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司法取引に関する日欧間の比較研究

主としてイタリアおよびギリシャの刑事手続において採用されている司法取引的制度の内容について、その歴史的経緯および学説上の議論を中心に調査・検討し、同制度の導入を考える上で有意義な知見を得た。また、わが国の刑事手続における司法取引的手法の導入の可否および当否を考える前提として理論的検討が必要とされるおとり捜査や公訴事実の同一性の問題等の基礎理論について従来の学説にはなかった新たな視点から根本的な見直しを行った。イタリア、フランス、ギリシャ等の欧州諸国における刑事手続および司法取引制度の歴史的沿革、現行制度の内容および運用等に関する資料・情報を収集・分析すると同時に、そこから、日本に同様の制度を導入することの是非・条件を論ずるための議論枠組を抽出し、その成果を公表する。研究初年度にあたる今年度は、とくにイタリア、フランス、ギリシャの司法取引に関する関係文献・資料の収集に重点をおいて、研究を遂行した。イタリアおよびフランス関連の文献・資料については、刑事実体法・手続法一般および司法取引に関する最近の文献で、とりわけ日本国内では入手不可能なものについて、収集を進めた。他方、ギリシャ関連の文献・資料については、平成19年7月18日から22日まで、アテネに赴き、専門家のアドヴァイスを得ながら収集を行なった。現在も、これらの文献・資料の収集を継続中であるが、同時に、既に入手済みの文献を講読・分析を徐々に進めている。これら欧州諸国の関連文献の収集と平行して、わが国の刑事手続における司法取引的手法に関する学説・実務の動向を把握するための手がかりとするため、とくにおとり捜査の手続的問題に関する研究を行い、阪大法学にその成果の一部を公表した。おとり捜査は、犯罪の組織化・隠密化・巧妙化に対する手続的な対抗手段という意味で司法取引と共通点をもつが、他方で、これと異なり、特別な立法措置を要することなく行なうことが許されると考えられており、現在の法制度の枠組内での許容性の要件が議論されている。この問題を検討しておくことは、本研究がその目的の一つとして確立を目指す、わが国における司法取引の導入の是非・条件を検討するための理論的枠組を考察する上で重要な意味をもつものと考えられる。研修2年目にあたる今年度は、まず、昨年度に開始したおとり捜査の手続的問題に関する研修を継続・完了し、その成果を、「『おとり捜査』について(2)(3)(4)・完)」として、「阪大法学」に掲載し、公表した。おとり捜査は、「司法取引」それ自体には属さないが、犯罪の組織化・隠密化・巧妙化に対する手続的な対抗手段という意味で司法取引と共通する問題であり、わが国における司法取引の導入の是非・条件を検討するための理論的枠組を考察する上で重要な意味をもつものと考えられる。本研究成果においては、おとり捜査の手続的問題をめぐる従来の議論を再検討するとともに、新たな角度から光をあて、この種の問題を考えるにあたっての基本的な検討枠組を提示した。他方、外国法の研究に関しては、昨年度に引き続き、とくにイタリア、ギリシャの司法取引に関する関係文献・資料の収集を行った。今年度は、とくにギリシャの司法取引関連の情報・文献・資料に重点をおき、その一環として、平成20年7月22日から8月4日まで、アテネに赴き、図書等の資料を収集するとともに、ギリシャ刑事手続一般の運用状況および司法取引の一般本な状況について、とりわけ実務家を中心として情報・意見の聴取を行った。本年度は、主としてイタリアにおける司法取引関連制度の文献収集および調査を行った。なかでも、イタリア現行刑事訴訟法が導入する「簡易裁判」、「当事者の請求に基づく刑の適用の手続は、公判手続に伴う手続的権利保障の放棄と引き換えに刑の減免という「報償」を被告人に与える制度であるが、この種の制度が、同国の憲法上の要請である「適正手続」および「起訴法定主義」といかなる関係にあるのかについて、刑事手続の全体像を踏まえながら検討し、その成果を「刑事法ジャーナル」誌上に「イタリアの刑事裁判と合意手続」として公表する予定である(現在校正中)。さらに、このような意味での「取引」と、司法への協力と引き換えに刑の減免等の利益与える「買春者」の制度との関係について、後者が一般に組織犯罪を念頭においた議論であるのに対して、前者は非組織犯罪で比較的軽微で争いのない事件を念頭においた議論であることが判明した。このような「取引」の様々な態様と位置づけについては、さらに理論的な検討を進める必要があり、その成果は来年度に公表する予定である。また、司法取引は、当該国の司法文化と密接に関係するものであるため、そのわが国への導入の是非を考察するに当たっては、単なる制度の形式的な比較では必ずしも十分ではなく、その比較研究を行う前提として、刑事法における比較研究そのものの意義を問い直す必要もある。そのため、イタリアにおける刑事比較法学に関する文献を検討し、そのうち最も重要な文献について翻訳し、公表した。本年度は、イタリア・ギリシャにおける司法取引関連制度の文献収集および調査を継続するとともに、その成果を論文にまとめる作業を行った。

とりわけ、イタリアにおいては、1970年代から、組織犯罪に関して、実務上、被告人が司法に協力した事実を量刑上有利に考慮する扱いがはじまり、1990年代後半以降は、関連立法が相次いで実現し、量刑上の扱いだけでなく、証人保護プログラム等が導入されるに至っている。その際、起訴便宜主義のもとでいわゆる「刑事免責」制度をとるアメリカとは異なり、(憲法上)起訴法定主義を採るイタリアでは、司法協力者に「免責」を認めることには消極的で、司法協力に対する実体的な「報償」としては、刑の減軽や行刑上の措置を講ずるにとどまることが確認された。また、イタリアにおいては、組織犯罪のなかでも、テロ犯罪とマフィア型犯罪とでは、司法への協力の動機が類型的に異なることから、両者を区別して議論していることも判明した。ギリシャに関しても,2000年以降、組織犯罪を対象に、司法取引的手法が導入されてきたが、最近では、贈収賄事件もその対象に含めることについて議論があることが分かった。これらの諸国の司法協力者の刑事手続上の扱いに関する実務・立法の沿革・現状については、現在、論文にまとめつつあるところである。他方、日本における司法取引的手法の導入の是非に関しては、司法取引それ自体の問題性を検討する前提との一つとして、公訴に関する基礎理論の再検討が必要となるものと考えられることから、訴因変更の限界・可否に関する刑訴法312条1項の解釈論をめぐる従来の学説に批判的検討を加え、「公訴」の対象事実の「単位」についての理論的検討を行った。
妊娠期における心身の出産準備を支援するセルフケア・アセスメントツールの開発と評価

