hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
前向き腎移植コホートにおける慢性移植腎障害関連分子に関するプロテオミックス解析

移植腎症(132例)を対象とする疾患コホートの臨床病理所見を中心としたプロファイルを作成した.高・低分子アディポネクチン変化は,腎機能ならびに心血管疾患および移植後糖尿病の独立関連因子であった.さらに,移植後糸球体硬化と間質線維化では,免疫組織学的検討により異なる膠原繊維の集積を明らかとした.腎移植時の免疫モニタリングでは,移植早期の末梢血リンパ球においてTh1, Th2, Th17, Treg(Foxp3+)サブセットおよびnon-classical HLA分子(可溶性HLA-G5)の早期変動を確認した.さらに,長期経過では,可溶性HLA-G5分子量と移植後eGFR変化率との関連を認めた.金沢医科大学において腎移植および腎生検が実施された移植腎症疾患コホートの臨床病理所見について,初年度プロファイルを作成し,後向き調査成績において腎機能ならびに生命予後に関する因子解析の実施および前向き調査による1)経時的移植腎生検の免疫病理学的検討による間質線維化因子の評価,2)血清・尿中機能分子の経時的解析による慢性移植腎症関連分子の特定,3)腎移植時の免疫モニタリングとその評価を目的とした.平成25年度計画に沿って移植腎症(132例)を対象とする疾患コホートの腎生検時臨床病理所見を中心としたプロファイルを作成し,後向き調査による予後調査成績ならびに測定指標を用いた多変量解析を実施し,低分子アデポネクチンの経時的増加による短期的腎機能に対する影響ならびに抗C型肝炎ウイルス(HCV)抗体陽性例の長期生着後の生命予後に対する独立した危険因子であることが確認された.さらに,前向き調査を継続しているこのコホート例の移植腎生検病理ならびに免疫組織学的検討による糸球体硬化と間質線維化について,特異的抗体を用いた免疫組織化学法によりその分子を同定し,画像解析装置を用いたスコア化により糸球体および間質病変では,異なる膠原繊維の集積(それぞれVI型とIII型)が確認された.さらに,この移植腎症における抗HLAクラスIおよびクラスII抗体のスクリーニングと抗体陽性例における腎組織所見を比較した.腎移植時の免疫モニタリングとその評価については,前向き疾患コホートとして作成した腎移植症例における末梢血細胞を用いたモニタリングを行い,移植早期の末梢血リンパ球/NK/マクロファージにおいてTh1, Th2, Th17, Treg(Foxp3+)サブセットおよびnon classical HLA分子の早期の変動を確認した.金沢医科大学において腎移植および腎生検が実施された移植腎症疾患コホートの臨床病理所見について,初年度にプロファイルを作成し,後向き調査成績において腎機能ならびに生命予後に関する因子解析を実施する.同時に前向き調査による1)経時的移植腎生検の免疫病理学的検討による間質線維化因子の評価,2)血清・尿中機能分子の経時的解析による慢性移植腎症関連分子の特定,3)腎移植時の免疫モニタリングとその評価を目的とした.平成26年度の計画に沿って移植腎症(132例)を対象とする疾患コホートの腎生検時臨床病理所見を中心にプロファイルを作成し,後向き調査を実施した.予後調査成績ならびに測定指標を用いた多変量解析を実施し,高・低分子アデポサイトカインの経時的増加による短期的腎機能に対する影響ならびに抗C型肝炎ウイルス(HCV)抗体および抗原陽性例の長期生着後の生命予後に対する独立した危険因子であることを明らかとした.さらに,このコホート例の前向き調査を継続した.くわえて,臨床病理学的診断における病変部血管・線維化の意義について,ヒト移植腎生検組織において長期移植腎障害時の糸球体線維化について,各膠原線維の特異的抗体による免疫組織化学法によりその分子を同定および画像解析装置を用いたスコア化し,その臨床的影響因子を明らかとした.さらに,この移植腎症における抗HLAクラスIおよびクラスII抗体のスクリーニングと免疫モニタリングとしてnon classical HLA分子(HLA-G)の変動を確認した.金沢医科大学において腎移植が実施された移植腎症疾患コホートの臨床病理所見について,腎機能ならびに生命予後に関する因子解析と前向き調査による1)経時的移植腎生検の免疫病理学的検討による間質線維化因子の評価,2)血清・尿中機能分子の経時的解析による慢性移植腎症関連分子の特定,3)腎移植時の免疫モニタリングとその評価を行った.移植腎症(132例)を対象とする疾患コホートの腎生検時臨床病理所見を中心にプロファイルを作成し,後向き調査を実施した.予後調査成績ならびに測定指標を用いた多変量解析を実施し,高・低分子アディポネクチンの経時的増加による短期的腎機能に対する影響ならびに長期生着後の生命予後,心血管疾患ならびに移植後糖尿病発症に対する独立した危険因子であることを明らかとした.さらに,このコホート例の前向き調査を継続した.さらに,臨床病理学的診断における病変部血管・線維化の意義について,ヒト移植腎生検組織の病理ならびに免疫組織学的検討による糸球体硬化と間質線維化について特異的抗体を用いた免疫組織化学法によりその分子を同定し,画像解析装置を用いたスコア化により糸球体および間質病変では,異なる膠原繊維の集積を明らかとした.

さらに,この移植腎症における抗HLAクラスIおよびクラスII抗体のスクリーニングと抗体陽性例における腎組織所見を比較した.腎移植時の免疫モニタリングとその評価については,前向き疾患コホートとして作成した腎移植症例における末梢血細胞を用いた免疫モニタリングを行い,移植早期の末梢血リンパ球/NK/マクロファージにおいてTh1, Th2, Th17, Treg(Foxp3+)サブセットおよびnon classical HLA分子(可溶性HLA-G5分子量)の早期の変動を確認した.さらに,長期経過では,可溶性HLA-G5分子量と移植後eGFR変化率(低下率)との関連を認めた.移植腎症(132例)を対象とする疾患コホートの臨床病理所見を中心としたプロファイルを作成した.高・低分子アディポネクチン変化は,腎機能ならびに心血管疾患および移植後糖尿病の独立関連因子であった.さらに,移植後糸球体硬化と間質線維化では,免疫組織学的検討により異なる膠原繊維の集積を明らかとした.腎移植時の免疫モニタリングでは,移植早期の末梢血リンパ球においてTh1, Th2, Th17, Treg(Foxp3+)サブセットおよびnon-classical HLA分子(可溶性HLA-G5)の早期変動を確認した.さらに,長期経過では,可溶性HLA-G5分子量と移植後eGFR変化率との関連を認めた.2年次の前向き研究を実施し,移植腎機能と関連する機能分子が確認されてきた.医学1)コホートにおける2年目の前向き予後調査を実施する.2)各種疾患に行った免疫抑制療法・血液浄化療法の臨床効果と予後の判定を行い,血清ならびに尿中分子のプロテオーム解析を継続する.特に免疫モニタリング実施2年以後の長期臨床効果と予後の判定を行う.3)追跡腎生検を実施した症例において登録時と同様の臨床病理・免疫組織化学を実施する.以上の検討から予後調査成績ならびに測定指標を用いた多変量解析により,各因子の腎機能ならびに生命予後に関する追跡2年目の解析を実施する.初年度に予定したコホート作成を終了し,当初の目的とした予後因子のスクリーニングと目標とする分子の移植腎障害への関与を確認できた.網羅的検索には限界があり,平成26年度以後は小分子アデポネクチンおよびnon-classical HLA分子と糸球体硬化および間質線維化に注目して計画を進める.
左右差に着目した両手協調動作の制御機構の解明―非線形力学系モデルによる検証―

