hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
シリコン基板埋め込みマイクロ二次電池内リチウムイオンの動的挙動のナノスケール評価

本年度は下記の3点について研究を実施した。1)シリコン基板埋め込み100x100μm^2全体型リチウム二次電池の形成シリコン基板にポリシリコン/窒化シリコン絶縁層を形成し、この絶縁層に100x100μm^2の二次電池埋め込み溝を作成した。この溝に正極材料LiMn_2O_4用ゾルーゲル溶液をスピンコートし、加熱処理後、溝以外の部分を機械的研磨により除去した。正極材料上に多孔質構造を有するLip_2O_4を添加した固体電解質SiO2-15%P_2O_5ガラスをスピンコーテイング法により形成し、さらにこの上にリチウム負極を装着した。この全固体型マイクロ・リチウム二次電池を20100pAの充放電により4.30V間の充放電特性を確認したが、微細化に伴う高抵抗化による放電時の急峻な電圧降下の改善が今後の新たな課題として残された。2)導電性プローブを有する。、子間力顕微鏡(AFM)を用いたバイアス電圧印加下のミクロン領域正極表面のナノスケール評価シリコン基板に埋め込まれた正極材料LiMn_2O_4に直接負バイアスを印加しく正極材料中のリチウムイオン伝導と表面形状変化の相関を調べた。Pt/Ir被服AFMプローブに-5.5Vの電圧を印加したとき、急峻な電流増加が観測され、表面の粒界が徐々に大きくかつ平坦化する現象が観測された。この現象はリチウムイオンの表面拡散に伴うリチウム過剰なLi_<1+x>Mn_2O_4相が正極材料表面に形成され、Mn-e_g-O-2p電子の反発によるJahn-Teller相転移に起因すると解釈した。3)新しい窒化物固体電解質及び関連物質の合成と物性評価新しい窒化物固体電解質としてLi_3AIN_2及びLi_3GaN_2を合成し、4.0eVのバンドギャップを有することを光吸収法及び光音響分光法を用いて決定した。さらに、LiZnAs結晶を作成し、Raman散乱法を用いて各ボンドの結合様式を明らかにした。1)シリコン基板埋め込み100x200μm^2並列構造全固体型リチウム二次電池の形成シリコン基板上に対電極として導電性多結晶シリコンを形成し、この上にSi_3N_4層を堆積した。正極材料LiMn_2O_4(あるいはLiCoO_2)を埋め込むための最大深さ2μm、幅100μm、長さ200μmの溝をドライエッチング法によりSi_3N_4層内に形成した。LiMn_2O_4用ゾル-ゲル溶液をスピンコーテイング法により溝に埋め込み、溝以外の部分を機械的研磨により除去した。正極材料上に多孔質構造を有する固体電解質Si_2-15%P_2O_5ガラスをスピンコーテイング法により形成し、さらにこの上にリチウム負極とその保護膜(アルミニウム)をそれぞれ真空蒸着法で形成し、全固体型マイクロ・リチウム二次電池を作成した。2)導電性プローブを有する原子間力顕微鏡(AFM)を用いたバイアス電圧印加下のミクロン領域

リチウム二次電池の充放電特性と電極表面のナノスケール評価マイクロ二次電池負極上の5μm平方の範囲をPt/Ir被服AFMプローブに正負バイアスを印加しながら固体電解質中を拡散してくるリチウムイオンの動的挙動を測定した。充電時に負極に移動してくるリチウムイオンによりアルミニウム表面電極は最大30nmの隆起を示し、放電時にはもとの表面形状が再現した。3)正極材料LiCoO_2の規則-不規則構造変態にともなう電気伝導機構の解明層状岩塩(規則)及びスピネル様(不規則)構造を有するLiCoO_2の電気抵抗の温度依存性測定からMott型のホッピング伝導を観測し、不規則構造の比較的低いフェルミエネルギーにおける状態密度は不規則構造の高い結晶格子対称性から生じるCoのT_<2g>バンド-ナローイングに起因していることを明らかにした。本年度は下記の3点について研究を実施した。1)シリコン基板埋め込み300x300μm^2構造全固体型リチウム二次電池の形成シリコン基板に300x300μm角の孔を貫通させ、孔の周辺部に他の孔との電気的絶縁のためにSiO_2構造を形成した。この孔に正極材料LiMn_2O_4用ゾルーゲル溶液を浸透させ加熱処理後、孔以外の部分を機械的研磨により除去した。正極材料上に多孔質構造を有する固体電解質Si_2-15%P_2O_5ガラスをスピンコーテイング法により形成し、さらにこの上にリチウム負極を装着した。正極材料側の孔に低融点ハンダを流し込んで対電極とした。この全固体型マイクロ・リチウム2次電池を70nAの充電及び1nAの放電により3.5V-0Vの2サイクルの充放電特性を確認したが、放電特性の更なる改善が新たな課題として残された。2)導電性プローブを有する原子間力顕微鏡(AFM)を用いたバイアス電圧印加下のミクロン領域リチウム二次電池の充放電特性と電極表面のナノスケール評価シリコン基板埋め込み200x100μm^2マイクロ2次電池負極上の5μm平方の範囲をPt/Ir被服AFMプローブに正負バイアスを印加しながら固体電解質中を拡散してくるリチウムイオンの動的挙動を測定した。μm^2当たり約2.9x10^<10>個のリチウムイオンの移動による充放電特性を観測した。3)新しい窒化物固体電解質の合成と物性評価新しい窒化物固体電解質としてLi_3AlN_2を合成し、4.4eVの直接遷移型バンド構造を有することを光吸収法を用いて決定した。インピーダンスのCole-Coleプロットから室温におけるイオン伝導度が約5x10^8Ω^<-1>cm^<-1>であることを明らかにした。1)シリコン基板埋め込み100x100μm^2全固体型リチウム二次電池の形成シリコン基板にポリシリコン/窒化シリコン絶縁層を形成し、この絶縁層に100x100μm^2の二次電池埋め込み溝を作成した。この溝に正極材料LiMn_2O_4用ゾル-ゲル溶液をスピンコートし、加熱処理後、溝以外の部分を機械的研磨により除去した。正極材料上に多孔質構造を有するLiP_2O_4を添加した固体電解質SiO_2-15%P_2O_5ガラスをスピンコーテイング法により形成し、さらにこの上にリチウム負極を装着した。この全固体型マイクロ・リチウム二次電池を20100pAの充放電により4.30V間の充放電特性を確認したが、微細化に伴う高抵抗化による放電時の急峻な電圧降下の改善が今後の新たな課題として残された。
細胞内動態制御・核内転写制御の最適化に基づいた人工遺伝子ベクターの開発

