hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
連続的炭素-炭素結合形成反応を機軸とする含八員環天然有機化合物の合成研究

Brook転位(ケイ素原子の炭素から酸素への1,2-アニオニック転位)を利用する[3+4]アニュレーションによる多官能性八員環形成反応を利用し,数種の天然物の合成検討を行い,以下のような結果を得た.(1)環状アクリロイルシランを原料として用いることで,asteriscanolideの特異なビシクロ骨格を効率的に構築した.(2)酸素原子を含む原料を用いることで(+)-prelaureatinおよび(+)-lauralleneの形式全合成を達成した.Brook転位(ケイ素原子の炭素から酸素への1,2-アニオニック転位)を利用する[3+4]アニュレーションによる多官能性八員環形成反応を利用し,数種の天然物の合成検討を行い,以下のような結果を得た.(1)環状アクリロイルシランを原料として用いることで,asteriscanolideの特異なビシクロ骨格を効率的に構築した.(2)酸素原子を含む原料を用いることで(+)-prelaureatinおよび(+)-lauralleneの形式全合成を達成した.本年度は含八員環天然化合物であるAsteriscanolideおよび(+)-Prelaureatinの合成の検討を行った.4, 4-dimethylcyclopent-1-enecarbaldehydeから導いた環状アクリロイルシランとシクロヘプテノンのリチウムエノレートとの[3+4]アニュレーションにより, Asteriscanolideの骨格を構築することに成功した.まず, 2000年にCrimminsらによって報告された(+)-Prelaureatinの全合成における中間体の合成を行った.アクリロイルシランと6-オキサ-2-シクロヘプテン-1-オン誘導体のナトリウムエノレートを用いる[3+4]アニュレーション/α-水酸化をワンポットで行った後に,四酢酸鉛で架橋部分を酸化的に開裂させることで, trans-α, α'-ジ置換基を有する八員環エーテル化合物を立体特異的に得ることができた.置換基の相対配置は[3+4]アニュレーションにおける面選択性により完全に制御される.その後, NBS/TBAFを用いる酸化的脱シリル化, Wilkinson錯体による脱カルボニル化反応など数段階の官能基変換を経て,全収率12%でCrimminsらの中間体を得ることができた.次に, [3+4]アニュレーションの四炭素単位として(+)-Prelaureatinの側鎖部分を有するオキサシクロヘプテンを用い,より短工程での全合成を検討した. [3+4]アニュレーションは問題なく進行し, 79%の収率で立体特異的にビシクロ体を得ることができた.さらに,酸化的脱シリル化,架橋部分の酸化的開裂を経て(+)-Prelaureatinの基本骨格に導くことができた.前年度に引き続き,含八員環天然有機化合物Asteriscanolideおよび(+)-Prelaureatinの合成の検討を行った.1. Asteriscanolidの合成水酸基を有する環状アクリロイルシランとシクロヘプテノンのエノレートとの[3+4]アニュレーションによって得られたトリシクロ体をα-水酸化/酸化的開裂反応に付し,架橋部分を開裂させることで,Asteriscanolideに変換可能なbicyclo[6.3.0]undecane骨格を有する多官能性化合物を得ることができた.2. (+)-Prelaureatinの合成(+)-Prelaureatinの側鎖部分に対応する置換基を有するオキサシクロヘプテンを四炭素単位として用い,[3+4]アニュレーションを行ったところ,良い収率でビシクロ体が得られた.前年度に報告した形式全合成をより効率的なものにするため,その後の置換基変換を検討した.その結果,以下のような合成経路を確立することができた.まずアニュレーション成績体をNBS/TBAFで処理することによりβ-シリルエノールシリルエーテルをエノンに導き,架橋部分のカルボニル基をエノールシリルエーテルとして保護する.エノン部分のカルボニル基を還元した後,エノールシリルエーテルを利用してカルボニル基のα位に水酸基を導入し,架橋部分を酸化的に開裂させる.生じたアルデヒドを利用して二重結合を異性化させて脱カルボニル化を行い,(+)-Prelaureatinの骨格を形成させる.その後,側鎖のヒドロキシル基をブロモ基に変換することができた.本経路では酸化/還元の段階が最小限に抑えられているため経路が短縮され,また,収率はすべての段階で満足のいくものであった.
細胞骨格と生体膜の可視化細胞系を用いた高等植物細胞の分裂機構に関する研究

本年度は、高等植物の細胞質分裂におけるアクチン繊維の動態と機能の解析に着目し、生細胞観察による経時的・定量的解析を実施した。まず、高等植物の細胞分裂研究の標準細胞株であるタバコBY-2細胞のアクチン繊維がGFP-ABD2により生体標識された形質転換細胞を確立した。この細胞株を用いて、細胞質分裂期のアクチン繊維構造の変化をスピニングディスク式共焦点レーザー顕微鏡を用いて、追跡した。その結果、分裂中期の分裂装置内にはアクチン繊維は目立って局在していなかったが、分裂後期になると分配された娘核近傍からアクチン繊維が出現し、細胞板が拡大する分裂終期では細胞板近傍へアクチン繊維が徐々に集積することが明らかになった。また、アクチン重合阻害剤であるbistheonellide Aを処理したところ、分裂終期における細胞板の拡大速度が低下することが2-3割減少することが示された。アクチン繊維破壊条件下で、細胞板近傍の内膜系の観察を行ったところ、細胞板と相互作用するエンドソームの運動性が低下すること、小胞体の細胞板近傍への集積が阻害されることが見出された。一連の解析結果から、アクチン繊維が高等植物の細胞質分裂に重要な役割を果たすことが示された。本研究は、細胞分裂におけるアクチン繊維の新たな役割を示した点て細胞生物学への貢献が認められる。また、本成果は2008年7月にBMC Plant Biology誌にて公表された。BMC Plant Biology誌はopen access journalであり、現時点で本論文は1600を超えるアクセス数を記録している。高等植物の細胞質分裂は、二つの娘核の間に形成される細胞板が遠心的に発達し、親細胞の細胞壁と癒合して完了します。この細胞板は、ゴルジ体に由来する小胞が微小管に沿って運ばれて蓄積し、形成されると考えられています。ところが、近年になって細胞膜に由来するエンドソームも細胞板の膜材料として輸送されること可能性が指摘されました。このような状況を踏まえ、細胞板形成におけるアクチン繊維とエンドソーム経路の寄与の定量的な評価に取り組みました。本年度は、まず、アクチン繊維と細胞板のタイムラプスイメージング実験系の確立を行いました。その結果、アクチン繊維プローブであるGFP-ABD2を発現させたタバコ培養細胞を蛍光色素FM4-64のパルスラベルし、これを高速撮像が可能なスピニングディスク式共焦点顕微鏡に供することで、アクチン繊維、細胞板、エンドソームを同時に高い時間空間分解能で可視化観察する実験系を確立しました。この実験系により、アクチン繊維は細胞板の拡大に伴って娘核周囲から徐々に細胞板へと集積していくことを明らかにしました。また、アクチン重合阻害剤を用いてアクチン繊維破壊の影響を調べたところ、特に細胞質分裂後期において細胞板の拡大速度が低下するように観察されました。そこで、タイムラプス像から細胞板の直径を半自動的に計測し、モデル式への回帰分析を行う画像解析プログラムを独自に開発し、詳細な解析を進めた結果、アクチン繊維破壊によって細胞板形成初期には細胞板への膜輸送がおよそ10%減少し、細胞質分裂の終期にはその減少率がおよそ25%に及ぶ、といったアクチン繊維の細胞板への寄与の時間変化を推定することができました。また、アクチン繊維破壊によって細胞板近傍のエンドソームの運動性が著しく低下していたことから、アクチン繊維はエンドソームの運動制御を介して、細胞板の拡大に寄与する可能性が考えられました。
局所生体防御ホルモンシステムの解明

