hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ステントグラフト内挿術：数値による周術期の新たな下肢血流評価方法の確立

平成30年度は、本研究の目的であるステントグラフト内挿術(EVAR)中の還流指標(PI:Perfusion Index)とABI(Ankle Brachial Index:足関節上腕血圧比)の対比をおこなうため、データ収集のプロトコールを関連施設とともに検討し、決定した。名古屋市立大学病院において同プロトコールを用いて、EVAR術中にPIとABIで下肢血流の評価がおこなわれた症例は2017年4月以降、43例であった。それらについて統計学的に検討したが、PIは症例間でのばらつきが大きく、ABIに対するPIの有用性を示すことができるデータは得られなかった。そのため、評価方法を再検討し、評価方法の変更をおこなった。新たな方法として、下肢血流評価においてPIの左右差を検討する方法を選択した。この方法を用いて2014年4月から2019年1月までに名古屋市立大学病院において腹部大動脈瘤に対するステントグラフト内挿術(EVAR)がおこなわれ、その術中に下肢血流の評価を還流指標(PI:Perfusion Index)を用いておこなった84例について後方視的解析をおこなった。Perfusion Index(PI)とABIの比較では予想された研究結果が得られなかったため、検討方法の変更が必要になった。そのため当初の予定より論文作成が遅延している。平成31年度は引き続きデータ収集を行い、並行して海外学会での発表を行う。論文作成は鋭意継続する。まず、平成29年度は、2014年4月から2017年3月までに名古屋市立大学病院において腹部大動脈瘤に対するステントグラフト内挿術(EVAR)がおこなわれ、その術中に下肢血流の評価を還流指標(PI:Perfusion Index)を用いておこなった62例について後方視的解析をおこなった。それらについて「Perfusion Index for evaluation of blood flow of the approachedarteries during endovascular aneurysm repair」として日本IVR学会総会(岡山)およびヨーロッパIVR学会(CIRSE:Cardiovascular and Interventional Radiological Society of Europe)(デンマーク)で発表をおこなった。この研究成果では、下肢血流の評価においてPIとその他の評価方法の一致率が非常に高かった。そのため下肢血流評価におけるPIの有効性を一定程度確立させるものであった。これらの研究成果をもとに、論文作成を進行中である。さらに、本研究の目的であるEVAR術中のPIとABIの対比をおこなうため、データ収集のプロトコールを関連施設とともに検討し、決定した。名古屋市立大学病院において同プロトコールを用いて、EVAR術中にPIとABIで下肢血流の評価がおこなわれた症例は2017年4月以降、30例であった。それらのうち有効なデータが得られた症例について中途解析をおこなった。しかし、下肢虚血合併症の発生した症例は無かったため正確な評価は困難であった。また、PIは症例間でのばらつきが大きく、評価方法の検討が必要と考えられた。EVAR術中の下肢虚血合併症の発生率を考慮すると、平成29年度の症例数では不足していると考えられ、今後症例の蓄積が必要である。名古屋市立大学病院において、2017年度にEVAR術中のPI測定が正確に行われた症例は合計30例であり、目標件数には達していない。また、下肢血流の低下が生じた症例はなく、下肢血流低下とPIおよび下肢血圧との関係を正確に評価するには至っていない。名古屋市立大学病院において引き続き症例の蓄積をおこなう。また、研究協力施設でのデータ取得が可能か調査し、症例数の増加を図る。また、下肢血流の評価方法について他の文献を検索し、論文作成を進行する。2018年度は予想された研究結果が得られなかったため、学会発表等をおこなうことが困難であり、当該助成金について余剰が生じる状況となった。2019年度は国際学会への参加、発表および論文作成をおこなうため、計画通りの使用が可能と考える。
上肢訓練ロボットを用いた訓練が脳賦活に及ぼす影響

ロボット訓練中の脳賦活は、多チャンネル近赤外線光測定装置を用いて評価した。訓練前は両modeともに障害側の脳賦活は得られにくい傾向にあったが、訓練開始から3週後では、manual modeの方がautomatic modeに比べより脳賦活が得られた。また、上肢の麻痺が改善を示したものほど運動野の脳賦活が得られやすい傾向にあった。上肢ロボット訓練は、脳卒中急性期患者に対しても体循環にほとんど影響を及ぼさないと考えた。脳卒中後の上肢麻痺の回復を促進するための手段の1つとして左右鏡像運動が注目されている。上肢ロボットは左右鏡像運動を効率よく行うことが可能であるため、今回、脳卒中急性期患者を対象に、上肢ロボットによる左右鏡像運動訓練の前後に多チャンネル近赤外線測定装置を用いて、上肢に該当する運動野における脳賦活訓練による脳賦活の影響を調査した。同時に、中大脳動脈平均血流速度、心拍数、心拍出量の測定し体循環と脳循環の評価を行った。脳卒中急性期患者の約半数は、比較的軽度の麻痺であり研究対象とならないことが多い。逆に、重度の上肢麻痺が残存している場合、さらに重度の失語症、注意障害、半側空間無視を合併し、本研究の除外基準項目に該当するため、研究対象から除かれることがある。そのため、本研究の対象となる患者が極めて少ないのが現状である。本年度対象基準を満たした対象者は6名であった。うち3名は5週間の本研究期間を満たさず他院に転院となった。残り3名が5週間の研究期間を満了したが、そのうち1名は初期評価で中大脳動脈の流速度が測定不可能であった。本研究の対象者は、中等度重度の上肢麻痺を有する者であり、訓練実施後も麻痺の改善は乏しく、上肢に該当する運動野の脳賦活は得られにくい傾向にあった。反対に、補助手レベルまで麻痺が改善したものは、上肢に該当する運動野の脳賦活が得られやすい状況にあった。また、中大脳動脈平均流速度や心拍出量や心拍の評価により、上肢ロボット訓練は、脳卒中急性期患者に対しても脳循環や体循環にほとんど影響を及ぼさないと考えた。脳卒中後の上肢麻痺の回復を促進するための訓練アプローチとして左右鏡像運動が注目されており、上肢ロボットは左右鏡像運動を効率よく行うことが可能である。今回、脳卒中急性期患者を対象に、上肢ロボットによる左右鏡像運動訓練の前後に多チャンネル近赤外線測定装置を用いて、上肢に該当する運動野における脳賦活訓練による脳賦活の影響を調査した。脳卒中急性期患者の約半数は、比較的軽度の麻痺であり本研究の対象とならないことが多い。反対に、重度の上肢麻痺が残存している場合、麻痺に加え重度の失語症、注意障害、半側空間無視を合併していることが多く、本研究の除外基準項目に該当し、研究対象から除かれる。そのため、本研究を実施可能な患者が極めて少ないのが現状である。本年度、対象基準を満たした対象者は9名であった。うち5名は5週間の本研究期間を満たさず他院に転院となった。残り4名が5週間の研究期間を満了したが、そのうち3名は初期評価で中大脳動脈の流速度が測定不可能であった。本研究の対象者は、中等度重度の上肢麻痺を有する者であり、訓練実施後も麻痺の改善は乏しい者は、上肢に該当する運動野の脳賦活は得られにくい傾向にあった。逆に、上肢機能の改善を認めた者は、上肢に該当する運動野の脳賦活が得られる傾向にあった。現在のところ、中大脳動脈平均流速度や心拍出量や心拍の評価により、上肢ロボット訓練は、脳卒中急性期患者に対しても脳循環や体循環にほとんど影響を及ぼさないと考えており、上肢ロボット訓練中に有害事象は認めていない。脳卒中後の上肢麻痺の回復を促進するための訓練アプローチとして左右鏡像運動が注目されており、上肢ロボットは左右鏡像運動を効率よく行うことができる。今回、脳卒中急性期患者を対象に、上肢ロボットによる左右鏡像運動訓練の前後に多チャンネル近赤外線測定装置を用いて、上肢に該当する運動野の訓練による脳賦活の影響を調査した。脳卒中急性期患者の約50%は、軽度の麻痺で本研究の対象とならない。反対に、上肢麻痺が重度の場合、麻痺に加え重度の失語症、注意障害、半側空間無視を合併していることが多く、本研究の除外基準項目に該当し研究対象から除かれるため実施可能な患者が少ないのが現状である。本年度、対象基準を満たした対象者は7名であった。

