hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ビス(ビベンジル)型天然物は新たな膜障害性抗MRSA薬となり得るか!

【化学面】平成27年度は各種大環状ビス(ビベンジル)誘導体の、膜障害性抗MRSA作用発現の必要最小構造を特定するための非環状ベンジル誘導体の合成と抗菌活性の解析を行った。その結果、各種非環状ビス(ビベンジル)が抗MRSA活性、殺菌的抗菌作用、膜障害性(エチジウムブロマイドの菌体内外の流入・流出と、菌内のK+イオン濃度が低下,Na+イオン濃度上昇)を示すことを明らかにした。このことより、大環状構造は活性発現には必須ではないが、高活性発現の十分条件であることを明らかに出来た。【計算化学面】平成27年度も,引き続き非環状分子について同様の解析を行い,さらに分子間の弱い相互作用を適切に取り込んだ解析を,多量体化と活性との関係を考察した。【生物活性面】RCは細胞膜に何らかの障害を与えていることで様々な物質の透過性を上昇させ,抗菌活性を示すことが示唆された。羊赤血球を用いてRCの溶血活性を測定し、MRSAに対するMICの10倍の濃度を加えても溶血活性は少ししか上昇しないことを見出した。走査型電子顕微鏡観察で枯草菌ではRC処理で表面構造の変化が認められた。グラム陰性菌ではRCは抗菌活性を示さなかった。しかしグラム陰性菌のRND型多剤排出ポンプの遺伝子を破壊した腸炎ビブリオ株では、抗菌活性が見られるようになった。Riccardin C誘導体(以下、RC)の作用機構を明らかにするために、26年度の結果を発展させ、(1)細胞から抽出した脂質を用いて作成したリポソームに対する影響の解析、(2)RC耐性に関わる腸炎ビブリオの遺伝子の同定、(3)腸炎ビブリオにおける新規RND型多剤排出ポンプの影響解析、を行った結果、RC誘導体の標的はおそらく膜タンパク質であることが考えられた。27年度が最終年度であるため、記入しない。【化学面】コケ由来大環状ビス(ビベンジル)型天然物には,イソプラジオチン型やマルカンチン型化合物も報告されている。平成26年度はイソプラジオチン型化合物合成を行い,抗MRSA活性を測定した。1,3-置換体がこれまでの誘導体中最も強く,既存抗MRSA薬と同等以上の活性を示した。一方で,1,4-置換体は抗MRSA活性を全く示さなかった。これらの結果から,ビス(ビベンジル)型天然物は,リカルディン型のみでは無く,他の大環状ビス(ビベンジル)型でも抗MRSA活性を示すことを発見した。また非環状のペロテチンにも中程度の活性を認めた。今回合成した,イソプラジオチン型化合物に関して,エチジウムブロマイドの菌体内外の流入・流出および菌体内外イオン濃度測定を行った。その結果,1,3-置換体,1,2-置換体において,EtBrの流入,流出が確認された。膜障害に伴う菌内のイオン濃度変化が観測された。【計算化学面】平成26年度は,非環状分子について解析を行い,さらには分子間の弱い相互作用を取り込んだ解析を実施した。高活性化合物では分子間π-πスタッキングが見られ、安定な多量体を形成することが理論的に示唆された。【生物活性面】RCの作用で、物質の透過性が増大することを確認した。また,細胞内Na+濃度はRCにより増大し,一方で細胞内K+濃度は減少することを確認した。RCは,細胞膜に何らかの障害を与えていることで様々な物質の透過性を上昇させ,抗菌活性を示すことが示唆された。羊赤血球を用いて、RCの溶血活性を測定した。その結果,MRSAに対するMICの10倍の濃度を加えても溶血活性は少ししか上昇しないことを見出した。グラム陰性菌のRND型多剤排出ポンプの遺伝子を破壊した腸炎ビブリオ株では、抗菌活性が見られるようになった。

Riccardin C誘導体(以下、RC)の作用機構を明らかにするために、26年度の結果を発展させ、(1)細胞から抽出した脂質を用いて作成したリポソームに対する影響の解析、(2)RC耐性に関わる腸炎ビブリオの遺伝子の同定、(3)腸炎ビブリオにおける新規RND型多剤排出ポンプの影響解析、を行った結果、RC誘導体の標的はおそらく膜タンパク質であることが考えられた。平成26年度計画外である,非環状のビス(ビベンジル)の合成法を確立し、天然物ペロテチンの合成を完了させた。さらに非環状構造においても中程度の抗MRSA活性を示すことを見出した。これらの化合物はオリゴマーとして化成を示す可能性が計算化学の結果示唆された。さらに、大環状ビス(ビベンジル)はグラム陰性菌には抗菌化成を示さなかったが、これが多剤排出ポンプから排出される可能性が生物実験でしめされた。これらの結果は予想外の知見であり,平成26年度計画以上の進捗と判断した。27年度が最終年度であるため、記入しない。【化学面】非環状化合物が本当に大環状化合物と同質、同分子標的に結合して抗MRSA活性を示すのか,合成化学的に検討と分枝標的のケミカルバイオロジー手法を用いた同定。【計算化学面】従来までの構造活性相関とは一線を画し、候補化合物の構造柔軟性を考慮したMRSA活性発現構造部分の理論的予測を行い、実験に先駆けた化合物の設計を行う。細胞膜や細胞壁を標的とした候補化合物群の作用をサイズアップしたシミュレーションで3次元可視化を行うことにより、実際の化合物がどのよう細胞膜、細胞壁に作用するのか理論的に明らかにしていく。【生物活性面】非環状化合物が本当に大環状化合物と同質、同分子標的に結合して抗MRSA活性を示すのか,生化学的に検討。分枝標的のケミカルバイオロジー手法を用いた同定。トランスポゾン挿入株を用いて、RC耐性にかかわる腸炎ビブリオの遺伝子を同定する。MRSAや腸炎ビブリオの細胞膜のLipidから作成したリポソームを用いて、Na+やK+の漏出実験を行う。標的がLipidであれば、当該細菌の種々のLipidとの結合活性を評価する。標的がLipidでない場合は、タンパク質である可能性が高い。そこで、当該細菌の細胞膜分画を単離し、結合するタンパク質の同定を進める。大環状ビス(ビベンジル)誘導体の膜障害性を確認する実験を複数う予定が、一つの実験に使用する、全学共通機器の修理点検が入ったため使用できなかったため。平成27年度に、器機が使用可能になり次第必要薬品類を購入し、私用代金の支払いを行って実験を実施する。
『金瓶梅』の創作論的・受容論的研究

