hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
心筋架橋による冠状動脈アラローム硬化抑制に関する分子・臨床病理学的研究

平成12-13年度に亘り、心外膜脂肪織中を走行する左冠状動脈前下行枝(LAD)の一部分を被覆する心筋架橋(MB)により惹起される同部冠状動脈内膜のアテローム硬化抑制機構につき、MBとその近位、遠位部の内膜内皮細胞及び内膜中において血管内でずり応力に関連して発現の変化する血管収縮蛋白、凝固・線溶関連蛋白の消長を分子病理学的に検討した。又、同時に、前下行枝における心筋架橋の位置・長さ・厚さなどの解剖学的特性による、冠状動脈硬化病変の局在に与える影響について形態計測的に検討した。[結果]3)LAD中におけるMBの位置、長さ、厚さを指標とした解剖学的特性とMB部分と近位・遠位部のそれぞれの内膜肥厚度の相互の関係を組織計測的に検討すると、MBの長さ・厚さに依存してMB部分の内膜肥厚抑制効果は、有意に増大する。1)2)3)は、MR部分の血流はずり応力によって支配されていることを間接的に示す形態学的所見と結論される。12年度は、左冠状動脈前下行枝(LAD)における心筋架橋(MB)の近位及び遠位、MB部分の冠状動脈の内皮細胞中における血管作動性物質(eNOS、ET-1、ACE)の発現状況について、免疫組織化学染色を行い、それぞれの部分における動脈内膜の肥厚度との関連を検討した。結果:1)内膜肥厚度の比較;MB被覆下LADでの内膜肥厚度は、MBより近・遠位部LADのそれより有意に低かった。2)内皮細胞における各血管作動性物質の発現は、MB近・遠位のLADでは、多数の内皮細胞に発現を認めた。これに対し、MB被覆下のLAD内皮細胞ではより低い発現が観察された。又、MB近位には、アテローム硬化性病変内の新生血管内皮細胞、中膜平滑筋細胞、内膜内の平滑筋細胞にも弱い発現が認められた。3)MB及びMB近位、遠位における各血管作動性物質発現群の統計的比較;MB下LADでの平均発現率を基準として、MBより近位及び遠位LADでの平均発現率を比較すると、3種の各血管作動性物質の発現率は、いずれもMB下LAD内皮細胞において、MBより近位及び遠位のLAD内皮細胞と比較して有意に低かった。4)アテローム硬化度と内皮細胞におけるeNOS、ET-1、ACEの発現は正の相関を示した。考察:12年度の研究から、すり応力と3種の血管作動性物質の内皮細胞における発現に関し、本研究結果では、高ずり応力環境下のMB部分の内皮細胞でET-1、ACE、eNOSは発現低下を示した。今回の研究結果であるeNOS発現低下は、in vitro環境下の培養細胞を用いた高ずり応力負荷時の発現増強という既報告とは逆の結果となったが、ET-1、ACEの発現に関しては、MB部分の内皮細胞で低下を示し、in vitro環境での既報告と同傾向であった。12年度の研究では、内膜肥厚の程度が強いMB部分以外の低ずり応力部位の内皮細胞にてET-1,ACEの発現は亢進していたところから、低ずり応力部位はET-1,ACEの発現に影響を与えていることにより、アテローム硬化進展に関与するものと考えられた。心筋架橋とアテローム硬化度・心筋梗塞の発生状況を一段と明確にして、臨床的な意義の結論を得る目的で、心筋架橋の有無に依らず、150例の左冠状動脈前下行枝を蒐集した。又、平成12年度及び13年の免疫組織化学で注目されたtissue factor,tissueplasminogenactivator,plasminogenactivator inhibitor-1につき、心筋架橋部の冠状動脈内膜及びその近位・遠位の内膜肥厚度と内皮細胞におけるこれらの蛋白の発現程度を比較検討した。[結果]心筋架橋の左前下行枝における位置、心筋架橋の長さ、厚さと内膜肥厚度への影響を検討したところ、心筋架橋の長さと厚さは共に有意な相関を示し、心筋架橋が長い或いは、厚い場合は、心筋架橋の冠状動脈硬化抑制に及ぼす影響も有意に大きかった。又、心筋架橋の位置が左冠状動脈入口部に近いほど、心筋架橋は長く、又厚みも増す傾向がみられた。

又、心筋架橋部の内皮細胞には、心筋架橋の入口より近位部及び出口より遠位部の内皮細胞K比べて、血液凝固・線溶に関する上記の蛋白の発現は、架橋部の内皮細胞にはずり応力が高いために抑制されており、これによりアテローム硬化の抑制が生じるものと考えられた。これらの所見から、心筋架橋部の内皮細胞には、ずり応力が高くなることによって、アテローム硬化の抑制が生じ、この過程は、又、心筋架橋の解剖学的特性によっても規制を受けていることが結論される。
ウコギ科植物における金属集積機構の解明と放射性ストロンチウム除去技術への応用

