hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
提携形ゲーム理論を用いた都市内における物流共同化の実現可能性と環境改善効果の分析

(2)共同輸送を行った場合の費用配分問題を、すべての事業者が共同化に参加する経済的な動機を持つ場合(コアが非空)と、持たない場合(コアが空)に分けて検討した。まず、コアが非空の場合に、事業者間で技術力の格差が存在することを想定して、シャプレイ値による利得配分の方法の有効性を分析した。このために3人ゲームで、事業者間での技術格差の組み合せを全ケース列挙し、シャプレイ値がコアに含まれないケースを抽出するとともに、コアに含まれるための改善方法を提案した。一方、コアが空である場合に、提携形ゲーム理論の最小コアの考え方を用いて、すべての事業者による共同化の実現に必要な補助金の算出方法を示した。この際、共同化への参加による環境負荷軽減への貢献度を考慮するために、各事業者ヘウェイトを与えた。そして、ある条件下ではウェイトに依存せず補助金の総額は一定となること、また同条件を満たさない場合は、事業者間での部分的な共同化を阻止するための追加費用を含んだ補助金が必要となること、事業者にウェイトを与えることにより拠出される補助金の総額が抑制できることを示した。
移行期ベトナムにおける高等教育民営化の実験

本研究では、体制移行のなかで進む民営化に伴って誕生してきた多様な高等教育機関類型に焦点を当てながら、主として管理運営のあり方に対する実態的側面からの検討を通じて、ベトナムにおける大学類型別の分化の実態と全体としての高等教育システムの特質を明らかにすることを目的とする。こうした目的のもと、平成25年度では、主として1高等教育制度の検討、2新類型の大学に関する実態面の検討、そして3体制移行に伴う高等教育の変容を分析するための前提となる理論の検討の3点から研究を進めた。具体的な成果として、1については主として大学入試制度改革や大学教授職の任命制度について検討した。その成果としては、おおまかな方向性として大学自律性の拡大みられるものの、入試問題の作成や大学教授職の任命に関して強い国家的統制が働いていることが明らかになった。2については、ハノイ市に滞在し(2014年9月、2015年3月)、相対的に高い自律性を享受する個別の大学や国家的シンクタンクである教育科学院を対象に聞き取り調査を実施した。制度的検討で明らかにしたように、入試問題の作成や大学教授職の任命といった特定のことがらに関する権限は国家が一貫して所掌しているものの、民営化の潮流のもと財源調達や教員人事に関する項目を中心にかなりの程度自主裁量が認められるようになっていることが明らかになった。そして3については、中国と旧ソビエトを中心に、体制移行に伴う教育変容の項目として主として高等教育民営化と大学自律性に着目して比較的検討をおこなった。両国とも高等教育の民営化を進める一方、大学自律性の拡大状況には差異が確認された。こうした作業を通じて、体制移行という事象は、一方でその経済的な側面として高等教育の民営化。営利化を促進するものであり、他方で政治体制の民主化は、一定程度の学術的側面の自由化を生じさせるものであるという仮説が得られた。26年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では、体制移行のなかで進む民営化に伴って誕生してきた多様な高等教育機関類型に焦点を当てながら、主として管理運営のあり方に対する実態的側面からの検討を通じて、ベトナムにおける大学類型別の分化の実態とそれを包含する高等教育システムの特質を明らかにすることを目的とする。こうした目的のもと、平成25年度では、主として1高等教育制度の検討、2新たな大学類型に関する実態面での検討、そして3体制移行に伴う高等教育の変容を分析するための前提となる理論の検討の3点から研究を進めた。具体的な成果として、1については近年の制度的改革の方向性としては大学の自律性の向上、私塾大学の営利的活動の抑制、そして政府・共産党による大学への関与の維持・強化に集約される。2については、ハノイ市に滞在し(2013年10月11月、2014年3月4月)、国家的にとりわけ重要な大学とされる国家大学をはじめ、私塾大学であるタンロン大学など多数の大学を対象として聞き取り調査を実施した。現地調査を通じて明らかになったのは、営利型に加え、私塾大学では非営利型の類型でも、教育関連の企業と提携することで営利活動を一定の枠内でおこなっているということである。ただし、こうした動きは政府のお墨付きを得た一部の国立大学にも存在している。3については、ベトナム高等教育の出発点となる「ソビエト・モデル」を分析した。その特徴の1つである高等教育行政構造に着目して中国を比較対照に置いた結果、ベトナムでは現在でも、所管省庁と傘下の大学が人事や予算の点で複雑に結びついている状況が存在することが明らかになった。以上の研究成果は、高等教育の民営化の潮流のもと、ベトナムが、大学の公共性の担保と、市場化が進むなかで生じる営利性の均衡点を探ろうとしている実態が明らかになった点で意義のあるものといえる。

26年度が最終年度であるため、記入しない。平成25年度には、国内外での関連資料の収集とその分析、現地での聞き取り調査の実施を通じて、研究課題に積極的に取り組んだ。具体的には、新たな機関類型である私塾大学の形成過程や、南北ベトナム統一期の高等教育の変容、中国との比較によるベトナム高等教育行政の特徴の析出といった点で、学会発表や投稿論文の形式で成果を挙げることができた。これらの成果はほぼ所期の進捗状況にあると評価することができる。初年度に引き続き、制度・実態・理論の3点から研究を遂行する。制度的検討に関しては、平成25年度の資料収集過程で新しく存在が明らかになった大学・職業教育省の紀要を手がかりに、マクロな高等教育システムの分析をおこなう。実態については、ハノイ市およびホーチミン市において初年度の調査結果について、研究員や大学の教員と意見交換を図りながら実態分析をおこなう。理論面での検討については、体制移行の類型枠組みにベトナムを位置づけ、より合理的な説明枠組みを構築する。
機能性表面構造を有する人工関節に関する基礎的研究

