hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
慢性腎臓病発症予測バイオマーカーとしての尿中L-FABPの前臨床研究

本年度は昨年度作成した腎線維化モデルにおけるL-FABPの変動を長期的に観察した。片側尿管閉塞ー再開通モデル(UUO-riverse 4週間)モデルを2頭(Cat 1&2)、UUO-reverse 8週間モデルを1頭(Cat 3)の計3頭作成した。8週間モデルでは、8週目に右腎を摘出後BUN、Cre、SDMA及び尿中L-型脂肪酸結合タンパク(L-FABP)は高値を示した。ネコは乏尿を呈し一般状態が悪化したため3日後に安楽処分とした。腎組織検査では尿細管間質の線維化、炎症細胞の浸潤が顕著に認められた。4週間モデルでは、Cat 1& 2共に右腎摘出後BUN、Cre、SDMAは一時的に高値を示したもののその後は参照値範囲内へ復した。Cat 1は428日にCre値が上昇し始め、現在IRISステージ3で推移している。尿中L-FABP値は術後57日より3μg/g Cre前後を推移し344日、即ちCre及びSDMA上昇の約100日前に12.4μg/g Creと高値を呈した。Cat 2は現在IRISステージ1のまま推移しており、尿中L-FABP値は1μg/g Cre前後と低値で安定している。両動物ともに腎組織検査ではHE、マッソントリクローム、αSMA染色において尿細管間質の線維化が確認されている。また、68頭のネコにおいてL-FABP値、Cre値、SDMA値についてそれらの相関性についても検討した。Log L-FABPはLog Cre及びBUNとは強い相関が認められなかった。一方で、SDMAを測定した49頭のネコではLog L-FABPとLog SDMA間に強い相関性が認められた。尿中L-FABPは既存の腎機能評価マーカーよりもより早期に腎の病態生理学的変化を予測できる可能性が示唆された。本年度は、ネコL型脂肪酸結合蛋白(L-FABP)と交差性が確認されている抗ヒトL-FABP抗体を用いてネコL-FABPの測定を行った。測定は酵素免疫測定法(ELISA)(ヒト型L-FABP測定キット、シミック(株)、東京)を用いて添付の文書通りに実施した。測定値は尿中クレアチニン値で補正した。本年度は国際獣医腎臓病研究グループ(IRIS)のネコの慢性腎臓病の基準を満たさない血清クレアチニン値が1.6mg/dL以下の健常ネコ100頭を対象としてL-FABPの参照値を得ることを目的とした。対象動物は学内で飼育している実験ネコおよび協力動物病院に依頼し必要頭数を確保する。現時点では80頭が確保されており、そのうち21頭でL-FABPが検査済みである。59頭は現在測定中である。21症例のL-FABP値の範囲は0.04.1ug/gCr、平均値±標準偏差は1.6±1.3ug/gCrであった。血清クレアチニン値の範囲は0.501.57mg/dL、平均値±標準偏差は0.92±0.35mg/dLであった。尿蛋白クレアチニン値は測定可能であった16頭ではその範囲は0.031.02、平均値±標準偏差は0.26±0.3であった。また、尿比重は測定可能であった14頭ではその範囲は1.0281.066、平均値±標準偏差は1.042±0.02であった。また、実験健常雄ネコ5頭を用いて、日内変動の尿中L-FABP値への影響を検証している。給餌後の観察期間は12時間とした。日内変動の影響に関する検証では午前と午後に膀胱穿刺により採尿した。尿サンプルは現在測定中である。96ウェルELISA測定キットを用いている関係でL-FABP値の測定が遅れている。サンプルは今後も継続的に採取して参照値をより正確なものにしていく予定である。本年度は猫の慢性腎臓病モデルの作成に取り掛かった。腎虚血再灌流障害により腎障害を惹起することによりモデルの作成を試みた。腹部正中切開後に左腎の腎動脈及び腎静脈を露出し、それぞれ60分間クランプすることにより虚血再灌流による一時的な片側急性腎障害を惹起した。1回目の手術から2週間後、同様の方法で左腎の虚血再灌流障害による一時的な片側性急性腎障害を再度惹起した。2回目の手術から2週間後に右腎を摘出した。術後、経時的に動物の腎機能および腎形態をモニタリングし、腎の慢性変化(線維化など)を確認した。左腎のみとなった実験猫は一時的に高窒素血症に陥ったが、その後約2週間かけてクレアチニン値は正常域に復した。術後1ヶ月で経皮的生検により組織検査を実施したが、腎間質の線維化などは確認されず、健常右腎の組織像と同様であった。腎虚血再灌流モデルでは腎臓に与えた障害は一時的なものであったため腎の線維化まで至らなかったと判断し、代替法としてげっ歯類等で実施されている片側尿管結紮モデルの作成を試みることとした。実験猫は左尿管を吸収糸で結紮することにより水腎を惹起した。

左尿管結紮手術から4週間後、左尿管を結紮部位よりも近位で切断し、その切断端と膀胱を吻合し尿路を再開通させた。術後、腎盂拡張の改善をもって腎機能の改善とした。尿管膀胱吻合手術(尿路再開通)から2週間後に右腎を摘出した。術後、経時的に動物の腎機能および腎形態をモニタリングし、腎の慢性変化(線維化など)を確認した。左腎のみとなった実験猫は一時的に高窒素血症に陥ったが、その後約2ヶ月かけてクレアチニン値は正常域に復した。しかしながら、尿路再開通時及び術後1ヶ月、2ヶ月での生検サンプルの組織検査では、腎間質の線維化、炎症細胞の浸潤などが確認されたため、本モデルをもって腎線維化モデル(CKD stage1)モデルとすることにした。腎線維化モデルの作成が遅れている。現在、さらに2頭モデル数を増やしL-FABPの変化を啓示的にモニターする予定である。また、L-FABP測定に関しては、既存のものよりも高感度なELISAキットが開発されたため、それを用いて測定する予定である。本年度は昨年度作成した腎線維化モデルにおけるL-FABPの変動を長期的に観察した。片側尿管閉塞ー再開通モデル(UUO-riverse 4週間)モデルを2頭(Cat 1&2)、UUO-reverse 8週間モデルを1頭(Cat 3)の計3頭作成した。8週間モデルでは、8週目に右腎を摘出後BUN、Cre、SDMA及び尿中L-型脂肪酸結合タンパク(L-FABP)は高値を示した。ネコは乏尿を呈し一般状態が悪化したため3日後に安楽処分とした。腎組織検査では尿細管間質の線維化、炎症細胞の浸潤が顕著に認められた。4週間モデルでは、Cat 1& 2共に右腎摘出後BUN、Cre、SDMAは一時的に高値を示したもののその後は参照値範囲内へ復した。Cat 1は428日にCre値が上昇し始め、現在IRISステージ3で推移している。尿中L-FABP値は術後57日より3μg/g Cre前後を推移し344日、即ちCre及びSDMA上昇の約100日前に12.4μg/g Creと高値を呈した。Cat 2は現在IRISステージ1のまま推移しており、尿中L-FABP値は1μg/g Cre前後と低値で安定している。両動物ともに腎組織検査ではHE、マッソントリクローム、αSMA染色において尿細管間質の線維化が確認されている。また、68頭のネコにおいてL-FABP値、Cre値、SDMA値についてそれらの相関性についても検討した。Log L-FABPはLog Cre及びBUNとは強い相関が認められなかった。一方で、SDMAを測定した49頭のネコではLog L-FABPとLog SDMA間に強い相関性が認められた。尿中L-FABPは既存の腎機能評価マーカーよりもより早期に腎の病態生理学的変化を予測できる可能性が示唆された。今年度は腎毒性物質として古くから知られているアミノグリコシド系抗生物質であるゲンタマイシンを用いてCKDモデルの作出を試みる。ゲンタマイシンはネコにおいて蓄積投与量が400500mg/kgで腎傷害を実験的に誘発できることが知られている。腎バイオプシーによる組織検査(免疫染色を含む)を経時的に実施することにより腎臓の病理組織学的変化を評価する。片側尿管結紮モデルの頭数を増やし、腎線維化と腎機能、L-FABPの推移を血液学的及び組織学的に検討する予定である。
都市水循環システムにおける病原微生物によるヒトへの健康リスクの評価

