hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
工学に現れる非線形差分方程式とその解

本研究の3つのテーマ、(1)非線形差分方程式に対する「特異性の閉じ込め」の概念の構造を解明すること、(2)工学に現れる非線形差分方程式にその概念を適用し、どのような実際的な役割を果しているかを考察すること、および(3)その中で、工学的に有用な手法を抽出すること、に関して以下の結果を得た。(1)、(2)について、非線形分散波動を記述する波動方程式の相似縮約として生じるパンルヴェI型方程式の離散版についてその解の構造を検討し、離散系でしか意味を持たず、連続化した場合つぶれる解が存在することを明らかにした。この結果は離散問題特有の状況を示すものとして興味深い。(3)について、戸田分子方程式と数列加速に対するεアルゴリズムが相互に関連するという性質を用いて、アルゴリズムの厳密な誤差評価を可能であることを指摘するとともに、離散戸田分子方程式に基づく新しい加速アルゴリズムを提案した。限られた対象ではあるが、離散可積分系が工学的にも有用であることを示した結果である。また通信に応用することが期待されるソリトンセルオートマトンに関して、離散戸田方程式に超差分化を施すことにより、2方向に伝搬するオートマトンシステムが実現すること、および空間2次元化が可能であることを示した。この結果は超差分化の考え方がきわめて一般的であることを示唆するもので、今後可積分系だけでなくより広いクラスの工学的に有用な差分方程式に適用できることが期待される。
X染色体不活性化に必要なXist機能付加因子及びリプログラミング因子の同定

本研究期間中に、XTTGFP/XTTGFPマウス(XTTGFP:Xistの抑制因子であるTsixの発現誘導アリル+X染色体連鎖GFP遺伝子)とXTX/Yマウス(XTX:Xistの発現誘導アリル)を導入・交配し、XTTGFPXTX ESCを樹立した。その細胞のXTX側X染色体のHprt遺伝子座にCRISPR/Cas9法を用いてmCherry遺伝子をノックインした後、遺伝子機能欠失スクリーニングのためのCas9遺伝子を導入し、EpiSCに変換した。CRISPRライブラリーを増幅し、レンチウイルス感染実験系を確立した。本研究の目的は、Xist機能付加因子及びリプログラミング因子の網羅的な同定である。胚性幹細胞(Embryonic stem cell, ESC)では、X染色体不活性化及びX染色体再活性化はXist依存的におこる。しかしながら、細胞分化に伴い、X染色体不活性化/再活性化のXist依存性は失われる。我々は独自の実験により、エピブラスト幹細胞(Epiblast stem cell, EpiSC)では、Xist依存性が失われる事を明らかにした。この事は、ESCに存在すると思われるXist機能付加因子が、EpiSCでは機能していない事を示唆している。本研究は、そのXist機能付加因子の単離・同定を目的としている。また、このスクリーニング法では、EpiSCからESCへの変換に必要な遺伝子(リプログラミング因子)の単離も可能であり、平行して行う。本研究は、(1)Xist/Tsix発現誘導ESC/EpiSCの樹立(実験系の開発と確立)(2)ESC特異的に発現している遺伝子発現ライブラリーの構築(選別の下準備)(3)Xist機能付加因子及びリプログラミング因子候補遺伝子群の単離および機能解析、の3段階に分けられる。昨年度は、Xist/Tsix発現誘導ESCの樹立による実験系の確立を行った(第一段階)。XTTGFP/XTTGFPマウス(XTTGFP:Xistの抑制因子であるTsixの発現誘導アリル+X染色体連鎖GFP遺伝子)とXTX/Yマウス(XTX:Xistの発現誘導アリル)を導入・交配し、その胚盤胞より2i培地を用いてXTTGFPXTXES細胞を樹立した。その細胞のXTX側X染色体のHprt遺伝子座にCRISPR/Cas9法を用いてmCherry遺伝子をノックインした。現在までに複数の相同組換え体が単離できており、実験は概ね順調に進展している。本研究は、Xist/Tsix発現誘導ESC/EpiSCの樹立(実験系の開発と確立)ESC特異的に発現している遺伝子発現ライブラリーの構築(選別の下準備)Xist機能付加因子及びリプログラミング因子候補遺伝子群の単離および機能解析、の3段階に分けられる。現在までに複数の相同組換え体が単離でき、実験系が確立できた。今後、単離の実験を行う予定である。研究を進めるにあたり、新しく発表された技術であるCRISPR libraryによる網羅的な遺伝子破壊によるスクリーニング(loss of function)の方が、当初の予定であったESC特異的に発現している遺伝子発現ライブラリーの構築とその発現によるスクリーニング(gain of function)よりも効率的と判断し、計画の修正を行った。予算の使用を一年延長する事により、この課題に取り組む予定である。本研究の目的は、Xist機能付加因子及びリプログラミング因子の網羅的同定である。胚性幹細胞(ESC)では、X染色体不活性化/再活性化はXist依存的におこる。我々は独自の実験により、エピブラスト幹細胞(EpiSC)におけるXist依存性の消失を明らかにした。また、平行してEpiSCからESCへの変換に必要な遺伝子(リプログラミング因子)の単離も行う。本研究は、(1)Xist/Tsix発現誘導ESC/EpiSCの樹立(実験系の開発と確立)(2)遺伝子発現ライブラリーの構築(選別の下準備)(3)候補遺伝子群の単離および機能解析、の3段階に分けられる。研究期間中に、CRISPR/Cas9を利用した遺伝子破壊用のライブラリーが開発されたため、本申請実験を、遺伝子機能付加スクリーニングから、遺伝子機能欠失スクリーニング系に変更した。

本年度は、CRISPRライブラリーを入手し、レンチウイルス感染の為の実験系を確立した。また、平行してXTTGFP/XTXmCherry ESCにCas9遺伝子を導入した。この様に、本年度は実験の第二段階(選別の下準備)まで完了する事ができた。第三段階(候補遺伝子群の単離および機能解析)に向けて、実験は現在も進行中である。本研究期間中に、XTTGFP/XTTGFPマウス(XTTGFP:Xistの抑制因子であるTsixの発現誘導アリル+X染色体連鎖GFP遺伝子)とXTX/Yマウス(XTX:Xistの発現誘導アリル)を導入・交配し、XTTGFPXTX ESCを樹立した。その細胞のXTX側X染色体のHprt遺伝子座にCRISPR/Cas9法を用いてmCherry遺伝子をノックインした後、遺伝子機能欠失スクリーニングのためのCas9遺伝子を導入し、EpiSCに変換した。CRISPRライブラリーを増幅し、レンチウイルス感染実験系を確立した。CRISPRベクターのデザインやトランスフェクションの条件検討、複数に渡る相同組換え体の選別などに時間を費やしたものの、最終的に相同組換え体を得る事ができたので、概ね順調に進展していると判断した。エピジェネティクス今後も計画とおりに研究を推進していく予定である。(1)ESCからEpiSCを引いたcDNAライブラリーの作製。完全長cDNAをESC, EpiSCよりそれぞれ作製し、サブトラクション法にてESCからEpiSCの遺伝子を除いたcDNA発現ライブラリーを作製する。(2)Xist機能付加因子及びリプログラミング因子候補遺伝子群の選別。前年度に作製した細胞に、ESCのcDNA発現ライブラリーを導入する。Xist機能付加因子及びリプログラミング因子が機能すれば、ドキシサイクリンの添加により細胞が赤から緑に変化する。この緑に変化した細胞をFacsにて回収し、cDNAの塩基配列より候補因子を同定し、その機能を解析する。平成27年度に、Xist機能付加因子及びリプログラミング因子候補遺伝子群の選別のためにES細胞特異的な遺伝子を集めたcDNAライブラリーを作成する予定であった。しかしながら、研究期間中に、CRISPR/Cas9を利用した遺伝子破壊用のライブラリーが開発され、本研究に応用可能である事が明らかになった。このため、本申請実験を、遺伝子機能付加(gain of function)スクリーニングから、遺伝子機能欠失(loss of function)スクリーニングの系に変更した。以上の理由により、cDNAライブラリーを作成する予定であった分の未使用額が生じた。前年度に購入する予定であったライブラリー作成キットを購入していなかった為。上記の理由により、未使用額を遺伝子機能欠失スクリーニング(CRISPR/Cas9を利用した遺伝子破壊用のライブラリー)に使用したい。今年度に繰り越された予算を用いて予定とおりライブラリー作成キットを購入する。
南極寒冷圏変動史の解読：第四紀の全球気候システムにおける南大洋の役割を評価する

