hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
細胞内で過剰発現された蛋白のオルガネラへの移行と存在量調節機構

ミトコンドリアに局在する極長鎖脂肪酸アシルCoA脱水素酵素をコードする全長cDNAをクローン化した。このクローンの持つアミノ酸配列から、他のアシルCoA脱水素酵素群よりもC末端側に約180アミノ酸から成る延長ポリペプチド部分を持つことが明らかになった。この延長ポリペプチド部分をC末端側から60アミノ酸ずつ削ったミュータントをcDNA上で作製し、各々のcDNAをワクシニアウイルス発現ベクターにくみ込んだリコンビナントウイルスを調製した。ウイルスはラットへパトーマH4への感染に使われた。感染後の経時的変化をイムノブロットで調べると、発現された全長の蛋白はミトコンドリア内に入り、安定な状態で存在する。C末端側から60アミノ酸ずつ欠いたミュータントのコードする蛋白はミトコンドリア内に入るが、全長の蛋白より安定性が劣るため経時的に分解減少してゆくことが明らかになった。またミュータントのコードする蛋白は膜結合性の性質を失って、水溶性蛋白に変じていた。さらに、二量体を形成する性質を失って、単量体で存在することもわかった。すなわち、C末側の延長ポリペプチドの機能は蛋白分子のミトコンドリア内での安定性に寄与していることがわかり、あまり例のない独特な存在量調節機構が存在することが明らかとなった。この酵素に対応するペルオキシソーム局在のアシルCoAオキシダーゼのヒトcDNAもクローン化され、C末側の延長ポリペプチド上に脱落を生じさせたミュータントを作り、発現させて解析したところ、前記の酵素の場合と同様に全長の蛋白よりもペルオキシソーム内における安定性が劣っていた。ミトコンドリア局在の蛋白として極長鎖脂肪酸アシルCoA脱水素酵素,ペルオキシソーム局在の蛋白としてアシルCoAオキシダーゼさらに対照としてミクロゾーム局在の蛋白としてチトクロームP450を選び,各々の全長cDNAおよびシグナルペプチドを欠いたもの,適当な部分を脱落させたもの計16種のcDNAについてワクシニアウイルスリコンビナント体を構築した。ラットヘパトーマH4・IIEC3を宿主として発現させたところ,極長鎖脂肪酸アシルCoA脱水素酵素は細胞総蛋白の0.2-0.3%を占める程度に発現されミトコンドリア中に95%以上の蛋白が局在していた。N末側の40アミノ酸を除去したものはミトコンドリアに挿入されず,サイトゾール中で完全に分解された。この蛋白はミトコンドリアに挿入されることが安定化の為の大きな要因であった。ミトコンドリアに挿入後の安定性についてはC末側200アミノ酸が大きな役割をはたしており,C末から180アミノ酸を欠いたものは短時間でミトコンドリア内で分解されてしまう。アシルCoAオキシダーゼに関してはC末端の3つのアミノ酸がペルオキシソーム挿入シグナルである。このシグナルを除去したクローンは発現量が正常のものの1/10程度であった。この両者のmRNA合成量がほぼ等しいことから,ペルオキシソームへの挿入が存在量調節のための最大因子と考えられたが,ペルオキシソームの存在しないZellweger細胞で発現させた場合にも通常細胞の場合と同様に,シグナルを除去したクローンは正常のものの1/10程度の発現量であった。このことは蛋白自体の細胞内での安定性が存在量調節のための大きな因子であることを示唆している。多数の欠落ミュータントクローンの発現結果から,C末付近に欠落を与えるとmRNAの安定性が極端に減少することがわかった。しかし,分子中央部に欠落を与えるとmRNAの安定性は全長分子よりもずっとすぐれているが,蛋白の安定性は著しく低下するという興味深い結果を得た。

この延長ポリペプチド部分をC末端側から60アミノ酸ずつ削ったミュータントをcDNA上で作製し、各々のcDNAをワクシニアウイルス発現ベクターにくみ込んだリコンビナントウイルスを調製した。ウイルスはラットヘパトーマH4への感染に使われた。感染後の経時的変化をイムノブロットで調べると、発現された全長の蛋白はミトコンドリア内に入り、安定な状態で存在する。C末端側から60アミノ酸ずつ欠いたミュータントのコードする蛋白はミトコンドリア内に入るが、全長の蛋白より安定性が劣るため経時的に分解減少してゆくことが明らかになった。またミュータントのコードする蛋白は膜結合性の性質を失って、水溶性蛋白に変じていた。さらに、二量体を形成する性質を失って、単量体で存在することもわかった。すなわち、C末側の延長ポリペプチドの機能は蛋白分子のミトコンドリア内での安定性に寄与していることがわかり、あまり例のない独特な存在量調節機構が存在することが明らかとなった。この酵素に対応するペルオキシソーム局在のアシルCoAオキシダーゼのヒトcDNAもクローン化され、C末側の延長ポリペプチド上に脱落を生じさせたミュータントを作り、発現させて解析したところ、前記の酵素の場合と同様に全長の蛋白よりもペルオキシソーム内における安定性が劣っていた。
植物のトバモウイルス認識機構における宿主ーウイルスタンパク質間相互作用の解析

