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精神疾患の発症機序における情動ストレスの役割に関する研究-情動ストレスと中枢モノアミン・ペプチド神経回路網の関連を精神疾患の動物モデルを用いて明らかにする-

本研究の目的は、情動ストレスの動物モデルとして恐怖条件付けストレス(CFS)を用い、CFSの中枢モノアミン及び神経ペプチドに対する影響を脳内透析法、RIA、in situ hybridization法、Northern Blot法などを用いて様々な脳部位において検討し、神経回路網における機能的局在を明らかにすることである。さらに、様々な向精神薬の作用を、様々な分子生物学的、神経化学的、行動学的手法によって明らかにした。1 CFSによって惹起されるすくみ行動を不安の指標として、様々な薬物の効果を検討した。選択的セロトニン(5-HT)再取り込み阻害剤(SSRI)によるすくみ行動の抑制効果をリチウム亜慢性投与が増強し、リチウムの効果が臨床的な治療域の血中濃度で得られることを明らかにした。5-HT1Aアゴニストによるすくみ行動抑制もリチウム亜慢性投与によって増強された。脳内透析実験ではSSRIによる細胞外5-HT濃度増加作用をリチウム亜慢性投与がさらに増強すること、リチウム亜慢性投与によっても細胞外5-HT濃度の基礎値が増大することが明らかになった。以上の結果は、リチウムによるSSRIの抗不安作用増強が、細胞外5-HT濃度増加作用や後シナプス5-HT1A受容体の感受性増強を介していることを示唆している。2モノアミン酸化酵素阻害剤(MAO阻害剤)のCFSに対する効果を検討した。MAO-A、MAO-B阻害剤単独では効果はみられなかったが、これらの併用投与はCFSによって惹起されるすくみ行動を顕著に抑制した。MAO阻害剤のCFSに対する効果の機序を明らかにするために、脳内透析法を用いてモノアミン放出の変化を検討したところ、MAO-A阻害剤とMAO-B阻害剤併用により細胞外セロトニン濃度が特異的に増加することが明らかになり、両剤併用による抗不安作用の作用機序として考えられた。3脳内のドーパミン2(D2)受容体のmRNAの発現がリチウム慢性投与やSSRIの投与によって増大することがNorthern Blotによって明らかとなった。mRNA発現の亢進が転写の亢進によることが明らかになった。本研究の目的は、情動ストレスの動物モデルとして恐怖条件付けストレス(CFS)を用い、CFSの中枢モノアミン及び神経ペプチドに対する影響を脳内透析法、RIA、in situ hybridization法などを用いて様々な脳部位において検討し、神経回路網における機能的局在を明らかにすることである。さらに、精神分裂病、うつ病のモデルとして、慢性覚醒剤中毒モデル、Katzの慢性ストレス誘発モデルを用い、CFSに対する反応性を様々な分子生物学的、神経化学的、行動学的手法によって明らかにする。以下に本年度えられた所見を列記する。選択的セロトニン(5-HT)再取り込み阻害剤(SSR1)がすくみ行動を抑制することはすでに報告したが、さらにSSR1の効果をLi、5-HT1B/1Dアンタゴニスト、5-HT前駆物質が増強することを見出した。現在、これらの薬物の増強効果の機序を明らかにするために、脳内透析法を用いてモノアミン放出の変化を検討中である。2最近注目されている抗うつ薬であり、抗不安薬でもあるモノアミン酸化酵素阻害剤(MAO阻害剤)のCFSに対する効果を検討した。

MAO-A、MAO-B阻害剤単独では効果はみられなかったが、これらの併用投与はCFSによって惹起されるすくみ行動を顕著に抑制した。MAO阻害剤のCFSに対する効果の機序を明らかにするために、脳内透析法を用いてモノアミン放出の変化を検討中である。3 Cholecystokinin(CCK)-B受容体アンタゴニストのCFSによって惹起されるすくみ行動に対する効果はすでに報告したが、本年度はさらにCFSによって引き起こされる脳内モノアミン代謝の変化に対するCCK-Bアンタゴニストの効果を検討した。その結果、CCK-BアンタゴニストはCFSによる前頭前野内側部ドーパミン代謝の先進をさらに増強した。このことは、CCK-Bアンタゴニストの抗不安作用と関連を有するかもしれない。さらに、RIAによって、ストレス時の脳内CCK-8S免疫活性の変化を測定した。まず、フットショックが扁桃体のCCK-8S含量を低下させることを見出し、ついでCFSのCCK-8S含量に対する影響を検討中である。また、ストレス時のCCKmRNAの変化を、in situ hybridization法を用いて検討中である。本研究の目的は、情動ストレスの動物モデルとして恐怖条件付けストレス(CFS)を用い、CFSの中枢モノアミン及び神経ペプチドに対する影響を脳内透析法、RIA、in situ hybridization法などを用いて様々な脳部位において検討し、神経回路網における機能的局在を明らかにすることである。さらに、精神分裂病、うつ病のモデルとして、慢性覚醒剤中毒モデル、Katzの慢性ストレス誘発モデルを用い、CFSに対する反応性を様々な分子生物学的、神経化学的、行動学的手法によって明らかにする。以下に本年度えられた所見を列記する。1 CFSによって惹起されるすくみ行動を不安の指標として、様々な薬物の効果を検討した。選択的セロトニン(5-HT)再取り込み阻害剤(SSRI)によるすくみ行動の抑制効果をリチウム亜慢性投与が増強し、リチウムの効果が臨床的な治療域の血中濃度で得られることを明らかにした。5-HT1Aアゴニストによるすくみ行動抑制もリチウム亜慢性投与によって増強された。脳内透析実験ではSSRIによる細胞外5-HT濃度増加作用をリチウム亜慢性投与がさらに増強すること、リチウム亜慢性投与によっても細胞外5-HT濃度の基礎値が増大することが明らかになった。以上の結果は、リチウムによるSSRIの抗不安作用増強が、細胞外5-HT濃度増加作用や後シナプス5-HT1A受容体の感受性増強を介していることを示唆している。2脳内のドーパミン2(D2)受容体のmRNAの発現をリチウム慢性投与やSSRIの投与が増大することがNorthernBlotによって明らかとなった。3 CCK-A受容体とCCK-B受容体のmRNA発現の胎生期からの発達における変化をin situ hybridization法を用いて検討し、特徴あるパターンを見出した。本研究の目的は、情動ストレスの動物モデルとして恐怖条件
転写調節因子の発現阻害によるペルオキシゾームの起源・形態形成の研究