ホルモンは生体の生理活性物質としてごく微量でその機能を具現化する。レニン-アンギオテンシン系(RAS)は血圧調節と水・電解質代謝の調節に働く。RASのトリガー的酵素であるレニンは主に腎臓から分泌されるが、他組織にも存在し、従来考えられなかった調節系の存在が報告されている。本研究の目的は、局所免疫機構に関与するホルモンシステムを特にRASを中心に解明することにある。レニンノックアウトマウスの形態学的観察を行い、以下の結果を得た。ホモ個体の腎臓は種々の程度に水腎症の形態を呈し、腎臓内血管は内皮細胞の肥厚と、平滑筋細胞の増殖を特徴とした。血圧は著しく低下していた。腎臓内血管壁には神経が増加していた。しかし、腎臓外レニン産生臓器、特に外分泌組織に顕著な形態学的変化は認められなかった。これらのことから、レニンは腎臓の形態形成には必須の因子であるが、腎臓外においては未知の因子が代償することが考えられた。免疫系に関しては、レニンをノックアウトすることによって胸腺萎縮を示す例も観察されたことから、免疫系に対し何らかの作用がある可能性が伺われた。さらに、精巣における局所免疫防御に関連する因子としての一酸化窒素(NO)に着目し、その合成酵素であるiNOSの発現を免疫組織化学的ならびに分子生物学的に観察した。その結果、iNOSは微小精巣環境とくに血液-精巣関門を構成する一因子としての役割を果たすものと考えられた。また、精巣において減数分裂中期特異的アポトーシスを示すマウスを解析し、その原因遺伝子としてExonuclease 1の存在を明らかにした。さらに、卵管局所から分泌されるOviduct glycoprotein (OGP)の機能を解析するため、そのプロモーターをSVTに連結することでトランスジェニックマウスを作製し、局所発現と腫瘍化について甲状腺ホルモンの関連する結果を得た。本年度は、レニンノックアウトマウスの作製とその形態学的観察を中心に行った。C57BL/6(単一レニン遺伝子系統)レニン遺伝子のエクソン1-3をLacZ遺伝子で置換し、定法に従ってホモならびにヘテロ個体が得られた。ホモ個体の腎臓は種々の程度に水腎症の形態を呈していた。腎臓内血管は内皮細胞の肥厚と、平滑筋細胞の増殖を特徴とした。レニン陽性細胞は観察されず、β-gal陽性細胞が糸球体近傍から小葉間動脈壁に広く存在していた。β-galは糸球体近傍ではSMA陽性細胞と同一の平滑筋細胞、ならびに外膜の繊維芽細胞、糸球体外血管間膜細胞に陽性であったが、より太い血管では中膜最外層の細胞のみが陽性を示した。さらに、糸球体内部の細胞にも本陽性反応が認められた。緻密斑はより顕著に形成され、PGP9.5陽性の神経終末がその近傍に多数みとめられた。電顕的に典型的な糸球体傍細胞は観察されなかった。ヘテロ個体の腎臓は、野生型腎臓と形態学的に差はみとめられなかった。

ホモ個体の血中レニン活性、アンギオテンシンI活性はほとんど検出されず、かつ血圧は著しく低下していたことから、レニンは血圧調節に不可欠の因子であることが確認された。レニン-アンギオテンシン系(RAS)は血圧調節と水・電解質代謝の調節に働く。RASのトリガー的酵素であるレニンは主に腎臓から分泌されるが、他組織にも存在し、従来考えられなかった調節系の存在が報告されている。本研究の目的は、局所免疫機構に関与するホルモンシステムを特にRASを中心に解明することにある。昨年度は、レニンノックアウトマウスの作製とその形態学的観察を中心に行った。すなわち、レニン遺伝子のエクソン1-3をLacZ遺伝子で置換し、定法に従ってホモならびにヘテロ個体が得られた。ホモ個体の腎臓は種々の程度に水腎症の形態を呈し、腎臓内血管は内皮細胞の肥厚と、平滑筋細胞の増殖を特徴とした。血圧は著しく低下していた。本年度は、このレニンノックアウトマウス腎臓を用い血管に分布する神経を観察し、興味ある知見が得られた。すなわち、腎臓の100-200μm厚標本を作製しPGP9.5による免疫染色を行い神経走行を可視化した。多数の神経終末が糸球体近傍に多数みとめられた。この傾向は葉間動脈においても同様であった。これらの所見は、血管平滑筋の増殖に伴う変化であり、血圧調節に不可欠な存在であるRASが十分に機能しないために惹起された代償性変化と考えられた。さらに、腎臓外レニンにはマウスの系統が存在することが知られているため、13系統について特に外分泌腺レニンの存在を比較検討し、その後レニンノックアウトマウスでの形態異常の有無について超微形態学的に観察した。その結果、レニンの有無に関わらず外分泌腺組織に顕著な異常は観察されなかった。このことから、外分泌腺レニンは別の因子によって代償されているものと考えられた。免疫系に関しては、レニンをノックアウトすることによって胸腺萎縮を示す例も観察されたことから、免疫系に対し何らかの作用がある可能性が伺われた。一昨年度は、レニンノックアウトマウスの作製とその形態学的観察を中心に行った。すなわち、ホモ個体の腎臓は種々の程度に水腎症の形態を呈し、腎臓内血管は内皮細胞の肥厚と、平滑筋細胞の増殖を特徴としていた。昨年度は、このレニンノックアウトマウス腎臓を用い血管に分布する神経をPGP9.5による免疫染色を行い可視化した。その結果、多数の神経終末が糸球体近傍に多数みとめられ、血圧調節に不可欠な存在であるRASが十分に機能しないために惹起された代償性変化と考えられた。今年度は、精巣における局所免疫防御に関連する因子としての一酸化窒素(NO)に着目し、その合成酵素であるiNOSの発現を免疫組織化学的ならびに分子生物学的に観察した。その結果、iN0Sは精細管セルトリ細胞の基底膜側に出現し、精細管ステージによって異なる発現態度を示すことが明らかとなった。
うつ病における唾液アミラーゼとDEX/CRH試験の相互作用