本申請研究は,遺伝子デリバリーシステムの細胞内動態と核内転写過程を独自の戦略に基づいて最適化し,ウイルスベクターを越える高い発現効率を有する人工遺伝子ベクターを開発しがん治療へ貢献することを目的とした.本申請研究は、(1)遺伝子及びそのベクターの細胞内動態の素過程を定量的に評価するシステムの構築:量子ドットを用いて蛍光強度の減衰を防止するとともに,3次元解析により細胞内局在を定量的に評価する。(2)上記定量系をスクリーニングシステムに活用し,各ステップを促進する素子の分子スクリーニングを行う.(3)アデノウイルスベクターと我々が構築した人工遺伝子ベクターとをin vivo及びin vitroで比較評価し,ウイルスベクターと比較して弱点となる過程を選択的に促進する素子を探索する.(4)以上のスクリーニングと最適化に基づいて構築された人工遺伝子デリバリーシステムのin vivoにおける標的組織到達性と遺伝子発現効率を定量的に評価する、という四つのステップからなり,ウイルスベクターを越える人工遺伝子ベクターを開発した.これまでに人工遺伝子ベクターとウイルスベクターはそれぞれ別個の研究グループにより開発が行われ,互いに一長一短を主張している.本研究は,それぞれのベクターの細胞内動態の律速段階を明らかとすると同時に,本スクリーニングシステムによりウイルスを越える機能を有する新たな細胞内ソーティング素子を開発することに成功した.遺伝子及びベクターの細胞内動態の素過程を定量的に評価した研究は非常に少なく,ブラックボックスとして扱われいる.我々はすでに遺伝子に核移行量の定量に成功しているが,各ステップ(kint, kesc, klys, kdeg, lys, kdeg, cyt, knuc, ktra)のを定量化することが可能となり,どこが律速段階になっているのか,ウイルスベクターと比較してどこに弱点があるのかが解明できるようになった.本申請研究は,遺伝子デリバリーシステムの細胞内動態と核内転写過程を独自の戦略に基づいて最適化し,ウイルスベクターを越える高い発現効率を有する人工遺伝子ベクターを開発しがん治療へ貢献することを目的とした.本申請研究は、(1)遺伝子及びそのベクターの細胞内動態の素過程を定量的に評価するシステムの構築:量子ドットを用いて蛍光強度の減衰を防止するとともに,3次元解析により細胞内局在を定量的に評価する。(2)上記定量系をスクリーニングシステムに活用し,各ステップを促進する素子の分子スクリーニングを行う.(3)アデノウイルスベクターと我々が構築した人工遺伝子ベクターとをin vivo及びin vitroで比較評価し,ウイルスベクターと比較して弱点となる過程を選択的に促進する素子を探索する.(4)以上のスクリーニングと最適化に基づいて構築された人工遺伝子デリバリーシステムのin vivoにおける標的組織到達性と遺伝子発現効率を定量的に評価する、という四つのステップからなり,ウイルスベクターを越える人工遺伝子ベクターを開発した.これまでに人工遺伝子ベクターとウイルスベクターはそれぞれ別個の研究グループにより開発が行われ,互いに一長一短を主張している.本研究は,それぞれのベクターの細胞内動態の律速段階を明らかとすると同時に,本スクリーニングシステムによりウイルスを越える機能を有する新たな細胞内ソーティング素子を開発することに成功した.遺伝子及びベクターの細胞内動態の素過程を定量的に評価した研究は非常に少なく,ブラックボックスとして扱われいる.我々はすでに遺伝子に核移行量の定量に成功しているが,各ステップ(kint, kesc, klys, kdeg, lys, kdeg, cyt, knuc, ktra)のを定量化することが可能となり,どこが律速段階になっているのか,ウイルスベクターと比較してどこに弱点があるのかが解明できるようになった.本研究は,遺伝子デリバリーシステムの細胞内動態と核内転写過程を独自の戦略に基づいて最適化し,ウイルスベクターを越える高い発現効率を有する人工遺伝子ベクターを開発しがん治療へ貢献することを目的とする.本研究は,(1)遺伝子及びそのベクターの細胞内動態の素過程を定量的に評価するシステムを構築する.さらに,量子ドットを用いて蛍光強度の減衰を防止するとともに,3次元解析により細胞内局在を定量的に評価する.(2)この定量系をスクリーニングシステムに活用し,各ステップを促進する素子の分子スクリーニングを行う.(3)アデノウイルスベクターと我々が構築した人工遺伝子ベクターとをin vivo及びin vitroで比較評価し,ウイルスベクターと比較して弱点となる過程を選択的に促進する素子を探索する.(4)以上のスクリーニングと最適化に基づいて構築された人工遺伝子デリバリーシステムのin vivoにおける標的組織到達性と遺伝子発現効率を定量的に評価する,という四つのステップからなり,ウイルスベクターを越える人工遺伝子ベクターを開発する.平成15年度は,細胞内動態の素過程の定量的評価系の開発を行った.遺伝子及びそのベクターの細胞内動態の素過程,すなわち,エンドソーム・ライソゾーム経路からの脱出,細胞質内の分解の回避,核内送達,核内転写の各ステップに分解し,各過程を定量的に評価するシステムを構築した.遺伝子の細胞内動態の解析を3次元解析へ拡張するために,核,エンドソーム・ライソゾーム系遺伝子をそれぞれ染色することにより遺伝子の細胞内局在を3次元的に解析するシステムの開発を行った.このスシスムにより,核内,エンドソーム・ライソゾーム系,細胞質に局在する遺伝子の蛍光強度を識別して定量することが可能となった.本申請研究は,遺伝子デリバリーシステムの細胞内動態と核内転写過程を独自の戦略に基づいて最適化し,ウイルスベクターを越える高い発現効率を有する人工遺伝子ベクターを開発しがん治療へ貢献することを目的とした.本申請研究は、(1)遺伝子及びそのベクターの細胞内動態の素過程を定量的に評価するシステムの構築:量子ドットを用いて蛍光強度の減衰を防止するとともに,3次元解析により細胞内局在を定量的に評価する。

(2)上記定量系をスクリーニングシステムに活用し,各ステップを促進する素子の分子スクリーニングを行う.(3)アデノウイルスベクターと我々が構築した人工遺伝子ベクターとをin vivo及びin vitroで比較評価し,ウイルスベクターと比較して弱点となる過程を選択的に促進する素子を探索する.(4)以上のスクリーニングと最適化に基づいて構築された人工遺伝子デリバリーシステムのin vivoにおける標的組織到達性と遺伝子発現効率を定量的に評価する、という四つのステップからなり,ウイルスベクターを越える人工遺伝子ベクターを開発した.これまでに人工遺伝子ベクターとウイルスベクターはそれぞれ別個の研究グループにより開発が行われ,互いに一長一短を主張している.本研究は,それぞれのベクターの細胞内動態の律速段階を明らかとすると同時に,本スクリーニングシステムによりウイルスを越える機能を有する新たな細胞内ソーティング素子を開発することに成功した.遺伝子及びベクターの細胞内動態の素過程を定量的に評価した研究は非常に少なく,ブラックボックスとして扱われいる.我々はすでに遺伝子に核移行量の定量に成功しているが,各ステップ(kint,kesc,klys,kdeg,lys,kdeg,cyt,knuc,ktra)を定量化することが可能となり,どこが律速段階になっているのか,ウイルスベクターと比較してどこに弱点があるのかが解明できるようになった.
ヒアルロン酸合成酵素遺伝子導入による間葉系幹細胞からの軟骨分化誘導と軟骨修復

