hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ウミガメの代替生活史：子供の量と質のトレードオフの探索

過去に屋久島永田浜で実施したアカウミガメの産卵個体調査から、餌場に関わらず、産卵期後期ほど卵が有意に重くなり、一腹卵数が減少する傾向が確認された。本種が環境の季節変化に応じて適応的に卵サイズを変化させている可能性が考えられた。しかし異なる年の卵重・卵数を比較したものなので、この傾向が真に季節的なものなのか、もしくは年変異なのかは不明であった。そこで同一産卵期内の調査を2年間行い、本種の卵重の季節的増加、及び卵重と卵数の間にトレードオフが存在するのかを検証した。次に5年間のデータを基に、卵重と卵数が有意に年変異しているのか検証した。2017年57月の各月に15日ずつ、また2018年の5月と7月に21日ずつ、屋久島永田のいなか浜において、本種の産卵個体調査を実施した。前後肢に標識を装着して個体識別し、ノギスで標準直甲長を測定した。巣に産出された一腹卵数を調べ、無作為に5卵の重さを量った。解析には5卵の平均値を用いた。また20142016年のデータを上記2年のデータに加えて、卵重と卵数の年変異を検証した。2017年には76個体が産んだ88巣を調べ、2018年には71個体が産んだ77巣を調べた。個体群及び個体レベル共に、両年とも月の間で、甲長を調整した卵重及び一腹卵数に有意な違いは見られなかった。回帰個体の方が新規加入個体よりも有意に重い卵を産んでいたが、卵数に違いは見られなかった。これらの結果は、過去の調査でみられた卵重の有意な「季節的」増加は年変異に起因しており、卵重と卵数の間にトレードオフは存在しないことを示唆した。実際、20142018年の間に、卵重に有意な違いが見られたが、卵数に違いは見られなかった。また各年の回帰個体の割合と平均卵重の間に正の相関がなかったことから、有意な卵重の年変異は標本採取個体の繁殖履歴に起因したものではなかった。同じ砂浜で産卵するアカウミガメでも、小型個体ほど外洋で浮遊生物を、大型ほど浅海で底生動物を摂餌する傾向がある。浅海摂餌者は外洋摂餌者よりも2.4倍多く幼体を産出することと、摂餌者間で中立マーカーにおいて遺伝的構造がみられないことから、多型は条件戦略で維持されていると考えられている。しかし外洋摂餌者由来の子供の、地上に出現してから最初の繁殖に至るまでの期間の生残率が2.4倍高ければ、適応度が釣り合うため、維持機構の再考を要する。本研究では、母親の餌場が違えば、子供の上記期間の生残率に関わってくる、初期体サイズ、活動性、成長速度、及び死亡率に差異を生じるのかを、同一環境で孵化飼育することで検証した。2016年7月上旬に、屋久島永田浜において、本種の産卵個体調査を実施した。小型と大型が産んだ卵塊を、一晩に13対、浜上部の孵化場へ移植した。小型と大型各10巣ずつを移植した。移植前に一腹卵数を調べ、5卵の重さを量った。そのうち1卵を採取し、安定同位体分析に供した。8月下旬に脱出幼体を捕らえた。幼体の甲長・甲幅・体重を測定した。また幼体をひっくり返して元に戻るまでの時間と傾向を測定するとともに、1巣につき1頭の幼体を水族館へ輸送し、同一環境で飼育した。卵黄の炭素・窒素安定同位体比に基づくと、外洋摂餌者が10個体、浅海摂餌者が10個体いた。外洋摂餌者由来の幼体の方が、甲長・甲幅・体重が有意に小さく、巣からの脱出成功率が有意に高かった。これらは、外洋摂餌者由来の卵重が小さく、一腹卵数が少なかったことに起因していると思われた。幼体の自己修復傾向及び時間、また成長速度と死亡率に、摂餌者間で有意差はなかった。これらの結果は、摂餌者間で適応度が釣り合わないことを示唆し、回遊多型の後天性を強く支持した。野外調査、室内化学分析、データ解析、学会発表、論文執筆、単著書籍の出版、本の出版記念トークショーを通じたアウトリーチなどを滞りなく実施できた。今年度の研究から、アカウミガメ成体雌の餌場は、子供の活動性や成長速度などの質に影響を及ぼさないことが明らかとなった。これは子供の量と質にトレードオフがないことを意味し、回遊多型の後天性を支持する結果である。ウミガメ類における代替生活史の維持機構の全容解明に一歩近づいた。また過去のデータとの比較から、アカウミガメが孵化温度が高くなる産卵期後半ほど大きな卵を産んでいることが示唆された。この現象は、高温により孵化幼体の体サイズが縮小することに対する適応反応であると考えられた。このような現象は、今のところウミガメ類において報告されていない。浅海摂餌者は外洋摂餌者よりも2.5倍多く卵を産出することと、摂餌者間で中立マーカーにおいて遺伝的構造がみられないことから、多型は条件戦略で維持されていると考えられている。

しかし外洋摂餌者由来の子供の生残率が2.5倍高ければ、適応度が釣り合うため、遺伝子マーカーや維持機構の再考を要する。今年度は、少産の外洋摂餌者が子供の生残率を高めるために、(1)海から離れた場所で産卵できる、幅の広い浜を選んでいるのか、(2)実際に浜の奥で産卵しているのか、を検証した。2011年および2017年の屋久島永田における、本種の産卵個体調査データを解析した。卵黄の炭素・窒素安定同位体比に基づいて判別した外洋と浅海の摂餌者の間で、海岸線に対して水平的かつ垂直的な産卵場所に有意差は見られなかった。これらの結果は、両摂餌者由来の子供の陸上での生残率に違いがないことを示唆し、適応度の不釣り合いや回遊多型の後天性を強く支持した。また過去の調査でみられた本種の卵重の季節的増加および一腹卵数の季節的減少が、真に季節的なものなのか年変動なのかを検証すべく、同一産卵期内に卵重・卵数の調査を行った。個体群レベルでは、月の間で、標準直甲長、卵重、および一腹卵数に有意な違いはみられなかった。個体レベルでは、卵重に有意差はみられなかったが、卵数は有意に減少していた。これらの結果は、過去の調査でみられた卵重の有意な「季節的」増加は年変動に起因しており、卵重と卵数の間にトレードオフは存在しないことを示唆した。しかし結論付けるには複数年の調査を要する。野外調査、産卵個体の保護監視、産卵見学者への解説を通じたアウトリーチ、室内化学分析、データ解析、学会発表、論文執筆、論文発表などを滞りなく実施できた。過去に屋久島永田浜で実施したアカウミガメの産卵個体調査から、餌場に関わらず、産卵期後期ほど卵が有意に重くなり、一腹卵数が減少する傾向が確認された。本種が環境の季節変化に応じて適応的に卵サイズを変化させている可能性が考えられた。しかし異なる年の卵重・卵数を比較したものなので、この傾向が真に季節的なものなのか、もしくは年変異なのかは不明であった。そこで同一産卵期内の調査を2年間行い、本種の卵重の季節的増加、及び卵重と卵数の間にトレードオフが存在するのかを検証した。次に5年間のデータを基に、卵重と卵数が有意に年変異しているのか検証した。2017年57月の各月に15日ずつ、また2018年の5月と7月に21日ずつ、屋久島永田のいなか浜において、本種の産卵個体調査を実施した。前後肢に標識を装着して個体識別し、ノギスで標準直甲長を測定した。巣に産出された一腹卵数を調べ、無作為に5卵の重さを量った。解析には5卵の平均値を用いた。また20142016年のデータを上記2年のデータに加えて、卵重と卵数の年変異を検証した。2017年には76個体が産んだ88巣を調べ、2018年には71個体が産んだ77巣を調べた。個体群及び個体レベル共に、両年とも月の間で、甲長を調整した卵重及び一腹卵数に有意な違いは見られなかった。回帰個体の方が新規加入個体よりも有意に重い卵を産んでいたが、卵数に違いは見られなかった。これらの結果は、過去の調査でみられた卵重の有意な「季節的」増加は年変異に起因しており、卵重と卵数の間にトレードオフは存在しないことを示唆した。実際、20142018年の間に、卵重に有意な違いが見られたが、卵数に違いは見られなかった。また各年の回帰個体の割合と平均卵重の間に正の相関がなかったことから、有意な卵重の年変異は標本採取個体の繁殖履歴に起因したものではなかった。今年度の研究から、アカウミガメ成体雌の餌場は、子供の活動性や成長速度などの質に影響を及ぼさないことが示唆された。今後は、母親の餌場が、幼体の、巣から出てきて海へ向かう際の移動能力や、海に入ってからの遊泳能力に影響を及ぼさないのかなども詳細に調べる必要がある。また幼体の質には孵化環境が大きく影響を及ぼすので、餌場の違う親ガメが、微少規模で産卵場所を選択しているのかどうかを詳しく検証する必要がある。
P300/CBPを介するコアクチベータ-ネットワークと胚性細胞の分化誘導