コシアブラのストロンチウム集積はマンガンとカルシウムにそれぞれ相関があることが判明した。ヤナギ類、コシアブラおよびタカノツメ木の樹皮中にはCaとSrを含んだ結晶状の物質が観察され、木本植物に吸収されたSrは、樹皮中で不溶性の結晶状物質を形成し、植物体内に長く留まる可能性があることが考えらえた。ヤナギ表皮部分から採取したRNAについて発現量解析を行った結果、Ca結合性タンパク質などの候補遺伝子群が得られた。菌根菌の分布を比較したところ、菌根菌が多いところはセシウム137が多いことが示唆された。水野・富岡:当初の目的だったウコギ科植物(タカノツメおよびコシアブラ)については、名古屋大学富岡との密なる連絡にもかかわらずカルス作成、再分化体の形成には至らなかった。これについては使用する植物ホルモン等の種類の変更や濃度等の条件検討が必要と思われた。また、再分化体の根を利用して作成予定だったcDNAライブラリーの作成も達成できなかった。25年度以降は自然に生育しているこれらのウコギ科植物根からのRNA抽出とcDNAライブラリーの作成、および各種金属輸送に関連する遺伝子の採取に努める。水野:中部及び北陸、近畿地方におけるマンガン超集積性植物コシアブラの分布と、それらの非放射性ストロンチウムおよびセシウムの集積量を測定した。その結果;ストロンチウムとマンガンの集積に一部相関が確認された。詳細なデータ解析、特にストロンチウム及びセシウムとマンガン及びカルシウムとの相関、および土壌からの濃縮については、25年度の課題とする。原田:モデル植物としてのヤナギ及びコシアブラの枝について、兵庫県の大型放射光施設(SPring-8)での金属分布を行った。コシアブラの枝については、表皮部分に集積が見られた。また、集積量に相関が認められたカルシウムとマンガンについては、集積場所が異なることが確認され、一概に同一の輸送、集積システムが利用されていないことが判明した。竹中:福島県の放射性セシウム汚染地帯の植物について、植物の集積と放射性物質の集積量解析を行った。データ解析は25年度の課題とした。コシアブラ、タカノツメ及びヤナギの実験に供した木本植物を部位別に分け元素分析を行ったところ、いずれの植物でも、木部より樹皮にSrをはじめとする金属の濃度が高いことが判明した。枝の凍結切片を作製し、放射光を用いたμ-XRF元素イメージングを行ったところ、樹皮中にCaとSrを含む粒子状の物質が多数検出された。低真空型SEMにより、樹皮の異形細胞中に金平糖状の集晶が観察された。木本植物におけるSr蓄積には、樹皮中でバイオミネラリゼーションにより生成するSr含有結晶が寄与していることが考えられた。XANES法およびラマン分光分析法を試みたが、結晶状物質の化学形態の同定には至らなかった。タカノツメのCd、Zn蓄積と抗酸化物質蓄積との関係性を検討したところ、ラジカル消去物質量やSOD様物質量との関係性は見出されなかった。タカノツメに内生している菌について、Cd,Znが高濃度に存在する鉱山跡地で生育しているタカノツメから単離した菌と、土壌中の平均的なCd,Zn濃度の二次林に生育しているタカノツメから単離した菌とで、Cd,Znに対する耐性を比較したところ、鉱山跡地で生育したタカノツメから単離した菌の方がCd,Znに対する耐性が高いことが明らかとなった。コシアブラのマンガン集積つについては2,4-Dのみをホルモン剤として用いた培養細胞作成は不調に終わった。一方で金属集積が高くなる10-11月にかけて、長野、滋賀、奈良等7地点において各地10本のサンプルから葉のサンプルを回収した。年度末にかけて分解用機器を購入し、26年度に金属集積を行う準備を行った。1滋賀県立大学と共に三重大学の遺伝子実験施設でヤナギにおけるSrの集積に関わる遺伝子の探索を行った。次世代シーケンサーIon Protonを用い、樹皮で発現する遺伝子のRNA-seqによる発現量解析を行った。得られた配列をポプラのゲノムを参照としてマッピングし、機能予測にはシロイヌナズナ、イネ、ブドウのアノテーションも利用した。その結果、Ca結合性タンパク質などの候補遺伝子群が得られた。また、植物のSr集積・解毒機構がCdのそれらと類似しているかを調べた。Sr処理植物のHPLC分析の結果、Cd処理で生合成されるチオール化合物ファイトケラチン(PC)が検出された。このことから、植物におけるSrの解毒機構はCd解毒と類似していることが考えられた。225年度にコシアブラカルスの誘導に成功したことを受け、遺伝子解析に用いる再分化体の誘導を引き続き行った。2,4-Dおよび6BAの濃度を振り、さらに濃度オーダーを3段階に分けて実験を行った。

結果、様々なタイプのカルスが誘導され、魚雷胚に近いものまで誘導ができたが、発根および発葉まで進む再分化は成功しなかった。3名古屋大学において行われたコシアブラの菌根菌同定と放射性セシウム集積に関わる研究を補助するため、滋賀県甲賀市においてコシアブラのサンプリングを行い、実験資材として提供した。さらに遺伝子解析を希望する筑波大学の植物生理学研究室、古川純准教授にも同じく資料を提供した。26年度が最終年度であるため、記入しない。植物栄養学・土壌学・生態学26年度が最終年度であるため、記入しない。実験材料として重要な各種ウコギ科植物の培養細胞(カルス)とその再分化に失敗したため、その後の遺伝子採取などが滞っているため。最終年度となる今年度は、本来3大学で進行している実験の統合を目指すところであるが、各チームにおいて進行状況にばらつきが有ることから、半年間を目処に各チームの個別課題の進行を行う。まず滋賀県立大学ではすでにヤナギのストロンチウム集積について放射光により詳細なデータが得られたことより、最終年度は最新型次世代シーケンサーによる発現解析に入る。これにより、木本植物のストロンチウムに重要な遺伝子についての重要な知見が得られるものと期待される。また名古屋大学ではタカノツメの培養細胞の作成に成功したことにより、これを用いたストロンチウムをはじめとするウコギ科植物の特異な金属集積についての解析を行い、同時に滋賀県大の放射光技術をタカノツメにも応用し、実際の樹木となっている植物体の場合におけるデータの獲得も目指す。名古屋大は竹中教授のチームによるフィールドでの金属集積を進め、ファイトレメディエーションや放射性同位元素を集積しないタイプの山菜を作り出すのに必要な知見の獲得を目指す。三重大学では、これまで単独での細胞培養誘導条件でうまくいかなかったことを踏まえ、2,4-Dのみならず各種濃度のNAAおよびサイトカイニンの6BA等のホルモンを新たに用いてカルス誘導を試み、最終的に遺伝子解析および再分化体を用いた金属集積について最終的な結論を出す予定である。コシアブラについては本科研研究とは別に、放射性同位元素取り込み試験が可能である筑波大に試料を提供することで、ストロンチウムおよびセシウムの放射性同位体の取り込みについて測定できることとなった(本予算とは別件となる)。本研究には野生のコシアブラだけでは測定が難しいことから、三重大学では培養細胞からの再分化体の作成を優先して行う。また昨年度日本各地で採取したコシアブラ葉および土壌のサンプルについても分析を進め、土壌ー植物間の物質移動についても検証を行う。再分化体の利用は断念し、天然木の根からのRNA抽出とcDNAライブラリの作成を行う。
microRNA補充療法のための革新的短鎖核酸医薬の開発

