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発生における細胞接着分子の動態と細胞系譜の発生工学的手法による共同研究

私達はアフリカツメガエルの形態形成と文化に細胞接着分子がどの様に関わっているかを研究してきた。アフリカツメガエルにカルシュウム依存性細胞接着メカニズムが存在しそれが哺乳類で同定されていたカドヘリンによる接着メカニズムと相同である事をあきらかにしカドヘリン系のツメガエルでの研究の口火をきった。この研究を契機として私たちのものを含めて世界中の研究室でツメガエルのカドヘリンの研究が開始され、脊椎動物の初期発生におけるカドヘリンの役割を明らかにできる絶好のシステムとして現在も盛んに研究が行われている。最近私達は、アフリカツメガエルの初期胚のカルシュウム依存性細胞接着がカドヘリンに対する抗体ではなく、実に意外な事にヒトの血液型B型物質に対する抗体で完全に阻害される事を見出した。この阻害は抗体のFabフラグメントでも起こり、また精製されたB型物質の添加でも生ずるので、単なる抗体の結合による立体障害によるものでは無い事が判明した。また調べてみると、確かにツメガエルの初期胚にはB型血液型物質を含む糖蛋白質と糖脂質が存在しており後者についてはその完全構造決定に成功した。免疫組織学的手法で調べてみると、B型血液型物質は細胞膜表面の細胞接着部位に存在しておりその細胞接着への積極的関与が窺われる結果を得た。おそらくヒトB型血液型物質はカドヘリンと直接に相互作用してその機能を膜上で調節したり、その膜上への輸送の調節に関与しているものと予想される。膜上への輸送の調節に関する世界的権威であるドイツEMBLのKai Simons教授の参加をえて、私たちの構造解析に成功したヒトB型糖鎖含有糖脂質のカドヘリン膜輸送への関与の研究を開始した。現在までに残念ながら肯定的な結果は得られていないが、この研究の途中で、ヒト血液型B型糖鎖がECFリセプター上に存在している可能性を強く示唆する実験事実を得た。最近EGFリセプターがカドヘリン・カテニン複合体と相互作用してカテニンをリン酸化する可能性が指摘されており、この結果はB型糖鎖の細胞接着における機能の解明を大きく前進させるものと期待している。またアメリカのJ.Thomsen教授(ニューヨーク州立大学・ストーニ-・ブルック分校)のグループからはこの糖鎖がBMPリセプターの上に存在している可能性の指摘をいただき共同研究を続ける事になっている。B型糖鎖がひろくリセプターの機能調節にかかわりツメガエルの形態形成と分化の誘導に関与している可能性が高い。さらに私たちは熊本大学理学部の但馬達哉助手との共同研究で、ツメガエルのXBカドヘリンの遺伝子をクローニングすることに成功した。この遺伝子をトランスフェクトしたL細胞を使って、XBカドヘリン蛋白質にたいするモノクローナル抗体を作成、胞胚の初期胚細胞の細胞接着を阻害する抗体を得た。この抗体を使って二重免疫染色で調べた結果、、初期胚の膜上でB型血液型糖鎖とカドヘリンは緊密に相互作用していることが判明し、上のモデルを強く支持することが分かった。現在このカドヘリンをドミナントネガティブ法でノックアウトする実験を行っており、胞胚腔形成の異常が観察されている。アンチセンスオリゴヌクレオチドの注射によるカドヘリン遺伝子産物のノックアウト実験についても効率を上昇させる有効な改良法が完成し、また有効なin situのハイブリダイゼイションの方法を本研究の共同研究者から教えていただいたので、これを利用しながら現在最終的確証実験を継続中である。また、細胞接着分子を含めた遺伝子産物一般の機能を探る上で有効であるが現在までカエルでは全く不可能であった技術にトランスジェニック・カエルの作成がある。共同研究者のGerhart教授らは昨年初めてその作成を報告したが、その後大幅な改良を加え完全に実用レベルの技法に仕上げていることが分かった。今後今回の共同研究の延長としてこの手法をとりいれるとともに日本に広く紹介し、脊椎動物の発生の研究の画期的システムとしてのツメガエル研究を推進していきたいと考えている。

膜上への輸送の調節に関する世界的権威であるドイツEMBLのKai Simons教授の参加をえて、私たちの構造解析に成功したヒトB型糖鎖含有糖脂質のカドヘリン膜輸送への関与の研究を開始した。現在までに残念ながら肯定的な結果は得られていないが、この研究の途中で、ヒト血液型B型糖鎖がECFリセプター上に存在している可能性を強く示唆する実験事実を得た。最近EGFリセプターがカドヘリン・カテニン複合体と相互作用してカテニンをリン酸化する可能性が指摘されており、この結果はB型糖鎖の細胞接着における機能の解明を大きく前進させるものと期待している。またアメリカのJ.Thomsen教授(ニューヨーク州立大学・ストーニ-・ブルック分校)のグループからはこの糖鎖がBMPリセプターの上に存在している可能性の指摘をいただき共同研究を続ける事になっている。B型糖鎖がひろくリセプターの機能調節にかかわりツメガエルの形態形成と分化の誘導に関与している可能性が高い。さらに私たちは熊本大学理学部の但馬達哉助手との共同研究で、ツメガエルのXBカドヘリンの遺伝子をクローニングすることに成功した。この遺伝子をトランスフェクトしたL細胞を使って、XBカドヘリン蛋白質にたいするモノクローナル抗体を作成、胞胚の初期胚細胞の細胞接着を阻害する抗体を得た。この抗体を使って二重免疫染色で調べた結果、、初期胚の膜上でB型血液型糖鎖とカドヘリンは緊密に相互作用していることが判明し、上のモデルを強く支持することが分かった。現在このカドヘリンをドミナントネガティブ法でノックアウトする実験を行っており、胞胚腔形成の異常が観察されている。アンチセンスオリゴヌクレオチドの注射によるカドヘリン遺伝子産物のノックアウト実験についても効率を上昇させる有効な改良法が完成し、また有効なin situのハイブリダイゼイションの方法を本研究の共同研究者から教えていただいたので、これを利用しながら現在最終的確証実験を継続中である。また、細胞接着分子を含めた遺伝子産物一般の機能を探る上で有効であるが現在までカエルでは全く不可能であった技術にトランスジェニック・カエルの作成がある。共同研究者のGerhart教授らは昨年初めてその作成を報告したが、その後大幅な改良を加え完全に実用レベルの技法に仕上げていることが分かった。今後今回の共同研究の延長としてこの手法をとりいれるとともに日本に広く紹介し、脊椎動物の発生の研究の画期的システムとしてのツメガエル研究を推進していきたいと考えている。