本年度は、このDRF複合体にアデノウイルスE1A結合蛋白質でコアクチベータ-であるp300及びATF-2転写因子が含まれる事を初めて明らかにした。相互の免疫沈降反応、Tag付発現ベクターによる相互の免疫反応、in vitroにおけるGST-pull downアッセイや、バキュロウイルス蛋白質を使用した解析によりp300のBr-C/H2ドメイン(963-1571a.a)とATF-2の(112-350a.a)のドメインが直接会合する事、及びATF-2の121のSerineのPKCαによるリン酸化がATF-2/p300によるトランス活性化には必要である事を証明した(Genes & Dev.12,233-245,1998)。今後はp300,ATF-2以外の第三の分子の同定が急務である。その他、p300とCBPの分化誘導、G1アレスト、アポトーシスの機能分担をリボザイムやアンチセンス法を用いて解析を進めている。
拍動時の歪み計測に基づく頸動脈プラーク性状の非侵襲的評価とその臨床的意義

筋性中動脈の局所ごとの壁伸展性を計測する手法は、これまで十分確立されていなかった。二次元スペックルトラッキング(2DST)法による総頸動脈壁の局所伸展性の評価が可能かどうか、また、その動脈硬化病変との関係を検討した。虚血性脳血管障害患者連続100例の頸動脈200側において、総頸動脈長軸像の遠位壁を5区域に分割し、各区域でIMT計測と2DST法によるトラッキングの可否の判定とピークストレインの計測を行った。全1000区域中885区域(88.5%)でストレイン計測が可能であり、プラーク部位(IMT≧1.2mm)では、それがない部位に比し、壁厚方向ピークストレインが有意に低下していた(-3.53+/-2.79%vs.-4.67+/-2.85%,p<0.0001)。2DST法は、頸動脈壁に生じた動脈硬化性病変の局所伸展性の評価に有用であると考えられた。予備的検討として、健常ならびに虚血性脳血管患者15例の頸動脈30側において、頸動脈壁スペックルトラッキングのための至的撮像・解析条件を検討した。その結果、発信・受信中心周波数10MHzのファンダメンタル画像で、デプス1.85mm、フレームレート40fps前後での撮像が最適であることがわかった。また、解析は、長軸遠位壁で最も容易であり、また、頚動脈内膜中膜複合体厚が正常範囲(数mm程度)の厚みでも、その長軸および厚み方向ストレイン曲線を描出できることがわかった。本法の妥当性の検討のために、別の虚血性脳血管障害患者17例の頸動脈34側の長軸像遠位壁5箇所において、厚み方向ストレインを計測した。2検者間の計測値はよく相関し、プラークや輝度上昇部位では、ストレインが有意に小さいことがわかった。このことから、動脈硬化性の局所の繊維化や石灰化による硬化を、この方法で定量的に評価できると考えられた。一方、これと平行して、頸動脈内膜剥離術施行前頚動脈50側のエコーの視覚的評価と手術所見とを照合した。まず、潰瘍のエコー診断については、我々が新たに考案した診断基準を使えば、潰瘍を正確に診断できることを示した。次いで、内膜や壁内部の異常運動と潰瘍・亀裂、プラーク内出血との関係を検討し、これらが密接に関係することを示した。これらの成績は、頸動脈エコーによる動きの評価がプラークの破綻や易破綻性の予測への有用性を示唆する成績と考えられた。昨年度の検討で定めた撮像条件と解析設定を用い、臨床例における頸動脈の2次元スペックルトラッキング(2DST)分析を行った。まず、虚血性脳血管患者の20例の頸動脈40側で、頸動脈長軸像と短軸像で描出される動脈壁局所の動態評価を試みた。その結果、トラッキング成功率は、長軸像遠位壁では高かったが、近位壁や短軸像の動脈壁では低かった。長軸像遠位壁では、計測されたストレイン(St)絶対値がプラーク部位で非プラーク部位より有意に低値であった。そこで、虚血性脳血管患者90例の頸動脈180側において、長軸像遠位壁の壁厚および長軸方向のSt値および拡張末期からピークStまでの時間(TP)を計測した。89%の区域でトラッキングが成功し、壁厚方向のStと長軸方向のStおよびTPは、再現性よく計測できた。壁厚方向St絶対値は、プラーク区域で非プラーク区域より有意に小であった。総頸動脈遠位壁では、2DSTによる壁伸展性の評価が可能であり、プラーク部位の伸展性低下を捉えうると考えられた。これと平行して、プラーク部位の動きの視覚的評価についても検討を進めた。新規の頸動脈内膜剥離術患者22例の頸動脈22側につき、手術時所見とエコー所見との対応を前視的に検討した。プラーク表面エコーの途絶は、プラーク破綻ないし潰瘍とよく対応した。また、表面の収縮期陥凹や内部の揺動などの不自然な動きは、手術時のプラーク内部の変性とよく対応した。頸動脈エコーによるプラークの動きの評価が、プラークの破綻や易破綻性の評価に有用である可能性を示す成績と考えられた。

