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高尿酸血症病態における禁煙補助薬バレニクリンによる動脈硬化進展の加速・増悪機序

我々はこれまでに、経口禁煙補助薬バレニクリンが動脈硬化促進作用を有し、その発現機序にマクロファージのスカベンジャー受容体LOX-1およびCD36が関与することを明らかにした。一方、高尿酸血症で動脈硬化形成が促進されるとの報告があり、バレニクリンによる動脈硬化形成促進作用が増悪することが推測される。本研究では、動脈硬化・高尿酸血症モデルマウスを用いて「高尿酸血症病態ではLOX-1およびCD36の発現量・機能の変容により、バレニクリン誘発動脈硬化症発症が増悪する」という仮説を検証し、その発症機序を明らかにすることを目的とした。動脈硬化モデルマウスであるApoE KOマウスを用い、食餌性の高尿酸血症を誘導することでモデル動物を作製した。高尿酸食は、通常飼育食および高脂肪食に2.5%オキソン酸、1%尿酸を含有させたものを準備し、最初の1週間は通常高尿酸食で飼育し、その後、高脂肪・尿酸食負荷に切り替えた。同時にバレニクリン0.5mg/kg/日の投与を開始した。郡分けとして、対照群(高脂肪食+生理食塩液投与)、バレニクリン群(高脂肪食+バレニクリン投与)群、高尿酸バレニクリン群(高脂肪尿酸食+バレニクリン投与)の3群で、動脈硬化巣形成を評価した。全大動脈および大動脈起始部の動脈硬化巣をoil red-O染色で評価したところ、バレニクリン群の動脈硬化形成促進作用は認められたが、高尿酸バレニクリン群と差が認められなかった。同時に採取した血液中の尿酸濃度は、高尿酸バレニクリン群で上昇していたが、これまでに我々が作成した高尿酸モデルの尿酸濃度の約50%程度(約2.0mg/dL)であり、十分な血中濃度の上昇が得られていないと考えられた。現在、高尿酸食の成分含量を数種準備し、十分な尿酸濃度上昇が得られる含量を検討している。当初予定していた高脂肪尿酸食の成分含量では、これまでに我々が確立した食餌性高尿酸血症モデルの血中尿酸濃度が達成できないことが分かった。高尿酸血症がバレニクリンの動脈硬化形成促進に影響しない可能性があるが、十分な尿酸濃度の上昇が得られたモデルにおいて最終的な判断ができると思われる。高脂肪尿酸食中のオキソン酸および尿酸含有量を変えた高脂肪尿酸食を数種準備し、高尿酸状態となるか検討を行っている。食餌性の高尿酸血症モデルが作製できない場合は、尿酸のみ腹腔内投与を行うモデルを検討する。また細胞実験では、マクロファージのLOX1およびCD36ノックダウン細胞の確立を始めており、十分なノックダウン効果が得られれば、前倒しにて実験をすすめていく。

また細胞実験では、マクロファージのLOX1およびCD36ノックダウン細胞の確立を始めており、十分なノックダウン効果が得られれば、前倒しにて実験をすすめていく。(理由)計画した食餌性高尿酸血症モデル作製が予定通りに進んでおらず、進捗が遅れたため。(使用計画)当初予定した使用計画通りとし、次年度使用額は細胞実験の消耗品費に充てる。
CRMP2による微小管ダイナミクス制御の相関構造解析

本研究は、微小管結合タンパク質CRMP2の微小管ダイナミクス制御の分子機構解明を通じて神経細胞軸索伸長の制御機構を明らかにする事を目的とし、以下の結果を得た。CRMP2は神経細胞の発生段階において、将来の軸索突起の先端に局在して軸索特有の「軸索型微小管」の重合を促し、効率良く軸索伸長を誘導することで神経細胞極性形成に大きく寄与する。分子モーターキネシンは、CRMP2が誘導した「軸索型微小管」を道標として、軸索突起に選択的に物質輸送を行う。CRMP2のC末端部がリン酸化を受けると、CRMP2と微小管との静電的反発により軸索型微小管の誘導効果が消失し、軸索誘導から反発へとシグナルが切り替わる。本研究課題は、微小管結合タンパク質CRMP2の微小管ダイナミクス制御の分子機構を解明し、さらにその制御機構によって神経細胞軸索伸長がどのように誘導されるのかについて、原子レベルから細胞レベルに至る多階層構造・機能解析法を用いて明らかにすることを目的とする。これに関して以下の進捗があり、論文投稿中である。1) CRMP2は、tubulinヘテロ二量体およびその重合体である微小管と結合する際、それぞれ異なる結合面を利用する。2) CRMP2は、tubulinヘテロ二量体に直接作用して、軸索に有意に多く存在するGTP型微小管を効率よく誘導する。微小管の重合誘導時、CRMP2は微小管側面には結合せず、tubulinヘテロ二量体と一過性の複合体を形成する。3) CRMP2は通常ホモ四量体を呈しているが、tubulinヘテロ二量体と複合体を形成する際は四量体を解体し、CRMP2-tubulinのヘテロ三量体を形成する。4) CRMP2の結晶構造を解明し、さらにCRMP2-tubulin複合体の溶液構造をX線小角散乱により明らかにした。これにより、CRMP2はH19ヘリックスを主要な結合部位として利用し、tubulinヘテロ二量体のプラス端面に結合することが明らかとなった。5)立体構造により同定した結合面のアミノ酸点変異を、ニワトリ脊髄後根神経節ニューロンおよび線虫神経系に導入した。前者においては、点変異体の過剰発現により神経細胞軸索伸長が抑制され、後者では軸索特異的な微小管誘導が抑制された。本実験結果により、CRMP2はtubulinとヘテロ三量体を形成して軸索型微小管の誘導を促進することを通して、軸索伸張のみならず、軸索特異性の付与をも行っていることが明らかとなった。平成27年度の研究計画はほぼ完了し、平成28年度の2種の研究計画のうち、X線小角散乱によるCRMP2-tubulin複合体の溶液構造解析を遂行することができた。さらにX線結晶構造解析の構造を併用することで、CRMP2-tubulinの結合領域を高い精度で同定することができ、CRMP2結合面の変異体導入の実験に効率よくつなげることが可能となった。CRMP2結合面の変異体を線虫やニワトリ神経細胞に導入する実験では、軸索微小管の伸長抑制のみならず、軸索微小管としての特徴の付与を阻害するという想定以上の表現型が得られ、CRMP2は微小管との相互作用を通じて、軸索伸長のみならず軸索としてのidentyを与えるために重要な働きをすることを明確に示すことができた。本研究課題は、微小管結合タンパク質CRMP2の微小管ダイナミクス制御の分子機構を解明し、さらにその制御機構によって神経細胞軸索伸長がどのように誘導されるのかについて、原子レベルから細胞、線虫個体レベルに至る多階層構造・機能解析法を用いて明らかにすることを目的とする。これに関して以下の進捗があり、論文改訂中である。(1)生化学的実験、蛍光顕微鏡(in vitroとCOS7細胞)で、CRMP2が微小管の重合促進能を有することを示した。(2)cryo電子顕微鏡によりCRMP2が軸索特有のGTP型微小管の形態を誘導すること、さらに全反射蛍光顕微鏡を用いてCRMP2が微小管の先端部分に集積することを証明した。(3)生化学的実験により、CRMP2はtubulinと複合体を形成することを通じて微小管の重合端にtubulinを付加する役割を持つことを示した。(4)X線結晶構造解析およびX線小角散乱法を用いてCRMP2-tubulin複合体の原子構造を解明した。(5)CRMP2-tubulin複合体の立体構造をもとに、その結合部位のアミノ酸点変異を導入したところ、この変異体は、in vitroで微小管伸長を遅延し、また軸索型微小管を作れなくなった。細胞レベルでも微小管伸長が遅延して細胞寿命が短縮し、さらに、線虫神経系では軸索に運ばれるべき物質が樹状突起に誤輸送される現象が観察された。これらの結果からCRMP2は、軸索突起の先端で微小管重合端周辺に局在してtubulinと結合し、軸索特有のGTP型微小管を効率良く重合させることを通じて、軸索に「GTP型微小管」という道しるべを作りながら効率良く軸索誘導を促進することが明らかになった。論文査読者の指示のもと、論文の改訂を行いながら、平成28年の研究計画を遂行した。(1)CRMP2-tubulin複合体の結合部位への点変異導入による構造モデルの検証実験に関して:平成27度は、線虫およびニワトリ後根神経節細胞を用いた検証実験を行った。

