hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
新しい森林生態系の窒素飽和メカニズムの提案とそれに基づく脆弱性の診断

化石燃料の燃焼に伴い大気中へ様々な物質が放出されるが、それらは大気の流動によって移動し、発生源から遠い場所にも降下する。近年我が国の周辺アジア地域でも産業発展が著しく、多くの物質が我が国にもたらされている。これらのうち窒素はその量が植物の成長を制限する要素であるため、大気からの負荷の増加は大きな問題である。特に、その負荷量が生物による要求量を超えた状態を窒素飽和といい、森林生態系においては、その結果は森林生態系から河川水中への窒素成分の流出という形で現れる。本課題では、我が国の窒素飽和現象について、そのメカニズムについてこれまで検討されていなかった窒素負荷量の季節性などから考察を行い、森林生態系の脆弱性をもたらす要因を明らかにすることを目的とした。これまで申請者らが調査を重ねてきた森林生態系のうち、窒素飽和に至っている場所をはじめとし、西日本およびアジア地域において河川水のサンプリングを行った。これらは5000点を超えた。これらのサンプルに対し、成分分析を行い、窒素飽和地点で主要な形態と示す硝酸態窒素濃度を測定し、さらにその一部についてはその酸素、窒素の安定同位体比を測定した。既存の研究にならい、硝酸態窒素濃度が100マイクロモル以上を示した場合、窒素飽和と定義した。高い硝酸態窒素濃度を示す地点は、その酸素同位体比から、必ずしも窒素飽和とは考えられない場合があることが示された。特に集水域の綿製が小さい場合、濃度のばらつきが大きく、1ヘクタール以下の場合は、窒素飽和と考えられないことが多いため、解析から除外した。残りの西日本の河川水の硝酸態窒素濃度の分布を、窒素負荷量、植生、気象条件などからランダムフォレストを用いて、寄与の高いものを抽出した。その結果、窒素負荷量そのものよりも、植物の生育期間に負荷される窒素が多い場所ほど窒素飽和が起こりやすいことがあきらかになった。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。昨年度は、これまで報告されてきた窒素飽和現象のみられる各地において、渓流水と土壌を採取し、その窒素状態を測定した。窒素飽和現象のみられる場所としては、秩父、谷川岳、東京大学田無試験地、富山県呉羽丘陵などを対象とした。また、近畿周辺の上流部に人家などの人為的発生源のない河川からも渓流水を採取した。これらのサンプルの硝酸態窒素濃度、硝酸態窒素中の窒素・酸素の安定同位体などを測定した。その結果、これらの窒素飽和が指摘されている地域の渓流水の硝酸態窒素中の酸素安定同位体比はほぼ10パーミル前後であったが、まれに非常に高い酸素安定同位体比を示す場合があった。高い酸素安定同位体をもつ硝酸は一般に大気由来といわれているが、GISを用いた河川集水域面積を求めたところ、高い酸素安定同位体比をもつ河川の中には面積の非常に小さいものが含まれている場合があることが明らかになった。すなわち、集水域面積が小さいため、滞水時間も短くなり、大気由来の硝酸が河川にみられ、一見窒素飽和現象のような値を示すものと考えられた。各地の渓流水を採取し、これまでの仮説の確認を行った。仮説に従わないものがみられたため、その原因について解明した。原因解明がなされ、ほぼ順調に進展しているといえる。窒素飽和に関わる状況を明らかにするため、我が国の多地点での渓流水のサンプリングを行った。これまで窒素飽和が報告されていた地域だけではなく、多くの地点で窒素飽和に相当する高い窒素濃度が確認された。河川水中の硝酸態窒素濃度(NO3)が高い要因として、大気由来あるいは森林生態系内部での硝酸生成による場合が考えられる。大気由来のNO3はオゾン層において生成されるため、その酸素同位体比(18O>80‰)が高く、生態系内において生成されるNO3は土壌中の酸素を用いるためその酸素安定同位体比は低い(18Oはほぼ0‰前後)。この違いをもちいることによって、NO3の由来を分別することができる。今年度は、得られたサンプルの18Oの測定を行い、起源を推定した。その結果、収集されたほとんどの河川水の18Oは-10から10‰の範囲にあった。これに従うと、これまで窒素飽和が指摘されている河川を含むほぼすべての河川において、河川水中のNO3の起源は生態系内であるということになる。生態系からNO3が流出するプロセスを検討すると、生態系内での内部循環を経る過程が大きければNO3中の酸素安定同位体比は低くなる。一般に窒素は生態系での制限要因であるので、内部循環に効率良く取り込まれることは従来の報告とも合致した。一方で、地域内での18Oの値のばらつきは、上記の起源の違いでは説明がしにくい。地域内での18Oの値のばらつきは、各集水域での生態系内で生成された硝酸態窒素の流出のしやすさを表す。すなわち、集水域の面積が小さい(<1ha程度)場合、生成された硝酸態窒素が生態系に取り込まれる時間が短いため、流出水中の18O値が大きくなる可能性が示された。以上のことから、昨年度得られたように18Oを用いて河川水中の硝酸態窒素の起源を推定する際には、対象とする集水域の面積に注意することが必要であることが明らかになった。

本課題が目的としてする新しい森林生態系の窒素飽和メカニズムの提案とそれに基づく脆弱性の診断のため、窒素飽和が報告されている流域ならびに継続的に水質観測がなされている流域において調査を行い、ほぼ予定通りの進捗状況である。我が国の多地点において採取された渓流水に対して、硝酸態窒素濃度(NO3-濃度)、その酸素安定同位体比の測定を行った。秩父サイトは、先行研究において窒素負荷量から3つの地域に分けられている(Tabayashi and Koba. 2011)。窒素負荷量の大きい地域ではNO3-濃度、fatmともに大きな値がみられ、さらに、窒素飽和の進行とともに、NO3-濃度とfatmの関係は図のように変化することが示唆された。しかし、近畿地方の窒素負荷量の大きくない地域において、図のように、集水域面積の小さい地点で秩父の窒素飽和地域よりも高いfatmがみられた。集水域面積が小さいと、滞水時間が短くなるため大気NO3-が渓流水中にそのまま流出しやすくなると考えられる。このことから、fatmを用いて森林の窒素飽和を検討する際には、窒素降下量に加えて、集水域面積も考慮する必要が示唆された。また、秩父以外の地域でも、NO3-濃度の低い地点ではfatmはばらつき、NO3-濃度の高い地点ではfatmは10%程度に収束し、窒素飽和状態にあると考えられる地点でも渓流水中NO3-に対する大気NO3-よりも硝化NO3-がかなり大きいことが分かった。さらに、NO3濃度もfatmも高い地点においては、渓流水のDOC/NO3-の値が小さく、窒素飽和に至る森林生態系内において窒素循環がC不足の傾向にあることが示唆された。さらにミャンマーにおける河川水の採水なども行い、これらも含め総合的に考察を加えた。これらのことから、窒素飽和の新たな指標として、NO3-とDOCの関係を詳細に検討する必要があることが示された。予定されていた我が国の多地点において採取された渓流水に対して、硝酸態窒素濃度(NO3-濃度)、その酸素安定同位体比の測定を行うことができた。また、それらの間に見られた関係は、当初予想されていたようにNO3-濃度の上昇に伴う酸素安定同位体比の上昇といった関係は見られないことが、δ18O、Δ17Oの両方から示された。すなわち、秩父以外の地域でも、NO3-濃度の低い地点ではfatmはばらつき、NO3-濃度の高い地点ではfatmは10%程度に収束し、窒素飽和状態にあると考えられる地点でも渓流水中NO3-に対する大気NO3-よりも硝化NO3-がかなり大きいことが分かった。このことは、窒素飽和がこれまでの理論的な解釈とはあわないことを示しており、新しい指標が必要であることを示唆する。それに対して、窒素飽和には炭素の制限がかかっているという点に関しての検討を進めた。NO3-濃度と溶存態有機炭素濃度(DOC)の間の関係は従来示されているものに近く、次年度からこの関係について検討を進めることにした。化石燃料の燃焼に伴い大気中へ様々な物質が放出されるが、それらは大気の流動によって移動し、発生源から遠い場所にも降下する。近年我が国の周辺アジア地域でも産業発展が著しく、多くの物質が我が国にもたらされている。これらのうち窒素はその量が植物の成長を制限する要素であるため、大気からの負荷の増加は大きな問題である。特に、その負荷量が生物による要求量を超えた状態を窒素飽和といい、森林生態系においては、その結果は森林生態系から河川水中への窒素成分の流出という形で現れる。
根分泌物質への走化性に基づく有用土壌細菌と植物相互作用成立機構の解明

