hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
間葉系細胞から上皮細胞への直接転換による新規皮膚潰瘍治療法の開発

皮膚潰瘍に存在する間葉系細胞から表皮ケラチノサイトへの直接転換による皮膚潰瘍治療方法の開発を目的として、真皮線維芽細胞に遺伝子導入することによって、ケラチノサイト同様の重層扁平上皮を形成する能力をもつ細胞への作製を試みた。初代培養真皮線維芽細胞、表皮ケラチノサイトのmicroRNA array, micro array,いくつかのbioinformatic analysisの結果より、80余因子を選択し、レンチウイルスベクターを用いて皮膚線維芽細胞への遺伝子導入を行った。様々な組み合わせを検討した結果、29因子の導入により、表皮ケラチノサイト類似の形態、増殖動態を呈する細胞を誘導することができた。コラーゲンゲルを担体として用いた皮膚3次元培養において、誘導された細胞が重層扁平上皮形成能を有することを確認した。誘導細胞の導入遺伝子特異的PCRの結果より、9因子がゲノム遺伝子に組み込まれていることが示唆されたため、同9因子を真皮線維芽細胞に遺伝子導入したところ、表皮ケラチノサイト類似の形態、増殖動態を呈し、3次元培養において、重層扁平上皮形成能を有する細胞を得ることができたため、今後は更なる因子の減少、最適化を進めていく。本研究の結果より、外来性の遺伝子導入により、皮膚間葉系細胞から、重層扁平上皮形成能を有する細胞へ直接的な細胞系譜の転換を起こすことができることが明らかとなった。更なる最適化によりin vivo、潰瘍局所での転換を惹起することができれば、あらゆる原因からなる皮膚潰瘍病変を短期間で上皮化させる新しい治療として応用することが可能である。26年度が最終年度であるため、記入しない。
惑星探査機搭載・非冷却赤外カメラの開発研究

惑星探査機に搭載する赤外カメラを開発するための基礎研究を行った。検出器としでは、極低温への冷却を要する従来の量子型素子ではなく非冷却ボロメータ素子を採用し、軽量化を図る。大規模なボロメータ素子(240×320画素)が近年開発され、そのような観測装置が現実的となったが、まだ宇宙での実績は乏しい。まず検出器の特性を把握するために、日本の金星探査計画(2009年)で採用を検討しているボロメータ素子を用いて、基礎実験を行った。非冷却ボロメータ素子は通常は常温物体(300K)を対象とするが、金星探査では大気上層の冷たい雲(230K)が撮像対象となるため、ノイズ低減のために工夫を要する。実験では、ヒータで温度制御可能な黒体塗装アルミ板を冷凍庫に入れて撮像対象とし、230Kから300Kまでの様々な温度において画像データを取得した。その結果によれば、低温対象物の撮像画像には次の3種類のノイズが含まれている。(1)時間的に安定した縞状の固定パターンノイズ。検出器の読出し方式に起因すると思われる。(2)画像の周辺の増光。光学系からの熱放射に起因すると思われる。(3)ランダムな時間変動ノイズ上記のうち(1)(2)はオフセットを適切に較正することにより除去可能であり、(3)は数十枚の画像積算により低減できることが実験で確かめられた。これらの結果から、金星探査機搭載の赤外カメラ(波長域9-11μm)において0.3K程度の透過雑音温度を達成できる見込みが得られた。さらに、高エネルギーの放射線が降り注ぐ宇宙空間で長期の使用に耐えるために、耐放射線性の試験を行った。放射線医学総合研究所の粒子線照射施設において、検出器がONの状態で約30kRadを照射したところ、2度ラッチアップしたものの深刻な影響は生じないことが分かった。以上の結果をもとに、搭載機器の試験モデルの設計と試作を行った。惑星観測用の非冷却赤外カメラ(波長域は金星大気の吸収を避けられる9-11μm)を開発するために、実際に採用を予定している2次元熱型素子(ボロメータ)を用いて基礎的な実験を行い、カメラの設計を概ね決定した。エレキ部を合わせた重量は約2.6kgであり、従来の冷却式カメラより軽量である。検出器のノイズレベルは2030mK(F/0.8,300K)であり、公称値より若干小さいことが確認された。これは300K付近の対象を見るのには十分な値である。しかし、240Kという低温の金星雲頂を撮像する場合、検出器に入射する赤外線の強度が300K物質の放射に比べて約1/10になるため、十分な科学観測を行うには積算などによりS/N比を向上させる必要がある。実験結果によれば、等価雑音温度(NETD)を画像の積算により50%程度、また2×2ビニングにより30%程度減少させることが可能である。このような処理により、金星においても0.10.2KのNETDを実現できることが分かった。また、ボロメータは通常は絶対輝度を計測する機能を持たないため、シャッターを用いる温度較正機能が新たに必要である。画面全体の平均値(オフセット)が時間の経過とともに大きく変化するが、実験の結果、シャッター較正のあと10秒程度以内に画像を取得すればその影響が小さく抑えられることが分かった。その上で、絶対較正精度3Kを達成するためには、光学系温度を0.1Kの精度でモニターする必要がある。さらに、宇宙空間での長期の使用に耐えるために、耐放射線性にも注意が必要である。

さらに、高エネルギーの放射線が降り注ぐ宇宙空間で長期の使用に耐えるために、耐放射線性の試験を行った。放射線医学総合研究所の粒子線照射施設において、検出器がONの状態で約30kRadを照射したところ、2度ラッチアップしたものの深刻な影響は生じないことが分かった。以上の結果をもとに、搭載機器の試験モデルの設計と試作を行った。
内因性光学イメージング法と光ファイバーセンシングを応用した術中脳機能内視鏡の開発