うち5名は5週間の本研究期間を満たさずに他院へ転院となった。残り2名が5週間の研究期間を満了したが、2名ともに初期評価で中大脳動脈の流速度が測定不可能であった。本研究の対象者は、脳卒中後に中等度重度の上肢麻痺を有し、上肢ロボット訓練実施後も麻痺の改善が乏しい者は、上肢に該当する運動野の脳賦活は得られにくい傾向にあった。逆に、上肢機能が改善傾向にある者は、上肢に該当する運動野の脳賦活が得られる傾向にあった。現在のところ、中大脳動脈平均流速度や心拍出量や心拍数の測定結果から上肢ロボット訓練は、脳卒中急性期患者に対しても脳循環や体循環にほとんど影響を及ぼさないと考える。
非一様な電場下における液晶の電気流体力学的対流とパターンの空間共鳴

一般に、液晶の電場に対する挙動を観察するときは、配向剤と透明電極が塗布された2枚のガラスの間に液晶を封入して行う。通常全面に透明電極の塗布されたガラスを用いるが、本研究では、一方のガラスの電極を細い帯状のものにすることによって、封入された液晶の一部にのみ電場が印加されるような容器を作成した。その容器を用いてネマチック液晶の電気流体力学的対流を引き起こし、理想的な1次元対流系を作ることに成功した。現在、対流発生(分岐)点近傍の対流系のふるまいは、「振幅方程式」と呼ばれる非線形偏微分方程式で記述されると考えられている。特に1次元系の場合の振幅方程式は、よく知られた「ギンツブルグ-ランダウ方程式」になる。本研究では、1次元対流系における周期的対流構造(パターン)の安定性を実験的に調べ、さらにある特定の空間モードで現れる「エクハス不安定性」のダイナミクスを詳細に観測した。また、実験結果をギンツブルグ-ランダウ方程式から得られる理論的結果を比較した。まず、分岐点近傍の対流パターンの安定性ダイヤグラムすなわち「ブッセ・ダイヤグラム」をつくり、それがギンツブルグ-ランダウ方程式から得られる理論的結果とよく一致することがわかった。また、エクハス・モードの波数と成長時間の攪乱波数に対する依存性を測定した。しかしこの結果は、エクハス不安定性によって不安定化する全てのモードの中で、成長率が最大であるモードがエクハス・モードとして観測されると考えてギンツブルグ-ランダウ方程式から導き出した理論的結果と一致せず、さらに高次の非線形性を考慮しなければならないことがわかった。
トランスミッタ-放出過程に於る低分子量GTP結合蛋白質の急速凍結法による機能解析

本年度は、神経伝達物質放出過程のシナプス小胞リサイクリング機構における低分子量GTP結合蛋白質smg p25A/rab 3A p25の役割に関して、ラット神経節接合部を材量とし、免疫電顕組織学的検討を行ない以下の結果を得た。1).中等度のsmg p25A免疫反応が運動神経終末の大部分シナプス小胞周囲に認められた。2).高度のsmg p25A免疫反応が前シナプス膜の微小領域(巾0.10.2μm)とそれをとり囲む数個のシナプス小胞に認められた。このsmgp25A高度反応領域は互いに約0.4μm間隔で配列していた。3).終末前の運動神経軸索では、中等度のsmg p25A免疫反応が軸索細胞質に均一に認められた。これらの結果から、smg p25Aは、シナプス内で濃度匂配をもって分布することが明らかとなった。このsmg p25Aの高濃度領域は、その大きさおよび配列様式がアクティブゾ-ンと極めて類似している。このことは、Smg p25Aの高濃度領域が開口分泌部位:(アクティブゾ-ン)に関連した機能ドメインを形成している可能性を強く指唆している。このようにsmg p25Aは、シナプス小胞関連蛋白質であり、かつ開口分泌部位指定に関与する機能を持つ蛋白質であることが明らかとなり、この蛋白質が生物学的に極めて重要な位置を占めることが示された。一方、smg p25Aの調節蛋白質、smg p25A GDP解離抑制蛋白質(smg p25A GDIの組織分布を検討し、本蛋白質が神経細胞に普通的に存在することを明らかにした。現在、さらにシナプス内の局在に関して、電顕レベルで検討を進めている。これらの研究成果から、トランスミッタ-の放出機構が分子レベルでより詳細にわたり解明できると考えている。
抱擁型コミュニケーションメディアを用いた情動支援による学習促進システムの実現

