hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
黒毛和種ゲノムDNAメチル化多型と脂肪交雑との関係に関する研究

高能力種雄牛の産子計200頭の腎周囲脂肪由来ゲノムDNAを供試した。脂肪組織内のDNAメチル化割合を算出した。また,DNAメチル化割合の結果と枝肉成績との相関解析を行った。その結果,種雄牛Aが子,種雄牛Bが父という親子関係にある高能力種雄牛であり,それらの産子における34種類の遺伝子上流域の高メチル化割合の傾向は類似している傾向にあったが,数種の特徴的な遺伝子上流域が明らかとなった。種雄牛AおよびB間で比較すると,Aの方の産子の枝肉成績が良いことが知られており,CHFRの高メチル化割合との関係性が強いと推察された。本年は、初年度計画の黒毛和種牛肉由来ゲノムDNAの高メチル化領域をメチル化アレイ解析に供する前の基礎的検討として、特に家系を考慮しない無作為の霜降り度が異なる黒毛和種牛肉ロース芯部間由来ゲノムDNAに関して高メチル化領域におけるメチル化度に差異がある特異領域の検出をMS-RDA法によって試みた。日本格付協会によるA5ランクおよびA3ランク以下の2群由来のゲノミックDNAを供して、それらの高メチル化領域のメチル化度に差異があると仮定し、それぞれメチル化感受型制限酵素(HaeII)で消化し混合後、特異アダプターを付加してMung Bean Nuclease処理を行った。その他、プロトコルに従い、特異シグナルを電気泳動後に切り出して精製、それらのサンプルをさらにPCR増幅と繰り返すことで特異が濃縮出来、クリアになった段階で塩基配列を調査しNCBI Webサイトからデーターベース照合を行った。検索結果と機能的に関連のある候補遺伝子について、リアルタイムPCR法を用いてmRNA発現量を検討した。また、それぞれの組織中タンパク質発現量を蛍光免疫染色法により調査した。格付けの異なる両牛肉由来ゲノムDNA間でメチル化度に差異がある特異領域が検出できた。データーベース照合の結果、相同性が高いプロモーター領域がみつかり、それによって制御されている遺伝子はアルギニノコハク酸合成酵素とアンドロゲン結合タンパク質の2つを候補遺伝子とできた。候補遺伝子のmRNA発現量と組織中タンパク質発現量について調査した所、A3ランク以下の牛肉のアルギニノコハク酸合成酵素が有意に高く発現していた。細胞由来のゲノムDNAの状態が悪いため、一部の実験が進んでいない。H28年度においてはそれらの再実験を実施し、H27年度の計画を補完する。しかしながら、当初の結果を推察できる結果が得られている。宮城県畜産試験場より提供された宮城県基幹種雄牛産子である24ヶ月早期肥育試験に供された黒毛和種枝肉A5およびA2A3ランクの枝肉100頭分からゲノムDNAをキアゲンのキットで抽出した後に,メチル化チップ解析を実施した。委託結果より,大きな差異のみられた約5000領域から,統計的に有意な領域250領域に絞り,クラスター解析を行った。さらに,DNAメチレーションサブトラクション法(MSRDA法)およびバイオインフォマティクス解析によりメチル化に差異のある領域の絞り込みを試みた。また,前述のA5およびA3ランクの黒毛和種の血液および脂肪組織から,前者はキアゲン,後者はニッポンジーンおよびタカラバイオのキットを用いてゲノムDNAを抽出し,バイサルファイトシーケンシング(キアゲン)によるDNAメチル化サイトパターン解析を行った。さらには,牛筋肉内脂肪前駆細胞株(以下,BIP細胞)における遺伝子発現解析を行った。ヒトゲノムでエピジェネティクス機構の影響を受けるとされる62万領域のCpG領域のうち,統計的解析により5000領域まで,さらには250領域まで絞り込みを行ったところ,明瞭なメチル化の差異を確認することが出来ただけでなく,クラスター解析により有意な関係性のある遺伝子群まで絞り込むことが出来た。また,格付間のメチル化度に差異のある領域からASS1遺伝子のプロモーター領域を絞り込むことが出来た。そして,ASS1遺伝子が脂肪細胞への分化初期と脂肪蓄積に関与し,結果的にしもふり形成に貢献しているという結果から,しもふり形成に関わる一部の遺伝子は,エピジェネティクスなメカニズムを介するということと,正確かつ効率的な改良の促進には,環境と遺伝子の相互作用に関する情報の取り込みが重要であることが推察された。一部のDMAサンプルの精製状態が悪く、バイサルファイト反応がうまく進んでいない可能性がある。結果的に、きれいなシーケンスデータが得られずに苦慮してきた。しかしながら、改善策を試み、次年度で予定の解析まで追いつく見込みである。主たる研究目的は、牛肉由来ゲノムDNAのメチル化多型と脂肪交雑との相関性について、家系間や格付け間、部位間を中心に調査し、関係性の強いゲノム領域を特定することを主な目的とした。先ずは、黒毛和種筋肉内脂肪前駆細胞(BIP細胞)を供試しメチル化ビーズアレイ解析(メチル化チップ解析)によって約800,000領域のメチル化領域を検出できた。その800,000領域の内、プロモーター領域にあるCpGアイランド数は183,815領域あることが推定された。牛の遺伝子数が30,000から40,000とすると単純計算で1遺伝子当たり平均4から6か所のメチル化領域を持ち制御されていることが概ねで推察された。次に、メチル化差異のある領域を検出するサブトラクション法であるMS-RDA法を用いて、格付間で比較した所、特にASS1遺伝子のプロモーター領域にメチル化度に差異があるように特異的に検出できた。