個体の発生過程・ペルオキシゾーム増殖剤の投与・様々な生理的な刺激のもとで、細胞増殖を伴いながら、ペルオキシゾームが小さな構造として現れて数と大きさが増す。この現象を解析し、ノックアウトマウスを用いてその仕組みを明らかにすることを目指している。本研究は、転写調節因子のひとつであるペルオキシゾーム増殖剤活性化受容体(PPAR)によるペルオキシゾームの形成機転・構造の調節機構を明らかにし、起源となる構造を検出することを目標とした。ペルオキシゾーム特異蛋白質の転写調節因子PPARαノックアウトマウスおよびanti-senseRNA法によりPPARの発現を阻害した培養細胞について解析、この二つの実験を行った。前者については解析が進んだものの、後者については発表できる結果が得られなかった。【研究結果】1)発生過程の腎臓を初めとする各種器官において、ペルオキシゾームは小さな構造として観察され、組織の成熟とともに数・大きさ・酵素量が増す。2)褐色脂肪細胞において、寒冷暴露により細胞増殖・ペルオキシゾーム増殖が起きる、その現象はPPARにより促進される。3)PPARαの活性の亢進により肝細胞において、細胞増殖・ペルオキシゾーム増殖・脂肪肝が起きる。その現象をPPARが制御していることが推測された。4)PPARαは肝細胞の細胞周期を調節する。【考察】ペルオキシゾームの数と大きさの調節についてはPPARαはペルオキシゾーム特異蛋白質量と大きさを制御し、他の因子が数を規定することが推定された。ペルオキシゾームの起源については、従来は、小さなペルオキシゾームが出現して大きくなりそれが分裂して数が増えると言われてきたが、必ずしもこのモデルが全てのペルオキシゾーム増殖現象に当てはまらないことが示された。ペルオキシゾーム増殖剤による肝発癌において、細胞周期の制御により、PPARαが重要な役割を演じていることが推測された。【付随的な成果】新生ペルオキシゾームを光顕・電顕で可視化するために、組織化学的な研究方法が開発された。転写調節因子のひとつであるペルオキシゾーム増殖剤活性化受容体(PPAR)によるペルオキシゾームの形成機転・構造の調節機構を明らかにし、さらに、その起源となる構造を検出することを目標として、ペルオキシゾーム特異蛋白質の転写調節因子PPARを遺伝子欠落せしめたマウス(ノックアウトマウス)およびanti-senseRNA法によりPPARの発現を阻害した培養細胞について解析を行っている。平成10年度は主にPPARαノックアウトマウスについて研究を行った。ノックアウトマウスにペルオキシゾーム増殖剤Wy-14643を投与した肝臓組織を用い、非投与群と正常マウスを対照として比較検討した。Wy投与によるペルオキシゾーム特異蛋白質の量的変化をウェスタンブロット法により比較した。パラフィン切片に免疫染色を行い、凍結切片を脂肪染色した。ロビクリルK4M超薄切片をプロテインA金法にてペルオキシゾーム特異蛋白質を免疫染色して電顕観察し、また、画像解析によりペルオキシゾームの数・面積の変化を解析した。ノックアウトマウスでは、基質・膜蛋白の量はWy投与により変化が起きなかった。電顕観察によれば、正常群ではWy投与によりペルオキシゾームの数と大きさがともに著明に増加したが、一方、ノックアウトマウスでは、Wy投与によりペルオキシゾームの数は著明に増加したものの、個々のペルオキシゾームの大きさは減少した。

PPARaは特異蛋白質量と大きさのみを制御し、他の因子が数を規定することが推定された。今後の研究の展開平成11年度は、初代培養肝細胞およびラット肝臓癌細胞H4IIEC3について、antisenseRNA法でPPARα・PPARβ・PPARγの発現を阻害する実験を予定している。個体の発生過程・ペルオキシゾーム増殖剤の投与・様々な生理的な刺激のもとで、細胞増殖を伴いながら、ペルオキシゾームが小さな構造として現れて数と大きさが増す。この現象を解析し、ノックアウトマウスを用いてその仕組みを明らかにすることを目指している。本研究は、転写調節因子のひとつであるペルオキシゾーム増殖剤活性化受容体(PPAR)によるペルオキシゾームの形成機転・構造の調節機構を明らかにし、起源となる構造を検出することを目標とした。ペルオキシゾーム特異蛋白質の転写調節因子PPARαノックアウトマウスおよびanti-senseRNA法によりPPARの発現を阻害した培養細胞について解析、この二つの実験を行った。前者については解析が進んだものの、後者については発表できる結果が得られなかった。【研究結果】1)発生過程の腎臓を初めとする各種器官において、ペルオキシゾームは小さな構造として観察され、組織の成熟とともに数・大きさ・酵素量が増す。2)褐色脂肪細胞において、寒冷暴露により細胞増殖・ペルオキシゾーム増殖が起きる、その現象はPPARにより促進される。3)PPARαの活性の亢進により肝細胞において、細胞増殖・ペルオキシゾーム増殖・脂肪肝が起きる。その現象をPPARが制御していることが推測された。4)PPARαは肝細胞の細胞周期を調節する。【考察】ペルオキシゾームの数と大きさの調節についてはPPARαはペルオキシゾーム特異蛋白質量と大きさを制御し、他の因子が数を規定することが推定された。ペルオキシゾームの起源については、従来は、小さなペルオキシゾームが出現して大きくなりそれが分裂して数が増えると言われてきたが、必ずしもこのモデルが全てのペルオキシゾーム増殖現象に当てはまらないことが示された。ペルオキシゾーム増殖剤による肝発癌において、細胞周期の制御により、PPARαが重要な役割を演じていることが推測された。【付随的な成果】新生ペルオキシゾームを光顕・電顕で可視化するために、組織化学的な研究方法が開発された。
新規受容体型PTPによる細胞機能変換の分子機構に関する萌芽的研究

