hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ステロイド依存性リンパ球アポトーシスの分子機序と疾患病態における意義に関する研究

1.グルココルチコイド(GC)刺激による胸腺細胞のアポトーシスの分子機序に係わるTDAG8遺伝子を強制発現させたトランスジェニックマウス(TG)を作成した。2.GC刺激により胸腺細胞のアポトーシスは、TGマウスの対照群に比して著名に増加し、その主体はCD4^+CD8^+胸腺細胞であった。アポトーシスは、胸腺皮質で著明であった。3.TGと対照群において、これまでアポトーシスに関与することが知られている遺伝子の発現をRNAse Protection Assay法にて検討した。その結果、FasL,FADD,TRAIL,TNF-Rp55,TRADDの遺伝子発現に差は認められなかった。従って、従来のアポトーシスとは、異なる機序でTDAG8は、アポトーシスに関与していることが示唆された。4.TGでは対照群に比して、アポトーシス時に、発現変化する遺伝子をDNAマイクロアレイ法にて検討した。c-MybとDok-2の発現が著名に減少していた。TGではc-Mybが減少することにより、bc1-2の発現が減少し、GCによるアポトーシスが亢進すると考えられた。5.TGでは対照群に比し、カスペース3,8,及び4の活性が亢進していた。グルココルチコイド(GC)刺激による胸腺細胞アポトーシスの分子機序に係わるDIG-1遺伝子を強制発現させたトランスジェニックマウス(TG)においては、対照群に比して無刺激にても胸腺が萎縮していた。GCをin vivo投与することにより、CD4'CD8'陽性胸腺細胞(DP胸腺細胞)が、対照群に比して有意に減少した。しかし、抗CD3抗体投与あるいは放射線照射による胸腺細胞のアポトーシスは対照群と明らかな差は認められず、DIG-1遺伝子はステロイド依存性アポトーシスに特異的に関与する分子であることが判明した。その作用機序を明らかにする目的で、これまでアポトーシスに関与することが判明している分子群につき検討した。TGと対照マウスにおいてFas,FasL,FADD,TRAIL,TNF-Rp55,TRADD等の遺伝子発現に有意差は認められなかった。Bcl-2及びBcl-xLの蛋白発現にも差は認められなかった。DIG-1 TGでは、GC刺激により対照群に比して有意にカスペース3,8,及び9の活性が上昇しており、胸腺細胞における活性型カスペース3と9蛋白も上昇していることが判明した。すなわちDIG-1は、GC刺激よりカスペース3,8,9の活性化を促進し、胸腺細胞のアポトーシスを抑制していることが明らかとなった。TNFファミリーやBcl-2ファミリーとは異なるアポトーシス制御機構が存在することを明らかにした。1.グルココルチコイド(GC)刺激による胸腺細疱のアポトーシスに先行して、発現誘導されるDIG-1遺伝子を未熟Tリンパ球に強制発現させたトランスジェニックマウス(TG)を作成した。2.上記TGマウスでは、胸腺細胞分化に影響が認められた。すなちCD8陽性びCD4陰性CD8陰性胸腺細胞(DN)の増加が認められた。DN細胞の中でCD25^<mid>CD44^<high>の分画が特に増加していた。3.ステロイドによりアポトーシスを示す胸腺細胞数は増加したが、放射線及びTCR刺激によるアポトーシスは増加しなかった。DIG-1遺伝子はステロイドによるアポトーシスに特異性の高い事が証明された。4.TGをステロイドで刺激すると、対照群に比して著明にカスペース3,8,9の活性上昇が認められた。DIG-1の下流にカスペースが存在することが示唆された。5.TGと対象群のマウスにステロイドを投与し、胸腺細胞における遺伝子発現プロファイリングをDNAチップを用いて検討した。TGでは対照群に比較して、c-MybとDok-2の発現が著名に減少していた。これはDIG-1によるアポトーシス経路の下流にc-MybとDok-2が存在する事を示唆する所見である。6.TGではc-Mybが減少することによりbcl-2の発現が減少し、このためにステロイードによるアポトーシスが亢進すると考えられた。

1.グルココルチコイド(GC)刺激による胸腺綱胞のアポトーシスに先行して発現誘導されるTDAG8の機能につき検討した。2.胸腺細胞は、放射線照射、GC刺激、抗CD3抗CD28刺激により、アポトーシスにおちいる。TDAG8は、GC刺激によるアポトーシスに先行して強発現するが、放射線照射によるアポトーシスでは、発現しない。一方、抗CD3抗CD28刺激においては、GC刺激に比して弱いながら発現が認められた。したがって、TDAG8は、GC刺激によって、誘導されるアポトーシスに特異的に関与する分子であることが示唆された。3.TDAG8遺伝子導入マウスを樹立した。無刺激の状態でも、胸腺は萎縮しており、CD4^+抗CD8^+胸腺細胞の著名な減少を認めた。遺伝子導入マウスでは、GCのin vivo投与により、胸腺の皮質細胞のアポトーシスが著明に増強した。4.TDAG8遺伝子導入マウスでは、GC投与により、カスペース3,8,及び9の活性化が著名に亢進した。
霊長類の老齢期の生活史とその社会生物学的意義

