hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
温度感受性腫瘍抗原遺伝子を用いた不死化角膜輪部上皮細胞株の作成と性状分析

長期にわたる継代培養が困難とされる角膜上皮細胞の代替として不死化細胞株を作成するため、研究者らはウイルス癌遺伝子の一つであるSV40ウイルスのもつ大型腫瘍抗原(以下、T抗原)遺伝子を角膜上皮細胞内に導入し、不死化培養角膜上皮細胞株の作成に成功した。しかし、その後の研究により細胞の悪性癌化を示す軟寒天内増殖能を有することや、一部の細胞骨格ケラチンの発現がないことなど形質転換が認められるに至った。本研究では、さらに正常角膜上皮細胞に性状の近い不死化株を作成するために前述のSV40ウイルスの突然変異株から分離された、温度感受性T抗原遺伝子の導入を行ない不死化株の性状分析を行なった。温度感受性T抗原遺伝子は温度依存的にT抗原の発現が変化し、野性株由来のT抗原遺伝子と異なり通常の培養温度より高温い非許容温度ではT抗原の発現が認められず、癌遺伝子としての機能が不活化されることから、培養温度を変化させることで不死化を制御することが可能である。今回、本遺伝子を導入した不死化株では1)37°Cではconfluent状態においても高い増殖能を示すが、42°Cではconfluent状態において重層化した細胞は増殖せず、正常角膜上皮細胞に類似した増殖曲線を示した。2)各々の抗体を用いた免疫蛍光染色において角膜上皮細胞特有の細胞骨格ケラチンは42°Cでより多く発現する一方、T抗原発現は37°Cでは常に発現が認められたが、42°Cでは増殖能の低下にともない経時的に減少した。3)位相差顕微鏡および走査型、透過型電子顕微鏡を用いた観察で42°Cで培養した細胞は正常角膜上皮細胞に類似した形態を示した。これらの結果、この温度感受性不死化株は非許容温度ではより正常角膜上皮細胞に類似した性状を保持していると考えられ、培養角膜上皮細胞の代替として細胞生物学的研究に有用であると考えられた。
ポリエン抗生物質アムホテリシンBが形成する超分子チャンネル複合体の構造解析

抗生物質アムホテリシンB(AmB)は、感染症治療に広く用いられている重要な抗真菌剤の一つである。その抗真菌作用は細胞膜におけるイオンチャネル複合体の形成により発現するとされており、選択毒性は膜含有ステロールの違いによると考えられている。しかしチャネル複合体の構造やステロール認識機構については未解明のままである。本研究では、AmBチャネル複合体の構造を明らかにするとともに、AmB分子同士間およびAmB-ステロール間の分子認識機構の解明を目指す。前年までにAmBを越えるチャネル活性を有するAmB連結二量体の作成に成功し、顕著な整流性を有することを示した。またAmB-ステロール連結体については、エルゴステロールを連結させた場合にコレステロール連結体よりもチャネル活性が高く、AmBのエルゴステロール選択性を連結体においても再現できた。さらに生合成的に調製した^<13>C標識AmBを用い、脂質膜中でのAmB分子の配向を固体NMRで調べた結果、AmBは単分子長で膜を貫通する配向をとっていることを明らかにした。同時に、距離測定に適した^<19>Fを化学的に導入したAmBの調製にも成功し、AmBと同等の活性を有することを明らかにした。今年度は、^<13>C標識AmBと^<19>F標識ステロールとの連結体を調製し、^<19>F-^<13>C間の固体NMR距離測定を行った。その結果、AmBとステロールが平行に並んで相互作用していることが明らかになった。また、^<13>C標識AmBと^<19>F標識AmB間の^<19>F-^<13>C間距離測定を行い、AmB同士が極性部分同士で相互作用していることを明らかにした。さらに、AmBの糖部分の配座を決定するため、分子内で架橋して糖部分の配座を固定した誘導体を調製した。その結果、チャネル複合体形成時における糖部分の配座の推定に成功するとともに、ステロールとの相互作用に糖の配座が重要であることを明らかにした。ポリエン抗生物質アムホテリシンB(AmB)は感染症治療に広く用いられており、極めて重要な抗真菌剤のひとつである。その抗真菌作用は主に細胞膜におけるイオンチャネル複合体の形成により発現するとされており、選択毒性は膜含有ステロールの分子認識の違いにより説明されている。しかし、チャンネル複合体の構造やステロール認識の機構については、未だ不明のままである。本研究では、AmBとステロールによって生体膜中で形成されるチャンネル複合体の構造を明らかにするとともに、AmB分子同士間、およびAmB-ステロール間の分子認識機構を解明することを目的とする。まず、脂質膜中でのAmBチャンネル複合体の安定化を図るため、AmB同士、またはAmBとステロールの連結分子を調製した。すでに申請者らはAmBと同等のチャンネル活性を有するAmB二量体分子の作成に成功しているが、これまでリンカーの結合部位としてAmBのアミノ基のみを用いてきた。そこで、平成14年度はAmBのカルボキシル基同士を連結した二量体の調製を行った。その結果、この二量体も強力な生物活性を有し、かつ脂質二重膜に作用してイオン透過性を向上させることが明らかとなった。このことは、二分子を連結させることでチャンネル複合体が安定化されたことを示している。さらに、AmBチャネル複合体はAmBのアミノ基とカルボキシル基間の分子間相互作用によって形成されていると考えられているので、この部分を連結させた二量体の調製も開始した。また、固体NMRによる距離測定を行うためのAmB標識体の調製も行った。AmB生産菌に^<13>C標識したプロピオン酸やグルコースを取り込ませることで、位置特異的もしくはユニホームに^<13>C標識されたAmBの調製に成功した。同時に、化学的に^<19>Fを導入したAmBやステロールの調製にも成功した。現在これら標識分子を用い、チャネル複合体形成時における^<19>F-^<13>C間の距離測定を行っている。抗生物質アムホテリシンB (AmB)は感染症治療に広く用いられており、重要な抗真菌剤の一つである。その抗真菌作用は主に細胞膜におけるイオンチャネル複合体の形成により発現するとされており、選択毒性は膜含有ステロールの違いによると考えられている。しかしチャネル複合体の構造やステロール認識機構については、未解明のままである。前年度にAmBと同等のチャンネル活性を有するAmB二量体分子の作成に成功しているが、これまでは長鎖リンカーを用いてきた。今回、短鎖かつ極性基を含むリンカーを用いて二量体を調製したところ、従来の10倍程度の活性を有することが明らかとなった。短鎖リンカーによりAmB同士が隣り合った配座をとりやすくなり、チャネル複合体が安定化されたためと考えられる。また、この短鎖二量体はチャネル電流測定において顕著な整流性を示した。非ペプチド性イオンチャネルで整流性が認められた例は少なく、今後の機能性イオンチャネルへの応用が期待できる。

