hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
リアルタイム・ミクロエリア・マーケティング支援システム開発の基礎的研究

当研究は、地理情報システム(GIS)を利用したリアルタイム・ミクロエリア・マーケティング支援システムの開発を目指して進めている.具体的には会員制スポーツクラブの協力を得て,同社が所有しているコンピュータを用いた会員管理および入退館管理システムのログデータを借用することで,本研究における事例研究にあてている.会員制スポーツクラブはあらゆる日時における利用率を安定的に高めることが求められる点で一般の商業施設とは異なる特性を有する.まず同社の東京都調布市にある店舗の,1999年5月9月にわたる期間の入会,退会,在会,休会者各データ,および秒単位の入退館データを入手し,当該店舗の利用客が集中する4市1区のGISデータを整備して分析を進めた.分析結果は適宜スポーツクラブ担当者と協議し,当事者の実感による裏付けをとることを重視した.本年度はひとつは入退館ログデータの統計分析を進め,入退館者データの分析から,早朝利用の高齢者,日中,長時間利用の主婦層,夜間・休日利用の勤め帰り層の3種の利用パターンが存在することを確認し,それぞれ滞在時間や居住地分布などの属性に各々異なる特徴があることを明らかにした.この結果については地理情報システム学会大会において発表した.もうひとつは,上記ログデータの情報不足を補うため,当該店舗店頭にて1週間にわたるアンケート調査を実施した.ここではとくに来館前後の出発地,帰着地のデータを集めることを目指した.これによって郊外型店舗特有の仕事帰り利用客の行動(生活)パターンの一端が明らかになった.また館内施設の利用行動なども同アンケートによって得ているが,この解析は今後の課題である.当研究は、地理情報システム(GIS)を利用したリアルタイム・ミクロエリア・マーケティング支援システムの開発を目指して進めている.具体的には会員制スポーツクラブの協力を得て,同社が所有しているコンピュータを用いた会員管理および入退館管理システムのログデータを借用することで,本研究における事例研究にあてている.会員制スポーツクラブはあらゆる日時における利用率を安定的に高めることが求められる点で一般の商業施設とは異なる特性を有する.まず同社の東京都調布市にある店舗の,1999年5月9月にわたる期間の入会,退会,在会,休会者各データ,および秒単位の入退館データを入手し,当該店舗の利用客が集中する4市1区のGISデータを整備して分析を進めた.分析結果は適宜スポーツクラブ担当者と協議し,当事者の実感による裏付けをとることを重視した.本年度はひとつは入退館ログデータの統計分析を進め,入退館者データの分析から,早朝利用の高齢者,日中,長時間利用の主婦層,夜間・休日利用の勤め帰り層の3種の利用パターンが存在することを確認し,それぞれ滞在時間や居住地分布などの属性に各々異なる特徴があることを明らかにした.この結果については地理情報システム学会大会において発表した.もうひとつは,上記ログデータの情報不足を補うため,当該店舗店頭にて1週間にわたるアンケート調査を実施した.ここではとくに来館前後の出発地,帰着地のデータを集めることを目指した.これによって郊外型店舗特有の仕事帰り利用客の行動(生活)パターンの一端が明らかになった.また館内施設の利用行動なども同アンケートによって得ているが,この解析は今後の課題である.地理情報システム(GIS)を利用したリアルタイム・ミクロエリア・マーケティング支援システムの開発を目指し,まずは会員制スポーツクラブの協力を取り付けることに成功した.同社コンピュータを用いた会員管理および入退館管理システムを導入しているので,このログデータを借用することにより,本研究における事例研究にあてることとした.会員制スポーツクラブはあらゆる日時における利用率を安定的に高めることが求められる点で研究が進んでいる一般の商店とは異なる特性を有する.同社のうち東京都調布市にある店舗の,1999年5月9月にわたる期間の入会,退会,在会,休会者各データ,および秒単位の入退館データを入手し,当該店舗の利用客が集中する4市1区のGISデータを整備して今後の本格的分析に備えると共に,本年度はまず統計処理により,それらがどのような特性をもつかの基礎分析をおこなった.分析結果は適宜スポーツクラブ担当者と協議し,当事者の実感による裏付けをとった.本年度は当該データについて非空間的な統計分析をおこなったが,入会者数がキャンペーン活動に大きな影響を受けること,退会しやすい在館期間が周期的に存在することが認められた.また入退館者データの分析からは,早期利用の高齢者,日中,長時間利用の主婦層,夜間・休日利用の勤め帰り層の3種の利用パターンが存在することが確認され,それぞれ滞在時間や居住地分布などの属性に各々異なる特徴があることが明らかになった.地理情報システム(GIS)を利用したリアルタイム・ミクロエリア・マーケティング支援システムの開発を目指した研究を進めている.は会員制スポーツクラブの協力を得て,同社が所有しているコンピュータを用いた会員管理および入退館管理システムのログデータを借用することで,本研究における事例研究にあてている.会員制スポーツクラブはあらゆる日時における利用率を安定的に高めることが求められる点で一般の商業施設とは異なる特性を有する.まず同社の東京都調布市にある店舗の,1999年5月9月にわたる期間の入会,退会,在会,休会者各データ,および秒単位の入退館データを入手し,当該店舗の利用客が集中する

4市1区のGISデータを整備して分析を進めた.分析結果は適宜スポーツクラブ担当者と協議し,当事者の実感による裏付けをとることを重視した.本年度はひとつは入退館ログデータの統計分析を進め,入退館者データの分析から,早朝利用の高齢者,日中,長時間利用の主婦層,夜間・休日利用の勤め帰り層の3種の利用パターンが存在することを確認し,それぞれ滞在時間や居住地分布などの属性に各々異なる特徴があることを明らかにした.この結果については地理情報システム学会大会において発表した.もうひとつは,上記ログデータの情報不足を補うため,当該店舗店頭にて1週間にわたるアンケート調査を実施した.ここではとくに来館前後の出発地,帰着地のデータを集めることを目指した.これによって郊外型店舗特有の仕事帰り利用客の行動(生活)パターンの一端が明らかになった.また館内施設の利用行動なども同アンケートによって得ているが,この解析は今後の課題である.
嚥下困難者及び嚥下障害患者における医薬品の至適投与法の確立

申請者は、これまでの研究によって、嚥下困難者や嚥下障害患者に汎用されているとろみ調整食品で医薬品を内服した場合、薬効が減弱してしまう医療上の深刻な問題を発見した。そのため、本研究では、介護保険施設に入居している嚥下困難者及び病院に入院している嚥下障害患者におけるとろみ調整食品を使用した医薬品の服薬方法の実態を明らかにするとともに、薬物動態に影響しない新たな服薬補助製品を開発し、嚥下困難者や嚥下障害患者に対する医薬品の至適投与法を確立する。
ケイ素-酸素結合を持つ巨大シリケートクラスターの探索

