hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
トランスポゾンタギング法を用いたホヤ発生遺伝学の展開

研究を開始した当初は、カタユウレイボヤのゲノムの情報はほとんど解っておらず、ENU等の点突然変異によって作製した変異体はその性質の解析が非常に困難であることが想像されていた。しかし、近年のCionaゲノムの情報量から、ENU処理などランダムな遺伝子破壊によって作成した変異ホヤでも、原因遺伝子の単離は困難であったとしても、その他の特性については、以前より遙かに多くのことが理解できうるようになってきた。そこで、本年度は米国UCサンタバーバラ校William C.Smith氏の研究室と共同研究でカタユウレイボヤを用いてENU処理による突然変異体の作製を試みた。ENU処理を施したホヤの中から約500匹のホヤについてスクリーニングを行い、約10個体の変異体候補を選抜することができた。変異体株として固定するためにはもう1世代必要なので、現在これら変異体候補はさらに交雑を行い、変異体株としての固定を目指しつつ、それらの変異体についての解析の準備を進めているところである。今回、単離できた変異体のひとつに、以前NakataniらによってCiona Savignyiから単離されたchmとその表現型が酷似した変異体候補が選抜された。この変異体候補とchmを異種間で交雑させた結果、この変異体候補はchm変異体の原因遺伝子を相補しうる変異体であることが解った。また、これ以外にも未発表であるがカタユウレイボヤで単離されている変異体を相補する変異体を選抜することが出来ている。また新規の表現型と思われる変異体候補も単離されており、それらの解析の準備を進めている。トランスポゾン系の確立は、所属研究室の笹倉靖徳らとの共同研究により、Tcl/marinersuperfamilyの一つであるMinosがカタユウレイボヤ内で活性を示すことを示し、その結果は現在論文として発表予定である。
小学生から高校生までの学校における怒りの多次元的特徴の検証とその予防的介入

小学生から高校生までの子どもたちが学校で感じる「怒り」を、感情面、認知面、行動面から測定する日本語版尺度を作成した。また、感情評価、ストレッサー、自動思考、社会的スキルとの関連を検討し、男女や学校段階で異なる関連性を見出した。したがって、子どもの学校での怒りは、多面的視点から理解する必要がある。また、小中学生で怒りのコントロールに関する心理教育を実践し、怒りの不適切な表出の緩和の効果を見出した。学校内での限られた時間でも、怒りの適切なコントロールに関する心理学的な教育支援が可能であることを示唆する結果であった。1)学校での怒りと感情評価との関連の検討前年度に作成された「学校での怒りの多次元尺度日本語短縮版」(JS-MSAI)を利用して、「陰性感情の否定的評価」との関連性を検討した。その結果、怒りへの否定的評価が低いと怒りの認知的側面や行動的側面が高くなる傾向にあることが示された。2)学校での怒りと学校ストレッサーとの関連の検討JS-MSAIと小中学生が学校で経験するストレッサーとの関連性について検討を行った。その結果、学校で表出される怒りの程度は、学校ストレッサーの多寡とほとんど関連しないことが明らかとなった。また学校に対する否定的態度は教師ストレッサーや親ストレッサー(中学生男子)や学業ストレッサー(中学生女子)、怒りの直接的表出は教師ストレッサーや自己ストレッサー(小学生女子)との関連することが明らかとなった。したがって、小中学生の学校での怒りの理解や不適切な表出への支援に際しては、学校ストレッサーの調整を視野にいれる必要性が示唆された。1)学校での怒りと自動思考との関連の検討:小中学生における学校での怒りと自動思考との関連性について、2波のパネル調査のデータを用いて検討した。その結果、感情的側面である怒り体験には、中学生男子のみ、ポジティブ自動思考から正の影響が示された。認知的側面である学校での敵意では、小中学生の男子でネガティブ自動思考からの影響があり、女子は小中学生ともに、自動思考のいずれとも双方向の影響性が示された。行動的側面のうち破壊的表出については関連が示されず、積極的対処に関しては、小学生男子と中学生女子でポジティブ自動思考からの正の影響が観測された。2)学校での怒りと社会的スキルとの関連の検討:小中学生における学校での怒りと社会的スキルとの関連性について、2波のパネル調査のデータを用いて検討した。その結果、感情的側面である怒り体験から社会的スキルへの影響はほとんどみられず、認知的側面である学校への敵意は、どの対象においても、ほぼすべての社会的スキルと相互抑制的な影響を及ぼしていた。行動的側面のうち破壊的表出については、小学生男子と中学生女子で複数のスキルと相互に抑制的な影響を及ぼしていた。積極的対処は、小学生女子以外の対象者について、概ね正の相互影響を示していた。3)学校での怒りに対する心理教育の効果:小学5年生を対象に、怒りのコントロールに関する2時間の心理教育を実践した。その結果、女子の破壊的表出の得点が低下しており、破壊的表出の緩和に効果のある可能性が示唆されたが、対照群を設定していないため、今後の検討課題である。また中学1年生を対象に、怒りのコントロールに関する心理教育を2時間実践した。その結果、実践したクラスの破壊的表出の得点が低下しており、破壊的表出に効果のあることが考えられる。したがって、怒りの不適切な表出については、比較的少ない回数でも変容可能である可能性がある。1)学校での怒りの多次元尺度日本語版の作成学校での怒りの多次元尺度(MSAI)について、日本語版を作成し(J-MSAI)、小学5年生から高校2年生までを対象に調査を行い、回答に不備のない3443名のデータを分析した。まず、因子の再現性を検討したところ、原尺度と同じ4因子構造(怒り体験・皮肉的態度・破壊的表出・積極的対処)の採用は妥当であると判断された。また、収束的妥当性、弁別的妥当性、基準関連妥当性と、内的一貫性、再検査信頼性をそれぞれ検証した結果、いずれも概ね良好な値が得られ、J-MSAIは十分な妥当性・信頼性を有していると判断された。さらに、男女差や小学生から高校生までの学校段階の差異を検討したところ、皮肉的態度(学校への敵意的認知の側面)は中学生で高まること、破壊的表出(学校での怒りの直接的表出)は中学生がやや高いものの、その差はさほど大きくないこと、積極的対処(学校での怒りの適応的に表出)については、女子が男子より高い傾向にあることなどが明らかとなった。2)J-MSAIの短縮版の作成より簡便な尺度構成とするため、J-MSAI36項目の短縮版(20項目)を作成し、その妥当性・信頼性を検証した。その結果、妥当性および信頼性に関して、J-MSAIと同程度の値が得られた。