本年度においては、『金瓶梅』の所謂崇禎本につき、過去の研究においてあまり問題とされなかった版本を実見することを大きな目標として掲げ、特別研究員を中途辞退する2008年9月までにおいて二度、中国で調査を行った。まず6月に北京大学図書館・国家図書館(分館)と天津市図書館、次に後述する学会参加の渡航を兼ね7月に上海図書館にて調査を行った(二度目のみ科研費を使用)。まず6月の調査について述べる。北京大学図書館には三種類の崇禎本が所蔵されるが、影印本の出ている善本(非公開)を除く二種(残本と抄本)について調査し、残本が至る所に誤りがあり本文価値においては劣る本であること、抄本が原本の行款を忠実に反映した本で、文字は所謂上海図書館乙本に一致する点が多いことを確認した。また、国家図書館分館に普通古籍(普155594)として収められている残本が、未紹介の崇禎本であることを発見した(第6871回が残存)。天津図書館本については、既に報告もあるように、上海図書館乙本に近い本であることが確かめられた。7月の調査については、上海図書館所蔵の所謂甲・乙本を実見する予定であったが、乙本は非公開とのことで甲本のみを閲覧した。この本は一般に北京大学所蔵本(上記善本)に近いとされるが、挿図を仔細に眺めると、細部において異なる点が散見された。この他、7月10日から14日にかけて山東省臨清市において開かれた「第六届国際《金瓶梅》学術討論会」に参加し、「《金瓶梅》的人物描写--以第三十四回西門慶人物形象的"矛盾"為中心」と題する報告を行った。この研究会は数年に一度開催されるもので、中国での研究動向を肌で知る貴重な体験となった。
細胞内シグナルネットワークにおけるGタンパク質の構造と機能

αβγの3種類のサブユニットよりなるGタンパク質は、膜7回貫通型受容体と連関し、細胞内に情報を伝えるシグナルのトランスデューサーとして働いている。一方、哺乳動物のMAPキナーゼは、主にERK、JNK、p38の3種類のグループに分けられ、ERKが細胞の増殖や分化に、JNKとp38は、アポトーシスやストレス応答に関与することが明らかにされつつある。しかし、Gタンパク質から各々のMAPキナーゼの活性化に至る分子機構に関しては多くの不明の点が残されている。そこで、Gタンパク質の各サブユニットから、どのような分子を介して各々のMAPキナーゼが活性化されるかを検討した。その結果、Gα12からJNKへのシグナル伝達経路にSrcファミリーチロシンキナーゼと低分子量GTP結合タンパク質のひとつであるRhoが関与すること、またRhoの上流でSrcが働くことが明らかとなった。一方、Giを介するJNKの活性化は、GαiとGβγの両方を介すること、そしてGβγによるJNKの活性化は主にMKK4を介するのに対して、GαiによるJNKの活性化はMKK4とMKK7のいずれも介さず新規のMKKが存在する可能性が強く示唆された。また、アラキドン酸生成の律速酵素であるホスホリパーゼA_2のGタンパク質共役受容体を介するシグナルによる活性化において持続的な細胞内Ca^<2+>の上昇およびそれに伴うホスホリパーゼA_2の核周辺への移行が必要であることが明らかとなった。また、Gタンパク質によって直接活性が制御されるGタンパク質共役内向き整流K^+チャネルは、GγがなくてもGβと結合できるがGβ単独では活性化されないことが明らかとなった。
autocrine系を介した新しい平滑筋細胞遊走因子の解析及び精製

家兎及びラット培養大動脈平滑筋細胞を使用して以下の成績を得た。1.家兎及びラット平滑筋細胞のコンディションメディウム(CM)は血小板由来増殖因子(PDGF)の数倍高い平滑筋細胞遊走活性を示した。この因子を平滑筋細胞由来遊走因子(SDMF)と命名した。2.SDMFはchemotaxisを起こす因子であった。その性質は、酸や塩基、凍結融解、還元処理に安定、分子量3500の膜によって透析されない、高熱処理・トリプシン処理によって失活するなどである。PDGFやフィブロネクチンの抗体で活性が抑制されないことよりこれら既知の因子とは異なると考えられた。3.正常中膜由平滑筋細胞と動脈硬化巣内膜由来平滑筋細胞の比較:既に両者は極めて異なるフェノタイプであることを報告しているが、SDMFの産生能においても内膜由来平滑筋細胞の方が2ー3倍高かった。即ち、内膜平滑筋細胞は遊走因子においても病的であることが明かとなった。4.SDMFの分泌調節:トランスフォ-ミング増殖因子β(TGFーβ)と平滑筋細胞をインキュベ-ション後SDMFの分泌能をみると中膜由来平滑筋細胞では強くSDMFの分泌が抑制された。一方、内膜由来平滑筋細胞はほとんど影響を受けなかった。ここでもフェノタイプの違いがあるものと推測された。5.SDMFの精製:ラット平滑筋細胞をビ-ズ法で大量培養し、そのCMを採取した。CM中のSDMFはヘパリンカラムに100%吸着し、1MのNaClで溶出された。この分画をHPLCによりsuperose 6でゲル濾過すると400KDと40KDの位置に2つのピ-クが見られた。後半のピ-クを,SDS存在下でsuperose12で更にゲル濾過すると、25KD、低分子の位置に2つのピ-クが見られた。精製度は数万倍に上昇している。現在単一のバンドにするべく検討中である。1.遊走系の確立:ラット平滑筋細胞を標的細胞とし、血小板由来増殖因子(PDGF)を用いて、Boyden-chamber法で細胞遊走の検討を行ったところ、1-10ng/mlの濃度域で容量依存的に遊走が見られた。2.ラット及び家兎の培養平滑筋細胞よりコンディションメディウム(CM)を採取し、平滑筋細胞に対する遊走刺激活性を検討したところ、容量依存的に遊走活性が見られた。最大活性は50%で見られ、PDGFのそれの数倍高かった。checker board analysisでこの遊走活性はPDGFと同様に方向性を持つchemotaxisであった。3.SDMFの性質:SDMFはゲルクロマトグラフィ-上440キロダルトンであった。酸や塩基、凍結-融解、還元処理に安定であり、分子量3500の膜によって透析されなかった。高熱処理、トリプシン処理によって失活した。

