hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
脂肪肝における肝由来低エントロピー小胞による動脈硬化発症のメカニズムの解明

【方法】HepG2を500μMのパルミチン酸(PA群)、もしくはコントロールとして1%のウシ血清アルブミン(BSA群)存在下に培養し、24時間後に培養上清中のEVを超遠心により回収した。血管内皮細胞であるHUVECと培養血管平滑筋細胞それぞれの培養液にEVを添加し、24時間後の遺伝子発現の変化をリアルタイムRT-PCRにより検討した。また、血管平滑筋細胞ではEVによる増殖能、遊走能の変化をそれぞれMTTアッセイ、リアルタイム細胞アナライザー(xCELLigence system)により解析した。同様の検討をより細胞障害性が弱いオレイン酸(OA)添加でも行った。【結果】HUVECでの検討ではEV添加によりPA群、BSA群の2群間において接着因子、eNOS、トロンボモデュリン、エンドセリン等の遺伝子発現の変化は認められなかった。血管平滑筋細胞ではPA群由来のEV添加によりBSA群に比して抗アポトーシスに働くBCL2A1とBCL2L1、炎症性サイトカインであるTNF-α、MCP-1、IL-1βなどの遺伝子発現の有意な増加が認められた。また、PA群のEV添加により平滑筋細胞の遊走能は有意に亢進が認められた。PA群、BSA群由来のEV添加により細胞増殖能に変化は認めなかった。また、OAを添加し得られたEVでの検討では、EV添加によりHUVECの細胞遊走能は亢進したが、遺伝子発現には変化を認めなかった。【結語】脂肪化肝細胞由来のEVは血管平滑筋の炎症、抗アポトーシス等の遺伝子発現変化を増強させ、また遊走能を亢進させることにより積極的に動脈硬化発症に重要な役割を演じることが示唆された。この現象はPAによる脂肪化細胞に特異的であることも判明した。今後マウスを使用してvivoでも同様の事象が認められるかを検討予定であるH29、30年度は培養細胞を用いた検討を行った。この結果により脂肪肝由来の細胞外小胞は血管内皮細胞には接着因子や炎症関連の遺伝子発現、および細胞増殖能に影響を与えなかったが、血管平滑筋細胞には細胞外マトリックス、炎症、抗アポトーシス関連遺伝子の発現に影響を与えるほか、細胞遊走能を高めることが示された。また、この結果はオレイン酸添加では認められず、パルミチン酸による脂肪化細胞に特異的な事象であることも判明した。これらの結果をうけて、脂肪肝マウスの血清からEVを抽出し、マウス血管平滑筋に与える変化を同様に検討予定であったが、脂肪肝マウス作成に当初の予定以上の時間がかかり、実験を施行することができなかった。このため研究期間の延長を申請することとなった。今年度は培養細胞で得られたデータをもとにマウスでの実験を中心に行う。マウスに高フルクトース、高コレステロールを与え脂肪肝マウスを作成し血中より抽出した細胞外粒子でも同様の検討を行う。得られた細胞外粒子と平滑筋細胞と共培養し、遺伝子発現、細胞増殖に与える影響を検討する。また、同時に血中で増加した細胞外粒子が肝細胞由来であることも確認する。最終的には肝細胞より由来する動脈硬化関連細胞外粒子が実際にヒトでも存在するか否かを脂肪肝患者血液中の細胞外粒子を用いて検討する。平成28年度はまず脂肪肝マウスの作成を行った。生後4週の雄マウスをコントロール群と高脂肪食群にわけた。さらに高脂肪食群を4週群、8週群、12週群、16週群に分けた。それぞれの群には最低4匹を含むようにした。これらのマウスにコントロール食、もしくは高コレステロール+高フルクトース食を与え、4週、8週、12週、16週で糖負荷試験を行い、翌日にsacrificeし、血液、肝組織、精巣周囲脂肪組織を採取した。高コレステロール+高フルクトース食群では経時的に耐糖能異常が出現した。また、肝組織HE染色では、肝細胞への脂肪沈着が経時的に増加することが確認された。今回の肝組織には線維化はほとんど来していなかった。血液より細胞外粒子を抽出し、フローサイトメトリーにより解析した。高コレステロール+高フルクトース食群では経時的に血液中の細胞外粒子が増加することが確認された。今後の検討に使用するため残りの血液、肝組織、脂肪組織を凍結保存した。また、細胞外粒子を可能な限り多く採取するため、現在再度マウスに高コレステロール+高フルクトース食を与え飼育中である。同時に培養肝細胞での検討も行った。HepG2に250μMのパルミチン酸を添加し、翌日培養上清より細胞外粒子を抽出した。培養細胞でも脂肪酸の添加により細胞外粒子分泌量が増加することが示された。更に、この粒子が動脈硬化発症に影響を与えるかどうかを確認するため、培養血管内皮細胞であるHUVEC細胞に添加し細胞内での遺伝子発現、蛋白発現の変化を検討中である。マウスにおいては高コレステロール+高フルクトース食を与えることで、脂肪肝が出現すること、また、血液中の細胞外粒子が増加することを確認可能であった。また、細胞外粒子の抽出および検出法の技術的な確立が可能であった。また、同様の方法を用いて培養肝細胞に関しても脂肪酸の添加により細胞外粒子の分泌が増加することを確認可能であった。【方法】

HepG2を500μMのパルミチン酸(PA群)、もしくはコントロールとして1%のウシ血清アルブミン(BSA群)存在下に培養し、24時間後に培養上清中のEVを超遠心により回収した。血管内皮細胞であるHUVECと培養血管平滑筋細胞それぞれの培養液にEVを添加し、24時間後の遺伝子発現の変化をリアルタイムRT-PCRにより検討した。また、血管平滑筋細胞ではEVによる増殖能、遊走能の変化をそれぞれMTTアッセイ、リアルタイム細胞アナライザー(xCELLigence system)により解析した。【結果】HUVECでの検討ではEV添加によりPA群、BSA群の2群間において接着因子、eNOS、トロンボモデュリン、エンドセリン等の遺伝子発現の変化は認められなかった。血管平滑筋細胞ではPA群由来のEV添加によりBSA群に比して抗アポトーシスに働くBCL2A1とBCL2L1、炎症性サイトカインであるTNF-α、MCP-1、IL-1βなどの遺伝子発現の有意な増加が認められた。また、PA群のEV添加により平滑筋細胞の遊走能は有意に亢進が認められた。PA群、BSA群由来のEV添加により細胞増殖能に変化は認めなかった。【結語】脂肪化肝細胞由来のEVは血管平滑筋の炎症、抗アポトーシス等の遺伝子発現変化を増強させ、また遊走能を亢進させることにより積極的に動脈硬化発症に重要な役割を演じることが示唆された。EV中のどのようなコンポーネントが関わるかについては今後の更なる検討が必要である。H29年度は培養細胞を用いた検討を行った。この結果により脂肪肝由来の細胞外小胞は血管内皮細胞には接着因子や炎症関連の遺伝子発現、および細胞増殖能に影響を与えなかったが、血管平滑筋細胞には細胞外マトリックス、炎症、抗アポトーシス関連遺伝子の発現に影響を与えるほか、細胞遊走能を高めることが示された。これらの結果から脂肪肝由来細胞外小胞は血管平滑筋の機能に変化を与えることで動脈硬化進展に寄与する可能性が高まったと考えられる。【方法】HepG2を500μMのパルミチン酸(PA群)、もしくはコントロールとして1%のウシ血清アルブミン(BSA群)存在下に培養し、24時間後に培養上清中のEVを超遠心により回収した。同様の検討をより細胞障害性が弱いオレイン酸(OA)添加でも行った。また、OAを添加し得られたEVでの検討では、EV添加によりHUVECの細胞遊走能は亢進したが、遺伝子発現には変化を認めなかった。【結語】
高性能リモ-トケミカルインタ-フェ-スの開発