さらに、男女差や学校段階の差異の知見もほぼ一致していたことから、研究での使用に足る短縮版が作成されたと考えられる。また、パーセンタイル得点を反映した、領域ごとに、男女別・学校段階別に、4段階からなる換算表を付録として追加した。これにより、尺度得点から当該児童生徒の学校での怒りの相対的な程度が把握でき、介入に際して有用な情報として活用されることが期待される。3年中の2年めでは、学校での怒りの関連要因を検討することが目的であったため、怒りと関連の深いストレッサーと感情評価について検討した。これらの成果は関連学会で発表し、現在投稿中または投稿準備中であることから、順調に進展していると判断した。研究の基礎となる尺度開発として、J-MSAIの標準版、および20項目短縮版が作成された。標準版の検討については心理学研究への掲載が決定しており、短縮版についても富山大学人間発達科学部紀要への投稿を準備中である。これらは計画当初の予定と一致しているため、達成は順調であると判断される。学校での怒りと関連する心理的変数、特に認知的側面(自動思考)と行動的側面(社会的スキル)との関連を検討する。これらの成果を踏まえ、実際に学校現場で予防的な心理教育を行い、生徒にとってどのような体験であるかを検討する。研究計画は、J-MSAI(標準版もしくは短縮版)を用い、学校での怒りに影響を及ぼす要因に関する調査研究が中心である。調査協力が得られている学校を対象に、怒りとの関連が示唆される、学校ストレッサー、自動思考、社会的スキル、感情への評価に関する調査研究を進めていく。研究データの入力補助のための謝金。研究データを分析を効率化するためのパソコンの購入。研究成果を学会で発表するための諸費用。1)研究に関する論文・著作等の収集、2)研究に関する研究発表のための学会出張(年2回予定)、3)研究データ入力のための人件費、を中心に使用予定である。
脂漏性角化症における色素産生亢進機序

強力な血管収縮ペプチドであるエンドセリン特にエンドセリン-1が、皮膚においてヒトメラノサイトの強力な増殖因子でかつ増殖状態のヒトケラチノサイトでその産生、分泌が著しく亢進することが近年解明されたが、表皮細胞の増殖を伴い色素産生の亢進する皮膚疾患においてその色素産生亢進機序へのエンドセリンの関与の有無は検討されていない。今回、我々は表皮細胞の増殖を伴い、かつ色素産生の亢進する皮膚疾患として、脂漏性角化症(表皮肥厚型、ブロッホ型)に着目し、、その表皮におけるエンドセリン-1 mRNAの発現をRT-PCR法で解析した。1)黒色調の脂漏性角化症および周囲の健常部を60°Cの生食に3分留置、表皮を剥離し、AGPC法により全RNAを抽出した。2)逆転写酵素を反応させ、cDNAを合成エンドセリン-1およびGAPDH遺伝子に特異的なプライマー、Taqポリメラーゼを加えPCRを行った。3)その生成物を電気泳動し、エンドセリン-1のmRNAの発現をGAPDH遺伝子の発現量を標準として半定量的に解析した。4)同時に色素産生亢進の指標としてチロシナーゼ遺伝子の発現量を上記の方法で解析した。結果:黒色調の脂漏性角化症3例(表皮肥厚型1例、ブロッホ型2例)全例で正常皮膚に比べ、エンドセリン-1およびチロシナーゼmRNAの発現量の著明な増加を認められ、以上より、脂漏性角化症での色素増強にエンドセリンの関与が示唆された。
国際美術展「ドクメンタ」の運営システムに関する研究

国際美術展ドクメンタは5年一度ドイツカッセル市で開催される世界でも著名な現代美術展のひとつである。本研究では、ドクメンタが世界有数の国際美術展として開催毎にその発信力を保持する理由に、本展が長きに渡り構築した独自の展覧会運営システムにあると仮定し、その仕組みを明らかにする。とりわけ、本展における運営組織の編成過程を対象とし、その特徴を整理記述し、国内で隆盛するアートフェスティバルへの基礎研究として寄与することを目指している。平成30年度は、同展の運営プロセス調査を実施するにあたり、芸術監督の選出過程に焦点を当て調査研究を行う予定であった。当課題の設定に関しては、事前研究にて明らかになっていたものであり、5年に一度開催されるドクメンタ展が開催終了し、次回開催にむけ着手する準備業務において最重要プロセスのひとつである。しかし、後述するように前回開催時(2017年)の財政問題が後を引き、主催組織であるドクメンタ運営会社が問題対応に追われたため、展覧会運営の基点となる芸術監督選出が例年にない遅延を見せた。ゆえに、本研究でも芸術監督選出の調査に関しては次年度へと延期し、本年度は、既存の収集資料を元に、ドクメンタ展の全体像、ならびに過去においてメルクマールとなる展覧会の特徴を分析した。調査では、過去ドクメンタ展のカタログ(レプリカも含む)、ブックレットならびに同展創設者のアルノルト・ボーデ自伝等を中心に展覧会運営の流れを整理し、展覧会運営組織に関する貴重な知見を得ることができた。ドクメンタ展の運営遅延により、芸術監督選出過程に関する調査が未着手となっているが、概ね順調に進展していると考えられる。ドクメンタは5年に一度開催され、直近開催として2017年に14回目が実施されている。通例であれば、翌年秋(2018年秋)には次回展覧会を統括する芸術監督(アーティスティックディレクター)を選出する時期となるが、2017年開催のドクメンタでは大幅な事業予算超過による財政問題が発生し、当該問題の対応に運営会社が追われたため、開催翌年度の重要アジェンダとなる次期芸術監督の選出が大幅に遅れる事態となった。芸術監督選出の遅延により、本研究での調査も合わせて延期することとなったが、今回の件を通して運営会社と芸術監督との間をめぐる責任所在と範囲も明らかになっている。そのため、次回の調査において両者の関係に関して研究進展が見込まれると考えている。第15回ドクメンタの芸術監督も2019年2月22日に無事に発表され、次回展覧会開催に向けた重要アジェンダも順調に進行している。次回の芸術監督は、アジア圏からの初選出であり、過去にない個人でなくグループによる監督となるため興味深い事例となっている。今後、芸術監督の選出過程についてさらに研究を進めていく予定である。今後の研究推進方策として、先述した運営会社事情により未着手となっている芸術監督選出過程の調査を実施する。令和元年度は展覧会に関する資料調査ならびに新規発表となった芸術監督に関する調査も行ない、現地での運営会社担当スタッフへの聞き取り調査を実施する予定である。展覧会運営プロセスに関する研究成果を各種学会での発表を予定している。

