hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
白血病関連転写因子AML1(PEBPαB)による造血制御の分子メカニズム

当該研究では、ヒト白血病における染色体転座の最も高頻度の標的遺伝子であり、造血発生制御に関与する転写調節因子をコードする遺伝子であるAML1の働きについて多角的に検討し、以下の結果を得た。1.マウス胚性幹細胞(ES細胞)をin vitroで血球系に分化させる新規実験系を確立し、この実験システムを用いることにより、AML1欠損マウス固体の表現型をin vitroで忠実に再現できることを示した。2.この系を用いてAML1欠損ES細胞の造血傷害が野生型AML1遺伝子の再導入によって救済(レスキュー)されうることを明らかにした。すなわち、AML1ノックアウトマウスで認められた造血障害はたしかにAML1の欠失のみによって生じていることを明らかにした。3.キメラマウス作成実験によってこのレスキューがin vivoでも認められることを明らかにした。4.AML1による造血初期発生制御はAML1分子の転写調節活性化能力に依存していることを証明した。5.AML1の生物活性にはAML1自身の転写レベルでのコントロールが重要である。6.この実験システムでの既知AML1標的遺伝子群の発現を検討したところ、多くのものがAML1欠損時にも発現しており、その造血発生制御には未同定の標的遺伝子(群)を介している可能性のあることが示唆された。今後、これらの実験系を利用してAML1の新たな標的遺伝子の探索やAML1変異体の生物学的機能解析を進めて行きたい。AML1は、ヒト白血病における染色体転座の最も高頻度の標的遺伝子であり、造血発生制御に関与する転写調節因子をコードする。当該研究では、その機能の分子メカニズムについてin vitro実験系を構築することによって検討し、以下の結果を得た。1.野性型マウスES細胞をin vitroで胚様体へと分化させるとその中に造血前駆細胞が出現してくる。一方、AML1欠損ES細胞を用いると、胚型赤血球系前駆細胞は検出されるものの成体型の造血コロニー形成細胞は生じないことが明らかにされた。すなわち、成体型造血の欠失というAML1欠損マウス個体の表現型をin vitroで忠実に再現しうる実験系をここに構築した。2.この系を用いて各種遺伝子発現について検討したところ、GATAなど胚型造血に関与する遺伝子群の発現はAML1欠損においても保持されていた。また、c-mybやPU.1などのように成体型造血と関わりをもつ遺伝子群や、c-fmsなどの既知のAML1標的遺伝子群の発現も検出可能であった。一方、G-CSF-Rの発現の欠失が認められたが、既報のG-CSF-R欠損マウスの記載から判断すると、この遺伝子発現の欠如をAML1欠損による表現型の原因とは考え難い。これらの結果は、AML1による造血発生制御には未同定の標的遺伝子(群)を介している可能性を示しているものと解釈される。3.前段の結果を踏まえ、AML1+/-細胞とAMLl-/-細胞それぞれのmRNAを抽出し、RDA(representational difference analysis)法を用いて、AML1による新規転写調節標的遺伝子の探索を行った。その結果、約120のDNA断片をクローニングし、現在そのAML1依存性発現について検討を行っている。今後はこれらの候補標的遺伝子について生物作用との関連へと解析を進めてゆく予定である。1.マウス胚性幹細胞(ES細胞)をin vitroで血球系に分化させる新規実験系を確立し、この実験システムを用いることにより、AML1欠損マウス個体の表現型をin vitroで忠実に再現できることを示した。2.この系を用いてAML1欠損ES細胞の造血障害が野生型AML1遺伝子の再導入によって救済(レスキュー)されうることを明らかにした。すなわち、AML1ノックアウトマウスで認められた造血障害はたしかにAML1の欠失のみによって生じていることを初めて明らかにした。

3.キメラマウス作成実験によってこのレスキューがin vivoでも認められることを明らかにした。4.AML1による造血初期発生制御はAML1分子の転写調節活性化能力に依存していることを証明した。5.AML1の生物活性にはAML1自身の転写レベルでのコントロールが重要である。6.この実験システムでの既知AML1標的遺伝子群の発現を検討したところ、多くのものがAML1欠損時にも発現しており、その造血発生制御には未同定の標的遺伝子(群)を介している可能性のあることが示唆された。今後、これらの実験系を利用してAML1の新たな標的遺伝子の探索やAML1変異体の生物学的機能解析を進めて行きたい。
実験動物頭部のファンクショナルMRIによる痛覚のビジュアリゼーション

近年、ヒトにおける痛み応答に関与する部位には、PETとfMRIによる研究から、第二体性感覚野、島皮質、anterior cingulated cortex(ACC:前帯状皮質)、反対側の第一体性感覚野および視床部が関与する事が知られるようになった。興味あることに、allodyniaなどの異常な痛みに対してACC領域以外の領域では血流量やfMRI-BOLD信号が上昇するのに対してACC領域では血流量やBOLD信号が低下することがある。さらに、ACC領域では痛みの強さや場所に関連した血流量の変化は起こらず、痛みによる不快感や嫌悪感などの「感情」に関する応答が起こる事が知られている。本研究では、ヒトACCに該当するラット脳cingulate cortex(CG)領域におけるホルマリン刺激に対する痛みに対する評価を刺激後24分間と比較的長く観察することにした。ホルマリン刺激を行った全ての個体において、第一体性感覚野領域のBOLD信号は、刺激直後から2分間の間にピークを迎えていた。その後、観察された24分後までBOLD信号は低下することなく4-5%程度のBOLD信号の増加を示していた。興味あることに、CG領域での時間変化は実験群の半数以上において、ホルマリン刺激後1分半程度にピークを示し、9%程度の信号上昇が観察され、刺激後信号が2%以下に一度低下した。その後、刺激後16分から再度信号は上昇した。第一体性感覚野領域でのBOLD信号は刺激後直ぐにピークを迎え、BOLD信号に観察された24分間に大きな変化がないことから、ラット脳CG領域は痛みの表現型そのものと考えることができる。第一体性感覚野などの体性感覚野領域は痛みの場所を特定し、ACCやCG領域では痛みに起因する感情的評価(不快感や嫌悪感)を表現していると考えることができる。今回実験を行った群において、CG領域で特異な反応が観察された。神経活動の上昇とBOLD-fMRI信号の上昇は等しいと考えられているが、現在までのところ、必ずしも等しいとは考えられていない。神経活動の増加により、局所的な酸素消費量の増加がおこり、デオキシヘモグロビン量がオキシヘモグロビン量を凌駕する。炎症性疼痛の後期や疼痛などの慢性痛における痛みはCG領域で強く起こっていることを示唆していることが可視化された。本年度、BOLD (blood oxygenation level dependent)法に基づくfMRI法を用いて、ラット脳の痛み刺激の解明手法の開発を行った。本研究の計画段階では、fMRI刺激時にはラットはある程度情動行動を抑えるために鎮静剤を用いて行ったが、α-クロラロースはこのような実験に最適な鎮静剤であるが、この薬剤は持続した投与が理想的であり、ボーラス投与の場合、ラットの応答が一定ではない事が知られている。このため、安定持続したα-クロラロース投与のために持続薬物投与装置マイクロシリンジポンプを用いておこなったが、それでも非常に不安定な結果となった。これは偏にα-クロラロースが持つ薬剤の特性であると考えられた。本研究では、1%イソフルラン麻酔下で痛み刺激fMRI実験を行った。この方法では再現性が高く、良好な結果が得られた。左前肢にホルマリン刺激を与えた場合、痛み刺激部位と反対側の大脳皮質右側第一体性感覚野において6%前後の応答が刺激直後から4分間観察され、一次反応が消失した後、刺激4分後から20分後まで2%程度の持続性の応答が見られた。モルヒネ投与下において同様の刺激を与えると、刺激直後の応答、ならびにその後の持続性の応答は見られなかった。一方、痛み刺激をカプサイシン刺激にて行ったところ、刺激直後の応答は平均で4%前後見られたが、1分以内に消失した。モルヒネ投与下では、刺激直後の応答はホルマリン刺激と同様に消失したが、その後の大脳全域で見られる原因不明の応答によるばらつきは抑制されなかった。このように、本年度はラット脳における痛みの評価系の質的向上、再現性の向上が達成された。翌年度以降に、この手法により様々な神経因性疼痛モデルのfMRIによる評価を行う。

