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電場によるマイクロ・ミキサーの高性能混合制御-混合と搬送の機能分割-

本研究課題は,電気浸透流により「流体の搬送」機能と「混合」機能を分離して流体の制御を行うことにより,混合部長さを従来の数分の1に抑え,流量変動にも対応した高性能マイクロ・ミキサーを開発することにある.T型およびクロス型チャンネルにおいて,流路に印加する電場を非定常に制御することにより,ジャンクション部で2種の流体が折り重なって多層化される電場パターンを求め,混合の促進を実現した.本研究課題は,電気浸透流により「流体の搬送」機能と「混合」機能を分離して流体の制御を行うことにより,混合部長さを従来の数分の1に抑え,流量変動にも対応した高性能マイクロ・ミキサーを開発することにある.T型およびクロス型チャンネルにおいて,流路に印加する電場を非定常に制御することにより,ジャンクション部で2種の流体が折り重なって多層化される電場パターンを求め,混合の促進を実現した.本研究課題は,電気浸透流により「流体の搬送」機能と「混合」機能を分離して流体の制御を行うことにより,混合部長さを従来の数分の1に抑え,流量変動にも対応した高性能マイクロ・ミキサーを開発することにある.本年度は以下の2項目について実施した.詳細を以下に記す.1.混合促進技術の開発「混合」の過程はマイクロチャンネル内での逆流により促進される.流路断面内の逆流は流路内の電場を非定常に制御することにより形成されることが明らかとなった.様々な印加電圧パターンを試みた結果,マイクロ・ミキサーのTジャンクション部に流入する2種の流体が「折り重なる」ように多層化され,その結果,ジャンクション部から約1.5mmの位置で90%の混合度まで達することに成功した.2.電場を利用した流体の駆動・制御技術の開発(非定常電気浸透流の数値シミュレーション)上記の2流体の「折り重なり」による混合促進の評価,ならびに流体の効率的な搬送の評価のため,非定常の電気浸透流のシミュレーションを行った.マイクロチャンネル内の電場を解析し,別途実験によって求めたゼータポテンシャルを用いて流動場の計算を行い,電場が切り替わった際の非定常の電気浸透流のシミュレーションが可能となった.本手法を用いることにより,電気浸透流により駆動されるマイクロ・ミキサーの最適電場印加パターンの評価が可能となった.本研究課題は,電気浸透流により「流体の搬送」機能と「混合」機能を分離して流体の制御を行うことにより,混合部長さを従来の数分の1に抑え,流量変動にも対応した高性能マイクロ・ミキサーを開発することにある.本年度は以下の3項目について実施した.詳細を以下に記す.1. T型およびクロス型チャンネルにおける混合促進流路に印加する電場を非定常に制御することにより,ジャンクション部で2種の流体が折り重なって多層化される電場パターンを求め,混合の促進を実現した. T型およびクロス型の単純形状の流路において,レイノルズ数がRe=約0.1の比較的高流量においても,電場の周波数をストローハル数でSt=0.3に維持することによりジャンクション部より1.0mmの以内で90%の混合度を実現することに成功した.2.マイクロ・ミキサーの性能評価基準の作成従来,マイクロ・ミキサーの性能は混合の度合いを示す混合度のみで評価されおり,流量や混合に必要な距離(マイクロ・ミキサーのサイズ)については評価基準が存在しなかった.熱伝導・物質拡散の相似則を用い,フーリエ数とレイノルズ数,シュミット数の3つの無次元数を用いることにより,マイクロミキサーの流量と混合に必要な距離を含めた評価基準を作成した.3.簡易シミュレーション手法による混合パターンの評価手法の開発混合に有効な印加電場パターンの検討のため,速度場・濃度場の簡易シミュレーションを開発した.実験より求めた流路壁のモビリティより定常流動場を計算し,印加電場パターンに合わせて流動場を切り替えることにより非定常流れをシミュレートすることが可能であり,従って濃度場のみの計算により物質拡散現象を評価することに成功した.非定常流動場の計算が不要であり,計算時間の大幅な短縮が可能となった.
生物応答を用いた排水試験法のためのニセネコゼミジンコに適した市販水の探索

本研究は、含有成分の変動が少なく市販されているナチュラルミネラルウォーター(NMW)に着目して、甲殻類であるニセネコゼミジンコ(ミジンコ)の繁殖試験に適した水を探索することである。この研究の成果は、あらゆる試験研究機関において、ミジンコの繁殖試験による排水の生物応答試験の実施を促せるものである。1.市販されているNMWの抽出ミジンコはカナダ産であり、温度25°C、pH6.5-8.5、硬度60-100mgCaCO_3/mLが生育と繁殖に適しているとされている。そこで市販されているNMWに着目した。インターネット上で検索できる267種類のNMWの中から、pH6.5-8.5、硬度40-120mgCaCO_3/mLの範囲で価格が150円/2L以下のものを25種類抽出した。2.ミジンコの継続飼育ミジンコは、国立環境研究所から譲受した。本学にある恒温槽を使って温度調整(26°C設定)と日照調整(16時間ON/8時間OFF)を行った。NMWは、抽出した中で、本学の近くに売っていたものを選択した(pH約7、硬度約80mgCaCO_3/mL、価格約80円/2L)。エサはRecenttecのYCT(1.7-1.9g/L)とクロレラ(40mg/mL)を使った。ミジンコの継続飼育では、照度とエサの量の検討を行った。照度は、100-600 lxぐらいが良いとされていたが、使用していた恒温槽では、その調整が難しかった。そこでミジンコと光源の位置を検討した。またエサの量の調整は、飼育水500mLに対して、YCTを500μL、クロレラを500μL加えていたが、ミジンコの飼育に影響を与えたのでその量を調整して継続飼育を成立させた。3.繁殖実験に適したNMWの検討現在、25種類のNMWについてミジンコの繁殖試験に適したものを実験で確認中である。実験後、データをまとめて論文発表を予定している。
交感神経性皮膚血流反応を利用した痛みの定量評価法の開発

