hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
新規に輸送ポンプで発見した多重リン酸化部位の構造-構能相関と調節の分子機構

H,K-ATPase触媒鎖Tyr-10とTys-7のkinaseによるリン酸化はCaに依存せず一方Ser-27のそれはCaを要求することが明かになった。またこれらリン酸化に関与するProtein kinasesとPhosphatasesの同定を試みた結果、Ser-27のリン酸化には80kDのconventional PKCがTyr残基のリン酸化にはSRCのC-末端部位に対する抗体とは反応するが、N-末端部位に対する抗体、Yes及びLynに対する抗体とも反応しない、新奇の60kDのTyr-kinaseの関与が明かにされた。一方Phosphatasesについて免疫学的に区別しうる数種の活性の存在があきらかにされたが、脱リン酸化に直接関与する分子種の同定にはいたらなかった。又同一の触媒鎖のTyrとSer残基が同時にリン酸化を受けるか否かにかんしては、否定的な結果がえられた。外来性の基質を添加しても両kinasesはもっぱらH,K-ATPase触媒鎖N-terminalのリン酸化のみを行い、表面活性剤の存在で初めて添加した基質がリン酸化された。これらの結果その他はH,K-ATPase触媒鎖N-terminalのごく近くに、特異的にTry-10,Try-7及びSer-27残基の可逆的リン酸化を行う酵素系が存在することを示唆している。これらリン酸化に伴う酵素活性の変動は現在迄のところ、検出できていない。これらの結果は可逆的リン酸化が酵素活性を調節するよりむしろ細胞骨格蛋白との相互作用に関与している可能性も示唆している。1.新規に見い出したブタ胃H^+,K^+-ATPase α鎖のTyr^<10>とTyr^7の他にSer^<27>が酵素標品中のkinasesによりリン酸化されることを証明した。またSer^<27>のリン酸化が酸分泌刺激によって上昇するとされるCa^<2+>に依存することも見い出した。Ser^<27>は内因性のSer-kinaseのみならず、外部から加えたC-キナーゼ及びA-キナーゼによってもリン酸化された。これらTry及びSerのリン酸化は可逆的で内在するフォスファターゼで脱リン酸化された。リン酸化反応のCa^<2+>濃度依存性、C-キナーゼの活性化因子の効果及び抗C-キナーゼ抗体との反応性から、内因性のSer-キナーゼはC-キナーゼであると結論した。一方、Try-キナーゼをCHAPSで可溶化後、精製を試み、一次構造をcDNA側から決定することを試みている。部分精製標品の分子量はゲルろ過カラム及び活性染色の結果から、約分子量5万と推定された。Maltose binding proteinとH^+,K^+-ATPase α鎖のGly^2からGln^<111>を含むpeptide部分からなる融合蛋白とその変異蛋白を用いた実験から、上記kinasesによるvanadate存在下でのリン酸化には細胞質に存在するH^+,K^+-ATPaseα鎖のN-terminalを含む最初のsoluble domainで充分であること、又Tyr^7のリン酸化にはTyr^0のリン酸化が必須であることも示された。従来までの研究により、H,K-ATPaseのα鎖のTyr10とTyr7が順に,またSer27がH,K-ATPase標品(GI画分)に内在するチロシンおよびセリンキナ一セによってそれぞれリン酸化されることを見いだした。本研究ではα鎖をリン酸化する両キナーゼの性質をα鎖、およびα鎖のリン酸化部位をマルトース結合タンパク質(MBP)と融合させたリン酸化モデル基質(MP,P-HK)を用いて検討し、さらに免疫反応から、その同定を試みた。GI画分にCaを添加して内在性キナーゼによるリン酸化反応を行ったところ,Ca濃度に依存(K1/2=0.9μM)してα鎖のセリンリン酸化量が増加したが,チロシンリン酸化はCa濃度に依存しなかった。

界面活性剤CHAPS存在下では、α鎖のセリンリン酸化量は減少し,Ca濃度依存性も消失したが,プロテインキナーゼC(PKC)活性化剤TPAを添加すると,Ca濃度に依存(K1/2=1.0μM)したリン酸化が観察された。CHAPS処理前後のα鎖,およびMBP-HKのセリンリン酸化は,PKC特異的阻害剤で阻害た。さらに、PKC抗体を用いたウェスタンプロッティングの結果より、Gl画分中にPKCαとPKCβIIが存在することが示され,両PKCともMBP-HKをリン酸化することが明らかになった。一方、チロシンホスファターゼ阻害剤であるバナジン酸存在下で観察されるα鎖のチロシンリン酸化は、pp60src阻害剤ゲニステインで阻害された。抗c-Src抗体を用いたウェスタンプロッティングの結果より、GI画分において分子量5万と6万のc-Src様プロテインキナーゼの存在を碓認した。免疫沈降により得られた、免疫複合体を酵素源とするとMBP-HKのチロシンリン酸化が観察された。CHAPSで可溶化したGI画分からこの2種のチロシンキナーゼをゲル濾過カラム(Superosel2)で分離し、MBP-HKへのチロシンリン酸化能を検討したところ、分子量6万のキナーゼのみがα鎖N末端の配列をチロシンリン酸化することを見い出した。本研究によって、GI画分に内在する模型のPKCαとβIIがcaに依存して、また膜型のc-Src様チロシンキナーゼがそれぞれα鎖をリン酸化することが示唆された。
[70]フラーレンの特異的化学修飾とそれを利用した分子デバイスの創成

