hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ヤスデ類における体サイズ大型化を伴う多発的な種分化メカニズム

研究実施計画に沿って実績を述べる。1.分子系統に基づく体サイズ大型化を伴う多発的な種分化パターンの解明:分子系統推定の精度を上げることが必要と判断されたため、多発的種分化が生じている、岐阜県、三重県、奈良県にてRAD-seq用サンプルの採集を行った。2.同所的な小型種と大型種の間の機械的隔離の確認:RAD-seqによる精度の高い系統推定に基づいて実施することとし、今年度は保留とした。3.体サイズ大型化要因の解明:寄生バエの影響についてデータ数を増やして解析した。その結果、ハエの雌についてはヤスデとの間に体サイズの有意な相関がみられた(n=10)。ハエの寄生でヤスデは死ぬことから、ハエ雌を通じてハエの寄生はヤスデの体サイズ小型化に影響を与えている可能性がある。ヤスデの体サイズ大型化要因は他に存在すると考えられる。4.種分化と体色擬態(追加):当初は体サイズと種分化の関係に着目していたが、研究を進める中で体色擬態と種分化についても興味深い現象が見られることがわかった。研究対象のババヤスデ属ミドリババヤスデ種複合体とアマビコヤスデ属の間で灰色のミュラー型擬態が生じていると考えられる。興味深いのはミドリババヤスデ種複合体の一部の系列が灰色ミュラー型擬態環を抜け出してオレンジに移行していること考えられることである。このオレンジへの移行にはミドリババヤスデ種複合体における多発的種分化が関与している可能性がある。予備調査として、多発的種分化が生じている岐阜県、三重県、奈良県にてアバンダンス調査を行うとともに、ヤスデ類を採集し、体色反射波長計測、体色バターン写真記録を行った。5.ババヤスデ科全種の分類リスト(追加):研究対象種を含むババヤスデ科全種の分類リストを報告した(Marek et al. 2014)。進化生態学作業項目毎に理由を述べる1.分子系統に基づく体サイズ大型化を伴う多発的な種分化パターンの解明:浸透交雑によりmtDNAの塩基配列では精度の高い系統推定は難しく、今後、核の複数領域もしくはRADシーケンシング等による解析が必要となった。2.同所的な小型種と大型種の間の機械的隔離の確認:この作業は、上記の系統推定の上に成り立つ。系統推定に課題が見つかったことから、本作業は保留とした。3.体サイズ大型化要因:寄生バエがヤスデ体サイズに与える影響については、その可能性を示唆する結果を得ることができた。計画していた3項目の一つ(1)「分子系統に基づく体サイズ大型化を伴う多発的な種分化パターンの解明」については、DNA塩基配解析のための機器類の整備とプロトコールの作成を終え、解析に入ることができた。十分なデータに基づいた解析にはいたらなかったが、本研究の仮説「体サイズ大型化による多発的な種分化」を支持する分子系統解析結果を得ることができた。(2)「同所的な小型種と大型種の間の機械的隔離の確認」については、予定していた交配実験を行うことができず、分子系統の解析結果からの検討にとどまった。最後の項目(3)「体サイズ大型化要因の解明」については、生活史の延長については十分な検討ができなかったが、ハエの寄生についてはハエの分類と生活史に関する基礎的なデータを得ることができた。総合的にみれば、これらの結果は本研究の基盤を形成するものであり、それに基づいて明確で効率的な研究計画の構築が可能となった。以下の方策により研究を推進する。
極微弱ラマン散乱分光システムの開発と原子層レベルの材料評価への応用

反射損失の少ない銀鏡を用いたダブル分光器にノッチフィルターを組み合わせ極微弱ラマン散乱スペクトルの測定システムを試作した。レイリー散乱の少ない試料を用いて、100-500cm^<-1>の領域で微弱ラマン光が測定できることを確認した。さらに高量子効率のCCD検出器を用いて微弱光の測定を行い、0.1フォトン/秒の検出が可能であることを実証した。このシステムを用いて、C_<60>結晶および半導体超薄膜の評価を試みた。(1)C_<60>結晶の測定C_<60>結晶は励起レーザー光の照射によって構造変化を起こす。従って非常に微弱な励起強度で測定する必要がある。本試作のシステムを用いて10μWのパワーでC_<60>結晶のラマンスペクトルを測定することができた。(2)ZnTe薄膜の評価2-100nmの厚さを持つZnTeエピタキシャル膜の多重LOフォノン線を共鳴条件下で測定し、この共鳴プロファイルが膜厚に非常に強く依存することを見いだした。ZnTe膜が薄くなるにつれて高次のLOフォノン線が消滅し、またラマン線が僅かに高波数側にシフトすることを観測した。このことからGaAs上のZnTe膜は界面近くでミスフィット転位の発生により格子緩和を起こしているため結晶性が悪く、界面から遠ざかるにつれ次第に結晶性が良くなってくると結論した。200nmの膜厚のアモルファスシリコン薄膜を熱処理し結晶化させた場合、サブミクロンサイズの微結晶粒が成長していることが確認された。さらにシランとジシランガスを用いて成長させたアモルファス膜ではシランを用いた膜の方が結晶粒成長の速度が早いことが分かった。上記以外に低温成長させたGaAsエピタキシャル膜、GaAs上に成長させたGaSbエピタキシャル超薄膜(2.5-100nm)、TiC上のSiC膜の結晶性や歪みなどをラマン散乱測定によって評価した。ホログラフィックノッチフィルターとダブルモノクロメターから構成される分光器にマルチチャネル検出器を接続した分光システムを試作し、原子層レベルの超薄膜からのラマン散乱検出を試みた。本年度は(1)反射鏡に銀鏡(反射率98%)を用いた分光器を組み立てた。(2)マルチチャネル検出器を使用する際に必要なフィルター分光器の代わりにホログラフィックノッチフィルターを用いることを試みた。(3)マルチチャネル検出器の直前に非対称スリットを新たに設け、レーリー光の除去を二重に行い、マルチチャネル検出器による低波数域(100400cm^<-1>)の測定を可能にした。(4)GaAs(100)基板の上にZnSe,ZnTe及びGaSb超薄膜をエピタキシャル成長させ、本試作装置を用いてこの超薄膜のラマン測定を試みた。GaSb/GaAsについては25A^^°(約20原子層)のGaSb薄膜のラマンスペクトル、ZnTe/GaAsについては20A^^°(約15原子層)のZnTe薄膜のスペクトルを観測することができた。この観測結果からGaSb薄膜はGaAs基板と部分的に格子整合を取り、膜厚が50A^^°以下になっても、結晶性が比較的良いことが分かった。