大うつ病性障害者100人(非寛解50人、寛解50人)、健康正常人100人である。治療開始前(非寛解)と治療開始後寛解になってからの2回この測定を行う。(寛解はHDRS7点以下)検査項目:(1)ストレス刺激として(1)TSST(Trier Social Stress Test)および(2)正中神経の電気刺激を条件刺激として用いる。唾液アミラーゼ測定試験;唾液アミラーゼ測定キットを用いて測定する。唾液コルチゾール試験:唾液アミラーゼELIZAを用いて測定する。(2)DEX/CRH試験:第1日目の23:00にデキサメサゾン1.5mgを服用し、第2日目の15:00に採血およびCRH100μgを静注を行い、以後30分、45分、60分、75分の時点で採血を行う。内分泌反応として各時点でのACTHおよびコルチゾール濃度を測定する。(3)心理テスト:STAI(State-Trait Anxiety Inventory)状態・特性不安検査STAI、POMS(Profile of Mood State)、うつ病症状評価尺度、不安尺度、(4)生理測定:HRV(Heart Rate Variability)心拍変動-交感神経、副交感神経の機能を測定する。現在データ集積中である。【目的】副腎髄質系を反映する唾液アミラーゼがストレスのとして注目されている。大うつ病性障害・パニック障害において物理的ストレスに対する唾液アミラーゼの分泌と不安・気分を評価する質問紙法であるSTAI・POMS・TCIについて研究を行なった。【方法】大分大学医学部附属病院を受診した外来患者でDSM-IV診断基準を満たす大うつ病性障害患者とパニック障害患者である。被験者にはSTAIを実施し、正中神経電気刺激によるストレスを与え、刺激直前・直後・20今後生の唾液アミラーゼを測定した。その後POMSを実施した。刺激直前と刺激直後のアミラーゼの値を比較し、増加した群と減少した群に分け、唾液アミラーゼの分泌とSTAI・POMS・TCIの関連について分析した。本研究は大分大学医学部倫理委員会の承認のもと、被験者よりインフォームドコンセントを得た。【結果】唾液アミラーゼ増加群では、特性不安・状態不安・緊張・不安・抑うつ-落ち込み・混乱の項目において大うつ病性障害患者と大うつ病性障害・パニック障害合併患者がパニック障害患者に比べ有意に得点が高かった。逆に、活気の項目ではパニック障害患者が大うつ病性障害・パニック障害合併患者に比べ、有意に得点が高かった。唾液アミラーゼ減小群では、抑うつ-・落ち込み・疲労・混乱の項目において大うつ病性障害患者と大うつ病性障害・パニック障害合併患者がパニック障害患者に比べ有意に得点が高かった。【考察】唾液アミラーゼ増加群・減少群いずれも、大うつ病性障害患者と大うつ病性障害・パニック障害併存患者はパニック障害患者よりも抑うつ-落ち込み・混乱の得点が有意に高いことから、ストレスを強く受けている可能性が示唆された。唾液アミラーゼ増加群では、大うつ病性障害患者と大うつ病性障害・パニック障害合併患者はパニック障害患者よりも特性不安・状態不安ともに有意に得点が高いことから大うつ病性障害の患者は不安が強い可能性がある。
ヒト尿路における一酸化窒素合成酵素のアイソザイムの同定とその局在に関する研究

平滑筋弛緩作用に対する一酸化窒素の関与については、血管平滑筋領域で解明が進んでいる。L-アルギニン由来の一酸化窒素は、内皮細胞由来弛緩因子として、また非アドレナリン非コリン作動性神経のメディエーターとして血管平滑筋弛緩作用を有する。泌尿器科領域においても尿道平滑筋、陰茎海綿体において一酸化窒素合成酵素(NOS)の存在が確認されている。本年度の研究実績として、まず尿管平滑筋組織内の一酸化窒素合成酵素陽性神経の存在をnicotinamide adenine dinucleotide phosphate(NADPH)diaphorase染色、anti-brain-NOS特異的抗体を用い免疫組織染色にて確認した。また、生理実験として尿管平滑筋のmuscle stripsを用いKrebs-Henseleit液中での経壁的電気刺激に対する収縮弛緩反応を調べた。10-^5M guanethidine、2×10-^6Matropine存在下の経壁的電気刺激に対し尿管切片は弛緩反応を示さず、10-^4ML-NGnitrosrginine methylester(NOS inhibitor)、10^2ML-arginine(NO source)の影響も認めなかった。10^4Msodium nitroprusside(NO donor)は電気刺激に関係なく弛緩反応を示した。これより生理実験においては蠕動運動に対するNOの関与は証明されなかった。この結果については、現在投稿中である。次に組織切片よりRNA抽出し、逆転写酵素によりcDNAを合成し、これをNO synthaseのprimerを用いたRT-PCR法にて増幅させることによりその存在を確認するRT-PCR法を尿路の各組織を用い調べた。現在のところ尿路において誘導型NOSは確認されたが神経型NOSは確認されていない。
家畜胚の組織分化と伸長を制御する分子基盤の解明

