hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
神経特異的RNA結合蛋白質HuDが担う部位特異的翻訳制御機構の解析

そして、候補因子の1つであったSMNがHuDとの結合活性依存的にHuDの翻訳活性化機能を阻害することを明らかにした。さらに、主として核局在を示すSMNがHuDとの共発現により細胞質へ移行することを明らかにし、これまで不明であったSMNの細胞質における機能を知る上で非常に重要な結果を得た。以上のように、本年度の研究からHuDとSMNの結合を介したmRNA-蛋白質複合体(mRNP)の翻訳抑制機構が存在する可能性を見出すことができた。本研究においてHuDと相互作用する因子によるHuDの翻訳活性化機能阻害を当研究室のもつ無細胞in vitro翻訳システムを用いて再現することは最も重要な課題であり、今後の分子機構解明に必須である。これらの観点から、本研究課題は順調に進展していると評価した。高等真核生物における遺伝子発現制御は非常に多岐にわたっており、単純なmRNAの転写量および翻訳量調節のみでは説明できない生命現象が数多く存在する。なかでも発生や分化においては、ある特定の遺伝子が特定の時期・場所に適正量供給されることが必須であり、このような遺伝子発現制御に対してmRNAの転写調節だけでは遺伝子発現の『場』まで規定することは非常に困難である。そのため、神経細胞のように特殊な形態の細胞ではmRNAレベルでの制御が必須である。具体的には異所的な遺伝子発現を防ぐために、転写が起こる『場(核)』から翻訳が起こる『場(シナプス・成長円錐など)』までmRNAが輸送される間mRNAの安定性を保持し、厳密に翻訳が抑制されている必要がある。この時、mRNAの翻訳スイッチとして機能している因子がRNA結合蛋白質である。本研究では、神経特異的に発現しているRNA結合蛋白質HuDが標的mRNAと共に適切な『場』まで輸送されている間のmRNA翻訳『OFF』状態を維持する機構について当研究室独自の生化学的手法を用いて解析を行った。HuDとの相互作用が明らかである既知因子(KIF3A、IMP1、SMN)について当研究室のもつ無細胞in vitro翻訳システムを用いてmRNAの翻訳に対する効果を評価した。その結果、IMP1およびSMNに関して、標的mRNAではない一般的なmRNA(cap-polyA mRNA)の翻訳に対して阻害的な効果を有することが明らかになった。さらに、SMNがHuDのもつmRNAの翻訳活性化能を阻害すること、HuDとの結合能を欠失させたSMN変異体がHuDの翻訳活性化能を阻害しなかったことから、SMNがHuDとの結合を介してHuDの翻訳活性化能を阻害する可能性が示唆された。本研究を通じて、HuDとSMNの相互作用が先述の『部位特異的翻訳制御』に関わる重要な知見を得た。神経細胞では外部からのシグナルに即座に応答するためにmRNAの転写後レベルでの制御が必須である。そして、シグナルに応答しmRNA翻訳のスイッチとなるのがRNA結合蛋白質である。本研究では、神経特異的RNA結合蛋白質HuDが標的mRNAと共に適切な場まで輸送されている間のmRNA翻訳OFF状態を維持する機構について当研究室独自の生化学的手法を用いて解析を行った。
減量プログラムの経済的評価：選択できる減量プログラムの提案を目指して

本研究の目的は,体重減少(以下,減量)プログラムや減量教室の効果を,体重や体脂肪率,内臓脂肪面積などの身体組成,血圧,血液(脂質,血糖)などの医学・生理学的指標に加え,経費や費用対効果などの経済学的指標を含めて評価することである.本研究が進むことで,プログラムを利用して人々の健康の保持増進を支援する者(支援者)は,経済的状況や実施に係る準備負担等,実施条件に応じたそのプログラム・教室を取捨選択できるようになることが期待される.さらには,参加者にとっては,参加(指導)頻度や期間によって変動しうる参加費(価格)と効果のバランス(費用対効果)等の情報を得ることができ,自分の条件やニーズに応じた健康づくりが可能となるため,より多くの受益者を生み出すことができる.より多くの人へ,より大きな効果を提供するための健康づくりプログラムを提供することを目指す研究である.なお,本年度はこれまでの研究に引き続き,指導頻度(講義回数),教室開催期間(介入期間),講義形態(集団講義や個人講義,運動指導や食事指導など),内容の異なる教室を開催した.とくに,食事指導の頻度を大幅に減らし,指導頻度は全6回(月2回ペース),介入期間は3か月という教室と,食事指導のない・減量を目的としない運動指導・運動の実技実践のみの教室(週2回,3か月間または6か月)という教室をおこない,それぞれの医学生理学的指標と経済的指標を比較した.最も減量効果が高いプログラム(週1回,3か月間で約57kgの減量)と比べると,全5回の減量教室の減量効果は小さい(23kgの減量)が,経費負担は小さくなった.一方で,運動実践のみの教室では減量効果ならびに費用対効果が最も低かった.ただし,減量を目的にしてはいないものの減量成功者が現れるなど,対象者のニーズや生活・社会環境に応じた教室を開催すべきであることが示唆された.本研究は,教育条件の異なる複数のプログラムを用意し,プログラムに沿った減量支援教室を開催し,その効果を比較している.教育条件のうち,例えば指導頻度が増えると,必要とするマンパワーが増え(指導頻度が減るとマンパワーが少なくて済む),それによって経費も増えることとなる.一方で,先行研究より,指導頻度と減量効果は必ずしも比例しない(指導頻度の増加とともに効果は徐々に小さくなる)ことが明らかになっていることから,指導頻度が増えると費用対効果を悪くする可能性がある.このように,指導条件の異なるプログラムの効果と経費,費用対効果の情報を得るため,これまで複数の教室を開催し,データ・情報を収集できた.本年度はそれらデータ・情報を整理し,報告書としてまとめる状況まで到達している.ただし,予定していた国際学会に参加・発表がかなわなかったため,本研究は「やや遅れいている」と判断した.すでにデータ・資料・情報の収集と主要なデータ分析は済んでいる.今後は,昨年度参加することができなかった国際学会に参加することと,報告書の作成(プログラムの提案)を残すだけである.本研究の目的は,体重減少(以下,減量)プログラムや減量教室の効果を,体重や身体組成,血圧,血液などの医学生理学的指標に加えて,経費や費用対効果などの経済学的指標を含めて評価することとした.本研究が展開されることによって,プログラムの利用者(支援者側)ならびに減量教室への参加者の状況や条件に応じて,複数のプログラム・教室から選択できるシステムを構築するための知見を得られる.最終的には,より多くの人へ,より効率良く,より大きな減量効果を引き出すプログラム・システムを構築,提供することを目指すものである.指導(講義)回数,期間,講義形態(個人指導と集団指導,食事指導のみ,食事指導と運動指導の併用)が異なる複数の教室を開催した.講義回数の増大や期間の延長は減量効果を高めるが,講義回数が10回程度を越えたり,期間が3か月を超えると,減量効果は得られるものの,その効果は非常に小さくなる傾向が見られた.一方で,講義回数の増大や期間の延長とともに,支援者側の負担が増し,それとともに経費が増大し,費用対効果が悪化した.さらには,参加者の脱落率が増加する傾向がみられた.また,個人指導による減量効果は,集団指導と差はないものの,経費が非常にかかり,費用対効果は小さかった.運動を併用した教室においても,運動による減量効果はごく僅かであった一方で,講義回数が増えることから,経費が増大し,費用対効果は小さいものとなった.本研究の目的は,教育条件の異なる複数の減量プログラムの減量効果ならびに費用対効果を比較することと,求められたニーズに応じたプログラムへの改善であった.複数の減量プログラムを用いて,複数の減量教室を提供・開催し,データを収集することができた.個人指導の形態を取ったり,集団指導でも講義回数が10回,期間が3ヵ月を超えたりすると,減量効果は増加する傾向にあるもののコストも増加する.また,コストの増加に対する減量効果(費用対効果),期間の延長に対する減量効果(単位時間あたりの減量効果)は小さくなる傾向がみられた.目的のひとつである,各プログラムの減量効果や費用対効果の比較ができた.教室開催の情報の到達度(伝播,拡散の程度,どのくらいの地域住民に届いたか)を検証できないことが本研究の限界であるため情報に対する反応度(情報到達件数に対する参加申込件数や問合せ件数の割合)について客観的な分析ができないが,講義回数が多い教室(週2回の教室)や指導期間の長い教室(6か月間の教室)は,参加申込件数や問合せ件数が少ない様子(反応が悪い)がうかがえた.

