hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
従属な拡張連続型　ｋ－システムの設計方法に関する研究

これらのシステムは、例えば2次元や3次元の物体のパターン認識確率の評価、立体的に配置されたセンサー(例えば衛星)等による監視システムの評価、デジタルサイネージ・液晶画面に代表される集積画素を用いた表示器の評価、複数種類の発電方法を連携させて地域全体の給電を効率良く運用する電力のコミュニティグリッドの最適運用と評価などに適用される。本研究はコンポーネント故障が従属な拡張連続型k-システムの信頼度算出方法(状態分布関数)及び最適構成導出方法と設計指針提案を行うことを目的とする。本年度は従属な拡張連続型k-システムの評価方法の提案のために、主に多状態連続型k-システムの最適配置の評価基準をシステム状態の期待値とした場合における、1)多状態連続k-out-of-n:Fシステムの最適配置を一意に導く各コンポーネント状態確率の関係(条件)の調査、2)大規模な多状態連続k-out-of-n:Fシステムの最適設計問題のためにSAを用いた効率的な近似解法の精査と提案、3)保守コストを考慮した円形連続k-out-of-n:Fシステムの最適配置施策の提案を行った。加えて1)から3)の考え方を加味し、4)設備配置問題における最適配置近似解探索アルゴリズムへの応用、5)多期間制約サイクル問題における最適切替問題への応用、また拡張連続型k-システムを一般ネットワークの特別な場合と捉え、6)多目的ネットワークシステムのパレート解算出方法とパレート解部分集合算出方法の提案を行った。2状態の拡張連続型k-システムについて、Domination理論による従属な場合のシステム信頼度評価、並びに、Signature理論による動特性評価を体系化し統一理論の構築するために「2Signature理論とDomination理論の統一理論の構築」と、拡張した「5拡張Signatureと拡張Dominationの提案」の試行を続けており、この成果は平成25年度にまとめる。本年度は主に「6多状態の従属な拡張連続型k-システムの評価基準の算出方法及び最適構成導出方法の提案」を行うための基礎研究として、多状態連続型k-システムの最適配置問題において、システムの状態確率の期待値を評価関数とした場合の最適配置を決定するコンポーネントの状態確率の傾向解析に取り組んだ。その結果、1)小規模なシステムにおいて特定条件下で最適配置が一意に決定できるコンポーネント間の状態確率の関係を数理解析により導くことができた。同時に、この問題のシステムサイズに対する一般化を進めるための着想を得た。しかし、大規模システムの最適設計問題のためには1)の手法では限界があるため、2)多状態連続型k-システムの最適配置問題にSAを用いた効率的な疑似最適配置算出方法の改善を進めることで、多状態の拡張連続型k-システムの最適構成の傾向の全容を明らかにし、従属性を考慮に加えることで、本研究課題の検討を進めた。更に、本研究課題の実社会への適用可能性を考察するために、3)多期間制約サイクル問題における最適切替問題への応用と、4)多目的ネットワークシステムのパレート解算出方法とパレート解部分集合算出方法の提案を進めた。以上の通り、本年度は研究計画に基づき概ね計画通りに進行していると考える。
タンパク質・脂質ラジカルの選択的検出・同定と画像化法の開発

生体内で発生したフリーラジカルは、周囲のタンパク質や脂質と速やかに反応し得る。結果としてタンパク質が変性し、あるいは生体膜流動性が低下することで疾患が進展する。しかしながら、従来のフリーラジカル評価法は、一次因子であるラジカル種や最終生成物のアルデヒド体などを指標としており、生体機能の中心を担うタンパク質や脂質ラジカルを選択的に検出する手法は全く存在しない。そこで、本研究は、タンパク質や脂質など、生体機能を司る分子の酸化障害と周囲の病変部位を画像化するために、蛍光・MRIプローブの開発を行なっている。さらに、ニトロキシドのラジカル捕捉能を活かし、原因ラジカルの同定、及びその周囲での病変解析を行うことを目的としている。本年度は、主に脂質ラジカルを対象とし、その検出、同定、および画像化を可能とする新規蛍光プローブの開発を行った。そのために、有機スピン化合物であるニトロキシドが、炭素中心ラジカルと付加体を形成する点、および蛍光原子団と相互作用する点に着目し応用した。具体的には、ニトロキシドのラジカル近傍置換基を修飾し、脂質ラジカル親和性を付与した。また、親化合物に蛍光原子団を導入し、脂質ラジカルを高感度に検出可能な蛍光プローブとした。この化合物を用い、試験管レベルで発生した脂質ラジカルを蛍光にて検出し、LC/MSにてその構造を推定できることを明らかにした。さらに、細胞や疾患モデル動物へと応用し、過剰に生成した脂質ラジカルの発生部位を蛍光イメージングにて画像化できる可能性を見出した。つまり、開発した化合物の特徴を応用すれば、脂質ラジカルの分子種、並びに発生する時期や場所を特定でき、疾患の発症・進展に関わる脂質過酸化反応の伝幡やその後の代謝産物を予測することが可能となる。以上より、本研究が、酸化ストレス疾患のメカニズム解明や創薬ターゲット創出の一助になると期待する。
鳥類下垂体転写因子PREBの生理遺伝学的研究

