hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
生殖内分泌制御系を介した新規分子の骨代謝制御への関わり

性周期制御におけるPRIPの機能解析とともに骨代謝制御への関わりを解明することを目的として本研究を遂行した。その結果、PRIPが性周期制御に関わるホルモンの分泌制御に関与し、そのことを介して、或いはさらに別の経路を介して、卵の成熟過程においてPRIPがその制御に機能していることが明らかになった。また、PRIPノックアウトマウス(PRIP-KOマウス)では、生殖系ホルモンのアンバランスによる骨量の減少が予想されたが、予想に反して骨密度や骨量の増加が認められ、これはホルモンによらない経路を介してPRIPが骨代謝制御に関与していることを示唆した。さらに解析を進めたところ、PRIP-KOマウスでは骨形成が亢進する一方で骨吸収が低下しているため、骨量の増加という表現型を呈することが判明した。これらのことから、PRIPは骨形成において抑制的に働くことが示唆された。骨代謝制御における新規分子PRIPの役割解明を目的として,初年度は以下の解析を行い結果を得た。野生型、PRIPノックアウト(KO)マウスについて、個体毎に体量および生殖に関わる器官(下垂体、子宮、卵巣、精巣)について、大きさ、形態、重量等を計測し、比較検討した。その結果、下垂体、卵巣、精巣の形態や重および体重には差がなかったが、子宮においては野生型に比べPRIP-KOマウスでその大きさや重量が小さいことが分かった。そこで子宮組織断面のHE染色を行ったが、両者で特に違いは見られなかった、野生型に比べPRIP-KOマウスで血中の性腺刺激ホルモン量が高植であったことを踏まえ、摘出した下垂体前葉を組織培養し、無刺激及びGnRH刺激時の分泌量を検討したところ、いずれの場合もPRIP-KO下垂体前葉において野生型の2倍以上の分泌量が見られた。次に、3、6、12ヶ月齢のメスの野生型およびPRIP-KOマウスより調製した大腿骨の組織学的解析を行った。その結果、特に6ヶ月齢において野生型に比べてPRIP-KOマウスでは酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ(TRAP)染色陽性の破骨細胞数がやや多く、これは性腺刺激ホルモン・性ホルモンのアンバランスから想定された通りであった。しかし、HE染色による骨芽細胞数の比較においてもPRIP-KOマウスの方が多い傾向が観察された。更に、μCTを用いた3次元計測では、海綿骨において野生型に比べPRIP-KOマウスで骨量や骨梁の幅、単位長あたりの骨梁数が多かった。これらのことから、PRP-KOマウスでは、骨芽細胞、破骨細胞ともに数が増加し、特に機能的な骨芽細胞の増加、あるいは機能的破骨細胞の減少などによって骨代謝が亢進し骨量が増加している可能性が示唆された.骨代謝制御における新規分子PRIPの役割解明を目的として,2年目は以下の解析を行い結果を得た。・下垂体前葉細胞において、受容体へのGnRHの結合か引き起こすシクナル伝達から性腺刺激ホルモン(LH,FSH)の分泌に至るまでの過程で、PRIPがどのステップに機能しているかを検討した。下垂体前葉から精製されたRNAおよび蛋白質を用いた性腺刺激ホルモンのqRT-PCRおよび蛋白質量測定を行ったところ、転写レベルでのLH、FSH量は、野生型およびPRIP-KOマウス間で差はなく、蛋白質レベルで下垂体前葉内に残る性腺刺激ホルモン量に差があることが分かった。つまり、野生型およびPRIP-KOマウスにおいてホルモンが同等量発現しているにも関わらず分泌量に差があるということで、細胞内でホルモン産生後分泌に至る過程でPRIPの有無が影響していることが示唆された。・大腿骨を用いたμCTによる解析において、野生型に比べPRIP-KOマウスで骨量増加が見られたので、生殖系ホルモンの影響を受けて生じた差なのかどうかを調べるために、卵巣摘出マウスを作製して骨量を測定した。その結果、ノックアウトマウスでは、卵巣を摘出しても骨量の減少が野生型ほど見られなかった。つまり、PRIP-KOマウスにおける骨量増加は、生殖系ホルモンが関与しない別の制御機構によるものと考えられた。・カルセイン2重標識による骨形成能の解析を行ったところ、PRIP-KOマウスにおいて骨形成速度の増加が見られた。これらのことから、PRIPは骨代謝の中でも特に骨形成制御においてより機能していることが示唆された。骨代謝制御における新規分子PRIPの役割解明を目的として,今年度は以下の解析を行った。

・野生型及びPRIP-KOマウスの頭蓋冠から調製した骨芽細胞前駆細胞に、BMP刺激を加え骨芽細胞への分化における両者の違いを検討した。PRIP-KOマウスでは分化した骨芽細胞の数が多く、アルカリホスファターゼ(ALP)活性も高く、また骨形成速度が亢進していることが分かった。・PRIP-KOマウスでは骨芽細胞の分化能が高いことが予想されたので、骨芽細胞分化・骨形成に重要な転写因子Smadのリン酸化レベルを計時的に追ったところ、リン酸化の延長が認められた。また、オステオカルシンやId1などの骨形成関連因子の発現を見たところ、いずれもPRIP-KOマウスで発現量が亢進していた。・マウス大腿骨の組織学的解析および初代培養細胞を用いた生化学的解析から、破骨細胞の細胞数もやや多い傾向にあり、酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ(TRAP)活性も相応の値であったが、通常より核数の多い大きな破骨細胞が認められた。・破骨細胞の初代培養を用いたpit assayでは、野生型に比べPRIP-KOマウスでは分化した破骨細胞数はやや多いくらいであったが、破骨細胞の吸収窩は野生型の半分以下であった。また、破骨細胞機能に重要なアクチンリングのサイズが小さく数も少なかった。破骨細胞分化に重要なOPGの発現は減少している一方、RANKLの発現は増加していた。これらのことから、PRIP-KOマウスでは、骨芽細胞への分化が促進しているために骨形成が亢進している一方、正常な機能を有する破骨細胞が少ないために骨吸収が低下しており、結果として骨量増加に至るものと考えられた。つまり、PRIPは骨形成に抑制的に働く分子であると結論した。
充腹構造断面の空力振動の発生機構に関する研究