トウガラシ属植物のトバモウイルス抵抗性の分子機構解明を目指し、抵抗性の特異性を決定する抵抗性タンパク質L1,L2,L3およびL4とそれらに認識されるトバモウイルス外被タンパク質の変異導入による機能解析に取り組んだ。Lと外被タンパク質は物理的に相互作用し、その親和性の強度が、認識特異性と抵抗反応強度を決定することを明らかにした。植物の宿主特異的抵抗性における抵抗性タンパク質(R)による病原体非病原力エフェクター(Avr)の認識機構を分子レベルで理解する為,トウガラシ属のLタンパク質ファミリーと,これらに認識されるトバモウイルスの外被タンパク質(CP)をモデル実験系として,認識特異性並びに抵抗性反応強度とL-CP間相互作用のアフィニティとの関連性について解析した。前年度までに,抵抗性タンパク質L4のLRRドメインのβシートモチーフへの変異導入により認識可能なCPの範囲が狭小化する変異体の作出と複数の変異箇所の組合せによって,認識特異性並びに抵抗性反応強度とL-CPタンパク質間相互作用のアフィニティの相関性があることを明らかにした。本年度は,CP側の被認識部位の特定を目指し,L1およびL2に認識されず,L3およびL4に認識される野生型のトウガラシ微斑ウイルス岩手系統(PMMoV-Iw)のCP遺伝子配列にランダムに点変異を導入することによってLタンパク質による被認識アミノ酸残基又は部位を探索した。はじめにL3又はL4に認識されなくなる変異体を選抜した結果,L3またはL4の認識に必要なCP上のアミノ酸部位が異なることが明らかとなった。さらにL2に認識されるようになる変異体を選抜したところ,得られた変異体のアミノ酸変異部位は多様であり,立体構造上の部位は一部に集約されず全体に分散した。すなわち,LによるCP認識の標的部位は,特定の部位ではなく,複数の部位がターゲットになりうるものと考えられた。植物の宿主特異的抵抗性における抵抗性タンパク質(R)による病原体非病原力エフェクター(Avr)の認識機構を分子レベルで理解する為,トウガラシ属のLタンパク質ファミリーと,これらに認識されるトバモウイルスの外被タンパク質(CP)をモデル実験系として,認識特異性並びに抵抗性反応強度とR-Avrタンパク質間相互作用のアフィニティの相関性について検証した.はじめに,認識可能なCPの範囲が最も広いとされるL4について,認識範囲が狭小化する変異体を得た.認識特異性を決定しているLeucine-rich repeat(LRR)ドメインの32個の推定βシートモチーフ配列xxLxLxxを個々にxALALAxとアミノ酸置換を導入し,それぞれの変異体のCP認識能を検証した.様々に認識範囲の狭小化が認められたが,モチーフ特異的にある種のCPが認識されなくなるのではなく,必ず認識されにくいCPから順に認識されなくなるという傾向が認められた.12番目のモチーフと32番目のモチーフのxALALAx変異体(L4LRR12A及びL4LRR32A)は,共に,認識範囲の狭小化が認められ,さらに最も認識されやすいCP(ToMV-CP)に対する抵抗性反応強度が弱まっていた.この2つの変異を持つ二重変異体(L4LRR12A32A)は,さらに認識範囲が狭くなり,かつToMV-CPに対する抵抗性反応強度が弱まっていた.すなわち認識範囲と抵抗性反応強度は,[wild type L4>L4LRR12A=L4LRR32A>L4LRR12A32A]となった.これらのRタンパク質とToMV-CPの相互作用を免疫共沈法で検証すると,どれも相互作用が認められ,そのアフィニティは,[wild type L4>L4LRR12A=L4LRR32A>L4LRR12A32A]であり,正の相関が認められた.研究目標である,認識特異性並びに抵抗性反応強度とR-Avrタンパク質間相互作用のアフィニティについて正の相関が認められることを明らかにできた点から,研究の進捗はきわめて順調である.研究計画では,R-Avrタンパク質間相互作用のアフィニティを定量化するために,蛍光タンパク質Keima-Redを用いた蛍光相互相関分光法による分子間相互作用解析を行う予定であった.しかし,Keima-Red結合タンパク質が安定して発現しなかった為,この実験については断念せざるをえないが,代わりに,免疫沈降後のウェスタンブロットのRとAvrのバンドの太さを数値化し,相対的なアフィニティ強度を定量化した.また,次年度に向けて,LRRへの変異導入試験の結果から,LRRドメインの特定の部位ではなく,複数の箇所が複合的にCPとの相互作用を規定している可能性が示され,認識機構を構造生物学的に解析するための情報が得られた.さらに,L4における認識範囲の狭小化変異を, L3に導入して,その影響を調べたところ,同一の変異を導入したL4とL3で異なる認識特異性の狭小化への影響が異なることが分かった.L3とL4に共に認識されるPMMoV-CPにランダムに変異を導入し,認識を回避する変異体を得たところ,L3の認識を回避する変異と,L4の認識を回避する変異のアミノ酸置換部位が異なっていた.

このことと併せて,L3とL4は同一のAvrタンパク質を認識するが,その認識する部位は異なり,これはL3とL4のLRRの立体構造の違いに起因するものと予想された.残す所,L3においても認識特異性がCPとの相互作用アフィニティにより規定されるかについて検証すれば,本研究課題の目的は概ね達成される.これらの実験は2年目に予定していたものであることから,当初の計画以上に進展していると判断する.トウガラシ属のL抵抗性タンパク質によるトバモウイルスの認識が,R-Avrの相互作用のアフィニティで決定することを,L3など他の抵抗性タンパク質についても明らかにする.具体的には,L3のLRRにxALALAx変異を導入した変異体で,認識範囲が狭小化したものについて,CPとの相互作用のアフィニティを野生型のL3と比較する.これまで,認識範囲が狭小化する,機能欠損変異体の解析をしていたが,機能欠損変異体の場合,アミノ酸の極性の差異や立体構造への影響など,どのようなアミノ酸置換の影響が理由で認識能が失われているかの考察が難しく,さらに詳細に解析するにも,予想以上に複数の認識範囲が狭小化したL4LRR変異体が得られた.そこで2年目は,反対に認識機能を獲得する変異体の作出を試みる.LRRについては複数箇所が認識に関わっていることが示唆されたため,サイズが大きくランダム変異のスクリーニングをすることはあまり現実的ではない為,CPについて被認識機能を獲得する変異体の作出を試みる.PMMoV-CPはL1, L2, L2bに認識されない.これらの抵抗性タンパク質に認識されるようになるPMMoV-CP変異体をスクリーニングする.このスクリーニングには,L3やL4の認識を回避するPMMoV-CP変異体のスクリーニングに用いたライブラリーが利用できる.被認識能を獲得した変異体CPは,Lタンパク質との相互作用のアフィニティが強化されていると考えられる為,この可能性について検証する.これらのデータを加え,論文としてまとめる.L-CPタンパク質複合体の立体構造モデリングについては,単純な構造モデル対構造モデルのドッキングシュミレーションが可能かどうかについて検討する.研究費の主な使用用途の内訳としては,1)消耗品費,2)人件費,3)国内旅費,4)その他,に分かれる.設備備品への研究費の使用予定はない.以下にそれぞれの使用計画を記す.1)消耗品費としては,主にタンパク質の機能解析に用いるウェスタンブロットや免疫沈降の試薬と日常的に使用するチューブやチップなどのプラスチック用品に使用する.加えて,実験植物の育成に必要な培養土,ポットなどの消耗品費も必要である.2)次年度初めは,遺伝子クローニングやPMMoV-CPの機能獲得変異体のスクリーニングと実験作業量が多いため,実験補助員を4ヶ月間雇用して効率化を図る.3)得られた研究成果の発表と情報収集を目的として植物病理学関連の学会に参加する.4)成果を論文にまとめ発表する為の諸経費.
エタノールによるミトコンドリアの融合と巨大化-培養心筋細胞を用いた数量的解析-

