hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
高等植物におけるエチレン生合成調節の分子機構に関する研究

本研究では、その発現調節機構を解明することを目的として、CMe-ACS2遺伝子の上流プロモーター領域中に存在するストレス応答性のDRE/CRT様シス配列(GCCGAC)に注目し、その配列に結合する転写調節因子の探索と機能解析を試みている。平成15年度に酵母ワンハイブリッド法によりメロン成葉のcDNAライブラリーからクローニングした3種類の転写調節因子(CMe-DREB1、CMe-ERF1、CMe-ERF2)の性質を調べたところ、CMe-DREB1は、ゲルシフト法、酵母ワンハイブリッドレポーター法によりシス配列へ強く結合することが明らかになった。またパーティクルガン法を用いたメロン成葉における一過的発現実験により、GCCGAC配列を介してin vivoにおける転写活性化能をもつことがわかった。ノーザン解析により、CMe-DREB1はジャスモン酸で発現誘導を受けるので、ジャスモン酸によるエチレン生成に関与する可能性が示唆されている。現在、これらの遺伝子をアラビドプシスに遺伝子導入して、過剰発現体を作成している。CMe-DREB1を過剰発現した個体は矮化せず、アラビドプシスのDREB1とは異なった機能を有している可能性が考えられる。これら過剰発現体においてACC合成酵素遺伝子が発現しているか検討する予定である。エチレンは高等植物において,多様な生理作用を行う植物ホルモンであり,その生合成制御の分子機構を解明することは,植物の生長調節機構を明らかにするうえで重要な課題である.高等植物のエチレン生合成経路においてACCシンターゼ(ACS)とACCオキシダーゼ(ACO)は主要な酵素である.これらの酵素には多数のアイソ酵素があり,それぞれ時期や組織,また様々な環境刺激に応答して特異的に発現している.これらの酵素遺伝子のプロモータ領域に特異的に結合する転写調節因子をクローニングして機能解析することにより,複雑に発現制御されているこれら遺伝子間の発現調節の分子機構が解析できる.今年度はCMeDREB/ERFを過剰発現するアラビドプシス形質転換体を作成した.これらの形質転換植物を用いてCMeDREB/ERFの機能解析を行う予定である.また,ACO遺伝子発現にEIN3様(EIL)遺伝子がどのように関与しているか調べた.メロン果実より2種類のCmEIL遺伝子(CmEIL1とCmEIL2)をクローニングした.それらのアミノ酸配列をEIN3タンパク質と比較するとDNA結合部分の配列は高い相同性を示した.メロン葉を用いた一過的発現系でCmEILタンパク質はCmACO1遺伝子発現を促進した.また,CmEILタンパク質は酵母One-hybrid法でCmACO1プロモータ配列と特異的に結合することが明らかになった.CmACO1mRNAレベルは果実の成熟で上昇した.また葉ではエチレン処理により著しく上昇した.CmEILmRNAレベルは果実で成熟に伴い上昇したが葉切片ではエチレン処理や傷害処理では変動しなかった(日本植物生理学会2005年度年会(筑波大学)で発表).
老齢ラットに於ける運動ニューロン死への一酸化窒素の関与についての研究

I.軸索の退縮と細胞死について:軸索が退縮してしまって脊髄外に出ていない運動ニューロンが老齢ラットでどの位生存しているのかを、末梢神経に注入されたHRPによって標識されない運動ニューロンの数を老若ラットで比較することによって検討した。非標識細胞の数は高齢になっても増えておらず、軸索が退縮してしまった運動ニューロンが長期間生存していることはないことが示唆された。2.一酸化窒素合成酵素の型について: NADPH-d陽性細胞が発現している一酸化窒素合成酵素について、神経型・誘導型・上皮型に対する抗体を用いて免疫組織学的に検討した。連続切片でNADPH-d陽性細胞は神経型一酸化窒素合成酵素に対する免疫活性を示すことを明らかにした。3.アポトーシスとの関連:老化に伴う運動ニューロン死がアポトーシスによるものかどうかをTUNEL法を用いて検射したが、典型的なTUNEL-陽性細胞は認められなかった。4.栄養因子の関与:脊髄クモ膜下腔に挿入したカテーテルで神経栄養因子(BDNF10マイクログラム/1日)を慢性投与し(28ヶ月齢から29ヶ月齢までの1ヶ月間)、運動ニューロンに於ける一酸化窒素合成酵素発現の状況を調べた。対照群(緩衝液のみ投与)に比べて、BDNF投与群でNADPH-d陽性細胞が少ない傾向がみられたが、例数が少なく結論を得るまでには至らなかった。以上、軸索が変性・萎縮して末梢神経から退いてしまうと、神経型一酸化窒素合成酵素が発現し、一酸化窒素の濃度が上昇し、細胞は速やかに死んでいくことが示唆された。この死が典型的がアポトーシスの過程を経るのか、一酸化窒素合成酵素発現に栄養因子(BDNF)の不足が関与しているかについては、・更に検討する必要がある。若い成熟ラットの脊髄運動ニューロンは通常一酸化窒素合成酵素(NOS)を発現していないことが報告されている。本年度は高齢になると運動ニューロンの中にNOSを発現するものが出て来ることがあるか否かを、組織化学的方法によってnicotinamide adenine dinucleotide phosphate-diaphorase(NADPH-d)陽性細胞を検出し、その細胞の特性を調べることによって検討した。実験は3つの異なる月齢グループ(若齢群:13-15ヵ月齢,n=9、中年群:24ヵ月齢,n=5、老齢群:29-32ヵ月齢,n=10)のF344ラットを用いて行なった。若齢群の腰部脊髄(L4-6)外側運動核内に大型のNADPH-d陽性細胞は全く見られなかったが、中年群、老齢群ではそれぞれ2.2±0.8(mean±S.D.)、7.9±5.4見られ、月齢が進むに従って増加していた。このNADPH-d陽性細胞の出現時期は運動ニューロン数が減少し始める時期とほぼ一致していた。これらのNADPH-d陽性細胞は多極性で、細胞体断面積は820±245平方ミクロン(n=56,範囲:359-1460平方ミクロン)と、大型運動ニューロンの範囲に分布しており、その脊髄内の分布部位とも合わせてアルファ運動ニューロンと考えられた。しかし、坐骨神経内に注入された蛍光色素(FluoroGold)で標識されなかった(3匹、17のNADPH-d陽性細胞)。従って、これらのNADPH-d陽性細胞は、その軸索が萎縮・変性によって末梢から後退してしまった運動ニューロンの可能性が強い。以上、本実験に於ける所見およびこれまでの報告から、高齢ラットに起こってくる運動ニューロン死に一酸化窒素が関与していることが示唆された。
頭頸部癌におけるセンチネルリンパ節の微小転移に関する実態調査

