hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ラミニンの基底膜形成機構の解明と癌転移抑制への応用

ラミニンの基底膜形成に関わるドメインの機能解析ラミニンの基底膜形成に関わるドメインの機能解析を行うため、ラミニンα1,β1,γ1各鎖のドメインV, VIの間の結合能を表面プラズモン法で解析した。各ドメインの間の結合力は非常に弱く、基底膜形成時のラミニンの多量体化は自己会合によってのみ起こるのではなく、細胞表面の受容体による固定や局所的濃度の増加、分子の配列などが関与すると考えられた。当初の計画の機能蛋白質(増殖因子や増殖抑制因子など)をキメラ化した自己会合可能な人工ラミニン分子の構成は困難と考えられたため、以下の研究を行った。新規の基底膜構成分子の網羅的探索とその機能解析基底膜や細胞周囲のマトリックスの分子組成は組織によって異なり、また、癌や病変における臓器の繊維化などにおいてもその組成は大きく変化する。この細胞外環境を形成する分子群によって細胞や組織はその性質と運命が決定されている。そこで、基底膜を構成する新規の細胞外マトリックス分子を網羅的に探索し、基底膜成分を明らかにしてその機能解析を行うことを目的として研究を行った。スクリーニングは遺伝子の大部分を網羅すると考えられる理研マウス完全長cDNA(約75,000個)からコンピューテーショナルな手法と実験的手法を用いて行った。最初に、一次構造から新規細胞外マトリックス分子と予想されるcDNAを1.分泌シグナルをもつ、2.膜貫通ドメインをもたない、3.アミノ酸残基数が300以上、4.新規である、ことを指標に選別した。その結果、約75,000個の中から約350個のcDNAを選出した。次に、RT-PCRにより各組織での発現が確認されたcDNAについて、細胞外マトリックスの特徴である細胞外分泌性を293細胞の強制発現系により確認した。分泌の確認された蛋白質の局在を明らかにするため、特異抗体を作製して免疫組織化学染色を行った結果、4クローンが基底膜や脳の脈絡叢に局在していることを明らかにした。基底膜に局在するクローンには、指の融合などの症状を呈する先天異常Fraser syndromeの原因遺伝子Fras1のN末端をコードする遺伝子、また、血管内皮基底膜に局在する分子で、ヘパリン結合性のヘパラン硫酸糖鎖をもつ新規蛋白質、コンドロイチン硫酸Eに結合する新規蛋白質などが見出された。ラミニンの基底膜形成に関わるドメインの機能解析ラミニンは、基底膜の主要構成分子であり、癌細胞による基底膜の破壊と周辺組織への浸潤に関与していると考えられている。その機能は、二次元の網目状会合体を形成して基底膜の主要骨格となり、他の細胞外マトリックス分子ととともに上皮細胞や癌細胞に作用することである。基底膜の構造の基礎となるラミニン分子の会合は、十字架状の分子構造のうち3つの短腕部が分子間結合にすることによる。そこで、ラミニンの自己会合に重要と考えられている短腕部のドメインVIの機能解析を行うため、自己会合が可能なラミニン1のα1,β1,γ1鎖のドメインV, VIを発現させることにした。最初に、α1,β1,γ1鎖をコードするcDNAが必要となるので、ラミニン1を発現していると思われるヒト胎児の腎臓由来のファージライブラリーからcDNAをクローニングすることにした。また、ラミニン1を多く発現しているJAR細胞からmRNAを抽出し、逆転写を行ってcDNAをPCRで増幅した。その結果、ファージライブラリーからのクローニングとRT-PCRにより、ラミニンβ1鎖のcDNAをクローニングすることができた。α1鎖とγ1鎖のcDNAは、共同研究者によりクローニングされ、本研究での使用させてもらうことになった。次に、ラミニンの各鎖のドメインV, VIの大量発現系には293EBNA細胞を用いることにし、His-TagをC末端につけ組換え蛋白質として発現させた。各鎖のドメインV, VIを発現する293EBNA細胞のステイブルトランスフェクタントを確立することができたので、大量発現を行い、Ni-resinによる大量精製を行った。そして、ラミニンの自己会合能を調べるため、精製した各鎖のドメインV, VIの間の結合能を表面プラズモン法で定量的に解析することにした。表面プラズモン法による解析の結果、各鎖のドメインV, VIの間の結合力は非常に弱く、基底膜形成時のラミニンの多量体化は自己会合によってのみ起こるのではなく、細胞表面の受容体による固定や局所的濃度の増加、分子の配列などが関与すると思われた。ラミニンの基底膜形成機構の解明には、短腕部のドメインだけでなく、長腕部のドメインも含めた機能解析も必要となると思われる。今後はラミニン分子全体を解析し、その知見を活かして機能蛋白質(増殖因子や増殖制因子など)をキメラ化した人工ラミニン分子の構成を目指す。

新規の基底膜構成分子の網羅的探索とその機能解析基底膜や細胞周囲のマトリックスの分子組成は組織によって異なり、また、癌や病変における臓器の繊維化などにおいてもその組成は大きく変化する。この細胞外環境を形成する分子群によって細胞や組織はその性質と運命が決定されている。そこで、基底膜を構成する新規の細胞外マトリックス分子を網羅的に探索し、基底膜成分を明らかにしてその機能解析を行うことを目的として研究を行った。スクリーニングは遺伝子の大部分を網羅すると考えられる理研マウス完全長cDNA(約75,000個)からコンピューテーショナルな手法と実験的手法を用いて行った。最初に、一次構造から新規細胞外マトリックス分子と予想されるcDNAを1.分泌シグナルをもつ、2.膜貫通ドメインをもたない、3.アミノ酸残基数が300以上、4.新規である、ことを指標に選別した。その結果、約75,000個の中から約350個のcDNAを選出した。次に、RT-PCRにより各組織での発現が確認されたcDNAについて、細胞外マトリックスの特徴である細胞外分泌性を293細胞の強制発現系により確認した。分泌の確認された蛋白質の局在を明らかにするため、特異抗体を作製して免疫組織化学染色を行った結果、4クローンが基底膜や脳の脈絡叢に局在していることを明らかにした。基底膜に局在するクローンには、指の融合などの症状を呈する先天異常Fraser syndromeの原因遺伝子Fras1のN末端をコードする遺伝子、また、血管内皮基底膜に局在する分子で、ヘパリン結合性のヘパラン硫酸糖鎖をもつ新規蛋白質、コンドロイチン硫酸Eに結合する新規蛋白質などが見出された。
肝細胞増殖制御因子の生物工学的技法による同定,遺伝子構造解析と大量生産のシステム化