リン酸化シグナルが生理・病理学的に重要なことは周知の事項であるが、一方、チロシンフォスファターゼ(PTP)による脱リン酸化も、オフシグナルとして同等に重要であるにもかかわらず、PTPに関する知見はまだ極めて少ない。そこで本研究では、新規受容体型PTPの生理学的意義ついて検討した。申請者らは、昨年度までに、PTPβ、DEP-1が細胞密度により発現誘導され、細胞の増殖抑制(あるいは接着阻害)に関わることが想定されたことから、本年度は、細胞増殖、細胞周期制御への関与の有無に注目し検討した。Tet誘導システムを用いたDEP-1遺伝子導入による細胞機能の変化を観察したところ、発現誘導がかからないクローンでは増殖速度に変化が無い一方、過剰発現が誘導されるクローンでは細胞増殖が抑制された。そこでDEP-1過剰発現細胞での細胞周期関連因子の発現プロファイルを、定常状態の遺伝子未導入細胞と比較検討したところ、p21、c-Mycの発現にはほとんど差がないが、p27発現で低下が観察された。一方の分解に関わるユビキチンリガーゼについては、Skp2、Fbw7が亢進、KPC1、KPC2はわずかに発現低下の傾向を示した。細胞の増殖抑制に関連して細胞周期を考察した場合、仮説としては抑止誘導が考えられたが、Skp2、Fbw7、p27の動態は、その仮説とは矛盾を含んでおり、DEP-1による細胞の増殖抑制機序の解釈には、細胞周期関連因子のタンパク発現レベルでの動態解析含めたさらなる解析が必要であろう。以上のごとく、細胞周期制御因子としてのPTPの機転機序を現状では証明できなかったが、細胞増殖抑制をもたらす受容体型PTPは、腫瘍の増殖制御など新たな細胞機能の制御戦略の端緒となりうることから、今回、発現動向に影響が示唆されたPTPと細胞周期に関する萌芽的な研究は、展開していくに値するものと考えられた。申請者らは血管壁のリモデリングに関して、複数の成長因子の受容体(リン酸化)シグナルの時空的階層的な統制が生理・病理学的に重要な役割を果たすことを解明してきた。本研究では、こうしたリン酸化シグナルの「スイッチオフ(脱リン酸化)」に関わりうる分子として内皮に発現を確認した受容体型フォスファターゼPTPβの生理学的意義の探索を行った。PTPβが機能的血管構築に与える影響を見るために、マウス虚血下肢モデルでの発現差違をマイクロアレイにより検討した。機能的血管新生の誘導により虚血下肢が救済されるFGF-2遺伝子導入群、救済されないFGF-1導入群での発現動態を比較した結果、両群間での有意な発現差は見られず、このモデルでの機能的血管構築に関する役割同定に至らなかった。一方、培養での内皮細胞密度による発現誘導は確認したものの、血管新生関連因子(VEGF、VEGF-C、HGF、FGF-2、TNFα、Ang-1)による内皮刺激では、有意な発現変化は認めなかった。つまり、現在までに判明している発現誘導要因は細胞密度(あるいは接着阻害)のみであり、その意義は、内皮細胞の増殖あるいは遊走制御に関わるものと推測された。一方、配列解析で、GenBank登録(Arg-1559)と違うCys-1559を同定した。これは、(1)他動物種のゲノムから推測した遺伝子情報との相同性解析、(2)同一族に属するフォスファターゼDEP-1との構造比較、(3)我々が得た複数の独立クローンが全てCys-1559である3点に加え、Cysは立体構築に重要でよく保存されるアミノ酸であることを踏まえ、既報は多型かエラーでありCysが正しい一次構造と結論した。来年度は、この構造情報に基づく組換え体等を用い、細胞同士の接着に関わる分子シグナル機構の解析にあたりたい。
フェノール水の塩素消毒とプレダイオキシン生成における反応機構の解明

フェノール化合物を含む水を塩素処理し、その際に生じるフリーラジカルをDMPOで捕捉し、そのDMPO-付加物の化学構造の決定を目的とした。まず、DMPO-付加物生成に関する情報を得るためにスピントラップ剤、塩素添加後の経時変化、塩素濃度、フェノール化合物濃度及び反応液のpHの検討を行なった。スピントラップ剤ではDMPOが最も明瞭なシグナルを与え、その強度は50-150分で最大となり、その後は徐々に減少した。塩素濃度が250 mg/l以上,フェノール濃度は最終濃度が0.4 mMの時,また反応液のpHではpH 7.0-8.0で最大のシグナル強度を与えた。以上得られた条件をもとに種々のフェノール化合物を塩素処理した結果、DMPO-付加物のシグナルはPhOH、2-MePhOH、3-MePHOH、4-MePhOH、2,4-DiMePhOH、2,6-DiMePhOH、3,5-DiMePhOH、2-Cl-PhOH及び4-Cl-PhOHで認められた。これらのことよりフリーラジカルがDMPOに捕捉されるのは水酸基がラジカルになったものではなく他の位置でラジカルとなり、DMPO-Rを形成することが分かる。更にDMPO-Rは2個の窒素原子と1個の水素原子により分裂して18本線を与えることが示された。以上のことよりフェノール由来ラジカルの構造を決定するためには反応混液中よりDMPO-付加物自体の抽出または分離が必要であり、その手段として高速液体クロマトグラフィーによる分離が最適と考えられる。これによりDMPO-付加物を分離後集めて、元素分析、質量分析、核磁気共鳴スペクトル及び赤外吸収スペクトル等の測定によりDMPO-付加物の構造決定は可能と考えられる。
粘性的双曲型保存系の非線型波の安定性

