hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ＡＤＯＣを用いた作業に焦点を当てた作業療法の費用効果分析

我々は,高齢者に対する作業療法が費用効果的であるかについてシステマティックレビューにて検証し,費用効果的な作業療法について検証した.また,それらの結果から,我々の開発したiPadアプリケーションである作業選択意思決定支援ソフトAid forDecision-making in Occupation Choice (以下,ADOC)を用いた作業に焦点を当てた作業療法が通常の作業療法療法と比較し費用効果的であるかについてクラスター型無作為化比較試験を用いて検証した.その結果,ADOCを用いた作業療法は,ADLの維持向上に効果があることが示唆され,費用効果であることも示唆された.本年は,高齢者に対する作業療法の費用効果に関する文献研究(システマティックレビューとメタアナリシス)と介護老人保健施設12施設の協力を経て,クラスター型無作為化比較試験を行った.文献研究の結果としては,作業療法群において,総費用の減少は認められないものの費用効果的である研究が2つ認められた.また,高齢者に対する作業療法介入において,費用効果的な介入方法についての示唆が得られた.本研究結果については,現在,論文執筆が終了し,国際ジャーナルに投稿中である.クラスター型無作為化比較試験については,10月2月(計4か月)までを介入期間とし,データ収集が終了した状況である.現在は,追加データの収集,データ解析,論文執筆を行っているところである.ADOCを用いた作業療法の効果と費用効果,作業療法士の勤務時間などについて検討する予定である.なお,本研究結果については,国際ジャーナルへの投稿を予定している.我々は,高齢者に対する作業療法が費用効果的であるかについてシステマティックレビューにて検証し,費用効果的な作業療法について検証した.また,それらの結果から,我々の開発したiPadアプリケーションである作業選択意思決定支援ソフトAid forDecision-making in Occupation Choice (以下,ADOC)を用いた作業に焦点を当てた作業療法が通常の作業療法療法と比較し費用効果的であるかについてクラスター型無作為化比較試験を用いて検証した.その結果,ADOCを用いた作業療法は,ADLの維持向上に効果があることが示唆され,費用効果であることも示唆された.平成24年度は、本研究におけるパイロットスタディとして、神奈川県内の老人保健施設において、作業に焦点を当てた作業療法の効果をシングルケースで行った。本年度の成果としては2点挙げられる。1点目は、老人保健施設で実施可能な作業に焦点を当てた介入方法を検討できたことである。従来、老人保健施設では、機能訓練を重視する傾向が高く、作業に焦点を当てた介入の実施可能な方法を模索することが最重要課題であった。ADOCを用いることで対象者からのニーズを聞き出すことができ、作業に焦点を当てた介入へとつなげることができたケースを経験した。また、そのためには、リハの介入時間だけでなく、介護職を含めたチームでの介入が重要であることが示唆された。2点目は、介入の効果判定であるoutcomeを検討し、作業に焦点を当てた作業療法の効果判定としてHRQOLの評価法であるSF-36を用いることが最も適していると検証できたことである。また、費用効果についての検証を行うための方法について、SF-36から算出された結果からSF-6Dのアルゴリズムを利用し、効用値を算出する予定である。効用値から、QALYを算出し、1QALYあたりの増分費用効果費を算出し、介入群との比較を行う予定である。特に老人保健施設の入所者に対しては、費用の項目について専門家と議論しているところである。これらの成果を元に、来年度は、老人保健施設18施設の協力を経て、Randomized control trialを実施する予定である。平成25年度は,24年度に行ったシングルケースから得られたデータをもとに多施設での無作為化比較試験を行った.また,多施設での研究に先立ち,作業療法の費用効果の研究のシステマティックレビューを行った.この成果については,国際紙に投稿中である.本研究のデザインは,シングルブランドのクラスター型無作為化比較試験(施設を無作為割付けする)とした.平成25年11月2月の4か月間を介入期間とし,介入前と介入後でブランド化した評価者によって評価を行い,その効果について検証した.平成25年9月と平成26年2月に多施設の研究協力者に対しての研究研修を行い,研究内容についての共有を行った.平成26年度は,主に25年度で行った無作為化比較試験の結果についての統計処理及び論文執筆を中心に行った.この成果については,国内外の学会および査読付き国際紙に投稿中である.作業療法学10月2月(4か月間)までを介入期間とし,現在は,追加データの収集,データ解析,論文執筆を行っているところである.平成26年度中には,国際ジャーナルへの投稿,国際学会での発表を予定している.平成24年度は、本研究におけるパイロットスタディとして、神奈川県内の老人保健施設において、作業に焦点を当てた作業療法の効果をシングルケースで行った。また、全国の施設に対してインターネットを利用し、リクルート活動を行った。また、沖縄県で研究説明会を行った。現在のところ参加施設は18施設であり、現在は研究施行に向けて準備を行なっているところである。概ね順調に進展しているが、費用の算出においてどこまで算出するかについて今後も議論が必要である。

今後は,追加データの収集が終わり次第,最終的なデータ解析を行い,論文執筆を行っていく予定である.最終解析について,クラスター型無作為化比較試験であるため,施設間の関連を考慮したマルチレベル解析を行うため,専用の統計解析ソフトの購入が必須となる.今後は、プロトコールに従い、研究施設のランドマイズド化(7月予定)、介入施設に対する研究説明会の実施(8月、9月を予定)などを行う。また、各施設へのiPadの配布などを行い、介入方法を再度検討していく。本年度は、実際の研究がスタートするため、各施設との連絡を密にして行なっていく必要がある。介入期間が10月2月であり,本年度中の研究終了は困難であり,本来,本年度使用予定であった英文校正費,論文出版費用などが未使用のままであったため.英文校正費,論文出版費用,統計解析ソフトに使用する予定である.上記計画に従い、全国の研究協力者に対しての説明会を実施する予定であるため、会議費にかかる交通費、宿泊費などが必要となる。また、必要に応じて謝礼としての費用も必要となる。また、iPadを配布する必要があり、その経費が必要となる予定である。
アドヘレンジャンクションにおける新規細胞接着機構ネクチン・アファジンの役割

