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間質性肺炎急性増悪の治療標的分子同定および体外式膜型人工肺を用いた新規治療法開発

間質性肺炎急性増悪は,日本人に好発することが知られている.治療法が限られており,致死率が非常に高い疾患である.本研究では病理学的側面からARDSと間質性肺炎急性増悪が類似している点に注目し,体外式膜型人工肺(Veno-verous extracorporeal oxygenation: V-V ECMO)の有用性の検討を行っている.本年度は,過去当院救命センター・ICUに入室した間質性肺炎急性増悪患者のV-V ECMOを使用した群,人工呼吸器のみで管理を行った群の剖検例の肺組織を用いてホルマリン固定後パラフィンフロックから薄切・hematoxylin-eosin染色(HE染色)標本を作製した.また特殊染色として,膠原線維を特異的に染めるMasson's Trichrome Stain染色(MT染色)を行った.現在論文投稿中である.さらに免疫染色で,びまん性肺胞出血で予後因子として報告があるKL-6,加えてARDSの報告からSP-D,RAGE,IL- 6,IL-8,Ang-2の染色を行った.それらの発現率をV-V ECMO使用群と非使用群(人工呼吸器のみで管理した症例)とを比較し,発現率の違いを検討した.剖検例の比較で発現率に差を認めたマーカーについて実際の患者検体においてVVECMO施行前から施行直後からの経時的変化を含めELISA法で測定を行い,学会等で発表し論文化を行なっている.動物モデル作成に向けて並行して研究を行なっている.研究結果については学会発表を終え論文化を行なっている.動物モデル,整備について若干遅れている.論文投稿と並行して,当初のH30年度予定である間質性肺炎急性増悪の動物モデルの作成についても行っていく予定である.間質性肺炎急性増悪は,日本人に好発することが知られている.治療法が限られており,致死率が非常に高い疾患である.本研究では病理学的側面からARDSと間質性肺炎急性増悪が類似している点に注目し,体外式膜型人工肺(Veno-verous extracorporeal oxygenation: V-V ECMO)の有用性の検討を行っている.本年度は,過去当院救命センター・ICUに入室した間質性肺炎急性増悪患者のV-V ECMOを使用した群,人工呼吸器のみで管理を行った群の剖検例の肺組織を用いてホルマリン固定後パラフィンフロックから薄切・hematoxylin-eosin染色(HE染色)標本を作製した.また特殊染色として,膠原線維を特異的に染めるMasson's Trichrome Stain染色(MT染色)を行った.さらに免疫染色で,びまん性肺胞出血で予後因子として報告があるKL-6,加えてARDSの報告からSP-D,RAGE,IL-6,IL-8,Ang-2の染色を行った.それらの発現率をV-V ECMO使用群と非使用群(人工呼吸器のみで管理した症例)とを比較し,発現率の違いを検討した.現在は,剖検例の比較で発現率に差を認めたマーカーについて実際の患者検体においてVVECMO施行前から施行直後からの経時的変化を含めELISA法と,フローサイト法を用いて測定を行っている.実際の間質性肺炎急性増悪患者(VV ECMO,人工呼吸器症例)の集積が若干遅れており,血清マーカーの測定が進んでいない.間質性肺炎急性増悪は,日本人に好発することが知られている.治療法が限られており,致死率が非常に高い疾患である.本研究では病理学的側面からARDSと間質性肺炎急性増悪が類似している点に注目し,体外式膜型人工肺(Veno-verous extracorporeal oxygenation: V-V ECMO)の有用性の検討を行っている.本年度は,過去当院救命センター・ICUに入室した間質性肺炎急性増悪患者のV-V ECMOを使用した群,人工呼吸器のみで管理を行った群の剖検例の肺組織を用いてホルマリン固定後パラフィンフロックから薄切・hematoxylin-eosin染色(HE染色)標本を作製した.また特殊染色として,膠原線維を特異的に染めるMasson's Trichrome Stain染色(MT染色)を行った.現在論文投稿中である.さらに免疫染色で,びまん性肺胞出血で予後因子として報告があるKL-6,加えてARDSの報告からSP-D,RAGE,IL- 6,IL-8,Ang-2の染色を行った.それらの発現率をV-V ECMO使用群と非使用群(人工呼吸器のみで管理した症例)とを比較し,発現率の違いを検討した.剖検例の比較で発現率に差を認めたマーカーについて実際の患者検体においてVVECMO施行前から施行直後からの経時的変化を含めELISA法で測定を行い,学会等で発表し論文化を行なっている.動物モデル作成に向けて並行して研究を行なっている.研究結果については学会発表を終え論文化を行なっている.動物モデル,整備について若干遅れている.症例の集積と並行して,当初のH30年度予定である間質性肺炎急性増悪の動物モデルの作成についても可能な限り行っていく予定である.論文投稿と並行して,当初のH30年度予定である間質性肺炎急性増悪の動物モデルの作成についても行っていく予定である.剖検検体を使用した病理組織学的検討を行った実験については当初の予定より順調に進んだため,物品費などの使用量が当初予定より少なかったためである.本年度は引き続きサイトカイン,血清マーカーの測定を継続していく予定であり,前年度分の物品費等を本年度の物品費等に使用していく予定である.本年度は引き続きサイトカイン,血清マーカーの測定を継続していく予定である.

また学会発表(国際学会を含めて),論文投稿(英文校正費)を行う予定である.しかし動物モデル,整備について研究が遅れており,次年度予算でそれらに対する研究を行うため次年度使用額が生じた.
宿主因子をターゲットにした新しいC型肝炎ウイルス治療

