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精神分裂病の病態と海馬領域の機能に関する実験生化学的研究

レセプターとベンゾジアゼピンレセプターおよびGABA_Aレセプターとの相互作用が示唆された。また[^<125>I]DOIを用いたレセプターオートラジオグラフィー法の方法を確立し、来年度の研究においてさらに検討する予定である。フェンシクリジンの単回または反復投与により、ラットの海馬や大脳皮質で、中枢型ベンゾジアゼピン受容体数が増加し、内嗅領皮質で減少していた。こういった結果は、フェンシクリジンの興奮性アミノ酸のNMDA受容体の阻害作用によるものであると考えられるが、この研究結果をまとめてNeurochemistry Internationalに投稿し受理された。分裂病死後脳を用いて、興奮性アミノ酸関連物質であるグリシン、セリンおよびスレオニンを高速液体クロマトグラフィーを用いて測定したが、Orbitofrontal cortexでのグリシンの増加、Putamenでのセリンが減少がみとめられ、分裂病の病態との関連が示唆された。この結果も同様に、Neurochemistry Internationalに投稿し受理された。[1^<125> I]DOIを用いたオートラジオグラフィー受容体結合実験では、幻覚や妄想といった分裂病の症状に似通った精神症状を呈することがある、肝性脳症モデルラットの脳をもちて研究を行い、前頭葉において結合数が減少しており、かつスキャッチャード解析の結果から、この減少が最大結合数の減少によるものであることを確かめた。この研究結果から、セロトニン-2受容体数の減少と肝性脳症の病態との関連が示唆され、脳内セロトニンおよびその関連物質の測定を行っている。:また、分裂病死後脳を用いて、末梢型ベンゾジアゼピン受容体に関する結合実験をおこない、Superior parieta lcortexやVisual area 1において結合数が減少していることがわかった。ラットにハロペリドールの慢性投与をしても、この末梢型ベンゾジアゼピン受容体数は、ほとんど変化しないことから、末梢型ベンゾジアゼピン受容体数の減少と分裂病の病態との関連が示唆された。
LDL受容体ファミリーLR11による血管平滑筋細胞のフェのタイプ変換機構の解明

樹立したLR11ノックアウトモデルを用い、カフ傷害による内膜肥厚モデルを作成し、遊走増殖刺激に対するノックアウトマウスの血管壁におけるSMCsの反応性を組織切片を用いて定量的評価を行った。LR11欠損マウスの血管傷害後内膜肥厚は著明に抑制され、LR11欠損平滑筋細胞はアンギオテンシンIIによる細胞遊走能が障害された。さらに、我々は人血中に可溶型LR11が存在することを発見した。血中可溶型LR11濃度の頸動脈硬化における臨床的意義を明らかにするために脂質異常症を有する一般住民402名(平均年齢61歳、男性193名)の頚動脈内膜中膜肥厚度(IMT)、血中可溶型LR11濃度、血中脂質値等を測定した。血中可溶型LR11蛋白は血清をRAP親和性カラム精製後電気泳動し免疫学的に同定し定量評価した。IMTは、性別、年齢、喫煙、血圧、HDL-C、トリグリセリド、インスリン、血中可溶型LR11蛋白と有意に単相関した。これらの項目を用いた2種類のモデルにおける多変量解析の結果、血中可溶型LR11蛋白はIMTを規定する最も高い独立変数だった。血中可溶型LR11蛋白値の4区分解析の結果、濃度依存性にオッズ比が上昇し、3.5U以上は2.1U未満に比べて7.6倍だった。血中可溶型LR11濃度は新規の動脈硬化関連マーカーとなることが明らかになった。動脈硬化巣にみられるSMCの機能変化は連続したものであり、多彩な様相を呈する。このSMCの機能変化により動脈硬化の進展が制御される。すなわち、このフェノタイプ変換が障害されることにより動脈硬化の進展が亢進することが考えられる。本研究の目的は、動脈硬化巣の肥厚内膜における内膜SMCの亢進した遊走能の分子機構を解明し、SMCのフェノタイプ変換に関わる分子機構への作用を解明し、それに対する修飾作用を明らかにすることにより新たな動脈硬化の治療法を探索する。我々は内膜平滑筋細胞に特異的に発現する遺伝子を同定し、LR11cDNAを平滑筋細胞に過剰発現し、その機能を解析した。LR11過剰発現細胞ではウロキナーゼ受容体、インテグリンの発現が亢進した。LR11過剰発現細胞及び可溶型LR11を添加することによりFAKのリン酸化活性、Rac1活性が亢進した。