脳腫瘍の外科的手術において、正常組織と腫瘍との境界がどこにあるのか、切除範囲をどう決めたらよいのかという問題は、患者の術後の神経機能を最大限に保持するために極めて重要な問題である。しかし、現在、治療で用いられている検査法は空間・時間分解能ともまだ十分ではない。本研究では光ファイバーセンシングの技術と、内因性光学イメージング法を組み合わせて、脳深部から神経活動をモニターできる新しい術中神経機能計測システムを開発することを目的とする。本年度は、まず、実験用脳機能内視鏡の開発を行い、実験動物でその有用性を検討した。開発した実験用脳機能内視鏡は、ハードは光源、検出系、記録系、モニターから構成された。光源には、リプルノイズのない高出力のタングステン・ハロゲンランプを用い、これを直流安定化電源で駆動した。検出系は、光ファイバーと光量差差分増幅装置からなり、光ファイバーとしては、特注の極細ファイバーを用いた。光ファイバーの機械側端には対物レンズを付け、さらに光量差差分増幅装置の高速CCDカメラとのコネクターを作成した。記録系としては、高速のコンピュータを用い、測定時間ができる限り短くなるようにした。一方、ソフト面では、リアルタイムでイメージングできるようなソフトウエアの開発を行った。有用性の検討対象として、比較的実験が容易なラットのバレル応答を用いた。ヒゲの機械刺激に伴うバレル応答に対しては、作成したシステムで十分に計測可能であることが明らかとなった。人への応用に関しても十分に可能であると考えられたが、倫理面の問題から実際に適用するには至らなかった。今後さらに開発を推進していく予定である。本年度は、以下の2点について検討した。(1)脳機能内視鏡の開発:開発しようとした脳機能内視鏡は、光源、検出系、記録系、モニターから構成される。検出系は、光ファイバーと光量差差分増幅装置(Imager2001)からなり、光ファイバーとしては、ファイバープレート顕微鏡を用いた。この際、ファイバーの径を細くしすぎると光量が少なくなりノイズが大きくなるので、脳溝に挿入可能な範囲でなるべく太いものに設計した。ファイバープレート顕微鏡の機械側端には対物レンズを付け、さらに光量差差分増幅装置の高速CCDカメラとのコネクターを作成した。(2)イメージングソフトウェアの開発:手術中の測定時間はできる限り短い方が患者への負担が軽くなるので、リアルタイムでイメージングできるようなソフトウェアの開発を行った。また、脳表面からの記録を組み合わせて、脳機能を三次元で表示するソフトウェアの開発も行った。これらの点に関しては、次年度も改良を進める予定である。本年度は、昨年度に引き続いて以下の2点について検討した。

(1)脳機能内視鏡の開発:開発しようとした脳機能内視鏡は、光源、検出系、記録系、モニターから構成される。光源には、リプルノイズのない高出力のタングステン・ハロゲンランプを用い、これを直流安定化電源で駆動した。検出系は、光ファイバーと光量差差分増幅装置からなり、光ファイバーとしては、ファイバープレート顕微鏡を用いた。この際、ファイバーの径を細くしすぎると光量が少なくなりノイズが大きくなるので、脳溝に挿入可能な範囲でなるべく太いものに設計した。ファイバープレート顕微鏡の機械側端には対物レンズを付け、さらに光量差差分増幅装置の高速CCDカメラとのコネクターを作成した。記録系としては、高速のコンピュータを用い、測定時間ができる限り短くなるようにした。(2)イメージングソフトウェアの開発:手術中の測定時間はできる限り短い方が患者への負担が軽くなるので、リアルタイムでイメージングできるようなソフトウェアの開発を行った。また、脳表面からの記録を組み合わせて、脳機能を三次元で表示するソフトウエアの開発も行った。脳腫瘍の外科的手術において、正常組織と腫瘍との境界がどこにあるのか、切除範囲をどう決めたらよいのかという問題は、患者の術後の神経機能を最大限に保持するために極めて重要な問題である。しかし、現在、治療で用いられている検査法は空間・時間分解能ともまだ十分ではない。本研究では光ファイバーセンシングの技術と、内因性光学イメージング法を組み合わせて、脳深部から神経活動をモニターできる新しい術中神経機能計測システムを開発することを目的とする。本年度は、ヒト脳用の計測システムに先立って、実験用脳機能内視鏡の開発を行い、実験動物でその有用性を検討した。開発した実験用脳機能内視鏡は、ハードは光源、検出系、記録系、モニターから構成された。検出系は、光ファイバーと光量差差分増幅装置からなり、光ファイバーとしては、特注の極細ファイバーを用いた。光ファイバーの機械側端には対物レンズを付け、さらに光量差差分増幅装置の高速CCDカメラとのコネクターを作成した。一方、ソフト面では、リアルタイムでイメージングできるようなソフトウエアの開発を行った。有用性の検討対象として、比較的実験が容易なラットのバレル応答を用いた。ヒゲの機械刺激に伴うバレル応答が、何とか開発したシステムでとらえられることが明らかとなった。
真のGISTの発生頻度と、その顕性化、悪性化に関与する遺伝子異常

一般的にGISTの発生頻度は人種に関わらず10万人に1-2人と考えられてきた。しかし平成18年度までの検索で、胃癌で全摘出された胃100症例のうち、35症例50病変の顕微鏡的GISTが存在することを明らかにした。その一部には既にGIST発生の原因遺伝子と考えられているc-kitの変異が生じていることも見出し、高頻度に発生する顕微鏡的GISTから臨床的GISTに進展するにはc-kit遺伝子変異に他の遺伝子変化が加わることが必須であると考えた。この遺伝子変化はこれまでの検討で悪性度に関わらずGISTで高頻度に欠失の見られる1p,14q,22q上のある癌抑制遺伝子であると推測されたことより、平成19年度は、この領域に限定した超高密度micro arrayをデザインし、通常、臨床的には切除対象とならない2cm以下相対的切除適応である3cm前後までのvery lowないしlow risk GIST13例、c-kit遺伝子exon13に変異のあるGISTcell line、およびc-kit,PDGFRA遺伝子変異を伴わないNF1に合併して発生したGIST1症例の解析を行っている。まだpreliminaryな解析ではあるが、14q、22qの複数の領域における欠失が、特に3cm以上のGISTにおいて生じている傾向がある。臨床的にも3cm以下の粘膜下腫瘍はほとんどは大きくならず、これらの欠失が段階的に生じている結果に合致する。同様の欠失はNF1合併GISTには見られず、異なるメカニズムにより発生していると考えられた。今後さらに症例の追加解析と、あらたに抗5-メチルシトシン抗体を用いた免疫沈降によるメチル化DNAの濃縮とタイリングアレイによる解析を組み合わせた網羅的なプロモーター領域異常メチル化の検索を行うことにより、1p,14q,22q上に存在すると推測されるGIST発生に関与する癌抑制遺伝子を特定する。・真のGISTの発生頻度を明らかにするため、胃癌にて切除された胃全摘出検体100症例を全割して標本を作製、一症例あたり標本を84-231個(平均130個)作成し、顕微鏡的なGISTの発生頻度を検索した。結果)100症例中、35症例50病変の顕微鏡的GISTを見出した。GISTはいずれもKIT陽性で大きさは0.2-4mm(平均1.5mm)、一部のGISTにはc-kit遺伝子変異が見られた。.また、発生部位も臨床的GISTが見られる胃体部に集中しており、これら顕微鏡的なGISTは臨床的GISTの前駆病変であると考えられた。臨床的なGISTの発生頻度は10万人に1-2人とされており,我々が見出した顕微鏡的GISTの発生頻度はその数万倍であると考えられる。この顕微鏡的GISTの段階で、すでにc-kit遺伝子変異が生じていることより、当初の仮説通り、臨床的GISTにまで進展するにはc-kit遺伝子変異+他の遺伝子異常が必須であると考えられ、新たな治療のターゲットとして有望である。・顕微鏡的GISTから臨床的GISTに進展する遺伝子異常の探索これまでのマイクロサテライトマーカーやCGHを用いた解析より、low-risk, high-riskのGISTに共通して1p, 14q, 22qの欠失が報告されている。この領域に顕微鏡的GISTから臨床的GISTに進展する原因遺伝子が存在している可能性が高いと考えられ、より小さなGIST(5mm-35mm大)における詳細な検索を行っている。1p, 14q, 22qに限定した超高密度のマイクロアレイを作成しCGH解析を行っているところである。最近、GISTにおける1p, 14q, 22qの欠失は独立したクラスターであるとする論文(Gunawan B et al.J Pathol 2007;211:463-470)が報告されているが,prellmlnaryな我々の解析結果では、5mm-30mm以下程度の小さなGISTにおいて、既に1p, 14q, 22qの一部に重複して欠失の見られることが明らかになっており、異なる結果である。さらに小さな顕微鏡的GIST病変について,whole genome amplificationの手法を用いたCGHを行い、目的の遺伝子を探索していく予定である。