慢性C型肝炎は世界で2億人近くが感染し、肝細胞癌や肝不全の原因の筆頭である。現在の標準治療の効果は十分とはいえず新たな治療法の確立は臨床上の急務である。経口剤のウイルス増殖阻害剤の欠点を克服すべく、我々は新たな環状ペプチドライブラリーを用いてHCVの増殖に必須である宿主因子の、サイクロフィリンの阻害薬のスクリーニングを行い、カルシニューリンと相互作用を持たないLead化合物を発見し、検討している。平成21年平成21年度はこれまでの実験系を再構築するために、HCVの増殖系であるレプリコンのGENOTYPE1a, 1b, 2aの増殖に対する種々のサイクロフィリンインヒビターの阻害効果を確認し、カルシンユーリンとの相互作用を阻害しないサイクロフィリンの部位に結合することによってもHCVの増殖を阻害できることを明らかにした。またリボゾーマルディスプレイでターゲットとなるサイクロフィリンがどれかを決めるためのプルダウンアッセイを施行した。15種類のサイクルフィリンのうちメジャーなA意外にも増殖に関与する可能性のあるものが示唆された。さらにそれを別の角度から確認するためにsiRNAを用いたノックダウンアッセイを行った。両者の結果に一部乖離があり、off targetおよびnon specificな作用による可能性を除外するために、現在新しいsiRNAを設計している。この一連の過程で問題になったのは増殖に関与しているのが、Cyp familyだけなのか、それとも別の宿主因子が関与しているかということである。現在宿主因子の耐性クローンの解析も同時進行で行っており宿主因子との相互作用に関係する部位を詰めている。この過程で2-3領域に絞られてきているが、耐性クローンの解析と、相互作用部位の解析も小型の特殊な人工ペプチドによる阻害効果をみる上で重要であるので、検討を行っている。またin vivoの系であるヒト化肝臓をもっSCIDマウスにおいても種々の抗ウイルス剤の効果をコントロールとして検討した。この系ではインターフェロン系が十分に働かないが、それ以外の薬剤は十分効果を発揮することが明らかになった。慢性C型肝炎は本邦でも200万人以上の患者が存在し、肝臓癌の原因の80%以上を占める。今日の標準治療であるペグインターフェロンとリバビリンの組み合わせでは約半数の患者でウイルス排除が起こるに過ぎず、治療効果としては全く不十分である。今日期待を持って検討されている治験はペグインターフェロンとリバビリンの新たな抗ウイルス剤である、プロテアーゼ阻害薬を加える治療である。この治療法により今まで治療を行いウイルスがいったん消失した後に再燃したrelapserは90%以上でウイルスが排除されるが、ウイルスが現在の標準療法で2log以上低下しなかった場合は、新たな治療でもウイルス排除は30%にとどまる。HCVはRNAウイルスで遺伝子型が6つに大きく分けられるが、プロテアーゼ阻害薬ではすべての遺伝子型のカバーは難しく、いったん耐性株が出現すると、すべてのプロテアーゼ阻害剤に耐性になる可能性がある。ウイルスに直接作用する抗ウイルス剤はすべてこのようなジレンマをはらんでおり、治療上別のストラテジーが必要となる。そこで我々が考案したのはウイルスが増殖するのに必要な宿主因子を標的にした治療法であり、すべての遺伝子型のHCVに有効でかつ、IN VITROの検討でも耐性のリスクは少ないと考えられる。これまでの検討よりサイクロフィリンファミリー(Cyp)はウイルス増殖に必須の宿主因子であり、Cypの働きを阻害することによりHCVの増殖が抑えられる、またCyp阻害薬の中でもこれまでは副作用を減らすために、カルシニューリン(CN)との結合の親和性が重視されてきたが、これまでの化合物ではレポーターアッセイでCNとの親和性が低くても、実際には阻害活性があり、今回はCNとの結合に全く影響を及ぼさずかつCyp活性を抑制する物質を探索的に検討し、毒性も治療域ではin vitroで認められず、かつCypの数倍の抗ウイルス活性をもつ物質を見いだした。C型慢性肝炎は約200万人が本邦で罹患し、末期肝硬変および肝細胞がんの原因の筆頭をしめる、医療健康上の重大な問題である。これまでの慢性C型肝炎治療はインターフェロンとリバビリンの組み合わせであり、この組み合わせは非特異的の抗ウイルス効果による治療であった。そのため治療の奏功率が50%以下であった。昨年末よりHCVのNS3Aを標的としたプロテアーゼ阻害剤が認可され、治療の奏功率は向上したが、有害事象を別にしても、耐性化と一部の遺伝子型にしか有効でないという重大な問題が惹起されている。HCVはその増殖にホスト側の因子としてサイクロフィリンを必要としている。我々はすでにインターフェロンにサイクロスポリンAを併用することにより治療の奏功率が著しく向上することを見いだし報告した。その後は有害事象を減らすためにカルシニューリン阻害作用が無く、サイクロフィリンへの親和性が高い物質を検討している。今回の検討でもA,Bの異なる化合物をcandidateとして検討した。

これらの化合物はin vitroの検討では、CsAの数倍のHCV増殖抑制効果を示し、またCNに対する結合性は化合物Aではin vitroのassayではレポーター系と細胞系で乖離が認められたが、化合物Bではそのような乖離は認められなかった。今後の展望としては宿主因子の阻害剤のライブラリーの構築が容易になった現在では、これまでにもまして可急的速やかに新たな阻害薬の開発が期待される。本研究もその嚆矢として位置付けられるものと考えている。
中枢神経細胞再生システム機能のミクログリアによる制御に関する研究

本研究では、神経細胞変性後の神経新生過程でのミクログリアの役割を明らかにするため、神経細胞障害後の神経新生過程でのミクログリア関連因子とそのシグナル経路について解析したところ、神経新生過程にミクログリアによるNF-kappa B p65を介したシグナルが関与することが示唆された。つまり、ミクログリアの制御メカニズム解明が神経変性後の神経新生促進を介した新たな治療法開発の基盤として期待される。マウス海馬歯状回顆粒細胞層は、トリメチルスズ(TMT)誘発性顆粒細胞脱落後に再構築される。本歯状回神経脱落後の神経新生過程におけるミクログリアの役割を解明する目的で、TMT誘発性海馬歯状回顆粒細胞脱落後のミクログリアの活性化および各種遊離因子について解析した。【方法】ddY系雄性マウスにTMT(2.8mg/kg)を腹腔内投与し、TMT処置後一定期間の海馬内各種遺伝子発現変化についてRT-PCR法により解析した。また、TMT処置後の一定期間における海馬歯状回での各種蛋白質の発現変化を免疫組織化学法およびウエスタンブロッティング法により解析した。【結果】Iba1抗体を用いてミクログリアの発現と形態を免疫組織化学法により解析したところ、海馬歯状回においてTMT処置後2-3日で活性化ミクログリアの著明な増加がみられた。活性化ミクログリアから放出されるTNFαおよびNOS2の発現をRT-PCR法により解析したところ、TMT処置後の神経再生期の初期段階であるTMT処置後3日目で最も著しい発現増強が認められた。また、海馬歯状回において神経系幹細胞として機能する放射状グリアを標識するネスチンおよびBLBPとNFκB p65を蛍光二重染色法により解析したところ、TMT処置3日目の歯状回顆粒細胞層下層でネスチンおよびBLBP陽性細胞の大部分にNF-κB p65の発現が認められた。さらに、ネスチン/BLBP陽性細胞の半数以上でNFκB p65の細胞核内移行がみられた。また、ウエスタンブロッティング法でもTMT処置後3日でNFκB p65の著明な細胞核内移行が確認された。【考察】ミクログリアは海馬歯状回顆粒細胞脱落後に著しく活性化されることが明らかとなった。また、活性化ミクログリアは、海馬歯状回顆粒神経細胞脱落後の神経新生過程に少なくとも一部は関与する可能性が推察される。脳内の免疫担当細胞であるミクログリアは、脳虚血や脳傷害時に速やかに活性化され病巣部への蓄積と活性化が認められる。このミクログリアの機能解明は脳疾患の治療およびその創薬研究には必要不可欠である。本研究では、神経細胞変性後の神経新生過程でのミクログリアの役割を明らかにするため、海馬歯状回神経細胞障害後の神経新生における活性化ミクログリア関連因子とそのシグナル経路について解析した。ddY系雄性マウスに海馬歯状回選択的神経毒性を示すトリメチルスズ(TMT)を投与後、ミクログリア活性化抑制薬として知られるミノサイクリンを処置し、歯状回での各種因子の発現変化を解析した。歯状回での活性化ミクログリアが放出するTNFalphaの発現をRT-PCRにより解析したところ、未処置群に比べTMT処置3日目で著しい発現増強が認められた。また、これらの発現増強はミノサイクリン処置により有意に減少した。一方、Iba1陽性細胞の発現を免疫組織化学法により解析したところ、歯状回では未処置群に比べTMT処置群で著明なIba-1陽性細胞数の増加が認められたが、このIba-1陽性細胞数の発現増加はミノサイクリン処置により明らかに減少した。続いて、nestinとNF-kappaB p65について蛍光二重染色を行ったところ、TMT処置3日目の歯状回顆粒細胞層下層でnestin陽性細胞の大部分にNF-kappa B p65の発現が核内に認められた。さらに、ミノサイクリン処置はこのNF-kappa B p65の核内への発現を有意に抑制した。以上の結果から、歯状回障害後の神経新生促進メカニズムにミクログリア活性化によるNF-kappa B p65を介したシグナルが関与することが示唆される。
高齢者の認知リハビリテーションによる脳機能可塑性のfunctionalMRI研究