昨年度は、三官能性長鎖アルキルトリアルコキシシランの加水分解・重縮合による無機有機層状組織体の合成を行い、両親媒性分子の自己組織化能を利用した二次元平面内でのSi-Oネットワーク形成を明らかにした。本年度は、Si-O結合を有する巨大クラスター合成の探索として、長鎖アルキルトリアルコキシシランの加水分解・重縮合過程に於いて、四官能性アルコキシシランを共存させたSi-Oネットワーク形成を検討し、無機有機層状組織体の生成およびその薄膜化に成功した。これは組織体内でのSi-O結合様式の多様化の試みであると同時に、形態制御の達成は、本物質系を機能性分子の固定化媒体と捉えた際のデバイス化への展開として興味深い。本研究では、長鎖アルキルトリメトキシシラン(C_nTMS;n7=6-18)とテトラメトキシシラン(TMOS)をテトラヒドロフラン/水混合溶媒中でHCl酸性条件下、室温で共加水分解・共重合させることで、出発ゾル溶液を調製し、ガラス基板上にスピンコート、乾燥させることで、層状組織体薄膜を得た。TMOS/CnTMS=4とし、薄膜調製を行った結果、n=6-10で透明性、高秩序性を有する層状組織体薄膜(膜厚約0.8μm)が得られた。得られた薄膜から粉末状の試料を作成し、^<29>SiMASNMR測定を行った結果、様々なSi環境を有するシロキサンネットワークの形成が示された。得られた薄膜のXRD測定から、最低角ピークのd値はC_nTMSのアルキル鎖長に依存して変化し、シリケート層(厚み1.6nm)の繰り返し間隔制御も可能であった。また、TMOS/C_<12>TMS比を4から10の範囲で変化させた結果、TMOS添加量の増大に伴い、d値の増大が観察され、シリケート層の厚みが増大していることが推測された。以上の結果から、本物質系でのゾルゲル法による無機有機層状組織体の形態及び構造制御が示された。本年度は物質系の探索に主眼をおき、種々の反応系の調査を行った。その結果、Si-O結合を有する巨大クラスター合成の一環として、長鎖アルキルトリアルコキシシランの加水分解と重縮合による無機有機層状組織体の合成に成功した。これは無機-有機双方の性質を利用した材料設計の新しいアプローチとしても興味深い。本研究は、炭素数1218の直鎖アルキル基を有するアルキルトリエトキシシラン(CnTE S;n=1218)を出発物質とし、極性溶媒中における加水分解・・縮重合反応生成物について検討した。反応はエタノール、水、および塩酸の混合溶液中に長鎖アルキルアルコキシシランを滴下した。得られた沈殿をろ別後、乾燥することにより白色粉末状の試料を得た。水のモル比が一定の値以上のときXRDパターンの低角度領域(2θ=220°)にいくつかの回折ピークが出現した。これはアルキル鎖の疎水相互作用に基ずく分子集合が秩序構造形成の駆動力となっていることを示している。各生成物のXRDパターンは層状構造に起因するものであり、最低角ピークのd値が層の繰り返し周期を示すと解釈できた。またアルキル鎖は垂直配向の二分子層を形成していると考えられた。29Si NMRスペクトルにより加水分解・縮重合反応の進行によるシロキサン骨格の形成、および縮合反応に関与しないシラノール基の存在が確認された。得られた生成物はその構造上、二次元平面内でシロキサン骨格を構成していると推定される。反応溶液中に生成した沈殿がシラントリオールの凝集体であり、乾燥過程における固相重合により高分子化が進行することがわかった。

また、TMOS/C_<12>TMS比を4から10の範囲で変化させた結果、TMOS添加量の増大に伴い、d値の増大が観察され、シリケート層の厚みが増大していることが推測された。以上の結果から、本物質系でのゾルゲル法による無機有機層状組織体の形態及び構造制御が示された。
ADF/Thioredoxinの再潅流障害抑制効果および心筋保護効果に関する研究

【結果】再灌流早期の心室細動発生率はコントロール群75%、SOD群43%、ADF-I群67%、ADF-II群8%、ADF-III群33%であった。全再灌流では83%、79%、83%、25%、50%であった。SOD群は早期の発生率を減少させるが有意でなく全再灌流ではコントロール群と同じになった。ADFはADF-II群で早期、全再灌流を通じて有意に心室細動発生率を抑制した。洞調律維持時間はADF-II群で有意に良かった。心室細動発生までの時間を比較するとSOD群は162±118秒とコントロール群の66±38秒に比べて有意に延長した。【考察】SODは、心室細動抑制効果は認められなかったが、ADFはADF-II群で最もよく不整脈を抑制した。ADFの至適濃度は0.1mmol/l付近にあると考えられた。
腐食環境を考慮可能な時空間統計モデルを用いた構造物の経年劣化シミュレータの開発

