hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
組織培養を利用した周縁キメラ解消によるキク突然変異の原因遺伝子の探索

多彩な花色変異を有するキクの枝変わりデージー系品種について,小花培養によって周縁キメラ構造を解消した全層変異体を作出した.4品種中3品種では全層変異体の花色は変化しなかった.全層変異体の花弁からRNAを抽出し,RNA-seq法により花色変異に関する原因遺伝子の探索を試みた結果,約5万の網羅的な発現遺伝子情報が取得できた.アントシアニンおよびカロテノイド色素の生合成系や分解系および転写調節に関わる遺伝子配列が取得でき,その一部で枝変わり品種間で顕著な発現レベルの違いが認められた.本研究はキクの枝変わり品種間の変異の原因遺伝子の効率的な解明を行うことを目的として、枝変わりの周縁キメラ構造を組織培養により解消した上でカスタムアレイおよびRNA-seq法により遺伝子解析を行うものである。27年度は異なる花色変異を有する3つの枝変わり品種群、マーブル系9品種、デージー系4品種、パラゴン系2品種を開花させ、各品種の開花直前あるいは開花時の筒状花を材料として表面殺菌後、植物ホルモンとしてBA濃度を2.0mg/Lとして、NAA濃度を0.2mg/Lと2.0mg/Lの2段階としたMS寒天培地に置床し、再分化植物体を誘導した。すべての枝変わり品種群においてNAA濃度を0.2mg/L、BA濃度を2.0mg/Lとした培地で再分化率が高い傾向が、また、枝変わり品種群の比較ではマーブル系、パラゴン系、デージー系の順に再分化率が高くなる傾向が認められた。供試した3つの枝変わり品種群のすべてから周縁キメラ構造を解消したと思われる再分化シュートを誘導することができた。再分化シュートが生じた培養物はNAA0.02mg/Lを添加したMS寒天培地に移植し、再分化シュートを伸長させた上で、メトロミックス360を充填したプラグトレイに挿し芽し順化中である。また、各枝変わり品種群の元品種であるピンクマーブル、ピンクデージー、パラゴンを材料として、未展開葉部からゲノムDNAを抽出し、黄色の花色変異に関わるキクのカロテノイド酸化開裂酵素(CmCCD4a)遺伝子ホモログの予備的解析を行った結果、品種ごとに異なる種類のホモログが見いだされた。当初計画で旧農研機構花き研究所で保存中のマーブル系9品種由来の周縁キメラ解消植物体を用いて遺伝子解析に取り組む予定であったが、植物材料が保存中に枯死してしまっていたことが判明し、27年度に改めて再分化植物体を誘導する必要が生じた。そこで、27年度にマーブル系9品種も含めてデージー系4品種、パラゴン系2品種からL1層由来の再分化植物体の誘導を行い、これまでに順調に再分化個体が得られており、開花特性の調査を準備中である。以上のようにマーブル系品種における遺伝子解析が遅れている。本研究ではキクの枝変わり品種間の変異の原因遺伝子の効率的な解明を行うことを目的として,枝変わりの周縁キメラ構造を組織培養により解消した上でRNA-Seq法により網羅的な遺伝子解析を行った.平成28年度は前年度に得られたデージー系4品種の小花培養由来全層変異体の花色変異の解析およびRNA-seq法による花色変異の原因候補遺伝子の抽出を行った.デージー系品種の小花培養由来全層変異体を開花させた結果,枝変わり3品種の全層変異体は元の品種と同じ花色を示したものの, 1品種の全層変異体で黄から赤へ花色が変化し,周縁キメラ構造の存在が示唆された.そこで,デージー系4品種の周縁キメラ構造の解析を目的に,花弁表皮および内層におけるアントシアニンおよびカロテノイド色素の発現を調べるとともに,黄色品種`マルテル'との交雑後代の花色分離についても解析した.アントシアニンについては花弁表皮における発現について2通り,カロテノイドについては表皮と内層における発現の有無について3通りの違いが認められ,1品種がカロテノイド発現について周縁キメラであることが確認できた.また,黄色品種との交雑後代における花色変異の解析では,カロテノイド色素を発現する後代と発現しない後代の両方の出現と発現する後代のみの出現に分かれ,花弁内層におけるカロテノイド発現の違いを反映したと考えられた.以上の結果,デージー系品種における周縁キメラ構造の存在が確認された.一方,4種類の全層変異体の花弁を材料としたRNA-seq解析の結果,約5万の発現遺伝子の全長および部分配列が得られ,花色変異の原因遺伝子の解析に有効なデータが取得できた.今後,原因遺伝子の解析を進めていく予定であるが,既にいくつかのアントシアニン生合成系,カロテノイド分解系遺伝子および転写因子遺伝子で,花色変異との関連が考えられる顕著な発現レベルの違いが認められている.多彩な花色変異を有するキクの枝変わりデージー系品種について,小花培養によって周縁キメラ構造を解消した全層変異体を作出した.4品種中3品種では全層変異体の花色は変化しなかった.全層変異体の花弁からRNAを抽出し,RNA-seq法により花色変異に関する原因遺伝子の探索を試みた結果,約5万の網羅的な発現遺伝子情報が取得できた.アントシアニンおよびカロテノイド色素の生合成系や分解系および転写調節に関わる遺伝子配列が取得でき,その一部で枝変わり品種間で顕著な発現レベルの違いが認められた.28年度は27年度に得た小花培養由来個体を開花させて、L1層由来の全層変異体を選抜する。得られた全層変異体および培養元品種の花色、葉色等を色彩色度計を用いて調査する。

その後、全層変異体を材料として、旧農研機構花き研究所で作成されたキクタニギク由来の60Kx8カスタムアレイおよびRNA-seq法を用いて花色変異の原因遺伝子の候補を探索する。具体的には開花期の花弁を材料にしてRNAを抽出し、キクタニギク由来のカスタムアレイを用いて全層変異体間で異なる発現を示す遺伝子を絞り込む。また、Illumina社HiSeqによるRNA-seqを行い、同じく全層変異体間で異なる発現を示す遺伝子を抽出する。両者の結果を総合し、アントシアニンの発現の有無、アントシアニンの発現の濃淡、カロテノイドの発現の有無の原因遺伝子を絞り込む。加えて、候補原因遺伝子の発現がみられない変異体において、原因遺伝子近傍の遺伝子配列を調べ、トランスポゾン等の挿入などについて解析する。園芸科学当初、花き研究所で保存されている周縁キメラ解消変異体を材料として遺伝子解析を行う予定であったが、保存中に枯死していたことからマーブル系についても改めて小花培養由来の再分化植物体を誘導した。28年度にマーブル系と併せてデージー系、パラゴン系について、開花特性の解析および遺伝子分析に取り組む。遺伝子解析についてはカスタムアレイおよびNGSによる解析を予定しているが、それぞれの解析にはかなりの費用を要することから、これまでに得られているマーブル系、デージー系、パラゴン系品種由来の再分化植物体の中から効率よく遺伝子解析用の材料を選定して解析を進める予定である。残り1年間でこれまでの計画の遅れは取り戻すことができ、研究期間中に解析を終えることができる見込みである。
現代フランス選挙政治の構造と展望