本研究は、家畜初期胚において組織分化を制御する因子の同定とその機構解明を目的とした。ウシ初期胚においては、CDX2発現抑制により胚発生の遅延が認められること、TEAD4発現抑制による胚発生への影響は認められないことが明らかとなった。また、FGF4発現抑制によって胚盤胞期への発生が著しく阻害されることが明らかとなった。また、ブタ胚においては、2-細胞期胚の片側割球のOCT-4発現を抑制した場合、当該割球に由来する細胞は栄養膜細胞に寄与しなかった。また、TEAD4発現の人為的な抑制により胚盤胞期への発生が阻害されたことから、TEAD4がブタ胚の組織分化の重要因子であることが明らかとなった。本研究では、ウシ胚の組織分化を制御する因子の同定とその機構解明を明らかにすることを目的としている。平成26年度の研究として、まず、ウシ胚の発生および組織分化機構におけるCDX2の役割を明らかにすることを目的に、ウシ初期胚においてRNA干渉法を用いたCDX2発現抑制を行い、それが胚発生および組織分化関連遺伝子発現におよぼす影響について検討した。ウシ1細胞期胚の細胞質内にCDX2発現抑制用のsiRNAの注入を行った。siRNA注入によるウシ胚におけるCDX2発現抑制は、桑実期までの発生に影響をおよぼさなかったものの、CDX2発現抑制胚では胚盤胞期への発生遅延が認められた。また、CDX2発現抑制によって、TE分化関連遺伝子であるGATA3遺伝子発現が減少するとともに、ICM分化関連遺伝子であるNANNOGの遺伝子発現が上昇した。これらの結果から、ウシ胚において、CDX2はTE分化関連遺伝およびICM分化関連遺伝子の発現を制御することでTE分化を制御していることが示唆された。しかし、CDX2発現抑制胚においては、胚盤胞期への発生遅延は認められたものの最終的に対照区と同程度の胚盤胞期への発生率を示した。このことは、CDX2発現が抑制された状態においてもTE形成が起こることを示しており、ウシ胚においてCDX2はTE分化の必須因子ではないことを示唆するものである。また平成26年度は、もう1つの候補因子であるTEAD4に関しても上記と同様の方法で実験を実施し、現在データを解析中である。また平成26年度は次年度以降の研究に用いる伸長期胚の採取を行い、網羅的遺伝子発現解析用にRNA抽出を行った。本研究では、家畜胚の組織分化を制御する因子の同定とその機構解明を目的としている。本年度の研究として、まずウシ初期胚におけるTEAD4の発現動態とTEAD4発現抑制胚の発生を明らかにし、TEAD4がウシ胚の発生・組織分化におよぼす影響を検討した。また、本年度における新たな取り組みとしてブタ初期胚におけるOCT-4発現が栄養膜細胞(TE)への分化におよぼす影響についても検討した。ウシ胚のTE分化を制御する因子としてTEAD4に着目した。各発生ステージにおけるTEAD4発現量および発現の局在性を検討した。その結果、ウシ胚のTEAD4mRNA発現は8-細胞期までは低いものの16細胞期から発現が上昇し、桑実期から胚盤胞期にかけて高い発現レベルを維持した。TEAD4タンパク質発現に関しては16-細胞期までは細胞質内に発現が認められ、桑実期以降はほぼ全ての細胞において細胞核での発現が認められた。TEAD4を対象としたsiRNAの顕微注入を行った胚においてもsiRNA未注入胚と同様の発生動態を示した。これらのことから、TEAD4発現抑制胚においてもTE形成が起こり、TEAD4発現抑制はICMおよびTE分化に影響をおよぼさないことが明らかとなった。ブタ2-細胞期胚の片側割球にのみOCT-4発現抑制用siRNAを注入した結果、胚盤胞期までの発生に影響をおよぼさないことが明らかとなった。それら胚においてはOCT-4注入割球のTEへの寄与率は低い値を示した。このことからブタ胚においてはTE分化にOCT-4の直接的な発現を必要とすることが明らかとなった。本年度は、ウシ初期胚の発生および組織分化を制御する因子としてTEAD4に着目し、本因子の胚発生および組織分化への影響を明らかにすることができた。さらには、ブタ初期胚におけるTE形成に対するOCT-4の役割も明らかにした。以上のことから、本研究は概ね順調に進展していると評価した。本年度は、ウシ胚の胚盤葉上層/原始内胚葉の分化を制御する分子基盤の解明を目的に、RNA干渉法を用いたFGF4の発現抑制実験を行い、FGF4の機能解析を試みた。実験に用いたウシ胚は、食肉処理場由来のウシ卵巣から卵子を吸引採取し、20時間の体外成熟の後、体外受精を行うことで得た。体外受精胚を培地中で最長8日間培養し、8細胞期から脱出胚盤胞期にかけての6つの発生ステージにおいてRNAサンプルを収集し、FGF4 mRNAの発現量解析を行った。ウシ胚に対するFGF4の発現抑制は、1細胞期胚の細胞質内にFGF4発現抑制用のsiRNAを注入することにより実施した。処理区は、FGF4発現抑制区の他に発現抑制効果のないControl siRNAを注入した区、およびsiRNA未注入区の計3区を設定した。FGF4発現抑制による初期発生への影響の他に、桑実胚および胚盤胞期胚を対象に、NANOGおよびGATA6発現への影響についても検討した。

ウシ胚において、FGF4 mRNAの発現は16細胞期までは認められず、桑実期以降の発生ステージにおいてのみ認められた。また、FGF4発現量は桑実期において高い値を示したが、拡張胚盤胞期において一旦有意(P<0.05)に低い水準まで低下し、脱出胚盤胞期にかけて再び桑実期と同等の水準まで上昇した。FGF4の発現抑制は、ウシ胚において胚盤胞期への発生を阻害した。桑実胚および胚盤胞期胚においてNANOGおよびGATA6発現量を解析した結果、FGF4 siRNA区のNANOG発現量はControl siRNA区と比較して有意(P<0.05)に高く、またFGF4 siRNA区のGATA6発現量はsiRNA未注入区と比較して有意(P<0.05)に低かった。本年度は、ウシ初期胚の発生および組織分化を制御する因子としてFGF4に着目し、本因子の胚発生および組織分化への影響を明らかにすることができた。本研究では、家畜胚の組織分化を制御する因子の同定とその機構解明を目的としている。本年度の研究として、ブタ初期胚におけるTEAD4の発現動態とTEAD4発現の人為的抑制がブタ初期胚の発生におよぼす影響について明らかにし、TEAD4がブタ胚の発生・組織分化におよぼす影響について検討した。ブタ胚の栄養膜細胞(TE)分化を制御する因子としてTEAD4に着目した。まず始めに各発生ステージにおけるTEAD4発現量およびTEAD4発現の局在性を検討した。ブタ胚におけるTEAD4 mRNA発現は、1-細胞期から8-16-細胞期にかけて上昇した後、BC期にかけて低下した。TEAD4タンパク質は16-細胞期以降において細胞核での発現が認められ、胚盤胞期胚では、少なくともTEでの発現が観察された。次に、RNA干渉法を用いてTEAD4発現を人為的に抑制したブタ初期胚の胚盤胞期までの発生率を検討した。TEAD4を標的としたsiRNAを1-細胞期胚に注入した。TEAD4 siRNA注入を行ったブタ胚では、TEAD4 mRNA発現の有意(P < 0.05)な低下が認められた。TEAD4発現を抑制したブタ胚では、桑実期までは発生したものの胚盤胞期(Day 5)への発生率が、Uninjected区およびControl siRNA注入区と比較して有意(P < 0.05)に低い値を示した。また、TEAD4発現抑制による遺伝子発現への影響においては、TEAD4発現抑制胚におけるSOX2 mRNA発現量がUninjected区およびControl siRNA注入区と比較して有意(P < 0.05)に高い値を示した。以上の結果から、ブタ胚の桑実期から胚盤胞期への発生においては、TEAD4が必須であり、TEAD4がブタ初期胚の組織分化に関与する可能性が示された。本研究は、家畜初期胚において組織分化を制御する因子の同定とその機構解明を目的とした。ウシ初期胚においては、CDX2発現抑制により胚発生の遅延が認められること、TEAD4発現抑制による胚発生への影響は認められないことが明らかとなった。また、FGF4発現抑制によって胚盤胞期への発生が著しく阻害されることが明らかとなった。また、ブタ胚においては、2-細胞期胚の片側割球のOCT-4発現を抑制した場合、当該割球に由来する細胞は栄養膜細胞に寄与しなかった。
新規セレノカルボン酸誘導体の分子設計と新合成法の開発