またAmB-ステロール連結体については、エルゴステロールを連結させた場合にコレステロール連結体よりもチャネル活性が高く、AmBのエルゴステロール選択性を連結体においても再現できた。さらに、^<13>C標識したAmBと^<19>F標識したステロールとの連結体の調製も完了し、^<19>F-^<13>C間の距離測定を行っている。さらに生合成的に調製した^<13>C標識AmBを用い、脂質膜中でのAmB分子の配向を固体NMRにより調べた。その結果、AmBは単分子長で膜を貫通する配向をとっていることが明らかとなった。同時に、距離測定に適した^<19>Fを化学的に導入したAmBの調製にも成功し、AmBと同等の活性を有することを明らかにした。抗生物質アムホテリシンB(AmB)は、感染症治療に広く用いられている重要な抗真菌剤の一つである。その抗真菌作用は細胞膜におけるイオンチャネル複合体の形成により発現するとされており、選択毒性は膜含有ステロールの違いによると考えられている。しかしチャネル複合体の構造やステロール認識機構については未解明のままである。本研究では、AmBチャネル複合体の構造を明らかにするとともに、AmB分子同士間およびAmB-ステロール間の分子認識機構の解明を目指す。前年までにAmBを越えるチャネル活性を有するAmB連結二量体の作成に成功し、顕著な整流性を有することを示した。さらに生合成的に調製した^<13>C標識AmBを用い、脂質膜中でのAmB分子の配向を固体NMRで調べた結果、AmBは単分子長で膜を貫通する配向をとっていることを明らかにした。今年度は、^<13>C標識AmBと^<19>F標識ステロールとの連結体を調製し、^<19>F-^<13>C間の固体NMR距離測定を行った。その結果、AmBとステロールが平行に並んで相互作用していることが明らかになった。また、^<13>C標識AmBと^<19>F標識AmB間の^<19>F-^<13>C間距離測定を行い、AmB同士が極性部分同士で相互作用していることを明らかにした。さらに、AmBの糖部分の配座を決定するため、分子内で架橋して糖部分の配座を固定した誘導体を調製した。その結果、チャネル複合体形成時における糖部分の配座の推定に成功するとともに、ステロールとの相互作用に糖の配座が重要であることを明らかにした。
近代都市環境形成史における近代和風庭園の研究

伝統的庭園の存在は、近代化の過程のなかで、新興勢力の実力者たちのあいだで、富と権力の象徴であった。その意味で、伝統的庭園は過去に属するものではなく、近代という時代に属するものなのである。本研究においては、典型的な近代和風庭園および新興富裕層に属するパトロンたちを、詳細に亘って分析している。すなわちそれらは、庭師である小川治兵衛、パトロンとしての三渓・原富太郎、渋沢栄一である。本研究では、上記の構図に従って近代都市環境形成期における重要な庭園が選択され、分析されている。すなわち小川治兵衛の主要作品群、原富太郎による横浜の三渓園、そして渋沢栄一の営んだ東京飛鳥山本邸の庭園などが深く考究されることとなった。その結果示されるのは、以下のような近代和風庭園の本質である。すなわち、それらは近代化の時代の時代精神の表現なのである。近代化と伝統的表現は、決して背反するものではなく、むしろひとつのコインの両面なのである。本研究の構成は下記である。1.序論日本庭園2.数寄者とパトロン・棟梁と建築家3.庭師小川治兵衛とその時代序論4.米国庭園倶楽部の来日と小川治兵衛の庭園5.三渓園と原富太郎6.近代日本庭園の名作としての三渓園7.瞹依村荘庭園の歴史的位置づけ伝統的庭園の存在は、近代化の過程のなかで、新興勢力の実力者たちのあいだで、富と権力の象徴であった。1.序論日本庭園2.数寄者とパトロン・棟梁と建築家3.庭師小川治兵衛とその時代序論4.米国庭園倶楽部の来日と小川治兵衛の庭園5.三渓園と原富太郎6.近代日本庭園の名作としての三渓園7.瞹依村荘庭園の歴史的位置づけ研究計画に従い、近代和風庭園調査を広げてゆき、一応の結論を得た。大きな成果としては、2006年に開園100周年を迎えた横浜の三渓園の形成過程とその中心にあった原富太郎の事跡を整理する作業がまとめられた。これには三渓園の全面的な協力を得ることができた。原富太郎(三渓)の岐阜県に所在する実家(青木家)および埼玉県と群馬県の境に所在する原家の現地調査を行い、和風文化の源流を探ることができた。これは三渓園保勝会から冊子として刊行された。同種の調査としては、東京に残る和風庭園として広尾に存在するドイツ大使館公邸庭園、三田綱町に存在するオーストラリア大使館庭園を調査することができた。いずれも江戸時代、明治時代を通じて維持されてきた庭園であり、前者は小泉策太郎、後者は蜂須賀侯爵家によって近代和風庭園として整備されたものである。申請者は過去にイギリス大使館庭園、ベルギー大使館庭園の調査も行っており、こうした調査をさらに拡大する予定である。このような成果は報告書のかたちによる刊行と、専門学術機関誌における公表とを想定している。また、上記成果は情報データベースとして整理できるかたちにし、今後の活用に備える。現在研究代表者は内閣府による和風迎賓館の構想懇談会、構想具体化検討会の委員および座長として検討に加わっているが、その作業を通じても近代和風住宅ならびに庭園の性格を明らかにする作業は大いに進展させることができた。研究計画に従い、近代和風庭園調査を広げてゆき、一応の結論を得た。このような調査の成果は西洋館と庭園の関係という視点にも拡大した。現在研究代表者は、内閣府による和風迎賓館の構想懇談会、構想具体化検討会の委員および座長とし検討に加わっているが、その作業を通じても、近代和風住宅ならびに庭園の性格を明らかにする作業は大いに進展させることができた。
食品中のコラーゲンの代謝およびその効果に関する研究