可溶型LR11を添加することにより細胞骨格の再構築が引き起こされ、葉状仮足の形成を促進した。可溶型LR11は培養平滑筋細胞のBTEB2、SMembの発現を亢進させた。これらの効果はLR11、ウロキナーゼ受容体、インテグリンの特異的中和抗体を添加することにより抑制された。更に我々は、BAC/129SvJゲノムライブラリーよりマウスLR11遺伝子17.8kbをクローニングし、蛋白翻訳認識部位をNeo遺伝子に置換した約8kbをターゲティングベクターPGTNに導入し、ES細胞にエレクトロポレーションした。組み換えが確認されたクローンをブラストシストにインジェクションし、LR11キメラマウスを獲得し、これらのキメラマウスを用いて、B6由来マウスと交配を行い、ノックアウトマウスの樹立を行った。今後、LR11ノックアウトマウスにおける動脈硬化進展の解析、動脈硬化巣における平滑筋細胞の機能解析、培養細胞におけるフェノタイプ修飾効果を明らかにし新たな動脈硬化の治療法を提示する。
非平衡系を活用した機能性分子集合体の特性チューニングとその材料への展開

1.緒言低分子ゲルは、非平衡系で形成される分子集合体である。本研究ではこの点に着目し、分子集合体の特性をチューニングすることを試みた。また、得られた機能性分子集合体を無機物(シリカゲル等)、あるいは高分子(ポリスチレン等)と複合化することにより、超分子材料への展開を試みた。2.実験および結果(1)フェナントロリンを基体とした低分子ゲル中において、フェナントロリンからプロトン化フェナントロリンへのエネルギー移動が起こることを既に明らかにしている。この分子集合体に対してゾルゲル転写法を適用することによって、有機無機複合体を得ることに成功した。非常に興味深いことに、無機物と複合化することによって分子集合体が安定化された(J.Mater.Chem.,15,2747(2005))。(2)ペリレンを期待とした超分子集合体をポリスチレンのマトリックス中に安定に担持することに成功した。得られたフィルムを剪断することによって、超分子集合体の機能性に異方性を付与することが可能であった。3.総括本研究では、機能性分子を基体とした低分子ゲル化剤を設計し、分子集合体中において特異な光化学特性が発現されることを明らかにした。また、これを機能性材料として展開するために、高分子や無機物などと複合化する方法を開拓した。2.実験および結果(1)機能性色素であるペリレンに様々な置換基を修飾した低分子ゲル化剤を複数合成した。ペリレンは修飾された置換基によって異なる光化学特性を示した。ある条件においてこれらを相溶させた一次元分子集合体が得られた。結果として、分子集合体の光化学特性をコントロールすることが可能であった(Angew. Chem. Int. Ed.,43,122(2004))。(2)フェナントロリンを基体とした低分子ゲル中において、フェナントロリンからプロトン化フェナントロリンへのエネルギー移動が起こることを既に明らかにしている。非常に興味深いことに、無機物と複合化することによって分子集合体が安定化された(J. Mater. Chem., in press)。(3)核酸塩基部位を有する低分子ゲル化剤と相補的なポリヌクレオチドの複合ゲルを設計した。このゲル中では核酸塩基間の相補的な水素結合が働いており、これによってゲルの物性をコントロールすることができた(Chem. Commun 1996(2004))。(4)機能性色素部位を有する水性低分子ゲルとカーボンナノチューブの複合化を試みた。これによって分散性の悪いカーボンナノチューブを水中に安定に分散することが可能であった。また、カーボンナノチューブと色素間の相互作用によって、色素の蛍光特性に変化が見られた(Chem. Lett.,33,1124(2004))。
神経活動履歴に伴う受容体輸送制御におけるＲａｂエフェクター分子の役割