本研究は、摺動面patterning技術を人工関節摺動面に応用してHDP摩耗粉の発生を抑え人工関節の寿命を延長させることを目的とし、そのための基礎的な検討として金属(SUS316L,Co-Cr合金)vs高分子材料(HDP)の摺動における摺動面パターン形成の効果について検討した。pin on diskによる摺動実験によって、金属(SUS316L,Co-Cr合金)vs高分子材料(HDP)において、pattern付加による潤滑性能向上(摩擦係数・磨耗量の減少)が確認された。また、patternの直径およびピッチには最適値が存在し、patternを付加することによる潤滑性能の向上は一時的なものではなく、長時間の潤滑実験をおこなってもpattern付加の優位性は変わらない。以上の結果をもとに、ボール(骨頭)にpatternを付加して、試作した関節シミュレータを用いて摩擦実験をおこなった。その結果、pattern付加による摩擦係数の減少は見られなかったが、摺動面の観察によって潤滑性能向上に対してのpattern付加の有効性が示唆された。ただし、patternにバリなどが存在すると、潤滑性能が悪化する事が考えられ、カップ側にpatternを付加することも含めて、pattern付加の方法に関して検討の余地が残された。また、実験に用いた関節シミュレータの、摺動面への荷重のかけ方に関しては改良の余地があり、新たな関節シミュレータの開発とそれによる再実験が今後の課題である。本研究は初年度において、予備実験で得られた人工関節摺動面の最適機能性表面構造(パターン構造)を用いて、実用的な試験条件で耐摩耗実験をおこない、人工関節使用時における骨頭とカップの接触状態や摩擦・摩耗現象をシミュレートする。さらに摺動現象を理論的に解析し、コンピュータ・シミュレーションにより人工関節表面の機能性表面構造の最適パターンを決定する。また固体の接触・摺動現象は摺動面の形状精度に左右されるため市販骨頭、ソケットを三次元形状測定機で計測した。次に機能性表面構造を実際に市販骨頭表面に構築するため、その加工法について検討した。以上により新たに得られた知見を要約すると、次の通りである。1.コンピュータ・シミュレーションによる機能性表面の決定は、未だ計算中であるが、摩耗試験の結果から構造の決定がなされた。それによると、直径0.5mmの円形凹型パターンで深さは0.10.5mm程度でよく、ピッチは1.2mmである。2.実用試験では、潤滑液は仔牛の血清を用い期間は14日、27日とおこなったが、共に摩擦抵抗が少なく、摺動運動は安定しており、摺動面も良好な結果が得られた。3.市販され使用されている骨頭とソケットの摺動面の真球度は、経度方向0.361.33μm、緯度1.217.7μmの幅があり、考えていた以上に悪く、磨耗量との関係を計算している。4.市販骨頭表面に機能性表面構造を構築することに成功した。本研究は本年度において、初年度で得られた研究成果に基づき、低磨耗で長寿命の人工関節を開発するため、市販人工関節の改良を行い、機能性表面構造を有する人工骨頭を試作し、また専用のシミュレータを設計開発して、耐磨耗テストを行い理想的な人工関節の設計製作原理を構築するため、実験検討した。1.今回はソケット(カップ)内面の形状精度を計測したが、真球度は数μm20±数μmと非常に悪く、あらさも数μmから数十μmに及び、改善の余地がある。2.市販人工骨頭に、機能性表面構造(パターン)を構築して、テストした結果、磨耗係数の減少は見られなかったがソケット内面の磨耗状態の改善が著しく見られ、パターン効果が確認された。3.完全球面体で滑らかな接触面を持つ骨頭とソケットの試作に成功した。
下垂体腺腫における血管新生関連遺伝子発現の検討とその制御による増殖抑制

43例の下垂体腺腫が本研究に後方視的に組み入れられた。うち、22例がRNA抽出に適切であり、その内訳は臨床的非機能性下垂体腺腫が16例、成長ホルモン産生下垂体腺腫が6例であった。これらの下垂体腺腫症例のパラフィン切片を用いて、Cathepsin D、VEGF受容体、Mammalian Target of rapamycin (mTOR:VEGFによる刺激で血管新生促進、アポトーシス抑制に働く)、BMP-1、FGF2の抗体を用いた免疫染色による発現量の評価を行った。そしてこれらの発現とvon Willebrand factor(血管構築・血管密度を示すと考えられる)の発現と比較検討した。また、パラフィン切片を用い、RNA抽出を行い(High Pure RNA Paraffin Kit : Roche)、Real Time-PCRによる上記分子やVasoinhibinを含めた血管新生に関わる遺伝子の発現量の評価を行った。Ki67による増殖能評価、von Willebrand factorあるいはVE-cadherin抗体を用いた血管密度の評価と、上記血管新生関連分子の蛋白および遺伝子発現量との相関関係を検証した。その結果、下垂体腺腫においては、Cathepsin DとFGF2は、血管構築との間において、相関関係があることが示された。特に、Cathepsin Dと血管構築・血管密度との間には負の相関があることが示された。現在まで免疫組織化学による検討やRNA発現による検討を行ってきている。当初の計画通り、研究を進めていく予定である。試料の作成が想定より安価であったため
重金属類の分離精製に用いる抽出試薬/溶媒の設計と装置型式の設計に関する研究

イオン会合抽出試薬tri-n-octylmethylammonium chloride(TOMAC)による塩酸からの【Co^(2+)】と【VO^(2+)】の抽出機構の解析および抽出平衡関係の確立を行なった。試薬分子に対する安定剤として配位した水分子と塩酸分子の挙動と金属抽出との関係を研究した。次の各項の結果が得られた。1.抽出機構の定量的表現および稀釈剤と調節剤の影響(1)塩酸抽出第一段階として塩酸抽出について研究した。稀釈剤として溶媒和作用の異なるベンゼン,キシレン,クロロホルムおよび2エチルヘキシルアルコールを用いた。試薬の水和と塩酸抽出能は各稀釈剤によって大きく異なるが、これは溶媒和効果によって説明できる。塩酸の抽出平衡関係を各稀釈剤について確立した。ここで、酸抽出は配位水との置換によるとした。(2)金属抽出溶媒和作用の弱いベンゼンを稀釈剤とした場合、金属抽出は金属イオンの抽出は試薬の塩酸附加物との反応、すなわち、金属イオンと塩酸および水分子との置換反応によって進行するとしたモデルによって表現できる。【Co^(2+)】でも【VO^(2+)】でも同一である。さらに、試薬保持率の増大に伴ない金属抽出種は自己会合し、安定化する。溶媒和作用の強いクロロホルムや2エチルヘキシルアルコールの場合、溶媒和作用によって、試薬分子の安定剤分子としての水と酸の必要性を減少させる。したがって、試薬に配位した水と配分子は抽出に関与しない。このため、金属抽出機構は簡単となるが、より大きな影響は試薬の安定化による金属抽出能の低下である。2.ミキサーセトラによる流通操作稀釈剤が工業的に用いられるキシレンなどの場合、ミキサー部の撹拌条件の選定とセトラー部の滞留時間を10minていどとすれば2液相の分離(分相性)に問題はない。平衡への到達時間も緩徐な撹拌下でも5minていどであり、問題はない。
Alzheimer病の分子病態をトリガーする循環因子の探索

老年期認知症の主要な原因であるAlzheimer病の根治的克服には、分子病態をトリガーする脳内Aβ蓄積に対する無症候期の早期介入が不可欠である。脳Aβ蓄積は高齢者の半数近くに認められ、正常老化に伴う軽度の認知機能低下の原因でもあることから、その克服は多くの高齢者のQOL向上につながる。本課題では、モデルマウスの老若並体結合を用い脳Aβ蓄積の加齢依存的循環性リスク因子を同定することから、リスクに関する理解を深め、リスク制御を可能にする方策の開発を目指す。同定する目的因子は、次世代型プレシジョン・メディシンにおいて、認知症リスクへの介入を実現するための標的分子となることが期待できる。
高赤方偏移の巨大Lyα輝線ガス雲と銀河形成

