hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
Er,Cr:YSGGレーザーを用いた窩洞形成と接着性の改善による歯冠修復法の確立

Er,Cr:YSGGレーザーを用いた歯の切削は、微小水蒸気爆発により歯面が粉砕されて生じることを確認した。レーザー切削象牙質面には熱変性層が生成されるが、熱変性層はリン酸処理後に次亜塩素酸ナトリウム処理を行った場合に除去された。レーザー切削面にリン酸処理あるいはリン酸と次亜塩素酸ナトリウムの併用による前処理を行うと2ステップセルフエッチシステム(歯質接着システム)の単独処理より接着強さが向上した。近年開発されたEr,Cr:YSGGレーザーは、エナメル質および象牙質を効率的に切削することが可能であるが、切削メカニズムが明らかでなく非接触であるが故に回転切削と比べて窩洞形成のコントロールが非常に難しい。そこで、まずハイスピードカメラ(動き解析マイクロスコープ・キーエンス社)を用いてEr, Cr:YSGGレーザーによるヒト歯エナメル質および象牙質の切削を撮影し、モニタリングにより切削メカニズムの分析を試みた。レーザー切削では適度な比率のウォータースプレーが必要であるが、撮影時にウォータースプレーによる水滴がレンズ表面に付着したため、明瞭な画像を得るのは非常に困難であった。そこで、できるだけウォータースプレー中の水の配合率を低く抑えた(4.0W/60%Air/40%Water)結果、比較的明瞭な画像(50倍)が得られた。撮影した画像をモニタリング(フレームレート:250)により分析した結果、ウォータースプレーとともにレーザー光が照射された歯面が白く光った瞬間に水が周囲に拡散したことが判明した。したがって、このモニタリング分析は、ウォータースプレーとともにEr,Cr:YSGGレーザーが照射されるとエナメル質では小柱間、象牙質では基質内で微小水蒸気爆発が生じて破壊・切削が生じるという報告(Maziar M,Lasers Med Sci,2009)を一部支持する結果となった。今後、照射面の微細形態を観察してエナメル質および象牙質におけるどの部分が破壊されるのか、詳細に検討していく予定である。SEM観察の結果、窩洞形成直後のエナメル質切削面にはエナメル小柱が露出された像と一部にエナメル小柱が溶融したような像が認められた。また象牙質切削面ではスミヤー層がなく、開口した象牙細管が認められた。37%リン酸処理(30秒間)後のエナメル質切削面は鱗片状エナメル小柱と微細な凹凸を呈し、象牙質切削面では象牙細管がロート状に開口していた。37%リン酸処理(30秒間)後に10%NaClO処理(90秒間)を行ったエナメル質切削面はリン酸処理後と類似しており、象牙質は残存した管周象牙質が突出しているような像がみられた。セルフエッチングプライマー処理(20秒間)後のエナメル質は微細な凹凸を呈し、象牙質はわずかに突出したような管周象牙質がみられた。アザン染色によりEr,Cr:YSGGレーザー切削面には熱変性層の存在が確認された。この熱変性層はリン酸処理およびセルフエッチングプライマー処理では除去されなかったが、リン酸処理後に10%NaClO処理を行った場合に除去された。ヒト抜去大臼歯の頬・舌側面に平坦なエナメル質面あるいは象牙質面を形成し、それらの平坦面表層をWaterlase MD Turbo hand pieceを用いて一層削除した。2ステップセルフエッチシステム(メガボンド)を用いて3種類の処理法(メガボンドのみ応用:M群、リン酸エッチング後メガボンド応用:EM群、リン酸エッチング後さらに次亜塩素酸ナトリウム溶液処理後メガボンド応用:ENM群)で切削面の接着処理を行った。ネガティブコントロールとしてレーザー切削面にメガボンド・ボンドのみ応用したもの(NC群)、ポジティブコントロールとして耐水研磨紙で形成した平坦面にメガボンドを応用したもの(PC群)を設定した。処理面にコンポジットレジンを築盛して試料を作製した。エナメル質については剪断接着強さを、象牙質については微小引張り接着強さを測定した。その結果、エナメル質に対する接着強さの平均値は、M群:20.8MPa、EM群:25.8MPa、ENM群:23.1MPa、NC群:17.3MPaならびにPC群:18.3MPaであった。また、象牙質に対する接着強さの平均値は、M群:21.8MPa、EM群:40.7MPa、ENM群:39.0MPa、NC群:22.0MPaならびにPC群:52.7MPaであった。一方、ヒト抜去大臼歯の頬・舌側面にWaterlase MD Turbo hand pieceを用いて椀型窩洞を形成し、前述と同じ3種類の処理法で窩洞面の接着処理を行ってからコンポジットレジンを充填して試料を作製した。また、前述と同様のコントロール試料も作製した。試料にサーマルサイクルストレスを負荷した後、色素を用いて窩壁不適合度を測定した。

その結果、窩壁不適合度の平均値は、M群:15.7%、EM群:7.1%、ENM群:5.8%、NC群:81.6%ならびにPC群:1.4%であった。SEM観察によりレーザー切削歯面の微細構造を明らかにできたが、TEM観察による超微細構造の解明に関してはまだ手つかずの状態である。また、EPMAによる切削面の歯質構成元素の分析を実施できなかった。さらに、熱変性層の詳細な組織化学的分析ならびに除去方法に関しても十分な検討がなされなかった。24年度が最終年度であるため、記入しない。レーザー切削面のTEM観察、EPMA分析に関しては、やはり専門技師の指導を受けることが必要である。今後、学内あるいは学外の専門技師の指導を仰ぎ、的確な研究成果を出すように努力したい。また、本研究計画に対する研究人員の不足を感じているため、今後の研究推進のために大学院生の研究協力を得る予定である。
虚血性脳障害におけるα_2アゴニストとリドカインの併用効果に関する研究

背景:α2アドレナリン受容体作動薬(α2アゴニスト)は、脳虚血に伴う脳内エピネフリン濃度の上昇を抑制し、また、局所麻酔薬のリドカインはフリーラジカルの産生の抑制や興奮性アミノ酸などの遊離抑制によって脳保護効果を示すとされている。今研究では、ラットの一過性前脳虚血モデルを用いて、デキサメデトメジンとリドカインの併用投与による脳保護効果を検討した。方法:ハロタン麻酔、調節呼吸下の雄SDラットを用いて、尾動脈(血圧測定、採血用)、右頸静脈(脱血用)にカテーテルを留置し、頭皮に脳波電極、側頭筋に体温プローブを挿入した。ラットを1:対照群(生食1ml/kg)、2:デキサメデトメジン群(3μg/kg)、3:リドカイン群(10mg/kg)、4:デキサメデトメジン+リドカイン群(デキサメデトメジン3μg/kg、リドカイン10mg/kg)の各群(n=8)に分け、薬物を脳虚血30分前と、再灌流後3、24、48時間後に皮下投与した。前脳虚血は脱血と総頚動脈の閉塞により作製し平坦脳波により確認した。脳虚血を10分間維持後、再灌流をおこなった。1)麻酔から覚醒し、神経学的検査を、再灌流後24時間、48時間、7日後におこない、7日後に脳を灌流固定してHE染色を用いて組織学的評価を、海馬、大脳皮質、線状体で行った。2)マイクロダイアリーシスのプローブを海馬に挿入し、虚血前後のノルエピネフリン、グルタミン酸の濃度を測定した。結果:生食投与ラットに比べ、デキサメデトメジンとリドカインの併用投与ラットでは24、48時間後の神経学的所見の欠落が少なく、CA1領域での虚血細胞数の割合が少なかった。しかし、併用投与群と単独投与群で差はなかった。脳虚血時のグルタミン酸の産生は上昇したが併用投与による減少はみられず、ノルエピネフリンの濃度も併用投与による差はなかった。結論:一過性前脳虚血に対するデキサメデトメジンとリドカインの併用投与は、単独投与に比べて神経学的欠落が少ないが、虚血細胞数の割合に変化なく、その機序としてはグルタミン酸やエピネフリン濃度の関与は低いことが示唆された。今研究では、ラットの一過性前脳虚血モデルを用いて、α2アゴニストであるデキサメデトメジンとリドカインの併用投与による脳保護効果を神経学的、組織学的に検討した。