植物は環境中で様々なストレスに対応した適応を遂げている。環境中では、光、熱、イオン障害などの非生物学的なストレスに加えて、病原性微生物や食害昆虫などの生物学的ストレスが混在して、それぞれに対応するシステムが相互に関連して協調的に適応を遂げていると考えられる。この研究では、生物学的なストレスの中で問題となる病害応答と、養分吸収などの連結性を、根圏微生物、根周辺のイオン動態及び根の応答の観点から解明を目指したものである。本年度は、植物側の視点からは、根の有機酸放出能力を決定する因子の一つである、STOP1転写因子のタンパク構造と有機酸放出遺伝子の転写制御について、転写活性化の初期シグナルにphosphatidyl inositolシグナルが関係することなどを見出すとともに、シロイヌナズナ、タバコ、イネなどで共通の遺伝子が転写活性化されることを見出した。一方、微生物側の視点からは、これまで報告がない複数の有用微生物の同定に成功することができた。これらのうち、いくつかの微生物は、有機酸ではなくアミノ酸類に走化性を示すことなどが示唆されたことは、植物ー根圏微生物の相互作用には根分泌物質が重要な役割をもつことが明らかとなるとともに、その決定要因が極めて複雑であることも示していた。これは、研究前半に実施した、チャ樹根圏微生物集団が複数の根分泌物質に誘引される性質を持つものから構成される解析結果を支持するものであった。以上、本研究では、新規の有用根圏微生物の同定に加えて、植物の根分泌物質制御の分子機構に関わる新しい知見を提供することができた。「植物と有用微生物の相互作用」(植物免疫の活性化、養分吸収の向上、生育促進等)を活用することは、食糧循環を成立させるための重要な要素であるが、生物農薬(資材)として積極的に活用できている状況ではない。この提案では,代表者の研究を発展させ,「植物と有用微生物の相性」を決める仕組みを分子レベルで解明し、有用菌を活用するための学術的な根拠を提供することを目的としている。これは、近年注目されている、プラントプロバイオティクスの分子基盤を明らかにするもので、有用菌の実効性の証明や重要な分子を同定することは、学術的なインパクトが大きいと考えられる。初年度にあたる平成27年度は、8月の採択通知以降、1茶樹根圏からの微生物群(細菌)の単離、2単離菌群の同定及び、3モデル植物における地上部の遺伝子発現を解析した。茶樹根圏からおよそ200系統の細菌を単離した。茶樹の栽培地としては、栄養が過多の場合に根圏微生物量が減少することに配慮して、静岡県内の準有機栽培(減農薬、施肥低減管理)圃場を使用した。単離菌株は、定法に従ってクローン化して分類試験を行ったところ、その多くが枯草菌類で根分泌物質に対して走化性を示すものも、いくつか存在することを確認できた。一方、植物免疫の亢進や、生育促進現象をモニターするために、典型的な植物免疫シグナル関連遺伝子の、遺伝子破壊株系統を増殖するなど、次年度以降に向けた準備も整えることができた。初年度は、茶樹根圏微生物の単離と同定が主な目的であったが、異なる栄養環境や、栽培履歴で育てられた茶樹の根圏微生物を単離して200系統程度樹立できたことから、十分な成果が得られたと判断できる。一方、この研究では、海外での実用化試験も最終年度に計画しているが、インド工科大学(インド)、スブラスマレット大学(インドネシア)などを、別経費で訪問して、関係者との議論を深めることもできた。枯草菌には病原菌は少なく、生物安全性(バイオセーフティ)の観点から、海外での使用ができる菌である可能性が高いと判断している。砂漠や極地等の極端な場所を除き,植物はその環境に「適応」して自然生態系を構成する。この適応には,「有用微生物」が大きな貢献を果たしている。例えば,根の内部に菌糸を伸ばす菌根菌は,リンなどの養分獲得に重要な役割を果たし,不良環境では菌根が死滅すると植物も生存できない場合すらある。実際には,長い時間をかけてこの関係は育まれる。この,「有用菌と植物の相互作用(共生を含む)」は,現代農業では十分に活用できていない。このような背景から,本研究では,「根分泌物質による有用菌のリクルーティング」について,共進化も含めて分子レベルで明らかにすることを目的としている。本年の研究では,インドでの実用化に焦点を絞って,有用なマメ科植物であるキマメの根分泌物質(有機酸)放出機構の分子基盤の理解,有用菌の単離,茶樹とキマメにおける毛状根組換え体の作成方法の確立を中心に研究を進めた。キマメでは有機酸輸送タンパク質遺伝子の発現を制御する転写因子と、その制御下にあるクエン酸輸送タンパク質の直接制御を、遺伝子組換え毛状根を用いて明らかにした。また、効率的な毛状根の作成方法を開発して、チャ樹においても毛状根を作成することに成功した。同時に実施した、次世代シーケンサ解析により、チャノキで発現が変化する膜貫通型遺伝子を複数同定することができた。また、年度末にインドを訪問して、バイオテクノロジーと遺伝学に関する研究所や、インド工科大学を訪問して、インド国内での有用菌の使用に関する状況と手続きに関して情報を入手することができた。貧栄養環境での有用菌の効果を調べるためには、インドなどの貧栄養施肥管理環境で実際に栽培される作物の根分泌物質の解析と、有用菌の効果の検証が必要である。

