hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
膜分離活性汚泥法の膜の目詰まりを抑制する酵素固定化型ろ過膜の開発

本研究は膜分離活性汚泥法における微生物由来のろ過膜の目詰まりを抑制するため、酵素を固定化したろ過膜を開発した。放射線グラフト重合法を適用し、ポリエチレン製精密ろ過膜をグラフトし、グラフト鎖に親水性の高い官能基を導入した。これにより、元のポリエチレンと変わらない高い透水性を確保することができた。次に、微生物が産生する微生物細胞間情報伝達物質を分解可能な酵素を固定化した。微生物細胞間情報伝達物質を介してバイオフィルム形成を行うAgrobacterium tumefaciensを供試細菌として、作製したしたろ過膜へのバイオフィルム形成試験を行った。この酵素固定化型ろ過膜を用いることで、バイオフィルムの形成を大幅に削減できた。排水の生物処理に導入されるろ過膜は、固液分離に用いられるが、微生物の凝集体およびポリマーで形成されるバイオフィルムによる目詰まりが問題となっている。この目詰まりの引き金になる微生物間情報伝達(クオラムセンシング)物質を遮断し、目詰まりが抑制可能な酵素固定化型ろ過膜の開発を行った。ポリエチレン製の精密ろ過膜にエポキシ基を有するグリシジルメタクリレート(GMA)をグラフトした。その後、ジエチルアミン溶液に浸漬させることにより、GMAのエポキシ基をジエチルアミノ基に置換した。ここに情報伝達物質(アシルホモセリンラクトン(AHL))のアシル基を分解可能な酵素であるアシラーゼを固定化し、酵素固定化型ろ過膜を作製した(DEA-酵素固定化膜)。DEA-酵素固定化膜はAHLの分解能を有していたものの、ろ過膜上への細菌の付着が避けられず、細菌細胞が付着しにくい表面を準備することができなかった。そこで、疎水性のタンパク質に対して付着抑制効果がある、N,N-ジメチル-γ-アミノブチル酸塩(DMGABA)をジエチルアミノ基の替わりに用いた。GMAをグラフトしたポリエチレン製ろ過膜にDMGABAを導入し、アシラーゼの固定化を図った(DMGABA-酵素固定化膜)。その結果、0.12mg-enzyme/cm^2の酵素の固定化が可能であった。固定化酵素の重量当たりのアシル基の分解速度は、懸濁している酵素と比較すると約2割であるものの、1.32mmol/mg-enzyme/minの分解速度を得ることができた。次に、Agrobacterium tumefaciensをモデル細菌としてバイオフィルム形成試験を行ったところ、DMGABAを導入した膜にアシラーゼを固定化することにより、バイオフィルムの形成を7分の1以下に抑えることができた。メンブレンバイオリアクターは、固液分離をろ過にて行うため、高い排水処理効率を有する一方で、膜の目詰まりが顕著な問題となっている。本研究では、この目詰まりの主要な原因であるバイオファウリングの引き金となる微生物間情報伝達物質を遮断し、目詰まりを抑制可能な酵素固定化型ろ過膜の開発を行った。ポリエチレン製の精密ろ過膜にエポキシ基を有するグリシジルメタクリレート(GMA)をグラフトした(GMA膜)。その後、N,N-ジメチル-γ-アミノブチル酸塩(DMGABA)を導入し(DMGABA膜)、さらに、微生物間情報伝達物質の一つであるアシルホモセリンラクトン(AHL)を分解可能なAcylaseIの固定化を行った(DMGAGA一酵素固定化膜)。膜の透水性評価の結果、グラフト重合による膜の孔径の縮小にもかかわらず、DMGABA膜はポリエチレン製膜と同様の透水性を示し、DMGABA-酵素固定化膜でも20%しか減少が見られなかった。次に、DMGABA-酵素固定化膜のAHLの分解性能を評価するため、AHLの一種であるC6-HSL溶液(5μM)を透水したところ、DMGABA-酵素固定化膜では50時間で完全にC6-HSLの分解が見られ、膜のAHL分解性能を確認した。DMGABA膜およびDMGABA-酵素固定化膜上へのバイオフィルム抑制効果を評価するため、AHLを情報伝達物質として用いるAgrobacterium tumefaciensによるバイオフィルム形成試験を行った。バイオフィルム量は対照系のGMA膜と比較してDMGABA膜は28%、DMGABA-酵素固定膜では8%であり、バイオフィルム形成を大幅に削減可能であった。DMGABA膜の有する親水性に加え、酵素固定化による微生物間情報伝達物質の分解といった相乗効果により、膜目詰まりの原因となるバイオフィルム形成を抑制できることが示唆された。
二枚貝(貝リンガル、貝メタボローム)を用いた沿岸生態系の影響評価

本課題では沿岸底質に生息し、移動能力に乏しく様々な環境影響を最も受けやすい二枚貝に着目して、貧酸素、硫化水素、赤潮などによる影響を殻体運動(貝リンガル)や浮上運動等の行動および糖代謝物のプロファイル(貝メタボローム)で評価し、生態系の評価・監視・回復を目指した。<タイラギ>有明海北東部において夏場に大量斃死を起こし大きな問題になっているタイラギ(Atrina pectinata)を用いて貧酸素に対する影響を調べた結果、(1)貧酸素下では、タイラギ体内のコハク酸濃度が上昇しリンゴ酸の濃度が減少した。(2)斃死率が高い水域のタイラギではコハク酸の濃度が上昇していた。(3)室内実験でタイラギは貧酸素条件になると底泥から殻体を半分以上浮上させ、好気条件になると沈み込む行動をとるが、繰り返し貧酸素水に暴露すると沈み込み幅が減少した。よってコハク酸とリンゴ酸の濃度および浮上運動が貧酸素の指標となることが明らかとなった。<アサリ>1990年代より西日本沿岸域に出現するようになった二枚貝を殺す渦鞭毛藻Heterocapsa circularisquamaを、アサリ(Ruditapes philippinarum)に暴露してその殻体運動に及ぼす影響を貝リンガルにより測定した。その結果、H.circularisquama暴露(5細胞/ml以上)により殻開閉運動の頻度が顕著に増加し、500細胞/mlで開殻時間が有意に減少することが明らかとなった。以上の結果から、貝リンガルおよび貝メタボロームを用いて貧酸素や赤潮プランクトンによる生態系に対する影響評価が可能であり、水産環境の保全のため、本手法が有効であることが明らかとなった。【目的】近年、有明海北東部において水産業上重要種であるタイラギ(Atrina pectinata)が夏場に大量斃死を起こすようになり大きな問題になっている。本研究では、夏季のタイラギ大量斃死の原因解明を目的として、タイラギの貧酸素に対する耐性を嫌気呼吸代謝物である有機酸(乳酸、ピルビン酸、リンゴ酸、フマル酸およびコハク酸)の濃度変化で調べると共に、その殻開閉運動を貝リンガル(東京測器製)で調べた。【方法】2005年2月に同干潟(殻長11.4cm)と沖合(殻長13.3cm)で採取したタイラギを実験室で1日馴致後、両タイラギ各6個体から閉殻筋を採取して凍結保存した。また両タイラギ各3個体ずつ30Lパンライト水槽3個に入れ窒素ガス暴気で6時間貧酸素状態にした。暴露後貝を取り上げて閉殻筋を採取して凍結保存し,後日閉殻筋における有機酸の濃度をHPLCを用いて測定した。さらに同時に採取した両タイラギ各4個体にホール素子センサーを装着し、5日間馴致後、貧酸素条件下で6時間貝リンガル装置を用いて殻体開閉運動を記録して貧酸素に対する行動を解析した。【結果及び考察】好気条件下における干潟および沖合のタイラギ閉殻筋の有機酸濃度に有意な差は見られなかった。しかし、貧酸素条件下に6時間おいた沖合タイラギ閉殻筋中のリンゴ酸濃度は干潟タイラギの159%と高く(p<0.05)、逆に同タイラギのコハク酸濃度は、干潟タイラギの41%と低かった(p<0.05)。よって沖合タイラギではリンゴ酸からコハク酸への代謝阻害とそれによる嫌気耐性の低下が示唆された。

