hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
クロイツフェルト・ヤコブ病の病原因子はプリオンでない可能性がある

しかし、94週後の脳を接種した9匹のマウスのうち1匹が139日後に、100週後の脳を接種した15匹のマウスのうち13匹が182426日後に発症し、112週後の脳を接種した17匹のマウスのうち10匹が193378日後に発症した。そして、これらの発症したマウスの脳内には感染型プリオン蛋白が認められた。これらの実験結果は、プリオン病の病原体が感染型プリオン蛋白で構成されていない可能性をさらに強く示唆した。しかし、10 ^5LD_<50>くらいの感染価を含む脳乳剤を接種したにもかかわらず、94週、100週、112週後の脳内に認められた感染価は10 ^3LD_<50>以下であった。50週、56週、58週後の脳内には全く感染性が検出できなかったことは、94週、100週、112週後の脳内に認められた感染価がはじめに接種した脳乳剤からのものではないことを示している。
金属人工格子に関する理論と設計指針の構築

金属人工格子の巨大磁気抵抗効果に対し、人工格子の界面近傍の不規則配列した磁性原子の存在が重要であることが、前年度の研究に於いて指摘された。この点をふまえ、今年度は、巨大磁気抵抗効果に関し、微視的モデルを用いた計算が重点的になされた。第一に、不規則配列した磁性原子を不純物とみなし、磁気抵抗比の物質依存性が調べられた。Cuを含む人工格子においては、FeとCoの合金属とCu層とからなる人工格子において、大きな磁気抵抗比が得られることが示された。また、遷移金属元素からなる人工格子においては、Fe/Crで巨大磁気抵抗が、Co/RuおよびFe/Ruで比較的大きな磁気抵抗が得られることが示された。以上の計算において、不規則配列した磁性原子の磁気モ-メントとd電子数が、磁気抵抗に対して、重要なパラメ-タであることが指摘された。第二子、界面近傍の不規則配列した原子によるランダムポテンシャルを、層に依存するコヒ-レントポテンシャル近似を用いて取り扱い、磁気抵抗の磁場依存性が調べられた。これらの計算結果は、実験事実と一致しており、したがって、界面近傍の不規則配列した磁性原子が、巨大磁気抵抗に対し重要な役割をはたしていることが確かめられたといえる。第三に、Fe、Co又はNiとCrからなる人工格子に対し、人工格子固有の周期性を取り入れたバンド計算がなされ、それらの電子構造及び磁気的性質が調べられた。この計算においても、界面における不規則性が、磁気抵抗に影響を及ぼすことが指摘された。最後に、Fe3原子層、Cr3原子層とからなるFe/Cr人工格子のフェルミ面がバンド計算によって得られ、フェルミ面の効果のみでも磁気抵抗効果が生じ得ることが指摘された。その定量性については、今後の課題である。磁気抵抗効果以外の研究結果については次の通りである。窒素やボロン(Xと記す)が強磁性鉄(001)面に侵入した人工格子(FeX)_1ー(Fe)_5に対する第一原理からのバンド計算が行われた。その結果、FeX面から離れたFe原子の磁気モ-メントが増加することが示された。遷移金属を含む系に、第一原理分子動力学法を拡張する定式化及びプログラムの拡張、開発が行われた。前段階として、Alが吸着したSi(111)面の構造が、この方法により調べられた。
電位依存性P型Ca^<2+>チャネル活性による関連受容体やチャネルの機能調節と小脳失調

P型Ca^<2+>チャネルをコードするα_<1A>サブユニットに変異が入り、ヒトでEpisodic Ataxia-2、家族性偏頭痛、遺伝性脊髄小脳変性症spinocerebellar ataxia 6 (SCA6)等の中枢神経疾患が引き起こされる。また、運動失調症を呈するtottering(tg)、leaner(tg^<la>)及びrolling Nagoya(tg^<rol>)マウスもP型Ca^<2+>チャネルをコードするα_<1A>サブユニットに変異があり、プルキンエ細胞のP型Ca^<2+>チャネルの活性が低下していることを明らかにするとともに、変異を入れたcDNAを培養細胞に導入しプルキンエ細胞での性質変化を再現した。更に、P型Ca^<2+>チャネルの活性と小脳失調の程度の間には逆相関があり、これらの遺伝子の変異によるCa^<2+>チャネルの活性低下がマウスの運動失調症を起こしていることが判明した。tg^<rol>マウスのP型Ca^<2+>チャネルの活性は低下し、平行線維-プルキンエ細胞間シナプスのEPSCは正常マウスに比べtg^<rol>1マウスで小さくなっているが、登上線維-プルキンエ細胞間のEPSCは予想に反して大きくなっていることを我々は報告した。この原因の一つはプルキンエ細胞体上のAMPA受容体のグルタミン酸に対する感受性が亢進していることであると証明し、P型Ca^<2+>チャネルの活性がシナプス下膜のAMPA受容体サブユニットの構成を制御している可能性を示した。また、新たに見つかった運動失調を示すマウスの電位依存性Ca^<2+>チャネルの変異を電位依存性Ca^<2+>チャネルの副サブユニットであるβサブユニットを安定発現させたbaby hamster kidney (BHK)細胞に一過性に発現させ、変異によるチャネル機能の変化を電気生理学的に検討した。電流密度には変化が無かったが、活性化曲線と不活性化曲線が有意に過分極側に移動していた。これらの変化が運動失調とどう繋がるのかは病態マウスを手に入れて解析する必要がある。しかし、本年度中にこのマウスを入手することができなかった。このマウスを至急入手し小脳プルキンエ細胞を急性単離し本マウスのチャネル機能の解析を進めたい。また、中枢神経系で神経伝達物質として働いていることが示唆されているATPの受容体の解析も行った。ATP受容体はイオンチャネル直結型のP2X受容体と7回膜貫通型受容体P2Yに分けられる。本研究ではP2X受容体が視床下部の弓状核に発現し陽イオンチャネルを形成し、電気生理学的及び薬理学的検討から受容体のタイプはP2X_2 homomultimer又はP2X_2/P2X_6 heteromultimerあることを明らかにした。