交感神経性皮膚血流反応(Sympathetic flow response,以下SFR)の有無は、侵害刺激入力の指標となる。このSFRを定量評価し,交感神経活動との関係を研究することにより,SFRの定量評価による痛みの客観的評価法の確立を目的として行った。健康成人ボランティアを対象とし,で温熱,痛覚刺激変化(強度,刺激時間)によるSFRの変化を定量的に評価した。安静仰臥位でSFRの血流減少比は、温熱刺激強度との間に有意な相関を認めた。この血流減少比は、覚醒時と比較して,ベンゾジアゼピン系鎖静薬の少量静注では変化せず,鎖痛作用を有する笑気の吸入(30%)では有意に減少した。また,いずれの場合も,SFRの血流減少比と温熱刺激強度との間に有意な相関を認め、痛みの定量的評価法としての有用性を報告した。(第50回日本自律神経学会総会で発表、投稿準備中)。次に、仰臥位と立位で、交感神経活動を変化させた場合のSFRの変化を観察した。いずれの場合も,熱刺激強度変化に対するSFRの血流減少比には有意差はなく,交感神経活動を増加させた状態でも痛みの認識の程度は変化しないことを確認し、交感神経緊張状態でも有用であることを報告した(第45回日本麻酔学会で発表、投稿準備中)。また、麻酔導入中の吸入麻酔薬濃度の上昇に伴い,SFRの血流減少比は有意に減少し、電気刺激強度の増加(強度、時間)でSFRの血流減少比は有意に増加し、情動反応を除いた場合も侵害刺激変化に鋭敏に反応することを確認した。マイクロニューログラフィーに関しては、現在のところ手術室内での導出は困難であり,現在も検討中である。動物実験でのSFR変化と吸入麻酔薬の肺胞濃度との関係も継続研究中である。このSFRを定量評価し、交感神経活動との関係を研究することにより,SFRの定量評価による痛みの客観的評価法の確立を目的として行った。今年度は,ヒト(ボランティア)で温熱,痛覚刺激変化(強度,刺激時間)によるSFRの変化を定量的に評価した。安静仰臥位でSFRの血流減少比は.温熱刺激強度との間に有意な相関を認めた。この血流減少比は、覚醒時と比較して,ベンゾジアゼピン系鎮静薬の少量静注では変化せず,鎮痛作用を有する笑気の吸入(30%)では有意に減少した。また,いずれの場合も,SFRの血流減少比と温熱刺激強度との間に有意な相関を認めることを報告した(第50回日本自律神経学会総会で発表,投稿準備中)。次に,仰臥位と立位での変化を観察した。いずれの場合も,熱刺激強度変化に対するSFRの血流減少比には有意差はなく.交感神経活動を増加させた状態でも痛みの認識の程度は変化しないことを確認した(第45回日本麻酔学会で発表予定)。来年度は、ヒト(ボランティア)での侵害刺激強度変化時のSFRとマイクロニューログラフイ-で得られる皮膚交感神経活動との比較,動物実験によるSVmR変化と吸入麻酔薬の肺胞濃度との関係(準備中),全身麻酔中のSVmRの出現頻度と血中カテコラミン濃度の変化を経時的に確認し,皮膚血流波形の周波数解析結果と比較,検討する予定である。
放射線照射による膀胱の損傷に対する骨髄由来細胞シートを用いた膀胱再生の試み

骨盤内臓器癌の放射線療法を受けると約半数の患者に排尿障害が生じる。しかし、有効な治療は皆無であり、治療に難渋する。放射線照射療法による排尿障害に対して、機能的な膀胱の再生は、非常に有望である。本研究は、温度応答性培養皿を用いて骨髄由来細胞シートを作製し、放射線を照射して傷害を与えたラット膀胱にパッチ移植した。放射線照射によって傷害を与えた膀胱に骨髄由来細胞シートを移植すると、膀胱組織が再生し、排尿障害が改善することが示された。また、膀胱再生を促進する24種類の細胞増殖因子、サイトカインを検出した。したがって、骨髄由来細胞シート移植によって、機能的な膀胱が再生されることが示唆された。研究代表者今村は、重篤な排尿障害に対して、骨髄由来細胞移植療法により機能的な膀胱の再生を試みている。これまでに、凍結、あるいは、放射線照射によって傷害を与えた膀胱に、骨髄由来細胞を注入移植すると平滑筋層や神経細胞が再生され、排尿障害が改善することを報告した。この細胞注入移植法での欠点は、培養期間中に産生された細胞外基質により単層を形成した細胞を球状の単一細胞として回収し、移植に用いることである。本研究は、温度感受性培養皿を用いて、培養によって形成された単層を維持した細胞シートの作製を試み、さらに、傷害を与えた膀胱に細胞シートを移植することによって、機能的な膀胱が再生されるのかどうか検討した。本年度は、ラットの大腿骨から、骨髄細胞を採取、初代培養を行い、培養皿に接着伸展した細胞を骨髄由来細胞とし、温度感受性培養皿へ継代培養を行った。継代培養を2日間行い、温度感受性培養皿を十分に低温にすることにより、培養された細胞の単層状態を維持した良質な細胞シート作製に成功した。作製した骨髄由来細胞シートを放射線照射した膀胱の前壁にパッチ移植した。対照群には、無細胞シートを用いた偽手術を行った。細胞シート移植4週間後に、膀胱内圧測定、組織学的解析、および、遺伝子解析を行った。細胞シート移植群の排尿閾値圧、排尿間隔時間、1回排尿量、および、膀胱容量は、対照群と比較して、有意に増大し、また、残尿量が有意に低下した。組織学的解析において、細胞シート移植群では、対照群と比較して、膀胱平滑筋層、および、神経細胞の有意な増大が認められ、また、繊維化の抑制、アポトーシス細胞数の減少も認めた。さらに、細胞シート移植すると、いくつかの血管、神経、平滑筋再生因子が確認できた。本年度の研究成果から、骨髄由来細胞シートを放射線照射傷害膀胱に移植すると、機能的な膀胱が再生されることが示唆された。われわれは、重篤な排尿障害に対して、骨髄由来細胞移植療法により機能的な膀胱の再生を試みている。特に、本研究で対象としているのは、放射線療法により生じた重度の排尿障害である。これまでに、放射線照射によって傷害を与えた膀胱に、骨髄由来細胞を注入移植すると排尿障害が改善することを報告した。臨床において、深刻な問題となるのは、放射線照射によって膀胱穿孔など組織が欠損した場合である。このような欠損をともなう膀胱に対しては、細胞を直接注入移植することが困難であるとともに、十分な効果を得られない。したがって、組織欠損が生じた膀胱への細胞移植は、細胞の足場となるような構造体との組み合わせが要求される。本研究は、骨髄由来細胞とその足場となるシートを組み合わせた細胞シートを作製し、組織を欠損させた放射線照射傷害膀胱モデルにパッチ移植する。この細胞シート移植によって機能的な膀胱が再生されるのかどうか検討する。本研究は、生命危機にさらされるような病態を想定し、骨髄由来細胞移植による機能的な膀胱再生を目指したものである。本研究によって、放射線照射療法における高レベル放射線照射による治療効果の向上、あるいは、治療後の膀胱機能低下にともなう排尿障害の回避による生活の質の向上などが期待できる。さらに、再生医療研究の最終目標である、生活の質の向上を目指した一人ひとりに即した質の高い医療の提供という命題に対して真摯に応え、再生医療の将来に対して新たな展開が期待できる。本年度は、良質な細胞シート作製、および、組織欠損を与えない放射線照射傷害膀胱へのパッチ移植を実施した。細胞シート作製における、初代培養した骨髄由来細胞の温度感受性培養皿への継代培養技術の改良を行ったことにより良質な細胞シート作製に成功した。また、欠損組織へのパッチ移植との比較検討するための欠損を与えない膀胱への移植を試みた。われわれは、治療に難渋する難治性の下部尿路障害に対して、Tissue Engineeringを基礎とした技術を応用し、機能的な下部尿路の再生を試みている。これまでに、凍結、あるいは、放射線照射によって傷害を与えた膀胱に、骨髄由来細胞を注入移植すると平滑筋層や神経細胞が再生され、排尿障害が改善することを報告してきた。

