hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
細胞集合体を用いたｉｎ　ｖｉｔｒｏでの歯髄様組織構築の試み

本研究課題では、歯髄再生医療に利用できる歯髄様組織をin vitroで創製することを最終目標とし、歯髄様形状(棒状)の細胞集合体を作製する技術の確立を目指した。本研究の結果、シート状に回収した歯髄幹細胞を用いることで棒状の集合体を作製することに成功した。さらに、歯髄幹細胞集合体が象牙質/歯髄複合体を構築する機能を有していることが明らかになり、歯髄様組織をin vitroで構築できる可能性が示された。In vitroにおける歯髄様組織構築に向け、本年度は、温度応答性高分子(pNIPAAm)ゲルを応用したラット歯髄細胞の棒状細胞集合体作製技術についての検討を行った。具体的には、歯髄の形状に近似した形態の凹みを有するpNIPAAmゲルに、ラットから採取した歯髄の初代培養細胞を播種することによる棒状細胞集合体の作製を試みた。まず、通常の培地で培養した歯髄細胞をpNIPAAmゲルに播種し、培養1日から2日後に細胞集合体の取り出しを試みたところ、いずれの培養日数においても、集合体が容易に分離し、成形体として取り出すことはできなかった。次に、歯髄細胞をあらかじめ細胞外基質産生を促進させる分化誘導培地で一定期間培養した後に集合体作製に用いた結果、棒状の歯髄細胞集合体を取り出すことに成功した。つづいて、この棒状の歯髄細胞集合体を振盪機培養すると、培養1日後には棒状の形態が失われてしまうが、静置培養を行うと、長期にわたって棒状の形態を維持できることが分かった。本年度において得られた歯髄細胞棒状集合体の作製および培養技術は、in vitroにおいて歯髄様組織を構築するうえで鍵となる重要な成果である。In vitroにおける歯髄様組織構築に向け、初年度の平成24年度では、モデルとしての細胞を用いて温度応答性高分子(pNIPAAm)ゲルを応用した三次元細胞集合体作製技術についての検討を行った。具体的には、歯髄の形状に近似した形態(棒状形)の凹みを有するpNIPAAmゲルを調製して、歯髄組織を構成する細胞のうち大部分を占める線維芽細胞(FB)、および象牙芽細胞と性質が類似している骨髄間葉系幹細胞(BMSC)の棒状集合体の作製を試みた。まず、三次元プリンタで造形したモールドを用いて、異なる大きさの直方体の凹みを付与したpNIPAAmゲル製培養チャンバーを作製し、細胞懸濁液を流し込むことにより各細胞の棒状集合体の作製を試みた結果、BMSCについては、pNIPAAmゲルで培養することで棒状の集合体を作製することに成功した。一方、FBについては、どの大きさの凹みを使用しても球状または不定形の集合体しか形成されなかったため、一旦形成したFB集合体をシーソー型の振盪機上で培養した後に、医療用注射針を通過させる方法を試みた。その結果、FBの球状集合体は棒状集合体に変化し、さらに注射針の直径を変えることで、成形される棒状集合体の太さを制御できることが明らかとなった。本年度において得られたBMSCおよびFBの棒状細胞集合体の作製技術は、実際の歯髄細胞を用いて棒状集合体を作製するうえでの重要な成果である。In vitroにおける歯髄様組織構築に向け、本年度は、昨年度に確立した温度応答性高分子(pNIPAAm)ゲルを用いた三次元棒状細胞集合体作製技術を応用して、ヒト由来歯髄幹細胞を用いた棒状集合体の作製を試みた。まず、歯髄幹細胞をコンフルエントの状態まで培養皿上で培養し、その後、5日間の培養を行った。次に、培養した細胞をセルスクレーパーでシート状の細胞塊として回収し、pNIPAAmゲルに填入後2日間の培養を行った。その後、ゲル周囲の温度を低下させることによって、ヒト由来歯髄幹細胞のみから構成される棒状の細胞集合体を取り出すことに成功した。一方、コンフルエントの状態後、トリプシン処理で回収した歯髄幹細胞をpNIPAAmゲルに注入したところ、培養期間に関わらず細胞集合体の作製は不可能であった。シート状に回収した歯髄幹細胞を用いることで細胞集合体の作製に成功したことは、歯髄幹細胞を細胞外基質が付着した状態で成形したことで細胞ー基質間接着を誘導できた結果であると考えられた。次に、作製した歯髄幹細胞集合体が硬組織形成能を有しているかを検討することを目的に、石灰化基質誘導培地を用いて最大50日間の培養を行った。各試料のパラフィン薄切切片を作製し、各種染色により内部構造を観察したところ、ヘマトキシリン・エオジン染色の結果、集合体内部の細胞は細胞核を有しているが、外層の細胞の細胞核が消失していることが明らかとなった。また、von Kossa染色およびdentin sialophosphoproteinの免疫蛍光染色の結果から、細胞集合体の外層で象牙質様の石灰化基質が形成されていることが分かった。

以上のように、ヒト由来歯髄幹細胞を用いて細胞集合体を作製することに成功し、またこの集合体が象牙質/歯髄複合体を構築する機能を有していることが示唆された。歯科生体材料学本研究課題は、三次元細胞集合体作製技術を応用したin vitroにおける歯髄様組織構築を目的としており、本年度は、ラット由来歯髄細胞を用いた棒状細胞集合体の作製方法の確立を目的としていた。研究実績の概要に記載した通り、あらかじめ歯髄細胞を象牙芽細胞分化誘導し、細胞外基質の沈着を促進させることで、棒状細胞集合体を作製することに成功した。また、棒状細胞集合体の長期培養を可能にする手法を考案した。以上のことから、現在までおおむね順調に研究が進展していると判断できる。本研究課題は、三次元細胞集合体作製技術を応用したin vitroにおける歯髄様組織構築を目的としており、本年度には、その基盤技術としての棒状細胞集合体の作製方法の確立を計画していた。研究実績の概要に記載した通り、BMSCについてはpNIPAAmゲルを応用することで、FBに関しては球状集合体を成形することによって、それぞれの細胞の棒状集合体を作製することに成功している。以上のことから本研究の進捗は、おおむね順調に進展していると判断できる。次年度は、今年度に確立した歯髄細胞から成る棒状細胞集合体を用いて、in vitroでの象牙質・歯髄複合体の作製を試みる。具体的には、歯髄細胞棒状集合体を象牙芽細胞分化誘導した後に、薄切切片を作製してDMP-1およびDSPの免疫蛍光染色を行い、象牙芽細胞マーカータンパク質の集合体内における局在を検討する。