hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ラピッドプロトタイピングの歯科領域への応用に関する研究

本研究は、産業界で多品種少量生産のための金型作製技術を主として発展してきたラピッドプロトタイピング技術の歯科領域への応用を目指して行ってきた。特に、ここでは、(1)歯科用CAD/CAMシステムのための加工技術の一つとしての応用、(2)3次元CTデータを元にした顎変形症などに対する手術シミュレーション用生体実体模型を作製するものの二つについて並行して検討してきた。このうち、前者はセラミックス/ポーセレンの粉末を用いてクラウンの直接積層造形による作製を目指したが、焼成時の体積収縮に伴う形状のコントロールが難しく,我々が求める精度に対する技術的確信やブレイクスルーは得られなかった.一方で,産学で進み始めた金属の積層造形については,特にチタンによる造形が可能になりつつあり,生体に直接応用できる可能性があるためたいへん期待をしている.これについては,さらに情報収集を行って検討を続けたい。後者の手術シミュレーション用模型の作製については、CTのデータを積層造形用のSTLデータへ容易に変換する手法として提案したVoxel Fomed STL形式をべースに,CTのボリューム全体に3次元のBi-Cubi〓法による補間を施してデータの拡張を行い,細部での形状の欠落を極力抑える事ができた.結果として1Voxeのサイズが0.25(W)×0.25(D)×0.50(H)mm程度で良好な手術シミュレーション用模型を実用的に作製することが可能となった.筋肉などの軟組織に対するアプローチでは,咬筋については処理が可能となったものの,今後はより容易な組織の認識・抽出が不可欠であると思われた.そこで,新たに領域拡張法の導入を試みているが,現在はまだテスト中である.これについても,本課題終了後も引き続き検討を重ねていきたいと考えている.本研究は、産業界で多品種少量生産のための金型作製技術を主として発展してきたラピッドプロトタイピング技術の歯科領域への応用を目指して行ってきた。後者の手術シミュレーション用模型の作製については、CTのデータを積層造形用のSTLデータへ容易に変換する手法として提案したVoxel Fomed STL形式をべースに,CTのボリューム全体に3次元のBi-Cubi〓法による補間を施してデータの拡張を行い,細部での形状の欠落を極力抑える事ができた.結果として1Voxeのサイズが0.25(W)×0.25(D)×0.50(H)mm程度で良好な手術シミュレーション用模型を実用的に作製することが可能となった.筋肉などの軟組織に対するアプローチでは,咬筋については処理が可能となったものの,今後はより容易な組織の認識・抽出が不可欠であると思われた.そこで,新たに領域拡張法の導入を試みているが,現在はまだテスト中である.これについても,本課題終了後も引き続き検討を重ねていきたいと考えている.本研究は、歯科領域におけるRPの応用を目指して、主に2つのテーマを内包するものである。そのうち、1つめのポーセレンクラウンの作製に関しては、まず既存の装置と樹脂を用いて、ポーセレンの積層造形によるクラウン作製が可能であることを検証した。次に、本年、本研究費により新たに導入した微細加工用光造形装置について、この装置の取り扱いと特性について検討した。さらに、この装置用の樹脂とポーセレンパウダーの混合によるシート加工についても検討を始めた。一方、実験用のCADデータの生成については、今までに作成してきたモデリングデータをもとに、本実験に最適な形式のデータに変換するソフトウェアの開発を進めているところである。2つめの、手術シュミレーション用軟組織模型の作製については、軟組織の抽出方法について、咬筋に絞って検討を重ねた結果、2次元の画像処理ではなく3次元的にデータを処理することにより、より的確に形状の抽出を行いうることを確認した。本研究は、産業界で定着しつつある新技術のラピッドプロトタイピングの歯科領域の応用を目指すものである。ここでは、CAD/CAM技術による歯冠補綴物の作製に際して、加工技術のひとつとしてこれを応用するものと、顎変形症などのチームアプローチとして手術計画を立案する際により良い咬合関係の確立を目指して手術シミュレーションを行うための生体実体模型作製に応用するものとの、主に2つの方向において検討を行っている。具体的には、前者ではポーセレンパウダーの積層造形によるセラミックスクラウンの作製を、後者では3次元CTのデータからの軟組織の抽出と造形を目指している。本年については、前者において、新たな焼成炉の導入によりポーセレンパウダーとバインダーである紫外線硬化樹脂との混合比率と焼成条件に関する基礎的データの収集を行ってきたが、微妙な比率の違いやポーセレンの種類により加工性に差異が生じ、より細かな条件設定による探索が必要なことが判明した。

後者の生体実体模型については、主に咬筋にターゲットを絞って行ってきたが、耳下腺との分離をプログラムで自動に行う部分で困難に直面しているものの、この点を除けば、ほぼ軟組織(咬筋)の自動抽出には成功し、実体模型の造形、手術計画立案のための評価のための硬組織(骨)との一体模型の作製にも成功した。現在、その形状やボリュームの評価方法の検討を進めているところである。また、この過程で、産業界でCAMのデータ形式として普及しているSTL形式をベースとして、本生体実体模型を表現するのに適した新たなデータフォーマットとして、Voxel-Formed STL形式を開発、提案することが出来た。本研究は、新技術として産業界で発展しつつあるラピッドプロトタイピングの歯科領域への応用を目指して行ってきた。特に、ここでは、(1)歯科用CAD/CAM技術の発展に伴い、これを利用する際の加工技術の一つとして捉えるもの、(2)頭頚部での手術シミュレーション用として生体実体模型を作製し、顎変形症などに対するチームアプローチを行う際の手術計画の立案とより良い咬合関係の確立のための一助に利用するもの、の二つについて並行して検討してきた。このうち、後者の手術シミュレーション用模型の作製については、咬筋に的を絞って軟組織の抽出を行ってきたが、本年度は過去に顎変形症により外科的矯正術を施行した症例数例に対して、術前、術後でのCTデータを入手し、これらの処理を施して模型作製を行い、実用性の検証をした。また、CTのボクセルデータを造形用のSTLデータへ容易に変換する手法として提案したVoxel Formed STL形式のデータについても、実際に複数の造形を行い、その実用性を検証した。その結果、この手法では、頭部でデータ量が数百MB程度と比較的大きくなるものの、造形そのものには特に大きな問題もなく、実用に耐えうることが判明した。一方、前者のポーセレンクラウンの積層造形による作製に関しては、光造形用樹脂とポーセレンパウダーの混合によるシート加工について未だ検討段階の域を出ていず、産業界で進み始めた金属粉末などの粉体の直接積層造形を中心に、より情報収集も重ねて検討している。なお、これとは別に、これらに用いる歯牙の形状モデリングについて、新たにマイクロX線CTで撮影した天然歯の歯冠・歯根データをもとに、形状モデリングを行う手法について検討を行い、単根歯についてはデータ処理とモデリングが可能となった。本研究は、産業界で多品種少量生産のための金型作製技術を主として発展してきたラピッドプロトタイピング技術の歯科領域への応用を目指して行ってきた。特に、ここでは、(1)歯科用CAD/CAMシステムを利用する際の加工技術の一つとして捉えるもの、(2)手術シミュレーション用生体実体模型を作製し、顎変形症などのチームアプローチを行う際の手術計画立案とより良い咬合関係の確立のための一助に利用するものの二つについて並行して検討してきた。このうち、前者はセラミックス/ポーセレンクラウンの積層造形による作製を目指したが、焼成時の体積収縮に伴う形状のコントロールが難しく,我々が求める精度に対する技術的確信やブレイクスルーは未だ得られなかった.一方で,産学で進み始めた金属の積層造形について,特にチタンによる造形が可能になりつつあり,生体に直接応用できる可能性があるためたいへん期待をしている.
国際的産業再編時代における合併事例の実証分析