エリスロポエチンはNF-κB活性化により急性脊髄損傷後の脊髄変性を阻害する

本研究では、急性脊髄損傷におけるエリスロポエチンの神経保護作用を明らかにした。マウス培養神経細胞にNMDAを加えると35%の細胞に活性型caspase3が発現しアポトーシスを生じるが、エリスロポエチンを投与するとcaspase3の発現は5%に抑制された。ラット胸髄を重錘にて圧迫し、完全横断性脊髄損傷モデルを作成した。このモデルを用いて、損傷15分後、24時間後にエリスロポエチンを腹腔内投与した群と何ら処置を加えなかった群について、活性型caspase3抗体とTUNEL法による染色を損傷6時間後から7日後まで行い、陽性細胞数を比較した。損傷7日後までエリスロポエチン投与群では、活性型caspase3の発現もTUNEL陽性細胞も有意に減少しており、損傷部脊髄細胞のアポトーシスをエリスロポエチンが損傷直後より損傷7日後まで抑制することが明らかになった。また、二重染色より神経細胞とグリアの両方にてアポトーシスは抑制されていた。エリスロポエチン受容体抗体による染色を行い、エリスロポエチン受容体が脊髄細胞に発現していることを確認した。しかし、損傷前後でエリスロポエチン受容体発現細胞数に変化を認めなかった。2.16週齢のWisterラットの胸椎部を椎弓切除し、120gの重錘にて圧迫し、完全対麻痺を呈する胸髄完全損傷モデルを作成した。このモデルを用いて、何ら処置を加えなかったコントロール群と損傷15分後と24時間後にEPOを静脈内投与したEPO投与群の2群について、損傷6時間後から7日後まで経時的に損傷脊髄を摘出し、活性型caspase3抗体とTUNEL法にて染色した。両群の活性型caspase3陽性細胞数とTUNEL陽性細胞数を比較すると、EPO投与群にて有意に陽性細胞数が減少していた。この結果、EPOはラット損傷脊髄において、アポトーシスを抑制することが明らかになった。3.何ら損傷を加えなかったラットと損傷を加えたラットの脊髄をEPO受容体抗体にて染色した。いずれのラットの脊髄においても、EPO受容体は発現していた。4.コントロール群とEPO投与群の脊髄を経時的にhematoxylin-eosinにて染色した。EPO投与群では、神経線維の変性が軽度であった。急性脊髄損傷の薬物治療として、受傷早期のステロイド大量療法が行われているが、二重盲検試験により、その有効性は乏しいと考えられている。その他にも、ナロキサンや興奮性アミノ酸受容体阻害剤の実験動物における有効性が報告されているが、生体への安全性や有効性に問題があり臨床応用されるに至らず、未だ有効な薬物療法は行われていない。本研究では、エリスロポエチンの神経保護作用を明らかにした。ラット胸髄を重錘を用いて圧迫し、完全横断性脊髄損傷モデルを作成した。エリスロポエチンは赤血球前駆細胞に作用してその生存を維持し、増殖と分化を促進する糖蛋白質であり、生体では腎臓に存在するが、近年、エリスロポエチンが脳および子宮でも生合成され、造血のみならず中枢神経系における神経細胞の保護、子宮における血管形成に重要な役割を持つことが報告されている。エリスロポエチンは、本来、生体内にて生成される物質であり、造血因子として臨床胎療に使用されており、生体における安全性は確立されている。本研究により急性脊髄損傷の治療に大きな進歩がもたらされるものと考える。
爆発直後および後期観測で探るla型超新星の三次元構造と爆発メカニズム

超新星爆発は一般的に、爆発後数週間の明るい時期が「光球期」と言われ、この時期に観測を行うと膨張大気のより外層について制限を与えることができる。Ia型超新星においては、極大絶対光度と減光速度に強い相関関係が認められ、一様な観測的特徴を示すことで知られている。このような特性を用いて、宇遠方超新星の観測から宇宙膨張は加速しているという重大な研究成果が得られている。しかしながら、爆発メカニズムや爆発する元の天体については決着がついておらず、その正体に制限を与えるような観測的研究が期待される。初年度は、広島大学宇宙科学センター付属東広島天文台にてかなた望遠鏡を用いて超新星の明るい初期に時間的に密な観測を実行した。本年度においては、爆発から200日以降の最大高度より100倍暗いフェーズにおける大口径望遠鏡を用いた観測研究を遂行した。このような爆発からおよそ一年経過した時期においては、超新星の膨張大気は光学的に薄くなり、噴出物質全体を見通した観測が可能となる。すなわち、爆発構造の最内層構造について幾何学的・物理学的に制限を与えることが可能である。私は国立天文台所有8.2m「すばる」望遠鏡での公募観測における観測提案を行い、2010年4月と2011年5月に超新星の非常に暗い状態での観測に成功した。対象となった超新星は、広島大学かなた望遠鏡、県立ぐんま天文台1.5m望遠鏡などを用いて初期に集中的に観測を行った極めて明るいIa型超新星「SN 2009dc」である。SN 2009dcは極大光度がIa型超新星としては異常に明るく、減光速度も遅く、またスペクトルにおいて炭素の吸収線が卓越した特異な超新星であることが明らかになっていた(Yamanaka et al.2009,ApJ,707L,118)。すばる望遠鏡の観測においては、このような描像に加え超新星の内部構造において、予期されぬ減光と本来外側に分布するはずのカルシウムが鉄より内側に分布していることを明らかにした。このような発見は特異なIa型超新星に強い制限を与える観測結果であり、現在論文を準備中である。現代天文学において、天体までの距離を求めることは重要な問題である。Ia型超新星は、その光度変化における減光率と絶対等級に相関関係があることが知られており、光度変化から距離を推定することが可能である。1990年代後半には、宇宙論的な距離で起こった多くのIa型超新星が調査され、宇宙膨張は加速に転じているという天文学史上重要な発見がなされた。このような背景を持つにも関わらず、その爆発する元の天体(親星)と爆発メカニズムはまだ決着がついていない。私は、これらの問題への制限にアプローチするために、Ia型超新星の爆発直後からの観測を実施している。超新星爆発は自由膨張しているため、外層から透けていき時間が経つとともに内側の層を観測されるようになる。したがって、超新星の爆発構造を知るためには{超新星の光度とスペクトルの時間進化を追うことが最適な手法になる。私は広島大学宇宙科学センター付属かなた望遠鏡や国立天文台すばる望遠鏡を用いてこのような観測を行っている。今年は特に、極めて明るいIa型超新星SN 2009dcの後期観測をすばる望遠用を用いて行い、早期観測と合わせて博士論文としてまとめた。すばる望遠鏡で得られた観測結果では、初期の光度から予測されるより有意に暗いことを見出した。また、Ia型超新星親星候補であるさそり座U星のアウトバースト直後の連続分光観測にも成功し、その爆発構造を明らかにした。この結果はすでに私を主著とした査読論文として公表されている。

