hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ラマン分光による短寿命分子種の研究

下記のように,二つの方向での研究を行った。1.生体内及び抽出されたカロテノイドの電子励起状態によるピコ秒時間分解共鳴ラマン散乱光合成細菌クロマチウム・ビノスムの光捕集色素・蛋白質複合体に含まれているカロテノイドであるスピリロキサンチンについて,生体膜(クロマトフォア)に含まれている状態と抽出したのちベンゼン溶液とした状態でピコ秒時間分解共鳴ラマンスペクトルを測定した。その結果から,最低励起一重項状態,最低励起三重項状態,基底状態におけるこの分子の動的挙動について多くの有用な情報が得られた。とくに,最低励起一重項状態は基底状態と同じ全対称(に近い)の対称性をもっているため,吸収やけい光の測定からは情報を得ることが困難な励起状態であり,この点でピコ秒時間分解共鳴ラマン分光法は極めて有用な手法である。最低励起一重項状態と基底状態からのラマンバンドについて,強度の時間依存性を比較すると,最低励起一重項状態から基底状態の高振動励起状態への直接の緩和が起き,それは50ピコ秒以内で完了することが明らかとなった。この測定で得られる基底状態からのラマンバンドは,室温での通常のラマン測定で得られるラマンバンドに比較して幅が広く,また非対称な形状をもっている。この事実は,基底状態の高振動励起状態に過渡的に存在する分子数がふえていることを意味する。また,生体内でのスピリロキサンチンについては,励起一重項状態から励起三重項状態が生成することが認められたが,抽出物については認められなかった。この事実は,生体内でスピリロキサンチン2分子が極めて近い位置に存在しており,励起一重項状態と基底状態とからいわゆるフィッション過程によって励起三重項状態が生成する可能性があることを示唆している。生体内スピリロキサンチンの励起一重項状態の緩和速度は,ベンゼン溶液中でのそれよりも速い。これは,生体内では上記のような緩和過程の他に,バクテリオクロロフィルにエネルギ-を渡すことによる緩和過程も存在していることに対応している。以上のような実験結果に加えて,生体内スピリロキサンチンについては,コヒ-レントスト-クスラマン散乱が観測された。これはやゝ異常な結果であるが,生体試料溶液が若干のにごりをもっており,これによって位相整合条件が見かけ上成立していないような場合でも,コヒ-レントスト-クスラマン散乱が観測されたものと考えることができる。2.生体内及び抽出されたカロテノイドにおける振動緩和上記の研究で用いたのと同じ生体内カロテノイド試料とベンゼン溶液について,ピコ秒時間分解アンチスト-クスラマン散乱を測定した。このアンチスト-クスラマン散乱は,励起一重項状態からの緩和によって生成する基底状態の高振動励起分子に由来するもので,その散乱強度の時間依存性から励起一重項からの緩和速度と基底状態における振動緩和の速度に関する情報が得られた。ベンゼン溶液中では,アンチスト-クスラマン散乱強度はレ-ザ-パルス光で励起後約10ピコ秒で最大となり,その後減衰するが,その減衰速度は約15ピコ秒である。生体試料については,全体の傾向は同様であるが,最大強度に達するまでの時間がベンゼン溶液に比べて短く(約8ピコ秒),その後の減衰速度はほぼ同じである。このような結果は既に得られた励起一重項状態からの緩和過程に関する知見と矛盾せず,カロテノイドの電子励起状態全体に関する描像をより明確化することに役立った。また,アンチスト-クスラマン散乱バンドのピ-ク波数を精密に測定すると,励起一重項状態からの緩和で生成する基底状態の高振動励起状態が振動量子数4以上のものであることが明らかとなった。今後,このようなアンチスト-クスラマン散乱の精密測定から,種々の分子について励起状態及び基底状態の緩和機構に関する多くの有用な知見を得ることができると期待される。

この事実は,生体内でスピリロキサンチン2分子が極めて近い位置に存在しており,励起一重項状態と基底状態とからいわゆるフィッション過程によって励起三重項状態が生成する可能性があることを示唆している。生体内スピリロキサンチンの励起一重項状態の緩和速度は,ベンゼン溶液中でのそれよりも速い。これは,生体内では上記のような緩和過程の他に,バクテリオクロロフィルにエネルギ-を渡すことによる緩和過程も存在していることに対応している。以上のような実験結果に加えて,生体内スピリロキサンチンについては,コヒ-レントスト-クスラマン散乱が観測された。これはやゝ異常な結果であるが,生体試料溶液が若干のにごりをもっており,これによって位相整合条件が見かけ上成立していないような場合でも,コヒ-レントスト-クスラマン散乱が観測されたものと考えることができる。2.生体内及び抽出されたカロテノイドにおける振動緩和上記の研究で用いたのと同じ生体内カロテノイド試料とベンゼン溶液について,ピコ秒時間分解アンチスト-クスラマン散乱を測定した。このアンチスト-クスラマン散乱は,励起一重項状態からの緩和によって生成する基底状態の高振動励起分子に由来するもので,その散乱強度の時間依存性から励起一重項からの緩和速度と基底状態における振動緩和の速度に関する情報が得られた。ベンゼン溶液中では,アンチスト-クスラマン散乱強度はレ-ザ-パルス光で励起後約10ピコ秒で最大となり,その後減衰するが,その減衰速度は約15ピコ秒である。生体試料については,全体の傾向は同様であるが,最大強度に達するまでの時間がベンゼン溶液に比べて短く(約8ピコ秒),その後の減衰速度はほぼ同じである。このような結果は既に得られた励起一重項状態からの緩和過程に関する知見と矛盾せず,カロテノイドの電子励起状態全体に関する描像をより明確化することに役立った。また,アンチスト-クスラマン散乱バンドのピ-ク波数を精密に測定すると,励起一重項状態からの緩和で生成する基底状態の高振動励起状態が振動量子数4以上のものであることが明らかとなった。今後,このようなアンチスト-クスラマン散乱の精密測定から,種々の分子について励起状態及び基底状態の緩和機構に関する多くの有用な知見を得ることができると期待される。
中性子過剰核の特異な構造を通じた核子間対相互作用の解明

