hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
多時間スケールダイナミクスによるメタルール生成とそれに基づく学習、進化の理論

4.適応:外界に応答して順応するという2つの時間スケールを持つ結合力学系を調べ、自由度間の干渉による大自由度特有の適応を見出した。生命システムが自らの発展を規定する規則を生成させていく過程の理論研究を進めた。主要な結果は以下のとおりである。1.入出力関係の学習、記憶と自発活動:記憶=アトラクターという描像にかわって、記憶の想起は入力に応じて、要請された出力が生じるように神経力学系の分岐が生じることであり、学習によってそのような分岐を起こす力学系が形成されるという描像の確立を進めた。従来の神経回路網モデルを拡張して、入力で適当な出力を持つアトラクターへと分岐するようなデザインを構築し、その解析を行った。また、アンチヘブ的なシナプス変化による学習則を提示して、入出力関係を分岐として学習していくことが可能であることを示した。さらに、入力がない時には、記憶に対応した出力を経巡るようなカオス的自発的神経活動が一般的に生成されることを確認した。これは近年の実験とも対応しうるので、今後その比較も行いたい。2.進化と発生をつなぐ関係の定式化:環境が変動する際には、それに適応するための可塑性が必要である。遺伝子発現(発生過程)のノイズが適度な大きさを持つと、ロバストネスと可塑性の両立が可能であることを示した。3.多時間スケールダイナミクスとしての適応現象の理論:速い応答を示し、遅く緩和する力学系としての適応現象をもとにして、これがWeber則(入力の比のみで決まる応答をする)をみたす条件、さらに大自由度力学系での集団としての適応を明らかにした。4.振動を示す力学系がサドルノード分岐を相互作用により起こす場合、結果として状態が分化することを明らかにし、これにより安定した細胞分化が生じるしくみを力学系、ネットワークの両面から明らかにし、実験との対応を議論した。力学系を拡張して、生命システムの自律的発展の理論を開拓した。1.入出力関係の学習、記憶と自発活動:昨年度までに、力学系のフローの変化(分岐)として記憶をとらえる描像を展開した。今年度は昨年度までに導入した学習モデルに相関のある入出力マップを逐次的に繰り返し学習させた。するとその相関の応じて入力をカテゴリー化させることが自発的に生じた。この時、カテゴリーは相空間内の階層的構造として記述され、入力が強くなるに従い、細かいカテゴリーの分別が生じることが示された。一方で時間的にみたときに、まず大雑把なカテゴリーに対応するアトラクターに漸近、ついで、細かく分かれたアトラクターへと分類されることが示された。これは我々が認知する過程と対応している。さらに入力がないときは、このようなカテゴリー構造を内包する自発神経活動が生ずることを示した。また、分岐としての記憶スキームが積分ー発火型ニューロンモデルにおいても「分岐による記憶描像」がうまく働くことを示して、ノイズに対する安定性を明らかにした。2.速い変数の集団カオスによる遅い変数のカオス的遍歴:多数の速い変数と1つの遅い変数が結合した力学系において、見出した状態遷移が、速い変数を消去して得られる、遅い変数の運動をあらわすブランチ間の遷移で表現されることを明らかにした。
日本の教育改革を実現するためのネオ・アースシステム教育の開発・実践研究

日本に総合的な理科教育を普及するために、アースシステム教育を進化させて、日本の文脈に適した総合的な理科教育「ネオ・アースシステム教育」の構築の基礎的研究を行い、そのカリキュラム開発や教材開発、そして教育実践を行い、その教育的効果について研究を行った。詳細は以下の通りである。1.代表者1名、分担者3名、研究協力者(小中高等学校の教師(6名)、教育センターの指導主事(2名)、博物館学芸員(2名))などで構成される研究会を組織し、ネオ・アースシステム教育を開発するための基礎的研究を進めた。ネオ・アースシステム教育の開発・研究の進め方を討議するために研究会を3回開いた。2.防災教育をを事例としたネオ・アースシステム教育のカリキュラムを開発した3.日本における持続可能な開発のための教育の紹介として「環境教育指導資料」を翻訳した。4.日本の教育に役立つアースシステム教育の英文テキストを翻訳した。5.アースシステム教育の理念を拡張・改善した防災教育用のアースシステム教育の理念を構築し、「小学校の防災教育」を執筆し、その成果を学会で発表した。6.持続可能な開発の教育を推進する教師教育に関する国際会議に参加し、この2年間で開発してきた教材や副読本を紹介、普及した。7.アースシステム教育の理念を日本の文脈に適するように、拡張することによって、科学を中心にすえた総合的な学習を展開できるような新しい理念「ネオ・アースシステム教育」の基盤を開発した。そして、その理念を基にカリキュラム開発や教師教育を教育センターなどで行った。特に、探究的な理科教育、持続可能な開発のための教育、防災教育のカリキュラムと教師教育プログラムの開発とその実践を行い、この研究成果を国内(日本地学教育学会)、海外の学会(National Science Teachers Association)などで発表・普及した。本研究の今年度の研究実績は以下の通りである。1.アースシステム教育の開発者Victor J.Mayer氏と連絡を取り、アースシステム教育と持続可能な開発のための教育の目的を含むネオ・アースシステム教育の理念やその教育のための教材・教具の開発について議論を深めた。そしてネオ・アースシステム教育のために開発された日本語のテキストについてレビューを受けた。2.アースシステム教育の理念を日本の文脈に適するように、拡張することによって、科学を中心にすえた総合的な学習を展開できるような新しい理念としてのネオ・アースシステム教育の可能性について研究会議を開催し議論を行った。その結果として、アースシステム教育の7つの理解目標を8つに拡張することで総合的な学習用の教材開発ができることを実証的に研究した。3.日本の教育に役立つアースシステム教育の英文テキストの一部を翻訳した。4.科学を中心とした総合的な学習や持続可能な開発のための教育「自然災害教育」の教材開発やカリキュラム開発を行った。また、そのカリキュラムを開発・実践できる教師を短期間で育成する具体的な現職教師教育プログラムを開発し、それを実践した。5.藤沢市教育文化センターで持続可能な開発のための教育としてのアースシステム教育の研究会を設定し、小学校や中学校のカリキュラム開発と教師教育プログラムの開発を行った。6.アースシステム教育の日本の事例を北米環境教育会議で研究発表を行い海外に発信した。1.日本の文脈により適したネオ・アースシステム教育用テキスト「防災教育」や教材教具の開発のための会議を3回開催した。2.日本の教育に役立つアースシステム教育の英文テキストを翻訳した。3.アースシステム教育の開発者Victor J.Mayer氏や海外の共同研究者を招聘し、開発した防災教育のためのネオ・アースシステム教育の理念や教材・教具、そしてテキストについてレビューを受けた。4.アースシステム教育の理念を拡張・改善した防災教育用のネオ・アースシステム教育の理念を構築した。5.ネオ・アースシステム教育の例として防災教育に特化した国際会議を行い、以下の成果を学会などで普及した。防災教育に関するフレームワークとガイドラインを作成した。(2)防災教育に関連する理論や理念を共有し、様々な地域で利用出来るような防災教育の概念を構築した。(3)日本のこれまでの防災教育のよい実践と世界の実践を紹介しあい共有し、それを元に今後の実践に対する示唆を与えた。(4)具体的な事例としてシステム概念に基づいたアースシステム教育の理念や実践を紹介した。(5)ACCU等で開発が進んでいる、防災教育教材をベースにしながら、教材として取り扱うべき、対象内容、普及方法についての議論を深めた。(6)防災教育に関する教育理念、能力開発、教育実践の共有、教材開発と普及方法を統合する防災教育の専門家・実践家でワークショップを行うことにより、今後、ESDで望まれる教育システムを構築し提案した。それによってDESDに対し具体的な教育システムの事例を提供出来た。