南大洋インド洋区のコンラッドライズにおいて,南極周極流の影響によって形成された巨大砂丘様海底地形(セディメントウェーブ)を新たに発見した。海底下地質構造解析を基にしたセディメントウェーブ形成史から,南極周極流がおよそ150万年前に北上したと推測される。最終氷期には冬季海氷縁が少なくとも緯度として15度程度北側に移動し,その影響で表層は低塩分化して成層が強化されていた可能性が高い。この現象は氷期の大気CO2濃度低下に大きく寄与していたであろう。また,冬季海氷分布は氷期の間に数千年スケールの周期で南北振動していた。本研究では,2回の白鳳丸航海(KH-07-4 Leg3, KH-10-7)で採取された海洋コア試料(DCR-1PC, COR-1bPC, LHB-4bPC, LHB-3PC)を用い,まず各コアの年代モデルの構築を進めた。LHB-3PCとLHB-4bPCについては,バルク有機炭素の放射性炭素年代測定と珪質微化石(珪藻,放散虫)の生層序によって年代モデルがほぼ確定した。また,COR-1bPCから浮遊性有孔虫を抽出し,放射性炭素年代測定と酸素同位体分析を組み合わせて詳細な年代モデルを構築した。これらの年代モデル構築によって,コア最下部の年代がおよそ4万年前であること,および,最終融氷期(ターミネーションI)を特定した。また,最終融氷期の酸素同位体比変動からは,南極アイスコアなどで認められているAntarctic Cold Reversal (ACR)が明瞭に検出された。このことは,南大洋では最終氷期最寒期から完新世温暖期への気候変動の時期に2回の大きな環境変動が生じていたことを物語っている。2航海で得られた海底地形データから,南大洋インド洋区のコンラッドライズ南西斜面で新たに発見したセディメントウェーブの空間分布と形態的特徴を明らかにした。また,地層探査および反射法地震探査による海底下地質構造を解析した結果,コンラッドライズでは上部ユニット(層厚約400m)ではセディメントウェーブが明瞭に観察されるが,下部ユニットでは観察されないことがわかった。1.南大洋インド洋区のデルカノライスから採取された海洋コア(DCR-1PC)から底生有孔虫を抽出し,酸素同位体層序を構築するとともに,浮遊性有孔虫の14C年代測定を行い,コアの年代モデルを構築した。得られた底生有孔虫の酸素同位体比の変動パターンは,昨年度実施済みである浮遊性有孔虫の酸素同位体比変化とは一部異なり,浮遊性有孔虫の酸素同位体層序に基づいていたこれまでの年代モデルが大きく改善された。その結果,最終氷期最寒期(LGM)と酸素同位体ステージ(MIS)4の亜氷期には,浮遊性有孔虫の酸素同位体比が有意に小さい値にシフトしていたことが明らかとなった。このことは,氷期の南大洋インド洋区の表層水がより低塩分化していた可能性を示唆しており,今後,他のプロキシを用いた検証が待たれる。2.コンラッドライズの海洋コア(COR-1bPC)について,各種の古環境指標(プロキシ)の分析を行い,南大洋インド洋区における表層環境変動の復元を行った。漂流岩屑(IRD)および珪藻群集解析の結果,最終氷期には冬季の海氷北限が数千年スケールの周期で南北振動していたことが明らかとなった。特に,IRDの増加イベントは,北部北大西洋で顕著に見られるハインリッヒイベントのタイミングとは必ずしも一致していなかった。3.DCR-1PCおよびCOR-1bPCの主要元素(窒素・炭素・硫黄)とバイオマーカーを分析し,約4万年前以降の古環境変動を復元した。その結果,2地点ともに氷期に有機炭素量と全硫黄量が増加すること,また,貧酸素環境を示唆するバイオマーカーであるスクアランの濃度も氷期に増加することが見いだされた。また,陸源高等植物由来の代表的バイオマーカーである長鎖アルカンのフラックスを復元し,最終氷期には南米起源のダスト供給量が有意に増加していたことを明らかにした。COR-1bPCから浮遊性有孔虫を拾い出し,酸素同位体分析を行うとともに,13層準にて14C年代測定を行い,年代モデルをほぼ確定させた。また,有孔虫が産出しないため有機炭素14C年代測定によって年代推定を行っていたLHB-3PCとLHB-4bPCについて追加の有機炭素14C年代測定を行い,前年度までの年代モデルを補強した。コンラッドライズのCOR-1bPCコアを中心に古環境変動復元分析を進めた。高緯度海洋における氷山・海氷の指標として使われている漂流岩屑(ice-rafted debris: IRD)を拾い出し,火山ガラスやパミスなどの火山性IRDとその他のIRDとに分類した後,それぞれの粒子数と重量を計測した。