本研究では,様々な腐食環境を考慮可能な実用に耐えうる構造物の経年劣化シミュレータを開発することを目的とした.そのために,構造物の各部材・部位における経時的な腐食挙動と腐食環境の相関関係を定量化した.その関係を過去に構築した時空間統計モデルに導入することで,腐食環境を考慮できる新しい時空間統計モデルを構築した.本研究では,様々な腐食環境を考慮可能な実用に耐えうる構造物の経年劣化シミュレータを開発することを目的とした.そのために,構造物の各部材・部位における経時的な腐食挙動と腐食環境の相関関係を定量化した.その関係を過去に構築した時空間統計モデルに導入することで,腐食環境を考慮できる新しい時空間統計モデルを構築した.本研究では,様々な腐食環境を考慮可能な実用に耐えうる構造物の経年劣化シミュレータを開発することを目的とする.そのために,構造物の各部材・部位における経時的な腐食挙動と腐食環境の相関関係を定量化する.その関係を過去に構築した時空間統計モデルに導入することで,腐食環境を考慮できる新しい時空間統計モデルを構築する.また,シミュレータを構造物の整備・維持管理へ適用する方法についても検討する.平成20年度には,経時的な腐食挙動の空間統計量と腐食環境の相関関係の定式化を目的として,以下を行った.(1)大気暴露環境における経時的な腐食挙動の時空間統計量の把握実施中の大気暴露試験(沖縄(海岸部))と追加実施する暴露試験(福岡(内陸部))から得られる部位・部材モデルの腐食試験体を時空間統計解析する.この結果から,経時的な腐食挙動の時空間統計量を明らかにした.(2)センサ出力を用いた腐食環境評価手法の構築様々な部位・部材モデルの大気暴露試験から得られるセンサ(腐食電流,温・湿度)の常時モニタリング出力を解析した.この解析結果に基づき,環境パラメータ(塩化物,温渡,湿度,降雨,結露)から腐食環境を評価する手法を構築した.ここでは,センサの出力特性の解釈や腐食電流の分析に際して,電気化学や金属表面工学などの分野について高度な専門知識が必要になるため,分担者(本センサの開発者)が担当した.本研究では,様々な腐食環境を考慮可能な実用に耐えうる構造物の経年劣化シミュレータを開発することを目的とする.そのために,構造物の各部材・部位における経時的な腐食挙動と腐食環境の相関関係を定量化する.その関係を過去に構築した時空間統計モデルに導入することで,腐食環境を考慮できる新しい時空間統計モデルを構築する.また,シミュレータを構造物の整備・維持管理へ適用する方法についても検討する.平成21年度には,腐食環境を導入可能な時空間統計モデルの構築を目的として,以下を行った.(1)様々な腐食環境における時空間統計モデルの構築代表者が既往の研究で構築した時空間統計モデルに平成20年度の研究成果を導入することで,様々な腐食環境を考慮可能な腐食劣化の時空間統計モデルを構築した.(2)実構造部材の腐食環境と腐食挙動の調査実構造物の各部材・部位における腐食環境と腐食挙動を明らかにするため,実構造物でミクロ腐食環境と腐食挙動を調査した.また,腐食挙動については,さびの膜厚,腐食組成分析や腐食表面性状など対象とした調査を実施した.現在も対象部材を増やすことで,調査を継続実施している.(3)時空間統計モデルの妥当性の検証(2)の調査結果から得られた基礎データに基づき,実構造物における各構造部材・部位のミクロ腐食環境と腐食挙動の相関関係を定量的に明らかにした.この関係を用いて,(1)で構築した腐食環境を考慮可能な時空間統計モデルの妥当性を検証した.本研究では,様々な腐食環境を考慮可能な実用に耐えうる構造物の経年劣化シミュレータを開発することを目的とする.そのために,構造物の各部材・部位における経時的な腐食挙動と腐食環境の相関関係を定量化する.その関係を過去に構築した時空間統計モデルに導入することで,腐食環境を考慮できる新しい時空間統計モデルを構築する.また,シミュレータを構造物の整備・維持管理へ適用する方法についても検討する平成22年度には,腐食環境を導入可能な時空間統計モデルを用いたシミュレーション手法の提案を目的として,以下を行った(1)実構造部材の腐食環境と腐食挙動の相関評価既往の研究で実施している大気暴露試験結果,および平成21年度に実施した実構造物の各部材・部位における腐食環境と腐食挙動の調査結果に基づき,腐食環境と腐食挙動の相関評価を行った.その結果から,実構造物のミクロ腐食環境と腐食表面性状の関係を空間統計学的手法により定量的に明らかにした.これにより,平成21年度で構築した時空間統計モデルを高精度化した(2)時空間統計モデルを用いた経時腐食表面性状のシミュレーション手法(1)の時空間統計モデルを用いて,様々な腐食環境における鋼構造物の部位・部材レベルのミクロ腐食環境から塗膜劣化後の経時腐食挙動を評価・予測することを可能とした数値シミュレーション手法を提案した(3)本シミュレーション手法の妥当性の検証腐食損傷した実構造物の腐食部材の表面性状を分析し,その分析結果を本シミュレーションにより推定した腐食表面性状と比較・検討した.この結果から,本シミュレーションの妥当性を確認した
大学院教育における教員－学生関係の社会学的研究：ハラスメントと不正行為の事例から

本年度は、125年度末に発表した単著書籍(2425年度の成果の一部をまとめた和書)の内容を足掛かりに、特に理論レベル(ジェンダー理論と方法論)の再考、見直しを行う作業と、補足的なインタビュー調査を進めるとともに、2自然科学系の学際的プロジェクトにおけるフィールドワーク調査も行った。まず、1については、前年度に和書で発表した内容の一部を、海外学会で発表した。特に方法論やジェンダー理論については、国内で受けた批判を踏まえて海外の関連研究者との議論につなげることができた。インタビュー調査については、対象者との連絡継続が難しくなり調査を休止せざるを得ない場面があった。だが、問いを発表倫理に関する一般的項目のみに限定した上で、分析を進めた。また、これまでの考察を関連する共同研究で得られたデータとあわせて検討し直すことで、英文論文(査読付き)として発表した。2については、自然科学系研究所および関連する研究室でのフィールドワークを行った。特に若手研究者に焦点を絞ったインタビュー調査を行い、異なる領域に所属する研究者間での学際的コミュニケーションにおいてギャップが生じるプロセスについて暫定的な仮説をまとめ、国内学会で報告した。学会報告では、仮説構築の背景となる理論枠組みの問題点などあらたな課題も指摘され、年度内の論文発表までは至らなかったものの、この成果をもとに今後議論を精緻化できる見通しである。また、研究発表倫理一般に関する議論について雑誌『教育』への論文寄稿を行ったほか、関連学会やハラスメント被害救済団体等での講演などを通じて、研究成果をより広い領域へも伝えることができた。26年度が最終年度であるため、記入しない。本研究の目的は、研究室教育の指導関係で生じる不正行為とハラスメントの連関に、ライフストーリー法を軸とした多様な研究法を組み合わせて接近することで、「教員一学生間の不可視化された協働ワーク」の過程・背景を広義のジェンダー研究の視点から読み解く研究である。この目的を達成するため、24年度は調査に関わる作業を中心に、理論に関わる作業も並行して行った。まず、前年度に共同研究(定量調査)において取得したデータを、本研究課題の目的において分析し直した結果、日本の自然科学研究者が、その共著者実践において、英米圏領域における主要な既存調査の結果に比しても顕著な混乱や困難を経験していることが明らかになった。既存の発表倫理研究は、バイオメディカル領域中心に進められていたが、本分析では、発表倫理をめぐる懸念が現場レベルで報告されながら十分な議論が行われてこなかった他の複数領域も射程に入れている点で、重要な意義をもつ。この分析結果を、International Sociological Association会議で報告し(筆頭・査読有)、関連研究者たちとのディスカッションを行うことができた。その結果、共著者実践における混乱を、グローバルな基準とローカルな研究スタイル・文化のせめぎあいとして読み解く議論へと、考察を深めることができた。また、不正行為とハラスメントが交差する問題経験を有するコア・インフォーマントへの聞き取りを複数回行った。これにより、さらに調査を重ねる必要があるが、研究室での人間関係形成の背景となる、グローバル化した研究体制の詳細を読み解くための手がかりを得ることができた。理論にかかわる作業としては、ポスト構造主義のジェンダー理論と経験的データの接合をテーマとした試論を、立教大学ライフストーリー研究会等において報告し、ライフストーリー法を専門とする研究者からのアドバイスを得た。調査に関わる作業としては、ハラスメント関与経験を中心に、当該年度以前から聞き取りを続けてきたインフォーマントへの追加インタビューを重ねた。事例横断分析の結果(ハラスメントの形成過程に関する暫定的仮説)を、学会(国内)で報告した。そこでは、「出来事」ではなく「関係性としてのハラスメント」が形成される過程が、異なる専門領域における語りを通底する経験として見出せることを示した。インタビュー調査から得られた知見を、ポスト構造主義的大学論等の理論的知見と接合する作業も進展した。まず、理論的考察に重点をおいた報告を学会(国外)で報告した。その後、海外学会で得られたコメントなどを反映させた議論を、国内学会(テーマ部会)で報告した。年度末には、昨年度までの研究知見と上記の成果の一部をまとめ、書籍(和書・単著)として刊行した。ハラスメントと不正行為の連関については、共同研究(定量調査〉から得られたデータも踏まえた検討を行うことで、より包括的な考察結果を得ることができた。特に複数著者論文におけるオーサーシップ不正の現状に関しては、昨年度から議論の精緻化を重ねたものを論文投稿し(英文・共著筆頭)、掲載が決定した。論文の中では、日本の自然科学領域において少なくない人々が受け入れている複数著者論文発表の慣習等が、意図せざる不正行為発生とも結びつきうる現状を、英米圏での議論と対照させながら検討した。これは、近年社会的にも関心が高まる不正行為問題とその防止を展望するための、議論の基盤となる成果と言える。また、総合誌への論文寄稿(和文・単著)を通じて、研究成果を大学内外の多様な領域に向けて発信した。