コラーゲンおよびコラーゲン分解物を摂取することによる生理機能は不明な点が多いが、その骨や皮膚への効果が報告されていることから健康補助食品として認知されている。そこで本研究では、食品として摂取されたコラーゲンが、胃および小腸で消化され、腸管から吸収、血中へ移行する代謝過程を追跡し、骨形成への影響について検討する事で、コラーゲンの新たな機能を解明する。本研究では、動物モデルに対するコラーゲン投与の影響について検討した。まず、骨粗鬆症モデル、自然発症型関節症モデルおよび皮膚萎縮モデルへのコラーゲン投与の効果について検討した。コラーゲンを給餌することにより、骨粗鬆症においては骨密度の改善および骨中のコラーゲン量の増加を認めた。関節症においては、膝関節部の軟骨損傷の改善効果が認められた。関節液中の遊離ヒドロキシプロリン量が増加し、骨端中のプロテオグリカンの増加を認めた。これらの成果の一部を食品加工技術に報告している。皮膚萎縮モデルは、I型糖尿病を誘導することで皮膚の萎縮を引き起こす。コラーゲン投与により若干真皮の厚みが増した。コラーゲン摂取は骨だけでなく、皮膚にも何らかの効果を示すものと思われる。また、コラーゲン代謝の研究のため、コラーゲン投与後のラットから経時的に採血し、血中の遊離アミノ酸の推移を測定した。その結果、コラーゲン量は、投与30分をピークとして6時間後には一定の値を示した。新たなコラーゲン資源探索のため、サメの各種臓器からコラーゲンの抽出を行った。コラーゲン特有のアミノ酸であるヒドロキシプロリンは、皮膚や軟骨以外に眼球や腸に認められた。また、筋肉中には抗コラーゲン抗体に反応する物質の存在を認めた。コラーゲンを構成するアミノ酸の大部分は必須アミノ酸ではなく、蛋白質の栄養成分としての評価基準であるアミノ酸スコアは0である。コラーゲンおよびコラーゲン分解物の生理機能は不明な点が多く、経口摂取による効果が明確でないにも関わらず健康補助剤として認知されている。'そこで本研究では、食品として摂取されたコラーゲンが、胃および小腸で消化され、腸管から吸収、血中へ移行する代謝過程を追跡し、骨形成への影響について検討する事で、コラーゲンの新たな機能を解明する。本年度の研究では、動物モデルに対するコラーゲン投与の影響について検討した。まず、卵巣摘出を行いエストロジェンの分泌を止めた(ovx)ラットを作製し骨粗鬆症への効果を検討した。また、自然発症型の関節症を誘発するモルモットへの効果についても検討した。これらの実験系において、コラーゲンやコラーゲン加水分解物を給餌することにより、骨粗鬆症においては、骨密度の改善を認めている。特に、骨基質の合成が盛んな海綿骨における骨密度の上昇が顕著であり、コラーゲン量の増加が確認できた。関節症においては、疾患部位における改善効果が認められた。これらの成果を、JAACT2002,Fuchuで発表している。新たなコラーゲン資源を開発し、その利用法を確立するため、水生動物由来のコラーゲンに着目した研究も行っている。従来から供給されている陸生動物由来のコラーゲンとの比較を行い、生化学材料としての利用特性を明らかにし、Biosci.Biotechnol.Biochem.,66,2673-2676(2002)に報告している。

そこで本研究では、食品として摂取されたコラーゲンが、胃および小腸で消化され、腸管から吸収、血中へ移行する代謝過程を追跡し、骨形成への影響について検討する事で、コラーゲンの新たな機能を解明する。本年度の研究では、動物モデルに対するコラーゲン投与の影響について検討した。まず、骨粗鬆症モデル、自然発症型関節症モデルおよび皮膚萎縮モデルへのコラーゲン投与の効果について検討した。コラーゲンを給餌することにより、骨粗鬆症においては骨密度の改善および骨中のコラーゲン量の増加を認めた。関節症においては、膝関節部の軟骨損傷の改善効果が認められた。関節液中の遊離ヒドロキシプロリン量が増加し、骨端中のプロテオグリカンの増加を認めた。これらの成果の一部を食品加工技術に報告している。皮膚萎縮モデルは、I型糖尿病を誘導することで皮膚の萎縮を引き起こす。コラーゲン投与により若干真皮の厚みが増した。コラーゲン摂取は骨だけでなく、皮膚にも何らかの効果を示すものと思われる。また、コラーゲン代謝の研究のため、コラーゲン投与後のラットから経時的に採血し、血中の遊離アミノ酸の推移を測定した。その結果、コラーゲン量は、投与30分をピークとして6時間後には一定の値を示した。新たなコラーゲン資源探索のため、サメの各種臓器からコラーゲンの抽出を行った。コラーゲン特有のアミノ酸であるヒドロキシプロリンは、皮膚や軟骨以外に眼球や腸に認められた。また、筋肉中には抗コラーゲン抗体に反応する物質の存在を認めた。
ユビキチン付加部位変異p53の癌遺伝子治療への応用に関する基礎的研究

癌抑制遺伝子p53蛋白質は,MDM2を介する分解を受けるが,その際,p53にユビキチンが付加され,最終的にプロテアソームで分解される.ユビキチン付加部位の候補として,C末端領域のリシン残基が考えられる.370,372,373,381,380のリシン残基をアラニンに置換した変異p53を作製して,そのユビキチン化の程度,細胞に与える影響を解析した.これらのリシン残基を4つ以上変異したp53をMDM2発現プラスミドとともに,非小細胞肺癌細胞株(H1299)で発現させると,野生型p53とMDM2の共発現で認められるような,p53蛋白レベルの低下,ユビキチン付加が認められなかったことより,p53C末端領域のリシン残基が重要であることが示唆された.しかし,それぞれのリシン残基単独の突然変異では,MDM2との共発現でp53蛋白レベルの低下,ユビキチン付加が認められたことより,これらのリシン残基の中で,ユビキチン付加部位として単独のリシン残基を想定するよりも,複数のリシン残基が同時にユビキチン付加を受けることが,p53分解に重要であると考えられた.このリシン残基変異p53の消化器癌に対しての治療効果を検討するため,大腸癌細胞株(Colo201,LoVo,WiDr)を用いて,リシン残基p53発現プラスミドをトランスフェクションし,コロニー形成能に与える影響を検討した.しかしながら,十分な発現を得ることが困難であり,効率の良い遺伝子導入法が必要となった.そのため,リシン残基p53発現アデノウイルスを作製した.今後は,このアデノウイルスを用いて,消化器癌細胞への効果を検討する予定である.癌抑制遺伝子p53蛋白質は,MDM2を介する分解を受けるが,その際,p53にユビキチンが付加され,最終的にプロテアソームで分解される.ユビキチン付加部位の候補として,C末端領域のリシン残基が考えられる.370,372,373,381,380のリシン残基をアラニンに置換した変異p53を作製して,そのユビキチン化の程度,細胞に与える影響を解析した.これらのリシン残基を4つ以上変異したp53をMDM2発現プラスミドとともに,非小細胞肺癌細胞株(H1299)で発現させると,野生型p53とMDM2の共発現で認められるような,p53蛋白レベルの低下,ユビキチン付加が認められなかったことより,p53C末端領域のリシン残基が重要であることが示唆された.しかし,それぞれのリシン残基単独の突然変異では,MDM2との共発現でp53蛋白レベルの低下,ユビキチン付加が認められたことより,これらのリシン残基の中で,ユビキチン付加部位として単独のリシン残基を想定するよりも,複数のリシン残基が同時にユビキチン付加を受けることが,p53分解に重要であると考えられた.リシン残基の変異がp53に与える影響は,主にH1299を用いて解析している.リシン残基変異p53は,野生型と同様,G1およびG2期で細胞周期停止を来した.γ線照射に対しては,野生型p53がアポトーシス誘導に働くのに対して,リシン残基変異p53は,より長時間のG2期停止を来たす一方,アポトーシスに対しては抑制的に働くことが示唆された.癌抑制遺伝子p53蛋白質は,MDM2を介する分解を受けるが,その際,p53にユビキチンが付加され,最終的にプロテアソームで分解される.ユビキチン付加部位の候補として,C末端領域のリシン残基が考えられる.370,372,373,381,380のリシン残基をアラニンに置換した変異p53を作製して,そのユビキチン化の程度,細胞に与える影響を解析した.これらのリシン残基を4つ以上変異したp53をMDM2発現プラスミドとともに,非小細胞肺癌細胞株(H1299)で発現させると,野生型p53とMDM2の共発現で認められるような,p53蛋白レベルの低下,ユビキチン付加が認められなかったことより,p53C末端領域のリシン残基が重要であることが示唆された.しかし,それぞれのリシン残基単独の突然変異では,MDM2との共発現でp53蛋白レベルの低下,ユビキチン付加が認められたことより,これらのリシン残基の中で,ユビキチン付加部位として単独のリシン残基を想定するよりも,複数のリシン残基が同時にユビキチン付加を受けることが,p53分解に重要であると考えられた.このリシン残基変異p53の消化器癌に対しての治療効果を検討するため,大腸癌細胞株(Colo201,LoVo,WiDr)を用いて,リシン残基p53発現プラスミドをトランスフェクションし,コロニー形成能に与える影響を検討した.しかしながら,十分な発現を得ることが困難であり,効率の良い遺伝子導入法が必要となった.そのため,リシン残基p53発現アデノウイルスを作製した.今後は,このアデノウイルスを用いて,消化器癌細胞への効果を検討する予定である.
脳における水チャネル、アクアポリンの分布局在の検討