平成14年度ではまず、マウス胚性腫瘍細胞で軟骨前駆細胞株であるATDC5に、インスリン存在下に培養することによって軟骨全分化過程モデルを作成することを可能とした。平成15年度ではATDC5にレトロウイルスベクターを用いてヒアルロン酸合成酵素(以下HAS2)を導入することに成功した。それによって得られたトランスフェクタントはいずれの軟骨分化時期においても安定したHAを合成することが可能となり、その結果、軟骨特有な細胞外基質の産生をもたらすことが出来た。また、純系ウサギ腸骨より採取した骨髄組織より軟骨分化能を有する間葉系幹細胞を分離培養し、ATDC5を用いて確立したレトロウイルスベクターを用いたHAS2遺伝子導入法を施行し、それによって得られた細胞をコラーゲンゲルに包埋して培養することに成功した。本年度は、同系のウサギの大腿骨遠位膝蓋大腿関節面に作成した軟骨欠損部に前述したゲル包埋培養した間葉系細胞を移植し、その上に脛骨近位よりの自家骨膜を逢着した軟骨修復モデルの作成に成功した。そして、その修復モデルにおいて、HAS2遺伝子導入群(レトロウイルスベクター群、遺伝子銃群)と非導入群と比較したところ導入後4週において免疫染色法の評価にていずれの導入群でも明らかにHA合成量の増加を認めた。さらに導入後12週においてRT-PCRを用いた2型コラーゲンmRNAの発現は導入群において高く、組織修復スコアーでも、Surface regularityとTotal scoreにおいて有意に非導入群よりも良好な修復を示した。以上より、HAS2を用いた遺伝子導入はより正常に近い硝子軟骨再生および修復をもたらす可能性が示された。平成14年度:軟骨前駆細胞株ATDC5へのHAS2遺伝子導入と軟骨分化能の解析骨髄より採取した間葉系幹細胞を培養して軟骨欠損部の修復に用いるにあたり、平成14年度では軟骨分化促進のために、ヒアルロン酸合成酵素2(HAS2)の遺伝子導入を細胞培養に併用した。移植部における長期間ならびに高濃度のヒアルロン酸合成を獲得するために、HAS2を遺伝子導入した培養細胞の移植を行い、さらに正常に近い硝子軟骨への分化をめざした。まず、in vitroの系で、レトロウィルスベクターを用いて安定なHAS2トランスフェクタントを作製し、軟骨細胞への分化能について検討した。1、ATDC細胞へのHAS2遺伝子導入ATDC細胞はマウス胚性腫瘍細胞(EC細胞)より単離された軟骨前駆細胞であり、培養上清中にインスリンを添加すると軟骨細胞へ分化し、II型コラーゲン優位の細胞外基質を産生するようになる。このATDC細胞にレトロウィルスベクターを用いてHAS2遺伝子を導入し、安定なトランスフェクタントを作製した。2、HAS2トランスフェクタントの解析これらの細胞について、HAS2合成量(RNAレベル、蛋白レベル)、ヒアルロン酸合成量(ヒアルロン酸結合蛋白を用いたELISAおよび染色)、II型コラーゲン合成量(RNAレベル、蛋白レベル)を測定し、軟骨分化促進に有効なHAS2導入条件を検討している。平成14年度では、軟骨欠損部における軟骨分化促進のために、軟骨前駆細胞株であるATDC5へのヒアルロン酸合成酵素(以下HAS2)遺伝子導入と軟骨分化能の解析を行った。すなわち、ATDC細胞は培養上清中にインスリンを添加することにより軟骨細胞へ分化し、II型コラーゲン優位の細胞外基質を産生した。本年度は引き続き、このATDC細胞にレトロウィルスベクターを用いてHAS2遺伝子を導入し、安定したトランスフェクタントを作製した。これらの細胞について、HAS2合成量、ヒアルロン酸合成量、ならびにII型コラーゲン合成量を測定することにより、軟骨分化促進に至適なHAS2導入条件を決定した。さらに、臨床応用にあたっての課題である長期的に安全でかつ安定した軟骨組織修復が得られる方法を確立するため、間葉系幹細胞移植を行うことにより硝子軟骨への分化の促進をめざした。

純系ウサギ腸骨より採取した骨髄組織より軟骨分化能を有する接着性の間葉系幹細胞を分離培養し、前述した導入条件にて、レトロウィルスベクターに組み込んだHAS2遺伝子を導入し、コラーゲンゲルに包埋して培養することに成功した。現在、培養開始後1週、2週、4週、8週の時点で、HAS2合成量、ヒアルロン酸合成量、II型コラーゲンの合成量および免疫染色、トルイジンブルー染色を行い、軟骨分化能について検討している。発現マーカーであるβ-galactosidaseを用い、遺伝子の発現を経時的に観察中である。平成15年度では軟骨前駆細胞株であるATDC5にレトロウイルスベクターを用いてヒアルロン酸合成酵素(以下HAS2)を導入することに成功した。それによって得られたトランスフェクタントはいずれの軟骨分化時期においても安定したHAを合成することが可能となり、その結果、軟骨特有な細胞外基質の産生をもたらすことが出来た。また、純系ウサギ腸骨より採取した骨髄組織より軟骨分化能を有する間葉系幹細胞を分離培養し、ATDC5を用いて確立したレトロウイルスベクターを用いたHAS2遺伝子導入法を施行し、それによって得られた細胞をコラーゲンゲルに包埋して培養することに成功した。本年度は、同系のウサギの大腿骨遠位膝蓋大腿関節面に作成した軟骨欠損部に前述したゲル包埋培養した間葉系細胞を移植し、その上に脛骨近位よりの自家骨膜を逢着した軟骨修復モデルの作成に成功した。さらに、その修復モデルにおいて、HAS2遺伝子導入群(レトロウイルスベクター群、遺伝子銃群)と非導入群と比較したところ導入後4週においてHA合成蛋白を用いた染色法の評価にていずれの導入群のほうでも明らかにHA合成量の増加を認めた。さらに導入後12週においてRT-PCRを用いた2型コラーゲンmRNAの発現は導入群において高く、組織修復スコアーでも、Surface regularityとTotal scoreにおいて有意に非導入群よりも良好な修復を示した。以上より、HAS2を用いた遺伝子導入はより正常に近い硝子軟骨再生および修復をもたらす可能性が示された。
ガウス過程潜在変数モデルを用いた韻律の分散表現

