hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
再発頭頸部扁平上皮癌のIGF-1R, EpCAMを中心とした網羅的ゲノム解析

また結果の分析も同様に行う予定でいる前年度に引き続き、頭頸部扁平上皮癌症例(口腔癌、中下咽頭癌、喉頭癌)症例の生検検体および切除検体に対して次世代シークエンサーを用いて腫瘍の遺伝子発現状態を網羅的にチェックしている。また本年度より頭頸部癌全般に対してp53も対象遺伝子として次世代シーケンサーによる解析を行った。p53の変異から機能を定義し、それと予後との関係性を解析した。カルテより頭頸部扁平上皮癌症例で初回治療を当院で行った症例のうち再発をきたし、その病変に対してsalvage手術を行った症例を抽出した。抽出した症例の初診時に病変より採取した生検材料および初回治療として手術を行った症例では切除検体を利用した。それらの検体から採取したサンプルをシークエンサーにかけ、腫瘍の遺伝子発現状況を調べている。上記症例に対して同様に再発腫瘍もしくは放射線治療後の残存病変に対して切除をおこなった症例に対して上記と同様の検討を行う。salvage手術によって得られた検体をシークエンサーで調査する。昨年度に引き続き、EpCAM, IGF-1Rについて免疫染色を用いて初診時と再発時の発現状況を比較検討している。対象は同様に上記で解析を行った症例としている。初診時検体および再発検体に対してEpCAMとIGF-1Rの免疫染色を用いてタンパクの発現状況を調査した。この解析に関しても昨年度と同様の傾向はでておりEpCAMは再発腫瘍でより強く発現している傾向がある。次年度も症例の蓄積を行っていく。予定の解析症例数に後れをとっており、次年度への引き続きの研究が必要である。現時点では初診時病変、再発病変におけるEpCAMの発現の変化には一定の傾向が認められつつあり、興味深い結果が得られそうである。次年度も引き続き同様に解析を行っていく。頭頸部癌におけるp53の発現や変異と予後の関係に関してはp53の発現状況をunfavorable functionとadverse functionと分類して定義した。それらと予後との関係を検討し研究成果として発表の予定である。研究の症例数はまだ少ないものの解析自体は順調に行えていると考えているので、今後は症例数を蓄積し検討結果を出していく予定である。実験に関しては当初の予定通り行えている。引き続き次年度も行うが最終年度となるので結果の解析と解釈も並行して行っていく予定でいる。こちらに関しても研究期間中に終了できる予定でいる。実験に関しては当初の通り行えているものの症例数の蓄積で予定症例数より少ない状況である。引き続き次年度も研究を継続させていただき最終年度として結果の解析と解釈も並行して行っていく予定でいる。基本的な推進方策に変更はなく、次年度内に終了できる予定でいる。また結果の分析も同時に行い、臨床情報との比較を行い解析結果の分析を行う予定でいる。研究の症例数が計画よりも少なくやや遅れをとっているために差額が生じている。
ポートフォリオ評価の実証的研究-評価基準づくりと自己評価力の形成過程の解明-

ポートフォリオ評価については、欧米では80年代からすでに実践されているが、我が国では萌芽的研究であるので、実際の授業実践過程においてその理論と方法の有効性を確かめることが必要である。こうしたことから、特に総合的学習においてその典型的な授業づくりを通して、ケーススタディ研究をもとにして明らかにしようとした。その方法については次の通りである。(1)愛知県のA市のT小学校で総合的学習のカリキュラム開発とポートフォリオ評価を試み、その実践過程で、元ポートフォリオ、凝縮ポートフォリオを実践し、また自己評価アンケートとを実施し、分析した。(2)アメリカのウイスコンシン、及びコロラド大学等の機関を訪問し、ポートフォリオの実践についての資料収集と文献収集等を行い、その先行成果についてまとめた。(3)日本の小・中学校での総合的学習についての中心校で各研究紀要物を集め、その評価について特に自己評価カードを分析しまとめた。ポートフォリオ評価を有効に実践するために、具体的評価基準(ルーブリック)が必要であり、また学習者本人の自己評価活動、相互評価活動にポートフォリオを活用することをによって互いに学び合い高め合う授業づくりが不可欠で、その過程でこそ有効な活用が可能になることを、特に下記の点との関係で実証的に明らかにした。(1)評価基準の具体化--ルーブリック(具体的評定指標)づくりの必要性と子どもの評価活動への参加。(2)授業づくりの実践過程で、評価基準の内面化、共有化、更新を図る。(3)自己評価力を育てる(客観化)のために、相互評価、評価基準の重要性(4)総括的評価として、デジタル化したCD-ROMづくりを凝縮ポートフォリオとして作成した。また、本研究との関連で『確かな力を育てるポートフォリオ評価の方法と実践』黎明書房2003年2月)を発刊し、そこに成果をまとめた。本研究は大きく次の3つの方向で着手し、成果をあげつつある。(1)愛知県下のA市のT小学校(実践協力校)5年生(2クラス50名)で、総合的学習のカリキュラム開発、実践づくりを行いポートフォリオ評価を試みた。子ども達がファイルをもとに自己評価活動・相互評価活動を行い、「コミュニケーション力」についてルーブリックを共に考え、評価基準づくりに参加し、更新していった。子どもと共に創った評価基準を用いて、再評価活動を行うという、新しい「提案授業」を試みた。また、7月と11月に子どもに自己評価力についてアンケートを実施し、分析した。(2)アメリカのウィスコンシン州、コロラド州、インディアナ州を訪問し、ティーチングポートフォリオの実物を収集し、評価のためのスタンダードやルーブリックについての資料を収集し、現在分析中である。(3)日本の小・中学校で、いくつかのすぐれた実践校を取り上げて、総合的学習の評価や通知票についての工夫を各学校の研究紀要物を収集し、分析中である。こうしたことから、特に総合的学習においてその典型的な授業づくりを通して、ケーススタディ研究から明らかにした。

(3)自己評価力を育てる(客観化)のために、相互評価、評価基準の重要性(4)総括的評価として、デジタル化したCD-ROMづくりを凝縮ポートフォリオとして作成した。また、本研究との関連で『確かな力を育てるポートフォリオ評価の方法と実践』黎明書房2003年2月)を発刊し、そこに成果をまとめた。
糸球体足細胞最終分化維持機構の解明と糖尿病性腎症に対する新規治療応用の開発