4.PDGFとの異同:熱処理、還元処理による性質の違い、分子量の違いから、SDMFはPDGFと異なると推測されるが、抗PDGF抗体でその活性が抑制されなかったことから、免疫学的にも両者は異なる因子と考えられた。5.fibronectinとの異同:分子量的にSDMFとfibronectinは近いので、gelatinへの吸着、抗fibronectin抗体による抑制実験の結果SDMFはfibronectinとは異なる因子であると考えられた。更に他の低分子の遊走因子とも明らかに異なっていた。以上の成績より、平滑筋細胞は自らに対する遊走因子SDMFをauto-crine系として分泌していること、SDMFは従来の遊走因子とは異なる新しい因子であることが推測された。前年度に大動脈平滑筋細胞がオ-トクライン系として新しい遊走因子、平滑筋細胞由来遊走因子(SDMF)を分泌することを証明したが、引き続き、家兎及びラット培養大動脈平滑筋細胞を使用して以下の成績を得た。1.正常中膜由来平滑筋細胞と動脈硬化巣内膜由来平滑筋細胞の比較:前者は正常家兎大動脈より、後者は高コレステロ-ル食飼育家兎大動脈より培養した。既に両者は極めて異なるフェノタイプであることを報告しているが、SDMFの産生能においても内膜由来平滑筋細胞の方が2ー3倍高かった。即ち、内膜平滑筋細胞は遊走因子においても病的であることが明かとなった。2.SDMFの分泌調節:トランスフォ-ミング増殖因子β(TGFーβ)と平滑筋細胞をインキュベ-ション後SDMFの分泌能をみると中膜由来平滑筋細胞は強くSDMFの分泌が低下した。一方、内膜由来平滑筋細胞はほとんど影響を受けなかった。このことによりTGFーβは遊走因子のオ-トクライン系を断ち切る因子の可能性があるが、より病的な細胞はTGFーβにも低抗性であることを示している。3.SDMFの精製:ラット平滑筋細胞をビ-ズ法で大量培養し、そのコンディションメディウム(CM)を採取した。CM中のSDMFはヘパリンカラムに100%吸着し、1MのNaC1で溶出された。この分画をHPLCによりsuperose6でゲル瀘過すると400KDと40KDの位置に2つのピ-クが見られた。後半のピ-クを,SDS存在下でsuperose12で更にゲル瀘過すると、25KD、低分子の位置に2つのピ-クが見られた。25KD付近の分画をSDSーPAGEで電気泳動し、ゲルを切り出して遊走活性を測定するとやはり25KDの位置に活性のピ-クがあった。精製度の数万倍に上昇している。現在単一のバンドにするべく検討中である。
ポルフィリン錯体担持カーボンナノチューブの機能探索と生体ガスセンシングへの応用

本年度は、検知対象ガスとしてアンモニア(NH3)を取り上げ、NH3に対して分子識別能をもつポルフィリン錯体の合成、およびポルフィリン錯体担持半導体単層カーボンナノチューブによるNH3ガスセンサーの開発を目的とした。まず、標準ガス希釈器(希釈率:1/1000)を導入し、濃度制御極微量ガス導入機構装備センサー評価装置を構築した。そしてこの装置を用いて、NH3に対してガス種選択性をもつことが報告されているCoモノマーポルフィリン(CoOEP)を半導体単層カーボンナノチューブ(s-SWNT)薄膜トランジスタに担持させたセンサーを作製し、NH3に対する応答特性を評価した。CoOEP担持s-SWNTの5 ppmのNH3に対するセンサー応答(コンダクタンスの変化率)は、CoOEP担持前と比較して、担持後はNH3に対する応答が約9倍向上し、半導体金属混合SWNTを用いた先行研究と比較して約8倍向上した。これにより、NH3に対するCoOEP担持半導体SWNTの有用性を実証した。さらに、ゲート特性の結果より、センサーがゲート中性点近傍で低電流動作をしていたため、硝酸によるpドーピングを用いて、トランスコンダクタンスが大きい状態での動作を実現させた。その結果、NH3に対する応答がさらに約1.6倍(先行研究と比較して約14倍)向上した。センサー応答の濃度依存性を測定した結果、NH3に対して200 ppbまでの低濃度の検知が可能であることがわかった。標準ガス希釈器(希釈率:1/1000)を導入し、濃度制御極微量ガス導入機構装備センサー評価装置を構築した。これにより、市販のNH3標準ガスの最低濃度1ppmのガスを用いて、1ppbまでの濃度測定が可能になった。モノマーポルフィリンの半導体単層カーボンナノチューブへの担持においては、半導体単層カーボンナノチューブ薄膜トランジスタをモノマーポルフィリン溶液に浸漬させる方法が有効であることがわかった。さらに、ポルフィリン浸漬後の試料をポルフィリン可溶溶媒で濯ぐことにより、過剰なポルフィリンが除去されて感度がより高まることが分かった。単層カーボンナノチューブトランジスタのトランスデューサとしての性能を高めるため、半導体単層カーボンナノチューブ(s-SWNT)薄膜(>99%)を採用した。これにより、Coモノマーポルフィリン(CoOEP)を担持した単層カーボンナノチューブ薄膜トランジスタのNH3に対するセンサー応答が先行研究に比べて大幅に向上(約8倍)した。さらに、トランスコンダクタンスが大きな領域で動作するように、半導体単層カーボンナノチューブ薄膜に対して硝酸蒸気曝露によるpドーピングを行った。適切な曝露時間調整で、動作電流の増加とセンサー応答量の増加(約1.6倍)を実現した。以上の工夫により、先行研究と比較して、約14倍のNH3に対するセンサー応答量を実現し、また、最低濃度200ppbまでの測定が可能であることを示した。1NH3に対するCoOEP担持半導体SWNTの分子識別能の検証を行うために、他のガス(CH4、アセトン、エタノール、NO)に対するセンサー応答を測定し比較する。2半導体単層カーボンナノチューブ(s-SWNT)薄膜トランジスタのトランスデューサとしての性能を安定化(ベース電流の増強によるS/N比の改善)させるため、SWNT薄膜の高密度化・均一化を図る。また、センサーの回復手法として、あるいは応答・回復速度を向上させる手法として、UV光照射やヒーター加熱を検討する。3他のセレクター分子として、s-SWNTとより強い相互作用が期待されるダイマーポルフィリンを採用し、s-SWNT上で高被覆率が得られるように溶媒(ジクロロメタンなど)の選定を行う。4半導体SWNTに担持させるポルフィリンの中心金属をCo以外(Cuなど)に変更し、NH3に対する応答を測定する。中心金属の種類によりNH3の吸着エネルギーを調整し、測定可能な濃度範囲を実用的な範囲(呼気診断に必要とされるNH3の検知濃度は100ppb10ppm)に拡大する。5次の検知対象ガスとして、アセトンを取り上げ、局所密度汎関数法による分子設計などから、アセトンに対する分子識別能を持つ中心金属を探索し、その結果に基づいて、金属ポルフィリン錯体担持センサーを作製・評価する。

