異点解消を用いて,F-有理でない正標数の局所環上にF-有理なRees環が存在する例(Boutotの定理の"F-有理版"の反例)を構成した.論文"Rees algebras of F-regular type"においては,Rees環R(I)のF-正則性をX=Proj R(I)の大域的F-分裂性にいいかえ,これを用いてAが標数0の2次元局所環の場合に,R(I)がF-正則型,或いは対数的端末特異点をもつための条件を,Xの特異点解消上の例外因子の双対グラフ等の幾何的性質により記述した.昨年度,正標数の可換環における密着閉包(tight closure)の概念を,与えられたイデアルIに付随して定まるI-密着閉包(I-tight closure)の概念に一般化し,これを用いて密着閉包の判定イデアル(test ideal)の一般化としてイデアルτ(I)を定義した.本年度においては,このイデアルτ(I)と,標数0の正規Q-Gorenstein環のイデアルIに付随して定まるmultiplier ideal Τ(I)との対応を示し,さらにこの対応を踏まえて,multiplier idealの種々の性質(Briancon-Skodaの定理,制限定理,subadditivity,トーリック環のトーラス不変なイデアルに付随するmultiplier idealの特徴付け)の正標数版をイデアルτ(I)に対して証明した.以上の結果は研究分担者の吉田健一氏との共同研究に基づくものであり,共著論文"A generalization of tight closure and multiplierideals"にまとめた.また,イデアルτ(I)のいくつかの環論的性質(局所化,余次元2以上でetaleな有限射における振舞いなど)を研究すると共に,Briancon-Skodaの定理の精密化であるSkodaの定理の正標数版を証明した.Skodaの定理はmultiplier idealに対しては特異点解消と標数0の消滅定理を用いて証明されるが,本研究で得られたτ(I)に対するSkodaの定理の証明はこのような標数0の難しい結果を用いずに,簡単な正標数の技法のみを用いて証明されるという著しい長所がある.この正標数版のSkodaの定理を射影多様体の斉次座標環の無縁極大イデアルのベキm^nに付随するm^n-密着閉包に適用することにより,射影多様体の随伴束の自由性などの幾何的性質を正標数の環論的手法を用いて考察することが適当な条件下では可能となる.例えば,藤田予想のごく特別な場合についてK.E.Smithが与えた正標数の証明に対するI-密着閉包を用いた別証明を検討するなど,代数幾何への応用を試みた.前年度までの研究でその定義と理論の基礎付けがなされたI-密着閉包の概念とこれを用いて定義される判定イデアルの一般化であるイデアルγ(I)の応用について考察した.これらの概念は正標数の可換環のイデアルIに対してフロベニウス写像を用いて定義されるが,標数0の代数幾何と可換環論において近年様々な応用が得られている乗数イデアルと密接な関わりをもつことがわかってきている.標数0の乗数イデアルの理論においては,特異点解消や消滅定理などが必要となるが,乗数イデアルの正標数版とも云うべきイデアルγ(I)に関してはこれらのある意味で超越的な手法の代わりに正標数の純粋に代数的な方法を用いて同等の結果(Skodaの定理,subadditivity等)が得られ,この簡明さはI-密着閉包の理論の著しい長所と考えられる.この哲学に基づき,I-密着閉包と『正標数の乗数イデアル』の理論を代数幾何及び可換環論における以下の問題に対して応用した.1.イデアルγ(I)に対するSkodaの定理の類似を偏極多様体(X,L)の斉次次数環の標準加群の部分加群に対して適用することにより,随伴束K_x+nLの大域生成性の問題を考察した.豊富な直線束Lの大域生成性を仮定した藤田予想のごく特別な場合に対するK.E.Smithによる正標数の証明の別証明を与え,さらにこれを代数幾何的に再評価することにより,Xの特異点に関する仮定をF-有理特異点からF-入射的特異点に弱めた.2.イデアルの乗法族I.={I_n|n=1,2,【triple bond】}に対して定まる漸近的乗数イデアルの正標数版γ(||I.||)を構成し, subadditivity等の基礎的な性質を調べた.
