hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
水晶振動子法による脂質汚れ洗浄過程のモデル的研究

本年度はこれまで固体脂質モデルとしてトリパルミチン、トリミリスチン、セチルアルコール、パルミチン酸を水晶振動子電極表面に付着させ、これらの固体脂肪表面への界面活性剤の吸着と、それに続く可溶化による汚れ分子の脱離過程について調べてきた結果を整理、解析した。いずれも固体脂肪の除去機構を共振周波数から追跡したが、特にアルカリ剤による脂肪の膨潤過程が観察され、これにより固体脂肪の除去の速度が大きく影響されることが示唆された。さらにこの膨潤と脱離の過程をより詳しく解析することを目的として、共振周波数と同時にアドミッタンス指標から脂肪の状態を測定した。また、脂肪モデルとしてより人間の脂肪汚れに近いラード、牛脂を使用し実験を行ない、トリパルミチンなどの除去過程と比較した。その結果、これらの脂肪ては、まず極めて短時間に脂肪表面への活性剤の吸着、内部への拡散、その後の脂肪の脱離が続いて起こっていると考えられる。またトリパルミチン、トリミリスチンの除去について、陰イオン界面活性剤ではミセルは関与せず、非イオン界面活性剤ではミセルが関与することが認められたが、ラード、牛脂でも同様に理解されることがわかった。水晶振動子法は振動子表面に付着した基質の脱離状態を共振周波数から重量変化として経時的に測定できる方法である。この方法を用いて洗浄の物理化学的過程を明らかにするため、単純化されたモデル系を設定し、脂肪汚れの洗浄の過程を研究した。具体的には、皮脂汚れ中3分の2を占める脂肪のモデル物質を振動子表面に付着させ洗剤溶液中でその膨潤と脱離過程を追跡した。今年度は昨年度に引き続きトリパルミチン、パルミチン酸と、さらにより皮脂汚れに近い成分の基質であるラード、牛脂を用い、各種界面活性剤(陰イオン系としてDBS、非イオン系としてC_<12>(EO)_7)および市販洗剤(弱アルカリ性洗剤、中性洗剤)による洗浄過程を調べた。その際添加濃度、温度およびpHを変化させて測定した結果、脂肪基質の膨潤、固体脂肪表面および内部への界面活性剤の吸着とそれに続く汚れの脱離過程における共振周波数変化を特定することができ、固体脂肪が除去される際の個々の段階を明らかにした。また、共振周波数変化と共に電極の付着物の粘性変化に伴う共振抵抗の逆数に比例するアドミッタンス指標の変化から、脱離過程における脂肪層の粘性の変化を経時的に追跡し、脂肪汚れの脱離過程についてより詳しい情報を得た。その結果、以下のことを確認した。1)複合汚れのラードの除去過程はトリパルミチンよりパルミチン酸の除去過程によく似ていることから、ラード層は荷電を持った脂肪層としてパルミチン酸と同じような挙動をしている考えられる。2)アドミッタンス変化の測定から膨潤が進むに従って見掛けの粘性が上がる過程があること、除去に従って見かけ粘性は下がって一定値となることを確かめた。共振周波数変化とアドミッタンス変化を測定することにより、基質脂肪汚れの除去と見掛けの粘性変化の過程を観察することができた。3)皮脂汚れに近いラード、牛脂でも除去過程の測定結果からTP、TM同様陰イオン界面活性剤ではミセルは除去に関与せず、非イオン界面活性剤ではミセルが関与することが認められた。
肉腫の免疫モニタリングによる新規治療標的探索

本研究は、治療対象になる希少がんである肉腫患者に対して前向きに採血を行い、免疫モニタリングを行うことである。肉腫に対する標準治療として一般的に行われている手術や抗がん剤治療レジメンが、免疫機能に与える影響を解析することを目的とし、新規治療標的やバイオマーカーの探索を進めてきた。具体的には、免疫機能が受ける影響に治療方法で差を認めることや、抗がん剤が免疫機能に与える影響に個体差があることを確認することで、新たな視点に基づく患者ごとに個別化した免疫療法の開発や、抗がん剤治療と免疫療法との併用療法の開発、また、肉腫における免疫系新規予後マーカーの開発にもつながることが期待している。最終的には、本研究から得られた知見を臨床応用し,骨軟部肉腫患者の治療成績の向上に繋げたいと考えている。今後の推進方策としては、現在論文作成の上で投稿中である。投稿論文における修正及び必要な追加実験を実施しながら、論文採択を目標とする。本研究は、肉腫(骨軟部腫瘍)領域において、標準治療として一般的に行われている手術や抗がん剤治療レジメンが、免疫機能にどのような影響を及ぼすかを解析することを目的とし計画した。免疫機能が受ける影響にレジメン間で差を認めたり、抗がん剤が免疫機能に与える影響に個体差があることが確認できれば、新たな視点による個別化医療開発や、免疫療法との併用療法の開発、また、新規予後マーカーの開発にもつながることが期待される。2015年4月に国立がん研究センター中央病院研究倫理審査委員会の承認を得た上で,悪性骨軟部腫瘍患者のうち,標準治療である1)手術単独例, 2)新規術前化学療法導入例,3)進行例に対する化学療法例の患者を対象に,実地臨床に合わせて各3ポイントでの前向き採血を実施した.採取後,末梢血リンパ球(peripheral bloodmononuclear cell: PBMC)を分離し,一部を凍結保存、一部をflow cytometryにて, T細胞のフェノタイプ・活性化マーカー,各種免疫抑制細胞などの解析した。2017年3月時点で105症例( 1)51例, 2)19例, 3)35例)に対して免疫モニタリング採血を施行した.疾患内訳は,脂肪肉腫28例, UPS15例,骨肉腫12例,粘液繊維肉腫9例,デスモイド8例,軟骨肉腫7例,他26例であった。予定を少し上回るペースでの検体採取ができている。肉腫に対する標準治療として一般的に行われている手術や抗がん剤治療レジメンが、免疫機能に与える影響を解析することを目的とし、新規治療標的やバイオマーカーの探索を進めている。免疫機能が受ける影響に治療方法で差を認めることや、抗がん剤が免疫機能に与える影響に個体差があることを確認することで、新たな視点に基づく患者ごとに個別化した免疫療法や抗がん剤治療と免疫療法との併用療法の開発、さらには、肉腫における免疫系新規予後マーカーの開発にもつながることが期待している。最終的に本研究から得られた知見を臨床応用し,骨軟部肉腫患者の治療成績の向上に繋げたいと考えている。さらなる検体集積、およびT/B/NK細胞のサブセット及び免疫チェックポイント分子発現についても解析を行っていく。その上で骨軟部肉腫特異的な免疫学的マーカーを模索する予定である。今後の推進方策として、現在までに採取し、凍結保存している末梢血検体を用いて、免疫担当関連細胞の解析を行う。具体的には、T・B・NK細胞のフェノタイプ・活性化マーカー、各種免疫チェックポイント分子発現を多重染色法を用いたマルチカラー解析法のためのFlow cytometry(BD社LSR Fortes X-20)を用いて解析を行う。また、各症例の臨床情報との関連を解析し、上記のMDSCなどの免疫抑制細胞とT・B・NK細胞などの免疫関連担当発現との関連を解析し、治療効果や予後関連する免疫抑制細胞及び免疫担当関連細胞を進め、新規治療標的やバイオマーカー開発を行う。本年度は検体収取がメインであったために、次年度以降の解析でさらなる費用負担が必要になるため理由本年度は採取検体の処理、統計解析がメインであったことから、次年度以降のメインの解析でさらなる費用追加の可能性があるため。使用計画解析のための交代購入、発表費用、論文校正費用など現在までに当該計画研究は研究継続中および論文投稿中であり、追加データ解析が必要である。
トップクォーク対と随伴生成されるヒッグス粒子の探索とトップクォーク湯川結合の測定