シナプスの機能は輸送される受容体分子によって大きく規定されるが、その膜輸送機構による制御機構は不明である。Rab5のエフェクター蛋白質であるrabaptin-5の役割について以下の点について明らかにした。1)Rabaptin-5はグルタミン酸受容体のサブユニット特異的な輸送に関与、2)神経活動履歴に応じてRabaptin-5の活動依存的変化、3)恒常的シナプス可塑性への寄与。これらの結果は、受容体のエンドソームからのリサイクルを介した膜輸送経路がシナプス機能及び可塑性発現に重要であることを示している。シナプスにおける神経伝達受容体の種類・数量は、シナプス伝達の強度を決めるのみならず、シナプス可塑性の性質を決める大きな要因である。さらに、シナプス可塑性の発現はその神経活動の履歴に依存していることが知られている。しかしながら、その分子機構は明らかではない。本研究では、「神経活動履歴に伴う受容体の輸送制御は、Rabエフェクター分子Rabatpin-5の活動依存的な制御に起因する」との仮説をたて、受容体の輸送に関わる細胞の膜輸送システムがシナプス伝達および可塑性の機能制御に果たす役割を明らかにすることを目的にしている。本年度は以下の項目について明らかにした。昨年度は恒常性シナプス伝達における関与を明らかにしたが、本年は、長期増強、及び、メタ可塑性における役割を検討した。培養細胞を用いた実験系において薬理学的に長期増強を誘導するとグルタミン酸受容体のシナプス部位への集積がみられるが、rabaptin-5をノックダウンすると、その変化は見られない。また、長期増強を誘導する前の神経細胞の活動状態変化させるとシナプスへ組みこまれる受容体のサブタイプが異なる事を見いだした。その上でrabaptin-5はサブユニット特異的な輸送に関与する結果を得ている。さらにその事実を裏付けを検討している。シナプス可塑性の発現は、さらに、神経活動の履歴が影響をおよぼすことが知られている。本研究では、「神経活動履歴に伴う受容体の輸送制御は、Rabエフェクター分子Rabatpin-5の活動依存的な制御に起因する」との仮説をため、受容体の輸送に関わる細胞の膜輸送システムがシナプス伝達および可塑性の機能制御に果たす役割を明らかにする。1.Rabaptin-5は恒常的シナプス可塑性を担う分子であるか?また、活動履歴を変化させた状態の神経細胞において、長期増強・長期抑圧発現における受容体輸送における役割を明らかにする。恒常的シナプス可塑性では、神経活動の抑制に対して微小シナプス後電流の増加を誘導するが、この増加がRabaptin-5を介してGluA1のシナプスへの膜輸送増加に依存するかを検討した。microRNAをもちいたノックダウンの結果、優位にGluRA1受容体を含むAMPA型受容体の発現を抑制した。このことは、Rabaptin-5が恒常的シナプス可塑性の発現において一因を担っていることを示唆している。2.神経活動履歴に応じてRabaptin-5の活動依存した発現は変化するか。メタ可塑性の発現は、神経活動履歴によって変化することが必須である。当該分子がその候補となるかを検討した結果。神経活動の上昇に伴い減少することを、さらに、ある特定の領域がその責任部位であるとこと突き止めた。昨年度まで、Rabpatin-5が活動に依存して減少すること、グルタミン酸受容体の表面発現を促進する機能があることを明らかにしてきた。本年度は、Rabaptin-5のスプライスバリアントの解析とKOマウスを用いた解析を実施した。Rabaptin-5は少なくとも5種のスプライスバリアントを持つことが報告されている。実際に脳組織でどのようなスプライスバリアントが発現しているかは不明であり、これを確認した。少なくとも、2種が発現していることをPCRから確認できた。このスプライスバリアントはRab5との結合領域を欠損するバリアントであり、機能的な違いが期待される。これまでの研究でRabaptin-5は活動依存的に減少することを明らかにしてるが、このRabaptin-4においてはその減少が見られないことが確認できた。すなわち、これらRabaptin-5のスプライスバリアントは、Rab5との結合能力と活動依存的に減少する機能を差別化してもち、受容体の輸送を精緻に制御できることを示唆している。

さらにこの分子の重要性を明らかにするために、マウス個体由来の組織標本を用いて解析を行った。急性海馬スライス標本でのシナプス機能解析、により、短期のシナプス可塑性では短期、長期のシナプス可塑性においても機能異常が確認できた。以上の研究により、Rabエフェクター蛋白質の活動依存的変化が、グルタミン酸受容体の輸送を制御する機構の一端が明らかにできた。神経科学申請時の計画では、H25年度は、「Rabaptin-5は、エンドソームからの受容体膜輸送のみを制御しているか?」である。これに対して、本年度は、シナプス伝達、及び、可塑性への関与においてエンドソームを含めた膜輸送システムを検討した。培養細胞を用いた実験系でグリシン刺激によって長期増強を誘導した際に起こるシナプス後部の受容体を評価した。