第15回ドクメンタの芸術監督も2019年2月22日に無事に発表され、次回展覧会開催に向けた重要アジェンダも順調に進行している。次回の芸術監督は、アジア圏からの初選出であり、過去にない個人でなくグループによる監督となるため興味深い事例となっている。今後、芸術監督の選出過程についてさらに研究を進めていく予定である。今後の研究推進方策として、先述した運営会社事情により未着手となっている芸術監督選出過程の調査を実施する。令和元年度は展覧会に関する資料調査ならびに新規発表となった芸術監督に関する調査も行ない、現地での運営会社担当スタッフへの聞き取り調査を実施する予定である。展覧会運営プロセスに関する研究成果を各種学会での発表を予定している。次年度使用額が生じた理由としては、前年度の調査課題である芸術監督の選出プロセスに関して、対象となる運営会社の事情により時期芸術監督選出の遅延が発生し、合わせて現地調査も延期せざるを得なくなったためである。今後の使用計画としては、当初の調査課題である芸術監督選出を実施するとともにキュレーターチームの編成過程に関して夏季および冬季の2回に分けて現地調査を実施する予定である。前年度の調査により資料取得の必要が生じているため、別途物品費を計上することとなった。
気管支喘息および肺線維症の発症分子機序におけるアドレノメデュリンの役割

Adrenomedullin(AM)ヘテロ接合体ノックアウトマウス(AMKO)とその同腹子(野生型)を用いてOvalbumin(OVA)腹腔内投与により感作した喘息モデルマウスを作製した。対照群には生理食塩水の投与を行った。マウスを麻酔・人工換気下におき気道内圧、気流を測定し、肺抵抗、肺コンプライアンスを算出した。気道反応性を評価するためメサコリン(MCh)吸入負荷を施行した。その結果、AMKOマウスにおいて有意に気道過敏性が亢進していることが判明した(EC200RL : saline-treated・AM^<+/+>, 16.81±2.01mg/ml ; saline-treated AM^<+/->, 16.73±2.34mg/ml ; OVA-treated・AM^<+/+>, 7.95±0.98mg/ml ; OVA-treated AM^<+/->, 2.41±0.63*mg/ml, respectively, *P<0.05 vs. the other groups)。MCh負荷前後の組織AM濃度を検討したところ、AMKO群ではMCh負荷後のAM濃度が有意に低く、組織AM濃度の不足が気道反応性の亢進に関与している可能性が示唆された。また、肺組織の形態学的解析を行ったところ、OVA感作AMKO群では野生型群と比較して有意に気道内腔が狭窄しており、気道周囲の平滑筋層の面積の増加、気道上皮細胞層の面積の増加もあわせて認められた。したがって、AMの不足が何らかの機序で気道周囲の平滑筋を腫大・増生させたり気道上皮細胞を膨化させるため、結果として気道内腔が狭窄すると考えられた。なお、気道周囲の好酸球浸潤の程度、気道分泌・杯細胞増生の程度、TH1、Th2系サイトカイン、ロイコトリエンについても検討したが、AMKO群と野生型群の間に有意な差は認められなかった。アドレノメデュリン(以下AM)が気管支喘息の発症分子機序に果たす役割を明らかにするため、AMのヘテロノックアウトマウス(AM-KO)を作製して実験に用いた。Ovalbumin腹腔内投与により感作したマウス(AM-KOマウス、野生型マウスを使用)に対して2日間(1日60分間)の抗原吸入負荷を施行し喘息モデルを作成した。対象群として、生理食塩水の腹腔内投与、吸入を施行したマウスを用いた。マウスを麻酔・人工換気下におき気道内圧を測定し、肺抵抗、肺コンプライアンスを算出した。気道過敏性を評価するため、メサコリン吸入負荷を施行し評価した。その結果、AM-KOマウスにおいて有意に気道過敏性が亢進している事実が明らかになった(肺抵抗を2倍に上昇させるために必要な吸入メサコリン濃度:saline-treated AM^<+/+>,16.81±2.01mg/ml ; saline-treated AM^<+/->,16.73±2.34mg/ml ; OVA-treated AM^<+/+>,7.95±0.98mg/ml ; OVA-treated AM^<+/->,2.41±0.63mg/ml)。

さらに、肺組織標本を作成して検討したところ、OVA感作群で高度の好酸球浸潤や杯細胞過形成、気道粘液分泌過剰を認めたが、AM-KOマウスと野生型の問に有意な差はみられなかった。気管支肺胞洗浄液中や血清中の細胞成分分画、IgE、IgG1、IL-4、IL-5、IFN-γ、ロイコトリエンの濃度を測定したが、AM-KOマウスと野生型マウスとの間に有意な差は認められなかった。組織形態学的解析を行ったところ、気道上皮の面積のみ、AM-KOマウスと野生型マウスの間に有意差が認められた。以上の結果から、AMのヘテロノックアウトマウスでは気道過敏性が亢進し、気道上皮細胞の膨化が関与している可能性が示唆された。Adrenomedullin(AM)ヘテロ接合体ノックアウトマウス(AMKO)とその同腹子(野生型)を用いてOvalbumin(OVA)腹腔内投与により感作した喘息モデルマウスを作製した。対照群には生理食塩水の投与を行った。マウスを麻酔・人工換気下におき気道内圧、気流を測定し、肺抵抗、肺コンプライアンスを算出した。気道反応性を評価するためメサコリン(MCh)吸入負荷を施行した。その結果、AMKOマウスにおいて有意に気道過敏性が亢進していることが判明した(EC200RL : saline-treated・AM^<+/+>, 16.81±2.01mg/ml ; saline-treated AM^<+/->, 16.73±2.34mg/ml ; OVA-treated・AM^<+/+>, 7.95±0.98mg/ml ; OVA-treated AM^<+/->, 2.41±0.63*mg/ml, respectively, *P<0.05 vs. the other groups)。MCh負荷前後の組織AM濃度を検討したところ、AMKO群ではMCh負荷後のAM濃度が有意に低く、組織AM濃度の不足が気道反応性の亢進に関与している可能性が示唆された。また、肺組織の形態学的解析を行ったところ、OVA感作AMKO群では野生型群と比較して有意に気道内腔が狭窄しており、気道周囲の平滑筋層の面積の増加、気道上皮細胞層の面積の増加もあわせて認められた。したがって、AMの不足が何らかの機序で気道周囲の平滑筋を腫大・増生させたり気道上皮細胞を膨化させるため、結果として気道内腔が狭窄すると考えられた。なお、気道周囲の好酸球浸潤の程度、気道分泌・杯細胞増生の程度、TH1、Th2系サイトカイン、ロイコトリエンについても検討したが、AMKO群と野生型群の間に有意な差は認められなかった。
大腸がん幹細胞の同定と細胞階層性・可塑性の解明