本研究の目的は、Mg同位体の系統的な準位構造の解明を行うことで、中性子過剰な原子核の構造を明らかにすることである。特に、本研究では中性子過剰な31Mgの準位構造を詳細に調べた。31Mgを含む中性子過剰な中性子数20近傍の質量領域は、安定核付近の原子核構造を非常によく説明してきた殻模型では説明できない状態が報告されており、注目を集めている。その構造を解き明かすために、様々な手法を用いて実験が行われてきた。しかし、31Mgについて詳細に明らかになっているのはほぼ基底状態に限られ、励起状態については基本的物理量であるスピン・パリティさえわかっていなかった。本研究では、昨年度カナダのTRIUMF研究所で、スピンを空間的にそろえた31Naのベータ崩壊によりそこから放出されるベータ線の非対称度を測定し、31Mgの励起状態のスピン・パリティを一度に決定する実験を行った。その解析の結果、31Mgの励起状態の5つの正パリティの状態のスピンを決定し、それに加え、過去に報告されていなかった11のガンマ遷移と2つの励起状態を新たに発見した。実験では31Mgに加えて、30Mgについてもデータを得ることができ、新たに3つの状態についてスピン・パリティを決定するなど大幅に準位構造を更新した。得られた準位構造について、その構造を調べるため理論計算と比較を行い、それぞれ30Mgと31Mgの励起状態における特徴的な構造が明らかとなった。30Mgでは、殻模型で説明できる状態と大きく変形した状態が比較的近い励起エネルギーで混在していることが分かった。31Mgでは、大きく変形した状態やそれが回転運動をしているという集団運動状態が低励起に存在するとともに、殻模型的な状態もやや高い励起エネルギーに存在していることが明らかとなった。27年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では中性子過剰な原子核である^<31>Mgの崩壊様式を詳細かつ精密に決定することによって、中性子過剰な質量領域の原子核での核子間の相互作用についての知見を深めることを目的としている。^<31>Mgを含むその周辺核は、中性子数20の魔法数の消失をはじめ、安定な原子核の構造を非常によく説明してきた殻模型では全く予見していない現象が次々に発見されており、「Island of Inversion」と呼ばれ様々な議論を呼んでいる原子核領域である。この領域の原子核構造を詳細に調べ、安定核と中性子過剰核での相互作用の違いを明らかにすることは、この領域だけでなく全原子核における原子核構造の統一的な理解の大きな一歩である。今年度はカナダで予定されている^<31>Mgの構造解明実験遂行のために必要な装置開発や様々な検出器や回路のテスト・メンテナンスなどを行った。^<31>Mgの構造解明には中性子の測定が非常に有効であることが新たにわかり、中性子検出器のテストも同時に行った。昨年12月には大阪大学核物理研究センターにおいて不安定核ビームを用いた中性子検出器の予備実験も行った。予備実験後すぐに1ヶ月間TRIUMFに滞在し、実際に開発した装置や検出器・回路系の組み上げを行った。その過程で必要となった装置などの改良・開発などもほぼ終了し、26年の^<31>Mgの実験のための事前準備を25年度内にほぼ完了させることができた。26年3月よりTRIUMFに滞在し、新たに製作した装置・検出器の組み上げや現地の研究者と実験実施のための細かな調整を行っている。本研究は中性子過剰な原子核である31Mgの準位構造を詳細に決定することにより、中性子過剰な質量領域の原子核において核子間の相互作用について知見を深めることを目的としている。31Mgを含む質量領域は、"island of inversion"と呼ばれ、中性子魔法数20の破れなど様々な特異な原子核構造が発見され、現在も盛んに研究されている原子核領域である。しかし、様々な実験・研究が行われてきたにも関わらず、基本的な物理量であるスピン・パリティに関して明らかになっているのはほぼ基底状態のみに限られる。研究対象としている31Mgに関しても、スピン・パリティが実験的に確定している状態は基底状態のみであった。本研究では偏極した31Naのベータ崩壊のベータ線の非対称度およびガンマ線・中性子を測定し31Mgの励起状態のスピン・パリティを効果的に決定する手法を用いて実験を行った。実験は世界最高偏極の31Naビームを得られるカナダのTRIUMFで行った。2015年4-5月にかけてTRIUMFに滞在し、検出器等の調整を行った。2015年8月に再びTRIUMFに出張し、検出器等の最終調整・ビームタイムに向けての最終準備を行い、8月27日から9月2日までの6日間に31Mgの励起状態スピン・パリティ決定実験を行った。得られたデータの詳細な解析の結果、31Mgの5つの励起状態に対して新たにスピン・パリティの決定、それに加えて新たな11つのガンマ遷移、2つの励起状態を発見した。今後はそれらを元に、31Mgの原子核構造の議論を行う予定である。

31Mgを含む中性子過剰な中性子数20近傍の質量領域は、安定核付近の原子核構造を非常によく説明してきた殻模型では説明できない状態が報告されており、注目を集めている。その構造を解き明かすために、様々な手法を用いて実験が行われてきた。しかし、31Mgについて詳細に明らかになっているのはほぼ基底状態に限られ、励起状態については基本的物理量であるスピン・パリティさえわかっていなかった。本研究では、昨年度カナダのTRIUMF研究所で、スピンを空間的にそろえた31Naのベータ崩壊によりそこから放出されるベータ線の非対称度を測定し、31Mgの励起状態のスピン・パリティを一度に決定する実験を行った。その解析の結果、31Mgの励起状態の5つの正パリティの状態のスピンを決定し、それに加え、過去に報告されていなかった11のガンマ遷移と2つの励起状態を新たに発見した。実験では31Mgに加えて、30Mgについてもデータを得ることができ、新たに3つの状態についてスピン・パリティを決定するなど大幅に準位構造を更新した。得られた準位構造について、その構造を調べるため理論計算と比較を行い、それぞれ30Mgと31Mgの励起状態における特徴的な構造が明らかとなった。30Mgでは、殻模型で説明できる状態と大きく変形した状態が比較的近い励起エネルギーで混在していることが分かった。31Mgでは、大きく変形した状態やそれが回転運動をしているという集団運動状態が低励起に存在するとともに、殻模型的な状態もやや高い励起エネルギーに存在していることが明らかとなった。本研究の中核となる31Mgのスピン・パリティ決定実験もすでに完了し、目的であった31Mgの励起状態のスピン・パリティに関しても5つの状態に対して明らかにした。それに加えて、検出器の調整のために収集した30Mgに関しても短時間のデータ収集にも関わらず、過去のデータを上回る統計量が得られた。30Mgに関しても、準位構造を明らかにできる見込みであり、より詳細なMg同位体の系統的研究が可能になった。27年度が最終年度であるため、記入しない。今後、理論計算と比較しながら31Mgの構造の理解を進めていく予定である。それに加え中性子測定によって、31Mgの中性子分離エネルギーより高いエネルギー準位についても準位構造を決定できる見込みであり、その解析を進めていく。その後、投稿論文としてまとめる予定である。今年度^<31>Mgの構造解明実験を実施する予定であったが、TRIUMFでの^<31>Naのビームタイムが来年度に割り当てられたため。しかし、現在検出器系のアップグレードを実施中であり、当初の予定よりもデータの収集効率を向上できる見込みである。2013年12月を予定していた^<31>Naのビームタイムが2014年8月となったため、^<31>Mgに関するデータの取得に遅れが生じる見込みであるが、その間検出器系のアップグレードを実施中である。特に今まではガンマ線、ベータ線のみを測定する予定であったが、^<31>Mgの構造解明には中性子の測定が非常に有効であるということが新たにわかり、中性子も検出可能な検出器システムを新たに構築中である。中性子検出器を用いた予備実験は大阪大学核物理研究センターにおいてすでに完了しており、現在は現地での動作テスト・組み上げ作業を残すのみである。
尿細管細胞の再生またはEMTを決定するマスター制御因子の解明