第一体性感覚野領域でのBOLD信号は刺激後直ぐにピークを迎え、BOLD信号に観察された24分間に大きな変化がないことから、ラット脳CG領域は痛みの表現型そのものと考えることができる。第一体性感覚野などの体性感覚野領域は痛みの場所を特定し、ACCやCG領域では痛みに起因する感情的評価(不快感や嫌悪感)を表現していると考えることができる。今回実験を行った群において、CG領域で特異な反応が観察された。神経活動の上昇とBOLD-fMRI信号の上昇は等しいと考えられているが、現在までのところ、必ずしも等しいとは考えられていない。神経活動の増加により、局所的な酸素消費量の増加がおこり、デオキシヘモグロビン量がオキシヘモグロビン量を凌駕する。炎症性疼痛の後期や疼痛などの慢性痛における痛みはCG領域で強く起こっていることを示唆していることが可視化された。
特徴抽出フイルターの可塑性

1.目的。感覚中枢の神経回路綱は、特徴抽出フィルターとして生体に与えられた刺激から一定の特徴を抽出し、それをより高次の中枢へ伝達する。本研究はこの特徴抽出回路における可塑性発現のメカニズム解明を目的とする。2.結果。津本班員は、成ネコと臨界期にある仔ネコの大脳皮質視覚野ニューロンに対する興奮性アミノ酸拮抗薬の作成を調べた。その結果、N-methyl-D-aspartate(NMDA)型受容体に対する選択的拮抗薬が成ネコでは無効であるのに、仔ネコでは有効であることを見い出した。外山班員は新生仔ラットの大脳皮質視覚野に胎仔期ラットの外側膝状体を移植し、胎仔外側膝状体がどこに移植されても、正しく標的細胞を見つけ出し、正常な神経回路を形成することを発見した。伊藤班員は、成ネコの大脳皮質視覚野に興奮性神経毒であるカイニン酸を微量注入した結果、抗P物質や抗エンケファリン活性を示すニューロンが多数出現することを発見した。岩村班員は、無麻酔サルで体性感覚野のニューロン活動を記録することにより、エッヂ検出や球と四角の識別に関係するニューロン群を見い出した。福島班員は、学習能力をもち、バターン認識能を自ずから身につけてゆく遠心性回路を含む階層型神経回路モデルを提唱した。前川班員は、前庭動眼反射および視運動性眼振に関与する神経回路の生後発達を調べ、出生直後の仔ネコがすでに小脳プルキン工細胞が視神経電気刺激に反応することを見い出した。3.考察。本年度は研究を開始したばかりにもかかわらず、各班員は当初の目的を達成し、特徴抽出回路の可塑性について一層の理解を深めた。-今後は、工学モデルとの相互検証を一層密に行うことによって特徴抽出回路綱の可塑性のメカニズムに関する研究の飛躍的発展が期待される。1.目的。2.結果。3.考察。
看護基礎教育における死に関する教育プログラムの開発

本年度は看護基礎教育における生と死に関する教育内容の検討のために、下記の調査を実施した。1)N看護大学生5名へのヒアリング調査より学生が生や死について考える契機となった授業には「生命倫理(必須科目)」「パリアティブ・ケア(選択科目)」があった。教材や授業方法としては、死に直面している人々の生き様を題材としたVTR教材や実際に遺族の体験談を聞いての話し合い、遺書の作成、ロールプレイが良かったと感じていた。実習では闘病している患者とその家族の姿を通して、遠い未知なものであった死が現実のものであることを実感していた。2)国内外の看護教育、死生学関連の専門家へのヒアリング調査よりQ大学看護学部(英国)では、3・4年次における選択科目として、「死の過程における感情と行動」「ホスピス及びパリアティブケアの原則と発展」「パリアティブケアにおけるぺインマネージメント」があり、大学教員のみならずホスピスの看護教育担当者による講義、施設見学が行われている点が特徴的であった。J短期大学看護学科・J大学医学部(台湾)では、仏教を基盤に、人間尊重が徹底されている。例えば、解剖学実習では学生は献体者を「先生」と呼び、氏名、経歴等を含め献体者の顔写真が掲げられ、火葬後の骨恰い、遺族との懇談までを一貫して関わる方法が取られている。T大学文学部(東京)は、宗教学を専門とする専門家による「生死観の比較研究」3年次を対象に、死生観とその文化的意味論、宗教・習俗との関わり、日本人の死生観とその変容、生命倫理等に関する内容を含んでいた。文学部という特性上、非常に観念的概念的な理解を主としていた。I女子短期大学看護学科(長野)は大学全体が浄土真宗を基盤としており、「仏教看護論」『ビハーラケア論」の科目がおかれ、それらが人間の誕生前から死後までのいのちの生老病死のすべてにかかわることを視野にいれ展開されている。死亡から納棺、葬儀までを実際に体験する授業、金魚とのふれあいを通じたいのちの実感を学ぶ授業等、ユニークな体験型の学習が特徴的であった。以上及び諸文献の検討を踏まえ、看護基礎教育においては、(1)生死の意味や定義、死生観とその文化的意味、悲嘆等に関する基礎的(概念的)事項、(2)(1)を踏まえた生命倫理(安楽死、尊厳死、中絶、出生前診断、遺伝子治療等)に関連する応用的事項、(3)ホスピスケア、パリアティブケアに関する臨床的事項の内容を含み、問題の所在を明らかにするための講義、VTR等の視聴、生や死を自分のこととして考え、実感するきっかけとなるような体験学習を有機的に組合せていくことが効果的であると考えられた。本研究の目的は1)看護婦の死生観とその形成過程、及びそれらに影響する要因を経時的に明らかにする。2)1)の結果及び死生学、死の準備教育等の文献、専門家の意見等を踏まえ、看護基礎教育において必要な死に関する教育のプログラムの作成(教育プログラムの内容の妥当性、プログラム実施後の評価方法の検討も含める)を行うという2点であり、今年度は上記目的の1)と2)の一部を実施した。1)看護婦の死生観の形成過程の明確化15名の就職後1年半の間の対象者の患者の死に関する体験を分析した結果、個々人によって体験された時期や頻度が異なるものの、4種類の体験がみられた。4種類の体験は、「強い動揺」「手際良く患者の死に対応することへの関心」「葛藤」「覚悟と積極性」であり、就職後4から6ヶ月間に「強い動揺」「手際良く患者の死に対応することへの関心」の体験が多く、同時期に患者の死を全く体験していない4名を除く11名全員がこれらを体験していた。就職後12ヶ月前後には「手際良く患者の死に対応することへの関心」から「葛藤」への変化が多く体験されていた。「覚悟と積極性」は就職後15ヶ月頃に4名の対象者が体験していた。対象者が語った死に関する4種類の体験は患者の受け持ち期間や意識レベル、死の予測の程度(急変か否か)に影響を受けており、同一対象者の中でも事例毎に異なる場合もあったが、それらの体験を時間的経過に沿って分析したところ、「関心の方向」「看護婦としての役割遂行の認識」「先輩看護婦と自分との違いの認識」「死に対する忌避感情」が時間と共に変化していたことが明らかになった。2)国内の死生学に関する文献の検討、専門家へのヒアリング上記の分析結果について緩和ケアの実践及び教育に長年関わっている専門家1名にヒアリング調査を行った。

