hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
マイクロカプセルにおけるDNAの動的高次構造変化および機能の解明

本年度には、カプセル化方法の各段階を最適化およびカプセル内におけるDNA構造変化の観測を中心に研究を実施して、主な成果はつぎの通りである。(1)ビーズの溶解方法を改善行い、ビーズの溶解後にグロビュール状態のDNAはコイル状態に変化して、カプセル内にコイル状態のDNAを観察できた。(2)長鎖DNAのカプセル壁への吸着を抑制するため、カプセル膜の組成の変更など検討していた。(i)DNAのトラップの段階においてDNA濃度をあげることによって、カプセル内でブラウン運動するDNAの割合は高くなるが、DNA凝集が起こりやすくなるデメリットがある。(ii)カプセル壁を作成する段階で弱い高分子電解質(例えばPAAとPAH)を用いると、ほとんどの場合にはビーズの溶解ではカプセルの変形や破裂とともにカプセルの凝集が起こる。pH調整によりカプセルの電荷を遮断させる場合にも同上の結果が得られた。また、安定なカプセルが形成したときに、カプセル内にDNAの状態は基本方法を用いて構築したカプセルと同様であった。(3)長鎖DNAの長さはカプセル内のDNA状態へ大きな影響を与えると考えて、中鎖DNA(約2000 bp)と短鎖DNA(約300 bp)のカプセル化実験を行った。これまで使用していたカプセル化方法を用いて、ほぼ100% DNAをビーズへのトラップできることを示した。高分子膜の作製、ビーズの溶解後に、中鎖DNAはカプセルの空間を占有して、ほぼ均一に分配することを観測し、DNAの長さによりカプセル内のDNA構造および分布が大きく異なると明らかにした。(4)Mg2+およびポリアミンなどDNAバインダーによるカプセル内でのDNA構造変化を観測行った。長鎖の場合には、大きな変化が見られなかったが、中鎖と短鎖DNAは、カチオン性のバインダーを溶液に加えることでカプセル膜付近に凝集することを観測した。昨年度には、当初の計画において提案した方法で人工細胞モデルを構築し、各段階における長鎖DNA分子の高次構造変化、カプセル内の分布など的評価できた。2019年度には、人工細胞モデルの構築に用いられるDNAおよび高分子について方法の最適化を行い、カプセルの安定性、カプセルに閉じ込めたDNA構造、カプセル内でのDNA分布などを統計的に検討して、本モデルのscope and limitationsを示した。また、溶液中のカチオン性化合物によるカプセル内でのDNA挙動を明らかにした。以上のことから、本研究は当初の計画通りにおおむね順調に進展していると言える。人工細胞モデルを利用して、カプセル内におけるDNA構造変化および転写活性について研究を実施する。(1)カプセル内でのDNAに対する高分子混雑(macromolecular crowding)の影響を解明する。(2)DNAカプセル化によりDNA損傷の保護作用を調べる。(3)カプセル化したDNAを用いて、カプセル内での生化学反応(転写)を行い、人工細胞モデルのバイオリアクターとしての使用の可能性について明らかにする。以上の実験は長鎖DNAおよび短鎖DNAで実施して、DNAの長さの影響を明らかにする。本研究は、DNAをカプセル化することで新型人工細胞モデルの構築ならびに人工細胞モデルにおける単一分子DNA挙動の解明を目指している。本年度は、DNAの多層薄膜でカプセル化法を開発していた。Na2CO3とCaCl2の溶液を混合させるときに、長鎖DNA溶液を加えることで、Na2CO3とCaCl2の反応で形成される10um CaCO3ビーズ内にDNAをトラップすることができた。次に、CaCO3ビーズの表面に高分子の多層薄膜を析出させ、EDTAでCaCO3の芯を除去することで、DNAを封入した高分子の多層薄膜中空カプセルを作製した。DNAおよびカプセルを構成する高分子を蛍光色素で標識して、DNA@カプセル系の構築の各段階について、CaCO3ビーズおよび高分子カプセルにおける単分子DNAの存在を蛍光顕微鏡で観察できた。以上の方法で人工細胞モデルの構築が可能と示したが、カプセル内でブラウン運動をするDNA分子の割合が非常に少なく、ほとんどのDNA分子がカプセルの膜に固定されていた。これから、DNA分子の高次構造変化を解析するため、カプセル内でブラウン運動をするDNA分子の割合を上げる必要があり、カプセルの作製方法の改善は今後の課題である。単分子DNAのカプセル化の実験に加えて、70 nm500 nmシリカナノ粒子のカプセル化実験を行った。DNAと同様の方法を用いて、ナノ粒子のカプセル化へ成功した。カプセル化後、カプセル内でブラウン運動をするシリカ粒子と膜に固定したシリカ粒子が共存して、ナノ粒子のサイズ減少および塩濃度の上昇によって膜に固定したシリカ粒子の割合が高くなることを示した。それ以外に、今後の研究の準備として長鎖DNA・ヒストンタンパクの複合体(クロマチン)を再構成して、単一分子観察により、2価と4価カチオンによるクロマチンの高次構造変化を明らかにした。当初の計画どおりに、DNAを高分子カプセルに閉じ込めることに成功し、人工細胞モデルの構築の各段階におけるDNA分子のトラップ率、DNA分子の高次構造、カプセル内の分布など多面的評価できた。更に、当初の計画にあった高分子DNAに限らず、微粒子のカプセル化もできることを示した。現時点の人工細胞モデルでは、カプセル内のDNA分子がほとんどカプセルの膜に吸着した状態にあるため、DNA高次構造変化のダイナミックスは検討できない難点があり、次年度に解決する必要がある。この問題を除いて、単一DNA分子のカプセル化方法を開発できたため、本研究は当初の計画と比べておおむね順調に進展していると言える。