加齢に伴う脳機能低下、脳構造変化が、どの認知機能、またどの脳部位から生じるかを同定し、認知症発症のメカニズム解明に脳機能画像研究から寄与することを目的とした。脳機能のfunctional MRI (fMRI)では、認知症の被検者が十分な課題遂行が行えず、健常者との比較はできなかった。脳構造のVoxel Based Morphometry (VBM)では、健常高齢者内において、血中レプチン濃度と右海馬と両側小脳の体積に統計学的に有意な相関があることがわかった。レプチンに神経保護効果があることを示唆するものであり、学術雑誌に受理された(Biological Psychiatry, in press)。CANTAB (Cambridge Cognition, CANTAB eclipse)のライセンスを得て、検査施行可能なように験者としてCANTAB提示の訓練を行ない、従来の認知機能テストとあわせて、被験者の評価を多角的にとらえる準備を行なった。画像研究に関して、まずMRガントリーの中で使用する目的の非磁性体マウス(CURRENT DESIGNS社:トラックボールや反応ボタン)を購入し、その非磁性体マウスをセットアップした。またそれらの非磁性体マウス使用時にも、MR撮影中にアーチファクトが混入されないかを確認した。functional MRIに関しては、CANTABを課題として施行する予定であったが、Cambridge大学の版権の問題や、CANTAB課題内容の複雑性、施行時間などを考慮して、CANTAB自体はMR撮像とは別に認知機能評価に使用することとした。そして、functional MRI用には簡便性と時間経過を考慮した課題を用いることとし、現在いくつかの課題を試用して模擬試験を行なっている。また、加齢に伴う脳機能低下の病態をより詳細かつ多角的に検討するため、高齢被験者には、CANTABだけでなく、WISC-IIIなどによる知能測定、神経成長因子BDNFやアディポネクチンなどの血液生化学的検査を追加している。そして、それらの指標とVBMやDTI画像との相関なども検討することとした。平成19年度は、Functional MRIに関しては、課題を修正して、working memory課題にて健常者高齢者と認知症患者を数名ずつ施行した。Working memory課題はN-back課題であり、数字が次々と被験者に提示され、「7」の数字の時にボタンを押すセッション(0-back)、ひとつ前にあらわれた数字と同じ数字が出現した時にボタンを押すセッション(1-back)、ふたつ前にあらわれた数字と同じ数字が出現した時にボタンを押すセッション(2-back)の3セッションで行った。健常高齢者においては、MR撮影しながらの課題でも課題成績に問題はなく、脳賦活も十分に得られた。しかし、認知症患者においては、課題の理解がなかなか得られず、練習にて課題が遂行可能と確認できた直後でも、MR撮影時の課題では十分な課題成績と脳賦活が得られなかった。Workingmemory課題の難易度を十分に再考し、functional MRI用の課題として、より簡便性のある課題を用いて行なうようにし、現在いくつかの課題を試用して、模擬試験を行なっている。一方、加齢に伴う脳機能低下の病態をより詳細かつ多角的に検討するため、高齢被験者には、WAIS-IIIなどによる知能測定、神経成長因子BDNFやアディポネクチンなどの血液生化学的検査を追加している。健常高齢者(計35名)においては、血液生化学的検査は終了した。健常高齢者34名(男性19名、女性15名、64.6+/-4.7歳、MMSE 29.4+/-0.8)に、VBM解析用のMR-T1強調画像を撮像し、動物実験で神経保護効果が報告されているレプチン濃度との相関を解析した。VBMによる局所的な脳灰白質領域の結果については、右海馬、両側小脳において、血中レプチン濃度と各被験者の灰白質領域に正の相関を認めた(FDR-corrected P=0.048)。一方、負の相関を示す領域はなかった。これらの結果は、動物実験におけるレプチン濃度と海馬領域のレプチン受容体のmRNA発現率との相関があった研究や、海馬の神経保護効果を認めた研究などの過去の報告と一致する結果である。近年では、レプチンがアルツハイマー病のAβ蓄積を防御する報告もあり、今回の結果とあわせて考察すると、高齢者においてレプチンには神経(脳灰白質)保護効果があることが示唆された。この結果は、高齢者の認知機能を守り、認知症への発症防止に貢献できる結果と考えられ、学術論文に投稿し、受理された。
アメリカ児童・思春期文学における強制収容表象の変容に関する系譜的研究

