hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ハプテンの新しい超高感度非競合測定法の開発と応用:受動喫煙者のニコチン代謝の解析

コチニンは、エチレンイミンによりアミノ基を導入後、ビオチン化し非競合免疫測定法により測定する。しかし、ビオチン化と同様の方法で調整したimmunogenで得られた抗体は、ビオチン化によって生じた化学構造と親和性を生じ測定の障害となっていた。そこで、ビオチン化と抗体の調整法を検討した結果、それぞれの調整に用いる化合物の反応手順を互いに変えることにより特異性が向上することが分かった。しかし、アミノ基導入の過程で生じる不用の非特異化合物が高濃度のため、低濃度(a mol)のコチニンを測定することはできなかった。そこで、この非特異化合物を種々のカラムや抗体を用い除去し、コチニンの非競合免疫測定法の高感度化を試みた。(1)アミノ基の導入後、疎水HPLCカラムにより、ビオチン化前に過剰の非特異化合物を除去し、ビオチン化後、SEP-PAKカラム、さらに抗コチニン抗体不溶化固相にトラップ、溶出し、ビオチン化後に生じた非特異化合物を除去した。最後に、ペルオキシダーゼ標識抗コチニンFab'とアビジン不溶化固相を用いた非競合免疫測定法により測定した。しかし、疎水HPLCカラムでは、非特異化合物を選択的に除去することはできず、測定感度は1 pmolであった。(2)アミノ基の導入後、HPLCカラムの代わりに、ビオチン化により生じた化学構造に親和性のある抗体を吸収して取り除いた抗体を不溶化させて調整した抗コチニン抗体不溶化固相にトラップ、溶出し、ビオチン化後(1)と同様に測定した。この吸収処理した抗コチニン抗体により非特異化合物が省かれ、測定感度は1 fmolに上昇した。これらの結果より、非特異化合物を除去するには、HPLCやSEP-PAKカラムより特異抗体が有効であることがわかった。そして、今後さらに特異性と親和性の高い抗体を用いることによって、amolレベルの測定の可能性が示された。コチニンは、エチレンイミンによりアミノ基を導入後ビオチン化し非競合免疫測定法により測定する。しかし、ビオチン化と同様の方法で調製したimmunogenで得られた抗体は、ビオチン化によって生じた化学構造と親和性を生じ測定の障害となっていた。ビオチン化と抗体の調製法を検討した結果、それぞれの調製に用いる化合物の反応手順を互いに変えることにより特異性が向上することが分かった。しかし、ビオチン化の過程で生成する不要の非特異化合物が高濃度のため、低濃度(a mol)のコチニンを測定することはできなかった。そこで、この非特異化合物をカラムや抗体を用い除去することにした。(1)抗コチニン抗体をビオチン化に用いたものと異なる化合物で調製したhemocyanin-trans-4′-carboxycotinineコンジュゲートにより免役して得られた抗体をテストしたが全く測定できなかった。(2)アミノ基の導入、ビオチン化後、SEP-PAKカラム、さらに抗コチニン抗体不溶化固相にトラップ、溶出し、非特異化合物を除去したがコチニンは全く測定できなかった。これは過剰のエチレンイミン非特異化合物が阻害しているものと考えられた。(3)アミノ基の導入後、疎水HPLCカラムにトラップ、溶出し、ビオチン化前に過剰の非特異化合物を除去し、ビオチン化後、(2)を行い再び過剰の非特異化合物を除去すると感度は1pmolであった。

(4)コチニンにアミノ基の導入後、HPLCカラムの代わりに抗コチニン抗体不溶化固相にトラップ、溶出し、ビオチン化後(2)により測定すると感度は1fmolに向上した。以上の結果より、疎水性カラムを用いるには限界があることが分かった。しかし、新たな特異性、親和性の高い抗体を用いれば、a molレベルの測定が可能である見通しを得た。直接ビオチン化できる反応基(アミノ基など)を持たないハプテンの超高感度非競合イムノアッセイを開発する。ハプテンとしてコチニンをモデルとした。コチニンは、エチレンイミンによりアミノ基を導入後、ビオチン化し非競合免疫測定法により測定する。しかし、アミノ基導入やビオチン化の過程で生じる不用の非特異化合物が高濃度のため、低濃度(a mol)のコチニンを測定することはできなかった。そこで、この非特異化合物を種々のカラムや抗体を用い除去し、コチニンの非競合免疫測定法の高感度化を試みた。(1)アミノ基の導入、ビオチン化後、SEP-PAKカラム、さらに抗コチニン抗体不溶化固相にトラップ、溶出し、非特異化合物を除去したがコチニンは全く測定できなかった。これは過剰のエチレンイミン非特異化合物が阻害しているものと考えられた。(2)アミノ基の導入後、疎水HPLCカラムにトラップ、溶出し、ビオチン化前に過剰の非特異化合物を除去し、ビオチン化後、SEP-PAKカラム、さらに抗コチニン抗体不溶化固相にトラップ、溶出し、ビオチン化後に生じた非特異化合物を除去した。しかし、疎水HPLCカラムでは、非特異化合物を選択的に除去することはできず、測定感度は1pmolであった。(3)アミノ基の導入後、HPLCカラムの代わりに、ビオチン化により生じた化学構造に親和性のある抗体を吸収して取り除いた抗体を不溶化させて調製した抗コチニン抗体不溶化固相にトラップ、溶出し、ビオチン化後(1)と同様に測定した。この吸収処理した抗コチニン抗体により非特異化合物が省かれ、測定感度は1fmolに上昇した。以上の結果より、非特異化合物を除去するには、HPLCやSEP-PAKカラムより特異抗体が有効であることがわかった。そして、今後さらに特異性と親和性の高い抗体を用いることによって、amolレベルの測定の可能性が示された。
アレルギー初期過程におけるSH2ドメインの細胞内動態の画像解析

