hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
胎児新生児期の内分泌撹乱物質暴露が生殖能及び中枢神経機能の発達に及ぼす影響の研究

昨年度は、神経細胞初代培養系を用いて、このグルタミン酸負荷による神経細胞のアポトーシスがいかなる機序で発症しているのかを検討し、グルタミン負荷による神経細胞のアポトーシスはBaxを介することが明らかとした(論文再投稿中)。現在、エストロゲン作用を有する内分泌撹乱物質の中枢神経細胞におけるアポトーシス抑制効果について、検討を始めている。本年度は、中枢神経系の発達において神経細胞とともに重要な役割を果たしているグリア細胞について、新たな検討を行った。グリア細胞の中でも、とりわけオリゴデンドロサイトは、脳室周囲白質軟化症の発症に深く関与していることが知られている。すなわち、胎内での感染や脳虚血を契機にオリゴデンドロサイト前駆細胞が障害を受けるが、この過程でアポトーシスや細胞壊死のメカニズムが深く関与している。そこで本年度は、このオリゴデンドロサイトの細胞障害がエストロゲンあるいはエストロゲン作用を有する内分泌撹乱物質により変化を受けるか否かを検討するために、その前段階としてオリゴデンドロサイト前駆細胞の細胞培養系を確立し、オリゴデンドロサイトの至適培養条件を検討した。その結果、通常の培養条件に比べて、低温下での培養のほうが細胞増殖能が優れていることが明らかとなった。すでに、この低温培養条件下でのオリゴデンドロサイト増殖能の変化に、いかなる因子が関与しているかを、DNA microarray法を用いて検討し、既に数百個の候補因子を得ることができた。今後は、これら因子について、実際にmRNAレベル、発現蛋白レベルで変化があるのかを検討し、次にこれらの因子が内分泌撹乱物質の負荷により変化するか否かを検討したい。本研究は、エストロゲン作用を有する様々な内分泌撹乱物質に胎児期・新生児期の暴露がその後の中枢神経系の発達にいかなる影響をもたらすかについて、検討を加える目的で行うものである。グリア細胞の中でも、とりわけオリゴデンドロサイト(OL)は、脳室周囲白質軟化症の発症に深く関与していることが知られている。OLの細胞障害がエストロゲンあるいはエストロゲン作用を有する内分泌撹乱物質により変化を受けるか否かを検討するために、その前段階としてOL前駆細胞の細胞培養系を確立し、OLの至適培養条件を検討した。その結果、通常の培養条件に比べて、低温下での培養のほうが細胞増殖能が優れていることを明らかとした(論文投稿中)。さらに、この低温培養条件下でのOL増殖能の変化に、いかなる因子が関与しているかを、DNA microarrayの手法を用いて検討し、cyclin D1, cyclin D2,などのcell cycleに関与する遺伝子の発現量に変化があること、また蛋白レベルではERK1/2のリン酸化が誘導されることも確認した。
横紋筋肉腫におけるRAS変異に基づいたプレシジョン医療開発のための基礎的検討

横紋筋肉腫(RMS)は、近年の集学的治療の進歩により約80%の長期生存が望めるようになったが、治療の合併症による性腺機能不全や恒常的な臓器機能欠損が深刻な問題となっており、副作用の少ない特異的な治療の開発が望まれている。プレシジョン医療とは、患者の個人差を考慮し、遺伝子診断などによって得られた遺伝子情報に基づきその患者に有効と考えられる特異的で副作用の少ない治療法を設定する医療であり、近年日本でも積極的に議論されるようになってきた。一方、小児がんの分野では、その腫瘍遺伝的バックグランドの多様性から、本来プレシジョン医療の適応があると考えられるが、いまだ十分に検討が行われているとはいえない。本研究ではRAS変異に基づいたプレシジョン医療開発のための基礎的検討を行うことを目的としている。具体的には1.横紋筋肉腫細胞株を使い、RAS変異の有無での各種RAS-RAF-MEK阻害剤の効果の違い、分子生物学的変化の違いをin vitro, in vivoで確認する。2.迅速簡便なRAS-RAF変異の検索方法の確立のため、患者血漿遊離DNAを用いたデジタルPCRでの検出法を確立する。今年度は、1についてRMS細胞株11種類のRAS-RAF経路変異の有無とRAF-MEK阻害剤感受性、およびその下流の活性を評価し、その増殖抑制効果がp21を介したG1 arrestであること、さらにマウス同所性移植モデルを作成し、In vivoでの効果も確認し、この結果を論文で発表した。2については、RAS変異細胞株由来DNAを用い、デジタルPCRでの変異検出法を確立できた。1: RMS細胞株11種類のRAS-RAF経路変異の有無とRAF-MEK阻害剤感受性、およびその下流の活性を評価し、その増殖抑制効果がp21を介したG1 arrestであること、さらにマウス同所性移植モデルを作成し、In vivoでの効果も確認し、この結果を論文で発表した。2: RAS変異細胞株由来DNAを用い、デジタルPCRでの変異検出法を確立できた。現在のところ、予定通りRAS-RAF変異の有無とRAF-MEK阻害剤の感受性に相関が認められたため論文として発表することができた。ERKのリン酸化の程度はRAF-MEK阻害剤の感受性に関与していない可能性が示唆されたのでその原因を解明したいと考えている。RAF-MEK阻害剤の臨床応用のためには、迅速で簡便なRAS-RAF変異の検出法の確立が重要である。我々はすでに他がん種において、遺伝子異常をデジタルPCRで検出できることを確認している。まず種々の横紋筋肉腫細胞株およびその上清を用い、デジタルPCRでのRAS-RAF変異検出法の検討を続けていく。実験手技としては新規のものはなく、我々実験室でも日々試行しているものばかりなので問題が発生するとは考えられない。今年度は、1について、当研究室にあるRMS細胞株13種類のRAS-RAF経路変異を確認し、変異の有無とRAF-MEK阻害剤感受性を確認した。当初の予想通りRMS細胞株においてRAS-RAF変異とRAF-MEK阻害剤の関連が確認できた。さらにその増殖抑制効果がp21を介したG1 arrestであることをWestern blotting、細胞周期解析、アポトーシス解析で確認した。また、RMS細胞株1つにおいて、マウス同所性移植モデルを作成し、In vivoでの効果も確認できた。2については、細胞株由来DNAを用いたデジタルPCR検出法のプライマー、プローブの調節中である。研究計画1:RAS-RAF変異のある横紋筋肉腫細胞株を使い、各種RAS-RAF-MEK阻害剤の効果、分子生物学的検討をin vitro, in vivoで行う。現在のところ順調に行うことができている。研究計画2:RAS-RAF変異のある横紋筋肉腫細胞株上清を使い、デジタルPCRでRAS-RAF変異の検出法を検討する。現在のところ細胞株DNAを用いた検討を行っている。