本年度は、昨年度までの実績(最近の企業統合に関する理論的発展についての整理、ならびに実際の企業統合に対する競走政策当局の審査の手続きおよび問題点についての整理)を踏まえて、実証的検討を行うことを目標とし、日本の上場企業に関する財務諸表データの収集と整理をおこなった。一方、平成15年2月7日13日まで、カナダのビクトリア市とバンクーバー市を訪れ、カナダにおける有機食品産業の再編動向についての調査を行った。この調査は、日本の成熟した金融業あるいは製造業に置ける合併事例を対象とした前述の研究とは異なり、有機食品という比較的新しく需要が急増している産業における企業統合を対象とするものである。大手食品メーカーが有機食品メーカーの買収を進めているといわれており、ブランド名はそのままにした買収は、市場の略奪競争の様相を呈している。今回の渡航で十分なデータが得られたとは言いがたいが、実際、従来の一般品と有機食品の価格差は縮小傾向にあることがわかった。今後は、こうした成熟産業と新規産業の特性に配慮し、それぞれの産業における合併の経済的背景について一層の研究を行う予定である。平成13年度の研究実績の概要は以下の通りである。(1)最近の企業結合に関する理論ならびに実証研究の発展について整理をおこなった。(2)実際の企業結合に関する公正取引委員会の審査の手続き、問題点について整理をおこなった。各国競争政策担当当局の審査の実務についても資料を入手した。(3)最近の企業統合に関する理論的発展を踏まえ、実際の事例についての実証的に検討を行うための合併対象企業のデータ収集作業に取り掛かっている。これまでに明らかになってきたのは、従前からある一定の取引分野(市場)の確定や効率性の抗弁にかかわる費用構造の確定等の問題に加え、最近では(1)持株会社や経営統合といった統合形態の複雑化や(2)合併事由が経営者の個人的利益の追求でかならずしも企業の利益とは一致していないという問題(いわゆる塹壕仮説)が大きくなってきているということである。次年度はこれらの問題点を、実証的に明らかにすべく、日本企業の実際の合併事例の分析を行うこととしたい。
ドナー・アクセプター結合型高極性両性分子の集合化と構造・物性

電子供与性と受容性の基を準非局在共役電子系で結び、高い両性をもつ極性分子(HAPM)を設計・合成して、分子内と分子間の双方に働きうる電荷移動相互作用を利用し新規電子物性の望める分子システムを構築すべく、様々な分子集合化を試みてその構造や光・電気物性を測定し、その特徴を捉えるのが本研究の目的である。今年度は、BEDT-TTFとTCNEのそれぞれ半分をキノノイドでつないだ分子をHAPMのテスト分子に選び、分子軌道計算による分子特性の予測、合成とその両性度のキャラクタリゼーションなどを中心にして研究を進めた。なお、試料の合成や結晶化・電気測定の試行など種々の取扱いに不可欠であった不活性雰囲気は、本補助金で購入した真空ガス置換型グローブボックスの利用により実現できた。この装置がなければ本研究は成立しない。テスト分子の半経験分子軌道計算の結果は、両端の基の電子的特性を保持しながら分子内電荷移動も中規模に実現しており、この分子がHAPMの特性をそなえていることを勇示唆した。キノノイドの結合系を拡張した分子の計算結果も大きな遷移双極子モーメントや振動子強度を示し、これらの最低エネルギー吸収波長に深色効果が販著なことからも、HAPMに期待される分子特性とこれらの特徴には相通じるものがある。実際に得たテスト分子は溶解性が低く熱的にも不安定なため、十分な精製や溶液相・気相での結晶・薄膜成長は困難だった。しかし、希薄溶液の電子スペクトルはg、MO計算による最低一重項遷移波長406nmより著しく長波長の670nmに最長波長吸収帯を示し、会合効果を示唆した。また、CVの結果も酸化/還元の電位差1.615Vを与え、多段階レドックス系のPDPL(0.99V)よりは低いが狭ギャップ半導体のBTQBT誘導体と同程度(1.65V)の両性を明らかにした。今後、これらの特性を伸ばした分子を考え集合化制御に向けて研究を進める。
心臓自動能におけるリアノジン受容体とその結合タンパクの機能の解明