ネクチン-アファジン-アクチン系細胞接着機構は、非神経上皮細胞のアドヘレンス・ジャンクションに局在する新規の細胞接着機構である。ネクチは、細胞外Ca2+非依存性の細胞接着活性を持つイムノグロブリン系細胞接着分子で、1型、2型、3型の3種のアイソフォームが存在する。今回私共は、脳シナプスにおけるネクチン-アファジン系の役割を解析した。その結果、ネクチン-アファジン系は、ゲッ歯類成獣海馬CA3領域の苔状線維終末-CA3錐体細胞間シナプスのPuncta Adherentia Junctionに局在していることが確認された。特徴的なことには、ネクチン1型がプレシナプ側、ネクチン3型がポストシナプス側に非対称性に局在していた。また、同部位のシナプス形成初期では、ネクチン1型と3型は、Puncta Adheentia JunctionのみならずSynaptic Junctionにも非対称性に分布していた。さらに試験管内で海馬神経細胞を、ネクチン1型の機能阻害物質存在下で培養すると、形成されるシナプスの大きさが小型化するとともに、シナプス数は増加した。これらのデータから、ネクチン-アファジン-アクチン系細胞接着機構は、シナプスの大きさ・位置の決定並びに可塑性の調節に関与していることが強く示唆された。新規細胞接着機構ネクチン・アファジン系の局在と機能の解析これまで私共は、ネクチン・アファジンが小腸上皮細胞のアドヘレンスジャンクションに局在することを示した。そこで次に、従来からアドヘレンスジャンクション様構造を持つと報告されてきた脳のPuncta adhaerentia junctionなどの構造にもネクチンとアファジンが存在するか否かを光顕・電顕レベルで解析した。その結果、アファジンには大小2つのアイソフォームが存在し、脳では、大アファジンは海馬のCA3領域のmossy fiberの神経終末にのみ限局して発現しているのに対して、小アファジンは脳全体に広く発現していた。またネクチンにも1型、2型、3型の3種のアイソフォームがあり、それぞれのアイソフォームがどのアドヘレンスジャンクション様構造に局在するかを解析した。その結果、ネクチン1型がmossy fiberの神経終末に、ネクチン3型がCA3領域錐体細胞樹状突起に局在することがわかった。さらに、ネクチン1型機能を阻害する物質、gD.を海馬培養細胞に作用させると、シナプスの直径が減少し、個数が増加することがわかった。このことから新規細胞接着機構ネクチン・アファジン系は、シナプス形成に重要な役割を果たしていることが示唆された。ネクチンは、細胞外Ca2+非依存性の細胞接着活性を持つイムノグロブリン系細胞接着分子で、1型、2型、3型の3種のアイソフォームが存在する。特徴的なことには、ネクチン1型がプレシナプス側、ネクチン3型がポストシナプス側に非対称性に局在していた。また、同部位のシナプス形成初期では、ネクチン1型と3型は、Puncta Adherentia JunctionのみならずSynaptic Junctionにも非対称性に分布していた。
フェライト系耐熱鋼における転位強化と析出強化の相乗効果メカニズムの解明

一般的な9Crフェライト系耐熱鋼において、クリープ強度は転位強化と炭化物析出強化の複合によって向上することが知られている。しかし、その複合による相乗的な作用の材料学的背景については不明な点が多い。本研究では、転位回復の抑制に寄与すると考えられているM23C6の分散状態を、それが生成する粒界の性格別に定量評価した。その結果、M23C6のサイズと被覆率には明らかな粒界性格依存性があり、旧γ粒界のM23C6サイズは大きく、被覆率が高い一方で、クリープ変形中の成長が早く、被覆率の低下が他の粒界に比べて顕著であることを明らかにした。本研究では、高Crフェライト鋼における転位強化と析出強化の相乗効果のメカニズムを解明することを第一の目的とする。そのために、マルテンサイト組織中のどの部分に位置するどの種類の析出物がどのような機構でラス組織を安定化するのか、また、その析出物のクリープ変形中の成長とそれによる鋼の弱化挙動について系統的な調査を行う。それらの結果から、高Crフェライト鋼の新規的なクリープ強化理論を構築することが本研究の最終目標である。。平成26年度では、「1.高Crフェライト鋼におけるM23C6析出状態の定量評価」と「2.クリープ変形に伴うM23C6の析出状態変化」について検討を行った。具体的には、9Cr系耐熱鋼と12Cr系耐熱鋼の初期材およびクリープ中断材に対して、粒界上のM23C6炭化物のサイズ・化学成分・粒界被覆率を走査電子顕微鏡、透過電子顕微鏡および結晶方位解析を組み合わせた微細構造解析により定量評価した。その結果から、変形前の初期材において、粒界性格の違いによりM23C6炭化物の分散状態に明確な違いがあること、大角粒界上では小角粒界上に比べて被覆率が高く、粒子サイズが大きく、Crに富んだ組成になっていることがわかった。また、クリープ変形のM23C6炭化物の粗大化が、大角粒界上において顕著であることもわかった。さらに、平成27年度計画の一部である「3.M23C6によるラス組織の熱的安定性向上メカニズムの解明と高強度化への指針提示」についても実験を進めており、その中で、各粒界上のM23C6炭化物によって生じる粒界移動に対するピンニング力をZenerの式に基づき算出したところ、大角粒界におけるピンニング力は小角粒界のそれに比べて2倍以上大きいものの、クリープ変形中に起こる粗大化によって徐々に減少する傾向にあることを確認した。本研究では、高Crフェライト鋼中に生成するM23C6炭化物のクリープ変形中の成長と母相組織の相関を明らかにし、鋼のクリープ弱化挙動について考察を行う。その結果から、高Crフェライト鋼の新たなクリープ強化理論を構築することを研究の目的とする。その結果、母相であるマルテンサイト組織に内包される結晶粒界の性格がM23C6炭化物の成長挙動に大きく影響を与えることがわかった。平成27年度は、10000時間を超えるクリープ試験など新たな条件で組織と強度を変化させたテストピースを用意して、項目1と項目2のデータを拡充し、炭化物生成・成長挙動とマルテンサイト組織との相関に関する系統的な調査を継続実施するとともに「3.M23C6によるラス組織の熱的安定性向上メカニズムの解明と高強度化への指針提示」についての検討を行った。具体的には、マルテンサイトラスの回復とM23C6炭化物挙動を定量的に比較検討し、特に旧オーステナイト粒界近傍での炭化物の粗大化が、ラスの回復とそれに伴うひずみ速度の増加の主要因であることを見出した。さらに、変形中の応力負荷が旧オーステナイト粒界およびパケット境界上の炭化物を優先的に成長させるという新たな知見を得るに至り、そのことに基づく新たなクリープ強化理論を構築した。研究実績の概要に記載のとおり、高Crフェライト鋼の各粒界において、その粒界性格とM23C6炭化物分散状態の関係性を明らかにすることができており、当該年度の計画は概ね達成されている。現在実施しているクリープ破断試験はいずれも6000時間を越えて加速域に到達しており、来年度中には当初計画で観察予定の全ての試料が用意できる見込みである。また、当初、平成27年度の計画としたM23C6によるラス組織の熱的安定性向上メカニズムの解明についても、すでに一部に着手しており成果を得ている。したがって、自己評価としては、「(2)おおむね順調に進展している」が妥当であると考える。金属物性