TF-inducible hESバンクを用いた遺伝子発現比較解析から、腎臓前駆細胞への分化誘導にかかわる転写因子を同定した。4つの転写因子を合成mRNAの形でヒトES細胞に遺伝子導入し、さらに別の4因子を2日間添加し3次元培養を行う事で、分化誘導開始後14日目に足細胞、近位尿細管細胞、遠位尿細管細胞の特徴を有した、ネフロン様構造を有する腎オルガノイドを分化誘導できた。TF-inducible ES細胞バンクのin silicoスクリーニングで、尿細管への分化を促す転写調節因子の候補転写因子を見つけることができ、その転写調節因子の合成mRNAをES細胞に加えることで、尿細管細胞への分化誘導を短期間で効率的に行えることを見いだすことができた。現在、確認のための検証をおこなっている。(2)腎尿細管EMTに関与するmiRNAの解析ヒト尿細管細胞株(HKC-8)を用いたマイクロアレイ解析から、miR-363がHKC-8においてEMTを促進することを見いだした。miR-363をHKC-8細胞に過剰発現すると、間葉系細胞の性質を獲得し、上皮頚細胞の性質を失うことが確認できた。さらに、スクラッチアッセイにおいて、miR-363はヒト尿細管細胞の遊走を促進することが明らかになった。miR-363の下流にはTWIST/canonical WNT pathwayが存在し、IWR-1によるcanonical WNTの抑制がmiR-363によるEMTの誘導を弱めることから、miR-363によるヒト尿細管細胞におけるEMTの誘導は、TWIST/canonical WNT pathwayの発現上昇を介していると結論づけた。この結果を、Clinical Experimental Nephrology誌に報告した。miRに関する研究は当初の目標を超え、論文投稿までおこなえた。TF-inducible ESバンクを用いた、新たな尿細管細胞の分化誘導に関しても有望な候補転写因子を見つけられており、順調に進展していると考えられる。連携研究者の慶應義塾大学医学部システム医学教室洪教授らの作成した網羅的転写因子遺伝子解析データから、腎尿細管細胞分化に関わる転写因子の同定に成功し、ある転写因子(論文投稿前のため、転写因子Xとする)をTF-inducible ES細胞で過剰発現することによりKSP, AQP1, MEGALIN陽性の近位尿細管様細胞への分化誘導に成功した。さらに、転写因子Xを含めた複数の転写因子の合成mRNAを作成し、ヒトES細胞に導入することで培養開始よりわずか9日で近位尿細管様細胞のみならず遠位尿細管様細胞を含めた腎尿細管様細胞の分化誘導に成功した。特に、これら複数の転写因子群を用いた誘導方法では、誘導開始2日目には既に腎前駆細胞のマーカーであるPAX8、LHX1の上昇を認めており、これらは腎前駆細胞としてのポテンシャルを持った細胞群と考えられた。この方法では、高効率に尿細管細胞への分化を促すことができる上に、前駆細胞を含むため今後の移植医療、Drug screeningを含めた臨床グレードへの応用が期待できる。本研究成果を、投稿するために、準備中である。連携研究者の慶應義塾大学医学部システム医学教室洪教授らの作成した網羅的転写因子遺伝子解析データから、腎尿細管細胞分化に関わる転写因子を同定に成功し、ある転写因子(論文投稿前のため、転写因子Xとする)の過剰発現によりKSP, AQP1, MEGALIN陽性の近位尿細管様細胞への分化誘導に成功した。さらに、転写因子Xを含めた複数の転写因子の合成mRNAをヒトES細胞に導入することで培養開始よりわずか9日で近位尿細管様細胞のみならず遠位尿細管様細胞を含めた腎尿細管様細胞の分化誘導に成功した。アメリカ腎臓学会などで報告をおこない、現在、投稿準備中である。micro RNAを介した腎尿細管障害の病態解明と腎線維化の抑制に関しては、研究成果を論文として発表したので、今年度は、TF-inducible ES細胞バンクを用いた尿細管マスター制御因子の同定と、転写因子の導入によるES細胞由来尿細管細胞の分化誘導方法を確立することを主眼に実験を遂行した。連携研究者の慶應義塾大学医学部システム医学教室洪教授らの作成した網羅的転写因子遺伝子解析データから、腎臓前駆細胞への分化を促進すると考えられる転写因子を14個、ネフロン上皮細胞への分化を促進すると考えられる転写因子を17個同定することができた。腎臓前駆細胞への分化を促進すると考えられた14個の転写因子のうち、SIX2+SALL1+となる最適な組み合わせをqPCR及び免疫染色、Flow cytometryを用いて検証したところ、4つの転写因子A, B, C, Dを同時に導入することで、誘導開始後わずか2日間で92%と高効率にSIX2+SALL1+ネフロン前駆細胞を誘導することができた。次に、ネフロン前駆細胞からネフロン上皮細胞への分化を促進するため、in silico解析で得られた候補転写因子17個を、合成mRNAとして上記で得られたSIX2+SALL1+のネフロン前駆細胞に過剰発現させた。低接着dishにて3次元培養を行った結果、E, F, G, Hの4因子を導入すると14日間で最も効率良くPODXL陽性足細胞、LTL陽性近位尿細管、CDH1陽性遠位尿細管からなるネフロン様構造を誘導できる事が分かった。この方法で作成された腎臓前駆細胞ならびに腎オルガノイドは、腎臓の再生医療への応用が期待されるだけでなく、腎疾患モデリングの新たなプラットフォームとして利用でき、CKDの新たな治療法の開発に役立つと考えられる。現在、本研究成果は、論文投稿中である。

