hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
マクロファージにより活性化される脱分化誘導因子のエピジェネティックな発現制御

フタホシコオロギの脚再生は、傷口の修復、再生芽の形成、位置情報の認識、再パターン形成の4段階からなる。我々は、昆虫マクロファージを枯渇させる実験から、マクロファージ枯渇個体では再生芽が形成されず、脚再生が阻害されることを見出した。マクロファージは自然免疫に関わることから、Toll-like receptor (TLR)シグナル因子の機能解析を行ったところ、TLRのいくつかや、TLRの下流ではたらくMyD88が再生に必須であった。TLRシグナルの活性化によりNFkB転写因子が核移行する。コオロギのNFkBはDorsal, Dif, Relishの3遺伝子にコードされ、再生に必要なのはDorsalとDifであった。TLRの活性化により昆虫サイトカインupdの発現が増加すること、ゲノム解析によりupdの上流領域にNFkB結合部位が存在することが分かった。マクロファージは活性酸素種を産生すること、H2O2産生にはたらくNADPH酸化酵素の機能を低下させたコオロギでも再生能が低下したことから、酸化ストレスに応答する転写因子Nrf2の機能解析を行ったところ、Nrf2を機能阻害すると致死となり脚再生は起こらなかった。マウスやヒトの幹細胞に高発現するLin28のコオロギホモログも機能解析を行ったが、Lin28は脚再生に寄与しなかった。これまでの研究成果をまとめた総説をInt J Dev Biol誌に発表し、脚再生におけるマクロファージの機能をまとめた論文を学術誌に投稿中である。TLRシグナルが再生芽の形成に重要であったことから、コントロール個体とマクロファージ枯渇個体の再生脚を用いたエピジェネティック因子のスクリーニングを計画しており、次世代シーケンス解析のためのRNAのサンプリングを行っている。DorsalやDif、Nrf2と協調的にはたらく因子の単離を目指す。コオロギ脚再生にマクロファージのはたらきが必須であることから、自然免疫関連分子に着目して研究を進めた。TLRシグナル経路の下流ではたらくNFkB転写因子のうち、DorsalとDifが再生を促進すること、TLRシグナルの活性化によって発現が増加する昆虫サイトカインupd遺伝子の上流にNFkB結合部位が存在することを見出した。また、創傷治癒過程で活性酸素種の産生が増加することが知られており、酸化ストレスに応答する転写因子Nrf2の機能も脚再生に寄与することが示唆された。これらの結果を踏まえ、次年度はRNA-seqを行ってNFkB転写因子やNrf2転写因子と協調的にはたらくエピジェネティック因子の単離を試みる。TLRシグナルの機能やエピジェネティック因子の単離が困難な場合を考え、幹細胞で高発現することが知られているLin28の機能解析も進めた。Lin28遺伝子はGC含量が非常に高くクローニングが難航することが予想されたが、機能解析まで行うことができた。Lin28が脚再生に必須である場合は、Lin28と協調的にはたらくエピジェネティック因子の単離を試みる計画であったが、Lin28は脚再生に寄与しないことが分かった。今後は、神経系の幹細胞を制御することが知られているSoxNについても解析を行いたい。コオロギが脚を切断されると、マクロファージがTLRシグナルや活性酸素種の産生を活性化させ、TLRシグナルの活性化によってNFkB転写因子DorsalとDifが、活性酸素種によって酸化ストレス応答転写因子Nrf2がはたらいて脚再生を促進することが示唆された。また予備的な実験から、マクロファージ枯渇個体の再生脚ではアセチル化ヒストンH3K9が減少していた。そこで今後は、DorsalやDif、Nrf2などと協調的にはたらくヒストンアセチル化酵素の機能解析を目指す。マクロファージ枯渇個体とコントロール個体の再生脚を用いた比較RNA-seq解析を行って、これら転写因子と強調してはたらくと考えられるヒストンアセチル化酵素を網羅的に単離する。活性化したTLRシグナルは、昆虫サイトカインupdの発現を増加させる。updの遺伝子領域の上流にはNFkB結合部位が見出されたことから、NFkB結合部位の周辺では脚再生に伴ってヒストンH3K9アセチル化が亢進していると期待される。再生過程においてupdの上流領域ではヒストンテイルがアセチル化されるのか、TLRシグナルを不活性した状態でupdの発現を増加させると脚再生は促進されるのかなどを検討していきたい。

マクロファージは活性酸素種を産生すること、H2O2産生にはたらくNADPH酸化酵素の機能を低下させたコオロギでも再生能が低下したことから、酸化ストレスに応答する転写因子Nrf2の機能解析を行ったところ、Nrf2を機能阻害すると致死となり脚再生は起こらなかった。マウスやヒトの幹細胞に高発現するLin28のコオロギホモログも機能解析を行ったが、Lin28は脚再生に寄与しなかった。これまでの研究成果をまとめた総説をInt J Dev Biol誌に発表し、脚再生におけるマクロファージの機能をまとめた論文を学術誌に投稿中である。TLRシグナルが再生芽の形成に重要であったことから、コントロール個体とマクロファージ枯渇個体の再生脚を用いたエピジェネティック因子のスクリーニングを計画しており、次世代シーケンス解析のためのRNAのサンプリングを行っている。DorsalやDif、Nrf2と協調的にはたらく因子の単離を目指す。コオロギ脚再生にマクロファージのはたらきが必須であることから、自然免疫関連分子に着目して研究を進めた。TLRシグナル経路の下流ではたらくNFkB転写因子のうち、DorsalとDifが再生を促進すること、TLRシグナルの活性化によって発現が増加する昆虫サイトカインupd遺伝子の上流にNFkB結合部位が存在することを見出した。また、創傷治癒過程で活性酸素種の産生が増加することが知られており、酸化ストレスに応答する転写因子Nrf2の機能も脚再生に寄与することが示唆された。これらの結果を踏まえ、次年度はRNA-seqを行ってNFkB転写因子やNrf2転写因子と協調的にはたらくエピジェネティック因子の単離を試みる。TLRシグナルの機能やエピジェネティック因子の単離が困難な場合を考え、幹細胞で高発現することが知られているLin28の機能解析も進めた。Lin28遺伝子はGC含量が非常に高くクローニングが難航することが予想されたが、機能解析まで行うことができた。Lin28が脚再生に必須である場合は、Lin28と協調的にはたらくエピジェネティック因子の単離を試みる計画であったが、Lin28は脚再生に寄与しないことが分かった。今後は、神経系の幹細胞を制御することが知られているSoxNについても解析を行いたい。コオロギが脚を切断されると、マクロファージがTLRシグナルや活性酸素種の産生を活性化させ、TLRシグナルの活性化によってNFkB転写因子DorsalとDifが、活性酸素種によって酸化ストレス応答転写因子Nrf2がはたらいて脚再生を促進することが示唆された。また予備的な実験から、マクロファージ枯渇個体の再生脚ではアセチル化ヒストンH3K9が減少していた。そこで今後は、DorsalやDif、Nrf2などと協調的にはたらくヒストンアセチル化酵素の機能解析を目指す。マクロファージ枯渇個体とコントロール個体の再生脚を用いた比較RNA-seq解析を行って、これら転写因子と強調してはたらくと考えられるヒストンアセチル化酵素を網羅的に単離する。活性化したTLRシグナルは、昆虫サイトカインupdの発現を増加させる。updの遺伝子領域の上流にはNFkB結合部位が見出されたことから、NFkB結合部位の周辺では脚再生に伴ってヒストンH3K9アセチル化が亢進していると期待される。
脂質ラジカル連鎖反応への水素分子の関与：水素の抗炎症作用メカニズムの解明に向けて

