hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
光CVD法によるアルミナ絶縁膜の低温堆積の研究

低圧Hgランプ照射の減圧下でアルミナ(Al_2O_3)の光CVDの研究を行った。原料としてアルミニウム・トリ・イソプロポキシド(ATI)を用いた。酵素雰囲気中でのアルミナ膜の堆積速度は、230から360°Cの基板温度の範囲において約200A^^○と一定であった。一方、熱CVD及び窒素雰囲気中での光CVDにおける活性化エネルギ-は、それぞれ20及び9.7Kcal/molと求められた。酸素雰囲気中での光CVDにおける堆積速度は、熱CVDにおける360°C付近の原料供給律速領域の値と同じであった。このことは、基板に供給それた原料が、低温においても全てアルミナの膜形成に寄与していることを意味している。堆積速度は紫外光185nmの約2mW/cm_2以上の強度で飽和傾向を示した。A1原子の堆積がアルミナ膜になる見かけの量子収率はほぼ1になることが解った。ATIや酵素分子の光吸収は小さいことを考慮すると、紫外光がアルミナ膜で吸収され、光生成された電子や正孔が光触媒のような効果で、表面における堆積反応を促進させていることが考えられる。また、堆積速度の増加にもかかわらず、アルミナ膜の屈折率及び誘電損失は劣化せず、むしろ改善の傾向が見られた。基板温度300°Cで作製したSiのMIS構造の界面準位は、ミッドギャップにおいて10^<11>cm^<-2>eV^<-1>を下まわる程度に小さかった。HF処理によるSi表面の水素終端効果と低温堆積が、界面準位の低減に効果があったと考えられる。これらのことはMIS精造作成において、アルミナ膜の光CVD法が有望であることを示している。またGaAsのMIS構造の作製では、硫黄によるGaAs表面のパッシベ-ションを利用し、プロセスの低温化を計ることにより、ミッドギャッブ付近の界面準位密度が、3×10^<11>cm^<-2>eV^<-1>程度と比較的小さいCーV特性が得られた。このことから、化合物半導体のMIS構造においても光CVDにおける低温化が有効であることが示された。
情報技術導入におけるビジネスシステム構築プロセスの理論化

本研究の目的は、新しい情報技術の導入によって再構築されるビジネスシステムのプロセスを理論化し、日本企業の情報インフラの効果的な設計、生産性の向上に貢献することである。既存研究の多くは、企業の情報化投資と生産性には直接的な因果関係がないことを指摘している。競争環境の激化は情報技術の更なる有効利用を企業に突きつけているが、多くの企業が新しい情報技術に対応した新しいビジネスシステムを構築できずにいる。その原因は日本企業の文化にあったシステムアーキテクチャの不在とその導入プロセスが不明瞭な点である。本研究では、我々が開発したシステムアーキテクチャを企業に導入し、新しいビジネスシステムを構築していくプロセスを理論化する。情報技術の特性と組織との関係、競争戦略における情報技術の位置付けなどを明らかにし、情報技術をより効果的に生産性に結びつける方法論を提示している。我々は消費者行動に関する分析システムに研究の焦点を当てている。現在、日本の流通システムでは多くのデータや情報が孤立しており、十分な消費者行動に関する分析ができない状態である。また近年のデータ蓄積は巨大化する一方で、通常の(基幹系の)システム技術では対応は難しい。そこで、大規模データベース解析に特化した我々のシステムアーキテクチャを導入し、それぞれのデータを結びつけることで、ビジネスチャンスを発見しようと試みている。本研究の特色の第一は、技術開発のみならず、その実践、効果検証、理論化という社会科学的アプローチを同時に行い、情報技術の影響を総合的に捉える文理融合の研究であること。第二に、研究成果が実践され、その有用性が証明されること。第三に、日本企業の情報インフラに、大学の最先端の研究蓄積を包含した1つの選択肢を提供することによって、社会へ貢献しようとする点をあげることができる。
融合型テラヘルツ帯分光によるガラスの普遍的励起の研究及びガラスの新評価法提案

ガラスの物理の未解決問題の一つであるテラヘルツ帯の普遍的励起のボゾンピークをテラヘルツ時間領域分光で検出可能であることを実証し、テラヘルツ帯赤外・ラマン分光、およびブリルアン散乱分光、非弾性中性子散乱、そして低温比熱による振動状態密度決定と、融合的な分光法によってボゾンピーク研究を推進した。特に低温比熱から決定した振動状態密度とテラヘルツスペクトルを比較することにより、代表的なネットワークガラスであるシリカガラス、そして水素結合系ガラスであるグルコースガラスをはじめとした分子性ガラスに対し、テラヘルツ光と振動状態密度の相互作用に関する基礎知見を得た。加えて、高分子ガラスの普遍的励起と考えられるフラクタルダイナミクス(フラクトン)がテラヘルツ分光で検出可能であることを、フラクトン領域に対する赤外光振動結合定数の定式化を行うことによって示した。ここでは、非晶質に対する線形応答理論とフラクトンモデルを組み合わせることによって定式化に成功している。これにより、高分子ガラスのボゾンピーク周波数以上のテラヘルツスペクトルにおいてフラクタル及びフラクトン次元がどのように現れるかを理解することができる。また、ボゾンピークのテラヘルツ分光による検出が可能であること及び赤外スペクトルにおける吸収係数の絶対値が決定できることに基き、非晶質物質に対する非破壊・非接触な結晶化度決定方法を新たなテラヘルツ光の利用例として提案した。本手法は、結晶性高分子の結晶化度決定などに応用可能である。ガラスの物理における未解決問題の一つとして、ガラス形成物質においてテラヘルツ帯に普遍的に現れるボゾンピークと呼ばれる励起がある。この数十年にわたり、実験・理論両面で多くの研究がなされてきたが、我々はテラヘルツ時間領域分光によってボゾンピークが明瞭に検出できることを世界に先駆けて示すことに成功している。近年進展が活発なテラヘルツ光技術を用いたボゾンピーク研究は、ガラスに関する基礎学理の大きな進展およびテラヘルツ光の新たな応用が期待できる。平成29年度は学術上重要な位置を占めるシリカガラスに対するテラヘルツ分光研究を初め、国内外の研究機関・企業と多くの共同研究を開始した。特に、イタリア、ポーランドを初めとした海外の研究グループと開始しているガラスセラミクスに関するボゾンピーク研究は、ガラスの結晶化度をテラヘルツ光で決定できる可能性を持ち、応用上の需要が今後見込まれる。これに関し、「ボゾンピークの測定値に基づいて、物質の結晶化度及び/又は密度を測定する方法及び測定装置」の特許を出願中であり(特願2017-227977)、本研究の目的の一つである「ガラスの新評価法の提案」の礎を作ることができた。また、本研究における主な対象であるボゾンピークに加え、従来見過ごされてきた、高分子ガラスに普遍的に現れると考えられるフラクタルダイナミクスのテラヘルツ光検出に関し、光とフラクトン励起に関する理論的考察の提案を行っている最中である。平成29年度は、既に開始していた国内の共同研究者とのシリカガラスに関する研究を皮切りに、複数の企業及び研究機関との共同研究のネットワークを拡げ、先端的機能性ガラスのボゾンピークの研究を開始することができている。さらに、ポーランドで開催された国際会議において招待講演依頼を受けたことをきっかけに、イタリアおよびポーランドのガラスセラミクスの研究グループと知り合い、ボゾンピーク評価の基礎と応用を目的として、共同研究に発展している。また、ポーランドの他の研究グループからも共同研究の申し出を頂き、高分子ガラスに対する研究の進展もある。その他も多くの共同研究依頼を受けており、当初予想していた研究展開を凌ぐ拡がりを見せている。また、テラヘルツ光によるボゾンピーク評価の新提案として、「ボゾンピークの測定値に基づいて、物質の結晶化度及び/又は密度を測定する方法及び測定装置」の特許を出願中であり(特願2017-227977)、本研究の目的の一つの礎を築くことに成功した。これは、赤外(テラヘルツ)分光における吸収係数の絶対値決定が可能であることを利用した、結晶化度の決定方法の新しい提案である。また、本研究における主目的であるボゾンピーク分光に加え、従来見逃されてきた、高分子ガラスに普遍的に現れると考えられるフラクタルダイナミクスのテラヘルツ光検出に関し、テラヘルツ分光による検出に関する理論的提案を行っている最中である。この提案は当初の予定よりも大幅にガラスのテラヘルツ帯ダイナミクスの理解を進展させるものであると考えており、今後、ガラス・高分子・テラヘルツ業界において、本提案内容が普及していくことが期待される。