TF-inducible hESバンクを用いた遺伝子発現比較解析から、腎臓前駆細胞への分化誘導にかかわる転写因子を同定した。4つの転写因子を合成mRNAの形でヒトES細胞に遺伝子導入し、さらに別の4因子を2日間添加し3次元培養を行う事で、分化誘導開始後14日目に足細胞、近位尿細管細胞、遠位尿細管細胞の特徴を有した、ネフロン様構造を有する腎オルガノイドを分化誘導できた。miRに関する研究は当初の目標を達成できた。今後は、TF-inducible ESバンクを用いた、新たな尿細管細胞の分化誘導を中心に研究を進める。TF-inducible ES細胞バンクを用いた尿細管細胞の分化誘導方法の確立について、論文投稿を行うとともに、必要な追加実験をおこなう。それとともに、尿細管前駆細胞分化誘導法を用いた発展的な研究に取り組む。具体的には、線維芽細胞に直接合成mRNAを添加することで、ダイレクトリプログラミングをおこすことを検討する。ダイレクトリプログラミング方法が確立できれば、皮膚からの線維芽細胞を採取するだけで、尿細管細胞に分化させることができるため、より臨床応用への可能性が高まる。腎臓内科学miRに関する研究は当初の目標を超え、論文投稿までおこなえたが、論文投稿の際の追加実験が当初の予定より、少なく済んだため。2つのプロジェクトのうち、1つが、予想より、早く成果が得られ、学会誌に発表できたため、今年度は、TF-inducible ES細胞バンクを用いた尿細管細胞の分化誘導方法の確立に専念した。micro RNAに関しては、消耗品費用がかなりかさむと予想されたが、そのプロジェクトの追加実験などが不要となったために、消耗品費用が少なく抑えられた。一方で、尿細管前駆細胞分化誘導法についての研究は来年度に消耗品費用が必要となるため、次年度に使用額をまわした。今年度以降は、TF-inducible ESバンクを用いた、新たな尿細管細胞の分化誘導に実験を集中する。すでに有望な候補転写因子を見つけられているので、それらの転写因子を用いた尿細管細胞の分化誘導実験をおこない、論文投稿を目指す。
末梢神経の髄鞘成熟における転写因子Soxファミリーの機能解析

前年の結果より、シュワン細胞において転写因子Sox10のターゲット分子としてS100Bが新たに同定された。S100B分子はカルシウム結合能を有する細胞内分子として、シュワン細胞に特徴的に発現することが古くから知られているが、その機能については未知であった。本研究の目的である、Sox転写因子群のシュワン細胞分化に於ける役割を解析する、という視点から、本年度はまずS100Bの機能解析を行った。まず、S100Bの過剰発現系およびshRNAを用いた発現抑制系を確立した。そして、シュワン細胞初代培養系に遺伝子導入したのちに、細胞増殖および細胞分化を観察することでS100Bの機能を観察した。その結果、S100Bの発現抑制は細胞増殖を促進することが明らかとなり、この結果はS100Bが細胞増殖に対し抑制的に機能することを示唆していた。培養細胞の実験からSox10およびそれによって誘導されるS100Bはシュワン細胞の増殖を抑制し、分化を促進することが予想されたため、個体レベルの発生過程でのSox10,S100Bの機能に着目した。胎生期から成体に至るまでラット坐骨神経サンプルを採取し、発現遺伝子解析を行ったところ、Sox10,S100Bともに髄鞘が形成される出生前後から発現上昇が見られ、その発現は成体になるまで維持されていた。このことはS100Bの発現が髄鞘形成およびその維持の時期に発現することで増殖を抑制し、分化形態を維持していることを示していると考えた。以上の結果より再生医療などの場面でシュワン細胞による髄鞘形成誘導に際してはSox10,S100Bは共に高い発現レベルで維持されているべきである、という新たな知見を得ることができた。始めに解析の対象となるSox9,10の発現ベクターおよび発現抑制のためのshRNAベクターの構築を行った。shRNAの導入によってシュワン細胞内在性のSox10は1/5まで抑制することが可能となった。また、シュワン細胞に発現するSox9,10量を定量PCRによって測定したところ、Sox9の発現量はSox10に比べ1/10以下と極めて少量であることも分かり、シュワン細胞の分化がSoxファミリーの中で主としてSox10によって制御されていることが示唆された。Sox10の過剰発現はシュワン細胞の細胞マーカーでもあるS100Bを誘導し、逆にshRNAによるSox10抑制によってS100Bの発現が減少した。このことからシュワン細胞を特徴付けているS100B分子がSox10の制御下にあることが示唆された。さらにS100Bの転写調節領域をルシフェラーゼ・レポーターに組み込んで解析したところ、複数のSox10結合領域が同定された。初年度の結果からSox10は未分化シュワン細胞のS100B分子の制御を介し、その細胞特性を形作っていることが示唆された。
超音波を利用した最重度難聴者のためのコミュニケーションエイドに関する基礎的研究