方法:ハロタン麻酔、調節呼吸下の雄SDラットを用いて、尾動脈(血圧測定、採血用)右頸静脈(脱血用)にカテーテルを留置し、頭皮に脳波電極、側頭筋に体温プローブを挿入した。ラットを1:対照群(生食1ml/kg)、2:デキサメデトメジン群(3μg/kg)、3:リドカイン群(10mg/kg)、4:デキサメデトメジン+リドカイン群(デキサメデトメジン3μg/kg、リドカイン10mg/kg)の各群(n=8)に分け、薬物を脳虚血30分前と、再灌流後3、24、48時間後に皮下投与した。前脳虚血は脱血と総頚動脈の閉塞により作製し平坦脳波により確認した。脳虚血を10分間維持後、再灌流をおこなった。麻酔から覚醒し、神経学的検査を、再灌流後24時間、48時間、7日後におこない、7日後に脳を灌流固定してHE染色を用いて組織学的評価を、海馬、大脳皮質、線状体で行った。結果:神経学的評価では、対照群に比べ、デキサメデトメジン群、リドカイン群、デキサメデトメジン+リドカイン群で改善傾向が見られた。組織学的評価でも同様に、デキサメデトメジン+リドカイン群で虚血細胞の減少が見られた。背景:α2アドレナリン受容体作動薬(α2アゴニスト)は、脳虚血に伴う脳内エピネフリン濃度の上昇を抑制し、また、局所麻酔薬のリドカインはフリーラジカルの産生の抑制や興奮性アミノ酸などの遊離抑制によって脳保護効果を示すとされている。今研究では、ラットの一過性前脳虚血モデルを用いて、α2アゴニストであるデキサメデトメジンとリドカインの併用投与による脳保護効果を神経学的、組織学的に検討した。方法:ハロタン麻酔、調節呼吸下の雄SDラットを用いて、尾動脈(血圧測定、採血用)、右頸静脈(脱血用)にカテーテルを留置し、頭皮に脳波電極、側頭筋に体温プローブを挿入した。1)麻酔から覚醒し、神経学的検査を、再灌流後24時間、48時間、7日後におこない、7日後に脳を灌流固定してHE染色を用いて組織学的評価を、海馬、大脳皮質、線状体で行った。2)マイクロダイアリーシスのプローブを海馬に挿入し、虚血前後のノルエピネフリン、グルタミン酸の濃度を測定した。結果:生食投与ラットに比べ、デキサメデトメジンとリドカインの併用投与ラットでは24、48時間後の神経学的所見の欠落が少なく、CA1領域での虚血細胞数が少なかった。しかし、併用投与群と単独投与群で差はなかった。海馬中のノルエピネフリンの濃度は虚血時には上昇したが、薬物投与による差はなかった。グルタミン酸の濃度も同様に虚血時には上昇した。
脊椎動物の頭部形成に関わる新規Dvl結合因子DBPの機能解析

ハエやヒトに至るまで種間を超えて個体発生に重要な役割を果たすWntシグナル伝達経路の新規制御因子DBPを単離し、その機能解析を行った。その結果、この因子がWntシグナル伝達経路の細胞内因子Dvlに結合し、Wnt/β-catenin経路を負に制御することを明らかにした。また、ヒトにおいて19種類存在する細胞外分泌因子Wntのうち、Wnt5aが受容体に競合的に結合することでWnt/β-catenin経路を抑制する新たな分子機構を明らかにした。Wntシグナル伝達経路は、線虫、ショウジョウバエのような無脊椎動物から、マウス・ヒトまで種間を超えて高度に保存されたシグナル伝達経路である。細胞外分泌因子Wntはその受容体Fz(Frizzled)に結合し、Fzを通して細胞内の3つの経路(βカテニン経路、平面内細胞極性(PCP)経路、Ca経路)へと伝えられて行く。そのうちβカテニン経路とPCP経路では、Fzからのシグナルが細胞内因子Dishevelled(Dvl)へと伝えられる。そして、Dvlを境に、細胞の増殖と分化を制御するβカテニン経路と、細胞骨格の制御を介して細胞運動と細胞極性の決定へと導くPCP経路に分岐する。しかし、Dvlがこれら2つのシグナル伝達経路を如何にして制御して、その下流へと伝えているのかに関しては依然として不明な点が多い。そこで本研究では、DvlをbaitとしたYeast two hybrid screeningを行い、脊椎動物では全くの新規Dvl結合因子Dishevelled Binding Protein(DBP)を単離した。本年度の成果は以下の通りである。(1) DBPポリクローナル抗体の作製大腸菌のタンパク発現系を用いて、グルタチオンSトランスフェラーゼ(GST)融合マウスDBP(mDBP)タンパクを大量に調整・精製を行い、精製mDBPタンパクを抗原としてウサギに免疫しDBP特異的なポリクローナル抗体を作製した。(2) DBP特異的siRNAの設計DBP特異的なsiRNAを5種類設計・合成し、上記のDBP抗体を用いて、マウス繊維芽細胞株(NIH3T3)での内在性DBPを高効率にノックダウンできるsiRNAを選別した。現在、NIH3T3細胞において内在性DBPをノックダウンした状況下でのβカテニン経路とPCP経路に対する影響を解析している。そのうちβカテニン経路とPCP経路では、Fzからのシグナルが細胞内因子Dishevelled (Dvl)へと伝えられる。そこで本研究では、DvlをbaitとしたYeast two hybrid screeningを行い、脊椎動物では全くの新規Dvl結合因子Dishevelled Binding Protein (DBP)を単離した。【DBP特異的siRNAを用いたノックダウンによるWnt/βカテニン経路に対する効果】DBPを特異的に且つ高効率にノックダウン出来るsiRNAをヒトにおいて3種類、マウスにおいて2種類設計した。HeLaS3(ヒト子宮頸癌由来細胞)とNIH3T3(マウス繊維芽細胞)においては、Wnt3a刺激後のWnt/βカテニン経路の直接の標的遺伝子Axin2の発現が半定量的RT-PCRによって容易に検出できる。この系を用いて、DBPノックダウン条件下でのWnt3a刺激依存性のAxin2の発現上昇を解析した。その結果、DBPをノックダウンしてもAxin2の発現に影響は見られなかった。ツメガエル胚でのDBPの発現領域は頭部神経領域に集中しているため、今後は神経組織由来の細胞株を用いて同様の実験を行う予定である。
陽電子消滅法と3次元アトムプローブ法の併用によるナノクラスター形成機構の解明