妊娠期におけるセルフケア・アセメントツールとしての尺度開発を目的として計画した、助産師・母親への半構造的面接調査に関しては、琉球大学人を対象とする医学系研究倫理審査委員会の承認が得られた。しかし、尺度評価の一環として、出産後の母児に対する唾液ストレスマーカー測定の必要性に対して、6回の修正を経て母親のみの唾液アミラーゼ測定で本倫理審査委員会の承認が得られた。そのため、望ましい出産準備状態への移行に効果的なセルフケア内容を助産師および出産後の女性の語りから質的に抽出する調査研究の開始が予定より大幅に遅れ、サンプルサイズの半分各5名づつ計10名の半構造化面接調査を実施できた。その逐語録の語りからBerelson.B.らの内容分析による質的分析を実施中である。具体的内容としては、1)研究計画に対する、本倫理審査委員会の審査内容に基づいた、研究計画の修正・再構築を行った。2)調査対象施設責任者に対して、調査協力の許諾を得るための研究計画の説明を再度実施した。3)調査対象である開業助産師や施設勤務助産師に対する、半構造的面接調査の説明会を実施した。4)国内外の文献検索によりアセスメントツール内容の再検討を行った。5)出産準備状態と出産後のストレスマーカーとしての母児の唾液コルチゾール等の唾液採取の予定だったが、出産直後の唾液採取において、特に新生児の負担、保存や測定方法等にも多額の費用がかかる点において、本倫理審査委員会から承認が得られず、母親のみで負担の少ない唾液アミラーゼによるストレスマーカー測定に変更することで研究の承認が得られた。6)助産師が実施する妊娠期の助産ケアに関する聞き取り調査を助産師5名、母親5名に対して半構造的面接を実施し、その逐語録の語りから、Berelson.B.らの内容分析による質的分析を進めている。良好な出産準備状態を評価する手段の一つとしてセルフケア・アセスメントツールの開発を考えている。そのツールの評価方法の一環として出産後ストレスマーカー、つまり母児の唾液コルチゾール値測定の実施を計画していたが、琉球大学人を対象とする医学系研究倫理審査委員会より、新生児の唾液採取上の必要性・問題点を指摘され研究計画の大幅な修正を余儀なくされた。6回の修正案を提出後、より簡便な唾液アミラーゼ測定による母親のみの測定へ変更した。その影響もあり、研究計画の修正に時間がかかり、当初予定より聴き取り調査開始が遅れた。また、研究者自身と同居している父母の闘病・在宅看護・看取り(父2018.8月、母2018.12月死去)が重なり、研究遂行に大幅に遅延が生じた。2018年度末3月までに確保した対象数は助産師5名、母親各5名のサンプルサイズであるが、2019年度初めには各10名の対象を確保し、その逐語録の語りから、Berelson.B.らの内容分析による質的分析を進め、アセスメントツール案を作成に向けて研究を進めている。妊娠期のセルフケアアセスメントツールの信頼性・妥当性の検証を対象妊産褥婦50症例に対して、インフォームドコンセントを適切に行いながら、唾液ストレスマーカーや他の心理尺度によって縦断的調査を実施する予定である。その結果から妊娠期のセルフケアアセスメントツールの信頼性・妥当性の検証を行う予定である。そのためには、同意を得られた妊産褥婦の出産前後における調査研究実施のために、各施設勤務臨床助産師の協力が不可欠なので、人件費を投入しながら研究対象者数を増やす努力を行い、研究者の時間を確保する。また、検証のための姙産褥婦50人の十分なサンプルサイズ確保のためには、2020年度までの研究計画延長が必要と考えている。29年度は、助産師が実施する妊娠期の助産ケアに関する聞き取り調査を研究調査協力が得られた助産師、母親各5名に対して実施した。その調査結果をもとに、妊娠期における心身の出産準備を支援するセルフケア・アセスメントツールの試案を作成、その信頼性・妥当性検証のためのパイロットスタディを診療所・助産所で実施する前段階にある。アセスメントツール試案完成のためには、さらに15組の調査対象を目標としているので、さらに10組の聞き取り調査が必要である。聞き取り調査結果の質的分析は,内容分析等で実施している。実施聞き取り調査症例、調査結果の質的分析等を経て、次年度調査のサンプルサイズは、20組を目標とすることにした。1研究計画に基づき、琉球大学人を対象とする医学系研究倫理審査委員会の審査を受け、研究計画内容の再確認を行った。2調査対象である助産師や妊産婦に対し、対象施設において調査協力の許諾を得るための研究計画の説明会を実施した。3開業助産師や産院勤務助産師に対する、質問紙法による聞き取り調査の説明会を実施した。4同時に国内外の文献検索によりアセスメントツール内容の検討を行った。5出産準備状態と出産後のストレスマーカーとしての母児の唾液コルチゾール等の唾液採取を同意が得られた症例に試験的に5組実施した。しかし、採取方法において困難な状況が見られ、特に出産直後の新生児の唾液採取に時間がかかり、保存や測定方法の再考を要する結果となった。出産準備状態と出産後のストレスマーカーとしての母児の唾液コルチゾール等の唾液採取方法において5組に試験的に実施した結果、採取上の問題点が見られた。特に出産直後の唾液採取に時間がかかり、保存や測定方法にやや困難な状況が出現しており、再考を要する。

新生児にとっては測定方法が難しいオキシトシン,コルチゾールではなく、よりストレスがかからない、簡便な測定方法である唾液アミラーゼキットでの測定への変更を考慮している。妊娠期におけるセルフケア・アセメントツールとしての尺度開発を目的として計画した、助産師・母親への半構造的面接調査に関しては、琉球大学人を対象とする医学系研究倫理審査委員会の承認が得られた。しかし、尺度評価の一環として、出産後の母児に対する唾液ストレスマーカー測定の必要性に対して、6回の修正を経て母親のみの唾液アミラーゼ測定で本倫理審査委員会の承認が得られた。そのため、望ましい出産準備状態への移行に効果的なセルフケア内容を助産師および出産後の女性の語りから質的に抽出する調査研究の開始が予定より大幅に遅れ、サンプルサイズの半分各5名づつ計10名の半構造化面接調査を実施できた。その逐語録の語りからBerelson.B.らの内容分析による質的分析を実施中である。具体的内容としては、1)研究計画に対する、本倫理審査委員会の審査内容に基づいた、研究計画の修正・再構築を行った。2)調査対象施設責任者に対して、調査協力の許諾を得るための研究計画の説明を再度実施した。3)調査対象である開業助産師や施設勤務助産師に対する、半構造的面接調査の説明会を実施した。4)国内外の文献検索によりアセスメントツール内容の再検討を行った。5)出産準備状態と出産後のストレスマーカーとしての母児の唾液コルチゾール等の唾液採取の予定だったが、出産直後の唾液採取において、特に新生児の負担、保存や測定方法等にも多額の費用がかかる点において、本倫理審査委員会から承認が得られず、母親のみで負担の少ない唾液アミラーゼによるストレスマーカー測定に変更することで研究の承認が得られた。6)助産師が実施する妊娠期の助産ケアに関する聞き取り調査を助産師5名、母親5名に対して半構造的面接を実施し、その逐語録の語りから、Berelson.B.らの内容分析による質的分析を進めている。良好な出産準備状態を評価する手段の一つとしてセルフケア・アセスメントツールの開発を考えている。そのツールの評価方法の一環として出産後ストレスマーカー、つまり母児の唾液コルチゾール値測定の実施を計画していたが、琉球大学人を対象とする医学系研究倫理審査委員会より、新生児の唾液採取上の必要性・問題点を指摘され研究計画の大幅な修正を余儀なくされた。6回の修正案を提出後、より簡便な唾液アミラーゼ測定による母親のみの測定へ変更した。その影響もあり、研究計画の修正に時間がかかり、当初予定より聴き取り調査開始が遅れた。また、研究者自身と同居している父母の闘病・在宅看護・看取り(父2018.8月、母2018.12月死去)が重なり、研究遂行に大幅に遅延が生じた。2018年度末3月までに確保した対象数は助産師5名、母親各5名のサンプルサイズであるが、2019年度初めには各10名の対象を確保し、その逐語録の語りから、Berelson.B.らの内容分析による質的分析を進め、アセスメントツール案を作成に向けて研究を進めている。妊娠期のセルフケアアセスメントツールの信頼性・妥当性の検証を唾液ストレスマーカーや他の心理尺度とともにすすめていく。そのためには、同意を得られた対象母児の出産前後における、臨床助産師の協力が不可欠なので、人件費を投入しながら研究対象者数を増やす努力を行う。
ナノスケール構造制御された複合系における非線形光学応答の巨大化