平成28年度は、生化学的にゲル濾過クロマトグラフィーおよび多角度光散乱法を組み合わせた複合体形成確認および分子量測定、全反射顕微鏡を用いたin vitroの微小管伸長実験、COS7細胞内の微小管伸長実験を行った。これにより、野生型CRMP2はtubulinとモル比1:1で複合体を形成し、in vitroでもCOS7細胞内でも微小管伸長を促進するのに対し、変異型CRMP2では複合体形成が阻害され、微小管伸長効果もキャンセルされることが明らかとなった。(2)CRMP2誘導GTP型微小管の相関電子顕微鏡解析に関して:本実験は、CRMP2が微小管の先端に局在することを明らかにするために計画したものであるが、CRMP2の微小管への結合は一時的であるため、電子顕微鏡による解析が困難であることがわかった。そこで、全反射蛍光顕微鏡を用いた解析へと変更し、CRMP2は微小管の重合を促進するときに、微小管の先端部分に集積することを証明した。以上、当初の計画とは実験方法を変更する必要があったが、平成28年度の研究目標を達成することができた。本研究課題は、微小管結合タンパク質CRMP2の微小管ダイナミクス制御の分子機構を解明し、神経細胞軸索伸長の誘導・制御機構を明らかにする事を目的とする。これに関して、以下の進捗があり、2本の論文にまとめて報告した。1) Niwa et al., Sci. Rep. 2017.野生型CRMP2が、軸索特有の形態を持つ「軸索型微小管」の重合を促す事により、効率良く軸索伸長を誘導し、神経細胞極性形成に大きく寄与する事を、多階層構造・機能解析法を用いて明らかにした。以下、詳細を記す。生化学的実験、全反射蛍光顕微鏡により野生型CRMP2が微小管の先端部分に集積して、微小管重合促進能を有する事を示し、cryo電子顕微鏡によりCRMP2が軸索特有の形態を持つ微小管を誘導する事を示した。さらに生化学的にCRMP2が微小管の構成要素Tubulinと複合体を形成する事を通じて、微小管の重合端にTubulinを負荷する役割を持つ事を示し、X線小角散乱法および結晶解析法によりCRMP2-Tubulin複合体の原子構造を解明した。最後に、CRMP2の結合面のアミノ酸点変異により、これらのCRMP2の機能が全てキャンセルされることを証明した。2) Sumi et al., Cell Struct. Funct. 2018. CRMP2は、CDK5およびGSK3βによりC末端部位のリン酸化を受けると、成長円錐の崩壊といった軸索反発を誘導することが知られており、またその過度なリン酸化はアルツハイマー病の発症にも関連する。本論文では、CRMP2のリン酸化によって微小管との結合が阻害され、上記の重合促進効果が見られない事を生化学的に示した。さらにリン酸化CRMP2の原子構造を解明し、CRMP2のリン酸化が微小管との結合の静電的反発を引き起こすことによる、軸索誘導から反発へとシグナルを切り替えることを示した。本研究は、微小管結合タンパク質CRMP2の微小管ダイナミクス制御の分子機構解明を通じて神経細胞軸索伸長の制御機構を明らかにする事を目的とし、以下の結果を得た。CRMP2は神経細胞の発生段階において、将来の軸索突起の先端に局在して軸索特有の「軸索型微小管」の重合を促し、効率良く軸索伸長を誘導することで神経細胞極性形成に大きく寄与する。
アロステリックシャペロンを用いた小児遺伝病に対する新規治療法の開発