本研究では、脳における水代謝を理解する目的で、水チャネルであるアクアポリンの分布局在を詳細に検討した。脳においては広範囲にわたってアクアポリン4が神経膠細胞であるアストロサイトの細胞膜に分布することが分かった。これまでアクアポリン4は血管周囲に限局するとされていたが、より広範囲に分布し、脳内の水の移動にきわめて重要なはたらきをしていることが推察された。また、脳を含めて広範囲にアクアポリンの分布を調べた結果、マウスの呼吸器系上皮ではアクアポリン5がラットの呼吸器系上皮よりも広範囲にわたって分布することを見出し、呼吸機能におけるアクアポリン5の重要性が示唆された。本研究では、脳内の水の移動ルートおよびその発生過程に伴う変化を理解することを目的とし、脳におけるアクアポリン(AQP)水チャネルの分布局在を検討する。本年度は申請者が作製したAQP1、AQP2、AQP3、AQP4、AQP5の特異抗体を用いてラット中枢神経における分布を免疫組織化学的に検討した。その結果、AQp1とAQP4が分布することが確認された。AQp1は脳室脈絡組織に分布したが、脳実質には分布しなかった。AQP4は脳実質の広範囲に分布した。AQP4は脳の血管周囲の神経膠細胞終足に分布することが報告されているが、血管周囲に限らず広範囲に分布することから、その分布を詳細に検討した。血管のマーカーとして糖輸送体GLUT1(glucose transporter 1)、神経細胞のマーカーとしてNeuN(neuronal nuclei)、神経膠細胞のマーカーとしてGFAP(glial fibrillaly acidic protein)を用いてAQP4との蛍光二重染色をおこない脊髄から脳の全領域を検討した。その結果、AQP4は血管周囲に限らず、神経膠細胞全体に分布することがわかりつつある。さらに種々の神経核では個々の神経細胞の周囲を取り囲むような強いAQP4の免疫反応が得られた。そのほかにも非常に強い免疫反応が得られる領域があることがわかった。これらAQP4の分布がとくに多い領域では、とりわけ水の供給量が多いことが想定され、興味深い結果である。AQP4の血管周囲の神経膠細胞終足への局在は、AQP4がアダプタータンパク質を介してアクチン細胞骨格と結合することで保たれる可能性が示唆されている。アダプタータンパク質の候補のひとつとしてRIL(reversion-induced LIM protein)に注目し、RILとAQP4との関係の解析もおこない論文として発表した。本研究は、脳内の水の移動ルートおよびその発生過程に伴う変化を理解することを目的とし、脳におけるアクアポリン(AQP)水チャネルの分布局在を検討してきた。前年度はラットを用いた解析をおこなったが、本研究者がこれまでにおこなってきたAQPの研究から、ラットとマウスではAQPの発現様式に違いが見られることが示唆される。AQPノックアウトマウスの解析をおこなう上での基礎データとして、マウスにおけるAQPの正確な分布局在を明らかにすることはきわめて重要であり、本年度はラットとマウスの比較検討をおこなった。脳を中心としてマウス組織を広範囲に検討していたところ、マウスの呼吸器系でのAQPの分布局在に興味深い結果が得られたので、詳細な検討をおこない論文として発表した。ラットではAQP5の発現は上部呼吸器の腺細胞とI型肺胞上皮細胞に限られるとの報告があるが、本研究でマウスの呼吸器上皮を詳細に検討したところ、鼻腔から肺胞にかけて広範囲に管腔面の細胞膜にAQP5が発現することが判明した。中でもラットではI型肺胞上皮にのみAQP5の発現がみられ、II型肺胞上皮には発現していないが、マウスではI型肺胞上皮に加え、II型肺胞上皮にも非常に高いレベルでの発現が認められた。呼吸器上皮の管腔表面には液体層が存在し、その量や、成分の調節は呼吸機能の維持のために重要である。その際に上皮細胞の管腔側細胞膜に分布するAQP5が水の透過経路として重要なはたらきをしていることが考えられる。また、基底側にはAQP3およびAQP4が分布することから、これらの水チャネルを介して経上皮細胞的な水の移動が可能である。ラットとマウスでとくにAQP5の分布が異なる理由の解明は今後の課題であるが、呼吸器上皮の水代謝を理解する上できわめて重要な結果が得られた。
アドホック無線通信機器を利用した位置トレース推定手法とその応用に関する研究