臨床的にも3cm以下の粘膜下腫瘍はほとんどは大きくならず、これらの欠失が段階的に生じている結果に合致する。同様の欠失はNF1合併GISTには見られず、異なるメカニズムにより発生していると考えられた。今後さらに症例の追加解析と、あらたに抗5-メチルシトシン抗体を用いた免疫沈降によるメチル化DNAの濃縮とタイリングアレイによる解析を組み合わせた網羅的なプロモーター領域異常メチル化の検索を行うことにより、1p,14q,22q上に存在すると推測されるGIST発生に関与する癌抑制遺伝子を特定する。
染色体進化におけるゲノムサイズ減少の解析

Kalimeris(ヨメナ)属とAster(シオン)属(狭義:以下同様)にみられるような染色体サイズの変化は,染色体の凝縮率を変化させるような突然変異が生じたことに起因しているか,もしくは染色体を構成するDNA配列の増減による要因の2つの可能性が考えられる.しかしながら,シオン属とヨメナ属を人工的に交配させた場合,ひとつの細胞中に短い染色体と長い染色体が共存することから,染色体凝縮率を変えるような遺伝的変化がおきているとは考えにくく,ゲノムサイズが変化した可能性の方が高い.本研究では,Kalimeris属とAster属の染色体のサイズ変化に関わるDNA配列の探索に必要となる両属のゲノムDNAの比較分析を行うため,小さい染色体から構成される核型をもつKalimeris pinnatifida(ユウガギク)と大きい染色体から構成される核型をもつAster ageratoides(シロヨメナ)を材料に,まず,両種の植物体からゲノムDNAを抽出し,EcoRI、BamHIおよびSau3AIを用いた制限酵素処理による限定分解を行った.次に,得られた結果をもとに,Aster ageratoidesのゲノムDNAを最適条件で制限酵素処理し,DNA断片をライゲーションによりプラスミドに挿入して,染色体サイズの変化に関与する配列単離のための部分的なAster ageratoidesゲノムDNAライブラリーを作成した.さらに,コロニーPCRにより,100bp以上2kb以下の挿入断片をもつプラスミドを保持するE. coliコロニーをスクリーニングし,合計143のDNA断片を単離した.現在は単離した断片のシークエンス中である.Kalimeris(ヨメナ)属とAster(シオン)属(狭義:以下同様)にみられるような染色体サイズの変化は,染色体の凝縮率を変化させるような突然変異が生じたことに起因しているか,もしくは染色体を構成するDNA配列の増減による要因の2つの可能性が考えられる.しかしながら,シオン属とヨメナ属を人工的に交配させた場合,ひとつの細胞中に短い染色体と長い染色体が共存することから,染色体凝縮率を変えるような遺伝的変化がおきているとは考えにくく,ゲノムサイズが変化した可能性の方が高い.本研究では,Kalimeris属とAster属の染色体のサイズ変化に関わるDNA配列の探索に必要となる両属のゲノムDNAの比較分析を行うため,小さい染色体から構成される核型をもつKalimeris pinnatifida(ユウガギク)と大きい染色体から構成される核型をもつAster ageratoides(シロヨメナ)を材料に,まず,両種の植物体からゲノムDNAを抽出し,EcoRI、BamHIおよびSau3AIを用いた制限酵素処理による限定分解を行った.次に,得られた結果をもとに,Aster ageratoidesのゲノムDNAを最適条件で制限酵素処理し,DNA断片をライゲーションによりプラスミドに挿入して,染色体サイズの変化に関与する配列単離のための部分的なAster ageratoidesゲノムDNAライブラリーを作成した.さらに,コロニーPCRにより,100bp以上2kb以下の挿入断片をもつプラスミドを保持するE. coliコロニーをスクリーニングし,合計143のDNA断片を単離した.現在は単離した断片のシークエンス中である.
吸入麻酔薬の心筋保護作用―サーチュインとミトコンドリア機能調節の役割―

短時間の虚血再灌流がその後の長時間の虚血に対する心筋梗塞サイズを減少させるという報告がなされた(Murry et al., Circulation 1986)。短期虚血によるプレコンディショニング(IPC)と呼ばれるこの現象は、虚血によって障害される心筋を保護するという観点から、臨床的に有用性の極めて高い発見であった。吸入麻酔薬であるイソフルランにおいても、前投与によって同様の心筋保護効果が得られることが報告されている。(Kersten et al., Anesthesiology 1996)。この吸入麻酔薬によるプレコンディショニング(APC)はIPCメカニズムと類似した部分が多いことが知られている。Sirt遺伝子はサーチュインsirtuin遺伝子とも呼ばれ、クラスIIIヒストン脱アセチル化酵素であり、遺伝子の転写制御において重要な役割をはたしていることで知られている。なかでもSirtは心血管系に作用することが報告され、ミトコンドリアに多く分布していることが知られている。さらに、近年の研究によると心機能の制御や虚血に対する心筋耐性をコントロールする作用についても報告されている。そこで、本研究において申請者らは、イソフルランの投与でSirtの発現が増加し、ミトコンドリアダイナミクスが与える影響を明らかにすることで、虚血プレコンディショニングの経路の解明に寄与することを目的とする。本年度は、APC刺激後のSirt発現をRT-PCR法およびイムノブロッティング法にて確認することで、イソフルランによってSirtの発現が上昇することを確認した。マウスに吸入麻酔薬イソフルランを吸入させた後(APC刺激)、心臓を取り出しホモジナイズしRT-PCR、イムノブロットを用いRNA及びタンパクレベルにおいてSirtの発現が増加していることを確認した。申請書に記載した研究目的には、初年度にAPC刺激後のSirt発現をRT-PCR法およびイムノブロッティング法にて確認する、と記載してあり、研究実績の概要に示すとおり進捗度合いは同じであり、おおむね順調と思われる。また、さらに、マウスin vivo虚血再潅流モデルを用いて対照群、APC群において心筋梗塞サイズを測定比較する実験に取り掛かっている。マウスin vivo虚血再潅流モデルを用いて対照群、APC群において心筋梗塞サイズを測定比較する。同様に、Sirtの誘導剤、阻害剤を前投与しSirtのAPC作用における関与を明らかにする。マウスを人工呼吸下にAPC刺激を30分行い、その後、心臓冠動脈を30分間閉塞し、2時間の再潅流を行う。その後心筋梗塞サイズを測定する。Sirtの誘導剤であるresveratrol、Sirtの阻害剤であるnicotinamideをAPC刺激前に投与し、同様の虚血再潅流実験を行う。
高等教育「後背地」理論モデル構築への挑戦的研究：オルタナティブな理論を目指して