セレノカルボン酸誘導体合成の最も基本的な出発原料となるアルカリ金属塩はこれまでジアシルセレニドと水酸化カリウムとの反応からの芳香族セレノカルボン酸カリウム塩の合成が知られていたにすぎない。今回、アシルクロリドとセレン化ナトリウム及びカリウムとの反応から直接ナトリウム塩(1)とカリウム塩(2)が容易に合成できることを見いだした。また、ルビジウム塩(3)及びセシウム塩(4)はRb_2Se及びCs_3Seの合成が難しく、さらにセレノカルボン酸自身の単離も難しいため、チオ及びジチオカルボン酸ルビジウム及びセシウム塩の合成に用いた方法を適用できない。今回、0-トリメチルシリルセレノンエステルとRbF及びCsFとの反応から高収率で合成・単離することに成功した。(Scheme 1)これらの塩は種々の求電子試薬と容易に反応し、相当するセレノカルボン酸誘導体を高収率で与える。
ホウ素欠乏と蒸散抑制の複合要因がトマトの「つやなし果」発生に及ぼす影響

ホウ素処理がトマト果実の「つやなし果」発症に及ぼす影響を調べた.ミニトマト`千果'を供試し,養液栽培でトマトを育てた.開花期から培養液中のホウ素濃度を上げたところ,植物体にはホウ素過剰による成育抑制が認められ,対照区に比べると果実が有意に小さくなったにも拘わらず,通常のホウ素濃度で育てた対照区に比べ,「つやなし果」の発症が抑制された.また,養液栽培で大玉トマト`麗容'を育て,開花期からホウ酸の散布処理区を設けたところ,夏栽培,秋栽培とも果実の大きさには処理区間で差がないものの,ホウ酸散布処理によって「つやなし果」の発症率ないし,発症程度が抑制された.こうした結果から,ホウ素処理にはミニトマトおよび大玉トマト共に「つやなし果」の発症を抑制させる効果があることが明らかとなった.「つやなし果」抑制メカニズムについて,ホウ素処理によりトマトの表皮が分泌するクチクラ量が増加し,クチクラが物理的に強化されるのではないかと考え,クチクラ量を比較した.しかし予想とは逆に,「つやなし果」を発症した果実の方がより大量のクチクラを分泌していた.こうした傾向は夏栽培と秋栽培で同様であったが,夏栽培と秋栽培を比較すると,日射量が減少する秋栽培では,夏栽培に比べるとクチクラ量は1/2以下であった.このように,クチクラ量と「つやなし果」の発症程度との間には正の相関は認められなかったことから,少なくともトマトを収穫した時点における表皮のクチクラ量は「つやなし果」の発症には直接関与していないものと考えられた.本実験では,当初ホウ素処理によってクチクラ合成が活性化するため,「つやなし果」が抑制されるのではないかと予想したが,結果はむしろ「つやなし果」の方がクチクラ量が多くなった.このように,ホウ素処理とクチクラ量との間には必ずしも正の相関が認められないという結果は新しい知見であり,トマトの「つやなし果」のメカニズムを考える上で,貴重なデータであると考えられる.本実験の結果は,2019年度の園芸学会で発表すると共に,2020年度に開催されるアジア園芸学会議でも発表予定であることから,順調に進展していると判断した.本実験ではトマト果実を着色開始期に収穫したが,本実験の結果は,果実の大きさや着色期におけるクチクラ量は「つやなし果」の直接的な発症要因とではない可能性を示唆している.「つやなし果」の発症を経時的に調べると,「つやなし果」は,果実が急激に肥大成長を開始する初期に発症し始め,その後果実成長に伴って症状が拡大して行く.エピクチクラワックスに亀裂が発生すると,果皮表面からの蒸散量が急激に増加することから,果実の肥大初期に「つやなし果」が発症した場合,亀裂を修復させるためのクチクラ合成が増加し,結果として「つやなし果」の方が正常果より多くのクチクラ量となるのかも知れない.したがって,次年度の研究では,果実肥大初期の「つやなし果」の発症がクチクラ合成に及ぼす影響について解析すると共に,ホウ素処理がクチクラの物理的性質,特に微細亀裂に大きな影響を及ぼすと考えられるクチクラの弾性について検討する.ホウ素処理がトマト果実の「つやなし果」発症に及ぼす影響を調べた.ミニトマト`千果'を供試し,養液栽培でトマトを育てた.開花期から培養液中のホウ素濃度を上げたところ,植物体にはホウ素過剰による成育抑制が認められ,対照区に比べると果実が有意に小さくなったにも拘わらず,通常のホウ素濃度で育てた対照区に比べ,「つやなし果」の発症が抑制された.また,養液栽培で大玉トマト`麗容'を育て,開花期からホウ酸の散布処理区を設けたところ,夏栽培,秋栽培とも果実の大きさには処理区間で差がないものの,ホウ酸散布処理によって「つやなし果」の発症率ないし,発症程度が抑制された.こうした結果から,ホウ素処理にはミニトマトおよび大玉トマト共に「つやなし果」の発症を抑制させる効果があることが明らかとなった.「つやなし果」抑制メカニズムについて,ホウ素処理によりトマトの表皮が分泌するクチクラ量が増加し,クチクラが物理的に強化されるのではないかと考え,クチクラ量を比較した.しかし予想とは逆に,「つやなし果」を発症した果実の方がより大量のクチクラを分泌していた.こうした傾向は夏栽培と秋栽培で同様であったが,夏栽培と秋栽培を比較すると,日射量が減少する秋栽培では,夏栽培に比べるとクチクラ量は1/2以下であった.このように,クチクラ量と「つやなし果」の発症程度との間には正の相関は認められなかったことから,少なくともトマトを収穫した時点における表皮のクチクラ量は「つやなし果」の発症には直接関与していないものと考えられた.本実験では,当初ホウ素処理によってクチクラ合成が活性化するため,「つやなし果」が抑制されるのではないかと予想したが,結果はむしろ「つやなし果」の方がクチクラ量が多くなった.このように,ホウ素処理とクチクラ量との間には必ずしも正の相関が認められないという結果は新しい知見であり,トマトの「つやなし果」のメカニズムを考える上で,貴重なデータであると考えられる.本実験の結果は,2019年度の園芸学会で発表すると共に,2020年度に開催されるアジア園芸学会議でも発表予定であることから,順調に進展していると判断した.本実験ではトマト果実を着色開始期に収穫したが,本実験の結果は,果実の大きさや着色期におけるクチクラ量は「つやなし果」の直接的な発症要因とではない可能性を示唆している.