「エタノールによる心筋細胞のミトコンドリアの融合・巨大化は、呼吸能の低下を代償する機構である」という仮説を検証し、その融合・巨大化のメカニズムの解明を目的とする。初代培養マウス心室筋細胞を0,50,200mMのエタノール培養液に曝露し、1,3,24時間後に、以下の方法で変化を計測した。(1)心筋細胞ミトコンドリアの大きさや膜電位(ΔΨm)などを検討するために、3つのミトコンドリア特異的な生体染色蛍光色素(JC-1(橙色蛍光と緑色蛍光の強度の比=ΔΨm;ATP合成能);MitoTracker^<【○!R】> Green FM(MTG;ミトコンドリア容積に比例);dihydrorhodamine 123(DHR;ROS発生量、ミトコンドリア呼吸鎖の機能の指標))で染色し、flow cytometryで測定して、エタノール曝露細胞の蛍光強度を非曝露群と比較した。ΔΨm(JC-1)が増加するのは、呼吸鎖での基質の酸化が進み膜内外のH^+勾配は形成されるが、ATP合成に利用されていない場合と考えられる。(2)【200mMエタノール曝露の効果】心筋細胞のミトコンドリア容積と個々の大きさが、曝露1時間後から次第に増大することが、細胞と単離ミトコンドリアの両方のMTGの蛍光量増加から示された。FSC(cell size)/SSC(granularity)(ミトコンドリア膨化の指標)は、24時間後に濃度依存的に減少したので、心筋細胞のミトコンドリアは、FSC/SSCがエタノール濃度に関係なくわずかに増加した非筋細胞と異なって、エタノールにより膨化を起こさず増大することが、光散乱因子でも示された。心筋細胞のΔΨmは曝露1時間後から次第に大きくなる一方(=ミトコンドリアにおけるATP合成は抑制されたまま)、呼吸鎖(DHR)は3時間後まではむしろ少し抑制されるが、24時間後には回復するか、むしろ亢進した。即ち、「心筋ミトコンドリア呼吸機能のエタノールによる阻害」は、flow cytometryによっても確かめられた。50mMエタノールではこれらの変化は小さかった。蛍光顕微鏡でもJC-1の橙色蛍光のエタノールによる増加を確認した。従って、心筋細胞のミトコンドリアは非筋細胞とは異なって、エタノール曝露によるミトコンドリア呼吸機能の低下に対して、ミトコンドリアの増大・巨大化という反応で対応して、呼吸鎖の機能の回復をはかり、拍動に要するエネルギー需要をまかなっていると考えられた。冒頭に掲げた仮説を十分には立証できなかったが、矛盾する結果もなかった。2.【シグナル伝達系】FITC-2次抗体を用いてNF-κBp65量をflow cytometryで測定した。心筋細胞の50mMでは変化がなく200mMの1時間から増加した。一方、非筋細胞の50mMでは減少傾向で200mMでは変化はなかった。従って、ミトコンドリア巨大化にNF-κBの関与の可能性が示唆され、かつ、少数の細胞サンプルの特定蛋白の変動の検出におけるflow cytometryの有用性が示された。

従って、心筋細胞のミトコンドリアは非筋細胞とは異なって、エタノール曝露によるミトコンドリア呼吸機能の低下に対して、ミトコンドリアの増大・巨大化という反応で対応して、呼吸鎖の機能の回復をはかり、拍動に要するエネルギー需要をまかなっていると考えられた。冒頭に掲げた仮説を十分には立証できなかったが、矛盾する結果もなかった。2.【シグナル伝達系】FITC-2次抗体を用いてNF-κBp65量をflow cytometryで測定した。心筋細胞の50mMでは変化がなく200mMの1時間から増加した。一方、非筋細胞の50mMでは減少傾向で200mMでは変化はなかった。従って、ミトコンドリア巨大化にNF-κBの関与の可能性が示唆され、かつ、少数の細胞サンプルの特定蛋白の変動の検出におけるflow cytometryの有用性が示された。「エタノールによるミトコンドリアの融合・巨大化は、呼吸能の低下を代償する機構である」という仮説のもとに、その融合・巨大化のメカニズムの解明を目的とする。本年度は手技の確立が目標であったが、エタノールの影響の成果もあったので報告する。生きた細胞のミトコンドリアを特異的に染色する蛍光色素として、今年度は、Mito Tracker【○!R】Green FM(MTG;蛍光強度はミトコンドリアの大きさに比例すると言われる)とJC-1(蛍光強度はミトコンドリアの膜電位(Δφm)に依存)を用いた。1.【生きた細胞のミトコンドリアの蛍光顕微鏡による観察】(1)MTGまたはJC-1を含む培養液中で培養心筋細胞を37°C、20分間培養し、ミトコンドリアを生体蛍光染色した。ミトコンドリアの落射蛍光倒立顕微鏡像をCCDカメラを通してARGUS-20(画像処理装置)で画像強調処理し、デジタル画像をパソコンに記録した。今年度購入したシャッター切替え装置のシャッターをARGUS-20からの信号でトリガーして開け、画像を取込む期間のみ細胞に励起蛍光が当たるようにして蛍光色素の褪色を防ぎ、経時的に連続観察できるようにセットアップできた。2.【電顕で観察されたミトコンドリアの巨大化のflow cytometryによる数値化】(2)心筋細胞を200mMエタノールに24時間曝露後、蛍光色素で生体染色してflow cytometryで測定したところ、MTGの緑色の蛍光強度が増大し、JC-1の赤色と緑色の蛍光強度、特に赤色が増大したので、エタノールによりミトコンドリアの量が増えるとともに、Δφmが過分極したと考えられた。(3)心筋細胞をNagarseを用いてホモゲナイズして、ミトコンドリアを分画することに成功した。MTGで染色しflow cytometryで測定したところ、200mMエタノールの24時間曝露により、粒子内の複雑さの指標であるSSCに変化はなかったが、緑色の蛍光強度のピークが大きい方ヘシフトしたので、エタノールにより個々のミトコンドリアが大きくなったことを、flow cytometryでも確認できた。「エタノールによるミトコンドリアの融合・巨大化は、呼吸能の低下を代償する機構である」という仮説を検証するとともに、その融合・巨大化のメカニズムの解明を目的とする。1.【生きた細胞のミトコンドリアの蛍光顕微鏡観察】(1)現在進行中であり、来年度にまとめて報告する。(2)200mMエタノール曝露1時間では、JC-1の緑色と赤色蛍光が0mM曝露に比べて減少したが、MTGやDiOC_6(3)の蛍光は少し増加し、DHRの蛍光は変化がなかった。
立体電子的に制御された酸触媒を用いる多環芳香族化合物への位置選択的アシル化反応

