hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
バイオエアロゾルの対流圏広域拡散:気球搭載蛍光粒子カウンターの開発と観測への応用

本研究では大気中の蛍光粒子をリアルタイムでカウントする蛍光粒子カウンターの開発を行った。さらにその応用として大気中の微生物粒子(バイオエアロゾル)の濃度計測を試みた。バイオエアロゾル計測では、代謝活動時に生成されるNADHを対象の蛍光分子として、実験・評価を行った。本研究のもう一つの目的として、気球に搭載可能なものにするため、小型、軽量、バッテリー駆動のシステムを設計した。開発では既存の光散乱式粒子カウンターの光源、光検出器を適切なものに変更し、また蛍光のみを検出する光学系を設計した。加えて、電波でデータを転送するシステムを構築した。実験ではPSL蛍光粒子、およびHADH、微生物、、黄砂を粒子化した試料を用いた。PSL蛍光粒子およびNADHでは、粒子数濃度を精度良く計測できることが確認された。黄砂粒子からは蛍光を検出しなかった。微生物を用いた計測試験では十分な蛍光シグナルを検出できなかった。そこで、各種試料の蛍光強度の計測を行い検討した。結果として、微生物の蛍光強度は非常微弱であり、本研究で開発した装置では微生物に対しては十分なS/N比が得られなかったと考えられる。ただし、ある種の有機物を検出可能とし、従来のエアロゾル粒子カウンターでは計測できなかった新たなパラメーターを取得することに成功した。今後、本研究を発展させることで、野外観測において有効なツールとなると考えられる。一方で、中国の黄砂発源地において気球を用い、バイオエアロゾルの観測を実施した。観測では、大気中に浮遊する黄砂粒子の1割程度がその表面に微生物を付着させており、微生物の付着は鉱物種によらないということを明らかにした。黄砂とバイオエアロゾルの混合状態に関する研究はこれまでになく、今回得られた成果は、黄砂バイオエアロゾルの挙動に関する理解にとどまらず、多くの分野で波及効果をもたらす結果であると思われる。本研究の目的は、光散乱式粒子カウンターの光源に紫外波長の光源を用いることで、蛍光を発する粒子(特に、バイオエアロゾル)の個数濃度を計測するシステム(蛍光粒子カウンター)を開発することである。開発の第一段階として、光散乱式パーティクルカウンターの光源(780nm)をより短波長の光源に交換し、標準粒子(PSL粒子、蛍光PSL粒子)を使用し、室内において計測テストを行った。励起光源には、(1)緑色レーザ(YAG,532nm)、(2)紫外LED(365nm)、(3)紫外レーザ(半導体,375nm)を用いてテストを行った。蛍光は、光学フィルターにより特定の波長を検出する。室内テストの結果は以下のとおりであり、それぞれ上記の番号の光源に対応する。(1)3μmの標準蛍光粒子を用いたところ、蛍光を検出できたが、信号は微弱であった。(2)このため、励起エネルギーの高い紫外LED(365nm,5mW))を組み込み、室内実験を行った。しかし、LED光源の指向性および出力の問題のため、粒子からの蛍光が非常に微弱であり、検出器でシグナルを検知できなかった。(3)紫外域半導体レーザ(375nm,20mW)を光源として、PSL粒子(1μm,2μm,3μm,5μm)、蛍光PSL粒子(3μm)を使用したテストを行い、蛍光粒子の計測に成功した。PSL粒子散乱光は、赤・黄の両フィルターで十分カットでき、黄色フィルターを装着することで蛍光PSL粒子からの蛍光信号のみを検出できた。紫外レーザ取り付けにより、蛍光粒子だけを分離して測定が可能であることを確認した。さらに、実際の大気環境中に常在している枯草菌(Bacillus subtilis)、酵母(Saccharomyces cerevisiae)、大腸菌(Escherichia coli, K-12 F+繊毛有;W3110 F-,繊毛無)を継代培養し、これらをエアロゾルとして発生させ、蛍光カウンターを用いた計測テストを試みている。今後は、大気エアロゾルの主要構成粒子である硫酸塩、代表的な鉱物種、海塩粒子を用い、バイオエアロゾルと無機エアロゾルの分類試験を行う。一方で、開発装置を野外で使用する際の観測候補地の視察(熊本県、石川県、中国敦煌市)および気球を用いた高高度でのバイオエアロゾルサンプリングを行い、蛍光粒子カウンターを用いた野外観測に備えた。本研究では大気中の蛍光粒子をカウントするシステム(蛍光粒子カウンター)を開発し、大気中の微生物粒子(バイオエアロゾル)濃度を計測しようとするものである。対象とする蛍光分子は、細胞の代謝活動時に生成されるNADHである。前年度は、光散乱式粒子カウンター(Optical Particle Counter,OPC)の光源を紫外波長帯のレーザに変更し、検出器前に光学フィルターを取り付けることにより蛍光のみを検出する光学系を構築した。本年度は実験室内を中心に、蛍光粒子カウンターの性能チェック及び改良を行った。室内実験ではネブライザー方式(噴霧方式)の粒子発生装置により各種粒子(PSL粒子、PSL蛍光粒子、微生物、黄砂標準粒子、スギ花粉)を発生させ、粒子の濃度・粒径および微生物の生死割合を調べた上で、蛍光粒子カウンターで粒子を計測した。微生物試料ではシグナルを十分検出ができなかったため、光学フィルターと光検出器の再検討を行い、光学フィルターを400nmカットのシャープなものに、検出器を光電子増倍管(PMT)に交換した。結果、微生物からの蛍光を十分に検出できるようになり、屋外での観測に利用できる可能性が示された。

今後は黄砂粒子および花粉粒子発生法の検討、海塩粒子・硫酸(塩)粒子を用いた蛍光バックグラウンドの評価、エアロゾルの内部混合状態にともなう蛍光への影響の評価を行う。また、黄砂発生源と熊本県において係留気球を用いたバイオエアロゾル観測を実施し、蛍光粒子カウンターを用いた気球観測にむけての予備実験とした。本研究では大気中の蛍光粒子をリアルタイムでカウントする蛍光粒子カウンターの開発を行った。さらにその応用として大気中の微生物粒子(バイオエアロゾル)の濃度計測を試みた。バイオエアロゾル計測では、代謝活動時に生成されるNADHを対象の蛍光分子として、実験・評価を行った。本研究のもう一つの目的として、気球に搭載可能なものにするため、小型、軽量、バッテリー駆動のシステムを設計した。開発では既存の光散乱式粒子カウンターの光源、光検出器を適切なものに変更し、また蛍光のみを検出する光学系を設計した。加えて、電波でデータを転送するシステムを構築した。実験ではPSL蛍光粒子、およびHADH、微生物、、黄砂を粒子化した試料を用いた。PSL蛍光粒子およびNADHでは、粒子数濃度を精度良く計測できることが確認された。黄砂粒子からは蛍光を検出しなかった。微生物を用いた計測試験では十分な蛍光シグナルを検出できなかった。そこで、各種試料の蛍光強度の計測を行い検討した。結果として、微生物の蛍光強度は非常微弱であり、本研究で開発した装置では微生物に対しては十分なS/N比が得られなかったと考えられる。ただし、ある種の有機物を検出可能とし、従来のエアロゾル粒子カウンターでは計測できなかった新たなパラメーターを取得することに成功した。今後、本研究を発展させることで、野外観測において有効なツールとなると考えられる。一方で、中国の黄砂発源地において気球を用い、バイオエアロゾルの観測を実施した。観測では、大気中に浮遊する黄砂粒子の1割程度がその表面に微生物を付着させており、微生物の付着は鉱物種によらないということを明らかにした。黄砂とバイオエアロゾルの混合状態に関する研究はこれまでになく、今回得られた成果は、黄砂バイオエアロゾルの挙動に関する理解にとどまらず、多くの分野で波及効果をもたらす結果であると思われる。
βグルカン分岐多糖類の精密有機合成とその機能評価