ユビキタス社会において,位置情報や位置情報を収集して得られる移動軌跡情報の様々なサービスへの活用が期待されている.現在,測位方式としてGPSが広く利用されているが,屋内や地下街などでは推定誤差が大きく利用できない.このため,ユビキタス社会の実現に向けて,どのような環境下でも位置や移動軌跡を正確に取得できる技術が重要である.本研究では,数万人規模の大多数の歩行者や車両などの位置や位置トレース(移動軌跡)を高精度かつ効率よく推定し,得られた推定情報を活用した次世代ユビキタスシステムの実現への技術向上への貢献を目標とする.本年度は,高精度に加え効率性の実現を目的とした新しい分散協調型位置推定手法の提案に取り組んだ.前年度に取り組んだ自律分散型の位置推定手法により,現在の位置や位置トレースの高精度な推定が可能となる一方,高精度に移動端末の位置を推定するためには,高頻度に位置推定や隣接端末とのメッセージ交換を行う必要があり,大多数の歩行者を対象としたシステムには適切ではなかった.そこで,会議場やショッピングモールなどにおける歩行者の移動が断続的であることに着目し,端末の移動状態を用いて全体の測位回数を抑制しつつ,高精度に推定する手法を提案した.提案手法をシミュレーションにより評価したところ,移動状態の検出を行わず,すべての端末を一定頻度で測位した場合と比較して同程度の位置精度を実現するために必要な測位回数を最大77%軽減できることを確認した.ユビキタス社会において,位置情報や位置情報を収集して得られる移動軌跡情報の様々なサービスへの活用が期待されている.現在,測位方式としてGPS(Global Positioning System)が広く利用されているが,屋内や地下街などでは推定誤差が大きく利用できない.よって,ユビキタス社会の実現に向けて,どのような環境下でも位置や移動軌跡を正確に取得できる技術が重要である.本研究では,数万人規模の大多数の歩行者や車両などの位置トレース(移動軌跡)を高精度かつ効率よく収集し,得られた位置トレースを活用した次世代ユビキタスシステムの実現への技術向上への貢献を目標とする.本年度は,屋内や障害物の存在する都市環境において,移動端末の位置トレースを高精度かつ低コストに推定するためのアーキテクチャの設計と推定アルゴリズムの設計を行った.低コストで実現するために,少数のランドマーク(正確な位置情報を配信する端末)とノード(アドホック通信機能機器を保持する端末)間の通信履歴情報(遭遇情報)のみを利用して高精度に移動軌跡を導出する.ノード間の遭遇情報から,遭遇時刻においてノード間の距離が無線距離以下であるという制約(遭遇制約)が得られる.提案手法では,はじめに高精度な推定が容易なノードを特定し,そのノードの推定位置を基準として,すべての遭遇制約を満たすように位置トレースを推定することにより高精度名推定を実現する.無線ネットワークシミュレータMobiREAL(http://www.mobireal.net)を用いたシミュレーション評価により,提案手法を既存の位置推定手法と比較した結果,位置推定誤差が改善されたことが分かった.また,都市環境における歩行者モデルや密度を再現した現実に近い環境においても,提案手法により位置推定誤差が数m程度の位置トレースを導出できることが確認された.ユビキタス社会において,位置情報や位置情報を収集して得られる移動軌跡情報の様々なサービスへの活用が期待されている.現在,測位方式としてGPSが広く利用されているが,屋内や地下街などでは推定誤差が大きく利用できない.このため,ユビキタス社会の実現に向けて,どのような環境下でも位置や移動軌跡を正確に取得できる技術が重要である.本研究では,数万人規模の大多数の歩行者や車両などの位置トレース(移動軌跡)を高精度かつ効率よく収集し,得られた位置トレースを活用した次世代ユビキタスシステムの実現への技術向上への貢献を目標とする.本年度は,前年度に取り組んだ位置トレース推定手法の拡張と,位置トレースの応用に関する研究を行った.前年度に提案した位置トレース取得手法では,高精度に移動端末の位置トレースを導出できる一方,導出に非常に時間を要するなどの課題があった.そこで,位置トレース取得手法を拡張し,各移動端末が通信履歴情報に基づき,自律分散で自身の位置および位置トレースを推定する手法を提案した.提案手法をシミュレーションにより評価した結果,移動端末の位置トレースだけでなく,現在位置も誤差数mで導出できることが確認された.また,位置トレース取得手法を応用した手法として,対象領域の地図(障害物の位置や形状)を自動で生成する手法の実現に取り組んだ.提案手法では,端末の位置トレースおよび端末間の通信履歴情報それぞれから,障害物が存在すると思われる領域を推定し,それらの結果を統合することで地図を生成する.提案手法を無線ネットワークシミュレータQualnetにより評価した結果,約350秒で推定精度85%程度の地図を生成できることが確認され,災害現場における倒壊建物の位置や形状の把握に応用できることが分かった.ユビキタス社会において,位置情報や位置情報を収集して得られる移動軌跡情報の様々なサービスへの活用が期待されている.現在,測位方式としてGPSが広く利用されているが,屋内や地下街などでは推定誤差が大きく利用できない.このため,ユビキタス社会の実現に向けて,どのような環境下でも位置や移動軌跡を正確に取得できる技術が重要である.

本研究では,数万人規模の大多数の歩行者や車両などの位置や位置トレース(移動軌跡)を高精度かつ効率よく推定し,得られた推定情報を活用した次世代ユビキタスシステムの実現への技術向上への貢献を目標とする.本年度は,高精度に加え効率性の実現を目的とした新しい分散協調型位置推定手法の提案に取り組んだ.前年度に取り組んだ自律分散型の位置推定手法により,現在の位置や位置トレースの高精度な推定が可能となる一方,高精度に移動端末の位置を推定するためには,高頻度に位置推定や隣接端末とのメッセージ交換を行う必要があり,大多数の歩行者を対象としたシステムには適切ではなかった.そこで,会議場やショッピングモールなどにおける歩行者の移動が断続的であることに着目し,端末の移動状態を用いて全体の測位回数を抑制しつつ,高精度に推定する手法を提案した.提案手法をシミュレーションにより評価したところ,移動状態の検出を行わず,すべての端末を一定頻度で測位した場合と比較して同程度の位置精度を実現するために必要な測位回数を最大77%軽減できることを確認した.
ヒトパピローマウイルスE6によるテロメラーゼ活性化機構の解明

テロメラーゼの活性化は全癌の85%以上に共通に見られるがんに特異性の高い変化である。これまでにテロメラーゼを活性化する事が知られている遺伝子はテロメラーゼ自身の逆転写酵素触媒サブユニット(TERT : human telomerase reverse transcriptase)のほかにいわゆる"高発がん性"ヒトパピローマウイルス(HPV)のE6と癌遺伝子のc-mycがある。テロメラーゼの活性化機構を解明するため、これらの遺伝子のテロメラーゼにおける作用を解析し、以下の点を明らかにした。2.初代ヒト線維芽細胞においては、E6もc-mycもテロメラーゼを活性化させることはできない。3.初代ヒト乳腺上皮細胞においてE6はc-mycの発現増加をさせることなくテロメラーゼを活性化させることができる。一方、E7はc-mycの発現を増加させるがテロメラーゼを活性化させることはできない。しかし、E6とE7を共に発現させるとE6単独導入に比ベテロメラーゼを強く活性化する。4.イーストthreehybrid法を用い、E6/E6AP複合体に結合する新たな細胞蛋白質のcDNAを複数単離し、一部については抗体を作出した。これらの結果より以下の仮説が導かれた。1.E6はTERT遺伝子領域のクロマチン構造を変化させ転写因子Mycのアクセスを可能にし、TERTの転写を増加させる。2.E6とE7が共発現する乳腺上皮細胞ではE7がMycの量を上げると共に、E6はMycによるTERTプロモーターの活性化を助けることで強いテロメラーゼの活性化が誘導される。これまでにテロメラーゼを活性化する事が知られている遺伝子はテロメラーゼ自身の逆転写酵素触媒サブユニット(TERT:human telomerase reverse transcriptase)のほかにいわゆる"高発がん性"ヒトパピローマウイルス(HPV)のE6と癌遺伝子のc-mycがある。しかし、E6とE7を共に発現させるとE6単独導入に比べテロメラーゼを強く活性化する。4.イーストthreehybrid方法を用い、E6/E6AP複合体に結合する新たな細胞蛋白質のcDNAを複数単離し、一部については抗体を作出した。
ペロブスカイト型酸化物への水の溶解と、その安定性とプロトン伝導