[70]フラーレンのデバイスへの応用を考えるにあたって,フラーレン骨格に対する適切な化学修飾が必要である.しかし[70]フラーレンはその中央部分に反応性の低いベルト構造と呼ばれる部分を持つため,今までのところ自由な化学修飾は妨げられている.そこで,私は[70]フラーレンの六重付加型二核金属錯体に対して化学的還元による化学修飾法を用いて[70]フラーレンのベルト構造に対する官能基化を試みた,[70]フラーレン六重付加体は金属カリウムによって2電子還元され,これに臭化ベンジルを加えることによって官能基がさらに2個導入された八重付加型二核金属錯体が生成した.構造決定は,X線結晶構造解析によって行った.これによると,確かにベルト構造が化学修飾された八重付加体が生成していることがわかった.位置異性体として3種類の化合物の生成が考えられるが,そのうちの1つの異性体のみが位置選択的に得られた.密度汎関数法を用いた量子化学計算によって反応中間体のスピン密度を計算したところ,反応機構を説明することができ,選択性の発現する理由を明らかにした.したがってこの研究によって,反応不活性な部位を持ち自由な化学修飾が困難だった[70]フラーレンの新しい化学修飾法を確立することとなった.カルボン酸部位を持った八重付加体の自己組織化単分子膜を作成し,その光電変換特性が2つの金属の効果によってどういう影響を受けるかを調べた.測定の結果,鉄二核錯体を用いたところカソード電流のみが流れ,ルテニウム二核錯体を用いたところアノード電流のみが流れた.メカニズムを考察すると,金属の電子状態の違いによって電流の方向をスイッチングできることがわかった.今後は八重付加体の電子構造を調整することによって,有機太陽電池の実用化に関して要請されている効率の上昇を目指したい.[70]フラーレンのデバイスへの応用を考えるにあたって,フラーレン骨格に対する適切な化学修飾が必要である.しかし[70]フラーレンはその中央部分に反応性の低いベルト構造と呼ばれる部分を持つため,今までのところ自由な化学修飾は妨げられている.そこで,私は[70]フラーレンの六重付加型二核金属錯体に対して化学的還元による化学修飾法を用いて[70]フラーレンのベルト構造に対する官能基化を試みた,[70]フラーレン六重付加体は金属カリウムによって2電子還元され,これに臭化ベンジルを加えることによって官能基がさらに2個導入された八重付加型二核金属錯体が生成した.構造決定は,X線結晶構造解析によって行った.これによると,確かにベルト構造が化学修飾された八重付加体が生成していることがわかった.位置異性体として3種類の化合物の生成が考えられるが,そのうちの1つの異性体のみが位置選択的に得られた.密度汎関数法を用いた量子化学計算によって反応中間体のスピン密度を計算したところ,反応機構を説明することができ,選択性の発現する理由を明らかにした.したがってこの研究によって,反応不活性な部位を持ち自由な化学修飾が困難だった[70]フラーレンの新しい化学修飾法を確立することとなった.カルボン酸部位を持った八重付加体の自己組織化単分子膜を作成し,その光電変換特性が2つの金属の効果によってどういう影響を受けるかを調べた.測定の結果,鉄二核錯体を用いたところカソード電流のみが流れ,ルテニウム二核錯体を用いたところアノード電流のみが流れた.メカニズムを考察すると,金属の電子状態の違いによって電流の方向をスイッチングできることがわかった.今後は八重付加体の電子構造を調整することによって,有機太陽電池の実用化に関して要請されている効率の上昇を目指したい.
ボードレール『悪の華』における「北方」的特質の研究

平成30年度は、まず共著書『象徴主義と風景ボードレールからプルーストまで』を刊行した。担当部分である「ボードレールにおける風景と個性」において、風景画は外的自然をただ写すばかりでなく芸術家自身の個性を映し出さなければならないというボードレールの思考をたどり、詩篇「風景」を読み解いた。詩篇「風景」は詩集『悪の華』再版において創設された章「パリ情景」の冒頭を飾る詩篇であり、この研究は令和2年度に計画を予定していた「パリ情景」における北方性の分析を先取るものである。そしてこのボードレールの「個性」に対する考え方こそ、現代社会を生きるわれわれが個々人において精神性を持った存在として生を実感する手がかりを与えるものである。次に日本フランス語フランス文学会2018年度秋季大会において、「ボードレールにおけるホフマンの影響ー「熱狂的旅人」を巡って」と題して研究発表を行った。この発表は、美術批評『1846年のサロン』に現れる「熱狂的旅人」という表現から、ボードレールにおけるホフマンの影響を探り、特にボードレールにおける「熱狂」の意義を明らかにしたものである。この研究は、平成30年度に予定していた「スプリーンと理想」の芸術詩群の分析と「反逆」の章の分析を横断的につないだものであり、芸術詩群に含まれる詩篇「地獄のドン・ジュアン」を「反逆」の章に通じる「北方的」芸術家像の発端とみなし、ドイツ作家ホフマンが作り出した「熱狂的旅人」との関連を解明した。こうした提示の仕方を取ることで、これまでのボードレール研究にない「熱狂」の新しい解釈を提出することができた。さらにパリに出張することで、現地において資料を収集するとともに、ボードレールが美術批評において取り上げた絵画作品を美術館で詳しく検証することができた。当初の研究計画を、その後の研究状況に従って、あるいは個別に成果を発表するに当たって、取り上げ方、焦点の当て方の点で変えている部分もあるが、全体においてボードレールの詩集『悪の華』における「北方」的特質を解明する目的に応じた内容で進展している。研究計画を横断する形で、すでに令和2年度の研究計画を先取りしている部分もあり、また平成30年度の研究計画に照らして提示の仕方を工夫している部分もあるが、内容的には研究計画に沿っている。今後の推進方策に関して、研究計画の大きな変更はない。ただし、平成30年度の研究実績にあるように、個別に研究成果を発表していくさいに、提示の仕方等を工夫し、より本研究がボードレール研究および現代社会において持つ意義を明確にしていきたいと考えている。
サイトカインの誘導するカルシウムチャンネル阻害タンパク質の検索

Ca^<2+>は細胞内セカンドメッセンジャーとして細胞機能発現に重要な役割を担っており、電位依存性Ca^<2+>チャンネルおよび受容体作動性Ca^<2+>チャンネルを通るCa^<2+>流入が重要な役割を果たしている。申請者らは、近年副腎クロマフィン細胞でインターロイキン(IL)-1が刺激誘発Ca^<2+>流入を抑制し、本作用はタンパク質合成阻害剤で拮抗されることを見出した。この知見はタンパク質合成を介した新しいCa^<2+>チャンネル調節機構の可能性を示唆するものである。本研究は本作用の詳細な検討と誘導されるタンパク質の同定により、新しいCa^<2+>シグナリング機構の解明とその生理的役割について検索し、以下の成績を得た。1.IL-1のCa^<2+>流入阻害作用はNa^<2+>チャンネル阻害時にも認められ、さらに受容体作動性Ca^<2+>チャンネル機構、細胞内Ca^<2+>動員系、およびNa^+/Ca^<2+> exchenge機構、Na^+,K^+ATPase等の細胞内Ca^<2+>調節機構には影響せず、電位依存性Ca^<2+>チャンネル阻害剤感受性のCa^<2+>流入を選択的に阻害した。2.IL-1は副腎クロマフィン細胞でベラトリジンによる細胞死(Ca^<2+>オーバーロードによる細胞死)に対して保護作用を有し、本保護作用はタンパク合成阻害剤で拮抗された。これらの成果は、電位依存性Ca^<2+>チャンネルの調節機構に、タンパク合成を介した新たな調節経路の可能性を示唆している。加えて細胞内Ca^<2+>の異常な増加による細胞死、およびCa^<2+>調節機構の障害がもたらす種々な疾患の病因・病態の解明に重大な基礎的基盤を与えるものであり、新しいタイプの医薬品開発の基礎的資料を提供するものである。又、L-1処置で発現するmRNAのクローニングおよびそれら遺伝子のコードするタンパク質の同定に時間を要しており、Ca^<2+>流入阻害タンパクの実体の解明は困難であった。尚、この点については今後の残された課題であり、現在さらに研究を押し進めている。
一価銅錯体と銅穴埋めっき