また、集合体を長期培養した後に、内部に沈着した象牙質様石灰化基質の局在の検討をvon Kossa染色を用いて行い、さらにフーリエ変換赤外分光分析あるいは微小X線回折解析により定性評価を行う。歯髄細胞棒状集合体の象牙質・歯髄複合体への分化誘導効率が悪い場合は、培養培地へFGF-2などの増殖因子を添加することで分化効率の促進を図る。これらの検討に基づき、最適な培養条件を特定することで、in vitroにおける象牙質・歯髄複合体の構築が可能となる。次年度は、今年度に確立した棒状細胞集合体作製方法を用いて、ラット歯髄細胞の棒状集合体の作製を試みる。使用する細胞種によって棒状集合体の成形性が異なることが分かっているが、今年度に確立した方法を応用することで可能になるものと予測される。また、作製した歯髄細胞集合体の機能評価を行うことを目的として、分化誘導培地を用いて培養を行った後に薄切切片を作製し、Dentin sialophosphoprotein(DSPP)等の象牙芽細胞マーカーの免疫組織学的検討と石灰化基質産生評価を行う。これにより、歯髄細胞から分化した象牙芽細胞の分布と機能評価が可能となり、得られた結果を総合的に評価し、これまでの実験にフィードバックすることで、in vitroでの機能的な歯髄様組織構築を確実なものにすることが可能であると考えられる。棒状集合体の作製法および培養法の確立に時間を要したため、今年度に予定していた、歯髄細胞棒状集合体の免疫蛍光染色法による分化マーカーの発現に関する検討が実施できなかったため。次年度は、作製した歯髄細胞棒状集合体の構造解析を主に行う予定であり、組織切片作製のための器材を購入する。さらに、免疫組織学的検討、石灰化基質定量評価に使用する試薬やキットの購入が必要となる。これら研究遂行に係る消耗品は、研究申請書に記載されている研究計画に則り必要性を吟味して効率的に使用する。
省電力運用に向けたSDN相互結合網でのクラスタ資源管理技法に関する研究

本研究では、SDN (Software Defined Networking)を利用した相互結合網におけるネットワーク資源管理基盤上で、相互結合網も考慮した省電力運用に向けたクラスタ資源管理技法の実現を目指している。具体的には、相互結合網も含めたクラスタシステムの縮小運用による省電力化を支援可能なクラスタ資源管理技法を、これまで研究開発を行ってきたSDN-enhanced JMS Framework上に配備する資源割当ポリシとして研究開発を行う。2018年度は、2017年度に引き続き関連研究・技術の調査を継続的に実施するとともに、本年度第2四半期より「課題2:割当ネットワーク資源の資源量保障機能の設計・実装」を目的とした研究を進めていくことを計画した。本計画に基づき、2018年度は下記を行なった。(a)関連研究・技術の調査およびクラスタシステム環境の構築・整備:本ステップでは、本年度第2四半期より行う(c)割当ネットワーク資源の資源量保障機能の設計・実装、に向け、クラスタシステムにおける既存の省電力化の研究・技術およびネットワークにおける通信制御技術に関する関連研究について文献調査を推進した。さらに、実際のクラスタシステムにおける資源管理で求められる制約条件について要件の整理を行った。また、本ステップでは2017年度に構築した小規模なクラスタシステムについて、本年度の開発・評価に向けた環境整備を行うとともに、ネットワーク資源管理の効果を検証するため広域分散型環境の構築・整備を行った。(c)割当ネットワーク資源の資源量保障機能の設計・実装:本ステップでは、課題1の割当資源の再構成後でも許可されたネットワーク資源量を保証するための機能について、ネットワークの既存技術であるQoS機能を利用して利用可能帯域幅を制御するクラスタ資源管理技法について検討を行った。本年度は、研究計画として以下の2つのステップを定め、研究を実施した。(a)関連研究・技術調査およびクラスタシステム環境構築(c)割当ネットワーク資源の資源量保障機能の設計・実装本研究計画において、(a)については計画どおりに実施した。(c)については割り当てたネットワーク資源量を保証するための機能について、クラスタ資源管理技法を適用する基盤であるSDN-enhanced JMS Frameworkでの拡張作業が想定より大きくなったため、プロトタイプ資源割当ポリシについては設計まで完了となった。また、本研究における課題に対する評価で必要になるとの考えから、研究計画には含まれていないが、さまざまなシステム構成での評価の観点からジョブスケジューリングシミュレータ、およびネットワーク資源管理の効果が大きく出るとの観点から広域分散型の評価環境の構築・検証を優先して実施している。それに伴い、前年度の残課題である「(b)ネットワーク資源割当の再構成手法の設計・実装」における評価については前述の環境構築と連動して進行中となっている。以上より、研究計画に含まれていなかった評価環境の構築により研究内容としては良くなったと考えるが、当初の研究計画からはやや遅れていると判断した。次年度以降は、本年度のステップ(a)の関連研究・技術の調査、および評価環境であるクラスタシステム環境、ジョブスケジューリングシミュレータ、広域分散環境の構築・整備を実施する。また、ステップ(c)の割当ネットワーク資源の資源量保障機能の設計・実装・評価を進め、ステップ(b)ネットワーク資源割当の再構成手法の評価をステップ(c)の評価と合わせて実施する。次年度後半からは「課題3:データに基づくジョブの通信特性の分析・分類技法の設計・実装」に移行する。この間に下記のステップを進める予定である。(d)データに基づくジョブの通信特性の分析・分類技法の設計・実装:本ステップでは、課題1および2のクラスタ資源管理技法において、ユーザがジョブに対して静的なパラメータ値として設定することを想定していたジョブの要求資源量を、ユーザプライオリティ等から値を推定するクラスタ資源管理技法を設計・実装し、それぞれの評価結果から複合した算出モデルの検討を行う。上記の計画に従い研究を推進する。初年度となる平成29年度は、関連研究及び関連技術の調査から開始し、後半期頃より「課題1:ネットワーク資源割当の再構成手法の設計・実装」を目的とした研究を進めていくことを計画した。本計画に基づき、平成29年度は下記を行なった。(a)関連研究・技術の調査およびクラスタシステム環境の構築・整備:本ステップでは、以降に行う(b)ネットワーク資源割当の再構成手法の設計・実装、(c)割当ネットワーク資源の資源量保障機能の設計・実装、および(d)データに基づくジョブの通信特性の分析・分類技法の設計・実装に向け、クラスタシステムにおける既存の省電力化の研究・技術およびネットワークにおける通信制御技術に関する関連研究について文献調査を推進した。また、本ステップでは開発・評価を行う小規模なクラスタシステムの環境構築を行った。(b)ネットワーク資源割当の再構成手法の設計・実装:本ステップでは、相互結合網でも省電力運用を行うためのネットワーク資源割当の再構成手法について検討を行った。(a)関連研究・技術調査およびクラスタシステム環境構築(b)ネットワーク資源割当の再構成手法の設計・実装本研究計画において、(a)については計画どおりに実施した。