採用最終年度となる平成21年度は,リズミカルなヒトの両手協調運動,およびその構成要素となる片手運動の制御機構を解明するため,京都大学大学院と東京大学大学院の共同研究体制を取りながら,以下の研究を実施した.第一に,スティックの使用が片手最速タッピング運動に与える影響について調査し,スティックの使用に伴ってタップカとタップ間隔の安定性が向上することを明らかにした(Fujii & Oda, 2009a).第二に,スティックの使用が両手最速タッピング運動に与える影響について調査し,スティックの使用により両手協調性の安定度が向上することを明らかにした(Fuji & Oda, 2009b).第三に,ノンドラマーとドラマーの片手最速リズム運動中の前腕筋表面筋電図活動を比較し,ドラマーはノンドラマーに比べて屈筋群の活動タイミングが安定しており,主動筋-拮抗筋群間の共収縮水準が低いことを明らかにした(Fujii et al.2009a)。第四に,世界最速ドラマーの片手最速リズム運動パフォーマンスと前腕筋表面筋電図活動を調査し,世界最速ドラマーはつよい右利きであるにも関わらず左右手ともに片手での10Hz動作を遂行可能であり,39ミリ秒の時間間隔で主動筋と拮抗筋を相互収縮させていることを明らかにした(Fujii et al., 2009b).第五に,バスケットボールの熟練選手は未熟練選手に比べて,ドリブル中のバウンス位置の誤差と変動性が小さく,手がボールに接触している時間が長いことを明らかにした(Katsuhara et al., in press).これらの研究成果は,道具の使用がヒトの運動機能に与える影響や,熟練音楽家・熟練スポーツ選手の運動スキル獲得機序について新たな知見を提供し,ヒトの身体運動制御・運動学習研究の発展に着実な貢献を施した点で意義深いといえる.今年度は、両手協調動作の制御機構を検討するため、以下の4つの実験を行った。第1の実験は、音楽家と非音楽家における両手協調動作制御時の注意要求の違いについて、非線形力学系モデルを用いて検討したものであった。実験の結果、音楽家は、自らの両手協調動作に対する注意要求が少なく、芸術的な音楽表現に注意を充てるだけの心理的余裕を持っていることが示された。また、そのような注意要求の減少および心理的余裕は、手の機能的左右差の減少により発現する可能性が示された。東京大学との共同によりおこなわれたこの実験成果は、2007年7月に行われたInternational Conference of Perception and Actionで発表され、書籍(Studies in Perception & Action IX)として出版された。第2の実験は、両手協調動作の構成要素となる片手動作に焦点を当て、熟練ドラム奏者と未熟練ドラム奏者のスティック制御機構の違いを筋電図学的に検討したものであった。実験の結果、熟練ドラム奏者は手首の筋群の同時収縮の水準が低く、リラックスした状態で効率的な打撃動作をおこなっていることが示された。この実験成果は、日本体育学会第58回大会にて発表された。第3の実験は、世界最速ドラマーコンテストの優勝者であるプロドラム奏者と、通常の技術レベルをもつドラム奏者とで、最速スティッキングパフォーマンスの違いを比較検討したものであった。実験の結果、通常レベルのドラム奏者は、片手で7Hzの動作が限界であるのに対し、世界最速ドラマーは、10Hzの動作を安定して遂行可能であることが示された。第4の実験は、道具の使用が両手協調動作に与える影響を検討したものであった。実験の結果、道具の使用により、両手協調動作の安定性が増大することが明らかとなった。以上4つの実験成果は、現在海外学術誌へ投稿中および投稿準備中である。本年度は、両手協調動作の制御機構を検討するため、以下の3つの研究を遂行した。第1の研究では、道具の使用がヒトの両手協調動作に与える影響を明らかにすることを目的とし、ドラム奏者の両手交互協調パフォーマンスに対するスティック使用の影響を調査した。実験の結果、スティックの使用は、打撃力の向上のみならず、両手協調動作の安定性を向上させることが明らかとなり、道具の使用はヒトの運動能力あるいは表現能力の拡張に寄与していることが示唆された。この研究成果は、国際学術雑誌Motor Control誌に受理され、現在印刷中である(Fujii and Oda,in press)。第2の研究では、両手協調動作の構成要素となる片手動作に焦点を当て、熟練した周期的片手動作の背景にある筋活動を明らかにすることを目的に、熟練ドラム奏者と非ドラム奏者のスティッキング動作中の手首筋活動を調査した。実験の結果、熟練したスティッキング制御の背景には、安定した筋活動タイミングと低い主動筋-拮抗筋間の同時収縮水準が存在することが示された。この研究成果は、国際学術雑誌Motor Control誌に受理され、現在印刷中である(Fujii et al.,in press)。第3の研究では、四肢の協調という観点から、ヒトの歩行動作に焦点を当て、予測不可能な段差に対する適応的な姿勢回復機構について検討した。実験の結果、ヒトは踏み外し後、即座に足関節の底屈筋群の活動を増大させること、着地した後、足の離地タイミングを調整し歩行リズムを維持すること、離地後には、膝を深く屈曲させ段差を乗り越える方略を取ることが明らかとなった。この研究成果は、国際学術雑誌Gait and Posture誌に発表された(Shinya,Fujii,and Oda,2009)。