本研究は、陽電子消滅法と3次元アトムプローブ(3DAP)法を組み合わせることによって、従来の手法では不明であった、材料中のナノクラスターの形成機構、空孔-溶質複合体の形成、その移動によるクラスター形成過程を解明することが目的である。今年度(最終年度)は、昨年度までに明らかにされた、Fe-Cu,Al-Ag,Al-Zn2元系合金中に生成する溶質ナノクラスターの電子構造やクラスター中の溶質濃度、空孔-溶質複合体形成等の情報をもとに、より一般的にナノクラスター形成の相安定性について議論した。我々が発見した、陽電子の埋め込みナノクラスターへの量子閉じ込め(陽電子親和性捕獲)現象を利用し、陽電子消滅2次元角相関(2D-ACAR)測定によって明らかにされた、ナノクラスターのフェルミ面のトポロジーを第一原理計算と比較した。その結果、パイエルス歪みや合金のヒューム・ロザリー則と同様の考察によって、ナノクラスター中の溶質濃度を決定する法則があることが示唆された。すなわち、格子歪みの影響が小さい微小のクラスターに対しては、ブリリュアン・ゾーンでのバンドギャップ効果がなるべく有効になるように価電子数(e/a)(言い換えるとフェルミ球の半径)が決まることがわかった。一方、従来3DAPでも検出が困難なサブナノクラスターの数密度を、陽電子消滅法を用いて定量的に評価する方法を見いだした。陽電子寿命-運動量相関測定法により陽電子のクラスターへの捕獲率を評価し、低速陽電子ビームを用いて陽電子の拡散定数の測定を行い、陽電子のクラスターの検出感度も評価し、両者を用いて数密度評価が行えることを示した。これらの成果から、陽電子と3DAPを組み合わせた埋め込みナノクラスターの新しい解析法が確立したといえる。本研究は、陽電子消滅法と3次元アトムプロープ(3DAP)法を組み合わせることによって、従来の手法では不明であった、材料中のナノクラスターの形成機構、特に、空孔-溶質複合体の形成、その移動によるクラスター形成過程を解明することが目的である。今年度は、Al合金、特にAl(-Li)-Cu-Mg-Ag合金中に熱時効によって生ずる溶質原子クラスターの形成過程を調べた。Al-Cu合金にMgとAgを微量添加すると、母相の{111}面にΩ相が形成され、2元系合金に比べて強度が著しく上昇する。このΩ相形成の初期にはAg-Mg原子の複合クラスターが形成され、これがΩ相の核生成と密接に関わっている。一方、Al-Li-Cu合金にMgとAgを微量に添加した場合にも、Ω相に類似のT_1相が{111}面に均一に析出するが、Mg-Ag複合クラスターは形成しない。この違いの原因を、陽電子消滅同時計数ドップラー広がり(CDB)と3DAP測定により、以下のように明らかにした。CDB測定の結果、わずか15sの時効で、Al-Cu-Mg-Ag合金では陽電子のAg電子との消滅が検出された。これはAg原子に隣接した空孔が陽電子を捕獲していることを示しているが、3DAP観察ではAgとMgの複合クラスターが観察されており、焼き入れ直後から存在するMg-空孔対が、15sの時効によりAgを捉えて、Mg-Ag-Vクラスターを形成し、それにより凍結空孔をトラップした状態にあることを示唆している。一方、Al-Li-Cu-Mg-Ag合金では陽電子寿命が4元合金よりも著しく短く、十分に空孔が凍結されないことを示唆している。焼き入れ後も15s時効後も主たる溶質原子であるCuに対応するピークのみが見られたが、Agのピークが現れない。

これはLi添加によりAg-Mg-Vクラスターの形成が抑制され、空孔がトラップされにくくなったと解釈される。空孔は5at.%のLiと結合することによりMg-Ag-Vクラスターの生成を抑制し、Liの拡散を担う過程で急速にシンクで消滅するものと解釈される。なお、試料作成には、三協エンジニヤリング製放電加工機を用いた。本研究は、陽電子消滅法と3次元アトムプローブ(3DAP)法を組み合わせることによって、従来の手法では不明であった、材料中のナノクラスターの形成機構、特に、空孔-溶質複合体の形成、その移動によるクラスター形成過程を解明することが目的である。今年度は、Al-Ag2元系合金中に生成する溶質ナノクラスターの電子構造、さらにクラスター中の溶質濃度を主として陽電子消滅法により明らかにした。試料は、単結晶Al-2.0at%AgおよびAl-6.2at%Zn合金を用いた。焼き入れ後に適当な熱時効を行い、マトリックスAlにコヒーレントなAgナノクラスターを作製した。陽電子は合金試料中のAgナノクラスターに捕獲(陽電子親和性捕獲)されることが、同時計数ドップラー広がり測定によってわかった。そこで、陽電子消滅2次元角相関(2D-ACAR)測定を行い、クラスターの電子構造(フェルミ面)を明らかにした。Al-Ag合金(すなわちAgナノクラスター)の2D-ACARは、純Agとは全く異なる異方性を示した。Al原子の混入によって純Agの場合よりもFermi球が大きくなり、FCC構造の第一ブリリュウアンゾーンのL点付近のネックの寸法が大きくなるだけでなく、X点にもネックが生じたと解釈できた。これは、AgナノクラスターにはマトリックスのAl原子が25%程度混入していることに対応する。ナノクラスターの数密度を定量評価するためには、陽電子の析出物に対する感度を知る必要がある。そこで、今年度は、低速陽電子ビームを用いて陽電子の拡散定数の測定も行った(この測定のため、低速陽電子ビーム高温測定用試料チェンバ、ターボポンプを購入した)。Feに対する陽電子の拡散定数の温度依存性を調べたところ、高温ほど拡散定数が大きくなることがわかった。これはFe中の不純物散乱による効果が大きいことを示唆している。本研究は、陽電子消滅法と3次元アトムプローブ(3DAP)法を組み合わせることによって、従来の手法では不明であった、材料中のナノクラスターの形成機構、空孔-溶質複合体の形成、その移動によるクラスター形成過程を解明することが目的である。今年度(最終年度)は、昨年度までに明らかにされた、Fe-Cu, Al-Ag, Al-Zn2元系合金中に生成する溶質ナノクラスターの電子構造やクラスター中の溶質濃度、空孔-溶質複合体形成等の情報をもとに、より一般的にナノクラスター形成の相安定性について議論した。我々が発見した、陽電子の埋め込みナノクラスターへの量子閉じ込め(陽電子親和性捕獲)現象を利用し、陽電子消滅2次元角相関(2D-ACAR)測定によって明らかにされた、ナノクラスターのフェルミ面のトポロジーを第一原理計算と比較した。その結果、パイエルス歪みや合金のヒューム・ロザリー則と同様の考察によって、ナノクラスター中の溶質濃度を決定する法則があることが示唆された。すなわち、格子歪みの影響が小さい微小のクラスターに対しては、ブリリュアン・ゾーンでのバンドギャップ効果がなるべく有効になるように価電子数(e/a) (言い換えるとフェルミ球の半径)が決まることがわかった。
エキシマランプを用いた有機非線形光学結晶の微細加工と素子の試作

