hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
超高速シーケンシング法による三日熱マラリア原虫近縁サルマラリア原虫のゲノム解読

本研究ではP.vivaxに特異的なゲノム変化の網羅的な同定を目指し、P.vivaxに最も近縁なサルマラリア原虫P.cynomolgiのゲノム解読、及び、比較ゲノム解析を行った。【結果】次世代シーケンサーの導入、及び、実験的手法によってP.cynomolgiのドラフトゲノムを構築することに成功した。既に解読されているP.vivaxおよびサルマラリア原虫P.knowlesiのゲノムとの3種間比較解析を行った結果、約9割のタンパク質コード遺伝子(4633個)が3種間で共通しており、残り1割の非共通遺伝子が各原虫種に固有であった。非共通遺伝子の多くは、ゲノム中に複数のホモログを持つ多重遺伝子族に属していた。特筆すべきは、3種の原虫の宿主赤血球への侵入に関与する分子であるDuffy binding protein(DBP)及びReticulocute binding protein(RBP)の遺伝子の数が、3種間で異なっていた点である。これは、今後P.vivaxとサルマラリア原虫種の宿主域を規定する分子基盤を解明する上で重要な発見と考えられる。さらに、比較ゲノム解析から、vir,kir,SICAvar遺伝子群の共通祖先の同定やヒプノゾイト形成に関わる候補遺伝子の推定、なども行うことができた。P.vivaxは、サルマラリア原虫には高い感染感受性を示すニホンザルに対しても感染しない。ニホンザルのDuffy Protein cDNA配列を決定したところ、低感受性のカニクイザルのそれと酷似していることが明らかになった。
DNA分析手法を応用した甲殻類捕食者によるヒラメ仔稚魚の被食生態の解明

従来の形態学的手法では種判別が困難であった甲殻類消化管内容物から、ヒラメDNAを種特異的PCR法により効率的に検出する手法を開発した。また、実際のフィールド調査の際に欠かせない、大量のサンプルを効率的に処理することが可能な検出法の開発に、DNA-DNAハイブリダイゼーション法とELISA法を応用することにより成功した。本手法は、エビジャコ等の肉食性甲殻類による捕食後(水温20°Cの条件下)810時間程度までのサンプルからヒラメDNAを検出可能であり、PCRによる増幅後最大2000サンプル程度まで一回の検出反応で処理可能である。エビジャコ胃内容物の顕微鏡による観察においてほとんど内容物が確認できなかったサンプルからもヒラメDNAを検出できたが、消化が進んで内容物が確認できないサンプルからの検出は一般に不可能で当たり前と考えられる。この結果は、消化によるDNAの検出阻害の影響を極限まで排除できたことを示しており、従来捕食後4時間程度までのサンプルが限界であった検出可能範囲を大幅に拡大することが可能となった。これにより、ヒラメ被食生態の解明のためのフィールド調査への適用が可能となった。ヒラメの天然稚魚および放流種苗の被食実態の一端を明らかにする目的で実施したフィールド調査結果から、被食者および甲殻類捕食者の生態学的知見などを得ることが出来た。宮古湾の調査結果からは、ヒラメ稚魚の着底時期や砂浜浅海域での成長、エビジャコの生息密度や体長組成、ヒラメ稚魚とエビジャコとの生態的関係などについて新知見を得た。若狭湾の調査からは、キンセンガニが積極的捕食者ではなくスカベンジャー的な生態的地位を占めることや、カミナリイカや他の魚類などがヒラメ放流種苗の強力な捕食者であることなどの新知見を多く得た。これらの情報は、異体類被食研究やより効果的な種苗放流技術の開発に非常に有用であると考えられる。今年度は、甲殻類消化管内容物の被食種判別をDNA分析を応用して行なうための手法開発と、宮古湾および仙台湾におけるフィールド調査等を行なった。DNA分析による被食種判別法開発では、ヒラメmtDNAの調節領域周辺について塩基配列を精査し、ヒラメのmtDNAを特異的に増幅するプライマーを数種作成し、増幅試験を行なった。その中でおよそ190塩基の長さのDNA断片を増幅するプライマーセットが、特に被食種判別に有用であることを見出した。評価にあたっては、フィールドで実際に甲殻類に捕食される可能性の高いマハゼ等の魚類、アミ類、多毛類、コエビ類等のDNAを比較対象として用いた。これを受けて、このプライマーセットによるヒラメmtDNAの検出力と甲殻類による消化時間との関係を明らかにするため、エビジャコを捕食者とした飼育実験を行なった。実験は、宮古湾で採集したエビジャコを1週間絶食させた後ヒラメを与え、1.5時間後に残餌を回収した時点を0として、1時間おきにエビジャコの回収を16時間後まで行なった。回収したエビジャコは直ちに冷凍固定し、消化管内容物からのDNA抽出に供した。なお実験時の水温は、ヒラメ仔稚魚着底時期の水温を想定し20°Cとした。また大量のフィールドサンプルを分析する際には、迅速かつ正確に処理する手法が不可欠となるため、ELISA法を応用した検出法の開発に着手した。開発中の手法は、PCR産物をナイロンメンブレンに転写後、DNA-DNAハイブリダイゼーションにより検出するもので、DNAの標識にはジゴキシゲニンによる化学標識が有効であり、安全性も高いことを確認した。