センサー応答の濃度依存性を測定した結果、NH3に対して200 ppbまでの低濃度の検知が可能であることがわかった。標準ガス希釈器(希釈率:1/1000)を導入し、濃度制御極微量ガス導入機構装備センサー評価装置を構築した。これにより、市販のNH3標準ガスの最低濃度1ppmのガスを用いて、1ppbまでの濃度測定が可能になった。モノマーポルフィリンの半導体単層カーボンナノチューブへの担持においては、半導体単層カーボンナノチューブ薄膜トランジスタをモノマーポルフィリン溶液に浸漬させる方法が有効であることがわかった。さらに、ポルフィリン浸漬後の試料をポルフィリン可溶溶媒で濯ぐことにより、過剰なポルフィリンが除去されて感度がより高まることが分かった。単層カーボンナノチューブトランジスタのトランスデューサとしての性能を高めるため、半導体単層カーボンナノチューブ(s-SWNT)薄膜(>99%)を採用した。これにより、Coモノマーポルフィリン(CoOEP)を担持した単層カーボンナノチューブ薄膜トランジスタのNH3に対するセンサー応答が先行研究に比べて大幅に向上(約8倍)した。さらに、トランスコンダクタンスが大きな領域で動作するように、半導体単層カーボンナノチューブ薄膜に対して硝酸蒸気曝露によるpドーピングを行った。適切な曝露時間調整で、動作電流の増加とセンサー応答量の増加(約1.6倍)を実現した。以上の工夫により、先行研究と比較して、約14倍のNH3に対するセンサー応答量を実現し、また、最低濃度200ppbまでの測定が可能であることを示した。1NH3に対するCoOEP担持半導体SWNTの分子識別能の検証を行うために、他のガス(CH4、アセトン、エタノール、NO)に対するセンサー応答を測定し比較する。2半導体単層カーボンナノチューブ(s-SWNT)薄膜トランジスタのトランスデューサとしての性能を安定化(ベース電流の増強によるS/N比の改善)させるため、SWNT薄膜の高密度化・均一化を図る。また、センサーの回復手法として、あるいは応答・回復速度を向上させる手法として、UV光照射やヒーター加熱を検討する。3他のセレクター分子として、s-SWNTとより強い相互作用が期待されるダイマーポルフィリンを採用し、s-SWNT上で高被覆率が得られるように溶媒(ジクロロメタンなど)の選定を行う。4半導体SWNTに担持させるポルフィリンの中心金属をCo以外(Cuなど)に変更し、NH3に対する応答を測定する。中心金属の種類によりNH3の吸着エネルギーを調整し、測定可能な濃度範囲を実用的な範囲(呼気診断に必要とされるNH3の検知濃度は100ppb10ppm)に拡大する。5次の検知対象ガスとして、アセトンを取り上げ、局所密度汎関数法による分子設計などから、アセトンに対する分子識別能を持つ中心金属を探索し、その結果に基づいて、金属ポルフィリン錯体担持センサーを作製・評価する。
ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ異常による新規病態の解明

先天性巨大血小板性血小板減少症の新規病因として、GPIIb/IIIa受容体の膜近傍領域変異を明らかにした。この領域はGPIIb/IIIa定常状態構造の維持に重要であるため、変異によりGPIIb/IIIaは恒常的に活性化状態となり、リガンド結合なしで信号伝達が起こる。血小板膜上へのGPIIb/IIIa発現は低下し、活性化型GPIIb/IIIaを認識するPAC1抗体の結合を認めるがP-セレクチン発現は認めない。変異型GPIIb/IIIaを強制発現させた培養巨核球からは大型で少数の血小板が産生された。本病態は本邦の先天性巨大血小板性血小板減少症において3番目に高頻度である。先天性巨大血小板性血小板減少症の解析において、新規原因として明らかにした恒常的GPIIb/IIIa受容体活性化異常を有する新規症例を複数同定した。昨年度までの研究において、恒常的活性化型GPIIb/IIIa受容体異常による先天性巨大血小板性血小板減少症は、フローサイトメトリによる血小板GPIIb/IIIa発現解析が有用であることが判明している。新規に解析した症例のうち、3症例では血小板GPIIb/IIIa発現低下と相対的GPIb発現上昇を認め、GPIIb/IIIa恒常的活性化の指標であるPAC1抗体の結合を認めた。GPIIb/IIIa遺伝子解析の結果、GPIIb/IIIaの定常状態の維持に必要な膜近傍領域においてGPIIb F993del、GPIIIa L718P、GPIIIaエクソン13欠失変異をそれぞれの症例において同定した。これら異常を有するGPIIb/IIIaを動物細胞に発現させたところ、GPIIb/IIIa発現量低下と恒常的活性を認めた。以上により、恒常的活性化型GPIIb/IIIa受容体異常による先天性巨大血小板性血小板減少症はGPIIb R995Wのみでなく、新規疾患entityであることが明らかになった。また、本疾患は本邦の先天性巨大血小板性血小板減少症のなかで3あるいは4番目に高頻度である。昨年度までの研究において、GPIIb/IIIaの定常状態の維持に必要な膜近傍領域におけるヘテロ接合性変異は恒常的活性化型GPIIb/IIIa受容体を引き起こし、恒常的インテグリン信号伝達の存在により巨核球からの早期血小板放出を引き起こすことによる大型で数少ない血小板を産生することが明らかとなった。この、GPIIb/IIIa異常による先天性巨大血小板性血小板減少症の診断には、フローサイトメトリによる血小板GPIIb/IIIa発現解析が有用であり、GPIIb/IIIa発現低下と相対的GPIb発現上昇、およびGPIIb/IIIa恒常的活性化の指標であるPAC1抗体の結合を認める。出血傾向は軽微もしくは認めない。本年度は、先天性巨大血小板性血小板減少症の鑑別診断解析の中で、出血症状と巨大血小板性血小板減少症を呈した症例を解析した。血小板GPIIb/IIIa発現低下とGPIb発現上昇、およびPAC1抗体の結合を認め、GPIIb遺伝子に父由来のGPIIb膜貫通領域のGFFKR配列中のG991C変異と、母由来の古典的血小板無力症の原因変異を同定した。機能解析実験によって、G991C変異はGPIIb/IIIa異常による先天性巨大血小板性血小板減少症の原因となる他の変異と同様に恒常的活性化型GPIIb/IIIa受容体を引き起こすことが明らかとなった。先天性巨大血小板性血小板減少症の新規原因として、恒常的GPIIb/IIIa受容体活性化を引き起こすGPIIb R995W変異を明らかにした。患者血小板膜上へのGPIIb/IIIa発現は正常の50-70%に低下し、活性化型GPIIb/IIIaを認識するPAC1抗体とフィブリノゲン結合を認めたが、P-セレクチン発現は認められなかった。血小板免疫ブロット解析では正常の70%のGPIIb/IIIa発現を認めた。変異を有するGPIIb R995W/GPIIIaを発現させたCHO細胞では患者血小板と同様に、PAC1抗体とフィブリノゲン結合を認めた。フィブリノゲン固相化面への接着・進展した細胞では波状波と胞体突起が観察された。液相中において、リガンドへの結合無しにFAKはリン酸化していた。症例解析により新たな変異を同定し、その分子異常を明らかにした。恒常的活性化型GPIIb/IIIa

受容体異常による先天性巨大血小板性血小板減少症はGPIIb R995Wのみでなく、新規疾患entityであることが判明した。予備実験段階から順調に進展している。新規症例の解析と分子病態を明らかにする。当初同定した変異に加え、本年度に行なった新規症例の変異解析で同定した変異を含めた解析を行なう。系統的血小板解析により本疾患を同定し、in vitro実験により分子病態を明らかにする実験に供する。研究成果を学会および論文に発表するために供する。予備実験段階で十分な準備を行なったため次年度に使用する予定の研究費が生じた。複数の変異について解析を進める。
東アジアにおける天道信仰の総合的研究―道教・陰陽道とのシンクレティズムを中心に