本研究は先行研究における頭頸部癌のセンチネルリンパ節ナビゲーション手術(Sentinel Node Navigation Surgery, SNNS)導入例を対象に転移リンパ節の状況を後ろ向きに確認して予後を比較解析し、センチネルリンパ節(Sentinel Node, SN)を微小転移とみなした場合に頸部郭清の省略が可能かを後ろ向きに検討し、SNNSで同定した微小転移例の頸部郭清の省略を、画一的な頸部郭清術を行う治療法と比較検証する前向き無作為比較試験を準備することを目的としている。本研究では当学で実施した先行試験1「口腔・咽頭がん患者を対象としたセンチネルリンパ節生検による頸部リンパ節転移予測に関する研究」に登録された、早期口腔癌患者31例を対象として、SNNSで同定したSNについて、AE1/3 cytokeratin染色を行いSNの病巣を再評価し、転移の有無、転移巣の大きさと予後情報を統合し、予防的頸部郭清を省略しうるSNの微小転移の大きさについて検討した。初回手術でSN転移陰性とされた25症例ではHE再染色およびAE1/3染色を行い、SN転移陰性を確認した。初回手術でSN転移陽性と診断された6例では、すべてAE 1/3染色でもSNに腫瘍細胞の転移が確認でき、手術を拒否した1例を除く5例で頸部郭清術が施行されていた。6例中、非SNリンパ節転移、術後頸部再発ともに認めなかった症例は2例で、SN転移巣最大径はそれぞれ1.76mm、10.0mmであった。非SNリンパ節転移陰性で術後頸部再発を認めた例は2例で、SN転移巣最大径はそれぞれ2.03mm、4.43mmであった。一方、非SNリンパ節転移が陽性で、術後頸部再発を認めなかった例は1例で、SN転移巣最大径は0.57mmであり、非SNリンパ節転移および術後頸部再発のどちらも認めた例は1例でSN転移巣最大径は2.18mmであった。2000年から2008年の期間に当科に入院しセンチネルリンパ節生検を施行された、臨床的にリンパ節転移を認めない早期口腔癌症例31例(T1N0M0 : 15例、T2N0M0 : 16例)を調査対象とし、31例全例で同定されたすべてのセンチネルリンパ節に対し、HE再染色およびAE1/3 cytokeratin染色を行った。センチネルリンパ節の転移の有無の確認、転移があった場合の転移巣の大きさの計測および患者予後等の臨床情報との統合も終了している。乳癌の領域において、SN転移はその最大径によってマクロ転移(2mmを超える)、微小転移(0.2mm2mmまで)、isolated tumor cell(ITCs)(0.2mm以下)に分類されており、日本乳癌学会診療ガイドラインでも、SNの転移が微小転移であると確定できた場合には、臨床病理学的因子を考慮し、適切な術後療法を加えることで腋窩リンパ節郭清を追加する意義は少なく、腋窩郭清を省略することが勧められている。今回、本研究で対象とした早期口腔癌症例31例中SN転移を認めた6例のうち、SN転移巣最大径が最小の0.57mmの症例でも非SNリンパ節転移を認めていた。このことから、本研究の結果からのみ、乳癌領域の微小転移の大きさを参考に微小転移の定義付けを行うことは困難と考えられた。今後、先行研究「早期口腔癌に対する臨床第2相試験口腔癌に対するセンチネルリンパ節ナビゲーション頸部郭清術の研究」より検討した、「口腔癌に対するセンチネルリンパ節ナビゲーション頸部郭清術における転移巣の大きさの検討」(2018年10月11日第20回SNNS研究会学術集会にて報告)で得られた組織病理学的情報と臨床情報を統合し、症例数を増やした上で、予後と転移病巣の大きさの関係を解析し予防的頸部郭清術を省略可能と考えられる微小転移の定義を試みる。本研究により、早期口腔癌におけるセンチネルリンパ節の微小転移が定義された場合、SNNSを行い微小転移とみなされ頸部郭清術を省略し経過観察とすると、SNNSを行わずに経過観察とするときの転移・再発のリスクを減じ、さらには頸部郭清術を一律に行うときの合併症や後遺症のリスクを減じることができる可能性があると考えられる。最終的には、SNNSで同定した微小転移例の頸部郭清の省略を、画一的に頸部郭清術を行う治療法と比較検証する前向き無作為化試験を準備することを目標としている。センチネルリンパ節ナビゲーション手術(Sentinel Node Navigation Surgery, SNNS)に関わる頭頸部癌の個別化医療の実用化に向けた国内多施設共同研究が平成21年より実施されている。本研究は、先行研究における頭頸部癌のSNNS導入例を対象に転移リンパ節の状況を後ろ向きに確認して予後を比較解析し、センチネルリンパ節(Sentinel Node, SN)が微小転移とみなした場合に頸部郭清の省略が可能かを後ろ向きに検討し、SNNSで同定した微小転移例の頸部郭清の省略を、画一的な頸部郭清術を行う治療法と比較検証する前向き無作為比較試験を準備することを目的としている。先行して追跡調査が行われている頭頸部癌のSNNSに関する臨床試験(先行試験)において、当学で実施している先行試験1「口腔・咽頭癌患者を対象としたセンチネルリンパ節生検による頸部リンパ節転移予測に関する研究」では33例の登録が済んでいる。