インタビュー調査については、対象者との連絡継続が難しくなり調査を休止せざるを得ない場面があった。だが、問いを発表倫理に関する一般的項目のみに限定した上で、分析を進めた。また、これまでの考察を関連する共同研究で得られたデータとあわせて検討し直すことで、英文論文(査読付き)として発表した。2については、自然科学系研究所および関連する研究室でのフィールドワークを行った。特に若手研究者に焦点を絞ったインタビュー調査を行い、異なる領域に所属する研究者間での学際的コミュニケーションにおいてギャップが生じるプロセスについて暫定的な仮説をまとめ、国内学会で報告した。学会報告では、仮説構築の背景となる理論枠組みの問題点などあらたな課題も指摘され、年度内の論文発表までは至らなかったものの、この成果をもとに今後議論を精緻化できる見通しである。また、研究発表倫理一般に関する議論について雑誌『教育』への論文寄稿を行ったほか、関連学会やハラスメント被害救済団体等での講演などを通じて、研究成果をより広い領域へも伝えることができた。26年度が最終年度であるため、記入しない。国際学会で報告し、専門研究者からペーパーに対するコメントを受けたことで、今年度の主要な目標については達成することができた。学会での議論を受けての再分析と理論部分の大幅な修正が必要となったため、論文発表までを完了することはできなかったが、来年度前半には英文論文として発表の予定である。また、理論検討についても、ライフストーリー法の専門研究者が集まる研究会での報告を行ったことで、今後のデータ分析に繋がる重要なアドバイスを得ることができた。24年度後半のインタビュー調査によって得られたデータからは、当初想定していた論点(共著者問題とデータ修正にかかわる問題経験)以外の問題点、特にグローバル化するチーム研究における「非伝統的学生」(特に非日本人、社会人)に関わる諸論点が浮き上がってきた。この点を受け、今後は当初のコア・インフォーマント・リスト(学生)を見直すとともに、北米圏で蓄積の厚い学生研究のレビューを行うなど、新たな論点に対応した修正を行う必要がある。また理論面でも、高等教育をフィールドとするエスノグラフィー記述一般における位置づけを確認する必要が生じたため、自然科学系に限らず人文社会科学系についても、一部考察の対象として含めるよう計画を修正する。(抄録なし)
PINK1によるミトコンドリアの形態制御と機能調節

ミトコンドリアは細胞の主要なATP産生の場であり,その機能とダイナミックな形態変化の関連は,近年注目されている。私達は線虫と動物細胞を用いて,ミトコンドリアの品質管理を制御するPINK1が1ミトコンドリア形態も制御していること,及び2ネクローシス様の細胞死を引き起こすことを見出した。特に,PINK1による細胞死は既存のメカニズムとは異なる機構で引き起こされており,パーキンソン病におけるドーパミン作動性神経の変性との関連性も興味深い。本研究では線虫と動物細胞を用いて,タンパク質リン酸化酵素であるPINK1のミトコンドリア形態における役割を解析している。本年度は次の点を中心に研究を進めた。1,線虫PINK-1が司るミトコンドリア形態制御機構:線虫PINK-1は,その発現抑制により体壁筋細胞のミトコンドリア形態に異常を引き起こす。しかし,この過程の下流には,既知のPINK1標的因子であるParkin(線虫PDR-1)は必要としないため,RNAiスクリーニングによりこの過程に働く因子を,ミトコンドリア形態を指標に検索した。1次スクリーニングの結果,pink-1の発現抑制と似た表現形を示す遺伝子(rnh-1.0)を1つ見出した。2,PINK1/Parkinを介した新たな細胞死(ネクローシス):ユビキチンリガーであるParkinはPINK1と共に膜電位の低下したミトコンドリアに標的化し外膜タンパク質をユビキチン化することで,特定のミトコンドリアを排除すると考えられている。私達はPINK1の恒常的な活性化によりParkinが常に働き続けることで,細胞死を引き起こすことを見出した。この細胞死は,ミトコンドリアの膜電位を無くす薬剤を添加することでも引き起こされる。また,アポトーシス阻害剤で細胞死が停止しないことから,ネクローシスであると推定できる。この細胞死は,全てのミトコンドリアがPINK1/Parkinにより排斥されることで引き起こされると考えられたが,実際はミトコンドリア排斥に働くオートファジーの因子に依存せず,また死細胞にはミトコンドリアが検出できることから,PINK1/Parkinがミトコンドリアの排斥ではなく別の機構で細胞死を引き起こすことが明らかとなった。1.PINK1/Parkinを介した新たな細胞死(ネクローシス):PINK1とParkin依存性に起きる細胞死は,電子顕微鏡解析から細胞膜が破断したネクローシス様の死であることが明らかとなっていた。本年度は,この細胞死がアポトーシスでないことを確認するため,シトクロムCのミトコンドリアからの遊離,カスパーゼの活性化などの項目を検討し,非アポトーシス性の細胞死であると結論付けた。また,この細胞死は,ミトコンドリア膜電位の消失だけでなく,PINK1の恒常的な活性化においても起こることを明らかにした。その際,PINK1が活性化していればミトコンドリアの膜電位は保たれていても細胞死は起こり,PINK1がこの細胞死のカギとなる分子であった。PINK1を介した細胞死は,Parkin活性とプロテアソーム活性が必須であり,オートファジー活性に依存していなかった。この結果より,PINK1の活性化はミトコンドリアの選択的オートファジーとは別に,細胞死を引き起こすことが明らかとなった。2.PINK1/Parkinを介したミトコンドリア品質管理の新たな制御機構:cAMP/PKA経路がPINK1/Parkinを介したミトコンドリア品質管理を負に制御するため,PKAにリン酸化修飾される基質を探索したところ,ミトコンドリアタンパク質複合体MICOSの2つのサブユニット(MIC60, MIC19)がフォルスコリン処理依存的にリン酸化されることを見出した。さらに,MIC60またはMIC19の発現抑制は,PINK1とParkinの障害ミトコンドリアへの標的化を阻害したことから,cAMP/PKA経路の下流でミトコンドリア品質管理に働く因子としてMIC60とMIC19が強く示唆された。PINK1/Parkinを介した細胞死の分子機構は,オートファジーと異なり,プロテアソームが必須な新たな細胞死であることが分かり,PINK1が細胞の品質管理だけでなく,死をも制御していることが明らかとなった。PINK1/Parkinを介したミトコンドリア品質管理のcAMP/PKA経路による制御機構では,下流で働くと考えられるミトコンドリアタンパク質を同定し,その発現抑制とPINK1/Parkinのミトコンドリア標的化の関連性を示したことで,全体像の大枠が見えてきた。線虫PINK-1が司るミトコンドリア形態制御機構に関わる因子の同定のためのスクリーニングは継続中であり,来年度には完了する予定である。以上の点により,本研究は,当初の計画以上に進展していると考えられる。1.線虫PINK-1が司るミトコンドリア形態制御機構:線虫PINK-1発現抑制は体壁筋細胞のミトコンドリアの形態異常を引き起こし,この過程の下流には,既知のPINK1標的因子であるParkin(線虫PDR-1)を必要としない。この過程に働く因子RNAiスクリーニングにより検索し,pink-1発現抑制と類似した表現形を示す遺伝子rnh-1.0を見出した。

