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移行経済諸国におけるエコロジー近代化の比較分析

移行経済諸国のエコロジー近代化(EM)に関する主要な研究業績を体系的に収集し、その内容を精査した上で、システマティックレビューの対象として約250点の文献を選択した。その一部は、出版物(徳永昌弘『20世紀ロシアの開発と環境』北海道大学出版会、2013年)の参考文献リストの一部として公開した。次に、EMに該当する研究数が多かった中東欧諸国に関する先行文献の分析から開始し、それぞれの文献属性をコーディングしたデータベースを作成したうえで、EMもしくは環境面での体制移行の評価、ならびにその過程で欧州連合が果たした役割に対する評価は、各研究の文献属性の一部とコーディング方法に影響されることが判明した。本研究の目的は、1980年代以降の欧州で発展した「エコロジー近代化」(以下EMと略す)という理論的フレームワークの中で、計画経済から市場経済への移行経済諸国における環境ガバナンスの展開を検討することにある。メタ分析を用いた先行研究のレビューにより、移行経済諸国に対するEMのアプローチと研究成果を整理した上で、世界のエネルギー浪費国と言われる中国とロシアにおけるEMの発展と展望について、実証的に分析する。さらに、2004年5月及び2007年1月のEU加盟がEMの促進を実現したとされる東欧諸国と比較することで、移行経済諸国のEMの特徴と問題点、並びに到達点について、対象国のパネルデータ分析を通じて明らかにする。本研究の中間年度に当たる平成24年度は、前年度(平成23年度)に作成したメタ分析対象文献リストの内容を精査し、約400点の論文・書籍の要約等をチェックした上で、最終的な分析対象として約150点の文献を選択した。その過程で、当初予想した以上に英語文献の数が多かったことと、現地語(主にロシア語と中国語)で発表された文献の多くは英語でも発表されていることが判明したため、当面は英語文献のみを取り上げることにした。そのリストは出版物(徳永昌弘『20世紀ロシアの開発と環境』北海道大学出版会、2013年)の参考文献リストの一部として公開した。メタ分析対象文献の内容は、所定の形式とルールに従って抽出され、データベース化されなければならない。検討の結果、国・地域別の共通点と相違点を探索的に分析することを重視し、1)どのようなEMの定義をしているか、2)どのようなEMの評価を下しているか、3)その決定要因を何に求めているかの3点を軸に整理することにした。分析対象となる文献は定性的研究が大半を占めるため、当面はシステマティックレビューとも呼ばれるメタ分析を進めることで合意した。本研究の狙いは、1980年代以降の欧州で発展した「エコロジー近代化」(以下EMと略す)という理論的枠組みを用いて、計画経済から市場経済への移行経済諸国における環境ガバナンスの展開を実証的に検証した先行研究の成果と課題について、メタ分析という手法を用いて客観的に把握することにある。本年度は、昨年度に検索・収集したメタ分析対象研究のコーディング作業と計量分析の段階に進み、研究成果の一部は移行経済分野の学術誌に発表した。メタ分析対象研究の数が多かった中東欧諸国に関する先行研究60点(すべて英語文献)の分析から開始し、各研究の文献属性をコーディングしたデータベースを作成したうえで、EMもしくは環境面での体制移行の評価、ならびにその過程で欧州連合(EU)が果たした役割に対する評価を従属変数に置き、各研究の文献属性を独立変数とする回帰モデルを構築した。今回のメタ分析対象研究は定性的性格のものが大半を占めたため、一般にシステマティックレビューと呼ばれるメタ分析の段階にとどめた(メタ統合・回帰分析や出版バイアスの検定は技術的に困難なため、順序プロビット推定量を用いた回帰分析を行った)。以上の分析結果の考察から、著者の所属機関所在地、複数国研究・単一国研究の別、分析対象国・地域、論文のトピックス、著者の専門領域、掲載誌の学問分野などの文献属性が、中東欧諸国におけるEMの成果や環境面での体制移行の成否、ならびにEUが果たした役割に関する評価に有意に影響していることが判明した一方で、分析結果の解釈が困難なケースやサンプル数の少なさに起因すると考えられる技術的な問題が発生するなど、今後の研究に向けて改善の余地が必要であることも分かった。本研究の目的は、1980年代以降の欧州で発展した「エコロジー近代化」という理論的フレームワークの中で、計画経済から市場経済への移行経済諸国における環境ガバナンスの展開を検討することにある。

本研究の初年度に当たる平成23年度は、メタ分析を用いた移行経済諸国のEM研究サーベイの第1段階作業として、主要な研究業績の収集とリスト作成を中心に行った。当初の研究計画では、既存の紙媒体や一般的なe-journalに加え、ロシアを中心とする旧ソ連・東欧諸国を専門とした学術データベースのEastView Information Servicesを活用する予定であったが、諸般の事情で契約を見送り(【現在までの達成度】の欄を参照)、英語、ロシア語、中国語の主要誌を中心に文献収集とリスト作成の作業に従事した。本作業は継続中で、次年度の前半中に終える予定である。以上の基礎研究と合わせて、中国とロシアにおける環境・エネルギー政策の動向をデータに基づき検証するとともに、中国において関係者に対するヒアリング調査や調査報告を行った。研究の性格上、こちらの研究成果は迅速に発表する必要があるため、本年度の研究業績の中心となった。本研究の狙いは、1980年代以降の欧州で発展した「エコロジー近代化」という理論的フレームワークを用いて、計画経済から市場経済への移行経済諸国における環境ガバナンスの展開を実証的に検証した先行研究の成果と課題について、メタ分析という手法を用いて客観的・体系的に把握することにある。最終年度に当たる本年度は、昨年度に中間成果報告として発表した研究成果に対する批評・コメントを踏まえて、分析対象となるサンプル数(先行研究の数)を増やすとともに、その属性のコーディング方法の見直しを行った。サンプル数が約150点と予想よりもかなり多く集まったため、中東欧諸国に関する先行研究のメタ分析を優先的に行い、定性的な研究成果の統合も可能なシステマティックレビューと呼ばれる手法を用いて、探索的な分析・検証を繰り返し行った。その結果、分析結果は各研究の属性(論文のトピックスや著者の専門領域など)に加えて、コーディングの仕方によって大きく変わることが判明したため、各々のコーディングの長所・短所を慎重に見極めた上で、最終的なコーディング・フォーマットを決定した。以上の研究成果は、次年度中に和文・英文の両方で専門誌に投稿予定である。中東欧諸国に限定した上記のサンプルに加えて、すでに収集済みの旧ソ連諸国(主にロシア)を対象にした研究成果をサンプルに加えた拡張版のデータベースの構築にも着手しており、その分析結果の公表は可及的速やかに行う所存である。移行経済前年度に行う予定であったが、諸般の事情により見送っていた学術データベースを用いた文献検索・収集ならびにリスト作成の作業を本年度中に行い、メタ分析に必要な基礎段階は終了した。この作業に予想以上の時間がかかったため、本来は本年度の後半から始める予定であった分析対象の研究内容の抽出とデータベース化の作業は、次年度以降に繰り越すことになった。したがって、当初の研究計画と比べると、半年程度の遅れが生じている。メタ分析の基礎段階の作業として必要な学術データベースを用いた文献検索・収集ならびにリスト作成の作業に予想以上の時間がかかったため、上記データベースに基づく分析・検証の作業と、その結果に基づく研究成果の発表に半年程度の遅れが生じている。
長崎、上海、ソウルにおけるうつ病に関する共同研究