本研究は、βグルカン分岐多糖の化学合成法の開発のその機能評価を行なった。まず、βグルカン多糖の部分構造の効率的な合成法の開発を行った。まう、β(1、3)16糖主鎖とする分岐および直鎖オリゴ糖の合成を行なった。合成糖鎖の機能評価を行ったところ、末端にアミノ基を有する16糖誘導体がDectin-1に対する高い親和性とDectin-1を介した自然免疫活性化能を有することを明らかにした。天然には特異な生物活性を示す多糖が多く存在する。しかしながら、それら多糖は一般に不均一である。さらに多糖を部分加水分解したオリゴ糖は分離精製が困難であり、純粋なオリゴ糖サンプルを入手することも困難である。そのため、多糖の生物活性発現に関与する糖鎖構造の解明や、その生物活性発現機構の解明は困難である。本研究では、精密有機合成本研究は、高度な化学合成技術を利用して、構造明らかな関連多糖の化学合成を行なうことによって、その生物活性発現機構を明らかにすることを目指した。特に、自然免疫活性化作用を有するβグルカン多糖関連オリゴ糖の合成を行なうことにより、その構造活性相関を明らかにすることを目的とした。本年度は、糖供与体および糖受容体部分を独立に設計した2糖ユニットを基盤とした1、3βグルカン直鎖糖の効率的な合成法の開発を行なった。その結果、ジオール型糖受容体を用いた場合に高収率で目的とするβ1、3結合が構築できることを見出した。本ユニットを用いて、直鎖型の糖鎖の合成を検討したところ、16糖の保護糖の合成を達成した。得られた保護多糖誘導体の固相脱保護法による脱保護を検討した。その結果、16糖という大きな糖鎖であっても、固相上に固定化できかつ、その脱保護がスムーズに進行することを明らかにした。本研究では、高度な化学合成技術を利用して、構造明らかな関連多糖の化学合成を行なうことによって、その生物活性発現機構を明らかにすることを目指した。本年度は、昨年度開発した合成ルートに基づいた直鎖および分岐鎖の合成を検討した。その結果、4、8、12、16糖からなるβ(1、3)直鎖オリゴ糖および、その糖鎖にβ(1、6)分岐糖を有する5、9、13、17糖の合成を達成した。さらに、ビーズに固定化したこれらの糖鎖に対する可溶性Dectin-1の結合試験を行ったところ、16糖、および17糖を固定化したビーズに対して、Dectin-1が結合可能であることを見出した。さらに、固定化された糖鎖によるDectin-1を介した免疫活性化作用を測定したところ、これらの誘導体は弱いながらもDectin-1に対するアゴニスト作用を有することを明らかにした。さらに多糖を部分加水分解したオリゴ糖は分離精製が困難であり、純粋なオリゴ糖サンプルを入手することも困難でオリゴ糖は分離精製が困難であり、純粋なオリゴ糖サンプルを入手することも困難である。これまでに、合成したβ(1、3)16糖を固定化微粒子は、デクチン-1結合作用を有することとその微粒子が弱いながらデクチン-1を介した免疫活性化作用を有することを見出している。本年度は、より低分子の結合性リガンドの探索を目的に、オリゴ糖を3量化できるテンプレートの開発を目指した。クリックケミストリーを用いる3量化テンプレートについて検討を行なったが、16糖のような大きなオリゴ糖の3量化は達成できなかった。

しかしながら、本研究を検討している中で、末端にアミノアルキル基を有する16糖は、微粒子に固定化した誘導体よりも高いデクチン-1結合作用を有することを明らかにした。さらに、本誘導体は、デクチン-1を介して自然免疫を活性化できることを見出した。本研究成果は、βグルカンがデクチン-1を介して自然免疫を活性化できる直接的な重要な証拠となった。
脳血管障害に対する脳局所冷却を用いた急性期リハビリテーション法の開発