本研究ではP2X受容体が視床下部の弓状核に発現し陽イオンチャネルを形成し、電気生理学的及び薬理学的検討から受容体のタイプはP2X_2 homomultimer又はP2X_2/P2X_6 heteromultimerあることを明らかにした。ヒトに於いてP型Ca^<2+>チャネルの変異が運動失調を引き起こすことが最近注目を集めている。脊髄小脳変性症6型(SCA6)はP型Ca^<2+>チャネルのC末でCAGリピートが異常伸長することが原因で起こる遺伝性神経疾患である。私はこのSCA6と同様の変異を持つ組み換えP型Ca^<2+>チャネルを電位依存性Ca^<2+>チャネルのβ_1 subunitとbaby hamster kidney(BHK)細胞に発現させ機能解析をしたところ、チャネルの不活性化曲線が過分極側に有意に移動していた。中枢神経細胞にはβ_1 subunitの他にβ_4 subunitも豊富に発現している為、β_4 subunitを安定発現したBHK細胞にSCA6と同様の変異を持つ組み換えP型Ca^<2+>チャネルを一過性に発現させその機能を解析しようとした。同じコントロールのP型Ca^<2+>チャネルでもβ_4 subunitと共発現させると、β_1 subunitと共発現させた時よりも不活性化曲線が脱分極側に約15mVシフトした。これにより、ラットやマウスの小脳プルキンエ細胞のP型Ca^<2+>チャネルの性質に近くなった。従って、来年度以降このβ_4 subunitを安定発現したBHK細胞にSCA6と同様の変異を持つ組み換えP型Ca^<2+>チャネルを一過性に発現させ、β_1 subunitと共発現させた時の以前のデータと比較検討していきたい。今後、SCA6と同様の変異を持つ組み換えP型Ca^<2+>チャネルを発現させた遺伝子改変マウスを手に入れ、このモデルマウスを使ってP型Ca^<2+>チャネルの機能を解析しヒトの運動失調の病因を明らかにしたい。運動失調を示すtottering(tg)、leaner(tg^<la>)、rolling Nagoya(tg^<rol>)マウスのP/Q型電位依存性Ca^<2+>チャネルのα_1サブユニットに変異が入っており、それぞれチャネル活性が低下していることが運動失調の原因であると我々は報告している(J Biol Chem 273:34857-34867,1998,J Neurosci 20:5654-5662,2000)。本年度は、新たに見つかった運動失調を示すマウスの電位依存性Ca^<2+>チャネルの変異を電位依存性Ca^<2+>チャネルの副サブユニットであるβサブユニットを安定発現させたbaby hamster kidney(BHK)細胞に一過性に発現させ、変異によるチャネル機能の変化を電気生理学的に検討した。電流密度には変化が無かったが、活性化曲線と不活性化曲線が有意に過分極側に移動していた。
表現型に性差を示すlong ncRNA Fat60 KOマウスの機能解析

ゲノムプロジェクトの成果から、「ゲノム上のがらくた」と思われてきた領域には、タンパク質をコードしないnon-coding RNA (ncRNA)が多量に存在することが分かってきた(Kapranov P、Science, 2007)。その中でmiRNAを代表とする小さなRNAの機能解析は進んでいるが、200塩基以上の長いncRNA(long non-coding RNA, lncRNA)は、個体レベルで機能が明らかになった例は僅かであり、その生理的な役割を明らかにすることが求められている。我々が発見したFat60 lncRNAの個体での機能を解析するためノックアウトマウスを作製したところ、一部個体で、発生に異常を示すマウスが出現することを明らかにした(未発表データ)。更に興味深いことに、表現型は性差を示すことが分かった。異常は雌KOマウスで見られるが、雄では異常は殆ど見られない。また、このような異常は同腹の野生型の個体では見られない。また、異なるESラインから作製したKOマウスにも同様の異常が見られたことから、表現型はlncRNAをKOしたことに由来すると想定される。更に発生を遡り胎仔期での表現型を詳しく調べると、既に発生過程で異常が見られることが分かった。このように。lncRNAの作用機序の解明に、細胞レベルで取り組む基盤が整った。KO胎仔の形態異常が「どの細胞」で「いつ」起こるか特定する目的で、胎仔期を遡り、発生の各ステージでの組織切片の詳細な解析を行った。組織切片、及び細胞の種類を染め分ける免疫染色による組織学的な解析を行った結果、異常を起こす組織及び、特定の細胞種を絞り込むことに成功した。現在、Fat60 lncRNA欠失と表現型の異常との関連を調べるため、雌雄KOマウスと野生型雌雄マウスの組織をDNAマイクロアレイ、及び次世代シーケンサーを使い解析中である。DNAマイクロアレイ、及び次世代シーケンサーを用いて得られるデータを解析し、lncRNAの発現消失による、遺伝子ネットワークの変化を検出する計画を立てている。体系的、網羅的遺伝子発現解析を行うことにより、lncRNA破壊と表現型との関連を分子レベルで明らかにしていく予定である。このように。
国家形成前段階における親族構造の地域的変異に関する研究ー九州南部を中心に―

本研究は、国家形成前段階における親族構造変動の地域的偏差の実態を、九州南部地域出土の古人骨資料の形質人類学的研究に基づいて明らかにするとともに、考古学的研究により当該地域の集団の首長や司祭者などの社会的地位や財の継承方法、集団の階層分化の様相も明らかにし、当該地域が律令国家に編入される前の社会組織の水準を明らかにする。異文化集団とも評価されてきた九州南部地域の非高塚古墳造営地域集団の親族組織の実態を、形質人類学的方法、自然科学的方法で解明する。また当該集団の社会構造の実態を、墳墓群および集落の内部構造の分析、あるいは個々の墳墓や住居址からの出土品の考古学的検討から考古学的方法で解明する。
ホルマリン固定・パラフィン包埋病理組織を用いた包括的エピジェネシス解析