有機分子性非線形光学結晶は高機能な光学特性を有する反面、機械加工を施しにくいという欠点があり、デバイス化を進める上で大きな障害となっている。このため新開発のXeおよびArエキシマランプを用いて、光エッチング技術の開発を行った。LAP、LHBFのα面に金属マスクをおき、エッチングを行った。LAPでは、エッチング後の経時変化がみられた。蒸発しにくく吸湿性があるリン酸成分が表面に残留し、空気中の水分ととに凝集していくためである。LHBFは、無機部分の蒸気圧が高いために凝集は起らなかった。Arエキシマランプの場合にも生じないことがわかった。MNA、m-NA、MBANP、MNBA、ABP、DAN結晶の劈開面に金属のメッシュ状のマスクをかけて同様にエッチング行った。172nm光でも、126nm光でもMBAMPでは照射された部分が非常に平坦であった。それ以外の結晶は内部構造を反映したすじ状のパターンが観察された。エキシマランプによるエッチングは光子が結合を直接切断する量子過程と、活性化された雰囲気ガスの介在する化学反応過程が混在している。Arエキシマランプの光子エネルギーは、これらの結晶のほとんどの化学結合よりもはるかに高いので、このすじ状パターンは光子が直接作用しているのではなく化学反応的過程であると思われる。雰囲気ガス種、圧力等の条件を整え、量子的過程を有効に用いればよりスムーズなエッチング面を得ることが出来る。
希土類錯体の電子状態や結合に関与するf-電子の役割りの理論的解明

本研究課題では、希土類錯体の電子状態や結合様式における4f電子の果たす役割を理論的に解明する事を目的とし、ab initio分子軌道法による理論計算を用いて諸問題に取り組んでいる。一連のランタニド三塩化物LnCl_3に対する理論計算により、f軌道への電子のつまり方に関して、これまでのs,p,d軌道のみを含む分子系の常識とは反した興味深い現象が見いだしてきた。7つのf軌道には電子はフント則に従って1つずつ詰まっていくが、7つのf軌道のすべてに電子が一つずつ詰まった後、8つ目の電子からは軌道エネルギーの高いf軌道から順に詰まっていく。本年度は錯体中の4f軌道の擬縮退の状態を解明し、それに基づいて上記の現象の理論的な解明に成功した。さらに、計算に際して配位子の基底関数におけるd分極関数の効果を確認し、その必要性を示唆した。加えて現在、ランタニド二核錯体Ln_2F_6の計算を行い、2組のf軌道の相互作用によるf軌道の分裂の様子や、それによってf軌道が結合へ参加する可能性、さらにf軌道が外部の分子に及ぼす化学的な影響の理論的解明を試みている。一方で、近年、O_h対称の構造をもつ6フッ化アニオンが安定に存在することが予測されていることに着目し、希土類多価負イオンLnF_6^<n->(n=2,3)の存在を理論的に検討している。まず、すべての希土類元素に対してLnF_6^<n->はOh対称の安定な分子構造を持ち、電子構造はLn=Gdではn=3、それ以外ではn=2で最安定であることを確認した。次いで、解離反応LnF_6^<n->→LnF_5^<(n-1)>+F^-の反応障壁、反応熱を求めて、LnF_6^<n->の安定性を考察した。一般には多価負イオンは解離に際してクーロンエネルギーの放出による発熱をともなう準安定分子であることが知られており、n=3の場合にはその反応障壁は10kcal/mol程度である。一方n=2の場合には、原系が生成系より安定に存在することを明らかにした。
代謝型グルタミン酸受容体のG蛋白質活性化に関わる構造変化解析

本研究では、代謝型グルタミン酸受容体(mGluR)の活性化に伴う構造変化を明らかにし、そこで得られる結果を、mGluRとは一次構造の類似性のないウシロドプシンを含むGPCRグループでの豊富な知見と比較し、単なる一次構造の比較では解らない活性化メカニズムの共通点を見いだすことを目的とする。本年度は研究計画に基づき、mGluRのG蛋白質相互作用部位である細胞質領域の構造変化をもたらす膜貫通領域の動きを解析するため、この領域に種々の変異を施し、構造変化に関わる知見を収集した。(1)これまでの研究から、ヘリックス2と4の細胞質側の相対的な距離の変化がG蛋白質の活性化にとって重要であることを見いだしている。そこで、これらのヘリックスについて網羅的に変異を施し、活性化に重要な残基を探索した。その結果、ヘリックス2において変異により刺激非依存的活性化能が上昇する残基(構成的活性化変異部位)を同定した。これまでにヘリックス2の細胞質側に同様の変異部位を同定しているが、これら2つの部位はαヘリックス1ターン分離れて同じ側に並んでいると考えられ、この2つの残基が受容体を不活性状態に保つのに重要な働きを担うと考えられた。(2)mGluRを含むGPCRグループの一員であるCa^<2+>受容体において、点突然変異により体内のCa^<2+>濃度の調整が異常になる疾患が知られている。そこで、これらの変異に相当する残基をmGluRにおいて変異させ活性化に対し影響がでるものを探索した。その結果、変異を施した22カ所のうち1カ所が構成的活性化変異部位であることを見いだした。この結果から、膜貫通領域の活性状態・不活性状態のシフトにおいてこの残基が重要な働きを担うと考えられた。本年度は研究計画に基づき、mGluRのG蛋白質活性化に関わる細胞質領域に種々の変異を施し、構造変化に関わる知見を収集した。(1)これまでの研究から、mGluRのヘリックス4の細胞質側に、変異により刺激非依存的活性化能が上昇する残基(構成的活性化変異)を同定している。そこで、膜貫通ヘリックスの細胞質側2カ所(ヘリックス4ともう一カ所)にシステインを導入した変異体を作製し、酸化剤存在時にアゴニスト依存的・非依存的なG蛋白質の活性化能に影響がでるものを探索した。その結果、ヘリックス2と4の細胞質側にシステインを導入した変異体において、酸化剤処理後にアゴニスト依存的活性化能が低下することを見いだした。これは、ジスルフィド結合形成により構造変化が阻害されたためであると考えられた。(2)(1)の探索過程で細胞質側に網羅的にシステイン残基の導入を行ったが、その際にヘリックス2と細胞質第1ループとの境界付近に、新たな構成的活性化変異部位を見いだした。構成的活性化変異体では活性化状態を模倣していると考えられるため、この残基はmGluRが活性化状態を形成する際にキーになるアミノ酸といえる。
粥状硬化の進展におけるＨＤＬ機能不全の役割に関する統合的研究

