hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
光増感機能を有する高分子膜を用いた太陽エネルギーの化学変換

光増感電荷分離機能を有する透明な高分子膜を作成し、これを用いた光電荷分離について検討した。光電荷分離システムを内臓する媒体として、EDTAをペプチド結合したアミノスチレン、2-ビニルピリジン、スチレンの三元共重合体(PETA)を合成し、成膜した後Ru【(bpy)(^(2+)_3)】およびメチルビオロゲン(【MV^(2+)】)を吸着させた(PRM膜)。乾燥したPRM膜またはAr飽和水溶液に浸したPRM膜に可視光を照射すると、メチルびオロゲンラジカルが急速に生成する。膜上に生成した【MV^+】の生成量は、本研究費で購入した日立150型分光光度計を用いて測定した。PRM膜系における【MV^+】の初期生成速度は、対応する均一水溶液系に比べて、約510倍に達することを見出した。PRM膜中では、ドナー、光増感剤、アクセプターが局所的に濃縮されているため、Ru【(bpy)(^(2+)_3)】の励起種から【MV^(2+)】への電子移動反応の速度が速くなると共に、EDTAとRu【(bpy)(^(2+)_3)】が靜電的に結合しているため、電子移動によって生成したRu【(bpy)(^(3+)_3)】が素早くEDTAによって還元され、いわゆる"逆反応"の割合が著しく減少するためと推定された。PRM膜を酸素を含む水に浸して可視光を照射すると、水中に過酸化水素が生成する。その生成速度は、対応する均一水溶液系とほぼ同程度であった。この場合、均一系でも低分子量EDTAとRu【(bpy)(^(2+)_3)】はイオン対を形成し、また膜中では酸素分子が濃縮されにくいので、膜系の電荷分離効率は、均一系と同じ程度になる。すなはち、どナーと光増感剤が近傍に存在し、さらにアクセプターが濃縮されている透明な膜を用いれば、光電荷分離効率の大きな光増感膜として機能することがわかり、高効率の光増感膜設計に対する有益な知見が得られた。
細胞内増殖機構における蛋白質リン酸化酵素PKNの機能に関する研究

本研究においては、PKNと直接的、間接的に相互作用することによりシグナリングを制御している分子の同定を種々の方法を用いて行い、既知のシグナリング分子との関連も含めて、複雑なシグナリングネットワークの解明の一助とすることを目指した。以下に、得られた結果の概略を記す。1.PKNと低分子量GTP結合蛋白質Rhoとの相互作用に関する解析細胞骨格の構築に重要な役割を担っていると考えられる低分子量GTP結合蛋白質PhoがPKNと直接GTP依存的に結合し、PKNの活性化を引き起こすことを示し、Rhoの標的蛋白質の一つとしてPKNが機能している可能性を示した。PKNとRhoの結合について、酵母Two hybrid systemなどを用いて詳細に検討した結果、Rhoとの結合にはPKNのアミノ末端側領域中に存在するロイシンジッパー様配列が重要であることを明かにした。2.PKNと相互作用する蛋白質の解析PKNと相互作用する蛋白質を酵母Two hybridsystemによりスクリーニングすることにより中間径フィラメントであるニューロフィラメントとPKNは直接結合し、またこれをリン酸化することによりニューロフィラメントの結合、脱重合を制御していることを示した。さらに他の中間径フィラメントであるビメンチンともPKNは結合することから、PKNはこれら中間径フィラメントのダイナミックな動きを制御している可能性が示唆された。また、上記と同様な方法で、細胞骨格蛋白質アクチンの重合に重要な機能を持っているα-アクチニンともPKNが直接結合することを示し、その結合領域、結合様式などを詳細に検討した。3.PKNの細胞内局在に関する解析PKNに対する特異抗体を用いてPKNの細胞内局在について解析したところ、通常の状態ではPKNは細胞質中に存在するのに対して、熱などのストレスにより速やかに核に移行することが明かとなり、PKNは、遺伝子発現制御を含む核内でのイベントにも何らかの機能を持っている事が示唆された。
位相空間論と連続体論を用いたカオス力学系の幾何構造の研究