一方で,講義回数が少ない教室や指導期間の短い教室は,参加申込件数・問合せ件数が多い様子(反応が良い)がうかがえた.教室の条件(講義回数や期間,開催日時など)によって,ニーズが異なるという先行研究があることから,反応の違いには参加者のニーズが影響している可能性が考えられた.この結果は,減量プログラムの実施可能性を高める(波及させる)ための有益な知見といえる.以上のことから,本研究は概ね順調に進んでいると判断した.本研究の目的は,体重減少(以下,減量)プログラムや減量教室の効果を,体重や体脂肪率などの身体組成,血圧,血液などの医学生理学的指標に加え,経費や費用対効果などの経済学的指標を含め評価することとした.本研究が展開されることで,プログラムの利用者(健康づくり・減量支援者側)ならびに減量教室の参加者が,それぞれの経済状況や実施・参加条件に応じたプログラム・教室を選択できるシステムを構築するための知見を得られる.最終的には,より多くの人へ,より大きな効果を求め,(時間的にも,経済的にも)より効率の良いプログラム・教室運営システムを提供することを目指すものである.なお,減量指導(講義)回数,教育(介入)期間,講義形態(個人vs集団,食事指導のみvs食事指導と運動指導の併用,運動指導のみ)が異なる複数の教室を,これまでに開催してきた.その結果,講義回数の増大や期間の延長は減量効果を高めるが,講義回数が10回,期間が3ヵ月を超えると,減量効果は大きくなるものの,その時間的効率は小さくなる傾向が見られた.それとともに,支援者側の負担の増大(主に,人的資源の増大による経費増大),費用対効果の低下が生じることとなった.さらには,とくに期間の延長は参加者の脱落率が増加する傾向が見られた.一方で,指導回数を5日に減らした場合,減量幅はやや小さくはなったが,経費が削減され,費用対効果としては高い結果となった.講義形態については,個人指導による減量効果は集団指導と明らかな差がなく,その一方で,個人指導は人的資源を有することから,集団指導よりも経費が大きくなり,費用対効果が低下した.運動を併用した教室は,運動によって劇的な体重減少は起こらなかったことから,運動指導のための講義・指導回数が増加し,それに伴う人的資源の増加によって経費負担が増えたことから,費用対効果は非常に小さいものとなった.本研究は,指導回数や期間など指導・教育条件の異なる複数のプログラムで教室を実施し,その時の減量効果と経費,費用対効果を比較することにある.これまで,指導回数が5回,12回,24回の教室や,指導期間が1.5ヵ月,3ヵ月,6ヵ月の教室,個人指導と集団指導の教室,食事指導のみの教室,食事指導と運動指導を併用した教室,運動指導のみの教室などを開催し,複数のプログラム・教室の減量効果と経費,費用対効果のデータを収集できた.なお,指導頻度や期間の増大は減量効果を大きくするものの,指導条件の充実に見合った減量効果は得られにくく,人的資源(マンパワー)の増加に伴う経費の増加によって費用対効果の低下に繋がる可能性が示唆された.また,運動指導のみの教室においても減量効果が認められたが,食事指導による減量幅よりも小さく(食事指導は約5kgの減量,運動指導は約2kgの減量),かつ,食事指導による教室よりも指導回数が多く,マンパワーを要するため,費用対効果は非常に小さいものとなった.以上のように,異なる教室のデータが得られたことから,本研究は概ね順調に進んでいると判断した.
Hot-filament法による塩化物浴からのアルミニウムの電解機構の解明