本研究では、33例中術前診断でリンパ節転移を認めなかった症例31例について、センチネルリンパ節に再度HE染色、AE1/3 cytokeratin染色を行い、組織病理学的情報の再評価と予後や再発転移の有無などの臨床情報を抽出することを目的としている。現在、31例について標本の再染色を終え、組織学的検討を行っている。術後の永久病理標本においてセンチネルリンパ節転移陽性と診断された症例が6例あり、その6例についてもHE染色、AE1/3 cytokeratin染色によりセンチネルリンパ節転移病巣の確認を行い、転移巣の大きさの確認を行っている。また、永久病理診断でセンチネルリンパ節転移陰性であったものの、本研究のAE1/3 cytokeratin染色により転移陽性と確認できる症例を1例認めた。この1例についても予後などの臨床情報との統合を行っている。先行して追跡調査が行われている頭頸部癌のSNNSに関する臨床試験(先行試験)において、当学で実施している先行試験1「口腔・咽頭癌患者を対象としたセンチネルリンパ節生検による頸部リンパ節転移予測に関する研究」で登録の済んでいる33例について、術前診断でN0であった症例31例について、センチネルリンパ節に再度HE染色、AE1/3 cytokeratin染色を行い、組織病理学的情報の再評価と予後や再発転移の有無などの臨床情報を抽出する作業を行っている。各症例につき、センチネルリンパ節の標本が1ー5個程度と複数存在し、再染色を行ったプレパラートの確認に時間がかかっている。また、現在福島県立医科大学付属会津医療センターに勤務しているため、臨床情報を確認するために福島県立医科大学本学でのカルテ操作が必要になるため、予後情報との統合に時間を要している。本研究は先行研究における頭頸部癌のセンチネルリンパ節ナビゲーション手術(Sentinel Node Navigation Surgery, SNNS)導入例を対象に転移リンパ節の状況を後ろ向きに確認して予後を比較解析し、センチネルリンパ節(Sentinel Node, SN)を微小転移とみなした場合に頸部郭清の省略が可能かを後ろ向きに検討し、SNNSで同定した微小転移例の頸部郭清の省略を、画一的な頸部郭清術を行う治療法と比較検証する前向き無作為比較試験を準備することを目的としている。本研究では当学で実施した先行試験1「口腔・咽頭がん患者を対象としたセンチネルリンパ節生検による頸部リンパ節転移予測に関する研究」に登録された、早期口腔癌患者31例を対象として、SNNSで同定したSNについて、AE1/3 cytokeratin染色を行いSNの病巣を再評価し、転移の有無、転移巣の大きさと予後情報を統合し、予防的頸部郭清を省略しうるSNの微小転移の大きさについて検討した。初回手術でSN転移陰性とされた25症例ではHE再染色およびAE1/3染色を行い、SN転移陰性を確認した。初回手術でSN転移陽性と診断された6例では、すべてAE 1/3染色でもSNに腫瘍細胞の転移が確認でき、手術を拒否した1例を除く5例で頸部郭清術が施行されていた。6例中、非SNリンパ節転移、術後頸部再発ともに認めなかった症例は2例で、SN転移巣最大径はそれぞれ1.76mm、10.0mmであった。非SNリンパ節転移陰性で術後頸部再発を認めた例は2例で、SN転移巣最大径はそれぞれ2.03mm、4.43mmであった。一方、非SNリンパ節転移が陽性で、術後頸部再発を認めなかった例は1例で、SN転移巣最大径は0.57mmであり、非SNリンパ節転移および術後頸部再発のどちらも認めた例は1例でSN転移巣最大径は2.18mmであった。
カルボキシルトランスフェラーゼのアセチル-CoA結合部位の構造解析

大腸菌アセチル-CoAカルボキシラーゼのサブユニットのうちの一つであるカルボキシルトランスフェラーゼ(CT)のアセチル-CoA結合部位の構造を解析する目的でピリドキサールリン酸誘導体を中心にして,化学修飾実験を行った.検索を行った試薬のうち,ピリドキサールリン酸(PLP)及びビスピリドキサールリン酸(bis(PLP))によりCTは効果的に化学修飾され,その酵素活性が消失することがわかった.特に反応できる活性なアルデヒド基を二つ有するbis(PLP)を用いた化学修飾実験ではCTの二つのサブユニットであるα及びβサブユニットの架橋反応が観察された.この架橋反応は失活反応とほぼ一対一で対応していた.また基質であるアセチル-CoAの共存下,PLPあるいはbis(PLP)による修飾反応を行ったところ,その失活反応が抑制されたことにより,これら両試薬はCTのアセチル-CoA結合部位に結合することにより,その失活を引き起こすと考えられた.またbis(PLP)を用いた架橋反応に及ぼすアセチル-CoAの効果について検討したところ,アセチル-CoAの存在によりCTのα及びβサブユニットのbis(PLP)による架橋反応は顕著に抑制されることが分かった.この結果よりCTのアセチル-CoA結合部位はCTのα及びβサブユニットのサブユニット間領域に存在することが明らかとなった.これら両化合物の反応性から,CTのアセチル-CoA結合部位には活性に必須のリジン残基が存在することが明らかとなった.またbis(PLP)より架橋反応が起こることから,そのリジン残基に近接してもう一つ別のリジン残基が存在することが分かった.大腸菌アセチル-CoAカルボキシラーゼのサブユニットのうちの一つであるカルボキシルトランスフェラーゼ(CT)のアセチル-CoA結合部位の構造を解析する目的でピリドキサールリン酸誘導体を中心にして,化学修飾実験を行った.検索を行った試薬のうち,ピリドキサールリン酸(PLP)及びビスピリドキサールリン酸(bis(PLP))によりCTは効果的に化学修飾され,その酵素活性が消失することがわかった.特に反応できる活性なアルデヒド基を二つ有するbis(PLP)を用いた化学修飾実験ではCTの二つのサブユニットであるα及びβサブユニットの架橋反応が観察された.この架橋反応は失活反応とほぼ一対一で対応していた.また基質であるアセチル-CoAの共存下,PLPあるいはbis(PLP)による修飾反応を行ったところ,その失活反応が抑制されたことにより,これら両試薬はCTのアセチル-CoA結合部位に結合することにより,その失活を引き起こすと考えられた.またbis(PLP)を用いた架橋反応に及ぼすアセチル-CoAの効果について検討したところ,アセチル-CoAの存在によりCTのα及びβサブユニットのbis(PLP)による架橋反応は顕著に抑制されることが分かった.この結果よりCTのアセチル-CoA結合部位はCTのα及びβサブユニットのサブユニット間領域に存在することが明らかとなった.これら両化合物の反応性から,CTのアセチル-CoA結合部位には活性に必須のリジン残基が存在することが明らかとなった.またbis(PLP)より架橋反応が起こることから,そのリジン残基に近接してもう一つ別のリジン残基が存在することが分かった.
右心不全モデルラットを用いた右心不全の生理学的特徴を加味した治療法の確立