本研究は、欧州原子核研究機構(CERN)の陽子衝突型加速器LHCのATLAS検出器によって取得するデータを用いて、トップクォーク対と随伴生成されるヒッグス粒子(ttH生成モード)を発見し、トップクォークとヒッグス粒子の結合定数(トップ湯川結合定数)を測定することが目的である。検出器運転に関しては、昨年度まで取り組んでいた業務引き継ぎを行うとともに、今年度で一新されたソフトウェア環境への移行作業にも取り組んだ。昨年度までの2年間で、データ取得システムの責任分担を主とし、ATLAS検出器の運転に従事することで重心系エネルギー13TeVで約36.1 fb-1の統計量のデータを取得した。今年度はそれらのデータを用いて、新たに考案した研究手法の詳細な評価を通じてその解析手法を確立させた。さらに、この手法で定義した各解析領域で多変量解析の最適化・フィッティングの妥当性評価を行うことで、最終結果を公表するに至った。観測されたttH生成は背景事象から1.4σの超過であった。当初の推定よりも背景事象の不定性が高く3σの信号量有意度は達しなかったが、従来よりも優れた解析方法を確立できた。これらの結果をまとめた論文は、来年度前半には出版される予定である。ヒッグスの他の崩壊モードと統合した結果は、背景事象のみと仮定した場合からは4.2σの超過となり、ATLASとして初めてttH生成の証拠を示すことに成功した。この結果をもとにトップ湯川結合の直接測定を行い、標準模型と一致する結果を得た。本研究の解析や検出器運転のグループを代表して成果・進捗を報告したことに加え、広く国際学会でATLASの代表として成果を報告する機会も多く、研究成果を広く発信することができた。29年度が最終年度であるため、記入しない。本研究は、欧州原子核研究機構(CERN)の陽子衝突型加速器LHCのATLAS検出器によって取得するデータを用いて、未だ発見されていないトップクォーク対と随伴生成されるヒッグス粒子(ttH生成モード)を発見し、トップクォークとヒッグス粒子の湯川結合定数を測定することが目的である。LHCの重心系エネルギーの増強に伴い、検出器の再校正が実施されデータの様相も大きく変更された。そのため、再開されたALASの運転に従事し、検出器およびデータ取得、それらの更新事項を十分に理解した。さらに、エネルギー増強によって粒子衝突の振る舞いが変わり、データを用いた背景事象の見積もりは再度最適化が必要となった。そこで、これらの見積もりを行う事で、背景事象・物理現象の理解を行った。現在もこの評価は継続中であり、次年度に取得される高統計のデータとともに評価を詳細に進めていく予定である。研究実施計画にも記した新手法の評価についても解析・評価を始め、ttH生成モードの感度向上の可能性を見出す事ができた。特に、ttH信号量と背景事象量がともに多いシミュレーションの校正領域から信号を優先的に選別する事ができた。本研究は、ATLAS稼働への従事や細部にわたる評価を必要とし、CERN現地での研究活動が非常に重要であった。次年度以降も継続して現地へ赴き、研究課題を充実させていく。今年度のLHCの運転は予定通りに重心系エネルギーを増強したものの、取得されたデータ量では本測定には不十分であった。そのため今年度は、増強されたエネルギーでの先行研究の再現を行い、解析方法の有用性を検討するとともに、検出器およびデータ取得といった、本研究に必要な知識・手法の獲得に多くの時間を割いた。次年度では高統計のデータとともに今年度培ったノウハウを用いて、トップ湯川結合について初めて統計的に有意な測定を期待する。今年度の取得データ量は本研究には不十分であったものの、研究に必要な知識や手法を理解して準備を進めることができた。ATLASの運転に携わることによって、読み出し系モニターの開発とデータ品質の判定に務めた。物理解析のための事象を選別する基準を増強された重心系エネルギーで確認できたが、これによって背景事象の見積もりが増強以前に比べて困難となり、今年度はこの見積もりのために多くの時間を割くこととなった。しかしながら、先行研究の再現と合わせて進めていく中で、解析に使用するツール開発や物理事象の詳細な理解をおおむね順調に進行できたと言える。また、シミュレーションを用いて、発見したいttH生成モードの信号感度向上の新手法を評価した。背景事象校正のための領域からttH信号を優先的に選別し信号領域に回復できる可能性を見出すことができた。詳細な評価や他の新手法については次年度以降に行うが、それらのためのツール開発は今年度中に行った。本研究は,欧州原子核研究機構(CERN)の陽子衝突型加速器LHCのATLAS検出器によって取得するデータを用いて,未だ発見されていないトップクォーク対と随伴生成されるヒッグス粒子(ttH生成モード)を発見し,トップクォークとヒッグス粒子の湯川結合定数を測定することが目的である.LHCの重心系エネルギーは13TeVに増強され,運転再開から2年間で約36.5 fb-1の統計量を得ることに成功している.今年度は従来の研究手法の再現・昨年度から継続して背景事象評価を行なったのち,自身の独自の発想による研究手法改善を行うことによって,ttHの発見の感度向上に努めた.また,この研究で最も大きな鍵となっているのは,背景事象モデリングの系統誤差の低減である.