心臓の自動拍動やその収縮には細胞内Ca^<2+>動態が重要な役割を果たす。この細胞内Ca^<2+>動態には細胞表層膜の電位依存性Ca^<2+>チャネル(L型、T型)、Na^+-Ca^<2+>交換機構(NCX)や細胞内小胞体のリアノジン受容体(RYR)が寄与する。本研究課題の中心である心臓自動能におけるRYRとその結合タンパクの役割を検討するために今年度は以下について検討を行った。1.去年度から継続して行っている特異的干渉RNA(siRNA)やアンチセンスoligoを用いた実験系を培養細胞系にて確立させた。系を確立させるにあたって派生した研究ではあるが、心臓自動能領域にも発現しているK^+チャネルについて新知見が得られたので日本薬理学会(2005年度年会、2005年度北部会)にて報告した。現在は心筋細胞に遺伝子導入するためのウイルスベクターを用いた系の確立を検討中である。2.去年度から継続して異常自動能に関与する可能性のある細胞内の新規タンパク質についてその生体内での役割を解明するためにノックアウトマウスを用いた検討を行った。ノックアウトマウスと野生型マウスの単離心室筋細胞で、電気生理学的手法や細胞内Ca^<2+>測定、また分子生物学実験にて比較・検討を行った。その結果、ノックアウトマウスの心室筋細胞は(1)beta刺激に対する感受性が低下していた(2)外向きK^+電流密度が野生型マウスに比べて小さかった。これらの結果は日本生理学会(2005年度年会)にて報告した。3.本年度は残念ながらRYRの結合タンパクではなかったが、既知の生体内物質が心臓自動拍動の調節に寄与する可能性を得た。現在、Ca^<2+>蛍光色素のみならず膜電位色素などを用いたイメージング解析を手法として、心臓自動拍動への作用メカニズムを検討中である。この自動拍動には細胞表層膜の電位依存性Ca^<2+>チャネル(L型、T型)や細胞内小胞体に存在するリアノジン受容体(RYR)が関与している。今年度は(1)マウス自動拍動にRYRが関与し、3つ存在するRYR isoformのうち3型RYRが特殊伝導心筋に特異的に発現していることの報告(FEBS Lett.2003)、(2)心臓自動能に関する研究の一環として、ペースメーカ領域の活動電位波形に対する薬物の作用(T型Ca^<2+>チャネル抑制薬etc.)などの報告を行った(Biol Pharm Bull. 2004,J PharmacolSci.2004)。本研究課題の中心である心臓自動能におけるRYRとその結合タンパクの役割を検討するためには、特異的干渉RNA(siRNA)やアンチセンスoligoを用いた実験系の確立が必要と考えた。そこで今年度は培養細胞を用いた系で心筋のイオンチャネルのノックダウンについて検討した。イオンチャネルのノックダウンの指標には、mRNAやタンパクレベルと共に電気生理学的手法も用いた。現在までにイオンチャネルによってはsiRNAではなくアンチセンスoligo法で十分に、また選択的にその機能がノックダウンできる事が確認できている。また今年度は、細胞内小胞体に存在する新規タンパク質に関する実験も同時に行った。現在、RYRと新規タンパク質との直接の結合の有無や作用は不明である。しかし、この新規タンパク質ノックアウトマウスでは心電図測定で不整脈(異常自動能)の誘発や、単離心室筋細胞の細胞内Ca^<2+>動態の異常が観察された。よって、この新規タンパク質は細胞内Ca^<2+>動態に影響を与えるものと示唆され、その機能や役割を明らかにしていきたいと考えている。
振動子系における拘束条件の自己言及的創出と創発的システム設計

従来のシステム設計では人間が拘束条件を明示的に設定し機能を規定していた。しかしこのような設計原理に基づく限り、予測できない状況に柔軟かつ発展的に対応することはできない。一方、著者は生物的「創発性」に着目し、粘菌の走化性における環境適応的形態形成やラットの空間認知マップ生成機構を解析してきた。そして、振動子系におけるリズムの相互引き込みによる拘束条件の「自己言及的」創出の重要性を明らかにした。そこで本研究課題では、この様な生命システムにおける創発現象の根源にある拘束条件の自己創出プロセスをモデル化し、さらに人工システムとしての創発的設計原理としての確立をめざした。具体的には、群ロボットシステムをモデル系として用い、大自由度分散系の設計における逆問題をこのような新しい視点から捉えなおすことを試みた。特に、歩行ロボット群において個々のロボットの歩行運動を一種のリズムと見なし結合振動子モデルを構成した。その結果、歩行リズムの相互引き込みによって生成する位相勾配パターンが、個々のロボットとシステム全体との位置関係、さらに外部環境とシステムの関係を表現していることが明らかにされた。そして、個々のロボットはこの情報に基づいて拘束条件を自己生成し、システム全体としての機能を創発するように協調的に機能分散できることが示された。しかも、あらかじめ予測できない環境変化に対しても、状況に応じて拘束条件をリアルタイムに生成し自律的に対応できることを示した。具体的には、グループ編成の問題と協調的荷物運搬の問題に取り組んだ。
ラット切歯におけるアポトーシス関連遺伝子の遺伝子組織化学的解析

囓歯類の切歯は常生歯として常に萌出を続けていることが知られている。その構成細胞であるエナメル芽細胞、象牙芽細胞、歯髄細胞は萌出に伴い常に増殖し、供給されている。これまでは、象牙芽細胞が前象牙芽細胞だけから供給されるのか明らかではない上に、象牙芽細胞や歯髄細胞について、臼歯歯胚と同様に漠然と歯胚領域で増殖しているという報告しかなかった。歯根膜細胞の増殖や移動については詳細は明らかではない。B6C3系マウスを用い、核酸のマーカーであるBrdUとそのホモログであるIrdUで分裂細胞をラベルし、パラフィン切片を作成してそれらの分裂と移動を追跡した。さらに細胞分裂のS期のマーカーである抗PCNA(proliferating cell uncleaeantigien)抗体との二重染色によっても検討した。その結果、以下の結論が得られた。歯髄の細胞も根突部辺縁に明確な増殖帯を有し、エナメル芽細胞や象牙芽細胞とほぼ同じ速度で切端部に向かって移動する。前象牙芽細胞の一部はその近傍の歯髄の細胞から供給される可能性がある。歯根膜細胞も根突孔よりやや切端部よりに増殖帯を持ち切端部に向かって移動する。抗PCNA抗体との二重染色によって内エナメル芽細胞および象牙芽細胞さらに歯髄細胞いずれにも、移動せずに増殖帯にとどまる細胞が存在し、それが再度分裂することが示された。これらの細胞は常に従来よりも限定された増殖帯で供給され、個々の細胞がそれぞれの場によって分裂増殖能の保持または獲得がなされているのではないかと考えられた。またやがて何らかの機序で細胞死を引き起こすことが強く示唆された。
新生鎖研究のためのリボソームin vitro人為選択技術の開発

