hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
コレラ菌制限酵素の遺伝子操作への応用と制限酵素産生性の感染源決定への応用

コレラ菌など病原ビブリオ(Vibrio cholerae 01,非01,腸炎ビブリオ,プレシオモナス,エロモナス)を用い,リゾチ-ム溶菌法により制限酵素産生菌のスクリ-ニングを行った。本法は病原菌から安全かつ迅速に制限酵素産生菌をスクリ-ニングする簡便な方法である。病原ビブリオは本法によりよく溶菌した。上記の病原ビブリオの中から約10パ-セントの割合で制限酵素産生菌が見い出された。このうち10株以上の制限酵素が精製され,その特異性が決定されたが,V.cholerae 01又は非01由来のものはすべてよく知られた制限酵素のアイソシゾマ-であった。しかしプレシオモナス(P.shigelloides 319ー73)から分離されたPshAIと,腸炎ビブリオ(V.parahaemo lyticus 4387ー61)から分離されたVpaK32Iは新型制限酵素であり,遺伝子操作に有用であろう。特にVpaK32IはNEB中央研究所で独立で発見されたSapI制限酵素と共に,5'ーGCTCTTC(1/4)というゆるみのない7塩基対認識制限酵素であり,これは世界で最初の発見である。現在本菌から耐熱性ヘモリシン陰性(=非病原性)変異株を分離する実験を遂行中である。PshAI及びVpaK32I生産菌はともに成育が早く,かつ酵素も安定であり,収率も高かった。なお,特異性の決定された腸炎ビブリオの制限酵素はすぼて非二回回転対象の塩基配列を認識・切断した。数度の試みにもかかわらず,ビブリオの制限酵素遺伝子の大腸菌への導入は成功に至っていない。また,サルモネラやエルシニアの特別の血清型には,一定の制限酵素が高率に見い出されることがあるが,病原ビブリオの場合はこうした傾向は現在の所見い出されていない。ビブリオ属菌から,安全かつ簡便に制限酵素産生菌を検出する方法を確立した。この方法は細菌をリゾチ-ムで溶菌し,ペリ酵素を溶出させ,ラムダDNAまたはT4dCDNAを基質として使用し,10mMtRNA(非特異的ヌクレア-ゼの阻害剤)を加えた反応系でアッセイするものである。本法により,150株のコレラ菌からA株の,83株のVibrio cholerae non01から16株の,68株の腸炎ビブリオから8株の,50株のプレシオモナス・シゲロイディスから2株の制限酵素産生菌を,それぞれ検出した。上記のデ-タは,ヒトに下痢症をおこすビブリオ属から,平均約10%の割合でII型制限酵素を検出できることを示している。このうち,V.cholerae non01の一株,腸炎ビブリオの二株,及びプレシオモナスの一株の制限酵素の特異性が明らかにされた。即ち,V.cholerae non01と腸炎ビブリオの制限酵素は,いずれもよく知られた制限酵素のアイソシゾマ-であったが,プレシオモナスのもの(PshAI制限酵素と命名)はGACNN/NNGTCという未発見の塩基配列を認識・切断する制限酵素であることを発見した。PshAIは活性も高く,安定であり,かつ新しい認識部位を持っていることもあり,遺伝子操作に有用であろう。

なお,PshAIの産生菌はプレシオモナス011抗原の標準株であり,島田と阪崎により研究されたものである。PshAIの遺伝子座は決定されていない。なお,コレラ菌の制限酵素遺伝子を大腸菌K-12に導入する実験が,くり返し行なわれたが,いずれも不成功に終っている.遺伝子が導入されても,あらたに作られる制限酵素や修飾酵素が,大腸菌K-12に致死的に作用するのかも知れない。エロモナス,腸炎ビブリオ及びVibrio cholerae非01(ナグビブリオ)各約100株から,リゾチ-ム溶菌法により制限酵素のスクリ-ニング実験を行った。上記三種のピブリオはリゾチ-ム溶菌法でよく溶菌した。本法によってそれぞれの種から,平均10%内外の割合で制限酵素産生菌が見い出された。エロモナスの制限酵素の特異性は決定されていないが,Vibrio cholerae非01の三種と腸炎ビブリオ由来の六種は精製され,その特異性が決定された。前者の制限酵素はいずれも有名な制限酵素のアイソシゾマ-であったが,後者6種の制限酵素のうちの一種は5'ーGCTCTTC(1/4)ー3'というゆるみのない7塩基対を認識・切断する新型制限酵素であることが判明した。本酵素はVpaK32Iと命名された。産生菌名はVibrio parahaemolyticus 4387ー61(01:K32)である。本菌は1961年日本で患者から分離されたもので,耐熱性ヘモリシン陽性である。クロラムクェニコ-ル,テトラサイクリン,セファロリジン,ポリミキシンB,ナリジクス酸,カナマイシン,エリスロマイシンに感受性であるが,アミノベンジルペニシリンとリンコマイシンに耐性を示した。本酵素はNew England Biolabs研究所において,サッカロポリスポラから独立して発見されたSapI制限酵素とともに,世界ではじめて見い出された7塩基対認識制限酵素であり,遺伝子操作に有用と思われる。なお,腸炎ビブリオの制限酵素の中には,かなり高率に非二回回転対象制限酵素が存在するのではないかと考えられる。特異性の決定されていないエロモナスやVibrio choleral非01の制限酵素の精製を現在逐行している。
量子力学及び場の量子論における数学的諸問題への無限次元解析によるアプローチ

量子電磁気学や量子光学に現れるモデルのスペクトル解析を行った。(1)量子光学において、相関関数を観測データとして量子系のランジュヴァン型方程式をたて、それを解くことで、相関関数から回転波近似のハミルトニアンを決定するという有限温度の場の量子論における逆問題を解いた。この逆問題の解を無限体積系の相関関数の長時間挙動を調べることに応用した。(J.Math.Soc,Japanに掲載予定)(2)量子電磁気学や量子化学に出てくるスピン・ボゾン模型の最低固有エネルギーの値は、物理や化学では近似的な表現を与えることしかできなかったが、厳密かつ具体的な表現公式を与えることに成功した。(J.Funct.Anal.に掲載予定)(3)円状の欠陥がある材料表面を量子力学的粒子が運動することを想定して、平面から円を抜き去った空間で、運動量演算子と位置の演算子によるハイゼンベルグとワイルの正準交換関係を調べた。この正準交換関係とアハラノフ・ボーム位相との関係も論じた。ボ-ス場と相互作用する量子系の粒子の相関函数を実験データとし,そのデータをもとに系のハミルトニアンを有限体積かつ熱平衡状態の下で回転波近似のハミルトニアンの形で推定するという逆問題を解いた.この結果を無限体積極限を取り拡張し,無限体積における相関函数の長時間挙動を調べた.量子電磁気学や量子光学に現れるモデルのスペクトル解析を行った。
超高圧下精密磁化測定装置の開発と超高圧下での磁気相転移の研究