本年度は,前年度行ったニューヨーク州セネカ湖州立公園(Seneca Lake State Park)において発生したクリプトスポリジウム症集団発生の解析結果をもとに,バイオテロリズムの対象としての噴水公園についての評価を行った。その結果,本事例の要因となったクリプトスポリジウムのように,一般に用いられている消毒剤である塩素に対する耐性の高い病原微生物が混入した場合に,健康被害が大きくなることが示された。今回の感染症集団発生を受け,ニューヨーク州ではこのような親水公園の水に対し,クリプトスポリジウムに対する不活化効果が高い紫外線による処理を追加するよう定めたが,今回作成したモデルの上では,処理導入により感染者数は減少するものの,その効果は限定的であり,感染症集団発生を完全に防ぐことはできない可能性が示された。また,フロリダ州の沿岸域で得た腸管ウイルスの検出結果をもとに,水浴により起こりうる健康被害の大きさを評価した。その結果,感染確率はU.S. EPAが提案する許容値(1回の水浴につき10^<-1.7>(1.9%))をわずかながら下回ったことから,対象水域での水浴による健康被害は許容できるレベルであることが示された。さらに,ノロウイルス感染症の集団発生の要因の1つとして指摘されている固体表面(床,机など)を介した感染経路の重要性について,固体表面上でのウイルス不活化速度の面からの検討を行った。細胞変性を用いる手法と遺伝子検出による手法で不活化速度に大きな差が見られたことから,近年盛んにおこなわれている遺伝子検出をもとにした固体表面上のウイルスによる健康被害の評価は,リスクの過大評価につながっている可能性が示された。本研究は、水循環システムにおけるクリプトスポリジウムの挙動解明を目的としている。本年度行った、海外における事例調査や文献調査により、河川水中のクリプトスポリジウム濃度は、河川底泥により何らかの影響を受けていることが考えられた。そこで、河川水中および河川底泥中のクリプトスポリジウムの挙動について、以下の仮説を立てた。河川水中のクリプトスポリジウムは、主に畜産排水や下水処理水に由来する。その多くは直接流下して河口に到達するものの、一部は沈降して底泥中、主にその表面に蓄積する。そして、降雨による流量増加時に、底泥の巻き上げと共に河川水中に再懸濁し、河川水中の存在濃度を押し上げる要因となる。本年度は、上記仮説を検証するための準備期間と位置づけ、水中および底泥中のクリプトスポリジウムの検出方法を開発し、さらに現場調査の選定ならびに予備調査を行った。1、クリプトスポリジウムの種・遺伝子型の判別手法の開発クリプトスポリジウムの種・遺伝子型の類別に、分子生物学的手法であるDGGE法を初めて適用した。9種の純株DNAを用いた評価により、本手法は、同一試料に複数種のDNAが混在していてもそれを類別できることや、試料中に未知の種が含まれる場合でも、それを見分けられることが示された。これらの特徴は、環境水を対象とした手法として、特に優れていると言える。2、高木川水系における現地調査(予備調査)次年度より行う本調査の予備調査として、高木川下流域、および松島湾にて底泥試料を採取し、クリプトスポリジウムの定量を行った。その結果、一部の底泥中から、河川水中と比較して高い濃度でクリプトスポリジウムが検出された。これは、先の仮説を裏付ける証拠となると考えられた。本年度は、実際に発生した感染症集団発生事件を例にとり、小規模な水循環システムの外部からの病原微生物の混入に対するシステムの脆弱性を、感染症リスクの変動を指標として評価した。2005年8月、ニューヨーク州セネカ湖州立公園(Seneca Lake State Park)において、4000人以上の感染者を出す大規模なクリプトスポリジウム症の集団感染事例が発生した。当該施設には子供が水と触れ合える噴水広場があり、この噴水の水が汚染源であることが考えられた(実際に、噴水広場の水からクリプトスポリジウムオーシストが検出された)。使用されていた水はプール水に対する水質基準(遊離塩素濃度1.5mg/L以上)を満たしており、また水の循環利用のための処理装置もアメリカ国内の噴水公園で一般に見られる方式であった。しかし、クリプトスポリジウムは塩素に対する耐性が非常に高いことと、水処理に使われていた濾材がクリプトスポリジウムのオーシストを除去するには不適切であったことにより、今回のような大規模な感染症集団発生が発生したと考えられる。噴水広場内の水循環システムにおいて、感染者の糞便による汚染があったと仮定し、水中のクリプトスポリジウムオーシストの濃度推移を推定するモデルを作成した。また、得られたモデルを元に、噴水広場の訪問者がクリプトスポリジウム症に感染する確率を推定した。その結果、ごく少量の糞便による汚染により、今回のような大規模な感染症集団発生が起こりうることがわかった。また、一度汚染されると、数日間は感染リスクの高い状態が続くことも示された。したがって、この水循環システムは外部からの汚染の混入に対し非常に脆弱であることが明らかとなった。この知見は、バイオテロリズムへの対策を講じる上で非常に重要である。