右心不全モデルラットにおけるテルミサルタンの効果を検討した。体重200gのSDラットに対してテルミサルタンを1mg/kg/日で飲用水に混入して投与した(T群)。投与4週後をend pointとして血行動態の評価と病理学的検討を行った。Kaplan Meier生存曲線でT群は有意に生存率の改善を認めた。右室の% fibrosisはT群で有意に抑制されていた。心機能解析でEes, Eed, dP/dt minはT群で有意に上昇を認めた。右室におけるPPARγの発現はT群で亢進を認めた。右室においてテルミサルタンはPPARγを介し心機能の維持に寄与している。【研究の目的】ARBによる抗左心不全効果に関しては多くの報告があるが、先天性心疾患に多く認める右心不全に関する効果に関しての報告は少ない。肺動脈絞扼術モデルラットとモノクロタリン肺高血圧モデルラットの右心室に対するARB(Telmisartan)の効果を評価する。【方法】体重200gのSDラットに対して人工呼吸管理下に開胸術を施行し主肺動脈絞扼術を行い作成した肺動脈絞扼術モデル(PAB群、n=12)とモノクロタリン60mg/kgを投与し作成した肺高血圧群(MCT群、n=12)に対して、背部にOsmoticポンプを留置しTelmisartanを0.3mg/kg/日で4週間持続皮下注射を行った。4週後にmicrocatheterによる血行動態の評価を行った後に心臓を摘出,しReal time RT-PCRにてmRNAの測定と病理学的検討を行った。コントロールは各群に生食(NS)を投与したラットを使用した。【結果】PAB群の右室圧は95.1±4.2mmHg,MCT群93.2±9.8で有意差は認めなかった。一回心拍出量はPAB群90.4±16.9ml/min PAB-NS群87.2±4.8,MCT群88.1±7.2,MCT-NS群61.1±9.1でMCT-NS群で有意な低下(P<0.01)を認めた。右室重量はPAB群で0.29g、PAB-NS群で0.31で有意差を認めなかったが、MCT群で0、35g、MCT-NS群で0.44gで有意差(P<0.01)を認めた。各右室より抽出したmRNAでpro-collagen 3、CTGFと右室%fibrosis、心筋面積はPAB群とPAB-NS群では有意差を認めなかったがMCT群はMCT-NS群と比較してすべてにおいて有意に抑制されていた。【考察】モノクロタリン肺高血圧モデルは心拍出量の低下があり右心不全を呈したがTelmisartan投与によって有意に線維化と心肥大が抑制された。肺動脈絞扼術モデルでは明らか効果は認めなかった。Telmisartanは右室直性な作用よりも肺血管への作用によって右室リモデリングを抑制していると考えられた。肺動脈絞扼術モデルラットの右心室に対するARB(Telmisartan)の効果とその作用機序を明らかにする。【方法】体重200gのSDラットに対して人工呼吸管理下に開胸術を施行し主肺動脈絞扼術を行い作成した肺動脈絞扼術モデル(PAB群、n=30)にTelmisartanを1mg/kg/日、4週間,経口飲料水に混ぜて投与を行った。4週後にmicro catheterによる血行動態の評価を行った後に心臓を摘出しReal time RT-PCRにてmRNAの測定と病理学的検討を行った。【結果】PAB群の右室圧、一回心拍出量はPAB群90.4±16.9ml/minPAB-NS群87.2±4.8で有意差は認めなかった。右室重量はPAB群で0.29g、PAB-NS群で0.31で有意差を認めなかった。PV loopによる心機能解析でEes,EedはTelmisartan投与群で有意な改善を認めた。各右室より抽出したmRNAでpro-collagen3、CTGFはPAB群とPAB-NS群では有意差を認めなかったが%fibrosisは有意な抑制効果が認められた。Kaplan Meier生存曲線でTelmisartan投与群は有意な生存率の改善を認めた。また免疫組織染色、右室心筋においてPPARγはTelmisartan投与群において有意な上昇を認めた。【考察】

TelmisartanはRNA levelでの線維化の抑制は認めなかったが病理学的に線維化を抑制した。また線維化の抑制にはPPARγの発現上昇が関与していると考えられた。心機能の改善はTelmisartanの抗線維化作用によるコンプライアンスの改善が寄与していると考えられた。
機能性ミニチュアRNAタンパク質複合体の構築

ATPと結合するRNA分子(アプタマー)はすでに報告されているが、RNAライブラリーによって多様化したリボヌクレオペプチド・ライブラリーから作成したリボヌクレオペプチドリセプターは、引き続きペプチドサブユニットを最適化することで、これまで報告されているATP結合性RNAアプタマーおよび先に得られたATP結合性リボヌクレオペプチドを超越した基質選択性を有するリボヌクレオペプチドリセプターの創製が期待される。このために、基質結合場近傍に位置すると考えられるペプチドサブユニットのN末端にランダムな7残基からなるペプチドループを導入したペプチドライブラリーをファージディスプレイ法を用いて作製し、先に得られたATP結合性リボヌクレオペプチドのRNAサブユニットと複合体を形成させることにより、ペプチドサブユニットに多様な構造をもつリボヌクレオペプチド・ライブラリーを作製した。このライブラリーを用いて、ATPとdATPを高度に識別するリボヌクレオペプチドリセプターを得た。もとのATP結合性リボヌクレオペプチドはATPとdATPを識別できないため、ペプチドサブユニットN末端に存在する7アミノ酸がこの分子認識に関与していると考えられる。この成果は論文に投稿準備中である。ここに述べた「RNAを多様化したライブラリー」と「ペプチドを多様化したライブラリー」を連続して用いるリボヌクレオペプチドリセプター法により、リボヌクレオペプチドに「高い基質選択性」と「化学反応性」を段階的に付与してテーラーメイド人工酵素を作製する方法論の基盤が確立できたと考えられるATPと結合するRNA分子(アプタマー)はすでに報告されているが、RNAライブラリーによって多様化したリボヌクレオペプチド・ライブラリーから作成したリボヌクレオペプチドリセプターは、引き続きペプチドサブユニットを最適化することで、これまで報告されているATP結合性RNAアプタマーおよび先に得られたATP結合性リボヌクレオペプチドを超越した基質選択性を有するリボヌクレオペプチドリセプターの創製が期待される。ここに述べた「RNAを多様化したライブラリー」と「ペプチドを多様化したライブラリー」を連続して用いるリボヌクレオペプチドリセプター法により、リボヌクレオペプチドに「高い基質選択性」と「化学反応性」を段階的に付与してテーラーメイド人工酵素を作製する方法論の基盤が確立できたと考えられる
メソポタミアにおける2千年紀の考古学的研究