本研究では鳥類のプロラクチンプロモーターに結合して発現制御を担うことが推測されているプロラクチン制御領域結合タンパク質(PREB)のクローニング、発現解析を行い発生期および繁殖周期における変動解析をプロラクチン遺伝子の発現との関連性から検討した。また、多型解析を様々な品種や系統において行い就巣性の有無との関連性を検討した。その結果、プロラクチン遺伝子の発現が上昇する際にはかならずPREBは同時にあるいは先んじて上昇することが確認されるほかにプロラクチンの放出因子であるVIPによる発現誘導も行われることを明らかにした。一方で、就巣性と多型に強い関連性は認められなかった。鳥類において認められる就巣行動は下垂体から分泌されるプロラクチン(PRL)が関与していることが古くから知られている。鳥類の中でもニワトリ、シチメンチョウやアヒルなどの家禽においてはPRLが産卵の停止と抱卵行動を誘起することが知られており、PRL遺伝子の発現調節機構の解明は国内外の多くの研究者の悲願である。PRLは就巣行動と密接な関係があり、行動発現、つまり巣箱の中で過ごす時間とPRL遺伝子の発現量変動には強い相関が存在する。また、PRL遺伝子の発現量変化は就巣行動以外にも胚発生期後期においても認められる。就巣行動中の変動には視床下部ペプチドである小腸血管作用性ペプチドの量的変化が強い影響している事が知られているが、胚発生期後期のPRL遺伝子の発現量増加要因はいまだ不明であることから、下垂体において発現する様々な転写因子との関連性が示唆されている。本研究は鳥類の就巣行動を制御するPRL遺伝子の発現に対して転写因子の遺伝子発現の関係を見るとともに、胚発生期の遺伝子発現量変化及び生理的放出因子やアデニルシクラーゼ活性剤の影響を検討し、PRL遺伝子のオンオフ制御機構を明らかにするとともに、抗体作成を試み、下垂体中のPREBの存在を検証する事を目的とした。さらに、就巣性を有する品種とそうでない品種間でPREB遺伝子内の遺伝子変異-多型に関連があるか否かを解明する。ニワトリ発生胚の下垂体におけるVIP及びフォルスコリンに対する反応を検討するとともに、白色レグホーン及び名古屋種(名古屋コーチン)の産卵鶏に対してのVIPシングル投与及び連続投与の影響を検討した。また、白色レグホーン、ロードアイランドレッド、岐阜地鶏、ジェリーン(フランスの地鶏)におけるPREB遺伝子多型の検討を行った。発生胚においては14日及び20日においてフォルスコリン刺激に対しての遺伝子発現上昇が認められたが、VIP刺激では20日胚では反応が認められたが14日胚においては認められなかった。また、産卵中の白色レグホーン及び名古屋種に対してのVIP刺激はPREB及びPRLの発現上昇を誘導する事が示された。これらの結果よりVIP刺激はVIPレセプターが存在しているのが前提であり、前年度に確認された繁殖周期におけるPREB遺伝子の発現変動は視床下部に存在するVIPの変動に影響を受けている事が強く示唆された。また、遺伝子多型解析に置いても系統として古くより存在している白色レグホーン及びロードアイランドレッドには特定の遺伝子多型のみが存在する一方で、岐阜地鶏、ジェリーンなどでは非常に多種の多型が存在している事が明らかになった。これらの結果は岐阜地鶏やジェリーンが改良途中であることを裏付ける結果であった。昨年度作成した抗体を用いたウェスタンブロット解析により予測された分子量のバンドが検出された。しかしながら非特異的なバンドも検出された事から、免疫染色解析に今後使用するには抗体精製あるいは免疫吸収などの処理があらかじめ必要である事も判明した。鳥類下垂体において発現する転写因子PREBの生理的段階における発現変化と名古屋種の系統における遺伝学的多型の存在し関して検討をおこなった。その結果、PREB遺伝子はPRLの生理的放出因子であるVIPの刺激下において発現が誘導されることが判明した。この発現は下垂体においてVIPの受容体が存在している時には強く認められるが、ほとんど発現していない時には見られないという結果が発生胚における下垂体を利用した実験のVIP受容体の定量により明らかにななった。発生胚の14日ではVIPによる発現誘導はPRL及びPREBともに見られないが、フォルスコリンによっては誘導が確認された。したがって、VIP受容体が発現していない状況においてもPREBあるいはPRLの発現に必要な最低限の機構は備わっており、PREBあるいはPit-1が発現増加していくことにより発生期のPRL上昇は誘導される可能性が高いことを明らかにした。また、名古屋種の各系統における多型解析をおこなったが、愛知県における名古屋種の複数の系統は最初に設立された系統から肉用あるいは卵用に選抜されていることを反映し、大きな系統間での多型頻度に差は見られなかった。このことからPREB遺伝子は就巣発現との関連性はほとんどないことが示された。予定した実験はほぼ行えたため。

応用動物科学今年度は名古屋種において成立している様々な系統間に遺伝子多型の構成頻度に差があるかを検討し、肉生産あるいは卵生産にPREB遺伝子がPRLを介して影響を与えるかを検討し、産卵種と肉用種あるいは兼用種における選抜マーカーとしての有用性について検討する。本研究では胚発生期及び繁殖周期中にPREB遺伝子の発現量変化をPRLあるいはPIt-1の遺伝子変動と比較して定量する事ができた。また、PRLの生理的放出因子であるVIPやアデニルシクラーゼの活性化剤であるフォルスコリンによるPREB遺伝子の発現誘導まで確認する事ができた。従って、mRNA発現の定量は予定通り修了する事ができた。一方で、鳥類PREB抗体の作成の為に抗原の作成から行ったが、予定通りには終える事が出来なかった。抗体の作成と抗体価の検定まで行う事ができたが、抗原であるリコンビナントPREBの大量培養は当初予定していたより大腸菌内における発現量が低く、抗原としての量を確保するのに時間が掛かり、抗体が年度末ギリギリに作成できたため、胚発生期及び繁殖周期の下垂体におけるウェスタンブロット解析までは終える事が出来なかったため。シーケンス解析を外部に発注しているが、年度内に発注しても請求書が代理店経由のために年度内支払いが難しいために次年度の外部発注に変更したため繁殖周期および発生ー成長期の下垂体をホモジネートした後、遠心分離を行い、上澄み分画を1次元および2次元電気泳動により展開し、PRL抗体とPREB抗体を用いてウェスタンブロット解析を行い、タンパク質の存在あるいは量的変動を検証し、遺伝子発現量変化との相関を明らかにする。また、下垂体中のPRL産生細胞との共発現があるのか否かを解明する為に免疫組織学的な解析を試みる。下垂体を繁殖周期および発生後期より採取し、固定した後に連続組織切片を作成し、PREB抗体およびPRL抗体を用いて同一の細胞に存在しているかを免疫組織科学的手法により検討する。ニワトリPREBには多くの変異ー多型がある事が明らかにされているが、この変異ー多型と品種との関係を明らかにするため、遺伝子構造解析を行う。PREB遺伝子の領域を2つに分け、エクソン1からエクソン5およびエクソン5よりエクソン9に分けてPCRによりPREB遺伝子断片を増幅させ、精製後に産物の塩基配列解析を行う。平成26年度は鶏品種のうち、名古屋種を集中的に解析する。申請者は愛知県との間に共同研究の経験があり、愛知県が維持している名古屋種の全ての系統(卵用、肉用を含む6系統:NG1NG6)の血液を多く有している。血液よりゲノムDNAを抽出後にPCRを行い、遺伝子配列解析を行い各系統における遺伝子多型頻度を検討する。肉用と卵用において明確な差が存在するかを検証する。解析数としては名古屋種としてはもっとも古いオリジナルの系統NG1を50サンプル、その他の系統はそれぞれ100150サンプルを予定している。本年度に予定している名古屋種の多型解析の解析試料と同時に前年度に解析できなかった試料の送付を行い、解析を同時に進める予定である。
咬合接触面積を用いた、義歯装着後の刺激唾液分泌量予測に関する研究