昨年度までの検討で定めた撮像条件と解析設定を用い、臨床例における頸動脈の2次元スペックルトラッキング(2DST)法による分析を進めた。虚血性脳血管患者100例の頸動脈200側において、長軸像遠位壁の壁厚および長軸方向のSt値および拡張末期からピークStまでの時間(TP)を計測し、その成功率や再現性を評価するとともに、これらの計測値とプラークや壁輝度上昇の有無とがどう関係するかを検討した。全1000区域中885区域でトラッキングが成功し、壁厚方向のstと長軸方向のStおよびTPは、再現性よく計測できた。壁厚方向St絶対値は、プラーク区域で非プラーク区域より有意に小(p<0.0001)であり、また、長軸方向Stは壁輝度上昇区域でそれがない区域より有意に低下(p<0.05)していた。総頸動脈遠位壁では、2DST法による歪み分析により壁伸展性の評価が可能であり、またこの方法で、一般にプラーク部位にみられる壁伸展性の低下を捉えることができると考えられた。これと平行して、頸動脈内膜剥離術(CEA)患者(30例)でのエコーによるプラーク異常運動の視覚的評価の検討も進めた。手術時所見との比較に基づき、プラークの拍動性異常運動がある例では、それがない例に比し、プラーク破裂/潰瘍(73%対32%、p<0.05)やプラーク内出血(100%対53%、p=0.01)が有意に多く、壊死(82%対63%)も前者に多い傾向がみられた。プラーク異常運動が、プラークの破綻/易破綻性の指標として有用である可能性を示す成績と考えられた。
自己免疫疾患マウスMRL/lprのIgGにおける糖鎖構造変化とその生理的意義

リウマチ因子(抗IgG抗体、RF)を産生するMRL/Iprマウスと対照のRFを産生しないMRL/nマウスの6ヶ月齢の血清を集めプロテインA-セファロ-スCL-4Bカラムにかけたところ、MRL/nマウスのIgG(Mn)はカラムに吸着し酸性緩衝液にて溶出したが、MRL/lprマウスのIgGはカラムに吸着せず遅れて溶出してくる画分(M1-I)とカラムに吸着し酸性緩衝液で溶出してくる画分(MIーII)に分画された。そこで、これら3種のIgG画分及びM1-IとM1-IIの混合物画分(M1)をそれぞれセファクリルS-300カラムにかけてさらに精製した。得られたIgG標品の純度はSD S-PAGE及び免疫化学的方法により高純度であることが確認された。つぎに、精製した4種のIgG標品をヒドラジン分解にかけてIgG糖鎖を定量的に遊離させた後、NaB^3H_4で還元してトリチウム標識オリゴ糖を得た。これを高圧濾紙電気泳動、Bio-Gel P-4 HPLC、RCA120-HPLC、各種グリコシダ-ゼによる逐次分解分析等にかけて糖鎖構造を調べた。その結果、どのIgG標品でも中性糖鎖が主成分であり、シアル酸を12分子含む酸性糖鎖も少量存在すること、脱シアル化中性糖鎖は±Galβ1→4GlcNAcβ1→2Manα1→6(±Galβ1→4GlcNAcβ1→2Manα1→3)Manβ1→4GlcNAcβ1→4(±Fucα1→6)GlcNAcで示される8種類の構造を有していることを明らかにできた。さらに、8種の糖鎖の存在比率はMnとMl-IIでは殆ど同じであったが、M1及びMl-IではMnと比較してガラクト-スを欠いた糖鎖が顕著に増加し、RFを産生する慢性関節リウマチ患者と同様に、IgG糖鎖の主成分となっていることが明らかとなった。以上の事実は、慢性関節リウマチ患者で見いだされたIgG分子の糖鎖異常が種を超えてRF産生MRL/1prマウスにも存在しており、しかも、対照のMRL/nマウスにはないIgGサブポピュレ-ションの存在により生じていることを明白に示している。
微生物の持つ植物ホルモン合成遺伝子を用いてのホルモン作用機作の研究

アグロバクテリウムの持つオ-キシン、サイトカイニン生合成遺伝子を用いてこれらホルモンの作用機作を探ることを目的とする。1.タバコ、ペチュニアを被検体とし、Tiプラスミドバイナリ-ベクタ-pGA580を持つアグロバクテリウムを感染させ、カナマイシン抵抗性の再分化個体を得た。さらにサザンハイブリダイゼ-ションにより目的とする遺伝子が植物ゲノムに組み込まれてたことを確かめ、形質転換および再分化の系を確立した。2.ポプラ、リンゴ、ナシのクラウンゴ-ルから腫瘍誘発能のあるノパリン型アグロバクテリウム18株を分離した。次にこれらのTiプラスミドからTーDNAを大腸菌ベクタ-puc19ヘクロ-ン化した。これらは完全なオ-キシン、サイトカイニン遺伝子を含んでいた。数種のクロ-ンの比較から、TーDNAは見掛け上3つのドメインに分かれた。一つは腫瘍形成に必要でオ-キシン、サイトカイニン遺伝子を含む右半分、二つ目は機能不明な左半分で両者とも構造はよく保存されていた。最後は前者2つの中間部であり、DNAの長さは各TーDNAに特異的であった。3.これら3つのドメインをそれぞれ別々にベクタ-pGA580へクロ-ン化し、アグロバクテリウムに導入した。これをタバコに感染させ、形質転換体を作成中である。これら組織をホルモン存在下、非存在下で育て、両条件におけるTーDNA上の遺伝子の発現の違いを調べる予定である。
グローバル化における国内議会の位置づけ

本年度の研究の内容は、概ね交付申請書における研究目的の欄に掲げたものに沿っており、その点で変更はない。すなわち、グローバル化の進展に伴う「民主主義の赤字」への対応として、国内議会が果たすべき機能の解明である。本年度の研究の成果という面では、博士学位論文「グローバル化時代の議会民主政--ドイツ・アメリカの議論を手がかりにして--」を完成させ、京都大学より博士(法学)の学位が平成24年3月26日に授与されたということを、なによりもまず挙げておかねばならない。当該論文において、私は、まず議会による条約承認手続に焦点を当てて、我が国における従来の議論、ドイツ連邦共和国における議論、アメリカ合衆国における議論を参照し、それを紹介した。その中で、条約承認手続の要求される、「条約」への該当を形式的な基準のみによるのではなく、実質的な観点から判断することの必要性を指摘するとともに、「条約」以外への類推適用による「拡張」の可能性についても言及した。また、アメリカにおける国際合意の締結の在り方が従来我が国で紹介されてきたものとは異なっているという点についても解明した。次に、私は「条約」承認には限られない、国内議会による対外事項への、より広く積極的な関与の可能性についても指摘した上で、議会の限界にも言及し、行政立法手続に関するものを主に念頭に置きつつ、行政手続の利用が国際的に形成される規範の民主的正統性の確保に当たり一定の役割を果たすことについても解明した。以上の検討は、当初の予定よりも、より深く掘り下げて行われたため、研究計画において挙げた、裁判所の役割の解明については、裁判所にも民主的正統性確保にあたって寄与する可能性があることを指摘できるにとどまってしまった。また、これに伴い、博士学位論文の全部ないし一部を本年度中に公表するに至ることができなかった上、書籍等の資料の拡充に研究費の大半が投入されることとなった。博士論文完成という点で、当初の計画を達成したということができるが、行政手続による民主的正統化については、その理論的な説明付について必ずしも十分な検討を終えることができなかった。また、裁判所の機能についても概括的な検討に留まってしまった。平成24年4月1日に、京都大学助教に採用されたため、特別研究員の資格を失い、当研究は廃止となる予定である。
咬合力の直接伝達を緩衝する歯根膜組織を有した次世代型歯科インプラントの開発