Lyα巨大輝線ガス雲(LyαBlobs, LABと略称する)とは、数年前から発見され始めた、数10kpcを越える広がりを持つ、高赤方偏移のLyα輝線天体であり、銀河形成の現場を直接観測することが出来る天体として、大きな注目を集めている。当初は、差し渡し100-200kpcのサイズを持つ非常に巨大なガス雲が数個知られていたのみであったが、最近の我々の観測により、赤方偏移z=3.1の輝線銀河の高密度領域に沿って30-200kpc広がりを持つLABが70個以上発見されるなど、高赤方偏移宇宙にある程度一般的に観測される天体であることが明らかになりつつある。これを受けて、本研究では、LABの研究において世界をリードするサンプルをつくるため、(i)高密度領域、及び比較のための一般領域を併せた十分な視野面積において、すばる望遠鏡によるz=3の輝線銀河のための深い狭帯域撮像観測を行い、多数の輝線銀河、とくにLABを検出して、銀河及びLABの分布を調べるとともに、(ii)同様の観測を、新しく作るフィルタを用いて赤方偏移z=2.4(近赤外KバンドでHα輝線の観測が可能)に展開することを目指した。本課題研究期間を通じて、すばる望遠鏡によって取得したこれまででもっとも深く広い高赤方偏移の狭帯域撮像となるz=3.1 Lyα輝線銀河の(LAE)分布を解析し、とくに、LAE分布における数10Mpcを超えるスケールでの密度超過について詳細に調べるとともに、LABの探査、および、非常に等価幅の大きなLyα輝線の性質について解析を行い、次のような成果を得た。(1)観測した高密度領域は大スケールでも非常に希少と予測されるような極端な密度超過に相当することを求めた。このような構造が観測されることは構造形成論において予測される確率は実は非常に小さく、高赤方偏移の銀河形成における大スケールでのバイアスの存在を強く示唆しており、その物理的な原因の解明は高赤方偏移における銀河形成・宇宙の熱進化の解明に重要な因子となるだろう(2)巨大LABはとくに高密度超過のピーク領域に集中しており、密度超過領域が「銀河形成領域」と呼ぶにふさわしい銀河形成が特に現在進んでいる領域であることが明らかになった(3)とくに多数の輝線等価幅の大きな銀河が発見されにさらに密度ピークに集中している。より始原状態に近いガスから形成された「若い」銀河の「銀河形成る領域」への集中は大変興味深い.Z=2.4のフィルタについては、設計、製作に成功し、その透過率特性などの評価を行うことができた。今後、すばる望遠鏡の観測時間を獲得し、観測を行いたい。

本年度は、まず、すばる望遠鏡Suprime Cam、及び、これまでと同じ赤方偏移z=3.1のLyα輝線観測用の干渉フィルタ(中心波長4790Å、波長半値巾80Å)を用いて、高密度領域であるSSA22天域について、さらに大きく視野を広げて、十分な体積での輝線銀河の探査と、さらに多数のLyman αBlobs(LAB)を検出して、LABの空間分布、サイズや表面輝度の分布と、銀河数密度などの環境との関係を調べる研究を行った。これにより、確実なLyα輝線天体約2000個を検出し、200-300Mpc四方(共同座標、奥行きは60Mpc程度)の天域での分布を調べまた、これらのSSA22の高密度領域の観測と対照するため、一般領域についても、同じ干渉フィルタを用いて、同程度に深い観測を、Suprime-Cam5視野程度について、行い、高密度領域以外でもLABは検出されるのか、高密度領域とそれ以外の領域でLABの性質に大きな違いがあるのか、などの研究を進めた。また、一部の領域でのLABについて、分光観測結果をまとめて論文にて報告した。これと並行して、赤方偏移z=2.4のLyman α輝線の検出を目的とした、すばる望遠鏡Suprime-Cam用の新しい干渉フィルタ(消耗品)を制作した。このz=2.4輝線銀河用干渉フィルタの設計・制作が、本申請課題の17年度経費に於いて、大きな割合を占めた。フィルタ中心波長は4122Å、波長半値巾は約70Åとすることをもくろみ、仕様を十分に満たすフィルタを作成することができた。設計・制作は、山田、及び分担者の林野が共同で担当した。Lyα巨大輝線ガス雲(LyαBlobs, LABと略称する)とは、数年前から発見され始めた、数10kpcを越える広がりを持つ、高赤方偏移のLyα輝線天体であり、銀河形成の現場を直接観測することが出来る天体として、大きな注目を集めている。最近の我々の観測により、赤方偏移z=3.1の輝線銀河の高密度領域に沿って30-200kpc広がりを持つLABが70個以上発見されるなど、高赤方偏移宇宙にある程度一般的に観測される天体であることが明らかになりつつある。これを受けて、本研究では、LABの研究において世界をリードするサンプルをつくるため、(i)高密度領域、及び比較のための一般領域を併せた十分な視野面積において、すばる望遠鏡によるz=3の輝線銀河のための深い狭帯域撮像観測を行い、多数の輝線銀河、とくにLABを検出して、銀河及びLABの分布を調べるとともに、(ii)同様の観測を、新しく作るフィルタを用いて赤方偏移z=2.4に拡張することを目的として行った。z=3.1の構造については、本年度は大スケールでの密度超過のより精度の高い測定、理論シミュレーションとの比較、そして、非常に強いLyα輝線(大きな等価巾)を示す天体に注目して、その特徴と分布を明らかにすることができた。輝線等価巾の大きな天体は、原始状態とも言える非常に金属度の低いガスからの星形成を示唆するもので、たいへん興味深い結果となった。また、Spitzer衛星による深く広視野の赤外線データを取得し、これと輝線天体を比較する研究を進めることができた。一方、17年度に制作を行ったフィルタについては、その透過率・一様性の測定を行い、使用可能な状態に完成することができた。これは今後のすばる望遠鏡を用いた研究に於いておおいに活かされるものと期待する。
遺伝子導入による自己発光性哺乳類細胞の構築とその細胞癌化・分化の解析への応用

研究の目的:哺乳類培養細胞にホタル(Photinus pyralis)から分離されたルシフェラーゼ遺伝子を導入して、自己発光する細胞株を作り、生きた細胞内での遺伝子制御を経時的、連続的に観察、記録することの出来る系を確立する。今年度の成果:1.ホタル・ルジフェラーゼ遺伝子にはチャイニーズハムスターメタロチオネイン遺伝子のプロモータ領域を結合して、誘導可能となるよう修飾を施した。2.チャイニーズハムスタ由来CHL細胞、ミドリザル由来Cos細胞、マウス由来細胞等に上述の遺伝子を一過性に導入後、Cd^<2+>、デキサメサゾンで誘導を行った。動物種差はかなり大きく、CHL,CosではCd^<2+>、デキサメサゾンで、ルシフェラーゼの発現の誘導が可能であったが、マウス細胞では発現は低く誘導も認められなかった。3.備品として購入したルミノメータは、上記細胞10^7ケ程度の材料について、ほぼ定量的測定が可能な感度を示し、有効に利用された。4.持続的にルジフェラーゼを発現する細胞株の樹立はCHL,Cos細胞について試み、それぞれ6株、2株を得た。これらの細胞株ではCd^<2+>により、ルシフェラーゼ発現の増強(数倍10倍以上)が認められた。5.魚類由来培養細胞にも、メタロチオネイン・ルシフェラーゼ融合遺伝子の導入を行い、その発現とCd^<2+>による発現の誘導を検出することが出来た。6.超高感度イメージングシステムを利用するには至らなかった。
カルシウム依存性レクチンの糖認識機構解析及びその新規機能性タンパク質構築への応用