また,一部のIRD粒子については,電子プローブマイクロアナライザによる主要元素分析を行い,起源の推定を行った。その結果,火山灰起源の粒子を除いたIRD岩片は,完新世ではほとんど産出しないが,約16ka以前の最終融氷期初期から最終氷期にかけて定常的に産出した。乾燥堆積物1g当たりのIRD産出数は,数千年スケールで周期的に増加する傾向を示した。IRDの起源の多くは南極大陸ではなくサウスサンドイッチ諸島起源の火山噴出物であることが判明した。よって,コンラッドライズにおけるIRDおよび海氷珪藻種の増大イベントは,最終氷期から最終融氷期初期にかけて周期的に海氷分布域が拡大する寒冷化イベントが南大洋インド洋区で繰り返し起こっていたことを示す。9月には東京大学にて研究集会を,3月には高知大にてワークショップを実施し,本研究を主体とした研究成果のとりまとめと今後の課題の整理を行った。コンラッドライズのセディメントウェーブに関する成果は,国際誌論文としてまとめて投稿準備を行った。平成24年3月には,研究分担者らによるワークショップを行い,最新の研究成果の集約と次年度の研究計画について検討した。各コアの年代モデルの見通しが立ったことから,その他の様々な古環境指標の分析を進展させる基礎固めが行われたことになる。よって,初年度の研究は概ね順調に進行していると判断される。25年度が最終年度であるため、記入しない。コンラッドライズのコアの古環境復元が進行し,最終氷期に周期的に海氷分布が拡大縮小を繰り返していたことが明らかとなりつつあり,一定の成果をあげてきている。また,セディメントウェーブに関する成果は国際誌へ投稿直前の状態である。よって,本研究はおおむね順調に進展していると判断される。研究に用いる各コアの年代モデルをさらに強固に構築するために,放射性炭素年代の測定層準を追加する必要がある。南大洋の高緯度域の堆積物は,珪質微化石が主体であり,放射性炭素年代測定に用いる有孔虫化石の産出が限定的である。特に,COR-1bPCコアの氷期層準では,浮遊性有孔虫の産出状況は芳しくない。しかしながら,堆積物量を増やして処理することにより,有孔虫個体数を確保することができる見込みであるため,時間をかけて年代測定試料の確保を行う計画である。また,緯度トランセクトをなすコア群の中で最も低緯度側に位置するDCR-1PCコアについては,酸素同位体比分析,放射性炭素年代測定ともに未実施であるため,次年度には試料の処理を進め年代モデル確立へ向けたデータセットの構築を行う必要がある。さらに,その他の古環境指標の分析解析を進めることによって,南大洋における最終氷期以降の表層環境変動を詳細に復元する。特に, COR-1bPCを中心に分析を進め,最終氷期最寒期最終融氷期完新世における海氷分布,生物ポンプ,栄養塩供給(湧昇流)を復元し,南大洋における海洋フロントの移動と生物地球化学プロセスの実態を明らかにする。予察分析の段階であるデルカノライズコア(DCR-1PC)から浮遊性有孔虫および底生有孔虫を連続的に抽出し,炭素酸素同位体比分析を行い,酸素同位体層序を確立する。また,浮遊性有孔虫の放射性炭素年代測定を行い,コアの年代モデルを補強する。各種の古環境指標(プロキシ)の分析を行い,南大洋における表層環境変動を詳細に復元する。
力センサーを装備した鼓膜切開刀の作製

(目的)生体ヒト鼓膜は試料として取り出すことが不可能なため、その力学的特性を調べることは困難である。今回、我々はカセンシング鼓膜切開刀を試作し、臨床例で鼓膜切開時におおる力の測定に成功した。(対象および方法)力センシング鼓膜切開刀は平行平板構造により押し込み方向の力を検出する力センサー部に切開刀替刀を装着したものである。切開時に切開刀にかかる押し込み方向の力は力センサー部からストレインアンプ,A/Oコンバータ、パソコンと接続されて計測され、カラーディスプレイに経時的な荷重の変化と共に切開の様子が写しだされる。まず、ヒト以外の生体膜としてモルモットの鼓膜切開を行った(新鮮)例9匹15耳,ホルマリン固定例3匹4耳)。ヒトでは3才65才までの滲出性中耳炎23例27耳について切開を行った。(結果および考察)モルモット鼓膜切開時の力は微小で測定不能であり、今後センサーの感度を上げていく必要がある。ヒト鼓膜な症例によりばらつきが大きく最大で443mN、最小で11mNを示した。これらの鼓膜を視診により菲薄,正常,肥原,高度肥厚の4種類に分類した切開時の力の平均はそれぞれ14.7mN,29.6mN,50.7mN,249.9mNであった。菲薄な鼓膜は正常なものより切開時にかかる力は小さく肥厚した鼓膜ほど大きな力を必要とすると言える。すなわち、この鼓膜切開刀を用いることによりヒト生体鼓膜の菲薄及び肥厚の程度、言いかえれば鼓膜の強度を定量的に表現できる。また、鼓膜切開時に鼓膜以外の硬度の高いもの、岬角・耳小骨などと接触すると計測値が急激に上昇し高値を記録することから、400mNを越える荷重を記録した場合、アラームを設定した。
魚類の発生初期における代謝調節因子の探索

水産養殖の中でも、種苗生産過程において、仔魚のへい死が問題となることが多い。発生初期の魚類体内では様々な代謝が起こっていることが想定されるが、今日まで詳細な研究報告は非常に限られている。本研究では、成体の肝臓で発現する様々な転写調節因子に着目し、発生初期のゼブラフィッシュにおいて遺伝子の発現解析を行った。その結果、いくつかの転写調節因子の発現が見られ、さらに低酸素、低温、低pHなどの環境ストレスに応答し発現を変動させるものも存在した。このことより、発生初期の魚類(胚仔魚)において、体内の代謝を環境ストレスに応じて変動させる能力があることが示唆された。動物の初期胚では、母親由来の卵黄を利用して胚発生が進行する。しかし、様々な組織が未発達のこの時期では、どのように卵黄が代謝され、利用されているかは不明な点が多い。脊椎動物のモデル魚であるゼブラフィッシュを用いた先行研究において、卵黄を包む多核の細胞層yolk syncytial layer (YSL)で複数の代謝関連遺伝子の発現が確認された。これらの遺伝子の多くは、外環境の変化に応じて発現量を増減させることが分かってきたが、その調節機構は不明である。本研究では、YSLにおける代謝をつかさどる因子を探索することを目的とし、哺乳類等で明らかとなっている転写因子に焦点を当て、ゼブラフィッシュ胚での発現を検討した。まず、脊椎動物の肝臓で糖を中心とした代謝機構の調節に関わるとされる転写調節因子10種、アミノ酸への応答に関与すると考えられる遺伝子1種について、ゼブラフィッシュ胚での発現を確認した。受精後3時間後から120時間後まで、発生ステージごとに分けて発現量の変化を調べた結果、受精後に発現が上昇し、受精6時間後と18時間後にピークに達する遺伝子がそれぞれ3種と4種みられ、1種の遺伝子は発生が進むにつれ発現量が上昇し続けた。2種の遺伝子はサンプリング期間を通して、発現量がごくわずかであった。成魚の各組織における発現プロファイルを調べたところ、肝臓において5つの遺伝子の発現が確認された。現在はin situハイブリダイゼーション法によりゼブラフィッシュ胚における各種遺伝子の発現部位の解析をすすめており、2種類の遺伝子がYSLに、1種類の遺伝子が表皮に発現していることを確認している。上記のように、いくつかの遺伝子に関してはin situハイブリダイゼーション法による発現部位の特定が進んでいるものの、多くの遺伝子については、その発現部位の特定に至っていない。今後、実験条件の改善等の検討を重ね、別実験と並行しながら再試行する予定である。これまでの研究により、発生初期の魚類は母親由来の卵黄を活発に代謝し、自らが利用できる形に変化させることが明らかとなりつつある。この研究の過程で、代謝関連酵素をコードする遺伝子が、環境変化に応答し発現を変動させることを発見した。本研究では、「魚類の発生初期に行われる卵黄代謝は、内外の環境変化に応じて適切に調節されている」という仮説を検証するため、ゼブラフィッシュ胚において代謝調節に関与しうる転写調節因子の探索を行っている。前年度までにゼブラフィッシュ胚で12種の転写調節因子が発現していることが明らかとなった。本年度では、これらの遺伝子についてin situハイブリダイゼーション法によりその発現部位の特定を試みた。その結果、8種類の遺伝子が、それぞれ異なるタイミングでyolk syncytial layer(YSL)に発現することが明らかとなった。さらに、それらの遺伝子に対し、環境変化に対する発現変動を検討した。その結果、低pHまたは低酸素環境で遺伝子発現が変動するものが複数存在した。これらの遺伝子のホモログは、脊椎動物の肝臓で糖代謝などの代謝機構を調節することが知られており、ゼブラフィッシュ胚でも同様の機能を持っていることが推察される。特にYSLに発現した遺伝子は、先行研究でYSLに発現することが明らかとなった代謝酵素遺伝子群をターゲットとしている可能性が考えられる。現在、低酸素化で発現が上昇する遺伝子に着目し、遺伝子ノックダウンにより下流に位置する遺伝子の特定と機能の推定を試みている。in situハイブリダイゼーションの精度が低く苦労したが、何とかほとんどの遺伝子の発現部位を明らかにできた。環境変化に対して発現量が変動する遺伝子の特定も完了し、残りは機能解析の結果を待つのみである。昨年まで、脊椎動物成体の肝臓で発現する複数の転写調節因子をターゲットに実験を進めた。その結果、上記転写調節因子のホモログをコードする遺伝子が、魚類の胚において発現することを明らかにした。また、そのうちのいくつかの遺伝子が、外環境の変化に応答し、発現量を変化させることが明らかとなった。上記の転写調節因子は、ゲノムデータベース上に登録されているものの、その全長塩基配列が不明なままであった。そこで今年度は、RACE法を用いてこの遺伝子の非翻訳領域(UTR)のクローニングを試みた。その結果、5' UTRにおいて271塩基、3' UTRにおいて683塩基の配列が明らかとなった。この遺伝子をターゲットとして遺伝子ノックダウンを試みたが、スプライシング阻害型のモルフォリノオリゴ(MO)が充分に作用しなかったため、今後は翻訳阻害型MOの使用を検討している。上記の問題より、転写調節因子をターゲットとした研究は難航した。そのため、代謝を調節するもう一つの重要なファクターである内分泌因子にも着目し、この役割を検討した。通常、成体では様々な状況に応じて内分泌器官よりホルモンが分泌され、体内の代謝を調節することが知られる。