本研究により,次に示す結果が得られた.適切な繰返し伸縮刺激は,間葉系幹細胞の細胞分化を著しく促進させる.ここでは間葉系幹細胞の腱細胞分化を評価し,細胞の配向を制御した場合,実際の腱組織が受けるひずみ5%を48h継続することで良い結果が得られた.また,細胞をその細胞が存在する生体環境に近い状態で培養することは,分化に限らず細胞外マトリックスの形成においても非常に有効であることがわかった.歯根膜組織を有した歯科インプラント開発を長期的最終目標に据え,本申請課題では短期的目標として線維性軟組織のin-vitroでの組織再生のための系統的な分化・組織再生メカニズムの解明を目的とした.初年度は,「1.細胞分化と機械的伸縮ひずみの相関性の解明」および「2.パターニング培養による細胞のたんぱく質発現の制御」を掲げ研究を行ったが,次年度に一部内容を継続することとした.そして当該最終年度は,「3.パターニング培養による高次構造を有する組織再生の試み」と「4.三次元培養による上記技術の高度化」を具体的な目標に掲げ研究を行った.1,2の研究を継続する中,間葉系幹細胞の分化機構を非一様ひずみ場を用いて定量的に解明する独自のシステムの開発に成功した.その結果,機械的伸縮刺激を用いた間葉系幹細胞の分化制御の研究においてその最適ひずみ量はこれまで不明であったが,タンパク質発現の観点からその最適値が8.0%であることを初めて明らかにした.3,4の研究として,可分離接触共培養と命名する独自の共培養系を開発した.この共培養系は,これまで直接共培養系で不可能であった,各細胞群が発現するmRNAおよびタンパク質を個別に定量評価することを実現する.さらに,これまでにない細胞間の接触が可能となり,新たな細胞間シグナル伝達を期待することができる.結果として,提案どおり共培養の各細胞群のmRNAおよびタンパク質発現を個別に定量評価することを可能とした.さらには,これまでの共培養系に比べて,間葉系幹細胞の分化が促進されることが判明し,可分離接触共培養系が分化・組織化促進の新たな手法として有効であることを示した.以上,申請段階で4つの具体的な目標を掲げ,研究を推進してきた.そして,それぞれの項目において重要かつ新規性の高い結果が得られ,最終目標実現のための本申請課題の責務を果たしたと考えられる.本研究により,次に示す結果が得られた.適切な繰返し伸縮刺激は,間葉系幹細胞の細胞分化を著しく促進させる.ここでは間葉系幹細胞の腱細胞分化を評価し,細胞の配向を制御した場合,実際の腱組織が受けるひずみ5%を48h継続することで良い結果が得られた.また,細胞をその細胞が存在する生体環境に近い状態で培養することは,分化に限らず細胞外マトリックスの形成においても非常に有効であることがわかった.歯根膜組織を有した歯科インプラント開発を長期的最終目標に据え,本申請課題では短期的目標として線維性軟組織のin-vitroでの組織再生のための系統的な分化・組織再生メカニズムの解明を目的としている.具体的には,力学的刺激に対する間葉系幹細胞の分化条件の定量的評価,および力学的刺激に対する高効率的な組織再生の最適条件の探索に従事する.当該年度の計画として,「1.細胞分化と機械的伸縮ひずみの相関性の解明」および「2.パターニング培養による細胞のたんぱく質発現の制御」を掲げていた.1に関しては,細胞分化に対する力学的刺激の受容性に関して非常に興味深い結果を得た.すなわち,繰返し伸縮刺激を受ける間葉系幹細胞において,線維性組織の成分の大部分を占めるType I Collagenの発現は,広範なひずみ値を受容した.一方,腱組織に特異なタンパク質であるTenascin Cの発現は,狭窄なひずみ値しか許容しなかった.これは,力学的刺激に対する幹細胞の分化メカニズムを解明する大きな手掛かりとなると考えており,今後も継続的に研究を行っていく予定である.2に関しては,間葉系幹細胞に力学的伸縮刺激を加える際,拒絶反応として自発的な配向挙動を示すが,それを抑制するよう細胞接着タンパク質にパターニングを施したサンプルのほうが,細胞の自発的な配向挙動を抑制しないサンプルに比べて,Type I Collagenの発現量が格段に上昇するという結果を得た.これは,細胞の分化に対してどのような力学的刺激が効果的であるかという議論において一定の結論を与えるものであると考えられる.すなわち,間葉系間細胞を楕円形と近似した場合,長軸方向の伸縮負荷が分化に対して非常に重要な因子となっていることを示唆している.しかしながら,データ量が十分でないため,今後も究明を続ける予定である.「研究実績の概要」に記したが,当初の研究実施計画の通り進捗していると言える.しかしながら,当該年度計画した研究内容に対して非常に興味深い結果が得られている.したがって,次年度研究実施計画で示した内容を遂行するとともに,並行して当該年度の研究内容を継続して実施する予定である.上述したようにH24年度の研究内容(1,2)を継続するとともに,次年度の研究実施計画(下記の3,4)に沿って研究を進めていく予定である.3.パターニング培養による高次構造を有する組織再生の試み申請者はこれまでの研究により,機械的伸縮刺激に対する間葉系幹細胞のたんぱく質発現量とECM組織の構造化には,異なるひずみ依存性を有することを示した.H25年度は,H24年度に行ったパターニングの研究において,タンパク質発現量の観点から,高次構造すなわち組織化の観点で研究を行う予定である.4.三次元培養による上記技術の高度化

これまで述べた研究内容は二次元培養下で行われる研究であり,実際に細胞がさらされる環境とは異なる.そこで,足場を三次元構造体とした三次元培養への応用を行う.その三次元培養において眼前の問題となる,細胞の運動挙動およびECMに作用する力学場の定量評価で必要となるDVC(Digital Volume Correlation)法と呼ばれるプログラムの開発に着手し,細胞周囲の力学的なMicroenvironmentの計測を試みる.幹細胞,細胞培養用試薬,増殖・分化遺伝子解析用試薬,蛍光観察用抗体試薬など,全般的に消耗品費として使用する予定である.
セイヨウナシのS遺伝子型同定システムの開発と単為結果性・自家摘果性の評価