ホール・エルー法と呼ばれるAl電解法は,エネルギー消費が高いため我が国のように電気代の高い国では操業できない現状にある.そこで,新しい製錬法の確立が望まれている.そのうちのひとつに,低温で電解できる塩化物浴法が提案されている.本研究では,肉眼で直接観察が出来るHot-filament法を用いてAlの析出状態や金属霧,陽極効果など特異現象を観察すると共に,電解途中で急冷した試料のEPMA分析結果などから電解機構の解明を行った.また,これを少しスケールアップしたルツボ法についても検討を行った.得られた結果をまとめてみると次のようになる.塩化アルミニウムの低温電解法におけるAlの析出状態は, NaCl-AlCl3浴では樹枝状の結晶が析出するが, Licl-AlCl_3浴では綿状(又は針状)に析出することがわかった.また,高温法では,最初粒状に(液滴状)析出するが,電解時間と共にこれが層状に発達し,電極表面を覆うようになる.金属霧は,電極上に析出したアルミニウムの再溶解によるものと考察されるが,浴電圧が高くなると一時的に電流値の低下がみられるようになる.そして, LiCl-AlCl3浴の方がNaCl-AlCl3浴に比べて金属霧の発生が起こりやすいことがわかった.ルツボ法の場合も同様の浴組成で行ったが,浴中に塩化アルミニウムを添加する方法として,固体で添加する方法や気体状態で添加する方法を検討してみた.その結果,浴電圧4V程度で電解した時,気体で添加した方が固体状態で添加した場合よりも約2.5倍ほどAlの析出量が多く,また,電流効率も90%と固体添加法に比べ非常に有利であることがわかった.ホール・エルー法と呼ばれるAl電解法は,エネルギー消費が高いため我が国のように電気代の高い国では操業できない現状にある.そこで,新しい製錬法の確立が望まれている.そのうちのひとつに,低温で電解できる塩化物浴法が提案されている.本研究では,肉眼で直接観察が出来るHot-filament法を用いてAlの析出状態や金属霧,陽極効果など特異現象を観察すると共に,電解途中で急冷した試料のEPMA分析結果などから電解機構の解明を行った.また,これを少しスケールアップしたルツボ法についても検討を行った.得られた結果をまとめてみると次のようになる.塩化アルミニウムの低温電解法におけるAlの析出状態は, NaCl-AlCl3浴では樹枝状の結晶が析出するが, Licl-AlCl_3浴では綿状(又は針状)に析出することがわかった.また,高温法では,最初粒状に(液滴状)析出するが,電解時間と共にこれが層状に発達し,電極表面を覆うようになる.金属霧は,電極上に析出したアルミニウムの再溶解によるものと考察されるが,浴電圧が高くなると一時的に電流値の低下がみられるようになる.そして, LiCl-AlCl3浴の方がNaCl-AlCl3浴に比べて金属霧の発生が起こりやすいことがわかった.ルツボ法の場合も同様の浴組成で行ったが,浴中に塩化アルミニウムを添加する方法として,固体で添加する方法や気体状態で添加する方法を検討してみた.その結果,浴電圧4V程度で電解した時,気体で添加した方が固体状態で添加した場合よりも約2.5倍ほどAlの析出量が多く,また,電流効率も90%と固体添加法に比べ非常に有利であることがわかった.昭和61年度はHot-Filament(Pt-Rh10%-Pt-Rh30%の熱電対を用いる)装置にポテンシオスタット-ガルバノスタットを組合せ各種組成に調整した混合塩化物浴の電解を行い、電解過程で起こる特異現象やAlの析出状態の観察を行った。更に、浴組成や電解条件によってこれら特異現象がどのように変化するか検討してみた。電解浴としては、Al【Cl_3】をNacl-KCl-LiCl混合溶融塩に溶解して行うが、NaCl-Al【Cl_3】系,LiCl-Al【Cl_3】系,KCl-Al【Cl_3】系で行う200400°CでAlを固体として析出させる低温法と、NaCl-LiCl-Al【Cl_3】浴で700800°Cで液体として析出させる高温法について調べた。得られた結果を要約すると次のようになる。(1)塩化アルミニウムの低温電解法におけるAlの析出状態は、NaCl-Al【Cl_3】浴では樹枝状の結晶が析出するが、LiCl-Al【Cl_3】浴では綿状(又は針状)に析出することがわかった。またKCl-Al【Cl_3】浴でもLiCl-Al【Cl_3】浴と同様綿状の金属Alの析出が起こった。(2)高温電解法では最初粒状に析出することがわかった。しかしながら電解時間と共に析出Alは層状に発達し、電極表面を覆うようになった。(3)析出したAlは電解時間と共に層状を呈するが、低温法でも、混合浴をパイレックス管中に真空封入して行ったため、電解により陽極から発生する【Cl_2】ガスの影響を受けて析出Alの再溶解が生じることがわかった。この状態は丁度金属霧が起こったような状態を呈した。(4)高温法の場合は電極上に析出したアルミニウムの再溶解による金属霧が発生した。(5)低温法,高温法いずれの場合も電解途中で急冷凝固し、電極表面をXMAで観察したところAlは電極表面に層状に密着して析出していることがわかった。
<宿題>と<住宅>から見た戦後日本の家庭-学校関係史

本研究では第一に、同和教育運動の中での<宿題>をめぐる議論や実践の事例を、各地の同和地区を訪ね歩きながら資料収集と聞き取り調査を重ね分析を行った。その中でも特に、高知県地方において、同和地区を対象に配置され、地域・家庭・学校の結び役として活躍した「福祉教員」の軌跡に重点を置いた。史料などに現れることのない、戦後初期同和教育の長欠生を対象とした「寺子屋学校」的な試み、宿直室での生徒とのコミュニケーションなどから、<宿題>が、単に学校教育の補完的役割を家庭に押しつけているばかりでなく、<宿題>が触媒となって、学校でも家庭でもない第三の空間作りに寄与している面が浮き彫りにできた。第二に、同和地区における住宅改良事業の展開を、教育の視点、とりわけ宿題の問題に引き寄せながら再解釈する試みを、同じく高知県をフィールドに試みた。福祉教員からの聞き取りを通じて、住宅の問題についても知見を得ることができた。またこれに関連して第三に、学校での経験を「住まう」という視点から捉えることの可能性に関する理論的、経験的考察を試みた。戦後初期から高度成長末期ごろまでの日本の学校においては、宿直室に典型的に現れているように、学校は単に授業や学習活動を行うハコではなく、そこに存在する人びとによる自由な意味構築活動を許容し、生活の足場になる空間だった。人びとはそこで多様なモノやコトを見出したり再発見し、それらとともに意味を作り出してきた。このような認識から、「住まう」という視点から学校のさまざまなモノやコト(宿題もそこに含まれる)に焦点を当てる教育叙述に豊かな可能性があることを明らかにした。平成18年度においては第一に、同和教育運動の中での<宿題>をめぐる議論や実践の事例を、各地の同和地区を訪ね歩きながら資料を渉猟した。18年度において特に重点を置いたのが、高知県地方において、同和地区を対象に配置され、地域・家庭・学校の結び役として活躍した「福祉教員」の軌跡に関する資料収集および聞き取り調査である。現在、経験者の高齢化が進み記録に残すのが喫緊の課題となっているが、さいわい草創期を知る経験者からインタビューをすることができ、それを日本オーラルヒストリー学会紀要『日本オーラルヒストリー研究』に発表することができた。第三に、<宿題>という事象が近代学校システムの本質にどのように関係し、いかなる論理でそれが必然化されたに関する理論的・思想的研究を行った。イリイチの学校批判(いわゆる脱学校論)を、シャドウワーク論の視点から読み替えることを試みた。平成19年度においては第一に、同和教育運動の中での<宿題>をめぐる議論や実践の事例を、各地の同和地区を訪ね歩きながら資料を渉猟した。18年度に続き、本年度においても特に重点を置いたのが、高知県地方において、同和地区を対象に配置され、地域・家庭・学校の結び役として活躍した「福祉教員」の軌跡に関する資料收集および聞き取り調査である。現在、経験者の高齢化が進み記録に残すのが喫緊の課題となっているが、前年度に続き、さいわい草創期を知る経験者からインタビューをすることができた。また今日においても同和教育への関心が持続して高い室戸地方において、地元市教委の協力を得て多くの関係者と会うことができた。それらの成果を、日本教育学会紀要『教育学研究』において研究ノートとして発表することができた。