これまでの研究で各センタ-においてほぼ一定の症状評価及び診断が可能なことが確かめられたため各外来部門を受診する新患について一定のScreening Scheduleを用いて各センタ-約100名の対象者を選択した。この対象者の中でうつ病圏疾患(躁うつ病(ICD-9:296)、神経症うつ病(300.4)、抑うつ反応(309)と診断されたものは長崎57例(57%)、上海51例(51%)、ソウル55例(49.5%)とほぼ一定していた。しかしうつ病疾患の内訳をみた場合、長崎・上海では躁うつ病(両極型、単極型)が約6割を占めたのに対して、ソウルでは神経症うつ病が約8割を占めており、各国において病像の違いが大きいことがわかった。1.総得点比較ではソウルで最も高得点であった。また不安、罪悪感の得点が他の2センタ-より高かった。また身体症状の出現率も高かった。2.従来の内因性うつ病に相当する群と神経症範疇に属するといわれる神経症うつ病群のHamilton Rating Scaleによる症状比較では長崎ではその両者が症状学的によく峻別されている。3.上海のうつ病患者は他の2センタ-と比較して病識は持っているにも拘らず職務・行動面には抑制はみられなかった。4.不眠のタイプによって296群、300群を識別することはできなかった。5.各国の296群に共通にみられた症状としては3型の不眠、身体的不安、消化器症状、体重減少といった睡眠と身体症状であることがわかった。これ迄に症状評価や診断に関しては,長崎,上海,ソウルの各研究センター間で,ほぼ一致するという結果を得たが,より細かな相違点についても討論を行ない,その結果については第9回西日本精神神経学会(昭和62年10月,岡山)において報告した.本共同研究の第2段階としては各センター外来施設を受診する新来患者について,一定のスクリーニングを行ない,構成面接法であるPSE(現在症診断表)を用いて面接し,症状評価を行なった.診断についてはICD-9(WHO), DSM-III(アメリカ精神医学会),及び各センターにおける従来の診断法(conventional)の3つを使用した.また今回,独自に開発したSummary Sheetを用いて,各対象者の就業状態,収入,家族,居住地域などに関する情報も得た.このような方法で収集された各センター100名ずつの患者を対象として,上記の3つの診断法,及びCATEGOシステムを用いてPSE各症状から得られるコンピューター診断を用い, 3センター間で比較し,症状についても解析中である.更に各センターのcatchment areaについても居住人口,医療体制などの背景因子に関する情報も集めた.各センター外来施設のスクリーニングで除外されたケースについても比較を行なった.昭和63年3月に長崎において,他の2センターから研究員が参加した, Exchange Meetingを開催した.これまでの研究で長崎、上海、ソウルの各センターにおいて各国の患者に対して、共通の精神医学的"道具"であるPSE,HamiltonRating Scale for Depressionといった症状評価尺度やICD-9,DSM-IIIといった診断基準を用いれば、各センターにおいてほぼ一定の症状評価及び診断が可能なことが確かめられた。これらの結果を得て各センターの外来部門を受診する新患について一定のScreening Scheduleを用いて各センター100名(ソウルに関しては111名)の対象者を選択した。これらの対象者の収集に各センター約6カ月を要したが、その期間が年全体の受診患者の動向と較べて偏りがないことを確かめて次のような解析を行った。

この対象者の中でうつ病圏疾患(躁うつ病(ICD-9:296)、神経症うつ病(300.4)、抑うつ反応(309))と診断されたものは長崎57例(57%)、上海51例(51%)、ソウル55例(49.5%)とほぼ一定していた。しかしうつ病圏疾患の内訳をみた場合、長崎・上海では躁うつ病(両極型、単極型)が約6割を占めたのに対して、ソウルでは神経症うつ病が約8割を占めており、各国において病像の違いが大きいことがわかった。従来の内因性うつ病に相当する群と神経症範疇に属するといわれる神経症うつ病群のHamiltion Rating Scaleによる症状比較では長崎ではその両者が症状学的によく峻別されていたが、上海ではさほど両者の差は明らかではなく、中国に多いといわれる「神経衰弱」といった概念も含めて更に検討を要すると思われた。またうつ病にともなう身体症状に関してはソウルにおいて出現頻度が高かった。これまでの研究で各センタ-においてほぼ一定の症状評価及び診断が可能なことが確かめられたため各外来部門を受診する新患について一定のScreening Scheduleを用いて各センタ-約100名の対象者を選択した。1.総得点比較ではソウルで最も高得点であった。また不安、罪悪感の得点が他の2センタ-より高かった。また身体症状の出現率も高かった。2.従来の内因性うつ病に相当する群と神経症範疇に属するといわれる神経症うつ病群のHamilton Rating Scaleによる症状比較では長崎ではその両者が症状学的によく峻別されていた。3.上海のうつ病患者は他の2センタ-と比較して病識は持っているにも拘らず職務・行動面には抑制はみられなかった。4.不眠のタイプによって296群、300群と識別することはできなかった。5.各国の296群に共通にみられた症状としては3型の不眠、身体的不安、消化器症状、体重減少といった睡眠と身体症状であることがわかった。
単クローン抗体惹起進行性病変モデルによる糸球体硬化機序の解析