本研究では,bクォーク由来のjetであるかの同定効率に着目することで,ttH事象を信号領域と背景事象のための校正基準領域を抜本的に見直すことにより,信号感度を従来の手法より約30%向上させることに成功した.これは昨年度におけるttH信号の校正領域からの回復に関する研究の拡張であり,ここで新たに定義した信号領域では,ただ信号量が多いだけでなく2つの主要背景事象のうち一方をほとんど抑制することで,モデリングの系統誤差低減へとつながっている.また,昨年度に引き続きATLASの運転に従事することによって,ATLAS検出器やデータ取得システム,それらの増強点の理解も継続して行った.特に,シリコンストリップ検出器のデータ品質に関する基準の見直しと明瞭化を行い,ATLASシリコンストリップ検出器のエキスパートとして稼働に大きな貢献を果たした.本研究は,ATLAS稼働への従事や細部にわたる評価を必要とし,CERN現地での研究活動が非常に重要であった.次年度以降も継続して現地へ赴き,研究課題を充実させていく.今年度前半は取得データのフィッティングから系統誤差を含めた信号強度の算出を行い,従来の解析結果を再現をおこなった.昨年度から継続して背景事象の見積もりを行い,統計量が不足気味であるものの,重心系エネルギー増強後初となる結果を8月に公表した.今年度のLHC加速器のATLAS実験は,増強された重心系エネルギー13TeVにおいて2年目のデータを取得し,統計量を36.5 fb-1へと大きく増やした.bjetに用いられる同定効率に着目し,系統誤差低減のための独自の手法を提案し,信号領域と校正領域の一新を行なった.CERNには長期に滞在し現地の研究者とも積極的に議論を交え,解析グループでの研究成果の進捗を他の解析グループの前で報告・議論を行なった.進捗は順調であり今夏には結果を公表する予定である.本研究は、欧州原子核研究機構(CERN)の陽子衝突型加速器LHCのATLAS検出器によって取得するデータを用いて、トップクォーク対と随伴生成されるヒッグス粒子(ttH生成モード)を発見し、トップクォークとヒッグス粒子の結合定数(トップ湯川結合定数)を測定することが目的である。検出器運転に関しては、昨年度まで取り組んでいた業務引き継ぎを行うとともに、今年度で一新されたソフトウェア環境への移行作業にも取り組んだ。昨年度までの2年間で、データ取得システムの責任分担を主とし、ATLAS検出器の運転に従事することで重心系エネルギー13TeVで約36.1 fb-1の統計量のデータを取得した。今年度はそれらのデータを用いて、新たに考案した研究手法の詳細な評価を通じてその解析手法を確立させた。さらに、この手法で定義した各解析領域で多変量解析の最適化・フィッティングの妥当性評価を行うことで、最終結果を公表するに至った。観測されたttH生成は背景事象から1.4σの超過であった。当初の推定よりも背景事象の不定性が高く3σの信号量有意度は達しなかったが、従来よりも優れた解析方法を確立できた。これらの結果をまとめた論文は、来年度前半には出版される予定である。ヒッグスの他の崩壊モードと統合した結果は、背景事象のみと仮定した場合からは4.2σの超過となり、ATLASとして初めてttH生成の証拠を示すことに成功した。この結果をもとにトップ湯川結合の直接測定を行い、標準模型と一致する結果を得た。
魚類における配偶システムの系統進化と脳内神経葉ホルモン遺伝子に関する研究

本研究は単系統群を形成するハゼ科ベニハゼ属・イレズミハゼ属を対象に配偶システム(一夫多妻,または一夫一妻)を決定する遺伝的基盤とその系統進化を示すことを目的とする.申請者らはベニハゼ属・イレズミハゼ属について配偶システムを野外調査し,さらに配偶システムを制御すると考えられる脳内神経葉ホルモンであるバソトシン(VT)/イソトシン(IT)に注目し,特に遺伝子の発現様式の変異,つまり転写調節領域の変異を解析し,配偶システムの異なる種間で比較する.これまでの研究により、カスリモヨウベニハゼT. marinae(以後、一夫一妻種と表記)の一夫一妻の成立には、(1)雌による継続的なパートナー選好性の獲得、および(2)雌によるパートナー防衛行動が寄与することが明らかになっており、行動薬理学的な操作実験から(1)にはITが、(2)にはVTが関与することが実証されている。これらの実験はVT、ITおよびペプチド性の各受容体拮抗剤を腹腔内に投与することで実施したが、一般的に体循環中のペプチドは血液脳関門の存在によって脳実質へ到達しないと考えられている.そこで本実験結果が中枢性の効果に依るものであるかは明らかでなかった。そこで、蛍光色素エバンスブルー(投与されると血中のアルブミンと速やかに結合し複合体を形成する)を本種の腹腔内に投与し、低分子量タンパクが脳実質へ到達するかを観察した。組織実験系を最適化したことで、投与2時間以後に固定した個体では脳内の広範囲にエバンスブルー_アルブミン複合体の血管外漏出と思われる蛍光シグナルを確認することができている。これは、先行研究の結果がVT、ITの中枢性の効果によって得られたものであることを強く示唆する結果である。本研究は単系統群を形成するハゼ科ベニハゼ属・イレズミハゼ属を対象に配偶システム(一夫多妻,または一夫一妻)を決定する遺伝的基盤とその系統進化を示すことを目的とする.申請者らはベニハゼ属・イレズミハゼ属で,まだ配偶システムが未知の種を野外調査し,さらに配偶システムを制御すると考えられる脳内神経葉ホルモンであるバソトシン(VT)/イソトシン(IT)に注目し,特に遺伝子の発現様式の変異,つまり転写調節領域の変異を解析し,配偶システムの異なる種間で比較する.28年度は奄美大島においてニンギョウベニハゼが一夫多妻であることが採集した性比より予測できた.またベニハゼ,チゴベニハゼ,アオベニハゼが飼育下で一夫多妻であることが明らかとなった.これらの種は雄を取り除くと最大の雌が雄に性転換し,雄を戻すと小型の雄は雌に性転換した.転写調節領域の遺伝子配列が決定した種は以下のとおりである:エリホシベニハゼ,イチモンジハゼ,チゴベニハゼ,オニベニハゼ,ベンケイハゼ.配列には大きな変異は見られず,これまでの結果と併せると,配偶システムとの相関は見られなかった.遺伝子自体よりも例えば脳内神経の分布の違いが行動を制御している可能性がある.そこで系統的に非常に近縁で一夫一妻の配偶システムを持つカスリモヨウベニハゼ,一夫多妻のアオギハゼを用いて配偶システムの差異を導く雌の社会行動を観察した.さらにホルモン投与あるいは阻害剤を用いて,その機能を検討したところVTが行動に大きく関与していることが明らかとなった.「研究実績の概要」で述べたように当初計画したバソトシン(VT)/イソトシン(IT)に関与する遺伝子,特に転写調節領域と配偶システムとの関係について,これまで明らかになった成果を検討したところ明瞭な対応関係は見られなかった.つまり一夫多妻あるいは一夫一妻でも変異はなく,遺伝子自体よりも脳内神経の分布の違いや,受容体の違いなどが配偶システムに影響していることが明瞭に示唆された.本研究は単系統群を形成するハゼ科ベニハゼ属・イレズミハゼ属を対象に配偶システム(一夫多妻,または一夫一妻)を決定する遺伝的基盤とその系統進化を示すことを目的とする.申請者らはベニハゼ属・イレズミハゼ属について配偶システムを野外調査し,さらに配偶システムを制御すると考えられる脳内神経葉ホルモンであるバソトシン(VT)/イソトシン(IT)に注目し,特に遺伝子の発現様式の変異,つまり転写調節領域の変異を解析し,配偶システムの異なる種間で比較する.これまで転写調節領域の遺伝子配列を一夫多妻のエリホシベニハゼ,イチモンジハゼ,チゴベニハゼ,オニベニハゼ,一夫一妻のベンケイハゼについて決定した.さらに一夫多妻のオキナワベニハゼ,アオギハゼ,一夫一妻のカスリモヨウベニハゼの結果と併せると配列には大きな変異は見られず,配偶システムとの相関は見られなかった.そこで遺伝子自体よりも例えば脳内神経の分布の違いが行動を制御している可能性が考えられることから系統的に非常に近縁で一夫一妻の配偶システムを持つカスリモヨウベニハゼ,一夫多妻のアオギハゼを用いて配偶システムの差異を導く雌の社会行動を観察した.29年度は昨年度に引き続き,VT, ITおよびそれらの受容体拮抗剤を腹腔投与し,配偶システムの形成に寄与する行動の変化を計測した.その結果,一夫一妻種であるカスリモヨウベニハゼにおいて容体阻害によってペア形成の阻害が確認された.