本研究ではNewton粘性や摩擦による粘性効果を持つ一次元圧縮性粘性流体の時間大域的な挙動を調べることを主目的とした.それらの方程式は双曲型粘性保存則系と呼ばれる連立の系で表現され,粘性衝撃波,希薄波,散逸波および接触不連続に対応する波などの非線型波を持つ.Newton粘性を持つ圧縮性Navier-Stokes方程式に対しては,主に強い希薄波の大域安定性を示す結果を求めた(Nishihara-Yang-Zhao).同様の結果は,p-システムに対するJin-Xin relaxationモデルに対しても得られた(Nishihara-H.Zhao-Y.Zhao).また,半空間におけるInflow問題では,境界層解や希薄波への漸近に関しては既に研究代表者と分担者による結果が得られていたが,粘性衝撃波が絡む場合にもある種の条件の下で粘性衝撃波と境界層解の重ねあわせに漸近することが得られた(Huang-Matsumura-Shi).粘性衝撃波からの擾乱の積分平均がゼロでない場合や粘性衝撃波と希薄波の重ね合せに漸近が予想される場合は依然として未解決として残っている.一方,Porous media中の1次元圧縮性流の方程式は粘性効果が摩擦によって生じ,線型dampingをもつp-システムとして表わされる.この系のCauchy問題の解はDarcyの法則から得られる放物型の方程式の解(これを散逸波と呼ぶ)に漸近することが分かっていて,その漸近を精密に考察した(Nishihara)結果,1次元および3次元2階消散型波動方程式と対応する熱方程式が密接に関連することが分かった(Marcati-Nishihara, Nishihara).その結果は半線型消散型波動方程式の大域解の存在と有限時間内の解の爆発に関する考察に応用された.その際の半線型項のcriticalな指数は半線型熱方程式に対する結果とと一致していることも説得力を持って示されたといえよう.この現象は,他の次元についても成立することがNarazaki, Ono, Ogawa-Hosonoらによって示された.一般の次元でのcritical指数についてはTodorova-Yordanovによる.また,抽象的な設定でも同様の現象が得られていて(Ikehata-Nishihara),消散型波動方程式に関連する考察に示唆をあたえる基本的な結果が得られたものと考えている.本研究では、通常のNewton粘性や摩擦による粘性効果をもつ双曲型保存系の非線型波-粘性的衝撃波、希薄波、散逸波-の安定性について考察する。今年度には、Porous Media中を流れる圧縮性流、すなわち、摩擦項をもつ双曲型保存系(p-system with frictional damping)の解の散逸波への漸近に関する新しい結果が得られ、Royal Soc. Edinburgh Proc. Aに掲載される予定である。摩擦項をもつ双曲型保存系の方程式の解は、Darcyの法則によって得られるPorous media方程式の解(散逸波)に漸近することがわかっている(Hsiao-Liu)。ここでは、左右遠方での値が等しいとき、散逸波のlocationを初期値から一意に決めることによって、ほぼ完全に満足すべき漸近の速さを得たものである。その決め方は、研究代表者、分担者の共同研究において用いた、粘性的衝撃波に対するものを応用したものである。また、この事実は、消散効果をもつ2階の波動方程式の解が、対応する放物型方程式の解を漸近形として持つことを示唆し、実際、3次元空間において、その事を証明し、半線型消散型波動方程式の大域解の存在証明に応用した。これに関する論文は現在投稿中である。本研究ではNewton粘性や摩擦による粘性効果を持つ一次元圧縮性粘性流体の時間大域的な挙動を調べることを主目的とした.それらの方程式は双曲型粘性保存則系と呼ばれる連立の系で表現され,粘性衝撃波,希薄波,散逸波および接触不連続に対応する波などの非線型波を持つ.Newton粘性を持つ圧縮性Navier-Stokes方程式に対しては,主に強い希薄波の大域安定性を示す結果を求めた(Nishihara-Yang-Zhao).同様の結果は,p-システムに対するJin-Xin relaxationモデルに対しても得られた(Nishihara-H.Zhao-Y.Zhao).また,半空間におけるInflow問題では,境界層解や希薄波への漸近に関しては既に研究代表者と分担者による結果が得られていたが,粘性衝撃波が絡む場合にもある種の条件の下で粘性衝撃波と境界層解の重ねあわせに漸近することが得られた(Huang-Matsumura-Shi).粘性衝撃波からの擾乱の積分平均がゼロでない場合や粘性衝撃波と希薄波の重ね合せに漸近が予想される場合は依然として未解決として残っている.一方,Porous media中の1次元圧縮性流の方程式は粘性効果が摩擦によって生じ,線型dampingをもつp-システムとして表わされる.この系のCauchy問題の解はDarcyの法則から得られる放物型の方程式の解(これを散逸波と呼ぶ)に漸近することが分かっていて,その漸近を精密に考察した(Nishihara)結果,1次元および3次元2階消散型波動方程式と対応する熱方程式が密接に関連することが分かった(Marcati-Nishihara, Nishihara).その結果は半線型消散型波動方程式の大域解の存在と有限時間内の解の爆発に関する考察に応用された.

その際の半線型項のcriticalな指数は半線型熱方程式に対する結果とと一致していることも説得力を持って示されたといえよう.この現象は,他の次元についても成立することがNarazaki, Ono, Ogawa-Hosonoらによって示された.一般の次元でのcritical指数についてはTodorova-Yordanovによる.また,抽象的な設定でも同様の現象が得られていて(Ikehata-Nishihara),消散型波動方程式に関連する考察に示唆をあたえる基本的な結果が得られたものと考えている.本研究では、Newton粘性や摩擦による粘性効果を持つ双曲型保存系の非線形波-粘性衝撃波,希薄波,散逸波および接触不連続に対応する波-の安定性を考察することを目的とする。代表者は主に摩擦による粘性効果を持っ双曲型保存系の問題から派生した2階消散型波動方程式の散逸効果を考察し、分担者は圧縮性粘性流の半空間におけるInflow Problemに関する考察を継続した。代表者は、Porous media中の圧縮性流の方程式の解がDarcyの法則から導かれる放物型の方程式の解に漸近することから、2階消散型波動方程式の解が、対応する放物型方程式の解に漸近することを、その差のL^p-L^q評価を調べることにより漸近の詳細を、空間一次元と3次元の場合に求めた。それらの結果は、J. Differential EquationsとMath. Z.に掲載が決まりすでに印刷中である。また、それらの結果を茨城大学でのセミナーで講演し、そのセミナーノートもいずれ発刊されると思われる。一方、分担者は、圧縮性粘性流体の空間一次元等エントロピーモデルに対する半空間上での初期値境界値問題、特に、Inflow problemに関連した研究を継続し、これまで、漸近挙動が境界層解のみまたは境界層解と薄波の重ね合わせと予想される場合が考察されて来たが、今回、漸近挙動が境界層解と粘性衝撃波との重ね合わせの場合の考察を行った([1])。また、境界の上で相転移などの反応がある場合に対応する自由境界値問題についても、進行波の存在と漸近安定性を示すことに成功した([2][3])。本研究ではNewton粘性や摩擦による粘性効果を持つ双曲型保存則系の非線型波---粘性衝撃波,希薄波,散逸波および接触不連続に対応する波---の安定性を考察することを主とした.希薄波の安定性に関しては圧縮性Navier-Stokes方程式に対する結果(Nishihara-Yang-Zhao)だけでなく,p-システムに対するJin-Xin relaxationモデルに対しても大域的に求めた(Nishihara-H.Zhao-V.Zhao).また,摩擦による効果を持つ解の漸近挙動から派生して考察を続けている消散型波動方程式に対しても考察を継続した.まず,抽象的な設定の下においても,2階線型発展方程式の解が対応する1階の発展方程式の解の漸近することが池畠氏によって示され,同氏と共同でその漸近のほぼ最適なオーダーを求めた(Ikehata-Nishihara).その結果はCill-Harauxが最適なものに改良した.3次元空間における2階消散型波動方程式のコーシー問題に対して前年度に得た結果(Nishihara)は,幾人かの数学者によって他の次元や一般の次元における結果に拡張された.そのような状況下で,新たに半線型項が吸収項となっている場合の考察を開始し,結果を得た.
合成アパタイト・骨誘導物質複合体による異所性骨髄形成を有する人工骨の開発