本研究は,構造物の充腹断面に生じる各種空力振動現象を,断面前縁部から生じる剥離せん断層のふるまいに着目してとらえ,風洞実験,水槽実験により得られる,流れのパターン,振動応答特性,非定常空気力特性,圧力分布等のデータにより,その発生機構を検討することを目的としている.具体的研究調査項目としては,以下のようである.1.剥離せん断層の不安定性の外的刺激による振動挙動,流れのパターンへの影響調査2.空力振動時の非定常圧力分布測定結果を用いた流体一振動系のエネルギー授受,剥離せん断層の非定常性と非定常圧力分布との関連性の調査3.各種空力振動現象の発生機構に対する剥離せん断層の役割と防振・〓振対策面で優れた断面形状に対する検討本研究ではとくに,矩形断面のギャロッピング振動に着目し,主流方向の微少風速変動を含む脈流気流中,格子乱流気流中など数種類の気流の作用下において,ギャロッピング振動応答特性,変化,非定常空気力,定常空気力特性の変化に検討を加え,同一変動気流中であっても,断面辺長比によって空力諸特性の変化の様子が異なり,剥離せん断層とギャロッピング振動との関連,および気流の乱れの効果を検討する際,断面辺長比のもつ重要性が明らかとなった.また,各種辺長比を有する矩形断面の非定常抗力特性も,脈流気流中において計測され,剥離せん断層の非定常性この関連性が検討された.本研究は,構造物の充腹断面に生じる各種空力振動現象を,断面前縁部から生じる剥離せん断層のふるまいに着目してとらえ,風洞実験,水槽実験により得られる,流れのパターン,振動応答特性,非定常空気力特性,圧力分布等のデータにより,その発生機構を検討することを目的としている.具体的研究調査項目としては,以下のようである.1.剥離せん断層の不安定性の外的刺激による振動挙動,流れのパターンへの影響調査2.空力振動時の非定常圧力分布測定結果を用いた流体一振動系のエネルギー授受,剥離せん断層の非定常性と非定常圧力分布との関連性の調査3.各種空力振動現象の発生機構に対する剥離せん断層の役割と防振・〓振対策面で優れた断面形状に対する検討本研究ではとくに,矩形断面のギャロッピング振動に着目し,主流方向の微少風速変動を含む脈流気流中,格子乱流気流中など数種類の気流の作用下において,ギャロッピング振動応答特性,変化,非定常空気力,定常空気力特性の変化に検討を加え,同一変動気流中であっても,断面辺長比によって空力諸特性の変化の様子が異なり,剥離せん断層とギャロッピング振動との関連,および気流の乱れの効果を検討する際,断面辺長比のもつ重要性が明らかとなった.また,各種辺長比を有する矩形断面の非定常抗力特性も,脈流気流中において計測され,剥離せん断層の非定常性この関連性が検討された.
歯元研削による表面硬化歯車の強度向上と破壊力学に基づくその評価法

1.SCM415およびSNC815材で試験歯車を作製した.試験歯車の主要諸元はモジュ-ル5,歯数18,歯幅8mmである.2.上記歯車に浸炭焼入れ処理を施した.有効浸炭深さはAGMAの推奨値を参考にして0.9mmとした。浸炭後に硬さの深さ方向分布を測定し,有効浸炭深さが所定の設計値にほぼ等しいことを確認した.3.SNC815歯車については通常の浸炭焼入れの他に,浸炭後に二段焼入れを施した試験歯車も用意した.これは通常の熱処理法と比較して組織が微細になり強度向上に効果があると考えたためである.4.SNC815歯車の曲げ疲労強度は約1090MPaであり,SCM415歯車の疲労強度より約200MPa高い.二段焼入れの場合疲労強度は約900MPaで,当初の予想と異なり強度向上の効果が認められなかった.二段焼入れの熱処理温度が適切でなく,表面に異常層が生じたことが原因と思われる.これに関して,研究者の提案した方法で初期き裂長さを求めて検討している.5.研究者らは主としてSCM材浸炭歯車について曲げ疲労強度を硬さと残留応力から推定する実験式を得ているが,SNC歯車の場合を概ねその実験式で強度を推定できることを確かめた.6.SCM415浸炭歯車の歯元のき裂進展をシミュレ-トし,この結果を用いて初期き裂長さを求め,歯元の異常層厚さと関連づけて論議した.7.表面硬化歯車の強度向上のための後処理加工として,ショットピ-ニングと化学研磨に注目して処理条件を決定した.浸炭焼入れを施した歯車をいくつかのグル-プに分け後処理加工条件を変えた試験歯車を作製した.現在疲労試験と破壊力学に基づく考察を行っている.8.浸炭層を模した曲げ試験片を作製した.AE法とき裂進展測定を併用して,き裂発生時期と発生条件,進展特性などを明らかにし,後処理加工による強度向上の機構を定量的に考察する研究を進めている.1.SCM415およびSNC815材で試験歯車を作製した.試験歯車の主要諸元はモジュ-ル5,歯数18,歯幅8mmである.2.上記歯車に浸炭焼入れ処理を施した.有効浸炭深さはAGMAの推奨値を参考にして0.9mmとした。浸炭後に硬さの深さ方向分布を測定し,有効浸炭深さが所定の設計値にほぼ等しいことを確認した.3.SNC815歯車については通常の浸炭焼入れの他に,浸炭後に二段焼入れを施した試験歯車も用意した.これは通常の熱処理法と比較して組織が微細になり強度向上に効果があると考えたためである.4.SNC815歯車の曲げ疲労強度は約1090MPaであり,SCM415歯車の疲労強度より約200MPa高い.二段焼入れの場合疲労強度は約900MPaで,当初の予想と異なり強度向上の効果が認められなかった.二段焼入れの熱処理温度が適切でなく,表面に異常層が生じたことが原因と思われる.これに関して,研究者の提案した方法で初期き裂長さを求めて検討している.5.研究者らは主としてSCM材浸炭歯車について曲げ疲労強度を硬さと残留応力から推定する実験式を得ているが,SNC歯車の場合を概ねその実験式で強度を推定できることを確かめた.6.SCM415浸炭歯車の歯元のき裂進展をシミュレ-トし,この結果を用いて初期き裂長さを求め,歯元の異常層厚さと関連づけて論議した.7.表面硬化歯車の強度向上のための後処理加工として,ショットピ-ニングと化学研磨に注目して処理条件を決定した.浸炭焼入れを施した歯車をいくつかのグル-プに分け後処理加工条件を変えた試験歯車を作製した.現在疲労試験と破壊力学に基づく考察を行っている.8.浸炭層を模した曲げ試験片を作製した.AE法とき裂進展測定を併用して,き裂発生時期と発生条件,進展特性などを明らかにし,後処理加工による強度向上の機構を定量的に考察する研究を進めている.
中英語頭韻詩における口承様式の定型表現

