hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
コリン作動性シナプスの構築・機能化・可塑性を制御する蛋白群の解析

強靭なコリン作動性シナプスを構築する培養上頸交感神経節細胞を用いて、1)プレシナプス構築と維持、2)構築されたシナプスの機能化、3)機能化したシナプスの時空間的活性化のメカニズムを解析し、コリン作動性シナプス構築・維持・強化・機能化を担い、シナプス活動に依存してダイナミックに変化するシナプス可塑性を担う蛋白分子の動態を明らかにすることを目的として研究を実施した結果、1)-3)を制御するものは、活動電位発火に伴って流入するCa2+、その濃度変化を感知して機能タンパク質を活性化するCa2+結合タンパク質群、流入するCa2+量を調節するCa2+チャネル制御タンパク質であることが確認された。平成25年度には、強靭なコリン作動性シナプスを構築する培養ラット上頸交感神経細胞をモデルシナプスとして、既存のC1からC2にアップグレードしたニコン共焦点レーザー顕微鏡システムを用いて、コリン作動性ポストシナプス構築蛋白分子群によるACh受容体クラスター化のメカニズムを解析し、発育途上/成熟シナプスのコリン作動性シナプス構築を担う各種蛋白群の働きを理解することを目標に掲げていたが、C2搬入が大幅に遅れたため、電気生理学的手法とC1での解析が可能である研究課題として平成28年度に計画していたACh小胞モーター蛋白Myosin IIBと新規モーター蛋白Myosin VIの遺伝子操作によるシナプス前終末の機能的活性化の検討を行い、Myosin IIBは神経活動に依存したシナプス小胞輸送を、VIは神経活動に非依存したシナプス小胞輸送を担うことを明らかにした。さらに、平成29年度に計画していたC2ドメインカルシウム結合蛋白(Synaptotagmin 1, 2)とEF handカルシウム結合蛋白(CaM, Calcineurin)の遺伝子操作によって、神経活動に伴うシナプス前終末カルシウム濃度上昇によるDynamin1, 2, 3活性化に起因する異なる小胞再取り込み経路選択への介在を確証する研究課題に着手して、シナプス活動に依存してダイナミックに変化するシナプス可塑性を担う蛋白分子の動態の手がかりを得た。平成25年度に着手したアセチルコリン小胞モーター蛋白Myosin IIBと新規モーター蛋白Myosin VIの遺伝子操作によるシナプス前終末の小胞移送のためのモーター蛋白の機能的活性化の解析を完結させるとともに、C2を用いてMyosin IIBとMyosin VI分子の局在を解析して、論文にまとめてJournal of Neuroscienceに投稿し、平成27年5月6日に受諾された。25年度報告書に記載したように、申請書には平成29年度に計画していた機能化したシナプスの時空間的活性化と不活性化のメカニズムの解析を平成26年度に実施して、神経活動とモーター蛋白の活性を時空間的に解析した結果、活動電位の発火パターンの違いよって活性化されるダイナミン1と3に駆動される時間経過が異なるエンドサイトーシスに引き続いて、モーター蛋白Myosin IIBとMyosin VIが、それぞれに、シナプス小胞を小胞放出部位に移送することを明らかにし、上記論文に含めた。また、シナプス前終末カルシウム濃度上昇による時空間的シナプス小胞制御を解析し、Molecular Pharmacologyに発表した。Alpha-synucleinはシナプス前終末膜に結合し、あるいは細胞質中に遊離して存在するが、その機能は不明である。パーキンソン病患者では細胞外のレビー小体に蓄積していることが確認されている。コリン作動性シナプスにおいて、alpha-synucleinが細胞外から作用してカルシウムチャネルの動態を制御してシナプス強化に関わることを見出し、Journal of Neuroscienceに発表した。さらに、シナプス小胞蛋白SV2Aがカルシウムチャネルの動態を制御してシナプス強化に関わることを見出し、European Journal of Neuroscienceに発表した。平成27年度には、アクテイブゾーンのタンパク質分子群のひとつであるCASTのリン酸化に注目し、リン酸化部位(serine 45)の遺伝子操作によるシナプス伝達機能変化を電気生理学的に検討して、シナプスタンパク質の機能的活性化を解析するとともに、C2コンフォーカル顕微鏡を用いてCASTリン酸化分子の局在と神経活動によるCASTリン酸化分子の増加を解析して、論文にまとめて12月にCell Reportsに投稿し、平成28年1月と平成28年5月6日にコメントを得て、再々投稿の準備中である。多くのタンパク質がシナプス小胞開口部位であるアクテイブゾーンを形づくっているが、その複合体の中心に位置すると考えられているCASTは、第45残基であるセリンが特異的にSADリン酸化酵素によってシナプス活動依存的にリン酸化を受け、シナプス小胞をアクテイブゾーンに移送する速度を遅くしてアクテイブゾーンで待機するシナプス小胞数を減少して、シナプス伝達を短期間抑制する短期シナプス可塑性という現象の一因となることが判明した。科学研究費補助金申請時、平成28年度に計画していた構築されたコリン作動性シナプスのシナプス活動に依存してダイナミックに変化するシナプス可塑性を担う蛋白分子の動態を明らかにする研究のうち、シナプス小胞開口放出関連タンパク質のリン酸化酵素によるシナプス機能活性化の研究課題について、アクテイブゾーンのタンパク質分子群のひとつであるCASTのリン酸化部位(serine 45)の遺伝子操作によるシナプス伝達機能変化を検討して、解析を完結し、論文を作成した。Cell Reportsに投稿した論文は査読され、再々投稿準備中である。