2.防災教育をを事例としたネオ・アースシステム教育のカリキュラムを開発した3.日本における持続可能な開発のための教育の紹介として「環境教育指導資料」を翻訳した。4.日本の教育に役立つアースシステム教育の英文テキストを翻訳した。5.アースシステム教育の理念を拡張・改善した防災教育用のアースシステム教育の理念を構築し、「小学校の防災教育」を執筆し、その成果を学会で発表した。6.持続可能な開発の教育を推進する教師教育に関する国際会議に参加し、この2年間で開発してきた教材や副読本を紹介、普及した。7.アースシステム教育の理念を日本の文脈に適するように、拡張することによって、科学を中心にすえた総合的な学習を展開できるような新しい理念「ネオ・アースシステム教育」の基盤を開発した。そして、その理念を基にカリキュラム開発や教師教育を教育センターなどで行った。特に、探究的な理科教育、持続可能な開発のための教育、防災教育のカリキュラムと教師教育プログラムの開発とその実践を行い、この研究成果を国内(日本地学教育学会)、海外の学会(National Science Teachers Association)などで発表・普及した。
がん細胞の結合と脱離の機構

がん細胞の浸潤・転移における細胞間接着分子カドヘリンの関与を探るため、正常細胞株3Y1と、srcによりトランスフォ-ムしたsrc3Y1における細胞接着活性を比較した。これらの細胞をコラ-ゲンゲルの中で培養すると、3Y1は樹枝状の形態をもったコロニ-を形成し、その中で細胞は互いに接着しているが、src3Y1のコロニ-では、細胞が互いに密着せず、コロニ-周辺部において細胞が分散する傾向が観察された。src3Y1における接着性の変化が、カドヘリン発現の低下に基づくものであるかどうかを調べるために、これらの細胞にE型カドヘリンのcDNAをトランスフェクションし、この分子を過剰発現させた。これらの細胞をコラ-ゲンゲルの中で培養し、コロニ-を形成させ、細胞の脱離活性を調べると、カドヘリンの発現量がかなり増大しているにも関わらず、脱離活性には変化がなかった。すなわちsrc3Y1細胞では、カドヘリンを有効に利用できないなんらかの異常が生じていることが示唆された。つぎに、この細胞で起きている異常とは何かを探るため、カドヘリンと、これに結合しているカテニンに、チロシンリン酸化が起きていないかどうか、抗リン酸化チロシン抗体を用いて調べた。その結果、カテニンが強くリン酸化を受けていることが明らかになり、これがカドヘリンの機能に影響を与えていることが示唆された。
異種移植に関わるα-1、3-ガラクトース糖鎖の免疫分子機能解析

ブタの臓器をヒトに移植するいわゆる異種移植を臨床の場で応用する研究が急速に進展してきている.この背景には深刻な臓器提供者不足の問題が生じていることが最大の理由である.我々の研究は異種移植における最も深刻な問題である超急性拒絶反応を回避するために、ヒト血清中に存在する自然抗体が認識するブタ臓器に発現している抗原を制御する新規かつ効率的な方法を生化学的及び分子生物学的手法により確立することを目的とした.1、ヒトに存在する自然抗体により認識される糖鎖抗原の解析.ブタ血管内皮由来細胞株よりα1-3ガラクトース糖鎖抗原を有する糖脂質、糖タンパク質の構造を生化学的手法により明かにした.糖脂質の構造では中性糖脂質と酸性糖脂質合わせて数種を分離、精製し、ガスクロマトによる成分分析,質量分析計による分子イオンの測定を行い、合わせて2種のLe^xを含む新規構造を明かにした.これらの得られた数種の糖鎖構造を用いてヒトの自然抗体でどのα1-3ガラクトース糖鎖抗原が強く親和性をしめすか検討を行っている.2、α1-3ガラクトース糖鎖抗原を有する糖タンパク質の構造解析.ブタ血管内皮由来細胞株(PK-15)より膜画分を調製し、α1-3ガラクトースに親和性を持つレタチンカラムを用いて糖タンパク質の精製を試みた.その結果、120kDに分子量を持ち、α1-3ガラクトース糖鎖を有する糖タンパク質が精製された.目下この糖タンパク質の一次構造解析のために気層のアミノ酸配列決定装置を用いてその構造解析を行っている.現在得られたアミノ酸配列と今まで知られている既知の配列をデータベースで調べると報告されていない糖タンパク質であることが示唆されたので、現在その配列を再度、いくつかのペプチドに分解して再検討を行っている.3、α1-3ガラクトース糖鎖抗原の発現抑制.PK-15細胞のα1-3ガラクトース糖鎖抗原を合成するα1-3ガラクトース転移酵素のcDNAを基にいくつかのアンチセンスオリゴDNAを合成した.これをPK-15細胞と協培養すると特定のアンチセンスオリゴDNAがα1-3ガラクトース糖鎖抗原の発現を抑制することがあきらかになり、同時に効果があったアンチセンスオリゴDNAがその後のヒト血清との反応に於で処理しない、あるいは効果のないものと比較して、結合が抑嗣されることが明かになった.このことは血清に含まれる自然抗体がα1-3ガラクトース転移酵素のアンチセンスオリゴDNAにより反応が抑制されたことを示している.現在効果があった箇所を含む更に長いアンチセンスDNAを作製し,これを発現ベクターに組み込み、この細胞にトランスフエクトし、α1-3ガラクトース糖鎖抗原の発現を恒久的に抑制したクローンを作製、選択している.1から3まで現在、研究を並行して行っており、得られたを考慮して今後更に異種移植実現に向けて精力的に研究に取り組みたい.ブタの臓器をヒトに移植するいわゆる異種移植を臨床の場で応用する研究が急速に進展してきている.この背景には深刻な臓器提供者不足の問題が生じていることが最大の理由である.我々の研究は異種移植における最も深刻な問題である超急性拒絶反応を回避するために、ヒト血清中に存在する自然抗体が認識するブタ臓器に発現している抗原を制御する新規かつ効率的な方法を生化学的及び分子生物学的手法により確立することを目的とした.1、ヒトに存在する自然抗体により認識される糖鎖抗原の解析.ブタ血管内皮由来細胞株よりα1-3ガラクトース糖鎖抗原を有する糖脂質、糖タンパク質の構造を生化学的手法により明かにした.糖脂質の構造では中性糖脂質と酸性糖脂質合わせて数種を分離、精製し、ガスクロマトによる成分分析,質量分析計による分子イオンの測定を行い、合わせて2種のLe^xを含む新規構造を明かにした.これらの得られた数種の糖鎖構造を用いてヒトの自然抗体でどのα1-3ガラクトース糖鎖抗原が強く親和性をしめすか検討を行っている.2、α1-3ガラクトース糖鎖抗原を有する糖タンパク質の構造解析.ブタ血管内皮由来細胞株(PK-15)より膜画分を調製し、α1-3ガラクトースに親和性を持つレタチンカラムを用いて糖タンパク質の精製を試みた.その結果、120kDに分子量を持ち、α1-3ガラクトース糖鎖を有する糖タンパク質が精製された.目下この糖タンパク質の一次構造解析のために気層のアミノ酸配列決定装置を用いてその構造解析を行っている.現在得られたアミノ酸配列と今まで知られている既知の配列をデータベースで調べると報告されていない糖タンパク質であることが示唆されたので、現在その配列を再度、いくつかのペプチドに分解して再検討を行っている.3、α1-3ガラクトース糖鎖抗原の発現抑制.PK-15細胞のα1-3ガラクトース糖鎖抗原を合成するα1-3ガラクトース転移酵素のcDNAを基にいくつかのアンチセンスオリゴDNAを合成した.これをPK-15細胞と協培養すると特定のアンチセンスオリゴDNAがα1-3ガラクトース糖鎖抗原の発現を抑制することがあきらかになり、同時に効果があったアンチセンスオリゴDNAがその後のヒト血清との反応に於で処理しない、あるいは効果のないものと比較して、結合が抑嗣されることが明かになった.このことは血清に含まれる自然抗体がα1-3ガラクトース転移酵素のアンチセンスオリゴDNAにより反応が抑制されたことを示している.現在効果があった箇所を含む