目的:高比重リポ蛋白コレステロール(HDL)はコレステロール引抜きに加え多彩な抗動脈硬化作用を有するも、慢性炎症や糖尿病などの病態下では「機能不全HDL」となる。本研究では簡便かつ再現性をもってHDL機能を包括的に評価できる方法を確立するとともに、臨床応用にむけ心血管リスク層別化における有用性を検討した。結果:1) HDL機能を修飾するミエロペルオキシダーゼおよびパラオキソナーゼ1の血清中での比率は冠動脈疾患のリスク層別化に有用であった。2)放射性同位元素や細胞を用いずにHDLのコレステロール取り込み能を評価する測定系を確立し、冠動脈疾患の層別化に有用であることを明らかにした。脂質異常症、高血圧、糖尿病、喫煙などの動脈硬化危険因子は、高比重リポ蛋白(High density lipoprotein, HDL)の機能異常をもたらすことが報告されている。HDL機能不全の病態解明と、HDL増加療法および動脈硬化の進展防止・退縮における新規の治療標的を明らかにすべく下記の検討を行った。1)冠動脈疾患リスクを有する患者において高純度イコサペント酸エチル(EPA)製剤がHDL機能に及ぼす影響について検討した。EPA製剤を1800mg/日・4週間内服投与したところ、血清のみならずHDL中のEPA/アラキドン酸比が増加した。一方、HDLの抗炎症作用ならびにコレステロール引き抜き能もEPA製剤投与前に比べ、投与後では増強を認めた。以上よりEPAがHDL機能を改善する可能性が示唆された。2)コレステリルエステル転送蛋白(CETP)阻害薬は血中HDL-コレステロール(HDL-C)を増加させるにもかかわらず、冠動脈疾患リスクを減弱したとの報告はない。CETP阻害薬がHDL機能に及ぼす影響について検討した。高脂血症および動脈硬化症を自然発症するWHHLウサギにCETP阻害薬であるトルセトラピブ60mg/日を7日間投与したところ、HDL-Cは増加した。一方、対照群である正常日本白色種ウサギに比してWHHLウサギではHDLの抗炎症作用ならびにコレステロール引き抜き能が低下していたが、トルセトラピブはWHHLウサギのHDL機能に影響は及ぼさなかった。以上よりトルセトラピブはHDL-Cを増加させるものの、HDL機能の改善作用は有さないことが示唆された。高比重リポ蛋白(High density lipoprotein, HDL)機能不全が動脈硬化の進展防止・退縮における新たな治療標的となりうるか明らかにすべく、本年度は下記の検討を行った。【背景】ミエロペルオキシダーゼ(MPO)はHDLの主要リポ蛋白であるApoA-1を酸化修飾し、HDLのコレステロール引き抜き能を減弱させる。他方、パラオキソナーゼ1(PON1)はApoA-Iと結合しHDL自体の酸化を抑制する。近年、HDL上でMPOはPON1を酸化し、その活性を低下させるとともに、PON1がMPOによるリポ蛋白の酸化修飾を抑制し、両者のバランスがHDL機能に重要な役割を担っていることが示唆されている。我々はこれまでに、血中におけるMPO/PON1比がHDLのコレステロール引き抜き能や抗炎症作用を反映することを報告した。しかしながら、MPO/PON1比が冠動脈疾患の新たな予測因子として有用であるかは不明であった。血清MPO/PON1比が経皮的冠動脈形成術(PCI)後の冠動脈病変の再発を予測することができるか検討を行った。【方法・結果】PCI施行後のフォローアップ冠動脈造影検査目的に入院された患者を対象に血清MPO/PON1比を測定し、再治療が必要な再狭窄もしくは新規病変の発生を一次エンドポイントとして観察を行った。MPO/PON1比高値群と低値群に分け、カプランマイヤー曲線を作成して検定したところ、MPO/PON1比高値群は低値群と比較して、イベントが有意に多く発生した。さらに年齢、性別、高血圧症、糖尿病、脂質異常症、喫煙を含む多重COX比例ハザード解析の結果、高MPO/PON1比は再PCIの独立した予測因子であった。【結論】高MPO/PON1比はPCI後の冠動脈病変再発と独立した関連を認め、冠動脈疾患の二次予防に有用なマーカーであることが明らかとなった。以前の検討にて血清MPO/PON1比が高値な場合、HDLの抗動脈硬化作用が減弱していたことより、HDL機能不全が動脈硬化性疾患に対する新たな治療標的となりうることが示唆された。高比重リポ蛋白(HDL)粒子は多彩な動脈硬化抑制作用を持ち、これまではHDLの量的指標として血漿HDLコレステロール(HDL-C)濃度が用いられてきた。しかし、最近の介入試験ではHDL-C上昇薬の心血管イベント抑制効果は証明されず、HDLの機能、とくにコレステロール引抜き能と動脈硬化との関係が重要視されている。従来のコレステロール引抜きの測定には、放射性標識コレステロールを培養マクロファージに取り込ませ、HDLの代用としてポリエチレングリコールによるアポB除去血清に引き抜かれたコレステロールを測定するため、簡便性や再現性で多くの問題があった。我々は、放射性同位元素や培養細胞を用いずに、血清中のHDL粒子に蛍光標識コレステロールを直接取込ませ、プレートに固相化したアポA-I抗体でHDLを捕捉した後のHDLの蛍光強度を「HDL特異的コレステロール取込み能」として測定する新規の測定系を開発した。健常人の血清を用いて検討すると、新規のコレステロール取込み能は、細胞を用いた従来のコレステロール引き抜き能と強い相関を認めた。

そこで、スタチンを中心とした薬物療法により血清LDL-C濃度が100mg/dL未満に管理されている125人の冠動脈疾患患者のコレステロール取込み能を測定したところ、冠危険因子の集積に伴ってコレステロール取込み能が低下していた。また、カテーテル治療後に再治療を必要とした患者では、必要としなかった患者に比べて取込み能が低下していた(p<0.05)。多変量解析では取込み能は再治療の規定因子であった。以上より、コレステロール取込み能はHDLの機能を反映しており、内服治療によりLDL-C濃度が適切に管理されている冠動脈疾患患者において残余リスクとなることが示唆された。目的:高比重リポ蛋白コレステロール(HDL)はコレステロール引抜きに加え多彩な抗動脈硬化作用を有するも、慢性炎症や糖尿病などの病態下では「機能不全HDL」となる。本研究では簡便かつ再現性をもってHDL機能を包括的に評価できる方法を確立するとともに、臨床応用にむけ心血管リスク層別化における有用性を検討した。結果:1) HDL機能を修飾するミエロペルオキシダーゼおよびパラオキソナーゼ1の血清中での比率は冠動脈疾患のリスク層別化に有用であった。2)放射性同位元素や細胞を用いずにHDLのコレステロール取り込み能を評価する測定系を確立し、冠動脈疾患の層別化に有用であることを明らかにした。HDLの質的変化と動脈硬化性疾患との関連について前向きに検討するという目的に対し、一定の成果を上げることができた。循環器内科学引き続きプロテオーム・メタボローム解析を含めたHDLの質的評価を行い、質的異常HDLと動脈硬化症との関連について次世代Optical coherence tomography (OCT)やVirtual histology-intravascularultrasound (VH-IVUS)などの最新画像診断を用いて検討する。またHDLの代謝酵素である血管内皮リパーゼ(EL)のヒト血清におけるmass/活性とHDLの機能や冠動脈硬化との関連についても検討を行う。H25年度の研究計画に挙げていたHDL機能に対する薬物治療効果の検討について一定の成果を上げることができた。引き続きプロテオーム・メタボローム解析を含めたHDLの質的評価を行い、質的異常HDLと動脈硬化症との関連について次世代Optical coherence tomography (OCT)やVirtual histology-intravascular ultrasound (VH-IVUS)などの最新画像診断を用いて検討する。
グローバル性労働と人身取引の狭間にあるもの：聞き取りとネットワークの分析から