これらの作物や、現地の菌株で実験を進めるためには、従来から用いられている方法を改変することや、菌の選抜方法を安定化させるなどの実験が必要となる。本年度の研究では、特に、毛状根の作成手法を、個々の作物で確立することに時間を要し研究が若干遅延した。自然界では植物と微生物は共生関係や相互作用する関係を保って生存している。特に重要なのは、根圏での緩やかな相互作用も含めて、土壌中で共生する細菌・菌類等と連携することで、様々な環境に植物は定着することが知られ、例えば、針葉樹(例えばマツなど)は、糸状菌と共生関係を築くことで貧栄養状態に適応している。このような菌類・細菌類との相互作用の関係を活用することで、生育の促進による増産、施肥量の低下によるエネルギー効率を改善した農業の実現、自然免疫の活性化による増産と農薬使用量の低減などに関わる技術を開発することは、持続可能な社会を実現する基盤技術と考えられる。この、植物と根圏微生物の共生関係は、宿主(植物)が微生物を誘引する何らかの機構を持つためと考えられ、その機構を明らかにすることの意義は深い。このような着想から、根からシュウ酸やリンゴ酸を放出する植物である、チャ樹の根圏から単離した微生物が、作物の生育促進と誘導抵抗性を持つ仕組みを調べた。その結果、単離菌株には枯草菌類が多く含まれること、特定の菌にはうどん粉病などの抑止性があることが明らかとなるとともに、有機酸放出を制御するSTOP1システムにより制御される有機酸放出では、起源が異なる遺伝子(例えばクエン酸放出に関わるMATEとリンゴ酸放出に関わるALMT1)が、プロモーター上に15塩基程度で通常の転写制御配列よりも長い共通配列を持つ現象などを見出した。これらの知見は、有用微生物を活用した栽培体系の確立や、ストレス耐性の分子進化過程の研究材料・アイデアを提示する点からも興味が持たれる。概ね順調に推移している。予期せぬ結果としては、クエン酸放出やリンゴ酸放出を制御する転写因子制御系で、転写制御を行う配列(プロモーター上のシス配列)が、高度に保存されている現象を見出したことである。通常は、起源が異なる遺伝子(クエン酸輸送体とリンゴ酸輸送体は全く異なる構造を持ち、違う分子ファミリーに属する遺伝子)が15塩基にも及ぶ長大にもかかわらず、極めて類似した配列を持つことを見出したことである。これは、本来ならば起源が異なる遺伝子であるものが、同じ制御機構に入った過程を解明するためのモデルとなるもので、学術的にも興味が持たれる。植物は環境中で様々なストレスに対応した適応を遂げている。環境中では、光、熱、イオン障害などの非生物学的なストレスに加えて、病原性微生物や食害昆虫などの生物学的ストレスが混在して、それぞれに対応するシステムが相互に関連して協調的に適応を遂げていると考えられる。この研究では、生物学的なストレスの中で問題となる病害応答と、養分吸収などの連結性を、根圏微生物、根周辺のイオン動態及び根の応答の観点から解明を目指したものである。本年度は、植物側の視点からは、根の有機酸放出能力を決定する因子の一つである、STOP1転写因子のタンパク構造と有機酸放出遺伝子の転写制御について、転写活性化の初期シグナルにphosphatidyl inositolシグナルが関係することなどを見出すとともに、シロイヌナズナ、タバコ、イネなどで共通の遺伝子が転写活性化されることを見出した。
異種原子層層状化合物の電子状態と光学的性質

本研究により、BiTiS_3を初めとする多くの異種原子層層状化合物(化学式MTS_3又は、(MS)_<1+x>TS_2で記される。但し、M=Sn,Pb,Bi,希土類元素;T=Ti,V,Mb)の単結晶の育成に成功するとともに、その第二ステージ化合物(MS)_<1+x>(TS2)_2への異種原子のインターカレーションが試みられ、Mgを二つのTiS_2層の間に挿入した層間化合物Mg_x(BiS)_<1+y>(TiS2)_2の単結晶を得るととみに、Bi原子の一部をCa原子で置換した置換型化合物(Bi_xCa_<1-y>S)_<1+y>(TiS_2)の単結晶の育成成功した。得られた単結晶の構造解析と組成分析が、粉末X線回折法とX線光電子分光法を用いて行なわれ、目的の結晶が成長していることが確認された。成長した結晶の電子状態は、内殻及び価電子X線電子分光スペクトルの測定と内殻電子励起及び価電子励起エネルギー損失スペクトルの測定によって調べられ、これらの母体試料の電子状態が、各原子層の電子状態を強く反映しているとともに、MS層からTS_2層への電荷の移動が起こっており、特に、希土類元素を含む材料で大きいことが示された。また、広いエネルギー(波長)領域にわたる光学的性質が、電子エネルギー損失スペクトルのKramers-Kronig解析により研究され、複素誘電率、反射率および光学吸収係数のエネルギー(波長)依存性が調べられた。この結果、この物質の光学特性は、各原子層の光学特性を強く反映しており、光学定数の波長依存性は、主として状態密度の変化の大きいTS_2層から起因していることが明らかにされた。今後の研究計画として、層間化合物や置換型化合物の電子状態と光学的性質を明らかにし、インターカレーションや原子の置換による母体結晶の電子状態や光学的性質への影響について調べる予定である。
より強い筋肉を作るために筋サテライト細胞の目覚めは必要か?