DACとSQUID振動型磁束計の組み合わせからなる高圧下磁化測定装置はピストン・シリンダー方式を遥かに越える圧力での精度の高い磁化測定を可能にした。本課題はこのシステムの性能向上とそれを用いた磁気相転移の研究である。初年度は測定感度、温度範囲、発生圧力に関して改良を行った。感度を上げるには測定磁場の増大が必要であるが、磁場によるバックグラウンドが大きいためにこれまでは3.0e以上印可することは出来なかった。2組の補助マグネットを設けることによりバックグラウンド補償が出来ることがわかり、これまでの10倍以上の磁場を印加することが可能になった。その結果、感度を一桁上げることが出来た。測定温度に関しては、DACとアクチュエータの断熱を良くすることにより、温度上限を2倍以上(70K)拡大出来た。圧力に関しては、レニウムをガスケットに用いることにより100GPa以上発生することが出来た。次年度は、CrTeの圧力誘起磁気相転移の検証とバナジウムの超高圧下での超伝導転移温度の圧力変化の測定を行った。CrTeはキュリー温度の圧力効果が非常に大きな強磁性体であることから高圧下の磁性について1970年代から多くの研究がなされてきた。3.5GPa以上で強磁性が消失することが報告されているが、当時の実験では実験精度や試料の質に関して問題があり詳細はわかっていない。今回、良質の試料を用いて18GPa付近まで測定を行い、67GPaで強磁性が消失することを明らかにした。バナジウムの超伝導転移温度Tcは正の大きな圧力係数を持つが、50GPaまでしか測定されていない。同じVB族のニオブでは4GPaと70GPa付近にフェルミ面のトポロジー変化によるものと思われるTcの圧力係数の大きな変化が見られるが、今回の測定でバナジウムのTcは112GPaまで単調に増大することがわかった。112GPaでは16.4K(常圧の3倍)にも上昇し、単体金属元素では最高のTcを示すこともわかった。ダイヤモンド・アンビル・セルとSQUID振動コイル型磁束計の組み合わせからなる本研究課題の装置は、これまで技術的に難しいとされていたピストン・シリンダー方式を遥かに越える圧力領域での精度の高い磁化測定を可能にした。現在では、13GPaまでの圧力下1.430Kの温度範囲での磁化測定が可能であり、これまでに磁性半導体EuTeの圧力誘起強磁性や擬2次元強磁性体K_2CuF_4の高圧下での強磁性の消失などを見いだしてきた。しかし、一歩踏み込んで磁性の詳細を調べるには、感度や測定温度範囲に関して現状のシステムの能力はまだ十分ではないため、性能向上を行わなければならない。本課題では、そのような目的で新しいクライオスタットを開発し、感度、温度、圧力に関して性能をこれまでに比べて大幅に向上することが出来た。感度を上げるには測定磁場を大きくしなければならないが、これまでバックグラウンド磁化が大きいため30e以上の磁場をかけることは出来なかった。今回、検出コイルの上下に設けた2組の補償用マグネットにそれぞれ逆向きの磁場を発生させることにより、バックグラウンドの原因である磁場勾配の補償を効率良く行うことが出来、24Oe以上まで磁場を印可することが可能になった。最大磁場の増加に伴い、ノイズの大きさが磁場の大きさにほとんどよらないことから感度を一桁上げることが出来た。

測定温度に関しては、DACとアクチュエータの断熱を良くすることにより、これまでの温度上限の2倍以上の70K付近まで測定精度を落とすことなく温度を上げることが出来るようになった。また、圧力に関しては、100GPa以上発生することが出来るようになり、超高圧下での圧力誘起超伝導の探索や100GPa領域での磁性体の研究等応用範囲を格段に広げることが可能になった。ダイヤモンド・アンビル・セルとSQUID振動型磁束計の組み合わせからなる高圧下精密磁化測定装置の開発とそれを用いての磁気相転移の研究が本課題である。前年度はクライオスタットの改良を行い測定感度、温度範囲、発生圧力に関して大幅な性能向上を達成した。今年度は、それを用いてCrTeの圧力誘起磁気相転移の検証とバナジウムのメガバールにいたる超高圧下での超伝導転移温度の圧力変化の測定を行った。CrTeはTcの圧力効果が非常に大きな強磁性体であることから高圧下の磁性について古くから多くの研究がなされてきた。1970年代にGrazhdankinaらのグループは高圧下ESRや中性子回折実験を行い3.5GPa以上でCrTeの強磁性が消失することを報告したが、実験精度や試料の質に関して問題があり詳細はわかっていない。今回、良質の試料を用いて18GPa付近まで磁化測定を行い、67GPaで強磁性が消失することを明らかにした。ただし、測定温度領域内ではキュリー温度を決めることが出来なかったので相図は描けなかった。測定温度の上限をさらに上げることが今後の課題である。バナジウムの超伝導転移温度は正の大きな圧力係数を持ち50GPaまで単調に増大することが知られている。この増加がどこまで続くか調べるために100GPaを越える圧力まで測定したところ、ニオブで見られているようなフェルミ面のトポロジーの変化は見られず、超伝導転移温度は112GPaまで依然として単調に増大することがわかった。112GPaでは16.4K(常圧の3倍)にも上がり、単体金属元素では現在知られている中で最高の転移温度を示すこともわかった。
ニホンナシのS不和合遺伝子群の定性及び応用に関する研究