(b)についてもネットワーク資源割当の再構成手法のプロトタイプ資源割当ポリシの設計・実装は計画どおり完了している。なお、本手法に対する基本的な評価は完了しているが、実践的な評価を残課題として次年度に完了する予定である。以上より、おおむね順調に進捗していると判断した。本研究では、SDN (Software Defined Networking)を利用した相互結合網におけるネットワーク資源管理基盤上で、相互結合網も考慮した省電力運用に向けたクラスタ資源管理技法の実現を目指している。具体的には、相互結合網も含めたクラスタシステムの縮小運用による省電力化を支援可能なクラスタ資源管理技法を、これまで研究開発を行ってきたSDN-enhanced JMS Framework上に配備する資源割当ポリシとして研究開発を行う。2018年度は、2017年度に引き続き関連研究・技術の調査を継続的に実施するとともに、本年度第2四半期より「課題2:割当ネットワーク資源の資源量保障機能の設計・実装」を目的とした研究を進めていくことを計画した。本計画に基づき、2018年度は下記を行なった。(a)関連研究・技術の調査およびクラスタシステム環境の構築・整備:本ステップでは、本年度第2四半期より行う(c)割当ネットワーク資源の資源量保障機能の設計・実装、に向け、クラスタシステムにおける既存の省電力化の研究・技術およびネットワークにおける通信制御技術に関する関連研究について文献調査を推進した。さらに、実際のクラスタシステムにおける資源管理で求められる制約条件について要件の整理を行った。また、本ステップでは2017年度に構築した小規模なクラスタシステムについて、本年度の開発・評価に向けた環境整備を行うとともに、ネットワーク資源管理の効果を検証するため広域分散型環境の構築・整備を行った。(c)割当ネットワーク資源の資源量保障機能の設計・実装:本ステップでは、課題1の割当資源の再構成後でも許可されたネットワーク資源量を保証するための機能について、ネットワークの既存技術であるQoS機能を利用して利用可能帯域幅を制御するクラスタ資源管理技法について検討を行った。本年度は、研究計画として以下の2つのステップを定め、研究を実施した。(a)関連研究・技術調査およびクラスタシステム環境構築(c)割当ネットワーク資源の資源量保障機能の設計・実装本研究計画において、(a)については計画どおりに実施した。
初期胚のヒストン修飾酵素活性をイメージングする

ヒストン修飾酵素は、細胞の中の遺伝子のはたらきを調節するために中心的な役割を担っています。発生初期の1細胞レベルでのゲノム構造の違いについては、少ない細胞でゲノム構造を解析する方法が限られており、これまでよく分かっていませんでした。本研究では、申請者が開発してきた蛍光標識ヒストンペプチド(FRETプローブ)を応用し、細胞内のヒストン修飾酵素の活性をイメージングすることによって、細胞単位でゲノム構造動態を可視化する方法を検討しました。本年度は初期胚を用い、FRETプローブによるヒストン脱メチル化酵素活性の検出を中心に条件検討を行い、組織でも細胞内のヒストン修飾酵素活性を可視化することが出来ることを始めて示しました。また、in vivoイメージング(共焦点顕微鏡)の結果を踏まえ、バックグラウンドの問題に対処するために新たにイメージングに適した蛍光標識メチル化ペプチドを合成しました。また、リジン修飾のセンサーであるエンドペプチダーゼについて、コドン最適化を行ったリコンビナント蛋白質発現ベクターを用いてS1ポケットの新たな変異体を合成し、その中からリジンメチル化に特異性の高い(即ちバックグラウンドの低い)酵素を同定しました。微量測定が可能な蛍光分光光度計(NanoDrop)を用いることにより、再現性の高い酵素活性の測定が可能になっています。一方、ヒストンメチル基転移酵素ASH1の標的遺伝子の探索から、発生初期の左右軸形成に関わるPitx2遺伝子の発現を制御する可能性のある転写因子がASH1の直接標的となっていることを明らかにしました。このように、初期発生を制御する転写因子が、ヒストン修飾によってどのように時間的空間的に制御されているかを明らかにすることにより、細胞不均一性の基盤にあるゲノム構造の役割についての理解が、今後一層進むことが期待されます。24年度が最終年度であるため、記入しない。発生初期における細胞分化の基盤には、極めてダイナミックなクロマチンの構造変化が基盤にあると考えられています。しかし、これまでのクロマチン構造を解析する手法は多くの細胞集団を必要とするなど、発生初期の解析は困難でした。本研究では、私たちが開発したFRET蛍光ラベルペプチドによるヒストン修飾酵素活性測定法を用いて、細胞内のヒストン修飾酵素の変化を直接可視化することを目的としています。本年度は、細胞内標識に適した新たなFRETペアによる蛍光標識ペプチドを合成するとともに、分子センサーとなるリジルエンドペプチダーゼの合成法に改良を加え、これまでホスト細胞の中で不溶性分画に含まれていたリコンビナント酵素の回収率を高めることに成功しました。さらに、ヒストンH3リジン4(K4)またはK36がメチル化されたFRET標識ペプチドを用い、培養細胞(HeLa)でK4およびK36の脱メチル化酵素活性を測定し、細胞固定法の条件検討およびFRET標識ペプチドの細胞内における発光強度、バックグラウンドの評価を行っています。一方、K36選択的メチル基転移酵素のひとつであるASH1に対する抗体を用いてChIP-seq解析を行い、ENCODEプロジェクトのモデル細胞の一つになっているK562細胞におけるASH1のゲノム結合パターンを検討しました。これまでに、ASH1といくつかのヒストン修飾との相関を示唆するデータを得ています。今後、細胞内のヒストン修飾酵素活性を可視化する技術によって、均一なクロマチン構造特性をもつ細胞だけを集めることが可能になります。従って、初期発生に於けるクロマチン動態の解析でも均一な細胞集団を用いてChIP-seqのような解像度の高いクロマチン構造解析を行うことが可能になり、初期発生の基盤にあるクロマチン構造に関する新たな知見を導くものと期待されます。
