hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
液液接触架橋・溶解過程として捉えられる血液の凝固と線溶

1.組織因子との接触による血漿の凝固過程を調べた。接触面を起点として、血漿と凝固層(ゲル)の界面が移動するのが観察された。界面付近における濁度の空間分布はガウス分布の微分で近似でき、濁度の最大傾斜点は時間とともに、最初、1次、その後1/2次で移動することが分かった。このことは、凝固の律速過程が時間とともに変化することを示唆する。2.上記1について、有限サイズ系における界面移動描像を用いた考察により、エネルギー律速過程から拡散過程への変化であることが示唆された。また、それぞれの過程が、血液凝固カスケード内の増幅によって生成される過飽和物凝集体層のエネルギー律速の成長過程と活性化したチモーゲンの拡散過程によるものであることが示唆された。3.上記1の系に組織由来プラスミノゲンアクチベータ(tPA)が含まれているときの線溶過程を調べた。線溶過程は、ラグタイムの後、凝固物が生成された点から起き、時間に対して1/2次で移動することが分かった。したがって、線溶は血液の凝固物がトリガーとなって、拡散過程により起きることが示唆された。上記13の結果はこれまで明らかとなっている血液凝固線溶のメカニズムと矛盾なく、また、これらの過程における動的因子を特徴づけるパラメータを血液と組織因子との接触系における濁度の変化から抽出できることを示唆している。これらのパラメータは一般に行われている生化学的検査では得られない血液の状態を表す物理量であることから、血液の凝固能・線溶能を表す評価因子としてもとらえることができる。全体としては、当初研究計画のとおり進めていく予定である。やや遅れている血液循環系での実験結果は、既に実験系ができていることから平成29年度前半には終了する予定である。一方で、旅行者血栓症モデルでの実験が可能になったことから、応用面での計画を前倒しして倫理委員会審査で承認を経て、試料を動物血液からヒト血液に代えて実験する計画である。全体として、当初研究計画のとおり進めていく予定である。また、当初予定に加えて、ヒト血液を用いた実験データを蓄積し、統計解析を行う準備も進めている。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
東アフリカにおける類人猿の進化と人類起源の研究

人類学から見たアフリカ大陸は、類人猿の進化、人類の起源と進化の舞台としてことに重要視されるところであるが、それに対応する中新世中期・後期からの化石資料が極めて乏しい。そのため、この時代は「人類化石の大ギャップ期」と呼ばれている。そこで、私共の海外調査では、重要であるにもかかわらず未知の部分が多いこの時代に焦点を合わせ、発掘によるアプローチを長く続けている。12年度も当初の計画に従い、北ケニアのナチョラ地域およびサンブル・ヒルズにおいて発掘および地質学的調査を実施した。その成果は以下のとうりである。ナチョラ地域ではこれまでに多数の化石産地を発見しているが、今年度は新属、新種のナチョラピテクス・ケリオイの全身骨格と産出したBG-K化石産地に特に焦点を当てた。具体的な作業としては、追加化石の発見、および今後の全面発掘の遂行のために、化石包含層を被う溶岩とその風化土砂の除去作業を行った。その層はBG-K化石産出層のほとんどを被うように拡がり、南北の長さが約160メートル、東西の巾が約30メートル、厚みが平均で4メートル強に達っするものであった。大勢の発掘人夫を雇用して、除去した岩塊と土砂の量は1万トン以上に達した。この結果、来年度(13年度)からの大規模発への調査準備が完了した。なお、発見した化石資料は哺乳動物を含めて50点以上に達した。サンブル・ヒルズでの調査はナカポレテラド川水系とモロ・アベニョウ近辺での地質調査が中心であり、比較的短時間のうちに堆積したとする考えを踏まえて堆積層の形成過程について調査、分析を行った。今後の調査については、BG-K化石産地の広大な被覆層を予定通りに除去したので、次回からはこの化石産地の全面発掘を行い、ナチョラピテクス・ケリオイの群を一群ごと発見し、この化石種の社会構造をも明らかなものとしたい。近年、人類の由来が徐々に明らかにされつつあるが、500万年以前についてはまだ謎に包まれている。これは人類誕生に深く関わる中新世中・後期のアフリカ産ヒト上科霊長類の化石資料が極めて貧弱なためである。そこで、この時代に焦点を合わせた発掘調査が人類学の最大課題となっている。私共の調査は北ケニアのナチョラ地域かちサンブルヒルズにいたる堆積層の露頭(1500万年前から500万年前)を対象とした発掘、古生物学的、地質学的な総合調査である。発掘調査については、これまでにサンブルピテクス(約950万年前)、ケニヤピクスとニアンザピテクス(いずれも1500万年前)、加えてオナガザル科のヴィクトリアピテクス(1500万年前)を多数発見しているが、今年度もナチョラ地域およびサンブルヒルズでの発掘調査を行い、多数のケニアピテクス化石を発見した。なかでもナチョラ地域のBG-K化石産地からケニアピテクス幼児の上・下顎骨を含む頭骨と四肢骨の発見は画期的であり、現在クリーニング(マトリックスの除去作業)を行っているが、これが完了次第公表する予定である。さらに、サンブルヒルズのモロアベニョウ地域からも大量の哺乳類化石を発見しており、その分析は中新世後期の環境に関する私共知識を一段と充実させるものになると考えられる。地質調査では、年代測定用の岩石の採集に加え、堆積機序の解明に向けた新たな試みをはじめた。

発掘調査に加えて、化石標本の記載、分析を同時に行うために、ケニア国立博物館、フランス国立自然史博物館、大英博物館(自然史)、アンタナナリブ大学、西オーストラリア大学など広範囲の研究機関を訪問、滞在して比較資料や情報の収集に努めた。人類学から見たアフリカ大陸は、類人猿の進化、人類の起源と進化の舞台としてことに重要視されるところであるが、それに対応する中新世中期・後期からの化石資料が極めて乏しい。そのため、この時代は「人類化石の大ギャップ期」と呼ばれている。そこで、私共の海外調査では、重要であるが未知であるこの時代に焦点を合わせ、発掘によるアプローチを長く続けている。11年度も計画通りに北ケニアのナチョラ地域およびサンブル・ヒルズにおいて発掘調査を実施した。その成果は以下のとおりである。ナチョラ地域ではBG-K化石産地を集中的に行った。その結果、ナチョラピテクス(ケニアピテクス類の1属)について、5個体に属する化石を含む合計60点余の化石を発見した。そのうち一組は顎と四肢長骨からなる保存状態が良い骨格である。上の化石産地以外からもナチョラピテクス化石を発見した。主なものは、BG-D化石産地からの完全に近い口蓋骨と、BG-Z化石産地からの同一個体の完全な上・下顎骨である。これら一連の発見から、ナチョラピテクスの食性と体のプロポーションについての知見が飛躍的に増強されることになった。サンブル・ヒルズでの調査はナカポレテラド川水系とモロ・アベニョウ近辺を中心に行い、新たに多くの化石産地を発見し、多数の有蹄類や食肉目の化石を収集した。これらの資料から、古生物から見たサンブルピテクス(私共がこれまでに発見、命名した大型の中新世中期ヒト上科)の生息環境の分析が一段と進展することになる。上述の地域における調査をさらに長々期にわたり続行することは、ナチョラピテクスの形態、行動、社会、環境など、さらにサンブルピテクスの形態、行動、環境などの分析を進展させ、人類誕生へのプロセスについて、その解明に大きな貢献を果たすものと期待される。そこで、私共の海外調査では、重要であるにもかかわらず未知の部分が多いこの時代に焦点を合わせ、発掘によるアプローチを長く続けている。12年度も当初の計画に従い、北ケニアのナチョラ地域およびサンブル・ヒルズにおいて発掘および地質学的調査を実施した。その成果は以下のとうりである。ナチョラ地域ではこれまでに多数の化石産地を発見しているが、今年度は新属、新種のナチョラピテクス・ケリオイの全身骨格と産出したBG-K化石産地に特に焦点を当てた。具体的な作業としては、追加化石の発見、および今後の全面発掘の遂行のために、化石包含層を被う溶岩とその風化土砂の除去作業を行った。その層はBG-K化石産出層のほとんどを被うように拡がり、南北の長さが約160メートル、東西の巾が約30メートル、厚みが平均で4メートル強に達っするものであった。大勢の発掘人夫を雇用して、除去した岩塊と土砂の量は1万トン以上に達した。この結果、来年度(13年度)からの大規模発への調査準備が完了した。なお、発見した化石資料は哺乳動物を含めて50点以上に達した。サンブル・ヒルズでの調査はナカポレテラド川水系とモロ・アベニョウ
遺伝子の発現を制御する卵細胞質因子に関する分子性物学的研究