現代フランス選挙政治について文献調査・ヒアリングを行った。文献調査としては,フランス国立図書館,フランス資料センターにおいて,数度にわたって,閲読,複写を行なった。ヒアリングとしては,フランス政治センター所長のパスカル・ペリノー教授に面会して懇切な指導を受けた。ちょうど,2012年がフランス大統領選挙の実施された年にあたっており,フランス選挙政治の構造と動態を研究するには貴重な研究機関であった。また,2014年には,統一地方選挙とEU議会選挙が行なわれ,研究対象において充実した資料を収集できた。「現代フランス選挙政治の構造と展望」を解明することを目的として,本年度は次のような活動と成果をあげた。具体的には、(1)錯綜する現代フランスにおける多数のさまざまな選挙の現実を相互に関連させながら総体的に掌握するために,2005年のフランス国民投票におけるEU憲法条約の批准の否決について様々な観点から分析し,研究した。フランスEU憲法条約の否決の意味は,Daniel Saugerも言うように,重要な意味を持つものであり,「なぜフランスの選挙民はEU憲法条約を否決したのか」は今後のフランス選挙構造の研究における中心的なモチーフになると確信した。(2)同時に、活発に展開されているフランス選挙政治学理論の成果の総合的な評価を定めることを目標にPascal Perrineau, Jean-Luc Parodi, Daniel Saugerらの著書・論文を収集し,閲読し,研究した。フランスの政治学理論は,欧米の他国からの強い影響を受けていることも考慮しなければならないことも考慮し,英米文献の収集も心がけたことは言うまでもない。(3)さらにそれらの意味を確認するために,著書『拒絶の投票-21世紀フランス選挙政治の光景-』を関西大学出版部より刊行した。この書をまとめるにあたって,1999年EU議会選挙から2011年フランス県議会選挙までの選挙史を通観した。ここで得たさしあたりの結論は,フランスにおける選挙は,大統領選挙,総選挙から始まって,地域圏議会選挙,県議会選挙,市町村議会選挙だけでなくEU議会選挙まで多種多様な選挙が錯綜し,循環し,連動しているということである。2010年12月と2011年3月には,パリに出張して,ミッテラン図書館とドキュマンタリー・フランセーズで資料収集を行なっただけでなく,現地でフランス政治研究者と意見交換した。1.2011年5月1日10日,2012年2月26日3月7日,フランス共和国パリにおいて「現代フランス選挙政治の構造と展望」に関する現地調査・文献収集・ヒヤリングを行なった。また,10月29日11月4日,別の研究課題でパリに滞在した合間を縫って,フランス現代政治研究所長パスカル・ペリノー教授と面会を果たすことができて,吉田徹北大准教授とともに2012年フランス大統領選挙について意見交換した。2.2011年6月,単著『拒絶の投票:21世紀フランス選挙政治の光景』(ISBN 9784873545172)を関西大学出版部より刊行した。ただし,関西大学出版部の会計年度の都合により,3月刊行の記載となっている。3.2011年7月,「現代日本における政権交代論の個人的考察」『関西大学法学論集』第61巻第2号を刊行した。一見,「現代フランス選挙政治の構造と展望」研究と関連ないようであるが,政権交代は選挙政治と深く関わり,現代日本の選挙政治は現代フランス選挙政治と通底するものを持っている。4.2011年11月,「キリスト教民主主義の全盛と衰退:第2次大戦後以降の比較政治史的考察」『関西大学法学論集』第61巻第4号を刊行した。第2次大戦後の西ヨーロッパのキリスト教民主主義政党について考察したものであるが,フランスのキリスト教民主主義の末流はバイル派の政党Modemにつながり,現代フランス選挙政治において重要な位置を占めている。5.2011年6月,日本比較政治学会研究大会(於北海道大学)に出席して,「比較政治史の中のキリスト教民主主義」について報告した。また,10月,日本政治学会研究大会(於岡山大学)に出席して,「現代フランス選挙政治の構造と展望」研究の知見を広めた。2012年にはフランス大統領選挙と総選挙が行われた年であったが,2013年はそれらの国政選挙の意味について,日本の学会で発表したり,大学の研究紀要に執筆した年であった。と同時に,9月,11月,1月に現地追跡調査のために渡仏した。現地,パリで多数の研究者と面談し,新聞週刊誌,新刊書籍を購入した。これらは1年後のフランス選挙政治の研究の貴重な資料となる。2014年は市町村議会選挙とEU議会選挙のある年となるが,2012年と2014年を結ぶ結節点として2013年は重要な年であった。現在までの研究成果にたって,現在のフランス(選挙)政治の問題点として次のように要約することができる。

1オランド大統領の不人気,2フランス経済の低迷,3野党UMPの結集度,4FNのマリーヌ・ルペンの指導力。以上は今後の研究の柱ともなる。2012年にはフランス大統領選挙と総選挙が行われた年であり,その実態の分析に集中した。5月には,現地調査のために渡仏した。現地,パリで多数の研究者と面談し,新聞週刊誌,新刊書籍を購入した。これらは今後のフランス選挙政治の研究の貴重な資料となる。フランスの大統領選挙は現職の候補者が敗れたことで,それは低迷するEUの行方にどのような影響を与えるのか予断を許さないが,現在のヨーロッパの一つの政治表徴として重要であった。今後さらに研究を深めたい。1.選挙史学については,Francois Goguelの業績について文献の収集を開始した。2.個別の選挙については,2014年に行われた,フランス統一地方選挙とEU議会選挙について,調査・分析して『法学論集』に論文を寄稿した。3.現地調査については,パリ市とレンヌ市に焦点を定め,当地において情報を収集した。26年度が最終年度であるため、記入しない。政治学26年度が最終年度であるため、記入しない。フランス現代選挙政治の現在進行形の情報,資料収集については,かなりの成果が得られたが,現代選挙政治研究の学説史については満足した成果が得られていない。すでに,2011年に『拒絶の投票』という著書を刊行し,その後も現代フランス選挙政治に関わる,論文,学会発表を行なっている。『拒絶の投票』において,フランスの選挙政治が2002年を境として大きく変わったということを立証した。この年の大統領選挙で,FNが第1回投票で社会党をしのぎ,決選投票に進出した。第2回投票ではシラクのUMPが圧勝した。2013年の論文(学会発表も同テーマである)「社会党の政権奪還」において,2012年大統領選挙では,社会党が勝利したが,これはサルコジの自滅であることを立証した。オランドは相手を圧倒したのではなかった。第3極を目指すFNのマリーヌ・ルペンの健闘も解明した。以上であるが,フランス選挙社会学の特色である「選挙の地理学」については紹介不十分であった。2011年3月に『拒絶の投票ー21世紀フランス選挙政治の光景ー』(関西大学出版部)を刊行したが,そこで論述した基本線にそって,21世紀のフランス選挙政治のダイナミズムを構造的に解明しつつある。その成果を2013年5月の日本選挙学会で報告することになっている。したがって,おおむね順調に進展していると言えよう。資料収集だけでなく,ヒヤリングの回数も増やしたい。また,パリだけの定点観測よりもフランスの地方都市にも研究調査の足をのばしたい。今後の研究の方向としては,昨年も述べたことであるが,フランスの現大統領オランドの政策を検討しつつ,フランス政治のなかで議会制民主主義が十全に機能しているかどうかさらに考察してみたい。具体的には,オランドの戦略は正しいか?野党UMPは次期大統領選挙で政権を奪還できるか?第3勢力にのし上がってきたFNは今後どのように行動するのか,政治制度論と政治過程論の両面から解明してゆきたい。
3次元立体集積化光デバイスおよび光集積回路網の研究