本研究では、高等教育機関の地域配置および高等教育の地域社会的効用について、高等教育あるいは高等教育機関の地理的影響範囲(高等教育「後背地」)の理論モデル確立を目指すべく、既存指標の収集、いくつかの地域での関係者へヒアリング等によって、影響評価の候補となる主観的/客観的指標を収集し、検討する。これは、研究者の研究・勤務経歴の偏り(特に都市/国立/研究大学)に起因するであろう高等教育領域の研究知の偏在を問い直す、オルタナティブな高等教育研究領域を切り開く企てでもある。
環拡張ポルフィリン化学の展開

ポルフィリンよりもサイズの大きい環拡張ポルフィリンは、複数の遷移金属を取り込む可能性があり、実際、ピロール8個からなるオクタフィリンは銅2価イオン2つと錯体を形成した。この錯体の溶液を加熱すると、2つのポルフィリンに分裂することを見出し、我々はこの現象を分子細胞分裂と名付けて報告した。この変化は大きな吸収スペクトルの変化を伴うために、記憶素子としての利用が考えられる。そこで石英基板上にスピンコート法でフィルムを形成し、熱を加えて吸収帯が変化することを確認した。今後はレーザーなどを用いて記録素子としての可能性を探る。複核錯体を形成する環拡張ポルフィリンの、金属を並べるプラットホームとしての性質も見逃せない。オクタフィリン銅2核錯体のほかに、ピロール環10個からなるデカフィリンの銅3核錯体を単離し、X線結晶構造解析によって構造決定した。中央の銅イオンは2価であると考えているが、これが正しければ、きわめて珍しい2配位の銅2価錯体の単離ということになり、現在慎重に解析を進めている。また、ヘキサフィリンが金イオンを取り込んで、平面2核錯体を生成することも明らかにした。更に大きな環拡張ポルフィリンを得ることを目的として、ピロール環3個からなるトリピランから直接環化反応を試みた。ねらいどおり、3の倍数のピロールで構成された環拡張ポルフィリンを得ることができ、このうち6,9,15個のピロールからなる拡張ポルフィリンに関してはX線で構造を決定するに至った。ジプロトン化ルビリンは、対アニオンの構造に依存した異なった構造を取り、吸収スペクトルも変化する。このため、アニオンセンサーとしての有望であることを示した。環拡張ポルフィリン化学の展開として、まず、ジピロメタンやトリピランを出発原料とした環サイズ選択的な環拡張ポルフィリンの合成法を確立した。この合成法により、ヘキサフィリンやオクタフィリンの合成が簡略化された。また、この合成戦略に基づいて、メゾ位のアリール位の異なるヘキサフィリンの合成にも成功し、アリール基の両オルト位に立体障害がないと、ヘキサフィリンが酸化反応を非常にうけやすく不安定であることを見い出した。これが、これまで通常のポルフィリン合成法で環拡張ポルフィリンが発見されなかったひとつの原因であることを指摘した。また、トリピランの酸化的カップリング反応により、ルビリンやノナフィリンの合成にも成功し、それぞれ結晶構造を決定した。メゾ位にアルキル置換基を持つ世界初の環拡張ポルフィリンとして、メゾートリフルオロメチル環拡張ポルフィリンの合成にも成功した。次に、これら環拡張ポルフィリンの金属錯体合成を試み、ヘキサフィリンからは、折れ曲がった銅2核錯体を合成した。4種類の銅2核錯体の結晶構造を解明し、その分子内の銅\ンコ間の磁気的相互作用を解明した。更に、オクタフィリンの銅2核錯体が熱的に定量的に解裂して、銅ポルフィリンを与えることを発見した。これまでに類のない斬新な反応で、環拡張ポルフィリンとポルフィリンの化学が繋がった。ポルフィリンよりもサイズの大きい環拡張ポルフィリンは、複数の遷移金属を取り組む可能性があり、実際、ピロール8個からなるオクタフィリンは銅2価イオン2つと錯体を形成した。複核錯体を形成する環拡張

ポルフィリンの、金属を並べるプラットホームとしての性質も見逃せない。オクタフィリン銅2核錯体のほかに、ピロール環10個からなるデカフィリンの銅3核錯体を単離し、X線結晶構造解析によって構造決定した。中央の銅イオンは2価であると考えているが、これが正しければ、きわめて珍しい2配位の銅2価錯体の単離ということになり、現在慎重に解析を進めている。また、ヘキサフィリンが金イオンを取り込んで、平面2核錯体を生成することも明らかにした。更に大きな環拡張ポルフィリンを得ることを目的として、ピロール環3個からなるトリピランから直接環化反応を試みた。ねらいどおり、3の倍数のピロールで構成された環拡張ポルフィリンを得ることができ、このうち6、9、15個のピロールからなる拡張ポルフィリンに関してはX線で構造を決定するに至った。ジプロトン化ルビリンは、対アニオンの構造に依存した異なった構造を取り、吸収スペクトルも変化する。このため、アニオンセンサーとしての有望であることを示した。
光照射により生細胞内の小胞輸送反応を制御するシステムの構築