本年度には、カプセル化方法の各段階を最適化およびカプセル内におけるDNA構造変化の観測を中心に研究を実施して、主な成果はつぎの通りである。(1)ビーズの溶解方法を改善行い、ビーズの溶解後にグロビュール状態のDNAはコイル状態に変化して、カプセル内にコイル状態のDNAを観察できた。(2)長鎖DNAのカプセル壁への吸着を抑制するため、カプセル膜の組成の変更など検討していた。(i)DNAのトラップの段階においてDNA濃度をあげることによって、カプセル内でブラウン運動するDNAの割合は高くなるが、DNA凝集が起こりやすくなるデメリットがある。(ii)カプセル壁を作成する段階で弱い高分子電解質(例えばPAAとPAH)を用いると、ほとんどの場合にはビーズの溶解ではカプセルの変形や破裂とともにカプセルの凝集が起こる。pH調整によりカプセルの電荷を遮断させる場合にも同上の結果が得られた。また、安定なカプセルが形成したときに、カプセル内にDNAの状態は基本方法を用いて構築したカプセルと同様であった。(3)長鎖DNAの長さはカプセル内のDNA状態へ大きな影響を与えると考えて、中鎖DNA(約2000 bp)と短鎖DNA(約300 bp)のカプセル化実験を行った。これまで使用していたカプセル化方法を用いて、ほぼ100% DNAをビーズへのトラップできることを示した。高分子膜の作製、ビーズの溶解後に、中鎖DNAはカプセルの空間を占有して、ほぼ均一に分配することを観測し、DNAの長さによりカプセル内のDNA構造および分布が大きく異なると明らかにした。(4)Mg2+およびポリアミンなどDNAバインダーによるカプセル内でのDNA構造変化を観測行った。長鎖の場合には、大きな変化が見られなかったが、中鎖と短鎖DNAは、カチオン性のバインダーを溶液に加えることでカプセル膜付近に凝集することを観測した。昨年度には、当初の計画において提案した方法で人工細胞モデルを構築し、各段階における長鎖DNA分子の高次構造変化、カプセル内の分布など的評価できた。2019年度には、人工細胞モデルの構築に用いられるDNAおよび高分子について方法の最適化を行い、カプセルの安定性、カプセルに閉じ込めたDNA構造、カプセル内でのDNA分布などを統計的に検討して、本モデルのscope and limitationsを示した。また、溶液中のカチオン性化合物によるカプセル内でのDNA挙動を明らかにした。以上のことから、本研究は当初の計画通りにおおむね順調に進展していると言える。当初の計画どおりに、これまで開発してきた人工細胞モデルを利用して、カプセル内における(a)カチオン性のバインダーにより単一分子DNAの折り畳み(凝縮)(b)高分子混雑効果によりDNA分子の高次構造変化を研究する。得られた結果を水溶液中におけるDNA高次構造変と比較して、DNA高次構造に対する閉じ込め効果の影響を明らかにする。また、これまでの研究から残った課題として、カプセル内にブラウン運動するDNA分子の割合を上げるために、カプセル化方法の最適化を行う。
高齢者の姿勢制御機能に関する基礎的研究:水平外乱に対する直立制御能

本研究における主たるネライは、高齢者の身体制御能力の特徴を明らかにすることによって、その基礎的資料にもとづいた、調整力の測定方法を開発することである。さらに、高齢者の身体制御能力の特性を明らかにし、その基礎資料にもとづいて、安全な環境づくり(人間工学的側面)のための提言を得ることである。実験方法としての独創的な点は、直立姿勢を保持する被検者に対して、水平移動の外乱条件を与えることである。1.測定方法としての人体移動装置:「人体移動装置」は、この度の科研費の補助金により、従来の圧縮空気に代って、油圧式による動力を用いてとくに、移動開始時の移動ムラ(移動速度のアソビ)が無くなりEMGの活動潜時を正確に測定することが可能となった。これにより、EMGの活動潜時の計測から、反射時間の特定と、高齢者と大学生との間の比較を精密に行うことができるようになった。2.キスラ-フォ-スプレ-トによる、加圧中心点動揺の定量的解析、直立能力および、姿勢の乱れの程度を、動作中の時間経過にともなって解析することが可能なシステムをつくることができた。現在、立ち上がり動作において、高齢者と学生との間で比較を行っている。その結果、ふだんから、登山などで運動を生活の中に取り入れている被検者においては、低くしゃがんだ姿勢から立ち上がり動作において、加圧点の動揺度は、大学生に比較して決して劣っていないことが示された。3.反応動作(水平外乱条件における特徴)60才以上の被検者において、基本的能力である全身反応時間を水平外乱条件で比較検討した結果、単純反応時間では、外乱条件下では高齢者は反応が遅くなる傾向を示した。これは、前方への水平外乱に対して、立ち直りの時間が遅延したためであろうと思われる。外乱に対する補償反応を追及する。本年度は、人体移動装置の動力部分を、これまでの圧縮空気ではなく、油圧式に改良した。これによって、水平外乱条件を与える際の移動刺激条件の精度をあげることができた。すなわち、刺激の立ち上がり部分がシャープになり、移動刺激に伴う反射性の筋放電の発現の生理学意義をよりたしかなものとすることができた。さらに、従来の各関節の変化をエレクトロブニオメーターによって検出し、姿勢の乱れの量をもとめる方法にかわって、キスラー社製フオースプレートを用いて、身体重心の移動量と移動経過とを検出できるようになった。本年度は、試作改良装置の検討を加え、次のような実験を行ない、成果を得た。被検者は、成人の値として、本学学生5名を用い、前頸骨筋、三角筋(左右)の筋電図を検出し、台移動にともなう、筋放電の活動潜時をもとめた。移動距離を、5、10、15cmと三種類の条件について、距離に対する構えの有無の反応をしらべた。この値に対して、50才以上の高齢者5名について、同様の実験を行った。台の移動を行なう前の筋感覚、移動距離の記憶が、次の移動刺激および身構におよぼす影響について検討している。高齢者において、筋電図の発現潜時に関しては差が認められなかったが、成人(学生)との差としては、移動中の姿勢補償および、移動終了直後における勢補償様式にあるようである。個人の特性によるものか、加齢に伴なうものか、更に例数を増やして検討する。今後は、高齢者の「転倒」の発現に関連づけても、姿勢制御能の特性を追求したい。
日本人中学生と英国人小中学生コーパスを活用した言語使用の解明と教育的利用研究