雌性生殖器の恒常性維持と粘膜免疫におけるガレクチンの役割

ガレクチンは、β-galactoshideを認識するレクチンで、雌性生殖器にはgalectin-1とgalectin-3が発現する。本研究では、マウスの雌性生殖器においてガレクチンが特定の細胞に発現することを明らかにし、プロジェステロンやエストロジェンなどの雌性ホルモンの影響をうけて、雌性生殖器の恒常性維持や粘膜免疫に関与する可能性が示した。ガレクチンはβ-galactosideを認識するレクチンで、細胞の分化や増殖、アポトーシスなどさまざまな生命機能を調節し、15種類のサブタイプが生体内に広く分布する。雌性生殖器ではgalectin-1とgalectin-3が主なサブタイプであり、性周期や妊娠に伴いダイナミックに発現変動する。本研究ではマウスの雌性生殖器におけるガレクチンの発現変動を明らかにし、エストロジェンおよびプロジェステロンなどの雌性ホルモンがガレクチンの発現に与える影響について検討した。Galectin-1は間質の線維芽細胞に発現するが、子宮ではプロジェステロン優勢期に、膣ではエストロジェン優勢期にgalectin-1強陽性の線維芽細胞が上皮直下に集積した。一方、galectin-3は粘膜固有層に浸潤する好酸球に発現するほか、エストロジェン優勢期では上皮や上皮内に侵入するマクロファージにもgalectin-3陽性反応が認められた。上皮におけるgalectin-3の発現は、子宮と膣どちらにおいてもエストロジェン優勢期で特に強かった。本研究により、エストロジェンやプロジェステロンなどの雌性ホルモンがガレクチンの発現調節に重要な役割を果たすことが明らかとなった。シアル酸転移酵素などの糖転移酵素の発現も性周期や妊娠に伴い変動することから、糖鎖とガレクチンの相互作用が雌性生殖器の恒常性維持や粘膜免疫に重要な役割を果たすことが予想される。本研究により明らかとなった所見は、ガレクチンの機能解明に重要な情報を提供すると思われる。雌性生殖器ではgalectin-1とgalectin-3が主なサブタイプであり、子宮と膣においてgalectin-1は間質の線維芽細胞に、galectin-3は上皮に発現する。両ガレクチンは性周期や妊娠に伴いダイナミックに発現変動することから雌性ホルモンがガレクチンの発現に関与することが予想される。本研究では、雌性生殖器におけるガレクチンの機能を、雌性ホルモンとの関係に注目して明らかにすることを目的とした。galectin-1陽性の線維芽細胞は、子宮ではプロジェステロン優勢期に、膣ではエストロジェン優勢期に上皮直下に集積する。galectin-1陽性の線維芽細胞は上皮に向かって突起を伸ばし、白血球を取り込んで上皮への侵入をサポートするような形態を示していた。一方、galectin-3はエストロジェン優勢期に子宮および膣上皮に強く発現しており、特定の時期にgalectin-3陽性のマクロファージが上皮内に侵入していた。卵巣除去マウスにエストロジェンを投与すると両ガレクチンの発現が誘導されることから、雌性ホルモンはガレクチンの発現調節に重要な役割を果たすことが明らかとなった。また、ガレクチンのリガンド糖鎖との親和性に関与するシアル酸転移酵素などの糖転移酵素の発現も雌性ホルモンにより影響をうけることから、糖鎖とガレクチンの相互作用が雌性生殖器の恒常性維持や粘膜免疫に重要な役割を果たすことが予想される。
抄物の文学的研究