唾液分泌量は、薬剤の副作用、全身疾患、ストレス等により低下し、治療に際しては、薬物療法、唾液腺マッサージ、保湿剤使用などが行われている。しかし、高齢者の刺激唾液分泌量低下の一因として、咬合接触面積の減少が関連している可能性も考えられるが、実際に義歯装着前後の唾液分泌量を比較した報告は少ない。また、義歯治療後の刺激唾液分泌量予測に関する報告もない。したがって、1義歯装着時・未装着時の咬合接触面積と刺激唾液分泌量との関連を検討する、2義歯装着による刺激唾液分泌量の予測式を得ることを目的として研究を行った。対象は、新潟大学医歯学総合病院義歯診療室を受診した患者で、義歯使用時に疼痛を訴えていない47名(男性13名、女性34名、平均年齢70.4±8.8歳)とした。義歯の装着時および未装着時の刺激唾液分泌量(サクソンテスト)、咬合接触面積、咬合圧を同日に測定し比較した。義歯未装着時の刺激唾液分泌量は2.9±1.4g、装着時は3.2±1.9gで有意差は認められなかった。しかし、口渇の副作用がある薬剤服用者を除外して解析したところ(n=27)、義歯未装着時は2.6±1.2g、装着時は3.2±1.9gで義歯装着時のほうが有意に増加していた(p=0.008)。咬合接触面積および咬合圧と唾液分泌量との関連について解析したが、有意な差が認められなかった。したがって、本研究の目的の一つであった、義歯装着による刺激唾液分泌量の予測式を得ることはできなかった。今回、測定時間の都合上、各対象者につき、計測は1回しか行っていない。サクソンテストに対する慣れが、結果に影響を与えた可能性は否定できない。今後、複数回の計測および測定のランダム化を図る必要がある。本研究の結果、口渇の副作用がある薬剤を服用していない患者では、義歯装着により、刺激唾液分泌量が有意に増加することが示唆された。今後、その要因について更なる検討を重ねたいと考えている。
DSGEモデルを用いた新興市場国における経済変動の決定要因に関する経済分析

貿易の自由化、金融のグローバル化が進展している新興市場国において発生した種々の通貨危機、金融危機により、当該国通貨が急激に減価したことからも明らかなように、安定的なマクロ経済運営においては、金融アーキテクチャーが極めて重要な役割を果たすことになる。しかしながら、新興市場国は先進国に比べ、より大きな経済変動に晒されている。これには様々な要因が存在するが、その一つにドル化が挙げられる。なかでも債務のドル化、ならびに通貨代替の程度が経済変動(後退)に大きく影響することが知られている。具体的には、異なる負債のドル化、ならびに異なる通貨代替の程度を組み合わせたシナリオの下でカリブレーション、インパルス応答関数、無条件分散分析による定量的分析を行い、自国、外国の金融政策ショックが自国経済に及ぼす影響について分析を行った。その結果、負債のドル化は実質為替相場の変動によりfinancial acceleratorやdebt-deflationメカニズムを通じ、経済変動に有意な影響を及ぼすこと、また通貨代替の程度は負債のドル化以上により大きな経済変動をもたらすことが明らかとなった。この結果は、新興市場国における中央銀行は金融政策を行う際に、負債のドル化の観点だけではなく、通貨代替の程度も考慮することが重要であることを示唆するものである。当初の目標として掲げていた分析を行い、一定の成果を得ることができたが、定量的分析を行う際のシナリオをより細分化し、分析を精緻化することについては早急に対応したい。分析に用いる基本モデルのさらなる修正、ならびに分析結果の解釈についての精緻化を行い、雑誌への投稿を随時行っていく予定である。<次年度使用額が生じた理由>注文をしていた複数の書籍の刊行日が延期となったこと、予定していた英語による論文校正を実施することができなかったため。<使用計画>上記の注文していた書籍の購入、英語による論文校正を実施する。
前弧海盆形成過程から読み解く，プレート沈み込み運動像

日本列島は,地球上でも有数の沈み込み型プレート境界に位置し,列島の形成や地震に代表される地殻ダイナミクスは,プレートの沈み込み運動に起因する.そのため,日本列島の変動や大規模自然災害の発生機構を理解するには,沈み込み型プレート境界の運動像を明らかにすることが極めて重要となる.そこで本研究では,プレート運動像の解明を目的として,前弧海盆の形成過程解析を行う.前弧海盆は沈み込み帯に形成される堆積盆であり,その形成過程がプレート運動と連動することが注目されている.地質調査をベースにした地質構造解析や岩石試料を用いた圧密試験によって前弧海盆の形成過程を復元し,プレート沈み込み運動像の解明を目指す.日本列島は,地球上でも有数の沈み込み型プレート境界に位置し,列島の形成や地震に代表される地殻ダイナミクスは,プレートの沈み込み運動に起因する.そのため,日本列島の変動や大規模自然災害の発生機構を理解するには,沈み込み型プレート境界の運動像を明らかにすることが極めて重要となる.そこで本研究では,プレート運動像の解明を目的として,前弧海盆の形成過程解析を行う.前弧海盆は沈み込み帯に形成される堆積盆であり,その形成過程がプレート運動と連動することが注目されている.地質調査をベースにした地質構造解析や岩石試料を用いた圧密試験によって前弧海盆の形成過程を復元し,プレート沈み込み運動像の解明を目指す.
尿細管上皮とマクロファージによる甲状腺ホルモン受容体を介した線維化抑制機序の解明