大腸がん組織を構成する細胞集団の多様性は治療抵抗性の大きな原因の一つであり、がん化学療法の確立を困難にする要因となっている。本申請課題では、生体組織の細胞多様性および階層性を再現することができる3次元培養法(オルガノイド培養法)を用いてヒト大腸がんの手術検体から患者由来オルガノイド(patient-derived organoids, PDOs)を樹立し、その細胞多様性を明らかにする。さらに、がん幹細胞を同定し、ゲノム編集法を用いた可視化や、cell-ablation実験により、がん組織を構成する細胞集団の多様性と生物学的特性を明らかにする。平成29年度までに、stageIV大腸がん手術検体から樹立されたPDO用いて、10xGenomics社chromiumによる1細胞遺伝子発現解析(scRNA-seq)を行い、情報解析に基づき、がん組織を構成する細胞クラスターと各クラスターのマーカー遺伝子に関する解析を行なった。一方、PDOのゲノム編集技術の最適化を進めた。平成30年度は、scRNA-seqのDEG解析により幹細胞マーカーを同定することに成功した。さらに最適化されたゲノム編集法により、幹細胞マーカー遺伝子座に可視化とcell-ablation実験を可能にするカセットを導入した。作製された遺伝子改変PDOsの細胞生物学的な一連の解析により、本研究で同定された幹細胞は、自己複製能と多分化を有していること、さらに幹細胞を除去することにより、オルガノイドの増殖が著しく阻害されたことから、がん組織の効率的な維持、増殖に需要な役割を果たしていることが明らかになった。大腸がん組織は、分化形質が異なる様々な細胞種から構成されており、その多様性は、奏功率の高いがん化学療法の確立を困難にしている。大腸がん組織の細胞多様性は正常組織との類似性が指摘されているが、ヒト成体で組織レベルの解析を行う事はできない。本申請課題では、ヒト大腸がんから樹立されたオルガノイドの1細胞解析を行い、細胞多様性を明らかにする。さらに、ゲノム編集法を用いて幹細胞を可視化し、幹細胞性と多分化能を明らかにするとともに、cell-ablation実験により可塑性を明らかにする。平成28年度は、がん研有明病院で手術が行なわれた大腸がん検体から樹立されたオルガノイドの中から、悪性度が高い肝転移再発がんから樹立されたオルガノイドの1細胞遺伝子発現解析を行なった。当該研究申請時には、C1 AutoPrep System(Fludigm社)を用いて1細胞をキャプチャーし、溶解、cDNAの作製、前増幅を行い、BiomarkHD (Fluidigm社)を用いたハイスループットリアルタイムPCRにより、intestinal cell signatureの発現解析を行う予定であった。しかし、幸い、新学術領域研究先端ゲノム解析研究推進プラットフォームに採択されたため、Chromium (10xgenomics社)を用いて1細胞を分離し、さらに、mRNA-seqによる遺伝子発現解析に変更した。その結果、7768個の細胞の遺伝子発現情報(Median UMI; 3,477)を得る事に成功した。当初の予定通り、1細胞遺伝子発現解析データを取得することができた。分化形質が異なる様々な細胞種から構成される大腸がん組織では、その細胞多様性により治療抵抗性が生じ、がん化学療法の確立を困難にする要因の一つとなっている。本申請課題では、ヒト大腸がんの手術検体から3次元培養法により樹立されたオルガノイドが、生体組織の細胞多様性および階層性を再現することに着目し、1細胞解析を行い、細胞多様性を明らかにする。さらに、ゲノム編集法を用いた幹細胞の可視化や、cell-ablation実験により一細胞解析のインフォマティクスにより得られた情報を細胞生物学的に実証する。平成29年度は、平成28年度に行われた大腸がんオルガノイドの1細胞遺伝子発現解析のインフォマティクス解析を行なった。具体的には、Filtering、Gene ceilingなどの前処理の後、t-SNEやMDSを用いてdimesional reductionを行い、クラスタリングを行なった。さらに各クラスターを構成する細胞集団の発現遺伝子について、すでに正常消化管組織や大腸がんで報告されている幹細胞マーカーや分化マーカーなどの遺伝子群をマップし、作製されたクラスタリングの妥当性を検討した。一細胞解析のバイオインフォマティクスの実証実験を行うために、効率的なオルガノイドのゲノム編集法を確立した。さらにこの手法を用いて細胞可視化と誘導的な自殺遺伝子の挿入が可能なドナーベクターを作製した。作製されたベクターは、エレクトロポレーションによりオルガノイドに導入し、遺伝子改変効率を検証した。様々な手法を用いたバイオインフォマティクスにより作製されたクラスタリングは、既知のマーカー遺伝子の発現パターンと照らし合わせても信頼性が高いと考えられた。さらに、新たなゲノム編集の手法を用いることにより、効率的な遺伝子改変が可能であることが明らかになった。

平成29年度までに、stageIV大腸がん手術検体から樹立されたPDO用いて、10xGenomics社chromiumによる1細胞遺伝子発現解析(scRNA-seq)を行い、情報解析に基づき、がん組織を構成する細胞クラスターと各クラスターのマーカー遺伝子に関する解析を行なった。一方、PDOのゲノム編集技術の最適化を進めた。平成30年度は、scRNA-seqのDEG解析により幹細胞マーカーを同定することに成功した。さらに最適化されたゲノム編集法により、幹細胞マーカー遺伝子座に可視化とcell-ablation実験を可能にするカセットを導入した。作製された遺伝子改変PDOsの細胞生物学的な一連の解析により、本研究で同定された幹細胞は、自己複製能と多分化を有していること、さらに幹細胞を除去することにより、オルガノイドの増殖が著しく阻害されたことから、がん組織の効率的な維持、増殖に需要な役割を果たしていることが明らかになった。平成28年度に取得されたデーターをもとに、様々なな幹細胞マーカーの発現パターンの解析を行なう。さらにそれらの結果に基づき、大腸がんの進展、特に転移あるいは抗がん剤耐性に関わることが予測される遺伝子マーカーを同定し、ゲノム編集による可視化と標的化のための誘導的な自殺遺伝子挿入を進める。各クラスターを構成する遺伝子群について、ナレッジデーターベースの検索を行い、細胞増殖や分化をはじめとする様々な生物学的機能を詳細に検討し細胞集団の特性を明らかにする。さらにクラスターに特徴的なマーカー遺伝子を情報科学的手法により検索する。その結果、一つのマーカー遺伝子で細胞集団を規定することができるクラスターについては、ゲノム編集により可視化とcell-ablation実験を行う遺伝子改変を行い、細胞多様性および階層性に関する実証実験を行う。また、単一マーカー遺伝子では難しい場合には、造腫瘍性や転移能などの特徴的な特性をもつ細胞集団を単離・回収し、さらに詳細な遺伝子発現解析を行い、細胞特性とクラスターとの関連性を明らかにすることにより、がん組織を構成する多様な細胞集団の生物学的特性を明らかにする。1細胞解析を新学術領域研究先端ゲノム解析研究推進プラットフォームの支援を受けたため。(理由)1細胞解析を新学術領域先端ゲノム解析研究推進プラットフォームの支援を受けたため。(使用計画)ゲノム編集により作製された遺伝子改変オルガノイドを用いた、実証試験の精度を向上させる。さらに、その結果に基づき、遺伝子発現情報の追加取得を行い、詳細な解析を行う。オルガノイドの遺伝子改変を、新規開発されたゲノム編集法を用いて進めるために、新たなベクターの作製を行なう。
シロイヌナズナ変異株を用いたメチオニン生合成制御機構の解析