本研究は、この課題に関する学術的議論と人道的政策の進展に貢献するために、理論および実証研究をもってグローバル性取引の実態を把握することを目的とする、複数の国にまたがる研究である。調査としては、1性取引に携り「脱法/不法就労者」とされた人々および人身取引対策等によって「被害者」とされた人々への聞き取り、2二次資料と関係者への聞き取りによる背景調査、3当事者と性風俗産業をつなぐ仲介者あるいは人身取引トラフィッカーの接触を中心としたネットワーク調査・分析を実施する。2018年度は、科研費交付から約4か月の期間に、上記調査についての準備を行った。具体的には、まず国内研究者の間で会合を持ち、仕事の分担、予算配分、連絡方法等の事務的な打ち合わせをし、内容に関する議論、情報交換、調査方法や実施のめどなど研究実施計画を練った。次に、分担者と海外協力者の間で、必要に応じて代表者も加わり、スカイプ会議で国内同様の打ち合わせを行った。タイには代表者が出張し対面の会合ももった。また、代表者は、リサーチアシスタントを雇用するための面接と試験的な共同作業を行った。詳細は「現在までの進捗状況」に記載する。なお、この準備の過程で、中国に関する性取引研究専門家研究者が、香港の協力者から台湾の研究者に変更になった。予算については、期間が短かったため85%を翌年度に繰り越した。2018年度中の約4か月間を研究開始のための準備期間とし、代表・分担・協力研究者間で打ち合わせを行った。国内分担者に関しては、先行研究ほか参考文献、方法論に関する文献等の共有も視野に、グローバル性取引における各国の現況、これに関する学術的・政策的動向について議論し、かつ、各自の研究経験にもとづく調査の困難の予測、海外協力者の準備体制や人となりをふまえ、あらためて実施計画を練った。とくにオランダから、研究が当事者に危害をもたらさないか、メリットがあるといえるかの疑義が呈された。全体にとって重要な論点であり、引き続き、実際にアクセスを模索しながら議論を深める。タイについては、代表者が現地に赴いて協力者およびアシスタントと会合をもち、具体的にどの団体に接触して当事者へのアクセスを図るかを計画した。中国をめぐる調査に関しては、予定していた香港の協力者の参加が叶わなくなったため、代わって、台湾国立中山大学の社会学者で大陸中国と台湾間の移動性労働に詳しい陳美華と神戸で面会し、協力者となってもらった。イギリスについては、年度内に計画していたネットワーク分析方法・方法論を中心とするワークショップを、2019年度初頭に持ち越すことを決めた。その打ち合わせの過程で、代表的海外協力者であるケンブリッジ大学犯罪学研究所のPaolo Campanaに加えて、エセックス大学社会学部移住研究センターおよび同センターに所属する移住性労働研究者のIsabel Crowhurstと、サセックス大学移住研究センターおよび同センター所長で、すでにタイの協力者とジェンダー化された移住にかんする研究協力の経験があるPaul Stathamが協力者として加わることになった。フィリピンについては協力者の都合で打ち合わせが必要最低限にとどまっているが、今のところ支障はない。2019年度のゴールデンウイーク中にUKワークショップを実施する。ワークショップはPaolo Campanaによるネットワーク分析方法・方法論の講義及び実技が中心となるが、新しく協力者に加わったエセックス大学社会学部移住研究センター、サセックス大学移住研究センターでもそれぞれワークショップを行い、移住性労働・人身取引についての研究報告・情報交換のほか、実証調査についての打ち合わせを行う。2018年度の日本での顔合わせが国内代表者・分担者のものにとどまったため、このUKワークショップは、代表者・分担者・協力者のほとんどが初めて顔を合わせる機会となる。したがって、学術的・内容的な議論のほかにも、実際的作業の打ち合わせ通じて共同研究を行うためのティームワークづくりの機会として重要である。その後は、方法論のすり合わせ、当事者へのアクセスの確保、当事者に対する危害の回避、ネットワーク分析にかかるソースの開拓、先行研究ほか文献資料の収集を進め、順次着手する。いつ誰が誰とどこでどのようなアクセスを計るか、関係する予算管理等の事務など、すべての作業は各国担当の代表者、分担者・協力者がそれぞれの国で担当することになるが、必要に応じてスカイプなどで遠隔打ち合わせを行い、本研究が実質的に国際共同実証研究としての総体をもつものとなるよう配慮を怠らない。全体の会合として、進捗報告会と現地視察をふくむワークショップを2019年9月末に予定している。その準備は、5月以降に代表者とアシスタントが進める。

また、代表者は、リサーチアシスタントを雇用するための面接と試験的な共同作業を行った。詳細は「現在までの進捗状況」に記載する。なお、この準備の過程で、中国に関する性取引研究専門家研究者が、香港の協力者から台湾の研究者に変更になった。予算については、期間が短かったため85%を翌年度に繰り越した。2018年度中の約4か月間を研究開始のための準備期間とし、代表・分担・協力研究者間で打ち合わせを行った。国内分担者に関しては、先行研究ほか参考文献、方法論に関する文献等の共有も視野に、グローバル性取引における各国の現況、これに関する学術的・政策的動向について議論し、かつ、各自の研究経験にもとづく調査の困難の予測、海外協力者の準備体制や人となりをふまえ、あらためて実施計画を練った。とくにオランダから、研究が当事者に危害をもたらさないか、メリットがあるといえるかの疑義が呈された。全体にとって重要な論点であり、引き続き、実際にアクセスを模索しながら議論を深める。タイについては、代表者が現地に赴いて協力者およびアシスタントと会合をもち、具体的にどの団体に接触して当事者へのアクセスを図るかを計画した。中国をめぐる調査に関しては、予定していた香港の協力者の参加が叶わなくなったため、代わって、台湾国立中山大学の社会学者で大陸中国と台湾間の移動性労働に詳しい陳美華と神戸で面会し、協力者となってもらった。イギリスについては、年度内に計画していたネットワーク分析方法・方法論を中心とするワークショップを、2019年度初頭に持ち越すことを決めた。その打ち合わせの過程で、代表的海外協力者であるケンブリッジ大学犯罪学研究所のPaolo Campanaに加えて、エセックス大学社会学部移住研究センターおよび同センターに所属する移住性労働研究者のIsabel Crowhurstと、サセックス大学移住研究センターおよび同センター所長で、すでにタイの協力者とジェンダー化された移住にかんする研究協力の経験があるPaul Stathamが協力者として加わることになった。フィリピンについては協力者の都合で打ち合わせが必要最低限にとどまっているが、今のところ支障はない。2019年度のゴールデンウイーク中にUKワークショップを実施する。ワークショップはPaolo Campanaによるネットワーク分析方法・方法論の講義及び実技が中心となるが、新しく協力者に加わったエセックス大学社会学部移住研究センター、サセックス大学移住研究センターでもそれぞれワークショップを行い、移住性労働・人身取引についての研究報告・情報交換のほか、実証調査についての打ち合わせを行う。2018年度の日本での顔合わせが国内代表者・分担者のものにとどまったため、このUKワークショップは、代表者・分担者・協力者のほとんどが初めて顔を合わせる機会となる。したがって、学術的・内容的な議論のほかにも、実際的作業の打ち合わせ通じて共同研究を行うためのティームワークづくりの機会として重要である。
植物根におけるカドミウム付着性物質の構造と機能