本研究では、代謝性ストレスを中心とした種々の足細胞障害性ストレスに対して、ビタミンDが最終分化段階を維持することを通じて保護作用を発揮するとの仮説を検証し、その機序を明らかにすることを目的としている。これまでに、in vivoでの検討においてparicalcitolが実際にストレプトゾトシン糖尿病マウスにおけるアルブミン尿を抑制することを観察した。また、in vitroでの検討では、温度感受性不死化マウス足細胞を分化条件で培養し、細胞障害性ストレスとしてTGF-β1やlipopolysacchalide (LPS)などを培養上清を添加、一方でvehicleまたは活性型ビタミンD(paricalcitolまたはcalcitriol)も加え、足細胞における細胞周期調節蛋白の発現や、細胞骨格の変化について検討を行っている。使用している培養細胞にはビタミンD受容体が発現していることが確認されており、活性型ビタミンDの存在下で受容体の発現が誘導されることが観察された。細胞周期調節蛋白のうちp21などいくつかの分子でTGF-β1存在下で発現の変化が認められ、活性型ビタミンDはその変化を抑制する方向に作用することが見出されている。また、スリット膜関連蛋白の中にも有意な変化を呈するものがあり、その機序については今後検討する予定である。TGF-β1は培養足細胞の細胞骨格および細胞形態を変化させるが、現在phalloidin染色を用いて詳細な検討を加えている段階にある。今後、変化の見られた分子についてsiRNAなどの手法を用いて、当該分子が細胞骨格や分化状態の維持にどのように関与しているかを詳細に検討する予定である。初年度は培養細胞を用いたin vitro実験で複数の活性型ビタミンD製剤と病的ストレス刺激を選択し条件検討を行ったのち、細胞周期調節蛋白・スリット膜関連分子・細胞内シグナル伝達分子についてその発現変化を検討し、ビタミンDによる足細胞保護作用に関連する可能性のある分子を選択することができた。次年度以降はその分子機序について検討を深める予定である。今後は細胞周期および分化度の検討(ウエスタンブロッティング、MTSアッセイ、スクラッチアッセイ等)および細胞骨格の詳細な検討を進めるとともに、いくつかの候補分子に絞って細胞内メカニズムの検討に移行する予定である。初年度の結果を基盤とした候補分子について、さらにmRNAレベル・蛋白レベルでの変化を複数回の実験により確認を行い、その後シグナル伝達経路をsiRNAを用いて特定の分子をノックダウンすることにより検討をする。この過程でリン酸化蛋白等に対するウエスタンブロッティングを行う。シグナル伝達経路が明らかになったところで、その増幅機構の検索を行う。その上で可能であればノックアウトマウスの作成とそれを用いたin vivoの実験による証明も行いたいと考えている。当該年度は培養細胞を用いた実験が多くを占め、当研究室既存の培養細胞および細胞培養用試薬、mRNA発現解析用の定量PCR用試薬(プライマーを含む)等を使用することができたため、初年度としては想定よりも少額の支出で実験を遂行することができた。

しかしながら、2019年度以降は、ウエスタンブロッティングや免疫沈降、組織染色などに用いる抗体を含む新規試薬の購入および培養細胞用試薬に多額の支出が必要であると見込まれる。
軟骨内骨化におけるレチノイン酸シグナルの機能解析

本研究は、レチノイン酸シグナルの軟骨内骨化における役割の解明を目的として、細胞レベルあるいは実験動物レベルでの検討を行った。結果、軟骨細胞で主な役割を果たすレチノイン酸受容体RARγを活性化させることで、軟骨細胞の増殖や分化が阻害されることが判明した。また、逆にRARγを抑制することで軟骨細胞の成熟が進み、動物レベルでは軟骨内骨化が促進され、骨形成の増進が認められた。更にこの過程では、多くの分子の関与が確認された。平成28年度は申請時の計画通り、「軟骨内骨化におけるRARγの転写アクティベーターとしての機能解析」を遂行した。具体的には、1初代培養のマウス軟骨細胞を用いたRARγアゴニスト添加による影響の解析を遺伝子発現の評価を中心に行い結果を得た。22週齢マウスにRARγアゴニストを投与し、その成長に対する影響の評価を行った。1においては、RARγアゴニストの添加により48時間後には軟骨細胞の形態に変化が認められた。これは他のレチノイン酸受容体に対するRARαおよびRARβアゴニストの添加では見られない変化であり、軟骨細胞においてはRARγがレチノイン酸シグナルの主要な役割を担っていることが示唆された。また、遺伝子発現の評価においてもRARγアゴニストによる特異的な変化が確認され、これによりRARγは軟骨細胞の成熟を促進させることが示された。2においては、RARγアゴニスト投与によりマウスの成長が特異的に阻害されることが明らかとなった。これは1と同様に、他の受容体アゴニストの投与では見られない変化であり、培養軟骨細胞で確認された変化が実際に生体でも生じている事を示唆する結果であった。以上の結果は2年間に渡る本研究計画において基盤となる結果であり、且つこれまでに報告されていない新たな知見である。これらの結果を基に申請計画の通り、更なる解析が必要であるが、現在までのところ期待された通りに成果を得ていると断言できる結果であった。平成28年度は申請時の計画通りに研究が進捗した。また、得られた結果もおおむね当初に期待していた通りであり、順調に進んでいる。本研究は、レチノイン酸受容体であるRARγの軟骨内骨化における機能を包括的に検討することを目的としている。そこで、RARγを特異的に活性化するアゴニストを用いて軟骨細胞への影響や、動物に投与した際の影響について調査するとともに、アンタゴニスト投与による骨の治癒促進効果について検討を行った。初年度である28年度には、RARγによって軟骨細胞分化が抑制されることを確認し、発生段階のマウスへアゴニストを投与することで軟骨内骨化により形成される骨の成長が阻害されることを確認した。また、この過程では多くの軟骨関連遺伝子の発現に変化が生じる事が明らかとなり、アンタゴニストによってこれらとは逆の影響があること、すなわち軟骨内骨化の促進が生じる可能性が確認された。最終年度となる29年度には、RARγによって制御される遺伝子を網羅的に探索するため、高速シークエンサーをもちいてRNAシークエンスを行った。具体的にはRARγアゴニスト投与を行った軟骨細胞と、投与しない軟骨細胞で発現するRNAの違いを検討した。この実験にあたっては、アゴニストによるオフターゲット効果を除去する目的で、RARγを欠損したマウスからも軟骨細胞を採取し同様の解析を行い、より精度高くRARγの下流で働く因子の探索を試みた。この結果、これまでの研究によってすでに関係の証明されている因子に加え、多くの因子がRARγの活性化により影響を受けている事が明らかとなった。また、骨欠損の治癒に対してRARγアンタゴニストの投与が有意に効果があるということをマウスを用いた実験で明らかにした。現在は、RNAシークエンスにて得られた膨大なデータの解析を進めており、軟骨形成における新たな遺伝子ネットワークを示すべく多面的なアプローチで検討している。合計2年間の研究計画であるが、初年度である平成28年度が順調に計画通り進行したことから、大きな計画の変更などは必要ないと思われる。今後も当初の計画に基づき研究の遂行に努める。解剖学
ヒトゲノムにおけるAlu配列の遺伝性疾患，遺伝的多様性に与える影響に関する研究