平成26年度成果から、ラスマルテンサイト中の各種粒界とM23C6炭化物の分散状態には明らかな相間があること、さらにクリープ変形中の炭化物の成長挙動が粒界性格に強く依存することが明確に示された。H27年度では、更にクリープ変形が進行した場合の組織変化について、H26年度に確立した組織観察手法を用いてデータの拡充を行うとともに、当初の計画通り「3.M23C6によるラス組織の熱的安定性向上メカニズムの解明と高強度化への指針提示」について研究を進める。具体的には、M23C6炭化物による各粒界・境界移動の抑制力やそれに起因した強化を具体的数値とともに評価し、各粒界上M23C6炭化物のそれぞれの役割とその重要度について明確にする。また、クリープ試験材についてマイクロビッカース試験やナノインデンテーション試験による硬度試験、走査電子顕微鏡内での結晶方位解析、透過電子顕微鏡を用いた転位密度測定などからラスの優先的回復サイトを特定し、先のM23C6炭化物分散状態・成長挙動評価の妥当性について検証する。硬度試験では組織の軟化、結晶方位解析では小角粒界長さの減少、透過電子顕微鏡観察では転位密度の低下によりラスの回復を検知できる。以上の結果から、ラス組織による転位強化と粒界上M23C6による析出強化の相乗効果の原理原則を解明する。また、その様式をモデル化することで本研究を総括し、それを基に高Crフェライト鋼の新たなクリープ強化理論について提案する。12Crフェライト系耐熱鋼のクリープ試験材作製のため、現在、5000時間のクリープ中断試験と想定破断時間1万時間程度のクリープ破断試験を試験請負企業に依頼して実施中である。当初これらの試験は平成26年度中に一部終了する予定であり、そのため直接経費「その他」に試験外注費を計上していたが、試験条件の選定、試験材の準備・加工等に時間を要したため、平成27年度まで試験を継続して行う必要が生じた。そのため、外注費を次年度使用額として繰り越して使用することとした。次年度使用額のほとんどは、実施中のクリープ試験の外注費として利用する。その他の経費に関しては当初計画から大きな変更はない。
プロスタノイドの血管病変形成における役割-骨髄細胞分化に及ぼす影響-

骨髄選択的にプロスタサイクリン受容体欠損させたマウスを利用して、「骨髄のIP欠損は,血管リモデリング増悪に重要であること」をあきらかにし、「骨髄由来内皮前駆細胞(EPC)の機能維持にプロスタノイドなかでも、プロスタサイクリン(PGI2)系が重要な役割をはたすこと」、さらに、骨髄特異的にプロスタサイクリン受容体(IP)を欠損させたマウス実験動物を用いて、「血管リモデリング、末梢虚血などの病態にEPCのPGI2/IP系が重要であること」を明らかにし、本研究申請目標のほとんどを達成したものと考える。なお、本研究の成果のうち、(1)血管リモデリングに関する研究は、すでに投稿中である。(2)末梢虚血性疾患におけるEPCに関する研究は、現在投稿準備中である。本研究の成果として重要な点として、強力な抗動脈硬化作用をもつPGI2の、新たな作用機序を明らかにしたこと、ユニークな実験動物モデルの作成により、in vivo各種病態でのEPCの役割、重要度などを明らかにしたこと。また、すでに臨床利用されているIP刺激薬のさらなる応用性についても提唱した点も重要である。我々は,"PGは骨髄前駆細胞の血管系細胞への分化増殖に作用し、動脈硬化病変進展に関与する。"という仮説をたて,以下の目的をあげて,研究を行っている.目的1:血管病変におけるPGの骨髄由来の細胞への関与を明らかにする目的2:骨髄前駆細胞の内皮、平滑筋細胞分化へのPGの作用機序を明らかにする18年度は,(1)骨髄移植モデルの作成;donor由来の骨髄細胞を98%以上移植させることの成功した.これによりプロスタサイクリン受容体IP欠損骨髄をもつマウスモデルを準備した.(2)大腿動脈障害による血管リモデリング;上記マウスモデルを用いて,骨髄のIP欠損有無による血管リモデリング形成への影響を検討した.この一連の研究から「骨髄のIP欠損は,血管リモデリング増悪に重要であること」をあきらかにした-(日本循環器学会(神戸),March,2007)(3)血管リモデリング部位での骨髄由来細胞の同定;性不一致骨髄移植後,Y染色体遺伝子含有細胞をin situ hybridizationで同定した.この結果,「骨髄にIP欠損は,障害血管部位に取り込まれる骨髄由来の平滑筋細胞が増加,障害血管内壁での内皮化修復が激減する」ことをあきらかにした.(日本薬理学学会(名古屋)-March,2007)以上から,18年度中に,予定通り,骨髄IPが,血管障害で誘発する血管リモデリング形成において重要な役割をはたすこと,この現象に骨髄由来の血管細胞の働きの異常が関与することが明らかにすることができた.今後,骨髄および血中の血管前駆細胞の同定(in vitroでの平滑筋および内皮分化誘導培養システム)を構築し,IPの血管前駆細胞の分化作用を明らかにしていく予定である.我々は,"PGは骨髄内皮前駆細胞(EPC)の血管系細胞への分化増殖に作用し、動脈硬化病変進展に関与する。"という仮説をたて,以下の目的をあげて,研究を行ってきた目的1:血管病変におけるPGの骨髄由来の細胞への関与を明らかにする目的2:骨髄前駆細胞の内皮、平滑筋細胞分化へのPGの作用機序を明らかにする17-18年度は,骨髄選択的にプロスタサイクリン受容体欠損させたマウスを利用して、「骨髄のIP欠損は,血管リモデリング増悪に重要であること」をあきらかにし、19年度は、その機序について解析実験を展開してきた。我々は、EPCは、プロスタサイクリン受容体発現細胞であり、またプロスタサイクリン産生細胞であることを見出し、様々なEPCの機能へのプロスタサイクリン伝達系の役割をあきらかにしてきた。すなわち、プロスタサイクリン受容体欠損EPCの増殖能、分化能が著明に低下すること。最終年度である20年度は、さまざまな遺伝子発現解析から、その責任遺伝子の同定と、論文発表にあたる予定である。我々は, "PGは骨髄内皮前駆細胞(EPC)の血管系細胞への分化増殖に作用し、動脈硬化病変進展に関与する。