この成体の代謝を調節する特定の内分泌因子に対する阻害剤を魚類の胚に作用させた結果、いくつかの主要な代謝遺伝子の発現が変化することが示唆された。このことより、胚発生の過程においても、その代謝は内分泌因子による調節を受けている可能性が考えられる。今後はこの内分泌因子に対する解析も継続する予定である。水産養殖の中でも、種苗生産過程において、仔魚のへい死が問題となることが多い。発生初期の魚類体内では様々な代謝が起こっていることが想定されるが、今日まで詳細な研究報告は非常に限られている。本研究では、成体の肝臓で発現する様々な転写調節因子に着目し、発生初期のゼブラフィッシュにおいて遺伝子の発現解析を行った。その結果、いくつかの転写調節因子の発現が見られ、さらに低酸素、低温、低pHなどの環境ストレスに応答し発現を変動させるものも存在した。このことより、発生初期の魚類(胚仔魚)において、体内の代謝を環境ストレスに応じて変動させる能力があることが示唆された。本研究で対象としている代謝調節に関与すると考えられる遺伝子群において、環境パラメーターの変化に対する遺伝子発現の変化を調べる。具体的にはまず、低酸素、低温、酸性環境にそれぞれ発生途中のゼブラフィッシュ胚を曝露し、代謝調節に関与すると考えられる遺伝子の発現変動を調べる。いくつかの候補遺伝子の発現量に変化が確認された場合、先行研究で明らかとなっている代謝酵素遺伝子の発現変化とともに、それらの酵素に対する基質または代謝産物の含量変化も確認する。代謝の調節に関わると想定される遺伝子と代謝酵素遺伝子において、様々な環境刺激に応答して類似した発現パターンが確認された場合、調節に関わる遺伝子のノックダウンを行い、代謝酵素遺伝子の発現調節を行っている可能性を調べる。更に、環境刺激と遺伝子ノックダウンを組み合わせ、環境刺激を仲介する代謝調節因子を明らかにする。低酸素下で最も顕著に発現が上昇した遺伝子に着目する。低酸素処理と遺伝子ノックダウンを組み合わせて実験を行うことで、転写調節因子の下流に位置する代謝関連遺伝子を特定する。魚類生理学
酸化反応を用いる多環芳香族炭化水素の高度利用

芳香族炭化水素の有効利用の方法を開発する目的で、我々は以前からオゾン、一重項酸素、その他の活性酸素種により多環式を含む芳香族炭化水素を酸化して有用物質に変換することを試みてきた。本年度は、芳香族化合物のオゾン酸化については、不安定な過酸化物中間体を安定化する役割をはたすt-ブチル基に注目し、t-ブチル基をもつ芳香族化合物としてt-ブチル化フェノール類のオゾン酸化を追求した。また、α-シリルオキシアルキル過酸エステルの遷移金属塩を触媒とする分解を利用して、芳香族化合物、オレフィン等の酸化反応について検討した。1.t-ブチルフェノール類のオゾン酸化、2,4-ジ-t-ブチルフェノールなど2,4位にt-ブチル基を有するフェノールでは、1,6位にオゾンが付加した中間体を経たと考えられる生成物が主生成物となる。一方2,6位にt-ブチル基をもつフェノールでは、1,2及び3,4位に2分子のオゾンの付加が起り、芳香環の開裂した生成物を与える。2.α-シリルオキシアルキル過酸エステルによる炭化水素の酸化この種の過酸エステルはパラジウム(【II】)、鉄(【II】)、銅(【II】)塩の存在下種々の炭化水素を酸化して一原子酸素移動反応を起す、例えばクメンからクミルアルコール、スチルベンからスチルベンオキシド、シクロヘキセンからシクロヘキセンオキシドが主生成物として得られる。この反応系を同一分子内に組込んだ位置選択的な酸化反応にも成功している。3.このほか、メチル置換ポリビニルナフタレンを可逆的一重項酸素キャリアーとして利用すること、また9-t-ブチル-10-メチルアントラセンの9,10-エンドオゾニドの遷移金属イオンによる分解反応を発表した。
エリサン前胸腺刺激ホルモンの分子、および産生細胞に関する研究