ヒトゲノム解読の後には遺伝子発現制御機構の解析が重要性を増すことが予想される。私どもはラットのサイクリンD1遺伝子5′側上流領域をクローニングし、白血病細胞のサイクリンD1発現がプロモータ領域のCpGメチル化によってEpigeneticalに制御されることを示した。さらにCpGメチル化を組織形態と対応して解析するために、病理組織検体からCpGメチル化を検出する方法の基礎的検討を行った。即ち、ホルマリン固定パラフィン包埋の薄切標本をアガローズビーズに封入してDNAの化学的修飾やPCR・DNAシーケンスを行うことにより、微量検体からのCpGメチル化検出を可能にした(Lab Invest2000)。また、ヒト前立腺癌においてBMP-6遺伝子プロモータ領域のメチル化がBMP-6の転写を制御することを示し、前立腺癌の手術・剖検症例を用いた検索を行った。BMP-6mRNAは低分化型腺癌に高率に発現するとともに他臓器の転移浸潤部位では発現が高い傾向を示したが、micro dissectionで切出した腫瘍組織を用いてCpGメチル化の解析を行い、BMP-6発現がプロモータのSp1結合配列近傍のCpGメチル化によって制御されることを報告した(J Bone Miner Res,in press)。腫瘍の増殖・進展過程でCpGメチル化の変化により遺伝子発現(あるいは発現抑制)を来たし、転移浸潤に関わる生物学的特性を獲得する可能性が示唆された。私どもの方法論により、組織像に着目して標本の任意の部位で対象遺伝子のCpGメチル化の解析を行い「組織形態と対応した遺伝子制御研究」を進めるとともに、病理組織検体として集積されたゲノム資源を活用して疾患病態の解明を行うことが可能になる。以上の成果は第89回日本病理学会総会ワークショップ、第23回IAP総会シンポジウムにて発表した。
内分泌撹乱物質のマウス情動行動及び性行動への影響に関する研究

研究目的内分泌撹乱物質の情動・記憶・学習等脳への直接的影響を調べる実験系として、記憶・学習・情動等の脳活動の機能に直接関与している脳組織として知られる「海馬」で特異的に発現しているNe112遺伝子を欠損するマウスを作成し、この欠損マウスの記憶・学習・情動行動について研究した。また人の痴呆に関与するベータアミロイドの代謝に関与するヒト型カルボキシペプチダーゼの機能についても研究した。研究結果1)遺伝子欠損マウスと野性型マウスについて、1回の電気刺激による暗室回避学習を行ったところ、野性型は回避率が80%以上と高かったが、欠損マウスは約40%と低下していた。一方、一旦回避学習を獲得したマウスでは、欠損マウスの方が野性型より長期にその記憶保持を維持していた2)遺伝子欠損マウスと野性型マウスについて、海馬依存性の空間学習としてモーリス水迷路実験系をもちいて空間学習脳を比較検討した。その結果、海馬依存性の空間学習能の点では欠損マウス、ヘテロマウス、野性型マウスとも高い学習能を示し、有為差は見られなかった。3)欠損マウス、野性型の脳海馬を電気生理学的方法を用いて調べたところ、記憶形成に関与するLTP(シナップス伝達の長期増強)反応が欠損マウスで野性型より約30%増加していた。4)その他に欠損マウスが雄特異的に不妊であることが種々の交配実験より明らかとなった。欠損雄マウスの精巣での精子形成、精子の運動性や形態は正常であることから、不妊の原因は精子と卵子の接合不全と考えられる。5)ベータアミロイドの代謝に関与するヒト型カルボキシペプチダーゼは、正常ヒトの海馬菱形神経細胞に特異的に存在し、痴呆の患者で著しく現象していることが判明した。これらの研究から幾つかの興味ある重要な結果が得られたが、今後そのメカニズムも含め、更に詳細に検索していく必要がある研究目的内分泌撹乱物質の情動・記憶・学習等脳への直接的影響を調べる実験系として、記憶・学習・情動等の脳活動の機能に直接関与している脳組織として知られる「海馬」で特異的に発現しているNe112遺伝子を欠損するマウスを作成し、この欠損マウスの記憶・学習・情動行動について研究した。これらの研究から幾つかの興味ある重要な結果が得られたが、今後そのメカニズムも含め、更に詳細に検索していく必要がある
Invivo部位特異的光架橋法によるE3リガーゼの基質認識メカニズムの解析

ユビキチンリガーゼ(E3リガーゼ)による基質の特異的な認識メカニズムを高次構造の観点から解明することは極めて重要である。しかし、X線結晶構造解析やNMR解析が困難である場合や大腸菌での発現も困難なE3リガーゼについて、基質の認識メカニズムを解析するためには、技術的なブレークスルーが必要である。我々は、小胞体関連分解(ERAD)に関与する膜貫通型E3リガーゼHrd1およびDoa10について、機能-構造情報を得るために、in vivo部位特異的光架橋法という新しい手法の導入を試みた。最初に、デグロンと呼ばれる酵母のDeg1配列を適当なレポーター遺伝子に融合して、酵母細胞のサイトゾルで発現させ、Doa10との相互作用の追跡を試みた。過去の研究によると、Deg1配列中の両親媒性ヘリックスが認識に重要という知見があり、その部位へアンバーコドンの導入を始めた。しかしながら本年度の途中で、従来考えられていたDeg1認識のメカニズムとは異なる新しい概念(N末端のアセチル化がDoa10による認識に関与する)が報告された。現在はDeg1の解析を継続しているが、同時にHrd1-Hrd3相互作用の解析を開始した。我々は遺伝学的スクリーニングによって、Hrd1の2番目の膜貫通ドメインがHrd3と相互作用している可能性が高いことを見出した。そこで、Hrd1の2番目の膜貫通領域に光架橋性アミノ酸を導入して、Hrd3との相互作用を解析している。この相互作用がERADの反応を停止させた時にどのように変化するか調べる予定である。しかし、X線結晶構造解析やNMR解析が困難であったり、大腸菌での発現も困難なE3リガーゼの場合、基質の認識メカニズムの解析には技術的なブレークスルーが必要である。過去の研究によると、Deg1配列中の両親媒性ヘリックスが認識に重要という知見があり、その部位ヘアンバーコドンの導入を始めた。現在はDeg1の解析を継続しつつ、Hrd1-Hrd3相互作用の解析を開始することも検討している。本研究によって膜貫通型Hrd1-Doa10 E3リガーゼの解析にin vivo部位特異的光架橋法を導入できれば、様々なE3リガーゼの認識メカニズムの解析へ適用が期待される。我々は、小胞体関連分解(ERAD)に関与する膜貫通型E3リガーゼHrd1およびDoa10について、機能-構造情報を得るために、invivo部位特異的光架橋法という新しい手法の導入を試みた。