"という仮説をたて,以下の目的をあげて,研究を行ってきた目的1 :血管病変におけるPGの骨髄由来の細胞への関与を明らかにする目的2 :骨髄前駆細胞の内皮、平滑筋細胞分化へのPGの作用機序を明らかにする17-18年度は,骨髄選択的にプロスタサイクリン受容体欠損させたマウスを利用して、「骨髄のIP欠損は,血管リモデリング増悪に重要であること」をあきらかにし、19年度から最終年度にかけて、「骨髄由来内皮前駆細胞(EPC)の機能維持にプロスタノイドなかでも、プロスタサイクリン(PGI2)系が重要な役割をはたすこと」、さらに、骨髄特異的にプロスタサイクリン受容体(IP)を欠損させたマウス実験動物を用いて、「血管リモデリング、末梢虚血などの病態にEPCのPGI2/IP系が重要であること」を明らかにし、本研究申請目標のほとんどを達成したものと考える。なお、本研究の成果のうち、(1)血管リモデリングに関する研究は、すでに投稿中である。(2)末梢虚血性疾患におけるEPCに関する研究は、現在投稿準備中である。本研究の成果として重要な点として、強力な抗動脈硬化作用をもつPGI2の、新たな作用機序を明らかにしたこと、ユニークな実験動物モデルの作成により、in vivo各種病態でのEPCの役割、重要度などを明らかにしたこと。また、すでに臨床利用されているIP刺激薬のさらなる応用性についても提唱した点も重要である。
核-細胞質間物質輸送制御の視点からの脳性差発現機構解明へのアプローチ

核一細胞質間蛋白質輸送機構に関する研究は、importin βファミリー分子、importin αファミリー分子、低分子量GTPase Ranやそのサイクルに関する因子群の性状解析が精力的に進められ、輸送機構に関する基本的な分子メカニズムが理解される段階にまで研究は進展した。しかし、核一細胞質間蛋白質輸送が、個体発生、細胞分化・増殖、細胞死、ストレス応答、細胞周期といった様々な生命現象とどのように深く関連しているのかという点についてはほとんど研究が進んでいない。本研究では、マウス脳において蛋白質の核輸送機構に性差による制御が存在し、それらが脳の性差発現に重要であるのではないかという仮説の下に、1)性差に着目したマウス脳における核輸送因子発現の網羅的解析、2)発現に性差が見られる核輸送因子により運ばれている脳の性差決定(維持)候補因子の同定、3)性差の見られた核輸送因子の脳内特定部位特異的なコンディショナルノックアウトマウス、及び脳の性差決定(維持)候補因子のノックアウトマウスを用いた脳性差発現の解析を行うことを目的として研究を進めた。昨年度の研究の結果、importin αファミリーに属する分子の1つであるimportin α5(NPI-1)の発現量が、蛋白質のレベルで、雌の脳(小脳、中脳、前頭葉、海馬、嗅球など)において増加していることが明らかとなった。一方、importin βの発現量には顕著な雌雄差は見られなかった。そこで、本年度は、神経細胞においてimportin α5によって輸送されている因子群の、質量分析法による網羅的同定を試みた。その結果、計47種類の脳の性差を決定する可能性のある候補分子を同定することができた。核-細胞質間蛋白質輸送機構に関する研究は、importin βファミリー分子、importin αファミリー分子、低分子量GTPase Ranやそのサイクルに関する因子群の性状解析が精力的に進められ、輸送機構に関する基本的な分子メカニズムが提唱される段階にまで研究は進展した。しかし、核-細胞質間蛋白質輸送が、個体発生、細胞分化・増殖、細胞周期といった様々な生命現象とどのように深く関連しているのかという点についてはほとんど研究が進んでいない。本研究では、マウス脳において蛋白質の核輸送機構に性差による制御が存在し、それらが脳の性差発現に重要である、という仮説の下に、1)性差に着目したマウス脳における核輸送因子発現の網羅的解析、2)発現に性差が見られる核輸送因子により運ばれている脳の性差決定(維持)候補因子の同定、3)性差の見られた核輸送因子の脳内特定部位特異的なコンディショナルノックアウトマウス、及び脳の性差決定(維持)候補因子のノックアウトマウスを用いた脳性差発現の解析を行うことを目的として研究を進めた。その結果、importin αファミリーに属する分子の1つであるimportin α5(NPI-1)の発現量が、蛋白質のレベルで、雌の脳(小脳、中脳、前頭葉、海馬、嗅球など)において増加していることが明らかとなった。現在、他のimportin βファミリー分子についても、質の高い抗体を手に入れる努力を続けて発現パターンの解析を進めるとともに、importin α5に雌雄差のあることの意義解明に向けた研究を進めている。
顎口腔組織に存在する神経堤由来細胞の解析と硬組織再生技術への応用