来年度は検出力の高いプローブの開発などを行い、大量処理法の実用化を図る予定である。さらにヒラメとの比較と広範な応用をめざして、イシガレイmtDNAの調節領域のクローニングを行った。これまでに約1000塩基対の配列を決定し、専用プライマーの開発等を行なっている。フィールド調査は、被食種の消化管内滞留時間とDNAの検出力を考慮して行い、DNAサンプルの調整やヒラメやエビジャコの生息密度など、本調査に向けた知見の整理を行なっている。今年度は、甲殻類消化管内容物からの被食種DNAの検出率と消化時間との関係を明らかにし、併せてサンプルの大量処理法の開発とその有効性の確認を行った。また野外調査により、捕食者および被食者の生息状況や被食実態の一部を明らかにした。水温20°Cにおける被食種DNAの検出率は、被食後8時間(捕食時間も加えると9.5時間)経過時点まで100%であった。その後時間経過と共にDNAの検出率は低下し、9-12時間後では40%以下、13時間以降のサンプルではほとんど検出不可能となった。これは時間経過と共に消化管内容物の確認が困難となり、8時間以降のサンプルからは消化物さえ確認できなくなるという解剖による観察結果と合致するものであった。この結果は種特異的PCR法によって増幅した被食種DNAを電気泳動法によって検出したものであるが、開発した大量処理法に用いたドットブロットハイブリダイゼーション(DNA-DNA)法とELISA法の組み合わせによる検出感度は、電気泳動法によるものと同等かそれ以上であり、明確な結果を得ることが可能であった。用いた8×11cmのナイロンメンブレンには1枚につき96サンプルをブロットすることができる上、一度に10枚程度を検出反応に供することが可能であり、実験操作も簡便で労力とコストの低減をはかることが可能となった。また、野外採集甲殻類サンプルからのヒラメDNAの検出にも成功し、本手法の有用性が実証された。以上の結果とエビジャコの生態を考慮すると、捕食者の採集は日没後12時間程度までの早朝に行うべきであると考えられる。宮古湾で行った野外調査の結果、ヒラメの着底時期が主に6月中旬から7月中旬であることや、エビジャコの生息密度とヒラメの生息密度の間に逆の相関関係があること等が明らかとなった。仙台湾での調査では、水深15m以浅に着底したイシガレイが成長と共に浅い海域に移動することと、それを追うようにエビジャコの生息密度が変化すること、主に大型のエビジャコがイシガレイ仔稚魚を捕食していること等が明らかとなった。今年度は3ヶ所で行った野外調査により得られたサンプルの解析を主に行い、捕食者および被食者の生息状況や被食実態を明らかにした。採集は前年度までの結果を踏まえて、日没後12時間程度までの夜間から早朝に行った。若狭湾においては、ヒラメの稚魚を捕食していた甲殻類はほとんどがキンセンガニであり、浅海域における優占的な捕食者であることが示唆された。採集されたキンセンガニのうち約6%の個体からヒラメのDNAが検出された。甲殻類以外でヒラメ稚魚を捕食していたのはカミナリイカ、ヒラメ成魚、マエソ、メバル、アカエイ、アオリイカで、特にカミナリイカはヒラメ稚魚の強力な捕食者であることが示唆された。宮古湾では、ヒラメの着底時期が主に6月中旬から7月中旬であることや、エビジャコの生息密度とヒラメの生息密度の間に逆の相関関係があること等が明らかとなった。
てんかん原性Cl-ホメオスタシス分子機構のヒト摘出病巣及びモデル動物を用いた解析

てんかんでは、脳内の局所的な神経の過剰興奮がしだいに周囲の細胞に拡がり、ついには脳全体が同期した痙攣波を生じ大発作を引き起こす。一方、大脳皮質発達期において抑制性伝達物質として作用すべきGABAやGlyが、逆に興奮性に作用する場合があることが示されてる。GABA及びGlyレセプターはCl^-チャネルを開口させるので、Cl^-ホメオスタシスがこの現象の要因になっている可能性が示されてきた。過剰な神経興奮によりCl^-ホメオスタシスが破綻することが、てんかんの形成や伝播、維持に探く関与している可能性がある。そこで、我々は、Cl^-ホメオスタシス調節分子として、Cl^-トランスポーターに着目した。臨床的に部分てんかんとよばれる系において大脳皮質形成異常を有する例が多いことが、近年の画像診断法の進歩により明らかになってきた。そこで、本研究は大脳皮質形成異常モデル動物及びヒト病巣摘出標本を用い、てんかんにおけるCl^-ホメオスタシス破綻の分子メカニズムを、In situハイブリダイゼーション組織化学法、免疫組織化学法による検討を行った。1.大脳皮質凍結損傷動物におけるNKCClタンパク質の発現細胞種の確認これまでの研究から凍結損傷4日後にNKCCl遺伝子の発現が損傷部位で上昇することがわかった。NKCC1の発現が上昇した部位は、神経細胞で構成されていることを免疫染色法により明らかにした。(第26回日本神経科学会、第33回北米神経科学会他)2.大脳皮質凍結損傷動物におけるglycine receptorサブユニット遺伝子の発現変化GlyRのサブユニットのうち、幼弱期にしか認められないα2サブユニットが凍結損傷後24日後に一過的に発現が上昇した。しかし、βサブユニットには発現変化は認められなかった。(第81回日本生理学会、第26回日本神経科学会、第33回北米神経科学会)3.ヒト摘出病巣におけるCl-transporterの発現変化大脳皮質形成異常を含む摘出病巣を用いてKCC2タンパク質について免疫染色を行った。その結果、大脳皮質形成異常に特徴的な所見である巨大細胞にはその発現に変化は認められなかったが、巨大細胞の周囲に存在する正常な神経細胞でKCC2タンパク質が減少していた。KCC2遺伝子についてin situ hybridization組織化学法を用いて調べた。同様にKCC2遺伝子の発現減少を認めた。NKCC1タンパク質についてはこのような変化は見られなかった。これらの結果から、大脳皮質形成異常部位において巨大細胞の周囲に存在する神経細胞で細胞内Cl^-濃度が上昇していることが示唆され、GABAに対する応答性が変化し、てんかん発生・維持に影響を与えていることが考えられた。近年、抑制性伝達物質として作用すべきGABAが、逆に興奮性に作用する場合があることが示されている。GABAはCl^-チャネルを開口させるので、過剰な神経興奮により、Cl^-ホメオスタシスが破綻することがこの現象の引き金になると考えられる。従って、脳の異常な興奮を引き起こすてんかんの形成や伝播などにCl^-ホメオスタシスが関与している可能性がある。本研究ではCl^-ホメオスタシスを調節する分子としてCl^-トランスポーター(KCC2,NKCC1)に注目した。加えて、臨床的に部分てんかんとよばれる系において大脳皮質形成異常を有する例が多いことが、明らかになってきた。本研究は大脳皮質形成異常モデル動物及びヒト病巣摘出標本を用い、てんかんにおけるCl^-ホメオスタシス破綻の分子メカニズムを解明する事を目的とし、in situハイブリダイゼーション法、Cl-imaging法等による検討を行った。1.大脳皮質発達におけるCl^-トランスポーター遺伝子と細胞内Cl^-濃度の関連正常動物の発達過程におけるCl^-トランスポーター遺伝子の発現変化をIn situハイブリダイゼーション組織化学法を用いて検討した。その結果、生直後の脳室帯ではNKCC1遺伝子の発現は、皮質板と比較して非常に強く、第5・6層でのNKCC1遺伝子の発現は皮質板より弱かった。KCC2遺伝子の発現パターンはNKCC1と逆転していた。この発現パターンはMEQを用いたCl^-イメージングによる細胞内Cl^-濃度と対応していた。(第25回神経科学大会他、Neuroreport他、2002年)。2.大脳皮質凍結損傷モデル動物(forcal freeze-lesionラット)におけるCl^-トランスポーター遺伝子の発現変化新生仔ラットの頭皮を切開し頭蓋骨表面を露出し、液体窒素で冷却した直径1mmの銅棒を8秒間頭蓋骨直上に静置し、大脳皮質凍結損傷モデル動物を作成する。この動物を用いて、凍結損傷部位及びその周辺部位におけるこれら遺伝子の発現についてIn situハイブリダイゼーション組織化学法により検討した。その結果、作成4日後にKCC2遺伝子の発現が消失している部分が認められ、また、NKCC1遺伝子の発現が損傷部位において増加していた(第80回日本生理学会、2003年3月)。3.ヒト摘出病巣におけるCl^-トランスポーター遺伝子の検出ヒトの各Cl^-トランスポーター遺伝子(KCC2,NKCC1)を正常部分を多く含んだ組織を用いてIn situハイブリダイゼーション組織化学法によりその発現局在等を検討した。その結果、NKCC1遺伝子は非常に弱いながらも、アストロサイトと神経細胞に、KCC2遺伝子は神経細胞にのみ認められた。