この研究は、中英語頭韻詩(Middle English Alliterative Verse)の韻律について、現代言語学と伝統的書誌文献学を融合した韻律研究方法により分析したデータと研究成果の集大成である。頭韻の制約の中で、音の繰り返しの意義と、語の組み合わせ、すなわちcollocation(連語)が果たす役割について考察し、中英語の韻文や散文に口承様式の定型表現が存在したか解明を試み、主立った中英語頭韻詩の分析データを蓄積することができた。そのデータを更に多面的に分析して中英語頭韻詩の特徴ごとに検索しやすく編集し、定型表現のように繰り返し登場する同一あるいは酷似したcollocationが、韻律の枠組みの中でどのように機能しているかを考察した。報告書では研究の基礎となる先行研究と英語史、英語音韻の特徴について説明した後、4つの研究成果を紹介した。これまでの研究成果は、国内学会での研究発表3編、国際学会での研究発表4編、国内外の学術誌に発表した論文9編である。中英語は、複雑な音韻変化、語形変化の単純化、おびただしい数のロマンス語語彙の借用など言語自体複雑な様相を呈するうえ、ヨーロッパの歴史的社会的背景がさまざまに絡み、古英語より解明が難しいとされている。そのため、中英語頭韻詩の韻律研究は、古英語頭韻詩の韻律ほどには研究者の合意を見ていない。本研究では、近年盛んになったコーパスを用いて頻度や総合的分類から研究する方法を用い、繰り返し登場する一定の語のcollocationに注目し、それぞれの作品の中で口承様式の定型表現を集め、音韻と統語の関係を明らかにした。また、個々の作品の特徴と全体に共通するテンプレートを明示することで13世紀から15世紀のあいだに英語文芸活動が頭韻詩において表現しようとした繰り返し表現の意義を明らかにし、言語変化の再構築に迫ることができた。中英語(Middle English)頭韻詩における音の繰り返しの意義、文芸手法として果たす言葉の役割について、特に中英語の韻文や散文に口承様式の定型表現が存在したか、に関する研究で行った今年度の実績は以下のとおりである。1)研究休暇を利用して4月から12月までオックスフォード大学英語科の研究員として英国に滞在し、英国の研究者及び客員としてオックスフォードに滞在中の欧米の研究者と意見交換ができた。またオックスフォード英語科図書館、各コレッジ図書館、オックスフォード大学コンピューティングセンター、大英図書館(ロンドン)、ノッティンガム大学図書館、ダラム大学図書館、など英国各地の大学図書館で、関連の図書、雑誌論文、写本、ファクシミリ版、CD-ROM版などを収集した。また11月には米国へ渡り、ハーバード大学、ボストン大学、イェール大学、ニューヨーク州立大学、コロンビア大学等の図書館でも写本関連の資料と絶版になっている出版物のコピーを入手した。2)2回の国際学会と1回の国内学会で研究発表をし、米、英、日の研究者と意義深い意見交換ができた。同年9月「中英語頭韻詩における定型表-同一句の繰り返しと慣用的語順」英語史研究会第10回記念大会、九州大学3)以下の論文3編を海外誌2誌と大学紀要に投稿し、大学紀要には掲載が決定している。4)データベースの作成は順調に進んでいるが、テクストの入力と語順の分類に意外と時間と手間を取ることが分かった。今年度購入予定だったMiddle English Dictionaryは、もうじきデジタル形式で入手可能になるので115分冊に印刷されたのを今購入するのはあまり意味がないということが分かり、来年度以降デジタル版で入手しデータベースに辞書からの情報も取り込む予定である。

中英語(Middle English)頭韻詩における音の繰り返しの意義、文芸手法として果たす言葉の役割について、特に中英語の韻文や散文に口承様式の定型表現が存在したか、に関する研究で行った今年度の実績は以下のとおりである。1.2度海外へ出かけ欧米の研究者と意見交換ができた。7月にはローマ国立図書館及びローマ市内の大学図書館で、関連の図書、雑誌論文、写本、ファクシミリ版、CD-ROM版などを収集した。また8月には米国で開催されたロマンス学会に行き研究発表やシンポジウムを聴き、大学図書館でも写本関連の資料と絶版になっている出版物のコピーを入手した。3.テクストの入力と語順の分類に意外と時間と手間を取ることが分かったが、データベースの作成は順調に進んでいる。中英語頭韻詩における語の並び方を、行全体、後半行ごとに分析したものと、後半行の最初に来る語とその品詞により並べ替えたものと、ひとつの作品につき4種類のデータを用意し、定型表現といえる繰り返しの使われ方があるか詳細に調べている。来年度はこのデータ収集を夏までに終わらせ、分析の作業、論文に仕上げる作業に取りかかりたいと計画している。1.7月に英国リーズで開催された国際中世学会で研究発表を行った。発表題、"Habitual Use of Certain Syntactic Structures in the SecondHalf-Line of Middle English."セッションの司会を務めたブリストル大学Ad Putter教授とは、2003年米国カラマズーの国際中世学会で研究発表をして以来の再会となり、中世英語の音韻やリズムについて意見の交換ができた。学会の前後で訪れたオックスフォード、エジンバラ、ロンドンでは図書館を巡り資料収集ができた。2.7月後半は、京都大学大学院で中英語頭韻詩についての集中講義を行った。大学院と学部4年生で、この種の特別講義にしては多くの参加があり、文学、言語学、文献学、辞書学などの観点から古英語、中英語、特に中英語頭韻詩を分析し、若い人たちの反応から学ぶところが多かった。また8月末には国際基督教大学大学院言語学セミナーで特別講演をし、英語の歴史と現代言語学の在り方について、この科研費研究でおこなっているデータ分析の方法と背景となる理論について説明した。中英語頭韻詩は、日本ではまだ研究者が少ない分野であるが、こういう機会を通して若手研究者への啓蒙活動ができた。3.テクストの入力と語順の分類は順調に進み、少し対象範囲を広げようと考えている。来年度は最終のまとめの年であるから、全データの分析と統合、議論の構築がこれからの課題である。
AICDにおけるIL-6依存性Fasリガンド発現抑制効果の機構解析

IL-6は細胞の増殖、分化、死などの様々な生理活性を呈する多機能サイトカインである。我々はIL-6サイトカインのシグナル伝達分子であるgp130に点変異を導入したF759マウスがリンパ球依存性の関節炎を発症することを明らかにした。このF759マウスには活性化T細胞の蓄積が認められ、IL-6添加によるAICD(activation-induced cell death)の減弱がin vitroで認められた。さらに、スーパー抗原であるSEBのマウス腹腔内投与によりSEB応答性のVb 8 CD4 T細胞のin vivoにおけるAICDもF759マウスでは顕著に抑制された。そこで我々はSEB刺激によるVb 8 CD4 T細胞のAICDにおけるF759変異の役割を検討した。IL-6欠損マウスを用いた実験により、生体内のIL-6はAICDを抑制する効果を有し、F759マウスではその効果が亢進していることが示唆された。さらにIL-6を欠損したF759マウスを用いた実験により、このAICD抑制効果はIL-6特異的なものであることが明らかとなった。さらに骨髄移植実験、T細胞移入実験により、AICDの抑制効果はT細胞以外の造血系由来の細胞のF759点変異によるものでることが明らかになった。また遺伝子改変、抗体投与により特定の細胞分画を欠損したマウスを用いることによってAICDの抑制効果に樹状細胞が関与することが示唆された。さらにTNFαを欠損したマウスではF759変異によるAICD抑制効果が消失したことからF759マウスにおけるAICDの抑制にTNFαが必須であることが示唆された。さらに、スーパー抗原であるSEBのマウス腹腔内injectionによりSEB応答性のVb8CD4 T細胞のin vivoにおけるAICDもF759マウスでは顕著に抑制された。そこで我々はSEB刺激によるVb8CD4 T細胞のAICDにおけるF759変異の役割を検討した。IL-6欠損マウスを用いた実験により、生体内のIL-6はSEBによるAICDを抑制する効果を有し、F759マウスではその効果が亢進していることが示唆された。さらにIL-6を欠損したF759マウスを用いた実験により、このAICD抑制効果はIL-6特異的なものであり、他のIL-6ファミリーサイトカインでは代償されないことが明らかとなった。T細胞移入実験によりF759マウスにおけるAICDの減少効果はT細胞自体のF759点変異によるものではなく周囲の環境の異常によるものであることが明らかとなった。さらに骨髄移植実験により、AICDの抑制効果は造血系由来の細胞のF759点変異によるものであり、非造血系細胞におけるF759点変異は必要ないことが示唆された。現在、どの細胞分画のF759点変異によってAICDが抑制されるのかを明らかにするために、細胞分画欠損マウス、細胞移入実験等を遂行している。
衝撃応答スペクトラムの事前予測および調整を可能とする衝撃試験法の開発