ニホンナシの不和合遺伝子(S遺伝子)を同定し、それらをニホンナシの裁培や育種に応用することを目的にタンパク質・核酸レベルからの研究を行った。花柱タンパク質の等電点電気泳動分析により、S_1S_5の遺伝子型に対応するタンパクバンド(Sタンパク質)が検出できた。これらは花柱特異的であり、後代のS遺伝子型に対応した遺伝様式を示し、花柱の発育に伴って増加することからS遺伝子の産物としての条件を満たしていると考えられた。また、S_1,S_3,S_5バンドは明らかにRNase活性を示した。S_2とS_4バンドについては、バンドのタンパク量が少なかったため活性が不明瞭であったと思われる。不和合反応におけるRNase活性の役割については明らかにできなかった。Sタンパク質はほとんど全てが可溶性タンパクとして花柱内に存在しており、柱頭部、花柱上部、花柱下部にほぼ均一に分布していた。このことは、Sタンパクが花柱の誘導組織に存在すると仮定すれば、花柱の基部にゆくに従って濃度が濃くなっていることになり、自家花粉管生長抑制パターン部位と良く一致する。しかし、自家花粉管生長が促進されるCO_2や温湯処理によってSタンパク質の質的・量的変化は認められず、RNase活性抑制も観察されなかった。自家和合性の`おさ二十世紀'と自家不和合性の`二十世紀'のSタンパクバンドを比較した結果、`おさ二十世紀'のS_4バンドが薄いことが認められた。また、Sタンパクのバンディングパターンから、S遺伝子型の不明であった数品種の遺伝子型を以下のように推定できた。`長寿':S_1S_5,`筑水':S_3S_4,`喜水':S_4S_5,`豊水'S_3S_3。S_4タンパク質のN末端から20個のアミノ酸配列を決定した。この配列は既に報告されているナス科のものとは全く異なっていた。ニホンナシは強い配偶体型自家不和合性を示し、品種間の交配試験結果から一連(S_1S_7)の不和合複対立遺伝子が決定されている。既に報告されている数種植物の例から考えること、ニホンナシのS遺伝子に対応するタンパク質(S-タンパク質)がニホンナシ花柱に存在し、それらの遺伝子は極めて相同性の高いことが予想される。本研究は、これ迄に我々がS遺伝子産物の候補として検出した数種のタンパク質を利用して、ニホンナシのS遺伝子を同定しようとするものである。まず本年度の研究として、ニホンナシ花柱から得たポリ(A)^十RNAを用いてcDNAライブラリーの作成を目的とした。ニホンナシ花柱からのRNA抽出は、ホットバッファー法により収量、純度共に良好な結果が得られた。収量は11.5mg/gF.W.程度であり、280/260nmの比もほぼ0.5となり満足のゆくものであった。このRNAからオリゴ(dT)セルロースカラムによってポリ(A)^十RNAを得たところ、総RNAの23%のポリ(A)^十RNA量となり、精製できたものと推察された。このポリ(A)^十RNAからcDNAを合成し(cDNA合成キッド;Pharmacia)、スパンカラムで精製した。

しかし、34μgのポリ(A)^十RNAから得られたcDNA量をサランラップ法で推定したところ、1.2μg0.08μgと品種によって差異が認められ、材料の調整やRNAの抽出・精製過程で改善すべき点があるものと思われる。次に合成されたcDNAとλgt10とのライゲーション(λgt10クローニングキッド;Stratagene)およびin vitroパッケージング(ギガパックIIゴールドパッケージングキット;Stratagene)を行い、ニホンナシ花柱に発現している遺伝子をもったファージ粒子を完成させた。更に、このファージを大腸菌(系統=C600、NM514)に感染させてcDNAライブラリーを作成した。現在、タイトレーションとマスタープレートの作成を行っている。咋年に引き続き、ニホンナシのS_1S_7不和合遺伝子(S遺伝子)の探索をタンパク質分析によって行った。既知のS遺伝子を有する品種群の花柱タンパク質を等電点電気泳動で詳細に検討し、S_1S_5遺伝子に対応する一連のかなり塩基性(推定pIは9.5以上)タンパクバンドを認めた。これらのタンパク質の組織特異性、後代への遺伝様式を検討したところ、花柱特異的であり、後代のS遺伝子型に対応した遺伝様式を示した('おさ二十世紀'のF_1および自殖第一代個体群で調査し、一部の例外は存在した)。従ってこれらのタンパク質は、BrassicaやNicotianaで報告されているS遺伝子の産物(Sタンパク質)と考えられた。これらのタンパク質のうち、S_3タンパク質を用いて花柱内の局在性、蕾の発育に伴う変化、花柱内での存在様式を調査した。S_3タンパクは柱頭を含んだ花柱全体にほぼ一定の割合で含まれており、Nicotiana花柱内におけるS-タンパク質の分布とは全く異なっていた。また、このタンパクは蕾の発育にともなって増加し、可溶性分画にのみ存在した。S遺伝子型の不明な数品種の花柱タンパク質を分析し、それらのSタンパク質の有無から遺伝子型を推定するることができた。'筑水'はS_3S_4,'長寿'はS_1S_5,'喜水'はS_4S_5,'豊水'はS_3S_3と推定され、交配試験を行ってこれらの遺伝子型が確認できた。二次元電気泳動によってS_1S_5タンパクバンドをさらに分離した結果、S_2とS_4バンド以外は数種のスポットに分かれ、S_1,S_3,S_5タンパク質がサブユニットを持っているのか、それらが数種のタンパクの混合物であることが明らかとなった。さらに、S_4バンドのN末端から20のアミノ酸配列を決定できた。
機能性配位子による金属錯体反応場の制御と高難度脱水素化反応における活用

本研究は、研究代表者がこれまでに明らかにしてきた機能性配位子と遷移金属の協働が生み出す反応場における有機分子の脱水素化反応を高度に発展させ、以下の目的の達成を目指すものである。すなわち、1)従来よりも脱水素化性能の高い新規イリジウム錯体触媒を合成する、2)エタノール水溶液の脱水素化による酢酸合成触媒系を新たに開発する、3)メタノール水溶液の脱水素化による水素製造触媒系を実用レベルにまで格段に発展させる、4)通常は困難なアミンの脱水素化を実現する新しい触媒系を構築する、という4つが目的である。昨年度までに、上記1)、2)、3)に関して大きな成果をあげてきた。本年度はまず、上記1)に関する成果として、機能性含窒素複素環カルベン配位子を有するイリジウム錯体の合成に成功した。さらに、本錯体を触媒として用いて環境調和性に優れた水を溶媒とする脱水素化触媒系の構築に成功し、各種アルコール類を原料として用いることにより、ケトン類やカルボン酸類を効率的に与える触媒系を開発した。また、上記4)に関する成果として、機能性ビピリドナート配位子を有するイリジウム錯体触媒を用いたピペラジン誘導体の効率的脱水素化触媒系を新たに開発した。さらに、本錯体触媒は、ピラジン誘導体の水素化反応においても高い性能を発現することを明らかにした。これらの成果をふまえ、本触媒系を格段に発展させることにより、ピペラジン誘導体を有機ハイドライドとして用いる高効率的な水素貯蔵システムを開発することにも成功した。29年度が最終年度であるため、記入しない。本年度はまず、上記1)に関する成果として、8-キノリノラート型の機能性配位子を有する新規イリジウム錯体の合成に成功した。さらに本錯体を触媒として用い、各種アルコールの水溶媒中での脱水素的酸化によって、カルボニル化合物と水素を同時に与える触媒系を構築した。次に、上記2)に関する成果として、6,6'-ジオナート-2,2'-ビピリジン型の機能性配位子を有するイリジウム錯体触媒を用い、炭酸水素ナトリウムの存在下でエタノール水溶液を加熱還流することによって、非常に高い収率で酢酸を得ることに成功した。本反応における副生成物は水素のみであり、環境調和性に優れた酢酸合成法として興味深いと考えている。さらに、上記3)に関する成果として、6,6'-ジオナート-2,2'-ビピリジン型の機能性配位子を有するイリジウム錯体触媒を用い、炭酸ナトリウムと炭酸水素ナトリウムから成る緩衝溶液条件下でメタノール水溶液の脱水素化を行うことにより、300時間以上の長時間に渡って持続的かつ一定速度での水素製造が可能な新規触媒系を開発した。平成28年度の当初の研究実施計画は、1)従来よりも脱水素化性能の高い新規イリジウム錯体触媒を合成する、2)エタノール水溶液の脱水素化による酢酸合成触媒系を新たに開発する、の2点であった。これら2点について、当初の目的を達成することができた。さらに、平成29年度に取り組む予定であった、3)メタノール水溶液の脱水素化による水素製造触媒系を実用レベルにまで格段に発展させる、という計画についても一定の成果を得ることができた。