アクセントや句末の疑問・確認などの発話意図に伴う韻律情報を音声から自動獲得する手法として,ガウス過程潜在変数モデルを用いた,韻律の分散表現の開拓・確立を目的として,本年度は以下の成果を得た.1.初年度に行ったガウス過程を深層構造化した深層ガウス過程(DGP)モデルの学習法の確立を行った.前年度に提案したDGP音声合成は初期値によって学習が正常に行われない場合があることがわかった.そこで,初期値にロバストな学習を行うための手法として,モデル化したい深層ガウス過程と類似した構造を持つ深層ニューラルネットワーク(DNN)を用いる事前学習手法を提案し,提案法によって頑健な学習ができることを示した.また,DNN音声合成とDGP音声合成の聴取試験による比較実験を行い,DGP音声合成で生成した音声が高い自然性を有することを明らかにした.2.DGP音声合成において,入力の一部を低次元の潜在変数で表現する深層ガウス過程潜在変数モデルを導入した.これにより入力変数として使用される韻律情報が未知であっても,韻律情報を潜在変数の分布として表すことが可能であり,これを用いることで音声合成の半教師あり学習を行うことができる.アノテーションコストの高い日本語のアクセントに対して評価実験を行い,アクセントラベルの付与された音声データが1割程度であっても,すべてのデータにラベルが付与されている場合と同程度に品質の高い合成音声を生成可能であることを示した.本研究の目的は,アノテーションコストの高いあるいは困難な韻律表現に対し,ガウス過程の潜在変数モデルを用いて分散表現を行うことであった.深層ガウス過程を用いることで,音声の言語的および音響的特徴の複雑な関係をモデル化しつつ,潜在変数を導入することに成功した.また,アクセントラベルの付与されていないデータによる半教師あり学習の応用例を示すことができたため,順調に進展していると言える.当初の計画通り,アクセントだけでなく,会話音声に現れる句末表現や,英語の強勢など他言語の韻律表現に適用し,その汎用性を検討する.また,深層ガウス過程潜在変数モデルは学習時間が長くなってしまうという問題があるため,計算コストの削減手法を検討する.音声合成技術の発展に伴いスマートフォンの音声対話システムや映像コンテンツなど,応用場面が広がりつつある.音声合成システムの構築は,発話内容を記述したラベルとそれに対応する音声を用意し,その関係を機械学習によりモデル化することで行われる.ただし,話し言葉やオーディオブックなどに含まれる音声の多様な表現を網羅するような学習データの作成は容易ではない.特に,アクセントや句末の疑問・確認などの発話意図に伴うピッチパターンを,人手でラベリングすることは困難である.そこで,韻律パターンの自動獲得を目的として,生成モデルであるガウス過程潜在変数モデルに基づく手法の確立を目指す.初年度はまず,ガウス過程潜在変数モデルに基づいて基本周波数曲線を低次元化する手法を,日本語のアクセントを対象に検討した.しかし,基本周波数曲線だけでは期待通り性能が得られなかったため,スペクトル情報との組合せの可能な深層ガウス過程の検討を行った.本研究において提案した深層ガウス過程による音声合成モデルは,入力にラベルに基づく音韻・韻律情報を,出力をスペクトル・基本周波数といった音響特徴量とするものである.このモデルは出力を未知とすることで識別モデルとして音声合成を行い,入力を未知とすることで生成モデルとしてラベルの潜在表現を獲得することが可能な柔軟性の高いモデルである.初年度の検討では,前者の音声合成の評価を行い,広く使用されているディープニューラルネットワークに基づく音声合成に比べ,高精度な予測が可能であることを客観評価実験により確認し,深層ガウス過程を使用することの有効性を示した.期待通りの結果が得られなかった場合に導入を計画していた,深層ガウス過程の検討を行った.しかし当初の予定では,モデルを識別モデルとして使用する音声合成システムだけではなく,生成モデルとして使用し韻律の自動獲得を目的としていた.したがってやや遅れているとの評価とした.アクセントや句末の疑問・確認などの発話意図に伴う韻律情報を音声から自動獲得する手法として,ガウス過程潜在変数モデルを用いた,韻律の分散表現の開拓・確立を目的として,本年度は以下の成果を得た.1.初年度に行ったガウス過程を深層構造化した深層ガウス過程(DGP)モデルの学習法の確立を行った.前年度に提案したDGP音声合成は初期値によって学習が正常に行われない場合があることがわかった.そこで,初期値にロバストな学習を行うための手法として,モデル化したい深層ガウス過程と類似した構造を持つ深層ニューラルネットワーク(DNN)を用いる事前学習手法を提案し,提案法によって頑健な学習ができることを示した.また,DNN音声合成とDGP音声合成の聴取試験による比較実験を行い,DGP音声合成で生成した音声が高い自然性を有することを明らかにした.2.DGP音声合成において,入力の一部を低次元の潜在変数で表現する深層ガウス過程潜在変数モデルを導入した.これにより入力変数として使用される韻律情報が未知であっても,韻律情報を潜在変数の分布として表すことが可能であり,これを用いることで音声合成の半教師あり学習を行うことができる.アノテーションコストの高い日本語のアクセントに対して評価実験を行い,アクセントラベルの付与された音声データが1割程度であっても,すべてのデータにラベルが付与されている場合と同程度に品質の高い合成音声を生成可能であることを示した.

本研究の目的は,アノテーションコストの高いあるいは困難な韻律表現に対し,ガウス過程の潜在変数モデルを用いて分散表現を行うことであった.深層ガウス過程を用いることで,音声の言語的および音響的特徴の複雑な関係をモデル化しつつ,潜在変数を導入することに成功した.また,アクセントラベルの付与されていないデータによる半教師あり学習の応用例を示すことができたため,順調に進展していると言える.今後は初年度に行うことのできなかった深層ガウス過程によるアクセントの自動ラベリングを行い,その評価を行う.また研究計画の通り,ラベル推定を行う半教師付き学習を用いた音声合成システムの検討を行い,話し言葉など様々な音声データに対して適用する.当初の計画通り,アクセントだけでなく,会話音声に現れる句末表現や,英語の強勢など他言語の韻律表現に適用し,その汎用性を検討する.また,深層ガウス過程潜在変数モデルは学習時間が長くなってしまうという問題があるため,計算コストの削減手法を検討する.本年度は主に既存のデータベースを用いた基礎的な研究に着手していたため,コーパス代や設備費が節約できた.次年度は応用に用いるアクセントラベルつきコーパスの整備,実験に用いるコンピュータの購入,クラウドソーシングによる評価実験,および成果発表が主な予算の使途である.
転移巣に注目した治療抵抗性尿路上皮癌に対する新規治療標的因子の探索