めっき液の維持管理として回転リング-デイスク電極を使用した。回転リング-デイスク電極は中心部にデイスク電極を有する。その円周にはリング電極がある。このデイスク電極に銅めっきすると一価銅を中間体として発生する。回転リング-デイスク電極を回転するとこの一価銅が遠心力で飛び出し必ず円周のリング電極上を通過する。ここでリングの電位を正にしておくと次の一価銅の酸化反応を起こす。この式で、一価銅とエレクトロンとは1:1である。エレクトロン即ち、リング電流を測ると発生一価銅量が明らかとなる。Cyclic Voltammetric Strippingでは、白金電極をまずカソードにして銅めっきをつけてそのあと反転して電位のゼロ点を通りアノードにして銅めっきを溶解する。溶解クーロン量は白金電極に析出した銅めっき量である。この銅めっき量はSPS濃度に比例して0,1.3,2.5と増大する。長時間電解した使用済の液のCVSの銅めっき量では、0-12時間電解した液を比較した。銅めっき量は0,2,4,6,8,10,12と電解時間に比例して単調に減少する。SPS濃度とリング電流とは直線関係にある。長時間電解した使用済の液のSPS添加量を決定する方法では、まず酸化滴定によって塩素イオンを測定する。次にPEG濃度を決定して塩素とPEGとの必要量を滴下する。次にSPS濃度とリング電流の関係よりSPS濃度を決定して必要SPS濃度を滴下する。長時間電解した使用済の液でTSVを埋めた場合の断面写真では、中央部にボイドを発生し埋め込み不良である。長時間電解した使用済の液に必要塩素、PEG、SPS量を滴下しためっき液のTSV埋め込み断面写真では、ボイドを発生せず、完全な良好埋め込みをしめした。以上の結果はSPS,塩素、PEGの三添加剤の場合である。回転リング-ディスク電極での3添加剤のモニター方法を確立した。米国ECI社のCVSでも3添加剤はモニターできている。ECI社ができない4添加剤のモニターを目指す。レベラーを含んだ4添加剤のモニター方法を確立する。本研究課題の現時点での進行状況は、おおむね順調であり、次年度への研究課題推進の為
クロロフィルa/クロロフィルb比調節におけるクロロフィルaオキシゲナーゼ(CAO)の役割

クラミドモナスの分子遺伝学的方法によって、クロロフィルb合成に関与する遺伝子を単離した。この遺伝子は,2Fe-2S型リースケセンターと非ヘム鉄の結合ドメインを持っており,他のオキシゲナーゼとアミノ酸配列の相同性が見られた。そこでこの遺伝子をChlorophylla oxygenase(CAO)と名づけた。次にCAOの機能を詳しく調べるため、シロイヌナズナからCAOを単離し、これを大腸菌で発現させ,in vitroで活性測定をおこなった。その結果CAOは二段階の酸素添加反応を触媒し,クロロフィルaをクロロフィルbに転換する酵素であることが分かった。さらに、フェレドキシンから電子を受け取り、この還元力を用いて酸素添加反応を触媒することも明らかになった。シロイヌナズナの野生型、及びクロロフィルb欠損株に、35Sプロモーター制御のCAOを導入した。導入した株を様々な光条件下で育て、クロロフィルbの蓄積を調べた。その結果、CAOの発現が誘導されている株ではクロロフィルbの合成が高まり、野生型より低いクロロフィルa/クロロフィルb比が得られた。また,低照度では高照度と比較して、低いクロロフィルa/クロロフィルb比を示し,したがって大きな集光装置をもっている。このように、シロイヌナズナの場合も、光環境に適応して、集光装置の大きさを変化させ、光エネルギーの捕捉を調節していると考えられる。しかし、CAOを過剰発現させた株では、そのような制御は見られず,常に低いクロロフィルa/クロロフィルb比をしめした。このことは、光強度が何らかの機構でCAOの発現を調節し、クロロフィルa/クロロフィルb比を制御していることを示している。これらの結果はクロロフィルa/クロロフィルb比の調節は、CAOの発現を通じておこなわれていることを強く示唆している。クロロフィルbは光化学系集光装置の周辺部分を構成する色素である。そのためクロロフィルa/クロロフィルb比は光合成系の集光装置の大きさを決定する重要な要因である。本研究の目的は、最近申請者が初めて単離に成功したクロロフィルb合成遺伝子CAO(ChlorophyII a oxygenase)のクロロフィルa/クロロフィルb比調節に対する役割を明らかにすることである。そこで本年度は次の点に焦点を当てて研究を行った。(1) CAO(クロロフィルaオキシゲナーゼ)の酵素学的解析一般にアミノ酸配列からだけでは、その反応機構を結論できないので、生化学的な実験かを行った。大腸菌で大量発現させたものを酵素標品として用い、Zn-chlorophyII IdeaまたはZn-7-hydroxychlorophyllideを基質にその酵素活性を測定した。その結果両者ともZn-chlorophyII bに転換された。この結果によって、CAOはクロロフィルaを7-ハイドロキシメチルクロロフィルを経て、クロロフィルbに転換することが明らかになった。(2)生理学的解析光強度に対するクロロフィルa/クロロフィルb比の変化をアラビドプシスを用いて調べた。その結果、低照度下で育てるとクロロフィルbの蓄積が誘導され、クロロフィルa/クロロフィルb比が低下することが解った。ノーザンハイブリダイゼーションによってCAOのmRNAの量を測定すした結果、低照度でCAOの発現が誘導された。(3)形質転換体の作製CAOの発現とクロロフィルa/クロロフィルb比の関連を調べるためには、CAOを大量発現したり、発現量を抑制した時のクロロフィルa/クロロフィルb比を調べることは有効な手段である。現在35SプロモーターにCAOのcDNAをつなぎ、アラビドプシスのクロロフィルb欠損株に導入し、CAO遺伝子の過剰発現株を作成している。