「日本人中学生と英国人小中学生コーパスを活用した言語使用の解明と教育的利用研究」の初年次研究を次の手順で計画通りに進めることができた。1.日本人中学生3年間(2002年度2004年度)の書き言葉学習者コーパス、英国BBC放送創作童話コンクール(2014年度2017年度)優秀者作品における5歳9歳の書き言葉コーパス、10歳13歳の書き言葉コーパスに品詞情報標識及び意味情報標識の付与作業を実施し本研究で詳細な分析が可能となるコーパスデータの構築及び整理を実施した。2.各コーパスデータを活用し高頻度順単語リストを作成し比較分析を実施した。3.各コーパスデータを活用し高頻度形容詞リストを作成し比較分析を通して各コーパスにおける特徴的な形容詞を抽出することができた。また、高頻度の形容詞+名詞のコロケーションを抽出し各コーパスにおける特徴的な形容詞+名詞のコロケーションについて特定した。4.分析にあたっては品詞情報標識に基づく分析に意味標識に基づく分析も加え各コーパスにおける特徴的な形容詞の分類と使用特徴を解明した。5.意味標識に基づいた形容詞の使用分析結果を活用した様々なDDL(データ駆動型学習)教材モデルを作成した。英語初級学習者(小学生中学生)を対象とした意味標識を活用したDDL(データ駆動型学習)の先行研究は国内外においてほとんど見られない。本研究の初級英語学習を対象とした意味標識分析に基づくDDLの教材開発は初級日本人英語学習者にとって年齢が近い英語母語話者コーパスデータを活用することによりこれまで困難とされてきたデータに関する難易度を解決するだけでなく英語母語話者が使用する幅広い形容詞及び形容詞+名詞のコロケーションを形容詞の意味用法を確認しながら学ぶことができるという点で大変意義のある研究といえる。本研究成果は国際学会での口頭発表及び論文投稿予定である。本研究計画に基づき初年次に予定していた研究内容はおおむね順調に進展している。本研究にあたって研究で使用するためのコーパスデータについて品詞情報標識を付与するだけなく新たに意味情報標識を付与し詳細な意味標識に基づく分類が可能となるコーパスデータを構築することができた。3年間の継続研究の初年次として研究の基盤となるコーパスデータの構築及び整理作業が予定通り実施できている。また、初年度は形容詞及び形容詞+名詞のコロケーション用法に焦点を当て各コーパスにおける特徴的な形容詞及び形容詞+名詞の使用を意味標識分類により特定することができている。さらに研究成果に基づき、日本人初級英語学習者(小学生中学生)を対象とした様々なDDL(データ駆動型)学習教材モデルを作成することができた。「日本人中学生と英国人小中学生コーパスを活用した言語の解明と教育的利用」の2年次研究予定は次の通りである。1.初年度に構築した品詞情報標識及び意味情報標識を付与した各コーパスデータを活用して動詞用法に焦点を当てていく。2.各コーパスにおける高頻度動詞リスト1位から100位を作成し比較分析を実施する。3.各コーパスにおける高使用頻度動詞の1位から100位の動詞についてコレスポンデンス分析を実施し各コーパスにおける特徴的な動詞を特定する。4.高使用頻度動詞1位から50位及び51位から100位について意味標識分析に基づく各コーパスにおける動詞使用の特徴を解明する。5.意味標識分析結果を活用した様々なDDL(データ駆動型学習)教材のモデル提示及び開発を行う。2年次研究では、さらに高頻度動詞1位から100位について詳細なコロケーションパターンを分析し抽出することによって日本人初級英語学習者(小学生中学生)にとって使用困難と考えられる動詞について、実際に英語話者が使い分けている動詞のことばの振るまいについて焦点を当て分析を行う。分析結果を活用して意味標識分析に基づいた分類によるDDL(データ行動型学習)の教材開発を進めていく予定である。

本研究計画に基づき初年次に予定していた研究内容はおおむね順調に進展している。本研究にあたって研究で使用するためのコーパスデータについて品詞情報標識を付与するだけなく新たに意味情報標識を付与し詳細な意味標識に基づく分類が可能となるコーパスデータを構築することができた。3年間の継続研究の初年次として研究の基盤となるコーパスデータの構築及び整理作業が予定通り実施できている。また、初年度は形容詞及び形容詞+名詞のコロケーション用法に焦点を当て各コーパスにおける特徴的な形容詞及び形容詞+名詞の使用を意味標識分類により特定することができている。さらに研究成果に基づき、日本人初級英語学習者(小学生中学生)を対象とした様々なDDL(データ駆動型)学習教材モデルを作成することができた。「日本人中学生と英国人小中学生コーパスを活用した言語の解明と教育的利用」の2年次研究予定は次の通りである。1.初年度に構築した品詞情報標識及び意味情報標識を付与した各コーパスデータを活用して動詞用法に焦点を当てていく。2.各コーパスにおける高頻度動詞リスト1位から100位を作成し比較分析を実施する。3.各コーパスにおける高使用頻度動詞の1位から100位の動詞についてコレスポンデンス分析を実施し各コーパスにおける特徴的な動詞を特定する。4.高使用頻度動詞1位から50位及び51位から100位について意味標識分析に基づく各コーパスにおける動詞使用の特徴を解明する。5.意味標識分析結果を活用した様々なDDL(データ駆動型学習)教材のモデル提示及び開発を行う。2年次研究では、さらに高頻度動詞1位から100位について詳細なコロケーションパターンを分析し抽出することによって日本人初級英語学習者(小学生中学生)にとって使用困難と考えられる動詞について、実際に英語話者が使い分けている動詞のことばの振るまいについて焦点を当て分析を行う。分析結果を活用して意味標識分析に基づいた分類によるDDL(データ行動型学習)の教材開発を進めていく予定である。ほぼ初年度研究費配分内で研究が行えており予算残額も少額となっている。翌年度分の研究費の研究図書費等の一部として使用を予定している。
ATL細胞の表現型の基盤となる量的・質的遺伝子発現異常の包括的解析