BMPにより異所性に誘導された骨および軟骨形成細胞における骨基質蛋白の遺伝子発現様式は,未だ十分に解明されていない。そこで本実験では,BMPにより誘導された硬組織形成細胞を対象とし,骨基質蛋白としてオステオポンチン,オステオネクチン,オステオカルシンについて,ディゴキシゲニン標識cRNA probeを用いたin situ hybridization法による遺伝子発現の検討を行った。I型コラーゲンを担体とした粗精製BMPをラット皮下に埋入した際には,はじめにオステオポンチン,オステオネクチンのm-RNAが発現したが,その発現細胞は形態学的に相違を示していた。さらに発現部位においても相違がみられ,オステオネクチン発現細胞はより広範な細胞で認められることが示された。またオステオカルシンは埋入後2週になり,石灰化を開始した部位の骨細胞あるいは骨芽細胞ではじめてシグナルを認めオステオポンチン,オステオネクチンの発現に比較して時期的に遅れ,骨芽細胞に分化した後に発現することが示唆された。電顕的観察結果からはBMPは未分化間葉系細胞に作用して,軟骨・骨系列の細胞に分化誘導(細胞系列の決定)し,その後の分化の振り分け(分化の決定)は,局所の環境や外的要因の影響を受けるものと考えられる所見を得た。また,この一連の分化過程にBMPによって活性化された単球・マクロファージやこれらの細胞によって分泌される骨誘導関連物質が深く関与していると考えられる。今後さらにBMPによる異所性骨誘導における骨基質蛋白の遺伝子発現様式が,発生過程にみられる骨および軟骨の遺伝子発現様式を再現しているかを再検討すべきであろう。
X線結晶構造解析及び、部位特異的変異法によるキサンチン脱水素酵素の構造・機能の研究

キサンチン脱水素酵素はヒトにおいてはプリン分解系の最終段階を触媒する酵素であり、キサンチンを尿酸に代謝する。もう一方の基質はNADであるが、酵素分子の高次構造の変化により、酸素を基質とするキサンチン酸化酵素へ変換することが知られている。このとき酵素反応の生成物として生ずる活性酸素が虚血再還流障害などの組織障害の原因となっているという多くの報告がある。本研究期間においては、結晶構造解析と部位特異的変異酵素の機能の解析を更に進めることにより、キサンチン脱水素酵素、酸化酵素の活性酸素生成機構に焦点を当て、これを解明中である。1)酵素(部位特異的変異酵素も含む)と基質アナログ、阻害剤との複合体の結晶構造の解析を行い、活性中心付近の反応メカニズムの推測を行った。より正確な議論を行うため、現在得られている結晶構造についても結晶化条件を改良するなどして分解能を高め、リファインメントを続けている。2)結晶構造より推測された活性酸素生成機構上重要であると考えられるアミノ酸残基を適宜変換した部位特異的変異酵素の作成を行う。FADと酸素との反応性を制御していると考えられる鉄硫黄中心のリガンド、あるいはその周辺のアミノ酸残基についても変換酵素の作成を行った。これら変異酵素について分光学的測定と、酵素学的解析(種々の基質、阻害剤に対するキネティカルなデータの収集、ストップドフローなどによる速度論的解析)を行い、既に得られている天然型酵素のデータとの比較を行うことによりFADにおける活性酸素生成機構に対する周囲アミノ酸の影響を解析中である。本研究の目的はキサンチン脱水素酵素の活性酸素生成機構を結晶構造、部位特異的変異酵素解析の両面より明らかにし、さらに生体内での活性酸素生成を抑制する新規薬剤の開発の基礎データを得ることである。平成13年度は生体内でのキサンチン脱水素酵素の生成物であるNADHとの複合体、反応中間体のよいモデルになると考えられているアロプリノール、4アミノ6ハイドロキシピラゾロピリミジンとの複合体の結晶を作成し、スプリング8にて採取したデータをもとに結晶構造を決定した。これらの結果より本酵素の持つ2個の活性中心(FAD,モリブデン)それぞれの反応機構、活性酸素生成機構についての重要な知見を得ることが出きた。さらに、日本国内において新規に開発され、抗痛風としての臨床利用が期待されている阻害剤BOF-4272,TEI-6720,Y-700についても酵素との複合体の結晶作成、構造を決定した。これにより上記阻害剤の阻害機構を知ることが可能になり、より強力な阻害剤開発に向けての知見を得ることが出来た。活性酸素生成に関与していると考えられているアミノ酸残基を部位特異的に変換した変異酵素を昆虫細胞にて発現させ、現在結晶化の条件を検討中である。
成熟心筋細胞の恒常性維持に対するポリコーム遺伝子群の機能解析