超音波聴覚の中枢、末梢のメカニズムの研究を行い以下の成果を得た。1.中枢メカニズムの研究(1)ポジトロン断層法(PET)による検討健聴成人男性9名と最重度難聴者5名を対象に、骨導超音波刺激・可聴音刺激による脳内局所血流量の増加をPET(PETscanner ADVANCE)により測定した。その結果、骨導超音波刺激によって有意に賦活された部位は左一次聴覚野内側部であった。超音波刺激によって聴覚野が賦活されたことから、超音波による音響情報の伝達が可能であることが示された。(2)脳磁図(MEG)による検討骨導超音波2チャンネル刺激に対する反応、骨導超音波のダイナミックレンジ、骨導超音波聴覚刺激持続時間が聴覚中枢に及ぼす影響を脳磁図を用いて検討した。気導可聴音刺激による反応との異同を明らかにすることによって、骨導超音波の中枢メカニズムの特徴を考察した。2.末梢メカニズムの研究入力された超音波がどの感覚器で受容され、どのようにして神経信号に変換されるかを理論的、実験的に検討した。(1)生体内音場解析法骨導音が提示されたときに生体内に形成される音場を実形状人体頭部モデルを用い、時間領域差分法(FDTD法)により定量的に求め、知覚との関連について考察した。その結果、骨超音波と骨導可聴音の音像の特徴の違いに生体内の音場の違いが深く関与していることがわかった。(2)超音波マスカーとダイナミックレンジ超音波マスカー下で気導音の閾値の変化を測定することによって、マスカーの周波数にかかわらずマスキーの周波数が14kHzで最大のマスキング効果があり、また骨導超音波のダイナミックレンジが気導音より有意に狭いことを実験的に確認した。このことから、超音波聴覚は、超音波自身が蝸牛の基底回転付近の基底板を振動させることによって生じ、このとき外有毛細胞の働きを介していないと考察した。ポジトロン断層法(PET)と脳磁図(MEG)を用いて、骨導超音波によって賦活される脳部位とその賦活潜時、強度ならびに刺激呈示部位の変化を脳のどこで検出するかについて検討した。1.ポジトロン断層法(PET)による検討対象は健聴成人男性9名と16kHz以下の周波数帯域で聴覚がない最重度難聴者5名である。聴力正常者に対しては、骨導超音波刺激、気導可聴音刺激、骨導可聴音刺激、触覚補聴器による振動刺激の4種類の刺激を用いた。最重度難聴者に対しては、骨導超音波刺激を用い、脳内局所血流量の増加をPET(PETscanner ADVANCE)により測定した。その結果、骨導超音波刺激によって有意に賦活された部位は左一次聴覚野内側部(Talairachの座標でx=-32,y=-32,z=22)であった。2.脳磁図(MEG)による検討対象は健聴者10名である。1kHzで振幅変調した40kHzの超音波刺激を2個の骨導超音波セラミック振動子を通して左右の頚部に提示した。刺激提示はオドボール課題に準拠した。その結果、ミスマッチ磁界(MMF)が誘発され、刺激側の変化が検出されたことを確認した。

刺激提示部位の変化を脳のどこで検出するかを調べたところ、聴覚野で検出されることが示された。また、骨導超音波で高頻度チャンネルに対する反応に左右差が無く、低頻度チャンネルに対しては左右聴覚野とも有意に(かつ特に反対側がより大きく)活動が増大した。さらに反応潜時はN1m、MMFともに気導可聴音のそれらよりも有意に遅れた。これらの違いは気導可聴音と骨導超音波の検知機構に差があることを示唆するものと考えられた。超音波聴覚について聴覚心理的検討と脳磁図による脳機能の検討を行った。聴覚心理的に、超音波の呈示部位、聴取可能者、音像、変調超音波聴覚などを調べた。脳磁図によって、超音波聴覚におけるダイナミックレンジならびに刺激持続時間とN1mの関係を調べた。1)聴覚心理的検討(1)呈示部位:乳様突起上および胸鎖乳突筋上に呈示したとき音感覚が感度良く得られる。(2)聴取可能者:聴力が100dB未満の被験者では音感覚が得られた。平均聴力レベルが両側とも100dB以上の感音難聴者53名では、28名で聴取できたが、100dB未満の難聴者に比べ超音波が聴取困難になる傾向があった。(3)音像:可聴音とは異なる性質をいくつか有していた(4)変調超音波:語音や純音・音楽で振幅変調した超音波を呈示したとき、その信号波成分を聴取することが可能であった。2)脳磁図による検討(1)超音波のダイナミックレンジ:聴力正常者6名に対して超音波、可聴音の音圧をそれぞれ変化させたときのN1mの大きさを脳磁図を用いて測定することによって、脳磁図における超音波のダイナミックレンジと可聴音のダイナミックレンジを比較した。その結果、気導音と比較して超音波の場合、音圧の変化に対してN1mの大きさの変化幅が大きいことが認められた。(2)超音波聴覚刺激持続時間が聴覚中枢に及ぼす影響:聴力正常者4名に対して超音波、可聴音の刺激持続時間をそれぞれ変化させたときのN1mの大きさを脳磁図を用いて測定した。その結果、骨導超音波と1kHz気導音の間に刺激持続時間による影響について明らかな差は認めなかった。超音波聴覚の中枢メカニズムの研究に引き続き、本年は末梢メカニズムつまり、入力された超音波がどの感覚器で受容されどのようにして神経信号に変換されるかを理論的、実験的に検討した。蝸電図、聴性脳幹反応を用いた検討では電磁ノイズの問題を、また耳音響放射では高周波音のフィルタリングや、観測時の同期の問題を完全にはクリアできず今後の課題とした。今回は以下の方法によって新しい知見を得たので結果を報告する。1)生体内音場解析法:骨導音が提示されたときに生体内に形成される音場を数値計算により定量的に求め、知覚との関連について考察した。骨導音を呈示する振動子の位置を乳様突起付近で10mm程度変化させたとき、生体内にどのような音場の違いが生じるかについて、刺激が可聴音のときと超音波のときの両者について、実形状人体頭部モデルを用い、時間領域差分法(FDTD法)で求めた。その結果、励振周波数が20kHz以上のときは、20kHz以下の時と異なり、刺激呈示の反対側にも刺激呈示側と同程度の大きさの音圧が分布すること、また、各刺激呈示位置の変化に応じてその分布が大きく変化することが確認された。これらの結果は、骨導超音波と骨導可聴音の音像の特徴の違いに生体内の音場の違いが深く関与している可能性を示唆するものであった。
as-インダセンおよび類縁体の合成と物性の解明