水素分子は優れた抗酸化作用を持つだけでなく、抗炎症作用、抗アレルギー作用、細胞死抑制作用、エネルギー代謝促進作用などの多彩な効果を有している。我々は水素分子が生体内において、細胞膜のフリーラジカル連鎖反応に介入し、脂質メディエイターとなる過酸化リン脂質生成を変化させることで炎症に関わる遺伝子の発現を制御することを明らかにした。本研究では炎症、アレルギー、細胞死に関わる免疫細胞に焦点をあて、免疫細胞の酸化還元状態をリアルタイムで測定できる実験系の開発を試みた。我々が開発した酸化還元モニタリングマウスであるroGFPマウスの免疫組織でのroGFPタンパク質の発現を調べた。ミトコンドリアでroGFPを発現するMROマウスと、細胞質でroGFPを発現するCROマウスのどちらの免疫系組織においても405nm,480nmの励起波長でのroGFPたんぱく質の発現が確認された。さらにroGFPマウスの脾臓から免疫細胞を単離し、フローサイトメーターで解析を行った。各種免疫細胞でのroGFPたんぱく質の発現が確認された。さらに還元剤であるDTT、酸化剤である過酸化水素で処理した免疫細胞は、処理前に比べて405nmと480nmの蛍光比率が変化し、酸化還元状態の測定が可能なことが分かった。今後はroGFPマウスの免疫細胞を用いて、炎症、アレルギー、細胞死を誘導し、水素分子を処理してex vivoでの水素分子の免疫細胞への影響を調べる。水素分子は抗酸化作用のみでなく抗炎症作用、抗アレルギー作用、細胞死抑制作用、エネルギー代謝促進作用など多彩な効果を有する。水素分子が活性酸素種の除去のみでなく様々な遺伝子発現を制御することがわかっているが、不活性物質である水素分子が生体内においてシグナル分子として働くとは考えにくく、水素による遺伝子発現制御メカニズムの解明が課題であった。多価不飽和脂肪酸を多く含む生体膜脂質は、非酵素的ラジカル連鎖反応によって過酸化が連鎖的に進み、一次生成物として共役ジエン構造を有するリン脂質ヒドロペルオキシドが生成される。このリン脂質酸化体の生成が過剰となり生体膜脂質酸化ホメオスタシスが破錠すると細胞死誘導へのシグナルが進み、疾患の原因となることが知られている。我々は水素分子が生体内において細胞膜のフリーラジカル連鎖反応に介入し、脂質メディエイターとなる過酸化リン脂質生成を変化させることで、炎症に関わるシグナル伝達を抑制するという仮説を立てた。そこで本研究では、生体内におけるフリーラジカル連鎖反応と炎症に関わるシグナル伝達経路の活性化に着目し、それらに対する水素分子の影響を確かめ、水素分子の抗炎症作用のメカニズムを解明することを目的とする。研究戦略は以下のステップで進める。1.化学的な実験系で、水素分子が脂質酸化のフリーラジカル連鎖反応に介入することを証明する。2.培養細胞を用いた実験系で水素分子が関与して生成する脂質メディエイターにより、活性が抑制される転写因子や増加が抑制される炎症性サイトカインを明らかにして、水素が関与するシグナル経路を見つける。3.マウスを用いた実験系で酸化ストレスを誘導し、水素投与により上記のシグナル経路が制御されることを証明する。1.化学的な実験系で、水素分子が脂質酸化の際のフリーラジカル連鎖反応に介入することを証明した。さらに水素分子は水溶性画分より脂肪酸画分への溶解比率が有意に高く、水素保持時間は飽和脂肪酸より不飽和脂肪酸が有意に高いことから、生体内での細胞膜脂質酸化に水素分子が関与するという仮説を化学的に裏付けることができた。2.培養細胞を用いた実験系で、水素存在下で酸化させたoxPAPCは、細胞内へのカルシウム流入効果が低く、炎症性サイトカインの発現が低いことが分かった。さらにその上流の転写因子NFATの活性が低いことが明らかになった。近年水素分子が生体内において様々な遺伝子発現を制御することがわかってきたが、そのメカニズムはまだ明らかとなっていない。化学的な実験系で、水素分子存在下で不飽和脂肪酸であるリノール酸を空気酸化させると、過酸化脂質であるジエン生成が低下した。さらに水素分子は細胞死を誘導する過酸化脂質生成を抑制し、細胞内のCa2+シグナル応答を制御した。このことは水素分子が脂質酸化の際のフリーラジカル連鎖反応に介入することを示唆している。そこで水素分子が生体内において、細胞膜のフリーラジカル連鎖反応に介入し、脂質メディエイターとなる過酸化リン脂質生成を変化させることで炎症に関わるシグナル伝達を抑制するという仮説を立てた。本研究では生体内におけるフリーラジカル連鎖反応と炎症に関わるシグナル伝達経路の活性化に着目し、それらに対する水素分子の影響を確かめ、水素分子の抗炎症作用のメカニズムを解明することを目的とする。実験には生体膜に多く含まれる不飽和脂肪酸の一種のリン脂質(PAPC:1-パルミトイル-2-アラキドノイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジルコリン)を用いた。PAPCは空気中においてフリーラジカル連鎖反応で酸化されると遺伝子発現制御を行う様々な脂質メディエーターを生じる。そこで、PAPCを水素存在下で空気酸化し、その酸化リン脂質を培養細胞に加える実験系で遺伝子解析を行う。水素分子により活性が抑制される転写因子や、増加が抑制されるサイトカインを明らかにして、水素分子が関与するシグナル経路を同定する。生体膜のリン脂質の一種で、構造内に不飽和脂肪酸をもつPAPCをフリーラジカル連鎖反応により酸化させた。水素存在下、非存在下で酸化させたPAPC(oxPAPC、H2oxPAPC)を培養細胞に作用させた。