その領域について、脂肪組織由来のゲノムに関しても格付間で比較した所、メチル化多型が確認された。続いて、ヒトゲノムでメチル化の影響を受けることが明らかにされている32領域に関するPromoter qPCRArray解析を試み、メチル化度と理化学特性等との相関解析を行った結果、肉質や食感に関わる要素とBRCA1、LOXのプロモーター領域のメチル化度との間で、有意な負の相関が認められた。特に、LOX遺伝子のプロモーター領域のメチル化度は、牛肉由来ゲノムDNAにおいてメチル化度が高く、このことは生体内でリジン6オキシダーゼ発現が抑制される傾向にあることを示しており、リジン代謝が促進され、脂肪蓄積能が高いということが推察された。以上のことから概ね主たる目的を達成でき、黒毛和種において肉質や食感に関わる脂肪交雑と関係性の深いメチル化領域の候補を見出せたと考えている。高能力種雄牛の産子計200頭の腎周囲脂肪由来ゲノムDNAを供試した。脂肪組織内のDNAメチル化割合を算出した。また,DNAメチル化割合の結果と枝肉成績との相関解析を行った。その結果,種雄牛Aが子,種雄牛Bが父という親子関係にある高能力種雄牛であり,それらの産子における34種類の遺伝子上流域の高メチル化割合の傾向は類似している傾向にあったが,数種の特徴的な遺伝子上流域が明らかとなった。種雄牛AおよびB間で比較すると,Aの方の産子の枝肉成績が良いことが知られており,CHFRの高メチル化割合との関係性が強いと推察された。1メチル化チップ(ヒト)を用いた宮城県基幹種雄牛枝肉由来ゲノムDNAにおけるメチル化解析を行い脂肪交雑との相関解析を実施する。2Promoter qPCR Array解析を特に宮城県基幹種雄牛由来ゲノムDNAを供して実施し、高低メチル化DNAを分取、リアルタイムqPCR法によるメチル化割合(%)を予測して種雄牛内・間で枝肉形質との相関解析を行う。31及び2のゲノムDNAについてRLGS法に供し特異メチル化領域を探索する。最終年においては、平成27年度28年度までの結果を踏まえ、さらに不十分な部分を再現性をとりながらデータを加える。また、平成29年度においては、再度、ウシ脂肪前駆細胞を用いた脂肪細胞分化と候補遺伝子群の発現動態の調査をメチル化チップで再検証し、絞り込んだ候補遺伝子群およびメチル化領域の細胞分化ステージにおける発現動態をリアルタイムPCR法で調査する。さらには、胚および若齢期ゲノムDNAメチル化多型と成長後の多型比較による相関解析を実施し、表現型に見られる特徴を検証する。特に、1胚性ゲノムDNAの候補遺伝子プロモーター領域のメチル化多型と枝肉成績との関係、2若齢期個体(5カ月齢)の候補遺伝子プロモーター領域メチル化多型と枝肉成績との関係、3肥育後(26ヶ月齢)の候補遺伝子プロモーター領域のメチル化多型と枝肉成績との関係をそれぞれ検証する。最後に、シミュレーションデータを用いて、ゲノムメチル化多型効果を数学モデルに反映した遺伝パラメータ推定(遺伝率および育種化)を試みて、現行モデルとの正確度を比較する。以上の実験を、最優先で検討していく。概ねのサンプリングは終了していくことから、精力的に進めていく。
ダイヤ分子凝集相の電子機能開拓

ダイヤモンドの結晶構造に特徴的な炭素のカゴ型クラスターを骨格にもつ化合物群「ダイヤ分子」は、バルク・ダイヤモンドの優れた物理的特性を受け継ぎつつ、ナノのサイズや特徴的な形状、高い対称性に起因した付加的電子機能を発現する可能性を秘めた新しい炭素系ナノテク素材である。全ての種類のダイヤ分子が室温で固体状態に凝集していることに我々は着目し、その結晶相に特有な新奇物性・電子機能の開拓に、実験と理論計算の双方から取り組んだ。研究の前半では、水素終端されたダイヤ分子を対象に詳細な研究を行った。光学応用に有用な性質として、バルク・ダイヤモンドの間接遷移型バンドギャップがダイヤ分子結晶では直接遷移型になりギャップ値もケージ数で系統的に変化すること、高周波用の低損失な絶縁材料の可能性として誘電率がダイヤモンドに比べて半減すること、ダイヤ分子結晶が紫外光を吸収して蛍光する性質をもつことなどを見出した。また、実験検証の出発点として、ダイヤ分子を高度に精製し大型で純良な単結晶に合成する手法も確立した。後半では、終端水素の化学置換により双極子モーメントを持つようになった「極性ダイヤ分子」を対象として、新たな研究展開を狙った取り組みを行った。ケトン化およびハロゲン化されたケージ数が1つと2つのダイヤ分子について、単離精製・単結晶化して基礎物性の実験的評価を行うと共に、分子単体および結晶相について第一原理計算による物性予測を進めた。誘電率の温度依存性において、結晶中の分子回転に起因する転移を反映した誘電異常の観測に成功した。これにより、回転のエネルギー障壁や異方性を制御・設計することにより、室温での強誘電性や非線形光学効果などの実現を目指す新たな研究の方向性を示すこともできた。24年度が最終年度であるため、記入しない。石油から抽出できる炭素系ナノテク新素材のダイヤ分子について、ナノサイズ・立体形状・対称性に着目しながら、ダイヤ分子の凝集相に特有で新奇な物性と電子機能を、固体物理化学的な実験と理論計算の連携によって開拓することに取り組んだ。4つまでのダイヤ・ケージ骨格をもつダイヤ分子について大型純良単結晶試料を育成し、それらを用いた光学特性の測定を行った。吸光スペクトルの測定を行ったところ、230nmよりも短い波長領域でわずかに光吸収のあることがわかった。実験に先立って行った第一原理計算から、ダイヤ分子の結晶相では、バルクのダイヤモンドでは間接遷移型であったバンド構造が直接遷移型に変化し、バンドギャップの値も6.3eV6.8eVをもつことを既に報告しているが、今回の実験結果はその予測と概ね一致するものであった。更に、光吸収による電子励起により、吸収波長よりも大きくレッドシフトした300nm付近で紫外発光(蛍光)することを見出した。光源の種類(ハロゲンランプ、レーザー)によらずに蛍光が観察されること、ダイヤ・ケージの数には蛍光特性が大きく依存しないことなどを確認した。フォトルミネッセンスが確認できたことにより、その延長線上にあるLEDなどのエレクトロルミネッセンスの実現に向けた研究にも弾みがつくことが期待される。ダイヤ分子は、無機EL材料と異なって高温での成膜プロセスを必要としないので、プラスティックなどのフレキシブルな基板上へのデバイス作製にも期待がもてる。また、既存の有機EL材料と異なって反応性の高い炭素2重結合などを含まないため、湿気や酸素で劣化する心配がない。つまり、ダイヤ分子を発光層に用いることで、無機材料と有機材料の両方の欠点を克服したフレキシブルで高寿命の発光素子を作れる可能性があるといえる。

研究成果を論文として専門誌に掲載し、その内容について新聞報道もなされるなど(2011年12月6日・日経産業新聞(10面))、成果の公表も順調に行えたことから。24年度が最終年度であるため、記入しない。セラミックス誌47号(p298)トピックス欄にて研究成果が紹介。純粋なダイヤ分子の結晶状態を対象として、素材そのものの持つ物性を多角的に検討することについては一定の研究成果をあげることができた。そこで今後は、分子自由度に着目したダイヤ分子の化学修飾や自己組織化などによる機能設計とその実証に関して重点的に取り組むこととする。
AML1およびPEBP2β遺伝子の点突然変異による白血病発症機構の解析