またほぼ同時に行った貝の殻開閉運動試験の結果、沖合タイラギは貧酸素暴露開始40分後から激しい開閉運動を開始し、貧酸素条件下6時間における開閉回数は平均9回/時と干潟タイラギの約5倍多かった沖合タイラギでは嫌気呼吸の代謝経路阻害が起こって嫌気耐性が低下し、貧酸素状態に耐えられず開閉運動を行ったと考えられる。平成18年度は、タイラギに硫化水素を暴露して、タイラギの貧酸素に対する耐性を嫌気呼吸代謝物である有機酸(乳酸、ピルビン酸、リンゴ酸、フマル酸およびコハク酸)の濃度変化で調べると共に、その殻開閉運動を貝リンガル(東京測器製)で調べた。その結果、硫化水素暴露区におけるコハク酸濃度(1.65±0.68Fmol/g)は貧酸素暴露区(0.85μmol/g)より高かった。しかし、硫化水素暴露後の翌日にもう一度硫化水素暴露を行った区では0.25μmol/gと嫌気条件下であるにもかかわらずコハク酸の濃度が低かった。このように、タイラギ閉殻筋のコハク酸濃度は前の硫化水素暴露の影響を受けることが示唆された。さらに、硫化水素暴露の翌日に貧酸素暴露を行った区(1.03μmol/g)と硫化水素暴露の翌日も硫化水素暴露を行い1週間後に貧酸素暴露を行った区(1.11μmol/g)のコハク酸濃度は貧酸素暴露区(0.85μmol/g)と有意な差がないことから、硫化水素暴露の影響は翌週の嫌気呼吸までは影響を及ぼさないと考えられた。また、高濃度の硫化水素(6.75mgS/L)を暴露しても6時間ではタイラギは死にいたらないことも判明した。以上の結果から、硫化水素の暴露によって翌日の嫌気代謝に何らかの影響を及ぼす可能性が示唆された。また、タイラギの開閉運動は、好気条件では素早い開閉運動を断続的に行っていたが、貧酸素条件では緩慢な開殻運動へ質的に変化していた。アサリに低塩分海水および有害プランクトンを暴露してその開閉運動を調べた。その結果、一定の速度で塩分を低下させた場合、塩分低下の速度に係らず、2026%(標準偏差の範囲)付近で全ての個体が閉殻を始め、その後短時間でほぼ完全に殻を閉じた。次に、塩分を5%・まで低下させた後、塩分を上昇させると、閉殻時とほぼ同様の1525%(標準偏差の範囲)付近から開殻が始まり、その後全ての個体が開殻状態の通常の殻体運動に戻った。有害プランクトンに暴露した結果は現在解析中である。近年、有明海北東部において水産業上重要種であるタイラギ貝が夏場に大量斃死を起こすようになり大きな問題になっている。本課題では沿岸に生息し、様々な影響を最も受けやすい二枚貝に着目して、その急性影響を貝リンガルで、また中・長期的影響を貝の糖代謝物のプロファイル(貝メタボローム)で評価し、生態系の評価・監視・回復を目指すものである。平成19年度は、タイラギを、1日6時間、貧酸素海水(溶存酸素0.5mg/L以下)に7回暴露し、貧酸素暴露前と暴露後におけるタイラギの底面から殻先端までの高さ(浮上高)を毎日測定した。また、貧酸素暴露後に閉殻筋を採取して保存した。得られた閉殻筋について、呼吸代謝物濃度(リンゴ酸,ピルビン酸,コハク酸,乳酸,フマル酸)はHPLCで、グリコーゲン含量はアンスロン法で測定した。タイラギを貧酸素海水に7回暴露した結果、リンゴ酸の濃度が減少した(p<0.05)。タイラギは貧酸素条件になると浮上し、好気条件になると沈み込む行動を繰り返したが、貧酸素暴露7回目で浮上高が低下した。3次元分散分析の結果、浮上高には暴露期間、貧酸素暴露回数、底質の因子が有意に作用していた。一方、1990年代より西日本沿岸域に出現するようになった二枚貝を殺す渦鞭毛藻、Heterocapsa circularisquamaをアサリに暴露し、その殻体運動に及ぼす影響を貝リンガルにより測定した。
ユビキチン様タンパク質結合系の解析と生理的役割の解明