1.抗体の作製.....エリサン前胸腺刺激ホルモン(PTTH)様ペプチドをその遺伝子から推定し,N末端17アミノ酸残基相当合成ペプチドに対する単クロン抗体(PTTH抗体),及び遺伝子から推定したエリサンボンビキシン様ペプチド-A1,B1の化学合成品に対する単クロン抗体(ボンビキシン抗体)を作製した。2.免疫組織化学によるホルモン産生細胞の同定.....PTTH抗体により,エリサン脳側方部の2対の神経分泌細胞が検出された。その軸索末端はアラタ体内部に分布していた。ボンビキシン抗体はエリサン脳中央部の16対の神経分泌細胞と反応した。その軸索末端は,アラタ体縁辺部に分布していた。3.イムノブロッティングによるホルモン分子の同定.....エリサン脳抽出液のゲル瀘過分画を,上記抗体によるイムノブロッティングで反応を検定した。PTTH抗体は30kDaの分画と,ボンビキシン抗体は5kDa分画と反応した。4.カイコにおける既知の事実との比較.....上記の結果は,カイコにおける結果とおおむね一致した。ただ,ボンビキシン細胞数がカイコで4対,エリサンで16対であることが大きく異っていた。5.残された課題.....両抗体に反応するペプチドの,PTTHとしての生物活性の検定はまだ終了していない。当初にたてた仮説,エリサンには大小2種のPTTHが存在することに対する実証が残された課題である。
高精度重力・電磁気連続観測にもとづく火道内マグマ上昇機構の解明

伊豆大島火山のマグマ上昇機構の物理モデルを構築するために,山頂火口近傍に無線/有線を用いた重力・電磁気LAN観測システムを構築し,以下の成果を得た.1.山頂火口近傍における重力連続観測の基準として,山麓およびカルデラ縁に3カ所の絶対重力観測網を構築し,これらを基準とする山頂火口近傍の重力変化観測が2005年5月,2006年9月,2007年5月に実施された.現在のところ,火山活動に伴う有意な重力変化は捉えられず,山頂火道内浅部へのマグマ移動は生じていない.重力変化に及ぼす降水の影響を補正するため,カルデラ域における重力季節変化と降水量との対応関係を調査し,重力季節変化が1次元水理拡散モデルで良く説明できることが分かった.2.山頂火口周辺に設置したACTIVE(制御霞流を用いた群列時間領域電磁探査法)受信機をLAN観測網に接続し自動連続観測を開始した.シミュレーションにより,ACTIVE観測データを用いて山頂火口地下の3次元的な比抵抗変化を推定できることを確かめた.さらに,山頂火口周辺の地下比抵抗構造変化を捉えるため,3次元インバージョン手法を開発した.3.伊豆大島全域の地殻変動および地震活動の観測結果から,地下深部からのマグマの上昇/蓄積による山体膨張が変動していることが分かった.さらに,マグマから脱ガスするCO_2をモニターするため,山頂火口東部で地中CO_2濃度の連続観測を平成17年度に開始した.その結果,山体膨張の加速,大島周辺のやや深い地震の増加およびCO_2濃度増加との問に対応関係が認められ,これらが大島火山の地下深部からのマグマ供給率の増大によって引き起こされていることが分かった.今後も,地殻変動,地震活動,三原山頂地下の帯磁変化と比抵抗変化および地中CO_2濃度変化の総合観測を継続し,伊豆大島火山のマグマ上昇/蓄積/脱ガス過程を捉え,マグマ上昇機構のモデル構築をめざす.伊豆大島火山のマグマ上昇機構の物理モデルを構築するために,山頂火口近傍に無線/有線を用いた重力・電磁気LAN観測システムを構築し,以下の成果を得た.1.山頂火口近傍における重力連続観測の基準として,山麓およびカルデラ縁に3カ所の絶対重力観測網を構築し,これらを基準とする山頂火口近傍の重力変化観測が2005年5月,2006年9月,2007年5月に実施された.現在のところ,火山活動に伴う有意な重力変化は捉えられず,山頂火道内浅部へのマグマ移動は生じていない.重力変化に及ぼす降水の影響を補正するため,カルデラ域における重力季節変化と降水量との対応関係を調査し,重力季節変化が1次元水理拡散モデルで良く説明できることが分かった.2.山頂火口周辺に設置したACTIVE(制御霞流を用いた群列時間領域電磁探査法)受信機をLAN観測網に接続し自動連続観測を開始した.シミュレーションにより,ACTIVE観測データを用いて山頂火口地下の3次元的な比抵抗変化を推定できることを確かめた.さらに,山頂火口周辺の地下比抵抗構造変化を捉えるため,3次元インバージョン手法を開発した.3.伊豆大島全域の地殻変動および地震活動の観測結果から,地下深部からのマグマの上昇/蓄積による山体膨張が変動していることが分かった.さらに,マグマから脱ガスするCO_2をモニターするため,山頂火口東部で地中CO_2濃度の連続観測を平成17年度に開始した.その結果,山体膨張の加速,大島周辺のやや深い地震の増加およびCO_2濃度増加との問に対応関係が認められ,これらが大島火山の地下深部からのマグマ供給率の増大によって引き起こされていることが分かった.今後も,地殻変動,地震活動,三原山頂地下の帯磁変化と比抵抗変化および地中CO_2濃度変化の総合観測を継続し,伊豆大島火山のマグマ上昇/蓄積/脱ガス過程を捉え,マグマ上昇機構のモデル構築をめざす.平成16年度は、重力・電磁気連続観測システムを伊豆大島火山の山頂火口近傍に構築し,無線テレメータによって伊豆大島火山観測所まで伝送し,LANを経由して地震研究所で収録すること,および,得られた観測データの予備的解析を行うことを計画し,以下のことを行った.(1)重力連続観測システムの構築とデータ解析・山頂火口近傍に設置する自動重力計の整備調整を行った.・重力連続観測システムを設置する山頂火口近傍の観測点から地震研究所までのLAN観測網を構築した.これにより,重力データの自動収集およびリモートメンテナンスが可能となった.・既存の観測データにもとづいて降水量と重力季節変化の対応関係を調査し,その特徴が判明した.・山頂観測点における重力連続観測の基準点とするため,今後,山頂カルデラ周辺にある既設中継観測点において絶対重力連続観測を行う予定である.そのため中継観測点の耐雷対策を強化した.(2)電磁気連続観測システムの構築とデータ解析・山頂火口周辺の5か所に設置したACTIVE(制御電流を用いた群列時間領域電磁探査法)受信機および1カ所に設置した地中温度計と地震研究所をつなぐLAN観測網を構築し,自動連続観測を開始した.・記録された時系列電磁気データめSNを改善するため,処理方法の高度化を行った.・火口下の電気伝導度変化をモデル化するための数値計算手法の開発を行った.平成17年度は,伊豆大島火山の山頂火口近傍に構築した重力・電磁気連続観測システムによる観測を継続するとともに,得られたデータを解析し,山頂火道内のマグマの移動を捉える上でノイズ要因となる変動の補正方法を開発することを計画し,以下のことを実施した.1.重力観測システムの高度化

