hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ウイロイド特異的スモールＲＮＡの品種・組織特異的生合成経路と病原性発現機構の解析

特異的small RNA生合成経路ー品種特性・組織特異性と病原性: 1PSTVdの強毒型と弱毒型間で可変領域と右末端領域に見られる3箇所(118、126、201番)の変異を相互交換した14種類の変異体をトマトに接種し、PSTVdの病原性領域と可変領域・右末端領域が病原性に果たす役割を分析した。変異は単独でも連鎖させても変異体は安定に複製増殖した。また、201番は自然界にない変異に変えても安定に複製し、自由に変化できる塩基であった。これら3塩基はどの組合せでも複製、増殖能に与える影響は小さく、PSTVdの病原性は病原性領域の性質に強く支配されていた。強毒型では弱毒型に比べて病原性領域から多量のPSTVd特異的small RNAが生成していたことから、この領域に由来するsmall RNAが病原性の強さに関与する可能性が示唆された。2PSTVdの201番の変異は移行への関与が示唆されるVirP1蛋白質と結合するRYモチーフ近傍に生じていた。RNAiでVirP1発現量を抑制した形質転換体トマトにPSTVdの強毒型、弱毒型、キメラ変異体を感染させても感染率に変化は見られなかったが、201番の塩基を改変しRYモチーフの2次構造を変化させると感染性が喪失した。II.ウイロイド標的RNAサイレンシングと病原性発現機構: 1RNAiでgibberellinβ-hydroxylase遺伝子発現を抑制したトマトを育成し、T1世代個体のsiRNA発現量を分析した結果、高濃度のgibberellinβ-hydroxylase遺伝子特異的siRNAが蓄積していた。III.ウイロイドを標的とするRNAサイレンシングとウイロイド抵抗性機構:1様々なPSTVd由来配列のヘアピンRNAを発現する形質転換N.benthamiana系統(T3)を選抜・育成した結果、最短で26塩基のPSTVd由来配列のヘアピンRNAを発現させることでPSTVd特異的small RNAを誘導させ、PSTVdの感染・増殖を阻害できることが明らかになった。26年度が最終年度であるため、記入しない。農学26年度が最終年度であるため、記入しない。ウイロイド特異的small RNAの病原性・品種・組織特異性に関する解析が予定より早く一年目で終了した。また、PSTVdの様々な配列に由来するhp-RNAを発現するタバコ(N.benthamiana)が順調に選抜でき、予定を上回るペースでそのウイロイド抵抗性検定試験が進展した。さらに、PSTVd強毒型と弱毒型のキメラウイロイド作出に成功し、次年度以降、キメラウイロイドを用いた実験系でウイロイドとRNAサイレンシングのより詳細な分析が可能になった。病原性が異なるウイロイド変異体を用いた実験から、ウイロイドの塩基配列と病原性の変化により、感染で誘導されるウイロイド特異的small RNAの発現パターンが変化することが明らかになり、当初予定した課題の一つが達成された。また、ウイロイド感染植物に蓄積するスモールRNAの詳細な分析から、ウイロイドの感染により特異的に発現量が低下するマイクロRNA種を特定できた点は、当初の期待を上回る成果である。
心筋梗塞合併高血圧症における動脈圧受容体反射機能の検討

ウィスター・キョ-トラットの心筋梗塞においてはウィスター・キョ-トラットのシャム群に比較して,慢性期(心筋梗塞作成4週後)における心拍数および腎交感神経活動に関する動脈圧受容体反射の感受性は減弱していた.高血圧自然発症ラットのシャム群ではウィスター・キョ-トラットのシャム群に比較して,動脈圧受容体反射の感受性は心拍数および腎交感神経活動の両者に関して減弱していた。高血圧自然発症ラットの心筋梗塞群では,心筋梗塞後4週後の慢性期において動脈圧受容体反射の感受性が高血圧シゼン発症ラットのシャム群に比較してさらに減頭していた。しかもこの動脈圧受容体反射の感受性の減弱は,心臓(心拍数)に関してのみならず,腎交換神経活動に関しても認められた.一方,ウィスター・キョ-トラットおよび高血圧自然発症ラットの心筋梗塞群に対してAngiotensinI変換酵素阻害薬のデラプリルの活性型(M-1)あるいはAngiotensinIIタイプ1受容体拮抗薬であるCV-11974の急性静脈内投与を施行したが、減弱した動脈圧受容体反射機能はあまり改善しなかった。以上の通り,心筋梗塞の合併は正常血圧動物においてのみならず高血圧動物においても動脈圧受容体反射の障害をもたらすことが示された.その結果,心筋梗塞を合併した高血圧症動物では,血圧変化に対する心拍数および交感神経活動の調節は極めて高度に障害されることが示された。
配列制御機構を利用した高粘弾性ポリマーの微生物生産