「研究実績の概要」で述べたように当初計画したバソトシン(VT)/イソトシン(IT)が特に一夫一妻の種において雌の継続的ペア選択,雌の配偶者防衛を維持する上で重要な役割を果たすことが示唆された.一夫一妻種では,一夫一妻の形成・維持に重要であることが, VT, ITの受容体阻害によって阻害されることが明らかとなった.一方で一夫多妻種では, VT, ITの投与によりそれらの行動に変化は見られなかった.これらの結果から,本系統における配偶システムの多様化には, VT, ITが関与した行動調節機構が寄与していることが示唆された.本研究は単系統群を形成するハゼ科ベニハゼ属・イレズミハゼ属を対象に配偶システム(一夫多妻,または一夫一妻)を決定する遺伝的基盤とその系統進化を示すことを目的とする.申請者らはベニハゼ属・イレズミハゼ属について配偶システムを野外調査し,さらに配偶システムを制御すると考えられる脳内神経葉ホルモンであるバソトシン(VT)/イソトシン(IT)に注目し,特に遺伝子の発現様式の変異,つまり転写調節領域の変異を解析し,配偶システムの異なる種間で比較する.これまでの研究により、カスリモヨウベニハゼT. marinae(以後、一夫一妻種と表記)の一夫一妻の成立には、(1)雌による継続的なパートナー選好性の獲得、および(2)雌によるパートナー防衛行動が寄与することが明らかになっており、行動薬理学的な操作実験から(1)にはITが、(2)にはVTが関与することが実証されている。これらの実験はVT、ITおよびペプチド性の各受容体拮抗剤を腹腔内に投与することで実施したが、一般的に体循環中のペプチドは血液脳関門の存在によって脳実質へ到達しないと考えられている.そこで本実験結果が中枢性の効果に依るものであるかは明らかでなかった。そこで、蛍光色素エバンスブルー(投与されると血中のアルブミンと速やかに結合し複合体を形成する)を本種の腹腔内に投与し、低分子量タンパクが脳実質へ到達するかを観察した。組織実験系を最適化したことで、投与2時間以後に固定した個体では脳内の広範囲にエバンスブルー_アルブミン複合体の血管外漏出と思われる蛍光シグナルを確認することができている。これは、先行研究の結果がVT、ITの中枢性の効果によって得られたものであることを強く示唆する結果である。「現在までの進捗状況」で述べたようにベニハゼ属やイレズミハゼ属を網羅的に調査するのではなく,特定の種に絞って研究を進めることが望ましいことが明らかとなった.今後は系統的に近縁で一夫一妻の配偶システムを持つカスリモヨウベニハゼ,一夫多妻のアオギハゼに注目し,VT/ITが脳のどの部分でどのように機能しているかさらに追及する方がより大きな成果が上がると考えた.今年度は特に一夫一妻種において、雌が雌間競争・継続的ペア形成を行っている際の脳内VT/IT産生神経細胞の形態、および各受容体の局在・存在量を免疫組織化学的手法により明らかにする。その後、同じ状況に置いた一夫多妻種雌、および平静時の一夫一妻種雌について同様の調査を行い、結果を比較することで雌の社会行動の表現に寄与するVT/ITの機能を明らかにする.これまで述べたように一夫一妻や一夫多妻といった配偶システムの決定にはバソトシン(VT)/イソトシン(IT)が重要な機能を果たすことが示唆される結果が得られた.30年度は最終年度になるのでこれまでの成果を論文としてまとめ投稿する.
内毒素シグナル伝達におけるホスホリパーゼD活性化の分子機構とその役割に関する研究

(1)我々は以前にLPSによりジグリセリド(DG)が産制され、これがNF-κB活性化に必須であることを明らかにした。本研究では、LPS刺激によりマクロファージ細胞の細胞質中のRhoAが膜へ移行し、これが引き金になってPLD/PAPが活性化されたことを明らかにした。(2)LPSによるマクロファージ活性化にはTLR4を介するシグナル伝達が重要であることが近年明らかにされている。lipid Aの構造類似体がLPSのアンタゴニストとして作用することが知られているが、これらアンタゴニストのTLR4を介するシグナル伝達への作用を解析した。その結果、lipid Aの構造類似体アンタゴニストB464とRSM256はLPSがCD14と結合した後のステップを阻害すること、そしてLPS-アンタゴニスト作用はTLR4を介するシグナル伝達の制御であることを示す結果を得た。(3)抗癌物質タキソールは構造的にはLPSと全く異なっているが、マウスのマクロファージに対してLPS様活性を示すことがこれまでに知られていた。そこでタキソールのLPS様刺激の分子メカニズムを解析した。その結果、TLR4・MD-2複合体がLPSだけでなくタキソールのシグナルも伝えることが明らかとなった。また、タキソールはマウスではLPS様活性を示すがヒトではLPS様活性を示さないことが知られているが、TLR4・MD-2複合体の種差がタキソール感受性の種差の原因になっていることも明らかにした。グラム陰性菌の外膜主要成分であるリポ多糖(LPS)は血清中のLPS結合タンパク質と複合体を形成したのち、マクロファージ細胞表面抗原CD14に結合し、この細胞に様々な刺激を伝達する。CD14はGPIアンカータンパク質で細胞質ドメインを持たないため、単独で情報を細胞内へ伝達できず、LPSの刺激情報を伝達するためにはCD14と相互作用する因子の存在が予想されているが、その実体は未だ明らかではない。CD14を介したLPS刺激による細胞応答の初期過程で、NF-kBの活性化、すなわち、NF-kBが細胞質から核内へ移行することが知られており、このNF-kB活性化はLPS刺激後速やかに(1030分)進行し、これがサイトカインなどの生理活性物質の産生に必須である。しかし、このNF-kBを活性化するシグナル伝達分子機構の詳細はまだ明らかではない。我々はLPSがCD14を介してホスホリパーゼD(PLD)およびホスファチジン酸脱リン酸化酵素(PAP)を活性化しホスファチジルコリン(PC)由来の一過性のジアシルグリセロール(DAG)産生を引き起こし、このDAG産生がNF-kBの活性化に必須であることを見い出した。さらに、このLPSによるPLDの活性化とNF-κB活性化のシグナル伝達機構においてPLDの活性化因子であるRhoAが関与することも明らかにした。LPSによるマクロファージ活性化にはTLR4を介するシグナル伝達が重要であることが近年明らかにされている。lipid Aの構造類似体B464とRS M256はマクロファージ系細胞J774.1のLPSによるNF-κB活性化を阻害するアンタゴニスト作用を有している。しかしながら、これらの薬剤はLPSとJ774.1細胞上のレセプターCD14との結合は顕著には阻害しなかった。このことから、アンタゴニストはLPSがCD14と結合した後のステップを阻害すると考えられた。一方、マウスプロB細胞Ba/F3にTLR4とco-receptorであるMD-2を共発現させるとBa/F3はLPS感受性になりNF-κBの活性化が誘導されるようになるが、これらのアンタゴニストはLPSによるNF-κB活性化を抑制した。