ロケットの各部分離や人工衛星の太陽電池パドル,アンテナ等の展開では,保持部分のひずみエネルギーが瞬時に解放されるため大きな衝撃が発生する.そのため,宇宙機は打上げ前に,システム全機での分離部作動試験で動作の健全性と共に,搭載機器の衝撃耐性を確認している.各搭載機器は,システム全機試験での不具合発生による手戻りを防ぐため,システム組立前に機器単体で耐性を確認する必要がある.この場合,一般的には,実環境と異なる代替的手法で機器に衝撃が印可される.代替的手法はシステム全機の試験よりも数桁低いコストで行える半面,衝撃応答スペクトラムの「予測」と「調整」のどちらもが不完全である.本研究では,部分構造合成法を用いて衝撃応答を予測する手法の検討を行う.また,錘を平板に落下(衝突)させて発生した衝撃を搭載機器に伝搬させて衝撃印可させる機械的インパクト式衝撃試験法に対して,衝撃伝搬経路に衝撃応答を調整する機構を挿入することによって,応答を調整する方法を検討する.予測に関して,平成30年度においては1衝撃を印可する板構造,2衝撃レベルを調整するための構造,3搭載機器のそれぞれについて単純なモデルによって振動モデルを構築し,試験機に入力する衝撃に対して搭載機器の応答を予測する数学モデルの構築を行うと共に,衝撃試験機による実際の衝撃試験結果との比較を実施し有効性を確認した.また,調整機構については,調整機構を搭載して試験を行うための試験機の改修とそれらに関わる安全対策を施した.これらによって,今後の研究の基礎となる結果が得られた.研究全体のアプローチは以下を想定している.【2018(平成30)年度】調整機構及びダミー供試対の製作及びそれらを搭載する試験機の改修を行いそれらの構造数学モデルを構築する.また,部分構造合成法で解析的にそれら結合して衝撃応答スペクトラムを予測し,調整機構を用いて実際に衝撃試験を行える環境を構築する.【2019(令和元)年度】ハンマリング試験で取得した搭載機器の動質量(印可力と応答加速度の伝達関数)を用いて部分構造合成法による連成解析を行い,試験結果と比較して予測精度を評価する.合わせて試験時間の削減効果を見積もる.また,質量・構造が変化した場合の評価を行う.【2020(令和2)年度】供試体の質量と1次共振周波数から動質量を仮定し,予測精度・時間短縮効果の評価を行う.平成30年度は,構造数学モデルの構築の一部と試験機の改修を実施し,構造数学モデルを用いて製作すべき調整機構の特性についての検討を実施した.特性解析の中で,当初想定していた調整機構の構造が適切でない可能性が判明し,当初とは異なるアプローチも含めた再検討が必要と判断している.よって,現段階で調整機構の製作に至っておらず,進捗に対してはやや遅れが生じており,進捗の改善に向けて,作業を急いでいるところである.予測手法検討については,遅れている調整機構の検討に資するため,簡易な構造数学モデルベースでの予測方法を優先的に進め,その後,詳細モデルを用いた検討を行うこととする.本研究においては,非線形な応答が,予測に対してどの程度支配的な現象であるかを見極めることが重要である.よって,各モデルによる予測結果と実試験データとの比較を綿密に行い,予測モデルの改善を実施する.調整手法検討については,宇宙機搭載機器の質量・共振周波数の情報をもとに,必要となる調整機構の特性を求めると,調整可能となる範囲を想定よりも大きくとらなければならない可能性がある.そこで,まずは平板とゴム接着による簡易な調整機構を製作し,実現性検討を実施する.これによって,調整機構の構造と衝撃応答の関係がある程度判明すると共に,本研究の方向性を確定できると考えている.その上で,520kg程度の搭載機器に適用可能な調整機構を製作し,有効性を検証する.以上によって,現段階では研究期間の延長が必要な状況にはないと想定される.ロケットの各部分離や人工衛星の太陽電池パドル,アンテナ等の展開では,保持部分のひずみエネルギーが瞬時に解放されるため大きな衝撃が発生する.そのため,宇宙機は打上げ前に,システム全機での分離部作動試験で動作の健全性と共に,搭載機器の衝撃耐性を確認している.各搭載機器は,システム全機試験での不具合発生による手戻りを防ぐため,システム組立前に機器単体で耐性を確認する必要がある.この場合,一般的には,実環境と異なる代替的手法で機器に衝撃が印可される.代替的手法はシステム全機の試験よりも数桁低いコストで行える半面,衝撃応答スペクトラムの「予測」と「調整」のどちらもが不完全である.本研究では,部分構造合成法を用いて衝撃応答を予測する手法の検討を行う.また,錘を平板に落下(衝突)させて発生した衝撃を搭載機器に伝搬させて衝撃印可させる機械的インパクト式衝撃試験法に対して,衝撃伝搬経路に衝撃応答を調整する機構を挿入することによって,応答を調整する方法を検討する.予測に関して,平成30年度においては1衝撃を印可する板構造,2衝撃レベルを調整するための構造,3搭載機器のそれぞれについて単純なモデルによって振動モデルを構築し,試験機に入力する衝撃に対して搭載機器の応答を予測する数学モデルの構築を行うと共に,衝撃試験機による実際の衝撃試験結果との比較を実施し有効性を確認した.また,調整機構については,調整機構を搭載して試験を行うための試験機の改修とそれらに関わる安全対策を施した.これらによって,今後の研究の基礎となる結果が得られた.研究全体のアプローチは以下を想定している.【2018(平成30)年度】調整機構及びダミー供試対の製作及びそれらを搭載する試験機の改修を行いそれらの構造数学モデルを構築する.