平成20年度においては、第一に前年度に引き続き、同和教育運動の中での<宿題>をめぐる議論や実践の事例を、高知県の同和地区を集中的に訪ね歩きながら資料収集および聞き取りを行った。4月・8月には室戸地方を訪ね、室戸市内に点在する同和校でかって福祉教員を経験した方々4名にお目にかかり、当時の実情をうかがった。史料などに現れることのない、戦後初期同和教育の長欠生を対象とした「寺子屋学校」的な試み、宿直室での生徒とのコミュニケーションなどの興味深い史実が明らかになった。<宿題>が、単に学校教育の補完的役割を家庭に押しつけているとするのは一面的で、福祉教員が担った実践においては、<宿題>が触媒となって、学校でも家庭でもない第三の空間作りに寄与している面が明らかになった。9月には高知市内の学校で福祉教員を経験された方3名、3月には県西部の幡多郡で福祉教員を経験された方1名から聞き取りを行い、貴重な証言を得ることができた。第二に、同和地区における住宅改良事業の展開に関する調査を、県内でもっとも住宅改善の取組が早かった高知市・小高坂地区において行い、教育の視点からの住宅問題考察に関する重要な手がかりをえることができた。また、福祉教員の事例を相対化する必要を認識し、同じような長欠対策の教育実践でありながら、異なった制度設計のもとで教育を進めた、京都市における夜間中学の事例の予備的調査も行った。こうした調査と並して20度には、学校での経験を「住まう」という視点から捉えることの可能性に関する理論的、経験的考察を試みた。戦後初期から高度成長末期ごろまでの日本の学校においては、宿直室に典型的に現れているように、学校は単に授業や学習活動を行うハコではなく、そこに存在する人びとによる自由な意味構築活動を許容し、生活の足場になるような空間だった。人びとはそこで多様なモノやコトを見出したり再発見し、それらとともに意味を作り出してきた。このような認識から、「住まう」という視点から学校のさまざまなモノやコト(宿題もそこに含まれる)に焦点を当てる教育叙述には、豊かな可能性があると考えられ、日本教育学会において共同報告を行った。
がん研究のための実験動物の維持と開発

本事業は昭和57年度より開始し、その後昭和59年度に大きく改組し我が国においてがん研究に使用する実験動物の質的向上をめざし、系統維用、品質管理と新しい動物の開発・改良、ミュータントマウスおよびヌードマウスの開発と分与、微生物学的・遺伝学的モニタリングの実施ならびに実験動物に関する基礎資料の整理・情報提供などを主な事業としたサービス業務を全国の研究者が協同して推進してきた。本年度はReference strainsの供給はマウス延66施設(計557匹の株分与)、ラット延30施設(計251匹の株分与)、遺伝学的モニタリング、微生物学的モニタリングはそれぞれ11施設(100系統)、19施設を行ない、種々の遺伝的背景のあるマウスにヌード遺伝子を導入した株の分与は8施設(18株)を行なった。congenic miceなど特殊のマウス株についても36施設(40系)からの分与に応じた。なお、保存すベきcongenic mice,mutant miceの激増にそなえて受精卵の保存法の技術開発・改良を継続し胚の保存と保存期間の影響を調べている。本年度から近交系モルモットの育成・維持・供給にも応じ、14施設に6系統の分与を行った。その他に無アルブミンラットを含んでいる。本年には近交系ラットのアイソザイムによるモニタリング法を完成し実用に応じはじめた。腎症候性出血熱(主にラット)の潜伏感染状況には特に注意を払い多数の機関についてラットと実験者について抗体検索の依頼に応じ、また抗体検索用スライドの分与を阪大微研の協力のもとに行っている。この1年の間に幸い新しい抗体保有者をみず、患者の発生もなかった。本委員会で維持している系統のみならず、全国の研究機関で維持されている動物をも含め実験動物のリストを作製し分与に応じている。
低体温循環停止における、アポトーシス制御を応用した新しい脳保護法の開発

心臓血管外科手術では、循環停止法は手術補助手段として有用であるが、特に脳保護が解決すべき重要な問題点の一つである。近年、脳虚血後にNF-kB(NF)が活性化され神経細胞障害を起こすことが報告され、一方、核酸医薬であるNF decoyによる虚血後神経細胞障害抑制の可能性があり、NF decoyを循環停止中に脳循環に注入することで虚血耐性獲得が可能であると考えられる。そこで全脳循環停止中に脳循環にNF decoyを投与し、その神経細胞保護効果を検討した。(方法)350gの雄SDラットにて、HVJ-lipospme法を応用し4°Cに冷却した溶液2mlを右総頚動脈から注入する一過性全脳虚血モデルを作成した。20分間の全脳虚血後、脳血流を再開、麻酔を覚醒した。まずFITCをラベルしたNF decoyを脳循環へ注入し、再灌流後1時間で蛍光顕微鏡で観察し導入の確認を行った。次にNF-kB decoyを注入、1時間後にTNF-a,IL-1b,ICAM1のmRNAをPCR法にて定量化し、control群(scrambled decoy投与群)と比較し、その抑制効果を検討した。また、7日後に犠牲死させ、これら脳組織の海馬CA1領域における神経細胞の障害をTUNEL染色(DNA障害の確認)、およびmicro tuble associated protein免疫染色を行い検討した。(結果)蛍光顕微鏡にて、血管内皮、海馬、大脳皮質の神経細胞の核に蛍光が認められ、NFdecoyが導入されたことが確認された。次に、PCR法にてTNF-a,IL-1b,ICAM1のmRNA量はNF群にて抑制され、組織学的検討では、CA1領域におけるTUNEL染色陽性核の割合は有意にNF decoy群で低値であった。また、MAP陽性細胞数は、有意にNF群で高値であった。(結語)ラット一過性全脳虚血モデルにおいて、脳循環停止下における脳神経細胞へのNF-kB decoyの血行性導入が確認され、NFkBの虚血後神経細胞障害への関与とそれに対するdecoyの保護効果が示めされた。以上より循環停止法における脳障害へのNF-kBの関与と、その抑制法としてのNF-kB decoyの脳保護効果が示唆された。(方法)350gの雄SDラットを開胸後、大動脈弓を露出、左右鎖骨下動脈および腕頭動脈をtapingした後、右総頚動脈を露出し、cannulationを行った。大動脈弓3分枝をsnare、全脳虚血とし4°Cに冷却した核酸導入液2mlを右総頚動脈から注入した。核酸導入効率を高めるためHVJ-lipospme法を用いた。20分間の全脳虚血後、遮断解除し脳血流を再開、麻酔覚醒させた。(実験1)FITCラベルを行ったoligonucleotideを含んだHVJ-lipospmeを右総頚動脈より注入し、再灌流後1時間で脳を摘出し、蛍光顕微鏡で観察した。