(1)クロロフィルaオキシゲナーゼ(CAO)の酵素学的解析大腸菌で多量に発現させたCAO蛋白質を用いた研究によって,CAOの反応機構がほぼ明らかになった。CAOは,クロロフィルaのメチル基(-CH_3)に酸素を添加しハイドロキシメチルクロロフィル(-CH_2OH)に転換したのち,さらに酸素を添加することによって,ジオール(-CH(OH)_2)を経てフォルミル基(-CHO)に転換させることが明らかになった。このように,CAOは2段階の酸素添加反応を触媒することによって,クロロフィルaを直接クロロフィルbに転換し,さらに,この反応には他の酵素を必要としないことが明らかになった。この結果は,クロロフィルb合成は,CAOの発現によって調節されている可能性を示唆している。(3)CAOを大量発現させた形質転換植物の作製シロイヌナズナのクロロフィルb欠損株にCAOを導入したところ,クロロフィルbの合成能が回復した。これによって,シロイヌナズナにおいても,CAOがクロロフィルbの合成に関与していることが証明された。そこで,CAOの発現とクロロフィルbの蓄積,集光装置の大きさの関連を調べるため,CAOを過剰発現させたシロイヌナズナの形質転換体の作製を試みた。35Sプロモーターを用いた発現ベクターによって,CAOをシロイヌナズナの野生型にアグロバクテリウムを用いて導入した。さらに形質転換されたシロイヌナズナのF3から,CAOがホモで導入された系統を単離した。この系統のCAOの発現を調べたところ,野生型に比べ,23倍のCAOが発現してた。そこで,クロロフィルを測定したところ,この形質転換植物は,野生型に比べ,クロロフィルa/クロロフィルb比が約0.2低かった。クロロフィルbは光化学系集光装置の周辺部分を構成する色素である。そのためクロロフィルa/クロロフィルb比は光合成系の集光装置の大きさを決定する重要な要因である。クロロフィルa/クロロフィルb比が高いと集光装置の小さい光化学系が、低いと大きな集光装置を持った光化学系ができる。このように植物がある決められたクロロフィルa/クロロフィルb比を持ったり、光環境に応答しクロロフィルa/クロロフィルb比を動的に制御することは効率的な光合成をおこなうためだけでなく、過剰な光エネルギーによる光障害を回避するためにも重要な仕組みである。我々が単離したCAOは二段階の酸素添加反応を触媒し,クロロフィルaをクロロフィルbに転換する酵素であり、クロロフィルb合成を単独で調節していると考えられる。そこで、シロイヌナズナの野生型、及びクロロフィルb欠損株に、35Sプロモーター制御のCAOを導入した。導入した株を様々な光条件下で育て、クロロフィルbの蓄積を調べた。その結果、CAOの発現が誘導されている株ではクロロフィルbの合成が高まり、野生型より低いクロロフィルa/クロロフィルb比が得られた。単細胞ドナリエラは光照度に敏感に応答し、クロロフィルa/クロロフィルb比を変化させることが知られている。
不整形地盤域の設計用入力地震動の策定

表層地質が地震動の特性に大きく影響し,地震動災害が限られた特定の地域に集中する現象をしばしば経験してきた.近年では,1985年メキシコ・ミチョカン地震では,軟弱な堆積盆地に立地するメキシコ市の特定地域での建物被害の集中が世界中の注目を浴びた.その異常震域の出現の理由の一つとして,盆地端部に地震動が入射する際に盆地内部を伝播する表面波が励起し,盆地の地震動の継続時間を著しく延ばしたことを指摘できる.上記の現象は軟弱な不整形地盤に立地するわが国の中枢都市においても十分予想される.以上の観点から,本研究では基盤境界の形状が3次元的に変化する不整形地盤の強震動を理論的に予測し,このような不整形地盤に立地するわが国の中枢都市の地震防災,並びに地震被害軽減のために資する基礎的資料を作成することを目的とする.3次元不整形地盤の地震動特性を境界要素法により理論解析している.本研究では半無限弾性地盤の3次元グリーン関数を精度よく計算したものを用いているので,弾性地盤の自由表面の応力零の境界条件を自動的に満足している.従って,硬質地盤と軟質地盤の地層境界面に関する境界要素で境界値問題を定式化できる.本法の妥当性を検証するために,Sanchez-Sesma et al.(1989)による波動関数展開による半球形堆積盆地の調和平面SH波による地動応答結果を本法による結果と比較し,両者のよく一致していることを確認している.次に,わが国の中枢都市域で典型的にみられる不整形堆積地盤モデルを設定し,3次元応力場として地震波動をSH波,P波,SV波,レイリー波などの各種平面波動による地動周波数応答を求め,高速フーリエ変換を用いて入力地震波に対する地動応答を評価している.地動応答に及ぼす地層境界の形状,地層インピーダンス比,入力地震波動の種別,および,不整形地盤を伝播する表面波等の諸要因の影響を詳しく吟味している.表層地質が地震動の特性に大きく影響し,地震動災害が限られた特定の地域に集中する現象をしばしば経験してきた.近年では,1985年メキシコ・ミチョカン地震では,軟弱な堆積盆地に立地するメキシコ市の特定地域での建物被害の集中が世界中の注目を浴びた.その異常震域の出現の理由の一つとして,盆地端部に地震動が入射する際に盆地内部を伝播する表面波が励起し,盆地の地震動の継続時間を著しく延ばしたことを指摘できる.上記の現象は軟弱な不整形地盤に立地するわが国の中枢都市においても十分予想される.以上の観点から,本研究では基盤境界の形状が3次元的に変化する不整形地盤の強震動を理論的に予測し,このような不整形地盤に立地するわが国の中枢都市の地震防災,並びに地震被害軽減のために資する基礎的資料を作成することを目的とする.3次元不整形地盤の地震動特性を境界要素法により理論解析している.本研究では半無限弾性地盤の3次元グリーン関数を精度よく計算したものを用いているので,弾性地盤の自由表面の応力零の境界条件を自動的に満足している.従って,硬質地盤と軟質地盤の地層境界面に関する境界要素で境界値問題を定式化できる.本法の妥当性を検証するために,Sanchez-Sesma et al.(1989)による波動関数展開による半球形堆積盆地の調和平面SH波による地動応答結果を本法による結果と比較し,両者のよく一致していることを確認している.次に,わが国の中枢都市域で典型的にみられる不整形堆積地盤モデルを設定し,3次元応力場として地震波動をSH波,P波,SV波,レイリー波などの各種平面波動による地動周波数応答を求め,高速フーリエ変換を用いて入力地震波に対する地動応答を評価している.地動応答に及ぼす地層境界の形状,地層インピーダンス比,入力地震波動の種別,および,不整形地盤を伝播する表面波等の諸要因の影響を詳しく吟味している.3次元の不整形盆地構造の地震動特性を解析するための方法として,様々なものがある。すなわち,まず最初にWave function expansionに基づく方法が挙げられる。この方法は半球関数を用いるため,盆地構造の地層境界が半球形から離れるに従いその精度は悪くなる。また,地表面の応力ゼロの境界条件を完全に満足させることは困難であり,盆地の規模の高々23倍の領域の地表面でのみ応力ゼロを満足させることが出来ない。従って表面波入力や盆地構造から離れた地点での断層震源に対して正しい応答を与えない場合がある。上記の方法以外に,空間的に盆地を周期的に配置するという仮定を設け解析を容易にしたAki and Larner(1970)の方法を3次元盆地構造に適用した研究がある(例えばHorike et al.,1990;Ohori,1990).この方法は計算が早いなどの長所をもつ反面,高振動数になるに従い膨大な記憶容量を必要とする。以上のような制約が最も少ない解析手法として境界積分方程式の方法が挙げられる。本研究では半無限弾性地盤のGreen関数(Yoshida and Kawase,1988)を用いて解析を行った。この方法による解析の長所として,(1)任意形状の3次元地層境界の盆地構造モデルの取扱が容易である。(2)地表面応力ゼロのGreen関数を用いるため入力波動として表面波の場合に対しても制約がない。(3)高振動数でも数値解精度が安定している。が挙げられる。本研究の結果をSanchez-Sesma et al.(1988)の結果と比較検討した結果両者はよく一致することが分かった。しかしながら無限積分で表示される