社会的ストレスが引き起こす呼吸循環反応の脳内メカニズムの解明

対人関係のトラブルなどに起因する社会的ストレスは、ストレスが引き起こす健康上の問題の引き金となる血圧や心拍数の増加を引き起こし、その反応には視床下部が大きな役割を果たしていることが明らかになった。また、この反応に視床下部に分布するオレキシン含有ニューロンやセロトニン受容体が関与している可能性が示された。しかし、このストレス性反応には、視床下部より下位の中脳の関与は確認されなかった。また、引越しなどに伴う住環境変化のストレスは、ストレス性の循環反応をもたらすほどの強いストレス要因にはなりえない可能性が示された。申請計画では、今年度は社会的敗北ストレスの脳内ネットワークの解明を行なう予定であったが、「現在までの達成度」の項目で述べるように実験動物の使用に問題が起きたため、社会的ストレス刺激が比較的簡単に作成できる次年度の計画である住環境ストレス(ホームケージ交換ストレス)を前倒しで行なうとともに、スタッフの実験手技の習熟を行なった。血圧、心拍数、および行動量をモニターするテレメトリープローブをあらかじめ埋め込んだ2匹1組のラットを別々のケージで2週間飼育した後に、それぞれのケージを交換し、60分間放置した。移されたラットは、ケージ交換直後から探査行動を開始し、落ち着かない様子でケージ内を60分間動き回った。その際、心拍数は約21beats/min、血圧は約13mmHg、移動前の状態から増加した。また、1匹のラットはホームケージ内でケージ交換ストレスと同じスケジュールで取り扱い対照動物としたが、行動に伴う血圧や心拍数の変動以外の特徴的な変化は認めなかった。それぞれの脳を薄切し、神経興奮性マーカーであるc-fosタンパクの免疫染色行なった結果、視床下部・背内側核(DMH)と傍脳弓領域(PeF)、中脳中心灰白質(PAG)、延髄縫線核(MR)と腹側野(RVL)に、対照と比して、c-fosタンパクのわずかな発現増加が認められた。先行研究によって、この領域に分布するニューロンへの化学刺激は、ストレス様自律神経反応を示すことが明らかになっており、ケージ交換はラットに軽微な昇圧と頻脈のストレス性自律神経反応を起こさせ、その反応には視床下部・DMH、PeF、中脳PAG、MRとRVLなどが関与している可能性が示された。そこで、視床下部・DMH、PeFと中脳PAG間のニューロンネットワークを明らかにするために、中脳へのトレーサー投与を行なう。今年度は社会的ストレスとその脳内機構に関して、5つの新知見が得られた。今回、住環境ストレスとして、自分のホームケージから攻撃性が高い他系統のラットが居住していたケージへ移動させるホームケージ交換ストレスを行った。このストレスは引越しに伴う住環境変化を模したもので、このケージ交換は血圧と心拍数の増加ならびに、視床下部(背内側核:DMH、脳弓周囲:PeF)や中脳中心灰白質(PAG)での神経細胞の興奮性を表すc-Fos陽性ニューロンの発現の増加傾向を示したが、いずれもストレスを加えないコントロール群と比して差が認められなかった。ヒトにおいて住環境の変化は大きなストレスとなり得るが、このストレスは毎日の累積的な負荷によるものであると考えられ、今回我々が用いた一過性の短時間のストレスでは、循環と組織のデータから、住環境ストレスを正確にもしていない可能性が示唆されたことは意義深い。これに対して、社会的敗北ストレスにおいては、攻撃性の高い居住者Long Evansラットによる優位性確立後、敗北行動を提示した侵入者ラットを金網で直接的な身体的接触をできなくした後でも、血圧、心拍数共に明らかに増加し、また中脳中心灰白質、視床下部領域の神経細胞の興奮性も大きく増加した。特に昇圧・頻脈に関与しているPAG背外側部とDMHとPeFにおいて著名な神経細胞興奮性の増加が認められた。従って、これら部位が他の生理的ストレス反応と同様に社会的敗北ストレスがもたらす生体反応の重要な部位であることが明らかになった。加えて、ストレス関連ペプチドであるオレキシンを含有する視床下部の興奮性が特異的に上昇していること、ストレス性の頻脈反応に視床下部DMHのセロトニン受容体が関与していることが示され、この二つの物質が社会的敗北ストレス反応発現の鍵を握っている可能性が新たに明らかになった。住環境変化と対人関係に基づく社会的ストレス時の自律神経性循環反応に対する視床下部・背内側核(DMH)、傍脳弓領域(PeF)、中脳中心灰白質(PAG)の役割と相互関係を意識下のラットを用いて検証した。対人関係の問題によるストレスを模した社会的敗北ストレスでは、ストレス暴露中に血圧と心拍数の有意な増加が認められた。この際に視床下部DMHとPeFに著しいニューロンの興奮が認められたが、中脳PAGのニューロンの興奮性には明らかな増加は認められなかった。また、視床下部DMHとPeFから中脳PAGへ、およびその逆の解剖学的な投射はわずかに認められたのみで、機能的な関与に言及するほどではなかった。以上の結果から、社会的敗北ストレスが循環反応を引き起こし、その反応に視床下部のDMHとPeFが大きく関与している可能性が示されたが、中脳の明らかな関与は認められなかった。さらに、社会的敗北ストレスによって興奮した視床下部DMHとPeFのニューロンのうち、約20%はストレス性自律神経反応への関与が示唆される神経ペプチド・オレキシンを含有していた。