ヨシコ・ウチダの児童向け強制収容物語、Journey to TopazとJourney Homeは市民権剥奪や人種差別への批判が弱いと思われるが、これはアメリカ社会を考慮した出版社側の意向を反映しているという申請者の仮説を検証した。オレゴン大学ナイト図書館やカリフォルニア州立大学バークレー校のバンクロフト図書館に行き、ウチダの寄贈資料の中からこの二作品に関する彼女と出版社とのやり取りや書評、彼女のメモを調査した。その結果、出版社やニューヨーク・タイムズの書評者、アジア系アメリカ人達もウチダの作品はアメリカ政府への批判が弱いと感じていたことがわかった。また、ウチダのメモから、出版社の意向ではなく、彼女自身がアメリカ政府への批判や恨みではなく、強制収容を耐え抜いた日系人たちの歴史を描きたかったことが明らかになった。アジア系アメリカ人運動を進める人々から「白人寄り」であると見なされ、ウチダが原稿を修正していたこともわかった。ウチダの資料から、Journey to Topazがアメリカのテレビ局からドラマ化されており、アメリカの負の歴史を伝える出来事として、文学作品とともに主流社会にインパクトを与えたことが確認できた。サンフランシスコ公共図書館で、強制収容の児童・思春期文学の作品について調査した。1945年の最初の強制収容物語、The Moved-Outers及び作家のフローレンス・クンネル・ミーンズについての資料を収集した。この物語は、彼女がコロラド州に戻ってきた日系人から聞いた収容体験談がもとになっていることがわかった。その他、この作品に関する批評文献を収集した。アメリカの図書館に出向くことにより、初期の強制収容物語について貴重な資料を収集し、新たな知見を得ることができた。収集したヨシコ・ウチダの資料にもとづき、彼女の強制収容体験とその作品について学会発表を行った。予想以上にアメリカの大学図書館に所蔵されているヨシコ・ウチダの資料が多かった上に、夏休み中で図書館の利用時間が短かったために全部の資料に目を通すことができなかった。残りの資料内にもウチダの収容物語に関する書評などの貴重な資料があるかもしれないと感じている。サンフランシスコ公共図書館で強制収容の児童・思春期文学作品を調査し、ジャンル、出版年や作者のエスニシティによってリスト化し、強制収容物語の出版物の全体像をつかむ予定であったが、滞在時間の関係上、全体像をつかむところまではいかなかった。アメリカの大学図書館での調査は今年度限りの予定であったが、来年度もう一度図書館に出向いて残りの資料を調査する予定である。ウチダの収容作品においてアメリカ政府への批判が弱い理由が彼女自身の意思によるとわかり、その後の他の作家による収容物語とウチダの作品との関連を見直す必要が出てきた。他の作家の作品について書評等の資料を図書館で収集したいと考えている。また、調査の過程で、ウチダには出版までこぎつけなかった収容物語があることがわかった。ウチダ・ヨシコのJourney to TopazとJourney Homeの執筆意図を分析するには、この作品を読んでみる必要があると思われる。原稿がバンクロフト図書館に所蔵されているので、この作品を分析した上でウチダの強制収容物語についてもう一度検証する。サンフランシスコの公共図書館で、日本では入手できない収容物語の作品について調査を進める。また、日系以外のマイノリティ作家は、自分たちの民族の人種差別や迫害の歴史と関連付けて収容物語を描く傾向がうかがえるため、この点について図書館で文献を収集し、それに基づき分析を進める。

サンフランシスコ公共図書館で強制収容の児童・思春期文学作品を調査し、ジャンル、出版年や作者のエスニシティによってリスト化し、強制収容物語の出版物の全体像をつかむ予定であったが、滞在時間の関係上、全体像をつかむところまではいかなかった。アメリカの大学図書館での調査は今年度限りの予定であったが、来年度もう一度図書館に出向いて残りの資料を調査する予定である。ウチダの収容作品においてアメリカ政府への批判が弱い理由が彼女自身の意思によるとわかり、その後の他の作家による収容物語とウチダの作品との関連を見直す必要が出てきた。他の作家の作品について書評等の資料を図書館で収集したいと考えている。また、調査の過程で、ウチダには出版までこぎつけなかった収容物語があることがわかった。ウチダ・ヨシコのJourney to TopazとJourney Homeの執筆意図を分析するには、この作品を読んでみる必要があると思われる。原稿がバンクロフト図書館に所蔵されているので、この作品を分析した上でウチダの強制収容物語についてもう一度検証する。サンフランシスコの公共図書館で、日本では入手できない収容物語の作品について調査を進める。また、日系以外のマイノリティ作家は、自分たちの民族の人種差別や迫害の歴史と関連付けて収容物語を描く傾向がうかがえるため、この点について図書館で文献を収集し、それに基づき分析を進める。アメリカの大学図書館で収集した資料の分析過程において、もう一度資料を確認する必要が出てきた。ヨシコ・ウチダの児童向け強制収容物語を分析するにあたって、出版に至らなかった作品のナラティブを検証する必要があると思われる。この作品との比較において彼女の収容物語を検証するほうが重要であると認識した。そのため、再度オレゴン大学とサンフランシスコ州立大学バークレー校の図書館に行き、ウチダの資料を調査する。また、滞在期間の関係で、日本では入手できない強制収容物語を調査する時間が足りなかった。もう一度サンフランシスコ公共図書館で調査し、強制収容の児童・思春期文学作品のリスト作成を行う。それとともに他の作家の強制収容物語に関する文献や書評を図書館で収集する。
リアルタイムハザードマップに向けた土石流の発生雨量・発生場所の予測

山地小流域単位でのリアルタイムハザードマップの評価基準を作成することを目的として、花崗岩類を基盤岩とする山地において、降雨による土石流に対して、複数災害の土砂移動分布図を用い、山地小流域を単位として、雨量・地形量・植生・気候・物性(地質・土質)と土石流到達の有無との関係を統計的手法により明らかにすることを目指す。補助事業の12年目はこれらのデータ収集と雨量指標・地形量の計算に重点を置く。23年目にこれらのデータを用いた統計解析を実施する。
流れ問題に対する特性曲線一般化粒子法の数学的基盤の整備

粒子法は偏微分方程式に対する数値計算手法の一つであり,その特徴から近年,津波のような移動境界問題に適用されている.しかし差分法や有限要素法などの数値計算手法と比較すると,粒子法に対する数学的基盤は十分に整備されていない.研究代表者は,固定領域上における移流拡散方程式に対する特性曲線一般化粒子法を提案し,その誤差評価を得ている.本研究課題ではこの成果を活用し,偏微分方程式に対する粒子法の数学的基盤の整備における次の段階として,固定領域上における非圧縮粘性流れ問題に対する粒子法の数学的基盤の整備,および提案する手法に基づくプログラム開発・計算機実装・精度検証を行う.粒子法は偏微分方程式に対する数値計算手法の一つであり,その特徴から近年,津波のような移動境界問題に適用されている.しかし差分法や有限要素法などの数値計算手法と比較すると,粒子法に対する数学的基盤は十分に整備されていない.研究代表者は,固定領域上における移流拡散方程式に対する特性曲線一般化粒子法を提案し,その誤差評価を得ている.本研究課題ではこの成果を活用し,偏微分方程式に対する粒子法の数学的基盤の整備における次の段階として,固定領域上における非圧縮粘性流れ問題に対する粒子法の数学的基盤の整備,および提案する手法に基づくプログラム開発・計算機実装・精度検証を行う.
低温プラズマにおけるレーザートムソン散乱計測の高信頼化に関する研究