すばる望遠鏡の観測においては、このような描像に加え超新星の内部構造において、予期されぬ減光と本来外側に分布するはずのカルシウムが鉄より内側に分布していることを明らかにした。このような発見は特異なIa型超新星に強い制限を与える観測結果であり、現在論文を準備中である。
新しい医薬資源からの抗腫瘍性天然物の探索とその分子標的および作用機序の解明

血管新生阻害およびアポトーシス誘導療法が新しいがんの治療法として注目されている現在、我々は、海洋生物、カビおよび薬用植物由来の化合物に着目し、多数の化合物に顕著なアポトーシス誘導作用を見出した。まず、オフィオボリンAについては、JNK1-2のリン酸化を促進し、カスパーゼ3の活性化を引き起こし、アポトーシスを誘導することが明らかにされたが、更に、サポニン類のにも同様の効果がある可能性が示唆された。ハレナキノンの構造類縁体であるセストキノンにはアポトーシス誘導活性が認められなかった事から、ハレナキノンの誘導体を種々合成し、PI3キナ-ゼ抑制作用およびアポトーシス誘導活性における構造活性相関を検討する事により、より有用な物質を検討した。真菌由来の化合物であるIC101に、より有用なPI3キナーゼ抑制作用およびアポトーシス誘導活性が認められ、現在、更に詳細に検討している。タイ産生薬マンゴスティーンは、これまで、抗炎症作用が見出されていたが、更にアポトーシス誘導作用が見出された。主要含有化合物であるα-mangostinおよびγ-mangostinにアポトーシス誘導作用が認められ、詳細なる検討により、アポトーシス誘導最終実行分子であるカスパーゼ3の断裂による活性化が認められた。また、抗炎症作用とアポトーシス誘導作用との関連性が報告されており、そのことも踏まえ研究した。がんの治療に関与する血管新生阻害作用を有する事が認められたゴニオドミンAは、細胞接着に対する作用とがんの転移に及ぼす効果が認められた。
次数２のジーゲル保型形式に対するフーリエ・ヤコビ型球関数の研究とその応用

本研究課題に対する予備研究・類似研究において、十分に満足いく成果をあげることができた。主な成果は、GL(3,C)のクラス1でない主系列表現に対するホイッタカー関数の明示公式の応用として得られるGL(3)×GL(2)に対する複素素点におけるアルキメディアンゼータ積分の明示的評価である。これらは保型形式およびL関数の明示的理論において重要な結果であると思われ、今後の発展が期待される。今年度は、次数2のジーゲル保型形式に対するフーリエ・ヤコビ展開と関連する特殊関数である、次数3の複素一般線形群GL(3,C)のクラス1でない主系列表現に対するホイッタカー関数の保型形式論への応用について研究を行い、特に保型L-関数に関連したゼータ積分について昨年度までの結果を前に進め、必ずしも理想的でない一部の場合について明示的評価を得た。フーリエ・ヤコビ展開に必要な特殊関数であるフーリエ・ヤコビ型球関数の理論については依然として未完であるが、これまでに様々な一般球関数についての類似研究を進め、一定の成果を上げてきた。今年度の成果はこれまでに得られた類似研究の成果の応用であり、フーリエ・ヤコビ型球関数の理論とも関連が深く意義がある。今年度はホイッタカー関数の明示公式、およびこの明示公式を活用したGL(3)×GL(1)およびGL(3)×GL(2)に対するアルキメディアンゼータ積分についての昨年度までの成果および知見に基づいて、GL(3)×GL(2)に対するアルキメディアンゼータ積分の明示評価が困難であった理想的でない一部の場合について明示的評価を得た。得られた成果はゼータ積分が消えないような適当なベクトルがGL(3)およびGL(2)の主系列表現の極小K-typeから取れない場合の複素素点におけるゼータ積分の評価である。すべての場合について明示的評価が成功しているわけでなく、最も困難を極める場合の考察を残しているが、対応する表現論についての予備的考察を進めているところである。今年度は、次数2のジーゲル保型形式に対するフーリエ・ヤコビ展開と関連する特殊関数である、次数3の複素一般線形群GL(3,C)のクラス1でない主系列表現に対するホイッタカー関数の保型形式論への応用について研究を行い、特に保型L -関数に関連したゼータ積分について昨年度までの結果に基づいて、ゼータ積分の明示評価が困難である場合についての知見を深めたフーリエ・ヤコビ展開に必要な特殊関数であるフーリエ・ヤコビ型球関数の理論については依然として未完であるが、これまでに様々な一般球関数についての類似研究を進め、一定の成果を上げてきた。今年度はホイッタカー関数の明示公式、およびこの明示公式を活用したGL(3) ×GL(1)およびGL(3) ×GL(2)に対するアルキメディアンゼータ積分についての昨年度までの成果に基づいて、GL(3) ×GL(2)に対するアルキメディアンゼータ積分の明示評価が困難である状況についての基礎的考察を行った。得られた成果はゼータ積分が消えないような適当なベクトルがGL(3)およびGL(2)の主系列表現の極小K -typeから取れない場合の複素素点におけるゼータ積分の評価についての予備的考察である。一般の場合の評価はGL(3) ×GL(1)の場合と同様に困難を極めるが、次に取り組むべき今後の課題であろう。今年度は、次数2のジーゲル保型形式に対するフーリエ・ヤコビ展開と関連する特殊関数である、次数3の複素一般線形群GL(3,C)のクラス1でない主系列表現に対するホイッタカー関数の保型形式論への応用について研究を行い、特にGL(3)×GL(2)の保型L-関数に関連したゼータ積分の明示的評価についての研究を完了した。今年度はホイッタカー関数の明示公式、およびこの明示公式を活用したGL(3)×GL(1)およびGL(3)×GL(2)に対するアルキメディアンゼータ積分についての昨年度までの成果および知見に基づいて、GL(3)×GL(2)に対するアルキメディアンゼータ積分の明示評価を考察し、満足いく結果を得て完了させた。最も困難を極める場合の評価を得るにはより深いK-typeを扱う必要があったが、対応する表現論を駆使し、これを克服することができた。数物系科学研究の目的に挙げたフーリエ・ヤコビ型球関数についての直接の成果ではないが、類似の特殊関数であるホイッタカー関数とその応用について、部分的ではあるが一定の成果が得られたことにより、研究は順調に進展していると判断される。