1930年代にシリアのマリ(Mari)遺跡から厖大な楔形文字史料が発見された。この画期的な発見を契機として、紀元2千年紀のメソポタミアにおける歴史的編年の研究は飛躍的な進歩を遂げた。それに比べ立ち遅れた観がある考古学的編年についての研究は、歴史的編年との間に介在する矛盾を内包しつつ、また多くの基本的問題が未解決のまま現在に至っている。当研究グループは、この紀元前2千年紀におけるメソポタミアの考古学的編年について、日本およびドイツ各隊の新発掘質料を基に修正・補足を加えつつ再検討し、研究史上最も妥当な編年体系を確立することを目的に、昭和62年から平成元年にかけての3年間、メソポタミア考古学の権威の一人であるルーダ教授と共に次のような共同研究を進めてきた。まず、日本およびドイツ各隊が北イラクでの発掘を通じて得た問題点を互いに提出しあい討議した結果、紀元前2千年紀の前半に北メソポタミアで流行したハブール土器(Khabur ware)について共通する疑問点を両者がもっていることがわかり、この土器に関わる問題に論点をしぼることになった。主な論点は次のようなものである。1.ハブール土器の出現と終了の年代について2.当研究分担者の一人であるルーダ教授が1957年に提唱したハブール土器の前・後期という時期細分について3.後期ハブール土器と紀元前2千年紀の中頃に流行したヌジ土器(Nuzi ware)の関係についてそして、これらの諸問題について討議した結果、下記のような結論を得た。1.ハブー
ル土器の出現年代は、従来、この土器と共伴する楔形文字史料によって、古アッシリアの王、シャムシ・アダドI世(Shamshi-Adad I)の時期〔中年代説をとると、この王の統治年代は紀元前1813年ー1781年頃〕に帰せられていたが、北イラクで日本あるいはドイツ各隊がそれぞれ発掘調査した、テル・ジカーン(Tell Jigan)そしてテル・ハメッド・アガ・サギール(Tall Hamad Aga as-Sagir)の各遺跡から得られた考古学的証拠がこの従来の説に適合せず、当研究グループは、まずこの土器の出現年代についての定説に疑いを抱いた。そして、討議した結果、この土器の出現年代は、理論的に証左できる段階、すなわち古アッシリアの王シャルウキン(Sharruken)まで、従来の定説よりも引き上げることができるという、意見の一致をみた。この土器の終了年代に関しては、従来ヌジ土器の出現年代(15世紀頃)が指標とされていたがしかし、前・後期というこの土器の時期細分概念について次の項目に記すような反論があるため、かなり議論の余地を残す問題として保留することになった。2.前・後期ハブール土器の概念についての討論のなかで、ルーダ教授は、自説を修正し、1979年にスタイン(D.L.Stein)によって提示された新概念に準ずるべきであることを主張した。それは、従来後期ハブール土器とされてきたものをヌジ土器の範疇に組み入れるという概念設定である。しかし、この場合、新たにヌジ土器の定義を検討する必要が生じてきた。何れにせよ、この新しいヌジ土器の概念にしたがえば、ヌジ土器の始まりは前16世紀頃となる。3.上記のような新概念設定により、前期ハブール土器から後期ハブール土器への系統性が否定され、後期ハブール土器と従来のヌジ土器との親縁性と、後期ハブール土器をも含めたヌジ土器の新しい概念規定が更に問題となってきた。なお、当研究グループの最終目標である当該時期・地域における考古学的編年の確立は未だ達成できないが、その達成までの一過程として、今までの研究成果を研究論文集として出版することを予定している。メソポタミアの2千年紀は,アッシリア,バビロニア,ヒッタイト,カッシート人などの種々の人種が入り混じる混迷の時代である.それだけに複雑な文化複合は,いまだ不明な点が多い.そこで,近年の発掘調査で得られた考古学的資料をもとに,これらの相互関係,編年を詳細にわたって研究し,暗黒時代の2千年紀の一端を明らかにすることを目的とする.昭和58年から61年度にわたって,国士館大学調査団は北イラクのエスキ・モースル地域の遺跡群を調査し,2千年紀のハブール式土器,ヌジ式土器など考古学的新資料を得た.よって,これから,編年と文化的特性を把握し,加えて,アッシリア学の権威者であるルーダ教授との研究協力を進め,メソポタミアの2千年紀の考古学的編年を確立した.1936年,マローワン(Mallowan)はチャガル・バザール(Chagar Bazar)の発掘によって,′′平行帯或いは幾何学文様からなる単彩かつ無光沢の彩色を施した貯蔵用の壺′′をハブール式土器(Khabur Ware)と命名し,マローワンとルーダ(Hrouda)はこれを前期(old)と後期(young)の二期に分けている.これらはヌジ式土器(Nuzi Ware)とともに2千年紀の代表的な土器であるが,その後の発掘調査によって種々の土器が出土し,これらの定義や編年の再検討が必要となっている.

そこで我々は,ハブール式土器を′′1.高頚て広口の壺で肩部や頚部に平行帯文,三角文,班点文等の単純な幾何学文を施したもの(jar). 2.竜骨形の鉢で口縁に短線を施したもの(bowl). 3.薄手の台付き杯(cup,goblet). ′′等に大分類した.そして,′′無光沢の赤色系(赤褐色,暗赤褐色等を含む)の彩色が施されたこれらは,すべて轆轤による製作である. ′′と定義づけた.今回,エスキ・モースル地域のジガーン遺跡の発掘調査を整理研究した結果,ハブール式土器が出土する層(IV,V,VI)は,後,中,前期(Late Intermideate,Early)の三時期に分けられる.更にこれらの前層(VII)には刻文と彩文を共に有する土器が出土し,これらがテル・タヤ遺跡4層にもみられるところから,ハブール式土器出現期は元来のシャムシ・アダドI(c.a 1813ー1781 B.C.)の頃を更に遡り,紀元前2000前後に推定される.また,最近トルコのカラカヤダム建設地域のイミクシャギ(imikusagi)やイマモキュル(imamoglu)からもハブール式土器が報告され,分布の北限が更に拡大しつつある.ただ,これらの問題に関しては科学的な土器の同定分析を行う必要があると,ルーダ教授は指摘する.今後は,特に後期のハブール式土器がヌジ式土器と共伴し,それらの土器の形式や彩文,また分布等に類似点か多いところから,これらの相互関係と,その編年を明らかにしたい.1930年代にシリアのマリ(Mari)遺跡から厖大な楔形文字史料が発見された。この画期的な発見を契機として、紀元2千年紀のメソポタミアにおける歴史的編年の研究は飛躍的な進歩を遂げた。それに比べ立ち遅れた観がある考古学的編年についての研究は、歴史的編年との間に介在する矛盾を内包しつつ、また多くの基本的問題が未解決のまま現在に至っている。当研究グループは、この紀元前2千年紀におけるメソポタミアの考古学的編年について、日本およびドイツ各隊の新発掘質料を基に修正・補足を加えつつ再検討し、研究史上最も妥当な編年体系を確立することを目的に、昭和62年から平成元年にかけての3年間、メソポタミア考古学の権威の一人であるルーダ教授と共に次のような共同研究を進めてきた。まず、日本およびドイツ各隊が北イラクでの発掘を通じて得た問題点を互いに提出しあい討議した結果、紀元前2千年紀の前半に北メソポタミアで流行したハブール土器(Khabur ware)について共通する疑問点を両者がもっていることがわかり、この土器に関わる問題に論点をしぼることになった。主な論点は次のようなものである。1.ハブール土器の出現と終了の年代について2.当研究分担者の一人であるルーダ教授が1957年に提唱したハブール土器の前・後期という時期細分について3.後期ハブール土器と紀元前2千年紀の中頃に流行したヌジ土器(Nuzi ware)の関係についてそして、これらの諸問題について討議した結果、下記のような結論を得た。1.ハブー
ル土器の出現年代は、従来、この土器と共伴する楔形文字史料によって、古アッシリアの王、シャムシ・アダドI世(Shamshi-Adad I)の時期〔中年代説をとると、この王の統治年代は紀元前1813年ー1781年頃〕に帰せられていたが、北イラクで日本あるいはドイツ各隊がそれぞれ発掘調査した、テル・ジカーン(Tell Jigan)そしてテル・ハメッド・アガ・サギール(Tall Hamad Aga as-Sagir)の各遺跡から得られた考古学的証拠がこの従来の説に適合せず、当研究グループは、まずこの土器の出現年代についての定説に疑いを抱いた。そして、討議した結果、この土器の出現年代は、理論的に証左できる段階、すなわち古アッシリアの王シャルウキン(Sharruken)まで、従来の定説よりも引き上げることができるという、意見の一致をみた。
高延性・耐水素脆化を発現する残留オーステナイト制御によるTRIP鋼の環境強度