カーボンナノチューブとその複合系および金属ナノ粒子の3次非線形光学応答の巨大化とそのメカニズム解明の研究を行った.単層カーボンナノチューブでは、一次元的な構造に特徴的な電子状態に共鳴して非線形性が増大することが明らかになった.さらに、C84フラーレンをナノチューブに内包させると、さらに非線形性が増大することを初めて明らかにした.また、金属ナノ粒子の場合、そのサイズを変えることによって光学非線形性の起源が、金属電子による表面プラズモン効果から分子的な性質である量子サイズ効果へクロスオーバーすることがわかった.カーボンナノチューブとその複合系および金属ナノ粒子の3次非線形光学応答の巨大化とそのメカニズム解明の研究を行った.単層カーボンナノチューブでは、一次元的な構造に特徴的な電子状態に共鳴して非線形性が増大することが明らかになった.さらに、C84フラーレンをナノチューブに内包させると、さらに非線形性が増大することを初めて明らかにした.また、金属ナノ粒子の場合、そのサイズを変えることによって光学非線形性の起源が、金属電子による表面プラズモン効果から分子的な性質である量子サイズ効果へクロスオーバーすることがわかった.1)フラーレンピーポッドの作製と光学応答の研究C_60、C_70を内包したカーボンナノチューブ(フラーレンピーポッド)を作製し、その光物性と非線形性の増大化を調べた。ラマンスペクトルの測定から、C_60ピーポッドの場合、C_60分子が重合して一次元ポリマーを形成していることがわかった。フェムト秒ポンプ・プローブ分光によってフラーレンピーポッドの3次非線形感受率を測定したところ、内包されたフラーレンに起因する非線形応答の成分が観測された。フラーレンとナノチューブを複合化することによって2eV近傍では非線形感受率が増大することを見出した。2)単層カーボンナノチューブの非線形光学応答の共鳴増大効果カイラリティの異なるナノチューブにおける特定の励起子準位にレーザー光を共鳴させることによって、擬一次元励起子の特徴を反映して非線形感受率が共鳴増大することがわかった。さらに、非線形感受率の励起スペクトルを詳細に測定することによって、フォノン放出を伴った励起過程を含む3次非線形光学過程により、特定チューブの非線形感受率が増大することを明らかにした。これは、一次元励起子系の非線形光学過程においてフォノンを伴った光学過程が現れることを示した成果である。3)単層カーボンナノチューブの励起子構造の研究ミセル化カーボンナノチューブの電場変調分光を行い、カイラリティに依存した励起子構造の詳細を明らかにした。電場変調スペクトルの解析から、2光子過程によって光学遷移が可能となる暗励起子と1光子許容遷移である明励起子は"近い縮退状態"にあり、暗励起子準位が明励起子のそれよりも高エネルギー側にあることがわかった。これらの研究により、これまで同定されていなかった暗励起子の準位構造が明らかになった。1)フラーレンピーポッドの非線形光学応答の研究C_<60>、C_<70>、C_<84>を内包したカーボンナノチューブ(フラーレンピーポッド)を作製し、その光物性と非線形性の増大化を調べた。C_<70>およびC_<60>ピーポッでは、3次非線形感受率はナノチューブと内包フラーレンの成分の単純な和になることがわかった。一方、C_<84>ピーポッドでは、半導体チューブの第2バンド間遷移エネルギー近傍においてナノチューブと比較して非線形性が増大することが明らかになった。この増大効果は、この遷移エネルギー近傍におけるエネルギーバンドの混成による遷移双極子モーメントの増大、および内包C_<84>から半導体チューブの第2バンドへの電荷移動によると考えられる。2)金属ナノ粒子の非線形光学応答の研究チオール分子で修飾された金クラスターおよびガラス中に分散された金ナノ粒子を対象にして、3次非線形光学応答のナノ粒子サイズ依存性とその起源を明らかにした。ナノ粒子の直径は117nmの範囲であり、その中に含まれる金原子数は25個から170000個に相当する。金原子数が142個以上では、3次非線形感受率の値は負であり、サイズの増加とともに非線形性は増大する。この増大効果は表面プラズモンによる光電場の増強効果に起因する。一方、71原子以下では正の値になり、サイズの減少とともに増加することがわかった。クラスター領域では、電子状態は量子サイズ効果によって分子的な性質を示すようになるために、離散準位の充填効果とチオール分子への電荷移動が非線形性を発現させること明らかになった。3)デンドリマー/金クラスター複合系の光物性の研究従来の研究においてデンドリマーに内包された金クラスターの発光とされていた発光スペクトルの起源を明らかにした。デンドリマーの酸化度と発光との関係を詳細に調べた結果、発光起源はデンドリマーであることがわかった。
AR Axis・微小環境を考慮した前立腺癌進行の機序解明と革新的治療戦略の構築