プレシジョン医療とは、患者の個人差を考慮し、遺伝子診断などによって得られた遺伝子情報に基づきその患者に有効と考えられる特異的で副作用の少ない治療法を設定する医療であり、近年日本でも積極的に議論されるようになってきた。一方、小児がんの分野では、その腫瘍遺伝的バックグランドの多様性から、本来プレシジョン医療の適応があると考えられるが、いまだ十分に検討が行われているとはいえない。本研究ではRAS変異に基づいたプレシジョン医療開発のための基礎的検討を行うことを目的としている。具体的には1.横紋筋肉腫細胞株を使い、RAS変異の有無での各種RAS-RAF-MEK阻害剤の効果の違い、分子生物学的変化の違いをin vitro, in vivoで確認する。2.迅速簡便なRAS-RAF変異の検索方法の確立のため、患者血漿遊離DNAを用いたデジタルPCRでの検出法を確立する。今年度は、1についてRMS細胞株11種類のRAS-RAF経路変異の有無とRAF-MEK阻害剤感受性、およびその下流の活性を評価し、その増殖抑制効果がp21を介したG1 arrestであること、さらにマウス同所性移植モデルを作成し、In vivoでの効果も確認し、この結果を論文で発表した。2については、RAS変異細胞株由来DNAを用い、デジタルPCRでの変異検出法を確立できた。1: RMS細胞株11種類のRAS-RAF経路変異の有無とRAF-MEK阻害剤感受性、およびその下流の活性を評価し、その増殖抑制効果がp21を介したG1 arrestであること、さらにマウス同所性移植モデルを作成し、In vivoでの効果も確認し、この結果を論文で発表した。2: RAS変異細胞株由来DNAを用い、デジタルPCRでの変異検出法を確立できた。現在のところ、予定通りRAS-RAF変異の有無とRAF-MEK阻害剤の感受性に相関が認められている。今後さらに細胞株を増やすことで否定的な結果が出た場合、変異以外のマーカーを検討することになる。ERKのリン酸化の程度が感受性に関与している可能性があるので、その程度をウエスタンブロット、免疫染色で比較する(In vitro, In vivoともに)。また、In vivoモデルにおいてもRAF-MEK阻害剤の効果が確認できているが、さらに細胞株を増やし検討を進めていく。RAF-MEK阻害剤の臨床応用のためには、迅速で簡便なRAS-RAF変異の検出法の確立が重要である。我々はすでに他がん種において、遺伝子異常をデジタルPCRで検出できることを確認している。まず種々の横紋筋肉腫細胞株およびその上清を用い、デジタルPCRでのRAS-RAF変異検出法の検討を続けていく。実験手技としては新規のものはなく、我々実験室でも日々試行しているものばかりなので問題が発生するとは考えられない。現在のところ、予定通りRAS-RAF変異の有無とRAF-MEK阻害剤の感受性に相関が認められたため論文として発表することができた。ERKのリン酸化の程度はRAF-MEK阻害剤の感受性に関与していない可能性が示唆されたのでその原因を解明したいと考えている。
耳鼻咽喉科領域疾患におけるTh1,Th2,Tc1,Tc2細胞の検討

T細胞は分化段階や機能の異なる様々なサブセットより構成されているが、特にエフェクターT細胞はサイトカインの分泌のパターンからTh1とTh2の2つに大きく分けられる。Th2細胞はIL-4,IL-5などを産生して液性免疫に作用し、またTh1細胞はIFN-・を分泌し主に細胞性免疫において重要な役割を果たしている。また、CD^8+T細胞もサイトカインの分泌のパターンからTh1,Th2細胞と同様にTc1,Tc2細胞が存在し、種々の疾患の病態において重要な役割を果たしていると推測されている。しかし、耳鼻咽喉科領域の炎症、アレルギー、自己免疫疾患におけるこれら細胞の役割についてはまだ十分な検討がなされていない。好酸球や好中球がアレルギー性炎症の重要なエフェクター細胞であることはあきらかであるものの、これらの細胞によるアレルギー炎症を抑制するためにはこれら細胞を効率的に制御するTh1細胞及びTh2細胞のインバランスを正常化させることが重要だと考えられる。まず疾患におけるTh1細胞及びTh2細胞のインバランスの度合いと、活動期と寛解期などの病期における変動を把握することが重要であり、かつ、Th1細胞とTh2細胞のインバランスを制御する可能性のあるTc1細胞とTc2細胞の作用について検討することは重要と考えられる。特に、難治性であるアレルギー性鼻炎におけるこれら細胞の役割を検討した結果、末梢血中のTh2及びTc1細胞がTh1およびTc2細胞に比較して有意に増加しており、このインバラスがこの疾患の病態において重要な役割をはたしていることが推測された。この傾向は、症状の重症度も正に相関し、症状増悪の1因と考えられる。Th2細胞はIL-4,IL-5などを産生して液性免疫に作用し、またTh1細胞はIFN-γを分泌し主に細胞性免疫において重要な役割を果たしている。また、CD8^+T細胞もサイトカインの分泌のパターンからTh1,Th2細胞と同様にTc1,Tc2細胞が存在し、種々の疾患の病態において重要な役割を果たしていると推測されている。この知見を踏まえ、さらに耳鼻咽喉科領域の難治性疾患である木村氏病やWegener肉芽腫症についても検討を加える予定である。

また、CD8^+T細胞もサイトカインの分泌のパターンからTh1,Th2細胞と同様にTc1,Tc2細胞が存在し、種々の疾患の病態において重要な役割を果たしていると推測されている。しかし、耳鼻咽喉科領域の炎症、アレルギー、自己免疫疾患におけるこれら細胞の役割についてはまだ十分な検討がなされていない。好酸球や好中球がアレルギー性炎症の重要なエフェクター細胞であることはあきらかであるものの、これらの細胞によるアレルギー炎症を抑制するためにはこれら細胞を効率的に制御するTh1細胞及びTh2細胞のインバランスを正常化させることが重要だと考えられる。まず疾患におけるTh1細胞及びTh2細胞のインバランスの度合いと、活動期と寛解期などの病期における変動を把握することが重要であり、かつ、Th1細胞とTh2細胞のインバランスを制御する可能性のあるTc1細胞とTc2細胞の作用について検討することは重要と考えられる。特に、難治性であるアレルギー性鼻炎におけるこれら細胞の役割を検討した結果、末梢血中のTh2及びTc1細胞がTh1およびTc2細胞に比較して有意に増加しており、このインバラスがこの疾患の病態において重要な役割をはたしていることが推測された。この傾向は、症状の重症度も正に相関し、症状増悪の1因と考えられる。
抗癌剤耐性に関与する糖鎖抗原の改変によるmodulation therapyの開発