成熟心筋細胞の恒常性維持に対するポリコーム遺伝子群の機能を解明するために、ホモ個体の多くが生後1年で心不全症状を示すPcgf5 KOマウスについて解析を行った。その結果、Pcgf5が成体心臓でもPRC1.5複合体を形成する事、構成タンパク質としてCK2α1、HDAC2を新たに確認した。Pcgf5 KOマウス心臓ではタンパク質のリン酸化状態が変化していた。RNA-seq解析により、生後12週令で変化なく、12ヶ月令のPcgf5 KOマウス心臓で特異的に変動している遺伝子を確認した。これらから、成熟心筋細胞の恒常性維持に対してPcgf5がタンパク質のリン酸化等を介して関与する可能性が示された。目的:ポリコーム(PcG)遺伝子Pcgf5のノックアウトマウスの解析を元に、成熟心筋細胞の恒常性維持を制御する分子機構解明を目指し、更に、様々なストレスによるこの分子機構の破綻がヒトにおける心疾患を生じさせ、PcG遺伝子群がその原因遺伝子である可能性について探索する。研究実績:1.Pcgf5遺伝子KOマウスの表現系解析:Pcgf5遺伝子KOマウス心臓の詳細な機能解析の結果、生後6ヶ月で左心室駆出率の低下が確認されている。本年度、より若い個体で解析を進めたところ、生後12週令で既に、心機能がわずかに低下し、Nppa、Myh7遺伝子の発現に変化は見られないものの、Acta1の発現が上昇していることが確認された。2.成熟心筋細胞へのストレスに対する恒常性維持機構における、Pcgf5及びその標的遺伝子の機能解析:12週令のPcgf5遺伝子KOマウスに対して、浸透圧ポンプを用いてイソプロテレノールを連続投与し、心臓にストレスを与えたところ、野生型、ホモ個体間で心機能に大きな差は確認されなかった。本研究費が追加採択であったため、当初予定していた、高額がかかるChIP-seqは本年度に行っていない。その代りとして、平成28年度に行う予定であった、ストレス負荷による心機能の解析を先行させ、順調に進展している。研究実績:1. Pcgf5タンパク質標的遺伝子の探索:Pcgf5タンパク質標的遺伝子を探索するために、12ヶ月齢の野生型マウス、Pcgf5遺伝子KOマウス左心室からtotal RNAを抽出し、RNA-seq法を用いた遺伝子発現解析を行った。2. Pcgf5タンパク質と複合体を形成するタンパク質の同定:共免疫沈降法を用いて、マウス左心室でPcgf5タンパク質と複合体を形成するタンパク質を解析したところ、Casein kinase 2α1(CK2α1)、Histone deacetylase 2(HDAC2)と複合体を形成していることを新たに見出した。3. Pcgf5遺伝子KOマウス心臓における、タンパク質リン酸化状態の解析:Pcgf5タンパク質がマウス左心室でCK2α1と複合体を形成していることから、Pcgf5遺伝子KOマウス心臓でタンパク質のリン酸化状態が変化している可能性が見出された。12週令、12ヶ月令のマウス左心室を用いて、リン酸プロテオミック解析を行い、タンパク質のリン酸状態を解析した。ChIP-seqは、使用する抗体の選定に時間がかかったが、決定したので次年度に行う。Pcgf5タンパク質と複合体を形成するタンパク質としてCasein kinase 2α1が確認されたため、リン酸化プロテオミック解析を優先して行った。また、Pcgf5タンパク質の標的遺伝子を探索するためにRNA-seqを行い、現在、詳細な解析を行っている。目的:ポリコーム(PcG)遺伝子Pcgf5のKOマウス解析を元に、成熟心筋細胞の恒常性維持を制御する分子機構解明を目指し、様々なストレスによるこの分子機構の破綻がヒトにおける心疾患を生じさせ、PcG遺伝子群がその原因遺伝子である可能性について探索する。Pcgf5遺伝子KO(Pcgf5 KO)マウスの解析:Pcgf5 KOマウスの多くは、生後約1年で心不全を伴って死亡する。詳細な機能解析を行った結果、生後12週令で心機能のわずかな低下が確認され、老化に伴った症状の増悪が確認された。また、Pcgf5 FloxマウスとNkx2-5/Creマウスを交配して心臓特異的なPcgf5 KOマウスを作成し、心機能低下が同様に生じることを確認した。Pcgf5タンパク質標的遺伝子の探索:Pcgf5タンパク質標的遺伝子を探索するために、12週令、12ヶ月令の野生型、Pcgf5 KOマウス左心室における詳細な遺伝子発現解析をRNA-seq法を用いて行ったところ、心筋症で発現が上昇するNppaやMyh7、炎症性時に変化する遺伝子の発現上昇が12ヶ月令で確認されたが、筋肉の収縮、リラックスに関連した遺伝子に発現変動は確認されなかった。Pcgf5タンパク質と複合体を形成するタンパク質の同定:共免疫沈降法を用いて、マウス左心室でPcgf5タンパク質と複合体を形成するタンパク質を解析したところ、Casein kinase 2α1(CK2α1)、Histone deacetylase 2(HDAC2)と複合体を形成していることを新たに見出した。

成熟心筋細胞へのストレスに対するPcgf5及びその標的遺伝子の機能解析:12週令のPcgf5 KOマウスに対して、浸透圧ポンプを用いて、イソプロテレノールを連続投与し、心臓にストレスを与えたが野生型、ホモ個体間で心機能に大きな差は確認されなかった。成熟心筋細胞の恒常性維持に対するポリコーム遺伝子群の機能を解明するために、ホモ個体の多くが生後1年で心不全症状を示すPcgf5 KOマウスについて解析を行った。その結果、Pcgf5が成体心臓でもPRC1.5複合体を形成する事、構成タンパク質としてCK2α1、HDAC2を新たに確認した。Pcgf5 KOマウス心臓ではタンパク質のリン酸化状態が変化していた。RNA-seq解析により、生後12週令で変化なく、12ヶ月令のPcgf5 KOマウス心臓で特異的に変動している遺伝子を確認した。これらから、成熟心筋細胞の恒常性維持に対してPcgf5がタンパク質のリン酸化等を介して関与する可能性が示された。1.Pcgf5遺伝子KOマウスの解析について:引き続き、Pcgf5遺伝子KOマウスにおける心不全症状がいつから生じるのか、心エコーを行い、詳細な組織学的解析を行う。2.次世代シークエンサーを用いた、Pcgf5タンパク質標的遺伝子の探索:ヒストンの修飾状態に対する抗体を用いて、Pcgf5遺伝子KOマウス及び野生型マウス心臓から抽出したDNA断片を次世代シークエンサーにより大量解析し、ヒストン修飾状態を網羅的に解析する。Pcgf5遺伝子KOマウスの心臓においてヒストン修飾状態が変化していた領域について、遺伝子の発現、タンパク質量がどのように変化しているか、qPCR法、Western blotting法、免疫組織学法により解析する。また同時に、RNA-seq法を用いてPcgf5遺伝子KOマウス心臓における遺伝子発現変化を詳細に解析し、Pcgf5の標的遺伝子を探索する。3.成熟心筋細胞へのストレスに対する恒常性維持機構における、Pcgf5及びその標的遺伝子の機能解析:前年度に引き続き、薬剤投与により心臓へのストレス負荷を行い、ヒストン修飾の状態をWestern blotting法を用いて解析するとともに、Pcgf5遺伝子KOマウス心臓で発現量の変化が見られた遺伝子について、ストレス負荷時により大きな変化が見られるかどうか解析する。1.次世代シークエンサーを用いた、Pcgf5タンパク質標的遺伝子の探索:ヒストンの修飾状態に対する抗体を用いて、Pcgf5遺伝子KOマウス及び野生型マウス心臓から抽出したDNA断片をChIP-seqにより大量解析し、ヒストン修飾状態を網羅的に解析する。また、Pcgf5タンパク質に対する特異的抗体を手に入れることができたため、Pcgf5タンパク質が結合するDNA断片を抽出し、同様にChIP-seq法により、標的遺伝子を探索する。Pcgf5遺伝子KOマウスの心臓においてヒストン修飾状態が変化していた領域、Pcgf5タンパク質結合遺伝子について、遺伝子の発現、タンパク質量がどのように変化しているか、qPCR法、Western blotting法、免疫組織学法により解析する。
極洋の魚類より抽出された不凍タンパクを用いた膵島細胞の凍結保存法の開発