その結果,本事例の要因となったクリプトスポリジウムのように,一般に用いられている消毒剤である塩素に対する耐性の高い病原微生物が混入した場合に,健康被害が大きくなることが示された。今回の感染症集団発生を受け,ニューヨーク州ではこのような親水公園の水に対し,クリプトスポリジウムに対する不活化効果が高い紫外線による処理を追加するよう定めたが,今回作成したモデルの上では,処理導入により感染者数は減少するものの,その効果は限定的であり,感染症集団発生を完全に防ぐことはできない可能性が示された。また,フロリダ州の沿岸域で得た腸管ウイルスの検出結果をもとに,水浴により起こりうる健康被害の大きさを評価した。その結果,感染確率はU.S. EPAが提案する許容値(1回の水浴につき10^<-1.7>(1.9%))をわずかながら下回ったことから,対象水域での水浴による健康被害は許容できるレベルであることが示された。さらに,ノロウイルス感染症の集団発生の要因の1つとして指摘されている固体表面(床,机など)を介した感染経路の重要性について,固体表面上でのウイルス不活化速度の面からの検討を行った。細胞変性を用いる手法と遺伝子検出による手法で不活化速度に大きな差が見られたことから,近年盛んにおこなわれている遺伝子検出をもとにした固体表面上のウイルスによる健康被害の評価は,リスクの過大評価につながっている可能性が示された。
粉雪雪崩の二次元数値シミュレ-ションの開発

粉雪雪崩の二次元数値解析手法を構築するために,模擬実験と数値シミュレ-ションを行った。模擬実験では粉雪雪崩現象を淡水中の塩水の密度フロントの運動に置き換えた実験を行った。実験ではアクリル製粉雪雪崩模擬実験装置を購入し,実験装置中に淡水を満たし,所定の角度に設置した傾斜板上に塩水塊を流下させることにより塩水サ-マルを発生させた。測定はビデオカメラによる塩水サ-マルの三次元形状の変化とその運動について行った。その結果サ-マルの運動速度が初期距離を経過後一定値となること,サ-マルの最大高さ,平面積,横広がり幅は各傾斜角毎に流下距離と共に直線状に増加すること,また横広がり幅と最大高さとの間にはべき乗で表わされる関係があることを示した。実験結果に基いて数値解析手法を検証すべく,粉雪雪崩の数値シミュレ-ションモデルを改造して,塩水サ-マルの運動シミュレ-ションプログラムとした。用いた方程式は,サ-マルの体積保存式,塩分の保存式,運動量保存式の三式であり,淡水のサ-マル心中への連行量は,粉雪雪崩で用いられている関係式を用い,さらに実験で得られた横広がり幅と最大高さとの関係式も用いた。計算結果は実験結果を良く再現し,本数値解析手法の全体的な適用性を示した。斜面の三次元的な情報を与えて粉雪雪崩の運動を自動的に計算するシミュレ-ションプログラムは,以上のプログラムを拡張し,流下方向と直角方向の運動量保存式を考慮したものを開発し,その性能をテストした。
チューイング力がストレス緩和に及ぼす影響

これまで我々は、チューイングによるストレス緩和効果を明らかにしてきた。しかしながら、ほとんどのチューイングによるストレス緩和の研究は若年者に対してであった。これまで、高齢者に対して、若年者と同様にストレスが緩和するという報告はない。そこで我々は、高齢者に対して、チューイングがストレスに及ぼす影響を検討した。その結果、高齢者は若年者のようには、チューイング時にストレス緩和をしなかった。今後は口腔内環境によって高齢者をグループ分けして、ストレス緩和しやすい方法を検討する必要がある。これまで、チューイングが精神的ストレスを緩和することは、唾液中のストレス指標を用いた研究により明らかとされている。しかし、チューイング時のどの運動要素が精神的ストレスの緩和に関与しているかについては、限られた報告しかない。本研究では運動要素の中のチューイング力に着目して、チューイング力の違いによる精神的ストレスの緩和に及ぼす影響を唾液中のストレス指標(神経系の指標であるアミラーゼ活性、内分泌系の指標であるコルチゾール濃度および免疫系の指標であるs-IgA分泌率)を用いて検討することを目的とした。研究結果により、チューイング力がストレス緩和に影響を及ぼすことが明らかとなった。また、唾液中のストレスマーカーとしてコルチゾール濃度がチューイングの研究には最も有効であることも示唆された。一方、ほとんどのチューイングによるストレス緩和の研究は若年者に対してであった。そこで我々は、高齢者に対して、チューイングがストレスに及ぼす影響を唾液中コルチゾール濃度を用いて検討した。その理由として、高齢者は若年者と違い、口腔内環境の不均一性が高いことが考えられた。今後は、口腔内環境によって高齢者をグループ分けして、グループごとに、ストレス緩和しやすい方法を検討する必要がある。これまで、当講座の研究によりチューイングによりストレスが緩和することが明らかとなった。また、若年者における研究で、チューイング条件(速度、力、時間)がストレス緩和に影響を及ぼすことも明らかとした。さらに、咀嚼能率がストレス緩和に及ぼす影響も検討したところ、影響がないことが明らかとなった。今回、我々は義歯装着高齢者に着目し、チューイングがストレス緩和に及ぼす影響を明らかにすることを目的とした。ストレス緩和の検討には唾液中のコルチゾールとアミラーゼを使用する。この研究により、義歯装着高齢者においてチューイングとストレス緩和との関係が明らかになり、口腔内からのQOL向上に反映することができると考えている。チューイング条件に関する研究として、Influence of chewing conditiononmental stress releaseという題材で9月6日にNetherlandsのRotterdamで行われた36th Annual Congress of the European Prosthodontic Associationで発表を行った。それにより、他の研究者の意見を伺うことや他の発表を参考にできた。具体的には、被験者の条件や、チューイングガムの性質や硬さおよび個人が持つ口腔内環境に関することである。特に、口腔内の環境の違いは若年者と違い、高齢者ではかなり個人差が認められるため、非常に重要な項目と成り得ることが推測される。それらを参考に、現在、被験者に対して引き続き実験を行っているところである。もう少し被験者数が集まった時点で学会発表を予定している。主には、これまでに実験を行った結果のバラつきに関してである。高齢者は、若年者と比較してデータに個人差が大きいことは推測していたが、その理由として口腔内環境における個人差だけではなく、服用薬剤における個人差が理由として考えられた。高齢者は全身的な疾患に対して薬を服用していることが多く、特に内分泌ホルモンに影響があると考えられる薬を慢性的に服用していることも多い。今回、ストレス計測には唾液中コルチゾール濃度を使用しているので、その場合、研究結果にも影響を与えかねない。しかし、被験者の人数がある程度集まらないと評価できないので、今回は義歯が与える影響を検討する前に、高齢者における影響を検討しようと考えている。被験者に関しては、内分泌ホルモンに関して影響のある薬剤の服用を行っていない者に関して、口腔内の環境は特定せずに、被験者を義歯装着高齢者から高齢者に拡大することを考えている。現段階で、薬剤を含めて、データに影響の無い被験者にさらにこの条件を追加してデータの収集を行っていく。昨年一年間を通して研究を行ったことから今後は、被験者を義歯装着高齢者から高齢者に拡大することを考えている。被験者に関しては、内分泌ホルモンに関して影響のある薬剤の服用を行っていない者に関して、口腔内の環境は特定せずに、実験を行う予定である。