通常、グリシン刺激によってシナプス後部構造であるスパインにAMPA型受容体が集積するが、Rabaptin-5のノックダウンを行った神経細胞では、その集積が阻害された。また、メタ可塑性への関与を検討するために、神経細胞の活動状態を変化させた状態で、グリシン刺激によるLTP誘導をおこなった。興味深いことに、活動状態が低い時にはGluA1が、活動状態が高い状態では、GluA2がスパインに集積する事を明らかにした。その内、Rabaptin-5はGluA1の輸送にのみ関与する事を明らかにした。このGluA1のシナプスへの輸送に関して、エンドソームからの輸送と、もしくはGolgi体からの輸送が考えられる。特に、rabaptin-5にはGGA1が結合すること、GluA1はシナプス近傍で合成されること、さらに、エンドソームからの輸送においてはGluA2の排他的機構が必要なことから、Golgi体からの輸送の可能性が高い事を示唆している。そのため、GGA1発現等を行うためのクローニングを実施した。1.Rabaptin-5は恒常的シナプス可塑性を担う分子であるか?また、活動履歴を変化させた状態の神経細胞において、長期増強・長期抑圧発現における受容体輸送における役割を明らかにする。本課題に関して、Rabaptin-5の過剰発現系、欠損型の発現によるシナプス部位の表面に発現する受容体GluA1,2を定量した。これによって、当該分子がGluA1の表面発現の寄与していることを明らかにできた。リサイクエンドソームの関連分子であるRab4の寄与についても解析を進めているが、十分な結果を得るに至っていない。2.Rabaptin-5の活動依存した発現量減少のメカニズムを明らかにする。内在分子、欠損型の分子を発現させ、活動上昇にともなう変化を明らかにした。また、その経時的な変化についても評価できた。また、上記の結果は、日本神経科学学会、北米神経科学学会、米国細胞生物学会にて報告をした。H26年度は以下の項目について明らかにしていく。・可塑性における役割をKOマウスを用いて検証する。KOマウスが利用できることで、急性スライス標本をもちいて長期増強、長期抑圧、シナプス伝達物質放出能の変化等、多岐にわたる神経系における機能を評価できる。
リキア地方(トルコ南西部)沿岸初期中世都市遺跡の発掘・調査

平成9年度は7年度に開始したゲミレル島第三聖堂の発掘を継続し、これまでの発掘区(アプシス及び内陣)に続く身廊の一部平方メートルト側廊の一部約平方メートルを発掘した。発掘により、オリジナルの聖堂建築が出土した。今回発掘した部分は、身廊と内陣とを隔てるテンプロン、及び聖職者の通路であるソレアを含んでいる。平成7年度からの発掘により、この聖堂のアプス、内陣、祭壇、テンプロンとソレアがすべて出土した。これらは聖堂の典礼がおこなわれる部分であり、典礼と建築各部の関係を調べる上で貴重な資料である。身廊と側廊の床には、モザイクの装飾が施されていた。モザイクには様々な色の石や色ガラスが用いられており、側廊は幾何学分様、身廊は植物が描かれている。このモザイクは芸術的価値が高いだけでなく、今後この地域がどの文化圏に属していたかという問題を明らかにするための手がかりとなるものである。また、聖堂内に合計6基の墓が作られているのが新たに発見された。土層の観察から、これらの墓は聖堂崩壊後、紀元後12世紀頃に作られたことがわかた。平成7、8年度の発掘により、この聖堂は紀元後6世紀頃に建設され、7世紀中頃、この地方にアラブ人が進出してきた時代に火災で崩壊したことがわかっている。9年度の発掘により、12世紀頃、ビザンティン帝国が再び勢力を取り戻してきた頃に、この聖堂の廃墟を墓地に転用したことが判明した。初期・中期ビザンティン時代のこの地方に言及した史料はほとんどないので、今回の発掘は歴史を実証的に解明したものとして意義がある。発掘区内では建築物すべての平面図、立面図、断面図、及び土層断面図を作成した。また出土品は現場で番号をふってカタログ化し、写真撮影、実測図作成をおこなった後、トルコの法令にしたがいフェティエ博物館に搬入した。平成7年度はゲミレル島第三教会の内部東端のアプス周辺約48平方メートルを発掘した。この発掘により、アプス内では階段状のシンスロノン(聖職者席)が発見された。シンスロノンの下部では保存状態がよく、漆喰で貼った化粧板が残存していた。アプスの西に続くベ-マ(内陣)では、日程の都合により床面まで掘り下げるのを保留し、床から約40センチメートル上で作業を中断した。