hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ゼブラフィッシュを用いた骨リモデリング機構の解明

骨組織の維持には、骨の形成と吸収のバランスが必要である(骨リモデリング)。このバランスの異常は、骨粗鬆症などの骨の病気を引き起こすが、その仕組みはよく分かっていない。我々は、ゼブラフィッシュの鱗(骨組織)を用いて、骨の形成過程を調べた。その結果、特殊な鱗(側線鱗)にある筒状の構造(管器)が、骨リモデリングによって、絶えず成長していることを示した。さらに、側線とよばれる神経組織(感覚器)が、骨リモデリングを制御していることを明らかにした(Wada et al., 2014)。この研究成果は、神経組織と骨組織が相互作用していることを意味していて、今後、骨の病気の原因解明につながると期待される。骨組織の維持には、内分泌系、神経系、免疫系にまたがる多くの組織が関与している。ゼブラフィッシュの側線鱗(管器)は、単純な構造を持ち、かつ骨形成・骨吸収過程を容易に観察できることから、骨リモデリング機構の解析のためのすぐれたモデルとなると考えた。本年度は、骨形成に関わる遺伝子を単離し、その発現パターンの解析を行った。骨芽細胞特異的なマーカー遺伝子sp7は、管器形成に伴い骨形成領域で発現し、破骨細胞特異的なマーカー遺伝子ctskは、逆に、骨吸収領域で発現することから、側線鱗の形成は、骨芽細胞・破骨細胞の働きからなる骨リモデリング過程であることが分かった。また、骨リモデリングは常に、神経組織(側線器官)の周囲で生じることが示された。神経組織では、Wntシグナルの抑制因子であるDkkが強く発現していた。Wntシグナルは骨形成に重要なシグナルであることが分かっている。今後、管器形成におけるDkkの役割について調べたい。さらに、破骨細胞の形成に異常を示すc-fms/panther突然変異体の解析を行った。破骨細胞の活性が正常な骨リモデリングに必要であり、c-fms/panther突然変異体では、管形成が阻害されることが分かった。また、この時、側線器官(感覚器)の成長も阻害された。鱗の移植実験から、これらの骨リモデリングには、神経組織(側線器官)が必要であることが示された。今後、神経組織と骨組織の相互作用について解析を行う予定である。骨組織を正常に維持するためには、骨芽細胞による骨形成と破骨細胞による骨吸収のバランスを調節する必要がある(骨リモデリング)。骨リモデリングの異常は、骨粗鬆症などの重大な骨疾患を引き起こす。ゼブラフィッシュの側線鱗は、単純な構造を持ち、かつ骨形成・骨吸収過程を容易に観察できることから、骨リモデリング機構の解析のためのすぐれたモデルとなる。昨年度は、骨芽細胞・破骨細胞で発現する遺伝子の単離と発現パターンの解析を行い、側線鱗の形成過程を記載した。また、破骨細胞に異常を示す突然変異体c-fmsでは、側線鱗の形成が阻害されることから、側線鱗の形成は、骨リモデリング過程によって生じるていることを示した。本年度は、側線鱗の骨リモデリング過程がどのようなメカニズムで生じるのか調べた。(1)側線鱗を除去し、再生過程を観察した。はじめ通常の鱗が形成し、次に、側線鱗の管構造が生じる。この過程は正常発生と同じであった。(2)側線鱗を除去したあと、通常の鱗を移植すると、移植した鱗には、管構造が生じた。(3)側線鱗を除去するさい、神経組織(interneuromast cells)の除去を行った。神経組織がないと、側線鱗の管構造は生じなかった。以上の結果から、側線鱗の骨リモデリングには、神経組織が必要であることが示された。この成果を、論文として発表した(Wada et al (2014) Dev. Biol. 392: 1-14)。鱗の形成には、表皮組織と真皮組織の相互作用が必要であると考えられている。しかし、どのようなシグナル分子が骨形成を制御しているのか分かっていない。表皮組織では分泌因子Shhが発現している。また、神経組織では、分泌因子Dkkが発現している。今後、これらの分子の機能解析を行い、骨リモデリングにおける組織間の相互作用の実体を明らかにする予定である。骨組織の維持には、骨芽細胞による骨形成と破骨細胞による骨吸収のバランスを調節することが必要である(骨リモデリング)。ゼブラフィッシュの側線鱗は、きわめて単純な構造を持ち、骨芽細胞・破骨細胞の動態を観察することが容易であることから、骨リモデリング機構の解析のための優れたモデルとなる。前年度(2014年)、側線鱗の管器の形態形成を解析し、骨リモデリングによって管器が常に成長していること、また、骨リモデリングには感覚器である側線器官(感丘)と、感丘どうしをつなぐ細胞(interneuromast)が必要であることを示した。つまり、骨リモデリングには神経組織と結合組織の相互作用が必要であることが分かった(Wada et al., 2014)。今年度(2015年)は、鱗の発生における表皮組織と真皮組織の相互作用に注目し、発生初期に発現する遺伝子の単離と発現パターンの解析を行った。その結果、Shh、BMP、Wntシグナル・パスウェイ遺伝子が発現することが分かった。

とくに、Shhは鱗の成長末端にある骨芽細胞と接する、表皮細胞で発現することから、骨形成との関連が強く予想された。今後、これらの遺伝子の機能解析を行い、骨リモデリングにおける組織間相互作用を明らかにする。なお、本研究を含むこれまでの研究の概要を、総説として発表した(Wada and Kawakami, 2015)骨組織の維持には、骨の形成と吸収のバランスが必要である(骨リモデリング)。このバランスの異常は、骨粗鬆症などの骨の病気を引き起こすが、その仕組みはよく分かっていない。我々は、ゼブラフィッシュの鱗(骨組織)を用いて、骨の形成過程を調べた。その結果、特殊な鱗(側線鱗)にある筒状の構造(管器)が、骨リモデリングによって、絶えず成長していることを示した。さらに、側線とよばれる神経組織(感覚器)が、骨リモデリングを制御していることを明らかにした(Wada et al., 2014)。この研究成果は、神経組織と骨組織が相互作用していることを意味していて、今後、骨の病気の原因解明につながると期待される。できた項目:(1)マーカー遺伝子の発現解析により、ゼブラフィッシュ側線鱗の形成過程を記載した。(2)移植実験により、側線鱗の骨リモデリング過程が神経組織によって引き起こされることを明らかにした。できなかった項目:遺伝子の機能解析をするために鱗の培養系の確立発生生物学当初から、遺伝子の機能解析をするために鱗の培養系の確立を目指しているが、うまくいっていない。その原因として(1)側線鱗の形成(再生)には、35日の比較的長い期間が必要なこと。(2)鱗には、表皮・真皮の他、毛細血管が走行しており、これらの組織が重要な役割をしていること、が考えられる。今後、遺伝子機能解析の他の方法としてエレクトロポレーションによるプラスミド発現ベクターの導入を行う。表皮からのシグナル分子として、Shh pathway、真皮における骨形成シグナルとして、Bmp pathway、さらに、神経組織からのシグナル分子としてWnt pathwayの機能解析を検討している。また、エンハンサートラップ系統のスクリーニングから、骨芽細胞でリポーター遺伝子を発現する系統を得ている。今後、この系統を用いて、鱗の発生過程・再生過程を解析する。できた項目:(1)ゼブラフィッシュの側線鱗(管器)の形成過程を詳細に記載することができた。(2)骨芽細胞・破骨細胞のマーカー遺伝子を単離し、発現パターンを解析した。(3)突然変異体を用いた解析と、鱗の移植実験により、骨リモデリングにおける神経組織の役割を明らかにした。できなかった項目:(1)鱗の組織培養系の確立。今後、遺伝子の機能解析をする上で、手軽なアッセイ系がぜひ必要。昨年度末に共焦点レーザー顕微鏡用のコンピューターに不具合が生じ、その買い換え(50ー60万円)を予定していた。しかし、その後、基盤の点検・清掃によって回復したため、その分の費用を次年度に繰り越した。本年度得られた知見(側線鱗の正常発生と、遺伝子の発現様式)をもとに、以下の実験を行う。(1)鱗の組織培養系の確立。(2)骨芽細胞・破骨細胞でGal4を発現するトランスジェニック系統を樹立する。(3)再生鱗における遺伝子発現パターン解析。(4)上に作成した系を用い、候補遺伝子の機能解析を行う。
ラジカルの反応性制御に基づく低イオン性ビラジカル生成モデルの開発