前立腺癌組織において発現が減少し、活性酸素の代謝に関わる遺伝子Superoxide disumutase 3 (SOD3)のを同定し、SOD3が腫瘍抑制因子として働いていることを突き止めた。前立腺癌細胞と前立腺癌由来間質細胞を共培養し、大量のテストステロンを添加すると、間質細胞において活性型エストロゲンの産生され、それが癌細胞の増殖を抑制することを明らかにした。さらに、アンドロゲン感受性前立腺癌細胞を非感受性前立腺癌細胞を培養すると、cross-talkにより、それぞれの増殖が促進されたり、浸潤能が変化することが明らかとなった。フラボノイド誘導体を合成し、前立腺癌細胞での抗腫瘍効果を確認した正常前立腺組織と前立腺癌組織から得られたRNAからcDNA microarrayを行うことにより、癌組織にて発現が減少し、活性酸素の代謝に関わる遺伝子Superoxide Dismutase 3 (SOD3)を同定した。このSOD3の発現を前立腺癌培養細胞で調べると、アンドロゲン依存性細胞LNCaP、非依存性細胞PC-3、DU145の3種類で低下していた。また正常前立腺組織と比べ、前立腺癌組織で発現が減弱していた。SOD3の前立腺癌組織での機能を明らかにするために、これらの細胞株に強制発現させたところ、SOD3が腫瘍抑制因子として働いていることが明らかとなった。前立腺癌細胞および前立腺癌由来間質細胞内での副腎性アンドロゲンの代謝を明らかにする研究において、テストステロンから代謝されるエストロゲンに注目した。間質細胞でのエストロゲン産生能があることを、間質細乳癌細胞株MCF-7との共培養でエストロゲン活性を示すことを明らかにした。この間質細胞をアンドロゲン非依存性PC-3と共培養し、テストステロンを添加すると、PC-3の増殖が抑制された。この作用はテストステロンの作用ではなく、代謝されたエストロゲンによる作用の可能性が示唆された。残念ながらエストロゲンで抑制される間質細胞からのサイトカインが何であるかは明らかにすることができなかった。さらに前立腺癌由来間質細胞でのアンドロゲン生合成の流れを明らかにするために、LNCaPと間質細胞との供培養において、DHEA, androstenediol, androstenedione, testosteroneを基質として加え、24時間後の代謝産物をLC-MS/MSで測定したところ、3β-HSDはDHEAをAdioneにしか変換せず、17β-HSDはAdioneをTにも変換するが、TをAdioneに代謝する作用の方が強いことが判明した。癌組織の微小環境研究するとき、しばしば、癌細胞と間質細胞との相互作用を研究することが多い。我々は、その相互作用だけでなく、癌細胞間の相互作用、つまり、混在しているアンドロゲン感受性前立腺癌細胞と、アンドロゲン非依存性前立腺癌細胞との相互作用により、前立腺癌の増殖や浸潤能が変化しているという仮説のもとに研究を行った。アンドロゲン感受性前立腺癌細胞LNCaPをアンドロゲン非依存性前立腺癌細胞DU145、PC-3細胞と共培養し、増殖の変化を観察した。PC-3細胞はアンドロゲンの有無にかかわらず、LNCaP細胞の増殖を促進しなかった。しかし、DU145細胞は副腎性アンドロゲンDHEA存在下でLNCaPの増殖を促進した。さらにDU145細胞はLNCaP細胞内のandrogen receptor(AR)のDHEA応答性も亢進させた。この機序には少なくともDU145細胞においてDHEAをtestosteroneに代謝する能力、つまり3β-HSDや17β-HSD活性が亢進していることがLC-MS/MSで明らかとなった。さらにDU145細胞はDHTによるLNCaP増殖促進やARの活性化も亢進させた。この機序にはDU145細胞からのサイトカインがARの核内移行を促進させていることが考えられた。また遊走能に関してはWound healing assayにて測定した。LNCaPはDU145の遊走能を阻害したのに対して、LNCaPはPC-3の遊走能を亢進させた。以上の結果より、アンドロゲン感受性前立腺癌細胞と非依存性前立腺癌細胞は相互作用を引き起こしていることが示唆された。アンドロゲン感受性前立腺癌細胞とアンドロゲン非依存性前立腺癌細胞のクロストークを確認できた。本研究では、前述した目的を達成するために、前立腺癌組織内の微小環境としてアンドロゲン感受性細胞LNCaPとアンドロゲン非依存性前立腺癌細胞PC-3およびDU145を用いて、両者の共培養を行い、LNCaPのアンドロゲン依存性増殖がDU145によりさらに促進されることを突き止めた。そこで、本年度は、これらの共培養によりそれぞれの遊走能や浸潤能がどのように変化するかを観察した。その結果、LNCaP細胞は、増殖とは逆に、DU145細胞の遊走能と浸潤能をむしろ抑制する方向に働いていた。一方、LNCaP細胞はPC-3細胞の遊走能と浸潤能を亢進させていた。さらに、変化を誘導する機序を明らかにするために、EMTに関与する遺伝子の発現を調べたところ、DU145ではLNCaPの有無によりEMT関連タンパク質の量に変化はなかったが、PC-3では、N-cadherin、Snail、Vimentinの発現が亢進していた。以上の結果より、LNCaPはPC-3細胞のEMTを誘導していることが示唆された。

また、サイトカインアレイを行うことにより、PC-3とDU145の増殖や遊走能、浸潤能に影響を与えるタンパク質の同定を試みたが、決定的な原因タンパク質は同定できなかった。治療に関しては、アンドロゲン感受性前立腺癌細胞とアンドロゲン非依存性前立腺癌細胞を同時にたたく薬剤の開発をおこなうため、薬30種類のフラボノイド誘導体の合成を行い、前立腺癌細胞に対する増殖能の抑制効果を調べた。その結果、数種類の誘導体が、すべての細胞株に対して抗腫瘍効果とアンドロゲン応答性の抑制効果を示すことが判明した。前立腺癌組織において発現が減少し、活性酸素の代謝に関わる遺伝子Superoxide disumutase 3 (SOD3)のを同定し、SOD3が腫瘍抑制因子として働いていることを突き止めた。前立腺癌細胞と前立腺癌由来間質細胞を共培養し、大量のテストステロンを添加すると、間質細胞において活性型エストロゲンの産生され、それが癌細胞の増殖を抑制することを明らかにした。さらに、アンドロゲン感受性前立腺癌細胞を非感受性前立腺癌細胞を培養すると、cross-talkにより、それぞれの増殖が促進されたり、浸潤能が変化することが明らかとなった。フラボノイド誘導体を合成し、前立腺癌細胞での抗腫瘍効果を確認したcDNA microarrayにて前立腺癌組織で発現の低下している遺伝子を同定し、その中でSOD3が腫瘍抑制因子として作用することを証明した。また前立腺癌組織内での内因性アンドロゲン生合成の経路を明らかにし、前立腺眼内でのエストロゲン生合成とその働きを明らかにした。アンドロゲン感受性前立腺癌細胞とアンドロゲン非依存性前立腺癌細胞のクロストークがどのような機序で成り立っているのかを明らかにする必要がある。癌細胞の培養液中に存在しているタンパク質の同定をサイトカインアレイを行い、数十種類のサイトカインを調査し、各種細胞株で発現の異なるサイトカインを明らかにする。さらに発現の異なるサイトカインを中和抗体で阻害したり、サイトカインを添加するなどして、共培養の結果と一致するかを確認する。28年度が最終年度であるため、記入しない。泌尿器科前立腺癌組織の微小環境では、アンドロゲン感受性細胞とアンドロゲン非依存性細胞が混在している状態と考えられるが、それらの細胞が独立して増殖しているのではなく、お互いが相互作用しながら増殖している可能性があるため、それらの細胞の供培養を行い、アンドロゲン応答性への影響、増殖・浸潤への影響を明らかにする予定である。アンドロゲン感受性前立腺癌細胞とアンドロゲン非依存性前立腺癌細胞のクロストークを順調に確認できたことで、実験消耗品類を次年度に使うことができたため。SCID mouseを購入し実験する予定であったが、本年度では研究が進まなかったので、その購入費用の残額が生じた。in vitroでの培養細胞の維持、管理、試薬等に研究費を継続して使用する予定である。また、サイトカインアレイを行うための試薬、メンブレン、中和抗体等を購入する予定である。
口腔癌のCGHによる遺伝子異常の解析と細胞死の研究