これに対してZnTe薄膜の場合は基板と成長膜が格子整合をほとんど取らずfree standingの状態で成長するが、50A^^°以下の膜厚の場合には高密度の転位が発生し、結晶性が悪いことが分かった。次年度は二組のノッチフィルターを使用してさらに低波数域のバックグラウンドの低下を図る。このことによって半導体薄膜の微弱ラマン信号のS/N比向上が期待でき、45原子層の超薄膜のラマンバンドの測定、解析ができると考えている。反射損失の少ない銀鏡を用いたダブル分光器にノッチフィルターを組み合わせ極微弱ラマン散乱スペクトルの測定システムを試作した。レイリー散乱の少ない試料を用いて、100-500cm^<-1>の領域で微弱ラマン光が測定できることを確認した。さらに高量子効率のCCD検出器を用いて微弱光の測定を行い、0.1フォトン/秒の検出が可能であることを実証した。このシステムを用いて、C_<60>結晶および半導体超薄膜の評価を試みた。(1)C_<60>結晶の測定C_<60>結晶は励起レーザー光の照射によって構造変化を起こす。従って非常に微弱な励起強度で測定する必要がある。本試作のシステムを用いて10μWのパワーでC_<60>結晶のラマンスペクトルを測定することができた。(2)ZnTe薄膜の評価2-100nmの厚さを持つZnTeエピタキシャル膜の多重LOフォノン線を共鳴条件下で測定し、この共鳴プロファイルが膜厚に非常に強く依存することを見いだした。ZnTe膜が薄くなるにつれて高次のLOフォノン線が消滅し、またラマン線が僅かに高波数側にシフトすることを観測した。このことからGaAs上のZnTe膜は界面近くでミスフィット転位の発生により格子緩和を起こしているため結晶性が悪く、界面から遠ざかるにつれ次第に結晶性が良くなってくると結論した。200nmの膜厚のアモルファスシリコン薄膜を熱処理し結晶化させた場合、サブミクロンサイズの微結晶粒が成長していることが確認された。さらにシランとジシランガスを用いて成長させたアモルファス膜ではシランを用いた膜の方が結晶粒成長の速度が早いことが分かった。上記以外に低温成長させたGaAsエピタキシャル膜,GaAs上に成長させたGaSbエピタキシャル超薄膜(2.5-100nm)、TiC上のSiC膜の結晶性や歪みなどをラマン散乱測定によって評価した。
酸化物超電導体の線材加工に及ぼす製造条件の影響

本年度に得られた結果は次のようにまとめられる。まず超電導粉末充填金属管の細線加工に関しては1.銀被覆管を用いた直径6mmから1mmまでの靜水圧押し出しおよびスウェージング加工は銀管の肉厚によらず容易に行いえた。これは銀管に割れがはいるアルミナ充填の場合とは異なっており粉体の性質が加工の成否に影響を与えることを意味している。2.ローラーダイス引き抜き加工では管材の肉厚不同や時には割れが生じた。3.成形時の加工圧力を高めるため銀管の外側を他の金属管で被覆した場合外管の強度が銀管のそれの2倍以上になると(軟鋼)、断面減少率が85%以上で内部の粉体部に周期的なくびれが発生し均一な加工は行い難かった。4.直径1mmの線材を圧延する場合(1)銀管の肉厚が半径の1/10以下になると銀管に割れが生じた。(2)1パス当たりの圧下量は0.1mm以下が望ましいがその場合も板厚0.2mm以下で粉体部に内部くびれが生じた。(3)潤滑は板の幅広がりを抑えまた粉体部の均一変形にも効果がある。つぎに磁束ピンニングセンターとしての可能性がある双晶界面の制御を行うために550°C(斜方晶温度域)でYBCO焼結体の圧縮加工を行った。圧縮応力の上昇に伴って圧縮面での(200)面回折強度に対する(020)面強度は急激に減少した(面指数は(abc)を意味しa軸の格子常数>b軸の格子常数とする)。この事は550°Cの圧縮変形によって圧縮方向に沿う長いa軸を短いb軸に交換するタイプの双晶変形が生じたことを示している。これは偏光顕微鏡からも確認された。この方法は双晶量を人為的に変える事を可能にするので双晶界面のJ_Cへの効果を調べる場合に有用であろう。より高温の正方晶領域で圧縮変形をおこなって底面すべりによる結晶のC軸配向の可能性を検討した。840°C以上で降伏応力が急激に低下し変形が容易になり、また圧縮面でのC面回折強度が相対的に強くなることが見いだされた。この配向化はBiーpb系でも同様に観察された。
空中映像と空中触覚の融合に関する基礎研究