過去の研究によると、Deg1配列中の両親媒性ヘリックスが認識に重要という知見があり、その部位ヘアンバーコドンの導入を始めた。しかしながら本年度の途中で、従来考えられていたDeg1認識のメカニズムとは異なる新しい概念(N末端のアセチル化がDoa10による認識に関与する)が報告された。現在はDeg1の解析を継続しているが、同時にHrd1-Hrd3相互作用の解析を開始した。我々は遺伝学的スクリーニングによって、Hrd1の2番目の膜貫通ドメインがHrd3と相互作用している可能性が高いことを見出した。そこで、Hrd1の2番目の膜貫通領域に光架橋性アミノ酸を導入して、Hrd3との相互作用を解析している。この相互作用がERADの反応を停止させた時にどのように変化するか調べる予定である。
生体内で脂肪に置換される吸収性材料の開発

乳癌患者の増加に伴い、乳房再建の需要が高まっている。現在乳房再建は、自家組織移植や人工物(シリコンインプラント)を用いた方法で行われている。しかしながら、各々自家組織の大きな犠牲や体内への人工物の長期埋入による様々な合併症を伴う。それらの問題を解決する方法として、生体内で長期間内腔を維持することで脂肪に置き換わる吸収性材料を開発した。この材料は、乳癌の再発や増殖を刺激する可能性のある細胞や細胞成長因子を用いておらず乳癌術後の再建へ安全に利用可能である。本研究では、この埋入材料の最適な形態と長期埋入による影響を検討を行い、自家組織犠牲や人工物が長期間体内に残らない新たな脂肪再生材料開発を進める。
生涯を通じた男性のケアの担い手としての発達支援方法の開発

本研究の最終目的は,男性の生涯を通じたケア力の発達を明らかにし、その発達のための各期の支援方法を提案することである。発達を親準備期世代、育児期世代、介護期導入世代の3つの世代に分けて、研究を進めていくことであった。平成29年度は、主に親準備期におけるケア力について調査を行った。ここでは、親準備力を情緒応答性(子どもが発するCUEを読み取る力とし、その読み取り力を日本版IFEEL PICTUREで測定し、被養育経験(日本語版personal bonding Instrument)と愛着スタイル(Experience in Close Relationship Inventory the generalized other version)と属性から調査を行った。結果として、JIFPとPBIとの関係では、高養護の母親からまた、同様に高養護の父親から育てられた方が情緒の読み取りが高いことが明らかになった。愛着スタイルでは、不安尺度得点と回避尺度得点の2方向から分析すると、回避尺度得点が低いほど情緒読み取りが、回避尺度が低いものより良いことが明らかとなった。結論として、親からの適正な愛情をもって育てられた方が、また、人と回避することをしない方が情緒の読み取りが高いことが分かった。さらに、属性の項目からの調査では、幼少時、妹・弟とのかかわりの経験よりも青年期前期頃に子どもとの遊びやかかわりの経験がある方が情緒読み取りを高くしていることも明らかになった。支援プログラムの一環として、キャリア教育に将来家族を設けることの自覚を促すような教育を始めた。育児期、介護導入期においても、調査をケア力を高めるための調査の準備を行った。平成29年度の親準備期の班の調査については順調に行われ、それなりの成果はだすことができた。しかし、平成30年の1月から2月に予定していたノルウエーでのフィールド調査は、調査協力をお願いしていた関係者と調整がつかず、次年度に持ち越すことになったことからやや遅れていると判断した。平成29年度に行うフィールド調査を平成30年度に繰り越し、改めて関係者との調整を試みることとした。そのほかについては、順調に進んでいるため、そのまま計画通りに実行することとする。
地震津波複合災害時におけるライフラインの被害推計と応急復旧過程のモデル化

本研究では、ライフラインシステムの中でも電力、都市ガス、上水道・下水道、道路網、通信に焦点をあて、東日本大震災のような地震と津波の作用が複合化する「地震津波複合災害」を対象とした上で、ライフラインシステムの物理的及び機能的被害と復旧支障の相互連関を精度よく表現する数理モデルを構築し、被害を受けた後の応急復旧過程の問題構造を定量的に明らかにした。平成24年度においては,東日本大震災の際の異種ライフライン間の被害の相互連関を考慮した「物理的・機能的被害推計モデル」のモデル構築に資する被害データの収集および解析的検討を行った.具体的には,第1に,対象とするライフラインの地震津波発生後の被害分布と応急復旧過程に関するデータを茨城県鹿行地域及び福島県いわき市等を主たる対象地域として収集・分析するとともに,第2に,電力・停電被害,道路網・橋梁被害,上水道・下水道被害にフォーカシングし,強震動及び液状化が支配的な被害データと津波作用が支配的な被害データに区分した上で,各ライフラインの属性データの観点から地震動強さ及び津波作用と各ライフラインの被害率の関係を推計し,経験的な地震津波被害関数のプロトタイプモデルを構築した.以上より,東日本大震災の際に,強震動,それによって励起される液状化,及び津波による複合作用を受けたライフラインの物理的・機能的被害の実相を作用形態に区分して定量的に明らかにし,貴重な実証的データの収集をはかるとともに,それに基づく有用な分析結果を示すことができた.このような研究の枠組みにおいて,研究代表者の庄司は,上記プロトタイプモデルの構築と検証,及び,電力・道路網・上水道・下水道の被害並びに応急復旧過程に係るデータ収集・分析を行った.研究分担者の永田と丸山は,上水道・下水道・道路網・都市ガスの被害並びに応急復旧過程に係るデータ収集・分析を行った.研究分担者の八木と連携研究者の藤井は今後発生が懸念される茨城県沖及び房総沖の地震津波の震源過程及び津波波源に関するモデルの分析を行った.研究分担者の村尾は対象とするライフライン全般の被害の受容に係るデータの収集・分析を行った.平成25年度においては,平成24年度から引き続いて,東日本大震災の際の異種ライフライン間の被害の相互連関を考慮した「物理的・機能的被害推計モデル」のモデル構築に資する被害データの収集および解析的検討を行った.特に,1)分析対象とするライフラインのシステム耐性に係るパラメータが被害率に与える感度に関してデータ整理と分析を進め,加えて,2)物理的・機能的被害の説明因子となる,強震動及び液状化の作用・曝露のハザード指標(例えば,地表最大速度,地盤沈下量など)や津波作用に係るハザード指標(例えば,水位,津波流速など)についてそれらの時空間の推計精度を精査し,地震津波被害関数のプロトタイプモデルの高精度化をはかった.以上の点に関しては,電力,上水道,下水道,道路・橋梁のライフラインに対して,一定の知見を得ることができた.これより,強震動,それによって励起される液状化,及び津波による複合作用を受けるライフラインの物理的・機能的被害を作用形態に区分して高精度に示し得る被害関数を体系化できつつある.このような研究の枠組みにおいて,研究代表者の庄司は,上記プロトタイプモデルの高精度化と検証,及び,電力・道路網・上水道・下水道の被害並びに応急復旧過程に係るデータ収集・分析を引き続き実施した.研究分担者の永田と丸山は,上水道・下水道・道路網・都市ガスの被害並びに応急復旧過程に係るデータ収集・分析を行った.研究分担者の八木と連携研究者の藤井は東北地方太平洋沖地震津波の震源過程及び津波波源に関するモデルの精度検証を行った.研究分担者の村尾は対象とするライフライン全般の被害の受容に係るデータの収集・分析を行った.平成26年度においては,1)平成25年度から引き続き,東日本大震災におけるライフライン被害の相互連関を考慮した「物理的・機能的被害推計モデル」の構成要素である地震津波被害関数のプロトタイプモデルを高精度化するとともに,2)ライフラインの応急復旧過程を記述するネットワークモデルを地震津波複合災害の場合に拡張するための数理ロジックを構築した.1)については,対象とするライフラインのシステム耐性に係わるパラメータが被害率や被害確率に与える感度を明らかにし,強震動・液状化及び津波作用のハザード指標(例えば,地表最大速度,加速度の繰り返し振幅,地盤ひずみ,水位,越流水深,流速など)の時空間の推計精度を高めることで地震津波被害関数を高精度化した.2)については,応急復旧過程を記述する時空間情報(例えば,復旧時間,復旧箇所など)と上記の地震津波被害関数を連結させることにより,応急復旧過程の遅延を連続的・統合的に評価可能な「応急復旧過程俯瞰モデル」の数理ロジックを明らかにし,ケースステディによる試算を実施した.以上の点に関しては,上水道・下水道並びに通信施設の埋設管路,道路交通インフラを構成する橋梁・盛土構造,及び,防潮堤施設のライフラインに対して,新規性及び有用性の高い一定レベル以上の学術的知見を得ることができた.