海産無脊椎動物グミ(Cucumaria echinata)体液中に存在するCa^<2+>依存性レクチンCEL-Iの糖認識機構を明らかにするために,CEL-I及びその糖との複合体のX線結晶構造解析を行った。その結果,糖結合部位には1個のCa^<2+>が結合しており,GalNAcなどの糖は,その3-OHと4-OHによってCa^<2+>との配位結合及びその他の糖結合部位アミノ酸残基(Gln101,Asp103,Glu109,Asn123)との水素結合を形成していることが明らかになった。また,GalNAcを特に強く認識するために,Arg115とGln70がGalNAcのアセトアミド基と水素結合やvan der Waals力によって相互作用していたことから,これらの残基をアラニンに置換した変異体を大腸菌で発現させ,その糖結合活性を検討した結果,Arg115のみの置換によって活性は約1/8程度にしか低下しなかったが,両残基を置換すると活性は1/100程度まで低下した。このことは両残基が水素結合とvan der Waals力によって協同的に結合に関与していることを示唆している。同じくグミ体液中に存在する溶血性レクチンCEL-IIIのX線結晶構造解析を行った結果,CEL-IIIは,立体的に明瞭に区別できる3つのドメイン(ドメイン1,2,3)からなることが明らかになった。ドメイン1,2はリシンやアブリンのB-鎖と同様,3つの繰り返し領域からなるβ-trefoil構造をとり,両者合わせて7ヵ所のCa^<2+>結合部位と,1ヵ所のMg^<2+>結合部位が認められた。一方,ドメイン3はこれまでに類似の構造が見当たらない,βシートに富むドメインを形成しており,これが細胞膜内で会合し,イオン透過性のポアを形成することが示唆された。また,ドメイン3には逆平行に並んだ2つの両親媒性αヘリックスが存在しており,これがドメイン1,2の境界部分のくぼみにちょうど収まるように位置していた。この領域は,合成ペプチドの研究から,細胞膜と相互作用することにより抗菌活性を発現する領域でもあり,細胞膜との相互作用や自己会合に重要な領域であることが示唆された。カルシウム依存性レクチンは生物組織及び体液中に広く存在し,細胞間認識や生体防御機構において極めて重要な役割を果たしている糖結合タンパク質である。今回,カルシウム依存性レクチンとして我々が単離した海産無脊椎動物グミ(Cucumaria echinata)体液中のC型レクチンCEL-Iの構造と糖認識機構を明らかにするために,数種の特異的糖との複合体結晶のX線構造解析を行った。特異的糖としては,GalNAc及びラクトースを用い,CEL-Iとの複合体結晶を作製した後に放射光を用いてデータ収集及び解析を行った。その結果,CEL-Iは糖の3位と4位の水酸基とタンパク質中のカルシウムイオンとの配位結合及び,近傍のアミノ酸との水素結合ネットワークによって糖を認識していること,さらに高い親和性を示すGalNAcに関しては,糖のアセトアミド基と115番目のArgとの2つの水素結合が重要であることが明らかになった。

一方,グミ体液中にはもう一つのカルシウム依存性レクチンCEL-IIIが存在するが,このレクチンは強い溶血活性を示す特異なレクチンであり,そのC-末端ドメインに存在する疎水性領域と細胞膜との相互作用により活性を示すものと考えられている。そこでこの疎水性領域に相当する20残基のペプチド3種を化学合成により作製し,細菌に対する作用を検討した。その結果,3種のペプチドのうち,P332と名づけたペプチドがグラム陽性菌,とりわけ黄色ブドウ球菌に対する高い抗菌活性を示すことが見出された。このペプチドは天然の抗菌性ペプチドに匹敵する抗菌活性を示す一方,他のペプチドに見られるような溶血活性が極めて低いことから,新規抗菌性ペプチドとしての用途にも適しているものと考えられた。海産無脊椎動物グミ(Cucumaria echinata)体液中に存在するCa^<2+>依存性レクチンCEL-Iの糖認識機構を明らかにするために,CEL-I及びその糖との複合体のX線結晶構造解析を行った。その結果,糖結合部位には1個のCa^<2+>が結合しており,GalNAcなどの糖は,その3-OHと4-OHによってCa^<2+>との配位結合及びその他の糖結合部位アミノ酸残基(Gln101,Asp103,Glu109,Asn123)との水素結合を形成していることが明らかになった。また,GalNAcを特に強く認識するために,Arg115とGln70がGa1NAcのアセトアミド基と水素結合やvan der Waals力によって相互作用していたことから,これらの残基をアラニンに置換した変異体を大腸菌で発現させ,その糖結合活性を検討した結果,Arg115のみの置換によって活性は約1/8程度にしか低下しなかったが,両残基を置換すると活性は1/100程度まで低下した。このことは両残基が水素結合とvan der Waals力によって協同的に結合に関与していることを示唆している。同じくグミ体液中に存在する溶血性レクチンCEL-IIIのX線結晶構造解析を行った結果,CEL-IIIは,立体的に明瞭に区別できる3つのドメイン(ドメイン1,2,3)からなることが明らかになった。ドメイン1,2はリシンやアブリンのB-鎖と同様,3つの繰り返し領域からなるβ-trefoil構造をとり,両者合わせて7ヵ所のCa^<2+>結合部位と,1ヵ所のMg^<2+>結合部位が認められた。一方,ドメイン3はこれまでに類似の構造が見当たらない,βシートに富むドメインを形成しており,これが細胞膜内で会合し,イオン透過性のポアを形成することが示唆された。また,ドメイン3には逆平行に並んだ2つの両親媒性αヘリックスが存在しており,これがドメイン1,2の境界部分のくぼみにちょうど収まるように位置していた。この領域は,合成ペプチドの研究から,細胞膜と相互作用することにより抗菌活性を発現する領域でもあり,細胞膜との相互作用や自己会合に重要な領域であることが示唆された。
頭頸部癌における癌幹細胞とEGFR標的治療との相関に関する研究