半無限弾性地盤のGreen関数の計算には多大な計算時間を必要とするため,現状の計算コードを大幅に改良する必要があることが分かった。表層地質が地震動の特性に大きく影響し,地震動災害が限られた特定の地域に集中する現象をしばしば経験してきた.近年では,1985年メキシコ・ミチョカン地震では,軟弱な堆積盆地に立地するメキシコ市の特定地域での建物被害の集中が世界中の注目を浴びた.その異常震域の出現の理由の一つとして,盆地端部に地震動が入射する際に盆地内部を伝播する表面波が励起し,盆地の地震動の継続時間を著しく延ばしたことを指摘できる.上記の現象は軟弱な不整形地盤に立地するわが国の中枢都市においても十分予想される.以上の観点から,本研究では基盤境界の形状が3次元的に変化する不整形地盤の強震動を理論的に予測し,このような不整形地盤に立地するわが国の中枢都市の地震防災,並びに地震被害軽減のために資する基礎的資料を作成することを目的とする.3次元不整形地盤の地震動特性を境界要素法により理論解析している.本研究では半無限弾性地盤の3次元グリーン関数を精度よく計算したものを用いているので,弾性地盤の自由表面の応力零の境界条件を自動的に満足している.従って,硬質地盤と軟質地盤の地層境界面に関する境界要素で境界値問題を定式化できる.本法の妥当性を検証するために,Sanchez-Sesma et al.(1989)による波動関数展開による半球形堆積盆地の調和平面SH波による地動応答結果を本法による結果と比較し,両者のよく一致していることを確認している.次に,わが国の中枢都市域で典型的にみられる不整形堆積地盤モデルを設定し,3次元応力場として地震波動をSH波,P波,SV波,レイリー波などの各種平面波動による地動周波数応答を求め,高速フーリエ変換を用いて入力地震波に対する地動応答を評価している.地動応答に及ぼす地層境界の形状,地層インピーダンス比,入力地震波動の種別,および,不整形地盤を伝播する表面波等の諸要因の影響を詳しく吟味している.
前方後円墳築造企画からみた政治秩序の構造的研究

本年度は、以下のように研究を進めた。まず第一に、古墳時代中期・後期の資料収集とデータベース化を行い類型化の作業を実施した。これによって古墳時代全体を通時的に見通し、前期の特色を抽出することができ、また各地の動態を知ることができた。第二に畿内大形前方後円墳の築造企画と地方古墳とのそれに対する有機的関連性について検討を加えた。その結果、必ずしも全ての前方後円墳が畿内大形前方後円墳と築造企画を共有しているのではなく、類型に漏れるものの存在が明確になった。これらの前方後円墳を理解するためにモデル地域として抽出し、岡山県美作地域をフィールドとして一定エリア内での事例研究を行う中で解釈の糸口を探ることにし、同県真庭郡落合町川東車塚古墳の発掘調査を実施した。また、調査中、隣接する久米郡久米町の奥の前1号墳において過去に出土した遺物を追跡調査し、国内三例目の竪矧板皮綴短甲を地元で発見し、調査研究のために借用した。第三にこれまで実施してきた研究成果を東北・関東前方後円墳研究会(1999年2月6・7日、於群馬大学教育学部)にて「前方後円墳築造企画の型式学的研究ー類型的研究法によるー」と題して口頭発表し、関連する研究論文の作成等、本研究課題のまとめを行うための準備に入った。本年度は、当初計画通り(1)畿内大型前方後円墳の築造企画の系統・系列関係の追求、(2)近畿・四国地方を中心とした古墳時代前期の前方後円墳の測量図を画像データとして取り込み、パソコンを用いてデータベースの作成を中心に課題に取り組んだ。また(3)類型化の作業も行ったが、関東・東北地方においても畿内大形前方後円墳と同企画墳(類型墳)が幾つか存在することを確認し、同時に多様な企画を持つもの(非類型墳)も再確認した。このうち(1)・(3)の課題に関しては、その成果を1998年1月24・24日に開催された第三回東北・関東前方後円墳研究会にて口頭発表を行い、一定の見解を導くことができた。ただし、(3)に関しては従来よりモデルとして想定していた、限られた空間における継続的な類型墳の展開とそれに伴う非類型墳の存在は各地で抽出したものの集成した資料の質(古墳の依存度、調査の有無、測量図の精度)は必ずしも均一なものではなく、より具体的な実相を検討するために1995年度より継続して踏査・測量調査を重ねている岡山県美作盆地に所在する前方後円(方)墳の三基(久米町油木高塚古墳、勝央町殿塚古墳、中央町諏訪神社裏古墳)の測量調査を実施し、墳丘形態・規模はもとより立地や出土遺物なども併せて調査した。その結果、美作地域は備前地域との関係の中で墳墓の築造がなされている可能性が認められるなど、新たな知見を得ることができた。ただし本地域は古墳の依存度が良好なものの未調査のものが依然として多く、自ら測量調査などを実施し均質な資料を蓄積する必要があるなど解決すべき課題も残されている。このような本年度の取り組みを通じ、(2)の作業を一部繰り越したほか、(3)に関しては美作地域に研究の重点を移し小地域を徹底的に同一基準で調査を実施することから仮説検証研究に臨んでゆくなどの課題を次年度に残した。
ポーランド・日本両国における消費動態における心理的要因の比較研究

本研究では、ポーランドと日本の消費動態を確認するため、日本側研究者とポーランド側研究者が相互に両国を訪問した。研究手法は消費者への長時間のインタビューにより,家計の意思決定の背後にある,家族関係,遺産相続,子弟の教育など基本的な家族構造を解明した上で,家庭,とりわけ主婦の意思決定がどのようになされるかを観察することにあった。ポーランドでは、社会構造の転換に伴い、消費者の心理が大きく変化していることが確認された。基礎的食料品や基礎的衣料品に関しては、その消費意思決定は極めて保守的で、所得の上昇による変化はみられなかった。一方、新たな消費対象、とりわけパソコンや乗用車への支出、ならびに家屋の新築や増改築などの資産形成には、所得の上昇と社会的風潮が大きく影響することが判明した。長期的で合理的な生活設計や資産配分を行っているとは到底述べることができない。一方,日本の場合,基礎的消費に関してはポーランド同様に保守的であったが,一方,家屋の新築・改築ならびに子供の教育費に関しては歴史的に与件として扱われ,長期的視野のもとに所得の変化などに無関係に実行されていることが分かった。家の新築と子供の教育は経済意思決定を超越する絶対的事項のように思われ,これが残余の消費に影響を与えていた。ただし,所得の上昇が乗用車など新規商品の購入に優先的に振り向けられていることは同様であった。本研究が採用したマイクロサーベイは、外国人が質問者になるという点も含めて,日本では前例のない手法であったが、きわめて強力な調査手法であるということが判明した。日本では未だマイクロサーベイが実施されていないが,本研究は大いに参考となろう。本年度は2年計画の初年度であり、ポーランド側の研究者4名を日本に招聘し、研究方法の詳細について打ち合わせを行い、その手法について共同の研究会を北海道大学にて開催した。予算的には、この招聘にほとんどの部分が支出された。研究方法としては、消費における心理的要因と、その結果としての象徴的消費財の発見のためには、個別のインタビューをもちいるが、しかしインタビューの数は極めて限定されるので、数量分析を行うことはできない故に、マクロ統計データを使用することが確認された。データ収集のうちあわせのため、研究分担者が東京と神戸にそれぞれ出張した。また日本の消費動態を分析するポーランド側研究分担者のため、札幌市、富山県、広島県でインタビューを行った。心理的要因が強く影響を及ぼす象徴的消費財としては、昭和30年代までは家庭電化製品の購入と家屋の購入・新築であり、昭和40年以降は自動車と家屋の購入・新築であろうという暫定的仮説を立てた。本年度の研究過程の中で、消費に関するマクロデータの入手の困難性が発見された。日本の場合には、北海道地方に限ってデータの入手が可能になるよう交渉中であるが、ポーランドの場合個別の家計データの入手はプライバシー保護法の観点から不可能であることが分かったので、平成12年度では、それにかわる代替手法を模索することが課題として残された。場合によっては、日本の消費動態の分析とポーランドの消費動態の分析手法が異なる可能性がでてきた。研究成果で平成11年度中に発表されたものはない。平成12年度においては、ポーランドでの消費動態を確認するため、日本側研究者3名は2回にわけてポーランドを訪問した。流通機構の調査、とりわけ大都市のカリフールなどの大規模スーパーと小都市の小売店舗の違いを調査した。現地の専門家との意見交換も行った。ポーランドの消費動態の分析はポーランド側研究分担者が実施することになったので、集中的な合同研究会を開催し、日本側は適切な助言を行った。