(実験2)NF kappa B decoy 200μgを含むHVJ-liposomeを作成し、右総頚動脈より注入、7日後に犠牲死させた。controlとしてscrambled decoy 200μgを含むHVJ-liposomeを注入した。これら脳組織をHE染色、TUNEL染色、microtuble associated proteinに対する免疫染色を行い、海馬CA1領域における神経細胞の性状を検討した。(結果)(実験1)血管内皮、海馬、大脳皮質の神経細胞の核に蛍光が認められ、NFkB decoyが脳実質へも導入された。(実験2)HE染色では、control群では、海馬CA1領域の神経細胞の核の濃縮、脱落が認められたが、decoy群では、海馬CA1領域の神経細胞の核はよく保たれていた。TUNEL染色陽性核の割合はcontrol群:41.2±19.3%、decoy群:12.0±14.8%であり、有意にdecoy群で低値であり、MAP免疫染色において、陽性細胞数はcontrol群:58.3±27.1%、decoy群:109±24.5%であり、有意にdecoy群で高値であった。(結語)ラット全脳虚血モデルにおいて、NFkB decoyを脳実質内に導入することにより、海馬CA1領域の神経細胞の障害が軽減された。以上より、NFkBdecoyは、循環停止の際の脳神経細胞保護薬としての可能性が考えられた。心臓血管外科手術では、循環停止法は手術補助手段として有用であるが、特に脳保護が解決すべき重要な問題点の一つである。近年、脳虚血後にNF-kB(NF)が活性化され神経細胞障害を起こすことが報告され、一方、核酸医薬であるNF decoyによる虚血後神経細胞障害抑制の可能性があり、NF decoyを循環停止中に脳循環に注入することで虚血耐性獲得が可能であると考えられる。そこで全脳循環停止中に脳循環にNF decoyを投与し、その神経細胞保護効果を検討した。(方法)350gの雄SDラットにて、HVJ-lipospme法を応用し4°Cに冷却した溶液2mlを右総頚動脈から注入する一過性全脳虚血モデルを作成した。20分間の全脳虚血後、脳血流を再開、麻酔を覚醒した。まずFITCをラベルしたNF decoyを脳循環へ注入し、再灌流後1時間で蛍光顕微鏡で観察し導入の確認を行った。次にNF-kB decoyを注入、1時間後にTNF-a,IL-1b,ICAM1のmRNAをPCR法にて定量化し、control群(scrambled decoy投与群)と比較し、その抑制効果を検討した。また、7日後に犠牲死させ、これら脳組織の海馬CA1領域における神経細胞の障害をTUNEL染色(DNA障害の確認)、およびmicro tuble associated protein免疫染色を行い検討した。(結果)蛍光顕微鏡にて、血管内皮、海馬、大脳皮質の神経細胞の核に蛍光が認められ、NFdecoyが導入されたことが確認された。次に、PCR法にてTNF-a,IL-1b,ICAM1のmRNA量はNF群にて抑制され、組織学的検討では、CA1領域におけるTUNEL染色陽性核の割合は有意にNF decoy群で低値であった。また、MAP陽性細胞数は、有意にNF群で高値であった。(結語)ラット一過性全脳虚血モデルにおいて、脳循環停止下における脳神経細胞へのNF-kB decoyの血行性導入が確認され、NFkBの虚血後神経細胞障害への関与とそれに対するdecoyの保護効果が示めされた。
ナノレセプターを用いるbisphenol Aの生体試料逐次計測用センサーの開発

BPAのナノレセプターであるBPA-MIPを実際に電極表面に修飾し、このBPA-MIP修飾電極を用いてリン酸緩衝液中に515μMに調製したBPAのCV測定を行った。BPAの酸化ピーク電流は約580mV付近に観察され、BPA-MIPを修飾した電極でも濃度依存的な応答を検出することが出来た。ラット血清サンプル中での5μMのBPAのCV測定をBPA-MIP修飾電極で検討した。血清サンプルを除タンパクの操作を行う必要はあったが、血清サンプル中でもBPAの酸化ピーク電流を検出することが可能であった。ナノレセプターと電気化学測定を組み合わせることで、既知の濃度のbisphenol A(BPA)の検出を行った。ナノレセプターは4-vinyl pyridineを機能性モノマー、EDMAを架橋モノマーとして分子鋳型法(Molecular Imprinting)により熱重合して調製し、吸着性は検討を重ね、90%以上の非常に高いBPAの吸着・溶離能が確認されている。また、検出方法は、溶離溶媒として使用した60w%アセトニトリル溶液でのBPAのサイクリックボルタンメトリー(CV)法による、電気化学測定での検討を行った。電気化学測定をおこなう際は、60w%アセトニトリルのイオン強度を高めるための支持電解質を加え、BPAの電気化学的反応を行った。BPAセンサーによる測定方法は、まずナノレセプターをつめた簡易カラムを製作し、そこに0.05mMBPA溶液を送液することで、ナノレセプターにBPAを吸着させ、次に溶離溶媒を流すことでナノレセプターからBPAを溶離させた。この手順で使用した液量は全て1mLで行った。二段階目として、その溶離液を、1mLを電気化学測定しBPAの検出を行った。ナノレセプターの吸着性の検討は前期に検討を重ね、吸着させたBPAのほぼ9割以上の回収が確認できている。BPAの電気化学測定に関しては電解質を加えていない60w%アセトニトリル中では、0.02mM以下の低濃度のBPAの電気化学的な反応を確認することはできなかった。そのため支持電解質を加えた結果、低濃度でのピーク電流値を得ることができ、BPAセンサーでの電気化学反応による検出の可能性を見出すことができた。0.05mMBPAを実際に簡易カフムで分離し、その後、吸着させた液と溶離させた液のCVから、溶離させたBPAは0.60.7VにBPAの電気化学的な反応が認められた。この結果より、ナノレセプターと電気化学測定を組み合わせたBPAセンサー構築を行えることが示された。平成19年度は、電極上にBPA用のMIP薄膜を形成させた修飾電極を作製し、電極と一体化させたBPAセンサの作製法について検討を行なった。MIP薄膜を修飾する電極として、平板上に金がスパッタされている、QCM電極を使用した。表面の金電極の一部だけが、液にさらされるように、電極周縁部をポリイミドで被覆した。この電極で、10μMのbisphenolAの顕著な酸化ピーク電流を測定することができた。さらに、MIP薄膜の作製は以下の方法で行なった。MIPは、BPAおよび4-vinylpyridine、EDMAをトルエンに溶解させMIPカクテルとした。これを電極上に滴下し、カバーガラスを被せ、紫外線照射による重合し、照射時間について検討した。さらに、薄膜化するため、MIPカクテルを電極上に滴下したのち、スピンコート処理を回転数1000rpmで行い紫外線重合した。重合後、ポリマーが乾燥するまで待ち、メタノールで鋳型分子や未反応の物質などを十分に洗浄して、MIP修飾電極を作製した。作製した修飾電極は、MIPによる修飾をAFMにより観察した。紫外線照射時間、2分および5分のものについて薄膜化するためにスピンコーティングをおこなった。これらについては、洗浄前は金の凹凸は観察されず、金粒子の谷をうめているのが認められた。また、これらを洗浄後には、洗浄前に比べて、凹凸がでてきており、未反応のものが除かれた結果、金の凹凸に近づいてはいたものの、金とは異なっていた。断面プロファイルを解析したところ、未修飾の金電極では、4°程度の平均傾斜角がMIPを重合すると小さくなり、MIPが金粒子の谷を埋めるように重合されており、これらを洗浄すると傾斜角は金のものに近づき薄膜が形成されていることが示唆された。MIP薄膜修飾した電極でもbisphenolAの酸化ピークが見られた。BPAのナノレセプターであるBPA-MIPを実際に電極表面に修飾し、表面形状をAFMで確認したところ、裸の状態の金電極の表面状態とBPA-MIP修飾後では、金電極表面の凹凸がBPA-MIP修飾により凹凸の減少が見られた。