トムソン散乱による低温プラズマの電子密度・電子温度計測において,レーザーは集光してプラズマに照射される。焦点近傍のレーザーエネルギー密度は極めて高く,多光子電離による電子の発生がプラズマ中に最初から存在する自由電子の密度に比べて無視できなくなる可能性がある。この点を定量的に把握しておくことが信頼性の高いトムソン散乱計測には不可欠である。このため真空チャンバ内のバイアスされた並行平板プローブの中央に集光したNd:YAGレーザービーム(2倍波532nm)を打ち込み,多光子電離で発生する電子を定量的に計測する測定系を構築した。チャンバには所定の圧力でガス又は空間アフターグロープラズマが導入される。なお,別の実験により焦点近傍のレーザービームプロファイルを詳細に測定し,多光子電離の起こる体積の概略が見積られている。予備的な結果では,焦点距離400mm程度のレンズで200mJのNd:YAGレーザービームを集光する場合,準安定Ar原子は高い確率で多光子電離を起こすが,基底状態Ar原子の多光子電離はほとんど起こらないことが明らかになった。N_2分子および純空気(合成空気)についても基底状態からの多光子電離を調べ,いずれも明確な多光子電離信号が観測された。空気からの信号はN_2からの信号より約5倍大きく,これは実験条件下でO_2の多光子電離がN_2より20倍以上起こりやすいことを示唆している。このためO_2ではTorrオーダーの中圧力プラズマで,基底状態からの多光子電離がトムソン散乱計測に影響を与える可能性が示唆される。現在用いているプローブは電荷収集体積にあいまい性を残しているので,この点を改良したプローブを作成し,引き続き,より広い範囲のガスに対して定量性の高い多光子電離効率のデータを取得し,どのような実験条件で信頼性の高いトムソン散乱計測が可能かを明らかにしてゆく。トムソン散乱による低温プラズマの電子密度・電子温度計測において,レーザー照射による準安定原子等の多光子電離が計測に与える影響を定量的に明らかにする実験を進めている。ガラス管を通るArガスを誘導結合でプラズマ化してAr準安定原子を生成し,これが計測チャンバに導入される方式の準安定原子源を制作した。YAGレーザー2倍波(200mJ/pulse)をAr圧力100mTorrに設定したチャンバ内に焦点距離40cmのレンズで集光し,集光点近傍から発生する電荷をバイアス電圧を印加した微小平行平板プローブで検出した(集光点はプローブ極板問にある)。その結果,準安定原子を導入しない状態でもかなりの電荷発生があることが明らかになった。準安定原子を導入したときの発生電荷はレーザーエネルギーの3乗程度に比例し,準安定原子を導入しない時は5乗以上に比例した。準安定原子の多光子電離の効率を定量的に測定する前に,まず準安定原子非導入時の電荷発生の原因がAr原子自体の多光子電離によるものか,不純物分子の多光子電離によるものか,また,電荷発生の原因となる原子(分子)電離率はいくらかを明らかにする必要がある。このためには電荷発生部の体積変動を考慮して発生電荷のレーザーエネルギー依存性を正確に測定することが必要であり,この測定が可能なように,電荷収集プローブの改良を進めている。平行して,準安定原子導入時にその密度および空間分布をレーザー吸収分光およびレーザー誘起蛍光で測定するための計測系を構築し,準安定原子が計測可能な十分な密度でチャンバ内に存在することを確認した。

焦点近傍のレーザーエネルギー密度は極めて大きく,多光子電離による電子発生の影響を把握しておく必要がある。このためバイアスされた並行平板プローブの中央に集光したNd:YAGレーザービーム(2倍波532nm)を打ち込み,多光子電離で発生する電子を定量的に計測する実験を進めている。今年度は焦点近傍のレーザービームプロファイルを詳細に測定することにより,多光子電離の起こる体積の概略を見積もることができるようになった。これによると,焦点距離400mm程度のレンズで200mJのNd:YAGレーザービームを集光する場合,準安定Ar原子は高い確率で多光子電離を起こすが,基底状態Ar原子の多光子電離はほとんど起こらないことが明らかになった(昨年度述べた信号は不純物によるものと推定される。)N_2分子および純空気(合成空気)についても基底状態からの多光子電離を調べ,いずれも明確な多光子電離信号が観測された。空気からの信号はN_2からの信号より約5倍大きく,これは実験条件下でO_2の多光子電離がN_2より20倍以上起こりやすいことを示唆している。このためO_2ではTorrオーダーの中圧力プラズマで,基底状態からの多光子電離がトムソン散乱計測に影響を与える可能性が示唆される。引き続き,より定量性を高めるために,レーザービームの確定した長さの部分から発生する電子のみが計測されるようにプローブ構造を改良し,より広い範囲のガスに測定を広げてゆく予定である。
中国における民間セクターをめぐる法と政治