網羅的遺伝子発現解析より、転移を有し死亡に至る症例において細胞周期や転写に関与する遺伝子群が有意に上昇している結果を見出した。同サンプルから癌組織内リンパ球を抽出し、細胞表面分子発現に基づいて免疫状態の分類を行ったところ、転移を認めない症例では細胞表面分子発現がその他の2群と比較して有意に低い結果となった。膀胱癌ではgenome instabilityを有しているといわれており、我々の解析結果でも癌組織内免疫担当細胞の発現様式に影響を及ぼしていることが判明した。現在膀胱癌においても抗PD-1抗体を始めとする新規免疫療法が有効な治療法とされており、今後更なる解析が必要であると考えている。1.解析サンプルの選択およびDNA・RNA抽出浸潤性尿路上皮癌の診断のもと、化学療法を施行した後に転移巣切除術を施行した症例および病理解剖を行った症例から1未治療原発巣2化学療法施行後原発巣3化学療法施行後転移巣のFFPEサンプルをからRNAを抽出するも、RNA qualityが網羅的解析に適さない結果となった。そのため、新鮮外科切除標本からのRNA抽出を行った。現在リンパ節転移もしくは肺転移を有する尿路上皮癌の原発および転移巣の新鮮標本からRNA抽出を行い、2へすすんでいる。2.mRNAに対するトランスクリプトームの包括的解析でまず、4症例において薬剤の使用のないリンパ節転移・原発巣を比較検討した。現在我々は、癌局所内における免疫状態の評価も同時に行っており、3例において原発巣とリンパ節転移部位での免疫担当細胞表面分子発現プロファイルが類似していることを突き止めた。リンパ節転移では原発巣と比較し、EMTマーカーの上昇や細胞接着因子の上昇が認められた。現在、さらなるデータの解析を行っているところである。3.DNAに対する膀胱癌に特徴的な遺伝子をターゲットとした次世代シークエンス当初計画していたFFPEサンプルからのRNA抽出が困難であったため外科切除サンプルの収集に時間を要している。また、抗がん剤を使用した後のサンプルの収集にも困難を極めており計画よりも遅れている。1解析サンプルの選択およびDNA・RNA抽出昨年度から引き続き、腫瘍サンプルを収集。合計14サンプル(原発巣10例、リンパ節転移部位4例)からtotal RNAを抽出し、2の解析を行った。2mRNAに対するトランスクリプトーム解析上記についてマイクロアレイ解析を行ったところ、転移およびその後の再発を認めない症例(n=3)、転移を有する症例(n=4)、転移を有し死亡に至った症例(n=3)での発現比較を行うことが可能であった。その結果、cell cycleや転写に関与する遺伝子群が有意な変化を認めていた。また、同時に同サンプルから癌組織内リンパ球を抽出し、細胞表面分子発現に基づいて免疫状態の分類を行ったところ、転移を認めない症例では、細胞表面分子発現がその他の2群と比較して有意に低い結果となった。膀胱癌では、遺伝子発現に基づいて、乳がんと同様に4群に大別されると報告されており、特にその中で、SCC likeやp53関連群についてFOXM1やPLK1の発現で代表されるgenome instabilityを有していると言われている。今回の我々の解析結果でも、転移を有し死亡に至った症例はFOXM1の発現が高いことから、癌細胞のgenome instabilityが癌組織内免疫担当細胞の発現様式に影響を及ぼしていることが判明した。現在、膀胱癌においても抗PD-1抗体を始めとする新規免疫療法が有望な治療法とされており、今後更なる解析が必要であると考えている。3DNAに対する膀胱癌に特徴的な遺伝子をターゲットとした次世代シークエンスTCGA Researchnetworkのデータベースより、特にp53のmutationの割合が高いことに注目し、genome instabilityとの関係を明らかにするため、ターゲットシークエンスを施行予定としている。4.膀胱癌細胞株・CTOS・マウス異所性移植モデルを使用した遺伝子機能解析平成27年度に得られた、抗癌剤抵抗性尿路上皮癌における特徴的な遺伝子発現、スプライシングの異常またはSomatic Mutationを用い、現在まで判明していない抗癌剤抵抗能の獲得メカニズムの解明を行う。大阪大学泌尿器科において作成されたCTOSやマウス異所性移植モデルを使用し遺伝子機能解析を行い、新規治療標的因子の探索を目的とする。5.Bioinformaticsを使用したNetwork Analysisによるクローン解析SomaticMutationの解析からNetwork Analysisを用いて、原発巣および転移巣を含めたクローン解析を行い、転移巣病変に対する治療前生検の必要性の有無を検討するNetwork Analysisはすでに研究代表者の過去の研究において経験済みであり、解析は可能である。6.血液サンプルを用いたCirculating Tumor DNAの評価血液サンプルから採取されたCirculating Tumor DNAは担癌患者において検出され、治療判定マーカーとして使用できる可能性が報告されている。現在CTやMRIなどでしか評価ができない病変の治療効果判定を可能とすることを目的として、大阪大学泌尿器科において集積された患者血液サンプルを用いて、上記で同定されSomatic Mutationの検討を行い、血液マーカーとしての妥当性を評価する。
超高帯域光通信路によるデータ収集系の研究

平成17年度はKEKBアップグレード計画(Super-B)のためにデータ収集系を一新する一環として引き続き光通信路の必要性および実現方法を研究した。平成16年度に設計・製作したVMEモジュールを使用してXilinx社のVirtexII Pro FPGA上のファームウェアの開発を行った。データ転送のプロトコルには、Xilinx社が無償で提供しているAuroraプロトコルを使用した。このモジュールでは、光通信用の実現に関して基板上にFPGAと光トランシーバ用のコネクタを用意するだけでよく、非常にコンパクトかつ安価に光通信を実現できるので、検出器のごく近傍にまで光通信路を配置するのに最適である。Super-B計画で必要とされる検出器および読出方法の開発研究も進みつつあり、特に非常に大量の信号量の予想されるピクセル検出器の信号読出しなどで高帯域の光通信路とFPGAの組合せの応用は広いことがわかった。逆に、当初試作を予定していた単純なアナログ・デジタル変換回路との組合せのような用途はなさそうである。本研究で試作したモジュールでは2Gbpsの光通信路を使用しているが、当初予定では、10Gbpsのトランシーバ機能を持つXilinx社のVirtex4-FX FPGAを使用してテストモジュールを試作する予定であり、発表されている規格を元に開発を進めていた。しかし、製造プロセスに難があるということで現在までのところ安定供給されておらず、本研究でも試作にいたらなかった。平成16年度はKEKBアップグレード計画(Super-B)のためにデータ収集系を一新する一環として光通信路の必要性および実現方法を研究した。Super-Bでのデータ収集には共通VMEモジュールにアナログ・デジタル変換モジュールを装着することにより実現するが、特にSuper-B用のシリコンバーテックス検出器や電磁カロリメータの読出しではこの方式では対応できず、検出器付近でのアナログ・デジタル変換が必要となる。このときにデータを検出器付近から共通VMEモジュールへ転送するのに必要となる高帯域光通信路の確立方法の検証のためにVMEモジュールを作成した。製作時には、当初予定していたXilinx社のVertexII Pro-XFPGAとRocketPHYの組合せにかわり10Gbpsに対応可能なVirtex4 FPGAが発表されていたが未出荷であったことおよび10Gbpsの基板設計時の問題点などがわかってきたこともあり、このモジュールはVertexII Pro FPGAを使用して設計された。データ転送速度こそ2Gbpsではあるが、この十分に高速データをFPGAから直接ドライブすることにより非常に限られた基板上でデータ転送およびFPGA内に含まれるPowerPC CPUを使用した高度な後段処理が可能になる。モジュールは16年度末に完成し、現在このモジュール間での光通信などの性能標価を行っているところである。
有機王水を用いた液相還元法による貴金属のナノ・マイクロ粒子の製造