アレルギー初期過程におけるSH2ドメインの細胞内動態の画像解析のために、SH2ドメインの中の相同性の高い領域の12残基のアミノ酸に対するモノクローン抗体を作製したところ、ラット好塩基球細胞株(RBL-2H3)の細胞内のSH2ドメインを認識する2種類の抗体(12E,32D)を得た。共焦点レーザ顕微鏡を用いてRBL-2H3細胞の抗原刺激前後でのSH2ドメインの細胞内動態を画像解析したところ、未刺激の細胞では細胞質に均一に分布していた蛍光が、12E抗体では抗原刺激後30秒から2分程度で細胞膜付近に強く分布するようになり、32D抗体では刺激後数分で細胞質内の蛍光が増大し顆粒状に分布する様子が観察された。次に、Western blottingにより抗体が認識している細胞内蛋白質の分子量を調べたところ、12E抗体と32D抗体はともに複数の蛋白質を認識しており、12E抗体は約60kDa、32D抗体は約120kDaの蛋白質を強く認識していた。12E抗体が認識している約60kDaの蛋白質はSrcであると予想されたため、12E抗体で免疫沈降した蛋白質を抗Src抗体でwestern blbttingしたところ、60kDaに特異的なバンドが検出され、12E抗体の認識している蛋白質の一つはSrcであることが分かった。また、12E抗体は神経成長因子によって神経細胞に分化させた副腎髄質褐色細胞腫(PC12)の神経突起を強く染色することが明らかになった。このように、12抗体はアレルギー反応関与する蛋白質だけでなく神経細胞の分化に関与する蛋白質も認識しており、これらの抗SH2抗体を用いるとアレルギー反応に関わる免疫細胞だけでなく神経細胞でも細胞内情報伝達におけるSH2ドメインの機能解析が可能になると期待された。アレルギー初期過程におけるSH2ドメインの細胞内動態の画像解析のために、SH2ドメインの中の相同性の高い領域の12残基のアミノ酸(実際にはチロシンキナーゼSrcの配列を用いた)に着目し、そのモノクローン抗体を作製した。作製したモノクローン抗体の中の2種類の抗体(12E,32D)は、ラット好塩基球細胞株(RBL-2H3)の細胞内のSH2ドメインを認識した。共焦点レーザー顕微鏡を用いてRBL-2H3細胞の抗原刺激前後でのSH2ドメインの細胞内動態を画像解析したところ、未刺激の細胞では細胞質に均一に分布していた蛍光が、12E抗体では抗原刺激後30秒から2分程度で細胞膜付近に強く分布するようになり、32D抗体では刺激後数分で細胞質内の蛍光が増大し顆粒状に分布する様子が観察された。次に、Western blottingにより抗体が認識しているRBL-2H3細胞の細胞内蛋白質の分子量を調べたところ12E抗体と32D抗体はともに複数の蛋白質を認識していた。これらの抗体を用いた免疫沈降によっても複数の細胞内蛋白質が検出された。12E抗体が認識している蛋白質のうち約60kDaの蛋白質はSrcであると予想されたため、12E抗体で免疫沈降した蛋白質を抗Src抗体でWestern blottingしたところ、60kDaに特異的なバンドが検出され、12E抗体の認識している蛋白質の一つはSrcであることが分かった。また、12E抗体は神経分化モデル細胞として知られているラットの副腎髄質褐色細胞腫(PC12)の細胞内蛋白質も認識しており、アレルギー初期反応に関与する蛋白質だけでなく神経細胞の分化に関与する蛋白質も認識している可能性が示唆された。次年度は変異IgEレセプターを発現した肥満細胞腫(P815)だけでなく、PC12細胞での細胞内動態も詳細に検討する。
油脂劣化のモデリング評価法の構築および劣化抑制法の開発

10種類の食用油を試料油として用いた。180°Cのフライ処理を行い、異なる劣化度の試料調製およびその脂肪酸組成の変化特徴を解析した。未加熱試料油の一価不飽和脂肪酸および多価不飽和脂肪酸の組成特性は食用油の劣化速度に大きな影響を与えることが明らかにした。180°Cで加熱処理した10種試料油の不飽和脂肪酸(UFA)の分解率に基づき、パルミチン酸(C16:0)とオレイン酸(C18:1)の比値に高い相関関係を存在したことを解明し、食用油の品質劣化評価指標の確立が成功した。この研究成果は国際雑誌EUROPEAN JOURNAL OF LIPID SCIENCE AND TECHNOLOGYに掲載された。(https://doi.org/10.1002/ejlt.201700528)また、微量成分トコフェロール組成の異なる試料油のフライ試験で調製したサンプルを用いて、フライ過程における微量成分の動的な分解特性を解明したとともに、試料油の不飽和脂肪酸の劣化速度への影響および抗酸化特性を検討した。この部分の研究成果は国際雑誌AnalyticalLettersに掲載された。1年目では、以下の3つの内容で研究を進めた。まず、異なる劣化度の試料調製およびその特性の解析を行った。菜種油をはじめ、大豆油、米油など数10種類の植物油を試料油とし、経時的にサンプリングし、異なるフライ時間における試料の不飽和脂肪酸分解特性を解明した。フライに伴う試料油の物理化学特性値の変動およびそれらの相関関係を検討する。またフライ試料油に対し、脂肪酸組成の変化をはじめ、二次酸化物質(CV)およびアルデヒド等有害成分の発生量を分析同定する(GCおよびGC/MS)を行った。試料油の脂肪酸組成およびフライによる生じた劣化成分の構成解析している。さらに、微量成分量の異なる試料油のフライ試験を通じて、幅広い劣化フライ油試料の調製と特徴解析を行い、トコフェロールなど微量成分(内部要因)を特徴に持つ試料油の劣化速度および劣化により生じた二次酸化物質および有害成分の組成を解析し、試料油の脂肪酸組成および微量含有成分の影響を検討している。2年目では、以下の3つの内容で研究を進めている。1メタボロミクス解析手法を活用したフライ油の劣化特性のモデリングの構築を行う。各劣化油の二次酸化物質をGC/MS、フラッシュGCノーズHERACLESIIおよび匂い嗅ぎシステムで分析したスペクトルデータを保持指標で統一形式に変換し、PLS回帰分析手法でフライ油の劣化度評価値(CV、TPCなど)との関連性を明らかにしながら劣化特性のモデルを構築する。2フライ油の脂肪酸組成が劣化モデリングに及ぼす影響を解明する。脂肪酸組成に特徴を持つ試料油のフライ劣化特性および劣化油から発生する揮発性匂い成分や有害物質の構成(GC/MS)をメタボロミクス手法とPLS回帰分析手法を融合した新しいモデリング解析技術で明らかにする。3微量成分が劣化モデリングに及ぼす影響を解明する。メタボロミクス手法とPLS回帰分析手法を融合した新しいモデリング解析技術で、微量成分の含有量(HPLC、LC/MS)の異なる試料油の劣化特性および発生する有害成分の組成変化を明らかにする。

各劣化油の二次酸化物質をGC/MS、フラッシュGCノーズHERACLESIIおよび匂い嗅ぎシステムで分析したスペクトルデータを保持指標で統一形式に変換し、PLS回帰分析手法でフライ油の劣化度評価値(CV、TPCなど)との関連性を明らかにしながら劣化特性のモデルを構築する。2フライ油の脂肪酸組成が劣化モデリングに及ぼす影響を解明する。脂肪酸組成に特徴を持つ試料油のフライ劣化特性および劣化油から発生する揮発性匂い成分や有害物質の構成(GC/MS)をメタボロミクス手法とPLS回帰分析手法を融合した新しいモデリング解析技術で明らかにする。3微量成分が劣化モデリングに及ぼす影響を解明する。メタボロミクス手法とPLS回帰分析手法を融合した新しいモデリング解析技術で、微量成分の含有量(HPLC、LC/MS)の異なる試料油の劣化特性および発生する有害成分の組成変化を明らかにする。前年度では、人件費・謝金の執行は計画より少なかったため、約10万円程度の残金が生じた。今年度分として請求する助成金と合わせて、計画とおりに各劣化油の二次酸化物質をGC/MS、フラッシュGCノーズHERACLESIIおよび匂い嗅ぎシステムでの分析し、PLS回帰分析手法でフライ油の劣化度評価値(AV、TPCなど)との関連性を明らかにしながら劣化特性のモデルを構築する。また微量成分含有量の異なる試料油の劣化特性および発生する有害成分の組成変化を明らかにする。そのために標準試薬品の購入量が増える予定である。
lux遺伝子のタンパク質―タンパク質間相互作用の検出への応用