頭頸部癌細胞株におけるEGFR発現とMT1-MMP発現との相関に関する検討では、HSC4にEGFRを添加するとMT1-MMP発現の増加を認めた。すなわち、EGFRは細胞増殖のみならずMT-MMPを介した腫瘍の浸潤増殖にも関与する可能性が示唆され癌幹細胞に関連するMT1-MMPとの相関を認めたことからEGFRと癌幹細胞との相関が示唆された。HSC4の癌幹細胞としてのクローン形成能)について検討したところ26%の細胞がクローン形成能が有り60%のクローンが内因性ALP陽性であった。HSC4における癌幹細胞マーカー発現を検討したところOct3/4とNanogが発現しCD133の発現は見られなかった。FACSによってHSC4からSP細胞を分離同定した。その結果、0.3-0.4%のSP細胞が同定された。FACSで分離同定されたSP細胞とnon-SP細胞(MP細胞)における各種癌幹細胞マーカーの発現を検討した結果、SP細胞においてOct3/4、Nanogの発現が有意に亢進していた。頭頸部癌細胞株SASおよびSCC4かからSP細胞とMP細胞を分離同定し癌幹細胞マーカーの発現を検討した。その結果HSC4と同様にOct3/4、Nanogの発現が有意に亢進していた。早期舌がん症例ステージI/IIの41例における癌幹細胞マーカー発現とリンパ節後発転移(DNM)との相関について検討した。その結果、DNMとOct3/4、Nanog発現とは有意に相関した。早期舌がんにおける様々な病理的特徴、癌幹細胞マーカー発現とリンパ節後発転移(DNM)との相関について多変量解析で検討した。その結果、腫瘍の血管浸潤とOct3/4がDNMにたいして独立した危険因子であることが証明された。以上から、EGFRは癌の浸潤、転移と関連し癌幹細胞マーカーとしてOct3/4はEGFRを介して癌の再発、転移に深く関わることが示唆された。【背景と目的】近年、癌幹細胞の概念が提唱され1997年急性骨髄性白血病において癌幹細胞の同定の報告以後、他の固形癌に於いても報告されている。2007年にはPrinceらにより頭頸部扁平上皮癌におけるSide Population(SP)細胞の同定とその癌幹細胞としての可能性が報告された。しかしながらその機能は十分に解明されていない。そこで我々は舌扁平上皮癌細胞株SASを用いてSP細胞の有無と癌幹細胞としての機能を検討した。さらに、頭頸部癌細胞株でEGFRの発現を確認し、発現している細胞株についてSP細胞とnon-SP細胞でEGFR発現の差を検討する。【方法】フローサイトメトリーによりDNA結合色素であるHoechst33342を用いSP細胞を回収した。SP細胞とNon SP細胞をRT-PCRで比較検討した。また、免疫染色でEGFR発現の有無を検討する。【結果】SASにおいてSPは0.8%認められた。Oct3/4、Nanogら神経幹細胞のマーカーがSP細胞においてnon SP細胞と比較して発現の亢進を認めた。一方Notchは両細胞間で有意な発現の差を認めなかった。CD133は両細胞ともに発現を認めなかった。さらに、SCC4細胞株で同様にSP細胞を採取し様々な幹細胞マーカーの発現を検討している。一方、SAS細胞とSCC4ではEGFR発現を確認したが、SP細胞におけるEGFR発現の差は現在検討中である。【考察】

SASではSP細胞が存在し、それらは癌幹細胞としての機能を有していると考えられた。頭頸部癌における癌幹細胞の同定とその機能の評価は癌の生物学的悪性度の指標となる可能性があり、EGFRは高率に発現していることから、癌幹細胞とEGFRとの関連をさらに解明すべきと考えられる。【背景と目的】近年癌幹細胞の概念が提唱され、1997年急性骨髄性白血病において癌幹細胞の同定の報告以後、他の固形癌に於いても報告されている。2007年にはPrinceらにより頭頸部扁平上皮癌におけるSide Population(SP)細胞の同定とその癌幹細胞としての可能性が報告された。頭頸部癌に於いてもSide Population(SP)細胞の同定とその癌幹細胞としての可能性が報告されているが、その役割は十分に解明されていない。そこで我々は(1)舌扁平上皮癌細胞株におけるSP細胞の有無,(2)SP細胞における癌幹細胞関連遺伝子の発現,(3)臨床検体における同関連遺伝子の発現とその臨床的意義について検討した。昨年度の研究でOct3/4、Nanogら神経幹細胞のマーカーの発現を検討しNotch及びCD133についても検討した。一方、SAS細胞とSCC4ではEGFR発現を確認した。今回は臨床検体についても各種の癌幹細胞マーカーを検討した。【方法・結果】(1)DNA結合色素Hoechst33342を用い舌癌細胞株をflowcytometryにてsortingした結果,SPはSASにて0.9%、HSC4にて0.7%、SCC4にて10.2%、それぞれ認められた。(2)RT-PCRにて癌幹細胞関連遺伝子の発現をSCC4のSP細胞とnon SP細胞の間で比較した結果、SP細胞で転写因子Oct3/4、Nanog、およびABC transporterのABCG2の発現が高かった。ALDH、CD133は発現を認めなかった。(3)初回治療として舌部分切除のみを行い、3年以上経過観察したstageI/II舌扁平上皮癌例のうち原発巣標本を入手しえた41例を対象に、Oct3/4とNanogの発現を免疫染色にて評価し,後発頸部リンパ節転移(delayed neck metastasis:DNM)との関係について検討した。DNMは13例(31.7%)に認められ、Oct3/4、Nanogの発現との間に有意な相関が認められた。【考察】頭頸部扁平上皮癌には癌幹細胞が存在し,その指標としてOct3/4、Nanogが有用である可能性,およびこれら指標を発現するcancer stem-like cellの存在がDNMに寄与している可能性が示唆された。【目的】近年癌幹細胞の概念が提唱され、1997年急性骨髄性白血病において癌幹細胞の同定の報告以後、他の固形癌に於いても報告されている。2007年にはPrinceらにより頭頸部扁平上皮癌におけるSide Population(SP)細胞の同定とその癌幹細胞としての可能性が報告されているが、その役割は十分に解明されていない。そこで我々は(1)舌扁平上皮癌細胞株におけるSP細胞の有無,(2)SP細胞における癌幹細胞関連遺伝子の発現,(3)転写因子Oct3/4,SOX2やABCG2の発現について検討しさらにEMT関連因子の発現の有無を検討する。【結果】
グラフェンの誘電体被覆によるドーピング制御と光学素子の開発