J短期大学看護学科・J大学医学部(台湾)では、仏教を基盤に、人間尊重が徹底されている。例えば、解剖学実習では学生は献体者を「先生」と呼び、氏名、経歴等を含め献体者の顔写真が掲げられ、火葬後の骨恰い、遺族との懇談までを一貫して関わる方法が取られている。T大学文学部(東京)は、宗教学を専門とする専門家による「生死観の比較研究」3年次を対象に、死生観とその文化的意味論、宗教・習俗との関わり、日本人の死生観とその変容、生命倫理等に関する内容を含んでいた。文学部という特性上、非常に観念的概念的な理解を主としていた。I女子短期大学看護学科(長野)は大学全体が浄土真宗を基盤としており、「仏教看護論」『ビハーラケア論」の科目がおかれ、それらが人間の誕生前から死後までのいのちの生老病死のすべてにかかわることを視野にいれ展開されている。死亡から納棺、葬儀までを実際に体験する授業、金魚とのふれあいを通じたいのちの実感を学ぶ授業等、ユニークな体験型の学習が特徴的であった。以上及び諸文献の検討を踏まえ、看護基礎教育においては、(1)生死の意味や定義、死生観とその文化的意味、悲嘆等に関する基礎的(概念的)事項、(2)(1)を踏まえた生命倫理(安楽死、尊厳死、中絶、出生前診断、遺伝子治療等)に関連する応用的事項、(3)ホスピスケア、パリアティブケアに関する臨床的事項の内容を含み、問題の所在を明らかにするための講義、VTR等の視聴、生や死を自分のこととして考え、実感するきっかけとなるような体験学習を有機的に組合せていくことが効果的であると考えられた。
逆遺伝子操作による鳥ロタウイルスの病原性発現分子機構の解明

鳥ロタウイルスA(RVA)の哺乳類への病原性の分子機構を解明するため、初めに鳥RVAの遺伝的多様性を明らかにした。解読した鳥RVA3株と既知RVAのゲノムの全分節ORFについて比較解析した。我々が解読した2遺伝子が、ロタウイルス遺伝子型認定機関により新規遺伝子型に認定された。次に、哺乳動物に病原性を示す鳥RVA・PO-13株ゲノムの細胞内合成にT7プロモーターとpolIIプロモーターを用いた逆遺伝子操作系を作製した。いずれの方法でも、ウイルスを回収できなかった。しかし、polIIプロモーターを用いた系ではRVAレプリコンの構築が確認でき、細胞内でのウイルスの転写・複製の再現が示された。鳥ロタウイルスPO-13株の11分節の各蛋白質のうち、モノクローナル抗体として確立済みのVP6およびNSP6以外の9蛋白質(VP1、VP2、VP3、VP4、VP7、NSP1、NSP2、NSP3、NSP5)に対する抗体を合成ペプチドにより作製した。結果として、3つの蛋白質(VP1、VP2、NSP5)に対する抗体を確立することができた。現在、残りの6蛋白質について部位を変えて合成ペプチド抗体の作製を行っている。同時に、本研究室でクローニングされているPO-13株の11本の分節ゲノム遺伝子の塩基配列の再確認を行った。確認後、全てのゲノム遺伝子cDNAを通常の逆遺伝子操作系で汎用されるT7プロモーターによる発現プラスミドに挿入した。発現が確認できる系において、細胞内での遺伝子発現を確認したところ、発現効率が極めて低いことが判明した。そこで、CMVプロモーターによる発現系に切り替え、発現プラスミドの再構築を行うこととした。これまでに、11本のうち、7本の遺伝子(VP1、VP2、VP3、VP4、VP6、VP7、NSP4)の発現プラスミドの構築を終えた。現在、残りの4本の遺伝子について発現プラスミドの構築を進めている。本研究の目的である鳥ロタウイルスの病原性解析を進めるため、PO-13株と病原性が異なる鳥ロタウイルスTy-1株、Ty-3株、Ch-1株の全ゲノムORFの塩基配列を決定・解析した。その結果、Ty-1株のVP4遺伝子、Ty-3株のNSP5遺伝子が新しい遺伝子型であることが判明した。また、新たにウシから検出された鳥ロタウイルスのVP4遺伝子の解析を行った結果、PO-13株に近縁でドイツにおいてウシで流行した993/83株に最も遺伝的に近いことが明らかとなった。鳥ロタウイルスPO-13株の逆遺伝子操作系を確立するため、H26年度に引き続き、CMVプロモーターの下流に各遺伝子分節RNAのcDNAを導入し、その支配下で各ウイルス蛋白質がより効率的に発現するプラスミドを構築した。今年度は、これまで構築していなかった計3分節の発現プラスミドを作製することに成功し、結果としてゲノム全11分節遺伝子の発現プラスミド(遺伝子・蛋白質発現プラスミド)を確立することができた。これら11種類のプラスミドを、ロタウイルス高感受性のMA104細胞の他、COS7細胞、HEK293T細胞、Vero細胞、あるいはBHK細胞に導入することにより、感染性ウイルスの回収、すなわち本ウイルスの遺伝子操作系の確立を試みたが、これまでに感染性ウイルスが回収できず、成功には至っていない。さらに、プラスミド導入細胞とMA104細胞との共培養により、微量なウイルスの増幅も試みたが、感染性ウイルスを回収することはできなかった。上記の各遺伝子・蛋白質発現プラスミドによるウイルス蛋白質の発現を確認するためには、それぞれの蛋白質を認識する抗体が必要となる。H27年度は、前年度に合成ペプチドの免疫により得ることができなかった計6種類の蛋白質(VP3、VP4、VP7、NSP1、NSP2およびNSP3)について、プラスミド免疫法による抗体の作製を試みた。上記のウイルス蛋白質を発現する免疫用プラスミドの構築をすべて終え、現在、マウスへの接種を複数回実施している。世界で初めてとなるロタウイルスの遺伝子操作系の確立が遅れているため、病原性の解析が進んでいない。鳥ロタウイルスPO-13株の逆遺伝子操作系を確立するため、H27年度までは、ゲノム全11分節遺伝子の各cDNAをCMVプロモーターの下流に挿入したプラスミドを構築した。それらプラスミドを複数の培養細胞に導入したが、感染性のウイルスを回収することができなかった。これらの結果は、11種類のプラスミドが効率的に細胞に導入されていないことが原因の一つであると想定し、今年度は、遺伝子導入方法の改変を行った。すなわち、細胞がより多くの遺伝子コピー数を取り込むことができるように、構築したプラスミドを鋳型としてCMVプロモーターとウイルスゲノム遺伝子の領域をPCRで増幅させ、発現のための最小機能構造を持つ断片化DNAとして細胞に導入した。ゲノム遺伝子のORFをルシフェラーゼ遺伝子に置換したモデルゲノムを用いた解析により、ロタウイルスのポリメラーゼが共存する条件では、ルシフェラーゼ産生が増加することを確認した。この結果は、改変した遺伝子導入方法でロタウイルスのレプリコンが作動していることを強く示唆した。そこで、全11分節遺伝子を断片化DNAとして細胞へ導入したが、現在まで感染性ウイルスの回収はできていない。