2.PINK1/Parkinを介した新たな細胞死(ネクローシス):恒常的活性化型PINK1が引き起こす細胞死は電子顕微鏡観察からネクローシス様であり,シトクロムCの遊離やカスパーゼの活性化などアポトーシスを示す表現型もなかったため,新たなプログラムされたネクローシスだと結論付けた。この細胞死は,ミトコンドリア膜電位消失とオートファジー活性が必要なく,Parkinのユビキチン化活性とプロテソームが必須であった。そのため,PINK1の恒常的な活性化は,ミトコンドリアの選択的オートファジーとは別にプロテソームに依存した細胞死を引き起こす異なる機構を制御していることが明らかとなった。3.PINK1/Parkinを介したミトコンドリア品質管理の制御機構:cAMP/PKA経路の活性化は,PINK1/Parkinを介したミトコンドリア品質管理を負に制御する。PKAによるリン酸化基質の探索によりミトコンドリアタンパク質複合体MICOSの2つのサブユニット(MIC60, MIC19)を見出した。MIC60/19はフォルスコリン処理でリン酸化され,その発現抑制ではParkinのミトコンドリア標的化を抑圧した。しかし,MIC60のリン酸化修飾はMICOSの主要機能であるクリステ構造形成には影響しなかった。これらの結果は,MIC60/19はミトコンドリア形態維持以外にcAMP/PKA経路と連動してミトコンドリア品質管理を制御することが示された。ミトコンドリアは細胞の主要なATP産生の場であり,その機能とダイナミックな形態変化の関連は,近年注目されている。私達は線虫と動物細胞を用いて,ミトコンドリアの品質管理を制御するPINK1が1ミトコンドリア形態も制御していること,及び2ネクローシス様の細胞死を引き起こすことを見出した。特に,PINK1による細胞死は既存のメカニズムとは異なる機構で引き起こされており,パーキンソン病におけるドーパミン作動性神経の変性との関連性も興味深い。「線虫PINK-1が司るミトコンドリア形態制御機構」については,当初の予定通り,スクリーニングにより候補遺伝子を見出した。予想よりは少ない遺伝子数であったが次の解析を予定通り進める。「PINK1/Parkinを介した新たな細胞死(ネクローシス)」についても計画通り進み,PINK1/Parkinによる細胞死の機構の全容が捉えられるところまで来た。「PINK1のミトコンドリア標的化・安定化機構」については,PINK1には典型的なMTS以外にミトコンドリアに標的化出来る配列があることが分かり,共同研究者とともに論文として報告したが,ミトコンドリア側のマシナリーであるTOM/TIM複合体の詳細な要求性を今後検討する必要がある。「PINK1/Parkinを介したミトコンドリア品質管理の新たな制御機構」では,PKAによる候補のミトコンドリアタンパク質のin vitroリン酸化反応を再構成したので,今後は細胞内での役割を詳細に解析する。最終年度は,線虫PINK-1が司るミトコンドリア形態制御機構に関わる因子の同定を完成させ,また,PINK1のミトコンドリア標的化・安定化機構についても注力して行く。加えて,PINK1/Parkinを介した細胞死の分子機構とミトコンドリア品質管理のcAMP/PKA経路による制御機構については,論文として報告できるように進めていく。分子細胞生物学「線虫PINK-1が司るミトコンドリア形態制御機構」については,スクリーニングで見出したrnh-1.0とpink-1との関連性を検討していく。
Photoswitchを応用した人工感覚器の有効性および安全性の検証

喪失した感覚機能の再建を目指し,外界情報を直接脳や神経に伝える神経刺激法の医療応用に向けた研究が盛んに取り組まれている.近年,光感受性有機化合物による神経細胞への光応答性効果を利用した光学的神経刺激法(photoswitch)が,高密度神経刺激法として提唱されている.しかし,喪失した感覚機能の回復に対する有効性や長期間刺激に対する安全性は十分に検証されていない.本研究では,神経系培養細胞と遊離網膜組織を用いたin vitro評価,および実験動物を用いたin vivo評価により,photoswitchによる光学的神経刺激法の有効性と安全性を検証する.喪失した感覚機能の再建を目指し,外界情報を直接脳や神経に伝える神経刺激法の医療応用に向けた研究が盛んに取り組まれている.近年,光感受性有機化合物による神経細胞への光応答性効果を利用した光学的神経刺激法(photoswitch)が,高密度神経刺激法として提唱されている.しかし,喪失した感覚機能の回復に対する有効性や長期間刺激に対する安全性は十分に検証されていない.本研究では,神経系培養細胞と遊離網膜組織を用いたin vitro評価,および実験動物を用いたin vivo評価により,photoswitchによる光学的神経刺激法の有効性と安全性を検証する.
赤血球凝集現象と流動血液のレオロジー的性質に関する理論的研究