本研究では,超小型高機能三次元光集積回路の基本技術の開発を目的として,(a)光機能デバイス自身の小型集積化を目指した三次元集積化光機能デバイスの設計・製作技術と,(b)光機能デバイス間を自在に配線する立体光配線技術,の2つの重点的開発を目指した.3年間に亘る本研究によって,(a)については,報告者らが開発した積層型マイクロリング共振器フィルタの偏光無依存化,透過帯域平坦化,入出力損失の低減と共振波長の精密な設定技術の開発を行った.この波長フィルタは,リング半径を数十μmまで超小型化したマイクロリング共振器を,網目状に構成したバスライン導波路の交点上に積層配置することによって高密度集積化を可能にした狭帯域Add/Drop波長フィルタである.しかしながら,フィルタ特性がローレンツ形関数であるので透過帯域が平坦ではなく,またリング半径の制限から共振波長間隔(FSR)は20nmが限界であった.そこで,3重直列結合共振器を提案し,試作した結果,FSRを26nmに拡大し,また透過帯域の平坦性を従来よりも約3倍に拡大した.また,バスライン導波路にスポットサイズ変換器を導入して入出力損失を8dBまで低減した.さらに,多波長フィルタアレイの中心波長間隔を狭間隔化するため,ポリマークラッドへの紫外線照射によるトリミング技術を用いて,従来はフォトマスクの製作制度の限界から5nm以下に出来なかった中心波長間隔を0.5nmまで狭間隔化することに成功した.また(b)については,すでに,製作許容誤差が大きく結合長が短い積層光結合器を開発し,結合器長約800μmで結合効率99%を一昨年度に実証した.本研究では,超小型高機能三次元光集積回路の基本技術の開発を目的として,(a)光機能デバイス自身の小型集積化を目指した三次元集積化光機能デバイスの設計・製作技術と,(b)光機能デバイス間を自在に配線する立体光配線技術,の2つの重点的開発を目指した.3年間に亘る本研究によって,(a)については,報告者らが開発した積層型マイクロリング共振器フィルタの偏光無依存化,透過帯域平坦化,入出力損失の低減と共振波長の精密な設定技術の開発を行った.この波長フィルタは,リング半径を数十μmまで超小型化したマイクロリング共振器を,網目状に構成したバスライン導波路の交点上に積層配置することによって高密度集積化を可能にした狭帯域Add/Drop波長フィルタである.しかしながら,フィルタ特性がローレンツ形関数であるので透過帯域が平坦ではなく,またリング半径の制限から共振波長間隔(FSR)は20nmが限界であった.そこで,3重直列結合共振器を提案し,試作した結果,FSRを26nmに拡大し,また透過帯域の平坦性を従来よりも約3倍に拡大した.また,バスライン導波路にスポットサイズ変換器を導入して入出力損失を8dBまで低減した.さらに,多波長フィルタアレイの中心波長間隔を狭間隔化するため,ポリマークラッドへの紫外線照射によるトリミング技術を用いて,従来はフォトマスクの製作制度の限界から5nm以下に出来なかった中心波長間隔を0.5nmまで狭間隔化することに成功した.また(b)については,すでに,製作許容誤差が大きく結合長が短い積層光結合器を開発し,結合器長約800μmで結合効率99%を一昨年度に実証した.本研究では,超小型高機能三次元光集積回路の基本技術の開発を目的として,(a)光機能デバイス自身の小型集積化を目指した三次元集積化光機能デバイスの設計・製作技術と,(b)光機能デバイス間を自在に配線する立体光配線技術,の2つの重点的開発を目指している.本年度は,(a)については,報告者らが一昨年度に開発した積層型マイクロリング共振器フィルタの透過帯域平坦化技術と従属接続によるフィルタ特性合成技術の開発を目指した.この波長フィルタは,従来のリング半径の大きなリング共振器では共振波長間隔(FSR)が1nm以下で波長多重通信用には適さなかった問題を,リング半径を数十μmまで超小型化することによって20nm程度にまで拡大し,さらにバスラインを網目状にしたクロスグリッド配置による高密度集積化を可能にした狭帯域Add/Drop波長フィルタである.しかしながら,単一共振器ではフィルタ特性がローレンツ形関数であるので透過帯域が平坦ではなく,また多チャンネル化時にフォトマスクの製作制度の限界(0.05μm)からチャネル間隔が5.7nmに制限されていた.そこで,リング共振器を2個積層化した結合2重共振器を提案してその設計・製作技術を開発し,素子を試作した結果,-10dB帯域幅に対する-1dB透過帯域幅の比を従来よりも約3倍に拡大して平坦化を実証した.また,マイクロリング共振器の網目配置を有効に利用した2個の共振器の従属接続によっても,透過帯域が平坦化されることを実証した.また(b)については,テーパー構造を使わない積層光結合器において,製作許容誤差が大きく結合長か短い擬強結合構造を提案して,結合器長約800μmで結合効率99%を実証した.本研究では,超小型高機能三次元光集積回路の基本技術の開発を目的として,(a)光機能デバイス自身の小型集積化を目指した三次元集積化光機能デバイスの設計・製作技術と,(b)光機能デバイス間を自在に配線する立体光配線技術,の2つの重点的開発を目指している.2年度目にあたる本年度は,(a)については,報告者らが開発した積層型マイクロリング共振器フィルタの透過帯域平坦化技術と高次直列結合によるフィルタ特性合成技術の開発を目指した.