これにより、高分子ガラスのボゾンピーク周波数以上のテラヘルツスペクトルにおいてフラクタル及びフラクトン次元がどのように現れるかを理解することができる。また、ボゾンピークのテラヘルツ分光による検出が可能であること及び赤外スペクトルにおける吸収係数の絶対値が決定できることに基き、非晶質物質に対する非破壊・非接触な結晶化度決定方法を新たなテラヘルツ光の利用例として提案した。本手法は、結晶性高分子の結晶化度決定などに応用可能である。平成30年度は、前年度に得た成果の論文発表、先端的機能性ガラスの分光評価、特許提案内容の実用化に向けた分光研究、そして、特に海外との共同研究ネットワークをさらに拡げ、当研究室をテラヘルツ分光によるボゾンピーク研究の中心地となるよう積極的に成果発表を行うことに努める。特に、本年度は日本においてテラヘルツ技術に関する最大の国際会議であるIRMMW-THz2018(名古屋)および、ガラスの国際会議ICG2018(横浜)が開催されるため、ネットワークを拡げる良い機会となる。特に後者のICG2018においては、イタリアの共同研究者らが当研究室を訪問し、今後の共同研究を進展させるために議論を行う予定である。他の助成金獲得および総合的な研究費の使用状況により、当該助成金が生じた。これを次年度の国際会議の参加費に使用する。
液晶偏光配向技術を用いた偏光干渉法による多次元異方性フォトニック素子創成

偏光ホログラムの手法と光架橋性高分子液晶を使って液晶回折格子素子を作成する効率的かつ実際的な方法を提案した。光架橋性高分子液晶の面内配向は、光配向過程において、直線偏光紫外光の露光量に依存して制御できた。この配向特性を応用することで、90度TN配向や0度のプラナー配向を共に混在させた様々なタイプの液晶回折格子素子を、2枚の光架橋性高分子液晶を塗布した空のセルに一度の偏光干渉露光することで形成可能であることを実証した。さらに本研究では、3光束、4光束での偏光干渉光を光架橋性高分子液晶を塗布した空の液晶セルに一度露光するだけで、複雑な配向パターン形成を実現できることも実証している。液晶光配向技術を用いた偏光干渉法による多次元フォトニック素子を創成するために、我々が開発した光架橋性高分子液晶を用いた捻れ配向技術を開発し、捻れ配向を含む2次元の回折格子素子を作製した。我々の開発してきた光架橋性高分子液晶は、偏光紫外線露光による軸選択的光架橋反応及び液晶分子の協調配向によって大きな異方性を発現させ、さらに低分子液晶を配向させることができる。我々の光配向技術の特徴は、強固な配向規制力が得られるだけでなく、露光量によって直交光配向と平行光配向を制御出来る事にある。昨年度は、この光架橋性高分子液晶の光配向技術の特徴を生かし、ガラスセルの両内面に光架橋性高分子液晶を塗布した空セルに外部から偏光紫外線を露光し、片側の光架橋性高分子液晶の光吸収によって両内面への露光量に差を付けることによって、一度露光で捻れ配向構造を形成する事ができることを見いだした。この技術を用いる事で、種々の偏光および強度分布を有する偏光干渉露光によって、露光面内だけでなく液晶セル内の捩れ配向分布を制御することが可能であることが見いだされ、偏光干渉法による多次元フォトニック素子を創成するための要素技術を開発できた。作製された偏光回折格子の偏光回折特性は理論で予想されたものと一致しており、計画していた光学特性および配向分布特性の理論解析手法の確立も確認出来た。これらの結果を踏まえて今後最終年度に向けて多光束での干渉露光法によって多次元フォトニック素子の創成の検討に入る予定である。液晶分子の高度な3次元配向構造体を形成可能な光架橋性高分子液晶の光配向技術を用い、多光束偏光干渉露光法によって多次元異方性フォトニック素子を創成することを目的に研究を継続している。我々の開発してきた光架橋性高分子液晶は、偏光紫外線露光による軸選択的な光架橋反応及び液晶分子の協調配向によって大きな光学異方性を発現させ、さらに低分子液晶を配向させることが出来る。昨年度までに、1一度露光で液晶の捻れ配向構造まで形成できる技術を確立、2偏光変調干渉露光だけでなく強度変調も組み合わせることで3次元分布を自由に形成する技術を実証、といった成果を挙げることが出来た。上記1の成果によって、液晶層の面内での配向分布の制御だけでなく厚さ方向の捻れ配向までが制御可能であることが実証され3次元構造体創成技術への可能性が強く示唆されている。また上記2の成果によって、干渉露光の場合には常識と考えられる正弦波状の回折格子だけでなく矩形や台形の格子を形成できることもわかった。このように3次元構造体を多光束偏光干渉露光によって創成できる見込みが出来たため、研究計画の最終段階として、3光束、4光束での露光実験を行い、3次元かつ異方性を有するフォトニック構造を作成し、その偏光回折特性などの基礎的な光学特性を観察する。液晶光配向技術を用いた偏光干渉法による多次元フォトニック素子を創成するために、我々が開発してきた光架橋性高分子液晶を用いた捩れ配向を含む2次元の回折格子素子を作成してきた。我々の光配向技術の特徴は、強固な配向規制力が得られるだけでなく、露光量によって直交光配向と平行光配向を制御出来ることにある。このことを利用すると、ガラスセルの両内面への露光量に差を付けることによって、一度露光で露光面内だけでなく液晶セル内の捩れ配向分布を形成できる。このことは、他の光配向技術の片側づつ偏光露光し、高精度に位置合わせして捩れ配向構造を含む構造を形成しなければならない技術と比較すると、その優位性は明らかである。本申請に関わる研究の最終年度では、これらの様々な高度光配向技術を生かし、3光束および4光束の偏光干渉露光を実施し、3次元空間に液晶分子の配向分布を形成した異方性フォトニック素子を形成することに成功した。これらのフォトニック素子は、回折の偏光依存性、偏光変換回折、多彩な波長依存性、など従来の等方性のフォトニック素子には無いユニークな性能を示した。以上の研究成果により、直線偏光方位角によって回折したりしなかったりする13