[1]甲状腺機能低下症マウスおよび甲状腺ホルモン受容体KOマウスを用いた解析腎間質線維化に対する甲状腺ホルモンの影響を解析するために、低ヨード食とメルカゾールを投与して作成した甲状腺機能低下症マウスを用いて、一側尿管結紮を行い、腎線維化の程度を検討した。甲状腺機能低下症マウスでは、健常マウスに比べて著明な腎間質の線維化、腎線維化マーカーの上昇、炎症性マクロファージ浸潤の著明な上昇、炎症マーカーの上昇を認めた。同様に、甲状腺ホルモン受容体(TRα)KOマウスを用いてUUOを作成して評価したところ、野生型マウスに比べて著明な腎間質の線維化、腎線維化マーカーの上昇、炎症性マクロファージ浸潤の著明な上昇、炎症マーカーの上昇を認めた。これらの結果は、甲状腺ホルモン受容体を介したシグナルが、腎間質の線維化進展に対して保護的な作用を担っていることを示している。[2]TRαKOマウスを用いた骨髄移植による解析次に、私たちはこのTRαKOマウスにおいてマクロファージの腎間質への浸潤が増加していることから、マクロファージに発現しているTRαに抗炎症作用があるのではないかという仮説を立てた。そこで、TRαKOマウスの骨髄を野生型マウスに移植する方法で骨髄由来細胞特異的にTRαが欠損したマウスを作製してUUOを行ったところ、腎間質の線維化、腎線維化マーカーの上昇、炎症性マクロファージ浸潤の著明な上昇、炎症マーカーの上昇を認めた。これらの知見は、骨髄由来マクロファージに発現するTRαに抗炎症作用があることを示唆している。2018年度の研究で得られた結果は、当初の仮説通りのものであり、研究の進捗状況も概ね研究計画書の通りに進んでいるので、上記のような評価となっている。2018年度の研究が計画通りに進んでいるので、今後も研究計画書に沿って進める予定である。2019年度は培養マクロファージmφを用いた検討を中心に行う予定で、培養マクロファージ細胞株であるRaw264.7細胞のTRαをknock downし、LPSおよびTRリガンドであるT3の存在下で、炎症マーカーの発現やマクロファージ極性を解析する。また、TRαをknock downしたRaw264.7細胞をLPSで刺激後に尿細管上皮細胞や線維芽細胞と共培養し、これらの細胞の形質転換誘導においてマクロファージに発現するTRαが与える影響について検討する。
ヒストン修飾によるDNAメチル化維持活性促進機構の生化学的研究とその機能評価

様々な環境への対応や老化などの過程で、DNAやタンパク質の修飾が変化し、それが複雑な生理機能を制御している。タンパク質の中でも、特に核タンパクであるヒストンの修飾は、遺伝子発現などに関与し、修飾の種類より遺伝子発現の促進・抑制の両方に関与する。一方、DNAも修飾され、最も有名な修飾はシトシンのメチル化である。このDNAメチル化は、一般に遺伝子発現の抑制に関与し、細胞分化の過程でいったん形成されたメチル化パターンは細胞分裂を超え、安定に維持される。この維持には、維持型のDNAメチル化酵素(Dnmt1)が関与する。これまでのDnmt1の酵素反応の解析から、酵素自身ではすでに形成されたメチル化模様を95%ほどの効率でしか維持できないことがわかっている。言い換えると5%ほどの取りこぼしがでる。この性質だけなら、細胞分裂が数回繰り返されると、DNAメチル化は有意に低下すると予想される。そのため、私たちの細胞には、メチル化活性を促進させる何らかの機構があると考えて調べた結果、ユビキチン化ヒストンがその促進に関与することを見出した。酵素学的解析から、ユビキチン化ヒストンは、Dnmt1活性の活性化エネルギーを下げることも報告している。本年度は、その促進機構のメカニズムについてさらに詳細に調べた。ユビキチン化ヒストンは、メチル化反応の反応中間体形成を促進することは無いものの、Dnmt1はDNA分子上を滑ってメチル化する効率上げることを見出した。ほぼ当初の計画通り、研究は進行している。研究内容は、投稿する段階に入っている。現在、ユビキチン化ヒストンのDnmt1活性促進の分子機構について調べている。Dnmt1の活性促進は、ユビキチン化ヒストン以外にも、Dnmt1結合因子のUhrf1分子内のSRAが関与するこをすでに報告している。ユビキチン化ヒストン、SRAの両方とも、Dnmt1分子内RFTSドメインを介することが分かっている。そこで、今後、ユビキチン化ヒストンとSRAによる促進が同じ経路を通るのか、また異なる経路を通っているかを調べ、Dnmt1活性促進機構について詳細に明らかにする予定である。私の移動に伴い、未使用分の萌芽を優先的に使用したため、基盤Cの使用額が停滞した。
ヘム合成と分解の複合的調節機序と関連疾患群の病態の解明

本研究においては、ヘムの生合成系と分解系における蛋白質-蛋白質結合による複合的な調節の仕組みを明らかにすることによりその異常が直接関わる疾患群の病態の詳細な理解と病因の解明に貢献する事を目的として、さまざまな検討を行ない、下記の結果を得た。1.ヘム合成系及び分解系の諸酵素と結合する新規の調節蛋白質の同定を目的として、ヘム生合成系および分解系の蛋白質をbaitとしてYeast Two-hybrid法によりスクリーニングを行い、それぞれの蛋白質に結合して調節する可能性のある蛋白質を検索した。その結果、ヘムオキシゲナーゼ2(HO-2)と結合する蛋白質として20Sプロテアソームの構成蛋白質の一つを同定した。この蛋白質を培養細胞で強制発現させるとHO-2蛋白質の発現量が減少する事から、本蛋白質とHO-2蛋白質の結合はHO-2蛋白質の分解制御に深く関わるものと考えられる。本研究結果については論文として発表予定である。2.RNA interference(RNAi)を利用して鉄芽球性貧血の疾患モデル細胞を作成する事を目的とし、赤血球型アミノレブリン合成酵素(ALAS2)の発現を抑制する効果的なshort-interfering RNA(siRNA)の配列を同定し、その配列をshort-hairpin RNA(shRNA)として恒常的に細胞内で発現させるための発現ベクターを構築した。この発現ベクターを赤芽球系細胞株であるYN-1細胞に導入して安定形質発現体を得て(YN1-ALAS2low)、その形質の変化につき検討したが、鉄芽球性貧血の診断に必須である環状鉄芽球様の細胞は認められなかった。YN1-ALAS2lowにおけるALAS2の発現はoontrol細胞に比して実に低下していたものの各種薬剤ではその発現の誘導が確認されたことから、ALAS2の発現の抑制が不十分であったと考えられた。本研究においては、ヘムの生合成系と分解系における蛋白質-蛋白質結合による複合的な調節の仕組みを明らかにすることによりその異常が直接関わる疾患群の病態の詳細な理解と病因の解明に貢献する事を目的として、以下の検討を行なった。1.ヘム合成系及び分解系の諸酵素と結合する新規の調節蛋白質の同定を目的として、赤芽球におけるヘム合成の律速酵素である赤血球型アミノレブリン酸合成酵素や、ヘム分解の律速酵素であるヘムオキシゲナーゼ1をbaitとしてYeast Two-hybrid法を用いてそれぞれの蛋白質に結合して調節する可能性のある蛋白質を検索中である。それぞれについて、いくつかの候補遺伝子を同定し、更に確認中である。2.また、RNA interference(RNAi)を利用して鉄芽球性貧血の疾患モデル細胞を作成する事を目的とし、赤血球型アミノレブリン酸合成酵素の発現を抑制する効果的なshort-interfering RNA(siRNA)の配列を同定し、その効果を確認した。さらに赤芽球系細胞株において継続的に赤血球型アミノレブリン酸合成酵素の発現を抑制する事を目的に、siRNAで効果を確認した配列をshort-hairpin RNA(shRNA)として恒常的に細胞内で発現させるための発現ベクターを構築した。この発現ベクターを赤芽球系細胞株であるYN-1細胞に導入して安定形質発現体を得、その形質の変化につき検討中である。また、赤芽球系以外の細胞におけるヘム合成の律速酵素である非特異的アミノレブリン酸合成酵素や、ヘムオキシゲナーゼのそれぞれのアイソザイム(HO-1とHO-2)の発現を効率良く抑制するsiRNAの配列も同定し、これらの遺伝子の発現を恒常的に抑制するためのshRNA発現ベクターを構築中である。