1.人為的餌付けのほとんど行われていない西アフリカの野生チンパンジーにおいて、35超歳の雌の活動性は必ずしも低くない。しかし、日常的に離合集散し単独行動の多いチンパンジー集団において、老齢雌は単独で広範囲を移動することが少ない。活動力低下を集団(パーティ)への高い依存度によって補っている可能性がある。年齢別出産率は913歳の初産から約10年で最高に達し、その後僅かに低下する。40歳を過ぎるまで出産を続けるが、40超歳での出産では初期死亡が多い。しかし少なくともこの集団では、繁殖年齢はこれまで考えられていたよりも長いことが分かった。2.雄は40歳を越えて2,3年してから下位の若い雄と優劣順位が入れ替わる。この集団では東アフリカの集団と異なり、若い雄は成熟前にほとんど消失し、優位雄が30歳代末頃に成熟した雄だけが集団に居残って集団を継承する、ゴリラ型であることが示唆された。雌雄ともに約40歳が高水準活動の限界であるが、日常的には変化は見られないことが分かった。3.ニホンザルも餌付け集団で観察されるかぎり、20超歳の雌の活動性は必ずしも低くはなく、孤立的で社会性が低いとは限らない。老齢雌は自ら他個体と社会関係を持とうとしなくても、多数の他個体(主として雌)が老齢雌と関係を持とうと接近したり毛づくろをする(与える)ことが多い。年齢別出産率は15歳を越えてもあまり低下せず、22,3歳を越えてから急速に低下する。すなわち、両種とも老化が行動や出産に表面化するのは、限界点を越えてから急速に起こることが示唆された。課題の性質上、長年月にわたり個体識別のもとに継続研究の行われている個体群が対象になる。このためサンプル数が少なく、一般性を論じる資料は多くないが、次のような示唆が得られた。1.人為的餌付けのほとんど行われていない野生チンパンジーにおいて、後繁殖年齢雌のアクティビティは必ずしも低くない。しかし、日常的に離合集散し、単独行動の多いチンパンジーの集団において、このような雌は単独で広範囲を移動することが少ない。個体の行動力低下を集団(パーティ)への高い依存度によって補っていると言えるかもしれない。2.餌付け集団の人工餌場で観察されるかぎり、後繁殖年齢雌のアクティビィは必ずしも低くはない。たとえ低くても、孤立性が高く社会性が低いとは限らない。後者については、自ら他個体と社会関係を持とうとしなくても多数の他個体(主として雌)が老齢雌と関係を持とうと接近したりグル-ミングをする(与える)ことが示唆された。3.野生パタスザルは高繁殖短寿命で、後繁殖年齢雌は発見できなかった。しかしその中でも、高年齢雌には成熟した若い(自分の)娘と優劣順位が逆転する例が観察された。微妙な差ではあってもアクティビティの低下が原因していることが示唆された。今後は積極的な(与える)社会性と受動的な(受ける)社会性を分けて検討する必要、また、老齢雌にとって近親者の多少も社会的環境として考慮する必要が示唆された。なお、人口学的資料の検討は現在進行中である。長年月にわたり個体識別のもとに継続研究の行われているチンパンジー(ギニア・ボッソウ)とニホンザル(高崎山)の各1個体群を対象に人口学的パラメータの変化と社会行動の変化を調べた。1.人為的餌付けのほとんど行われていない野生チンパンジーにおいて、35超歳の雌の活動性は必ずしも低くない。

活動力低下を集団(パーティ)への高い依存度によって補っている可能性がある。年齢別出産率は1013歳の初産から約10年で最高に達し、その後僅かに低下する。40歳を過ぎるまで出産を続けるが、40超歳での出産では初期死亡が多い。しかし少なくともこの集団では、繁殖年齢はこれまで考えられていたよりも長いことが分かった。2.雄は40歳を越えて2,3年してから下位の若い雄と順位が入れ替わった。この集団では東アフリカの集団と異なり、若い雄は成熟前にほとんど消失し、優位雄が30歳代末頃に成熟した雄だけが集団に居残って集団を継承する、ゴリラ型であることが示唆された。雌雄ともに約40歳が高活動の限界であることを示した。3.ニホンザル餌付け集団で観察されるかぎり、20超歳の雌の活動性は必ずしも低くはなく、孤立的で社会性が低いとは限らない。老歳雌は自ら他個体と社会関係を持とうとしなくても、多数の他個体(主として雌)が老歳雌と関係を持とうと接近したり毛づくろをする(与える)ことが多い。年齢別出産率は15歳を越えてもあまり低下せず、22,3歳を越えてから急速に低下する。すなわち、両種とも老化が行動や出産に表面化するのは、限界点を越えてから急速に起こることが示唆された。今後は統計的検定にたえる量の資料を積む必要がある。
礫のネットワーク解析に基づく沿岸混合粒径土砂の移動機構の解明

現在日本の様々な海岸で砂浜が減少し,大きな社会問題となっている.この研究は,変動帯に位置し,急峻な河川から土砂供給を受けるわが国の海浜環境の特徴である礫サイズの粒子を含む混合粒径場における土砂移動機構を,礫の接触ネットワークという新しい視点から解析し,砂礫共存場での土砂輸送予測を格段に高精度化することを目的とし実施した.まず,任意波形振動流装置において,中央粒径7.3mmの礫と0.27mmの砂の混合比を変え,流速非対称振動流による漂砂量の測定を行った.その結果,礫の体積混合率が約60%を超えると,漂砂量が大きく減少することが明らかになり,砂礫混合土砂の漂砂量に関して,臨界混合比が存在することが示された.次に,臨界混合比付近の混合比にある砂礫の3次元的な粒子間の接触関係を調べるため,個別要素法により混合粒径粒子の充填を行なった.その結果,礫の体積率が臨界混合比に達すると,砂礫混合層内で礫-礫間の配位数が急激に上昇し,礫同士の接触ネットワークが発達する一種の相転移が生じることが明らかとなった.このような混合土砂の粒子間接触ネットワークの相転移に起因する土砂移動量の変化についてはこれまでほとんど議論されておらず,本研究で,このような効果の存在がはじめて定量的に明らかにされたと言える.また,接触ネットワークの相転移の効果を漂砂モデルに組み込むことにより,漂砂量の予測精度が格段に向上することが確認された.本研究では,混合する砂礫の粒径を固定して実験を行っていたため,その適用性には限界がある.しかし,本研究で明らかにした接触ネットワークの効果に着目したより広範な水路実験データを積み重ねることにより,一般の二粒径混合土砂,さらには多粒径混合土砂にモデルを拡張し,より適用性の広い混合砂礫土砂の輸送量に関する予測法の確立が見込まれる.現在日本の様々な海岸で砂浜が減少し,大きな社会問題となっている.この研究は,変動帯に位置し,急峻な河川から土砂供給を受けるわが国の海浜環境の特徴である礫サイズの粒子を含む混合粒径場における土砂移動機構を,礫の接触ネットワークという新しい視点から解析し,砂礫共存場での土砂輸送予測を格段に高精度化することを目的とし実施した.まず,任意波形振動流装置において,中央粒径7.3mmの礫と0.27mmの砂の混合比を変え,流速非対称振動流による漂砂量の測定を行った.その結果,礫の体積混合率が約60%を超えると,漂砂量が大きく減少することが明らかになり,砂礫混合土砂の漂砂量に関して,臨界混合比が存在することが示された.次に,臨界混合比付近の混合比にある砂礫の3次元的な粒子間の接触関係を調べるため,個別要素法により混合粒径粒子の充填を行なった.その結果,礫の体積率が臨界混合比に達すると,砂礫混合層内で礫-礫間の配位数が急激に上昇し,礫同士の接触ネットワークが発達する一種の相転移が生じることが明らかとなった.このような混合土砂の粒子間接触ネットワークの相転移に起因する土砂移動量の変化についてはこれまでほとんど議論されておらず,本研究で,このような効果の存在がはじめて定量的に明らかにされたと言える.また,接触ネットワークの相転移の効果を漂砂モデルに組み込むことにより,漂砂量の予測精度が格段に向上することが確認された.本研究では,混合する砂礫の粒径を固定して実験を行っていたため,その適用性には限界がある.しかし,本研究で明らかにした接触ネットワークの効果に着目したより広範な水路実験データを積み重ねることにより,一般の二粒径混合土砂,さらには多粒径混合土砂にモデルを拡張し,より適用性の広い混合砂礫土砂の輸送量に関する予測法の確立が見込まれる.現在日本中の海岸で砂浜が減少し、大きな社会問題となっている.この研究は、変動帯に位置し、急峻な河川から土砂供給を受けるわが国の海浜環境の特徴である礫サイズの粒子を含む混合粒径場における土砂移動機構の解明および土砂移動予測の高精度化を目的とし,礫の接触ネットワークに着目した実験と数値シミュレーションを行った.具体的に実験では,振動流水路に,砂(平均粒径0.27mm)と礫(平均粒径7.3mm)を様々な比率で混合し,土砂の移動特性を解析した.その結果,礫の表面被服率が95%を越えると,極端に土砂の移動が抑制されることが明らかになった,このような土砂の移動特性に対して臨界混合比が存在するメカニズムを解明するため,個別要素法シミュレーションによる混合粒径球のパッキング計算を行った.その結果,粒径比が5の大小粒子を用いた場合に,体積混合比約60%で大きな粒子同士の3次元的な接触ネットワークが無限大に発散し,配位数が増加することが明らかになった.この体積混合比は実験の表面被服率とほぼ対応することが確認され,土砂の移動抑制が大きな礫同士の接触ネットワークの発散および,配位数の増加と関係していることが明らかになった,本年度の研究の意義は,混合比による混合土砂の非線形応答の存在を明らかにしたことであり,さらに重要な点は,そのメカニズムを解明した点である,今後このメカニズムを元に,実験やモデル化を行うことで,定量的な土砂輸送の予測精度を向上させることができると考えられる.現在日本の様々な海岸で砂浜が減少し,大きな社会問題となっている.