動物の発生において遺伝子の発現を制御する二つの大きな要因として、卵の細胞質中にあらかじめ準備された因子と、細胞間相互作用が考えられている。原索動物のホヤの卵は古くから典型的なモザイク卵の一つとして知られており、前者の卵細胞質因くにより遺伝子の発現制御機構を解析する上で格好の実験系と考えられる。そこでホヤ胚における筋肉細胞分化に的をしぼり、日本側は主として筋特異的遺伝子の解析を通して、米国側は主として細胞質因子の解析を通して、この問題にアプロ-チすることを試みた。1.筋肉細胞特異的遺伝子の解析:米国側ですでに単離していたシロボヤの筋肉アクチンcDNAをプロ-ブとしてマボヤ尾芽胚のcDNAライブラリ-をスクリ-ニングした結果、少くとも4種類の筋肉アクチンをコ-ドするcDNAクロ-ンが得られた。これら4種はそのタンパク質コ-ド領域の塩基配列は非常によく似かよっていたが、3'非コ-ド領域の塩基配列はお互いに異なっていた。そこでその中の一つHrcMA4の3'非コ-ド領域なるプロ-ブを作り、この遺伝子の発現をノザンブロット法、in situハイブリダイゼ-ション法により解析した結果、HrMA4遺伝子の転写は覆任期から分化しつつある筋肉細胞に限って起こることが明らかになった。次に、この特異的プロ-ブを使ってジェノミック・ライブラリ-をスクリ-ニングした結果HrMA4遺伝子を含む約20KbのDNA断片クロ-ンが得られた。この断片を調べてみるとHrMA4遺伝子を初めとして他に少くとも3つの筋肉アクチン遺伝子がクラスタ-を作って存在していることが明らかになった。またHrMA4遺伝子の解析から、この遺伝子は2つのイントロンによって分断されていること、イントロンの位置は無脊椎動物のアクチンや脊椎動物の細胞骨格型アクチンではなく脊椎動物の骨格筋型アクチンに類似すること、5'上流域にはTATAボックス、CArGボックスを初めとして、MyoD1などの筋分化調節因子が結合すると予想されているEーボックスが少くとも7個存在すること、などが明らかになった。さらにこのHrMA4遺伝子の5'上流域約1Kbに大腸菌のCAT遺伝子をつないだ人為的遺伝子を作り、それをマボヤの受精卵に顕微注入したところ、多くの例で尾芽胚の筋肉細胞に限ってその発現が認められた。このことは、この5'上流約1Kbの中に、この遺伝子の正確な空間的発現を制限するエレメントがそろっていることを示唆する。現在、さまざまな長さの5'上流域とCAT遺伝子との融合遺伝子を作製中であり、でき次第受精卵に注入して調べ、HrMA4遺伝子の発現制御に関わるシスエレメントを検索していく予定である。2.細胞質因子の解析:ホヤ胚の筋肉細胞分化に関わる因子は卵のマイオプラズムと呼ばれる細胞質部域に存在すると考えられている。日米両側それぞれ独自の研究で、この部域には少くとも10以上の特異的タンパク質が存在することが明らかになっていた。さらにこのマイオプラズムの構成成分を特異的に認識するモノクロ-ナル抗体が12個得られていた。日本側での役割はこの中の一つの抗原タンパク質のcDNAを得てその分子的実体を探ることであった。スクリ-ニングや解析などに2.3年を要したが、つい最近になってほぼ全塩基配列を決定した。他のタンパク質との類似性を検索したところ、細胞骨格系のタンパク質との類似性が認められた。マイオプラズムは特殊な細胞細格系を形成し、それが因子の正確な予定筋肉細胞の配分に役立っていると考えられているので、このタンパク質はそのような役割を担っているのかも知れない。一方、米国側は、オタマジャクシ幼生(したがって筋肉を作る)を発生させるホヤとオタマジャクシ幼生を発生させないホヤ(したがって筋肉を作らない)の卵細胞質を比較することによって、筋分化決定因子の分子的実体にせまろうと考えた。実際、両国の協力によりこの二種のホヤの卵のcDNAライブラリ-を作り、スクリ-ニングした結果、前者にのみ存在し後者に存在しないcDNAクロ-ンを3種類得た。現在それぞれの全塩基配列の決定を急いでいるが、これまで得られた結果ではその中の一つはその塩基配列中にロイシン・ジッパ-モチ-フを含むことが明らかになった。このように、遺伝子側および細胞質因子側の両方から研究は進んでおり、将来の研究の展開に期待をいだかせる。そこでその中の一つHrcMA4の3'非コ-ド領域なる