平成29年度も当初の研究実施計画にしたがって遂行していくが、特に「通常は困難なアミンの脱水素化を実現する新しい触媒系を構築する」を重点的に検討する。基礎的な反応の調査から着手するのはもちろんのこと、アミンの脱水素化反応を活用する新しい有機ハイドライド水素貯蔵システムの構築にまで発展させることを目指す。また、「エタノール水溶液の脱水素化による酢酸合成触媒系の開発」、「メタノール水溶液の脱水素化による水素製造触媒系の実用レベルへの発展」についても、平成28年度までに得た成果をもとにして研究を継続する。29年度が最終年度であるため、記入しない。
歯周病原細菌プレボテラ・インターメディアのヘム鉄獲得機構の解明

歯周病原細菌Prevotella intermediaにおいてヘム鉄の獲得はその生存に欠かせない。これまでの研究からヘム鉄獲得に必要なコンポーネントがType IX分泌システム(T9SS)により輸送されることが示唆された。本研究ではまず全ゲノム配列を決定、全遺伝子からT9SSにより輸送されると予測される候補遺伝子を6個抽出、変異株の作製を試みた。5つの遺伝子変異株の作製に成功し解析をおこなった。結果1つの遺伝子がヘム鉄獲得に必須であることを明らかにした。ヘム鉄獲得にはまずヘム蛋白質であるヘモグロビンの分解によるヘム鉄の遊離が必須である。Prevotella intermediaの全遺伝子検索からは蛋白質分解酵素が多数検出された。その中から大腸菌で作成したリコンビナント蛋白質を用いた実験からinterpain A(inpA)にヘモグロビン分解活性が報告されている。そこでまずヘム分解酵素の候補としてinpA遺伝子の変異株作成を行った。inpA遺伝子と上下流領域を含む断片をPCRにて増幅する。その後inpA遺伝子の領域をBacteroides由来のエリスロマイシン耐性遺伝子ermFに置き換えて、inpA遺伝子変異株作成用のtargeting constructを作成する。このコンストラクトをBacteroides-大腸菌のshuttle plasmidから作成したスクロース存在下でplasmidが脱落するpTCB-sacBに挿入する。このプラスミドを大腸菌株S17-1に形質転換後、Pre. intermedia遺伝子操作可能株に共培養により接合伝達させる。得られた形質転換株からinpA遺伝子ermFに置き変わった変異株をスクロース存在下で選択、inpA変異株を得た。得られた変異株を用いてinpAの活性を10mM Boc-Val-Lue-Lys-MCAを基質に用いて王や株と比較したところ、変異株では完全に活性が失われたいた。一方血液寒天上での集落の観察からinpA変異株でも黒色色素産生性が維持されていることが明らかになった。そこで当初の計画に沿って電気泳動により膜蛋白画分から親株に存在、Por分泌機構変異株で存在しない蛋白スポットを探索した。結果inpAと同じくT9SS分泌シグナル(CTD domain motif)保有、family C10に属する分解酵素遺伝子を候補蛋白質として選んだ。また本菌が含まれるBacteroides属で見いだされたPor分泌機構すなわちType 9分泌機構(T9SS)がヘム鉄の遊離とその輸送と活性発現に必須であることが示唆されていた。これまでの報告でアミノ酸配列からT9SSにて菌体表面、培養上製へ分泌されることが予測されるタンパク分解酵素とてinterpain A(inpA)がヘム鉄の遊離の遊離にはたらくことが予測されていた。そこで本研究で確立したPre. intermediaにおける遺伝子特異的変異株作成方法を用いてinpA変異株を昨年度の研究で得た。変異株では完全にinpA活性が失われたが、血液寒天上での集落の観察から黒色色素産生性が維持されていることが明らかになった。そこで本年度の研究ではまずPre. intermediaにおけるT9SSの変異株(porK遺伝子変異株、porT遺伝子変異株)を作成、親株と比較することでT9SSのPre. intermediaにおける役割を検討した。その結果、T9SSはヘム鉄の遊離及び黒色色素産生性に必須であることを明らかにした。そこでまずPre. intermediaにおける全ゲノム配列の決定、さらに本菌のゲノム構造、遺伝子構成の詳細な解析を行った(論文発表及びGenbank登録公開)。得られたゲノム情報からinpAと同じくT9SS分泌シグナル(CTD domain motif)保有する候補蛋白質として選んだ(5遺伝子)。それぞれの遺伝子特異的変異株の作成を試みたところ、4遺伝子の変異株を得ることができた。これらの変異株のうち一つに黒色色素産生性の欠損を認めた。当初の計画に沿って、Prevotella intermediaからヘモグロビンの分解の候補蛋白質分解酵素であるinterpainA遺伝子の変異株の作成に成功したが、当初のもくろみとは違って本菌の黒色色素産生性にはinpA変異だけでは影響がないことを明らかにした。そこで本年度はPrevotella intermediaのゲノム配列の詳細な解析を基に、他のヘモグロビンの分解の候補蛋白質分解酵素の選出とそれぞれの変異株の作成をめざした。結果候補遺伝子5つのうち、4つの遺伝子の変異株を得ることができた。さらに得られた変異株のうち一つが黒色色素産生性に必須であることを明らかにすることができた。これまでの研究でタンパク質分解酵素interpain A (inpA)がヘム鉄の遊離にはたらくことが予測されていた。昨年までの研究で我々が本研究で確立した変異株作成方法により本菌の黒色色素産生性にはT9SSが必須であること、さらにinpA遺伝子が責任遺伝子ではないことを明らかにした。