CGHで14種の口腔扁平上皮癌細胞と11例の口腔癌においてDNAコピー数の異常を検索した。培養細胞は患者の腫瘍細胞よりもDNAコピー数の異常が多い傾向にあった。この原因として、培養細胞が培養過程で生体と異なった環境に順応するためにDNAコピー数を変化させる必要があるのではないかと考えられた。両者の共通した染色体異常領域はGeinが5p,8q,5q、一方Lossは18q、19pであり、この領域の異常が口腔癌において癌化や腫瘍の増殖などに関与していることが示唆された。またDNAコピー数の異常はDNAdiploidよりもDNA anuoloidの腫瘍で強く発現しており、また腫瘍径で分類すると進行した腫瘍で有意に多い傾向にあった。このことから、DNA aneuploidと腫瘍の増大は染色体の不安定性を反映していると考えられた。抗癌剤シスプラチンによる口腔扁平上皮癌KM-1の細胞死を検討した。細胞は濃度依存的に死滅するが典型的なアポトーシス細胞の形態は呈さず、またDNAの切断も少なかった。しかし、ヒト白血病細胞のHL-60では短時間で明瞭なアポトーシスが認められたことから、KM-1細胞はアポトーシスを生じにくいことが考えられたが、開発中の抗癌剤KRN5500ではHL-60と同様に典型的なアポトーシスが誘導されるため、シスプラチンは扁平上皮癌に対しアポトーシスを誘導しにくいのではないかと思われた。その原因としてシスプラチンはDNAに結合するため、アポトーシス誘導に必要な蛋白が合成されないか、もしくはシスプラチンが蛋白と結合してアポトーシスのシグナルが阻害されているとが推察された。現在、固形癌の化学療法の中心的薬剤となっているシスプラチンがもたらす細胞死を扁平上皮癌細胞KM-1を用いて検討した。これらの細胞をl00uMのシスプラチンで処理し、プロピディウムアイオダイドとローダミン123で染色するとプロピディウムアイオダイドに染色されとローダミン123には染色されない細胞が多いことからこれらの細胞は死細胞であることを確認された。細胞は48時間以内にほとんど死滅した。その細胞形態は膨化している細胞が11.6%、核濃縮を生じた細胞が80%、アポトーシス様細胞が8.4%であった。また、これらの細胞を電気泳動したところ、DNAの断片化はみられず、TdT法を用いてフローサイトメトリーで解析すると、DNAの切断は低頻度の細胞から高頻度の細胞まで広く分散していた。これよりKM-1細胞はDNAの断片化を生じるが、典型的なアポトーシスによる細胞死ではないことが判明した。次にシスプラチンの処理濃度を臨床使用濃度に近い10uMにして細胞死を検討し、またアポトーシスによる細胞死を呈する白血病細胞のHL-60をコントロールとした。細胞死はHL-60では処理後10時間で始まり、典型的なアポトーシスを生じるが、KM-1では遅れて24時間後から始まり、また細胞形態は膨化したものがほとんどであった。これらの細胞をフローサイトメトリーにてFITCの取り込みを測定した結果、FITC量の増加すなわち細胞内蛋白量が増加しており、KM-1は細胞死に際して細胞死に関与する蛋白を産生しているものと考えられた。すべての染色体の遺伝学的変化を検索する方法としてcomparative genomic hybridzation(CGH)法があり、包括的にDNAのコピー数のlossとgainの検討が可能である。今回、14種のヒト由来の口腔扁平上皮癌細胞株の染色体の不均衡と構造異常をフローサイトメトリーならびに(CGH)を用いて検討した。すべての細胞はDNAanuploidを示し、そのDNAindex(癌細胞のDNA量/正常細胞のDNA量)は1.26から2.01の範囲にあり、約70%の細胞は1.3-1.5付近に分布していた。

すべての細胞株でDNAコピー数の異常、すなわちgainとlossがみられた。DNAのlossがみられた領域は18q12-22(71.4%)、4q31-ter(64.3%)、4p(28.6%)、21q(21.4%)、16p(14.8%)、19p(14.8%)、22q(14.8%)であり、DNAのgainは5p(85.7%)、8q23-ter(78.5%)、20p(57.1%)、20q(57.1%)、Xq21(35.7%)、11p(28.6%)、2q22-32(28.6%)、7q(21.7%)、1p21-31(14.3%)、5q23-34(14.35)、6q22.3-25.1(14.3%)、9q33-ter(14.3%)、12q22-23(14.3%)であった。DNA量の異常と染色体構造異常との間に関連性はみられなかったが、特に18q12-22と4q31-ter領域のlossと5pおよび8q23-terのgainの頻度が非常に高いことから、この領域の異常が口腔扁平上皮癌の進展に探く係わっていることが示唆された。口腔癌患者11例をCGHによるDNAのコピー数の異常とレーザースキャンサイトメーターでDNA量を測定し、腫瘍径との関係を検討した。DNAコピー数のGainは染色体上において3q25-28(6/11),5p(6/11),8q(5/11)でみられ、Lossは18q(4/11),19q(4/11),17p(3/11),19p(3/11)に認められた。特に5pの領域は2例において増幅していた。DNA aneploidは6例において認められ、そのDNA indexは1.30-1.82に分布していた。DNAコピー数の異常はDNA diploidよりもDNA anuoloidの腫瘍で強く発現しており、また腫瘍径においてT1の腫瘍に比べてT2以上の腫瘍で有意に多い傾向にあった。このことから、DNA aneuploidと腫瘍の増大は染色体の不安定性を反映していると考えられた。開発中の抗癌剤KRN5500をヒト白血病細胞HL-60に作用させ、この薬剤の殺細胞効果と分化誘導能を検討した。10nMの低濃度で処理した細胞細胞は72時間後には細胞質に顆粒を有する好中球へ分化した細胞が認められた。しかし、1μM以上の高濃度で処理すると6時間以内に細胞質が凝縮し、核が濃縮したアポトーシス細胞が観察された。アポトーシスは電気泳動でラダー形成により確認され、フローサイトメトリーを用いてDNAの切断時期をTdT法により検討した結果、このKRN5500による細胞死は細胞周期のG1期に生じることが判明した。この抗癌剤を口腔扁平上皮癌細胞に使用したところ、以前に実験したシスプラチンとは異なり明瞭はアポトーシスが誘導されたが、薬剤製造会社の都合により結果を発表することができなかった。
熱帯地域特異的神経変性疾患の現地調査と病因に基づく新規モデル動物作製