研究の目的に挙げたフーリエ・ヤコビ型球関数についての直接の成果ではないが、類似の特殊関数であるホイッタカー関数とその応用について、部分的ではあるが一定の成果および問題の困難さについての多くの知見が得られたことにより、研究は順調に進展していると判断される。今後もフーリエ・ヤコビ型球関数とその応用について、直接的もしくは間接的に考察を進め、新たな知見を獲得しつつ問題の困難さを徐々に克服していくのが正しい方針であると信じる。今年度は研究の過程で判明したアルキメディアンゼータ積分の明示的評価の困難さに対する予備的考察を中心に研究を進めたため、成果発表や専門家との意見交換に関する研究活動が予定よりも減じたため。今年度に行った予備的考察によって得られた知見の蓄積を活用してアルキメディアンゼータ積分の明示的評価の困難さを克服できる見通しであるため、これまでに計画していた成果発表や専門家との意見交換に関する研究活動を次年度に繰り越して実施する計画である。今年度の研究実施にあたり、理想的でない状況におけるゼータ積分の計算の予備的考察に想定以上の時間を費やしたため、知見を深めることはできたものの、他の専門家との意見交換や学会における発表の機会を次年度以降に繰り越すこととなった。次年度においては部分的であってもその知見をまとめ、意見交換等によって研究を進展させる予定である。
アレー型超音波センサーによる射出成形金型内樹脂温度分布の測定

プラスチック射出成形加工では,高品質・高精度が求められている.そこで, CAEによる解析が多く行われているが,解析結果を検証することが難しい.本研究では,アレー型超音波センサーとトレーサを利用した樹脂内部の温度分布測定方法について検討した.具体的には,樹脂内部に混入されているガラス繊維などのトレーサ間の音速をその距離と時間間隔から算出し,温度-音速の関係から,温度分布を求める方法について検討した.その結果,アレー型超音波センサーを使って金型内樹脂の温度分布を測定できることを明らかとした.また,温度分布や固化層の発達挙動(冷却挙動)に,金型表面と流動する樹脂間で発生するせん断発熱が影響することを示した.プラスチック射出成形加工では,高品質・高精度が求められている.そこで, CAEによる解析が多く行われているが,解析結果を検証することが難しい.本研究では,アレー型超音波センサーとトレーサを利用した樹脂内部の温度分布測定方法について検討した.具体的には,樹脂内部に混入されているガラス繊維などのトレーサ間の音速をその距離と時間間隔から算出し,温度-音速の関係から,温度分布を求める方法について検討した.その結果,アレー型超音波センサーを使って金型内樹脂の温度分布を測定できることを明らかとした.また,温度分布や固化層の発達挙動(冷却挙動)に,金型表面と流動する樹脂間で発生するせん断発熱が影響することを示した.平成19年度は,以下のような実験を行い,アレー型超音波センサーを利用した樹脂内部の温度分布測定について検討を行った.(1)常温常圧時における樹脂内部のファイバー位置測定について.射出成形機を用いてファイバー入り成形品を作製するとファイバーは樹脂の流動方向へそろった形で厚さ方向に分布する.ファイバーの混入量は,射出成形機のホッパーへ樹脂ペレットとファイバーを入れるときの割合で調整する.実際にファイバーを厚さ方向に数から数十個入れた板状の資料を射出成形機で作製する.その板表面から超音波を直接投射し,ファイバー表面で反射してくる波形をアレー型超音波センサーで観測すると同時に,ファイバーの位置を特定する手法を開発する.(2)超音波による定常温度分布の測定について.射出成形樹脂の温度分布が定常状態にあるときの温度を超音波で測定する.これらの実験を行った結果,次のような結果が得られた.(1)ファイバーを入れた板状の成形品にアレー型超音波センサーを当てることにより,ファイバーを検出することが出来た.また,CRT上で画像が表示される位置から成形品中のファイバー位置を特定できることを確認した.(2)使用した樹脂の温度-音速-圧力の関係から,ファーバー問距離とその間を往復伝播する超音波の時間から,成形品藍の温度分布を測定できることが明らかとなった.以上のように,平成19年度の研究では,樹脂内部の温度分布を測定する方法についての基礎的な知見を得ることが出来た.平成19年度の基礎的研究に引き続き,平成20年度は,アレー型超音波センサーとトレーサを利用した樹脂内部の温度分布測定について,以下のような実験を行い検討した.(1)種々の成形条件で射出成形加工を行い,トレーサ間の音速をその距離と時間間隔から算出し,温度-音速の関係から,温度分布を求め,充填終了後の樹脂内部の温度分布に与える成形条件の影響を調べる.(2)樹脂冷却挙動として単発超音波送受信子で固化層の発達挙動を測定し,成形条件が固化層発達に及ぼす影響について検討し,アレー型超音波センサーで測定された樹脂内部の温度分布と比較・検討する.これらの実験を行った結果,次のような結果が得られた.(1)溶融樹脂が金型キャビティ内を流動する速度が速いと,充填終了後の樹脂内部の温度は金型壁面付近が高くなり,温度分布は比較的平坦となる.これは,溶融樹脂が金型キャビティ内を流動するときに金型表面と流動する樹脂間で発生するせん断発熱が,流動速度が速いほど大きくなるためと考えられる.また,速度が遅いと流動中に奪われる熱量が多いためと考えられる.(2)固化層発達挙動に与える成形条件の影響を調べた結果,溶融樹脂の流動速度が速いと固化層の発達が遅くなることが示された.これは,(1)で述べたようにせん断発熱の影響があるためである.以上のように,平成20年度の研究では,実際に射出成形を行ったときの樹脂内部の温度分布を測定することができ,成形条件の違いにより温度分布が異なることが明らかにされた.具体的には,せん断発熱があることが示された.また,固化層発達挙動についても温度分布と同様に,せん断発熱の影響があることが示された.