これより,強震動やそれによって励起される液状化,及び,津波の複合作用を受けるライフラインの物理的・機能的被害を作用形態に区分して高精度に評価可能な地震津波被害関数を介して,ライフラインの応急復旧過程を連続的・体系的に推計できるモデルが構築されつつある.平成27年度においては,1)各ライフラインに対する地震津波被害関数を「物理的・機能的被害推計モデル」に適用する数理ロジック(例えば,被害のスクリーニング・ロジック)を精査した上で,2)ライフラインシステムの応急復旧過程を記述するネットワークモデルに「物理的・機能的被害推計モデル」を接続させ,復旧時間や復旧箇所などの指標に基づき応急復旧過程を定量的に推計可能な「応急復旧過程俯瞰モデル」を構築した.併せて,3)南海トラフ地震津波などによる巨大地震津波のリスクが蓋然的に高いと考えられる地域を対象とした被害推計を実施した.研究代表者の庄司は,「物理的・機能的被害推計モデル」の数理ロジックを精査した上で「応急復旧過程俯瞰モデル」を構築するとともに,電力・道路網・上水道・下水道・通信の被害並びに応急復旧過程に係わるデータ収集・分析を実施した.研究分担者の永田と丸山は,上水道・下水道・道路網・都市ガスの被害並びに応急復旧過程に係わるデータ収集・分析を行なった.研究分担者の八木と連携研究者の藤井は被害推計の対象地域に係わる巨大地震津波の震源過程及び津波波源のモデル化を試みた.研究分担者の村尾は対象とするライフライン被害の受容に係わるデータの収集・分析を行なった.以上より,「物理的・機能的被害推計モデル」を構成する地震津波被害関数の高精度化されたバージョンや,「応急復旧過程俯瞰モデル」の構築あるいは適用過程で得られる,対象地域の被害推計結果については国内外の関連する学協会に論文発表することで第一線の学術的成果を発信するとともに,ライフラインの管理運営を担う事業主体や自治体等の地震津波防災対策の効率化に役立つ情報提供を行なった.本研究では、ライフラインシステムの中でも電力、都市ガス、上水道・下水道、道路網、通信に焦点をあて、東日本大震災のような地震と津波の作用が複合化する「地震津波複合災害」を対象とした上で、ライフラインシステムの物理的及び機能的被害と復旧支障の相互連関を精度よく表現する数理モデルを構築し、被害を受けた後の応急復旧過程の問題構造を定量的に明らかにした。強震動・液状化・津波による複合作用を受け,対象とするライフラインに甚大な物理的・機能的被害が生じた地域の被害データに対する分析が着実に進捗するとともに,「物理的・機能的被害推計モデル」の構成要素となる地震津波被害関数のプロトタイプモデルを高精度化し,これらを「応急復旧過程俯瞰モデル」に接続させるための数理ロジックを明らかにすることができたため.27年度が最終年度であるため、記入しない。ライフライン地震津波工学1)各ライフライン地震津波被害関数を「物理的・機能的被害推計モデル」に適用する枠組みの数理ロジックを修正・再精査した上で,2)ライフラインの応急復旧過程を記述するネットワークモデルに「物理的・機能的被害推計モデル」を接続させ,応急復旧過程(例えば,復旧時間,復旧箇所など)を定量的に推計可能な「応急復旧過程俯瞰モデル」に統合化し,3)巨大地震津波のリスクが蓋然的に高いと考えられる地域を対象とした被害推計を実施する.強震動,液状化,及び津波による複合作用を受け,対象とするライフラインに甚大な物理的・機能的被害が生じた地域の被害データを着実に得ることができ,本研究において開発を意図している「物理的・機能的被害推計モデル」の要素となる,経験的な地震津波被害関数のプロトタイプモデルを構築することができたため.強震動,液状化,及び津波による複合作用を受け,対象とするライフラインに甚大な物理的・機能的被害が生じた空間領域の被害データに対する精査が着実に進捗し,本研究において開発を意図している「物理的・機能的被害推計モデル」の要素となる,地震津波被害関数のプロトタイプモデルの高精度化をはかることができたため.27年度が最終年度であるため、記入しない。
HLA-A24陽性肺癌ペプチドワクチンの開発:ペプチドによる末梢リンパ球からのCTLの誘導