本研究の目的は、熱帯植物摂取の食習慣と疾患の因果関係を調査し、その原因に迫ることである。グアム島を中心に、バンレイシ科植物の分布、摂取状況、PD関連疾患患者の食習慣を調査したところ、疾患と植物摂取状況の間には弱い相関が認められた。また、バンレイシ科植物中から単離同定した物質の中でO,O-dimethylcoclaurine (DMC)およびその誘導体の毒性を調べたところ、DMCはP糖タンパク質を阻害し、またその基質となることが明らかとなり、疾患と関係のある物質のひとつである可能性が考えられる。熱帯地域特異的に発生するパーキンソン病関連疾患は、環境因子(当該地域において日常的に摂取される果実に含まれる神経毒性物質)と遺伝因子の両者が発症に関与している可能性が考えられる。遺伝因子としては、例えば、薬物の能動輸送活性や細胞毒性物質の排出機能を持つ膜タンパク質であるP糖タンパク質(P-gp)の機能不全などが想定される。そこでまず現地において、熱帯植物の分布、現地住民の熱帯植物摂取の食習慣、疾患と食習慣の因果関係を研究協力者と調査する。調査により採集した植物サンプルから、P-gpの基質となる神経毒性物質の単離同定を行い、当該物質をP-gp欠損マウスに投与することにより病態モデルを作製する。本モデルの妥当性を評価し、我々が既に合成し保有しているパーキンソン病治療薬候補物質群の評価、および既存のパーキンソン病治療薬を再評価することにより、効率的に地域特異的神経変性疾患の治療薬開発を行うことを本研究の目的とする。初年度はバンレイシ科植物トゲバンレイシからの抽出を行い、数種類の化合物を単離した。また、過去にバンレイシ科植物から単離同定した化合物も含めて、これらの物質がP糖タンパク質の基質となるか否かについて検討を行った。P-gpの薬物依存性ATPase活性を利用したP-gp活性測定キットを用いて、P-gpの基質となるか否かを現在検討中である。また、パーキンソン病発症モデル化合物であるMPP^+を細胞に低濃度曝露することにより、オートファジー阻害や細胞内輸送異常の観点から熱帯地域特異的パーキンソン病関連疾患のモデルとなり得るか否かについて検討を行っている。一方、グアムメモリアル病院を訪れ、研究協力者であるスティール博士と研究打ち合わせを行い、今後の調査、研究方針について議論した。今年度は、バンレイシ科植物トゲバンレイシから同定された化合物およびその誘導体が、P糖タンパク質の基質となるか否かについて検討を行った。P-gpの薬物依存性ATPase活性を利用したP-gp活性測定キットを用いて、P-gpの基質となるか否か検討を行ったところ、一部の化合物がP-gpの基質となることが示唆された。一方、パーキンソン病発症モデル化合物であるMPP+を細胞に低濃度曝露したところ、オートファジーを阻害することが明らかとなり、細胞内輸送の異常についても原竿検討中である。このように、低濃度MPP+を曝露した細胞は、熱帯地域特異的パーキンソン病関連疾患のモデル細胞となり得る可能性が考えられる。熱帯地域特異的に発生するパーキンソン病関連疾患は、環境因子と遺伝的素因の両者が発症に関与すると考えられており、環境因子としては現地で摂取する習慣のあるトゲバンレイシなどの熱帯植物などが想定される。一方、遺伝的素因としては、薬物輸送や毒性物質の排出に関与するP糖タンパク質の遺伝多型などが考えられる。今年度も昨年度に引き続き現地、特にグアムにおいて、研究協力者の協力の下、熱帯植物の分布、現地住民の熱帯植物摂取状況に加えて、熱帯植物中の神経毒性を有するベンジルイソキノリン誘導体と疾患との関連について調査を継続して行った。一方、熱帯植物バンレイシ科トゲバンレイシよりこれまでに単離同定した種々の化学物質の中から、神経毒性の強い物質について更なる検討を行った。

着目したベンジルイソキノリン誘導体の中でもO,O-dimethylcoclaurineは、in vitro反転腸管法においてP糖タンパク質により取り込まれ、ヒトP糖タンパク質の基質になることが明らかとなった。そこで、O,O-dimethylcoclaurineを化学合成し、C57BLマウスに投与したところ、行動異常などの神経毒性が認められた。O,O-dimethylcoclaurineに限らず、1位がベンジル基、特にメトキシベンジル基に置換された誘導体は、P糖タンパク質の基質となる化合物が多く、神経細胞死誘導活性も強力であることを明らかにしたことから、O,O-dimethylcoclaurineおよび化学構造類似のベンジルイソキノリン化合物の摂取が、当該疾患の環境要因のひとつとなっている可能性が考えられる。26年度が最終年度であるため、記入しない。神経毒性学26年度が最終年度であるため、記入しない。現地で打ち合わせを行ったものの、現地調査とサンプル採集に関しては計画より遅れていると考えられる。モデル作製、調査共にやや進行が遅れている。調査を継続するとともに、P-gpの基質となる植物含有物質の探索、およびそれをP-gpノックアウトマウスに投与することによる疾患モデル動物を作製する。最終年度では、P-gpの基質として見出された一部の物質をP-gp欠損マウスに投与し、低容量でパーキンソン病モデル動物ができるか否かを調べる。一方で、現地の調査研究も並行して行い、研究室での実験研究と調査研究の両者を相互にフィードバックさせて研究をまとめる予定である。現地調査と、P-gpノックアウトマウス購入を中心とした実験動物購入、P-gp活性測定キットなどの消耗品費に充てる。研究の進行がやや遅れているため。もともと平成25年度に実施する予定であった研究計画も併せて行う。この際の消耗品費、旅費として使用する予定である。
地域主権時代の公共劇場を担う人材育成～キャリア形成実態調査を基盤として