研究の基盤となるグラフェンの合成では、化学気相成長中に故意に大気を導入するというアイディアで、直径2.5 mmという世界レベルのサイズで、かつ高結晶性の単結晶成長に成功した。また、大気導入が合成段階のどのプロセスで有効に働くかを詳細に調べ、酸素分子の効果を含めたメカニズムに関する提案を行った。この高結晶性の単結晶グラフェンを用いて、誘電体被覆を行った。誘電体被覆にはシリコンモノオキサイド(SiO)の真空蒸着を用いており、前年度の結果でグラフェンへ欠陥が導入されないことを確認している。ドーピング量の計測にはグラフェン電界効果トランジスタ(FET)の電気計測を用いた。通常のリソグラフィを用いたデバイス作製ではレジスト残渣によるドーピングの影響が排除出来ないため、シャドウマスク(穴径:45 μm、間隔125 μm)を用いたNiの真空蒸着による電極のパターニングを行った。また、大気中の吸着分子の影響を排除するため、電子顕微鏡中で作動するナノプローバーを用いて真空中での電気計測を行い、再現性良いFET測定を実現した。電気計測の結果、SiOx膜(屈折率2.0)をグラフェン上に形成することで約5V (SiO2ゲート酸化膜90 nm)のnドープが起こることを電気計測により明らかにした。蒸着レートによるSiOx膜の組成(SiとO)制御が出来ることは屈折率測定により確認しているが、組成制御によるドープ制御が今後の課題である。26年度が最終年度であるため、記入しない。研究の基盤となるグラフェンの合成では、プロセス最適化をはかると共に、化学気相成長(CVD)における基板表面のミクロ構造や合成条件を探索した。その結果0.6ミリという大面積かつ高品質のグラフェン成長に成功し、デバイス作製に必要となる高品質グラフェンの合成法を確立した。また、合成前に銅基板を高圧(約3気圧)でアニールするとステップテラス表面が形成され、この表面形態がグラフェン大面積化に重要な核生成の抑制に重要であることを初めて明らかにした。研究課題名前半の「グラフェンの誘電体被膜」に関して、シリコンモノオキサイド(SiO)の真空蒸着によりグラフェン上へ欠陥を導入することなく誘電体被膜を形成することに成功し、「ドーピング制御」の基礎となるグラフェンの誘電体被膜プロセスを確立した。同様のSiO_2の電子ビーム蒸着による誘電体被覆では、グラフェンへ欠陥が導入されることから、SiOの真空蒸着プロセスの優位性を明らかにした。また、SiOで被覆したグラフェンがUV-オゾン処理や大気中加熱(5000°C)に耐性を示し、SiO膜がデバイス応用上有効な保護膜の役割を有することを示した。研究課題名の中央部の「ドーピング制御」については、転写CVDグラフェンを用いたデバイスの作製と電気特性評価を検討し、基礎特性の解析手法を確立した。得られた電気特性の解析結果から、転写したCVDグラフェンのキャリア易動度、フェルミレベル(ドーピング量)を見積もった。また、電気特性評価では真空中での測定が必須であることを示した。今後は、今回確立した手法を用いて、研究課題名の後半部の「光学素子」を視野に入れた応用研究へ展開する。本年度はグラフェン合成、誘電体被覆、デバイス作製及び電気特性評価等の研究の基礎部分を固めることに成功した。また改善点も見出したので、今後、研究課題名後半部の「ドーピング制御」、「光学素子」へとスムーズに展開できると考える。本年度確立したグラフェン合成、誘電体被覆、デバイス作製及び電気特性評価を基本指針として、シリコンモノオキサイドによるドーピング制御と光学素子応用へ展開していく。ただし、電気特性評価で得られたグラフェン電子易動度には改善の余地があるため、主にグラフェン転写プロセスについての見直しを行う。具体的には転写時に用いているサポート層の種類や除去法の再検討・改善を行う。
埋め込まれたナノ粒子の集団的同一方向へのロッド化変形：メカニズム解明

本研究では、主要な問い「ナノ粒子のロッド化現象はどのようなメカニズムによるか?」に答えるべく、これまでに提案されてきたハンマリング+融解モデルや熱応力モデルなどを吟味しながら、新のメカニズムに迫る。熱応力モデルでは、高速重イオンによりSiO2中に円筒形の変質領域が形成され、それらがコア・シェル型(円筒中心部のSiO2が未照射部より低密度で、これをより高密度のSiO2がシェル状に取り囲む構造)であることが重要とされる。イオン衝撃で融解した低密度のコア部に、同時に融解した金属ナノ粒子が流れ込むことによりロッド化変形が起こるとされている。一方、従来の説ではコア・シェル型トラックは高速重イオンでも高電子阻止能(Se)の場合に起こると信じられており、SiO2が融解かつ気化された場合のみに形成されると信じられてきた。一方、我々はナノ粒子ロッド化が低Seでも起こることを実験で示し、矛盾を指摘してきた。今回、豪州国立大学とHelsinki大学の協力により感度ぎりぎりの難しい測定と大型数値計算を行い、低Seでも小さなコア・シェル型トラックが形成されており、ナノ粒子ロッド化が起こることを示すことができた。つまり熱応力モデルの否定根拠のひとつを排除でき、メカニズム解明にひとつ近づいた。量研機構と実施している、電子的阻止能は高速重イオンと同程度だが極めて低速なC60クラスターイオン照射によりナノ粒子ロッド化が起こるかどうかという課題については、照射実験・評価を行った。偏光光吸収の異方性を観測し、透過電子顕微鏡観察でナノ粒子ロッド化を確認した。現在、第一報の論文の準備を進めている。また、強力なスパッタリングや極めて短いイオントラックが観測され、高速重イオン照射とは極めて異なる状況が実現されているようであり、現象の総合的な理解には更なる研究が必要である。SiO2でのコア・シェル型イオントラック形成の従来モデルと我々が観測したナノ粒子ロッド化のエネルギー依存性の矛盾の問題はそう簡単に解決されないだろうと予想していたが、豪州国立大学の最高感度のX線小角散乱測定、Helsinki大学の大型数値計算の協力を得て、我々の測定結果の方が正しく、広く受け入れられているコア・シェル型トラック形成モデルの方が間違っていることを指摘できた。広く受け入れられてきたモデルが間違っているということは関連分野の研究者に対して、極めて大きなインパクトを放ったと思われる。一方、CaF2など高速重イオン照射により非晶質しにくい材料中でのナノ粒子ロッド化現象の確認については、低エネルギーイオン照射法でAgナノ粒子を内部に形成した後、高速重イオン照射を行い、ナノ粒子ロッド化よると思われる偏光光吸収の異方性を観測した。しかし、現在の方法ではAgナノ粒子のすぐそばにあるCaF2までが本当に非晶質化していないと断言できない点に気がついた。そこで現在の方法以外でCaF2中にAgナノ粒子を形成する手法を探索している状況である。C60クラスターイオンでのナノ粒子のロッド化の観測には成功した。しかし、高速重イオン照射下では観測されない強力なスパッタリングや極めて短いイオントラックなどが観測され、高速重イオン照射とはだいぶ状況が異なっていることがわかった。現象を正しく理解するためには更なる研究が必要で、もう少し時間がかかる。以上のように、予想していなかった良い成果、予想しなかった問題点、成果は出たが更なる研究が必要な点などを勘案し、状況は「(2)おおむね順調に進展している」を選択した。CaF2などの高速重イオン照射で非晶質化しない材料中でのナノ粒子のロッド化の課題については、低エネルギーイオン注入法によるナノ粒子の導入だけではなく、別の方法でCaF2中にナノ粒子を作る方法を試みる。例えば、薄膜上に数nmのAuの連続薄膜を作成し、高速熱処理を行うことによりナノ粒子化し、その上にCaF2膜を堆積する方法である。別の手法で作ったCaF2中のナノ粒子に対して高速重イオン照射を行って挙動を観測する。C60イオン照射によるナノ粒子の楕円化については、イオンエネルギー依存性などを明らかにする。また、非晶質SiO2の代わりに結晶性SiO2を使い、形成された短いイオントラックを透過電子顕微鏡で観察し、トラック長(やトラック径)のエネルギー依存性を明らかにする。