プロ-ブを作り、この遺伝子の発現をノザンブロット法、in situハイブリダイゼ-ション法により解析した結果、HrMA4遺伝子の転写は覆任期から分化しつつある筋肉細胞に限って起こることが明らかになった。次に、この特異的プロ-ブを使ってジェノミック・ライブラリ-をスクリ-ニングした結果HrMA4遺伝子を含む約20KbのDNA断片クロ-ンが得られた。この断片を調べてみるとHrMA4遺伝子を初めとして他に少くとも3つの筋肉アクチン遺伝子がクラスタ-を作って存在していることが明らかになった。またHrMA4遺伝子の解析から、この遺伝子は2つのイントロンによって分断されていること、イントロンの位置は無脊椎動物のアクチンや脊椎動物の細胞骨格型アクチンではなく脊椎動物の骨格筋型アクチンに類似すること、5'上流域にはTATAボックス、CArGボックスを初めとして、MyoD1などの筋分化調節因子が結合すると予想されているEーボックスが少くとも7個存在すること、などが明らかになった。さらにこのHrMA4遺伝子の5'上流域約1Kbに大腸菌のCAT遺伝子をつないだ人為的遺伝子を作り、それをマボヤの受精卵に顕微注入したところ、多くの例で尾芽胚の筋肉細胞に限ってその発現が認められた。このことは、この5'上流約1Kbの中に、この遺伝子の正確な空間的発現を制限するエレメントがそろっていることを示唆する。現在、さまざまな長さの5'上流域とCAT遺伝子との融合遺伝子を作製中であり、でき次第受精卵に注入して調べ、HrMA4遺伝子の発現制御に関わるシスエレメントを検索していく予定である。2.細胞質因子の解析:ホヤ胚の筋肉細胞分化に関わる因子は卵のマイオプラズムと呼ばれる細胞質部域に存在すると考えられている。日米両側それぞれ独自の研究で、この部域には少くとも10以上の特異的タンパク質が存在することが明らかになっていた。さらにこのマイオプラズムの構成成分を特異的に認識するモノクロ-ナル抗体が12個得られていた。日本側での役割はこの中の一つの抗原タンパク質のcDNAを得てその分子的実体を探ることであった。スクリ-ニングや解析などに2.3年を要したが、つい最近になってほぼ全塩基配列を決定した。他のタンパク質との類似性を検索したところ、細胞骨格系のタンパク質との類似性が認められた。マイオプラズムは特殊な細胞細格系を形成し、それが因子の正確な予定筋肉細胞の配分に役立っていると考えられているので、このタンパク質はそのような役割を担っているのかも知れない。一方、米国側は、オタマジャクシ幼生(したがって筋肉を作る)を発生させるホヤとオタマジャクシ幼生を発生させないホヤ(したがって筋肉を作らない)の卵細胞質を比較することによって、筋分化決定因子の分子的実体にせまろうと考えた。実際、両国の協力によりこの二種のホヤの卵のcDNAライブラリ-を作り、スクリ-ニングした結果、前者にのみ存在し後者に存在しないcDNAクロ-ンを3種類得た。現在それぞれの全塩基配列の決定を急いでいるが、これまで得られた結果ではその中の一つはその塩基配列中にロイシン・ジッパ-モチ-フを含むことが明らかになった。このように、遺伝子側および細胞質因子側の両方から研究は進んでおり、将来の研究の展開に期待をいだかせる。1.筋肉細胞特異的遺伝子の解析:マボヤ胚のcDNAライブラリ-から筋肉特異的ミオシン重鎖およびアクチンのcDNAクロ-ンを単離した。
骨シアロプロテインの機能についての研究

骨シアロプロテイン(BSP)の機能に関して次の知見を得た。1、BSP分子のI型コラーゲン(COL1)分子重合の促進効果に関してin vitroで、酸性のCOL1溶液の水素イオン濃度を中性に再調整し、37°Cに保持するとCOL1が重合して溶液が濁ってくる。この現象にBSPがどう影響するか、分光光度計で経時的に濁度の変化をモニターし解析した。その結果BSPはpH7.25あるいはpH7.67ではI型コラーゲンの重合に影響を及ぼさなかったが、pH6.55程度の弱酸性条件では10nM以下の低濃度でもI型コラーゲンの重合を有意に速めた。2、BSP-フィブロネクチン(FN)分子間相互作用が骨芽細胞様細胞株の細胞撞著に与える影響に関してプラスチックプレートを用いた骨芽細胞様細胞株(MC-3T3 E1 cell)の細胞接若能解析実験で、あらかじめBSPでcoatしたプラスチックの表面をさらにFNでcoatした場合は、BSPのみでcoatした場合と比較すると細胞接若率が有意に高かった。これはプラスチック表面のBSP分子にFN分子が結合したことで、BSPのみの局面より、骨芽細胞が接着しやすい局面になったことを示唆した。BSPが骨においてFNなどのECM蛋白をhydroxyapatite結晶に連結する留め金としての機能を有することを示唆した。3、BSP-卜ロンボスポンディン(TSP1)分子間相互作用BSPと親和性を有する血清中の物質をBSP固定化カラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーで検索した。その結果、BSPに結合する主要な血清蛋白は還元条件で175kDaの蛋白であった。この蛋白は抗ウシ-TSP1抗体陽性でTSP1と同定された。それ自体が骨芽細胞増殖作用を有し、またTGF-β1の活性化因子であるTSP1をBSPが骨基質に集積して骨代謝を調節している可能性を示唆した。骨において骨芽細胞から分泌されたI型コラーゲン分子は骨シアロプロテイン(BSP)などのコラーゲン分子と親和性を有する種々の骨非コラーゲン蛋白の存在下で重合し不溶性の線維を形成し、それらの骨非コラーゲン蛋白の作用により石灰化していくと考えられている。我々はBSPの機能の研究としてI型コラーゲン分子の重合過程へのBSP分子の影響を解析することとした。In vitroで酸性のI型コラーゲン溶液の水素イオン濃度を中性に再調整し、37°Cに保持するとコラーゲン分子が重合して溶液が濁ってくる。この現象にBSPがどのような影響を及ぼすかを、分光光度計を用いて経時的に濁度の変化をモニターして解析した。その結果ウシBSPはpH7.3あるいはpH7.7の燐酸緩衝液内でのウシI型コラーゲンの重合に影響を及ぼさなかったが、pH6.5程度の弱酸性条件では10nM以下の低激度でもI型コラーゲンの重合を有意に速め、しかもI型コラーゲンが完全に重合し終わった時点での濁度を上昇させた。対照のウシ血清アルブミンはいかなる水素イオン濃度でもI型コラーゲンの重合に影響を与えなかった。またコラーゲンに結合能を有するプロテオグリカンであるデコリンはpH7.3、pH7.7ではコラーゲンの重合に影響を与えなかったが、pH6.5では4nMの濃度でコラーゲンの重合を遅らせたが最終的な濁度は変化させなかった。吸光度走査、超遠心等による検索でBSPはpH6.5という弱酸性条件で可溶性であり、上記の結果はBSP分子とコラーゲン分子の相互作用によるものと考えられた。