本研究においては、生体に必須の分子であるヘムの生合成と分解系における複合的な調節の仕組みを明らかにすることにより、その異常が直接関わる疾患群の病態の詳細を理解することを目的として、以下の研究を行った。1.ヘム生合成系および分解系の諸酵素と結合してその機能を調節する新規の蛋白質の同定を目的としてYeast Two-hybrid法によりスクリーニングを行った。このうち、ヘム分解の律速酵素の一つであるヘムオキシゲナーゼ2(HO-2)と特異的に結合する蛋白質としてユビキチン特異的蛋白質分解系の一部を構成する蛋白質を同定し、その結果を現在投稿中である。また、ヘム分解系の律速酵素であるHO-2の発現を抑制するsiRNAを培養細胞に導入すると、もう一方のアイソザイムであるHO-1の発現が増強することを明らかにして報告した。2.RNA interference(RNAi)を利用して鉄芽球性貧血の疾患モデル細胞を作成する事を目的とし、赤血球型アミノレブリン酸合成酵素の発現を効率よく抑制するshort-interfering RNA(siRNA)の配列を同定した。さらに赤芽球系細胞株において恒常的に赤血球型アミノレブリン酸合成酵素の発現を抑制する事を目的に、siRNAで効果を確認した配列をshort-hairpin RNA(shRNA)として細胞内で発現させるための発現ベクターを赤芽球系細胞株であるYN-1細胞に導入して安定形質発現体YN-1(ALAS2low)を得て、その形質の変化につき検討した。その結果、YN-1(ALAS2low)においてはALAS2遺伝子の発現低下により明らかにヘム合成量が減少し、ヘモグロビンの合成量も減少した。しかしながら当初予想していた様な、鉄芽球性貧血の特徴である環状鉄芽球様の細胞(ミトコンドリアへの過剰な鉄の沈着)は観察されなかった。
ミセルの脂質膜への結合・融合過程の分子論的機構

本研究では、球状ミセル同士、あるいは球状ミセルの脂質膜表面への結合過程、さらにエネルギー障壁を乗り越えての融合過程について、分子動力学シミュレーションに基づく自由エネルギー解析を行った。対象系として、代表的な球状ミセルであるSDSミセルを、また実在細胞膜のモデルとしてPOPCからなる脂質二分子膜の平面膜のパッチを用いた。ミセルがミセル表面や膜表面へと結合し、熱揺らぎにより融合に至るまでの分子レベルのメカニズムを解明し、さらにミセルの結合や融合に要する時定数をキネティクスの解析から評価した。ミセルが脂質膜表面に結合するまでの自由エネルギー変化および結合のキネティクスを、分子動力学(MD)計算を用いて評価した。球状ミセルと脂質膜純膜からなる系をシミュレーションの対象とし、ミセルのバルクから膜表面に至るまでの平均力ポテンシャルを評価した。十分に平衡化させたミセルおよび膜をそれぞれ個別に準備し、それらを1つの系にまとめ、ミセルと膜が離れた状態から互いに接触するものまでについて、初期配置を複数用意した。ミセル中心と膜中心間の距離zに拘束をかけつつMD計算を実行し、ミセルと膜の間の平均力F(z)、およびF(z)の積分より得られる平均力ポテンシャルΔG(z)を距離zの関数として評価した。ΔG(z)から、ミセルと膜表面との相互作用レンジやその強さについての解析を行った。これをもとに、バルクと膜表面との間でのミセルの分配に関する解析をおこなった。なお、本研究において用いる高並列用汎用分子動力学計算ソフト“MODYLAS"に関して、今回対象となるミセル・脂質膜共存系でも効率的に利用できるよう、直方体セルでも計算可能なように拡張をあらかじめ行い、それを用いてMD計算を実施した。平均力F(z)の揺らぎから、第二種揺動散逸定理を用いて、拡散係数D(z)をzの関数として評価した。これとΔG(z)をもとに、透過係数のモデル(J. Phys. Chem. 98,4115(1994))にしたがって解析し、結合状態と解離状態の間の移行速度の評価を試みた。平成27年度は、ミセルの膜への融合メカニズムの解明を目指した研究を開始した。まずはミセルと膜との親和性を評価するために、バルクの水中にある界面活性剤がミセル中および膜中とに移行した場合の自由エネルギー変化を評価した。バルク水中からミセル中への移行の自由エネルギーをΔGm、バルク水中から膜中への移行の自由エネルギーをΔGbとすると、ミセルと膜との自由エネルギー差は、ミセルを基準としてΔGb-ΔGmである。ここでは、界面活性剤として、イオン性、非イオン性、両性イオン性及び非イオン性の界面活性剤として、SDS、DTAC、DDAOおよびC12E8を選び、また脂質分子としては生体膜のモデルとしてPOPCを選んだ。複数の界面活性剤分子をターゲットとすることによって、効率的に膜への親和性の高い界面活性剤分子の探索を行った。さらに界面活性剤分子のヘッドグループの違いによる膜への親和性の差異に関して分子論を展開した。並行して、ミセルの膜への結合・融合過程の平均力ポテンシャル計算を進めた。自由エネルギー計算には、平均力計算による方法およびWHAM法のいずれが適しているかについての事前検討を行った。ミセルと膜が融合する前後で対象系のトポロジーが変化する。したがって、融合により反応座標の連続性が失われる。本研究では、膜表面へのミセルの結合と、それらが融合して一体化してしまう状態との間の遷移状態について、近似的な取扱をすることによって連続的に結び付ける試みを行った。これらの計算は自由エネルギー計算が主であるため、計算負荷がきわめて大きい。短期間での効率的な実施を可能とするために、本課題で導入したコンピュータの他に、分子科学研究所計算科学研究センターのスパコンを併用しつつ研究を実施した。予定していた2種類の計算、すなわち、ミセルと膜の間の界面活性剤分子の移行自由エネルギー計算、およびミセルと膜との融合シミュレーションのいずれも実施できたため。薬物の細胞膜透過過程をはじめとする種々の生体分子過程において、ミセルと膜との相互作用が重要な役割を担っている。本研究では、ミセルと脂質膜との相互作用に関する微視的知見を得るために、古典系の全原子分子動力学計算による自由エネルギー解析を進めてきた。ミセルや膜単体についての溶液中における安定性の評価、およびミセル同士の相互作用についての評価を行ったうえで、ミセルのバルク水中から膜表面への結合過程について、ミセル重心と膜表面間の距離を反応座標とした自由エネルギー解析を実施した。さらに、膜表面に結合したミセルの膜への融合過程についても検討を進めた。ミセル単体の安定性については、水中に分散したSDSの会合過程における動的スケーリング則(Chem. Phys. Lett.(2015))を初めて示し、また生成した球状ミセルの界面張力に対する局所圧力の寄与の分子論を展開した(J. Chem. Phys.(2016))。これらはいずれも親水基の静電相互作用に支配されていることを明らかにし、さらに、陰イオン性のSDSのみならず、陽イオン性のDTACや両性イオン性DDAO、非イオン性のC12E8といった異なる荷電状態の界面活性剤へと対象を拡張することによって、親水基の荷電状態とミセルの安定性、会合挙動、構造(J. Mol. Liq.(2016))との密接な関連性を明らかにした。