微生物産生ポリエステル(PHA)は、糖や脂質などの様々なバイオマスから合成可能であり、プラスチック材料として利用できる高分子である。加えて、海洋分解性を有する数少ないプラスチックの一つであり、近年の海洋のプラスチック汚染に対する関心の高まりを受けて、注目されている。PHAはすでに産業利用されている材料であるが、さらなる用途拡大のためには、物性の拡張が必要とされていた。ポリマー材料の構造と物性は、モノマーユニットの構造およびそれらが重合される際のモノマー配列によって大きく影響される。二種類のポリマーを貼り合わせた構造を有するブロック共重合体は、2つのポリマーの物性を併せ持つ有用な物性を示すことから、合成高分子分野で盛んに合成されている。一方、PHAをブロック化させることは困難であり、これまで成功例はなかった。研究代表者の研究グループでは、特殊なPHA合成系を構築することにより、ブロック配列を有するPHAの生合成に初めて成功した。本手法では、二種類以上のモノマー前駆体の混合物を組換え大腸菌の培地に添加してポリマー合成を行う。すると、大腸菌内で自発的にある特定の配列でポリマーが重合されブロック共重合体が合成される。本研究課題では、この特異なポリマー合成系に対し、合成機構の解明と材料生産への応用の2つの側面から取り組んだ。合成機構の解明では、モノマーが重合される速度を知るために、インビトロ系による酵素活性測定を実施した。研究代表者は、PHAの共重合の解析方法を初めて構築した。本手法を用いて、これまでに複数のポリマー合成系について酵素活性測定を行い、興味深い結果を得ることができた。加えて、ポリマーをフィルムに加工して、熱的・機械的性質の測定も行った。ブロック配列を有しない従来型のPHAとは異なる物性を示すことを確認できた。最も重要な目標としている材料開発の研究内容において、期待通りのポリマーフィルムが得られているため、概ね順調に進展していると言える。一方で、ポリマーの構造解析については、まだ技術的な課題が残っている。材料開発については、ポリマーの組成によって物性が変化するため、種々の組成のポリマーを合成し、構造・物性相関を明らかにする。加えて、高分子材料は、ポリマーの熱履歴によっても物性が変化する。これは、ブロック共重合体の相分離構造や、各相の結晶化などがある一定の温度域で促進されるためである。そのため、上記の組成だけでなく、熱処理条件も加えて、ポリマー物性に与える影響を評価する。ポリマー構造の解析については、NMRによる分析は精密且つ容易であるが、近接する分子同士の構造しか解析できない制限がある。そこで、より大局的な構造を解析することをこころみる。今年度まではポリマーの部分加水分解による構造解析を試みたが、明確な結果は得られていない。そこで、来年度はポリマー構造特異的に分解する手法の開発に取り組む。微生物産生ポリエステルは、天然では微生物が細胞内に貯蔵蓄積するポリマーである。本ポリエステル生合成系は、バイオマスを原料としてプラスチック材料を合成できる有用なシステムである。このシステムを用いると、ホモポリマーだけでなく、同一分子鎖内に複数のモノマーユニットを含む共重合体も合成可能である。その際、ポリマー鎖内のモノマー配列を制御できないのが欠点であったが、研究代表者のグループでは、モノマー配列を制御する合成方法を初めて見出した。本ポリマーは、2種類のモノマーユニットがそれぞれ単独で重合したホモポリマー構造を有する。このため、二種類のホモポリマーセグメントが同一分子鎖内にあるのか、2種類のホモポリマーの混合物であるのかの判断が鍵であった。研究代表者のグループでは、2つのホモポリマーの溶媒溶解性の違いを利用して、通常は溶媒分離可能な2つのポリマーが、本条件で合成したポリマーの場合分離できないことを示した。このことは、得られたポリマーがブロック共重合体であることを支持した。さらに、ブロック共重合体に特徴的なミクロ相分離構造を検出したことから、得られたポリマーがブロック共重合体であることを示した。次に、このような配列制御性がなぜ生じるのかを、ポリマー合成系酵素の酵素学的性質から推定した。その結果、今回使用した重合酵素は、片方のモノマーの重合速度がもう片方より圧倒的に速く、この速度の違いが配列を生じる原因の一つであることが見出された。配列制御性について、ポリマー構造の確認に加え、生合成機構も解明し、これらの結果を論文発表した。現在は、新規ポリマーの合成条件の探索を行っているが、この進捗状況も含めて、おおむね計画通りに進展している。

本手法では、二種類以上のモノマー前駆体の混合物を組換え大腸菌の培地に添加してポリマー合成を行う。すると、大腸菌内で自発的にある特定の配列でポリマーが重合されブロック共重合体が合成される。本研究課題では、この特異なポリマー合成系に対し、合成機構の解明と材料生産への応用の2つの側面から取り組んだ。合成機構の解明では、モノマーが重合される速度を知るために、インビトロ系による酵素活性測定を実施した。研究代表者は、PHAの共重合の解析方法を初めて構築した。本手法を用いて、これまでに複数のポリマー合成系について酵素活性測定を行い、興味深い結果を得ることができた。加えて、ポリマーをフィルムに加工して、熱的・機械的性質の測定も行った。ブロック配列を有しない従来型のPHAとは異なる物性を示すことを確認できた。最も重要な目標としている材料開発の研究内容において、期待通りのポリマーフィルムが得られているため、概ね順調に進展していると言える。一方で、ポリマーの構造解析については、まだ技術的な課題が残っている。微生物産生ポリエステルの物性は、構成するモノマーユニットの構造によって大きく変化する。既往の研究から、微生物産生ポリエステルのモノマーユニットのうち、中鎖モノマーと呼ばれる炭素数が612の3ーヒドロキシアルカン酸ユニットを含むポリマーは、柔軟な物性を有することが知られている。このことから、中鎖ユニットを含む配列制御型ポリマーが合成できれば、材料に柔軟性を付与できると期待される。そこで本年度は、中鎖モノマーの供給系を大腸菌に導入し、重合系とともに発現させることで、中鎖モノマーを含むポリエステルの合成条件を探索する。大腸菌株、モノマー供給酵素について、いくつかの条件を検討し、得られた菌体を分解して低分子量化させたのち、ガスクロマトグラフィーでモノマー成分を分析することにより、得られたポリマーの量とモノマー組成を測定する。ポリマーの蓄積が確認された条件が見つかった場合、培養体積を増やしてポリマー合成を行い、得られた菌体をクロロホルム抽出に供することにより、菌体内に蓄積されたポリマーを抽出する。その後、菌体成分を濾別することにより、純粋なポリマーとして単離する。得られたポリマーを核磁気共鳴測定装置により解析することにより、ポリマー中のモノマーユニットの配列構造を解析し、目的とする配列制御性が得られているか判断する。上記の実験により、中鎖ユニットを含み、何らかの配列制御性が認められるポリマーが得られた場合、ポリマーの合成量をさらに増大させ、ソルベントキャストフィルムを作成する。得られたフィルムの機械的性質を測定することで、ポリマーの構造と物性の相関関係を明らかにする。その結果に基づいて、より優れた物性を示すポリマーの分子設計を行う。材料開発については、ポリマーの組成によって物性が変化するため、種々の組成のポリマーを合成し、構造・物性相関を明らかにする。加えて、高分子材料は、ポリマーの熱履歴によっても物性が変化する。
"A Sweet and Calorie-free Bacillus!?": Production of L-glucose in B. subtilis