(1)山頂火口近傍の観測点において施設の改修工事が行われたため自動重力計の設置が遅れたが,無線LAN経由で測定データを取得することの目処がついた.(2)山頂観測点における重力連続観測の基準点とするため,地震研究所の研究協力者により,山麓の伊豆大島火山観測所およびカルデラ縁にある既設中継観測点2カ所で絶対重力連続観測がそれぞれ1週間実施され,地震研究所からLAN経由で観測データの取得および稼働状況のモニターが可能であることが確認できた.2.電磁気連続観測システムの改良とデータ解析(1)山頂火口周辺5カ所に設置したACTIVE(制御電流を用いた群列時間領域電磁探査法)受信機による観測データを無線LAN経由で取得することは,トラブルもなく順調に継続できた.(2)観測された時系列データのSNを改善するため,処理方法の高度化を行った.(3)山頂火口下の電気伝導度変化を推定する計算手法を開発し,シミュレーションにより,3次元的な変化を推定できることを確かめた.3.山頂火口近傍での地中炭酸ガス濃度の連続観測大島全域の地殻変動および地震活動の観測結果から,地下深部からのマグマの供給/蓄積による山体膨張が一様ではなく,変動していることが分かった.特に,膨張加速後にやや収縮する現象は,噴火準備過程(マグマ中に揮発成分が濃集して浮力を獲得し,再上昇する条件がどのようにして達成されるかということ)と密接に関係する。そこで,マグマから最初に脱ガスするCO2をモニターするため,山頂火口近傍で地中温度およびCO2濃度の連続観測を開始した.平成18年度は,伊豆大島火山の山頂火口近傍に構築した重力・電磁気・CO2連続観測システムによる観測を継続するとともに,山頂火道内でのマグマ移動を捉えるための3次元電気伝導度構造インバージョン手法の開発および深部からのマグマ上昇・蓄積・脱ガス過程を捉えることを計画し,以下の知見を得た.1.重力観測(1)山頂観測点における重力連続観測の基準点とするため,地震研究所の研究協力者により,山麓の伊豆大島火山観測所およびカルデラ縁にある既設中継観測点2カ所での絶対重力連続観測および島内全域の相対重力測定が実施された.有意な重力変化は認められず,現在,山頂火道内浅部へのマグマ移動は生じていない.2.電磁気連続観測(1)山頂火口周辺5カ所に設置したACTIVE(制御電流を用いた群列時間領域電磁探査法)受信機による観測データは,無線LAN経由で順調に取得できた.(2)山頂火口下の3次元電気伝導度構造変化を推定するため,CSMT法3次元インバージョン手法を開発した.(3)山頂火口地下見掛け比抵抗に2006年8月頃に若干の低下が認められた.3.山頂火口周辺での地中炭酸ガス濃度調査と連続観測三原山頂周辺の地中CO2高濃度地域を特定し,山頂火口東部と西部の高濃度域近傍での連続観測を実施した.大島全域の地殻変動および地震活動の観測結果から,地下深部からのマグマの供給/蓄積による山体膨張が一様ではなく,時間・空間的に変動していることが分かった.
高齢者のヘルスプロモーションを推進する口腔保健支援システムの開発

この研究の目的は口腔保健調査の診査項目を整備し,得られたデータの集計,分析,蓄積および結果の解釈に関し,地方自治体,保健所,保健センターに対し支援することである。その手段として,最終的には,口腔健康調査用のデータペースソフトウエアを試作するものであるが,その構築に不可欠な科学的なエビデンスを得るために1年に1度(6月に)追跡調査を行っている。研究期間の4年間に得られたデータは莫大な量に上り,数多くの研究成果が得られた。研究対象はベースライン時の70歳600名,80歳163名である。調査・診査項目は口腔診査(有歯顎率,平均残存歯数,歯と歯周の健康診査,根面う蝕,顎間接,口腔粘膜,唾液検査など),生活習慣アンケート,食生活聞き取り,全身疾患・健康状態(問診,一般検査,血液検査,心電図など),運動機能測定,骨密度測定など可能な限り多く設定した。研究成果の概要は以下の通りである。1)歯列・咬合破壊は身体的,精神的な健康悪化,および生命予後と密接に関連していた。2)咬合破壊は歯の喪失が主原因であり,歯の喪失をもたらす一因に根面う蝕がある。根面う蝕の発生に関連している要因はベースライン時に根面未処置歯あり,歯冠う蝕経験あり,LAが大,唾液中lactobacilliレペルが高い,歯間ブラシ・フロスを使用していないという口腔関連変数に加え,BMIが小がリスクプレディクターであった。3)歯周疾患進行のリスクファクターには,喫煙とLA6mm以上が有意に関連した。4)X線学的研究では,残存歯の37%が無髄歯であり,そのうち36%に根尖病巣が認められ,かつ30%の骨吸収度であった。5)喪失歯の発生者率は30.8%,一人平均の年間喪失歯数は0.27本であった。また,歯の喪失リスクに関する要因分析の結果,歯周状態や歯の修復状況,根面う蝕などの口腔局所の要因に加え,高齢期の全身健康状態が歯の喪失に関わっていることがわかった。6)抗酸化剤としての重要性が認められているビタミンC, E,カロテン類を供給する緑黄色野菜群の摂取量が,咀嚼能力の低い群で有意に少なかった。7)寝た切りにつながる下肢の筋力,バランス,敏捷性の低下に有意に影響する因子として咬合支持数の減少があげられた。以上より,高齢者の健康水準を左右する口腔要因としてカギを握る歯の喪失に影響を及ぼす要因をターゲットに予防プログラムを策定することになる。その手段として,口腔健康調査用のデータベースソフトウエアを試作する。

新潟市の住民基本台帳より70歳および80歳全員(6,629名)を対象に,郵便による調査主旨説明を行い,参加同意書を依頼した。有効回答は79%,5267名から得られ,その内,母集団と著しく異ならないように性比率を調整し,70歳600名,80歳163名をコホート調査の対象者に選んだ。最終モデルでの診査項目を決定するための基礎情報を得るために,初年度の調査・診査項目は口腔診査(有歯顎率,平均残存歯数,歯と歯周の健康診査,根面う蝕,顎間接,口腔粘膜,唾液検査など),生活習慣アンケート,食生活聞き取り,全身疾患・健康状態(問診,一般検査,血液検査,心電図など),運動機能測定,骨密度測定など可能な限り多く設定した。実際のフィールド診査に先立ち,項目のコード化を計り,延べ1週間にわたる口腔診査者のキャリブレーションを行い,診査者間・内の一致性を検討する資料とした。次年度は同じ対象者を追跡調査し,基礎資料を得るとともに,本年度得たベースラインデータを解析する予定である。この研究の目的は口腔保健調査の診査項目を整備し,得られたデータの集計,分析,蓄積および結果の解釈に関し,地方自治体,保健所,保健センターに対し支援することである。その手段として,口腔健康調査用のデータベースソフトウェアを試作する。ベースライン調査は70歳600名,80歳163名について実施された。歯冠平均DT,FT,DFTは対象者全体でそれぞれ0.27,7.86,8.12,根面平均DS,FS,DFSはそれぞれ0.57,1.40,1.97であった。根面DS所有者は歯冠DT所有者より多く,根面FS所有者は歯冠FT所有者より少なかった。歯冠DTを所有している者はない者より根面DSを所有している確率が5.6倍高かった(P<0.001)。歯冠DTと根面DSの相関係数は0.32であった。ミュータンス連鎖球菌レベルが高いほど根面う蝕歯面率は高く,平均根面う蝕歯面数も多い結果を認めた。有歯顎者658人(70歳554人,80歳104人)について,平均現在歯数は70歳で18.8本,80歳で12.8本であり、年齢に有意差が認められたが有意な性差はなかった。平均PDは70歳で2.0mm,80歳で2.2mmと年齢差は認められなかった。現在歯数別にみると,70歳では現在歯数の多い群で小さい傾向にあった。平均LAは70歳で3.1mm,80歳で3.4mmと年齢差はなかったが,男が女より大きな値を示した。現在歯数別にみると,現在歯数の多い群でLAは有意に小さかった。現在歯数と食物摂取状況との関連を重回帰分析により評価した結果,歯牙本数別では総摂取エネルギーに有意差は認められなかったが,20本以上の群に比べ0本群、110本群で6群別の野菜群の摂取エネルギーが有意(p<0.05)に少なくなっていた。また口腔内の自覚症状項目で歯の動揺ありと回答した者は有意(p<0.05)に野菜群の摂取エネルギーが少なくなっていた。次年度は同じ対象者を追跡調査(2年目コホート)し,基礎資料を得るとともに,その変動(1年間・2年間)について解析する予定である。その手段として,口腔健康調査用のデータベースソフトウエアを試作する。そのために必要な基本的な基礎データ解析を本年度は行った。70歳591名および80歳158名について,社会的要因などの交絡因子の影響を考慮し,高齢者における体力と咬合機能・形態との関連性をみることを目的とした。口腔形態として現在歯数,Eichner
生殖細胞における染色体テロメアの機能構造の解析