(1)速度論的に安定なas-インダセンの合成のモデル実験として、s-インダセン誘導体の新合成法の開拓を検討した結果、目的物を得ることに成功した。この新合成法はas-インダセン誘導体に適用可能であるので、その目処がついた。(2)チオフェン縮合as-インダセンの類縁体の合成を目的として、o-キノジメタン型の異性体を生成したところ、4+4付加した二量体が得られることを見出しその構造を決定した。かさ高い置換基の導入による速度論的安定化を試みたが目的物の単離に至らなかったことから、本系の安定性の限界を明らかにした。また、二種類のジヒドロ-o-キノジメタン型化合物の合成と光学的物性の調査を行った。(1)速度論的に安定なas-インダセン誘導体の物性調査速度論的に安定なas-インダセンの合成には少なくとも四つのかさ高い立体保護基の導入が必要とされる。そのため不飽和ケトンを経る合成ルートを考案したが、その実現可能性を探るため、s-インダセンをモデルとして検討した。その結果、ジエチニルアセチレン誘導体を中間体とする転位を含む環化反応を用いた新しいs-インダセン合成法の開拓に成功した。さらに、不飽和ケトンを用いた四つの立体保護基の導入も行い、as-インダセン系においてもこの方法による置換基の導入が可能であることを確認した。この結果をうけてas-インダセン骨格の合成に着手する。(2)チオフェン縮合as-インダセン類縁体の合成と物性調査目的としている6種類の構造異性体のうち、o-キノジメタン型の異性体の1種類について前駆体の合成を達成した。立体保護基のない化合物の合成を目指した反応を行ったところ、[4+4]型の二量体を思われる生成物を単離した。これは反応系中において目的物が生成していることを示す証拠であり、立体保護基の導入により目的物の合成が可能であることを示唆している。o-キノジメタン型の残りの2種類についても原料合成に着手している。なお、[4+4]型の二量体は、ねじれたシクロオクタテトラエン骨格をもつ珍しい化合物であるため、その構造と物性についても調査し、類似の化合物との比較を行いこの共役系の特徴づけを行っている。(1)速度論的に安定なas-インダセン誘導体の物性調査においては、まだas-インダセン骨格の構築にいたっていないが、モデル系のs-インダセン骨格の新しい構築法を開発するとともに、立体保護基の導入法について確認した。(2)チオフェン縮合as-インダセン類縁体の合成と物性調査については、o-キノジメタン型の異性体の1種類について直前の前駆体まで合成を達成するとともに、立体保護基のない化合物の合成反応において、目的物の生成を示唆する二量体を単離、確認することができた。これらの成果は、いずれも目的物が合成できる可能性を支持するものである。(1)速度論的に安定as-インダセンの物性調査速度論敵に安定化されたas-インダセン誘導体を合成するためのモデル実験として、昨年度に引き続いてs-インダセン誘導体の合成の検討を行った。すなわち、ジブロモジエチニルアセチレンとベンズアミドとの付加ー転位による新合成ルートの条件検討を行った結果、母骨格の構築を従来に比べて非常に効率的に行うことに成功した。引き続き、置換基の導入と還元的脱ヒドロキシ化により、ヘキサフェニル-s-インダセンの合成を達成した。これは単離されたインダセンの炭化水素誘導体の二つ目の例である。この新合成法は目的のas-インダセン誘導体にも適用可能であるため、as-インダセンの合成まで行うことはできなかったが、その目処を付けることができた。(2)チオフェン縮合as-インダセンの類縁体の合成と物性調査可能な6種類の母骨格のうち、昨年度はo-キノジメタン型の一つが低収率ながら二量体を生成することを見出した。今年度はさらにその追試実験を行い、各種スペクトルに基づき二量体の構造を決定した。この高反応性のo-キノジメタン型インダセンを速度論的な安定化するため、かさ高いメシチル基を導入した誘導体の合成を試みたが、目的物を単離することはできなかった。チオフェン環の縮合により高反応性のインダセンの性質が顕著に現れ高活性点が増えたため、メシチル基による安定化が不十分であったと考えられる。もう一つのo-キノジメタン型についても同様の結果がえられた。これらの結果から、チオフェン縮合as-インダセン誘導体を室温の大気下で単離することは困難であると判断した。そのため目的物を蛍光発光性のジヒドロ誘導体に転換し、二種類のo-キノジメタン型化合物の合成と光学的物性の調査を行った。

かさ高い置換基の導入による速度論的安定化を試みたが目的物の単離に至らなかったことから、本系の安定性の限界を明らかにした。また、二種類のジヒドロ-o-キノジメタン型化合物の合成と光学的物性の調査を行った。(1)速度論的に安定なas-インダセン誘導体の物性調査については、予備実験の結果をうけてas-インダセン骨格の構築と目的物の合成に着手する。またモデル実験で合成したs-インダセン誘導体について、構造や物性の調査を行う。特に置換基の違いによる構造の対称性やそれに基づく物性の違いに着目した研究を行う。(2)チオフェン縮合as-インダセン類縁体の合成と物性調査については、o-キノジメタン型の異性体の残りの2種類についても合成を進める。現在、直前の前駆体まで合成した異性体については、立体保護基を導入した目的物の合成と単離、構造決定を行う。また置換基をもたない目的物の二量体については、ねじれたシクロオクタテトラエン骨格をもつ珍しい化合物であるため、その構造と物性についても調査する。有機化学27年度は予備実験段階であり、比較的手持ちの試料を用いて合成することが多かったたため研究費を節約することができた。しかし、28年度は従来とは全く異なる方法で新規骨格の合成に着手するため、これまでより格段に多くの薬品の購入が必要となる。新規骨格合成のため、クロスカップリング用のパラジウム触媒を多用する。そのため高額の薬品を購入する必要がある。
階層的制御機能を有する機能的電気刺激システムの開発とその麻痺上肢制御への応用