成人T細胞白血病(ATL)、及びHTLV-1感染細胞の全遺伝子発現、エピゲノム、スプライシング、遺伝子翻訳の異常を網羅的且つ統合的に解析し、ATL細胞の複雑な成立過程の一端を明らかにした。HTLV-1感染初期に誘導されるエピゲノム異常を起点に遺伝子発現異常が起こり、さらにmRNAスプライシングの異常が蓄積していく様子を明らかにした。この遺伝子発現の量と質の変化は、NF-κB経路、Hedgehog経路、TAK1-p38経路などの活性化を引き起こし、ATL細胞の表現型を規定していることがわかった。さらに複数の治療標的候補分子を同定し、各種阻害剤の有効性と特異性に関する非臨床POCを取得した。ATL細胞におけるNF-kBの恒常的活性化の原因の一つとして、TAK1-p38経路の活性化を明らかにした。TAK1は定型的経路の慢性的な活性化を誘導し、またp38を介して様々な転写因子の制御に関わることがわかった。またATL細胞の網羅的発現解析から、EVC1/2遺伝子座のエピジェネティック異常がHedgehog経路の活性化を引き起こし、ATL細胞の増殖、抗アポトーシスに作用していることがわかった。TAK1、p38、Hedgehog経路に対する特異的阻害剤は、いずれもATL細胞に著しいアポトーシスを誘導することから、新規標的分子として有用であると考えられた。ATL細胞のエピゲノム異常をChIP-on-chipを用いて明らかにした。ATL細胞はH3K27me3パターンが劇的に変化しており(リプログラミング)、メチル化の異常な蓄積が非常に多くの遺伝子群を負に制御することにより、腫瘍細胞としての特性を維持していることがわかった。制御される遺伝子群には機能未知な転写因子やmicroRNAが多数同定され、さらに複雑な遺伝子制御ネットワークの存在が示唆された。またTaxによって不死化したT細胞はATL細胞に酷似したエピゲノム異常を示したことから、これらが腫瘍化の初期過程であると考えられた。H3K27メチル化酵素EZH2に対する特異的阻害剤はATL細胞及びTax不死化細胞の増殖及び生存能を特異的に抑制することがわかった。内丸らが開発したHAS (HTLV-1 Analysis System)-Flow法によってATL患者由来腫瘍細胞、感染細胞、非感染細胞におけるスプライシング・バリアントの種類と量がどのように変化するのか検討し、非感染細胞から腫瘍細胞にむけて、個別のmRNA (CASPASE8、HELIOSなど)異常バリアントの増加を認めた。さらに次世代シーケンス技術を用いて網羅的にスプライシング異常の蓄積を解析する実験条件の検討を開始した。昨年度までに明らかにしたATL細胞におけるTAK1-p38経路の活性化の意義を検証した結果、下流のeIF4Eの恒常的なリン酸化を促し、その結果ATL細胞における遺伝子翻訳の異常な活性化を引き起こしていることが明らかになった。翻訳活性化の標的遺伝子には、RNAスプライシングやクロマチン制御に関わる遺伝子が多く含まれており、腫瘍細胞の恒常性維持に関わると考えられた。またTAK1は同時にNF-κB経路の活性化を介して、細胞周期の促進やサイトカインの過剰産生を引き起こすことがわかった。TAK1の阻害はATL細胞に強力にアポトーシスを誘導することから、さらなる解析を進めることでATL細胞の理解につながると考えられた。一方ATL細胞のエピゲノム異常を網羅的に解析し、さらに遺伝子発現との統合解析を行った結果、特徴的なエピゲノム異常が遺伝子の約半数で見られ、遺伝子転写異常の基盤となっていることを明らかにした(Blood, 2016)。さらにこれらの制御するEZH1/2が責任遺伝子であり、ATL及びHTLV-1感染細胞に対する新たな分子標的として有用であることを証明した。ATL細胞での遺伝子発現異常について、これまでATL細胞では多くの遺伝子が過剰発現しており、そのうちCASPASE8、HELIOSなどのmRNAは、異常なスプライシング・バリアントを多く含むことが分かった。そこでH27年度は、健常人CD4+ T細胞(n=8)と急性型ATL患者PBMC (n=16)より単離したmRNAについて、エクソン・アレイ解析を行い、ATL細胞中の異常なmRNAを網羅的にプロファイルした。その結果、正常細胞に比べATL細胞では約10,000種類のmRNAにおいて、エクソンの欠損または重複が有意に起こっているという結果を得た。このようなmRNAの“質"の変化は、コードされるタンパク質の機能に直接関わるものであり、ATL細胞の分子異常の基盤の一つを成していると予想している。今年度の成果により、ATL細胞の遺伝子発現の量の異常の背景に、これまでに明らかにしてきたシグナル伝達系の活性化に加え、エピゲノム変化による転写制御異常が極めて重要であることがわかった。さらに、これまでに研究が行われなかった翻訳制御にも取り組み、遺伝子の転写、翻訳の両過程において異なる遺伝子制御を行うことにより、より複雑な遺伝子の脱制御が起こっていることが示された。つまりATL細胞は、セントラルドグマの複数のメカニズムにおいて多段階の異常を包含する。これらの研究成果はATL細胞における遺伝子発現の量の制御の実態であり、原因となるメカニズムに対して多角的に標的とすることにより、より効果的かつ特異的な分子標的療法へとつながると考えられた。またこれらの異常がHTLV-1感染によって引き起こされることも確認しており、ATL細胞の発生と進展における基本的な分子メカニズムとして重要であることが示されている。またそれぞれを特異的に阻害する化合物の選定とその評価も順調に進んでいる。

ATL細胞での遺伝子発現の質的異常については、H27年度は健常人CD4+ T細胞(n=8)と急性型ATL患者PBMC (n=16)においてエクソン・アレイ解析を行った。将来的には次世代シーケンサーによるRNAシーケンスを視野に入れ準備を進めているが、より安価で解析のしやすいエクソン・アレイ解析においても、ATL細胞で発現しているmRNAの質的異常の規模が明らかになりつつあり、データベース化にむけて重要なデータセットを取得できたと考えている。ATL細胞におけるエピゲノム異常(ヒストンのメチル化、ユビキチン化、アセチル化、RNApol IIの結合パターン)、NF-kBなどの転写因子群の結合パターン、及びATL及びHTLV-1感染細胞のtranscriptomeを複合的に解析し、ATL細胞における遺伝子発現パターン及びその原因を明らかにした。さらに転写制御の起点となるEZH1/2の異常を同定し、さらに新規EZH1/2阻害剤の開発と臨床研究への橋渡しにも成功した。またATL細胞におけるTAK1-p38-eIF4Eの活性化、eIF4Aの活性化、及びmicroRNAの大規模な発現減少をそれぞれ発見し、ATL細胞における遺伝子翻訳の異常な活性化の存在を明らかにした。さらにリボソーム解析と発現アレイを組み合わせた翻訳標的遺伝子群の同定に成功し、ATL細胞の新たな特徴と分子標的としての可能性を明らかにした。ATL細胞のmRNAスプライシング異常について、健常人CD4+ T細胞(n=8)と急性型ATL患者PBMC (n=16)でエクソン・アレイ解析を行い、ATL細胞での約10,000 mRNAのエクソン欠損・重複を見出した。次にATLで過剰発現が顕著なmRNA (CADM1, EVC, MAP3K14, MYB, TIAM2など)にエクソンが欠損するパターンが集積していることを見出し、異常タンパク質の過剰発現の可能性を示した。また我々の遺伝子発現アレイ解析(GSE33615)との統合解析からATL細胞では多くのスプライシング・ファクターが発現低下しており、スプライシング制御不全との関連が示唆された。さらにHAS-Flow法によりATL患者より分取した細胞でもエクソン・アレイ解析を行い、不死化・腫瘍化過程でのスプライシング異常の蓄積の様子を明らかにしつつある。以上、本研究によりHTLV-1感染細胞の多段階発がん過程における遺伝子制御異常の実態が明らかになった。成人T細胞白血病(ATL)、及びHTLV-1感染細胞の全遺伝子発現、エピゲノム、スプライシング、遺伝子翻訳の異常を網羅的且つ統合的に解析し、ATL細胞の複雑な成立過程の一端を明らかにした。HTLV-1感染初期に誘導されるエピゲノム異常を起点に遺伝子発現異常が起こり、さらにmRNAスプライシングの異常が蓄積していく様子を明らかにした。この遺伝子発現の量と質の変化は、NF-κB経路、Hedgehog経路、TAK1-p38経路などの活性化を引き起こし、ATL細胞の表現型を規定していることがわかった。さらに複数の治療標的候補分子を同定し、各種阻害剤の有効性と特異性に関する非臨床POCを取得した。
ダクトからの騒音低減のための音場解析