応募者等が開発した新規核酸医薬Guide hairpin RNA-34a (ghRNA-34a)は、一般的なMimic miRNAと比較して全長が2/3程度まで短縮されており、核酸に対する副作用である自然免疫応答が抑制されていた。また、肺がんモデルマウスを用いた実験から、生体内において腫瘍抑制効果が確認された。さらに、ghRNAは核酸短縮化技術として、汎用性があり、他のmiRNAにも適用出来た。従ってghRNAは、安全性の高いRNA干渉型核酸医薬として有用である。以上の成果は、原著論文としてMolecular Therapy誌に投稿し、掲載された。核酸に対する自然免疫応答は、投与する核酸の長さに強く依存することが知られている。応募者等が開発したus-miR-34aは、内在性の二本鎖miR-34aと比較して全長が2/3程度まで短縮されていることから、自然免疫応答を誘導しにくい核酸になっていると考えられた。核酸に対する免疫反応は、単球、マクロファージ、樹状細胞によって産生されるIL-6やTNFα等の炎症性サイトカインに起因する。ヒト末梢血より単球を分離し、短縮型miR-34aを導入後、炎症性サイトカインの産生をreal-time PCR法およびELISA法を用いて計測したところ、有意な炎症性サイトカインの抑制が見られた。また、生体における核酸に対する免疫応答の計測には、野生型(C57BL/6)マウスを用いた。キャリアーには毒性の低いキトサンを用いて、短縮型miR-34aを尾静脈より全身投与する。炎症性サイトカインの産生はELISA法を用いて計測したところ、生体内でも炎症性サイトカインの誘導抑制が見られた。miR-34aは最も強力な腫瘍抑制性miRNAの一つであり、肺がんに対する抑制活性が複数報告されている。肺がん細胞株を用いたin vitro assayでは、通常のmiR-34aと同等の増殖抑制活性がus-miR-34aに認められているが、生体内における腫瘍抑制能は不明である。従って、肺がんモデルマウスを用いてus-miR-34の腫瘍抑制効果を測定した。肺がんモデルには、100%の確率で肺がんを発症する活性化型変異KRASノックインマウス(KRASG12Dマウス)を用いた。結果、us-miR-34a投与群で、有意な腫瘍の抑制が認められた。以上の成果は、第104回日本病理学会および第7回日本RNAi研究会にて発表を行った。平成27年度では、炎症性サイトカインの分泌抑制の検証および、生体内における肺がん抑制の検証を主に行った。結果、ヒト単球を用いた検証および野生型マウスを用いた検証実験で、短鎖型核酸医薬のIL-6やTNFα等の炎症性サイトカインの誘導が抑制されていることが明らかとなった。また、肺がんモデルマウスを用いて、生体内における肺がん抑制効果を検証したところ、これまでにVitroの実験で得られていた短縮型核酸医薬の腫瘍抑制効果と同様の結果が、生体内においても観察できた。従って、ほぼ計画通りに進行している。応募者等が開発したGuide hairpin RNA-34a (ghR-34a) (昨年度まではus-miR-34aと呼称していたもの)は、内在性の二本鎖miR-34aと比較して全長が2/3程度まで短縮されていることから、自然免疫応答を誘導しにくい核酸になっている。生体における核酸に対する免疫応答の計測には、野生型(C57BL/6)マウスを用いた。2015年度は、尾静脈からの全身投与し、血液中の炎症性サイトカインの産生をELISA法にて計測した。2016年度は、眼球への硝子体注射による局所投与にて、生体内でも炎症性サイトカインの誘導抑制が見られることを確認した。従って、肺がんモデルマウスを用いてghR-34aの腫瘍抑制効果を測定した。昨年度に続き、生体内における有意な腫瘍抑制効果がみられ、実験の再現性の確認がとれた。ghRNAが核酸短縮化技術として、汎用性があることを調べるために、他のmiRNAに適用出来るか検証した。let-7a, miR-29bの配列からghRNA (gh-let-7a, ghR-29b)を作成し、各々の標的遺伝子であるHMGA2, TGFB3の抑制効率で評価した。その結果、gh-let-7a, ghR-29b共に通常の二本鎖の形態と同等の抑制活性が認められた。また、第19回米国遺伝子治療学会年会(ASGCT 2016 Annual Meeting, Washington, DC, USA)にて発表を行った。平成28年度では、炎症性サイトカインの分泌抑制の検証および、ghRNAの核酸医薬短縮化技術として汎用性の検証を主に行った。結果、野生型マウスに対する硝子体投与による検証実験で、短鎖型核酸医薬のIL-6やTNFα等の炎症性サイトカインの誘導が抑制されていることが明らかとなった。

また、ghRNAの汎用性の検証に関しては、miR-34a以外にlet-7aおよびmiR-29bを用いて検証し、どちらでもRNA干渉活性を保ったままghRNA化することが出来たことから、ghRNAの汎用性を証明することができた。また、これまでの結果は、学術論文としてまとめてMolecular Therapy誌に投稿し、掲載された。従って、ほぼ計画通りに進行している。核酸に対する自然免疫応答は、投与する核酸の長さに強く依存することが知られている。応募者等が開発したGuide hairpin RNA-34a (ghR-34a) (初年度まではus-miR-34aと呼称していたもの)は、内在性の二本鎖miR-34aと比較して全長が2/3程度まで短縮されていることから、自然免疫応答を誘導しにくい核酸になっている。2015年度は、野生型(C57BL/6)マウスの尾静脈からの全身投与し、血液中の炎症性サイトカインの産生をELISA法にて計測した。2016年度は、眼球への硝子体注射による局所投与にて、生体内でも炎症性サイトカインの誘導抑制が見られることを確認した。2017年度は、ghRNAに種々の化学修飾を付加し、RNA分解酵素耐性およびRNA干渉活性の増強の検討を行った。miR-34aは最も強力な腫瘍抑制性miRNAの一つであり、肺がんに対する抑制活性が複数報告されている。従って、肺がんモデルマウスを用いてghR-34aの腫瘍抑制効果を測定した。生体内における有意な腫瘍抑制効果がみられ、実験の再現性の確認がとれた。ghRNAが核酸短縮化技術として、汎用性があることを調べるために、他のmiRNAに適用出来るか検証した。let-7a, miR-29bの配列からghRNA (gh-let-7a, ghR-29b)を作成し、各々の標的遺伝子であるHMGA2, TGFB3の抑制効率で評価した。その結果、gh-let-7a, ghR-29b共に通常の二本鎖の形態と同等の抑制活性が認められた。以上の成果は、原著論文としてMolecular Therapy誌に投稿し、掲載された。また、第19回米国遺伝子治療学会年会(ASGCT 2016 Annual Meeting, Washington, DC, USA)にて発表を行った。応募者等が開発した新規核酸医薬Guide hairpin RNA-34a (ghRNA-34a)は、一般的なMimic miRNAと比較して全長が2/3程度まで短縮されており、核酸に対する副作用である自然免疫応答が抑制されていた。また、肺がんモデルマウスを用いた実験から、生体内において腫瘍抑制効果が確認された。さらに、ghRNAは核酸短縮化技術として、汎用性があり、他のmiRNAにも適用出来た。従ってghRNAは、安全性の高いRNA干渉型核酸医薬として有用である。これまで短縮型核酸医薬のVitroおよびVivoにおける腫瘍抑制効果を明らかにした。今後は、マウスを用いた実験の再現性を検証しつつ、短縮型核酸医薬の機能性を解析する。はじめにパッセンジャー鎖の無効化の検証を行う。通常の合成miRNAは、本体であるガイド鎖と半相補的なパッセンジャー鎖の二本鎖である。ガイド鎖による標的遺伝子の発現抑制を目的に使用されるが、実はパッセンジャー鎖も相補的な配列を有する遺伝子の発現抑制に働く。多くの場合、このパッセンジャー鎖は望まない遺伝子抑制に働くため、副作用の原因になると考えられる。
受容体とカップルするADPリボシールシクラーゼ分子の個体レベルでの解析