今後、表面プラズモン共鳴を利用した解析装置によるBSPとI型コラーゲンの相互作用の解析、重合の結果生成したI型コラーゲン線維の電子顕微鏡による評価などを計画している。1、骨シアロプロテイン(BSP)-トロンボスポンディン分子間相互作用の発見BSPと生体の他の蛋白質との相互作用を解析しBSPの機能の解明を試みた。BSPは骨のみならず血清にも存在することから、他の血清蛋白と相互作用して機能することも考えられ、BSPと親和性を有する血清中の物質をBSP固定化アガロースゲルカラムを用いて検索した。実験においては血清フィブロネクチンはBSPと他の物質の相互作用を修飾する可能性があるので、ゼラチン固定化ゲルカラムであらかじめ血清フィブロネクチンを除去したウシ胎児血清を用いた。その結果、BSPに結合する主要な血清蛋白は170kDaの蛋白であった。非還元条件でこの蛋白は540kDaで、3量体オリゴマーであり、さらに抗ウシ-トロンボスポンディン抗体陽性で、トロンボスポンディンと同定された。トロンボスポンディンは血小板-血液凝固系に関連する蛋白であり、BSP-トロンボスポンディン分子間相互作用の存在は、BSPが血小板-血液凝固系に関連している可能性を示唆した。2、BSPとフィブロネクチンを固定化したプラスチック表面への骨芽細胞様細胞株の接着現象に関する知見プラスチックプレートを用いた骨芽細胞様細胞株の細胞接着能解析実験で、あらかじめBSPでcoatしたプラスチックの表面をさらにフィブロネクチンでcoatした場合、フィブロネクチンのみでcoatした場合あるいはBSPのみでcoatした場合と比較すると、細胞の接着率が有意に高い値を示した。このことはプラスチック表面上に存在していたBSP分子にフィブロネクチン分子が結合したことで、BSP単独あるいはフィブロネクチン単独でcoatした局面より、骨芽細胞が接着しやすい局面が形成されたことを示した。この結果は骨芽細胞の細胞接着にBSPとフィブロネクチンの分子間相互作用が関連する可能性を示唆した。
実機の状態での磁気特性考慮永久磁石モータの磁界解析法の開発とその実証的研究

応力印加時、温度変化時、回転磁界下の磁気特性の測定を行い、約50MPa以下では圧縮応力によって透磁率と鉄損が大きく変化することを明らかにした。また、約2T近くでの回転鉄損の振る舞いを解明できた。このような実機の状態での磁気特性を考慮して,永久磁石モータの鉄損を精度良く算定する有限要素解析手法を開発するとともに,実機に適用して実測値と解析値の比較を行った実機の状態での磁気特性を考慮して,永久磁石モータの鉄損を精度良く算定する有限要素解析手法を開発するとともに,実機に適用して実測値と解析値の比較を行うことにより,解析精度が向上していることを実証するために、以下の研究を行う。(1)応力印加時、温度変化時、回転磁界下の磁気特性の測定(2)実機の状態での磁気特性のモデリング手法の検討とシミュレーションによる検証(3)実機の状態での磁気特性考慮磁界解析システムの構築(4)実機モータの鉄損等の測定及び解析結果との比較検証応力印加時、温度変化時、回転磁界下の磁気特性の測定を行い、約50MPa以下では圧縮応力によって透磁率と鉄損が大きく変化することを明らかにした。このような実機の状態での磁気特性を考慮して,永久磁石モータの鉄損を精度良く算定する有限要素解析手法を開発するとともに,実機に適用して実測値と解析値の比較を行った応力印加時、回転磁界下の磁気特性を単板磁気試験器を用いて測定し,この上うな実機の状態での磁気特性を明らかにして,これを本研究者らが開発したモータ解析ソフトウェアに組み込むとともに,実機の解析を行って,鉄損推定精度が向上していることを確かめた。本年度の成果を要約すると,以下のようになる。1.計測システムの構築と測定精度の検討ディジタル方式の計測システムを構築し,システム全体における位相誤差などが測定精度に与える影響を検討した。2.応力印加時の磁気特性の測定モータ鉄心のプレス打ち抜き時やケースへの圧入時は主に鉄心に圧縮応力が印加されているので,けい素鋼板の試料に圧縮応力を印加して,B-H特性と交番磁界下での鉄損特性を測定し,100MPa程度の圧縮応力を印加すると鉄損が約10-20%増加することを示した。3.焼きばめ応力付加時の局所磁気特性劣化の測定実機モデルを用い,素材特性と焼きばめが施されている固定子のバックヨーク部の磁気特性を測定し,これらの測定結果を用いてモータの焼きばめが鉄損に与える影響について検討を行った4.回転磁界下の磁気特性の測定モータでは固定子鉄心に回転磁束が生じるので,モータの鉄損を正確に推定するには,回転磁束条件下での鉄損を精度良く測定しておく必要がある。本年度は我々が考案している高磁束密度下での二次元磁気特性を測定する装置の測定領域内の磁界分布の均一度を確かめるとともに,回転磁束条件下の鉄損の測定を行った。5.歪んだ楕円回転磁界印加時の鉄損推定法の検討前記(4)項で求めた回転磁界下での軸比別の鉄損測定値を用いて鉄損推定を行うため,歪んだ楕円回転磁界による鉄損Wを,磁束密度の基本波成分で作られる楕円回転磁界による鉄損W_0と,高調波成分による交番鉄損W_nの和で表されると仮定して推定を行うと,推定精度が改善されることを示した。本年度測定を行った磁気特性の温度特性と、昨年度測定を行った応力印加時及び回転磁界下の磁気特性の測定値を用いたシミュレーションシステムを構築するとともに、供試機を用いたモータの鉄損測定法の検討を行った。本年度の成果を要約すると、以下のようになる。1.温度が磁気特性に及ぼす影響の測定自動車用のモータなどでは150°C程度まで温度が上昇するので,この場合のモータ用の電磁鋼板の磁気特性を,焼鈍炉内に挿入したリング試料を用いて測定した。実機で使用される2Tまでの範囲で,B-H特性,鉄損特性を測定した。また、磁界解析に使えるように,ヒステリシス損と渦電流損への分離も行った。その結果、透磁率と鉄損が温度とともに減少することを明らかにした。2.応力印加時,回転磁界下,高温時の磁気特性の測定値を用いたシミュレーションシステムの構築圧縮応力と磁束密度を変化させた場合の磁気特性,長軸,短軸,高調波成分を変化させた場合の楕円回転磁界下の磁気特性,高温下での磁気特性を計算機に入力できる形にモデリング(データベースをもとにした補間)して,実際の機器の状態での解析が可能なシステムを構築した。3.モータの鉄損測定法の検討供試モータを無励磁状態で外部より駆動させた時のトルクTを求め,W=(2・N/60)×T(Nは回転数)により鉄損W(w)を求めた。機械損は,着磁していない永久磁石回転子をかわりに挿入したモータのトルクを測定して求めた。この場合の微小トルクの精度が問題なので,カップリング,モータとトルクメータの設置精度がどの程度損失の測定値に影響を及ぼすかの検討を行った。鉄損の測定結果を有限要素法を用いた解析結果と比較して、解析値と差が生ずる原因の検討を行った。

実機の状態での磁気特性を考慮して,永久磁石モータの鉄損を精度良く算定する有限要素解析手法を開発するとともに,実機に適用して実測値と解析値の比較を行うことにより,解析精度が向上していることを実証し,広くモータ産業,自動車産業,家電産業などで実用できる手法を開発することを目的として研究を行った。研究の成果を要約すると,以下のようになる(1)キャリア高調波を考慮したインバータ駆動時の永久磁石モータの解析と実験インバータ駆動時のキャリア周波数は数10KHzであり,このような高調波が含まれるモータの非線形解析をステップ・バイ・ステップ法を用いて実用的に計算を行う手法の検討を行った。(2)マイナーループ鉄損の推定法の検討磁束波形はティースの先端部などでかなりひずんでいる。これは多数の複雑なマイナーループが各部で生じていることを示している。そこで,マイナーループが存在する場合の鉄損を推定する方法を検討するための第一ステップとして,種々のマイナーループ条件下での鉄損の測定を行った。さらに,異常渦電流が無視できないので,これを考慮したヒステリシスのモデリング法の検討を行った。(3)積層鉄心のモデリング法の検討モータギャップ部のフリンジング磁束により誘起される渦電流による局部損失の正確な算定をするために,積層鋼板1枚毎を細かく有限要素に分割していては,解析は実用上不可能である。そこで,表面の数枚の鋼板のみを細かく分割し,それ以外の鋼板を導電率に異方性を有するバルクとして取り扱い,かつ透磁率を巧妙に制御することにより,実用的な解析が可能な手法を確立した。
英国絶対主義形成期における国際関係の研究