強度-延性バランスを発現する代表的強化機構である変態誘起塑性現象を中心にしたTRIP鋼、マルテンサイト系鋼、高張力熱処理鋼、オーステナイト系鋼の低温、水素環境中における環境強度を、微小試験片法によるレーザー溶接金属部の低温強度を含め、水素環境脆化感受性が高い金属間化合物と比較して、評価できた。1.TRIP薄鋼板の現寸法の制約を解決できる厚さ0.5mm×10mm角微小試験片を用いた小型パンチ(SP)により、延性脆性遷移曲線、延性脆性遷移温度(DBTT)、低温環境強度、破壊形態、ワイブル分布特性を評価した。0.37%C-1.13%Si-1.35%Mn鋼(残留オーステナイトγ_R=15%,YP=692MPa,TS=970MPa,EI=31%)、0.11%C-1.18%Si-1.55%Mn鋼(γ_R=6%,YP=412MPa,TS=615MPa,EI=37%)の2種類のTRIP鋼板のSP-DBTTは、高γ_R鋼で高く、ワイブル分布の形状パラメータmと分散σの温度依存性は両者で異なり、低温域における残留オーステナイトの延性への寄与の違いが認められた。2.鉄鋼のレーザー溶接部のミクロ組織と対応させた低温衝撃特性(DBTT,FATT)を、0.7,1.0,1.5mm角超小型の衝撃試験片を用いて評価し、JIS標準寸法試験片との相関を確認して、今後の高強度薄鋼板の低温衝撃特性評価法を確立した。3.高張力熱処理鋼(PC鋼棒)の耐水素脆化に及ぼす合金元素および熱処理の影響を調べて、焼入れ焼戻し熱処理組織とSi,Ni添加により水素脆化が改善できた。Type316オーステナイト系鋼の耐水素脆化に及ぼす鋭敏化処理およびTi添加効果を、低歪み速度試験法により調べた。4.トリチウム電顕オートラジオグラフ法により、ミクロ組織と対応させた水素分布観察を行った。強度-延性バランスを兼ね備えた高強度薄鋼板であるTRIP(変態誘起塑性)現象を活用した残留オーステナイト(γ_R)→α^--マルテンサイト変態付与のα+ベイナイト+γ_R複合組織鋼(r_R=15,6%)、固溶・析出強化したIF鋼および焼入れ-焼きもどし鋼の3種類の強化鋼板について、初年度は薄鋼板現寸法(厚さ1.1mm以下)を用いた強度-延性・靭性および環境強度評価のための微小試験片法を確立させ、以下の成果を得た。1.本研究費により以下の3種類の環境制御下の微小試験片材料試験装置を作製することができた。2.77K室温、環境雰囲気、電気化学制御で一定ひずみ速度下の微小引張試験片(平行部2.2x10mm、厚さ0.3mm)を用いた試験が可能となった。3.0.7mm角x20mm微小試験片を用いた衝撃試験機および10mm角x0.5mm厚さの小型パンチ(SP)試験機により、延性-脆性遷移曲線を測定して、強化組織の異なる薄鋼板のDBTT、上部棚エネルギー、破面遷移およびワイブルプロットによる破壊の統計的評価を行い、脆性を支配する因子を検討する準備ができた。4.Cu-IF鋼の時効析出硬化を中心にしたアノードおよびカソード分極曲線を測定し、複合組織の電気化学的変化は不動態維持電流密度および不動態化電位に大きく反映されることがわかった。

5.複合組織鋼におけるγ_R組織をナイタールエッチング+テンパーカラー着色法、ひずみ誘起マルテンサイト組織を磁気コロイド法、水素トラップサイトをトリチウム電顕オートラジオグラフィ法によりそれぞれ可視化させて定量画像解析ができるように準備した。6.以上に得られた基礎的知見と準備をうけて、次年度は研究課題を計画どおり展開することができる。強度-延性バランスを発現する代表的強化機構である変態誘起塑性現象を中心にしたTRIP鋼、マルテンサイト系鋼、高張力熱処理鋼、オーステナイト系鋼の低温、水素・水蒸気雰囲気における各種強化組織の環境強度を、微小試験片法によるレーザー溶接金属部の低温強度を含め、水素環境脆化感受性が高い金属間化合物と比較して、評価した。購入した熱処理炉系により、制御組織を得ることが出来た。1.厚さ0.5mmx10mm角超小型試験片を用いる小型パンチ(SP)試験および微小衝撃試験により、各種高強度薄鋼板の破壊エネルギーを測定して、延性脆性遷移特性、延性脆性遷移温度(DBTT)を評価できた。0.37%C-1.13%Xn鋼(残留オーステナイトγ_R=15%,YP=692MPa,TS=970MP_a,E1=31%)、0.11%C-1.18%Si-1.55%Mn鋼(γ_R=6%,YP=412MPa,TS=615MPa,E1=37%)の2種類のTRIP鋼板のSP-DBTTおよび衝撃DBTTは共に、高γ_RTRIP鋼で高く、ワイブル分布の形状パラメターmと分散σの温度依存性は両者で異なり、低温域におけるγ_Rの延性・靱性への寄与の違いが認められた。2.0.7,1.0,1.5mm角超小型試験片を用いる微小衝撃試験法により、レーザー溶接金属部の局所、微小部のミクロ鉄鋼組織と靱性(DBTT)を評価することができた。3.高張力熱処理鋼(PC鋼棒)の熱処理(焼入れ、焼入れ焼戻し)およびSi,Ni添加の影響が、水素脆性感受性に及ぼす影響を調べて、焼入れ焼戻し熱処理組織とSi,Ni添加により水素脆性を改善できた。
肝内微小環境による膵癌細胞のセレクション機構解明と微小環境ストレスの制御