高等植物におけるメチオニンの生合成制御機構を明らかにするため,シロイヌナズナのmtol-1変異株の分子生物学的解析を行った.mtol-1変異株は若い時期のロゼット葉に野生型株の40倍に及ぶ遊離メチオニンを蓄積するがアスパラギン酸属の他のアミノ酸の蓄積には変化がない.従って,mtol-1変異株はメチオニンの生合成経路がスレオニンと分岐する点以降の反応段階に変異を持つと考えられた.野生型株をメチオニンを与えて栽培すると,メチオニン生合成における鍵酵素と考えられているシスタチオニンγシンターゼ(CGS)遺伝子のmRNAの蓄積が抑えられたが,mtol-1変異株では抑えられなかった.従って,野生型株ではメチオニン過剰下でCGSmRNAの蓄積を抑える制御機構が存在するのに対して,mtol-1変異株ではこの制御機構が欠損していると考えられた.遺伝的マッピングにより,mtol-1変異はシロイヌナズナ3番染色体の上端部にマップされた.一方,CGS遺伝子も3番染色体の上端部にマップされた.野生型株とmtol-1変異株についてCGS遺伝子の塩基配列を調べた結果,mtol変異はCGS遺伝子の第1エキソン内に点変異を持つことが明らかになった.従って,この領域の変異がCGSmRNAの蓄積制御に関わっているものと考えられる.野生型株とmtol-1変異株について液体培地でのカルス培養を起こし,エレクトロポレーションを用いた一過的発現系での解析をおこなった.その結果,mtol変異はCGS遺伝子のmRNAの安定性に関わる制御機構に変異を持つと考えられた.高等植物におけるメチオニンの生合成制御機構を明らかにするため,シロイヌナズナのmtol-1変異株の分子生物学的解析を行った.mtol-1変異株は若い時期のロゼット葉に野生型株の40倍に及ぶ遊離メチオニンを蓄積するがアスパラギン酸属の他のアミノ酸の蓄積には変化がない.従って,mtol-1変異株はメチオニンの生合成経路がスレオニンと分岐する点以降の反応段階に変異を持つと考えられた.野生型株をメチオニンを与えて栽培すると,メチオニン生合成における鍵酵素と考えられているシスタチオニンγシンターゼ(CGS)遺伝子のmRNAの蓄積が抑えられたが,mtol-1変異株では抑えられなかった.従って,野生型株ではメチオニン過剰下でCGSmRNAの蓄積を抑える制御機構が存在するのに対して,mtol-1変異株ではこの制御機構が欠損していると考えられた.遺伝的マッピングにより,mtol-1変異はシロイヌナズナ3番染色体の上端部にマップされた.一方,CGS遺伝子も3番染色体の上端部にマップされた.野生型株とmtol-1変異株についてCGS遺伝子の塩基配列を調べた結果,mtol変異はCGS遺伝子の第1エキソン内に点変異を持つことが明らかになった.従って,この領域の変異がCGSmRNAの蓄積制御に関わっているものと考えられる.野生型株とmtol-1変異株について液体培地でのカルス培養を起こし,エレクトロポレーションを用いた一過的発現系での解析をおこなった.その結果,mtol変異はCGS遺伝子のmRNAの安定性に関わる制御機構に変異を持つと考えられた.シロイヌナズナのmto1-1変異株は若い時期のロゼット葉に野生型株の約40倍の遊離メチオニンを蓄積する.メチオニンはアスパラギン酸族のアミノ酸であるが,同族の他のアミノ酸の蓄積には大きな違いは見られない.メチオニンの生合成経路が他のアミノ酸から分岐するO-ホスホホモセリン以降の経路の酵素遺伝子の発現を調べたところ,シスタチオニンγシンターゼ(CGS)mRNAの蓄積が野生型株の2-4倍に増加していた.また,野生型株をメチオニンを与えて栽培するとCGSmRNAの蓄積が抑えられたが,mto1-1変異株では抑えられなかった.従って,野生型株ではメチオニン過剰下でCGSmRNAの蓄積を抑える制御機構が存在するのに対して,mto1-1変異株ではその機構が欠損していると考えられた.遺伝的マッピングにより,mto1-1変異,CGS遺伝子ともに第3染色体の最上端の極めて近い位置にマップされた.CGS遺伝子全体を含む6651塩基対の領域について親株とmto1-1変異株で塩基配列を比較したところ,CGS遺伝子の第1エキソンにアミノ酸置換を伴う1塩基置換が見いだされた.独立に分離した4つのmto1変異株についてCGS遺伝子の第1エキソンの塩基配列を調べたところ,いずれもmto1-1変異と近接した領域にアミノ酸置換をもたらす1塩基置換が見いだされた.従って,この領域の変異がCGSmRNAの蓄積制御に関わっているものと考えられる.mto1変異が半優性変異であることを併せ考えると,mto1変異はCGSmRNAの安定性を制御するシス配列に生じた変異と考えるのが妥当と考えられる.現在,mto1変異部位の持つ機能を解析している.高等植物におけるメチオニンの生合成制御機構を明らかにするため,シロイヌナズナのmto1-1変異株の分子生物学的解析を行った.mto1-1変異株は若い時期のロゼット葉に野生型株の40倍に及ぶ遊離メチオニンを蓄積する.

メチオニンはアスパラギン酸族のアミノ酸であるが,mto1-1変異株において同族の他のアミノ酸の蓄積には大きな違いは見られないことから,メチオニンの生合成経路が他のアミノ酸から分岐するO-ホスホホモセリン以降の段階に変異を持つものと考えられる.シスタチオニンγシンターゼ(CGS)はメチオニン生合成における鍵酵素と考えられているが,mto1-1変異株について調べたところ,CGS mRNAの蓄積とCGSタンパク質の蓄積が共に野生型株に比べて増加していた.また,野生型株をメチオニンを与えて栽培するとCGSmRNAの蓄積が抑えられたが,mto1-1変異株では抑えられなかった.従って,野生型株ではメチオニン過剰下でCGS mRNAの蓄積を抑える制御機構が存在するのに対して,mto1-1変異株ではその機構が欠損していると考えられた.遺伝的マッピングならびに塩基配列の解析により,mto1変異はCGS遺伝子の第1エキソン内にアミノ酸置換を伴う点変異を持つことが明らかになった.従って,この領域の変異がCGS mRNAの蓄積制御に関わっているものと考えられる.エレクトロポレーションを用いた一過的発現系での解析等により,mto1変異はCGS遺伝子のmRNAの安定性に関わる制御機構に変異を持つことが分かった.
テネイシンCの軟骨修復促進作用における分子機構の解明とその治療への応用