セイヨウナシ5品種に対して除雄無受粉と他家受粉処理を行い,単為結果果実と有種子果実の果実形質を調査した.単為結果果実の大きさ,糖度は有種子果実より劣っていたことから,ラ・フランスなどの強い単為結果性を持つ品種でも他家受粉が必要であることを明らかにした.1花そう2花の他家受粉では交配後著しい生理落果が観察された.一方1花そう1花の他家受粉は安定的な結実をもたらした.そこで,セイヨウナシ15品種に対して1花そう1花の除雄無受粉,自家受粉および他家受粉を行ない,各品種の単為結果性と自家不和合性を調査した.ほとんどすべての品種が単為結果性を有しており,結実率を指標にした不和合・和合の識別は困難であった.しかし,単為結果性の要因を排除した指標SI index[(評価対象の交配における充実種子数/交配花数)/(和合交雑における充実種子数/交配花数)×100]は和合・不和合の明確な判定を可能にした.S1S7対立遺伝子を有するセイヨウナシの遺伝子型を推定できるPCR-RFLP (S1S7)システムを用いて27品種の3遺伝子型を推定したところ,14種類の遺伝子型に分類され,そのうち8種類の遺伝子型には複数の品種が分類された.同じ推定S遺伝子型をもつ品種が交雑不和合であったことから,セイヨウナシの雌しべ側S遺伝子産物もS-RNaseであり,本システムは高い信頼性をもつことが立証された.一方で,S1S7-RNaseと異なる新規S8S11-RNaseをクローニングし,それらの全塩基配列を決定した.セイヨウナシは同じナシ亜科のニホンナシやリンゴと同様に1遺伝子座複対立遺伝子系に制御される配偶体型自家不和合性を示す。セイヨウナシは単為結果性を有し、結実率による判定が難しく、S遺伝子型は決定されていない。我々は、セイヨウナシの雌しべ側S遺伝子産物もS-RNaseであるとの仮定に基づき、RT-PCRにより6つのS-RNase cDNA断片(S1S6-RNase)を同定し、12品種のS遺伝子型を推定している。本年度は,'プレコース'からRT-PCRにより新規S-RNase cDNA断片(S7-RNase)をクローニングした。S1S7-RNaseを有する6品種から3'及び5'RACEによりS1S7-RNase cDNAの完全長塩基配列を決定した。S1S7-RNaseの推定アミノ酸配列は、ナシ亜科S-RNaseに典型的な構造(5つの保存領域、1つの超可変(HV)領域、2つのヒスチジン残基、8つのシステイン残基)を有していた。セイヨウナシS2-RNaseとリンゴS5-RNaseは98.3%の高い相同性を有し、HV領域の配列は完全に一致していた。ゲノミックPCRによりS-RNase断片を増幅し、S1S7-RNase cDNA断片との対応付けを行った。S2-RNase断片は約1.5kb、S1-RNase断片は約1.3kb、S5-RNase断片は約1.0kb、S6-RNase断片は約400bp、S3-,S4-,S7-RNase断片は約350bpに検出された。また、3品種からS1S7-RNaseと異なる新規のS8S11-RNaseが増幅された。除雄無受粉、自家受粉、他家受粉を行ない、結実率と充実種子数を調査した。単為結果性の影響を排除したSeeds/Flower(総充実種子数/交配花数)を指標とする判定方法を考案した。セイヨウナシ5品種に対して除雄無受粉と他家受粉処理を行い,単為結果果実と有種子果実の果実形質を調査した.単為結果果実の大きさ,糖度は有種子果実より劣っていたことから,ラ・フランスなどの強い単為結果性を持つ品種でも他家受粉が必要であることを明らかにした.1花そう2花の他家受粉では交配後著しい生理落果が観察された.一方1花そう1花の他家受粉は安定的な結実をもたらした.そこで,セイヨウナシ15品種に対して1花そう1花の除雄無受粉,自家受粉および他家受粉を行ない,各品種の単為結果性と自家不和合性を調査した.ほとんどすべての品種が単為結果性を有しており,結実率を指標にした不和合・和合の識別は困難であった.しかし,単為結果性の要因を排除した指標SI index[(評価対象の交配における充実種子数/交配花数)/(和合交雑における充実種子数/交配花数)×100]は和合・不和合の明確な判定を可能にした.S1S7対立遺伝子を有するセイヨウナシの遺伝子型を推定できるPCR-RFLP (S1S7)システムを用いて27品種の3遺伝子型を推定したところ,14種類の遺伝子型に分類され,そのうち8種類の遺伝子型には複数の品種が分類された.同じ推定S遺伝子型をもつ品種が交雑不和合であったことから,セイヨウナシの雌しべ側S遺伝子産物もS-RNaseであり,本システムは高い信頼性をもつことが立証された.一方で,S1S7-
細菌感染によるAtg5依存・非依存オートファジーの分解と炎症誘導メカニズムの解析