また、シナプス活動に依存してダイナミックに変化するシナプス可塑性を担う蛋白分子の動態を明らかにする研究計画のうち、シナプス小胞タンパク質のシナプス機能活性化の研究課題について、alpha-synuclein、SV2A(東京医科大学医学部助手谷藤章太)は、それぞれ、カルシウムチャネルの動態を制御してシナプス強化に関わることを見出し、平成26年にJournal of Neuroscience,平成27年にEuropean Journal of Neuroscienceに発表した。申請時、平成29年度に計画していたシナプスでの時空間的活性化と不活性化の解析のうち、活性化が時空間的に異なるエンドサイトーシスを駆動するDynamin isoformsの機能について検討して(東京医科大学医学部助手谷藤章太)、平成25年度にJournal of Cell Biologyに発表した。また、シナプス前終末カルシウム濃度上昇による時空間的シナプス小胞制御を解析し(東京医科大学医学部大学院生森倫範)、平成26年にMolecular Pharmacologyに発表した。さらに、Dynamin isoformsとMyosin isoformsとの活性化時間の違いの検討(東京医科大学医学部学生林田迪剛)から、それぞれの蛋白の機能位置と時間を推測し、平成27年にJournal of Neuroscienceに発表した。「構築されたコリン作動性シナプスのシナプス活動に依存してダイナミックに変化するシナプス可塑性を担う蛋白分子の動態を明らかにする研究」のうち、平成27年度に電気生理学的・組織化学的解析を行ったアクテイブゾーンのタンパク質分子群のひとつであるCASTのリン酸化部位(serine 45)の遺伝子操作によるシナプス伝達機能変化の検討を論文にまとめて12月にCell Reportsに投稿し、査読者からのコメントに対応して平成28年3月に再投稿、6月28日に再々投稿して、更なるコメントに対応して8月2日に再々々投稿して、9月13日に掲載された。シナプス小胞開口部位であるアクテイブゾーンでは、複数のタンパク質が複合体を形成しているが、その複合体の中心に位置すると考えられているCASTは、第45残基であるセリンが特異的にSADリン酸化酵素によってシナプス活動依存的にリン酸化を受け、シナプス小胞をアクテイブゾーンに移送する速度を遅くしてアクテイブゾーンで待機するシナプス小胞数を減少して、シナプス伝達を短期間抑制する短期シナプス可塑性という現象の一因となることをまとめた論文から、追加実験によって、CASTの発現量とリン酸化がアクテイブゾーンタンパク質の大きさを変化させ、他のタンパク質密度を制御することが確認された。さらに、神経伝達物質放出を引き起こすカルシウムイオンを流入させるN型Ca2+チャンネルがSUMO化されるとチャンネル活性が増強されることを確認していたが、SUMO化によって伝達物質の放出が制御されることを確認して2月24日にJournal of Physiologyに投稿し、再投稿を準備中である。
野生漢方薬原料植物カラスビシャクの迅速作物化の為の有効多糖成分合成遺伝子の同定

半夏の有効成分多糖であるアラバンの、カラスビシャク植物の各器官における存在量を検討するために、昨年度確立した坑アラバンモノクローナル抗体を用いた電気泳動-免疫ブロッティング法により、各器官から抽出した水溶性多糖画分を検討材料として、アラバンの定量を行なった。その結果、アラバンは塊茎には存在するが、根、葉、葉柄中には検出限界以上の存在は見出されなかった。一昨年単離した複数のアラビノース転移酵素オルソログをコードするcDNAの配列を用いて、これらクローンを区別し得るPCRプライマーを作製した。次いで、れらを用いたRT-PCRにより各クローンの発現器官の検討を行なった。その結果、複数種のクローンに相当する遺伝子が塊茎で発現していることを見出したが、塊茎特異的な発現を示すものは見出せなかった。また、獲得したアラビノース転移酵素オルソログやガラクトース転移酵素オルソログがアラバン生合成に関わるかを検討するために必須である、カラスビシャクの形質転換系の構築を進めた。まず、自然光下で生育させた植物の葉及び葉柄に、イントロンを持つGUSを発現させるバイナリーベクターを持つアグロバクテリウムを感染させ、GUSの活性染色により一過的な形質転換細の存在を検討したが、GUS活性を示す細胞はみいだされなかった。そこで、無菌植物由来の葉片を用いて同様な感染を行った結果、一過的な形質転換細胞が確認された。次いで、この条件でイントロンを持つGUSを発現させるバイナリーベクターを持つアグロバクテリウムを感染させた葉片を、アグロバクテリウムの増殖を抑える抗生物質を含む個体再生培地上で培養することで、GUS活性染色により染色される形質転換不定胚を獲得することに成功した。全国から採取した34系統のカラスビシャクを制御環境下で栽培し、その中から最も生育の良い系統を選び出した。また、この系統を含む複数の系統について、塊根中の坑アラバン抗体反応性を検討し、この生育の良い系統の塊根中にもアラバンが存在することを確認すると共に、これら複数の系統におけるアラバン含量の定量を進めた。また、上記の最も生育の良い系統の葉から、PCR反応の鋳型とするために、DNAを抽出した。これと平行して、研究開始時点において公共データベースに登録されており公開されていた、中国大陸産のカラスビシャク関連の電子配列情報と、多種の類縁遺伝子のイントロンエクソン構造を下に、網羅的解析のために用いるRNAの純度検定に用いるためのRT-PCR反応で対象とする候補の遺伝子候補を5種選び出した。次いで上記のDNAを鋳型としたPCR反応を行うことで、これらのうち3種についてはDNA断片が増幅されることを確認した。またこれら増幅断片の配列解析を進め、解析が終了した100塩基程度からなる1種の断片中に、アミノ酸置換を伴う3塩基の置換を見出した。このことから、中国と日本のカラスビシャク中にはかなりの変異が存在する可能性が示唆された。また、年度途中に中国のグループにより公開されたカラスビシャクの塊根のRNAseqデータを用いて、他植物で見出されたアラビノース転移酵素のオルソログの検索を順次進めた。現在迄に検索が終わった2種の酵素においては、共に完全長cDNAの配列をアセンブルすることに成功している。カラスビシャクから高純度のRNA調製が行えたことの確認のために、中国の研究グループの報告にある既知の遺伝子を用いたRT-PCRを行うことを計画しており、この候補遺伝子5種について、本邦産カラスビシャクのゲノムDNAを用いたPCRによりDNA断片の増幅を試みた。しかしなかなかPCRでの増幅が認められず、結果的にPCRに使用でくるプライマーの設計に手間取ってしまい、RNA抽出の条件を決定するに至らなかったため、当初計画した方法での研究に遅れが生じている。一方、年度途中に中国の上記と別の研究グループが、カラスビシャクの塊茎の網羅的トランスクリプトーム情報を公共データベース上に公開したことを受けて、他植物の既知のアラビノース転移酵素との相同性解析から、二種のことなるアラビノース転移酵素のカラスビシャクのオルソログの推定mRNA配列の構築に成功しており、候補の絞り込みという点では、当初計画した方法とは異なる方法ではあるが、予定より進展している。また、複数の系統由来の塊根におけるアラバン量の定量解析や、蓄積量の多い系統の選抜については予定どおり推移した。一方、種子を経由した遺伝的多様性の獲得については、自家受粉及び他家受粉とも殆ど種子が形成されなかったため、この方向での研究は進んでいない。これらを総合して、やや遅れていると判断した。九州大学でコレクションした複数系統の中から、昨年度迄に見いだしていた最も生育の良い系統を材料に、根、塊根、葉、葉柄から、逆転写酵素の阻害因子を多量に含まず、また殆ど分解が起きていないRNAを抽出する条件を設定した。次いでこれらのRNAを鋳型として、RNAseq反応に供した。その結果、100塩基の長さのcDNA断片の配列を、根、塊根、葉、葉柄のそれぞれ、4.3Gb、4.6Gb、4.7Gb, 4.4Gbの長さ分を得た。現在、これらの配列情報の解析を進めている。昨年度、公開配列情報を下にアセンブルした2種のアラビノース転移酵素候補のうち、異種発現でアラビノースに富む糖鎖の合成が認められると報告されているもののオルソログをコードするcDNAのクローニングを、上記の最も生育の良い系統を出発材料として進めた。