本研究の目的は、東アジアおよび日本各地で「天道(天)」をめぐるフィールド調査および史資料の調査を行い、陰陽思想・道教を含む「宗教複合」思想を浮き彫りにすること、とりわけ「大陸とのつながり」を視野に入れて精査することにより、従来の研究では抜け落ちていた「天道」思想の現代につながる意義を見出すことを目的とするものである。平成29年度は、平成27年度及び平成28年度の「日本国内における天道信仰に関する調査」および「韓国および台湾の天道信仰についての調査」について収集したデータを踏まえ、資料整理および補足調査を行うとともに、吉田神道と天道についての資料調査をすすめ、ここまでの研究成果を学会や研究会で発表し識者のアドバイスを得てまとめていくことであった。現在まで3年間の成果として浮かび上がってきたのは以下の3点である。第一に、わが国の天道概念は、天神(アマツカミ)、牛頭天王、素戔嗚尊、天神(菅原道真)と関連・習合・同一視されつつ展開すること。第二に、対馬系天道思想の源流は、吉田神道の祖・卜部平麻呂であり、わが国の天道思想の流布には、吉田神道が密接にかかわること。第三に、天道信仰には、大陸から伝来した道教書『太上感応編』が重要な役割を果たしていること。第四に、道教系天道信仰は、沖縄および九州地区にも多くみられ、当該地区の信仰は、琉球諸島を経て大陸から流伝した形跡があることである。以上のうち、第四点については、当初は予想していなかった成果であり、しかも我が国の天道信仰成立にとって重要な役割を果たしている。そこで、大陸からわが国への天道思想の伝播ルートを位置づけるために申請した「天道信仰の発展的研究ー琉球から大陸への展開を中心に」において、調査を発展させていく予定である。平成27年度は科学研究費助成金基盤研究(C)「東アジアにおける天道信仰の総合的研究ー道教・陰陽道とのシンクレティズムを中心に」の研究代表者として、基本となる文献の収集および調査と、国内外のフィールド調査を行った。特に本年度の国内調査としては、北関東・千葉県における、天道信仰と道教・陰陽道に関する史料調査およびフィールドワークを、国外調査としては、韓国における民間信仰と道教・陰陽道に関する史料収集調査を行った。国内調査においては、天道念仏の信仰が残る、千葉・茨城・栃木・群馬のフィールド調査と資料収集および当該地域における天道ないし天の名を冠する神社の調査を行い、いずれの地域にも修験者の介在がみられるという調査結果を得たのは大きな収穫であった。他方資料調査において、修験道関連の儀礼・文献資料の中に、道教・陰陽道の影響が明らかに見て取れる部分を見出した。当該の調査結果については来年度以降、学会発表等の形で発表していく予定である。国外調査においては、韓国の民間信仰に見られる「天」ないし「天道」に関する儀礼等が見出されるかどうかが焦点となったが当該資料に当該の概念を見出したのは収穫である。今後、日本の天道信仰と、韓国の当該概念の比較検討を慎重に行っていく予定である。他方、本年度は、近世日本の仏教者、鈴木正三および近代日本の仏教者、清沢満之の天道信仰についての検討を踏まえて鈴木正三のテキスト翻訳の成果を『鈴木正三著作集』上・下巻および『清沢満之』(中央公論新社)の解題の形で発表した。まずは国内の調査において、天道信仰と修験道の繋がりを媒介に、道教・陰陽道とのつながりを見出したのは基礎調査として重要な成果であった。また韓国のフィールド調査において資料収集と儀礼調査を行うことができたのは、初年度の計画に照らして順調といえる。平成28年度は、研究計画に従って基本となる史資料の収集の内容分析及び、国内外のフィールド調査を行った。国内調査としては、北関東・千葉県における、天道信仰と道教・陰陽道に関する史料調査およびフィールドワークを、国外調査としては、韓国における民間信仰と道教・陰陽道に関する史料収集調査を行った。国外調査においては、台湾の民間信仰に見られる「天」ないし「天道」に関する儀礼等が見出されるかどうかが焦点となったが、特に台湾の道教信仰には、天道信仰との重要な関連が見出されたことが重要な収穫である。今後、昨年度調査の韓国と台湾の当該概念の比較検討を慎重に行い、順次発表していく予定である。また、これまでの研究成果を、仏教思想学会第32回大会で発表し、識者から貴重なアドバイスを得た。『在家仏教』誌で「お天道さまに恥じない生き方」を発表し、一般読者向けに研究成果の一部を公表した。さらに関連する研究業績として、日本中世の習合思想に関する、「痴兀大慧の『廓庵十牛図』理解」という論考を『東方』32号に発表した。また海外調査として、台湾のフィールド調査において資料収集と儀礼調査を行うことができたのは、第二年目の研究計画に照らして順調といえる。

本研究の目的は、東アジアおよび日本各地で「天道(天)」をめぐるフィールド調査および史資料の調査を行い、陰陽思想・道教を含む「宗教複合」思想を浮き彫りにすること、とりわけ「大陸とのつながり」を視野に入れて精査することにより、従来の研究では抜け落ちていた「天道」思想の現代につながる意義を見出すことを目的とするものである。平成29年度は、平成27年度及び平成28年度の「日本国内における天道信仰に関する調査」および「韓国および台湾の天道信仰についての調査」について収集したデータを踏まえ、資料整理および補足調査を行うとともに、吉田神道と天道についての資料調査をすすめ、ここまでの研究成果を学会や研究会で発表し識者のアドバイスを得てまとめていくことであった。現在まで3年間の成果として浮かび上がってきたのは以下の3点である。第一に、わが国の天道概念は、天神(アマツカミ)、牛頭天王、素戔嗚尊、天神(菅原道真)と関連・習合・同一視されつつ展開すること。第二に、対馬系天道思想の源流は、吉田神道の祖・卜部平麻呂であり、わが国の天道思想の流布には、吉田神道が密接にかかわること。第三に、天道信仰には、大陸から伝来した道教書『太上感応編』が重要な役割を果たしていること。第四に、道教系天道信仰は、沖縄および九州地区にも多くみられ、当該地区の信仰は、琉球諸島を経て大陸から流伝した形跡があることである。以上のうち、第四点については、当初は予想していなかった成果であり、しかも我が国の天道信仰成立にとって重要な役割を果たしている。そこで、大陸からわが国への天道思想の伝播ルートを位置づけるために申請した「天道信仰の発展的研究ー琉球から大陸への展開を中心に」において、調査を発展させていく予定である。本年度は、引き続き日本国内のフィールドワークを実施するととにもに、海外調査としては台湾におけるフィールドワークを行う。他方、仏教思想学会、日本思想史学会等で中間報告的発表を行い、識者の意見を乞い、研究を推進する。引き続き日本国内のフィールドワークを実施するととにもに、海外調査としては韓国におけるフィールドワークを行う。他方、日本思想史学会・日本倫理学会等で学会発表を行い、識者の意見を乞い、研究を推進する。
唾液腺患者におけるプロラクチンに関する研究

1)実験動物を用いたものに関しては、マウスを用いて行っているため耳下腺、顎下腺、舌下腺などの組織が小さく、特に月齢が小さいものほど採取に苦労し、やや検体数を増やして検討を行い、ほぼ月齢に伴いプロラクチンの変化について免疫組織化学的に認められていますが、現在、また補足分の検討を行っているところです。また、免疫化学的検討ではまだ検討中の段階で、検体の組織量が足りないために補足分の検討と伴せて再度検討を行う予定でおります。(組織量の問題と抗体の希釈濃度に問題があると考えています。)2)臨床からの材料を用いたものに関しては手術症例で唾液腺を摘出できる症例が少なく、いましばらくの組織採取期間が必要であると考えられます。また、唾液の分泌量の測定を外来にて行っておりますが、現段階では検体数が少なく同様にもう少しの採取期間を必要としています。全体的に臨床からの検体に関しては検体数が少ないうえに年齢や全身状態などにばらつきが多く、検討するのに苦慮しています。実験動物を用いたものに関しては、近いうちに発表できるものと考えています。
レーザ照射による熱ひずみ制御を用いた高温割れ対策