1.oxPAPCを作用すると細胞内情報伝達を担う細胞内のカルシウムの上昇がみられたが、1.3%以上の水素存在下で酸化させたH2oxOAPCは、カルシウムの細胞内上昇が抑えられた。2.マイクロアレイによる網羅的解析と、RT PCRによる遺伝子発現解析で、カルシウムシグナルにより活性化する転写因子NFATと水素分子の関与が明らかとなった。3.ヒト培養細胞にフリーラジカル発生剤であるAAPHを加え、フリーラジカル連鎖反応を引きおこした。水素が1.3%以上存在するときに、フリーラジカル連鎖反応は抑制された。AAPH存在下では、細胞内のカルシウム濃度が上昇し、水素の存在下で抑制された。同時にNFATの活性も水素によって抑制された。また、NFATにより転写される遺伝子の発現もAAPHによって上昇し、水素のよって下降した。以上の結果は、空気酸化によりPAPCをフリーラジカル連鎖反応で酸化させた結果と一致した。また、マウスを用いた実験系でザイモサンを腹腔内投与、または経鼻投与し、炎症モデルを作製した。水素分子とNFATの阻害剤であるサイクロスポリンAを投与して、水素分子が生体内の免疫系細胞のNFAT核移行を抑制することを証明しようと試みたが、有意な結果は得られていない。水素分子は優れた抗酸化作用を持つだけでなく、抗炎症作用、抗アレルギー作用、細胞死抑制作用、エネルギー代謝促進作用などの多彩な効果を有している。我々は水素分子が生体内において、細胞膜のフリーラジカル連鎖反応に介入し、脂質メディエイターとなる過酸化リン脂質生成を変化させることで炎症に関わる遺伝子の発現を制御することを明らかにした。本研究では炎症、アレルギー、細胞死に関わる免疫細胞に焦点をあて、免疫細胞の酸化還元状態をリアルタイムで測定できる実験系の開発を試みた。我々が開発した酸化還元モニタリングマウスであるroGFPマウスの免疫組織でのroGFPタンパク質の発現を調べた。ミトコンドリアでroGFPを発現するMROマウスと、細胞質でroGFPを発現するCROマウスのどちらの免疫系組織においても405nm,480nmの励起波長でのroGFPたんぱく質の発現が確認された。さらにroGFPマウスの脾臓から免疫細胞を単離し、フローサイトメーターで解析を行った。各種免疫細胞でのroGFPたんぱく質の発現が確認された。さらに還元剤であるDTT、酸化剤である過酸化水素で処理した免疫細胞は、処理前に比べて405nmと480nmの蛍光比率が変化し、酸化還元状態の測定が可能なことが分かった。今後はroGFPマウスの免疫細胞を用いて、炎症、アレルギー、細胞死を誘導し、水素分子を処理してex vivoでの水素分子の免疫細胞への影響を調べる。1.培養細胞を用いた実験系で、いくつかの薬剤で酸化ストレスを誘導し、水素が関与すると思われる経路に関わる転写因子それぞれの阻害剤を用いて活性化解析を行い、水素の関与を証明する。
化学療法による末梢神経障害に対する治療法の開発-臨床研究と動物実験による解明-

タキサン系の抗癌剤では末梢神経障害のため、患者のQOL低下や投薬中止を余儀なくされるが、有効な治療方法はない。我々は、その末梢神経障害に対して鍼治療の安全性と効果を臨床研究、基礎研究から明らかにすることを目的とした。ヒストリカルコントロール(Weekly-Paclitaxel療法12週連続投与)では、投与回数(蓄積容量)に依存して、自覚症状(VAS)、感覚機能(SWMT)は増悪する傾向を示した。末梢神経障害が発症した患者(Paclitaxel療法)に対する鍼治療では、鍼治療では中等度以上の有害事象は認められず、自覚症状(VAS)は有意に軽減した。有効条件の検討では、末梢神経障害が軽度である症例において鍼治療の有効性がより高いことが示唆された。モデル動物を用いた基礎研究では、鍼通電刺激は、Paclitaxelに伴う末梢神経障害による機械的閾値の低下と血流を改善した。これらのことから、Paclitaxel投与による末梢神経障害に対する鍼治療は、安全で有効な治療方法であることが示唆された。化学療法(タキサン系薬剤)では末梢神経障害(痛みを伴うしびれ)のため、患者のQOL低下や投薬中止を余儀なくされるが、有効な治療方法はない。我々は、その末梢神経障害に対して鍼治療が安全で有効な治療方法であることを臨床試験及び動物実験により検討することを目的とした。臨床試験:化学療法により末梢神経障害が発症し、本臨床試験に同意の得られた患者を対象とした。鍼治療は、下肢(陽陵泉-懸鐘、陰陵泉-三陰交:2Hz・10分間の鍼通電刺激、太衝:置鍼)を週1回で6週間行なった。結果、VASで評価される自覚症状は、53.1±4.3mm(mean±SE)が37.8.1±5.1mmへと有意に軽減した。タッチテストで評価される客観的指標は、異常値を示した足背14名中7名、足裏11名中9名が改善した。また、鍼治療の有効条件の検討では、「軽減因子(温めると症状悪化vs温めると症状軽減)」では、温めると軽減する群では症状が有意に改善した。鍼治療による有害事象は、中等度以上は認められなかった。軽度なものは、一過性(主に初回治療時)の軽度倦怠感、軽度違和感、軽度症状悪化であった。動物実験:雄性SD系ラット(300-350g)をコントロール群(n=7)、鍼通電刺激群(n=6)の2群に分けた。神経障害モデルは、パクリタキセル(1mg/Kg、隔日4日)を投与することで作成した。鍼通電刺激は右下腿(足三里-懸鍾相当部位)へ2Hz・3mA・30分間とし、初回投与後10日より週2回行った。結果、Von Frey hair testで評価される機械的閾値は、閾値が正常値に戻る日数では両群間に有意な差は認められなかった。しかし、皮膚表面温度は、鍼通電刺激群が改善する傾向を示した。化学療法では末梢神経障害(痛みを伴うしびれ)のため、患者のQOL低下や投薬中止を余儀なくされるが、有効な治療方法はない。我々は、その末梢神経障害に対して鍼治療が安全で有効な治療方法であることを本科学研究費等で臨床研究及び動物実験により検討している。当該年度では、化学療法の中でもタキサン系の薬剤であるPaclitaxel (PTX)に焦点を当てて見当した。臨床研究:PTX投与に起因する下肢末梢神経障害(しびれ)を有する15名に対し、週1回の間隔で合計6回の鍼治療(陽陵泉-懸鐘・陰陵泉-三陰交:鍼通電刺激、太衝:置鍼術)を行った。研究期間は、評価を含め7週間とし、鍼治療期間前(鍼治療1回目開始前)と鍼治療期間後(鍼治療6回目終了1週間後)に評価を行った。結果、鍼治療期間前後において、しびれの主観的評価であるVASは63[46-73]mmから42[9-68]mm(中央値[四分位範囲])と有意な改善が認められた(p=0.038)。また鍼治療期間後アンケートによる軽減群と不変群の検討では、タッチテストにおいて不変群に異常値が多く2群間に有意な差が認められた(p=0.035)。