更に長いアンチセンスDNAを作製し,これを発現ベクターに組み込み、この細胞にトランスフエクトし、α1-3ガラクトース糖鎖抗原の発現を恒久的に抑制したクローンを作製、選択している.1から3まで現在、研究を並行して行っており、得られたを考慮して今後更に異種移植実現に向けて精力的に研究に取り組みたい.
環状化合物を利用したレアメタル高選択的抽出剤の開発に関する研究

分子内に硫黄を有しており、ベンゼンで構成されている大環状化合物であるチアカリックス[n]アレーンは金属イオンと親和性が高いことが知られている。本研究ではチアカリックスアレーンを基にしたレアメタルに対する高選択性を有する抽出剤の開発を目指した。その結果、数種類のレアメタル抽出能を有する新規誘導体の合成に成功し、最近では白金に対する選択的抽出能を有する化合物も得られている。それらの結果に対して数件の論文及び特許出願し、アメリカ特許も出願中である。本年度の研究実施計画に記載した、(1)「新規チアカリックス[6]アレーン誘導体の合成」では、本年度は5種類の合成に成功した。また、(3)「新規TCAを用いた金属抽出能の検討」としては、本年度合成に成功した5種類のうち、4種類について金属抽出実験を行い、レアメタル抽出特性の検討を実施した。抽出結果としては抽出率の差があるもののほとんど、Pd、Zrに対して選択性を示し、高いものは80%程度の抽出率を示す誘導体もあった。また、(2)「新規TCAを用いた希土類金属との錯形成能の検討」としては、本年度合成に成功した5種類のうち、リン酸を修飾させた新規誘導体についてPdとの錯体形成様式の検討を行い、Pdがチアカリックスアレーンに直接配位するのではなく、硝酸イオンとPdが錯形成を行い、その複合体がチアカリックスアレーンと錯体を形成していることが実験結果より明らかとなった。しかしながら、金属との錯体結晶構造解析はまだ行われておらず、現在結晶を作成中である。今年度には様々な結晶作成ができ、構造解析の実施ができると考える。また、他の基礎的なデータである粉末X線構造解析装置、熱分解特性などについては、本年度はレアメタル抽出特性のみの実験を行っていたため実施できなかった。しかしながら、合成手法は確立されており、来年度新たに合成する新規誘導体とともに、これらの基礎的データの採取、及び錯体様式に関する研究を実施する。今年度金属錯体の構造ではなく、新規誘導体のみの構造で論文を報告した。本年度の研究実施計画に記載した、「新規チアカリックス[6]アレーン誘導体の合成」では、2種類の新規誘導体の合成に成功した。それぞれについてレアメタル抽出能の検討を行ったところ、これまで白金の抽出ができなかったが、ジフェニルフスフィンを修飾させた新規誘導体が白金に対する抽出能を新たに示した。この結果を、学会にて発表またDOWAホールディングス株式会社と共同で特許出願し、現在アメリカ合衆国へ出願書類を提出したところである。その他の新規誘導体は、数種類合成を行っているが、現段階では成功に至っていない。今後、継続して新規誘導体の合成を行っていく物とする。昨年度より継続していた、金属錯体の合成では、結晶ができるが、その形がX線結晶構造解析に不適合な大きさや形状であるものがほとんどであった。しかしながら、上記ジフェニルフスフィンを修飾させた新規誘導体の合成において、金属との錯体ではないが、中間体がシクロヘキサンを中心として、周囲に中間体6個が並び、見た目が蜂の巣状である興味深い結晶構造が得られ、他の基礎的なデータである粉末X線構造解析装置、熱分解特性などについても実施し、現在論文投稿中である。本年度は新規誘導体の合成に時間が掛かり、新規誘導体の合成は2種類しかできなかったが、そのうちの一つが白金に対する抽出特性を示し、これまで得られなかった新たな結果であり、来年度の研究に対して大きな進展であると考える。本年度の研究計画に記載した研究計画の「新規チアカリックスアレーン誘導体の合成」においては、ビリジンを導入したチアカリックス[4]アレーン新規誘導体の合成に成功した。その後、環サイズの大きいチアカリックス[6]アレーンへのピリジンの導入を試みた。しかし各種の分析により合成には成功していることが示されたが、最後の分離精製の段階で単一成分のみの単離が困難であった。現段階でも継続して精製法について検討を行っているところである。このような状況により、今年度は1種類の新規誘導体しか合成ができなかった。また、チアカリックス[6]アレーン新規誘導体が合成できた後に、まとめて金属抽出を行う予定としていたため、レアメタル抽出特性については今後の予定となっている。金属錯体の合成及び構造解析では得られたピリジンを導入したチアカリックス[4]アレーン新規誘導体について銅とパラジウムについて錯体合成を行った。銅及びパラジウムの錯体は得られ、結晶作成の準備段階として、各種溶媒への溶解性の確認を行ったところ、高沸点溶媒であるDMF、DMSO、ピリジンに対する溶解性が確認出来た。現在、それぞれの結晶を作成中であり、結晶が得られたら構造解析を実施予定である。レアメタルのリサイクルに関しては将来の産業発展に不可欠な大きな課題である。現段階の技術では不十分な点が多く、様々な所で研究がなされている。その中でも新規抽出剤の開発は最も困難な課題である。本研究課題が達成されれば産業発展及び学術的にも大きな意味があるものと考えられる。
多様なシグナル伝達を調節するアダプター分子の制御機構解明