この波長フィルタは,リング半径を数十μmまで超小型化したマイクロリング共振器を網目状に構成したバスライン導波路の交点上に積層配置することによって高密度集積化を可能にした狭帯域Add/Drop波長フィルタである.しかしながら,単一共振器ではフィルタ特性がローレンツ形関数であるので透過帯域が平坦ではなく,またリング半径の制限から共振波長間隔(FSR)は20nmが限界であった.そこで,リング共振器を3個積層化した3次直列結合共振器を提案してその設計・製作技術を開発し,素子を試作した結果,FSRを26nmに拡大し,また-10dB帯域幅に対する-1dB透過帯域幅の比を従来よりも約3倍(0.57)に拡大して透過帯域特性の平坦化を実証した.さらに,バスライン導波路のスポットサイズが入出力ファイバのそれに比べて約10分の1と小さいため,入出力損失が30dBと大きかったが,バスライン導波路にスポットサイズ変換器を導入して入出力損失を8dBまで低減した.また(b)については,すでに昨年度に,製作許容誤差が大きく結合長が短い積層光結合器を開発し,結合器長約800mmで結合効率99%を実証した.本研究では,超小型高機能三次元光集積回路の基本技術の開発を目的として,(a)光機能デバイス自身の小型集積化を目指した三次元集積化光機能デバイスの設計・製作技術と,(b)光機能デバイス間を自在に配線する立体光配線技術,の2つの重点的開発を目指した.最終年度にあたる本年度は,(a)については,報告者らが開発した積層型マイクロリング共振器フィルタの精密な設計指針の確立と共振波長の精密な設定技術の開発を行った.この波長フィルタは,リング半径を数十μmまで超小型化したマイクロリング共振器を,網目状に構成したバスライン導波路の交点上に積層配置することによって高密度集積化を可能にした狭帯域Add/Drop波長フィルタである.昨年度までに1×8フィルタアレイや偏光無依存化などを実証してきたが,製作に当たってリング共振器の曲率半径が約10μmと微小でしかも積層結合であるため,バスライン導波路とリング共振器間の結合特性を解析的に設計するのが困難であった.したがって,製作に当たっては試行錯誤と経験による構造パラメータの設定を行わざるを得なかった.そこでバスライン導波路とリング共振器間のバッファ層厚および横方向偏位を様々に変えたフィルタを多数製作して,そのフィルタ特性を測定して,構造パラメータの最適値を探索した.また,製作誤差によって中心波長が設計値からずれる問題を解決するため,コアの誘電体材料に紫外線レーザを照射して中心波長をトリミングする技術を開発して,約60GHzのトリミングを実証した.また(b)については,すでに,製作許容誤差が大きく結合長が短い積層光結合器を開発し,結合器長約800mmで結合効率99%を一昨年度に実証した.
オステオネットワークの維持と破綻:顎顔面骨疾患の病態解明を目指した基盤研究

顎顔面骨疾患の病態解明をオステオネットワークという概念で捉えることを目指した基盤研究を行い、以下の成果を得た。1.骨芽細胞・骨細胞・破骨細胞間ネットワークを可視化するための骨バイオイメージング法の開発の基盤を構築した。2.矯正的歯牙移動モデルマウスを用いて歯の移動における骨細胞の役割を明らかにした。3.CCN3は骨再生の抑制因子であることを明らかにした。4.ヒト口腔癌による骨破壊におけるRANKLの役割を明らかにした。骨内外の緊密なコミュニケーションを担っている細胞・分子群の相互連関をオステオネットワークという概念で捉え、以下の研究を行った。1.骨芽細胞・骨細胞・破骨細胞間ネットワーク維持機構の解析(1)骨芽細胞・骨細胞・破骨細胞間ネットワークを可視化するための骨バイオイメージング法の開発の基盤を構築した。(2)骨芽細胞・骨細胞・破骨細胞間ネットワークにおけるNotchシグナルの役割を解析するために、Notch関連分子のトランスジェニック(Tg)およびノックアウト(KO)マウスを作成し、表現型を解析した。2.矯正的歯牙移動モデルマウスを用いたメカニカルストレスによるオステオネットワークの維持機構解析・骨細胞で特異的にジフテリア毒素受容体)DRT)をdmpl promoterを用いて骨細胞で特異的に過剰発現させたTgマウスにジフテリ毒素を投与して骨細胞を特異的に死滅させると、破骨細胞性骨級が減弱し、矯正的歯の移動も減少することを明らかにした。3.骨再生過程におけるCCN3の役割をCCN3 TgおよびKOマウスを用いて検討中。4.ヒト口腔癌による骨破壊モデルマウスを用いて抗RAKL抗体の投与が顕著に癌による骨破壊を抑制することを明らかにした。1.骨芽細胞・骨細胞・破骨細胞間ネットワーク維持機構の解析(1)骨芽細胞・骨細胞・破骨細胞間ネットワークを可視化するための骨バイオイメージング法の開発の基盤を構築し、その手法を用いて骨細胞、骨芽細胞の分化過程を解析した。(2)骨芽細胞・骨細胞・破骨細胞間ネットワークにおけるNotchシグナルの役割を解析するために、Notch関連分子のトランスジェニック(Tg)およびノックアウト(KO)マウスを用いて骨再生過程を解析し、Notchシグナルが骨細胞の機能を制御している可能性を示す所見を得た。2.骨細胞で特異的にジフテリア毒素受容体(DRT)をdmp1 promoterを用いて骨細胞で特異的に過剰発現させたTgマウスにジフテリ毒素を投与して骨細胞を特異的に死滅させると、破骨細胞性骨級が減弱し、矯正的歯の移動も減少することを明らかにした。4.ヒト口腔癌による骨破壊モデルマウスを用いて、マウスとヒトの種特異的なRANKL抗体を用いて、癌細胞と間質細胞が産生する各々のRANKLの機能を明らかにした。骨内外の緊密なコミュニケーションを担っている細胞・分子群の相互連関をオステオネットワークという概念で捉え、オステオネットワークの維持と破綻による顎顔面骨疾患の病態解明を目指した基盤研究を行い、以下の結果を得た。1.骨芽細胞・骨細胞・破骨細胞間ネットワーク維持機構:1骨芽細胞・骨細胞・破骨細胞間ネットワークを可視化するための骨バイオイメージング法の開発の基盤を構築し、その手法を用いて骨細胞、骨芽細胞の分化過程を解析した。2骨芽細胞・骨細胞・破骨細胞間ネットワークにおけるNotchシグナルの役割を解析するために、Notch関連分子のトランスジェニック(Tg)およびノックアウト(KO)マウスを用いて骨再生過程を解析し、Notchシグナルが骨細胞の機能を制御している可能性を示す所見を得た。3.骨再生過程におけるCCN3の役割をCCN3 TgおよびKOマウスを用いて検討, CCN3 KOマウスでは骨再生が遅延していることを明らかにした。骨芽細胞・骨細胞・破骨細胞間ネットワーク維持機構の解析,メカニカルストレスにおける骨細胞の役割、骨再生過程におけるCCN3の役割、口腔癌による骨破壊のメカニズムなどに関して順調に研究を推進できた。24年度が最終年度であるため、記入しない。特に大幅に研究内容を変更する予定はなく、現在の計画で研究をさらに推進する予定である。
網膜神経回路活動の光学的多次元同時計測