この研究は,変動帯に位置し,急峻な河川から土砂供給を受けるわが国の海浜環境の特徴である礫サイズの粒子を含む混合粒径場における土砂移動機構を,礫の接触ネットワークという新しい視点から解析し,砂礫共存場での土砂輸送予測を格段に高精度化することを目的とし実施した.まず,任意波形振動流装置において,中央粒径7.3mmの礫と0.27mmの砂の混合比を変え,流速非対称振動流による漂砂量の測定を行った.その結果,礫の体積混合率が約60%を超えると,漂砂量が大きく減少することが明らかになり,砂礫混合土砂の漂砂量に関して,臨界混合比が存在することが示された.次に.臨界混合比付近の混合比にある砂礫の3次元的な粒子間の接触関係を調べるため,個別要素法により混合粒径粒子の充填を行なった.その結果,礫の体積率が臨界混合比に達すると,砂礫混合層内で礫-礫間の配位数が急激に上昇し,礫同士の接触ネットワークが発達する一種の相転移が生じることが明らかとなった.このような混合土砂の粒子間接触ネットワークの相転移に起因する土砂移動量の変化についてはこれまでほとんど議論されておらず,本研究で,このような効果の存在がはじめて定量的に明らかにされたと言える.また,接触ネットワークの相転移の効果を漂砂モデルに組み込むことにより,漂砂量の予測精度が格段に向上することが確認された.本研究では,混合する砂礫の粒径を固定して実験を行っていたため,その適用性には限界がある.しかし,本研究で明らかにした接触ネットワークの効果に着目したより広範な水路実験データを積み重ねることにより,一般の二粒径混合土砂,さらには多粒径混合土砂にモデルを拡張し,より適用性の広い混合砂礫土砂の輪送量に関する予測法の確立が見込まれる.
畜産・水産廃棄物からの機能性ペプチドの製造

畜産・水産廃棄物としてコラーゲンを多く含む骨、皮、魚鱗に着目し、それら廃棄物の機能性食品素材への変換を試みた。最初に、市販酵素剤の中からコラーゲンペプチド製造に適した酵素を選択した。選択したBacillus sp.由来のプロテアーゼを用いて製造したペプチドについて、抗ラジカル活性およびアンジオテンシンI変換酵素(ACE)阻害活性を測定した結果、すべてのペプチドが優れた活性を示した。その中で、脂質をほとんど含有しない魚鱗を材料として選択し、酵素的加水分解物(コラーゲンペプチド)を製造して詳細に検討した。0.6N HCl溶液に浸漬する脱灰処理の後に酵素分解したところ、92%の分解率が得られ、製造したペプチド混合物のACE活性を50%阻害する濃度(IC_<50>)は0.57mg/mlであった。高血圧ラットを用いたin vivo評価を行った結果、300mg/kg-body weightのペプチド添加飼料を経口投与した群において、コラーゲンペプチドを投与しなかった対照群と比較して、有意に(p<0.05)血圧上昇抑制作用が認められた。そこで、Sephadex LH-20 (Ammersham Pharmasia Biotech、ゲルろ過)、UNO Q-1(BioRad、陰イオン交換)、Superdex Peptide HR 10/30 (Ammersham Pharmasia Biotech、ゲルろ過)、Sephasil Peptide C18 column (Ammersham Pharmasia Biotech、逆相)の4段階のカラム精製を行い、血圧上昇抑制作用を示すペプチドの構造を調べた。一連の精製操作により、4種類の精製ペプチドを得ることができ、各ペプチドのアミノ酸配列はGly-Tyr, Val-Tyr, Gly-Phe, Val-Ile-Tyrであることがわかった。精製したペプチドのACE阻害活性は精製前のペプチドと比較して5倍から20倍に向上し、中でもVal-Ile-TyrおよびVal-TyrのIC_<50>値はそれぞれ7.5μMおよび16μMと、これまで報告されているACE阻害ペプチドと比較して遜色のない高い活性を有していた。また、ACE阻害ペプチドのカルボキシ末端には疎水性アミノ酸が多いことが知られているが、今回、魚鱗から製造し精製したコラーゲンペプチドのカルボキシ末端もまた、チロシン(Tyr)やフェニルアラニン(Phe)といった疎水性アミノ酸であった。Bacillus sp由来の市販酵素剤を使用し、基質濃度125g/l,酵素濃度6.25g/l, pH8.0,温度60°Cの条件で、実容積1lの反応槽を用いて酵素分解を行った。その結果、馬骨や魚骨では75-80%、豚皮や魚鱗では90-95%と高い分解率が得られた。得られた酵素分解物の平均重合度をTNBS法により測定した結果、馬骨、魚骨、豚皮、魚鱗のすべてが約3であったので、酵素的加水分解物はオリゴペプチドの混合物であると思われた。得られた酵素的加水分解物のアミノ酸組成を分析した結果、魚骨のグリシン含量がやや低かったが、豚皮および魚鱗の酵素分解物ともにグリシンが約33%であった。