ラット脳梗塞モデルに対する局所脳冷却の効果を調べた。光塞栓法により形成された皮質梗塞巣を15°Cの温度で冷却を実施したところ、脳梗塞の拡大が抑えられた。また、運動機能に関しても速やかな回復が見られ、機能回復に対しても有効であることがわかった。さらに、ネコ・サルの脳梗塞モデルに対しても十分な冷却性能を持つデバイスを試作し、中大型動物による冷却実験が実施可能となった。ラットを用いた実験を継続して実施した。光塞栓法により引き起こす皮質性梗塞巣に対する局所脳冷却の影響を急性期と亜急性期で確認した。急性期では梗塞巣周辺で起きるてんかん様放電を計測しながら、梗塞巣を15°Cで冷却した。その結果、てんかん用の異常脳波の顕著な抑制を確認した。梗塞巣形成直後より5時間にわたる冷却によって冷却後の異常脳波は冷却前と比較して有意に低下していた。急性期の冷却実験後、5日間に渡って、運動機能を計測した。握力計を用いた実験では、非冷却群と比較して、冷却群では運動機能の維持と速やかな回復が観察された。以上のラットを用いた実験により、局所脳冷却の皮質梗塞モデルに対する有効性が確認された。ラット実験での有効性確認後、ネコ脳梗塞モデルに対する実験について検討した。ネコに対しては、光塞栓法による脳梗塞を形成する前に、冷却の長時間実施による、正常脳への影響を正確に把握するため、長期冷却実験を実施した。バイタル集中管理下において、皮質の局所冷却を4872時間実施し、脳波の基礎律動、体性感覚誘発電位、脳血流の計測を実施した。局所冷却によって、誘発電位と脳血流は顕著な低下を示したが、復温後、十分な時間を置くことで、それぞれのレベルは冷却前と同程度まで回復を見せた。中大動物への適用に時間は掛かったが、最終的に、脳梗塞モデルに対する実施体制は確立した。脳梗塞に対する急性期治療に対して、低体温療法や咽頭冷却による脳低温療法が効果的であることは多くの研究で報告されている。そこで、我々は、脳梗塞領域を直接的かつ局所的に冷却する方法である局所脳冷却であれば、重大な副作用なしに脳梗塞に対して、高い急性期治療効果があると仮定し、実験を開始した。光塞栓法と局所脳冷却のいずれも中動物に適用可能な手法とした確立された技術であるため、初期はネコを用いた実験でセットアップを開始したが、脳梗塞に対する局所脳冷却の治療効果をラットで調べた例は無かったため、まず、ラットを用いた実験を実施した。実験では光塞栓法による脳梗塞巣の形成後、1時間以内に梗塞巣領域を開頭し、ペルチェデバイスを用いた冷却を6時間(冷却群)と冷却を行わず6時間放置した群(対象群)でそれぞれ実験を行った。6時間後、灌流固定を実施して、脳を摘出し、TTC染色による脳梗塞領域の評価を行った。冷却群は対象群と比較して、有意に梗塞領域の拡大が抑えられていた。さらに、冷却実験後、そのまま生存させる群を作製し行動実験を行った。上肢の運動機能を握力計を用いて調べた。その結果、冷却群において、運動機能が維持されていることが確認できた。これら一連の実験では、経時的に脳波計測も実施しており、脳梗塞の形成によって引き起こされる異常脳波(てんかん用の棘波)が光塞栓法による脳梗塞巣からも引き起こされる事を確認し、その異常脳波の発生を抑えていることが確認できた。これは、我々がこれまでに実施してきたてんかん焦点より発生する異常脳波に対する抑制効果と類似した影響と見られた。初年度はネコ・サルを用いて脳梗塞に対する実験はできなかったが、局所脳冷却に対する影響はネコ(2頭)、サル(1頭)で実施し、脳梗塞実験実施における手技的や装置に関する問題はほとんど改善された状況にあるといえる。申請時には、ネコを用いて実験をする予定にしていたが、初期の時点でネコを追加確保するための十分な費用が、研究費内で賄えるかどうか難しい状況であった。そこで、ラットを用いて急性期と亜急性期の実験を実施することで、中動物を用いた実験が速やかに開始できることも念頭に置き実験を開始した。ラットの実験では概ね良好な結果を得た、一方で、中動物への適用において実験手法に再検討が必要な点も見つかった。初年度の結果を踏まえて次年度は中動物(ネコ・サル)を用いた実験に着手することで、当初の目的を達成できるよう努力する。ネコを用いた実験を開始する。光塞栓法を用いて梗塞巣を形成させ、その領域を局所的に冷却することによって、脳梗塞の拡大を抑えるという基本方針は同じである。また、ラットで得られた知見を元に、申請書における実験方法に追加して、より臨床での条件に近い設定で実験を行う。実験は急性期から亜急性期にかけての脳梗塞領域に対する長期的な局所脳冷却の効果と長期間の局所脳冷却が全身状態に及ぼす影響を調べる。

また、初年度はネコ・サルを用いて脳梗塞に対する実験を達成できなかったが、局所脳冷却自体の実験はネコ(2頭)、サル(1頭)で実施し、脳梗塞実験実施における手技的や装置に関する問題はほとんど改善された状況にある。●備品:初年度の実験において、脳波解析が脳梗塞領域の状態を評価するために効果的であることがわかった。そこで、実験・解析を円滑に進められるよう、脳波解析ソフトを最新版に更新する。●消耗品1:動物の購入費用に当てる。●消耗品2:消耗品として冷却用のペルチェでバイスや、温度センサーを購入する。また、冷却システムの維持に必要な電子部品やデータ保管用のHDDを購入する。●旅費等:研究成果を報告するために学会参加用の旅費や論文発表に必要な経費を計上する。
新規抗生物質カイコシンと、宿主由来活性促進因子との相互作用解析

宿主因子の機能ドメインを欠損したリコンビナントタンパク質を調製し、ライソシンEの抗菌活性に対する影響を検討したところ、野生型のものと比較して抗菌活性の亢進活性が低下していた。次に、ライソシンEと宿主因子の相互作用を解析するため、マイクロカロリメトリーを行ったが、定量的な結果が得られなかった。また、プラズモン共鳴法による解析では、ライソシンEと宿主因子との相互作用が観察されたが、やはり定量的な結果が得られなかった。両者の混合液を注意深く観察したところ、パーティクルサイズが不均一な沈殿物の形成が認められた。従って、ライソシンEと宿主因子は相互作用し、不溶化してしまうと考えられ、マイクロカロリメトリーとプラズモン共鳴法での定量的な解析結果が得られないことが矛盾無く説明できる。同定した宿主因子は、グラム陰性細菌の細菌表層との相互作用があることが知られていた。そこで、グラム陽性細菌の黄色ブドウ球菌の表層との相互作用について検討した。培地に宿主因子と黄色ブドウ球菌を混合し、菌体を遠心により回収後、表面を洗浄し結合量を検討したところ、宿主因子は濃度依存に菌体表面に結合していることがわかった。また、機能ドメインを欠損したリコンビナントタンパク質は、結合量が低下していた。さらに、菌体表層成分を分画し、宿主成分によるライソシンEの抗菌活性亢進活性に対する影響を検討したところ、ペプチドグリカン画分の添加により亢進活性が低下することが明らかになった。従って、宿主成分は黄色ブドウ球菌の表層構造であるペプチドグリカンと結合し、ライソシンEの抗菌活性を亢進していると考えられる。27年度が最終年度であるため、記入しない。本研究で取り扱っているライソシンE(旧名カイコシンE)は、カイコ黄色ブドウ球菌感染モデルでの治療効果を指標に探索された新規抗生物質であり、細胞膜中のメナキノンを標的とする新しい作用機序を有する。ライソシンEは血清中の特定のタンパク質によって、抗菌活性が促進することが明らかになっている。本研究では、そのタンパク質とライソシンEの相互作用について解析した。これまでにライソシンEとメナキノンの混合により沈殿形成されることが明らかになっているが、予め水溶液中に本タンパク質を加えておくと、ライソシンEとメナキノンの混合物中に、本タンパク質が共沈することが明らかになった。従って、これらの3つの化合物は三者複合体を形成すると考えられる。また、本活性化因子によるライソシンEの抗菌活性の亢進は、黄色ブドウ球菌の細胞壁画分を加えることによって抑制された。このことから、黄色ブドウ球菌の細胞壁画分が本活性に関わっていると考えられる。さらに、本タンパク質の活性ドメインを欠失したタンパク質を作製し、ライソシンEの抗菌活性に対する影響を検討した。その結果、欠失型は野生型に比べライソシンEの抗菌活性の促進活性が低下していた。このことから、本活性ドメインは、本タンパク質のライソシンEの活性促進に必要であると考えられる。さらに、ライソシンEの血清中の抗菌活性の促進因子について、同定したタンパク質の寄与率を検証する目的で、本タンパク質をコードする遺伝子破壊マウスから血清を調製し、ライソシンEの抗菌活性の促進活性を定量した。その結果、遺伝子破壊マウスの血清では野生型に比べ12%まで、ライソシンEの抗菌活性の促進活性が低下しており、大部分が本タンパク質によって説明できることを明らかにした。今後は、本遺伝子破壊マウスを用いて同定したタンパク質のライソシンEの治療効果への影響について検討する必要がある。当初研究計画通りに研究が遂行できており、さらに研究計画では来年度に実施予定であった活性化因子の欠損マウスによる解析を前倒しで実施できたためことから判断した。