神経堤細胞は胎生初期に神経管閉鎖の際、神経管背側から脱離して胚内を広く遊走した後に様々な細胞へ分化する。一部の神経堤由来細胞は成体後も体内で多分化能を持つことから、再生医療の細胞ソースとして応用へ期待されている。神経堤由来細胞を標識できる、P0-Cre/CAG-CAT-EGFP成体マウスの神経堤由来細胞の分布解析から、顎口腔組織広範囲にGFP陽性細胞が認められた。口腔粘膜から純化した神経堤由来細胞は、誘導培地で骨芽細胞様細胞へと分化した。成体顎口腔組織の様々な部位に神経堤由来細胞が存在し、特に口腔粘膜は細胞を低侵襲に採取できる組織として、硬組織再生へ応用可能なことが示唆された。神経堤細胞は、脊椎動物の胚発生の過程で神経管近傍に出現する細胞集団であり、その大部分は上皮間葉移行を起こし、全身の細胞に遊走する。遊走先によって様々な細胞に分化し組織の重要な機能を担う非常に特殊な細胞集団であることから、第四の胚葉とも呼ばれる。近年神経堤細胞の一部は成体においても組織幹細胞として存在することが明らかとなっており、その特殊性からも再生医療における細胞ソースとして有用性が非常に期待されている。その有用性から非常に注目されている神経堤細胞だが、全身を遊走し細胞特性を変化させる性質上成体における詳細な分布はいまだに解明されていない。再生医療における細胞ソースとしての利用が可能であるかどうかを検討するためにも、成体における詳細な分布解析は必須の検証項目である。そこで、神経堤由来細胞が蛍光タンパク質で標識される遺伝子改変マウスを用いて顎口腔組織における分布を解析し、神経堤由来細胞が頬粘膜など口腔組織に多く分布することを明らかにした。さらに、これまでの結果に基づいて神経堤由来細胞の詳細な組織内での機能や細胞種、そしてそれらの分化能を検討し、口腔組織のうち、鼻腔介、歯肉、舌、頬粘膜に神経堤由来細胞が存在することを組織学的な解析により見出した。神経堤細胞は胎生初期の神経管が閉鎖される時期に、神経管背側から脱離して胚内を広範囲に遊走した後に様々な細胞へ分化する。神経堤から遊走した一部の神経堤由来細胞は、大人になってもマウスの体内で多分化能を持つことから、再生医療の細胞ソースとして臨床応用への期待が高まっている。申請者は神経堤由来細胞を標識できる、ミエリンプロテインゼロのプロモーター下でGFPを発現するP0-Cre/CAG-CAT-EGFP成体マウス(P0マウス)の口腔・顎顔面組織における神経堤由来細胞の分布を解析すると、鼻甲介、口蓋、上顎/下顎切歯部歯肉、上下顎臼歯部歯肉、および頬粘膜にGFP陽性細胞の存在が認められた。組織学的解析から、鼻甲介で観察された神経堤由来細胞は、主に嗅細胞であった。皮膚真皮に存在する神経的由来細胞は、マイスネル小体と一致して存在した。口腔粘膜組織からフローサイトメーターで純化した神経堤由来細胞の多分化能について解析すると、GFP陽性細胞は、BMP-2含有の骨芽細胞分化誘導培地で強いALP活性染色とAlizarin red染色陽性を示す骨芽細胞様細胞へと分化した。さらにInsulin含有の分化誘導培地によってOil Red O染色陽性の脂肪細胞が出現した。以上の結果から成体になっても顎口腔組織の様々な部位に神経堤由来細胞が存在し、それらの細胞は骨芽細胞様細胞や脂肪細胞様細胞など誘導できる多分可能を有していた。特に口腔粘膜は細胞を低侵襲に採取できる組織として、硬組織再生へ応用可能なことが示唆された。26年度が最終年度であるため、記入しない。歯科矯正学26年度が最終年度であるため、記入しない。筆者はは、全身表皮における神経堤由来メラノサイトの詳細な分布を視覚化する事に成功し、上半身に多く存在することを見出した。またそれらの分布は出生後1日目から上半身に多く分布し、生涯を通して分布に大きな変化は生じないと推測され、発生・解剖学的に意義深い結果を示した。さらに、組織学的解析結果から、頬粘膜の上皮細胞が神経堤由来であることを明らかにした。この点についてはおおむね順調に進んでいる。しかし、遺伝子発現の解析が予想以上に困難であり、予定していた重要遺伝子の候補を絞りきれていないことについてはやや遅れている。申請者ら研究グループは頬粘膜真皮に存在する神経堤

由来細胞がin vivoにおいて増殖能を示し、骨芽細胞分化能を示すことを確認しているが(論文投稿中)、再生療法への応用のためには、さらに効率的な細胞採取法、処理方法、セルソーターによるソーティング法、培養、分化誘導法を確立しなければならない。遺伝子改変マウスを用い、in vitroにおける実験を行い最適な細胞処理法、ソーティングにおけるゲーティングのかけ方、分化誘導条件等の検討を行う。この実験に基づき頬粘膜の神経堤由来細胞の移植実験を行う。神経堤由来であるGFP陽性細胞と、その他の細胞であるGFP陰性細胞をセルソーターにより単離する。ヌードマウスに各細胞懸濁液とともに骨芽細胞誘導培地を加え腹部に注射する。2-3週間期間を置いた後、同部を開腹し作られた石灰化物を取り出す。取り出した石灰化物を高分解能μCTで解析し、カルシウム含有量を測量する。GFP陽性細胞とGFP陰性細胞の両方について行う事によりその分化能、再生能を比較し評価する。上記の移植実験を行った上で、取り出された石灰化物および移植細胞塊の解析を行う。マイクロアレイと定量的PCR法による遺伝子解析、遺伝子の発現レベルを検証し硬組織再生のメカニズムを解明する。これは組織侵襲時に神経堤由来の組織幹細胞による再生メカニズムを解明するものであるため、この結果を踏まえ生体内で起こっている神経堤細胞の再生への関与や疾患の発症との関連性について検証を行う。
神経変性を引き起こす金属イオン輸送の破綻に関する研究