Alu配列はヒトゲノム中の100万コピー以上もあるとされ、全ゲノムの約10%を占める。Alu配列は霊長類の進化とともに出現した。Alu配列はこれまで意味のない配列と考えられてきたが、最近その機能についての知見がすこしづつ報告されてきている。イントロン内のAlu配列が近傍エクソンのスプライシングに与える影響について解析した。ACAT1遺伝子イントロン9へ、元々イントロン6に存在したAlu配列のタンデムに並んだ配列を逆方向(AluYcーAluSzーAluSxの順)で挿入した場合、miniーgene splicing実験でエクソン10をスキップさせることを見いだしていた。このAluYcーAluSzーAluSxを1つのAluSxのみとしてもエクソン10スキップが生じた。一方同じイントロン10の上流に存在した正方向のAluJoを取り除くと、エクソン10をスキップする効率は低下した。続いてAluSxの位置をエクソン10に近づけるとスキップする効果が強くなった。このようにイントロン上の逆方向に挿入されたAlu配列はその位置、周りのAluの存在に影響されつつエクソン10スキップを来すことが明らかになった。HMG-CoA lyase欠損症について、MLPA法を確立し、通常の遺伝子解析で一方の変異を同定出来なかった2例についてMLPA法で解析し、1例ではヘテロ接合でのエクソン2ー4の欠失を証明し、その切断点のイントロン1側がAlu配列内であることを明らかにした。またもう1例ではMLPA法の結果から、Alu配列の関与する遺伝子再構成ではなく、Uniparental disomyが病因であることが示唆され、マイクロアレイ解析にて証明することが出来き,平成27年度に論文化できた。27年度が最終年度であるため、記入しない。申請者はこれまで小児科の先天代謝異常症および臨床遺伝を専門として、ケトン体代謝異常症の分子病態の解析を行ってきた。その中でAlu配列間での非同一相同組換えによる複数のエクソンの欠失、挿入などの遺伝子再構成を伴う症例を経験し、Alu配列に注目してきた。25年度の新学術領域研究の『ゲノムを支える非コードDNA領域の機能』における研究に引き続き、ACAT1遺伝子イントロン9へAlu配列を挿入した際のエクソン10認識に与える影響について解析をすすめた。Alu配列の特徴によるのかAluを含むスプライシングベクターの構築に時間がかかっているが、現在イントロン9へ挿入したAlu配列を1コピーにしたconstruct、上流に元々存在するAlu配列を欠失しステムループ構造をとらなくしたconstruct、Alu配列の位置をよりspliceacceptor siteに近づけたconstructなど複数のmini-gene constructsを作成しているところである。これらの発現実験を今後行う予定である。HMG-CoA lyase欠損症について、MLPA法を確立した。そして通常の遺伝子解析で一方の変異を同定出来なかった2例についてMLPA法で解析し、1例ではヘテロ接合でのエクソン2ー4の欠失を証明し、その切断点のイントロン1側がAlu配列内であることを明らかにした。またもう1例ではMLPA法の結果から、Alu配列の関与する遺伝子再構成ではなく、Uniparental disomyが病因であることが示唆され、マイクロアレイ解析にて証明することが出来た。連携研究者の遠藤によるbioinformaticsによるAlu配列のイントロン内の位置とalternative splicingを受けるエクソンとの関連についての解析は進行中である。

またもう1例ではMLPA法の結果から、Alu配列の関与する遺伝子再構成ではなく、Uniparental disomyが病因であることが示唆され、マイクロアレイ解析にて証明することが出来き,平成27年度に論文化できた。本来であればすでに多様なConstructsを作成を終了し、スプライシング実験を行っているはずであるが、Constructの作成に時間をとられてまだスプライシング実験にはいれていない。Constructsを作成することが律速段階であり、効率の良い遺伝子変異導入法の導入により、Constructs作成を進めたい。27年度が最終年度であるため、記入しない。上述のように変異導入法を改善し、Alu配列の位置、向き、数などとその下流のエクソンの認識についての解析をすすめ、論文としてまとめれるようにする。連携研究者によるバイオインフォーマティクスからは、alternative splicingを起こすエクソンの上流にAlu配列が多く存在し、その位置がどのように存在するかについて解析し,発現実験系の結果との比較をおこなう。
薬剤性腎障害におけるアポトーシス誘動と腎障害発現防御に関する研究

アポトーシスによる細胞死は遺伝子によってプログラムされた自発的機構であり、個体の発生過程や恒常性維持における役割が明らかにされている。近年、種々の疾患や病態にアポトーシスの関与することが指摘されてきている。我々は既に、シスプラチンによる腎障害の発現にアボトーシスの関与することを示唆した。本研究では、腎障害性薬物の作用部位として重要な近位尿細管細胞のモデル系であるブタ腎由来培養上皮細胞LLC-PK_1を用い、薬剤性腎障害におけるアポトーシス誘導と腎障害発現防御に関する検討を行った。1.アミノグリコシド系抗生物質及び免疫抑制剤シクロスポリンAで処理したLLC-PK_1細胞におけるアポトーシス誘導:コンフルエントに達したLLC-PK_1細胞を種々の濃度のゲンタマイシン及びシクロスポリンAで処理したところ、断片化DNAによるラダーの形成が認められた。同様の条件で処理したLLC-PK_1細胞の核クロマチンを、DNA特異的に結合する蛍光色素を用いて観察したところ、アポトーシスに特徴的なクロマチンの凝集が認められたことから、ゲンタマイシン及びシクロスボリンによってアボトーシスの誘導されていることが明らかになった。同条件下で培養を継続したところ、培養液中へのLDH遊離、及び細胞ホモジネート中の頂側膜酵素活性の低下が認められたが、シスプラチンの場合とは異なり細胞タンパク量の減少は認められなかった。2.腎障害発現防御に関する検討:還元型グルタチオンはインビボ動物実験において、シスプラチンの腎障害を軽減することが報告されている。そこで、LLC-PK_1細胞をシスプラチンとグルタチオンで同時処理したところ、細胞障害の発現及びアポトーシス誘導は共に抑制されることが明らかになった。
西アフリカにおけるイモ類資源の再評価