まず、RT-PCRにより、根,葉と塊茎にこの遺伝子オルソログの発現の可能性を示す結果を得た。次いでこれら産物のクローニングと配列解析を進めた。現在迄に解析の終了した根由来の2クローンは同一の配列を有しており、また昨年度アセンブルした配列より,1アミノ酸残基長いタンパク質をコードすることを見いだしている。アラビノース転移酵素候補に対するcDNAの獲得ができたことで、候補遺伝子産物の単離は順調に推移していると考えられる。また、種子を経由した遺伝的多様性と遺伝子の伝達のための解析対象の獲得については、2系統で自殖条件を確立することが出来、またこれら自殖種子由来の個体も得ることが出来た為、概ね順調に推移していると考えられる。RNAseqのデータ獲得については、高純度RNAの調製に手間取ったため、年度末まで時間を要してしまい、これについては計画より少し遅れていると考えられる。以上を総合すると、本研究は概ね順調に進展していると考えられる。昨年度獲得したRNAseqデータを分析するために必須である、坑アラバンモノクローナル抗体を用いたELISA法による器官別のアラバン定量データの獲得を進めた。しかしながら、葉および葉柄由来の抽出液中ににELISAを阻害する活性が存在したため、ELISA法による定量が出来なかった。そこで、透析、塩析、有機溶媒沈殿等の前処理により、阻害活性の除去を試みたが、結果の改善は認められなかった。そのため、抽出材料としている凍結乾燥後の組織粉末を、有機溶媒で処理することにより、阻害活性の除去を試みたが、この方法によっても阻害活性を除くことが出来なかった。そこで、阻害物質とアラバンを簡便に分離する可能性のある方法を検討したところ、電気泳動により分離し、それをブロッティングにより膜に転写し、次いで抗体と反応させることでアラバンの定量が可能であることを見いだした。現在、この方法を用いてアラバンの定量を進めている。上記のアラバン定量の実験と平行して、昨年度獲得したアラバンの主鎖の形成に関わる可能性があるアラビノース転移酵素と同様な方法で、アラバンの枝分かれした側鎖の合成に関わる可能性のある酵素の一つの可能性があるガラクトース転移酵素についての探索を進めた。すなわち、アラビノース転移酵素と同様にRNAseqデータのアセンブルの結果得られた配列と、異種植物のガラクトース転移酵素タンパク質の配列情報を用いて、カラスビシャクのガラクトース転移酵素cDNAの獲得を進めた。その結果、630程度のアミノ酸残基からなるガラクトース転移酵素オルソログのcDNAの獲得に至った。ELISAによる組織別のアラバン定量が、抽出液中のELISA阻害活性により実行できなかった。そこでこれを回避する方法の開発を進め、最終的に電気泳動による分離を用いることで定量が可能となったが、この方法の開発に時間を要したため、RNAseqのデータを用いた、候補遺伝子産物の絞り込み作業に遅れが生じている。半夏の有効成分多糖であるアラバンの、カラスビシャク植物の各器官における存在量を検討するために、昨年度確立した坑アラバンモノクローナル抗体を用いた電気泳動-免疫ブロッティング法により、各器官から抽出した水溶性多糖画分を検討材料として、アラバンの定量を行なった。その結果、アラバンは塊茎には存在するが、根、葉、葉柄中には検出限界以上の存在は見出されなかった。
転移RNAの挙動に基づいた新規腎障害マーカーの確立

tRNAの構成成分である修飾核酸1-メチルアデノシンの挙動変化を検知することが急性腎傷害の新しいバイオマーカーとなることを明らかにした(Mishima,JASN,2014)。また大迫研究コホートのサンプルを用いた一般住民の解析から血中の1-メチルアデノシン濃度がその後の総死亡率と相関することを明らかにした。さらに本研究の過程から各種修飾塩基(1-メチルアデノシン、N6メチルアデノシン、シュードウリジン、5-メチルシチジン)に対するモノクローナル抗体を使用してRNA内の修飾を簡便に検出するImmuno-Northern blotting法を確立した(Mishima,PLoS ONE,2015)。酸化ストレスは細胞ダメージを引き起こし急性および慢性腎不全を含む様々な疾患の病態形成に関与する。申請者らは独自に樹立した転移RNA特異的な抗体と質量分析装置による解析から細胞障害時の転移RNA(tRNA)の挙動を検知することが新規の組織障害のバイオマーカーとなりうることを見出してきた。我々が確立したELISAおよびLC-MSを用いて血中tRNA由来物濃度の測定を行った所、急性腎障害(心臓外科手術を受けた後の患者)および慢性腎臓病の患者において腎機能の悪化と血中tRNA由来物濃度に相関性と認めた。さらにこの血中濃度の変化は既存の腎機能マーカーである血清Crの上昇よりも早期から上昇することを認めた。また、細胞障害時におけるtRNAの分解が担う生理的意義の検討を進めた。この検討のために細胞ストレス時のtRNAの分解を行う酵素であるAngiogeninのKOマウスを作成した。腎障害を惹起させた本マウスの解析することで、腎障害の病態形成におけるストレス誘導性のtRNA分解が担う役割の検討を進めている。また培養細胞を用いたストレス実験(酸化ストレス、虚血ストレス)においてtRNA分解の誘導および阻害を行い細胞死への寄与を検討している。各種ストレスおよび酵素誘導により培養細胞においてもストレス誘導性のtRNA分解を確認することができており、細胞生存、細胞応答への影響をMTTアッセイ、migrationアッセイ、炎症性サイトカイン発現量の変化等で検討を行う。tRNAを含むRNA中の修飾塩基を検出する方法として、修飾塩基(1-メチルアデノシン、シュードウリジン、N6-メチルアデノシン、5-メチルシチジン)に対する抗体を用いてノーザンブロッティング変法であるImmuno-Northern Blotting法を新規に確立した。またLC-MSによる各ターゲット修飾塩基の検出法も開発し、Immuno-Northern Blotting法との比較バリデーションを行った。(Mishima and Jinno et al., PLos One 2015)また,修飾核酸の中でもtRNAの構成成分の一つである1-メチルアデノシンは急性腎傷害など組織障害に血中に増加すること、そして血中1-メチルアデノシンは急性組織障害のバイオマーカーとなることをマウス、ラット、ブタの各組織障害モデル、およびヒト心臓外科術中の臨床検体を解析して明らかにした。さらに血中1-メチルアデノシン濃度があがる機序として酸化ストレスがtRNAの構造変化を引き起こし、それにひきつづく細胞外へのtRNA構成成分の漏出であることを1-メチルアデノシン特異的抗体を用いたin vitro,in vivoの解析系から示した。さらに一般住民コホート:大迫研究のサンプルを用いた解析から、血中1-メチルアデノシン濃度の高値はその後の死亡率上昇の独立した危険因子となることを多変量解析から明らかにした(Mishima,et al.J Am Soc Nephrol.2014)tRNAの構成成分である修飾核酸1-メチルアデノシンの挙動変化を検知することが急性腎傷害の新しいバイオマーカーとなることを明らかにした(Mishima,JASN,2014)。本研究の目的である腎障害のバイオマーカーとしての血中tRNA由来物質濃度の有用性に関しては、腎機能の悪化と血中tRNA由来物質濃度に相関性を得ることができており、今後は病型ごとの違いや予後との関連の解析を進めていく。Angiogenin KOマウスは樹立されており、現在本マウスの表現形の検討を進めているところである。tRNA由来物の測定や解析に用いる方法は確立されつつおり、今後は解析方法のさらなる改良をすすめる。このため当初の年次目的を概ね達成していると考えられる。腎臓病学倫理申請をすでに承認されている各種腎臓病の患者検体を用いて、腎臓病の病型、腎機能、予後と血中tRNA由来物濃度の関連性の検討を継続する。Angiogenin KOマウスを用いて、各種腎障害モデル(シスプラチン腎症、アデニン誘発性腎症、5/6腎摘出モデル)を惹起させることで、腎障害発生におけるAngiogeninが関与するストレス誘導性tRNA分解反応の重要性の検討を進める。培養細胞実験でも同様に各種ストレスモデルを用いてtRNA分解反応の誘導および阻害が細胞傷害に与える影響の検討を進めていく。またtRNA由来物質の測定系に関してはさらなる精度の上昇に務めるべく改良を行っていく。