このことから、lipid A構造類似体のLPS-アンタゴニスト作用はTLR4を介するシグナル伝達の抑制であることが示唆された。抗癌物質タキソールは構造的にはLPSと全く異なっているが、マウスのマクロファージに対してLPS様活性を示すことがこれまでに知られていた。そこでタキソールのLPS様刺激の分子メカニズムを解析した。Ba/F3細胞株にマウスTLR4とマウスMD-2を共発現させた場合にタキソール刺激によるNFκB活性化が認められた。TLR4のみを発現させた場合は活性化は極めて弱かった。LPS刺激の場合と同じくTLR4とMD-2の両方の発現がNFκBの活性化に必要であることがわかった。さらに興味深いことにヒトTLR4とヒトMD-2を共発現させた場合にはLPS刺激とは異なりタキソール刺激によるNFκBの活性化は見られなかった。以上の結果からTLR4・MD-2複合体がLPSだけでなくタキソールのシグナルも伝えることが明らかとなった。タキソールはマウスではLPS様活性を示すがヒトではLPS様活性を示さないことが知られている。TLR4・MD-2複合体の種差がタキソール感受性の種差の原因になっていると考えられた。
磁気ビーズを用いた新しい血管新生阻害療法の開発

ヒト臍帯由来血管内皮細胞(HUVEC)に磁性ビーズとして、Dynabeads Pan Mouse IgG(直径4.5±0.2μm)とDynabeads Protein G(直径2.8±0.2μm)を結合させてその細胞破壊効果をIn Vitroにて検討した。抗CD31抗体と磁性ビーズを結合させた後に、HUVECと抗CEA抗体-磁性ビーズの複合体を抗原抗体反応により結合させた。細胞・磁性ビーズ複合体を分離し、チューブに懸濁、チューブの底に永久磁石を置くことにより細胞-磁性ビーズ複合体を凝集させた。パルス磁気刺激用の円形コイルの中心にチューブを置き刺激、5秒おきに20回の刺激を行い、細胞の生存率を計測した。走査型電子顕微鏡による形態の変化もあわせて観察した。パルス磁気刺激を受けた細胞生存率はコントロール群と比較し有意に減少した(コントロール群:刺激群;99%:45.3±14.0%(Pan Mouse IgG)、99%:34.7±9.2%)。また、走査電子顕微鏡では、細胞膜を引きちぎることにより細胞傷害をもたらしていることが観察され、がん細胞で認められた所見と一致していた。腫瘍血管に特異的に発現する抗原を標的として磁性ビーズの結合とパルス磁気刺激による新しい血管新生阻害療法に応用できる可能性が示唆された。血管内皮細胞に対する影響を見る前に、癌細胞で磁気刺激に対する影響を検討した。胃癌細胞株MKN45に磁性ビーズとして、Dynabeads Pan Mouse IgG(直径4.5±0.2μm)とDynabeads Protein G(直径2.8±0.2μm)を結合させてその細胞破壊効果をIn Vitroにて検討した。抗CEA抗体と磁性ビーズを結合させた後に、MKN45と抗CEA抗体-磁性ビーズの複合体を抗原抗体反応により結合させた。パルス磁気刺激を受けた細胞生存率はコントロール群と比較し有意に減少した(コントロール群:刺激群;99%:55.7±13.4%(Pan Mouse IgG)、99%:63.9±13.3%)。また、走査電子顕微鏡では、ビーズが細胞膜を貫通したり、細胞膜を引きちぎることにより細胞傷害をもたらしていることが観察された。抗原抗体反応による磁性ビーズの結合とパルス磁気刺激による新しい癌治療法に応用できる可能性が示唆された。
層状超伝導物質へのコインターカレーションによるキャリア数・結晶構造制御と電子物性

実用化に向けての期待から、高井超伝導転移温度(Tc)を持つ、いわゆる高温超伝導物質の研究は社会的にも興味が持たれ、これまで盛んに研究が行われてきた。過去に発見されている高温超伝導物質はいずれも次元性の低い層状構造を有するという共通点があり、この低次元構造が高いTc発現のカギとなっている可能性が指摘されてきた。そこで本研究では、層状窒化物超伝導体LixHfNClに着目した。この物質ではこれまでの本研究により、層間距離を意図的に拡げる、即ち物質の次元性を下げることにより、Tcが約30%程度も上昇するという振舞いを明らかにしてきた。これは理論的にも説明不可能な現象であり、層状物質における高いTc発現のメカニズムを明らかにする知見が得られる可能性がある。そこで本研究では、層状窒化物超伝導体LixHfNClにおいて、層間距離を拡げる前後での光反射率測定を行い、プラズマ周波数の解析からキャリア密度・有効電子質量などの解析を行い、層間距離拡大に伴うTc上昇のメカニズムを明らかにすることを試みた。その結果、層間距離拡大前後で電子伝導面内でのキャリア有効質量はほとんど変化しないことを明らかにした。これは、層間距離拡大に伴うTcの上昇が状態密度の変化によるものではなく、フォノンに加えて電荷やスピン揺らぎなどが系の次元性低下に伴い増大した結果であることを示している。即ち、次元性の低い超伝導物質でこれまで高いTcが観測されてきたのは、おそらくこれらの物質においては既存の理論で期待されるよりもはるかに大きい揺らぎが存在することを示唆しており、今後層状物質における高温超伝導発現機構の解明に繋がる研究成果であると考えている。
絶滅危惧動物の飼育集団に関するＤＮＡ多型と血統の情報による集団構造解析手法の開発