この結果は、社会的敗北ストレスによって引き起こされる循環反応に、視床下部領域に局在するオレキシン含有ニューロンが一定の役割を果たしていることを示している。対人関係の問題によるストレスによってもたらされる健康上の問題に対して、視床下部とオレキシン含有ニューロンを標的とした研究が、今後の課題となることを示した。以上の結果に対し、住環境変化のストレスは血圧や心拍数にも明らかな変化を引き起こさず、また視床下部DMHやPeF、および中脳PAGに分布するニューロンの興奮性に有意な増加を認められなかった。これらの結果より、住環境変化ストレスはその初期には自律神経性の循環反応をもたらすほどの強いストレス要因とはなり得ない可能性が示された。対人関係のトラブルなどに起因する社会的ストレスは、ストレスが引き起こす健康上の問題の引き金となる血圧や心拍数の増加を引き起こし、その反応には視床下部が大きな役割を果たしていることが明らかになった。また、この反応に視床下部に分布するオレキシン含有ニューロンやセロトニン受容体が関与している可能性が示された。しかし、このストレス性反応には、視床下部より下位の中脳の関与は確認されなかった。また、引越しなどに伴う住環境変化のストレスは、ストレス性の循環反応をもたらすほどの強いストレス要因にはなりえない可能性が示された。昨年度は実験動物使用施設の整備遅れによって動物実験申請書認可とスタッフ教育に時間を要したため、計画の変更(昨年度と今年度の計画の交換)や実験計画そのものに遅れが生じたが、今年度はスタッフ一同の努力により、昨年度の遅れを大幅に取り戻し、昨年度の目的達成も含め、概ね今年度の目的を達成できたと考えている。1年前倒しで行った住環境ストレスは昨年度に引き続き、今年度も継続した。その結果、住環境ストレスの負荷強度が小さく、自律神経反応や中枢の反応が十分に観察できないことが判明したが、今後の実験展開や住環境ストレスの生体に及ぼす影響に関しては一定の見解が得られた。一方、前年度から今年度に変更した社会的敗北ストレスでは、実績の概要にも述べたように仮説を裏付けるデータを得ることができ、平成27年3月の第92回日本生理学会大会で発表を行い、また9月の国際自律神経学会に演題登録を行ったので、今年度の目的をほぼ達成できたと考えている。加えて、次年度の実験のための重要な情報となる神経ペプチド・オレキシンの社会的敗北ストレスによる自律神経反応への関与の可能性とストレス反応への視床下部セロトニン受容体の役割が今年度の実験により明らかになった。いずれも生理学会での発表と秋の国際学会での演題登録を行った。今年度、目的達成が遅れているのは、神経トレーサーによる視床下部と中脳中心灰白質間の神経投射の確認実験である。神経トレーサーとc-Fosの二重染色の条件設定に時間を要したため、現在までに3例の実験が行われ、解析を進めるとともに、来年度の追加実験を予定している。以上のように、視床下部ー中脳の神経ネットワークの解明の遅れはあるが、昨年度の遅れはほぼ取り返し、来年度の目的に関する情報や実験データがすでに得られているため、表記の目的達成度区分とした。自律神経科学、生理学今後は、今年度の実験結果をもとに、予定通り視床下部と中脳の神経伝達物質の解明と社会的ストレスによって引き起こされる自律神経反応の中枢内ネットワークを視床下部と中脳を中心に総括できるように計画を進める予定である。
重症薬疹における早期診断および重症度予測マーカー検索

重症薬疹(中毒性表皮壊死症:TEN、Stevens-Johnson症候群:SJS)は眼症状などの重篤な後遺症を残すことがあり、時に致死的疾患である。血漿交換や大量免疫グロブリン療法などが試みられているが、いまだ難治症例も多くみられる。本研究課題においてさらなる臨床における新規の診断マーカーを検索し、加えて重症度を予測できるマーカーも検索することを目的とした。薬疹症例において、薬疹原因薬剤は患者末梢血単核球(PBMC)を刺激、活性化させ、重症薬疹において産生が亢進される、またはより優位に亢進するものの検索を行った。本研究ではsFasLや、granulysinなど細胞死誘導因子が候補として同定された。これまで申請者は、早期診断が早期治療開始に結びつくと考え研究を行ってきた。我々は血清中granulysinが発症早期に著増し、早期診断に有用であることを明らかにした。全国の医療機関に重症薬疹患者の血清の提供を呼びかけ、これまで60例以上の症例の血清を収集した。また北大病院に定期通院中の15名以上の重症薬疹患者が、例数を多く検討できる状況である。これらの薬疹症例において、薬疹原因薬剤は患者末梢血単核球(PBMC)を刺激、活性化させた。この原因薬剤刺激時に、重症薬疹において産生が亢進される、またはより優位に亢進するものを検索を行った。PBMCのmRNAを用いてDNA microarrayを施行し、重症薬疹と通常薬疹のデータを比較し、重症薬疹で優位に発現増強されるmoleculeの同定を行った。候補同定後、原因薬剤刺激したPBMCの培養上清においてタンパクレベルでの発現をELISAを用いて測定した。具体的にはsFasLや、granulysinなど細胞死誘導因子が候補として同定された。しかし今回の研究課題では新規の因子の同定にはいたらかった。今後も検討を続け、さらに重症薬疹早期診断マーカー迅速測定キット作成も行う。本年度、申請者は北大病院に定期通院院している重症薬疹患者の症例に加え、新たに全国19大学に重症薬疹および通常薬疹の早期診断マーカー検索の協力を依頼した。また本研究課題は北海道大学医学研究科医の倫理委員会で承認を得ている。すでに申請者はSJS/TENの発症早期に可溶性FasLの上昇や血清グラニュライシンが上昇し診断マーカーとして有用であることを報告している。現在症例数を増やし眼球結膜や皮膚の粘膜疹出現前の通常薬疹と鑑別が困難なSJS/TEN発症早期で血清グラニュライシンが優位に上昇し、発症後も通常薬疹と比較して優位に上昇していることを確認した。また、新たに薬剤性過敏症症候群においても血清グラニュライシンが上昇していることを報告した(Saito N,Murata J et al., Br J Dermatol in press)。薬剤過敏性症候群では、SJS/TENと比較して紅斑発症後20日後まで血清グラニュライシンの上昇が遷延していた。今後も全国の医療機関からの血清収集を引き続き行っており、さらにサンプル数を増やして検討する。原因薬剤刺激における発現増強するmRNAおよびタンパクの検討:重症薬疹および通常薬疹患者のPBMCに原因薬剤を添加刺激し、その後PBMCのmRNAを採取した。また、重症薬疹と健常人の表皮細胞からmRNAを採取しこれらのmRNAを用いてDNA microarrayを施行した。重症薬疹と通常薬疹のデータを比較したところ、表皮細胞では、TNF superfamily 14, MHC class2 DQ beta1が健常人に比較して重症薬疹で優位に上昇しておりシークエンスを実施し更なる検討を進めている。症例数の蓄積は順調に進んでおり、種々の重症薬疹における早期診断マーカーの同定も行うことができた。また、DNA microarrayにおいて新規診断マーカーや病態の本質に関与しうる因子を数種類同定することができた。以上の理由により、研究計画はおおむね順調に進展していると考える。今後は、重症薬疹以外の種々の病態(通常型薬疹、GVHD、および全身性ウィルス性発疹症など)における早期診断マーカーの挙動を症例の蓄積により解析し、本マーカーの特異度を検討する。また、DNAマイクロアレーによって絞られた新規候補因子の解析を進め、病変部皮膚におけるマーカーおよびその受容体の発現検討(免疫染色・RT-PCR等)、細胞内シグナルの検討および患者血清を用いた血中濃度動態の検討を進める。