本研究では、抱擁型コミュニケーションメディア(ハグビー)を使った抱擁対話がもたらす話への集中効果の生起条件や学習への影響を詳細に調査することで、聞くことを促進するメカニズムの理解と集団授業時の児童の話を聞く能力の支援とそれに伴う学力向上を目指している。今年度は、昨年度の成果を踏まえ、ハグビーの読み聞かせシステムの改良、読み聞かせシステムの効果の計測として傾聴内容に対する記憶率やその変位の調査を行った。1年目の事例研究により、音質の低さや準備の手間がかかることが、本システムの問題点として、インタビューなどからわかってきた。これらの問題点を解決するために、通信方法として、ラジオ電波ではなく、WIFI通信を利用した読み聞かせシステムの開発を行った。また、1年目の事例研究により、ハグビーは児童の聞く行動を促すことが示された。しかし、確認できたのは聞く姿勢の維持であり、聞けている内容の量の変化は観測できていない。そこで実際にハグビーを学校授業に長期的に導入し、傾聴内容に対する記憶率とその変位を確認した。その結果、傾聴内容に対する記憶率がハグビーを使用した場合において、使用しない場合より有意に高いことが示された。さらに、興味深いことに、情動制御に課題を抱える児童に対して大きな効果(記憶率が2倍になる)が見られた。そのことから、本システムは児童の情動に働きかけることで、傾聴の支援を行っていることが推察できる。以上のことから、抱擁型コミュニケーションメディアは、情動支援を通して、児童の傾聴行動を支援し、学習支援につながる可能性が示された。今年度成果は、論文誌Computer in HumanBehaviorに投稿中である。29年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では、抱擁型コミュニケーションメディア(ハグビー)への抱擁がもたらす話への集中効果の生起条件や学習への影響を詳細に調査することで、聞くことを促進するメカニズムの理解と集団授業時の児童の話を聞く能力の支援とそれに伴う学力向上を目指している。今年度は、コミュニケーションメディアへの抱擁がもたらす話への集中効果の有効性や生起条件について、児童への読み聞かせでの事例研究や実験室実験で検証した。また、より使いやすいデザインを目指して装置の改良を行った。さらに、それらの結果から推測される生起条件から、他の場面での応用を検討した。3つの児童への読み聞かせの事例研究では、コミュニケーションメディアへの抱擁がもたらす話への集中効果の有効性と生起条件の推測を行った。それらの結果から、抱擁型コミュニケーションメディアは、児童に聞く態度を促す支援システムとして有効であること、同部屋複数グループでの読み聞かせが可能であること、使用者自身に安心感や落ち着きをもたらすことにより、児童の聞く行動を支援していることが示唆された。以上の成果は、国際論文誌Frontiers in Psychologyに採録された。実験室実験では、抱擁型コミュニケーションメディアは、そこから感じる対話相手の存在感が、使用者の注意を引き付け、聞くことを促しているかどうかの検証を行い、仮説の否定が示唆された。また、メディアを使用中の脳波を取り、データ解析を行い、その結果、メディアの使用中には脳の新規性を感知する部位が有意に反応していることがわかってきた。装置の改良では、児童の荒い使用により装置が分離してしまう点、音質が悪い点、試用手順が複雑な点を改善した。また、派生研究として、安心感や落ち着きが児童の快眠につながると考え、保育園の昼寝の活動にハグビーを導入し、通常の昼寝と記録したビデオから調査を行った。本年度の主な目標は、抱擁型コミュニケーションメディアへの抱擁がもたらす話への集中効果の生起条件や学習への影響を調査することである。国際論文誌Frontiers in Psychologyに採録された児童への読み聞かせの事例研究からは、集中効果の有用性が明らかとなった。また、そのメカニズムについて言及が行えている。さらに、そのメカニズムについて追加の実験実実験で確認を行っており、調査は確実に進捗していると言える。また、それらのメカニズムから考え得る新たな応用研究にも取り組んでおり、研究のさらなる広がりが期待される。しかし、生起条件(インタフェースのデザイン)に関しては言及されておらず、来年度の進展を望む。一方で、来年度の目標である長期実験・改良にすでに取り組みを始めており、順序に前後はあるものの総合的に概ね順調に進捗していると言える。

その結果、傾聴内容に対する記憶率がハグビーを使用した場合において、使用しない場合より有意に高いことが示された。さらに、興味深いことに、情動制御に課題を抱える児童に対して大きな効果(記憶率が2倍になる)が見られた。そのことから、本システムは児童の情動に働きかけることで、傾聴の支援を行っていることが推察できる。以上のことから、抱擁型コミュニケーションメディアは、情動支援を通して、児童の傾聴行動を支援し、学習支援につながる可能性が示された。今年度成果は、論文誌Computer in HumanBehaviorに投稿中である。28年度の進捗を踏まえ、話への集中に対する人を抱きしめている触感の影響を調査する。被験者には2人の話者の音声を同時に聞かせ、一方の話者の話を注意して聞くよう指示する。ハグビーを抱きながら対象の話者の音声をハグビーから聞いた場合、ハグビーを抱くがハグビーから音声を聞かない場合、ハグビーを抱かずイヤホンから対象の音声を聞く場合で話題の内容の記憶度合による集中度合いの評価に取り組む。メディアを使用中の脳波のデータはすでに取集しており、メディアの使用中には脳の新規性を感知する部位が有意に反応していることがわかってきた。この反応が、メディアの初使用の効果か、もしくはメディアを使用すると必ず起きる反応であるかを実験室実験にて突き止めていく予定である。また、長期実験についてもすでに取り組みを始めており、データ解析を行い、まとめ、論文化する予定である。29年度が最終年度であるため、記入しない。
立体因子で制御される不斉なフォトクロミック系の構築

立体障害の大きい熱不可逆性ビスチエニルフルギド,3,4ビス[1-(2,5-ジメチル-3-チエニル)エチリデン]-3,4-ジヒドロ-2,5-フランジオン,を2-ブチン-1,4-ジオール誘導体のパラジウム触媒を用いたカルボニル化法により合成し,フォトクロミック反応挙動を解析した。ビスチエニルフルギド,トリクロロエチレンをブチルリチウムで処理した後,3-アシル-2,5-ジメチルチオフェンとの反応によりアセチレンジオールを収率45%で得た。アセチレンジオールをパラジウムアセテート存在下,一酸化炭素との反応(カルボニル化)によりビスチエニルフルギドを3種の構造異性体混合物で得た。これら混合物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで分離し,2つの二重結合に関してEE,EZ,ZZ,の3種の異性体をそれぞれ4,3,1%で得た。異性体の構造は,^1H NMRおよびそれらのフォトクロミック挙動より確定した。ZZのトルエン溶液に366nm光を照射すると,EE,EZ,および2種類の閉環着色体(C_<EE>,C_<EZ>)が生成した。2種の閉環着色体に554nmを照射すると,EE,EZが生成した。EEおよびEZから生成する閉環着色体(C_<EE>,C_<EZ>)は,互いにジアステレオマーの関係にある。366nm光照射の光定常状態では,EE,EZ,ZZが全体のそれぞれ17,14,8%存在し,C_<EE>が58%生成するのに対し,C_<EZ>は,3%であった。すなわち,EE二重結合異性体から生成する環化着色体C_<EE>がジアステレオ選択的に生成する(90%de)ことが判った。本年度の「立体因子で制御される不斉なフォトクロミズム系の構築」に関する成果は,以下の通りである。1. C_2対象をもつビスチエルフルギドのジアステレオ選択的フォトクロミズムPd触媒を用て合成できる,C_2対称性をもつビスチエニルフルギドがジアステレオ選択的フォトクロミズムを示す理由を計算により明らかにした。この結果は,1999年5月の第37回有機合成化学協会関東支部シンポジウム(八王子)で発表する予定である。2.ビナフトール縮合ジアリール無水マレイン酸の合ビスチエニル無水マレイン酸のカルボニル基に(R)-フトールを縮合した化合物は,ジアステレオ選択的なフォトクロミズムを示す可能性がある。この化合物がどのような選択性を示すかを,計算により明らかにした。3.架橋ジアリールエテンの合インドリル基とベンゾチエニル基をもつパーフルオロシクロペンテンのインドール1位とベンゾチオフエン2位を架橋し,ラセミ化を押さえた化合物の合成を検討しているが,まだ合成できていない。4.クラウン鎖架橋ジアリールエテンの合成研究ビス(5-ヒドロキシメチル-2-メチル)チエニルパーフルオロシクロペンテンをオリゴ(エチレンオキシ)鎖で架橋した化合物は,ジアステレオ選択的なフォトクロミズムを示し,エナンチオ選択的な分子認識能力をフォトクロミック反応に伴って変化させる可能性があるが,まだ合成できていない。5.スピロピランのトリカルボニルクロム鎖体の合トリカルボニルクロムにフォトクロミック化合物の芳香環が配意した化合物はジアステレオ選択的なフォトクロミズムを示す可能性がある。インドリノスピロピランの錯体を合成し,現在ジアステレオ選択的フォトクロミック反応を検討している。本年度の「立体因子で制御される不斉なフォトクロミズム系の構築」に関する成果は,以下の通りである.