2009年段階で正式に登記された社会組織は43万1069団体(うち社会団体23万7847、民営非企業事業体19万479、基金会1843)に上るが、これを遙かに上回る未登記の団体が闇で活動しており、不安定な法的状態にある。設立に当たっての業務主管部門での設立許可と民政部門における登記という二重の管理体制を取ることにより、法人格取得へのハードルを高くしていることがその背景にある。結社については「許されていないことは、禁止される」というのが実態であり、憲法の結社の自由規定とは裏腹に「結社禁止」が原則となっている。目下、社会団体法制の整備に向けて議論が続いているが、いかに社会団体の活性化を図りつつ、他方でその反体制化を避けるべく上からの政治的統制も緩めないという二律背反を具体的な制度に表現するかは容易な課題ではない。厳しい法制環境、共産党組織による統制のなかでもすでに民間団体は、市場経済化のなかで多元化しつつある利益の調整機能、社会の自律調整機能、行政には困難なサービス提供機能、ある種の政治的「参加」機能、社会的公益機能を果たすことによって、政治の民主化を欠く中国で一種の緊張放散的効果をもたらしている。本研究は、中国において政治国家と経済市場の間で存在感を増しつつある「社会」ともいいうる第3の領域である民間セクター(民間組織、社会団体、第三セクターとも称する)に着目し、中国法、中国政治の専門家により、以下の課題を遂行した。(1)民間セクター設立の根拠となる法制度(とくに設立許可手続、登記手続、監督制度、税制などの支援制度)、その運用実態、実際にいかなる団体が組織され、いかなる活動を展開しているかを明らかにすること。(2)中国の民間セクターをめぐる法と政治の特徴とそれらを規定する諸要因(政治、経済、文化など)を分析すること。(3)民間セクター法制の将来に向けての選択肢、今後、それが社会変革に及ぼす可能性について展望を示すこと。本研究の特徴としては、(1)民間セクターの現況について法的側面からアプローチするものであること、(2)法の規範レベルだけではなく、それがいかに運用されているか、また現行法が民間セクターの現実との間でいかなる問題点を抱えているかを実証的に明らかにする点がある。中国民間セクターにおける設立および管理に関する法制度の歴史、現行法の枠組み、問題点、具体的に各地で活動する組織の実態について、文字文献による調査、および広東、北京における主要メンバーによる現地調査を通じて端緒的に明らかにする作業を行った(申請書研究目的1に対応)。具体的には、広東では労働者保護問題に取り組む二つのNGO(深〓当代社会観察研究所、深〓打工者職業安全健康センター)とハンセン病患者の支援団体(広東省漢達康福協会)、中山大学華南民間組織研究センター、華南師範大学法律援助センターを、北京では労働問題を扱うアメリカ公平労働協会中国オフィス、北京大学法学院のNGO法研究センター、清華大学のNGO研究所を訪問し、活動する草の根NGOの実態把握につとめ、また法的環境についてNGO問題研究者からヒヤリングを行い、問題点を把握につとめた。その結果、以下のようなことが明らかとなった。(1)現下、中国の民間セクターにとって正式な法的地位の獲得の問題が最大の問題となっており、主管部門での許可+法人登記という二段階管理システムが、民間セクターの発展を大いに阻害しているという実情。活動場所確保、銀行口座開設、人材確保などに困難が生じている。(2)法的環境に大きな問題点があるため、きわめて多くの組織が営利法人を前提とした工商登記によって法的ステータスを獲得するか、未許可のまま活動するという実態があること。(3)中国民間セクターの最大の資金源が外国からの資金援助であり、偏った資金構造となっていること。(4)民間組織に関する研究がいくつかの大学では活発化しつつあり、それが民政部民間組織管理局での民間組織の法的環境の変容を促しつつあること。今年度は研究メンバー全員で黒竜江省ハルビンで以下の諸機関を訪問して、民間組織について聞き取り調査を行った。(1)黒竜江省、ハルビン市、ハルビンの区の民政部門民間組織事務担当者への聞き取り(黒竜江大)、(2)黒龍江省民間諸団体代表者との座談会(黒竜江大)、

(3)馬長山教授をはじめとする黒竜江大学法学院の研究者との座談会、(4)黒竜江省対外経済貿易企業協会、(5)黒竜江省青少年発展基金会、(6)黒竜江省区域経済学会。以上の調査により、黒竜江という後進地域でのNGO活動の現状、法制度の問題点についての実態を把握した。さらに、中国NGO問題の専門家を招聘して、以下のように研究会を開催、現状の問題点と今後の展望につき知見を深めることができた。(1)劉開明(シンセン当代社会観察研究所執行理事)2008年953日(水)「非政府組織(NGO_s) :中国大陸に湧き上がる市民社会の力」(北海道大学法学研究科)、(2)同9月6日(土)「中国的堀起及其労工問題」(東京大学東洋文化研究所)、(3)王名(中国清華大学NPO研究所教授)2009年1月17日(土)「中国NPOの現状・課題・展望」(北海道大学法学研究科)、(4)沈潔(浦和大学教授)2008年10.月3日(金)「中国の医療・福祉サービスNPO」(北海道大学法学研究科)。以上の研究活動を通じて、中国の民間組織は主管行政部門と民政部門という二重の行政管理に置かれ、自由に活動する空間を極度に狭められながらも、とくに海外の資金援助組織と結びつくこと、半官半民の形態をとること、二級単位と呼ばれる合法組織の下部組織という形をとること、法的手続以外のルートを通じて合法性を獲得することなどにより、事実上の存在空間を拡大しつつあることが判明した。「和楷社会」の建設という新たな政治状況のもとで、民間組織法制が曲がり角に来ていること、民間組織の発展の足かせとなっているのが、まさに法的地位の問題であることが明らかとなった。今年度はそれぞれが分担する領域についての資料収集、それらに対する解析を継続するとともに、(1)中国から4名のNPO関連の研究者を札幌、東京に招聘して研究会を開催し、(2)メンバー全員で12月下旬、香港・広州の大学、NPOを訪問して、聞き取り調査を行った。(1)については、陳衛東(中国人民大学法学院)氏には刑事司法改革とNPO、常凱(同労働人事学院)氏には市場経済の発展・ひずみと労働組合の変容、王燦発(中国政法大学環境法センター)氏には環境問題とNPO、馬長山(黒竜江大学法学院)氏には市民社会の発展とNPOの理論問題についてそれぞれ報告してもらい、討論を行うことにより、多面的に中国社会の変容におけるNPOの実際と理論把握につき知見を深めた。(2)ついては香港で中国内地の労働問題に取り組むNPO(中国労工通訊、Asia Monitor Resource Centre)、中国の人権派弁護士の支援組織である中国維権律師関注組(何俊仁主席ら)を訪問し、活動状況、法的諸問題についてヒヤリングを行い、香港大学法律学院の傅華伶教授からは中国のNPOが置かれている状況全般につき、また広州・中山大学社会学系の鄭広懐教授らのグループからは合法/非合法で労働者問題に取り組む広東のNPOについてヒヤリングを行った。香港は中国法の適用を受けない自由な政治空間が残されており、内地の社会問題に取り組むNPOの多くが香港に拠点を置きながら、内地の組織や個人と緊密に連携して活動に取り組んだりしていることが分かった。
超高速偏光スイッチングを可能にするマイクロ波アンジュレータの開発