主なる研究対象とした非可逆性硬化性腎病変は雌性Wistarラットの左腎摘出後に抗Thy-1単クローン抗体(mAb)1-22-3 500μgを1回静注する事により作成した。このモデルは2週後には一度減少傾向を示すものの、以後増加し続け100mg/日を優に越す著名な蛋白尿と早期より持続する尿細管間質障害を含めた増殖性糸球体腎炎像を特徴とする。3週から6週にかけて半月体形成や間質への高度な細胞浸潤と尿細管の変性、拡大を伴った典型的な糸球体硬化性病変が認められ、血清Urea-N,クレアチン値の有意な上昇も認められる。この病変は、抗接着分子阻害剤、抗補体剤、抗線維化剤、ACE阻害薬、漢方薬(紫苓湯)により抑制されることが明らかとなった。また両腎ラットへのmAB1-22-3 1回静注による可逆性モデルとの種々のパラミターの比較検討を行った。発病初期の糸球体病変の程度に可逆性、非可逆性両群間で著差が認められない一方でTRPM3陽性の活性化マクロファージ並びにα-平滑筋アクチン陽性細胞の間質への浸潤が非可逆性群で著明に認められ、これらが間質病変増悪に関与し、病変初期の間質病変の程度が非可逆性の糸球体硬化性病変誘導の重要な因子であると考えられた。また蛋白尿を減少させ、腎糸球体障害、間質障害を軽減させたACE阻害剤、並びにアンギオテンシン受容体拮抗剤はともにTGF-β、typeI,III collagenのmRNAレベル、並びに蛋白レベルでの発現を抑制していたことから、TGF-β,collagen I,IIIの産生分泌増加が硬化性病変誘導に密接に関与するものと解された。本年度は単クローン抗体(mAb)1-22-3を片腎摘出1時間後Wistar雌性ラット(7週令)に1回(500μg/ラット)静注することにより惹起される進行性腎病変モデルを主な研究対象とし、まずこのモデルの非可逆性・進行性の確認と種々のparametersの動態について検索した。2週後には一度減少傾向を示すものの、以後増加し続け100mg/日を優に越す著名な蛋白尿が認められた。6週後の腎重量、並びに血中尿素窒素、クレアチニン値は各々、いずれの対照群(片腎摘出後生食投与群偽手術後mAb投与群、偽手術後生食投与群)と比較しても有意に増加していた。また光顕所見としては、mesangiolysisは観察されたものの、7日目以降は、尿細管間質障害も含めて、増殖を主とした糸球体腎炎像が持続し、3週から6週にかけて半月体形成や間質への高度な細胞浸潤と尿細管の変性、拡大を伴った典型的な糸球体硬化性病変が認められた。この時期には免疫組織化学的検索においても、T細胞(とりわけOX-8陽性細胞)単球・マクロファージ(ED-1陽性細胞)等炎症細胞数の増加と、LFA-1,ICAM-1等接着分子の表現の増強がとくに間質で著名であった。間質型コラーゲン、ファイブロネクチン等細胞外基質、メサンギュウム細胞の性状変化のよき指標とされるα-平滑筋アクチン、更には、基質増加に関与するTGF-β等サイトカインの糸球体内局在が硬化性病変と平行して増強することが明らかとなった。糸球体上皮細胞の障害マーカーと考えられるリン酸化ビメンチンの局在が証明され、この病変への糸球体上皮細胞の関与も示唆された。

また尿細管間質の病変惹起に、尿中補体の尿細管細胞表面上での活性化が一因となっていることも判明した。来年度はこれらの諸因子の可逆性モデルとの比較、並びに修飾による病変軽減の可能性につき検討を加える予定である。非可逆性硬化性腎病変は雌性Wistarラット(7週令)の左腎摘出後に抗Thy-1単クローン抗体(mAB)1-22-3,500μgを1回静注する事により作製した。また両腎ラットに同様にしてmAb1-22-3を1回静注した可逆性モデルを作成し、種々のパラミターの動態を不可逆性のものと比較検討した。片腎非可逆性硬化性モデルでは、両腎可逆性モデルに比較して早期ED-1,TRPM-3陽性細胞の糸球体への浸潤が始まる傾向が認められたが、ピーク時の浸潤細胞数は両群間で著差は認められなかった。糸球体でのαsmoothe muscle actin(α-SMA)陽性細胞は両群ともmAb1-22-3投与3日後に初めて陽性となり、その出現時期、程度に差は無かった。間質のα-SMA陽性細胞出現頻度は非可逆性群で有意に高かった。糸球体におけるTGM-β,collagen type・の沈着は、両群とも抗体投与後2週で初めて陽性となり、2週、3週で、その程度に著差は無かった。発症初期の糸球体変病の程度に可逆性、非可逆性両群に著差がない一方で、間質病変が非可逆性群で出現時期が早く程度も強いことからTRPM3陽性の活性化マクロファージ並びにα-SMA陽性細胞の間質への浸潤が間質変病増悪に関与し、変病初期の間質変病の程度が非可逆性の糸球体硬化性変病誘導の重要な因子であると考えられた。また前年度予防的前投与により有効性が証明された紫苓湯は抗体投与1日後、並びに7日後からの投与でも進展制御効果を有することが判明した。また片腎モデルであることからも関心を持たれる血行動態に影響を及ぼす薬剤の効果につき検討を加えた結果、ACE-阻害薬は蛋白尿を減少し(19.2±3.5 vs.150.5±17.1mg/day)、腎糸球体障害、腎間質障害を軽減し、TGF-β,typ・,・・・collagenのmRNA、及び蛋白レベルでの発現を抑制した
腎障害におけるタンパク質分解機構の役割の解明