本研究課題では、ライソゾーム病の一つ、β-ガラクトシダーゼ欠損症に対し、アロステリックシャペロン化合物の開発を行い、候補化合物2個を同定した。また、既存の基質競合阻害型シャペロン化合物を元に、側鎖構造を変換した新規化合物を合成し、阻害活性の低い新規化合物を開発した。この化合物はいくつかの変異酵素に対し有意な酵素活性上昇効果を示す、新規シャペロン候補化合物であることが分かった。本課題では、ライソゾーム病に対する酵素活性部位に結合せず、阻害活性を示さない、アロステリック作用によるシャペロン化合物を開発することを目的とする。本年度は、まず、アロステリックシャペロン化合物探索のためのスクリーニング系の確立を行った。蛋白質の疎水残基に特異的に結合し、蛍光を発する蛍光標識を用い、蛋白質構造の折りたたむ状態をリアルタイムに検出できる系を確立した。次に、ムコ多糖症II型の欠損酵素であるイズロネート-2-スルファターゼ(IDS)酵素蛋白質を用い、FDA認可薬化合物ライブラリーとICCB化合物ライブラリーの中から、IDS酵素蛋白質に対して安定化活性を示す化合物のスクリーニングを行い、化合物を同定した。この化合物の中には、以前のスクリーニングですでに同定されていたIDSの阻害剤以外の化合物も含まれていた。次に、候補化合物の変異IDS酵素に対するシャペロン効果を検討するためにミスセンス変異を人工的に導入した変異IDS cDNA発現ベクターを構築し、変異IDS発現細胞実験系を構築した。本課題では、ライソゾーム病の原因酵素に対し、阻害活性を示さないアロステリック作用により酵素安定化活性を示すシャペロン化合物を開発する事を目的とする。本年度は、昨年度、ムコ多糖症II型欠損酵素に対し、従来の阻害活性スクリーニングと、酵素安定化活性スクリーニングにより同定した化合物の、培養細胞に対する効果を調べた。結果、変異特異的なシャペロン効果を示す化合物を複数認めた。次に、β-ガラクトシダーゼに対するアロステリックシャペロン候補化合物を同定した。予備的な解析の結果、候補化合物のうち少なくとも1化合物が変異β-ガラクトシダーゼに対するシャペロン効果を培養COS細胞系で認めた。現在、これらの候補化合物について、培養細胞実験系を用い変異特異的シャペロン効果について解析を行っている。さらに、最終年度に向けて蛋白構造変化について検討するためのシステムの構築を行っている。本課題では、ライソゾーム病の原因酵素に対し、阻害活性を示さないアロステリック作用により酵素安定化活性を示すシャペロン化合物を開発する事を目的とした。本年度は、昨年度同定したβーガラクトシダーゼに対するアロステリックシャペロン候補化合物について、培養COS細胞発現実験系を用い、化合物のシャペロン効果を検討した。結果、2つの変異βーガラクトシダーゼに対し、有意なシャペロン効果を示すことが分かった。一方、βーガラクトシダーゼに対する既存のシャペロン化合物NOEVについて、側鎖構造を改良し、阻害活性を10倍低下した新規シャペロン化合物を開発した。予備的な検討の結果、この新規化合物は、NOEVより広範な変異型に対する有効性を示すことが分かった。ライソゾーム病2疾患、ムコ多糖症II型とGM1-ガングリオシドーシスに対するアロステリック作用によるシャペロン候補化合物を複数同定できた。また、予備的な解析により、そのうちのいくつかの化合物において、培養細胞に対するシャペロン効果を認めることができ、今後さらに解析をすすめることで、新規シャペロン治療薬としての開発に進展する可能性が示唆されたため。27年度が最終年度であるため、記入しない。小児神経学本年度までに同定した、ムコ多糖症II型とGM1-ガングリオシドーシスの2疾患に対する新規アロステリックシャペロン候補化合物について、培養変異酵素cDNA発現系を用い、有効性を示す変異型を明らかにする。具体的には、GM1-ガングリオシドーシス88種類などすでに確立している疾患モデル細胞を用い、候補化合物を加え48時間培養後に酵素活性の上昇で測定する。さらに、これらのモデル細胞内のGM1-ガングリオシドなどの蓄積、オートファジーなどの機能異常などについて検討する予定である。また、これらの候補化合物と変異蛋白の関係を、構造生物学的に検討し、その結合様式を明らかにし、さらに新たなシャペロン開発の情報とする予定である。ライソゾーム病の一つムコ多糖症II型に対し、試験管内酵素安定化活性を指標とした化合物スクリーニングにより、アロステリックシャペロンの候補化合物を複数同定できた。また、変異IDS cDNA発現細胞実験系を構築した。これらの成果は、ムコ多糖症II型のアロステリックシャペロン開発にための有用な成果であると考えられた。現在の探索ではアロステリックシャペロンが、予想以上に少なく、予定していた機能解析や構造生物学的解析が遅れたため。

そのために、成果発表が予定より少なかったことも使用額が少なくなった理由である。27年度が最終年度であるため、記入しない。ムコ多糖症II型について、シャペロン候補化合物の培養細胞に対する効果を検討する。具体的には、異なる変異IDSをもつ患者由来皮膚線維芽細胞、または変異IDS cDNA発現細胞系を用い、変異酵素活性上昇効果を検討する。また、変異IDS酵素蛋白質発現量の検討も行う。一方で、GM1-ガングリオシドーシスについても、同様のスクリーニング手法を用い、新規アロステリックシャペ候補化合物の同定を行う。また、既存の阻害活性を有するシャペロン化合物の活性との比較検討を行う。候補シャペロンが発見できてきたので、本年度は機能解析も含めた詳細な解析さらに、構造生物学的な解析にも踏み込む予定であり、当初予定以上に予算が必要である。さらに、成果発表も積極的に行う予定であり、こちらにも予定以上の予算をかける予定である。研究がおおむね順調に進展し、当初の計画に比べ、打ち合わせのための旅費及び人件費等が抑えられたため。研究計画に沿って、試薬・消耗品等の購入、成果発表及び打ち合わせのための旅費、人件費、機器利用料等で使用する。
有用菌を主とする乳腺組織内細菌叢の発達を支える腸管を基軸とした細菌供給機構の解明

粘膜面に常在する細菌叢は、病原性微生物の感染を防御するほか体内の免疫や代謝を制御する中枢として機能することが知られている。本研究員は、これまで哺乳動物に必須とされる乳腺組織において母乳の合成が盛んとなる授乳期に細菌叢が形成されることを初めて明らかとしてきた。しかしながら、乳腺組織内で形成される常在細菌叢が乳腺に備わる免疫機能や生理機能に関与するのか、その特徴は未だ明らかとされていない。そこで、平成30年度は乳腺組織の機能に対する常在細菌叢の特徴を明らかにすべく、細菌叢と同じく授乳期の乳腺組織内で発達する免疫グロブリンA(IgA)産生と乳汁合成に着目し、常在細菌の有無による免疫および生理因子の変動の調査を実施した。具体的には、SPFまたは無菌環境で飼育した授乳期のBALB/cマウスから乳腺組織を回収し、mRNAを抽出後にIgA産生または乳汁合成関連因子の遺伝子発現をrealtime_PCRにより測定した。その結果、SPFまたは無菌環境で飼育したマウスの乳腺組織内において、IgA産生と乳汁合成関連因子は同程度の遺伝子発現が認められ、乳腺内の常在細菌は組織に備わる免疫および生理機能と非依存的な関係性を有することが明らかとなった。このような乳腺組織内の細菌叢に関する特徴は、原著論文「Development of immune and microbial environments is independently regulated in the mammary gland.」として国際誌に掲載し、高い評価を得た。当研究員は平成30年度に実施した研究を通して、乳腺の細菌叢が組織に備わる免疫および生理機能と非依存的に発達するという特徴を明らかにし、この発見は原著論文として国際誌で公表した。また、乳腺内に存在する常在細菌の役割に関して発展的な研究を実施し、新たな知見も得られた。近年の常在細菌叢に関する研究では、母乳中に多様な微生物が存在することが報告されており、乳腺内に存在する微生物は母乳中へ移行することが示唆された。このような微生物は恐らく、哺乳を介して仔の腸管へと移動し、仔の腸内細菌叢や免疫系の発達に寄与すると考えられる。そこで、平成30年度には乳腺組織内の常在細菌に関する発展研究として母体由来の微生物が仔の腸管免疫系に関与する知見を得るべく、無菌マウスや、抗生物質投与により母体の微生物環境を攪乱させたマウスを用いた実証実験を行った。その結果、母体の微生物環境が欠失または攪乱すると、その母乳を摂取した仔の腸内において離乳後のIgA産生が正常ではないことが示された。これは、母体由来の微生物がIgA産生を含む仔の腸内環境の形成に必須であることを示唆するものである。しかしながら、母体由来の微生物が仔の腸内環境形成にどのように作用するのか、その具体的要素は特定されておらず更なる研究が必要とされる。そのため、今後は実証実験で得られた知見を基に、母体由来の微生物と仔の腸内環境の関係性を追求する。本年度は、仔の腸内環境形成における母体由来微生物の働きの解明を通して、仔の健全育成を可能にする母体内の微生物叢制御に向けた学術基盤の形成を目指す。そのために、離乳後の仔の腸内で産生されるIgAの微生物に対する特異性と、母体が有する微生物叢との関係に焦点を当てた実験を実施する。まず、離乳直前の授乳期および離乳直後の仔の腸管内で産生されるIgAの微生物に対する特異性を明らかにすべく、自身が有する、あるいは母体の腸管内に生息する微生物を認識するIgAの特異性を明らかにする。具体的には、仔の糞便中のIgAー微生物複合体に加え、授乳期の母体から糞便を回収し、懸濁液を作成後、その実仔から回収した糞便上清中のIgAを懸濁液中の母体内微生物と反応させたIgAー母体由来微生物複合体を、抗IgA抗体を用いたMACS法によって回収する。その後、精製した複合体より微生物由来ゲノムDNAを抽出し、次世代シーケンサーに供することで、IgAの特異性を明らかにする。さらに、母体由来の微生物によって誘導される仔の腸内IgAが自身の腸内細菌叢の構築に寄与することを実証する。そのために腸管管腔内へのIgA輸送に関わるpolymeric immunoglobulin receptorを欠損するマウス(PigR欠損マウス)および野生型マウスを用意する。そして、腸管でIgAの産生が開始される離乳後の両マウスから経日的に糞便を回収し、DNAを抽出後、次世代シークエンサーを用いた微生物叢のメタゲノム解析に供することで、PigR欠損マウスと野生型マウスの細菌叢構成を比較検討する。上述した過程で得られた成果は、国内学会で報告するほか、原著論文として公表する。