【目的】DMT1 (Divalent Metal Transporter 1)は12回膜貫通型のFe2+トランスポータであり、H+との共輸送により細胞内への鉄輸送に深く関与している。鉄は生体必須の因子である一方で、活性酸素種(reactive oxygen species:ROS)の生成を触媒し神経障害を増悪することが知られている。本研究では電気生理学的にDMT1の機能解析を行い、酸化的ストレス誘発細胞障害におけるDMT1の役割について検討した。【方法】電気生理学的検討は、アフリカツメガエル卵母細胞にラットDMT1のcRNAを注入し34日間培養し、二電極膜電位固定法によりwhole-cell膜電流を測定することにより行った。初代培養大脳皮質神経細胞は胎生18日齢のラット胎仔の大脳皮質より調製し、10-13日間培養した後に実験に用いた。【結果】電気生理学的測定により、DMT1発現卵母細胞においてpH5.5で濃度依存的なFe2+誘起電流が認められたが、これはpH7.4では認められなかった。またFe2+、Cd2+、Mn2+、Zn2+、Co2+、Ni2+など他の2価カチオンでも電流応答が観察されたがCa2+、Ba2+では観察されなかった。一方Gd3+、La3+などの3価カチオンでも電流応答は見られず、これらはMn2+誘起電流に影響を与えなかった。初代培養大脳皮質神経細胞に対してH2O2やパラコートなどのROS供与体を処置すると濃度依存的な細胞死が惹起され、これは鉄のキレーターにより有意に抑制された。またこれらの薬物を細胞死を惹起しない低濃度で24時間処置するとDMT1発現量の増大が観察され、これはRNAおよびタンパクの新規合成阻害薬の適用によりほぼ完全に消失した。またH2O2やパラコートの24時間の処置濃度依存的に59Fe2+の取り込み量が増大した。【考察】DMT1はFe2+以外にもCd2+、Mn2+などの2価カチオンを輸送することが示された。初代培養大脳皮質神経細胞では酸化的ストレス負荷時にDMT1の発現量が増大することが明らかになった。脳虚血時、高グルコース条件下でのpHの低下とROSの生成はDMT1の機能増強と発現量増大を引き起こし、細胞内への鉄の取り込み量を増加させることで、ROS生成促進作用を介して神経細胞毒性を増悪させることが示唆される。【目的】DMT1(Divalent Metal Transporter 1)は12回膜貫通型のFe2+トランスポータであり、H+との共輸送により細胞内への鉄輸送に深く関与している。【方法】

電気生理学的検討は、アフリカツメガエル卵母細胞にラットDMT1のcRNAを注入し34日間培養し、二電極膜電位固定法によりwhole-cell膜電流を測定することにより行った。初代培養大脳皮質神経細胞は胎生18日齢のラット胎仔の大脳皮質より調製し、10-13日間培養した後に実験に用いた。【結果】電気生理学的測定により、DMT1発現卵母細胞においてpH5.5で濃度依存的なFe2+誘起電流が認められたが、これはpH7.4では認められなかった。またFe2+、Cd2+、Mn2+、Zn2+、Co2+、Ni2+など他の2価カチオンでも電流応答が観察されたがCa2+、Ba2+では観察されなかった。一方Gd3+、La3+などの3価カチオンでも電流応答は見られず、これらはMn2+誘起電流に影響を与えなかった。初代培養大脳皮質神経細胞に対してH2O2やパラコートなどのROS供与体を処置すると濃度依存的な細胞死が惹起され、これは鉄のキレーターにより有意に抑制された。またこれらの薬物を細胞死を惹起しない低濃度で24時間処置するとDMT1発現量の増大が観察され、これはRNAおよびタンパクの新規合成阻害薬の適用によりほぼ完全に消失した。またH2O2やパラコートの24時間の処置濃度依存的に59Fe2+の取り込み量が増大した。【考察】DMT1はFe2+以外にもCd2+、Mn2+などの2価カチオンを輸送することが示された。初代培養大脳皮質神経細胞では酸化的ストレス負荷時にDMT1の発現量が増大することが明らかになった。脳虚血時、高グルコース条件下でのpHの低下とROSの生成はDMT1の機能増強と発現量増大を引き起こし、細胞内への鉄の取り込み量を増加させることで、ROS生成促進作用を介して神経細胞毒性を増悪させることが示唆される。
リアルタイム細胞間コミュニケーション解析マイクロシステム