血流が非常に遅くなると赤血球は集合し可逆的な凝集体を形成する。本研究においては、血流におよぼす赤血球凝集体形成とその沈降の効果がモデルを用いて理論的に見積もられ、報告されているいくつかの実験結果と比較された。(1)水平細管を流れる血液の見掛けの粘性率におよぼす凝集体の効果:凝集傾向の程度に応じて二つの流動モデルが提案され、見掛けの粘性率が求められた。(a)凝集力が強い場合の「剛体核モデル」に基づいて、見掛けの粘性率と沈降程度の関係が求められた。この結果は実験結果を良く再現した。また、凝集し沈降して流れたほうが血流抵抗が低くなる場合があることが示唆され、その条件が示された。(b)凝集力が弱い場合の「二流体モデル」に基づいて見掛けの粘性率が求められた。その結果、沈降程度の大きい領域においては見掛けの粘性率は沈降程度の増加とともに増大し、その振る舞いは実験結果を良く再現した。(2)細管内赤血球濃度におよぼす凝集体の効果:水平細管内に、ある瞬間滞在する血液中の赤血球濃度と沈降程度の関係が上記二つのモデルを用いて求められ、実験との比較から赤血球濃度のずり速度依存性が定量的に求められた。その結果、低ずり速度領域では細管内濃度は流出した血液中の赤血球濃度より高くなることが示唆された。(3)凝集体形成の過渡現象:赤血球凝集体の形成過程に対する運動論的モデルが提案され、凝集体の大きさが時間の関数として求められ、赤血球の平均速度が時間の関数として求められた。凝集体形成初期を除けば、求められた結果は定性的定量的に実験結果と良く一致した。ここで提案されたモデルはある限られた条件の下でのみ有効であることは言うまでもない。特に生体中での現象を理解するにはさらなるモデルの改良が必要である。ここで得られた結果はそのための基礎となるものである。水平な細管中をゆっくり血液が流れる場合、血液中の赤血球は可逆的な凝集体を形成し、沈降する。流れに及ぼす凝集体形成とその沈降の効果を調べるため、平成6年度においては、赤血球間の凝集力がずり応力にくらべ十分強い場合に適用できる流動モデルを作った。個々ばらばらに流れていた赤血球は流れが遅くなると管の中心部で凝集体を形成するが、それは時間とともに沈降し、定常な分布に達した後には一体となって移動することが観測されている。この観測から、管内の流れを凝集赤血球から成る円柱状固体の中心核とそれを取り巻く赤血球サスペンションの2層から成るとし、定常状態では中心核が一定の偏心度を保って移動すると仮定した。この仮定のもとで圧力差-流量の関係を計算し、見かけの粘性率(流動抵抗の程度を与える)を求め、これにおよぼす中心核の大きさ(凝集程度を表すパラメータ)および中心核の偏心度(沈降の程度を表すパラメータ)の影響を調べた。沈降の影響が無視できる垂直管での結果と比較した場合、流動抵抗は凝集の程度や沈降の程度によらず高くなることが示され、実験的に知られている結果を再現した。

しかし、水平管内の流動抵抗におよぼす凝集体の大きさおよび沈降の程度の効果は複雑である。凝集体の大きさを一定に保った場合、流動抵抗は沈降の程度が増すにつれ単調に増加する。しかし、沈降の程度を一定に保った場合には、流動抵抗は凝集体の大きさに対して極大値を持つ場合があることが示された。すなわち、凝集せずに一様なサスペンションとして流れる場合に比べ、凝集し沈降して流れる方が流動抵抗が低くなる場合があることが示され、その条件が与えられた。これらの結果は、国内外の会議の場で、および個人的に、実験家および臨床家との間で議論された。技術的に難しいと指摘されているものの、理論結果と比較しうる定量的な実験データが待たれる。水平な細管中をゆっくり血液が流れる場合、血液中の赤血球は可逆的な凝集体を形成して沈降する。凝集体沈降の流れへの影響を調べるため、平成7年度においては、凝集体に働くずり応力にくらべ赤血球間の凝集力が比較的弱い場合に適用できる流動モデルを作り、流体力学的手法を用いて流れを解析した。個々ばらばらに流れていた赤血球は流れが遅くなると管の至る所で小さな凝集体を形成し、それらが個々に沈降すると予想される。そこで、定常状態においては、凝集体の沈降によって管の下部にできる赤血球濃度の高いサスペンション層が上澄み液であるプラズマ層と分離して流れるとし、その界面は滑らかで水平に保たれるとする2層流動モデルを採用した。また、血液はニュートン流体であると見なし、その粘性率は赤血球濃度とともに指数関数的に増加するとした。このモデルを用いて、管内の速度分布、見掛けの粘性率、単位時間に輸送される赤血球の体積等を求め、これらのおよぼす沈降程度の依存性を明らかにした。また、これまでに報告されている実験結果との比較検討を行った。血流抵抗は沈降程度の増加とともにゆるやかに減少し、最小値に達した後急激に増加し最大値に至ることが示された。沈降程度の大きい領域における血流抵抗の振る舞いは、実験結果を良く再現した。しかし、沈降程度が小さい領域において、血流抵抗が最小になる沈降状態が存在するという興味ある結論は実験的にはまだ確認されておらず、今後モデルの正当性の吟味が必要であると思われる。これらの結果の一部は、国内の関連学会(第18回日本バイオレオロジー学会年会、第20回日本微小循環学会総会)および国際会議(the 9th International Congress of Biorheology)にて報告され、議論された。結果は論文にまとめられ、国際雑誌BIORHEOLOGYに投稿された。微小血管内のある区間にある瞬間滞在する血液中の赤血球濃度(Tube Hematocrit:H_T)は血流抵抗を決定する重要な因子の一つであり、酸素の組織への分配を決定する重要な因子の一つであことが知られている。ガラス管等での実験から、直径がおよそ300μm30μmの細管では、H_Tは管から流出した血液中の赤血球濃度(Discharge Hematocrit:H_D)より低い値をとることが知られており、この現象はFahraeus効果と呼ばれている。流動する血液中で形成される赤血球の凝集体とその沈降は、この効果に著しい影響をおよぼすと予想される。そこで、平成8年度においては、これまでに提案した二種類の流動モデル(剛体核モデルと二流体モデル)を用いてH_Tと赤血球凝集体の沈降程度との関係を理論的に考察した。その結果、赤血球間の集合力が比較的弱いヒト全血の場合には、二流体モデルが適していることが示され、H_Tは平均ずり速度の減少にともなって増加し、約1sec^<-1>以下のずり速度では逆に、H_T>H_Dとなることが示された。この結果の一部は関連学会にて報告され、日本バイオレオロジー学会誌に投稿された。
頭蓋骨骨延長における骨形成機構の放射線照射による影響に関する組織学的研究