高性能リモ-トケミカルインタ-フェイスの系として植物間のケミカルコミュニケ-ションに注目し,特に実験系としてシラカンバ間のケミカルコミュニケ-ションを取り上げた。シラカンバについては冬芽精油成分中の揮発性化学物質がケミカルコミュニケ-ションに関与していることが示唆されていた。まず,ゲラニオ-ル等の一部のアルコ-ルが高濃度ではシラカンバ種子の発根を阻害し,低濃度では発根を促進する現象を見い出した。さらに,種子自身からも発根調節物質が放出されているのではないかと考え,揮発性及び水溶性の種子抽出物の発根への影響を調べた。相互作用のない単独種子の場合と比べ,相互作用のある多数播種の場合は,早い時期に高い発根率が認められた。また,水溶性成分については,シラカンバ種子から抽出された4成分のうち,2成分に関して発根への影響を調べたところ,対照に比べて発根開始時間を912時間遅らせる効果があり,また最終的な発根率も対照を下回った。このように,種子間のケミカルコミュニケ-ションが確かに存在していることは示されたが,個々の化学物質の同定や,濃度の定量には至らなかった。特に揮発成分に関しては,従来からのガスクロマトグラフィ-のような方法では,逐次分析が困難であるためsurface acoustic wave(SAW)デバイスによる検出系の確立を試みた。第一に,SAWデバイス上を各種脂質で被覆することにより,低分子アルコ-ルやアルデヒドを数10ppm以上で検出できるという成果を得た。次に,膜脂質をLB膜化して配向させてSAWデバイスを被覆することにより,数ppm以上で検出が可能となった。また,被覆する膜脂質の種類ごとに個々の化学質への応答が異なることから,複数の膜脂質被覆デバイスの応答パタ-ンで,化学物質の同定も可能となる見通しを得た。高性能リモ-トケミカルインタ-フェ-スの概念を明確にするため、分担者との討論を重ねた結果、ケミカルコミュニケ-ションの実際の系として、相互に物理的接触が起こらない植物が化学物質によるコミュニケ-ションのみを調べたり、解析したりするには最適の系であるという結論に達した。植物としては、シラカンバを取り上げた。シラカンバはその精油成分中に多種の揮発成分を含んでおり、その揮発性化学物質が相互になんらかの作用をしていることが示唆されているが、濃度と相互作用の関係等についてはまだ知られていない。従ってこの糸で、ケミカルコミュニケ-ション物質の分離・精製や相互作用の解析を進めることとした。まず微量の揮発性化学物質のセンシング機能を知るための高感度検出システムの試作を行った。検出システムはsurface acoustic wave(SAW)デバイス上をフォスファチジルエタノ-ルアミンやフォスファチジルコリン等の膜脂質で被覆したセンサ-および、窒素ガスの導入コックと排気口が設けられた測定チャンバ-から構成されるものとして試作された。SAWデバイスの共振周波数変化はNetwork/Spectrum分析器で検知された。SAWデバイスは共鳴周波数が高いため高感度の検出が期待できる。このシステムを用いてcitral,B-Iononeなどについて共振周波数変化を調べたところ、数10ppm以上で検出が可能であり、気相ケミカルコミュニケ-ション物質の定量に今後適用できる可能性を得た。第二に生物のケミカルコミュニケ-ションについては、シラカンバ精油中の揮発性成分がシラカンバ種子へのケミカルコミュニケ-ションに果たす作用について調べるシステムを製作した。このシステムによる検討の結果、1部の成分(ゲラニオ-ル、オイゲノ-ル等)で低濃度における発根促進が認められた。また精油成分は高濃度では阻害を示し、濃度により定性的に全く異なる作用をすることが明らかになった。高性能リモ-トケミカルインタ-フェ-スの系として、植物間のケミカルコミュニケ-ションに注目し、特に実験系としてシラカンバ間のケミカルコミュニケ-ションをとり上げた。シラカンバについては冬芽精油成分中の輝発性化学物質がケミカルコミュニケ-ションに関与していることが示唆されていた。前年度にゲラニオ-ル等の一部のアルコ-ルが高濃度ではシラカンバ種子の発根を阻害し、低濃度では発根を促進する現象を見い出した。本年度は、種子自身からも発根調節物質が放出されているのではないかと考え、揮発性及び水溶性の種子抽出物の発根への影響を調べた。相互作用のない単独種子の場合と比べ、相互作用のある多数播種の場合は、早い時期に高い発根率が認められた。また水溶性成分については、シラカンバ種子から抽出され分離された4成分のうち2成分に関して発根への影響を調べたところ、対照に比べて発根開始時間を9ー12時間遅らせる効果があり、また最終的な発根率も対照を下回った。このように、種子間のケミカルコミュニケ-ションが確かに存在していることは示されたが、個々の化学物質の同定や、濃度の定量には至らなかった。特に揮発成分に関しては、従来からのガスクロマトグラフィのような方法では、遂次分析が困難であるため、Surface acoustic Wave(SAW)デバイスによる検出系の確立を試みている。