本研究課題は小胞体ストレスの際に活性化される小胞体の品質管理機構であるunfolded protein response(UPR)の制御機構の解明を目指し、タンパク質分解機構のバランス異常という側面から腎臓の病態を解き明かすことを目的としている。さらに本研究課題から得られる知見を元に、タンパク質分解機構を標的とした腎疾患治療戦略、小胞体ストレスが関連する腎病態の克服に繋げていくことを究極の目的としている。最終年度に当たる採用第3年度目(平成28年度)は、in vivoでの腎臓における本機構の役割を検証することに従事した。これまでに、オートファジー調整因子が小胞体ストレスセンサータンパク質のキナーゼドメインへ直接結合し、それが小胞体ストレスセンサータンパク質を介したタンパク質分解を制御することを明らかにしている。そこで小胞体ストレスセンサータンパク質とオートファジー調整因子の結合を阻害するシステムの構築を試みたが、培養細胞内で高効率に結合を阻害するシステムは構築出来なかった。そこで、腎培養細胞を用いて様々な薬剤をスクリーニングした結果、本機構を介したタンパク質分解機構を抑制できる薬剤を複数同定した。いずれの薬剤も腎培養細胞の小胞体ストレスによる細胞傷害、細胞死をさらに悪化させた。これらの薬剤をマウスへ投与して、in vivoでの解析を行った結果、腎障害の際に惹起される組織傷害が増悪した。以上より、タンパク質分解機構が腎臓の恒常性維持に重要な役割を果たしていることが示唆された。28年度が最終年度であるため、記入しない。本研究課題は小胞体ストレスに対するストレス応答系であるUnfolded protein response(UPR)の制御機序の解明からUPRの、特にタンパク質分解機構を標的とした腎疾患治療戦略、小胞体ストレスが関連する腎病態の克服に繋げていくことを究極の目的としている。UPRを構成する分子経路のひとつであるIRE1経路はタンパク質分解機構を誘導する。これまでに、小胞体ストレス応答センサータンパク質IRE1の活性化は様々な調整因子が相互作用することにより制御されており、IRE1経路が活性化または抑制されていることが報告されている。研究代表者もIRE1がオートファジー調整因子Atg12-Atg5複合体の相互作用により制御されていることを見出している。これまでに細胞内に発現するAtg5とAtg12のほとんどは共有結合により複合体を形成しているが、ごく一部複合体を形成しないAtg12がミトコンドリアの恒常性の維持やアポトーシスの誘導に関与することが報告されている。これらの知見を踏まえて研究課題を実施し、平成26年度は以下の研究成果を得た。1in vitroの解析により単量体Atg5とAtg12はIRE1に結合することが出来るが、IRE1の活性化には関与しなかった。2培養細胞を用いた過剰発現の実験系の解析によってもIRE1の活性化にはAtg12-Atg5の複合体の結合が関与した。3腎障害モデルにおいてもIRE1の活性化にAtg12-Atg5複合体の結合が関与しており単量体Atg5とAtg12は関与しなかった。4複合体を形成出来ない変異体Atg5とAtg12の過剰発現はAtg12-Atg5複合体のIRE1への結合を阻害した。5Atg5はIRE1のkinase領域付近に結合することが確認されたが、Atg12はIRE1へ直接的に結合することが確認されなかった。本申請課題は小胞体ストレスに対するストレス応答系であるUnfolded protein response(UPR)の制御機序の解明からUPRの特にタンパク質分解機構を標的とした腎疾患治療戦略、小胞体ストレスが関連する腎病態の克服に繋げていくことを究極の目的としている。具体的にはタンパク質分解機構のバランス異常という側面から腎臓の病態の本質を理解したい。そのために平成27年度は以下のことを課題に取り組み、いくつかの知見を得ることができた。すでにオートファジー調整因子が小胞体ストレスセンサータンパク質に結合し、制御していることを明らかにしている。平成27年度はオートファジー調整因子が小胞体ストレスセンサータンパク質へ結合するための最短アミノ酸領域の特定、結合を特異的に阻害する手法の確立、腎培養細胞での役割の解析に従事した。その結果、オートファジー調整因子が小胞体ストレスセンサータンパク質のキナーゼドメインへ直接結合することを明らかにしたが、結合を特異的に阻害するための最短アミノ酸領域は特定するまでは至らなかった。そこでオートファジー調整因子の変異体を腎培養細胞へ過剰発現する実験系を構築し、その役割を評価したところ、オートファジー調整因子により調整される小胞体ストレスセンサータンパク質を介したタンパク質分解機構は小胞体ストレスをはじめとする様々な薬剤で誘導される細胞死を緩和するが明らかになった。タンパク質間の結合を特異的に制御するために結合に不可欠な最短アミノ酸領域の同定を試みが、特定まで至らなかった。しかし、腎細胞において本申請課題で取り上げているタンパク質分解機構の役割の一端が明らかに出来たため、上記の達成度を提示した。

これまでに、オートファジー調整因子が小胞体ストレスセンサータンパク質のキナーゼドメインへ直接結合し、それが小胞体ストレスセンサータンパク質を介したタンパク質分解を制御することを明らかにしている。そこで小胞体ストレスセンサータンパク質とオートファジー調整因子の結合を阻害するシステムの構築を試みたが、培養細胞内で高効率に結合を阻害するシステムは構築出来なかった。そこで、腎培養細胞を用いて様々な薬剤をスクリーニングした結果、本機構を介したタンパク質分解機構を抑制できる薬剤を複数同定した。いずれの薬剤も腎培養細胞の小胞体ストレスによる細胞傷害、細胞死をさらに悪化させた。これらの薬剤をマウスへ投与して、in vivoでの解析を行った結果、腎障害の際に惹起される組織傷害が増悪した。以上より、タンパク質分解機構が腎臓の恒常性維持に重要な役割を果たしていることが示唆された。本研究課題は第一義に腎細胞におけるUPRの制御機序の解明を目指す。本年度得られた成果は制御機序を明らかするために重要な知見となるため、上記の達成度を提示した。最終年度は、in vivoでの腎疾患モデルにおけるタンパク質分解機構の役割を検証することを第一義的に行う予定である。28年度が最終年度であるため、記入しない。IRE1とAtg5、Atg12、またはAtg12-Atg5複合体とが結合する詳細なメカニズムを明らかにし、これらの結合をin vitro、in vivoで制御するシステムを開発し、タンパク質分解経路の誘導を制御することを目指す。
高活性人工酵素触媒『ナノザイム』の開発研究