カドミウムを含む水耕液で栽培したタチスベリヒユの粉砕調製物ではカドミウムはほとんどが沈殿画分に存在した。この沈殿をペクチナーゼで処理することでカドミウムを可溶化した。この可溶性画分に含まれるカドミウム結合性物質を各種クロマトグラフィーで単離・精製した。この際に、新たに開発したソフト金属キレーター分析法を適用した。精製した物質はNMR測定からその構造を酸性多糖と決定した。Cdに特異的に結合する物質を探索するために、ポストラベル剤としての合成ポルフィリン、5,10,15,20-tetrapheny1-21H,23Hporphinetetrasulfonic acid(以下TPPS)の適用を図った。すなわち、TPPSは410nmに吸収極大を有するが、これがCdと錯体を形成することで吸収極大が460nmにシフトすることを利用したものである。これにより、従来のCu(1)との親和性を程度を指標として分析を行っていたのに対して、本法はCd(II)との親和性を指標とするために、Cd(II)親和性物質探索における確度が上昇するものと考えられる。上記と平行して、植物中のCd結合物質の分析を行った。検出はCu(I)-bathocuproinesulfonate錯体の脱消光を用いた。また、Cdはチオール基と高親和性を示すが、チオール基は空気中の酸素で酸化されてジチオールになりやすい。このために、試料の還元について検討した。酸化型のグルタチオンをモデル化合物として、種々の還元剤を検討し、水素化ホウ素ナトリウムが最適であることを突き止めた。Cd存在下で栽培したコマツナの分析に上記方法を適用した。試料を凍結粉砕し、還元剤(100 mM NaBH4)存在下、弱アルカリ性溶液(50 mM NaHCO3)で抽出後、2% TFAで1.5倍に希釈して酸性にして分析を行った。Cdストレスでコントロールサンプルに対して増加するピークを確認し、構造解析を行っている。ソフト金属に特異的なキレーター分析法を開発し、タチスベリヒユでのCd応答解析に用いた。根の可溶性画分の分析で、Cdストレスにより増加したピーク成分を検出し、これを分取した。最も蛍光強度の強かったピークは自家蛍光を持り蛍光物質であり、キレーターであるとはいえなかった。この化合物は、^1H-NMRの結果からベンゼン環を含む化合物であるが構造決定にまでは至っていない。植物における蛍光物質として細胞壁のフェルラ酸などが知られており、Cdストレスにより細胞壁がリグニン化してこれらの成分が増加し、それを検出した可能性もある。一方、不溶性画分に関しては、ペクチナーゼ処理により遊離してくるCd結合物質の構造を解析した。分析で検出した、未知のキレーターのピーク成分を分取し、^1H-NMR、^13C-NMRの2-D NMRにより構造解析した。その結果、^1H-NMRで4.18、4.46、5.08ppm、^13C NMRで6872、78、100ppmにシグナルが現われ、これらは糖に由来するものと考えられた。特に^1H NMRで5.08ppm、^3C-NMRで100ppmに現われたシグナルは糖の1位のCに由来するピークである可能性が高く、Cd結合物質が糖類であることを強く支持していた。さらにこの^1H NMRで5.08ppmに現われたピークについて^13C NMRとの相関を測定すると、170ppmのシグナルが観測され、にカルボキシル基と同定され、糖にカルボキシル基の配位した糖酸であると考えられた。また、DOSYスペクトルにより、これらの糖酸に由来すると思われるピークは、拡散速度が遅い。これはこの糖が低分子ではなく、連なった糖鎖として存在していることを示唆していた。以上から、Cdは細胞壁のポリガラクツロン酸などの糖酸に結合して存在していることが推定された。タチスベリヒユでは、厳しい環境ストレス下に適応するために、細胞内部へのCdの侵入を妨げるために細胞壁への吸着機構を働かせていることが推定された。
上皮管腔組織形成におけるＭｏｂの役割とその破綻

上皮管腔組織の形成・維持には、液性因子起因シグナル経路と細胞接触起因シグナル経路による細胞増殖、細胞死、幹細胞動員、未分化性維持、極性等複数の事象制御が大切である。近年新たな細胞接触起因シグナルとしてHippo経路が報告された。しかしながら哺乳類Hippo経路各分子には相同分子が極めて多く、どの上皮管腔組織の形成・維持局面にどのHippo経路分子が最も大切であるかの解明が急務である。またHippo経路遺伝子欠損マウスの多くは胎生早期致死であり、各Hippo経路分子の上皮管腔組織形成における役割やその破綻病態の多くが未だ不明であった。本研究ではこのHippo経路の中でも、癌において蛋白質発現低下や遺伝子変異を高頻度にみ、機能が未だ不明なMob1による上皮管腔組織制御機構やその破綻疾患を解析することをその目的とする。平成24年度には、Mob1全身ホモ欠損マウスが胎生致死となること、全身部分欠損マウスに皮膚外毛根鞘がんなどが発症することを見いだし、Journal of Clinical Investigationに報告した。平成25年度には、(1)子宮内膜特異的Mob1ホモ欠損マウスでは、内膜上皮の過形成と腺管形成の抑制をみて不妊となること、(2)肝胆管細胞特異的Mob1ホモ欠損マウスでは胆管の過形成と未分化性亢進をみ、早期に胆管がんや肝がんを発症すること、(3)肺気管支上皮特異的Mob1ホモ欠損マウスでは肺胞・気管支上皮の過形成をみるものの、ヘミデスモゾーム構造が傷害されるために、細胞間接触は弱くなり、気管支上皮には内腔側への剥離がみられることなどを見いだしている。本研究は今後、上皮管腔組織の形成・維持機構の解明に、管腔組織上皮由来悪性腫瘍の治療標的解明につながり、作製したマウスは疾患モデルマウスとなり治療開発に必須なツールとなる。25年度が最終年度であるため、記入しない。(a)Mob1A/Mob1B全身欠損マウスの機能解析:Mob1A、Mob1B欠損マウスにはそれぞれ表現形がみられないものの、Mob1A/Mob1B全身ダブル完全欠損マウスは胎生致死となること、部分欠損マウスは、皮膚外毛根鞘がん・骨肉腫・肝がん・乳がん・唾液腺がんなどがみられることを発見し、報告した。(b)毛嚢・肺胞細気管支・胆管におけるMob1A/Mob1Bの機能解析:皮膚特異的にMob1A/Mob1Bを欠損したマウスは、毛髪周期に異常があること、皮膚上皮のなかでも管腔組織の1つである毛嚢の増殖が特に顕著であること、多くのマウスが離乳前後に致死となることなどを報告した。さらにヒト皮膚外毛根鞘がんにおいて、高頻度にMOB1の発現抑制、YAP1の発現亢進をみることを報告した。また肺胞細気管支・肝胆管特異的にMob1A/Mob1Bを欠損したマウスは、ダブルホモ欠損マウス作製するところまで完了し、準備実験から、肝胆管特異的にMob1A/Mob1Bをホモ欠損したマウスは、胆管の過形成や肝・胆管がんをみることを見出している。項目2:Mob1A/1Bダブルホモ欠損組織にみられる、上皮管腔組織形成に関わる細胞生物学的・生化学的変化:上皮管腔組織の形成・維持には、細胞増殖、細胞死、接触抑制、組織幹細胞分化、Apico-