本研究は、タンパク質-タンパク質相互作用検出用センサーシステムを開発することを目的とする。アシルCoAプロテインシンテターゼ(S)とアシルCoAレダクターゼ(R)は、脂肪酸還元酵素複合を構成しており、SからRへ活性化された長鎖脂肪酸が運搬されるとルシフェラーゼの反応に必要な基質である長鎖アルデヒドが生成される。従ってRとSサブユニットを、それぞれ相互作用を調べたい2つタンパク質と一つずつ融合させ、相互作用すると長鎖アルデヒドが生成し、ルシフェラーゼ反応により発光する。この発光を検出することによってタンパク質-タンパク質相互作用検出システムが構築できる。本センサーシステムは、更に、それらの相互作用を活性化させたり阻害したりする新しいリガンドの探索に有用であるばかりでなく、新しい標的蛋白質の有用なスクリーニング系としても利用可能である。発光細菌であるPhotobacterium phosphoreumからluxC(S)とluxE(R)をクローニングし、大量発現用のpETベクターに挿入して大腸菌で発現させた。その抽出液は活性を示し、活性のある形で2つの遺伝子を発現させることに成功した。また、その遺伝子の5'端、3'端のどちらにHis-tagを添加しても活性は得られ、各サブユニットに相互作用を観察したい蛋白質を融合させることが可能であることが確認できた。元々相互作用を観察するモデルと考えていたDnaAタンパク質は宿主のE.coliに対して毒性が高く発現が上手くいかないことが判明したので、ロイシンジッパー蛋白質であるC-JunとFosBをモデル蛋白質として選び、その発現を試みている。この2つの蛋白質は強い結合を示すはずであり発現がうまくいけば、luxC(S)とluxE(R)は近接した状態となり、調査アルデヒドが生成するはずなので発光が観察できると予想される。本研究の目的は、発光を利用したタンパク質-タンパク質相互作用を調べるセンサーシステムを開発することである。このセンサーシステムの原理は脂肪酸還元酵素複合体の中のアシルCoAプロテインシンテターゼ(S)からアシルCoAレダクターゼ(R)サブユニットへ活性化された長鎖脂肪酸が運搬されることによりルシフェラーゼの反応に必要な基質である長鎖アルデヒドが生成されることに基づいている。RとSサブユニットを、それぞれ相互作用を調べたい2つタンパク質と一つずつ融合させ、相互作用が起こると上述の反応が起こり、ルシフェラーゼ反応に基づく発光が検出される。この発光を検出することによってタンパク質-タンパク質相互作用を調べることが可能になり、本センサーシステムは、それらの相互作用を活性化させたり阻害したりする新しいリガンドの探索に応用可能であるばかりでなく、新しい標的タンパクの探索にも応用可能である。既にPhotobacterium phosphoreum, Photobacterium fischeri, Vibrio harveyi, and Xenorhabdus luminescensといった4つの異なる発光細菌が得られ、P. phosphoreumからluxC(R), luxE(S), luxAB(ルシフェラーゼ遺伝子)とそれらをコードするluxオペロン遺伝子郡をPCRにより調製し、これらを発現させるためにEscherichia coliに形質転換した。発光測定に必要な試薬及び機器類は全て購入し、実際に発光測定ができることを確認した。元々の提案であったDnaAタンパク質とS及びRサブユニットの融合実験は行ったが産物であるDnaAタンパク質は宿主のE. coliに対して毒性が高く発現が上手くいかないことが判明し、現在異なる標的タンパクを選定している。
虚血性網膜浮腫におけるポリアミン代謝に関する研究

STD Wistar系ラットにsilicone塞栓による内頸動脈閉塞を施し,一過性能虚血を作製し,対照群,無処置群, indomethathine 4mg/kg投与群について10分, 50分, 2時間, 3時間閉塞とし,それぞれ閉塞後50分間血流を再開して検索した.1)能局所血液量は,電解式血量計を用い,低位能固定装置に固定したラット頭頂部皮質で計測した.内頸動脈閉塞後,局所血流は減少(23.7±2.6対4.3±1.4ml/min/ioomg)し,再開により20.5±4.3ml/min/10.0mg)と増加した.3)対照群の網膜には内・外境界膜を置くミューラー細胞の突起にエタクリン酸高感受性Mg ATPase, Na, K ATPaseの局在を認めた.虚血後,網膜ミューラー細胞の膜,小脳体に含まれるMg ATPase, Na-K ATPaseは活性が低下し,内網状層の浮腫がみられた.神経細胞傷害を高度で,特に神経節細胞において著明であった. HRPを用いた電顕では,浮腫液の血管からの細胞外腫への〓〓が観察され,血液網膜関門は破綻している.永久閉塞群と再開群の虚血部毛細血管には内皮細胞の〓脱,血小板の付着がみられ,再開群において顕著であった.4)抗ポリアミン抗体を作製し, vasegenic edema治療への試みは今年度では検討するに至らなかった.STD Wistar系ラットにsilicone塞栓による内頸動脈閉塞を施し,一過性能虚血を作製し,対照群,無処置群, indomethathine 4mg/kg投与群について10分, 50分, 2時間, 3時間閉塞とし,それぞれ閉塞後50分間血流を再開して検索した.1)能局所血液量は,電解式血量計を用い,低位能固定装置に固定したラット頭頂部皮質で計測した.内頸動脈閉塞後,局所血流は減少(23.7±2.6対4.3±1.4ml/min/ioomg)し,再開により20.5±4.3ml/min/10.0mg)と増加した.3)対照群の網膜には内・外境界膜を置くミューラー細胞の突起にエタクリン酸高感受性Mg ATPase, Na, K ATPaseの局在を認めた.虚血後,網膜ミューラー細胞の膜,小脳体に含まれるMg ATPase, Na-K ATPaseは活性が低下し,内網状層の浮腫がみられた.神経細胞傷害を高度で,特に神経節細胞において著明であった. HRPを用いた電顕では,浮腫液の血管からの細胞外腫への〓〓が観察され,血液網膜関門は破綻している.永久閉塞群と再開群の虚血部毛細血管には内皮細胞の〓脱,血小板の付着がみられ,再開群において顕著であった.4)抗ポリアミン抗体を作製し, vasegenic edema治療への試みは今年度では検討するに至らなかった.
全方位蛍光集光2光子励起レーザー顕微鏡の開発と細胞内Ca^<2+>動態と作用の解析