1.ビスチエニルフルギドのジアステレオ選択的フォトクロミック環化反応ビスチエニルフルギドは,熱不可逆なフォトクロミズムを示すフルキドの一種である.この化合物は二つの二重結合に関してE,E体,E,Z体,Z,Z体の3つの異性体があり,E,E体,E,Z体は紫外光照射により環化し,二種類の着色体を生成する.これら5成分からなるフォトクロミック系の光反応を解析することによりE,Eの二重結合異性体から生成する環化着色体が優勢に生成する(90%de)ことが判った.また,ビスチエニルフルギドがジアステレオ選択的フォトクロミズムを示すのは,電子的な理由でなく,立体的要因によることをAM1分子軌道計算により明らかにした。2.熱可逆性フォトクロミック化合物ベンゾチエニルフルギド誘導体の光反応と熱反応アダマンチリデン基を有し,芳香環の光環化する炭素原子上の置換基が水素原子であるフルギドは,光環化後,1,5-水素転位により熱可逆性フォトクロミズムを示すR-formになり,太陽光下で着色し,暗所で消色する.このような反応を示す4種のヘリオクロミックベンゾチエニルフルギド誘導体を合成し,光反応および熱反応の系統的研究を行った.合成した4種誘導体の閉環消色反応の熱消色速度定数および活性化エネルキーを測定し,AM1分子軌道計算で得たO-formの安定配座との関係を明らかにした.
計算物理学-物性研究における新展開-多体系、巨視系のダイナミックス

上田顕(福井県立大学)は、構造不規則系の量子MD法による研究のために、Car-Parrinello(CP)法を液体Naに応用し、k点のとりかたが電気伝導度に及ぼす影響などを検討している。米沢富美子(慶大)は、複雑液体における異常緩和の機構を解明するために、ランダム・ウォークのモンテカルロ・シミュレーションを実行し、一粒子描像の有用性を明らかにした。小田垣孝(九大)は、ガラス転移のダイナミクスの研究のために、分子動力学シミュレーションを実行し、複雑系におけるミクロなダイナミクスの多くの側面を明らかにした。川崎恭治(九大)は、複雑な流体の静力学及び動力学の研究のために、大規模なシミュレーションを実行し、流体力学的効果を明らかにした。河村雄行(北大)は、並列コンピュータにおける分子動力学法などのプログラム開発を行ない、大規模粒子系のMD計算によって、数百から6000粒子の系のシリカ融体において、X線構造因子、拡散係数、粘性などの諸物性に粒子数依存性があることを確認した。蔵本由紀(京大)は、非線形素子多体系のダイナミクスの研究を進めており、大域結合複素Ginzburg-Landau振動子系において集団カオスを見い出し、種々の側面からその特徴付けをおこなった。土井正男(名大)は、エレクトロレオロジー流体の粒子の凝集構造や凝集ダイナミクスを明らかにする目的で計算機シミュレーションを実行し、粒子が均一分散状態から双極子相互作用により凝集する過程において、粒子の成長則とスケーリング則を明らかにした。能勢修一(慶大)は、分子動力学シミュレーションによる結晶構造相転移の研究を行なっており、高濃度のコロイド懸濁溶液に振動的なズレ応力を加えた時に起こる構造変化を非平衡分子動力学シミュレーション法により調べた。上田顕(福井県立大)は、構造不規則系の量子MD法による研究のために、Cer-Parrinelloの方法を使って、液体Naの電子状態の計算を進めており、k点のとりかたなどを検討している。米沢富美子(慶大)は、複雑液体における個別運動と集団運動の解明のために、樋渡保秋(金沢大)は、ガラス・ガラス転移のダイナミックスの研究のために、さらに、小田垣孝(京工繊大)は、不規則媒質中の粒子のダイナミックスと波動の伝播の研究のために、それぞれ分子動力学法シミュレーションを実行しており、これらの複雑系におけるミクロなダイナミクスの多くの側面が明らかにされつつある。川崎恭治(九大)は、複雑な流体の静力学及び動力学の研究のため、大規模なシミュレーションを実行し、スケーリング則への流体力学的効果を明らかにした。河村雄行(北大)は、マルチコンピューター及び並列コンピューターにおける分子動力学法などのプログラム開発を行っており、計算プログラムを大きく分割し、一個のタスクの軽山稜を大きくすることによって、並列化効果を著しく良くできることを確認した。蔵本由紀(京大)は、非線系素子多体系のダイナミックスを進めており、大域的に結合した非線形振動子の大集団のモデルおける集団カオスの発生条件を検討した。田中実(東北大)は、流体系中距離秩序動的相関の計算機実験を行っており、3重点近傍から臨界領域までのシミュレーションのプログラムを開発した。土井正男(名大)は、濃厚なコロイド分散系のエレクトロレオロジー効果の計算機実験を行っており、イオノーマーにおけるミセルの大きさと、イオン化度との関係などを調べた。能勢修一(慶大)は、分子動力学シミュレーションによる結晶構造相転移の研究を行っており、温度一定条件の分子動力学シミュレーションにおいて、どの程度、カノニカル分布が実現されているかを調べた。
軟骨細胞におけるＩｈｈの発現制御機構の解明