採用最終年度となる平成21年度は,リズミカルなヒトの両手協調運動,およびその構成要素となる片手運動の制御機構を解明するため,京都大学大学院と東京大学大学院の共同研究体制を取りながら,以下の研究を実施した.第一に,スティックの使用が片手最速タッピング運動に与える影響について調査し,スティックの使用に伴ってタップカとタップ間隔の安定性が向上することを明らかにした(Fujii & Oda, 2009a).第二に,スティックの使用が両手最速タッピング運動に与える影響について調査し,スティックの使用により両手協調性の安定度が向上することを明らかにした(Fuji & Oda, 2009b).第三に,ノンドラマーとドラマーの片手最速リズム運動中の前腕筋表面筋電図活動を比較し,ドラマーはノンドラマーに比べて屈筋群の活動タイミングが安定しており,主動筋-拮抗筋群間の共収縮水準が低いことを明らかにした(Fujii et al.2009a)。第四に,世界最速ドラマーの片手最速リズム運動パフォーマンスと前腕筋表面筋電図活動を調査し,世界最速ドラマーはつよい右利きであるにも関わらず左右手ともに片手での10Hz動作を遂行可能であり,39ミリ秒の時間間隔で主動筋と拮抗筋を相互収縮させていることを明らかにした(Fujii et al., 2009b).第五に,バスケットボールの熟練選手は未熟練選手に比べて,ドリブル中のバウンス位置の誤差と変動性が小さく,手がボールに接触している時間が長いことを明らかにした(Katsuhara et al., in press).これらの研究成果は,道具の使用がヒトの運動機能に与える影響や,熟練音楽家・熟練スポーツ選手の運動スキル獲得機序について新たな知見を提供し,ヒトの身体運動制御・運動学習研究の発展に着実な貢献を施した点で意義深いといえる.
パッチクランプによる脊髄前角細胞におけるアデノシン受容体の神経保護作用の研究

パッチクランプ法を用いて電気生理学的検討を行った結果、アデノシンならびにアデノシンA_1受容体作動薬はシナプス後細胞である脊髄前角細胞に発現しているアデノシンA_1受容体に直接的に作用して過分極させることが明らかとなった。またアデノシンA_<2a>受容体についての作用について検討を行ったところ、脊髄前角細胞にA_<2a>受容体作動薬を投与すると約40%の前角細胞で興奮性シナプス後電流の発生頻度は有意に増加した。また、アデノシンA_1受容体作動薬の投与により、約70%の前角細胞において過分極応答が観察されたが、同一細胞にA_<2a>。受容体作動薬を投与すると大半の前角細胞において内向き電流が観察された。以上より、脊髄前角細胞においてアデノシンはA_1、とA_<2a>受容体は相反する作用を有しており、脊髄損傷の治療の際にはアデノシンよりも選択的なA_1受容体作動薬が有効であることが示唆された。そこで、脊髄前角細胞において、人工脳脊髄液から酸素とブドウ糖を除去した実験的虚血負荷を行った。そしてアデノシン、A_1受容体作動薬、A_<2a>受容体作動薬を添加し、コントロール群と比較した。この結果、実験的虚血負荷開始から数分後には急速な脱分極が起こり、記録した全ての脊髄運動ニューロンは細胞死に至った。急速な脱分極が発生するまでの潜時は平均281秒であったが、アデノシン、A_1受容体作動薬、A_<2A>受容体作動薬を添加して灌流すると、その潜時はそれぞれ363秒、348秒、284秒であり、アデノシンあるいはA_1受容体作動薬を添加した場合、急速な脱分極が発生するまでの潜時は有意に延長した。以上より、アデノシンあるいはA_1受容体作動薬が脊髄運動ニューロンにおける実験的虚血負荷による神経細胞死を抑制することが示唆された。ホールセル・パッチクランプ法を適用して,脊髄前角細胞において単一細胞レベルでアデノシンの作用機序について検討を行った.深麻酔下に,幼若Sprague-Dawley系雄性ラットの脊髄を摘出して,脊髄横断スライス標本を作製した.近赤外線システムを装備する顕微鏡を用いて脊髄前角細胞から記録を行い,アデノシンおよびアデノシンA_1受容体作動薬を灌流適用すると,ほとんど全ての脊髄前角細胞においてグルタミン酸を介する興奮性シナプス後電流の発生頻度は有意に減少した.したがって,アデノシンならびにアデノシンA_1受容体作動薬はシナプス前のアデノシンA_1受容体に作用して興奮性神経伝達物質であるグルタミン酸の遊離を抑制した.

また,アデノシンおよびアデノシンA_1受容体作動薬を灌流適用すると,半数以上の脊髄前角細胞において外向き電流(過分極応答)が観察された.すなわち,アデノシンならびにアデノシンA_1受容体作動薬はシナプス後細胞である脊髄前角細胞に発現しているアデノシンA_1受容体に直接的に作用して過分極させることが明らかとなった.脊髄損傷における二次損傷の原因として,グルタミン酸毒性や細胞の過剰興奮が考えられているが,アデノシンならびにアデノシンA_1受容体作動薬によるアデノシンA_1受容体の活性化によって細胞レベルにおいてこれらの神経毒性に拮抗する可能性が示唆された.以上の結果から,脊髄損傷の急性期の治療薬としてアデノシンおよびアデノシンA_1受容体作動薬が有効である可能性が示唆された.前年度の研究において、パッチクランプ法を用いて電気生理学的検討を行った結果、アデノシンならびにアデノシンA_1受容体作動薬はシナプス後細胞である脊髄前角細胞に発現しているアデノシンA_1受容体に直接的に作用して過分極させることが明らかとなった。本年度はアデノシンA_<2a>受容体についての作用について検討を行った。脊髄前角細胞にA_<2a>受容体作動薬を投与すると約40%の前角細胞で興奮性シナプス後電流の発生頻度は有意に増加した。また、アデノシンA_1受容体作動薬の投与により、約70%の前角細胞において過分極応答が観察されたが、同一細胞にA_<2a>受容体作動薬を投与すると大半の前角細胞において内向き電流が観察された。以上より、脊髄前角細胞においてアデノシンはA_1とA_<2a>受容体は相反する作用を有しており、脊髄損傷の治療の際にはアデノシンよりも選択的なA_1受容体作動薬が有効であることが示唆された。そこで、脊髄前角細胞において、人工脳脊髄液から酸素とブドウ糖を除去した実験的虚血負荷を行った。そしてアデノシン、A_1受容体作動薬、A_<2a>受容体作動薬を添加し、コントロール群と比較した。この結果、実験的虚血負荷開始から数分後には急速な脱分極が起こり、記録した全ての脊髄運動ニューロンは細胞死に至った。急速な脱分極が発生するまでの潜時は平均281秒であったが、アデノシン、A_1受容体作動薬、A_<2A>受容体作動薬を添加して灌流すると、その潜時はそれぞれ363秒、348秒、284秒であり、アデノシンあるいはA_1受容体作動薬を添加した場合、急速な脱分極が発生するまでの潜時は有意に延長した。以上の結果より、アデノシンあるいはA_1受容体作動薬が脊髄運動ニューロンにおける実験的虚血負荷による神経細胞死を抑制することが示唆された。
脳内Aβ産生を制御する新規分子ILEIに基づくアルツハイマー病の診断治療法