1。HLA-A2402遺伝子を、RT-PCRで増幅しTAクローニング法で発現ベクターに組み込み、遺伝子配列を確認した。さらに、細胞で発現させて、HLA-A24特異的モノクローナル抗体により確認した。3。HLA-A24陽性肺癌患者末梢血より単核球を分離し、IL-4およびGM-CFS処理で樹状細胞を誘導した。この細胞にペプチド抗原をパルスした後、一週間おきに3回刺激し、増殖した細胞の特異性をIFNγ産生を指標に測定した。標的細胞は、HLA-A24陰性の細胞株を対照として、HLA-A24陽性細胞株(KE4)、およびHLA-A2402を遺伝子導入した細胞株(VA13,C1R-A2402)にペプチドを感作した細胞を用いた。HLA-A24肺癌患者を含む癌患者4例および健常人8例の末梢血単核球を用いて上記の方法で誘導したCTLの特異性を調べたところ、全ての末梢血からHLA-A24拘束性にKE4を認識するT細胞が誘導された。4。以上の結果等を踏まえて、SART-1抗原ペプチドに関しては、倫理委員会で承認された食道癌患者で、さらに、肺癌患者ではサイクロフィリンB(Gomi et al.,J.Immunol.,163,4994-5004,1999)の抗原ペプチドにおける第一相臨床試験を開始した。現在のところ、有害事象は認められず、半数以上の例で、腫瘍特異的CTL前駆細胞の出現頻度が上昇した。さらに、SART-1_<259>陽性の肺癌患者に対しても次年度以降開始する予定である。1) HLA-A2402遺伝子を、RT一PCRで増幅した後、TAクローニング法にて発現ベクターに組み込み、遺伝子配列を確認した。さらに、細胞にトランスフェクトして、特異抗体を用いたフローサイトメトリー法で蛋白レベルでの発現を確認した。3) HLA-A24陽性肺癌患者末梢血より単核球を分離し、IL-4およびGM-CSF処理で樹状細胞を誘導した。この細胞を合成ペプチドで感作し抗原提示細胞とした。この細胞で末梢血単核球を一週間おきに三回刺激し、増殖した細胞の特異性をIFNγ産生を指標に測定した。標的細胞としては、HLA-A24陰性の細胞株を対照として、HLA-A24陽性細胞株(KE4)、およびHLA-A2402をトランスフェクトしたVA13細胞株に抗原ペプチドを感作した細胞を用いた。HLA-A24の肺癌患者を含む癌患者4例、および健常人8例の末梢血単核球を用いて、上記の方法で誘導したCTLの特異性を調べたところ、全ての末梢血からHLA-A24拘束性にKE4を認識するCTLが誘導された。健常人末梢血単核球からもin vitroでSARTl特異的CTLが高頻度に誘導された理由として、(i)本ペブチドは癌細胞に検出されるSART1_<259>だけでなく、増殖性の正常細胞にも発現するSART1_<800>にも存在し、これが何らかの機序でT細胞に提示される、(ii)酵母の膜蛋白にHLA-A24に結合するモチーフを持ち、抗原ペブチドと高いホモロジーを有するペプチドが存在し、これを認識するCTLが癌細胞のSARTlペプチド抗原を認識する可能性などが考えられた。今後、これらの機序をより詳細に検討する予定である。1。3。4。
内視鏡医療診断のためのポリープ自動識別と形状・大きさの復元システム

本研究では内視鏡画像からポリープの形状と絶対的な大きさを推定するため,内視鏡を前後移動させて撮影した2枚の画像を用いる方法を検討した.内視鏡の移動量を既知とした場合には,一様な拡散反射画像に変換後の画像に対して反射係数を推定することでポリープの大きさ推定を可能にした.拡散反射画像の見直しも行うとともに,1点光源,2点光源モデルの評価を行い,2点光源での形状復元に対する高精度化を示した.ポリープの自動識別ではエッジ情報と色情報を用いて尤度マップを算出,尤度の高いポリープ候補領域に対してHOG特徴量を用いて機械学習による分類を行い,ポリープを検出する方法の他,良性・悪性を識別する提案を行った.本研究では,通常の医療用内視鏡を想定し,点光源照明,透視投影の仮定で得られる内視鏡画像から対象の凹凸形状を復元する際に,その相対的な形状を復元する手法をもとに絶対的な大きさを推定するための方法を検討し,形状復元を行う方法について研究を行った.ポリープの大きさを求めるためには通常1枚の画像では困難であり,これまで反射係数を経験的に与えることで大きさ推定をしていた.ポリープの反射係数を出来るだけ自動的に求めることを目的として,手術用の縫合糸を入れた画像をもとに,糸の幅は既知として3次元的に形状を求めながら,糸の場所で相応しい位置を最適化で参照することで,反射係数の推定を行い,ポリープの大きさを求める手法を研究した.1枚の画像でも特徴点として相応しい点を抽出することである程度の大きさ推定が出来ることを明らかにした.別途,1光源さらにはカメラと光源を前後させった近接2光源問題への拡張を考え,内視鏡を前後移動させて撮影した2枚の画像から絶対的な大きさを復元する手法を研究した.ここでは,鏡面反射を含む内視鏡画像をもとにLambert化画像を生成する手法を前処理として加え,輝度極大点において内視鏡の移動量と復元される距離の移動量との誤差を最小にする反射係数を推定する方法を開発した.点光源照明,透視投影のもとで1枚の画像から形状復元する方法としてハミルトンヤコビ方程式を解くVBWモデルがあるが,復元されるスケールが相対スケールであるため,ニューラルネット学習を用いて正しい傾き修正を行い,さらに距離分布の修正を行う方法について研究を行った.通常内視鏡画像からポリープの大きさとともに,その三次元形状を復元するために,本研究では,内視鏡を奥行方向にずらした2枚の画像から輝度極大点を検出し,それぞれの点で得られる奥行推定量の差が内視鏡のずらし量に一致するときの反射係数を最適化により求める方法を検討した.まず,内視鏡の奥行き方向のずらし量を既知とした場合に,反射係数の値を変数として変えながらずらし量と輝度極大点での奥行きの差を計算することで,その差が最小になるときの反射係数を求めることとした.反射係数が決まれば各点での距離分布を求めるために傾きパラメータを求めるが,これについては1枚で相対的な形状を復元するVBWモデルを用いて初期状態を求め,その結果から得られる傾きパラメータを,形状既知の球を用いてニューラルネットで正しい傾きパラメータにするように学習をすることで,修正する方法を研究し,推定された反射係数と修正した傾きパラメータを用いて距離分布の精度を向上させる方法を開発した.さらに内視鏡の移動量を未知とした場合への拡張として縫合糸をもとに2枚の画像における対応点を決定し,それらから内視鏡移動量の推定,さらに反射係数の推定を行い,ポリープの大きさを推定する形状復元手法を提案した.さらに血管抽出情報からいくつかの特徴点を抽出し,ポリープの大きさを復元するための方法を研究した.ポリープの検出に関する方法としてはDSCエッジフィルタと楕円フィッティング,双曲線フィッティングにより得られる特徴量をもとにSVMで分類するための研究をHSVを用いることで血管情報をポリープのエッジと誤って認識してしまう問題を改善する方法ほか,エッジ情報と色情報を用いた尤度マップによりポリープ候補領域の精度を高めることでランダムフォレストによるポリープ識別を行う方法を研究した.当初の目的に基づいて検討を行いながら研究を遂行しており,得られた知見や結果に関する研究発表を行った.内視鏡画像の観測系としてこれまでの1点光源モデルの観測システムから実際の内視鏡に近い2点光源照明のもとでの形状復元と大きさ推定を行う方法を新たに検討した.2点光源照明の仮定で完全拡散反射の球に対して光源位置を推定後,傾き分布を求める際に奥行き分布(高さ分布)の差分を用いるが,その際に生じる誤差を吸収するため球画像を用いてニューラルネットワーク(NN)で学習し,内視鏡画像に適用してNNを用いて修正しZの初期値を更新,傾きを最適化,高さを計算という処理を繰り返して形状精度を上げる方法を提案した.さらに1枚の縫合糸の情報から平坦になっている箇所を探索.幾何学的に反射係数を推定することでポリープの形状と大きさ推定を行う方法を提案した.内視鏡画像のLambert化においてはHSV変換してHのヒストグラムの中で最頻値となるなるビンをメインクラス,メインクラスに一番近いビンをサブクラスとしてサブクラスをVの比を用いることでメインクラスに吸収させる方法を開発し,従来より高速に安定したLambert化画像を得ることを可能にした.