4.RT-PCR法によるCl^-トランスポーター遺伝子の検出正常ラットの大脳皮質の脳スライス標本を用いたgramicidin穿孔patch clamp法を行い、細胞内Cl^-濃度を測定した単一神経細胞よりmRNAを採取し、Single-cell mutiplex RT-PCR法を用いて、Cl^-トランスポーター遺伝子及び内部標準としてβ-actin遺伝子を検出し、半定量を行える条件を決定した。てんかんでは、脳内の局所的な神経の過剰興奮がしだいに周囲の細胞に拡がり、ついには脳全体が同期した痙攣波を生じ大発作を引き起こす。一方、大脳皮質発達期において抑制性伝達物質として作用すべきGABAやGlyが、逆に興奮性に作用する場合があることが示されてる。GABA及びGlyレセプターはCl^-チャネルを開口させるので、Cl^-ホメオスタシスがこの現象の要因になっている可能性が示されてきた。過剰な神経興奮によりCl^-ホメオスタシスが破綻することが、てんかんの形成や伝播、維持に探く関与している可能性がある。そこで、我々は、Cl^-ホメオスタシス調節分子として、Cl^-トランスポーターに着目した。臨床的に部分てんかんとよばれる系において大脳皮質形成異常を有する例が多いことが、近年の画像診断法の進歩により明らかになってきた。そこで、本研究は大脳皮質形成異常モデル動物及びヒト病巣摘出標本を用い、てんかんにおけるCl^-ホメオスタシス破綻の分子メカニズムを、In situハイブリダイゼーション組織化学法、免疫組織化学法による検討を行った。1.大脳皮質凍結損傷動物におけるNKCClタンパク質の発現細胞種の確認これまでの研究から凍結損傷4日後にNKCCl遺伝子の発現が損傷部位で上昇することがわかった。NKCC1の発現が上昇した部位は、神経細胞で構成されていることを免疫染色法により明らかにした。(第26回日本神経科学会、第33回北米神経科学会他)2.大脳皮質凍結損傷動物におけるglycine receptorサブユニット遺伝子の発現変化GlyRのサブユニットのうち、幼弱期にしか認められないα2サブユニットが凍結損傷後24日後に一過的に発現が上昇した。しかし、βサブユニットには発現変化は認められなかった。(第81回日本生理学会、第26回日本神経科学会、第33回北米神経科学会)3.ヒト摘出病巣におけるCl-transporterの発現変化大脳皮質形成異常を含む摘出病巣を用いてKCC2タンパク質について免疫染色を行った。その結果、大脳皮質形成異常に特徴的な所見である巨大細胞にはその発現に変化は認められなかったが、巨大細胞の周囲に存在する正常な神経細胞でKCC2タンパク質が減少していた。KCC2遺伝子についてin situ hybridization組織化学法を用いて調べた。同様にKCC2遺伝子の発現減少を認めた。NKCC1タンパク質についてはこのような変化は見られなかった。
メルケル細胞膜上にあるアセチルコリン受容体チャネルの性質とその生理的役割

実験前日に蛍光色素キナクリンをラット腹腔内に注入し、皮膚表皮基底層に存在するメルケル細胞にキナクリンを選択的に取り込ませた。表皮片を酵素及び機械処理して細胞を単離し、蛍光顕微鏡下でキナクリン蛍光を発する単離細胞(メルケル細胞)をマークした。位相差顕微鏡下に移してマークされたメルケル細胞にナイスタチン穿孔パッチクランプ法を適用した。メルケル細胞の特徴である一過性K電流(A電流)と遅延K電流の発生することを確認した後、Y字管法を用いてアセチルコリン(ACh)溶液を同細胞に投与した。-40mVの保持電位において約20%のメルケル細胞が応答電流を惹起し、それは全てコンダクタンス増大を伴う一過性の内向き電流だった。イキ値は10μMぐらいで、逆転電位は0mV以上であった。ニコチン溶液は同様の電流を惹起したが、ムスカリン溶液は惹起できなかった。ACh惹起電流はニコチン様拮抗薬であるD-ツボクラリンによっては抑制されたが、骨格筋型の同拮抗薬α-ブンガロトキシンでは抑制されなかった。これらのことより、一部のメルケル細胞はニコチン様ACh受容体をもち、AChの結合により一過性の脱分極を生じることがわかった。AChの由来に関しては、副交感神経終末、感覚神経終末(レシプロカル・シナプスをもつ)、またはメルケル細胞自身からの放出等が推測されるが、今のところ不明である。ACh惹起電流は脱感作が顕著であるため、数回の繰り返し刺激しか行えなかった。現在は、ラット皮膚触盤(メルケル細胞・神経-複合体)の機械刺激に対する応答を感覚神経線維束から記録しつつ、アセチルコリンやD-ツボクラリンを触盤に注入することによって、これら薬物の機械応答に対する作用を検討しているところである。
高機能自閉スペクトラム症者への就労支援プログラムの普及と内容改定に関する検討

高機能の自閉スペクトラム症(以下、HFASD)のある者への就労における就労支援プログラム(池田, 2016)を通じた長期的な就労支援が行える環境の構築を検討することを目的とする。1就労支援従事者の人材育成を観点とし、就労支援プログラム(以下、プログラム)の普及法を検討し、それに基づき就労支援機関に所属する職員へ実施、その効果を明らかにする。2就労支援プログラムの継続的な開発(職場定着のための支援ツールの早期導入・集団用プログラムの改定)と効果の検討を行う。
酵母全基準株のrRNA情報データベース構築と多次元情報解析による分類体系再構築