本年度はT9SS依存性に輸送分泌されると予測されるT9SS分泌シグナルを保有する他のタンパク質分解酵素の遺伝子5つの詳細な解析を行った。M6ファミリーに属する遺伝子(1個)の変異株を作製することはできなかった。作成できた4種の遺伝子の変異株(C10ファミリー遺伝子2個、S8ファミリー遺伝子2個)を解析したところ、S8ファミリー遺伝子の一つの変異株で黒色色素産生性が失われていた。この遺伝子の変異株は当初、一個だけしか取得できなかったので、目的遺伝子以外に変異が生じている可能性を排除できなかった。そこで再度変異株作成を行い、新たに8株を得て黒色色素産生性が失われていること、標的遺伝子の周囲のゲノム配列には変異がないことを確認した。またこの遺伝子とC10ファミリーの遺伝子1つではバイオフィルム形成能が著しく低下していた。これらの結果から本菌のT9SSはヘム鉄獲得だけでなくバイオフィルム形成にも重要なタンパク質の輸送分泌に働くことで、本菌の病原性に重要な働きを持つことを明らかにした。(本成果の論文を作成中)歯周病原細菌Prevotella intermediaにおいてヘム鉄の獲得はその生存に欠かせない。これまでの研究からヘム鉄獲得に必要なコンポーネントがType IX分泌システム(T9SS)により輸送されることが示唆された。本研究ではまず全ゲノム配列を決定、全遺伝子からT9SSにより輸送されると予測される候補遺伝子を6個抽出、変異株の作製を試みた。5つの遺伝子変異株の作製に成功し解析をおこなった。結果1つの遺伝子がヘム鉄獲得に必須であることを明らかにした。当初の計画に沿って、Prevotella intermediaからヘモグロビンの分解の候補蛋白質分解酵素であるinterpainA遺伝子の変異株の作成に成功した。また得られた変異株の性状解析を行うことにより、inpAリコンビナント蛋白質で特異基質を用いて示されていた蛋白質分解活性がinpA変異株で完全に失われていることを明らかにできた。また本菌の黒色色素産生性にはinpA変異だけでは影響がないことも明らかにした。今後の解析のための他のヘモグロビンの分解の候補蛋白質分解酵素の選出も行うことができた。Prevotella intermediaの全ゲノム配列解析から得られた全遺伝子のモチーフ検索から選び出したT9SS依存性に分泌されることが予測された5つのタンパク分解酵素遺伝子についての解析を行う。昨年度までは候補遺伝子うち4つの変異株を得ているので、残りの1遺伝子の変異株の作成を行う。また作成した変異株のうち、黒色色素産生性がみられなくなった遺伝子について詳細な解析を行う。この遺伝子のリコンビナント蛋白質を大腸菌にて発現、精製を行う。得られたリコンビナント蛋白質を用いてヘモグロビン分解活性やヘム鉄結合性をその結合条件(pH,酸化還元状態)を含めて調べる。
びまん性肺疾患のディジタルX線写真による診断能の向上に関する研究

本研究はディジタルX線写真の診断能の評価をX線CTと肺標本の解析を基礎に実施する計画を立てた。対象疾患として肺癌の他に肺線維症、塵肺などの各種びまん性肺疾患を選んだ。研究を着手した段階でこれらの疾患の病変の場が肺実質であり、しかもそれらの病変のX線学的コントラストがやはり肺実質によってもたらされることに注目した。しかし肺実質の構築の詳細については放射線医学の立場からの研究は殆どなされておらず、この問題抜きにはディジタルX線写真の正確な評価は難しいと判断し、研究に着手した。肺実質の構築に関する研究は伸展固定肺標本を用い、実体顕微鏡による観察と組織像の組み合わせを特に重視した。必要に応じて標本のX線像、CTを利用した。実体顕微鏡による標本の3次元的観察を重視したのは組織像が2次元像であり、肺実質の構築を解析するには不十分だからである。研究結果を以下に要約する。肺実質は空間を緻密に充満するスポンジ様構造体である。肺実質は気管支、肺血管を取り囲み、肺全体の容積の9割を占める。スポンジ様構造体は空気を含む流路とそれを囲む微細構造に分かれる。実体顕微鏡観察ではそれぞれは肺胞管固有腔と肺胞に相当する。肺胞は隣接する肺胞管を境するように背中合わせに2層並ぶ。この際肺胞ドームは共有されるが、この事を十分に周知して来なかったため肺の構築に関する理解は臨床医のレベルで世界的に遅れたものになっている。肺胞管は細気管支と異なり、その全体的形状は多面体であり、空間を充満するのに適している。肺胞管は分岐により流路の連続性を保ち、呼吸細気管支に通じる。肺血管は肺胞管の間の狭い空間を走行するので血管周囲性に浸潤する病変は血管を囲む肺胞管内の空気でコントラストが付与される。一方肺腺癌は肺胞ドームを連続的に浸潤しつつ等方的に拡大する。肺結核は肺胞管を充満する典型的気腔性病変である。このように肺実質の構築から肺疾患の画像診断の見直しを進める必要がある。肺疾患を胸部写真やHRCTによって診断する際最も重要なステップは、肺既存構造と病変の関係を正確に解析する事である。これにより鑑別診断の幅が狭まることはHRCTと病理の過去30年に亘る比較検討で明らかにされて来た。然しながら肺既存構造の内、肺実質については画像診断の立場からは充分に検討されておらず、本研究の課題である胸部写真とHRCT間の関係解明を肺実質病変で目指すには未だ不明な点が多い。そこで本年度は肺実質の基本的解剖とその構築について検討した。伸展固定肺標本を対象とし、実体顕微鏡による立体観察と組織標本の顕微鏡観察を組み合わせて解析した。結果を以下に要約する。(1)肺実質は気管支、肺血管、小葉間隔壁、肺胸膜等から区別される空間充填型の構造である。(2)肺実質は空気と軟部組織から構成され、軟部組織は肺胞隔壁と肺細血管から成る。(3)空気は肺胞と肺胞道に含まれる。肺胞道は直径0.3mmの流路であり、呼吸細気管支に繋がる。(4)肺胞隔壁は側壁と天井が区別される。