骨延長法を応用した骨トランスポート法は延長距離に制限がなく,また骨採取などの侵襲が患者に加わらないことから,今後骨の欠損修復,再建術で汎用されることが想像される。しかし同法でも,放射線治療後の骨欠損に対しては骨形成が期待できないので,適応は禁忌であるとされている。その一方,放射線照射後でも骨延長に問題がなかったという報告もあり,詳細は不明である。本研究では,私の確立したラット頭蓋骨骨延長モデルを用い,放射線照射後に骨延長を試みることによって骨形成が生じうるか否か,また正常ラットの頭蓋骨骨延長における骨形成と組織学的にいかなる相違があるのかを組織学的手法を用いて検索することを目的とした。昨年度に引き続き組織学的な検索を中心に行った。当初の実験計画では,放射線照射後6ヵ月目に骨延長装置装着の手術を行い骨延長を行うことを予定していたが,昨年度と同様に,実験をより簡便にするため,放射線照射直後に装置装着の手術を行い骨延長を行うよう,実験計画を変更した。実験群として第1群は10Gy,第2群は20Gyの照射を行った後,骨延長を行った。また頭蓋骨に骨欠損を作製し,延長ストレスをかけない第3,4群を作成し,第3群には10Gy,第4群には20Gyの照射を行った。定期的に観察材料を採取し,組織学的に観察した。非脱灰標本でマイクロCTによる観察,脱灰標本でH-E染色による形態学的な観察では,第3,4群では終始新生骨の形成は見られなかった。一方第1群では新生骨の量は正常ラットの骨延長時のそれより少ないものの,骨新生の部位,様相は類似したものであった。一方第2群では,骨新生が顕著に抑制され,骨延長によって生じた延長ギャップが新生骨によって埋められることはなかった。免疫組織化学的に観察すると,3,4群ではBMP-2,4,PCNA陽性の細胞が認められなかったが,第3群では相当数認められた。第4群では第3群より陽性細胞数が少なかった。以上の結果より,放射線照射によってある程度組織の障害を受けていても,延長ストレスによって新生骨形成を促進させることが可能であることが分かった。今後BMPをはじめとする骨形成因子の定量的分析を行い延長ストレスの骨形成系細胞への影響を分析する予定である。腫瘍切除によって生じた骨欠損を骨トランスポート法によって再建する試みが始まっている。同法は延長距離に制限がないことから,大きな骨欠損の再建が可能となり,また骨採取など,患者に大きな侵襲を与えないという利点から,さらなる臨床応用に期待が集まっている。しかし同法でもってしても,放射線治療後の骨欠損に対しては骨形成が期待できないので,適応は禁忌であるとされている。その一方で,放射線照射後でも骨延長に問題がなかったという報告もあり,その詳細は不明である。本研究では,これまでの私の実験によって明らかになってきたラット頭蓋骨骨延長モデルを用い,放射線照射後に骨延長を試みることによって骨形成が生じうるか否か,また正常ラットの頭蓋骨骨延長における骨形成と組織学的にいかなる相違があるのかを組織学的手法を用いて検索することを目的としている。今年度は放射線照射ラットの頭蓋骨骨延長モデルを確立することを主眼に実験を行ってきた。放射線照射後6ヵ月目に骨延長装置装着の手術を行い骨延長を行うことを予定していたが,実験をより簡便にするため,放射線照射直後に装置装着の手術を行い骨延長を行うよう,実験計画を変更した。放射線量は10Gy,20Gyの2群とし,非脱灰標本でマイクロCTによる観察,脱灰標本でH-E染色による形態学的な観察を行った。10Gy照射群では新生骨の量は正常ラットの骨延長時の新生骨量に比べやや少なかったが,骨新生の部位,様相は類似したものであった。一方20Gy照射群では,骨新生が顕著に抑制され,骨延長によって生じた延長ギャップが新生骨によって埋められることはなかった。また骨延長による骨形成に基質小胞の関与があることが分かった。現在免疫組織化学的な観察を行っており,組織像に相違が生じた原因としてBMPをはじめとした骨形成関連因子の有無,組織内の局在等について検索している。

また頭蓋骨に骨欠損を作製し,延長ストレスをかけない第3,4群を作成し,第3群には10Gy,第4群には20Gyの照射を行った。定期的に観察材料を採取し,組織学的に観察した。非脱灰標本でマイクロCTによる観察,脱灰標本でH-E染色による形態学的な観察では,第3,4群では終始新生骨の形成は見られなかった。一方第1群では新生骨の量は正常ラットの骨延長時のそれより少ないものの,骨新生の部位,様相は類似したものであった。一方第2群では,骨新生が顕著に抑制され,骨延長によって生じた延長ギャップが新生骨によって埋められることはなかった。免疫組織化学的に観察すると,3,4群ではBMP-2,4,PCNA陽性の細胞が認められなかったが,第3群では相当数認められた。第4群では第3群より陽性細胞数が少なかった。以上の結果より,放射線照射によってある程度組織の障害を受けていても,延長ストレスによって新生骨形成を促進させることが可能であることが分かった。今後BMPをはじめとする骨形成因子の定量的分析を行い延長ストレスの骨形成系細胞への影響を分析する予定である。
リボソーム攻撃性抗生物質の活用による糸状菌の潜在的二次代謝能活性化技術の確立