またミセル同士、およびミセルと膜との会合過程においても、それぞれの表面の親水基近傍における電気二重層の斥力的な相互作用により、会合が著しく抑制されることが明らかとなった。速度論的な解析に基づいて会合の時定数を評価したところ、単純な球状SDSミセル同士の会合においても数十μ秒に及ぶ長い時間を要することが明らかとなった。本研究では、球状ミセル同士、あるいは球状ミセルの脂質膜表面への結合過程、さらにエネルギー障壁を乗り越えての融合過程について、分子動力学シミュレーションに基づく自由エネルギー解析を行った。対象系として、代表的な球状ミセルであるSDSミセルを、また実在細胞膜のモデルとしてPOPCからなる脂質二分子膜の平面膜のパッチを用いた。ミセルがミセル表面や膜表面へと結合し、熱揺らぎにより融合に至るまでの分子レベルのメカニズムを解明し、さらにミセルの結合や融合に要する時定数をキネティクスの解析から評価した。ミセルと脂質膜との間のMD計算による平均力および自由エネルギープロフィールの本計算を順調に実施できており、研究は概ね順調に実施できている。また並行して、トラジェクトリについての解析も実施している。溶媒や対イオンの効果についても検討を進めており、ミセル表面に露出する疎水基や、ミセル周囲や膜表面におけるイオン雰囲気、電気二重層の寄与についても知見を得ている。前年度までに得られたミセルと膜の融合の平均力ポテンシャルに加えて、膜近傍でのミセルの拡散性の評価を行うことにより、膜融合のキネティクスを明らかにする。原理的にはミセル・膜の融合現象は動的NMRによって観測可能であるが、実際に観測された例は知られていない。本計算で得られたキネティクスの知見をもとに、NMRによる観測可能性の評価を行い、測定可能な場合にはNMRの測定パラメータの提案や、得られるシグナルの形状の予測を行う。さらに得られた平均力ポテンシャルやメモリー関数をもとに、ミセル・膜系のランジュバン動力学シミュレーションを行い、膜近傍でのミセルの分布や融合の頻度についての大規模シミュレーションを実施する。得られた計算結果について可視化し研究成果を内外に発信する。物理化学初年度に進めてきミセルの膜との接触までの結合過程から、さらに両者の融合過程へと研究を進める。はじめに、ミセル中の界面活性剤分子が膜に自発的に移行し融合するか否かを判定するために、ミセル中と膜中とにおける界面活性剤分子の自由エネルギーを比較し、結合状態の安定性評価を行う。これよりその後、融合のシミュレーションを実施し、融合のメカニズム解明に向けた解析を行う。すでに利用中のデータバックアップシステムを活用することにより、平成27年度に導入を予定していたハードディスク及びレイドシステムの導入を見合わせることができた。これにより、本年度は未使用額が生じた。研究開始当初に導入を計画していたMD計算解析用コンピュータと同等の性能を持つ後継機種の価格が下がったため。データバックアップシステムはそろそろ容量的に限界にあり、また研究実施概要でも述べたとおり、研究の進捗に伴い計算量が当初より増えたため、取り急ぎバックアップ用のハードディスクが必要である。前年度未使用分はこの経費に充てる。種々のミセルや膜についての検討を行っており、分子動力学計算の実行数が当初予定より多くなる可能性があるため、生成データ量も増加する見込みである。
各種正常および悪性腫瘍における糖鎖抗原発現分布と糖転移酵素遺伝子発現の定量