イギリス絶対主義国家の形成過程において,国際関係(対外的要因)は如何なる影響を及ぼしたか,この問題を明らかにする企画の下,絶対主義成立の前夜たる15世紀イギリスの対外関係を究明し,その中から,イギリス絶対主義国家の諸要因をみいだした。具体的には,ランカスター朝ヘンリー6世の外交政策と英仏百年戦争,二重王政の成立と解体,バラ戦争期における政権交代と外交的要因=ヨーク朝エドワード4世の外交政策と政権の動き,テューダー朝成立の国際的環境,を考察した。平成3年度は,ランカスター朝ヘンリー6世の外交政策と二重王政支配体制(治世摂政期における二重王政支配の実現と親政期での解体過程,その背景),平成4年度は,ヨーク朝エドワード4世(リチャード3世も含む)の外交政策とバラ戦争期の政権交代,西欧諸国の動き(親ブルゴーニュ策の功罪)について重点的に研究をすすめた。その結果,次の成果=結論を得た。Oヘンリー6世の二重王政政策は究極には失敗に終ったが,その後,イギリスはフランスと対策の王国の地位を確立出来た点,絶対主義国家成立への一歩を築いたことになる。それは,二重王政がイギリス国王をフランス国王の臣下としての位置なら脱皮させたからである。Oエドワード4世の外交政策は,西欧におけるフランス王国とブルゴーニュ公国の勢力均衡の上にフランス封じ込め策を行い,自らの絶対主義的統治体制を成功させたが,公国解体後、西欧においてフランス王国の勢力が増大し、彼(ヨーク朝)の外交の基盤が崩壊,チューダー朝絶対主義国民国家誕生の国際的環境がつくられたのだった。本研究は,筆者の従来研究(絶対主義国家の成立過程における国内的要因=バスタード・フューダリズムとバラ戦争の解明)から一歩前進して,絶対主義国家の成立過程に占める国際的=外交的要因を明らかにしたものに他ならない。本年度は、イギリス絶対主義国家の成立要因を培養したランカスタ-朝ホンリ-6世の外交政策の特質を考察した。更に、ヨ-ク朝エドウワ-ド4世治世前半期(1461ー70)の外交政策とランカスタ-朝1時復位を巡る大陸諸国の動向についてもあわせて検討した。しかし、とくに重要なのは、ヘンリ-6世の外交政策である故、この点に力を入れた。ヘンリ-6世の外交政策は、ヘンリ-5世の意図したランカスタ-朝二重王政Lancastrian Dual Monarhy二複合国家体制を推進したが、それを解体に導く結果となった。百年戦争の敗北・外交政策の失敗である。ランカスタ-朝二重王政の解体は、中世的封建国家形態を、同朝の崩壊は、大貴族支配体制を終らせ、絶対主義国身国家への道を開いた。ヘンリ-6世の外交政策は、かかる行特への接着材の役割をはたした。これら研究成果の主要点を要約すると次の通りである。Iヘンリ-6世の外交政策【○!A】摂政期ー142237年の外交ーランカスタ-朝二重王政の成立・維持・後退、対仏百年戦争の優位から劣勢の背景(政府・諮問会議内の対立)【○!B】親政期ー1437ー53年の外交ー対仏戦争敗北の過程と二重王政解体に導く英仏外交大陸における解体要因としてのブルブ-ユュの動向【○!C】混乱期ー145361年の外交ー対仏戦争終了以後の西欧外交・対仏関係の変化(ヘンリ-6世の親仏政策への転換)IIヨ-ク朝エドワ-ド4世治世前半期の外交政策とランカスタ-朝1時復位期の大陸諸国の姿勢ーエドワ-ド4世の親ブルゴ-ニュ策とウオリック伯の親仏策の対立

上記成果を挙げたが、この中とくに、基本となルヘンリ-6世治世摂政期の外交を中心に論を展開、この成果の1端が『鳴門教育大学研究記要』(7)の掲載した論文である。今年度は、バラ戦争期=エドワード4世(リチャード3世を含む)の外交政策=国際関係を検討してきた。当該時代は、イギリス絶対主義の先駆的形態の現れた時期=絶対主義の成立期に当り、3度の政権交代をもたらしたが、そのいずれもが、フランス王国とブルゴーニュ公国がかかわっていた。ランカスリー朝ヘンリー6世の一時復位の際は前者、ヨーク朝エドワード4世の政権再興には後者(エドワード4世が一時政権の座を追われたのも、治世前半期の親ブルゴーニュ策が最〓)が支援した。バラ戦争最後の政権交代は、ヨーク朝からテューダー朝への移行であったが、テューダー朝ヘンリー7世政権誕生に貢献したのはフランス王国であった。エドワード4世は治世後半、対仏包囲網(封じ込め)政策から対仏戦争、有利な和平協定締結(フランスから膨大な賠償金・年金を得る)を行い、国家財政を豊かにした。そのため、王権中心の統治体制をつくることが出来た。しかるに、彼の治世後半の外交政策は絶対主義的統治体制の実現に成功する一方、テューダー朝誕生の土壊をの譲成したのである。彼の外交政策は、フランス王国とブルゴーニュ公国の勢力均衝の上に立って成り立つものである故、公国が解体すると、フランスが強大化し、これまでの外交政策の施行が不可能になった。フランスはランカスター家と密であり、同系のテューダー家を支援するのである。かくして、バラ戦争期の政権交代には、王国、公国が関与、或面、影響力を発揮したが、後者の解体はヨーク朝外交政策の基軸の一角を崩し、同朝滅亡への道を開いたともええよう。ここに、バラ戦争期の国際関係は、イギリス絶対主義国家の成立過程に重要な位置を占めたと結論づけることが出来よう。
降雨による谷埋め盛土地盤の水分分布の変化予測手法の開発