オートファジーは,哺乳類細胞においては,飢餓時に細胞内のアミノ酸供給に働くだけでなく,異常タンパク質や老化した細胞内器官の分解,細胞内に侵入した微生物の分解にも機能する.この,微生物の分解については,生理的なオートファジーと異なる点が見いだされるが,その膜生成に関わるオートファジーには,通常とは異なる様々なRabタンパク質が用いられていることが明らかとなった.A群レンサ球菌のモデルでは,Rab9A, Rab23だけでなくRab17, Rab30といった様々なRabタンパク質が利用されていることが明らかとなった.本研究では、細菌感染時の菌体排除・免疫誘導機構として注目されるオートファジーについて、Atg5依存性の選択性オートファジーとAtg5非依存性のRab9により誘導される代替性オートファジーの菌体認識・分解に関わる分子機構を明らかとする.この機構を明らかとすることで、i)細胞内に侵入した菌を分解して排除するための機構、ii)細胞内での菌の動態を菌種別に高精度に感知して、有効な炎症・免疫誘導・抑制を行うためのスイッチング機構としての機能、iii)菌体を効率良く排除するためにAtg5依存性・非依存性双方の膜誘導を制御するための機構を解明することとなり、様々な細菌感染症に対する生体の新たな防御機構の制御を可能とするだけでなく、創薬標的の同定、種々の細菌感染症の発症メカニズムの解明につながると考えられる.そこで、平成25年度では、Atg5依存性・非依存性オートファジーにおける細菌感染の認識、特にA群レンサ球菌特異的に誘導されるオートファジーに必要となる(1) Atg5依存・非依存性のオートファジー誘導に必要なPAMPs, DAMPsを認識する分子の同定.(2) Atg5依存・非依存的に誘導されるA群レンサ球菌特異的オートファジーの分子メカニズム解明.特に、Rab9と結合する分子の網羅的な解析、また同様にA群レンサ球菌感染時に必須となるRab23と結合する分子の網羅的な解析によりそのネットワークを解明することを目的とした.本研究では、細菌の細胞質内への侵入に伴う炎症反応の惹起を,従来細胞内の検知システムと考えられていたNod1, Nod2レセプター以外のNod-like receptor群に着目し,A群レンサ球菌の侵入に伴う初期炎症反応の惹起するシステムを明らかにするとともに,細胞内への侵入に伴って誘導される細胞死の誘導メカニズムについて解析を加える(図1).さらに,オートファジーによって分解される菌は,細胞質内で分解されることから従来のMHCクラスIIによる抗原提示だけでなく,クラスI分子を介した抗原提示を導く可能性が示唆される.そのため,これらの可能性も含め,免疫担当細胞活性化のレパトアに対するオートファジーの影響についても検討を加える.本年度は,A群レンサ球菌感染特異的に誘導されるオートファジーについて,飢餓誘導で誘導されるオートファジーとの差違を明確にするために細胞内小胞輸送に必須であるRabタンパク質についてさらに詳細な解析を行った.その結果,感染特異的に誘導される因子として既に報告を行ったRab9, Rab23A以外の因子であるRab17を同定し,この因子によって,リサイクリングエンドソームからの膜供給が行われることを新たに見いだした.本研究では, A群レンサ球菌の細胞内侵入に伴って惹起される感染特異的なオートファジーによる炎症惹起メカニズムと細胞内小胞輸送に必須であるRabタンパク質についての解析を行った.前年度では,感染特異的なオートファジーに必須なRabタンパク質としてRab9A, Rab23以外にRab17も重要な役割を果たしていることを示したが,本年度ではさらにRab30が重要な役割を果たしていることを明らかとした.Rab30は,通常の細胞ではゴルジ体の形態形成に重要な役割を果たしているが,Rab30のノックダウン細胞では,A群レンサ球菌を包み込むオートファゴソームの形成が抑制され,また細胞質内の菌の分解も抑制されていた.Rab30は飢餓誘導で誘導されるオートファゴソームにも局在は認められたものの,飢餓誘導でのオートファゴソーム形成そのものには関与していなかった.これらの結果からRab30は,A群レンサ球菌によるオートファゴソーム形成とゴルジ体の形態保持という2つの異なった機能を示すことが明らかとなった.オートファジーは,哺乳類細胞においては,飢餓時に細胞内のアミノ酸供給に働くだけでなく,異常タンパク質や老化した細胞内器官の分解,細胞内に侵入した微生物の分解にも機能する.この,微生物の分解については,生理的なオートファジーと異なる点が見いだされるが,その膜生成に関わるオートファジーには,通常とは異なる様々なRabタンパク質が用いられていることが明らかとなった.A群レンサ球菌のモデルでは,Rab9A, Rab23だけでなくRab17, Rab30といった様々なRabタンパク質が利用されていることが明らかとなった.感染特異的に誘導されるオートファジーに関わる因子で,特に細胞内小胞のトラフィッキングに重要な役割を果たしているRabについて解析を行っているが,通常の飢餓誘導ではなく感染時にのみ誘導される因子を多数同定することが出来ている.特に,本年度報告したRab17は,リサイクリングエンドソームに特異的と考えれてきたが,このRab17を用いてリサイクリングエンドソームをオートファジーに利用することができることを証明できた.27年度が最終年度であるため、記入しない。

細菌学本研究を行うにために,培養細胞レベルでのCRISPR/Cas9による遺伝子破壊法を導入したが,その方法がかなり確実に遺伝子破壊細胞を作成することができるようになった.現在,表題で示しているAtg5以外にも,オートファジーに必須であるAtg4, 7, 9, 12, 14などの欠損細胞も完成し,またRabタンパクについても20種以上のKO細胞が完成しているため,さらに詳細な解析を行っていく予定としている.平成25年度では、オートファゴソーム形成に関わるRabタンパク質のスクリーニングを行った.現在60種あるヒトのRabタンパク質のほぼ全ての発現系を構築し、A群レンサ球菌の感染によってオートファゴソーム形成に関わるほぼ全てと考えられるRabタンパク質を同定した.これは、飢餓誘導時に誘導されるオートファゴソーム形成で誘導されるRabタンパク質の分布とは大きく異なり、細菌感染で誘導される巨大な膜の誘導には、通常では使用されることのないRabタンパク質群をも動員されていることが明らかとなった.また、これまでオートファゴソーム形成に必須であるAtgタンパクについては、これまでKOマウス由来のMEF細胞が使われてきたが、ゲノム編集法によりHeLa細胞などの培養細胞系でもAtg5, Atg7などのオーファゴソーム形成に必須なタンパク質群のKO細胞株の作成に成功することができた.そのため、Atg5依存性・非依存性のA群レンサ球菌誘導に関わるAtg遺伝子群と、それに関わる菌体成分認識分子のスクリーニングにも、これらの培養細胞を使用できるようになった.そのため、これまでMEF細胞でのみ解析を行ってきた解析が、ヒト由来細胞でも解析が可能となったため、解析の精度が上がった.細胞内の菌体認識成分の1つであるNRLX1に着目し、その相互作用する因子の解析を行ったところ、NRLX1と相互作用を行う因子の1つが炎症反応の誘導制御に関わっていることを明らかにすることができたため、これらの分子を細胞死の誘導に関わる因子をさらに詳細に検討する.27年度が最終年度であるため、記入しない。平成26年6月から8月にかけて,前任地の東京医科歯科大学から京都大学への移転にかかり,すべての実験がストップした状況となったため.27年度が最終年度であるため、記入しない。上記の結果を踏まえ、平成26年度は以下の項目の研究を行う.A群レンサ球菌感染特異的に誘導される選択性および代替性オートファジーに関連するTLRs、NLRsの機能解析.選択性および代替性オートファジーの誘導に必須なTLRs、NLRsの下流の分子群に着目し、炎症反応に関わるシグナル伝達因子を同定する.ここでは、分子と会合するシグナルパスウェイにある分子群の機能を解析すると共に、Luciferaseアッセイによる解析を行う. Rab9、Rab23結合因子の細胞内動態の機能解析.H25に得たRab9あるいはRab23の結合分子群について、GFPタグ、mCherryタグ、および抗体を用いた免疫染色法により、その細胞内局在を同定する.A群レンサ球菌変異株を用いた機能解析.これまで同定した新規分子を強発現あるいはノックダウンした培養細胞系において、A群レンサ球菌の表層抗原、分泌タンパク、二成分制御系の各遺伝子破壊株(40株程度)の感染モデルを構築し、上記1の結果も踏まえて、菌側の責任担当構造を解析する.A
危機言語継承教育に対する日本語教育の方法の適用―沖縄語を対象として―