細胞内のバルクなタンパク質分解系であるオートファジーに関わるApgタンパク質の解析が進んだ結果、15個の遺伝子のうち半数以上がユビキチンに類似の結合系に関与している。Apg12はApg7,Apg10をそれぞれE1,E2酵素として最終的にApg5のリジン残基とイソペプチド結合を形成する。この反応はUb1と標識タンパク質が1:1対応をし、非可逆的である。またこの形成は飢餓によって変動せず構成的である。この結合体は更にApg16と結合して350kDの4セットからなる複合体を機能単位としてオートファ後ソーム形成に関わっている。Apg12の構造解析の結果、ユビキチンホールドにそのすべての機能があることが判った。もう一つのUb1であるApg8/Aut7は合成後C-末端のアルギニン残基がApg4によって切断され、末端グリシンを露出する。このプロセスされたApg8はApg7によって活性化された後、Apg3に渡され最終的には膜リン脂質PE頭部とアミド結合を形成する。この反応は可逆的であり、サイクルすることがオートファジーの進行に必須である。Apg12の脂質化反応は精製したApg8,Apg7,Apg3とpEを含むリポソームのみでin vitro再構成が可能であることが判った。これら2つの結合反応系はE1酵素を共有してしているのみならず、相互に密接に関係している。Apg12系の欠損はApg8-PEレベルを劇的に減少させる。これらの系は空間的にも液胞近傍のオートファゴソーム形成に中心的に働くpreautophagosome structure(PAS)上に共局在している。これら2つの系は哺乳動物、高等植物にも保存されており、それらの解析も進んだ。自食作用は、真核細胞に普遍的な生理現象であり、その解明は細胞を理解する上で必須である。自食作用の機構をめぐる最大の課題の1つは、オートファゴソーム(AP)と呼ばれる二重膜構造体がいかに形成され液胞に細胞質成分を送り込むかと言う点にある。自食作用に必須なタンパク質Apg8pの解析を開始し、Apg8pが飢餓条件下にその発現が誘導され、細胞内局在を大きく変動させること、さらにこの蛋白質がAPに係わる膜構造体に局在することを発見した。APの形成に関する既存の膜による囲い込みとする従来の説を覆す新しいモデルを提唱した。Apg8pのさらなる解析を進め、Apg8pは翻訳後C-末端の1アミノ酸Argが切断を受ける。このプロセシングはオートファジーに必須である。さらにこの切断には自食作用遺伝子として分離されていたAPG4が関与している。さらにin vitro系を用いてApg4pが新規のシステインプロテアーゼとしてこのプロセシングに関与することを見いだした。このプロセシングによってApg8pのC-末端にはGlyが露出する。Apg8pは見かけの分子量が変化することはないがC-末端Glyを介してさらに翻訳後修飾を受け、膜に強固に結合した型Apg8-Xに変換される。さらに重要なことはApg4が単にプロセシング酵素として機能しているのではなく、一旦膜に結合したApg8-X分子を切断し膜から離脱することがオートファジーの進行に必須であることを見出した。Apg8pはAP形成に際して修飾反応によって一過的に膜に結合することが重要である。さらにこの修飾反応がユビキチンに類似した結合反応系によっていることを明らかにした。

我々が発見したオートファジーに必須なユビキチン様タンパク質Apg12を活性化するE1酵素Apg7によって活性化され、新規のE2酵素であるApg3に受け渡される。最終的にApg8の末端グリシンは生体膜の主要構成脂質の一つであるホスファチジルエタノールアミンのアミノ基とアミド結合を形成する。この反応系は新規のタンパク質の脂質修飾であり、高等生物にまで広く保存されている。この新しい脂質修飾系の膜動態における役割の解明はさらに大きな意味を持っている。酵母のオートファジーに必須な2つのユビキチン様蛋白質の機能解析をさらに進めた。本年度に得られた主な成果は以下の通りである。ユビキチン様蛋白質、Apg12はApg5と共有結合を形成するが、この結合体はApg16によって約300kDの複合体を形成することによって始めて機能し得ることが明らかとなった。第2のユビキチン様蛋白質、Apg8は前駆体として合成され、Apg4によって末端アルギニンが切断され、グリシンを露出する。Apg12と共通の活性化酵素Apg7により活性化され、Apg3を経て膜リン脂質ホスファチジルエタノールアミンに結合する。Apg12経路の欠損株ではApg8PEの量が著しく低下することから、この2つの経路は独立に働き得るが、相互に密接に関連している。Apg蛋白質に蛍光蛋白質を融合して細胞内における局在及び動態を観察した結果、これらの結合体が他のApg蛋白質が共存する構造体を発見し、前オートファゴソーム構造と名付けた。この構造上でオートファゴソームが形成されることも明らかとなった。Apg8の脂質化反応の機序を明らかとすることを目的として、この反応に関わる3つの因子を大腸菌内で発現し、これらの因子のみでApg8の脂質修飾が起こり得ることを証明した。さらに精製蛋白質と、ホスファチジルエタノールアミンを含むリポソームを用いた再構成に成功した。PEへの修飾にはリポソームのPE含量が重要な要因であることが明らかとなった。これまでに引き続きオートファジーに必須な遺伝子群であるAPGの解析を進めた。その中で中心的な役割と持つ2つのユビキチン様タンパク質に関しては、Apg12-Apg5は細胞内でその殆どがApg16と結合し4量体として機能していること、その多量体形成が必須であることを明らかにした。また動物細胞におけるApg16のカウンターパートとしてC-末端にWD繰り返し配列を持つApg16Lを同定した。Apg16Lも同様にApg12-Apg5結合体と大きな複合体を形成する。Apg8の完全in vitro系を確立したC脂質化反応にはリポソームにおけるPE含量が効率に重要であることが判った。多数のApgタンパク質が共局在する液胞近傍の構造としてpre-autophagsome structure (PAS)を同定した。PASは、オートファゴソーム形成に中心的な役割を担っていると考えられる。その実体の解明が急務である。オートファジーにおける分泌経路の関与を系統的に解析した結果ERからの膜のフローが必須であることが明らかとなった。細胞の飢餓時における分泌経路の解析から、ERが高率にオートファゴソームに取り込まれること、ゴルジ以降の輸送が液胞への変換されることが明らかとなった。
ミトコンドリアに選択的に集積する脂溶性陽イオンの抗腫瘍剤としての有用性

脂肪親和性陽イオン(Delocalized Lipohilic Cation,DLC)は電位差に従い,より負電位の高い腫瘍細胞ミトコンドリアに選択的に集積し細胞障害を起こすことが知られている.今回我々はin vitro,in vivoにおけるDLC化合物FJ776の抗腫瘍作用および毒性を検討した。【材料と方法】in vitroではヒト癌培養細胞株(MKN45,MKN74,Colo205,WiDr,C1,HT29,CRL1420,LS174T)および担癌症例より得られたヒト脾細胞(n=10)を用いてgrowth assayを行いMTT判定により50%抑制率(IC50)を算出した.ヌードマウス可移植性ヒト腫瘍株(MKN45,Co-4,HT29,LS174T)をマウス側背部皮下に移植し,腫瘍が一定の大きさに達した時点で以下の治療を行った(各群n=5).(1)FJ776,3.75または7.5mg/kg/day隔日14回腹腔内投与(ip)群,(2)FJ776,7.5mg/kg/day連日14日間ip群,(3)皮下埋没型浸透圧ポンプによるFJ776,7.5,20,30,40mg/kg/dayの7または14日間持続皮下投与(sc)群.抗腫瘍効果の判定は生存期間およびT/C比よりおこなった.【結果】ヒト脾細胞のIC50が47.10±12.44μg/mlであったのに対し,培養細胞株におけるIC50は2.010.1μg/mlに分布し,最大約30倍の選択毒性が示された。FJ776のin vitro抗腫瘍効果はAUCに依存していた.in vivo,MKN45に対するFJ776,7.5mg/kg/day隔日ip群は対照群に比して生存期間の延長を示した.Co-4に対しては連日ip群が抗腫瘍性を示さなっかたのに対し,持続sc群は最小0.58のT/Cを示した.HT29およびLS174Tに対してFJ776持続sc群は用量依存的な抗腫瘍効果を示し,本投与法における最大耐容量20mg/kg/dayと推定された。【考察】FJ776のin vitro抗腫瘍性はACUに依存し,in vivoにおいても持続投与法が優れた抗腫瘍性を示すことが示された.脂肪親和性陽イオン(Delocalized Lipohilic Cation,DLC)は電位差に従い,より負電位の高い腫瘍細胞ミトコンドリアに選択的に集積し細胞障害を起こすことが知られている.今回我々はin vitro,in vivoにおけるDLC化合物FJ776の抗腫瘍作用および毒性を検討した。【考察】FJ776のin vitro抗腫瘍性はACUに依存し,in vivoにおいても持続投与法が優れた抗腫瘍性を示すことが示された.
第2言語としての日本語習得と日本語フィラー習得の関係に関する調査研究