交付申請書に記した計画に従って、まず始めに2-メトキシナフタレンを基質に用い、種々の金属塩化物触媒存在下、塩化ベンゾイルによるベンゾイル化反応について検討した。その結果、反応の位置選択性は、反応温度とともに用いる触媒種により劇的に変化することが明らかとなった。加熱条件下、通常用いられる塩化アルミニウムを触媒として反応を行うと、1-位ベンゾイル化物が優先的に生成するが、それよりも、酸強度の弱い塩化インジウムに代表される中程度の強さのルイス酸を用いると6-位ベンゾイル化物が80%以上の選択率で選択的に生成した。さらに、酸性の弱い塩化銅等を触媒とすると逆に1-位置アシル化物が選択的に生成した。このような、位置選択性に及ぼす酸触媒の効果について検討したところ、6-位アシル化物を選択的に与える触媒は、1-位アシル化物を6-位アシル化物に異性化する能力があることがわかった。このことは、適度なルイス酸性度を持つ触媒は、反応を可逆にすることを意味する。次に、触媒の酸性度や立体的環境を調節する目的で、塩化インジウム触媒といくつかの配位子ならびに溶媒の組み合わせで上記反応を検討した。ピリジン系の窒素配位子を用いると、触媒の酸性度が低下し、いずれの溶媒中でも1-位置置換体が選択的に生成した。これに対し、ニトロベンゼンやニトロトルエンのような化合物を配位子兼溶媒として用いると6-位置換体の生成速度が増加し、短時間でより高い選択率が達成されることがわかった。これは、ニトロ化合物が配位により酸性度をそれ程低下させることなく、その極性ならびに立体効果を発現させるのに適当であることを示す。これらの、知見に基づいて、いくつかの脂肪族ならびに芳香族酸塩化物による種々ナフタレンならびにフェナントレン化合物のアシル化を塩化インジウム存在下、ニトロベンゼンを溶媒に用いて検討したところ、β-位置にアルコキシ基が置換したこれら多環芳香族化合物では、いずれの場合も位置選択的に反応が進行することが明らかとなった。
哺乳類の神経分化を制御するヘリックス・ループ・ヘリックス型転写因子ネットワーク

哺乳動物の神経分化機構を明らかにする目的で、ヘリックス・ループ・ヘリックス(HLH)型転写因子群を同定し、神経分化における役割を解析してきた。我々は、今までに、(1)HLH型因子HES-1は、同じくHLH型の正の神経分化因子Mash-1に対してドミナント・ネガティブな作用を示し、神経分化を抑制すること、および(2)HLH型の正の神経分化因子の候補として新たにMATH因子群を同定したことを報告してきた。今回、さらにHES-1ノックアウトマウスの解析およびMATHについての解析を行ったので以下に報告する。HES-1ノックアウトマウスでは、胎生9.5日目頃から頭部神経管閉鎖不全がおこり、open brainになった。その後、神経細胞死がおこり、やがて無脳症に至った。HES-1ノックアウトマウスでは、Mash-1が正常よりも早く、しかも高レベルに発現しており、神経分化が早く進行していた。以上の結果から、HES-1欠損によりMash-1活性が強まり神経分化が正常よりも早く進行すること、おそらくそのために頭部神経管閉鎖不全がおこることが示唆された。同様に、網膜においても神経分化が早く進行しており、正常な層構造が維持できずに、異常なロゼット構造を形成した。従って、脳や網膜の形態形成には、HES-1のような神経分化抑制因子が非常に重要な役割を担っていることが示された。また、MATHの発現分布をしらべたところ、MATH-1は背側部に、MATH-2は大脳皮質部に強く発現しており、これらの領域の分化に密接に関与していることが示唆された。さらに、MATH-1は転写活性化因子として機能するが、その活性はHES-1によって完全に抑制されることが明らかになった。従って、哺乳動物の神経発生には、Mash-1、HES-1、MATHのようなHLH型因子群がバランスよく機能することが重要であるといえる。
光熱変換現象の基礎過程の解明と応用

物質に光を照射したときに生ずる熱に注目して行う計測を総称して光熱変換法と呼ぶ。光熱変換法は本質的に、非破壊、あるがまま、生きたままでの計測、多量の妨害物質中の超微小超微量成分の超高感度計測といった要件を満たす可能性のある計測手法の一つであり、先端分野における計測上の最重要課題を解決する技術へと発展することが期待できる。しかし、この研究分野は光計測法と比較していまだ未開拓な領域が多い。以上の認識に基づき本研究では次の二点を目的とした。1.光熱変換現象に関わる光と物質との様々な相互作用の基礎過程を従来と異なる視点から解明し、未開拓な物理化学現象を発掘し独創的な技術を萌芽させる。2.従来法も含めて、光熱変換関連技術の可能性と問題点とを明確にする。この目的を達成するため、調査および研究を行った。光熱変換現象で生ずる相互作用の基礎過程に関する調査、期待される適用分野での要求と対応する光熱変換関連技術の調査が行われた。調査結果を持ち寄って行われた研究会は、平成3年11月8日、学士会館分館(東京都文京区本郷)において研究分担者全員参加により開催された。研究会では、様々な形態で光熱変換現象に関わる研究者が学問分野を越えて学際的に結集し、この分野にある現状の問題点を整理するとともに、応用の展開を図るために必要な条件と光熱変換現象の利用の可能性を論ずるができた。これらを通して多くの新しい独創的な着想が生まれた。さらに、本研究グル-プを再編成して重点領域研究へと発展させることがきわめて重要であり、かつ、海外における本分野の研究進歩状況から勘案して、緊急性を有することが確認された。これを受けて、本研究課題を平成5年度重点領域研究課題として申請するために、東京大学工学部において数回の打ち合せを行い、平成5年度発足に向けて申請を準備した。
近代ドイツにおける食肉観の科学化―動物・食品・獣医―