また、ヒドロキシプロリンは7.6-7.9%、プロリンが11.4-12.6%含まれており、市販のコラーゲンと同様の組成を有していることが確認できた。酵素的加水分解物のin vitroの系における抗ラジカル活性および血圧上昇抑制作用を測定した結果、酵素分解物はIPOX_<50>(抗ラジカル活性の指標),IC_<50>(血圧上昇抑制作用の指標)ともに1mg/ml以下であり、抗ラジカル活性、血圧上昇抑制作用の両方ともに明らかな生理活性が認められた。Kim S.K.ら^<1)>は、牛皮ゼラチンを種々の酵素で加水分解して得られた分解物の中で最も活性が高かったもののIC_<50>は0.689mg/mlと報告している。測定条件が若干異なるので得られたIC_<50>値を直接比較することはできないが、製造した酵素分解物の血圧上昇抑制作用は、少なくとも彼等が報告したペプチドと同等の活性を有しているものと考えられた。オリゴペプチドであれば体への吸収性も良いと考えられることから、酵素分解物は食品素材等への利用が期待できた。今後は得られたペプチドのアミノ酸配列まで明らかにし、試作・評価を行う。畜産・水産廃棄物の中で、脂質をほとんど含有しない魚鱗を材料として選択し、平成13年度に選択した市販酵素剤を用いて酵素的加水分解物(コラーゲンペプチド)を製造した。0.6NHCl溶液に浸漬する脱灰処理の後に酵素分解したところ、92%の分解率が得られ、製造したペプチドのアンジオテンシンI変換酵素(ACE)の活性を50%阻害する濃度(IC_<50>)は0.57mg/mlであった。高血圧ラットを用いたin vivo評価を行った結果、300mg/kg-body weightを経口投与した群において、コラーゲンペプチドを投与しなかった対照群と比較して有意に(P<0.05)血圧上昇抑制作用が認められた。そこで、SephadexLH-20(Ammersham Pharmasia Biotech、ゲルろ過)、UNOQ-1(BioRad、陰イオン交換)、Superdex Peptide HR 10/30(Ammersham Pharmasia Biotech、ゲルろ過)、Sephasil Peptide C18 column (Ammersham Pharmasia Biotech、逆相)の4段階のカラム精製を行った。その結果、4種類の精製ペプチドを得ることができ、各ペプチドのアミノ酸配列はGly-Tyr, Val-Tyr, Gly-Phe, Val-Ile-Tyrであった。精製したペプチドのACE阻害活性は精製前のペプチドと比較して5倍から20倍に向上し、中でもVal-Ile-TyrおよびVal-TyrのIC_<50>値はそれぞれ7.5μMおよび16μMと、これまで報告されているACE阻害ペプチドと比較して遜色のない高い活性を有していた。また、ACE阻害ペプチドのカルボキシ末端には疎水性アミノ酸が多いことが知られているが、今回、魚鱗から製造し精製したコラーゲンペプチドのカルボキシ末端もまた、チロシン(Tyr)やフェニルアラニン(Phe)といった疎水性アミノ酸であった。
脱カルボニルを鍵反応とするカルボヘテロアトム化反応を用いた複素環合成法

炭素-ヘテロ原子結合のように、不活性なため反応に用いることが困難であった結合、あるいは官能基の活性化法を新たに開発して、これを触媒反応における素反応として組み込むことで複素環新規合成法の開発を検討した。検討の結果、入手容易なカルボニル化合物の遷移金属触媒への酸化的付加と脱カルボニルを鍵反応に用いる事により、炭素-ヘテロ原子結合の酸化的付加体等価体が反応系中で調製できる事に着目し、これを不飽和化合物のカルボヘテロアトム化反応に用いる事により、複素環化合物群の新規合成法の開発に成功した。有機合成化学を研究する科学者には、有用な物質を社会に供給する効率の高い反応方法論を開発することが望まれています。また、有機合成化学の飛躍的進歩を促す新概念や新現象の発見を含んだ反応の開発も重要です。遷移金属触媒を用いた環化付加反応は、複数の結合が一挙にでき、位置、立体の各選択性に関して高いレベルでの制御ができることから、極めて強力な環式化合物を合成するための手法です。遷移金属触媒を用いない従来法では不可能であった形式の環式化合物の合成が、遷移金属触媒を用いることで可能になることから、これまでにも精力的に開発されてきました。環式化合物の一つである複素環化合物は、天然有機化合物から合成医薬品、農薬などの多岐にわたる物質に内包される主要骨格です。その理由が複素環構造の多様性に由来するとも言えます。したがって、21世紀のライフサイエンスを支える観点からも複素環合成法はいくらあっても多すぎることはないと言えます。後周期遷移金属の一つであるニッケルは、様々な反応に対して高い触媒活性を示すことが古くから知られており、有機金属化学の歴史の初期の段階に詳細に検討され、数多くの興味深い反応が見いだされています。そこで、このニッケル触媒の高い反応活性を用いることにより、今までの手法では反応に用いることが困難であった結合、あるいは官能基の新しい活性化法を創製し、それを触媒反応に組み込むことにより、複素環化合物の新合成方法論を開発できるのではないかと考えました。実際に、ニッケル触媒を用いることで、合成入手容易な複素環化合物の一部分から分子を脱離させて、かわり異なる分子を挿入させる、分子置換型の環化付加反応により、新たに有用性の高い複素環化合物が簡便かつ選択的に合成できる、新合成反応の開発に成功しました。今後はこれまでに見出した新しい概念・手法に基づき、この研究課題を積極的に展開していこうと考えています。環化付加反応は、複数の結合が一挙にでき、位置、立体の各選択性に関して高いレベルでの制御ができることから、極めて強力な環式化合物を合成するための手法です。後周期遷移金属の一つであるニッケルは、有機金属化学の歴史の初期の段階に詳細に検討され、様々な反応に対して高い触媒活性を示すことが古くから知られており、数多くの興味深い反応が見いだされています。そこで、このニッケル触媒の高い反応活性を用いることにより、複素環化合物の新合成方法論を開発できるのではないかと考えました。実際に、ニッケル触媒を用いることで、合成入手容易な複素環化合物の一部分から分子を脱離させて、かわり異なる分子を挿入させる、分子置換型の環化付加反応により、新たに有用性の高い複素環化合物が簡便かつ選択的に合成できることを見出しました。
拡散テンソル画像法および神経造影法による神経線維描出の精度向上