1.アルツハイマー病(AD)発症要因における脳ILEI発現レベル低下の意義ILEIはγセクレターゼ複合体に結合し、基質APP-C99の安定性を低下させAβ産生を抑制する。AD脳ではILEI発現レベルが低下していることから、この発現低下が脳内Aβ増加、引いてはAD発症の一次的要因として関与している可能性があり、モデルマウス作出を通してこれを検証する。ILEIが個体発生において機能する可能性があるため、CaMKIIプロモーター下で神経細胞に特異的、かつタモキシフェン(Tm)誘導性にILEI遺伝子欠失を操作できるコンディショナルノックアウト(ILEI-icKO)マウスの作出を進めている。ゲノム編集を行った受精卵から胚移植を行い産仔を得た。ゲノムPCR及びDNAシーケンシングによりILEI-floxedマウスを選別中である。2.診断バイオマーカーとしてのILEIの意義ILEIは分泌タンパク質であり髄液中に検出される。臨床研究計画について倫理委員会から承認を受け、AD発症前ないし初期軽症例において、髄液中ILEIレベルを検討している。昨年度樹立済のELISAシステムを用い、現在まで15症例の髄液中ILEIの測定を行った。3. ILEIを標的とする先制医療の探索ILEIとPS1の結合様式を統計力学3D-RISM理論を用いて解析し、分子設計によるAβ産生阻害薬の開発を目指している。この結合はPS1のC末端細胞外領域にあるDQL配列の近傍であること、この結合が複合体形成に依存せず当該アミノ酸配列によることを見出した。今年度、ILEIの予測構造上にDQL配列の側鎖の分布をマッピングした結果、ILEIのPS1認識部位の候補として、Lys84残基の近傍が特定された。現在、Lys84置換変異体を作製して、培養細胞を用いて解析を進めている。AD脳ではILEI発現レベルが低下していることから、この発現低下が脳内Aβ増加、引いてはAD発症の一次的要因として関与している可能性を検証する。マウス個体にILEI遺伝子ノックアウト技術を用いるが、ILEIが個体発生において機能する可能性があるため、成熟後に発現を低下させるアプローチとしてCre-loxPシステムによるILEI-cKOマウスの作出を進めている。マウスILEI遺伝子BACクローンからベクターを構築し、マウスの作製を行っている。2.診断バイオマーカーとしてのILEIの意義ILEIは分泌タンパク質であることから髄液中に検出される。AD発症前ないし初期軽症例において、髄液中ILEIレベルを検討する。ILEI上の認識部位の異なる2種類のモノクローナル抗体を作製した。作製済のポリクローナル抗体と組み合わたELISAにより高感度な定量が可能なことを確認した。現在、臨床研究計画を倫理委員会において審査中である。まず、この結合はPS1のC末端細胞外領域にあるDQL配列の近傍であること、この結合が複合体形成に依存せず当該アミノ酸配列によることを見出した。また、ILEIの予測構造上にDQL配列の側鎖の分布をマッピングした結果、ILEI上のPS1認識部位の候補が特定できた。γセクレターゼ複合体の立体構造上におけるDQL配列領域に、ILEIのPS1認識部位をドッキングすると、ほとんど立体障害のない結合様式が予測された。ILEI-cKOマウスの作出については計画よりもやや遅れているが、ILEI活性の脳内誘導ないし補充による治療法開発については、3D-RISM理論を用いたアプローチが予想以上に捗っており、薬剤の分子設計の可能性が高まった。以上より、達成度は「おおむね順調」と判断された。

この結合はPS1のC末端細胞外領域にあるDQL配列の近傍であること、この結合が複合体形成に依存せず当該アミノ酸配列によることを見出した。今年度、ILEIの予測構造上にDQL配列の側鎖の分布をマッピングした結果、ILEIのPS1認識部位の候補として、Lys84残基の近傍が特定された。現在、Lys84置換変異体を作製して、培養細胞を用いて解析を進めている。1. AD発症要因における脳ILEI発現レベル低下の意義ゲノム編集CRISPR/Cas9システムを用い、loxP配列を挿入したILEI-floxedマウスを作出する(Genome Biol 16:87, 2015)。ついで、Tam投与により神経細胞特異的なCreリコンビナーゼの発現を誘導可能なCaMKII-CreERT2マウスとの交配により、成熟期の神経細胞においてILEI発現が消失するマウスを得る。ILEI-icKOマウスとADモデルマウス[ヒト化Swedish変異型APP-KIマウス(AppNLF) (Nat Neurosci 17:661, 2014)]との交配によるILEI-icKO/ AppNLFマウスを用い、Tam投与によるILEI遺伝子欠損誘導後の脳Aβ蓄積の経時的変化と記憶障害出現を陰性対照マウスと比較評価する。2.診断バイオマーカーとしてのILEIの意義計画通り、AD症例ないし予備群の髄液のILEI濃度の解析から、その変化や診断閾値などを検討する。3. ILEIを標的とする先制医療の探索ILEIのプロモーター解析および転写因子解析などからILEI発現誘導剤の検討も進める。3D-RISM理論に基づく薬剤の分子設計については、さらなる結合様式解析をもとにペプチド、低分子量化合物の両方から設計の可能性を探る。候補分子については、培養細胞を用いILEI様活性を評価してリード化合物を特定していく。一部の試薬について、使用時期が予想よりも遅滞したことから購入を次年度に延期したため。試薬は次年度に購入する予定であり、経費は当初の計画通りに使用する。
歯周疾患の病原性機構における歯肉線維芽細胞に発現するCD14の意義

歯周疾患が、グラム陰性細菌による感染症であることは現在広く認められている。そのグラム陰性細菌群の菌体表面上に存在するリポ多糖体(LPS)は,強力な炎症性サイトカイン産生の誘導因子であることから、本疾患における特徴的な病態である歯肉の炎症と歯槽骨吸収に深く関与することが多くの研究より示唆されている。CD14は単球/マクロファージ系の細胞や好中球に発現するLPSのレセプターの一つであり、LPSの細胞応答の初期過程において重要な役割を演じていることが数多くの研究から示されている。故に,本疾患の発症と成立機構を解析するうえでLPSのCD14を介する情報伝達機構について検討することは,意義あることと考えられる.従来より、CD14はマクロファージ系の細胞や好中球に優先的に発現し、線維芽細胞などの間葉系細胞における発現についての詳細な知見は得られていなかった。歯肉線維芽細胞は歯周組織を構成する重要な機能的細胞群の一つであり,歯周病原性細菌の感染時にLPS,線毛などの細菌構成成分(病原性因子)と対応し,様々な細胞応答を誘導し,歯周疾患の発症と発展に関与するものと考えられる。以上の観点から、歯肉線維芽細胞がLPSのレセプターであるCD14を発現とその細胞内情報伝達機構について検討した。その結果、以下に示すようないくつかの新たな知見を得た。1歯肉線維芽細胞におけるCD14発現を遺伝子及び蛋白質レベルで明らかにした。3このLPSは本線維芽細胞のCD14を介して骨吸収サイトカインであるinterleukin-1や単球走化性因子(MCP-1)などの発現を誘導した。本研究は、歯周疾患病原性細菌P.gingivalisの病原性因子であるLPSの歯肉線維芽細胞におけるCD14を介する情報伝達とその作用機構を解明した。LPSのレセプターの一つであるCD14がヒト歯肉線維芽細胞並びに骨芽細胞に発現しているか否かを酵素抗体法、遺伝子発現、さらに免疫沈降反応を用いて解析を試みたところ、これら細胞に明らかなCD14の発現を検知することができた。これらの結果は、リポ多糖体(LPS)の骨吸収刺激作用がこれら細胞のCD14を介して誘導される炎症性サイトカインの破骨細胞分化促進によることの可能性を示唆した。ゆえに、LPSの骨吸収刺激作用におけるD14の役割とその機構、さらに、その骨吸収抑制剤について検討した。その結果、LPSはCD14を介してIL-1βの遺伝子発現ならびにその産生を誘導し、破骨細胞の分化を促進することが抗IL-1β抗体を用いた結果から示された。また、このCD14を介する骨吸収刺激作用にはendogenousCD14が深く関与していることが示された。すなわち、LPSによる頭蓋冠骨細胞のD14発現を調べたところ、明らかな発現の上昇が認められ、antisense D14 oligonucleotideを用いたところ、LPS誘導性IL-1βの遺伝子発現が抑制され、さらにその骨吸収刺激作用もまた明らかに抑制された。一方、このようなCD14を介する骨吸収刺激作用はintereferon-γにより著明に抑制された。この抑制機構はintereferon-γによるCD14発現の抑制に基ずくIL-1β発現の抑制に依存することが推察された。他方、歯周疾患における歯槽骨の吸収を抑制することは極めて意義あることである。本疾患は細菌感染症であることから、広く有用されているマクロライド系抗生物質についてその作用を調べたところ、エリスロマイシンがCD14を介するLPS骨吸収刺激作用を著明に抑制した。