レーザ照射を用いることで溶接時に生じる高温割れの抑制可能性を調査する予備的検討を実施した.本研究では,高温割れの中でも凝固割れを対象としている.平成30年度は,凝固割れ発生予測手法に対して実験ならびに熱弾塑性解析と凝固理論を加えたシミュレーションから構築した.凝固割れ発生予測手法を基に,レーザ照射が凝固割れ性に与える影響についてシミュレーションと実験の両方から検討を実施した.凝固割れ性を評価可能な拘束緩和式U型高温割れ試験を使用し,TIGアークを溶接熱源とし,レーザ照射を併用し,凝固割れ発生に対するレーザ照射の影響を調査した.凝固割れの発生は,高速度ビデオカメラを用いた直接観察による凝固割れ発生ひずみを計測することで評価した.レーザ照射条件としては,レーザスポット径,レーザ出力,レーザ照射位置,レーザ照射タイミング等,それぞれの組み合わせに応じて様々である.そのため,熱弾塑性解析を用いてレーザ照射条件の最適化を試みたところ,レーザ照射タイミング,レーザ照射位置のそれぞれで凝固割れが抑制される可能性が見出された.そこで,予測されたレーザ照射条件に対して拘束緩和式U型高温割れ試験を実施したところ,予測結果と同様の傾向を得ることができ,凝固割れ抑制に効果的なレーザ照射条件を明らかにした.特に,溶接主熱源とともに溶接金属に沿ってレーザを照射し,レーザ照射部が力学的溶融温度以下に熱せられる際に凝固割れが抑制可能であることが示唆された.平成30年度の研究進捗としては,レーザ照射が凝固割れ感受性に与える実験的検討に加えて,熱弾塑性解析と溶接凝固解析を併用した凝固割れ発生予測の実施,実験と解析によるレーザ照射条件の最適化の3点について検討した.凝固割れ評価の際には,高速度ビデオカメラを用いた直接観察によるひずみ計測を実施し,凝固割れ発生を定量的に評価しており,熱弾塑性解析と溶接凝固解析を併用した凝固割れ発生予測シミュレーションの妥当性を示唆できている.実験と解析を駆使することで,凝固割れ抑制に効果的なレーザ照射条件を効率的に導出できており,その効果を実験において検証できている.平成31年度は,レーザ照射条件を熱弾塑性解析と溶接凝固解析を併用した凝固割れ発生予測シミュレーションを用いて最適化することを試みる.昨年度までに,ある特定のレーザ照射条件のもとで凝固割れが抑制されることが示唆され,レーザ照射により凝固割れ発生に寄与するひずみが緩和されることが解析,実験的に明らかとなっているものの,ひずみ緩和に至った要因の特定までは至れていない.そこで,レーザ照射によるひずみ緩和の支配因子を特定することを目標とする.溶接凝固中の温度履歴ならびに温度分布に注目して,レーザ照射が凝固割れ感受性に与える影響について考察を加える.レーザ照射を用いることで溶接時に生じる高温割れの抑制可能性を調査する予備的検討を実施した.本研究では,高温割れの中でも凝固割れを対象としている.平成30年度は,凝固割れ発生予測手法に対して実験ならびに熱弾塑性解析と凝固理論を加えたシミュレーションから構築した.凝固割れ発生予測手法を基に,レーザ照射が凝固割れ性に与える影響についてシミュレーションと実験の両方から検討を実施した.凝固割れ性を評価可能な拘束緩和式U型高温割れ試験を使用し,TIGアークを溶接熱源とし,レーザ照射を併用し,凝固割れ発生に対するレーザ照射の影響を調査した.凝固割れの発生は,高速度ビデオカメラを用いた直接観察による凝固割れ発生ひずみを計測することで評価した.レーザ照射条件としては,レーザスポット径,レーザ出力,レーザ照射位置,レーザ照射タイミング等,それぞれの組み合わせに応じて様々である.そのため,熱弾塑性解析を用いてレーザ照射条件の最適化を試みたところ,レーザ照射タイミング,レーザ照射位置のそれぞれで凝固割れが抑制される可能性が見出された.そこで,予測されたレーザ照射条件に対して拘束緩和式U型高温割れ試験を実施したところ,予測結果と同様の傾向を得ることができ,凝固割れ抑制に効果的なレーザ照射条件を明らかにした.特に,溶接主熱源とともに溶接金属に沿ってレーザを照射し,レーザ照射部が力学的溶融温度以下に熱せられる際に凝固割れが抑制可能であることが示唆された.平成30年度の研究進捗としては,レーザ照射が凝固割れ感受性に与える実験的検討に加えて,熱弾塑性解析と溶接凝固解析を併用した凝固割れ発生予測の実施,実験と解析によるレーザ照射条件の最適化の3点について検討した.凝固割れ評価の際には,高速度ビデオカメラを用いた直接観察によるひずみ計測を実施し,凝固割れ発生を定量的に評価しており,熱弾塑性解析と溶接凝固解析を併用した凝固割れ発生予測シミュレーションの妥当性を示唆できている.実験と解析を駆使することで,凝固割れ抑制に効果的なレーザ照射条件を効率的に導出できており,その効果を実験において検証できている.平成31年度は,レーザ照射条件を熱弾塑性解析と溶接凝固解析を併用した凝固割れ発生予測シミュレーションを用いて最適化することを試みる.昨年度までに,ある特定のレーザ照射条件のもとで凝固割れが抑制されることが示唆され,レーザ照射により凝固割れ発生に寄与するひずみが緩和されることが解析,実験的に明らかとなっているものの,ひずみ緩和に至った要因の特定までは至れていない.