昨年度、レジスタンス運動による筋肥大モデル動物を確立し、筋肥大とサテライト細胞活性化の関係を明らかにすることを目的に検討したが、筋肥大を起こす条件や、活性化サテライト細胞の検出条件を決めることが困難で、研究デザインの改良が必要であることがわかった。そこで、平成21年度は、レジスタンス運動によって筋萎縮が回復する過程において、筋サテライト細胞が関与するかどうかを明らかにすることにした。まず、レジスタンス運動による筋萎縮回復モデルマウスの作製を行った。レジスタンス運動の方法は、警告音のあと床面から電気刺激を行い、壁スイッチを押せば、その電気刺激から回避できるレジスタンス運動ボックスを製作し、電気刺激の前の警告音で壁スイッチを押すようマウスを学習させた。壁スイッチの高さを、ラットが立ち上がり、踵が離地する位置に設置すると、警告音後、立ち上がってスイッチを押すようになる。このような立ち上がり運動を学習した後、尾部懸垂を1週間行い、下肢筋の萎縮を起こし、その後、立ち上がり運動を1週間行った。その結果、1週間の不活動により筋が萎縮すると、ヒラメ筋の筋線維横断面積の減少、筋核数の減少が起こるが、その萎縮筋に一週間のレジスタンス運動を行うと、筋線維断面積の早期回復、筋核数の増加が起こることがわかった。さらに、萎縮筋にレジスタンス運動を行うと、筋核数/筋線維断面積比が大きいことがわかり、レジスタンス運動による筋線維断面積の増大に先だって筋核数が増えることがわかった。増殖した核の数と位置を観察すると、レジスタンス運動2日目に筋細胞外に増殖核が増え、3日目に細胞内に増殖核が増えることが分かった。この現象は、レジスタンス運動によって筋サテライト細胞が活性化・分裂し、その後融合した可能性がある。今後、免疫学的手法により、増殖核がサテライト細胞の核であることを明らかにする予定である。平成20年度は、レジスタンス運動による筋肥大モデル動物を確立し、その後、肥大筋における筋サテライト細胞活性化の時期を、組織学的手法を用いて明らかにことを目的に行った。まず、レジスタンス運動による筋肥大モデルラットの作成を行った。レジスタンス運動の方法は、警告音のあと床面から電気刺激を行い、壁のスイッチを押せば、その電気刺激から回避できるラット用レジスタンス運動ボックスを製作し、電気刺激の前の警告音で壁にあるスイッチを押すようラットを学習させた。壁スイッチの高さを、ラットの後肢を最大限伸ばし、踵が離地する位置に設置する。すると、警告音後、立ち上がってスイッチを押すようになる。このようなつま先立ち運動の学習を1週間行った後、ラットに、重り付ジャケットを着用させ、重りを徐々に重くしていき、斬増レジスタンス運動を行った。レジスタンス運動は7週間で、負荷は、ラットの体重の5→100%まで増加した。7週間のレジスタンス運動後、H-E染色で後肢筋8種の筋線維断面積を測定した。ヒラメ筋に筋肥大を認めたが、その他の後肢筋には、筋肥大が認められなかった。また、肥大したヒラメ筋に免疫染色を施行し、活性化したサテライト細胞を観察したが、認められなかった。課題として、レジスタンス運動を行ったラットは、対照群に比べて体重が小さかったので、おもり負荷の増加率や運動期間など実験デザインの一部改良が必要であることがわかった。また、活性化したサテライト細胞は、レジスタンス運動早期に現れる可能性があるため、検出する条件を検討するべきであることがわかった。
細胞骨格蛋白遺伝子欠損による心筋症の病態解明と新しい遺伝子・薬物療法の開発

遺伝子治療の可否は他の治療と同様に最終的に生体内心筋の収縮能と動物の予後の改善を指標にして判定すべきである。筆者らはδ-SGとレポーター遺伝子のLac Zを同一のCMVプロモーターで駆動したrAAVを作製し、検討を厳密にする為に上記TO-2系心筋症ハムスターを先と同様、開胸手術して両ベクターをco-transfection (n=26)またはLac Zのみ単独投与した(n=20)。投与の時期として心筋に不可逆性の変化が出る前で手術侵襲に耐えられる5週令を選んだ。なお予備実験でδ-SGとLac Zは遺伝子発現に関して相互に干渉しない事を確認した(Kawada et al.,B.B.R.C.,2001)。従来、正常ハムスターは約100週生存し、TO-2系心筋症ハムスターは1/4の30週程度の寿命とされた(Sole, Hamster Information Service 1986)。今回Lac Zのみ投与した群は4週から死亡し始め160週目からは急速に死亡数が増加した。この結果は従来の報告とほぼ一致し、遺伝子投与の際に行った手術の後遺症は残らなかったと考える。一方δ-SGとLac Zとを共投与した群では死亡例が無く、追跡した250日まで活動していた。またこの間、超音波検査で心筋の収縮能を検討した結果、左室の拡張期径(LVDd)は両群で差を認めなかったが、左室の収縮期径(LVDs)は改善し、算出した収縮率(%FS)と左室駆出率(LVEF)も著明に改善した。これは遺伝子異状による心不全のrescueに成功した最初の報告である(Kawada et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,2002)。BIO 14.6の左室心筋内にβ-gal及びfull lengthのδ-SG遺伝子を含むHLを注入し、7日後に心臓を摘出後、常法通り免疫染色を行った。BIO 14.6の心筋はδ-SG抗体によって染色されなかった。BIO 14.6の心筋内にδ-SGとβ-gal遺伝子をco-transfectionさせた結果、細胞膜と細胞質にδ-SGが、細胞質にβ-galの明確な免疫染色が認められ、δ-SGとβ-galが共発現する事が確認された(Kawada T.et al.J.Card.Failure,in press)。従って今回用いた遺伝子導入法は今後の遺伝子治療を開発する上で非常に有用と期待される。更に効率の良い、長期間発現可能なベクターを開発して上記遺伝子治療を発展させる予定である。筆者らは心筋症ハムスター(BIO 14.6)の責任遺伝子がδ-sarcoglycan(δ-SG)の欠失である事、また不活化したHVJとリポソームを結合させたHVJ-リポソーム(HL)を用いて、in vivoで生体内の心筋細胞内にβ-galも含む多種の遺伝子を強制発現させうる事を報告した。今回、両結果に基付き遺伝子治療を試みた。BIO 14.6の心筋内にδ-SGとβ-gal遺伝子をco-transfectionさせた結果、細胞膜と細胞質にδ-SGが、細胞質にβ-galの明確な免疫染色が認められ、δ-SGとβ-galが共発現する事が確認された。更に効率良く長期間

発現可能なベクターを開発し、上記遺伝子治療を発展させる予定である。なお筆者らは遺伝子発現を確認する為のb-galの発現は従来の免疫組織化学的方法よりは特異抗体を用いれば感度も特異性も優れている事も併せ報告した。また従来の心筋症について最も正確に診断が可能なMRIを用いて、その病態が徐々に変化し一時点のみの形態診断と遺伝子型との対応には慎重を期す必要が有る事も判明した。ジストロフィン関連糖蛋白複合体(DAGC)は細胞膜直下のジストロフィンと細胞外マトリクスのラミニン-α2を結合し、細胞膜を安定化する。当研究室では心筋症ハムスターでDAGCの中のδ-サルコグリカン(SG)遺伝子の欠損を証明した。昨年ヒトの心筋症家族でハムスターと同じδ-SG遺伝子の欠損による重症心不全症例が報告され、共通の病態が示された。更に筆者らは遺伝子治療の為に最初HVJリポソームベクターを用いて生体内の心筋細胞に数種の遺伝子を発現させたが、このベクターは生体に無害な反面、発現期間が短く、長期治療には適さず、新しいベクターの開発が必要となった。種々のベクターを模索した結果、安全性、発現効率、発現期間共に優れている事が報告されているrAAVに注目し、CMVプロモーターの下流にレポーター遺伝子(Lac Z)、又は正常配列のδ-SG遺伝子を含むrAAVベクターを作成した。5週令の雄性TO-2系ハムスターにLac Z単独、又はLac Zと正常配列のδ-SG遺伝子を左室心尖部筋層に投与した。10-30週後に心を分離し、Northern blotting,Western Blottingおよび病理学的、免疫組織学的検索に供した。また一部の動物は心臓カテーテル検査による血行動態、心エコー検査によりin vivoの収縮能を測定した。更に44匹の動物を2群に分け、TO-2の生存期間を越える40週後まで予後を追跡した。その結果、I.Northern blottingの結果TO-2にδ-SGのmRNAが認められ、Western Blottingでも正常動物と同じ分子量のδ-SG蛋白を認めた。II.rAAVによる遺伝子発現効率は投与部位で約40%と優れていた。またその発現は40週まで認められ、ほぼ生涯発現する事も示された。またこの時、予後も明らかに改善した。
新規バクテリオファージゲノム由来ヌクレオシドの抗ウイルス活性の可能性検討