エンインアレンのMyers-Saito型芳香環化反応によって生じるα,3-ジデヒドロトルエンビラジカルは一重項ビラジカルであることから、高いZwitterione的な性質を有している。このビラジカルのイオン的な反応性を抑え、ラジカル的な性質を高くするためにベンジル位に種々の置換基を導入し、その反応性を検討した。その結果ベンジル位に電子吸引基を導入した場合、イオン的な反応性が抑えられ、ラジカル的な反応性が高まることを見出した。また、ラジカル性が高いビラジカル及びイオン性が高いビラジカルのDNA切断活性を測定したところ、ラジカル性が高いものは高い切断活性を示したのに対し、イオン性のビラジカルはほとんど活性を示さなかった。以上の結果を基に、ベンジル位に電子吸引基を持つビラジカルを生成するモデル化合物を開発した。このモデル化合物の特徴は、シアンヒドリンの脱プロトン化によりカルボニル基が生じ、そのカルボニル基がエンジイン骨格のエンインアレンへの異性化を引き起こし、芳香環化反応が起きることにある。すなわち、シアンヒドリンの水酸基の保護基という形で「Triggering Device」を導入できるという特色を有している。この特色を生かして、加水分解、光照射をトリガーとするビラジカル生成モデルの開発に成功した。光照射をトリガーとするモデル化合物では、シアンヒドリンの保護基(光照射により脱保護されるもの)を種々検討し、その部分の最適化を行うと同時に、DNAの光切断にエンインアレンの芳香環化によって生じたビラジカルが関与していることを明らかにした。また、このモデル化合物のDNA切断活性の向上を目的としてDNA親和性を導入したモデル化合物を合成した。DNA親和性部位としてSpermine, Spermidine等をのポリアミン類を導入したところ、切断活性の飛躍的な向上が見られた。Myers-Saito型芳香環化反応により生じるデヒドロトルエンビラジカルはスピン-軌道相互作用により一重項となるため、対イオン的な挙動を示すと考えられている。このイオン的な性質はビラジカルの持つDNA切断能などの生理活性を著しく低下させることから、ビラジカルのラジカル性を高めるための分子設計指針の確立は重要な課題となっている。今年度は、分子設計指針の確立を目標として、種々の置換基をビラジカルに導入し、その反応性を検討した。その結果、種々の電子吸引基をベンジル位に導入した場合、ビラジカルのイオン性が低下し、ラジカル的な反応性が著しく高まることを見いだした。電子吸引基の効果を理論化学的に検証するために電子供与基、吸引基を導入したビラジカルの完全活性空間法を用いた分子軌道計算を行ったところ、電子吸引基を導入した場合、ラジカル状態とイオン対の状態のエネルギー差が非常に大きくなり、イオン対が不安定化されることが分かった。また、一重項と三重項のエネルギー差(S-T splitting)も電子供与基を導入した場合に比べ小さくなっており、電子吸引基を導入することによりビラジカルのラジカル性が高まるという実験結果と良一致を示した。これらのビラジカルはいずれも高いDNA切断活性を示したことから。現在、ビラジカル生成分子にトリガー機能を組み込み、種々の生体内反応により活性化されるビラジカル発生剤の開発を進めている。
イラン国立博物館ほか所蔵のパルティア期資料の調査

本研究で明らかにすることの一つは、イラン国立博物館等に所蔵されている、あるいは現地に残る、アルシャク朝時代の浮彫資料や小型造形資料に対して、写真撮影を中心とする作業を行ない、それを元に遺物の3Dモデルを作成することである。複数の時期に刻まれた浮彫・碑文については、先後関係に注意しながら、作風を美術史の観点から比較し変化を明らかにする、また、アラム系文字碑文については後彫りによって削られてしまった部分を考慮しながら残存部分の解読を行なう。このような作業を行なうことで、決定的に資料の不足しているアルシャク朝最末期の状況、とくにスーサを中心とした地方の支配者と皇帝との関係、を明らかにする。
筋ジストロフィーに対するMMP-9を標的とした新規治療法の開発