また、口腔内環境に対する検査項目に関しては、前年度のものと同様に、咬合力と咬合接触面積とを参考にするので、特別な変化はない。咬合力接触面積を測定する機械でも咬合力に関して計測できるが最大咬合力に関しては、オクルーザルフォースメーターでないと計測できないので、前年度通りにする予定である。そのため、被験者に対しては検査項目が少し多くなるが、この検査項目をすべての被験者に対して行い、もう少し人数を追加していく。その上で、秋に行われるInternational College of Prosthodontistsで発表を行う予定である。その学会で得られるであろう貴重な意見を参考にさらに推考を重ねたものを、論文発表する予定である。実験に対する検査費用に使用予定である。主には、唾液中コルチゾール濃度の測定とアミラーゼ活性の測定、また咬合状態の測定に用いる検査キットにかかる予定である。コルチゾール濃度の測定にはサリベッテを用いるため、その費用が必要となる。アミラーゼの計測には、アミラーゼ活性モニター専用チップが必要となる。咬合接触面積に関しては、デンタルプレスケール用の測定チップが必要となる。また最大咬合力に関しても計測予定のため、咬合力計測器オクルーザルフォースメーターのチップにも使用予定である。現時点では、使用予定はないが、咀嚼筋の筋活動に関しても計測しているので、その計測機器の不具合がおきた場合はその修理にかかる費用や、使用する咬筋相当部に貼る計測用のチップの購入等にかかる費用にあてる予定である。その実験から得られるデータに対して統計処理を行い学会発表を行う予定である。9月18日にItaliaのTorinoで行われるInternational College of Prosthodontistsで発表を行う予定である。そのため、それに関してかかる学会参加費用や、ポスター作成理非用に使用予定である。さらに、学会で得られるであろう貴重な意見を参考にして、論文発表する予定である。現段階の予定としては、Journal of Oral Rehabilitationに投稿予定であるが、その時の投稿料や翻訳の確認費用に使用予定である。
小細胞肺癌に対するTh17細胞誘導を介した新規抗腫瘍免疫療法の開発

限局型小細胞肺癌(SCLC)患者に存在するTh17細胞が認識する抗原を明らかにする目的でSCLC表面抗原の解析を行った。浮遊で増殖する分画において癌幹細胞マーカーであるCD133が表出されており、癌幹細胞に特異的な抗原がTh17誘導に関わっていると考えられた。プロテオーム解析の結果、癌幹細胞に優位な発現パターンを持つ蛋白質4つを同定した。その中の一つであるDEAD/H(Asp-Glu-Ala-Asp/His)box polypeptide 3,X-linked(DDX3X)を用いたワクチン療法は抗腫瘍効果をもつことを明らかにしている。現在、DDX3Xを用いたTh17誘導抗癌幹細胞免疫療法の開発が進行中である。小細胞肺癌(SCLC)患者末梢血中におけるエフェクターCD4^+T細胞(Teff, CD62L^<low>T細胞)と制御性T細胞(Treg, CD62L^<high>CD25^+CD4^+T細胞)のCD4^+T細胞に対する比率、Teff/Treg比率と臨床病期の関連について検討した結果、限局型(LD)-SCLCではTeffが健常者コントロールに比しても増加しており、遠隔転移を持つ進展型(ED)-SCLCではTeffが全く増加していないばかりかTregが有意に増加していることを見出した。化学放射線療法により3年以上無再発生存している患者では、健常者に比しても高いTeff/Treg比を維持していた。一方、LD-SCLC患者であっても、遠隔転移により再発した患者はTeffが減少しTregが増加することでED-SCLC型のTeff/Treg比に変化していた。さらに、LD-SCLC患者で増加したTeffはTh17型の性質を有しており、同数のTeffで比較しても有意に多量のIL-17を産生することを明らかにした。LD-SCLC患者の単球からin vitroで誘導した樹状細胞はED-SCLCや健常者由来単球から誘導した樹状細胞に比べて多くのIL-23を産生した。以上よりLD-SCLCでは、健常者、ED-SCLCには見られないIL-23/Th17軸の活性化の結果、Treg誘導が抑制されTeff誘導が促進されていると考えられた。誘導されたTeffは小細胞肺癌細胞の腫瘍抗原特異的サイトカイン産生を示したことから、末梢血中で免疫学的障壁として転移を抑制していることが示唆された。以上の結果は、日本呼吸器学会総会において発表の後、Clinical Cancer Resarchに誌上発表した。小細胞肺癌由来株化癌細胞について表面抗原を解析した。この結果、近年癌幹細胞マーカーとして知られているCD133陽性細胞が少なからず存在すること、浮遊で増殖する細胞株に関してはその90%以上がCD133を表出していにることを見出した。癌幹細胞関連抗原がTh17誘導に関わっている可能性があると考え、マウスメラノーマ腫瘍系において解析を進めた。CD133+癌幹細胞とCD133-通常癌細胞を分離培養し、通常癌細胞とCD133+癌幹細胞を樹状細胞存在下に皮下接種し所属リンパ飾に誘導されたCD4+T細胞を解析した。癌幹細胞抗原により誘導されたT細胞にはIL-17を癌幹細胞特異的に産生するTh17型細胞が大量に含まれていた。このT細胞は経静脈的に投与することで、親株腫瘍に対して通常癌細胞により誘導されたT細胞に比べて極めて高い抗腫瘍効果を示した。癌幹細胞特異的Th17投与したマウスの腫瘍内では活性化樹状細胞の浸潤がみられ、エフェクター型CD4T細胞が多数認められた。一方この腫瘍内や腫瘍所属リンパ節では制御性T細胞の誘導が抑制されていた。癌幹細胞、通常癌細胞や、それらと共培養した樹状細胞から産生されるIL-12,IL-23,IL-6などに差はみられなかった。以上より、癌幹細胞に特異的抗原がTh17誘導に関わっていると考え、二次元電気泳動法を用いてプロテオーム解析をおこなった。癌幹細胞に発現が多い蛋白質4つを同定した。以上の結果は、2009年日本癌学会学術総会、及び2010年American Association for Cancer Researchにおいて発表した。現在、論文投稿中である。遠隔転移を持つ進展型小細胞肺癌患者にみられず限局型小細胞肺癌症例に存在するTh17-CD4エフェクターT細胞が遠隔転移を防いでいる仮定すれば循環腫瘍細胞に対する抗腫瘍効果を担っている可能性高いと考え、浮遊で増殖する能力を持つ小細胞肺癌株の表面抗原を解析した。
アジア経済危機下の契約再交渉過程の法社会学的研究 -日本・タイ国際取引調整をめぐって-