西アフリカのヤムイモとキャッサバについて、育種と栽培面からの生産性の向上を検討するとともに、ポストハーベストの実態を明らかにして作物資源としての経済的発展性について研究を行った。これまでの研究により「ヤムイモの周年栽培」の試験栽培に成功した他、ヤムイモ種苗生産の新手法である「挿し木技術を用いたミニ塊茎生産技術」を確立させた。これらの結果は海外学術誌、日本熱帯農業学会、日本アフリカ学会、国際ヤムイモワークショップで発表した。また、これらの研究は産経新聞(平成20年8月29日朝刊)、NHKBS放送(同9月25日)今日の世界の特集「気候変動最前線:ヤムイモは地球を救う」、NHKBS放送(平成21年4月25日)特集番組「イモは世界を救う」で紹介された。東京農業大学、鹿児島大学、国際熱帯農業研究所(IITA:ナイジェリア)およびサバンナ農業研究所(SARI:ガーナ)の連携協力を具体的な形とし、日本の先進的な研究開発力とIITAおよびSARIの実践的な技術開発力を有機的に連動させながら研究を開始した。特に、西アフリカのヤムイモとキャッサバについて、育種と栽培面からの生産性の向上を検討するとともに、ポストハーベストの実態を明らかにして作物資源としての経済的発展性について調査を行った。主な成果は次のとおりである。1.ヤムイモ種苗生産技術の研究について、適応品種の選別、挿し木増殖法の改良の実証試験を行い、実用的な生産技術であることを確認した。2.ヤムイモの周年栽培を農家レベルで試行し、ナイジェリアのWatershed Initiative in Nigeria (WIN 2001:NGO)と共同でイモ類と稲作の2毛作の実証試験を開始した。3.ヤムイモとキャッサバの貯蔵および流通技術の改善について、貯蔵、流通および加工実態、ポストハーベストに関する調査をナイジェリアとガーナで実施した。4.新技術の普及における農家経済への影響に関して、伝統的営農様式を踏まえた新技術普及ポテンシャルの解析と農家の経営戦略指針を作成するための調査をガーナで実施した。5.小規模農家の所得向上に関する研究について、ナイジェリアの小農を対象にイモ類の種苗生産および周年栽培技術の研修をSasakawa Africa Association/IITAヤムイモ普及プロジェクト(20052007年)(共同研究員の菊野日出彦がリーダー)と行った。この活動を基にして共同研究員の菊野が申請していた日本ODA小規模無償資金協力によるヤムイモ種苗増産・加工センタープロジェクト(20062008年)が採択された。東京農業大学、鹿児島大学、国際熱帯農業研究所(IITA:ナイジェリア)および作物研究所(CRI:ガーナ)の連携協力を具体的な形とし、日本の先進的な研究開発力とIITAおよびCRIの実践的な技術開発力を機能的に連動させながら研究を行っている。1.ヤムイモ種苗生産技術の研究について、挿し木増殖法が実用的な技術であることを確認し、実用化に向けた研究を開始した。2.ヤムイモの周年栽培を農家レベルで試行し、ナイジェリアのWatershed Initiative in Nigeria(WIN2001:NGO)と共同でイモ類と稲作の2毛作の実証試験を行っている。3.ヤムイモとキャッサバの貯蔵および流通技術の改善について、貯蔵、流通および加工実態、ポストハーベストに関する調査をナイジェリアとガーナで実施し、FAO統計と現状の乖離の乖離を明らかにした。5.小規模農家の所得向上に関する研究について、ナイジェリアの小農を対象にイモ類の種苗生産および周年栽培技術の研修をIITA(共同研究員の菊野日出彦がリーダー)と行った。この活動をソフトウエアにして日本ODA草の根無償資金協力によるヤムイモ種苗増産・加工センタープロジェクト(20062008年)が開始された。東京農業大学、鹿児島大学、国際熱帯農業研究所(IITA:ナイジェリア)および作物研究所(CRI:ガーナ)の連携協力を具体的な形とし、日本の先進的な研究開発力とIITAおよびCRIの実践的な技術開発力を機能的に連動させながら研究を行った。1.ヤムイモ種苗生産技術の開発は実証試験を終了して普及へ移した。

2.ヤムイモの周年栽培を農家レベルで試行し、その結果を海外学術誌に発表した。3.ヤムイモとキャッサバの貯蔵および流通技術の改善について、貯蔵、流通および加工実態、ポストハーベストに関する調査をナイジェリアとガーナで実施し、その結果を学会で報告した。4.新技術の普及における農家経済への影響に関して、伝統的営農様式を踏まえた新技術普及ポテンシャルの解析と農家の経営戦略指針を作成するための調査をガーナで実施し、取りまとめを行った。5.小規模農家の所得向上に関する研究について、ナイジェリアの小農を対象にイモ類の種苗生産および周年栽培技術の研修をIITA(共同研究員の菊野日出彦)と行った。これらの結果は産経新聞(平成20年8月29日朝刊)、NHKBS放送(同9月25日)今日の世界の特集「気候変動最前線:ヤムイモは地球を救う」、NHKBS放送(平成21年4月25日)特集番組「イモは世界を救う」で紹介された他、平成20年12月14日にチューリヒ工科大学で行われた国際ヤムイモワークショップで発表した。
調節性分泌の分子機序と内分泌代謝性疾患の発症・病態への関与