本研究は、日本中世における漢文学を踏まえるか、また五山漢詩文の傾向にあるかを踏まえた上で、「抄物」が、中世漢文学のなかでいかなる位置にあるかを解明した。抄物は、宋代に文学理論を踏まえているが、別に日本的な視点も存在する。それがどのような点にあって、特に五山詩にどのように影響しているかを明らかにした。(1)『後二条師通記』に『朗詠』の引用が頻繁になる。その筆致は単なる文飾ではない。特に自然描写は、時令思想に基づいて記録され、なかでも、夥しい雪に関しての記事は豊年に関する意識と結びつく。そもそも自然が規則正しく巡ることが徳政の証であったということを前提として、記述されているのである。加えて、師通の漢文表現引用の動機が、たとえば、寺院の参詣の際や漢籍に触れた際の心の動きにあることは、諷誦文や書序・詩序などの公文書を想定しての表記であると推測される。それは、『小右記』や『権記』の漢籍引用が現実の事件を漢籍の表現で文飾したり、または漢籍に載る事件で再確認したりしているということと、性格を異にする。つまりは、彼等官人が実生活の指針として、実際に中国思想に依拠していたという証が、『後二条師通記』に至ってより明確になっていると確認することが出来るのである。(2)句題詩と詩序の形式についての論を『江談抄』より取り出し、そのことが示す意味を論じた。句題詩の「題目」「破題」「本文」(「譬喩」)の形式、その形式化に伴って、結句における「述懐」にその内容的発展が遂げられたのが天暦期以降であり、詩序の第二段に「題目」「破題」「本文」(「譬喩」)という題に対する意識がされたのが菅原文時あたりからで、さらにその詩序の自謙部分に個人的は不遇感をしのばせることが出来るようになったのも天暦期であると考えられる。こう考えると、大江匡房の「詩境記」の区分のなかでも、中興した承平・天暦期こそが句題詩形式の確立からは重要な区分であって、詩序もそれに準ずるといえる。この観点からさらに大江匡房が語った『江談抄』に記されている詩話の話者を時期で区分すると、当時の詩や詩序の変遷と重なってくる。『三体詩』の抄物が往々にして、深読みをして、政治的解釈や諷喩の意識を含ませるのは、『三体詩』が総集であるということと、やはり無関係ではなかろう。別集に比べて作者の事情が個々であったり、また不明であったりするために、作品に様々な解釈が可能であったことで初めて可能になったはずである。『三体詩』の作者のなかには僧侶がいたり、隠遁生活を謳った作が垣間見られたりする。その『三体詩』講釈の意義として、義堂周信は、禅道の一助を掲げるが(『空華日用工夫略集』応安二年<一三六九>九月二日)、天隠注序の「禅熟、文熟、詩熟」という詩禅一致の考えは、禅僧が詩を賦すための大儀ともなったはずである。であるからその解釈は過熱していったと考えられる。五山僧のその詩学の相伝は抄物において過剰な深読み、所謂「底意」を生む。そもそも「底意」が顕著な『三体詩』の「底意」の上限は江西龍派または心田清播あたりと考えられる。自ら付されたと考えられる江西龍派の文集『続翠稿』の注は夥しく、経典や散文からの引用による注はもちろん、漢詩の詩句から換骨奪胎したような注も顕著である。例えば、『三体詩』に「底意」として安史の乱を読み取ることなどは、応仁の乱を体験した禅僧に自然の発想であると考えられるが、乱中の閉塞状態は、さらに詩の贈答等によって彼らの紐帯を増したのではないかとも想像されるのである。「底意」の隆盛の時期は、唱和や詩学の啓蒙に根ざした自注の出現、江西龍派・九淵龍〓・万里集九の時代と重なるからである。のみならず、同時に和歌において「裏説」を解した心敬・宗祇の連歌に、やはり啓蒙的な自注が付されていることとも符合するからである。総じて、抄物などの詩歌の背後を過度に読み取る「底意」「裏説」は、相伝された詩歌学隆盛の果ての現象で、それを自らの作品で実践すれば、自注となる。五山詩文を景物・形式・典拠引用の観点から論じた。そこには、平安漢詩文と明らかに相違する視点を見出すことができる。禅宗の理念に文字を超越する教義があったのであるから、五山詩僧の詩はやはり、そのことに対する大儀から出発する必要があった。であるから、理を通す傾向にあることは自然な成り行きと言えようか。