研究計画通り、同定したライソシンEの抗菌活性の促進メカニズムを明らかにするための解析を引き続き実施する。現在、ライソシンEの大量調製を試みており、本研究計画で最も難しいライソシンE-メナキノン-活性化因子の構造解析について検討する。27年度が最終年度であるため、記入しない。
膜輸送分子を指標としたペルオキシゾーム形態形成の研究

ペルオキシゾーム特異蛋白質の膜輸送分子の局在性を、ペルオキシゾームの新生が起きている組織・細胞において免疫組織化学的に研究して、ペルオキシゾームの細胞内小器官「原基」を見い出すことを目的とした。1)現有する抗ターゲテイングシグナル抗体(抗合成SKLモノクローナル・ポリモノクローナル抗体)の特異性を検定するとともに、ペルオキシゾーム新生モデルにおけるターゲテイングシグナルの局在性を検索する、2)ターゲテイングシグナル受容体抗体(抗SKLイデイオタイプ抗体)の作成、の2つの実験を進行させた。抗ターゲテイングシグナル抗体は生化学的な研究からSKLの配列を強く、類似した配列を弱く認識し、形態学的には、ペルオキシゾームを特異的に認識して、それ以外の細胞内構造は認識しないことが示された。この現象は種を越えていた。それゆえ本抗体はペルオキシゾームの形態学的な研究に極めて適していると判明した。ペルオキシゾーム新生モデル:ペルオキシゾーム増殖性薬剤・個体発生・系統発生における局在性の検索に応用して新たな結果が得られた。一方、抗SKLイデイオタイプ抗体の作成は難航した。モノクロナル・ポリクロナルの2種類を作成したが、ターゲテイングシグナル受容体抗体として実用化は不可能であった。部分的には論文・学会発表を行いつつあるものの、最終目的である細胞内小器官「原基」の検出には、現時点では到達していない。今後も、方法を変えて本研究を継続する必要がある。ペルオキシゾーム特異蛋白質の膜輸送分子の局在性を、ペルオキシゾームの新生が起きている組織・細胞において免疫組織化学的に研究して、ペルオキシゾームの細胞内小器管「原基」を見い出すことを目的としている。本年度の計画は,1)現有する抗ターゲテイングシグナル抗体(抗合成SKLモノクローナル・ポリモノクローナル抗体)の特異性を検定するとともに、ペルオキシゾーム新生モデルにおけるターゲティングシグナルの局在性を検索する、2)ターゲテイングシグナル受容体抗体(抗SKLイデイオタイプ抗体)の作成、の2つの実験を進行させている。抗ターゲテイングシグナル抗体はSKLの配列を強く、また、ペプチドを弱く認識することが、合成ペプチドと精製ペルオキシゾーム酵素を用いて示した。免疫組織化学では、抗ターゲテイングシグナル抗体はペルオキシゾームを特異的に認識して、それ以外の細胞内構造は認識しないことが示された。ペルオキシゾームの内部構造との関連から判断すると、認識する蛋白質の種類と内部構造は極めて良い一致性が有ることがわかった。現在、ペルオキシゾーム新生モデルにおける局在性の検索と抗SKLイデイオタイプ抗体の作成を進めている。前者の結果は次第に集まりつつあるが,後者においては難航している。
ウォーターフットプリント用データベースと影響評価手法の開発

水循環モデルを用いた影響評価手法(流達率)の開発近年、富栄養化による生物多様性や社会資産の損失が多数報告されている。これに対し、既存研究では一地域または一国を対象とした評価手法の開発のみが行われているのみであり、開発国によりコンセプトが異なるため、単純な比較をすることが難しい。このため、同じコンセプトの下、全球を対象とした評価手法の開発が望まれる。そこで本研究では水循環モデルを用いて全球を対象に富栄養化の要因となる窒素の流達率係数の開発を行った。結果として各国の窒素流達率は約70 1%未満と国によって大きな差異が生じた。係数が高い国としてニュージーランド、フィリピン、スリランカ、ハイチ、ジャマイカ、クウェート、デンマーク、台湾、トリニダード・ドバコやイギリスなどが挙げられる。これは海に囲まれているまたは近い国は窒素が集水器に到達するまでの距離が短いため、集水域の流達窒素が大きくなり、富栄養化への影響力が高くなったと考えられる。その一方で、オーストリアやチャド、コンゴ、ハンガリー、レソト、パラグアイ、スロバキア、スイス、ウガンダ及びザンビア等の内陸国に属している国は集水器までの距離が長いため、流達窒素による影響は低い傾向にあることが分かった。今後は本研究を土台として流達窒素による溶存酸素の低下、生物多様性や社会資産の損失までの手法開発及び気候変動による将来予測の検討が全球で可能となる。溶存酸素の低下量は各海域の基礎条件によって変化するため、各海域の詳細な統計値を収集するとともに各データの更新を行う必要がある。生物多様性や社会資産に関してもサンゴ礁や貝類などの固定生物種の生育分布等を整理する必要がある。27年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では“汚染に着目したウォーターフットプリントインベントリデータベースの開発"を行った。ウォーターフットプリントには量的な側面と質的な側面があり、両方を加味する必要があるが、今回は質的な側面に着目し、データベースの開発を行った。本データベースは、富栄養化物質である窒素とリン、それらを希釈するのに必要となる希釈水の排出原単位を算定した。日本の2005年版産業連関表を用いて得た環境負荷原単位は対象物質ごとに403部門あり、国内の一次・二次・三次産業すべてを包括し、かつ、直接・間接を網羅したデータ源として、汎用的にウォーターフットプリントインベントリ分析を行うのに貢献する貴重なデータ源として認識される。窒素とリンの原単位を産業別に分析すると負荷の傾向は整合しており、希釈水は全部門で窒素由来であることが分かった。これらの原単位と水消費原単位を比較した結果、水消費原単位は一次産業が大きく、それらに関連する二次産業や三次産業の部門が波及効果から大きくなる。一方、希釈水原単位に着目すると二次産業の負荷が大きく、それらに関連する一次産業や三次産業の部門が大きくなることが分かるなど、原単位別に傾向を捉えることができた。本研究の結果と既存研究の結果を併用することによってISO規格やWFNのガイドラインで要求されている基本フローを考慮したWFの実施を容易にすることができる。すでに複数の国内企業が本研究の成果を利用しており、産業界のニーズの高い研究成果を発信していることは特筆に値する。当初の計画通り、日本における汚染に着目したウォーターフットプリントインベントリデータベースの開発を行った。富栄養化物質である窒素とリン、それらを希釈するのに必要となる希釈水が対象である。2005年版日本産業連関表を用いて403部門の環境負荷原単位を作成し、分析を行った。本研究で得られた結果は既に日本LCA学会でアクセプトされ、多くの研究や企業の分析に利用されている。一方で、中国におけるデータベースについては未だ完成していない。