18S rDNAの塩基配列の決定を行うと同時に、rDNA遺伝子の分類指標としての評価を行った。さらに、Metchnikowiaceae科をモデルとして、多次元情報解析を行った。その結果、全ての属において、18S rDN塩基の進化速度は、26S rDNA D1/D2領域の進化速度に比べ遅いことがわかった。また、これまでにも報告があったが、rDNAには変位に富む部分とそうでない部分があることもわかった。これらを属レベル、種レベルの同定手段として使い分けて用いることができる。非常に興味深かったのは、属内の異なる種を比較した際、26S rDNA D1/D2領域の相同性に連続性があったが、18S rDNAには不連続性があり、特に、Pichia属にはいくつかのまとまった集団があることが示唆された。この不連続性が分類群としてまとまりとして捕らえることができるのではないかと思われた。多次元情報解析の結果、すべてにおいて共通した結果が得られたものについては、よりその分類体系が正しいという結果と受け止められるが、解析により結果が異なる分類群については、どれが正しいというよりは、新規であるという認識を持つべきではないかという考えに達した。18S rDNAの塩基配列の決定は、カルチャーコレクションに保存されている既知種に対して行うと同時に、新規分類群についてもその探索をも含めて行い、新しくrDNAデータを蓄積することができた。深海底の試料およびリンゴの樹木など自然界から分離された担子菌酵母の新種、マングローブ林より分離された子嚢菌酵母の新種を見出した。これらについては、18S rDNAに加え、26S rDNAのD1/D2領域およびITS(internal transcribed spacer)領域の塩基配列の決定も加えて行った。本研究では、研究体制を整え、酵母菌18S rDNA塩基配列の決定と、18S rDNAデータと表現形質データとのデータ整理の構築に努めた。まず、それぞれの研究分担者が有する微生物株の18S rDNAの塩基配列を解析し、それに関連した酵母の18S rDNA塩基配列の収集と整理を行った。その結果、子嚢菌系不完全酵母Candida属の基準株100株、子嚢菌酵母Debaryomyces属全種、Q9を有するPichia属全種、Galactomyces属全種、Metschnikowia属全種、Clavispora属全種、その他、Q8を有するPichia属数種について解析が終了した。また、病原性酵母については、子嚢菌、担子菌を合わせ、50%強の解析が終了した。次に、18S rDNAデータ解析、並びに表現形質の多次元解析については、国立大学遺伝研究所、宮崎(研究分担者)らが開発したソフトInforBIOを利用し、解析、並びにデータベースより収集した菌株のデータベースの構築を開始した。今後、生理性状のデータについても同時にデータベースかを進めていく予定である。18S rDNAの二次構造作成用ソフトウェアの開発については、推定二次構造を考慮したアライメント作成のアルゴリズムの構築を現在行っている。アルゴリズムの完成には至っていないが、ほぼそのシステムは定まり、実際にこれらを使用する酵母のデータベース作成研究分担者の要望を考慮しつつ進めているところである。担子菌酵母については、Urediniomycetes綱に分類されるRhodosporidium属について、rDNA塩基配列並びにその介在配列であるITS領域の解析を行った。続いて本属の多相分類学を基盤とする分類体系構築のために重要な生物学的情報のひとつとして交配型に着目し、Rhodosporidium属の基準種であるRhodosporidium toruloidesの保存菌株について交配試験を行った。

子嚢菌酵母については、Metscknikowia属について、多次元情報解析のために、生物学的情報の一種である発酵性、炭素源資化性試験について近縁種との比較情報に乏しかった性質の解析を行った。Pichia属、Candida属について、それぞれの新種を見出し、それらのrDNA塩基配列、ならびにITS領域の塩基配列も決定した。Saccharomyces属について、その一種と思われる分離株について18S rDNAを決定したところ、近年報告されたSaccharomyces kudriavzeviiとほぼ一致するにもかかわらず、表現形質が極めてSacchromyces cerevisiaeに類似していることを見出した。本株について、染色体の核型解析、全ゲノムのアレイ解析、ミトコンドリア遺伝子の解析を進め、その結果、本分離株のrDNA導伝子のみがS.cerevisiae型ではないことを見出した。18S rDNAを始めとするrRNA遺伝子は、生物の系統進化を反映しているとされている。しかし、本属において、その疑問が持たれた。現在、ゲノム構成について検討している。多相的解析の目的のために、国立遺伝研が開発したInfoBioに加え、BioNumericsを用いて、系統解析、表現系との比較解析、主成分解析を行った。18S rDNAの塩基配列の決定を行うと同時に、rDNA遺伝子の分類指標としての評価を行った。さらに、Metchnikowiaceae科をモデルとして、多次元情報解析を行った。その結果、全ての属において、18S rDN塩基の進化速度は、26S rDNA D1/D2領域の進化速度に比べ遅いことがわかった。また、これまでにも報告があったが、rDNAには変位に富む部分とそうでない部分があることもわかった。これらを属レベル、種レベルの同定手段として使い分けて用いることができる。非常に興味深かったのは、属内の異なる種を比較した際、26S rDNA D1/D2領域の相同性に連続性があったが、18S rDNAには不連続性があり、特に、Pichia属にはいくつかのまとまった集団があることが示唆された。この不連続性が分類群としてまとまりとして捕らえることができるのではないかと思われた。多次元情報解析の結果、すべてにおいて共通した結果が得られたものについては、よりその分類体系が正しいという結果と受け止められるが、解析により結果が異なる分類群については、どれが正しいというよりは、新規であるという認識を持つべきではないかという考えに達した。18S rDNAの塩基配列の決定は、カルチャーコレクションに保存されている既知種に対して行うと同時に、新規分類群についてもその探索をも含めて行い、新しくrDNAデータを蓄積することができた。深海底の試料およびリンゴの樹木など自然界から分離された担子菌酵母の新種、マングローブ林より分離された子嚢菌酵母の新種を見出した。これらについえては、18S rDNAに加え、26S rDNAのD1/D2領域およびITS(internal transcribed spacer)領域の塩基配列の決定も加えて行った。
震災復興初期における暫定的土地利用方針に関する緊急研究