筋ジストロフィー患者の骨格筋変性におけるMMP-9の役割について、ジストロフィン及びMMP-9のダブルノックアウトマウス、MMP-9ノックアウトマウスを用いた骨格筋傷害モデルを用いて解析した。MMP-9は若年患者の骨格筋ではケモカインや炎症細胞の遊走に対する作用を介し炎症の収束遅延、組織変性の増悪を引き起こす一方で、高齢では間質線維成分を分解することで組織の線維化を抑制する作用が主体となることが明らかになった。MMP-9を標的とする治療は、若年患者には有効となる可能性があるが、臨床応用には治療を行う病期や投与期間を十分に検討する必要性が示唆された。方法:1野生型マウスとMMP9-/-マウスの前脛骨筋内にカルディオトキシンを注入することで骨格筋傷害モデルを作製し、急性炎症から組織修復の過程でのMMP-9の働きについて免疫組織学的および分子生物学的手法を用いて解析した(N=4-5)。2ジストロフィン欠損(mdx)マウスにMMP-9を欠損させたmdx;MMP9-/-マウスを作製し、骨格筋の炎症、壊死、再生、線維化について、2、4、8、14週齢および1歳齢で上記と同様の手法を用いて解析した(N=3)。結果と考察:骨格筋傷害モデルの解析では、MMP-9の欠損によりMCP-1発現およびMΦの浸潤が増加し、MIP-2発現および好中球浸潤は減少していた。さらに再生促進作用を有するM2MΦの浸潤は増加し、DMDの表現型の軽症化に関わると考えられているosteopontinの発現増加を認めた。4週齢のmdx;MMP9-/-マウスではMIP-2発現の低下、MCP-1発現の増加を認め、組織の炎症細胞浸潤はこれらに呼応する変化を示し、さらにはosteopontinの発現は一過性に著明に増加していた。14週齢のmdx;MMP9-/-マウスの骨格筋では再生線維が増加し、血清CK値の低下と筋力の増加が確認された。一方、1歳齢のmdx;MMP9-/-マウスでは骨格筋間質のI型コラーゲンの蓄積が増加し、筋力は低下していた。以上よりmdxマウスの骨格筋変性におけるMMP-9の主な役割は、若年期にはケモカインや炎症細胞の遊走に対する作用を介して炎症の収束を遅延させる一方で、高齢では間質線維成分の分解を促進し、組織の線維化を抑制する働きが主体となることが明らかになった。よって、MMP-9を標的分子とする治療は若年DMD患者には有効となる可能性があるが、臨床応用のためには治療を行う病期や投与期間を十分に検討する必要性が示唆された。計画は一部変更したものの、ダブルノックアウトマウスの解析により筋ジストロフィーの新規治療法開発のために有用と考えられる興味深い結果が得られた。2014年11月に筋ジス治療研究会にて成果報告し現在論文投稿中である。筋ジストロフィーH26年度の研究により、ジストロフィン欠損筋においてMMP-9は、若年期には炎症収束と筋再生を遅延させ、高齢期には線維化に対し抑制的に働いている可能性があることが明らかとなった。平成27年度の計画を繰り上げてMMP-9抑制剤の経口投与を試みたが、現時点では投与に失敗している。腹腔内埋め込み型のオスモティックポンプの使用や腹腔内注射による投与なども検討して、計画を遂行する。試薬の節約と割引価格での試薬購入を心掛けたことから次年度使用額が生じた。次年度使用額は少額であるため、平成27年度請求額と合わせて消耗品費に使用する。
確率論的手法による数学諸分野の研究

当初の目的の1つである“確率論固有の分野及び既にその手法の有効性が評価されている領域の更なる発展"については,かなりの成果を得たといえる。代表者である神田は,ポテンシャル論と関連する分野に於て,時空空間でのレヴィ-過程のエネルギ-について新しい結果を得,積年にわたる課題であった容量に関するショケ-の対生の,マルコフ過程の立場からは最終的ともいえる証明を,フイツシモンズとの共同研究により与える事ができた。この研究により,ドラシェリ等によるマルコフ過程の一般理論の有効性が検証され,更に明記した事は,両側マルコフ過程の重要性が認識された事である。両側マルコフ過程の理論は,従来のマルコフ過程の対象領域を拡大し,確率解析等との新たな関連が期待されている。分担者である笠原は、極限定理への独自の接近を押し進め,重要な道の空間D([0,1]R^d)×D([0,3],R^d)について興味ある結果を得た。将来統計学上の問題とも関連してその発展が期待される。また南は,シュレ-ディンガ-作用素に関連するランダム・ポテシャルについて,注目すべき成果をあげた。それは数理物理的観点からも興味ある結果であり,数理物理に関して定評ある雑誌に発表される予定である。杉浦は,統計学での重要な問題を通じて,行列に関する深い理論とも関連する大切な結果を得た。赤平は,経済学,情報理論など広い分野の研究を通じて,最適性等に関する顕著な成果を得た。平良は,拡散過程の理論と密接に関係する一般境界値問題の研究を精力的に続け,ほぼ最終的に近い成果をあげた。平良の成果はもとより,微分方程式専門の分担者,微分幾何専門の分担者等による当該年度に於ける成果は,確率論研究の將来に大きな刺激を与えるものと思われる。
ゲノム塩基配列の網羅的解析法による疾患遺伝子探索と新規分子生命現象の発掘

本邦国民の失明原因の上位を占める緑内障と加齢黄斑変性の克服を目指し、ゲノム解析の手法を活用して発症機序解析を行った。緑内障研究としては、既知原因遺伝子の産物蛋白質、ミオシリンとオプチニュリンにそれぞれ結合する蛋白質を新たに同定し、同疾患に新たな現象や細胞機能が関与する可能性を見出した。加齢黄斑変性の研究には、ラット網膜光障害実験モデルを用いた。可視光照射による網膜光障害の感受性がラットの系統に依存することから、感受性の責任遺伝子を追究したところ、二つの遺伝子が同時に関与することが判明し、ゲノム解析によりそれらをラット5番、19番染色体に限局化できた。これらの遺伝子のヒト相同遺伝子を解析して、加齢黄斑変性発症との関連を解析する計画である。1.(1)ゲノム悉皆解析法により新規の遺伝子ファミリーYPELを同定した。YPELファミリーは広範な真核生物に存在するため、生命維持に重要な働きを持つことが推測された。また、同ファミリーのタンパク質は、中心体や紡錘糸に局在し、細胞分裂に関連する機能を担うことが推定できた。(2)緑内障の候補ゲノム領域のうち、7q35-q36上のGLC1F領域4Mbを対象としてゲノム悉皆解析法を遂行した。その結果、何らかの転写物が高い相同性を示した遺伝子または推定遺伝子73個を確認した。このうち眼で発現する遺伝子は47個であった。73個のうち3個は非全長cDNAクローンしか存在しないため、現在、実験によりそれらの遺伝子の全長cDNAの単離、同定を進めている。2.(1)メダカの飼育システムの導入を完了し、CAB株の飼育と卵、胚、稚魚、成魚の材料蓄積を開始した。(2)前記材料を用いて発生段階別cDNAライブラリーを作製している。(3)次のメダカ遺伝子及びcDNAを単離している。◆猫目症候群原因遺伝子領域に存在する未知の眼形態形成遺伝子群のメダカ相同遺伝子◆眼の発生、形成関連の遺伝子(pax6,shh, otx2等)3.(1)青錐体一色型色覚の日本人2家系の赤緑遺伝子解析を行い、1家系については、欠失範囲を1塩基レベルで決定した。(2)緑内障の新規遺伝子同定のために、拡張候補遺伝子アプローチとポジショナルクローニングの両面から準備を進めている。同疾患の邦人36家系(患者93人)を収集し、52人(患者49人)から採血して、44例はB細胞株樹立に成功した。一方、ヒト網膜RNAを用いたY2H用PREYライブラリーを作成し、MYOC、OPTNをベイトとしたクローン同定を進めている。4.単一遺伝子疾患の変異データベース構築を継続しており、本年度に62疾患、26遺伝子、1,659種類の変異、3,249の症例データを469篇の文献から構築した。現在の総計データは、510疾患、294遺伝子、8,711種類の変異、症例数18,618、文献数2,306篇である。1.ゲノム悉皆解析法を用いて、昨年度のGLC1F領域4Mb(7q35-q36)に加えて、3q22-q23上のGLC1C領域8Mbの解析も行った。その結果、機能未知cDNA/ESTを含めて何らかの転写物と高い相同性を示す遺伝子または推定遺伝子をGLC1F領域に73個、GLC1C領域に60個同定した。GLC1F領域の1遺伝子に関しては、公共データベースに登録のない転写物のクローニングと構造解析も行った。2.(1)メダカCAB株の発生時期特異的cDNAとRACE用cDNAを調製した。(2)2472hpfのcDNAからヒトの猫眼症候群原因遺伝子領域に存在するCECR1, CECR5a, CECR6遺伝子のメダカ相同遺伝子の翻訳領域全長をカバーするcDNAクローニングを行った。3.(1)緑内障の新規遺伝子同定に利用するために、現在までに同疾患の日本人68家系を収集し、患者85人から採血しDNAを抽出し、B細胞株樹立にも成功した。プレスクリーニングとして、それらの症例における既知緑内障原因遺伝子の変異の有無をスクリーニングしている。(2)緑内障の新規原因遺伝子同定を「拡張候補遺伝子アプローチ」で以下のように進めた。OPTNの全長cDNAをベイトとし、ヒト網膜RNAより構築したcDNAをプレイとして用いて酵母2ハイブリッド法でOPTNタンパクと相互作用するタンパクのcDNAの探索を行った。現在までに36個の候補遺伝子を単離し、性状解析を行った。それらの中で、構造や遺伝子座等に特徴があるものは以下のとおりであった。