BaをドープしたLaScO_3は加湿雰囲気ではH2_Oが溶解し、電離したプロトンが電気伝導に寄与する。しかし、300°C程度以上で脱水反応が起こり、燃料電池の電解質への応用は困難である。そこで、H2_Oとの親和性の大きいBaOの濃度が高いほど酸化物中のH2_Oが安定化すると考え、価数の1つ大きいZr(IV)をSc(III)サイトに同時にドープし、BaOの固溶量を大きくし、H2_Oの安定性向上に成功した。BaをドープしたLaSc03はLaサイトへのドーパントであるBa(II)がLa(III)サイトを置換し、全体の電気的中性を保つために酸素空孔が生じる。この酸素空孔を利用して加湿雰囲気ではH20が溶解し、その電離により、プロトンが導入され、これが電気伝導に寄与する。本材料の問題点は、低い温度での脱水反応である。脱水反応の高温化のためには、Baのドープ量を増やす必要がある。そこで、増やせるドープ量を考える上で基本となる状態図の確定を行った。また、種々の物性を系統的に把握する上でも状態図は重要である。本年度に得た結果は以下のようである。(1)1600°CでのLa01.5-Sc01.5-Ba0擬3元系状態図を確定した。この状態図において、LaSc03へのBa0の固溶量はXSc01.5=0.5の時、X Ba0=0.24である。(2)詳細な実験により、1600°CでのLa01.5-Sc01.5-Ba0-Zr02擬4元系状態図を作成し、広い組成領域に立方晶ペロブスカイトの固溶体が存在することがわかった。また、斜方晶の安定領域も決定した。また格子定数を精密測定した結果、酸素空孔濃度が高い状態では、酸素空孔が規則配列を起こすか、もしくはペロブスカイトを構成するカチオン同士がある特殊なペアを形成し、格子が縮小した可能性が示唆された。BaをドープしたLaScO3はドーパントであるBa(II)がLa(III)サイトを置換し、全体の電気的中性を保つために酸素空孔が生じる。更に加湿雰囲気ではH20が溶解し、その電離により、プロトンが導入され、これが電気伝導に寄与する。このため600°C程度で動作する中温型燃料電池の電解質への応用が期待される。本系において、酸化物中の水の安定性の評価、プロトン伝導機構のアイデアを得るために、前年度に引き続き、La0.6Ba0.4Sc02.8-BaZr03系の相平衡関係を調査した。またBaOの固溶限以下の種々の組成をもつこの系の酸化物中のH20の安定性、プロトン伝導度とBaOの濃度の関係を調査した。その結果、以下の結論を得た。(1)1600°CでのLa01.5-Sc01.5-BaO擬3元系状態図を作成した。この状態図において、LaSc03へのBaOの固溶量はXSc01.5=0.5の時、XBa0=0.24である。(2)1600°CでのLa01.5-Sc01.5-Ba0-Zr02擬4元系状態図を作成することにより、広い組成領域に立方晶ペロブスカイトの固溶体が存在することがわかった。また、酸素空孔濃度が高い状態で酸素空孔が規則配列を起こすか、もしくはペロブスカイトを構成するカチオン同士がある特殊なペアを形成し、格子が縮小したと考えられる。(3)BaOの濃度が増加すると、酸化物中のH20が安定化してプロトン濃度が高くなるだけでなく、プロトンの拡散の活性化エネルギーも小さくなることで、電気伝導度が高くなる。(4)試料A2(La0.575Ba0.425Sc0.875Zr0.12502.85)を用いてH20の浸透を調べたところ活性化エネルギーの観点から、H20の浸透はH+とO2-が拡散することと同等であると考えられる。
口腔発癌モデルを用いた口腔癌発生の分子病理学的追求とその化学予防の基礎的研究

本研究は、我々が確立した4-Nitroquinoline 1-oxide(4-NQO)誘発ラット口腔癌モデルを用いて、口腔癌の発生過程を分子病理学的に解析するとともに、その発育・進展を阻害するいわゆる化学予防物質の検索とその阻害機構を明らかにし、一次癌・二次癌を含めた口腔癌の予防・治療に有用な基礎的資料を得る事を目的として行われた。実験は全て雄F344ラットを用いて行い、以下の結果を得た。1.口腔前癌性病変、腫瘍のPCR-SSPC法による分子病理学的検索では、異形成で11%、乳頭腫で0%、扁平上皮癌で24%にHa-ras codon 61(A→T)に変異を認めたが、Ki-ras,N-ras,p53に変異はみられなかった。2.本モデルでは過形成→異形成→乳頭腫→扁平上皮癌という多段階の過程を経て癌が発生すること、さらに異形成、乳頭腫、扁平上皮癌にはGGT陽性、GST-P陽性などの形質変化がみられた。また、免疫組織化学染色でc-myc、c-fos、c-Ha-ras、c-erbB、p53の発現は弱いながら病変の進行とともに強くなる傾向がうかがえた。3.ヒトが日常摂取している食物中に存在する天然性化合物のうち、フェノール(プロトカテク酸、PCA)、フラボノイド(ヘスペリジン、クルクミン)、カロテノイド(β-カロテン、アスタキサンチン、カンタキサンチン)やタイ王国の食用野菜中に含まれるキサンチンオキシダーゼ抑制物質1'-acetoxychavicol acetateをイニシエーション相、プロモーション相に混餌投与すると口腔癌の発生を抑制することが判明した。同時に前癌性病変(過形成、異形成)の発生も抑制した。抑制メカニズムの検討では、被験物質投与により組織中のポリアミン量、BrdU標識率、AgNORs数の低下がみられ、細胞増殖の抑制が関与していることが明らかとなった。4.lndole-3-carbinolにはラット口腔癌、肝癌の発生抑制作用がみられることを報告しているが、自然発症ラット内膜癌の抑制作用もみられることを確認した。5.PCAには大腸癌、肝癌、胃癌、膀胱癌の抑制作用が、アスタキサンチン、カンタキサンチンには膀胱癌、大腸癌の抑制作用がみられることもラット発癌モデルで明らかとなった。6.合成レチノイドKYN-54やアロチノイドmofaroteneにも口腔癌発生抑制作用がみられ、細胞増殖抑制がそのメカニズムとして考えられた。7.PCAには強力なプログレッション抑制効果もみられた。8.以上の被験物質にはラットに対する毒性はみられず、ヒト口腔癌の化学予防物質として有用であることが示唆された。以上の結果を踏まえ、今後は上記物質を用いた口腔癌の予防・治療のための臨床応用の検討とヒト材料による分子病理学的手法を加えたさらなる抑制メカニズムの検討を加えていきたい。