肺胞側壁は同じ肺胞道に属する肺胞を境し、肺胞天井は隣接する肺胞道に属する肺胞を境する。(5)肺胞道に開口する肺胞群は、平面の敷き詰めの如く隙間無くに配列する。その様子は蜂巣に模される。(6)肺胞の配列は菱形12面体を原型とした蜂巣モデルから説明される。(7)肺胞の立体的配列は両面蜂巣モデルから説明される。両面蜂巣モデルは隣接する肺胞道に属する肺胞群が背中合わせに2層重ねられた状態を指す。従って肺胞天井は平滑な面でなくジグザグ様である。(8)肺胞道と所属肺胞群を呼吸管とすると、呼吸管は空間を充填する構築を示す。呼吸管どうしの連絡は呼吸管を境する両面蜂巣の壁を間引きする事で可能となり、2以上の多分岐、有角度ならびに無角度分岐も説明できる。(9)肺細血管は呼吸管間の肺胞天井側に分布する。びまん性肺疾患は両側性に散布する微細陰影に特徴がある。一方でびまん性肺疾患のX線診断は主として胸部写真と肺HRCTによって行われる。両者は現在では相補的に使われるのが一般的である。微細陰影の内最も重要な所見は粒状影である。そこでびまん性粒状影を示す肺疾患の代表例について肺標本を解析し、肺既存構造と病変の関係について以下に要約するような結果を得た。その際本研究の初年度に得た肺実質の構築についての知見との関連性に注意した。1.肺血管中心性の分布:肺細血管は肺実質内の互いに隣接する複数の肺胞道を境する肺胞ドームに囲まれて分布する。この肺血管を中心に癌性リンパ管症、サルコイドーシス、悪性リンパ腫など肺リンパ路に沿って浸潤する疾患の病変が見られる。従って本病変は肺血管の延長上に分布し、しかも末梢血管の全周性の異常影として捉えうると想像される。2.傍肺細血管性の分布:肺胞道と肺胞からなる呼吸管の1つを病変が充満すると病変は1の場合と異なり、肺細血管の片側に位置する事となる。経気道性播種の性格を示す肺結核に見られる病変である。3.傍呼吸細気管支性:呼吸細気管支の肺胞開口部から始まると予想される病変で、びまん性汎細気管支炎や細葉中心性肺気腫を想定している。4.肺胞隔壁性:肺胞ドームとその両側の肺胞側壁を肥厚させ、肺胞ドームのネットワークを介して浸潤する病変で、細気管支肺胞上皮癌、特発性肺線維症で見られる。4は線状、粒網状影、さらにすりガラス状影となる病変である。肺実質内の肺胞隔壁、肺細血管の構築を意識した胸部写真とHRCTの読影技術の開発は未解決の問題を多く含みさらに検討を要す。
効果的な運動学習に向けたグループ練習効果とそのグループ親密度に関わる要因の検証

平成30年度では健常成人を対象として,運動学習における個人および対人関係をふまえた3名によるグループ練習効果を検証するために以下の3つの研究を実施し,グループ練習の効果とその影響する要因についての知見を得た。まず,グループ練習効果に影響を及ぼす要因として,個人の自己効力感が運動学習に与える影響について検証した。具体的には,上肢運動学習課題において,自己効力感を高める実験対象者自ら選択した練習条件と,実験者から指定された練習条件の2群においてその学習成績と練習への積極的関与を比較した。その結果,男性では学習成績および積極的関与について有意な差は認められなかったものの,女性では自ら選択した練習条件において有意な学習効果と積極的関与を認めた。次に,運動学習におけるグループ練習効果の影響を身体接触の有無を加えて検証した。具体的には,手指功緻動作学習課題に3人組練習に取り組む際,実験群として各グループ内対象者同士にて握手による身体接触を加えた群を設け,その課題成績およびグループ内の親密度変化を検証した。その結果,グループ練習の際の身体接触の有無には性別差がみられ,女性同士グループでは身体接触の有無により学習成績および親密度には差が認められなかったのに対し,男性同士グループでは身体接触によりいずれも有意な上昇が認められた。さらに,課題に取り組む際の効果的なグループ構成人数を検証した。発想が求められる解決型認知課題に個人・2人組・3人組の3群にて取り組むことによる課題成績および実験対象者の実施中の会話量と楽しさ(自覚的)を比較した。その結果,課題成績に顕著な差が認められなかったものの,課題中の会話量および課題終了時点での自覚的楽しさでは3人組において高い値を示した。平成30年度においては,グループ練習による学習効果をグループ内の対象者同士の親密度として身体接触の有無および会話量の変化からその効果を検証することができた。また,取り組むグループ構成人数に関して課題成績だけでなく,対象者の心理面の変化からも一定の知見を得ることができた。しかしながら,当初計画としては,親密度および精神心理行動変化として視線変化(アイコンタクト)を計測してその学習効果および親密度の差を検証することを計画していた。しかしながら,学習課題中の視線変化を計測するシステム整備に関して,予算的問題から計測する段階に到達できておらず,十分な検証に至っていない。平成31年度では視線変化の計測システムを当初の予定から変更し,予算内で構築可能な方法(機器)を検討し,そのシステムを用いて健常成人を対象として,学習課題におけるグループ練習効果を対象者の視線変化からも検証する。さらに,グループ構成において会話量・表情・視線の変化を意図的に操作した群を設け,その学習効果および親密度の変化を検証する。本研究にて計画していた視線変化計測システムについて,計画申請時点における請求額と実際の助成金額とに差が大きく,計画を変更する必要が生じた。従って,次年度においはその予算内にて構築可能な視線変化計測システムを整備するために使用する。
「広い」太平洋文学における白人表象についての研究