本研究の目的は、2光子励起による蛍光を顕微鏡ステージ上下両方向から測光し、最大集光効率で蛍光の切片イメージを記録する顕微鏡(全方位蛍光集光2光子励起レーザー顕微鏡)を開発することと、この装置及び通常のCa^<2+>イメージング法と電気生理学的手法を組み合わせて、ニューロン細胞内Ca^<2+>動態とその作用機構を明らかにするのが目的であった。全方位蛍光集光2光子励起レーザー顕微鏡を作成し、実用試験に入ったが、下記の理由により具体的な稼動試験は平成14年度に持ち越された。通常の2光子励起レーザー倒立顕微鏡システムにステージ上方の対物レンズと分光器を介して測光する光学系を追加した。その結果、二つの対物レンズによる切片画像の加算により、通常の2光子励起レーザー顕微鏡の約1.5から2倍の明るさとS/N比の画像が得られた。また、超短派パルスレーザーを顕微鏡後方から対物レンズを通して細胞に入射し、カゴメ化合物の一点励起を行う装置を開発した。カエル運動神経のシナプス前終末では、反覆神経活動によるCa^<2+>流入によるCa^<2+>カルモジュリンキナーゼIIの活性化とcyclic ADP-riboseの産生により、リアノジン受容体のプライミング(活性化準備)により、Ca^<2+>誘起性Ca^<2+>遊離機構(CICR)が活性化され、伝達物質の開口放出と短期の可塑性が促進されることや、ウシガエル交感神経節シナプス前終末のIP_3受容体を介するCICRにより伝達物質放出の長期増強が起こることが明らかになった。シナプス後ニューロンでは、リアノジン受容体と細胞膜のCa^<2+>チャンネルとBKタイプのCa^<2+>依存性K^+チャンネルが90nmの距離で存在し三つ組み構造を形成し、これによるCICRが活動電位スパイクの下降相を形成し、SKタイプのCa^<2+>依存性Xチャンネルの活性化により後電位を発生し、これらの機構が可塑性を持つことが解った。1)全方位蛍光集光2光子励起レーザー顕微鏡の開発:一方向からの超短パルスレーザーの走査と2対の対物レンズと光電子倍増管による蛍光測定によるシステムの設計を終了し、(株)ニコンインステックで試作中である。又、一つの対物レンズ(1)と光電子倍増管による集光ともう一つの対物レンズ(2)により集光した蛍光を、反射鏡により同レンズ及び試料と対物レンズ(1)を通して、試料からの直接の蛍光と合わせて光電子倍増管により測光するシステムを考案し、これは、次年度に製作に取りかかる予定である。2) 2光子励起による点領域でのカゴメ化合物活性化光学系の設計製作と応用:カバーグラス上の溶液中とウシガエル交感神経節細胞内でのCa^<2+>カゴメ化合物の活性化による細胞内Ca^<2+>濃度([Ca^<2+>]_i)上昇を記録した。3)ニューロン内Ca^<2+>動態の解析:カエル運動神経終末のライノジン受容体を介する細胞内Ca^<2+>遊離機構が、比較的低頻度(110ヘルツ)の刺激によりプライミングされ、更なるCa^<2+>の流入により活性化され、自発的のみならずインパルスによる伝達物質の放出を数10倍に増強することが解った。

この増強は、開口放出部位の[Ca^<2+>]_iの残存により起こるFacilitaion,高感度のCa^<2+>受容体を介するAugmentationやPotentiation等の短期可塑性の促進のみならず、遊離したCa^<2+>が開口放出に直接関与することが示唆された。更に、ウシガエル交感神経節細胞で、細胞膜の興奮によるCa^<2+>の流入により細胞膜直下で、Ca^<2+>遊離が起こり、活動電位の後電位の発生に寄与し、細胞膜の興奮により核膜胞からもCa^<2+>が遊離され、[Ca^<2+>]_i上昇が核内をCa^<2+>誘起性Ca^<2+>遊離により伝播することが発見された。1.通常の落射蛍光法に加えて、反対側より蛍光測定の為の対物レンズ微細上下動装置と明視蛍光測光切替装置とモノクロメーター分波光量測定装置を制作した。今後は2光子励起全方位蛍光測光により画像測定の実用試験に入る予定である。2.運動神経反復刺激(1020Hz、数分)により、ライアノジン受容体が、数分の時間経過で活性化準備(プライミング)され、次のCa^<2+>流入により活性化され、インパルスによる細胞内Ca^<2+>上昇を数倍に、伝達物質の放出を数10倍に促進し、更なるCa^<2+>流入により不活性化されること、この促進はライアノジンやサプシガーギンにより抑制されること、短期可塑性の内、Facilitationは不変だが、AugmentationとPotentiationが顕著に増大し、その後の促進の減衰は脱プライミングによることが明らかになった。さらに、Ca^<2+>チャンネルとライアノジン受容体と開口放出機構が80nm以内の距離に機能的に連関しており、Ca^<2+>貯蔵オーガネラがシナプス小胞である可能性が示唆された。3.ウシガエル交換神経節ニコチン性シナプスで、同様の条件刺激により、興奮性シナプス後電位とインパルスによるシナプス前終末内のCa^<2+>上昇が顕著に数時間以上促進され、サプシガーギンで抑制されるがライアノジンでは阻害されないこと、またFacilitationは不変であることが明らかになった。4.ウシガエル交換神経節細胞で、活導電位によるCa^<2+>流入により細胞膜直下でライアノジン受容体が活性化され、Ca^<2+>遊離が起こり、BKタイプのCa^<2+>依存性K^+チャンネルを活性化し、スパイクの下降を促進し、更にSKタイプのCa^<2+>依存性K^+チャンネル活性化し、緩除後電位を発生する事が解った。通常の落射蛍光法に加えて、反体側より蛍光測定の為の対物レンズ微動上下動装置と明視蛍光測光切り替え装置とモノクロメーター分派測光装置を作成し、実用試験に入ったが、明視蛍光測光切り替え装置の切り替えの遊びが大きく、この遊びを最小にすべく改良を行った為に具体的な稼動試験は平成14年度に持ち越された。しかしながら、本研究の最終目標であるニューロン細胞内Ca^<2+>動態とその作用に関して、興味ある多くの新知見が得られた。カエル運動神経のシナプス前終末では、比較的長期の反覆神経活動によるCa^<2+>流入によるCa^<2+>カルモジュリンキナーゼIIの活性化とcyclic ADP-riboseの産生が起こり、リアノジン受容体が関与するCa^<2+>誘起性Ca^<2+>遊離機構(CICR)がプライミング(活性化準備)され、その後のCa^
災害復興・防災のための地籍図・古地図を活用したＧＩＳデータベースの構築