本研究での第一の課題は、トポロジーと位相力学系に関わる多くの問題のうちでコンパクト距離空間の連続写像のカオス性についての問題、特にカオス力学系の核になる空間のindecomposability性について詳しく研究することである。この課題について以前から以下の結果が知られていた。1994年、Barge等はグラフ上の写像の逆極限とシフト写像という制限された条件の下で、以下の3つの条件:正のエントロピー、horse shoeの存在、indecomposabilityの存在が同値であることを証明した。またKennedy, Yorkeは多様体の力学系に現れる複雑なトポロジー、特にindecomposabilityの研究を長年続けている。2002年、Blanchard等はこの方面の長年の予想「正のエントロピーはLi-Yorkeのカオスを導く」を証明して大きなブレイクスルーとなった。2011年、Mouronはarc-likeの場合に、正のエントロピーがindecomposabilityを導くことを証明している。また近年、局所エントロピー理論がBlanchard, Ye, Kerr, Liなどの研究により大きく発展し、現在エントロピー理論の新局面を迎えている。こうした中にあって、研究代表者は2015年Darjiとの共同研究で、正のエントロピーをもつ同相写像を許容する一般のグラフ・ライクな連続体はindecomposable連続体を含むという定理の証明に成功した。さらに研究代表者は2017年から2018年の2年間に、この成果を更に発展させてグラフ・ライク連続体上ではBlanchard等の結果と空間のindecomposabilityを融合した全く新しい幾何学的かつ力学的構造定理が得られることを示した。この定理の証明のために幾つかのアイデアを導入したが、これらのアイデアは今後のこの方面に大きく貢献できる重要な道具になると考えている。位相力学な発想から、写像のeventual coloring numberの概念を新たに導入しその評価公式を得ることで、この方面の研究を発展させることに成功した。同相写像のゼロ次元力学系への持ち上げで、そのfactor mapがfinite-oneになるものを構成した。局所コンパクト空間上の任意の連続写像について、その周期点集合を`最適'に保存するコンパクト化が存在することを証明した。あるカオス的な力学系(たとえばゼロ次元周期点集合をもつ力学系)において、最近の物理学に登場するダークマターにヒントを得たダーク空間を定義し、全体空間がダーク空間でほとんど覆われていることを証明した。また、関数解析への応用として、Banachの著名な`等長埋め込み定理'を更に発展させた定理を得た;つまり、任意の可分距離空間Xはヒルベルト立方体上の関数空間C(Q)に等長的に埋め込み可能で、さらに任意のpoint-wise boundedなX上の等長変換群はC(Q)上の等長線形変換群に自然に拡張される。また、U. Darji氏との共同研究でエントロピー正の力学系は複雑な幾何構造を許容することを証明した。すなわち、正のエントロピーをもつ同相写像を許容するグラフ・ライクな連続体は、indecomposable連続体を含む。この結果は、エントロピーとindecomposable性に関するこの方面の問題の重要な結果である。また、一般的な逆極限の幾何構造についての研究を行った。特に、その逆極限の次元についての評価式を得た。これまでDarji氏との共同研究でエントロピー正の力学系は複雑な幾何構造を許容することに成功していた。すなわち、正のエントロピーをもつ同相写像を許容するグラフ・ライクな連続体は、indecomposable (分解不可能な)連続体を含む。この結果は、エントロピーとindecomposable性に関する重要な結果である。今年度この結果を更に精密化させた構造定理を得ることに成功した。より具体的には、グラフ・ライクな連続体上のトポロジカルエントロピーが正である同相写像は、その上で重要なカオスを引き起こすカントール集合を含み、かつそのカントール集合は分解不可能な連続体のコンポーザントに横断的に埋め込まれることを証明した。この結果は、この方面の最終定理と考えられる。また、一般的な逆極限の幾何構造についての研究を行い、dimensionally stepwise spaces,次元、ANR性などに関する重要な定理を得ている。本研究の目的は、幾何学的トポロジーの主な研究対象であるコンパクト距離空間・可分距離空間とその上の連続写像の力学的・幾何学的性質を、位相空間論・幾何学的トポロジー(特に連続体論)と位相力学系理論およびエルゴート理論を駆使して総合的に研究することである。位相力学系に現れる複雑な不変集合の幾何構造と力学的構造の解明を研究のメインテーマとする。そうした複雑なコンパクト距離空間の幾何構造・力学的構造はたいへん興味深い研究対象である。本研究の研究実績として以下の結果を得ている。あるカオス的な力学系(たとえば0-次元周期点集合をもつ力学系)において、最近の物理学に登場するダークマターにヒントを得たダーク空間を定義し、全体空間がダーク空間によってほとんど覆われていることを証明した。関数解析への応用として、バナッハの著名な`等長埋め込み定理'を更に発展させた定理を得た;つまり、任意の可分距離空間はヒルベルト立方体上の関数空間C(Q)に等長的に埋め込み可能で、さらに可分距離空間上の任意の点有限な等長変換群はC(Q)上の等長線形変換群に自然に拡張される。また、外国人研究者との共同研究で、エントロピー正の力学系は複雑な幾何構造を許容することを証明した。

すなわち、正のエントロピーをもつ同相写像を許容するグラフ・ライクな連続体は、分解不可能な連続体を含む。この結果は、エントロピーと分解不可能性に関するこの方面の大きな問題の解決となった。また、一般的な逆極限の幾何構造についての研究を行った。特に、その逆極限の次元についての強力な評価式を得た。ごく最近、正のエントロピーをもつ同相写像を許容するグラフ・ライクな連続体について、最終的な構造定理(幾何学的構造と力学的構造の関連を表示する)を得た。幾何的な構造と力学的な構造の複雑さがバランスよく調和した定理である。正のエントロピーをもつ同相写像を許容するグラフ・ライクな連続体について、構造定理(幾何学的構造と力学的構造の両方を同時に表示する)を得た。この定理は、カオス・アトラクターが複雑な構造(分解不可能性)をもつという経験的に知られた事実を数学的に証明したものである。さらに、その幾何学的構造(分解不可能性)と力学的な構造(Li-Yorkeカオス)が理想的な形で関連していることを証明した定理である。そのカオス性について、エントロピー正が限界であることも示している。この定理はこの方面の大問題を完全に解いたものとなっており、幾何学的トポロジーと位相力学系研究の進展に大きく貢献する結果と考えている。本研究での第一の課題は、トポロジーと位相力学系に関わる多くの問題のうちでコンパクト距離空間の連続写像のカオス性についての問題、特にカオス力学系の核になる空間のindecomposability性について詳しく研究することである。この課題について以前から以下の結果が知られていた。1994年、Barge等はグラフ上の写像の逆極限とシフト写像という制限された条件の下で、以下の3つの条件:正のエントロピー、horse shoeの存在、indecomposabilityの存在が同値であることを証明した。またKennedy, Yorkeは多様体の力学系に現れる複雑なトポロジー、特にindecomposabilityの研究を長年続けている。2002年、Blanchard等はこの方面の長年の予想「正のエントロピーはLi-Yorkeのカオスを導く」を証明して大きなブレイクスルーとなった。2011年、Mouronはarc-likeの場合に、正のエントロピーがindecomposabilityを導くことを証明している。また近年、局所エントロピー理論がBlanchard, Ye, Kerr, Liなどの研究により大きく発展し、現在エントロピー理論の新局面を迎えている。こうした中にあって、研究代表者は2015年Darjiとの共同研究で、正のエントロピーをもつ同相写像を許容する一般のグラフ・ライクな連続体はindecomposable連続体を含むという定理の証明に成功した。さらに研究代表者は2017年から2018年の2年間に、この成果を更に発展させてグラフ・ライク連続体上ではBlanchard等の結果と空間のindecomposabilityを融合した全く新しい幾何学的かつ力学的構造定理が得られることを示した。
パーソナル環境連続モニタリングを活用した曝露リスクアセスメント手法の確立