前年度は、SAWデバイス上を各種膜脂質で被覆することにより、低分子アルコ-ルやアルデヒドを数10ppm以上で検出できるという成果を得たが、本年度は膜脂質をLB膜化して配向させてSAWデバイスを被覆することにより、数ppm以上での検出が可能となった。また被覆する膜脂質の種類ごとに個々の化学物質への応答が異なることから、複数の膜脂質被覆デバイスの応答パタ-ンで、化学物質の同定も可能となる見通しを得た。高性能リモ-トケミカルインタ-フェイスの系として植物間のケミカルコミュニケ-ションに注目し,特に実験系としてシラカンバ間のケミカルコミュニケ-ションを取り上げた。シラカンバについては冬芽精油成分中の揮発性化学物質がケミカルコミュニケ-ションに関与していることが示唆されていた。まず,ゲラニオ-ル等の一部のアルコ-ルが高濃度ではシラカンバ種子の発根を阻害し,低濃度では発根を促進する現象を見い出した。さらに,種子自身からも発根調節物質が放出されているのではないかと考え,揮発性及び水溶性の種子抽出物の発根への影響を調べた。相互作用のない単独種子の場合と比べ,相互作用のある多数播種の場合は,早い時期に高い発根率が認められた。また,水溶性成分については,シラカンバ種子から抽出された4成分のうち,2成分に関して発根への影響を調べたところ,対照に比べて発根開始時間を912時間遅らせる効果があり,また最終的な発根率も対照を下回った。このように,種子間のケミカルコミュニケ-ションが確かに存在していることは示されたが,個々の化学物質の同定や,濃度の定量には至らなかった。特に揮発成分に関しては,従来からのガスクロマトグラフィ-のような方法では,逐次分析が困難であるためsurface acoustic wave(SAW)デバイスによる検出系の確立を試みた。第一に,SAWデバイス上を各種脂質で被覆することにより,低分子アルコ-ルやアルデヒドを数10ppm以上で検出できるという成果を得た。次に,膜脂質をLB膜化して配向させてSAWデバイスを被覆することにより,数ppm以上で検出が可能となった。また,被覆する膜脂質の種類ごとに個々の化学質への応答が異なることから,複数の膜脂質被覆デバイスの応答パタ-ンで,化学物質の同定も可能となる見通しを得た。
フェムト秒レーザーによる電子直接加速に関する研究

現在安定に稼動しているRFガン・ライナックからのピコ秒電子ビームを、フェムト秒レーザーを集光することによって得られる相対論的ポンデラモーティブ力によって加速、数フェムト秒に切り出す方法に着目した。チタン・サファイヤレーザーからのビームをビームスプリッターで電子生成用と加速用に分割し、電子生成用は3倍高調波に変換し、RFガンに入射させて電子ビームを生成する。フォトカソード電子銃と電子線型加速器はレーザーと同期したRFによって駆動され、10MeVの電子ビームが得られる。シケイン型磁場圧縮器を用いて電子ビームのバンチ幅を衝突点で1ps以下・φ150μmにする。加速用レーザーは半径4μmまで収束させる必要がある。加速された電子を磁場型スペクトロメータによって分析し、マイクロチャンネルプレートにて検出を行う。この方式の最大の問題点は、時間的同期の困難さと加速される電子量である。時間的同期はSバンド同期装置にレーザーと電子ビームから得たシグナルを入れることにより、最小600fs(RMS)の同期をとることに成功した。ところが加速用されてくる電子の量が少なく検出できなかった。理由として、レーザーのプロファイルの劣化による収束径の拡大、電子ビームのフォーカス不足、時間的完全同期の不一致などが考えられる。特にレーザーと電子ビームのフォーカス点を完全にあわせることが非常に困難であった。この2年の研究では結果まで間に合わなかったが、実験体系、計測器系、ともに完成しているので引き続き実験を続けていく予定である。加速用レーザーは半径2.4μmまで収束させ相互作用させる。このレーザーの強電場で加速する手法における最大の障壁は、空間的時間的同躬の困難さである。我々のグループではすでにRMS値でジッターが340fstいう、電子ビームとレーザーの時間同期安定性が得られているが、長時間のドリフト成分が存在する。レーザー光アライメント等の実験セットアップのために、長時間同期が必要であり、そのため平成17年度は、Sバンド位相検出器及び位相シフターを購入し、長時間における位相変調によるドリフトを一時間半で600fs(rms)まで抑えることに成功した。ビームの時間サイズはおよそ半値幅で1psであり、600fsの同期精度で問題がないであろう。またレーザー照射位置を動的フィードバックにより、20μmの位置精度で固定することに成功した。ビームの水平方向のサイズは約1mmであり、20μm動いたとしても加速される電子ビームの量は大差ないと思われる。かつポンピングYAGレーザーを安定化させることにより、ビーム電流安定性を4%(一時間半、rms値)まで安定化させることに成功した。これら成果によって、レーザー光によって加速された電子ビームを積算して測定することが可能となった。
在宅ＡＬＳ患者・家族の社会的孤立とその支援構築に関する日韓比較研究

今年は、まず、昨年予定していた、論文を投稿して「韓国におけるALSの人を支援する制度の現在とその改善可能性」というタイトルで、発表することができた。それ以外にも上半期が終了した時点で、全体的な博士論文の方向性や、構成を点検される構想発表会に参加し、研究科の先生らと在学・卒業生からいい評価を得ることができた。それにとどまらず、博士論文の以外に研究する課題をいくつか捉えて、日韓のALS協会の差異や、医療社会学的な観点の問題、介護の心理的問題を取り上げて、韓国語、英語で発表を行った。何より、その内容が、研究を深めれば深くするほど、聞き手の外国人にも研究の重要性を認めてもらう機会が多くなり、関係する研究者との関係も新たに形成されることになった。このように、日本と国際の場で、研究結果を知られることと同時に、韓国でも2014年5月に行われた韓国ALS協会で自分の研究の紹介および発表をすることができた。特にその場は、韓国のALS関係者や、ALSの人、家族がたくさん集まる唯一の場であり、向こう側から多様な意見を聞いて、研究に反映させることができた。今まで韓国では、ALSについて、治療薬開発や、介護者のQOLなどだけで論じられてきたが、この研究を深くすることによって、制度と介護の関係も繋いで論じる必要性を提示できたと思う。また、ALSと関係している人と交流していく中で、その判断が、研究者単独の判断ではなく、共通な問題を持っていることも確認できた。26年度が最終年度であるため、記入しない。本研究は、ALS患者と支援者の支援方法を多角的部分で解決できる方法を模索することを目的とする。そのため、患者の生活に大きな影響を与えている部分を把握し、その部分を中心的に把握する調査を行った。まずは、修士論文で確認した意思伝達に関する様々な動きに関して、実践として、韓国のALS患者にスイッチ(患者の身体能力に合わせて改造したナースコール)を提供した。その結果、韓国の意思伝達装置などに関しての認識が高くなり、政府からも小規模でありながら意思伝達支援事業が増えることになった。また、日韓の支援制度に関して調査を行った。実際、患者の生活が成り立てている要素である介護が誰によって行われていて、それが、その介護者にどのような困難があるのかは、すでに看護学の論文で確認されている。しかし、その介護が成立するための前提である支援制度の調査に関しては(特に韓国)極めて少ない。そのため、日韓のALS患者のための支援制度を調査し、両国の相違点と問題に関して把握し、「ALS患者をめぐる支援制度の日韓比較--難病・障害支援制度と介護保険制度の分析を通じて--」(研究ノート)にまとめた。また支援制度に関する客観性を図るためにアメリカの支援制度を調査し、その問題点を把握した。また、本研究科と交流している韓国障害者連合会のセミナーに参加し、両国の難病患者の事情を話し合った。そこで、「コミュニケーション支援技術--「障害があることで感じる不便さ」の解消における社会モデルの再検」というタイトルで発表した。また、中国難病支援に関するセミナーに参加し、事情を把握することができた。このように1年間、日韓およびアメリカと中国のALS患者の生活を支えている支援に関して把握することができた。本研究はALSの人の生活上での問題や、それをめぐる制度、また、両国のALS協会の歴史に関する研究である。その中で、25年度に計画した研究目標の中で、以下のことを実際行った。1. ALSの人と家族が社会的孤立から、抜けるための装置である、介護支援制度に関して調査し、まず、韓国に関しての調査結果を踏まえて、昨年度にインタビューした内容を基にし、「韓国におけるALS患者家族の社会的孤立とその課題」というタイトルで、日本福祉社会に発表を行った。その後、日韓比較を行った上に、その制度の改善可能性を構想する内容を3月1920日では国際カンファレンス「社会正義とカタストロフィ:リスク・責任・互恵性」で発表した。その内容は、ALSの人と家族の支援制度についてAmartya Senの議論を用いて発表であった。2. ALSの人の位置づけに関して、考察する目標だった。この内容に関しては、今後具体的に取り上げる予定だが、今回参加した、韓国ALS協会の学術大会および総会では、ALSの人に関する話題が医学的内容に偏っていることが確認でき、仮説の通り、障害者としての支援は必要されるが、常に、医学情報に敏感になっていることを確認した。3. ALSの目韓比較に関する国際学会での参加は、計画通りにできた。まず、11月2123日は生存学研究センターで行われた障害学国際セミナーで韓国ALSの人の介護サービスを利用時の困難を単著で、ALSを巡って日韓の認識に差があるTLSという現象に関して共著でポスター発表をした。12月上旬にはイタリアのミラノで行われた世界のALS協会の集まりであるAnnual Alliance Meetingと専門家グループのシンポジウム、国際ALSシンポジウムまで参加し、ポスター発表を共著で実施した。