これは各部門より排出される汚染物質の推計において中国が公表している統計資料間で整合性がとれていないことが原因である。27年度が最終年度であるため、記入しない。グローバル水循環モデルを用いた影響評価手法(水の汚染に着目した影響評価係数)の開発本研究では収集可能な汚染のインベントリデータが窒素及びリンであるため、富栄養化に着目した影響評価係数とした。既存の研究の地理的評価範囲は地域的である。また、欧州と日本でコンセプトが異なるため、単純な比較をすることができない。本研究では同じコンセプトの下、全球的に影響評価係数を開発する。開発する係数はライフサイクルアセスメントにおける特製化係数である。開発には全球レベルの耕作面積、面積当たりの窒素施肥量、窒素循環モデル、窒素除去比率、水循環モデルが必要となる。そこで、本研究では耕作面積、面積当たりの窒素施肥量をFAO、窒素循環モデルを林ら、窒素除去比率を須賀ら、水循環モデルを花崎らのデータを用いる。これらのモデルは全球を対象にしており、空間解像度は0.5°*0.5°であるため、既存研究に比べ対象範囲が広く、かつ詳細である。
東北・九州地方における外来型工業化地域の生産システムと新産業創出に関する比較研究

この研究では,東北・九州地方を対象に生産システムと新産業創出に関する比較研究を行った。具体的には,山形県と熊本県を対象としている。その結果,研究期間内に主として遂行し得た事項は以下の通りである。1.統計的な分析によって,生産配置と労働生産性を指標とした工業の部門別変動の地域的特徴を明らかにした。2.山形県米沢市の繊維工業と熊本県荒尾市の陶磁器産業の実態を調査し,両産地の動向,生産構造,技術の継承システムなどを明らかにした。3.山形県米沢市における機械工業の「学習システム」をとくに取り上げ,その形成の背景,機能などを詳細に明らかにした。対応する組織は,熊本県にはわれわれの調査の限りでは存在しなかった。今年度は、山形県米沢市における産業支援策・企業間ネットワークに関する実態調査および熊本県における産業支援策・企業間ネットワークに関する予備調査を行った。米沢市および熊本県におけるより詳細な実態把握は次年度以降の課題である。今年度明らかになった諸点は以下の通りである。米沢市における米沢電機工業会および米沢市電子機器・機械工業振興協議会(「電振協」)の設立経緯、機能等について関連機関、加盟企業、設立に関わったキーパーソンなどへのヒアリング調査を通じて、従来の研究にみられる当該組織に対する評価とは異なると思われる、あるいは設立に至るより詳細な背景に関する、知見が得られた。とくに米沢電機工業会設立に至る経緯については、当時の当該地域における大手メーカー(工場)を取り巻く環境変化、すなわち1980年代初頭における地方工場での品質管理強化の動きが重要であったこと、そのために下請関連企業を含めた生産体制の整備が必要であったこと、などが背景にある。従来の研究ではこの点(設立の説得的な理由)に関説したものは管見の限り見あたらない。他方、こうした大手の動きをいち早く察知して設立されたのが、地元企業を対象とする「電振協」である。これらの組織の重要な機能は、集団的な「学習システム」(TQC運動への共同の取り組みなど)を構築したことであり、当該地域の企業は組立系が中心であったことから、こうした組織的な取り組みをより有効なものとした。地域企業の組織化(地域産業集積の形成)による取引関係のネットワーク化については、あくまでこうした活動(相互の技術力に対する認識とそのレベルアップ)を基盤として展開されるものであり、組織の目的としてはむしろ副次的なものであると考えられる。この点も、従来の研究とは異なる我々の当該組織に対する評価である。具体的な取引関係等の変化、新製品開発等との関連については次年度以降の課題である。昨年度は、山形県米沢市における産業支援策・企業間ネットワークに関する実態調査および熊本県における産業支援策・企業間ネットワークに関する予備調査を行った。今年度はその予備調査を基礎にして、熊本県における製造業企業のヒアリング調査を中心に実施した。ヒアリングの対象とした業種は、自動車部品関連企業、金属加工(金型)関連企業、工作機械関連企業である。その結果、明らかになった点は以下の通りである。1.自動車部品関連企業の場合には、熊本県といった比較的狭い空間スケールというよりも、北部九州全域にわたって企業間ネットワークが形成されつつある。この特徴は、それが従来の系列を越えて展開していることである。しかしながら、その本格的な展開はこれからといったところであった。民間主導という点で、「米沢電機工業会」と共通する点がある。2.金属加工関連企業の場合には、企業自らの展開あるいは創業にあたって、熊本県工業技術センターの行っている異業種交流のための「研究会」が重要な役割を果たしていることが明らかになった。つまり、「公」の提供する「場」が新産業創出のために重要な機能を果たしていることが熊本県の場合には見て取れる。この点は、昨年度、実施したテクノポリス財団の事業とも共通している。3.以上の点と米沢市で実施した調査結果を比較すると、米沢市の場合には企業間ネットワークが民間主導で形成されている点に特徴があり、熊本県の場合には「公」の役割がより重要となっているといえる。
非侵襲的男性不妊症診断及び治療法の確立

私たちは、マイクロアレイやPCRによって、男性不妊症患者の10%以上の原因遺伝子を特定することができる系を開発した。一方、私たちは生薬である甘草がマウスにおいて授精能を上げることを見出した。今後、これたの結果をもとに、男性不妊症患者の遺伝子診断の結果と甘草の受精上昇効果の関連を解析し、男性不妊症DNA診断にもとづきARTよりも容易な治療薬の提供を目指す。私たちは、マウスを用い精子細胞特異的遺伝子の機能不全が雄性不妊症の原因であることを明らかにしてきた。また、同定してきた不妊症原因遺伝子について、そのヒトゲノムDNAの一次構造を男性不妊症群と妊孕性確認群の2つの集団で解析を進めた。その結果、原因不明の男性不妊症患者のうち1割以上の原因と考えられる男性不妊症関連SNPs(Single Nucleotide Polymorphisms)および遺伝子変異を明らかにしている。本研究では、これらに関して迅速な遺伝子診断キットを作成し、臨床研究を進め、3年で実用キットとして確立したい。一方で多岐にわたる男性不妊症患者の原因を明らかにするための研究を進め、SNPs診断キットに順次加える。また、男性不妊症マーカーと考えられるタンパク質の解析を進め、その同定を行い分子生物学的解析を進める。本年度は、日本人男性に多く見出される精子特異的遺伝子上のSNPsに関して生化学的解析を進めた。その結果、エネルギー代謝に関与する精子細胞に特異的に発現するアイソザイムの2つの遺伝子に存在するSNPsによって、遺伝子産物の酵素活性が低下すること、さらにそのSNPをもつ男性不妊症患者の精液中のるアイソザイムの酵素活性が低下することが明らかになった。来年度は、男性不妊症に関係するSNPsを容易に同定できる反応系を用い、非侵襲的に男性不妊症原因を診断できる臨床応用を視野に入れ研究を進めたい。その他のいくつかの男性不妊症関連SNPsを国際科学雑誌で出版する事が出来た。最終年度は、男性不妊症に関係するSNPsを容易に同定できる反応系を用い、非侵襲的に男性不妊症原因を診断できる臨床応用進る。その結果、エネルギー代謝に関与する精子細胞に特異的に発現するアイソザイムの2つの遺伝子に存在するSNPsによって、遺伝子産物の酵素活性が低下すること、さらにそのSNPをもつ男性不妊症患者の精液中のるアイソザイムの酵素活性が低下することを明らかにし、国際科学雑誌に報告した。さらに、男性不妊症に関係するSNPsを容易に同定できる反応系を用い、非侵襲的に男性不妊症原因を診断できる臨床応用について、臨床現場での手続きと方法検討した。男性不妊症関連SNPsを検索し、同定できたSNPsを血液から容易に診断し、一割の患者さんの原因遺伝子を同定できることを目標としてきた。現在までのSNPsディスカバリーの成果で、達成できた。今後は臨床研究を進めたい。さらに、精子活性化分子を同定できた。本物質の至摘濃度を決定し臨床試験を進めたい。24年度が最終年度であるため、記入しない。