本研究では神経線維の描出を明瞭化することを目的とし,拡散テンソル画像法(DTI)のパルスシーケンスにおける撮像パラメータ選択について検討を行い,上記撮像で一般的な撮像パラメータのb値を一定とした場合,パラメータの1つであるq値を小さくすることがDTIにより得られる拡散異方性を強調するのに適していることをシミュレーションおよびキャピラリプレートを用いたファントム実験より確認した.また,上記研究により作成したシミュレーションシステムを応用し,b値,q値共に大きく設定することが拡散強調機能的MRI(DW-fMRI)の精度向上に有効であることを確認した.さらに,線維交叉部における誤追跡,未追跡に対応した線維追跡手法として曲率偏差最小化探索法を開発した.本研究では神経線維の描出を明瞭化することを目的とし,拡散テンソル画像法(DTI)のパルスシーケンスにおける撮像パラメータ選択について検討を行い,上記撮像で一般的な撮像パラメータのb値を一定とした場合,パラメータの1つであるq値を小さくすることがDTIにより得られる拡散異方性を強調するのに適していることをシミュレーションおよびキャピラリプレートを用いたファントム実験より確認した.また,上記研究により作成したシミュレーションシステムを応用し,b値,q値共に大きく設定することが拡散強調機能的MRI(DW-fMRI)の精度向上に有効であることを確認した.さらに,線維交叉部における誤追跡,未追跡に対応した線維追跡手法として曲率偏差最小化探索法を開発した.近年,拡散テンソル画像法(DTI)や神経造影法(Neurography)による神経線維束の描出が盛んに行われている.DTIは主に脳神経の描出に用いられ,脳機能の解明や脳梗塞・脳腫瘍の描出に有効な手法である.また,線維追跡(tractography)によりDTIからの神経線維描出も盛んに研究されている.Neurographyは主に末梢神経系の描出に用いられており,神経系に生じた異常を画像として表示することができ,悪性腫瘍を描出しうる.上記手法の精度向上は,神経系疾患の診断支援になるばかりでなく,脳神経組織の機能的結合評価など様々な応用が期待されている.本年度は,DTI計測および線維追跡の精度向上を目指し,拡散テンソルの異方性を強調したDTI計測法および線維交叉部における誤追跡,未追跡を低減する新しい線維追跡手法の開発を行った.具体的には,DTI計測では,一般にb値をパラメータとして撮像を行うが,同一のb値に対しても複数の撮像パラメータセットを生成することが可能であり,本年度はこのパラメータセットを拡散異方性の1つであるfractional anisotropy (FA)を強調できるように選択する方法について検討した.このFAを強調したDTI計測を用いることにより,異方性を指標として実行される線維追跡の精度向上に寄与するものと考えられる.また,上記の撮像法を検討する際に構築したシミュレーションシステムにより,拡散強調画像法を用いた機能的MRI (fMRI)の撮像パラメータについても検討した.本手法は,現在一般的に用いられているBOLD方を用いたfMRIより時空間分解能の向上が可能である手法として期待されている.さらに,我々は独自の手法である類似度探索を用いた線維追跡法の開発した.本手法により線維交叉部における誤追跡,未追跡を低減することができ,線維追跡精度の向上を実現した.近年,拡散テンソル画像法(DTI)による神経線維束の描出が盛んに行われている.DTIは,脳機能の解明や脳梗塞・脳腫瘍の描出に有効な手法である.また,線維追跡(tractography)によりDTIからの神経線維描出も盛んに研究されている.上記手法の精度向上は,神経系疾患の診断支援になるばかりでなく,脳神経組織の機能的結合評価など様々な応用が期待されている.本年度は,DTI計測および線維追跡の精度向上を目指し,拡散テンソルの異方性を強調したDTI計測法および線維交叉部における誤追跡,未追跡を低減する新しい線維追跡手法の開発を行った.具体的には,DTI計測では一般にb値をパラメータとして撮像を行うが,同一b値に対しても複数の撮像パラメータセットを生成することが可能であり,本年度は拡散異方性の1つであるfractional anisotropy (FA)を強調できるようにこの撮像パラメータを選択する方法について検討した.その結果,q値を小さく,つまり拡散時間を長く設定することが有効であることをシミュレーションにより確認した.また,6100μmの毛細管を有するキャピラリプレートを用いた計測においても本手法の有効性を確認した.このFAを強調したDTI計測を用いることにより,異方性を指標として実行される線維追跡の精度向上に寄与するものと考えられる.また,上記の撮像法を検討する際に構築したシミュレーションシステムにより,拡散強調画像法を用いた機能的MRI(fMRI)の撮像パラメータについても検討を行った.本手法により,現在一般的に用いられているBOLD法を用いたfMRIより時空間分解能の向上が期待されている.さらに,我々は独自の手法である曲率偏差探索法を用いた線維追跡法の開発した.本手法により線維交叉部における誤追跡,未追跡を低減することができ,線維追跡精度の向上を実現した.
筋線維芽細胞の機能発現に焦点を当てた網膜変性疾患に対する創薬研究

加齢黄斑変性(AMD)に対する創薬が研究目的。独自に得た以下の知見が研究基盤である:1)新たなMRTF結合タンパク質が網膜変性疾患の要因となる網膜色素上皮細胞(RPE)の上皮間葉転換(EMT)惹起に極めて重要であること及びその分子機構を解明した、2)殺虫剤として用いられているbenzoylphenylurea (BPU)に属する化合物がRPEのEMT、筋線維芽細胞の機能発現、血管新生及びin vivoでの網膜下瘢痕組織形成を阻害する。本研究では複数のアプローチ(1MRTF機能阻害化合物の探索と2BPU類縁体をシードとした研究)から創薬研究を行い、根治的AMD治療薬創成を目指す。
特異摂動系の分岐理論に基づく心筋細胞興奮ダイナミクスとパラメータ感受性の徹底解明