具体的には、SPFまたは無菌環境で飼育した授乳期のBALB/cマウスから乳腺組織を回収し、mRNAを抽出後にIgA産生または乳汁合成関連因子の遺伝子発現をrealtime_PCRにより測定した。その結果、SPFまたは無菌環境で飼育したマウスの乳腺組織内において、IgA産生と乳汁合成関連因子は同程度の遺伝子発現が認められ、乳腺内の常在細菌は組織に備わる免疫および生理機能と非依存的な関係性を有することが明らかとなった。このような乳腺組織内の細菌叢に関する特徴は、原著論文「Development of immune and microbial environments is independently regulated in the mammary gland.」として国際誌に掲載し、高い評価を得た。当研究員は平成30年度に実施した研究を通して、乳腺の細菌叢が組織に備わる免疫および生理機能と非依存的に発達するという特徴を明らかにし、この発見は原著論文として国際誌で公表した。また、乳腺内に存在する常在細菌の役割に関して発展的な研究を実施し、新たな知見も得られた。近年の常在細菌叢に関する研究では、母乳中に多様な微生物が存在することが報告されており、乳腺内に存在する微生物は母乳中へ移行することが示唆された。このような微生物は恐らく、哺乳を介して仔の腸管へと移動し、仔の腸内細菌叢や免疫系の発達に寄与すると考えられる。そこで、平成30年度には乳腺組織内の常在細菌に関する発展研究として母体由来の微生物が仔の腸管免疫系に関与する知見を得るべく、無菌マウスや、抗生物質投与により母体の微生物環境を攪乱させたマウスを用いた実証実験を行った。その結果、母体の微生物環境が欠失または攪乱すると、その母乳を摂取した仔の腸内において離乳後のIgA産生が正常ではないことが示された。これは、母体由来の微生物がIgA産生を含む仔の腸内環境の形成に必須であることを示唆するものである。しかしながら、母体由来の微生物が仔の腸内環境形成にどのように作用するのか、その具体的要素は特定されておらず更なる研究が必要とされる。そのため、今後は実証実験で得られた知見を基に、母体由来の微生物と仔の腸内環境の関係性を追求する。本年度は、仔の腸内環境形成における母体由来微生物の働きの解明を通して、仔の健全育成を可能にする母体内の微生物叢制御に向けた学術基盤の形成を目指す。そのために、離乳後の仔の腸内で産生されるIgAの微生物に対する特異性と、母体が有する微生物叢との関係に焦点を当てた実験を実施する。まず、離乳直前の授乳期および離乳直後の仔の腸管内で産生されるIgAの微生物に対する特異性を明らかにすべく、自身が有する、あるいは母体の腸管内に生息する微生物を認識するIgAの特異性を明らかにする。具体的には、仔の糞便中のIgAー微生物複合体に加え、授乳期の母体から糞便を回収し、懸濁液を作成後、その実仔から回収した糞便上清中のIgAを懸濁液中の母体内微生物と反応させたIgAー母体由来微生物複合体を、抗IgA抗体を用いたMACS法によって回収する。その後、精製した複合体より微生物由来ゲノムDNAを抽出し、次世代シーケンサーに供することで、IgAの特異性を明らかにする。さらに、母体由来の微生物によって誘導される仔の腸内IgAが自身の腸内細菌叢の構築に寄与することを実証する。
藻類ファージの生活史をまねた多元代謝経路によるアルカン高生産系の構築