リスクアセスメントは、その結果により対策措置を決定することが最大の目的である。その重要な過程である曝露評価プロセスは、各作業場ごとに、ハザードの強さ、曝露の濃度、期間と頻度の程度などからリスクの程度を定め、対応措置を決定することにつながる定量的なステップとされている。そこで本研究の目的は以下の2点である。1.曝露リスクアセスメントの重要な手順として、個人曝露量の連続モニタリングによる、リスクアセスメントの汎用手法を確立すること。2.現場測定データや保護具の効果判定、体内取り込み量の推定などをもとに、採るべき対策の優先順位を決定し、効果的な対策方法を導き出すリスクアセスメント方法を構築すること。本研究では平成11年度までに個人曝露連続モニタリング技術を開発し、平成1213年度にはこの技術を複数の現場で応用して有機物質、騒音、および粉じんの個人曝露濃度の測定を行った。有機物質については、機器洗浄作業、化学合成棟のメンテナンスなどで実測データを蓄積した。これにより作業内容と共に変化する個人曝露濃度の時間変動を相対的なものとして把握することが可能なことを確認し、一部を学術誌へ投稿した。騒音については化学繊維紡糸工程での実測と聴力リスクアセスメントを実施し、基礎データを蓄積した。粉じんについては、プッシュプル型換気装置を設置した作業場で個人曝露濃度の連続測定を行うことにより、外乱気流などによる曝露濃度への影響を確認した。この成果は対策へと繋がり、学術誌へ投稿した。さらに蒸気・ガス状の有機溶剤の曝露濃度を推定する数理モデルの研究についても本研究の成果の一部として纏め、これも学術誌に投稿した。本研究の成果は今後のリスクアセスメント研究の基礎的データを示すものになったと考えられる。化学物質のリスクアセスメントは,その結果により化学物質に対する措置を決定することが最大の目的である。その重要な過程である曝露評価プロセスでは,各現場ごとに,ハザードの強さ,曝露の濃度,期間と頻度の程度などからリスクの程度を定め,対応措置を決定することにつながる定量的なステップとされる。本研究では,曝露リスクアセスメントの重要な手順として,個人曝露量の連続モニタリングを取り上げ,汎用手法を確立するとともに,モニターしたデータや保護具の効果判定,体内取り込み量の推定などをもとに取るべき対策の優先順位を決定して,効果的な対策方法を導き出すリスクアセスメント方法を構築することをめざしている。本年度は,有機物質と,浮遊性粉じんを対象にして,それに対応した個人曝露連続モニタリング技術を構成する装置を購入・整備し,いくつかの現場で測定を試みた。その結果,有機物質濃度について,物質ごとの分離定量は困難ではあるが,作業内容と共に変化する個人曝露濃度の時間変動を,相対的なものとして把握することが可能であることを確認した。また溶接現場において,粉じん濃度の連続測定を実施することにより,局所排気装置の特性と作業方法によって,曝露濃度が変化することを明らかにし,作業改善のために必要な基礎資料を得ることができた。また関連分野の文献収集も進めており,今後はさらに上記のような現場データの蓄積を進めるとともに,保護具の防護ファクター測定技術の情報収集や実測データの蓄積を進める化学物質のリスクアセスメントは,その結果により化学物質に対する措置を決定することが最大の目的である。

本研究では,曝露リスクアセスメントの重要な手順として,個人曝露量の連続モニタリングを取り上げ,汎用手法を確立するとともに,モニターしたデータや保護具の効果判定,体内取り込み量の推定などをもとに取るべき対策の優先順位を決定して,効果的な対策方法を導き出すリスクアセスメント方法を構築することをめざしている。本年度は,有機物質と,騒音を対象にして,昨年度までに開発した個人曝露連続モニタリング技術を応用して,いくつかの現場で測定を試みた。有機物質については,化学工場の調合現場,化学繊維紡糸工程などで実測データを蓄積し,有機物質濃度について,物質ごとの分離定量は困難ではあるが,作業内容と共に変化する個人曝露濃度の時間変動を,相対的なものとして把握することが可能であることを昨年度に引き続き確認した。騒音については,化学繊維紡糸工程での実測と聴力リスクアセスメントを実施して,基礎データを蓄積した。また昨年度に引き続き,関連分野の文献収集も進めており,今後はさらに上記のような現場データの蓄積を進めるとともに,保護具の防護ファクター測定技術の情報収集や実測データの蓄積を進める予定である。リスクアセスメントは,その結果により対策措置を決定することが最大の目的である。その重要な課程である曝露評価プロセスでは,各作業場ごとに,ハザードの強さ,曝露の濃度,期間と頻度の程度などからリスクの程度を定め,対応措置を決定することにつながる定量的なステップとされている。本研究では,曝露リスクアセスメントの重要な手順として,個人曝露量の連続モニタリングを取り上げ,汎用手法を確立するとともに,モニターしたデータや保護具の効果判定,体内取込量の推定などをもとに採るべき対策の優先順位を決定し,効果的な対策方法を導き出すリスクアセスメント方法を構築することを目指した。平成11年度までに開発した個人曝露連続モニタリング技術を応用して,平成12年度に引き続き本年度も,いくつかの現場で,有機物質,騒音,および粉じんの個人曝露濃度の測定を試みた。有機物質については,機器洗浄作業,化学合成棟メンテナンスなどで実測データを蓄積し,作業内容と共に変化する個人曝露濃度の時間変動を相対的なものとして把握することが可能であることを確認し,一部を学術誌に投稿した。粉じんについては,プッシュプル排気装置を設置した作業場で,粉じんの個人曝露濃度の連続測定を行い,外乱気流の影響により曝露濃度が高くなることを確認し対策につなげられたことを学術誌に投稿した。また、蒸気・ガス状の有機溶剤の曝露濃度を推定する数理モデルの研究についてまとめて学術誌に投稿したが,本研究の成果の上になり立つものとなった。さらに、本研究の成果は,今後のリスクアセスメント研究の基礎的データを示すものとなったと考えられる。
シアノバクテリアにおけるレドックスネットワークの解明