地盤内の礫・空隙の混入率,および細粒部の乾燥密度が土の水分特性に及ぼす影響を明らかにするために,大型アクリル円筒を用いた不飽和浸透実験を行った.実験より,礫・空隙の混入が土の水分特性曲線の形状に及ぼす影響は小さく,細粒部の乾燥密度の影響は大きい事が明らかとなった.また,土に空隙を混入させた場合,土が不飽和のうちは水分の浸透速度が小さくなった事から,不飽和地盤に水が浸透する時には,水は空隙を通るのではなく,細粒部を通る事が明らかとなった.地盤内の礫・空隙の混入率,および細粒部の乾燥密度が土の水分特性に及ぼす影響を明らかにするために,大型アクリル円筒を用いた不飽和浸透実験を行った.実験より,礫・空隙の混入が土の水分特性曲線の形状に及ぼす影響は小さく,細粒部の乾燥密度の影響は大きい事が明らかとなった.また,土に空隙を混入させた場合,土が不飽和のうちは水分の浸透速度が小さくなった事から,不飽和地盤に水が浸透する時には,水は空隙を通るのではなく,細粒部を通る事が明らかとなった.平成21年度には,以下の2点に着目した研究を行った.1)土に含まれる礫分・空隙が土の水分特性に及ぼす影響について平成21年度は,大型アクリル円筒を用いて砂分以下の土,礫分混入の土に関する土の水分特性を計測した.実験では両者とも砂分以下の土の乾燥密度を一定とし,礫分混入による土の水分特性への影響を観察した.その結果,土の水分特性曲線の形状は砂分以下の土の乾燥密度にのみ依存し,礫分の混入には依らないこと,また砂分以下の土の乾燥密度が等しい場合,礫分の混入により透水速度が低下する事が明らかとなった.平成22年度には,礫分の代わりに空隙を混入した供試体を用いた試験を行い,土の中に多数の空隙が存在した場合の土中水の動きが礫分混入の土の場合とどのように異なるのかを観察する.これらの結果を整理する事によって,盛土地盤の飽和度分布に影響を及ぼす要因(土の密度,礫分混入率,空隙率など)とその寄与割合が明らかとなり,盛土地盤防災の発展に寄与できるものと考えている.(2)降雨による谷埋め盛土内の水分分布の経時変化を予測するための予備解析平成21年度は,(1)で実施した大型アクリル円筒を用いた土の水分特性試験を模擬した2次元不飽和浸透流解析を行い,不飽和浸透流解析コードが実際の室内試験における水分分布の経時変化を再現できるかを検討した.解析メッシュは横20cm,縦220cmの領域を2×2cmの正方形メッシュで1100個のメッシュで等分割したメッシュを用いた.礫分のメッシュの位置は乱数を発させて決定した.土質パラメータは(1)の大型アクリル円筒を用いた試験および室内試験から得られた値を用いた.解析の結果は,大型アクリル円筒を用いた試験の飽和度の経時変化をよく再現できており,今後の実地盤への適用にむけて期待が持てるものであった.本研究では,以下の2点に着目して研究を行った.(1)土に含まれる礫分・空隙が土の水分特性に及ぼす影響について大型アクリル円筒を用いて砂分以下の土,礫分,空隙を混入した土に関する土の水分特性を計測した.実験では砂分以下の土の乾燥密度を一定とし,礫分・空隙混入による土の水分特性への影響を観察した.その結果,土の水分特性曲線の形状は砂分以下の土の乾燥密度に大きな影響を受けるが,礫分・空隙の混入の影響は小さい事,また砂分以下の土の乾燥密度が等しい場合,礫分・空隙の混入により透水速度が低下する事が明らかとなった.この事より,不飽和地盤中を水が浸透するとき,水は砂分部分を主に通過し,礫分・空隙は浸透の障害となることが示された.(2)降雨による谷埋め盛土内の水分分布の経時変化を予測するための予備解析(1)で実施した大型アクリル円筒を用いた土の水分特性試験を模擬した2次元不飽和浸透流解析を行い,不飽和浸透流解析コードが実際の室内試験における水分分布の経時変化を再現できるかを検討した.解析メッシュは横20cm,縦220cmの領域を2×2cmの正方形メッシュで1100個のメッシュで等分割したメッシュを用いた.礫分・空隙のメッシュの位置は乱数を発生させて決定した.土質パラメータは(1)の大型アクリル円筒を用いた試験および室内試験から得られた値を用いた.解析の結果は,大型アクリル円筒を用いた試験の飽和度の経時変化を比較的良く再現できた.特に地盤内の空隙の浸透時のふるまいを再現できた成果は大きい.今後,不飽和地盤内の水分の経時変化予測を行うにあたって,大きな前進となるろう,
膿胸リンパ腫発生におけるEBV関連免疫応答不全の解析

3. EBNA2-6の発現が見られないEBV陽性鼻腔リンパ腫組織中のEBV genomeの同領域を検索したところ、全例typeAであり、10例中1例に変異を認めた。患者末梢血中のEBV genomeの同領域の検索でも全例typeAであり、ほぼ変異は認められず、末梢血中とリンパ腫組織中で塩基配列に違いを認めない場合がほとんどであった。PALの場合とは明らかに異なり、PALにおけるEBVの選択は、その抗原性の違いによる可能性が強く示唆された(manuscript submitted)。2)我々の樹立したPAL細胞株OPL-1におけるEBNA蛋白の発現を、慢性関節リウマチ患者血清を用いたWestern blot法で確認し、またEBNA4-specificなRT-PCR法にてEBNA4mRNAの発現を認めた。さらに上記PAL症例のうち新鮮凍結組織が保存されていた6例についてRT-PCR法にてEBNA4mRNAの発現を検討したところ、うち4例でその発現を確認した。さらにリンパ腫組織中のEBV genomeのEBNA4抗原決定基領域をdirect sequencingしたところ、type A genomeを有する4例中3例にCTL誘導を減弱させることが知られている変異を認めた。またtype B genomeを有する3例においてはprototype type Bと同一の塩基配列であったがprototype BそのもののCTL誘導能は弱いことが知られている。また、type Aで変異を認めなかった1例のHLA-A alleleはA11以外であり、これら7例についてはEBNA4抗原決定基に対するCTL誘導は低いレベルにあることが示唆された(manuscript submitted)。同様の変異は東南アジアでendemicなEBV strainにおいても報告されており、PALの発生が日本をはじめ東アジアに偏る理由として、こうしたEBV遺伝子の変異が示唆された。現在、こうした遺伝子変異のリンパ腫発生上での意義をより厳密に検討するため、EBNA2-6の発現が見られない他のEBV陽性腫瘍中のEBV genome、あるいはPALを発症していない膿胸患者咽頭うがい液中のEBV genomeの同領域を検索する準備を進めている。
骨代謝疾患治療のための糖鎖によるオートファジーを介した破骨細胞分化制御機構の解明