軟骨損傷に対する新しい治療法としてテネイシンC(TNC)に着目した。ヒト関節軟骨を培養し、TNCを添加したところ軟骨細胞増殖作用、プロテオグリカン合成促進作用を認めた。TNCの関節軟骨欠損に対する治療効果を調べるために、マウスの膝関節に軟骨全層欠損を作り、TNCを局所投与した。TNCを投与すると、プロテオグリカンやII型コラーゲンの豊富な軟骨修復が得られ、軟骨修復促進剤として有用である可能性が示された。軟骨損傷に対する新しい治療法に利用する候補分子として、マトリックス細胞タンパクの一つであるテネイシンC(TNC)に着目した。TNCが軟骨修復を促進する分子メカニズムを明らかにするとともに、この分子を用いた軟骨の修復促進や変性を抑制する方法を動物モデルで検討している。TNCの培養軟骨細胞への作用を調べるために、変形性膝関節症に対して人工膝関節置換術を行うときに得られた関節軟骨を単層培養し、TNCを添加した。TNC濃度は1μg/mlと10μg/mlとした。コントロールとして、TNCを加えないものも作製した。細胞増殖の変化(ELISA・BrdU化学発色キット)を評価し、軟骨基質であるプロテオグリカンの発現と沈着量の変化はリアルタイムPCRとDimethylmethylene blue(DMMB)を用いて定量的に評価した。コントロールとTNC 1μg/ml投与例では軟骨細胞増殖作用、プロテオグリカン合成促進作用は認めなかったが、TNC 10μg/mlでは両者の効果を認めた。TNCの関節軟骨欠損修復効果を検討するために、マウス膝関節の大腿膝蓋関節面に大きさ0.3mm径で、深さは軟骨下骨を貫く骨軟骨欠損を作製した。TNCを投与した群と投与しない群を作り、術後448週で頚椎脱臼法にて屠殺し膝関節部を採取した。現在、脱灰標本を用いた組織標本を作製して、修復軟骨のプロテオグリカンやII型コラーゲンについて、組織学的検討を行っている。投与したTNCの濃度は100μg/ml、10μg/ml群とし、コントロールとしてTNCを投与しないempty群も作製した。術後1週、2週、3週、6週、12週で頚椎脱臼法にて屠殺し膝関節部を採取した。HE染色、サフラニン-O染色を行い、modified WAKITANIscoreを用いて軟骨修復を定量化し、比較した。その結果、TNC 100μg/ml投与群において3週でサフラニン-Oに染色される軟骨様組織で修復された。この修復組織は6週で周囲正常軟骨と同程度の厚さに戻った。一方でTNC 10μg/ml投与群、empty群では3週以降で軟骨下骨は修復されたものの、サフラニン-Oに染色される軟骨様修復はわずかであった。軟骨修復の定量化において、1週、2週では各群に有意差は認めなかったが、3週、6週、12週でTNC 100μg/ml投与群はempty群より有意に良好な結果であった。マウス関節軟骨全層欠損部に対するTNC 100μg/mlの投与は軟骨修復に有効である可能性が示唆された。TNCの関節内投与方法、量による関節軟骨修復効果を検討した。TNCの濃度は1μg/ml、10μg/ml、100μg/ml群とし、TNCを投与しないコントロール群も作製した。その結果、TNC 100 μg/ml投与群において3週でサフラニン-Oに染色される軟骨様組織で修復された。一方で他の群では3週以降で軟骨下骨は修復されたものの、サフラニン-Oに染色される軟骨様修復はわずかであった。

軟骨修復の定量化において、1週、2週では各群に有意差は認めなかったが、3週、6週、12週でTNC 100 μg/ml投与群はコントロール群より有意に良好な結果であった。抗II型コラーゲン抗体を用いた免疫組織化学的検討において、TNC 100 μg/ml投与群は3週、6週、12週で高発現していた。すなわち、プロテオグリカンが豊富で、II型コラーゲンによる組織構築も再生して、良好な軟骨修復が得られた。24年度が最終年度であるため、記入しない。TNCの関節内投与方法、量による関節軟骨修復効果を検討する予定である。TNCを徐放するためのキャリアの使用を検討している。
メラミンフォームを用いた新規義歯清掃用具の開発

メラミンフォームが義歯の清掃に使用できるかどうかについて検討した。床用材料として用いる各種レジンをメラミンフォームで研磨した場合の表面粗さは、最終研磨に用いるルージュで研磨した場合と有意差なかった。また、人工歯用硬質レジンの摩耗試験にメラミンフォームを使用した場合の表面粗さは、義歯ブラシを使用した場合よりも小さかった。以上より、義歯の清掃にメラミンフォームを利用できる可能性が示唆された。メラミンフォームが義歯の清掃に使用できるかどうかを検討するために,各種レジンを臨床で一般に行っている方法で研磨した場合とメラミン・オームで研磨した場合の表面性状を比較した.義歯床用レジンとしてクイックアクロン,アクロンMC,ポリペースII,リライン材としてトクヤマリベースII,汎用レジンとしてユニファストIIIを用い,メーカー指示に従い試料を作製した.各試料を, EDポイントコース, EDポイントファイン,ポリサンド,ブライトルージュ,圧縮メラミンフォームで研磨したもの,および研磨なしのコントロールについて,超深度形状測定顕微鏡を用いてカラー超深度画像を観察し,表面粗さを測定した.その後,クイックアクロン試料の走査型電子顕微鏡像を観察した.コントロール以外の試料ではいずれにも摩耗痕が観察され,メラミンフォームで研磨した試料は,ルージュで研磨した試料に類似した表面像を示した.表面粗さに対して二元配置分散分析を行った結果,研磨法の寄与率が約94%となり,表面粗さは研磨法に依存することがわかった.そこで,レジン種別に,研磨方法間での表面粗さの比較検討を行ったところ,すべてのレジンにおいてルージュ,メラミンフォーム,コントロール間に有意差は認められなかった.走査型電子顕微鏡像においては.ルージュ,圧縮メラミンフォームではかすかな線状痕と点状痕がみられ,類似した画像を示した.臨床における義歯の最終研磨はルージュであり,今回の実験においてメラミンフォームによる研磨がルージュによる研磨と有意差なかったことから,義歯ブラシや義歯洗浄剤では落ちない汚れの清掃にメラミンフォームを使用できる可能性が示唆された.市販硬質レジン人工歯と同じ成分の試料をメラミンフォームおよび義歯装着者が使用している可能性のある清掃材で摩耗試験を行ったときの表面粗さについて比較検討した.人工歯試料としてエンデュラ用硬質レジン(松風)15個を使用した.この試料を,臨床で行われている方法に従い仕上げ研磨まで行った後,超深度形状測定顕微鏡(VK-8550, KEYENCE)を用いて表面粗さを測定した.清掃材には,(a)4倍圧縮メラミンフォーム(大文字),以下MEL,(b)義歯用ブラシ(ライオン),以下BRU,(c)義歯用ブラシ+義歯用歯磨剤(ポリデント泡フレッシュ,グラクソ・スミスクライン),以下POL,(d)義粛用ブラシ+義歯用歯磨剤(タフデント入れ歯の歯みがき,小林製薬),以下TAF,(e)義歯用ブラシ+歯磨剤(Aquafresh,グラクソ・スミスクライン),以下AQUを用いた.摩耗試験装置(ラビングテスターIMC-151B型,井元製作所)を使用し,荷重200g,速度1往復/秒,動作幅20mm,摩耗回数10,000ストロークで,各清掃材につき3試料の摩耗試験を行い,表面粗さを測定した.清掃材間で表面粗さを比較した結果,TAFとAQUはMEL, BRU, POLに対し,有意に大きな値を示した.MEL, BRU, POL間に有意差は認められなかったが,BRUはMELとPOLよりも大きな値を示した.また,各清掃材における摩耗試験前後の表面粗さの比較では,MELとPOLでは有意差が認められなかったが,BRU, TAF, AQUでは有意に増加した.以上より,水のみのブラッシングでも摩耗を生じたのに対し,メラミンフォームでは摩耗の影響が認められず,硬質レジン歯の清掃にもメラミンフォームを利用できる可能性が示唆された.
犯罪被害者の心の推論と支援的環境の構築