【背景】重症糖尿病に対する膵島細胞移植の成績は、細胞培養法や免疫抑制法の進歩により飛躍的に改善している。しかしながらドナーの絶対的不足と複数ドナーからの膵島が必要なことが普及の障害となっており、オンデマンド供給の可能な膵島細胞の効率的な凍結保存法が求められている。不凍糖タンパクは南極や北極近海の水温が零下になる極洋の魚が保有しているタンパク質である。魚は通常-0.7°C程で凍結してしまうが、不凍蛋白をもつ魚は-2°C以下まで海水温が下がっても凍結しない、このことによって、極洋でも生存が可能になっているのである。前年度の研究により合成不凍糖タンパクが氷晶形成抑制により凍結解凍時に膵島保護効果を持つことを明らかにしたが、その後の研究により低温保存時により強い保護効果を持つことが明らかとなった。【目的】不凍糖タンパクの持つ低温ストレスに対する膵島保護効果を明らかにする。【方法】C57B6マウスより膵島を分離UW保存液中で72時間4°Cで低温保存を行った。その後、STZ糖尿病C57B6マウス腎被膜下に600個の膵島を移植、移植後の血糖値正常化率をUW保存液中にGalGalNAc合成不凍糖タンパク30mg/ml添加群と非添加群で比較した。また移植後7日目にIPGTT(ブドウ糖負荷試験)を行い血糖値の推移を比較した。【結果】合成不凍糖タンパク添加群では7例中6例(85.7%)で血糖値の正常化が得られたのに対し、非添加群では5例中血糖値の正常化が得られたものはなかった(0%)。移植後30日目に膵島を移植した腎臓を摘出し、血糖値の再上昇を確認。血糖値の正常化が低温保存膵島移植によるものであることを確認した。移植後7日目に行ったIPGTTにおいて合成不凍糖タンパク添加群では正常マウスの血糖推移に近い血糖推移が認められた。非添加群では血糖値の低下はまったく認められなかった。【結論】合成不凍糖タンパクは72時間4°Cという長時間の低温ストレスからマウス膵島を保護し、移植後の膵島機能を維持した。また、臓器と異なり、膵島細胞は凍結保存が可能である点も臨床上の大きなメリットである。【目的】細胞の凍結保存で最大の問題は細胞内外の水分が氷晶化することによって細胞破壊がおきることである。不凍糖タンパクには氷結晶成長抑制作用があり、この性質を膵島の凍結保存に応用することを試みた。【方法】8週齢雄性Wistarラットより膵管内コラゲナーゼ消化法、Ficoll-Conray比重遠心法にて膵島を単離。RPMI164010%FCS 37°C5%CO2にて24時間前培養後、2M DMSO RPMI1640 10%FCSに不凍糖タンパクを01000μg/mlの各濃度にて添加、プログラムフリーザーを用い-0.3°C/minにて植氷を-5.5°Cにて行い、-40°Cまで緩徐凍結、その後、液体窒素中(気相)に1週間保存した。凍結膵島は37°Cウォーターバスにて急速解凍し、0.75MスクロースRPMI1640にてDMSOを除去した後、RPMI1640 10%FCS 37°C5%CO2にて24時間培養後、評価をおこなった。さらに、凍結過程を低温顕微鏡を用い観察した。【結果】凍結前後の膵島回復率(凍結後膵島数/凍結前膵島数)は、不凍糖タンパク500μg/mlにて85.0+/-2.6%(mean+/-SEM)ともっとも良好で、非添加群では63.3+/-5.8%であった(p<0.05)。グルコース応答性インスリン分泌能(Static Stimulation Index)は不凍糖タンパク500μg/mlにて3.86+/-0.43%ともっとも良好で、非添加群では2.98+/-0.22%であった(p<0.05)。低温顕微鏡による凍結過程の観察によって合成不凍糖タンパク500μg/mlのときにもっとも膵島に対し保護的な氷晶形成抑制を認めた。逆に高濃度(1000μg/ml以上)の場合、針状結晶を形成し凍結時膵島を破壊した。【結論】不凍糖タンパクは500μg/mlという、ある定まった濃度において凍結解凍時、膵島に対し保護効果を認めた。

しかしながらドナーの絶対的不足と複数ドナーからの膵島が必要なことが普及の障害となっており、オンデマンド供給の可能な膵島細胞の効率的な凍結保存法が求められている。不凍糖タンパクは南極や北極近海の水温が零下になる極洋の魚が保有しているタンパク質である。魚は通常-0.7°C程で凍結してしまうが、不凍蛋白をもつ魚は-2°C以下まで海水温が下がっても凍結しない、このことによって、極洋でも生存が可能になっているのである。前年度の研究により合成不凍糖タンパクが氷晶形成抑制により凍結解凍時に膵島保護効果を持つことを明らかにしたが、その後の研究により低温保存時により強い保護効果を持つことが明らかとなった。【目的】不凍糖タンパクの持つ低温ストレスに対する膵島保護効果を明らかにする。【方法】C57B6マウスより膵島を分離UW保存液中で72時間4°Cで低温保存を行った。その後、STZ糖尿病C57B6マウス腎被膜下に600個の膵島を移植、移植後の血糖値正常化率をUW保存液中にGalGalNAc合成不凍糖タンパク30mg/ml添加群と非添加群で比較した。また移植後7日目にIPGTT(ブドウ糖負荷試験)を行い血糖値の推移を比較した。【結果】合成不凍糖タンパク添加群では7例中6例(85.7%)で血糖値の正常化が得られたのに対し、非添加群では5例中血糖値の正常化が得られたものはなかった(0%)。移植後30日目に膵島を移植した腎臓を摘出し、血糖値の再上昇を確認。血糖値の正常化が低温保存膵島移植によるものであることを確認した。移植後7日目に行ったIPGTTにおいて合成不凍糖タンパク添加群では正常マウスの血糖推移に近い血糖推移が認められた。非添加群では血糖値の低下はまったく認められなかった。【結論】合成不凍糖タンパクは72時間4°Cという長時間の低温ストレスからマウス膵島を保護し、移植後の膵島機能を維持した。
フォスカルネット耐性ヘルペスウイルス感染症の治療法と迅速診断法のための基礎研究