心臓洞房結節におけるペースメーカ細胞のHodgkin-Huxley型モデルを用い,様々なパラメタに対するペースメーカリズムの感受性を徹底的に調べた.その結果,ペースメーカ周期に強い影響を及ぼすイオンチャネルとほとんど影響を及ぼさないイオンチャネルの違いなど,イオンチャネル(電流)のペースメーカリズムへの関わりを明らかにした.これらの結果から,遺伝的または環境の影響により引き起こされたイオンチャネル異常がペースメーカのリズム異常や洞性不整脈を導く仕組みに関する有用な知見を得た.心臓洞房結節におけるペースメーカ細胞のHodgkin-Huxley型モデルを用い,様々なパラメタに対するペースメーカリズムの感受性を徹底的に調べた.その結果,ペースメーカ周期に強い影響を及ぼすイオンチャネルとほとんど影響を及ぼさないイオンチャネルの違いなど,イオンチャネル(電流)のペースメーカリズムへの関わりを明らかにした.これらの結果から,遺伝的または環境の影響により引き起こされたイオンチャネル異常がペースメーカのリズム異常や洞性不整脈を導く仕組みに関する有用な知見を得た.代表的分岐解析ソフトウェアであるAUTOを使用し,心臓洞房結節のペースメーカ細胞に関するHH型モデルの大域的分岐構造を網羅的・包括的に解析することで,これら心筋細胞のパラメータ感受性(ひいては薬物感受性)の解明を試みた.詳細は以下の通り:洞房結節のペースメーカ細胞のHodgkin-Huxley型モデルであるYNIモデルとZhangモデルを用いて,心筋細胞の電気的興奮の性質及びパラメータ感受性に関して解析を行い,洞房結節内の部位間での類似点・差異を明らかにした.また,これらのHH型モデルには,イオンチャネルを通したイオンの流出入(速い現象)のみを考慮したものと,イオンポンプやイオン交換体を通した遅いイオンの流れと細胞内外のイオン濃度変化(これも遅い現象)も考慮したものがある.これらのイオンの流れは時間スケールの相当異なる現象であり,速い流れと遅い流れの両者を考慮したモデルは,数学的には特異摂動系となる(実際には,イオンチャネルの中にもやや遅いものと速いものがあり,さらに複雑なマルチスケールの特異摂動系である).これら特異摂動系の分岐解析には様々な困難が存在するので,平成21年度は,イオンポンプやイオン交換体を通したイオンの流れと細胞内外のイオン濃度変化などの遅い現象を一時的に無視する(定数として扱う)ことで,詳細な分岐解析を可能にした.代表的分岐解析ソフトウェアであるAUTOを使用し,心臓洞房結節のペースメーカ細胞に関するHH型モデル(Zhangモデル)の大域的分岐構造を網羅的・包括的に解析することで,これら心筋細胞のパラメータ感受性(ひいては薬物感受性)の解明を試みた洞房結節は自発的に活動電位を発生する心臓ペースメーカであり,最も重要な心筋である.昨年度までは,代表的な洞房結節細胞モデルであるが比較的単純であるYanagihara-Noma-Irisawa (YNI)モデル(Yanagihara et al., 1980)と詳細なZhangモデル(Zhang et al., 2000)の解析を行った.今年度はZhangモデルでの残りの解析を完成させた.解析結果がモデルに依存する可能性があるので,モデル間の結果の比較検討を行った.特に,2つのモデルに対して,イオンチャネルのコンダクタンス変化に対する振動周期の変動性を詳細に比較した.その結果,モデル間で対応するイオンチャネルについては,その薬物感受性の強さが一致していることを確認できた.以上の結果から,(洞性)不整脈の予測診断・治療に有益な薬物感受性などの知見を得ることができた.また,心臓洞房結節の細胞間結合態様を調べるための文献調査を行った上で,手始めに単純なYNIモデル用いて,単一細胞の解析だけでなく細胞の結合系の解析を開始した前年度に引き続き,代表的分岐解析ソフトウェアであるAUTOを使用し,洞房結節のペースメーカ細胞に関するHH型モデルの大域的分岐構造を網羅的・包括的に解析した.さらに,最終年度にあたって,分岐解析結果を総合し,ペースメーカ細胞の様々なパラメータに対する感受性(ひいては薬物感受性)やロバスト性及び非線形興奮ダイナミクスの特質を洗い出した.心拍制御という目的に特化した,電気信号を用いて心筋細胞が行う制御や計算の仕組みについても議論を行った.具体的には以下を行った.・洞房結節細胞のZhangモデルを用いて,洞房結節の中心細胞と周辺細胞それぞれについて,詳細な分岐解析を行った.洞房結節細胞の電気的興奮の性質及びパラメータ感受性の部位(中心細胞と周辺細胞)間での類似点・差異を明らかにした.特に,ペースメーカ周期の変動性に注目して解析を行った.・洞房結節全体の解析を行うための準備的研究として,中心細胞と周辺細胞の結合系に対する分岐解析を行い,細胞間の(電気シナプス)結合により,ペースメーカ周期の変動性やその感受性がどのように変化するかを明らかにした.・心筋細胞のHH型モデルには,イオンチャネルを通したイオンの流出入(速い現象)のみを考慮したものと,イオンポンプやイオン交換体を通した遅いイオンの流れと細胞内外のイオン濃度変化(これも遅い現象)も考慮したものがある.これらのイオンの流れは時間スケールの相当異なる現象であり,速い流れと遅い流れの両者を考慮したモデルは,数学的には特異摂動系となる(実際には,イオンチャネルの中にもやや遅いものと速いものがあり,さらに複雑なマルチスケールの特異摂動系である).

特異摂動系の観点からシステムの特質を明らかにするため,比較的単純な振動子モデル(BVP,FHNモデル)を用い,単一振動子や結合系における(同期)振動リズムの調節メカニズムを解析した.
半自然草原に生息するシジミチョウ類の個体群動態および保全・保護に関する研究

「半自然草原に生息する絶滅危惧種のチョウの保全に関する研究」をテーマに以下の研究実績をあげた.1.ミヤマシジミの食草選択実験:ミヤマシジミは本来コマツナギのみを食草にしているが、海外に生息しているミヤマシジミは多食性であることが知られている。そこで、ミヤマシジミに他の食草を与えたところ、クサフジ、ナヨクサフジ、ダイズ、シロツメクサを摂食し、成虫になった。しかし、コマツナギ食のミヤマシジミと比較して、正常な発育とは言えなかった。2.ミヤマシジミの母蝶の産卵選好性実験:1において、コマツナギ以外でも発育することが明らかとなったため、成虫が他の植物へ産卵するか実験した。その結果、成虫はコマツナギに有意に産卵することが分かり、コマツナギと最も形質が近いと考えられる外来コマツナギにも、あまり産卵しなかった。3.ミヤマシジミ休眠卵と非休眠卵の産み分け実験:ミヤマシジミは卵で越冬することが知られている。よって、夏の間は非休眠卵を産卵するが、最終化性の成虫は休眠卵を産卵する。そこで、成虫がいつ、なにを感受して産み分けをしているか調べるために、実験を行った。その結果、幼虫期を長日条件にした個体は他のステージが短日条件でも非休眠卵を産み、幼虫期を短日条件にした個体は休眠卵を産卵した。よって感受期は幼虫期であることが分かった。4.オオルリシジミのDNA解析のためのサンプル集め:DNA解析を行うために安曇野市と東御市のオオルリシジミのサンプリング調査を行った。また、本来生息していない地域から突発的に発生している個体が見つかったために、サンプリングを行った。5.オオルリシジミの生息地調査:オオルリシジミの保全活動が円滑に進んでいる東御市の生息地調査を行った。その結果、一定間隔に食草のクララが植栽されており、火入れは土地所有者は毎年行っていることが明らかとなった。「半自然草原に生息する絶滅危惧種のチョウの保全に関する研究」をテーマに以下の研究実績をあげた.1.遺伝子的攪乱を調べるためのDNA解析:長野県内に生息しているミヤマシジミを使い,CO1領域とND5領域のDNA解析を行った結果,県内には4系統が生息していることが明らかとなった.2.ミヤマシジミ保護区の作成:信州大学農学部構内において保護区を作成し個体群回復に成功した.3.オオルリシジミ安曇野個体群の回復:オオルリシジミの保全には春先の野焼きが重要であることを証明し,2011年に15年ぶりに自然個体群が回復した.4.オオルリシジミの2化成虫が出現する条件の解明:室内飼育を行い,2化が出現する温度条件(25°C以上),日長の感受期(老熟幼虫蛹期の間の4日以上の連続明期),臨界日長(16.5L),および低照度(20Lux)などを明らかにした.5.ジョウザンシジミの室内飼育実験:オオルリシジミの近縁種であるジョウザンシジミの飼育を行い,卵期と幼虫期の発育零点と有効積算温度を算出した.また22°C以上で2化成虫が出現し,30°Cでは出現率は50%となることを明らかにした.6.ミヤマシジミの室内の飼育実験:化性と発生予察を行うために異なる温度帯で飼育し,非線形モデルを使ってシミュレーションを行い,高温による発育遅延を組み込むモデルを考案した.ミヤマシジミ幼虫が中国産コマツナギを摂食して正常に成長するかどうかを確認した.生存率,羽化不全率,発育期間に関しては,在来コマツナギ食と差がなく,蛹体重と前翅長は,在来コマツナギ食より中国産コマツナギ食の方が大きかったことを明らかにした.「半自然草原に生息する絶滅危惧種のチョウの保全に関する研究」をテーマに以下の研究実績をあげた.1.ミヤマシジミの食草選択実験:ミヤマシジミは本来コマツナギのみを食草にしているが、海外に生息しているミヤマシジミは多食性であることが知られている。