空中映像と空中触覚の融合を調べるための実験装置が完成した。触覚刺激を与えるための透明板を当初の予定ではリニアモーターで制御することになっていたが、リニアモーターで駆動させるのは困難だと分かって、最終的には回転式モーターとベルト駆動方式に変更した。空中触覚は視覚と独立した情報提示手段として使えることが分かり、触覚から物体の位置や形状を認識できると分かった。しかし駆動方式変更のため、2018年度後半で実験結果がまとまり、学会発表は2019年度に行うことになった。実験1は空中映像に3種類の形状(円・正方形・長方形)を表示し、それと同じ形状を空中触覚で提示する設定で行なった。空中映像と同時に空中触覚を提示して練習した。次に視覚の提示なしに、触覚のみの提示により、位置認識や形状認識を行い、空中触覚に対する認知性能の測定を行なった。形状の認識率は提示条件により全体的に64%78%となり、長方形の認識率が高く、コンフュージョンマトリクスから正方形と円形の区別が困難である事が判明した。指でなぞる触覚提示では「角」の認識が困難であることに要因があると思われる。実験2では空中触覚を使った簡単なゲームを作成し、ゲーム内で採用された空中触覚がゲームの臨場感向上に役に立ってるのかを定量的に調査した。ゲームの概要は、画面上に横方向の複数車線の道路があり、そこに多数の自動車が走行している。その中をすり抜け、他の車を次々と追い抜きながら被験者が指先で運転してる車が高速に走行する。指が運転してる車に触れてる間は触覚刺激が与えられるが、他の車と接触し、「事故を起こしたら」触覚がなくなり、車が「あたってしまった」との感覚を与える。このゲームの評価実験がまだ進行中だが、現時点までのアンケートから、触覚刺激の効果が見られる。ただし、まだ優位な評価が得られる被験者数に達してないので、定量的な評価は今後の課題である。空中触覚の認知に関する基礎実験を継続している。提示方法のチューニングを行い、また認知プロセスについて仮説を立てることを進めている。被験者の数や範囲(年齢・国籍・文化的背景等)を増加し、これまでに得られた実験結果の汎用性について知見を得た上で、データを確立させようとしている。応用例であるゲームについて、まだ数名の被験者しかないため優位性のあるデータが得られてない。そのため、複数の被験者にゲームで実験してもらい、基礎認知実験と同様に結果をまとめる作業を進めている。得られたデータについて、まだ十分解析できてない側面として、認知に必要とされる時間がある。傾向として分かってるのは、最終の認知制度が低い時に時間が長いだが、その定量的な相関等がまだ解明されてない。また同一の被験者の複数回の実験において、認知時間がどう変更するのかが、まだ不明となっている。これらの定量的な情報を中心に、これまでの実験を見直す事を進めている。基礎実験で分かったことから応用の可能性について検討し、応用実験を行う。現時点まで試みたのは、簡単なゲーム(自動車走行シミュレーション)だが、被験者のコメントから、空中映像に空中触覚を加えることが臨場感につながると推測できる。現時点での成果を「CME2019」国際会議(ドイツ・2019年9月)で発表する予定となっている。空中映像を用いて、複雑な医療画像データ(CT・MRI・超音波エコー等)を提示する時に、その理解を高めるため、画像情報に空中触覚のチャンネルを加え、ビジュアルな理解と触覚による理解を並行して行うことを研究する予定。2つのモダリティを使うことによって、ビジョンだけと比べて利用者の精神的な負担を軽減し、単一チャンネルのオーバーロードを防ぐことが期待される。触覚刺激の提示方法としてこれから新たに導入したいのは、表面荒さおよび表面の凹凸と言った情報の追加である。現状では提示する触覚は「平面」と「輪郭」のみとなっており、比較的に単純な情報となっている。これに対し、表面上に指を動かすに連れて表面を前後に微小に動かし、それで表面荒さや凹凸を表現できることを試みたい。表面を指移動と連動し運動させるための制御方法を開発し、新しい刺激方法で実験できる様に実験装置を改造する予定となっている。またこの刺激方法を活用したシーンを記述する書式を設計し、空中映像のイメージと空中触覚の「イメージ」をつなぐ表現を開発する。この段階で医療従事者との連携が必須となり、画像データによる診断の専門家に協力を得て、触覚チャンネルに適した情報の選定や提示方法について相談する予定。この時、提示するシーン内に輪郭・空洞・テクスチャー・凹凸の各種表現をどの様にして有効に使えるのか、利用者の立場となって探ってみる。テクスチャーについて、触覚刺激の空間周波数として提示できる範囲を調べ、基礎的な認知性能も調べる。3Dプリント等で形成された物理的なサンプルを触る時の認知性能と移動する透明板で実現する仮想的な「表面」を使った時の認知性能を比較することにより、空中触覚と言った新しい情報提示方法について基礎的な知見を得ることを期待している。1.透明板を使った実験装置の開発状況:空中映像に空中触覚を加えるための実験装置の主要な部分として下記のものが完成した。(1)実験装置の筐体(高輝度LCD、30X30cmのDCRA光学素子、タッチフレーム)、(2)空中触覚を与えるための透明板と駆動用リニアモーター、リニアスケール、

(3)透明板の駆動を制御するリニアモーター制御ユニット(「ODrive」社製)。実験装置を完成させるため、現在は(3)のソフト開発に取り組んでいる。このソフトが完成したら、空中映像のコンテンツおよび利用者の操作に合わせて透明板を素早く移動させ、指先が接触してるところが空洞か物体かを感じさせる様になる。2.空気シートを使った実験装置の開発状況:空気シートを発生させる装置を導入し、その性能を確認した。元の構成では空気シートが広く、コンプレッサーの容量不足で十分な触覚効果が得られなかったが、空気シートの幅を約10cmまで狭めたら触覚が得られ、実験可能な性能と判断できた。現在は空気シート発生装置を組み込むための筐体を作成し、完成したら下記の触覚実験3.実験方法の検討:2018年3月20日に岡山大学にて行った共同研究者と討議の結果、空中触覚による形状認識実験を企画し、岡山大学の研究チームが使っている、空間周波数を変更した触覚認識用テストピースの形状を元に実験を設計することにした。更に、空中触覚刺激を提示する時の位置認識精度や速度を持って定量的な認知実験を企画している。当初計画で透明板を動かすリニアモーターに付属したドライバーを使う予定だったが、このドライバーは公表値より低い速度での動作しかできず、新しいドライバーを導入する必要ができた。新規ドライバーは追加費用が高くないが、ソフト開発に一定の時間がかかり、遅れが発生した。空中映像と空中触覚の融合を調べるための実験装置が完成した。触覚刺激を与えるための透明板を当初の予定ではリニアモーターで制御することになっていたが、リニアモーターで駆動させるのは困難だと分かって、最終的には回転式モーターとベルト駆動方式に変更した。空中触覚は視覚と独立した情報提示手段として使えることが分かり、触覚から物体の位置や形状を認識できると分かった。しかし駆動方式変更のため、2018年度後半で実験結果がまとまり、学会発表は2019年度に行うことになった。実験1は空中映像に3種類の形状(円・正方形・長方形)を表示し、それと同じ形状を空中触覚で提示する設定で行なった。空中映像と同時に空中触覚を提示して練習した。次に視覚の提示なしに、触覚のみの提示により、位置認識や形状認識を行い、空中触覚に対する認知性能の測定を行なった。形状の認識率は提示条件により全体的に64%78%となり、長方形の認識率が高く、コンフュージョンマトリクスから正方形と円形の区別が困難である事が判明した。指でなぞる触覚提示では「角」の認識が困難であることに要因があると思われる。実験2では空中触覚を使った簡単なゲームを作成し、ゲーム内で採用された空中触覚がゲームの臨場感向上に役に立ってるのかを定量的に調査した。ゲームの概要は、画面上に横方向の複数車線の道路があり、そこに多数の自動車が走行している。その中をすり抜け、他の車を次々と追い抜きながら被験者が指先で運転してる車が高速に走行する。指が運転してる車に触れてる間は触覚刺激が与えられるが、他の車と接触し、「事故を起こしたら」触覚がなくなり、車が「あたってしまった」との感覚を与える。このゲームの評価実験がまだ進行中だが、現時点までのアンケートから、触覚刺激の効果が見られる。
カーボンナノチューブにおける高温超伝導の研究