測定に用いる消耗品であるカラムおよびELISAキットの納入が遅れたため、その費用のため次年度に繰り越すため血中tRNA由来物濃度の測定のための消耗品であるカラムおよびELISAキットの購入に当てる
ICP／PSDプラズマCVDハイブリッド法によるDLC膜の高速成膜技術の開発

擬火花放電プラズマCVD法を用いて、DLC膜の成膜装置の開発を行った。XPSスペクトルは非晶質炭素に典型的なC1sピークを示した。膜中のsp3結合の存在比と膜硬度は、基板電圧の増加に伴って増加した。DLC膜の最大硬度は基板電圧-300 Vで5.8GPaであった。電極間に浮遊電極を追加し、挿入前と比べるとイオン密度がわずかに減少し、プラズマが継続して撃ち出されなかった。装置に追加した水素によるICPの基礎特性を調べた。RF電力300 W時、200 mm下流のイオン密度は1012 cm-3オーダーであった。また、RF電力(50300 W)に対して電流と電圧の位相差が変化することを確認した。本研究では大電流放電ありながら拡散した放電を形成する擬火花放電(PSD)に、水素原子注入用の誘導結合プラズマ(ICP)を追加したPSD/ICPハイブリッドプラズマCVD法を用いて、DLC膜作製時の成膜速度の向上を主な目的としている。今年度はICP用の電源を購入したが、まだPSD成膜装置への取り付け作業を行っていない。そこで、平成27年度はプロセスガスとして用いた水素希釈メタンガスの水素ガス流量および基板電圧の変化に対するDLC膜の特性変化について調べる基礎的な実験を行った。H2ガス流量を変化させた際の膜特性の変化をラマンスペクトルから調査した結果、アモルファスカーボン膜と同様、GおよびDピークを持ったブロードなスペクトルが観測された。しかしながら、スペクトルのベースラインに蛍光成分がみられたことから、水素を多く含むポリマー構造の膜であることが予想された。また、H2のガス流量が増すとラマンスペクトルのGピークの位置が低い波数側にシフトしていたことから、膜中のsp3結合の割合は増加していることが予想される。XPSを用いて、膜の構造およびsp3およびsp2結合の存在比に関して調べた。膜のC1sスペクトルから、炭素のsp3結合、sp2結合、カルボニル基、カルボキシル基の4つのピークから構成されていた。この結果から酸素との結合が確認された。また、sp3の存在比および膜硬度が水素のガス流量の増加に対してそれぞれ増加傾向にあることがわかり、相関関係があることがわかった。しかしながら、膜硬度の最大値は5.8GPaであり、DLC膜の硬度に達していなかった。そこで、硬度の改善を目的に、基板電圧増加の効果について調べた。その結果、水素流量の増加に対して硬度が改善することを確認した。また、ラマンスペクトルにみられた蛍光成分についても減少を確認し、基板電圧増加の効果を確認した。プロセスガスである水素希釈メタンガスの水素ガス流量の増加によって、膜特性の改善および硬度の増加を確認した。しかし、ラマンスペクトルの特性からベースラインで傾きがみられる蛍光成分が確認された。これは膜中の水素含有量が多い、ポリマー状の膜が作製された可能性が考えられる。そこで、C-Cのダイヤモンド結合に比べて結合エネルギーが低いC-Hの結合を除去する目的で、基板電圧の増加の効果について調べた。これはイオンによるエッチングによって、水素原子の除去が目的である。その結果、基板電圧を増加させることで、膜特性・硬度が改善されていることがわかった。以上の結果から、更なる膜特性の改善を目的に基板電圧の増加を試みた。具体的には基板電圧を最大で-700Vまでを目標にしていたが、実際に電圧を上昇させると基板ホルダーと真空チャンバー間で放電が発生する問題が起きるとともに、基板を加熱するヒーターが放電時にダウンする問題が発生した。前者については、放電作動気圧が低気圧領域であるとともに、電極から撃ち出されたプラズマが接地状態のチャンバー内壁に拡散していることが理由として考えられる。今後は絶縁対策を施し、基板電圧上昇を実現させる予定である。また、後者のヒーターのダウンについては放電時にサージが発生していることが考えられる。この原因として、放電電極とホルダー間の短絡現象が起きている可能性も考えられた。これも低気圧領域での放電およびホルダー内のヒーターが接地状態であることが原因として考えられた。これについては、電源の形式をスイッチング方式のものを用いることで解決できた。今後は基板電圧の上昇を実現させ、研究計画の遂行に取り組んでいく。本研究の目的は、ホローカソード効果により拡散した放電を形成する擬火花放電をプラズマCVD法のプラズマ源に用いて、ダイヤモンドライクカーボン(DLC)膜の高速成膜装置の開発である。昨年度は成膜速度が最大で52 μm/hに達することが確認されている。しかしながら、ラマンスペクトルおよびXPSの計測結果により、DLC膜中の水素濃度が高い傾向にあることがわかり、その結果、ナノインデンターで計測したDLC膜の硬度も6 GPa程度と、DLC膜の硬度に達していなかった。特にラマンスペクトルにはベースラインが傾きをもつ蛍光成分が観測され、このことが膜硬度の低下の要因であることが考えられた。そこで、本年度はメタン流量2 ml/minに対して、水素流量を4080 ml/minで変化させた際の膜中の水素濃度について調べた。絶縁破壊電圧2.1 kV、放電電流の最大値は8 kAである。イオン引き込み電圧ー100 V、成膜気圧はおよそ15 Paである。水素濃度はラマンスペクトルのベースラインの傾きとGバンドのピーク値の比を求め、これと水素前方散乱分析法(HFS)に対する特性結果を用いて見積もった。その結果、プロセスガスの水素割合を増加させることで、膜中の水素濃度が低下することがわかった。