真核細胞内の小胞輸送反応について、この反応を駆動する因子に光依存的に大きな構造変化を起こすフォトトロピンPHOT1を融合させることにより、光照射によって酵母細胞内の小胞輸送反応を光制御するシステムの構築を試みた。小胞体からゴルジ体への小胞輸送を制御するSar1をターゲットとしてPHOT1-Sar1-mCherryの融合タンパク質を作成し酵母細胞内で発現させたものの、現在まで光照射による活性制御には至っていない。真核細胞内の代表的な物質輸送システムである小胞輸送反応について、この反応を駆動する因子に光依存的に大きな構造変化を起こすことが知られているエンバク由来の光センサータンパク質であるフォトトロピンPHOT1を融合させることにより、光照射によって生きた酵母細胞内の小胞輸送反応を光制御するシステムの構築を試みた。平成24年度は前年度に引き続いて、低分子量GTPase Sar1pを活性制御のターゲットとして、Sar1pが小胞体膜と結合するN末端にPHOT1中の光受容部位であるLOVドメインとそれに隣接するJアルファヘリックス領域を融合させ、さらに細胞内局在の検出用としてC末端に蛍光タンパク質mCherryを融合させたPHOT1-Sar1p-mCherryをデザインし、これを酵母細胞内で発現させる系を構築した。共焦点顕微鏡による観察からPHOT1-Sar1p-mCherryの小胞体膜上への発現は検出できるものの、残念ながら光照射による大きな局在変化は観察されなかった。研究期間全体を通じて、酵母細胞内の小胞輸送反応を光制御することを目的として、Sar1pを活性制御のターゲットとして選定し、in vitroとin vivoの両面からのアプローチを行った。in vitroにおいては、光照射による構造変化が可能なフラビンを結合したPHOT1を含むPHOT1-Sar1p融合タンパク質を大腸菌から精製することに成功したものの、試験管内再構成系による輸送反応を光制御するまでには至らなかった。また、in vivoによるアプローチにおいても、PHOT1を融合したSar1pの構築と小胞体膜への発現には成功したものの、光照射による活性制御には残念ながら至っていない。今後は、PHOT1とSar1pとの融合部位の検討や、Sar1p以外のターゲットを選定して実験をデザインする必要がある。真核細胞内の代表的な物質輸送システムである小胞輸送について、この反応を駆動する因子に、光依存的に大きな構造変化を起こすことが知られている植物由来の光センサータンパク質であるフォトトロピンを融合することにより、光照射によって生きた酵母細胞内の小胞輸送反応を光制御するシステムの構築を試みた。当初の計画ではシロイヌナズナ由来のフォトトロピンを光制御のためのユニットとして使用する予定であったが、より大きな構造変化が期待できるエンバク由来のフォトトロピンを使用することとし、エンバク種子より光センサータンパク質であるフォトトロピンPHOT1をコードするcDNAを単離した。活性制御のターゲットとして、出芽酵母における小胞体からの輸送小胞形成反応において中心的な役割を果たす低分子量GTPase Sar1pを選定した。このSar1pが膜と結合するN末端部位にPHOT1中の光受容部位であるLOVドメインとそれに隣接するJアルファヘリックス領域を融合させ、さらにアフィニティ精製用のGSTを融合させたGST-PHOT1-Sar1pをデザインし、このタンパク質をコードする大腸菌発現ベクターを作成した。大腸菌においてGST-PHOT1-Sar1pの発現、精製を行い、部位特異的プロテアーゼによりGST部分を取り除いたPHOT1-Sar1pの精製標品を得ることができた。また、得られたPHOT1-Sar1pについて分光学的な解析を行ったところ、この分子にフラビンの結合が示唆されるデータが得られている。研究計画において設定した今年度に達成すべき項目はほぼ全てについて手を付けられたものの、光センサータンパク質をコードする遺伝子が大腸菌に対して弱い毒性を示すという予想外の困難があり、目的とする発現ベクターの構築に時間を費やしたため、作成した光センサー融合タンパク質の試験管内再構成系を用いた生化学的評価がやや遅れている。初年度において作成した光センサー融合タンパク質について、輸送小胞形成の試験管内再構成系を用いた活性評価を行う。また、目的の活性が確認されたタンパク質については、酵母細胞内で発現させる酵母株を構築し、酵母細胞内での小胞輸送反応の光活性制御の検討を行う。初年度において、光センサータンパク質をコードする遺伝子が大腸菌に対して弱い毒性を示すという予想外の困難があり、目的とするタンパク質を発現させるベクターの構築に多くの時間を費やしたため、その後に予定していた大腸菌によるタンパク質の大量精製、および試験管内再構成系による活性評価への着手が遅れたため、これらの実施に伴う消耗品分として次年度使用額が生じた。初年度に引き続き、小胞体からの輸送小胞形成に関わる因子を対象として、光センサー融合タンパク質の作成に伴い、分子生物学試薬、微生物培養培地、生化学試薬の購入のために消耗品の購入を行う。また、初年度に予定していたタンパク質の大量精製、および試験管内再構成系による活性評価を実施するための消耗品(主に試薬類)の購入についても行う。また、成果発表のための旅費、および研究成果の論文発表のための費用についても計上する。
アブシジン酸シグナルを介した種子休眠を制御するシグナルネットワークの解明

β-エストラジオールでAHIP11の発現を誘導する組換え植物のホモラインの選抜に成功し、作出したAHIP11組換え植物は、ABA応答に異常を示すかについて現在解析中である。AHIP11に相互作用する候補因子の一つについて、T-DNA挿入変異体を単離した。また、候補因子のホモログのT-DNA挿入変異体も単離し、二重変異体を作成した。二重変異体の種子におけるABA感受性の応答を調査したが、野生型と有意な差が見られなかったため、現在三重変異体の作出を試みている。昨年度、AHIP4は錯体と結合することを見出し、錯体の配位に関わる候補アミノ酸残基の同定にも成功した。本年度、錯体の配位に関わるアミノ酸残基に変異を導入した過剰発現体を作出し、種子におけるABA応答を観察したところ、AHIP4過剰発現体が示すABA高感受性の表現型が、錯体の配位に関わるアミノ酸残基に変異を導入することで抑制された。以上より、今回同定したアミノ酸残基は、AHIP4の錯体との配位子であることが強く示唆された。EMSにより変異処理を行ったYFP-AHIP4過剰発現体を用いたサプレッサー解析も実施し、AHIP4内に変異を同定することに成功し、現在その生理的意義を解析している。28年度が最終年度であるため、記入しない。AHIP4の相互作用因子は、シロイヌナズナの野生型Col-0にAHIP4とYFPを融合させたYFP-AHIP4を発現させた過剰発現体を用い、YFP-AHIP4にそれぞれ相互作用する因子をGFPアフィニティーカラムで精製し、質量分析装置を用いた解析を行った。これまでに複数のAHIP4に相互作用する可能性がある候補因子の単離に成功し、現在、AHIP4の真の相互作用であるかを酵母ツーハイブリット法により検証している。AHIP11の相互作用因子もAHIP4と同様の手法を用い、単離する予定であったが、YFP-AHIP11を過剰に発現した組換え体を得るに至らなかった。そこで、シロイヌナズナ均一化cDNAライブラリーを用いた酵母ツーハイブリッド法により、AHIP11に相互作用する因子の探索を行い、これまでに複数のAHIP11に相互作用する候補因子の単離に成功した。また、質量分析装置を用いた解析より、AHIP4の候補リン酸化部位と候補ユビキチン化部位の同定に成功した。現在、これら翻訳後修飾部位に変異を導入した変異タンパク質を発現させた植物体の作出を試みている。酵母ツーハイブリット法(Y2H)を用いた解析より、AHIP4とAHIP11にそれぞれ相互作用を示す因子の同定に成功し、現在詳細な解析を進めている。昨年度アフィニティーカラムを用いたプロテオーム解析で単離した候補AHIP4相互作用因子について、Y2Hによる確認実験を行ったところ、候補AHIP4相互作用因子はAHIP4との相互作用が弱かった。AHIP11過剰発現体の作出が困難であったため、β-エストラジオールでAHIP11の発現を誘導する組換え植物を作出し、今後の解析に用いる予定である。AHIP4の機能解析では、昨年度同定したAHIP4の候補リン酸化部位と候補ユビキチン化部位にアミノ酸置換を導入した組換え植物体を作出した。候補ユビキチン化部位をアルギニンに置換した組換え植物体は、ABA応答がベクターコントロールと同程度であった。一方、同定した候補リン酸化部位を全てアラニン残基に置換した組換え植物体は、ほとんどAHIP4変異タンパク質の発現が検出さず、これらアミノ酸残基の置換は、AHIP4の機能に何らかの影響をおよぼす可能性が示唆された。興味深いことに、AHIP4は錯体を配位することを見出した。さらに、錯体の配位に関わるAHIP4の候補アミノ酸残基の同定にも成功し、現在詳細な解析を進めている。AHIP4とAHIP11に関する研究は順調に進展している。特に、AHIP4が錯体を配位するなど、AHIP4の機能解明につながる新たな知見を得ることにも成功し、AHIP11に関しては、AHIP11の相互作用因子より、AHIP11の機能推定に役立つ結果も得たことから、本年度の目標を達成したと考えている。