最終年度である本年は、今までの私たちの成果を国際科学雑誌や学会で発表する事により、臨床研究の共同研究者を発掘する事が重要である。すでに共同研究者が存在するがさらに多くの研究者とデータを集めることにより、男性不妊症SNPs検査キットの実用化が期待できる。24年度が最終年度であるため、記入しない。
放射線高感受性細胞死の分子生物学的研究

マウス小腸上皮細胞群の分画方法を確立させた。すなわち、マウス体内より切り出し、さらに内外を反転した小腸組織から出発し、じゅう毛の先端部分から増殖単位であるクリプトの底部に至るまで、順次、細胞群を取り外しながら分画していく方法である。Iー125でラベルされたデオキシウリジンをマウス腹腔に投与し、上記操作にて小腸上皮細胞群の分画を行い、取り込まれた放射能をガンマカウンタ-にて測定した。さらに、酸不溶分画でもってDNA中に取り込まれている放射能を測定した。Iー125の放射能値のピ-クが1.52.0時間の時点に出現するように操作を改良し、分画方法を確立した。マウス下半身に10Gyを照射し、照射後0.55日にかけてのHー3チミジン反復投与法によりマウス腸上皮の幹細胞がラベルできることを確認した。さらにこのようにラベルしたマウスを長期間飼育し、0.5,1,2,3,4カ月の各時点でCー14チミジンを1回投与し、30分後に腸上皮の細胞群の分画操作を行い、液体シンチレ-ションカウンタ-にて、それぞれの放射能を測定した。幹細胞の分画(Hー3)はDNA合成細胞の分画(Cー14)と同一ではなく、しかもクリプト底部に対応した分画であることが示された。同様にして幹細胞をラベルしたマウスを作成し長期間飼育した後、ガンマ線照射で細胞死を起こす細胞つまり放射線高感受性細胞とHー3チミジンを何ヵ月も保持する細胞(幹細胞)との同一性を調ベた。長期間ラベルを保持している細胞は休止期にあると考えられるが、このような細胞のクリプト内分布はクリプトの底部からの細胞位置で3番目近くにその中央値を示した。これに対し、0.5Gyまたは9.0Gyのガンマ線照射によって細胞死を起こした細胞のクリプト内分布は5番目付近に中央値を示した。つまり、長期間ラベルを保持する細胞と放射線高感受性細胞とは別の細胞集団であることが示された。まず、マウス小腸上皮細胞群の分画方法を確立させた。すなわち、マウス体内より切り出し、さらに内外を反転した小腸組織から出発し、じゅう毛の先端部分から増殖単位であるクリプトの底部に至るまで、順次、細胞群を取り外しながら分画して行った。細胞群の取り外しには化学的方法と物理的方法とを組み合せて使用した。細胞分画実験での5段階の操作で使用する溶液として、種々の薬品、キレ-ト剤、栄養源等の量を変え、各操作に最適な組成を探し出した。物理的方法としては、ボ-テクスにより溶液中での振とうで細胞を順次剥離した。次に、I-125でラベルされたデオキシウリジンをマウス腹腔に投与し、上記操作にて小腸上皮細胞群の分画を行い、取り込まれた放射能をガンマカウンタ-にて測定した。放射能は最初の分画では酸可溶性部分に多く出現するが、その後はほとんど不溶性部分に存在する。さらにI-125の放射能値のピ-クが1.52.0時間の時点に出現するように操作を改良し、分画方法を確立した。マウスの下半身を10Gyで照射し、腸上皮回復期間中(照射後18時間から5日目まで)6時間ごとにH-3チミジンを17回投与した。これにより、幹細胞はH-3でラベルされる。幹細胞以外の小腸細胞はたとえH-3チミジンを取り込んでも、約3.5日で腸管へ捨てられるが、幹細胞のラベルは長時間クリプトに存在する。こうして作成したラベルされた幹細胞をもつマウス小腸において、幹細胞が上記操作で得られるどの分画に入っているかを現在調べている。

長期間ラベルを保持している細胞は休止期にあると考えられるが、このような細胞のクリプト内分布はクリプトの底部からの細胞位置で3番目近くにその中央値を示した。これに対し、0.5Gyまたは9.0Gyのガンマ線照射によって細胞死を起こした細胞のクリプト内分布は5番目付近に中央値を示した。つまり、長期間ラベルを保持する細胞と放射線高感受性細胞とは別の細胞集団であることが示された。昨年までにマウス小腸上皮細胞群の分画方法を確立させた。すなわち、マウス体内より切り出し、さらに内外を反転した小腸組織から出発し、じゅう毛の先端部分から増殖単位であるクリプトの底部に至るまで、順次、細胞群を取り外しながら分画して行った。Iー125でラベルされたデオキシウリジンをマウス腹腔に投与し、上記操作にて小腸上皮細胞群の分画を行い、取り込まれた放射能をガンマカウンタ-にて測定した。Iー125の放射能値のピ-クが1.52.0時間の時点に出現するように操作を改良し、分画方法を確立した。マウスの下半身を10Gyで照射し、腸上皮回復期間中(照射後18時間から5日目まで)6時間ごとにHー3チミジンを17回投与した。これにより、幹細胞はHー3でラベルされる。幹細胞以外の小腸細胞はたとえHー3チミジンを取り込んでも、約3.5日で腸管へ捨てられるが、幹細胞のラベルは長期間クリプト内に存在すると考えられる。こうして作成したラベルされた幹細胞をもつマウス小腸において、幹細胞が上記操作で得られるどの分画に入っているかを調べた。結果は、Hー3チミジン反復投与後3カ月を経たマウスにおいても、その小腸上皮にはHー3でラベルされている細胞が存在した。これらのHー3ラベルマウスにCー14チミジンを1回投与し、30分後に小腸上皮細胞群を分画し、液体シンチレ-ションカウンタ-にて、それぞれの放射能を測定した。幹細胞の分画(Hー3)とDNA合成細胞の分画(Cー14)とが全く同一でないことが示唆された。これまでにマウス小腸上皮細胞群の分画方法を確立させてきた。すなわち、マウス体内より切り出し、さらに内外を反転した小腸組織から出発し、じゅう毛の先端部分から増殖単位であるクリプトの底部に至るまで、順次、細胞群を取り外しながら分画していく方法である。また、マウス下半身に10Gyを照射し、照射後0.55日にかけてのHー3チミジン反復投与法によりマウス腸上皮の幹細胞がラベルできることを前年度までに確認した。今年度はこのように腸上皮幹細胞をHー3チミジンでラベルしたマウスを長期間飼育し、0.5,1,2,3,4カ月の各時点でCー14チミジンを1回投与し、30分後に腸上皮の細胞群の分画操作を行い、液体シンチレ-ションカウンタ-にて、それぞれの放射能を測定した。幹細胞の分画(Hー3)はDNA合成細胞の分画(Cー14)と同一ではなく、しかもクリプト底部に対応した分画であることが示された。同様にして幹細胞をラベルしたマウスを作成し長期間飼育した後、ガンマ線照射で細胞死を起こす細胞つまり放射線高感受性細胞とHー3チミジンを何ヵ月も保持する細胞(幹細胞)との同一性を調べた。
ルーラルフリンジに立地する農村の類型化とシュリンク・メカニズムの解明