カーボンナノチューブ(CNT)における超伝導転移の再現性と転移温度(Tc)の向上を目指した研究を行った。この結果、レーザー蒸発法を使って触媒を介した単層CNTへのホウ素ドープに成功し、ホウ素が炭素原子を置換していることを核磁気共鳴や共鳴ラマン散乱で証明した。また、その単層ナノチューブを精製しシリコン基板上に高均一で集積し薄膜構造にした試料においてTc=12Kのマイスナー効果を発見することに成功し、ホウ素ドープ量とマイスナー効果との相関を解明した。さらに、as-grownの単層CNTロープを強い超音波洗浄で完全に分散し基板上に集積・薄膜化した試料に数10Mパスカルの圧力を印加することでTcを19Kまで上昇させることに成功した。また、このTc上昇がCNT固有のフォノンであるRadial Breathing Modeの圧力印加による周波数上昇に起因していることを圧力依存共鳴ラマン散乱の実験から明らかにした。これらにより、今後のCNT超伝導研究の発展への大きな道筋をつけた。本年度は本科研費補助金プロジェクト「カーボンナノチューブ(CNTs)における高温超伝導の研究」の実施初年度であったため、以下のような観点から基礎的なデータを積み上げることに主眼を置いて研究を行った。春山(青学大):(1)磁化測定とマイスナー効果の同定、(2)超伝導の再現性向上、(3)ホウ素注入の可能性検討など。丸山(東大)・篠原(名大):気相成長により生成される多層CNTsの触媒量との相関、品質・生成量などの制御斉藤(東工大):ホウ素注入と超伝導発現の相関の理論的探索その結果主に以下のような成果を得ることが出来た。マイスナー効果の同定のために、昨年度電気抵抗の低温での減少の観点から超伝導を報告した試料の作成プロセスに基づいて、CNTs合成に使用している強磁性触媒Fe/Coを徹底的に削減し、その上で効率よく高品質多層CNTsを生成することを試みた。その結果、触媒を電気化学的にアルミナ膜テンプレートのナノ細孔底に成長する際の、エネルギー(溶媒温度、印加電圧・時間)を下げることで触媒量が激減できることを発見した。さらにその条件下で、気相成長直前にAr+H_2ガスで触媒表面を還元することで、高効率で多層CNTsを合成できることを発見した。これにより、試料中に残留するFe/Co触媒の量を激減させながら、大量の多層CNTsを合成することに成功した。この条件で合成された試料においてまず電気抵抗を測定し、超伝導に起因すると思われる電気抵抗の減少が観察できた試料で磁化の測定を行った。その結果、規格化された磁化と温度の依存性においてT_c=19Kから緩やかで飽和しない磁化の落ちを発見した。各温度でのこの磁化の磁場依存性は第二種超伝導体のマイスナー効果特有の傾向を示し、かっ、上部臨界磁場の温度依存性もT_c近傍でマイスナー効果特有の振る舞いを示すことを確認した。また、この上部臨界磁場の温度依存性より超伝導コヒーレンス長が約47nm程度と見積もれ、この値も炭素関連の超伝導体と比べて合理的な値であることを確認できた。さらに、蜂の巣アレイ状に配置している多層CNTsのチューブ間結合がこのマイスナーに強く寄与している可能性を発見し、マイスナー効果のための遮蔽電流は複数のCNTsをまたがって流れている可能性を指摘できた。カーボンナノチューブ(CNT)における高温超伝導を探索した。アルミナ膜ナノ細孔に気相成長した多層CNTアレイにおいて電気抵抗の観点から報告してきた超伝導を磁化(マイスナー効果)の観点から同定・発展させるために、CNT成長のための強磁性触媒の量などの構造パラメータ・プロセスを最適化した。その結果、ナノ細孔底に成長する強磁性触媒の量を減らし、CNT成長直前に触媒表面を還元することで、残留触媒量を劇的に減らしつつ、質の高いCNTを大量に生成することに成功し、約20Kの転移温度を持つマイスナー効果の発見に成功した。さらに、このマイスナー効果が1本の多層CNT中で発生するのでは無く、アレイ構造の集合体において発生していることを解明し、この原因がマイスナー反磁性出現のための磁場遮蔽渦電流の経路が直径7nm程度の多層CNT1本では存在し得ないためであることを明らかにした。

この結果は集合体構造がCNTにおける超伝導発現にとって必要不可欠であることを立証したものであり、今後CNT超伝導の物性を解明し、30K以上の高転移温度を実現するために極めて重要なものである。また、キャリアドープの観点から単層CNTへのホウ素ドープの実験に取り組み、触媒粉末中にあらかじめホウ素粉末を含有させ、CNTを成長することで、単層CNT中にホウ素が取り込まれる可能性を、核磁気共鳴や共鳴ラマン散乱による測定で同定した。最終年度にあたって、ホウ素ドープ単層カーボンナノチューブ(CNT)の結晶性改善と超伝導転移温度(T_c)の向上に注力した。結晶性は、CNT成長温度の最適化、触媒へのホウ素の含有の方法の最適化、の二点から行った。また、T_c改善は、(1)ホウ素濃度の低減、(2)直径が1nm以下の細い単層ナノチューブの生成と使用、(3)薄膜試料への高圧印加、の三点から行った。その結果、結晶性は、温度の最適化で向上したことが共鳴ラマン散乱の測定で確認できた。T_c向上は(3)のみで実現できた。(1)では触媒中のホウ素濃度を1原子%以下に低減すると単層ナノチューブ中にホウ素がドープされない場合が発生し、マイスナー効果自体が消えてしまった。その観点で微量ナホウ素のドープ方法の改善が必要である。(2)では直径0.6nm付近の試料ではアモルファス構造が激増し、質の高い単層ナノチューブが採れなかった。これもチューブ生成方法の最適化が必要である。(3)では、成長時に自然形成される単層ナノチューブロープ(集合体)が薄膜中に多いと、その薄膜に圧力を印加してもT_cがほとんど変化しないことをまず確認した。そこで、超音波洗浄を長時間、強力に行いそのロープを徹底的に分散し個々の単層ナノチューブにした。それらの単層ナノチューブを基板上に塗布して集積化し薄膜にした構造では、7Kから19KまでT_cが上がることを発見した。圧力を印加した共鳴ラマン散乱測定でこの薄膜の単層ナノチューブのフォノン振動数が圧力印加で上昇することを発見し、これがTc上昇の原因であることを究明した。今後の再現性向上やT_c,改善においてこれらは極めて重要な発見である。
腸管アウエルバッハ神経叢のシナプス伝達における一酸化窒素(NO)の役割