1.臨床例における免疫組織学的検討α1-2Fucosyl基を認識する抗体YB-3を用いて術前放射線化学療法の生検大腸癌組織を染色し、免疫染色の結果と抗癌剤や放射線療法の実際の関係をretrospectiveに検討しin vitroで認められた関係が臨床でも見られるか検討した。症例数が少なく差を検討するまでに至らなかったので、今後、症例の追加を待って再検討することとした。2.Fucose含有糖鎖による細胞増殖に及ぼす効果の検討抽出したDNAを用いて電気英道を行うとDNA ladderが認められ、この細胞死にはapoptosisが関与していることが明らかとなった。3.Fucose含有糖鎖のin vivoでの細胞増殖抑制活性マウスの腹膜転移の実験系を用いてin vivoでの検討を行った。その結果、かえって腫瘍の重量が重くなる傾向が認められた。In vitroの結果との差は、合成糖鎖の腹膜からの吸収が関与している可能性が示唆されたので。リポソームに内含させるあるいは、膜状に固定することで生体内での滞留を側インする製剤の形状の変更を検討中である。一部の合成2糖、3糖を用いた検討ではin vivo,in vitroともに抗腫瘍効果が確認されつつある。4.研究の総括糖鎖の改変による抗ガン剤の感受性の変化を明らかとし、温熱耐性と糖鎖抗原の関係についても明らかとなった。1.抗癌剤耐性株における細胞糖鎖抗原の特性消化管癌に多く用いられている抗癌剤5FUに長時間暴露することにより得られた、耐性株、DLD-1/5FUの表面糖鎖抗原をFACSをもちいて解析すると、DLD-1に比べFucosyl糖鎖抗原の発現が増強していた。2.抗癌剤耐性株における糖転移酵素活性3.糖鎖抗原の発現と温度感受性FUT1遺伝子が欠損しているマウス大腸癌細胞株に遺伝子を導入した細胞株を作成した。この遺伝子導入株はH抗原が強く発現しており、温度耐性は親株に対して減弱していた。4.酵素受容体活性をもつ糖による表面糖鎖の改変in vitroでα1-2fucosyltransferaseの受容体活性をもつphenyl galactoseを培地に添加することにより細胞のα1-2fucosyl基が減少することが明らかとなった。1.合成糖のlipo化と薬理効果酵素受容体活性をもつ糖による抗癌剤効果の増強をマウスを用いた腹膜播種転移系で検討したが、合成糖の分子量が小さく腹腔内に留まらないことが判明した。そこで糖鎖の末端にコレスタノールを付加した糖を化学合成しこれを用いてliposomeの作成を試みた。安定性のある糖鎖含有リポソームの作成ができin vitroの活性を検討したところ、増殖抑制活性が認められた。2.遺伝子導入細胞における温度耐性の機序糖転移酵素、とくにFucose転移酵素の遺伝子FUTを導入した細胞株では温熱治療に対する感受性に差があることが明らかとなった。その機序としてHSPの発現量をwestern blottingにて比較したが差が認められず糖鎖と感受性の差との関係は明らかとならなかった。今後HSP以外の因子の解析を行う予定である。3.臨床例における免疫組織学的検討α1-2 Fucosyl基を認識する抗体YB-3を用いて大腸癌組織を染色したところ大腸の部位により正常粘膜の発現に差がみられた。右結腸における腫瘍における発現とリンパ節転移の有意な関連が認められた。1.lipo化合成糖の細胞増殖抑制14年度に明らかにした酵素受容体活性をもつ糖をリポソームの増殖抑制、アポトーシス誘導作用を解明する目的で数種類の合成糖鎖による活性の差を検討した。その結果、最も強い増殖抑制活性を呈した糖鎖は、GlcRac-Gal構造を持つものであった。またGalのみでは活性を有しないことが明らかとなった。2.疎水基の種類との関連安定性のある糖鎖含有リポソームを作成するために、糖鎖に結合する疎水基はコレスタノールが適していることが明らかとなった。通常用いられるコレステロールでは、十分なアポトーシス誘導ができないことも併せて明らかとなった。3.lipo化合成糖の細胞内分布

リポ脂質に蛍光色素をラベルしたlipo化合成糖を細胞に24時間作用させ、蛍光顕微鏡にて細胞内の分布を検討した。合成糖の種類により、細胞内の取り込みに差が認められた。細胞増殖抑制活性を持つlipo化合成糖鎖は細胞の核にspot状に集積していた。細胞への取り込みは疎水基の種類によっても左右されることが明らかとなった。マウス腹膜転移モデルではコントロールのリポソームに対して有意に腹膜腫瘍重量を抑制した。また、同モデルにおいてマウスの生存率の差を認めた。1.臨床例における免疫組織学的検討αFucosyl基を認識する抗体、レクチンを用いた免疫組織染色を大腸癌の組織献体を用いて行った。左側大腸では通常糖鎖抗原の発現が減弱するが正常の粘膜で認められた。糖鎖抗原であるA抗原やB抗原の発現が癌組織に発現することが認められた。これは癌組織における特異的は抗原の発現と関係することが期待された。しかし、これらの抗原と予後や抗ガン剤の感受性との関係は見いだせなかった。2.GlcNac含有糖鎖による細胞増殖に及ぼす効果の検討これは、マウス大腸癌Cell Line、人食道癌、大腸癌の細胞株においても同様の結果が認められた。またオリゴ糖単独では作用が無く、Cho 1等の脂質が必要であった。蛍光物質でラベルした糖鎖構造を細胞に投与すると、細胞質に集積することが認められ、おそらく糖鎖の合成の場であるゴルジに集まり細胞自体の糖鎖合成系に影響を与えていることが示唆された。今後、抗ガン剤の耐性というばかりでなく糖鎖を含む抗腫瘍剤の開発につながる結果である。
細胞間接着を維持し細胞外基質との連絡を失った角化細胞の分化に対する液性因子の影響