AML1は急性白血病で最も頻度の高い染色体転座点に位置し、白血病の発症に関与している。AML1は造血に関わる種々の分子の転写を調節する転写因子でrunt領域でPEBP2βとヘテロダイマーを形成すると同時にDNAへ結合する。我々は白血病細胞においてAML1遺伝子の点突然変異を見出した。本研究ではまず160例中8例に見出したAML1の点突然変異の機能解析を行なった。ミスセンス変異の3例ではDNA結合能の低下および転写活性化能の消失を認め、正常AML1の機能を抑制していることが明らかになった。ノンセンス変異の2例は両対立遺伝子ともにDNA結合能の低下、転写活性化能を認ず、AML1の機能を全く消失していた。次に、120例の急性白血病においてPEBP2β遺伝子の変異は見出されなかった。さらに、初期のスクリーニングにおいて高頻度にAML1遺伝子変異を検出したM0症例における検索を行なった。その結果、30例中6例に新たにAML1遺伝子変異を証明しえた。すなわち、AML1遺伝子変異はM0という病型との密接な相関が証明され白血病発症機構に強く関与していると考えられた。6例のAML1遺伝子変異はすべてrunt領域に集中し、欠失や挿入によりフレームシフトを来たす異常であった。DNA結合能や転写活性化能は現在検討中であるが、いずれもAML1機能消失を来たしてAML1 haploinsufficiencyとなっていると考えられる。高率に急性骨髄性白血病を併発する家族性血小板異常症の原因がAML1遺伝子のhaploinsufficiencyであることが1999年秋に報告された。このようにAML1遺伝子の点突然変異は白血病発症を来たしやすくする素因としてその発症機構に深く関与していることが明らかになった。本年度は白血病細胞に見いだしたAML1遺伝子の点突然変異クローンの機能解析を行った。160例中8例にAML1の点突然変異を見いだしたが、2例はサイレント変異で多形性と考えられた。残る6例はすべて骨髄性白血病で、すべてAML1のルント領域に点突然変異を認め、ミスセンス変異4例、ノンセンス変異2例であった。AML1は造血に関与する種々の分子の転写を調節する転写因子でルント領域でPEBP2β鎖とへテロダイマーを形成すると同時にDNAへ結合する。ミスセンス変異の3例ではDNA結合能の低下および転写活性化能の消失を認めた。さらに正常AML1を同時に存在させると濃度依存的にその転写活性化能を低下させ、正常AML1の機能を抑制していることが明らかになった。これらの症例では他にも染色体異常があり、再発や急性転化時にAML1の変異を認めたことから病気の進行に関与していると推察された。一方、ノンセンス変異の2例は両対立遺伝子ともにDNA結合能の低下、転写活性化能を認めない異常を呈し、AML1の機能が全く消失していることが明らかになった。このようにミスセンス、ノンセンス変異ともにAML1の機能消失を示し、白血病発症機構への関与はさらに解析を進める必要がある。これらのAMLl点突然変異は少なくともt(8;21)転座に由来するAML1/MTG8融合遺伝子のトランスジェニックマウスと同様AML1機能消失を呈することから発症の一段階を担っていると考えられた。本年度はまずPEBP2β遺伝子の変異の有無をPCR-SSCP法を用いて120例の急性白血病細胞において検索した。しかし、PEBP2β遺伝子の変異は見出されなかった。

次に、初期のAML1遺伝子変異のスクリーニングにおいて急性骨髄性白血病のうちFAB分類のM0という病型に9例中3例と高頻度にAML1遺伝子変異を検出したことから、病型との相関を検討する目的で全国の施設よりM0症例の検体を提供していただき、AML1遺伝子変異の検索を行なった。その結果、30例中6例に新たにAML1遺伝子変異を証明しえた。すなわち、AML1遺伝子変異は最も未分化な骨髄性白血病と言われるM0という病型に高頻度に認められ病型との極めて密接な相関が証明されたことから白血病発症機構に強く関与していると考えられた。新たにAML1遺伝子変異を見出した6例のM0症例はいずれもひとつのアリルの異常で対立遺伝子は野生型であった。6例のAML1遺伝子変異はすべてrunt領域に集中し、欠失や挿入によりフレームシフトを来たす異常であった。DNA結合能や転写活性化能は現在検討中であるが、いずれもAML1機能消失を来たしてAML1 haploinsufficiencyとなっていると考えられる。高率に急性骨髄性白血病を併発する家族制血小板異常症の原因がAML1遺伝子のhaploinsufficiencyであることが1999年秋に報告され、M0症例におけるAML1遺伝子の点突然変異も白血病発症を来たしやすくする素因としてその発症機構に深く関与していることが明らかになった。
菌状息肉症.ATLの発症予防・治療法確立の為のサイトカインを中心とした病態解析

T細胞の悪性腫瘍である菌状息肉症と皮膚型ATLとは時として、その臨床が極めて類似する。両者は病理組織学的にも免疫組織学的にも鑑別不能な場合があるがその決定的な相異はHTLV-1の関与の有無である。ATLではその腫瘍細胞に1L-2レセプターの恒常的発現の亢進がみられ、それにHTLV-1が関与している可能性が考えられている。今回、両者間に1L-2レセプターレベルでの相異があるかどうかを以下の方法で検討した。i)血清中の可溶性1L-2レセプターをELISA法でii)病変部に浮潤している腫瘍細胞表面の1L-2レセプターを免疫染色で、iii)PBMCのCell extractを用い可溶性1L-2レセプターをELISA法で、そしてiv)皮膚病変部よりRNAを抽出し、RT-PCR法にて、1L-2レセプター・mRNA検討した。結果としては、皮膚型ATLにおいて血清中可溶性1L-2レセプター、浮潤腫瘍細胞表面の1L-2レセプターそして1L-2レセプター・mRNAで有意の上昇がみとめられた。ATLの腫瘍化機序として1L-2・1L-2レセプター系によるオートクライン・パラクラインの増殖機構が考えられているが、この点より考えると、菌状息肉症での腫瘍化機序はATLのそれとは異なっている可能性が示唆される。1)ELISAにより血清中の可溶性IL-2Rαを測定したところ、c-ATLではtumor groupが17,200U/ml、non-tumor groupが2,900U/mlであり、MFではtumor groupが2,700U/ml、plaque groupが500U/mlとc-ATLが有意に高値を示した。2)皮膚病変部の浸潤細胞のうちIL-2Rα陽性細胞の占める割合はc-ATLではtumor groupが62%、non tumor groupが36%であり、MFではtumor groupが5.8%、plaque groupが14.2%とc-ATLで高値が認められた。さらに皮膚病変部でIL-2Rα陽性細胞の割合が高いもの程、可溶性IL-2Rが高値を示す傾向があり、両者には正の相関が認められた。3)c-ATLの皮膚病変部とMFのそれにおけるIL-2Rα・mRNAの発現をRF PCRで検討したところ、c-ATLにおいてより高値を示した。以上の結果より、IL-2Rαレベルにおいて両者間にはかなりの相異が認められた。近年、ATLの腫瘍化機序について、IL-2・IL-2R系にオートクライン・パラクラインによる増殖過程を経て腫瘍化へと進行する可能性が考えられているが、今回の結果より考えると、両者の腫瘍化機序は異なっている可能性が示唆された。Mycosis fungoides(MF)とCutaneous type ATL(C-ATL)とは、その臨床および病理所見が極めて類似することがある。両者を鑑別する決定的要因は、その腫瘍化機序にHTLV-Iの関与がある(c-ATL)か、ない(MF)かである。さて、ATL細胞には特定の刺激なしにIL-2Receptor(IL-2R)の発現があることが報告されており、近年はHTLV-IのpXgeneによりコードされるP40^<tux>がIL-2Rの転写を亢進させる可能性が示唆されている。以上の点に注目し、病初期におけるMF、c-ATL間におけるIL-2Rレベルでの相異を検討した。