たださらにそこには、禅僧という身分や社会情勢以外に、宋朝での詩論の隆盛を考慮に入れなければならないはずである。平安漢詩に比して、五山の詩は詩を論じることが頻繁であった。その要因も宋詩の依拠にあると考えられる。宋詩の特徴のひとつに、散文的論理性を見出すという捉え方があるが、五山漢詩の特徴も作詩という行為を客観視したことにあると考えられる。そもそも、五山では実際に詩を論じることが日常で行われていたことが推測されるが、それが詩に賦されているところに、五山の理知性があるといえる。中国詩は擬古詩という形式に端を発して、第一句に先代の句を用いるという手法が累々と受け継がれた。一方で、日本漢詩において、擬古詩は定着しなかった。換骨奪胎においても一句をそのまま当てはめるということは、現存する作品を見るかぎりにおいては行なわれていなかった。これが十三世紀以前の中国詩と日本漢詩における相違の一つである。それが五山漢詩には、一句をそのまま借用するという作品が見られるようになる。それは一句をそのまま当てはめるという手法と、句のなかに引用する方法と、一両字を改変して引用するという方法に分けることができる。「底意」を探る傾向にある五山抄物のなかでも特に一韓智翊の「山谷抄」に過度に、王安石非難が現れているのは、まず当時すでに王安石の政策を非難する意識があったこと、その下地のなかで中国注釈に頼りながらも、『山谷詩集』にある政治的表現に対してすでに五山僧が時代を取る傾向にあったということ、加えて、直接には桃源の「蘇詩抄」解釈に王安石を酷評していることが、その要因である。
代数的組合せ論における直交多項式の研究

代数的組合せ論の基礎を与えるアソシエ-ションスキ-ムの指標表は、ある種の直交関係をみたし,直交多項式と密接に関係している。研究代表者は,従来よりシュバレ-群とその部分群から得られるアソシエ-ションスキ-ムについて考察を続け,特に指標表の目盛りに相当するsubーdegreeを計算するのに,置換指標のMackey分解と部分群との関係に注目することが,小さい群についてはしばしば有効であることを示してきた。今年度は,大きな群の代表であるGLn(z)とその部分群から定義されるアソシエ-ションスキ-ムに対して,この方法を適用してsubdegreeを計算することを目ざしてきた。今回は結果を発表するまでには至らなかったが,現在も研究は継続中である。この方法が,置換表現と部分群との関係に対する理解を深める上で役に立つものと期待している。アソシエ-ションスキ-ムの指標表の意味については,直交多項式との関係が明らかにされている小数の例外を除いて,ほとんと理解されていない。今後の研究が待たれるところである。また,従来のようにケ-スバイク-スの計算にたよるのではなく,ある程度は統一的なアプロ-チが必要である。このようなアプロ-チが直交多項式の立場から可能なのかどうか,今後の研究課題としたい。今年度の科学研究費補助金により,研究分担者はそれぞれの専攻分野において,各地の研究者と活発な研究交流を行い,成果をあげることができた。詳細は省略するが,裏面の研究発表の欄に,発表された論文をまとめておく。
ストレス負荷による遺伝子発現異常の解析(ストレス障害における漢方薬の役割)

我々は慢性ストレスの生体への影響を様々な観点から検討してきた。一般に生体は同種のストレスを繰り返し受けると慣れが生じ、ストレス反応は減弱する。これはストレスに適応したかに見えるが、実は表面的な現象に過ぎず、慣れが生じた時点でそれまでとは異なった現象が惹起され(GR発現異常等)、それ以後も同種のストレスを受け続けるとそれまでのストレス反応とは全く異なった反応(セロトニン等の放出阻害等)を起こす可能性を述べてきた。本研究ではソーシャルストレスで、うつ病の器質的な変化とも思われるGR遺伝子発現異常を惹起させうるのか、あるいは他のどのようなストレスが長期にわたるGR発現異常を引き起こすのかを中心に検討した。(ソーシャルストレス)ソーシャルストレスを4週間負荷後、1ヶ月経過後の運動量と海馬GR発現量を測定し、ソーシャルストレス負荷群では対照群と比べ運動量の有意な増加と海馬GRの発現過多が認められた。(母子分離ストレス負荷による海馬GR発現異常)母子分離ストレスを仔マウス誕生から1週間負荷することにより、仔マウスは10週令になっても海馬GRの発現増加が認められたが、デキサメサゾン抑制試験では正常であった。