本研究ではin vitro再構成技術を用いてribosomal RNAを人為進化させる方法の開発を目的とした。16S rRNAからの試験管内30S ribosomalsubunit再構成と再構成翻訳システム、リポソーム、セルソーターを組み合わせることにより、再構成後により高い翻訳活性を持つ16S rRNAを選択することができた。選択実験を約10ラウンド繰り返した結果、翻訳活性の高い変異体を複数得ることに成功した。配列解析の結果、複数の固定変異が見つかった。そのうち1つの点変異は、それだけで翻訳活性を数倍上昇させることを見出した。この変異はこれまでの研究では、致死変異として同定されていた。自ら調べたところ、確かにこの変異を持つ16S rRNA遺伝子のみを持つ大腸菌は生育できなかった。この結果は、大腸菌内で致死の変異であっても、再構成系では高い活性を持つことを示している。さらにこの変異の影響を調べたところ、この変異によって30S ribosomal subunitの再構成頻度は大きくは変わっていないことが明らかになった。これに対し30S ribosomal subunitあたりの翻訳活性が上昇していることを見出した。本研究により16S rRNAを完全に試験管内で人為進化させる技術の開発に成功した。さらに50S subunitについても同様な人為進化系を構築するために、Geobacillus stearothermophylusと大腸菌のキメラリボソームが翻訳活性を持つことも明らかにした。G. stearohermophylusの50S subunitは大腸菌とは異なり試験管内で再構成に成功していることから、この知見により50S subunitについても人為進化への道が開けたと考える。28年度が最終年度であるため、記入しない。本研究は生鎖研究のためにリボソームの変異体をin vitroの人為選択により作り出す技術の開発を行う。その最初のステップとして以下の3つの計画を行い、16S,及び23S rRNAの人為進化より新生鎖の合成速度を上昇させたリボソーム変異体を取得する方法を確立することを目指す。1.rRNAのin vitro転写と共役したリボソームのPURE SYSTEM内再構成、2.人工脂質小胞内で再構成したリボソームの翻訳活性を蛍光で検出、3.セルソーターを使って、新生鎖合成の速いリボソームの選択本年度は上記の1ー2を達成することを目的とし、実際にその両方を達成することができた。1については、リボソーマルタンパク群を調製し、試験管内転写したrRNAと混合することで機能のある30Sリボソーマルサブユニットを再構成し、その翻訳活性を測定することができた。また2については、30Sサブユニットの再構成反応を人工脂質小胞に封入し、rRNAの転写依存にレポーター遺伝子の翻訳と蛍光による活性検出ができることを示した。さらに3の内容であるセルソーターを使って、新生鎖合成の速いリボソームを選択する実験も行った。ランダムに変異をいれた16s rRNAを使ってよりレポーター遺伝子の発現の多い配列を選択する操作を行った。現在までに平均の遺伝子発現が増加していることを確認しているが、本当に新生鎖合成速度が上がっているかは今後検証する必要がある。当初はrRNAの選択実験は来年度の計画としていたが、研究が予想以上に進展し、本年度に1部の計画を前倒しで実行することができたため。選択実験を続けるとともに、得られた変異体16s rRNAの機能解析を行う。解析する機能としてin vitroでの再構成効率、翻訳効率、vivoでの活性等を測定する予定である。
インクルーシブ教育のための発達障害対応型教室周り個別学習支援空間の整備要素

国内の市町村3か所の教育委員会に対しヒアリングを行い、インクルーシブ教育の実態について把握した。特別支援学校、インクルーシブ教育に積極的に取り組む普通学校を視察し、特別支援に対する方策として様々な形があることを認識した。特に着目した点は、幼稚園・保育園の年長から小学校に進学する際の就学先決定プロセス、および普通小学校に特別支援児が入学した場合の人的サポートの面である。就学先決定プロセスには、自治体ごとに特徴がでた。千葉市はIQテストや行動検査の結果をもとに教育委員会の方から保護者に対して就学先を提案していく形をとっている。対して、大阪市は保護者の意向を100%汲む体制であり、特別支援児を迎え入れる普通学校は、対策を講じる必要があり、そのための人的サポート体制が整備されていた。広島市は、千葉市と大阪市の中間的な方法で就学先を決定している。人的サポートについては、調査した3市とも加配の教員、もしくは教職免許を持っていないサポーターをつけている。特に大阪市は専門職のサポーターの配置も充実しており、インクルーシブ先進市といえる。イギリスの特別支援学校やインクルーシブ学校などを8校視察し、イギリスの特別支援の在り方、様々なインクルーシブの在り方を把握した。イギリス特有の空間構成についても見てきた所である。調査では特に、自閉症児のための落ち着きスペースに着目した。落ち着きスペースは、教室からのアクセスのしやすさにより段階的に設けられている。教室から直接アクセスできるカームルームやグループルーム、庭やテラスが落ち着きを取り戻したい時の最初のチョイスとなる。次には、廊下からアクセスする何も置いてない、または机や椅子だけの簡素なカームルーム、ゆっくり歩いて気持ちを整えられるスロープ、柔らかい物ばかりで構成されるソフトプレイルームがある。国内調査と1度の海外調査を実施済である。海外調査は2回を予定しているので、あと1回を残りの期間で行う。残る海外調査は、インクルーシブ教育に意欲的に取り組み実績のある普通学校を視察することである。訪問国はスウェーデンを予定していたが、インクルーシブの在り方は様々で、他の国の方策も参考にできることから、訪問国については再度検討している所である。具体的には、元は特別支援学校だった所を普通学校にしている事例のあるドイツ、国家として多文化主義を主張しマイノリティーへのサポートが手厚いオーストラリアなども考慮に入れている。今後、共同研究者の都合などもあわせて検討していく予定である。次年度使用額は、14730円でありおおむね予定通り研究が進んだことを示している。翌年度分と合わせて調査旅費に使用する予定である。
複製フォークの安定化機構とその破綻による病態の解析