頸髄損傷による重度の四肢麻痺や、脊髄損傷による対麻痺などの患者の麻痺した上肢や下肢を帰納的電気刺激(FES)よって制御し、運動機能を補助・再建するために、高機能のFESシステムを開発することが目標である。主な成果は次の通りである。(1)手の指、手関節、肘、肩の動作について健常者の随意運動時の筋活動電位(EMG)を多チャネルで記録し、バイオメカニズムシミュレ-タの基礎デ-タをおさえた。この多チャンネルEMGの発火パタ-ンを参照してFES用の刺激パタ-ンを作成し、手の指、手関節、肘という階層的な構造を有する神経筋系の制御に応用し、臨床的に極めて有効であることを示した。(2)ポ-タブル型FES装置を試作、改良して、臨床的な応用へそなた。これは、複数個接続して制御をおこなえる。(以上、日本電気三栄KKの協力を得た)(3)マ-タ-・スレ-ブ方式の高機能FESシステムに、FESで発現される把持の巧緻性について、患者自身がCRTを会して会話的に電気刺激のパラメ-タを修正する学習機能を付与することができた。(4)頸髄損傷患者は運動機能ばかりでなく感覚系も麻痺している。FESで発現された手、指、肘などの変位・移動の情報を患者の肩への電気刺激によって感覚フィ-ドバックする具体的な方法として、ファントムセンセ-ションを利用した一方向移動感覚の呈示条件を明らかにした。(5)麻痺した体幹をFESによって制御することによって寝たきりの患者の寝返りを実現するための基礎研究として、ヒトの寝返り動作に関与する多数の筋の筋活動電位を記録・分析した。また、これに基づいて健常人の被験者において表面電極を介して電気刺激して下肢と体幹の外的制御をおこないうることを確認した。(1)手の指,手関節,肘,肩の動作について健常者の随意運動時の筋活動電位(EMG)を多チャネルで記録し,機能解剖学の立場からの分析を行いバイオメカニズムシミュレーションの基礎データをおさえた.(2)我々が最近提案した多チャネルEMGの発火パターンを参照して刺激パターンを発生するアルゴリズムを,手の指,手関節,肘という階層的な構造を有する神経筋系の制御に拡張し,臨床的に極めて有効であることを示した.これは,新たに開発した「マスター・スレーブ」方式の48チャネル機能的電気刺激(FES)システムを用いて行った.(3)頚髄損傷患者は運動機能ばかりでなく感覚系も麻痺している.FESで発現された手,指,肘などの変位・移動の情報を撲者の肩への電気刺激によって感覚フィードバックする具体的な方法として,ファントムセンセーションを利用した一方向移動感覚の呈示条件を明らかにした.(4)FESで発現される把持の巧緻性について,患者自身がCRTを介して会話的にパラメータを修正する学習機能を付与することができた.(5)当初の計画には記しておかなかったが, FESによる麻痺肢の制御において極めて重要な「神経刺激電極」について,従来の市販品に比して,格段に柔軟性に富み,機械的強度が大である「生体内埋め込み用多重撚線電極(25μm, 19本)」の開発に成功し,量産化の見通しを得た(メーカと協同研究)ことは,本研究を推進し,多チャネルFESによる麻痺肢の制御の実用化をはかる上で重要である.昭和63・64年度にはこれらの成果の上にたって,多チャネル神経・筋系のバイオメカニズムシミュレーションを進めながら,本格的な階層制御機能を有するFESシステムの開発を進めたい.

頸髄損傷による重度の四肢麻痺や脊髄損傷による対麻痺などの患者の麻痺した上肢や下肢を機能的電気刺激(FES)によって制御し、運動機能を補助・再建するため、高機能のFESシステムを開発することが最終目的である。本年度は、下記のような研究成果を得た。(1)昨年度、主要部分の開発を終了した「マスタースレーブ」方式の48チャンネルFESシステムに学習機能を付与した。これはハードウェア的に階層的構造を有するもので、多チャンネルの神経・筋系を刺激すると同時に、患者が対話的に把持動作の修正を行いうる。そのため、患者の自助努力が装置の機能向上に反映できる。(2)昨年度までに基礎的性質について調べた「皮膚電気刺激を介した移動感覚の呈示方法」の設計論を確立した。これは、感覚も麻酔している四肢麻痺患者にFESで運動機能再建する場合の感覚フィードバックとして有用である。(3)健常人の筋運動中の筋活動電位を同時記録し、これをもとに多チャンネル刺激パターンを作成する方式が有効であることを、四肢麻痺患者の手の握りと肘の同時制御、および対麻痺患者を立たせる(64チャンネル刺激)ことに成功し、確認した。(4)上記(3)の機能を有する16チャンネルのポータブルシステムを量産化する設計と試作に成功した(メーカと共同)。(5)上記(4)を4台同時に用いて階層的制御を試みた。(6)その他研究代表者の星宮と強力者の二見が北海道大学応用電気研究所から東北大学工学部へ、協力者の半田が信州大学医学部から東北大学医学部へそれぞれ転任したので、階層的制御システムのシミュレータの開発研究は中断し、やや遅れている。頚髄損傷による重度の四肢麻痺や、脊髄損傷による対麻痺などの患者の麻痺した上肢や下肢を機能的電気刺激(FES)によって制御し、運動機能を補助・再建するために、高機能のFESシステムを開発することが最終目標である。本年度は、前2年度の研究を引き続き継続すると共に、あらたに、FESによって寝たきりの患者の寝返りを実現するための基礎研究を展開した。本年度の主な成果は次の通りである。(1)ポ-タブル型FES装置を改良して、チャネル数を30チャネルに増加して高機能とし、さらに小型化(400g)することに成功し、臨床的な応用へそなえた。また、これを複数個接続して階層的な制御をおこなえるように改良した。(以上、日本電気三栄KKの協力を得た)(2)麻痺した体幹をFESによって制御することによって寝たきりの患者の寝返りを実現するための基礎研究として、ヒトの寝返り動作に関与する多数の筋の筋活動電位を記録・分析した。また、これに基づいて健常人の被験者において表面電極を介して電気刺激して下肢と体幹の外的制御をおこないうることを確認した。(3)拮抗筋、協同筋など多数の筋の相互作用、関節をこえて作用する筋の相互作用を取り入れた筋運動系の階層的制御のシミュレ-タ開発の基礎をおさえることはできたが、脊髄を中枢とした局所的なフィ-ドバック系の特性など、今後の動物実験などの成果を待たなければならない点が残されている。
アディポカインの機能調節機構の解明