また,エッジ情報と色情報を用いてポリープの確率の高い箇所の値が大きくなるようにマップを作成することでポリープ候補領域を検出し,検出した領域からHOG特徴量を抽出,ランダムフォレストによる分類を行うことでポリープを検出する手法や.SVMを用いて内視鏡のシーン分類を行う方法を提案するとともに通常内視鏡画像から余分な検出情報を排除して血管を自動的に精度良く抽出する方法を開発した.ポリープの検出のほか通常内視鏡画像,染色液画像,NBI画像の3種類の画像用いてポリープ画像のCNN特徴量をもとに良性,悪性を判定するための方法も検討・提案した.本研究では内視鏡画像からポリープの形状と絶対的な大きさを推定するため,内視鏡を前後移動させて撮影した2枚の画像を用いる方法を検討した.内視鏡の移動量を既知とした場合には,一様な拡散反射画像に変換後の画像に対して反射係数を推定することでポリープの大きさ推定を可能にした.拡散反射画像の見直しも行うとともに,1点光源,2点光源モデルの評価を行い,2点光源での形状復元に対する高精度化を示した.ポリープの自動識別ではエッジ情報と色情報を用いて尤度マップを算出,尤度の高いポリープ候補領域に対してHOG特徴量を用いて機械学習による分類を行い,ポリープを検出する方法の他,良性・悪性を識別する提案を行った.当初の目的に基づいて理論的な検討を行いながら研究を遂行しており、得られた知見や結果に関する研究発表を行った。形状復元の評価としてはより様々な内視鏡画像への適用すること,血管候補を手がかりとした場合のポリープの大きさ復元手法の研究,2フレームからの内視鏡奥行移動量の推定のみならず,動画像からのカメラの運動と距離分布を同時に復元するともに,ポリープの形状と大きさを精度よく復元するための方法の研究が課題である.ポリープ識別の高精度化を目的として学習用画像データセットを自動的に生成する方法他,実証実験にもっていくための研究を進める.コンピュータビジョン開発した手法をもとに,様々な内視鏡画像に適用したときの問題点の整理と改良,さらに動画像処理に対応するために,動画像における対応点探索とともに3次元情報の構築をして拡張するための研究がある。形状復元に加えてポリープ識別の高精度化に関する研究,評価を行う.理論的な方法論に加えて、今度の推進方策としては、ポリープの識別を行うための学習用画像データセット自動生成の研究他,実証実験にもっていくための研究を進める.パソコンの購入にあたり,予定していた経費よりも値引きとなったことと,平成27年度の研究が効率よく進んだ結果,若干額を次年度に繰越することとなった.基本的には研究計画に従って使用をしたが,次年度研究に継続するため,今年度の用品計画の一部を残して次年度の備品計画に繰り越すこととしたため,次年度使用額として残すことになった.次年度の研究において学会発表等で計画的に使用する予定である.今後の研究の推進方策とともに,研究打ち合わせをはじめ,これまでの研究成果をもとに成果発表を行う.次年度の研究費の使用においては,物品ほか,旅費,参加費,研究謝金を中心に使用する予定である.
若年性骨髄単球性白血病に対する新規分子標的療法の開発