CD14は単球/マクロファージ系の細胞や好中球に発現するLPSのレセプターの一つであり、リポ多糖体(LPS)の細胞応答の初期過程において重要な役割を演じていることが数多くの研究から示されている。従来より、CD14はマクロファージ系の細胞や好中球に優先的に発現し、線維芽細胞などの間葉系細胞における発現についての詳細な知見は得られていなかった。以上の観点から、歯肉線維芽細胞がLPSのレセプターであるCD14の発現とその細胞内情報伝達機構について検討した。その結果、昨年度、P.gingivalis LPSの歯肉線維芽細胞におけるCD14を介する情報伝達とその作用機構を解明した。この結果を基に本年度は以下のいくつかの新たな知見を得た。1.歯肉線維芽細胞はそのLPSに応答し、単球走化性因子のレセプターであるCCR2を発現し、そのリガンドであるMCP-1はIL-6発現を明らかに促進させた。本研究の結果から、歯肉線維芽細胞はCD14を介してLPSに応答し、IL-6などの産生を促し、破骨細胞の分化に係わる因子の産生を調節していることが示唆された。この事は歯周疾患患者の歯周組織の破壊機構の一端を明らかにしたと考えられる。
中近世漢字音の研究-泉涌寺宋音を中心として-

1日本漢字音資料,取り分け中近世漢字音資料として有用なものを追求すべく,京都泉涌寺を初めとして東北大学,京都大学,国立国会図書館等を巡り,漢字音文献の調査を行った.2各調査箇所において,本研究に寄与する文献のリストアップ及び一部収集をした.泉涌寺では特に執筆から,宋音(資料)に係わる実際の読経音や経文に付された各種記号の指示内容についての貴重な情報を直接得ることができた.3本研究開始以前に収集したものも含め,資料の分析を日本漢字音史の展開を脳裏に置きながら進めた.それとともに,分析結果のコンピュータ処理を図るため付属部品を購入し,必要な情報の入力を行いつつ所期の目的に沿って従来の研究を踏まえながら中近世漢字音,そしてその一構成要素であるところの泉涌寺宋音について考察を試みた.4考察の過程で,中近世漢字音なかんずく泉涌寺宋音の特徴の把握や歴史的な位置づけをし,さらにそれを通じて中近世日本語の音韻状態を明らかにするためには,上代以降の日本漢字音史の解明が必要であることが明白となった.そこで,中近世漢字音・宋音の研究を旨としながらも,上代中古の漢字音すなわち呉音漢音の研究も行った.5上記4までの研究の結果,当初の目的を達成することができた.その成果の一部は, 62年度中に発刊予定の筑波大学の紀要で発表する.なお,現在,その他の成果の発表を行うべく準備を進めている.1日本漢字音資料,取り分け中近世漢字音資料として有用なものを追求すべく,京都泉涌寺を初めとして東北大学,京都大学,国立国会図書館等を巡り,漢字音文献の調査を行った.2各調査箇所において,本研究に寄与する文献のリストアップ及び一部収集をした.泉涌寺では特に執筆から,宋音(資料)に係わる実際の読経音や経文に付された各種記号の指示内容についての貴重な情報を直接得ることができた.3本研究開始以前に収集したものも含め,資料の分析を日本漢字音史の展開を脳裏に置きながら進めた.それとともに,分析結果のコンピュータ処理を図るため付属部品を購入し,必要な情報の入力を行いつつ所期の目的に沿って従来の研究を踏まえながら中近世漢字音,そしてその一構成要素であるところの泉涌寺宋音について考察を試みた.4考察の過程で,中近世漢字音なかんずく泉涌寺宋音の特徴の把握や歴史的な位置づけをし,さらにそれを通じて中近世日本語の音韻状態を明らかにするためには,上代以降の日本漢字音史の解明が必要であることが明白となった.そこで,中近世漢字音・宋音の研究を旨としながらも,上代中古の漢字音すなわち呉音漢音の研究も行った.5上記4までの研究の結果,当初の目的を達成することができた.その成果の一部は, 62年度中に発刊予定の筑波大学の紀要で発表する.なお,現在,その他の成果の発表を行うべく準備を進めている.
ため池の劣化度と動特性の関係の明確化とため池性能劣化予測モデルの構築