高等真核細胞における染色体の様々な非コードDNA領域には、「脆弱部位」が進化上保存されており、生命維持に必須な何らかの機能が想定されている。本研究ではcommon fragile siteをはじめとした脆弱部位のクロマチン動態や、複製フォークの安定化機構について、ヒト疾患との関連に着目して解析を行った。具体的には、染色体ストレス高感受性部位のゲノムワイドな解析、複合体プロテオミクスによる複製フォーク安定化と崩壊機構、染色体ストレス下のチェックポイントキナーゼATRIP-ATR初期活性化機構などについて、重点的に解析した。1)染色体ストレス高感受性部位の網羅的解析:染色体ストレス高感受性部位を同定し、その性状を解析するため、まずATRIP、FANCD2に対する抗体を作成中である。両者のGST融合蛋白質を大腸菌から精製し、ウサギ二匹づつに免疫を行っている。また、GFPやFLAG-HAタグを付加したATRIP、FANCD2等のDNA損傷応答タンパク質を発現するヒト細胞株を入手、作成した。最低限これらの細胞を使用して検討は可能であるが、さらに、タグ配列を内在性遺伝子座にノックインした細胞を作成するのが望ましいと考え、最近注目のゲノム編集法であるTALENの導入を開始した。一方、ニワトリDT40細胞におけるfragile siteの同定のため、ヒト細胞と同様のプロトコールで染色体断裂の誘導を試みたが、不調に終わった。さらに、ヒト3番染色体をもつDT40を鳥取大学押村教授より入手し、同様に調べたが、染色体断裂は観察できなかった。ニワトリ細胞でもヒトなどのfragileサイトに相当する遺伝子は保存されているが、その性質は異なっていると考えられ、ニワトリにおける染色体断裂としてのfragile siteの検討は不可能であると判断した。2)複合体プロテオミクスによる複製フォーク安定化と崩壊機構の解析:Hela S3細胞に、ATRIP、FANCD2、FANCI、FANCLなどをFLAG-HAタグを付加してレトロウイルスで発現させた。これらの因子の複合体精製を行い、新規の会合因子を複数同定することに成功した。染色体ストレス下のATRのリン酸化基質の網羅的同定を目指し、Silac法の検討を開始した。3)染色体ストレス下のチェックポイントキナーゼATRIP-ATR初期活性化機構の解析:染色体ストレスの初期応答においては、中心分子であるATRがクロマチンに集積し、さらに様々な因子依存的にATRが活性化される。しかし、その分子機構はいまだに十分理解されていない。我々は、ATRの必須会合分子であるATRIP分子がクロマチンに集積するために、ファンコニ貧血コア複合体成分が重要であることを見出した。この成果を論文投稿中である。1)染色体ストレス高感受性部位の網羅的解析:染色体ストレス下におけるDNA損傷応答タンパク質のクロマチン集積を指標に、ストレス高感受性部位を同定し、その性状を解析する。新規のゲノム編集酵素であるTALENを用いてヒト細胞のFANCD2遺伝子C末領域に3xFLAGタグをノックインすることに成功した。今年度は、ChIP条件の検討をほぼ完了したので、来年度は太田班との連携でChIP-seq法を実施し、非コードDNA領域との関連に着目しつつ、ストレス高感受性部位をゲノムワイドに同定することを試みる。2)複合体プロテオミクスによる複製フォーク安定化と崩壊機構の解析: ATRIP、FANCL、FANCD2、FANCIの複合体精製により同定された因子のうち、FANCD2に会合するCtIPを中心に解析した。CtIPはFAND2依存的に損傷局所に集積し、DNA二重鎖切断の末端においてend resectionに機能することがわかった。これらの結果は、CtIPがFANCD2の機能的エフェクターとして複製フォーク安定化に寄与することを意味している。3)染色体ストレス下のチェックポイントキナーゼATRIP-ATR初期活性化機構の解析:ATRIP因子のクロマチン集積にファンコニ貧血コア複合体成分が重要な役割を果たすことを見出した。ATRIPとFANCLは会合することが判明し、ATRIPとRPAの結合を安定化する。これらの成果をまとめ論文発表した(Nucleic Acids Res. 41(14):6930-6941 (2013))。4)領域内の他班との連携:ChIP-seqは太田班との連携研究である。小林班の同定した酵母においてrDNA安定性に重要な因子の高等生物における機能にを明らかにするためRPL27A分子のノックアウト細胞構築を行った。また、桝本班とは、CENP-AシャペロンHjurpのDNA損傷と複製ストレスにおける役割について検討中である。特に、Hjurpの損傷局所への集積と、各種因子との直接会合を検討した。1)染色体ストレス高感受性部位の網羅的解析:てヒト細胞のFANCD2遺伝子C末領域に3xFLAGタグをノックインし、太田班との連携でChIP-seq法を実施した。低用量アフィディコリンの刺激下でFANCD2は既知のcommon fragile siteとして知られる領域、しかも遺伝子領域(イントロンを含む)に一致して局在していた。この結果は、複製ストレス応答におけるFANCD2の集積に転写の影響が大きいことを示唆する。今後はD2の集積に及ぼす転写やスプライシングの影響について調べる。2)複合体プロテオミクスによる複製フォーク安定化と崩壊機構の解析: FANCD2に会合するCtIPはFAND2依存的にクロスリンク損傷局所に集積し、クロスリンク部位切断後のDNA二重鎖切断の末端処理に機能することがわかった。

この結果は、Cell Reports 2014 May 22;7(4):1039-47.にて報告した。3)In Cell AnalyzerによるsiRNAスクリーニング解析に供するため、(1)FANCAのCRISPR/CASによるノックアウト(293T、U2OS)、(2)FA患者細胞、およびペアとなる相補された細胞(GM6914、GM6914+FANCA)のGFP、RFP、mCherryなどの発現、(3)細胞周期マーカFUCCIの発現(U2OS)等を行った。MMC刺激後の細胞数の解析では、GM6914よりもGM6914+FANCAの方が明確な低下を示しており、スクリーニングに使用しにくいことがわかった。今後、細胞周期などのパラメータをテストする。4)RPAに会合する新規分子(従来比較的解析されていない)が相同組換えと複製ストレス応答に重要であることを同定した。複製フォーク安定化に重要と考えられる。この分子の生化学的な解析を進めているが、同時に個体レベル機能の解明のため、ゼブラフィッシュのシステムを導入した。今後、CRIPSRによるノックアウト個体を準備する。複製ストレス下のファンコニ貧血遺伝子FANCD2のゲノムワイドな分布をChIP-seq法にて検索した。U2OS細胞のFANCD2遺伝子座の終止コドンに3XFLAGタグをTALEN法によってノックインし、抗FLAG抗体によってクロスリンクしたクロマチンを免疫沈降し、ゲノムDNAを次世代シーケンサーによる解析にかけた(東大太田研究室、総研大印南研究室との共同研究)。その結果、低用量アフィディコリンによる複製ストレス下におけるFANCD2の全長0.5-1.0Mbpの巨大遺伝子の中央部分イントロンに集積しており、しかも従来同定されたcommon fragile siteとの一致が目立っていた。この集積は、RNAseH1の発現によって低下するらしく、FANCD2のフォーカス形成も著しく低下することがわかった。面白いことに、マイトマイシンC刺激による集積も極度に低下していた。これらの結果は、FANCD2の集積メカニズムにおけるRループ形成の役割を強く示唆している。今後、なぜFANCD2が遺伝子中央部分に集積するのか、解明を試みる。高等真核細胞における染色体の様々な非コードDNA領域には、「脆弱部位」が進化上保存されており、生命維持に必須な何らかの機能が想定されている。本研究ではcommon fragile siteをはじめとした脆弱部位のクロマチン動態や、複製フォークの安定化機構について、ヒト疾患との関連に着目して解析を行った。具体的には、染色体ストレス高感受性部位のゲノムワイドな解析、複合体プロテオミクスによる複製フォーク安定化と崩壊機構、染色体ストレス下のチェックポイントキナーゼATRIP-ATR初期活性化機構などについて、重点的に解析した。
超音波探傷板波法による鋼橋に生じる疲労き裂の検出と長期監視システムの構築