本研究では、全国公立文化施設職員への質問紙調査から、雇用状況・職歴・職務意識を明らかにし、公共劇場を担う専門人材のキャリア開発について課題と可能性を探った。調査は、運営主体や人口規模による雇用状況の差を明らかにした。また、職員の「専門性」の認識には、劇場マネジメント志向と地域マネジメント志向という2つの方向性があること、これらは施設の規模や立地、職員の業務、事業形態などと相関があることが分かった。本年度は、主に以下の2つを柱に調査研究を行った。1.初年度末に実施した全国公立文化施設職員へのキャリアパスに関する質問紙調査のとりまとめ2.アメリカにおけるリージョナルシアターの地域コミュニティにおける活動状況とそれを支える人材に関する調査1.公立文化施設職員への質問紙調査は、全国から2,522件の回答を得ることができた。集計・分析の結果から、人材の雇用状況に関して、世代構成、性別、学歴等において、都市部と小規模自治体の間に格差が存在すること、また、自治体直営施設と指定管理者施設では、職員のモチベーションや仕事満足度などにおいて、明らかな差が存在すること、そして舞台技術職以外には、明確なキャリアパスを見いだすことができない、といったことが明らかになった。また、職員が考える公立文化施設職員の専門性認識には、舞台芸術を提供する「劇場マネジメント」、地域の多様な課題へ向かう「地域マネジメント」という二つの方向性があることが見いだされた。施設が立地する地域特性や地域における役割に応じて、この2方向性を適切に調和させて行くこと、また職員研修や既存のアートマネジメント教育に取り入れて行くことが示唆される。2.アメリカのリージョナルシアターの調査からは、非営利組織が多様な資金をきめ細やかに開拓しながら、観客に支えられる劇場運営を発展させてきたことが確認できた。しかし一方で、ステークホルダーが明確な、劇場と支援者の濃密な関係性は、舞台作品の革新性においては、ネガティブな影響を与えていることが伺えた。また、地域社会の具体的な課題(移民、性的マイノリティ、貧困など)解決に、劇場のミッションとしてとりくむコミュニティ・シアターが、地域社会で存在感を増していること、事業展開には、地域コミュニティの多様な団体とパートナーシップを構築していることが分かった。最終年度は、前年度に実施した全国公立文化施設職員への質問紙調査分析のまとめと、非営利の地域劇場スタッフへの聞き取り調査を補足的に行い、地域劇場運営に求められる専門人材像を検討した。質問紙調査では、公立文化施設職員約2500人の回答が得られた。集計結果は、運営主体や人口規模による雇用状況の差を明らかにした。アートマネジメントや舞台芸術に関して専門的に学んだ職員は、都市部の指定管理者運営施設に少数偏在していること、また雇用条件の厳しい指定管理者運営施設の職員の方が、職務意識や仕事満足度が、直営施設職員よりも高い傾向があることなどが明確に現れた。キャリアパスという観点からは、舞台技術職を除いて、公立文化施設職員特有の職歴は形成されておらず、最終学歴での専門分野、前職歴、職務内容も非常に多様であり、専門職を要する文化施設であるという位置づけは希薄なことが改めて明らかとなった。一方、職員自身が考える公立文化施設スタッフの「専門性」について検討したところ、舞台芸術の創造、提供を志向する「劇場マネジメント」と、設置自治体の持つ地域資源や課題に目を向ける「地域マネジメント」志向という2つの方向性があること、また、これらは施設の規模や立地、職員の業務、事業形態などと相関があることが分かった。それぞれの公立文化施設のミッションに応じて、「劇場マネジメント」志向の人材と「地域マネジメント」志向の人材を適切に配置していくことが公共劇場には求められるだろう。これまでのアートマネジメント教育は、「舞台芸術」の企画制作・運営に関する専門知識や実践という面で捉えられて来たが、地域における公共劇場としての機能を充実させていくためには、地域特性や地域課題に立脚する事業・組織の運営に関する専門性を、アートマネジメント教育に取り入れていく必要がある。本研究の目的は、劇場やホールの運営を担う「アートマネジメント人材」について、まず現在これらの施設で働く人材が、どのような専門教育や現場での実践経験を経てきたかキャリア形成の実態を把握し、「公共劇場」を運営する人材育成のあり方を構想することである。初年度は、施設規模、事業内容などから、特徴的な公立文化施設を抽出し、職員への聞き取り調査等をもとに、キャリアパスを検討した。それをもとに、全国公立文化施設職員へのアンケート調査を実施した。公立ホールに勤める職員の現在の雇用状況を把握するとともに、仕事に必要な専門性や知識をどのように捉えているのか、またこれまでどのように身につけて来たのか、など学歴・職歴を把握することを主眼としたものである。調査票は、全国公立文化施設協会で把握しているリストをもとに、自主事業を行っている施設(1,384カ所)を抽出し、職員(約12,000人)を対象に配布し、年度末に回収した。(なお、東日本大震災の影響を鑑み、東北地方の公立文化施設への調査票配布は行わなかった。)日本の公立ホールにおける職員のキャリアパスの実態について、貴重な基礎データが集積できた。

また、検討モデルのひとつとして、地方の公共劇場が充実しているドイツを対象に、特に人口規模が小さい地方都市でありながら、作品創造の機能を担っている劇場を訪問し、職員への聞き取り調査等を行った。そこから、地域社会における劇場の教育的機能という位置づけを改めて確認すると同時に、地域特性、事業ジャンル、劇場規模に応じて非常にきめ細やかな事業展開が行われていること,また、細分化された専門を担う人材が配置されており、これらの専門人材間のスムーズな恊働が劇場運営の基盤となっていることが把握できた。公立文化施設職員を対象としたキャリアパス調査の分析が概ね終了し、公立文化施設職員の学歴、職歴などの個人的な背景と、雇用状況の実態が把握できた。また、地域における公共的な劇場のあり方のひとつとして、アメリカのリージョナルシアターとコミュニティシアターの実態を調査し、地方都市における劇場の社会的役割、またそのような劇場を担う専門人材像とその獲得すべき能力について考察を深めることができた。公立文化施設職員のキャリアパスを把握する実態調査は、本研究の重要な基礎資料となるため、回収数を少しでも増やすため、またプライバシーへの配慮を厚くするという観点からも、当初の計画を変更し、個別封筒で調査票を回収することとした。そのため、郵便事業者等との調整に時間を要することとなり、回収後の集計を年度内に行うことができなかった。集計分析に必要な人件費などの支出に遅れが生じた。コミュニティの課題解決を使命とするアメリカの非営利コミュニティ・シアターは、日本での取組事例は少ないが、今後劇場の社会的役割を考えて行く上で、重要な参照事例になると考えられる。また、そのような劇場の事業や活動を支えて行く人材育成が、とりわけ、地方都市や中山間地の公立文化施設では求められるであろう。今年度は、全国質問紙調査の内、職務経験を通して身につけた専門知識に関する分析の残作業を終わらせ、国内先進事例劇場の運営を担うスタッフへの聞き取り調査をとりまとめ、前年度までに得られた知見とあわせて、今後の地域劇場に求められる人材像を地域特性や施設規模を踏まえながら類型化し、そのような専門人材を育成するための教育プログラムや教育機関のあり方について考察する。また、全国質問紙調査については、主な集計結果をホームページにて公開する。今年度は、昨年度中に着手できなかったキャリアパス・アンケート調査の集計分析を早急に行い、公立ホール職員が、教育機関で学び習得した専門知識、実践やキャリアパスを通じて経験・獲得した技術・能力などを整理し、現状から見えるアートマネジメント人材育成の課題を明らかにする。引き続き、国内先進事例のNPO法人等民間運営による「公共劇場」も含めて、スタッフへの聞き取りを実施し、優れたアートマネジメント人材に共通する資質や技術、基盤となる知識や経験などを検討する。実態調査から想定されるキャリアパスとの比較しつつ、地域の劇場に求められる職員の専門性を、地域特性や劇場のミッションとの関わりに着目しながら明確にして行く。
統計的手法に基づくモートセンシング画像間の時間変化領域抽出法の開発