本研究においては、太平洋島嶼作家にニュージーランドのマオリ作家を含めた、「広い」太平洋文学作品における白人の描かれ方をに注目し、太平洋の作家が、太平洋世界を長らく一方的に記述する立場にあったヨーロッパ人を、文学作品の中でどのように解釈し、加工し、表象するかということを通時的、かつ共時的に検証した。また、「さらに広い」太平洋文学として、日本の植民地小説も視野に入れて、包括的な他者表象分析を試みた。平成24年度はマオリ文学の読解と関連資料の発掘を中心に研究を進めた。特にIhimaeraを中心課題とし、マオリ民族への歴史・文化背景と作品モチーフとの相同性・相違性を探る一方で、前年度の課題として検証したAlbert Wendtなどの島嶼作家が問題化するテーマとの比較検討を行った。研究継続中のため暫定的な結論となるが、物語の白人表象について島嶼作家とマオリ作家との間にはかなりの差が確認された。たとえばWendtの作品では一貫して白人は批判の対象であり、経済格差とともにもたらされる文化的な侵入に対して非常に敏感である。他方、マオリ作家は現代マオリ民族における白人文化の影響に対して島嶼作家ほどの批判的姿勢は明確にせず、所与のものとして扱っている。ヨーロッパ系ニュージーランド人はマオリの土地簒奪という脈絡では批判の対象として現前化するものの、それ以外の場面では背景に隠れてしまうことが多い。「広い」太平洋文学という視点に立った場合、こうした差異を個々の作家の作風や歴史状況といった個別的な要因に還元するだけではなく、これからの太平洋世界における民族主体のあり方の徴候として包括的に扱う必要がある。こうした知見を踏まえると、環太平洋という「さらに広い」コンテクストも本研究課題の次のステップとして浮上した。本年度はニュージーランドへ渡航し、ウェリントン大学とオークランド大学において資料の収集を行った。前年度に行った国内での資料調査の結果、現地で集める資料を具体化できたため、効率のよい調査ができた。また、平成25年度、さらには次の研究対象として期待できる環太平洋の文学におけるヨーロッパ人表象の関連で、1月に沖縄、3月に台北での共同研究の可能性の検討を行った。最終年度は前年度に検証した島嶼作家とマオリ作家の比較を主軸に、2000年代のニュージーランド文学作品にまで研究対象を広げるとともに、サモアの白人像としてAlbert Wendtが強く意識するR. L. Stevensonにも遡りながら研究を進めた。WendtとWiti Ihimaeraの比較によって、島嶼文学とマオリ文学の合流地点を1980年代後半から1990年代前半にかけた期間に同定できた。それまで両者は環境の違いによるテーマや表現方法の差異が目立ったが、歴史観の書き換えの手段としての白人表象という概念で作品群を読解すると、1990年頃以降において密接な相互関連性の存在が顕在化する。ここで重要な作品となるのが、IhimaeraのThe Matriarch (1986)である。マオリ土地運動を描いたこの作品は、白人によって書かれた歴史への批判となっている一方で、そのマジック・リアリズム的な表現方法は、近未来のニュージーランドを舞台としたWendtのBlack Rainbow (1992)と共鳴する。また、The Matriarchのヒロインは、WendtがOla (1991)において描出した、地方性を超越した太平洋女性像の原型とも解釈できる。さらには、民族の歴史の再構築という試みは、Alistair Campbellの詩集Maori Battalion (2001)やPatricia GraceのTu (2004)といった国際紛争を題材にしたマオリ性の再検証というテーマへと続く系譜となる。一方、Wendt作品における白人像を分析にするため、彼がThe Mango's KIss (2003)に白人像のモデルとして登場させたStevenson自身の歴史観も間接的に検証した。前年度のオークランド大学、今年度のハワイ大学での資料収集はこうした成果に大きく貢献した。平成23年度は太平洋文学の代表的作家Albert Wendtを中心に研究を進めた。彼を起点に、Epeli Hau`ofaやLarry Thomas、Vilsoni Hereniko、Sia Figelなど、Wendtと同時代もしくは彼に続く作家を広く取り上げ、太平洋文学におけるWendtの位置づけを相対化したが、その過程で彼の創作活動の場の変遷が重要な検討項目として浮上した。Wendtの作風の変化を辿ると、居住地の移動や旅行といった彼を取り巻く状況の変化がかなり直接的に作品に反映されていることに気づく。なかでもBlack Rainbow(1992)は、太平洋の島嶼作家からニュージーランドにおけるポリネシア系作家へのWendtの変化を刻印する作品として重要である。明確にポリネシア人とは言及されない主人公や、ポストモダン的な手法による重層的な物語構造は従来の彼の作品には見られないものである一方で、90年代や2000年代における伝統回帰の色の濃いWendt作品を暗示する。Black Rainbowの論考は初年度における具体的な成果である。本年度後半には計画を前倒しして、ニュージーランドの文学状況(とくにマオリ作家)についての研究にも着手済みである。

申請書においては、ニュージーランドやフィジーに資料収集に赴くことになっていたが、作業の効率を上げるために国内で入手できる資料についてはできる限り収集し、海外での資料収集はそれを補完するものとした。目下、Witi Ihimaera、Patricia Grace、Keri Hulme、Alan Duffといった作家の作品を継続して読解中であり、読解と国内資料収集にある程度の目処がついた時点(平成24年度中頃)で、海外への渡航を行う予定である。前年度は当初の研究計画を前倒しして、島嶼作家からマオリ作家の作品読解へと移行することができた。今年度においてPatricia GraceやAlan Duffのテクスト読解はおおむね計画通りに進行したが、Ihimaeraは多作であることにくわえて、その作品はおしなべて大部であるため、本研究テーマに合致するもの、また評価の高いものを中心に検証に取り組んでいるものの、当初の予定よりもかなり時間がかかっている。また、彼の作品を読み進めていく過程で、作品世界におけるマオリの土地戦争問題の重要性が浮上し、それらの歴史研究にかなりの時間をかけたことも研究進行の遅延の原因である。歴史表象の問題に関しては、ニュージーランドで収集したヨーロッパ系作家によるマオリの土地戦争をテーマにした作品を読解することで、マオリ作家による歴史表象および白人表象の相対化を試みている。おおむね当初の研究計画通りに進行している。Albert Wendtをはじめとする島嶼作家については、短編や評論にいたるまで網羅的に検証した。それと平行して、太平洋の歴史や民族史をヨーロッパ人入植を中心に整理した。また、ニュージーランドのマオリ作家についても基礎資料の収集とその読解に着手した。現地での資料収集は、作業の効率化を図り国内でできる限りの資料を集めることにしたため、当初計画した初年度の渡航は遂行できなかったが、それを除けば研究はおおむね計画通りに進展している。島嶼作家の作品読解と歴史研究は平成23年度にほぼ完了しているため、今年度前半はマオリ作家の読解とともにニュージーランドの歴史研究を進め、島嶼作家、マオリ作家のそれぞれが描く白人表象を比較・検証する。本年度の歴史・文化分野の研究で重要になってくるのは、現代のニュージーランドにおける民族地勢図の急速な変化である。20世紀後半の島嶼民族の帰化や20世紀末のアジアからの移民の増加によって、ニュージーランドの民族はヨーロッパ系とマオリ系の二項対立で捉えることができなくなっている。文化背景の共有領域が拡大した二種類の作家群が、21世紀において白人/現地人の構図をどのように捉えているのか、どの領域を共有し太平洋民族として白人を眺めるのか、その一方で、民族固有の視点をどのように保持し続けるのかを同定することが今年度中盤からの中心作業となる。これまでの研究が示唆する環太平洋の概念の必要性も念頭に置き、学際的な共同研究や共同シンポジウムの可能性も同時に探る。
Hansenula属酵母によるエネルギー非依存的清酒香気成分の生産技術の設計