一方、新たな消費対象、とりわけパソコンや乗用車への支出、ならびに家屋の新築や増改築などの資産形成には、所得の上昇と社会的風潮が大きく影響することが判明した。かなりの家庭が無謀とも思えるローンを組んでいた。合理的な生活設計や資産配分を行っているとは到底述べることができない。このような結果は、伝統的な家計調査では確認することができず、平成11年度に日本で実施した長時間にわたる家庭内での面接調査によってはじめて確認することができる。ポーラン側研究者も同様の手法を用いてポーランド国内で調査を実施した。長時間をかけて個々の家庭で面接調査を実施する手法は、非常に有効であり、とりわけインタビューアーが外国人の場合、通常は話さないような微妙な問題まで非常にフランクに回答してくれることが分った。本研究が採用したマイクロサーベイは、日本では前例のない手法であったが、きわめて強力な調査手法である。平成12年度では、研究成果の最終的とりまとめのため、ポーランド側研究者1名が来日して、共同の研究会を開催した。
真核生物の複製装置形成に関与する蛋白質複合体の研究

真核生物の染色体の複製は、複製開始点から細胞周期のDNA合成期に一度だけ行われるように厳密に制御されている。DNA複製フォークの形成過程で、GINS複合体(Sld5-Psf1-Psf2-Psf3)は、複製ヘリカーゼの構造形成に関与すると考えられ、DNAポリメラーゼのローディングも示唆されている。この複合体蛋白質の構造機能相関を目的に、4種のサブユニットを同時発現させ、その結晶をを調製し立体構造解析した。そして様々なGINSサブユニットの変異体を作製し、複合体の安定性を評価したところ、Sld5のBドメインはその複合体形成に非常に強く関わっているが、一方でPsf1のBドメインは構造形成に関与していないことがわかった。また、アフリカツメガエルの卵抽出液を用いて、野生型GINS複合体を免疫除去後、ヒト組換変異GINS複合体を再添加し、複製活性やクロマチン結合画分を調査することでGINS複合体上の機能部位の特定を行った。この結果、Psf1のBドメインが複製の初期反応に重要であり、このドメインを介してCDC45蛋白質と同時に複製初期反応にMCMヘリカーゼの構造的成熟に関与していることがわかった。つまり、GINSコア複合体は複製初期反応に重要なPsf1のBドメインの構造安定化に寄与していると考えられる。構造情報が欠損しているPsf1のBドメインは、類似構造からモデル作製することができ、Sld5のサブユニット結合に相当するアミノ酸を露出していることがわかった。これらのアミノ酸変異も複製活性に影響したため、GINSはこれらの残基を介して他の因子に結合していると推測された。以上の結果は昨年の立体構造の結果とあわせ論文で報告した。真核生物のDNA複製の初期過程は、S期以前にMCM2-7複合体を特定のDNA領域に複製前複合体として形成させることから始まる。続いてS期特異的に働くプロテインキナーゼの活性化と様々な蛋白質の介入によって、MCM複合体は複製に必須なヘリカーゼとして構造的に成熟する。そしてDNA合成を担う数種のDNAポリメラーゼのローディングによって、レプリソーム複合体が構築されると考えられている。多くの介在する蛋白質因子の中で、GINS複合体(Sld5-Psf1-Psf2-Psf3)は、複製ヘリカーゼの構造形成に関与すると考えられ、またDNAポリメラーゼのローディングも示唆されている。本研究者は、このGINS複合体の4種のサブユニットを大腸菌で同時発現させるシステムを作製し、共発現を経て、その複合体結晶を調製した。2.3Å分解能で構造解析したGINSコア複合体(Psf1のみN末端ドメインのみ)は、新規のサブユニット構造を持つ。4種類すべてのサブユニットは、共通する2種類のドメイン構造(A,B)で構成され、Sld5とPsf1のドメイン配置はA-Bであるのに対し、Psf2とPsf3のそれはB-Aとなっていた。つまりこれらのサブユニットの遺伝子は、進化的に共通の祖先から派生したことを示し、このことはGINSサブユニット内部の構造的特徴から立証することができた。この複合体は、Sld5とPsf1、Psf2とPsf3それぞれのサブユニットがダイマーを形成しながら二層に配置されている。すなわち、隣り合うサブユニットは疎水結合を介した相互作用面を形成し、環状の高次構造を形成していた。さらに様々なGINS複合体蛋白質の変異体を作製することで、蛋白質の安定性を評価したところ、Sld5のBドメインはGINSコア複合体のコア構造の安定性に非常に強く関わっているが、この立体構造解析で欠失させたPsf1のBドメインは、その複合体の構造形成に関与していなかった。
現代ドイツ文学におけるオートフィクションの諸相