L-gluconate生産に用いるDniiolM, AhyiolN, lgnH遺伝子を、Pgrac100プロモーターの下流でプラスミド上から発現させたところ、各酵素の生産はWestern blottingで確認できるが、その量は非常に少ないものであった。そこで、各遺伝子の発現量を増大させるため、DniiolMを例としてプロモーターの検討を行った。その結果、枯草菌由来強力プロモーターのPrpsOを用いた方が発現量が高く、また野生型遺伝子と枯草菌コドン使用頻度に最適化した遺伝子では、後者の方が発現量が高くなることが明らかになった。今後は"PrpsO-コドン最適化遺伝子"の組み合わせで検討することとした。2,枯草菌宿主の改良iolG以降のinositol代謝遺伝子を欠損させた枯草菌に対して、inositol取り込みに関わるiolTを高発現させる株を作製した。決定したLgdAの立体構造を元に,活性中心残基(K106, D191, H195)及びいくつかの基質結合に関与する残基を同定した。3つの活性中心残基をいずれもAlaに置換した変異体は、酵素活性を失ったことから、これらの残基が酵素活性に重要であることが明らかになった。また基質結合に関与する残基のうち本酵素に特徴的なR178, H318を選択し、いずれもAlaに置換したところ、R178Aではscyllo-inositolに対してよりもL-glucoseに対するdehydrogenase活性が強くなることが明らかになった。またH318Aでは、scyllo-inositolに対するKm値が約1/100に低下することが見いだされた。当初計画では、DniiolM, AhyiolN, lgnHの3遺伝子を枯草菌内に同時導入し、L-gluconate生産の可否を検討する予定であったが、導入遺伝子の発現量が低いことが判明したため、より強発現を達成するためのプロモーターの検討に時間がかかってしまった。全体の研究計画には変更はないが、速やかに3種の遺伝子を導入した枯草菌の作成を達成し、少なくともL-gluconate生産が可能であるかどうかを検討したい。2. iolMNオルソログ・lgnHの枯草菌内での大量発現系の構築DniiolM, AhyiolN, lgnHの各遺伝子及びそれらのコドンを枯草菌に最適化した遺伝子(Bs)をpHT255にクローン化し、枯草菌内での発現を試みた。C末端に付加したStrep-tagを用いたWestern-blottingの結果、DniIolMはnativeな遺伝子を導入した場合に著量生産され、そのBs遺伝子からの生産量はやや減少していた。それに対してAhyIolNのnative遺伝子及びlgnHのBs遺伝子はかろうじて検出可能な程度の少量だけ生産されることが判明した。AhyiolN及びlgnHについては発現量の増大を図る必要があることが判明した。枯草菌宿主の改良については、myo-inositolを取り込みinososeへと変換するが、その後の代謝が起こらない変異株を作製したので、おおむね順調に進展している。iolMNオルソログ・lgnHの枯草菌での発現については、それぞれの遺伝子の発現は確認できたものの、iolN及び1gnHの発現量の増大を今後検討する必要があることが明らかになった。LgdAの結晶構造については、詳細な立体構造を明らかにすることに成功した。1.枯草菌宿主の改良前年度作製した、iolT及びiolG以外のinositol代謝酵素遺伝子を破壊した株に、さらに強力プロモーターPrpsOの制御下でiolGを発現するconstructをamyE領域に導入した株を作製した。この株はmyo-inositolを効率的にinososeへと変換することが可能であり、この株を今後のL-glucose生産の宿主とすることとした。2. L-gluconate醗酵生産系の確立昨年度の結果から、特にAhyiolN, lgnH(Bs)遺伝子の発現量が極めて低いことが明らかになったので、より強力なプロモーターを用いた発現系の構築が必要になった。そこで、pHT255のPgrac100プロモーターを枯草菌由来のPrpsOと置換することを試みたが、今までのところ成功していない。なお、pHT255-DniiolM及びpHT255-lgnHを導入した枯草菌抽出液中に、それぞれの酵素活性を検出することに成功し、少なくともこれら2つの酵素は活性を保持した形で枯草菌内で生産されることが明らかになった。これと並行して、pHT255-DniiolMを昨年度作製した枯草菌宿主に導入し、培地にmyo-inositolを添加して培養したところ、少量ながらdiketo-inositolが生産されることを確認した。このことから、培地中のmyo-inositolがinososeを経由してdiketo-inositolへと変換されることが明らかになった。3.酵素改変によるL-gluconate reductaseの創製昨年度の結晶構造解析の結果を踏まえて、LgdAとL-glucono-lactoneとの結合部位を同定した。その結果、R178を変異導入の候補とした。

当初は、L-gluconateへの変換に必要なDniiolM, AhyiolN及びlgnH遺伝子を同時に枯草菌宿主に導入し、myo-inositolからL-gluconateへの変換が可能かどうかまで検討する予定であったが、より高発現を図るためのプロモーターの検討を行うことを優先したため、この点についての検討を行うことができなかった。L-gluconate生産に用いるDniiolM, AhyiolN, lgnH遺伝子を、Pgrac100プロモーターの下流でプラスミド上から発現させたところ、各酵素の生産はWestern blottingで確認できるが、その量は非常に少ないものであった。そこで、各遺伝子の発現量を増大させるため、DniiolMを例としてプロモーターの検討を行った。その結果、枯草菌由来強力プロモーターのPrpsOを用いた方が発現量が高く、また野生型遺伝子と枯草菌コドン使用頻度に最適化した遺伝子では、後者の方が発現量が高くなることが明らかになった。今後は"PrpsO-コドン最適化遺伝子"の組み合わせで検討することとした。2,枯草菌宿主の改良iolG以降のinositol代謝遺伝子を欠損させた枯草菌に対して、inositol取り込みに関わるiolTを高発現させる株を作製した。決定したLgdAの立体構造を元に,活性中心残基(K106, D191, H195)及びいくつかの基質結合に関与する残基を同定した。3つの活性中心残基をいずれもAlaに置換した変異体は、酵素活性を失ったことから、これらの残基が酵素活性に重要であることが明らかになった。また基質結合に関与する残基のうち本酵素に特徴的なR178, H318を選択し、いずれもAlaに置換したところ、R178Aではscyllo-inositolに対してよりもL-glucoseに対するdehydrogenase活性が強くなることが明らかになった。またH318Aでは、scyllo-inositolに対するKm値が約1/100に低下することが見いだされた。当初計画では、DniiolM, AhyiolN, lgnHの3遺伝子を枯草菌内に同時導入し、L-gluconate生産の可否を検討する予定であったが、導入遺伝子の発現量が低いことが判明したため、より強発現を達成するためのプロモーターの検討に時間がかかってしまった。おおむね当初の研究計画通りに推進していくが、iolN及びlgnHの発現量の増大を図ることを重点的に行う必要がある。具体的には、枯草菌由来の強力プロモーターを利用して、その下流にこれらの遺伝子を接続し、発現量について検討を行っていく予定である。全体の研究計画には変更はないが、できるだけ速やかにプロモーターの検討を行い、3種の遺伝子を導入した枯草菌の作成を目指す。全体の研究計画には変更はないが、速やかに3種の遺伝子を導入した枯草菌の作成を達成し、少なくともL-gluconate生産が可能であるかどうかを検討したい。
接着分子、増殖因子発現による癌転移の予測診断

本研究は原発巣の腫瘍組織を材料にして、癌細胞表面の接着分子、増殖因子およびそのレセプター、さらに血管新生因子を検討し、転移の予測診断への応用を目的とするものである。肝癌の組織標本を用いてerb-Bファミリー分子の発現を免疫組織学的に検討したところ、erb-B (EGFレセプター)およびerb-B3の発現と癌の分化度、増殖能、転移との間に強い相関関係を認めたが、erb-B2、erb-B4は癌の悪性度と関連性を認めなかった。胃癌組織におけるCEA (癌胎児性膠原)の発現を免疫組織学的に検討し、CEAの染色パターンで分類したところ、強陽性例、特に間質まで漏出して染色されるパターンを示す例(間質型)で肝転移をおこす頻度が高い結果を得た。本来は膜結合型であるCEAを切断する酵素が見出され、悪性度との関係が今後、興味深いと考えられる。胃癌組織標本でangiopoietin-2の発現を免疫組織学的に検討したところ、その発現はCD31陽性で示される血管密度と相関し、予後にも強い影響を及ぼしていた。
急速冷却による心筋小胞体Ca放出チャンネル開口機序と生理学的意義