清酒中の酢酸イソアミルは、吟醸香の主要香気成分とされ、醸造酒の品質に大きな影響を与える。酢酸イソアミルの合成はアルコールアセチルトランスフェラーゼ(AATFase)によってイソアミルアルコール(iAmOH)とアセチルCoAから、またエステラーゼによってiAmOHと酢酸から合成され、いずれの場合においてもiAmOHが基質となる。そこで各種Hansenula属酵母について、iAmOHや酢酸エチルに対して耐性を示すような株をスクリーニングした。その結果、H.mrakii IFO 0895株とH.anomala IFO 0149株が高い耐性を示した。特に、前者はiAmOHに対する耐性が高いことから、H.markiiについて以後解析を行った。清酒醸造酵母であるS.cerevisiae協会7号酵母とH.mrakiiにおける酢酸イソアミルの合成を比較したところ、好気培養では協会7号酵母ではほとんど酢酸イソアミルの合成は観察されなかったのに対し、H.mrakiiは15°C、30°Cのいずれにおいても酢酸イソアミルを合成していた。協会7号酵母のAATFaseは高温(30°C)、あるいは好気培養では失活することが知られているが、H.mrakiiにおいては30°Cで好気培養しても酢酸イソアミルを合成していることから、本菌においては熱や好気培養に耐性のAATFaseが存在するか、あるいはAATFase以外の酢酸イソアミル合成機構が存在している可能性が示唆された。そこで本菌の生菌体を用いて、エステラーゼ、あるいはAATFaseによる酢酸イソアミルの合成について検討した。その結果、対数期、定常期いずれの細胞においても、また15°C、30°Cいずれの温度で培養した菌体でもエステラーゼの方がAATFaseより多くの酢酸イソアミルを合成した。このことより本菌において酢酸イソアミルの合成にエステラーゼが関与している可能性が示唆された。次に、菌体を破砕し、超遠心によって得た可溶性画分と不溶性画分における酢酸イソアミル合成活性を測定した。その結果、酢酸イソアミル合成を行うエステラーゼは全て可溶性画分に、またAATFase活性は不溶性画分に存在した。AATFaseは不溶性画分から高濃度のTriton X-100によって可溶化されたことから、本菌においてもAATFaseは膜に結合していること、また本菌のAATFaseは酸素に対し耐性を示すことが示唆された。本菌における可溶性画分と不溶性画分による酢酸イソアミル合成能を比較したところ、対数期では約10%、定常期では約20%の酢酸イソアミルがエステラーゼによって合成されていることが明らかとなった。本菌のエステラーゼの発現パターンを電気泳動後の活性染色による検討するとともに、エステラーゼの精製も試みた。また、本菌を用い清酒の小仕込試験を行った。官能試験の結果、アルコール度は低いが、果実香のする飲料が得られた。酢酸イソアミルの合成は、アルコールアセチルトランスフェラーゼ(AATFase)においてはイソアミルアルコール(iAmOH)とアセチルCoAから、またエステラーゼではiAmOHと酢酸から合成され、いずれの場合においてもiAmOHが基質となる。そこで高エステル産生酵母として知られるHansenula属酵母について、iAmOHや酢酸エチルに対して耐性を示すような株をスクリーニングした。その結果、H. mrakii IFO 0895株とH. anomala IFO0 149株が高い耐性を示した。特に、前者はiAmOHに対する耐性が高いことから、H. mrakiiについて以後解析を行った。清酒醸造酵母であるS. cerevisiae協会7号酵母とH. mrakiiにおける酢酸イソアミルの合成を比較したところ、好気培養では協会7号酵母ではほとんど酢酸イソアミルの合成は観察されなかったのに対し、H. mrakiiでは15°C、30°Cのいずれにおいても酢酸イソアミルを合成していた。協会7号酵母のAATFaseは高温(30°C)、あるいは好気培養では失活することが知られているが、H. mrakiiにおいては30°Cで好気培養しても酢酸イソアミルを合成していることから、本菌においては熱や好気培養に耐性のAATFaseが存在するか、あるいはAATFase以外の酢酸イソアミル合成機構(エステラーゼの逆反応?)が存在している可能性が示唆された。次に、α-ナフチル酢酸を基質とするNative-PAGE後の活性染色において、H. mrakiiでは電気泳動的に分画可能な4種類のエステラーゼのアイソザイムが存在することを確認した。そこで、培地中の炭素源の種類やその濃度、培養温度、あるいは生育期の違いによりそれらエステラーゼアイソザイムの出現パターンがどのように変動するかを検討した。その結果、対数期では15°C、30°Cのいずれにおいても見かけ上1本のエステラーゼのバンドが認められるのみであるが、定常期に入ると複数のエステラーゼが出現し、またこの時酢酸イソアミルの分解活性も上昇した。エステラーゼの出現パターンは培地中の炭素源の種類によっても変動し、またグルコースによるカタボライトリプレッションも観察された。そこで、対数期において認められるエステラーゼの精製を試みた。しかしながら、本エステラーゼは不安定であり、4°Cでは2週間で完全に活性は消失した。安定化剤のスクリーニングを行ったが、効率的な安定化の条件を現段階では設定できておらす、精製には至っていない。

酢酸イソアミルの合成はアルコールアセチルトランスフェラーゼ(AATFase)によってイソアミルアルコール(iAmOH)とアセチルCoAから、またエステラーゼによってiAmOHと酢酸から合成され、いずれの場合においてもiAmOHが基質となる。そこで各種Hansenula属酵母について、iAmOHや酢酸エチルに対して耐性を示すような株をスクリーニングした。その結果、H.mrakii IFO 0895株とH.anomala IFO 0149株が高い耐性を示した。特に、前者はiAmOHに対する耐性が高いことから、H.markiiについて以後解析を行った。清酒醸造酵母であるS.cerevisiae協会7号酵母とH.mrakiiにおける酢酸イソアミルの合成を比較したところ、好気培養では協会7号酵母ではほとんど酢酸イソアミルの合成は観察されなかったのに対し、H.mrakiiは15°C、30°Cのいずれにおいても酢酸イソアミルを合成していた。協会7号酵母のAATFaseは高温(30°C)、あるいは好気培養では失活することが知られているが、H.mrakiiにおいては30°Cで好気培養しても酢酸イソアミルを合成していることから、本菌においては熱や好気培養に耐性のAATFaseが存在するか、あるいはAATFase以外の酢酸イソアミル合成機構が存在している可能性が示唆された。そこで本菌の生菌体を用いて、エステラーゼ、あるいはAATFaseによる酢酸イソアミルの合成について検討した。その結果、対数期、定常期いずれの細胞においても、また15°C、30°Cいずれの温度で培養した菌体でもエステラーゼの方がAATFaseより多くの酢酸イソアミルを合成した。このことより本菌において酢酸イソアミルの合成にエステラーゼが関与している可能性が示唆された。次に、菌体を破砕し、超遠心によって得た可溶性画分と不溶性画分における酢酸イソアミル合成活性を測定した。その結果、酢酸イソアミル合成を行うエステラーゼは全て可溶性画分に、またAATFase活性は不溶性画分に存在した。AATFaseは不溶性画分から高濃度のTriton X-100によって可溶化されたことから、本菌においてもAATFaseは膜に結合していること、また本菌のAATFaseは酸素に対し耐性を示すことが示唆された。本菌における可溶性画分と不溶性画分による酢酸イソアミル合成能を比較したところ、対数期では約10%、定常期では約20%の酢酸イソアミルがエステラーゼによって合成されていることが明らかとなった。本菌のエステラーゼの発現パターンを電気泳動後の活性染色による検討するとともに、エステラーゼの精製も試みた。また、本菌を用い清酒の小仕込試験を行った。官能試験の結果、アルコール度は低いが、果実香のする飲料が得られた。酢酸イソアミルの合成はアルコールアセチルトランスフェラーゼ(AATFase)においてはイソアミルアルコール(iAmOH)とアセチルCoAから、またエステラーゼではiAmOHと酢酸から合成され、いずれの場合においてもiAmOHが基質となる。AATFaseは一般には熱安定性が極めて低く、また好気培養することにより増加する細胞膜脂質成分中の不飽和脂肪酸により失活することが知られている。