昨年度は当該研究プロジェクトの基礎研究としてアフリカツメガエル卵母細胞の発現系の開発と初代培養肝細胞の新しい応答系の確立を行った結果、非肝実質細胞が肝細胞の増殖制御に重要な役割を果たしていることが判明した。そこで本年度は、ヒト単球(マクロファ-ジ)が産生する種々の因子群の検討を生物工学的方法で行った。1.活性化単球に特異的なcDNAライブラリ-の作成。ヒト末梢血から単球を大量に分離精製し、エンドトキシンであるリポポリサッカライド(LPS)で刺激培養した。LPS無刺激ヒト単球から調製したpoly(A)^+mRNAより、LPS(-)cDNAライブラリ-を作成し、LPS(+)cDNAライブラリ-間で差引きハイブリダイゼ-ションを行い、LPS刺激で発現される特異的なcDNAライブラリ-を得た。上記で作製した差引きcDNAライブラリ-からT3RNAポリメラ-ゼによりin vitroでmRNAを合成した。合成したmRNAの検定はインタ-ロイキンー1及びー6をプロ-ブとしたノザンブロット法で行い、それらが単球から分離したmRNAのサイズとほぼ同じであったことから合成されたmRNAが完全鎖であることが判明した。3.マイクロインジェクションによる生物活性の検討。合成したmRNAをアフリカツメガエル卵母細胞に注入し、培養上清の生物活性を検討した。インタ-ロイキンーの検定をMH60株細胞の増殖促進活性で調べると、添加した血清は用量依存的に細胞増殖を促進した。このことはバイオアッセイ系が正常に作動していることを示している。そこで、この培養上清を初代培養肝細胞系に添加してその機能変化を解析した結果、肝細胞に対する著名な生存促進活性がみられた。また上清の酸性処理でDNA合成の抑制活性が観察された。現在、これらの生理作用を示す遺伝子を探索中である。ツメガエル卵の発現系の確立:生物活性を指標としたスクリ-ニングシステムを構築する為、アフリカツメガエル卵母細胞の培養とマイクロインジェクション技法を確立した。つめがえるに性腺刺激ホルモンを注入し、成長させた卵を分離後コラゲナ-ゼ処理によって濾胞細胞を除去してから18°Cで培養した。この卵母細胞が外来メッセ-ジを翻訳し得る活性を維持しているか否かを検討する為ラット肝臓から分離精製したPoly(A)mRNAをマイクロインジェクションし、培養液中へ分泌されたラットアルブミンをその特異抗体を用い検索した結果、分子量約67000の成熟型アルブミンが同定された。従って、この実験系がバイオアッセイによる未知遺伝子の解析システムに有効であることが確認された。肝細胞の増殖制御に拘る因子の同定:我々は肝細胞の初代培養系を用いて現在までに肝細胞の増殖に関係する種々の因子群を同定してきた。新しい肝細胞の増殖促進因子としてHGFを発見し、また肝細胞の増殖抑制因子としてはトランスフォ-ミング成長因子β(TGF-β)やインタ-ロイキンIL-1βやIL-6が効果的に作用することも証明した。興味深い点はこれらHGF,TGF-β,IL-1β,IL-6など肝実質細胞の増殖制御に関係する因子群が全て非肝実質細胞に存在することである。また、肝実質細胞と非肝実質細胞を共存させて初代培養すると増殖因子の無添加でも肝実質細胞の増殖が著しく促進されることが判明し、非肝実質細胞の初代培養では肝実質細胞の均質な培養系であるにも拘らず、外来の増殖因子を加えなくても活発な細胞増殖が認められたので、この細胞には自己増殖促進物質を分泌している可能性が示唆された。そこで、現在、この成熟した非肝実質細胞と幼若肝実質細胞から大量にPoly(A)mRNAを抽出し、ツメガエルの発現系システムでの未知物質の同定を進めている。

そこで、この培養上清を初代培養肝細胞系に添加してその機能変化を解析した結果、肝細胞に対する著名な生存促進活性がみられた。また上清の酸性処理でDNA合成の抑制活性が観察された。現在、これらの生理作用を示す遺伝子を探索中である。
主食である米タンパク質摂取によるインスリン応答と糖代謝調節機能に関する検討

「こしひかり」と「春陽」由来の米胚乳タンパク質を、成熟期ラットや自然発症の非肥満2型糖尿病モデルラットに給与して長期の飼養試験(対照はカゼイン食)を実施した。両米タンパク質摂取群の空腹時血糖値やインスリン値に低下傾向がみられ、血中アデイポネクチン濃度は有意に上昇し、カゼインに比べてインスリン応答や糖代謝調節維持に有効である可能性が強く示唆された。今後、ヒト試験をふまえて社会的貢献が大いに期待できる。最近,米タンパク質の大量調製が可能となり,これまでにアルカリ処理とデンプン分解酵素処理によって,米タンパク質のIn vivo消化性の相違や,生体内での米タンパク質利用効率の差異を動物試験で明らかにしてきた.アルカリ処理米タンパク質は,消化・吸収性や体内利用効率に優れているので,新しい植物性タンパク質素材として,食品産業界での活用が期待される.しかし,主食として食べ続けてきた米タンパク質の栄養生理機能については,大豆タンパク質と同様な脂質代謝改善作用があることを明らかにしたが,他の生理機能については未知の点が多い.そこで,コシヒカリと春陽由来米タンパク質(アルカリ処理調製)をヒト健常成人のモデルとして成熟期ラット,生活習慣病のモデルとして非肥満型自然発症2型糖尿病モデルラットに摂取させて,糖代謝調節機構への影響について,まずインスリン応答や糖代謝に関連する血液マーカー,貯蔵脂肪量等について測定し検討した.1,米タンパク質摂取が成熟期ラットの糖代謝に与える影響20週齢Wistar系雄ラットを予備飼育後,3週間の栄養試験を実施した結果,対照のカゼイン群に比べて腎臓・副睾丸周囲の貯蔵脂肪量,血漿総・HDLコレステロール,トリグリセリドともに有意に低値であった(p<0.05).18hr絶食後血糖値は少し低くなる傾向がみられ,血漿インスリン濃度はカゼイン群に比し有意に低かった(p<0.05).これより,米タンパク質の摂取は基底インスリン濃度を下げ,インスリン感受性を高めることが示唆された.2.2型糖尿病モデルラット(GKラット)における2種類の米タンパク質摂取の影響7週齢雄GKラットに米タンパク質(コシヒカリと春陽由来)を2週間摂取させた後の絶食後血糖値はカゼイン群に比し,特に春陽由来の米タンパク質で低く,血漿インスリン濃度も低下した.さらに試験期間を10週間とし,測定項目を増やして糖代謝調節の差異について検討を継続している.自然発症2型糖尿病モデルラット(7週齢Goto-Kakizaki雄ラット)を用いて,「コシヒカリ」と「春陽」由来の米胚乳タンパク質(CP20%)を10週間にわたって制限給餌した飼養試験(コントロールはカゼイン食)等を実施した.血液,腎臓,尿サンプル等を採取して,血漿インスリン濃度をはじめ,糖代謝調節にかかわるマーカーを測定し比較検討した.1.1週間毎に空腹時血糖値を測定した結果,13週目では特に「春陽」由来タンパク質群の血糖値は有意に低値を示した(p<0.05).10週間にわたって両米タンパク質群の血糖値は常にカゼイン食に比べて低い傾向を示した.2.試験終了日の空腹時インスリン値は,両米タンパク質群でカゼイン食に比較して低下傾向がみられた.しかし,試験9週目に行った糖負荷試験(20%glucose溶液,2g/kg経口投与)では,健常ラットとは明確な差がみられたけれども3群間では有意差はみられなかった.3.血中アデイポネクチンレベルは内臓脂肪の増加に伴い減少し,インスリン抵抗性,2型糖尿病の発症,メタボリックシンドローム,脂質代謝異常などと逆相関することが知られている.血中アデイポネクチン濃度は,両米タンパク質群がカゼイン群に比べて有意に高値であり(p<0.05),米タンパク質摂取は血中アデイポネクチンレベルの上昇に関与することが明らかになった.以上の結果と,その他の尿中微量アルブミン濃度等の測定結果から,米タンパク質摂取はカゼインに比べてインスリン応答や糖代謝調節維持に有効である可能性が強く示唆された.
抗癌剤による卵巣機能不全の分子機構解明と予防方法の確立