レドックス制御は、タンパク質の酸化還元(レドックス)状態を変化させることでタンパク質の活性を調節する分子機構である。光合成生物のレドックス制御については、植物葉緑体で研究が進められており、光合成で得られた還元力を利用してチオレドキシン(Trx)が代謝酵素など様々なタンパク質を還元することで、光照射に応答した代謝制御を行なっていることが明らかになっている。しかし、葉緑体の起源であるシアノバクテリアのレドックス制御系については研究が立ち遅れている。そこで、本研究では、窒素固定型、ヘテロシスト形成型シアノバクテリアAnabaenasp. PCC 7120(Anabaena 7120)のレドックスネットワークの解明を目指して研究を行なっている。本年度はレドックスネットワークのin vivoでの作用機序と生理的重要性の解明を目的とし、以下の研究を行なった。1Trxの細胞内発現量Anabaena 7120が持つTrxの内、6種について細胞内のタンパク質発現量を調べた。抗体染色法を用いて定量し、Trx-m1が他のTrxに比べて著しく多く発現していることを明らかにした。2ヘテロシスト内のレドックス制御系Anabaena 7120の栄養細胞とヘテロシストにおけるレドックス制御系を調べた。栄養細胞とヘテロシストそれぞれにTrxの標的を特異的に発現させた株を作製した。光条件下の細胞内におけるTrxの標的のレドックス状態を調べ、ヘテロシストでは栄養細胞に比べて標的が酸化されていることを明らかにした。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。レドックス制御は、光合成生物において光照射に応答した代謝の切り替えに重要である。光合成生物のレドックス制御に中心的な役割を果たすのは、チオレドキシン(Trx)とTrx reductase、それらのハイブリットタンパク質であるNADPH-Trx reductase C (NTRC)であると考えられている。緑色植物葉緑体のレドックス制御についてはすでに様々な研究が行われているが、その起源であるシアノバクテリアについては情報が乏しい。そこで、本研究では、窒素固定型シアノバクテリアAnabaena sp. PCC 7120 (Anabaena 7120)のレドックスネットワークの解明を目指して研究を行っている。本年度は以下の研究を行なった。1レドックス制御におけるNTRCとTrx各サブタイプの標的タンパク質の選択性と分子機構の解明Anabaena 7120が有する6種のTrxの組換え体を作製し、これらの組換え体タンパク質を抗原として抗体も作製した。また、窒素固定での還元力供給に重要なGlucose 6-phosphate dehydrogenase (G6PDH)のレドックス制御機構を解明した。2レドックスネットワークのin vivoでの作用機序と生理的重要性の解明Anabaena7120の遺伝子破壊株の作製、生長解析、顕微鏡観察:薬剤耐性カセットの挿入により、レドックスネットワークを構成するタンパク質の遺伝子破壊株を作製した。また、これらの破壊株について増殖解析および顕微鏡観察を行なった。一部の破壊株で生育不良や細胞形態の異常が見られた。また、1に述べたG6PDHの制御がin vivoでも行われていることを明らかにした。1レドックス制御におけるNTRCとTrx各サブタイプの標的タンパク質の選択性と分子機構の解明G6PDHのレドックス制御については、レドックス制御に重要なシステイン残基やTrxの選択性を明らかにしたが、他の標的タンパク質に関する研究は進んでいない。組換え体Trxを用いたアフィニティークロマトグラフィーについては、現在準備中である。また、Trx以外の還元力供給系タンパク質の研究は、現在実行中である。2レドックスネットワークのin vivoでの作用機序と生理的重要性の解明各還元力伝達因子の破壊株を作製することに成功し、増殖解析も実施した。しかし、FTRの遺伝子の完全破壊はできなかった。G6PDHのレドックス制御の生理的重要性を明らかにした。Anabaena 7120の栄養細胞とヘテロシストではレドックス制御システムが異なることを示唆する結果を得た。光合成生物では、光合成電子伝達系からチオレドキシン(Trx)還元酵素、Trxを介した還元力伝達経路とNADPH、NADPH-Trx reductase C (NTRC)を介した還元力伝達経路がレドックス制御の中枢であると考えられている。このシステムによって、光照射による環境変化に応答した代謝制御が行なわれる。植物葉緑体のレドックス制御についてはすでに様々な研究が行なわれているが、その起源と考えられているシアノバクテリアのレドックス制御系については研究が立ち遅れている。そこで、本研究では、窒素固定型(ヘテロシスト形成型)シアノバクテリアAnabaena sp. PCC 7120 (Anabaena 7120)のレドックスネットワークの解明を目指して研究を行なっている。1レドックス制御におけるNTRCとTrx各サブタイプの標的タンパク質の選択性と分子機構の解明昨年度の研究でTrxが活性化因子OpcAの酸化還元状態を変化させることでGlucose 6-phosphate dehydrogenase (G6PDH)の活性を調節していることを明らかにした。

本年度はOpcAとG6PDHの相互作用について調べ、OpcAの酸化還元状態はG6PDHとOpcAは複合体の形成に影響を与えないことを明らかにした。さらに、Trxへの還元力伝達経路を調べ、2種類のTrx還元酵素が各Trxに対して選択性を持つことを明らかにした。2レドックスネットワークのin vivoでの作用機序と生理的重要性の解明Anabaena7120の細胞内の各Trxの酸化還元状態を調べ、強光かつ窒素欠乏条件下で特異的に機能するTrxが存在することを明らかにした。1レドックス制御におけるNTRCとTrx各サブタイプの標的タンパク質の選択性と分子機構の解明Anabaena 7120が持つ2種類のTrx還元酵素(NTR、FTR)および各Trxの組換え体タンパク質を作製した。NTRは遺伝子データベース上ではNTRと表記されているが、実際にNTRとしての機能を持っているか明らかでなかった。そこで、生化学実験を行ないNTRがNADPHから還元力を受け取り、一部のTrxを還元することを明らかにした。さらに、FTRから各Trxへ還元力が伝達するかを調べ、2種類のTrx還元酵素がそれぞれの種類のTrxに対して選択性を持つことを明らかにすることができた。また、各Trxへの還元力伝達効率に違いがあること見いだした。現在、還元力伝達効率についてさらに詳細な実験を行なっている。2レドックスネットワークのin vivoでの作用機序と生理的重要性の解明抗体染色法により各Trxの細胞内のレドックス状態を調べ、ある種のTrxは強光かつ窒素欠乏条件で特異的な役割を果たしていることを明らかにすることができた。現在、Trxアフィニティークロマトグラフィーを行ない、このTrxの標的を同定中である。また、細胞内のTrxのタンパク質蓄積量の研究は現在実行中である。昨年度作製したTrx破壊株について酸化ストレスに関わる生理パラメータの測定を予定していたが、本年度は実施できなかった。レドックス制御は、タンパク質の酸化還元(レドックス)状態を変化させることでタンパク質の活性を調節する分子機構である。光合成生物のレドックス制御については、植物葉緑体で研究が進められており、光合成で得られた還元力を利用してチオレドキシン(Trx)が代謝酵素など様々なタンパク質を還元することで、光照射に応答した代謝制御を行なっていることが明らかになっている。しかし、葉緑体の起源であるシアノバクテリアのレドックス制御系については研究が立ち遅れている。そこで、本研究では、窒素固定型、ヘテロシスト形成型シアノバクテリアAnabaenasp. PCC 7120(Anabaena 7120)のレドックスネットワークの解明を目指して研究を行なっている。本年度はレドックスネットワークのin vivoでの作用機序と生理的重要性の解明を目的とし、以下の研究を行なった。1Trxの細胞内発現量Anabaena 7120が持つTrxの内、6種について細胞内のタンパク質発現量を調べた。抗体染色法を用いて定量し、Trx-m1が他のTrxに比べて著しく多く発現していることを明らかにした。
母乳栄養法が児の食行動の発達に与える影響