一般に,成長因子が正常付着性細胞を増殖させるには細胞と細胞外基質との連絡が不可欠なので,皮膚表皮基底上層でepidermal growth factor receptor(EGFR)が活性化すると増殖以外の変化が角化細胞におこる可能性がある.そこで,EGFRの活性化が浮遊培養下の正常ヒト表皮角化細胞に与える影響を検討した.特殊樹脂で被覆したシャーレ上で角化細胞を強制浮遊培養すると,培養開始24時間以内に早期分化マーカーであるkeratin10が,48時間以内に後期分化マーカーであるprofilaggrinが発現し,表皮角化過程を模倣した分化が誘導された.この系にEGFRリガンド(EGF及びTGF-α)を添加すると,keratin10の発現量は低下したが,profilaggrin発現量およびtype1 transglutaminaseの発現量と全酵素活性量が増加し,さらに,最終分化産物cornifiedenvelope出現までの時間は短縮した.また,分化マーカー蛋白質は,定常状態メッセンジャーRNAレベルにおいても同様の変動を示した.これらのEGFRリガンドの効果は,EGFRに対する中和抗体やEGFRのチロシンリン酸化活性阻害剤の同時投与により阻害されたので,EGFR活性化によると考えられる.さらに,EGFRリガンドによるprofilaggrin発現増強作用は,protein kinase C阻害剤やmitogen-activated protein kinase kinase阻害剤により抑制されたが,keratin10の発現抑制作用には影響を与えなかった.以上より,浮遊状態でのEGFR活性化は,培養角化細胞の最終分化を促進,加速させることが示された.今回の結果より,表皮全体でEGFR活性化した場合,基底細胞層での増殖が亢進しても,表皮基底上層での最終分化が促進され,表皮構築がある程度一定状態に維持される可能性が示唆された.一般に,成長因子が正常付着性細胞を増殖させるには細胞と細胞外基質との連絡が不可欠なので,皮膚表皮基底上層でepidermal growth factor receptor(EGFR)が活性化すると増殖以外の変化が角化細胞におこる可能性がある.そこで,EGFRの活性化が浮遊培養下の正常ヒト表皮角化細胞に与える影響を検討した.特殊樹脂で被覆したシャーレ上で角化細胞を強制浮遊培養すると,培養開始24時間以内に早期分化マーカーであるkeratin10が,48時間以内に後期分化マーカーであるprofilaggrinが発現し,表皮角化過程を模倣した分化が誘導された.この系にEGFRリガンド(EGF及びTGF-α)を添加すると,keratin10の発現量は低下したが,profilaggrin発現量およびtype1 transglutaminaseの発現量と全酵素活性量が増加し,さらに,最終分化産物cornifiedenvelope出現までの時間は短縮した.また,分化マーカー蛋白質は,定常状態メッセンジャーRNAレベルにおいても同様の変動を示した.これらのEGFRリガンドの効果は,EGFRに対する中和抗体やEGFRのチロシンリン酸化活性阻害剤の同時投与により阻害されたので,EGFR活性化によると考えられる.さらに,EGFRリガンドによるprofilaggrin発現増強作用は,protein kinase C阻害剤やmitogen-activated protein kinase kinase阻害剤により抑制されたが,keratin10の発現抑制作用には影響を与えなかった.以上より,浮遊状態でのEGFR活性化は,培養角化細胞の最終分化を促進,加速させることが示された.今回の結果より,表皮全体でEGFR活性化した場合,基底細胞層での増殖が亢進しても,表皮基底上層での最終分化が促進され,表皮構築がある程度一定状態に維持される可能性が示唆された.
パーオキシナイトライトによるシトクロムC修飾作用のアポトーシス様細胞死への関与

1.パーオキシナイトライト処理による細胞内カスパーゼ経路活性化能の検討前年度にin vitroにおけるカズパーゼ-3の活性化について免疫ブロッティング法を用いて解析し、パーオキシナイトライト処理シトクロムcではカスパーゼ-3活性化能が低下していることを見いだした。本年度は神経膠芽腫培養細胞にパーオキシナイトライトを作用させた場合のカスパーゼ-3および上流経路の活性化の有無を免疫ブロッティング法、蛍光性擬似基質の切断活性により検討した。細胞生存率はパーオキシナイトライト濃度依存的に減少したにも関わらず、持続的なパーオキシナイトライト処理によりカズパーゼ-3および-9活性化が抑制されることが示された。また、短時間のパーオキシナイトライト処理ではアポトーシスが進行することが示された。これによりin vitro系に対応する現象が培養細胞系でも観察されたことになる。2.パーオキシナイトライト処理による培養細胞内シトクロムcの修飾反応の解析前年度の検討において、パーオキシナイトライト処理によってラット神経膠芽腫培養細胞内の12〓14kDa付近の蛋白質がニトロ化されることが明らかとなった。培養細胞のパーオキシナイトライト処理によって実際に細胞内のシトクロムcがニトロ化されるか否かを免疫沈降法を用いて検討したところ、パーオキシナイトライト処理により細胞内でシトクロムcがニトロ化されることが示された。さらにin vitro系でニトロ化されたシトクロムcを加水分解し修飾部位を検討したところ、Trp59およびTyr67を含むペプチド断片に変化が観察された。3.無処理シトクロムcを添加した場合のカスパーゼ-3活性化能回復の可能性についての検討パーオキシナイトライト処理神経膠芽腫細胞から細胞抽出液を調整しシトクロムcを添加してカスパーゼ-3活性化能が回復するかを検討したが、活性化は観察されなかった。(1)パーオキシナイトライト修飾シトクロムcによるカスパーゼ-3活性化能のin vitro系による検討パーオキシナイトライト(PN)がシトクロムc(cyt.c)に作用した場合、チロシン残基がニトロ化修飾され、さらに電子伝達活性に変化が生じることをこれまでに示した。cyt.cはアポトーシスにおけるカスパーゼ活性化カスケードにおいても重要な役割を果たすことが知られるため、PNによって修飾されたcyt.c(PN-cyt.c)のカスパーゼ活性化に及ぼす影響を検討した。神経系培養細胞から細胞質抽出液を調製し、これにPN-cyt.cを添加した。カスパーゼカスケードの下流に位置するカスパーゼ-3の活性型を免疫ブロッティング法を用いて検出することにより、PN-cyt.cの効果を検討した。その結果、PNを高濃度短時間作用させたcyt.cではカスパーゼ活性化能に変化が見られなかったのに対し、低濃度長時間作用させたcyt.cではカスパーゼ活性化能の低下が見られた。作用させるPNの総量が一定にもかかわらず、活性に及ぼす影響に差が見られたことから、低濃度で持続的なPN生成すなわち長期間に渡る酸化的ストレスが、細胞本来のアポトーシスのカスパーゼ活性化カスケードをかく乱する可能性が示唆された。(2)パーオキシナイトライトによる細胞蛋白質のニトロ化反応の検討PNが細胞に作用した場合、蛋白質に実際にニトロ化反応が引き起こされるかについて、神経系培養細胞を用いて免疫ブロッティング法により検討した。その結果、PNを作用させることにより、30kDa及び14kDa付近を中心とした比較的低分子領域の限られたいくつかのバンドでチロシンニトロ化修飾引き起こされていることが明らかとなり、PNによるニトロ化反応がある程度の特性を有する可能性が示唆された。3.無処理シトクロムcを添加した場合のカスパーゼ-3活性化能回復の可能性についての検討パーオキシナイトライト処理神経膠芽腫細胞から細胞抽出液を調整しシトクロムcを添加してカスパーゼ-3活性化
溶媒抽出データベースの標準化と流通システムの実用化