本研究はこれまでの米国における契約理論、交渉理論の検討、とりわけ、いわゆる関係的契約をめぐる理論とその適用による法杜会学的な契約交渉過程の実証研究、ならびに企業等の組織が契約交渉に与える影響を射程に収めた組織的契約理論などの研究をベースに、日タイ契約関係に関するデータを分析し、通貨危機時における日系企業のタイでの契約再交渉過程の特質を明らかにしようとしたものである具体的には日タイ国際契約取引関係について、一方でタイの外国投資法、契約法、民事訴訟法などについての変容をフォローしつつ、現地にて日系タイ企業の行動パターンについて、各社の駐在員、担当者へのインタビュー調査を実施した。とりわけ通貨危機時の紛争処理行動と、それが長期的な契約関係のあり方や企業戦略とどのようにかかわっているのかえを検証し、その上で関係的契約論や組織論的な契約理解が、実証的にも妥当性を有していることを確認した。また、さらに、このタイでの法的交渉関係で得た知見をベースにより広く、アジアにおける紛争解決制度研究の基本的視座の構築へも発展的に詩作を展開した。本研究は、本年度でいったん終了するが、現在、京都大学の「東アジアの法と近代化」(4ヵ年計画)についての共同研究、およびカナダ、ブリティッシュ・コロンビア大学を中心とするアジアの紛争解決共同研究プロジェクト(5カ年計画)にも日本側代表者として参加しており、その中で、本研究で得た知見をさらに発展的に展開していくことを考えている。本年度は、第一に、理論的枠組みの形成を目的として、米国における契約理論、交渉理論の検討を行った。とりわけ、いわゆる関係的契約をめぐる理論とその適用による法社会学的な契約交渉過程の実証研究、ならびに企業等の組織が契約交渉に与える影響を射程に収めた組織的契約理論などを中心に、日タイ契約関係への適用可能性を念頭におきつつ検討した。第二に、日タイ間の取引関係の通貨危機をはさんだ構造変容をマクロな観点からさぐるために、各種統計資料の検討のほか、日本においてタイ投資委員会、タイにおいてバンコク日本商工会議所などで、ヒアリングと資料収集を行った。第三に、日タイ国際契約取引関係の基本的枠組みを知るため、タイの外国投資法、契約法、民事訴訟法などについての理解を得るため、資料を収集し、協議を行った。とりわけ、通貨危機以後、タイの経済関係法制は大きく変容しており、この動きの激しい政策に関しても、逐次、タイから資料を取り寄せ、フォローする体制を整えた。これによって、新たな経済法制と、いまだ必ずしもそれが浸透せず定着していない契約実践とのギャップと問題点も検討することができた。第四に、タイの民事裁判所ならびに新しく設置された破産裁判所でもインタビューを実施し、この訴訟や破産事件の動きからも、通貨危機以後のタイでの企業取引の動態を把握することに努めた。次年度以降は、在タイ日系企業を中心に、通貨危機以後、タイ企業との間でいかなる契約調整を行ったかについて本格的に調査し、本年度得られたマクロなタイ経済、契約関係の理解と結びつけつつ、契約の社会的機能につき、多元的角度から考察を進めていく予定である。2年目の本年度は、タイにおける日系企業とタイ企業の取引行動について、国内およびタイにおいて本格的なヒアリング調査、ならびに質問紙によるサーヴェイを実施した。それによると、一般に、日系企業の取引行動や契約ビヘイビアは、欧米企業と異なるのはもちろん、タイ企業と比べても、より特殊な関係重視型の要素が強いことがわかった。サーベイにおけるタイおよび日系企業担当者の見解も、また具体的事例を通じて明らかになるデータも、同様の傾向を指し示している。これらは従来日本型と呼ばれた行動パターンであり、国内での変容とは別に、海外進出に際して、状況によっては未だそれが維持されうることを示している。さらにデータの分析によると、タイの取引状況の中では、それがまた長期的な経済合理性を有すると見ることもできるように思われる。本年度はこのように日系企業の土地引き行動パターンの抽出を行ったが、来年度は、この調査を補充しつつ、こうした日系企業の取引パターンを可能にし、また経済合理的ならしめているタイの取引環境、社会的・文化的・法的要因の複雑な関係モデルを精査していくことにしたい。なお、本研究の成果は、中間的に、下記のシンポジウムですでに発表、あるいは発表をエントリーしている。

本年度は、最終年度であり、これまでの米国における契約理論、交渉理論の検討、とりわけ、いわゆる関係的契約をめぐる理論とその適用による法社会学的な契約交渉過程の実証研究、ならびに企業等の組織が契約交渉に与える影響を射程に収めた組織的契約理論などの研究をベースに、日タイ契約関係に関するデータの解釈、整理を行った。また、引き続き、日タイ国際契約取引関係について、一方でタイの外国投資法、契約法、民事訴訟法などについての変容をフォローしつつ、現地にて日系タイ企業の行動パターンについて、各社の駐在員、担当者へのインタビュー調査を実施した。とりわけ通貨危機時の紛争処理行動と、それが長期的な契約関係のあり方や企業戦略とどのようにかかわっているのかを検証し、その上で関係的契約論や組織論的な契約理解が、実証的にも妥当性を有していることを確認した。また、さらに、本年度は最終年度でもあるため、このタイでの法的交渉関係で得た知見をベースにより広く、アジアにおける紛争解決制度研究の基本的視座の構築へも発展的に詩作を展開した。本研究は、本年度でいったん終了するが、現在、京都大学の「東アジアの法と近代化」(4カ年計画)についての共同研究、およびカナダ、ブリティッシュ・コロンビア大学を中心とするアジアの紛争解決共同研究プロジェクト(5カ年計画)にも日本側代表者として参加しており、その中で、本研究で得た知見をさらに発展的に展開していくことを考えている。
モロッコ王国における侵襲性歯周炎の発症を制御する因子の細菌・免疫学的解析