歴史地理学が今まで研究を進める中で蓄積してきた経験を生かして、東日本大震災の被災地について震災前の地籍図・古地図に表現された郷土の姿に注目し、それらの地籍図・古地図に含まれる地理情報を地図やデジタルマップの形で地域住民に提示することで、復興支援に資するのが研究目的である。過去における歴史災害や土地形状の歴史遺産を読み取るという、従来も取り組んできた研究に立脚した上で、地籍図を基にして、将来の防災と復興に向けた社会的実践に結び付ける新たな視点を提唱した。本研究プロジェクトは、歴史地理学が今まで研究を進める中で蓄積してきた経験を生かして、東日本大震災の被災地について震災前の地籍図・古地図に表現された郷土の姿に注目し、それらの地籍図・古地図に含まれる地理情報を地図やデジタルマップの形で地域住民に提示することで、復興支援に資する目的を持つ。さらに、この実践を通じて、今後に日本列島で想定される災害に立ち向かうために必要な地籍データを歴史地理学の観点から問題にする。研究上における視点の特徴と課題は、1)被災地域における明治初期の地籍図の収集とその作製過程とその地理(地図)情報に関する研究、2)地籍図・古地図情報にもとづく国土情報管理・景観復原と現代のGISデジタルマッピング地図作製と復興支援、の2点にまとめられる。今年度は、地籍データが一括して福島県歴史資料館に所蔵されている福島県をフィールドとして選定し、1)地籍図の作成過程に関しては、福島県全体について見通しを得た。福島県は廃藩置県で複雑な過程を経たが、残存状況に優れており、全国から見ても標準的な事例になると期待できる。収集に関しては、近世相馬藩を構成した旧宇多郡に特に注目した。地籍データのうち、地籍帳・丈量帳については、中心となる相馬城下町や津波の被害を受けた原釜港など主要な地区に留めたものの、地籍図は全てのデジタル化を終えた。そして、2)についても順次、GIS化を進めている途上である。以上のように、本研究プロジェクトの意図は、地籍図・古地図に現れた郷土の姿を被災者に提示することによって復興への活力に結びつけようとする点にある。過去における歴史災害や土地形状の歴史遺産を読み取るという、従来も取り組んできた研究に立脚した上で、地籍図を基にして防災と復興に向けた社会的実践に結び付ける新たな視点の研究アプローチを今後とも目指す。地籍データが一括して福島県歴史資料館に所蔵され、残存状況に優れている福島県をフィールドとして選定し、全国への位置づけを試みた。地籍図の作成過程と収集に関しては、近世相馬藩を構成した旧宇多郡に特に注目した。地籍データのうち、地籍帳・丈量帳についても、中心となる相馬城下町や津波の被害を受けた原釜港など主要な地区について、地籍図を用いたGIS化の作業を進めている途上である。一方で、残存状況に優れている大津市など、他の事例にも考察を及ぼしつつある。地籍データのうち、地籍帳・丈量帳についても、中心となる相馬城下町や津波の被害を受けた原釜港など主要な地区について、地籍図を用いたGIS化の作業を順調に進めている。一方で、残存状況に優れている大津市など他の事例にも注目し、考察を及ぼしている。

以上のように、本研究プロジェクトの意図は、地籍図・古地図に現れた郷土の姿を被災者に提示することによって復興への活力に結びつけようとする点にある。過去における歴史災害や土地形状の歴史遺産を読み取るという、従来も取り組んできた研究に立脚した上で、地籍図を基にして防災と復興に向けた社会的実践に結び付ける新たな視点の研究アプローチを今後とも目指す。本研究プロジェクトは、歴史地理学が今まで研究を進める中で蓄積してきた経験を生かして、東日本大震災の被災地について震災前の地籍図・古地図に表現された郷土の姿に注目し、それらの地図類に含まれる地理情報を地図やデジタルマップの形で地域住民に提示することで、復興支援に資する目的を持つ。さらに、この実践を通じて、今後に日本列島で想定される災害に立ち向かうために必要な地籍データを歴史地理学の観点から問題にする。研究上における視点の特徴と課題は、1)被災地域における明治初期の地籍図の収集とその作製過程とその地理(地図)情報に関する研究、2)地籍図・古地図情報にもとづく国土情報管理・景観復原と現代のGISデジタルマッピング地図作製と復興支援、の2点にまとめられる。一括して福島県歴史資料館に所蔵された地籍データは、残存状況に優れ、県の重要文化財に指定されている福島県をフィールドとして選定し、全国への位置づけを試みた。地籍図の作成過程と収集に関しては、近世相馬藩を構成した旧宇多郡に特に注目した。地籍データのうち、地籍帳・丈量帳についても、中心となる相馬城下町や津波の被害を受けた原釜港など主要な地区について、地籍図を用いたGIS化の作業を進めた。その上で、住民に説明する機会を設けて、ご協力の約束が得られた。その一方で、全国に位置づけるために、残存状況に優れている大津市など他の事例にも注目し、研究協力者の古関大樹を中心に考察を及ぼすことで、一定の成果も得られた。以上のように、本研究プロジェクトの意図は、地籍図などに現れた郷土の姿を被災者に提示することによって復興への活力に結びつけようとする点にある。歴史地理学が今まで研究を進める中で蓄積してきた経験を生かして、東日本大震災の被災地について震災前の地籍図・古地図に表現された郷土の姿に注目し、それらの地籍図・古地図に含まれる地理情報を地図やデジタルマップの形で地域住民に提示することで、復興支援に資するのが研究目的である。過去における歴史災害や土地形状の歴史遺産を読み取るという、従来も取り組んできた研究に立脚した上で、地籍図を基にして、将来の防災と復興に向けた社会的実践に結び付ける新たな視点を提唱した。明治初期に作成された地籍図と地籍帳から成る地籍データは、福島県の重要文化財として一括して所蔵されている県歴史資料館側のご協力が得られて、明治期に書かれた資料解読の経験も持つ院生の助力を得て、入力を終えた。これに福島地方法務局相馬支局のデータも補充して、GIS化への作業を地道に進めている。その成果を地元住民に還元して、意見を徴収する前に、相馬市役所は、住宅の再建を実際に進めていく実務のために、地元住民との話し合いを始めようとしており、市役所との交渉を慎重に進めている。これは、市役所との協力関係を図り、信頼関係を得るためには重要な手続きであると認識している。
ノンコーディングRNA干渉による大腸癌進展機構の解明

大腸癌細胞株を用いたlncRNA PCRアレイによる網羅的解析の結果、通常酸素環境と比べ低酸素環境で発現亢進し、かつ、核分画で発現低下し細胞質分画で発現亢進するlncRNAを5種類同定した。そして、大腸癌データベースで発現差で予後に差があり、他癌でoncogenicな働きが知られているLINC00152に注目した。LINC00152は、大腸癌ではmiR-193a-3pに、胆嚢癌ではmiR-138に対しceRNAとして働く事が近年報告された。我々は、miRcodeを用いてLINC00152と低酸素誘導因子であるHIF1Aの両者に結合するmiRNAを検索し、上記2種類以外に数種類のmiRNAが結合する事を確認した。本研究により、LINC00152が低酸素暴露で細胞質で発現亢進し多くのmiRNAと競合し大腸癌の予後不良に関与する事が示唆された。今後、LINC00152が大腸癌における有用なバイオマーカーや治療標的となる可能性があり非常に意義のある研究結果といえる。
クマル酸とその誘導体の光誘起トランス－シス異性化機構の解明