空調装置などのようにダクト開口端からの騒音の低減は,環境問題でも重要な課題の一つになっている.以下に報告する研究実績はすべてダクトからの騒音低減の数値シミュレーションに関している.著者は,まずダクト内部に膨張型空洞部を設け,その空洞部の寸法を変化させ,ダクト内部音場特性を調べた.その結果,特定の空洞部半径に対し消音器として有効であることがわっかた.これに関しては「ダクト内の音場への空洞部の影響」と題して機械学会論文集に発表した.次に,ダクト開口端でのフランジの有無およびその形状,位置による開口端からの音の放射とその外部放射音場特性に及ぼす影響について数値解析した.これについては,JSME International Journalに「Finite Difference Solutions to Sound Radiation from Cylindrical Ducts」と題して発表した.さらに,ダクト開口端に空洞部を取り付けることにより外部放射音場への音の低減が可能であることを明らかにした.これについては,第26回流体力学講演会において「トンネル出口形状の音波放射に及ぼす影響」および第8回数値流体力学シンポジウム講演会にて「外部放射音場へのダクト出口空洞部の影響」と題して発表した.ダクト管内音場では従来より,管壁が固定壁としてモデル化されているが,実際には内部音場と連成し管壁も微小であるが振動する.この問題に対し,「弾性壁円管内の音の伝播特性」と題して第8回数値流体力学シンポジウム講演会にて発表した.空調装置などのようにダクト開口端からの騒音の低減は,環境問題でも重要な課題の一つになっている.以下に報告する研究実績はすべてダクトからの騒音低減の数値シミュレーションに関している.著者は,まずダクト内部に膨張型空洞部を設け,その空洞部の寸法を変化させ,ダクト内部音場特性を調べた.その結果,特定の空洞部半径に対し消音器として有効であることがわっかた.これに関しては「ダクト内の音場への空洞部の影響」と題して機械学会論文集に発表した.次に,ダクト開口端でのフランジの有無およびその形状,位置による開口端からの音の放射とその外部放射音場特性に及ぼす影響について数値解析した.これについては,JSME International Journalに「Finite Difference Solutions to Sound Radiation from Cylindrical Ducts」と題して発表した.さらに,ダクト開口端に空洞部を取り付けることにより外部放射音場への音の低減が可能であることを明らかにした.これについては,第26回流体力学講演会において「トンネル出口形状の音波放射に及ぼす影響」および第8回数値流体力学シンポジウム講演会にて「外部放射音場へのダクト出口空洞部の影響」と題して発表した.ダクト管内音場では従来より,管壁が固定壁としてモデル化されているが,実際には内部音場と連成し管壁も微小であるが振動する.この問題に対し,「弾性壁円管内の音の伝播特性」と題して第8回数値流体力学シンポジウム講演会にて発表した.
地域高齢者のための「易転倒性」評価法の確立

本研究の目的は、転倒予防の視点から地域高齢者の転倒状況と身体活動能力等を3年間縦断的に観察し、易転倒性の評価法を検討することである。最終年度である本年度は、まずは対象者の転倒調査から横断的に転倒に関連する活動能力指標について解析した。<結果>1.平成15年10月に実施した聞き取り調査では、ベースライン時(平成12年10月)の対象者(男134名、女250名)のうち、男74名、女137名の計211名が参加した。2.過去1年間の転倒について聞き取った結果、男性で4名(5.4%)、女性で23名(16.8%)が転倒していた。この1年間の骨折者は7名(男性1名、女性6名)であり、骨折部位はろっ骨2名、前腕骨3名、脊椎圧迫骨折1名、踵骨1名であった。3.転倒者の平均年齢は男女とも転倒していない者より高かったが、有意差はなかった。女性では"普段よくつまずく"とした者での転倒者の割合が有意に高かった。4.開眼片足立ち時間が30秒未満を静的バランス力不良、タンデム歩行6歩不可を動的バランス力不良とした。女性ではそれぞれのバランス不良者での転倒者の割合は25.0%、30.0%であり、バランス良好者での割合(それぞれ10.8%、11.1%)に比べて有意に高かった。男性ではバランス力と転倒者の割合に有意な関係はみられなかった。5.歩行速度などから評価する脚力は男女とも転倒の割合と有意に関係していなかった。6.さらに縦断的観察による易転倒性の関連要因について解析を継続中である。初年度は、横断的観察から地域高齢者の転倒状況とそれに関連する要因について検討した。1.対象は、調査の呼びかけに同意して地域公民館に出向いた住民6079才の男134名、女250名とした。2.聞き取りによる過去1年間の転倒歴がある転倒者は、男20名(14.9%)、女54名(21.6%)と女性の方が多く、複数回転倒者(男4名、女13名)も女性に多くみられ、60代より70代でより転倒していた。転倒者74名より得られた、のべ87件の転倒の状況は、転倒場所については屋外(男95.5%、女52.3%)がもっとも多く、次いで、屋内-自宅(男4.5%、女33.8%)、屋内-自宅外(男0%、女13.8%)であった。転倒のきっかけは、屋外については「すべった」(男23.8%、女47.1%)、「つまずいた」(男42.9%、女29.4%)が多く占め、女性の自宅では「つまずいた」(40.9%)の他「ふらついた」「踏み外した」などがみられた。転倒後の受傷は、転倒87件中51件でみられ、打ち身や打撲ほか骨折が5件(女5名)発生していた。3.転倒者の身体的ADL(activities of daily living)は、1回転倒者では転倒しない者と同様に78割が歩行や階段昇降に困難を感じていなかったが、複数回転倒者では17名中9名がそれらに困難を感じ、3名が歩行補助具を使用していた。脚力の指標となる歩行や椅子立ち座りの速度は、転倒者で有意に低く、性、年令を補正後も転倒者に有意な低下が認められた。バランス不良者(開眼片足立ち時間<10秒)の割合も性や年令を補正後、転倒者で多い傾向がみられた。また男女とも転倒者では普段からつまずく傾向を自覚している者の割合が有意に高く、女性では、脳血管障害の治療または既往の割合が転倒者で有意に高かった。散歩や定期的な運動習慣を持つ者の割合は、転倒者と転倒しない者の間に有意差がみられなかった。本研究の目的は、地域高齢者を対象に転倒状況と身体活動能力等を3年間縦断的に観察し、転倒予防の視点から易転倒性の評価法を検討することである。本年度は、ベースライン調査より1年間が経過し、その間の対象者の転倒状況や身体活動能力を追跡した。<結果>1.平成13年10月に実施した調査では、ベースライン時(平成12年10月)の対象者(男134名、女250名)のうち、男88名、女174名の計262名が参加した。2.過去1年間の転倒について聞き取ったところ、男性では9名(10.2%)、女性では27名(15.5%)が転倒していたが、これらはベースライン時の転倒率(男11.5%、女21.9%)より低かった。女性では複数回の転倒者が4名あった。2年間とも転倒歴があったのは男2名、女11名であった。転倒場所は男性では9名(100.0%)、女性では20名(74.1%)が屋外で転倒していた。またこの1年間の骨折者5名のうち、3名は転倒による骨折(手首、足甲2)であった。