それにとどまらず、博士論文の以外に研究する課題をいくつか捉えて、日韓のALS協会の差異や、医療社会学的な観点の問題、介護の心理的問題を取り上げて、韓国語、英語で発表を行った。何より、その内容が、研究を深めれば深くするほど、聞き手の外国人にも研究の重要性を認めてもらう機会が多くなり、関係する研究者との関係も新たに形成されることになった。このように、日本と国際の場で、研究結果を知られることと同時に、韓国でも2014年5月に行われた韓国ALS協会で自分の研究の紹介および発表をすることができた。特にその場は、韓国のALS関係者や、ALSの人、家族がたくさん集まる唯一の場であり、向こう側から多様な意見を聞いて、研究に反映させることができた。今まで韓国では、ALSについて、治療薬開発や、介護者のQOLなどだけで論じられてきたが、この研究を深くすることによって、制度と介護の関係も繋いで論じる必要性を提示できたと思う。また、ALSと関係している人と交流していく中で、その判断が、研究者単独の判断ではなく、共通な問題を持っていることも確認できた。26年度が最終年度であるため、記入しない。1年目は、日韓ALS患者の生活の把握とその問題点を探ることが目標であり、そのうえ、アメリカと中国のALS患者の生活を支えている支援に関して把握することができたため、おおむね順調に進展していると評価できる。日韓の制度や、日常生活に関して、文献調査や、インタビューを通じ、情報の把握が進んでいる。また、その内容を国内および、海外で発表する機会を増やして、自分の研究の幅を広げている。今後も支援に関する状況を充実に把握することと共に、生活全般にかかっている経済的な問題や、医学的な問題などの検討を予定している。ALS患者だけではなく、主に介護を担っている(大部分家族)人の困難や、社会的に孤立していく過程を把握することで、視野を広げる作業を通じ、研究を深めていきたいと思う。まずは、昨年度に国際カンファランスで発表した内容を「ALSの人に対する社会的責任の現状と可能性」というタイトルで論文化する。それと同時に、韓国ALS協会の総会参加や、ALSの患者会と関係を構築しながら、変化した日韓の福祉制度に関して把握する。そこで得られた結果を基にして、7月には博士論文の構想発表会を行い、論文の構成を整える作業をする。その後、実際、ALSの人とその家族の生活に関するインタビュー資料を基に、9月福祉社会学会誌に「韓国におけるALSの人の家族の社会的孤立とその課題」というタイトルで投稿する。11月には、本大学院の生存学センターが主催する日韓障害学セミナーに参加し、ALSの人とその家族に対して、障害者福祉制度の意味に関する報告をする。さらに、2011年に実施した、ニューヨークALS協会のインタビュー内容と韓国、日本での調査資料を整理し、そこから得られた結果を取りまとめ、12月には国際ALSシンポジウムで「ALSの人(親)を介護するこの心理的問題(仮)」について発表を行う。
IL-7レセプターを指標としたB細胞記憶形成機構の解明

インターロイキン7レセプター(IL-7R)は、リンパ球前駆細胞の増殖・分化や成熟T細胞の維持(ホメオスターシス)を介して免疫システムの形成と維持に重要な働きをしている。このユニークなサブユニットであるIL-7Ra鎖は、末梢T細胞で発現しているが、特に記憶T細胞の初期段階において高レベルで発現し、その維持に重要な働きをしている。一方、末梢B細胞ではIL-7Ra鎖が発現していないために、今までその機能については注目されていなかった。一方、末梢T細胞では、グルココルチコイド刺激により、IL-7Ra鎖遺伝子の転写が増強し、細胞表面でのIL-7Rの発現が増加する。そこで、末梢B細胞における、グルココルチコイド刺激によるIL-7Ra鎖の誘導を解析した。まず、脾臓B細胞を磁気ビーズで単離し、グルココルチコイド存在下で培養すると、6時間後には細胞表面でのIL-7Ra鎖の発現が検出され、12時間後にはピークになった。さらに、IL-7Ra鎖のmRNAレベルを定量的RT-PCRにより解析すると、2時間後には誘導が検出され、6時間後にはピークになった。さらに、誘導されたIL-7Rから生存シグナルが入るかどうか確認するために、B細胞をグルココルチコイドとIL-7で刺激すると、グルココルチコイド単独と比べて生存率が上昇することがわかった。また、この時シグナル分子Stat5がリン酸化され、標的遺伝子であるCis-1の転写が誘導された。以上の結果から、末梢B細胞においても、グルココルチコイド刺激によりIL-7Ra鎖遺伝子の転写が活性化され、機能的なIL-7Rの発現が誘導されることが明らかとなった。生体内においても末梢B細胞がIL-7Rを再発現し、生存シグナルを受け取る可能性が示唆された。このユニークなサブユニットであるIL-7Rα鎖は、T細胞の分化過程においてその発現が巧妙に調節されており、特に、記憶T細胞の前駆段階において高レベルで発現し、記憶T細胞の維持に重要な働きをしている。一方、末梢B細胞ではIL-7Rα鎖が発現していないために、今までB細胞におけるIL-7Rの機能については注目されていなかった。一方、末梢T細胞では、グルココルチコイド刺激により、IL-7Rα鎖遺伝子の転写が増強し、細胞表面でのIL-7Rの発現が増加する。そこで、末梢B細胞における、グルココルチコイド刺激によるIL-7Rα鎖の再誘導を解析した。まず、脾臓B細胞を磁気ビーズで単離し、グルココルチコイド存在化で培養すると、6時間後には細胞表面でのIL-7Rα鎖の発現が検出され、12時間後にはピークになった。さらに、IL-7Rα鎖のmRNAレベルを定量的RT-PCRにより解析すると、2時間後には誘導が検出され、6時間後にはピークになった。以上の結果から、末梢B細胞においても、グルココルチコイド刺激によりIL-7Rα鎖遺伝子の転写が活性化され、IL-7Rの発現が誘導されることが明らかとなった。
雪氷中の微生物活動が氷河アルベドに及ぼす影響評価