本研究の目的は、膵癌において肝転移が成立する際に作動する循環癌細胞の選択機構の解明と、肝内微小環境におけるセレクション機構を利用した肝転移制御、新規治療法の開発である。肝転移巣における好中球細胞外トラップ(NETs)の実行を確認するため、NETsに伴って生じるシトルリン化ヒストン(Cit-H3)の発現を免疫組織化学染色で評価したところ、膵癌自然発生マウス(KPCLマウス)から採取した癌細胞を脾注した肝転移モデルマウスでは肝転移巣においてCit-H3の発現が見られた。さらにNETsによって放出されるDNAの網を可視化するため、細胞膜非透過性核酸染色液の静注後に癌細胞を脾注し、解剖して観察した肝組織では不均一に分布した細胞外DNAが観察された。癌細胞の脾注後から微小肝転移が形成されるまでの経時的観察では癌関連線維芽細胞(CAFs)に先立って好中球の集簇が確認され、その後CAFsが存在する部分にのみ癌細胞が見られるようになった。また、肝転移マウスモデルにおける癌関連線維芽細胞の由来として、肝星細胞を想定し、in vitroの実験において、癌細胞、好中球を単独あるいは両方の存在下に肝星細胞と共培養し、その活性化について検討したところ、癌細胞、好中球の両方と共培養した場合のみ肝星細胞の遊走・浸潤能が亢進し、その作用はNETs阻害薬によって抑制されることがわかった。以上から、癌細胞と好中球の相互作用によってNETsが起こり、線維芽細胞の活性化から癌細胞が定着する足場が形成され、肝転移が成立していくといったひとつのメカニズムについて明らかにすることができた。まず、In VivoにおいてマウスにGFPを導入した膵癌細胞を脾注して肝転移・肺転移モデルを作成し、癌細胞のトラップから微小転移の形成まで時間ごとに解剖して経時的変化を観察した。肝微小転移巣では肺に比べて有意にα-SMA陽性癌関連線維芽細胞が多く誘導されており、肝微小転移巣では辺縁に好中球浸潤も認めた。好中球は好中球細胞外トラップ(NETs)を来すと、肺線維化を促進することが知られているが、膵癌自然発生マウスのKPCL(LSL-Kras G12D/+ ;LSL-Trp53 R172H/+; LSL-Luciferase;Pdx-1 -Cre)マウス、および肝転移モデルマウスにNETs阻害薬であるDNaseIを投与するとコントロール群に比べて有意に肝転移が抑制された。微小肝転移巣の病理学的検討ではDNaseI投与群ではGFP陽性癌細胞の数、α-SMA/GFPの面積比、α-SMA陽性病変の割合、いずれもコントロールに比べて低下していた。また、In Vitroの検討でマウスから濃度勾配遠心法や磁気ビーズを用いて分離採取した好中球を膵癌自然発生マウスから樹立した癌細胞と共培養すると、好中球のNETs形成促進作用が見られた。微小肝転移の成立に微小環境中の好中球が関与しており、好中球は癌細胞によってNETsを来してα-SMA陽性の癌関連線維芽細胞を誘導することで、肝転移の形成を促進している可能性が示唆された。肝内微小環境における癌細胞の生存、接着に好中球によるNETs形成が重要な役割を果たしている可能性を明らかにし、さらにNETsによる癌関連線維芽細胞の誘導が肝転移の成立を促進している可能性があることが分かった。一方で循環癌細胞が肝内に捕捉される際にどのようなセレクション機構が働いているか、どのような物理的ストレス、変形を来しているかについてはまだ明らかになっておらず、今後の検討課題である。

以上から、癌細胞と好中球の相互作用によってNETsが起こり、線維芽細胞の活性化から癌細胞が定着する足場が形成され、肝転移が成立していくといったひとつのメカニズムについて明らかにすることができた。癌細胞の脾臓内注入による肝転移モデルの観察から癌細胞の形態、経時的変化、生存細胞の特徴など、癌細胞側の因子について解析を進め、In Vitroでの再現に努める。再現可能できた場合には変形ストレスを受けた癌細胞の機能、形態的特徴の解析を進める。うまくいかない場合には膵癌オルガノイドを作成し、オルガノイドに対する細胞集団レベルでの外圧が癌細胞の特徴にどのような影響を与えるか検討する。研究計画はおおむね順調に進展しており、研究資金を有効に使用できたため。次年度は研究用試薬、器材、抗体などの消耗品に使用する予定である。
言語記憶における概念体系のモデル化

長期記憶における情報は次の検索に備えて系統的に貯えられている。この長期記憶の中にはどのような規則もしくは構造によって、多大の情報が整然と蓄積されているのであろうか。長期記憶の重要な概念構造として本研究ではカテゴリ概念、意味及びテ-マをとり上げ、これらの概念体系の保持に及ぼす影響を検討した。実験Iでは特定のカテゴリに属する具象名詞の再生及び再認の程度と、そのカテゴリ内での各名詞の位置づけとの関連性を検討した。名詞で表現されるこれらの言語情報はは単独よりもむしろ文章の形で提供されることが多い。実験IIでは文章の意味及びテ-マといったより広い意味での概念の記憶に及ぼす影響を検討した。さらに実験IIIではカテゴリ名及びカテゴリ内での典型例をプライミングとして反応時間(RT)を測定することによってカテゴリ構造の保持に及ぼす効果を検討した。本研究によって得られた結果は以下のごとくである。1)単語の保持に及ぼすカテゴリ概念の影響:同一概念からの名詞の再生は1カテゴリ1名詞の統制条件下での保持に比して優れている。また同一カテゴリ内では典型性の高い名詞の方がより再生されやすい。2)文章の保持に及ぼすテ-マの影響:複数の文の保持に際しては統一的なテ-マは有用であり、再生することのできなかった文章中の重要語が比較的容易に再認される現象がみられた。3)再認におけるプライミング効果:カテゴリ名及び典型例のいずれも再認おけるdifferent反応を有意に促進したが、same反応については影響がみられなかった。またこのとき両プライム間の有意差は観察されなかった。実験Iでは抽象対具象のカテゴリ概念の想起に及ぼす影響を検討し、実験IIにおいては文意、テ-マなどのより広い意味での概念が各単語の想起に及ぼす影響を検討し、言語情報の記憶に及ぼす種々の概念の影響について検討した結果、以下の事実を明らかにした。カテゴリ概念の想起に及ぼす影響については、単一カテゴリ内の各単語の想起と属するカテゴリに統一性をもたない単語群の想起とを比較した結果、再生においてはカテゴリ概念が想起を増大する傾向がみられた。再認において正答を示すHit:False alarmの比率は約2:1であり、「無し」と正しく答える方が難しい。また文意及びテ-マの想起に及ぼす影響については、文意及びテ-マの想起に及ぼす影響は再生及び再認のいずれの方法においてもほぼ同様の傾向を示し、統一的なテ-マをもたない複数の文章の想起は統制条件であるランダムな単語群よりも想起し難く、統一的なテ-マをもった文章群の場合にはとくに再生に際して高い想起を示している。さらに各文章の内容を最もよく表すと思われる重要語句を指定し、これらがどの程度想起されるかを検討した結果、統一テ-マ条件の方が複数文よりも再生、再認ともに重要語の想起が優れていた。また再生されない重要語であっても再認においては正答が得られており、このような重要語は想起おいて大きな役割をもっと思われる。長期記憶に貯えられる情報は、次の検索に備えて系統的に整理されている。これらの情報を体系づける際にカテゴリ概念、テ-マ等、の概念が有効であることを示した平成元年度の研究結果に基づいて、平成2年度はプライミング手法を用いて、種々のプライムに対する反応時間の変化から言語記憶の構造について検討した。先ず、カテゴリ名及びそのカテゴリ内で典型性の程度の高い成員をプライムとして、典型性の異なる各単語間及びカテゴリ名との関連性を測定することによって、上位概念が下位概念の記憶に及ぼす影響の諸相について検討した。その結果、元年度の再認における正答率によっては相違のみられなかったにも拘らず、反応時間(RT)を指標とした本実験においては、カテゴリに統一性をもたない名詞を提示した統制群に比べて、単一カテゴリからの名詞群に限定した概念群のRTは有意に小さく、名概念の検索がより容易であることを明らかにした。