我々はPCRを応用した高感度かつ定量的なテロメレース活性の検出方法を独自に解析し、テロメレースのDNA合成酵素としてのprocessivityをはじめとする生化学的解析を行ってきた。その結果、非常に高純度のヒトテロメレースを純化精製することに成功した。一方、テトラヒメナ・テロメレースのp80蛋白質配列を用いたデータベースサーチから、最近、テロメレースを構成する蛋白質の一成分のcDNAクローンを世界ではじめて単離することに成功した。このcDNAクローンの構造解析により、約2,800アミノ酸をコードするopenreading frameが同定された。部分的なリコンビナント蛋白質を大腸菌で発現させ、ウサギを用いてポリクローナル抗体を得た。この抗体は、ウエスタンブロッティングおよび免疫沈降により、SDS-PAGE上、約260 kDの分子量に相当する泳動度を示す蛋白質を同定した。蛋白質精製に用いた複数のクロマトグラフィーの画分の検討により、この蛋白質の存在と活性の溶出パターンは完全に一致した。さらに、抗体を用いた免疫沈降物にはテロメレース活性を検出することができた。以上のことより、我々は、クローン化したcDNAは、テロメレースを構成する蛋白質の一つであると結論し、TLP1(telomerase protein 1)と名付けた。次に、熊本大学阿部訓也助教授との共同研究により、マウス初期胚に見られる始原生殖細胞のテロメレース活性を検討するために、アルカリフォスファターゼ-lacZ癒合遺伝子のトランスジェニックマウスより得られた精製始原生殖細胞について検討したところ、意外なことに周囲組織の初期胚細胞よりも低い値を示した。現在、TLP1蛋白質の有無について解析中である。
原子運動に基づく連続体力学とその分子動力学的検討

物質の力学的あるいは熱力学的な挙動を巨視的に記述する方法は既に確立されていると見ることができる.しかしそれを原子の運動を基礎にして積み上げる場合には多少の問題が残っている.多数の原子の運動を平均化によって巨視的な量におきかえる際の積分領域をどうとるか,またその領域内部での変動の影響を無視することは妥当かどうか,などの問題点である.本研究ではこの点をメンドメインなる概念を用いて検討し,その小領域内部での諸量の変動も考慮する理論を始めに展開した.これにより,内部の高次変形の影響を考慮した高次物質に対する保存則を導くことができた.高次物質特有の高次応力は,通常の物質における熱流束の一部とみなすことができる.このことと,高次物質におけるエントロピーの関係を見るために,エントロピーの微視的表現をGibbsの式を用いて導出した.ここに高次応力仕事率に関する表現が用いられている点が特徴的である.高次物質のエントロピーと,通常の物質のエントロピーとの相違を確認するために,分子動力学法に基づく数値計算を行ない,得られた原子の速度に,上で得られた式を適用した.その結果,高次物質のエントロピーは,通常の物質のエントロピーに比べ値が小さくなることを定量的に明らかにすることができた.物質の力学的あるいは熱力学的な挙動を巨視的に記述する方法は既に確立されていると見ることができる.しかしそれを原子の運動を基礎にして積み上げる場合には多少の問題が残っている.多数の原子の運動を平均化によって巨視的な量におきかえる際の積分領域をどうとるか,またその領域内部での変動の影響を無視することは妥当かどうか,などの問題点である.本研究ではこの点をメンドメインなる概念を用いて検討し,その小領域内部での諸量の変動も考慮する理論を始めに展開した.これにより,内部の高次変形の影響を考慮した高次物質に対する保存則を導くことができた.高次物質特有の高次応力は,通常の物質における熱流束の一部とみなすことができる.このことと,高次物質におけるエントロピーの関係を見るために,エントロピーの微視的表現をGibbsの式を用いて導出した.ここに高次応力仕事率に関する表現が用いられている点が特徴的である.高次物質のエントロピーと,通常の物質のエントロピーとの相違を確認するために,分子動力学法に基づく数値計算を行ない,得られた原子の速度に,上で得られた式を適用した.その結果,高次物質のエントロピーは,通常の物質のエントロピーに比べ値が小さくなることを定量的に明らかにすることができた.
Xanthan高密度化生産による環境保全型バイオリアクターの開発