日本語学習者の発話に現れるフィラーについて発話コーパスを分析し、その結果、一定の出現順序があり、それは概ね、母音の長音形フィラー、指示詞からの派生形フィラー、副詞からの派生フィラー、そして最上級段階に指示詞の一部(「このー」)が現れることを跡付けた。これは、習得の深化に伴って起きる現象であることを述べた。2010年度の研究成果は、「日本語学習者の発話に見られるフィラー『こう』について」という論考にまとめた。この論文では、まず、KYコーパス(鎌田修・山内博之)に収録された初級から超級までの学習者について、各段階から2名を選び、その出現フィラーを調査した。その結果、初級では母音延引系(「アー」類)、中級では指示詞系「あのー」、上級では副詞系「まあ」「もう」および母音延引系「えー」「えーと」、そして、超級になると「こう」が出現するという結果になった。日本語学習者の発話に現れるフィラーは、学習段階と強い相関があることが予想される。この結果をもとに、今年度は、「こう」がなぜ超級にならないと現れないのかという点について、母語話者の「こう」の用法と比較しつつ検討を加えた。その結果、「こう」は、「心的に思い浮かべられた対象を、言語化のために、分節し、表象的な把握を行うとともに、言語生成へと向かう心的な動きを、ある場合には一括してまたある場合には時間的な流れの中で捉えつつ、言語化への動きを促進するもの」であるが、超級まで現れないのは、「自身の発話生成の過程に、イメージ的な要素の言語的な取り込みを行いつつ発話を進めるという、より創造的な発話が行われるようになっているから」であるとした。日本語学習段階とフィラーとの相関については他の研究者によっても指摘されているが、個々のフィラーの性質の検討を踏まえた議論はほとんど行われていないと思われる。その点で、今年度の成果は、この分野の研究の可能性を開いたものと言えると思われる。本年度は、日本語学習者のフィラーについてのデータ収集とその分析を主たる目的としていたが、その過程で、フィラーの規定の再考を迫られることになった。それは、データ収集に際しては、その対象が的確に規定されていなければならないが、実際のデータを前にすると、判断に迷うような例も少なくないからでもあった。同時に、フィラーとするものの範囲も再検討することにし、これまで検討対象としてきたフィラー専用の語、指示詞および副詞からの派生語に加えて、もうひとつのグループとして、応答表現のフィラー化について検討することにし、フィラーとして扱われることもある「そうですね」「いや」の2語についてその用法を検証した。その結果、「そうですね」については、対人的な応答表現という面と、その対人性が希薄化し、自己指向的な談話標識というもう一つの用法のあることが観察された。後者は実質的な肯定の意味を失いつつあり、フィラー化の方向にあるともみられるが、現段階では談話標識としての実質的な機能を持っており、フィラーとするには至っていないと考えられる。また、「いや」も、フィラー化しているとは言えないという結論に至った。それは、やはり実質的な談話操作性を持っているからである。が、内容間の関係を示すものとしての談話標識ではなく、「そうですね」とも共通するが、談話内容に対する話者の心的な姿勢を表示する点、さらに、その姿勢が大まかな方向が示されるだけでそれ以上の情報がないという点に、フィラーではないが、明確に談話内の要素とも言えない性格を持ったものであるとも言える。その点で、話しことばに現れる要素を、もう少し緩い枠組みで捉える必要があるようにも思われた。次年度に、この観点を生かして、再び当初の課題に沿ったデータの収集と分析を行いたい。日本語のフィラーが、日本語学習者(第2言語としての日本語を学習する者)にどのように習得されていくか、日本語学習者の習得段階とそのフィラー使用との間に何らかの関係があるか、あるとすればどのような要因によるか、このことをテーマに研究を進めた。この問題に関しては、小出(2011)において、OPIの学習段階設定に従って示せば、初級(母音延引系(あー))→中級前半(指示詞系「あのー」)→中級後半(母音延引系「えー」「えーと」)→上級(副詞系「まー」「もー」)→超級(指示詞系「こー」)のように、学習段階とフィラーには画然とした相関関係の見られることを指摘した。フィラーは、あくまで対象言語の体系に属するものであり、学習の対象となるものなのである。しかし、フィラーは明示的な学習項目として取り上げられることは、「あのー」を除いてほぼない。それにもかかわらず、習得が進み、かつ、学習段階と相関している。これは言語の自然習得が体系的に進むということのよい例であると思われる。

しかし、その一方で、日本語母語話者が少数であるが使用する「このー」などの出現が日本語学習者にほとんど観察されなかったことを見ると、母語話者の使用頻度が反映したもので、学習者は話しことばの日本語に触れ、その際に、フィラー使用について統計的な出現状況の処理を行っているからではないかとも思われる。フィラーは、話しことばにはつきものであり、そのような統計的な処理を行うためのデータには事欠かないからである。また、発話には、フィラー的な要素が必要であり、明示的な教示の有無にかかわらず、日本語学習者は必要な形式を探すことになる。フィラーは、発話内容そのものの形成にはかかわらないが、発話行動というものを形成するためには欠かすことのできないものなのであるし、フィラー研究は発話行動という観点から行われるべきものと思われる。第9項に述べたように、フィラーという対象の規定を再検討する必要が生じた。そのため、当初の計画よりいくぶん遅れている。しかし、日本語学習者の発話に現れる、学習段階に特徴的なフィラーの分析はおおむね行われており、次年度は、今年度の検討によって得られた新しい規定に基づくフィラーのデータ収集と分析を行うことで、当初の計画の実現を予定している。24年度が最終年度であるため、記入しない。前項に述べたように、研究対象の規定を修正したことで、調査・分析の対象が広がったが、年度内に対応し、投書の計画を実現する予定である。
固体フッ素源を用いた遷移金属フッ素化合物の合成とストイキオメトリー

フッ化物は、応用分野において重要な役割を担っているが、その合成の困難さゆえにその機能開拓がまだ不十分である。本研究では、新たな機能性材料の開発とその機能性を制御することを念頭に置いて、固体フッ素源を用いたフッ化物のより簡便な合成法を開発し、遷移金属フッ化物の探索を行う。また、固体フッ素源を用いることによりフッ素量を調節した遷移金属フッ化物の合成を行い、遷移金属フッ化物におけるフッ素の組成、構造および機能性の関係を明らかにする。
金属錯体の光応答性とその作用機構