また,部分構造合成法で解析的にそれら結合して衝撃応答スペクトラムを予測し,調整機構を用いて実際に衝撃試験を行える環境を構築する.【2019(令和元)年度】ハンマリング試験で取得した搭載機器の動質量(印可力と応答加速度の伝達関数)を用いて部分構造合成法による連成解析を行い,試験結果と比較して予測精度を評価する.合わせて試験時間の削減効果を見積もる.また,質量・構造が変化した場合の評価を行う.【2020(令和2)年度】供試体の質量と1次共振周波数から動質量を仮定し,予測精度・時間短縮効果の評価を行う.平成30年度は,構造数学モデルの構築の一部と試験機の改修を実施し,構造数学モデルを用いて製作すべき調整機構の特性についての検討を実施した.特性解析の中で,当初想定していた調整機構の構造が適切でない可能性が判明し,当初とは異なるアプローチも含めた再検討が必要と判断している.よって,現段階で調整機構の製作に至っておらず,進捗に対してはやや遅れが生じており,進捗の改善に向けて,作業を急いでいるところである.予測手法検討については,遅れている調整機構の検討に資するため,簡易な構造数学モデルベースでの予測方法を優先的に進め,その後,詳細モデルを用いた検討を行うこととする.本研究においては,非線形な応答が,予測に対してどの程度支配的な現象であるかを見極めることが重要である.よって,各モデルによる予測結果と実試験データとの比較を綿密に行い,予測モデルの改善を実施する.調整手法検討については,宇宙機搭載機器の質量・共振周波数の情報をもとに,必要となる調整機構の特性を求めると,調整可能となる範囲を想定よりも大きくとらなければならない可能性がある.そこで,まずは平板とゴム接着による簡易な調整機構を製作し,実現性検討を実施する.これによって,調整機構の構造と衝撃応答の関係がある程度判明すると共に,本研究の方向性を確定できると考えている.その上で,520kg程度の搭載機器に適用可能な調整機構を製作し,有効性を検証する.以上によって,現段階では研究期間の延長が必要な状況にはないと想定される.調整手法検討に関連して,宇宙機搭載機器の質量・共振周波数の情報をもとに,必要となる調整機構の特性を求めると,調整可能となる範囲を想定よりも大きくとらなければならない可能性があった.そこで,まずは平板とゴム接着による簡易な調整機構を製作し,実現性検討を実施することになった.これによって,調整機構の製作を2018年度から2019年度に遅らせることとなったため,物品費が想定よりも小さくなったことが原因である.2019年度には調整機構の製作を実施するため,研究期間全体としての使用計画に変更はない.
核内膜蛋白質MAN1によるBMP経路の阻害と神経化のメカニズム

我々がBMP経路の抑制因子として見出した核膜内膜蛋白質Man1は、最近になり、少なくとも培養細胞レベルではTGF-β/activin/noda1経路を抑制する因子でもあることが明らかになってきた。本研究では、in vivoにおけるMan1の役割を調べるために、Man1欠損マウスの解析を行い、昨年度は、ホモ変異胚は胎生10.5日前後に致死となること、その原因として血管新生の異常が考えられることを報告した。本年度は、この血管新生の異常が起こるメカニズムについて検討し、次のことを明らかにした。1)血管内皮特異的PECAM-1染色により、Man1欠損胚では原始血管網から成熟した血管ができるリモデリングが起こらない。2)Man1欠損胚では、BMP-Smad1/5経路の活性は野性型とほとんど変わらなかったのに対し、TGFβ1-Smad2/3経路が異常に亢進していた。3)TGFβ1-Smad2/3経路の下流のフィブロネクチン(FN)の発現が上昇し、免疫組織染色においてFNの異所性の沈着が血管周囲を含む胚全体にわたって認められた。4)Man1欠損胚では、平滑筋細胞の血管周囲へのリクルートの異常が認められた。以上の結果から、Man1はTGFβ1-Smad2/3経路を介して血管のリモデリングを制御していることが明らかになり、核膜内膜蛋白の全く新しい機能を見出すことができた。一方、培養細胞レベルではMan1の機能阻害により、BMP、TGFβ1双方に対する反応性が高まるのに対し、Man1欠損胚では、本研究開始時の予想に反し、Smad1/5経路に対するSmad2/3経路の優位性が認められた。これは、生体内におけるBMP経路とTGFβ1/Noda1経路とアンタゴニズム(拮抗作用)の存在を示唆しており、そのメカニズムの解明は今後の重要な課題である。我々は核膜内膜蛋白質MAN1が、骨形成因子(BMP)からのシグナルを仲介するSmad1/5/8と結合することによってBMP経路を抑制し、神経化に関わることをアフリカツメガエルの系を用いて明らかにしてきた。本年度は、MAN1のマウス発生過程での機能を調べるために、MAN1遺伝子が「トラップ」されたES細胞からMAN1欠損マウスを作製し、その解析を主に行った。まず、ヘテロ変異マウスでX-gal染色を行い、発生過程におけるMAN1の発現パターンを調べた。その結果、MAN1は6.5日目胚ではノードに、7.5日目胚では原条や尿膜に、10日目胚では、中枢神経系、鰓弓、膵臓原基、心球などに強く発現することがわかった。ヘテロ変異マウスは正常に発育したが、ホモ変異胚は胎生10.5日前後で致死となった。ホモ変異胚における体軸形成、神経形成の異常の有無を、種々のマーカーを用いて全胚in situハイブリダイゼーション法により検討した結果、ホモ変異胚は野生型胚に比べ著しい発育不全を示したものの、体軸の形成、神経組織のパターン形成に顕著な異常は認められなかった。一方、胎生10.5日のホモ変異胚では、原始血管網の形成は見られたが、成熟した血管の形成は認められず、血管新生過程の異常が胎生致死の主たる原因であると考えられた(投稿準備中)。MAN1の血管内皮細胞の増殖と移動に対する影響、増殖因子に対する応答性を細胞レベルで検証するために、RNAi法によりMAN1の機能を阻害した血管内皮細胞、及びポリオーマ・ミドルT抗原を用いてホモ変異胚由来の血管内皮細胞株を樹立した。これと平行して、組織特異的MAN1欠損マウスの作製を開始し、ベクターの作製とES細胞のスクリーニングのための条件検討まで終了した。また、MAN1結合蛋白のスクリーニングを行い、複数の結合蛋白の候補を得た。

これは、生体内におけるBMP経路とTGFβ1/Noda1経路とアンタゴニズム(拮抗作用)の存在を示唆しており、そのメカニズムの解明は今後の重要な課題である。
公認会計士監査,監査役監査および内部監査の関係と相互影響