しかしながら、水素の流量の最大値80 ml/minの条件でも水素濃度が40 %以上と高いことからわかった。また、膜質向上の目的で擬火花放電プラズマに加えて、水素ガスによる誘導結合プラズマ(ICP)の導入実験を行うために、ICPの生成実験を行い、プラズマの生成を確認した。基板電圧の上昇時に発生したいくつかの問題(基板ヒーター用の電源のダウンなど)の対策としていくつかの取り組みを行ったがうまくいかなかった。また、装置のガス導入および排気機構に改良を加えたところ、これまでの成膜条件下でDLC膜の生成が得られない問題が発生したため、研究遂行に想定以上の時間を要した。本研究の目的は、ホローカソード効果により拡散した放電を形成する擬火花放電をプラズマCVD法のプラズマ源に用いて、ダイヤモンドライクカーボン(DLC)膜の成膜装置の開発である。今年度は膜特性(膜硬度)の向上を目的に、基板電圧を-300 Vに高め、その効果について調べた結果、基板電圧-100 Vで5.0 GPaであった硬度が、5.8 GPaと向上した。また、膜中のsp3/(sp2+sp3)割合をXPSスペクトルから見積もった結果、その値が向上していることも確認した。次に、擬火花放電電極間にフローティング電極を追加した多重電極化の初期実験を行った。1枚のフローティング電極を挿入することで、気圧に対する絶縁破壊電圧特性が挿入前に比べて、低気圧方向にシフトしたが、実験気圧(17 Pa程度)ではその絶縁破壊電圧値に大きな差は見られなかった。また、その特性から放電路が電極間の最短距離も長い放電路が形成される擬火花放電の形成を確認することができた。トリプルプローブ法を用いて、フローティング電極の有無でイオン密度を比較した結果、未挿入に比べて挿入時はイオン密度がわずかに減少することが確認され、且つ、プラズマが継続して撃ち出されない問題を確認された。最後に、ICPによる水素原子注入システム追加を目的に、まずはICP単独動作によるその基礎特性を調べたところ、RF電源によって投入電力300 Wの条件において、ICPコイルからおよそ200 mmの位置のイオン密度が10^12 cm^-3オーダーであることがわかった。また、実験気圧14 Paの下、RF投入電力を50300 Wまで変化させ、電流電圧波形の位相差を波形から計測した結果、投入電力に対して位相差の変化を確認した。100 Wまでは位相差が90°に近づいていき、その後減少傾向が見られたが、300 W以降、再び位相差の増加が見られた。擬火花放電プラズマCVD法を用いて、DLC膜の成膜装置の開発を行った。XPSスペクトルは非晶質炭素に典型的なC1sピークを示した。膜中のsp3結合の存在比と膜硬度は、基板電圧の増加に伴って増加した。DLC膜の最大硬度は基板電圧-300 Vで5.8GPaであった。電極間に浮遊電極を追加し、挿入前と比べるとイオン密度がわずかに減少し、プラズマが継続して撃ち出されなかった。装置に追加した水素によるICPの基礎特性を調べた。
ピロリ菌に含まれる糖脂質によるｉＮＫＴ細胞の活性化とその機能

ヘリコバクター属の細胞壁の構成分子として、コレステリルalpha-グルコース転移酵素(aCgT)から合成されるコレステリルalpha-グルコシド類(aCG類)が知られている。私達はaCG類がピロリ菌感染にどのような影響を及ぼすかを調べた。内視鏡検査で採取されたピロリ菌臨床分離株を用いた結果から、aCgT活性の高いピロリ菌ほど増殖が早く、胃粘膜の萎縮に関与していた。宿主側では、aCG類がインバリアントNKT(iNKT)細胞を活性化し、aCgT活性の高いピロリ菌ほどiNKT細胞に排除される傾向が認められた。これらの点より、aCG類はピロリ菌側と宿主側の双方に重要な役割を果たすことが示唆される。ヘリコバクター属の細胞壁を構成する主要な分子としてコレステリルalpha-グルコシド(aCGL)とaCGLから合成される誘導体がコレステリルalpha-グルコシド類(aCG類)として同定されている。私達は、aCGLの合成に関与するコレステロールalpha-グルコース転移酵素(aCgT)が、胃粘膜深部の粘液に発現している特異的なO-結合型糖鎖によって阻害されることより、ピロリ菌の増殖抑制や形態異常を生じることを報告してきた。aCG類がピロリ菌感染にどのような影響を及ぼしているか長い間不明であったため、本研究の一連の研究結果より、aCG類のピロリ菌感染における役割を明らかにした。(1)胃粘膜標本の病理学データと臨床分離株のaCgT活性の解析より、aCgT活性は胃萎縮の程度と正の相関を示したことから、aCgTから合成されるaCG類は細胞障害性に関与していることが示唆された。(2)ピロリ菌のaCG類は宿主側の免疫担当細胞に認識されるかどうかを調べると、CD1d上で提示されたピロリ菌のaCG類はインバリアントナチュラルキラーT(iNKT)細胞を活性化することが明らかになった。(3)活性化したiNKT細胞のピロリ菌感染における機能を明らかにするため、野生型マウスおよびiNKT細胞欠損マウスへのaCgT遺伝子改変ピロリ菌を用いた短期感染実験を行ったところ、活性化したiNKT細胞はピロリ菌の排除に関与していた。これらの研究結果より、aCgTによって生合成されるaCG類が胃粘膜の萎縮をはじめとする炎症の惹起に関与していること、一方で、宿主側にとってaCG類がiNKT細胞に対する免疫応答を引き起こしてピロリ菌の排除に機能していることは、aCG類が胃粘膜傷害の程度を決定する一因になりうることを示唆している。ヘリコバクター・ピロリ(ピロリ菌)は胃に生息するグラム陰性菌で、世界人口の約50%に感染しており、慢性胃炎、消化性潰瘍や胃癌の主な原因の一つである。ヘリコバクター属の細胞壁を構成する主要な分子として、コレステリル-alpha-グルコシド類(alphaCG類)が同定されている。以前に、私達は、alphaCG類がコレステロール-alpha-グルコース転移酵素(alphaCgT)によって合成されることを報告した。近年、私達は、ピロリ菌のalphaCG類が免疫担当細胞の一つであるインバリアントNKT(iNKT)細胞の活性化を引き起こすことを明らかにした。本研究は、ピロリ菌がもつalphaCG類によって活性化するiNKT細胞の病理学的および免疫学的な機能を明らかにすることを目的とする。平成24年度は、5つの実験計画のうち、3つにおいて遂行した。(1)iNKT細胞によるalphaCG類の認識では、in vitroおよびin vivoの両レベルにおいて、alphaCG類がiNKT細胞を活性化することを明らかにした。(2)ホモロジーモデリング法により、aCgTの立体構造を推測した。(3)aCgT改変ピロリ菌を用いて、マウスのピロリ菌感染時におけるiNKT細胞の発現や、サイトカインレベルの変動を解析した。本申請では、次のような5つの実験計画を立案している。(実験1) in vivoレベルでのalphaCG類によるiNKT細胞の活性化の測定、(実験2)alphaCG類とCD1dとの分子間相互作用の解析、(実験3)ピロリ菌の初期感染におけるiNKT細胞の制御機構とネットワークの解明、(実験4)パラフィン包埋胃生検ブロックを用いたiNKT細胞と免疫担当細胞の発現、(実験4)パラフィン包埋胃生検ブロックを用いたiNKT細胞と免疫担当細胞の発現、(実験5)ピロリ菌感染から慢性炎症や胃癌への進行におけるiNKT細胞の機能解析、である。