本研究は、「科学」が「食」に介入するようになった歴史的現象を、ドイツにおける獣医学の台頭と食肉検査体制の成立を関連付けながら明らかにしたものである。19世紀半ばまでの検査は、医学の監視のもと肉屋が行うのが慣例となっており、消費者が自ら食中毒から身を守ることが期待されていた。実施する自治体の間にも温度差があり、規則も全国的に統一されていなかった。ところが、人獣共通感染症を危惧するようになると、状況は一変する。獣医学者が専門家集団として影響力を持つようになると、肉屋・人医・消費者を排除することで、公共と場を中心とする検査体制が1880年代に全国的に確立し、その後、世界に輸出されていった。現代社会では、人間が口にする肉の「安全性」を検査してから消費者へ食べ物として届けられるのが当たり前である。3つの「危険性」が食肉に潜むからだ。1つは、牛をはじめとする畜産動物が患う病気が人間に感染する恐れ。2つは、畜産動物がと畜される場で「汚染」する可能性。3つは、小売業や消費者の扱い方により商品が「腐敗」する危険性である。これらの「危険性」を科学者が検査するという国家システムが整うのは意外にも遅い。20世紀に入ってから近代的な食肉検査体制が、ヨーロッパを中心にようやく普及する。本研究は、草分け的な役割を果たしたドイツに焦点をあて、食肉観の「科学化」が起きる原因を探るものである。平成26年度は、資料収集、学会参加、論文執筆に時間を割いた。3つの分野にまたがる研究のため、食、動物、科学の歴史研究をまず整理することから取り掛かった。学会では、それぞれの分野の専門家と議論をする機会を得た。とりわけ、医学・獣医学の歴史研究に従事する海外の研究者と意見交換を積極的に図り、4回にわたる海外出張を通して、国際的な研究動向の中に本研究を位置づけることができた。これらの活動と並行して、資料調査も実施した。ベルリン、ミュンヘン、ドレスデン、デッサウの図書館および公文書館を訪れ、貴重な一次資料を発掘することに成功した。これらの資料を分析し、2つの国際学会にて研究成果の一部を発表し、多様な研究者よりフィードバックを得た。現在、1本の論文を国際的な学術誌にすでに投稿し、2本目の論文の執筆に取り掛かっている。現代社会では、人間が口にする食肉の「安全性」を検査するシステムが整い、国民の健康被害を防いでいる。3つの「危険性」が食肉の安全性を脅かすからだ。1つは、牛や豚をはじめとする畜産動物が患う病気が人間にも移ってしまう「危険性」。2つは、畜産動物がと畜される場で汚染する「危険性」。3つは、小売業や消費者の扱い方により商品が腐敗してしまう「危険性」である。これらの「危険性」を人医と獣医が検査する公共施設が登場するのは意外にも遅く、草分け的な役割を果たしたドイツでさえ、20世紀に入ってからようやく法整備が進んだ。このように時間のかかった理由を、多角的に明らかにするのが本研究の目的である。平成27年度は、直接関係する学会での発表回数を減らし、資料収集と論文執筆により多くの時間を割いた。食肉を巡る様々な食中毒事件に関する一次資料の発掘のため、ベルリンの国立公文書館に足を運び中央政府の対応を調べることに加え、地方の状況を知るため、ザクセン州立公文書館でも研究も実施した。これらの研究旅行で得た資料を分析し、ベルギーのブリュッセルにて食の安全性を問題とする学会で報告を行った。最大の成果として、医学史を代表する国際的な学術誌(Medical History)へ論文を投稿し、受理されたことと、現在、執筆中の2本目の論文が食の学際研究に関する国際的な学術誌(Food & Foodways)への掲載が内定していることである。当初の計画通り研究は進展している。平成26年度は、2次文献や出版資料を中心に研究を進め、調査が順調に進んだため、一次資料の調査を前倒しした。その際、5つの関係する国際学会に出かけた。平成27年度は、一次資料の更なる発掘を進め、1本目の論文を執筆し投稿した。2本目の論文も執筆中である。また、動物や食に関する学会発表は国内と国外を合わせて4回も行い、計画書より早く研究を進めることができている。本研究は、「肉食」と「科学」の関係性を、ドイツにおける獣医学の発展を通して、明らかにするものである。これまでは、1860年代に問題となった豚肉の病気(せん毛虫)、1890年代から大きな被害をもたらした牛の病気(結核)を分析し、ドイツにおける食肉観の科学化について考察を重ねてきた。平成28年度は、国際学会における発表を控え、論文執筆に力を入れた。医学史を代表する国際的な学会誌(Medical History)にて、論文が正式に公開されたことに加え、英国獣医史学会誌(Veterinary History)へ論文を投稿し、受理された。また、食の学際研究に関する国際的な学会誌(Food & Foodways)における論文の掲載も正式決定した。これらに加えて、現在、論文を3本執筆しており、平成29年度中の投稿を目指す。そういった研究活動をしていく中で、日本との歴史的比較にも興味を抱くようになった。

食肉検査体制の確立と、植民地を増やしていった日本帝国と獣医師の密接な関係について、アジア医学史学会(台湾)にて発表し、研究を広げるヒントを得た。これについては、アジアと食の関係性を問う共著本の1章として収録される予定である。当初の計画よりも早く研究は進展している。平成28年度は、引き続き、順調に研究活動を重ねることができた。平成27年度は、1本の論文執筆に留まったが、平成28年度は、2本の論文を投稿することができ、計画より多い。平成29年度は、そのペースがさらに加速する予定である。本研究は、食肉と科学の関係性を、ドイツの獣医学の発展を通して、明らかにするものである。これまでは、1860年代に社会問題化した豚の病気(せん毛虫)と、1890年代に大きな関心を集めた牛の病気(結核)に着目し、どのように科学が動物死体に介入したのかを問題としてきた。平成29年度は、限られた予算の制約を受けつつも、ドイツの国立公文書館を1回訪れ、中央政府の行政資料の発掘に引き続き力を入れ、20世紀初頭にまで研究対象とする時期を拡げた。その際、1920年代以降、ツベルクリンやワクチンなど、食用動物の健康状態の向上をさせようとする獣医師が畜産の現場に介入して行く動きを追った。どのようなやり取りや駆け引きが畜産業者と科学者との間で行われ、最終的に、科学が死体に留まらず生体にまで介入するに至ったのかを調査した。実際、抗生物質の注入が盛んとなるのは第二次世界大戦以後となるが、本研究は、戦後を理解するためにも1930年代までを視野を入れることは重要であると考える。今後は、収集した資料の分析をさらに進め、1冊の研究書としてまとめる予定である。本研究は、ドイツを対象国としてきたが、日本に加えて東アジアとの比較に興味を抱くようになった。そのため、日本における食肉検査体制の発達を調査するとともに、戦前、安価な牛肉の輸入先として中国の青島がどれだけ大きな役割を果たしたのかを問い、研究を発展させている。本研究は、「科学」が「食」に介入するようになった歴史的現象を、ドイツにおける獣医学の台頭と食肉検査体制の成立を関連付けながら明らかにしたものである。19世紀半ばまでの検査は、医学の監視のもと肉屋が行うのが慣例となっており、消費者が自ら食中毒から身を守ることが期待されていた。実施する自治体の間にも温度差があり、規則も全国的に統一されていなかった。ところが、人獣共通感染症を危惧するようになると、状況は一変する。獣医学者が専門家集団として影響力を持つようになると、肉屋・人医・消費者を排除することで、公共と場を中心とする検査体制が1880年代に全国的に確立し、その後、世界に輸出されていった。当初の計画より早く研究が進展している。平成26年度は、2次文献や出版資料を中心に研究を進める計画だった。ところが、9月にその調査は実質終了したため、一次資料を求め、3月には前倒ししてザクセン州の公文書館を訪れた。その際、多くの行政資料の収集を行った。また、当初の計画では、3つの学会への参加を計画していたが、合計5つの関係する国際学会に出かけた。直接関係するテーマでは、発表は2回に留まったが、動物や食に関する発表を含めば、合計5回発表したことになる。これらの発表で得た知見は、本研究にも活かされている。今後は、1次資料の発掘を進めるとともに、論文を2本執筆し、投稿する。
核内輸送担体と核外輸送担体のリサイクリングから捉えた流通の制御機構の解析