量研機構と実施している、電子的阻止能は高速重イオンと同程度だが極めて低速なC60クラスターイオン照射によりナノ粒子ロッド化が起こるかどうかという課題については、照射実験・評価を行った。偏光光吸収の異方性を観測し、透過電子顕微鏡観察でナノ粒子ロッド化を確認した。現在、第一報の論文の準備を進めている。また、強力なスパッタリングや極めて短いイオントラックが観測され、高速重イオン照射とは極めて異なる状況が実現されているようであり、現象の総合的な理解には更なる研究が必要である。SiO2でのコア・シェル型イオントラック形成の従来モデルと我々が観測したナノ粒子ロッド化のエネルギー依存性の矛盾の問題はそう簡単に解決されないだろうと予想していたが、豪州国立大学の最高感度のX線小角散乱測定、Helsinki大学の大型数値計算の協力を得て、我々の測定結果の方が正しく、広く受け入れられているコア・シェル型トラック形成モデルの方が間違っていることを指摘できた。広く受け入れられてきたモデルが間違っているということは関連分野の研究者に対して、極めて大きなインパクトを放ったと思われる。一方、CaF2など高速重イオン照射により非晶質しにくい材料中でのナノ粒子ロッド化現象の確認については、低エネルギーイオン照射法でAgナノ粒子を内部に形成した後、高速重イオン照射を行い、ナノ粒子ロッド化よると思われる偏光光吸収の異方性を観測した。しかし、現在の方法ではAgナノ粒子のすぐそばにあるCaF2までが本当に非晶質化していないと断言できない点に気がついた。そこで現在の方法以外でCaF2中にAgナノ粒子を形成する手法を探索している状況である。C60クラスターイオンでのナノ粒子のロッド化の観測には成功した。しかし、高速重イオン照射下では観測されない強力なスパッタリングや極めて短いイオントラックなどが観測され、高速重イオン照射とはだいぶ状況が異なっていることがわかった。現象を正しく理解するためには更なる研究が必要で、もう少し時間がかかる。以上のように、予想していなかった良い成果、予想しなかった問題点、成果は出たが更なる研究が必要な点などを勘案し、状況は「(2)おおむね順調に進展している」を選択した。CaF2などの高速重イオン照射で非晶質化しない材料中でのナノ粒子のロッド化の課題については、低エネルギーイオン注入法によるナノ粒子の導入だけではなく、別の方法でCaF2中にナノ粒子を作る方法を試みる。例えば、薄膜上に数nmのAuの連続薄膜を作成し、高速熱処理を行うことによりナノ粒子化し、その上にCaF2膜を堆積する方法である。別の手法で作ったCaF2中のナノ粒子に対して高速重イオン照射を行って挙動を観測する。C60イオン照射によるナノ粒子の楕円化については、イオンエネルギー依存性などを明らかにする。また、非晶質SiO2の代わりに結晶性SiO2を使い、形成された短いイオントラックを透過電子顕微鏡で観察し、トラック長(やトラック径)のエネルギー依存性を明らかにする。研究課題申請時、量研機構の加速器については使用料を支払って使用することを計画に入れていた。しかし、2018年度から量研機構の連携重点研究対象に採択されたため、加速使用料を免除され、旅費を一部補助されることとなった。
肥大心より同定された新規G蛋白活性制御因子の解析

受容体のみならず、G蛋白を直接活性化する蛋白の存在が知られ、これが細胞のストレス適応に関係する。我々は大動脈縮窄マウスの肥大心で発現するG蛋白活性調節因子の同定を試みた。その結果、MITF/TFE転写因子であるTFE3がGα16に対するG蛋白活性調節因子であることを見出した。興味深いことに、TFE3はGα16を細胞核内へ移行させ、心筋細胞膜の重要な構成蛋白であるclaudin14の転写を亢進させた。これは、G蛋白とそのG蛋白活性調節因子による、圧負荷下でのあらたな転写調節機構の存在を示した。平成20年度は、先に申請者が同定した新規G蛋白活性調節因子の機能解析を酵母系を利用して解析した。用いた酵母ではヒトあるいはラットGαサブユニットが発現しており、G蛋白が活性化されると酵母が増殖するように修飾が加えられている。先のスクリーンで得られたのは新規G蛋白活性調節因子の部分であったが、各蛋白の全長をクローニングし酵母内で発現させ、以下の検討を行った。1)G蛋白サブユニットの選択性:新規G蛋白活性調節因子の全長蛋白は酵母で全長サイズとして発現していることがウェスタンブロットで確認された。全長G蛋白活性調節因子は他のGαサブユニットに比べ、Gα16に対して強い活性を示した。2)G蛋白を介する作用を確認:G蛋白あるいはその下流が欠如している酵母株で全長G蛋白活性調節因子の生物活性を検討を行ったところ、G蛋白サブユニットを欠如する酵母株では生物活性を示さなかったことから、G蛋白に直接作用しているものと考えられた。3)G蛋白活性化能力を検討:G蛋白の下流にLacZを導入した酵母株を用いて、同定したG蛋白活性制御因子間のG蛋白活性化能力を比較検討したところ、同定した3種類のうち、1種類で非常に強いG蛋白活性化能を認めた。また、ウェスタンブロットによる結果から、この生物活性の差は、蛋白の発現レベルによるものではないことが明らかとなった。また、新規G蛋白活性調節因子とGα16をCOS細胞に発現させ、Gα16に対する抗体で免疫沈降を試みたところ、新規G蛋白活性調節因子はGα16とともに共沈降され細胞内で複合体を形成していることが示唆された。申請者は、心肥大モデルより3種類の新規G蛋白活性制御因子の同定に成功したが、興味深いことに、これらはすべてTEEファミリーに属する転写因子であった。同定した新規G蛋白活性制御因子がG蛋白サブユニットと複合体を形成するか、G蛋白活性調節因子をGST融合蛋白として大腸菌で作製し、G蛋白との相互作用をin vitroのpull down assayにより検討した。G蛋白活性調節因子・G蛋白の相互作用はGα16サブユニットに確認されたが、Gαi、Gαs、あるいはGαqサブユニットには認められなかった。また、新規G蛋白性制御因子とGα16サブユニットの相互作用は、Gαの活性化状態に依存し、非活性型変異Gα16あるいは持続活性型変異Gα16はさきのG蛋白活性制御因子と相互作用を示さなかった。COS7細胞に新規G蛋白活性制御因子とGα16サブユニットを発現させ、G蛋白活性調節因子・G蛋白複合体が細胞内で形成されるか免疫沈降法により検討した。In vitroでの検討と同様に同定したG蛋白活性制御因子はGα16サブユニット選択的に複合を形成することが確認された。さらに、G蛋白活性調節因子・G蛋白複合体の細胞内局在を蛍光免疫染色法により検討した.Gα16サブユニットは単独で発現させると細胞質を中心に分布した。ところが、Gα16サブユニットを同定したG蛋白活性調節因子と共発現させると、両蛋白とも細胞核に集積することが明らかとなった。一方、持続活性変異型のGα16サブユニットは細胞核以外の細胞質に分布することから、Gα16サブユニットの核内集積にはGαサブユニットの活性化のみならず、蛋白複合体を形成するG蛋白活性制御因子が強く関与しているものと考えられた。今後は、細胞核内に移行したG蛋白活性調節因子・G蛋白複合体が遺伝子の転写活性調節に関与するか検討を進める予定である。申請者は、心肥大モデルより3種類の新規G蛋白活性制御因子の同定に成功したが、それらはすべてMITF/TEE転写因子であった。これまでの検討で1)同定したG蛋白活性制御因子はGαサブユニットの中でGα16に選択的な作用がある、2)TFE3はGα16と細胞内で複合体を形成する、3)Gα16とTFE3を発現させると共に細胞核内へ移行することが明らかになった。本年度は、4)哺乳類細胞でのG蛋白情報伝達系への関与を検討したが、TFE3は細胞膜受容体を介する情報伝達には影響を与えないことが明らかになった。