心筋の収縮は筋小胞体から放出されるCaイオンによって誘起される。生理的な筋小胞体からのCa放出には、細胞外からCa電流として流入するCaイオン自身によりCa放出が誘起されるCa誘発性Ca遊離機構が働いているものと考えられている。他方、溶液の温度を急速に低下させると筋小胞体からCaイオンが放出される。この急冷によるCa放出機序を、フェレットの心室筋にCa感受性発光蛋白エクオリンを適用して調べた。溶液の温度を急速に30度Cから4度Cにまで低下させると、活動電位を伴わないで一過性に細胞内Caイオン濃度が増加減少した。急冷誘発Ca遊離は細胞外液のKイオン濃度を変化させて膜電位を変えても影響されなかった。急冷誘発Ca放出はリアノジン処理筋では観察されないので、温度変化が直接筋小胞体からCaを放出するものと考えられた。急冷により放出されるCa量は急冷直前の細胞内Ca濃度には影響されなかった。また、外液NaをLiやTMAで置換すると急冷誘発Ca放出は抑制されたが、その直後に作用させた高濃度カフェインによるCa放出量は増加した。これらの結果は、急冷誘発Ca放出機構はカフェイン誘発Ca放出機構とは異なることを示唆している。急冷により増加したCa減衰過程の時間経過は、Na-Ca交換機構および、筋小胞体のCa取り込み機構を抑制すると僅かに延長し、ミトコンドリアのCa取り込みを抑制すると著しく遅延した。これらの結果から、急冷中に増加したCaはミトコンドリアにも相当量取り込まれることが推測された。これまでにフェレット右室より摘出した乳頭筋表層細胞内にエクオリンを注入して、急速冷却時の細胞内Ca濃度を測定した。頻回刺激のあとに液温を30゚Cに急速に低下させると、細胞内Ca濃度は一過性に変化した。細胞内Ca濃度は約1MMに達した。急冷による細胞Ca濃度は温度変化が大きいほど大きな値を示した。リアノジンであらかじめ処理しておくと、急冷によるCa濃度変化はみられなくなった。また、急冷により細胞内Ca濃度が増加・減少した後、カフェインを投与するとCa濃度の増加がみられた。このカフェインによるCa濃度増加は、急冷によるCa濃度増加が少ないと大きくなり、逆に急冷によるCa濃度増加が多いと少なくなった。これらの結果は、急速冷却は筋小胞体からCaイオンを放出させることを示唆している。急速冷却によるCa放出は溶液のKイオン濃度変化の影響を受けなかった。また、急冷直前のCa濃度レベルには関係なくCa放出がみられた。これらの結果は、急冷誘発Ca放出は、Ca誘発性Ca遊離機構とは異なることを示唆している。更に、溶液中のNaclをLiclと置換したりTMAclと置換すると、急冷誘発Ca放出は次第に減衰した。しかし、カフェインでは十分なCaが放出された。この結果は、急冷によるCa放出には細胞内Naイオンが必要であることを示唆している。急冷により細胞内に増加したCaイオンは細胞質から除去される。この除去過程は、筋小胞体のCaポンプを撰択的に抑制するタプシガルギンの影響を受けず、ルテニウムレッドにより著しく延長することがわかった。従って急冷により放出されたCaイオンは主にミトコンドリアにより取り込まれるか、またはNa-Ca交換系により処理されることが考えられる。低温下では筋小胞体によるCa取り込みは主なCa処理機構ではないと考えられた急速冷却によるCaイオン遊離機構と、細胞内に増加したCaイオンの除去機構を、エクオリン法を用いて調べた。エクオリンの光信号を細胞内Caイオン濃度に変換するために、種々の温度でCaイオン濃度とエクオリンの発光との関係を測定して、較正曲線をもとめた。溶液の温度を30°Cから、24、18、12、7、4°Cの各温度に低下させ、その時の細胞内Caイオン濃度を測定した。

急速冷却時の温度が低くなるに従い、Ca信号の立ち上がりは遅くなった。また、Ca信号の減衰時間が延長した。急速冷却により放出されるCaイオン濃度は、冷却温度が低くなるに従い高くなった。これらの結果は、心筋筋小胞体のCa放出チャネルの開口は、急速冷却時の温度差に依存することを示唆している。低温下におけるCa除去機構を調べるために、各Ca除去機構に対する阻害剤を用いて抑制し、低温下における細胞内Ca除去機構を調べた。(1)Na-Ca交換機構を抑制するNiや無Na溶液中では、Caの減衰時間は軽度に延長した。(2)筋小胞体のCa取り込みを抑制するタプシガルギン存在下ではCaの減衰時間はほとんど延長しなかった。しかし、タプシガルギンと同様な作用を持つTBQ存在下では、軽度な減衰時間の延長が認められた。(3)ミトコンドリアのCa取り込みを抑制するルテニウムレッドは著しく減衰時間を延長させた。これらの結果は、低温下ではCaはミトコンドリアに取り込まれると同時に、一部はNa-Ca交換系と小胞体によっても処理されることを示唆している。
尿意の発生に関与する機械刺激受容チャネルASICの包括的機能解析