乳がん特異的チロシンキナーゼ(Brk)は,正常乳腺組織において発現していない一方,乳がん細胞の60%以上という高頻度で発現がみられる.特にtriple negative (エストロゲン受容体・プロゲステロン受容体・HER2の3つのマーカーが確認されない)の乳がんは予後不良であるが,ヒトTNBC由来の培養細胞および腫瘍組織でBrkの発現が確認されている.ヒト乳がん培養細胞において,STAP-2とBrkの存在によりSTAT3およびSTAT5bが活性化された結果、細胞増殖が誘導されるため,それぞれのタンパク質を高純度調製し,生化学的・構造生物学的な手法により評価した.BrkおよびSTAP-2全長の組換えタンパク質を大量調製することに成功した。特にチロシンホスファターゼと共発現させることで組換えBrkを大腸菌で大量調製できるようになり、様々な変異体解析を比較的容易に行うことができるようになった。さらにSTATについても全長の組換えタンパク質を大量調製することに成功した。精製タンパク質の系を用いて、これらの活性化機構を詳細に解析できる構築することができるようになった。活性評価のひとつとして行ったwhole-cell lysateキナーゼアッセイでは、STAP-2存在下でのみBrkにより、移動度から65および70kDaと見積もられるタンパク質に対するチロシンリン酸化が亢進した。このことからSTAP-2は何らかの作用によりこれらのタンパク質に対するBrkの活性を向上させることがわかった。それは少なくとも局在変化の結果生じたものではない。またこれらのチロシンリン酸化タンパク質はその移動度からAkt、Sam68またはPaxillinであることが予想される。さらにin vitro kinase assayによりSTAT5aおよびSTAT5bに対するBrkの活性がSTAP-2により亢進することがわかった。つまりSTAP-2は直接Brkと相互作用し、活性を亢進させていると考えられる。表面プラズモン共鳴を用いた結合実験系を構築した。チロシン非リン酸化型のSTAP-2はBrkとの有意な結合がみられた。これは活性化のための機能的な複合体形成のための結合に加え、酵素と基質との間でみられる結合も含む。X線小角散乱解析から、STAP-2はチロシンリン酸化の有無によらず、部分的にunfoldな構造をとることがわかった。これはSTAP-2のドメイン間の柔軟性およびPro残基に富んだC末端側の存在によるものだと考えられる。乳がん特異的チロシンキナーゼ(Brk)は,正常乳腺組織において発現していない一方,乳がん細胞の60%以上という高頻度で発現がみられる.特にtriple negative (エストロゲン受容体・プロゲステロン受容体・HER2の3つのマーカーが確認されない)の乳がんは予後不良であるが,ヒトTNBC由来の培養細胞および腫瘍組織でBrkの発現が確認されている.ヒト乳がん培養細胞において,STAP-2とBrkの存在によりSTAT3およびSTAT5bが活性化された結果、細胞増殖が誘導されるため,それぞれのタンパク質を高純度調製し,生化学的・構造生物学的な手法により評価した.本研究の行う上で相互作用解析・複合体結晶構造解析などに必要な目的分子群を、高度に精製しなければならない。熱力学・構造学的研究のためには数ミリグラム単位での蛋白質が必要であり、多ドメインを保持する本研究の対象蛋白質群は、蛋白質調製を行う過程が一つ目の大きな関門となる。組み換えBrkの発現系として昆虫細胞Sf9を用いた。SDS-PAGE上でシングルバンドとなるまで精製を行った。結晶化スクリーニングの試行が可能であるような収量(1L培養あたりのタンパク質収量1-2 mg)で得ることに成功し、約1200条件で結晶化試行した。得られた結晶に関しては、次回の放射光ビームタイムでX線回折実験を行う。組み換えSTAP-2については精製時の収量が少なく(同50-100μg程度)、新たな発現コンストラクトを作成し高収率での精製を目指している。また、スライシングを担っているファクターPSFおよびp54複合体については二段階の精製を行うことにより、SDS-PAGE上で高純度で精製することに成功した。PSFとBrk間の相互作用については、BrkによるPSFチロシンリン酸化の解析および表面プラズモン共鳴を用いた結合実験を現在行っている。Brkはリン酸化状態と非リン酸化状態でのコンフォメーションが異なることが予測されるため、フォスファターゼにより脱リン酸化処理を行い、コンフォメーション変化をX線溶液小角散乱法で確認するなどの実験を構築中である。また、リン酸化に応じた相互作用解析実験を表面プラズモン共鳴や等温滴定型熱量計にておこなっている。STAP-2の組換え体を精製する方法はこれまで報告されていなかったにもかかわらず、我々は精製することに成功した。まず、HEK293T細胞で大量に蛋白質を得ることを目指した。これまでSTAP-2結合分子の探索は主に免疫沈降・プルダウンアッセイなどで行われてきており、細胞生物学実験を行うための発現系は存在した(CMVプロモーター使用)。しかし、その検出は特異的タグに対する抗体を使用するものであり、そのままでは構造生物学的研究に必要な量を供給できないことが判明した。AGプロモータ(chicken β-actinとrabbit β-globinを組み合わせたもの)を利用した発現ベクターを使用しても同程度の発現量であった。