本年度は、マイクロアレー法にて薬疹関連マーカーの新規候補因子を絞った時点で終了しており、これらの解析が次年度での主な遂行項目となる。病変部皮膚におけるマーカーおよびその受容体の発現検討(免疫染色・RT-PCR等)、細胞内シグナルの検討および患者血清を用いた血中濃度動態の検討を進めるべく各種試薬の購入を必要とする。また、症例がさらに増えた場合にはマイクロアレー法を施行し、さらなる候補因子の同定や、現時点で考慮している新規因子の再現性・信頼性を検討する。平成23年度未使用額の発生理由:DNAマイクロアレーにて同定された薬疹関連マーカーの新規候補因子のシークエンスや発現検討を平成23年度に見込んでいたが、当該年度では一部遂行できなかった。よって、残った部分の検討を平成24年度に行うため、未使用額を全額平成24年度に使用予定である。
ナノ・マイクロ熱物性センシング工学の確立と応用

ナノ・マイクロレベルのエネルギー・運動量・物質輸送物性(熱伝導率,温度伝導率,粘性係数,表面張力,拡散係数,ソーレー係数)を包括的にセンシング可能なナノ・マイクロ熱物性センシング技術群を開発し,従来にない時空間分解能と精度で高度化することによって,次世代シーケンサーやMEMSセンサー等への工学的応用を開拓し,ナノ・マイクロ熱物性センシング工学と呼べ新たな学術創出に足る知見を得るに至った。平成24年度は独自に開発を行ってきたナノ・マイクロレベル熱物性センシング技術の高度化を行い、下記に示す成果を得た。さらに新たな工学的応用の可能性を示した。(1)レーザー誘起表面波法の開発:12光束干渉の干渉縞間隔や鮮明度等の光学条件を最適に設定した。即時センシングシステムを新たに導入することで、1分以内での採血-分析システムを構築した。2新しい数値解法を提案し、測定精度を飛躍的に向上することに成功した。本提案により広範な温度範囲で粘性率変化の高感度リアルタイムセンシングを実現した。(2)近接場光学熱物性顕微鏡の開発:1時間相関シングルフォトンカウンティングシステムを導入し、空間分解能:200nm以下かつ時間分解能:数十ピコ秒での温度センシング手法を確立した。2単一DNA分子に対する配列解読を目的として、ナノポア近傍でのナノ物質輸送の観察とプラズモンを利用した局在増強電場発生に取り組んだ。電子ビーム照射により、シリコンメンブレンに直径10nm前後のナノポアを形成し、紫外光照射による蛍光修飾単一DNAのナノポア通過を検出した。また電気泳動を用いて、直径4050nmのナノポアに対して直径40nmの金ナノ粒子を挿入し、数nmの空隙を持つナノスリット構造を形成した。金ナノ粒子からの二光子励起発光を通して、空隙にプラズモン局在増強電場が生じていることを確認した。高感度アッセイ法の開発を目的として、金ナノ粒子複合体の識別検出技術の高度化に取り組んだ。単一粒子からの散乱信号の強度と偏光回転のダイナミクスから総合的に判断することにより、特に二量体間距離に敏感な計測を実現した。(3)ソーレー強制レイリー散乱法の開発:12光束干渉によって励起された液体試料の高速な濃度生成・緩和過程をセンシングする手法を確立し、ミリ秒オーダーで拡散係数・ソーレー係数(ばらつき2%)の同時測定を実現した。平成25年度は前年度までに開発したセンシング技術の更なる深化を行い、ナノ・マイクロレベル熱物性センシング技術の基盤体系の確立を行った。また次年度の前倒しとして工学応用の予備的検討を行った。(1)リプロン表面光散乱法の開発:1励起光入射角度可変システムにより、リプロン波長を選択的にセンシングすることが可能となった。本手法により1μm1.5 mmまでの広範なリプロン波長域の測定が可能となり、表面揺らぎスペクトルスコピー技術を確立するに至った。2酸素含有ナノバブル水と窒素含有ナノバブル水に提案手法を適用し、気体元素の違いによる表面粘弾性質の違いを明らかにすることに成功した。(2)環境制御型周期加熱サーモリフレクタンス法の開発:1励起光と観察光の形状および位置を高精度にコントロールすることで、厚さ1001000nmの高温超伝導薄膜の熱伝導率測定が可能となった。22501000nm厚のYBCO薄膜に提案手法を適用し、5300Kの温度域における熱伝導率-温度依存性を測定することに成功した。(3)ナノ・マイクロ熱物性センシングの工学応用の予備的検討:ナノポアを基盤とした液中物質輸送制御と単一分子DNAシーケンサへの応用に取り組んだ。紫外光照射下で、蛍光標識した長さ10kbpの長鎖DNAを直径7nm前後のナノポアに通過させ、その通過過程と通過後の拡散過程を観測した。特にZ偏光紫外光励起を導入することにより、空間分解能として30nm程度を実現し、通過過程と拡散過程を分離観察できることを実証した。主たる知見として、印加電圧と通過速度の強い相関を見出した。DNA検出の高分解能・高感度化を目指し、プラズモニックナノポア(ナノポア・金属ナノ粒子複合構造)の形成、評価を継続して実施した。構造形成の歩留まりを向上させ、また簡便な構造評価方法として光学異方性の検出が適切であることを明らかにした。本年度は,前年度までに開発してきたセンシング技術の更なる高度化(精度・時空間分解能の向上)を行うとともに,ナノ・マイクロレベル熱物性センシング技術の工学的応用を行った。1.高熱伝導性ナノコンポジットの開発:(1)垂直配向カーボンナノチューブにパリレンを気相合成し,熱伝導性の高いコンポジットの作製に成功した。(2)フォトサーマル赤外検知法の高度化を行った。感度解析の結果,加熱用レーザーの最適な周波数範囲を決定した。(3)高熱伝導性ナノコンポジットの熱伝導率測定を行い,提案手法の有効性を明らかにした。(4)パリレン気相合成技術に着目し,新しい熱伝導率センシング手法(パリレン蒸着型非定常細線法)を考案し,その妥当性を実験的に明らかにした。2.光MEMS熱物性センサーの開発:(1)試料の振動状態等の擾乱に追従してセンシングが可能なトラッキングシステムを提案し,高い安定性で試料の粘性率をセンシングすることが可能となった。