本プロジェクトでは、現代ドイツ文学における「オートフィクション」に関する研究をしている。伝統的な文学においてフィクションとオートビオグラフィー(自伝)のようなノンフィクションを明確に分離することは前提条件といえるものであった。しかし、現代文学において、著者はフィクションを加えることなく自伝を事実だけで綴ることを諦め、経験的知識を組み込んだフィクションを取り入れながらストーリーとして展開する傾向が見られる。このような背景から、現代ドイツ文学の文脈で「オートビオグラフィー」が「オートフィクション」と呼ばれるに至った。この点に関する具体的なデータを収集し、分析を行なった。代表研究者はPeter Handkeを中心に研究を展開した。彼の50年にわたる全著作は特に「私」をテーマとする作品が常に顕著にみられる。この「私」をテーマとした作品は、伝記ではなくフィクションである。オーストリアとスロベニアという両地域にまたがるアイデンティティをもつ「私」は、両地域に立脚することで、内面でも葛藤が見られる。スロベニアは作家にとってメルヘンのような、平和的、マルチカルチャーな理想郷であり、異邦である。この理想はしかし90年代にユーゴスラビアの混乱により崩壊する。この崩壊によりHandkeは新しいアイデンティティを探す必要に駆られる。ユーゴスラビアに関するHandkeのエッセイを調べ、作家による「私」のあり方の変遷を研究した。分担研究者は、Kathrin Roegglaの通過のための「場」に注目し、どのように「私」がそのような場で構築されるのかを考察した。オートフィクションに関する議論は近年急速に展開しており、大変多くの出版物が刊行されている。若手作家では例えばデジタル世界での「私」など新しい成立条件のもとで構築される「私」への注目が観察される。研究は、おおむね計画通りに進んでいる。今後は、「私」と「場」の関係についてさらに研究を進める。デジタル化社会を迎えた現代において、著作するということはどのような可能性があるのかを考察する。現代はメディア変革の最中にあり、作家はヴァーチャルとリアリティの狭間に生き、書くという問題に直面している。現代作家の中には、作家としての「私」をヴァーチャルなリアリティの中で生きるアバターのような存在を手本として書くものも出てきている。その例としてRainald Goetz、Clemens J. Setz、Michel Houellebecqの一部作品、Elfriede Jelinekのインターネット上の作品などが挙げられ、これらの作品の中での「私」の構成とデジタル社会における「私」のあり方を比較、考察する必要がある。一方でこのような科学技術の発展に反発する作家もいる。Peter Handkeは80年代終わりから鉛筆で執筆を続けることに固執した。積極的に技術革新を受け入れ新しい可能性を取り入れる作家、あえて従来の手法にこだわる作家などそれぞれの手法を対比し、互いの「私」のあり方の違いについて差異がみられるか注目する。計画していた書籍の購入が、書籍の出版延期によりできなかった。来年度に購入を延期し、該当する額を繰越しすることとした。
透析患者のドライウエイト設定と血管透過性に関する研究

慢性維持血液透析患者は、高齢者、糖尿病患者の増加にともない、透析困難な透析患者を対象として日常臨床を行わなければならなくなってきている。臨床家としてこれらの患者を管理する上で、ドライウエイトの設定、除水速度の設定は苦慮するところである。しかし、ドライウエイトの設定は、心胸郭比などといったある一つの指標のみでは決定できず、透析前後の心房性Na利尿ペプチドの値、心エコーでの左心房径、下大静脈径など様々な指標が提唱されている。しかし、未だに確個たるフローチャートが作成されていないのが現状である。そこで、今回の我々の研究の目標は、ドライウエイト設定へのアプローチ方法とフローチャートの作成、および、その臨床的根拠の検討である。ドライウエイト設定にあたっては、循環血液量の変化を知ることが重要で、その結果plasma refillingを予想することが可能となる。さらにこのplsama refillingを規定する因子を明らかにすることによりここの患者の循環動態の特性を予想することができる可能性が強い。我々は、透析前後の蛋白濃度を測定し、その時の体重変化から、循環血漿量変化率(%ΔCPV)と体重変化率(%ΔDBW)から、PWI(Plasma-water index)=%ΔCPV/%ΔDBWとして求め、透析中の循環動態との関連を検討してきた。その結果、循環血液量の変化は、低Na血症、低蛋白血症など循環血液量の変化速度が特殊な状態になるものを除けばほぼ直線的で、PWIにて代替することが可能であることを明らかにした。そこで、PWIを用いてDW設定の指標を作成してみた。蛋白濃縮を中心としたフロチャートである。I)PWI<2.0 1)血圧安定→DWを下げる、2)血圧低下→血圧低下はDW設定以外の原因II)PWI2.0-4.0 1)血圧安定→DW適性、2)血圧低下→血圧低下はDW設定以外の原因III)PWI 4.0以上DWを上げることを検討する慢性維持血液透析患者は、高齢者、糖尿病患者の増加にともない、透析困難な透析患者を対象として日常臨床を行わなければならなくなってきている。I)PWI<2.0 1)血圧安定→DWを下げる、2)血圧低下→血圧低下はDW設定以外の原因II)PWI2.0-4.0 1)血圧安定→DW適性、2)血圧低下→血圧低下はDW設定以外の原因III)PWI 4.0以上DWを上げることを検討する透析患者では、透析間に体重の5%前後の水分貯留が必須で、透析ではそれを4時間という短時間で除水しなければならない。この時、透析後体重の設定が透析の良否に大きな影響を与え、心不全を惹起したり、透析中の血圧低下、透析後の全身倦怠感などを誘発する。今回の我々の研究の目標は、透析後の適性体重(ドライウエイト)設定へのアプローチ方法とフローチャートの作成、および、その臨床的根拠の検討である。現在、一般的にドライウエイト設定に使用されている指標としては、1)心胸郭比、2)透析中の血圧低下、3)透析後ANP、4)下大静脈径の変化などがある。我々は、最近開発された光学的な方法による非観血的連続へマトクリット測定装置クリットライン(CRIT-LINE、In-Diagnostics社製)を用い、ドライウエイト設定の様々な指標の客観的評価と個々の患者の病態変化による循環血液量の変化を、それぞれの因子を明確にして多重回帰を行う基礎的研究を積み重ねることにより、ドライウエイト設定のためのフローチャートと個々の症例での循環動態変化に対する対処方法の選択基準が作成できると考えている。本年度は、クリットラインによる循環血液量の変化と心胸郭比、ANP、BNPの関係について検討を行なった。2つの関連施設で安定維持血液透析を受けている230名と、心臓合併症を有する当院入院中の患者30名の計260名を対象とした。