そこで、バキュロウイルス遺伝子発現ベクターを使用して昆虫細胞Sf9での大量発現を試みたところ、1L培養液当たり0.1mg程度ではあるが、発現・精製することに成功した。これは、GSTタグとHisタグを共に融合させたものであり、種々の結合実験を行う上で最適である。また、タグは特異的プロテアーゼ(3Cプロテアーゼ)を用いて、結晶化などの目的で必要に応じて除去することが出来る。良質の組換えSTAP-2が高純度に調製できたことは、その後の生化学的・構造生物的な実験を進める上で非常に画期的な進歩である。また、BrkやPSF複合体が調製できたことは、研究の進行を考える上で非常に大きく、予定通りの進行状況と考えて良い。多くの結合パートナーを持つSTAP-2のように複雑な相互作用を取り扱う系では,結合の順序による構造変化の可能性にも充分注意を払う必要がある.相互作用は表面プラズモン共鳴(SPR)法や等温滴定型熱量計(ITC),示差走査型熱量計(DSC),分析超遠心機(AUC)法を使用し,精密に相互作用パラメータを評価する.変異体作製により,各相互作用残基の役割を精査する.これらの機器は身近にあり申請者が常に使用しているものであるため,効率の良い実験ができる.蛋白質間相互作用の必要最小領域を絞り込み,実際に細胞中で改変領域が評価される必要がある.STAP-2分子発見者である松田正教授が北大薬学研究院で細胞及び個体レベルの研究を行っており,我々の実験結果をタイムリーでフィードバックしてもらえるため,vivoでの挙動を再度,研究設計に反映することができる.具体的には,変異体導入によるシグナル入力の変化や細胞内蛋白質の局在観察である.我々の経験上,高分子同士の複合体結晶を得るためには,組換え発現コンストラクトの最適化が肝要となるケースが多い.相互作用ドメインの複合体結晶を得るには,適切なドメインのみにするために,コンストラクトの刈り込みも必要であろう.麻本プロジェクトではマルチドメインからなる蛋白質群の複合体が構造解析対象となり,低分解能のX線回折データしか得られない可能性もある.その場合においても,申請者は多くの結晶構造解析経験があるため,効果的な問題解決ができる.もしも複合体結晶が得られなかった場合を想定し,X線小角散乱法を平行活用する.これは溶液中の分子の概略を計算することができる有用な方法であり,最近は構造生物学者の使用例も増えてきている.設備備品費に関しては複合体も含めて,蛋白質の結晶化はランダムマトリックス法以外にも,体系的にスクリーニングする方法もおこなう.その際,サンプルを各条件と混和した際の挙動を丹念に観察・記録する必要があるため,初期の段階で高倍率の双眼実体顕微鏡を1台購入する(110万円程度).消耗品等・哺乳類細胞や昆虫細胞培養のための培地代100千円程度必要である.・等温滴定型熱量測定用消耗品:専用サンプルバイアル瓶及びシリンジ代として200千円申請する.・表面プラズモン共鳴用消耗品:L1センサーチップ,HPAセンサーチップ,専用緩衝液,サンプルバイアルの購入費として200千円を申請する.・
血管新生阻害剤としてL-carbocisteineを臨床応用するための基盤研究

Colon-26マウス直腸がん細胞埋め込みモデルを作成し、抗癌剤cisplatinおよび5-FU単独投与とL-carbocisteine併用投与における腫瘍増殖を経時測定することで血管新生阻害剤としてのL-carbocisteineの有用性評価を行った。Cisplatinおよび5-FUはそれぞれ単独でvehicleと比べ有意な腫瘍増殖抑制効果が見られたが、L-carbocisteineの併用により、相乗的な増殖抑制効果が見られた。従って、L-carbocisteineの血管新生抑制作用は既存の抗がん剤との併用効果が期待できることが示唆された。近年、血管新生は癌の増悪のみならず、加齢黄斑変性や糖尿病性網膜症、リウマチとの関連が報告され、血管新生阻害剤の開発が活発化している。現在、臨床現場ではbevacizumab (アバスチン)やramucirumab (サイラムザ)といった血管新生阻害剤による治療が行われているが、これらは静脈投与で効果を示す抗体製剤であり、患者の肉体的負担・医療費負担が問題となる。我々はin vivo実験の結果、去痰薬であるL-carbocisteineが副作用等の有害事象を発現することなく腫瘍血管新生抑制効果を示すことを明らかとしている。また、ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVECs)を用いたin vitro実験の結果、L-carbocisteineは血管内皮細胞において、血管内皮増殖因(VEGF)受容体とPLCgの複合体形成を抑制し、血管内皮細胞の増殖・遊走・管腔形成を抑制することを明らかとしている。本年度は採択課題における検討箇所であるL-carbocisteineとcisplatin、5-FUの腫瘍増殖抑制の相乗効果の検討を行った。文献を参考に、cisplatinを隔日3 mg/kg、5-FUを5 mg/kgでそれぞれ腹腔内投与した。cisplatinは単独での効果が強く、L-carbocisteineによる相乗効果は認められなかったが、5-FU単独群と比較し、L-carbocisteine併用群では相乗的腫瘍増殖抑制効果が見られた。動物実験申請の関係で当初の予定を変更し、先にL-carbocisteineと5-FU、cisplatinの併用による腫瘍増殖抑制効果の検討をin vivoで行った。colon-26細胞をBALC/cマウスの背面皮内に埋め込み、腫瘍モデルマウスを作製し抗腫瘍効果の検討を行った結果、cisplatinは単独での効果が強く、L-carbocisteineによる相乗効果は認められなかったが、5-FU単独群と比較し、L-carbocisteine併用群では相乗的腫瘍増殖抑制効果が見られた。酸素誘導網膜症(OIR)モデルでの検討に着手し、予備検討を開始している。今後は、OIRモデルでの検討および、腫瘍モデルマウスでのL-carbocisteineの併用効果の検討を進めることで、in vivoでのL-carbocisteineによる血管新生抑制療法の有用性検証を実施する。薬学動物実験において、腫瘍モデルマウス、酸素誘導網膜症モデルの実施順に変更が生じたために次年度使用額が生じた。実験動物の購入に使用する。
蝸牛血管条細胞内電位とイオン分布