若年期の食行動はその後の人生の食行動に多大な影響を与えるだけでなく、生活習慣などの発症リスクにも影響する。健やかな人生を送るためには健全な食行動の発達が重要である。母乳は、人生で最初に口にする食品である。母乳中には栄養成分以外にも生理活性物質が含まれており、母乳栄養法は人口栄養法に比較して児の成長過程での健康問題のリスクを低減することが報告されている。しかし、母乳栄養法が児の食行動の発達に与える影響を検討した報告は見られない。本研究は、母乳中の栄養成分および摂食調節因子としてレプチン濃度を測定し、これらが児の身体組成だけでなく、児の食行動の発達に与える影響を解析すること、母乳栄養法が児の成長過程における健康問題のリスク低減に与える影響を解析することを目的とし、研究を行っている。平成29年度は、病院、助産院へ母乳提供を依頼し、検体を集めた。その検体を用い、糖質、タンパク質、脂質、脂肪酸組成、レプチンの測定を行った。平成30年度は、母乳中の季節変動を捉えるため、年間を通して、糖質、タンパク質、脂質、脂肪酸組成、レプチンの測定を行った。測定方法は、前年度と同様に、糖質はそのほとんどが乳糖であることからラクターゼによりグルコースとガラクトースに分解して、その比率により乳糖量を求めた。タンパク質は、ミクロケルダール法により測定した。脂質はリーゼ・ゴッドリーブ法により測定した。脂肪酸組成は、ガスクロマトグラフィー法により解析した。また、レプチン濃度はELISA法により測定を行った。現在、蓄積したデータの解析をすすめている。平成30年度に予定していた年間を通しての母乳成分の解析がおむね順調に進展している。平成29年度、平成30年度に蓄積された母乳中の栄養成分組成とレプチン濃度の関係性を検討する。栄養方法の違いが児の離乳食以降の嗜好にどのように影響するのかについては、児の食事量の調査を乳幼児健診、1歳半健診にて行う。離乳期以降は経産婦のみを対象にして、思い出し法によるアンケート調査を行う。若年期の食行動はその後の人生の食行動に多大な影響を与えるだけでなく、生活習慣病などの発症リスクにも影響する。母乳は人生で最初に口にする食品である。母乳中には栄養成分以外にも生理活性物質が含まれている。母乳栄養法は人工栄養法に比較して児の成育過程での健康問題のリスクを低減することが報告されている。本研究は、母乳中の栄養成分および摂食調節因子としてレプチン濃度を測定し、これらが児の身体組成だけでなく、児の食行動の発達に与える影響を解析することで、母乳栄養法が児の成長過程における健康問題のリスク低減に与える影響を検討することを目的とし、研究を行っている。その検体を用い、糖質、たんぱく質、脂質、脂肪酸組成、レプチンの測定を行った。具体的には、糖質はそのほとんどが乳糖であることからラクターゼによりグルコースとガラクトースに分解して、その比率により乳糖量を求めた。たんぱく質はミクロケルダール法により測定した。脂質は、レーゼ・ゴッドリーブ法により測定した。現在、蓄積したデータの解析を行っている。その後、経産婦へのアンケート調査により、児の身体組成や児の食事摂取状況を調査し、栄養方法の違いが児の成育における食事量の調節能力の発達および成長過程における健康問題のリスク低減に与える影響を解析する。平成29年度に予定していた検体の収集と栄養成分の解析がおおむね順調に進展している。これらのデータを蓄積し、現在データ解析を行っている。

また、レプチン濃度はELISA法により測定を行った。現在、蓄積したデータの解析をすすめている。平成30年度に予定していた年間を通しての母乳成分の解析がおむね順調に進展している。栄養成分のデータ解析と並行し、経産婦へのアンケート調査を実施する。平成29年度、平成30年度に蓄積された母乳中の栄養成分組成とレプチン濃度の関係性を検討する。栄養方法の違いが児の離乳食以降の嗜好にどのように影響するのかについては、児の食事量の調査を乳幼児健診、1歳半健診にて行う。離乳期以降は経産婦のみを対象にして、思い出し法によるアンケート調査を行う。
血管内膜障害における平滑筋細胞増殖機構の分子生物学的解明と治療

動脈硬化および経皮経管冠動脈形成術(PTCA)後再狭窄の発症・進展における血管の炎症と病的リモデリングの血管生物学的機序とその生理学的特徴を解明することを目的とした。本研究では第一に血管壁、特に血管外膜側の炎症に注目し、炎症細胞に発現する接着因子P-セレクチンの役割をラット頚動脈バルーン傷害モデルを用いて検討した。P-セレクチンは、内皮細胞が剥離された後の内皮下組織に粘着・凝集した活性化血小板に強く発現する一方、外膜側の小血管内皮細胞にも傷害後7日目まで強く発現した。障害後8日目における傷害血管壁へのCD45陽性細胞の浸潤は抗P-セレクチン抗体投与によって有意に抑制されていた。バルーン傷害後14日目の抗P-セレクチン抗体による治療群(P群)の新生内膜面積は、対照群(C群)すなわち無治療群に比較して有意に抑制され、その効果は56日後にも持続していた。内弾性板および外弾性板の長さは56日目にはP群で長く、外膜の線維化も著明に抑制されており、傷害後56日目のP群の内腔面積はC群の約3倍広く保たれていた。P-セレクチンはバルーン傷害後の血管壁の炎症過程において、傷害内腔面だけでなく外膜側からも関与することが明らかとなり、抗P-セレクチン抗体投与により傷害血管壁への白血球浸潤が抑制され、新生内膜肥厚・病的血管リモデリングの進展が改善された。第二に傷害血管における血管収縮弛緩反応の変化を薬理学的手法で検討した。ラット頚動脈バルーン傷害後2週間目に摘出した頚動脈の壁張力を記録しながら血管作動性生理活性物質を投与した。その結果、正常血管と傷害血管とでは基本的な収縮力は障害血管では有意に低下していたが、血管作動性物質への反応性には差を認めなかった。弛緩反応においては最大弛緩反応が傷害血管で低下していたが、弛緩反応を誘起する物質間での反応性の差異は明らかでなかった。動脈硬化や血管形成術後の血管傷害においては血管壁の炎症がその病変形成に重要である。我々は、ラット頚動脈バルーン障害モデルにおける内膜肥厚と血管リモデリングについて、Pセレクチンを介した白血球、血小板の役割について検討している。免疫組織化学染色によりPセレクチンの発現を観察したところ、内皮障害後1日から3日にかけて障害血管内膜面に付着した活性化血小板に強く発現していた。以後、徐々に発現は減少し14から28日の経過で消退した。抗ラットPセレクチン抗体(S789G)による治療群(P群;n=7)では新生内膜肥厚がマウスコントロール抗体を投与した対照群(C群;n=7)に比べ有意に抑制された。また、血管の外弾性板の長さすなわち血管の外径はP群においてC群に比べ有意に大きく、血管の収縮リモデリングが抑制され、これらの結果障害血管の内腔面積はP群においてC群に比べ有意に大きく、2ヶ月後の慢性期まで維持された。バルーン障害後8日における新生内膜および中膜のCD45陽性細胞数/総細胞数をC群(n=6)とP群(n=6)で比較したところ有意に治療群で減少していた。走査電子顕微鏡による障害血管内腔面の観察では1から5日で多数の血小板が内皮下組織に粘着し、白血球の接着像も観察された。