細胞内のCaをセカンドメッセンジャーとするCaシグナリングは、数多くの受容体の下流に存在する重要な信号伝達機構の一つである。最近、リアノジン感受性の細胞内Caプールを開く細胞内リガンドはサイクリックADPリボース(cADPR)であると考えられるようになってきた。この数年、我々はcADPRがIP3のようなセカンドメッセンジャーであるとするこの仮説を検証してきた。そしてNADからcADPRを産生する膜酵素が受容体によりコントロールされていることをムスカリン受容体を大量発現するNG108-15細胞(J.B.C.,1997)とβアドレナリン受容体を持つ心臓心室筋(J.B.C.,1999)を用いて始めて証明することができた。アメフラシのADPリボシルシクラーゼと相同性を持つことで知られるCD38をノックアウトしたマウスで測定したところ、ADPリボシールシウラーゼが全く測定できなかった。この結果は我々の予測と異なり、CD38以外に酵素活性を持つ、タンパク質が存在しないことを示している。そこで研究として、次の仮定を確かめるために研究を転開した。すなわちパーキンソン病脳におけるcADPリボースの役割を明確にするため、ラット脳線状体でのADPリボシルシクラーゼ活性を測定した。ドーパミン添加によりシクラーゼ活性が上昇することをはじめて見出し、現在この活性上昇のメカニズムを追求している。また、脳可塑性に重要な役割を果たす代謝型グルタミン酸受容体のADPリボシルシクラーゼヘのカップリングを研究し、興味あるサブタイプごとに異なる特異的な反応を見出した。今年度はアメフラシのADPリボシルシクラーゼと相同性を持つことで知られるヒトCD38のcDNAをプローベとしてノーザンブロットをしたところニューロブラストーマNG108-15細胞ではシクラーゼのRNAは検出できなかった。また前実験としてラット大脳膜分画のADPリボシルシクラーゼ活性を測定したところ、NG108-15細胞のそれと同じ性質をもつ酵素活性を得た。従って、CD38以外の内在性のADPリボシールシクラーゼ(CD38とは全く別のタンパク質かまたはCD38の脳型アイソホーム)が存在している可能性があることがわかった。1.ラット大脳(100g)あるいはNG108-15細胞(200フラスコ分)をタンパク分解酵素阻害剤の存在下でホモゲナイズし、105,000g15分の遠心により粗膜分画を得た。2.上澄みをプル-Aセファロースカラムにかけ0.5M NaClで洗った後、0.5M KSCNで溶出。3.次に,ヒドロキシアパタイトカラムにかけた。洗浄後0.1Mリン酸で溶出した。4.コンカナバリンA-セファロースカラムにかけ、0.5M methyl-α-glucopyranosideで溶出。5.最後にレッドAセファロースで分画した。6.電気泳動上、単一バンド精製産物を得た。7.ここまで研究をすすめた段階で、CD38ノックアウトマウスを、東北大学岡本教授より頂き、ADPリボシールシクラーゼを測定した。8.膜分画のADPリボシールシクラーゼの95%は消失していた。

従って、活性はCD38によっていることが判明した。細胞内のCaをセカンドメッセンジャーとするCaシグナリングは、数多くの受容体の下流に存在する重要な信号伝達機構の一つである。最近、リアノジン感受性の細胞内Caプールを開く細胞内リガンドはサイクリックADPリボース(cADPR)であると考えられるようになってきた。この数年、我々はcADPRがIP3のようなセカンドメッセンジャーであるとするこの仮説を検証してきた。そしてNADからcADPRを産生する膜酵素が受容体によりコントロールされていることをムスカリン受容体を大量発現するNG108-15細胞(J.B.C., 1997)とβアドレナリン受容体を持つ心臓心室筋(J.B.C., 1999)を用いて始めて証明することができた。アメフラシのADPリボシルシクラーゼと相同性を持つことで知られるCD38をノックアウトしたマウスで測定したところ、ADPリボシールシウラーゼが全く測定できなかった。この結果は我々の予測と異なり、CD38以外に酵素活性を持つ、タンパク質が存在しないことを示している。そこで研究として、次の仮定を確かめるために研究を転回した。すなわちパーキンソン病脳におけるcADPリボースの役割を明確にするため、ラット脳線状体でのADPリボシルシクラーゼ活性を測定した。ドーパミン添加によりシクラーゼ活性が上昇することをはじめて見出し、現在この活性上昇のメカニズムを追求している。そしてNADからcADPRを産生する膜酵素が受容体によりコントロールされていることをムスカリン受容体を大量発現するNG108-15細胞(J.B.C.,1997)とβアドレナリン受容体を持つ心臓心室筋(J. B. C.,1999)を用いて始めて証明することができた。また、脳可塑性に重要な役割を果たす代謝型グルタミン酸受容体のADPリボシルシクラーゼへのカップリングを研究し、興味あるサブタイプごとに異なる特異的な反応を見出した。
宇宙線22年周期変動プロファイルを利用した2万5千年前の太陽圏構造の研究

本研究は、未知の領域である約2万5千年前の上山年輪試料用いて1年輪毎の14C濃度をAMS測定し、太陽11年周期および22年周期に着目してその変動プロファイルを調べたものである。これまでの我々の研究から、10年の短期間で14C濃度が大きく変動する時期があることが示唆された。本研究では、この急激な変化をしている可能性のある領域の26年について単年輪の約60試料の14C濃度測定をAMSにより行った。試料のAMS測定は、1グラファイト試料につき9回測定した。1回の平均計数が約1000カウントであるので約1%の統計精度であるが、1年輪試料につき2グラファイトの測定であるので約0.7%の測定精度で行っている。26年輪の平均の14C年代は、22271 yrBP±118であった。この14C年代は、現在よく用いられている較正曲線IntCal04の限界を越えているので、コロンビア大学の実年代較正計算プログラムで計算すると26778 yrBP±178であった。26年輪の^<14>C年代プロファイルは、3点移動平均では2つ山の変化パターンが示された。時間間隔は約12年程度であった。山の高さは157年と109年であった。この変動は^<14>C濃度変化とすると約2.0%と1.4%程度である。約25000年前の^<14>C濃度は現在の濃度に比べ約40%も高かったことが分かっているため大きな周期変動の可能性もある。この要因としては地磁気強度の低下、太陽活動の停滞、銀河宇宙線強度の増大などが考えられる。本研究で示唆された26年輪の^<14>C濃度変動プロファイルは、未だ測定精度が粗いが太陽11年および22年周期変動の可能性を示唆している。約2万5千年前の年輪試料は山形県上山市の須川から出土したもので、約130年輪あり年輪幅は0.2mmから1.8mmの間に分布していて平均は約1mmであった。年輪幅のスペクトル解析をしたところ11年の周期性が見えており気候変動との関連が考えられる。測定試料の準備として1年輪ごとの剥離を行い年輪毎に約2gから5gを得ている。外周年輪を極低レベル液体シンチレーション法により測定し22169±86放射性炭素年代を得た。2万年まえの太陽11年周期活動を調べるためには1年輪毎の炭素14濃度の高精度測定が必要であり、測定時間の制約から加速器質量分析法(AMS)を用いた。AMS法の測定精度の安定性を調べるために年輪中央部の3つの単年輪試料について2個のグラファイトを作成して測定値の比較を行った。それぞれ約22000放射性炭素年代に対して互いの差が0.4%,0.06%,0.03%であった。このことからグラファイト作成および測定の安定性が確認できた。この年輪中央部の平均放射性炭素年代は重み付平均で22364±29であった。C14年代と暦年代の較正曲線はC14年代で21500年、暦年代で26000年までのIntcal04が2004年に出ている。