国内コウノトリ集団に多くの子孫を残している基礎個体5羽を対象として、一度に百億塩基以上のDNA配列データの取得が可能な次世代シークエンサーを利用し、遺伝的多様性を評価するために必要なDNA多型マーカーの大規模な開発を実施した。1億8千万本を超える101塩基のDNA配列データを取得し、バイオインフォマティックスによる解析の結果、7万以上の多型マーカー候補を検出した。これらのうち、5羽の基礎個体のすべてについてマーカー型データが得られた約3万8千の多型マーカーを利用して様々な解析を実施し、個体間の遺伝的関係を明らかにした。本年度は、まず、念のため、RRL法に関わるライブラリーの作製条件すなわち制限酵素とサイズフラクションとの組み合わせ等についての追加実験を行い、先に決定した組み合わせが最適であることを再確認した。次に、5羽の各始祖個体におけるSNP候補のマーカー型の検討を行った結果、メジャーアリルホモ型はいずれの個体も23,000程度、マイナーアリルホモ型は約8001,500、ヘテロ型はいずれの個体も15,000程度であり、ヘテロ型の割合は37.538.3%であることが明らかとなった。特定の始祖個体に特異的なSNPアリルの数は、約1,8003,400の範囲の数であった。始祖個体の各二組間でマーカー型が一致したSNPの割合は、最大で57.1%、最小で46.8%であった。さらに、これらの多量のSNP候補のマーカー型データから、始祖個体間の遺伝的関係行列を評価するとともに、主成分分析を実施し、多変量解析の観点から始祖個体間の遺伝的関係の有用情報を得た。国内コウノトリ集団への貢献度の高い個体に対して、大規模シークエンサーを利用したreduced representation library (RRL)法を適用し、一塩基多型(SNP)候補を検出するとともに、各個体のマーカー型を決定した。まず、1羽の血液サンプルから、高品質のゲノムDNAを精製し、様々な4塩基認識の制限酵素でゲノムDNAを切断して、その電気泳動パターンから適切と考えられる制限酵素を選択した。次に、選択した制限酵素で切断したゲノムDNA断片を電気泳動し、サイズフラクションごとにゲノム断片を精製して、ライブラリー作製の最適条件として制限酵素とサイズフラクションの組み合わせを決定した。続いて、国内コウノトリ集団の家系情報をもとに寄与率の高い5羽の基礎個体を選定して、決定した条件に従ってライブラリーを作成し、ライブラリーに含まれる全ゲノム断片の両端100bpの塩基配列をイルミナ社のシークエンサーHiSeq2000を用いて決定した。HiSeq2000によるシークエンスデータの概要は、全体での総リード数、トリミング後の総リード数およびフィルタ済み総リード数は、それぞれ約1億8千6百万、約1億7千6百万および1億2千7百万であった。5羽の個体ごとのフィルタ済み総塩基数に占める高品質塩基数の割合は、いずれも約93%であり、個体ごとのフィルタ済み総リード数は約3千万から2千2百万の範囲であった。SNP候補の検出では、全体で約6千4百万のリード・ペアデータから約1千万のコンセンサス配列が作成された。バイオインフォマティクスを使用して必要な編集を行った結果、最終的に5羽の個体のすべてについてマーカー型データが得られたSNP候補として、ゲノムの全域にわたる約3万5千箇所を検出した。コウノトリについてのこのような多量のSNP候補の検出は、世界で初めての成果と考えられる。平成24年度は、国内コウノトリ集団への貢献度の高い個体について、大規模シークエンサーを利用してゲノムの全域にわたる多量のSNP候補を検出し、各個体のマーカー型を決定するとともに、それらのマーカー型の情報を用いた個体間のゲノム配列の類似性とゲノム関係行列の評価を目的とした。これらのうち、予定課題の9割を占める最も重要な課題である多量のSNP候補の検出と各個体のマーカー型データの取得に成功した。取得した多型データによる個体間のゲノム配列類似性とゲノム関係行列の評価は目下実施中であり、4月末には完了する。本研究で解析の対象とした5羽の基礎個体の後代群の血統データを取り上げ、血統解析により、各後代個体の近交係数、個体間共祖係数などの基本的パラメータの値を評価するとともに、ゲノムに関する有効数などの集団遺伝学的パラメータを算出する。次に、平成24年度に取得した多量のSNP候補のマーカー型データから、5羽の基礎個体間の複数の遺伝的関係行列を評価し、これらの遺伝的関係の情報を後代群の血統情報と統合した集団遺伝学的解析を実施して、血統解析による結果と比較する。また、国内コウノトリ人工飼育集団の遺伝的多様性の評価を行う。さらに、5羽の基礎個体についての多量のSNP型データをより有効に利用するため、当初の研究計画では挙げていなかった主成分分析を追加的に実施して、多変量解析の観点からの基礎個体間の遺伝的関係の情報も得ることとする。

また、RRL法に関わるライブラリーの作製条件すなわち制限酵素とサイズフラクションとの組み合わせに関して、追加実験を行い、先に決定した組み合わせが最適であることを再確認する。なお、本研究での一連の数値解析に係る演算プログラムについては、絶滅危惧動物の人工飼育集団における公式利用に供するため、当初はパッケージ化を図ることを目的としていたが、平成24年度において数値解析の組み立ての観点から検討を加えた結果、既存の複数のプログラムを賢明に組み合わせることにより実施可能と考えられた。そこで、既存のどのようなプログラムをどのように組み合わせることによって実施できるか、その仕様をまとめ、提供することとする。「次年度使用額」の約60万円は、平成24年度に配分を受けた総研究費が申請額を下回ったため、研究の対象個体数、すなわちライブラリー作成や次世代シークエンサーによる解析の対象個体数を減らさざるを得なかったことに依る。結果的に、平成25年度においては、概して120万円の研究費を使用する。平成25年度には、平成24年度に取得したSNPマーカー型データの数値解析研究が主体となるが、素データ量が多量であるため、適当なパソコンとワークステーションの購入を予定し、合わせて60万円を充てる。また、ライブラリー作製の最適条件の検証実験および数値解析に関わる消耗品費として30万円、研究成果の学会発表等のための旅費として30万円を充てる予定である。
複数の環境に適応可能な移動ロボット群向けの分散アルゴリズム設計