尿意切迫感を伴う病態として、過活動膀胱(overactive bladder; OAB)の概念が知られており、その患者数は800万人とも言われている。高齢化が加速する近年、下部尿路症状を呈する患者は更に増加することが予想され、対策の重要性が叫ばれている。近年、抗コリン薬に加えてβ3刺激薬が臨床応用されるなど治療法が多様化しているが、全ての人の愁訴を取り除くには至っていない。切迫性の尿意は、排尿筋過活動による急な膀胱の収縮の結果と、膀胱の知覚そのものの過敏に分類できる。しかし、現在OABに対して臨床応用されている薬物は、いずれも遠心性神経/排尿筋接合部が主たる治療標的である。このため、まずは尿意発生の根本のメカニズムを理解し、それに基づいた治療戦略が必要であると考える。私たちはこれまでに機械刺激受容体候補遺伝子であるASIC(Acid Sensing Ion Channel)ファミリーを中心に解析を行ってきた。しかし、ASICファミリーはヘテロ複合体を形成していることが報告されており、サブユニット単体だけを欠損させたノックアウトマウスでは機能解析に限界があった。私たちは今回、膀胱に発現しているASICサブタイプ(ASIC1/2/3/4)の全てをノックアウトしたクワドラプル(4重)ノックアウトマウスおよびCRISPR/Cas9システムを利用したタグペプチド-ASIC融合蛋白質のノックインマウスを作出することで、膀胱機能、特に伸展刺激受容におけるASICファミリーの役割を解明することを目的として解析を行う。本研究では、酸感受性イオンチャネル(ASIC)遺伝子ファミリーのサブユニットがマウスの膀胱で機械刺激受容機能に関与している可能性を包括的に探るため、遺伝子改変動物を用いた形態学的、機能的解析を計画している。これまでに当教室で作出し管理しているASIC1、ASIC3、ASIC4ノックアウトマウスを交配し、現在までにトリプルノックアウトマウスを得た。現在、ASIC2ノックアウトマウスの入手について手続きを進めている段階であり、入手後に交配を開始する予定である。これまでに、ASIC4の局在を明らかにするためにASIC4-βガラクトシダーゼレポーターマウスを用いて膀胱におけるASIC4の局在を検討したところ、膀胱筋層にASIC4陽性細胞が散在することが確認された。また、CRISPR/Cas9システムを用いてASIC4-タグペプチド融合タンパクノックインマウスの作出を試み、現在までにホモマウスを得ている。得られた個体の脳組織をpositive controlとして抗タグ抗体を用いたwestern blottingを行った結果、野生型マウスとノックインマウスの間に予想される高さに明確な差をもつバンドが1本得られた。このことから、作製したタグペプチド融合ASIC4は予測の通りに機能していると考えられた。膀胱組織およびポジティブコントロールとして脳組織を用いて免疫組織化学染色を行った結果、脳組織にて比較的明瞭な染色像が得られたが、膀胱においては現在までに明瞭なシグナルが得られず、今後の検討課題である。前年度までに作出したタグペプチド融合ASIC4ノックインマウスの解析を更に進め、膀胱筋層におけるASIC4の詳細な分布を明らかにする事で機能解析の足がかりとすることを目標とする。同時にc-kitなど腸管の筋層間神経叢に見られる分子との2重染色を試みる。また、ASIC4について、アフリカツメガエルの卵母細胞を用いた発現系を使った2電極膜電位固定法による電気生理学的解析を行ったところ、浸透圧変化が電流に影響をあたえる可能性が示唆された。これはASICファミリーが物理的な刺激に応答する可能性を示唆するものであり、今後さらなる解析を行っていく予定である。現在までのところASIC4-LacZレポーターマウスおよびASIC4-タグペプチドノックインマウスのいずれも尿路上皮における陽性シグナルは得られていない。しかし、核酸レベルでは尿路上皮にAISCファミリーが発現しているとする報告が見られる。尿路上皮におけるASIC発現の有無は炎症における低pHによる上皮の動態にとって重要であると考えられることから、電気生理学的解析により尿路上皮におけるASICの発現を傍証するため、パッチクランプのシステムを現在構築中である。さらに、ASIC2ノックアウトマウスの当大学動物施設への搬入についての計画を推進する予定である。尿意切迫感を伴う病態として、過活動膀胱(overactive bladder; OAB)の概念が広く認知されるようになった。高齢化が加速する近年、下部尿路症状を呈する患者は更に増加することが予想される。また、頻尿や尿意切迫感はQOLや社会的活動度を著しく低下させるため、健康長寿に向けてOABへの対策の重要性が叫ばれている。近年、抗コリン薬に加えてβ3刺激約が臨床応用されるなど治療法が多様化しているが、全ての人の愁訴を取り除くには至っていない。切迫性の尿意は、排尿筋過活動(deatrusor overactivity)による急な膀胱の収縮の結果と、膀胱の知覚そのものの過敏とに理屈の上で分類できる。このため、尿意発生の根本の理解と、膀胱の求心性神経を治療標的とした薬剤の開発が求められている。これまでにも、TRPV4やPiezo1/Piezo2など複数の機械刺激受容体候補が膀胱で研究されてきた。しかし、尿意の発生をつかさどる分子は未確定というのが一般的な見解である。私たちはこれまで機械刺激受容体候補遺伝子であるASIC(Acid Sensing Ion Channel)

ファミリーを中心に解析を行ってきた。しかし、ASICファミリーはヘテロ複合体を形成しており、サブユニット単体のノックアウトマウスでは機能解析が困難であった。私たちは今回、膀胱に発現しているASICサブタイプ(ASIC1/2/3/4)の全てをノックアウトしたクワドラプル(4重)ノックアウトマウスおよび各種ノックインマウスを作製することで、膀胱機能、特に伸展刺激受容におけるASICファミリーの役割を解明することを目的とする。本研究では、酸感受性イオンチャネル(ASIC)遺伝子ファミリーのサブユニットがマウスの膀胱で機械刺激受容機能に関与している可能性を包括的に探るため、遺伝子改変動物を用いた形態学的、機能的解析を計画している。これまでに当教室で作出し管理しているASIC1、ASIC3、ASIC4ノックアウトマウスを交配し、現在までにトリプルノックアウトマウスを得た。現在、ASIC2ノックアウトマウスの入手について手続きを進めている段階であり、入手後に交配を開始する予定である。これまでに、ASIC4の局在を明らかにするためにASIC4-βガラクトシダーゼレポーターマウスを用いて膀胱におけるASIC4の局在を検討したところ、膀胱筋層にASIC4陽性細胞が散在することが確認された。βガラクトシダーゼによるレポーター系では、陽性細胞の検出は可能であるが細胞内局在についての情報を得ることはできない。そこで、免疫組織化学染色法によるASIC4の細胞内局在の検討を試みた。様々な市販の抗体を購入し、ウエスタンブロットによる特異度の検討、染色時における各種の条件の検討を行ったが、ASIC4を検出するために高感度、高特異度の抗体を市販抗体の中に見いだすことはできなかった。このため、後述のようにASIC4-標識分子融合ノックインマウスを作出する必要があると考えられ、この作出のためのベクター作製に時間を要し、全体の進捗はやや遅れていると考えられた。尿意切迫感を伴う病態として、過活動膀胱(overactive bladder; OAB)の概念が広く認知されるようになった。高齢化が加速する近年、下部尿路症状を呈する患者は更に増加することが予想される。また、頻尿や尿意切迫感はQOLや社会的活動度を著しく低下させるため、健康長寿に向けてOABへの対策の重要性が叫ばれている。近年、抗コリン薬に加えてβ3刺激約が臨床応用されるなど治療法が多様化しているが、全ての人の愁訴を取り除くには至っていない。切迫性の尿意は、排尿筋過活動(detrusor overactivity)による急な膀胱の収縮の結果と、膀胱の知覚そのものの過敏とに理屈の上で分類できる。しかし、現在OABに対して臨床応用されている薬物は、いずれも遠心性神経/排尿筋接合部が主たる治療標的である。このため、まずは尿意発生の根本のメカニズムを理解し、それに基づいた治療戦略が必要であると考える。
大人による育児語使用と子どもの言語発達