本研究では、グラニュフィリンという分子が関わる新たな分子間相互作用を見出し、分泌穎粒の細胞膜ドッキングの分子機構をマウス個体レベルで解明した。またインスリンとグラニュフィリンを別々に蛍光標識した細胞で、分泌穎粒の動態を全反射顕微鏡で高速に画像取得する系を確立した。この系を用いて、分泌穎粒の開口放出に関わる分子の機能を生細胞で解析できる。また、Rab27エフェクター分子エキソフィリン7とエキソフィリン8が、それぞれ、細胞膜に接着していない非ドッキング穎粒の開口放出、穎粒の細胞深部から皮質部アクチン網への輸送に関与することを明らかにした。これまで申請者らは、Rab27aおよびそのエフェクターgranuphilinが、膵β細胞インスリン顆粒の細胞膜ドッキングと融合の制御に重要な役割を担うことを示してきた。しかしその後、全反射顕微鏡を用いた、生きた膵β細胞における顆粒の開口放出現象の観察により、分泌様式は必ずしも一様ではなく、これを裏打ちする複数の分子機序の存在が示唆された。そこで本研究では、調節性分泌経路で働く低分子量GTPase Rab27a/bとそのエフェクター分子exophilinsを中心とした、分泌小胞開口放出に関する分子基盤を解明する。この目的のために、(1)Rab27a、granuphilin等に結合する分子群のプロテオミクス解析による網羅的同定、(2)生細胞における、小胞膜局在分子の分泌小胞細胞内動態に及ぼす影響の解明、(3)機能解明が進んでいないRab27エフェクター、およびこれらと相互作用する分子に関する遺伝子欠損動物の作製・表現型解析、を行う。これまでわれわれは、低分子GTPase Rab27aのエフェクターGranuphilinが、インスリン顆粒を細胞膜に定常的に接着(ドッキング)させるのに必須の分子であることを、そのノックアウトマウスに由来する膵β細胞を解析して明らかにした。しかしその分子基盤の詳細は不明である。そこで、Granuphilinと膵β細胞内で複合体を形成する分子の探索を行っている。これまでGranuphilinは、Rab27aの他にSyntaxin-1a、Muucl8-1と結合することを示したが、これら分子は必ずしも同時にGranuphilinと結合せず、構成要素が異なるGranuphilin複合体の存在がわかってきた。現在、これら複数の複合体が分泌過程でどのように形成され、異なる役割を有しているのか、を解析している。また、未知の構成因子を同定する目的で、タグをつけたGranuphiiinを膵β細胞株に過剰発現し、pull-down法を行い、プロテオミクス解析を行っている。また膵β細胞には、別のRab27aエフェクターExophilin8が発現しているが、その機能は明らかでない。Exophilin8を過剰発現すると、Granuphilinの場合とは異なる細胞内特定部位に、インスリン顆粒が集積し、またその開口放出数も影響を受けることがわかった。現在、この変化がどのような分子基盤で起こるのか、相互作用する分子の探索を行っている。これまで我々は、低分子量GTPase Rab27aのエフェクター分子granuphilinが、インスリン顆粒を細胞膜に定常的に接着(ドッキング)させ、次の膜融合過程を抑制していることを明らかにした。本所見は分泌小胞の定常的ドッキングが次の膜融合に必須の前過程である、というこれまでの定説を覆すものである。実際、全反射顕微鏡を用いた単一顆粒レベルでの開口放出過程の観察により、非ドッキング顆粒からの開口放出を認めている。そこでドッキングと膜融合の関係を分子レベルで明らかにするために、granuphilin欠損膵β細胞に、種々のgranuphilin変異体を導入して、開口放出の変化を全反射顕微鏡で解析している。具体的には、Rab27a,syntaxin-1a,Munc18-1,細胞膜リン脂質と親和性を欠失した変異体や、翻訳後修飾を失わせた変異体を、欠損細胞に発現させ、細胞膜ドッキングやその後の膜融合に必須の分子間相互作用を解析している。またこの目的のために2色で全反射顕微鏡観察を行う系を確立した。これまで我々は、低分子量GTPase Rab27aのエフェクターgranuphilinが、インスリン顆粒を細胞膜に定常的に接着(ドッキング)させ、次の膜融合過程と抑制していることを明らかにした。本過程に関与する分子として、granuphilinが親和性を示す、細胞膜に局在するリン脂質やsyntaxin-1a/Munc18-1複合体があげられる。我々は、これら分子との親和性を特異的に喪失させたgranuphilin変異体を見出し、これをgranuphilin欠損膵β細胞株に発現させた。その結果、細胞膜リン脂質との結合が、granuphilinの分泌顆粒ドッキング作用に必須であることがわかった。

またgranuphilinは、syntaxin-1a以外の細胞膜局在syntaxinsとも相互作用することが判明し、これら複数のsyntaxinsとMunc18-1からなる複合体が開口放出を調節していることが示唆された。実際、syntaxin-1a欠損マウス由来の膵β細胞は、granuphilin欠損マウス膵β細胞とは異なる表現型を示した。すなわちsyntaxin-1a単独の欠損では、ドッキング障害が認められず、上記in vitroの結合実験で得られた知見を支持する結果が得られた。現在、上記変異型granuphilinの顆粒動態と開口放出に対する影響や、granuphilin/syntaxin-1aダブル欠損マウス膵β細胞の表現型を詳細に解析している。低分子量GTPase Rab27aのエフェクターGranuphilinは、インスリン顆粒細胞膜ドッキングに必須の分子であるが、これまで本分子は、顆粒膜上のRab27aと細胞膜上のSyntaxin-1aを架橋することによって分泌顆粒を定常的に細胞膜にドッキングさせると考えられてきた。申請者らは、Syntaxin-1a欠損マウスを新たに解析し、その膵β細胞におけるドッキング顆粒は、Granuphilin欠損マウス膵β細胞のそれに比し、ごく軽度に減少しているにすぎず、Granuphilinは、細胞膜上の他のSyntaxin-2,3とも相互作用して顆粒のドッキングを仲介している可能性を示した(Wang et al.,J.Biol,Chem.2011)。また、X染色体上に局在するGranuphilin遺伝子の発現量が、視床下部など特定部位の脳において著明な性差があり、本遺伝子が性特異的な行動を制御していることを欠損マウスを用いて示した(Xu et al,Ce11 2011)。さらにRab27a欠損膵β細胞とGranuphilin欠損膵β細胞のインスリン分泌における表現型が異なることから、Rab27aの別のエフェクターの機能を探索した。その結果、Exophilin7が膵β細胞に特異的に高発現し、非ドッキング顆粒の開口放出に関与しているという知見を見出した(投稿準備中)。このように、インスリン顆粒の開口放出に関与すると考えられる分子の作用機序、機能的意義に関する新知見を見出した。われわれは、低分子量GTPase Rab27aおよびそのエフェクター分子granuphilinが、インスリン顆粒膜に局在し、その開口放出機構に関与することを示してきた。しかし、それぞれの分子の機能を失活させた遺伝子変異マウス膵β細胞の表現型が異なる(具体的には、Rab27a変異マウスが分泌低下、細胞深部の顆粒数低下を示すのに対し、granuphilin変異マウスは分泌亢進、細胞膜直下の顆粒消失を示す)ことから、granuphilin以外のエフェクター分子が存在し機能していることが示唆された。われわれは、Rab27エフェクターの1つexophilin7が、膵β細胞に特異的に発現し、granuphilinが細胞膜に接着したドッキング顆粒の開口放出を制御するのとは対照的に、あらかじめ細胞膜に接着していない非ドッキング顆粒の開口放出を促進することを見出した。またこのexophilin7の機能は、そのC2Aドメインが細胞膜リン脂質に対する結合活性を有していることに依存していることを見出した。
Metablic Surgeryにより糖尿病が改善する分子メカニズムの解析