光応答性を有する配位子の合成とそれを含む金属錯体の創製を目的とした研究である。光によるシス-トランス変化を示すスチルベンを骨格に有する新しいタイプの架橋四座配位子を合成した。合成法は、まずパラートルエンカルボン酸の硫黄による酸化カップリングを行いトランス-スチルベン-4、4'-ジカルボン酸を経て、塩化チオニルにより酸クロリドを作り、N、N-ジエチルエチレンジアミンを大過剰加えることによりアミドを形成させ、最終的にLiAlH_4によってアミンに還元した。得られた配位子の構造は次のようになっており、トランス-スチルベンを架橋部位に持つ四座配位子であることがわかった:Et_2NCH_2NHCH_2(C_6H_4)CH=CH(C_6H_4)CH_2NHCH_2CH_2NEt_2=Lと略記。そこでまず、手始めに塩化銅を用いて錯体を合成したところ、CuCl_2LCuCl_2なる組成を持つ新しい錯体が得られた。この錯体は、水、アルコール類、アセトン等に良く溶け顕著なソルバトクロミズムを示した。これは、塩化物イオンの解離平衡が用いた溶媒のアクセプター性の強さに依存することによるものであることが明らかとなった。現在その定量的な平衡定数を検討しているところである。次にこの錯体に、光を照射することにより不安定なシス型の合成を試みたところ、部分的に反応していることは明らかであるが、それを単離することはできなかった。現在さらに塩化物イオンの変わりにより安定な二座配位子を含む混合錯体の合成を検討しているところである。
日系多国籍企業のコラボレーティブ経営とグローバル・アントレプレナーに関する研究

グローバル知識経済時代を迎え、日系多国籍企業には新しい経営の展開が求められている。それは世界のサプライヤー、提携パートナー、顧客、大学・研究機関などと連携するコラボレーティブ経営である。この経営の推進にはグローバル・アントレプレナーが不可欠である。この新しい研究課題について、先駆的な理論の研究と国内外での実態調査によって、日系多国籍企業の新たなビジネス・モデルにはコラボレーティブ経営とグローバル・アントレプレナーの役割を組み込むことが不可欠で、それには日本本社と海外子会社、海外子会社と現地アクターとの埋め込み関係やビジネス・エコシステムの検討も必要になることが明らかになった。本研究課題は、国際ビジネス論や多国籍企業論の分野ではフロンティア的な研究領域である日系多国籍企業の新たな成長戦略のための「コラボレーティブ経営」と、その推進役である「グローバル・アントレプレナー」との関係に関する諸問題について研究するため、まず既存の関連諸理論(グローバル競争論、新興国市場戦略論、イノベーション論、アライアンス論、組織・人材マネジメント論、国際起業家論など)の応用可能性や限界などを検討する必要がある。次に、そうした経営を展開している企業についての現状分析や実証研究のための仮設、モデル、分析フレームワークを構築する必要がある。今年度は、本研究課題に関連する諸理論をレビューし、それらの応用可能性や限界を研究するとともに、主に日系多国籍企業に対する実態調査や実証研究のための仮設、モデル、分析フレームワークの構築を試みた。この結果、日系多国籍企業の新たな成長のためのビジネス・モデルに関し、イノベーション、グローバル競争戦略、新興国市場開拓、新規事業・製品開発、人的資源開発を中心に、パイロット調査のための仮設、モデル、分析フレームワークを構築することができた。次に、これらの仮設、モデル、分析フレームワークを用いて、昨年の8月にベトナムとタイ、今年の3月にシンガポールに進出している日系多国籍企業(製造業とサービス業の企業、合計10社)を対象にパイロット調査を実施した。その調査結果については、現在整理・分析中であるが、次年度の調査研究のベースになる事実や新たな知見が得られた。今年度は、このような研究活動を通じて、その成果の一部として「新興国市場開拓のビジネス・モデルの構築に向けて」(『異文化経営研究』異文化経営学会誌、第10巻に所収)を発表した。今年度は昨年度に引き続き、本研究課題に関連する諸理論をレビューし、それらの応用可能性や限界を研究するとともに、昨年度に構築した日系多国籍企業に対する実態調査や実証研究のための仮設、モデル、分析フレームワークをもとに海外調査を実施した。昨年の9月にはベトナムとタイに所在する日系多国籍企業の製造業5社を訪問し、ヒアリング調査を実施した。また、今年の3月にはマレーシアと香港で製造業とサービス業の5社を訪問し、ヒアリング調査を実施した。これらの海外調査の結果については、現在整理・分析中であるが、日系多国籍企業の新たな成長のためのビジネス・モデルに関し、新たな事実や知見が得られ、昨年度構築した仮設、モデル、分析フレームワークの適応可能性と問題点が明らかになり、現在それらを今後の実態調査と実証研究のために、さらに精緻化しているところである。また、今年度は本研究課題の中の日系多国籍企業の組織構造や組織文化に関し、アンケート調査の実施のための仮設、モデル、分析フレームワークをも構築した。今年度は、主に過去2年間に国内外で実施した日系多国籍企業に対する実態調査によって得られた研究結果を分析・整理し、論文を作成すると同時に、それを学会で発表することに重点を置いた。これまでの研究で、日系多国籍企業が海外で新規事業・新製品を開発するためには、その海外子会社が探索的活動を行い、現地企業とコラボレートすることが不可欠で、さらに日本の派遣社員や現地人材が起業家精神を発揮することが重要で、一部の企業にはそのような活動がみられた。また、そのような活動を行う際には、日本本社と海外子会社、海外子会社と現地企業との関係(埋め込みの関係)の再検討も必要であることも明らかになった。このような問題の研究は、日系多国籍企業の新たな成長にはきわめて重要であるが、わが国ではまだほとんど行われていない。そこで、本年度はそのような経営活動を行っている企業に焦点を当て、その研究成果をケーススタディという形でも整理を試みた。その成果については、昨年9月にイタリアのベローナで開催されたEuroMed Academy of Businessの第8回国際大会で“Managing Explorative Activities and Dual Embeddedness in a Foreign Subsidiary: A Case Study in Japanese MNCs"というテーマで発表(共同)した。さらに、この研究成果の延長線上で総合商社に焦点を当て、論文にまとめ(共著)、今年6月にアメリカのニューオリンズで開催されるAssociation of Japanese Business Studiesの第28回年次大会に提出し発表する。今年3月には中国の上海で日系多国籍企業4社のヒアリング調査を行い、以上のような課題について、実証的な研究を行った。現在その整理と分析を行っているところである。本年度の研究計画の中心は、過去2年間で構築した仮説、分析フレームワーク、モデルを用いて実施した海外における日系多国籍企業に対するヒアリング調査結果をベースに研究成果をまとめ、論文を作成し、国内外の学会で発表することであった。学会発表については、昨年9月にイタリアのベローナで開催されたEuroMed Academy of Businessの第8回国際大会で行い、また今年6月にアメリカのニューオリンズで開催されるAssociation of Japanese Business Studiesの第28回年次大会で行う予定であるので、おおむね計画通りであると思う。