抽出条件の選択や結果の予測を可能にする目的で、溶媒抽出平衡の数値データや図表データの整理・収録を進め、データベース化した。典型的なキレート抽出系はもとよりイオン会合抽出系、協同抽出系や工業的抽出系のデータ、湿式製錬や原子力分野での有用なデータも適切に評価、収集する方法を確立した。定数として与えられていない数多くの分配比や抽出率などの数値あるいは抽出曲線についても数値化して収録することを可能にした。付随する書誌事項はもとより、抽出試薬などの名称についても商品名、略称も含めて化合物のデータテーブルを作成し、それぞれのデータテーブルを相互に検索利用できるシステムを構築した。また、以前に構築された抽出定数、付加錯体生成定数、分配定数に関するデータベース、SEDATAから計4,500件を統合した。その結果、SEDATA-IIはデータ総数20,000件を超えている。データの転送に光通信を用いることにより、データのやり取りが高速化された。さらに、新しい試みとして、本システムのセンターマシンとして、ワークステーションを導入し、LANに結合することにより、各研究分担者から直接アクセスできるようにした。インターネット上にホームページを開設したことにより、本データベースの広報・配布を効率よく行うことが可能となった。本成果の一部を国際溶媒抽出会議(1996年3月、メルボルン)および第13回日本溶媒抽出討論会(1996年11月、千葉)で紹介した。溶媒抽出平衡の数値データや図表データの整理・収録を進めると共に,抽出条件の選択や結果の予測を可能にする目的で,国際的な学会誌に搭載された,主に1992年以降の研究についてその抽出データをデータ入力用フォーマットあるいは直接フロッピ-ディスクに収録した。データの管理,利用のシステム化に関して検討を行った結果,典型的なキレート抽出系はもとよりイオン会合抽出系,協同抽出系や工業的抽出系のデータ,湿式精錬や原子力分野での有用なデータも適切に評価,収集する方法を確立した。付随する書誌事項はもとより,抽出試薬などの名称についても商品名,略称も含めて化合物のデータテーブルを作成し,それぞれのデータテーブルを相互に検索利用できるシステムを構築した。これまではデータベース化されたデータのファイルを作成し,これをフロッピ-ディスクにコピーして共同研究者に配布しデータを利用する方法をとっていたが,本年度の改良の一つはデータの転送に光通信を用いた点を挙げることが出来る。これによりデータのやり取りが高速化された。さらに,新しい試みとして,本システムのセンターマシンとして,ワークステーションを導入し,LANに結合することにより,各研究分担者から直接アクセスした。これにより,一極集中化をさけ,データベースの収集・管理・利用の効率をあげることの可能性が大きくなったところが本年度の最大の成果である。抽出条件の選択や結果の予測を可能にする目的で,溶媒抽出平衡の数値データや図表データの整理・収録を進め,データベース化した。典型的なキレート抽出系はもとよりイオン会合抽出系,協同抽出系や工業的抽出系のデータ,湿式製錬や原子力分野での有用なデータも適切に評価,収集する方法を確立した。また,以前に構築された抽出定数,付加錯体生成定数,分配定数に関するデータベース,SEDATAから計4,500件を統合した。その結果,SEDATA-IIはデータ総数20,000件を超えている。データの転送に光通信を用いることにより,データのやり取りが高速化された。さらに,新しい試みとして,本システムのセンターマシンとして,ワークステーションを導入し,LANに結合することにより,各研究分担者から直接アクセスできるようにした。インターネット上にホームページを開設したことにより,本データベースの広報・配布を効率よく行うことが可能となった。
フランス中等教育における進路指導の比較研究‐学校と外部機関の連携に注目して‐

本研究は、我が国で関係機関と連携したキャリア教育の推進が求められている現実を踏まえ、フランスの中学校に導入されている「進路への教育」について、比較教育学の観点から考察するものである。特に、教員と情報・進路指導センターに所属する進路指導心理相談員を対象にインタビュー調査(半構造化面接)を行うことで、両者のパートナーシップの実態を把握し、外部機関がどの程度まで学校現場に介入し、実践に際して両者がいかなる形で連携することが望ましいか明らかにすることを目的としている。年度前半には、前年度に実施したフランスでの調査結果を分析し、学会発表した。第1に、教員の役割に焦点を当て、彼らが「進路への教育」をどう捉え、いかなる形で関与しようとしていたか、その導入期に遡って検討した。さらに、「学級生活の時間」における「進路への教育」の実践に着目し、教員と資料専門員との連携の意義を明らかにした。第2に、相談員の役割に諸点を当て、その職務をA.制度的活動、B.個別的活動、C.集団的活動に分類して具体的に考察した。第3に、教員と相談員の連携実態について、リヨン郊外の進路困難校を事例として検証を試みた。相談員が授業外で進路相談を行い、教員が授業内で進路学習を行うという共通理解が築かれており、専門性の違いが実践を豊かなものにしている。年度後半には、「職業発見」の現状をより詳細に把握することを目的に、第3回実地調査を遂行した(2010年9月5日19日)。パリ、リヨン、ストラスブールの3都市において、中学校、職業高校、情報・進路指導センター、他の関連諸機関を訪問し、関係者にインタビューを行った。新たに分かったのは、2009年度から「職業発見」が、資格取得を通じた移行支援の手段として、「職業と教育訓練の発見行程」(PDMF)という中等教育を一貫する枠組みにおいて実践されているという事実である。本研究は、我が国で関係機関と連携したキャリア教育の推進が求められている現実を踏まえ、フランスの中学校に導入されている「進路への教育」を比較教育学の観点から考察するものである。とりわけ、情報・進路指導センターから各学校に派遣される進路指導心理相談員と教員とのパートナーシップについてインタビュー調査(半構造化面接)を行い、外部機関がどの程度まで学校現場に介入し、実践に際して両者がいかなる形で連携することが望ましいか明らかにすることを目的としている。年度前半には、まず調査対象である情報・進路指導センターや進路指導心理相談員に制度について文献調査を行い、その制度を明らかにした。並行して、我が国におけるキャリア教育の問題点を把握するため、生徒を対象に質問紙調査を行い、職業・労働社会に精通していない教員だけでは、キャリア発達の効果的促進にあたって限界があることを示した。これらの成果に基づき、(1)学校生活における相談員と教員との連携、(2)職業発見」(両者が共同で実施する授業)、(3)進路指導をめぐる諸改革と今後の連携の在り方、に関する質問項目を決定した。年度後半には、2回(2009年9月及び2010年3月)にわたってフランスで実地調査を行った。リヨンでは、郊外の困難校とそこを担当する情報・進路指導センターを訪問し、教員と相談員にインタビューを実施した。またパリでは、第11区・12区情報・進路指導センターを訪問し、所長及び各相談員に対してインタビューを試みた。さらに、今年度から相談員の制度を大幅縮小する改革案が検討されはじめたことをふまえ、現場以外の利害関係者、すなわち国民教育省、労働組合、相談員の養成機関の三者からも改革に対する見解を聴取した。以上の調査結果については分析中であるが、連携に対する教員と相談員との意識の相違及び共通点をまとめ、次年度に成果を関係諸学会において発表する予定である。