小さな子ども(特に乳児)に話しかけるとき,声は高くなり,抑揚も大げさになるなど,独特な話し方になりがちである(対乳児発話Infant-Directed Speech)。これに加えて,日本語では,犬のことをワンワンと呼ぶなど,子どもに話しかけるための独特な語彙(育児語)の使用が見られる。本研究課題においては,大人が子どもに対して使用する育児語は,子どもの月齢が進むにつれてどのように変化していくのか(変化しないのか),また,それと子どもの言語発達とのあいだには何らかの関係が見られるのか,について調べるため,1横断調査(6か月から18か月の子どもを持つ養育者対象),2短期縦断調査(子どもが18か月,24か月の,2時点での縦断調査),3長期縦断調査(子どもがゼロ歳台のときから24か月に至るまでの期間にわたる縦断調査)を実施してきた。1のデータ収集は既に,前年度に終了していたが,本年度は2短期縦断調査,3長期縦断調査についてもデータの収集を終了することができた。データを分析した結果,1より,母親の育児語使用は,子どもが6か月の時から1歳過ぎにかけて増加し,そのあと24か月までに減少するという発達経過を示すこと,2より,子どもが18か月と24か月時点での母親の育児語使用には関連があるものの,24か月時点での育児語使用と同時点の子どもの語彙とのあいだに明瞭な関連は見られず。18か月時点での母親の育児語使用と24か月時点での子の産出語彙にポジティブな関連が見られること,3より,母親が子どもの発達に応じて育児語の使用量を大きく増減させている場合ほど,その子どもの24か月時点での産出語彙は多くなっていること,が明らかになった。子ども(特に乳児)に話しかけるときの話し方は,声が高くなり,抑揚が大げさになるなど,独特なものになりがちであることが知られている(対乳児発話)。このような特徴に加えて,日本語では乳児に,犬のことをワンワンと呼ぶというように、大人どうし,あるいは,より年長の子どもに対しては決して使わない特別な語彙(育児語)を使って話しかけるといったことも見られる。育児語は、音の繰り返しや特殊音節の使用など独特の音韻形式を持ち、乳児の単語聴取を助けるとの指摘がある一方、大人は使わない語彙を発達の過程でいったん子どもに覚えさせることは無駄だとの声もある。本研究では、1子どもの発達にともない大人の育児語使用はどのように変化するのか、2育児語の使用は子どもの言語発達のどの段階にどのような影響を及ぼしているのか、を明らかにし、上の論争に対し、エビデンスに基づく答えを呈示することをめざしている。H28年度は,1について明らかにするために,6, 9, 12, 15, 18か月のこどもを持つ養育者を対象として、育児語使用の横断調査を実施し,子どもの月齢と育児語使用の関係について検討してきた。この横断調査の途中の経過については,H29年3月の発達心理学会で発表した。さらに,横断調査で見出された発達的変化が,縦断調査でも確認されるか,また,育児語使用の月齢変化が子どもの語彙発達とどのような関連があるか,検討するために,横断調査に参加した養育者から,定期的に継続して育児語使用状況や子どもの語彙発達などについてデータを収集している。当初,予定していたとおりのペースで,横断調査,縦断調査を進めることができている。大人が小さな子ども(特に乳児)に話しかける時には,声は高く,抑揚も大げさに,というように,独特な話し方(対乳児発話Infant-Directed Speech)になることが知られている。これに加えて,日本語では,犬のことをワンワンと呼ぶなど,子どもに話しかけるための独特な語彙(育児語)が用いられたりする。

本研究課題においては,大人が子どもに話しかける言葉(育児語を含む)は子どもの月齢が進むにつれてどのように変化していくのか(変化しないのか),また,それと子どもの言語発達とのあいだには何らかの関係が見られるのか,について調べるため,昨年度から引き続き,1横断調査(6か月から18か月の子どもを持つ養育者対象),2短期縦断調査(子どもが18か月,24か月の,2時点での縦断調査),3長期縦断調査(子どもがゼロ歳台のときから24か月に至るまでの期間にわたる縦断調査)を実施してきた。横断調査についてはH29年度中にデータ収集を終え,子どもの月齢にともなう,養育者の話しかけ(言葉かけ)の発達的変化について,その概要をつかむことができた。2についても,H29年度中に,追跡予定のサンプルから1回目のデータはすべて収集し終えることができ,H30年度に24か月時点のデータを収集することで調査を終了できる見通しとなった。3についても,対象者からはこれまで,子どもが生後6か月,もしくは10か月を始点とし,ほぼ3か月ごとの縦断的な調査への回答を得ることができており,H30年度中には予定通り24か月時点のデータまでとり終えられるところまで進んだ。子どもの成長にともなう変化を縦断的に追跡する研究計画であるが,予定どおりのスケジュールで進めることができているため。予定通り,研究を進めていく。予定どおりデータ収集を進めるとともに,全体の結果のまとめ,および,論文化の作業に入る。もともと耐震工事との関係で年度中に研究室の引越が予定されていたが,学内事情によりそのタイミングが年度を越えることになり,それにあわせて物品の購入を先送りしため。縦断調査への協力者への謝金を,都度払いでなく,すべての縦断調査の終了後にまとめて払うことにしたため。研究室の引越作業が終了したあとに予定していた物品の購入を行う。
トシオ・モリ文学の全体像の構築とジャパニーズ・アメリカニズム研究の確立