鋼橋の部材が交差する部分において,疲労き裂の発生が問題となっている.疲労き裂の検出手法としては,これまでは目視が主であったが,一つの橋だけでも検査箇所は多いということ,目視では客観性に欠けるなどの問題点がある.検出手法として超音波探傷試験が取り入れられつつある.鋼の音響異方性は,超音波探傷試験を行う際に問題となるものの一つである.超音波波動は鋼材中では弾性波として伝播していく.伝播速度や伝播方向に影響を与えるのが弾性係数である.音響異方性が強い場合,超音波探傷試験結果はセンサの公称の仕様とはまったく異なった結果を示すことになる.鋼の音響異方性は圧延時の冷却速度や圧下率の影響を受けるといわれている.この過程を考慮すると板厚方向の弾性係数などの特性は変化していることが考えられる.実験により板厚方向の弾性係数の変化を調べた.試験体として,音響異方性の高い板と比較的低い板を用意した.板の厚さは40mmである.板厚方向に板を切削した試験片を作成した.各試験片に対して,音速を計測した.弾性波動伝播速度は物体の密度の影響も受ける.試験片の密度も計測した.実験の結果,密度は板厚方向でそれほど変化しないことが認められた.また,音速は板表面に近いほど音速が速くなる傾向が見られた.圧延の影響を調べるために,鋼の結晶を板厚方向の変化を考慮しながら,顕微鏡で観察した.その結果,板表面近傍では結晶が扁平に近いという結果が得られた.鋼プレートガーダー橋の横桁取り付け部など部材が交差する部分において疲労き裂の発生が問題となっている.これらの疲労き裂は検出されたとしても,火急の対策を必要とするものばかりではなく,進展挙動を定期的に監視するだけでよいものもある.しかしながら,1つの橋梁において,検査すべき箇所は多数存在し,監視員の目視に頼るだけでは効率的な検査を行うことは困難である.平成16年度は長さ4メートルほどの桁を用いた実験を行った.はじめに,垂直補剛材があることにより,波形がどのように変化するかを調べた.垂直補剛材を見立てた鋼板を溶接する前と溶接したあとの波形の変化を調べた.また,微小なき裂を模擬した穴を桁に開け波形の変化を検出できるか検討した.さらに,補剛材近辺にも穴を開け,補剛材が存在した場合にも穴を検出できるか検討した.実際の疲労き裂は穴とは異なるので,数値シミュレーションによっても波形の変化を検出できるか検討した.波動伝播解析において,残留応力の影響を調べることを念頭に入れ,残留応力の数値解析も行った.溶接過程において発生する相として,パーライト,オーステナイト,液相,マルソテンサイトを考慮した.ヤング率など材料特性の温度依存性の他に,相変化に伴う潜熱や体積変化も考慮できるモデルとした.今後は疲労試験を行うことや,多チャンネルで波形をとること,板波だけではなく,表面波などの異なった種類の波動の利用の検討,および波動伝播の数値解析を行うことを検討している.鋼橋の部材が交差する部分において,疲労き裂の発生が問題となっている.疲労き裂の検出手法としては,これまでは目視が主であったが,一つの橋だけでも検査箇所は多いということ,目視では客観性に欠けるなどの問題点がある.検出手法として超音波探傷試験が取り入れられつつある.鋼の音響異方性は,超音波探傷試験を行う際に問題となるものの一つである.超音波波動は鋼材中では弾性波として伝播していく.伝播速度や伝播方向に影響を与えるのが弾性係数である.音響異方性が強い場合,超音波探傷試験結果はセンサの公称の仕様とはまったく異なった結果を示すことになる.鋼の音響異方性は圧延時の冷却速度や圧下率の影響を受けるといわれている.この過程を考慮すると板厚方向の弾性係数などの特性は変化していることが考えられる.実験により板厚方向の弾性係数の変化を調べた.試験体として,音響異方性の高い板と比較的低い板を用意した.板の厚さは40mmである.板厚方向に板を切削した試験片を作成した.各試験片に対して,音速を計測した.弾性波動伝播速度は物体の密度の影響も受ける.試験片の密度も計測した.実験の結果,密度は板厚方向でそれほど変化しないことが認められた.また,音速は板表面に近いほど音速が速くなる傾向が見られた.圧延の影響を調べるために,鋼の結晶を板厚方向の変化を考慮しながら,顕微鏡で観察した.その結果,板表面近傍では結晶が扁平に近いという結果が得られた.
生涯学習社会における学校教育と学校外教育の役割と連携

当初の研究計画に基づき,平成7年度に引き続いて、研究分担者を次の3班に編成して研究を進めた。1)中等教育に関する研究班:単位制による定時制・通信制を先進的に試みている大阪府立桃谷高校を訪問調査し、教員との意見交換や資料収集を行った。そのうえで大阪府立富田林高等学校定時制教頭の今西氏より、大阪府の定時制・通信制学校の現状と課題について、とくに学校教育と社会教育の連携(学社融合)に焦点づけた研究報告を受け、集中討議を行った。2)不登校・フリースクールに関する研究班:民営フリースクール「なわて遊学場」、光栄フリースクール「パル」(大阪市)、大阪府の適応指導教室、フリースクール関係者の市民サークル「もうひとつの学びの場」の運営責任者より、その現状と課題について報告を受け、とりわけ生涯学習社会における学校教育の新たな位置づけについて研究討議を深めた。3)外国情報に関する研究班:アメリカ合衆国のクロンララ・フリースクール高等部長のナット・ニードル教育学博士より、「オルタナティブ教育と生涯学習」のテーマによる論文寄稿を得て、同スクールにおいて教員を勤めていた若林氏とともに研究討議を行った。また、デンマーク、カナダ、英国等の、とくにホーム・スクーリングに関する資料収集を行い、家庭教育と学校教育・社会教育の役割と連携について研究を進行中である。本研究課題は、追加採択された旨の連絡を平成7年10月下旬に受けて以後本格的に始動したため、本年度末までに申請書に記した当初計画のすべてについて遂行することはできなかったが、(1)初等・中等教育、(2)不登校・フリースクール、(3)外国情報に関する3研究班のうち、不登校・フリースクールに関する研究班が中心となって以下のような研究活動を進めた。1.不登校児童・生徒のための受け皿として、あるいは既存の学校教育の枠組みにとらわれない学びの場として各地で活動を続けるフリースクールについて、その活動実態を具体的に知り、研究参加者間で知見を共有するために、大阪・兵庫を中心とした地域で活動するフリースクール主宰者を研究会に招き、それらのスクールが置かれている状況や子どもたちの様子について、資料をもとに紹介・報告を受けた。2.一方これとあわせて、各自治体の教育委員会、あるいは各学校において不登校・いじめ問題にの取り組む担当者・教員にも参加を仰ぎ、行政の立場や学校現場の意識について知見を深めた。さらにフリースクール主宰者と学校・行政担当者との間での意見交換の場を設け、双方からの疑問点、あるいは共通の課題として取り組むべき問題点を検討した。また府下自治体の生涯学習施策担当者を招き、学校教育と学校外教育の連携の可能性について現行の生涯学習行政の視点も交えて意見交換をおこなった。3.なお、府県レベルでの生涯学習への取り組みの実態を把握するため、いくつかの都府県の生涯学習センターなどを視察し、資料収集をおこなった。
アディポサイトカイン分泌異常に基づくＮＡＳＨ病態解析からの新規糖鎖マーカーの開発