新たに分かったのは、2009年度から「職業発見」が、資格取得を通じた移行支援の手段として、「職業と教育訓練の発見行程」(PDMF)という中等教育を一貫する枠組みにおいて実践されているという事実である。
ニューラルネットワークを用いた実環境共存型ロボットのための言語と行動の統合学習

本研究は,ロボットが人間の言語指示を理解し作業を行うための,言語と行動の関係性を学習するモデルの構築を目的としている.前年度は,翻訳や対話システムに用いられるsequence to sequence(seq2seq)学習の手法を応用し,言語シーケンスから行動シーケンスへ変換するモデルを提案したが,二点課題を残した.一つ目は,視覚特徴量の抽出アルゴリズムを人手で設計していたことである.言語の意味に対応する視覚特徴の形式は多様であるため,これ自体学習から得られることが望ましい.二つ目は,変換が言語から行動への一方向のみであったことである.逆方向,すなわち,ロボットが自身の生成した行動を言語的に説明できる能力も,ロボットの挙動の解釈可能性の観点から鑑みて必要である.そこでまず一つ目の課題を解決するために,視覚特徴抽出モジュールを作り込みのものから学習可能なオートエンコーダネットワークに置き換えた.オートエンコーダは,画像のデータセットから,そのデータセットをうまく表現する特徴量を自動で抽出することを学習するため,恣意的な特徴量設計を回避できる.二つ目の課題に対しては,二つのseq2seqモデルを組み合わせ,言語のベクトル表現と,それに対応する行動のベクトル表現が,互いに近くなる拘束をかけて学習することで,得られた共有表現を通して言語シーケンスと行動シーケンスを双方向に変換することを提案した.このように拡張したモデルの有効性を実ロボットを用いた実験によって評価した.3単語からなる指示説明文と10関節からなる行動シーケンス(およびカメラ画像)のペアのデータセットを作り学習を行なった.学習後のモデルはその時の視覚状況に応じて,言語指示から行動シーケンスへの変換,および行動シーケンスから説明文への変換をおこなうことができた.特に,未学習の状況でもこれらを実現する汎化能力を示した.平成30年度が最終年度であるため、記入しない。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。本研究は,人間の言語指示の意味をその場の状況に即して理解し作業を行うロボットのための,言語と行動の関係性を獲得する学習モデルを構築することを目的としている.ロボットが人間と言語コミュニケーションをとりつつ共同作業を行うには,離散系である言語を,連続空間内における意味的行動に結びつける記号接地問題を,解決することができなければならない.本研究は,これを解決するために,近年,自然言語処理分野で翻訳や対話システムに用いられているsequence to sequence(seq2seq)学習の手法を応用した.Seq2seq学習はリカレントニューラルネットワークモデルの学習法の一つであり,対となるシーケンス間の対応関係を学習する.学習後のモデルは,比較的計算量の少ない順伝播計算により,入力文に対応する出力文を生成することができる(例:英語->日本語,質問->応答).本研究では,モデルへの入力を,言語指示のみでなく,視覚情報とロボットの関節角度情報を加えたものとし,出力についてはロボットの未来の関節角度情報を予測するものとして置き換えた.これによりモデルは,言語指示を現在の環境とロボット自身の状態を踏まえた形で理解し,対応する行動を生成することを学習する.また単に指示と行動の対応関係を学習するだけでなく,一連の時系列のデータから,指示受容フェーズ,行動応答フェーズ,待機フェーズといったインタラクションの進行パターンを,ネットワークのダイナミクスにおけるアトラクタとして表現することも学習する.実際にこのモデルを実装して行なった検証実験で,小型のヒューマノイドロボットに旗揚げやベル叩きといった卓上タスクを学習させた.学習後のモデルは動詞,目的語,副詞,論理語からなる文章と,視覚情報から,適切な行動を生成することができた.特に未学習の状況において正しい行動を生成する汎化能力も確認できた.上述のモデルは,実時間での言語指示から行動生成を可能にするが,二点課題を残していた.ひとつめは,視覚特徴量の抽出アルゴリズムは人手で設計していたことである.単語やフレーズに対応する視覚特徴の形式は多様であるため,これ自体学習から得られることが望ましかった.そこで視覚特徴抽出モジュールを,作り込みのものからオートエンコーダに置き換えた.オートエンコーダはディープニューラルネットワークの一種であり,画像のデータセットから,そのデータセットをうまく表現する特徴量を自動で抽出することを学習する.ふたつめは,変換の方向が言語指示からロボットの行動への一方向のみであったことである.逆方向の変換,すなわち,ロボットが自身の生成した行動を,言語的に説明できる能力も,ロボットの挙動の解釈可能性の観点から鑑みて重要である.そこで,二つのseq2seqモデルを組み合わせ,言語のベクトル表現と,それに対応する行動のベクトル表現が,互いに近くなるような拘束をかけて学習することで,得られた共有表現を通して言語シーケンスと行動シーケンスを双方向に変換することを提案した.このモデルについても実装して,評価のためのロボット実験を行なった.具体的には,簡単な3単語程度の指示説明文と行動シーケンスのペアのデータセットを作り学習を行なった.学習後のモデルは,実際に言語指示から行動シーケンスへの変換,および行動シーケンスから対応する説明文への変換をおこなうことができ,やはり未学習の状況でもこれらを実現する汎化能力を示した.これらの成果についてもすでに国内学会と国際学会にそれぞれ投稿済みである.以上の点も踏まえて,本研究はおおむね順調に進展している.本研究は,ロボットが人間の言語指示を理解し作業を行うための,言語と行動の関係性を学習するモデルの構築を目的としている.前年度は,翻訳や対話システムに用いられるsequence to sequence(seq2seq)