「簡易合成ナノ粒子」と「二重活性化型不斉触媒」とを融合し、天然酵素触媒の問題を克服した人工酵素不斉触媒『ナノザイム』の創製を目指した結果、下記反応・触媒の開発に成功した:1)光学活性なヘテロ環状化合物を効率的に合成するMBH型ドミノ反応. 2) MBH反応に極めて高い活性を示すスピロ型酸塩基触媒. 3)α-メチレンγ-ブチロラクトンを効率的に与える不斉RC反応.4)光学活性な新規イオン性液体・スピロ1, 2, 3-トリアゾニウム塩.「簡易合成ナノ粒子」と「二重活性化型不斉触媒」とを融合し、天然酵素触媒の問題を克服した人工酵素不斉触媒『ナノザイム』の創製を目指した結果、下記反応・触媒の開発に成功した:1)光学活性なヘテロ環状化合物を効率的に合成するMBH型ドミノ反応. 2) MBH反応に極めて高い活性を示すスピロ型酸塩基触媒. 3)α-メチレンγ-ブチロラクトンを効率的に与える不斉RC反応.4)光学活性な新規イオン性液体・スピロ1, 2, 3-トリアゾニウム塩.天然酵素触媒は、pHや温度に対する依存性が大きく失活しやすい,大きな分子量にも関わらず反応に関与する触媒サイトが酵素分子中に一ヶ所のみといった問題がある。本研究では、申請者がこれまで展開してきた「簡易合成ナノ粒子」と「二重活性化型不斉触媒」とを融合し、天然酵素触媒の問題を克服した高活性人工酵素触媒『ナノザイム』の創製を目指した。『ナノザイム』創製の鍵となる球状ナノ粒子の構築には、表層に水酸基を密に有するナノ粒子を合成して,そこに触媒を導入する手法を検討した。界面活性モノマーが形成する球状ミセルを重合反応により不可逆的に固定化する方法を検討した結果、水溶媒中、光重合剤を用いることで分子量27000の球状ナノ粒子を合成できた。また、金属と多座配位子の錯形成を利用する金属架橋型高分子不斉触媒研究では、螺旋型高分子不斉触媒の開発に成功した。現在、螺旋構造の詳細な解析と触媒活性の確認を行っている。ドミノ反応は、一度の操作で複数の連続する反応が進行して生成物が得られる。不安定な反応中間体を単離する必要が無く、使用する試薬や溶媒の量を削減できるなどの利点を有する。申請者は,触媒分子に酸性および塩基性官能基を導入した二重活性化型有機触媒により、アザ-MBH反応を高エナンチオ選択的に促進することに既に成功している。今回、球状ナノ粒子表層に導入する二重活性化型有機触媒について、その構造と、固定化後、適用するドミノ反応について検討を行った。その結果、アザ-MBH/アザ-マイケル/アルドール/脱水反応の4つの反応が連続的に進行して、テトラヒドロピリジン誘導体を高エナンチオ選択的に与える反応を見出した。さらに、有機触媒が促進する連続反応として、アザ-MBH反応に続く分子内アザ-マイケル反応からなる不斉ドミノ環化反応を確立し、多官能性イソインドリンを効率的に合成することに成功した。天然酵素触媒は、pHや温度に対する依存性が大きく失活しやすい、大きな分子量にも関わらず反応に関与する触媒サイトが酵素分子中に一ヶ所のみといった問題がある。『ナノザイム』創製の鍵となる球状ナノ粒子の構築には、表層に水酸基を密に有するナノ粒子を合成して、そこに触媒を導入する手法を検討した。界面活性モノマーが形成する球状ミセルを重合反応により不可逆的に固定化する方法を検討した結果、水溶媒中、光重合剤を用いることで球状ナノ粒子を合成できた。申請者は、触媒分子に酸性および塩基性官能基を導入した二重活性化型有機触媒により、アザ-MBH反応を高エナンチオ選択的に促進することに既に成功している。その結果、下記4つの成果を得た。1)光学活性なヘテロ環状化合物を効率的に合成可能な新規アザ-MBH型ドミノ反応の開発に成功した。2)アザ-MBH反応に極めて高い活性を示すスピロ型酸塩基触媒の開発に成功した。3)α-メチレンγ-ブチロラクトンを効率的に与える新規不斉RC反応の開発に成功した。4)光学活性な新規イオン性液体・スピロ1,2,3-トリアゾニウム塩の開発に成功した。
酵母チロシンtRNAの分子識別部位の同定とその改変

(1)酵母チロシンtRNAを大腸菌生体外タンパク質合成系で使おうとすると、大腸菌リシル-tRNA合成酵素により僅かにミスアシル化を受けることが判明したので、このミスアシル化を防止を最優先に研究することにした。(2)5'-末端側にextra配列を持つ酵母チロシンtRNA遺伝子DNA(野生型・変異型)を合成し、変異導入のための適当なプライマーセットと共にPCRして変異チロシンtRNA前駆体の遺伝子DNAを作成した。これを鋳型としてT7RNAポリメラーゼで転写して変異チロシンtRNA前駆体を作製した。上記の目的を考慮してアンチコドンステム内の3つのA-U対をG-C対に改変したものやアクセプターステム内の数ヵ所に変異を入れたtRNAを作成した。これらの変異チロシンtRNAにつき酵母チロシル-tRNA合成酵素によるチロシン受容能と大腸菌リシル-tRNA合成酵素によるリシンの誤受容能を測定した。(3)その結果、アンチコドンステム内の3つのA-U対をG-C対に改変した変異体はチロシン受容能を保持したまま劇的にリシンの誤受容が減少していること、すなわちこれらの変異は大腸菌リシル-tRNA合成酵素に対する負のアイデンティティー要素であり得ることが判明した。(4)酵母チロシル-tRNA合成酵素のアミノ酸基質特異性を改変することに成功した。(5)酵母チロシンtRNAのアンチコドンとmRNAのコドンにWatson-Crick塩基対以外の新規塩基対を導入し、新しい塩基対合ルールを開拓することを試みた。(1)大腸菌RNase Pの構成成分である"C5タンパク質"と"M1 RNA"をそれぞれ独立に大量調製し、in vitroで再構成して「試薬量」のRNase P標品を確保するための方法を確立した。"C5タンパク質"についてはHis-tag付きでクローン化した遺伝子から大量発現し、アフィニティーカラムにより精製した。"M1 RNA"は遺伝子を鋳型にT7 RNAポリメラーゼで転写して作製した。これらの試料調製に必要な紫外線吸収計と記録計は本年度設備備品費にて購入した。変異を導入する部位としては、本年度はアクセプターステム内とアンチコドンアーム内を優先的に行った。(3)上で作製した変異チロシンtRNA前駆体を(1)のRNase Pを用いて切断して一連の変異チロシンtRNAを作製し、その塩基配列を解析して変異個所を確認した。(4)これらの変異チロシンtRNAにつき酵母チロシル-tRNA合成酵素によるチロシン受容能を測定し、kcat/Kmを求めて正のアイデンティティー決定部位を確認する作業を継続している。(1)酵母チロシンtRNAを大腸菌生体外タンパク質合成系で使おうとすると、大腸菌リシル-tRNA合成酵素により僅かにミスアシル化を受けることが判明したので、このミスアシル化を防ぐことを優先的に考えることにした。上記の目的を考慮してアンチコドンステム内の3つのA-U対をG-C対に改変したものやアクセプターステム内の数カ所に変異を入れたtRNAを作成した。