動物実験:当該年度は、鍼刺激の有効な刺激条件を検討することを目的として、刺激量を変更(2Hz、0.07mA)して実施した。雄性SD系ラット(300-500g)をコントロール群、鍼通電群の2群に分けた。神経障害モデルは、PTX(1mg/Kg、隔日4日)投与することで作成した。鍼通電刺激は、右下腿(足三里-懸鐘付近)へ行った。その結果、機械的閾値は、閾値が正常に戻る日数では両群間に有意な差は認められなかった。しかし、皮膚表面温度は、鍼通電刺激群が改善する傾向を示した。タキサン系薬剤では末梢神経障害のため、患者のQOL低下や投薬中止を余儀なくされるが、有効な治療方法はない。我々は、その末梢神経障害が発症した患者に対する鍼治療を行い、鍼治療が安全で有効な治療方法であることを臨床研究で明らかにした。そこで平成23年度は予防効果について検討した。乳がんの術前・術後化学療法の患者(パクリタキセル療法×12週)のヒストリカルコントロールと鍼治療群の比較検討を行った。末梢神経障害の自覚症状を評価するVASでは、ヒストリカルコントロール群(n=17)は、33.6±9.0mm(投与6回目)が63.5±8.1mm(投与12回目)へと増加したが、投与6回目から実施した鍼治療群(n=8)では、63.5±8.1mmが31.6±9.7mmと改善した。また、末梢神経障害の感覚閾値を評価するタッチテストでは、ヒストリカルコントロール群では、21/36部位(患者数12名)で触覚閾値の低下が認められたが、鍼治療群では2/16部位で改善、9/16部位で変化を認めなった。動物実験:雄性SD系ラット(300-350g)をコントロール群(n=7)、鍼通電刺激群(n=6)の2群に分けた。神経障害モデルは、パクリタキセル(1mg/Kg、隔日4日)を投与することで作成した。鍼通電刺激は右下腿(足三里-懸鍾相当部位)へ2Hz・3mA・30分間とし、初回投与後10日より週2回行った。結果、Von Frey hair testで評価される機械的閾値は、閾値が正常値に戻る日数では両群間に有意な差は認められなかった。
平均曲率一定曲面の指数の評価と離散的平均曲率一定曲面の存在,分類,指数について

この研究により得られた結果は以下の通り。1.離散的な極小曲面と平均曲率定曲面をvariationalなアプローチでPolthier氏と共同研究した。variationalなアプローチによって離散的なcatenoidとhelicoidとデロネー回転面といわれる曲面の例を作った。Catenoidの場合には表示が得られた。離散的な極小曲面の指数も計算した。その計算は連続的な極小曲面の指数の評価に有用だった。2.R^3内のコンパクトな平均曲率定トラスのMorse指数の評価をした。その曲面はWente toriとよく呼ばれている。私はWente toriのMorse指数はいつも6より大きいことを証明した。さらにLima氏、Sousa Neto氏と共同で7より大きいことを証明した。3.数理物理に現われる解析のテクニックを使って、コンパクトではない平均曲率一定曲面のMorse指数の評価をした。Dirichlet boundary conditionによりその曲面のコンパクトな部分が大きくなるとMorse指数も大きくなるが、Lima氏、Berard氏と共同でコンパクト部分が増大するときのMorse指数のgrowth rateを計算した。4.Thayer氏とWohlgemuth氏と共同でR^3内のdoubly-periodicな極小曲面の例を調べた。5.山田光太郎氏と梅原雅彰氏と共同で3次元双曲空間内の全曲率が上に有界な平均曲率一定1曲面を分類した。6.山田光太郎氏と梅原雅彰氏と國分雅敏氏と共同で3次元双曲空間内のガウス曲率0曲面の特異点についての研究を始めた。7.Schmitt氏とKilian氏と共同で、可積分系の方法を使って、R^3内と双曲空間内と3次元球面内の平均曲率一定trinoidと呼ばれている曲面の作り方の研究を始めた。以上の結果は学術論文に発表されたことを付記しておく。今年度は次の五つの研究を行った。1)K.Polthier氏の協力を得て、variationalなアプローチにより離散的な平均曲率が一定の曲面を考えた。離散的な平均曲率が一定の曲面の指数評価を求め、それを用いて連続的な平均曲率が一定の曲面の指数評価を行った。それについて論文を書いた。2)3次元ユークリッド空間内と3次元双曲空間内の平均曲率が一定の曲面の存在と一意性と指数の研究を続けた。Edward Thayer氏とMeinhard Wholgemuth氏と一緒にdoubly-periodicな極小曲面の存在についての論文を出版した。また、Plateau問題の解が埋めこまれるための条件について、論文を出版した。また、Pierre Berard氏、Levi Lima氏と一緒に、コンパクトではない例に対しての指数のgrowthについての論文を投稿し、受理された。また、平均曲率が一定のWente曲面の指数について論文を投稿した。3)梅原氏、山田氏と一緒に、双曲空間内の小さい全曲率を持つ平均曲率が一定で1となる曲面の分類について、四つの論文を書いた(一つは、すでに出版された)。ユークリッド空間内の極小曲面と双曲空間内の平均曲率が一定で1の曲面の関係についてのsurveyの論文を単著で書いた(すでに受理されている)。4)多様体のラプラシアンのdiscretespectrumとWeylの漸近公式について、研究をした。特に、完備ではない例について考えた。この研究は平均曲率が一定の曲面の研究に応用がある。それについて、Jun Masamune氏と一緒に論文を出版した。5)ドイツでDorfmeister氏、Pedit氏、Wu氏、Bobenko氏と話をして、DPWという方法について研究を始めた。

今年度は次の五つの研究を行った。1)去年、ドイツでDorfmeister氏、Pedit氏、Wu氏、Bobenko氏と会い、DPWという方法についての研究を始めた。今年、アメリカで三回、日本で一回、Schmitt氏、Kilian氏、Pedit氏と会い、現在、3次元ユークリッド空間内と、3次元双曲空間内と3次元球面内のはめ込まれた平均曲率一定trinoidとbubbletonという曲面の存在について、DPWの方法で研究を続けている。特に、その曲面のperiodicityとエンドの性質を調べている。神戸大学の大学院生小林真平氏もこの研究のプロジェクトに入っている。この研究は以下の3)とよく関係がある。2)K.Polthier氏の協力を得て、variationalなアプローチにより離散的な平均曲率一定曲面を考えた。離散的な平均曲率一定曲面の指数評価を求め、それを用いて連続的な平均曲率一定曲面の指数評価を行った。それについて論文を書いた(すでに受理されている)。3)3次元ユークリッド空間内と3次元双曲空間内の平均曲率一定曲面の存在と一意性と指数の研究を続けた。Pierre Berard氏、Levi Lima氏と一緒に、コンパクトではない例に対しての指数のgrowthについての論文を投稿し、受理された(すでに受理されている)。また、平均曲率一定のWente曲面の指数について論文を投稿した(すでに受理されている)。4)梅原氏、山田氏と一緒に、双曲空間内の小さい全曲率を持つ平均曲率一定で1となる曲面の分類について、四つの論文を書いた(一つは、すでに出版された)。ユークリッド空間内の極小曲面と双曲空間内の平均曲率一定で1の曲面の関係についてのsurveyの論文を単著で書いた(すでに出版された)。5)多様体のラプラシアンのdiscretespectrumとWeylの漸近公式について、研究をした。特に、完備ではない例について考えた。この研究は平均曲率一定曲面の研究に応用がある。それについて、Jun Masamune氏と一緒に論文を出版した。この研究により得られた結果は以下の通り。1.離散的な極小曲面と平均曲率一定曲面をvariationalなアプローチでPolthier氏と共同研究した。variationalなアプローチによって離散的なcatenoidとhelicoidとデロネー回転面といわれる曲面の例を作った。Catenoidの場合には表示が得られた。離散的な極小曲面の指数も計算した。その計算は連続的な極小曲面の指数の評価に有用だった。2.R^3内のコンパクトな平均曲率一定トーラスのMorse指数の評価をした。その曲面はWente toriとよく呼ばれている。私はWente toriのMorse指数はいつも6より大きいことを証明した。さらにLima氏、Sousa Neto氏と共同で7より大きいことを証明した。
大気中の酸素濃度と二酸化炭素の炭素同位体を用いた地球規模の炭素循環の解明