平成元年度,2年度の研究成果から,血管条辺縁細胞の正確な電位,Na^+K^+イオン濃度を同定するためには,どうしても内リンパ側から血管条辺縁細胞へ刺入するアプロ-チが必要であることが判明した。そこで,前庭階に小孔を作成し,ライスネル膜を経由して,内リンパ側から辺縁細胞への電極刺入を試みた。しかしながら,その結果は,血管条外側壁からのアプロ-チによる結果と大差なかった。すなわち,血管条辺縁細胞の電位は,蝸牛中央階の電位よりも,約10mV低く,Kイオンもやや低く,Naイオンはやや高いという結果が得られた。また,血管条内でのイオン濃度勾配は,内リンパ側が,Kが高く,Naは低いという結果であった。また,dataのバラツキもかなり大きかった。以上の結果は,内リンパ経由で辺縁細胞に電極刺入をしても,その結果は,血管条外側壁からのアプロ-チにくらべて,手技的困難さだけが増し,何ら,新しい情報は得ることができなかった。辺縁細胞の定量的解析には,技術的な改良も大事であるが,新たな測定器械の開発が必要と思われる。従来、血管条内電位測定を行う際は、蝸牛中央階骨にドリルで小孔を開けそこより、ガラス電極を刺入していた。しかし、このapproachの方法では、刺入前は、1μ以下の先端直径をもっている電極でも刺入後はほとんど数μの大きさになっており、このようなapproach法で得られた電位は信頼性に乏しい。われわれは、蝸牛骨胞をφ0.5mmの大きさで、リンパ液のもれがない状態でとりはずす方法を開発した。この方法で電極を刺入すると、電極先端は刺入前後で、1μ以下と変化がなく、また、電極抵抗も4050MΩで、刺入前後でほとんど変化しなかった。このapproachを用いて、血管条内の電位をtraceしたところ、血管条辺縁細胞内電位は、蝸牛中央階より、数mV低い電位であると推定された。さらに、本研究費で購入したシングルチャンネル細胞内記録用アンプ(ニュ-ロデ-タ社IR-183)を用いて、血管条内での電極入力抵抗を経時的に測定した。入力抵抗が、血管条に入ると、急激に低下することを利用して、血管条辺縁細胞内電位を調べたところ、やはり、辺縁細胞内電位は蝸牛中央階静止電位(EP)より数mV低いと推定された。次にアノキシア後の血管条辺縁細胞内電位の変化をみると、その変化は、コルチ器を破壊されたカナマイシン動物の蝸牛中央階静止電位(EP)の変化と酷似していた。この所見は、EPの成り立ちを考える上で、非常に興味深い所見である。次に、先端直径1μ以下のNa^+またはK^+感受性二重電極を用いて、血管条内のイオン分析を調べた。K^+は蝸牛中央階に近づくにつれ上昇し、Na^+は逆のPatternをとることがわかった。特にEPの成立に重要なK^+は、中央階より数十mM低い値を示すことがわかった。血管条内のNa^+,K^+の分布勾配とアノキシア時のイオン変化および血管条内の電位変化について研究を行った。このために,まず,光端直径が1μm以下のNa^+,またはK^+感受性二重電極を作成した。血管条内のK^+は,血管条内リンパ側に向うにつれてその濃度が大きくなり,Na^+は逆のイオン勾配をもつことがわかった。また血管条内静止電位は,内リンパ側に向うにつれて段階状に正電位が大きくなり,血管条辺縁細胞と考えられる部位では,EP(蝸牛内リンパ静止電位)とほぼ同等の値になることがわかった。蝸牛内リンパのイオン濃度は,K^+が約130mM,Na^+は約1mMであった。アノキシア時には,内リンパK^+は低下し,Na^+は上昇するが,血管条内のNa^+,K^+も同様の変化を示した。EPの発生機序を知るのに,極めて重要なことは,血管条内辺縁細胞内のNa^+,K^+および細胞内電位の絶対値とそれらの内リンパ腔における値の相対的関係である。今まで得られた結果からは,辺縁細胞内では,内リンパ腔にくらべて,K^+はやや低く,Na^+はやや高く,静止電位は数mVEPより低い傾向がみられた。ただし,これらの値はバラツキが大きく,電投利入のアプロ-チ法に問題があると考えられ,内リンパ腔より血管条へのアプロ-チが必要であると考えられた。辺縁細胞内マ-キング法による細胞内電位同定を試みたが現時点では成功していない。また,血管条内でのイオン濃度

勾配は,内リンパ側が,Kが高く,Naは低いという結果であった。また,dataのバラツキもかなり大きかった。以上の結果は,内リンパ経由で辺縁細胞に電極刺入をしても,その結果は,血管条外側壁からのアプロ-チにくらべて,手技的困難さだけが増し,何ら,新しい情報は得ることができなかった。辺縁細胞の定量的解析には,技術的な改良も大事であるが,新たな測定器械の開発が必要と思われる。
都市縮減社会における住居系市街地の減容化に向けた換地と地域自治組織に関する研究

本研究では住居系市街地を対象に、住民自らが地区の範囲を縮め、生活や活動の規模を1「減容化」することを前提とした、2「区画整理の換地を応用した土地交換の方法」、3「住民自らによる協議体制の組織」の3点を検討することを目的とする。1は集約型都市構造への再編に住民自らの視点を導入する点、2は区画整理の換地という実効性のある土地交換の方法の検討である点、3は2ひいては1の実現の基礎として地域自治組織の再編を検討する点で独自性と創造性を持つ。2では換地の応用に関する全国調査を、3では減容化といえる取り組みを行う地域自治組織の事例調査を行い、1の減容化の概念に接合して最終的に応用モデルを提案する。
ポストゲノム時代におけるバイオベンチャー企業の経営戦略と組織間関係

「日本における好業績を獲得したバイオベンチャー企業(以下BV)は,いかなる特性をもつか」を問題意識として調査を行った。日本のバイオ業界は米国と比して発展段階が初期の状態にあり,既存企業内で全てのR&D活動を行うことは困難だと思われるため,今後バイオベンチャー企業が重要な役割を果たすと考えられるためである。(1)企業が有する経営資源・能力を基にBVを分類し,好業績がいかなる組み合わせによって達成されるかを分析した。結果として,「マーケティングとR&D能力を両方もつグループ」,「コスト・品質の管理と資金調達能力を有するグループ」が好業績を達成していることが判明した。先行研究では,新製品を生み出すR&D能力と製品をいかに販売するかというマーケティング能力の両方が重要であるとされてきた。したがって,最初のグループは先行研究と一致した結果であろう。次のグループは,製品に対するコスト・品質管理と資金調達能力が高いグループであり,同時に企業内での同僚の評価(peer reviewing)とメンバー間の頻繁なコミュニケーションを特徴としていた。不確実な成果を目指したBVが高い資金調達能力を有する時,資金面で問題なく継続的に製品開発を行うことが可能になる。(2)企業が製品開発を行う際に必要な技術資源を,自社内のR&Dで獲得するのか,ライセンスなどによって購入するのか,もしくは提携や共同R&Dによって協力して獲得するか,というトピックを問題意識として文献調査を行った。先行研究ではこのような技術資源の獲得形態に関して3要因を提示していることを明らかにした。それは主に,企業要因(自社のR&D能力の程度、R&D経験の程度、自社内開発経緯)、技術要因(技術のLCの程度、開発コストの程度、技術の不確実性)、外部環境要因(技術の専有可能性の程度、市場規模、競争の程度)である。これらの要因を日本のコンテクストに当てはめて定量的な調査をすることを今後の課題とする。本研究は現在多く出現しているバイオベンチャーに関して、いかなる要因がその存続を可能にするのかを問題意識としている。20022003の研究実績に関して触れたい点は以下の2点である。ひとつは、バイオベンチャーの経営者とのインタビューを通じて、分析対象を明確に設定する必要性(適切なサンプルの確保)を認識したことである。ひとことでバイオベンチャーと言っても、IT、医療、環境、電子、化学、農業のように産業横断的な性質を有する。同時に、同一産業内においてもビジネスモデルが明確に異なる状況にある。例えば、医療分野に目を向ければ、創薬、再生医療、機器、研究支援など対象とする事業によって、キャッシュフロー、顧客、研究開発期間など経営戦略を策定・実行する上で重要となる要素が決定的に異なってくる。今後20032004年においては、医療関係のバイオベンチャーに質問表を配布し、ビジネスモデルの差(事業領域の差)をコントロールして分析する予定である。もうひとつは、組織間関係の重要性である。たとえ事業化に成功し企業を立ち上げても、長期間生存するためには製品や特許などの知的財産を継続的に収益に結びつけたり、出資企業から出資の継続を確保することが重要である。特に顧客や出資先を企業に設定している場合が多いバイオベンチャーにおいては、事業相手との関係性が重要になると考えている。この関係性が生まれる契機を考察するため、技術資源をキーワードに「企業組織が技術資源の獲得形態を決定する要因」を早稲田大学大学院商学研究科紀要に提出した。今後20032004年においては、質問票によってバイオベンチャーと企業との組織間関係を調査する予定である。
発電所温排水流を利用した海水ウラン吸着に関する基礎研究