7日より粘着している血小板数は減少したが、14日においても平滑筋細胞間などに血小板の付着が観察された。一方、P群は14日における内腔面はすでに増殖平滑筋により偽内皮化されており、血小板の付着も減少していた。抗P-セレクチン抗体投与による治療は、バルーン障害後の血管リモデリングを抑制した。これらの機序として抗P-セレクチン抗体が活性化血小板に発現したP-セレクチンを介した白血球の動員抑制し、また、障害内膜面における増殖平滑筋による偽内皮化を促進し、血小板の付着を減少させたことが示唆された。動脈硬化および経皮経管冠動脈形成術(PTCA)後再狭窄の発症・進展の機序として、内膜肥厚に加えて血管の病的リモデリングが強く関与し、その発生過程における血管壁の炎症が重要視されている。今年度、第一に血管壁、特に血管外膜側の炎症に注目し、炎症細胞に発現する接着因子P-セレクチンの役割をラット頚動脈バルーン傷害モデルを用いて検討した。P-セレクチンは、内皮細胞が剥離された後の内皮下組織に粘着・凝集した活性化血小板に強く発現し、外膜側の小血管内皮細胞にも傷害後7日目まで強く発現し、外膜側への高度の白血球浸潤を伴っていた。障害後8日目における傷害血管壁へのCD45陽性細胞の浸潤率は高度な順に、外膜、新生内膜、中膜であり、抗P-セレクチン抗体投与によって、炎症細胞浸潤はそのいずれの血管壁においても有意に抑制(外膜:64.9%抑制、新生内膜:85.0%抑制、中膜:78.1%抑制)されていた。P-セレクチンはその発現様式からバルーン傷害後の血管壁の炎症過程において、傷害内腔面だけでなく外膜側からも関与していることが明らかとなった。さらに、臨床的に使用されているnon-compliant ballonカテーテルの効果を検討したところ、傷害後の血管壁の炎症、内膜肥厚の進展は上記のCompliant balloonによるものに比し若干弱いものの同様の進展様式を取ることが示された。第二に傷害血管における血管収縮弛緩反応の変化を薬理学的手法で検討した。ラット頚動脈バルーン傷害後2週間目に摘出した頚動脈の壁張力を記録しながら血管作動性生理活性物質を投与した。基本的な収縮力は障害血管では有意に低下していたが、血管作動性物質の反応性には有意の差を認めなかった。弛緩反応においては最大弛緩反応が傷害血管で低下していたが、弛緩反応を誘起する物質間での反応性の差異は明らかでなかった。
CSK類似chkチロシンキナーゼによる細胞増殖制御機構の解析

Src型チロシンキナーゼの酵素活性は、増殖因子などの刺激によって一過性の活性上昇を起こし、C-terminal Srckinase(Csk)により抑制的に調節される。発癌遺伝子産物として知られているSrc型キナーゼの変異体は、抑制調節を全く受けずに恒常的活性化を示す。Src型キナーゼとその活性制御機構は多細胞生物特有である。ヒトなどの哺乳動物細胞でのSrc型キナーゼの機能を研究することは、制癌においてとても重要である。我々は、Cskhomologous kinase(Chk)がCskとファミリーを形成すること、膜結合型Chkを介したLynキナーゼ選択的Src型キナーゼ制御機構の存在を明らかにしてきた。本研究では、Chkを恒常的過剰発現したKMT-2血液系細胞で見られる増殖の遅延・多核化を調べるために、生きたままの分裂期の細胞を微分干渉光学系顕微鏡下で経時的に観察した。染色体整列が不完全である細胞が多く見られた。さらに、多数の不均衡染色体分配を起こしたときに、疑似細胞質分裂を経由した細胞質分裂不全が誘発され、細胞の多核化形成の決定的瞬間を初めて観察することができた。Src型キナーゼLyn・pp64およびChk・Cskが分裂期染色体と分裂期紡錘糸に強固に会合していた。Chk過剰発現によりLynの自己リン酸化の減少を伴うpp64のチロシンリン酸化の亢進が見られ、紡錘糸の形成ががなり抑制されていた。Src型キナーゼとその調節因子が分裂期染色体の動態に重要な役割をもつものと考えられる。したがって、染色体と紡錘糸上に存在するSrc型キナーゼとその制御機構の平衡の傾きによるチロシンリン酸化の変動が、紡錘糸形成を通して染色体の動態に影響を与えている可能性が考えられる。
脂質輸送機構を介したアルボウイルスの節足動物内輸送と垂直感染機構の解明