しかし、細胞直接注入法は、培養期間中に産生された細胞外基質により単層を形成した細胞を球状の単一細胞として回収し移植に用いることから、単層状態の崩壊、細胞生存率の低下などの欠点を有している。そこで、本研究は、温度感受性培養皿を用いて細胞シートの作製を試み、傷害を与えた膀胱に細胞シートを移植することによって、機能的な膀胱が再生されるのかどうか検討した。ラットの大腿骨から、骨髄細胞を採取、初代培養を行い、培養皿に接着伸展した細胞を骨髄由来細胞とした。その細胞を温度感受性培養皿へ継代し、2日間培養を行った。2日後、温度感受性培養皿を十分に低温にした後、単層を維持した培養細胞をシート状で回収した。作製した骨髄由来細胞シートを放射線照射した膀胱の前壁にパッチ移植した。対照群には、無細胞シートを用いた偽手術を行った。細胞シート移植4週間後に、膀胱内圧測定、組織学的解析、遺伝子解析を行った。組織学的解析において、細胞シートを移植すると、膀胱組織の再生が認められた。また、膀胱内圧測定において、細胞シート移植群での膀胱の機能回復が認められた。以上から、骨髄由来細胞シートを放射線照射傷害膀胱に移植すると、機能的な膀胱が再生されることを示した。さらに、この膀胱再生機序に関与すると考えられる細胞成長因子を検出した。これらの研究成果は、第11回泌尿器科再建再生研究会にて研究会賞を受賞するとともに、学術誌Tissue Engineeringに採択された。泌尿器科学本年度は、良質な骨髄由来細胞シートの作製、および、放射線照射傷害膀胱へのパッチ移植に成功し、さらには、細胞シート移植による機能的な膀胱の再生を示唆する結果を得た。昨年度から継続してきた良質な骨髄由来細胞シートを作製するために、温度感受性培養皿へのコラーゲンコーティングなどの工夫が成功した。また、シートのパッチ移植に関しては、当初の計画通りに、問題なく遂行できた。このことから、当初の計画よりも研究を大きく進めることができた。本年度では、細胞シート移植によって、膀胱機能が正常機能レベルまでに回復すること、膀胱組織が再生についても、組織学的解析により示すことができた。次の段階として、細胞シート移植による機能的な膀胱の再生機序について考察が必要である。現在、移植した細胞(シート)の正着を確認できており、さらに、再生を促進したと考えられる、いくつかの血管、神経、平滑筋再生因子を確認した。次年度では、これらの結果をもとに、細胞シート移植による膀胱再生の機序についての考察を進める。本年度は、当初の計画よりも順調に進み、最終目標を達成に大きく近づいた。本研究の遂行において、順調に進行中である。本年度は、最終目的である骨髄由来細胞シートのパッチ移植による機能的な膀胱再生を遂行するための予備実験を中心に行った。まず、精度の高いパッチ移植を行うには、良質な細胞シートの作製が必須となる。初代培養を終えた骨髄由来細胞のシート作製するために、温度感受性培養皿に継代培養するが、このとき培養皿に対する細胞の接着性が脆弱であり、良質なシート作製が困難であった。
頭部外傷による神経細胞の再生能力の破綻と細胞死の解明

本研究は頭部外傷による神経細胞損傷に関する研究である。受傷後の神経細胞の変化を観察するために、シナプトフィジン、グルタミン酸トランスポーター及びグルタミン合成酵素等の各種抗体を用いて、免疫組織化学的検討を行った。まず、Wistar系雄ラットを用いて頭部外傷モデル動物を作製した。全身麻酔下のラットの頭頂骨正中部にドリルで約0.5cmの骨窓を開け、female lure-lookを留置し48時間飼育した。その後、脳損傷作成装置Fluid PercussionDeviceを装着し、側方打撃を与えた。打撃約48時間後に還流固定し、脳のパラフィン切片を作製した。受傷後の脳では、脳挫傷、神経細胞死、軸索損傷などが観察された。また、損傷の程度及び範囲は打撃強度に依存しており、頭部外傷モデル動物として使用可能であることが分かった。シナプトフィジン抗体を用いた免疫染色では、損傷後の脳において、著しい染色性の増強及び局在性の変化が観察された。しかし、ウエスタンブロット法において損傷部分とコントロール群ではシナプトフィジンの発現量に著明な変化は認められなかった。従って、受傷後の神経細胞では軸索損傷等によって軸索流が遮断され、シナプトフィジンの局在性が変化すると推察された。なお、グルタミン酸トランスポーター及びグルタミン合成酵素の発現量についても同様の方法を用いて検討を行った。本研究成果の一部は第87次日本法医学会総会で発表予定である。損傷後の神経細胞ではグルタミン酸トランスポーター(EAAC1)の発現が上昇し、同時にグルタミン合成酵素が発現する。即ち、グルタミン酸を細胞内に積極的に取り込み、細胞外のグルタミン酸濃度を低下させ、同時に細胞毒性のあるグルタミン酸を無毒なグルタミンに変換する事で神経細胞を保護していると推察されている。そこで、頭部外傷によるグルタミン酸トランスポーターやグルタミン合成酵素の発現量の変化を調べるために、頭部外傷モデル動物を作製した。全身麻酔下のラットの頭頂骨正中部にドリルで0.5cmの骨窓を開け、femaleluer-lockを留置し48時間飼育した。その後、全身麻酔下で脳損傷作製装置Fluid Percussion Deviceを装着し、側方打撃(約3.5atm)を与えた。打撃約48時間後に灌流固定し、脳のパラフィン切片を作製した。その結果、肉眼所見では、打撃部を中心に硬膜外出血と硬膜下出血を認めた。また、脳実質に出血を認めた。組織所見では、打撃部直下の白質内をに軽度の出血を認め、灰白質の神経細胞に変性を認めた。また、白質には数個のspheroid小体を認め、軸索損傷が観察された。次に、打撃の強度を変化させ脳損傷を与えた。約2.5atmでは、白質内に極軽度の出血を認めた。一方、約5.7atmでは約半数が打撃直後に死亡した。なお、打撃後48時間生存したラットの脳では打撃部直下の灰白質に広範な出血を認めた。従って、損傷の程度および範囲は打撃の強度に依存していることが示唆された。現在、グルタミン酸トランスポーターEAAC1やグルタミン合成酵素等の各種抗体を用い免疫染色を行っている。今後、これらの発現量の変化を観察し、受傷後の神経細胞の防御と再生能力の有無を調べることで神経細胞の致死機序を検討する。
高齢期における精神病性症状の神経病理学的基盤の解明