3.今年度の転倒者では、転倒していない者に比べて年令差はなく、歩行速度や椅子立ち座りの速さに有意な違いはみられなかったが、転倒者女性では普段つまずく者の割合は有意に高かった。バランス不良者(開眼片足立ち10秒以下)の割合は転倒者とそうでない者で有意差はみられなかった。本研究の目的は、地域高齢者を対象に転倒状況と身体活動能力等を3年間縦断的に観察し、転倒予防の視点から易転倒性の評価法を検討することである。本年度は、ベースラインから2年めであり、その間の対象者の転倒状況を追跡調査した。<結果>1.平成14年10月に実施した聞き取り調査では、ベースライン時(平成12年10月)の対象者(男134名、女250名)のうち、男81名、女133名の計214名が参加した。2.過去1年間の転倒について聞き取ったところ、男性では4名(4.9%)、女性では20名(15.0%)が転倒していた。女性では転倒者の半数10名が複数回の転倒を起こしていた。転倒場所は男性では4名中3名が、女性では20名中10名が屋外であった。またこの1年間の転倒による骨折者は7名であり、骨折部位はろっ骨3名、大腿骨頸部2名、脊椎1名、中足骨1名であった。3.今年度の転倒者では転倒していない者との間に年令差はなかった。転倒者女性では転倒なしの女性より普段つまずく者の割合は有意に高かったが、転倒者男性では全員が"普段つまずくことはない"としていた。4.転倒調査は次年度にもおこない、対象者の縦断的観察を継続する予定である。本研究の目的は、転倒予防の視点から地域高齢者の転倒状況と身体活動能力等を3年間縦断的に観察し、易転倒性の評価法を検討することである。最終年度である本年度は、まずは対象者の転倒調査から横断的に転倒に関連する活動能力指標について解析した。<結果>1.平成15年10月に実施した聞き取り調査では、ベースライン時(平成12年10月)の対象者(男134名、女250名)のうち、男74名、女137名の計211名が参加した。2.過去1年間の転倒について聞き取った結果、男性で4名(5.4%)、女性で23名(16.8%)が転倒していた。この1年間の骨折者は7名(男性1名、女性6名)であり、骨折部位はろっ骨2名、前腕骨3名、脊椎圧迫骨折1名、踵骨1名であった。3.転倒者の平均年齢は男女とも転倒していない者より高かったが、有意差はなかった。女性では"普段よくつまずく"とした者での転倒者の割合が有意に高かった。4.開眼片足立ち時間が30秒未満を静的バランス力不良、タンデム歩行6歩不可を動的バランス力不良とした。女性ではそれぞれのバランス不良者での転倒者の割合は25.0%、30.0%であり、バランス良好者での割合(それぞれ10.8%、11.1%)に比べて有意に高かった。男性ではバランス力と転倒者の割合に有意な関係はみられなかった。5.歩行速度などから評価する脚力は男女とも転倒の割合と有意に関係していなかった。6.さらに縦断的観察による易転倒性の関連要因について解析を継続中である。
加齢性嗅覚障害の病態生理解明とその診断治療法開発のための分子生物学的研究

1カロリー制限により加齢に伴う嗅粘膜変性が悪化した。またカロリー制限は傷害後の嗅神経組織の再生を悪化させ、その背景に基底細胞の分裂能低下があることが示唆された。2Poly(I:C)経鼻投与により感冒罹患後嗅覚障害のモデルマウスを作成し、本モデルにおいて嗅粘膜に浸潤する好中球、特にその放出するエラスターゼが嗅神経上皮の主要な組織傷害因子であることが示唆された。3エストロゲンはERβを介して鼻粘膜の恒常性維持に関与していることが示唆された。4FAT-1マウスは嗅粘膜傷害後の神経組織再生が対照群に比べて良好であり、生体内脂肪酸組成が嗅粘膜傷害後の再生過程に関与することが示唆された。嗅神経上皮は生理的状態で神経細胞のターンオーバーがあり、傷害時にはこの機能が賦活化されて組織再生が起こるという高い再生能がある。しかしながら加齢に伴って再生能は低下し、結果として神経上皮の不可逆的な変性が起こる。従って加齢に伴う嗅覚障害克服のための一助として、嗅神経上皮の変性を抑止するための予防戦略が求められている。カロリー制限は長寿遺伝子の発現や酸化ストレスの軽減を介して哺乳動物において寿命、代謝疾患、循環器疾患、神経疾患などさまざまな老化関連疾患の発症を抑える唯一の確実な介入として知られており、耳鼻咽喉科領域では我々の研究グループがマウスにおいてカロリー制限が加齢性難聴の進行を抑止できることを報告している。本研究では末梢嗅覚器においてもカロリー制限によって同様の加齢変化の抑止がみられるかを検討した。【対象と方法】実験1ではICRマウスをコントロール群と32%カロリー制限群に割り付け、それぞれカロリー以外の栄養素を同等に調節した専用のペレットを使用して12か月飼育した。飼育後灌流固定、断頭、頭部を脱灰し嗅粘膜の組織切片を作成し嗅粘膜の神経変性の状態を評価した。実験2ではC57B6マウスを同じくコントロール群とカロリー制限群に割り付け1か月飼育したのちメチマゾールの腹腔内投与で嗅粘膜傷害を惹起させた。傷害後2か月の時点で固定、嗅粘膜の組織切片を作成し、傷害後の最終的な再生の程度を評価した。【結果と考察】実験1ではカロリー制限群ではコントロール群に比較して嗅粘膜における神経変性が大きかった。また実験2においてもカロリー制限群はコントロール群と比較して最終的な嗅神経上皮の再生が不完全であった。以上の結果から、カロリー制限は嗅粘膜においては加齢性の神経上皮変性を悪化させること、またそれは傷害時の不完全な再生の蓄積に基づく可能性が示唆された。【緒言】カロリー制限は長寿遺伝子の発現や酸化ストレスの軽減を介して、哺乳動物において様々な老化関連疾患の発症を抑える介入方法とされている。一方で、カロリー制限は細胞増殖を抑制し、創傷治癒が遅延するなどの負の効果も知られている。本研究では、カロリー制限が嗅覚システムにどのような影響を与えるのかについて、組織学的な解析を行った。【対象と方法】C57BL6マウスをカロリー制限群と対照群の2群に分けて飼育した。それぞれにメチマゾールの腹腔内投与により可逆的な嗅上皮傷害を与え、傷害後1週の時点で基底細胞の増殖能を、傷害後2ヶ月の時点で成熟嗅細胞数をカウントし2群間で比較した。【結果と考察】カロリー制限群では対照群に比べ傷害後1週の時点で嗅上皮基底細胞の増殖が有意に少なく、また傷害後2ヶ月の時点で成熟嗅神経細胞数が有意に少なかった。カロリー制限は嗅上皮傷害後の再生過程において新生細胞の産生量低下を誘導し、結果として嗅覚機能の低下を引き起こすと予想する。ICRマウスを2群に分け、コントロール食(28kcal/週)とカロリー制限食(18kcal/週)を与え10ヶ月長期飼育したのちolfactory habituation-dishabituationtestによる嗅覚の評価を行い、マウスを潅流固定し嗅粘膜の組織切片を作成した。切片にHE染色及び抗olfactory marker protein(OMP)抗体染色を行い嗅神経上皮の変性の度合いを半定量評価したところ、カロリー制限群ではコントロール群に比較して有意に嗅神経上皮の変性が大きかった。また嗅覚検査でもカロリー制限群はコントロール群に比較し反応が悪い傾向にあった。次にカロリー制限が嗅粘膜傷害からの再生過程に及ぼす影響を評価した。C57BL6マウスを2群に分け、上記コントロール食とカロリー制限食を1ヶ月投与ののちメチマゾールで嗅粘膜傷害を惹起し、傷害後1週間目、2ヶ月目でそれぞれマウスを潅流固定し嗅粘膜の組織切片を作成した。