雪や氷の中での微生物活動が、氷河表面のアルベド(反射率)を低下させることによって氷河の融解を促進する過程を理解し、その影響を評価するために、様々なタイプの氷河で氷河のアルベドと微生物相や表面構造、気象条件などに関する現地調査を行ない、その結果を比較した。これらの調査により、氷河上での微生物活動と氷河アルベドとの関係の理解に必要な、氷河微生物相や氷河アルベド、環境条件の様々な地域差が明らかになった。アジア高山域の「黒い氷河」、つまり微生物活動によるアルベド低下が非常に大きい氷河において、氷河上の微生物活動によるアルベド改変プロセスを理解することを目的に、中国新疆ウイグル自治区のウルムチNo.1氷河において、6月から8月の融解期に、氷河上の汚れサンプルを定期的に採取するとともに、氷河上にアルベド計と自動撮影装置を設置してアルベドと氷河表面の構造の連続記録をおこなった。(竹内)また、そのアルベド変化が将来の環境変動に大きな影響をもつグリーンランド氷床において、微生物相と表面構造、アルベドに関する予察的現地調査を行なった(幸島)。その結果、ウルムチNo.1氷河では、汚れ物質の移動や表面構造の変化の様子を初めて長期間克明に記録することに成功した。グリーンランド氷床では、アルベドの低い氷床北西部(カナック地区)では、アルベドの高い南西部(カンゲルーサック地区)より生物生産が高く汚れ量が多いこと、クリオコナイトホールなどの表面構造に大きな違いがあること等が明らかになった。現在、氷河表面構造の形成プロセス分析(藤田)やリモートセンシングによる分析(竹内)を進めるとともに、以上の調査地で採取したサンプルから微生物を分離・培養(吉村)し、遺伝子解析(牛田)を進めている。微生物活動によるアルベド低下が非常に大きいアジア高山域の「黒い氷河」において、氷河上の微生物活動によるアルベド改変プロセスを理解することを目的に、ネパール、ランタン地方にあるヤラ氷河(標高5,100m-5,500m)において、7月から9月の融解期(モンスーン期)に、標高の異なる地点で氷河表面の汚れと雪氷微生物サンプルを定期的に採取し、クリオコナイトホールなどの表面構造の変化を記録するとともに、氷河上にアルベド計と自動撮影装置を設置してアルベドと氷河表面の構造の連続記録をおこなった。また涵養域での汚れ物質生産過程調査のために、手動ドリルによる表層アイスコア採取をおこなった。(幸島、竹内、牛田、藤田)その結果、ヤラ氷河における汚れ物質の移動や表面構造の変化の様子を初めて長期間記録することに成功した。また、深さ8mまでのアイスコアを採取し、約20年分の積雪と涵養域表面で増殖した微生物と汚れ物質の変化が記録されていることを確認した。さらに、1985年や1991年の調査時に較べて、汚れに含まれる微生物や汚れの反射率が変化していること等が明らかになった。現在、クリオコナイトホールなどの氷河表面構造の形成モデル構築(藤田)やリモートセンシングによる氷河微生物分布分析法の開発(竹内)を進めるとともに、これまで北アルプス立山連峰の季節積雪および雪渓の調査、アラスカ、グリーンランド、中国などの氷河微生物調査で採取したサンプルから、氷河や雪氷のアルベド改変に関わっていると考えられる、雪氷藻類やバクテリア、菌類などの微生物を分離・培養(吉村)し、遺伝子解析(牛田)を進めている。これまで氷河生物の未調査域であったパミール山脈の氷河、タジキスタン共和国のフェドチェンコ氷河において、8月の融解期に、氷河上の微生物相と微生物活動によるアルベド改変プロセスに関する調査を行うともに、アルベドと関係する微生物活動の経年変化を明らかにするために、アイスコア採取を試みた(竹内及び大学院生1名)。輸送トラブルのため、アイスコア試料の採取はできなかったが、パミール山脈の氷河微生物に関する貴重な試料を採取することができた。本調査によって、この地域の氷河が「黒い氷河」、つまりヒマラヤと同様に、微生物活動によるアルベド低下が大きい氷河であることが確認された。また、「白い氷河」、つまり微生物活動によるアルベド低下が小さい氷河である、南米チリ・パタゴニア北部氷原のネフ氷河とチリ・湖水地方のモチョ火山氷河において、11月から12月の融解期に、氷河上の汚れサンプルを高度別に採取するとともに、アルベドと氷河表面の構造の分析をおこなった(幸島及び大学院生1名)。その結果、特にネフ氷河では、研究代表者が26年前に採取したサンプルとの比較が可能な、貴重な氷河生物と汚れ物質サンプルを採取することができた。また、モチョ火山氷河では新たな氷河昆虫サンプルも得られた。現在、以上の調査地で採取したサンプルから微生物を分離・培養(吉村)し、遺伝子解析(牛田)を進めるとともに、氷河表面構造の形成プロセス分析(藤田)やリモートセンシングによる分析(竹内)を進めている。

今後、本年度の結果を、これまでに調査した黒い氷河(中国、ヒマラヤ、グリーンランド北部)、白い氷河(グリーンランド南部)、ピンクの氷河(アラスカ)の結果と比較しながら、氷河上の微生物活動によるアルベド改変プロセスに関するモデル構築を行う予定である。(幸島、竹内、吉村、藤田、白岩、牛田)
動力伝達用プラスチック歯車の低騒音化に関する研究