高速に光の偏光をスイッチングすることが可能な高周波アンジュレータに関する開発研究を行った。本研究で開発するマイクロ波アンジュレータは、電子を水平・垂直方向に振動させる2つの直行する電磁場モードをマイクロ波空洞内に励振させ、これら2つの電磁場モードが重畳することによりビーム軸に沿って螺旋状の(ヘリカル)電磁場分布を形成する。高周波空洞の共振周波数は11GHz付近のXバンドとし、リッジ構造を採用することにより強い偏向場を生成するようにした。また、高周波の入力カップラー部の設計は困難を極めたが空洞主要部分のリッジ部にビーム進行方向にわたりほぼ均一強度の偏向電磁場を作り出すことが電磁場計算により確認することができた。この電磁場計算をもとにマイクロ波空洞試作機を製作しその性能を評価した。高周波の位相を反転させることにより、高周波空洞内の電磁場モードをIQ変調器により高速に操作するシステムを構築した。当初、高周波はSバンドを使用する予定であったためXバンドの試験空洞を用いた電磁場スイッチングの測定を実施することはできなかった。また一方で、テラヘルツ波領域の時間的にコヒーレントなアンジュレータ放射を発生し、その可干渉性を利用して直線偏光したアンジュレータ放射から左右円偏光や楕円偏光、直線偏光の光を発生することについても検討した。マーチン・パブレット型の干渉計を用いることによって高速に偏光スイッチングをするシステムも考案し、テラヘルツ領域ではあるが試験的なビーム実験を実施し、直線偏光の放射から円偏光や楕円偏光の放射へと変換することを確認した。本研究では超高速偏光スイッチングを可能にするマイクロ波アンジュレータの開発を目指しているが、その主コンポーネントである長軸Febry-Perot共振器構造をした特殊な高周波空洞の設計、試作の基礎データになる電磁場解析および電子ビームの空洞内の電磁場相互作用について考察を行なった。平成27年度は最も単純なマイクロ波アンジュレータの構造である矩形導波管に定在波を励振させるタイプのマイクロ波アンジュレータについて電磁場解析コードを用いてシミュレーションを行なった。共振周波数は2856MHz、励振モードはTE01モードとし、空洞断面形状や結合空洞、ビームダクト形状に関する考察を行なった。概ね、定在波空洞および結合空洞の設計は完了でき、進行波型の高周波空洞に現在は取り掛かっている。進行波型については矩形空洞をベースに設計を始めた。また本研究では、高周波空洞内に水平方向と垂直方向にビームを蛇行させる2つのモードを励振・伝播させる必要があるが、この2つのモードの分離・独立性をどのように確保するか検討を開始した。また、マイクロ波アンジュレータ内の電磁場と電子ビームの相互作用についても、電磁場コードにより求めた電磁場中を相対論的エネルギーの単一電子がどのような軌道で運動するかを3次ルンゲクッタ法により調べた。また、その際に単一電子が作り出す光の電場の時間分布やスペクトル分布についても考察を行なった。一方、実験的にマイクロ波の位相を高速にスイッチングするIQ変調器を用いた移送器のテストなども実施した。平成27年度は1マイクロ波アンジュレータ内の電磁場と電子ビームの相互作用について、2マイクロ波アンジュレータの高周波空洞製作準備を計画していた。1については、単一電子についてではあるが、単純構造のマイクロ波アンジュレータ内での電子軌道などについて数値計算を行なうことができた。2のマイクロ波アンジュレータ空洞製作の準備についても、最も単純な定在波型のマイクロ波アンジュレータの電磁場計算からスタートし、高周波空洞の設計を進めている。アンジュレータ放射の高速偏光スイッチを実現すべく、本研究ではマイクロ波アンジュレータの開発を行なっている。平成28年度は初年度に引続き電磁場解析コードを用いて、主コンポーネントである長軸Febry-Perot共振器構造のマイクロ波空洞の設計を行なった。マイクロ波空洞の形状については、最初に矩形空洞(導波管形状)内にTE01モードを励振し、そのあと励振モードをTE03、TE05モードと次数を上げていき、空洞内の電磁場分布を確認した。放射光の偏光スイッチを実現するためには、1つのマイクロ波空洞内のビーム軸上に電磁場の方向が90度異なる2つのモードを励振する必要がある。これまで検討してきた水平・垂直方向に対称な空洞形状では2つのモードの独立性を確保することが困難であることが分かった。そこで、結合空洞形状に非対称性を取り入れ、またアンジュレータの上流と下流側の2方向からマイクロ波を供給する方法を導入することによりモードの独立性を確保するよう設計方針を転換した。これまで長軸のFebry-Perot共振器構造のマイクロ波空洞を想定していたが、今後は、より実現性の高い断面が矩形形状のマイクロ波空洞を設計のベースとして開発を進めていく予定である。またアンジュレータ内の電磁場と電子ビームの相互作用について考察した結果、アンジュレータ端部のマイクロ波入力空洞内で電子ビームが電磁場の非対称性により偏向される効果を打ち返すために、十分な強さの軌道補正用の電磁石がアンジュレータ両端部で必須であるということが分かった。その他、マイクロ波の高速位相スイッチングのローレベル試験を空洞設計と平行して行なった。平成28年度中にマイクロ波アンジュレータの基本設計を完了し、試作機製作を取り掛かる予定であった。

マイクロ波アンジュレータの設計では、単純な矩形形状からスタートし空洞形状を決定する予定でいたが、高速偏光スイッチングのために必要な電磁場の方向が90度異なる2つのモードを1つのマイクロ波構造体に励振する空洞設計を完了していないため、研究の進捗状況はやや遅れている。その他の、空洞内の電磁場と電子ビームの相互作用に関する考察やローレベルでのマイクロ波位相スイッチング試験などは概ね順調に進んでいる。本研究では、アンジュレータ放射光の偏光方向を高速にスイッチするためのマイクロ波アンジュレータの開発を行なっている。高周波空洞の形状は電磁場解析コードを用いて、フェブリペロー共振器構造をベースにした主高周波空洞部および結合空洞部の設計をこれまで行なってきた。昨年度より、構造が単純で加工の容易さも考慮し矩形導波管形状も候補に含め、空洞設計に取り掛かっている。ビーム軸に対する回転角が90度異なる電磁場分布を実現することが極めて困難であり、空洞の試作機製作などが予定よりも少し遅れている。空洞形状に僅かに非対称性を取り入れることにより、問題を解決できることが分かってきており、試作機製作用の図面の準備を現在進めている。偏光スイッチングに必要な入力高周波の位相高速制御については、I-Q変調器を使いそのテストを行なった。また一方で、放射波長よりも電子ビームのバンチ長が短い場合に得られるコヒーレントアンジュレータを用いた偏光スイッチング法の提案を2017年9月に開催された国際会議(WIRMS2017)で行なった。この手法は、アンジュレータ放射光の可干渉を利用することにより、高速偏光制御を実現するものである。マイクロ波アンジュレータの場合、永久磁石に比べ周期長を短くできないという問題があるが、この手法ではテラヘルツ領域のコヒーレント放射を100フェムト秒程度の電子ビームで実現するものであり、周期長は100mm前後でよい。マイクロ波アンジュレータはビーム偏向パラメータ(K値)が小さいため、放射強度を上げるためにアンジュレータ周期数を多くするなどの改良も必要になる。克服すべき問題はあるが、本手法は高速偏光スイッチングを可能にする新たな手法として期待できる。そして、これまでも行なってきたアンジュレータ放射の計算プログラム等の開発も試作機製作と平行して行なっていく。平成29年度中にマイクロ波アンジュレータの試作機を製作し、そのローレベル高周波測定を実施する予定であったが、試作機の構造が複雑であるために加工が困難な箇所があり、未だ試作機の製作に取り掛かれていない。加工(主に切削)順序を色々見直すなどし、電磁場解析コードで導き出したフェブリペロー構造をベースにした構造体を製作しようと試みたが、主構造体形状の見直しが必要であると判断した。だが、矩形導波管構造を取り入れることで、構造の簡略化が図れることが明らかになったので、矩形構造を取り入れた主高周波空洞形状を軸に設計を進めることで、加工の難易度は下げられると考えている。その他、ローレベルでのマイクロ波位相スイッチング試験などは概ね順調に進んでいる。また、コヒーレントアンジュレータ放射を用いた新たな高速偏光スイッチング法の提案も29年度中に行い、今後、詳細についても検討していく予定である。高速に光の偏光をスイッチングすることが可能な高周波アンジュレータに関する開発研究を行った。
嫌気性アンモニア酸化(Anammox)リアクター中の微生物共生関係の解明