本年度は、CRISPR/Cas9を用いて作出した領域Aを欠失したマウスを用いて、胎生期における領域AのIhh遺伝子発現への寄与を検証した。まず、E18.5の胎仔を用いて、whole mount skeletal double stainingと脛骨近位の骨組織に対するヘマトキシリン・エオシン染色とvon Kossa染色を行った。その結果、領域Aのホモ欠失マウスではIhhノックアウトマウスで認められる骨殻の形成不全、成長板における軟骨細胞の分化過程の異常は認められなかった。次に、Ihh遺伝子の発現量を野生型マウスと領域Aのホモ欠失マウスのE18.5胎仔間で比較したところ、領域Aのホモ欠失マウスでは野生型に比べて5%程度のコピー数の減少を認めるのみで統計学的有意差を認めなかった。以上の結果より、胎生期における領域A単独の欠失がIhh遺伝子発現へ与える影響はわずかであり、Ihhの発現制御においては、複数のエンハンサーによって各々の機能を補完しあうエンハンサーネットワークが存在することが示唆された。領域Aにおけるエンハンサー活性の制御機構に関する検討では、今回新たにマウス新生仔肋軟骨細胞におけるSox6のChIPシークエンスを行い、得られたデータを解析した。その結果、Sox6は軟骨細胞において遠位エンハンサーのSoxモノマーモチーフを介して軟骨形成に関与する遺伝子群の転写制御に関与している可能性が示唆された。さらに領域AでSox6のピークを認めたことから、Sox6とSox9は共に領域Aに作用することが示唆された。これまでの、一連のゲノムワイドな解析により得られた結果は、領域Aの活性制御にSox trioが関与している可能性を支持するものであった。29年度が最終年度であるため、記入しない。平成28年度はまず、マウス新生仔肋軟骨より採取した初代軟骨細胞を用いたChIP-seqにより、Ihh遺伝子の上流100 kbに渡って、エンハンサーの指標となるH3K4me2を伴う5つの領域(遠位から順にA、B、C、D、Eとする)を同定し、in vitroとin vivoでの機能評価を行った。In vitroの検討においては、Ihh promoter領域と候補エンハンサー領域を接続したベクターを作製し、マウス新生仔肋軟骨細胞を用いたルシフェラーゼレポーターアッセイによりエンハンサー活性を評価した結果、領域AとDで強いエンハンサー活性を認めた。領域Aに関して、さらにLacZレポータートランスジェニックマウスを用いてin vivoにおけるエンハンサー活性を評価した。胎生16.5で上肢、頭蓋底、肋骨、骨盤、下肢に限局した活性を認めたのに対し、Ihhの発現が報告されている肝臓、消化管、胃、腎臓では活性を認めなかった。組織学的解析の結果、領域Aが長管骨の前肥大軟骨細胞を中心にIhhの発現領域にほぼ一致した活性を示すことから、領域AがIhhの転写調節に関わる軟骨細胞特異的エンハンサーであると示唆された。さらに、領域Aを欠失したマウスをCRISPR/Cas9を用いて作出することに成功した。次に、領域Aにおけるエンハンサー活性の制御機構に関して検討を行った。領域AはChIP-seqにおいてSox9のピークを認めると共に、ChIP-seqで予想されるSoxダイマーモチーフが確認された。領域AのSox trio反応性のエンハンサー活性には、同領域に存在するSoxダイマーモチーフが必要であることをルシフェラーゼレポーターアッセイにより確認すると共に、Soxダイマーモチーフ配列を用いたゲルシフトアッセイにより、同領域へのSox9の特異的結合を確認した。本年度の計画通り、ChIP-seqから同定した候補エンハンサー領域に関して、in vitroとin vivoの検証を行うことにより、領域Aが軟骨細胞特異的なIhhのエンハンサーである可能性を明らかとしただけでなく、領域Aを欠失したマウスをCRISPR/Cas9を用いて作出に成功している。さらに、領域Aにおけるエンハンサー活性の制御機構に関する検討においてもいくつかの実験結果を取得しており、期待通り研究が進展したと評価する。

さらに領域AでSox6のピークを認めたことから、Sox6とSox9は共に領域Aに作用することが示唆された。これまでの、一連のゲノムワイドな解析により得られた結果は、領域Aの活性制御にSox trioが関与している可能性を支持するものであった。29年度が最終年度であるため、記入しない。
時空間変調した電界刺激による細胞分裂の阻害メカニズムの解明とその応用