糖尿病モデルラットを用い、種々の肥満手術モデルを作成することに成功した。十二指腸-空腸バイパス手術、Roux-en Yバイパス手術により、体重減少と耐糖能が改善することを確認した。Sleeve手術では耐糖能も体重減少も確認できなかった。消化管ホルモンの変化は確認できなかった。また、十二指腸-空腸バイパス手術、Roux-en Yバイパス手術により憩室化した十二指腸粘膜が萎縮することを明らかにした。今後は小腸粘膜からのRNA抽出及び遺伝子発現の変化確認を行う予定である。肥満手術としてのGastric bypass手術で糖尿病が治癒することが数多く報告され、米国糖尿病学会ガイドラインではBMIの高い症例では糖尿病治療としての肥満手術が推奨されている。Gastric bypass手術により術後初期よりインスリンの分泌が正常化することが報告され、その原因にGLP-1やGIPなどのインクレチンと総称されるホルモンの関与が示唆されているが、それらホルモンが術後に上昇するメカニズムの詳細は明らかでない。手術により血糖が低下する原因を動物実験で明らかにすることで、糖尿病治療における手術治療の確立につなげることを目的に本研究を行っている。OLEFTrat(2型DMモデル)を用い、十二指腸-空腸バイパス手術を行い、血糖が低下する効果を明らかにできた。また、組織採取も順調に進んでいる。今後ヒートマップの作成を行い、小腸粘膜の遺伝子発現の変化を検討する予定である。十二指腸ー空腸バイパス手術の手術や各種検体採取の際に予測していない死亡が多々あり、手技が安定するまでに時間を要した。手技が安定した後は概ね順調で、十二指腸ー空腸バイパス手術で体重減少がもたらされる前に高血糖が改善することが明らかになった。また血液や小腸粘膜等の採取は順調にすすんでおり、胃ー空腸バイパス手術やSleeve手術も安定して行うことができるようになった。手術により血糖が低下する原因を動物実験で明らかにすることで、糖尿病治療における手術治療の確立につなげることを目的に研究を行った。平成27年度は糖尿病モデルラットの作成を行った。OLFTErat (CCK受容体欠損による過食⇒肥満、2型糖尿病モデル)を用い、糖尿病発症を確認したのちに手術を行った。手術は十二指腸-空腸バイパスとsham手術を行い、手技の安定化に成功した。OGTT試験では、十二指腸-空腸バイパス手術で有意に耐糖能が改善することが明らかになった。平成28年度は、胃-空腸バイパス(Roux-en Y法)とSleeve手術(SG)モデルの作成を行った。いずれも手技確立に難渋し、胃-空腸バイパス(Roux-en Y法)のみ研究を継続した。sham手術と比較し、有意に耐糖能が改善するが、十二指腸-空腸バイパス手術とは有意差は認めなかった。手技安定に時間を要し、腸粘膜の遺伝子発現のヒートマップを作成するまでには至らなかったが、H-E染色では小腸粘膜に大きな変化は認めなかった。今後も本研究を継続し、遺伝子発現のヒートマップを作成する予定である。手技が安定したため、採取した組織などの検体が十分量集まった後に、抽出したRNAを用いてマイクロアレイ法によるRNA発現解析を行う。偽手術ラットにおけるRNA発現と比較し、遺伝子発現のヒートマップの作成を行う。また、ヒートマップで最もインスリン関連遺伝子の発現が増加していた部位の小腸粘膜よりクリプトを分離する。単離したクリプトをRT-PCRを用いて、小腸上皮のLGR5やBmi1などのStem cell markerの発現を確認する。また、インスリン遺伝子、neuroD、pax4、nkx6.1などの膵β細胞の分化・成熟に重要な転写因子の発現を観察し、インスリン産生細胞への分化の確認を行う。消化器外科
運動時におけるクレンチングによる顎口腔系および聴覚系への影響について

本研究,クレンチングと顎機能異常の関連を明らかにする基礎的研究として,クレンチングが中耳機能に及ぼす影響を検索したところ若干の知見を得たので報告する.被験者は,顎口腔系に異常を認めず,耳疾患の既往のない健常者歯顎者8名(2128歳,以下,健常者)である.クレンチング時の筋活動量の測定は,Muscle Balance Monitor BM-II (GC社製,以下,BM-II)を用い,柳田の報告に準じ,左右側閉口筋活動の非対称性指数(A.I.)の絶対値が11を越える者5名10耳(以下,BM+群)と11以下の者3名6耳(以下,BM-群)の2群に分類した.中耳機能の測定は,Impedance Meter MA-4000(モリタ社製)を用い,Tympanometry 4測定項目static compliance,impedance,press,ear clearance (以下,STC,IMP,PRS,EAC)とした.2群における安静時および最大噛みしめ時のSTC,IMP,PRS,EACについて比較検討を行った結果,BM-群では,4項目すべてにおいて有意な変化は認められなかった.BM+群では,最大噛みしめ時においてSTCに減少傾向が認められ,また,危険率5%にてPRSの有意な増加が認められた.顎機能異常や咬合接触状態の有用な評価法の一つとして左右側閉口筋活動の非対称性指数(A.I.)が示唆されている.演者らは,健常者におけるA.I.値の大きさに着目し,その相違による中耳機能への影響の検索を行ったところ以上の結果を得た.BM+群ではBM-群に対しA.I.値が大きいことから,いわゆる健常者の範疇にあるものの左右閉口筋筋活動量の非対称性が推察される.この筋活性の不調和が最大噛みしめ時における鼓膜張筋の収縮とそれにともなう鼓膜のstiffを生み,また,同時に鼓膜の内陥作用による中耳腔圧の上昇が惹起されたものと推察された.なお今回のこの報告は、平成10年度第99回補綴学会にて発表する予定である.本研究,クレンチングと顎機能異常の関連を明らかにする基礎的研究として,クレンチングが中耳機能に及ぼす影響を検索したところ若干の知見を得たので報告する.被験者は,顎口腔系に異常を認めず,耳疾患の既往のない健常者歯顎者8名(2128歳,以下,健常者)である.クレンチング時の筋活動量の測定は,Muscle Balance Monitor BM-II (GC社製,以下,BM-II)を用い,柳田の報告に準じ,左右側閉口筋活動の非対称性指数(A.I.)の絶対値が11を越える者5名10耳(以下,BM+群)と11以下の者3名6耳(以下,BM-群)の2群に分類した.中耳機能の測定は,Impedance Meter MA-4000(モリタ社製)を用い,Tympanometry 4測定項目static compliance,impedance,press,ear clearance (以下,STC,IMP,PRS,EAC)とした.2群における安静時および最大噛みしめ時のSTC,IMP,PRS,EACについて比較検討を行った結果,BM-群では,4項目すべてにおいて有意な変化は認められなかった.BM+群では,最大噛みしめ時においてSTCに減少傾向が認められ,また,危険率5%にてPRSの有意な増加が認められた.顎機能異常や咬合接触状態の有用な評価法の一つとして左右側閉口筋活動の非対称性指数(A.I.)が示唆されている.演者らは,健常者におけるA.I.値の大きさに着目し,その相違による中耳機能への影響の検索を行ったところ以上の結果を得た.BM+群ではBM-群に対しA.I.値が大きいことから,いわゆる健常者の範疇にあるものの左右閉口筋筋活動量の非対称性が推察される.この筋活性の不調和が最大噛みしめ時における鼓膜張筋の収縮とそれにともなう鼓膜のstiffを生み,また,同時に鼓膜の内陥作用による中耳腔圧の上昇が惹起されたものと推察された.なお今回のこの報告は、平成10年度第99回補綴学会にて発表する予定である.
偏光走査近接場光学顕微鏡による結晶性高分子薄膜の局所構造評価