(1)GLC1F(7q35-q36)にマップする(2遺伝子)、(2)眼、神経等に特異的な発現を示す、(3)アポトーシス関連、(4)ゴルジ輸送関連、(5)ユビキチン関連。このうち、(1)の2遺伝子が新たな緑内障原因遺伝子である可能性を検証するために、GLC1F領域をマップした研究者と共同研究で変異探索を開始した。4.単一遺伝子疾患の変異データベース構築を継続しており、現在までに、590疾患、324遺伝子、17,685件の変異データを2,491報の文献から構築した。1.オプチニューリン(OPTN)と相互作用するタンパクの解析(1)GLC1F領域にマップする二つの候補遺伝子OIP-F01と0IP-F02の変異解析を行った。患者検体は、GLC1F領域を報告した米国のM.K.Wirtz博士との共同研究で入手した。その結果、患者のOIP-F02で5種類の塩基配列変化を同定したそのうち、77G/Aはアミノ酸置換を伴う。これらに関して、独自に収集中の緑内障家系での存否を検討したが、いずれの塩基変化も患者群と正常対照群で出現率に有意差を認めなかった。(2)NRLは網膜色素変性の原因遺伝子である。NRLとOPTNのラット生体眼組織での発現を免疫染色で解析したところ、NRLは既報告どおり視細胞の核に存在したが、OPTNは既報告の神経節細胞、内網状層の細胞以外に、NRLと同じく視細胞にも検出された。このことは、両タンパクの生体での相互作用、および網膜色素変性と緑内障に何らかの関連が存在する可能性を示唆する。2.ミオシリン(MYOC)と相互作用するタンパクの解析(1)遺伝子座が緑内障候補領域内に存在する遺伝子9種を同定し、そのうち5種(GLC1L内に3種、GLC1F内に2種)について、患者検体で変異解析を開始した(豪州のP.N.Baird博士及び上記Wirtz博士との共同研究)。(2)他の眼疾患(黄斑変性症、網膜色素変性等)の原因遺伝子あるいは関連遺伝子が9種得られた。これは、それらの発症機構が緑内障と関連する可能性を示すので、現在生体内での相互作用を確認している。(3)細胞外で機能すると考えられる遺伝子が11種得られた。これらについても、cDNA単離と生体内での相互作用の確認を進めている。3.遺伝子疾患症状オントロジーデータベースの構築と公開遺伝的要素を持つ疾患を対象として、症状、診断所見、検査データ等を体系的に収集、分類し、それらのデータを疾患名、原因・関連遺伝子に結びつけるデータベースSYMPHONIEの構築を継続して浜松医科大学よりインターネットで公開した。1.緑内障(GLC)の新規遺伝子探索と背景現象の解明(1)収集したGLC家系のうち患者数が比較的多い家系で連鎖解析を行ったところ、8p21.3付近のD8S258がLOD値2.50を示し、新たなGLC原因遺伝子の存在可能性を示唆した。(2)昨年度までに単離した既知原因遺伝子ミオシリン(MYOC)の相互作用蛋白のうち、細胞外で機能する3種類について培養細胞でMYOCと共発現し共免疫沈殿によって相互作用を確認できた。若年マウスの眼組織を用いたMYOCの免疫組織蛍光染色により、これまで報告されていなかった網膜色素上皮細胞において、MYOCの局在を確認した。(3)既に単離した既知原因遺伝子オプチニューリン(OPTN)の相互作用蛋白を次のカテゴリーに分類して、それぞれ性状解析を開始した:
細胞の塩環境適応と膜イオン輸送蛋白質の機能制御の分子的基盤

細胞の中でH^+,Na^+,K^+,Ca^<2+>などの重要なイオンに関する環境は一定に保たれており、その調節は,細胞膜や細胞内小胞などの生体膜に存在するイオン輸送性の膜蛋白質によって細胞の内や外へのイオンの輸送のレベルで行われている。特にNa^+は、細胞内部では低く保たれ、細胞外では高い。この状態は、Na^+がエネルギーイオンとして使われていることと呼応している。本研究では、このNa^+勾配を利用しpH制御に関わったり、Na^+の制御、すなわち細胞や個体の耐塩性に中心的役割を果たすNa^+/H^+交換輸送蛋白質(NhaA,Nha1p,NHEと省略)の構造と機能、制御について分子レベルで研究を行った。期間の成果として、真正細菌に広く存在する交換輸送蛋白質NhaAについてイオン輸送に関わる膜中ドメイン(TM)4,5,10,11について、それぞれを構成するアミノ残基をシステインに置換し、機能の変換およびNEMの結合を指標にそれぞれの残基の機能と空間配置を考察した(JBC(2004)発表済みおよび準備中)。この結果、NhaAの中に水で満たされたchannel構造が4つのTmで形成されること、またイオン結合に関与する残基の配置が推定された。さらにNhaAのカルボキシ末端に蛍光蛋白GFPの誘導体を結合し、細胞膜内でNhaAが2量体を形成していること、2量体の形成サブユニットはイオン輸送においてLi^+の結合にともなって相互の位置関係の変化(構造変化)をすることが明らかになった(投稿中)。酵母のNha1pのイオン輸送活性を直接測定する実験系を酵母内の輸送膜小胞にNha1pを蓄積させることによって実現した。その結果、Nha1pは一価のメタル陽イオン全般について輸送能を有すること、またそのイオンに対する見かけの親和性は低いことが明らかになった(BBA印刷中(2005))。Nha1pは、2量体を形成すること、2量体は粗面小胞体ですでに形成されていることも明らかになった(JBC投稿中)。Nha1pに結合し耐塩力の増強に関与する新規因子(JBC(2004)印刷済み)については、アイソフォームの遺伝子を欠失させ、それらの機能の解析を行った。ヒトの細胞に存在する4つのNHEについては、細胞内の異なる小胞に存在し、小胞内のpH制御に関わることを明らかにした(JBC(2005)印刷済み)。NHEについて機能発現に必至なCHPについて機能と構造の解析を行った。(1)細菌において最も重要なアンチポーターNhaAのイオン輸送・pHセンサー機構の解明研究開始前に明らかにしていた大腸菌のNhaAに加えて、ピロリ菌NhaAのイオン輸送および輸送のpH依存の制御に必至な膜内在性部分を遺伝学的解析を中心に、また大腸菌とのキメラ体の作成により究明した。