藻類は、効率的にバイオマスを生産でき、かつ食糧生産と競合しないバイオマス源として近年注目を集めている。しかしながら、藻類は細胞内にオイル成分を蓄積するため、培地から希薄な細胞を濃縮・回収し、抽出を行う必要がある。また、細胞の培養には窒素・リン酸・金属イオンなどの培養液成分が必要である。本研究は、藻類による有用物質の大量生産の問題点を解決するため、ラン藻細胞に導入した複数の代謝系をファージに倣って時系列的に誘導制御することにより、有用バイオマスであるアルカン/アルケンの高生産系を構築、藻類ファージのように細胞内の高分子を分解し、最終的に可溶化させることで、培地中に生産したオイル類やアミノ酸・ヌクレオチド類を放出させることで、オイル成分の回収を容易にするとともに、培地を再利用する方策を開発することを目的とする。ラン藻細胞の代謝改変のシグナルとして、植物ホルモンのエチレンとエチレンのセンサーをラン藻の内在性のヒスチジンキナーゼと連結して、エチレンセンサーとして働くキメラセンサーの作製を試みた。ラン藻細胞内でのキメラセンサーのア構築はこれまでに複数の成功例があり、機能未同定のHik2の機能解析については今年度公表した1)。シロイヌナズナの5種のエチレンセンサーから、キメラ型のヒスチジンキナーゼを作製し、ラン藻内で発現させた結果、3種は常に活性型で2種は常に不活性型であったが、いずれもエチレンの刺激に応答しなかった。植物のエチレンセンサーは、3回の膜貫通ヘリックスとGAFドメインをシグナルインプットドメインに持ち、膜貫通ドメインにエチレンの結合部位が存在する。5つのセンサーは互いに相同性が高く、アミノ酸配列の比較だけからは、活性の有無を評価できなかったため、様々なドメイン交換体を作製した。その結果、活性型の膜貫通ドメインを有することが、活性の発現に必須であることがわかった。25年度が最終年度であるため、記入しない。本研究は、藻類による有料物質の大量生産の問題点を解決するため、ラン藻細胞に導入した複数の代謝系をファージに倣って時系列的に誘導制御することにより、有用バイオマスであるアルカン/アルケンの高生産系を構築する。シロイヌナズナの5種のエチレンセンサーから、キメラ型のヒスチジンキナーゼを作製し、ラン藻内で発現させた結果、3種は常に活性型で2種は常に不活性型であって、いずれもエテホン、エチレンの刺激に応答することができなかった。エチレンセンサーとキナーゼドメインのリンカーに相当するαヘリックスの長さにより、キメラセンサーの活性を調節できることがわかった。TakaraBio社のiDimerizeシステムを活用し、人工的に活性を制御するセンサーの構築を目指したが、リガンドに応答する人工センサーは得られなかった。植物のエチレン受容部が、ラン藻細胞内でエチレンに応答しない原因として、センサーが本来局在する植物の小胞体膜とラン藻の細胞膜の脂質組成の違いが原因となっていることが考えられた。ラン藻のヒスチジンキナーゼでエチレンセンサーのエチレン結合部位と高い相同性が指摘され、実際にエチレンとの結合が報告されているSlr1212の膜貫通ドメインをキメラ型のヒスチジンキナーゼに組み込むことでエチレンに応答可能なセンサーの構築を目指す。

活性型となったのは、末端にレシーバードメインを有する構造のエチレンセンサーであった。ヒスチジンキナーゼドメインのアミノ酸配列との相関は見られなかった。それらのレシーバードメインを持つエチレンセンサーが植物細胞内でどの様な機能を有するかは明らかではない、今後の解析が必要である。エチレンセンサーとキナーゼドメインのリンカーに相当するαヘリックスを順に欠失していくと、活性だ他のキメラセンサーの活性が周期的に変動することがわかった。このことはリンカーによりN末端側のシグナルインプットドメインとC末端側のキナーゼドメインの配位方向に変化が、キナーゼの活性の強弱を決めている要因であることを示すもので、将来的にリンカー部分の長さにより、キメラセンサーの活性を調節できることがわかった。人工的に細胞内で目的タンパク質を低分子リガンドの投与により、二量体化を抑制・誘導できるTakaraBio社のiDimerizeシステムを活用し、人工的に活性を制御するセンサーの構築を目指した。元々動物細胞での使用を目的としたキットで、原核細胞への応用例はほとんどなかったが試みた。残念ながら恒常的に活性型の分子しか得ることができず、低分子リガンドの投与によってもそれに応答する人工センサーは得られなかった。植物のエチレン受容部が、ラン藻細胞内でエチレンに応答しない原因として、センサーが本来局在する植物の小胞体膜とラン藻の細胞膜の脂質組成の違いが原因となっていることが考えられた。植物の小胞体膜は新脂質を主な膜脂質として構成されるが、ラン藻の細胞膜は糖脂質を主成分としリン脂質はホスファチジルグリセロールを唯一含むだけである。この違いが膜中に存在するエチレンの結合部位との関係を変化させていた可能性があるため、ラン藻のヒスチジンキナーゼでエチレンセンサーのエチレン結合部位と高い相同性が指摘され、実際にエチレンとの結合が報告されているSlr1212の膜貫通ドメインをキメラ型のヒスチジンキナーゼに組み込むことでエチレンに応答可能なセンサーの構築を目指したい。また、エチレンセンサーのエチレン結合部位に変異を導入し、エチレンに応答性となるものをスクリーニングすることも検討する。25年度が最終年度であるため、記入しない。
海洋天然物由来糖脂質の合成と機能探索

近年、細胞表層に存在する糖タンパク質や糖脂質などの糖鎖が細胞間の認識現象に深く関与する分子種であることが明らかとなり、特に高等動物より見出された糖鎖の化学的、生物学的研究が盛んに行われている。一方、無脊椎動物より見出された糖鎖構造はほ乳類の糖鎖構造とは大きく異なっているが、単離・構造決定にとどまり機能解明にまで至っていない。そこでこれら無脊椎動物由来の糖鎖構造と生物機能に興味を持ち、化学合成を行うことで機能解明を目指している。今回、数種類の海綿とホヤより見出された糖鎖の化学合成及び機能探索を行った。当研究室では細胞表層における複合糖質糖鎖の機能解明の一助として、下等動物より得られる糖脂質や糖タンパク質糖鎖の化学合成を目指してきた。本研究では、海洋生物の持つ新規な糖脂質の合成を目指している。海洋生物が生産する化学物質は、陸上生物由来の天然化学物質には見られない、新奇で多彩な化学構造と様々な生理活性の発現が期待されている。今回、特に海洋生物の中で、海綿とホヤに着目してこれらより見出された糖脂質を合成目標とした。今年度はカイメンの中で、Spheciospongia vespariaより見出されたAraβ1-6Galβ1-Cer及び、Agelas disparより見出された5種(Galα1-2Galβ1-Cer 1, Glcα1-2Galβ1-Cer 2, Galfα1-3Galβ1-Cer 3, GalNAcα1-3Galβ1-Cer 4,GalNAcβ1-6(Galα1-2)Galβ1-Cer 5)の糖脂質の全合成を目指した。後者に関しては、糖脂質合成の鍵反応を単糖セラミド誘導体と次の糖との縮合に置き、ガラクトシルセラミドを合成後、ガラクトース供与体及びガラクトフラノース供与体を縮合することによりGalα1-2Galβ1Cer, Galfα1-3Galβ1Cerの二種類の糖脂質の合成を完了した。一方、ホヤの一種、Microcosmus sulcatusより見出されたGalβ1-4(Fucα1-3)Glcβ1Cerは、当研究室でこれまでに合成し、NO産生抑制活性を報告してきたカイメン由来の糖脂質GalNAcβ1-4(Fucα1-3)GlcNAcβ1Cerのアミノ糖部分が水酸基であるラクトースに置き換わった構造をとり、構造活性相関の観点から興味深く、合成目標とした。下等動物由来糖脂質の合成研究の一環として本助成では海綿やホヤより見出された新規糖脂質の合成を行っている。26年度は、カイメンの1種Amphimedon compressaより2種の糖脂質の全合成を完了させ、2種類の糖脂質誘導体を合成した。完了した糖脂質は、Galα1-6Glcβ1-Cer及び、Galβ1-6Glcβ1-Cerであり、6位水酸基遊離のグルコース受容体と、ガラクトースの2位をベンジル基で保護し隣接基関与を持たせない供与体を、NIS/TfOH存在下、縮合させ、Galα1-6GlcとGalβ1-6Glcの二糖誘導体を同時に合成し、その後、カラムクロマトグラフィーにより分離、精製し、それぞれを脂質と縮合した。この時、セラミド受容体との直接縮合はかなり低収率であったため、アジドスフィンゴシン受容体と縮合し、アジド基の還元後、長鎖脂肪酸を導入することで、収率の向上を図った。また、GlcNAcβ1-Cer及び、GlcNAcβ1-6Glcβ1-Cerも合成目標としており、前者に於いてはGlcNAc供与体とアジドスフィンゴシンとの縮合が高収率で達成でき、二糖体も同様に得た。現在、セラミドへの変換及び脱保護を行っている。一方、Agelas diperから見出された糖脂質はGalα1-Cerのガラクトース2位又は3位に糖が結合しているが、単ガラクトースとセラミド受容体との直接縮合の収率が、先ほど同様低収率であり、アジドスフィンゴシン受容体との縮合に切り替えた。現在ではグラムスケールで単糖アジドスフィンゴシン誘導体を得ることが出来、各種糖鎖伸張を行っている。本研究では無脊椎動物由来複合糖質の合成研究の一環として、海洋生物であるカイメン及びホヤ由来の糖脂質の合成研究を行っている。本年度はSpheciospongia vespariaから見出された糖脂質のうち、1.ガラクトフラノースからなる非還元末端三糖α-D-Galf-(1→2)-[α-D-Galf-(1-3)]-β-D-Galf、2. Agelas disper由来α-D-Galp-(1→2)-α-D-Galp-(1→1)-Cerおよび、3. Amphimedon compressa由来のGlcNAcβ1-Cerの合成を完了した。1についてはGalfの2,3位水酸基遊離の単糖受容体に過剰量のチオフェニル基を脱離基とする単糖供与体をNIS/TfOHの存在下縮合させ位、2カ所のグリコシド結合がいずれもα-体である三糖誘導体を効率よく合成した。