沖縄語には明治期以来の研究の蓄積があるが、外国語教育の方法にもとづいて語彙や文型を整理して学習するための教科書はまだ存在しない。本研究では、日本語教育の方法論を用いた文型積み上げ式の初級沖縄語教材を開発した。名詞文から始まり、身につけやすいものから複雑なものへと、既習の学習項目の上に積み上げていく形で文法事項を学習するように配慮した。沖縄語と日本語との共通性から、名詞文、形容詞文や動詞文の順で提出し、活用形、ヴォイスや待遇表現(敬語)までの流れを考慮してテキストを作成した。ただし、主題の形、動詞活用、指示語の用法など沖縄語と日本語とで異なる部分については提出順序や説明などを工夫した。本研究は実践・研究の長い歴史があり、教授法・教材なども整備されている日本語教育の方法論を用いて、系統が同じで構造も類似している沖縄語の初級教科書を作成することにある。2013年度は基礎的作業として以下のことを行った。(1)数種の日本語教科書から文型・語彙と提出順序をデータベース化した。(2) (1)で整理した日本語教育でもちいられる文型・語彙を参考にしながら初級沖縄語教科書のための文型を設定し、文法解説を執筆した。文法解説は、項目を執筆しながら提出順序が適切になるように入れ替えるという往還作業を行いつつ、また作成した例文などをインフォーマントにチェックしてもらいつつ(昨年度は合計4回の出張を行った)、執筆を進めた。その過程で、日本語教育の方法論をもちいることの有効性が確認できた。その中で沖縄語の文法や音韻論についていくつかの研究課題がみえてきたが、2つほどのテーマついて論文の執筆をこころみ、そのうちのひとつを発表することができた((3)を参照)。2014年度は引き続き会話文と練習問題を作成し、初級用沖縄語教材として完成させる予定である。(3) 1研究の背景や執筆中の教科書の文型について概観したもの、2執筆の過程で生じた問題意識から沖縄語の「ティ形」について考察したものの2つの論考を発表した(いずれも2014年3月)。また、2014年6月に行われる日本言語学会春季大会でポスター発表を行う予定である。本研究は実践と研究の長い歴史があり、教授法・教材なども整備されている日本語教育の方法論を応用して、系統が同じで構造が類似している沖縄語の初級教材を作成することにある。2014年度は以下の作業を行った。(1)昨年度に設定した文型一覧から教科書本文を作成した。また、既に執筆済みの文法解説につてい見直し必要な改定を行った。(2)作成した教科書について、学習者を集め試用を行った。試用していく過程で本文の文型・語彙提出順序や文法解説をより適切なものとすることができ、また日本語教育の方法論で沖縄語教育が可能なことが確認できた。ただ、十分な学生が集まらず、また集まった学生も多忙であったため、7課まで(全27課)の試行しか行えなかった。(3)成果の発表としては、2014年6月に日本言語学会148回大会(法政大学)で、2015年3月に琉球語継承言語会(沖縄キリスト教学院大学)で研究発表を行った。前年度に引き続いて教科書の改訂を行った。特に27年度は4月から学部の学生を集めて学期中に週一度程度模擬授業を行いつつ、テキストの分量が一回の授業について適当か、練習問題が学習項目と合っているか、などについて検討を行うことができた。また、8月に沖縄に出張してさまざまな点について確認をしたほか、2月に沖縄語のネイティブ・スピーカーを招いて東京で全体をチェックしていただいた。年度末には初級沖縄語教育において動詞活用をどう教えるかについての論文を執筆し勤務先の紀要に発表した。昨年度中に教科書を完成させる予定で、教科書本文・文法解説などはおおむね完成していたが、受講生を集めての試行しようとしたところ、思ったように学生が集まらず、また学生が多忙なため27課文の7課までしか試用ができなかったため、期間を一年延長することにした。日本語学昨年度終わりからは多方面に呼びかけ、作成した教科書を試用した沖縄語入門講座の学生を一定数確保し、実際に教科書を試用して、文型や語彙の提出順序などもふくめ改訂していき、沖縄語母語話者や研究者に意見を校閲・観衆をお願いして、教科書を完成させる予定である。また、本文・会話が確定した時点で音声の吹き込みや、練習問題のイラストなども専門家の協力を仰いでよりよいものにしていきたい。日本語教科書の文型調査、沖縄語教科書のテキストの文型の策定、文法解説の執筆などほぼ計画どおりに進んでいる。昨年、作成した教科書を試用するために沖縄語入門講座を開いたが、学生の確保がうまくいかなかったため。

応募時に計画した研究スケジュールに従って研究を継続する。今年度は会話文と練習問題を作成し、インフォーマントと相談しながら改訂していく。昨年度執筆した文法解説も書き改めていきたい。今年度は学生数を確保し、実際に教科書を試用して、文型や語彙の提出順序などもふくめ改訂していき、沖縄語母語話者や研究者に意見を校閲・観衆をお願いして、教科書を完成させる予定である。また、本文・会話が確定した時点で音声の吹き込みや、練習問題のイラストなども専門家の協力を仰いでよりよいものにしていきたい。
C 型肝炎ウイルスによる B 細胞蛋白質チロシンリン酸化への影響

B細胞におけるC型肝炎ウイルス(HCV)による病原性発現機構として、ウイルス蛋白質のチロシンリン酸化に着目、NS5A蛋白質がB細胞で癌や免疫系のシグナル伝達を調節するチロシンキナーゼFynに会合し活性化することを見出した。B細胞の機能障害や免疫監視機構への影響が示唆された。またプロテオーム解析にて、HCVの複製が血糖コントロールやAMP依存性プロテインキナーゼにより調節されていることを見出した。(1) HCV蛋白質を発現するB細胞の実験系の確立とHCV蛋白質によるチロシンリン酸化反応への影響:ヒトB細胞を用いてHCV蛋白質の発現系を構築し、細胞内シグナル伝達機構、特に蛋白質チロシンリン酸化反応への影響を網羅的に解析する目的で、HCVの非構造タンパク質の一つであるNS5Aを安定発現させ、肝臓の細胞同様にチロシンキナーゼSykに対する影響の有無を解析したが、当初の予想に反し、影響は認められなかった。現在はマウスモデルを用いた更なる解析を進めている。(2)プロテオーム解析:既に肝細胞についてプロテオーム解析を開始しており、HCVの複製に関与すると考えられる分子を網羅的に同定することに成功した。特に細胞内のエネルギーセンサーであるAMPK活性化に関与する酵素ATICの発現に変導を見いだし、更なる解析を進めた。(3) HCVの複製機構の分子メカニズムの解析:AMPKは細胞内AMP濃度依存的に酵素活性が上昇し、糖新生、脂肪酸合成、コレステロール合成を抑制することが知られている。またAMPKは経口糖尿病治療薬メトホルミンの標的分子である。AMPKの活性化薬と阻害薬を用いた解析により、HCVのウイルスゲノムの複製は、AMPKの活性化により負に調節されていることを見いだした。一方、培養液中のグルコース濃度を高濃度から正常域に下げることや、糖尿病治療薬であるメトホルミンの添加により、AMPK非依存性にHCVの複製が抑制されることも明らかとなった。糖尿病治療薬メトホルミンはミトコンドリアComplex 1の機能を阻害しATP産生量を減少させることが知られている。これらのことは糖尿病のコントロールや経口糖尿病薬の投与がHCV複製を抑制することを示しており、新たなHCV治療に対する道を開くものであると考えられる(投稿中)。AMPKは抗HCV薬開発の新たなターゲットであると考えられる。(1)HCV蛋白質を発現するB細胞の実験系の確立:昨年度の課題であった、HCV蛋白質(非構造タンパク質のNS5A)を安定発現させたB細胞株を樹立した。(2)HCV蛋白質とB細胞シグナル伝達分子の相互作用:B細胞をpervanadate(チロシンホスファターゼの阻害薬)で処理すると、HCV蛋白質NS5Aがチロシンリン酸化されることを見いだした。その会合蛋白質を種々のSH2ドメインのGST融合蛋白質を用いたpulli-down実験により検索したところ、チロシンキナーゼFynのSH2ドメインが劇的に会合することを見いだした。両者の会合はFynのSH2ドメインの176番目のアルギニンをリジンに置換することで消失することから、NS5Aのチロシンリン酸化チロシンを介するものと考えられた。またNS5Aの側についてはアミノ末端側の領域が会合には関与しないことが、変異体を用いた解析から明らかとなった。蛍光標識抗体を用いた解析やショ糖密度勾配遠心法による解析により、両者が細胞膜で会合していることや、far-western法により、直接会合していること、さらにNS5Aが共発現することによりFynの自己リン酸化が更新していることがそれぞれ明らかとなった(投稿中)。これらの結果はHCV感染によるBリンパ腫発症の病態解明の糸口となると考えられる。(3)HCVの複製機構の分子メカニズムの解析:昨年度の解析結果により、HCV感染により発現量が変化する蛋白質として、AMPKの活性化に関与する酵素ATICが同定された。今年度はAMPKの活性化制御や細胞培養液中のグルコース濃度の変化に対するHCV複製について解析した結果、糖尿病のコントロールや経口糖尿病薬の投与がHCV複製を抑制することを明らかにし、論文を発表した(Nakashima et al.2011)。1HCV蛋白質とB細胞シグナル伝達分子との相互作用:B細胞をチロシンホスファターゼの阻害剤pervanadate(PV)処理すると、NS5Aはチロシンリン酸化される。特異的アミノ酸配列中にあるリン酸化チロシンを認識するSrc homology 2(SH2)領域とGSTとの融合蛋白質を用いて、結合蛋白質の探索実験を行った。その結果FynのSH2領域がPV処理されたB細胞NS5Aに結合する事が明らかとなった。FynのSH2領域内でリン酸化チロシンと会合すると176番目のアルギニンをリジンに置換するとNS5Aとの会合は消失した。