研究課題は「高齢期における精神病性症状の神経病理学的基盤の解明」であり、成人後期以降・高齢期に呈する精神病性障害の病態解明が目的である。昨年度(初年度)においては、死後脳バンクの連続剖検脳62例から、臨床神経病理評価をおこない、50歳以上で初めて精神症状を呈する症例では神経変性疾患の関与を考慮すべきであり、50歳未満発症の精神疾患における神経変性疾患の関与は低いと考えられる知見を得た。今年度の実績としては、2つの成果を得ることができた。第一は、統合失調症の長期経過のなかで、発症当初は激しい幻覚妄想などの症状がみられいわゆる寛解期を経たのち認知症症状の精神症状を呈する症例(いわゆるつよい陰性症状)があるのは経験的に知られていたが、その背景病理は不明なままである。われわれは、統合失調症の長期経過のなかで、認知症症状を示した3症例【(症例1)死亡時75歳男性。(症例2)死亡時64歳女性。(症例3)死亡時69歳女性。】の臨床神経病理評価をおこない次のような知見を得た。この3症例の神経病理学的評価は、生理的な範囲での軽度の老人斑や神経原線維変化や、軽度の嗜銀性顆粒の出現が観察されたが、臨床症状に見合うような組織病理学所見は見いだされなかった。統合失調症の高齢期における認知症性の精神症状の病理背景は、既知の認知症病理にでは説明できないことを明らかにできた。第二の成果は剖検脳から、ハンチントン病の症例で、臨床情報から、精神病症状ではじまる症例と運動症状からはじまる群を見いだした。病理で診断確認された症例を後方視的にみると、若年期に多くの精神障害が発症する中で,ハンチントン病の精神症状先行群も発症年齢は1030代が多く,症状そのものも多彩であるため、非器質性精神疾患と診断してしまう可能性があることを報告した。今研究課題は、保存死後脳(ブレインバンク)すなわち、複数の精神科病院で病理解剖によって得られた脳組織を基盤にしている。その脳保存症例を、神経病理学的に検索し、CPC(臨床病理カンファレンス)を通じて病理確定診断を継続的におこなっている。すなわち、複数の神経病理学者の観察を背景に確定診断を下し、その情報とともに、これもまた複数の精神科専門医によって病歴を診療録によって再検討し、精神医学的評価がなされた。このような、複数の医師による臨床・病理の相関的評価は、通常の臨床ではおこなわれておらず、前述した研究実績は、貴重な医学情報である。今年度(平成30年度)の精神病院で死亡の剖検数は、11例であり、日本国内でもこのような系統的な精神科での剖検脳の集積を実施しているところはなく、当研究課題遂行には不可欠な事項である。今年度は、昨年度以前に剖検がなされた症例を中心にCPCを15症例おこない、そのなかから、研究成果をあげることが可能となった。剖検活動と、それに基づいたCPCは、研究活動の基盤であり、その観察自体が医学の進歩に直接的につながるものである。この活動を推進・維持すること自体が研究課題の進捗状況に結びつくものである。また、いわゆる内因性精神疾患の病因病態解明においては、通常の古典的神経病理検索だけでなく、神経伝達の検討(TH、NPY、Calbindinなどの神経伝達物質)も必要であり、そのため剖検脳の一部を免疫染色のために特殊固定をおこないつつある。すでに、統合失調症の死後脳に対して、THやNPYなどの免疫染色をおこない一定の所見を得ている。この神経伝達物質の技術を、とくに高齢者の精神症状を呈した症例の死後脳に適応し、病因病態の解明をすすめていく基盤を整備できた。以上から進捗は概ね想定どおりと考える。今後は、研究の推進を加速するために、前年度から引きつづき、研究リソースである剖検脳の蓄積とCPCを通じた臨床評価および病理評価をあわせて推進する。同様に医学的な学術進歩に貢献しうると思われる症例は積極的に学会報告および論文化に努める。さらに、このような古典的神経病理学的検索を経た症例について、免疫組織学敵技法を用いて機能的な側面から病理学的異変を検討し、神経病理学的側面から病因病態解明を目指すことをすすめる。とくに、従来からの研究成果に基づいて、TH(Tyrosine hydroxylase),GABAergc neuron(Calbindin,Parvalbumin,NeuropeptideY)などの神経伝達物質に着目する。当面の具体的な推進方策としては、昨年度からの続きでは、ハンチントン病の死後脳の集積を続けるとともに、ハンチントン病の患者群のうち精神症状の先行する症例および運動症状の先行する症例の2群間において神経病理学的な評価を進める。これら臨床表現型のちがう症例を比較検証することによって、高齢期における精神症状発現の機序を考察する。すでに、ハンチントン病の死後脳は集積しており,病理検討や特殊染色をすすめる段階までになっている。一方で、この課題の下支えになっているブレインバンキング(脳の集積)も臨床精神医学の研究全般に必要なリソースであり、その活動も継続的にすすめていく。この活動は、AMEDの日本ブレインバンクの構築事業とリンクしていおり、この精神科ブレインバンク活動を維持するため、第115回日本精神神経学会(2019年6月)および第60回日本神経病理学会(2019年7月)において公募採択されたシンポジウムおよびワークショップで、研究成果と共にブレインバンク活動を喚起することを予定している。研究課題は「高齢期における精神病性症状の神経病理学的基盤の解明」である。

成人前期に発症する統合失調症などの精神病性障害との比較において、成人後期以降・高齢期に初発する精神病性障害の病態解明が目的である。今年度は、われわれの死後脳バンクから、生前情報を検索し、神経病理学的検討の上で、精神症状の検索をおこなった。神経病理学的評価を終えた62症例を対象として、精神科初診時年齢を50歳未満(平均発症年齢27歳)群、50歳以上(平均発症年齢70歳)群に分けて各神経変性疾患の頻度について臨床病理学的検討をおこなった。アルツハイマー病(AD)についてはIntermediate-あるいはHigh-likelihood、レビ-小体病(LBD)についてはlimbicあるいはneocortical subtype、嗜銀性顆粒病(AGD)についてはSaitoステージIIあるいはIIIを有意に神経変性疾患ありとした。初診時年齢別の神経変性疾患の頻度は、40歳未満4/26、40歳代1/3、50歳代4/6、60歳代4/5、70歳以上18/22であった。50歳未満群(29症例:平均死亡時年齢67歳)では、AD(Intermediate-likelihood)が2例(死亡時年齢74歳と89歳)、ハンチントン病が3例だった。50歳以上群(33症例:平均死亡時年齢79歳)では、AD16症例(High-likelihood 10症例、Intermediate-likelihood 6症例)、LBD5症例(辺縁型4症例、大脳皮質型1症例)、CBD1症例、進行性核上性麻痺1症例、AGD8症例であった。双極性障害4症例では、AGDを含む神経変性疾患は認めなかった。50歳以上で初めて精神症状を呈する症例では神経変性疾患の関与を考慮すべきであり、50歳未満発症の精神疾患における神経変性疾患の関与は低いと考えられ新規知見を得た。今回対象にした保存死後脳(ブレインバンク)は、複数の精神科病院で病理解剖によって得られた脳組織である。その脳保存症例を、神経病理学的に検索し、CPC(臨床病理カンファレンス)を通じて病理確定診断を継続的におこなっている。すなわち、複数の神経病理学者の観察を背景に確定診断を下し、その情報とともに、これもまた複数の精神科専門医によって病歴を診療録によって再検討し、精神医学的評価がなされた。このような、複数の医師による臨床・病理の相関的評価は、通常の臨床ではおこなわれておらず、前述した研究実績は、貴重な医学情報である。また、病因病態解明においては、通常の古典的神経病理検索だけでなく、神経伝達の検討も必要であり、そのため剖検脳の一部を免疫染色のために特殊固定をおこない、本年度は準備段階であるが、死後脳での各種神経伝達物質の免疫染色が可能なことを確認した。一方で、これらに医学情報をより充実させるためには、より多数の脳の検討が必要である。それには、臨床情報を十分に備えた病理解剖による死後脳の継続的な蓄積が必要になる。いままでに蓄積した脳の検討だけでなく、ブレインバンキングの継続的な維持活動も重要である。今年度は、主として精神科病院において病理剖検を7例おこない、現在、それらの病理標本を作製中である。今年度は、昨年度以前に剖検がなされた症例についてCPCを14症例おこなって検討試料の充実を図った。
ALMA Long Baseline 観測による原始惑星の直接撮像