本研究は、網膜神経回路の情報処理の各ステージ、すなわち、視細胞層、水平細胞層、双極細胞層等の神経活動を実時間並列・可視化する手法を確立すると共に、網膜の情報表現、伝達、処理の過程を解析することを目的として進めた。昨年度は、カラーディスプレイを用いた多入力高頻度刺激法を確立し、開発手法によって網膜水平細胞の受容野、すなわち、空間特性の非線形性の抽出に成功した。そこで、本年度は、時間的な特性を解析するため、高速な時間制御が可能な赤、緑、青の3色LED刺激によるダブルフラッシュ応答を水平細胞より、記録、解析した。その結果、水平細胞には、時間及び色に関する時間的な非線形成分が存在することがはじめて明らかとなった。また、こうした非線形性は、視細胞と水平細胞間のシナプス結合に由来することが示唆された。こうした網膜神経細胞の応答生成及びシナプス伝達には、細胞内カルシウムイオンが重要な役割を果している。昨年度、視細胞を対象に細胞内カルシウム濃度の測定技術を確立し、その基本特性を解析した。本年度は、こうして測定された濃度データを定量的に解析するため、細胞内カルシウム機構の数理モデル化を進めた。提案モデルは、カルシウムの流入、排出、結合、ストア等の機構を含み、細胞内カルシウム濃度の時空間特性を記述したものである。その結果、細胞応答やシナプス伝達に関わる細胞内カルシウム濃度変化を可視化が可能になると共に、実験的に得られたカルシウム濃度変化の定量的解析を行えるようになった。今後は、本研究で確立した手法をベースに、網膜神経回路全体の情報処理様式の詳細な解析を進めていく予定である。本研究は,網膜神経回路の情報処理の各ステージ,すなわち,視細胞層,水平細胞層,双極細胞層などの神経活動を実時間並列計測・可視化する手法を開発すると共に,網膜で実現されている回路レベルの情報表現,伝達,処理の過程を解析することを目的としている.本年度はまず,網膜神経細胞の基本的性質を明らかにするため,多入力高頻度刺激による動的光受容野の計測技術を確立した.すなわち,カラーディプレイを用いた多入力高頻度刺激法を網膜水平細胞の受容野特性の計測に適用した.実験にはコイ剥離網膜を用い,L型およびR/G型水平細胞より細胞内応答を記録した.水平細胞応答の各刺激部位の1次核を高速m変換アルゴリズムによって推定した結果,ノイズの少ない安定した応答が得られた.また,L,R/G型水平細胞とも2次核が存在し,既にこのレベルで光情報が非線形な情報処理を受けていることが明らかになった.開発手法によれば,比較的短時間に動的受容野を計測でき,網膜神経細胞の受容野特性の解析に有効な新しい手法である.次に,こうした網膜神経細胞の活動を光学的に測定するための基本計測技術を確立するため,単離細胞を対象に細胞内カルシウム濃度の光学的測定を行った.視細胞の細胞内カルシウム濃度測定を行った結果,本実験システムで,視細胞内のカルシウム濃度の時空間的変化を測定可能なことを確認すると共に,視細胞の外節-内節間にはカルシウムイオンのダイナミックな相互作用が存在することが明らかとなった.今後は,確立した実験・解析システム,光学的測定の基本技術をベースに,網膜内での情報処理様式のより詳細な特性を解析する.すなわち,網膜スライス標本を対象に,特定のシナプス伝達経路を制御した条件で各細胞の応答特性がどのように変化するか,視細胞錐体,視細胞杆体に刺激を与えた場合,どのような経路が主に活性化するかなど,網膜内各神経経路の具体的な特性,役割を明らかにしていく.本研究は,網膜神経回路の情報処理の各ステージ、すなわち、視細胞層、水平細胞層、双極細胞層等の神経活動を実時間並列・可視化する手法を確立すると共に、網膜の情報表現、伝達、処理の過程を解析することを目的として進めた。

そこで、本年度は、時間的な特性を解析するため、高速な時間制御が可能な赤、緑、青の3色LED刺激によるダブルフラッシュ応答を水平細胞より、記録、解析した。その結果、水平細胞には、時間及び色に関する時間的な非線形成分が存在することがはじめて明らかとなった。また、こうした非線形性は、視細胞と水平細胞間のシナプス結合に由来することが示唆された。こうした網膜神経細胞の応答生成及びシナプス伝達には、細胞内カルシウムイオンが重要な役割を果たしている。昨年度、視細胞を対象に細胞内カルシウム濃度の測定技術を確立し、その基本特性を解析した。本年度は、こうして測定された濃度データを定量的に解析するため、細胞内カルシウム機構の数理モデルかを進めた。提案モデルは、カルシウムの流入、排出、結合、ストア等の機構を含み、細胞内カルシウム濃度の時空間特性を記述したものである。その結果、細胞応答やシナプス伝達に関わる細胞内カルシウム濃度変化を可視化が可能になると共に、実験的に得られたカルシウム濃度変化の定量的解析を行えるようになった。今後は、本研究で確立した手法をベースに、網膜神経回路全体の情報処理様式の詳細な解析を進めていく予定である。
自己免疫疾患を制御するNK-T細胞の分化と機能