学習の手法を応用し,言語シーケンスから行動シーケンスへ変換するモデルを提案したが,二点課題を残した.一つ目は,視覚特徴量の抽出アルゴリズムを人手で設計していたことである.言語の意味に対応する視覚特徴の形式は多様であるため,これ自体学習から得られることが望ましい.二つ目は,変換が言語から行動への一方向のみであったことである.逆方向,すなわち,ロボットが自身の生成した行動を言語的に説明できる能力も,ロボットの挙動の解釈可能性の観点から鑑みて必要である.そこでまず一つ目の課題を解決するために,視覚特徴抽出モジュールを作り込みのものから学習可能なオートエンコーダネットワークに置き換えた.オートエンコーダは,画像のデータセットから,そのデータセットをうまく表現する特徴量を自動で抽出することを学習するため,恣意的な特徴量設計を回避できる.二つ目の課題に対しては,二つのseq2seqモデルを組み合わせ,言語のベクトル表現と,それに対応する行動のベクトル表現が,互いに近くなる拘束をかけて学習することで,得られた共有表現を通して言語シーケンスと行動シーケンスを双方向に変換することを提案した.このように拡張したモデルの有効性を実ロボットを用いた実験によって評価した.3単語からなる指示説明文と10関節からなる行動シーケンス(およびカメラ画像)のペアのデータセットを作り学習を行なった.学習後のモデルはその時の視覚状況に応じて,言語指示から行動シーケンスへの変換,および行動シーケンスから説明文への変換をおこなうことができた.特に,未学習の状況でもこれらを実現する汎化能力を示した.今後は,可動域のより広い大型のロボットを用いて,タスクをより複雑なものにし,スケーラビリティを評価する実験をおこなう予定である.また外乱へのロバスト性を向上するために,アテンション機構と呼ばれるモジュールを加えることを計画している.アテンション機構を加えたモデルは,通常型のseq2seqモデルと違い,入力の言語指示の情報を行動生成中に内部状態として保持しておくため,外乱や環境の変化が起きた際にも,安定して指示された行動を生成可能であることが期待される.モジュール自体はすでに実装済みであり,予備実験として現在数値実験を進めている.平成30年度が最終年度であるため、記入しない。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
音声における韻律的特徴の聴取能力測定を目的としたテスト開発のための基礎研究

平成10-11年度にわたり、音声の韻律的特徴の聴取能力測定を目指した基礎研究を行った。研究期間中は、音声の発話速度が、聞き手の主観的ピッチ感、および話者の性格印象に与える影響について、重点的に研究した。(1)音声の発話速度が主観的ピッチ感に与える影響Exp.1ではPICOLA方式で話速を制御した音声刺激に対して、評定尺度法によって主観的ピッチ感と発話速度感の測定を行った。その結果、発話速度が速くなると、ピッチはより高く認知されることが見出された。Exp.2では異なる3種類の話速変換方式で操作した刺激を用いて実験を行い、Exp.1と同様の結果を得た。Exp.3では、STRAIGHT方式で音声の基本周波数を直接操作し、その主観的ピッチ感を測定した。その評定値を媒介変数に、発話速度が主観的ピッチ感に及ぼすバイアス量を推定した。この実験結果について、平成11年9月の日本心理学会で発表を行った。(2)音声の発話速度が話者の性格印象に与える影響次に、韻律的特徴である発話速度が、話者の性格印象に与える影響を検討した。話速変換した音声刺激に対し、性格の5因子論に基づいた評価項目を用いて測定をした。その結果、聞き手は発話速度が異なる音声に対して、内的で独立した印象評価を行っていることが見出された。すなわち、速い発話では協調性の性格印象評定が低下し、一方、ゆっくりとした発話では外向性、経験への開放性、誠実性の評価が低減する傾向が見出された。この結果については、平成11年8月の日本教育心理学会で発表した。(3)音声の発話速度の制御が主観的ピッチ感および話者の性格印象に与える影響上記の(1)と(2)の研究成果をまとめ、日本音響学会の学会誌に投稿し、採択された。現在、印刷中である。音声中の韻律的特徴の聴取能力測定のための基礎研究として、平成10年度は音声の発話速度が、聞き手側の主観的ピッチ感および話者の性格印象に与える影響に関して重点的に研究が行われた。近年、話速変換技術が実用化されつつある。この技術は声の高さを変えることなく、話者の個人性の情報も保存したまま発話速度を制御することを可能にしている。今回、この新しい技術を聴覚心理実験の刺激作成に応用し、音声の発話速度が聞き手の聴覚印象に与えるバイアスを測定した。その結果、発話速度の上昇に伴って、ピッチが高く認知されることが示された。Exp.2ではさらに異なる3種類の話速変換方式で作成した刺激を用いて実験を行い、Exp.1と同様の結果を得た。さらにExp.3では、STRAIGHT分析合成方式によって音声の基本周波数を直接操作し、そのピッチ感を測定した。そして、その評定値を媒介変数に発話速度が主観的ピッチ感に及ぼすバイアスを推定した。現在、この結果をまとめ、平成11年9月の日本心理学会で発表の予定である。(2)音声の発話速度が話者の性格印象に与える影響音声の韻律的特徴である発話速度が話者の性格印象に与える影響を検討した。話速を操作した音声刺激に対し、性格の5因子論に基づいた評価項目を用いて測定を行った。その結果、聞き手は発話速度を操作した刺激に対して,5因子もしくは3因子の独立した内的な印象評価を行っていることが見出された。そして、速い発話では調和性の性格印象が低下し、逆にゆっくりした発話では外向性、経験への開放性、及び誠実性での印象の低下が見出された。これらの結果については、平成11年8月の日本教育心理学会で発表の予定である。

この結果については、平成11年8月の日本教育心理学会で発表した。(3)音声の発話速度の制御が主観的ピッチ感および話者の性格印象に与える影響上記の(1)と(2)の研究成果をまとめ、日本音響学会の学会誌に投稿し、採択された。現在、印刷中である。
IL13Ra2 標的化イムノトキシンによるメラノーマ坦がんマウスの抗体治療