本研究は、南海トラフ巨大地震による大規模災害に備える三重県を対象にして、被災後の震災復興事業の迅速な推進に向けて、その重要な準備段階である「震災復興初期における暫定的土地利用計画」を検討することを目的としている。震災復興の対策に関して先進的に取り組んでいる東京都および都区市部の震災復興マニュアル等における暫定的土地利用の分析などを通じて、暫定的土地利用計画の骨格と策定手順、暫定的土地利用計画図、応急仮設住宅ガイドラインについて考案した。平成27年度の研究成果は、第一に、本研究を産・官・学の連携で推進するために関係機関に呼びかけをして「応急仮設住宅ガイドライン研究会」を設置して、研究体制を構築したことである。参加機関は、三重県建設業協会、三重県建築士事務所協会、国土交通省中部地方整備局、三重県県土整備部・健康福祉部、伊勢市都市整備部、志摩市建設部、亀山市建設部、伊賀市建設部、三重大学浅野研究室であり、これによって関連データの収集、行政機関等の意見集約を効率的に行うことが出来た。これは当初計画にはなかったもので大きな成果であった。第二に、三重県の新しい地震被害想定調査結果の集計データの収集と詳細化として、三重県防災対策部の協力のもとで、同調査結果の集計データを収集し、研究会メンバーである4市を対象として、市単位及び行政区単位ごとに調査結果を詳細化した。第三に、震災復興初期の土地利用のニーズの推計・集計として、震災復興初期の時期区分ごとの土地利用の用途のニーズ(救援活動用地・仮設住宅建設地・災害廃棄物仮置場等)を明らかにするとともに、国によって示されている現行の用途ごとの用地選定基準を把握した。第四に、4市における暫定的土地利用の現状の候補地データの収集と詳細化として、現状の候補地データを用途ごと(救援活動用地・仮設住宅建設地)に収集するとともに、市単位及び行政区単位ごとに被害想定調査結果を詳細化した。第五に、「暫定土地利用計画図(案)」の作成として、計画の策定手順を検討し、基本方針の検討、必要な土地利用の内容の検討、必要量(面積)の推計、候補地の選定、利用計画の策定、必要量の充足度評価、計画図の作成等からなると仮定した。また計画図(応急対策期・復旧対策期)の試案を伊勢市を対象に作成し、次年度以降の研究に向けて計画図の有用性と課題について検討した。第一に、当初計画にはなかった産官学による「「応急仮設住宅ガイドライン研究会」の設置を通して、研究体制の構築をすることが出来た。第二に、三重県の新しい地震被害想定調査結果の集計データの収集と詳細化、震災復興初期の土地利用のニーズの推計・集計、4市における暫定的土地利用の現状の候補地データの収集と詳細化について、ほぼ予定通りに進めることが出来た。なお、当初計画では研究対象を8市としているが、初年度は4市を対象としており、次年度以降に他市を追加する予定である。第三に、上述の研究成果を踏まえて、「暫定的土地利用計画図」として、策定手順の検討と伊勢市を対象とした「応急対策期・復旧対策期」における「暫定土地利用計画図(案)」の作成について、ほぼ予定通りに作成することが出来た。平成28年度の研究成果は、第一に、平成27年度に立ちあげた「応急仮設住宅ガイドライン研究会」を継続して設置するとともに、内湾低平地部の北勢地域から四日市市、半島・島しょ部の東紀州地域から紀北町の2市町を新メンバーとして招へいし、充実した研究体制を構築出来たことである。第二に、新たに研究会メンバーとなった2市町を対象として、三重県の新しい地震被害想定調査結果の集計データをもとに、市単位、行政区単位、小学校区単位ごとに調査結果の詳細化を行った。第三に、2市町における暫定的土地利用の現状の候補地データを用途ごと(救援活動用地・仮設住宅建設地)に収集するとともに、特に仮設住宅建設地に対しては現地調査を行った。第四に、平成28年4月14日に熊本地震が発生したが、被災地では応急仮設住宅の建設地の迅速な確保の重要性がクローズアップされたことから、平成28年度は、特に仮設住宅に焦点をあてて研究を進め、応急仮設住宅ガイドライン案を作成した。本ガイドラインは、仮設住宅の建設に関する一連のプロセスとその内容を解説することを目的として、仮設住宅の検討方針の設定、仮設住宅の必要戸数と必要用地面積の推計、建設候補地の検討、建設候補地の充足度評価の実施、建設候補地における配置計画の検討等を行うことができる内容としている。熊本地震による被災地の多くは、応急仮設住宅の建設候補地を事前に選定してこなかったために迅速な用地の確保が困難となり、その結果、東日本大震災と同様の状況が繰り返されてしまい、改めて事前準備の必要性が強く認識されることとなった。第一に、「応急仮設住宅ガイドライン研究会」の設置を継続し、新たに2市町の参加を得て、充実した研究体制の構築をすることが出来た。第二に、平成28年度に引き続き、新たに2市町を対象として三重県の新しい地震被害想定調査結果の集計データの収集と詳細化、暫定的土地利用の現状の候補地データの収集について、ほぼ予定通りに行うことが出来た。第三に、熊本地震の発生を踏まえて、特に仮設住宅に焦点をあてて研究を進め、応急仮設住宅ガイドライン案を作成することが出来た。第一に、平成27年度に立ちあげた「応急仮設住宅ガイドライン研究会」の活動を継続し、平成28年度に作成した「応急仮設住宅ガイドライン(案)」の細部を詰めて、「応急仮設住宅ガイドライン-計画編-」を完成させたことである。

第二に、完成した同ガイドラインを三重県が主催して県内29市町担当者が参加する「応急仮設住宅市町担当者会議」において公表、解説するとともに、三重大学が主催して主要な報道関係者(新聞・テレビ・ラジオ)が参加する「第30回定例記者懇談会」においてマスコミ発表を行うなど、研究成果を社会に対して広く公表するように積極的に努めたことである。第三に、震災復興に関する先進的な事例である東京都及び都区市部を対象にして震災復興マニュアル等を分析し、同マニュアル内に位置づけられた暫定的土地利用の現状と課題について考察をしたことである。全国的にみて東京都及び都区市部の震災復興への取り組みは先進的であるが、震災復興マニュアル等における暫定的土地利用に関する詳細な計画内容(選定条件、候補地一覧、配置図等)は不在である場合が多いことを明らかにし、今後の課題としてこれらを十分に検討することが必要であることを考察した。第四に、以上の分析結果を踏まえて、将来の発生が危惧される南海トラフ巨大地震後の震災復興の際に必要となる暫定的土地利用の在り方について検討し、暫定的土地利用計画の骨格をとりまとめたことである。同計画の基本的枠組みは、時期区分、ハザード情報、計画単位、都市施設、防災施設、生活利便施設、暫定的土地利用候補地等から構成されるものとし、また策定手順は、暫定的土地利用の必要面積の推計、候補地の検討、暫定的土地利用計画図の作成、充足度の評価と見直し等から構成されるものとした。最後に県内市町におけるケーススタディを行い、試案として暫定的土地利用計画図を作成した。本研究は、南海トラフ巨大地震による大規模災害に備える三重県を対象にして、被災後の震災復興事業の迅速な推進に向けて、その重要な準備段階である「震災復興初期における暫定的土地利用計画」を検討することを目的としている。震災復興の対策に関して先進的に取り組んでいる東京都および都区市部の震災復興マニュアル等における暫定的土地利用の分析などを通じて、暫定的土地利用計画の骨格と策定手順、暫定的土地利用計画図、応急仮設住宅ガイドラインについて考案した。平成28年度においては、第一に、研究対象として4市を追加する。平成27年度の研究においては、4市(亀山市・伊賀市・伊勢市・志摩市)を対象としたが、地域特性を考慮して「内湾低平地部」(北勢地域・中勢地域)、「半島・島しょ部」(南勢地域・東紀州地域)から研究対象とする自治体を選定するとともに、各市における暫定的土地利用の現状の候補地データの収集と詳細化を行う。第二に、平成27年度に検討をした「暫定土地利用計画図」の策定手順と試案について必要に応じて見直しを行うとともに、新たに「復興対策期」における「暫定土地利用計画図」の試案を作成する。第三に、東北地方の被災地を訪問して、自治体担当者へのヒアリング調査、暫定的土地利用のデータ収集、現地調査を実施する。第四に、以上の研究の推進にあたり、平成27年度に設立した「応急仮設住宅ガイドライン研究会」を継続して開催し、研究会を通じて「暫定土地利用計画図」の策定手順と作成した試案についての議論を行い、同計画の内容について精査する。第一に、市町の災害廃棄物処理計画を入手し、暫定的土地利用の1つである災害廃棄物仮置場の候補地データの収集を行う。平成28年度は市町が災害廃棄物処理計画を策定中であったため、災害廃棄物仮置場の候補地データを収集することが難しかったが、策定済みの市町も増えてきたことから、適宜、候補地データの収集を行う。
セリンプロテアーゼ様蛋白HtrAlをターゲットとした新規ケロイド治療の基礎的検討