このことから、BPA-MIPの電極修飾が確認された。このBPA-MIP修飾電極を用いてリン酸緩衝液中に515μMに調製したBPAのCV測定を行った。BPAの酸化ピーク電流は約580mV付近に観察され、BPA-MIPを修飾した電極でも濃度依存的に酸化ピーク電流を検出することが出来た。これまでにMIPを電極修飾した報告ではMIP中に支持電解質が必要であったが、本研究では支持電解質を含浸させず、CV測定が可能であったため、簡易なMIP修飾電極でのセンサーの可能性を見出せた。食品添加物として多く使用されている、アスコルビン酸(AA)存在下でのBPA-MIP修飾電極を使用したBPAのCV測定を行った。またBPA-MIP修飾電極の重合時間による電流値の変化を比較し、BPAは5μM、AAは50μM酸に濃度を調製しCV測定を行った。それぞれのCV測定において、AAは非常に酸化されやすく酸化ピーク電流値は200mV付近に見られ、BPAは前述したとおり580mV付近に確認された。それぞれの酸化ピーク電流値を金電極とBPA-MIP修飾電極で比較すると、BPA-MIPを電極修飾するため、AA、BPA共に酸化電流ピーク値は減少した。しかし、重合時間2分、5分共にAAの酸化ピーク電流値の減少がBPAに比べて大きくなった。これはBPAがBPA-MIPの結合サイトに取り込まれて電気化学反応をするのに対して、アスコルビン酸の反応はBPA-MIPによって阻害されたためだと考えられる。さらに、BPAが内分泌撹乱作用を疑われているため、リン酸緩衝液で稀釈したラット血清サンプル中での5μMのBPAのCV測定をBPA-MIP修飾電極で検討した。血清サンプルを除タンパクの操作を行う必要はあったが、血清サンプル中でもBPAの酸化ピーク電流を検出することが可能であった。
無細胞タンパク質合成系を用いた新規HIV-1薬剤耐性検査法の基盤技術開発

無細胞タンパク質合成系を用いた新規HIV-1薬剤耐性表現系検査法の開発に成功した。酵素活性を指標とした薬剤耐性検査法の技術開発を目的として研究を行い、以下の結果を得た。i)無細胞合成法により生化学的アッセイに充分量の活性を保持したPRを合成することに成功した、ii)Gag内部切断配列p2-p7をデザインしたビオチン化人工基質の切断を、アタザナビル(ATV)、アンプレナビル(APV)、ダルナビル(DRV)、インディナビル(IDV)の4種のプロテアーゼ阻害剤(PI)存在下で定量的に検出することに成功した、iii)薬剤耐性変異G48S/I54V/V82F/L90Mを持つPRについて、4種のPIに対するIC50値を算出し、野生型PRと比較解析した結果、得られた耐性評価が従来法のウエスタンブロットによる解析結果や遺伝子検査法とよく一致することを確認したiv)患者血漿由来ウイルスRNAから、サブクローニングすることなく活性を保持したプロテアーゼを調製することに成功した。スタンフォード大学Robert Shafer博士より分与された詳細な感受性検査結果をもつHIV-1感染性分子クローン8種類について、上述の4種のPIに対する耐性検査を行い、遺伝子検査および感受性検査結果と比較することで、結果の妥当性を検証した。その結果、本手法と感受性検査を比較した場合に最もよく耐性評価が一致し(22/32検体)、続いて感受性検査と遺伝子検査(18/32検体)、本手法と遺伝子検査(16/32検体)であった。このことから本手法は、定量的にPRの薬剤耐性を評価できヽ得られた解析結果は感受性検査とよく一致することが示された。本研究成果については論文投稿準備中である。
ビタミンＥ誘導体ＥＴＳ－ＧＳを用いた脊髄損傷に対する新規治療法の開発