本研究は、アタカマ大型ミリ波サブミリ波干渉計(Atacama Large Millimeter/submillimeter Array: ALMA)の観測、アーカイブデータを用いて、生まれたばかりの赤ちゃん星「原始星」周囲の円盤において、惑星が形成されている様相を調べることを目的とする。年齢が1千万年程度の若い星(Class II天体)周囲の円盤においては、ALMAを用いた詳細観測がこれまで行われてきた。これにより円盤内に惑星の存在を示唆する溝状の構造が捉えられてきている。しかし、まさに現在形成されている「原始惑星」を、円盤内で直接観測できた例は皆無である。これは、惑星形成がClass IIより若い、原始星段階(Class 0, I)で始まっている可能性を示唆する。そこで、本研究では、ALMAの詳細観測やアーカイブデータの検索により、原始星周囲の円盤における惑星形成の観測的徴候を得ることを目指す。今年度は、Class I段階からClass II段階への遷移段階にあると考えられる原始星HL Tau、Class I天体IRAS 04169+2702、および原始星連星L1551 NE, IRS 5などの解析を行った。HL Tau周囲の円盤においては、惑星の軌道の「けものみち」である溝状の構造が捉えられている。ALMAデータはこの円盤のみならず、円盤周囲に回転しつつ円盤に落ち込んでいくガスの成分「エンベロープ」の存在を示唆した。この落ち込んでいくエンベロープのガスは、惑星に質量を供給する源になっていると考えられる。一方、原始星のALMAのアーカイブデータの検索も並行して行っている。その結果をもとに、海外の関連分野の研究者と共同で、ALMAの大型観測計画(ラージプログラム)の提案書(プロポーザル)を執筆、提出した。研究は限られた時間、マンパワーの中においては、概ね順調に推移しているといえる。一方で、本研究の究極の目標である原始惑星の検出についてはまだ見通しがたっておらず、これについては今後さらなる努力が必要となる。個別の成果については、まずClass I-II原始星HL Tau周囲の円盤、エンベロープのALMAデータの解析、論文出版は全て完了した。さらに別のClass I原始星IRAS 04169+2702については、サブミリ波干渉計(SMA)のデータ解析から、エンベロープと円盤が逆回転している様相を見出した。これは惑星形成の母体である円盤の形成過程において、磁場が本質的な役割を果たしていることを観測的に示したものである。本論文を出版するとともに、この逆回転の様相をより詳細に調べるためのALMA観測を現在進めている。一方、太陽程度の星の過半数が双子の星「連星」であることがわかっており、連星周囲に付随する惑星も多く見つかってきている。そこで原始星連星に付随する円盤「周連星系円盤」のALMA観測も行っている。これまでClass Iの原始星連星L1551 IRS 5, L1551 NEのALMA観測を完了し、両者の周連星系円盤に渦巻き構造が見られることがわかった。さらにL1551 NEにおいては渦巻き腕の中での物質の分布が一方向に偏っているm=1モードが存在しているのに対して、L1551 IRS 5においてはそのようなモードになっていないことも明らかになった。また今後ALMAによって詳細観測すべき観測候補天体をリストアップし、国際共同研究のもと、ALMAラージプログラムのプロポーザルを提出した。このプロポーザルは、20天体近くに及ぶ原始星周囲の円盤において、惑星形成の兆候の直接検出を目指すものである。今後は、まずは論文化されていないALMAデータの論文出版を精力的に行っていく。原始星連星L1551IRS 5周囲の渦巻き腕の構造が、隣の別の原始星連星L1551 NEのそれと異なっているのは非常に興味深く、タイムリーな出版が望まれる。またL1551 IRS 5, NEと同じ領域にある別の連星XZ TauのALMAアーカイブデータの解析を大学院生に行ってもらっている。これについても今年度中の論文化を目指す。さらにXZ Tauについては大学院生と共同で新たなALMAプロポーザルも提出している。このプロポーザルにおいては、連星の軌道運動の直接検出を目指している。これが成功した場合は、ALMAの動画として天体の運動を捉えることができることになり、原始惑星の軌道運動の検出にもつながる成果となる。本研究の大目標である原始惑星の検出については、まだ十分な見通しはたっていない。今年度初頭に提出したALMAラージプログラムのプロポーザルが採択されることが、本研究が計画年度内までに最大限の成果を上げるためには本質的に重要である。このためにはおそらく5倍にも達する倍率を勝ち抜いて、本プロポーザルが採択される必要がある。できるベストは尽くしているので、なんとか本プロポーザルが採択されることを祈りたい。もしALMAラージプログラムのプロポーザルが採択されなかった場合は、地道にアーカイブデータのイメージング、解析を進めていくしかない。この際、本研究の目的に合致するALMAデータを取得した他の研究グループとも積極的にコンタクトをとり、国際共同体制のもので、成果を出していく。また、本研究計画の最終年度にはもう一度、ALMAのプロポーザルの提出機会がある。そこで今度こそプロポーザルを通せるように、最大限の努力をしていく。