しかし、ロタウイルスのレプリコン系はこれまでに報告がなく、この方法の応用はロタウイルス遺伝子の転写・複製機構に関与すシス、トランス因子の解析を可能にし、病原性発現分子機構の解明に貢献することが期待できる。鳥ロタウイルスA(RVA)の哺乳類への病原性の分子機構を解明するため、初めに鳥RVAの遺伝的多様性を明らかにした。解読した鳥RVA3株と既知RVAのゲノムの全分節ORFについて比較解析した。我々が解読した2遺伝子が、ロタウイルス遺伝子型認定機関により新規遺伝子型に認定された。次に、哺乳動物に病原性を示す鳥RVA・PO-13株ゲノムの細胞内合成にT7プロモーターとpolIIプロモーターを用いた逆遺伝子操作系を作製した。いずれの方法でも、ウイルスを回収できなかった。しかし、polIIプロモーターを用いた系ではRVAレプリコンの構築が確認でき、細胞内でのウイルスの転写・複製の再現が示された。当初の計画では、PO-13株の11蛋白質に対する抗体作製が終了する計画であったが、6つの蛋白質に対する抗体作出が失敗したため、やや進行が遅れているとした。その他については、概ね計画通り研究が遂行されている。PO-13株の逆遺伝子操作系を確立するため、各種の遺伝子・蛋白質発現プラスミドの導入比率の検証を行なっていく。さらに、プラスミドを導入する培養細胞の種類についても、さらに検証を続ける。計11分節の遺伝子・蛋白質発現プラスミドからの蛋白質発現が低効率である可能性を考慮して、ウイルス複製に重要と考えられる蛋白質については、別にプラスミドを構築し、遺伝子・蛋白質発現プラスミドと共に細胞に導入する予定である。28年度が最終年度であるため、記入しない。人獣共通感染症遺伝子操作系の確立のためには、各ウイルス蛋白質の発現状況の把握が重要となる。従って、確立できなかった6蛋白質に対する抗体の作出を進める。T7プロモーターをCMVプロモーターに変更した発現プラスミドを使って発現状況を確認し、プラスミドからのウイルスの回収を試みる。回収が難しい場合、細胞の変更、ポリA付加シグナルの挿入などの工夫を加える。初年次に計画した抗体の確立に関し、その作出に時間を要し、年度をまたいでいるため28年度が最終年度であるため、記入しない。すでに6つの合成ペプチド抗体作出の発注を終えているため、5月には予算の消費が見込まれる。
カゼインキナーゼ1シグナル伝達系をターゲットにした難治性疼痛治療戦略

新規鎮痛薬開発ターゲットとして、脊髄および感覚神経に発現するカゼインキナーゼ1 (CK1)情報伝達系に着目し、その候補としてvacuolar-ATPase (vATPase)、およびWnt3a情報伝達系の可能性を評価した。その結果、vATPase阻害薬(バフィロマイシンA1)の脊髄くも膜下腔投与は、神経障害性疼痛の発症を抑制し、一方、Wnt3aくも膜下腔投与は、機械的疼痛を惹起した。また、CK1阻害薬のスクリーニング系を新たに構築し、新規CK1阻害薬を複数見出した。マウス疼痛行動に対するこれら阻害薬候補化合物の効果を検討したところ、良好な鎮痛効果を発揮する化合物が得られた。本(初)年度は、本研究の土台の一部となる成果を原著論文にまとめた(Kurihara et al., Mol Pain, 2014)。すなわち、炎症性疼痛発症におけるカゼインキナーゼ1活性化の役割に関する報告である。急性炎症性疼痛にはカラゲニンモデル、遷延性炎症性疼痛には完全アジュバント(CFA)モデルを用い、それぞれ投与後6時間、あるいは3日の時点に市販のCK1阻害薬(IC261)、あるいは新規CK1阻害薬(TG003)を髄腔内投与すると、両モデルにおける疼痛行動を濃度依存的に抑制した。しかし、カラゲニンあるいはCFAの投与は、脊髄およびDRGにおいて、CK1α、δおよびεアイソフォームタンパクの有意な発現上昇をもたらさなかった。そこで、これらCK1阻害薬の脊髄における作用メカニズムを検討するため、脊髄横断スライス標本を作製し、痛覚情報修飾に重要な脊髄後角膠様質ニューロンから膜電位固定下で自発性興奮性シナプス後電流(EPSC)、あるいは自発性抑制性シナプス後電流(IPSC)を、ホールセルパッチクランプ法を用いて記録した。コントロール群においては、両阻害薬(1 μM)の単独灌流適用はEPSC、IPSCの発生頻度、大きさ共に影響を与えなかった。一方、両炎症モデルにおいては、EPSCの頻度と大きさを有意に抑制したが(頻度をより顕著に抑制)、IPSCの頻度と大きさには影響しなかった。以上の結果から、カラゲニンあるいはCFAモデルマウスにおける脊髄痛覚伝達に、両起炎物質の炎症刺激がもたらすCK1活性化が寄与し、CK1阻害薬はこの活性化、特にEPSCの頻度をより顕著に抑制することから主にシナプス前における活性化を抑制することで鎮痛効果を示すことが推測された。またTG003を含めた複数の新規CK1阻害薬に関し、特許出願を行った(特願2013-261396)。本年度は、昨年度見出した複数の新規カゼインキナーゼ1阻害薬の鎮痛効果の特徴に関して検討を行い、中でも興味深い薬理学的特徴を示した1つの化合物Xに関して、集中的な解析を行った。化合物Xは髄腔内投与において特に炎症性疼痛(マウスカラゲニンモデルを用いた、機械的および熱性痛覚過敏現象)に対して低用量(1 pmol)でも強い鎮痛効果を示す化合物であった。そこで同疼痛モデルを用いて全身投与(腹腔内投与)の効果を検討したところ、比較的低濃度(1 mg/kg以下)でも鎮痛効果が認められた。そこで、腹腔内投与による鎮痛効果の薬理学的解析を行ったところ、カンナビノイド2受容体拮抗薬、末梢型オピオイド受容体拮抗薬、あるいはある種のニコチン性アセチルコリン受容体サブタイプ拮抗薬(これらの拮抗薬を化合物Xと同時腹腔内投与)により有意に鎮痛作用が抑制されたことから、鎮痛作用の一部は末梢に由来することが示唆された。さらに、霊長類疼痛モデルを用いて、化合物Xの鎮痛効果を検討した。カニクイザル収束光熱刺激誘発疼痛モデルは、オピオイド鎮痛薬が薬効を示すモデルとされるが、化合物X(10 mg/kg)の経口投与は、モルヒネ(10 mg/kg)あるいはプレガバリン(30 mg/kg)経口投与による鎮痛作用と同等以上の鎮痛効果を示した。すなわち、化合物Xは霊長類に対しても経口で有効性を示し、しかも現在まで目立った副作用を引き起こさないなど、新規鎮痛薬のリード化合物として有望であることが示唆された。今後は化合物Xの詳しい作用メカニズムを検討するとともに、中枢および末梢組織におけるカゼインキナーゼ1シグナル伝達と疼痛受容調節に関して更なる解析を継続する予定である。本年度も、これまで見出した複数の新規カゼインキナーゼ1(CK1)阻害薬の鎮痛効果の特徴に関して検討を行い、中でもマウス及びカニクイザルにてモルヒネと同等以上の鎮痛作用を示した化合物APX(昨年度の報告ではXと表記)に関して、臨床試験を見据えた検討を共同研究者とともに行った。その結果、急性毒性試験、反復経口投与試験、遺伝毒性試験等において、特に問題はみられないことを確認し、以下に述べる5つのAPX誘導体とともに、平成28年度「橋渡し研究加速ネットワークプログラム」シーズBに応募した。5つのAPX誘導体に関しても、マウス疼痛モデルを用いた検討が進行中である。現在まで、疼痛モデルとしてカラゲニンおよび完全アジュバント後肢投与モデル(いずれも炎症性疼痛モデル)を用い、機械的および熱性痛覚過敏現象を指標に、髄腔内投与で鎮痛効果が認められるか否かを検討した。その結果、いずれの誘導体も濃度依存的(0.1ー100 pmol)に、APXに匹敵する強い鎮痛効果を認めている。