桂皮酸誘導体の電子励起状態の無輻射失活およびトランス→シス異性化の初期過程を明らかにする研究を行った。超音速分子線/レーザー分光および極低温マトリックス赤外分光を行い、並行してS1励起状態からの無輻射緩和ルートを理論計算により探索した。実験の結果、プロペニル基に対してオルト位,メタ位に置換体を付けた桂皮酸誘導体はS1状態寿命が10ナノ秒に対し、パラ位に置換体は数百ピコ秒以下の短い寿命であることが分かった。さらに、水分子がC=O基に水素結合するとS1状態が短くなった。実験結果と理論計算との対応から、S1状態からは直接異性化するルートと1np*状態に内部転換するルートが競合することが分かった。超音速分子線中に生成した極低温気相クマル酸エステルOMpCAとパラ位の水酸基をメタ位、オルト位に置換したOMmCA, OMoCAの単体および水素結合体について、S1電子励起状態の寿命測定を行った。OMpCAについては単体と水分子が水素結合したOMpCA-H2Oについては既に報告しているが、今回アンモニア分子との水素結合体OMpCA-NH3でも同様の傾向を示した。さらに時間変化を解析したした結果、OMpCAの水素結合体では、S1励起直後一度分子内振動緩和した後、エネルギーが障壁を超えて異性化する、と考えると観測された時間変化やそのエネルギー依存性が説明できることが分かった。これらの解析により、OMpCA-H2O水素結合体では異性化の障壁が200cmー1、OMpCA-NH3水素結合体では700cm-1であると見積った。一方、OMmCA, OMoCAのS1電子励起状態の寿命は15ナノ秒と長く、またエネルギーが大きくなっても寿命があまり変わらないという結果を得た。このことより、パラ位に水酸基をもつOMpCAのみが、S1電子励起状態で速やかにトランス体からシス体へと異性化することが明らかになった。実験と平行して理論化学計算CIS(D)により、OMpCA、OMmCA、OMoCAそれぞれについて電子励起状態でのトランスーシス異性化座標に沿ったポテンシャルエネルギー計算を行った。OMpCAは異性化に対してエネルギー障壁は存在しないが、OMmCA、OMoCAではどちらも障壁が存在する結果となり、実験結果を支持するものとなった。これらの結果について、国内学会や国際学会で発表した。本研究では,クマル酸誘導体の電子励起状態の無輻射過程について,実験と理論計算の両面から検討した。対象とした分子は,p-, m-, o-methoxy methycinnamate (p-MMC, m-MMC, o-MMC)である。実験では,超音速分子線で冷却した各気相分子の電子スペクトルを,共鳴イオン化あるいはレーザー誘起蛍光法で測定した。また,電子励起状態の寿命を,蛍光の減衰曲線やピコ秒レーザーによるポンプープローブ法により減衰曲線を観測し,レーザー巾を取り込んだコンボリューション法により減衰曲線をフィットして決定した。その結果,p-MMCは,S1電子状態の寿命が零点準位で280 psで,エネルギーが増えるに従い短くなり500 cm-1高エネルギー側で13 psと著しく短くなることが分かった。一方,m-MMCやo-MMCは,S1電子状態の寿命がm-MMCで27 16 ns,o-MMCで107 nsとp-MMCに比べ長くまた明瞭なエネルギー依存性はみられなかった。また,p-MMCについては,水分子との1:1錯体を形成し電子励起状態の寿命を測定したところ,二つの異性体の零点準位で21 ps , 35 psとなり,どちらも単体に比べ短くなることが明らかになった。この実験結果に対して,S1電子励起状態からの初期無輻射過程のルートとして1S1電子状態ポテンシャル上でのトランス体からシス体への異性化座標に沿ったエネルギー変化,2S1(ππ*)状態から1nπ*へのポテンシャル交叉を通した内部転換(IC)について,励起状態の断熱エネルギー準位,およびポテンシャルエネルギー曲面を信頼度の高い量子化学計算で求めた。その結果,メチルシンナメート酸誘導体のS1(ππ*)励起後の初期緩和過程が,トランス体→シス体への異性化がもっとも有力であると結論し,論文を米国物理学会誌J. Chem. Phys.に発表した。また,低温マトリックス単離赤外分光を行い,p-MMCが紫外励起で実際にトランス→シス異性化が起きていること、また光によう逆反応も可能であることを実験的に示した。桂皮酸誘導体は、自然界ではPhotoactive Yellow Protainの発色団として働き、また植物表皮を構成し紫外線遮蔽の役割を果たすリグニンの成分である。また身近な例では、紫外光による日焼けどめ化粧品として使われている。これら物質の共通の特徴は光誘起trans →cis異性化であるが、現在までのところその詳細は明らかにされていない。本研究はこれら分子の異性化を含めた無輻射過程の機構を明らかにすることを目的とした。まずS1電子状態の寿命を測定した結果、o-,m-HMCおよびo-,m-MMCともに数ナノ秒10ナノ秒の寿命で励起エネルギー依存を示さない一方、p-MMCはS1オリジンの寿命が280ピコ秒と短く励起エネルギーとともに著しく短くなることが分かった。また、p-HMCではS1オリジンが8ピコ秒とさらに短い寿命であった。

p-MMCのカルボニル基にH2Oを水素結合させると、S1状態寿命が更に短くなった。これらの結果と量子化学計算をもとに解析した結果、これら分子には、trans体のS1状態から直接cis体に異性化するルートとS1→1npi*の内部転換ルートが競合し、水素結合によりそのバランスが変わると、結論した。桂皮酸誘導体の電子励起状態の無輻射失活およびトランス→シス異性化の初期過程を明らかにする研究を行った。超音速分子線/レーザー分光および極低温マトリックス赤外分光を行い、並行してS1励起状態からの無輻射緩和ルートを理論計算により探索した。実験の結果、プロペニル基に対してオルト位,メタ位に置換体を付けた桂皮酸誘導体はS1状態寿命が10ナノ秒に対し、パラ位に置換体は数百ピコ秒以下の短い寿命であることが分かった。さらに、水分子がC=O基に水素結合するとS1状態が短くなった。実験結果と理論計算との対応から、S1状態からは直接異性化するルートと1np*状態に内部転換するルートが競合することが分かった。対象分子の電子状態分光,寿命測定について置換基効果,水素結合効果など、光異性化に及ぼす内部的要因,外部的要因を実験的に研究することができた。また,理論計算により励起状態ポテンシャル曲面,励起状態間の交叉を求め,実験結果を検証することができ,最も妥当な結論を得ることができた。また,初期過程だけではなく,異性化生成物を分光学的に観測することができ,励起波長依存等からこれまでの結論を支持する結果を得ることができた。二重結合にブリッジをかけ光異性化できないクマル酸誘導体を合成し,励起状態寿命がどのように変化するかを観測する。これにより,S1励起後の分子の初期過程がS1電子状態ポテンシャル上でのトランス体からシス体への異性化座標に沿った変化であるかについて、より明確な結論を導きだすことができる。また,時間分解光電子装置を完成させ,電子状態ポテンシャル上での分子の構造変化を追跡する。クマル酸エステルに関しては、当初の計画通り、パラ体、メタ体、オルト体の各目的分子を化学合成して、S1-S0電子スペクトルや励起状態寿命測定の実験を進めることができた。その結果、異性化が置換基の位置で大きく左右されることを実験で明らかにすることができた。また、信頼できる励起状態のポテンシャルエネルギー計算を行うことができた。無輻射過程の二つの可能性(異性化およびn,pi*状態への失活)について計算結果を得ることができた。これらの結果から、励起状態の無輻射過程がビニル基周りのトランスーシス異性化である確信を得た。またパラ体については、水分子より塩基性の強いアンモニア分子との水素結合体の方がさらに励起状態寿命が長くなることが分かり、異性化の障壁が水素結合結合強度に依存することも明らかにすることができた。一方、水酸基をメトキシ基に置換した分子の合成にも着手しており、これらの分子に対してもレーザー分光実験や寿命測定を開始するべく準備をしている。これらのことより、当初の計画をおおむね順調に進めることができていると判断する。置換基の効果を検証するために、水酸基をメトキシ基に変えた分子について励起状態寿命の測定を開始する。合成はほぼ終わっており、パラ体、メタ体、オルト体合成次第順次実験を始める予定である。
情報処理空間としての細胞壁高次構造の構築と動態制御