EMSにより変異処理を行ったYFP-AHIP4過剰発現体を用いたサプレッサー解析も実施し、AHIP4内に変異を同定することに成功し、現在その生理的意義を解析している。AHIP4に関する研究は順調に進展している。AHIP11に関する研究は、当初予定していたAHIP11過剰発現体を用いたAHIP11の候補相互作用因子の探索を行えなかった。しかし、申請書で代案として記述していた酵母ツーハイブリット法により、複数のAHIP11に相互作用する候補因子の単離に成功したことから、本年度の目標をほぼ達成したと考えている。引き続き、AHIP4とAHIP11の機能解析やこれまでに同定したAHIP4とAHIP11にそれぞれ相互作用する因子の機能解析を行い、ABAシグナルを介した種子休眠を制御するシグナルネットワークの解明を目指す。28年度が最終年度であるため、記入しない。H26年度に引き続き、AHIP4は1)AHIP4の相互作用因子の解析、2)AHIP4の転写後修飾の意義などAHIP4自身の解析についても行う。AHIP11は、1)AHIP11の相互作用因子の解析、2)発現誘導性プロモーターを利用し、YFP-AHIP11を発現する組換え植物体の作出を試みる。本研究を進展するためには、H28年度以降も専門知識と技術を有する研究支援者のサポートが必須であり、そのためにはH27年度配分された研究費の一部をH28度以降に繰り越す必要があった。そのため、次年度使用額が生じた。本研究を進展するためには、H27年度以降も専門知識と技術を有する研究支援者のサポートが必須であり、そのためにはH26年度配分された研究費の一部をH27度以降に繰り越す必要があった。次年度使用額は、H28年度からH29年度の研究支援者の人件費として主に使用する。万が一、古い実験機器が故障するなど不測の事態が発生した際、必要な場合は古い機器の修理や更新に使用することも検討する。次年度使用額は、H27年度からH29年度の研究支援者の人件費として主に使用する。
循環調節ペプチドを用いた新たな難治性肺疾患治療の開発

成人呼吸促迫症候群(ARDS)と肺動脈性肺高血圧症(PAH)に対する新規の治療法開発を行った。(1)ARDSなどの急性肺障害は、肺毛細血管の炎症と肺血管透過性充進、アポトーシスに起因する難治性肺疾患である。血管拡張作用をもっ循環調節ペプチドとして発見されたアドレノメデュリン(AM)は、近年、抗炎症作用、血管透過性充進抑制作用、抗アポトーシス作用を持つことが示された。そこでリポポリサッカライド(LPS)を用いた急性肺障害ラットに対するAMの治療効果を検討した。AM持続投与はLPSにより生じる肺組織障害、肺胞洗浄液(BALF)中の炎症細胞浸潤や炎症性サイトカインの増加、血管透過性の指標となるBALF中の蛋白濃度上昇を有意に改善させ、肺胞壁細胞のアポトーシスも抑制した。また、これらの効果は重篤な血圧低下を起こさない投与量で認められた。AMは急性肺障害、特にARDSの新たな治療薬となる可能性が示された。(2)PAHは進行性に肺血管抵抗が増加し、右心不全から死に至る難治性肺疾患である。既存薬のプロスタサイクリン(PGI_2)は代謝時間が極めて短いために持続投与が必要であり、治療抵抗例も存在する。そこで徐放型PGI_2アゴニストを開発し、モノクロタリン(MCT)を用いた肺高血圧ラットへの治療効果を検討した。PLGAでポリマー化された製剤は1回の皮下投与で血中薬物濃度と、セカンドメッセンジャーであるcAMPの血中濃度を約3週間上昇させた。また、1回の皮下投与でMCT投与により生じる右室収縮期圧の上昇、右室肥大、肺動脈中膜肥厚を改善させた。これらの効果は血管拡張作用に加えて、この製剤が新たにもつトロンボキサン合成酵素阻害作用、細胞増殖シグナル(ERKのリン酸化)抑制作用を一部介したものであることが示唆された。この徐放型PGI_2アゴニストはPAHに対する新たな治療薬となる可能性が示された。急性肺障害は肺毛細血管のびまん性障害に起因する難治性肺疾患であり、炎症と肺血管透過性亢進、アポトーシスが病態悪化に関与する。アドレノメデュリン(AM)は強力な血管拡張ペプチドとして発見された循環調節ペプチドであるが、その後の研究により抗炎症作用、血管透過性亢進抑制作用、抗アポトーシス作用を合わせ持つことが明らかとなった。そこで成人呼吸促迫症候群(ARDS)らの急性肺障害に対するAMの治療効果を検討するために、リポポリサッカライド(LPS)を用いた急性肺障害ラットに対するAMの効果を検討した。LPS (1mg/kg)気管内投与による急性肺障害モデルラットを作成し、生理食塩水またはAMを持続静注した。LPS投与6時間後と18時間後に、肺障害の評価として肺重量測定と肺組織の病理学的解析を行った。また、気管支洗浄液(BALF)中の好中球数と炎症性サイトカイン(TNF-α,CINC)濃度の測定、血管透過性亢進の指標としてBALF中のアルブミン、総タンパク濃度の測定、アポトーシス検出のための免疫染色を行った。LPS投与により、肺重量の増加、著明な肺組織障害を認めたが、AM投与によりそれらの変化は有意に抑制された。また、AMはLPS投与により増加したBALF中の好中球数、TNF-α、CINC、アルブミン、総タンパク濃度を有意に減少させ、また肺胞壁内の細胞アポトーシスも抑制した。以上より、AMは抗炎症、肺血管透過性抑制、抗アポトーシスらの作用を介してLPSによる肺障害を抑制することが示された。これらの結果より循環調節ペプチドとして知られるAMが、急性肺障害とくに難治性肺疾患であるARDSの新たな治療薬となる可能性が示唆された。

また、1回の皮下投与でMCT投与により生じる右室収縮期圧の上昇、右室肥大、肺動脈中膜肥厚を改善させた。これらの効果は血管拡張作用に加えて、この製剤が新たにもつトロンボキサン合成酵素阻害作用、細胞増殖シグナル(ERKのリン酸化)抑制作用を一部介したものであることが示唆された。この徐放型PGI_2アゴニストはPAHに対する新たな治療薬となる可能性が示された。
次世シーケンサーを用いた慢性特発性偽性腸閉塞症の原因遺伝子探索