切片に抗Ki67抗体と抗OMP抗体による免疫染色を行い傷害後の細胞増殖と神経再生の程度を検討したところ、傷害後1週間の組織でKi67陽性細胞数はカロリー制限群で有意に少なく、また傷害後2ヶ月の組織でカロリー制限群は有意に嗅神経上皮の変性部位が大きかった。これらの結果より、カロリー制限により加齢に伴う嗅粘膜の変性が促進されること、その背景に基底細胞の分裂能低下による傷害時の神経再生の低下があることが示唆された。各実験群の動物モデル作成は終了し、組織学的解析も順調に進行しているが、遺伝子解析や蛋白解析が当初の予定よりも遅れており、今後早急に遂行する必要がある。カロリー制限という全身状態が嗅粘膜の細胞動態に影響を与えうることが組織学的に確認され、今後研究を進める上で最も重要な現象の変化を捉えることに成功した。これにより、今後変化の背景にある分子メカニズムを解析するための道筋がつけられた。本年度の研究成果からカロリー制限は嗅粘膜においては加齢性の神経上皮変性を悪化させること、またそれは傷害時の不完全な再生の蓄積に基づく可能性が示唆されたが、今後はこの現象の背景にある分子生物学的メカニズムを解析するため嗅粘膜における遺伝子発現、蛋白発現の変化をDNAマイクロアレイやPCR,ウェスタンブロット等で解析する。DNAマイクロアレイ法及びリアルタイムPCR法を用いて、カロリー制限マウスの嗅粘膜でupregulateまたはdownregulateされる細胞サイクル、増殖因子などの遺伝子群を同定する。この情報からターゲットを絞り、カロリー制限による嗅神経上皮の基底細胞の増殖能低下の背景にある分子メカニズムの解析を進める。さらにこの分子機構を人為的に制御し、逆に細胞増殖を亢進させることで傷害後の嗅神経上皮の再構築を改善できるかどうかを検討し、将来的な予防治療法の可能性について探る。上記の分子生物学的解析に必要となる試薬の購入が中心となる。これに加えて継続遂行中の組織学的解析に必要な抗体等の試薬を購入する予定である。次年度は上記の解析を行うためカロリー制限モデルマウスを再度作成し、傷害後経時的に組織を採取する必要がある。したがって動物の購入費用、カロリー制限食及びコントロール食の購入、抗体等試薬の購入および成果発表のための旅費に研究費を使用する予定である。
数学的構造における決定手続きの研究

本年度は,構造とその中である述語で定義される部分構造との関係を中心に研究を行なった.L-構造Mがあるとする.Lに一変数述語PがあるときN=M^Pを考えるとNは自然にL^-=L\{P}構造になる.ここで,Nの中の関係が外側のMの中で定義されるとすると,それはすでにNの中で定義されているという状況を考える.このときMはN上reduction propertyをもつという.この性質を厳密に定義しようとすると何通りかの定義が考えられる.そこで,O-reduction property,reduction property,strong reduction property,uniform reduction propertyという性質を提唱し,これらの性質の相互関係を調べ,またこれらの条件のもとでNの性質がどの程度Mに移るかを調べた.Mの理論が安定の場合はO-reduction propertyがstrong reduction propertyを除いて最も強く,reduction propertyとuniform reduction propertyが同値になる.一般にはstrong reduction propertyからreduction propertyが導かれるが,他のものは独立な性質になることが分かった.Mが可算モデルのとき,その理論がP上極小でstrong reduction propertyをもつならばNの〓_0-範疇性はMに移る.0-reduction propertyしか成り立たない場合には,構造を増やしてこの反例に拡張する一般的方法を与えた.さらに,Mの理論TがP上極小でuniform reduction propertyをもつ場合,Nの理論T^-が〓-安定ならばTもそうなり,また単次元性も移ることを示した.O-reduction propertyだけある場合は,上と同様に反例に拡張できる.他に,非決定性と交代Turing機械の間の関係,n×n盤上のオセロゲームの計算量の決定,ジャンプナンバー問題に関する研究などを行なった.本年度は,構造とその中である述語で定義される部分構造との関係を中心に研究を行なった.L-構造Mがあるとする.Lに一変数述語PがあるときN=M^Pを考えるとNは自然にL^-=L\{P}構造になる.ここで,Nの中の関係が外側のMの中で定義されるとすると,それはすでにNの中で定義されているという状況を考える.このときMはN上reduction propertyをもつという.この性質を厳密に定義しようとすると何通りかの定義が考えられる.そこで,O-reduction property,reduction property,strong reduction property,uniform reduction propertyという性質を提唱し,これらの性質の相互関係を調べ,またこれらの条件のもとでNの性質がどの程度Mに移るかを調べた.Mの理論が安定の場合はO-reduction propertyがstrong reduction propertyを除いて最も強く,reduction propertyとuniform reduction propertyが同値になる.一般にはstrong reduction propertyからreduction propertyが導かれるが,他のものは独立な性質になることが分かった.Mが可算モデルのとき,その理論がP上極小でstrong reduction propertyをもつならばNの〓_0-範疇性はMに移る.0-reduction propertyしか成り立たない場合には,構造を増やしてこの反例に拡張する一般的方法を与えた.さらに,Mの理論TがP上極小でuniform reduction propertyをもつ場合,Nの理論T^-が〓-安定ならばTもそうなり,また単次元性も移ることを示した.O-reduction propertyだけある場合は,上と同様に反例に拡張できる.他に,非決定性と交代Turing機械の間の関係,n×n盤上のオセロゲームの計算量の決定,ジャンプナンバー問題に関する研究などを行なった.
ナカドマリンAの不斉全合成研究