次元回折素子、直線偏光を円偏光に変換しながら回折する13次元回折素子、青色レーザーは回折するが赤色レーザーは回折しない13次元フォトニック回折素子、など多彩な回折素子を形成出来る事が総合的に実証され、回折格子素子の新しい研究分野・応用分野の開拓がなされたものと考えられる。偏光ホログラムの手法と光架橋性高分子液晶を使って液晶回折格子素子を作成する効率的かつ実際的な方法を提案した。光架橋性高分子液晶の面内配向は、光配向過程において、直線偏光紫外光の露光量に依存して制御できた。この配向特性を応用することで、90度TN配向や0度のプラナー配向を共に混在させた様々なタイプの液晶回折格子素子を、2枚の光架橋性高分子液晶を塗布した空のセルに一度の偏光干渉露光することで形成可能であることを実証した。さらに本研究では、3光束、4光束での偏光干渉光を光架橋性高分子液晶を塗布した空の液晶セルに一度露光するだけで、複雑な配向パターン形成を実現できることも実証している。当初の計画通り、3次元の異方性フォトニック構造を創成するために、我々の光配向技術の基本特性を調査した。その結果、1一度露光で液晶の捻れ配向構造まで形成できる技術を確立、2偏光変調干渉露光だけでなく強度変調も組み合わせることで3次元分布を自由に形成する技術を実証、という成果が得られた。この2つの成果は当初の予想以上に配向分布の制御性が優れていた。さらに、多光束の偏光露光の準備も順調に進んでおり、本年度中には種々の構造体の形成が実証される見込みである。27年度が最終年度であるため、記入しない。光エレクトロニクス2年間の検討結果を踏まえて、当初の計画通り、3次元の異方性フォトニック素子の試作を行う。作成した構造体の光学特性の理論解析に若干の課題は残るが、想定の範囲内であり、計画通り推進する計画である。当初の計画では、25年度には、まず2光波での偏光干渉露光法によって、光波伝搬方向(厚さ方向)での液晶分子の捻れ構造を含む配向構造を制御する技術の開発を目指していた。2枚の基板を組み合わせた低分子液晶充填前の空セルに、偏光紫外光を照射し、上側基板における光吸収によって上下基板の露光量が変わることを利用した一度露光によって捻れ配向構造を形成できることを偏光回折格子に適用できることが見いだされ、さらに、種々の偏光回折格子液晶セルの形成にも成功した。また、これらの特性を理論的に解析する手法も確立できた。初年度の2光束偏光干渉露光による液晶分子の捻れ構造を含む配向分布制御技術およびその光学特性に関する検討、および適切な材料の検討結果をもとに、多光束偏光干渉露光実験光学系を構築し、強度及び偏光が変調された干渉露光と偏光および露光量によって制御される液晶の3次元配向によって異方性フォトニック構造を創成する。このことによって初年度の結果を発展させ、多次元回折が可能な偏光変換・分離・検出機能を有する異方性フォトニック回折格子素子の実現を目指す。購入予定の干渉露光用レーザーをとりあえず試験的に現有レーザーで代用した。またさらに新上位機種が出たため、設備使用計画を変更した。上記新上位機種の発売状況及び本年度の研究進捗状況を鑑みて、本年もしくは来年度に基金部分を使用する。
難治性乳癌を克服するためのDNA修復因子の発現量制御機構の解明

BRCA1はその変異が遺伝性乳がん・卵巣がん症候群の原因となるがん抑制遺伝子である。BRCA1変異による家族性乳がんやBRCA1の発現量が低い散発性がんは、白金製剤やPARP阻害剤に高感受性である。我々は、新規BRCA1結合分子BRCA1-interacting protein (BIP)がBRCA1と、BRCA1の結合分子であるBARD1の発現量を制御するメカニズムを明らかにした。また、がん細胞で、BIPとBRCA1の発現量に負の相関関係があることが明らかになり、BIPが、治療のバイオマーカーや分子標的としての有望であることが示唆された。家族性乳がん原因遺伝子BRCA1はその生殖細胞系列変異により、乳がん、卵巣がんを引き起こすがん抑制遺伝子で、近年は難治性乳がんのTriple negative乳がんとの関わりが注目されている。BRCA1変異による家族性乳がんやBRCA1の発現量が低い散発性がんは、DNA架橋剤である白金製剤や分子標的治療薬であるPoly(ADP-Ribose) Polymerase (PARP)阻害剤に高感受性であるが、タキサン系薬剤には抵抗性で、BRCA1の発現量により抗がん剤感受性が異なる。我々は、BRCA1の新規結合分子として、RNF43を同定し、RNF43がDNA損傷応答に関与し、BRCA1の発現量を制御することを発見した。本研究はRNF43によるBRCA1の発現量制御機構を解明し、この機構に関与する分子の治療のバイオマーカーや分子標的としての有用性を検討し、難治性のTriple negative乳がんを克服する個別化医療を開発することを目的としている。本年度の研究により、BRCA1がユビキチン化される領域を明らかにすることが出来た。また、BRCA1の各種欠失変異体を用いた解析により、BRCA1のN末端の領域がユビキチン化されて、DNA損傷応答の場所となるクロマチンに移行することが明らかになった。また、多数のがん細胞株で解析した結果、RNF43の発現量とBRCA1の発現量には負の相関関係があることが明らかになり、RNF43がBRCA1の発現量を制御することを示唆する結果が得られた。我々は、BRCA1の新規結合分子を同定し、本分子がDNA損傷応答に関与し、BRCA1の発現量を制御することを発見した。本研究はこの分子によるBRCA1の発現量制御機構を解明し、この機構に関与する分子の治療のバイオマーカーや分子標的としての有用性を検討し、難治性のTriple negative乳がんを克服する個別化医療を開発することを目的としている。BRCA1はBARD1とヘテロダイマーを形成し、DNA修復や中心体制御に関与することが明らかになっているが、本年度の研究により、このがBRCA1だけでなく、BARD1の発現量も制御することが明らかになった。また、昨年度の解析により、RNF43によるBRCA1の発現量の制御には、BRCA1のN末端の領域が重要であることが明らかになっていたが、BARD1と結合能が消失する変異体では本分子によるBRCA1の発現量の変化がなくなり、本分子によるBRCA1の発現量制御にはBARD1が重要な役割を果たすことが明らかになった。一方、本分子によるBARD1の発現量の変化には、BRCA1との結合領域が欠失しても生じ、BRCA1には非依存的であることが明らかになった。我々は、BRCA1の新規結合分子を同定し、この新規BRCA1結合分子BRCA1-interacting protein (BIP)がDNA損傷応答に関与し、BRCA1の発現量を制御することを発見した。本研究はこの分子によるBRCA1の発現量制御機構を解明し、この機構に関与する分子の治療のバイオマーカーや分子標的としての有用性を検討し、難治性のTriple negative乳がんを克服する個別化医療を開発することを目的とした。本研究により、BIPがBRCA1だけでなく、BARD1の発現量も制御することが明らかになった。しかし、そのメカニズムは異なり、BIPは、RINGドメインを持ちE3ユビキチンリガーゼ活性をもつが、BRCA1の発現量の制御はこの活性に依存せず、BARD1の発現量の制御にはこの活性が重要であることが明らかになった。また、各種がん細胞株を用いた解析により、BIPとBRCA1の発現量に負の相関関係があることも明らかになった。