「つやなし果」の発症を経時的に調べると,「つやなし果」は,果実が急激に肥大成長を開始する初期に発症し始め,その後果実成長に伴って症状が拡大して行く.エピクチクラワックスに亀裂が発生すると,果皮表面からの蒸散量が急激に増加することから,果実の肥大初期に「つやなし果」が発症した場合,亀裂を修復させるためのクチクラ合成が増加し,結果として「つやなし果」の方が正常果より多くのクチクラ量となるのかも知れない.したがって,次年度の研究では,果実肥大初期の「つやなし果」の発症がクチクラ合成に及ぼす影響について解析すると共に,ホウ素処理がクチクラの物理的性質,特に微細亀裂に大きな影響を及ぼすと考えられるクチクラの弾性について検討する.
中国における日本の政府開発援助ODAの社会経済効果に関する研究

本年度は日中環境開発モデル都市構想に立案されたプロジェクトについて、日本の援助供与機関(日本外務省,元通産省,元環境庁,国際協力銀行,国際協力事業団)に提出された各種報告書と中国の業界紙・専門誌,地元新聞の収集を行ない、日本資金援助の代表事例として貴陽市地域の複数のプロジェクトの環境改善効果,認知度,評価と政策的影響について,実施に係わった地域各主体(政府関係者,環境保護研究機関,企業と住民)に対して中国の現地研究機関に調査協力を依頼し、実施状況の把握に努めた。中間研究報告書を作成し、1.中国の環境問題の現状(環境保護制度管理・執行上の問題、企業における環境保護対策の問題、住民レベルの環境保護に関する問題)、2.西部大開発と内陸開発方向の転換、3.日本の対中ODAと環境保護の位置づけ、4.日中環境開発モデル都市における環境保護の実施状況といった構成で、環境保護と国際協力に関する主要観点を整理した。呉暁林は日本の研究機関・大学・学会の研究会に参加し,学術交流と研究発表を行なった。アジア政経学会東日本研究会(文部省学術研究センター),同学会全国大会(神戸大学で開催),日本地域経済研究センター主催の中国地域開発シンポジウム,日本中国経済学会に出席し,計4回ほど,個人の研究発表を実施した.本年度は日中環境開発モデル都市構想に立案されたプロジェクトについて、日本の援助供与機関(日本外務省,元通産省,元環境庁,国際協力銀行,国際協力事業団)に提出された各種報告書と中国の業界紙・専門誌,地元新聞の収集を行ない、日本資金援助の代表事例として貴陽市地域の複数のプロジェクトの環境改善効果,認知度,評価と政策的影響について,実施に係わった地域各主体(政府関係者,環境保護研究機関,企業と住民)に対して中国の現地研究機関に調査協力を依頼し、実施状況の把握に努めた。アジア政経学会東日本研究会(文部省学術研究センター),同学会全国大会(神戸大学で開催),日本地域経済研究センター主催の中国地域開発シンポジウム,日本中国経済学会に出席し,計4回ほど,個人の研究発表を実施した.
ニューラルネットワークにおける学習過程のカオス力学的研究

本研究では、ニューラルネットワークによる時系列の学習過程を、ネットワークの結合荷重を変数とする非線形力学系として捉え、学習の最適状態への収束性を解析的に検討した。得られた成果を以下に要約する。(1)離散および連続力学系から生成される時系列の学習収束条件を、結合荷重を変数とする力学系の不動点の安定性として解析し、学習される時系列が周期的、概周期的、カオス的な場合のそれぞれに対して最適状態への収束条件を導出した。(2)カオス時系列を学習する場合は不動点近傍での線形近似解析が一般には成立せず、学習の収束問題は本質的に非線形であることを明確にした。(3)線形近似解析が成立しない学習系の具体例として、線形近似系の安定性を保証する法線リアプノフ指数が負であっても最適状態を表わす不動点がリアプノフの意味では安定にはならず、riddled basinと呼ばれる非常に複雑な引力圏を持ったアトラクタとなるものを構成し、その存在証明を与えた。ニューラルネットワークによる時系列の学習の収束性については、従来、確率的な解析しかなされていなかったが、本研究において力学系の理論を適用することにより厳密な収束条件を与えることができた。また、カオス時系列の学習収束条件はカオス的外力に駆動された非自律系の不動点の安定条件であり、これはカオスの工学的応用のための鍵を握る重要な性質として注目されている「カオスの同期現象」の安定条件と同型になる。このように、本研究の成果はニューラルネットワークによる時系列学習の基礎理論としてのみならず、カオスの応用という観点からも重要な知見を与えている。
イネ窒素利用に関するＧｘＥ　ＧＷＡＳによる研究

本研究は、環境に呼応して機能を変化させる農業関連遺伝子の単離・解析手法の確立とそれを利用した分子育種を目指す。農業関連形質の多くは量的形質(QTL)であり、その研究はQTL解析により研究が進められてきた。しかし、QTL解析には圃場作業に多くの労力と時間を要し解析の対象が両親に限られるため、多様なゲノムについて同時に検討できない欠点がある。申請者の所属研究室はQTL解析ではなくより効率的にQTL遺伝子を単離するゲノムワイド関連(GWA)解析技術を構築した。本研究はこのGWA解析を用いて、外的環境に呼応してその機能をダイナミックに変化させるQTL遺伝子の単離・解析技術を目指す。
都市内分権のなかの熟議と代表制デモクラシーの関係をめぐる比較地方自治研究