しかし、その先はいくつかの較正曲線が提案されており不確定性が大きい、最近コロンビア大学で出したC14年代と暦年代の較正曲線により暦年代を求めると26844±82年である。大気中C14濃度は15000年から過去は濃度が現在の約40%増加しているモードにありこの年輪が地磁気の変動と太陽活動の変動の効果を比較するのに適している年代にあることが分かった。放射性炭素年代と実年代の関係を示す較正曲線は約5万年まで伸ばされているが、データセットとしてはC14年代で21500年までであり、それより過去についてはほとんどデータがない。このため、山形県上山市の須川から出土した年輪試料を使って連続する26年輪の単年輪測定を集中的に行った。年輪試料はセルロース処理ののちグラファイト試料として東大タンデム加速器により加速器質量分析法(AMS)によりC14年代測定を行った。グラファイト試料は各単年輪に対して2個作成し合計60試料について測定した。C14年代測定の統計誤差は約80年であり平均C14年代は重み付平均で22283±12年であった。26年輪の各2個のグラファイトの差は4年輪を除いて統計誤差の範囲内で同様な年代を示した。FairbanksO107の較正曲線からこのC14年代は、実年代26792±117年に計算されデータセットが未知の部分に相当していることが分かった。60個のデータセットの分布をガウス分布で適合させると標準偏差1σが127±23年と測定の統計誤差より大きな値を示した。C14濃度変動について年輪順に対するC14年代の変動を3点移動平均により調べた。移動平均曲線は約12年の幅の二つの山があり、それぞれ比較的シャープな山となだらかな山であった。シャープな山の振幅は約80年であり、10‰の変動となり通常の太陽活動による宇宙線強度変動に比べかなり大きい。約26000年前のC14濃度は現在より約40%も高かったことが分かっているが、太陽活動の寄与がどの程度であるかは未知である。本研究成果は、約2600年前の宇宙線22年変動パターンと太陽圏構造の考察の糸口を示している。
ハロゲン基を利用した超持続性三重項ジアリールカルベンの創製

ハロゲン基を立体保護基として持つ3つのジアゾ化合物を合成し、その光分解によって発生した三重項ジアリールカルベンを特性化した。オルト位に4つのヨード基を有するジフェニルカルベンは、2MTHF中200 Kまで安定に存在し、室温脱気ベンゼン中では、半減期18.4分の超持続性三重項カルベンであった。オルト位に2つのヨード基と1つのトリフルオロメチル基を有するジフェニルカルベンは、100 Kまで存在し、ベンゼン中半減期は40 msであった。トリアゾール環の1,4-位に2,6-ジフルオロフェニル基を有する(トリアゾール-5-イル)(フェニル)カルベンは220 Kまで観測され、超持続性であると推測された。いまだ実現されていない三重項カルベンの単離を目指し、三重項カルベンと反応しないハロゲン基を立体保護基として有するジフェニルカルベンの前駆体として、片方のオルト位に2個のヨード基とパラ位にtert-ブチル基を有し、もう一方のフェニル基に1個のトリフルオロメチル基、パラ位にフェニル基を有するジフェニルジアゾメタンを合成した。このジアゾメタンをMTHFマトリックス中77 Kで光分解し、UV-visスペクトルによって対応する三重項カルベンを、293, 335, 500 nmに観測した。また昇温実験により、このカルベンは100 Kで減少し始めることがわかった。また同条件のESR測定では、カルベンのシグナルはヨード基の重原子効果のため観測されなかったが、120 Kに試料を昇温することによって、カルベンが分解して発生したと考えられるラジカル種を観測した。室温脱気ベンゼン中でのレーザー閃光光分解により、この三重項カルベンは二次減衰し、半減期40 msの長寿命な三重項ジフェニルカルベンであることが示された。また、このカルベンは三重項カルベンのよい捕捉剤である酸素と1,4-シクロヘキサジエンに捕捉され、それぞれ、二分子反応速度定数は、それぞれ、1.6 ×108、1.9 ×102 M-1s-1と求まった。これらの結果から、ヨード基とトリフルオロメチル基はよい立体保護基であるものの、3つの保護基では立体保護効果が不十分なことがわかった。また、DFT計算による構造最適化を行い、三重項状態が一重項状態よりも15.1 kcal/molも安定であることが示された。いまだ実現されていない三重項カルベンの単離を目指し、三重項カルベンと反応しないハロゲン基を立体保護基として有するカルベンの前駆体として、オルト位に4個のヨードル基を有し、両パラ位にはtert-ブチル基を有するジフェニルジアゾメタンを合成した。このジアゾ化合物をMTHFマトリックス中77 Kで光分解し、UV-visスペクトルによって対応する三重項カルベンを、350, 369, 462, 480, 506 nmに観測した。また、昇温実験により、このカルベンは200 Kまで殆ど分解せずに観測され、非常に安定であることがわかった。カルベンのESRシグナルはヨード基の重原子効果のため観測されなかったが、カルベンが分解する200 Kまでの昇温で、カルベンが分解して発生したと考えられるラジカル種を観測した。一方、室温脱気ベンゼン中でのレーザー閃光光分解により、この三重項カルベンが半減期18.4分の現在最も長寿命な三重項ジフェニルカルベンであることが示された。また、ベンゼン中でのカルベンの減衰は二次減衰であり、生成物としてカルベンが二量化したテトラアリールエテンが得られた。また、このカルベンは三重項カルベンのよい捕捉剤として知られる酸素や1,4-シクロヘキサジエンに捕捉され、それぞれ、対応するケトンおよび二水素引き抜き反応によるジフェニルメタンを好収率で生成した。その捕捉速度定数は、それぞれ、6.5 ×105、1.5 M-1s-1と非常に小さく、反応のモードは不安定なジフェニルカルベンと同じであるが、反応自体は非常に遅いことがわかった。また、DFT計算により三重項カルベンは一重項状態よりも16.6 kcal/mol安定であり、実験結果を支持する結果が得られた。