現在、第1回の測定を130名で終了し、集計中であるが、合併症のない、適正体重の設定に問題の無いと思われる患者では、体重の1%の除水にて循環血液量は3%前後減少することが明かとなった。しかし、循環器合併症、電解質異常、低蛋白血症管など様々な因子がこの関係を破綻させている。現在、透析前後の体重、透析前後の総蛋白濃度、ANP、BNPの値と、循環血液量変化速度の関係についてコンピューター解析中である。透析患者では、透析間に体重の5%前後の水分貯留が必須で、透析ではそれを4時間という短時間で除水しなければならない。この時、透析後体重の設定が透析の良否に大きな影響を与え、心不全を惹起したり、透析中の血圧低下、透析後の全身倦怠感などを誘発する。今回の我々の研究の目標は、透析後の適性体重(ドライウエイト)設定へのアプローチ方法とフローチャートの作成、および、その臨床的根拠の検討である。現在、平成13年度には、維持血液透析患者計130名を対象として、クリットラインによる循環血液量の変化と心胸郭比、ANP、BNPの関係について検討を行なった。その結果、適正体重の設定に問題の無いと思われる患者では、体重の1%の除水にて循環血液量は3%前後減少することが明かとなった。さらに、除水量1%体重当たりの循環血液量減少率(%BV/%BW)は、ANP、BNPと逆相関するすることが明らかとなった。すなわち、透析前ANP、BNPが高値の症例では、循環血液量の過剰負荷があり、そのような状態では除水にてもplasma refillingが十分であるため、循環血液量の変化率は少ない。逆に透析前ANP、BNPが低値の症例では、循環血液量の過剰負荷がなく、除水にてもplasma refillingが十分でないため循環血液量は除水により減少する速度が大きくなる。このことは、我々が仮説としてきた「透析患者においては、ANPが血管透過性の調節因子である」ことを強く示唆する所見であった。本年度は、心不全を合併する症例36名を対象に同様の検討を行った。その結果、%BV/%BWは、合併症のない患者群と有意差が無いことが明らかとなった。しかし、透析前ANP、BNP値と%BV/%BWの関係は、逆相関があるものの、平行移動を示していた。すなわち、ANP、BNPが高値であるほどplasma refillingは亢進するが、その程度は合併症の無い患者群に比べ少なかった。このことは、循環器合併症のためにANP、BNP高値が持続することにより、血管透過性亢進はdown regulationを受けていることを示唆するものと考えられた。透析患者におけるDW設定の指標としては、1.心胸郭比(CTR)、2.下大静脈径(IVC)、3.心エコー図(UCG)、4.心房性Na利尿ホルモン(ANP)、5.蛋白濃縮率(PWI)、6.持続ヘマトクリット測定装置(クリットライン)などがある。我々は、過去3年間これらの指標の(1)経済性、(2)数量化、(3)検査時間、(4)検査労力、(5)影響因子、(6)単独指標の可否などを評価項目として評価してきた。その結果、経済性、数量化・検査時間を考慮するとCTRと蛋白濃縮率(PWI)が最も優れており、これらの指標を中心としたDW設定が容易であるという結論を得た。その方法としては、それぞれの検査の特性を理解して紅み合わせることが重要である。
脊柱靱帯骨化症の病因として間葉系幹細胞が果たす役割の解明

本研究は『脊柱靭帯の間葉系幹細胞が、骨芽細胞様細胞へ間違って分化し、靱帯組織が骨化する』と言う仮説の検証を目標にした。まずヒト脊柱靭帯組織に間葉系幹細胞が存在することを証明した。つぎに靭帯組織での局在と、骨化に伴う局在変化を検討した。その結果、正常時に血管周囲にのみ存在した間葉系幹細胞が、骨化で靭帯実質部全体に分布し、特に骨化移行部に集中することを明らかにした。最後に患者の間葉系幹細胞と正常のものとの多分化能を比較し、前者は正常のものに比して、骨分化能が極めて高いことを明らかにした。いずれの結果も上記仮説を支持し、形質転換した間葉系幹細胞が重要な役割を果たすことを示している。1)平成24年度は間葉系幹細胞の脊柱靭帯組織の中での局在場所(ニッチ)の証明を終えた。平成25年度は、それを更に発展させて、骨化患者組織における間葉系幹細胞の局在の変化を免疫組織化学的に解析した。その結果、正常組織では血管の周囲に存在する周皮細胞(ペリサイト)に間葉系幹細胞のマーカーが集約されていたのに対して、骨化患者では、靭帯実質部、そして骨化部位の周辺である骨化前線部に多数の間葉系幹細胞が存在した。さらにその骨化前線部に存在する間葉系幹細胞は、軟骨細胞のマーカーを合わせて発現していた。このことは、我々が主張してきた、"異所性骨化も内軟骨性骨化(軟骨を経て骨化に至る)の過程を経て起こる"と言う説を指示するものといえる。2)患者靭帯組織由来の間葉系幹細胞をセルソーターで精製し、その細胞を用いて、多分化能を検討したところ、脂肪細胞化、軟骨細胞化、増殖能等には、非骨化組織由来のものとの間に差は見出されなかったが、骨化能のみ、患者由来の細胞で著明に高かった。従って、間葉系幹細胞から靭帯組織の細胞になるべきところを、間違って骨芽細胞様の細胞に分化したことが、発症の機序であることを強く示唆する結果を得た。3)このin vitroでの証明にもとづき、次にin vivoでの易骨化能を明らかにするため、間葉系幹細胞にGFP遺伝子を導入して、生体内でのトレースを可能にし、免疫不全マスに移植して、それらの細胞が骨化組織を形成するかどうかを検討することにした。導入前の検討として、GFP遺伝子を導入した細胞の肝細胞機能に変化がないことを確認する必要があり、現在その検討を進めているところである。4)治療薬のシーズとなる物質(骨化・石灰化を抑制する薬物)の探索の探索を、平成25年度も引き続き行った。in vitroでの石灰化を抑制する天然物、及び合成誘導体を数種類見出した。現在細胞毒性の有無を検討している。平成24年度の研究計画に挙げた主な目標は、1)間葉系幹細胞の脊柱靱帯組織における存在証明、2)疾患組織由来の間葉系幹細胞の易石灰化能の証明であった。まず1)について。手術時に摘出したヒト脊柱靭帯組織を、コラゲナーゼ処理して細胞を単離した。その細胞を、間葉系幹細胞に特異的な細胞表面マーカー3つに対する抗体で染色し、それを元に細胞をセルソーターで分離したところ、3つのマーカーを共発現している細胞が得られた。その細胞を1個ずつ培養ディッシュに撒くと、増殖してコロニーを形成した。その増殖した細胞はやはり、間葉系幹細胞に特異的な細胞表面マーカー3つを共発現していた。以上の結果から、この細胞は間葉系幹細胞のMinimum Criteria(自己再生能、高い増殖能、特異的細胞表面マーカーを発現)を満たす細胞であることが確認できた。次に2)について。非骨化靭帯組織(ヘルニア等)と、骨化靭帯組織(脊柱靭帯骨化症OPLL)から同様にして単離した間葉系幹細胞を培養し、骨化誘導刺激を加えたところ、後者の細胞が前者に比べて著明な石灰化を起こした。以上のことから、OPLL患者の靭帯組織に存在する間葉系幹細胞が、間違った分化を起こして(靭帯細胞ではなく、骨芽細胞様細胞に分化して)、異所性の骨化を起こすという我々の仮説を支持する結果が得られた。研究プロジェクト全体の目標は、難治疾患である“脊柱靱帯骨化症"の病因解明とその薬物治療法確立である。我々はこれまでの10年にわたる研究成果を踏まえて、『ヒト脊柱靭帯組織に間葉系幹細胞が存在し、それらが様々な環境因子・局所因子に晒されることで骨芽細胞様細胞へ間違った分化を起こし、その結果靱帯組織が骨化・石灰化する』と言う仮説を立てた。