(遺伝子ノックダウン用のdsRNAの合成)蚊は最も遺伝子解析が進んでいるネッタイシマカを使用する事とした。ネッタイシマカの脂質輸送蛋白質関連因子として、8遺伝子を選出した。これらに対する2本鎖RNA (dsRNA)の合成に加えて、ノックダウンにより形質変化を示す事が報告されているorphan nuclear receptor HR3遺伝子のdsRNAを人工的に合成した。(培養細胞を用いた遺伝子ノックダウン実験)ネッタイシマカ由来の培養細胞(ATC-10)を用いて、遺伝子のノックダウン実験を行なった。上記8遺伝子の中、ATP合成酵素βサブユニット遺伝子のみACT-10細胞内でも安定して発現している事が明らかとなった。上記で作成したATP合成酵素βサブユニット遺伝子のdsRNAをATC-10細胞に遺伝子導入した。陰性対照としてGFPのdsRNAをトランスフェクションした。ATP合成酵素βサブユニット遺伝子の遺伝子発現をリアルタイムPCRで解析した所、陰性対照と比べて1/4に減少している事が確認された。これにより、dsRNAはノックダウンを行う機能を有する事が示された。(生体への蚊のノックダウン実験)蚊の胸部にdsRNAを注入し、接種後3日の蚊を解析した。一部のヴィテロジェニン遺伝子は吸血後でのみ発現が誘導されるため、ヴィテロジェニン解析群ではdsRNA接種後24時間の蚊に吸血させた。dsRNA接種後24時間の蚊を観察した所、飛行能力が低下し、衰弱している様子が認められた。実験終了後まで生存していた蚊からRNAを抽出し、定量PCRを用いて解析を行なった所、標的遺伝子がノックダウンしている事を確認する事ができた。今後、脂質輸送蛋白質をノックダウンした蚊にウイルスを感染させ、更なる解析を進める予定である。遅延の理由として以下の2点が挙げられる。1点目は北海道大学から岐阜大学に研究の場を移したため、研究環境を整えるのに時間を必要とした。また、2点目として岐阜大学は大規模改修中であり、引っ越し作業により実験が行えない期間があった。しかし、共同研究者の保有するネッタイシマカの遺伝子発現状態を解析し、遺伝子のノックダウンには成功しており、感染実験を進める準備は完了している。脂質輸送蛋白質をノックダウンしたネッタイシマカにウイルスを感染させ、ネッタイシマカ内のウイルス分布を解析する事で、脂質輸送で重要な輸送蛋白質を推定する。また、上記の結果をもとに、特定の脂質輸送蛋白質を蚊に由来する培養細胞で発現させ、ウイルスとの結合を免疫沈降で解析することで、ウイルスの輸送に重要となる脂質輸送蛋白質を特定する。蚊に蛍光色素を付加した脂質輸送蛋白質を注入し、その後、ウイルスを感染させる。ウイルス結合脂質輸送蛋白質が生殖細胞に局在する脂質輸送蛋白質の受容体に結合するか組織学的に解析する。ウイルス結合脂質輸送蛋白質が脂質輸送蛋白質の受容体に結合しているかを明らかにする。上記で明らかになった脂質輸送受容体を阻害する抗体を蚊に注射し、ウイルスの垂直感染率の変化を解析する。脂質輸送受容体のウイルス垂直感染における役割を明らかにする。

また、上記の結果をもとに、特定の脂質輸送蛋白質を蚊に由来する培養細胞で発現させ、ウイルスとの結合を免疫沈降で解析することで、ウイルスの輸送に重要となる脂質輸送蛋白質を特定する。蚊に蛍光色素を付加した脂質輸送蛋白質を注入し、その後、ウイルスを感染させる。ウイルス結合脂質輸送蛋白質が生殖細胞に局在する脂質輸送蛋白質の受容体に結合するか組織学的に解析する。ウイルス結合脂質輸送蛋白質が脂質輸送蛋白質の受容体に結合しているかを明らかにする。上記で明らかになった脂質輸送受容体を阻害する抗体を蚊に注射し、ウイルスの垂直感染率の変化を解析する。脂質輸送受容体のウイルス垂直感染における役割を明らかにする。実験の遅延のため支出を一部繰り越すこととなった。遅延の理由として1点目は北海道大学から岐阜大学に研究の場を移したため、研究環境を整えるのに時間を必要とした。また、2点目として岐阜大学は大規模改修中であり、引っ越し作業により実験が行えない期間があったためである。次年度は本格的に感染実験を始めるため、今年度使用予定であった実験器具や遺伝子・蛋白質解析試薬が必要になると考えられる。
諸科学に現れる数理科学的手法の研究

数学がどのように数理科学に用いられているかを調査する一つの方法として,世界数学者会議の講演の題目と,国際工業数学応用数学会議の講演の題目を比較対照する作業から始めてみることが必要である。そこから,数学がどのように諸科学に用いられているかをうかがうことができる。これ自体,相当な作業をともなうため未着手である。本年度はこの研究の準備のための連絡のために費用を用いた。また,基本的な問題として,数学と数理科学がどう異なるのか?という問題があり,研究者により,数学=数理科学と思っている人も多い。そこで、このことについて徹底的に討論するために,平成7年8月に一泊二日をもちいて合宿して討論を行った。問題提起として,研上淳、薩摩順吉,砂田利一,西浦廉政,藤田宏の8名,計16名が参加して活発な討論となった。この結果は別に冊子の一部として発表される。その議論の内容の一部を紹介すれば,数学=数理科学の論をされる論者は,「本来数学はギリシャ以来,種々の応用に関心を持ち,その問題を解いてきた。ただ,20世紀の数学のみが特殊になって,純粋数学の中に閉じてしまったのである。」という意見であり,数理科学を数学と区別したい論者は,「20世紀の現実を踏まえ,本来の数学にかえすためには,数理科学を特に強調すべきだ。」というのである。どちらも,20世紀の数学に対する反省は一致している。」というのである。
多能性幹細胞の分化抵抗性における核小体の役割解明