近年、提案者は、有機王水を用いた貴金属精錬法を開発した。本研究は、有機王水を用い貴金属(Au, Pd等)を溶解し、水溶液等の添加による液相還元法により、貴金属のナノ・マイクロ粒子を製造することを目的とする。1)有機王水に溶解した貴金属の還元条件の違いによる析出物の形状の違いの定量化とマッピング、2)大気圧走査電子顕微鏡(Atmospheric Scanning Electron Microscope, ASEM)を利用したその場観察による粒子成長のメカニズムの解析を行った。本研究の目的は、有機王水を用いた溶解と水溶液等の添加による液相還元法により貴金属のナノ・マイクロ粒子を製造することを目的とする。平成28年度は、有機王水を利用した溶解と液相還元法により、ナノ・マイクロ粒子の生成が既に確認できているAuに関して、1)溶解したAuの還元条件の違いによる析出物の形状の違いの定量化とマッピング、2)大気圧走査電子顕微鏡(ASEM)を利用したその場観察による粒子生成・成長のメカニズムの解析に取り組んだ。1)に関しては、塩化銅を溶解した一定量のDMSO溶液にAuを溶解させ、それに様々な塩素イオン濃度の塩酸水溶液を添加することによりAuを還元させた。そして、生成した析出物をろ過、乾燥後、SEM-EDSにより形状観察した。そこでは、DMSO溶液中の金濃度と、添加する塩酸水溶液の塩素濃度の違いにより、粒子がコンペイトウ状になる領域と球状になる領域があることをマッピングすることができた。2)に関しては、産業技術総合研究所バイオメディカル研究部門の協力を得て、各種条件において、還元塩酸水溶液の添加直後のAuの核生成から粒成長の様子をASEMによりその場(in-situ)観察することに世界で初めて成功した。Auマイクロ粒子は、液相還元開始してから60秒後には既に生成していることが観測され、概ね30分程度で粒子の生成と粒成長は終了していることが示された。液相中での粒径は概ね1 μm程度で、それ以上大きな粒子は観察されなかった。1)では、球状粒子が生成すると報告していた液相還元領域においても、in-situで観察によりコンペイトウ状に成長していることが分かった。液相にて生成したコンペイトウ状粒子が、その後、ろ過、洗浄、乾燥工程を経た際に球状粒子へと変化したものと考えられる。球状粒子の生成のメカニズムについては、今後の検討課題と認識された。平成28年度は、1)溶解したAuの還元条件の違いによる析出物の形状の違いの定量化とマッピング、2)大気圧走査電子顕微鏡(ASEM)を利用したその場観察による粒子生成・成長のメカニズムの解析に取り組んだ。2)に関しては世界で初めての試みが成功し、既に論文として発表することができた。当初は、生成した粒子の形状の違いによる機能性の違いの定量化に関しても行う予定であったが、粒子生成機構が予想とは異なり、球状粒子が生成すると報告していた領域においても、ASEMによるin-situ観察によりコンペイトウ状に成長していることが分かった。それゆえ、その機構の解明を先にしたうえで、機能性の違いの定量化を行うことにした。Pdを溶解したDMSO溶媒系とクエン酸水溶液を用いることで、パラジウムマイクロ粒子を製造できることを見出した。また、ASEMを用いることでパラジウムが液相還元により溶液中で析出する様子をその場観察することに成功した。溶解実験ではCuCl2およびNaClを溶解したDMSOを用いてPdを液中に溶解できることが確認されたこのときの溶解速度は最大で5.57 mg cm-2 h-1であり、Cl-イオン濃度を増加させることで溶解速度が向上することが確認された。さらに、このPd溶解DMSOにクエン酸水溶液を3倍量添加することで、溶解したPdをマイクロ粒子として回収でき、クエン酸濃度を調整することで多角形状および球状の形状制御ができることが見出された。これは、クエン酸が核成長過程で粒子表面に吸着し保護剤として粒子同士の合体を緩和したためであると考えられる。ASEMによる液中観察では、粒子の成長が25分以内に終了していることと、粒子が液中で珊瑚状の構造体を形成していることが示唆される結果が得られた。また、乾燥後の粒子のSEM像との比較により、液中で珊瑚状の構造体を形成している粒子が、乾燥過程において粒へと変形していることが示唆された。平成29年度においては、他の貴金属(Ag, Pd)のナノ・マイクロ粒子の製造に取り組み、その機能性の違いを検討する。有機王水は、塩素や臭素等ハロゲンイオンを含有しているにも関わらず、Agを高速で溶解できる特長を有している。従って、有機王水にてAgを溶解させた後、液相還元法にて析出させ、ナノ・マイクロ粒子の製造が可能と考えられる。

但し、塩酸などのハロゲン含有の水溶液を添加したのでは、電位ーpH図から全てのpH領域においてハロゲン化銀として析出することが示唆されるので、エタノールやアスコルビン酸などの還元剤を用いて析出させることを試みる。さらに、Auも含めて生成した粒子の形状の違いによる機能性の違いの定量化に取り組む予定である。リサイクル工学平成28年度に成果発表等のための海外旅費を計上していたが、発表を平成29年度にするために予算を残した。また、ロータリーエバポレータなどの備品の購入を計画していたが、研究協力者から拝借できたため購入しなかった。平成29年度には、成果発表等のために海外出張を行う予定である。また、各種貴金属試料の購入費や、粒子物性測定のための分析費が多くかかることが予想されている。
ソフトウエアの動作推定に基づく情報改竄に頑健な不正アクセス検知方式の構築