我々は、新規BRCA1結合分子BRCA1-interacting protein (BIP)がBRCA1と、BRCA1の結合分子であるBARD1の発現量を制御するメカニズムを明らかにした。また、がん細胞で、BIPとBRCA1の発現量に負の相関関係があることが明らかになり、BIPが、治療のバイオマーカーや分子標的としての有望であることが示唆された。本分子がBRCA1だけでなく、BARD1の発現量も制御することが明らかになった。また、本分子によるBRCA1の発現量制御にはBARD1が重要な役割を果たすことが明らかになった。BRCA1とBARD1の発現量の制御機構が複雑であることが明らかになるとともに、BRCA1とBARD1は、ヘテロダイマーを形成し、DNA修復に関与することから、本分子が、抗がん剤感受性に大きく関与することを示すことができた。よって、本分子が抗がん剤感受性を予測するバイオマーカーとして有用である可能性が高まったと考えられる。腫瘍生物学今後は、本分子のBRCA1の発現量の制御メカニズムの解明に加えて、BARD1の発現量の制御メカニズムの解明も合わせて行う。本分子の、BRCA1とBARD1の発現量の制御におけるユビキチン化修飾について、精製タンパク質を用いて生化学的にさらに詳細に検討していく。また、BRCA1の発現量制御に働くUBE2Tが、BARD1の発現量の制御には関与するかどうかも検討する。また、プロテオミクス解析により、本分子の新規結合分子を同定も進める。さらに、Triple negative乳がんとその他のがんの細胞株や臨床検体で、本分子、UBE2T、本分子の新規結合分子とBRCA1とBARD1の発現量との関連を解析する。培養細胞については、抗がん剤感受性との関連についても検討し、これらの分子の抗がん剤感受性を予測するバイオマーカーとしての有用性を明らかにする。BRCA1がユビキチン化される領域がN末端に存在すること明らかにすることが出来た。また、この領域は、以前我々が解明した、DNA損傷部位に集積する領域となっており、今回、DNA損傷応答の場所となるクロマチンに移行することと一致する。よって、この領域にフォーカスして解析することで、さらに研究が進むと思われる。学会発表の旅費や人件費を他の経費でまかなうことができ、また物品費も予定額より少ない金額でまかなうことが出来たため、次年度使用額が生じた。今後は、BRCA1のN末端のユビキチン化が、RNF43、UBE2Tによることを生化学的に明らかにし、分解を導くものであるかどうかも細胞レベルで解析する。また、プロテオミクス解析により、RNF43の新規結合分子を同定する。RNF43を安定発現する細胞株は、今のところ樹立に成功しなかったため、一過性発現した細胞の抽出液を用いて、実験を行う予定である。または、RNF43のGSTを付加したRNF43の精製タンパク質でアフィニティ精製を行うことも検討中である。また、RNF43、UBE2T、RNF43の新規結合分子の発現を誘導、または抑制できる細胞株を樹立し、これらの発現量の変化によるBRCA1の発現量の影響について検討する。
新規ナトリウムークロライド共輪送体ファミリーのクローニングと生理的役割の解明

ナトリウムークロライド共輸送体ファミリーの新しいものをクローニングして機能を明らかにして、その生理的意義を解明するのが今回の研究の目的であった。今回クローニングしたのは次のような遺伝子である。カリウムークロライド共輸送体としてKCC3(CCC8)をクローニングした。ナトリウムークロライドーカリウム共輸送体ファミリーとしてCCC6とCCC7をクローニングした。ナトリウムーリン共輸送体ファミリーとしてNaP1のファミリーであるNaP3をクローニングした。クロライドー重炭酸-ナトリウム輸送体としてAE4(NBC5)をクローニングした。クロライドー硫酸輸送体としてSAT6,SAT7をクローニングした。ナトリウムークロライドーカテコラミン共輸送体の新規遺伝子をクローンニングした。グルコース輸送体のGLUT8をクローニングした。電位依存性ナトリウムチャネルとしてTPC1をクローニングした。またカルシウムチャネルと考えられるCD20のファミリーを8つクローニングした。またカルシウム輸送体でチャネル構造をしたCAT1,ECAC1,カプサイシン受容体のファミリーで浸透圧に反応するSAC1,SAC2をクローニングした。一方クロライドチャネルとして水チャネルの構造に近いAQPX1,AQPX2をクローニングした。これらのタンパクの組織分布をノーザンブロットと組織染色でタンパクの局在をあきらかにするとともにアフリカツメガエル卵や培養細胞に発現させて機能解析をおこなった。機能がかならずしもすべてあきらかにできたわけではなく、発現調節とともに今後解析を続ける必要がある。申請の時点でラット腎によりクローニングした共輸送体(CCC6)と、ヒト脳よりクローニングした共輸送体(CCC7)と、カリウムークロライド共輸送体の新規メンバー(CCC8)をラット腎よりクローニングしていた。途中CCC8は他の2つのグループによってKCC3として報告されてしまった(J Biol Chem 274:10661ー10667、1999;J Biol Chem274:16355ー16362、1999)。そこでCCC7とCCC6を中心に研究を進めてきた。比較する目的でCCC7のラット版を腎臓よりクローニングした。ヒトとラットのCCC7はアミノ酸で93%の相同性があった。なおヒトのCCC7はクロモソーム7q22、1にマップされた。ラットCCC7をアフリカツメカエル卵に発現させたがCl、Na、Rbの有意のとりこみをみとめなかった。一方CCC6には2つのスプライトバリアントが存在することがあきらかになり、みじかいクローン(2つの膜貫通領域を欠損する)はアフリカツメカエル卵に発現させてもRbのとりこみを増強しなかった。またCCC6の合成部分ペプチドに対する抗体を作成したが抗体値は十分上昇したものの、組織では検出できていない。今後CHO細胞やCOS細胞に一過性に発現させてNa、Cl、Rbの輸送を検討するとともに、生理的役割をあきらかにする目的でCCC6のスプライスバリアント、CCC7それぞれに対する抗体を作成し、組織染色によってその局在をあきらかにするとともに、動物を脱水にすることにより、CCC6、CCC7それぞれのメッセンジャーRNAとタンパクが変化するかどうかをノーザンブロットとウエスタンブロットであきらかにする予定である。ナトリウム-クロライド共輸送体ファミリーの新しいものをクローニングして機能を明らかにして、その生理的意義を解明するのが今回の研究の目的であった。カリウム-クロライド共輸送体としてKCC3をクローニングした。ナトリウム-クロライド-カリウム共輸送体ファミリーとしてCCC6とCCC7をクローニングした。ナトリウム-リン共輸送体ファミリーとしてNaP1のファミリーであるNaP3をクローニングした。クロライド-重炭酸-ナトリウム輸送体としてAE4をクローニングした。クロライド-硫酸輸送体としてDRA1,DRA4,DRA7をクローニングした。一方、輸送体とチャネルの違いは近年ほとんどなくなっており、広い意味での輸送体であり、カチオンチャネルとアニオンチャネルもクローニングをおこなった。