分子内Pauson-Khand反応では、四級炭素形成を伴うビシクロ[4.3.0]骨格の構築は従来困難とされていたものの、今回、反応を助長させるような基質の設計を行うことにより、その閉環が進行することを見出した。この概念に基づいた合成を行うことにより、当初計画していた多環状骨格を有する(+)-ナカドマリンAの高立体選択的かつ効率的な形式不斉全合成を達成したばかりでなく、短工程での(±)-メロシンの全合成にも至った。一方、自身らが開発したアレン-アルケン体の分子内Pauson-Khand型反応を用いれば、上記のような基質特異性を利用することなく四級炭素形成を伴うビシクロ[4.3.0]骨格の構築が可能であり、その一般性を明らかなものとした。本年度はPauson-Khand反応を活用したナカドマリンAの効率的不斉全合成に取り組んだ。その結果、L-ピログルタミン酸を出発物質として、天然品のエナンチオマーである(+)-ナカドマリンAの形式全合成を達成した。6環構造(A-F環)を有するナカドマリンAの核となるABD環部分の合成として、アルキン末端にアルキル鎖を有するエンイン体を用いてPauson-Khand反応を行ったが目的の閉環体は全く得られなかった。種々検討した結果、アルキン末端のα位に二重結合を導入したジエンイン体を、Co_2(CO)_8と^nBuSMeを用いたPauson-Khand反応の条件に付したところ、良好な収率かっ高立体選択的に目的の三環性化合物が得られることを見出した。当初予定していたアレニルアルケン体を用いたPauson-Khand型反応を用いずとも反応が進行したため、続いてその後の環構築を行った。得られた環化体の二重結合、つまりPauson-Khand反応で必要であった二重結合部分をジオールに変換後、酸と処理することによりフラン環(C環)が生成した。このように、アルキン末端に導入した二重結合はPauson-Khand反応の反応性を促進するのみならず、その後のフラン環合成の足がかりとしても利用可能であった。ABCD環の構築後にA環上の不要な二重結合を還元すべく接触還元に付したところ、歪んだフラン環が優先的に還元された。これまでに報告されているナカドマリンAの合成研究でも同様の問題が報告されており、その直接的な解決法は見出されていなかった。しかしながら、D環上のアミン部の保護基を種々検討したところ、Fmoc基に変換することにより位置選択的な還元が進行し、目的物が得られることを見出した。これはおそらくFmoc基がフラン環部分を覆うように位置して還元を防いでいるためだと考えている。最後に閉環メタセシスによるE環構築とその後の官能基変換を経て(+)-ナカドマリンAの形式合成に至った。来年度はPauson-Khand反応で得られた環化体の環拡大反応を検討し、類縁化合物であるマンザミンAやイルシナールAの合成を行う予定である。1,昨年度までにPauson-Khand反応を利用したナカドマリンAの形式不斉全合成を達成した。通常のエンイン体を用いたPauson-Khand反応では、四級炭素構築を伴うビシクロ[4.3.0]誘導体の合成は困難である。しかしながら、アルキンに多重結合成分を連結することにより、その閉環が実現することを見出し、6環性構造(AF環)を有するナカドマリンAの5-6-5員環(ABD環)に相当する骨格の構築に適用することができた。新たに得られたこの知見をもとに、今年度はメロシンの全合成を行った。本合成では、側鎖のベンゼン環のテンプレート効果を巧みに利用したエンイン体のPauson-Khand反応により、5環性構造のメロシンの核となる5-6-5員環の構築が実現可能であった。その後、各種官能基変換を経て、目的のメロシンの全合成を達成した。四級炭素の構築に加え、二環性化合物を一挙に合成できる本法は、天然物合成の効率化に大きく寄与しており、本合成経路はこれまでに報告されている経路に比べて格段に工程数の短いものとなった。2,ナカドマリンAの全合成では当初、自身らが開発したロジウム触媒によるアレン-アルケン体の分子内Pauson-Khand型反応を利用する予定であった。本法は、閉環を助長するような反応部位を設計することなく四級炭素構築を含むビシクロ[4.3.0]誘導体の合成が可能である点で、基質特異性を利用する1のような従来法とは一線を画している。
骨－感覚神経連関の解明と骨粗鬆症治療薬への応用

本研究では、骨への感覚神経の投射が健康な骨の発達に寄与することを証明した我々の研究(Nature 2013)を発展させ、感覚神経による骨代謝調節機構の詳細なメカニズムの解明を目的としている。はじめに、感覚神経と骨との解剖学的な連関を明らかにするために、マウスの骨髄内にGFP発現神経トレース剤を投与する実験を行った。トレース剤の投与後、経時的に脊髄の組織切片を作成したところ、後根神経節(DRG)内にGFPを発現する多数の感覚神経細胞を認めた。次に、感覚神経と骨芽細胞の機能的な連関を明らかにするために、オプトジェネティクスの手法を用いて感覚神経を刺激し、それが骨芽細胞に与える影響を検証した。具体的には、アデノ随伴ウイルスにてチャネルロドプシン2 (ChR2)を発現させたDRGを青色光で刺激し、骨芽細胞における応答を対照群と比較した。しかし、DRGを一過性に青色光で刺激しても、骨芽細胞の有意な応答を確認することは困難であった。生理的条件化において、骨芽細胞は恒常的に感覚神経からのシグナルを受容していると考えられ、オプトジェネティクスの手法を用いた一過性の刺激では、生理的な状況を再現することが困難であることが示唆された。そこで、特定の神経活動を持続的に操作するために、DREADD (Designer Receptor Exclusively Activated by Designer Drug)システムによる感覚神経活動操作法の確立に着手した。現在、人工リガンドであるクロザピンーN-オキサイド(CNO)の添加による感覚神経活動の活性化を検討中である。さらに、感覚神経と骨の関係性を三次元的に評価するために、2017年から骨組織の透明化技術の開発に取り組んでいる。2018年度はさらに技術開発を進め、組織の破壊が最小限に抑えられた質の高い骨内の神経・血管系の可視化に成功した。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。感覚神経活性化による骨芽細胞へのシグナル伝達を、骨芽細胞内Caの濃度変化を指標に解明するため、マウス胎児から後根神経節(DRG)を単離・培養する技術を習得し、DRGと骨芽細胞を共培養するシステムを確立した。共培養の結果、蛍光ラベルしたDRGから発芽・分岐する感覚神経線維の一部が骨芽細胞に投射している像を確認できた。さらに、感覚神経を種々の薬剤で活性化し、骨芽細胞の細胞内Caの濃度変化をfluo-4を用いたCaイメージングにて観察した。また、生きたマウスのDRGに直接、ウイルスを投与する技術を確立し、アデノ随伴ウイルスを用いてDRGにおけるチャネルロドプシン2(Ch2)の発現誘導を試みた。アデノ随伴ウイルスのDRGへの投与から2週間後に組織切片を作成したところ、DRGにおけるChR2の発現が確認された。加えて、DRGを酵素処理して細胞培養用ディッシュに播種したところ、single cellでもChR2の発現が認められた。感覚神経系からのシグナルを受容する骨芽細胞をFACSにて単離し、その遺伝子発現を解析するため、マウス脛骨から骨芽細胞を単離する方法を検討した。脛骨を破砕・酵素処理し、抗ALP抗体等を用いて骨芽細胞を単離する方法が最適であることを見出した。さらに、一般的な免疫染色による二次元的な組織学的解析では骨内の感覚神経の走行の把握に限界があるため、三次元的に感覚神経と骨の関係性を解析することを目指した。近年開発された組織透明化技術を改良し、Sox10-Venusマウスを用いて骨組織の透明化技術の開発を進めた。申請1年目で、骨と感覚神経の連関を解明するために必要な新規実験系・解析系の確立に成功したため。