いまだ実現されていない三重項カルベンの単離を目指し、立体保護基のC-H結合に挿入することによって減衰する三重項カルベンの反応部位であるC-H結合を、三重項カルベンと反応しないC-F結合に置き換えたジアリールカルベンの前駆体である、2,6-位をフッ素化したフェニル基を1,4-位に有する(1H-1,2,3-トリアゾリル-5-イル)(4-tert-ブチル-2,6-ジメチルフェニル)ジアゾメタンを合成した。このジアゾメタンを2MTHFマトリックス中77 Kで光分解し、対応するカルベンのUV-vis吸収を269, 280, 361-444 nmに観測した。このマトリックスの昇温実験を行ったところ、361-444 nmで観測したカルベンの吸収は220 Kまで観測され、240 Kまで昇温すると消失した。フルオロ基を持たない母体カルベンを同条件で発生させた場合、カルベンの吸収は105 Kで減少し始めることから、カルベンが非常に安定化されていることがわかった。この安定性の向上は、フルオロ基の導入によってカルベンの分子内C-H挿入による減衰経路がなくなり、カルベンが速度論的に安定化されたことを示している。また、DFT計算(B3LYP/6-31G*)によって、カルベンの一重項と三重項状態の構造最適化とエネルギー計算を行い、観測したUV-vis吸収が三重項カルベンの吸収であること、三重項が一重項よりも約3 kcal/mol低エネルギーであり、このカルベンの基底状態が三重項であることがわかった。物理有機化学10月から3月末まで大学の改修工事があり、生成物分析を実施するのに必要な装置が使用できず、また、他施設等で代替利用できるものがないことから、進捗が遅れた。立体保護基としてオルト位にヨード基を4個有するジフェニルカルベンに関する研究はほぼ完遂できた。しかし、このカルベンの前駆体であるジフェニルジアゾメタンの合成に時間がかかり、2,6位に2個のヨード基を、2',6'位に2個のトリフルオロメチル基を有するカルベンの前駆体であるジフェニルジアゾメタンの合成は現在進行中である。2,6位に2個のヨード基と4位にtert-ブチル基を有し、2',6'位に2個のトリフルオロメチル基と4'位にフェニル基を有するジフェニルジアゾメタンを合成し、この光分解によって対応する三重項ジフェニルカルベンを発生させ、その特性化と安定性について研究を行う。3,5位にポリフルオロフェニルを有するトリアゾリル基を置換基として有するフェニルジアゾメタンを合成し、対応するジアリールカルベンについても同様の観測をおこない、三重項カルベンの安定化に対するハロゲン置換基の効果を検討する。また、これらカルベンの構造とスピン分布を理論計算し、三重項カルベンの安定性を予測する。2,6位に2個のヨード基と4位にtert-ブチル基を有し、2',6'位に2個のトリフルオロメチル基と4'位にフェニル基を有するジフェニルジアゾメタン、および2,6位に2個のヨード基と4位にtert-ブチル基を有し、2'位に1個のトリフルオロメチル基と4'位にフェニル基を有するジフェニルジアゾメタンをそれぞれ合成する。これら前駆体の光分解によって対応する三重項ジフェニルカルベンを発生させ、その特性化と安定性について研究を行う。3,5位にペンタフェニルを有するトリアゾリル基を置換基として有するフェニルジアゾメタンを合成し、対応するジアリールカルベンについても同様の観測をおこない、三重項カルベンの安定化に対するハロゲン置換基の効果を検討する。該当なし
看護師の倫理的感受性と倫理的意思決定選好要因に関する研究

本研究の目的は、(1)倫理問題を同定する能力である倫理的感受性を測定するために作成した、倫理的感受性測定尺度の妥当性と信頼性の検証、(2)看護師の倫理的意思決定の際「善行」「自律」「誠実」「正義」「忠誠」等の倫理原則が選好要因としてどのように影響しているのか明らかにすること、(3)看護師が実践面で直面する倫理問題に対しどの問題を優先するべきであるのかの判断基準を見出すである。以下のことを実施した結果が得られた。1)倫理的感受性測定尺度:昨年度の調査結果の分析を進め、倫理的感受性に影響する要因を精選した。主に価値観を形成する因子と倫理的感受性の向上または低下に影響を及ぼす因子との2つのカテゴリーが抽出された。この結果をもとに、倫理的感受性測定尺度案を作成した。2)選好要因:上記で得られたデータより、倫理的判断の基準となる倫理原則を抽出した。抽出された原則は「自律」「正義」「公平」等だった。医療者に求められる主な倫理的原則の認識とそれに基づく判断はなされていた。しかし、直面する状況や看護師個々の能力によって、どの原則をもとに倫理的判断がなされているが、状況によってどの原則を優先的扱うのか異なっていた。さらに分析を進めたところ、倫理原則の中で「自律」については他の原則以上に強く認識されていることが明らかとなった。また、インタビューの対象が病棟勤務の看護師だったためか、「正義」に関する問題を認識している者はいなかった。この点は、アメリカの臨床看護師と大きく異なる点であった。アメリカの看護師は倫理的問題をより広くとらえていた。また、看護師の実践能力そのものが倫理的存在であることを強く認識していた。3)質問紙作成:抽出された内容と先行研究をもとに、実際に医療現場で直面するであろうと考えられる場面を設定し、仮想的質問紙を作成した。含まれる原則は「自律」「善行」「誠実・忠誠」「正義」とした。1)「倫理的感受性測定尺度」信頼性と妥当性の検証について臨床看護師に対するインタビュー結果の質的分析内容をさらに検討し、カテゴリーを精選した。主に、倫理的感受性を形成する因子と倫理的感受性に影響する因子とに分類されたが、「形成因子」と「影響因子」との関係をさらに検討する必要性が考えられた。また、看護師の倫理的感受性に関する文献検討も行った。今後は、抽出したカテゴリーと文献検討によって得られた内容をもとに看護師の倫理的感受性測定尺度案を作成し、妥当性・信頼性を検討することする。2)「倫理的感受性測定尺度」の英語版作成について1)の作成と平行して、共同研究者とともに作成する。米国においては、臨床看護師へ調査協力に関する交渉は行っており、内諾は得た。3)仮想的質問紙作成について平成19年度に予定している調査に向け、仮想的室も尿氏に関する文献検討を行った。[研究の目的]本研究の目的は、看護師が倫理的ジレンマの生じる状況の中で下す倫理的意思決定に影響を及ぼす選好要因について、倫理的問題を見出す能力である倫理的感受性とその問題に対処するために必要な倫理的意思決定との関係も明らかにすることである。[実施結果]1)倫理的感受性測定尺度について:昨年度の調査結果をスーパーバイザーのアドバイスを受けながら、グランデッドセオリー・アプローチによる分析を進め、倫理的感受性に影響する要因を精選した。