各単語を1つずつ検索するよりも同一グル-プ内の単語として各名詞を検索する方が全体の検索時間が短縮されることから、カテゴリ概念が想起を効率化していることが示唆される。さらにカテゴリ名とカテゴリの典型例をプライムとして提示し、各プライムの再認に及ぼす効果について検討した。その結果、新項目が旧項目に含まれていないと正しく反応するdifferent反応においてはとくにプライミングの効果が大きく、単一カテゴリに属する名詞群の想起が有意に促進されるが、一方、新項目が旧項目に含まれていると正しく反応するsame反応においては全条件を通じて有意差はみられなかった。またプライミング効果は各概念の上位概念内での位置、典型性の程度によっても大きく影響されることが示された。
SiRNAを用いた転写制御による骨形成促進機序の解明と治療応用

Twist-1の骨分化に与える影響を調べるために、Twist-1強発現ベクターを骨前駆細胞のC3H10T1/2に導入し、安定形質転換株を得た。C3H10T1/2の野生株にBMP2をかけると骨分化マーカーが上昇するが、Twist-1強発現株ではalkaline phosphataseやosteopontin, osteocalcinのBMP2による誘導も抑制された。そこで骨分化を促進するためにTwist-1のsiRNAをc3H10T1/2細胞に導入することにした。正電荷型ゼラチン修飾或いは磁性粒子修飾HVJ envelope vectorによりsiRNAを導入すると、骨形成が促進された。BMPの刺激によってSmad1は核内に移行し、Twist-1と共存することからTwist-1がSmadと相互作用について免疫沈降法で調べるとTwist-1とSmadの結合が示唆された。Twist-1の共沈実験より、E47とTwist-1の相互作用が明らかになり、E47遺伝子の発現により、Twist-1の安定性が増加することが明らかにされた。一方、IdlはTwist-1の分解を促し、結果的に骨分化を促進することがわかった。E47存在下でもId1の発現によりTwist-1の分解が促進されることがTwist-1のpulse-chase実験で明らかになった。次にTwist-1を安定に発現する骨芽細胞株MC3T3-E1でTwist-1をFlag抗体で免疫沈降させた分画の中に、ピストン脱アセチル化酵素(HDAC)1が共存すること、さらにその中にはSmad4が存在すること、がわかった。しかしSmad1は共沈しなかった。以上より、Twist-1のBMPシグナルの抑制はTwist-1がHDAC1をリクルートすることによってSmad4による転写活性化を抑制していることが原因であろうと考えられる。C3H10T1/2の野生株にBMP2をかけると骨分化マーカーであるalkaline phosphatase活性が上昇するが、Twist-1強発現株ではその上昇が見られなかった。また骨分化のマーカーであるosteopontin, osteocalcinのBMP2による誘導も抑制された。そこで骨分化を促進するためにTwist-1のsiRNAをC3H10T1/2細胞に導入することにした。正電荷型ゼラチン修飾或いは磁性粒子修飾HVJ envelope vectorによりsiRNAを導入し、最も強くTwist-1を抑制するsiTwist-691を見出した。BMPシグナルを伝えるSmadの結合配列を持っ3GC2-LuxをsiRNAと同時にC3H10T1/2細胞に導入し、BMP2による刺激を加えた。Scramble SiRNAを用いた場合と比較して、siTwist-691導入の場合にはBMP刺激によるルシフェラーゼ活性が3倍以上増強されることがわかった。同様に3GC2-Lux遺伝子とSmad1,4遺伝子を導入した場合にも、siTwist-691によりBMPシグナルが増強された。Twist-1,Smadの細胞内局在を間接蛍光抗体法によって調べると、BMPの刺激によってSmad1は核内に移行し、Twist-1と共存することがわかった。このことからTwist-1がSmadと相互作用するのではないかと考え、Flag-Smad, myc-Twist-

1遺伝子を作成してCOS7細胞に導入し、エピトープタッグに対する抗体で共沈実験を行ったところ、Twist-1とSmadの結合が示唆された。今後は内在性のTwist-1,Smadの相互作用についても調べる必要がある。前年度の研究より、Twist-1がSmadとの相互作用を通じてBMPシグナルを抑制し、骨分化を抑制すること、そのsiRNAにより骨分化マーカーのosteopontin, osteocalcinの発現が増強し、アルカリフォスファターゼ(ALP)の活性も増加することが明らかになった。今年度はTwist-1の安定性がId1とE47により調節されていること、Twist-1がどのようにしてBMPシグナルを抑制するかを明らかにした。Twist-1の共沈実験より、E47とTwist-1の相互作用が明らかになり、E47遺伝子の発現により、Twist-1の安定性が増加することが明らかにされた。E47結合能のないTwist-1変異体を用いると、BMPシグナルの抑制効果は消失した。一方、Id1はTwist-1の分解を促し、結果的に骨分化を促進することがわかった。E47存在下でもId1の発現によりTwist-1の分解が促進されることがTwist-1のpulse-chase実験で明らかになった。次にTwist-1によるBMPシグナルの抑制機構を解明するため、Flagタッグを付けたTwist-1を安定に発現する骨芽細胞株MC3T3-E1を作成した。Twist-1をFlag抗体で免疫沈降させた分画の中に、ヒストン脱アセチル化酵素(HDAC)1が共存すること、さらにその中にはSmad4が存在すること、がわかった。しかしSmad1は共沈しなかった。以上より、Twist-1のBMPシグナルの抑制はTwist-1がHDAC1をリクルートすることによってSmad4による転写活性化を抑制していることが原因であろうと考えられる。このことは、HDACの阻害剤であるtrichostatinを用いるとTwist-1強発現のMC3T3-E1におけるALP活性やosteopontin発現が回復することからも裏付けられた。