HtrAlは、ケロイドに特徴的な遺伝子発現に重要な役割を担うことが示唆され、組織染色の結果とあわせて、ケロイド治療のターゲットならびに、治療方針の選択においてひとつの指標となる可能性を見いだした。真性ケロイドにおけるHtrAlの局在を決定するため、インフォームドコンセントを得た患者検体より、パラフィンブロックを作成し、Human HtrAl probeを用いたin situ hybridizationならびに抗HtrAl抗体を用いた免疫組織学的染色を6例に行った。その結果、HtrAl遺伝子及び蛋白は、ケロイド病変部の辺縁に強く発現する傾向がみられた。今後引き続き、症例数を増やし、この傾向が真性ケロイドに一貫するものかを確証する予定である。また、哺乳類細胞用発現vector, pcDNA3.1(-)にhuman HtrAlの蛋白コード領域全長が挿入されたプラスミド作製を完了した。Lipofectamine 2000,Optifect (Invitrogen)を用いて、293細胞にこのプラスミドを導入したところ、HtrAl蛋白が発現、分泌されていることが確認できた。今後、正常皮膚由来、ケロイド由来線維芽細胞にて導入を行い、変化を観察する。昨年度より引き続き、インフォームドコンセントを得た患者検体より、パラフィンブロックを作成し、Human HtrA1 probeを用いたin situ hybridizationならびに抗HtrA1抗体を用いた免疫組織学的染色を実施し、症例数を増やすことにつとめた。この結果、HtrA1の発現強度と、臨床経過がよく相関することが判明し、HtrA1が治療方針の決定に役立つ可能性が示唆された。これまで組織染色を行った症例に対して、術後の外来における臨床経過観察をさらに綿密に行い、HtrA1の発現と臨床経過の相関を観察ことが重要かつ有意義であることが判明した。また、ケロイド細胞においてHtrA1のノックダウン実験を行うことに成功した。コントロールケロイド細胞とHtrA1ノックダウンケロイド細胞とで、遺伝子発現をマイクロアレイ法に比較検討した。その結果、申請者らがケロイドにおいて過剰発現しいてる特徴的な遺伝子として報告した(Naitoh, et al. Genes Cells, 10. 1081-1091, 2005)遺伝子のうちのひとつが、発現低下することが判明した。このため、HtrA1は、ケロイドに特徴的な遺伝子発現に重要な役割を担うことが示唆され、組織染色の結果とあわせて、ケロイド治療のターゲットならびに、治療方針の選択においてひとつの指標となるい可能性が示唆された。
エンインアレン類の光化学的発生法の開発

本研究では、抗腫瘍活性を有する不安定エンインクムレン型抗生物質をモデルとして、光照射を引き金とする[2+2]開裂によるいくつかの不安定不飽和化合物の発生に関する研究を行った。1.[3]クムレンの発生:まずプロペラテトラエン1をエノン2と1,4-ジクロロ-2-ブテンとの光[2+2]付加物から合成した。1の光分解によりインダンとともに不安定な[3]クムレン(3)が発生できることが明らかとなった。また反応は照射する光の波長に依存し、短波長光(254nm)を照射した場合に効率よく(約30%)クムレンが発生したが、長波長光を用いた場合にはジパイメタン転位生成物がえられた。2.直線状ポリインの発生:エノン2とトリクロロエチレンとの光[2+2]付加物からジエチニルプロペラトリエン4を合成した。4の光照射を行ったところ、インダンとともにヘキサトリイン6が良好な収率(65%)でえられた。さらにパイ系が拡張した5の光分解でも、デカペンタイン7が好収率でえられた。この際にも少量の光転位生成物が副生することがわかった。以上のように、[4.3.2]プロペラン骨格を母体とする基質の光分解により、目的の[2+2]開裂反応が生起し、不安定不飽和分子を発生しうることが明らかとなった。本研究では、エンインアレンを発生しうる前駆体8の合成までは至らなかったが、現在エノン2とプロパルギルアセテートとの光[2+2]付加物を合成し、8への変換について検討中である。
新規βカテニンリン酸化動態可視化法を用いた生体内Wntシグナル調節機構の解析

本研究課題では、新たにβカテニンのリン酸化動態を可視化するプローブを開発することで、Wntシグナルをβカテニンタンパク質レベルで実時間定量する方法の開発に取り組んだ。その結果、既存のプローブと比較してWntシグナルに対する応答性の高いプローブを複数開発することに成功した。今後はこれらプローブのS/Nおよび感度をより改良し、生体内Wntシグナルの定量解析とその調節機構の解析に取り組む。本年度は新たな定量的かつ高感度なβカテニンリン酸化動態のリアルタイム可視化プローブの開発に取り組んだ。まず、既存のGSK3バイオセンサー(GSK3によってリン酸化・分解される人工ペプチド配列とEGFPの融合タンパク質)のEGFPを、高輝度発光タンパク質Nano-lantern(Takai et al., PNAS 2015)と置換し、新たに発光タンパク質型GSK3バイオセンサーを開発した。このプローブのWntシグナル刺激に対する応答性を3T3細胞における1細胞イメージングで検討した結果、既存のプローブと比較して同等以上の感度を示すという予備的な結果が得られた。しかしながら一過性の遺伝子発現では、Wnt刺激非依存的にプローブを高発現する細胞が数多くいるとみられ、プレートリーダーを用いた蛍光・発光測定ではこれらプローブのWnt応答性をS/Nよく定量的に検出することができなかった。この問題は安定発現株を樹立することで解決でき、プレートリーダーを用いた測定の結果、新たなプローブは既存のプローブと同等以上のWnt応答性を持つことが定量的に示された。以降、プローブの活性評価のためには安定発現株を樹立するストラテジーをとることとした。次にβカテニンN末端ペプチド配列とリン酸化依存的核外移行ペプチドを組み合わせ、新たなGSK3リン酸化ペプチドをデザインし、Nano-lanternのN末あるいはC末と融合することで、最終的に10種類の発光型βカテニンリン酸化動態可視化プローブを作製した。これらを発現した細胞のWnt応答性を検討したところ、オリジナルのGSK3バイオセンサーよりも高いWnt応答性を持つものが複数開発できていることが判明した。今後はこれらの新たに開発した発光型βカテニンリン酸化動態可視化プローブを用い、さらなるS/Nや感度の改善を図りながら予定通り研究計画を進めていく。当初の計画では予期しなかった問題もあったが、最終的にそれらの大部分は回避でき、着実に成果が得られているため。本年度はまず、前年度に開発したGSK3バイオセンサーの感度・S/Nの改善を目的とし、バイオセンサー領域のタンデム化の効果を評価した。まず、2リピートのタンデムにしたGSK3バイオセンサーペプチド領域を高輝度発光タンパク質Nano-lantern (Takai et al., PNAS 2015)のN末側またはC末側に融合し、Tol2トランスポゾンシステムを用いて3T3細胞に遺伝子導入した。次に目的のGSK3バイオセンサーを安定発現する細胞株を選抜し、Wnt刺激下における発光強度の増大をWntシグナル応答性として評価した。その結果、1リピートの場合と比較してWnt応答性が改善したバイオセンサーが得られた。しかしながらGSK3バイオセンサーの種類によっては安定発現株が得られない場合もあり、タンデム化によりWnt応答性が改善するかどうかはGSK3バイオセンサーの種類に依存する可能性が示唆された。次に、前年度に開発したGSK3バイオセンサーに加え、KTR (kinase translocation reporter)作製法をベースに新たなGSK3バイオセンサーを作製し、そのWntシグナル応答性を解析した。その結果、前年度に作製したGSK3バイオセンサーよりもさらにWnt応答性の良いバイオセンサーを得ることができた。さらにWnt刺激化における各バイオセンサーの核内外の局在変化を1細胞蛍光イメージングにより解析し、これらGSK3バイオセンサーのKTRとしての活性を検討した。今後はこれらの改良型βカテニンリン酸化動態可視化プローブを用い、スプリットルシフェラーゼ技術をNano-lanternに応用するなどの工夫によりさらなるS/Nや感度の改善を図りながら研究を進めていく予定である。概して当初の予定通りの進捗状況であるため、次年度も計画に沿って研究を進めていく予定である。発生生物学、細胞生物学消耗品の価格改定などにより、若干の端数が生じた。比較的少額であるので、当初の計画から大きな変更はない。
動学的一般均衡モデルによる経済格差拡大要因の解明と政策分析