その結果、4つの膜貫通ドメイン(TM4,5,10,11)にイオン輸送に必至な残基が集中しイオン透過経路を形成し、アルカリ条件下の活性化調節には第7ループとTM8の残基が関与することを明らかにした。イオン輸送に必至なAsp残基を含むTM4についてすべての残基をCysに置換しNEMの結合能を指標にAsp近傍の膜内のチャネル構造の一部を明らにできた。また、ピロリ菌NhaAの大量精製にも成功し、その生化学的性質を検討し、結晶化の予備実験を行っている。NhaAのイオン輸送経路の詳細な知見は、酵母、ほ乳類のアンチポーターのイオン輸送の機構を解明する上で大きな手がかりになると信ずる。(2)酵母の細胞膜アンチポーターNha1イオン輸送と制御の機構数種の酵母のNha1をクローン化し構造を決定した。その結果、一次構造は異なるにも関わらず、細胞内ドメインに加えて長大な細胞質ドメインをいずれも有しており、この点でほ乳類のものと良く似た構造を持つことが明らかになった。細胞質ドメインは種間での相同性が低いが一部に6カ所の保存された領域(C1-C6)があることを明らかにした。細胞膜に近接したC2部分に結合しイオン輸送を正に制御する新規膜蛋白COS3が存在することを明らかにした。C1,C2はほ乳類のアンチポーターとは構造的類似性がない。ほ乳類アンチポーターNHEでも、分子内位置として酵母のC,C2に相当する部分にCHP(カルシニューリンホモロガス蛋白)が結合することを見いだしており、CHPとCOS3の機能的類似性に注目している細胞の中でH^+,Na^+,k^+,Ca^<2+>などの重要なイオンに関する環境は一定に保たれており、その調節は,細胞膜や細胞内小胞などの生体膜に存在するイオン輸送性の膜蛋白質によって行われている。特にNa^+は、細胞内部では低く保たれ、細胞外では高い。本研究では、このNa^+勾配を利用しpH制御に関わったり、Na^+自身の制御、すなわち細胞や個体の耐塩性に中心的役割を果たすNa^+/H^+交換輸送蛋白質(NhaA, Nhalp, NHEと省略)の構造と機能、制御について研究を行った。本年度の成果として、真正細菌に広く存在する交換輸送蛋白質NhaAについてイオン輸送に関わる膜中ドメイン(TM)4,5,10,11について、それぞれを構成するアミノ残基をシステインに置換し、機能の変換およびNEMの結合を指標にそれぞれの残基の機能と空間配置を考察した。この結果、NhaAの中に水で満たされたchannel構造が4つのTmで形成されること、またイオン結合に関与する残基の配置が推定された。さらにNhaAのカルボキシ末端に蛍光蛋白GFPの誘導体を結合し、細胞膜内でNhaAが2量体を形成していること、2量体の形成サブユニットはイオン輸送においてLi^+の結合にともなって相互の位置関係の変化(構造変化)をすることが明らかになった。酵母のNhalpのイオン輸送活性を直接測定する実験系を酵母内の輸送膜小胞にNhalpを蓄積させることによって実現した。その結果、Nhalpは一価のメタル陽イオン全般について輸送能を有すること、またそのイオンに対する見かけの親和性は低いことが明らかになった。Nhalpは、2量体を形成すること、2量体は粗面小胞体ですでに形成されていることも明らかになった。Nhalpに結合し耐塩力の増強に関与する新規因子については、アイソフォームの遺伝子を欠失させ、それらの機能の解析を行った。ヒトの細胞に存在する4つのNHEについては、細胞内の異なる小胞に存在し、小胞内のpH制御に関わることを明らかにした。
フレアー理論とパーシステント加群の応用に関する研究

研究C(研究Aにおける基本群に課す条件の緩和)について本年度は、当初の予定通り基本群に課した仮定を仮想的R群にまで緩和することが出来た。※研究A:「任意の閉シンプレクティック多様体のハミルトン微分同相写像は、非可縮周期軌道を少なくとも1つ持てば無限個持つ」というギュレル予想の研究研究D(フレアー・パーシステント理論の一般論の習得、先行研究の調査)についても計画通り進めた。さらに、具体的にどこを明らかにすれば良いかを把握した。研究Dに関連して、本年度はスペクトル不変量、部分シンプレクティック擬状態に関する研究が進んだ。2006年にエントフとポルテロヴィッチは「任意の閉シンプレクティック多様体上の任意の運動量写像は非交叉配置不可能なファイバーを持つ」ことを示した。2009年に彼らは非交叉配置不可能性よりも強い性質として、ある部分シンプレクティック擬状態ζに対するζ-heavinessを導入した。本年度は川﨑盛通氏(京都大学数理解析研究所)と共同で、非交叉配置不可能性よりも強く、ζ-heavinessよりも弱い性質であるζ-psuedoheavinessを導入し、「任意の閉シンプレクティック多様体上の任意の部分シンプレクティック擬状態ζに対して、任意の運動量写像はζ-pseudoheavyなファイバーを持つ」ことを示した。また、「一般の部分シンプレクティック擬状態に対してはζ-heavyなファイバーがいつも存在するとは限らない」ことも具体的な例により分かった。研究C,D,ともに計画通り進められ、関連する共同研究も極めて順調だったが、研究Eについては芳しくなかったため2番目の区分にした。研究Cについては、シンプレクティック多様体に課す仮定の緩和に挑戦する。今年度は、基本群だけでなくシンプレクティック形式も対象となる。研究Dに関連して、本年度功を奏したζ-pseudoheavinessに関する研究を発展させる。具体的には、幾つかの古典的なリュービル可積分系に対してsuperheavyなファイバーの存在を示す。ここでのζは一般の部分シンプレクティック擬状態ではなく、余接束の零切断に関するラグランジアン・スペクトル不変量を用いて定義されるものである。このように、具体的なスペクトル不変量からパーシステント加群のバーコード理論への還元を目論む。研究Eについては、申請書記載の困難Eを解決させる。ポツニャックの定理をフレアー・ノビコフ理論の枠組みへ一般化させることが肝要である。
日本における環境税(炭素税)導入のシミュレーション分析