本年度は初年度であり、課題遂行にかかわる基本的な分離・分析機器計測機器など周辺装置類の整備に重点を置いて研究を進めた。装置類の整備と試験結果1.ドラフトチャンバー吸着床に充填した吸着剤から海水ウランを効率よく分離し、ウランのα線計測用試料を作成するに至る一連の操作をスムースに実施できるシステムを組み入れたカリフォルニアフード(ヤマト化学(株)FYK型)を導した。このチャムバー内には、ウラン系列のα放射性核種(^<226>Ra以下の短寿命核種)の標準設定が可能な生成・分離装置も組込である。各システムの操作試験から、本装置が有効に作動することを確かめた。2.α線計測装置現有装置の有効利用を図る観点から我々はガスフロー型α線測定器、シリコン半導体検出器つき波高分析器の両方を現有しているので、これらを利用しα線スペクトルによる測定を主として進めることにした。このために電着法による測定試料の調整用電着セルを製作した。各種動作特性試験の結果、本装置ではバックグラウンドもほとんど検出されないので、ウラン濃度の高い試料海水ウランのα線スペクトル測定が精度よく実施できる見込を得た。3.吸着床本研究の主目的である吸着床の開発について、初期計画に沿って高速温排水流に適応できることに重点を置いた流動方式平行板型吸着床を設計し試作した。試作吸着床は水槽を用いて吸着床中の流れ状態のチェックを中心に試験継続中であるが、十分適応できる見込を得ている。なお実温排水流による試験は発電所の都合から5月以降実施する予定である。
肝切除・部分肝移植後の肝再生と肝不全に関する網羅的病態解析プログラムの開発

【背景と目的】黄疸を特徴とする肝再生時肝不全の病態を明らかにするため、ラット肝切除後肝再生時遺伝子発現推移をマイクロアレイを用いて網羅的に解析した。さらにATP binding cassettetransporterの発現に焦点を絞って高サイトカイン血症の肝再生への影響についても検討を試みた。【結果】1)マイクロアレイの結果4,722個の遺伝子が1点以上の点で2倍以上の発現変動を示し、既知1587遺伝子については相同19パターンに分類された。機能別遺伝子発現パターンは従来の報告と一致し、肝再生モデルとしては的確であると判定された。ATP bindingcassette transportersに焦点を絞ると、肝細胞取り込み型蛋白(OATP。2,4,NTCP)遺伝子(は24時間で著明に発現低下したのに・対して、排泄型膜蛋白(MRP1,2,3,4,5,6)遺伝子ではMRP2が著明にdown-regulateされ、MRP1,3はup-regulationを示した。RT-PCRの結果も同様であった。2)肝再生時にLPSを負荷した場合、これらの変化は相加的に生じること確認された。【結論】マイクロアレイによる肝不全の病態パターン診断の有用性が示唆された。肝再生と感染(LPS負荷)は、ともにMRP2 down-regulationを誘発すること肝不全を呈することが判明した【背景と目的】黄疸を特徴とする肝再生時肝不全の病態を明らかにするため、ラット肝切除後肝再生時遺伝子発現推移をマイクロアレイを用いて網羅的に解析した。肝再生と感染(LPS負荷)は、ともにMRP2 down-regulationを誘発すること肝不全を呈することが判明した【背景と目的】黄疸を特徴とする肝再生時肝不全の病態を明らかにするため、ラット大量肝切除後肝再生時の全遺伝子発現の推移について、マイクロアレイを用いた網羅的解析を行った。【結果】0時をコントロールとして3倍以上の発現レベル差を認めた遺伝子数は、24時間1341個、72時間709個、168時間460個、いずれかの時間1763個であった。これをクラスター解析し、20の発現パターンが観察された。また、有意な発現を示した既知遺伝子をキーワードによりカテゴリー分類し、遺伝子の機能毎に発現推移のパターンを特定した。このうちABCC、BCRP、BSEP、cMOTA(MRP2)、GSH transporter、MDR1(P-GP)、MDR3、MDR3、MRP3、NTCP、OATPをキーワードとする遺伝子を検索し、有機アニオン輸送関連遺伝子の検索を行ったところ、3倍以上の有意な発現変動は見られなかった。さらにRT-PCRで個々の遺伝子発現の推移を確認した。【結論】ラット大量肝切除後肝再生時の全遺伝子に関する発現推移の解析を終了した。肝再生時肝不全に特徴的に見られる高ビリルビン血症の発症機序には、肝再生は直接的には関与していないことが明らかとなった。予定通り、サイトカイン負荷モデルを作成し、肝不全を誘発する第二のtriggerの存在について検討を継続する予定である。【背景と日的】黄疸を特徴とする肝再生時肝不全の病態を明らかにするため、ラット肝切除後肝再生時遺伝子発現推移をマイクロアレイを用いて網羅的に解析した。さらにATP bindingcassette transporterの発現に焦点を絞って高サイトカイン血症の肝再生への影響についても検討を試みた。ATP bindingcassette transportersに焦点を絞ると、肝細胞取り込み型蛋白(OATP,2,4,NTCP)遺伝子(は24時間で著明に発現低下したのに対して、排泄型膜蛋白(MRP1,2,3,4,5,6)遺伝子ではMRP2が著明にdown-regulateされ、MRP1,3はup-regulationを示した。肝再生と感染(LPS負荷)は、ともにMRP2 down-regulationを誘発すること肝不全を呈することが判明した。
In situの分子生物学的手法による組織内病原真菌の検出・同定