1970年代以降、先進諸国で、経済格差が拡大していることに関し、所得格差指標である上位1%シェアが上昇している事実などが報告されるようになり、その原因を解明することが課題となっている。本研究では、政策の変化が格差の拡大に与えた影響に焦点をあてマクロ経済学的に分析を行った。主となる研究では、所得税などの税制の変化が人々の間の所得格差に影響を与える効果を分析するため、マクロ経済理論の構築と分析を行った。具体的には、研究期間中には、理論モデルの中で所得税の変化により所得格差などが少しずつ変化する様子(移行動学)を数値計算する方法の開発を行った。また、開発した理論の現実妥当性を、「理論が正しいとしたら、の現象が起きているはずである」という理論予測を立て、それを現実と比較する形で検証した。本研究では、1970年代以降のアメリカの上位1%シェアの上昇を、所得税などの税率の変化により説明できることを理論的に示した。この成果は、研究期間中に学術誌に採択され公刊された。従となる研究では、日本の国立大学間での競争的研究資金の割合の増加による、大学間での研究資金の格差拡大が、国立大学の研究成果にどのような影響を与えるかをマクロ経済学の手法を使い分析し、その成果を研究期間中に公刊した。これらの研究成果は、現実の経済格差に対しあるべき政策を議論していく上で、役立つものと考えられる。今後の研究の展開として、本研究で開発した理論モデルを、現実の様々な現象を分析するために利用していくことを考えている。1970年代以降、経済格差の拡大に付随して、米国などで、金融部門が大きく成長するようになっている事実などが報告されるようになっている。現在、こうした現象を本研究の理論モデルで説明可能かどうかの分析を行っている。次に、Aoki and Nirei (2015)で用いた偏微分方程式として表される所得分布の遷移式を、より望ましい方法で数値計算する方法に関して研究を行った。また、関連研究に関する文献調査を行った。(2)科学・技術の影響を考慮した動学的一般均衡モデルの構築および政策分析次に、科学・技術の影響を考慮した動学的一般均衡モデルを構築するために、関連研究に関して文献調査を行った。「当初の予想以上に進展している」部分と「やや遅れている」部分の2つがあるため、中間をとって「おおむね順調に進展している」と判断した。「当初の予想以上に進展している」部分に関しては、「研究実績の概要」で説明した2本の論文が公刊予定であることがあげられる。特に、American Economic Journal: Macroeconomicsに投稿した論文に関しては、予想以上に公刊までのプロセスが順調に進んだ。「やや遅れている」部分に関しては、Aoki and Nirei (2015)モデルを拡張して分析し、論文を作成することを予定していた。しかし、数値計算方法に関して検討が必要と判断したため、平成28年度はその作業を行い、論文の形にする作業は次年度に持ち越すことにした。(1) Aoki and Nirei (2015)モデルを用いた所得税仮説の検証および政策分析(2)科学・技術の影響を考慮した動学的一般均衡モデルの構築および政策分析交付申請書の「研究計画・方法」にて、研究期間中に公刊を目指すと記載した4本の論文のうち3本は、現時点で公刊済みである(ただし、3本のうち1本は研究期間前に採択済み)。一方、残り1本の論文に関しては、論文で提示した理論仮説の検証を行う必要がある。そのためには、データセットの作成とその分析が必要である。これらの作業に時間がかかることから、残り1本の論文に関しては、研究期間中には公刊が間に合わないこと等が予想される。

「Aoki and Nirei (2015)モデルを用いた所得税仮説の検証および政策分析」に関しては、Aoki and Nirei (2015)のモデルで、1970年代以降、フランスや日本ではアメリカほど上位1%所得シェアが上昇していない事実を説明できるかを検討する。あわせて、先進諸国で、第二次世界大戦の前後で所得格差が縮小した事実をモデルで説明できるかを検討する。これらの結果を論文にまとめる。「科学・技術の影響を考慮した動学的一般均衡モデルの構築および政策分析」に関しては、科学・技術に関するファクトを整理し、科学・技術の影響を考慮した動学的一般均衡モデルのプロトタイプを構築する。「Aoki and Nirei (2015)モデルを用いた所得税仮説の検証および政策分析」に関しては、長期の所得・資産格差の推移を分析できる理論モデルを構築することを優先して行いたい。その上で、当モデルが格差の推移を説明しうるか分析する。「科学・技術の影響を考慮した動学的一般均衡モデルの構築および政策分析」に関しては、未公刊の論文の理論仮説の検証のために必要なデータの作成と、科学・技術の影響を考慮した動学的一般均衡モデルの構築の2つを進めたい。ただし、時間的な制約上、上記の方策の全てを最終年度中に実現することは難しいことが予想されるため、達成が容易なものから研究を進めていく。当該年度は、論文の改訂と公刊に注力し、資料収集等の作業に関しては、次年度以降に後回しになった。そのため、旅費等の支出額が予定よりも低くなった。また、査読誌への投稿した論文に関しては、順調に採択まで進んだため、予定よりも英文校正費等がかからなかった。当初計画では、未公刊論文の海外の学会での発表等を見込んでいたが、その前に論文の採択が決まった。そのため、その分の支出が行われなかった。そのため、最終年度終了後、平成29年度の「次年度使用額」と同額程度が未使用で返還されることが予想される。平成29年度請求額とあわせて、次年度以降の資料収集・研究発表等によりかかる旅費の支出等にあてる。
免疫系細胞の増殖・分化及び癌化に関与する核内因子の機能解析