(母子分離ストレスによる行動異常)母子分離ストレス負荷により、仔マウスが成獣(8週令以上)になってからの行動(運動量、高架式十字迷路)に関し検討した。その結果、母親の違いにより大きく異なり、母子分離ストレスの仔への影響は母親によっては解消される可能性が示唆された。結論4週間のソーシャルストレス負荷により、長期にわたり海馬GR発現増加が引き起こされる。母子分離ストレス負荷による仔への行動学的影響は親の違いが大きく影響することが示唆されたが、海馬GR発現増加は長期にわたり(10週)引き起こされる。拘束水浸ストレスを長期間負荷することにより、デキサメサゾン抑制試験で非抑制が認められ、海馬あるいは前頭葉皮質のグルココルチコイドレセプター(GR)の障害が見られることを報告してきた。本研究は、拘束水浸ストレス以外のGR障害が見られるモデル系を確立し、さらにはそのGRの異常を分子生物学的に詳細に検討することを目的としている。本年度は、ストレスモデル作成に主眼をおいた。すなわち、マウスを用い出生当日より1日2時間あるいは4時間の母子分離ストレスを毎日1週間に渡って負荷した。その後1013週の間に行動学的試験(高架式十時迷路)、デキサメサゾン抑制試験(DST)およびGRの発現量をReal time RT-PCR法により検討した。その結果、DSTでは正常な抑制がかかるにもかかわらず海馬でのみGR異常が認められ、行動学的には強い不安を呈することが確認された。乳児期母子分離ストレスによる慢性ストレスモデルを確立した。乳児期母子分離ストレスモデルにおいて幼児期ではDSTでの非抑制や海馬あるいは前頭葉皮質でのGR発現の変動が示されている。しかし、本研究の結果では10週令以上の成獣では少なくともDSTにおける異常は認められなかった。この結果は、乳児期のストレス負荷によってもたらされる変化は幼児期と成熟期とで分けて議論する必要性を強く示唆するものである。成長するに従い、乳児ストレスによるDSTの非抑制あるいは前頭葉皮質でのGR発現増加は一見正常に戻ったように見える。しかし、行動学的には強い不安をきたし、海馬での有意なGR発現増加が確認され、乳児期母子分離ストレスが長期的な影響をもたらすことを明らかにすることができた。今後はGRの発現量とDSTの結果、行動についてのより詳細な関連性を検討するための実験を進めていく予定である.具体的には、海馬で発現しているGRのtypeについての検討、各個体レベルでのGR発現量とDSTとの関連や行動との関連を詳細に検討する予定である。さらに、乳児期母子分離ストレスによる性差の違いなどにも注目していく予定である。治療の手段としての漢方薬の検討も行なっていく。

毎日一定時間母から分離(母子分離ストレス:MS)されて育った仔は、成長後に行動異常を示すことが昨年度までの検討で明らかになったが、その結果は不安定であった。これは、MSが弱いストレスであり、しかも母のストレス感受性に個体差が大きく、ストレスが一定に負荷されていないためと考えられた。そこで、より強くて安定したストレスである「拘束ストレス(S)」を母に負荷することにし、母が受けるストレスが仔に与える影響をさらに深く検討した。MSとSを負荷された母に育てられた仔(MS+S群)は、他の群(対照群、MS群)よりも体重が軽かった。これより、母が受けたストレスが仔の発育不全を引き起こすことが示唆された。また、発育不全マウスの行動を観察すると、離乳期以降の運動量が他の群よりも多く、多動であることが明らかとなった。しかし、不安の程度を高架式十字迷路試験で検討したところ他の群との差を認めなかったので、多動は不安と関連しないと思われた。一般に、仔の発育不全の一因として母乳の栄養価の低下がある。母乳成分は血清成分を強く反映するため、本研究では母の血清アルブミンと総蛋白を測定したところ、どちらもMs+S群では対照群と比べ高く、仔の発育不全が母乳栄養価の低下に起因する可能性はほぼ棄却された。MS+Sを負荷された母には、ストレス負荷期間中および解除後1週間の時点で、他群には認められないうつ症状と不安行動が認められたことから、母が「精神不安定」になり、「育児」に何らかの支障を来たしたものと考えられる。現在、これらの成長および行動異常を遺伝子レベルで捉えるため、各マウスの脳における遺伝子発現の解析を行っているところである。(結論)子育て中の母マウスの過度なストレスは、仔マウスに影響し、行動学的な異常はその仔が成長しても残ることが示唆された。