1.前年度でNK-T細胞の直接前駆細胞をZAP-70ノックアウトマウス、RAGノックアウトマウス胸腺内に同定し、報告した。前駆細胞はNK1.1^+ CD3^-で、これらをin vitroでNK-T細胞内に分化させることに成功しているが、今年度はMHCクラスI拘束性TCRトランスジェニックマウス(2C)を用い、NK-T細胞分化を解析した。これらのマウスで分化するNK-T細胞は、MHCクラスI分子によって異なる表現形、機能を持つことを初めて明らかにし、報告した。特に、CD8鎖(αα、αβ)の違い、IFN-γ産生能などから、これらNK-T細胞はTh1タイプの自己免疫疾患と関係することが示唆された。2.同系混合リンパ球反応(MLR)の系で、CD8^+T細胞が主として反応する細胞であること、さらにNK-T細胞が自己APCに対して増殖反応を示すことを初めて明らかにした(論文投稿中)。3.NK-T細胞の分化に胸腺髄質上皮細胞とのcognate interactionが重要な役割を果たすことを発見し、報告した。4.NZ系自己免疫マウスで、加齢とともにNK-T細胞が減少し、この減少には自己抗体が関与する結果を得た。また、lpr系自己免疫マウスでは、NK-T細胞の減少が認められないことを明らかにした(論文投稿中)。T細胞の分化・機能に必須のシグナル伝達分子、ZAP-70欠損マウスではNK-T細胞が産生されないことを明らかにした。このマウスの胸腺、脾臓では、その代わり正常マウスでは認められないNK1.1^+TCRαβ^-細胞が増加していた。このポピュレーションは通常のNK細胞、NK-T細胞とは異なるフェノタイプを示し、細胞傷害活性、INF-γ産生などのNK機能を持っていた。さらに、NK1.1^+TCRαβ^-細胞を新生児胸腺器官培養の系において、PMAとイオノマイシンで刺激すると、RAG mRNAの発現が認められ、TCR遺伝子の再配列が誘導され、NK-T細胞へと分化した。従って、これらNK1.1^+TCRαβ^-細胞は、NK-Tの前駆細胞であることが、判明した。次に2C TCRトランスジェニックマウスにおける、NK-T細胞の分化を解析し、これらのマウスでは、クロノタイプ陽性のCD8^+NK-T細胞が産生されることを発見した。これらCD8^+NK-T細胞は、MHCクラスI分子によって、正の選択を受けること、刺激によってINF-γは産生するが、IL-4は産生しないことが判明した。最後に、NK-T細胞がin vitroの補体処理によって、特異的に障害されることが判明した。この現象は、一部のSLEモデルマウスでも認められたが、B細胞、抗体の存在しないDO10/D2/RAG-/-マウスでは認められないことから、NK-T細胞には生体内で、自己抗体が結合していることが示唆された。

4.NZ系自己免疫マウスで、加齢とともにNK-T細胞が減少し、この減少には自己抗体が関与する結果を得た。また、lpr系自己免疫マウスでは、NK-T細胞の減少が認められないことを明らかにした(論文投稿中)。
リグノセルロースからのイソプレンのワンステップ製造法の開発

二酸化炭素排出量の削減や海外へのエネルギー依存度軽減のために、再生可能資源であるバイオマス資源を用いた輸送用燃料や化成品原料の製造(バイオリファイナリー)の研究開発が、世界的に行われてきている。しかし、現在までに実用化されているバイオリファイナリー技術は、トウモロコシなどの可食性バイオマスを原料として用いているため、食品価格の高騰を招くという弊害が生じている。また、爆発的な人口増加の予測にも関わらず、食料をバイオリファイナリー原料として利用することへの強い懸念がある。更には近年の米国におけるシェールガス生産量の増加より、エチレン製造を目的としたナフサの熱分解設備の縮小が見込まれており、世界的にイソプレンの生産量の減少が見込まれている。このような背景から食料と競合しない非可食性バイオマスであり、多糖類(セルロース,ヘミセルロース)と芳香族化合物(リグニン)からなるリグノセルロースの炭素骨格を最大限活用した化成品原料の製造プロセスの早期開発が強く求められている。本研究では非可食性バイオマスの分解力が高い白色腐朽菌にイソプレン合成遺伝子を導入することにより、非可食性バイオマスから化成品原料として利用されるイソプレンを製造することを目的としている。白色腐朽菌であるヒラタケにおいて、強力かつ構成的に働くプロモーターの下流に、ヒラタケに最適化したイソプレン合成遺伝子を連結したプラスミドを作製後、本プラスミドを用いてヒラタケを形質転換を行った。昨年度までの研究で、本形質転換体を広葉樹の木粉を単一炭素源として培養した際に、イソプレンを生産することを確認しているが、今年度は、微生物により分解されにくい結晶性セルロースを単一炭素源として用いたさいにも、イソプレン合成遺伝子を導入した形質転換体がイソプレンを生産することを確認した。本研究では非可食性バイオマスの分解力が高い白色腐朽菌にイソプレン合成遺伝子を導入することにより、非可食性バイオマスから化成品原料として利用されるイソプレンを製造することを目的とした。白色腐朽菌で強く働くプロモーターの下流に白色腐朽菌に最適化したイソプレン合成遺伝子を連結したプラスミドを作成後、本プラスミドを用いて白色腐朽菌を形質転換することにより、本形質転換体がイソプレンを生産することを確認した。今後はイソプレン生産量を向上させるための培養条件の検討や、イソプレン製造するために最適なバイオマスの種類について検討を行っていく。平成28年度の目標は1「白色腐朽菌を宿主に用いたイソプレン発酵能を有する形質転換体の作製」と、2「発酵イソプレン純度の評価」の実施であった。白色腐朽菌を宿主に用いたイソプレン発酵能を有する形質転換体の作製においては、宿主にはリグノセルロース分解力が高いヒラタケを用いた。

また、β-tubulin遺伝子のプロモーター領域とターミネーター領域、ハイグロマイシンB耐性遺伝子を用いた薬剤耐性マーカーを形質転換の指標として用いた。イソプレン合成遺伝子の構築においては、イソプレン合成遺伝子のオープンリーディングフレーム(ORF)には、植物由来のイソプレン合成遺伝子の配列を基に、ヒラタケに最適化したイソプレン合成遺伝子の設計と化学合成を行った。化学合成したイソプレン合成遺伝子のORFに対して、PCR法により増幅させたヒラタケのプロモーター領域とターミネーターをダブルジョイントPCR法により連結を行うことでヒラタケに適したイソプレン合成遺伝子を構築した。形質転換体の培養においては、宿主、ならびに形質転換体の培養はグルコースを炭素源として含む液体培地を用いた。培養液中のイソプレン純度の評価にはGC-MSを用いた。H28年度は、バイオマス分解力の高い白色腐朽菌であるヒラタケにイソプレン合成遺伝子を導入することにより、バイオマスから化成品原料として利用されるイソプレンを合成することを目的とし、ヒラタケで強力に働くプロモーターの下流にヒラタケに最適化したイソプレン合成遺伝子を連結したプラスミドを作成後、形質転換を行った。この結果、本形質転換体がグルコースを炭素源とした培地でイソプレンを生産することを確認した。今後はイソプレン生産量を向上させるための培養条件の検討や、イソプレンの製造に適した実バイオマスについて検討を行っていく。宿主として白色腐朽菌を使用したが、ヒラタケでイソプレンを生産できたため、当初予定していたシイタケ等の白色腐朽菌の使用は行わなかった。このため、シイタケ等に適したイソプレン合成遺伝子の化学合成にかかる費用等に関して差額が生じた。ガラス器具や試薬などの物品費用として使用をすることで、研究を加速する。
バレル神経回路の機能発達におけるニコチン性アセチルコリン受容体の役割