平成30年度の課題は「ルーラルフリンジに立地する農業集落の類型化」であった.武山は,愛媛県に立地する全2,950集落の属性データを分析し,土地利用および産業構造に着目した類型化手法を検討した.内川は,長野県根羽村の試験地等で,粗放的林地・耕作放棄地での山地酪農の導入を検討した結果,用地確保および新規就農者導入の現況,および当該自治体全体における土地利用計画の必要性を示した.山下は,コミュニティの担い手の多様化,地域外部者との連携による既存の地域組織の刷新に対する地元側の認識等について事例的に分析した結果,地域の継承に対してネガティブに作用する要因およびその解消や緩和に関する方策を示した.九鬼は,大阪府茨木市の遊休農地対策を調査し,都市住民参加の農作業教室によって興味を持つ市民を取り込み,期間が終われば府の独自制度である準農家への移行を勧め,遊休農地の担い手としての独立を支援していることを明らかにし,フリンジでの遊休農地活用手法としての可能性を検討した.田村は,栃木県内における5つの改良区を対象として地区除外の手続きに関する実態把握を行った結果,約10年間に受益面積の0.57%に相当する農地が地区除外されている実態を明らかにした.中島は,群馬県みなかみ町「たくみの里」を対象に,3要素に係る諸課題の関係を構造的に整理し,ワークショップにより課題構造の精度,および意識醸成の効果の観点から検証した.服部は,陸前高田市広田地区を対象に,地区内農地の変遷について1977年と2013年の比較解析を行った結果,農地としての残存率は8214%と非常に幅があること,農地からの変化はほとんど林地化であることを明らかにした.また,Vietnamの土地利用制度とハノイ市のマスタープラン,ハノイ市近郊の土地利用現況をまとめた.研究チーム全体では,当初の研究計画を上回るスピードで事例研究が進展し,極めて良好な研究成果を挙げている.また,これらの事例研究をとりまとめ,類型化指標として確立する作業も進展が見られる一方,平成30年7月豪雨等の災害対応のため,研究代表者における本研究課題への取り組みが一時的に中断を余儀なくされたため,類型化指標の精査を社会実装可能なレベルに引き上げる作業が十分に行えていない点に不満が残る.しかし,平成31年度にこれに取り組む目処は付けられたため,研究計画は概ね順調に進展していると判断できる.武山は,愛媛県内の農業集落を対象に,研究分担者から提示された類型化指標を用いて,ルーラルフリンジに立地する農業集落の類型化手法を確立させる.また,研究分担者は,ルーラルフリンジのシュリンクをコントロールする方策を事例研究より明らかにする.具体的には,内川は,根羽村にて,特に新規就農就農者が実際の放牧を開始したことによる集落土地利用および住民心理への影響等について明らかにする.山下は,ルーラルフリンジエリアにおける民間投資による地域経済活性化の可能性について,SDGsの観点から分析する.九鬼は,大阪府の準農家制度の実態解明を通じて,遊休農地の担い手像の変化と制度によるフリンジでの農地保全の可能性を検討する.田村は,栃木県の土地改良区を対象に,受益地区内に市街化区域を擁する改良区における地区除外面積の発生傾向と手続きに関する課題,および改良区ごとに異なる他目的使用の運用実態を比較検討するとともに,その原因ならびに今後の運用可能性について検討を行う.中島は,ワークショップにおける主体間連携のあり方,およびシュリンク問題が発生しているエリアを対象とした具体的な農地保全計画の提案を行なう.服部は,陸前高田市広田地区において,震災後の復旧過程を中心として類型化指標になり得る地域構造の把握を試みるとともに,ハノイ市近郊の土地利用変換に関する農家調査結果のまとめをおこなう.平成29年度は,聞き取りおよび現地踏査から,類型化指標となり得るデータを収集した.武山は,愛媛県西条市を対象に,「土地利用」をキーワードに調査を行い,都市計画および農業振興地域計画に基づくゾーニングの変更や,農地法改正による農地転用規制の強化,および土地改良における計画区域の設定等が,農村地域の農地のシュリンクに及ぼす影響を把握した.中島は,群馬県みなかみ町において,「都市農村交流」をキーワードに調査を行い,都市農村交流の実践地域における農地保全計画の策定に向け,農地利用変遷の類型化,分布特性の分析,および観光資源周辺の実態解明を行った.服部は,岩手県陸前高田市において,「災害対応」をキーワードに調査を行い,1次産業の多様性と地形条件が地域構造を規定するメカニズムの解明を試みた.内川は,長野県根羽村において,「インフラ整備」をキーワードに,粗放的林業エリアにおける「山地酪農」の導入を検討し,技術・社会条件の両面から必要条件を検討した.田村は,栃木県那須塩原町において,「農村組織」をキーワードに調査を行い,土地改良区が管理する施設の他目的利用による費用徴収に着目し,複数の土地改良区における他目的利用の実態を明らかにした.九鬼は,和歌山県古座川町において,「耕作放棄」をキーワードに調査を行い,10年に及ぶ参与観察の結果,調査結果を基にした地域住民への働きかけが,獣害対策や水道施設などの維持管理作業への後継者世代の参加を促したことを明らかにした.