血液型関連糖鎖抗原であるsialylLewis^xあるいはsialyl Lewis_a(sLe^a)抗原は、大腸、膵臓、胃、肺などの癌組織で発現しており、腫瘍マーカーとして臨床診断にも応用されている。大腸腺癌患者および非小細胞肺癌患者より手術時に腫瘍部位とその周辺の非腫瘍部位を採取した.その生体組織サンプルを使用して、抗ialyl Lewis抗原抗体によって免疫組織染色、およびその生合成に寄与することが考えられる12種類の糖転移酵素遺伝子の発現の定量を行った.大腸癌患者11名については、腫瘍部位においてFuc-TTV,ST3Gal IIの増加、ST3Gal IIIの減少が見られた.他の酵素については統計上相関はしないが個々では上昇傾向であった.また、sialyl Lewis抗原の発現量と相関する糖転移酵素は見いだせなかった.この結果、癌化における糖鎖抗原の変化は、複数の酵素が同時に上昇する協同作用の結果と考えられた.近年さらに多くの糖転移酵素遺伝子のクローニングが報告されており鍵酵素もその中にある可能性がある.肺非小細胞癌の患者20人については5種類のα1,3Fuc-T遺伝子の定量を行った.Fuc-TIIIが最も多く発現しており、腫瘍部位で全例増加していた。Fuc-TVIは低発現であるが、腫瘍部位での増加し、比活性も高いことから、sLex抗原の発現に関与していると考えられた。ウェスタン解析により、4人のルイス陰性患者ではsLe^X抗原の発現が見られたが、sLe^a抗原は全く発現していなかった.Le遺伝子型を考慮に入れると、肺癌組織中のsLe^X抗原量はFuc-TIIIとFuc-TVIの2種類の酵素の活性総和量ときわめて相関していた.すなわち、Fuc-TIIIとFuc-TVIが鍵酵素となり、肺癌組織中のsLexを決定していると結論できた.生体組織サンプルは、大腸腺癌患者11人の外科手術時に腫瘍組織とその周辺の非腫瘍組織を採取した。免疫組織染色により、11例すべての正常組織部にはsLe^x,sLe^a抗原の陽性像は見られなかったが、癌組織部位ではすべての患者にsLe^x抗原の陽性像が見られた。sLe^a抗原は11例中6例の癌組織に陽性像が見られた。各組織よりcDNAを合成して、competitveRT-PCR法によってシアリル化Lewis抗原生合成に関与する11種類糖転移酵素遺伝子の発現を検討した。5種類のα1,3フコース転移酵素のうち、Fuc-TIIIが最も多く発現しており、Fuc-TIVとVIはFuc-TIIIの約半分量の発現が見られた。Fuc-TV,VIIはほとんど発現は見られなかった。腫瘍部位と正常部位を比較するとFuc-TIII,VIの発現はほとんど変化がないが、Fuc-TIVの発現は11例すべての癌組織で上昇していた。4種類のα2,3シアル酸転移酵素遺伝子のうち、ST3Gal IVが最も多く発現しており、ST3GAl I、II、IIIの発現は、それぞれST3Gal IVの20%、10%、10%であった。ST3Gal IとIIは腫瘍部位で増加し、ST3Gal IIIが減少していた。ST6Gal I、β1,4GalTとCore2 GnTは、わずかながら腫瘍部位で増加する傾向であったが、腫瘍部位と正常部位で劇的な変化は見られなかった。大腸腺癌では、癌化により発現量が変化する酵素とsLe^x,sLe^a抗原の発現変化との関連は見いだせなかった。癌化における糖鎖抗原の変化は、複数の酵素が同時に上昇する協同作用の結果と考えられたが、未知の酵素が存在する可能性を否定できない。母核構造及び末端構造を合成する未知の鍵酵素が、まだ存在する可能性も残されている。ウェスタン解析により、4人のルイス陰性患者ではsLe^X抗原の発現が見られたが、sLe^a抗原は全く発現していなかった.Le遺伝子型を考慮に入れると、肺癌組織中のsLe^X抗原量はFuc-TIIIとFuc-TVIの2種類の酵素の活性総和量ときわめて相関していた.
新たな高感度リキッドバイオプシーによる進行肝癌治療マネージメントへの挑戦索

進行肝細胞癌の治療薬の第一選択肢は分子標的薬であり非常に高価なチロシンキナーゼ阻害薬が中心である.しかしながら,本薬剤の治療効果を早期に判定できる血清バイオマーカーは存在せず,無効な薬剤の漫然とした投与による副作用出現や医療費の高騰をもたらしている.各種治療の効果判定を早期に可能とする血清バイオマーカーとしてリキッドバイオプシーに注目した.本研究では極少量のDNAからでも任意の遺伝子のメチル化レベルを1コピーでも測定可能としており,候補遺伝子の肝癌の治療効果判定としての有用性を検証する.これにより,不必要な薬剤投与の抑制による医療コスト削減や副作用減少につながることが期待される.進行肝細胞癌の治療薬の第一選択肢は分子標的薬であり非常に高価なチロシンキナーゼ阻害薬が中心である.しかしながら,本薬剤の治療効果を早期に判定できる血清バイオマーカーは存在せず,無効な薬剤の漫然とした投与による副作用出現や医療費の高騰をもたらしている.各種治療の効果判定を早期に可能とする血清バイオマーカーとしてリキッドバイオプシーに注目した.本研究では極少量のDNAからでも任意の遺伝子のメチル化レベルを1コピーでも測定可能としており,候補遺伝子の肝癌の治療効果判定としての有用性を検証する.これにより,不必要な薬剤投与の抑制による医療コスト削減や副作用減少につながることが期待される.
イデユコゴメの葉緑体ヌクレオイドからみた真核藻類の起源

(1)今回購入したオリンパス落射型蛍光顕微鏡装置を用いて、イデュコゴメの培養細胞についてDAPI染色法によるオルガネラ核構造の観察を行ない、また顕微鏡テレビ法を用いてDNAの定量化に努めた。RK-1型,M-8型ともに細胞核・葉緑体核・ミトコンドリア核の分化は認められるが、RK-1型は現在知られている真核藻類としては最も下等なものと考えられ、葉緑体ヌクレオイドは棒状(CN型)で、藍藻に近縁でありDNA量も少ない。M-8型は環状(CL型)であって、褐藻や珪藻に近縁のものと考えられる。今回は中枢(細胞核)と端末(葉緑体核)とのDNA量を定量化することによって、真核化の度合いを示すめやすとし、細胞進化機構を比較検討した。(2)イデュコゴメM-8型はブドウ糖を加えた有機培地の方が、明暗両条件ともに良好な発育を示すので、このDG細胞に光を照射し、葉緑体核と光合成活性およびヒル反応との量的関係を求めた。その結果、DG細胞の光合成活性は失われているが、光照射によって3日間で構造機能ともに旧に復した。その間のヌクレオイド蛍光像を画像解析装置によって面積定量を行なった結果、葉緑体およびヌクレオイドの量的増加が光合成活性の増加とよく対応した。(3)イデュコゴメ細胞の同化産物については、既に低分子炭水化物特にフロリドシド類についての分析結果を発表しているが、今回は炭化水素および脂肪酸についてガスクロによる分析を行なった。M-8型とRK-1型はこの点でも特徴的な違いを有し、RK-1型は相当量の奇数炭素系のn-アルカン酸を有する特異的な微細真核藻類であることを示した。(4)イデュコゴメ細胞の生態学的分布とモノグラフについては今研究期間中も調査を続行し、新たに草津、万座、渋などの温泉中から本藻の新株を採集分離した。
相関影像法による3次元内部イメージング