2については二糖合成後のセラミドとの縮合は収率と立体選択性の観点から効率が悪いと考え、Galα1-Cer誘導体合成後にガラクトース供与体を縮合させ二糖誘導体を得ようとしたが、副生成物の分離が困難であることが判明し、セラミドの代わりにアジドスフィンゴシン誘導体に変換したところ、糖鎖伸張の立体選択性が増し、目的のα-体のみが得られた。また、これまでに合成及びNO産生抑制活性を報告してきた海綿Aplysinella rhax由来の糖脂質であるβ-D-GalNAc-(1→3)-[α-D-Fucp-(1-4)]-β-D-GlcNAcp-(1→1)-Cerに、エストロゲン誘導ヒト乳癌由来細胞株(MSF7)の増殖抑制が見られ、新たな生物活性を見出した。近年、細胞表層に存在する糖タンパク質や糖脂質などの糖鎖が細胞間の認識現象に深く関与する分子種であることが明らかとなり、特に高等動物より見出された糖鎖の化学的、生物学的研究が盛んに行われている。一方、無脊椎動物より見出された糖鎖構造はほ乳類の糖鎖構造とは大きく異なっているが、単離・構造決定にとどまり機能解明にまで至っていない。そこでこれら無脊椎動物由来の糖鎖構造と生物機能に興味を持ち、化学合成を行うことで機能解明を目指している。今回、数種類の海綿とホヤより見出された糖鎖の化学合成及び機能探索を行った。Amphimedon由来の糖脂質が2種全合成出来たのは予定通りだが、Agelas由来の糖脂質の合成が思ったほど進行できなかった。これは単糖糖脂質誘導体の量を確保するのに多くの時間が費やされたためである。次に糖鎖伸張に於けるグルコースのα選択性が問題点としてあげられるが、今回、ある程度量を確保できたことから、予備実験により、条件検討してα選択的な縮合法を見いだせると考えている。糖化学天然物化学本年度は引き続き、残りの糖脂質合成を行い、さらにSpheciospongia vespariaから見出されたガラクトフラノース構造を持つ五糖の合成に取りかかる予定である。フラノースの合成はこれまでに当講座では行ったことがなく、ピラノースの誘導体合成や、縮合と安定性などの問題で困難が予想されるが、新規糖脂質としてその生物機能に大変興味深くチャレンジしていく。得られた糖脂質は、様々ながん細胞を用いて細胞毒性を調べる予定である。現在、Agelas dispar由来の糖脂質合成において、単糖糖脂質受容体が不足しているため、大量に原料供給を合成している。その後、非還元末端側のグルコースやガラクトサミン誘導体の合成を行い、糖供与体とし、立体選択的にグリコシド化する条件を検討する。さらに、別のカイメンより見出された糖脂質についても合成に着手する。
海底噴出熱水のホウ素同位体化学から迫るホウ素グローバル循環の解明