侵襲性歯周炎は思春期前後のアフリカ系の若者に特異的にみられ、特にモロッコ王国において多発的に発症することが知られている。今回我々は1侵襲性歯周炎患者固有な細菌プロファイルの解析、2末梢血を用いたミトコンドリアDNAの解析による侵襲性歯周炎の疾患感受性と人種特異性の解析を行った。本解析により、侵襲性歯周炎に特異的な細菌叢プロファイルが明らかになった。疾患感受性と分子遺伝学的分類による人種との関連については明確な相関は見られなかった。侵襲性歯周炎は思春期前後の若年者に発症し、歯周組織の破壊が急速であること、前歯および第一大臼歯に限局した骨吸収を示すこと、アフリカ系の人種特異的に発症することなどが明らかとなっている。本疾患の罹患者の歯周ポケットからグラム陰性桿菌A. actinomycetemcomitans、特にJP2クローンが多く単離され、同クローンの有無が非常に強く関与することが明らかにされてきた。しかし、本疾患に特異的な唾液細菌叢の解析は行われておらず、その健常者との相違等については不明である。そこで、モロッコ王国Mohammed V大学の学生について口腔内診査を行い、侵襲性歯周炎の検査を行った。検査と同時に同意者について唾液および血液サンプルを採取した。途中、現地研究スタッフが調査に参加できず予定通りに研究が進まない時期もあったが、現在は再開しており、臨床データおよび臨床サンプルの採取を継続している。これまでに得られた臨床サンプルについて、唾液より精製したゲノムDNAおよび次世代シーケンサーを用いて決定した16S rRNA遺伝子の塩基配列を基に唾液細菌叢の暫定的な解析を行ったところ、侵襲性歯周炎に特異的な細菌種、健常者に特異的な細菌種が有意差をもって認められた。同様に血液からDNAを精製し、分子人類遺伝学的解析のためミトコンドリアDNAのDループの塩基配列を決定している。また、これまでのデータから歯周ポケット深さなどの臨床データと口腔細菌叢の関連などの暫定的な解析を行い、今後も臨床サンプルの採取を続行するのか解析した。このように小規模な解析では唾液中に疾患特異的な細菌種を認めることができたため、現在調査およびサンプリングを継続して行い、対象者を増やした大規模な解析を行う予定である。侵襲性歯周炎の発症年齢である大学生を対象として解析する目的で、モロッコ王国Mohammed V大学の学生について口腔内診査を行い、侵襲性歯周炎の検査およびスクリーニングを行っている。また、検査と同時に唾液および血液サンプルを採取している。平成27年度は現在採取できている唾液および血球について、DNAの採取を行った。また、現在口腔内診査および唾液・血液のサンプリングが終了しているものについて、唾液より精製したゲノムDNAおよび次世代シーケンサーを用いて決定した16S rRNA遺伝子の塩基配列を基に唾液細菌叢の暫定的な解析を行ったところ、侵襲性歯周炎に特異的な細菌種、健常者に特異的な細菌種が有意差をもって認められた。同様に血液からDNAを精製し、分子人類遺伝学的解析のためミトコンドリアDNAのDループの塩基配列を決定しているが、まだクラスター解析までは行っていない。今後対象者を増やすことで更なる新知見が得られる可能性が示唆されたため、対象者の口腔内診査および唾液・血液等臨床サンプルの採取は次年度も継続して行うことが決定している。侵襲性歯周炎は思春期前後の若年者に発症し、歯周組織の破壊が急速であること、前歯および第一大臼歯に限局した骨吸収を示すことなどが明らかとなっている。本疾患の罹患者の歯周ポケットからグラム陰性桿菌A. actinomycetemcomitans、特にJP2クローンが多く単離され、同クローンの有無が強く関与することが明らかにされてきた。そこで、モロッコ王国Mohammed V大学の約900名について口腔内診査を行い、侵襲性歯周炎の検査を行った。そのうち、患者60名、健常者60名より唾液を採取後、唾液中細菌16S rRNAをターゲットとしたDNAシーケンシングを行った。次にその塩基配列を基に唾液中細菌の菌叢解析を行った。唾液の菌叢解析の結果、患者ー健常者間に有意に特異的な細菌属が認められた(p<0.05)。患者唾液にはFirmicutes, Bacillus, Streptoccocus,およびTreponemaなどスピロヘータといった菌群が有意に多く見られた。また、健常者唾液にはPorphyromonas, Lactobacillusといった慢性歯周炎およびう蝕に多く見られる細菌群が有意に多く認められた。以上の様に本疾患に特異的な菌群が明らかになった。その構成細菌種を基にクラスター分類を行ったところ、唾液の構成細菌による患者ー健常者のクラスターは全く異なることが示唆された。さらに、機械学習の手法を用いて菌叢から個体が侵襲性歯周炎である可能性について解析した結果、82.8%の正確さで予測できた。

このことから、誤りは健康である人を侵襲性歯周炎だと誤ったのみで、侵襲性歯周炎であるが健康だと判断した誤りはないという結果が得られた。侵襲性歯周炎の発症年齢である大学生を対象として解析する目的で、モロッコ王国Mohammed V大学の約900名について口腔内診査を行い、侵襲性歯周炎の検査およびスクリーニングを行った。検査と同時に唾液および血液サンプルを採取した。平成28年度は唾液および血球を用いた解析を行った。まず、患者・健常者それぞれ60名の唾液から、唾液中細菌のゲノムDNAを精製後16S rRNAをターゲットとしたDNAシーケンシングを行い、その塩基配列を基に唾液中細菌の菌叢解析を行った。唾液の菌叢解析の結果、患者ー健常者間に有意に特異的な細菌属が認められた(p<0.05)。患者唾液にはFirmicutes, Bacillus, Streptoccocus, Staphyrococcus,等の菌群およびTreponemaなどスピロヘータが多く見られた。また、健常者唾液にはPorphyromonas, Lactobacillusといった慢性歯周炎およびう蝕に多く見られる細菌群が多く認められた。以上、患者と健常者のそれぞれに特異的に多く見られる菌群が明らかになった。また、患者および健常者の構成細菌種を基にクラスター分類を行った。その結果、唾液の構成細菌による患者ー健常者のクラスターは全く異なることが示唆された。さらに、機械学習の手法を用いて、菌叢(Operation Taxonomy Unit, OTUとその出現頻度)から個体が侵襲性歯周炎である可能性について解析した結果、誤りは116サンプルのうち20となり、82.8%の正確さで予測できた。以上の結果から誤りであったのは健康である人を侵襲性歯周炎だと誤ったのみで、侵襲性歯周炎であるが、健康だと判断した誤りはないという結果が得られた。以上の様に、侵襲性歯周炎患者の唾液細菌叢について詳細な情報を得ることができた。侵襲性歯周炎は思春期前後の若年者に発症し、歯周組織の破壊が急速であること、前歯および第一大臼歯に限局した骨吸収を示すことなどが明らかとなっている。本疾患の罹患者の歯周ポケットからグラム陰性桿菌A. actinomycetemcomitansの特にJP2クローンが多く単離され、同クローンの有無が非常に強く関与することが明らかにされてきた。しかし、本疾患に特異的な細菌叢の解析は行われておらず、健常者との相違等については不明である。そこで、モロッコ王国Mohammed V大学の約900名について口腔内診査を行い、侵襲性歯周炎の検査を行った。検査と同時に同意者について歯肉縁下プラークおよび血液サンプルを採取した。そのうち、患者60名、健常者60名より前歯・臼歯からそれぞれ4か所、計8か所から歯肉縁下プラークを採取後、細菌16S rRNAをターゲットとしたDNAシーケンシングを行った。次にその塩基配列を基に歯肉縁下プラーク細菌の菌叢解析を行った。菌叢解析の結果、患者ー健常者間に有意に特異的な細菌属が明らかになった(p<0.05)。その構成細菌種を基にクラスター分類を行ったところ、歯肉縁下プラークの構成細菌による患者ー健常者のクラスターは全く異なることが示唆された。
軽い中性子過剰核のHeクラスター崩壊モードの研究