情報処理システムとしての植物細胞壁の機能は,その高次構造と密接に関連している。植物細胞壁はセルロース微繊維がキシログルカンと呼ばれる多糖類により架橋された構造モデルが古くより提唱されてきたが,この構造モデルでは説明できない事象が報告されていた。本研究の最も重要な成果は,セルロース分子同士を繋ぎ換える酵素CETを発見したことである。この新規酵素の働きを基にして,情報処理システムとしての新しい細胞壁動態モデルを提唱した。植物細胞壁は典型的な動的複雑系で,その構築・再編や機能制御には膨大な数の酵素群と制御因子が関わる。本研究では,植物細胞壁の分子動態を,発生過程や刺激応答などの時間軸と、組織パターンや細胞極性などの空間軸に沿って解剖することにより,植物細胞壁が多元的な情報処理機能を発揮するメカニズムの解明を目指して研究を進め,以下の成果を得た。1.イネ細胞壁におけるXTH/キシログルカン系の役割を検証するためにイネの組換えXTHタンパク質を作成し,キシログルカンが主要な基質であることを実証した。XTHファミリーの各メンバーの新規な分子機能の解明を目指し,コケ,シロイヌナズナのXTHの組換え体をPichiea内で大量に発現させる系を確立した。2.PME35の分泌過程での活性化メカニズムの解明を目指して,RFPとGFPを,それぞれPro領域のN末,PME領域のC末に融合したタンパク質をエストラジオール誘導性プロモーター下で発現させる実験系を構築した。3.ネナシカズラの茎寄生過程を植物細胞壁の情報処理機能解析のモデル系として確立するために,アメリカネナシカズラ(Cuscuta pentagona)とネナシカズラ(C.japonica)の両種について,種子の採種,栽培,寄生反応時のオミクスを行う為の予備実験を終えた。4.シロイヌナズナの葉肉細胞プロトプラストからの細胞壁を高い頻度で再生する系を開発し,細胞壁再生に関わる遺伝子や外的因子の探索を進める方法を確立した。5.大きな遺伝子ファミリーからなる細胞壁関連遺伝子群を対象にして,高い精度で,遺伝子機能を推定するために,ゲノム情報をもとにする新たな方法で共発現データの改良を行った。またRNAseqデータに基づく遺伝子共発現データの導出を大規模に行うためのパイプラインを作成した。本研究では,植物細胞壁の分子動態を,発生過程や刺激応答などの時間軸と、組織パターンや細胞極性などの空間軸に沿って解剖することにより,植物細胞壁が多元的な情報処理機能を発揮するメカニズムの解明を目指して解析を進め以下の成果を得た。1.陸上植物のXTHファミリー全般を視野に入れた新規機能の解明を目指して組換え蛋白質の生化学的な解析を進めた。その結果シロイヌナズナのAtXTH3およびヒメツリガネゴケのPpXTH31が,βグルカンを基質とすることを示す予備的結果を得た。2.茎寄生植物の行動と,寄生に伴う道管分化誘導,異種植物間組織融合などにおける細胞壁動態の分子解剖を目指し,組織学的解析と,レーザーマイクロダイセクション法を用いたオミクス解析を,昨年に引き続き進めている。3.シロイヌナズナの2倍体で胚軸の細胞伸長が促進されることを見出した。更に2倍体では,クチクラの機能が変化し,ワックス輸送関連の一連の遺伝子群の発現が低下していることを明らかにした。4.シロイヌナズナの葉肉細胞プロトプラストから細胞壁を高い頻度で再生する系を確立し,セルロース微繊維の動態およびキシログルカンとの相互作用について最近提唱されている細胞壁の生力学ホットスポットモデルを指示する新しい知見が得られた。5.イネ細胞壁内のβ1,3/1,4グルカン含量を低下させた形質転換体を用いて,組織内のケイ素分布がβ1,3/1,4グルカンにより影響を受けることを実証した。6.RNAseqに基づく共発現構築法の改良を進め,低発現量遺伝子について安定して共発現関係が推定できるようになった。また,共発現データの評価を多角化し,既知機能が十分に利用できない非モデル生物種についても,正確な質の評価を可能にした。本研究の目的は植物細胞壁の分子動態を発生過程や刺激応答などの時間軸と、組織パターンや細胞極性などの空間軸に沿って解剖することにより,植物細胞壁が多元的な情報処理機能を発揮するメカニズムを解明することである。H27年度の研究成果は以下の通りである。(1)XTHファミリー全般を視野に入れた新規機能の解明を目指して組換え蛋白質の生化学的な解析を引き続き進めた。その結果AtXTH3がキシログルカン以外の新規な細胞壁多糖類に対して作用し,新規な転移反応を引き起こすことを見いだした。また,シロイヌナズナの葉肉細胞プロトプラストから細胞壁を80%以上の高い効率で再生させる実験系を確立し,その方法を用いて,細胞壁再生過程におけるセルロース微繊維の動態を定量的に可視化し解析する手法を開発し,様々な条件や変異体内でのセルロース微繊維の動態の解析を進め,細胞壁の高次構造の構築とその再編過程におけるXTHの新規な機能を提唱するとともに,その機能を元にした陸上植物細胞壁の新規な動的モデルを提唱した。