散乱媒体の背後に隠された物体をイメージングする手法は、多くの応用が期待されていることから、様々な検討が行われてきた。本研究では、申請者の保持しているレンズレス位相シフトデジタルホログラフィック顕微鏡技術、平面導波路型デジタルホログラフィック顕微鏡システムの技術、および相関演算技術を元に、散乱媒体の背後や内部への3次元イメージング手法を開発する。2018年度は、強く薄い散乱層の背後にある3次元物体のイメージングとして、インラインデジタルホログラフィによる散乱媒体(拡散板)の背後の顕微3Dイメージングシステムを提案し、実証した。通常、拡散板の背後にある物体は、拡散板により散乱され、直接観察することができない。そこで被写体側に参照点光源をインラインで付加し、物体光と干渉させて、その干渉縞を取得することで、拡散板背後のイメージングを行う手法を提案し、実験により実証した。拡散板上に形成されるが散乱されてしまう参照光と物体光波の干渉縞は、拡散板上の光強度をレンズにより撮像素子に結像させることで取得した。ここで、参照光を位相シフトすることによって1次光のみの再生像を抽出した。基礎的な原理実験光学系により、伝搬距離が異なる位置でそれぞれの物体にフォーカスが合う3次元イメージングや、ビースを用いた定量位相イメージングを実現した。当初の計画通り、2018年度は薄く強い散乱層の背後にある3次元物体のイメージングにおいて、視野の拡大や高精度複素振幅分布の取得を目指し、下記の項目を実施した。さらに、CGIの高速化やCGIによる3次元イメージングへ向けた基礎検討として、光相関を利用した計算機ゴーストイメージングを提案し、実証した。1.位相シフトデジタルホログラフィーの光学系を元に、追加光学系を加えて強い散乱層の背後にある3次元物体イメージングシステムを開発した。ここで、薄く強い散乱層をすりガラスと仮定し、光学系を構成する要素デバイス(撮像素子など)の仕様を制約条件として、光学系設計法と分解能に関して定量的に考察し、実証した。2.インラインデジタルホログラフィによる散乱媒体の背後の顕微3Dイメージングにおいて、複数点光源用デバイスの基礎設計を実施した。3.光相関を利用した計算機ゴーストイメージングを提案し、実証した。2019年度では下記の項目を実施する予定である。1.インラインデジタルホログラフィによる散乱媒体の背後の顕微3Dイメージングにおいて、平面導波路型位相シフトデジタルホログラフィーの光学系を拡張し、複数点光源の導入効果に関する光学系設計とデバイスの試作を実施する。2.散乱媒体の背後の3次元内部イメージングに向けたデバイスを設計・試作する。3.光相関計算機ゴーストイメージングを利用した3次元イメージングや散乱媒体背後のイメーイングを実施する。

2018年度に購入を予定していた光学部品において、より詳細な設計を実施した後に購入するほうが、本研究の目的に適したシステムを構築できることが分かった。そのため、2019年度にその助成金を繰越し、詳細設計を実施したうえで、光学部品を購入することとした。
触媒的ビスメタル化における多元素系活性中間体の精密反応制御と相補的分子構造構築

触媒的ビスメタル化の触媒サイクルにおける鍵化学種「多元素系活性中間体」の反応挙動制御に注目し、位置選択性の決定に関わる鍵因子を明らかにするとともに、この中間体の新たな機能開拓および相補的な分子構造構築のための方法論確立を目的として研究を行った。平成21年度は、平成20年度の研究において確立したアルキンの位置逆転シリルホウ素化を基に、交付申請書に記載の研究項目「精密分子変換手法への応用」ならびに「鍵中間体の同定と反応機構の解明」を主として実施した。位置逆転シリルホウ素化により調製した化合物をアルカリ金属の水酸化物で処理したところ、ケイ素上への酸素原子の導入とボリル基への分子内配位が連続的に進行し、5員環構造を有する4配位ホウ素化合物へ効率よく変換できることが明らかとなった。この4配位ホウ素化合物を用いてパラジウム触媒の存在下ハロゲン化アリールとの反応を行ったところ、通常反応の進行に必須となる塩基を必要とせずにボリル基部位でのカップリングが効率よく進行したことから、4配位構造形成による効果的なホウ素部位の活性化が達成されていることが明らかとなった。また、触媒的位置逆転シリルホウ素化の反応機構に関する知見を得るために、化学量論反応による検討を行った。パラジウム前駆体、1-ボリル-2-プロモアルケン、およびシリルリチウムの化学量論反応により、触媒反応中間体と想定されるパラジウム錯体の調製を検討したところ、錯体の形成は確認できなかったものの、触媒条件と同一の生成物が得られたことから、ボリル基の転位を伴なう素反応過程の存在が明らかとなった。本知見と平成20年度に得た知見を総合的に考察することで、位置選択性制御を合理的に説明可能な特徴ある触媒反応機構を提案することができた。これらの知見は、触媒的ビスシリル化を基軸とする精密有機合成手法の確立と新様式の触媒反応開拓に資すると考えられる。交付申請書に記載の「研究項目1.アルキンの触媒的"位置逆転シリルホウ素化"の開発」において、まずシリルボランのケイ素上の置換基効果、および触媒上の配位子の電子的.立体的効果について検討した。モデル基質として1-オクチンを用いて検討を行った結果、ケイ素上にクロロ基が置換したシリルボランを用い、立体的にかさ高く電子供与性の強いリン配位子を有するパラジウム触媒存在下反応を行うことにより、位置逆転シリルホウ素化が選択的に効率よく進行し、シリル基が末端炭素にボリル基が内部側炭素に導入された付加生成物が収率よく得られることを見出した。次にこの最適条件を用いて様々なアルキンに対する反応を検討したところ、脂肪族末端アルキンでは置換基の立体的な影響を大きく受けることなく反応が進行し高い位置選択性で付加生成物が得られたのに対し、芳香環の置換した末端アルキンでは選択性が低下することが明らかとなった。また、分子内にクロロ基やシアノ基などが存在する基質に対しても問題なく反応が進行し、本反応が高い官能基選択性を示すことが明らかとなった。これらの知見を基に、交付申請書に記載「研究項目2.鍵中間体の同定と反応機構の解明」において、分子内に非等価な反応部位を有する1,6-ジインおよびエンインのシリルホウ素化を検討した。その結果、得られた生成物の構造からシリルボランのボリル基がシリル基に優先して有機分子へ導入されていることが示唆された。これらの知見は触媒中間体の構造と反応挙動の理解に有用であり、その特徴に基づいた新しい分子変換手法の確立に資すると考えられる。

パラジウム前駆体、1-ボリル-2-プロモアルケン、およびシリルリチウムの化学量論反応により、触媒反応中間体と想定されるパラジウム錯体の調製を検討したところ、錯体の形成は確認できなかったものの、触媒条件と同一の生成物が得られたことから、ボリル基の転位を伴なう素反応過程の存在が明らかとなった。本知見と平成20年度に得た知見を総合的に考察することで、位置選択性制御を合理的に説明可能な特徴ある触媒反応機構を提案することができた。これらの知見は、触媒的ビスシリル化を基軸とする精密有機合成手法の確立と新様式の触媒反応開拓に資すると考えられる。