海底熱水系におけるホウ素の挙動を明らかにするため,西太平洋の島弧・背弧熱水系における噴出熱水のホウ素濃度及びホウ素同位体比を明らかにした.中央海嶺熱水系に比べ,島弧・背弧熱水系のホウ素濃度及びホウ素同位体比は,多様な地質条件を反映して大きなバリエーションを示すが,基本的に反応した岩石または堆積物から溶出したホウ素の量に支配されることが示唆された.また,二相分離している熱水系であっても,噴出熱水のホウ素同位体比は主に水-岩石反応を反映している.海底熱水系におけるホウ素の挙動を明らかにするため,西太平洋の島弧・背弧熱水系における噴出熱水のホウ素濃度及びホウ素同位体比を明らかにした.中央海嶺熱水系に比べ,島弧・背弧熱水系のホウ素濃度及びホウ素同位体比は,多様な地質条件を反映して大きなバリエーションを示すが,基本的に反応した岩石または堆積物から溶出したホウ素の量に支配されることが示唆された.また,二相分離している熱水系であっても,噴出熱水のホウ素同位体比は主に水-岩石反応を反映している.本年度はまず,ホウ素同位体分析の前処理(ホウ素の化学分離)を行うための,実験室整備を行った.具体的には,クリーンルーム内のドラフトにボロンレスフィルターを装備し,ドラフト内に試料分解・乾固およびテフロンバイアル洗浄用の耐酸性ホットプレート2台を設置した.ドラフト内におけるホウ素ブランクのチェックを行った結果,ブランクは十分に低いことが確認された.熱水試料の分析は,本年度は濃度についてのみ行った.分析の前に,文献調査,既存データの整理,試料の保存状態チェックを綿密に行い,同位体分析に適していると思われる試料を各地点(水曜海山,マリアナトラフ,マヌス海盆,北フィジー海盆,沖縄トラフ)の熱水系から,ベント(噴出孔)ごとに35試料ずつ選定した.ホウ素および主要元素濃度(Na,K,Mg,Ca,Sr)については,ICP-AESで,その他の微量元素については,ICP-MSを用いて測定を行った.約20年前に採取された試料のため,経年変質していることも懸念されたが,Mg濃度が以前に測定された値と良く一致したことから,これらの試料はホウ素同位体分析に適していることが確認された.Mg濃度から計算されたホウ素濃度のエンドメンバーは,堆積物のない熱水系においては母岩の組成を反映し,玄武岩では低く(6-10ppm),安山岩では高い(17-19ppm)という結果を得た.厚い堆積物に覆われている沖縄トラフ熱水系のホウ素濃度は非常に高く(40-60pp田),堆積物からのホウ素溶出を示していると考えられる.同様の結果は,アルカリ金属元素であるLi,Rb,Csについても見られた.本年度は,熱水試料のホウ素同位体分析を行い,噴出孔ごとに熱水の端成分を推定し,ホウ素濃度とあわせて考察を行った.1)堆積物で覆われていない熱水系:マヌス海盆Vienna Woodsの噴出熱水はホウ素濃度が低く同位体比が高い(0.54 mM, 29.8‰)という中央海嶺熱水系に似た組成を示した.一方,マヌス海盆PACMANUSと伊豆小笠原弧水曜海山は,ホウ素濃度が高く同位体比が低い(1.45-1.52 mM, 13.6-18.5‰)という特徴を示した.マリアナトラフのAlice SpringとForecast ventは,これらの中間的な値(0.63-0.72 mM, 19.9-24.0‰)を示した.これらの特徴は,基本的に母岩のホウ素濃度の違いによると考えられる.2)二相分離している熱水系:海底下での二相分離により気相に富んでいる北フィジー海盆の噴出熱水は,中央海嶺熱水系と似た組成(0.44-0.56 mM, 34.5-35.9‰)を示した.二相分離におけるホウ素同位体分別は非常に小さいことを考えると,この組成は水ー岩石反応を反映していると考えられ,熱水がMORB的な岩石と反応したことを示している.3)堆積物に覆われた熱水系:沖縄トラフの噴出熱水は,非常に高いホウ素濃度と低い同位体比(4.4-5.9 mM, 1.5-2.6‰)を示し,高いCs/B比を持つ.このことは,熱水が岩石だけでなく堆積物とも反応し,多量のホウ素が堆積物から熱水に溶出したことを意味する.全ての噴出熱水のホウ素同位体比は濃度の逆数に比例し,基本的に反応した岩石または堆積物から溶出したホウ素の量に支配される.本研究は,島弧・背弧熱水系のホウ素濃度及び同位体比を体系的に明らかにし,水ー岩石反応におけるホウ素の挙動及びホウ素循環における噴出熱水の寄与に関して,重要な知見をもたらした.試料の保存状態が良いことが確認され,ホウ素を含む各元素の濃度測定から,今後のホウ素同位体分析に適している試料を選定することが出来た.24年度が最終年度であるため、記入しない。引き続き実験環境の整備を行い,ホウ素同位体分析のための前処理ラインを立ち上げる.また,高知コアセンターの表面電離型質量分析計を用いて熱水試料のホウ素同位体を測定し,得られた成果を論文にまとめる.24年度が最終年度であるため、記入しない。
痛み情報伝達におけるATP受容体群の役割に関する神経薬理学的研究

イオンチャンネル型ATP受容体サブクラスP2X3が侵害刺激を伝える後根神経節(DRG)ニューロンC線維の侵害受容器に限局して発現していることが明らかにされ、「ATPと痛み」の関係が注目されてきた。痛み伝達の機能はP2X3とP2X2のヘテロポリマーにより担われているとの指摘もあるが詳細についてはほとんど未検討であったので、我々はまずラットグリオーマ由来細胞C6BU-1あるいはヒト腎臓上皮細胞由来HEK293にP2X3およびP2X2のcDNAを強制発現させた系を用いて、細胞内カルシウム濃度([Ca]i)および電気生理学的指標により痛みの情報伝達におけるATP受容体群の生理機能に関する基礎研究を行った。その結果、ATP刺激により、P2X2発現系では比較的な大きな特続的な内向き電流が引き起こされ、P2X3発現系では比較的小さく急速に減少する内向き電流が引き起こされた。P2X3およびP2X2同時発現系では、ATP刺激により両者の中間に位置する性質を持った内向き電流が引き起こされた。濃度依存性の検討ではP2X3発現系ではATPの高濃度(>30uM)から作用が認められたが、P2X3発現系ではより低濃度(>1uM)から作用が認められた。P2X3およびP2X2同時発現系での用量作用曲線はそれぞれ単独とは明らかに異なり、両者のほぼ中間に位置した。Caイメージでは、P2X2発現系では、ATPによりかなり大きな[Ca]i上昇が認められ、αβ-メチレンATPには全く反応しなかった。一方P2X3発現系では、[Ca]I上昇は非常に小さいかあるいはほとんど認められなかったが、αβ-メチレンATPには一度だけ大きな反応を示した。P2X3およびP2X2同時発現系では、ATP刺激により安定した大きな[Ca]I上昇が認められ、さらにαβ-メチレンATPに対する反応性も獲得した。このように、P2X3およびP2X2同時発現系はそれぞれの単独発現系とは明らかに異なる性質を示し、おそらくヘテロな発現系として機能していることが推察された。ヘテロになることにより[Ca]i上昇は有利となり、おそらく生理的意義もこの点にあるのではと考えられる。そこで今年度は、実際DRGでの反応と比較検討し、痛み情報伝達におけるATP受容体群の性質を明らかにすることを試みた。その結果、DRGには形態的に大、中、小の神経細胞があり、電気生理学的指標によれば、知覚神経毒カプサイシンに感受性を示すのは中核および小型細胞であり、それぞれの細胞でATP誘発電流の性質を調べたところ、中型細胞ではP2X2+3のヘテロ発現系に、小型細胞ではP2X3モノ発現系に近似した性質を得た。mRNAのin situ hybridizationの結果もこれと良く一致し、小型細胞ではP2X3のみが、中型細胞ではP2X2とP2X3のmRNAが発現していた。大型細胞ではこれらの発現はなかった。以上、生体ではATP受容体P2X2およびP2X3が知覚発生・伝達に重要な役割を果たしていることが明らかになった。