(2)オートフォーカシング技術をセンサーに実装し,手振れによる焦点ズレの影響を低減することに成功した。本提案手法により,振動場や試料の設置状態に依存しない新しい粘性率センシング手法が実現した。3.ナノ・マイクロ熱物性センシングの工学的応用:(1)数nm径の貫通孔(ナノポア)を有するメンブレンを用い,シーケンサへの応用を目指したDNA通過過程の光学的検出・ダイナミクス計測技術の開発を行った。シリコンメンブレンと紫外光励起をベースとした高時間分解能による通過過程観察に成功し,光学的測定の優位性を示した。(2)集束イオンビームによってナノポアを形成した窒化シリコンメンブレンに金ナノ粒子を充填するプラズモニック・ナノポアの作製技術を確立した。さらに,酸化アルミニウム被膜によってメンブレンの帯電を制御し,DNAの通過速度を低減(S/Nの向上)できることを実証した。平成27年度は前年度までに開発してきたセンシング技術の更なる深化・高度化を行い,従来の古典的測定方法では適用が不可能な系において,計測パラメータの拡張と工学的応用を実現した。具体的な研究成果を下記に示した。1.結合輸送現象センシング技術の開発:ソーレー強制レイリー散乱法を深化させ,従来法では測定が極めて困難であった3成分溶液での結合輸送現象センシング技術を構築した。(1)試料の屈折率ー波長依存性を利用し,異なる波長の観察用レーザーを導入することで,複数のパラメータを分離して測定可能なセンシング技術を確立した。(2)炭化水素系のベンチマーク試料等を用いた3成分系溶液の結合輸送現象を観察し,妥当性を実験的に明らかにした。2.周期加熱サーモリフレクタンス法の深化:周期加熱サーモリフレクタンス法の高精度化と高感度化を行い,熱伝導率異方性センシングやデバイス劣化その場モニタリングの実現可能性を示した。(1)高感度信号検出を実現する光学システムを構築するとともに,試料面内方向の熱物性情報を高感度に測定可能な試料形状を決定し,その妥当性を実験的に明らかにした。(2)金バンプ劣化メカニズムの解明を目指し,劣化に伴う界面熱抵抗変化をモニタリング可能な光学システムと劣化加速試験装置の構築を行った。3.ナノ・マイクロ熱物性センシングを用いた様々な工学的応用:本研究課題の最終年度に予定している実用化に向けた実証実験を前倒しし,様々な工学的応用を試行した。(1)ナノポアDNAシーケンサへの応用を想定した液中物質輸送制御に取り組み,制御メカニズムを明らかにすることに成功した。(2)金ナノ粒子局在表面プラズモン共鳴による相変化誘起の観察を行い,熱的・非熱的相変化を選択的に制御可能な実験条件を明らかにした。平成27年度は研究計画のすべての項目を達成している。更に,これまでに深化・高度化を行ってきた革新的センシング技術を用いて新たな工学的応用を開拓し,下記に示す当初計画していた以上の知見を得るに至った。(1)セミクラスレートハイドレートの熱伝導率ー温度依存性の解明:開発したパリレンコート型非定常細線法を深化させ,適切な計測プロトコルを確立し,ハイドレート生成状況を光学的に観察しながら高精度に熱伝導率を測定することが可能となった。(2)MEMS熱物性センサーの開発:バイオ分野への適用を目指し,MEMS熱物性センサーを開発した。
ストレス顆粒の生理的意義の解明と皮膚老化への関与

細胞は特定のストレス刺激に応答してストレス顆粒と呼ばれる一過性の構造体を形成し、不要不急のmRNAの翻訳を停止することで、ストレス存在下での生存を図る。ストレス顆粒形成は酵母から哺乳動物に至るまで保存され、生物の基本的なストレス応答機構であると考えられる。酵母では低栄養で容易にストレス顆粒形成が観察されるのに対し、哺乳動物では生理的ストレスによるストレス顆粒形成は観察されにくく、哺乳動物細胞が日常的に暴露される生理的ストレス下でのストレス顆粒形成の意義は未だ曖昧である。そこで本研究では前年度までに、ストレス顆粒形成を促進あるいは抑制する低分子化合物の探索を行った。皮膚由来の培養細胞であるHaCaT細胞、およびがん細胞としてHeLa細胞を用いてストレス顆粒形成を制御する低分子化合物の探索を行った結果、両細胞間で得られた化合物が大きく異なった。特に、HeLa細胞を用いたスクリーニングからは、ストレス顆粒形成を強く抑制する化合物が3種類同定されたため、はじめにそれら3種類の化合物によるストレス顆粒形成抑制の分子機構を解析し、がん細胞の抗がん剤感受性への影響を検証した。本年度は、皮膚細胞におけるストレス顆粒形成に焦点を当て、様々な生理的ストレスによる皮膚細胞でのストレス顆粒形成を検証した。次に、ストレス顆粒形成能が加齢性に変化するかを検証した結果、老化した細胞では、ストレス顆粒形成能が低下する傾向が見られた。そこで、HaCaT細胞を用いた化合物スクリーニングによって得られたストレス顆粒形成を促進する化合物で、人工的に老化細胞にストレス顆粒形成を誘導すると、細胞老化が抑制されるかどうかを現在検証中である。また、老化によるストレス顆粒形成能への影響を個体レベルで検証するため、ヒト早老症を模倣したモデルノックインマウスを二系統樹立し、皮膚において顕著な老化が見られることを確認した。細胞は、特定のストレス刺激に応答してストレス顆粒と呼ばれる一過性の構造体を形成し、不要不急のmRNAの翻訳を停止することで、ストレス存在下での生存を図る。ストレス顆粒形成は酵母から哺乳動物まで保存され、生物の基本的なストレス応答機構であると考えられるが、酵母では低栄養で容易にストレス顆粒形成が観察されるのに対し、哺乳動物では生理的ストレスによるストレス顆粒形成は観察されにくい。そのため、哺乳動物細胞が日常的に曝露される生理的ストレス下におけるストレス顆粒形成の意義は未だ曖昧である。そこで本研究では、高感度のストレス顆粒形成アッセイ系を構築し、ストレス顆粒形成を促進、抑制する低分子化合物の探索を始めに行う。次に、得られた化合物を用いて、皮膚細胞におけるストレス顆粒形成の生理的意義を明らかにするとともに、老化により低下した皮膚細胞のストレス顆粒形成能の回復が治療的に有用かを検証する。平成28年度は、はじめにHaCaT細胞においてSplit-GFPの系(GFP1-10にTIA1を、GFP11にG3BPを融合させ、ストレス顆粒形成が誘導され両者が会合した時にのみ緑色蛍光が観察される系)を用いて、ストレス顆粒形成を高感度、定量的、簡便に評価するアッセイ系の樹立を試みた。しかしながら、樹立した細胞株では細胞を刺激しなくてもストレス顆粒形成が誘導されてしまった。これは、TIA1及びG3BPの細胞内発現量が過剰であるためと考えられるため、安定発現細胞株のシングルセルクローニングを行い、最適な細胞の選択を行っている。