腸管神経系には,一酸化窒素(NO)を合成する酵素(NO合成酵素,NOS)の存在の明らかになっており、これまでの研究でNOが神経細胞・神経細胞間シナプスの伝達物質として作用する可能性が知られている。本年度はNOSに対する抗体を用いて、NOを神経伝達物質として用いる可能性のある腸管神経細胞の形態と,電気生理学的特徴を詳細に検討した。標本には切除したモルモットの摘出小腸を用いた。粘膜層と内輪状筋層を剥離して、アウエルバッハ神経叢を外縦走筋層上に露出した標本を作製した。あらかじめ細胞内の移動性の高いトレーサー(Neurobiotin)を先端に封入したガラス微小電極で、腸管神経細胞を刺入し、その電気活動を記録した後、Neurobiotinを細胞内に電気泳動的に注入した。実験終了後、標本を固定した後、蛍光抗体を結合させたNOSに対する抗体を用い、NO合成酵素の存在部位を明らかにし、かつNeurobiotinを注入した神経細胞をジアミノベンチジンで発色させて、その形態を検討した。その結果、モルモットの小腸のアウエルバッハ神経叢では、約10%の神経細胞にNOを産成する酵素が発見され、そのほとんどは神経軸策が一つしかない、単極神経細胞であった。一方、複数の神経軸策を持つ多極神経細胞には、NOSの存在は確認できなかった。このことから、腸管神経叢ではNOの神経終末からの放出する神経は、主に単極神経細胞であり、これらの細胞は腸管壁平滑筋を抑制する運動神経であり、かつまた、腸管神経間のシナプス伝達を調節する機能も合わせ持つ可能があると考えられた。本年度では、水溶液中でNOを遊離する作用のあるSodium Nitroprusside(ソヂウムニトロブルシッド、以下Na-NPと略す。)を用いて、腸管神経系のアウエルバッハ神経細胞でのシナプス電位に対するNOの作用を検討した。Fast EPSPはアセチルコリンによるシナプス電位であるが、これは高濃度のNa-Npを投与しても変化が見られなかった。一方slow EPSPは、その伝達物質が未同定の興奮性シナプス電位であるが、これはNa-NPにより容量依存性に抑制された。さらにNa-NPによるslow EPSPの抑制は、酸化ヘモグロビンやメチレンブルーによって逆に拮抗された。このことからNa-NPによる抑制は、遊離されたNOによるものであり、NOは腸管神経系においては、非アドレナリン性非コリン性の興奮性シナプス伝達に選択的に作用すると考えられた。またNOは、サブスタンスP、セロトニン、フォルスコリンによるシナプス後膜の脱分極には変化を与えなかったことから、シナプス前終末に作用し、シナプス伝達物質の放出を抑制すると考えられた。
ミツバチのショ糖分解酵素のアロステリック性に関する反応速度論的解析

1.ミツバチ成虫から三種のαーグルコシダ-ゼ(HbGーI,HbGーII,HbGーIII)を精製した。同時に、ハチ蜜からもαーグルコシダ-ゼ(HbGーIII)を精製した。2.生体内における分布を免疫学的方法により検討した結果、HbGーIは中腸に、HbGーIIは血リンパと中腸に、HbGーIIIは下咽頭腺に局在していることを確認した。ハチ蜜から精製したHbGーIIIは体内から精製したHbGーIIIと免疫学的および酵素的にも同一であることが認められた。3.各αーグルコシダ-ゼについて様々な手法で解析を行ったところ、HbGーIおよびHbGーIIがアロステリックな挙動を示すことが認められた。両者は“履歴酵素"(秒、分単位の緩慢な立体構造変化を触媒時に生ずる酵素)である確認を得た。HbGーIIIはミカエリス-メンテン型の酵素であった。4.HbGーIIおよびHbGーIIIのサブサイト親和力を算出し、既に報告したHbGーIを含む三者間で比較した。いずれも第4サブサイト以降の親和力が負の値を示した。この傾向はHbGーIIIが最も顕著であった。5.諸性質、基質特異性および免疫化学的性質からハチミツαーグルコシダ-ゼはHbGーIIIと同一の酵素であることが判明した。HbGーIIIは下咽頭腺に存在することからミツバチが採集する花蜜中に分泌され、その主成分であるショ糖の分解を行うことにより、ハツミツ生成に直接関与する酵素であることが示唆された。両酵素はショ糖に対し、高い分解活性を有している。1.ミツバチ成虫から三種のαーグルコシダ-ゼ(HbGーI,HbGII,HbGーIII)を精製した。同時に、ハチ蜜からもαーグルコシダ-ゼ(HbgーIII)を精製した。2.生体内における分布を免疫学的法により検討した結果、HbGーIは中腸に、HbGーIIは血リンパと中腸に、HbGーIIIは下咽頭腺に局在していることを確認した。ハチ蜜から精製したHbGーIIIは体内から精製したHbGーIIIと免疫学的および酵素的にも同一であり、本質的には同一酵素と推定されたが、分子量にわずかな差が認められた。3.これらのαーグルコシダ-ゼについてそのアロステリック性を検討した。いずれの酵素もモノメリックな酵素であるが、HbGーIは正負の協同性を、HbGーIIは正の協同性をHbGーIIIは全く協同性を示さなかった。4.反応速度論的方法により触媒活性に直接関与している活性解離基を検討した結果、酸性側の解離基はーCOO^ー、アルカリ側の解離基はーCOOHと推定された。しかし、DEPCを用いた化学修飾による結果は、ヒスチジンのイミダゾ-ル基も触媒活性に関与していることが推定された。5.これらの三種のαーグリコシダ-ゼはともに高い糖転移能を有する。(1)ミツバチ成虫から精製した三種のαーグルコシダ-ゼ(HbGーI,II,III)のうち、HbGーIIIの基質特異性を解析した。(2)各αーグルコシダ-ゼについて様々な手法で解析を行なったところ、HbGーIおよびHbGーIIがアロステリックな挙動を示すことが認められた。HbGーIIIはミカエリスーメンテン型の酵素であった。

(3)HbGーIIおよびHbGーIIIのサブサイト親和力を算出し、既に報告したHbGーIを含む三者間で比較した。いずれも第4サブサイト以降の親和力が負の値を示した。この傾向はHbGーIIIが最も顕著であった。(4)HbGーIIIおよびハチミツαーグルコシダ-ゼのN末端側よりそれぞれ約35および25アミノ酸残基の配列を決定した。両配列は高い相同性を示すが、同一のものではなかった。HbGーIおよびHbGーIIIはN末端αアミノ基が修飾されていた。一方、親和標識試薬を用いてHbGーIの触媒部位の一次構造を解析した。(5)諸性質、基質特異性および免疫化学的性質からハチミツαーグルコシダ-ゼはHbGーIIIと同一の酵素であることが判明した。HbGーIIIは下咽頭腺に存在することからミツバチが採集する花蜜中に分泌され、その主成分である蔗糖の分解を行うことにより、ハチミツ生成に直接関与する酵素であることが示唆された。両酵素は蔗糖に対し、高い分解活性を有している。
炎症性骨破壊におけるtoll-like receptorの生理的役割の解明