今後は神経障害性疼痛モデルなど他のマウス疼痛モデルに対する効果を検討するとともに、全身投与(腹腔内投与、経口投与)でも効果を示すか、さらには霊長類に対しても有効性を示すか検討を行う。同時に、有害作用にも注意を払い、APXのバックアップ化合物候補として引き続き評価を継続する予定である。また、APXの鎮痛作用にはCK1阻害効果以外の寄与も示唆されているので、これらAPX化合物群のさらなる薬理学的特徴の検討とともに、中枢および末梢組織におけるCK1シグナル伝達と疼痛受容調節に関しての解析も継続する予定である。新規鎮痛薬開発ターゲットとして、脊髄および感覚神経に発現するカゼインキナーゼ1 (CK1)情報伝達系に着目し、その候補としてvacuolar-ATPase (vATPase)、およびWnt3a情報伝達系の可能性を評価した。その結果、vATPase阻害薬(バフィロマイシンA1)の脊髄くも膜下腔投与は、神経障害性疼痛の発症を抑制し、一方、Wnt3aくも膜下腔投与は、機械的疼痛を惹起した。また、CK1阻害薬のスクリーニング系を新たに構築し、新規CK1阻害薬を複数見出した。マウス疼痛行動に対するこれら阻害薬候補化合物の効果を検討したところ、良好な鎮痛効果を発揮する化合物が得られた。疼痛治療に有望な新規化合物を見出し、PCT出願を行った。本新規化合物は霊長類においても経口投与で鎮痛作用を示すとともに、薬効発現用量で副作用は目立った副作用は見られないなど、興味深い結果が得られつつある。医歯薬学各種疼痛モデルマウスを用い、研究計画書調書あるいは交付申請書に記載した各種薬物の効果を、引き続き疼痛行動学的・電気生理学的に解析を行うとともに、新たに見出された新規疼痛治療候補化合物の作用機序を検討していく予定である。本申請研究の土台の一部となる成果の一端を原著論文にまとめ、出版することができた。また疼痛治療に有望な新規カゼインキナーゼ1阻害薬を新たに見出し、特許出願を行った。現在原著論文にまとめている途中である。各種疼痛モデルを用い、研究計画調書あるいは交付申請書に記載した各種薬物の効果を疼痛行動学的・電気生理学的に引き続き解析・検討していく予定である。
サポニン類の新しい機能開発と応用に関する研究

種々のoleanene型トリテルペンサポニンを含有することが予想される生薬について、ラットにおけるグルコース負荷での血糖値上昇の抑制活性及びアルコール吸収抑制活性試験でスクリーニングした結果、延命皮(ムクロジ果皮)及び忍冬(スイカズラ地上部)のサポニン分画に強い活性を見い出した。延命皮について、上記の活性試験を指標に分離精製したところ、活性成分としてsapindoside A,B,MS-IIIなどのhederageninオリゴ配糖体を得た。また,忍冬からは、oleanolic acidオリゴ配糖体を単離し、構造を明らかにした。これらの活性サポニンについて、部分加水分解や電極酸化反応等による化学修飾を行い、得られた各種誘導体について活性を比較検討した。その結果、血糖値上昇の抑制活性やアルコール吸収抑制活性の発現には、oleanene型トリテルペンの28位カルボキシル基及び3位にグルクロン酸又は中性二糖の存在が必須であるなど、サポニン構造と活性について興味深い知見を見い出した。酸棗仁(サネブトナツメ、種子)から新規変形ダンマラン型トリテルペンサポニンjujuboside A_1,C,acetyljujuboside B,jujubaspinoside I,II,IIIを単離し、それらの構造を明らかにするとともに、ラット肥満細胞からの顕著なヒスタミン遊離抑制作用を有することを見い出した。また、三七人参やアメリカ人参から、notoginsenoside-A,-B,-C,-D,-E,-G,-H,-I,-J,-K及びquinquenoside I,II,IIIなどの新規ダンマラン型トリテルペンサポニンを得、これらサポニン類にマウスでの_<D->ガラクトサミンとリポ多糖での肝傷害の抑制活性のあることを明らかにするなど、サポニン類の新しい機能開発と応用に関する有用な知見を得ており、当初計画をほぼ完全に達成した。
Ewing肉腫におけるアポトーシス抑制機構の解明と分子標的治療の開発