人間活動によって大気に放出された二酸化炭素が陸上生物圏と海洋にどのくらい吸収されているかを定量的に評価するために、二酸化炭素濃度と炭素同位体を組み合わせて解析する方法と、酸素濃度と二酸化炭素濃度を組み合わせて解析する方法を実施した。まず二酸化炭素濃度と炭素同位体を組み合わせて解析することによって得られた人為起源二酸化炭素の陸上生物圏と海洋による吸収量を1984-2000年の期間について評価した。その結果二酸化炭素吸収は、陸上生物圏について1.21GtC/yr、海洋について1.59GtC/yrとなり、観測期間全体を平均すると陸上生物圏も海洋も二酸化炭素の吸収源となっていたことが明らかになった。これらの吸収源の強度は年々変動しており、特に陸上生物圏による吸収がエルニーニョ現象や火山噴火による異常気象の影響を強く受けて変化することが明らかになった。一方、酸素濃度と二酸化炭素濃度を組み合わせることによって評価した1999-2003年の二酸化炭素吸収は、陸上生物圏について1.1±1.0GtC/yr、海洋について2.0±0.6GtC/yrと見積ることができた。2つの独立した研究から得られた成果を観測期間がほぼ重なっている時期について比較した。陸上生物圏による二酸化炭素吸収量は、二酸化炭素濃度と炭素同位体から得られた1994-2000年の値が0.90GtC/yrであり、酸素濃度と二酸化炭素濃度から得られた値が1.1±1.0GtC/yrと評価された。また、海洋による二酸化炭素吸収量は、二酸化炭素濃度と炭素同位体から得られた1994-2000年の値が1.73GtC/yrであり、酸素濃度と二酸化炭素濃度から得られた値が2.0±0.6GtC/yrと評価された。2種類の全く異なった研究方法によって得られた結果が良く一致しているため、本研究によって信頼性の高い結果が得られたと考えられる。極めて高い精度での酸素濃度測定を長期間にわたって安定して行うために、独自に開発した酸素濃度測定装置を細部にわたって調整した。また、長期観測によって得られるデータの統一性を保つために、第1次、第2次、作業用からなる酸素濃度測定用標準ガスのシステムを確立した。さらに、酸素濃度の測定には試料の変質を避けるために特殊なガラス容器を使用することが不可欠であることが研究から判明したので、新たに試料採集・保存のための専用容器を製作した。試料空気をガラス容器に加圧採取すると酸素濃度が時間とともに低下することが我々の研究から明らかになった。これを避けるために空気試料は大気圧で採取することにした。同じ空気試料から二酸化炭素濃度の高精度同時測定を行う必要があるが、従来用いられてきた非分散赤外分析計には大量の空気試料が必要になるため利用することが出来ない。このため、少量の試料の分析が可能な現有のガスクロマトグラフを新たに二酸化炭素濃度計測システムに組み込み、調整を行った。本研究を遂行するためには二酸化炭素の炭素同位体測定みついても0.02%という高い精度を維持する必要があるため、現有の質量分析計を再整備した。また、国際標準となっているNBS-18を用いて本研究の基準となる標準ガスを新たに製作し、従来の研究で使用してきた作業用ガスの再検定を行った。南極昭和基地および北極ニーオルスン基地、波照間島に加えて、日本-米国間と日本-ニュージーランド間の就航している定期商船上、および日本上空での商用定期航空機上において系統的な大気試料採集を実施した。試料が採集された容器を東北大学に返送してもらい、二酸化炭素濃度と酸素濃度、および二酸化炭素の炭素同位体を分析した。

1.南極昭和基地および北極ニーオルソン基地、波照間島、日本-北米間と日本-ニュージランド間に就航している定期コンテナ船上、および仙台-福岡に就航している日本エアシステムのジェット旅客機や東邦航空の単発セスナ機を用いて日本上空での系統的な大気採集を継続実施し、二酸化炭素濃度やその同位体および酸素濃度データの蓄積をおこなった。また、試料採集容器をさらに追加製作し、稚内-利尻、七類-隠岐、博多-那覇に就航しているフェリーに依頼して日本付近の時間・空間分解能を高めるた試料空気の採取も開始した。2.二酸化炭素濃度やその同位体および酸素濃度の分析結果を解析した結果、それぞれについてきわめてきれいな季節変化と経年変化が得られた。二酸化炭素濃度は春季に最高濃度、夏季に最低濃度となるような季節変化を示し、さらに経年的に増加するような変化を示すのにたいして、二酸化炭素の炭素同位体や酸素濃度は二酸化炭素濃度と対称的な季節変化を示すことが明らかになった。また炭素同位体や酸素濃度は経年的に減少していることも明らかになった。これらの広域にわたる時間的・空間的変動の特性を明らかにするとともに、それらの原因について検討した。3.酸素濃度測定の精度や標準ガススケールを相互比較するため、米国プリンストン大学の研究グループと多数の空気試料の交換を行い、それらの測定結果の詳細な比較検討を実施した。4.全球3次元大気輸送モデルへの二酸化炭素と酸素の循環過程の組み込みを行った。そのモデルに現在広く受け入れられている幾つかの二酸化炭素放出・吸収のシナリオを入力して、実際に大気中の二酸化炭素濃度と酸素濃度、二酸化炭素の炭素同位体比を計算した。人間活動によって大気に放出された二酸化炭素が陸上生物圏と海洋にどのくらい吸収されているかを定量的に評価するために、二酸化炭素濃度と炭素同位体を組み合わせて解析する方法と、酸素濃度と二酸化炭素濃度を組み合わせて解析する方法を実施した。まず二酸化炭素濃度と炭素同位体を組み合わせて解析することによって得られた人為起源二酸化炭素の陸上生物圏と海洋による吸収量を1984-2000年の期間について評価した。その結果二酸化炭素吸収は、陸上生物圏について1.21GtC/yr、海洋について1.59GtC/yrとなり、観測期間全体を平均すると陸上生物圏も海洋も二酸化炭素の吸収源となっていたことが明らかになった。これらの吸収源の強度は年々変動しており、特に陸上生物圏による吸収がエルニーニョ現象や火山噴火による異常気象の影響を強く受けて変化することが明らかになった。一方、酸素濃度と二酸化炭素濃度を組み合わせることによって評価した1999-2003年の二酸化炭素吸収は、陸上生物圏について1.1±1.0GtC/yr、海洋について2.0±0.6GtC/yrと見積ることができた。2つの独立した研究から得られた成果を観測期間がほぼ重なっている時期について比較した。陸上生物圏による二酸化炭素吸収量は、二酸化炭素濃度と炭素同位体から得られた1994-2000年の値が0.90GtC/yrであり、酸素濃度と二酸化炭素濃度から得られた値が1.1±1.0GtC/yrと評価された。また、海洋による二酸化炭素吸収量は、二酸化炭素濃度と炭素同位体から得られた1994-2000年の値が1.73GtC/yrであり、酸素濃度と二酸化炭素濃度から得られた値が2.0±0.6GtC/yrと評価された。
光癌治療を目指した新規ケイ素型光増感ナノ粒子の創製