(3)これらの変異チロシンtRNAにつき酵母チロシル-tRNA合成酵素によるチロシン受容能と大腸菌リシル-tRNA合成酵素によるリシンの誤受容能を測定した。(4)その結果、アンチコドンステム内の3つのA-U対をG-C対に改変した変異体はチロシン受容能を保持したまま劇的にリシンの誤受容が減少していること、すなわちこれらの変異は大腸菌リシル-tRNA合成酵素に対する負のアイデンティティー要素であり得ることが判明した。(5)酵母チロシンtRNAのアンチコドンとmRNAのコドンにWatson-Crick塩基対以外の新規塩基対を導入し、新しい塩基対合ルールを開拓することを試みた。
超微量タンパク質絶対定量法によるがん関連シグナル伝達系の包括的プロファイリング

本研究の無細胞タンパク質合成法と質量分析を用いた絶対定量法では、下記1の構造の安定同位体標識ペプチドと、安定同位体標識されていない濃度既知の定量用タグを用い、下記2の計算式を用いて試料中のターゲットペプチドを定量する。2LVTDLTK添加量×定量用タグ比(標識/非標識)×ターゲットペプチド比(非標識/標識)オリジナルの定量用タグLVTDLTKを基に、LVXXLTKを新規定量タグの候補として設計した。置換するアミノ酸には、トリプシン消化を受けるもの、酸化や脱アミド化などの修飾を受けるもの、質量分析における検出強度が低い傾向があるもの等を除いた11種類を用いた。121種類のLVXXLTKとそれらのリジン13C6安定同位体標識ペプチドを質量電荷比(m/z)順に並べ、前駆体イオンの識別が困難にならないように、43種類まで選別した。それらをFmoc固相合成法により合成し、溶解性の低かった8種類を除外し、最終的に35種類を選別した。そして、化学合成ペプチドの濃度をアミノ基定量法により精密定量し、定量スタンダードミックスを調製した。また、各々をコードするプラスミドを作製した。構築した35種類の多重定量法の評価は、市販の質量分析用スタンダード(6タンパク質のトリプシン消化物)を用いて行った。選別したターゲットペプチドをコードする上記1の鋳型DNAをPCR法により調製し、それら35種類を混合し、同一反応系で無細胞合成法により合成することができた。それをトリプシンで消化し、質量分析用スタンダードと定量スタンダードミックスを混合し、nanoLCとオービトラップ質量分析計を用いて解析し、正しく定量できることを確認した。無細胞タンパク質合成法と質量分析を用いた絶対定量法は、安定同位体標識内部標準ペプチドの調製量をフェムトモルオーダーに抑えた極めて安価で簡便な定量法である。しかしながら、LVTDLTKという特定の配列の定量用タグを用いるという原理のため、多重解析を行うことができなかった。そこで本年度は定量法の改良に取り組み、新たに34種類の定量用タグを構築し、それらをコードするプラスミドと、濃度既知のスタンダードペプチドミックスを調製した。定量用タグを多様化したことにより、一度の分析で35種類のペプチドをfmolオーダーで定量可能な系を確立した。さらに、改良した定量法を用いて、共同研究も含め、リボソーム再構成メカニズム解析、膜受容体の発現及び機能解析、大規模がんマーカースクリーニングなどが進捗しており、期待以上の研究の進展があった。リボソーム再構成メカニズム解析に関しては、リボソーム30Sサブユニットを構成する21種類のタンパク質の構成比及びその変動を定量解析することができ、その再構成メカニズムの解明に繋がる知見を得た。定量用タグを多様化したことにより、一度の分析で35種類の非翻訳後修飾ペプチドを定量可能な系を確立した。今後は、リン酸化などの翻訳後修飾ペプチドを定量可能な系の確立を試みる。その後、改良した定量法を用いて、シグナル伝達因子の包括的プロファイリングの構築に取り組む。キナーゼや転写因子等の定量ターゲットペプチドを選別し、構築した定量用タグと組み合わせた安定同位体標識ペプチドを無細胞合成法により合成する。そして、HEK293T(ヒト小児腎臓細胞)やCHO(チャイニーズハムスター卵巣細胞)などの非がん細胞株や、HeLa(ヒト子宮頸がん)、MCF-7(ヒト乳がん)、HepG2(ヒト肝がん)などのがん細胞株を用いて、各因子の発現量、細胞内分布、リン酸化状態を質量分析により定量解析する。

しかしながら、LVTDLTKという特定の配列の定量用タグを用いるという原理のため、多重解析を行うことができなかった。そこで本年度は定量法の改良に取り組み、新たに34種類の定量用タグを構築し、それらをコードするプラスミドと、濃度既知のスタンダードペプチドミックスを調製した。定量用タグを多様化したことにより、一度の分析で35種類のペプチドをfmolオーダーで定量可能な系を確立した。さらに、改良した定量法を用いて、共同研究も含め、リボソーム再構成メカニズム解析、膜受容体の発現及び機能解析、大規模がんマーカースクリーニングなどが進捗しており、期待以上の研究の進展があった。リボソーム再構成メカニズム解析に関しては、リボソーム30Sサブユニットを構成する21種類のタンパク質の構成比及びその変動を定量解析することができ、その再構成メカニズムの解明に繋がる知見を得た。定量用タグを多様化したことにより、一度の分析で35種類の非翻訳後修飾ペプチドを定量可能な系を確立した。今後は、リン酸化などの翻訳後修飾ペプチドを定量可能な系の確立を試みる。その後、改良した定量法を用いて、シグナル伝達因子の包括的プロファイリングの構築に取り組む。キナーゼや転写因子等の定量ターゲットペプチドを選別し、構築した定量用タグと組み合わせた安定同位体標識ペプチドを無細胞合成法により合成する。そして、HEK293T(ヒト小児腎臓細胞)やCHO(チャイニーズハムスター卵巣細胞)などの非がん細胞株や、HeLa(ヒト子宮頸がん)、MCF-7(ヒト乳がん)、HepG2(ヒト肝がん)などのがん細胞株を用いて、各因子の発現量、細胞内分布、リン酸化状態を質量分析により定量解析する。
Endothelin-1シグナルを標的とした非小細胞肺癌細胞の造骨性骨転移抑制