応用一般均衡モデルという手法を利用し、日本における二酸化炭素排出規制の経済的効果について分析をおこなった。分析により、(1)応用一般均衡モデルによる排出規制の分析において、新エネルギー、新技術を考慮することの重要性、(2)日本から中国への技術移転における問題点、(3)日本の温室効果ガス削減の中期目標設定における様々な選択肢の経済的効果について明らかにすることができた。平成19年度には、日本におけるCO2排出規制を分析するためのCGEモデルの構築に取り組んだ。モデルの主な特徴は以下の通りである。(1)まず、風力発電、太陽光発電等の新エネルギー、CCS(炭素回収・貯留)をモデルに組み込んだ。新エネルギーもCCSも有望なCO2削減策として期待されているものであり、その動向によりCO2規制の費用が大きく変わってくる可能性がある。第二に、(2)部門間の生産構造の差を考慮するために、部門別に異なったタイプの生産関数を想定するように変更した。具体的には、発電部門、農業部門、化石燃料部門、その他の4つの部門のタイプを考慮し、それぞれに異なった生産関数を想定した。第三に、(3)同じ動学モデルであっても動学的最適化モデルよりも扱いが容易な逐次動学モデルに変更した。以上のようなCGEモデルを構築し、日本におけるCO2規制の分析に取り組んだ。まだモデルの様々な部分に改良の必要があり、現在のところ試算の段階でしかないが、次のような結果が得られている。まず、新エネルギー、CCSを考慮したモデルでは、考慮しないモデルと比較し、CO2削減の費用を大きく軽減できる可能性があるという結果が出た。これは新エネルギー、CCSを考慮しないモデルでCO2規制を分析した場合、費用を過大に見積ってしまう可能性があるということである。CO2規制の費用は規制導入の是非を左右する最も重要な要素であるが、本研究の分析はより正確な費用の評価に寄与するものである。ただし、費用の推定値はは新エネルギー、CCSの導入可能量、技術・費用水準等についての想定に非常に強く依存するという結果も出ているため、より詳細、かつ現実に沿った形で新エネルギー、CCSをモデルに組み込んでいく必要がある。地球温暖化では世界全体のCO2排出量が問題となるため、世界全体での温暖化対策が必要となる。CO2排出量の多い先進国における排出規制が必要なのは言うまでもないが、近年急速な成長を遂げつつあるBRICs等の途上国の排出量増加をいかに抑制するかも重要な課題となっている。しかし、CO2排出規制はエネルギー利用の削減・抑制を意味するため、経済発展をその最重要課題とする途上国が自発的な排出規制に取り組むことは難しい。経済発展を維持しつつ途上国の排出量を抑制するためには、先進国が何らかの形で途上国の排出規制を支援することが必要になる。そのための方法の一つに先進国から途上国への技術移転がある。先進国と比較し一般に途上国はエネルギー利用に関する技術(省エネルギー技術)が低い。そこで、先進国から途上国への省エネ技術の移転を促進することで、途上国の経済発展を維持しつつ、CO2排出量を抑制することができる。しかし、技術の移転が可能であったとしても、それだけで排出抑制が実現するとは限らない。というのは、技術が採用されるかは、生産物・生産要素の価格等にも依存するからである。以上のような問題意識から、本研究では、火力発電武門における日本から中国への技術移転、資本移転とCO2排出規制の関係について分析した。具体的には、技術移転、資本移転、またその組み合わせが、CO2排出量、GDP、厚生等に対してもたらす効果を分析し、どのような政策を採用すれば日本、中国の双方にとって望ましい形でCO2排出量を抑制できるかを明らかにしている。
"シトルリン-NOサイクル"は存在するか?

齧歯類のマクロファージでは免疫刺激により誘導型一酸化窒素合成酵素(iNOS)が発現し多量の一酸化窒素(NO)が産生される。NOは殺菌作用を持ち生体防御に働くと考えられるが、一方で宿主細胞にも傷害を与え宿主個体にとっても血圧低下など有害に働く可能性がある。従って、過剰なNO産生を抑制する何らかの機構の存在が考えられる。NOはNOSによってアルギニンから生成されるが、アルギニンはアルギナーゼの基質でもあるため、アルギナーゼがNOSと同一の細胞に発現すると基質を競合し、NO産生を抑制するものと推測される。我々はアルギナーゼによるNO合成調節の可能性をラット腹腔内マクロファージを用いて検討した。8週令ラットにポリペプトンを投与し、腹空内マクロファージを採取した。初代培養細胞にリポポリサッカライド(LPS)を添加し、RNAブロット法によりiNOSと肝型アルギナーゼ(アルギナーゼI)に発現を解析したところ、LPS濃度依存的にiNOSおよびアルギナーゼ発現の誘導が観察された。また、LPS投与ラットの肺においてもin vivoでiNOSとアルギナーゼIの共誘導が認められた。現在、LPS刺激マクロファージにおけるアルギナーゼI誘導の機構と役割を解析中である。一方、既にクローニングされている肝型アルギナーゼの他に、腎臓などにアルギナーゼアイソザイムがあることが以前より知られていた。そこでアルギナーゼによるNO合成調節の解明を目的として、非肝型アルギナーゼ(アルギナーゼII)のクローニングを試みた。ヒト肝癌細胞株HepG2より非肝型アルギナーゼと思われる約280bpのcDNA断片を得た。この領域において約60%のホモロジーを示した。これをプローブとしたRNAブロット解析により腎臓に高い発現を認めたが肝臓にはほとんど発現を認めなかった。また、マウスマクロファージ細胞株Rawにおいて、LPS投与によりiNOSと本遺伝子の共誘導を認めた。
有機ホウ素化合物の革新的な合成法の開発