光癌治療に用いる光増感色素の高効率化を目指した研究を行った。従来化合物よりも一重項酸素の光増感効率と癌細胞による取り込み効率の向上に成功した。ケイ素により選択的な腫瘍集積効率も増加し、治療効果が著しく向上することを明らかにした。腫瘍集積性をさらに向上させるためにナノシリカとの複合化を行った。有機溶媒中ではナノシリカ表面に光増感色素を修飾しても高い一重項酸素の光増感効率を維持できることを確認できた。我々はこれまでに光線力学療法に用いる光増感色素への応用を目指し、新しい高効率なケイ素型光増感色素を開発してきた。本課題の目的は、EPR効果を利用して開発してきたケイ素型光増感色素の腫瘍集積性を向上させることである。具体的にはEPR効果を示すシリカナノ粒子にケイ素型光増感色素を修飾させ、その光物性を明らかにすることである。初めに、光増感色素をシリカナノ粒子に修飾するために、トリエトキシシリル基を有するシリルポルフィリンの合成を行った。この色素は他のシリルポルフィンと同様に高い一重項酸素の増感量子収率を示すことも明らかにした。次に、トリエトキシシリル基を有するシリルポルフィリンとシリカナノ粒子をシランカップリング反応により表面修飾した。反応後、シリカナノ粒子が着色し、吸着していることが確認できた。また、シリカナノ粒子に吸着したシリルポルフィリンの光物性を各種分光学的手法により評価した。シリルポルフィリンによって良溶媒であるTHF中では、シリカナノ粒子に吸着した色素と未吸着のものでは、ほぼ同じ吸収・蛍光スペクトルを示し、蛍光寿命や一重項酸素の増感量子収率などの光物理パラメーターもほぼ同じであったことから、シリルポルフィリンはシリカナノ粒子に吸着しても高い効率を維持していることが明らかになった。しかし、生体環境である水中では、一重項酸素の増感量子収率が低下してしまうことが明らかとなった。この原因を明らかにするために吸収・蛍光特性を調べた結果、水はシリルポルフィリンにとって貧溶媒であるため、色素分子間で会合を起こし、効率が低下してしまうことが明らかになった。以上の結果から、水中でも高い効率を維持するためには、光増感色素にとって水が良溶媒である必要があり、次年度は水溶性シリルポルフィリンをシリカナノ粒子に修飾する必要があることがわかった。癌の光化学療法である光線力学療法に用いる薬剤(光増感色紙)の開発を行った。本課題では、我々がこれまでに開発してきたケイ素型光増感色素のさらなる高効率化、及び腫瘍選択性を向上させるためにシリカナノ粒子との複合化について研究した。光増感色素の改良に関しては、以前に合成したシリル基を有する水溶性ポルフィリンの親水置換基をスルホ基からカルボキシル基に変更したところ、一重項酸素の光増感効率は0.66から0.72へと増加した。また、癌細胞による色素取り込み効率も40%向上し、光照射によって培養癌細胞を殺傷する能力は10倍近くに向上した。さらに担癌ヌードマウスを用いて新しい光増感色素の評価を行ったところ、非ケイ素型色素では腫瘍選択的集積性は見られなかったのに対し、ケイ素型色素では筋肉と腫瘍で10倍の濃度差が観測され、ケイ素型にすることにより腫瘍への選択的集積性が向上することがわかった。これらのケイ素の効果により、癌治療効果が著しく向上し、腫瘍の治癒に成功した。この成果については特許出願した。一方、シリカナノ粒子との複合化については、光増感色素にシランカップリング基を導入してからシリカ表面に修飾する方法と、反応性基を有するシランカップリング剤でシリカ表面を修飾した後、光増感色素を導入する方法のどちらでも複合化に成功した。シリカ表面に修飾した光増感色素は有機溶媒中では単量体として存在し、一重項酸素を高い効率で光増感したが、水溶液中では色素が会合体を形成してしまい、一重項酸素の増感効率が低下してしまうことがわかった。会合を抑制するために、1.表面色素密度を低下させた、2.色素を水溶性の化合物に変更した、が回避できなかった。今後会合を防止するために、ケイ素置換基をさらに嵩高くすることなどを検討する必要が有る。
好酸球性副鼻腔炎の病態解明-制御性T細胞とIL-17産生性T細胞の関与について