我々が新規に合成したビタミンEにタウリンとグルタチオンを結合させたETS-GSというビタミンE誘導体が脊髄損傷の二次的損傷を軽減し、神経学的機能の改善に有効であるのではないかと仮定し、ラットの脊髄損傷モデルを用いて検証を行った。ETS-GS投与により術後3日目より有意な運動機能の改善が認められ、摘出した脊髄から抽出したタンパクを分析したところ、myeloperoxidase、malondialdehyde、caspase-3は減少していた。組織学的にも損傷部位の縮小、アポトーシス細胞減少が認められた。ETS-GSは抗炎症、抗酸化、抗アポトーシス作用により神経保護作用を持つことが示唆された。平成25年度は新規ビタミンE誘導体ETS-GSを0.5%含有した餌を長期間(4週間)投与した場合の運動機能の改善効果について検討した。運動機能は前年度の報告で述べたように、脊髄損傷受傷3日目より有意差をもって改善が認められた。餌の摂取量は最初の3日間は10-15 g/day、ETS-GSに換算すると50-75 mg/dayであった。今回血中濃度を測定していないので、この量のどれくらいが吸収されたのかは不明である。1週間後から1日20-25g前後(ETS-GS 100-125mg)で推移した。組織学的検討では4週間後の脊髄組織の空洞化の軽減が認められ、これは運動機能の有意な改善と一致する結果であった。長期間投与による運動機能改善のメカニズムについていくつかの文献を参考にMIF (macrophage inhibitory factor), HMGB-1(high morbidity group box-1), galectin-3の関与について検討した。脊髄損傷受傷1週間後に摘出した脊髄組織よりタンパクを抽出しウエスタンブロット法によりシャムオペ群、脊髄損傷群、脊髄損傷+ETS-GS投与群でMIF、HMGB-1、galectin-3の発現を比較した。しかしながらいずれも脊髄損傷により発現の増加は認められるもののETS-GS投与により有意な変化は認められなかった。これらの結果からETS-GSの効果は別の経路を介していると考えられた。平成24年度ではラット脊髄損傷モデルにおけるビタミンE誘導体ETS-GS投与の改善効果を検討した。まず脊髄損傷急性期と慢性期におけるETS-GSの効果を検討するため、3日間筋注(10mg/kg)するプロトコールと4週間経口摂取(ETS-GS 5%含有の餌)させるプロトコールを立てた。運動機能の改善は両群ともに認められており、投与経路はどちらも有効であったことが示された。次に運動機能の改善についてBasso-Beattie-Bresnahanスコアを用いて評価を行ったところ、3日間プロトコールにおいて3日目に有意な運動機能の改善効果を認めた。同様に4週間プロトコールにおいても3日後から運動機能改善効果が認められた。脊髄損傷の症状進展に炎症、酸化ストレスが関与することが知られているので、炎症のマーカーとしてmyeloperoxidase (MPO)、酸化ストレスのマーカーとしてmalondialdehyde (MDA)を測定した。またアポトーシスも脊髄損傷の進展を引き起こすことが知られているので、caspase-3の測定および脊髄損傷部の組織をTUNEL法で染色した。3日間プロトコールにおいて脊髄損傷によるMPO, MDAの上昇はETS-GS投与により有意に抑制されていた。またcaspase-3においても同様の結果が得られ、TUNEL染色ではETS-GS投与によりアポトーシス細胞の減少が認められた。以上の結果より炎症、酸化ストレス、アポトーシスが抑制されたことが、ETS-GSの運動機能改善効果のメカニズムの一部と考えられた。最後に4週間後の脊髄組織をHE染色、KB染色したところ、脊髄損傷モデルでは空洞化が目立ち、神経組織の欠損が認められたが、ETS-GS投与により空洞化は縮小されており、運動機能の改善と一致する所見が得られた。今年度はラット脊髄損傷モデルにおける新規ビタミンE化合物ETS-GSの脊髄保護効果のメカニズムを詳細に検討することを目標として実験を行った。まず可能性のあるシグナル経路を中心とした伝達物質のリン酸化を網羅的に調べるためにBio-Plexを用いて、脊髄損傷に関連するという報告のあるPI3K, Akt, mTOR, ATF-2, MEK1, NF-kB, p38MAPK, STAT3, GSK-3bについてそれぞれのリン酸化をシャムオペ群、対照群(脊髄損傷あり)、ETS-GS群(脊髄損傷+ETS-GS投与)について検討した。その結果、ETS-GS群ではPI3-Akt-mTOR経路、STAT3, GSK-3bが活性化しており、これらのシグナルが関与している可能性が示唆された。現在ウエスタンブロット法により確認しているところである。またETS-GSの抗酸化剤としての直接効果を確認するため、iNOSの発現をウエスタンブロット法を用いて調べたところ、ETS-GS投与によりiNOSの発現は抑制されており、抗酸化作用も脊髄保護効果に関与していることが示唆された。TUNEL染色を詳細に検討したところ、今回のモデルではグリア細胞を中心としたアポトーシスが認められ、神経細胞にはあまり認められていないことがわかった。今年度は昨年度に引き続きラット脊髄損傷モデルにおける新規ビタミンE化合物ETS-GSの脊髄保護効果のメカニズムを詳細に検討することを目的として実験を行った。

まず、昨年度Bio-Plexを用いて脊髄損傷に関連すると報告されているシグナル経路をsham群(脊髄損傷なし)、control群(脊髄損傷あり、ETS-GS投与なし)、ETS-GS群(脊髄損傷あり、ETS-GS投与あり)において検討した結果、ETS-GS投与によりPI3K-Akt-mTOR経路が変化していたためウエスタンブロット法による検証を行うとともに、オートファジーの関与についても検討した。受傷後24時間ではETS-GS投与によるPI3Kの有意な変化は認められなかったが、Akt, mTORはcontrol群で有意な活性低下が認められ、ETS-GS投与により有意な増加が認められた。mTORはmTOR複合体1(mTORC1)、2(mTORC2)という2種類の複合体を形成することが知られている。mTORC1の下流にあるS6タンパクをウエスタンブロット法で発現を調べたところ、ETS-GS群ではcontrol群と比較して有意な増加が認められており、オートファジーを抑制するmTOR1経路の活性化が示唆された。ETS-GS群ではPI3Kの変化を伴わずAktの有意な活性化が認められるため、mTORC2経路の活性化も同時におこっていることが考えられ、caspase-3の有意な発現低下が示すようにAkt活性化がアポトーシスの抑制にも関与していることが考えられた。今までの実験の結果からETS-GSが脊髄損傷による障害を軽減するメカニズムとして、抗酸化、抗炎症作用とともにmTORを介したアポトーシス、オートファジーの抑制が関与している可能性が示唆された。我々が新規に合成したビタミンEにタウリンとグルタチオンを結合させたETS-GSというビタミンE誘導体が脊髄損傷の二次的損傷を軽減し、神経学的機能の改善に有効であるのではないかと仮定し、ラットの脊髄損傷モデルを用いて検証を行った。ETS-GS投与により術後3日目より有意な運動機能の改善が認められ、摘出した脊髄から抽出したタンパクを分析したところ、myeloperoxidase、malondialdehyde、caspase-3は減少していた。組織学的にも損傷部位の縮小、アポトーシス細胞減少が認められた。ETS-GSは抗炎症、抗酸化、抗アポトーシス作用により神経保護作用を持つことが示唆された。bioplexを用いて網羅的解析を行った結果、複数の伝達物質が候補としてあがってきたため、検証するのに時間がかかってしまった。敗血症・炎症性疾患今年度はbioplexで得られた情報から、ETS-GSの脊髄保護作用におけるシグナル経路を同定する予定である。今年度検討した項目はETS-GSの効果のメカニズムを説明するには不十分であった。今後は網羅的に検討して絞り込む作業が必要である。ラット脊髄損傷モデルにおけるビタミンE誘導体ETS-GSの有効性は確認できており、そのメカニズムとして抗炎症、抗酸化、抗アポトーシス効果があることがわかった。検討項目が複数あるため、検証方法の検討と物品の選定に時間を要したため。まずシグナル伝達経路を網羅的に解析したのち、ETS-GS投与により変化のあった経路を重点的に検討し、それに関連したサイトカインやケモカイン等を検討することによりETS-GSの効果のメカニズムの解明を目指す。
筋肉の超分子マシナリー「サルコメア」の構築と恒常性維持機構