慢性特発性偽性腸閉塞症(CIIP)は乳児期に発症し,腸閉塞症状を呈する稀な疾患である.我々は極めてまれなCIIP父子例を管理中である.父子は同一の症状を呈し,かつ4世代に渡る家系調査では本父子以外に発症者はいなかった.そのため,少なくとも本症例は突然変異を発端とした単一遺伝子疾患であると考え、同一家系内のCIIP罹患者と非罹患者の遺伝型を比較し,次世代シーケンサーを用いた網羅的ゲノム解析により原因遺伝子を探索した.死後症例のDNAの質が悪く,原因遺伝子を十分に絞り込むことができなかった.一方,CIIPの既知原因遺伝子であるACTG2,MYH11の変異も検索したが、本家系に異常はなかった。現在管理中の慢性特発性偽性腸閉塞症(CIIP)父子例を中心とした4世代に渡る詳細な家系図を作成した.それをもとに本疾患発生の原因を推定し、突然変異を発端とした優性遺伝継承が最も考えられ、常染色体優性遺伝を呈する単一遺伝子疾患として以降の解析を進める方針とした.千葉大学生命倫理審査委員会による承認を得た後,十分な説明と同意を得た上で,CIIP罹患者,及びその家系内の非罹患者のヒト試料として血液などの提供を受けた.血液検体からゲノムDNAを抽出し、TruSight One(イルミナ社)によるゲノムワイド関連解析及び全ゲノムシークエンシングを施行した.CIIP罹患者,及びその家系内の非罹患者のヒト試料として血液試料からのDNA抽出が終了し,既知の遺伝性疾患の原因遺伝子領域を網羅的に濃縮するキットであるTruSight One(イルミナ社)を利用してサンプル調整し,NGS(MiSEQ600cycle試薬:total 12.5Gbase/kit)で解析した。家系を4世代にわたり詳細に調査した結果、突然変異を発端とした優性遺伝継承が最も有力な仮説と考えられた。そのため、常染色体優性遺伝を呈する単一遺伝子疾患として解析を進める方針とした。千葉大学生命倫理審査委員会の承認を取得後、十分な説明と同意を得たうえで、血液検体の提供を受けた。血液検体からゲノムDNAを抽出し、ゲノムワイド関連解析および全ゲノムシークエンシングを行った。同一家系内における、慢性特発性偽性腸閉塞症の罹患者と非罹患者の遺伝型を比較し、原因遺伝子を探索したが、絞りこむことができなかった。浸透率が高く、単一遺伝子疾患が想定されるため、本来は原因の同定される可能性の高い疾患である。しかしDNA品質の問題に直面している。家系内のKey personである罹患児の母親のDNAサンプルの質が悪く、このサンプルを除外した場合の遺伝子変異候補が絞り切れていない。慢性特発性偽性腸閉塞症(CIIP)は乳児期に発症し,進行性の腸閉塞症状を呈する稀な疾患である.我々は極めてまれなCIIP父子例を管理中である.父子は同一の症状を呈し,かつ4世代に渡る家系調査では本父子以外に発症者はいなかった.そのため,少なくとも本症例は突然変異を発端とした単一遺伝子疾患である事が有力となった.そこで同一家系内のCIIP罹患者と非罹患者の遺伝型を比較し,次世代シーケンサーを用いた網羅的ゲノム解析により原因遺伝子を探索した.しかし父の母が既に没後であり,生前に行われたリンパ節生検検体からDNA抽出を試みた.その抽出されたDNAの質が悪く,原因遺伝子を十分に絞り込むことができなかった.一方,CIIPの既知の遺伝子異常としてACTG2 (Enteric smooth muscle actin γ-2),MYH11 (myosin heavy chain 11)が知られている.そこで,ACTG2,MYH11についてCIIP罹患者と非罹患者とで比較を行った。罹患者にあって非罹患者にない変異はACTG2で8つのSNV(Single Nucleotide Variant),MYH11で6つのInsertion & Deletion,13のSNVであった.この内,Exon上に変異があったのはひとつだけ(rs1050113)であった.ただSNPのReferenceを調べてみると,このrs1050113はマイナーアレルがホモ(A/A)の確率が8.9%であった.CIIPの原因として単一遺伝子を想定しているが,人類の8.9%にみられる変異では仮説に合致しないため,本症例の原因としては認められないと判断した.慢性特発性偽性腸閉塞症(CIIP)は乳児期に発症し,腸閉塞症状を呈する稀な疾患である.我々は極めてまれなCIIP父子例を管理中である.父子は同一の症状を呈し,かつ4世代に渡る家系調査では本父子以外に発症者はいなかった.そのため,少なくとも本症例は突然変異を発端とした単一遺伝子疾患であると考え、同一家系内のCIIP罹患者と非罹患者の遺伝型を比較し,次世代シーケンサーを用いた網羅的ゲノム解析により原因遺伝子を探索した.死後症例のDNAの質が悪く,原因遺伝子を十分に絞り込むことができなかった.一方,CIIPの既知原因遺伝子であるACTG2,MYH11の変異も検索したが、本家系に異常はなかった。ゲノムワイド関連解析及び全ゲノムシークエンシングから得られたデータをもとに,バイオインフォマティクス解析を施行していく予定である.具体的には、総ターゲット領域12MbaseのTruSight Oneにより,家系解析に加えて当該家系の解析によるvariation候補と,すでに所持するデータベースとも照合させ,さらに候補を絞り込んでいる。

また,TruSight Oneに搭載されない他の領域を否定するためにも,解析に重要なI-2,3,II-1,2,6,IIIの6サンプルについては全ゲノム解析を実施していく(原因候補変異の検証)。同一家系内の被検者をつのり、サンプルを増加させることでTargetを絞り込む。また、全国の施設に呼びかけ、対象となる家系を追加することで、Targetを絞り込んでいく。小児外科
誘導型プロモーターによる植物の誘導変異遺伝子タギング法の開発