研究期間中、3次にわたり飯田市(長野県)で地域自治区調査を行い、また2次にわたりポートランド市(米国オレゴン州)で「近隣の参加」制度の調査を行った。飯田市では、20の地域自治区の基礎的な資料を収集し、複数の当事者インタビューを行った。また、ポートランド市では「近隣の参加」の制度を管轄する近隣参加局でのインタビュー、6の近隣アソシエーションでの公開定例会の傍聴と当事者インタビュー、2の区域連合でのスタッフへのインタビューを行った。飯田市の地域自治区制度については研究成果は未発表であるが、ポートランド市の「近隣の参加」については、3篇の学術論文を公刊し、2本の学会発表を行った。また、平成28年3月1日から9日にかけてオレゴン州ポートランド市を訪ね、同市の都市内分権の中核をなす95の「近隣のアソシエーションNeighborhood Association」と7の「地区連合District Coalition」のうち、2の近隣のアソシエーションと2の地区連合の活動を調査するとともに、アソシエーションの会員や役員ら関係者への聴き取り調査を行った。また、近隣のアソシエーションを支援するNPOでの聴き取り調査も行った。さらに、平成27年8月26日から29日にかけて、地域自治区制度が導入された長野県飯田市において、3の地域自治区の地域協議会、まちづくり委員会、ならびに自治振興センターの関係者に聴き取り調査を行った。飯田市では、同市の地域自治区制度の設計に大きな役割を果たした元市職員から、制度の意図や導入の過程に関する情報を得た。以上のように、ポートランドで現地調査を行い、同市の近隣のアソシエーションは、本研究課題の検討対象として最適であるとの確信を得た。また、国内研究対象として選択した飯田市の地域自治区の制度は、わが国の都市内分権の代表例といいうる新潟県上越市との比較対象として好適であるとの手応えを得た。交付申請書の「平成27年度の研究実施計画」においては、アメリカの都市内分権と市民協議機関についての先行研究レビューと論点の把握、ポートランド市での現地調査、さらに上越市の地域協議会の調査を行うことを計画としてあげた。この計画に照らして、同年度の研究の進捗は、ほぼ順調といいうる。アメリカの都市内分権と市民協議機関については、当該分野の定評ある文献や最新の研究成果を読みすすめ、わが国の都市内分権との比較研究上の論点の把握に努めてきた。また、ポートランド市での現地調査を当初の計画どおり行った。同市では、近隣のアソシエーションや地区連合で活動する市民を対象に複数の聴き取り調査を行い、市民が地域の公共交通や環境問題など公共のことがらにつき時間をかけて議論を行い、さらに市政府と協議していく過程の一端を観察することができた。上越市の地域協議会については、会議録の解読に努め、また市役所や市議会とのコンタクトを継続したものの、現地調査を実施することはできなかった。その一方で、上越市と同じく地域自治区の制度を導入した飯田市で現地調査を実施し、複数の地域自治区のまちづくり委員会や地域協議会をはじめとする関係者への聞き取り調査を行い、次年度以降の本格的な調査研究の先鞭をつけることができた。平成27年度の調査をつうじて、飯田市の地域協議会での市民の討議のあり方は上越市のそれとは随分と異なることが判明した。今後も飯田市での調査を継続すれば、わが国における熟議と代表制デモクラシーの関係を考察するための重要な知見を得ることができると思われる。その意味で、本研究の初年度に飯田市で現地調査を行ったことには、大きな意義がある。また、平成27年度から継続しているオレゴン州ポートランド市の近隣のアソシエーションの制度と運用実態を考察した研究報告を、コミュニティ政策学会第15回大会(平成28年7月2日・3日、江戸川大学)で行った。この研究報告に向けて、平成27年度の現地調査で収集した資料・文献と情報を精読し、近隣のアソシエーションのしくみと運用についての洞察を深めた。国内の都市内分権と熟議に関する研究として、平成27年度に引き続き長野県飯田市の地域自治区の研究を進めた。平成28年9月12日から14日にかけて現地調査を行い、市議会議員や地域自治区の制度設計に関わった市職員、現在制度の運用に関わる市職員らにインタビューを行い、同市の都市内分権と熟議のしくみ、運用の実態把握に努めた。また、平成28年12月26日と平成29年3月17日に、他の研究者らとともに飯田市の地域自治区に関する研究会を開催し、同市の都市内分権の特徴につき議論した。交付申請書の「平成28年度の研究実施計画」においては、アメリカの都市内分権制度の文献調査、ポートランド市の近隣アソシエーションの現地調査の遂行を目標としてあげている。このうち、都市内分権制度の文献の読解はかなり進捗し、代表制デモクラシーと熟議の緊張関係と補完関係、参加デモクラシーの意義について考察を深めることができた。これらの研究の成果として、アメリカの代表制デモクラシーと熟議に関する論点を提起する論文を執筆した。次に、ポートランド市の現地調査は実施できなかったものの、平成27年度の現地調査で収集した多くの資料の解読を進めた結果、平成29年度に実施を予定する現地調査で調べるべき論点が相当程度に明瞭となった。平成28年7月には学会報告も行っており、発表と質疑応答をつうじて、ポートランド市の近隣アソシエーションがもつ参加デモクラシー、熟議デモクラシーへの洞察を深め、その学術的意義の大きさを確信した。平成29年度の研究を進めるための強いモチベーションを得ることができた。

他方で、国内研究においては、当初予定していた上越市の調査はほとんど進展していないものの、飯田市の地域自治区の調査は進捗をみた。特に、飯田市での現地調査と2回にわたる学外研究者らとの共同研究会をつうじて、同市の地域自治区の制度運用、他市と比較しての特徴などを把握しつつある。飯田市の地域自治区のしくみと制度運用は、上越市のそれとは随分と異なるのであるが、今後も飯田市での調査を継続すれば、日本の地方自治体における代表制デモクラシーと熟議についての重要な知見を得ることができると思われる。平成29年度において、長野県飯田市の都市内分権と地域自治区の調査、ならびにアメリカ合衆国オレゴン州ポートランド市の近隣アソシエーションの調査と分析を行った。以下、詳細を記す。平成29年9月10日から13日にかけて、飯田市において、同市の都市内分権のしくみにかかわる複数のキーパーソンから、制度の導入経緯と現況につき聴き取り調査を行った。調査の焦点となったのは、地域自治区が導入されるに至る過程で、この仕組みを当事者たる市と住民がどのように受容したか、地域自治区の住民はいかにしてこの仕組みを地域の実情に合ったものへと微調整していったのかである。聴き取り調査の主な対象者は、地域自治区のセンターの職員(市職員)、地域自治区の導入に際して実務を担った元職員、地域自治区の住民である。他方、平成30年3月11日から16日にかけて、ポートランド市の4つの近隣アソシエーションと1つの区域連合を訪問し、近隣アソシエーションの理事会ならびに公開月例会議の傍聴、理事への聴き取り調査を実施した。4つのアソシエーションは、いずれも今次の調査で初めて接したものである。調査では、近隣アソシエーションで何がアジェンダとして議論されているか、どのような市民が参加しているか、議論されたことがらがいかに市政に反映されていくかに着目した。調査で得られた知見は、きわめて興味深いものであった。たとえば、大規模な再開発計画が浮上した近隣で、再開発に対する規制ルールのありかたがアソシエーションで取り上げられ、これに関心を抱く新しい参加者を獲得しつつ数年にわたって粘り強く熟議が続けられている状況をみることができた。なお、平成29年度においては、ポートランド市の近隣アソシエーションを題材に、都市内分権の仕組みをつうじての熟議のあり方を考察する論文を2篇公刊し、また学会報告を1本行った。研究期間中、3次にわたり飯田市(長野県)で地域自治区調査を行い、また2次にわたりポートランド市(米国オレゴン州)で「近隣の参加」制度の調査を行った。飯田市では、20の地域自治区の基礎的な資料を収集し、複数の当事者インタビューを行った。また、ポートランド市では「近隣の参加」の制度を管轄する近隣参加局でのインタビュー、6の近隣アソシエーションでの公開定例会の傍聴と当事者インタビュー、2の区域連合でのスタッフへのインタビューを行った。飯田市の地域自治区制度については研究成果は未発表であるが、ポートランド市の「近隣の参加」については、3篇の学術論文を公刊し、2本の学会発表を行った。平成28年においては、前年度に引き続き、ポートランド市で現地調査を行うことを計画している。
超微粒子等方高圧成形体のナノ多結晶体過程の個別要素法による解析