破骨細胞の分化制御因子の同定とその機能解析は、炎症性骨疾患の治療方法の開発に役立つ。我々は、破骨細胞の分化過程における遺伝子発現の変化を網羅的に解析し、signal transducers and activators of transcription(STAT) 5という転写因子が破骨細胞分化を抑制する可能性を見出した。現在、論文投稿の準備中で、これらの成果は今後の骨代謝研究や炎症性骨疾患などの医療の発展に貢献すると期待される。歯周病や関節リウマチなどの炎症性骨疾患は、持続した炎症によって骨組織破壊が生じ、最終には歯牙の損失や関節機能が破綻するなど、患者のQOLを著しく損ねる。このように、炎症と骨吸収は密接に関わっており、歯周組織や関節のさまざまな細胞やサイトカインを介した複雑なメカニズムによって制御されていることが知られている。細菌の構成成分であるLipopolysaccharide(LPS)はToll-like receptor 4 (TLR4)に直接結合し、炎症や自然免疫を引き起こすことが知られており[Akira S., etal.Nat Immunol.2 : 675-680(2001)]、これまで、LPSやTLRによる炎症性骨破壊の発症メカニズムについて、多くの研究が報告されている。平成22年度は、TLRシグナルの骨吸収における役割を明らかにするため、破骨細胞の分化課程における遺伝子発現変化を網羅的に解析した。まず、マクロファージを破骨細胞分化誘導因子であるRANKLで刺激し、0、24、72時間後の細胞からRNAを調整しマイクロアレイを行った。TLRシグナルの下流の分子に着目して解析を行った結果、転写因子interferon regulatoryfactor 5 (IRF5)の発現が経時的に減少することがわかった。そこで、IRF5強制発現ベクターを構築し、レトロウイルスでマクロファージに強制発現させたが、破骨細胞形成が顕著に抑制されることはなかった。そこで、以前Zhao B.らによって報告された結果をもとに、破骨細胞分化を負に制御している転写因子IRF8の発現を制御している因子群の挙動について、再検討を行った。その結果、転写因子STAT5がIRF8の発現を制御していることが示唆された。現在、マクロファージにSTAT5を強制発現させる、あるいはSTAT5 siRNAで発現抑制させたとき、破骨細胞分化がどのように変化するか検討している。歯周病や関節リウマチなどの炎症性骨疾患は、持続した炎症によって骨組織破壊が生じ、最終的には歯牙の損失や関節機能が破綻するなど、患者のQOLを著しく損ねる。このように、炎症と骨吸収は密接に関わっており、歯周組織や関節のさまざまな細胞やサイトカインを介した複雑なメカニズムによって制御されていることが知られているが、詳細なメカニズムはいまだ不明な点が多い。そこで本研究では、骨吸収能を担う破骨細胞の分化を制御する因子を探索し、その機能解析を行い、炎症性骨破壊のメカニズムの一端を解明することとした。単球・マクロファージは破骨細胞と樹状細胞の共通の前駆細胞で、RANKLというサイトカインで刺激すると破骨細胞へ分化し、GM-CSFというサイトカインで刺激すると樹状細胞へと分化する。共通の前駆細胞からそれぞれの細胞へ分化が振り分けられており、この分化過程における遺伝子発現変化をマイクロアレイを用いて網羅的に解析した。このとき、Zhao B.らによって転写因子IRF8が破骨細胞分化を負に制御していることが報告され(Nature Medicine 15:1066-1071, 2009)、この結果を基に、IRF8の発現を制御している因子群の挙動について、さらに検討した。その中で、破骨細胞分化過程で発現変化が見られた因子で、樹状細胞の分化に必須の転写因子であるSTAT5が有力な候補因子として挙げられた。以前、転写因子STAT5がIRF8の発現を制御していることが報告されたことから、マクロファージにSTAT5を強制発現させる、あるいはSTAT5特異的阻害剤やSTAT5 siRNAでマクロファージでのSTAT5の発現を抑制させたとき、破骨細胞分化がどのように変化するか検討した。その結果、STAT5は破骨細胞分化を負に制御していることが示唆された。今後、更なる解析を行い、STAT5がどのように骨代謝を関与しているか解析を行う。
突発性発疹再罹患とHHV-6およびHHV-7との関連に関する研究

母親が成人T細胞白血病ウイルス(HTLV-I)のキャリアであるために生後3か月から24か月まで定期的(3か月、6か月、9か月、12か月、18か月、24か月)にHTLV-I抗体検査を受け、その際の血清が保存されていた人工栄養の小児12例のHHV-6抗体、HHV-7抗体を測定した。HHV-6抗体の陽転時期は、36か月3例、69か月3例、912か月5例であり、24か月まで抗体陰性であった1例を除き全て12か月まで抗体陽転していた。このことは、12か月以降はHHV-6初感染例が少なく、この時期の突発性発疹症例にはHHV-6以外のウイルスが関与していることを示唆している。また、人工栄養の小児の12か月でのHHV-6抗体陽性率92%(11/12)は一般小児集団の12か月での抗体陽性率とほぼ同じであり、母乳がHHV-6の主要な感染経路ではないことを示している。一方、HHV-7抗体については、24か月までに陽転がみられたのは3例のみで、3例とも陽転時期は12か月24か月であった。このことより、HHV-7は12か月以前の突発性発疹よりも12か月以降の突発性発疹に関与していると考えられる。12か月以降の突発性発疹に再罹患例が多いことから、突発性発疹再罹患とHHV-7との関連が縦断的調査でも間接的に示されたことになる。なお、今回の検討ではHHV-6より先にHHV-7に感染したケースはなかった。
中国の地域開発戦略は有効か?-ハーシュマンの分極効果と浸透効果の観点から

本研究では,中国の地域格差が注目される中で,政府が実施している地域開発戦略が有効かどうか,分極効果と浸透効果の観点から計量的に明らかにしようとするものである。中国の31省地域間産業連関モデルを構築し,分析した結果,中国では分極効果よりも浸透効果が上回るようになってきた。実際, 2008年に実施された4兆元の財政支出の効果をシミュレートしてみても,浸透効果のために格差は縮小する可能性が高い。本研究の目的は,中国の地域開発政策が地域格差縮小にどれだけ貢献できたかを,労働を考慮した地域間産業連関モデルによって計測することにある。平成21年度は,8月と2月に現地調査(北京)を実施した。8月には国家信息中心とともにモデルやデータについて意見交換した。労働を考慮する産業連関モデル設計のアイデアは理解していただいたが,2地域間モデルにしか適用できない,労働のデータ収集が難しいという意見をもらった。2月には社会科学院経済研究所等で地域開発戦略の概要についてヒアリングをおこなった。現在は地域政策が都市圏レベルでの実行に変化してきている。各種地域政策をシミュレーションすることになれば,地域区分をできるだけ詳細に行う必要がある。モデル推計の要であるデータ収集については,各地域の産業連関表を収集した。2002年度については公開されており収集できたが,2007年度は全国表のみ入手できた。今後の公開可能性によっては全国表から地域表を推計する必要がある。その他の関連データ(GDP,生産額)は順調に整理・入力がすすんでいる。地域間交易係数では,距離データの収集加工が進められており,外生変数については部門数を小さくすれば問題ないことが判明している。今後部門数の設定によってデータ収集が困難になるかもしれない。地域開発戦略に関する文献についても英文,和文,中文について収集を行った。ほぼ関連文献はサーベイが完了したと言えるであろう。今後は,実際のモデル推計,開発戦略の数量化という課題に取り組むことになる。平成22年度は,8月に現地調査(上海)と3月に現地調査(大連、武漢、上海)を実施した。8月には上海復旦大学において地域開発政策と格差に関する分析手法について意見交換した。藩剣勇教授(上海復旦大学)からは、製造業集積拠点の中小都市において沿海地域では土地がなくなってきたこと、内陸部では中小都市に開発区として企業を誘致する土地があるために製造業集積の構造が変化してきていることが紹介された。3月の現地調査では、東北振興では資源枯渇型都市、旧工業都市の再工業化がテーマになっていること、中部崛起では武漢都市圏のように都市による空間的な地域開発の牽引が期待されていることがわかった。上記のような中国の地域開発政策をフォローするとともに、地域間産業連関モデルを構築した。現時点では2007年を対象にして1部門31省で推計を行った。地域間交易の推計では、確率変数を用いて推計するもの、グラビティモデルから距離のべき乗関数として推計する方法などを用いて試作した。その成果については2010年12月に応用地域学会で報告するとともに,いただいたコメントを元に同学会誌に投稿している。最終年度である今年度は,モデル推計の精度を高めるとともに,開発戦略の数量化及びその地域格差に関する貢献度などハーシュマンの浸透・分極効果という観点から実証分析に取り組むことになる。最終年度である平成23年度は,暫定的な地域間産業連関表とその分析結果を作成した。9月にはその結果をもって,ロンドン大学とOECDの専門家と意見交換するとともに,10月日本地域学会,12月応用地域学会にて報告,発表した。昨年度作成した地域間産業連関モデルは2007年を対象にして1部門31省で推計を行った。今回は昨年度の研究成果を用いて,地域間距離の推計を再度行うと共に3部門の地域技術系数を推計して,3部門31省の地域間産業連関モデルを構築した。また地域間交通網の発展データを用いて1987年,1992年,1997年,2002年,2007年の5時点の中国地域間産業連関データベースを作成した。この地域間産業連関データベースを用いて,中国の地域開発をハーシュマンの浸透効果と分極効果の考えを利用しながら分析を行なった。とくにネットワーク分析において,広東,江蘇,浙江,山東が中核地域であることがわかり,その上内陸部においても湖北省や四川省は中核地域として存在が増していることがわかった。生産波及効果や雇用波及効果においても中核地域から周辺地域への浸透効果は分極効果は上回っており,生産と雇用の面で地域間格差の縮小が観察された。