本研究では、同一の観測領域を異なる2時期に衛星や航空機に搭載したセンサで収集した多重時刻多重分光画像データセットを用いて、対象領域の経時変化の有無、経時変化の種類を自動抽出するデータ処理手法の開発を目的としている。本年度は、先ず新しい経時変化領域抽出法の理論構築を行い、次いで人為的に作成した擬似画像での数値実験を行った。さらに、実際に米国の地上探査衛星LANDSATで得られた衛星画像を対象に処理を行い、本手法の有効性を評価した。最後に本手法の問題点を検討し、その解決のための改善案の提案も行った。以下にその概要を示す。1.新しい経時変化抽出法DETECT法の提案経時変化抽出はこれまで差分や内積、外積といった演算処理を画素ごとに施し、その結果に閾値処理を行うことによって実現されてきたが、画素単位の処理はパルス雑音の影響を受けやすい上に、閾値処理の際に設定する閾値が解析担当者の経験に基づく主観的な値であるなどの問題点があった。そこで、処理を領域単位にすることにパルス雑音の平滑化を行い、変化の有無の判断に統計理論に基づくカイ二乗検定法を応用することにより閾値設定から恣意性を排除することに成功した。2.擬似画像や実画像を用いたDETECT法の有効性評価乱数を用いて作成した擬似画像や、1979年と1987年の同じ日(5月21日)に収集した実際の衛星画像(米国LANDSAT衛星のMSS画像、観測対象地域は茨城県つくば市)を対象に処理を行ったところ、従来法では見かけの変化まで拾ってしまっているのに対して、DETECT法では顕著な変化を正確に捉えた。3.DETECT法の問題点とその改善策DETECT法では時間変化の有無の判定に統計的検定を用いているが、処理対象画像のチャネル数が増加すると検定の際の自由度が大きくなって処理結果の画像の解像度が劣化する問題点が判明した。そこで、多変量解析法のひとつ正準相関分析法を用いて経時変化が顕著に現れるような画像再構成を行ったところ良好な結果を得た。
胎生期における脂肪酸摂取比の乱れが大脳皮質形成および脳機能に及ぼす影響の解析

n-6脂肪酸摂取過多かつn-3脂肪酸摂取欠乏という栄養状態が大脳新皮質形成および脳機能に及ぼす影響を解析するため、コントロール飼料またはn-6脂肪酸過多/n-3脂肪酸欠乏飼料(n-6/n-3飼料)を妊娠C57/BL6マウスに投与した。胎生14日目において大脳皮質原基から神経幹細胞を培養し、アストロサイトへの分化能を解析したところ、n-6/n-3飼料投与群においてアストロサイトへの分化が亢進していた。さらに生体内でのアストロサイト産生を評価するため、生後10日目においてアストロサイトの数を免疫染色法および定量PCR法により評価したところ、飼料間に差が見られなかった。続いて生後1日目においてアストロサイトの増殖能を解析したところ、ここでも飼料間に差が見られなかった。これにより、胎生期に亢進している神経幹細胞のアストロサイト分化は、生後のアストロサイトの増殖能に差がないため、最終的なアストロサイトの数に変化をもらたらさないことが分かった。続いて昨年度に同定したエポキシドが神経幹細胞の分化能に及ぼす影響を解析した。エポキシエイコサトリエン酸(EET)およびエポキシドコサペンタエン酸(EpDPE)をそれぞれ培養した神経幹細胞に添加したところ、EETはアストロサイト分化を促進し、EpDPEはニューロン分化を促進した。これにより、EETとEpDPEの量のバランスによって神経幹細胞の分化運命が制御され、最終的に大脳新皮質形成異常を引き起こしたことが示唆された。最後に昨年度に見いだした組織学的異常が脳機能に及ぼす影響を解析するため、生後10日以降を標準飼料にて飼育した成体仔マウスにおいて不安様行動の解析を行なった。するとn-6/n-3飼料投与群において不安様行動の増加が見られた。これにより、n-6/n-3飼料投与群では胎生期において将来の不安の亢進が決定されていることが分かった。26年度が最終年度であるため、記入しない。神経幹細胞は自己複製能と多分化能を持つ細胞として定義される。胎生期において、神経幹細胞はまず自己増殖を繰り返し、後に神経細胞への分化、アストロサイトへの分化が順序だって行われる。大脳新皮質形成において、神経細胞は胎生期にその産生が終了し、胎生後期から生後にかけて移動し、最終的に6層からなる大脳新皮質を形成する。大脳新皮質6層はそれぞれ異なる機能を担っており、様々な高次機能の中枢として機能している。先進国において見られる、n-6脂肪酸摂取過多かつn-3脂肪酸摂取不足という栄養状態が胎生期における大脳新皮質形成に及ぼす影響を解析するため、n-6脂肪酸とn-3脂肪酸がバランスよく配合されたコントロール餌、またはn-6脂肪酸過多/n-3脂肪酸欠乏餌(n-6/n-3餌)を、妊娠C57/BL6マウスに投与した。胎生14日目において胎仔脳の脂肪酸組成をガスクロマトグラフィーを用いて解析したところ、n-6/n-3餌を与えた胎仔脳において、n-6脂肪酸が増加し、n-3脂肪酸が減少していた。このことから、餌中の脂肪酸が母獣を介して胎仔の脳に供給されていることが確かめられた。次に、上述した胎仔脳における大脳新皮質形成の組織学的解析を行った。大脳新皮質の厚さ、未成熟な神経細胞層の厚さ、成熟神経細胞層の厚さの減少が確認されたが、神経幹細胞層の厚さに変化は見られなかった。さらに、大脳新皮質の神経細胞層減少の原因を探るため、神経前駆細胞層、細胞増殖、細胞死をそれぞれ解析したが、いずれも有為な変化は認められなかった。このことから、神経細胞への分化が障害を受けている可能性が考えられた。本実験結果は、先進国においてみられる脂肪酸摂取状況により、脳形成におけるニューロン分化が影響を受ける可能性を示唆しており、先進国における脂質栄養学の発展に寄与できる可能性がある。n-6脂肪酸摂取過多かつn-3脂肪酸摂取欠乏という栄養状態が大脳新皮質形成に及ぼす影響を解析するため、コントロール餌またはn-6脂肪酸過多/n-3脂肪酸欠乏餌(n-6/n-3餌)を、妊娠C57/BL6マウスに投与した。仔の大脳新皮質を、層構造形成が終了している生後10日目において解析したところ、下層ニューロンには有為差が見られなかったものの、上層ニューロンの数が有為に減少していた。昨年度の結果と合わせて考えると、n-6過多/n-3欠乏状態によって神経幹細胞の上層ニューロンへの分化能が低下している可能性が考えられた。そこで上層ニューロンへの分化が始まる胎生14日目において大脳皮質原基から神経幹細胞を、ニューロスフェア法を用いて培養し、その分化能を解析したところ、n-6/n-3餌投与群においてニューロン分化の低下が認められた。これにより、n-6過多/n-3欠乏状態では神経幹細胞の上層ニューロンへの分化能が低下し、大脳新皮質形成が妨げられたと考えられた。続いてn-6脂肪酸をn-3脂肪酸に変換する酵素であるFat-1を発現するFat-1マウスを用いた解析を行なった。Fat-1マウスにn-6/n-3餌を与えたマウス脳の脂肪酸組成をガスクロマトグラフィーを用いて解析したところ、野生型マウスにコントロール餌を与えた群と比べてn-6/n-3比に変化は認められなかったものの、n-3脂肪酸の一つであるEPAの増加とDHAの減少が認められた。