造骨性骨転移形成非小細胞肺癌細胞株ACC-LC-319/bone2においてET-1の高発現がmRNAおよびタンバクレベルで認められた。ACC-LC-319/bone2細胞株との共培養により、骨芽細胞の増殖が有意に亢進した。その増殖促進は拮抗剤bosentanにより有意に抑制された。TNF-α、II-1βによるET-1産生量が用量依存的に増加した。モデルマウス骨転移巣において、骨近傍の細胞でET-1、TNF-αおよびMMP-7が高発現していた。これらの実験成績より、ACC-LC-319/bone2細胞株から産生されるET-1に生理学的活性があり、その阻害にET-1拮抗剤bosentanが有効であることが示された。また、ACC-LC-319/bone2細胞のEndothelin-1産生制御機構において、TNF-α、IL-1βが関与している可能性が示唆された。【目的】肺癌の骨転移は溶骨性病変を形成することが多いが、約25%の症例においては造骨性病変を形成する。溶骨性骨転移、造骨性骨転移ともに臨床的に患者のQOLを低下させる重要な因子であり、溶骨性骨転移については、破骨細胞機能を抑制するビスフォスフォネートによる治療が確立されているが、肺癌の造骨性骨転移に対する治療法は無いのが現状である。本研究の目的は、遠隔転移モデルにおいて、肺癌の難治化の要因の一つである骨転移形成における分子標的の検索を行なうとともに、難治癌とされる肺癌の骨転移因子を分子標的とした新規治療法を確立することである。申請期間内に、in vitroにおいて、造骨性骨転移形成非小細胞肺癌細胞株ACC-LC-319/bone2におけるEndothelin-1(ET-1)の役割および産生制御機構を明らかにしたいと考えている。【方法】ヒト肺腺癌細胞株ACC-LC-319(名古屋大・高橋隆先生より供与)からin vivo selectionによりACC-LC-319/bone2を樹立した。細胞株におけるmRNA発現をRT-PCR法、タンパク産生量をELISA法にて測定した。ET-1受容体拮抗剤を作用、無作用群において、共培養による骨芽細胞増殖能の変動をMTT-assayにて評価した。【結果】ACC-LC-319/bone2においてET-1の高発現がmRNAおよびタンパクレベルで認められた。TNF-α、IL-1βによるET-1産生量が用量依存的に増加した。申請期間内に、造骨性骨転移形成非小細胞肺癌細胞株ACC-LC-319/bone 2におけるEndothelin-1(ET-1)の役割および産生制御機構を明らかにしたいと考えている。【方法】ACC-LC-319/bone 2をSCIDマウス尾静脈より接種し、肺腺癌骨転移モデルマウスを作成した。骨転移巣組織の免疫組織染色を行った。【結果】ACC-LC-319/bone 2においてET-1の高発現がmRNAおよびタンパクレベルで認められた。TNF-α、IL-1βによるET-
植物アルカロイドの探索と合成研究を基盤とした、疼痛および脳機能改善薬の創成

1. TRP受容体アンタゴニスト活性を有するイボガ型インドールアルカロイドに関する研究では、キョウチクトウ科植物Voacanga africanaの葉部の成分探索を実施し、アスピドスペルマ型インドールアルカロイドが二量化した構造を有するIsovoafoline及びVoafolineに加え、構造未知のアルカロイドを単離した。現在本化合物の構造解析を行っている。加えて、イボガ型インドールアルカロイドの網羅的不斉全合成研究を行った。酵素を用いた光学分割法により得られた重要中間体である光学活性シクロヘキセン誘導体から、天然物のIbogamine-16-carboxylic acid 17,20-didehydro-5,6-dioxo-10-methoxy methyl ester及びCatharanthineの不斉合成を達成した。2.強力な鎮痛活性を発現する新規ミトラガイナアルカロイド誘導体MGM-30を再度合成し、オピオイド受容体におけるバイアス型アゴニスト活性試験を共同研究者に依頼した。その結果、本化合物はβ-ArrestineをリクルートせずGタンパク質のみを活性化しているバイアスアゴニストであることが示された。本試験結果は今後の創薬研究に向けて極めて有益で有望な成果と言える。3.アセチルコリンエステラーゼ阻害活性を有するリコポジウム属アルカロイドの探索と全合成研究を行った。この中で、Lycopoclavamine-A, Lycopodine, Flabelliformineの不斉全合成を論文として発表することができた。また、Huperzine Hの不斉全合成による構造決定も行うことができた。4.中枢神経系に作用する天然物の探索を目的に、いわゆる脱法ハーブとして知られる「シニクイチ」の成分探索を行い、新規キノリチジンアルカロイドを発見、構造決定した。さらに、2種の新規アルカロイド4"-O-Demethyllythridineと14-epi-4"-O-Demethyllythridineの不斉全合成を達成し、それぞれの構造を確認できた。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。1. TRPチャネルに対するアンタゴニスト活性を有する天然物リガンドのイボガ型インドールアルカロイドの全合成を検討した。その結果、代表的アルカロイドのVoacangineと2種の新規アルカロイドVAR5 (Voacangineの5位6位間の結合が酸化的に解裂したユニークな構造を有する)およびIbogamine-16-carboxylic acid 5,6-dioxo-10-methoxy methyl esterの初のラセミ全合成を達成した。引き続き、本全合成ルートの不斉化を検討した。新規インドールアルカロイドであるKopsiyunnanine Kの不斉全合成とこれによる構造決定が完了した。また、同じ植物から単離したアルカロイドのAndranginineに関しても不斉全合成を達成し、天然物の絶対配置と光学純度を明らかにした。2.モルヒネとは基本骨格が全く異なる新しいタイプのオピオイド性鎮痛アルカロイド誘導体の全合成を検討し、エント型の18,19-dehydromitragynineの7ーヒドロキシインドレニン体を不斉全合成できた。オピオイドμ受容体の活性型コンフォーマーとのドッキング計算を実施し、結合モデルを構築した。3.アセチルコリン(ACh)エステラーゼ阻害剤を見いだすために、Lycopodium属植物の成分探索を行い、Lycopodium carinatumから数種の新規アルカロイドを見いだし、活性評価用サンプルとして供した。Lycopodiumアルカロイドの合成研究を行い、3種のアルカロイド(リコポジン、リコポクラバミン、ヒューペリジンH)の基本骨格構築まで達成した。本研究にて見いだした新規インドールアルカロイドであるKopsiyunnanine Kの不斉全合成とこれによる構造決定が完了し、その成果を論文として公表できた。また、同じ植物から単離したアルカロイドのAndranginineに関しても不斉全合成を達成し、天然物の絶対配置と光学純度を明らかにした(論文投稿中)。さらに、新規アルカロイドを発見、構造決定し、論文として公表できた。モルヒネとは基本骨格が全く異なる新しいタイプのオピオイド性鎮痛アルカロイド誘導体であるエント18,19-dehydromitragynineの7ーヒドロキシインドレニン体の不斉全合成を達成した。中枢神経系への作用が考えられるヘイミア属植物アルカロイドであるLasubine Iの不斉全合成を達成し、論文公表できた。植物から単離したこれらアルカロイドの中枢性作用については活性評価中である。1. TRP受容体アンタゴニスト活性を有する新規イボガ型インドールアルカロイド発見を目指し、キョウチクトウ科植物Voacanga africanaの葉部及び同科植物Ervatamia cumingianaの地下部を用いて成分探索を実施した。その結果、後者の素材から3種の新規インドールアルカロイドを単離、構造決定した。さらに、同活性を有するイボガ型アルカロイドの不斉全合成に取り組み、酵素を用いた光学分割法を鍵段階として、網羅的にイボガ型アルカロイドを合成可能とする重要中間体の合成に成功した。この中間体から、今年度はVAR5と仮称した新規アルカロイドの初の不斉全合成を達成した。2.当研究室において見出したミトラガイナアルカロイド類は、β-ArrestineをリクルートせずGタンパク質のみを活性化しているバイアスアゴニストであることが示され、これによりモルヒネと比べ消化管運動の抑制などのオピオイドに特有な副作用が弱い可能性が示された。そこで、強力な鎮痛活性を発現する新規誘導体MGM-30のオピオイド受容体とのドッキング計算を行った。