ポリエチレン(PE)等の結晶性高分子の結晶構造は、結晶性高分子が示す典型的な凝集構造である。試料として等温結晶化した高密度ポリエチレン(HDPE)薄膜を用いた。HDPE薄膜のクロスニコル下での偏光顕微鏡(POM)観察ではマルテーゼクロスと共に周期が約3 μmの消光リングを有する直径が約100μmの球晶が観察された。HDPE薄膜の原子間力顕微鏡(AFM)像には同心円上の周期的な起伏が観察され、この起伏の周期はおよそ3μmで、消光リングのそれとほぼ一致することから、この起伏はラメラのねじれに対応していることが明らかとなった。HDPE薄膜の消光リングと表面の起伏の相関を評価するため、クロスニコル下で偏光近接場光学顕微鏡(偏光NSOM)観察を行った。偏光NSOM像では、POM像と同様のマルテーゼクロスと消光リングが観察された。消光リングの周期はおよそ3μmであり、POM像における消光リングの周期と一致した。一方、NSOMの形態像では、AFM像と同様の周期的な起伏が観察され、この起伏の周期は偏光NSOM像で観察された消光リングの周期と一致している。このことから、表面の起伏に対応して光学的性質が変化し、ラメラ中の分子鎖軸(c軸)は、表面起伏の高い部分では膜表面に対して平行に、表面起伏の低い部分では膜表面に対して垂直に配向していることが明らかとなった。また、HDPE薄膜球晶表面の非晶部を除去するために過マンガン酸カリウムの濃硫酸溶液を用いてエッチングした。表面エッチングしたHDPE薄膜をクロスニコル下でPOM観察すると、マルテーゼクロス及び消光リングが観察された。同心円状の起伏の高低差は、エッチングの前後で大きくなった。これらのことより、結晶化過程でHDPE薄膜の極表面に非晶成分が析出することが示唆された。エッチング後のHDPE薄膜の偏光NSOM像は明確な消光リングを示し、表面の凹凸と明確な相関を示した。
ハチアレルギーにおける重症度マーカーの解析とIgEをターゲットとした治療の研究

ハチアレルギー患者における重症度マーカーを解析するために、末梢血好塩基球からのLTC4、Histamine、PGD2の分泌を測定した。その結果、ハチアレルギー患者は健常人に比べ、ハチ毒特異的にLTC4及びHistamineの分泌克進が認められたが、重症度との相関は得られなかった。一方、ハチアレルギーマウスモデルによる抗IgE抗体の有効性について解析した結果、抗IgE抗体はハチ毒によって産生された血清総IgE値を減少させ、その効果持続期間は2-3週間以内であった。また、抗IgE抗体はアナフイラキシー症状の出現を抑え、牌細胞からのLTC4分泌やTh2型サイトカイン産生を抑制し、Thl型サイトカイン産生を誘導した。この結果、抗IgE抗体はアナフイラキシーの発症予防に有効である可能性が示唆された。ハチアレルギー患者における重症度を予測するマーカーを解析するために、スズメバチまたは、アシナガバチに刺され、血清ハチ特異的IgE抗体陽性の12例{全身皮膚症状のみ(軽症)3例、呼吸器症状を呈した(中等症)2例、アナフィラキシーショック(重症)7例}の患者から末梢血好塩基球、及び単核球を採取した。これらの細胞に対しハチ毒エキス、またはPMA+ionomycinで刺激し、1時間後の好塩基球培養上清中のロイコトリエンC4、ヒスタミンとプロスタグランディンD2濃度をEIA法で、ハチ毒エキス刺激24時間後の好塩基球、及び単核球培養上清中のIL-4、IL-13の濃度をELISA法で解析した。その結果、6例(軽症2例、中等症1例、重症3例)の患者において、抗原(ハチ毒エキス)特異的にロイコトリエンC4、及びヒスタミン濃度の著名な産生増加が認められたが重症度に一致しなかった。また、抗原刺激による単核球からのサイトカイン産生は、全てのハチアレルギー患者において認められなかった。今回、残り6例の患者でロイコトリエンC4とヒスタミン産生亢進が認められなかった理由として、検査時においてハチ刺傷1か月以内もしくは2週間以内にステロイド投与されていることが考えられた。本年度の研究から、ハチアレルギーの診断における好塩基球からのロイコトリエンC4やヒスタミン値を測定することは、ハチアレルギーの補助的診断の一つの方法として重要であると考えられた。しかし、重症度マーカーとして将来的に使用できるかどうかを明らかにすることはできなかった。今後、症例数を増やすことと共に、上記化学伝達物質以外にトリプターゼや血小板活性化因子(PAF)の測定や、各種サイトカイン産生においてもメッセージレベルで詳細に解析する必要性があると考えられた。ハチアレルギーマウスモデルを作成し、ハチ毒のアナフィラキシー反応における抗IgE抗体の有効性について、in vivoおよびin vitroに大別して解析した。In vivo;ハチアレルギーマウスモデルの作成において、8周令のBalb/cマウスにハチ毒エキス(Wasp; 10μg/ml)0.25mlをDay0およびDayl4に腹腔内注射(感作)し、Day27に抗IgE抗体10μg/匹。または対照として抗IgG抗体10μg/匹を腹腔内投与した。そして、Day28にWasp; 10μg/ml 0.25ml腹腔内投与前および投与30分後に体温測定と、血清のLTC4濃度を測定(EIA法)するために採血を行った。その結果、抗IgG抗体処置群ではWasp投与後の体温は投与前と比較し、有意(p<0.05)な低下(37.7±0.23 vs 37.2±0.36°C)を認めた。一方、抗IgE抗体処置群では、Wasp投与前および投与後の体温に変化(37.8±0.33 vs 37.8±0.23°C)は認められなかった。また、Wasp投与30分後の血清LTC4値は、抗IgG抗体処置群に比べ抗IgE抗体処置群で、有意(p<0.05)に抑制(180.7±10.5 vs 28.1±14.3pg/ml)された。In Vitro ; Waspで感作した抗IgG抗体または抗IgE抗体処置マウス脾細胞(1×10^6個/ml)において、Wasp(10μg/ml)で刺激・培養した。そひて、48時間後に培養上清中のサイトカイン(IL-4, IL-13, IFN-γ)産生量についてELISA法で解析した。