本研究では,細胞に電界を与えて染色体や微小管に誘電泳動力を働かせ,細胞分裂を阻害して壊死させる新しいガン治療法の確立を目指している.そのために,交流電界中で細胞の分裂過程を解析して電界による分裂阻害のメカニズムを解明すること,分裂の阻害に最も効果的な電極配置と電圧印加条件を予測する数値シミュレーション法を確立すること,の2つを目的とした.平成30年度は,分裂過程を明瞭に観察できるアフリカツメガエルの受精卵を実験対象とし,1分裂過程の三次元形状計測と2数値シミュレーションによる最適な電極配置と電圧印加条件の検討を行った.1では「くびれ」を生じながら分裂する受精卵を経時的に化学固定し,形態計測を行った.連続切片を作製して形状をデジタイズする方法では,形状のゆがみや位置あわせの不正確さという問題が生じた.また,共焦点レーザー顕微鏡では深さ方向に十分な観察が行えなかった.そこで,マイクロCTによって形状を取得し,PC上で三次元形態を再構築する方法を用いた.その結果,「くびれ」を再現した有限要素モデルを構築することができた.2では,この有限要素モデルを用いて,電界と誘電泳動力の分布を計算する数値シミュレーションを行った.平行平板電極の間に卵を置き,交流電界の周波数や電界に対する「くびれ」の方向が誘電泳動力の大きさに与える影響を検討した.さらに,細胞内外の溶液と細胞膜の導電率および比誘電率の違いの影響も評価した.その結果,球状の卵に外部から交流電界を与えても卵内の電界強度は一様になるが,分裂過程で「くびれ」の生じた卵では電界の集中が生じ,その場所で大きな誘電泳動力を生じることが示された.また,誘電泳動力の大きさや最大値をもたらす周波数帯は,細胞外基質の導電率,細胞内溶液の導電率,細胞膜の比誘電率,細胞直径の4つのパラメータに最も大きな影響を受けることが明らかになった.平成30年度は,1受精卵の分裂過程の三次元形状計測,2数値シミュレーションによる最適な電極配置と電圧印加条件の検討の2つを行う予定であった.1については,当初の共焦点レーザー顕微鏡を用いる方法と連続切片を作製して顕微鏡観察する方法では十分に正確な形態計測を行うことができなかったが,マイクロCTを用いた方法に変更することで,より正確な形状データをより簡便に得ることができた.2については,有限要素モデルにおいて薄い細胞膜をモデル化せずに境界条件を与えて表現する方法を用いて,予定通りの解析を行うことができた.平成31年度は,前年度に引き続き,数値シミュレーションによる最適な電極配置と電圧印加条件の検討を行う.これまで平行平板電極中に置かれた受精卵を対象とした解析を行ったので,これを発展させて,例えば四対の電極を対向させ種々の電極をペアにして電圧を印加する条件でも解析を行う.そして,電極の配置と印加条件(周波数,溶液の誘電率)が誘電泳動力の分布に与える影響を明らかにするだけでなく,細胞分裂の方向や段階に応じた最適な印加条件を明らかにする.また,この解析結果をもとにして,実験に際して製作しなければならない実験装置の大きさや卵の配置について検討を行う.そして,培養容器と電極から構成される実験装置を製作する.具体的には,金属平板電極を絶縁チューブで覆った絶縁電極を作製し,培養容器の中で八角形をなすように電極を固定する.電極に交流電圧を印加し,発生する電界を光電界センサーによって計測するとともに,その結果を数値シミュレーションと比較する.本研究では,細胞に電界を与えて染色体や微小管に誘電泳動力を働かせ,細胞分裂を阻害して壊死させる新しいガン治療法の確立を目指している.そのために,交流電界中で細胞の分裂過程を解析して電界による分裂阻害のメカニズムを解明すること,分裂の阻害に最も効果的な電極配置と電圧印加条件を予測する数値シミュレーション法を確立すること,の2つを目的とした.平成30年度は,分裂過程を明瞭に観察できるアフリカツメガエルの受精卵を実験対象とし,1分裂過程の三次元形状計測と2数値シミュレーションによる最適な電極配置と電圧印加条件の検討を行った.1では「くびれ」を生じながら分裂する受精卵を経時的に化学固定し,形態計測を行った.連続切片を作製して形状をデジタイズする方法では,形状のゆがみや位置あわせの不正確さという問題が生じた.また,共焦点レーザー顕微鏡では深さ方向に十分な観察が行えなかった.そこで,マイクロCTによって形状を取得し,PC上で三次元形態を再構築する方法を用いた.その結果,「くびれ」を再現した有限要素モデルを構築することができた.2では,この有限要素モデルを用いて,電界と誘電泳動力の分布を計算する数値シミュレーションを行った.平行平板電極の間に卵を置き,交流電界の周波数や電界に対する「くびれ」の方向が誘電泳動力の大きさに与える影響を検討した.さらに,細胞内外の溶液と細胞膜の導電率および比誘電率の違いの影響も評価した.その結果,球状の卵に外部から交流電界を与えても卵内の電界強度は一様になるが,分裂過程で「くびれ」の生じた卵では電界の集中が生じ,その場所で大きな誘電泳動力を生じることが示された.

また,誘電泳動力の大きさや最大値をもたらす周波数帯は,細胞外基質の導電率,細胞内溶液の導電率,細胞膜の比誘電率,細胞直径の4つのパラメータに最も大きな影響を受けることが明らかになった.平成30年度は,1受精卵の分裂過程の三次元形状計測,2数値シミュレーションによる最適な電極配置と電圧印加条件の検討の2つを行う予定であった.1については,当初の共焦点レーザー顕微鏡を用いる方法と連続切片を作製して顕微鏡観察する方法では十分に正確な形態計測を行うことができなかったが,マイクロCTを用いた方法に変更することで,より正確な形状データをより簡便に得ることができた.2については,有限要素モデルにおいて薄い細胞膜をモデル化せずに境界条件を与えて表現する方法を用いて,予定通りの解析を行うことができた.平成31年度は,前年度に引き続き,数値シミュレーションによる最適な電極配置と電圧印加条件の検討を行う.これまで平行平板電極中に置かれた受精卵を対象とした解析を行ったので,これを発展させて,例えば四対の電極を対向させ種々の電極をペアにして電圧を印加する条件でも解析を行う.そして,電極の配置と印加条件(周波数,溶液の誘電率)が誘電泳動力の分布に与える影響を明らかにするだけでなく,細胞分裂の方向や段階に応じた最適な印加条件を明らかにする.また,この解析結果をもとにして,実験に際して製作しなければならない実験装置の大きさや卵の配置について検討を行う.そして,培養容器と電極から構成される実験装置を製作する.具体的には,金属平板電極を絶縁チューブで覆った絶縁電極を作製し,培養容器の中で八角形をなすように電極を固定する.電極に交流電圧を印加し,発生する電界を光電界センサーによって計測するとともに,その結果を数値シミュレーションと比較する.
脳虚血後のNMDA受容体チロシンリン酸化と細胞内情報伝達に関する研究