Alternaria alternataの7つの病原型の病原性は、宿主特異的毒素によって決定されている。先に、5つの病原型から毒素生合成遺伝子(TOX)クラスターを同定し、それらが生存には必要でないconditionally dispensable(CD)染色体に座乗することを見出した。さらに、CD染色体には共通起源となった染色体が存在すること、CD染色体の成立は古く、その成立には野生宿主が関与したことを示唆する結果を得た。本研究では、TOXクラスターとCD染色体の起源を検証するとともに、野生宿主を探索する。今年度は、主に以下の研究を実施した。腐生的(非病原性)A. alternata菌株が起源染色体を保有すると予想される。日本産、メキシコ産、ペルー産の非病原性菌株から、CD染色体保存遺伝子の網羅的なPCR検出によって、それぞれ2%、8%、5%が起源染色体候補を保有することを見出した。さらに、ペルー産菌株のドラフト配列を次世代シークエンサーを用いて決定した。先に、リンゴ斑点落葉病菌の12個のAM毒素生合成遺伝子(AMT遺伝子)のうち7個が、Mycosphaerella属菌から水平移動したことを示唆する結果を得た。本年度は、コムギ葉枯病菌(M. graminicola)の病原性におけるAMT相同遺伝子(MgAMT遺伝子)の機能を解析するために、アグロバクテリウム形質転換系を用いて2株のMgAMT1破壊株の作出した。さらに、破棄株の接種試験よって、MgAMT1が病原性に関与しない可能性を見出した。リンゴ斑点落葉病菌、ナシ黒斑病菌、イチゴ黒斑病菌の野生宿主を探索するために、農研機構果樹茶業研究部門に保存されているバラ科果樹の多数の系統について、リンゴ菌、ナシ菌に対する感受性検定をさらに進め、主要なリンゴ品種、ナシ品種以外からも感受性品種を見出した。また、リンゴ斑点落葉病菌の潜在的宿主として報告されているボケ8品種について、リンゴ菌感受性を検定し、3品種が感受性であることを見出した。A.alternataは自然界に広く分布する本来腐生的な糸状菌である。したがって、宿主特異的毒素を生産する7つの病原型は、それぞれ固有の毒素生産能を獲得することによって病原菌化したと考えられ、腐生菌の病原菌化、すなわち病原菌の起源を研究するための単純かつ好適なモデルである。A. alternata病原菌のTOXクラスターが座乗するCD染色体の起源染色体の探索については、起源染色体候補を保有する複数の菌株を見出すとともに、それらのうちペルー産菌株のゲノムドラフト配列を次世代シークエンサーを用いて決定した。TOXクラスターの起源遺伝子の機能解析については、コムギ葉枯病菌のMgAMT遺伝子の病原性機能を解析するためにMgAMT変異株を作出する必要がある。本菌は、成育が極めて遅く、形質転換も容易ではないが、アグロバクテリウムを用いた形質転換系を確立し、MgAMT1の破壊株の作出を試みた。MgAMT1破壊ベクターを保有するアグロバクテリウムを用いて分離した200株の形質転換体から、2株の遺伝子破壊株の同定に成功した。予備実験では、MgAMT1が病原性に関与しない可能性が見出された。A. alternata病原菌の野生宿主の探索については、農研機構果樹茶業研究部門に保存されているバラ科果樹の多数の系統について、リンゴ斑点落葉病菌、ナシ黒斑病菌およびイチゴ黒斑病菌に対する感受性検定を進め、すでに主要品種以外にも感受性品種が存在することを見出している。リンゴ斑点落葉病菌の潜在的宿主であることが示唆されていたボケについて、さらに供試品種を増やし、それらのAM毒素、リンゴ菌に対する感受性を検定し、8品種のうち3品種が感受性であることを明らかにした。この結果は、リンゴ以外にも宿主植物が存在すること、ボケにも感受性と抵抗性の系統が存在することを示した。以上のように、今年度は、当初予定した研究をほぼ実施することができ、研究は順調に進展している。A. alternataの7つの病原型のうち、バラ科作物を宿主とするリンゴ斑点落葉病菌、ナシ黒斑病菌、イチゴ黒斑病菌を主に用いて、以下の研究に取り組む。腐生的(非病原性)A. alternata菌株が保有すると推定されるCD染色体の起源染色体を探索するために、ペルー産菌株のゲノムドラフト配列のアノテーションによって、起源染色体候補の配列解析をさらに進めるとともに、起源染色体候補を保有する他の菌株についても候補染色体の構造を解析する。リンゴ斑点落葉病菌が水平移動によって獲得したと推定されるコムギ葉枯病菌のAMT相同遺伝子(MgAMT遺伝子)の機能を解析する。本研究で作出したMgAMT1破壊株について、それらの病原性を含めた各種形質をさらに調査し、MgAMT遺伝子の機能を解明する。MgAMT1破壊株の病原性検定によって、MgAMTが葉枯病菌の病原性に関与しない可能性が示されている。この結果が確認できれば、本来病原性機能を持たなかった遺伝子群が他種菌に水平移動し、新たに毒素の生産に利用され、病原性進化に活用されたことを実証することになる。農研機構果樹茶業研究部門に保存されているバラ科の野生種も含めた多数の系統を用いて、3病原菌に対する感受性検定を順次進め、新たな宿主を探索する。
リンゴ斑点落葉病菌に感受性の品種が存在することが確認されたボケについて、さらに供試品種を増やし、感受性・抵抗性分化について検証する。また、潜在宿主として報告されているユスラウメについても、AM毒素およびリンゴ菌感受性を検定し、本菌が感受性リンゴ品種だけでなく、他種の植物に対しても病原性を有することをさらに確認する。さらに、ボケとユスラウメが自然宿主であることを実証するために、ボケ、ユスラウメに発生している自然病斑から菌を分離し、それらの感受性リンゴ品種に対する病原性、AM毒素生産性を検定することによって、リンゴ斑点落葉病菌の分離を試みる。Alternaria alternataの7つの病原型の病原性は、宿主特異的毒素によって決定されている。先に、5つの病原型から毒素生合成遺伝子(TOX)クラスターを同定し、それらが生存には必要でないconditionally dispensable(CD)染色体に座乗することを見出した。さらに、CD染色体には共通起源となった染色体が存在すること、CD染色体の成立は古く、その成立には野生宿主が関与したことを示唆する結果を得た。本研究では、TOXクラスターとCD染色体の起源を検証するとともに、野生宿主を探索する。今年度は、主に以下の研究を実施した。腐生的(非病原性)A. alternata菌株が起源染色体を保有すると予想される。今年度は、分担者児玉が分離した小型の起源染色体候補を保有する非病原性菌株のうちペルー産菌株について、次世代シークエンサーを用いてドラフト配列を決定した。先に、リンゴ斑点落葉病菌の12個のAM毒素生合成遺伝子(AMT遺伝子)のうち7個が、系統学的に離れたMycosphaerella属菌から水平移動したことを示唆する結果を得た。本年度は、コムギ葉枯病菌(M. graminicola)の病原性におけるAMT相同遺伝子(MgAMT遺伝子)の機能解析を目的として、遺伝子破壊株を作出するためのアグロバクテリウム質転換系を確立した。本研究では、バラ科野生植物を中心に、リンゴ斑点落葉病菌、ナシ黒斑病菌、イチゴ黒斑病菌の野生宿主を探索する。今年度は、農研機構果樹茶業研究部門に保存されているバラ科果樹の多数の系統について、リンゴ菌、ナシ菌に対する感受性検定を進め、主要なリンゴ品種、ナシ品種以外からも感受性品種を見出した。先に、リンゴ斑点落葉病菌の潜在的宿主であることが示唆されていたボケについて、5品種のリンゴ菌感受性を検定し、2品種が感受性であることを確認した。A.alternataは自然界に広く分布する本来腐生的な糸状菌である。したがって、宿主特異的毒素を生産する7つの病原型は、それぞれ固有の毒素生産能を獲得することによって病原菌化したと考えられ、腐生菌の病原菌化、すなわち病原菌の起源を研究するための単純かつ好適なモデルである。A. alternata病原菌のTOXクラスターが座乗するCD染色体の構造比較によって、共通起源となった染色体が存在することが示唆され、研究分担者児玉は、国産および外国産の非病原性菌株から、起源染色体候補を保有する複数の菌株をすでに見出している。今年度は、それらのうちペルー産菌株のゲノムドラフト配列を次世代シークエンサーを用いて決定し、起源染色体の同定に向け、準備を整えた。