荷電粒子飛跡検出器の一種である多線式比例計数管を開発し、理化学研究所リングサイクロトロン施設でのビーム実験に使用しその有効性を確認した。比例計数管はX四面、U二面、V二面の合計八面のセンス面から構成され(読み出しチャンネルは96チャンネル)、有感領域は横方向に190mm、縦方向に140mm、奥行き方向に128mmである。斜め方向にワイヤーが張られたU,Vセンス面を有する為、荷電粒子の飛跡を複数飛跡に対しても不定性なく三次元的に再構築可能である。飛跡再構築のためのアルゴリズムを考案し、ソフトウェアを開発した。核子当たり70MeVの14Beビームに対し一面当たりの測定位置分解能70μmを得た。当比例計数管を、14Be->12Be+2n及び19C->18C+n分解反応のエクスクルーシブ測定による14Be核と19C核の非束縛準位の探索実験に使用した。計数管は液体水素標的の下流で、かつ分析電磁石の上流に位置する箇所に配置した。計数管の情報を用いることで散乱荷電粒子の出射方向を0.1度の精度で決定可能となった。さらに、この情報を分析電磁石の下流側に配置された既設の飛跡検出器の情報と組み合わせることで、荷電粒子の質量をA/ΔA(FWHM)=50と従来を70%上回る精度で決定可能となった。これにより、分析電磁石系を含む既存の実験セットアップでの分光学研究の対象核種を、質量数が25程度までのより重たい領域にまで広げることができた。今後データ解析を進め、14Be核と19C核の中性子崩壊閾値より上に位置する励起準位の探索を行う。また、インクルーシブな反応チャンネである19C->18Cの一中性子ストリッピング反応の断面積を求め、これを近年SurreyならびにMSUの理論グループにより開発されたアイコナール近似に基づく理論計算結果と比較し、19C核の基底状態のスピン、パリティの情報を得る。初年度は申請課題遂行に必要な以下三点の実験機器の整備に取り組んだ。1、二次標的下流側に設置する多線式比例計数管の信号読み出し経路を設計、製作した。本比例計数間を設置予定の双極電磁石の間隙は400mmと狭く、アノードワイヤーからの信号をロジック信号に変換するアンプディスクリカードを本体に直に接続できない。そこで、アノード信号はケーブルにより磁石間隙外部に導く仕様とした。微小なアノード信号は電気ノイズの影響に弱いので、ノイズ対策としてケーブルは同軸フラットケーブル(ケーブル長3m)とした。また、アンプディスクリカードを収納するラックマウント型ボックスを製作、テストした。2、二次標的に使用する液体水素標的をマウントし、ビームライン上流側との接続を保つ散乱槽を設計した。散乱槽の形状は、下流側に設置される多線式比例計数管、中性子検出器のアクセプタンスを損なうことなく、且つ、上流側のビーム診断装置と下流側の双極電磁石との間隙に挿入可能なように決められた。散乱槽は、ビームライン上流側とは独立して真空を引くことが可能である。冷却された水素標的が上流側から残留ガスを引き寄せることによる標的の純度の悪化を防ぐ為、薄い膜により上流側と標的部分とを切り離すことができる仕様とした。3、実験データ収集系を構築した。上記、比例計数管を含む各検出器からの信号はCAMAC ADC、TDCを用いてデジタル化された後コンピュータに取り込まれる。理化学研究所加速器施設において標準的に用いられているデータ収集システムを導入し、宇宙線や、55Fe線源からのX線を用いたオフラインでの比例計数管のテスト、並びに飛跡再構築ソフトウェアの開発に必要な機器を整備した。

今後データ解析を進め、14Be核と19C核の中性子崩壊閾値より上に位置する励起準位の探索を行う。また、インクルーシブな反応チャンネである19C->18Cの一中性子ストリッピング反応の断面積を求め、これを近年SurreyならびにMSUの理論グループにより開発されたアイコナール近似に基づく理論計算結果と比較し、19C核の基底状態のスピン、パリティの情報を得る。
口腔癌における浸潤・転移関連遺伝子の検索

我々は口腔癌の浸潤・転移のメカニズムを明らかにするために、各種ヒト口腔扁平上皮癌細胞株を用いて、既知あるいは未知の関連遺伝子の検索を行ってきた。Autocrine Motility Factor(以下、AMFと略す)は自己分泌型遊走因子として知られ、発生の初期段階の未分化な繊維芽細胞やある種の腫瘍細胞で特異的に分泌されるサイトカインである。AMFと癌の浸潤能との間に深い関連を示唆する報告が相次いでおり、また臨床材料では腫瘍組織におけるAMF受容体AMF Receptor(以下、AMFRと略す)の発現量と予後との間に関連性を示唆するデータもいくつか報告されている。我々は各種ヒト口腔扁平上皮癌細胞株の間で、このAMFとAMFRの発現の検索を行ってきた。我々は高転移性株LMF-4がAMFを分泌していることをみいだし、LMF-4の分泌したAMFは、口腔癌以外の繊維肉腫細胞株(HT1080)にも作用することがわかった。しかも、LMF-4の運動能はAMFの濃度依存性に高まることがわかった。一方、各種ヒト口腔扁平上皮癌細胞株の間でAMFRのcDNAをプローブにノーザンブロット解析を行ったところ、非浸潤型で非転移性のHSC-2、HSC-4ではmRNAの発現レベルが、口腔癌細胞の持つ浸潤・転移の能力との間に相関があることが示唆された(以上、Y.NIINAKA et al.:INTERNATIONALJOURNAL OF ONCOLOGY,9:433-438,1996)。なお現在我々は転移抑制遺伝子として注目されてきたnm23/NDP kinaseの口腔癌における発現と機能についても解析中である(口腔病学会雑誌65巻2号in press)。我々は口腔癌の浸潤・転移のメカニズムを明らかにするために、各種ヒト口腔扁平上皮癌細胞株を用いて、既知あるいは未知の浸潤・転移の関連する遺伝子の検索を行ってきた。Autocrine Motility Factor(以下AMFと略す)は自己分泌型遊走因子として知られ、発生の初期段階の未分化な線維芽細胞やある種の腫瘍細胞で特異的に分泌されるサイトカインである。AMFの作用と癌の浸潤との深い関連を示唆する報告が相次いでおり、また臨床材料における腫瘍のAMF受容体(AMF Receptor、以下AMFRと略す)の発現量と予後との関連も示唆されている。我々は各種ヒト口腔扁平上皮癌細胞株の間で、このAMFとAMFRの発現検索を行ってきた。我々は高転移株LMF-4がAMFを分泌していることをみいだし、LMF-4の分泌したAMFは、口腔癌以外の線維肉腫細胞株(HT1080)にも作用することがわかった。しかも、AMFの濃度に依存してLMF-4の運動能は高まる傾向にあることがわかった。AMFと癌の浸潤能との間に深い関連を示唆する報告が相次いでおり、また臨床材料では腫瘍組織におけるAMF受容体AMFR eceptor(以下、AMFRと略す)の発現量と予後との間に関連性を示唆するデータもいくつか報告されている。