このうち、平成24年度は、実験1-3において結果が得られたため、当初の予定通りに研究が進んでいる。当初の研究計画通り、5つの実験計画のうち、平成25年度は、(実験4)パラフィン包埋胃生検ブロックを用いたiNKT細胞と免疫担当細胞の発現、(実験5)ピロリ菌感染から慢性炎症や胃癌への進行におけるiNKT細胞の機能解析、について研究を行う。現在のところ、条件検討など順調に進んでおり、実験計画通りに遂行できる見込みである。備品を除いて、消耗品、旅費などは研究計画書の通りに使用する予定である。消耗品として、プラスチック消耗品、一般汎用試薬、分子生物試薬、微生物用試薬・培地などを購入する予定である。旅費は、日本糖質学会年会や、米国糖質学会などに参加する予定である。備品については、当初、高速冷却遠心機を計上していたが、異動先の研究室では、高速冷却遠心機が既に設置してある。よって、本申請での高速冷却遠心機の購入は見直しを検討したいと考えている。
幕藩制国家の沿岸警備体制に関する研究

幕政史と藩政史の構造的連関性を総合的に把握することによって、幕藩制国家の沿岸警備体制を再構築し、東アジア世界のなかでの幕藩制国家の特質を明らかにすることを目的として研究を進めた。特に従来、幕府レベルの政策の大名レベルへの影響、それに伴う諸大名の対応という、幕藩間における政策の相関性・連動性などが不明確であり、昨年度から行っている個別事例の検討を継続して行った。「漂流民送還船への幕藩制国家の対応-貞享二年の南蛮船来航をめぐって-」(『洋学史研究』掲載決定)家光政権の政策がいかに幕藩制国家に根付き、機能し得たのかという問題については、十分な検討がなされてこなかったことから、貞享二年の南蛮船来航を事例に、その時の対応を具体的に解明し、この事例が徳川政権の対外政策にどう位置づけられるのか考察した。その結果、(1)在長崎の長崎奉行川口源左衛門(宗恒)が、南蛮船の来航目的と船・船員の調査を踏まえた上で「別条無御座船」として対応に当たり、大名側の対応を抑制する動きを見せたこと、(2)そして、幕府の方針が長崎に伝えられても、川口源左衛門(宗恒)は一貫した方針でことにあたり、大名側の対応を制御した。また、大名側もそれに従うかたちで対応にあたったこと、(3)さらに幕府(老中)の対応としては、南蛮船を帰帆させ、「跡々之例等考」え、事後報告として老中に伝えるという体裁で今回の南蛮船の来航を処理した。つまり、「御制禁」である以上ただ単に船を帰帆させることが幕府には出来ないため、長崎奉行レベルでの事件としてこの件を幕府が位置づけようとしたことが明らかになった。
アフリカのコウモリから分離された新規パラミクソウイルスの研究

本課題の研究対象であるBat mumps virus (BMV)は2014年にザンビアで捕獲したピーターケンショウコウモリ(Epomophorus crypturus)から分離された。同コウモリ群におけるBMV保有率を明らかにするために、2014-15年に捕獲した計81頭のコウモリを対象にBMVに対する遺伝学的スクリーニングを実施した。その結果、21% (81頭中17頭が陽性)の個体がBMV遺伝子を保有することがわかった。BMVの組織ごとの分布を調べたところ、脾臓において最もBMV検出頻度およびウイルス力価が高かった。ついで、肺、腎臓、結腸、唾液腺におけるBMV検出頻度が高いことがわかった。ヒトのMumps virus同様、唾液腺におけるウイルス増殖が認められたことは興味深い。以上の結果から、唾液、尿、便などの分泌物を介してBMVがコウモリ間を伝播していることが窺えた。今後はE. crypturus以外のコウモリについても分子疫学的および血清学的スクリーニング実施し、BMVの自然界での生存様式に関する知見を蓄積したいと考えている。BMVの宿主特異性、病原性などを解析する目的で、様々なげっ歯類モデル動物(マウス、ラット、ハムスター、モルモット)を用いた実験感染を実施した。BMVを腹腔内もしくは鼻腔内接種したところ、顕著な臨床症状は示さなかったもののいずれの個体においても抗体の陽転が確認された。また、ラットおよびハムスターの臓器(脾臓、唾液腺、結腸等)からBMV遺伝子が検出された。これらの結果は、BMVがコウモリ以外の哺乳動物に対しても感染性を有することを意味する。ザンビアで捕獲したコウモリにおけるBMVの保有状況およびげっし類動物モデルを用いた感染実験など、初年度に計画していた実験を滞りなく実施することができた。詳細な解析を継続する必要はあるが、概ね計画通りに進捗していると判断することができる。E. crypturusに対するBMV遺伝子のスクリーニングは完了したものの、血清学的な解析は実施していない。精製ウイルスもしくはウイルス蛋白質を抗原としたBMV特異抗体の検出あるいは感染性BMVに対する中和試験を実施し、コウモリのBMVに対する過去の感染状況についての知見を得る。ザンビアではE. crypturus以外にも他種多様なコウモリを捕獲している。パラミクソウイルス遺伝子を広範囲に検出できるPCR法を用いて、E. crypturusを含む多様なコウモリにおけるパラミクソウイルスの分布状況を把握し、コウモリパラミクソウイルスの生態学的・進化学的な知見を得たい。BMVの動物実験によりげっ歯類動物の組織におけるウイルス増殖は確認されたものの、臓器中のウイルス力価などの詳細については解析をする必要がある。また、臨床観察による症状は確認されなかったものの、組織学的な解析により各臓器における病理学的変化を観察したい。また、免疫染色法により各組織におけるウイルス抗原を検出し、BMVの組織学的な特異性あるいは生体における増殖様態などに関する知見を得たいと考えている。BMVの動物実験によりげっ歯類

動物の組織におけるウイルス増殖は確認されたものの、臓器中のウイルス力価などの詳細については解析をする必要がある。また、臨床観察による症状は確認されなかったものの、組織学的な解析により各臓器における病理学的変化を観察したい。また、免疫染色法により各組織におけるウイルス抗原を検出し、BMVの組織学的な特異性あるいは生体における増殖様態などに関する知見を得たいと考えている。当研究課題を開始するにあたり、過去の研究により採集し、国内で保管されているコウモリの余剰検体を用いた実験から着手した。解析の結果、当初の予想よりも好ましい結果が得られたため、初年度に予定していたザンビア出張を先送りにした。次年度使用額については初年度に延期したザンビア出張および現地での活動に必要な経費に充てる。また、研究成果を発表するための国内学の学会参加費にも使用する計画である。
痴呆老人の看護ケアに関する研究-コミュニケーション障害と異常行動を中心に-