前年度の研究の結果としては、皮膚病変部・浸潤細胞1のIL-2R、陽性率や血漿中可溶性IL-2R(sIL-2R)値がMFと比較し、c-ATLにおいて、有意に上昇していること、個々の患者において病変部のIL-2R陽性細胞数とsIL-2R値とは正の相関を示すことを、さらに末梢血中巣核細胞(PBMC)のIL-2Rは両疾患間で差のなかった(ともに正常値)ことより、病変部IL-2R陽性細胞数の上昇がsIL-2Rの上昇に関連していることを報告した。今年度は両疾患の初期病変部におけるIL-2R・RNAの発現をRT-PCR法を用いて検討した。HTLV-Iのmonoclonal integrationがあり、IL-2Rの発現が認められるMT-2 cell lineを用いてのスタンダードカーブを作成した。それによるIL-2R・RNAの半定量では、c-ATLにおいては、皮膚病変部1.0gあたり、MT-2細胞の873個に相等するIL-2R・RNAが存在しており、MFのそれでは100個以下のIL-2R・RNAしか存在しなかった。以上の結果より、タンパクおよび核酸レベルでも両疾患間にIL-2Rレベルでの相異があることが確認された。
サトイモ遺伝資源の分子遺伝学的解析・保全整備と耐病性育種素材の探索

サトイモ(Taro.Colocasia esculenta)は、熱帯から温帯にかけ広く、水田、畑地、山地などの栽培・生態環境に適し、特に環太平洋諸島などでは欠くことのできない作物である。しかしながら、多くの品種の減少が危惧され、多様性に富む品種資源に関する異分野横断型の総合研究は皆無と言えよう。本研究は、次世代に必要な農資源を継承していくためにA.遺伝資源の保全、B.遺伝資源としての品種特性などの分子遺伝学的解析、C.耐病性基盤研究、また、高齢化社会の食生活、幼児期の食の安全に欠かせない問題と考えD.栄養学、調理学的研究など基盤研究を行うことを目的としている。A.ゲノム配列が決定されていないサトイモにおいてDNAマーカーの作出法は限られており、多型検出が高い19のSSR(Simple Sequence Repeat)マーカーを用いて、日本の在来品種群を含む東南アジア、アフリカ、オセアニアなどの系統解析を行うと共に、葉緑体ゲノムマーカーを加え、日本在来種の祖先種の解析も開始した。B.タロイモの超低温保存法の1つであるガラス化法とクライオプレートを用いて、土垂品種の培養茎頂の超低温保存法の確立を試み結果、75%以上の高い生存率を得た。C.鹿児島の土壌より、H29年度に分離したFusarium solaniに加え、F. oxysporumも分離し、共にサトイモに病原性を示した。また、F.solaniが病原性が強い事を見出した。さらに、Trichoderma属菌(未同定)を鹿児島の土壌より分離した。D.サトイモの成分で品種間差が大きいのはタンパク質と食物繊維であり、同一の品種の親芋と子芋の成分を比較した結果、タンパク質は子芋が多い傾向があり、糖質はすべての品種で親芋の方が多い事が解った。A.サトイモ遺伝資源の系統整備:土垂、糖芋、黒軸、セレベス、蓮葉芋など117系統を選び、26SSRマーカーの内、多型が観察された19SSRマーカーにより得られたバンドパターンをARWIN software version 6 (Perrier 2003)を用いて、UPGMA法により系統樹を作製した。B.培養茎頂を用いた遺伝資源保存法の確立:イモから直接生えた芽から得た茎頂を茎頂培養により無菌で栽培した植物体からの茎頂を用いて、ガラス化法とクライオプレート法を試みた結果、大きく生存率が向上した。また、ガラス化の方法を改変し、PVS2(脱水)処理を2時間0度で行うことにより75%以上の生存率効率を得た。C.遺伝資源を活用した耐病性育種素材の探索:鹿児島県産の乾腐症状を示していたサトイモ塊茎から、選択培地などを用いて2株の糸状菌Fusarium oxysporumとF. solaniを分離し、塊茎を用いた両病原の接種系を確立した。又、人工汚染土壌を用いた接種系の確立を検討している。さらに、鹿児島土壌からTrichoderma属菌(未同定)を分離した。D.サトイモ遺伝資源の活用法の確立:サトイモ成分の品種間差異の検討した結果、品種間差異が大きいのはタンパク質と食物繊維であることが判明した。タンパク質はぬめりを構成する糖タンパク質として重要な成分であり,食物繊維の性質や含量も食感に影響を与える。さらに,同一品種の親イモと子イモの成分を比較すると,タンパク質は子イモで含量が高く,糖質は親イモの方が含量が高いことが判明した。サトイモ粉末の乾燥条件の検討した結果、乾燥条件の違いにより,ペーストの硬さ,付着性および凝集性は変化することが判明した。中でも,蒸し加熱後に乾燥した粉末で調製したパーストは,最もやわらかく,付着性が低く,凝集性が高かった。A.サトイモ遺伝資源の系統整備:SSRマーカーに葉緑体ゲノムマーカーを加え、日本在来種の祖先種の解析も開始すると共に、マーカー数を増やし、正確な系統解析を行う。また、各地域で栽培されている在来種などを収集し、病害抵抗性品種の選抜の材料とする。GRAS-Di法を用いて、病害抵抗性マーカーを作製しする準備を行い、病害抵抗性選抜育種に役立てる。B.培養茎頂を用いた遺伝資源保存法の確立:タロイモの超低温保存法の1つであるガラス化法とクライオプレートを用いて、土垂品種の培養茎頂の超低温保存法の確立を試み結果、75%以上の高い生存率を得たので、その他の品種においても開発した方法が有効か検証する。C.遺伝資源を活用した耐病性育種素材の探索:非病原性Fusarium oxysporumを用いて、F. solani、F. oxysporum両病害に対する生物防除試験を塊茎系および人工汚染土壌で実施する。平成30年度に鹿児島土壌から分離したTrichoderma属菌を用いた生物防除試験を塊茎系および人工汚染土壌で実施し、生物防除効果が見られたならば、このTrichoderma属菌の同定を行う。D.サトイモ遺伝資源の活用法の確立:一般成分分析からサトイモの品種間および親子間で成分含量の違いを検出したので、更に詳細な成分分析としてデンプンの特性、粘質物の特性を解明する。成分の違いから、各サトイモの品種に適した新規高齢者食・介護食の検討として、品種の異なるサトイモを乾燥後に粉末化し、パンや米飯、粥などの米加工品に添加する。サトイモ粉末無添加をコントロールとして、テクスチャー測定と官能評価を行い、高齢者食や介護食としての適性を検討する。