年齢が1千万年程度の若い星(Class II天体)周囲の円盤においては、ALMAを用いた詳細観測がこれまで行われてきた。これにより円盤内に惑星の存在を示唆する溝状の構造が捉えられてきている。しかし、まさに現在形成されている「原始惑星」を、円盤内で直接観測できた例は皆無である。これは、惑星形成がClass IIより若い、原始星段階(Class 0, I)で始まっている可能性を示唆する。そこで、本研究では、ALMAの詳細観測やアーカイブデータの検索により、原始星周囲の円盤における惑星形成の観測的徴候を得ることを目指す。今年度は、Class I段階からClass II段階への遷移段階にあると考えられる原始星HL Tau、Class I天体IRAS 04169+2702、および原始星連星L1551 NE, IRS 5などの解析を行った。HL Tau周囲の円盤においては、惑星の軌道の「けものみち」である溝状の構造が捉えられている。ALMAデータはこの円盤のみならず、円盤周囲に回転しつつ円盤に落ち込んでいくガスの成分「エンベロープ」の存在を示唆した。この落ち込んでいくエンベロープのガスは、惑星に質量を供給する源になっていると考えられる。一方、原始星のALMAのアーカイブデータの検索も並行して行っている。その結果をもとに、海外の関連分野の研究者と共同で、ALMAの大型観測計画(ラージプログラム)の提案書(プロポーザル)を執筆、提出した。研究は限られた時間、マンパワーの中においては、概ね順調に推移しているといえる。一方で、本研究の究極の目標である原始惑星の検出についてはまだ見通しがたっておらず、これについては今後さらなる努力が必要となる。個別の成果については、まずClass I-II原始星HL Tau周囲の円盤、エンベロープのALMAデータの解析、論文出版は全て完了した。さらに別のClass I原始星IRAS 04169+2702については、サブミリ波干渉計(SMA)のデータ解析から、エンベロープと円盤が逆回転している様相を見出した。これは惑星形成の母体である円盤の形成過程において、磁場が本質的な役割を果たしていることを観測的に示したものである。本論文を出版するとともに、この逆回転の様相をより詳細に調べるためのALMA観測を現在進めている。一方、太陽程度の星の過半数が双子の星「連星」であることがわかっており、連星周囲に付随する惑星も多く見つかってきている。そこで原始星連星に付随する円盤「周連星系円盤」のALMA観測も行っている。これまでClass Iの原始星連星L1551 IRS 5, L1551 NEのALMA観測を完了し、両者の周連星系円盤に渦巻き構造が見られることがわかった。さらにL1551 NEにおいては渦巻き腕の中での物質の分布が一方向に偏っているm=1モードが存在しているのに対して、L1551 IRS 5においてはそのようなモードになっていないことも明らかになった。
日本の介護労働市場の労働経済学的分析

「福祉労働市場の労働経済学的分析わが国の福祉労働市場の実態を把握するために、名古屋、東京において社会福祉士資格取得者に対して福祉職選択の理由、福祉士取得の理由、職務内容、賃金形態、賃金水準、仕事への意識について聞き取り調査を行った。また、長野県介護福祉士会長から聞き取り調査のうえ、介護福祉士資格取得者の雇用形態・賃金実態についてアンケート調査を実施するとともに同会より資料収集を行った。アンケート調査を統計解析ソフトを使用して分析した。[一連の調査を通じて、日英の福祉資格について(1)福祉専門職が職場を変える頻度が日本が極端に少ないこと、(2)日本は公務員に準じた年功的賃金体系であるのに対し英国は賃金の幅が狭く、職務に対応した賃金であること、(3)英国では資格取得者と無資格者の間に職務の明確な分離があるが日本では曖昧であること、などが確認できた。共通点としては福祉労働の女性化・パート化が進んでいること、ケア・マネジメント職務において看護職と競合していることが確認できた。]」「福祉労働市場の労働経済学的分析わが国の福祉労働市場の実態を把握するために、名古屋、東京において社会福祉士資格取得者に対して福祉職選択の理由、福祉士取得の理由、職務内容、賃金形態、賃金水準、仕事への意識について聞き取り調査を行った。]」
低分子量ヒアルロン酸の自己分泌/傍分泌によるがん細胞活性化制御機構

我々の結果は、プログレッションの進んだがん細胞ではヒアルロン酸(HA)合成酵素2(HAS2)-ヒアルロニダーゼ2(Hyal2)-CD44分子が発現しており、これらの分子がHA産生、分解をがん細胞膜上で行い、がん細胞の運動能を始めとする上皮ー間葉転換(EMT)における細胞形質、細胞機能を亢進させていることを示したものである。この知見はがん細胞の浸潤転移機構の一つの重要なステップの一つであると考えられ、この機構に関わる分子群は、がんの悪性度の評価と、がん転移の制御に向けた分子標的治療に展開されることが期待される。がん組織にはヒアルロン酸(HA)が多量に存在し、低分子量HAがより高い比率で含まれることが報告されている(Nat Rev Cancer,7:528,2004)。また、HAの受容体であるCD44は、浸潤先端の癌細胞や造腫瘍細胞に高い発現を示す。我々は、がん細胞株HeLaS3細胞はhyaluronan synthase 2を発現しており、高分子量HAを細胞膜上で産生している。この産生された高分子量HAはCD44とhyaluronidase 2の複合体により、低分子量HAに細胞膜上で分断され、さらに、この分断されたHAがreceptorであるCD44にリガンド結合し、EGFRと会合、EGFR細胞質内ドメインのチロシンキナーゼをリン酸化することを見出している。この自己分泌/傍分泌(オートクリン/パラクリン)機構により、活性化されたRTKリン酸化シグナルが、同細胞のRho GTPase、ERK1/2、NFKBなどの多系列のシグナルを活性化に結びつき、細胞運動能亢進やタンパク分解酵素発現などの細胞活性化を起すことを見出し、発表している(15^<th> World Congress on Advances on Oncology Greece,2010.10、Keystone Symposia,Vancouver,2011.1.)。この知見は、低分子量HAが起動する細胞活性化は、がん細胞の浸潤転移能を含めた悪性形質の進展の機構となる可能性を示唆している。本研究の目的は、この低分子量HAによる細胞活性化形質の同定と、その分子機構を分子・細胞生物学や形態学の方法を用いて解析することと、さらにこの機構のがん進展における役割を解明することであり、CD44の機能を踏まえて分子レベルで解析することも含まれる。生体組織では、hyalronan(HA)は、HA合成酵素HAS1、HAS2またはHAS3、およびCD44依存的にビアルロニダーゼ(のHyal)1とHYAL2によって分解により合成される。HAとHYALsは複雑に腫瘍の増殖および転移に関与している。また、ランダムな細胞の動きは、一般的にがん細胞が原発巣から離脱して、周囲組織に浸潤する際の重要な細胞機構(EMT)である。増殖因子などの刺激因子を添加することなしにがん細胞が運動能を自発的に有している場合があり、この状態の運動能をbasal motility(BM)と呼ぶ。BMにおけるHAS2とHYAL2/CD44の役割を調べるために、我々は、HAS2とHAS3を発現しているHeLa細胞-S3細胞のBMをBoydenチャンバーアッセイにより検討した。HAS2のsiRNAノックダウン(KD)は、HeLa-S3細胞のBMを低下させた。HeLa-S3細胞は50ng/mlの高分子量HA(HMW-HA)を6時間培養上清中に分泌するが、CD44やHyal2をKDした細胞ではBMが消失し、また、これら分子をKDさせた細胞では外因性HMW_HAを添加しても、細胞の運動能を向上させることができず、MHW-HAはHYAL2-siRNAを処理したHeLa-S3細胞のBMの回復できた。これらの結果は、HeLaiS3細胞がBMを促進できるLMW-HAを自己産生できるシステムを固有に持っていることを示唆する。これらの結果は一部のがん細胞ではHAS2-CD44/HYAL2システムがオートクライン機構としてがん細胞細胞膜にあり、HMWHAを産生し、細胞膜で自己分解を介してLMWHAを創り出し、がん細胞の運動能を亢進させている。この知見はがん細胞の浸潤転移の初期機構と考えられ、がんの悪性度の評価ととくにがん転移の制御に向けた分子標的治療に展開されることが期待される。CD44の細胞内ドメインには既知の酵素活性を示唆する構造は存在せず、他の細胞内会合分子の動員によってその多彩な細胞制御能が発揮されることが想定されている。我々は既にyeast-two-hybrid法でCD44細胞内ドメインへ会合する分子を3分子(RanBPM、hMena、clone3-11)同定している。