本研究の目的は、心筋細胞におけるアクチン動態の制御機構の解明を通じて、サルコメアという超分子マシナリーの恒常性維持機構を解き明かすことである。心筋細胞は、アクチンとミオシンの両線維が規則正しく整列した収縮装置であるサルコメアによって、効率的に強い収縮力を発生するが、この収縮装置サルコメアがどのようにして形成されるかはよく分かっていない。我々はこれまでに心筋に特異的に発現するアクチン調節蛋白質forminの一つFhod3が、心筋サルコメアの形成に必須の役割を果たすことをFhod3欠損マウスの解析により明らかにしてきたが、その分子機構は依然不明であった。本年度は、その分子機構を明らかにするために、アクチンと結合出来ない変異型Fhod3を胎生期の心臓に特異的に発現するトランスジェニックマウスを作出した。当該マウスは、Fhod3欠損マウスと同様に、心筋サルコメアの形成不全により心臓が形成されずに胎生期に致死となったことから、Fhod3のアクチン結合能が胎生期の心臓形成に必須であることが明らかとなった。さらに、野生型Fhod3を胎生期の心臓に特異的に発現するトランスジェニックマウスも作出し、これを用いて心臓形成過程におけるサルコメア内のFhod3の局在様式を詳細に検討した結果、Fhod3はサルコメア内のアクチン線維の周期的配置が完成するより前からサルコメア中央部に局在し、Fhod3に挟まれた領域でアクチン線維のトリミングが生じていることを見出した。これらの結果より、Fhod3がサルコメア内のアクチン線維の周期的な配置の完成に関わる可能性が示唆された。27年度が最終年度であるため、記入しない。本研究の目的は、心筋におけるアクチン動態の制御機構の解明を通じて、サルコメアという超分子マシナリーの恒常性維持機構を解き明かすことである。我々はこれまでに、心筋におけるアクチン動態の調節機構の解析を進めてきた結果、心筋特異的なアクチン調節蛋白質Fhod3が、マウス胎仔の心臓発生過程におけるサルコメアの新規形成に必須の役割を果たすことを明らかにしてきた。本年度は、Fhod3変異によるヒトの心筋異常の可能性を考え、既知の原因遺伝子に変異が見いだされない日本人家族性拡張型心筋症患者を対象としてFHOD3遺伝子の変異を検索した結果、進化上よく保存されたアミノ酸のミスセンス変異を1名の患者に検出した。当該変異により、アクチン動態依存性に活性化される血清応答因子SRFの転写活性が減少したことから、Fhod3がアクチン動態依存的にヒトにおける拡張型心筋症の発症に関わる可能性が示唆された。ほぼ計画通りに遂行しているため27年度が最終年度であるため、記入しない。今後も、当初の研究実施計画に従って、研究を推進する。
植物の開花とストレス経路を統合制御する因子の解析とその育種的利用

イネとシロイヌナズナを用い、環境ストレスが植物生活環で最も重要な生存戦略である開花に及ぼす影響を解析し、植物が環境ストレスを回避して開花・結実することができるような育種へと応用することを目的として研究を行った。シロイヌナズナではストレスによる早期開花経路に2つの遺伝子が関与している可能性、イネでは開花を制御するEhd2が先行研究で示された光周性開花経路で機能するだけでなく、温度依存的開花シグナルに関与している可能性が示唆された。本研究は、重要作物・モデル植物であるイネ、ダイズと研究の進んだモデル植物であるシロイヌナズナを用い、生存限界に近い環境ストレスが植物生活環で最も重要な生存戦略である開花に及ぼす影響を分子レベルで解析し、その知見を植物が環境ストレスを回避して開花・結実することができるような育種へと応用することを目的とする。本年度は以下の実験を行った。<シロイヌナズナを用いた実験>野生型において塩ストレスによる早期開花の現象の再現性を確認するため、Col-0の野生型を様々な塩濃度(0240 mM)、様々な発育ステージ(119日)で24時間処理し、その後に通常の生育条件に戻して開花の表現型を確認した。その結果、発芽後9日目での処理は塩濃度に比例して開花が遅れること、発芽後12日19日では240 mMの塩濃度で開花が早くなることが見いだされた。<イネを用いた実験>イネの晩生変異体(日本晴、台中65号、ひとめぼれ、あきたこまち背景)とそれぞれの野生型を用いて実験を行った。晩生変異体は長日・短日・自然条件の用いた全ての日長において野生型よりも晩生の表現型を示した。また、日本晴の変異体において原因遺伝子を次世代シークエンサー解析によって同定したところ、既知のEhd2遺伝子の変異体で有り、新しいアリルであることが明らかになった。<ダイズを用いた実験>ダイズにおいてはエンレイとPekingの初期生育において解析を行った。幼若栄養生長期から成熟栄養成長期への移行は、第4葉期から5葉期の間に起こり、葉の大きさ、トライコームの数など様々な要因を伴っていることが明らかとなった。本研究は、重要作物・モデル植物であるイネと研究の進んだモデル植物であるシロイヌナズナを用い、生存限界に近い環境ストレスが植物生活環で最も重要な生存戦略である開花に及ぼす影響を分子レベルで解析し、その知見を植物が環境ストレスを回避して開花・結実することができるような育種へと応用することを目的とする。<シロイヌナズナを用いた実験>myb2、myc2、hb6の3つの遺伝子型の全ての系統と野生型であるCol-0のエコタイプを短日条件、あるいは長日条件で処理し、各遺伝子型の日長処理のみでの表現型を確認した。その結果、日長処理では全ての3つの遺伝子型では野生型と有意な差を確認することはできなかった。このことから、MYB2、MYC2、HB6は通常の条件下では開花に機能していないことが明らかとなった。また、これらの3つの遺伝子型と野生型であるCol-0のエコタイプに弱い塩ストレスを処理し、ストレス応答と開花表現型を調査した。ストレス応答の表現型として開花までの葉数、根の伸長具合を調査した。myc2、hb6の変異体では100mMの塩処理を行ったときに開花までの葉数が若干減少したが、根の伸長度合いには差異は認められなかった。このことから、用いた全ての変異遺伝子型においては弱いストレス条件下では開花に機能を持たないことが明らかとなった。<イネを用いた実験>イネの晩生変異体(日本晴late・台中65 late)とそれぞれの野生型を用いて実験を行った。晩生変異体は長日・短日・自然条件の用いた全ての日長において野生型よりも著しい晩生の表現型を示した。また、発達段階における遺伝子発現解析を行ったところ、晩生変異体は開花のスイッチ遺伝子であるHd3a遺伝子の発現が認められず、日長条件によって開花を促進に切り替えるスイッチの機能が失われているとの結論を得た。<シロイヌナズナを用いた実験>塩濃度を0180 mMとし、長日条件(16h 22°C/8h 18°C)で栽培し、開花期の評価として抽苔日と抽苔時葉数を計測した。2遺伝子(At1G13930、At4G35300)の各2アリルずつ4系統の耐塩性を評価した。