また、海外における日系多国籍企業のヒアリング調査から、本研究課題に近い経営活動を行っている企業を選んで、ケーススタディを行う予定であったが、製造業2社、サービス業2社について行うことができたので、これについてもおおむね計画通りである。しかし、研究計画では日系多国籍企業に対してアンケート調査も行う予定で、その調査のためのフレームワークや質問事項については作成したが、まだ実施していない。今年度実施する予定である。また、日系多国籍企業の新たな成長のためのビジネス・モデルやその理論構築についても、まだ不十分で、さらに検討が必要である。これについても、今年度の研究課題である。今年度は、過去3年間に国内外で実施した日系多国籍企業に対する実態調査の結果得られた研究成果について論文を作成するとともに、それを海外の学会で発表することに重点を置いた。これまでの研究で、日系多国籍企業の海外での新規事業・新製品開発のためのコラボレーションには、日本からの派遣社員や現地人材の起業家的活動が不可欠で、また、それには日本本社と海外子会社、およびその海外子会社と現地企業の関係の再検討も必要だということが明らかになった。すなわち、日本本社と海外子会社の埋め込み関係を弱くする一方、現地企業との埋め込み関係を強化することが、両者のコラボレーション活動を促進し、新規事業・新製品開発へとつながるのである。このような活動は、日系多国籍企業では、現在のところ製造業の企業よりもサービス産業の企業により多くみられる傾向にある。このため、今年度は主にサービス産業の企業に焦点をあてた研究も行った。昨年8月にはタイとマレーシアに進出しているサービス企業4社に対し、現地調査を実施した。この4年間の研究成果については、著書にして公表する予定で、現在その執筆中である。グローバル知識経済時代を迎え、日系多国籍企業には新しい経営の展開が求められている。それは世界のサプライヤー、提携パートナー、顧客、大学・研究機関などと連携するコラボレーティブ経営である。この経営の推進にはグローバル・アントレプレナーが不可欠である。この新しい研究課題について、先駆的な理論の研究と国内外での実態調査によって、日系多国籍企業の新たなビジネス・モデルにはコラボレーティブ経営とグローバル・アントレプレナーの役割を組み込むことが不可欠で、それには日本本社と海外子会社、海外子会社と現地アクターとの埋め込み関係やビジネス・エコシステムの検討も必要になることが明らかになった。
都市型準限界集落のソーシャルキャピタルコーディネーター育成プログラム開発と評価

高齢化が進む今日、地域の自助・互助の住民力を強め、地域特性に応じたソーシャルキャピタルの醸成が急務である。特に、都市部の郊外住宅団地で限界集落が増加しており、定年退職後の役割喪失による引きこもりや周囲からの孤立が課題となっている。研究者らは、20122013年に都市型準限界集落において、地区把握・課題分析し、健康づくりを切り口とした支援体制の仕組みづくりを行い、住民の役割意識を醸成し、世代間の交流ができる多様な活躍の場を提供するまちづくりの仕掛けが重要であることを明らかにした(眞崎直子他.日本公衆衛生学雑誌2016)。さらに、20152017年には、同地区でのセルフケアとソーシャルキャピタル向上推進プログラムの開発と評価を実施し、高齢者サロンを中心とした健康づくりに関する相談会および講座等を行い、地域のソーシャルキャピタルおよび住民の健康づくりに関するセルフケア能力、健康関連QOLを介入前後の比較およびそれらを推進する要因を明らかにすることを目的とし、評価を行っている。その結果、市全体・他地域と比較し、身体機能は低下傾向にあるものの、役割機能や社会活動に積極的であることが明らかとなった(眞崎直子他.日本公衆衛生雑誌2017)。一方、サロンに出てくることのできない地域で孤立しがちな人々への支援が困難であることが課題であった。このような援助を自ら求めない人への支援を民生委員が担っており、その業務の多忙さから負担感も大きくなっていた。本研究では、都市型準限界集落における地域の信頼関係や絆であるソーシャルキャピタルを推進していくための仕組みづくりとして何を構築するべきかを明らかにする。今年度は、WHOの「自殺を予防する地域の取り組みを促進するためのツールキット」の翻訳を行い、プログラム構築の参考とした。今後はこれを元にプログラム作成、調査研究を進めていく予定である。プログラム開発の参考となるWHO「自殺を予防する地域の取り組みを促進するためのツールキット」の英語文献を翻訳し、参考とした。今後、これを元にプログラム作成し、調査研究を進めていく予定である。現在、研究倫理審査申請中であり、承認が得られ次第、調査研究を進めていく予定である。調査研究準備のための資料整理、翻訳のためのアルバイト代等謝金が発生したため。
DNA損傷時における細胞死誘導に関わる新たな分子機構の解明

稀な劣性遺伝疾患であるファンコニ貧血の原因遺伝子産物の一つであるFANCD2は、DNA損傷(特にDNA鎖間架橋)の細胞応答及び修復に重要な機能を持つことが以前より報告されていた。本研究課題では、アポトーシスを誘導するような重度のDNA損傷に応答して、FANCD2がカスパーゼ3依存的に複数個所で切断されることを新たに見出した。また、それら切断部位の全てを特定し、それらの部位の全てに変異を導入することでカスパーゼによる切断に対して耐性を示す非切断型FANCD2を安定に発現する細胞を、FANCD2欠損細胞を親株として樹立した。非切断型FANCD2は4ヶ所に変異が導入されているにも関わらず、DNA架橋剤に対して野生型FANCD2発現細胞と同等の耐性を示した。一方、外因性DNA損傷非存在下でのアポトーシス誘導系においては、野生型FANCD2発現細胞のみが耐性を示し、非切断型FANCD2発現細胞は、親株であるFANCD2欠損細胞と同程度の高い感受性を示すことを見出した。これらの研究成果は、FANCD2がこれまで報告されているようなDNA損傷応答とは独立した機構として、アポトーシスを負に制御している可能性を示唆している。申請者は以前にファンコニ貧血原因遺伝子産物の一つであるFANCD2タンパク質がDNA損傷ストレスに応答してカスパーゼ依存的に複数か所で切断されることを見出し、そのうちの1か所を同定していた。今年度はカスパーゼに対する特異的siRNAを用いた発現抑制実験を行い、FANCD2の切断がカスパーゼ3依存的である事を実験的に証明すると共に、新たに2か所の切断部位を同定した。また、同定した部位に突然変異を導入する事によって、カスパーゼによる切断に対して抵抗性を示す「非切断型FANCD2」を安定発現する細胞株をFANCD2欠損細胞を用いて樹立した。それらの細胞を用いてDM損傷ストレスに対する応答を解析したところ、非切断型FANCD2を発現する細胞は、野生型FANCD2を発現する細胞よりも、DNA損傷ストレスに対してより抵抗性を示す事が見出された。また、同様の細胞を用いてアポトーシス誘導においても解析したところ、非切断型FANCD2を発現している細胞は、アポトーシス誘導が遅延する事も判明した。このようなFANCD2の変異によって現れるDNA損傷ストレスに対する抵抗性及び抗アポトーシス性は、これまで他に報告はなく、FANCD2がDNA架橋の修復のみではなく、アポトーシス誘導においても何らかの機能を持つ可能性を示唆するものである。これは、がん細胞の抗がん剤に対する獲得耐性の機序解明の観点からも非常に興味深い結果であると言える。申請者は前年度までにファンコニ貧血原因遺伝子産物の一つであるFANCD2が重度のDNA損傷ストレスに応答して、カスパーゼ3依存的に切断されることを見出し、そのうちの3か所の切断部位を同定した。今年度は、さらに残りの1ヶ所の切断部位を同定し、FANCD2は合計4ヶ所で切断されることを見出した。また、同定した部位の全てに突然変異を導入する事によって、カスパーゼによる切断に対して完全に抵抗性を示す「非切断型FANCD2」を作成し、これを安定発現する細胞株を、FANCD2欠損細胞を用いて樹立した。その細胞を用いてDNA損傷ストレスに対する応答を解析したところ、野生型FANCD2を発現する細胞よりも、DNA損傷ストレスに対してより抵抗性を示す事が見出された。また、同様の細胞を用いてアポトーシス誘導についても解析したところ、野生型FANCD2を発現する細胞に比べて、アポトーシス誘導が遅延する事も判明した。一方、核内で機能するFANCD2が切断されることによる細胞への影響を調べるため、FANCD2の最もC末端側に位置するカスパーゼ切断部位に終止コドンを導入し、カスパーゼ切断を擬したC末端欠損FANCD2を安定発現する細胞株を樹立した。しかし、この変異型FANCD2は核内での発現が認められず、その影響を見るに至らなかった。そのため、核内で機能的なFANCD2を任意のタイミングで切断可能にするために、TEVプロテアーゼ切断モチーフを上述の非切断型FANCD2に導入した新たな変異型FANCD2を安定発現する細胞株を樹立した。この細胞は、野生型FANCD2発現細胞と同程度のマイトマイシンC抵抗性を示し、核内で機能的であることが確認された。