またカルシウム輸送体でチャネル構造をしたCAT1,ECAC1,カプサイシン受容体のファミリーで浸透圧に反応するSAC1,SAC2をクローニングした。またこれらのアフリカツメガエルホモログであるXCAT,XVRLもクローニングした。またこれらはTRPファミリーに属しているがそのメンバーの新規遺伝子であるTRP10をクローニングした。一方クロライドチャネルとして水チャネルの構造に近いAQPX1,AQPX2をクローニングした。これらのタンパクの組織分布をノーザンブロットと組織染色でタンパクの局在をあきらかにするとともにアフリカツメガエル卵や培養細胞に発現させて機能解析をおこなった。機能がかならずしもすべてあきらかにできたわけではなく、発現調節とともに今後解析を続ける必要がある。
ホイッスラーコーラス波動による放射線帯電子散乱過程の数理モデル

本研究課題は、電子散乱過程におけるホイッスラーコーラス波による非古典的な拡散過程を準線形的な古典的拡散と統一的に扱うスキームの構築を目的としている。2018年度に得られた主な成果は以下のものである:1波動との非共鳴な相互作用による拡散過程の波動のパラメータ(振幅、バンド幅など)への依存性を議論した。振幅依存性に対する議論から、粒子の分散の時間発展は波動の振幅が大きい場合でも規格化した準線形理論で良く記述できることが分かった。また、バンド幅については依存性が低く、バンド幅が十分小さい場合でも準線形的な記述が良く成立することが明らかになった。21と同様に、波動との共鳴相互作用による拡散過程の波動のパラメータ(振幅、バンド幅など)への依存性を議論した。共鳴相互作用の場合は共鳴する周波数の振幅が重要であるため、波動の磁場エネルギーを一定にすると振幅とバンド幅が独立ではなくなるが、小バンド幅にしても1と同様に粒子の分散の時間発展は準線形理論で良く記述できることが分かった。これは、準線形理論で通常前提とされる波動場のランダム性が担保されない場合でも、拡散過程としてとらえた時に区別がつかない場合があることを示している。3非共鳴拡散の場合、各時間窓に対して評価した時間相関関数が減衰振動することが分かった。このような減衰振動する時間相関関数のモデルとして、森の射影演算子法から一般化ランジュバン方程式を導出し、摩擦係数を与える表式を示した。一方で、共鳴拡散の場合は現実的な波動強度の範囲では顕著な時間相関関数の減衰が見られなかった。4齊藤ら(Saito etal, JGR, 2016)で波動の由来の統計性を反映させるために導入された位相破壊を確率モデルとして一般化し、ノイズ項の統計的性質によって拡散への影響が異なることを明らかにした。年度当初予定していたテスト粒子計算および射影演算子法の適用に加え、位相破壊の確率モデルの検討もすでに進めており、その意味では当初の計画以上の進展がある。一方で、上述したテスト粒子計算結果は、バンド幅を考慮しても確率モデルの前提となる統計性が共鳴散乱のみでは担保されないことを示唆しており、数値モデルに内在し得る位相破壊の物理機構を明らかにするためには波束の振幅変化などの影響をより詳細に検討する必要がある。今後は、モデル方程式と直接数値計算との比較を通じ、古典的拡散に極力近い形を念頭に、ホイッスラーコーラス波による電子散乱過程の確率モデルの探索を行う。モデルの探索においては、時間相関関数や拡散係数などの統計量の再現性を重視する。また、上記の振幅変化の影響などに関係して、各粒子が受ける電磁場の時系列データの統計的性質と粒子時系列データの統計的性質の相関を詳細に調べ、衛星観測データとの対応を議論するための理論的な基礎づけを行う。特に、古典拡散・非線形効果が混在する場合やコーラス波による電子散乱で重要な役割を持つ背景場の非一様性の影響について重点的に議論する。並行して、確率項の数値計算スキーム上の取り扱いが計算結果に与える影響について検討を行う。進展が順調であれば、射影演算子法を用いたランジュバン方程式導出に関する技術的側面について、より近年の非平衡統計物理の知見を踏まえた再考も行う予定である。

今後は、モデル方程式と直接数値計算との比較を通じ、古典的拡散に極力近い形を念頭に、ホイッスラーコーラス波による電子散乱過程の確率モデルの探索を行う。モデルの探索においては、時間相関関数や拡散係数などの統計量の再現性を重視する。また、上記の振幅変化の影響などに関係して、各粒子が受ける電磁場の時系列データの統計的性質と粒子時系列データの統計的性質の相関を詳細に調べ、衛星観測データとの対応を議論するための理論的な基礎づけを行う。特に、古典拡散・非線形効果が混在する場合やコーラス波による電子散乱で重要な役割を持つ背景場の非一様性の影響について重点的に議論する。並行して、確率項の数値計算スキーム上の取り扱いが計算結果に与える影響について検討を行う。進展が順調であれば、射影演算子法を用いたランジュバン方程式導出に関する技術的側面について、より近年の非平衡統計物理の知見を踏まえた再考も行う予定である。
触媒的不斉水素化に基づく光学活性β-アミノ酸類の効率的合成