糖鎖β-glucanの1つcurdlanが、破骨細胞前駆細胞に特異的に発現しているパターン認識受容体dectin-1に作用して、破骨細胞分化や骨吸収活性を抑制することを見出した。さらに、その抑制メカニズムとして、非受容体型チロシンキナーゼであるspleentyrosine kinase (syk)のタンパク発現抑制が関与していることを証明した。興味深いことに、この負の制御は、遺伝子レベルの発現抑制を介さず、細胞質タンパクの代謝に中心的な役割を果たすオートファジーによるタンパク分解機構が関与することが示唆された。そこで今回、β-glucanとdectin-1との相互作用の結果、誘導されるオートファジーによる破骨細胞の分化抑制メカニズムの全容を明らかにすることを目的として詳細な解析を展開する。そこで得られた知見をもとに、未だ不明な点が多い自然免疫系による骨代謝制御機構を明らかにするとともに、破骨細胞に選択的な治療効果を示す創薬の開発を目指す。破骨細胞前駆細胞RAW264.7のdectn-1過剰発現株を樹立し、curdlanを添加して培養を行ったところ、dectin-1とともにsykタンパクの発現が著明に減少した。この減少は、bafilomycin A1の前処理により回復することから、curdlanによるdectin-1、sykタンパクの分解が、オートファジー・リソソーム系に依存している可能性が示唆された。このことは、curdlan添加により、オートリソソームの形成が亢進すること、そして、オートファゴソーム・オートリソソームのマーカーであるLC3-IIの形成が誘導されることからも支持された。さらに、オートファゴソームによるバルク分解系の誘導に、phoshatidylinositol 3-kinaseの活性化が関与している可能性が示唆された。申請書において2018年度は、「オートファジー誘導に関する分子機構の解明」を目的に、β-glucanで刺激した破骨細胞前駆細胞に対し、GFP標識LC3抗体を用いた蛍光染色法による細胞内動態の観察や、オートファジーの各進行過程に関連する制御分子の発現や活性化についてWestern blotting法、分子間相互作用について共免疫沈降法を用いて解析する研究計画を設定した。研究実績の概要にあるように計画通りの研究を遂行し、破骨細胞において、β-glucanとdectin-1の相互作用によるオートファジーの誘導を証明することができた。加えて、骨系細胞にはタンパクの品質を管理する機構が必要で、これに小胞体ストレス応答が使われる。この応答において、小胞体内に蓄積した異常タンパクを感知する3種の小胞体ストレスセンサー(PERK、IRE1、ATF6)が存在する。本申請研究において、申請者は、β-glucan刺激による破骨細胞前駆細胞におけるIRE1の発現増強も見出した。IRE1は、破骨細胞分化を制御することが報告されており、β-glucanによる破骨細胞分化抑制には、小胞体ストレス応答も関与していることが示唆された。破骨細胞は骨組織の約1%程度であるが、骨粗鬆症における骨量減少や、関節リウマチ、歯周病等の炎症性骨吸収の中心的役割を果たしており、これらを制御する技術が求められている。骨と免疫系は密接に関係しており、この相互作用にフォーカスした融合領域は「骨免疫学」として発展してきた。免疫系による骨代謝制御に関して、細胞質の大規模なタンパク分解システムであるオートファジーとともに小胞体ストレスの関与を証明したことは、骨免疫学研究の加速化・重層化・統合化に繋がると考える。細胞内の代謝システムの統合的な制御には、細胞内の輸送システムであるオートファジーと並び、細胞外物質を取り込み、リソソームに輸送するエンドサイトーシスが関わっている。我々は、sucroseによるクラスリン依存性、methyl-β-cyclodexitrinによるカベオラおよび脂質ラフト依存性エンドサイトーシスの阻害より、curdlanに誘導されるsykタンパクの分解が回復することを見出している。このことから、β-glucanによるオートファジーを介した分解系の誘導にエンドサイトーシスが関与していることが示唆された。そこで、β-glucan添加後の細胞における、クラスリン、カベオリンタンパクの発現と局在を蛍光顕微鏡視下に観察する。一方、小胞体ストレス応答において、IRE1は異常タンパクを感知すると立体構造が変化し、転写因子である活性型XBP1が産生される。IRE1-XBP1経路は、小胞体の恒常性に関わる一方、重度のストレスが負荷されると、IRE1は、Ask1、JNKを活性化してアポトーシスを誘導する。β-glucanによるIRE1発現増強の小胞体ストレス応答への関与について、XBP1、Ask1とJNKの活性化について解析する。関与が示唆された経路については、ノックダウン実験を行い、破骨細胞分化への影響を確認する。

そこで得られた知見をもとに、未だ不明な点が多い自然免疫系による骨代謝制御機構を明らかにするとともに、破骨細胞に選択的な治療効果を示す創薬の開発を目指す。破骨細胞前駆細胞RAW264.7のdectn-1過剰発現株を樹立し、curdlanを添加して培養を行ったところ、dectin-1とともにsykタンパクの発現が著明に減少した。この減少は、bafilomycin A1の前処理により回復することから、curdlanによるdectin-1、sykタンパクの分解が、オートファジー・リソソーム系に依存している可能性が示唆された。このことは、curdlan添加により、オートリソソームの形成が亢進すること、そして、オートファゴソーム・オートリソソームのマーカーであるLC3-IIの形成が誘導されることからも支持された。さらに、オートファゴソームによるバルク分解系の誘導に、phoshatidylinositol 3-kinaseの活性化が関与している可能性が示唆された。申請書において2018年度は、「オートファジー誘導に関する分子機構の解明」を目的に、β-glucanで刺激した破骨細胞前駆細胞に対し、GFP標識LC3抗体を用いた蛍光染色法による細胞内動態の観察や、オートファジーの各進行過程に関連する制御分子の発現や活性化についてWestern blotting法、分子間相互作用について共免疫沈降法を用いて解析する研究計画を設定した。研究実績の概要にあるように計画通りの研究を遂行し、破骨細胞において、β-glucanとdectin-1の相互作用によるオートファジーの誘導を証明することができた。加えて、骨系細胞にはタンパクの品質を管理する機構が必要で、これに小胞体ストレス応答が使われる。この応答において、小胞体内に蓄積した異常タンパクを感知する3種の小胞体ストレスセンサー(PERK、IRE1、ATF6)が存在する。本申請研究において、申請者は、β-glucan刺激による破骨細胞前駆細胞におけるIRE1の発現増強も見出した。IRE1は、破骨細胞分化を制御することが報告されており、β-glucanによる破骨細胞分化抑制には、小胞体ストレス応答も関与していることが示唆された。破骨細胞は骨組織の約1%程度であるが、骨粗鬆症における骨量減少や、関節リウマチ、歯周病等の炎症性骨吸収の中心的役割を果たしており、これらを制御する技術が求められている。骨と免疫系は密接に関係しており、この相互作用にフォーカスした融合領域は「骨免疫学」として発展してきた。免疫系による骨代謝制御に関して、細胞質の大規模なタンパク分解システムであるオートファジーとともに小胞体ストレスの関与を証明したことは、骨免疫学研究の加速化・重層化・統合化に繋がると考える。細胞内の代謝システムの統合的な制御には、細胞内の輸送システムであるオートファジーと並び、細胞外物質を取り込み、リソソームに輸送するエンドサイトーシスが関わっている。
哺乳類未受精卵における新規超低温保存法の開発