そこで,レーザ照射によるひずみ緩和の支配因子を特定することを目標とする.溶接凝固中の温度履歴ならびに温度分布に注目して,レーザ照射が凝固割れ感受性に与える影響について考察を加える.平成31年度に購入を検討していた二軸テーブルの購入したため,当初予定とは異なる使用額となった.本繰越金に関しては,研究遂行に必要な消耗品購入(試験片加工ならびにTIGトーチ周辺備品)のために使用予定である.
スパッタ・イオンプレーティング複合人工格子作製装置の開発研究

制限反応スパッタリングと名付けた新しいスパッタリング法を研究開発した.この技法を用いて,次世代MOSFET用ゲート絶縁膜としてZrO2誘電体膜を形成した.Si基板表面の酸化が抑制され20を越える高い比誘電率が得られた.酸化物ターゲットを用いた通常のスパッタリング法では酸素イオンや活性種が励起されSi基板は直ちに酸化してしまうが,この堆積法では,そのような酸化種が発生しないので,Si基板とその上の堆積膜の界面は急峻に形成できる.制限反応スパッタリングと名付けた新しいスパッタリング法を研究開発した.この技法を用いて,次世代MOSFET用ゲート絶縁膜としてZrO2誘電体膜を形成した.Si基板表面の酸化が抑制され20を越える高い比誘電率が得られた.酸化物ターゲットを用いた通常のスパッタリング法では酸素イオンや活性種が励起されSi基板は直ちに酸化してしまうが,この堆積法では,そのような酸化種が発生しないので,Si基板とその上の堆積膜の界面は急峻に形成できる.本年度は、スパッタ装置と電子ビーム蒸着装置を同一真空漕内で稼動させるための条件について詳しく検討した。電子銃は真空度が10^<-4>Torr以下にしないと異常放電を引き起こし、使用できない。一方、スパッタ装置はスパッタガスであるArを10^<-4>Torr程度導入しないと堆積速度がかせげないという矛盾した問題がある。そこで、高電圧(-4kV)でバイアスしてある電子銃のフィラメントの周りにイオンコレクターを設置し、スパッタガンから飛来するArイオンを排除することによりこの問題を解決できることを示した。これによりスパッタ法と電子ビーム蒸着法を組み合わせた新しい複合薄膜作製装置を安定して作動させることが可能となった。さらに、本装置に熱陰極電子源を設置し、電子銃のルツボ(蒸着源)を正にバイアスしこの熱電子を引き込むことにより陽極アーク放電を起こし、蒸発源蒸気を高効率にイオン化できることが可能となった。通常イオン化を促進するためにArガスなどの放電補助ガスを加えるが、本装置では蒸発源そのものがプラズマ化するので放電補助ガスは不要であり、高真空下での動作が可能である。このイオン化方式により、イオンプレーティング環境下における薄膜作製ができるものと期待される。昨年度、スパッタ法と電子ビーム蒸着法を組み合わせた新しい複合薄膜作製装置の基礎特性に関する検討を行ったが、両製膜法の動作ガス圧の調整が極めて微妙であり、両立させて安定して動作させることは得策でないと判断した。そこで、本年度はガス圧に関係なく電子ビーム蒸着法と同様に真空蒸着が行える、フラッシュ蒸着法を検討した。まず、粉末状原料を滑らかにかつ一定常速度で供給するために、回転式ミキサー構造の原料供給装置を考案した。次に熱膨張による変形や歪みに耐え、熱集中度のよいW製局所加熱源を試作し、1800°C程度で定常運転できるフラッシュ蒸着装置を完成させ基礎実験を開始した。Si基板上にSi膜を成長させたところ、原料粉末Siの表面酸化によりエピタキシャル成長が阻害されることもなく、基板温度500°Cでエピタキシャル成長することが確認できた。次年度は、より高品質の結晶成長を実現するために水素等を導入し還元雰囲気中でのフラッシュ蒸着を検討していく。また、スパッタ法との併用による薄膜成長技術の開発を行う。雰囲気のガス圧力に関係なくしかも組成制御がしやすいフラッシュ蒸着法について、装置の開発を行ってきた.一定速度で粉末状の原料を1800-2100°Cのタングステン製加熱源に落下させるミキサー式の装置の制御性が十分でなかったため振動スライダー方式を導入した.この改良により本装置は,ほぼ完成したといえる.本装置を用いてSi粉末(粒径75μm)を原料としてSi基板上にSi膜の成長を試みたところ,現状では装置の真空度が十分でないため結晶性は良いとはいえないが、基板温度500°Cでエピタキシャル成長することが観測された.さらにSi基板上にFeを成膜したところ,RHEED観察の結果500°Cでは多結晶成長であったが600°Cでは単結晶構造が見られた.XRD測定では,Fe200のみの回折ピークが現れ,FeがSi上にエピタキシャル成長している可能性があることがわかった.しかし,目的とするβ-FeSi2に関するピークは現れず,SiとFeの反応が十分ではないと考えられる.
尿道下裂の遺伝子制御機構の解明と遺伝子導入細胞シートを用いた新規手術法の開発

尿道下裂モデルラットの作製と原因遺伝子検索により、下記の2つの研究を実施した。1)尿道下裂モデルラットの作製11週齢の妊娠Sprague-Dawleyラットに対し非ステロイド性抗アンドロゲン剤flutamide 7.5mgを、日数を調節して腹腔内投与することで、胎仔の尿道形成時期を特定した。すなわち、ラットの尿道形成は、妊娠15日目から始まり、妊娠17日目が最も重要な時期で、妊娠19日目には終了することが確認された。妊娠15日目と17日目と19日目に胎仔の陰茎でどのような遺伝子発現が変化しているのかを調べることで尿道形成に関わる遺伝子が同定できる可能性が示唆された。胎仔の陰茎採取方法は、実体顕微鏡下に氷冷したリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に妊娠ラットから摘出した子宮をおき、羊膜を開け胎仔を取り出す。胎仔の性腺を実体顕微鏡で確認し雌雄を識別したのち、雄仔から陰茎を採取する。胎仔の陰茎は、遺伝子採取用、タンパク抽出用、組織検査用に保存した。2)胎仔陰茎の遺伝子解析・タンパク解析・発現局在解析遺伝子採取用の胎仔陰茎からtotal RNAを抽出し、逆転写によってcDNAを合成する。合成されたcDNAは、マイクロアレイチップにハイブリダイズさせスキャナーによる解析を行った。マイクロアレイの結果である遺伝子発現プロファイルをパスウェイ解析にかけ、尿道形成の重要な遺伝子経路の同定を試みた。尿道形成に重要な遺伝子の候補として、新規遺伝子(Pip: Prolactin-induced protein)を同定した。免疫染色による発現局在解析の結果、陰茎包皮の表皮基底層に発現を認めた。ラットだけでなくヒトにおいても同様の結果であった。マイクロアレイの結果である遺伝子発現プロファイルの解析に時間を必要としているためである。パスウェイ解析の導入により遺伝子パスウェイの同定、すなわち単独遺伝子一つ一つの確認をせずに、遺伝子群として遺伝子発現変化を捉えることを行っている。この遺伝子同定が今回のキーポイントとなると考え、集中的に解析を継続している。パスウェイ解析にて得られた遺伝子パスウェイ上の遺伝子について、裏付けとなる定量RT-PCR法により実際の発現差を確認する。さらに、発現部位を同定するために、胎仔陰茎のin situ hybridization法と免疫染色を行い、組織学的に検討する。同定された遺伝子の中で特徴的なものは、候補遺伝子としてcDNAをサブクローニングして、遺伝子導入研究を行う予定である。11週齢の妊娠Sprague-Dawleyラットに対し非ステロイド性抗アンドロゲン剤flutamideを投与することにより尿道下裂モデルラットの作成を行った。アンドロゲン依存的に外性器が形成される妊娠後期、すなわち妊娠1320日に抗アンドロゲン剤を3日間連日腹腔内投与し、尿道下裂モデルラットを作成した。抗アンドロゲン剤の投与方法に関しては、私たちがこれまでに停留精巣モデルラットを作成したときと同様flutamide7.5mgをカルボキシルメチルセルロースに溶解し0.5%溶液としたのちに妊娠ラットの腹腔内に投与した。抗アンドロゲン剤の投与日の違いにより、正常な陰茎から様々なタイプの尿道下裂(亀頭部・陰茎部・会陰部)まで作成可能であった。抗アンドロゲン剤投与期間の検討から、妊娠17日目が尿道下裂発生に重要であることが示唆された。そこで、尿道下裂のモデルラットとコントロールである正常ラットの双方から、雄仔の陰茎を採取した。具体的には、まず正常ラットの妊娠15、17、19日目と尿道下裂モデルラットの尿道下裂発生の臨界期である妊娠17日目に、胎仔を取り出した。実体顕微鏡下に、氷冷したリン酸緩衝生理食塩水(PBS)内で胎仔の性腺を確認し雌雄を識別後、雄仔から陰茎を採取した。採取した陰茎からtotal RNAを抽出し、逆転写によってcDNAを合成した。合成されたcDNAは、20500遺伝子を搭載したマイクロアレイチップにハイブリダイズさせスキャナーによる解析を行った。20500遺伝子を搭載したマイクロアレイ解析の結果の解釈に時間がかかっている。遺伝子発現の差を順序良く整理することは終了しているが、それらの遺伝子がどのパスウェイに属しているか、またパスウェイの上流や下流の遺伝子発現はどうなっているか、を理解して遺伝子制御の状況をきちんと把握することが、本研究の今後の道筋を作るうえで極めて重要であると考えている。よって、十分な時間を必要としている。