本研究は痴呆老人のコミュニケーション傷害や異常行動の実態を明らかにし,効果的な看護ケアの方法を検討することを目的とした61年度よりの2年間に渡るものであるので,その実施計画は1.特別養護老人ホームに入所中の痴呆老人の実態(痴呆老人の頻度と日常生活上の障害,並びにそれらへの関わり方)の分析2.在宅痴呆老人の日常生活上の問題と家族の対応のしかたの把握を行ない.痴呆老人の問題行動や日常生活上の障害の緩和にむけての看護ケアの方法を検討するものである.研究成果の主なものは次の通りである. 1-1) Y特別養護老人ホーム入所老人では248人の対象者のうち,長谷川式スケールで痴呆(0-10点)の者の割合は31.5%であり,男では26.2%女では33.1%であり男の方が低い. 1-2)痴呆の割合は年齢と共に増加している. 1-3)痴呆の程度と日常生活動作能力との関係をみると,痴呆の程度の高い老人ほど日常生活動作が全般的に低下を示し,意志疏通面では意志の表示,話の了解などのコミュニケーション障害が大きく低下している. 2-1)ぼけ老人をかかえる石川家族の会の呆け老人30人(男8人,女22人)の呆けに気付いたきっかけは(1)つじつまのあわない話をするようになって, (2)被害妄想的な言動がめだって, (3)今言ったことをすぐ忘れるようになって,が多くみられた. 2-2)現在家族が困るような問題行動やコミュニケーション障害を訴える割合は80%以上であるが,各々の対応に苦慮がみられる. 2-3)ほぼ半数の痴呆老人に気持ちの緩和や不安の静穏に効果的な事物がみられる.これらには老人のこれ迄の生活過程と関連が深い例もみられる.以上より痴呆老人のケアには,これ迄の生活過程を大切にした対応が要求され,今後さらに痴呆老人の内面の世界に迫れるような対応の仕方の検討が必要と考える.本研究は痴呆老人のコミュニケーション傷害や異常行動の実態を明らかにし,効果的な看護ケアの方法を検討することを目的とした61年度よりの2年間に渡るものであるので,その実施計画は1.特別養護老人ホームに入所中の痴呆老人の実態(痴呆老人の頻度と日常生活上の障害,並びにそれらへの関わり方)の分析2.在宅痴呆老人の日常生活上の問題と家族の対応のしかたの把握を行ない.痴呆老人の問題行動や日常生活上の障害の緩和にむけての看護ケアの方法を検討するものである.研究成果の主なものは次の通りである. 1-1) Y特別養護老人ホーム入所老人では248人の対象者のうち,長谷川式スケールで痴呆(0-10点)の者の割合は31.5%であり,男では26.2%女では33.1%であり男の方が低い. 1-2)痴呆の割合は年齢と共に増加している. 1-3)痴呆の程度と日常生活動作能力との関係をみると,痴呆の程度の高い老人ほど日常生活動作が全般的に低下を示し,意志疏通面では意志の表示,話の了解などのコミュニケーション障害が大きく低下している. 2-1)ぼけ老人をかかえる石川家族の会の呆け老人30人(男8人,女22人)の呆けに気付いたきっかけは(1)つじつまのあわない話をするようになって, (2)被害妄想的な言動がめだって, (3)今言ったことをすぐ忘れるようになって,が多くみられた. 2-2)現在家族が困るような問題行動やコミュニケーション障害を訴える割合は80%以上であるが,各々の対応に苦慮がみられる. 2-3)ほぼ半数の痴呆老人に気持ちの緩和や不安の静穏に効果的な事物がみられる.これらには老人のこれ迄の生活過程と関連が深い例もみられる.以上より痴呆老人のケアには,これ迄の生活過程を大切にした対応が要求され,今後さらに痴呆老人の内面の世界に迫れるような対応の仕方の検討が必要と考える.本研究は痴呆老人の日常生活上の障害(特にコミュニケーションの障害と異常言動)について、その実態を明らかにし、それらとの関連要因を宿主側と環境側から分析し、痴呆老人に対する看護ケアの方法を検討することを目的とした61年度よりの2年間にわたるものである。本年度の実施計画は施設と在宅の痴呆老人にみられる日常生活上の障害の実態を明らかにすることであったが主に施設入所老人の実態が中心となった。研究成果の概要は次の通りである。1.石川県のY特別養護老人ホームの入所老人274人のうち、長谷川式簡易知的能力評価スケールで10点以下(痴呆)の者は101人(36.9%)であった。また、性別での痴呆の割合は、男性で28.4%、女性で39.6%と女性に多かった。さらに年齢別での痴呆の割合は、6069歳では、18.4%,7079歳では26.8%,8089歳では44.3%,90歳以上は70.8%と年齢の増加と共に痴呆の割合は多くなっていた。2.入所老人の痴呆の程度と日常生活動作能力(ADL)の関連をみると、痴呆の度合の高い老人の方が、基本動作能力,意志疎通能力共に自立の程度が低かった。

3.痴呆の度合の高い老人において、頻度が高くみられる日常生活上の障害は、年歳によって若干相違がみられるが、排泄,身の周りの整理,衣類の交換,入浴の面での障害が目立った。4.痴呆の程度の高い老人の異常言動には、徘徊,独語,奇声,暴言,作話,収集癖,妄想など一般的に挙げられているものであったが、これらの異常言動の出現は各々に特徴的であり、それまでの生活史との関係が示唆されるケースがみられた。また、異常言動の出現時には、緊張感が高まっている様子が感じられたが、62年度はさらに経時的に観察を行ない、これまでの成果をもとに、痴呆老人の日常生活上の障害と異常言動の緩和にむけての具体的な看護ケアを検討したい。
外部刺激に応答して崩壊するナノキャリアシステムの設計