平成14年度に製作した1Lの攪拌槽型バイオリアクターと比較するために、平成15年度は直径93mm、容積3Lの標準気泡塔型バイオリアクターを製作した。攪拌槽型および気泡塔型リアクターによる培養の際の液中溶存酸素濃度および菌体数の経時変化を測定した。両者とも、培養の進行と共に急激に溶存酸素濃度が減少し、約35日後には0に達した。指数関数的に増加していた菌体数は溶存酸素濃度が0となると共に減少した。これは、菌体数の増加に伴い総摂取酸素量が増え酸素枯渇により菌体の一部が死滅し、菌体数が減少し始めたと考えられ、本菌体は生存およびXanthan生産のために高い酸素摂取量を必要とすることがわかった。また、見かけ粘度は培養液中のXanthan濃度の指標として用いたが、約8日後にそれぞれの最大濃度に達した。一方、2つのバイオリアクターの酸素移動性能を調べるために、数種のXanthan濃度のモデル培養液を調製し、k_Laの測定を行った。バイオリアクターによらず、供給空気流量の増加及びXanthan濃度の減少に伴いk_Laは増加したが、0.4wt%Xanthanでの実験結果では、攪拌槽型の方が大きいk_Laを示した。そこで、平成16年度には気泡塔内に多孔仕切り板を挿入した分割気泡塔型バイオリアクターを製作し、菌体を含まないXanthan水溶液中への酸素移動性能の測定を行った。多孔仕切り板を垂直に挿入することにより、気泡塔内のガスホールドアップならびに酸素移動速度も向上した。これにより高密度菌体培地あるいはXanthan溶液でも酸素枯渇を防止でき、最終濃度の向上を未反応培養液の削減が見込まれた。以上より、より高効率で環境保全に適したXanthan生産装置の開発の知見を得ることができた。Xanthomonas Campestris菌株による最適Xanthan生産条件を見出すために、約1Lの撹拌槽型バイオリアクターおよびpH、DO、温度、撹拌回転数、トルクおよび吹き込み空気流量のオンライン測定システムを設計・製作した。撹拌翼は高粘度液用パドル型を用い、回転数120rpmで一定とした。3種類の吹き込みガス流量で約7日から10日間、最小培地を用い一種の栄養ストレス条件下で、培養およびXanthan生産を行った。すべての条件下で、培養の進行と共に培養液中の酸素濃度は急激に減少し、約4日目になると0となった。酸素濃度が0に達するまでは菌体濃度は対数的に増加したが、酸素濃度が0になるとほぼ同時に菌体数は減少に転じた。これはバイオリアクターへの酸素供給速度を菌体の総酸素摂取速度が超えたためと考えられる。一方、菌の増殖とともにXanthan濃度も増加し、みかけの液粘度も急激に増大した。培養終了後にサンプリングしたXanthan溶液のレオロジー特性を調べ、降伏応力をもった非ニュートン性を示すことを確認した。撹拌槽型バイオリアクターでの最終的に得られた最大Xanthan濃度は0.2wt%に達した。一方、培養液のpHは培養の進行と共に低下した。そこで装置に改良を加え、液のpHをオンライン測定し自動制御でアルカリ滴下し、pHを中性域に維持し、最適培養条件を保持できた。以上の実験により、Xanthomonas campestris菌は大きな酸素要求量をもち、Xanthanの分泌により培地粘度が急上昇するので、その成長およびXanthan生産は菌体への十分な酸素供給速度をもつバイオリアクターが必要であることがわかった。

これらの知見をもとに、気泡塔型バイオリアクターの装置設計および開発に着手する。平成14年度に製作した1Lの攪拌槽型バイオリアクターと比較するために、平成15年度は直径93mm、容積3Lの標準気泡塔型バイオリアクターを製作した。攪拌槽型および気泡塔型リアクターによる培養の際の液中溶存酸素濃度および菌体数の経時変化を測定した。両者とも、培養の進行と共に急激に溶存酸素濃度が減少し、約35日後には0に達した。指数関数的に増加していた菌体数は溶存酸素濃度が0となると共に減少した。これは、菌体数の増加に伴い総摂取酸素星が増え酸素枯渇により菌体の一部が死滅し、菌体数が減少し始めたと考えられ、本菌体は生存およびXanthan生産のために高い酸素摂取量を必要とすることがわかった。また、見かけ粘度は培養液中のXanthan濃度の指標として用いたが、約8日後にそれぞれの最大濃度に達した。一方、2つのバイオリアクターの酸素移動性能を調べるために、数種のXanthan濃度のモデル培養液を調製し、k_Laの測定を行った。バイオリアクターによらず、供給空気流量の増加及びXanthan濃度の減少に伴いk_Laは増加したが、0.4wt%Xanthanでの実験結果では、攪拌槽型の方が大きいk_Laを示した。そこで、平成16年度には気泡塔内に多孔仕切り板を挿入した分割気泡塔型バイオリアクターを製作し、酸素移動性能およびXanthomonas compestrisの培養を行い、先に製作した2種類の標準的な培養形式との比較を行う。平成14年度に製作した1Lの攪拌槽型バイオリアクターおよび平成15年度に製作した容積3Lの標準気泡塔型バイオリアクターによるXanthomonas菌を用いたXanthan生産実験により以下の現象が観察できた。(1)培養の進行と共に急激に培養液中の溶存酸素濃度が減少し、約35日後には0に達した。(2)指数関数的に増加していた菌体数は溶存酸素濃度が0となると共に減少した。(3)培養液中のXanthan濃度は培養開始後約8日後に最大濃度に達し、それ以降はむしろ減少した。以上より、菌体数の増加に伴い総摂取酸素量が増え酸素枯渇により菌体の一部が死滅し、菌体数が減少し始めたと考えられ、本菌体は生存およびXanthan生産のために高い酸素摂取量を必要とすることがわかった。そこで、平成16年度は気泡塔型バイオリアクターの酸素移動性能を調べるために、数種のXanthan濃度のモデル培養液を調製し、標準気泡塔においてk_Laとガスホールドアップの測定を行い、塔径を小さくしスラグ気泡流動状態を形成させるとより大きなkLaが得られることを示した。また、実験データを整理し、装置内のk_Laを±40%で推定できる相関式を提出した。以上の成果をもとに、気泡塔でより高いk_Laを得るために、塔内に多孔仕切り板を挿入した分割気泡を考案した。分割気泡塔を用いてXanthan溶液によりk_Laを測定し、より高い酸素溶解性能を確認した。この技術により、分割気泡塔型バイオリアクターを用いれば標準的な気泡塔よりも高い菌体への酸素供給性能、デッドスペースの除去、容易なスケールアップが実現できると推察でき、高収率、低廃液が可能な環境保全型Xanthan生産装置の開発が見込まれた。
薬剤感受性試験結果に基づく適切な抗MRSA薬選択による菌血症治療成績向上への試み

研究目的MRSA(メチシリン耐性黄色ブドウ球菌)菌血症治療において、ガイドラインで代替薬とされる抗MRSA薬テイコプラニン(TEIC)が実際には第1選択として用いられている場合も多く、その妥当性は不明である。一昨年度の科学研究費採択課題において、TEICのMRSA菌血症に対する治療効果を抗菌薬感受性指標である最小発育阻止濃度(MIC)に着目した結果、CLSI基準で感受性ありとされるMIC=4または8μg/mLの症例は、MIC≦2μg/mLの症例と比較し治療効果が低い可能性が示された。本研究ではTEICとバンコマイシン(VCM)のMRSA菌血症に対する治療効果を特にMICに着目して比較検討した。研究方法北海道大学病院において2008年1月から2016年4月までにMRSA菌血症を発症しVCMまたはTEICを第1選択として用いられた患者に対し、各薬剤の治療効果を後ろ向きに比較検討した。1)血液培養陽性後30日以内の死亡、2)投与終了時における菌の持続、3)投与終了後60日以内の菌の再発のいずれかを満たす場合、治療失敗と定義した。研究成果VCMおよびTEIC投与群における治療失敗例は16/53(30.2%)、8/19(42.1%)、有効群および無効群におけるVCM投与例は37/48(77.1%)、16/24(30.2%)、TEIC投与例は11/48(22.9%)、8/24(33.3%)であり、いずれも統計学的有意な差はなかった。一方、有効群および無効群におけるTEIC MIC>2μg/mLは2/38(5.26%)、5/20(25.0%)(p=0.041)であり、TEIC MIC>2μg/mLが治療失敗に寄与する因子として示唆された。以上よりTEIC MIC>2μg/mLである場合、VCMなど他の抗MRSA薬への変更を推奨することが菌血症治療成績向上に繋がる可能性を示した。