8.以上の被験物質にはラットに対する毒性はみられず、ヒト口腔癌の化学予防物質として有用であることが示唆された。以上の結果を踏まえ、今後は上記物質を用いた口腔癌の予防・治療のための臨床応用の検討とヒト材料による分子病理学的手法を加えたさらなる抑制メカニズムの検討を加えていきたい。計173匹の雄F344ラットを9群に分け、以下の処置を行なった。第1群(19匹):20ppmの4-NQOを8週間飲水投与した。第2群(20匹):4-NQO+0.05%PCA。第3群(19匹):4-NQO+0.1%PCA。第4群(21匹):4-NQO+0.2%PCA。第5群(21匹):4-NQO→0.05%PCA。第6群(19匹):4-NQO→0.1%PCA。第7群(20匹):4-NQO→0.2%PCA。第8群(16匹):0.2%PCA。第9群(18匹):無処置対照群。PCAは第2-4群で4-NQO投与1週前より10週間、第5-7群では4-NQO投与終了後1週目より22週間、第8群では実験期間中(32週)混餌投与した。別に、22匹の雄F344ラットに20ppmの4-NQOを36週間飲水投与し、実験開始後12、20、28週で各4匹、36週で10匹の動物を屠殺し、発癌過程の病理学的変化の解析、分子病理学的検討、免疫組織学的検討、細胞増殖の変化の解析に供した。PCAの発癌修飾実験では、舌腫瘍の発生率が第2-7群でそれぞれ3/20(15%)、2/19(11%)、2/21(10%)、4/21(19%)、5/19(26%)、2/20(10%)で第1群の11/19(58%)に比して有意に低下していた(P<0.05)。尚、第8、9群に舌腫瘍の発生はみられなかった。舌の前癌性病変の頻度・AgNORs数・ポリアミン量もPCA投与群で有意に低下しており(P<0.05)、PCAはinitiation期、postinitiation期いずれに投与しても4-NQO誘発舌発癌を抑制し、細胞増殖の抑制がその発癌抑制効果に関与していること、またPCAに毒性作用は無く、口腔癌の化学予防物質として有望であることが明らかとなった。一方、4-NQO誘発口腔癌の発癌過程は過形成→異形成・乳頭腫→扁平上皮癌という多段階の過程を経ること、さらに異形成上皮・乳頭腫・扁平上皮癌にはGGT陽性・GST-P陽性などの形質変化がみられた。c-myc、c-fos、c-Ha-ras、c-erbB、p53の発現を免疫染色で検討したが現在のところ陽性所見は得られていない。抗体の選択・固定法を含めさらに検討をすすめている。一方、ki-ras(exon1,2)、p53(exon4、5、6、7)の遺伝子変異を11個の扁平上皮癌でproteinase K処理後、フェノール/クロロホルム法によりDNAを抽出し、PCR-SSCP法にて検索したが、いずれも変異を認めなかった。今後、Ha-rasの変異について検索を進める予定である。前年度はミカン、シキミ、ダイウイキョウなどの果実に含まれ抗酸化作用を有するフェノールのprotocatechulcacidついて4-nitroquinoline 1-oxide(4-NQO)誘発ラット口腔発癌モデルを用いて、口腔癌抑制作用をあきらかにした。また、舌組織のポリアミン量、AgNORs染色による細胞増殖の抑制作用も明らかにした。
ヒト生体内において重要な役割を果たすトキソプラズマの病原性因子の探索

トキソプラズマは、ヒトを含め全ての恒温動物に感染することが可能な細胞内寄生生物である。近年、国内においてもトキソプラズマ感染の機会が増えていることから、トキソプラズマに関する研究が注目されてきている。トキソプラズマの研究はこれまで主にモデル生物であるマウスを用いて行われてきており、ヒトの細胞および生体内における宿主免疫とトキソプラズマ間相互作用は未だほとんど明らかとなっていない。そこで本研究では様々なヒトの細胞に着目し、ヒトの細胞内で機能するトキソプラズマの病原性因子の同定とその機能の解析を行うことで、ヒト-トキソプラズマ間相互作用を包括的に理解する。
硝子体手術併用による新規高効率遺伝子治療開発

我々はサル由来レンチウイルス(SIV)ベクターを媒体として用いた遺伝子治療の有用性をこれまで検証してきた。今回ベクターの硝子体内投与では効率的な遺伝子導入や治療効果が得られないため、硝子体手術により眼内のゲル状組織を除去し、より効率的な遺伝子導入を目指して研究を行った。具体的にはラットやラビットを対象動物とし、硝子体切除後にベクターを眼内に投与したが、標的とする神経節細胞への導入効率は、硝子体切除の有無で有意差を認めなかった。今年度は、前年度に引き続き、各種導入効率評価用、および治療用遺伝子導入ベクターの構築を行った。具体的には眼内投与後の遺伝子導入・発現効率の検証、および治療用ベクターの効果判定基準用のコントロールベクターとして、LacZ、GFP遺伝子を搭載したSIVagm-VSVG, SIVagm-F/HNを構築する。治療用ベクターとしては、神経保護因子2種PEDFおよびFGF2、および血管新生抑制因子sFlt-1を搭載遺伝子とし、各々を搭載した発現ベクター2種(SIVagm-VSVG, SIVagm-F/HN)を構築した(計6種)。さらにベクターの培養型における生物活性の検討を行った。すなわち、新規ベクターの生物活性を、標的細胞である網膜神経節細胞(ラット眼球よりELISAにて採取)、網膜色素上皮細胞(ヒト・ARPE-19細胞株)を用いて培養系での検討を行った。具体的には、1標的細胞への導入効率の検討、2感染細胞における目的遺伝子の発現、および発現蛋白(PEDF, FGF2, sFlt-1)外分泌の確認、3感染細胞への導入による細胞障害の有無の検討を行い、良好な導入発現効率が得られ、細胞毒性のないベクターの至適濃度を確認した。引き続き、ラット等の動物を対象とし、作成した各種ベクターを用いて硝子体切除併用による遺伝子導入・発現特性を検討する予定であったが、他業務等への従事時間の増加のため、遂行に遅れが生じている。今年度は、前年度に引き続き、ラットを対象とした硝子体切除後の硝子体内投与による、LacZ遺伝子搭載ベクターによる眼内導入細胞の検討、およびGFP遺伝子搭載ベクターによる遺伝子発現の経時的変化の検討、さらに治療用ベクター投与後の各遺伝子発現量の検討(Western blotting、ELISA)を行った。硝子体非切除症例と比較して、硝子体切除後の導入効率がやや高いことが示されたが、有意差は無かった。このため、疾患モデル動物を用いた治療実験は一旦保留した。他ほ導入効率を上昇させる方法を模索し、硝子体をより郭清するplasmin製剤やcollagenase等を併用する方法を試行したが、明らかな導入効率の上昇を認めなかった。新規ベクターの生物活性を、標的細胞である網膜神経節細胞(ラット眼球よりELISAにて採取)、網膜色素上皮細胞(ヒト・ARPE-19細胞株)を用いて培養系での検討を行った。具体的には、以下の実験を実施した。(1)標的細胞への導入効率の検討、(2)感染細胞における目的遺伝子の発現、および発現蛋白(PEDF, FGF21)外分泌の確認、(3)感染細胞への導入による細胞障害の有無の検討現時点で網膜神経節細胞の高い培養効率が確立されておらず、網膜神経節細胞を用いた導入効率等は確認できていない。一方、網膜色素上皮細胞においては高効率の導入効率と発現、外分泌が確認されている。今年度、ベクターの培養系における生物活性の検討、および動物を対象とした硝子体手術併用による生体内遺伝子導入・発現特性の検討を行い、動物モデルを対象とした遺伝子治療実験を予定であった。しかし、生体内遺伝子導入・発現特性の検討を行っている際、他業務等への従事時間の増加のため、当初想定した期間内に、生体内遺伝子導入・発現特性の検討を終えることができず、現在も継続して検討を行っている状況である。なお、未使用額については、平成25年度に継続して行う、生体内遺伝子導入・発現特性の検討動物モデルをを対象とした遺伝子治療実験の経費として使用する。最も遺伝子導入のターゲットとしている網膜神経節細胞のin vitroでの培養が高効率に行えておらず、in vitroにおける基礎的導入特性が確認できない状態にある。今年度は、前年度に引き続き、ベクターの培養系における生物活性の検討、および動物を対象とした硝子体手術併用による生体内遺伝子導入・発現特性の検討を行い、動物モデルを対象とした遺伝子治療実験を予定する。具体的には新規ベクターの生物活性を、標的細胞である網膜神経節細胞(ラット眼球よりELISAにて採取)、網膜色素上皮細胞(ヒト・ARPE-19細胞株)を用いて培養系での検討を行う。さらにラットを対象とし、作成した各種ベクターを用いて硝子体切除併用による遺伝子導入・発現特性を検討する。具体的には硝子体切除術後に硝子体内投与、さらに一定時間経過後に硝子体内をwash outすることで、その導入動態を検討する。さらに投与ベクター濃度を各段階設定し、詳細な検討を行う。以上を踏まえ、良好な導入発現効率が得られるようであれば、緑内障、加齢黄斑変性モデルを用いた治療実験へと移行する。