難治がんの治療へ向けて分子標的の同定が様々な方法ですすめられているが、我々は抗体探索を起点としたシード抗体の取得と開発を目指している。薬物送達機能を有する抗体の単離および抗原の同定を進めて来た結果、メラノーマを標的化する抗体のうち、特に内在化活性を有する抗IL13Ra2抗体を樹立した。メラノーマの組織アレイおよび病理学的な解析から、IL13Rα2陽性群が確かに存在した。IL13-IL13Rα2経路が腫瘍形成に血管新生へ寄与する結果を得ており、作用機序と治療用抗体としてイムノトキシンを創製して検討を進めている。既存の抗がん剤である低分子化合物と抗体を組み合わせた抗体薬物架橋体(ADC: Antibody Drug Conjugate)が開発されつつあるが、標的化を可能とする抗体の包括的な探索については技術も知見も十分に成熟していない。標的化抗体作製の基盤技術を開発し、メラノーマを標的化できる抗IL13Ra2抗体(NS66)を見出していた。以下、研究実績の概要を記す:(1)メラノーマ細胞株11種類について、Il13Ra2の発現を検討した。全ての細胞が陽性ではなかったが、確かに一部のメラノーマ細胞では発現していることが確認された。また、flowcytometryによる解析に加えて、このうちの幾つかの細胞については、IL13Ra1ならびにIL4 (co-receptorとして知られる)についてリアルタイムPCRによって発現量を検討した。(2)メラノーマA375細胞株を含む11種類の細胞株についてKSN/Slcを宿主とした坦癌モデルの可能性を検討した結果、NS66クローンを得た抗原細胞でもあるA375細胞が相応しいと判断した。造腫瘍性を検討した期間は最長で6ヶ月であるが、造腫瘍性を示さないメラノーマ細胞株も存在した。(3)NS66クローンを無血清培地(Cosmedium005)によって培養し、Protein G Sepharoseを用いてanti-IL13Ra2抗体を大量調製した。この抗体を125マイクログラム、KSN/Slcヌードマウスに投与したが、明らかな毒性は示さなかったので、今後治療実験に使う材料とする。上記の計画目標に到達したと考えている。平成25年度における目標は完了し、平成26年度到達目標は以下のとおり設定した。(4)DT3C組み換えタンパク質の大量調製:山口ら(Yamaguchi et. al., 2015)が従来行っていた複数カラムを利用する精製法よりも簡便に、one-stepにて大量調製する方法を確立した。約5mg/Lの収率により精製することが可能となった。同様に抗体も大量調製を行った。(5)イムノトキシンNS66:DT3CによるA375に対するin vitro殺癌効果:DT3C:NS66複合体はin vitroではIC50を約10nMの強い活性を示した。またIL13Ra2陰性のSKMEL28細胞には殺細胞効果を示さない。(6)A375メラノーマ担癌マウスに対するNS66:DT3Cイムノトキシンによる治療実験:予備的な実験として昨年度にDT3C:NS66治療実験において統計的に優位な抗腫瘍効果は見出せていなかった。そこでIL13Ra2の造腫瘍性を司る必要十分性を詳細に検討する目的で、IL13Ra2をノックダウンしたA375細胞株、IL13Ra2陰性細胞に強制発現した機能昂進型細胞株を樹立し、移植したところ、IL13Ra2依存的な造腫瘍性を呈することを示した。また樹立したKH7B9抗体を用いてTissue microarrayを行ったところIL13Ra2陽性のメラノーマ患者が存在することを明らかにした。研究期間全体を通じて実施した研究の成果の概要:治療ツールとしては(a) DT3C:NS66をクロスリンク複合体、(b) NS66抗体遺伝子を増幅したDTscFv(NS66)組換えトキシン、(c)サポリン結合型抗マウス二次抗体Mouse-ZAPを購入して治療実験を進めつつある。量ならびに投与間隔の最適化が必要であると考えられる。以上の成果の一部については、生化学会大会および国際学会において発表を行った。投稿準備中にある。腫瘍医科学当初計画していた計画(1)-(3)については、目標到達したと考えている。さらに以下に記した(4)-(6)について、25年度から現在まで引き続き取り組んでいる。平成25年度および26年度を想定した研究計画は以下のとおり(4)DT3C組み換えタンパク質の大量調製, (5)イムノトキシンNS66:DT3CによるA375に対するin vitro殺癌効果, (6)A375メラノーマ担癌マウスに対するNS66:DT3Cイムノトキシンによる治療実験

以下、現在までの達成度について記した。(4) DT3CをM15(pREP4)大腸菌を宿主として大量調製する方法は確立(1Lから5mg-10mg)したが、His-tagによるアフィニティ精製ではエンドトキシン除去ができず、治療実験には十分量を適用できなかった。エンドトキシンの除去を複数こころみたが、EndTrapでも十分な収率と除去レベルに至らない。ごく最近、Lucigen社が販売する大腸菌Clearcoli(LPSを脂質に変換する)を宿主として組み換えタンパク質を発現•精製することでエンドトキシンフリーとすることを目指しつつあり、現在までに発現誘導とNiNTA agaroseによるHis-tag DT3Cのアフィニティ精製に成功したので、今後、大量精製のための条件最適化を行う。(5) DT3Cを利用したin vitroにおけるA375に対する殺癌効果は、信頼度高く再現されている。この実験におけるDT3C:NS66複合体のIC50は、数十nM程度であった。(6)予備的実験として、合計4度の実験をすすめたが、いずれもNS66:DT3Cによる有意な治療効果を認めなかった。しかしながら、腫瘍内投与後の造腫瘍性は一時的に抑制されたとみられ、エンドトキシン除去したDT3Cを用いて増量したイムノトキシンによる治療効果が期待される。特に(4)および(6)について推進していく。(4)DT3C組み換えタンパク質の大量調製,(6)A375メラノーマ担癌マウスに対するNS66:DT3Cイムノトキシンによる治療実験以下に概要を記す。(4)大量培養および精製のための条件最適化を行ったのち、Clearcoliを宿主としたDT3C精製標品の毒性を検定する。これはKSN/Slcヌードマウスに125マイクログラムを投与して評価するとともに、毒性が観られない場合には、さらに10倍量を投与する。これまで毒性がある場合には、2日目までには結果がでるが、生存した場合には最長で1ヶ月目まで観察を行う。(5)エンドトキシンフリーなDT3Cを用いてin vitro殺癌効果を検討するとともに、IC50を算出する。また、あらたな方策としてDT3C:NS66を混合してアフィニティによる複合体形成をさせたあと、クロスリンクによって架橋複合体を作成することを検討している。これは、従来混合したイムノトキシン複合体を利用してきたが、架橋複合体のほうがより強い効果を示すのではないかという仮説に基づくものである。架橋複合体の効果が高いことが検証できれば、これを動物実験に利用することが望ましい。(6)動物実験として(4)ならびに(5)の問題点を克服し次第、担癌モデルマウスにおける検討を行う。実験のデザインについては、計画のとおりで特に変更は無い。(その他)特筆すべきことに、新たに取得していたIL13Ra2抗体(KH7B9)は、ウエスタン解析、腫瘍塊のパラフィン薄切片における腫瘍部を認識することができる抗体である。これを利用した担癌モデルマウスの評価、ならびにTissue microarrayによる解析について、本研究計画には記載していないが推進する予定である。