研究代表者はこれまでに、リボソーム攻撃性抗生物質を活用した遺伝学的および生理学的に異なる二つのアプローチがバクテリアの潜在能力を引き出す手法として有効であることを明らかにしてきた。本研究において、その手法がバクテリアのみならずカビや酵母(真核微生物)の潜在能力活性化にも有効であることを実験的に証明した。加えて、ハイグロマイシンB耐性変異および同抗生物質によるホルミシス効果でカビの潜在的二次代謝能が向上する現象に着目して、その仕組みについて詳しく解析したところ、リボソーム攻撃性抗生物質を用いた同じ手法でも、カビと細菌とでは異なる仕組みで潜在能力が引き出される可能性があることを見出した。リボソーム攻撃性抗生物質を活用した遺伝学的および生理学的に異なる二つのアプローチで糸状菌の潜在的二次代謝能を引き出せることを実験的に証明することに取り組んだ。加えて,その仕組みを生化学・分子生物学的な面から解析するための解析にも着手しはじめた。なお本研究は,当初の計画に基づき,以下の二つを重点課題として実施した。各課題に対する具体的な実績を以下に述べる。課題1:糸状菌の潜在的二次代謝能を引き出す薬剤(リボソーム攻撃性抗生物質)耐性変異の探索。紅麹菌Monascus pilosusNBRC4520から80菌株のハイグロマイシンB耐性変異株,および30菌株のシクロヘキシミド耐性変異株を取得した。これらのうちハイグロマイシンB耐性変異株の1菌株が親株に比べて高い二次代謝能を有することを明らかにした(二次代謝能の評価は赤色および黄色色素の生産量を指標にした)。このハイグロマイシンB耐性変異株における変異遺伝子を特定するために,次世代シーケンス技術による全ゲノム解析を実施したところ,同変異株がMFS (major facilitator superfamily) transporterに点変異を有することを見出した。課題2:糸状菌の潜在的二次代謝能を強力に活性化するリボソーム攻撃性抗生物質の探索とその活性化現象の解析。紅麹菌NBRC 4520株を最小生育阻止濃度(MIC,同菌に対するハイグロマイシンBのMICは0.08 mg/mL)よりも低濃度(MICの1/320 1/40濃度)のハイグロマイシンB存在下で培養すると,同菌株の色素生産量が劇的に増加し,その生産量が最大で添加時の8倍に達することを明らかにした。ハイグロマイシンB以外のリボソーム攻撃性抗生物質による二次代謝活性化効果についても検討しはじめた。これまでの検討から、リボソーム攻撃性抗生物質(ハイグロマイシンB)を活用した遺伝学的(ハイグロマイシンB耐性変異による活性化効果を活用)および生理学的(ハイグロマイシンBのホルミシス効果:濃度依存的現象による活性化効果を活用)に異なる二つの手法で糸状菌(紅麹菌Monascus pilosus NBRC 4520)の二次代謝能を高められることを明らかにした。加えて、二次代謝能が向上したM. pilosusNBRC4520のハイグロマイシンB耐性変異株は、Major Facilitator Superfamily(MFS)トランスポーター遺伝子にフレームシフト変異を有することを見出した。この変異によりMFSトランスポーターの281番目以降のアミノ酸配列が大きく変わることから、変異株では同トランスポーターの機能が変化している可能性が考えられた。さらに、発現解析の結果から、変異株におけるMFSトランスポーターのmRNA発現量が親株の約60%と低いことも新たに突き止めた。一方、紅麹菌M. pilosus NBRC 4520は、0.001 mg/mLのハイグロマイシンB存在下で培養すると(同菌株に対するハイグロマイシンBの最小生育阻止濃度は0.00008 mg/mL)、変異株と同様に二次代謝産物の生産量が増加する。興味深いことに、そのような条件下でもMFSトランスポーターのmRNA発現量が低い(ハイグロマイシンB存在下の発現量は非存在下の約40%程度であった)ことが判明した。これらの結果は、MFSトランスポーターの発現低下や機能変化が紅麹菌の二次代謝能向上に関与することを強く示唆した。細菌の潜在的二次代謝能の活性化にはリボソーム変異が関与することが知られている。以上のことから、リボソーム攻撃性抗生物質を用いた同じ手法でも、糸状菌と細菌とでは異なる仕組みで潜在的な二次代謝能が引き出されることが新たに明らかになった。研究実績の概要でも述べたように、細菌の潜在的二次代謝能の活性化にはリボソーム変異が関与する一方で、紅麹菌の二次代謝活性化には、MFSトランスポーターの発現低下や機能変化が関与する可能性を新たに見出した。この結果は予想外の新知見であったため、成果発表(学会発表および論文発表)に向けてMFSトランスポーターの変化と二次代謝活性化との因果関係を精密かつ具体的に解析する必要が出てきた。その解析に時間を要しているために、予定よりも進捗状況に遅れが生じ、結果的に成果発表(学会発表および論文発表)も遅れている。以上の理由を総合判断し、上で述べたような自己点検評価に至った。紅麹菌Monascus pilosusNBRC4520の親株と赤色色素高生産ハイグロマイシンB耐性変異株[Major Facilitator Superfamily(MFS)トランス

ポーター遺伝子に1塩基挿入変異を有する]を用いた種々の生理・分子生物学的解析から,紅麹菌で認められたハイグロマイシンB耐性と二次代謝活性化はMFSトランスポーターの発現低下に起因することが判明した。これらの結果から,バクテリアと糸状菌とでは全く異なる仕組みでリボソーム攻撃性抗生物質耐性の表現型を獲得し,二次代謝の活性化が起こることが明らかになった。一方,リボソーム攻撃性抗生物質を用いた遺伝学的手法(抗生物質耐性変異の活用)および生理学的手法(抗生物質の濃度依存的効果:ホルミシスの活用)により糸状菌以外の真核微生物の潜在能力を引き出すことにも有効か否かを検討した。その結果,ジャポニカス分裂酵母Schizosaccharomyces japonicusの親株と薬剤耐性選抜法によりこの親株から取得した153菌株のG418耐性変異株を用いた種々の生理学的解析から,G418耐性変異には分裂酵母の性質[細胞の形状,耐糖性(高濃度グルコース存在下での生育),耐凍性,発泡性,および代謝産物の生産性]を劇的に変化させる作用があることが明らかになった。そのような性質をもたらすG418変異の同定には至らなかったが,以上の結果から,リボソーム攻撃性抗生物質を活用した遺伝学的手法が分裂酵母の潜在能力を引き出すことにも有効であるという見通しを新たに得ることができた。研究代表者はこれまでに、リボソーム攻撃性抗生物質を活用した遺伝学的および生理学的に異なる二つのアプローチがバクテリアの潜在能力を引き出す手法として有効であることを明らかにしてきた。本研究において、その手法がバクテリアのみならずカビや酵母(真核微生物)の潜在能力活性化にも有効であることを実験的に証明した。加えて、ハイグロマイシンB耐性変異および同抗生物質によるホルミシス効果でカビの潜在的二次代謝能が向上する現象に着目して、その仕組みについて詳しく解析したところ、リボソーム攻撃性抗生物質を用いた同じ手法でも、カビと細菌とでは異なる仕組みで潜在能力が引き出される可能性があることを見出した。課題1[糸状菌の潜在的二次代謝能を引き出す薬剤(リボソーム攻撃性抗生物質)耐性変異の探索]は,おおむね順調に進展している。最大のポイントは,初年度の最大目標に掲げていた「紅麹菌のハイグロマイシンB耐性と二次代謝能の向上に関わる変異遺伝子の候補の特定」を達成できたことにある。現在,この成果を含めた原著論文の作成・投稿準備を進めている(Applied Microbiology and Biotechnology誌に投稿予定)。一方,課題2(糸状菌の潜在的二次代謝能を強力に活性化するリボソーム攻撃性抗生物質の探索とその活性化現象の解析)については,ハイグロマイシンBに紅麹菌の二次代謝能を向上させる作用があることを実証できたものの,同作用が紅麹菌以外の糸状菌にも認められるか否か,さらには,ハイグロマイシンB以外のリボソーム攻撃性抗生物質にも強い二次代謝活性化作用が認められるか否かは,未だ明らかにできていない。現在,これらの点については,本格的に実験を実施しているため,問題にはならない程度の遅れと捉えている。以上の理由を総合的に判断し,上述したような自己点検評価に至った。Major Facilitator Superfamily(MFS)トランスポーターの発現および機能変化により糸状菌の二次代謝能が向上する仕組みの解析。