生物季節と伝統的風物誌:固有性・変異性・地方性の人類学的応用に関する研究

・サンゴ礁生態系、マングローブ生態系や干潟生態系に強く依存している海辺社会や山村社会で展開される様々な生業維持活動の中で採捕活動に焦点を当てて現地調査研究を行ってきた。特に礁原、汽水域・河口部や干潟における水族資源の伝統的な採捕技術・資源利用・維持・管理や干拓と、山間部の採集活動等にみられる季節性を重視した基礎的データを収集し、人類学的応用を試みた。・海と陸を同時に兼ね備えた礁原、汽水域・河口部、マングローブ域や干潟は,いわば半陸半海の生態系として人類が、長い間、さまざまな水族資源を採捕・確保する上で重要な「海の畑」だった。大した技術を労しないで,女性,子供,老人たちがごく日常的に関わり合ってきた場は、一日の潮の干満を利用するだけで採捕が周年可能であったし、その多様性・豊饒性・自給自足性は、古くから人類の食物獲得戦略に重要な要素と捉えるべきである。・多種多様な生物相を育くむ生態系の中で、熱帯・亜熱帯などの相違する自然環境で展開される伝統的なヒトの生計維持機構と採捕にかかわる種々の風物誌は、様々な生物種の生物的季節変化に規定されることが多く人類が獲得した伝統的な文化である。その相関性にかかわる詳細な資料・データの集積とその緻密な分析は、生物季節がもつ人類学的意義を検討・考察を加えていくうえで不可欠な作業である。・狩猟採集経済から、新石器革命といわれる食物生産経済にいたる人類進化史的な過程を復元・考察するさいに現代文明から希薄になりつつある伝統的な採捕技術とその生物季節的変化に注目し、人類学的な応用を試みる視座は重要である。さらにその伝統性の固有性・変異性・地方性も取り込んだ総合的な記録と分析は、現在、とりまとめているが、その成果は地球に優しい生態系の保全に必要な基礎資料を提供するばかりか、緊急かつ不可欠な学際的研究課題でもあるといえよう。・サンゴ礁海域や干潟生態系での採集や漁労に強く依存してきた海辺社会や山村社会で展開される様々な生業維持機構(subsistence strategy)を対象に現地調査研究を行っきた。特にイノー(reef flat)を抱えたサンゴ礁生態系(reef flat ecosystem)、汽水域(brackish water zones)や干潟生態系(tidal flat ecosystem)における水族資源の伝統的な採捕技術・資源利用、資源維持管理や干拓と、山間部の生業等に焦点を当てながら、現地調査研究を行った。・特に海と陸を同時に兼ね備えたイノーや河口の汽水域や干潟は,いわば半陸半海の生態系として人類が、長い間、さまざまな水族資源を採捕・確保する上で重要な「海の畑」だった。大した技術を労しないで,女性,子供,老人たちがごく日常的に関わり合ってきた場は、一日の潮の干満を利用するだけで採捕が周年可能(daily-basis availability)であったし、古くから人類の生活を維持するためにその多様性(species-diversity)・豊饒性(affluence)・自給自足性(self-sufficiency)は、重要な鍵を握っていた。・多種多様な生物相を育くむ生態系で展開されている伝統的なヒトの生計維持機構とそれに連動するような風物誌は、様々な生物種の生物的季節変化に規定されることが多く、その相関的な関係を集積し、有機的な関係の分析を通して、生物季節がもつ人類学的意義を考察中である。

・狩猟採集経済(hunting-gathering economy)から食物生産経済(food-production economy)にいたる人類進化史的な過程を復元する上で不可欠な基礎的なデータの収集を集積している。現代文明から希薄になりつつある伝統的な採捕技術の研究を通して民俗とその伝統文化の記録と分析は、地球に優しい生態系の保全に必要な基礎資料を提供するばかりか、緊急かつ不可欠な学際的研究課題として検討・考察中であり、その総合的かつ学際的な研究成果は注目されていいだろう。●サンゴ礁生態系、マングローブ生態系や干潟生態系に強く依存している海辺社会や山村社会で展開される様々な生業維持活動の中で採捕活動に焦点を当てて現地調査研究を行ってきた。特に礁原、汽水域・河口部や干潟における水族資源の伝統的な採捕技術・資源利用・維持・管理や干拓と、山間部の採集活動等にみられる季節性を重視した基礎的データを収集し、人類学的応用を試みた。●海と陸を同時に兼ね備えた礁原、汽水域・河口部、マングローブ域や干潟は,いわば半陸半海の生態系として人類が、長い間、さまざまな水族資源を採捕・確保する上で重要な「海の畑」だった。大した技術を労しないで,女性,子供,老人たちがごく日常的に関わり合ってきた場は、一日の潮の干満を利用するだけで採捕が周年可能であったし、その多様性・豊饒性・自給自足性は、古くから人類の食物獲得戦略に重要な要素と捉えるべきである。●多種多様な生物相を育くむ生態系の中で、熱帯・亜熱帯などの相違する自然環境で展開される伝統的なヒトの生計維持機構と採捕にかかわる種々の風物誌は、様々な生物種の生物的季節変化に規定されることが多く人類が獲得した伝統的な文化である。その相関性にかかわる詳細な資料・データの集積とその緻密な分析は、生物季節がもつ人類学的意義を検討・考察を加えていくうえで不可欠な作業である。●狩猟採集経済から、新石器革命といわれる食物生産経済にいたる人類進化史的な過程を復元・考察するさいに現代文明から希薄になりつつある伝統的な採捕技術とその生物季節的変化に注目し、人類学的な応用を試みる視座は重要である。さらにその伝統性の固有性・変異性・地方性も取り込んだ総合的な記録と分析は、現在、とりまとめているが、その成果は地球に優しい生態系の保全に必要な基礎資料を提供するばかりか、緊急かつ不可欠な学際的研究課題でもあるといえよう。
礫河川の土砂移動・河床近傍流れ・水温の通年・多地点モニタリング技術開発と現地計測