4.オオルリシジミのDNA解析のためのサンプル集め:DNA解析を行うために安曇野市と東御市のオオルリシジミのサンプリング調査を行った。また、本来生息していない地域から突発的に発生している個体が見つかったために、サンプリングを行った。5.オオルリシジミの生息地調査:オオルリシジミの保全活動が円滑に進んでいる東御市の生息地調査を行った。その結果、一定間隔に食草のクララが植栽されており、火入れは土地所有者は毎年行っていることが明らかとなった。平成23年度に設定した研究目標のうち,その1つである「人間活動によって形成された半自然草原とシジミチョウとの関係の解明」については,絶滅危惧種のミヤマシジミを材料に,温度-発育関係の非線形モデル化とそれを使った発生予察シミュレーションの手法を開発し,また実践的研究としてオオルリシジミとミヤマシジミについて絶滅地域での回復実験に成功した.もう一つの目標である「半自然草原に適応した生活様式の進化メカニズムの解明」については,オオルリシジミの2化成虫が出現する温度・日長条件の解明,ミヤマシジミについては幼虫と成虫の食草選択実験を実施することができた.オオルリシジミに関しては九州亜種の生息域調査を行い,長野県の生息管理方法を比較することで継続的にオオルリシジミの自然個体群回復の方法を提言する.またオオルリシジミのDNA解析を行い,人為的放蝶によって遺伝的攪乱がおきないように,DNAマップを作製して放蝶範囲などを設定する。DNA解析については信州大学の他キャンパスで行っているため交通費がかかってしまう.そのため所属キャンパス内でDNA解析が行えるよう環境を整えていく.ミヤマシジミに関しては日本でコマツナギしか食べない理由を解明するため幼虫の餌選択実験と母蝶の産卵選好性実験を行う.長野県内の分布調査を行い,農牧業の変遷との関連から半自然草原に適応した生活様式への進化を明らかにしていく.
ユウレイボヤにおける中胚葉誘導の分子メカニズムの解析

私の研究はユウレイボヤにおける胚発生に必要な遺伝子のネットワークを明らかにすることが目的である。2004年の研究ではまずユウレイボヤのすべての転写因子の発現を解析した。ユウレイボヤEST解析により得られたクローンとゲノム配列より予測した遺伝子に基づきスクリーニングで単離したものあわせて389個の転写因子についてすべてin situ hybridization法により受精卵から後期尾芽胚までの発現を調べた。この数はユウレイボヤのすべての転写因子をほぼ網羅する。これらの転写因子の発現パターンはその写真とともにデーターベース化しインターネットで見られるようになっている(http://ghost.zool.kyoto-u.ac.jp/tfst.html)。今年度はこれらの転写因子のうち、原腸胚期までに発現する72個の転写因子についてその機能を阻害するモルフォリノオリゴを作成した。次に、それぞれのモルフォリノオリゴを顕微注入した機能阻害胚における遺伝子の発現をreal time PCR法により調べた。初期原腸胚期に発現するすべての転写因子と後期原腸胚期に発現する転写因子の一部についてその発現量をモルフォリノオリゴ顕微注入胚とコントロール胚とで比較した。また、どの組織での遺伝子の発現が影響されているのかin situ hybridization法により確認した。この情報に基づき、遺伝子ネットワーク図を各割球ごとに作成し、ウェブサイトに掲載した。これまでの研究で私はコウレイボヤにおいてβ-cateninに始まる中胚葉誘導および内胚葉分化のカスケードの一端をあきらかにしてきた。今年度はその中でCs-FGF9/16/20による中胚葉誘導の下流で働く分子を明らかにした。Cs-twist-likelはbHLHをコードする転写因子で、FGF9/16/20のシグナリングによりその下流で発現する。Cs-twist-likelは64-110細胞期と非常にはやい段かいで間充識細胞にのみ発現する。twist-likelの働きをアンチセンスモルフォリで阻害すると、間充識細胞は全く分化せず、かわりに筋肉細胞と内胚葉細胞が過剰にできる。つまりtwist-likelは間充識細胞のspecificationに重要な役割を果たしているのである。又、この他に同じbHLHファミリーに属するCs-trlcとCs-twist-like2も同定した。Cs-trlcは間充識細胞の一部のTLC(trunk latecal cell)に64細胞期に発現し、その後のCs-twist-likelの発現を制御する。Cs-trlcの働きをアンチセンスモルフォリノで阻害するとTLC細胞の分化が全くみられなくなる。このことはCs-trlcはTLCのSpecificationを担っていることを示している。Cs-twist-like2は比較的後のステージ(神経胚ごろ)から間充識細胞で発現しはじめる。Cs-twist-like2はCs-twist-likelの下流遺伝子であることも明らかにした。ユウレイボヤにおける胚発生に必要な遺伝子のネットワークを明らかにするために、まずユウレイボヤのすべての転写因子の発現を解析した。ただしzincfingerをもつ転写因子につては、転写因子として働くかどうか不明なものもあるので、転写因子として働くことが他の生物の研究から明らかになっているもの以外は解析の対象から外した。これらの転写因子の発現パターンはその写真とともにデーターベース化しインターネットで見られるようになっている(http://ghost,zool.kyoto-u.ac.jp/tfst.html)。解析された389個の遺伝子のうち、zygoticな発現が見られたものが199個あった。また、389個の遺伝子のうち、224個にいては母性での発現が認められた。これらの転写因子の発現パターンをもとにして、さらに遺伝子間のネットワークを明らかにするため、まず始めにβカテニン、FoxD,FGF9/16/20の2つの遺伝子についてその下流遺伝子をreal time PCR法を用いて探索した。これらのFoxD,FGF9/16/20については私が以前に行った解析により、ホヤ初期胚の脊索誘導において重要な役割をもっていることが明らかとなった遺伝子である。また、βカテニンは植物極側の細胞運命の決定に重要な役割をもっていることが明らかになっている。real time PCRの結果38個のβカテニンの下流遺伝子、9個のFoxDの下流遺伝子、10個のFGF9/16/20の下流遺伝子が明らかになった。