次に、HaCaT細胞に東京医科歯科大学が所有する化合物ライブラリーの低分子化合物を投与し、ストレス顆粒形成を誘導する化合物の探索を行い、ストレス顆粒形成を誘導する候補化合物を数種類得ることに成功した。さらに、HeLa細胞を用いて、ストレス顆粒形成を抑制する化合物も数種類同定した。平成28年度は、ストレス顆粒の好感度で簡便なアッセイ系の樹立と、ストレス顆粒形成を誘導・促進あるいは抑制する化合物の探索、獲得を当初の目標としていた。アッセイ系の樹立に関しては、細胞株樹立には至ったものの、感度の面で充分とは言えず、最適化を図っている段階である。一方、ストレス顆粒形成を制御する化合物の探索に関しては、誘導する化合物、抑制する化合物の候補をそれぞれ数種類得ることに成功した。さらに、皮膚の老化とストレス顆粒の関係を解析するための加齢促進マウスの作製にも着手した。具体的には、CRISPR法を用いてヒトの二種類の早老症モデルマウスの作製を目指しており、順調に推移している。そこで本研究でははじめに、ストレス顆粒形成を促進あるいは抑制する低分子化合物の探索を行う。次に、得られた化合物を用いて、皮膚細胞におけるストレス顆粒形成の生理的意義を解析するとともに、老化によるストレス顆粒形成能への影響とその分子機構の解析を行う。前年度までに、皮膚由来の培養細胞であるHaCaT細胞、およびがん細胞としてHeLa細胞を用いてストレス顆粒形成を制御する低分子化合物の探索を行った結果、両細胞間で得られた化合物の種類が大きく異なった。

特に、HeLa細胞を用いたスクリーニングからは、ストレス顆粒形成を強く抑制する化合物が3種類同定された。そこで今年度はそれら3種類の化合物によるストレス顆粒形成抑制の分子機構を解析し、がん細胞の抗がん剤感受性への影響を検証した。また、老化によるストレス顆粒形成能への影響を個体レベルで検証するため、ヒト早老症を模倣したモデルノックインマウスを二系統樹立した。そのうち一系統のマウスに関して、基本的解析を行った結果、老化モデルマウスは、体重が約15%軽く、白髪、脱毛、筋肉の萎縮が早期から見られ、平均45週で死亡することがわかった。平成28年度は、構築した細胞アッセイ系を利用してストレス顆粒形成を制御する低分子化合物のスクリーニングを行い、いくつかの候補化合物を得た。平成29年度はそれらの化合物によるストレス顆粒形成の制御機構の解析と、その結果細胞に生じる影響について検証を行った。本研究では、当初、得られた化合物を皮膚細胞におけるストレス顆粒形成の解析、および老化との関連の検証に利用する予定であったが、化合物スクリーニングを行った結果、ストレス顆粒形成を制御する化合物の種類は、細胞の種類によって全く異なることが明らかになった。このことから、ストレス顆粒形成の分子機構は、細胞の種類(個体においては組織の種類)によって、それぞれ異なることが予想される。これは、研究開始時には全く想定していなかった結果である。そこで、平成29年度は、当初は予定しなかった、がん細胞におけるストレス顆粒形成制御と、抗がん剤感受性に着目した解析も行った。また、平成29年度は、前年度から行ってきた早老症モデルマウスの作製を完成させた。細胞は特定のストレス刺激に応答してストレス顆粒と呼ばれる一過性の構造体を形成し、不要不急のmRNAの翻訳を停止することで、ストレス存在下での生存を図る。ストレス顆粒形成は酵母から哺乳動物に至るまで保存され、生物の基本的なストレス応答機構であると考えられる。酵母では低栄養で容易にストレス顆粒形成が観察されるのに対し、哺乳動物では生理的ストレスによるストレス顆粒形成は観察されにくく、哺乳動物細胞が日常的に暴露される生理的ストレス下でのストレス顆粒形成の意義は未だ曖昧である。そこで本研究では前年度までに、ストレス顆粒形成を促進あるいは抑制する低分子化合物の探索を行った。皮膚由来の培養細胞であるHaCaT細胞、およびがん細胞としてHeLa細胞を用いてストレス顆粒形成を制御する低分子化合物の探索を行った結果、両細胞間で得られた化合物が大きく異なった。特に、HeLa細胞を用いたスクリーニングからは、ストレス顆粒形成を強く抑制する化合物が3種類同定されたため、はじめにそれら3種類の化合物によるストレス顆粒形成抑制の分子機構を解析し、がん細胞の抗がん剤感受性への影響を検証した。本年度は、皮膚細胞におけるストレス顆粒形成に焦点を当て、様々な生理的ストレスによる皮膚細胞でのストレス顆粒形成を検証した。次に、ストレス顆粒形成能が加齢性に変化するかを検証した結果、老化した細胞では、ストレス顆粒形成能が低下する傾向が見られた。
トランスポゾン・タッギングによるジベレリン情報伝達系に関わる調節遺伝子の探索

発芽時に、イネでは植物ホルモン・ジベレリン(GA)が主要な役割を担う。この際発現する、様々なGA誘導型の遺伝子のひとつである、α-アミラーゼ遺伝子の発現を指標として、トランスポゾン・タッギングによるGA情報伝達系の調節遺伝子の探索を行った。[変異体の検出]Ac系統と、RAmy1A/GUS系統を交配した無胚半切種子をGAで処理し、胚乳デンプンの糖化の程度とGUSの発現レベルが正常より遅れる固体を検出した。残りの胚切片は、1/2MS、スクロース培地上で生育させ、発芽の進行度と幼植物の形態を観察した。15固体の独立のF1植物から得たF2種子のうち、約800粒のスクリーニングを行い、GA応答や発芽時の発生・成長に関与すると考えられる変異体を検出した。これらはa)RAmy1A/GUSの誘導が遅延する変異、b)乳胚の糖化が起こらない変異、c)発芽の遅延、あるいは発芽しない変異であり、全体の27.5%でいずれかの変異が観察された。[変異の遺伝とAcとの連鎖]変異系統(F2世代)で観察された表現型は約60系統のF2植物より得られた自殖F3種子1000粒のうち、ほぼ全てのF3種子において、遺伝していた。これら顕著な表現型を持つ17系統を選び、サザン法によりAcとの連鎖を調べた。合計270固体のF3植物を解析したうち、表現型の分離と一致するAcは観察されなかった。これらはAcの新たな挿入によるものではなく、過去にAcの活発な挿入、再転移により蓄積された変異と考えられた。[変異の固定]胚乳の糖化が遅延する変異を持つ系統の一部では、Acはすでに存在しないが、変異がほぼ固定し、生化学的解析に供し得る系統が得られた。また、遺伝解析を行うために、戻し交配を行い、F1種子を得た。この変異はGAの刺激により、Ca^<2+>を介してアミラーゼの翻訳・分泌を制御する経路に関わる遺伝子である可能性が高い。