本研究の目的は,礫河川が抱える河床環境上の問題発生要因を分析するため,平水から中小出水まで通年で,地点毎に異なる土砂移動や河床近傍の乱流を,素過程から定量的かつ緻密に把握する新たな計測技術を確立することである.平成30年度は,河床近傍の乱流を計測する実用的な手法を開発した.具体的には,河床の粗面に作用している水圧の高精度・高周波数での計測を,実河川で実施するためのデバイスを,Dr.Jeffrey Tuhtan, Dr.Juan Fran Fuentes-Perez (the Tallinn University of Technology)と共同で開発した.デバイスは5cm角程度の水密容器に格納されたコントローラーと3つの絶対圧センサーにより構成され,2050Hzでの計測が可能であり,3カ月程度のスタンバイが可能である.スタンバイからの復帰や再スタンバイは,水圧の閾値設定により調整可能である.このスタンバイ機能を実装することで,出水時のみ計測できるため,バッテリーや記憶容量を有効利用しつつ高周波数での計測が可能となる.これまで利用していた水圧センサーでは2Hzで半日程度しか連続計測ができず,また複数の水圧センサーの同期をとることができず,差圧を算定できなかった.新たに開発したデバイスでは,いつ起きるか事前に知ることができない自然出水を対象とした計測が可能であり,3つの全圧センサーは同時計測ができるため,差圧が算出でき,圧力変動を介した乱流現象の分析を実河川で実用的に実施できるようになった.想定していたより高機能のデバイスを作成することができたが,水理実験や実河川での計測については最終年度に持ち越すこととなった.平成29年度は調査を予定していた出水イベントが実施されず,平成30年度は,作成していたデバイスの完成が年度内に終わらなかったため,水理実験や実河川での圧力変動の計測についてはとりかかれていない.圧力変動の計測デバイスは想定していたより高機能のものを作成することができた.その他に,平成30年度では,水中音響通信を用いたセンサーネットワークの基礎研究を行った.具体的には,M系列の疑似ランダム信号で位相変調したパルス信号の時間間隔によりデータ転送を行う通信方式を,平水時の河川において試験して,150m程度の距離で10%程度の欠測が確認された.平成29年度に実施した単側波帯振幅変調を用いた通信では100mの通信距離で13%程度の欠測が確認されたことから,位相変調したパルス信号方式は,送付できるデータ量は少ないが,実環境での通信可能距離が大きいことが確認できた.圧力変動の計測デバイスを用いて6月に実施予定の出水イベントで現地調査を行う予定である.4台分の圧力変動計測デバイスを作成中であり,ハイドロフォン式土砂移動検出デバイスと組み合わせ,水深・流速の異なる地点に配置し,水位・流量の変化と,河床近傍の乱流や土砂移動状況との関係を実測する.6月の出水イベントの後は,直線的な河道区間において自然出水の計測を目指した連続観測を行う予定である.連続計測と並行して,室内の開水路を用いて,河床近傍の圧力の計測を行って,その実験結果をもとに,現地調査で得られた計測結果の解釈を行う予定である.以上の成果をもとに,(1)センサーネットワーク型の計測方法をベースとした礫河川の河床環境の実測方法を確立し,(2)出水時の河床で起きている土砂移動と乱流の相互関係を実証的に分析する.特に圧力変動を視点とした河床近傍の乱流の検討は,研究例が少ないが,本研究により実用的な実測が可能になったこともあり,多様な展開が期待できる.【研究目的】礫河川が抱える河床環境上の問題発生要因を分析するため,平水から中小出水まで通年で,土砂移動を軸として,現地計測により河床環境状況の変化を明らかにする.礫河川は,ダム建設など人為的影響を受け,河床材料の粗粒化などの問題を抱えている.河床材料の変質と関連して魚類の採餌・産卵場としての機能低下などの生態環境の問題も起きている.これらの問題解決には,地点毎に異なる土砂移動や河床近傍の乱流を,素過程から定量的かつ緻密に把握し,地点に合った対応策を選択する必要がある.本研究では河床環境を通年で実測する新たな計測技術を確立し,河床環境の変化を把握し,河床環境改善策の選定や効果分析に利用できる計測技術を提供する.【当該年度の実施内容】平成29年度は,1シングルボードコンピューターを用いた計測デバイスの開発を進めた.水中音・水圧・水温を計測可能であるが,本年度は水温計測に集中して計測用プログラムを作成した.2上記計測デバイスによる水温計測の精度確認とバイアス補正方法の開発のために室内実験と現地河川での計測を行った.本年度実施する予定であった3一回目のフラッシュ放流を対象とした現地計測については,予定していたフラッシュ放流の実施が取りやめとなり,実施できなかった.【意義・重要性】これまでは既製品を用いて水中音・水圧・水温の計測を行ってきた.しかし,既製品では時間分解能・連続計測時間や計測トリガーの設定条件に制約があった.本年度はシングルボードコンピューターとセンサーを組合わせた計測デバイスを試作した.これにより上記の条件設定の制約を解消することができ,実河川での出水を確実に計測する基盤が整った.【順調な点】機器開発についてはシングルボードコンピューターとセンサーを組合わせた計測デバイスを試作し,室内実験と現地河川での計測による水温計測の特性などを把握することができた.

また,従来から利用していたロガー式水温・水圧計についても計測周期を短くすることができた.【問題点】機器開発に時間をとられ,現地での河床環境状況の変化の調査にはとりかかれなかった.また予定していたフラッシュ放流中の計測は,予定していたフラッシュ放流の実施が取りやめとなり,実施できなかった.本研究の目的は,礫河川が抱える河床環境上の問題発生要因を分析するため,平水から中小出水まで通年で,地点毎に異なる土砂移動や河床近傍の乱流を,素過程から定量的かつ緻密に把握する新たな計測技術を確立することである.平成30年度は,河床近傍の乱流を計測する実用的な手法を開発した.具体的には,河床の粗面に作用している水圧の高精度・高周波数での計測を,実河川で実施するためのデバイスを,Dr.Jeffrey Tuhtan, Dr.Juan Fran Fuentes-Perez (the Tallinn University of Technology)と共同で開発した.デバイスは5cm角程度の水密容器に格納されたコントローラーと3つの絶対圧センサーにより構成され,2050Hzでの計測が可能であり,3カ月程度のスタンバイが可能である.スタンバイからの復帰や再スタンバイは,水圧の閾値設定により調整可能である.このスタンバイ機能を実装することで,出水時のみ計測できるため,バッテリーや記憶容量を有効利用しつつ高周波数での計測が可能となる.これまで利用していた水圧センサーでは2Hzで半日程度しか連続計測ができず,また複数の水圧センサーの同期をとることができず,差圧を算定できなかった.新たに開発したデバイスでは,いつ起きるか事前に知ることができない自然出水を対象とした計測が可能であり,3つの全圧センサーは同時計測ができるため,差圧が算出でき,圧力変動を介した乱流現象の分析を実河川で実用的に実施できるようになった.想定していたより高機能のデバイスを作成することができたが,水理実験や実河川での計測については最終年度に持ち越すこととなった.平成29年度は調査を予定していた出水イベントが実施されず,平成30年度は,作成していたデバイスの完成が年度内に終わらなかったため,水理実験や実河川での圧力変動の計測についてはとりかかれていない.圧力変動の計測デバイスは想定していたより高機能のものを作成することができた.その他に,平成30年度では,水中音響通信を用いたセンサーネットワークの基礎研究を行った.具体的には,M系列の疑似ランダム信号で位相変調したパルス信号の時間間隔によりデータ転送を行う通信方式を,平水時の河川において試験して,150m程度の距離で10%程度の欠測が確認された.平成29年度に実施した単側波帯振幅変調を用いた通信では100mの通信距離で13%程度の欠測が確認されたことから,位相変調したパルス信号方式は,送付できるデータ量は少ないが,実環境での通信可能距離が大きいことが確認できた.開発したシングルボードコンピューターとセンサーを組合わせた計測デバイスの開発を進める.具体的には(1)計測項目を増やす,(2)精度検証と必要なキャリブレーション手順を確立する,(3)防水性や整備性などを念頭に計測デバイスのパッケージを再構築することを考えている.