本研究ではバレル神経回路において興奮・抑制バランスを修飾する可能性のある受容体としてニコチン性アセチルコリン受容体に注目した。研究の結果、代表的なサブユニットb2, a7そのものの局在解析は困難であることが分かったため、a7の細胞膜局在に必須であるTMEM35の発現解析によりa7の細胞発現を推定した。その結果、発現パターンの強弱に神経化学特性との関連性があり、三叉神経核領域では興奮性細胞に、逆に視床や大脳皮質では抑制性介在細胞に発現していた。これらの結果から、a7受容体が、三叉神経核レベルと視床・大脳皮質レベルでは逆の発現パターンを持ち、興奮・抑制の調節に寄与する可能性が示唆された。本研究課題では、視床から興奮性細胞への入力を増強し、かつ抑制性介在細胞への入力を抑制することにより興奮・抑制バランスの修飾作用を発揮することが分かっているニコチン性アセチルコリン受容体に着目し、興奮・抑制バランス依存的なバレル神経回路形成制御機構を明らかにすることを目的とする。バレル神経回路におけるニコチン性アセチルコリン受容体の発現について、mRNAレベルでの解析を行った。1バレル神経回路を構成する興奮性ニューロンおよび抑制性介在ニューロンに発現するニコチン性アセチルコリン受容体サブユニット構成の同定:リボプローブを用いた高感度の多重蛍光in situハイブリダイゼーション法により、大脳皮質バレル野、視床VPM核、三叉神経核の各細胞種における発現サブユニットの構成を明らかにした。2主たる発現サブユニットに対する特異的抗体の作成に着手:現時点ではノックアウトマウスで反応が消失する特異的抗体が存在しないために、ニコチン性アセチルコリン受容体がシナプス前終末あるいはポストシナプス側に存在するのかといった基本的な局在について未だ不明な点が多い。今年度作成した抗体のうち、N末端側を抗原としたものが特異的抗体に近そうであるという予備データを得た。本研究課題では、バレル神経回路において視床から興奮性細胞への入力を増強し、かつ抑制性介在細胞への入力を抑制することにより、興奮・抑制バランスの修飾作用を発揮する可能性のある受容体としてニコチン性アセチルコリン受容体に注目している。昨年度は3種類のニコチン性アセチルコリン受容体サブユニットのmRNAの脳内発現を蛍光in situ hybridization法で解析し、さらにβ2サブユニットに対する抗体を作成した。本年度はまずこの抗体の特異性について検討し、局在解析を行った。ウエスタンブロットによる検討を行った結果、HEK細胞を使った強制発現系では妥当なサイズにバンドが確認でき、他のサブユニットとの交差性も認められなかった。従ってこの抗体はβ2サブユニットを特異的に認識していることは確認できた。その後のマウス脳切片を用いた組織染色の結果、mRNA発現に対応する領域での陽性反応は確認できたものの、シグナル強度が弱いことがわかった。したがって詳しい局在を解析するためには今後染色条件等を改善する必要があることが明らかになった。今年度の目標は、作成した抗体を使用したタンパク質レベルでの局在解析を進展させることであった。抗体の特異性と染色性を検討した結果、特異性は確認できたものの、染色性に検討の余地があることがわかった。従って、質の高い解析をするためには今後条件を最適化する必要があることと判断された。昨年度はほぼ計画どおりの進展であったが、現状ではやや遅れていると言わざるを得ない。本研究課題では、バレル神経回路において興奮性細胞への入力を増強し、かつ抑制性介在細胞への入力を抑制することにより、興奮・抑制バランスの修飾作用を発揮する可能性のある受容体としてニコチン性アセチルコリン受容体に注目した。H26-27年度には3種類のニコチン性アセチルコリン受容体サブユニットのmRNAの脳内発現を蛍光in situ hybridization法(FISH)で解析し、さらに脳内で最も多いb2サブユニットに対する抗体を作成しその特異性を検証した。この抗体は強制発現細胞やウエスタンブロットでは特異性が確認できたものの、マウス脳の組織切片上では検出効率が悪かった。mRNA、タンパク質レベルの解析結果を総合し、b2サブユニットを解析対象とするのは困難であると結論したため、H28年度は方針を変更し、次に多い発現サブタイプであるa7サブユニットとその細胞膜局在に必須の関連タンパク質(TMEM35)を中心に解析を進めた。TMEM35の方がa7サブユニットそのものよりも遥かに発現レベルが高く、検出効率が良かったため以降の解析はTMEM35を中心に進めた。特異的プローブと抗体を用いた解析の結果、TMEM35は脳内に広く発現しているものの、発現パターンの強弱には神経化学特性との関連性が認められた。三叉神経核領域の興奮性細胞は抑制性介在細胞よりも発現レベルが高く、逆に視床や大脳皮質では抑制性介在細胞で発現レベルが高かった。これらの結果からはアセチルコリン受容体が、三叉神経核レベルと視床・大脳皮質レベルでは逆の作用を持ち、興奮・抑制バランスの調節に寄与している可能性が示唆された。

その結果、発現パターンの強弱に神経化学特性との関連性があり、三叉神経核領域では興奮性細胞に、逆に視床や大脳皮質では抑制性介在細胞に発現していた。これらの結果から、a7受容体が、三叉神経核レベルと視床・大脳皮質レベルでは逆の発現パターンを持ち、興奮・抑制の調節に寄与する可能性が示唆された。今年度の目標はマウスのバレル神経回路において、興奮性・抑制性ニューロンに発現するニコチン性アセチルコリン受容体サブユニットを同定するというものであった。今年度はIn situ hybridizationによるmRNAレベルでの発現解析が終了し、次の段階としてのタンパクレベルの局在解析に使用するための特異的抗体作成も順調に進行している。従って概ね計画通りの進捗状況といえる。今後は解析を進めるために、染色や検出条件・検出方法の改善策を練る必要がある。また抗体に頼らず毒素等を利用した検出も視野に入れて検討を行う。神経解剖学今年度の研究成果を踏まえ、来年度はタンパク質レベルでの解明を目指す。そのためにも特異的抗体の作成を急ぎ、来年度中には分子解剖学的な基盤を明らかにすることを目標とする。平成27年度中に発注・納品された物品の支払い請求が次年度にずれこんだため。平成27年度中に発注・納品された物品の支払いに充てる。
癌の免疫核医学診断・治療を目的とする腫瘍部位解裂性ヨウ素標識試薬の開発