(1)抗癌剤投与後のヒト卵巣組織の病理学的解析から.抗癌剤の種類と傷害細胞の剖位を同定する。調べた限りでは、CPT-11と顆粒膜細胞ほどの抗癌剤特異的障害部位は見いだせなかった。(2)動物実験による抗癌剤誘発卵巣顆粒膜細胞傷害の証明とその分子機序を解明するCPT-11による顆粒膜細胞傷害については、p53,Fas,FasL,BCL-22,BAX,DAPK,Caspaseなどのアポトーシス関連分子の発現変動を免疫染色し、キー分子候補として、FasL,p53の関与を同定した(論文執筆中)。CPT-11以外の抗癌剤、および複数種類の抗癌剤を投与した場合の卵巣細胞アポトーシスに関与するキー分子の同定は動物実験が十分に進んでおらず、結論を出ていない。(3)動物実験による抗癌剤誘発卵巣顆粒膜細胞傷害の予防法を確立する。既にCPT-11誘発卵巣顆粒膜細胞アポトーシスについては、GnRHagonist療法の臨床応用を考えるためのより詳細な至適投与条件を検討した。CPT-11以外の抗癌剤による卵巣傷害についても、抗癌剤の種類に応じた異なる予防法を検討する。本研究の最終目標は妊娠である。GnRH agonistによる予防法を確立した場合は、必ずマウスの交配実験を繰り返し、次世代までの妊娠率や奇形率に問題がないかどうかまで確認した(論文執筆中)。(4)遺伝子改変マウスを用いて,各種抗癌剤による卵巣機能障害のキー分子を確定する。DAPK変異マウス卵巣では、FSHRやERαのタンパク発現は変化なく、ERβ発現が著明に低下していたことも発見しており、関連性を調べている(論文執筆中)。抗癌剤による卵巣機能障害を回避するために、卵巣組織を凍結せずに抗癌剤の副作用を回避する方法として、卵巣組織を抗癌剤治療中のみ一時的に抗癌剤不応性状態に保つ方法を着想した。今回の申請研究の目的は、抗癌剤による卵巣機能障害の分子機構を解明することでより効率的な予防方法を確立すること、内分泌療法による予防法の至適投与条件を確立して、早急に臨床応用を目指した研究を展開することにある。今年度は以下の成果を得た。(1)GnRH agonistによる予防機序の解析:すでに、CPT-11誘発卵巣機能障害マウス実験モデルを確立しており、このマウス実験モデルを用いて、GnRH agonistによる予防機序の解析を行った。DAP kinaseシグナルとは異なるアポトーシスシグナル感受性を抑制することで、卵巣機能温存効果を証明した(諭文執筆中)。長期的な安全性も実証した(論文執筆中)。(2)GnRH agonistによる予防機序の臨床応用解析:GnRH agonistには、マウス実験モデルからエストロゲン抑制を伴わない卵胞温存作用が有ることが証明されたことから、実際の妊孕性温存癌患者に投与された場合のGnRH agonistの効果を臨床内分泌学的に解析した。対象患者はおかれていないが、実際に抗癌剤治療後に早期の排卵、妊娠、出産に成功した症例が出てきている。(3)各種抗癌剤による卵巣機能障害とアポトーシス関連分子の解析:マウス実験から、Fas-FasL以外に、p53経路が関与していることを証明した(論文執筆中)。(4)臨床検体の病理組織学的解析:症例数がまだ集まらず、結論を出すには解析不十分である。次年度にも継続研究としている。
重イオンビーム変異とゲノム編集技術を用いたミネラル栄養価の高いコシヒカリの作出

鉄や亜鉛栄養価が高いコシヒカリを作出し、日本人が日々摂取する米食から鉄や亜鉛をより多く摂取できれば、日本人の鉄欠乏性貧血症や亜鉛欠乏症の改善に貢献できる。また、これによりコメの商品価値を高めれば、農家にとっても利益となる。そこで、重イオンビームにより変異を導入したコシヒカリの変異系統を種子中の微量元素の含有量と収量、表現型を元に選抜し、鉄や亜鉛含有量が高く、他の形質が通常のコシヒカリと同等の新しいコシヒカリ品種を作出することを目的としている。平成28年度の圃場栽培の結果、選抜系統の玄米の鉄含有量は野生株と比較して最大で1.4倍に、玄米の亜鉛含有量は野生株と比較して最大で1.7倍に増加していた。平成29年度には、選抜したM6植物体個体の圃場試験栽培を行った。表現型、収量、捻率を調査した。玄米中の鉄や亜鉛濃度が高く、その他の表現型に明確な変化が見られず収量も野生株と同等の系統を3系統選抜した。また、鉄や亜鉛栄養価の高い3系統の変異株とコシヒカリの野生型と戻し交配を行い、平成30年の春にF2種子を得た。F2植物を圃場栽培し、WT10系統を含む454個体の収量を測定し、玄米の鉄、亜鉛含有量を測定した。さらに、鉄・亜鉛含有量の高いM6植物体の1系統よりゲノムを抽出し、次世代シーケンサーにより全ゲノムを解析した。野生株に比べて鉄栄養に関連する遺伝子の一つを含む領域が欠損していることが分かった。原因遺伝子の同定のため、次世代シーケンシングを実施し、原因遺伝子の候補を決定したが、まだ確定には至っていない。また、ゲノム編集のためのベクターの作製をまだ終えていない。研究が遅れてしまっている原因としては、2018年度の前期は本科研費の研究課題とは別に、石川県立大学においてJSTのプロジェクト研究員としての研究課題に専念する必要があったためである。2018年度後半には秋田県立大学において助教のポジションを得て異動したが、新たに本研究課題を遂行するための研究環境を整えるのに時間がかかってしまった。1)コシヒカリの野生型と戻し交配を行った系統の金属含有量結果をもとに、QTL-Seq法により、原因遺伝子を決定する。2)ゲノム編集用のベクターを完成させ、選抜系統に導入し、より鉄・亜鉛栄養価の高いイネの作出を目指す。3)M6世代で選抜した3系統を元に秋田県農業試験場と共同研究を進め、あきたこまち等、秋田県のオリジナルのイネ品種と交配し、新たなブランド米を作出する予定である。平成27年度までに選抜した15系統のM5世代の植物を各60個体ずつ石川県立大学の圃場水田で栽培し、M6種子の玄米中と白米中の鉄・亜鉛やその他の微量元素の含有量を測定し選抜した。現在、収穫した種子の玄米と白米の鉄・亜鉛等の微量元素の元素分析を進めている。また、コシヒカリの野生型と戻し交配を行い、平成29年の秋にF1種子を得た。さらにF1植物体を冬から春にかけ温室で栽培し、平成30年3月にF2種子を得た。また、鉄・亜鉛含有量の高いM6植物体よりゲノムを抽出し、次世代シーケンサーにより配列を解析しているところである。原因遺伝子の同定のため、次世代シーケンシングを実施し、QTL-seqのための戻し交配と次世代の栽培を予定通り進めている。一方で、ゲノム編集のためのベクターの作製をまだ終えていないため、やや遅れているとした。