二次共生における共生藻のオルガネラ化過程の解明

異なる進化段階の二次葉緑体をもつ3つの生物群(ハテナ、クロララクニオン藻、パーキンサス)を対象に、葉緑体が駆動する進化・寄生化仮説を検証した。盗葉緑体段階にあるハテナの比較トランスクリプトーム解析と全ゲノム解読から、核に転移した共生藻遺伝子候補を30個得て、盗葉緑体の統合の程度を推定した。オルガネラ段階の二次葉緑体をもつクロララクニオン藻について、共生藻と核の協調機構の一部および共生藻核ゲノムの進化を解明し、二次葉緑体の獲得・維持機構の理解に大きく貢献した。貝類寄生性原生生物パーキンサスについて、縮退葉緑体の機能解明に必要な高効率葉緑体単離法を新たに確立し、寄生性獲得原理の解明に道をつけた。本研究は、二次共生における異なる進化段階を代表する生物((1)一時的な色素体をもつ半藻半獣原生生物ハテナ、(2)オルガネラとしての色素体をもつが祖先共生藻の縮退核(ヌクレオモルフ)も有するクロララクニオン藻、(3)非光合成性の極端に縮退した色素体をもつ寄生生物パーキンサスとマラリア原虫)について、色素体への依存の仕方や程度、宿主-色素体の関係維持機構を解析し、それぞれの共生藻(色素体)と宿主の統合機構を明らかにすることで、色素体のマトリョーシカ型進化原理を理解し、色素体が駆動する進化・寄生化仮説を検証することを目的としている。そのために以下の3つの項目について重点的に研究を展開している。1.細胞内共生藻のオルガネラ化初期段階プロセスの解明(井上):半藻半獣原生生物ハテナをモデルとして、ゲノム解析を進めてハテナ核ゲノムに転移した遺伝子推定と分裂関連遺伝子の探索を行なう。今年度は、ハテナ核ゲノムに転移した遺伝子推定のため、ハテナ共生藻Nephroselmis株の5'EST解析を行った。Nephroselmis株からRNA抽出を行い、外注により、次世代シーケンサーGSFLXTitaniumを用いて、各々210.824リード・208,483リードを取得した。得られた配列をアセンブルし,各々のリードから12,811コンティグ・7,730コンティグを得ることに成功した。それぞれのコンティグの中からBLAST検索により細胞分裂に関わる遺伝子を探索し、複数の細胞分裂関連遺伝子を同定した。2.二次共生における共生藻ゲノムの進化、宿主との相互作用(石田):共生藻ゲノムの進化を比較ゲノム解析によって明らかにするために、既に先行してドラフト配列取得済の2種(Amorphochlora amoebiformis、Lotharella vacuolata)についてヌクレオモルフゲノム解読を完了し、さらに別系統に属しヌクレオモルフゲノムサイズが最も大きい(約1Mbp)Partenskyella glossopodiaについて配列解読を開始した。また、色素体へのタンパク質輸送機構の解明に向けて、B.natansの全ゲノム配列より核コード色素体タンパク質遺伝子配列を網羅的に取得し、色素体への輸送シグナル配列を比較して、多様なタンパク質輸送機構の存在を示唆した。さらに、クロララクニオン藻からの無傷色素体単離法を開発した。3.寄生性原生生物における二次葉緑体の機能と寄生性獲得との関連(松崎):今年度は、パーキンサスの二次葉緑体を、ミトコンドリアとの物理的相互作用に注意しながら、単離する方法を検討した。オルガネラを蛍光タンパク質で標識した形質転換株を用い、オルガネラ形態を維持したまま細胞破砕を行う条件を見出したことで、今後行うプロテオーム解析の精度向上が期待できるようになったことは特筆すべき点である。またプロテオーム解析の効率を上げる目的で、次世代シーケンサーを用いたトランスクリプトーム解析を進めており、これにより暫定ゲノム配列の遺伝子情報を補完する予定である。研究項目1.半藻半獣原生生物ハテナ共生藻のトランスクリプトーム解析を行った。また、ハテナ共生藻に近縁な自由遊泳性ネフロセルミス培養株のトランスクリプトーム解析も行った。解析の結果、両者の遺伝子発現は一部が異なっていることがわかった。また、ハテナゲノム解析については、昨年度少数の細胞を用いた全ゲノム増幅では成功しなかったため、ハテナを含む天然のサンプルから直接DNA抽出を行い、次世代シーケンス解析を行った結果、全ゲノム増幅しなければ、ハテナゲノムが解読できることを見いだした。研究項目2.二次共生における共生藻ゲノムの進化、宿主との相互作用:共生者ゲノムの進化について、ヌクレオモルフゲノム解読が3種について完了し、既報のBigelowiella natansを含む4種で比較ゲノム解析を行い、共生藻ゲノムの進化について結論を得た(論文準備中)。また、ヌクレオモルフの染色体が倍数化していること、ヌクレオモルフ遺伝子の進化速度が核ゲノム遺伝子の約3倍であること、その原因の一つとしてヌクレオモルフで分子シャペロンが高発現していることなど、新規の特徴を発見し、国際学術雑誌に報告した。さらに、共生者と宿主の分裂協調に関して、B. natansにおいて葉緑体ーヌクレオモルフー核の分裂プロセスを微細構造レベルでほぼ明らかにした。研究項目3.寄生性原生生物における二次葉緑体の機能と寄生性獲得との関連:パーキンサスの二次葉緑体を単離する目的で前年度に作成した細胞株が、株として不安定で精製実験に不適であったため、株が不安定化するメカニズムの解析と、組換えコンストラクトの改良を進めている。