単一細胞レベルにおけるリアルタイムでのサイトカイン分泌の観察、及びオンチップRT-PCRによるRNA発現状態の解析が可能なマイクロ流体システムを実現するために、これまでは、全反射蛍光顕微鏡を用いたリアルタイム観察に適したマイクロウェルアレイチップの作製プロセスの確立と、マイクロウェルアレイ上での薬物刺激や細胞間のコミュニケイション解析を行うためのマイクロ流路やスライドチャンバシステムの搭載、そしてオンチップRT-PCRのためのヒータ搭載に向けたシミュレーションを行ってきた。昨年度では、スライドチャンバシステムを用いてウェル同士を連結することに成功したが、操作性上の問題点が多かったため、本年度では引き続きスライドチャンバシステムを搭載するためのプロセス検討を行った。これまでの実験から、液漏れの主な原因はスライド時にPDMSの変形することにあると考えられるため、より硬度の高いエラストマー材料の選定、及び高硬度エラストマー材料を用いたデバイス作製プロセスを検討した。高硬度エラストマー材料を用いたマイクロウェルの作製においては、通常のPDMSキャスティングなどに用いるSU-8鋳型作製プロセスでは、固めた高硬度エラストマーを鋳型から外す際にSU-8構造体が剥がれて鋳型が壊れてしまうため、鋳型を作製する際にSU-8と基板の密着性を高めるプロセスを行った。高硬度エラストマー製マイクロウェルを用いた、スライド実験では、スライド時のデバイスの変形量は減少したものの、完全に液漏れの問題を解決することは困難であった。26年度が最終年度であるため、記入しない。単一細胞レベルにおけるリアルタイムでのサイトカイン分泌の観察、及びオンチップRT-PCRによるRNA発現状態の解析が可能なマイクロ流体システムを実現するために、本年度では、全反射蛍光顕微鏡を用いたリアルタイム観察に適したマイクロウェルアレイチップの作製プロセスを確立した。この全反射対応マイクロウェルは、スルーホールを有するPDMS薄膜と全反射層として機能するCYTOP^<TM>層、そしてガラス基板で構成される。マイクロウェル構造体をPDMSで作製することにより、今後予定されているマイクロ流路やスライドチャンバシステムの搭載・集積化が比較的容易となる。また、ガラス基板とPDMSの間にCYTOP層を設けることにより全反射界面での屈折率が均一となり、優れた光学特性を発揮する。PDMSスルーホールは、ネガティブフォトレジストSU-8で作製したピラーアレイ上にPDMSをコートして硬化させた後、02とCHF3の混合ガスを用いたRIEで残膜をエッチングすることで作製した。これをガラス基板上に塗布したCYTOP層と貼りあわせ、最後にO_2プラズマでウェル内のCYTOPを除去することで前反射対応マイクロウェルが完成する。CYTOPはフッ素樹脂であるためPDMSとの接合が困難だが、GOPTSとアミノシランカップリング試薬を用いて表面修飾することでPDMSとCYTOPの接合に成功した。引張試験を行った結果、接合強度は約0.74MPaと十分な強度が得られていた。作製した全反射対応マイクロウェルの性能を評価するために、ウェル内に蛍光分子を導入し、全反射蛍光観察時のシグナルーバックグラウンドノイズ比の計測を行った。PDMSのみで作製した一般的なマイクロウェルでは屈折率の違いにより励起光が漏れ、エバネッセント場の外にある蛍光分子も励起されてしまい、S/N比は約1.40であった。これに対し、全反射対応マイクロウェルでは励起光が一様に全反射しているためノイズは少なく、S/N比は約4.51であった。この結果から、新しく作製した全反射対応マイクロウェルの有用性が確認できた.単一細胞からのサイトカイン分泌のリアルタイム観察、およびオンチップRT-PCRによるRNA発現状態の解析が可能なマイクロ流体システムの実現に向け、昨年度では全反射蛍光顕微鏡を用いたリアルタイム観察に適したマイクロウェルアレイチップの作製プロセスを確立した。本年度では、マイクロウェルアレイ上での薬物刺激や細胞間のコミュニケイション解析を行うためのマイクロ流路やスライドチャンバシステムの搭載、そしてオンチップRT-PCRのためのヒータ搭載に向けたシミュレーションを行った。マイクロウェル上への流路搭載では、PDMSの変質により流路との接合が困難であるという問題点を解決した。マイクロウェル作製の際、ウェル中のCYTOP層をエッチングのためにO_2プラズマを用いたエッチングを行うが、このプロセスによりマイクロウェルのPDMS表面が変質し、流路との接合に影響を及ぼしていた。そのため、変質したPDMS層を除去するためにO_2とCHF_3の混合ガスを用いたプラズマエッチングを行うことでマイクロウェルと流路の接合を可能にした。また、このプロセスで用いるO_2とCHF_3の混合ガスはガラスもエッチングしてしまうことが知られているため、TIRF観察に影響を及ぼさないよう、エッチング時間とガラス基板の表面粗さの関係をAFMを用いて評価し、プロセスを最適化した。スライドチャンバシステムについては、PDMSを用いてチップを作製し、試薬の導入、およびスライドによってウェル同士の連結することに成功し、片方のウェルに導入した試薬がもう一方のウェルに拡散することが確認できた。しかし、試薬導入時の流路抵抗が高いことや、スライド時にPDMSの変形により液漏れしやすいなどといった操作性に問題点が多く、実際の細胞を用いた解析に応用するのは未だに困難であることが分かった。RT-PCRのためのヒータ搭載に向けたシミュレーションでは、電極形状と電極の発熱に関するシミュレーションを行った。

単一細胞レベルにおけるリアルタイムでのサイトカイン分泌の観察、及びオンチップRT-PCRによるRNA発現状態の解析が可能なマイクロ流体システムを実現するために、これまでは、全反射蛍光顕微鏡を用いたリアルタイム観察に適したマイクロウェルアレイチップの作製プロセスの確立と、マイクロウェルアレイ上での薬物刺激や細胞間のコミュニケイション解析を行うためのマイクロ流路やスライドチャンバシステムの搭載、そしてオンチップRT-PCRのためのヒータ搭載に向けたシミュレーションを行ってきた。昨年度では、スライドチャンバシステムを用いてウェル同士を連結することに成功したが、操作性上の問題点が多かったため、本年度では引き続きスライドチャンバシステムを搭載するためのプロセス検討を行った。これまでの実験から、液漏れの主な原因はスライド時にPDMSの変形することにあると考えられるため、より硬度の高いエラストマー材料の選定、及び高硬度エラストマー材料を用いたデバイス作製プロセスを検討した。高硬度エラストマー材料を用いたマイクロウェルの作製においては、通常のPDMSキャスティングなどに用いるSU-8鋳型作製プロセスでは、固めた高硬度エラストマーを鋳型から外す際にSU-8構造体が剥がれて鋳型が壊れてしまうため、鋳型を作製する際にSU-8と基板の密着性を高めるプロセスを行った。高硬度エラストマー製マイクロウェルを用いた、スライド実験では、スライド時のデバイスの変形量は減少したものの、完全に液漏れの問題を解決することは困難であった。26年度が最終年度であるため、記入しない。初年度の研究計画通り、リアルタイム観察に必要な全反射蛍光観察に対応したマイクロウェルアレイの作製プロセスを確立し、全反射蛍光観察時に優れた光学的性能を発揮するデバイスを作製することに成功したため。マイクロウェル上への流路搭載やスライドチャンバにより、試薬の導入やマイクロウェル同士の連結に成功したものの、実際の細胞間コミュニケーション解析に応用するためには、未だに解決すべき問題点が多いため。リアルタイムでの細胞間相互作用解析に向け、全反射蛍光観察対応マイクロウェルアレイチップ上へのマイクロ流路・スライドチャンバシステム、及びオンチップRT-PCR用マイクロヒータ等の搭載を行う。マイクロ流路とスライドチャンバシステムについては、単一細胞に対する試薬導入や細胞操作方法の確立を目標とする。また、RT-PCR用マイクロヒータについては、まずシミュレーションによりマイクロウェル内の温度分布を解析・最適化を行った後、デバイスへの組込みを行う。リアルタイム細胞間相互作用解析システムが完成し次第、実際に細胞を用いた解析を行い、細胞間相互作用におけるサイトカインの働きや、分泌量とRNAの発現量の相関などについて調査する。リアルタイムでの細胞間相互作用解析に向け、全反射蛍光観察対応マイクロウェルアレイチップ上でのスライドチャンバシステム、及びオンチップRT-PCR用マイクロヒータ等の搭載を行う。
波長多重光メモリ用量子ドット材料の研究