カリフォルニア州オークランド出身のトシオ・モリ(1910-80)文学の全体像を構築するために、まず、第二次世界大戦中のトパーズ強制収容所体験を基に描いた死後出版の中編小説「ムラタ兄弟」や関連の短編を読み解くことによって、処女作『カリフォルニア州ヨコハマ町』(1949)等で出来上がった穏やかな作風の作家という偏ったイメージを修正した。次に、アメリカニズムを民主主義や自由等の国家的な価値観を標榜するナショナリズムの現れ方として容認した上で、多様性を認め合うポストモダニズムの時代にふさわしいエスニシティ重視の対抗的な文学的ヴィジョンとして、ジャパニーズ・アメリカニズムを確立する道筋を提唱した。「トシオ・モリ文学の全体像の構築とジャパニーズ・アメリカニズム研究の確立」という本研究課題遂行のために、まず2013年9月にカリフォルニア州オークランドに渡り、すでに知己を得ているトシオ・モリの息子の好意で、彼の二人の高齢の従兄姉に会うことができ、彼らの親で作家の叔父にあたるマサオとタダシの生没年を確認することによって、ほぼ正確な作家のファミリー・ツリーを確立できた。さらに、モリの父ヒデキチのハワイ渡航が、1899年11月25日に(11月12日横浜港出港)蒸気船にてホノルルに到着という事実も、ハワイ大学の歴史資料室での調査で確定できたので、モリ文学の歴史的背景に関する研究の精度をかなり高めることができた。それ故、伝記的背景を基盤にした彼の作品分析は、かなり緻密に行うことができるようになった。一方、作品に関しては、カリフォルニア大学バークレー校バンクロフト図書館で、既刊のモリの3冊の作品集に収録されていない短編「コルネット奏者」「箒を持った女」「ある幸せな家族」、およびエッセイ風スケッチ「トパーズ駅」を複写で入手でき、これらをモリ文学の全体像の中に位置づける研究結果を現在論文に作成中である。これにより、1942年10月にユタ州トパーズ強制収容所に移住する前後の彼の活動の実態がかなり明確になったが、「歴史記録部」に配属された彼が、所内の新聞『トパーズタイムズ』や文芸誌『トレック』を引き継いだ『オール・アボード』の編集作業に関わった詳細については、なお今後の調査を待たねばならない。もう一つの問題は、モリ自身がウィリアム・サローヤン宛の書簡で言及している471頁の未発表の小説『これらホームレスの人々をお送り下さい』の原稿が、モリ家の倉庫に眠っていると息子の口から聞いているので、モリ文学の全体像を解明するためにも、この貴重な資料を調査する機会が与えられるのを辛抱強く待つ必要がある。カリフォルニア州オークランド出身のトシオ・モリ(1910-80)は、日系アメリカ文学のパイオニア的作家として認知されているにもかかわらず、従来それに値するだけの評価を受けて来なかった。その主な理由は、『終わらざるメッセージートシオ・モリ作品選集』(2000年出版)に収録された「ムラタ兄弟」という中編小説が発表されるまでは、主たる研究対象が、彼の穏やかな作風の作品に偏重していたせいであり、それによって作り上げられた、人間の穏便な面を描く作家という歪んだ作家像のためである。しかし、1941年12月の太平洋戦争勃発と同時に、彼が家族や他の8000人余りのサンフランシスコ湾周辺の日系人と一緒に送り込まれたユタ州トパーズ強制収容所を舞台にした「ムラタ兄弟」は、そうした一面的な、ある意味で間違ったイメージを一掃するだけの内容を伴った重要な小説である。その中で展開されている、いわゆるアメリカ派と日本派に分断された収容所内の政治的対立と葛藤が絡まったムラタ兄弟の闘いを、ユタ大学やカリフォルニア大学バークレー校に収蔵されている、収容所内で刊行の文芸雑誌や新聞等の歴史的な背景資料や、書簡等の伝記資料を駆使することによって、モリの立場を考察しながら読解した。さらに、1970年代のアメリカ社会に台頭した新しいエスニシティ意識と連動した文化多元主義という先鋭なイデオロギーの浮上を視野に入れて、モリ文学が静かに主張する姿勢を、ジャパニーズ・アメリカニズム(Japanese Americanism)という概念で表現することを試みた。それは換言すれば、アメリカ社会を特徴づける民主主義や人権尊重という高邁な理念を、全面的に支持することを表明しながら、同時に、民族的ルーツを日本人とする文化的遺産や記憶を大切に継承する姿勢を打ち出すという意識の在り様、あるいはイデオロギーの提唱・推進への意思の表明である。カリフォルニア州オークランド出身のトシオ・モリ(1910-80)は、日系アメリカ文学のパイオニア作家として認知されているにもかかわらず、処女作の短編集『カリフォルニア州ヨコハマ町』(1949)、長編小説『広島から来た女』(1978)、二作目の短編集『ショーヴィニストその他の短篇』(1979)から作り出された一方的な作家像の影響もあって、正当な評価を受けてこなかった。つまり、人間の穏便な面を描く穏やかな作風の作家という偏ったイメージに影響されてきた。その不当な扱いを打破し修正するために、彼が1941年12月の太平洋戦争勃発によって送り込まれたユタ州トパーズ強制収容所での体験を基に創造した中編小説「ムラタ兄弟」(2000年出版の『終わらざるメッセージートシオ・モリ作品選集』に収録)や、その体験直前の苦境を扱った数編の短編を緻密に読み解き、そこにモリの作家としての深い洞察力と想像力をみることで、彼の文学の全体像の構築を試みた。

その際、ユタ大学やカリフォルニア大学バークレー校等に収蔵されている、収容所内で刊行の文芸雑誌や新聞等の歴史的な資料や、書簡等の伝記資料を参照することができた。次に、1970年代のアメリカ社会に台頭した新しいエスニシティ意識と連動した文化多元主義という先鋭なイデオロギーの浮上を視野に入れて、モリ文学が静かに主張する姿勢を、ジャパニーズ・アメリカニズム(Japanese Americanism)という概念で表現することを目指した。つまり、アメリカニズムを民主主義や自由等の国家的な価値観を標榜するナショナリズムの現れ方として認知した上で、多様性を認め合うポストモダニズムの時代にふさわしいエスニシティ重視の対抗的な文学的ヴィジョンとして、民族的ルーツを日本人とする文化的遺産や記憶を大切に継承する姿勢を打ち出すジャパニーズ・アメリカニズムを確立する道筋を提唱した。カリフォルニア州オークランド出身のトシオ・モリ(1910-80)文学の全体像を構築するために、まず、第二次世界大戦中のトパーズ強制収容所体験を基に描いた死後出版の中編小説「ムラタ兄弟」や関連の短編を読み解くことによって、処女作『カリフォルニア州ヨコハマ町』(1949)等で出来上がった穏やかな作風の作家という偏ったイメージを修正した。次に、アメリカニズムを民主主義や自由等の国家的な価値観を標榜するナショナリズムの現れ方として容認した上で、多様性を認め合うポストモダニズムの時代にふさわしいエスニシティ重視の対抗的な文学的ヴィジョンとして、ジャパニーズ・アメリカニズムを確立する道筋を提唱した。本研究課題の平成26年度の主たる目標は、上記の研究実績の概要で言及した中編小説「ムラタ兄弟」を精緻に読解し、それを基盤にモリ文学の全体像の構築に向けての的確な道筋をつけることであった。その目標を達成するために、カリフォルニア大学バークレー校やスタンフォード大学の図書館だけでなく、ユタ大学、ユタ州立大学の図書館で、作者とウィリアム・サローヤンとの間の書簡や、モリが関わった文芸誌『トレック』や『オール・アボード』、あるいは、『トパーズ日報』等の新聞に掲載の諸作品や関連資料を収集し、太平洋戦争中、彼が他の日系人8000人余りと一緒に暮らしたユタ州トパーズ強制収容所内での彼の文芸活動を跡づけて、アメリカ市民としてのアイデンティティ確定や徴兵志願の是非を巡って収容所内で起きた日系人同士間の暴力的対立の様相を描いた「ムラタ兄弟」について、学会誌に論文を発表した。その意味では、本研究の達成度としては、ほぼ順調に進んでいると言える。但し、『アジア系アメリカ文学』(1982)の著者であるカリフォルニア大学バークレー校のエレーン・H・キム教授と、『発見された遺産』(2005)の編著者であるブリガムヤング大学(ユタ州プロヴォ市)のキース・ロレンス教授と会見し、意見交換を行う予定であったが、両教授が偶然にもサバティカル中ということで、その機会が実現しなかった。その一方で、『カリフォルニア州、ヨコハマ町』、『ショーヴィニスト、その他の短編』、および『ヒロシマから来た女』をまず個別に分析し、それらをモリ文学の全体像の中で見すえることで、アメリカ社会を統合する中心的概念である「アメリカニズム」に照らして、文化多元主義という批評理論を基盤にした「ジャパニーズ・アメリカニズム」という本研究受託者が確立を目指している全体的なヴィジョンを、さらに精緻な研究理論として示すということでは、やや遅れている。
メタロ-β-ラクタマーゼの構造的基盤に基づいた特異的阻害剤の精密設計