今年度においては,公認会計士監査が,監査役監査および内部監査とどのような関係を有し,またどのような相互影響があるのかを検討するのに先立って,そもそも公認会計士が保証する財務諸表の質とはいかなるものであるのかについて検討した。一般に,公認会計士による監査は財務諸表の信頼性を保証するといわれるが,そこでいう「信頼性」がいかなる意味をもつ用語であるのかを明らかにするとともに,それが会計(学)の領域で用いられる信頼性とは異なった内容をもっていることを示した。さらに,現在監査基準等で規定されているゴーイング・コンサーン問題に対する公認会計士の対応を鑑みると,公認会計士による財務諸表の監査は,財務諸表の信頼性だけではなく,その目的適合性をも保証していると考えることが妥当ではないかとの観点から,さらに検討をすすめているところである。また,監査役監査および内部監査を含めた企業の内部統制が,公認会計士監査にいかなる影響を与えているのかを明らかにするため,公認会計士に対するアンケートを準備している。公認会計士が監査計画を設定する際には,監査役および内部監査を含めた内部統制を評価しなければならないが,現在計画中のアンケートでは,そうした公認会計士による評価結果が監査計画にいかなる影響を与えているのかを明らかにすることに主眼が置かれる。次年度以降,監査法人の協力も得ながら,本アンケートを実施に移すことを予定している。
霊長類劇症肝炎モデルに対するハイパフォーマンス膜を介したブタ摘出肝異種交叉灌流

1.ブタ摘出肝交叉灌流システムの機能評価体重15-24kg食用ブタより全身麻酔下、全肝を摘出した。リザーバーA(RA)、B(RB)を設置し膜型oxygenatorを介してRBと摘出肝を接続した閉鎖回路を作製した。RA内に低分子デキストラン液およびNH_4Cl、D-galactose、lidocaine、RBにはブタ血漿を各々注入し、それらの含有液が分子量7-10万の物質透過性を有するhollow fiber型透析カラム(Cascadeflo EC40W)の内・外腔を通過させる交叉灌流システムを作製した。同システムの機能評価として、灌流中、RA、RB含有液を経時的に採取、RAに混注した各物質の回路内総量を測定したところ、6時間の交叉灌流でRA、RB含有液中からNH_3 47.3±10.2%、D-galactose 89.5±1.7%、lidocaine 95.5±1.0%が除去され、また摘出肝の酸素消費が確認されたことから、6時間の交叉灌流中、摘出肝の機能維持が示唆された。併せて本研究で用いた半透膜はアルブミンを透過させ、IgMを遮断することも確認された。2.サル劇症肝炎モデルに対する同種摘出肝交叉灌流の効果体重約10kgのマカクサルは本実験の計画で指定したalpha-amanitin、lipopolysaccharideの門脈内投与では劇症肝炎が起きず、代わりに試行したD-galactosamine 1g/kgおよびlipopolysaccharide 10ug/kgの門脈内投与でも肝障害は軽度であった。そのため、現在、Pringle法を用いた2時間の全肝温阻血にて肝不全を作製、阻血解除6時間目より体外循環回路および血漿分離器を用いて上記システムとの間で交叉灌流を6時間行い、その効果判定を行っており、生存時間延長が確認されている。リザーバーA(RA)、B(RB)を設置し、膜型oxygenatorを介してRBと摘出肝を接続した閉鎖回路を作製した。同システムの機能評価として、灌流中、RA、RB含有液を経時的に採取、RAに混注した各物質の回路内総量を測定したところ、6時間の交叉灌流でRA、RB含有液中からNH_347.3±10.2%、D-galactose89.5±1.7%、lidocaine95.5±1.0%が除去され、また摘出肝の酸素消費が確認されたことから、6時間の交叉灌流中、摘出肝の機能維持が示唆された。2.ブタ劇症肝炎モデルに対する同種摘出肝交叉灌流の効果サルを用いた本実験に先立ち、同種劇症肝炎モデルに対する本システムの有効性を検討した。体重2030kgの食用ブタにalpha-amanitin 0.1mg/kg、lipopolysaccharide 1ug/kgを門脈内投与して劇症肝炎モデルを作製、薬剤投与9時間目より体外循環回路および血漿分離器を用いて上記システムとの間で交叉灌流を6時間行った。

その結果、非治療群に比較して生存時間の延長(22.3±2.7vs41.6±9.3時間、n=5、P<0.05)、循環動態の改善、および肝障害の軽減が認められた。3.今後の方針体重10kg前後のカニクイザルに対して上記方法で劇症肝炎モデルを作製、ブタ摘出肝を用いた異種交叉灌流の有効性を検討したい。1.ブタ摘出肝交叉灌流システムの機能評価体重15-24kg食用ブタより全身麻酔下、全肝を摘出した。リザーバーA(RA)、B(RB)を設置し膜型oxygenatorを介してRBと摘出肝を接続した閉鎖回路を作製した。RA内に低分子デキストラン液およびNH_4Cl、D-galactose、lidocaine、RBにはブタ血漿を各々注入し、それらの含有液が分子量7-10万の物質透過性を有するhollow fiber型透析カラム(Cascadeflo EC40W)の内・外腔を通過させる交叉灌流システムを作製した。同システムの機能評価として、灌流中、RA、RB含有液を経時的に採取、RAに混注した各物質の回路内総量を測定したところ、6時間の交叉灌流でRA、RB含有液中からNH_347.3±10.2%、D-galactose 89.5±1.7%、lidocaine 95.5±1.0%が除去され、また摘出肝の酸素消費が確認されたことから、6時間の交叉灌流中、摘出肝の機能維持が示陵された。併せて本研究で用いた半透膜はアルブミンを透過させ、IgMを遮断することも確認された。2.サル劇症肝炎モデルに対する同種摘出肝交叉灌流の効果体重約10kgのマカクサルは本実験の計画で指定したalpha-amanitin、lipopolysaccharideの門脈内投与では劇症肝炎が起きないことが判明したため、D-galactosamine 1g/kgおよびlipopolysaccharide 10ug/kgの門脈内投与で劇症肝炎モデルを作製、薬剤投与9時間目より体外循環回路および血漿分離器を用いて上記システムとの間で交叉灌流を6時間行い、その効果判定を行っている。
ＰＧＤ２産生制御による病態治療と組織再生方法の確立