現在は、DNA損傷ストレスのない条件下で、TEVプロテアーゼによってFANCD2を切断した時の細胞への影響を解析中である。研究代表者は前年度までにファンコニ貧血症の原因遺伝子産物の一つであるFANCD2が、重度のDNA損傷ストレスに応答してカスパーゼ3依存的に切断されることを見出し、最終的に合計4箇所の切断部位を同定するに至った。また、同定した部位の全てに突然変異を導入する事によって、カスパーゼによる切断に対して抵抗性を示す「非切断型FANCD2」を作成し、これを安定発現する細胞株をFANCD2欠損細胞を用いて樹立した。その細胞を用いてDNA損傷ストレスに対する応答を解析したところ、非切断型FANCD2を発現する細胞は4箇所の変異を持つにも関わらず、野生型FANCD2を発現する細胞と同程度のDNA損傷ストレス抵抗性を示す事が見出された。つまり、アポトーシスの下流で機能するカスパーゼ3によるFANCD2切断を阻害しても、DNA損傷修復に関しては大きな影響を及ぼさないと考えられる。一方、外因性DNA損傷ストレスの非存在下でのアポトーシス誘導に対する応答を解析するため、TNFαとシクロヘキシミド処理によりアポトーシスの上流で機能するカスパーゼ8を活性化させアポトーシス誘導を行った。その結果、野生型FANCD2を発現する細胞のみが有意にアポトーシス抵抗性を示すことが見出された。今回用いたアポトーシス誘導系がカスパーゼ8の活性化によることから、非切断型FANCD2発現細胞が親株のFANCD2欠損細胞と同程度の高いアポトーシス感受性を示したのは、導入された変異によって野生型FANCD2が有するアポトーシス誘導の上流において働く何らかの機能が失われたためと推察される。これらの結果は、これまでFANCD2の機能として一般的に提唱されているDNA鎖間損傷応答とは独立した「負のアポトーシス制御機能」の存在の可能性を示唆するものである。これらの結果は、これまで他に報告がなく大変興味深い研究成果と言える。カスパーゼ3によるFANCD2切断部位全4ヶ所の同定や、非切断型FANCD2導入による細胞への影響の解析など、おおむね研究計画通りに解析は進行しており、重度のDNA損傷に応答したFANCD2の新たな翻訳後制御が明らかになりつつある。24年度が最終年度であるため、記入しない。今後は研究計画に記載されている通り、重度のDNA損傷ストレス下でのFANCD2との相互作用因子の探索など、FANCD2とアポトーシスとの関わりを中心に解析を進めて行く予定である。また変更点としては、上述したように、C末端欠損FANCD2を核内で発現する細胞の樹立ができず、カスパーゼによるFANCD2切断の細胞への影響を調べることができなかったため、対応策として、核内で機能的なFANCD2を任意のタイミングで切断可能する新たな系の樹立を行っている。
シナプス可塑性の基盤となるカルシウムシグナルの可視化

シナプスにおける伝達効率の長期的変化の1つの形態としてLTP (long term potentiation)がある。LTPによりシナプス伝達効率が上昇するに伴い、シナプスの体積が大きくなることが知られている。そのメカニズムとして細胞骨格(アクチン繊維)が再構成されることが報告されている。LTPを誘導する刺激が入ると、(1)シナプス内のカルシウムイオン濃度の上昇、(2) CaMKII (calcium-calmodulin-dependent kinase type II)の活性化、(3) CaMKIIによるRho1タンパク質の活性化、(4)アクチン繊維ネットワークの再構成、が順次起こるとされている。しかしながら、この過程の時空間的動態は未解明である。本課題では、(3)から(4)を媒介するN-WASPの活性化に注目した。まず、N-WASPの活性を可視化するためFRETプローブ(N-WASP intramolecular sensorsおよびN-WASP/Arp2-3 inter-molecular sensors)の開発に取り組んだ。多くのプローブの作製と培養細胞を用いたスクリーニングを繰り返し、N-WASP活性化刺激に対して高い応答を示すプーブを得ることに成功した。本プローブ群を用いたLTP誘導時のN-WASP活性化の可視化解析は、京都大学医学部(林康紀研究室)にて行った。脳スライスにプローブを導入し、LTPを誘導した際のN-WASP活性化の時空間パターンを蛍光寿命顕微鏡FLIMを用いて検討した。LTPのトリガーとなるカルシウムイオン濃度変化からN-WASP活性変化、アクチン繊維変化、スパインの形態変化を包括的に解析することに成功した。N-WASPセンサーの開発と改良により、in vivoにおける神経シグナル伝達の理解促進が期待される。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
転写因子Sox9の新規転写コファクターの同定とその機能的役割の解明