ウイルス感染症に対する化学療法では、ヌクレオシドの構造をベースにした核酸類似体が使用されている。一部のバクテリオファージ(ファージ)は、ユニークなゲノムDNAを有している。本研究では、抗ウイルス薬の創薬基盤となりうる新規核酸をファージゲノムDNAから捜索した。LC-MSを使用しファージゲノムDNAを分析した結果、ほとんどのファージは、通常のゲノムDNAであった。一方、黄色ブドウ球菌ファージS6では、チミンがウラシルに完全置換されたゲノムDNAを有することは明らかとなったが、抗ウイルス薬の創薬基盤となりうる新規核酸の発見には至らなかった。ウイルス感染症に対する化学療法では、ウイルスの複製を阻害させる核酸類似体が使用されている場合がある。中でも、ヌクレオシドの構造をベースにした核酸類似体が高頻度で使用されている。一部のバクテリオファージ(ファージ)は、様々な修飾された核酸塩基を有していると期待される。新規の核酸誘導体は、抗ウイルス薬のリソースになりうる可能性を十分有している。それゆえ、本申請研究では、ファージの新規ヌクレオシドの捜索を行い、抗ウイルス作用の検討を目的とした。初年度(平成25年度)では、酵素を使用しファージ核酸をヌクレオシドへ分解し、LCーMS(ナノ液体クロマトグラフィー・精密質量分析器)による分解ヌクレオシドを定量的に測定可能な分析方法を立ち上げた。数種類のファージ核酸を分析した結果、ユニークなヌクレオシド構造は認められなかった。しかしながら、数種類の同属に属するファージDNAの分析を行ったところ、ヌクレオシドの種類と遺伝学的な分類方法で相関性がみられることが明らかとなった。これを、論文に報告した(Uchiyama J, et al. (2012) Arch Virol. 157(8):1587-92.)次年度(平成26年度)は、ファージのヌクレオシドの測定により、ファージ2株でチミンの代わりにデオキシウラシル(dU)を有するファージを発見した。これら、dUを有するゲノムDNAに有するファージの発見を論文へ報告した(Uchiyama J, et al. 2014ISME J. in press.)。これまでの研究成果は、論文業績は出ているものの、本研究が目標とする新規核酸誘導体の発見とその評価につながるものではない。その理由の一つが、平成25年度、平成26年度とも機器の故障、大学業務等があり、順調に研究が遂行可能な状況になかったことが考えられる。しかしながら、現在、核酸類似体に対しても耐性ウイルスの出現などが報告されている。また、既存の核酸類似体の基盤となるライブラリーも限界があること、新規核酸誘導体の基盤となるリソースに関しても制限があるため、新規の核酸誘導体のリソースの探索は、将来の当該分野の研究開発に対して極めて有効であると考えられる。一部のバクテリオファージ(ファージ)は、様々な修飾された核酸塩基を有しており、新規の核酸誘導体のリソースに十分なりうる可能性を有している。本年度は、ウイルス感染症に対する化学療法で使用される核酸誘導体(ヌクレオシド類似体と称するヌクレオシドの構造を大幅に改変しない程度の改変がなされた化合物)候補分子となりうる候補分子のスクリーニングを行った。特に、ウイルス分類学的に新規核酸を有すると期待されるファージや新規ファージのゲノム核酸塩基の分析を行った。これまでのウイルス分類学やファージ生物学的知見を回顧し、新規ヌクレオシドをゲノムDNAに含有すると予想したファージ6株を選定した。ゲノム核酸をヌクレオシドへ分解し、解析を行った。その結果、ファージ4株は通常の核酸塩基を有した。残りの2株はチミンの代わりにデオキシウラシル(dU)を有していた。残念ながら、有効な核酸誘導体の候補となる核酸塩基の発見には結びつかなかった。しかしながら、ファージ分類学上の研究成果(Archive of Virology, 157(8):1587-92, 2012)、また、通常毒性を示すdUを有する生物を発見した(論文投稿準備中)。それゆえ、本申請研究では、ファージの新規ヌクレオシドの捜索を行った。

平成24年度では、酵素を使用しファージ核酸をヌクレオシドへ分解し、LCーMS(ナノ液体クロマトグラフィー・精密質量分析器)による分解ヌクレオシドを定量的に測定可能な分析方法を立ち上げた。数種類のファージ核酸を分析した結果、ユニークなヌクレオシド構造は認められなかった。しかしながら、数種類の同属に属するファージDNAの分析を行ったところ、ヌクレオシドの種類と遺伝学的な分類方法で相関性がみられることが明らかとなった。これを、論文に報告した(Uchiyama J, et al. (2012) Arch Virol. 157(8):1587-92.)平成25年度は、ファージのヌクレオシドの測定により、チミンの代わりにデオキシウラシル(dU)を有するファージを発見した。平成26年度は、これら、dUを有するゲノムDNAに有するファージの発見を論文へ報告した(Uchiyama J, et al. 2014ISME J. 8(9):1949-52.)。細菌学以上の研究成果を論文報告した。研究責任者は、これらの結果を分類学的・分子生物学的に考察し、ウイルス分類学での研究成果として発表した(Archive of Virology, 157(8):1587-1592, 2012)。また、チミンの代替えとして、ウラシルを二重鎖DNAの塩基にdUを保有する生物を発見したことは、生命科学上非常に意義のある結果と、他の分子生物学・細菌学・ウイルス学の研究者らからのコメントを頂いた。それゆえ、本成果に関して、論文へ報告した(Uchiyama J, et al. 2014 ISME J. in press.)。これまでの研究成果は、論文業績は出ているものの、本研究が目標とする新規核酸誘導体の発見とその評価につながるものではない。それゆえ、これまでの研究達成度は、十分といえない。その理由の一つが、平成25年度、平成26年度とも機器の故障、大学業務等があり、順調に研究が遂行可能な状況になかったことが考えられる。本年度は、ファージ株6株(Enterococcus phage φEF24C、Staphylococccus phage K、Staphylococcus phage S6、Escherichia coli phage lambda、Bacillus phage PBS1、Serratia phage KSP100)由来のヌクレオシド分析を行った。まず、はじめに、ナノ液体クロマトグラフィー・精密質量分析器で標準ヌクレオシド(デオキシアデニン, A;デオキシグアノシン, G;チミジン, T;デオキシウリジン, dU;デオキシシチジン, C)の分離・分析を行い、測定条件の設定を行った。次に、ファージを大量培養・精製を行い、ファージ由来ゲノム核酸を抽出した。ゲノム核酸を酵素によりヌクレオシドへ分解し、ナノ液体クロマトグラフィー・精密質量分析器で測定を行った。その結果、4種類のファージ(phages φEF24C、K、KSP100、lambda)では、通常のDNA(A, T, G, C)であった。残りの2種類(phages S6、、PBS1)は、dUを有するDNA(A, dU, G, C)であることが明らかとなった。
これ迄の研究の総力を結集させたアミロイドーシスの早期診断・病態解析システムの開発