これらの会合分子の低分子量ヒアルロン酸(LMWHA)-CD44相互作用における役割を、我々が会合を見出した分子のsiRNAknock-downを行い、細胞運動能、CD44核内移行を指標として検討した。23-kDaを中心としたLMWHAは極めて効率よくCD44の細胞質-核内移行を誘導することを我々は見出しており、我々の結果からはCD44はLMWHA刺激によりendocytosisされ、また、核内に移動すると考えられる。RanBPMはCD44の細胞質内ドメインに結合し、LMWHA-CD44相互作用を仲介する。この分子のknockdownによってLMWHA刺激によるCD44の核内移動が抑制され、さらに、RhoA活性化の抑制が解除される。したがって、LMWHAのligationによりRanBPMはCD44の細胞質内ドメインに会合することにより、CD44の核内移行を制御していると考えられる。そこでRanBPMとCD44結合ドメインをmimicしたペプチドを合成し、この間の会合を阻止し、細胞運動能を抑制することを検討した。現在、この阻止作用をもったペプチドをスクリーニングした段階で、さらに、これらのペプチドを用いて癌浸潤転移を阻止する治療戦略の確立を企画している。我々は、過去に、CD44が細胞膜上でHAの低分子化に働き、産生されたLMWHAはCD44の核内移行のtriggerとなることを示している(2010)。[考察]現在では癌細胞がEMTを起こすことにより癌幹細胞形質を持つ細胞が生まれることは多くの人が知っている。EMTが癌幹細胞の誕生に繋がるということで、現在の治療学的観点から考えると、EMTに大きな関わりを持つCD44機能の解明は癌幹細胞の発生や癌細胞の運動能の作用機構の解明に連なり、将来のがん治療の根幹に結びつく研究であると考えられる。一昨年までの成果をSaitoT(Int J Oncol)に報告してから、その後、個々の細胞運動を計測できるシステムを導入し、ピアルロン酸ががん細胞の浸潤転移機構に与える影響を分子レベルで解析している。とくに、この機構にNF-_kBやRanBPM分子の活性化、動態が重要であることを追求している。今後、ビアルロン酸刺激にもとづく、がん細胞運動能の分子レベルの解析を、CD44,ERK1/2,RhoGTPase,NF-_kB,hMenaのバリアント、上皮間葉変換に関わる分子の関連を中心に解析する。このことにより、がん浸潤転移を阻止する治療に結び付けるように研究を展開する。
コロイド分散系におけるコロイドアモルファスの構造解析と大面積センサー材料の作製

荷電コロイド分散系において、粒径、粒子濃度、塩濃度を実験パラメータとして、結晶、アモルファス、ランダム状態を連続的、系統的に作製することができた。具体的には、粒径、粒子濃度、塩濃度を変えた単分散ポリスチレン粒子の水分散液を作製し、これらを平板状キャピラリーセル内に充填し、反射スペクトル測定を行うことによりコロイド結晶化臨界濃度を決定した。これにより、各粒径における粒子濃度vs.塩濃度の結晶化相図が作成でき、結晶相、非結晶相形成条件を明らかにすることができた。各条件の試料について、角度依存反射および透過スペクトル測定や、目視および写真撮影を行った。その結果、荷電コロイド分散系においても角度依存性がなく均一な色彩を示す試料が得られる条件があることがわかった。次に、外部刺激により色彩変化するセンサー材料の作製を試みた。コロイドアモルファスとなる条件のポリスチレンコロイド水分散液に、ゲル化剤を溶解させ、平板状キャピラリーセル内に充填し、紫外線照射による光重合を行った。その後、アクリレート系紫外線硬化樹脂を用いて粒子配列の樹脂固定化を試みた。アクリレート系樹脂を用いることで樹脂フィルム化することに成功したが、スペクトル特性の劣化がみられた。紫外線照射条件や開始剤濃度などの樹脂化の細かな条件を検討することにより、スペクトル特性を維持した樹脂フィルムが得られる可能性があり、来年度の研究に向けた方向性が示された。粒子濃度vs.塩濃度の結晶化相図を作成し、結晶相、非結晶相形成条件を明らにすることができた。さらにコロイド分散系においても角度依存性がなく均一な色彩を示す試料が得られる条件があることがわかった。樹脂フィルム化には成功したが、スペクトル特性の劣化がみられた。紫外線照射条件や開始剤濃度などの細かな条件を検討し、スペクトル特性を維持した試料の作製を行う。得られた試料に引張りおよび圧縮応力を印加し、スペクトルや色彩変化を評価する。
酵母の転写因子変異により獲得した有機溶媒耐性の耐性メカニズム解析