薬剤を病変した組織にだけ選択的に運搬し、局所的に機能させるドラッグターゲティングが有害な副作用を減らし、飛躍的に治療効果を向上させる有効な手法として注目されている。本研究では、DNAを基盤とした新しいキャリアシステムを構築すると共に、X線をトリガーとして薬剤を放出する分子システムを構築した。近年、様々な機能を示す修飾DNAが盛んに研究され、新しいバイオ材料として注目されている。そこで、平成24年度は、DNAオリゴマーのドラッグキャリアとしての可能性を調べるため、リン酸部にアルキル鎖を介してアセチレン部位を導入した両親媒性DNAオリゴマーを合成し、会合体形成能を調べた。5つのアルキルアセチレン部を連続したリン酸部に導入した11量体のDNAオリゴマー(ODN 1)を合成した後、ベンジルアジド、アスコルビン酸ナトリウム、Cu-TBTAを添加し、クリック反応による化学修飾を行った。反応後HPLCで生成物を分取し、MALDI-TOF MSで分析したところ、5つのアセチレン部すべてにベンジル基が導入されたODN 2が生成したことがわかった。次に、ODN 1とODN 2の会合体形成能を疎水性の蛍光色素ナイルレッドを用いて調べた。各種濃度のODN 1とODN 2共存下でのナイルレッドの蛍光強度を測定し、臨界会合体形成濃度(CAC)を求めたところ、それぞれ169μM (ODN 1)、146μM (ODN 2)であった。このことからODN 1およびODN 2は水溶液中で会合体を形成し、ナイルレッドを内包できることがわかった。さらに、ナイルレッドを薬剤に見立て、細胞内への運搬実験を行った。ODN 1及びODN 2会合体にナイルレッドを内包させた後、A549細胞に投与したところ、細胞内からナイルレッドの強い発光が確認できた。すなわち、両親媒性DNAはドラッグキャリアとして駆動することが示された。X線照射によって崩壊し、内包した薬剤を放出するドラッグキャリア分子の開発を進めた。親水性化合物PEGの末端に疎水性の放射線応答分子インドールキノン誘導体を導入した両親媒性化合物IQ-PEGを合成し、物性及びX線照射下における反応特性を調べた。IQ-PEGの会合体形成挙動を動的光散乱(DLS)を用いて観察した。その結果、2mMの濃度でIQ-PEGは会合体を形成し、60.9nmの粒径を持つことがわかった。分子模型から算出したIQ-PEGの分子長は1.2-1.5 nmであることから、この化合物は球状ミセルとは異なる会合体を形成していると考えられる。次に、IQ-PEGの放射線一電子還元反応特性を調べた。2-methyl-2-propanolを含有する希薄水溶液の放射線分解により水和電子が選択的に生成し、高い還元反応特性を示すことから、同水溶液にIQ-PEGを溶解し、低酸素条件でX線を照射した。反応をHPLCで追跡した結果、IQ-PEGは効率よく分解することがわかった。続いて、有酸素条件で同様にX線を照射したところ、低酸素条件下と比べて分解が顕著に抑制された。溶存酸素は水和電子の捕捉作用をもつことが知られていることから、IQ-PEGの分解反応は水和電子による一電子還元反応を経て進行することがわかった。なお、低酸素および有酸素条件下におけるIQ-PEGの消失G値はそれぞれ269.0nmol/J、44.9 nmol/Jであった。以上のように、IQ-PEGは想定通りの機能を持ち、X線照射によって崩壊することがわかった。平成24年度に、生きた細胞を用いた機能評価を進める予定である。計画では、平成23年度に両親媒性化合物の設計と化学的手法による機能評価を終え、平成24年度に細胞を用いた機能評価を進める予定であった。平成23年度はIQ-PEGの合成と評価を終えることができたため。化学的な手法による評価を終えたシステムから順に、生体細胞を用いたシステム評価を行う。薬剤を内包したナノキャリア分子を、代表者がすでに保有している細胞(EMT6/KU細胞、MCF7細胞、A549細胞等)に投与した後、X線照射を行い、薬効発現を確認する。内包する薬剤としては、従来のプロドラッグ開発研究で用いていた抗がん剤(Camptothecin, 5-fluorodeoxyuridine, Cytorabineなど)を選択し、キャリア分子の有無で薬効が変わるか調査する。次年度はシステムの評価を継続して進める。主に生化学的な手法による機能評価を進めるために、必要な試薬、ガラス器具等の消耗品を購入する。また、情報交換および成果報告のための旅費を計上する予定である。
遺伝子治療による次世代血友病治療法の開発と非ヒト霊長類を用いた前臨床研究

研究計画に従いマウスおよびサルを用いた前臨床研究を行った。血友病B遺伝子治療研究はマウスでの検討を終え、カニクイザルを用いた前臨床実験を遂行している。ヒト第IX因子(FIX)特異的モノクロナル抗体で検出可能な変異カニクイザル第IX因子(FIXT262A:262位のThrをAlaに置換)を発現するAAV8ベクターを作製した。このベクターはマウスで1000%以上のFIX発現をえることができる。サルに末梢静脈あるいは腸間膜静脈枝から同ベクターを投与したところ、中和抗体陰性の3頭では治療レベルの導入遺伝子由来FIX(FIXT262A)発現が得られた。しかし、既感染に基づくAAV8に対する中和抗体が低力価でも存在するサル3頭では腸間膜静脈からベクターを投与しても血中に期待される治療域レベルのFIXの長期発現は得られなかった。中和抗体のAAV8ベクターの遺伝子導入阻害を回避するベクター投与法を抗AAV8中和抗体が存在するカニクイザル3頭にて試み、治療域に達するFIX発現がえられた。血友病A遺伝子治療研究では、ヒトFVIIIは血友病Aマウスでは血液レベルを高めることがこれまで困難であったが、AAV8ベクターとHCRHAAT-プロモーターを用いること、および免疫反応を制御することで、血友病AマウスにおいてヒトFVIII活性を50-100%に維持することが可能となった。よりヒトに近い種属の血友病モデル動物(血友病Aクローンブタ)の作製に成功した。遺伝子細胞治療として、AAV Rep遺伝子を用いた19番染色体AAVS1領域への部位特異的FVIII遺伝子組込が効率よく行えることが確認できた。完全長FVIIIと導入遺伝子由来のB領域欠如型FVIIIを識別するための検出方法を確立でき、非ヒト霊長類のカニクイザルを用いた血友病A遺伝子治療の前臨床実験を行うことを目的として、カニクイザルでのFVIII発現実験を開始した。In vivoへのベクターの直接投与には染色体への組み込みがほとんどおこらないAAVベクターを用い、exvivoにて細胞へ遺伝子導入し再移植するときには染色体への組み込みが必要であるためSIVベクターを用いる検討した。血友病A遺伝子治療:種々のプロモーターの下流にイヌFVIII遺伝子を搭載したベクターを作製し、血友病Aマウスで発現を検討したところ、AAV8ベクターと強力な肝臓特異的なHCRHAAT-プロモーターを用い肝臓に限定してイヌFVIIIを発現させることで、イヌFVIII活性を免疫抑制なしに正常イヌFVIII活性の100%以上に保つことができた。一方、ヒトFVIIIはマウスにおける血液半減期が極めて短く血液レベルを高めることがこれまで困難であったが、AAV8ベクターとHCRHAAT-プロモーターを用いることで血友病AマウスにおいてヒトFVIIIを50-100%に維持することが可能となった。血友病B遺伝子治療:ヒトFIX特異的モノクロナル抗体で検出可能な変異カニクイザルFIX(FIXT262A:262位のThrをAlaに置換)を発現するAAV1ベクターを3頭のカニクイザル骨格筋に投与することで変異カニクイザルFIXの血液レベルを4-40%で長期間維持することが可能であった。マウスで1000%以上のFIX発現をえることができるAAV8ベクターをサルに末梢静脈あるいは腸間膜静脈枝から投与したところ、AAV中和抗体陰性の3頭では治療レベルの導入遺伝子由来FIX発現が得られた。しかし、サルに既感染に基づくAAV8に対する中和抗体が低力価でも存在するサル