骨格の大部分を形成する内軟骨性骨化は、未分化間葉系細胞から分化誘導された軟骨細胞により遂行される。軟骨細胞分化過程においては転写因子Sox9が必須的役割を担うことから、本研究ではSox9の転写活性を調節する転写コファクターの検索を行いp54^<nrb>およびDmrt5を同定した。p54^<nrb>はSox9のスプライシング因子として内軟骨形成を制御すること、またDmrt5は軟骨細胞分化のみならずSox9依存性の性分化にも関与していることを見出した。本研究より、我々の構築したスクリーニングシステムの有効性とそれにより得られたSox9新規転写コファクターの生物学的重要性が明らかとなった。転写因子Sox9の新規転写コファクターの同定とその解析を行った結果以下のような研究結果が得られた。1、Sox9の標的遺伝子であるII型コラーゲンのプロモーター領域を用いたスクリーニングシステムを構築し、軟骨細胞用細胞株ATDC5より作成した完全超cDNAライブラリーを用いて網羅的スクリーニングを行った。スクリーニングされた遺伝子の中にはWntやSox5などの軟骨細胞分化における重要性が既知である遺伝子が検出されたことから、スクリーニングシステムは有効であると考えられる。2、スクリーニングされた遺伝子の中で新規性が高く、かつ転写因子に属する遺伝子を選び出し、Sox9の転写活性に対する効果を検討した。最終的に、Sox9の転写活性を強く増強する遺伝子を同定し、Sox9 Activating Factor(SAF)と名付けた。3、そのうちの一つであるSAF1は精巣や胎生15.5日齢の四肢などSox9が生物学的に重要な組織に強く発現していることが明らかとなった。4、SAF1はSox9と物理的に結合して協調的に作用することにより軟骨細胞分化を促進することが明らかとなった。さらに精巣でのSox9標的遺伝子であるミューラー管阻害因子(MIS/AMH)に対しても同様の効果を示すことを見出した。したがって、SFA1はSox9の共役転写因子として機能していることが明らかとなった。5、さらに詳細な解析の結果からSAF1とSox9の結合には、SAF1のC末端領域が重要であることが明らかになった。現在SAF1のin vivoにおける重要性を明らかにするために軟骨細胞特異的にSAF1を過剰発現させるトランスジェニックマウスの作成を行っているところである。1、本年度は平成19年度にスクリーニングされた因子についてさらに詳細な解析を行った2、その中で転写因子p54^<nrb>は胎生15.5日齢の四肢および成長板軟骨などSox9が生物学的に重要な組織に強く発現していることが明らかとなった。3、p54^<nrb>はSox9と物理的に結合し転写活性を著明に増強させたのみならず、Sox9依存性の軟骨細胞特異的遺伝子のスプライシング制御に深く関与することを見出した。また構成的不活性型p54^<nrb>を過剰発現させたトランスジェニックマウスは軟骨細胞の機能不全による成長障害を示した。これらの結果より、内軟骨性骨形成におけるp54^<nrb>の生物学的重要性を明らかにした。4、上記のp54^<nrb>の他に、DMドメインを有する新規の転写因子をクローニングしており、現在この遺伝子についての詳細な検討を進めている。この遺伝子は軟骨組織のみならず胎生期の精巣にも強く発現していることを見出した。今後さらに検討を進めていく予定である。1、本年度は平成20年度にスクリーニングされた因子をさらに詳細に検討するために、Sox9が重要な役割を演じる性分化過程での標的遺伝子ミューラー管阻害因子(MIS/AMH)のプロモーター領域を用いたレポーターアッセイによる二次スクリーニングを行った。その結果、性分化過程および軟骨形成過程の両方においてSox9の転写活性を促進する転写因子Dmrt5のクローニングに成功した2、Dmrt5はSox9と物理的に結合し転写活性を著明に増強させた。さらに、Dmrt5遺伝子徳的な抗体を作製し免疫組織学的検討を行った結果、Dmrt5は増殖軟骨層ならびにE14.5日齢の精巣に強く発現している事を見出した。3、また構成的不活性型Dmrt5(DN-Dmrt5)を作製しその効果を検討したところ、DN-Dmrt5は軟骨細胞分化ならびにMIS/AMHの発現を著明に抑制した。
リポ蛋白質の相反する作用の決定因子としてのリゾリン脂質シグナル分子

リポ蛋白質に含まれるリゾリン脂質の抗動脈硬化作用を調べた。血管内皮細胞では、HDLによる抗動脈硬化作用の一部はスフィンゴシン1-リン酸(S1P)/S1P受容体とアポA/スカベンジャー受容体(SR-BI)の二つの経路で媒介された。LDLはシグナル伝達系の一方であるアポA/SR-BI系を抑制し、S1P/S1P受容体系は抑制しなかった。HDL中のS1Pによる抗動脈硬化作用はLDLで抑制されなかった。血漿リポ蛋白質は動脈硬化症など血管病に密接に関係していることが知られている。たとえば、低密度リポ蛋白質(LDL)は動脈硬化性に、一方、高密度リポ蛋白質(HDL)は抗動脈硬化性に作用する。これらのリポ蛋白質作用はコレステロール代謝と深く関連しているが、最近の研究ではコレステロール代謝に関連しないリポ蛋白質作用も血管機能と密接に関連していることが指摘されている。しかし、LDLとHDLがどのようなメカニズムで相反する作用を発揮するかは不明の点が多い。本研究では血漿リポ蛋白質中のリゾリン脂質分子のバランス変化がこれらの相反する作用を説明する可能性を検証する。健常者ボランティアより血液を採取し、血漿を密度勾配遠心法で分離した各種リポ蛋白質中、あるいは血漿中のS1P、LPAのバランスを調べた。また、LDLとHDLの動脈硬化性(血管平滑筋細胞における細胞遊走促進活性)ならびに抗動脈硬化性(血管平滑筋細胞における細胞遊走抑制活性、血管内皮細胞における細胞遊走促進活性、NOS活性化、細胞接着抑制活性)の活性との関係を調べた。血漿におけるサンプル取り扱いに難しさがあり、実験手順の煩雑さを解消し、スムーズに各実験を行っていく必要があることがわかった。検査として成立させるためには多数のサンプルを一度に処理できる方法の確立が必要なこともわかった。したがって、調製直後のLDLから保存可能なLPA、S1P画分を調製した後にこれらの一連の実験を行うことでも同様な結果がでることを検討して、その後、本研究で確立した方法を用いて、複数の血管機能疾患患者から得られた血漿について同時に解析し、それらのデータを基に、S1P、LPAのバランス変化が動脈硬化症などのバイオマーカーとなるかどうかを検証していく。したがって、調製直後のLDLから保存可能なLPA、S1P画分を調製した後にこれらの一連の実験を行うことでも同様な結果がでることを検討して、その後、本研究で確立した方法を用いて、複数の血管機能疾患患者から得られた血漿について同時に解析し、それらのデータを基に、S1P、LPAのバランス変化が動脈硬化症などのバイオマーカーとなるかどうかを検証している。また、血管内皮細胞において、HDLの抗動脈硬化作用に対して、LDLがどのように働くかを調べたが、HDLがLDLと競合して抗動脈硬化作用を発揮していることが示唆された。健常者ボランティアより血液を採取し、血漿を密度勾配遠心法で分離した各種リポ蛋白質中、あるいは血漿中のSIP、LPAのバランスを調べた。SIPはHDLに、LPAはLDLに多く分布していた。