サトイモ(Taro.Colocasia esculenta)は、近年、熱帯アフリカ地域で急速に生産が進み、農資源の重要な農作物の地位にある。その栽培地域は、熱帯から温帯にかけ広く、水田、畑地、山地などの栽培・生態環境に適し、特に環太平洋諸島などでは欠くことのできない作物である。しかしながら、多くの品種の減少が危惧され、多様性に富む品種資源に関する異分野横断型の総合研究は皆無と言えよう。本研究は、次世代に必要な農資源を継承していくためにA.遺伝資源の保全(系統維持、茎頂保存、DNA票本)、B.遺伝資源としての品種特性などの分子遺伝学的解析、C.耐病性基盤研究、また、高齢化社会の食生活、幼児期の食の安全に欠かせない問題と考えD.栄養学、調理学的研究など詳細な基盤研究を行うことを目的としている。A.ゲノム配列が決定されていないサトイモにおいてDNAマーカーの作出法は限られており、多型検出が高い26のSSR(Simple Sequence Repeat)マーカーを用いて、日本の在来品種群を含む東南アジア、アフリカ、オセアニアなどの系統を解析している。B.タロイモの超低温保存法の1つであるガラス化法を用いて、培養茎頂の超低温保存法の確立を試みた。in vitroで栽培した幼苗の茎頂を用いてガラス化法による超低温保存は成功したが、生存率が低いため、冷却・加温率がよく再生率が非常に高いクライオプレート法を試みている。C.南九州で壊滅的被害を発生させている土壌病害の原因を明確にするため、病原の単離・同定を行った。鹿児島および宮崎の汚染土壌で栽培したサトイモから病原を分離し、単離した病原により乾腐病が再現された。D.サトイモの新たな加工方法や調理方法を確立する事を目的に、サトイモの物性測定した結果、サトイモと他のイモ類の物性の違いを概ね把握できた。A.サトイモ遺伝資源の系統整備:土垂、唐芋、黒軸、セレベス、蓮葉芋など90系統を選び、26のSSRマーカーを用いて、系統解析を行なっている。現在、すべてのサンプルの葉からDNAを抽出し、SSRマーカーのプライマーを用いてPCRを行ない、バンドパターンを確認した。B.培養茎頂を用いた遺伝資源保存法の確立:シンプルなガラス化法を用いて、サトイモ由来(土垂品種)の茎頂の凍結保存を試みたが、いずれの茎頂も成育しなかった。次に、イモから直接生えた芽から得た茎頂と茎頂培養により無菌で栽培した植物体からの茎頂を用いて、茎頂凍結保存の違いを検証した結果、多数の芽を得る事ができる種イモからの単離茎頂が超低温保存に適していなかった。無菌培養シュートの茎頂を用いて、ガラス化法により生存個体生えられたのは大きな成果であった。しかしながら、無菌培養シュートの茎頂を用いても超低温保存の再生個体の生存率は低く、植物材料の超低温保存に用いられ始めている冷却・加温率がよく再生率が非常に高いクライオプレート法を試みている。C.遺伝資源を活用した耐病性育種素材の探索:鹿児島県産の乾腐症状を示していたサトイモ塊茎から、選択培地などを用いて、2株の糸状菌を分離した。菌学的性状からFusarium oxysporumと考えられ、イモへの接種実験より、塊茎の乾腐症状が再現され、分離菌が乾腐症状の病原であることが確認された。
中枢特異的プロスタサイクリンリガンドによる神経細胞死の制御

プロスタサイクリンは末梢神経系では循環系の制御因子として知られているが、中枢では汎用される安定誘導体であるイロプロストやシカプロストが結合活性がほとんどないこともあり、生理的な役割は謎のままであった。我々は、中枢特異的なプロスタサイクリンリガンドが培養海馬ニューロンにおいて酸化ストレスなどの刺激によるアポトーシスを抑制し、その抑制作用は、中枢特的なプロスタサイクリン受容体への結合活性と相関することを見出した。また個体レベルにおいても、中枢特異的なプロスタサイクリンリガンドはスナネズミにおける前脳虚血によるCA1錐体細胞の神経細胞死やマウス局所脳虚血による神経細胞死を抑制した。これらの実験結果は中枢特異的なプロスタサイクリンリガンドの生理的な役割として、神経細胞の生存維持作用があることが示唆される。さらに海馬ニューロンに投射するコリン作動性ニューロンが含まれる中隔野における神経細胞生存維持作用を検討した。中枢特異的なプロスタサイクリンリガンドである15-deoxy-TICはコリン作動性ニューロンのみではなくそれ以外のニューロンに対しても神経細胞生存維持作用を発揮した。この作用はコリン作動性ニューロンにのみ作用するNGFとは対照的であり、個体レベルの実験においてアミロイドペプチドによる記憶障害作用を抑制することも相まって、新たなタイプのアルツハイマー病治療薬となる可能性がある。またサルやヒトでもポジトロンエミッショントモグラフィー(PET)を用い、末梢から投与された中枢特異的なプロスタサイクリンリガンドである15R-TICが、その受容体を発現している視床や線条体などへの集積が観察された。これは中枢特異的なプロスタサイクリンリガンドが有効に脳血液関門を通過しうることを示唆する。ブロスタサイクリンは末梢組織では循環系の制御因子として知られているが、中枢では汎用される安定誘導体であるイロプロストやシカプロストが結合活性がほとんどないことなどもあり、生理的な役割が謎のままである。中枢特異的受容体を介したプロスタサイクリンの生理作用を明らかにする日的で、15R-TICなどのプロスタサイクリン安定誘導体の培養海馬ニューロンのアポトーシスに対する影響を調べた。海馬ニューロンは気相中の酸素濃度を上げて酸化ストレスを加えるか、培養液中の血清を除くと核の凝集を伴う典型的なアポトーシスが誘導される。このとき、15R-TICや15-deoxy-TICを存在させると、アポトーシスは完全に抑制された。プロスタサイクリンは部分的ではあるが有意に抑制したが、その代謝産物である6keto-PGF1αは全く影響がなかった。海馬ニューロンのアポトーシスに対するIC50は15R-TIC及び15-deoxy-TICにおいてそれぞれ、300,30nMであり、これは中枢型プロスタサイクリン受容体に対する結合活性とよく相関した。この作用は海馬ニューロンに限らず、中隔野のコリン作動性ニューロンの細胞死なども抑制し、その抑制作用は中枢特異的なプロスタサイクリン受容体の分布とほぼ一致していた。これらの結果から、プロスタサイクリンの新たな生理作用として中枢神経細胞の生存維持作用があることが示唆された。15R-TIC及び15-deoxy-TICの投与により、スナネズミにおける前脳虚血によるCA1錐体細胞の神経細胞死や、マウスの局所脳虚血による主に線条体の神経細胞死も顕著に抑制された。また15R-TICはアミロイドペプチドによる記憶障害モデルでもその障害レベルを軽減する作用があり、個体レベルでも有効な脳神経細胞保護剤であることが明らかになった。