胎仔の性腺を実体顕微鏡で確認し雌雄を識別したのち、雄仔から陰茎を採取する。胎仔の陰茎は、遺伝子採取用、タンパク抽出用、組織検査用に保存した。2)胎仔陰茎の遺伝子解析・タンパク解析・発現局在解析遺伝子採取用の胎仔陰茎からtotal RNAを抽出し、逆転写によってcDNAを合成する。合成されたcDNAは、マイクロアレイチップにハイブリダイズさせスキャナーによる解析を行った。マイクロアレイの結果である遺伝子発現プロファイルをパスウェイ解析にかけ、尿道形成の重要な遺伝子経路の同定を試みた。尿道形成に重要な遺伝子の候補として、新規遺伝子(Pip: Prolactin-induced protein)を同定した。免疫染色による発現局在解析の結果、陰茎包皮の表皮基底層に発現を認めた。ラットだけでなくヒトにおいても同様の結果であった。マイクロアレイの結果である遺伝子発現プロファイルの解析に時間を必要としているためである。パスウェイ解析の導入により遺伝子パスウェイの同定、すなわち単独遺伝子一つ一つの確認をせずに、遺伝子群として遺伝子発現変化を捉えることを行っている。この遺伝子同定が今回のキーポイントとなると考え、集中的に解析を継続している。遺伝子のパスウェイに関しては、解析ソフトなどを有効に活用して研究のスピードアップに努める。尿道下裂の発生に関連した遺伝子パスウェイを見極めたうえで、それらの遺伝子発現について個々に定量RT-PCRで確認する。確認できた特徴的遺伝子については、cDNAをサブクローニングし遺伝子強制発現ベクターを作成するか、もしくはsiRNAを作成し、遺伝子発現変化の影響を検討する予定である。パスウェイ解析にて得られた遺伝子パスウェイ上の遺伝子について、裏付けとなる定量RT-PCR法により実際の発現差を確認する。さらに、発現部位を同定するために、胎仔陰茎のin situ hybridization法と免疫染色を行い、組織学的に検討する。同定された遺伝子の中で特徴的なものは、候補遺伝子としてcDNAをサブクローニングして、遺伝子導入研究を行う予定である。本研究の核となる組織培養の方法等を年度半ばで見直しをしたため次年度使用額が生じた。マイクロアレイで得られた遺伝子発現変化を、パスウェイ解析ソフトで解析する予定である。具体的には「Ingenuity Pathway Analysis」というソフトを使用するのに経費がかかる。また、得られた特徴的遺伝子群のサブクローニングにも経費がかかる予定である。サブクローニングの具体的な内容としては、定量RT-PCRにより個々の遺伝子発現を確認すること、cDNAから遺伝子強制発現ベクターを作成すること、siRNAを作成すること、の3つを予定している。
指示忘却の検討を中心としたワーキングメモリの能動的な制御能力の比較心理学的研究

外界を認識し対応する原始的な心と,ヒトの持つ自らを認識し世界に働きかける心をつなぐと考えられる,“情報を能動的に選択し,処理する心"に迫るために,能動的な情報処理と関連する“指示忘却"現象を用いて,情報の保持や符号化を行うワーキングメモリ過程の能動的な制御について検討する。申請者は,ラットを対象に指示忘却の検討を行った。ラットにおける指示忘却の手続きについては確立してきているが,そのメカニズムは十分には明確ではない。ラットにおける指示忘却が,能動的なリハーサル制御による忘却項目から記銘項目への“記憶資源の再配分"に起因する可能性について,行動実験のレベルで証明する。
バイオマス炭化物による重金属イオンの除去特性に関する研究

1.目的バイオマスは多種多様で、各成分が大きく異なるため、資源化にあたり各バイオマスの構成成分や構造等を十分に把握する必要があると考えている。その原料特性を考慮した最適な利用法を選択できるようなシステム創りが必要と思われる。今回はその第一歩として、バイオマス炭化物に着目し、重金属処理材としで利用することを想定した。そこで本研究の目的は、バイオマス原料およびその炭化物の各成分分析を行った上でカドミウムイオンの浄化処理実験を行い、含有成分や細孔構造等と処理特性との関係を検討することとした。2.実験方法バイオマス試料はイナワラ、モミガラ、コメヌカ、リンゴ剪定枝、孟宗竹とし、窒素気流中400°Cと800°Cでとれそれ1時間炭化して作製した。成分分析はイオンクロマト法を用いた。カドミウム処理特性は塩化カドミウム水溶液を用い、各炭化物(粒径20100μm)に対して回分法で求めた。カドミウムイオンは比色法により測定した。その他、細孔分布、XRD、繊維分析、元素分析等を行い、各バイオマス特性を求めた。3.研究成果今回用いた5種類の炭化物すべてがカドミウム除去能を持つことが分かった。特にイナワラとコメヌカの除去能が優れていた。(最大除去量80mg/g)また炭化物中のカリウム含有量がカドミウム除去能と相関関係にあることを見出した。さらにナトリウムの依存性を確認するためカドミウム除去能が低いリンゴ枝に、塩化ナトリウムを添加した炭化物に対して同様の浄化処理を行ったところ、大きく改善できることが分かった。これは海水に浸漬した木質系バイオマスの有効利用法としても期待できる。以上のようにバイオマスには含有する成分や構造等の原料特性に応じた利用法を選択することが重要であり、簡単な処理によって高機能性材料への変換も可能となることが示唆された。