若年性骨髄単球性白血病(JMML)は治療抵抗性の症例が多く、新規薬剤の開発が望まれる。92例のJMML患者検体を用いて次世代シークエンサーによる解析を行い、SETBP1およびJAK3変異が新規原因遺伝子であることを明らかにした。また、これらの遺伝子変異を有する症例は有意に生命予後が不良であることが判明した(Sakaguchi H, et al., Nature Genetics 2013)。また、患者検体を用いた検討で、チロシンキナーゼ阻害薬であるDasatinibやMEK阻害剤であるMEK162が濃度依存性に造血コロニー形成抑制、細胞増殖抑制、アポトーシス細胞数を増加させることを確認した。13人の若年型骨髄単球性白血病(JMML)患者の白血病細胞と正常細胞からDNAを抽出して、全エクソンシークエンスをおこない、発症に関わる遺伝子変異を探索した。その結果、11例に既知のRAS伝達経路に位置するPTPN11、NF1、KRAS、NRAS、c-CBL変異が同定された。さらに、既知の遺伝子変異の他に、新規遺伝子変異として、SETBP1、JAK3、SH3BP1変異が発見された。既知の遺伝子に、新規遺伝子を加え10遺伝子の全エクソンについて92人のJMML患者の白血病細胞由来のDNAからアンプリコンを作成し、ディープシークエンスをおこなった。RAS伝達経路以外に位置するSEPBP1、JAK3等の2次的変異が23%の症例に認められ、これらの2次変異は従来予後不良とされているPTPN11/NF1変異がみられた46例では、18例(39%)に検出されたのに対し、残りの46例では、5例(11%)に検出されたのみで予後との関連が推測された。実際、2次変異がみられた群の全生存率は75%で、2次変異がみられない群の30%と比較して有意に良好であった(p=0.01)。今回新規のがん関連遺伝子として発見されたSETBP1は、一部の成人骨髄異形性症候群や骨髄増殖性疾患からも発見され、予後不良因子として報告されている。同じく、92例を対象に10遺伝子についてメチル化の有無を検討したところ、CDKN2A、BMP4、CALCA、H19、IGF2遺伝子に高メチル化を認めた。これらの5つの遺伝子のメチル化がひとつもない群は、ひとつでもメチル化を示す群と比較して、有意に無移植生存率が低かった(p=0.009)。さらに、多変量解析でも、メチル化の有無は、PTPN11/NFI変異や、染色体異常の有無と独立して、有意な予後不良因子であった。現在JMMLに対しては造血幹細胞移植が唯一の有効な治療法とされるが、新規薬剤の開発も試みられている。RAS経路の恒常的活性化がみられることからFarnesyl transferase阻害剤であるR115777の臨床試験が米国では開始されている。今回、チロシンキナーゼ阻害薬であるDasatinibや細胞増殖シグナル伝達経路(ERK MAPキナーゼ経路)に存在するリン酸化酵素MEKの阻害剤であるMEK162についてJMMLの治療薬となる可能性について検討した。PTPN11、KRAS、CBL変異が判明しているJMML患者(5例)の骨髄血を用いて、GM-CSF(10ng/ml)添加、無添加の条件でコロニー形成能を検討した。この系に各種濃度のDsatinibやMEK162を添加した。造血コロニー形成はGM-CSFの添加、無添加群ともにDsatinibやMEK162の濃度依存性に抑制された。また、10日間液体培養した後に、フローサイトメトリーを用いたBrdU、SubG1法で増殖細胞やアポトーシスをおこした細胞の比率を定量的に検討した。造血コロニーと同様に、DasatinibやMEK162は濃度依存性に増殖細胞を抑制し、アポトーシスをおこした細胞数は増加した。予後良好とされるRAS変異患者由来の骨髄血は、治療抵抗性とされるPTPN11&SETBP1変異患者由来骨髄血と比較して、有意に増殖が抑制された。フローサイトメトリーをもちいたBrdU、SubG1法は簡便で、定量性にも優れ、JMMLに対する分子標的薬のスクリーニング法として有用である。RAS経路の恒常的活性化がみられることから、Farnesyl transferase阻害剤であるR115777の臨床試験が行われた。

今回、チロシンキナーゼ阻害薬であるDasatinibや細胞増殖シグナル伝達経路(ERK MAPキナーゼ経路)に存在するリン酸化酵素MEKの阻害剤であるMEK162についてJMMLの治療薬となる可能性について検討した。PTPN11、KRAS、CBL変異が判明しているJMML患者(5例)の骨髄血を用いて、GM-CSF(10ng/mL)添加・無添加の条件でコロニー形成能を検討した。この系に各種濃度のDasatinibやMEK162を添加した。造血コロニー形成はGM-CSFの添加・無添加群ともにDasatinibやMEK162の濃度依存性に抑制された。また、10日間液体培養したのちに、フローサイトメトリを用いたBrdU、SubG1法で増殖細胞やアポトーシスを起こした細胞の比率を定量的に検討した。造血コロニーと同様に、DasatainibやMEK162は濃度依存性に細胞増殖を抑制し、アポトーシスを起こした細胞数を増加させた。予後良好とされるRAS変異患者由来の骨髄血は、治療抵抗性とされるPTPN11+SETBP1変異患者由来骨髄血と比較して、有意に増殖が抑制された。フローサイトメトリを用いたBrdU、SubG1法は簡便で、定量性にも優れ、JMMLに対する分子標的薬のスクリーニング法として有用である。26年度が最終年度であるため、記入しない。医歯薬学26年度が最終年度であるため、記入しない。平成24、25年度に予定されていた92例の若年骨髄単球性白血病患者の1)遺伝子プロモーター領域におけるメチル化プロファイルの検討2)次世代シークエンサーによる新規原因遺伝子の探索はほぼ終了した。1)については、高メチル化をしめす遺伝子の同定、予後に与える影響、2)についても、RASシグナル経路以外にあらたに2次変異として新規がん関連遺伝子であるSETBP1を発見し、現在、論文投稿中である。JMMLの発症に関わる遺伝子を、92例を対象に次世代シークエンサーを用いて検討し、新規がん遺伝子であるSETBP1を発見した。SETBP1は予後に関連し、分子標的となりうると考えられた(Nature Genetics 2013)。また、遺伝子プロモーター領域におけるメチル化プロファイルを検討し、高メチル化群が予後不良であることを確認した。本症に対する脱メチル化薬による治療の可能性が開かれた。若年型骨髄単球性白血病の治療に有用な候補薬剤のスクリーニングを予定していたが、この度、有力な製薬企業から、本症に対するMAPh経路を標的にした分子標的薬の臨床開発を打診され、今後はこの薬剤を中心に細胞、動物レベルでの検討を予定している。エクソーム解析をおこなっても、原因遺伝子がみつからない症例が、JMML全体の10%にみられることから、これらの症例を対象に全ゲノム解析をおこない新規原因遺伝子の発見に努める。我々が発見したSETBP1に対する分子標的薬のスクリーニングをおこない、候補薬剤を発見する。遺伝子シークエンス、PCR用の試薬に80万円、細胞培養に必要な試薬として40万円、リン酸化蛋白解析キットに50万円、各種抗体に30万円、免疫不全マウスの購入に70万円、PCR解析装置の購入に100万円を予定している。ノックアウトマウスを購入予定だったが、作成が年度内に間に合わなかったため。ノックアウトマウスのデザイン・初回の受精卵へのインジェクションに50万、追加のインジェクションに25万、微生物検査に10万、輸送費に5万。