中国における日本漢文の受容

本研究は日中文化交流の「逆輸入」という特別な視点から、従来ほとんど顧みられることがなかった日本漢文の中国本土へのフィードバックの状況を全面的に検討した。唐代から清末までの中国の典籍に著録されている多くの日本漢文作品を確認し、その時代背景と作者の経歴、作品成立の経緯および中国での反響等を考察することによって、日本文化の世界に向けての発信の歴史ないし東アジア漢字文化圏における文学往還の事象を、新たな角度から照らし出すことができ、日中文化交流史研究の新しい一ページが開かれたと言えよう。日本文化の中国へのいわゆる「逆輸入」、特に日本文化の重要な構成要素であった日本漢文の中国への流伝については、いままで学界でほとんど言及されていないため、研究代表者はこの空白を埋めようと考えている。中国においては詩話と文話はいずれも重要な文学ジャンルである。「詩話」(漢詩にまつわる評論)は宋の欧陽修が名付けて以来長い歴史を有するが、最初に著された「文話」(漢文にまつわる評論)は実は中国人の著書ではなく、江戸文人斎藤正謙の『拙堂文話』八巻(文政十三年、1830)ならびに『続文話』八巻(天保七年、1836)である。斎藤正謙のこれらの文献は常に中国で重視され、その結論は今でもよく引用される。本研究は『拙堂文話』の中国への流布過程を全面的に解明した上で、その東アジア漢字文化圏における歴史的な意義を再評価しようと考えている。研究作業において、『拙堂文話』と『続文話』の本文および日本側の関係資料についての検討は大体終わったが、中国側の関係資料は検索手段の制限があり一部入手困難なので、中国への流布過程の全容を徹底的に究明できた段階には未だ至っていない。それでこのいわゆる「逆輸入」の課題に関連性がある別のテーマに先に着手し、宋代文人楊億の『楊文公談苑』に所収の入宋僧寂照の漢詩作品を取り上げ、「日本漢詩西伝挙隅ー以『楊文公談苑』為例」と題し、2013年10月中国四川師範大学と西華師範大学共催の「東方詩話学会第8回国際学術研討会」で報告した。当論文は韓国延世大学『洌上古典研究』第38号(2013)に掲載された(『西華師範大学学報』2014年第1号に転載)。そこでこれからは『拙堂文話』の中国への流布過程に関する研究にもどり、2014年度内に決着をつけるべく努力する所存である。なお、前年度の「唐人所見日本漢文考」は『唐代文学研究』(広西師範大学)第17号に掲載された。日本文化の中国へのいわゆる「逆輸入」、特に日本文化の重要な構成要素であった日本漢文の中国への流伝については、今まで学界で殆ど言及されていないため、研究代表者はこの空白を埋めようと考えている。唐代は日本漢文が中国へ伝わった原点と言える時代である。よって中国における日本漢文の受容を検討しようとすれば、唐代から出発しなければならない。研究代表者は奈良時代末期の石上宅嗣の『三蔵賛頌』、そして空海の遣唐使として福建の地方長官に提出した「為大使與福州観察使書」、「與福州観察使入京啓」等の唐代文人の目にとまった漢文について調べ、「唐人所見日本漢文考」という論文にまとめて2012年8月に中国新疆師範大学で開催された「唐代文学学会第16回国際学術研討会」で発表した。そこで出された研究関係者の意見を踏まえて修正した後、学術誌に投稿する予定である。なお、このテーマに関連する課題である「李長栄『海東唱酬集』再考」という論文を、2012年9月に中国社会科学院と安徽大学が共催する「清代文学国際学術研討会」で発表した。また、以前の論文を改訂した「日本填詞西伝考」は『国際中国文学研究叢刊』第2集(上海古籍出版社)に掲載された。