basal極性制御、平面極性制御、上皮間葉転換等の事象が複層的に潜んでいることが明らかになってきたことから、皮膚特異的Mob1A/1Bダブルホモ欠損組織を用いてこれらの事象変化を検討したところ、細胞増殖亢進、細胞死抵抗性、細胞接触抑制障害、未分化性亢進、中心体数増加、毛髪異常などをみることを報告した。予定通りに研究が進み、平成24年度にはインパクトの高いJournal of Clinical Investigationに研究成果を報告することができた。また、読売新聞・朝日新聞などで新聞報道もされ、広く国民に成果の報告ができたことから、概ね順調に進展しているといえよう。(1)各種上皮管腔組織特異的Mob1A/1Bダブルホモ欠損マウスにおける上皮管腔組織形成障害とその破たんによる疾患の有無:平成25年度には、(a)肺気管支、(b)肝胆管、(c)子宮内膜、(d)乳腺、(e)唾液腺等の各組織特異的にMob1A/1Bをダブルホモ欠損するマウスを作製・解析し、これら組織の管腔形成におけるMOB1A/1Bの機能やその破綻病態を解明する。(2)各組織特異的Mob1A/1Bダブルホモ欠損組織にみられる、上皮管腔組織形成に関わる細胞生物学的・生化学的変化:平成25年度には、上記(a)肺気管支、(b)肝胆管、(c)子宮内膜、(d)乳腺、(e)唾液腺等の各組織特異的における、細胞増殖、細胞死、接触抑制、組織幹細胞分化、Apico-basal極性制御、平面極性制御、上皮間葉転換等の事象の有無を検討する。25年度が最終年度であるため、記入しない。
糖鎖機能の統合的理解を目指した糖鎖改変マウスのＮ－統合グライコプロテオーム解析

糖転移酵素が標的とする糖タンパク質を同定することは、糖鎖機能を理解する上で重要である。本研究では、糖転移酵素遺伝子のノックアウトマウスを用いて、糖転移酵素に特異的な標的タンパク質群の大規模同定を行うことを目標とした。糖鎖キャリア分子をグライコプロテオミクス技術(IGOT-LC/MS法)で同定して、野生型マウスとノックアウトマウスとの比較解析を行った結果、その候補キャリアタンパク質を多数同定することが出来た。このように標的タンパク質の分子性状に共通した特徴および傾向が明らかになることで、特定のタンパク質に対して特異的な糖鎖構造が選択的に付加されるメカニズムの解明が進むと期待される。糖転移酵素遺伝子に欠失や突然変異を生じたモデル生物は、多様な生理機能の異常を呈する。種々の糖転移酵素の標的タンパク質を同定することは、生体内における糖鎖の機能を理解する上で重要な鍵となる。本課題では、各糖転移酵素に特異的な標的タンパク質の大規模同定を行うために、これまでに作製した糖転移酵素の遺伝子ノックアウトマウス群を用い、糖鎖キャリア分子(糖ペプチド)をレクチン捕集し、N-結合型糖ペプチドを糖鎖付加位置特異的な安定同位体標識法(IGOT法)で標識し、LC/MSショットガン法で同定する事により、野生型マウスとノックアウトマウスとの比較グライコプロテオーム解析を行っている。昨年度までに、野生型及びB4galt1遺伝子欠損マウスの肝臓よりβ1,4-ガラクトース末端をもつ糖ペプチドをRCA120カラムで捕集し、そのキャリアタンパク質を1000分子種以上同定した。同定されたタンパク質のバイオインフォマティクス解析を実施した結果、β4GalT1標的タンパク質の分子性状に共通した特徴および傾向が見出された。今年度までに、LacdiNAc合成酵素やルイスx合成酵素等の遺伝子ノックアウトマウス・細胞株でも同様の解析が出来るように系の構築を進め、それらを用いて解析を行った結果、それぞれの糖鎖のキャリア分子である糖タンパク質群を同定している。その他、糖鎖遺伝子ノックアウトマウス・細胞株を必要に応じて作製し、同様の解析が出来るように系の構築を進めており、順次解析していく予定である。糖転移酵素遺伝子に欠失を生じたモデル生物は、多様な生理機能の異常を呈す。種々の糖転移酵素の標的タンパク質を同定することは、生体内の糖鎖機能を理解する上で重要な鍵となる。β4GalT1は最も解析が進んだ糖転移酵素ではあるが、同じ糖転移活性を有する複数のβ4GalTアイソザイムが存在しており、β4GalT1が生体内でどのように使い分けられているのかは不明であった。そこでまずは、野生型及びB4galt1(-/-)マウス肝臓よりβ1,4-ガラクトース末端をもつ糖ペプチドをRCA120カラムで捕集し、そのキャリアタンパク質を同定した。同定された全1176タンパク質のうち、181タンパク質が野生型マウス試料からのみ同定された。この結果は、B4galt1(-/-)マウスにおいて、これら181タンパク質には目的糖鎖構造(Galβ1-4GlcNAc)が形成されないことを示唆している。即ち、これらのタンパク質はβ4GalT1標的タンパク質であることが推定された。現在、他の糖転移酵素、例えばLacdiNAc合成酵素やルイスx合成酵素等の遺伝子ノックアウトマウスでも同様の解析が出来るように系の構築を進めており、順次解析していく予定である。本課題では、各糖転移酵素に特異的な標的タンパク質の大規模同定を行うために、糖転移酵素の遺伝子ノックアウト(KO)マウス群を用い、糖鎖キャリア分子(糖ペプチド)をレクチン捕集して、野生型マウスとKOマウスとの比較グライコプロテオーム解析を行った。昨年度までに、野生型及びB4galt1(-/-)マウス肝臓より、そのキャリアタンパク質を1000分子種以上同定し、標的分子の分子性状に共通した特徴・傾向を見出した。今年度はLewis x構造(Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc-R)を合成する、α1,3-フコース転移酵素9(Fut9)に着目し、KOマウスを用いた解析を行った。Fut9(-/-)