山下は,石川県七尾市において,「地域経済」をキーワードに調査を行い,過疎地域において「少額多業収入経済」を実現するために必要な労働力賦存量を「分割・多業種に援用可能な労働力」と「固定的・非柔軟な労働力」に分けて評価する手法を検討した.主担当フィールドを対象に,キーワードに基づく類型化指標を収集するH29年度の目標は達成できており,H30年度における指標の妥当性検証作業に向けた準備が整っているから.平成30年度の課題は「ルーラルフリンジに立地する農業集落の類型化」であった.武山は,愛媛県に立地する全2,950集落の属性データを分析し,土地利用および産業構造に着目した類型化手法を検討した.内川は,長野県根羽村の試験地等で,粗放的林地・耕作放棄地での山地酪農の導入を検討した結果,用地確保および新規就農者導入の現況,および当該自治体全体における土地利用計画の必要性を示した.山下は,コミュニティの担い手の多様化,地域外部者との連携による既存の地域組織の刷新に対する地元側の認識等について事例的に分析した結果,地域の継承に対してネガティブに作用する要因およびその解消や緩和に関する方策を示した.九鬼は,大阪府茨木市の遊休農地対策を調査し,都市住民参加の農作業教室によって興味を持つ市民を取り込み,期間が終われば府の独自制度である準農家への移行を勧め,遊休農地の担い手としての独立を支援していることを明らかにし,フリンジでの遊休農地活用手法としての可能性を検討した.田村は,栃木県内における5つの改良区を対象として地区除外の手続きに関する実態把握を行った結果,約10年間に受益面積の0.57%に相当する農地が地区除外されている実態を明らかにした.中島は,群馬県みなかみ町「たくみの里」を対象に,3要素に係る諸課題の関係を構造的に整理し,ワークショップにより課題構造の精度,および意識醸成の効果の観点から検証した.服部は,陸前高田市広田地区を対象に,地区内農地の変遷について1977年と2013年の比較解析を行った結果,農地としての残存率は8214%と非常に幅があること,農地からの変化はほとんど林地化であることを明らかにした.また,Vietnamの土地利用制度とハノイ市のマスタープラン,ハノイ市近郊の土地利用現況をまとめた.研究チーム全体では,当初の研究計画を上回るスピードで事例研究が進展し,極めて良好な研究成果を挙げている.また,これらの事例研究をとりまとめ,類型化指標として確立する作業も進展が見られる一方,平成30年7月豪雨等の災害対応のため,研究代表者における本研究課題への取り組みが一時的に中断を余儀なくされたため,類型化指標の精査を社会実装可能なレベルに引き上げる作業が十分に行えていない点に不満が残る.しかし,平成31年度にこれに取り組む目処は付けられたため,研究計画は概ね順調に進展していると判断できる.研究チームが現地調査より抽出した指標を持ち寄り,類型化指標として適切かどうかを検証するとともに,指標間の関連性を整理する.また,多変量解析による類型化方法を検討する.研究代表者の武山および分担者の九鬼・服部は,多変量解析による農業集落分析に関する既往の業績を持つ.そこで,各研究者が持つ手法と知見を持ち寄ることで,適用性の高い類型化方法の確立を可能にする.
iPS細胞技術を応用した軟骨形成腫瘍における変異IDHの機能解明

軟骨形成腫瘍の起源細胞の候補である骨髄由来間葉系幹細胞(MSC)に軟骨形成腫瘍に高頻度に変異が認められるIDH1(R132C)遺伝子を発現ベクターを用いて導入した。変異IDH1によって2-ヒドロキシグルタル酸の産生、軟骨への分化マーカーであるSOX9, COL2A1の発現上昇、骨分化マーカーであるALP発現の低下が認められた。これは変異IDH1遺伝子がMSCの軟骨への分化誘導能を持つことを示した。また変異IDH1を発現させたMSCにおいてはリシン4メチル化ヒストンH3、リシン9メチル化ヒストンH3の発現が上昇しており、ヒストンのmodificationが起こっていた。軟骨形成腫瘍に特異的に存在しているIDH遺伝子の変異の生物学的意義を、iPS細胞を始めとする幹細胞生物学の技術を駆使して、分化段階特異的に解析することで、腫瘍発生における役割を明らかににすることを目的とする。平成25年度はまず予備実験として、骨髄由来間葉系幹細胞(MSC)に軟骨形成腫瘍において高頻度に変異が認められる変異IDH1(R132C)遺伝子を発現ベクターを用いて導入した。変異IDH1発現MSCにおいては、変異IDH1によって産生される2-ヒドロキシグルタル酸(2HG)の産生、軟骨への分化マーカーであるSOX9, COL2A1の発現上昇、骨への分化マーカーであるALP発現の低下が認められた。これは変異IDH1遺伝子がMSCの軟骨への分化誘導能を持つことを示唆した。またIDH1の変異によってアルファケトグルタル酸(αKG)の産生が低下し、これによってヒストン脱メチル化酵素の機能が阻害され、ヒストン全体のメチル化が亢進することが予想される。実際変異IDH1発現MSCにおいてはリシン4メチル化ヒストンH3(H3K4me3)、リシン9メチル化ヒストンH3(H3K9me3)の発現が上昇しておりヒストンのmodificationがおこなっていることが示された。続いてiPS細胞を用いた実験系確立に向けて、変異IDH遺伝子を薬剤(doxycyvline)誘導型発現ベクターに組み込んだ。このベクターをiPS細胞に導入し、doxycyclineにより任意の分化段階で変異IDHD1を誘導できる、doxcycline-inducible iPSを作成することに成功した。このiPS細胞をMesoderm由来のMSCに分化させた後にdoxcyclineを添加し、変異IDH1の発現が誘導されることを確認した。軟骨形成腫瘍に特異的に存在しているIDH遺伝子の変異の腫瘍発生における役割を明らかにすることを目的とする。前年度はR132C変異型IDH1を発現するヒト骨髄間葉系幹細胞を樹立し、変異IDH1発現によって軟骨分化のマーカーであるSOX9とCOL2A1遺伝子の発現が上昇し、骨への分化マーカーであるALP発現は抑制されること、またリシン4メチル化ヒストンH3(H3K4me3)、リシン9メチル化ヒストンH3(H3K9me3)の発現が上昇しておりヒストンのmodificationが起こっていることを見出し、この結果からR132C発現によって間葉系幹細胞は軟骨細胞への分化をコミットされると考えられた。今年度はさらに変異IDH1発現間葉系幹細胞を用いて三次元軟骨分化誘導を行った。その結果、軟骨への最終分化は抑制されていることがわかった。R132C発現によって産生された2-HGが細胞外基質の成熟を阻害している可能性が示唆された。一方、石灰化に重要な役割を果たすALPL遺伝子の発現は抑制されており、実際に骨への最終分化誘導を行ったところ、石灰化は抑制されていた。この結果は骨肉腫にはIDHの変異はほとんど認められないとの報告と一致する。骨分化能に対する影響を更に確認するために、doxycyclin誘導型ベクターを用いてヒト骨肉腫細胞株であるANOSにR132C変異型IDH1を発現させた。doxycyclinを添加しながらANOSの骨分化を誘導したところ、R132Cの発現はALPLの発現を有意に抑制した。結論として変異型IDH1は遺伝子特異的ヒストン修飾を起こして、間葉系幹細胞の軟骨分化と骨分化を調整不全にすることで、軟骨形成腫瘍の形成に関係することが判明した。現在doxycyclin誘導型変異IDH1を組み込んだiPS細胞を用いて骨軟骨分化能、腫瘍発生における役割を解析している。骨軟部腫瘍予備実験として行った、骨髄由来間葉系幹細胞(MSC)に軟骨形成腫瘍において高頻度に変異が認められる変異IDH1(R132C)遺伝子を強制発現される実験によって、変異IDH1遺伝子が多分可能をもつMSCを軟骨へ分化誘導する機能を持つことが判明した。これは変異IDH1が軟骨形成腫瘍発生に重要な役割を果たすという我々の仮説を支持する。