本研究の目的は、アンチセンスによる遺伝子発現の抑制系を応用し、変異誘導の調節可能な変異体作出のモデル実験系を構築し評価することである。つまり植物の染色体中にランダムに誘導型プロモーターを挿入し、転写を誘導することにより表現形を得る。ランダムな挿入法としてアグロバクテリアTiプラスミドを利用した常法を、誘導型プロモーターとしてはテトラサイクリンリプレッサータンパク質結合部位をもつCaMV35Sプロモーターを採用した。実験系の評価のため次の事柄について検討した。(i)培養細胞用いT-DNA挿入変異を飽和させ、目的の突然変異体が分離できること。これは塩素酸耐性の細胞をテトラサイクリンによるプロモーター誘導条件下で選抜することで試みたが突然変異体の取得には至らなかった。主として、低い形質転換効率が原因である。(ii)導入プロモーターからの転写物が誘導されること。これは形質転換タバコにテトラサイクリンを与え、誘導プロモーターからの転写誘導をRNaseプロテクション法を用い確認した。プレート法では切断した葉を用いた真空浸透法による誘導に比べて誘導は非常に弱かった。これは蒸散量が少ないこと、テトラサイクリンの不安定性に原因であると考えた。支持体を用いた水耕栽培法で植物を生育し、誘導プロモーターからの転写を誘導したところ、良好な誘導が見られた。(iii)破壊された遺伝子座の誘導によるRNAの変動の確認。これは形質転換植物においてはゲノムにランダムに組み込まれていると考えられる挿入DNAの隣接部位をIPCR法によりT回収した。現在のところ、非形質転換体植物での転写が得られる断片の取得には至らず、現在進行中である。以上の結果を総合的に考察すると、挿入プロモーターの発現の制御は可能であるが、実験系として確立するためには、より多くの形質転換体を得て解析を進める必要がある。これまでに、テトラサイクリン(Tc)による誘導ならびにアンチセンスRNAによる遺伝子の発現抑制がタバコで実際に可能であることを確かめるために、以下の実験を行った。まず、Tc誘導型プロモーター下で硝酸還元酵素(NR)遺伝子のアンチセンスRNAを発現するコンストラクトを作成し、リ-フディスク法によりタバコ植物体に導入した。得られた形質転換体タバコを水耕栽培法により生育させ、Tcの有無による塩素酸への耐性を調べた。その結果、Tcを与えないと塩素酸の添加によりこのタバコは枯死したが、Tcを与えると塩素酸を添加してもほぼ正常に生育した。さらに、ストランド特異的プローブを用いたノザン解析により、NR遺伝子のmRNAおよびアンチセンスRNAの存在量を調べた。それによれば、Tcを与えたタバコではアンチセンスRNAが合成されていたのに対し、与えなかったタバコではほとんど合成されていなかった。また、前者のNR遺伝子のmRNA量は後者に比べ減少していた。以上のことから、TcによりNR遺伝子のアンチセンスRNAの転写が誘導され、さらには合成されたアンチセンスRNAによってNRタンパク質の機能が抑制されることが明らかとなり、目的とする誘導変異遺伝子タギング法が可能であるものと考えられた。そこで次に、Tc誘導型プロモーターのみを持つコンストラクトをタバコにランダムに導入することを試みた。植物体では扱える個体数に限りがあるので、培養細胞の系を用いることにした。そのためにまず、テトラサイクリンリプレッサータンパク質(TetR)を高発現しているタバコの葉からカルスを誘導し、培養細胞系を確立した。そして、これら培養細胞からRNAを単離し、ノザン解析によりTetRが高発現されていることを確認した。現在、この培養細胞を用いて形質転換を行い、多数の形質転換体を作出している段階である。今後は、得られた変異体からTcの有無により塩素酸耐性に違いがあるものを強制的に選抜する予定である。そしてそれにより、ランダムに変異導入が可能であることを確認したいと考えている。

現在のところ、非形質転換体植物での転写が得られる断片の取得には至らず、現在進行中である。以上の結果を総合的に考察すると、挿入プロモーターの発現の制御は可能であるが、実験系として確立するためには、より多くの形質転換体を得て解析を進める必要がある。
親水性高選択的吸着材を作成し実海域の係留装置を用いて海水産ウラン鉱石を作る研究

近い将来に予想されるウラン資源の不足に備えて,海水に溶存しているウランを採取する研究が進められてきた.海水中でウランは,1m^3中に3mgの濃度で,三炭酸ウラニルイオンという形態で溶けている.黒潮の流れに乗って毎年約500万トンという量のウランが日本の近海を流れている.海水中のウランを選択的に吸着する官能基としてアミドキシム基が選ばれてきた.アミドキシム基をさまざまな高分子マトリクスに導入して吸着材が作成され,その性能が評価された.高分子マトリクスの物理的強度を保ちながら官能基を導入できるという放射線グラフト重合法の利点を生かして,わたしたちはポリエチレン製繊維からアミドキシム吸着材を作成した.さらに吸着速度を上げるためには,ウランの吸着材内での拡散を促進する必要がある.本研究では,アクリロニトリル(AN)に親水性モノマー(ここではメタクリル酸MAA)を共グラフト重合させた後にアミドキシム化し,吸着材を調製した.調製した吸着材を充填した装置を,深さ43mの海域に係留し,ウランの吸着実験を実施した.ANとMMAとの共グラフト重合させたポリプロピレン製不織布から作成したアミドキシム吸着材を使うと60日間でウラン吸着量が1.7g-U/kgとなった.また,ウランとともにバナジウムが約2倍量吸着することがわかった.さらに、海水中からのウラン吸着とそれに続く塩酸中でのウラン溶出の繰返しに伴う吸着材のウラン吸着性能の低下を抑えるために、ANとMAAに加えて親水性架橋剤を共グラフト重合させた。これにより、吸着溶出の繰返しに対して高い耐久性を示す吸着材を得ることができた。近い将来に予想されるウラン資源の不足に備えて,海水に溶存しているウランを採取する研究が進められてきた.海水中でウランは,1m^3中に3mgの濃度で,三炭酸ウラニルイオン(UO_2(CO_3)_3^<4->)という形態で溶けている.黒潮の流れに乗って毎年約500万トンという量のウランが日本の近海を流れている.海水中のウランを選択的に吸着する官能基としてアミドキシム(AO,-C=N(OH)NO_2)基が選ばれてきた.アミドキシム基をさまざまな高分子マトリクスに導入して吸着材が作成され,その性能が評価された.高分子マトリクスの物理的強度を保ちながら官能基を導入できるという放射線グラフト重合法の利点を生かして,わたしたちはポリエチレン製繊維からアミドキシム吸着材を作成した.ポンプ利用および海流利用方式でのウラン吸着特性を明らかにしてきた.さらに吸着速度を上げるためには,ウランの吸着材内での拡散を促進する必要がある.本研究では,アクリロニトリル(AN)に親水性モノマー(ここではメタクリル酸MAA)を共グラフト重合させた後にアミドキシム化し,吸着材を調製した.調製した吸着材を充填した装置を,深さ43mの海域に最長60日間係留し,ウランの吸着実験を実施した.ANとMMAとの共グラフト重合させたポリプロピレン製不織布から作成したアミドキシム吸着材が,ANの単独グラフト重合不織布から作成したアミドキシム吸着材に比べて,ウラン吸着量が約5倍大きいことを明らかにした.近い将来に予想されるウラン資源の不足に備えて,海水に溶存しているウランを採取する研究が進められてきた.海水中でウランは,1m^3中に3mgの濃度で,三炭酸ウラニルイオンという形態で溶けている.黒潮の流れに乗って毎年約500万トンという量のウランが日本の近海を流れている.海水中のウランを選択的に吸着する官能基としてアミドキシム基が選ばれてきた.アミドキシム基をさまざまな高分子マトリクスに導入して吸着材が作成され,その性能が評価された.