1.これまでに、Importinβのリサイクリングには低分子量GTPaseRanのみが必要と考えられていた。しかし、生細胞を用いた解析よりimportinβの核外移行(リサイクリング)反応がATPを要求することが示唆されたため、semi-intact細胞を利用したin vitro輸送アッセイ系を用いて、importinβのリサイクリングに関与するATP感受性因子を活性を指標に精製した。その結果、構成的に発現する熱ショック蛋白質hsc70(70kDa heat shock cognate protein)を同定した。ATPase活性を欠く点変異体がimportinβのリサイクリングを促進しないことから、importinβのリサイクリングにATP感受性因子としてhsc70が関与することを新たに同定することができた。2.βカテニンは輸送担体のように核膜孔複合体と直接相互作用しながら、核と細胞質の間をシャトルする典型的な分子の1つである。β-cateninの核内外移行を詳細に解析したところ、β-cateninの核内移行と核外移行を担う領域が一致した。しかし、importinβやCASなどの核内外輸送担体による競合阻害実験では、β-cateninの核膜孔通過反応に対する阻害効果が核内移行と核外移行で異なることが明らかになった。さらに、importinβやCASがリサイクリングする条件下とリサイクリングしない条件下においても、阻害効果に違いが見られた。これらの結果から、細胞質から核内へ向かう核膜孔通過反応と、核から細胞質に向かう核膜孔通過反応の分子間相互作用に違いがあることがはじめて示された。3.importinα/β輸送経路がストレスに応答して機能低下することを見いだした。生化学的手法と生細胞内で輸送因子の挙動を調べたところ、importinαの核内リテンションとリサクリング阻止がimportinα/β輸送経路活性低下の1つの要因であることが判明した。これは、核一細胞質間輸送因子の活性制御が、細胞がストレス環境に適応するための制御系の1つとして作用することを示唆している。importin α/βは蛋白質を細胞質で認識した後に、核膜孔を通過して核内に移行する。核内に移行したimportin αがCASとよばれる別の輸送担体で核内から細胞質に運搬されるのに対し、importinβは核膜孔複合体と直接相互作用しながら核内から細胞質に戻る(輸送担体のリサイクリング反応)。CASとよばれる核外輸送担体は核内輸送担体importinβと同様に核膜孔複合体と直接相互作用しながら、それ自身が単独で核膜孔を通過する能力をもつ分子である。ところが、GFPで標識したimportinβとCASの細胞内局在をliving cellで観察すると、importinβは細胞質に優位に存在し、CASは核内に優位に存在する。同じファミリーに属するimportinβとCASの細胞内局在の相違に注目し、importinβとCASの挙動をセミインタクト細胞を用いたin vitro輸送系で調べると、importinβは系に加えた細胞質抽出液とATPの両方に依存して核内から核外に移行するのに対し、CASは系に加えた細胞質抽出液とATPの両方に依存して核外から核内に移行することがわかった。さらに、importinβの核外移行活性を指標に、細胞抽出液からATPアガロースを用いてATP結合蛋白質を吸収すると、importinβの核外移行活性の低下が認められた。

そこで、ATP結合蛋白質をさらに分離精製することで、importinβの核外移行活性化因子として構成的に発現している熱ショック蛋白質hsc70(70kDa heat shock cognate protein)を同定した。現在、hsc70がimportinβのリサイクリングや核蛋白質輸送機構にどのように関与しているかを解析中である。importinαは核内輸送担体importinβで核内に運搬され、核外輸送担体CASで核外に運搬される。生細胞内でCASとimportinβの挙動を調べると、importinβは優位に細胞質に局在し、CASは優位に核に局在することが判明した。セミインタクト細胞を用いたin vitro輸送再構成系で、生細胞で観察されたimportinβとCASの挙動の再現を試みたところ、importinβは系に加えた細胞質抽出液とATPに依存して核外に移行し、CASは系に加えた細胞質抽出液とATPに依存して核内に移行した。このことから、核内輸送担体importinβと核外輸送担体CASは、各々が基質を受け取る場にリサイクリングするために、核膜孔を逆方向に通過するように積極的に制御されていると判断した。importinβとCASのリサイクリングを担う因子を、輸送再構成系を用いて同定することを試みた。その結果、importinβのリサイクリングにはRan、p10、hsc70、が関与すること、CASのリサイクリングにはRanとp10が関与することがわかった。importinβのリサイクリングを促進するには、hsc70が核内に移行する必要があり、これはhsc70が核内または核膜孔複合体の核質側で作用する可能性を示している。一方、importinαを積極的に核内に送り込むと、CASの核外移行が誘導されることが確認された。これは、Ranとp10の作用によるCASの核内集積が、importinαによる核内リテンションのためではなく、CASと核膜孔複合体構成因子の相互作用がRanの作用で変化する可能性を示している。本研究で、両輸送担体のリサイクリングを担う因子を同定できたことが評価でき、今後、同定した各々の因子が作用する因子を具体的に同定していきたいと考えている。
遺伝子導入による血小板膜GPIb/IX複合体発現細胞の確立と機能解析への応用