非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)は現在増加の一途をたどっており、肝硬変・肝がんへと進展しうる。NASH診断は現在肝生検によってのみ可能であるが非侵襲的な血液診断が待望されている。我々は糖鎖とアディポサイトカインに着目してNASHの病態解析および新規バイオマーカー開発を行った。本研究でアディポサイトカインsecreted frizzled related protein 5 (Sfrp5)欠損が肝臓線維化を進展させることを明らかとし、またフコシル化ハプトグロビン、Mac-2 binding protein(Mac2bp)、フェチュインAが新規NASHバイオマーカーとなることを見いだした。平成25年度も計画書に従い、研究を遂行していった。平成24年度に同定した非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)の新規鑑別・病期診断血液バイオマーカーであるMac-2 binding protein(Mac-2bp)、フコシル化ハプトグロビンについてはそれぞれ論文化することができた。これら平成24年度に行ったestimation studyに引きつづき、他施設共同研究によるvalidation studyのために非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)患者血清を集めていった。現在300例を超える血清の収集が済んでおり、今後Mac-2bp、フコシル化ハプトグロビンについて検討をしていく予定である。また現在Mac-2bp欠損マウスを作製中である。さらに肝臓におけるフコシル化の中心的糖転移酵素であるFut8の欠損マウスも現在作製中である。これらマウスが作製できればNAFLD病態進展におけるMac-2bp、フコシル化の役割について基礎的検討を行っていく予定である。また平成25年度は新規アディポサイトカインであるSfrp5(secreted frizzled-related protein 5)の肝臓線維化進展における役割の検討を行い、Sfrp5がWnt5aシグナルを抑制することにより肝線維化進展に中心的役割を担う肝星細胞の増殖・遊走を阻害すること、四塩化炭素誘発肝線維化モデルでSfrp5欠損マウスは野生型マウスに比べ肝線維化が増悪することを示し、現在これら研究成果を論文投稿中である。今後Sfrp5のヒトNAFLD患者での役割についても検討していく予定である。平成24年度は計画書に従い、まずヒト非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)患者血清126検体を用いて血清の新規糖鎖マーカーのシーズ探索を行った。24例の健常コントロール、19例の単純脂肪肝患者、107例の非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)患者血清を用いた。以下の新治験を得た。1,血中フコシル化ハプトグロビン値を当研究室で開発したELISAキットを用いて測定したところ健常コントロールと単純脂肪肝患者では差を認めなかったがNASH患者では著明に上昇していた。2,血中フコシル化ハプトグロビン値は従来の単一血清NASH診断マーカーとして知られているcytokeratin 18 fragment(M30)より有用性が高かった。3,血中フコシル化ハプトグロビン値はNASHの特徴的な組織像である風船様肝細胞の出現頻度と強い相関関係を持っており、多変量解析の結果でも他の血中マーカーと独立して風船様肝細胞のスコアの決定因子であった。4,フコシル化の標的蛋白として我々が既に同定していたMac2 binding protein (Mac2bp)に着目し、同様に我々の開発したELISAキットを用いてNASH鑑別能について検討したところフコシル化ハプトグロビン以上に有用性の高いNASH鑑別マーカーであることがわかった。5,血中Mac2bp濃度は健常コントロールに比べ、単純脂肪肝患者で有意に高く、NASH患者ではさらに高値を示した。また線維化のステージ進展に伴い有意に上昇していった。以上の成果について現在論文投稿中である。25年度以降はさらにMac2bpのフコシル化の程度の違いがNASHの診断マーカーになるかどうかについて検討していく。またフコシル化タンパク、Mac2bpに着目して動物モデルを用いた検討を行い、フコシル化、Mac2bpのNASH進展における意義について基礎的検討を展開していきたい。四塩化炭素誘発肝線維化モデルを用いた検討ではSfrp5 KOマウスでWTマウスに比べ肝線維化進展が有意に増悪した。In vitroの検討ではWnt5aにより肝星細胞の遊走・増殖が促進され、Sfrp5はそれらを完全に抑制した。C-jun N terminal kinase (JNK)リン酸化は肝線維化を促進的に作用することが知られている。

Wnt5aは肝星細胞のJNKリン酸化を起こすがSfrp5はこれも抑制した。以上の検討により、新規アディポサイトカインSfrp5はWnt5aの作用を阻害することで肝線維化を抑制することが明らかとなった。糖鎖バイオマーカー開発のためまず肝生検で組織診断のついている127名のNAFLD患者血清を用いて血中Fuc-Hpt、Mac2bpを測定した。これら2つのマーカーはNASH鑑別診断において従来有用性が最も高いとされているcytokeratin 18 fragmentよりも鑑別能が優れていた。一方血中フェチュインA値は代表的肝臓線維化マーカーであるヒアルロン酸値と逆相関し、肝臓線維化進展と逆相関することがすでに知られている血小板数と正の相関を示した。肝生検NAFLD症例では線維化の早期の段階で血中フェチュインA値が低下することがわかった。肝臓病学estimation studyとしてフコシル化ハプトグロビン、Mac-2 binding proteinがそれぞれ新規NASHバイオマーカーであることを示すことができ、論文化することができた。validation studyのための他施設共同研究での血清収集も順調に進んでいる。基礎実験についてはMac-2bp欠損マウス、Fut8欠損マウスをそれぞれ作製が進行しており、平成25年度はこれらを用いた実験を開始できる予定である。Sfrp5欠損マウスの実験については線維化抑制について機序を含めた研究成果を出すことができ、論文投稿中である。以上より当該研究はおおむね順調に進展していると考える。集めたNAFLD患者血清を用いて当初予想した理論通り血中のフコシル化タンパクがNASHと単純性脂肪肝の鑑別マーカーになりうることを示すことができた。まだ症例数が少ない点、validation studyが出来ていない点については今後多施設共同研究によりさらに症例を蓄積して行っていきたい。マウス実験については現在新規アディポサイトカインsecreted frizzled related protein 5 (Sfrp5)欠損マウスを用いた実験、肝臓のフコシル化に重要なFut8の欠損マウスを用いた実験を準備中である。現在収集中の他施設共同研究でのNAFLD患者血清を500例まで収集し、Mac-2bp、フコシル化ハプトグロビンについてのvalidation studyを行っていく。マウスはMac-2bp欠損マウス、Fut8欠損マウスを作製し、NAFLD病態進展におけるMac-2bp、フコシル化の意義についての検討を行っていく。ヒト検体を用いた検討については今後多施設共同研究により症例数を増やし、今回見いだした血液糖鎖マーカーがNASH鑑別マーカーとなりうるかについてvalidation studyを行っていきたい。
高等植物細胞壁のアラビノガラクタン－プロテインの糖鎖構造と機能