本研究では,ため池堤体の劣化度と動特性関係の明確化と性能劣化予測モデルの構築を目的とした.愛媛県の3つのため池で比抵抗電気探査,表面波探査および常時微動計測を実施した.また,地下水位ー固有振動数関係の明確化のために,実験土槽内で模擬地盤を作成し,常時微動計測を実施した.固有振動数と地下水位の上昇による地盤の強度や有効応力の低下には相関があり,当初からの強度低下や有効応力の減少を劣化度とすれば,劣化度ー動特性関係が求められ,常時微動計測によりため池堤体の劣化を推定できる可能性を示唆した.また,モンテカルロフィルタを用いてため池堤体の減衰定数と剛性を推定し,堤体の性能劣化の予測を試みた.本研究では,ため池の耐震対策のための耐震診断として,ため池堤体の劣化と卓越周期および増幅特性の関係を非破壊物理探査法により推定することを目的とする.またその関係から,ため池劣化度診断システム,ため池劣化度ー動特性モデル,ため池性能劣化予測モデルを構築する.本課題では,「非破壊物理探査法によるため池堤体の諸量の計測」,「ため池劣化度診断システムの構築」,「ため池劣化度ー動特性モデルの構築」,「ため池性能劣化予測モデルの構築」の4ステップに従い研究を進めるが,本年度はステップ2, 3を実施した.●ステップ2:貯水位を変化させて比抵抗電気探査を実施し,その結果を比較すれば,堤体内の含水状況が把握でき,遮水性に対する劣化度が評価できる.また,表面波探査結果からは,堤体のVs構造がわかり,強度に関する劣化度が評価できる.さらに,双方の結果を総合的に診断するために,自己組織化マップを用いたシステムの開発を行った.●ステップ3:ステップ2で開発したため池劣化度評価システムでは,ため池の縦・横断面における2次元の劣化度が求められる.したがって,劣化度はため池の位置により異なるため,その位置で常時微動を計測した.これより,ため池劣化度ー動特性(卓越周期,増幅特性)関係が得られた.本研究では,ため池堤体の劣化度と動特性関係の明確化と性能劣化予測モデルの構築を目的とした.愛媛県の3つのため池で比抵抗電気探査,表面波探査および常時微動計測を実施した.また,地下水位ー固有振動数関係の明確化のために,実験土槽内で模擬地盤を作成し,常時微動計測を実施した.固有振動数と地下水位の上昇による地盤の強度や有効応力の低下には相関があり,当初からの強度低下や有効応力の減少を劣化度とすれば,劣化度ー動特性関係が求められ,常時微動計測によりため池堤体の劣化を推定できる可能性を示唆した.また,モンテカルロフィルタを用いてため池堤体の減衰定数と剛性を推定し,堤体の性能劣化の予測を試みた.農業用ため池は,その約75%が築造されてから100年以上経過しており,数多くのため池が何らかの機能障害を起こしている.このように老朽化によって本来の健全な状態が損なわれていると,被害が発生する可能性がより高くなり,近年では地震や豪雨によるため池災害がしばしば発生している.そのため,大規模地震に対する老朽ため池の改修や地盤特性に応じたため池の耐震対策は緊急を要している.本研究では,ため池の耐震対策のための耐震診断として,ため池堤体の劣化と卓越周期および増幅特性の関係を非破壊物理探査法により推定することを目的とする.またその関係から,ため池劣化度診断システム,ため池劣化度ー動特性モデル,ため池性能劣化予測モデルを構築する.本課題では,「非破壊物理探査法によるため池堤体の諸量の計測」,「ため池劣化度診断システムの構築」,「ため池劣化度ー動特性モデルの構築」,「ため池性能劣化予測モデルの構築」の4ステップに従い研究を進めるが,本年度はステップ1を実施した.●比抵抗電気探査:比抵抗電気探査は、地盤に電流を流して地盤の電気抵抗分布を調査するものである.計測項目は溜池堤体の比抵抗分布および含水状況とした.●高精度表面波探査:起震機(人口震源)により地表面に上下振動を与えることにより発生させたレイリー波を検出器により検出し,その伝播速度を測定する.計測項目はS波速度構造および溜池堤体内部の空洞とする.●常時微動計測:微小な地盤振動を測定して,ため池堤体の動特性の推定や地盤種別の判定などに利用する.計測項目は卓越周期,増幅特性とした.農業用ため池は,その約75%が築造されてから100年以上経過しており,数多くのため池が何らかの機能障害を起こしている.このように老朽化によって本来の健全な状態が損なわれていると,被害が発生する可能性がより高くなり,近年では地震や豪雨によるため池災害がしばしば発生している.

そのため,大規模地震に対する老朽ため池の改修や地盤特性に応じたため池の耐震対策は緊急を要している.本研究では,ため池の耐震対策のための耐震診断として,ため池堤体の劣化と卓越周期および増幅特性の関係を非破壊物理探査法により推定することを目的とする.本課題では,「非破壊物理探査法によるため池堤体の諸量の計測」,「ため池劣化度診断システムの構築」,「ため池劣化度ー動特性モデルの構築」,「ため池性能劣化予測モデルの構築」の4ステップに従い研究を進めるが,本年度はステップ3, 4を実施した.昨年度の非破壊物理探査結果より,貯水位の変動により常時微動の値に変化が見られ,卓越振動数にも影響することがわかった.しかしながら,貯水位と堤体内の浸潤線の変動は必ずしも一致しないため,貯水位と卓越振動数の間に一定の法則性がみられなかった.そこで,地下水位変動と地盤卓越振動数の関係を明確にするために,実験土槽内で模擬地盤を作成し,常時微動計測を実施した.また,ポータブルコーン貫入抵抗試験による貫入抵抗値および有効応力と地盤卓越振動数の関係の検討を行った.貫入抵抗値および有効応力が小さくなると,卓越振動数も小さくなる明確な傾向が示された.貫入抵抗値および有効応力と劣化度の関係を示すことにより,ため池劣化度ー動特性モデルおよび劣化予測モデルが構築できることになる.農業土木学・農村計画学愛媛県の漏水ため池で,比抵抗電気探査,高精度表面波探査,常時微動計測を複数回行い,堤体内の含水状況,Vs構造,卓越周期および増幅特性を把握した.また,これらの研究成果を第21回日本雨水資源化システム学会大会,平成25年度農業農村工学会大会講演会で発表した.さらに,平成25年度農業農村工学会大会講演会に3編投稿した.愛媛県の2か所の漏水ため池で,比抵抗電気探査,高精度表面波探査,常時微動計測を複数回行い,堤体内の含水状況,Vs構造,卓越周期および増幅特性を把握した.また,これらの結果を研究成果を第20回日本雨水資源化システム学会大会で発表した.さらに,平成25年度農業農村工学会大会講演会に投稿した.先ず,ため池諸元(堤高,堤頂長)の異なる堤体での調査により,諸元に依存したため池劣化度ー動特性モデルを構築する.次に,ため池老朽化度ー動特性(卓越周期,増幅特性)関係が明らかになれば,常時微動測定という簡易な測定から得られる動特性からため池の劣化度が簡単にわかることになる.これより,性能劣化モデルが作成でき,さらに,供用中の常時微動測定と粒子フィルタから劣化予測モデルを構築する.すなわち,以下の式を更新することによりモデルが完成する.本課題では,「非破壊物理探査法によるため池堤体の諸量の計測」,「ため池劣化度診断システムの構築」,「ため池劣化度ー動特性モデルの構築」,「ため池性能劣化予測モデルの構築」の4ステップに従い研究を進めるが,平成25年度ははステップ2,3を実施する.●ステップ2:貯水位を変化させて比抵抗電気探査を実施し,その結果を比較すれば,堤体内の含水状況が把握でき,遮水性に対する劣化度が評価できる.また,表面波探査結果からは,堤体のVs構造がわかり,強度に関する劣化度が評価できる.さらに,双方の結果を総合的に診断するために,自己組織化マップを用いたシステムの開発を行う.●ステップ3:ステップ2で開発したため池劣化度評価システムでは,ため池の縦・横断面における2次元の劣化度が求められる.したがって,劣化度はため池の位置により異なるため,その位置で常時微動を計測する.これより,ため池劣化度ー動特性(卓越周期,増幅特性)関係が得られる.さらに,ため池諸元(堤高,堤頂長)の異なる堤体での調査により,諸元に依存したため池劣化度ー動特性モデルを構築する.予定していた論文投稿を,次年度にしたため.平成26年度は最終年度であり,成果の発表(学会参加,論文投稿)に使用する予定である.平成24年度に引き続き,複数回の調査を行うため,旅費および謝金が研究費の約50%を占める.物品費は50万円以上の物品を購入する予定はなく,すべて消耗品である.また,学術論文集への投稿を予定しており,その投稿料を計上している.
多孔質セラミックス担体を用いた未分化間葉細胞分化による歯髄・象牙質複合体再生