Anammox菌の重要な酵素と思われるヒドラジン酸化酵素(HZO)の性質の解明とHZOをコードするHZO遺伝子の塩基配列を決定した。ヒドラジンの酸化に対するKm, Vmaxはそれぞれ5.5μM、6.2μmol/min/mg proteinであり、ヒドロキシルアミンによるヒドラジン酸化の拮抗阻害が観察された。このKiは2.4μMとかなり低くかった。従来の報告にはHZOのような性質の酵素の報告はなかった。HZOは菌体タンパク質の10%以上も発現しており、脱窒を行うAnammoxの中心的な酵素であると思われた。HZOを=コードする遺伝子は2種類(HZOA.HZOB)あり、HZOBがHZOAの35倍多く発現していた。一方、他栄養性脱窒菌脱窒菌のキー酵素である異化型亜硝酸還元酵素(Nir)遺伝子、nir Sを汚泥中から多種類検出した。しかし、nir Sの発現量はかなり低く、従属栄型脱窒菌の共生は非常に限定したものであると推測された。我々の研究グループは、不織布をAnammox汚泥の付着固定化担体とする独自の連続培養リアクターを考案して、Anammox菌の集積培養に成功した。現在は、50リッター規模のカラムリアクターを連続運転している。この培養の化学量論と上記化学量論とには若干のずれがあり、リアクターによって、その生態系のメンバーが多少異なっていると推定される。この大量調製したAnammox汚泥の16S-rDNAの分析を行い、デルフト工科大学の研究グループの報告した菌株と92%のidentityしかない新属のAnammox菌が優占種として集積されていること、同時に、脱窒能を有すると思われる特定の嫌気性菌がAnammox菌の周囲をフィルム状でカバーしていることが分った。安定同位体^<15>NH_3をつかったAnammox反応で生成する^<15>N ^<14>N窒素ガスの測定から、脱窒のおおよそ8590%がAnammox反応によることが分ったが、残り1015%がAnammox反応だけでは説明できなかった。おそらくAnammox菌と他栄養性脱窒菌との共生系によって系が安定に維持されていると考え、他栄養性脱窒菌脱窒菌のキー酵素である異化型亜硝酸還元酵素(Nir)の遺伝子の検出およびその遺伝子を持つ細菌の定量を試みた。その結果、nir Kは検出できなかったが、nir Sを汚泥中から検出した。検出したnir Sの塩基配列はDNAデータベースに登録されている他のnir Sすべてと系統発生学的にかなり離れていた。したがって、Anammox汚泥中にいる他栄養性脱窒菌は従来報告されている他栄養性脱窒菌とは違って新規な細菌であることが分かった。現在この他栄養性脱窒菌のFISHによる定量を試みている。安定同位体窒素を使った測定からAnammox菌と他栄養性脱窒菌との共生系によって系が安定に維持されているとことが考えられた。昨年度、他栄養性脱窒菌脱窒菌のキー酵素である異化型亜硝酸還元酵素(Nir)遺伝子、nir Sを汚泥中から検出した。今年度検出したnir Sがリアクター中の主要なNirであることを確認した。さらに、この遺伝子周辺領域の塩基配列を決定したところ,本nir Sは従来報告のある他栄養性脱窒菌の遺伝子構造とは全く異なっていた。他栄養性脱窒菌のnir S周辺にある電子伝達に関連する複数の酵素遺伝子が、今回取得したnir S遺伝子では単一のオープンリーディングフレーム中にあった。これから推定できることは、大きな分子量の融合酵素が発現し、効率の良い脱窒が行われているように思われた。上記のことを調べるため、このnir Sを持つ他栄養性脱窒菌の単離を試み、単一のバクテリアを得ることができた。今後、このバクテリアの16S rRNA

遺伝子の塩基配列を調べ、本菌を同定するとともに、本菌が持つNir Sの酵素化学的性質の解明を行い、Anammox菌との共生にどのようにかかわっているのか明らかにする。Anammox菌の重要な酵素と思われるヒドラジン酸化酵素(HZO)の性質の解明とHZOをコードするHZO遺伝子の塩基配列を決定した。本HZOは62kDaのポリペプチドに8個のヘムが結合した単量体の2分子からなる130kDaの2量体で、活性中心にP472があった。ヒドラジンの酸化に対するK_<m'>,V_<max>はそれぞれ5.5μM6.2μmol/min/mg proteinであり、ヒドロキシルアミンによるヒドラジン酸化の拮抗阻害が観察された。このK_iは2.4μMとかなり低くかった。従来の報告にはHZOのような性質の酵素の報告はなかった。HZOは菌体タンパク質の10%以上も発現しており、脱窒を行うAnammoxの中心的な酵素であると思われた。HZOをコードする遺伝子は2種類(hzoA. hzoB)あったが、両者のORFから推定されるアミノ酸配列には1残基の違いしかなかったが、hzoBとhzoAはともに多量に発現していたが、hzoBがhzoAの35倍多く発現していた。両遺伝子のプロモータ領域は異なっており、環境条件によっては、hzoBとhzoAの発現量が異なる可能性が示唆された。一方、他栄養性脱窒菌脱窒菌のキー酵素である,異化型亜硝酸還元酵素(Nir)遺伝子、nir Sを汚泥中から多種類検出した。これは、Anammox汚泥に従属栄型脱窒菌が共生していることを示している。Anammox汚泥から抽出したRNAに対して、検出したnir Sの遺伝子のうち主要と思われるnir Sをプローブとするノーザンハイブリダイゼーション解析を行った。その結果、ポジティブなバンドを検出できず、発現量が非常に少なく、一種類というより複数の従属栄型脱窒菌が集まってもたいした発現量にはならないように思われた。