本研究は、“血管透過性抑制因子として知られるプロスタグランジンD2(PGD2)の産生制御を炎症病態の治療と損傷組織における血管再生に応用すること"を目的として行った。遺伝子欠損マウスを作製して薬理学・生化学的な手法を用いて解析を行い、i)PGD2産生制御機構の解明、ii)尿中PGD2代謝産物検出方法の確立、iii)癌や肺炎に代表される炎症病態へのPGD2シグナルの治療応用、iv)PGD2シグナルを利用した血管や組織再生方法の確立に成功した。本研究は、"血管透過性抑制因子PGD2の産生制御を炎症病態の治療と損傷組織における血管再生に応用すること"を目的とする。初年度である平成22年度はi)PGD2産生制御機構の解明、ii)PGD2検出方法の確立、iii)慢性炎症病態への治療応用、について検討した。以下に各項目の研究結果を記載する。1.PGD2産生制御機構の解明:PGD2を産生する炎症性細胞にはカベオラという膜の窪み構造がある。その構造蛋白質であるCaveolin-1にPGD2合成酵素(H-PGDS)とCOX-1が細胞内のCa2+濃度の上昇に伴って結合し、効率よく基質(膜リン脂質)からPGD2を産生していることを解明した。この結合にはCaveolin-1のscaffoldingドメインが関与していた。さらに膜透過性のCaveolin-1ペプチドを合成し、投与することでPGD2の産生抑制に成功した。2.PGD2検出方法の確立:移植癌の成長や肺炎の症状増悪に伴い、PGD2の代謝産物であるPGDMの尿中への排泄量が増加することが、質量分析装置を用いた検討により明らかとなり、この病態マーカーとしての有用性が示された。3.慢性炎症病態への治療応用:PGD2が組織の慢性炎症と繊維化に及ぼす影響を、"血管透過性と病態進行との相関"に焦点をあて検討を行った。その結果PGD2の欠損が菌体成分投与による肺炎、ブレオマイシン投与による肺線維症、炎症誘発性の大腸癌の発症や進行を大幅に促進することが分かった。またこれらの症状の増悪には、各組織における血管透過性の異常亢進が伴うことを明らかにした。本研究提案では、“血管透過性抑制因子PGD2の産生制御を炎症病態の治療と損傷組織における血管再生に応用すること"を目的とする。平成23年度は、以下の3項目について明らかにした。1. PGD2産生制御機構の解明:膜たんぱく質であるCav-1のscaffoldingドメインがPGD2合成酵素(H-PGDS)に結合することで、その活性を調節していると仮説立てた。この仮説をプルダウンアッセイ法を用いて、これらのタンパク質間結合を証明した。2. PGD2検出方法の確立:肺癌の増殖に伴い、モデルマウスの尿中に排泄されるPGD2代謝産物の量が増加することを発見した。3.慢性炎症病態への治療応用: DP受容体作動薬の連続投与が、移植癌の増殖や肺の炎症を抑制することを明らかにした。骨髄細胞特異的な遺伝子欠損マウスを作成してもちいることで、これらの治療効果が血管内皮細胞のDP受容体活性が必須であることを明らかにした。4.血管再生方法の確立: PGD2の産生阻害が、血管新生を促進するメカニズムの解明を目的に実験を行った。遺伝子発現解析の結果、虚血状態に陥った組織において、PGD2産生阻害は血管新生促進因子やサイトカインの発現を上昇させることを明らかにした。本研究は、“血管透過性抑制因子PGD2の産生制御を炎症病態の治療と損傷組織における血管再生に応用すること"を目的に行った。平成24年度は、以下の項目について明らかにした。1. PGD2産生制御機構の解明と応用:膜たんぱく質であるCav-1のscaffoldingドメインの膜透過性ペプチドの作成に成功した。またこの膜透過性Cav-1の投与が単離血管内皮細胞のPGD2産生を抑制することを明らかにした。2. PG検出方法の確立:マウスのDSS誘発性腸炎やTNBS誘発性腸炎、アジュバンド誘発性リウマチモデルの尿中に排泄されるPG代謝産物の濃度測定を行い。この一部の代謝産物が、これの病態のマーカーとなる可能性があることを示すことができた。3.慢性炎症病態への治療応用: PGD2受容体作動薬の連続投与が、マウスの腸炎やそれに続く発がんを抑えることを明らかにした。一方でマウスの肺線維症に対しては大きな治療効果を示さないことを明らかにした。4.血管再生方法の確立:将来的な治療応用を見据え、新規PGD2受容体阻害剤のスクリーニング系を確立し、複数の候補物質の選択に成功した。本研究は“血管透過性抑制因子

PGD2の産生制御を炎症病態の治療と損傷組織における血管再生に応用すること"を目的とする。平成23年度は、1)PGD2産生制御機構の解明、2)PGD2検出方法の確立、3)慢性炎症病態への治療応用、4)血管再生方法の確立、の4項目について検討する予定であった。研究実施途中において、予定していた遺伝子欠損マウスの作成と繁殖が遅れたため、実験計画に遅延が生じた。しかし、現在までにマウスの作成は成功し、当初予定していたほぼすべての実験項目を完了することができた。25年度が最終年度であるため、記入しない。研究目標達成にむけ、今後(最終年度)以下の4項目について検討を終える。1PGD2産生制御機構の解明:膜融合タンパクとCav-1の機能制御ドメインを融合させた蛋白質の投与が、in vitroとin vivoの両レベルでPGD2の産生量を抑えることができるか検討を行う。2PGD2検出方法の確立:腫瘍においてPGD2代謝産物が病態マーカーとして応用可能であることを明らかにして報告した。最終年度は肺炎や肺線維症モデルなどの他の病態においての検証を進める。3慢性炎症病態への治療応用:肺炎や肺線維症に対して、PGD2受容体刺激が組織の血管透過性を抑制し、症状を緩和することを明らかにしている。これをまとめ報告するとともに発がんモデルについて検討を進める。4血管再生方法の確立:損傷や虚血に陥った組織において、血管透過性から血管新生へと繋がる分子機構として血管新生促進因子やサイトカインの発現上昇が関与しているという知見を得た。今後これらの因子の産生上昇機構を明らかにする。またこれまでの結果をまとめ報告する。
タンパク質新生の超解像・迅速追跡を志向した高輝度タグ‐プローブシステムの構築