哺乳類生殖細胞の超低温保存は、効率的な遺伝資源の保存やヒト生殖補助医療への応用に重要である。未受精卵、特に成熟卵(排卵卵子)および未成熟卵(卵巣卵子)などハプロイドの細胞を保存することは、個体復元時に雄の遺伝的背景が選択できることから貴重な技術となりえる。本研究は、未受精卵の新規超低温保存法の開発を目的とし、ラット、マウスおよびブタ未受精卵について検討した。本研究により、ラット成熟卵およびマウス成熟卵・未成熟卵は卵丘細胞が付着した状態で、Ca無添加EG添加液を用いた新規超低温保存法により保存することで、体外受精後に受精能を有し、それぞれの未受精卵から作出された胚は産子への発生能を示した。ラット成熟卵において超低温保存した雌雄両配偶子における体外受精を介した個体復元は世界初であり、マウス成熟卵および未成熟卵においても本研究の成果により効率的な個体復元が可能となった。また、ブタ成熟卵においてもホスホジエステラーゼ阻害剤であるカフェインにより処理することで、ガラス化保存後に紡錘体が維持され、体外受精後の受精能が大幅に向上することが明らかとなった。さらに、AFPより安価な新規CPAであるCOOH-PLLは、マウス、ラットおよびブタ成熟卵および胚の効率的なガラス化保存法に用いることが可能であることが明らかとなった。本研究により開発された手法は、高価な設備や試薬を必要とせずにマウス、ラットおよびブタ未受精卵を超低温保存し、効率的に受精卵の作出または個体復元することが可能であり、本研究の成果は実験動物や家畜の遺伝資源の保存に特に有用であると考えられる。(抄録なし)本研究は哺乳類卵細胞質中に不凍タンパク質をマイクロインジェクションにより直接導入することで,高い耐凍性を有する超低温保存法の開発を目的としている.さらにこの超低温保存法を用い,保存が困難とされる未受精卵を用いた超低温保存の検討を行うことにより,保存した未受精卵から体外受精および胚移植を介した産子作出を試みる.平成24年度はマウスおよびブタ未受精卵における超低温保存を検討した.未受精卵は卵丘細胞を取り除いてから超低温保存することが一般的であり,保存後の受精能および胚発生能が低下する.そこで,卵丘細胞を除去することなく卵丘細胞卵子複合体の状態で超低温保存したところ,ICR・C57BL/6Jマウス未受精卵は高い生存性,受精能および産子への発生能を示すことを明らかにした.この方法により超低温保存したマウス未受精卵は,保存を行わない新鮮卵と比較し,同等の受精能および胚発生能を示した.ブタ未受精卵は細胞質内に存在する脂肪滴が要因となり低温に対する感受性が高く,保存後の生存性および受精能が著しく低下する.そのため,保存したブタ未受精卵からの産子作出の成功例はない.本研究では受精時に重要とされているイノシトール3リン酸受容体(IP_3R)と紡錘体に関する検討を行った.超低温保存したブタ未受精卵は新鮮卵と比較し,IP_3Rおよび紡錘体が大きく損傷していることが明らかとなり,これが受精を阻害する要因であることが示された.さらに,ガラス化保存ブタ未受精卵はカフェイン処理することにより紡錘体が維持され,受精能が改善されることを示した.哺乳類生殖細胞の超低温保存は、効率的な遺伝資源の保存やヒト生殖補助医療への応用に重要である。

本研究は哺乳類卵細胞質中に不凍タンパク質をマイクロインジェクションにより直接導入することで,高い耐凍性を有する超低温保存法の開発を目的としている.平成24年度は,マウスおよびブタ未受精卵における超低温保存を検討した.現在までの研究により,超低温保存したマウス未受精卵における体外受精後の個体への発生能は高い値を示し,既に実用可能なレベルに達していると考えられる.また,超低温保存したブタ未受精卵の受精率は以前までと比較し,大きく向上させることに成功した.現在までに,マウス,ラットおよびブタ未受精卵における超低温保存法を検討した.今後は実際に入手および作製した不凍タンパク質をマイクロインジェクションにより直接導入したマウス,ラットおよびブタ未受精卵における新規超低温保存法の開発を行う.さらに,超低温保存した未受精卵の体外受精・胚移植を行ない,産子の作出を試みる.(抄録なし)
カゼインホスホペプチドの免疫賦活機能の解明

筆者はまず,牛乳αs1-カゼインのトリプシン消化物を対象にリンパ球の増殖調節ペプチドの探索を行い、5979域に相当するホスホセリン集中域を念むペプチドがリンパ球の増殖を促進することや免疫グロブリンの生産を促進することを明らかにした。ホスホセリン集中域を有するカゼイン由来のペプチドは一般にカゼインホスホペプチド(CPP)と呼ばれており,CPPは牛乳β-カゼインからも調製できる。そこで筆者は,牛乳β-カゼインのトリプシン消化物からβ-カゼインの125域に相当するCPPを調製し,そのペプチドにも牛乳αs1-カゼインの5979域と同様の免疫促進活性があることを確認した。CPPはカルシウムの吸収促進を目的として市販されている。そこで筆者は,市販のCPP標品を購入し,その標品にも細胞培養系において牛乳αs1-カゼインの5979域やβ-カゼインの125域のCPPと同様の免疫促進活性があることを示した。また,市販CPP標品をマウスや仔豚の飼料に添加して与えると,それら動物の腸管の抗原特異的および総IgAレベルが有意に高くなり、妊娠豚に与えると分娩後の初乳中のIgAレベルとIgGレベルがCPP無添加の場合よりも高くなることを見出した。一方、各種合成ペプチドを用いることにより,CPPがマイトージェン活性,リンパ球増殖促進活性およびIgA生産促進活性を発現するためには,SerP-X-SerPという構造が必要であり,遊離のホスホセリンやSerP-SerPにはそれら免疫促進活性はないことを明らかにした。さらに、CPPはTh2細胞に作用して,インターロイキン-5やインターロイキン-6の生産を有意に高めることを観察した。「カゼインホスホペプチドの免疫賦活機能の解明」という課題のもとでの研究成果は、以下のように要約される。(1)牛乳αs1-カゼインのトリプシン消化物を対象に、免疫賦活ペプチドの検索を行い、ホスホセリン残基を4個含むαs1-カゼインの59-79域のペプチドを分離同定した。(2)分離ペプチドは、T及びBリンパ球の増殖を促進するとともに、それ自体もマイトージェン活性を有していた。また、分離ペプチドは免疫グロブリンの分泌を強く促進した。(3)分離ペプチドと共通した構造を持つ牛乳β-カゼインの1-25域のペプチドを調整し、脾臓リンパ球や腸管パイエル板リンパ球に対する作用を調べたところ、αs1-カゼインの59-79域のペプチドと同様の免疫促進活性があることが示された。(4)免疫賦活ペプチドとして同定した上述のペプチドはカゼインホスホペプチドである。カゼインホスホペプチドは従来からカルシウムの吸収促進を目的とした特定保健用食品素材として利用されている。そこで、市販のカゼインホスホペプチドについて、脾臓リンパ球や腸管パイエル板リンパ球に対する作用を調べたところ、分離ペプチドと同様の免疫促進活性があることが示された。(5)カゼインホスホペプチドに各種プロテーゼやホスファターゼを作用させ、作用後のペプチドの免疫賦活活性を調べたところ、免疫賦活のための活性中心とカルシウムの吸収促進のための活性中心は同一であることが示された。(6)カゼインホスホペプチドをマウスに経口投与することにより、腸管IgAの産生が顕著に高まることが示された。以上のように、カゼインホスホペプチドはインビトロとインビボの双方において免疫賦活活性を有するとともに、その活性発現にはりん酸残基が重要であることを明らかにした。「カゼインホスホペプチドの免疫賦活機能の解明」と題した申請課題のもとに、平成11年度行った研究の成果は以下のように要約される。