本研究は、腫瘍細胞への集積性と高い代謝安定性・尿排泄性を示す放射性ヨウ素標識化合物を酸で開裂する蛋白質標識試薬の開発を目的とする。本研究成果は、以下のように要約される。1.腫瘍集積性ヨウ素標識化合物の探索...高い代謝安定性と尿排泄性を有する種々のヨウ素標識アミノ酸を合成した。マウスエールリッヒ腹水癌細胞では、ヨウ素標識チロシン誘導体がアミノ酸能動輸送機構への高い親和性を示し、腫瘍細胞へ投与後速やかに高く集積することが判明した。2.モデル結合体の作成と酸解離性の評価...高い腫瘍集積性を示したヨウ素標識アミノ酸と、結合部位として数種の無水酸とを組み合わせたモデル結合体を合成した。得られた結合体の標識は、簡便な操作で短時間に高い標識率と放射化学的純度を示し、本標識試薬の標識条件を確立した。これらのヨウ素標識モデル結合体を用い、種々のpHにおける解離性を評価した結果、すべての結合体が生理的pHでは安定であった。更に、低pH環境において結合体の解離が進行した。特にアルキル側鎖を有する結合体ではpH感受性が高く、本標識試薬のデザインに有望な結果が得られた。3.高い代謝安定性と尿排泄性を具備する新規化合物の設計...上記の検討から、ヨウ素標識アミノ酸のα-炭素上の置換基の有無が結合体の生成に影響すると考え、腫瘍への高い集積に必要なアミノ酸膜能動輸送機構への親和性を有するとともに高い代謝安定性と尿排泄性を併せもつ新規ヨウ素標識アミノ酸を設計し、その生体内挙動を詳しく検討した。4.腫瘍特異的代謝に基づく滞留性を示す新規化合物の合成・評価...更に、これらの知見から特定の腫瘍で特異的亢進を示す代謝系への親和性に基づく滞留性の向上を目的とした新規アミノ酸開発の一端として、黒色腫細胞で異常に亢進しているメラニン形成に着目し、チロシナーゼ基質類似体を用いて腫瘍集積性ヨウ素標識化合物としての有用性を評価した。5.標識試薬の合成...腫瘍細胞に高く集積したヨウ素標識アミノ酸の尿排泄機序を詳しく検討した。これらの腎における通過機構は同一ではないものの、尿排泄性は既存の腎機能診断薬に匹敵するものであった。本研究では、高い尿排泄性、生体内代謝安定性を有する一方で、腫瘍細胞への集積性を有する放射性ヨウ素標識化合物を酸性pHで開裂するスペーサーを介して蛋白質に結合する標識試薬の開発を目的とする。本年度は、以下の項目に対して検討を実施した。1.腫瘍集積性ヨウ素標識化合物の探索・・・・生体内脱ヨウ素化反応をはじめとする分解代謝系に対する高い安定性、尿排泄性を具備する種々のヨウ素標識アミノ酸を選択し、合成した。マウスのエールリッヒ腹水癌細胞を用いる検討の結果、α-methyl-L-tyrosine、D-tyrosine等のヨウ素標識体が膜能動輸送機構への高い親和性を示し、腫瘍細胞へ投与後速やかに高く集積することが判明した。現在、他の腫瘍細胞系に関しても検討を継続している。

2.モデル結合体の作成・・・・上記検討の結果、ヨウ素標識チロシン誘導体が腫瘍細胞への高い集積性を示したことから、そのモデルとしてα-methyl-L-tyrosine、p-hydroxynorephedrineを選択し、一方、酸解離性スペーサーのアミン結合部位として数種の無水酸と結合させたモデル結合体を合成した。これらは反応性の違いはあるものの生成が確認されたが、再結晶法により分離精製できない結合体もあり、今後の課題が提示された。今回得られた結合体の標識は、簡便な操作で短時間に高い標確率を示し、精製後、高い放射化学的純度の無担体標識体が得られた。3.モデル結合体の酸解離性の評価・・・・上記の結果得られたヨウ素標識モデル結合体を用い、種々のpHにおける解離性を評価した結果、今回検討したすべての結合体が血中pHでは48時間まで安定であった。更に、低pH環境において、本結合体の解離が進行し、特にアルキル側鎖を有する結合体ではpH感受性が高くなる傾向を示し、本標識試薬のデザインに有望な結果が得られた。本研究では、高い生体内代謝安定性、尿排泄性を有する一方で、腫瘍細胞への集積性を有する放射性ヨウ素標識化合物を酸性pHで開裂するスペーサーを介して蛋白質に結合する標識試薬の開発を目的とする。本年度までに、以下の項目に関して検討を実施した。1.腫瘍集積性ヨウ素標識化合物の探索・・・・酵素的脱ヨウ素化反応を含む分解代謝系に対する高い安定性と尿排泄性を具備する種々のヨウ素標識アミノ酸を合成した。マウスエールリッヒ腹水癌細胞では、α-methyl-L-tyrosine、D-tyrosine等のヨウ素標識体がアミノ酸能動輸送機構への高い親和性を示し、腫瘍細胞へ投与後速やかに高く集積することが判明した。また、検討した腫瘍系では高い代謝安定性を示し、これらの尿排泄性も腎機能診断薬に匹敵するものであった。更に、これらの知見から特定の腫瘍細胞系における細胞内滞留性の向上を目的とした新規アミノ酸誘導体をデザインし、合成した。2.モデル結合体の作成・・・・上記検討の結果、高い腫瘍集積性を示したヨウ素標識チロシン誘導体のモデル化合物としてα-methyl-L-tyrosine、p-hydroxynorephedrineを選択し、一方、アミン結合部位として数種の無水酸と結合させたモデル結合体を合成した。これらは反応性の違いはあるものの生成が確認された。今回得られた結合体の標識は、簡便な操作で短時間に高い標識率を示し、精製後、高い放射化学的純度の無担体標識体が得られたことから、本標識試薬の標識条件を確立したと考えられた。3.モデル結合体の酸解離性の評価・・・・上記検討より得られたヨウ素標識モデル結合体を用い、種々のpHにおける解離性を評価した結果、今回検討したすべての結合体が生理的pHでは48時間まで安定であった。更に、低pH環境において本結合体の解離が進行した。特にアルキル側鎖を有する結合体ではpH感受性が高くなる傾向を示し、本標識試薬のデザインに有望な結果が得られた。本研究では、高い生体内代謝安定性、尿排泄性を有し、腫瘍細胞への集積性を示す放射性ヨウ素標識化合物を酸性pHで開裂するスペーサーを介する蛋白質標識試薬の開発を目的とする。昨年までに以下の点が確認された。1.腫瘍集積性ヨウ素標識化合物の探索・・・・高い代謝安定性と尿排泄性を具備する種々のヨウ素標識アミノ酸を合成した。