2.上記で使用したプラスミドからGPIb/IX複合体を発現するstable transformantsを確立した。リストセチン凝集により膜表面に発現したGPIb/IX複合体は正常ヒト血小板レセプターと類似の機能を有することが証明されたが、継代を続けることによりGP遺伝子のmRNA発現が低下し、GPIb/IX複合体発現量も著明に低下した。stable transformantsはGPIb/IX複合体に存在する各種GP遺伝子上に存在する遺伝子多型、特に血栓傾向との関係が指摘されている遺伝子多型と凝集能との関係を機能レベルで検討することに応用可能であることが示唆されたがGPIb/IX複合体の発現量を維持するためにvectorの検討等の対策が必要である。Bernard-Soulier症候群(BSS)患者2家系において見いだした新規の遺伝子異常の結果惹起される表現型の異常を解析した。発現プラスミドにGPIb/IX複合体を構成する3種類の遺伝子を組み込み、3種類の発現用組み替えプラスミドを作成した。これに加えて、我々が見いだした遺伝子異常を組み込んだ変異体も作成し野生型との比較に用いた。遺伝子発現実験の結果、FACSによる表面抗原の解析で変異体において膜表面GPIb/IX複合体の発現が著しく低下していることが確認された。また、免疫染色においてもGPIb/IX複合体の発現は著しくて低下しており、我々の見いだした遺伝子異常の結果、BSS表現型の異常が惹起されることを証明した。さらに、上記で用いた組み替えプラスミドをもちいて蛋白質の構造-機能相関解明のための解析を施行予定である。具体的には、GP遺伝子に存在するleucine rich repeat (LRR)構造に着目している。このLRR構造は蛋白質の高次構造維持に重要であると考えられているが、GPIb/IX複合体発現との関係についてはnatural mutationを解析した幾つかの報告が存在するに過ぎず、詳しい検討はなされていない。そこで、GP遺伝子に存在するLRR構造内の1アミノ酸残基に変異を導入し、その結果もたらされる膜表面GPIb/IX複合体発現量の変化をFACSあるいは免疫染色により解析することとした。これによりGPIb/IX複合体発現にかかわるGP蛋白内LRR構造の機能が明らかとなる。先年、Bernard-Soulier症候群(BSS)患者2家系において見いだした新規の遺伝子異常が、BSS発症の原因となることを発現実験をとおして証明した。具体的には、GPIb/IX複合体を構成する3種類の遺伝子を発現プラスミドに組み込み、3種類の発現プラスミドを作成した。これに遺伝子変異を導入し、GPIb/IX複合体の発現量の変化を野生型と比較した。その結果、FACSおよび免疫染色で変異群において膜表面GPIb/IX複合体の発現量が著しく低下していることが確認された。上記で作成した組み替えプラスミドをもちいてGPIb/IX複合体蛋白の構造-機能相関解明のための解析を施行中である。具体的には、GPIb/IX複合体に存在するleucine rich repeat(LRR)構造に着目し、GP構成蛋白の一つであるGPIbβ遺伝子のLRR構造をコードする部に変異を導入し、その結果もたらされる膜表面GPIb/IX複合体発現量の変化をFACSおよび免疫染色により解析した。GPIbβLRR構造内のロイシン残基の変異はGPIb/IX複合体の発現量を低下させることが判明しており、この構造がGPIb/IX複合体形成過程に密接に関与する構造であることが判明した。さらに、血小板表面上の他の糖蛋白質(GP)の影響にとらわれない純粋な系でのGPIb/IX-フォンヴィレブランド因子(vWF)との反応の解析を可能にするため、上記で作成した組み替えプラスミドを利用しstable cell lineの確立に取り組んでいる。現時点ですでに何種類かのstable cell lineの作成を終えているが、これらのcell lineは培養を続けるとレセプターの発現量が極端に低くなることが認められており、尚しばらくの検討が必要と考える。
在宅中心静脈栄養を行う進行癌患者および家族のQOLに関する基礎的研究

本研究では,在宅中心静脈栄養法(以下HPNとする)を行う進行がん患者の日常生活の実態を把握することを目的とし,参加観察と面接により調査し,帰納的分析を行った.対象は,2大学病院でHPNを行う患者20例で,平均年齢53.6歳,男12例女8例,疾患は全て進行消化器癌だった.継続中の3名を除く17名のHPN継続期間は平均64.4日で,14名はHPN開始時から6ヶ月迄に病院で死亡した.〈HPN導入時〉導入は全て入院で行い,平均入院期間は35.4日だった.身体的には,全て対症療法を受けていたが,日常生活動作は自立していた.18名が医療者の勧めをきっかけとし,説明直後は衝撃を受けたが,その後は葛藤しながら受け入れる努力をしていた.このようなHPNの受け止めには,身体状況,病気や病状の認識,家族や医療者のサポート,経験による自信の確立が影響していた.人間関係の機会は,病院内での退院へ向けたサポートが中心となり,家族や医療者への信頼は高まり関係は密になった.〈HPN継続中〉全て外来管理下で継続された.身体的状況は徐々に悪化し,症状コントロール困難を理由に14名がHPNを中断した.心理的には,HPNに慣れても不安や拘束感は持続し,さらに病気や病状,症状,成り行きに対する不安が増強した.心身への自信のなさから,活動はベット中心に制限された.家族以外の対人関係は減少し,家族の負担は増加した.医療者との交流は,孤立する患者や家族の日常的な対処を支える上で重要と認識されていた.様々な葛藤下でも家の方が自由であり落ち着けると感じていた.以上の結果より,進行がん患者におけるHPN導入時の意志決定では,迅速で十分なインフォームドコンセントが重要であると考えられる.また,HPN継続中には患者の身体的心理的負担は増大するが,社会から孤立し,サポートは減少する傾向があり,緊急事態も予測したより一層の支えが必要になることが示唆された.近年経口摂取困難な進行癌患者に対し、QOL向上を期待して在宅中心静脈栄養(以下HPNとする)が行われる機会は増えつつある。QOLの向上を目的として癌患者にHPNを導入していくためには、導入や管理に伴い患者及び家族がどのような不安や困難を抱えているのかを把握し、実際に意義のある治療となるように、患者や家族のニードに対する適切なケア提供を十分に検討していく必要がある。そこで、本研究では、HPNを行う進行癌患者及び家族の生活実態を把握し、ニードを明らかにすることを目的とし、参加観察およびインタビューによる調査を行っている。これまでの調査における対象は、2大学病院でHPNを行う患者12例で、年齢2892歳の男7例女5例である。疾患は全て消化器癌で、男2例を除く10例は遠隔転移を伴った進行癌である。現在は、対象から得られたデータを、個別に分析し、ニードや影響要因をHPN導入期、維持期に分けて抽出しつつある段階である。対象は、告知の状況、社会的役割、家族構成、ADLの自立の程度等において様々にことなっているが、導入時および導入後にみられる患者や家族のケアニードには、HPN管理(IVHの種類、輸液の投与時間)、症状、受け止め、性別、職業、サポートなどがニードに影響を与える共通要因としてあらわれている。今後は、さらに事例を積み重ね、十分な実態調査に基づいて、個別のニードや影響要因を把握してゆく。そして、それらの積み重ねから共通してみられるニードや影響要因を導いていく予定である。本研究では,在宅中心静脈栄養法(以下HPNとする)を行う進行がん患者の日常生活の実態を把握することを目的とし,参加観察と面接により調査し,帰納的分析を行った.対象は,2大学病院でHPNを行う患者20例で,平均年齢53.6歳,男12例女8例,疾患は全て進行消化器癌だった.継続中の3名を除く17名のHPN継続期間は平均64.4日で,14名はHPN開始時から6ヶ月迄に病院で死亡した.〈HPN導入時〉導入は全て入院で行い,平均入院期間は35.4日だった.身体的には,全て対症療法を受けていたが,日常生活動作は自立していた.18名が医療者の勧めをきっかけとし,説明直後は衝撃を受けたが,その後は葛藤しながら受け入れる努力をしていた.このようなHPNの受け止めには,身体状況,病気や病状の認識,家族や医療者のサポート,経験による自信の確立が影響していた.人間関係の機会は,病院内での退院へ向けたサポートが中心となり,家族や医療者への信頼は高まり関係は密になった.〈HPN継続中〉全て外来管理下で継続された.身体的状況は徐々に悪化し,症状コントロール困難を理由に14名がHPNを中断した.心理的には,HPNに慣れても不安や拘束感は持続し,さらに病気や病状,症状,成り行きに対する不安が増強した.心身への自信のなさから,活動はベット中心に制限された.家族以外の対人関係は減少し,家族の負担は増加した.医療者との交流は,孤立する患者や家族の日常的な対処を支える上で重要と認識されていた.