1、ナノ多結晶体生成条件に関する実験的検討(主にムライトを対象に) :粒子径10nm程度のアルミナおよびシリカ超微粒子の凝集構造をコロイド科学的手法で分散して混合し、ナノメーターオーダーまで均質な複合超微粒子を調整した。この超微粒子から、最大1GPaの等方超高圧成形法により最大相対密度80%の高密度成形体を得た。高密度成形体は従来より3百度以上低い1300°Cの焼結で緻密化する特異な焼結特性を示した。微構造はきわめて微細で、特に、13001450°Cの低温焼結条件では前年度行った、分子レベルまで均一化したムライト全駆体超微粒子よりも緻密化した。したがって、ナノ混合が、低温条件での焼結では特に有効であることが確認された。2、粒度分布を制御した球形シリカ微粒子による緻密化過程のモデル的検討:金属アルコキシドから合成した粒子径が異なる数種類のサブミクロン以下10nmまでの球形単分散シリカ微粒子を用いて、粒度分布を様々に変化させ、粒度分布が緻密化過程に及ぼす影響をモデル的に検討した。その結果、粒度分布の制御がサブミクロン以下の微粒子でも焼結体の緻密化などに有効であることを確認し、緻密化を支配する粒度制御方法の指針を作成できた。3、緻密化過程を再現する個別要素法プログラムの開発:一個一個の粒子の収縮、焼結過程を個別要素法で離散的にシミュレートできるプログラムの開発を行った。既に開発していた超微粒子の凝集シミュレーションにより作製した凝集体群を用い、充填、圧縮成形した一個一個の粒子の座標が求められる離散的な成形体の再現に成功した。焼結過程は、一個粒子間の物質移動機構を固相拡散を仮定し、個別要素法を用いて各粒子の収縮過程をシミュレーションできるプログラムを作成した。焼結の初期過程については再現が可能となり、焼結終期の緻密化過程を含めたシミュレーションへの拡張を試みている。実験結果との比較から、成形体内部の凝集による不均一構造が焼結特性や焼結体構造に及ぼす影響を焼結過程での成形体内の細孔径分布変化の細孔径分布変化などに着目して定量的解析を実施した。
歯の形成におけるRUNX2によるCTGF/CCN2発現調節機構の解析

鎖骨頭蓋異形成症の9歳女児および母親の末梢静脈から血液を採取後,DNAを抽出し,ダイレクトシークエンス法によりRUNX2の8つのexonの塩基配列を決定した.この塩基配列を対照の健常者およびGenBankの配列と比較してRUNX2遺伝子変異解析を行った結果,母子共にRUNX2遺伝子のexon8内,1205塩基目のシトシンが欠失し(c.1205delC),フレームシフト変異していたことを同定した.患児の臨床症状では,両側鎖骨低形成,大泉門閉鎖遅延,低身長,歯の萌出遅延,過剰埋伏歯などを認め,母親も同様の既往であった.我々が渉猟した範囲では,c.1205delC変異報告例を1例認めたが臨床症状の報告はなかった.そのため同変異による臨床症状の差異は検討できなかったが,本報告は鎖骨頭蓋異形成症の遺伝子型と表現型との比較検討に有用であると考えられた.また同患者より抜去した過剰埋伏歯および正常な対象者から便宜抜去した正常萌出小臼歯おけるRUNX2とCTGF/CCN2のタンパク質局在を明らかにし比較解析した.その結果正常萌出小臼歯ではRUNX2とCTGF/CCN2は象牙芽細胞および歯髄細胞に発現が認められた.一方で鎖骨頭蓋異形成症の埋伏過剰歯では, RUNX2は象牙芽細胞に,CTGF/CCN2は象牙芽細胞と象牙前室に発現が認められた.このように鎖骨頭蓋異形成症と正常対象者とを比較するとRUNX2とCTGF/CCN2のタンパク質局在に若干の変化が認められた.これらの結果とRUNX2の遺伝子変異による発現変化によってCCN2のタンパク質発現も変化するという過去の報告から,歯の形成においてCCN2はRUNX2の調節下で歯の形成を調節する因子として働いている可能性が示唆された.初年度に計画していた計画が,ほぼ予定通りに達成された.1)RUNX2によるCTGF/CCN2発現調節の証明とRUNX2と相互作用してCTGF/CCN2発現調節を行う新規因子の同定;CTGF/CCN2およびRUNX2の発現を確認済みのヒト骨芽細胞様細胞株Saos-2を使用して解析する.2)CTGF/CCN2発現調節を行うRUNX2タンパク質の機能領域の特定;CTGF/CCN2およびRUNX2の発現のないサル腎臓由来細胞Cos-7細胞株を使用して解析する.1推定されたRUNX2機能領域情報に基づき,RUNX2遺伝子の全長および機能領域と推定される部分の発現ベクターを作成し,Cos-7細胞にDNA transfectionして強制遺伝子発現させ,Cos-7細胞のendogenousなCTGF/CCN2遺伝子が反応してCTGF/CCN2発現が変化するか否かを確認する.21で機能が確認された領域の遺伝子配列の変異体を作成し,2)ー1と同様の解析を行ってRUNX2機能領域を特定する.鎖骨頭蓋異形成症の9歳女児および母親の末梢静脈から血液を採取後,DNAを抽出し,ダイレクトシークエンス法によりRUNX2の8つのexonの塩基配列を決定した.この塩基配列を対照の健常者およびGenBankの配列と比較してRUNX2遺伝子変異解析を行った結果,母子共にRUNX2遺伝子のexon8内,1205塩基目のシトシンが欠失し(c.1205delC),フレームシフト変異していたことを同定した.患児の臨床症状では,両側鎖骨低形成,大泉門閉鎖遅延,低身長,歯の萌出遅延,過剰埋伏歯などを認め,母親も同様の既往であった.我々が渉猟した範囲では,c.1205delC変異報告例を1例認めたが臨床症状の報告はなかった.そのため同変異による臨床症状の差異は検討できなかったが,本報告は鎖骨頭蓋異形成症の遺伝子型と表現型との比較検討に有用であると考えられた.また同患者より抜去した過剰埋伏歯および正常な対象者から便宜抜去した正常萌出小臼歯おけるRUNX2とCTGF/CCN2のタンパク質局在を明らかにし比較解析した.その結果正常萌出小臼歯ではRUNX2とCTGF/CCN2は象牙芽細胞および歯髄細胞に発現が認められた.一方で鎖骨頭蓋異形成症の埋伏過剰歯では, RUNX2は象牙芽細胞に,CTGF/CCN2は象牙芽細胞と象牙前室に発現が認められた.このように鎖骨頭蓋異形成症と正常対象者とを比較するとRUNX2とCTGF/CCN2のタンパク質局在に若干の変化が認められた.これらの結果とRUNX2の遺伝子変異による発現変化によってCCN2のタンパク質発現も変化するという過去の報告から,歯の形成においてCCN2はRUNX2の調節下で歯の形成を調節する因子として働いている可能性が示唆された.初年度に計画していた計画が,ほぼ予定通りに達成された.1)RUNX2によるCTGF/CCN2発現調節の証明とRUNX2と相互作用してCTGF/CCN2発現調節を行う新規因子の同定;CTGF/CCN2およびRUNX2の発現を確認済みのヒト骨芽細胞様細胞株Saos-2を使用して解析する.2)CTGF/CCN2発現調節を行うRUNX2タンパク質の機能領域の特定;CTGF/CCN2およびRUNX2の発現のないサル腎臓由来細胞Cos-7細胞株を使用して解析する.1推定されたRUNX