また様々な欠失・置換変異体を用いて調べた結果、NS5Aのアミノ末端側は両者の会合には寄与せず、またNS5Aの334番目のチロシン残基がリン酸化部位であることが同定された。Far-western法やショ糖密度勾配遠心法により、両者は直接会合し、脂質ラフトにて共局在していることが見出された。これらの結果はNS5Aがチロシンリン酸化依存性にFynのSH2領域に会合することを示している。さらに、NS5AによりFynのキナーゼドメインの自己リン酸化部位のリン酸化が亢進していることや、キナーゼとしての酵素活性が上昇していることが明らかとなった。以上の成果は論文(Nakashima et al. PLoS One 2012)や学会にて発表した。なお、当初予定してたSykのSH2領域とは会合が認められなかった。これに関連して、チロシンキナーゼSykとその阻害剤についての総説の発表と学会発表を行った。2HCVの感染や複製への影響:本研究では単一蛋白質のB細胞における発現系で実験を行ったために、HCVの感染や複製への影響を解析することは出来なかった。今後より高度な実験系を樹立することにより引き続き解析を行う必要性があると考えられる。HCV蛋白質と相互作用するチロシンキナーゼを同定することに成功し、その機能を明らかにすることが出きたため。24年度が最終年度であるため、記入しない。今年度見いだした現象について、今後は詳細な分子メカニズムを明らかにすることや、疾患発症のメカニズムとの関連を明らかにすることが必要である。また、単一の蛋白質の発現系だけではなく、HCVゲノム全体を用いた感染実験系を新たに導入することが重要であると考えられる。
RNAを高次構造特異的に切断する人工酵素の分子設計

大環状シッフ塩基配位子を有するランタニド錯体を合成し、tRNA^<Phe>の切断を試みた。いずれの場合にも、きわめて高い活性でRNAを加水分解により切断することができた。さらに、極めて興味深いことに、有機配位子を付与し錯体とすることにより、イオンの場合に比べて、明らかに切断部位の選択性が向上することを見いだした。さらに、tRNAの高次構造を保持するのに必須であるマグネシウムイオンを除いた条件下で切断反応を行なったところ、切断部位の選択性の低下が認められた。従って、ランタニド錯体による切断の選択性には、tRNAの高次構造が深く関わっており、立体的に嵩高い配位子がtRNAの高次構造を認識して切断しているものと考えられる。また、核酸とランタニド錯体の相互作用に関する基礎的な知見を得るために、ジヌクレオチドとランタニドイオンおよび錯体の錯形成能を^1H NMRシグナルのシフトより求めた。その結果、ランタニドイオンに比べてランタニド錯体が約10倍大きな錯形成定数を有することが判明した。従って、有機配位子により錯形成能をも制御しうることが明かとなった。以上の結果は、有機配位子の分子設計が、切断位置の制御および活性の発現にきわめて有効であることを示している。これらの知見をふまえ、現在、さらに有用な切断活性をしめす金属錯体の分子設計を進めている。また、相補的な塩基配列のDNAを切断活性部位(ランタニド錯体、もしくはオリゴアミン)とハイブリッドさせることにより、任意の位置でRNAを切断しうる人工酵素の分子設計も試みている。
純チタンおよびセラミックス面へのキャスタブル・セラミックスの鋳接

今回、純チタンとキャスタブル・ガラス・セラミックスの鋳接技法を臨床応用することを目的として、キャスタブル・ガラス・セラミックスと純チタンあるいは他のセラミックスとの接合法のついて検討するとともに、その接合状態を観察した。すなわち、純チタン製メタルフレームにキャスタブル・ガラス・セラミックスを鋳接し、これら試験体について、クラックの有無および色調遮断性を観察し、同試験体の切断面においてセラミックスとチタンの接合状態をSEM観察し、組成元素の拡散状態をEDS分析した。また、純チタン面にオペーク陶材を焼付け後、キャスタブル・ガラス・セラミックスを鋳接する方法、および、セラミックス鋳接後にステイニング、グレージングを行い、色調を改善する方法についても検討を加え、以下の結果を得た。1.肉眼的に、セラミックス内にクラックの観察された試験体は全くなかった。しかし、メタルフレームの色調が透過する傾向が見られ、オペーク陶材の使用により色調は改善された。当技法を特に前歯部に使用する場合、何らかのオペーク処理を行う必要性を認めた。2.試験体切断面における接合界面のSEM観察においては、チタン表層には、反応層と見られる組織が観察され、同層とキャスタブル・ガラス・セラミックスあるいはオペーク陶材の接合状態はおおむね良好であったが、同層とチタンとの間で一部剥離が生じていた。3.グレージング、ステイニングを行うとセラミックス体内でクラックが生じる傾向が見られ、これらの処理については、さらに検討を加える必要がある。15EA05:4.当技法を使用するにあたり、チタン表面における反応層の生成を可及的に少なくする必要があると思われ、さらに検討を要するものの、臨床応用可能であることが示唆された。