また、鉄や亜鉛栄養価の高い3系統の変異株とコシヒカリの野生型と戻し交配を行い、平成30年の春にF2種子を得た。F2植物を圃場栽培し、WT10系統を含む454個体の収量を測定し、玄米の鉄、亜鉛含有量を測定した。さらに、鉄・亜鉛含有量の高いM6植物体の1系統よりゲノムを抽出し、次世代シーケンサーにより全ゲノムを解析した。野生株に比べて鉄栄養に関連する遺伝子の一つを含む領域が欠損していることが分かった。原因遺伝子の同定のため、次世代シーケンシングを実施し、原因遺伝子の候補を決定したが、まだ確定には至っていない。また、ゲノム編集のためのベクターの作製をまだ終えていない。研究が遅れてしまっている原因としては、2018年度の前期は本科研費の研究課題とは別に、石川県立大学においてJSTのプロジェクト研究員としての研究課題に専念する必要があったためである。2018年度後半には秋田県立大学において助教のポジションを得て異動したが、新たに本研究課題を遂行するための研究環境を整えるのに時間がかかってしまった。F2植物体を圃場栽培し、鉄・亜鉛含有量を分析する。含有量が高い系統と低い系統からゲノムを抽出し、次世代シーケンシングを用いたQTL-seq法により、原因遺伝子の推定を行う。また、ゲノム編集により目的の遺伝子の挿入、変異を加え、イネの鉄・亜鉛含有量をさらに増加させることを目指したベクターを作製し、選抜系統に対して、ゲノム編集を実施する。1)コシヒカリの野生型と戻し交配を行った系統の金属含有量結果をもとに、QTL-Seq法により、原因遺伝子を決定する。2)ゲノム編集用のベクターを完成させ、選抜系統に導入し、より鉄・亜鉛栄養価の高いイネの作出を目指す。3)M6世代で選抜した3系統を元に秋田県農業試験場と共同研究を進め、あきたこまち等、秋田県のオリジナルのイネ品種と交配し、新たなブランド米を作出する予定である。平成29年度に、デスクトックパソコンを購入する予定であったが、昨年度は所属研究室にある既存のパソコンで事足りたため、購入を見送った。また29年度は、実験補助スタッフを本科研費で通年で雇わず、収穫後のイネの分析のために短期間の雇用に留めたため、人件費が想定より安くなった。従って、486365円を次年度に繰り越した。本年度には、この余剰予算を、次世代シーケンスによる変異遺伝子の同定にかかる費用や、遺伝子機能解析、ゲノム編集のためのベクター作製費用のために充てる予定である。2018年度の前期はJSTのプロジェクト研究員としての研究課題に専念する必要があったこと、2018年度後半には秋田県立大学において助教のポジションを得て異動したが、研究環境を整えるのに時間がかかってしまったことにより、本研究課題で予定していた実験・研究の実施が遅れ、次年度使用額が生じてしまった。次世代シーケンサーの受託費用、ゲノム編集の実施にかかる試薬類などは高額になるので、そちらに次年度使用額を当てる予定である。
N-ニトロソ化合物による肝障害機構の解明:一酸化窒素と活性酸素の役割

N-ニトロソ化合物による毒性発現機序は肝薬物代謝酵素CYPによって生成したアルキルカチオンがDNAおよびタンパクをアルキル化することによって毒性を発現する。その一方でCYPはN-ニトロソ化合物から一酸化窒素(NO)を発生させることも報告されている。本研究ではN-ニトロソ化合物の毒性発現機序への酸化ストレスの関与を明らかにすることを目的として、中国から輸入された健康食品に含まれていたN-ニトロソフェンフルラミン(NO-fen)について、DNA損傷能とその反応機構について検討を行った。その結果、1)NO-fenはCu(II)存在下、活性酸素を発生しpBR322DNAに対して強力な切断活性を示した。このDNA切断反応はフェンフルラミン(fen)では進行しないことから、N-ニトロソ構造を有するNO-fenに特徴的であることがわかった。また、DNA切断反応は一価の銅のキレート剤であるバソキュプロインを添加すると抑制されることから、N-ニトロソ化合物による銅の還元が進行していることがわかった。2)活性酸素のスピントラップ剤としてDEPMPOを用いて、NO-fenとCu(II)存在下、ESRを測定したところ、ヒドロキシルラジカル付加によるDEPMPO-OHのシグナルが観測された。また,ESRによる一酸化窒素検出試薬としてcarboxyPTIOを用いたところ、NO発生に特徴的なcarboxyPTIのシグナルが観測された。以上の結果より、NO-fenはCu(II)の-電子還元反応を経由して酸素を還元活性化し、ヒドロキシルラジカル様活性酸素として銅結合型の活性酸素(Cu(I)-OOH)を発生してDNAを切断すること、また、その過程で一酸化窒素を発生することが明らかとなった。本研究結果はN-NO化合物の毒性発現への活性酸素の関与を予測するものである。しかしながらNO-fen投与ラットの肝臓について活性酸素障害のマーカーである8-0HdG量を測定してみたところ、有意な上昇はみられなかった。今後は投与計画の再検討をおこなうとともに、他のNO化合物についても活性酸素毒性について検討を行う予定である。N-ニトロソ化合物は消化管発がん性や肝傷害性を有しているものが多い。最近では中国からダイエットを目的として輸入された未承認医薬品および健康食品に含まれていたN-ニトロソフェンフルラミン(NO-Fen)による重篤な肝障害が大きな問題となった。本研究ではN-ニトロソ化合物の毒性発現機序を酸化ストレスとの関連において解明することを目的として、NO-FenによるDNA損傷能とその反応機構について検討を行った。pBR322DNAを用いてNO-FenのDNAに対する損傷能について解析した。その結果、NO-Fen単独ではpBR322DNAに影響を与えないが、Cu(II)を添加すると強力なDNA切断反応が進行した。この切断反応はCu(II)存在下で進行し、他の金属では全く進行しなかった。また、同様の切断反応はフェンフルラミンでは進行しないことら、Cu(II)存在下におけるDNA切断反応はN-ニトロソ構造を有するNO-Fenに特徴的な反応であることがわかった。次にこのDNA切断反応のメカニズムについて各種阻害剤を添加して検討した。