これまで通り、網膜神経節細胞の高効率のin vitroでの培養を目指すためにその方法を洗練させる。同時にin vivoでの網膜神経節細胞への導入効率上昇を動物モデルを用いて確認する作業に取りかかる。in vitroの実験としての細胞培養系、試薬として使用する。またラットを中心とした動物購入を検討する。さらに実験系の取得、また当該研究に関連した学会参加・発表の経費、論文作成としても使用する予定である。in vivoにおける網膜神経節細胞の培養を目指したツールに必要な各種器具、試薬等を購入する。および動物を用いた実験への準備、設備を整えるために使用する。
短期間低酸素処理による青果物の品質保持効果とその機構解明に関する研究

短期間低酸素処理によりピーマン果実の呼吸活性が抑制されたのに対し、アルコール発酵代謝は活性化された。処理解除後もそれらの影響は維持され、ピーマン果実のアスコルビン酸代謝も活性化された。バナナ果実でも短期間低酸素処理で呼吸活性が抑制され、アルコール発酵代謝は活性化された。処理解除後は香気成分量やアルコールアシルトランスフェラーゼ活性の増加が抑制され、追熟の進展が遅延された。これらのことから、短期間低酸素処理が青果物の品質保持に効果があることが示唆された。ピーマン果実をOおよび1%O_2と空気を加湿して、通気しながら20°C暗所下で10日間貯蔵した。さらに、Oおよび1%O_2貯蔵の一部は貯蔵3日に空気に変更して貯蔵した。呼吸活性は空気下では貯蔵中一定レベルで推移したが、Oおよび1%O_2では抑制された。しかし、Oおよび1%O_2から空気に変更すると呼吸活性は貯蔵4日には急激に増加し、1%O_2では空気下と同一レベルまでに回復して、その後そのレベルを維持した。また、0%O_2では空気下に比べて2倍となり、その後はそのレベルを維持した。アセトアルデヒド含量は1%O_2および空気下で貯蔵当初のレベルを維持し、1%O_2から空気に変更しても変わらなかった。一方、0%O_2下では増加したが、0%O_2から空気に変更すると急激に減少し、貯蔵10日で空気と同一レベルになった。エタノール含量は1%O_2および空気下で貯蔵当初のレベルを維持し、1%O_2から空気に変更しても変わらなかった。一方、0%O_2下では増加したが、0%O_2から空気に変更すると急激に減少し、貯蔵10日で空気と同一レベルとなった。ピルビン酸脱炭酸酵素の活性は、0%O_2および空気下で貯蔵当初のレベルを維持し、0%O_2から空気に変更しても変わらなかった。一方、1%O_2下では増加し、1%O_2から空気に変更しても同一のレベルを維持した。アルコール脱水素酵素の活性は、0%O_2および空気下で貯蔵当初のレベルを維持し、0%O_2から空気に変更しても変わらなかった。一方、1%O_2下では増加し、1%O_2から空気に変更しても同一レベルを維持した。アルコール脱水素酵素の電気泳動パターンでは1%O_2で最もバンドの数が多く、Oおよび1%O_2から空気に変更するとそのバンドの濃さは濃くなった。0および1%O_2と空気を加湿して通気しながらピーマン果実を20°C暗所で10日日間貯蔵した。そのうち、低酸素処理は貯蔵3日に処理を解除し、空気下で貯蔵した。その結果、アスコルビン酸ペルオキシダーゼは貯蔵3日に0および1%O_2から空気へ変更することで活性が増加した。カタラーゼは0%O_2から空気に変更しても空気と同様に貯蔵中変化がなかったが、1%O_2から空気に変更した場合には増加が認められた。グルタチオン還元酵素は1%O_2から空気に変更しても空気と同様に貯蔵中変化がなかったのに対して、0%O_2から空気に変更した場合には増加傾向であった。一方、酸化型アスコルビン酸還元酵素とモノデヒドロアスコルビン酸還元酵素は、低酸素処理中および低酸素処理解除も空気下と活性の変化に差は認められなかった。ピーマン果実の果皮を含む果肉組織の円筒状切片をコルクボーラーで調製し、0100mMアセトアルデヒドおよび0100mMエタノールを含む50mMリン酸緩衝液(pH7.0)中で30°C下24時間インキュベートした。その結果、テトラゾリウムによる組織の健全性をみるとアセトアルデヒド処理では50mM以上で、エタノール処理は750mM以上で組織に障害が発生し、アセトアルデヒド処理がエタノール処理よりも低濃度で障害発生が起こった。アセトアルデヒド処理ではインキュベート中アセトアルデヒド含量は変化がなかったのに対し、エタノール含量が増加する傾向であり、エタノール処理ではエタノール含量が変化しなかったのに対して、アセトアルデヒド含量が増える傾向であった。いずれの処理も処理濃度が高いほどその傾向は大きかった。0および1%O_2と空気(無処理)を加湿して、通気しながらピーマン果実を20°C暗所で14日間貯蔵した。低酸素処理区は貯蔵7日で処理を解除して、空気下でさらに無処理と同様に7日間貯蔵した。それら貯蔵中のアルコール発酵代謝の変化を調査した。ピルビン酸脱炭酸酵素の活性は、1%0_2処理では貯蔵7日まで増加し、処理解除後は経時的に減少した。それに対し、アルコール脱水素酵素の活性は、貯蔵7日まで増加し、処理解除後もそのレベルを維持した。0%O_2処理は両酵素とも処理中および処理解除後も活性変化は無処理と同様にあまりなかった。