罹患副鼻腔粘膜への好酸球浸潤を特徴とする好酸球性副鼻腔炎の病態形成に、ヘルパーT細胞サブセットのアンバランスが存在するのではないかと考えた。本研究課題では慢性副鼻腔炎患者の鼻ポリープと末梢血単核球を採取して、ヘルパーT細胞サブセットを比較検討した。好酸球性副鼻腔炎患者は慢性副鼻腔炎患者と比較して、鼻ポリープ、末梢血単核球ともにIL-4陽性CD4陽性細胞、IFN-γ陽性CD4陽性細胞が高発現していた。好酸球性副鼻腔炎患者は免疫能が亢進している可能性が示唆された。当院で手術に至った好酸球性副鼻腔炎患者2例、非好酸球性副鼻腔炎2例を対象に、十分な説明を行い、同意を得たあとに検討を行った。対象から血液20mlを採取して、比重遠心分離法にて末梢血単核球を分離してPMAとIonomycinで刺激し、モネシンでサイトカインの細胞外放出を阻害してFlow cytometoryにてヘルパーT細胞中のTh1、Th2、Treg、Th17陽性細胞の割合を測定した。測定の方法として抗CD4抗体と抗IL-4抗体(Th2)、抗IFN-γ抗体(Th1)、抗Foxp3抗体(Treg)、抗IL-17抗体(Th17)の二重染色を行った。反応時間は3時間で行った。好酸球性副鼻腔炎患者は非好酸球性副鼻腔炎と比較してIL-4陽性T細胞(Th2)の発現が増強している傾向があった。IFN-γ陽性T細胞(Th1)は好酸球性副鼻腔炎患者、非好酸球性副鼻腔炎患者両群において発現が増強している傾向があった。Foxp3陽性T細胞(Treg)の発現は両群間に大きな差は無く、IL-17は発現を同定することが出来なかった。CD4陽性細胞におけるIL-17陽性細胞の占める割合は少なく、検出が不十分であったので今後PMAの反応時間を延ばしたり、抗体の濃度を増量して再検討するとともに、全体的に対象を増やして有意差検定を行っていく予定である。さらに副鼻腔粘膜局所における各Thサブセットの割合を免疫染色を用いて検討していく予定である。当院で手術に至った好酸球性副鼻腔炎患者2例、非好酸球性副鼻腔炎2例を対象に、十分な説明を行い同意を得たあとに検討を行った。対象から鼻ポリープを採取しパラフィン包埋してスライド上に連続切片を作成し、抗CD4抗体と抗GATA-3抗体、抗t-bet抗体、抗Foxp3抗体、抗RORγt抗体を反応させて、二重染色にてCD4陽性細胞中の各サブセットの発現細胞数を測定した。好酸球性副鼻腔炎患者は非好酸球性副鼻腔炎と比較してGATA-3陽性のCD4陽性細胞とt-bet陽性のCD4陽性細胞を多く認めた。この結果から好酸球性副鼻腔炎の局所ではTh1、Th2型免疫応答がともに亢進している可能性が示唆された。また、Foxp3陽性CD4陽性細胞と抗RORγt陽性T細胞の発現は好酸球性副鼻腔炎群、非好酸球性副鼻腔炎群ともに同定することが出来なかった。もともとCD4陽性細胞におけるIL-17陽性細胞、Foxp3陽性細胞の占める割合は少ないので、今後抗体の反応時間を延ばしてTreg、Th17陽性Th細胞を同定するとともに、全体的に対象症例を増やして検討し、有意差検定を行っていく予定である。また、対象から血液20mlを採取して、比重遠心分離法にて末梢血単核球を分離してFlow cytometoryにてTh1、Th2、Treg、Th17陽性T細胞の割合を測定した。IFN-γ陽性T細胞(Th1)は非好酸球性副鼻腔炎患者において発現が増強している傾向があった。Foxp3陽性T細胞(Treg)の発現は両群間に大きな差は無く、IL-17は好酸球性副鼻腔炎群1例で高発現していた。今後全体的に対象を増やして有意差検定を行っていく予定である。対象から鼻ポリープを採取しパラフィン包埋してスライド上に切片を作成した。

作成した連続切片に対し、抗CD4抗体と抗GATA-3抗体、抗t-bet抗体、抗Foxp3抗体、抗RORγt抗体を反応させて、二重染色にてCD4陽性細胞中の各サブセットの発現細胞数を測定した。好酸球性副鼻腔炎患者は非好酸球性副鼻腔炎と比較してGATA-3陽性のCD4陽性細胞(Th2細胞)とt-bet陽1生のCD4陽性細胞(Th1細胞)を多く認めた。この結果は昨年と同様であった。また、Foxp3陽性CD4陽性細胞(Treg)と抗RORγt陽性T細胞(Th17)の発現は好酸球性副鼻腔炎群、非好酸球性副鼻腔炎群ともに同定することが出来なかった。今回対象とした鼻ポリープ組織中には単核球浸潤を多く認めるものがあまりなかったこと、また、抗体の反応時間を延長したが、Foxp3、RORγt陽性細胞を検出することができなかった。また、対象から血液20mlを採取して、比重遠心分離法にて末梢血単核球を分離してFlow cytometoryにてTh1、Th2、Treg、Th17陽性T細胞の割合を測定した。好酸球性副鼻腔炎患者は非好酸球性副鼻腔炎と比較してIL-4陽性T細胞(Th2)の発現が増強している傾向があった。IFN-γ陽性T細胞(Th1)は非好酸球性副鼻腔炎患者において発現が増強している傾向があった。Fox p3陽性T細胞(Treg)の発現は検出することが出来なかった。
急性中耳炎における粘膜過形成の制御に関わる新たな増殖因子の検索

急性中耳炎の病理組織学的および分子生物学的メカニズムの解明を解明し、病態解消に向けた新たな治療戦略開発を目指すべく、増殖因子に注目して基礎実験を行った。実験的環境で強力な中耳粘膜増殖効果を示すHBーEGFという増殖因子に着目し、この増殖因子の作用を詳細に検討した。検討により、HBーEGFが作用する際のドミナントなシグナル伝達経路および、実際の細菌性中耳炎においてHBーEGFが粘膜増殖に重要な役割をになっていることを示した。急性中耳炎は高頻度に小児が罹患する代表的な上気道炎であり、また一部の患児ではこの病態が遷延・反復することで、慢性中耳炎や感音難聴などの晩期合併症を来たし、言語発達や学業成績に影響することがあることが知られている。急性中耳炎の主な組織病理学的病態として中耳粘膜の過形成であり、その本態は細胞増殖・分化である。さらにこの状態が反復・遷延することで慢性中耳炎でみられるような鼓室の換気障害や肉芽形成、線維化などの一部不可逆的な病態を惹起し、上述の晩期合併症に関連することも知られている。それゆえに中耳粘膜過形成の病理組織学的および分子生物学的なメカニズムの解明は重要と考えられる。増殖因子は粘膜過形成を制御する主な因子であり、中耳粘膜においてはEGFやFGFが関与することが知られているが、現在まで10種類程度の因子しか調べられておらず、網羅的な検討はされていなかった。申請者はこの点に鑑み急性中耳炎の粘膜過形成を制御する新たな増殖因子の検索をテーマとして基礎実験を行った。細菌性中耳炎モデルマウスにおけるDNAマイクロアレイを用いた増殖因子の検索にて、中耳粘膜の過形成と同様の時間経過でmRNAの発現上昇を呈する7種類(HB-EGF,Amphiregulin, Epiregulin, Inhibin beta A, LIF, GDF15, Cxcl1)の新たな増殖因子を同定した。中耳粘膜器官培養組織による中耳粘膜増殖アッセイを用いて、前述の7因子の作用を検討したところ、HB-EGFにおいて著明な粘膜増殖効果を示し、急性中耳炎における粘膜過形成に寄与している可能性が示唆された。抗HB-EGF抗体を用いた免疫組織染色ではHB-EGFは中耳粘膜上皮および上皮および浸出液中の炎症細胞より産生されていることがわかり、以前の研究の結果と合わせるとこの炎症細胞は好中球と考えられた。急性中耳炎は高頻度に小児が罹患する代表的な上気道炎であり、また一部の感じではこの病態が遷延・反復することで、慢性中耳炎や感音難聴などの晩期合併症を来たし、言語発達や学業成績に影響することがあることが知られている。急性中耳炎の主な組織病理学的病態は中耳粘膜の過形成であり、その本態は中耳粘膜細胞の細胞増殖および分化である。この状態が反復・遷延することで鼓室の肉芽形成・線維化・換気障害などの一部不可逆的な病態を惹起し、上述の晩期合併症に関連することも知られている。それゆえに、中耳粘膜過形成の病理組織学的および分子生物学的メカニズムの解明は重要と考えられる。昨年までの研究で我々は中耳粘膜過形成を主に制御すると考えられる増殖因子に注目し、DNAマイクロアレイを用いた網羅的検索とその後の中耳粘膜器官培養組織による中耳粘膜増殖アッセイを用いて、HB-EGFによる著明な粘膜増殖効果を示し、急性中耳炎における粘膜過形成に寄与している可能性を見いだしている。今年度の研究にて、そのHB-EGFの粘膜増殖への作用機序を解明すべく、細胞増殖に関わるシグナル伝達経路に注目し、Kinase Inhibitorを用いて、ドミナントなシグナル伝達経路を検討した。AKT, ERK, JNK, p38MAPK経路に特異的な各種キナーゼ阻害剤を中耳粘膜器官培養組織に添加し、最終的な中耳粘膜培養組織の面積を計測した。結果AKT経路およびERK経路の阻害剤にて有意な粘膜増殖の減少が認められ、AKT経路およびERK経路がHB-EGFによる細胞増殖のドミナントな経路として考えられ、この経路の制御が中耳粘膜過形成の制御に関わる可能性が示唆された。今年度の研究では急性中耳炎における粘膜過形成おいて実際どの程度HBーEGFが関与しているかを確認するために、感染を惹起させた中耳粘膜の器官培養組織用意し、HBーEGFに対する中和抗体を培養液に添加し、粘膜増殖の程度を比較した。