その結果、一価の銅Cu(I)のキレート剤であるバソキュプロインを添加すると切断反応は抑制された。またヒドロキシルラジカル消去剤のうち、チオウレアやアジ化ナトリウム、メチオナールはDNA切断を阻害する一方、DMSOやエタノール、およびマンニトールによる阻害効果はみられなかった。この結果よりNO-FenはCu(II)の一電子還元反応を経て酸素を還元活性化し、銅結合型の活性酸素種(Cu(I)-OOH)を発生していることが示唆された。以上、NO-Fenは従来のアルキルカチオンによるDNA傷害とともに、酸化的ストレスによる毒性も関与していることが予測された。来年度は酸化的毒性発現機構をさらに詳細に検討するとともに動物への影響についても解析を行う。本研究ではN-ニトロソ化合物による肝障害への活性酸素毒性の関与を明らかにすることを目的として、N-ニトロソフェンフルラミン(NO-fen)の毒性発現機構について検討を行っている。近年、中国からダイエットを目的として輸入された未承認医薬品および健康食品による重篤な肝障害が大きな話題となった。これらの成分として食欲減退作用を示すフェンフルラミン(fen)の代わりに含まれていたのがNO-fenである。昨年度は、Cu(II)存在下、NO-fenはpBR322DNAを切断し、同様の切断反応はfenでは進行しないことからN-ニトロソ構造を有するNO-fenに特徴的な反応であること、また、このDNA切断反応には活性酸素が関与していることを明らかにした。今年度はDNA切断反応についてESRを利用した詳細な解析および本反応におけるNO-fenからの脱ニトロソ化反応について検討を行い以下の結果を得た。1)活性酸素のスピントラップ剤としてDEPMPOを用いて、NO-fenとCu(II)存在下、ESRを測定したところ、ヒドロキシルラジカル付加によるDEPMPO-OHのシグナルが観測された。また、ESRによる一酸化窒素検出試薬としてcarboxyPTIOを用いたところ、carboxyPTIOのシグナルの減少とともにNO発生に特徴的なcarboxyPTIのシグナルが観測された。2)ESRにより脱ニトロソ化反応が確認されたので、反応をスケールアップして脱ニトロソ化体の構造について検討した。しかし長時間反応させてもNO-fenを回収するのみで、脱ニトロソ体を確認できなかった。以上の結果より、NO-fenはCu(II)の一電子還元反応を経由して酸素を還元活性化し、ヒドロキシルラジカル様活性酸素として銅結合型の活性酸素(Cu(I)-OOH)を発生してDNA切断反応が進行すること、また、その過程で一酸化窒素が発生することが明らかとなった。しかしながら、脱ニトロソ化体の構造が確認されなかったことから、NOの発生は微量であることも考えられた。来年度は酸化的毒性発現機構についてさらに詳細な解析を行うとともに動物に対する酸化的ストレスについても検討を行う。
微細加工技術を利用したナノピラー型マルチフェロイック複合体材料の開発

本研究は、a軸配向(Bi3.25Nd0.65Eu0.10)Ti3O12(BNEuT)強誘電体ナノプレートを微細加工して得られる構造体をテンプレートに用い、それらの空隙にコバルトフェライト強磁性体ナノ粒子を高密度充填して、理想的なマイクロピラー型構造を模したマルチフェロイック複合体を開発することを目的としている。本年度は、高温スパッタ法によりNbドープTiO2(101)基板(Nb = 0.79 mass%)上に約2.0μmの膜厚をもつエピタキシャルa軸配向膜を作製した。作製した薄膜は、反応性イオンエッチング(RIE)法により、ナノプレート成長方向と同じ[010]方向に沿って2-5μmピッチ間隔でマイクロプレート構造体に加工した。本年度は非水系ゾルゲル法を用いてCFO堆積によるCFO/BNEuTの複合化を検討した。得られた研究成果は以下の通りである。(1)スパッタ法によるa軸配向BNEuT薄膜を反応性イオンエッチング(ICP-RIE)装置を用いて、ナノプレートの溝(b軸)方向に平行に加工した。その際、反応性ガスはCl2:BCl3:CH4 = 5:50:2.4なる塩素系混合ガスが強誘電体の特性劣化も少なく、高精度に2-5μmピッチ間隔をもつマイクロプレートに加工できることを見出した。(2)高精度RIE加工の実現には、強誘電体膜上に約150 nm厚みのPt犠牲層を付与することが有効であることを見出した。(3)非水系ゾルゲル法によりプレート間隙を反応場としてCFO粒子を高密度に堆積させるためには、予めマイクロプレート表面を疎水性から超親水性に改質させる必要があることを見出し、それに必要な超親水化処理技術を確立した。(4)非水系ゾルゲル法によるCFO合成プロセスを確立するとともに、得られたCFO/BNEuT複合体薄膜がすぐれた強誘電性と磁気特性を示すことを明らかにした。当初の計画では、強磁性体CFOの導入手法としてMOCVD法を予定していましたが、装置加熱部の不良に伴う大幅な改良を余儀なくされたので、非水系ゾルゲル法に切り替えて検討を行った。その結果、現在までのところ、CFO充填量に関し若干の課題は残るが、CFO/BNEuT複合体薄膜のマルチフェロイック特性を観測することに成功している。本年度は加熱部の不具合が完全に解決したMOCVD装置を用いて、2-5μmピッチ間隔で約1μm深さのマイクロプレート構造体の間隙にCFOを堆積させる実験を行う。MOCVD合成実験では、マルチフェロイック特性に関し基板温度(500-600°C)と保持時間(30-120 min)依存性を検討する。また、アズデポ膜を種々の条件でポストアニール(550-700°C、1 min)することにより、CFO粒子(磁区)サイズが磁化-磁場特性や電気磁気効果に及ぼす影響について検討を行う。