LC-MS/MSを用いた解析法によりアミロイド原因蛋白質を同定法するため、後ろ向き及び前向き解析を実施。すでに診断がついている各種アミロイドーシスのホルマリン固定組織を解析したところ、本解析法と臨床診断の一致率は、97%で、非常に高い一致率を示した。前向き解析として、病型診断に至っていないアミロイドーシス患者21例の組織を解析。結果、本法と臨床診断との一致率は95%であった。以上より新たなアミロイドーシス診断法として有用な方法であることが判明した。高齢者の消化管に高率に認められる未知のアミロイドーシスに対して、同方法を駆使し、Ffibrin3が新たなアミロイド原因物質であることを同定発見した。新たな迅速にして確実なアミロイドーシス診断法を確立して、これまで同定できなかったアミロイドーシスの病態と診断を確立するため、以下の研究を行った。1レーザーマイクロ・ダイセクションとLC/ MS MSを組み合わせた方法でアミロイド原因蛋白質を同定できるか検証するために、すでに診断がついている各種アミロイドーシス(AL、AA、SSA、FAP、DRA)患者のホルマリン固定組織(心臓、神経など)を解析した。その結果、免疫組織染色で同定できなかったALアミロイドーシス標本で、本法が有効であるとともに、本解析法と臨床診断の一致率は97%と非常に高い一致率を示した。解析結果から、本法は、様々なタイプのアミロイドーシス患者からアミロイド原因蛋白質を同定できることが明らかとなった。さらに、解析に用いたアミロイド沈着組織は、心臓、神経、舌など様々であったが、いずれの臓器からでもアミロイド原因蛋白質の検出は可能であった。2組織沈着アミロイドの抽出液にプロテイナーゼKを入れると、アミロイドの収率が大きく向上することを発見した。3膝組織に沈着したアミロイドの約60%がTTRであることが判明したが、40%は現在のところ原因不明で、現在なお上記方法で検討中である。4熊本県との共同作業で、「アミロイドーシス診断構築事業」を立ち上げ、アミロイド診断センターで全国各地から送られてくるアミロイドーシスの検体を診断したところ、FAP患者サンプルの解析において、世界初の遺伝子変異1例、国内初の遺伝子変異4例が明らかになった。LC-MS/MSを用いた解析法が、アミロイド原因蛋白質の同定法として有用であるか検証するために、後ろ向きおよび前向き解析を実施した。1本解析法でアミロイド原因蛋白質を同定できるか検証するために、すでに診断がついている各種アミロイドーシス(AL(κ,λ)、AA、SSA、FAP、DRA)患者25例のホルマリン固定組織(心臓、神経など)を解析した。その結果、本解析法と臨床診断の一致率は、97%で、非常に高い一致率を示した。2前向き解析として、病型診断に至っていないアミロイドーシス患者21例の組織を解析した。解析の結果、本法と臨床診断との一致率は95%であった。本解析例には、原因蛋白質が不明であった角膜アミロイドーシス、1例や従来法の免疫染色ではアミロイド原因蛋白質を同定できなかったALアミロイドーシス、3例、アミロイド沈着量が極わずかであったFAP、1例が含まれており、本解析法の有用性が示された。遺伝子診断、質量分析装置、組織診断法などを駆使した新たな迅速にして確実なアミロイドーシス診断法を確立して、これまで同定できなかったアミロイドーシスの診断、病態解析を行うとともにアミロイドーシス診療体制構築事業を作り、本邦のアミロイドーシスの診断・病態解析に大いに貢献した。主な成果は以下のとおりである。1高齢者の腸管の血管周囲にアミロイド沈着をきたし消化管出血の原因となりうる原因不明のアミロイドーシスの原因タンパク質がFibrin3であることを、レーザーマイクロ・ダイセクションとLC/ MS MSを組み合わせた方法で、新たに同定した。また本タンパク質は脳のアミロイド小体の主要構成タンパク質であることも明らかにした。2膝組織に沈着したアミロイドの約60%がTTRおよびApoAIであることが判明したが、40%は現在のところ原因不明で、現在なお上記方法で原因タンパク質の解析を行っている。3熊本県との共同作業で、「アミロイドーシス診断構築事業」を立ち上げたところ、3年間で1050例の各種アミロイドーシスの診断依頼を受けた。

解析の結果、ALアミロイドーシスが4割を占め、トランスサイレチン(TTR)が原因となる老人性全身性アミロイドーシスおよびFAPは約3割を占めた。患者サンプルの遺伝学的解析により、世界初の遺伝子変異2例、国内初の遺伝子変異5例が明らかになり論文報告を行った。4FAPのモデル動物で現在組織にアミロイド沈着をきたすものはなかったが、TTR81-127のフラグメントを細胞に発現させると、細胞外にアミロイド沈着をきたすことが新たに明らかになった。現在、本フラグメントを発現させたtransgenic miceを作成中である。また、上記細胞による実験系を用いて、抗体治療や様々なアミロイド形成阻止が可能と考えられる低分子化合物のアミロイド阻害効果を検討中である。26年度が最終年度であるため、記入しない。医歯薬学26年度が最終年度であるため、記入しない。レーザーマイクロ・ダイセクションとLC-MS/MSを用いた解析法にプロテイナーゼK抽出液を組み合わせた方法がアミロイド原因蛋白質の同定法として有用であることがほぼ証明できた。今後はさらにLC-MS/MSの解析技術の向上を図るとともに、解析ソフトの充実を図る。またさらに依頼が多数来ている未知のアミロイドーシス解析を行い、診断をつける作業が、確実に進行している。LC-MS/MSを用いた解析法が、アミロイド原因蛋白質の同定法として有用であることがほぼ証明できた。またさらに依頼が多数来ている未知のアミロイドーシス解析を行い、診断をつけ、世界に情報発信する。これまでの結果を、国内の検査医学、神経関係の学会で発表する。また上記のように今後はさらにLC-MS/MSの解析技術の向上を図るとともに、解析ソフトの充実を図り3年目のプロジェクトに備える。これまでの結果を、本年行われる、世界家族性アミロイドーシス学会(リオデジャネイロ)や国内の検査医学、神経関係の学会で発表する。また上記のように今後はさらにLC-MS/MSの解析技術の向上を図るとともに、解析ソフトの充実を図り2年目のプロジェクトに備える。
パナスコピック形態制御された希土類系物質の高圧力誘起電磁物性