内蔵脂肪組織でのアディポカイン分泌異常がメタボリックシンドロームの病因であり、その発現や機能調節の解明は新たな治療法開発に繋がる。そこで、その1つであるオメンチン発現の調節因子を検討した。Caco-2細胞でのオメンチンmRNA発現はインスリンで抑制、糖質コルチコイドで上昇した。オメンチン遺伝子上流1.5 kbのプロモーター解析では、これらの刺激に対する反応は認めず、1.5kbより上流の領域の関与が示唆された。一方、HepG2細胞溶解液に含まれるタンパクから抗アディポネクチン抗体で共沈してくる新規の結合タンパクを同定した。この結合には糖鎖は関与せず、新たな結合様式が示唆された。メタボリックシンドロームの病態の根源をなす組織は脂肪組織と考えられ、近年では脂肪組織は単なるエネルギー貯蔵臓器ではなく、分泌タンパクである「アディポカイン」を放出する内分泌臓器として位置づけられるようになっている。このアディポカインが各種臓器に作用し、糖・脂質代謝、動脈硬化等の病態に大きな役割を果たすことが証明されてきた。従って、これらアディポカインの量を制御したり、その作用機序を明らかにしたりすることは、メタボリックシンドロームにより惹起される動脈硬化性疾患の治療や予防に役立つ。アディポカインとして、腸管と内臓脂肪で産生されるオメンチンに着目した。我々は、血清中のオメンチン濃度が虚血性心疾患患者で低下していること、動脈硬化発症モデルマウスにオメンチンを投与することにより、動脈硬化性病変の発症・進展が抑制されることを報告してきた。本研究では、オメンチン産生能を有するヒト結腸ガン細胞株Caco-2細胞を、糖・代謝に関係する様々な因子で刺激した際のオメンチンmRNA発現を定量リアルタイムPCR法により評価し、オメンチンmRNAを正・負に制御する因子を同定した。さらに、アディポカインの作用を調節する分子は、タンパク同士の結合を介して相互に作用することが予想されるため、結合タンパクの同定を試みた。本研究では、アディポカインに対する抗体を用いた免疫沈降法→SDS-PAGE→銀染色→質量分析、という方法を用い、試料には各種細胞の溶解液のみならず、細胞培養液、ヒト血清などの液性因子を使用した。前年に引き続いて、アディポカイン産生機構の解明および、アディポカイン結合タンパクの解析を行った。アディポカイン産生機構については、ヒト結腸ガン細胞株Caco-2細胞におけるオメンチンmRNA発現を調べ、糖代謝に関わる因子が負の制御を、抗炎症に関わる因子が正の制御をすることが明らかとなった。また、核内転写因子の1つPPAR(peroxisome proliferator-activated receptors)の各種リガンドがオメンチンmRNA発現を促進した。そこで、オメンチン遺伝子のプロモーターをクローニングし、ルシフェラーゼ遺伝子上流に組み込んだレポーターベクターを作製し、これを用いてレポーター活性を測定した。その結果、前述した糖代謝や抗炎症に関わる因子は1.3 kbのレポーター活性に影響を与えなかった。従って、これら因子の作用する部位はより上流に存在することが考えられた。また、PPARの各種リガンドの添加により、このレポーター活性は低下を認めた。mRNA発現とレポーター活性が相反する結果になったため、他の制御因子の関与がこの系に生じている可能性が考えられた。一方、前年に同定された幾つかのアディポカイン結合候補タンパクについては、アディポカインとの結合をin vitroの系で確認した。結合が確認できた分子の1つである膜タンパクについては、各種変異体を作製し、アディポカインとの結合部位の同定を行っている。さらに、動脈硬化に対する作用をin vitroの系を構築して検証している。本研究ではアディポカインの機能調節メカニズムの解析を2つの側面から検討しているが、両方とも平成25年度に行う予定であった基礎実験の結果が初年度に得られており、順調に進展していると考えられる。25年度が最終年度であるため、記入しない。I :アディポカインの発現調節の解明各種アディポカインのうちオメンチンについて、有意なmRNA発現変化を認める各種薬剤刺激を同定し得たため、次にそのプロモーター配列を有するレポーターベクターを作製し、レポーター・アッセイを行う。様々なプロモーター長、あるいは様々な変異を有するレポーターベクターを用いた結果から、刺激に反応する部位を同定する。また、この刺激を調整する薬剤などを検討していく。II :各種アディポカインの生理的機能の検討同定されたアディポカイン結合タンパクとアディポカインの結合をin vitroの系で再確認する。結合が確認できた分子について、各種変異体のアディポカイン結合能の相違から結合部位を同定する。さらに、細胞間接着などのアディポカイン結合タンパクの有する生理的機能に与えるアディポカインの影響を調べる。
アンモニア態窒素の森林生態系に対する影響に関するモニタリング研究

森林生態系の酸性沈着に対する反応は窒素の飽和状態によって異なる。窒素飽和の状態では、硝酸イオンと共にカルシウムイオン、マグネシウムイオンなどの塩基が流亡し、土壌酸性化が促進され、植物の生育に悪影響をおよぼす。本研究は、スギ林地における酸性沈着の影響を、窒素化合物の動態に着目し、モニタリングを中心とした環境動態に関する研究である。試験地におけるアンモニウムイオンの一年間の降下量は平成9年度1.05kmolcha^<-1>であったが、平成10年度は0.75kmolcha^<-1>であった。しかし、硝酸イオンと合わせると15kg ha^<-1>の窒素が大気降下物によって森林に供給されていることが明かとなった。これは、窒素飽和起こる基準とされる10kg ha^<-1>を大きく超えていた。本試験地における林内雨中のアンモニウムイオン濃度は、林外雨に比べて低くなっており、スギ樹冠においてアンモニウムイオンが吸収されたと考えられる。また、土壌溶液中ではアンモニウムイオンは検出されず、硝酸イオンが著しく増加していた。しかし、深さが増すにつれ硝酸イオン濃度も減少し、植物根による窒素の吸収が示唆された。このことから、窒素飽和の兆候は見られず、むしろ大気由来の窒素がスギの栄養源として寄与していると考えられる。さらに、試験地土壌は、カルシウムなどの交換性塩基に富んでおり、塩基飽和度が高いことから、窒素飽和に伴う土壌酸性化の影響が顕在化しにくいと考えられる。窒素飽和のメカニズムを明らかするためには、今後、植物体の分析、微量必須元素の動態なども含めて、モニタリングを継続していくことが重要である。森林生態系の酸性降下物に対する反応は窒素の飽和状態によって異なる。本研究は、スギ林地における酸性降下物の影響を、窒素化合物の動態に着目し、モニタリングを中心とした環境動態に関する研究である。試験地におけるアンモニウムイオンの7月から12月における降下量は昨年度の2倍以上に増加した。平成10年1月までの一年間の降下量は1kmolcha^<-1>を超え、平成5年度から7年度にかけて環境庁が実施した調査結果に比べて著しく多かった。硝酸イオンと合わせると20kgha:1の窒素が大気降下物によって森林に供給されていることが明かとなった。これは、窒素飽和起こる基準とされる10kgha^<-1>を大きく超えていた。乾性沈着や葉からの溶出の影響により、林内雨中のイオン濃度が増加するのが一般的である。しかし、本試験地における林内雨中のアンモニウムイオン濃度は、林外雨に比べて低くなっていた。これは、スギ樹冠においてアンモニウムイオンが吸収されたためと考えられる。窒素が不足している森林生態系においても同様の結果が報告されており、本試験地において大気降下物中の無機窒素化合物はスギの栄養源として寄与していることが示唆された。森林土壌に供給されたアンモニウムイオンは硝化作用により硝酸イオンヘと変化する。土壌溶液中で多かった硝酸イオンも、渓流水中においては低く、窒素飽和の兆候は認められなかった。