本年度は加熱部の不具合が完全に解決したMOCVD装置を用いて、2-5μmピッチ間隔で約1μm深さのマイクロプレート構造体の間隙にCFOを堆積させる実験を行う。MOCVD合成実験では、マルチフェロイック特性に関し基板温度(500-600°C)と保持時間(30-120 min)依存性を検討する。また、アズデポ膜を種々の条件でポストアニール(550-700°C、1 min)することにより、CFO粒子(磁区)サイズが磁化-磁場特性や電気磁気効果に及ぼす影響について検討を行う。
性の解放と資本主義－労働力の均質化をめぐる表象文化論的考察

本研究の成果として、「労働力均質化時代における性と文化」を題目に、年度ごとに立てた研究内容「支配文明の基本構造」、「性の解放と資本主義の精神」、「性の思想化と脱肉体化」に従い、年に2篇ずつ計6篇の論文を計画通り発表した。研究を進めるなかから、労働力を均質化する資本主義の20世紀的な徴候が脱肉体化した人間関係を生みだした事実が判明した。脱肉体化した社会を「不在の美学」という観点から芸術的創造に結びつけたレベッカ・ホルンと、脱肉体化したメディア社会を思想的に分析したヴィレム・フルッサーが必然的に次の考察対象として浮かび上がり、それが科研費「脱肉体化時代の美学的考察」の獲得へと結びついた。西欧が今日支配文明になりえた最大の理由が、資本主義を「だれもが参加できる制度」として発展させた事実に見いだせる、という研究初年度に得られた成果を踏まえ、本年度は、資本主義を支えてきた性的悦楽を憎悪する精神と、資本主義がもっとも浸透し発展した地域において、20世紀後半期に性と女性の解放が要求されたことの矛盾の解明が、研究の課題として掲げられた。問題の在処を明確にするために、「世界の文化地図」という資料が用いられた。それによると、今日資本主義を機能させる条件がもっとも整った地域が、地球規模でみるとヨーロッパ北方と北米英語圏に依然として限定されていることが判明した。そのうえで、1960年以降、性と女性の解放運動が勃発した地域もまた、この資本主義がもっとも発展したプロテスタント地域と重なる事実が確認された。厳しい禁欲を実践することで発展してきた資本主義世界において、性と女性の解放が世界に先駆けて叫ばれるようになった理由を解明するための道標として、女性の現代アートを取り上げた。その理由は、ハイデッガーが『芸術作品の根源』で述べたように、理屈では理解しがたい人間がおかれた真の立ち位置を心に訴えうるうえで、芸術が他に代えがたい手段を果たすからである。その意味で女性パフォーマンスが表象するのは、資本主義世界における性と女性がおかれてきた世界そのものであった。ただ本研究は、性と女性が抑圧から解放されたことを評価する視点にはとどまらない。6070年代に切実な問題であった性解放の必然性は、そのわずか数十年後にはまったく理解されなくなってしまう。そこから本研究は、じつは主体的な運動としてとらえられた性の解放も、じつは、女性的他者を均質化された労働力として取り込むために資本が仕組んだ戦略であったのではないか、という問題提起に至ったところで本年度の区切りを付けた。研究初年度において、西欧が支配文明になりえた理由を、資本主義を「だれもが参加できる制度」として発展させた事実に見いだしたこと、それを受け次年度においては、性的悦楽への憎悪を動力源に、資本主義をもっとも発展させえた地域において、20世紀後半期に性と女性の解放が要求された事実から、資本主義の発展と性の解放のあいだには、変革への主体性を越えるダイナミズムが働いた可能性が考えられることが解明された。研究最終年度の平成25年度においては、性の解放運動が単なるセックスの解放を唱えただけではなく、性を哲学的に根拠づけようとしたこと起点に、「性の思想化」の内実と、その評価に取り組んだ。研究の具体的方策としては、性の解放を理論的に根拠づけた哲学者として当時の若者に評価されたマルクーゼの主著『エロスと文明』を取り上げた。この著書が、じつはフロイトの『文化の中の居心地の悪さ』への批判的考察という形態をとっていることは、そもそも本研究が当初からフロイトの超自我論を、全体の縦糸として掲げてきたことを考えると、マルクーゼが、フロイトの超自我論の20世紀的解釈として『エロスと文明』を上梓している事実は、本研究の円環をひとまず閉じるうえで格好の材料をなした。研究課題を達成するうえで本研究は、現代アートへの着目をいまひとつの特色としてきた。その理由は、ハイデッガーが『芸術作品の根源』で述べているように、言語化しがたい人間の立ち位置を直接心に訴えうるうえで、芸術には他に代えがたい力があるからである。性をめぐる思想と芸術を結びつけるうえで、研究最終年度においては、二つの大きな発見があった。それは、人間から肉体性を奪いプログラムされたもはや制御不能な組織に呑み込んでしまった現代を読み解いた思想家ヴィレム・フルッサーと、抑圧され不在化した肉体をテーマに表現する芸術家レベッカ・ホルンとの出会いである。初年度の目標であった、労働力の均質化を生みだす西欧の支配文明としての基本構造を明らかにする課題を果たすべく研究は進められた。地球上に数ある文化のなかで、どうして西欧だけが普遍性を主張する支配文明となりえたのか。