電子を原子レベルの小さい領域に閉じ込めると電子の「波の性質」が露わになってエネルギーがとびとびの値を持つ。結晶の自己組織化を応用してこのような究極の微細構造である量子ドットの形成が可能になって来たが、そのサイズが均一でない。本研究ではこの「不揃いな量子ドット」がそれぞれ固有の波長の光にのみ反応することを用いて波長方向に情報を記録する高密度光メモリを実現することを検討した。先ず量子ドットの形成を実際におこない、サイズのバラツキには一定の法則が存在することを世界で初めて発見した。すなわち、分子線結晶成長法(MBE)によるStranski-KrastanowモードによるInAs/GaAs自己集合歪み量子ドットについてドットの体積分布および位置分布にスケール則が成り立つことを見出した。歪みによるドットの自己形成が比較的単純な機構に基づいていることを示唆する。さらにメモリの持続時間を増やすためのトンネル効果の発現の研究を行い、InAlAs/AlGaAs量子ドットにおいて量子ドットからAlAs層への電子のトンネル現象を確認した。また量子ドットの数を増やすための積層化が可能であることを明らかにした。さらにInAs/GaAs量子ドットにおいてイオン・チャネリング法により量子ドット周辺での原子レベルの格子歪みを調べた結果、量子ドットへのGa原子の拡散を確認し、拡散がInAsの供給量に非常に敏感であることを見出した。1.InAs量子ドットの作製と島サイズ・スケール関数の評価GaAs基板上にStranski-Krastanow(S-K)モードにより作製されるInAs量子ドットについては、分子線結晶成長法(MBE)などによる多くの報告があるが未解明の部分も多い。特に、そのサイズ分布には、どの報告でも10%程度のバラツキがある。本研究では、このサイズのバラツキを利用した波長多重の光メモリの実現を目指しており、このために、量子ドットの平均サイズおよびサイズ分布は重要なパラメータである。成長メカニズムの知見を得、デバイス化のための基礎データを得るためにInAS量子ドットの作製とサイズ分布の評価を行ったInAs量子ドットを基板温度490°CでMBEにより成長し、サイズ分布の評価を行った。ドットの密度、体積は、InAsの被覆率Θに大きく依存するが、サイズ分布をサイズの平均値で規格化すると、全て同じ曲線にのる。即ち、ドット密度10^9-10^<11>/cm^2の広い範囲にわたり(被覆率にして1.6-2.2分子層程度と見積もられる)、スケール則が成立することが分かった。一般に報告されている10%のサイズゆらぎは、成長機構に起因する本質的なものであることが分かった。2.InAs量子ドットの多層化の検討波長多重の光メモリでは1つのレーザ・スポットで100ビット程度の情報を記録することを目標にしている。このため、量子ドット層を40層程度多層化することが必要とされる。多層化の可能性を検討するために20層の積層構造を作製し、断面TEM観測により評価したところ、所望の量子ドットの積層構造が形成されていることを確認した。1. InAs量子ドットの形成とスケール関数による形成機構の評価GaAs基板上にStranski-Krastanow(S-K)モードにより作製されるInAs量子ドットについては、分子線結晶成長法(MBE)などによる多くの研究報告があるが、そのサイズ分布には、どの報告でも10%程度のバラツキがある。成長メカニズムの知見を得、デバイス化のための基礎データを得るためにInAs量子ドットの作製とスケール関数の評価を行った昨年度は基板温度490°CでMBEにより成長し、成長直後に1分間のアニールをして形成したInAs量子ドットにおいてサイズ分布のスケール則が成立することを見出した。今年度は、さらにアニールを行わないサンプルにおいても、同じスケール関数が得られることを確認し、サイズ分布スケール則の普遍性を確認した。更にドットの形成機構を調べるためドットの空間分布のスケール則を調べたところ、サイズ分布よりはバラツキが大きいものの、スケール関数が存在することを見出した。

2つのスケール関数を計算機シミュレーション、および理論予測と比較することにより、量子ドットの形成は、これまで報告されているような歪みの寄与する複雑なモデルではなく、極めて単純な島形成モデルで記述される可能性が高いことが分かった。2. InAs量子ドットの多層化の検討波長多重の光メモリでは量子ドット層を40層程度多層化することが必要とされる。昨年度形成した20層の積層構造を断面TEM観測により詳細に評価したところ、一部にV字型の転位が認められた。転位はInの供給過剰により生じた大きな島から発生していることが分かり、供給量に留意すれば所望の量子ドットの積層構造を形成できる見通しを得た。1.InAs量子ドットの形成とスケール関数による形成機構の評価: GaAs基板上にStranski-Krastanow(S-K)モードにより作製されるInAs量子ドットについて、そのサイズのバラツキを利用した波長多重の光メモリの実現を目指している。このために、量子ドットの平均サイズおよびサイズ分布が重要なパラメータである。成長メカニズムの知見を得、デバイス化のための基礎データを得るためにInAs量子ドットの作製とスケール関数の評価を昨年度に引き続き行った。昨年度は基板温度490°CでMBEにより成長したInAs量子ドットにおいてサイズ分布およびドット位置の空間分布のスケール関数を見出した。今年度は、さらにスケール関数の温度依存性を調べた。基板温度が490°Cから540°Cまでは、サイズ分布のスケール関数には顕著な変化が認められない。空間分布もほぼ不変である。これに対し、550°Cではサイズ分布、空間分布ともに全く異なる様相を示すことが分かった。さらに、基板温度560°Cでは量子サイズのドットが消滅することが分かった。550°C以上ではInの再蒸発の可能性が高く、成長機構がより低温とは大きく異なることが予測される。したがって、再蒸発が関与しない基板温度490°Cから540°Cまでの広い範囲に亘って同じスケール則に従うことが分かった。本質的に490°Cと同じ単純な成長機構に支配されていることを意味し、スケール則の普遍性が更に確かなものとなった。2.InAs量子ドットの多層化の検討:波長多重の光メモリでは量子ドット層を数十層多層化することが必要とされる。昨年度までに形成した20層の積層構造では一部にV字型の転位が認められた。このV字型の転位を断面TEM観測により詳細に評価した。この結果、V字型の転位はハーフループを形成して居らず基本的には原因の異なる2種類の転位からなることが分かった。InAs自己集合量子ドットでのGa拡散の検討:InAs量子ドットにおいては下地のGaAsからのGa原子の拡散が起こることを、我々は既に、世界に先駆けて見出している。また他の機関からの類似の報告もある。