我々は、中枢特異的なプロスタサイクリンリガンドが培養海馬ニューロンにおいて酸化ストレスなどの刺激によるアポトーシスを抑制し、その抑制作用は、中枢特的なプロスタサイクリン受容体への結合活性と相関することを見出した。また個体レベルにおいても、中枢特異的なプロスタサイクリンリガンドはスナネズミにおける前脳虚血によるCA1錐体細胞の神経細胞死やマウス局所脳虚血による神経細胞死を抑制した。これらの実験結果は中枢特異的なプロスタサイクリンリガンドの生理的な役割として、神経細胞の生存維持作用があることが示唆される。さらに海馬ニューロンに投射するコリン作動性ニューロンが含まれる中隔野における神経細胞生存維持作用を検討した。中枢特異的なプロスタサイクリンリガンドである15-deoxy-TICはコリン作動性ニューロンのみではなくそれ以外のニューロンに対しても神経細胞生存維持作用を発揮した。この作用はコリン作動性ニューロンにのみ作用するNGFとは対照的であり、個体レベルの実験においてアミロイドペプチドによる記憶障害作用を抑制することも相まって、新たなタイプのアルツハイマー病治療薬となる可能性がある。またサルやヒトでもポジトロンエミッショントモグラフィー(PET)を用い、末梢から投与された中枢特異的なプロスタサイクリンリガンドである15R-TICが、その受容体を発現している視床や線条体などへの集積が観察された。これは中枢特異的なプロスタサイクリンリガンドが有効に脳血液関門を通過しうることを示唆する。
M期染色体凝縮の異常によって誘導される新規細胞死の解析

(1)我々はこれまでに、M期の染色体凝縮異常によってeEF1A1の発現減少によるアポトーシスとは異なった細胞死が誘導されることを見出していたが、eEF1A1の発現制御メカニズムは不明であった。eEF1A1の発現抑制機構にはeEF1A1 mRNAの非翻訳領域(UTR)が関与していることを示唆する予備的なデータを得ていたことから、レポーター遺伝子であるd2EGFPの上流あるいは下流に、EEF1A1遺伝子のUTR配列を繋いだコンストラクトを作成し、細胞死誘導時におけるd2EGFPの発現量の変化を調べたところ、eEF1A1の発現制御にeEF1A1 mRNAの5'UTRが関与していることを見出した。加えて、eEF1A1 mRNAの5'UTRにはこれまで機能未知であったRNA結合タンパク質であるCNBPが結合し、eEF1A1の翻訳を抑制することでeEF1A1の発現減少を誘導していることを見出した。(2)eEF1A1の相同分子であるeEF1A2が多くの癌組織において過剰発現している例が数多く報告されているが、このような癌細胞では、eEF1A1の発現低下を伴った細胞死誘導機構が働かなくなったがゆえに癌化に至った可能性が考えられた。そこで、そのような癌細胞株であるヒト乳癌由来MCF-7細胞株においてeEF1A2の発現をRNAi法によって抑制したところ、染色体凝縮異常を誘導した際の細胞死が亢進することを見出した。このことから、eEF1A2の過剰発現はeEF1A1の発現低下による細胞死を抑制し、細胞癌化を亢進させている可能性が考えられた。なお、(1)と(2)の研究成果については現在論文投稿中である。(3)染色体凝縮異常を伴った細胞死誘導時には多くの遺伝子の発現が変化していることが考えられるため、それを網羅的に解析する目的で、既に樹立している誘導型shRNA発現システムを用いたhCAP-E(コンデンシンのサブユニット)の発現抑制系を用いてマイクロアレイ法を行い、発現量が大きく変化する遺伝子群を同定した。現在、これらの遺伝子の過剰発現あるいはRNAi法による遺伝子の発現抑制により、細胞死に与える影響を解析中である。
高病原性トリインフルエンザウイルス新規侵入経路の解明：高病原性の新解釈

高病原性トリインフルエンザウイルスH5N1亜型(HPAI H5N1)は、その高い致死率を始めとして他の亜型とは大きく性質が異なっている。従って、HPAI H5N1特異的な現象を解明していくことは、その高病原性を理解するうえで非常に重要な情報となりうる。インフルエンザウイルスはシアル酸をレセプターとして細胞内に侵入する。ところが、HPAI H5N1ではシアル酸依存的な侵入経路を阻害しても高率に細胞内にウイルスが侵入する所見を得た。これは高病原性のウイルスが、シアル酸レセプター以外の異なる機序で特異的に細胞へ侵入することを示唆している。本研究では、この新規経路の解明を行った。2009年に発生した、ブタ由来新型インフルエンザウイルスの世界的大流行(パンデミック)は世界を大きな混乱に陥れた。幸運なことに、このパンデミックウイルスは比較的低病原性であったため、被害はあまり大きなものにはならなかった。しかし、2003年以降に世界中のトリの間で拡散しつづけている高病原性トリインフルエンザウイルスH5N1亜型の恐怖が取り払われたわけではない。それどころか、H5N1亜型がパンデミックを引き起こすことの現実性が再認識された。高病原性トリインフルエンザウイルスH5N1亜型は、その高い致死率を始めとして他の亜型とは大きく性質が異なっている。これまでの研究で、通常のシアル酸依存的な侵入経路に加えて、H5亜型特異的なアミノ酸配列により、新規の侵入経路を示唆する所見、およびこの配列の変異により培養細胞での侵入能正常化の知見を得た。本研究では、これらの所見をもとに、このアミノ酸配列に関してH5N1亜型特異的な新規侵入経路を解明するとともに、そのアミノ酸配列特異的な中和抗体作製を目指す。本研究では以下の項目を研究課題として予定している。1.新規侵入経路に必須なウイルス遺伝子領域の確定および宿主側の機能の検証2.H5N1亜型の増殖に新規侵入経路が占める役割の大きさの検証3.病原性と新規侵入経路の関連の検証および新規侵入経路を標的とした治療法の検討本研究は高病原性への新たなアプローチとして、ウイルス学的にも医学的にも非常に重要な意義を持っている。また新規の治療法への標的部位としてもその意味合いは非常に大きい。幸運なことに、このパンデミックウイルスは比較的低病原性であったために、被害の拡大は最小限で抑えられた。しかし、2003年以降に世界中のトリの間で拡散し続けている高病原性トリインフルエンザウイルスH5N1亜型の恐怖が払拭されたわけではない。逆に、H5N1亜型がパンデミックを起こしうる可能性があることを再認識させる結果となった。高病原性トリインフルエンザウイルスH5N1亜型は、その高い致死率を最大の特徴とし、他の亜型とは性質が大きく異なっている。これまでの研究では、通常のシアル酸依存的な侵入経路に加えて、H5亜型特異的なアミノ酸配列による新規の侵入経路を示唆する所見を得ている。また当該配列に変異がある場合はシアル酸依存的な侵入しか行えないことも示した。最終年度ではこの配列特異的な抗体を作製した。加えて、この抗体によって新規侵入経路を阻害することを培養細胞の実験系によって示した。加えて、マウスの感染実験を行うことで、マウスへの病原性を限定的ではあるが押さえることが可能であるという所見も得た。本研究は高病原性トリインフルエンザの病原性を理解する上で、ウイルス学的にも医学的にも非常に意義のある意味を持つことが期待される。