象牙質再生に適した形状の多孔質セラミックスを担体として自己の未分化幹細胞から歯髄・象牙質複合体を再生し、歯根再生を実現することを目的とする従来の一連の研究結果から、気孔率を55%、そして、気孔径を150300μmの円筒状の多孔質セラミックス担体をメーカーに作製依頼し、試験に供した。円柱状と円筒状の多孔質セラミックス担体によるin vivoの実験で、担体の形状は気孔内での骨形成量に影響を及ぼすことが確認された。すなわち、ラット大腿骨から採取した骨髄幹細胞を円柱状および円筒状の多孔質セラミックス担体に播種して同系ラットの背部皮下に埋入した結果、担体の気孔に形成された骨量は円柱状担体より円筒状担体の方が多い結果が得られた。円筒状担体の中空部には結合組織が増殖し、気孔内にも小血管を含む結合組織の侵入が認められた。一方、円柱状の担体においては中心部に存在する気孔には結合組織の増殖が認められなかった。円筒状の多孔質セラミックス担体は、円柱状の担体と比較すると中空部内面があるために周囲組織との接触面積が大きい。円筒状担体にはこの内表面が存在するので、担体を包む周囲組織が外表面と中空部内表面に侵入して栄養および骨形成に必要な生理活性物質を気孔内に有効に伝達すると考えられる。本件申請者らが目的とする、歯髄・象牙質複合体の再生、さらには、歯根の再生にとって、象牙質形成能を有する多数の間葉系細胞の採取は困難であり、培養系での象牙質形成には長期間を必要とする。本件申請者らは、自己の未分化細胞から歯髄・象牙質複合体を再生し、歯根再生を実現することを目的として実験を積み重ねてきた。この目的を達成するひとつの段階として、円筒形の多孔質セラミックス担体を用いることによって、より少数の間葉系細胞から硬組織を形成する可能性を見出すことができた。これは象牙質再生に向けての今後の研究において極めて有意義な結果と考える。象牙質再生に最も適した多孔質セラミックスの設計、作製を目的とし、さらに、それを担体として用いて自己の未分化細胞から歯髄・象牙質複合体を再生し、歯根再生を実現することを目的として本研究を実施した。象牙質再生に適する多孔質セラミックス担体について、従来の研究結果を参考にして気孔率55%および気孔径150250μmの条件で作製をメーカーに依頼し、円筒状および円柱状の担体を作製した。多孔質担体を用いたin vivoの実験で、未分化間葉細胞の分化促進のための因子としてヒアルロン酸とラミニンを多孔質担体気孔内に作用させ、これをラット背部皮下に埋入した。一般にin vivoで皮下に埋入することによって骨形成を誘導させるために必要な担体に播種する細胞数の1/10ではヒアルロン酸あるいはラミニンを気孔内に作用させていない多孔質担体においては骨が形成されなかった。

しかし、両物質のいずれかを応用した担体では、細胞が必要な数の1/10であっても、有意に多数の気孔内に骨形成が誘導される結果が得られた。すなわち、ヒアルロン酸あるいはラミニンは担体の気孔内で骨髄由来の未分化間葉細胞を効果的に分化誘導した。また、担体の形状は気孔内での骨形成量に影響することが明らかになった。象牙質再生のために円柱状、および、円筒状の多孔質セラミックス担体について比較した結果、接触面積の大きい円筒状の担体では有意に多数の気孔で骨形成が認められた。多数の歯髄細胞の採取は困難であるとともに、培養系で歯髄細胞を増殖させるためには長期間を必要とする結果が得られている。今回の結果はより少数の細胞で硬組織形成が可能になることを示したもので、象牙質再生に向けての今後の研究において極めて有意義である。象牙質再生に最も適した形状の多孔質セラミックスを作製し、さらに、それを担体として用いて自己の未分化細胞から歯髄・象牙質複合体を再生し、歯根再生を実現することが本研究の目的である。従来の研究結果から、象牙質再生に適した多孔質セラミックス担体の気孔率は55%、そして、気孔径は150300μmとして、これらの条件で多孔質セラミックス担体の作製をメーカーに依頼した。その形状は円柱を基本として、歯の形状に留意して円筒状の担体を作製した。多孔質セラミックス担体の形状は気孔内での骨形成量に影響を及ぼすことがin vivoの実験で確認された。ラット背部皮下に埋入された円柱状の担体での骨形成量は円筒状の骨形成量より少なかった。円筒状の多孔質セラミックス担体では周囲組織との接触面積が大きく、栄養および骨形成に必要な生理活性物質が気孔内に有効に運ばれる故であると考えられる。円筒状担体の中空部には結合組織が増殖し、気孔内にも小血管を含む結合組織の侵入が認められた。一方、円柱状の担体においては中心部に存在する気孔には結合組織の増殖が認められなかった。なお、歯髄・象牙質複合体の再生、さらには、歯根の再生にとって、象牙質形成能を有する多数の間葉系細胞が必要であるがその採取は困難であり、培養系での象牙質形成には長期間を必要とすることは明らかである。今年度は、円筒形の多孔質セラミックス担体を用いて、より少数の間葉系細胞から硬組織を形成する可能性を見出すことができた。この結果は、象牙質再生に向けての今後の研究において極めて有意義と考える。
複製と修復をカップリングする損傷乗り越え複製の普遍性