1.研究の目的マウスES細胞は、細胞集団中の一つ一つの細胞がその未分化性や分化多能性を一様に示しているわけではなく、多様性を持った集団である。なぜ、同じ培養条件下の同じ細胞集団の中に多様な性質の細胞が存在するのか、また個々の細胞はその亜集団間を遷移するが、どのような分子メカニズムが関与するのかはわかっていない。本研究では、より未分化なマウスES細胞に発現している転写因子Nanog及びRex1を指標として用い、マウスES細胞の中に亜集団が存在することのメカニズムを明らかにしようと試みた。2.平成30年度に行ったこと主にNanog-GFPマウスES細胞について、LIF受容体とヘテロダイマーを形成するgp130タンパク質の変位株を樹立した。この細胞株はLIF下流のErkシグナルが遮断されていると考えられる。まずNanog-GFP強度をFACSで測定した。通常の培養条件ではNanog陽性細胞とNanog陰性細胞の二つの亜集団が現れるが、gp130変異株ではNanog陽性細胞の亜集団しか現れなかった。さらに、GFP強度が野生型の細胞のNanog陽性細胞よりも高くなっていた。この現象はMEK阻害剤を添加して培養した細胞と同様であった。gp130変異によりLIF/STATシグナルからのErkシグナルが消失したことが、Nanog陰性細胞の消失の原因であると考えられる。このことから我々の仮定「LIF/STATシグナルからのErkシグナルが、細胞がすぐに分化するための状態(= primed)に移行するために必要である」を支持する結果が得られたと考えられる。Nanog陰性細胞が全く消失していることから、FGF由来のErkシグナルがNanog陰性細胞の出現に関与していないことが示唆される。これは、胚発生とES細胞における未分化生維持及び分化誘導のメカニズムでの大きな違いとして考えられる。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。培養皿中のES細胞集団は、その大きな特徴である「未分化性」と「分化多能性」にばらつきを持って存在している。in vivoの発生においては、ES細胞の元であるICMはFGFなどのシグナルに応じて分化する。しかしながら、ES細胞はvivoの発生を模してプロトコルによって分化誘導しても、すべての細胞が目的細胞に分化するわけではない。そのため、未分化性と自己増殖能を保った細胞は増殖し続けて腫瘍になってしまう。このような分化シグナルへの応答性の相違は、培養皿中のES細胞が不均一であるために引き起こされると考えられる。そこで、どのような点においてES細胞集団の不均一なのか明らかにするために、以下の検討を行った。(1)まずES細胞の未分化マーカーであるNanog遺伝子の転写活性の違いによって細胞を2群に分け、マイクロアレイの解析およびシグナル伝達物質の発現量の検討を行った。その結果、より未分化なES細胞では、これまで分化に必要であると考えられてきたErkシグナルがより強く、またErkシグナルにより転写を制御される遺伝子群にも差が見られた。(2)上記(1)よりNanog陽性細胞において、Erkシグナルの亢進、およびその制御を受ける遺伝子発現の増加が見られたため、このシグナルを遮断することで、Nanog遺伝子の発現にどのような影響が見られるかを検討した。(3)Nanog遺伝子の発現量により、細胞の増殖速度や細胞周期に差があるか検討した。研究実績の意義Erkシグナルは、初期胚においてFGFにより活性化されてその後の分化誘導に寄与することが明らかにされている。しかしながら、我々が見出したErkシグナルがより未分化なES細胞において亢進しているという発見は、これまで考えられてきたErkの役割とは一線を画すものである。なぜES細胞は細胞集団内で多様性を持っているのか、その分子メカニズムは解明されていない。また、ES細胞は細胞集団中の亜集団がそれぞれ固定されているのではなく、個々の細胞におけるNanogやRex1など一部の未分化マーカー遺伝子の発現が変動することが知られている。このような、細胞の未分化性の遷移についても、なぜ起こるのか、その分子メカニズムは分かっていない。我々の発見した、Erkシグナルがより未分化な細胞で亢進しているという現象は従来から考えられているErkの役割から外れている。しかしながら、細胞の未分化性の遷移が起こる原因として、Erkシグナルが必要となるのかもしれない。というのは、Erkの上流因子MEKの阻害剤を培地中に加えると、ES細胞の不均一性がなくなるためである。Erkのシグナルが細胞内で揺らぐことにより、ES細胞の亜集団間の遷移が起きていることが仮説として考えられる。また、なぜErkシグナルがより未分化な細胞で高い活性を示しているのか、その分子メカニズムを明らかにする必要がある。我々が現在考えているのは、より未分化な細胞ではLIFシグナルが亢進しているため、その下流シグナルの一つであるErkも活性化されるという仮説である。これについては、LIFR(LIF受容体)のmRNA発現量がより未分化な細胞では亢進していることから考えられる。しかしながら、より未分化な細胞の状態にErkシグナルの亢進が必須なのか不必要なのかは、これから解明する課題である。研究の大目的マウスES細胞は、細胞集団中の一つ一つの細胞がその未分化性や分化多能性を一様に持っているわけではなく、多様性(heterogeneity)を持った集団である。

なぜ一つの細胞集団の中に多様な性質の細胞が存在するのか、また個々の細胞はその亜集団(subpopulation)間を遷移するが、何が引き金となるのか、どのような分子メカニズムが関与するのかはわかっていない。本研究では、より未分化なマウスES細胞に発現している転写因子NanogおよびRex1を指標として用い、マウスES細胞の中に亜集団が存在することのメカニズムを解明しようと試みる。平成29年度に目指したことNanog遺伝子座もしくは、Rex1遺伝子座にGFP cDNAを導入したNanog-GFPマウスES細胞、およびRex1-GFPマウスES細胞を用いて研究を行なっている。それぞれの細胞株をLIF/FBS添加の条件で培養すると、GFP陽性細胞(= Nanog or Rex1陽性細胞)とGFP陰性細胞(= Nanog or Rex1陰性細胞)の亜集団が存在する。このことから、Nanog、Rex1遺伝子を発現している細胞と発現していない細胞が存在し、細胞集団中の多様性を示す指標とできる。前年度までの研究から、GFP陽性細胞においてはLIF/STATシグナルが亢進していることがわかった。また、LIFシグナルの下流の一つであるERKシグナルも、GFP陽性細胞において亢進していた。このERKについての実験結果は、ERKがマウスES細胞の分化促進に寄与するという従来の知見と異なるため、さらに詳しくERKシグナルがNanogもしくはRex1陽性細胞においてどのような機能を果たしているのか、明らかにすることを目的とした。マウスES細胞の未分化性を維持する因子であるLIF (Leukemia Inhibitory Factor)は細胞膜上の受容体LIFRとgp130の複合体に結合し、下流のSTAT3、ERK、Aktへシグナルを伝える。STAT3はマウスES細胞の未分化性維持に必須の因子であることが報告されている。一方、ERKシグナルはマウスES細胞が分化する際に必要であることが知られている。ES細胞をより未分化なnaive状態にするためにはERK上流のMEK阻害剤、またGSK阻害剤を加える。しかし近年、ERKシグナルはマウスES細胞を未分化な状態での長期的な培養に必須であることが報告された。我々の先行研究で、培養皿中のES細胞の中でより未分化な集団でより強くリン酸化されているという、これまでの報告とは真逆の結果を得ている。そこで、LIFシグナル下のSTAT3にのみシグナル伝達を行うよう改変したgp130 Y757F変異体のみを発現する変異株マウスES細胞をCRISPR技術を用いて樹立し、ERKおよびAktシグナルがマウスES細胞集団の多様性にどのように関与しているのか、検討することにした。一般的に変異のドナーとなるDNAはssODN (single strand oligodeoxynucleotide)としてコトランスフェクションするプロトコルが報告されているが、その方法では変異体を得ることができなかった。そこで、gRNAおよびCas9発現プラスミドと標的となる変異を入れたドナープラスミドをコトランスフェクションし、変異株の樹立を試みた。