生体高分子や代謝産物などを標的とした蛍光イメージングは非侵襲的に細胞や個体を観察可能なことから,それまで明らかでなかった細胞内イベントを解明することに役立っている。ゲノム編集技術は主にゲノム上の標的配列を特異的に切断するヌクレアーゼの作用によって修復時に変異が導入され,タンパク質のノックアウトに利用される。ここ数年でのCRISPR-Cas9の開発によって従来と比較して研究期間の大幅な短縮が実現されている。また,ゲノム上でのタンパク質配列の改変などこれまでとは異なる利用方法の実現が望まれている。本研究ではゲノム上の標的タンパク質遺伝子にタグ遺伝子を導入して,恒常的なタンパク質発現という条件下での観察手法を開発する。そのために,蛍光イメージング法とゲノム編集技術を組み合わせた,より高精度なタンパク質挙動観察の手法を確立する。これまでに開発してきたタグ-プローブシステムはタンパク質に遺伝子工学的に導入することができ,タグ-プローブペアの会合とほぼ同時に蛍光の増大が見られる。この特長を利用してタンパク質蛍光イメージングの問題点を克服するシステムを構築する。本年度は従来タグ配列として用いてきた二本鎖へリックスに環境応答性蛍光基NBDを導入し,より低分子量の1本鎖へリックスをタグ配列とするシステムの可能性を検討した。タグペプチドによる標的タンパク質機能への影響を抑制するためである。このシステムにおいてもストップトフローを利用した測定によって1秒以内での蛍光増大が確認され,細胞内にタグ融合型タンパク質を発現させた場合,プローブの導入によってタンパク質の局在解析が可能であることが示唆された。今回は核内に局在するヒストンタンパク質H2Bを対象としたが,細胞内,細胞膜表面などで発現するどのようなタンパク質にも利用できると期待できる。また,ゲノム上へのタグ組込みの可能性を引き続き検討する。29年度が最終年度であるため、記入しない。ここ数年でのCRISPR-Cas9システムの開発によって従来と比較して研究期間の大幅な短縮が実現されている。初年度ではペプチド合成によって作製したタグ,プローブペプチドを用いてストップトフロー法により蛍光増大に要する時間を測定した。タンパク質翻訳過程から局在化までを追跡するためにtet-onプロモーターをもつプラスミドを用いて細胞内で観察を行う計画を立てた。ストップトフロー装置を利用した蛍光強度変化の測定では当初予測していた通り,会合による蛍光増大が非常に早い反応であると示唆された。また,tet-onシステムで利用するタンパク質発現ベクターの構築も計画通りに行い,GPCRである(アドレナリンレセプター)ADR,ヒストンタンパク質(H2B)に赤色蛍光タンパク質mKOを融合したマーカータンパク質の発現について検討を開始した。初年度の研究実施計画では下記の項目を立てていた。下記項目2-4は実施することができたため順調な進展と評価している。1.分子進化法によるタグ配列の最適化:タグ-プローブ形成による蛍光強度増大について,その変化量を最大化するためにタグ配列全体に変異を導入したライブラリーを用いて最適化する。ライブラリーサイズ,細胞表面提示の手法などを考慮して酵母を用いた実験(yeast display法)を利用する。2.タグおよびプローブペプチドの合成と精製タグ-プローブペア形成の速度論的解析を行うためにタグペプチドとプローブペプチドをFmoc固相合成法によって合成する。プローブには環境応答性蛍光基である4-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazole(NBD)を用いる。NBDは2,3-diaminopropanoic acidと縮合し,Fmoc化して固相合成に用いる。タグは比較的長鎖であるため,2つのセグメントに分けて合成し,Native Chemical Ligation法によって連結する手法をとる。3.タグ-プローブペア形成による蛍光増大過程の解析ストップトフロー装置を設置した蛍光分光光度計を利用して,タグとプローブを混和後の蛍光増大を測定する。また温度変化による蛍光増大の違いなども確認する。4.tet-on型プロモーターを利用した転写開始制御系の構築細胞内においてタグ-プローブペアの形成を時間的に制御できることを検証する。標的タンパク質を可視化するために常に蛍光観察できる蛍光タンパク質遺伝子(monomer Kusabira Orange:mKO)をC末端側に導入する。未消化の項目として,項目1の分子進化法によるタグ配列の最適化が挙げられるが,これについては大腸菌を用いる系と並行して構築中である。

ゲノム編集技術は主にゲノム上の標的配列を特異的に切断するヌクレアーゼの作用によって修復時に変異が導入され,タンパク質のノックアウトに利用される。ここ数年でのCRISPR-Cas9の開発によって従来と比較して研究期間の大幅な短縮が実現されている。また,ゲノム上でのタンパク質配列の改変などこれまでとは異なる利用方法の実現が望まれている。本研究ではゲノム上の標的タンパク質遺伝子にタグ遺伝子を導入して,恒常的なタンパク質発現という条件下での観察手法を開発する。そのために,蛍光イメージング法とゲノム編集技術を組み合わせた,より高精度なタンパク質挙動観察の手法を確立する。これまでに開発してきたタグ-プローブシステムはタンパク質に遺伝子工学的に導入することができ,タグ-プローブペアの会合とほぼ同時に蛍光の増大が見られる。この特長を利用してタンパク質蛍光イメージングの問題点を克服するシステムを構築する。本年度は従来タグ配列として用いてきた二本鎖へリックスに環境応答性蛍光基NBDを導入し,より低分子量の1本鎖へリックスをタグ配列とするシステムの可能性を検討した。タグペプチドによる標的タンパク質機能への影響を抑制するためである。このシステムにおいてもストップトフローを利用した測定によって1秒以内での蛍光増大が確認され,細胞内にタグ融合型タンパク質を発現させた場合,プローブの導入によってタンパク質の局在解析が可能であることが示唆された。今回は核内に局在するヒストンタンパク質H2Bを対象としたが,細胞内,細胞膜表面などで発現するどのようなタンパク質にも利用できると期待できる。また,ゲノム上へのタグ組込みの可能性を引き続き検討する。前年度完了できていなかった酵母を用いたタグペプチドの分子進化実験(yeast display法)を行う。細胞表面に提示されるAga2との融合タンパク質としたプラスミドを構築して酵母に導入する。タグ融合Aga2が発現された酵母にプローブペプチドを加えるとタグ-プローブが形成された場合に蛍光が観察される。蛍光強度の高い酵母集団をフローサイトメトリーで選抜(ソーティング)して,それらの酵母から得られるタグ遺伝子情報を解析する。異なる局在を示す標的タンパク質のタイムラプス観察:これまでの検討から得られた最適条件を利用してタグ-プローブペア形成による標的タンパク質の観察を行う。細胞を1-ピレンブチレートで処理した後に観察用顕微鏡(共焦点レーザー蛍光顕微鏡(TCS SP-8,Leica)と超解像顕微鏡システム(ELYRA,Zeiss)を利用)にマウントし,プロープペプチドを加えた直後から観察を開始する。タンパク質翻訳は細胞質で開始されるため細胞質から細胞膜や核への蛍光の移行が観察されると期待される。
クリープ疲労微小き裂にフラクタル破壊力学

クリープ疲労条件化にて耐熱材料表面あるいは内部に発生・伝ぱし,材料全体を破壊に導くマルチクラックについて以下の観点から検討した。(1)内部微小クラックに関する数値シミュレーション:研究代表者らがこれまでに作成した表面微小クラックの発生・伝ぱに関するモンテカルロ・シミュレーションのプログラムを発展・改良し,材料内部に発生・伝ぱする微小クラックの数値シミュレーション用プログラムを作成した。本プログラムを用いて数値シミュレーションを行い,代表的な耐熱鋼である304ステンレス鋼の内部に発生するマルチクラックの挙動を明らかにした。(2)初期クリープ疲労損傷に関する理論解析:クリープ疲労条件下では,疲労寿命の極初期から結晶粒界上に多数のクリープ・キャビティが発生し,それが連結して1結晶粒界サイズの微小クラックを形成する。本研究では,クリープ・キャビティと材料と材料にクリープ疲労損傷量(キャビティ面積率,有効断面積率等)の関係について解説し,両関係を定式化した。これは,今後実施する予定のフラクタル解析の理論的基板となる。(3)内部微小欠陥に関する逆問題解析:材料内部に存在するマルチクラックの分布状態を正確に把握するため,材料表面でのクラック分布から材料内部のクラック分布を逆推定する手法を確立した,また,クラックの個数が少ない場合や材料表面での観察領域面積が限られている場合を想定し,内部クラックの分布をその分布の存在確率とともに確率論的に逆推定する手法を提案した。