Ewing肉腫(ES)は、骨軟部悪性腫瘍の中で最も生命予後不良な腫瘍である。ESでは染色体転座による特異的融合遺伝子EWS-Fli1みられるが、その発がん機構は不明であった。我々は、転写因子EWS-Fli1の標的遺伝子の同定を進め、G1/S期への移行に関わる細胞周期制御因子であるCyclinD1、CyclinE、p21、p27がEWS-Fli1の標的であることを明らかにした。ESにおいては、癌抑制遺伝子Rbとp53の遺伝子異常がほとんど見られないが、我々の研究結果からESにおいてはRb経路の抑制が起こっていると考えることができる。一方、世界的に見てもESにおけるp53経路の解析は行われておらず、特に、p53の重要な機能であるアポトーシス誘導に関しては全く不明である。本研究の目的は、1)ES細胞でのEWS-Fli1によるp53機能抑制、特にアポトーシス誘導の抑制の機構と、そこに関わるEWS-Fli1の標的遺伝子を明らかにし、2)それらの標的分子を阻害することでES細胞にアポトーシスを誘導できるか検討を加え、ESの新しい分子標的治療の開発につなげることである。EWS-Fli1融合遺伝子はESに特異的であり正常細胞には存在しない。本研究は、正常細胞に全く作用のないESに特異的な新しい治療法の開発につながる、極めて独創的かつ重要な研究である。本年度において我々は、ESにおけるEWS-Fli1によるp53機能抑制のメカニズムについて解析し、EWS-Fli1はp300およびp53と複合体を形成して、p300によるp53のアセチル化を抑制すること、これがp21などのp53標的遺伝子の発現誘導低下の原因であること、を明らかにした。すなわち、EWS-Fli1はp300の機能阻害を介してp53機能の一部を抑制している可能性が示された。しかし、一方で、EWS-Fli1がp300を介さずp53に直接結合しうる事も明らかとなり、EWS-Fli1によるp53機能の抑制機構は単純ではないことも判明した。従って、今後さらに強力に研究を推進し、EWS-Fli1によるp53阻害機構の全貌を明らかにしたいと考えている。
抗アセチルコリンレセプター抗体陰性、抗MuSK抗体陽性重症筋無力症患者の病態

全身型のMGの20%でAcetylcholine receptor(AChR)抗体の検出がなされない。この33%で抗筋特異的チロシンキナーゼ(MuSK)自己抗体陽性の患者が存在する。抗MuSK自己抗体陽性の患者の上腕二頭筋で筋生検を行い病理組織学的検討を行った。抗MuSK抗体が陽性MG患者の年齢は22歳から60歳で、男性1名、女性9名で女性に多く、眼瞼下垂や複視が認められ、嚥下障害や頭部挙上困難、呼吸不全の症状を呈した。筋病理では、抗AChR抗体陽性のMGと同様全例にTypeII fiberatrophyを認めた。また、抗MuSK抗体陽性患者では、抗AChR抗体陽性のMG患者に比べ、TypeI線維が萎縮している例が多かった。しかし、TypeIやTypeII線維の萎縮の程度と抗MuSK抗体価、運動終板の変化との間の相関は認めなかった。AChR抗体陽性のMG運動終板では全例にC3の沈着が認められた。MuSK抗体陽性患者10名中2名で補体は陽性であったが、8名は陰性であった。また、MuSK抗体陽性MGの運動終板のAChR量は比較的保たれていた。電子顕微鏡で観察した運動終板では、Postsynaptic areaが狭小化していたが、foldの破壊は認めなかった。マーカインで破壊したラットの再生筋に抗MuSK抗体が陽性MG患者の血清IgGとヘパリンを作用させ、運動終板の再生に対する影響を検討したが、光顕で観察する限り、MuSK発現量、AChR量に影響はなかった。MuSK抗体の病態発症機序は不明だが、TypeI線維の萎縮をきたし、抗AChR抗体陽性MGが補体介在性であるのとは異なり、別の機序で発症していて、MuSKは運動終板の形成維持に関与していると推察される。重症筋無力症(以下MG)患者の約20%では,血清抗アセチルコリン受容体抗体(以下抗AChR抗体)が検出されず,sero-negative MGとしてその病態機序の解明が進められている.2001年,Hochらは,運動終板に存在する筋特異的チロシンキナーゼ(muscle specific tyrosine kinase, MuSK)蛋白をsero-negative MGの標的抗原と考え,抗体測定を行った。その結果,sero-negative MG患者の5070%で抗MuSK抗体が検出されると報告している.本邦では、抗AChR抗体陰性重症筋無力症に抗MuSK抗体陽性患者の占める割合は約20%程度に認められる。患者は全例女性で、球麻痺や呼吸筋麻痺を来しやすい。また、抗AChR抗体陽性MGに比べ抗MuSK抗体陽性患者ではテンシロンテストの判定が困難で、また、臨床検査ではwaningも証明しにくい。また、抗MuSK抗体陽性患者では、従来のMGと比較して運動終板への補体の沈着もない。(7名中1名が補体の沈着あり、抗AChR抗体陽性MGではほぼ100%で陽性。また、抗AChR陽性MGに比較して、組織上の運動終板でαバンガロトキシンでラベルしたアセチルコリンレセプター量は、減少が少ない。運動終板での運動終板の微細構造は運動終板面積が減少するが、membrane densityの減少はない。神経終末のシュワン細胞に被われていない部分の長さに対する後シナプスのMembraneの長さの比を比べると、抗MuSK抗体陽性患者では減少している。MuSKはアグリンを介してアセチルコリン受容体の形成に関与していることと矛盾しない。