本研究では,新興薬剤耐性基盤メタロ-β-ラクタマーゼを標的とし,その基質加水分解機構の解明と三次元立体構造に立脚した阻害剤の開発を目的とした.この目的のために,第一に日本で発見されたメタロ-β-ラクタマーゼ(IMP-1)の活性中心に存在する二つのZn(II)イオン(Zn1、Zn2)の溶液中での配位構造とZn1とZn2の役割について調べるために,野生型IMP-1からZn^<2+>を取り除いたアポ酵素の調製を行った.その結果,IMP-1溶液に直接EDTA脇を添加し変性防止剤として30%のグリセリンを加えゲルろ過法により過剰のEDTAを取り除くことで、ほぼ100%活性回復するアポ酵素の調製法に成功した.第二に,Zn(H)イオンのキレート試薬であるEDTA共存下における野生型IMP-1の二つのZn(H)イオンの解離速度並びに解離過程を速度論的に解析した.この結果,IMP-1からのZn(II)イオンの解離は二つの逐次的な一次反応で進行することを明らかにした.第三に,メルカプトカルボキシレート化合物(rac-2-ω-phenylpropy1-3-mdrcapotpropionic acid)と特に欧州の医療施設で問題となっているVIM-2型メタロ-β-ラクタマーゼの複合体の結晶化に成功し2,3Aの分解能で立体構造を決定した.VIM-2とPheny1C3SHとの複合体の全体構造は他のメタロ-β-ラクタマーゼで見られるαβ/βαsandwich構造を形成していた。VIM-2の分子中には阻害剤であるPhenylC3SHが一分子が存在することがわかった。VIM一2のloop1にあるPhe61(42)のフェニル基は活性中心を向いており,阻害剤のメチレン鎖とCH-π相互作用していることがわかった.本研究では,新興薬剤耐性基盤メタロ-β-ラクタマーゼを標的とし,その基質加水分解機構の解明と三次元立体構造に立脚した阻害剤の開発を目的とした.この目的のために,第一に日本で発見されたメタロ-β-ラクタマーゼ(IMP-1)の活性中心に存在する二つのZn(II)イオン(Zn1、Zn2)の溶液中での配位構造とZn1とZn2の役割について調べるために,野生型IMP-1からZn^<2+>を取り除いたアポ酵素の調製を行った.その結果,IMP-1溶液に直接EDTA脇を添加し変性防止剤として30%のグリセリンを加えゲルろ過法により過剰のEDTAを取り除くことで、ほぼ100%活性回復するアポ酵素の調製法に成功した.第二に,Zn(H)イオンのキレート試薬であるEDTA共存下における野生型IMP-1の二つのZn(H)イオンの解離速度並びに解離過程を速度論的に解析した.この結果,IMP-1からのZn(II)イオンの解離は二つの逐次的な一次反応で進行することを明らかにした.第三に,メルカプトカルボキシレート化合物(rac-2-ω-phenylpropy1-3-mdrcapotpropionic acid)と特に欧州の医療施設で問題となっているVIM-2型メタロ-β-ラクタマーゼの複合体の結晶化に成功し2,3Aの分解能で立体構造を決定した.VIM-2とPheny1C3SHとの複合体の全体構造は他のメタロ-β-ラクタマーゼで見られるαβ/βαsandwich構造を形成していた。VIM一2のloop1にあるPhe61(42)のフェニル基は活性中心を向いており,阻害剤のメチレン鎖とCH-π相互作用していることがわかった.本研究では、新興薬剤耐性基盤メタロ-β-ラクタマーゼを標的とし、その基質加水分解機構の解明と三次元立体構造に立脚した阻害剤の開発を目的とした。この目的のために本年度は、日本で発見されたメタロ-β-ラクタマーゼ(IMP-1)の活性中心に存在する二つのZn(II)イオン(Zn1、Zn2)の溶液中での配位構造とZn1、Zn2の役割について調べるために、まずWTIMP-1からZn^<2+>を取り除いたアポ酵素(apo IMP-1)の調製を行った検討を行なった。これまで野生型IMP-1からZn^<2+>を取り除いたアポ酵素(apo IMP-1)の調製は行われていた。しかしながら、再びZn(II)イオンをapo IMP-1へ添加した際に活性が100%回復するapo IMP-1酵素の調製には成功していなかった。そこでapo IMP-1酵素の調製法を詳細に検討したところIMP-1溶液に直接EDTAを添加し、変性防止剤として30%のグリセリンを加え、ゲルろ過で過剰のEDTAを取り除くことで、100%活性回復するapo IMP-1調製法を確立することができた。本研究では、新興薬剤耐性基盤メタロ-β-ラクタマーゼを標的とし、その基質加水分解機構の解明と三次元立体構造に立脚した阻害剤の開発を目的とした。本年度は、メルカプトカルボキシレート化合物(rac-2-ω-phenylpropyl-3-mercapotpropionicacid)と特に欧州の医療施設で問題となっているVIM-2型メタロ-β-ラクタマーゼの複合体の結晶化に成功し2.3Åの分解能で立体構造を決定した。

VIM-2とPhenylC3SHとの複合体の全体構造は他のメタロ-β-ラクタマーゼで見られるαβ/βαsandwich構造を形成していた。VIM-2の分子中には阻害剤であるPheny1C3SHが-分子が存在することがわかった。VIM-2のloop1にあるPhe61(42)のフェニル基は活性中心を向いており、阻害剤のメチレン鎖とCH-π相互作用していることがわかった。この複合体においてloop1が全体的に活性中心の入り口へ移動するように変化していることがわかった。特に、Phe61(42)では1.8Åの変化が見られた。IMP-1型メタロ-β-ラクタマーゼでは、Phe61(42)-Ala64(45)がloop1とされており、IMP-1では、VIM-2型のTyr67(47)とPhe61(42)がそれぞれVal67(31)とVal67(25)になっている。X線結晶構造解析から、IMP-1においてVIM-2で観測されたPhenylC3SHとの芳香間相互作用による複合体の安定化の寄与がないと考えられる。このことがPhenylC3SHのIMP-1とVIM-2に対する阻害効果の差を反映している要因の一つであることがわかった。従って、Loop1は今回の阻害剤だけではなく、基質の取り込み・結合に重要な役割を担っていることが明らかとなった。