1.新しい菌属・菌種同定の系の確立菌種レベルでの病原真菌用プローブの作製を試みた。Pasteur研究所のDr.Jp LatgeらにA.fumigatus特異的レトロトランスポゾンをクローニングしたプラスミドの分与を受けた。更に、A.flavusについては、米国United States Department of Agriculture(USDA)、Dr.McAlpin CEより、プラスミドの供与を受けている。A.fumigatusおよびA.flavus特異的プローブについて設計した各プローブの特異性解析をした。プローブの標識はdigoxigenin(DIG)標識dUTPを用いてPCR法により作成した。in situの分子生物学的手法のうち、主にin situ hybridization(ISH)法を行った。約500bpのプローブのプライマーを変え、PCR効率を上げ、プローブの作製が容易になった。約半分の333bpのプローブでも強度はやや落ちるものの、特異性は高く、臨床応用が期待される。A.flavusのレトロトランスポゾンのLTRの一部、225bpからなるプローブはA.flavusは強陽性であったが、わずかにA.nidulansと反応した。そのため、ペプチド核酸の導入を試みた。peptide nucleicacid(PNA)プローブおよびlocked nucleicacid(LNA)プローブを導入した。従来のプローブと異なるので反応条件の検討を要したが、高い特異性を出すことができた。また、このプローブは従来のプローブと異なり、DNaseに分解されにくいので、今後の自動化に向けた適応に向いていると考えられる。1.新しい菌属・菌種同定の系の確立菌種レベルでのプローブの作製を試みた。すでにPasteur研究所のDr.JP LatgeらにA.fumigatus特異的レトロトランスポゾンをクローニングしたプラスミドを分与を受けた。A.fumigatusおよびA.flavus特異的にプローブについては、すでに設計を終わらせた。A.terreusについても設計済みである。Candida特異的菌種については次年度の課題とする。2.感染動物臓器切片の作製プローブの標識はdigoxigenin(DIG)標識dUTPを用いてPCR法により作成した。in situの分子生物学的手法のうち、主にin situ hybridization(ISH)法、すなわち、標識プローブを用いて、ハイブリダイゼイションを行った。今回、A.fumigatus特異的プローブについては特異性が確認できた。A.flavusについてもほぼ適当な条件が整った。菌種レベルでの前年度に作製した各プローブの特異性解析をした。前年度に作製したプローブから数ベースプライマーを移動させた。また、約半分の領域の特異性を各菌種感染臓器を用いて解析した。プライマーを変えたことにより、PCR効率が良くなり、プローブの作製が容易になった。A. flavusのレトロトランスポゾンのLTRの一部を用いてプローブを作製した。225bpからなるプローブはA. flavusは強陽性であったが、わずかにA. nidulansと反応した。そのため、特性を高めるためにペプチド核酸の導入を試みた。
網羅的エピゲノム解析技術システムを用いた卵巣癌化機構の解明について

卵巣癌細胞、組織を用い、網羅的なエピジェネティックな修飾の変化(DNAメチル化異常)と病因、病態(年齢、進行期、組織型)について関連性の検討を行ない、癌抑制遺伝子、インプリンティング遺伝子群の早期変異について明らかにした。発症予防の観点から、生活習慣などの環境要因についても検討した。さらに、新規メチル化異常測定系の開発に着手し、その性能評価を行なった。本研究の目的は、卵巣癌の癌化機構において、エピジェネティックな修飾を受ける遺伝子の構造上あるいは機能的な特徴を見いだし、この修飾に共通して影響を受ける転写因子やそのネットワークを多方面から評価することである。・ChIP-on-Chipシステムによる解析;卵巣癌細胞株(PA1,SKOV)を用い正常卵巣上皮細胞株と比較解析し、網羅的・系統的なエピジェネティックスの解析を行った。DNAは超音波により断片化し、抗メチル化シトシン抗体で免疫沈降後、抗メチル化シトシン抗体に結合するDNAのプロファイリングを行った。その結果、癌細胞で有意にメチル化の変化を受ける(8-16倍以上)107領域を同定した。この領域には、癌抑制遺伝子のプロモーター(P14、P16)、既知のインプリント制御領域(アレル特異的メチル化領域)、DNA修復遺伝子(14-3-3s遺伝子)発現調節領域も含まれていた。統計学的解析も行っている。・インプリント制御領域のメチル化の解析;卵巣癌DNAをバイサルファイト処理し、PCR後制限酵素で消化し、電気泳動するCOBRA法でメチル化の定量を行った。対照実験として、年齢をマッチさせた正常卵巣組織22検体について同様に解析した。正常卵巣組織の結果(平均%)、H19:44.3、GTL2:43.4、PEG1:36.4、LIT1=50.7、ZAC:35.4、PEG3:40.4、SNRPN:21.8のメチル化を示した。一方卵巣癌では、H19:38.1、GTL2:41.2、PEG1:41.9、LITI:41.7、ZAC:35.4、PEG3:44.7、SNRPN:22.5のメチル化を示した。高メチル化(2SD以上)はH19で7症例、GTL2で10症例、PEG1で4症例、LIT1で3症例、ZAC:3、PEG3:6、SNRPN:8症例みられ全体のおよそ42%に異常を認めた。一方で低メチル化(2SD以下)はH19:9、GTL2:12、PEG1:1、LIT1:12、ZAC:2、PEG3:1、SNRPN:7に認められた。今後も症例の追加、患者背景、組織型など細分類を行う。・卵巣癌患者の登録;今年度は症例予定登録50例の84%に達している。昨年度抗メチル化シトシン抗体を用い、ChIP-on-Chipとwhole genome tiling arrayを組み合わせ網羅的なDNAメチル化の変異の解析を行った。本年度は、そのうち既知のインプリント制御領域(アレル特異的メチル化領域)に着目し、7つのインプリント制御領域についてDNAメチル化とインプリント遺伝子の発現パターンについて解析した。【具体的内容】1)卵巣癌患者の登録;今年度は、症例74例がすでに登録されており、症例予定登録50例にすでに達している。2)インプリント制御領域のメチル化の解析;メチル化異常(正常の±2SD以上)は全体のおよそ62%に確認された(H19 : 16例、GTL2 : 22、PEGI : 5、LITI : 15、ZAC : 5、PEG3 : 7、SNRPN : 15)3)インプリント異常の解析(遺伝子発現) ; (H19 : 15%、IGF2 : 42、GTL2 : 4、PEGI : 39、LITI : 33、PEG3 : 6、SNRPN : 0)でメチル化異常の頻度に較べ低いことが判明した【意義】本来エピジェネティックな修飾は発生プログラムに従って確立され細胞の記憶として働くが、その破綻が細胞癌化に繋がると考えられ注目されている。よってエピジェネティックスの解明は、今後の医療に新しい展開をもたらし得る大いなる可能性を秘めている。本研究成果は、卵巣癌の病態解明に貢献する。【重要性】未だ早期診断法がなく、予後不良な卵巣癌の分子機構の解明は、疾患の予防、新しい診断マーカーや創薬治療開発に新たな癌治療戦略を拓くことが可能である。本研究の目的は、卵巣癌において、エピジェネティックな修飾を受ける遺伝子の構造上あるいは機能的な特徴を評価することである。これまでに、網羅的なDNAメチル化変異解析と生物学的特性について検討した。