ほかに、江戸文人斎藤正謙の『拙堂文話』の中国への流布についても検討し始め、2013年10月に中国西華師範大学で開催される「東方詩話学会第8回国際学術研討会」で発表する予定である。上記の一連の成果は、研究代表者が目指している『中国における日本漢文学の受容』という著書の一部となるものである。日本文化の中国へのいわゆる「逆輸入」、特に日本文化の重要な構成要素であった日本漢文の中国への流伝について、いままで学界でほとんど言及されていないため、研究代表者はこの空白を埋めようと考えている。頼山陽の『日本外史』は日本史の名著で、江戸末期出版後日本人に広く愛読されているのみならず、中国にもかなり影響を及ぼしていた。幕末に日本の貿易船から上海の地方長官に贈呈されたのが中国における流布の発端で、その後上海さらに

広東で翻刻され、今でも中国の多くの図書館に所蔵されている。中国では『日本外史』は日本漢文の代表作として高く評価されただけでなく、日本の歴史に関する知識の普及にも重要な役割を果たしていた。これらは今のところ事実としては知られているものの、その背景の解明や理論的な分析などの専門的な研究はほとんどないため、本研究では『日本外史』の中国への流布過程を全面的に究明した上で、その東アジア漢字文化圏における歴史的意義を再評価しようとするものである。その成果を「頼山陽『日本外史』中国流布考」と題し、2014年8月中国湖北民族学院主催の「中国古代文学理論学会第19回年会曁国際学術研討会」で報告し、その修訂版をさらに10月中国浙江工商大学主催の「中国古文献研究第2回国際会議」で報告した。研究関係者の意見を参考にして改訂した当論文は2015年中刊行予定の『域外漢籍研究集刊』第12輯に掲載される。前年度計画していた斎藤拙堂『拙堂文話』についての研究は、中国に伝わった痕跡は少ないことが判明されたので、それをやめて今は明治文人竹添井井『桟雲峡雨日記並詩草』の中国への流布について検討中である。文学「中国における日本漢文の受容」というテーマは今まで学界ではほとんど認識されておらず、斬新とも言える研究分野であるので、研究代表者の発表した論文は開拓的な意義があると自負している。平成25年度は研究計画『拙堂文話』の中国への流布についての究明には至っていないものの、資料の検討はかなり進んでおり、関連テーマの学会発表をもおこなった上、賴山陽『日本外史』の中国への流布の調査にも着手したことを考えると、「おおむね順調に進展している」と言えよう。(理由)「中国における日本漢文の受容」というテーマは今まで学界ではほとんど認識されておらず、斬新とも言える研究分野であるので、研究代表者の発表した論文は開拓的な意義があると自負している。平成24年度は研究計画通りに「唐代における日本漢文の受容」に関する学会発表をおこなった。また、『拙堂文話』の中国への流布についての検討にも着手したことを考えると、「おおむね順調に進展している」と言えよう。*本課題の研究対象として、入唐僧圓仁の『入唐求法巡礼行記』、入宋僧成尋の『参天台五臺山記』、江戸時代斎藤正謙の『拙堂文話』、賴山陽の『日本外史』等有名な著書のみならず、多くの文献に散見する漢文で書かれた官製文書、私用書簡等も視野に入れて、様々なルートを通して中国に伝わった日本漢文を網羅的に集める予定である。その上で、日本漢文の中国への流伝の全容を解明しようと考えている。今後は時代ごとに検討を加えた上で、すでに大部分を完成させた「中国における日本漢詩の受容」に関する研究成果と整合性を持たせ、原稿の整理・補足をし、『中国における日本漢文学の受容』という著書にまとめることが目標である。もしこの研究が完成すれば、従来殆ど顧みられることがなかった日中文化交流史の新しい一ページが開かれ、研究の空白を埋めるに違いなく、東アジア漢字文化圏全体に対する視座を大きく変えることもできるのではないかと考える。漢詩漢文という純粋な中国文学のジャンルにさえ相互交流の事実があったことは、世界に対する日本文化の発信の歴史を新たな角度から照らし出すことにもなるのである。一方、安易に閉鎖的且つ自足的なものと考えられてきた中国文学も開放性・包容性を孕むものとして捉え直され、さらに広い視野で再検討されることも考えられる。本課題の研究対象として、入唐僧圓仁の『入唐求法巡礼行記』、入宋僧成尋の『参天台五臺山記』、江戸時代斎藤正謙の『拙堂文話』、賴山陽の『日本外史』等有名な著書のみならず、多くの文献に散見する漢文で書かれた官製文書、私用書簡等も視野に入れて、様々なルートを通して中国に伝わった日本漢文を網羅的に集める予定である。