次に、それぞれのモルフォリノオリゴを顕微注入した機能阻害胚における遺伝子の発現をreal time PCR法により調べた。初期原腸胚期に発現するすべての転写因子と後期原腸胚期に発現する転写因子の一部についてその発現量をモルフォリノオリゴ顕微注入胚とコントロール胚とで比較した。また、どの組織での遺伝子の発現が影響されているのかin situ hybridization法により確認した。この情報に基づき、遺伝子ネットワーク図を各割球ごとに作成し、ウェブサイトに掲載した。
癌の画像診断・温熱治療への応用を目的とした磁性ナノ粒子の創製

本研究では、磁気共鳴画像法(MRI)と磁気温熱療法(磁気ハイパーサーミア)を一体化する「セラノスティクス」の実現を可能にするような磁性ナノ粒子の開発に取り組んだ。葉酸とポリエチレングリコールを修飾した超常磁性マグネタイトナノ粒子クラスター(FA-PEG-SPION NCs)を担癌マウスに静脈内投与することで、MRIで腫瘍を造影することに成功した。さらに、このNCsを静脈内投与したマウスに人体に無害な交流磁場を印加すると、腫瘍のみが加熱され、腫瘍の温度は周囲の正常組織の温度よりも約6°C高くなった。この結果、腫瘍細胞の増殖を抑制でき、生存率を大幅に改善することができた。本研究では、MRIと磁気ハイパーサーミアを一体化する「セラノスティクス」の実現を可能にするような磁性ナノ粒子の開発を目的とした。平成24年度に、MRI造影剤及び磁気ハイパーサーミア用発熱体として応用するために必要な特性を満たす磁性ナノ粒子を合成することができていたため、平成25年度は、この磁性ナノ粒子を用いて、担癌マウスを用いた動物実験により、腫瘍をMRIで造影し、さらに、磁気ハイパーサーミアで治療することを試みた。この磁性ナノ粒子を担癌マウスに静脈内投与すると、24時間後に腫瘍を造影することができた。腫瘍の組織解析から、この磁性ナノ粒子は腫瘍組織内の壊死している組織ではなく、生存している組織に局在していることが明らかになった。さらに、この磁性ナノ粒子を担癌マウスに静脈内投与してから24時間後に交流磁場(230 kHz, 100 Oe)を印加することで、この磁性ナノ粒子を用いた磁気ハイパーサーミアの治療効果を評価した。この磁性ナノ粒子を投与した担癌マウスに交流磁場を印加すると、腫瘍だけが加熱され、20分後には腫瘍の温度が周囲の正常組織の温度より6°C高くなっていることがサーモグラフィで確認された。また、腫瘍の体積変化から、この磁性ナノ粒子を用いた磁気ハイパーサーミアにより腫瘍細胞の増殖が著しく抑制できるということが明らかになった。さらに、生存率も大幅に改善し、対照群(無処置、磁性ナノ粒子投与のみ、交流磁場印加のみ)は8週以内に全滅したが、磁気ハイパーサーミアを行った群は12週以上生存率100%であった。さらに、生化学検査によりこの磁性ナノ粒子の毒性を評価したところ、毒性は認められなかった。以上の結果は、本研究で開発した磁性ナノ粒子を用いることで、MRIと磁気ハイパーサーミアを一体化する「セラノスティクス」の実現が期待できることを示唆している。平成24年度は、癌に高度に集積し、磁気共鳴画像法(MRI)の造影剤及び磁気ハイパーサーミアの発熱体として応用可能な超常磁性酸化鉄ナノ粒子の合成を目的とした。研究実施計画に基づき、鉄(III)アリルアセチルアセトネート(IAA)を前駆体として用いた加水分解・縮合により、アリル基が結合した超常磁性酸化鉄(マグネタイト)ナノ粒子(Allyl-SPIONs)を合成した。マクロファージによる貪食を回避し、癌への集積量を高めるために、チオール-エンクリック反応を利用して、Allyl-SPIONsにポリエチレングリコール(PEG)及び葉酸(FA)を修飾した。この反応過程で、PEGがSPIONsを包み込むためSPIONsから成るクラスターが生成した。つまり、SPIONsのクラスター化、PEG化、FA修飾が同時に達成された。TEM観察から、粒径79 nmのSPIONsが集合して直径60100 nmのクラスターが生成しており、このクラスターは47 nmの有機層で覆われていることが明らかになった。SPIONsから成るFA及びPEGで修飾されたナノクラスター(FA-PEG-SPION NCs)の生理活性食塩水中での粒度分布及びゼータ電位を動的光散乱(DLS)で測定したところ、単分散であり、ゼータ電位はゼロであった。ゼータ電位がゼロであるということは体内に投与した際に血中の蛋白質等の非特異的な吸着を抑制するために非常に重要な特性である。FA-PEG-SPION NCsの磁気特性を評価したところ、超常磁性を示し、現在臨床で使用されている酸化鉄MRI造影剤Resovistよりも飽和磁化が20倍も大きいことが明らかになった。このため、Resovistよりも大きいMRI造影能及び交流磁場中での発熱量が得られた。さらに、マウスを用いた実験により、腫瘍をMRIで検出することや良好な治療効果が得られている。当初は、平成24年度は、MRI及び磁気ハイパーサーミアに応用可能な超常磁性酸化鉄ナノ粒子の合成と評価を行うことを計画しており、動物実験は平成25年度に行うことを計画していた。

しかし、研究が順調に進んだため、平成24年度に、担癌マウスを用いて、MRIによる腫瘍検出や、磁気ハイパーサーミアの治療効果の評価に取り掛かることができた。現在行っているFA-PEG-SPION NCsを用いたMRIによる腫瘍検出と磁気ハイパーサーミアの治療効果の評価を継続して行っていく。現在のところ、問題なく順調に進んでいるため、当初の研究計画に基づき行っていく。また、当初は非常に困難と思われた超常磁性酸化鉄ナノ粒子の静脈内投与による磁気ハイパーサーミアでも良好な治療効果が得られる可能性がある知見が得られているので、この研究も精力的に遂行していく。平成25年度の研究費は、実験動物やFA-PEG-SPION NCsを合成するための試薬の購入、学会発表のための旅費、論文掲載費や英文校正費に用いる。次年度への繰越額は論文掲載費及び学会発表のための旅費に使用する予定である。