情報流出事故を引き起こす不正アクセスを検知するために,ソフトウエアの挙動をネットワークトラヒックから推定し,プロトコルヘッダなどが改竄された場合でも適切に動作可能なトラヒックの解析・評価方式を構築した.情報流出事故を引き起こす不正アクセスを検知するために,ソフトウエアの挙動をネットワークトラヒックから推定し,プロトコルヘッダなどが改竄された場合でも適切に動作可能なトラヒックの解析・評価方式を構築した.本研究は、近年大きな社会問題となっているネットワークを経由した情報流出事故を防ぐために、不正なネットワークアプリケーションの自動検知を目標としている。情報流出を引き起こす不正アプリケーションは、アプリケーション識別に利用されるポート番号を容易に変更することが出来るため、ポート番号に依存しないアプリケーション識別方式が必要となる。そこで本研究では、パケットサイズやアプリケーションペイロードの遷移パターンを利用したアプリケーション識別方式の提案を行った。提案方式は、各ネットワークアプリケーションには、ユーザー認証、バージョン情報交換などの共通の情報交換が通信の初期段階で行われ、それらの規則性を適切にモデル化出来れば、ポート番号に依存しないアプリケーション識別が可能であるとの仮定に基づいている。パケットサイズの遷移パターンを利用したアプリケーション識別においては、識別性能を確保するために、一定数以上のパケットを利用することが必要であるが、一定数以上のパケットの通信が行われると、パケットサイズがMTU付近で一定になってしまい、アプリケーション間の差異が埋没してしまう問題が明らかとなった。そこで本研究では、パケットサイズの逆数を利用することでこの問題を解決し、90%以上の識別精度を達成することが出来た。更に、パケットサイズを利用した識別では、不要データのパディングなどによってサイズを変更されてしまう問題もあるため、通信内容を利用した識別手法の構築も行った。この手法は、ペイロードを8ビット毎のコードに分割し、その発生確率を利用してペイロードの数値化を行っている。この数値化方式は、通信内容の不可逆な変換で通信の秘匿性を保持した方式である。この数値化したデータの遷移パターンの法則性を学習することにより、パケットサイズを利用した方式と同等のアプリケーション識別精度を達成した。本研究は、近年大きな社会問題となっているネットワークを経由した情報流出事故を防ぐために、不正なネットワークアプリケーションの自動検知を目標としている。提案方式は、各ネットワークアプリケーションには、ユーザー認証、バージョン情報交換などの共通の情報交換が通信の初期段階で行われ、それらの規則性を適切にモデル化出来れば、ポート番号に依存しないアプリケーション識別が可能であるとの仮定に基づいている.ケーション識別が可能であるとの仮定に基づいている。パケットサイズの遷移パターンを利用したアプリケーション識別においては、TCPヘッダに記録されているポート番号が正しいものと仮定し、その妥当性の評価を行う手法として識別アルゴリズムを利用するシステムの構築を行った。構築した識別システムでは、97%以上の精度で識別を正しく行えることが明らかとなり、ポート番号を一切利用しない識別アルゴリズムと比較して高精度な識別を実現することが出来た。更に、パディングなどの影響を受けない指標として、パケット送受信の時間間隔をアプリケーション毎に学習し、識別可能であるかを検証した。ペイロード長と比較すると外乱の入り易い特徴量であるが、90%以上の正確性でアプリケーション識別を行えることが明らかとなり、改窟が困難な指標としての可能性を見出すことに成功した。
シュワン細胞の動的変形と神経インパルスの変調

脳でのグリア細胞による神経細胞周辺の微小環境調節機構をモデル系で調べるため,近縁の細胞であるイカのシュワン細胞の神経線維活動に及ぼす影響を調べてきた。特に,シュワン細胞と軸索の間の間隙やシュワン細胞層のイオン透過性を人工的に変化させることができるイカ巨大神経線維標本を用いて実験した結果,次のようなことが明らかになった。1)軸索外表面のKイオンの蓄積はシュワン細胞と軸索の空間的な位置関係により大きくかわる。シュワン細胞層と軸索に浸透圧勾配を与えると外向きの浸透圧勾配ではKイオンの蓄積が減少し,内向きの勾配ではKイオンの蓄積が増大する。2)細胞外の溶液のKイオン濃度(シュワン細胞の周りのKイオン濃度)を高めると,軸索外表面のKイオンの蓄積は増大する。Kイオンの蓄積の時間経過から求められるシュワン細胞と軸索の間の間隙の幅(Θ)やシュワン細胞層のKイオン透過性(P)は減少することが分かった。つまり,シュワン細胞の形態がKイオンにより変化することを示している。3)神経線維を頻回刺激した際の活動電位の発生パタ-ンはシュワン細胞層の性質を表すパラメ-タΘやPの変化に伴い,興奮性の閾値が変化するために発火ミスをも含む様々なパタ-ンを示すことを神経線維用いた実験やコンピュ-タシミュレ-ションにより明らかにした。4)同様なことが生理的条件下でも起こり軸索から神経の活動状態をシュワン細胞に伝えるメカニズムとしてKイオンや伝達物質の役割が検討されている。又,シュワン細胞が神経の活動に応じて,細胞の体積やKイオン透過性などを合目的的に変化させていると推定している。この研究は日英共同研究として現在進行中である。5)麻酔剤などの薬物の作用の軸索とシュワン細胞に対する効果を分離して解析する方法を検討中である。無随神経線維では軸索の周りをシュワン細胞が取り囲んでいるが、その機能は明らかでない。近年脳のグリア細胞との類推から様々な機能が推定されているが、生体の中にある状態に近い系での実験的な研究は始まったばかりである。本研究では実験的に扱い易いイカ巨大軸索とその周りのシュワン細胞とからなる標本を用いて、シュワン細胞による軸索外表面Kイオン濃度の調節機構に焦点を当て実験を進めた。浸透圧勾配を細胞内とシュワン細胞層の外側である細胞外に与えると(シュワン細胞層の方が軸索膜に比して半透性が低いため)シュワン細胞ー軸索膜間隙への水の流入と流失に差が生じる。この結果、外向きの浸透圧勾配を与えた場合(細胞外液の浸透圧が細胞内液の浸透圧より高い場合)、シュワン細胞ー軸索膜間隙が拡大してKイオンの蓄積は減少し、逆向きの浸透圧勾配を与えるとこの間隙が縮小してKイオンの蓄積は増大する。又、細胞外液のKイオン濃度を予め高濃度にすると以後のKイオンの蓄積は増大する。つまりKイオンを加えるとシュワン細胞ー軸索膜間隙が狭くなるように見える。Kイオンの蓄積が多い標本では頻回刺激で発生する神経インパルスの発生パタ-ンが変化する。現在までのところ、軸索外表面のKイオン濃度の調節はシュワン細胞層の物理的拡散障壁としての作用の変化(形態的な変化)に基づくと考えてよさそうである。これを検討するため、顕微鏡下での光学的測定としては神経線維表面の映像の変化の測定と神経線維表面からの光散乱強度の時間変化の測定との両方を行う予定である。現在、倒立顕微鏡の光源はコンデンサ