その結果、本化合物は活性型オピオイドμ受容体に於いて、モルヒネとは異なる部位で、非常に効率よくポケットにはまっていることがわかった。3.アセチルコリンエステラーゼ阻害活性を有するリコポジウム属アルカロイドの探索と全合成研究を行った。この中で、LycopoclavamineとLycopodineの不斉全合成を達成することができた。ヒガンバナ科植物から発見した新規ヘテロ二量体アルカロイドの全合成研究を実施し、これを構成する二つのユニット(ガランタミン型とタゼチン型)の不斉合成を完了した。4.中枢神経系に作用する天然物の探索を目的に、いわゆる脱法ハーブとして知られる「シニクイチ」の起源植物であるHeimia salicifoliaの成分探索を行い、多くの新規キノリチジンアルカロイドを発見、構造決定した。キョウチクトウ科植物Ervatamia cumingianaの地下部を用いて成分探索を実施し、3種の新規インドールアルカロイドを単離、構造決定できた。(投稿論文執筆中)また、いわゆる脱法ハーブとして知られる「シニクイチ」の起源植物であるHeimia salicifoliaの成分探索を行い、多くの新規キノリチジンアルカロイドを発見、構造決定した。植物から単離したこれらアルカロイドの中枢性作用については活性評価中である。活性化合物であるイボガ型インドールアルカロイドVAR5と2種のリコポジウムアルカロイドの不斉全合成を達成できた。1. TRP受容体アンタゴニスト活性を有するイボガ型インドールアルカロイドに関する研究では、キョウチクトウ科植物Voacanga africanaの葉部の成分探索を実施し、アスピドスペルマ型インドールアルカロイドが二量化した構造を有するIsovoafoline及びVoafolineに加え、構造未知のアルカロイドを単離した。現在本化合物の構造解析を行っている。加えて、イボガ型インドールアルカロイドの網羅的不斉全合成研究を行った。酵素を用いた光学分割法により得られた重要中間体である光学活性シクロヘキセン誘導体から、天然物のIbogamine-16-carboxylic acid 17,20-didehydro-5,6-dioxo-10-methoxy methyl ester及びCatharanthineの不斉合成を達成した。2.強力な鎮痛活性を発現する新規ミトラガイナアルカロイド誘導体MGM-30を再度合成し、オピオイド受容体におけるバイアス型アゴニスト活性試験を共同研究者に依頼した。その結果、本化合物はβ-ArrestineをリクルートせずGタンパク質のみを活性化しているバイアスアゴニストであることが示された。本試験結果は今後の創薬研究に向けて極めて有益で有望な成果と言える。
気道粘膜の感染防御機構におけるヒトβデフェンシンの作用解明

デフェンシンは抗微生物活性を示す塩基性ペプチドであり、αデフェンシンは主に好中球、βデフェンシン1は主に腎、子宮などの泌尿器に、2は主に皮膚や気道の上皮に存在する。特発性肺線維症(IPF)症例の血漿と気管支肺胞洗浄液(BALF)を用いて、我々が開発したRIA法により、αデフェンシンを測定した。その結果は健常者と比較して有意に血漿で高値であり、その値は呼吸機能検査値や動脈血酸素分圧値と逆相関を認めた。このことから、IPF症例ではαデフェンシンがその肺障害において何らかの関与をしていることが明らかとなった。また、肺生検組織のαデフェンシンの免疫染色では線維化が強い部分で発現がみられており、線維化とαデフェンシンの関連性も示唆された。また、びまん性汎細気管支炎(DPB)症例でその血漿とBALF中のαデフェンシンとβデフェンシン1,2を測定し、αデフェンシンとβデフェンシン2が血漿・BALFともに高値であり、IL-8やIL-1βなどのサイトカイン値とよく相関することを示した。また、合成したαデフェンシン、β1、β2では緑膿菌に対する感受性試験で、β2以外は緑膿菌に対する殺菌作用がみられなかった。このことから、DPBをはじめとする慢性気道感染症ではその気道内のβ2デフェンシンが重要であることが示唆された。またβ2デフェンシンの免疫染色では健常肺では主に肺胞II型細胞で発現がみられた。しかし、DPB症例では気道上皮細胞に主に活性がみられ、気道炎症においては気道上皮細胞からのβ2デフェンシンの産生が重要であることが明らかとなった。また、気道上皮細胞を用いてin vitroの研究を行っているが、αデフェンシン50μg/mlの濃度での刺激で気道上皮細胞からIL-8、IL-1β、GM-CSFなどのサイトカインのmRNAの発現が亢進することを(Rnase protection assayにて)明らかとしたが、この作用はβ2デフェンシンには認められなかった。現在、サイトカインの産生に対するマクロライド薬の影響を検討中である。またヒトβデフェンシン3のRIA開発を目的として合成ペプチドを作製し、この抗微生物活性を確認した。現在このペプチドをウサギに免疫し、抗βデフェンシン3抗体を作製が終了しており、RIAの開発中である。