入手容易で安価な芳香族並びに脂肪族化合物の炭素-水素結合活性化を機軸とするジボロンやヒドロボランによる直接的なホウ素化反応が、イリジウムなどの適当な遷移金属錯体を触媒として用いることにより進行することを明らかにした。これらの反応は、有機合成中間体、生理活性物質あるいは機能性分子として注目されている有機ホウ素化合物の経済的で環境調和型かつ効率的な合成法である。本研究は、芳香族炭化水素類の安定な炭素-水素結合の直接的かつ触媒的なホウ素化反応による簡便でクリーンかつ経済的なアリール型ホウ素化合物の合成法を確立するとともに、得られたアリール型ホウ素化合物の鈴木・宮浦カップリングあるいはα,β-不飽和カルボニル化合物への1,4-付加などへの利用による効率的な炭素-炭素結合形成法ならびに新規な触媒的アリール化反応の開発を目的としている。1.反応条件(石山担当):効率的なホウ素化反応を実現するための反応条件(触媒前駆体、配位子、溶媒、添加物、温度など)を精査した。触媒前駆体としてはIr(OMe)(cod)錯体、配位子として4および4'位にt-Bu基を有するビピリジンが優れ、ヘキサンを溶媒とすると室温で、量論量の芳香族炭化水素のホウ素化が達成できた。2.ホウ素化剤(石山担当):反応を精査した結果、ジボロンにおいては、二つのホウ素基が利用可能であった。また、ヒドロボランとしてピナコールボランが同様の反応条件下利用可能であることもわかった。3.基質の適用範囲と選択性(山本担当):基質として様々な置換基を有する芳香族化合物のホウ素化について検討を行った。低原子価の金属錯体に対して高い活性を示す芳香族ヨウ化物を基質に用いてもホウ素化は芳香族炭素-水素結合でのみ進行した。また、複素環芳香族化合物においても位置選択的なホウ素化に成功した。本研究は、アルキルベンゼン類の安定なベンジル位炭素-水素結合の直接的かつ触媒的なホウ素化反応による簡便でクリーンかつ経済的なベンジル型ホウ素化合物の合成法を確立するとともに、得られたベンジル型ホウ素化合物の鈴木・宮浦カップリングあるいはα,β-不飽和カルボニル化合物への1,4-付加などへの利用による効率的な炭素-炭素結合形成法ならびに新規な触媒的ベンジル化反応の開発を目的としている。1.反応条件(石山担当):基質としてアルキルベンゼン類を用いる場合には、活性化が可能な結合としてベンジル炭素-水素結合のほかに芳香族炭素-水素結合も存在する。芳香族炭素-水素結合のホウ素化を抑え、ベンジル位炭素-水素結合のホウ素化を選択的に行うための反応条件(触媒前駆体、配位子、溶媒、添加物、温度など)を精査した。その結果、Pd/C触媒の存在下基質を溶媒として用いることにより100°Cで進行し、対応するベンジル型ホウ素化合物を収率良く与えることを見出した。3.基質の適用範囲と選択性(山本担当):基質として様々な置換基を有するアルキルベンゼンのホウ素化について検討を行った。官能基を持たない基質では収率良くベンジル型ホウ素化合物が得られるが、基質に酸素あるいはフッ素などのヘテロ原子が存在する場合には反応性が著しく低下した。ビニル位炭素-水素結合の活性化に基づくホウ素化反応1.反応条件とホウ素化剤環状ビニルエーテル類のビス(ピナコラート)ジボロンおよびピナコールボランによるビニル位炭素-水素結合の活性化を伴う直接ホウ素化反応が、[Ir(OMe)(COD)]2および4,4'-ジ-tert-ブチル-2,2'-ビピリジンとから調整した触媒の存在下オクタン中120°Cで進行し、対応するビニル型ホウ素化合物を収率良く与えることを見出した。2.反応の一般性と選択性基質としては1,4-ジオキセン、ジヒドロピランやジヒドロフラン類が利用可能である。単純なジヒドロピランやジヒドロフラン類の反応ではα/βの選択性は低いが、γ位に置換基を導入することで高いα選択性が実現できた。また芳香族炭素-水素結合を有する基質でもビニル位でのホウ素化が高い選択性で進行する。3.反応機構の解明ビニル位を重水素化した基質を用い、本反応における触媒サイクルの律速段階が炭素-水素結合の切断過程であることを明らかにした。また、本反応の速度論的な解析を行ったところ、炭素-水素結合の切断過程がイリジウム触媒の酸化的付加であることも明らかにした。[連携研究者]北海道大学・大学院工学研究院山本靖典4.有機合成への有効利用グルカール類のα位選択的ビニル位C-Hホウ素化に続くハロゲン化アリールとのクロスカップリングによる生理活性物質であるC-アリールグルカール類のワンポット合成を実現した。
複相鋼の水素脆化機構の解明に向けたマルチスケール解析手法の確立

水素助長損傷発達挙動解析および水素可視化技術確立に主眼を置き、以下の成果を達成した。1種々な複相鋼の損傷発達曲線を作成することで、安定オーステナイトが水素由来損傷を有意にアレストすることを見出した。つまり、BCCマルテンサイトなど耐水素感受性が高い相が存在していてもオーステナイト領域で損傷成長は止まり、破断に至らない。2電子チャネリングコントラスト法を用いて双晶や転位を結像することで、薄板状マルテンサイトの損傷形成機構を明らかとした。3ケルビンプローブおよび銀デコレーション法を用いてマルチスケールかつ時間分解能を有する水素可視化技術を確立した。本研究は、二相鋼の水素脆化機構解明を目的として、汎用的な損傷成長挙動の評価手法およびマルチスケール水素分布可視化手法の確立を試みた。発生、停留、成長の三段階に特徴を分割して行わる損傷成長挙動の解析は、フェライト/マルテンサイト二相鋼だけでなく、オーステナイト/マルテンサイト二相鋼にも適用可能であることを示した。具体的には、オーステナイト/マルテンサイト二相鋼では、オーステナイト/薄板状マルテンサイト界面および、薄板状マルテンサイト同士のジャンクションが水素助長損傷の発生起点となり、オーステナイト部で損傷が停留することが明らかとなった。このため、Ni偏析などを用いた、オーステナイトの安定性の不均一化は、耐水素脆化特性改善に対して有効であることが示された。水素の可視化については、Kineticallyな解析についてScanning Kelvin Probe Force Microscopyが、マルチスケールな解析について銀デコレーション法が有効であることが示された。前者は上記のマルテンサイト界面における水素のMobilityが高いことを高解像度で経時変化を示すことで明らかとした。また、銀デコレーション法は一般に走査型電子顕微鏡によって行われるが、近年のデジタル光学顕微鏡で十分有用な情報が得られることがしめされ、100-2000倍程度の水素分布解析が容易にできることを示した。これら解析結果では、いずれもマルテンサイトのジャンクションにおいて界面の水素Mobilityが高いことを示しており、上記、水素助長損傷形成にあたって、局所の水素のMobilityが非常に重要であることを視覚的に示すことに成功した。計画した内容の研究はすべて順調に遂行されている上に、銀デコレーション法においては、相界面レベルのきわめて高分解能の分布解析に成功した。この、銀デコレーションによる高分解能解析は当初期待していたなったものである。本研究では、鉄鋼材料における損傷発達の定量的かつ統計的解析法が、BCC/BCT二相鋼の他、FCC/BCTおよびFCC/HCP二相組織の損傷発達の議論に有効であることを示した(ここで、BCTとHCP相はマルテンサイトである)。具体的には、顕微鏡による微小ボイド観察から、損傷面積率、損傷数密度、損傷平均サイズを解析することにより、全ての鉄鋼二相組織における損傷発達過程が、1損傷形成前駆過程→発生、2損傷成長停留過程、3損傷成長→破壊の三つの段階に分けられることが示唆された。水素はそれぞれの損傷発達段階において異なる機構で延性に影響を与える。つまり、複相鋼の水素脆化機構を理解するためには、この三つの段階それぞれに個別の組織解析をする必要がある。さらに、損傷形成前駆段階は局所塑性ひずみ発達によって特徴づけられる。局所塑性ひずみ発達挙動は画像相関法を用いた局所ひずみ測定により明らかとされる。この問題を詳細に明らかとするため、画像相関法による局所ひずみ観察、電子チャネリングコントラストによる損傷周辺の組織観察の手法を確立した。これら結果を総括すると、複相鋼における水素は、損傷成長のアレスト能を著しく低下させており、例え損傷が形成しても、成長を停留させれられる耐水素複相鋼の創製が望まれる。また、特に最終年度では、水素可視化技術確立に注力し、FCC/BCC鋼、FCC/HCP鋼の銀デコーレーションによる水素分布可視化に成功した。加えて、これら結果に対応するケルビンプローブフォース顕微鏡による、より微視的でかつ時間経過依存性の情報を含む水素分布の可視化に成功した。これら結果より、水素は組織界面に顕著に偏析しており、その偏析箇所に沿って損傷発生が起こっている。将来的には、損傷のアレスト能低下の原因を明らかとするため、き裂先端の高分解能な水素可視化技術確立が望まれる。現在のところ、すべて順調である。研究計画に示した内容とこのまま推進するとともに、追加して、高分解能銀デコレーション法の技術確立を行う。鉄鋼材料強度学2015年度に計画していた出張がキャンセルされましたので、次年度使用額が生じました。上記の件、次年度に変更になりましたので、次年度使用額は2016年度出張旅費として使用いたします。
真核生物における環境適応応答遺伝子ファミリー(two-component system)の単離と機能解析