付加価値の仮想交易についての推計では,世界システム論のウォーラーステインが指摘するような周辺地域から中核地域への付加価値移転が見られるが,時系列でみてみるとその移転量は減少している。ここから,中国の地域開発政策は地域格差縮小に貢献していることがわかったのである。以上の研究成果は過去の研究成果と合わせて平成24年度に単著として公開する予定である。
粗さ測定における対象の多様化と測定の迅速化のための光スキッド法に関する研究

光スキッド式粗さ測定用センサを実現するためち、2つのタイプの方法でセンサを構成した。一つは半導体レーザをコリメートした光源からのビームを2本に分け、それぞれの対物レンズ系で試料面上と試料面より離れた位置に合焦させる構造である。もう一つは、対物レンズをアクチュエータで振動させて、試料面上で合焦した瞬間と、試料面から一定距離だけ離れた瞬間とを捉える構造である。いずれの場合も、試料面で合焦するのが光スタライス、試料面から離れた位置で合焦するスポットが光スキッドの役目を担う。後者は試料面上で100倍以上前者より大きくなり、粗さ成分を平滑する。研究の結果、光スタイラスと光スキッドの両方を一つの対物レンズで実現できること、両方とも測定範囲の1/1000以上の分解能をもつこと、光スキッドが実際に一般的な粗さ面の空間周波数を平滑できること、しかし、解析格子のような規則的な変化をする面形状については単純な平滑フイルタとして働かないこと、スキッド法が外乱として混入する振動の影響を20dB以上低下すくことができること、などを実証することが出来た。しかし、2つの試作機は、両者共存学系の構造が複雑でその調整が難しく、当初の目標の分解能10nmを達成できなかった。これは、測定範囲を100μmと大きく欲張って設計したこと、センサとしてのコンバクト化を狙ったため部品の組み立て精度が十分で上げられなかったことなど、基本設計の不完全さに原因があること判明している。今後この難点を改良した2号機を試作して、実用に耐えるスキッド式あらさセンサを完成させるべく準備中である。
統合失調症モデルとしてのオリゴデンドロサイト障害マウスの検討

統合失調症の発症にオリゴデンドロサイトの障害が関与するかを検討するために、オリゴデンドロサイトの分化に重要なOlig2に注目した。幼若期の臨界期にのみOlig2の発現量を減弱させることのできるトランスジェニックマウスを用いて実験を行った。行動実験では明らかな有意差はみられず、ウェスタンブロットにおいても有意な差を認めなかった。問題点として、本実験系においてはトランスジェニックマウスにおける組み換えが十分に起こっていない点が考えられた統合失調症の発症にオリゴデンドロサイトの障害が関与するかを検討するために、オリゴデンドロサイトの分化に重要なOlig2に注目した。幼若期の臨界期にのみOlig2の発現量を減弱させる下記のトランスジェニックマウスを用いた。幼若期の臨界期に特異的にOlig2の発現量を減弱させるために、転写因子Olig2のプロモーター下流にタモキシフェン(TM)依存性Creリコンビナーゼが配置された“Olig2-CreERTMマウス"と、CAGプロモーター下流にCreリコンビナーゼ反応性配列loxPとdiphtheria toxin A(DTA)が配置された“CAG-loxP-DTAマウス"を交配させたダブルトランスジェニックマウス(Olig2発現細胞特異的細胞死誘導マウス)を用いて研究を行った。このOlig2発現細胞特異的細胞死誘導マウスの生後7日目(P7)からP14に、タモキシフェン(100mg/kg)を1日2回腹腔内投与し、コントロール群にはPBSを腹腔内投与し、その後、P28及びP70に行動実験(オープンフィールドテスト、モリス水迷路テスト)を行った。行動実験終了後、脳を摘出し、前頭葉、海馬のオリゴデンドロサイト関連因子(MBP、Olig2、NG2、SOX10)の発現量を免疫染色法、ウェスタンブロット法により測定した。問題点として、本実験系においてはトランスジェニックマウスにおける組み換えが十分に起こっていない点が考えられた。今後は十分に組み換えを起こし、Olig2を減弱させる方法を検討し、再度、統合失調症とオリゴデンドロサイトの障害との関係について検討していきたいと考えている。問題点として、本実験系においてはトランスジェニックマウスにおける組み換えが十分に起こっていない点が考えられた幼若期の臨界期に特異的にOlig2の発現量を減弱させるために、転写因子Olig2のプロモーター下流にタモキシフェン(TM)依存性Creリコンビナーゼが配置された"Olig2-CreERTMマウス"と、CAGプロモーター下流にCreリコンビナーゼ反応性配列loxPとdiphtheria toxin A(DTA)が配置された"CAG-loxP-DTAマウス"を交配させたダブルトランスジェニックマウス(Olig2発現細胞特異的細胞死誘導マウス)を用いて研究を行っている。このOlig2発現細胞特異的細胞死誘導マウスの生後7日目(P7)からP14に、タモキシフェン(100mg/kg)を1日2回腹腔内投与する。コントロール群にはPBSを腹腔内投与する。その後、P28及びP70に行動実験(オープンフィールドテスト、モリス水迷路テスト)を行った。行動実験では明らかな有意差はみられず、免疫染色およびウェスタンブロットに関しては検討中である。免疫染色およびウェスタンブロットに関しては、オリゴデンドロサイト関連因子の抗体がうまく機能していないと考えられる。また、鳥取大学に異動となり、研究室の再整備が必要となり研究の進行が遅れていると考えている。免疫染色およびウェスタンブロットに関しては、オリゴデンドロサイト関連因子の抗体を変更して再度行っていく。行動実験についても個体数を増やして検討する。オリゴデンドロサイト関連因子の抗体は、平成23年度に使用したものとは別のものを購入する。行動実験に関して、高架式十字迷路テスト・パッシブアボイダンステストを行うために機材を購入する。また、鳥取大学に異動となり研究の進行が遅れたこともあり、次年度への繰越金が発生した。
HGF(肝細胞増殖因子)の大量発現法ならびに高感度イムノアッセイ法の確立