我々は高転移性株LMF-4がAMFを分泌していることをみいだし、LMF-4の分泌したAMFは、口腔癌以外の繊維肉腫細胞株(HT1080)にも作用することがわかった。しかも、LMF-4の運動能はAMFの濃度依存性に高まることがわかった。一方、各種ヒト口腔扁平上皮癌細胞株の間でAMFRのcDNAをプローブにノーザンブロット解析を行ったところ、非浸潤型で非転移性のHSC-2、HSC-4ではmRNAの発現が低いが、高浸潤型で高転移性ののHSC-3、LMF-4では発現が高いことがわかった。すなわちAMFRのmRNAの発現レベルが、口腔癌細胞の持つ浸潤・転移の能力との間に相関があることが示唆された(以上、Y.NIINAKA et al.:INTERNATIONALJOURNAL OF ONCOLOGY,9:433-438,1996)。
卵母細胞における新規の紡錘体二極性化機構の解明

染色体を正しく分配するうえで紡錘体が二極性であるということは非常に重要である。しかしながら哺乳動物の卵母細胞には紡錘体の極性を決定する中心体が無く、紡錘体が二極性化する機構は未だ明らかになっていない。そして現在までに我々は微小管と染色体とを接続する動原体の構成タンパク質が卵母細胞において紡錘体を二極性化することに必要であることを明らかにしてきた。本研究では、マウス卵母細胞において動原体が紡錘体を二極性化する機構の解明を目的とし、動原体タンパク質へ変異を導入し紡錘体の二極性化の解析を行った。その結果、動原体タンパク質は既知の微小管と染色体との接続する機能に加え、逆方向性微小管束形成を促進するクロスリンカータンパク質を動原体へとリクルートすることが明らかになった。さらにその微小管束のクロスリンカータンパク質レベルを増加/抑制すると染色体分配異常が引き起こされることが明らかになった。そしてクロスリンカータンパク質が動原体から動原体近傍の紡錘体微小管へとダイナミックに移動していることが示唆された。これらの結果より、マウス卵母細胞においては逆方向性微小管束形成を促進するクロスリンカータンパク質の空間的制御が、染色体の分配に重要であることが予想される。動原体には多数の微小管が接続される。マウス卵母細胞においては、動原体に逆方向性微小管束形成を促進するクロスリンカータンパク質を集積させることにより動原体近傍より効率的に紡錘体が二極性化されていること、そしてその機構が染色体分配に重要であることが示唆された。染色体を分配する紡錘体が二極性であるということは非常に重要である。しかしながら哺乳動物の卵母細胞には、多くの体細胞とは異なり紡錘体の極性を決定付ける中心体が存在しない。そして卵母細胞において紡錘体が二極性化する機構は未だ明らかになっていない。現在までに我々は微小管と染色体とを接続する動原体の構成タンパク質が、卵母細胞では紡錘体の二極性化に必要であることを明らかにした。中心体の無い卵母細胞においては動原体が紡錘体の二極性化に重要な機能を担っていることが予想される。そこで、動原体構成タンパク質が動原体において紡錘体の二極性化に機能しているかを明らかにするために、動原体構成タンパク質に変異を導入し、動原体への局在と紡錘体の二極性化に相関性があるかを検討した。さらに変異型タンパク質を作製することにより、微小管との接続能と紡錘体の二極性化の関連についても検討した。またマウス卵母細胞においては動原体近傍において逆方向性の微小管束形成が促進しているかを明らかにするために、卵母細胞の紡錘体形成における経時的な微小管の観察を行った。その結果、卵母細胞では紡錘体形成初期においては様々な方向から伸びた微小管が動原体へと接続されており、それらが減数分裂の進行に伴い二極性化していることが明らかになった。これらの結果より、マウス卵母細胞においては動原体の機能が紡錘体の二極性化に重要であることが示唆された。中心体の無いマウス卵母細胞においては動原体の機能が紡錘体の二極性化に必要であることが予想された。変異型動原体タンパク質の作製や変異型タンパク質の機能解析についても進行中である。また、卵母細胞における微小管の詳細な観察を行うための条件検討も進んでおり、卵母細胞内の微小管の配向性を解析する準備も整ってきている。一方で、卵母細胞内においてsiRNAなどによって標的タンパク質を抑制することは難しいため、ノックアウトマウスの作製なども検討中である。次年度ではより具体的な紡錘体の二極性化機構の解明を目指す。

マウス卵母細胞においては、動原体に逆方向性微小管束形成を促進するクロスリンカータンパク質を集積させることにより動原体近傍より効率的に紡錘体が二極性化されていること、そしてその機構が染色体分配に重要であることが示唆された。マウス卵母細胞においては動原体の機能が紡錘体の二極性化に必要であることが予想される。さらに紡錘体の二極性化に必要な微小管相互作用タンパク質が動原体へと局在していることから、これらの微小管相互作用タンパク質に変異を導入、あるいは発現を抑制することにより、動原体におけるこれらタンパク質が紡錘体の二極性化に機能しているかを明らかにする。また動原体近傍では紡錘体の二極性化に伴い、周囲に接続されている微小管が多極性方向から二極性方向へと変化していく。卵母細胞において紡錘体の二極性化に伴う微小管の配向性と、動原体の機能を抑制した場合に観察される微小管の配向性を比較することにより、動原体が紡錘体の二極性化にどのように機能しているかを明らかにする。これらの結果より我々の「動原体を基点とした紡錘体の二極性化モデル」を検証し、マウス卵母細胞において紡錘体が二極性化する機構を明らかにする。研究計画の変更により、購入予定の物品、及びその時期に変更が生じた。またマウスの卵母細胞を用いた実験が当初の予定より増えるため、マウスの購入、及び飼育管理費の増加、そして卵母細胞の実験に用いる物品購入の増加が見込まれる。