(2)典型的な茎寄生植物であるネナシカズラの実験室内での栽培法を世界に先駆けて確立し,組織学的解析とレーザーマイクロダイセクション法を用いたトランスクリプトーム解析を用いて,寄生時のネナシカズラの道管分化誘導,ネナシカズラと宿主間の組織融合過程における細胞壁動態の分子解剖を進めた。更に,寄生過程で特異な発現変動を示す遺伝子群のクラスター解析に成功した。更に,寄生過程において細胞伸長が重要な役割を担うこと,その過程に核内倍加が関わることなどを明らかにした。(3)RNAseqに基づく共発現構築法の改良を進め,低発現量の細胞壁関連遺伝子群についても安定して共発現関係を推定できるようにした。また,共発現データの評価を多角化し非モデル生物種の解析も可能にした。概要に記した(1)(3)三つの成果はいずれも当初計画で期待した以上の成果である。それぞれの理由は以下の通りである。(1)本研究により今回解明したAtXTH3の新規機能は,セルロース微繊維間の架橋構造やその再編過程についてのこれまでの常識を覆すもので,植物細胞壁の分野において大きな発見であり,細胞壁の動態やそれを基盤にした諸機能の研究領域への波及効果は計り知れない。その点で,この研究は当初の研究計画を遙かに超えて進展していると判断できる。また,葉肉細胞プロトプラストから細胞壁を80%以上の高い効率で再生する系を確立したことにより,セルロース微繊維とキシログルカンの相互作用の定量的な高解像力イメージングが初めて可能となり,細胞壁の高次構造の構築再編に関わる諸因子の探索に新しいアプローチを切り開いた点で,重要な成果である。(2)ネナシカズラの実験室内での栽培法を世界に先駆けて確立した意義は大きく,更に,組織学的解析とレーザーマイクロダイセクション法を用いたトランスクリプトーム解析により寄生過程に関わる細胞壁動態の分子解剖にも予想以上の早さで成功した。(3)共発現データベースも当初の予想以上に強力な推定が可能であることが,多数の利用者により実証されつつある。本研究の目的は植物細胞壁の分子動態を発生過程や刺激応答などの時間軸と、組織パターンや細胞極性などの空間軸に沿って解剖することにより,植物細胞壁が多元的な情報処理機能を発揮するメカニズムを解明することである。(1)アメリカネナシカズラを人工気象器内でシロイヌナズナまたはタバコを宿主として寄生させ、生育、開花、採種させる実験系を確立し、純系統を確立することに成功した。この純系統を用いて全ゲノム53,227遺伝子モデルの解読を終えた。更に、吸器形成過程を追って組織特異的な遺伝子発現をRNAseq法により包括的に解析して発現プロファイルデータベースを作成した。このデータベースを用いた解析の結果、吸器形成時の成長に核内倍加が関与し、その制御を担う遺伝子としてCCS52Aを同定し、更に、この過程がエチレンにより制御を受けることを解明した。また、吸器の道管分化に係わる一群の候補遺伝子を特定した。(2)シロイヌナズナのXTHファミリーの中の進化的に基部に位置するサブファミリーに属するAtXTH3の酵素機能を、組み換え蛋白質を用いて、酵素化学的に解析した。その結果、この酵素が非結晶性のセルロース微繊維をドナー基質として、それをアクセプター基質であるセルロースオリゴ糖に転移することを見出した。この酵素活性を申請者はCellulose Endo Transglycosidase(CET)と命名した。(3)共発現データの質の多角化を行い、信頼性を向上させた。大規模ファミリーの解析ツールを充実させてATTED-IIに実装した。
類推に基づく多戦略学習モデルの開発とそのタンパク質機能予測への適用

本研究の目的は、高い機能・性能をもつ多戦略学習型知識システムを実現するための基本的な問題について考察を行い、その結果を、アミノ酸配列データからのタンパク質機能予測の問題に適用することである。その基礎的なアイデアは次のとおりである。帰納的な学習手法をデータベース情報に適用し適切な仮説の候補を導出する。類推学習の機能を用いて仮説の候補を拡張する。演懌的な学習手法により仮説の検証を試みる。これは、合成問題でしばしば用いられる生成検査法における制御レベルに類推による学習手法を適用することになる。これによって合成型問題で扱う膨大な解空間の探索を効率化する。本研究は、従来の知識システム技術の延長上に存在し、比較的少数の事例データと領域知識を使う、類推に基づく多戦略学習方式の確立を試みる点に特色がある。これは、既知の構造や機能に関する知識を、事例データに適用して、「抽象化に基づく類推」により、未知データの機能を分類・予測するものである。そして従来の知識ステムが備えるのと同程度の専門知識を用いて知識集約的な学習を実現しようという点で、帰納的手法・演懌的手法と相補的な関係にある。この方法では、利用者との対話的なシステム利用によって、従来の学習システムには見られない、「学習機能の漸進的な向上」を達成することが可能となり、ゲノム情報のような非定型的な「データベースからの知識発見」問題に対する新しい道具となる可能性を秘めているといえる。一方、本手法を人工知能研究の立場から評価するためには、最近活発な研究がなされている帰納論理プログラミングや認知心理的な立場からの類推との関連性をより深く調査する必要がある。また、本手法を一般的な設計問題に適用して、応用分野の拡大をはかることも重要である。本研究では、高い機能・性能をもつ多戦略学習型知識システムを実現するための基本的な問題について考察を行い、その結果を、アミノ酸配列データからのタンパク質機能予測の問題、ならびに、一般の機械設計問題に適用する。そして従来の知識ステムが備えるのと同程度の専門知識を用いて知識集約的な学習を実現しようという点で、帰納的手法・演繹的手法と相補的な関係にある。本年度は、(1)計算機上で実現容易な類推に基づく多戦略学習モデルを確立するとともに、(2)膜タンパク質の一種であるロドプシンファミリーの一部を例題に用いて、タンパク質配列データベースから、事例を収集し、(3)プロトタイプシステム上で機能予測実験を行った。そして、膜タンパク質の一種であるロドプシンファミリーに対する実験の結果、類推に基づく多戦略学習モデルの有用性がある程度明らかにした。本手法をより実用的なものにしていくためには、分散データベースと本プロトタイプシステムを有機的に統合する方法を開発する必要がある。本研究の目的は、高い機能・性能を持つ多戦略学習型知識システムを実現するため基本的な問題について考察を行い、その結果を、アミノ酸配列データからのタンパク質予測の問題に適用することである。

類推学習の機能を用いて仮説の候補を拡張する。演懌的な学習手法により仮説の検証を試みる。これは、合成問題でしばしば用いられる生成検査法における制御レベルに類推による学習手法を適用することになる。これによって合成型問題で扱う膨大な解空間の探索を効率化する。本年度は、前年度に引続き、合成型問題を対象とする多戦略学習型知識システムを実現するための類推学習モデルについて前年度に引き続いて考察を行い、その結果を、アミノ酸配列データからのタンパク質機能予測の問題に適用した。これにより、次の機能をもつ多戦略学習モデルもプロトタイプを実現した。(1)タンパク質配列データベースからのテキスト情報を入力とする。(2)機能・構造上の類似性を説明するための知識の蓄積・修正を可能とする。(3)類推学習機能を備えた推論システムをもつ。さらに、一般の設計問題に対しても、このプロトタイプシステムの適用を試み、本研究で開発する手法の妥当性について検討した。