本研究では以下の項目を研究課題として予定している。1.新規侵入経路に必須なウイルス遺伝子領域の確定および宿主側の機能の検証2.H5N1亜型の増殖に新規侵入経路が占める役割の大きさの検証3.病原性と新規侵入経路の関連の検証および新規侵入経路を標的とした治療法の検討本研究は高病原性への新たなアプローチとして、ウイルス学的にも医学的にも非常に重要な意義を持っている。また新規の治療法への標的部位としてもその意味合いは非常に大きい。本研究における達成度は、1)新規侵入経路に関与するウイルス遺伝子領域、アミノ酸配列の特定2)その領域がどのようなメカニズムで細胞に侵入に関与するかの検証3)その領域を抗体等で阻害することでウイルス増殖に与える影響の評価、の3項目に関しては順調に進行した。遺伝子領域、アミノ酸配列の特定に関しては既にその領域の同定に成功した。この領域は精製タンパクレベルでもその機能が維持されているアミノ酸領域であり、ウイルスレベルでの実験を含め検討が終了している。またその領域の配列から既知の非ウイルスタイプの細胞侵入経路との相同性を確認し、その経路と非常に類似した侵入パターンであることを確認した。一方で、H5N1由来配列に特異的なパターンも発見した。次の項目である「特定した領域の阻害による病原性への影響の評価・動物実験」において予想外のことにより実験が遅延した。動物実験に用いるための抗体は既に獲得しており、順調に進むと思われたが、得られた抗体を産生する細胞は通常と比較して非常に抗体産生量が低く、動物実験に用いるには十分量の確保ができなかった。そこで本研究室で最大のスケールで抗体を回収したが、十分な抗体を確保するのに数か月を要することになった。このため、当初の予定より実験計画が遅れることになった。現状では最小限の動物実験しか行えていないが、ある程度のウイルス増殖窓外効果は得られている。延長期間のうちに該当項目を終えることは可能であると考えられる。本研究の該当年度の計画は、1)新規侵入経路に関与するウイルス遺伝子領域、アミノ酸配列の特定2)その領域がどのようなメカニズムで細胞に侵入に関与するかの検証3)その領域を抗体等で阻害することでウイルス増殖に与える影響の評価、の3項目である。一方で、うH5N1由来配列に特異的なパターンも発見しており、今後の発展が期待される。領域阻害による影響はラビットのポリクローナル抗体による実験により阻害の確認ができた。マウスのモノクローナル抗体はこの領域のマウスのエピトープとしての相性の問題のためか、数度にわたる挑戦にもかかわらず得られることがなかった。そのため、ラビットでのモノクローナル抗体の作製に転じ、すでに抗体を得た。この抗体の機能に関しては今後の研究により検討される。以上のことから、本研究はおもむね順調に進行しており、今後の展開が期待される。
神経芽腫細胞上に特異的に存在するガングリオシドの構造と機能に関する研究

昨年度得られたモノクロナル抗体の抗原脂質はスフィンゴ糖脂質と考えられる。そこで、スフィンゴ糖脂質やコレステロールが極在すると考えられている脂質ラフトに注目し、本脂質の分布を詳細に検討したところ、その略全量がこの分画に局在している事を解明した。本研究で使用〓ている神経芽腫細胞はBrdUで処理するとシュワン細胞に、また培地中の血清を除去する事によって神経細胞に分化する事が知られて居る。この何れの処理によっても細胞表面の抗原脂質がモノクロナル抗体と反応しにくくなる事を解明した。ところでFACS解析において、このモノクロナル抗体は神経芽腫細胞の表面のみを認識し、他の調べた限りの細胞は殆ど認識しない事を明らかにしたが、脂質をこれらの細胞から抽出してTLCブロッティングを行うと、神経芽腫細胞同様に検出される事を明らかにした。またシュワン細胞および神経細胞に分化誘導させた後にも、FACS解析においてはネガティブになるものの本脂質は細胞内部には存在することを確認した。しかも何れにおいても脂質ラフト中に局在する事を明らかにした。これらの結果は、脂質ラフトは細胞表面および内部に存在する事を示唆している。ところで、上記の脂質を抗原とするものとは対照的に、他に何れの細胞もFACS解析によって認識するが、神経芽腫細胞のみは認識しないモノクロナル抗体を発見し、その抗原がCD44と言う糖タンパク質である事を解明した。次いで、神経芽腫細胞をシュワン細胞に分化誘導した際にのみこの分子が発現される事も明らかにした。またこの分子にはalternative splicingに由来する多数のアイソフォームが存在するが、新たに発現されるものの分子構造をRT-PCR法によって解明した。さらに、この分子も分化によって得られたシュワン細胞においては、脂質ラフトに局在する事を解明した。神経芽腫細胞のGOTO細胞が他の細胞に比較して高い血小板凝集・血液凝固能を有する事を発見し、更に本細胞をBrdUによって分化誘導するとこの活性が激減する事をも発見した。その血小板凝集・血液凝固能のメカニズムを検討したところ、本細胞が血液凝固第X因子を補助してプロトロビンよりトロンビンを産生する事を確認した。そこでその反応に関与するであろう物質を、本細胞より単離精製してそのメカニズムの解明を目指した研究を開始した。先ず本細胞の分化誘導前後で細胞表面分子が変化すると考え、その変化を認識するモノクロナル抗体の作成を試みた。その結果得られた興味あるモノクロナル抗体の一つの抗原は意外にもタンパク質ではなく、極性の高い脂質であった。現在のところ未だその化学構造は正確には解明されておらず、質量分析および核磁気共鳴法による検討を行っているところである。今後は更にその生合成経路を解明すべく、放射ラベルされた各種代謝前駆物質を細胞に与え、その取込みを調べて代謝経路よりその構造のヒントを得たいと考えている。例えば、スフィンゴ糖脂質であれば、アミノ酸のセリンの取込みの確認およびその特異的阻害物質の影響等が有効であると考えられる。又糖脂質かどうかの検討にはガラクトースの取込み等が考えられる。更にその機能に関しても構造の解明とともに進めて行く予定である。血小板上で通常上記の反応が行われる際に関与が確かめられている酸性リン脂質以外の脂質の関与は大変に興味深い。本研究で使用している神経芽腫細胞はBrdUで処理するとシュワン細胞に、また培地中の血清を除去する事によって神経細胞に分化する事が知られて居る。