様々な葛藤下でも家の方が自由であり落ち着けると感じていた.以上の結果より,進行がん患者におけるHPN導入時の意志決定では,迅速で十分なインフォームドコンセントが重要であると考えられる.また,HPN継続中には患者の身体的心理的負担は増大するが,社会から孤立し,サポートは減少する傾向があり,緊急事態も予測したより一層の支えが必要になることが示唆された.
自然発症糖尿病ラットにおける正中口蓋縫合部拡大後の修復に対するb-FGFの効果

研究目的:糖尿病患者の増加が指摘されており、今後同患者に対する歯科矯正治療の機会は増加するものと考えられる。今回BB/W-DPラットを用いて上顎側方拡大を行い、正中口蓋縫合を離開させた同部に線維芽細胞成長因子(b-FGF)を局注し、拡大を伴う骨の新生、添加などの修復過程について、病理組織学的、組織科学的に比較検索しようとするものである。結果:前実験期間を通じて、縫合部の修復は対照群の方がBBラット群より速やかに行われていた。本研究では両群ともに拡大後、正中口蓋縫合部は血餅で満たされ、骨壁付近には断列した結合組織線維が認められた。しかし対照群ではBBラット群と比較してその様相は、弱く毛細血管、線維芽細胞、骨芽細胞が多く認められた。これらの相違は、インスリン欠乏もしくは高血糖状態により線維芽細胞や骨芽細胞への分化の抑制あるいは細胞自体の機能低下によって生じたものと考えられる。修復期間として保定五日から保定七日までをみると、この時期には血餅のほとんどが肉芽細胞や結合組織線維に置換されており、毛細血管や線維芽細胞が豊富になっていた。またこの時期には、結合組織線維の伸張は徐々に弱くなり、新生骨梁の形成がみられた。これらの修復期の変化は、BBラット群に比べ対照群で強くみられた。これはインスリン欠乏が細胞の機能低下をもたらすことを、また骨芽細胞の生産する様々なサイトカインによる細胞間の相互作用として、破骨細胞の分化や活性化を調節することが示唆されており、骨芽細胞の機能異常が破骨細胞に影響を及ぼすことが考えられる。
食塩感受性高血圧におけるアルギナーゼの役割

Dahl-S(DS)ラット(食塩負荷により血圧が上昇する)とDahl-R(DR)ラット(食塩負荷により血圧が上昇しない)を比較するとDSラットにおいて腎アルギナーゼ(AR)活性が低下していること、それは食塩負荷の影響や血圧の影響を受けないことを前年度報告した。我々は更にウエスタン法とノーザシ法を用いそれがアルギナーゼIIの蛋白量とmRNAの低下によることを明らかにした。アルギナーゼはアルギニシを尿素とオルニチンに分解するが、尿素はNa-K-2Clcotransporterを抑制し、SHR-SPラットやL-NAME高血圧ラットにおいて降圧効果があることが知られている。また尿素は尿の濃縮に必要な浸透圧物質であるが、DSラットはDRラットに比べて希釈尿を排泄している。我々はDSラットにおいて、食塩負荷と同時に尿素を6週間投与した。すると尿素補充により血圧が低下し、尿量が減少し、尿浸透圧が上昇した(4%食塩食群vs4%食塩+5%尿素食群;血圧151.0±4.6vs123.6±2.2mmHg;尿量33.5±2.7vs28.1±4.9ml/day;尿濃透圧465.O±29.7vs658.9±64.6mOsm/kgH_2O)。この結果より、DSラットにおいて腎アルギナーゼの低下は高血圧の発症と尿濃縮力の低下に奇与している可能性が示唆された。我々は今後腎アルギナーゼの生理的役割を更に明らかにするため、アルギナーゼをアデノウイルスベクターによ-って腎近位尿細管で強制発現させ、DSラットにおいて、高血圧の発症と尿濃縮力の低下を改善するかどうかを検討する予定である。4週令のDahl-S(DS)ラット(食塩負荷により血圧が上昇する)とDahl-R(DR)ラット(食塩負荷により血圧が上昇しない)を4%NaCl食(H群)と0.5%NaCl食(L群)に分け、4週間後腎アルギナーゼ(AR)活性、アルギナーゼI・アルギナーゼIIのmRNAを定量した。4週令の食塩負荷前のDSラットとDRラットにおいても腎アルギナーゼ(AR)活性を測定した。結論:食塩感受性高血圧モデルにおいてAR活性は高血圧発症前から低下しており、食塩負荷による影響はうけなかった。その機序としては、一部転写レベルでの調節が考えられた。ARはL-アルギニンを尿素とオルニチンに分解するが、尿素はNa-K-2C1cotrasporterを抑制し、SHR-SPラットにおいてはNa利尿効果と降圧効果があることがしられており、腎AR活性の低下は食塩感受性高血圧の原因の一つかもしれない。