動力伝達用プラスチック歯車の低騒音化を図る方策を検討することを目的としてナイロン樹脂歯車と鋼歯車の歯車対における騒音発生機構を詳細に調べた.検討に先立ち,歯車の振動・騒音の発生に大きな影響を及ぼすと考えられているかみ合い伝達誤差(幾何学的に決定される正確なかみ合い位置からの回転方向のずれ)を計測するとともに,かみ合い伝達誤差計測のために取り付けた高分解能のロータリーエンコーダのパルス信号を回転角度検出の基準信号として用いることにより,かみ合い伝達誤差と歯元ひずみ波形などの変動関係を正確に捉えることのできる計測システムを新たに構築した.また,試験機を試作し,静荷重によるプラスチック歯車の変形状態を調べるとともに静的な変形を考慮したかみ合い伝達誤差の計算モデルを検討した.プラスチックは振動や衝撃の吸収性に優れていることからプラスチック歯車は振動吸収性に優れ低騒音であると考えられている.しかし,比較的低速な回転速度(400rpm程度)の運転条件における騒音発生機構を調べた結果,ナイロン樹脂歯車(従動側)と鋼歯車(駆動側)の歯車対では,歯のかみ合いが2対かみ合い領域から1対かみ合い領域に移る際にナイロン樹脂歯車の歯が急激にたわみ,歯車本体が振動していることが明らかになった.この結果についてはナイロン樹脂歯車の歯のたわみ変形について検討した結果とも一致した.プラスチック歯車の歯車対では歯のたわみが大きいため,かみ合い伝達誤差が大きくなる.このことは歯車の振動・騒音発生の主な原因とされているCorner impact(かみ合い始めに従動歯車歯先かど部が駆動歯車歯元部に強く衝突すること)が大きくなることを意味する.しかし,歯車本体の振動状態からナイロン樹脂歯車の歯車対においてCorner impactの影響は予想されるほど大きくないことが明らかになった.動力伝達用プラスチック歯車の低騒音化を図る方策を検討することを目的としてナイロン樹脂歯車を鋼歯車と組み合わせ使用する場合の騒音発生状態について詳細に調べるとともに試験歯車の振動モード解析を実施した.また,ナイロン樹脂歯車と組み合わせた歯車対とフェノール樹脂歯車を鋼歯車と組み合わせた歯車対の騒音発生状態を比較し,プラスチック材料の機械的性質が騒音発生に及ぼす影響について検討した.プラスチックは振動や衝撃の吸収性に優れていることからプラスチック歯車は振動吸収性に優れ低騒音であると考えられる.しかし,検討の結果,ナイロン樹脂歯車と鋼歯車の歯車対では,ナイロン樹脂の弾性率が鋼に比べ非常に小さいため,かみ合い時のナイロン樹脂歯車の歯のたわみが相手鋼歯車に比べ非常に大きくなること,歯のたわみの違いが歯車対に大きなかみ合い伝達誤差を生じさせること,歯車対に生じる大きなかみ合い伝達誤差が運転騒音を大きくする主な原因であることが明らかになった.また,ナイロン樹脂とフェノール樹脂の機械的性質の違いが歯車の運転騒音発生に及ぼす影響を調べた実験では,ナイロン樹脂の方が振動や衝撃の吸収性に優れているにもかかわらず,ナイロン樹脂歯車の運転騒音が小さいとういう結果は得られず,逆にナイロン樹脂歯車と鋼歯車の歯車対の歯車軸系の振動はフェノール樹脂歯車と鋼歯車の歯車対より激しくなるという結果が得られた.この結果もナイロン樹脂の弾性率がフェノール樹脂に比べ約1/6と小さいためフェノール樹脂歯車よりナイロン樹脂歯車の歯のたわみが大きくなる影響が現れたものと考えられる.以上の結果より動力伝達用プラスチック歯車の低騒音化を図るには,相手鋼歯車との歯の剛性の違いから生じるかみ合い伝達誤差を減少させ滑らかな歯のかみ合いを実現することが重要であることが明らかになった.動力伝達用プラスチック歯車の低騒音化を図る方策を検討することを目的としてナイロン樹脂歯車と鋼歯車の歯車対における騒音発生機構を詳細に調べた.検討に先立ち,歯車の振動・騒音の発生に大きな影響を及ぼすと考えられているかみ合い伝達誤差(幾何学的に決定される正確なかみ合い位置からの回転方向のずれ)を計測するとともに,かみ合い伝達誤差計測のために取り付けた高分解能のロータリーエンコーダのパルス信号を回転角度検出の基準信号として用いることにより,かみ合い伝達誤差と歯元ひずみ波形などの変動関係を正確に捉えることのできる計測システムを新たに構築した.また,試験機を試作し,静荷重によるプラスチック歯車の変形状態を調べるとともに静的な変形を考慮したかみ合い伝達誤差の計算モデルを検討した.プラスチックは振動や衝撃の吸収性に優れていることからプラスチック歯車は振動吸収性に優れ低騒音であると考えられている.しかし,比較的低速な回転速度(400rpm程度)の運転条件における騒音発生機構を調べた結果,ナイロン樹脂歯車(従動側)と鋼歯車(駆動側)の歯車対では,歯のかみ合いが2対かみ合い領域から1対かみ合い領域に移る際にナイロン樹脂歯車の歯が急激にたわみ,歯車本体が振動していることが明らかになった.この結果についてはナイロン樹脂歯車の歯のたわみ変形について検討した結果とも一致した.プラスチック歯車の歯車対では歯のたわみが大きいため,かみ合い伝達誤差が大きくなる.このことは歯車の振動・騒音発生の主な原因とされているCorner impact(かみ合い始めに従動歯車歯先かど部が駆動歯車歯元部に強く衝突すること)が大きくなることを意味する.しかし,歯車本体の振動状態からナイロン樹脂歯車の歯車対においてCorner impactの影響は予想されるほど大きくないことが明らかになった.
X線マイクロCTと画像解析によるミクロスケール多相系組織形態変化の抽出,マイクロメカニクスベースモデルの開発,データサイエンスを導入した不均質性のモデル化を実践する.これらの先端技術導入の一方で,既存の調査・実験で得られるごく基本的な物理量を用いた力学挙動の記述により,広範な土木実務者の地盤挙動解釈を飛躍的に深度化させる.さらに,可視化が困難な土構造物内部の物性値の分布を既存技術で得られる地盤情報から完全に構築する先駆的理論を提示する.X線マイクロCTと画像解析によるミクロスケール多相系組織形態変化の抽出,マイクロメカニクスベースモデルの開発,データサイエンスを導入した不均質性のモデル化を実践する.これらの先端技術導入の一方で,既存の調査・実験で得られるごく基本的な物理量を用いた力学挙動の記述により,広範な土木実務者の地盤挙動解釈を飛躍的に深度化させる.さらに,可視化が困難な土構造物内部の物性値の分布を既存技術で得られる地盤情報から完全に構築する先駆的理論を提示する.
癌に対する低侵襲局所療法と樹状細胞癌ワクチン療法との融合による相乗効果