本研究は、1)一般の人々を対象に、犯罪被害者(以下「遺族」とする)に対する心の推論の特性、および、心の推論が遺族への態度に及ぼす影響、さらに、遺族が法廷で表出する感情に対する、裁判員としての法的判断プロセスを明らかにすること、また2)遺族自身を対象に、他者からの心の推論に関する推論(メタ推論)、および、メタ推論が対人態度に及ぼす影響を検証した。遺族の心の推論については、調査(N=100)研究の結果、「悲嘆」より「怒り」が多く推論されており、人々は「加害者に強い怒りを抱く」遺族像を保持していることが示された。また、シナリオ実験より(N=250)、「人間は他者の過ちに寛容であるべき」という規範的な信念の強い第三者は、このステレオタイプに合致する遺族に対し、少ない支援意図を示していた。同様のプロセスは、法廷で感情表出する遺族への認知でも確認され、第三者の規範的な信念が、(遺族の望む方向とは逆に)軽い量刑判断をもたらすことが明らかになった(N=100)。遺族を対象とした半構造化面接(N=20)の逐語分析からは、遺族が実際、第三者による「賠償金に関する誤解」「受傷の過小評価」を体験しており、「社会には遺族への偏見がある」というメタ認知と対人不信、さらにはコミュニティ上の孤立や行動制限につながっていることが示唆された。また、遺族自身も第三者同様、遺族という社会的カテゴリーに対し、「怒ってばかり」という否定的なイメージを有していた。しかし、他の遺族によるこまやかで実際的な支援を受けることで、そのようなイメージが払しょくされていく様子もまた確認された。遺族は全般的に、被害経験を境目として対人関係の質的・量的な変化を実感していた。25年度が最終年度であるため、記入しない。(1)被害者の心の理解に関する一般的理解の解明:被害者の心の状態に対する一般の人々のステレオタイプ的認知の詳細を明らかにするための調査を実施した。全国に居住する20歳から70歳までの男女を対象に、Web調査を実施し、犯罪被害のタイプごとの被害者への印象について、100名から回答を得た。その結果、「強盗目的」および「知人」により殺害された被害者に対しては、性格や対人行動上の欠点を指摘する記述が相対的に多くみられ、「裕福だが情は薄い」「社会的地位はあるが自分中心的」など、ポジティブ・ネガティブ要素の混在する相補的なイメージを付与される傾向が確認された。(2)裁判員裁判場面での被害者の感情表出に対する評価と判断との関係:被害者やその家族が被害者参加制度のもと、裁判での意見陳述で表出する発言が、どのように裁判員の判断に影響するかを検討するための実験を実施した。その結果、被害者遺族の発言により心を動かされたと回答した参加者ほど、より長い量刑年数を選ぶこと、また、被害者参加制度に否定的な参加者は、遺族の発言による自己影響を否定し、その結果として、より短い量刑年数を選択するという過程が示された。(3)被害者自身の心の推論に関するメタ認知調査:被害者が周囲からの支援をどのように受け止め、自身が支援者や周囲の人からどのように見られていると思っているか(メタ推論)、「支援者」に対してどのような印象を抱いているかなどについて、被害者に対するインタビューデータを収集し、分析を進めている。被害者ステレオタイプや裁判場面での判断に関する研究については、Web調査や実験が順調に進行し、すでに、論文執筆を行っているものもある。また、現在、被害者ステレオタイプに関する本調査実施のための質問紙策定も進んでいる。被害者インタビューについては、現在、被害者の方々の協力を得て、インタビューを実施中である。

インタビューは、現在も続行されており、貴重なデータが一定数集まることが期待される。以上、被害者が望む支援の在り方の構築に資する知見を生み出すという、本研究の最終的な目的に向けて、議論の基盤となるデータ収集が、順調に進展していると考えている。被害者ステレオタイプに関する研究については、学生や一般成人を対象にした、ステレオタイプに関する質問紙調査をさらに進め、より精緻な知見にまとめることを目指している。また、被害者ステレオタイプを低減し、より実情に即した心の推論を可能にする条件を特定するため、被害者の視点取得を促進する操作が、被害後ステレオタイプにもたらす効果を検証するための実験を予定している。被害者自身の心の推論のメタ認知については、さらにインタビューデータを重ね、その内容を詳細に分析することに着手する予定である。また、被害者支援の有効性検討のため、被害者とその周辺の人々(友人など)を対象とした調査を行い、被害者支援の実態とその意義を検討する予定である。25年度が最終年度であるため、記入しない。
オオムギの耐塩性に関わる生理機構と遺伝子座の統合的解明