主に価値観を形成する因子と倫理的感受性の向上または低下に影響を及ぼす因子との2つのカテゴリーが抽出された。この結果をもとに、倫理的感受性測定尺度案を作成した。2)選好要因について:上記で得られたデータより、倫理的判断の基準となる倫理原則を抽出した。抽出された原則は「自律」「正義」「公平」等だった。医療者に求められる主な倫理的原則の認識とそれに基づく判断はなされていた。しかし、直面する状況や看護師個々の能力によって、どの原則をもとに倫理的判断がなされているが、状況によってどの原則を優先的扱うのか異なっていた。そこで、抽出された内容と先行研究をもとに、実際に医療現場で直面するであろうと考えられる場面を設定し、仮想的質問紙を作成した。3)日米との比較について:1)2)の結果を踏まえ、Wisconsin大学のLea Rae教授の紹介により、米国の看護教員と臨床看護師に前述の質問紙をもとに、インタビュー調査を行った。その結果、同様の状況に対して、日米間の倫理的問題に対する意識やとらえ方が異なることが明らかとなった。また、看護師の倫理的役割に対する関心にも差がみられた。
光重合型分子糊の開発と脳腫瘍治療への応用

生体高分子表面に接着するためのグアニジニウム基、フォトクリックケミストリーを利用した光重合における反応点であるテトラゾールおよびオレフィンを分子内に有する分子糊モノマーを合成することに成功し、光照射によって接着性を発現する「光重合型分子糊」の開発に成功した。また、上記と類似の発想をもとに、光刺激によって接着性を永続的なものに変換する、「フォトクリッカブル分子糊」を開発した。さらに、上記とは異なる光応答性ユニットを導入し、機械的な力を生み出すことのできる「光応答性分子糊」を新たに開発した。生体高分子表面に接着するためのグアニジニウム基とフォトクリックケミストリーを利用した光重合における反応点であるテトラゾール、オレフィンのそれぞれを有する2種類の分子糊モノマーを合成することに成功した。これらの分子糊モノマーを混合した水溶液に一定時間紫外光を照射することで、生成物であるピラゾリン由来の蛍光が観察されるようになった。また、動的光散乱法による粒径測定の結果、光照射後に平均粒径が顕著に増大していることが明らかになった。これらの結果より、期待通り分子糊の光重合が達成されていることを示した。同様の戦略に基づき、テトラゾールとオレフィン部位の両者を1分子内にもつ分子糊モノマーの合成にも成功し、より高効率な光重合を達成した。デオキシリボ核酸(サケ由来)を生体高分子のモデルとして分子糊モノマーと混合し、同様に光重合を行い、アガロースゲル電気泳動にて解析したところ、光照射の有無で核酸の泳動度が変化することが明らかになった。これは、光重合によってグアニジニウム基を多数有するポリマーが系中で生成し、多価相互作用による強い接着が生じたことを示唆する結果である。以上の結果より、本研究課題の基本戦略である、「光照射によって分子糊の接着性を生み出す」ことに成功した。これは、「研究の目的」にあるように、分子糊の非特異的な接着性によって引き起こされる副作用や効率の低下という問題を一挙に解決し、任意の組織・細胞で選択的に機能する抗がん剤の実現性を示すと同時に、高分子医薬に特有の新規な作用機序による薬剤活性と低分子医薬の優れた細胞内動態を併せ持つ、新たな薬剤治療戦略の有効性を示す成果である。生体高分子表面に接着するためのグアニジニウム基とフォトクリックケミストリーを利用した光重合における反応点であるテトラゾール、オレフィンの両者を分子内に有する分子糊モノマーを合成することに成功した。上記と類似の発想をもとに、光刺激によって接着対象との間に共有結合を形成し、その接着性を永続的なものに変換する、新しいタイプの「フォトクリッカブル分子糊」を開発した。これを用いることで、癌細胞の増殖において重要な役割を担う微小管-キネシンの動的な会合を永続的に固定し、極めて希薄な条件でも作用させることに成功した。これは、希釈や拡散が生じる生体内環境においても効率的に機能する、優れた抗癌剤へと応用できる技術である。また、上記とは異なる光応答性ユニットを導入し、機械的な力を生み出すことのできる「光応答性分子糊」を新たに開発した。分子糊の生体膜への接着性を利用し、膜のイオン透過性を光刺激によってコントロールすることに成功した。膜のイオン透過は重要な生体現象の一つであるシグナル伝達の根幹を担うものであり、神経系の疾患治療への応用が期待されるものである。分子糊モノマーとして、当初の予定に加えて新たに1種の化合物を合成したが、これによって目的とする光重合の効率を大きく向上させることに成功したため。25年度が最終年度であるため、記入しない。今回合成に成功した分子糊モノマーについて、引き続き重合挙動の調査を行う。特に生細胞内での光重合の可否や二光子吸収過程を経る重合が可能かどうかについて検討する。また、同様の戦略に基づいて、光刺激に応答して接着性を大きく向上させる「光反応性分子糊」の開拓に着手する。これは、生体内の希釈・拡散環境下においても効率良く癌細胞の増殖を抑制できるものと期待される。
トランジスタの発明の特許と論文における情報の保護と公開に関する実証的研究