結果、非感染粘膜では差がみられなかったが、感染組織では有意に増殖が抑制され、感染時における粘膜過形成にHBーEGFが相応の役割を担っていることが確認された。以上の結果より急性中耳炎による中耳粘膜過形成を抑制するターゲットとしてHBーEGFが有力な候補ではないかと考えられた。急性中耳炎の病理組織学的および分子生物学的メカニズムの解明を解明し、病態解消に向けた新たな治療戦略開発を目指すべく、増殖因子に注目して基礎実験を行った。実験的環境で強力な中耳粘膜増殖効果を示すHBーEGFという増殖因子に着目し、この増殖因子の作用を詳細に検討した。検討により、HBーEGFが作用する際のドミナントなシグナル伝達経路および、実際の細菌性中耳炎においてHBーEGFが粘膜増殖に重要な役割をになっていることを示した。26年度までに行う予定のプロジェクトの一部が終了していない。耳鼻咽喉科当初の研究計画通りに研究を遂行するとともに、HB-EGFがどの程度実際の細菌性中耳炎における中耳粘膜増殖に起用するのかという疑問に対し、in vivoもしくはin vitroの実験系を組み立てて明らかにする予定である。25年度に行うこととしてたプロジェクトの一部が完了していない。平26年度までに行う予定であった研究の一部がまだ遂行されていないため。当初の研究計画の通りに研究を遂行するとともに、HB-EGFが好中球からも産生されているという結果を考慮し、HB-EGFの好中球機能への関与も検討する予定である。平成27年度に上記の一部研究および27年度に行う予定の研究を遂行する平成25年度に行う予定であった研究の一部がまだ遂行されていないため。平成26年度に上記の一部研究および26年度に行う予定の研究を遂行する。
マーカー遺伝子導入によるヒト胃癌の血行性転移過程の解析

1.既に樹立しているヒト胃癌ヌードマウス自然転移株(GLM-1)に加えて、期間中に新たにヒト胃癌ヌードマウス転移株(GLM-2)を樹立した。また、ラット前立腺癌細胞株(PLS30)を新たに樹立し、これにLacZ遺伝子を導入し微少転移モデルを作製した。これらの細胞はいずれも大小の細胞魂として血流中を移行し、血管外脱出する前に主として血管内で管内性増殖をし、転移巣を形成することがX-Gal染色とbrdUの二重染色から明らかとなった。この事実は内皮細胞との接着を介したサイトカイン刺激により癌細胞表面のインテグリンが活性化され、癌細胞が血管外に遊走し、増殖を開始するという従来の白血球遊走モデルでは説明できない。癌の転移様式は多様であり、白血球モデルとは異なった二次腫瘍(転移)形成の分子機構が存在する可能性が強く示唆された。LacZ遺伝子導入マウスLewis肺癌細胞を用いた転移の初期過程の解析から本株は上記白血球遊走モデルに類似した転移様式をとることが明らかになった。本細胞による実験肺転移はフイブロネクチン由来のRGDSペプチドではなく、ヘパリンの前投与により強く抑制された。このことから本細胞の転移巣における定着にはインテグリン以外の細胞表面受容体(Syndecan)が関与している可能性が強く示唆された。ヒト胃癌転移株(GLM-1)からの培養細胞株の樹立をこれまでに数回にわたって試みたがいずれも10代前後の継代で増殖を停止し、未だ株化に至ってない。また、ヒト株非転移株(HSC-39、浮遊細胞系)へのLacZ遺伝子の導入についても発現の安定した株は得られておらず、今後も遺伝子導入の方法を改良するなどして継続して分離を試みてゆく予定である。ヒト胃癌の血行性転移過程を明らかにするために転移性、非転移性細胞株をヌードマウス皮下に移植し、血液中癌細胞および肺転移巣の経時的変化をサイトケラチン19(CK19)PCR、抗CK19抗体および抗Brdu抗体を用いた免疫染色により解析した。その結果、転移性のGLM-1、GLM-2株を移植したヌードマウスではCK19PCR法でいずれも血中癌細胞が陽性であり、免疫染色から癌細胞は血液中では大小の腫瘍塊として存在していることが明らかとなった。また肺では癌細胞は主として血管内で増殖して微小転移巣を形成することが明らかとなった。血管内での癌細胞の増殖はS期の指標であるBrduの取り込みから確認した。一方、非転移性細胞株のヌードマウス血液中癌細胞の陽性率は40%(2/5)で、陽性株(HSC-39およびHSC-43)は免疫染色の結果から主として単一細胞として存在している傾向が明らかとなった。以上の結果から転移性細胞は血液中に細胞塊として移行し、管内性に増殖して転移巣を形成するのに対して、非転移性細胞は血液中に移行できないか、移行できても転移先で定着あるいは増殖ができないものと考えられた。転移機構を分子レベルで明らかにするためには転移性細胞に特定の遺伝子を導入し、転移に及ぼす影響をin vivoの実験転移系で検証する必要がある。そのために転移性のGLM-1株の培養細胞株の樹立をexplant culture法を用いて試みている。株化中の細胞は浮遊細胞型であり現在、継代30代目を数えているが増殖は依然として遅くまだ株化には至っていない。また非転移性細胞が二次転移巣形成のどの過程で排除されるのかを明らかにするために非転移細胞株HSC-39にLacZ遺伝子の導入を試みている。