光学活性β-アミノ酸は生理活性ペプチド抗生物質の構成要素として、あるいはβ-ラクタム抗生物質合成のキラル構成単位として古くから注目されている重要な天然物である。本一般研究Cでは2,2'-ビス(ジフェニルホスフィノ)-1,1'-ビナフチル(BINAP)を配位子とするルテニウム二価錯体のエナミド類に対する高いエナンチオ選択能および触媒的水素化能に着目して、触媒的不斉反応に要求される実用的要素となる(1)基質合成の容易さ、(2)触媒調製の容易さ、(3)操作の容易さ、(4)高反応性、(5)高不斉収率を十分考慮して、光学活性β-アミノ酸類の効果的合成への展開を目指した。その結果、対応する3-オキソカルボン酸エステルからエナミンへの変換、アシル化、光異性化を経て水素化基質の大量合成に成功すると同時に、購入可能あるいは容易に調製できるルテニウム触媒前駆体として[RuCl_2(cod)]n、[RuCl_2(C_6H_6)]_2、RuCl_2[Sb(C_6H_5)_3]_3を用いることによってBINAP-ルテニウムハロゲンおよびアセテート錯体の簡易合成法の開拓を実現した。従来法に比較して収率、操作法ともに格段に優れだ方法である。触媒活性・選択性も従来のBINAP-ルテニウム錯体と同じであり、操作の容易さ、高反応性、高不斉収率を満足する本触媒的不斉水素化法の実用性をさらに高めることができたと考えている。同錯体を用いてβ-アシルアミノアクリル酸誘導体を最高96%の不斉収率で水素化することに成功した。この選択性は現段階で最も高いものである。さらに、各種オレフィン類の水素化において基質構造とエナンチオ選択性との相関関係が明らかにすることができた。本研究者は、分子レベルでの触媒反応の詳細な機構解明が、高効率化、合成化学的一般性の確立、そして実用化への飛躍に直結すると確信するものであるが、その基盤の一部を確立することができたと考えている。
子どもの描画における表現及び解析技法のコンピュ-タ化に関する基礎開発的研究

本研究は,子どもの描画について心理学的に研究する際の新しい方法論の提起を目的とし,一般研究(C)の萌芽的研究として申請したものである。ここでいう描画研究の新しい方法論とは,子どもの描画表現過程,および,子どもの描画の心理学的解析過程にコンピュ-タ・システム等を導入することである。その目的は,1つには子どもの描画表現の外見的未熟さが認識能力の問題なのか表現能力の問題なのかを明らかにすることであり,もう1つは効率性の高い描画解析法を開発することにあった。本研究の成果は,以下の2点に集約される。1.描画の表現過程のコンピュ-タ化コンピュ-タによる描画の方法として,第一に,いわゆる「お絵かきソフト」を用い,入力機器としてのマウス(またはトラック・ボ-ル)を用いることが考えられるが,実際に子どもにやらせてみるとマウスの操作方法だけでなく,ソフトウェアの描画手続きが子ども用としては適当でないことが明らかになった。むしろ,描画専用機である「グラフィック・コンピュ-タ」(ソニ-)が操作性の点で格段に優れていた。なお,本研究では予算と時間の制約のために果たせなかったが,描画過程のリアル・タイム記録の問題が今後の重要な課題である。2.描画の解析過程のコンピュ-タ化子どもの描画をカラ-・イメ-ジ・スキャナ-でコンピュ-タに取り込み,直線の長さ,曲線の曲率,面積などを分析する技法について検討した。現行のイメ-ジ・スキャナ-の問題点は,CRT画面表示の段階とプリンタ-印刷の段階で情報量に少なからぬロスが生じる点にあり,今後の性能の向上がまたれる。むしろ実用的にはエリアカ-ブメ-タ-による線長・面積の測定法が現段階では有効性が高いことが明らかになった。
培養肥満細胞を用いた抗アレルギー剤の開発研究

試験管内で増殖性の肥満細胞を大量にかつ恒常的に供給することが出来れば、作用機構が明白な抗アレルギー剤の効果的な開発に繋がると考えられ、培養肥満細胞の作製と維持、特に増殖と機能活性に関する詳細な検討を行った。まず、培養肥満細胞として成熟した結合組織型肥満細胞の一種、腹腔性肥満細胞の長期培養条件を検討した。腹腔性肥満細胞は単独細胞では培地に加えた牛胎仔血清成分と反応して短時間に脱顆粒を起こし破砕するが、基層培養として、ラット胎仔肝組織,あるいは胎仔皮膚組織の培養を行った後、腹腔性肥満細胞を培養すると、顆粒やヒスタミンをよく保有した培養把満細胞が得られる。しかし、一部もしくは基層培養細胞由来と思われる神経細胞様の樹状突起を有した細胞に変異するが、この変異細胞は顆粒(メタクロマジー陽性)やヒスタミンを含有することから肥満細胞と考えられる。また、IL-3依存性の増殖性肥満細胞株(P-3)を、WHEI細胞の馴化培地を用いて維持した。癌化肥満細胞は、増殖活性は高いが機能活性が低いので、酪酸とグルココルチコイドにより機能を活性化して使用する。酪酸の場合は、顆粒形成を含めて肥満細胞の機能指標が全べて活性化するが、ステロイドの場合はヒスタミン生合成酵素のみが特異的に誘導合成される。これらの培養肥満細胞のヒスタミン,プロスタグランジン,HETE,ヘパリンなどの生合成および分泌活性について検討を加えた。分泌活性に関しては、免疫型刺激としてDNP-Asc,抗原,抗体反応,非免疫型刺激としては従来からヒスタミン遊離剤として知られていたcompound48/80から、【Ca^(2+)】依存的に免疫刺激様反応を起こすN-methyl p-methoxyphonylethylamineの13量体オリゴマーを分離し、合成して用いると良好なかつ簡便な抗アレルギー剤のスクリーニング系となることかを明らかにした。以上、本研究から培養肥満細胞を用いて抗アレルギー剤を開発する為の基礎的知見を得た。
ヒト細胞の放射線誘発突然変異の遺伝子座特異性

2,8ジハイドロキシアデニン(DHA)を成分とする尿路結石を主症状とする劣性遺伝病が常染色体16番長腕上に遺伝子が存在するアデニンフォスフォリボシルトランスフェラ-ゼ(APRT)欠損に因る。そこで患者の親から樹立されたリンパ芽球様細胞株(LCL)を材料にaprt+/ー→ー/ーの突然変異ジアミノブリン抵抗性(DAP^r)を指標として定量的に検出する素を開発した。^<137>Csγ線照射によって同時に測定したHPRT座位上の変異であるチオグアニン抵抗性(TG^r)に比べ、約10倍の効率でDAP^r変異が誘発された。近畿大学原子炉(UTRーKINKI)の核分裂中性子とγ線の混合放射線によるDAP^r誘発もTG^r誘発の710倍高い効率であったが,RBEは2以下で他の生物学的終結点や従前の報告とは異っているので次年度での繰返し実験による確認が必要である。ヘテロ保因者由来LCLがRFLPについてもヘテロの二重異型接合体であることをSphIで見出しこのヘテロ接合状態の喪失を指標に(LOH)放射線誘発突然変異の特徴を解析した。サザンブロット解析で自発DAP^rクロ-ンでは22/26(85%) ^<137>Csγ線2Gy(7倍上昇)では64/69(93%)でLOHを伴っており,大きなゲノム変化がDAP^rの成因と考えられた。これに対し紫外線10J/n^2(2倍上昇)では17/13(55%)MNNG1.2μs/ml(20倍上昇)では13/43(30.2%)であった。これまで我々がHPRT座位でTG^rクロ-ンのDNA解析から自発変異で29%^<137>Csγ線で47%に何らかの大きなゲノム変化(欠失)を観察していることから,常染色体上のAPRT座位の場合には,相同染色体のheritable変異がlocalized change(点突然変異と極めて小さい欠失)である限り,大きなゲノム変化を伴う変異体が生存して回収される確率の高いことが,自発変異粗度,電離放射線誘発頻度でDAP^rがTG^rより約10倍高い理由であることが示唆された。
毛髪特異的なCreマウスの作製