申請者は、連続培養中に得られた有機溶媒耐性酵母KK-211株を解析し、転写因子Pdr1pの1アミノ酸変異が重要性を発見してきた。本研究ではPdr1p変異体において転写誘導される細胞膜、細胞壁タンパク質群の中で耐性を与える直接的原因となるものを同定し、親水性・疎水性という性質の違いによって関与するものが異なることを明らかにした。またPdr1pの相同遺伝子であるPdr3pに着目し、有機溶媒ストレスに対するシグナル伝達について調べたところ、有機溶媒ストレス応答にはPdr3pが関与していることを明らかにした。さらに、そのシグナルはミトコンドリアを介してPdr3pに伝達されるという機構を提唱した。微生物を用いて高効率な疎水性物質生産を行うため、有機溶媒耐性付与が重要な技術課題である。連続培養中に得られた有機溶媒耐性酵母KK-211株を基に、申請者はトランスクリプトーム解析により転写因子Pdr1pの1アミノ酸変異が重要であることを発見してきた。本研究は有機溶媒対酵母において、変異型Pdr1pにより制御されている遺伝子だけだなく、Pdr1pの認識配列であるPleiotropic Drug Response Element(PDRE)を持たないにもかかわらず転写レベルの上昇した遺伝子群の中から、実際に耐性に関わるものを同定するとともに、耐性を示す有機溶媒の種類を調べることによって耐性機構の解明を試みる。また、プロモーター中のPDREへの他の転写因子の作用、PDRE配列のゆらぎ、プロモーター中での位置や数について調べ、転写制御機構を解明する。有機溶媒耐性酵母KK-211株ではABCトランスポーターや各種細胞表層タンパク質をコードする遺伝子の転写誘導が見られ、その転写制御にPdr1pの1アミノ酸変異が重要であることをこれまでに発見してきたが、本年度においては、転写誘導された細胞膜、細胞壁タンパク質の中で有機溶媒耐性を与える直接的原因となる因子の同定を試みた。ABCトランスポーターについてはC末端にEGFPを融合した形で過剰発現を行い、EGFPの蛍光観察による発現と局在の確認を行った後、有機溶媒存在下での生育を測定することにより有機溶媒耐性への関与を調べた結果、有機溶媒耐性に関与するABCトランスポーターを同定することができた。さらにGPIアンカー型の細胞壁タンパク質についてEGFPの融合は行わずに過剰発現を行い、リアルタイムRT-PCRにより発現確認を行った後、同様に有機溶媒耐性を調べた。その結果、有機溶媒耐性に関与する細胞壁タンパク質の同定にも成功した。本研究では有機溶媒対酵母において、変異型Pdr1pにより制御されている遺伝子だけだなく、Pdr1pの認識配列であるPleiotropic Drug Response Element(PDRE)を持たないにもかかわらず転写レベルの上昇した遺伝子群の中から、実際に耐性に関わるものを同定するとともに、耐性を示す有機溶媒の種類を調べることによって耐性機構の解明を試みる。また、プロモーター中のPDREへの他の転写因子の作用、PDRE配列のゆらぎ、プロモーター中での位置や数について調べる。これにより、変異Pdr1pによる転写活性化の分子機構を解明する。申請者らが単離した有機溶媒耐性酵母KK-211株を解析した結果、転写因子Pdr1pの1アミノ酸変異(R821S)が有機溶媒耐性の原因であることを明らかにしてきた。Pdr1p(WT)では有機溶媒に応答して下流の有機溶媒耐性に関する遺伝子の転写が活性化されるのに対して、Pdr1p(R821S)では下流遺伝子の転写が常時活性化されていることが示されている。Pdr1pの結合配列はSaccharomyces cerevisiaeのゲノム中に200以上存在するが、実際にPdr1p(R821S)に転写誘導されるのは10%以下である。そこで本研究ではPdr1pと一部機能が重複するPdr3pについて着目することで、酵母有機溶媒耐性機構の更なる解明に迫った。PDR経路の転写因子Pdr1pとPdr3pは遺伝子重複により生じた相同遺伝子で、多剤耐性では重複した機能を持つと考えられてきた。しかし今回、有機溶媒ストレス応答にはPdr3pは関わるもののPdr1pは関与しないことを明らかにした。さらに、欠損株を用いた実験で有機溶媒ストレスのシグナルはミトコンドリアを介してPdr3pに伝達されることを示唆した。申請者は、連続培養中に得られた有機溶媒耐性酵母KK-211株を基にトランスクリプトーム解析を行い、転写因子Pdr1pの1アミノ酸変異が重要であることを発見してきた。本研究では有機溶媒耐性酵母において、変異型Pdr1pにより制御されている遺伝子だけでなく、Pdr1pの認識配列であるPleiotropic Drug Response Element (PDRE)を持たないにも関わらず転写レベルの上昇した遺伝子群の中から、実際に耐性に関わるものを同定するとともに、耐性を示す有機溶媒の種類を調べることによって有機溶媒耐性機構の解明を試みる。

有機溶媒耐性酵母KK-211株ではABCトランスポーターや各種細胞表層タンパク質をコードする遺伝子の転写誘導が見られ、その転写制御にPdr1pの1アミノ酸変異(R821S)が重要であることをこれまでに発見してきたが、転写誘導された細胞膜、細胞壁タンパク質群の中で有機溶媒耐性を与える直接的原因となるタンパク質を同定することができ、親水性、疎水性という有機溶媒の性質によって関与するものが異なることを明らかにした。また、Pdr1p(WT)では有機溶媒に応答して下流の有機溶媒耐性に関与する遺伝子の転写が活性化されるのに対して、Pdr1p(R821S)では下流遺伝子の転写が常時活性化されている。Pdr1pの相同遺伝子であり一部機能が重複するPdr3pについても着目し、有機溶媒ストレスに対するシグナル伝達について調べたところ、有機溶媒ストレス応答にはPdr3pが関与していることを明らかにした。さらに有機溶媒ストレスのシグナルはミトコンドリアを介してPdr3pに伝達されるという機構を提唱した。また、Pdr1pにおいてR821S以外のアミノ酸変異を追加することで耐性を強化できる可能性を見出した。申請者は、連続培養中に得られた有機溶媒耐性酵母KK-211株を解析し、転写因子Pdr1pの1アミノ酸変異が重要性を発見してきた。本研究ではPdr1p変異体において転写誘導される細胞膜、細胞壁タンパク質群の中で耐性を与える直接的原因となるものを同定し、親水性・疎水性という性質の違いによって関与するものが異なることを明らかにした。またPdr1pの相同遺伝子であるPdr3pに着目し、有機溶媒ストレスに対するシグナル伝達について調べたところ、有機溶媒ストレス応答にはPdr3pが関与していることを明らかにした。さらに、そのシグナルはミトコンドリアを介してPdr3pに伝達されるという機構を提唱した。これまで多剤耐性において機能が重複すると考えられていたPdr1pとPdr3pについて、野生株で有機溶媒ストレス応答における両者の役割が異なることを明らかにした。さらに有機溶媒ストレスシグナルはミトコンドリアを介してPdr3pに伝達されることも判明した。以上のように有機溶媒ストレス応答機構に関する新たな知見を得ることができたため、研究はおおむね順調に進展していると判断した。応用生化学転写因子Pdr1pはプロモーター中のPDRE配列を認識して転写制御を行っていることが知られているが、有機溶媒耐性に関わるPdr1p(R821S)変異体において、実際にPdr1p(R821S)によって転写誘導される遺伝子はPDREをもつ遺伝子のうち、わずか10%以下と少なく転写誘導レベルも遺伝子によって異なる。したがって、他の転写因子の作用、PDRE配列のゆらぎ、プロモーター中でのPDREの数と位置など、何らかの選択機構の存在が考えられる。そこで、Pdr1p(R821S)の制御対象となる遺伝子がどのように識別・選択されているのかについて研究を推進していく予定である。当初のH25年度の研究実施計画では、有機溶媒耐性酵母KK-211株で転写誘導されているABCトランスポーターや細胞表層タンパク質群に着目し、有機溶媒耐性に関わるものの同定を予定していた。