重症筋無力症の発症原因として、抗MuSK抗体も関与している。重症筋無力症は自己抗体と補体が関与する自己免疫疾患である。約80%の患者でニコチニックアセチルコリンレセプター(AChR)抗体が検出される。全身型の重症筋無力症の20%にAChR抗体の検出がなされない。しかし、免疫療法には反応する。AChR抗体陰性30名を対象とした。年齢は5歳から77歳まで男9名、女21名。診断は電気生理学的検査で反復電気刺激での10%の減少があった患者でテンシロンテスト陽性を呈したことで行った。MuSK抗体は^<125>IでラベルしたMuSKを使用して測定した。上腕二頭筋から筋生検は同意を得て行った。MuSK抗体陽性患者8名、眼筋型MG20名、全身型MG37名(II型24名、III型10名、IV型3名)、ランバート・イートン筋無力症候群5名、ボツリヌス中毒3名、筋萎縮性側索硬化症8名、正常患者8名を対象とした。運動終板はペルオキシダーゼでラベルしたαバンガロトキシンと抗C3抗体で染色した。また、電子顕微鏡観察の為に3%グルタールに固定し、エポンに包埋して観察した。結果は30名のAChR抗体陰性患者のうち、10名で抗MuSK抗体が陽性であり、22歳から60歳まであった。全員女性であり、眼瞼下垂や複視が認められ、嚥下障害や頭部挙上困難、呼吸不全の症状を呈した。AChR抗体陽性の重症筋無力症運動終板では全例にC3の沈着が認められた。MuSK抗体陽性患者8名中1名で補体は陽性であったが、7名は陰性であった。また、運動終板のペルオキシダーゼでラベルしたαバンガロトキシン量を半定量したが、重症筋無力症は低下していた。MuSK抗体陽性MGは眼筋型重症筋無力症と同じ程度に減少していた。電子顕微鏡で観察した運動終板では、Postsynaptic areaが狭小化していたが、flodの破壊は認めなかった。MuSK抗体の病態発症機序は不明だが、重症筋無力症が補体介在性であるのとは異なり、別の機序が関与しているのであろう。重症筋無力症(MG)は自己抗体と補体が関与する自己免疫疾患であり、約80%の患者でニコチニックアセチルコリンレセプター(AChR)抗体が検出される。しかし、全身型のMGの20%でAChR抗体の検出がなされない。この33%で抗筋特異的チロシンキナーゼ(MuSK)自己抗体陽性の患者が存在する。抗MuSK自己抗体陽性の患者の上腕二頭筋で筋生検を行い病理組織学的検討を行った。筋生検は患者の同意を得て行った。MuSK抗体陽性患者9名、抗AChR抗体陽性のMG患者10名、正常患者9名を対象とした。凍結切片を作成し、ルーチンATPase染色、他を行い検討した。また、電子顕微鏡観察も行った。抗MuSK抗体が陽性MG患者の年齢は22歳から60歳で、男性1名、女性9名で女性に多く、眼瞼下垂や複視が認められ、嚥下障害や頭部挙上困難、呼吸不全の症状を呈した。筋病理では、抗AChR抗体陽性のMGと同様全例にTypeII fiberatrophyを認めた。また、抗MuSK抗体陽性患者では、抗AChR抗体陽性のMG患者に比べ、TypeI線維が萎縮している例が多かった。
大型半潜水式浮体ユニットの急速結合法に関する研究

超大型半潜水式浮体を実現するためには、気象・海象の変化の影響を極力小さくするため、建設現場における工事期間を最短にする建設工法の開発が重要になる。そこで、本研究においては、現地に曳航されてきたユニットどうしの結合に、従来の溶接継手に替えて機械継手を採用するものとし、溶接継手と同じように全構造内力を伝達し、剛性もほぼ維持される、新しいアイデアに基づく機械継手の開発を目的とする。平成13年度には、種々のアイデアを検討してコンセプトとしてまとめ、これに基づいて継手の模型を作成し、甲板の格子構造と6本の円筒コラムから構成される半潜水式構造模型の甲板桁位置に装着して、波浪強制実験を実施した。この結果、開発した機械継手はほぼ満足する機能を有していることが確認された。これを受けて、平成14年度では、当初の計画を一部変更して、継手の基本構造内力伝達メカニズムを明らかにするとともに、外力として繰り返し荷重を作用させて、考えている機械継手の疲労現象に関わる劣化の様相の概略を知るために、水槽模型に比べ大型の継手模型を組み込んだ甲板桁模型を製作し、基本荷重実験と繰り返し荷重実験を実施した。この模型では、凹部構造と内部ブロックの接続部に挿入されているコイルバネのバネ力を測る12個の小型ロードセルを埋め込み、静的荷重として引張り、圧縮、サギング曲げ、ホギング曲げ、剪断、捻りの基本荷重を作用させて、内力伝達のメカニズムを把握した。また、30回の繰り返し引張り・圧縮荷重を加えたが、目立った劣化は現れず、繰り返し荷重にも十分な強度を有する可能性を示した。これらの結果、本研究で開発した機械継手は、実用化のために更なる研究を進める価値が高いことが判明した。平成13年度、14年度の2年間に渡る科学研究費補助金による研究計画の内、13年度実施予定の研究をほぼ計画通り実行した。則ち、半潜水式構造体ユニットの設置海域における結合を短期間に仕上げ、大型半潜水式浮体の建設を実現化するために、溶接継手に替える機械継手のコンセプトを創出した。この継手のコンセプトは、結合する二つのユニットの双方の甲板桁位置に作る二つの凹部構造、この両者へ跨がって挿入する凸部構造体、両者の間の空隙部に充填する充填材および凸部構造体と充填材の膨れ出しを防ぐための二つの蓋構造の主要4種類6要素から構成される。このようにすることにより、沖合における厳しい荒天状態の波浪荷重に耐える強度を有するとともに、沖合では、静穏と言えども想定せざるを得ない波浪状態においても結合作業が可能であり、結果として短期間に建設が完了することが期待出来る。これは大型浮体の実現性に関し基本的に重要な事柄である。格子構造の甲板と6本の円筒コラムから構成される、典型的コラム支持型の大型半潜水式浮体の部分模型2個を、甲板縦桁の位置に装着した機械継手模型によって結合して一体化した半潜水式浮体模型を製作した。大型角水槽において、この模型の縦波状態での波浪強制実験を行った。コラム上の12点における鉛直変位、中央点における2方向水平変位、重要点における甲板桁材の歪の計測を行い、それぞれの周波数応答関数を得た。また、機械継手の替わりに桁要素で剛結された模型についても波浪強制実験を実施した。一方、研究代表者等が開発した、半潜水式浮体の波浪応答解析プログラムVODACによって周波数応答関数を求めた。これらの比較から、開発した機械継手模型は剛結の場合とほぼ同様の構造内力を伝達できることが分かった。

そこで、本研究においては、現地に曳航されてきたユニットどうしの結合に、従来の溶接継手に替えて機械継手を採用するものとし、溶接継手と同じように全構造内力を伝達し、剛性もほぼ維持される、新しいアイデアに基づく機械継手の開発を目的とする。初年度である平成13年度には、研究目的に適う機械継手について種々のアイデアを検討し、有効なアイデアをコンセプトとしてまとめた。これは、結合する二つのユニット双方の甲板桁位置に設ける凹部構造、この両者へ跨がって挿入する凸部構造体(内部ブロック)、両者の間の空隙を充填する多数の小球状充填材と蓋部構造から構成されている。この継手の模型を、甲板の格子構造と6本の円筒コラムから構成される半潜水式構造模型の甲板桁位置に装着して、波浪強制実験を実施した。この結果、開発した機械継手はほぼ満足する機能を有していることが確認された。これを受けて、平成14年度では、当初の計画を一部変更して、継手の基本構造内力伝達メカニズムを明らかにするとともに、外力として繰り返し荷重を作用させて、考えている機械継手の疲労現象に関わる劣化の様相の概略を知るために、水槽模型に比べ大型の継手模型を製作し、凹部構造と内部ブロックの接続部に挿入されているコイルバネのバネ力を測る12個の小型ロードセルを内装し、静的荷重として引張り、圧縮、サギング曲げ、ホギング曲げ、剪断、捻りの基本荷重を作用させて、内力伝達のメカニズムを把握した。また、30回の繰り返し引張り・圧縮荷重を加えたが、目立った劣化は現れず、繰り返し荷重にも十分な強度を有する可能性を示した。これらの結果、本研究で開発した機械継手は、実用化のために更なる研究を進める価値が高いことが判明した。
紅藻類に含まれるフグ寄生性カイアシ類の新規駆虫成分に関する研究