我々はマウスの癌モデルを用いて光線力学的治療と樹状細胞癌ワクチン療法との相乗効果を報告してきた(Saji H et al, Clin Cancer Res. 2006)。本研究では臨床応用に向けた前臨床研究を行った。免疫治療を進める上で宿主の免疫状態を把握することは重要である。(1)肺癌切除検体50例を用いて免疫染色にてFOXP3+腫瘍浸潤性Regulatory T cellを測定し、臨床病理学的因子との相関関係を調べた。年齢、性別には有意差は無い。組織型では扁平上皮癌に比べて腺癌で多い傾向があり、リンパ節転移頻度とも相関関係を認めた。症例を150例に増やして研究を継続している。(2)「切除不能進行再発非小細胞肺癌に対する自己樹状細胞腫瘍内注入療法と光線力学的治療、ラジオ波、抗癌剤治療との併用療法の臨床研究」の実施計画書を作成する。(1)の結果を踏まえて対象症例を選別し、試験開始と症例登録に向けて準備をしている。1、医師主導臨床試験として「切除不能進行再発非小細胞肺癌に対する自己樹状細胞腫瘍内注入療法と既存抗癌治療との併用療法の臨床研究」実施計画書を作成した。現在、当施設の医学倫理委員会に提出して審議中である。最近の文献的考察から既存抗癌治療としては、レーザー治療、放射線治療、抗癌剤単剤との併用とした。さらに腫瘍内注入樹状細胞の投与は計4回を原則として、その毒性と腫瘍縮小効果を検討する。症例集積は12例を目標として、平成22年度から登録開始予定である。2、上記臨床試験の免疫獲得におけるメカニズム解明目的に下記試験を計画した。当院にある腫瘍切除検体を用いて免疫染色にてFOXP3、CD3+腫瘍浸潤性T細胞を、酵素結合免疫吸着法にてTGF-betal、インターフェロンガンマ、インターロイキン10、インターロイキン12p70、血管内皮増殖因子の発現を測定する。近年、樹状細胞癌ワクチンの免疫獲得に対して抑制に働く主な細胞因子として制御性T細胞の存在が明らかになり、特に乳癌に対してそのメカニズムと生存に関与するとの報告がある。本研究では肺癌組織でのその検討の加えて、以前より指摘されている免疫応答に関与する液性因子である上記サイトカインの発現も同時に測定し、それらにおける相関関係に関しても検討を試みる。3、腫瘍免疫の獲得には宿主の状態の把握が重要である。免疫に関与するものにリンパ節の状態がある。肺癌切除例928例を対象として、そのリンパ節転移個数ならびに郭清個数と予後に対する検討を行い2009年米国癌治療学会に発表した。現在、最近の研究から自己樹状細胞の投与方法、さらに宿主の制御性T細胞の状態による効果の違いがあるとの見地から、まずは肺癌組織における上記宿主の状態を検討する前臨床研究を先行している。2、上記前臨床研究の具体的な方法は下記のごとくである。免疫獲得におけるメカニズム解明を目的として、当院にある腫瘍切除検体150例を用いて免疫染色にてFOXP3、CD3+腫瘍浸潤性T細胞を、酵素結合免疫吸着法にてTGF-beta1、インターフェロンガンマ、インターロイキン10、インターロイキン12p70、血管内皮増殖因子の発現を測定する。肺癌切除例928例を対象として、そのリンパ節転移個数ならびに郭清個数と予後に対する検討を行い2010年4th Asian Pacific Lung Cancer Conferenceに発表した。現在、自己樹状細胞の投与方法、さらに宿主の制御性T細胞の状態による効果の違いがあるとの見地から、まずは肺癌組織における上記宿主の状態を検討する前臨床研究を先行している。2、免疫獲得におけるメカニズム解明を目的として、当院にある腫瘍切除検体100例を用いて免疫染色にてFOXP3、CD3+腫瘍浸潤性T細胞を測定した。腫瘍内

FOXP3発現ならびにFOXP3陽性腫瘍浸潤性T細胞(Tregs)集積程度は生存に関与する傾向を認めた。現在、酵素結合免疫吸着法にてTGF-beta1、インターフェロンガンマ、インターロイキン10、インターロイキン12p70、血管内皮増殖因子の発現を測定し、上記サイトカインの発現も同時に測定し、それらにおける相関関係に関しても検討を試みる。3、腫瘍免疫の獲得には宿主の状態の把握が重要である。免疫に関与するものにリンパ節の状態がある。肺癌切除例928例を対象として、そのリンパ節転移個数ならびに郭清個数と予後に対する検討を行いJournal of Thoracic Oncology 2011に掲載された。
同窓生ネットワークの社会的機能

本年度は、戦前期からの歴史をもつ共学大学において、(1)学校行事や同窓会の場で大学の「伝統」にまつわるいかなる言説が語られているかを分析し、(2)さらにそれらの場で語られる「伝統性」に対して、後輩にあたる在校生たちがいかなる意識をもつのかを調査した。学校行事や同窓会の場では、挨拶に立った同窓生(同窓会役員など)や教師によって、学校史の連続性や同窓生たちの「一体感」が繰り返し語られていることが分かった。また、そこで強調される大学文化は、実際そこで一時期を過ごした全ての者たちの文化を反映しているというよりも、一部の側面(運動部や応援団など)を強調して象徴的に用いられていることも明らかになった。これらに対して在校生たちは、必ずしもそこで強調される「一体感」を自らに連続するものとして捕らえるわけではない。むしろ在校生たちが感じるのは「一体感」よりも「違和感」であることが明らかになった。なお、共学大学の場合、これら行事の場面で強調される大学の「伝統」は、得てして男性文化的な側面が強いが、大学の「伝統」に対する在校生の「一体感」/「違和感」には、それほど顕著なジェンダ-差はみられなかった。なお、現在、これまでの研究で明らかになったことを元に、今後若干の調査・分析を付け加え、最終的な知見を発表する準備をしているところである。本研究では、戦前期からの伝統を持つ共学大学において、新制大学以降の卒業生が大学文化からいかなる影響を受け、卒業後、いかなる同窓生ネットワークを形成しているかを最終的に明らかにすることを目的としている。同時に、戦前期に男子教育機関として成立し、伝統的に男性文化を継承してきた大学文化および同窓生集団内において、男子卒業生や女子卒業生の文化適応やネットワーク形成にいかなる同一性と差異が見られるのかもあわせて考えていくことを第二の目的としている。次年度の調査実施に先だって、本年度は、関連領域の文献資料の収集と整理および、これまで行われてきた類似の調査のレビューを行った。文献資料の収集・整理を行ったのは、(1)高等教育研究、(2)学校文化研究、(3)ライフコース研究、(4)ネットワーク研究、の各領域と、(5)ジェンダー研究、(6)集団形成と権力に関する研究、の各領域である。過去の調査のレビューとしては、本研究が調査対象とする大学を対象とした既存の卒業生調査を再分析し、次年度に実施する調査の課題抽出を行った。また、他大学で行われた卒業生調査の結果を収集し、とりわけ卒業生がどのような社会的ネットワークを形成しているかをレビューした。同時に、先行研究において類似の同窓会調査が行われている高等学校の資料館訪問と資料収集、関係者への簡単なヒアリングを行い、強固な同窓生ネットワークがいかにして形成されたかについて考察を深めた。
ATP依存性K^+チャネルおよびセロトニン感受性K^+チャネルの構造と機能解析