本プロジェクトでは、自律移動ロボット群向けの協調および合意問題に対する研究を行う。平成24年度は、自律エージェントのグループがグラフを描くために協調するという拡張問題についての成果を主に得た。研究代表者らは以下の2つのソフトウェアツールを開発した。1つ目のプログラムは、環境の抽象的表現を入力情報としてとり、あらゆる探索アルゴリズムを生成する。本ツールにより、逆に、不能問題にはアルゴリズムが存在しないということを証明することができた。本成果は、他の研究者による既存論文の誤りの指摘に役立っている。2つ目のプログラムは、専門的なモデルチェックツールである。探索プログラムの正確性を自動的にチェックする。環境サイズ、ロボット数といった特定のパラメーターにより、本ツールは(1)アルゴリズムが構文的に正しいか、(2)アルゴリズムが安全か(たとえば、衝突の回避が保証できるか)、そして(3)アルゴリズムが正確か(たとえば、探索が必ず成功するか)を示す。現在のところ、本ツールはリングトポロジーのみで動作する。主な結果を以下に示す・移動ロボット向けの現実的なシステムモデルの定義を行った.ロボットは実際に体積を持ち,連続的な空間を移動できるモデルにおいて,ロボットはお互いに可視な最小限の表面積を持ち存在するように最適な設定で定義をした.結果として,上記のような設定では,任意の台数のロボットに対しての一般化する事はできない.また,最大22台のロボットに対して幾何学的な観点から特別な場合がある2点を発見した.我々は,現在,集合問題を一般化するための定義を行っている.・我々は,個体差を用いずメモリの大きさが小さいロボットを用いた格子構造の探査問題に対して成果を得た.いくつかの重要なシステムモデルに対して効果的な協調アルゴリズムを開発した.我々は,現在結果を国際会議に提出するために論文の執筆を行っている.・Sabotage gameの名として知られている,グラフ内におけるエージェント(ロボット)に関する一般化と解析を行った.我々は,新たに複雑性の証明をおこない,新たに有効なアルゴリズムの開発を行った.結果は,国際会議に提出した.主な結果を以下に示す.- Oblivious(忘却型)移動ロボット群を用いたグリッド探索の開発は,OPODIS 2012の国際会議に掲載され,口頭発表を行った.-不連続的な環境及び連続的な環境における自律型移動ロボット群の経路計画問題のモデル開発を行った.本研究において,環境を2次元のGird状に置き換えて,様々なレベルの非同期の移動ロボット群を用いた環境下で重要な成果を得ることができた.さらに,2次元及び3次元のユークリッド空間における連続した環境に対し,一部の成果を拡張する事ができた.現在,成果を論文に執筆中であり,完成次第投稿する予定である.-移動ロボットコンピューティングにおいて,ある問題内に様々なバリエーションのモデルが存在し,問題を一般化しアルゴリズムを"簡単"に開発することを可能とすることができた.同じ問題で各々のバリエーションのモデルに対して,解決方法を発見する事自体が困難な状態であった.また,各問題に対して,特有の制約が存在する事も問題点の一つである.以上の問題点を解決するために.ある問題に対して,全ての可能なバリエーションのアルゴリズムを一括で自動生成する手法を提案した.リング状のPerpetual Exploration問題を課題にして,我々のツールの可用性を証明した.本成果は,国際会議に投稿した.-自律システムにおける故障検出器に関する研究は完了した.本研究成果は,"Distributed Computing"の論文誌に採択されており,掲載予定である.本プロジェクトでは、自律移動ロボット群向けの協調および合意問題に対する研究を行う。経路計画と探索問題の自動生成に関して,計画書の提出段階では想定していなかった,いくつかの将来性がある問題と方法論を発見した.本分野において非常に重要な意味合いがある.今後の研究に対して,主に次の2点の問題に注目している.1)非連続環境における探索問題について,現状の成果をさらに一般的な問題に対して拡張し,自動生成を可能とする.2)非連続環境内における自律移動ロボット群の移動経路設計を複数の故障モデルに拡張する.
巨大領域のための有限要素法と関連事項

1.研究代表者を中心として得られた知見(1)円外ラプラス問題に付随するスチェクロフ作用素の代用電荷法による離散化手法。有限要素-代用電荷結合解法を平成10年度提案しその数学解析を平成10、11両年度に実施した。その鍵となる周期関数に対する(連続)フーリエ係数と離散フーリエ係数の関係を考察した。(2)二次元外部ラプラス問題に対して提案した有限要素-代用電荷結合開放による数値計算を、指導する大学院生の協力により実施し、本結合解法の有効性を確認した。(3)ポテンシャル関数と流れ関数を精密計算することによる、有限要素計算にもとづく翼の等角写像の決定法の考察を進めた。(4)円外帰着波動問題の定めるスチェクロフ作用素の、基本解による近似手法。二次元外部ヘルムホルツ方程式の数値解法として、有限要素-基本解近似結合解法を提案した。2.分担者が著しい成果を収めた研究課題(分担者名)(1)ニューラルネットワークを用いた偏微分方程式の数値解法、形状因子による境界条件充足解法、MHD平衡方程式とナビエストークス方程式への適用、ガウスニュートン法による高速化(竹田辰興、福原誠)。(2)領域分割計算におけるヘルムホルツ方程式の反復解法、外部無限領域へ接続する有界領域における波動伝播の数値解法と数値計算、ニューマーク法の安定性と収束性の証明(加古孝)。(3)ルンゲ・クッタ法の線形システム論手法による安定性解析、遅延微分方程式に対するルンゲ・クッタ法の安定性解析(小藤俊幸)。(4)外部ヘルムホルツ問題に対する波動方程式解法の数学的正当化、新しい人工境界条件の提案と正当化(小山大介)。3.電気通信大学数値解析研究会の継続開催平成10年度11年度とも14回にわたっておおむね金曜午前に開催した。その内、神谷淳(山形大)、坂上貴之(名古屋大)、田上大助(九州大)、山本野人(九州大)、松尾宇泰(名古屋大)、金山寛(九州大)、中口悦史(大阪大)各氏の講演は本研究費に支援された。これらの例会に加えて、一日特別講演会、二日にわたる記念講演会各一回を開催し、本研究課題とその関連課題を追求した。1.研究代表者を中心として得られた知見(1)スチェクロフ作用素による透過境界条件を、計算対象の翼型を含む十分大きな円の周上に設定して、翼まわり流れの流れ関数を有限要素法で数値計算することによってクッタの条件を満たす流れを可能な限り精確に計算出来ることを既に示している。十分一般な翼型に対してこの方法の有効性を検証することを目指して準備作業を実施した。(2)円の外部におけるラプラス作用素に附随するスチェクロフ作用素の代用電荷法による離散化手法を追究して、有限要素数値計算法を提案し典型問題に対する事前誤差評価を調べた。(3)ニ次元外部領域におけるヘルムホルツ方程式の数値解法に関して、円の外部における帰着波同問題の定めるスチェクロフ作用素を、基本解を用いて近似する手法を研究した。ラプラス外部問題における仮想境界上のスチェクロフ作用素の代用電荷法による近似法を、自然な類推に導かれて、帰着波動問題に適用するものである。