インターフェロン系の転写制御因子IRF-1欠損マウスの胎性線維芽細胞を用い、活性型Ha-ras遺伝子を発現すると細胞が癌化することを見い出し、IRF-1が癌抑制遺伝子として機能することを明確にした。さらにHa-ras遺伝子によって誘導されるアポトーシスがIRF-1欠損線維芽細胞では見られないことを明かにした。すなわちIRF-1が癌遺伝子による細胞の癌化とアポトーシスを決定する因子であることが強く示唆された。一方、ヒトIRF-1遺伝子が白血病、骨髄異形成症候群(MDS)で頻繁にみられる5q欠損において重要な遺伝子である結果を得ていたが、更にヒトIRF-1にはalternative splicingによるDNA結合領域欠失異体が存在すること、MDSあるいはMDSから白血病へ移行した患者の骨髄や末梢単核球細胞を調べると約20%において正常mRNAがほとんど検出されない事を見いだした。このIRF-1変異体には癌抑制活性がないことからIRF-1の新たな不活性化機構が類推された。一方、非受容体型チロシンキナーゼ(PTK)Syk PTKが、IL-2によるc-myc遺伝子の誘導並びに細胞増殖に必須の領域であるIL-2受容体(IL-2R)β鎖の細胞内"serine-rich"領域と会合し、活性化される事を明らかとした。更にSyk PTKに加え、最近新たに同定されたJak-ファミリーPTKs、Jak1およびJak3がL-2刺激により速やかに活性化されること、Jak1、Jak3がそれぞれIL-2Rβ鎖、IL-2Rγ鎖のIL-2シグナル伝達に必須の細胞内領域と選択的に会合していることを明らかとした。また、機能的IL-2R、およびJak1を発現しているNIH3T3線維芽細胞にJak3を遺伝子導入により発現させによりることによりこの細胞がIL-2に応答して細胞周期がG_1期からS期へと進展することを明らかとした。我々はインターフェロン(IFN)系の転写因子IRF-1及びIRF-2の機能解析を行い、両者は共通のDNA配列を認識し、IRF-1は転写活性化因子、IRF-2は抑制因子としてIFN-α,-β遺伝子並びにIFN誘導遺伝子の発現を制御することを明かとしている。本年度は、IRFの細胞周期における発現をNIH3T3細胞で調べたところ、Glarrest時にIRF-2:IRF-1比の減少がみられ、増殖刺激により増加することが明かとなった。そこで、両因子の比を変動させることでの細胞増殖への影響を調べる為、IRR-2発現ベクターを導入したNIH3T3細胞株を樹立した。得られた6細胞株はいずれも細胞飽和密度の上昇、メチルセルロースゲル内でのコロニー形成、ヌードマウスでの腫瘍形成がみられ、IRF-2がoncogeric poten tialを有することを明かとした。さらにこれらの細胞株はIRF-1ゲノム遺伝子導入によって野生型に復帰することを明かとし、IRF-1のanti-oncogeric poten tialをみいだした。これらの現象は、レトロウイルスを用いた遺伝子導入によっても同様に確認された。我々はさらに、ヒトIRF-1遺伝子が白血病やMDS患者細胞で高率に欠損の見られる染色体5q31.1に位置することを明かとした。そこで5qに異常の見られた白血病及びMDS患者13例のサンプルで5q31に位置するIL-

4,IL-5,IRF-1,CDC25C,GM-CSF遺伝子の欠損をサザンブロット解析により検討した。その結果、IRF-1遺伝子のみがすべての症例に一致して欠損していた。更に、1alleleの欠損に加え、残りのalleleにプロモーター部位の欠損が起こり不活化されたIRF-1遺伝子を持つ白血病の一症例を検出した。また、in situhybridization法により、IRF-1遺伝子両allele欠損が急性白血病症例に主に観られること見い出した。これらのことから、IRF-1欠損と白血病、MDS発症の関連が示唆された。インターフェロン(IFN)系の転写制御因子IRF-1,IRF-2のDNA認識配列が、多くのIFN誘導遺伝子、細胞増殖関連遺伝子に存在することを見いだし、更にIRFを中心とした遺伝子制御ネットワークが存在することをヒトIRF-1,IRF-2遺伝子発現の解析からを明かにした。また、IRF-1ないしIRF-2遺伝子欠損マウスの作製に成功し、IRF-1欠損マウスの胎児線維芽細胞で二重鎖RNA刺激でのIFN-α,-βの発現が低下することを見いだした。しかし、ウイルス感染時では変化はなく、IFN-β処理によるIFN誘導遺伝子(PKR,1-8,2′-5′オリゴA合成酵素遺伝子)の発現にも変化が見られなかった。一方、IRF-1欠損マウスのマクロファージでのIFN-γによる一酸化窒素(NO)の産生、誘導型NO合成酵素(iNOS)遺伝子の発現誘導がみられず、iNOS遺伝子の発現は特にIRF-1に依存している事を見いだした。これらの事から、IFNシステムにおけるIRFの重要性と共にredundancyが存在することを明かにした。一方、IL-2シグナル伝達機構の解析から、IL-2受容体(IL-2R)β鎖とp59^<fyn>が共役し、この会合がp59^<fyn>及びp53/56^<lyn>のチロシンキナーゼ(PTK)活性化に関与することを明かとし、IL-2によるsrc型PTK分子の活性化カスケードの存在を示した。更にNIH 3T3細胞に再構成したIL-2R(IL-2Rαβγ鎖)は高親和性IL-2結合能及びIL-2の細胞内への取り込みがみられ、IL-2刺激に応答してMAPキナーゼのチロシンリン酸化の亢進及びc-jun,c-fos,c-myc遺伝子の発現誘導がおこるが、IL-2依存的な細胞増殖能を示さず、IL-2Rの再構成だけではIL-2依存的な細胞増殖の誘導に不十分であることを明かとした。インターフェロン系の転写制御因子IRF-1欠損マウスの胎性線維芽細胞を用い、活性型Ha-ras遺伝子を発現すると細胞が癌化することを見い出し、IRF-1が癌抑制遺伝子として機能することを明確にした。さらにHa-ras遺伝子によって誘導されるアポトーシスがIRF-1欠損線維芽細胞では見られないことを明かにした。すなわちIRF-1が癌遺伝子による細胞の癌化とアポトーシスを決定する因子であることが強く示唆された。