(1)平成6年度、電気生理学的に“セロトニン感受性K^+チャネル"の存在が確認されているアメフラシ腹部神経節のcDNAライブラリーを検索し、高等動物では報告されていない新種のK^+チャネル、aKv5.1及びaKv6.1cDNAの単離を報告した。また、発現実験により、aKv5.lが神経細胞の静止膜電位及び発火のコントロールに寄与することを示した。平成7年度はさらに、もう一方のaKv6.1についてアミノ酸末端を含むcDNAクローンを単離し、aKv6.1の一次構造及びチャネル特性を解析した。その結果、aKv6.1は推定膜貫通領域Sl、S2間が他のK^+チャネルと比較して90アミノ酸残基も長く、またその電気生理学的特性は活性化過程が遅く不活性化が見られないなど、既知のK^+チャネルにはない構造的、機能的特性を有することが明らかになった。現在、アメフラシ神経細胞においてこれらの新種K^+チャネルとセロトニン受容体との共発現、再構成実験により、セロトニン感受性K^+チャネルと近い特性を持つ可能性につて検証を行っている。(2)“ATP依存性K^+チャネル"については、マウス及びヒト膵臓cDNAライブラリーよりcDNAの単離を試みていたが、清野らにより、膵臓β細胞ATP依存性K^+チャネルの構造と機能解析の報告があった。このチャネルは既知の内向整流性K^+チャネルと同じく膜二回貫通型の構造特性を有する。これらのチャネルに共通して、推定膜領域及びその周辺でアミノ酸配列が良く保存されており、我々はこれらの領域よりデザインしたprimerを用いて、脳神経系に存在するATP依存性K^+チャネルのスクリーニングを行った。その結果、内向整流K^+チャネルの構造的特徴を有する複数のクローンを単離した。新たに、IRK2,IRK3,GIRK2,GIRK3cDNAを単離し、RNA blotting法よりこれらが脳に局在することを明らかにした。また、これらのチャネルにおいて、いくつかのvariantの存在を確認した。(1)電気生理学的に“セロトニン感受性K^+チャネル"の存在が確認されているアメフラシ腹部神経節よりRNAを抽出した。この組織は微小であるため、限られたIst strand cDNAをPCR法により増幅することによりcDNAライブラリーを調製した。また、アメフラシ中枢神経のcDNAライブラリーも常法により調製した。既に報告のあるK^+チャネルの一次構造を比較すると、推定膜貫通領域S5とS6の間に極めて保存性の高い領域が存在する。この領域に着目してオリゴヌクレオチドプローブを作成し、前述のcDNAライブラリーのスクリーニングを行った。その結果、577および730アミノ酸残基のタンパク質をコードする新種のcDNAクローンを単離した(aKv5.1,aKv6.1)。卵母細胞およびアメフラシ神経細胞に特異的に発現させたaKv5.1は、全く不活性化過程の見られないK^+チャネル特性を示し、アメフラシの特定した神経細胞での発現実験によりaKv5.1が神経細胞の静止膜電位および発火のコントロールに寄与することが判明した。さらにaKv5.1は、他種のK^+チャネルと会合することによりセロトニン感受性K^+チャネルと近い特性を持つ可能性が示唆された。現在、aKv6.1の発現実験と併せて、この可能性について検証を行っている。(2) “ATP依存性K^+チャネル"

cDNAの単離にあたり、マウスおよびヒト膵臓poly(A)^+RNAよりcCNAライブラリーを調製した。この間に、他のグループより心臓のATP依存性K^+チャネルの構造が発表されたため、それに基づきプライマーを合成しPCR法により内向整流K^+チャネルの構造的特徴を有するクローンを取得した。現在、コ-デイング全領域をカバーするcDNAの単離を行っており、これを用いて膵臓ATP依存性K^+チャネルの機能解析および培養細胞系での発現実験を行う計画である。(1)平成6年度、電気生理学的に“セロトニン感受性K^+チャネル"の存在が確認されているアメフラシ腹部神経節のcDNAライブラリーを検索し、高等動物では報告されていない新種のK^+チャネル、aKv5.1及びaKv6.1cDNAの単離を報告した。また、発現実験により、aKv5.1が神経細胞の静止膜電位及び発火のコントロールに寄与することを示した。平成7年度はさらに、もう一方のaKv6.1についてアミノ酸末端を含むcDNAクローンを単離し、aKv6.1の一次構造及びチャネル特性を解析した。その結果、aKv6.1は推定膜貫通領域S1、S2間が他のK^+チャネルと比較して90アミノ酸残基も長く、またその電気生理学特性は活性化過程が遅く不活性化が見られないなど、既知のK^+チャネルにはない構造的、機能的特性を有することが明らかになった。現在、アメフラシ神経細胞においてこれらの新種K^+チャネルとセロトニン受容体との共発現、再構成実験により、セロトニン感受性K^+チャネルと近い特性を持つ可能性について検証を行っている。“ATP依存性K^+チャネル"については、マウス及びヒト脾臓cDNAライブラリーよりcDNAの単離を試みていたが、清野らにより、脾臓β細胞ATP依存性K^+チャネルの構造と機能解析の報告があった。このチャネルは既知の内向整流性K^+チャネルと同じく膜二回貫通型の構造特性を有する。これらのチャネルに共通して、推定膜領域及びその周辺でアミノ酸配列が良く保存されており、我々はこれらの領域よりデザインしたprimerを用いて、脳神経系に存在するATP依存性K^+チャネルのスクリーニングを行った。その結果、内向整流K^+チャネルの構造的特徴を有する複数のクローンを単離した。新たに、IRK2,IRK3,GIRK2,GIRK3cDNAを単離し、RNA blotting法よりこれらが脳に局在することを明らかにした。また、これらのチャネルにおいて、いくつかのvariantの存在を確認した。