複製と修復をカップリングする損傷乗り越え合成(TLS)の普遍性を明らかにするために、ヒトDNAポリメラーゼ・イータ(Polη)と主要な紫外線損傷であるCPDを含むDNAとの共結晶をX線構造解析した。その結果、PolηはCPDを含むDNAに対して添え木のように働いた。またこれまで不明であったヒトPCNAのポリユビキチン化の機構について、あらかじめE2上に形成されたポリユビキチン鎖がPCNAに付加されることが明らかになった。研究代表者および研究分担者は、複製と修復をカップリングする損傷乗り越え複製の普遍性を明らかにするために、以下の研究を協力して進めた。(1)ヒトPolηの機能構造の解析:米国NIHのグループなどとの共同研究により、ヒトPo1ηとCPDを含む鋳型・プライマーDNAとの共結晶構造解析を行った。CPDを含むDNAは歪みを有するが、Polηが結合することによりCPD周辺のDNA構造の歪みが解消され、無傷のDNAと同様な構造をとることが明らかになった。つまり、PolηはCPDを含むDNAに対して添木のように作用し、DNA構造を変化させながら、正確で効率のよいTLSを担えることが明らかになった。(2)Polηによる損傷乗り越え複製の損傷特異性の解析:CPDには4つの幾何異性体が存在し、紫外線照射により最も大量にcis-syn型が生じるが、次いでtrans-syn型が生成する。大阪大学のグループが、世界で初めてtraps-syn型のCPDの化学合成に成功した。そこで、ヒトPolηによるtrans-synCPDの乗り越え複製反応について解析を行った。Polηはcis-syn型CPDとは異なり、trans-syn型CPDに対してはヌクレオチドを重合は出来るものの、そこで反応は停止し、乗り越え効率は非常に低いことを明らかにした。(3)複数の損傷乗り越え複製機構間の連携機構の解析:Polηは紫外線損傷の正確な乗り越え複製を担うのに対して、Polζ(ゼータ)は誤りがちな乗り越え複製に関与していると考えられている。京都大学のグループなどとの共同研究により、ニワトリDT40の異なる損傷乗り越え欠損細胞における種々のDNA損傷に対する応答を調べた。その結果、Polζ欠損下では、Polηが存在することにより、おそらく組換え修復などの経路が阻害され、細胞死に繋がっていることが示唆された。(1)ヒトREV1の機能の解析:ヒートショックタンパク質Hsp90は、DNA損傷応答に関係したタンパク質の制御に関わっていることが知られている。REV1の制御を調べるためにHsp90との相互作用を調べたところ、両者は物理的に相互作用していることが分かった。Hsp90の特異的阻害剤17-AAGはREV1タンパク質のレベルを下げ、紫外線誘発突然変異頻度を下げる。同時に17-AAGはモノユビキチン化PCNAとREV1との結合を低下させ、REV1のフォーカス形成を下げることも示された。すなわちHsp90はREV1の構造を保ち、その機能を制御することが分かった。(2)ヒトNBS1の損傷乗り越え複製における役割の解析:NBS1はDNA2本鎖切断の修復に必須のタンパク質であるが、このたびPol ηの紫外線損傷部位でのフォーカス形成にも必須であることが分かった。NBS1は直接的にはRAD18と相互作用し、RAD18の損傷部位へのリクルートに働くこと、またRAD18はRAD6と協同してPCNAのモノユビキチン化に働くが、NBS1とRAD6とはRAD18の同じ部位と相互作用することが分かった。(3)体細胞超突然変異(SHM)におけるREV1とPOLHの遺伝的相互作用:REV1の不活性型変異体とPOLH遺伝子欠損を組み合わせて、SHMにおける両遺伝子の作用を調べたところ、それぞれ単独の変異に比べ、両方に変異を持つマウスはCからGおよびGからCのトランスバージョン変異を低下させることが示された。この結果から、上記トランスバージョン変異はREV1の触媒活性とPOLHが起こす経路のほか、REV1の非触媒活性とPOLHの関わる別経路によって起きることが分かった。研究代表者と研究分担者は、複製と修復をカップリングする損傷乗り越え複製の普遍性を明らかにするために、以下の研究を協力して進めた。(1)ヒトDNAポリメラーゼ・イータ(Polη)の構造とシスプラチン損傷乗り越え反応:ヒトPolηは、主要な紫外線損傷のシクロブタン型ピリミジン二量体を効率よく、また比較的正確に乗り越えて複製することができる。一方、制がん剤として用いられているシスプラチンによるDNAの鎖内架橋に対しては、あまり効率がよくなく、また誤りがちな乗り越えしか出来ない。その構造的な基盤を明らかにすべくヒトPolηとシスプラチン損傷を持つDNAとの共結晶を作成し、X線解析により構造を明らかにした。その結果、ヒトPolηはシスプラチン損傷DNAの折れ曲がりを正すことが出来ず、プライマーの末端で鋳型DNAとの塩基対が異常な構造を取ることを見出した。

(2)ヒト細胞におけるPCNAの翻訳後修飾による複製阻害回避機構の解析:DNA損傷トレランス機構(DDT)において、PCNAの翻訳後修飾が重要であることが明らかになってきており、中でも164番目のリジン(K164)のモノユビキチン化は損傷乗り越え複製の鍵を握っていると考えられている。しかしヒト細胞でのPCNAの翻訳後修飾の生理的な意義は必ずしも明らかでなく、またホモ三量体を形成しているPCNAのそれぞれの修飾状態については議論がされていない。そこでK164をアルギニンに置換した変異体PCNAを発現するヒト細胞株を作成し、ヒト細胞でのPCNAのユビキチン化について解析した。その結果、変異体PCNAを発現するヒト細胞ではDDTが低下し、Polηの有無に関わらず、紫外線に高い感受性を示すことが明らかとなった。研究代表者と研究分担者は、複製と修復をカップリングする損傷乗り越え複製の普遍性を明らかにするために、以下の研究を協力して進めた。(1)ヒトDNAポリメラーゼ・イータ(Polη)によるWAモチーフでの体細胞超突然変異(SHM):SHMは、特異抗体を産生するために免疫グロブリン遺伝子の可変領域においてプログラムされた塩基置換により生ずる。SHMのホットスポットは、RGYWおよびWA(R、プリン;Y、ピリミジン;W、A or T)という二つのモチーフであることが分かっている。Polηは、鋳型Tに対してdGTPを取り込むことにより、上記のWAモチーフをWGモチーフに変換するところに働いていると示唆されている。そこで、ヒトPolηと鋳型TA、AA、GA、CAに対しdATPの代わりにdGTPが取り込まれるときの結晶構造と反応のキネティクスを比較した。T:dGTPというwobble塩基対は、Polηに特異的に保存されているGln-38とArg-61により安定化された。プライマー末端の弱い塩基対であるW(T:AまたはA:T)とPolηとの異なる相互作用は、WAモチーフに対してGを取り込ませた。Polηは二つのWAモチーフの間では、AAに対してTAのほうがAからGへの変異を起こし易く、T:Gミスペアを効率よく伸長した。(2)シクロブタン型T-N4-meC二量体の安定性:TT部位のシクロブタン型ピリミジン二量体(CPD)は比較的安定で、その修復やDNA合成の阻害について詳しく研究されている。一方、Cを含むCPDは、Cが容易に脱アミノ化を起こしてUになるので、その修復やTLSの機構の研究が遅れている。今回、N4-meCを用いることでCの安定化が起き、脱アミノ化が抑制されること、Polηによる合成反応でN4-meCに対してdGMPの他にTMPの取り込みが明らかにみられることを見出した。(1)ヒトTLSポリメラーゼ活性を変化させる低分子化合物:ヒト