HGF(肝細胞増殖因子)は成熟肝細胞をはじめ多くの上皮系細胞の増殖、運動性、形態形成を促す因子で、1989年私達はHGFのcDNAクローニングに成功し、世界に先駆けて全一次構造を解明した。HGFは発見当初から長らく実体の不明であった肝再生因子の本体と考えられてきたが、私達は最近HGFが腎再生因子としても機能することを見い出した。本研究はHGFの大量発現法ならびに高感度イムノアッセイ法の確立を主たる目的として行なわれ、研究期間内に以下ような成果を得て、当初の目的を十分達成することができた。(1)ヒトHGFcDNAを含む発現ベクターを培養細胞に導入し、10mg/LのHGF産生株を樹立し、HGFの高発現法を確立した。(2)ヒトHGFに対するポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を作製し、ヒトHGFの高感度イムノアッセイ系を確立し0.1ng/ml以上のヒト血清中のHGF量を正確に測定することを可能にした。(3)ラットリコンビナントHGFの大量発現法を開発するとともに、ラットHGFに対するポリクローナル抗体を作製し、ELISA法による高感度アッセイ法を確立した。(4)肝炎、肝癌切除、腎癌、急性腎不全、肺炎、肺癌など様々な臓器疾患をもつ患者血清中のHGFレベルは健常人に比べ著しく増加していること、血清HGFレベルを示標に病態の予後の判定が可能であることなどを明らかにした。(5)様々な肝傷害、腎傷害を引き起こした実験動物にリコンビナントHGFを投与し、HGFがin vivoで強力な肝再生因子、腎再生因子として機能することを実証した。以上の研究成果はいずれもHGFが種々の肝疾患、腎疾患に対する有効な治療薬、診断薬となり得ることを示している。今後、各種臓器疾患モデル動物を用いたHGFの投与実験、病態予後の判定を目的としたHGFレベルの詳細な検討を行なうことによって、HGFが様々な臓器疾患に対する治療薬、診断薬として利用され、臨床医学の分野に多大な貢献をするものと考えられる。1.HGFの大量発現法の開発:human HGF cDNAを発現ベクタ-に組み込み、このベクタ-をCHO細胞ならびにC127細胞に導入した後、高発現クロ-ンのスクリ-ニングを繰り返した。その結果、当初の目標であった20mg/1のHGFを産生する細胞株を得ることに成功した。2.human recombinant HGFに対するポリクロ-ナルおよびモノクロ-ナル抗体の調整:上記、HGFを高発現している細胞の培養上清を回収し、イオン交換クロマトグラフィ-、ヘパリンアフィニティ-クロマトグラフィ-、疎水性クロマトグラフィ-、逆相HPLC等を組み合わせ、human recombinant HGFを精製した。精製HGFをマウスに投与した後、このマウス脾臓からリンパ球を調整し、マウスミエロ-マ細胞(SP2/0)との細胞融合を行った。HGFに対する抗体を産生しているハイブリド-マをスクリ-ニング後、ハイブリド-マをクロ-ン化し、これらハイブリド-マ培養上清中ならびに腹水中よりモノクロ-ナル抗体を調整した。3.ELISA法による高感度イムノアッセイ法の確率:上記、抗HGFポリクロ-ナル抗体ならびに抗HGFモノクロ-ナル抗体を用いて、サンドイッチ法によるELISA系(酵素抗体法)確率の検討を行った。

その結果今回確立したELISA法によって、0.120ng/mlのhuman HGFを高感度で測定することが可能となった。当初の予定どおり、来年度においてhuman HGFの高感度ELISA系を確立することができた。来年度において種々の肝疾患、腎疾患とHGFの動態、実験動物を用いた、実験的肝傷害、腎傷害に対するHGFのin vivoでの作用を検討する上で、上記イムノアッセイ系は有力なツ-ルとなると考えられる。HGF(肝細胞増殖因子)は成熟肝細胞をはじめ多くの上皮細胞を標的とする増殖因子で、1989年私達はHGFのcDNAクローニングに成功し、世界に先駆けて全一次構造を解明した。HGFは発見当初から実体の不明であった肝再生因子の本体であると考えられてきたが、私達はHGFが賢再生因子としても機能することを見い出した。本研究はHGFの大量発現法ならびに高感度イムノアッセイ法の確立を主たる目的として行なわれたが平成4年度においては以下の成果が得られた。まず、遺伝子工学的手法を用いてラットHGFの大量発現法を開発し、ラットHGFに対するポリクローナル抗体を作製し、ラットHGFの高感度ELISA系を確立した。また、実験的に様々な肝傷害あるいは賢傷害を引き起こしたマウスにヒトリコンビナントHGFを尾静脈より投与したところ、HGFが肝再生ならびに賢再生を著しく促進することが明らかになり、HGFがin vivoで肝再生因子、賢再生因子として機能することを実証した。しかもHGFはα-naphtylisothio-cyanateによって引き起こされる急性の肝炎を抑え、肝機能を維持する抗肝炎作用があることが明らかになった。また、HGFによる肝再生の促進作用をビーグル犬を用いた実験系においても実証した。次に本研究において確立したHGFの高感度ELISA法を用いて、肝炎、肝癌切除、賢癌、急性腎不全、肺炎、肺癌などの患者血清中のHGFレベルを測定したところ、これら種々の臓器疾患においてHGFレベルが著しく増加していることが明らかになった。以上の研究成果はいずれもHGFが種々の肝疾患、腎疾患さらには胚疾患等に対する有効な治療薬、診断薬となりうることを示している。今後、各種臓器疾患モデル動物を用いたHGFの投与実験、病態予後の判定を目的としたHGFレベルの詳細な検討を行なうことによって、HGFが治療薬、診断薬として利用され、臨床医学の分野に多大な貢献をするものと考えられる。