(4)ポテンシャル関数と流れ関数を精密計算することによる、有限要素計算にもとづく翼の等角写像の決定法の考察を進めた。2.分担者が著しい成果を収めた研究課題(分担者名)(1)ニューラルネットワークを用いた偏微分方程式の数値解法、特に形状因子による境界条件充足解法(竹田辰興、福原誠)。(2)ヘルムホルツ方程式の仮想境界における高次放射境界条件(加古孝)。(3)ルンゲ・クッタ法の線形システム論手法による安定性解析(小藤俊幸)。(4)外部ヘルムホルツ問題に対する波動方程式解法の数学的正当化(小山大介)。3.電気通信大学数値解析研究会の継続開催本年度14回にわたっておおむね金曜午前に開催した。その内、神谷淳(山形大)、坂上貴之(名古屋大)、田上大助(九州大)、山本野人(九州大)各氏の講演は本研究費に支援された。1.研究代表者を中心として得られた知見(1)円外ラプラス問題に付随するスチェクロフ作用素の代用電荷法による離散化手法。昨年度に提案した有限要素-代用電荷結合解法の数学解析を続行し、その鍵となる周期関数に対する(連続)フーリエ係数と離散フーリエ係数の関係を考察した。(2)二次元外部ラプラス問題に対して提案した有限要素-代用電荷結合解法による数値計算を、指導する大学院生の協力により実施し、本結合解法の有効性を確認した。(3)円外帰着波動問題の定めるスチェクロフ作用素の、基本解による近似手法。二次元外部ヘルムホルツ方程式の数値解法として、有限要素-基本解近似結合解法を提案した。(4)核表示可能な周期関数に対する等間隔選点近似法。円外帰着波動問題の基本解近似問題の解明を目指している。2.分担者が著しい成果を収めた研究課題(分担者名)(1)ニュートラルネットワークによる偏微分方程式の数値解法、MHD平衡方程式とナビエストークス方程式への適用、ガウスニュートン法による高速化(竹田辰興、福原誠)。(2)外部無限領域へ接続する有界領域における波動伝播の数値解法と数値計算、ニューマーク法の安定性を収束性の証明(加古孝)。(3)遅延微分方程式に対するルンゲ・クッタ法の安定性解析(小藤俊幸)。(4)外部ヘルムホルツ問題の波動方程式解法における新しい人工境界条件(小山大介)。その内、松尾宇泰(名古屋大)、金山寛(九州大)、中口悦史(大阪大)各氏の講演は本研究費に支援された。これらの例会に加えて、一日特別講演会、二日にわたる記念講演会各一回を開催し、本研究課題とその関連課題を追究した。
オオムギ高親和性硝酸イオン輸送系の機能発現機構解明にむけた組織細胞学的アプローチ

本研究では、オオムギ根の高親和性硝酸輸送系を構成する2つのタンパク質(HvNRT2.1およびHvNAR2.3)の相互作用について、組織細胞生物学的に明らかにした。まず、2つのタンパク質は根の皮層における最も外側の細胞層の細胞膜に存在していることを明らかにした。続いて、HvNRT2.1とHvNAR2.3が細胞膜上で相互作用することをBiFC法で明らかにした。さらに、2つのタンパク質をタマネギ表皮細胞で個別に発現させたところ、それぞれのタンパク質単独では細胞膜に局在できないことを明らかにした。以上の結果より、両タンパク質が細胞膜に局在するためにはお互いの存在が必要であることが示唆された。本研究は、オオムギ根において低濃度の硝酸イオンの吸収を担う高親和性硝酸輸送系を構成する2つのタンパク質(HvNRT2およびHvNAR2)の機能発現機構について、組織細胞生物学的な側面から明らかにすることである。2つのタンパク質が相互作用することで硝酸輸送活性を発現する可能性が示唆されているが、今年度は、両タンパク質がオオムギ根組織のどの様な細胞に局在しているのかを免疫組織化学的手法で明らかにした。硝酸塩を含む培養液で生育させたオオムギ幼植物根の根端から基部に向かって20mmの位置で、リニアスライサーを用いて横断切片を作成した。切片に対して、抗HvNRT2抗体あるいは抗HvNAR2抗体を一次抗体として反応させたのち、さらに蛍光標識二次抗体を反応させ、蛍光シグルを蛍光顕微鏡で観察した。蛍光観察の結果、2つのタンパク質はともに皮層域の最も外側の細胞層において、遠心側の細胞膜にのみ局在することが示された。また、2つのタンパク質は硝酸塩の供給によって発現誘導されることが明らかになった。今回の結果により、2つのタンパク質が同一の細胞層に同時に発現していることが明らかになり、2つのタンパク質が相互作用する可能性を細胞生物学的側面から示すことができた。また、根における低濃度の硝酸イオンの吸収が、これまで考えられていたような根の皮層域全体ではなく、皮層域の最も外側の細胞層でのみで行われていることがが強く示唆された。本研究の目的は、オオムギ根において低濃度の外部硝酸イオン吸収に関わる高親和性硝酸輸送系(HATS)を構成する2つのトランスポータータンパク質(HvNRT2およびHvNAR2)の機能発現機構について、組織細胞生物学的側面から明らかにすることである。2つのタンパク質は、硝酸イオン吸収の際に根の細胞膜上において機能していると予想されている。26年度は、両タンパク質が根の皮層域の最も外側にある同じ細胞層の細胞膜上に存在していることを免疫組織化学的手法で明らかにした。この結果は、2つのタンパク質が何らかの相互作用をして硝酸吸収系として機能することを示唆している。27年度は、HvNRT2およびHvNAR2が実際に相互作用をするのかをin votroで解析した。まず、細胞膜から露出していると予測されているHvNRT2.1のC末端断片(HvNRT2.1c)およびHvNAR2.3の中央断片(HvNAR2.3cent)を大腸菌における発現タンパク質として精製した。つづいて、HvNRT2.1cとHvNAR2.3centの相互作用をaffinity-column法で解析した。すなわち、HvNAR2.3の中央断片を固定化したカラムにHvNRT2.1のC末端断片アプライしたところ、両タンパク質断片がカラム内で相互作用することが明らかになった。これにより、両タンパク質の結合部位が初めて示唆された。アミノ酸置換した変異NRT2.1タンパク質C末端領域をいて同様の実験を行ったところ、463番目のセリン残基がアラニン残基に置換された断片において、顕著な結合能の低下が見られた。このことから、HvNRT2.1のS463の水酸基がNAR2.3との結合に重要であることが示唆された。本研究は、オオムギ根のHATSを構成する2つのトランスポータータンパク質(HvNRT2およびHvNAR2)の機能発現機構を組織細胞生物学的側面から明らかにし、低窒素条件下での作物の窒素利用効率の向上技術に寄与できる分子基盤を提示することを目的とする。期間内で明らかにしようと計画している具体的項目は、1)オオムギ根組織内におけるHvNRT2.1およびHvNAR2.3の局在性の解明、2)HvNRT2とHvNAR2の相互作用に関係するアミノ酸配列の解明、3)インタクト植物細胞内におけるHvNRT2.1とHvNAR2.3の相互作用の解析、の3項目である。以上の計画のうち、今年度は2)を達成することができたので、研究はおおむね順調に進展していると判断した。本研究は、オオムギ根において低濃度の外部硝酸イオン吸収に関わる高親和性硝酸輸送系を構成する2つのタンパク質(HvNRT2およびHvNAR2)の機能発現機構について、組織細胞生物学的側面から明らかにすることを目的とする。2つのタンパク質は、硝酸イオン吸収の際に根の細胞膜上において何らかの相互作用をして機能すると予想されている。前年度までに、両タンパク質が根の皮層域における最も外側の細胞層の細胞膜上に共通して存在していることを免疫組織化学的に明らかにした。