19年度は主に以下のようなテーマに絞り研究を行った。1)高濃度近藤化合物CeAu2Si2の高圧下における電子物性この物質は層状構造を持ち、約8Kで反強磁性秩序を示す。ネール温度TNは高圧下で消失すると考えられ、より高圧側での電子状態に興味が持たれている。高圧下の近藤効果の実験はスイスのJaccard達により調べられているが、TNやメタ磁性転移磁場B_Mの圧力効果などについての詳細な研究はまだなされていない。更に単結晶を使った精密な電気抵抗測定はその例がない。このようなことから本研究においては3.4GPaまでの圧力範囲で電気抵抗や磁気抵抗を調べた。常圧では反強磁性特有のハンプを示して抵抗は上がり、ピークを作って再び下がりはじめる。この抵抗のハンプは圧力を上げるとはっきりしなくなるが明らかに高温側にシフトしている。このハンプの始まりの温度をネール温度TNと定義し、ピークの温度をTmasと定義する。T_NとTmaxはいずれも加圧により増加し、圧力に対してほぼ同じような振る舞いをする。しかし細かく見るとT_Nは圧力に対して1GPa近傍で異常を示す。この詳細な理由は今のところよく分かっていないが磁気構造の異常によるものと思われる。常圧下における磁気抵抗効果は磁場がそれぞれa軸、c軸に平行な場合に対して大きな異方性を示した。c軸に平行な場合は約4T(=B_M)でメタ磁性転移による不連続な飛びを示す。圧力効果については低圧でははっきりと見えていた転移が高圧下ではかなり不鮮明になり、更にB_Mは加圧とともに増加する事が明らかとなった。この増加はT_Nの加圧による増加と熱力学的によく対応している。2)反強磁性化合物CeIn3の高圧合成Ceの特異な圧力-温度相図を使って磁気秩序を示す重い電子系化合物CeIn3の高圧合成を行った。これまでは高圧合成により磁気秩序を示さない化合物の合成に成功しており、またこの化合物の成長が冷却速過程によることを明らかにした。今回更に作製条件を明らかにするため冷却速度の最適化を図った。その結果作製直後は反強磁性を示さない試料が約一週間後に測定してみると磁気秩序を示すことが分かった。即ちこれらの試料は結晶学的に不安定状態で出来ており、経時変化を示すことが明らかとなった。今後より詳細な作製条件を突き止めていく。今年度は高圧下で形態制御されたときに誘起される希土類金属間化合物の特異な電子状態について以下に述べる3つの方向で研究を行った。1)特異な電子構造を持つ物質で誘起される新しい電磁物性2)新しい機能を持つと期待される物質の合成3)これまでに高圧下で全く研究されなかった新しい物質系今年度は交付決定後数ヶ月しか無いという短い研究期間であるが1)においては重い電子系物質として知られるCeAl_2において高圧下でこれまでと全く異なる圧力誘起の電磁物性を発見した。2)では新機能物質としてスピンの層状配列を持つ物質の開発、即ち新物質の合成と良質単結晶の育成に力を注いだ。このような物質として、CeNiGe_2を選び、スピンの反強磁性配列が磁場印加によりメタ磁性転移を起こすときに現れる巨大磁気抵抗の観察に成功した。今後も引き続きCe-Ni-Ge3元系の物質深策を行いたい。最近我々はFe-Cr人工格子において巨大磁気抵抗が圧力下で大きく強調されることを見出したが3)では同様な研究を高圧下で大きく電子状態が変わると期待される希土類化合物へ拡張するため、希土類元素を含む金属人工格子としてFe/Tbを選び、その作成を行い高機能試料の作成に成功した。希土類元素を含む多くの化合物の中で高温超伝導体や重い電子系物質などは層状の結晶構造及びスピン構造をもつものが多い。また巨大磁気抵抗効果等で知られる新機能人工格子はスピンが層状構造をもつ事で知られている。このようなことから本研究では「層状構造」をキーワードにしてスピンが2次元(又は1次元)の配列を持つ系を対象にして物質創成と圧力と磁場を形態制御変数として醸し出される物質の新しい機能を探索することを目的とした。従って今年度は目標として以下の3つのテーマをたて研究を行った。(1)希土類元素の特異な圧力-温度相図を使った新機能物質の合成(2)希土類元素を含む新しい層状化合物の合成と基礎物性(3)高圧下で新機能が誘起されると期待される希土類人工格子の探索希土類金属の結晶構造や電子物性は圧力や温度を変えると大きく変化することはよく知られてる。(1)では、はじめに金属Ceを例にとり、重い電子系物質の高圧合成を行った。これらの物質の電子物性は究極的にはf電子の数が担っている。その数の制御を圧力を用いて試みた。次に(2)では新機能物質としてスピンの層状配列を持つ物質の開発、即ち新物質の合成と良質炭結晶の育成に力を注いだ。更に最近我々はFe/Cr人工格子において巨大磁気抵抗が圧力下で大きく強調されることを見いだしたが(3)ではこの種の研究を高圧下で大きく電子状態が変わると予測される

希土類元素を含む人工格子へ拡張するため、希土類元素を含む金属人工格子としてFe/Tbを選び、高機能試料の作成を行い、9Tの磁場で約8%の磁気抵抗がでることを確認し、更に高度な技術を要請される高圧下の磁気抵抗の測定にも成功した。本年度の研究目標は大きなものとして以下の3つであった。1)希土類元素を含む新機能層状化合物の創成と電磁物性の解明(Ce系金属間化合物)3)圧力を用いた物質制御による新機能物質の合成これらについて今年度得られた成果で主なものを以下に示す。1)については本年度から候補物質としてCeAu2Si2を例に取り、高圧・高磁場下で電気抵抗を測定することにより、反強磁性転移温度T_Nとメタ磁性転移磁場H_Mの圧力依存性などを調べることにより形態制御下の反強磁性の安定性を調べた。予備的な成果としてはTN, HMいずれも圧力をかけると増加することが分かった。この結果はこれまでの報告例と異なるものであった.現在20GPaまでの電気抵抗の測定を試みている。希釈冷凍機のカバーする温度領域までの実験を予定しているので量子相転移付近の電子状態が明らかになるものと思われる。2)について:[Fe(12nm)/Tb(15nm)]_<25>及び参考物質としてTb薄膜(1800nm)を用いて電気抵抗と磁気抵抗の圧力変化を定量的に調べた。前者はヘリウム温度付近で8%の大きな磁気抵抗を示すがとめ圧力変化は小さく、3GPaの圧力でわづかに減少するという結果が出た。また高磁場で磁気抵抗を測ったがFe/Tbは30Tで20%を超える巨大磁気抵抗効果を観測した。3)について:この研究は金属セリウムの特異な圧力-温度相図を使って物質創製を試みるといろ全く新しい試みである。圧力を3GPaとし、1600°Cの条件下でCeIn_3の合成を行った。この物質は常圧下で10Kに反強磁性秩序をし、高圧下で超伝導が観測される重い電子系物質である。常圧と高圧下での合成を行い、結晶構造、磁気的性質、比熱などの測定を行った。常圧下で合成された試料は10Kで反強磁性転移に伴う異常が観測されたが高圧合成のものは10Kにおいでそのような異常は全く見られなかった。従って高圧合成で得られた試料はCeがα状態で固溶しているものと考えられる。しかしこれらについてはまだ不明な点も多く、今後の系統的な研究がまたれる。19年度は主に以下のようなテーマに絞り研究を行った。1)高濃度近藤化合物CeAu2Si2の高圧下における電子物性この物質は層状構造を持ち、約8Kで反強磁性秩序を示す。ネール温度TNは高圧下で消失すると考えられ、より高圧側での電子状態に興味が持たれている。高圧下の近藤効果の実験はスイスのJaccard達により調べられているが、TNやメタ磁性転移磁場B_Mの圧力効果などについての詳細な研究はまだなされていない。更に単結晶を使った精密な電気抵抗測定はその例がない。このようなことから本研究においては3.4GPaまでの圧力範囲で電気抵抗や磁気抵抗を調べた。常圧では反強磁性特有のハンプを示して抵抗は上がり、ピークを作って再び下がりはじめる。この抵抗のハンプは圧力を上げるとはっきりしなくなるが明らかに高温側にシフトしている。このハンプの始まりの温度をネール温度TNと定義し、ピークの温度をTmasと定義する。
固体表面上の吸着種の反応性に関する触媒化学的研究