その結果、抗IgE抗体処置群では抗IgG抗体処置群に比較し、IL-13産生の有意(p<0.05)な抑制(8.4±2.5 vs 18.2±4.8pg/ml)およびIFN-γ産生の有意(p<0.05)な促進(13.5±2.3 vs 6.5±3.8pg/ml)が認められた。一方、IL-4産生において、これらの抗体処置群間で有意な違いは認められなかった。これらの結果から、抗IgE抗体はハチアレルギーにおける全身アナフィラキシー反応を抑制し、更にLTC4分泌やTh2型サイトカインを抑制し、Th1型サイトカインを誘導することが考えられた。以上より、抗IgE抗体はハチアレルギーのアナフィラキシーの発症予防に有効であることが示唆された。
マウス及びヒト抗c-erbB2抗体を用いたヒト腫瘍治療実験モデルの作製

平成7年度は前年度にc-erbB-2の発現に関して検索した乳癌株、胃癌株を用いてc-erB-2遺伝子産物に対するマウスモノクローナル抗体(mu4D5)と、その抗体の可変領域を含めすべての蛋白をヒト型に置き換えたc-erB-2ヒトモノクローナル抗体(rhu4D4)に関して、in vitro,in vivoにおける抗腫瘍効果を比較検討した。1.c-erbB-2発現ヒト乳癌株SK-BR-3に対する抗体の直接的な増殖抑制をMTTアッセイをもちいて検討した。rhu4D5,mu4D5ともに0.1-100ug/mlの濃度でSK-BR-3に対して増殖抑制を示したが、rhu4D5はmu4D5に比較して増殖抑制の程度は低かった。2.SK-BR-3およびc-erbB-2発現ヒト胃癌株4-1STに関して、マウス脾細胞、ヒト末梢血単核細胞とrhu4D5,mu4D5の組み合わせによるADCCを^<51>Cr放出法を用いて比較した。SK-BR-3、4-1STに対して、rhu4D5とヒト末梢血単核細胞を用いたときに最も強い細胞傷害性が認められた。SK-BR-3に対してはマウス脾細胞とmu4D5の組み合わせで軽度の細胞傷害性が見られたが、4-1STに対してはマウス脾細胞とmu4D5の組み合わせを含め他の組み合わせではADCCが認められなかった。また、c-erbB-2非発現株に対してはADCCを認めなかった。3.4-1ST移植SCIDマウスにrhu4D5,mu4D5を投与し腫瘍の増殖抑制をin vivoで検討したところ両抗体とも増殖抑制効果を示したが、mu4D5でより強い増殖抑制が見られた。c-erbB-2非発現株に対しては両抗体とも増殖抑制は認めなかった。4.4-1ST静注SCIDマウスにrhu4D5とヒト末梢血単核細胞を投与し、転移性肺癌からのマウスの延命効果を検討したところ、ヒトIgG投与対照に比較してわずかに延命効果が認められたが、mu4D5の延命効果には遠く及ばなかった。平成6年度は乳癌、胃癌、肺癌等のヒト腺癌株に関して、Western blot法とNortherm blot法を用いてc-erbB-2遺伝子産物の発現を比較検討した。さらに重症免疫不全(SCID)マウスへの可移植性を比較・検討し、SCIDマウスに可移植性ののc-erbB-2強発現ヒト胃癌株4-1STと、対照としてSCIDマウスに可移植性のc-erbB-2非発現ヒト胃癌株St-15を選択、以下の結果を得た。(1)ヒト腫瘍のマウス移植性に対するマウス型抗体の影響:0.2x10^5個、あるいは1x10^5個の4-1STをSCIDマウス皮下に移植し、c-erbB-2遺伝子物産に対するマウス型モノクローナル抗体“mu4D5(12mg)を投与した場合には、4-1STはSCIDマウス皮下に腫瘍を形成する事はなかったが、対照としてHB virusに対するモノクローナル抗体HBs(12mg)を投与した場合には、全てのSCIDマウスに皮下腫瘍を形成した。

(2)ヒト腫瘍の増殖抑制に関するマウス型抗体の影響:5x10^5個の4-1ST、あるいはSt-15をSCIDマウスに移植し、100-300mm^3の皮下腫瘍を形成させた後、36mg/kgの4D5あるいはHBsをSCIDマウスに投与した。4-1STでは、4D5を投与した場合、一時腫瘍の大きさは減少したが、その後徐々に増大した。しかし、HBsを投与した場合には腫瘍の大きさは減少しなかった。一方、St-15では、4D5あるいはHBsを投与した場合、腫瘍の大きさは減弱しなかった。さらに、36mg/kgの4D5を連続投与した場合、4-1STでは10日間以上にわたり、腫瘍の大きさが減少した。(3)転移性肺腫瘍形成抑制に対するマウス型抗体の影響:4-1ST(1x10^6個)をマウス尾静脈から投与し、36mg/kgの4D5あるいはHBsを投与した。HBsを投与した場合には4D5投与後40-80日間で全てのマウスが肺転移腫瘍により死亡したが、4D5を投与した場合には全てのマウスが180日以上生存し、肺転移は見られなかった。平成7年度は前年度にc-erbB-2の発現に関して検索した乳癌株、胃癌株を用いてc-erB-2遺伝子産物に対するマウスモノクローナル抗体(mu4D5)と、その抗体の可変領域を含めすべての蛋白をヒト型に置き換えたc-erB-2ヒトモノクローナル抗体(rhu4D4)に関して、in vitro,in vivoにおける抗腫瘍効果を比較検討した。1.c-erbB-2発現ヒト乳癌株SK-BR-3に対する抗体の直接的な増殖抑制をMTTアッセイをもちいて検討した。ruh4D5,mu4D5ともに0.1-100ug/mlの濃度でSK-BR-3に対して増殖抑制を示したが、rhu4D5はmu4D5に比較して増殖抑制の程度は低かった。2.SK-BR-3およびc-erbB-2発現ヒト胃癌株4-1STに関して、マウス脾細胞、ヒト末梢血単核細胞とrhu4D5,mu4D5の組み合わせによるADCCを^<51>Cr放出法を用いて比較した。SK-BR-3、4-1STに対して、ruh4D5とヒト末梢血単核細胞を用いたときに最も強い細胞障害性が認められた。SK-BR-3に対してはマウス脾細胞とmu4D5の組み合わせで軽度の細胞傷害性が見られたが、4-1STに対してはマウス脾細胞とmu4D5の組み合わせを含め他の組み合わせではADCCが認められなかった。また、c-erbB-2非発現株に対してはADCCを認めなかった。3.4-1ST移植SCIDマウスにrhu4D5,mu4D5を投与し腫瘍の増殖抑制をin vivoで検討したところ両抗体とも増殖抑制効果を示したが、mu4D5でより強い増殖抑制が見られた。c-erbB-2非発現株に対しては両抗体とも増殖抑制は認めなかった。4.4-1ST静注SCIDマウスにrhu4D5とヒト末梢血単核細胞を投与し、転移性肺癌からのマウスの延命効果を検討したところ、ヒトIgG投与対照に比較してわずかに延命効果が認められたが、mu4D5sの延命効果には遠く及ばなかった。