Wiskott-Aldrich症候群患者に対する免疫能構築のためHLA一致同種骨髄移植を施行した.増悪したHSV-1感染による皮膚病変に対しフォスカルネット(PFA)投与療法を行ったが,PFA投与約1ヶ月後にPFA耐性HSV-1が分離された.免疫不全患者が増加している今日,PFA耐性ヘルペスウイルス感染症の増加が予想される.今年度は,PFA耐性HSV-1感染症の治療法に関する知見を得るため,以下の実験を行った.単純ヘルペスウイルス1型(HSV-1)TAS株からプラーク精製された33クローンを作製した.そのプラーク精製された各HSV-1クローンをそれぞれフォスカルネット(PFA)添加培地にて培養することによって,PFA耐性HSV-1を作製し,さらにそのPFA耐性HSV-1から,プラーク精製によって33クローンのPFA耐性HSV-1株を作成した.これらPFA耐性HSV-1 33クローンのシドフォビル(CDV),グアノシンアナログ系抗ウィルス剤[アシクロビル(ACV),ガンシクロビル(GCV),ペンシクロビル(PCV), S2242]に対する感受性をVero細胞におけるプラーク減少法で評価した.PFA感受性親株(PFA添加前のウイルス)および実験株代表としてVR-3株の各種抗ウイルス剤に対する感受性を検討した.親株やVR-3株より高い感受性を示した場合を過感受性,ほぼ同等に感受性を示す場合を感受性、より低い感受性を示した場合を耐性とした.PFA耐性株33クローンの薬剤感受性は, CDVに対して過感受性33株中13株(39%)感受性16株(48%)耐性4株(12%),ACVに対して過感受性0株(0%)感受性17株(52%)耐性16株(48%),GCVに対して過感受性3株(9%)感受性29株(88%)耐性1株(3%),PCVに対して過感受性0株(0%)感受性21株(64%)耐性12株(36%)S2242に対して過感受性0株(0%)感受性13株(39%)耐性20株(61%)であった.このようにPFA耐性株が他の抗ウイルス剤に交差耐性を示す場合がある一方,親株に比較してより高い感受性や同等の感受性を示す場合がある.特にGCVに交差耐性を示したものは3%のみであった.これらの成績は,チミジン燐酸化酵素に変異を伴わないPFA耐性株が出現したとしても,他の薬剤による治療が可能であることを示唆している.この薬剤感受性パターンとDNAポリメラーゼとの関連を解析中である.アシクロビル(ACV)耐性単純ヘルペスウイルス1型(HSV-1)感染症の既往のあるWiskott-Aldrich症候群患者に対する免疫能構築のためHLA一致同種骨髄移植を施行した.増悪したHSV-1感染による皮膚病変に対しフォスカルネット(PFA)投与療法を行ったが,PFA投与約1ヶ月後にPFA耐性HSV-1(R98/3株)が分離された.PFA投与前に分離されたACV耐性HSV-1(R98/l株)のチミジンリン酸化酵素(TK)遺伝子には,1061-1064番目の塩基配列にみられる4連続するCの配列からのCの1塩基欠損が認められた.このTK遺伝子変異は,1994年以降本患者から分離されたACV耐性HSV-1のTK遺伝子変異(J Med Virol 58:387-393,1999)と同じであった.R98/1株とR98/3株はともにACVに対して耐性[Vero細胞を用いたプラーク減少法で測定したACVの50%ウイルス増殖抑制濃度(50%inhibitory concentration;IC_<50>)は,ともに>100μg/ml]であったが,PFAにはそれぞれ感受性(PFAのIC_<50>:20μg/ml),耐性(PFAのIC_<50>:>100μg/ml)であった.R98/3株のTK遺伝子配列を決定したところ,R98/1株のTK遺伝子変異と同じ変異が認められた.さらに両株のDNAポリメラーゼ(DNApol,UL30)遺伝子塩基配列を直接シークエンス法で決定し比較したところ,後者のDNApol遺伝子の2144番目の塩基TがGに置換し,この変異により保存領域IIに位置する715番目のアミノ酸バリン(V)がグリシン(G)に置換していた.DNApol遺伝子にはその他の変異は認められなかった.この遺伝子変異(V715G)がPFAに対する耐性を獲得させたものと考えられた.PFA耐性R98/3株はTK遺伝子における1塩基欠損とDNApol遺伝子における1塩基置換の二重変異を有していることが明らかにされた.R98/1株とR98/3株のウイルス増殖能(one step growth)は,本患者から分離されたACV感受性HSV-1 TAS株に比較して,それぞれ3分の2,3分の1に低下していた.また,HSV-1 R98/3株のTK遺伝子変異はTK欠損株であることを示し,マウスに対する神経病原性は低いと考えられた(日児誌102:402-409,1998).Wiskott-Aldrich症候群患者に対する免疫能構築のためHLA一致同種骨髄移植を施行した.増悪したHSV-1感染による皮膚病変に対しフォスカルネット(PFA)投与療法を行ったが,PFA投与約1ヶ月後にPFA耐性HSV-1が分離された.

免疫不全患者が増加している今日,PFA耐性ヘルペスウイルス感染症の増加が予想される.今年度は,PFA耐性HSV-1感染症の治療法に関する知見を得るため,以下の実験を行った.単純ヘルペスウイルス1型(HSV-1)TAS株からプラーク精製された33クローンを作製した.そのプラーク精製された各HSV-1クローンをそれぞれフォスカルネット(PFA)添加培地にて培養することによって,PFA耐性HSV-1を作製し,さらにそのPFA耐性HSV-1から,プラーク精製によって33クローンのPFA耐性HSV-1株を作成した.これらPFA耐性HSV-1 33クローンのシドフォビル(CDV),グアノシンアナログ系抗ウィルス剤[アシクロビル(ACV),ガンシクロビル(GCV),ペンシクロビル(PCV), S2242]に対する感受性をVero細胞におけるプラーク減少法で評価した.PFA感受性親株(PFA添加前のウイルス)および実験株代表としてVR-3株の各種抗ウイルス剤に対する感受性を検討した.親株やVR-3株より高い感受性を示した場合を過感受性,ほぼ同等に感受性を示す場合を感受性、より低い感受性を示した場合を耐性とした.PFA耐性株33クローンの薬剤感受性は, CDVに対して過感受性33株中13株(39%)感受性16株(48%)耐性4株(12%),ACVに対して過感受性0株(0%)感受性17株(52%)耐性16株(48%),GCVに対して過感受性3株(9%)感受性29株(88%)耐性1株(3%),PCVに対して過感受性0株(0%)感受性21株(64%)耐性12株(36%)S2242に対して過感受性0株(0%)感受性13株(39%)耐性20株(61%)であった.このようにPFA耐性株が他の抗ウイルス剤に交差耐性を示す場合がある一方,親株に比較してより高い感受性や同等の感受性を示す場合がある.特にGCVに交差耐性を示したものは3%のみであった.これらの成績は,チミジン燐酸化酵素に変異を伴わないPFA耐性株が出現したとしても,他の薬剤による治療が可能であることを示唆している.この薬剤感受性パターンとDNAポリメラーゼとの関連を解析中である.