遺伝子KOトキソプラズマ原虫作製法の確立と弱毒生ワクチン開発への応用

1)トキソプラズマ原虫のベクター化トキソプラズマ原虫由来のピリメタミン耐性ジヒドロ葉酸レダクターゼチミジル酸シンターゼ(DHFR-TS)遺伝子と海洋生物由来の緑色蛍光タンパク質(GFP)遺伝子発現ユニットの間にマルチクローニングサイト(MCS)を持つトランスファーベクターpDMGを構築した。MCSに外来抗原遺伝子を挿入したpDMGプラスミドをElectroporation法によりトキソプラズマ原虫に導入した後に、ピリメタミンによる薬剤選択とGFPによるカラー選択を行ったところ、目的の外来抗原遺伝子を発現する組換えトキソプラズマ原虫を効率よく作製することに成功した。2)ネオスポラ原虫のワクチン抗原NcSRS2を発現する組換えトキソプラズマ原虫の作製とワクチン効果の評価ネオスポラ原虫の主要ワクチン候補抗原NcSRS2遺伝子を発現する組換えトキソプラズマ原虫Tg/NcSRS2を作製した。1組換えTg/NcSRS2により発現されたNcSRS2の局在、分子量及び抗原性などはネオスポラ原虫由来の天然型NcSRS2に類似していることが示された。一組換えTg/NcSRS2で免疫したマウスではネオスポラ原虫に対する感染防御効果が認められた。3)クリプトスポリジウム原虫のワクチン抗原CpP23を発現する組換えトキソプラズマ原虫の作製とワクチン効果の評価クリプトスポリジウム原虫の主要ワクチン候補抗原CpP23遺伝子を発現する組換えトキソプラズマ原虫Tg/CpP23を作製した。組換えTg/CpP23により発現されたCpP23の局在、分子量及び抗原性などはクリプトスポリジウム原虫由来の天然型CpP23に類似していることが示された。組換えTg/CpP23で免疫したマウスではクリプトスポリジウム原虫中和抗体の上昇が認められた。本研究では迅速で簡便な遺伝子KOトキソプラズマ原虫の作製法を開発し、それにより本原虫の病原性因子の同定を行い、最終的には病原性遺伝子をKOした有効な弱毒生ワクチンの開発を目指して企画した。本研究は4年間の研究期間内に以下のような手順で実施していく。1)トキソプラズマ原虫のタキゾイト、シスト及びオーシストなど異なる生活環の虫体のcDNライブラリーを作成する。2)各生活環でキー役割を果たす主要遺伝子を同定する。3)各主要遺伝子のKO原虫を作製する。4)各遺伝子KO原虫のマウス及びネコにおけるシスト或いはオーシスト形成能及び病原性を調べる。5)病原性遺伝子KO原虫(弱毒化された原虫)のマウス及びネコにおける強毒原虫の感染に対する防御免疫誘導能を調べる。6)他の病原体の抗原遺伝子を発現する価組換えワクチン(トキソプラズマ病と他の病原体の感染症を同時に予防できる)の作製と応用を検討する。本年度に得られた主な成績は以下の通りである。1)トキソプラズマ原虫のタキゾイト虫体より抽出したmRNAを鋳型として、cDNAライブラリーを構築した。2)cDNAライブラリーより、SAG1、SAG2、SAG3、GRA1、ROP2などの遺伝子をPCRにてクローニングした。3)ピリメサミン耐性(抗T.gondii薬剤)ジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)遺伝子、海洋生物由来の緑色蛍光タンパク質(GFP)遺伝子をダブル選択マーカーとした迅速で簡便な組換えトキソプラズマ原虫の作製法を確立した。