Li_2O触媒上でのn^ーブテン異性化反応の形態はシス凸形であり、滴定法により表面に塩基点が観測された。様々な調製法で調製されたMgO触媒表面において滴定法により塩基量および塩基度分布を測定したところそれぞれのMgOにおいて大きな相違が観測された。また、n^ーブテンの異性化の形態もそれぞれのMgOにおいて異なった。出発原料や調製法の異なるTiO_2触媒表面上の酸量および酸強度分布を滴定法で測定したところ、それぞれのTiO_2において大きな相違が観測された。またn^ーブテン異性化反応を行うと塩基触媒に特徴的なシス凸型の形態を示した。そこで塩基滴定を行ったところ表面に塩基点が存在することが判明した。Sm_2O_3触媒上では1ーブテンの異性化反応が非常に速く進行しシスートランス比は22.2と非常に大きなものであった。3種類の吸着水素がTPD法によりPt上に観測され、それぞれの水素と吸着アンモニアとの反応の反応性は異なることが観測された。TCNEなどで修飾したMg_2Niを触媒としてH_2ーD_2交換反応を行ったところ、気相水素は吸蔵水素と反応性衝突をして1原子交換または2原子交換することがわかった。赤外分光法によりSm_2O_3触媒表面上に独特の形態の水素が吸着することが判明した。Sm_2O_3触媒表面上にギ酸が吸着して3種類のギ酸イオンが形成することを確認した。これらのギ酸イオンは533K以上の温度で分解すること、ギ酸の分解は雰囲気に依存しないこと、またギ酸イオンの分解には同位体効果があることがわかった。重水素ギ酸イオンを水素気流中543Kで反応させるとCーH/CーD交換反応がおこることが観測された。同様にメトキシドをSm_2O_3触媒表面上に生成させてその安定性を観測すると酸素雰囲気下では酸化されギ酸イオンを表面に形成すること、また水素気流中下で重水素メトキシドは、533K以上の温度でメチル基のCーD/CーH交換反応が進行することがわかった。テトラシアノエチレン(TCNE)で修飾した水素吸蔵合金Mg_2Niを触媒として、水素吸蔵および気相に水素が共存している状態下における水素ー重水素交換反応を行った。気相水素と吸蔵水素との間に軽水素ー重水素交換反応がおこり、気相水素は吸蔵水素と反応性衝突をして1原子交換または2原子交換した。昇温脱離法を利用して、白金上に化学吸着したアンモニアに対する水素ー重水素交換反応の反応性を調べた。白金上には3種類の化学吸着水素が観測され、それぞれ異なった反応性を示すことがわかった。酸化リチウム上でnーブテンの異性化反応を行った。相対異性化反応速度定数から求めた反応プロフィ-ルはシス凸であった。安息香酸滴定法により、酸化リチウムの表面上には塩基点が観測された。通常酸触媒として知られている酸化チタン表面でブテンの異性化反応を行ったところ塩基触媒に特徴的なシス凸のプロフィ-ルを示すことがわかった。安息香酸滴定法により塩基点を測定したところ、塩基点が存在することが確認された。赤外分光法により酸化サマリウム上に導入したメタノ-ルを観測した。

メタノ-ルは吸着してメトキシドを形成し、昇温とともに徐々に分解したメトキシドは酸素雰囲気下では酸化されてギ酸イオンを形成し、その後CO_2とH_2Oに酸化された。また水素雰囲気下において重水素メトキシドの重水素は水素と交換することが観測された。また、メチル基の重水素がひとつづつ水素と交換されていく反応機構で進行することも判明した。高温で真空排気前処理をした酸化サマリウム触媒を用いると、1ーブテンの異性化反応が非常に速く進行する。またこのときに生成するシスー2ーブテンとトランスー2ーブテンの比は22.2と非常に大きかった。また滴定法により表面の塩基性度を測定したが、超強塩基に帰属される塩基点は観測されなかった。赤外分光法により、酸化サマリウム触媒表面上生成したメトキシド吸着種の反応性を観測した。特に重水素メタノ-ルを水素気流中で反応させるとメチル基のCーDがCーHと交換していくことが観測された。また、この反応の速度は気相の水素圧が10Torr付近で最大となり、高圧になれば速度が減少することから、水素とCーH結合が活性化されるサイトが同一であることが判明した。同様に同触媒表面上でのギ酸吸着種の反応挙動についての観測も行った。373Kにおいてギ酸は3種類のギ酸イオン吸着種を表面上に形成する。昇温するとバイデンテ-トギ酸イオン1種類となり533K以上の温度で分解し表面上にOH基とカ-ボネイト吸着種を形成することが観測された。メトキシド吸着種の場合と同様にCーD,CーH交換反応がギ酸イオンの分解を伴いながらおこることが確認された。赤外分光法を用いて酸化サマリウム表面上に水素が吸着して独特の吸着種を形成することが観測された。グラファイト層間化合物触媒を用いて2ーブテンと2ーペンテン類の競争異性化反応を行ったところ、シスー2ーブテンの反応性が最も高かった。グラファイト層間化合物をスチレンで修飾した化合物を触媒として、オレフィン類の異性化反応の反応性の検討を行った。半導体光触媒であるTiO_2表面にセリウムイオンを添加することで新たに水素生活性サイトが形成されることが判明した。