次に転写因子であるG蛋白活性調節因子とG蛋白の相互作用がその転写活性に与える影響を検討し、5)細胞核内へ移行したGα16-TCFE3は接合部蛋白であるclaudin14の発現を著しく増加させる、6)また興味深いことにclaudin14の誘導にはGα16の核内での活性化が必要であることを明らかにした。さらに心肥大モデルにおける各コンポーネントの発現変化を検討したところ、7)Gα16およびTCFE3は肥大心で発現が上昇しており、claudin14も約5倍発現が上昇していた。8)心筋細胞のGα16およびTCFE3をsiRNAにより抑制するとclaudin14の発現も低下した。このことは三量体G蛋白・G蛋白活性制御因子によるまだ解明されていない遺伝子調節機構が存在することを示唆していた(Sato M., et al.J.Biol.Chem 2011 in press)。
サンゴの白化現象と海水中に光化学的に生成するヒドロキシルラジカルの関係

3年間に渡る本研究テーマに関して多くの知見を得ることができた。しかし,3年の研究期間では,十分に解明することができなかった新たな課題も数多く見つかった。本研究テーマの発展性を確認し,今後さらに継続して研究していく必要性を強く感じた。研究3年目の本年度は,以下の研究成果が得られた。1.連続流水混合実験システムについて本研究で開発した連続流水混合実験システムに関して,供給海水を送る速度について検討を行った。流速を速くした場合,海水中成分濃度の変化が小さくなることと,供給海水の消費量が多くなり,長期間の実験ができないためである。実験の結果,流速が遅い場合,サンゴ培養容器内のpHが自然の海水で観測されるよりも大きぐ減少し,サンゴ骨格である炭酸カルシウムが物理化学的に溶解することがわかった。この結果を基に,サンゴにとってストレスにならない程度の遅い流速を決定した。2.沖縄沿岸海水中の過酸化物についてヒドロキシルラジカル生成に大きく関与する海水中過酸化物の挙動に関して,海水中の光化学生成が大気からの乾性沈着よりも重要であることがフィールド実験の結果,明らかになった。乾性沈着による過酸化物の増加は無視できる程度であった。また,Fe(II)に関しても,日中増加し、夜間減少する日周変化が確認できた。3.海水中に光化学反応で生成するOHラジカルについて海水中のOHラジカル計測用に新たなにトラップ剤を模索したが、現在,使用している安息香酸以上の検出限界を得ることはできなかった。今後も模索を続けるが,安息香酸を用いて海水中のOHラジカルの生成速度,消失速度などについても実施していく予定である。研究初年度にあたる本年度は、主に、1)海水中に光化学生成するヒドロキシルラジカル測定用の光化学実験システムおよび測定システム(HPLC)の購入と構築、2)予備実験として、沖縄本島北部で海水試料のサンプリングとその成分分析(pH、硝酸イオン、溶存有機炭素など)を行った。海水中に光化学生成するヒドロキシルラジカルは、温度および波長を制御(モノクロメータ)することができるシステムで測定可能になった。ヒドロキシルラジカルの生成速度、特定波長における量子収率などの測定を継続して行っている。また、海水中でヒドロキシルラジカルの重要なソースとなる過酸化水素(HOOH)およびFe(II)、溶存全鉄イオンの定量を沖縄本島北部、東村平良湾と瀬底島で行い、濃度の日周変化(太陽光照射の影響)を観測した。HOOHおよびFe(II)の濃度は、日中に高く、夜間は低くなる傾向が見られた。また、サンゴを実験室内の水槽中で研究する新しいシステム(連続流水混合モデル)の構築に成功した。この実験システムは、新鮮な海水を連続的にサンゴに供給しつつ、海水温度、光強度、光照射時間、海水の組成などの環境要因をコントロールすることができ、サンゴにヒドロキシルラジカルが与える影響を評価することができる。来年度以降、連続流水混合モデルを用いたサンゴへの海水温度および光照射が海水の成分組成に与える影響(サンゴの代謝による影響)の実験を計画している。研究二年目の本年度は、沖縄島沿岸で採取した海水中に光化学的に生成する活性酸素種(過酸化水素とOHラジカル)およびOHラジカル生成に重要な役割を果たすFe(II)について研究を行った。また、昨年度開発した連続流水混合実験システムを用いて、サンゴの代謝量について研究を行った。沖縄島周辺の海水中に光化学反応で生成する活性酸素種について研究した結果、海水中でのOHラジカル生成には、過酸化水素とFe(II)の反応(フェントン反応)が重要であることがわかった。特に、沖縄島沿岸でも赤土や生活廃水の流出の見られる海域で、OHラジカルや過酸化水素の生成が速い結果が得られた。連続流水混合実験システムを用いたサンゴの代謝に関する研究では、新鮮海水を供給する流速がサンゴの代謝に及ぼす影響を調べた。その結果、新鮮海水の流速はサンゴの代謝に大きな影響を及ぼさないことがわかった。しかし、流速が遅くなりすぎると、海水のpHが大きく下がり、サンゴの骨格である炭酸カルシウムが物理化学的に溶解してしまう可能性が示唆された。また、海水温度の影響を調べる実験より、サンゴの代謝は、海水温度が29°Cから31°Cに上がった時点で大きく変わることが明らかになった。特に、サンゴの呼吸量が増加したことと、アンモニア代謝量が増加したことは顕著であった。今後、さらに、連続流水混合実験システムを使って、海水温度の変化によるサンゴの代謝量変化およびサンゴの代謝物質から生成されるOHラジカルについての研究を進める。