本研究では単細胞緑藻類のクロミドモナスをモデル生物とし、光合成関連諸酵素の遺伝子発現に関わる情報伝達機構にバクテリア型の情報伝達ストラテジが組み込まれていると仮定し、センサー遺伝子を単離するためにRT-PCRとクラミドモナスゲノムライブラリースクリーニングが行われた。その結果、2種類の遺伝子(CHS1,DHS2と命名した)の単離に成功し、またそれらの相同性検索の結果、原核生物や真核生物を問わず今までに報告されている多くの二成分制御系のセンサー領域と相同性を示した。どの生物種でもセンサードメインに保存される短いモチーフはH、N、G1、F、G2モチーフの五種類が存在するが(Hモチーフはヒスシジン残基の自己リン酸化、G1、G2モチーフはヌクレオチド結合)、本研究でクローニングされた遺伝子のコードするタンパク質において、H、G1モチーフが確認された。これらの事実より、本研究でクローニングされた遺伝子(CHS1とCHS2)はクラミドモナスでは初めてのセンサー遺伝子であることが示された。また、本研究で単離されたCHS1、CHS2遺伝子と真核生物で報告されているSLN1、Nik-1、ETR1、phyC(シロイヌナズナのフィトクローム遺伝子)遺伝子とE.coliのevgS遺伝子とで相同解析を行った結果、CHS1、CHS2遺伝子はバクテリア型二成分制御系におけるセンサー遺伝子ともフィトクローム遺伝子とも相同性を示すことが明らかとなった。また、CHS1遺伝子はSLN1やNik-1とは異なりETR1のようにヒスチジンキナーゼドメインがイントロンにより分断されている構造が確認された。分裂酵母,クラミドモナスcDNAライブラリーをファジミドベクターを用い,作製し,その後にtwo-component systemに属すると思われるクローンをスクリーニングした.two-component systemにおいては,センサーとレギュレーター蛋白質において,保存されたアミノ酸領域が特定されている.これらの保存領域を一方のプライマーに選択し,かた一方のプライマーとして,ベクター側に存在する既知のシーケンスを選択し,cDNAライブラリーを用いて,PCR反応をおこなった.また,クラミドモナスを光照射下で培養し,特異的なcDNAクローンを取得するために,RACEPCR法をおこなった.これらの結果,得られたクローンを用い,大腸菌において,発現させ,センサー,レギュレーターとしての機能解析を行った.つまり,大腸菌RU1012(ΔenvZ,φompC-lacZ)において,今回単離された遺伝子によりコードされた蛋白質がクロストーク反応をおこし,外膜蛋白質の発現を促すかどうか調べられた.これらの結果,分裂酵母,クラミドモナス細胞においても,細菌環境応答遺伝子,2-component systemに相同な遺伝子が存在することが,示唆された.本研究では単細胞緑藻類のクロミドモナスをモデル生物とし、光合成関連諸酵素の遺伝子発現に関わる情報伝達機構にバクテリア型の情報伝達ストラテジが組み込まれていると仮定し、センサー遺伝子を単離するためにRT-PCRとクラミドモナスゲノムライブラリースクリーニングが行われた。
地質情報を基盤とした東南アジア地域の地下と地上をつなぐ空間情報処理システムの構築

対象地域をベトナムの首都であるハノイに設定し、ハノイの「地下データ(地質ボーリングデータ)」・「地表データ(地形標高データ)」・「地上データ(建物分布データ)」を収集し、地下から地上までをつなぐ空間情報処理システムの構築を目指した。今年度の研究実績は,以下の3点が上げられる.(1)ベトナム・ハノイの歴史地図・地形図のGISによるマッピング.(2)ベトナム・ハノイの詳細DEMの作成・解析.(3)研究成果の発表・公開.(1)については,交付申請書に記載した研究協力者から入手したベトナム・ハノイの歴史地図約100点と地形図30点をデジタル化し,GIS(地理情報システム)上にマッピングした.これにより,ハノイの約100年間の都市の変遷を鮮明に可視化することができた.(2)については,研究協力者から入手したハノイの測量データ約1万点を使って詳細なDEM(デジタル数値地図)を作成した.作成したDEMの解像度は約2mである.これは現在日本で一般的に利用できる国土地理院の数値地図50m標高(解像度50m)よりも解像度がはるかに高いものである.また,約50年前のフランス作成のベトナム・ハノイの地形図から作成したプログラムを用いてDEM(解像度2m)を作成した.来年度は,この作成した両者のDEMを用いて,ハノイの地形変化を解析し,ハノイの旧河道や埋立・盛土のマッピングを行う.また,ハノイの東を流れる紅河の堤防の変遷を調べ,洪水への治水対策についても考える予定である.(3)については,(2)の研究成果を中心に2本の投稿論文,2つの学会発表をおこなった(11.研究発表に記載).これらの研究成果は,いづれも高い評価を受けており,特に今後の研究であるハノイの100年間の地形変化の解析を望む声が多かった.来年度は,この地形解析を中心に研究を行い,同じく投稿論文・学会発表という形で研究成果を公開する予定である.さらに,今年度構築したWeb-GISサーバを用いて横断的に研究結果を公開する予定である.今年度の研究実績は、以下の3点が上げられる。(1)ベトナム・ハノイの50年の都市変容。(2)ベトナム・ハノイのボーリングデータの入手と解析。(3)研究成果の発表・公開。(1)については、1950年のフランス植民地時代に作成されたハノイの地形図(紙媒体)を入手した。これをデジタル処理し、STRIPE法と呼ばれる手法を用いて、紙媒体の地形図からデジタルの地形図(DEM)を作成した。平成19年度に作成した2005年のDEMと今回作成した1950年のDEMの差分を取り、ハノイの50年の地形変化を調べた。これにより、ハノイの堤防の増築や旧市街地の地盤沈下を具体的に示した。(2)については、研究協力者からハノイ全域でおこなわれたボーリング調査結果のデータを入手した。ボーリング数は140本あり、これを用いてハノイの地下構造を推定している。研究代表者が開発した3次元地質モデリングの手法を用いて、地下構造をGISソフトを用いて3次元で可視化することが可能になった。ハノイの地形データと統合することで、地下と地上をつなぐこれまでにない地域研究が可能となった。今後は、この研究成果を活用してハノイの地下水分布や地盤沈下に関して研究をおこなっていきたい。(3)については、(1)や(2)の研究成果をまとめて3つの学会発表をおこなった。また、本科学研究費補助金の研究成果をまとめた図書の執筆をおこなった(11。研究発表に記載)。これらの研究成果は、ベトナムの歴史研究や都市研究の分野でいづれも高い評価を受けている。また、研究代表者は2008年12月にベトナム国営放送(Vietnam TV)の取材を受け、本研究成果が2009年1月にベトナムのニュース番組で取り上げられた。