本研究では、毛髪に特異的に発現する毛ケラチン35(Krt35)遺伝子のプロモーターの調節下にCreリコンビナーゼを発現するトランスジェニックマウス(Krt35-Cre)を作製することを目的とする。Krt35-Creの塩基配列を有するトランスジェニックマウスを作製し、B6. 129X1-Gt(ROSA)26Sortm1マウスと交配させることにより、Krt35-Cre(+)/EYFP(+)のマウスの作製に成功した。しかしながら、毛髪特異的なEYFPの発現は認められなかったことから、本研究計画は目的を達成することができなかったと結論付けた。多くの謎に包まれている毛髪の分化機構を明らかにするための手法の1つとして、毛髪に発現するさまざまな遺伝子のノックアウトマウスの作製および解析が挙げられる。しかしながら、それらの遺伝子の多くが表皮や他臓器にも発現しているため、重篤な毛髪外症状を呈するという問題がある。本研究では、毛髪に特異的に発現する毛ケラチン35(Krt35)遺伝子のプロモーターの調節下にCreリコンビナーゼを発現するトランスジェニックマウス(K35-Cre)を作製することを目的とする。平成27年度は、mouse Krt35 promoter (約3Kb; exon 1のstart codonより上流の配列も含む)・SV40 intron・Creリコンビナーゼ・SV40-3UTRのシークエンスを、pBluescript-SKベクター(Stratagene)に順次クローニングした。クローニング後、BigDye Terminatorを用いてSanger sequencingを行い、すべての塩基配列が正しいかどうかを確認した。作製したベクターを制限酵素で直鎖化後、マウス受精卵前核にマイクロインジェクションした。生まれてきたマウスの耳からゲノムDNAを抽出してPCR法でジェノタイピングを試行した結果、トランスジーン陽性のF0マウスが2匹得られた。現在、F0マウスを野生型C57BL/6マウスと交配させることにより、トランスジーンをヘテロで有するF1マウスの作製を行っている。当初の研究計画では、平成27年度末までにF1マウスを作製する予定だった。現在、F1マウスが得られる直前の段階まで到達していることから、計画通りにおおむね順調に進展していると考えられる。多くの謎に包まれている毛髪の分化機構を明らかにするための手法の一つとして、毛髪に発現するさまざまな遺伝子のノックアウトマウスの作製および解析があげられる。しかしながら、それらの遺伝子の多くが表皮や他臓器にも広く発現しているため、重篤な毛髪外症状を呈するという問題がある。平成27年度は、mouse Krt35 promoterの塩基配列の下流にCreリコンビナーゼの塩基配列を組み込んだベクターを作製し、直鎖化後にマウス受精卵前核にマイクロインジェクションした。それにより、トランスジーン陽性のF0マウスを2匹得た。平成28年度は、F0マウスを野生型マウスと交配させることにより、トランスジーンをヘテロで有するF1マウスを1匹得た。その後、トランスジーン陽性のF1マウスをさらに野生型マウスと交配させることにより、トランスジーン陽性のF2マウスを計8匹得た。それらのF2マウスをRosa26-loxP-stop-loxP-EYFPマウス(B6. 129X1-Gt(ROSA)26Sortm1)と交配させ、ジェノタイピングによりKrt35(+)/EYFP(+)、Krt35(-)/EYFP(+)、Krt35(+)/EYFP(-)またはKrt35(-)/EYFP(-)のF2マウスを抽出し、それぞれの皮膚および内臓を採取してOCTコンパウンド内に封入して凍結保存した。トランスジーン陽性のF0マウスを野生型マウスと交配させた際に、トランスジーンをヘテロで有するF1マウスがなかなか得られなかった。交配をやりなおした結果、ようやく目的のF1マウスを得ることに成功した。さらに、研究代表者が平成29年1月16日に新潟大学から山口大学に異動したことも影響し、当初の研究計画よりもやや進行が遅れた。平成28年度に、トランスジーン陽性のF1マウスを野生型マウスと交配させることにより、トランスジーン陽性のF2マウスを作製し、更にそれらのF2マウスをRosa26-loxP-stop-loxP-EYFPマウス(B6. 129X1-Gt(ROSA)26Sortm1)と交配させ、ジェノタイピングによりKrt35(+)/EYFP(+)、Krt35(-)/EYFP(+)、Krt35(+)/EYFP(-)またはKrt35(-)/EYFP(-)のF2マウスを抽出し、それぞれの皮膚および内臓を採取してOCTコンパウンド内に封入して凍結保存した。平成29年度は、まずこれらのマウスの皮膚の新鮮凍結切片を作製して蛍光顕微鏡で観察したが、すべてのマウスで毛髪に緑色の蛍光の発色が観察された。つまり、この発色は非特異的なバックグラウンドと考えられた。

そこで、抗EYFP抗体を用いて免疫染色を行い、2次抗体にAlexa594を使用することによって赤色の蛍光を発する陽性シグナルの検出を目指した。しかしながら、Krt35(+)/EYFP(+)でも陽性シグナルが毛髪に認められなかった。また、Krt35(+)/EYFP(+)の皮膚からtotal RNAを抽出してRT-PCRを施行した結果、Creの発現はごくわずかしか検出されなかった。以上の結果から、本研究で作製したKrt35-Creマウスでは、目的通りに効率よくCreリコンビナーゼを強発現しておらず、そのためにEYFPの陽性シグナルが得られなかったと結論付けた。本研究では、毛髪に特異的に発現する毛ケラチン35(Krt35)遺伝子のプロモーターの調節下にCreリコンビナーゼを発現するトランスジェニックマウス(Krt35-Cre)を作製することを目的とする。Krt35-Creの塩基配列を有するトランスジェニックマウスを作製し、B6. 129X1-Gt(ROSA)26Sortm1マウスと交配させることにより、Krt35-Cre(+)/EYFP(+)のマウスの作製に成功した。しかしながら、毛髪特異的なEYFPの発現は認められなかったことから、本研究計画は目的を達成することができなかったと結論付けた。平成28年度に採取したマウスの組織を用いて、Krt35(+)/EYFP(+)のマウスでEYFPが毛髪特異的に発現しているかどうかについて、RT-PCR法と組織切片の蛍光顕微鏡下での観察により検討する。目的通りのトランスジェニックマウスの作製に成功した場合は、B6. 129-Ctnnb1tm2Kem/KnwJ(beta-cateninのノックアウトアレルを有する)マウスと交配させ、毛髪特異的にWntシグナルを欠失させた際にどのような毛髪異常を生じるかを解析する。皮膚科学分野物品購入等の納品検収は平成27年度内に完了したが、支払いが4月となったため。物品購入等は当該年度にすでに完了し、4月に支払いが完了している。
出芽酵母全プロテインホスファターゼ遺伝子二重破壊変異株の構築と機能解析