-部を取り除けるように改造して、ステ-ジ上で実体顕微鏡を用いた細胞内灌流を行い、その場で高分解能の光学的測定と電気生理学的測定を行えるような装置を試作して調節中である。シュワン細胞の機能を明らかにするため,本研究では生理的条件を保ち易いイカ巨大軸索とその周りのシュワン細胞とからなる標本を用いて実験を進めた。実験は昨年度の報告書に述べたのと同様な電気生理学的実験と光学的実験の二本立てで行った。「電気生理学的実験」実験方法は昨年度報告したように細胞内潅流したイカ巨大神経線維を用いた電気生理学的な方法で,1)シュワン細胞ー軸索の間隙にKイオンを軸索膜のKチャネルを通じて細胞内から注入し,2)軸索外表面のKイオン濃度を軸索膜Kチャネルの平衡電位EKを測定することにより求める。この方法の有効性が明確になったので,細胞外のKイオンや陰イオンを変化させてシュワン細胞ー軸索間隙でのKイオンの蓄積を測定した。シュワン細胞の働き(Kイオン濃度の制御機構)にはシュワン細胞外のKイオンや陰イオンが影響を与えることが明らかになった。シュワン細胞ー軸索間隙のKイオンの蓄積の状況により神経インパルスの発生パタ-ンが変化する。又,シュワン細胞の機能に対する麻酔剤アルコ-ルの作用を調べたが,神経線維に対する作用ほど顕著ではなかった。「光学的実験」倒立蛍光顕微鏡下で神経線維の細胞内潅流を行うため,実体顕微鏡とステ-ジ上に移動できるように,通常の透過照明部とステ-ジを新規に作成した。先ず,シュワン細胞の形態を調べるために,シュワン細胞に蛍光色素を注入すること試みた。シュワン飽胞は予想されたとおりの木の葉状の薄くて平べったい細胞であった。Kイオン濃度の制御に伴うシュワン細胞の形態的変化を調べるために,シュワン細胞の活動に伴う光散乱変化の検出を行う予定であったが,神経線維とシュワン細胞の膜電位の光学的測定と併せて測定する予定で現在実験が進行中である。
マウス皮膚再構成モデルにおける上皮―間葉細胞のクロストークと組織幹細胞の機能

皮膚は体の表面を覆う最大の臓器であり、また組織細胞の治療応用が最も進んだ臓器でもある。事故や熱傷による皮膚組織の欠損に対して、患者自身の皮膚や同種・異種の培養皮膚が医療現場で利用されている。しかし実際に用いられている移植用の培養皮膚は表皮ケラチノサイトと真皮繊維芽細胞による細胞シートで構成され、被覆・防護機能は果たせるものの、毛嚢や皮脂腺などの皮膚付属器を欠いている。このように創傷より治癒した皮膚が付属器を欠くことは生理的及び美容的に大きな問題であり、毛嚢・皮脂腺・汗腺を有する正常により近いリアルな皮膚組織の供給が望まれている。昨年度までの研究で、我々は胎児マウスの皮膚より単一細胞として調整した表皮細胞と真皮細胞をヌードマウスの背部へ皮下移植すると、3週間で付属器を有する完全な皮膚組織が形成されるin vivo皮膚付属器形成モデルを開発した。しかしこのような皮膚組織の完全な再形成は、残念ながら培養環境では再現することができない。横浜市立大学の武部准教授らによる組織原基(肝芽)形成を参考にして、我々は妊娠16日目胎仔マウスの皮膚より調整した表皮細胞、真皮細胞に血管内皮細胞と間葉系幹細胞、さらにマウス腹腔マクロファージを加えてマトリゲル上で混合培養した。培養24時間で細胞がほぼ凝集してまとまり、72時間でスフェロイドを形成した。このスフェロイドを免疫染色したところ、層構造を形成していることが確認された。このスフェロイドをヌードマウスの背部へ皮下移植し、3週間後に皮膚付属器の形成能を評価したところマクロファージ陽性のスフェロイドは脂肪様組織を形成していた。以上の結果から、上皮ー間葉インタラクションにマクロファージが重要な役割を果たしていると考えられた。27年度が最終年度であるため、記入しない。しかし実際に用いられている移植用の培養皮膚は表皮ケラチノサイトと真皮線維芽細胞による細胞シートで構成され、被覆・防護機能は果たせるものの、毛嚢や皮脂腺等の皮膚附属器を欠いている。このように創傷より治癒した皮膚が附属器を欠くことは生理的および美容的に大きな問題であり、毛嚢・皮脂腺・汗腺を有する正常により近いリアルな皮膚組織の供給が望まれている。マウス胎児皮膚より単一細胞として調整した表皮細胞と真皮細胞をヌードマウス背部皮膚にシリコンチャンバーを用いて移植すると、3週間で毛嚢等附属器を有する完全な皮膚組織が形成された。しかしこのような皮膚組織の完全な再形成は、培養環境では残念ながら再現することができない。この研究班の横浜市立大学武部貴則准教授らはマウスに移植すると機能する肝臓組織を形成できる肝臓原基の作成に成功した。これは複数種の細胞が3次元構造を形成しながら分化できる環境を保証することで、発生初期のプロセスを培養内で再現して臓器(組織)を形成させる方法である。この方法を参考にして、我々が妊娠16日目のマウス胎児皮膚より調製した表皮細胞、真皮細胞に血管内皮細胞と間葉系幹細胞を加えてマトリゲル上で混合培養したところ細胞が凝集し始め、72時間以内に層状の構造を有するスフェロイドを形成した。このスフェロイド形成には血管内皮細胞は必須ではなかったが、間葉系幹細胞は不可欠であった。また免疫染色の結果から、このスフェロイドの外層には表皮細胞が、内層には血管内皮細胞が分かれて分布していた。

上皮-間葉インタラクションについての検討は、ほぼ予定とおりに進行している。また新たな展開として、皮膚附属器を培養内で作製するための、組織原基の作製に成功している。再構成皮膚や培養皮膚組織の実験に供した際に、この組織原基由来の附属器ができるかどうかを検討している。27年度が最終年度であるため、記入しない。マウス皮膚再構成モデルを用いて、上皮-間葉細胞で異なる胎齢の組み合わせが皮膚附属器形成にどのような影響があるかを検討する。またin vitroで作製した皮膚組織原基に附属器形成能があるかどうか、マウス皮膚再構成モデルやin vitroで作製する皮膚組織などを用いて検討する。