研究は、多くが当然の前提として見過ごしがちなこの疑問への答を真摯に模索するなかから、西欧だけが世界に規範を提供する支配文明となりえた理由の核心を、諸文化の固有性や差異を超えた「だれもが参加できる制度」を生みだしたことに見いだした。その観点に基づき、支配文明を、特定の地域や民族に限定されず一定の知識と能力さえもてばだれもが参加しうる人間関係を生みだしえたことにあると定義した。その上で、この「だれもが参加しうる人間関係」こそが、じつは近代資本主義であると位置づけた。つぎに研究は、資本主義がアルプス北方ヨーロッパに生まれ発展した理由には、この地域にしか存在しない特殊性があるはずだという仮説のもとに、それが何であったのかを解明することを課題とした。その結果、16世紀に資本主義を生みだし、そこからやがて労働力の均質化を宿命づける制度を、5世紀近くにわたり発展させてきた西欧文明の核心には、フロイトが展開した超自我をめぐる言説が大きく関係している可能性に気づいた。性的な活動を断念させ,代わりに労働への意欲を産出するための監視法廷である超自我がもつ厳格さは、けっして普遍的に有効なものではなく、北方ヨーロッパの厳格な自然環境においてこそその必然性が認められるものである。となると、普遍を主張する支配文明が、じつはきわめて特殊限定的な環境条件から生まれたことになる。この事実を踏まえたうえで、それでは西欧はいかにして「だれもが参加できる制度」へと転換しえたのか、そのためには何が必要であったのかを考察することを次の課題と定めた。労働力均質化のメカニズムを解明するうえで、2年目の研究課題として計画していた、禁欲を至上命令とする資本主義の精神と20世紀後半期に起きた性の解放との矛盾の解明をめぐって、「労働力均質化時代の性と文化II.性の解放と資本主義の精神(1)」と「労働力均質化時代の性と文化II.性の解放と資本主義の精神(2)」という二つの論文を書き上げられたことが、計画通りの成果が上げられたと考える最大の理由である。一つ目の論文は、資本主義が円滑に機能するために欠かせない情報と契約への信頼を最優先に実践する人びとが暮らす地域が、いまだ地球上で限られている視座に立ったうえで、じつは20世紀後半期に性の解放運動が勃発した地域もまた、これらプロテスタント諸国とも言い換えられる地域とみごとに重なっていることに着目した。この一見矛盾する関係を解く鍵が、女性アーティスト、キャロリー・シュニーマンの作品『胎内からの巻物』において体現されていることを示したうえで、このような性と女性の解放を唱える風潮が、21世紀にはいると理解不能になっている不可思議な現実を指摘した。二つ目の論文は、主体的に引き起こされたと思われてきた性の解放運動が、じつは資本主義が新たな段階に至るための通過儀礼であったのではないかという問題提起からはじまる。そのうえで、性の解放が1960年代に勃発するうえで、その舞台を準備した三つの要素について論じた。これらの要素は、歴史的偶然であるかに見えながら、じつは、女性的他者を資本のスタジアムに取り込むための条件を整えるうえで不可欠な役割を果たしたことが判明する。女性と非西欧人を均質化された労働力に変換するためには、女性の領域として存在しつづけてきた性と官能の世界を、男性的価値で測定しうるものに還元する必要があったのである。
グループホーム的居住機能を有する住宅・福祉空間計画手法に関する研究

本研究はノーマライゼーションの理念に基づき、居住・福祉サービスの小規模分散配置、家庭的環境条件整備の視点からグループホーム的居住形態を有する各種施設・住宅を対象として、存在構造と改変方向、具体的整備指針を明らかにすることを目的としている。本年は平成10年度に実施した郵送アンケート調査の継続的分析と、平成11年度に実施した施設事例調査の補足、さらに比較検討するための施設調査、グループホームの継続訪問調査と先駆的事例のケーススタディ等を行った。その結果以下の点が把握できた。各種先駆的事例の考察から「施設の住宅化」と「住宅の福祉化」が把握できた。集まって住むという両者の延長上にグループホーム的居住が要として位置付けられる。グループホーム的居住実践の拡大傾向が各施設種でみられる。特に定員に比べ在籍者が減少傾向にある施設では個室化、小グループ化の試みが増大しており、制約条件の大きい既存施設においても住生活重視の方向性が顕著である。空間的な限界も示された。その場合、個室化優先施設群(高齢者施設等)と小グループ化志向施設群(児童福祉施設等)と2軸が存在していることが明確となった。知的障害者グループホームの継続調査を通して、4人単位の有効性、住生活の経験をふまえた生活の向上、地域内居住での生活圏の拡大等グループホーム的機能の意義が確認できた。住空間についても個の領域としての個室の役割、交流の場である台所・食堂・居間の重要性が明らかとなった。施設が各種グループホーム的機能を段階的に準備し、地域とネットワークを持つことで利用者の自立をさらに促進できることも確認できた。多様な展開を実践しているグループホーム的居住像を今後さらに具体的に解析したい。本研究はノーマライゼーションの理念に基づき、居住・福祉サービスの小規模分散配置、家庭的環境条件整備の視点からグループホームと社会福祉施設の存在形態と改変方向を明らかにすることを目的としている。本年は東北6県の居住型各種社会福祉施設・老人保健施設分野全施設1009件を対象に居住機能・空間問題に焦点を当ててアンケート調査を実施した。有効回収数は593例(回収率58.8%)であった。居室構成をみると、個室中心型から4人部屋中心型、一部大部屋型と広く分布し、養護児童、知的障害児・者、身体障害者、高齢者と主体条件が異なる施設種類の違いが居室構成の差異と対応していることが明らかになった。また、同一施設種内でも建設時期、方針等が反映して様々な形態に分れている。生活単位についても同様な傾向がみられた。現状の施設空間に対する不満も「間取り」を中心に多くの項目で顕在化しており、空間条件の諸問題の所在が明確化した。改革の方向については施設種間で差異がみられ、小グループ化、家庭的空間化については肯定的・否定的見解がともに存在し意見が分散している。各項目に関してさらに分析を深めているところである。脱施設化の流れの中で実践が拡大しているグループホーム的居住形態について、先駈例のケーススタディを実施した。施設を拠点として地域展開している例として、コロニー雲仙(長崎県)、カナンの園(岩手県)、ほたる学園(宮城県)等を訪問調査し、存在構造と展開方向を把握した。施設、自立訓練ホーム、グループホームとネットワークで地域展開をしていることが明らかになった。また、以前調査した宮城県内のグループホームを本研究でも継続的にケーススタディし、経年変化、住み方、住要求、地域生活展開について考察した。その結果、個室・居間の有効性や地域生活の拡大傾向が明瞭になった。本研究はノーマライゼーションの理念に基づき、居住・福祉サービスの小規模分散配置、家庭的空間・環境条件整備の視点から各種グループホームと居住型社会施設福祉の存在形態と改変方向を明らかにすることを目的としている。