出芽酵母の遺伝子機能解析プロジェクトの一環として、欧米で全遺伝子6,000の網羅的な破壊プロジェクトが進行しているが、機能重複のためか表現型の検出が困難であることが明らかになりつつある。本研究では、全塩基配列情報によりゲノムに32種存在することがわかっているプロテインホスファターゼ(PPase)遺伝子のうち、申請者ら、および他の研究室によって、単独破壊株が生存可能であることが明らかにされた29種について、)全ての組合わせ(406通り)の二重破壊株を作製し、どのような組み合わせの二重破壊株が致死となるか、ii)また生存可能なものについてはどのような表現型が現れるかを網羅的に解析することを目的とした。昨年までに、約268通りの組み合わせについて二重破壊株を構築したので、本年は、残りの組み合わせについて二重破壊株の取得を試みた。その結果、新たに42通りの組み合わせで二重破壊株が得られ、合計310通りとなった。一方、現在までに直接形質転換によって二重破壊株が取得できていないものについては、二重破壊が致死である可能性を考え、四分子分析により二重破壊株の致死性検定を行った。すなわち、接合型の異なる単独破壊株を交雑し、四分子の中に二重破壊株が出現するか否かで二重破壊の致死性を検定した。その結果、現在までに行った26通りの組み合わせの全ての場合において二重破壊株が取得された。従って、これらを合わせると、現在までに合計336通りの二重破壊株が取得されたこととなり、未解析の組み合わせは70通りとなった。一方、単独破壊株の網羅的な表現型解析で、以前にyvh1破壊株が増殖の低温感受性を示すことを見出していたが、この知見に関連してyVHlの転写が低温で誘導されるか否かを解析した。その結果、培養温度を30°Cから13°Cにシフトすると約30分後に転写産物の増加が見られ、その後13°Cで培養を続けると、9時間後には30°Cでのレベルに戻ることがわかった。この結果より、YVH1PPaseは、出芽酵母の低温での増殖適応に何らかの役割を果たしているものと思われた。
霊長類角膜内皮細胞の増殖制御機構の解明

【目的】霊長類の角膜内皮細胞は生体内ではほとんど増殖しない一方で、生体外で適切な条件で培養することにより増殖させることが可能である。今回、カニクイザルの培養角膜内皮細胞におけるDNA/RNA同時測定による培養角膜内皮細胞の細胞周期解析を行い、さらに細胞周期制御分子の発現を免疫組織化学的手法により検討したので報告する。【方法】カニクイザル培養角膜内皮細胞を継代培養し、1サンプル当たり3000個の細胞をHoechst33342とPyronin Yにて染色後、In Cell Analyzer 1000^<[○!R]>を用いてDNAとRNAの同時測定を行い細胞周期解析を行った。また、p16、p21、p27、p53、リン酸化p53に対する免疫染色を行い、角膜内皮細胞における細胞周期制御分子の発現を検討した。【結果】In Cell Analyzer 1000^<[○!R]>により培養角膜内皮細胞の細胞周期の解析(G0期:6%、G1期:89%、S,G2,M期:6%)が可能であった。また、免疫染色によりすべての細胞にp16、p21、p27の発現が認められた。p53の発現が認められたが、リン酸化p53の発現は認められなかった。【結論】カニクイザル角膜内皮細胞の培養条件下における細胞周期解析が可能であった。また、細胞周期制御分子を介して細胞増殖が抑制されていることが示唆され、霊長類の角膜内皮細胞増殖を制御する因子の解明に有用であると考えられた。霊長類の角膜内皮細胞と培養角膜内皮細胞における細胞周期制御分子の検討霊長類の角膜内皮細胞は生体内ではほとんど増殖しない一方で、生体外で適切な条件で培養することにより増殖させることが可能である。本研究では、カニクイザルの角膜組織の内皮細胞と培養角膜内皮細胞における細胞周期制御分子の発現を免疫化学的手法により比較検討した。カニクイザル角膜組織およびIV型コラーゲンでコーティングしたプレート上で継代培養したカニクイザル培養角膜内皮細胞を4%PFAで固定し、Rb、サイクリンA、p16、p21、p53、リン酸化p53に対する免疫染色を行い、角膜内皮細胞における細胞周期制御分子の発現と細胞における局在を比較検討した。角膜組織の内皮細胞ではRb、p16はすべての細胞で核内に、p21はすべての細胞で細胞質に発現が認められた。サイクリンA、p53、リン酸化p53の発現は認められなかった。培養角膜内皮細胞ではRb、p16、p53はすべての細胞で核内に、p21はすべての細胞で細胞質に発現が認められた。Rbは一部の細胞では強く発現していた。サイクリンAは一部の細胞にのみ核内に局在する発現が認められた。リン酸化p53の発現は認められなかった。カニクイザルの角膜組織の内皮細胞と培養角膜内皮細胞を用いて、細胞周期制御分子の検討を行うことが可能であり、霊長類の角膜内皮細胞増殖を制御する因子の解明に有用である可能性が示唆された。
細胞内プロテアーゼ・カルパインによる筋組織恒常性維持機構の解明

カルパインの筋組織における機能を解析するため、全身および心筋特異的カルパインー1とー2両遺伝子欠損マウスを作製して、繁殖を行った。通常の両遺伝子欠損マウスは胎生致死になるため、Cre-loxPシステムによる条件特異的遺伝子欠損をおこない、全身欠損についてはMeox2プロモーター<ジャクソン研究室#3755>、心筋特異的欠損にはMyh6プロモーター<ジャクソン研究室#9074>制御下で発現するCreリコンビナーゼ発現マウスとの交配により作製した。全身欠損マウスで一部出生率の異常がみられたが、出生したマウスに大きな変化は見られなかった。しかし、生後3か月ごろから体重減少傾向が観察された。また東京大学・大阪大学との共同研究により、カルパインの阻害タンパク質であるカルパスタチンの欠損マウスの心筋において、N-カドへリンがカルパインによって切断されることで心筋症が促進することを示した。しかし9月から民間企業への就職のため本研究を断念し、廃止申請をした。これまでに作製したカルパインー2欠損マウスについては、理化学研究所・実験動物開発室<http://mus.brc.riken.jp>に寄託する予定である。これまでカルパインは病態を促進するプロテアーゼと一般的に認識されているが、カルパインが過剰活性化するような環境下では他の病態促進機構も働いており、カルパイン阻害のみを対象にした治療法は現実的ではない。一方で、カルパイン欠損が胎生致死や成体発育不良になることから、カルパインの生理的環境における機能やシグナル伝達機構を解明することで病態への新たな治療法の確立につながる可能性がある。