この何れの処理によっても細胞表面の抗原脂質がモノクロナル抗体と反応しにくくなる事を解明した。ところでFACS解析において、このモノクロナル抗体は神経芽腫細胞の表面のみを認識し、他の調べた限りの細胞は殆ど認識しない事を明らかにしたが、脂質をこれらの細胞から抽出してTLCブロッティングを行うと、神経芽腫細胞同様に検出される事を明らかにした。またシュワン細胞および神経細胞に分化誘導させた後にも、FACS解析においてはネガティブになるものの本脂質は細胞内部には存在する事を確認した。しかも何れにおいても脂質ラフト中に局在する事を明らかにした。これらの結果は、脂質ラフトは細胞表面および内部に存在する事を示唆している。ところで、上記の脂質を抗原とするものとは対照的に、他の何れの細胞もFACS解析によって認識するが、神経芽腫細胞のみは認識しないモノクロナル抗体を発見し、その抗原がCD44と言う糖タンパク質である事を解明した。次いで、神経芽腫細胞をシュワン細胞に分化誘導した際にのみこの分子が発現される事も明らかにした。またこの分子にはalternative splicingに由来する多数のアイソフォームが存在するが、新たに発現されるものの分子構造をRT-PCR法によって解明した。さらに、この分子も分化によって得られたシュワン細胞においては、脂質ラフトに局在する事を解明した。現在これらも成果を投稿すべき準備中である。
免疫チェックポイント阻害薬のバイオマーカー探索

本研究期間内においては、非小細胞肺がんに対する免疫チャックポイント阻害薬の治療効果予測のバイオマーカーを探索するために、末梢血中の可溶性PD-L1タンパクに着目した。非小細胞肺がん患者において、末梢血中の可溶性PD-L1タンパクの発現レベルは、がん組織中のPD-L1発現強度と相関している可能性を想定した。この仮説の検証のために、非小細胞肺がん患者(n=63)の手術前後の末梢血から血漿を回収して、血漿中の可溶性PD-L1タンパクの濃度をELISA法で測定した。血漿中の可溶性PD-L1レベルは、手術1か月後には、手術前よりも軽度の上昇を認めたが、約30%の症例においては、手術前よりも10%以上の上昇を認めた。手術前の血漿中の可溶性PD-L1レベルと予後(手術後の無再発生存期間)との関連について調査したところ、手術前の血漿中の可溶性PD-L1レベルが高値であった群では、低値であった群に比較して予後不良である傾向があり、特に、リンパ節転移や遠隔転移を認めない群(pN0M0群)においては、有意に予後不良であった。次に、肺がん組織に対して、抗PD-L1抗体(clone: 28-8)を用いた免疫組織染色を行い、がん細胞のPD-L1発現強度を半定量化して求めた。その後、がん細胞のPD-L1発現強度と手術前の血漿中の可溶性PD-L1レベルとの関連について調査したが、両者の間に有意な相関は認めなかった。肺がん組織のPD-L1免疫組織染色を、さらに解析すると、PD-L1陽性細胞は、単にがん細胞のみならず、腫瘍浸潤マクロファージも含まれることが判明した。このことから、手術前の血漿中の可溶性PD-L1レベルや、手術後の可溶性PD-L1レベルの変動には、腫瘍浸潤マクロファージも関与している可能性が示唆された。末梢血中の可溶性PD-L1タンパクレベルの継時的なモニタリングが、がん細胞のPD-L1発現レベルの代替マーカーとして有用である可能性を予測したが、今年度の研究結果から、末梢血中の可溶性PD-L1タンパクレベルは、必ずしもがん細胞のPD-L1発現レベルを反映しているとは限らないことが示唆された。さらに、末梢血中の可溶性PD-L1タンパクレベルは、がん組織中の他のPD-L1陽性細胞である腫瘍浸潤マクロファージによって制御されている可能性が浮上した。このことは、非小細胞肺がんに対する免疫チャックポイント阻害薬の治療効果予測のバイオマーカーを探索する際には、単にがん細胞のみならず、がん間質のPD-L1陽性細胞にも着目する必要があるという新たな知見が得られた。腫瘍浸潤マクロファージのタイプ別(M1とM2マクロファージ)におけるPD-L1発現レベル、またにPD-L1発現を制御する因子の特定を行う。さらに、腫瘍浸潤マクロファージによる可溶性PD-L1タンパクの産生について特定する。さらに、免疫チャックポイント阻害薬のPD-L1陽性の腫瘍浸潤マクロファージへの影響についても調査する。肺扁平上皮がん細胞株(LK-2、EBC-1)にIFN-γを濃度別に添加し、IFN-γ用量依存性に肺がん細胞のPD-L1発現が上昇することをフローサイトメトリーで確認した。また同細胞株のPD-L1(cDNA)の発現がIFN-γ添加により増加し、IFN-γ除去により減少することをRT-PCRを用いて確認した。さらに2008年2012年の肺扁平上皮がん手術切除検体77例を用いて、肺がん組織のPD-L1とMHC-class Iの発現、さらには腫瘍微小環境のCD8陽性リンパ球について免疫組織染色を行い、MHC-class Iの発現と肺がん組織におけるPD-L1の発現が相関することを示し、かつPD-L1発現とCD8陽性リンパ球浸潤の相関も示した。このことは、MHC-class Iを発現している肺がんはCD8陽性細胞が放出するINF-γによってPD-L1発現が制御されている可能性を示唆した。2008年2014年の早期非小細胞肺がん(ステージIA,IB)切除検体105例を用いて、PD-L1抗体による免疫組織染色を行った。PD-L1の染色強度を半定量的に測定し、PD-L1の発現強度と肺癌臨床病理学的特徴のうち、分化度と関連することを示した。早期肺癌術後再発は、PD-L1が高い群で有意に少ないことを示した。免疫細胞が放出するIFN-γとの接触でPD-L1が発現することがすでに示されており、このことからPD-L1が発現している肺がん細胞ほど免疫細胞との接触が高率であることが予想され、そのため無再発生存期間が延長すると考えられ、PD-L1の発現がバイオマーカーになりうる可能性が示唆された。平成29年度に計画した1非小細胞肺がん(扁平上皮がん)のMHC-class I分子とPD-L1発現の関連、さらにはCD8陽性リンパ球浸潤との相関、2ヒト非小細胞肺がん細胞株におけるIFN-γとPD-L1発現の相関をフローサイトメトリー、RT-PCR、77例の肺扁平上皮がん手術検体の免疫組織染色を用いて示した。また105例の非小細胞肺がん(腺がん)手術検体を用いて、PD-L1の免疫組織染色と臨床日理学的因子、無再発生存期間との関連を示した。