植物の細胞壁は主にセルロースと各種の多糖(ペクチン、ヘミセルロース)ならびにアラビノガラクタン-プロテイン(AGP)と呼ばれる糖タンパク質で構成される。本研究ではAGPの糖鎖に着目し、糖鎖を特異的に分解する酵素の探索、酵素遺伝子のクローニング、酵素によるAGP糖鎖の断片化と構造解析、得られたオリゴ糖の生理機能解析を目指した。エノキタケ培養液から新規な酵素、エンド-β-1,3-ガラクタナーゼ、を精製してその性質を明らかにした。各種AGP分解酵素を用いてアラビドプシス葉のAGP糖鎖を断片化して構造を調べAGP糖鎖の構造モデルを構築した。同様にして、ダイコン成根AGPの糖鎖構造を明らかにした。本研究ではAGPの糖鎖に着目し、糖鎖を特異的に分解する酵素の探索、酵素遺伝子のクローニング、酵素によるAGP糖鎖の断片化と構造解析、得られたオリゴ糖の生理機能解析を目指す。申請者達はAGP糖鎖の特異的分解酵素(特定の糖鎖配列を認識して分解する酵素)として、既にエキソ-β-1,3-ガラクタナーゼとエンド-β-1,6-ガラクタナーゼを見出している。平成23年度はエンド-β-1,3-ガラクタナーゼの探索を行い、エノキタケ培養液から各種クロマトグラフィーで酵素を精製した。精製酵素のN末アミノ酸配列を調べ、その配列をもとにエノキタケcDNAデーターベースを利用して全長cDNAを単離した。精製酵素の基質特異性などの性質を調べ、その成果を専門誌(Kotake et al., Journal of Biological Chemistry, 286巻, 2011年)に発表した。平成24年度はAGP糖鎖の特異的分解酵素として、今までに知られていないエキソ-β-1,6-ガラクタナーゼを見出すために各種微生物培養液を用いてその酵素活性を探索した。現在までのところ良好な結果は得られず、活性測定系の再検討などが必要と考えている。さらに、ケンブリッジ大学のDupree教授と共同で、今までに見出した各種AGP分解酵素を用いてアラビドプシス葉のAGPの断片化とその構造解析を行った。得られたオリゴ糖の構造を調べAGP糖鎖の構造モデルを構築した。本成果を専門誌(Tryfona et al., Plant Physiology, 160巻, 2012年)に発表した。本研究によってアラビドプシスAGPの生理機能解明がさらに進展すると期待される。精製酵素のN末端アミノ酸配列を調べ、その配列をもとにcDNAを単離した。酵素の基質特異性などの性質を調べ、その成果を発表した(Kotake et al., Journal of Biological Chemistry, 286巻, 2011年)。平成24年度はAGP糖鎖の特異的分解酵素として、今までに知られていないAGP分解酵素活性を探索した。平成25年度も継続したが良好な結果は得られていない。ケンブリッジ大学のDupree教授と共同で、今までに見出した各種AGP分解酵素を用いてアラビドプシス葉のAGPの断片化とその構造解析を行った。得られたオリゴ糖の構造を調べAGP糖鎖の構造モデルを構築した(Tryfona et al., Plant Physiology, 160巻, 2012年)。

申請者達は、微生物起源の酵素を検索・精製して、AGP糖鎖の特異的分解酵素(特定の糖鎖配列を認識して分解する酵素)を見出した。このうち、エキソ-β-1,3-ガラクタナーゼとエンド-β-1,6-ガラクタナーゼは新規な酵素であり、EC numberが付与されている。本申請課題では、さらなるAGPの糖鎖分解酵素の検索と精製を目指す。具体的には、エンド-β-1,3-ガラクタナーゼとエキソ-β-1,6-ガラクタナーゼに着目する。これら酵素を用いた糖鎖の断片化と構造解明を進める。得られたオリゴ糖の生理機能解明を試みる。これらの実験ステップによってAGPの糖鎖構造・機能相関に関する知見の進展を図る。平成23年度はエンド-β-1,3-ガラクタナーゼの探索を行い、エノキタケ培養液に酵素活性を見出した。培養液からイオン交換クロマトグラフィーとゲルろ過クロマトグラフィーにより酵素を精製した。精製酵素の相対分子量は30 kDaだった。精製酵素のN末アミノ酸配列を調べ、その配列をもとにエノキタケcDNAデーターベースを利用して全長cDNAを単離した。cDNAを発現ベクターに組込み、ピキア酵母を用いて組換え酵素を作製した。様々な多糖類を用いて酵素の基質特異性を調べたところ、ネイティブ酵素、組換え酵素いずれもβ-1,3-ガラクタンに最も活性を示した。これらの成果を専門誌(Journal of Biological Chemistry, 286巻, 2011年)に発表した。平成23年度はエンド-β-1,3-ガラクタナーゼの精製を行った。実施計画では平成24年度に予定していたが平成23年度内に目的酵素をコードしている遺伝子のクローニングが終了した。平成24年度は本課題で得られた組換えエンド-β-1,3-ガラクタナーゼと他のAGP分解酵素と組み合わせて、ケンブリッジ大学のDupree教授と共同でアラビドプシス葉のAGPの特異的断片化とAGP糖鎖構造モデルの構築を行った。本課題は平成23、24年度の2年間を予定していたので、研究実施計画より早く研究を進めることができた。平成23、24年度の研究成果は論文発表出来たので満足のいく研究達成度であると自己評価している。しかしながら、平成24年度の目標の一つであったエキソ-β-1,6-ガラクタナーゼの探索は良好な結果が得られなかった。本課題については平成25年度も引き続き酵素の探索を継続する。平成23年度の研究実施計画では、エノキタケ培養液からのエンド-β-1,3-ガラクタナーゼの精製を予定していたが、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過等で酵素を精製することができた。実施計画では平成24年度に目的酵素をコードしている遺伝子をクローニングする計画であったが、平成23年度内にクローニングが終了し、またピキア酵母を用いて組換え酵素タンパク質を発現・調製できた。Native酵素と組換え酵素の一部の性質を明らかにすることができた。これらの研究成果は論文として発表した。研究実施計画より早く研究を進めることができ、満足のいく研究達成度であると自己評価している。平成23、24年度とも研究実施計画より研究を早く進めることが出来たが、平成24年度に予定していたエキソ-β-1,6-ガラクタナーゼの探索は良好な結果は得られなかった。平成25年度も引き続き酵素の探索に取り組む。