1.トランジスタ発明における特許出願と論文発表の経緯ベル研究所の副所長として固体増幅装置の研究を企画したKellyは研究成果の公表に極めて熱心であったが,知的財産権の取得にはさらに積極的であった。KellyはBardeenとBrattainのトランジスタの発明について厳重な緘口令を引くとともに,彼らに先ず特許出願を指示した。彼らは競争相手による発表に焦慮しつつも,1948年6月17日に特許出願を終え,その直後にPhysical Reviewに掲載されるよう論文執筆を行った。研究リーダーであるShockleyは点接触型トランジスタの発明から閉め出された。彼の貢献を書き加えると,Lilienfeldの特許が先願公知となる恐れがあったからである。トランジスタの発明という栄光の座を逃すことを苦慮したShockleyは短期間に接合型トランジスタのアイディアと理論を構築し,6月26日に特許出願をした。この接合型トランジスタの発明こそがその後のトランジスタの発展,半導体物理学の発展の礎となった。2.特許と論文(研究発表)のあるべき関係への考察1)特許出願がもたらした学術進歩への貢献トランジスタの発明の論文の公表は特許の出願後直ちに行われた。特許は発表を数ヶ月遅延させたが,学術進歩への大きな支障とはいえない。むしろ発明行為を厳密に問う米国の特許制度がShockleyをして接合型トランジスタという半導体産業のみならず半導体物理学を初め諸科学の飛躍的発展をもたらす発明に至らせた。2)特許と論文が担う情報特許は産業効果を目的とする技術情報であり,論文は普遍的な科学を伝えるものである。トランジスタの特許は信号増幅機能を実現する技術を記述しており,科学はその実現性を証明する役割を演じる。3)大学における特許と論文の相克とその緩和大学における特許と論文の相克を緩和する施策として研究者の評価処遇,大学内における早期出願の仕組み,発表後の特許出願猶予期間の延長などの特許制度の三面から考えていく必要がある。1.文献の収集整理と文献リストの作成「トランジスタの発明における特許と論文」において,本研究が追究する「研究情報の保護と公開」がどのように実施されたかを,深く広く考察するために,関連する文献を可能な限り多く収集した。それらはトランジスタの発明前の半導体物理学の研究論文から最近の科学技術政策の論文まで145編を含む。さらにトランジスタ発明や論文と特許に関連するWWWページを探索し,ブックマークとして分類し収録した。2.主要文献(特許,論文)の読解と翻訳3.文献が開示している研究および技術情報の調査と整理収集した文献は一通り目を通し,要旨を作成した。これらを文献データベースRef for Windows2000に収録し,キーワードあるいは時系列で検索や引用を可能とした。4.開示情報の考察研究を進めるうちに当初想定した以上に,本テーマは研究活動における本質的な問題を包含するものであることが明らかとなった。情報の保護と公開に関する動機を研究者個人,研究者を雇用する組織,社会的要請の三つから考察することが必要であり,トランジスタ発明に置けるそれらの具体的状況を把握することに努めている。Ben研究所は世紀の大発明の情報の保護と公開に細心の注意を払ったように見える。一方発明者であるShockley, Bardeen, Brattainの3人には3様の言動があった。その後の数多くの文献がそのことを示している。この間,青色LED特許裁判等の係争が進行した。この問題もまた本研究と深く関連しており,日米の発明に対する保護と公開の思想の比較考察も行った。
ゲノムワイド関連解析による関節リウマチ重症化遺伝子同定とその臨床応用への基盤整備

ゲノムワイド関連解析(GWAS)を用い、まず関節リウマチ(RA)の疾患感受性遺伝子の同定を試みた。単独のGWASでは既知の疾患感受性領域であるHLAが同定されたのみだったが、多施設共同研究でのメタ解析により9つの新規疾患感受性領域を同定し、他に14の既知の疾患感受性遺伝子領域での関連を確認した。ゲノムワイド水準を超える関連を認める疾患重症化領域はなかったが、HLA-DRB1とPADI4での関連を確認した。ゲノムワイド関連解析(GWAS)を用いて関節リウマチ(RA)の疾患重症化に関連する遺伝子を同定する。さらに同定された重症化関連遺伝子群の遺伝子型と臨床指標の組み合わせに基づく表現型予測アルゴリズムを作成し、オーダーメイド医療に向けた基盤技術の整備を進める。重症化遺伝子遺伝子の同定に向け、まずDNA収集を終えている1504名のRA患者のうち発症5年時に当センターに通院しており、発症5年時の両手X線が入手可能だった628例について、標準的読影方法の一つであるSharp van der Heijde法によるスコアリング(SHS)を行った。既にタイピングを終えている疾患感受性遺伝子群の情報を用いて重回帰分析により行った予備的解析の結果、発症年齢、性に加えHLA-DB1及びPADI4遺伝子多形(もしくはPADI4遺伝子多形と関連する抗CCP抗体価)とSHSとの関連を認めたことで、このサンプルセット及び解析手法の確からしさが担保されたと考えている。628例のうちHLA-DRB1の多形情報及び抗CCP抗体価の情報がなかったものを除き、SHSでランク付けを行い、上位110例、下位110例を抽出した。各々DNA1300ngを分注したが、質の低いサンプルについては次の順位のサンプルと差し替えていった。研究計画では、DNAチップとしてGenome-Wide Human SNP Array5.0(アフィメトリクス社)を使用する予定だったが、DNAチップの価格低下が得られたため、上位互換性のあるGenome-Wide Human SNP Array6.0(アフィメトリクス社)を使用してタイピングを行った(研究計画で想定した範囲の変更)。現在、重回帰分析によるquantitative trait locus analysis [QTL]with extreme phenotypeを用い、自動化プログラムによりデータの解析を続けている。DNA収集を終えている1504名のRA患者のうち、Sharp vander Heijde法に基づく発症5年時の両手X線スコア(SHS[hands])を入手し得た628例を対象とした。628例のうちHLA-DRB1の多形情報及び抗CCP抗体価の情報がなかったものを除き、SHS(hands)でランク付けを行い、上位110例、下位110例を抽出した。各々DNA1300ngを分注したが、質の低いサンプルについては次の順位のサンプルと差し替えた。DNAチップとしてGenome-Wide Human SNP Array 6.0(アフィメトリクス社)を使用してタイピングを行った。平均QC call rateは97%を超えているが、QC call rateが95%未満のサンプルも多く、予算の制約もあるが次年度中に再タイピングが可能か検討している。QTL解析にはフリーソフトウェアであるPLINKを用いるものとし、ダウンロードの上でテスト解析を行っている。またPerlを用いた自動化プログラムを作成し、データ整理、解析が自動化のもとで運用可能か検討している。同時にこれまでに同定された既知の疾患感受性遺伝子上の多型を抽出し、単回帰分析、重回帰分析により解析を行っているが、PADI4以外は重症化遺伝子として抽出されなかった。これが検定力不足に基づくものか否か今後の検討が必要である。二次コホートの準備も進めており、400例を目標としたDNAの収集とX線読影作業を継続実施している。また、sub解析に必要な関連情報を当施設で実施中のIORRAコホート研究からデータを得て、重回帰分析により遺伝子以外の重症化因子の検索を行う予定出ある。DNA収集を終え、Sharp van der Heijde法によるスコアリング可能だった関節リウマチ(RA)患者628例のうち、424例についてGenome-Wide Human SNP Array 6.0(アフィメトリクス社)を使用して909,622SNPのタイピングを行った。次いで以下の手順でQuality Control (QC)を行った(解析にはPLINKを使用):1.Call rate<90%のサンプルを除去、2.Call rate<90%、non-autosomal、monomorphic、rsID以外のSNPID、同一SNPに複数のジェノタイプが存在するSNPを除去、3.MAF<0.1のSNPを除去。QCの結果1例を除去し、423例、679,692SNPを解析対象とした。SHSをquantitative traitとして回帰分析を行った結果、P<1X10-5レベルで2SNP、P<1X10-4レベルで19SNPを同定した。このうち同じ遺伝子上に位置し、連鎖不平衡にある複数SNPからは1つを選択し、計15SNPを二次コホートによるvalidationの対象とした。