本研究は一過性全脳虚血後,NMDA受容体チロシンリン酸化を介する細胞内情報伝達への関与に主眼を置き,企画された.本年度はラット一過性(15分)全脳虚血によって引き起こされるNMDA受容体サブユニットNR2AとNR2Bのチロシンリン酸化の増大が細胞内情報伝達に関わる可能性を前年度に引き続き検討した.GST融合PI3-kinaseのSH2ドメインをタンパク質間相互作用実験に用いた結果,一過性全虚血・再灌流後にそのSH2ドメインとチロシンリン酸化NR2Bの結合は増大した.一方,一過性脳虚血・再灌流後NR2Aのチロシンリン酸化増大はNR2Bと比較し,顕著であるにも関わらず,PI3-kinaseのSH2ドメインはその増大したチロシンリン酸化NR2Aとは全く結合しなかった.近年,SH2ドメインがリン酸化チロシン残基非依存的に結合する可能性を示した結果が報告されたため,一過性全脳虚血後のチロシンリン酸化NR2BとPI3-kinaseのSH2ドメインはリン酸化チロシン残基非依存的である可能性が示唆された.そこで本研究はこの可能性を検討するために,外因的に脱チロシンリン酸化酵素を作用させ,チロシンリン酸化NR2BとPI3-kinaseSH2ドメインの結合実験を遂行した.その結果,外因的に作用させた脱チロシンリン酸化酵素は一過性脳虚血後のNR2チロシンリン酸化を阻害し,かつ濃度依存的にPI3-kinaseSH2ドメインとの結合を阻害した.この研究結果は,一過性脳虚血後のPI3-kinaseSH2ドメインとNR2Bの結合はリン酸化チロシン残基依存的であることを明らかにした.さらに本研究では,NR2Bの細胞内領域に存在するPI3-kinaseSH2ドメインと結合可能な配列のペプチドを用い,競合結合実験を遂行した.ペプチドにはYAHM配列を用い,そのリン酸化ペプチドと非リン酸化ペプチドの比較を行った.その結果,リン酸化YAHMペプチドは一過性脳虚血後のNR2BとPI3-kinaseSH2ドメインとの結合を濃度依存的に阻害した.一方,非リン酸化YAHMペプチドは一過性脳虚血後のNR2BとPI3-kinaseSH2ドメインとの結合を阻害しなかった.以上本年度の研究結果より,一過性脳虚血後のNR2BとPI3-kinaseSH2ドメインの結合はNR2Bのリン酸化チロシン残基を介すること,かつ,NR2B細胞内領域YAHM配列のリン酸化チロシン残基を介することが明らかとなった.これらの結果は一過性脳虚血後のチロシンリン酸化NR2Bサブユニットを介した細胞内情報伝達起動の可能性をより明確にした知見であると考えられた.本研究は遅発性神経細胞死を呈する海馬CA1領域と虚血耐性を示すCA3/dentate gyrus(DG)でのNMDA受容体チロシンリン酸化の経時的変化ならびにリン酸化チロシン残基を介する細胞内情報伝達への関与に主眼を置き,企画された.本年度はラット一過性(15分)全脳虚血モデルを用い,海馬CA1領域とCA3/DG領域でのNMDA受容体サブユニットNR2AならびにNR2Bチロシンリン酸化の経時的変化を検討した.その結果,一過性脳虚血後再灌流早期(再灌流10分)からNR2AおよびNR2Bサブユニットのチロシンリン酸化は偽手術群と比較し,両領域で増大した.NR2Aのチロシンリン酸化の増大は,両領域で再灌流後24時間まで持続した.一方,CA3/DGでのNR2Bのチロシンリン酸化増大は再灌流後24時間まで持続するものの,CA1領域のNR2Bチロシンリン酸化は再灌流24時間後には偽手術群レベルまで戻った.また,一過性脳虚血後のNR2Aチロシンリン酸化は両領域でNR2Bのそれと比較し顕著であった.次に,チロシンリン酸化NR2サブユニットの脳虚血病態での役割を検討するために,Src homology 2(SH2)ドメインとの相互作用実験を遂行した.GST融合PI3-kinaseSH2ドメインをタンパク質間相互作用実験に用いた結果,そのSH2ドメインはチロシンリン酸化NR2Bサブユニットに結合し,一過性脳虚血・再灌流後にその結合は増大した.一方,再灌流後のNR2Aチロシンリン酸化はNR2Bのそれと比較し顕著であるにも関わらず,偽手術群あるいは虚血群のNR2AはPI3-kinaseのSH2ドメインと結合しなかった.以上本年度の研究結果より,一過性脳虚血後のチロシンリン酸化NR2Bサブユニットを介した細胞内情報伝達起動の可能性を示唆する新しい知見を得た.本研究は一過性全脳虚血後,NMDA受容体チロシンリン酸化を介する細胞内情報伝達への関与に主眼を置き,企画された.本年度はラット一過性(15分)全脳虚血によって引き起こされるNMDA受容体サブユニットNR2AとNR2Bのチロシンリン酸化の増大が細胞内情報伝達に関わる可能性を前年度に引き続き検討した.GST融合PI3-kinaseのSH2ドメインをタンパク質間相互作用実験に用いた結果,一過性全虚血・再灌流後にそのSH2ドメインとチロシンリン酸化NR2Bの結合は増大した.

一方,一過性脳虚血・再灌流後NR2Aのチロシンリン酸化増大はNR2Bと比較し,顕著であるにも関わらず,PI3-kinaseのSH2ドメインはその増大したチロシンリン酸化NR2Aとは全く結合しなかった.近年,SH2ドメインがリン酸化チロシン残基非依存的に結合する可能性を示した結果が報告されたため,一過性全脳虚血後のチロシンリン酸化NR2BとPI3-kinaseのSH2ドメインはリン酸化チロシン残基非依存的である可能性が示唆された.そこで本研究はこの可能性を検討するために,外因的に脱チロシンリン酸化酵素を作用させ,チロシンリン酸化NR2BとPI3-kinaseSH2ドメインの結合実験を遂行した.その結果,外因的に作用させた脱チロシンリン酸化酵素は一過性脳虚血後のNR2チロシンリン酸化を阻害し,かつ濃度依存的にPI3-kinaseSH2ドメインとの結合を阻害した.この研究結果は,一過性脳虚血後のPI3-kinaseSH2ドメインとNR2Bの結合はリン酸化チロシン残基依存的であることを明らかにした.さらに本研究では,NR2Bの細胞内領域に存在するPI3-kinaseSH2ドメインと結合可能な配列のペプチドを用い,競合結合実験を遂行した.ペプチドにはYAHM配列を用い,そのリン酸化ペプチドと非リン酸化ペプチドの比較を行った.その結果,リン酸化YAHMペプチドは一過性脳虚血後のNR2BとPI3-kinaseSH2ドメインとの結合を濃度依存的に阻害した.一方,非リン酸化YAHMペプチドは一過性脳虚血後のNR2BとPI3-kinaseSH2ドメインとの結合を阻害しなかった.以上本年度の研究結果より,一過性脳虚血後のNR2BとPI3-kinaseSH2ドメインの結合はNR2Bのリン酸化チロシン残基を介すること,かつ,NR2B細胞内領域YAHM配列のリン酸化チロシン残基を介することが明らかとなった.これらの結果は一過性脳虚血後のチロシンリン酸化NR2Bサブユニットを介した細胞内情報伝達起動の可能性をより明確にした知見であると考えられた.
cell free DNAを用いたEGFR阻害剤耐性獲得機序解明