耐塩性の高いオオムギ品種OUE812と低い品種OUC613の塩ストレス反応を比較して、耐塩性の生理機構を検討した。その結果、OUE812はOUC613に比較して、短期間の塩ストレス条件では吸水を維持して、そして長期間の塩ストレス条件では葉内のK^+濃度に対するNa^+濃度の比を小さく維持して、地上部の成長速度を高く維持することが分かった。さらに、OUE812はOUC613に比較して、塩ストレス条件でも稔実歩合が高いことによって子実重を大きく維持することが分かった。そして、塩ストレスによる稔実歩合低下に関する量的形質遺伝子座を、Russia6とH.E.S.4の組換え自殖系統群を用いて、4領域推定した。1.耐塩性が最強の品種OUE812と耐塩性の弱い品種OUC613を用いて、100mM、200mMNaCl(以下、100mM、200mM NaCl処理)を含むバーミキュライト、あるいは水耕液に、出芽時から成熟期まで生育させ、乾物生産や光合成速度、吸水に関わる性質などを、NaClを加えない培地(以下、OmMNaCl処理)で生育したオオムギと比較しつつ検討し、以下の結果を得た。(1)バーミキュライトに生育するオオムギを用いて幼植物期から成熟期まで、412週にわたる長期間のNaCl処理を行った。その結果、NaCl処理によって受ける影響の品種間差は、形質とNaCl濃度によって異なり、(1)100mMNaCl処理では稔実歩合のみに顕著な品種間差がある;(2)200mMNaCl処理では稔実歩合に加えて、光合成速度,乾物重に有意な品種間差が認められる;(3)NaCl処理による品種間差が最も明らかに現れるのは稔実歩合の低下である;ことがわかった。(2)水耕液に生育するオオムギを用いて幼植物期に100mMNaCl処理を7日間行った。その結果、処理2日目以降はOUE812はOUC613に比較して、葉面積と光合成速度の低下程度が小さくなった。これは、OUE812はOUC613に比較して、根の成長を高く維持し、さらにアクアポリン遺伝子の発現量が増加することにより吸水を維持し,葉の水ポテンシャルを高く維持したことによるものと推察された。2.岡山大学で作出した遺伝解析用8集団の両親の耐塩性に関わる形質を比較したところ、稔実歩合の大きく異なる1組み合わせを見出した。そこで、この組み合わせを次年度以降の耐塩性に関わる遺伝子座解析の材料として選定した。本研究は耐塩性の大きく異なるオオムギ品種を用いて、塩ストレス条件における光合成と乾物生産、子実生産に関わる生理機構とその分子機構を解明すること、および、耐塩性に関わる形質の遺伝子座を検出し、その遺伝子座の生理機能を解明することを目的とする。平成23年度は以下の成果が得られた。(1)100mMNaClを含む水耕液を灌水したバーミキュライトに幼植物から生育させると、耐塩性の高いオオムギ品種OUE812は耐塩性の低い品種OUC613に比較して、出穂期における光合成速度および稔実歩合の低下程度が明らかに小さい。そこで、Na^+、Cl^-、K^+の蓄積量を品種間で比較し,植物体内のイオン濃度と光合成速度および稔実歩合との関係について検討した。その結果、100mM NaCl処理植物の葉身のNa^+、Cl^-濃度は、若い葉身ほど低く、そして、OUE812はOUC613に比較して有意に低かった。100mM NaCl処理植物の葉身のK^+濃度はOUC613で低下し、その結果、Na^+/K^+はOUE812が有意に低くなった。一方、穂では、100mM NaCl処理によって子実のNa^+、Cl^-の濃度は両品種ともに増加は認められなかったが、内外頴、穂軸と小穂軸、芒では濃度は増加し、UE812の増加程度が大きかった。K^+膿度はOUE812の内外頴を除いて、100mM NaCl処理による増加は認められなかったので、子実以外の穂各部位のNa^+/K^+はOUC613よりもOUE812の塩処理区で有意に高くなった。葉身の光合成速度はNa^+、Cl^-濃度との間には負の、K^+の間には正の相関が見られた。しかし、内外頴のNa^+、Cl^-濃度と稔実歩合の間の関係は明らかでなかった。

以上の結果から、Na^+、Cl^-濃度を低く、そしてK^+の濃度を高く維持することが葉の光合成速度を高く維持することに関係するが、穂の稔実歩合にはイオン濃度以外の要因が関与することが示唆された。(2)耐塩性に関わる量的形質遺伝子座(QTL)解析材料を作出するため、OUE812とOUC613の組換え近交系の育成をF_5世代まで進めた。本研究は耐塩性の大きく異なるオオムギ品種を用いて、塩ストレス条件における光合成と乾物生産、子実生産に関わる生理機構とその分子機構を解明すること、および、耐塩性に関わる形質の遺伝子座を検出し、その遺伝子座の生理機能を解明することを目的とする。平成24年度は以下の成果が得られた。(1)まず、Russia 6とH.E.S.4の組換え自殖系統群(RILs)を用い、第1葉展開完了時から収穫期までNaClを含まない水耕液(0mM NaCl処理)、あるいは100mMのNaClを含む水耕液(100mM NaCl処理)で生育させ、高塩類濃度条件における稔実歩合維持に関わる量的形質遺伝子座(QTL)を推定した。1)100mMNaCl処理によって穂重および稔実小穂重はH.E.S.4はほとんど低下しなかったが、Russia 6はそれぞれ83%,56%と大きく減少した。小穂数,稔実1小穂重はいずれの品種も100mM NaCl処理によってもほとんど低下しなかった。100mM NaCl処理の稔実歩合はH.E.S.4では89%であったが、Russia 6では68%に低下した。以上の結果から、100mMNaClによる両品種の穂重と稔実小穂重の相違は稔実歩合の違いによって生じていることが分かった。RILsの稔実歩合の平均値は両親の間にあった。2)QTL解析の結果、第2染色体上のG5近傍,第6染色体上のU187近傍、第7染色体上のU013近傍にH.E.S.4が稔実歩合を高めるQTLが、第4染色体上のU264近傍にRussia 6が稔実歩合を高めるQTLが推定された。(2)耐塩性の大きく異なる品種OUE812とOUC613の組換え近交系の世代促進をF6世代まで進め、遺伝解析集団を作成した。平成23年度実施予定であった長期間の塩ストレス条件下で子実生産を維持する機構の解明については、当初の計画よりも内容を充実させて現在研究を進行させている。岡山大学が作成したオオムギの遺伝解析材料の中から、耐塩性の異なる両親由来の遺伝解析材料を見出した。これを用いて、稔実歩合に関わるQTL解析を実施している。これは平成23年度計画になかった研究で、計画以上に進展している内容である。24年度が最終年度であるため、記入しない。岡山大学が作成したオオムギの遺伝解析材料の中から、耐塩性の異なる両親由来の遺伝解析材料を見出したので、これを用いて、耐塩性に関わる形質のQTL解析をさらにすすめる。併せて、耐塩性の強い品種OUE812と弱い品種OUC613由来の組換え近交系(以下、RIL)を用いた遺伝解析材料を完成させ、耐塩性に関わる形質のQTL解析を実施する。これに基づいて耐塩性オオムギ品種育成のためのDNAマーカーの作出と耐塩性関連形質の遺伝子同定に向けて今後の研究戦略を立てる。