本年は昨年度実施した郵送アンケート調査(東北6県の居住型各種社会福祉施設・老人保健施設分野全施設を対象、有効回収数606例回収率60.1%)の分析をさらに深めるために典型例の平面図等の資料収集を行なった。居住者の主体条件(年齢・性別・介護程度)の類型化を基に居室構成との関係をみると、全体では生活集団を棟単位、フロアー内、建物の階でグルーピングしている動向、性別中心に小集団化している傾向が把握できた。また、施設種間の共通性とともに個室化が先行している施設、小グループ化を優先している施設等施設設置主旨や制度的な諸条件に想定されながらも変革を試みている各施設個別の特性を整理できた。脱施設化の流れの中で実践が拡大しているグループホーム的居住状態について、先駆例の訪問調査を実施した。その知見を基に宮城県内の知的障害者グループホームの調査を実施し、県内73ホームの地域配置、居住者主体条件と利用圏、空間条件、世話人、バックアップ施設との関係などを把握した。その結果、居住型施設中心のバックアップ体制に規制されたホームの地域偏在傾向、男性中心の利用者像と女性別居世話体制、既存住宅や公営住宅の活用などの特性が明らかとなった。地域展開を実践している宮城県ほたる学園を対象としてケーススタディを実施した。施設→自立訓練棟→自立ホーム→グループホームの利用者自立プログラム内容、各居住空間の使い方、住み方を調査しグループホーム的居住機能の有効性と問題点の所在を把握した。本研究はノーマライゼーションの理念に基づき、居住・福祉サービスの小規模分散配置、家庭的環境条件整備の視点からグループホーム的居住形態を有する各種施設・住宅を対象として、存在構造と改変方向、具体的整備指針を明らかにすることを目的としている。本年は平成10年度に実施した郵送アンケート調査の継続的分析と、平成11年度に実施した施設事例調査の補足、さらに比較検討するための施設調査、グループホームの継続訪問調査と先駆的事例のケーススタディ等を行った。その結果以下の点が把握できた。各種先駆的事例の考察から「施設の住宅化」と「住宅の福祉化」が把握できた。集まって住むという両者の延長上にグループホーム的居住が要として位置付けられる。グループホーム的居住実践の拡大傾向が各施設種でみられる。特に定員に比べ在籍者が減少傾向にある施設では個室化、小グループ化の試みが増大しており、制約条件の大きい既存施設においても住生活重視の方向性が顕著である。空間的な限界も示された。その場合、個室化優先施設群(高齢者施設等)と小グループ化志向施設群(児童福祉施設等)と2軸が存在していることが明確となった。知的障害者グループホームの継続調査を通して、4人単位の有効性、住生活の経験をふまえた生活の向上、地域内居住での生活圏の拡大等グループホーム的機能の意義が確認できた。住空間についても個の領域としての個室の役割、交流の場である台所・食堂・居間の重要性が明らかとなった。施設が各種グループホーム的機能を段階的に準備し、地域とネットワークを持つことで利用者の自立をさらに促進できることも確認できた。
感覚を統合し意識を生み出す場“前障”の機能解析

本研究では、前障の投射ニューロンで特異的にCreを発現するトランスジェニックマウス(Cla-Creマウス)を用いて、前障を介する神経回路とその生理機能を明らかにすることを目的として実験を行った。我々は昨年度までに、アデノ随伴ウイルス(AAV)および狂犬病ウイルス(RV)を用いた遺伝学的手法により、Cre陽性ニューロンの投射先および前シナプスニューロンの同定を行った。その結果、Cre陽性ニューロンが大脳皮質の幅広い領域および一部の皮質下領域と相互的に神経結合することが示されていた。本年度は、Cre陽性ニューロンの投射様式をさらに詳細に調べるために、犬アデノウイルス(CAV2)とAAVを用いて、特定の脳領域に投射するCre陽性ニューロンの軸索側枝の可視化を行った。まず、前障の主な投射先である前頭前野皮質あるいは嗅内皮質の軸索末端からCAV2を感染させ、これらの領域に投射するCre陽性ニューロンのみでFlp組換え酵素を発現させた。次に、AAVを前障に注入してFlp依存的に膜局在型GFPを誘導し、投射先特異的にCre陽性ニューロンの軸索の蛍光標識を行った。その結果、どちらの脳領域にCAV2を感染させた場合でも、前頭前野皮質、前嗅核、島皮質、扁桃体基底外側部、嗅内皮質など幅広い脳領域で軸索が観察され、Cre陽性ニューロンが脳内の幅広い領域に同時に軸索側枝を投射していることが示唆された。我々の研究チームでは、スライスおよびin vivo電気生理学的実験により、前障Cre陽性ニューロンが大脳皮質の幅広い領域の活動を一過的に抑制することを示している(未発表データ)。今回得られた結果は、単一の前障投射ニューロンが脳内の幅広い領域に投射し、その活動を同期的に制御する可能性を示唆しており、電気生理学実験で得られた結果を支持するものである。前障は大脳皮質と基底核の間に存在するシート状の脳領域で、すべての哺乳類に存在するがその生理機能はほとんど分かっていない。我々は、前障の投射ニューロンで特異的にCre組換え酵素を発現するトランスジェニックマウス(Cla-Creマウス)を用いて、前障を介する神経回路と前障の生理機能を解明することを目的として実験を行った。まず、前障投射ニューロンの投射様式を明らかにするために、アデノ随伴ウイルスベクターを用いてCre依存的に蛍光蛋白質tdTomatoを発現させ、Cre陽性ニューロンを可視化した。その結果、Cre陽性ニューロンは、前頭前皮質を含む広範囲の大脳皮質(主にIV層)、前嗅核、扁桃体基底外側部、嗅内皮質など、脳内の幅広い領域へ投射することが明らかとなった。これらの投射の大部分は同側性であったが、終脳前部への投射は対側にも認められた。また、前障の前後軸に沿って異なる領域にウイルス注入を行った結果、前頭前皮質や前嗅核は、主に前障の前方部から投射を受けることが明らかとなった。次に前障の生理機能について調べるために、Cre陽性ニューロンの神経活性を人為的に操作することを試みた。まず、アデノ随伴ウイルスベクターを用いてCre依存的にジフテリア毒素(DTA)を発現させたところ、約90%のCre陽性ニューロンを死滅させることに成功した。また、DREADD(Designer Receptors Exclusively Activated by Designer Drugs)と呼ばれる変異型ムスカリン受容体をCre依存的に発現させ、リガンドであるCNO(clozapine N-oxide)を腹腔内注射することにより、Cre陽性ニューロンの活性を人為的にオン・オフできることを確認した。今後はこれらのマウスを用いて包括的な行動実験スクリーニングを行い、前障の生理機能を明らかにしていく予定である。我々は、前障の投射ニューロンで特異的にCre組換え酵素を発現するトランスジェニックマウス(Cla-Creマウス)を用いて、前障を介する神経回路および前障の生理機能を解明することを目的として実験を行った。昨年までの研究から、前障は前頭前皮質を含む大脳皮質、前嗅核、扁桃体基底外側部、嗅内皮質など、脳内の幅広い領域へ投射することが示されている。本年度は、前障が脳のどの領域から入力を受けるのかを調べるために、狂犬病ウイルスベクターを用いた逆行性経シナプス標識法によりCre陽性細胞の前シナプス細胞の同定を行った。その結果、前頭前皮質、島皮質、前嗅核、扁桃体基底外側部、嗅内皮質など、前障の投射先と重複する幅広い領域が標識され、前障はこれらの領域と相互的に神経結合することが示された。またこれらの領域以外にも、Cre陽性細胞は一部の視床核や海馬、縫線核などからも入力を受けることが明らかとなった。さらに、前障内のニューロンも多数標識された。これらの前シナプス細胞の大部分はGABAを発現しないが、前障内部にのみGABA陽性細胞が存在した。このことから、前障は脳の様々な領域から興奮性の入力を受け、その情報を前障内部の抑制性ニューロンを含む神経回路で処理し、他の脳領域にフィードバックしている可能性が示唆された。また、前障の生理機能を解明するために、ジフテリア毒素(DTA)でCre陽性細胞を死滅させたマウス(Cre-DTAマウス)を作製し、基本的な行動テストバッテリーを行った。