臨床検体を用いて以下のことを明らかにした。(1)転移を有する原発巣KRAS野生型の約10%で循環DNAから変異型KRASが検出され、これらの症例では抗EGFR抗体による腫瘍縮小効果が得られない。(2)循環DNAのKRAS, BRAFが野生型であれば90%の確率でEarly Tumor Shrinkage (ETS)が得られる。(3)抗EGFR抗体の2次耐性を獲得する前に、80%の症例で循環DNAからKRAS変異が、40%からBRAF変異が検出される。本研究の目的は末梢血中を循環するcfDNAを用いて大腸癌治療における抗EGFR抗体治療の2次耐性獲得の機序を解明することである。治療開始前より継続的にcfDNAの質的、量的変化を解析する。我々は、『抗EGFR抗体により阻害されるEGFがトリガーとなる増殖シグナルの経路であるKRAS、NRAS、BRAF、PIK3CAあるいはEGFRそのものに変異が生じることにより抗EGFR抗体に対する2次耐性が形成される。また、cfDNA量は腫瘍の増大に伴い増加し、腫瘍の縮小により減少する。腫瘍増大時にはcfDNA量が増加するだけでなく変異アレル数も増加する』との仮説をたてた。cfDNA量は仮説どおりに腫瘍の増大あるいは縮小に伴い増減し、この変化はCT等の画像上の変化あるいはCEAなどの腫瘍マーカーの変化が同定される前におこることがわかった。さらにこのcfDNA量の変化は原発巣切除あるいは肝転移巣切除によっても生じることが解明された。抗EGFR抗体に対する2次耐性を獲得した患者で、臨床的に耐性を獲得する以前にcfDNAにてKRAS変異が同定されるようになる患者がいることがわかった。この変異は1%以下という極めて低位頻度の変異として認められるため、cfDNAによる解析では低頻度変異を検出可能な高感度系が必要である。どのような患者からどのようなタイミングでKRAS変異が同定されるようになるかは未だ不明である。これまでにBRAFの変異が認められるようになった症例はなく、またNRAS、PIK3CA、EGFRについては適切な検出方法の条件設定を行っているところである。本研究の目的は循環DNAを用いて大腸癌患者における抗EGFR抗体への耐性獲得メカニズムを明らかにすることである。抗EGFR抗体を投与する患者に化学療法開始前、開始後は2-3ヵ月ごとに採血し、循環DNAを抽出した。デジタルPCRを用いて循環DNAのKRAS変異を解析した。これまでにわかったことは、転移巣を有するKRAS変異型大腸癌の90%で循環DNAが検出できる、KRAS野生型の10%で循環DNAで変異型KRAS変異型が同定され、これらの症例に抗EGFR抗体を投与しても奏効しない、原発巣、循環DNAともにKRAS野生型の90%で抗EGFR抗体が奏効するが、約1年で耐性化し、耐性化症例の50%では循環DNAでKRAS変異が同定される、等である。これまでの成果を国内および海外学会で発表し、Cancer Scienceに投稿し、acceptされた。当初は耐性化症例の6-7割の循環DNAから変異型KRASが同定できると考えていたが、意外に低く、その他の耐性化の原因を調べる必要がある。現在、KRAS以外の変異をデジタルPCRと次世代シーケンサーを用いて検索しており、今後HERE2の増幅を検査する予定である。この研究過程で変異だけではなく循環DNAの量や質が新たなバイオマーカーとなる可能性が示されたため、これらが抗EGFR抗体に対する耐性化に係わるかどうかについても検討中である。circulating tumor cellも利用する予定であったが、効率よく採取できていない。新たに開発された機器を6月から使用できるため、これを用いてCTCを解析することでよい結果が得られることを期待している。本研究の目的は循環DNAを用いて抗EGFR抗体に対する耐性化メカニズムを解明することである。耐性化症例の50%では治療中にKRASが変異することがわかり、治療中のKRASが消失変異は抗EGFR抗体の耐性化に大きく関与する必要があることがわかった。一方で残りの50%における耐性化メカニズムについては不明であり、今後明らかにする必要がある。末梢血から循環DNAを抽出し、KRASおよびBRAF変異を高感度に検出する方法を開発した。この方法を用いることで転移を有する原発巣KRAS変異型症例の約90%で末梢血から抽出した循環DNAを用いてKRAS変異の検出が可能であった。また、KRAS変異が検出された症例では、末梢血内の変異型KRASコピー数は腫瘍の縮小とともに減少し、腫瘍の増大とともに増加することがわかった。抗EGFR抗体を投与した転移を有する大腸癌症例から、化学療法開始前、化学療法中には2ヶ月毎に末梢血を採取し、循環DNAを採取してKRASおよびBRAFの変異を解析した。その結果、(1)転移を有する原発巣KRAS野生型の約10%で循環DNAから変異型KRASが検出され、これらの症例では抗EGFR抗体による治療縮小効果が得られない、(2)循環DNAのKRAS, BRAFが野生型であれば90%以上の確立でearly tumorshrinkage (ETS)が得られる、(3)抗EGFR抗体の2次耐性を獲得する前に、80%の症例の循環DNAからKRAS変異が、40%からBRAF変異が検出される、ことを明らかにした。これらの成果の一部はCancer Science誌に掲載された。抗EGFR抗体に耐性化した症例のうち20%では循環DNAからKRAS、BRAF

変異が検出されないことがわかり、現在これらの症例における耐性化機構の解明に取り組んでいる。臨床検体を用いて以下のことを明らかにした。(1)転移を有する原発巣KRAS野生型の約10%で循環DNAから変異型KRASが検出され、これらの症例では抗EGFR抗体による腫瘍縮小効果が得られない。(2)循環DNAのKRAS, BRAFが野生型であれば90%の確率でEarly Tumor Shrinkage (ETS)が得られる。(3)抗EGFR抗体の2次耐性を獲得する前に、80%の症例で循環DNAからKRAS変異が、40%からBRAF変異が検出される。本研究に必要な臨床サンプルはほぼ順調に集積できている。当初の仮説どおり、新規のKRAS変異は同定することができ、これが抗EGFR抗体に対する2次耐性獲得に関わっている可能性が示唆された。これについては国内および国際学会で発表を行ない、現在論文執筆中であり投稿間近である。BRAFは0.01%の変異を検出する我々独自の検出系を確立している。しかし、これまでにBRAF変異を認めた症例はいない。抗EGFR抗体投与によりBRAF変異が生じるかどうかを明らかにするためには症例を更に集積する必要があると考えている。NRAS、PIK3CAについては適切な検出法を確立できていない。次世代シーケンサー(NGS)についても同様である。特にNGSについては我々が独自に開発したInvader Plus法やデジタルPCRで検出できる1%以下の変異が検出できない。NRAS、BRAF、PIK3CA、EGFR以外の変異もKRASと同様に低頻度の変異をおこしている可能性があるため、cfDNAの採取法、シーケンスの条件の変更あるいは使用機種の変更も含め柔軟な対応が必要である。引き続き抗EGFR抗体治療に耐性化した症例を集積し、循環DNAサンプルを採取する。抗EGFR抗体に耐性化してもKRAS変異をきたさなかった50%の症例ではBRAF変異、PIK3CAの変異、HER2の増幅等が原因として関与すると考えており、これらについては今後明らかにする必要がある。また未知の要因については次世代シーケンサーを用いた解析により解明していく予定である。消化器外科今後検討すべき点としては以下の項目が挙げられる。(1)本来KRAS野生型でありながら抗EGFR抗体を投与することによりcfDNAが検出されるようになる患者の頻度、および検出されるようになるまでの時間を検討する。(2)NRAS、BRAF、PIK3CAについてもKRASのように新規の変異が起こりうるか検討する。(3)次世代シーケンサーを用い、NRAS、BRAF、PIK3CA以外にも新たな変異が生じていないか検討する。2,3については前述の如く検出法が十分に確立できていない。しかし本年度の情報収集活動の結果、この状況を打開できる可能性のある方法をいくつか見いだしており、次年度にはこれらの方法に取り組む。