魚類寄生性カイアシ類(動物プランクトン)は魚類の組織、血液などを栄養源とし、特にフグ養殖業に大きな損害を与えていることから、安全な駆虫剤の開発が急務とされている。海藻を対象にフグ寄生性カイアシ類Pseudocaligus fuguに対する駆虫物質の探索研究を行い、マクリ"海人草"Diginea simplex(紅藻類)の水抽出物から二つの駆虫活性成分を単離することができた。一つは興奮性アミノ酸の一種であるカイニン酸(C_<10>H_<15>NO_4,分子量; 213)であり、もう一つは、高速液体クロマトグラフ及び質量分析などの機器分析の結果からカイニン酸と同様の分子量をもつ新たな異性体であることが推定された。近年、日本では、高級魚として知られるトラフグTakifugu rubripesの養殖が九州地方を中心に盛んに行われているが、一方で、魚体に寄生虫が付着しやすいため、その対策が養殖業者にとって大きな課題となっている。このうち、寄生性カイアシ類Caligidae(カリグス科)とその近縁のカイアシ類は魚体表面やエラに付着し、組織、血液などを栄養源とするため消費者からの苦情の原因となったり、吸血部位から細菌感染をおこし組織が破壊され商品価値を落としたりする。現在、寄生性カイアシ類は、フグ以外にも世界の水産業に年間数億ドルの損害を与えているが、これまでのところ効果的な駆虫法がなく、安全な駆虫剤の開発が急務とされている。このような観点から寄生性カイアシ類に対する駆虫活性成分のスクリーニングを目的として、海藻の粗抽出液を添加した海水中で数種カイアシ類の寄生したクサフグを飼育したところ、紅藻類の一部にPseudocaligus fuguなどに代表されるフグ寄生性カイアシ類に対して、高い駆虫効果が認められた。これらの成分は、新たなフグ類をはじめとする魚類寄生虫駆虫剤を開発する上でのリーディングコンパウンドになる可能性があることから、本研究ではその基礎データを入手することを目的としている。そこで本年度は、まず、本研究を円滑に遂行する上で、必要となる駆虫活性スクリーニングの対象となる数種の紅藻類の採集と活性のスクリーニングを中心に行った。すなわち、平成20年6月18目、沖縄県石垣市川平湾沖のリーフの複数の地点において、カイニン酸を多量に含有するカイニンソウ(マクリDigenea simplex)を採取するとともに、未同定の海藻5種を採取し、粗抽出液を用いた駆虫活性のスクリーニングを行ったところ、主にカイニンソウに効果の期待できる駆虫活性が確認された。含まれる駆虫成分の特定やその含有量などについて引き続き研究を進めている。また、平成20年9月8日フィリピンセブ島の北部海域においても紅藻類を含む数種の海藻を採取し、同様に魚類寄生虫に対する駆虫活性のスクリーニングを行った。魚類寄生虫であるカリグス科とその近縁種のカイアシ類は魚類の組織、血液などを栄養源としており、世界の水産業に巨額の損害を与えているが、その効果的な駆除法はなく、安全な駆虫剤の開発が急務とされている。このような社会情勢のもと、海藻の当該寄生虫に対する駆虫活性を数種カイアシ類の寄生したクサフグTakifugu niphoblesを用いて調べたところ紅藻類のいくつかにきわめて高い駆虫活性が認められた。本研究課題では、これらの成分を単離し、その化学構造や駆虫活性の詳細を調べるとともに、同様の興奮性アミノ酸の一種であるドウモイ酸やカイニン酸などの既知成分との化学構造の比較から構造活性相関も視野に入れた新たなフグ類をはじめとする魚類寄生虫駆虫剤を開発する上での基礎データを入手することを目的としている。今年度は、主として、前年度の研究成果をもとに、主として駆虫活性成分の単離を中心に研究を進めた。試料には、2009年6月に沖縄県石垣島のリーフにて採取したマクリ[海人草(カイニンソウ)]Digenea simplex 2000g(湿重量)を用い、液体窒素による凍結後、藻体を粉砕し、蒸留水による浸せきにより活性成分を抽出した。引き続き、得られた粗抽出液を透析チューブ(3500 cut off)に入れ、蒸留水に対して充分透析し、透析外液を減圧濃縮後、活性炭クロマトグラフィー、ODSクロマトグラフィー(日本精密科学)により活性画分を得た。最後に、得られた活性画分をBio-Gel P-2カラム(φ20×300mm)に負荷し、0.03M酢酸にて活性成分の分画(Fr.1100,5mL/Fr.)を行った。

その結果、マクリには、少なくとも3つの活性成分が存在し、Fr.1219には、2つの大きな画分Fr.I,Fr.IIがあり、TLC、HPLCによる分析結果からそのうちの1つがカイニン酸であることが判明した。一方、Fr.80以降にも2つのピーク(Fr.III,Fr.IV)が認められたが成分の特定には至らなかった。これら未同定成分の早急な特定と活性評価を行う予定である。本研究では、紅藻類に含まれる生理活性物質探索の一環として、紅藻類を対象にフグ寄生性カイアシ類P.fuguの駆虫物質の探索研究を行い、今年度は活性成分を単離することができたのでその諸性状に検討を加えた。活性成分の精製過程において、ODSカラムクロマトグラフィーにより溶出した1%AcOH-10%CH_3CN画分(Fr.I)、H_2O画分(Fr.II)、MeOH画分(Fr.III)を薄層クロマトグラフィー(TLC)に供したところ、Fr.Iは、カイニン酸(Rf=0.30)を主成分としていたが、既知アミノ酸10成分とRf値の一致しない未同定成分(Rf=0.53)を含むなどその組成は特徴的なものであった。また、100%MeOHで溶出したFr.IIIは、Rf値がカイニン酸(Rf=0.30)と一致する1成分のみを含んでいた。次に、Fr.I-IIIをLC-MS分析に供した。Fr.I-IIIの各画分からカイニン酸が検出されたが、一方、カイニン酸(m/z=214)クロマトグラムに関して、Fr.II,IIIとカイニン酸標準溶液との保持時間において明らかな相違が見られた。さらに、Fr.IIIをカイニン酸アナライザーに供したところ、標準溶液と一致するピーク(保持時間9分)と同時に異なるピーク(同11分)が検出された。以上の結果から、今回の精製過程を通して、カイニン酸異性体と考えられる成分を単離できる可能性が期待された。紅藻類マクリD.simplexには、フグ寄生性カイアシ類P.fuguやマダイ寄生性カイアシ類に対する駆虫活性成分が含まれ、その主成分は興奮性アミノ酸の一種であるカイニン酸(C_<10>H_<15>NO_4、分子量213)であることが示された。一方、マクリにはカイニン酸以外に分子量(213)を同じくする異性体、すなわち、LC-MSでは、カイニン酸としてm/z=214(M+H)^+が観測されるが、保持時間が異なるにもかかわらず同様にm/z=214(M+H)^+が観測される成分の存在することが、確認された。この成分の存在はHPLC、LC-MS,NMRによっても支持された。本異性体の構造活性相関の解明が新薬(寄生虫駆除薬)の開発の鍵となるであろう。