その結果、DRGには形態的に大、中、小の神経細胞があり、電気生理学的指標によれば、知覚神経毒カプサイシンに感受性を示すのは中核および小型細胞であり、それぞれの細胞でATP誘発電流の性質を調べたところ、中型細胞ではP2X2+3のヘテロ発現系に、小型細胞ではP2X3モノ発現系に近似した性質を得た。mRNAのin situ hybridizationの結果もこれと良く一致し、小型細胞ではP2X3のみが、中型細胞ではP2X2とP2X3のmRNAが発現していた。大型細胞ではこれらの発現はなかった。以上、生体ではATP受容体P2X2およびP2X3が知覚発生・伝達に重要な役割を果たしていることが明らかになった。新たにクローニングされたイオンチャネル型ATP受容体サブクラスP_<2×3>が侵害刺激を伝える後根神経節ニューロンC線維および侵害受容器に限局して発現していて,これが既知のP_<2×2>とヘテロポリメリゼーションにより実際には機能している可能性が示唆され,「ATPと痛み」の関係が注目されてきた。しかし詳細についてはほとんど未知のままである。我々はまずラットグリオーマ由来細胞C6BU-1あるいはヒト腎臓上皮細胞由来HEK293にP_<2×3>およびP_<2×2>のcDNAを強制発現させた系を用いて,痛みの情報伝達におけるATP受容体群の生理機能に関する基礎研究を行った。その結果,次のような成果を得た。(1)ATP受容体P_<2×3>およびP_<2×2>のcDNA,あるいはそれぞれ単独に導入し受容体を発現させる系(リポフェクトアミン法)を確立した。受容体発現効率は約20数%程度であり,発現した細胞としない細胞との識別がその後の生理反応を確認するために重要であるが,これを非侵襲的に行う手法をも確立した(CD8抗体ビーズ認識法)。(2)上記系を用いた電気生理学的研究:P_<2×2>発現系では,ATP刺激により比較的大きな持続的な内向き電流が引き起こされた。一方P_<2×3>発現系では,ATP刺激により比較的小さく急速に減少する内向き電流が引き起こされ,また同一標本での2回目のATP刺激での反応は極端に低下した。P_<2×3>およびP_<2×2>同時発現系では,ATP刺激により両者の中間に位置する性質を持った内向き電流が引き起こされた。(3)上記系を用いたCaイメージング:同標本において、細胞内カルシウム濃度([Ca]i)を指標に各受容体の機能を検討した。P_<2×2>発現系では,ATP刺激によりかなり大きな[Ca]i上昇が認められた。一方P_<2×3>発現系では,[Ca]i上昇は非常に小さいかあるいはほとんど認められなかった。P_<2×3>およびP_<2×2>同時発現系では,ATP刺激により両者の中間に位置する性質を持った[Ca]i上昇が認められた。以上の成績から,P_<2×3>単独発現系ではATP刺激に対する反応が小さくまた脱感作が顕著であり,実際の知覚神経ではやはりP_<2×2>とのヘテロマ-として機能している可能性が強く示唆された。今後[Ca]i上昇の意義を含めてより詳細に検討を進める。
マグネシウム系薄膜による表示デバイス開発のための基礎研究

本研究では,原子間に水素を取り込むMgZn2合金及び水素化時に吸熱反応を示すFeに注目し,Mg-Zn及びMg-Fe薄膜を作製し,特性の検討を行った。その結果,原子間に水素を取り込む金属又は合金は,Mgを水素化及び脱水素化する触媒として,機能しないと考えられた。一方,水素化時に吸熱反応を示す材料は,Mgを水素化するための触媒として作用すると考えられた。次に,酸化還元特性を有する金属フタロシアニンであるMgフタロシアニン(MgPc)に注目し,その薄膜の作製及び特性の検討を行った。その結果,Mg系薄膜と組み合わせることにより,新規のエレクトロクロミックデバイスを作製できる可能性があることが分かった。Mgを室温にて水素化するためには,Mgより低エネルギーにて水素化する材料が膜内部に必要である。一方,Mg系水素吸蔵合金には,水素と結合する物と原子間に水素が入り込む物とがある。Mg-NiやMg-Cuは,水素と結合する水素吸蔵合金である。そこで,原子間に水素を取り込むMg-Znの薄膜の検討を行った。その結果,様々な条件にてMg-Zn薄膜を作製したが,全く調光ミラー特性を示さなかった。このことから,原子間に水素が入り込むMg系水素吸蔵合金には,Mgを水素化する触媒として機能しないことが分かった。また,Mg系水素吸蔵合金は,水素を取り込ませるとMgが発熱するのに対し,NiやCuは吸熱し,TiやV,希土類金属は発熱する。これらが調光ミラー特性とどの様に関係するかを調べるため,現在はMg-Feに関して,検討を行っている。反射型クロミック特性(調光ミラー特性)を示す材料の中でも,Mg系薄膜は,水素化すると最も高い可視光透過率を有することから,本研究室では,Mg系薄膜に注目し,検討を行ってきた。その結果,薄膜内部の水素吸蔵合金として知られるMg2NiやMg2Cuが,Mgを室温にて水素化又は脱水素化するための触媒として作用することを明らかにしている。しかし,水素吸蔵合金であるMgZn2合金の検討を行った結果,Mg-Zn薄膜において調光ミラー特性を得ることができなかった。これは,水素と結合しない合金は,触媒として機能しないことを示唆していると考えられた。そこで本研究では,Mgを水素化,脱水素化するための触媒となる添加材料を探索するため,水素化時の添加材料の吸熱・排熱に注目し,Niと同様に,水素化時に吸熱反応を示すFeを添加材料として用い,Mg-Fe薄膜の検討を行った。その結果,Mg-Fe薄膜は,水素化時に,約400nmより短波長側にて,透過率が上昇する傾向を示し,可視光透過率が,最大で約20%を示した。このことから,FeはMgを水素化するための触媒として作用していると考えられた。従って,水素化時に吸熱反応を示す材料は, Mgを水素化するための触媒として作用すると考えられる結果を得られた。一方,Mg系薄膜/Pd超薄膜/有機材料薄膜の構造の新規の調光ミラーエレクトロクロミックデバイス作製のため,水素原子やイオンを貯蔵することが可能な有機材料薄膜を作製する準備を行った。具体的には,るつぼ型真空蒸着装置の整備及び有機材料の選定,選定した有機材料の特性調査を行った。本研究では,Mg系調光ミラーデバイスを表示素子として応用するための基礎研究を行うことを目的としている。これを実現するために,平成23年度は,既存のMg系薄膜の特性の検討及び,Mg系薄膜を用いた表示デバイスのために,Mgに組み合わせる新規材料の検討,探索を行うことを計画していた。そこで,Mg系薄膜の上に水素分離層として堆積しているPd超薄膜に注目し,希釈水素ガス雰囲気中におけるMg-Ni薄膜の透過率及びスイッチング特性についての検討を行った。その結果,Pd膜厚が5nmの場合,希釈水素ガス雰囲気の圧力,2.0kgf/cm2にて,最も透過率が高くなるとともに,10秒程度の短時間にて透過率が変化していることが分かった。これらのことから,希釈水素ガス雰囲気においてMg系薄膜の調光ミラー特性を向上させるためには,水素分離層として,Pdをより機能させるために,Pd膜厚を十分に調整する必要があることが分かった。次に,Mg-Ni薄膜の上にPd超薄膜を堆積させたデバイスの複数回水素化及び脱水素化を行い,可視光を反射する状態と透過する状態の特性についての検討を行った。