この部分では、かつて祭壇の四隅に立てられていたと見られる大理石の円柱と柱頭が出土した。また、大理石の彫刻や浮き彫り片約200点、土器片数十点、青銅製コイン3点が出土した。大理石彫刻片は、テンプロン(祭壇を囲む石造の障壁)などの建築装飾の断片と思われる。発掘区の建築物については平面図、立面図、断面図を作成した。出土品は現場で番号をふってカタログ化し、写真撮影、実測図作成をおこなった後、トルコの法令にしたがいフェティエ博物館に搬入した。また発掘と並行して、この教会の現存するすべての壁面を内・外面にわたって実測し、立面図を作成した。出土した大理石彫刻の多くは、初期ビザンティン時代、5世紀末から6世紀にビザンティン帝国の各地で流行した様式を見せている。この年代は建築物の特徴からこれまでに得られた推測とも一致するので、ほぼ確実といえる。一方、コインはいずれも11、2世紀のもので、床面上約40センチメートルの瓦礫の中から出土した。このことから、教会は12世紀までにはすでに廃墟となっていたことが想像される。ただし建てられてから12世紀までのいつ、どのような原因で廃墟となったのかはまだ不明である。

この点については来年度、床面まで発掘を進めれば知見が得られると期待される。平成7年度にゲミレル島第三教会の内部東端のアプス周辺約48平方メートルを発掘したのに引き続き、8年度ではその西に続くベ-マ(内陣)とその南北のスタイロベイト(列柱台座)部分の約48平方メートルを床まで発掘した。床面の保存状態はよく、石灰岩の板が全面に敷かれていた。ベ-マ中央には祭壇があった。祭壇は大理石製のテーブル状のもので、押しつぶされて床に散乱していたが、断片から復元が可能である。祭壇の基壇には長さ約2メートル、幅1メートル、厚さ約7センチメートルの石灰岩製の板が用いられており、比較的良好な保存状態で出土した。基壇には十字架、植物文様などの特徴的な線刻があった。ベ-マの西端では、身廊とベ-マを区切っていた大理石製のテンプロン(障壁)の下部が出土した。発掘により、大理石の彫刻や浮き彫り片約200点、土器片数点、鉄製釘23点が出土した。出土品は現場で番号をふってカタログ化し、写真撮影、実測図作成をおこなった後、トルコの法令にしたがいフェティエ博物館に搬入した。祭壇基壇も、薬品処理で硬化し来年現場に戻すため、実測図と拓本を取った後フェティエ博物館に一時保管した。発掘区内では建築物すべての平面図、立面図、断面図、及び土層断面図を作成した。昨年と同様、出土した大理石彫刻の多くは、初期ビザンティン時代、5世紀末から6世紀にビザンティン帝国の各地で流行した様式を見せている。発掘区の層位は床面直上は炭化した木材の層、その上が5層の石材や砂礫の層となっており、最初この聖堂の木造の屋根が火災で焼け落ち、その後石造の壁が崩落したことが確かめられた。また、床面から釘以外の金属物が見つからなかったことから、この聖堂が7世紀頃にこの地方に侵入するようになったアラブ人の略奪を受け、その後炎上したことも考えられる。平成9年度は7年度に開始したゲミレル島第三聖堂の発掘を継続し、これまでの発掘区(アプシス及び内陣)に続く身廊の一部18平方メートルと側廊の一部約6平方メートルを発掘した。発掘により、オリジナルの聖堂建築が出土した。今回発掘した部分は、身廊と内陣とを隔てるテンプロン、および聖職者の通路であるソレアを含んでいる。平成7年度からの発掘により、この聖堂のアプス、内陣、祭壇、テンプロンとソレアがすべて出土した。これらは聖堂の典礼がおこなわれる部分であり、典礼と建築各部の関係を調べる上で貴重な資料である。身廊と側廊の床には、モザイクの装飾が施されていた。モザイクには様々な色の石や色ガラスが用いられており、側廊は幾何学文様、身廊は植物が描かれている。このモザイクは芸術的価値が高いだけでなく、今後この地域がどの文化圏に属していたかという問題を明らかにするための手がかりとなるものである。また、聖堂内に合計6基の墓が作られているのが新たに発見された。土層の観察から、これらの墓は聖堂崩壊後、紀元後12世紀頃に作られたことがわかった。平成7、8年度の発掘により、この聖堂は紀元後6世紀頃に建設され、7世紀中頃、この地方にアラブ人が進出してきた時代に火災で崩壊したことがわかっている。9年度の発掘により、12世紀頃、ビザンティン帝国が再び勢力を取り戻してきた頃に、この聖堂の廃虚を墓地に転用したことが判明した。
フォトクロミック蛍光タンパク質を用いた超解像顕微鏡

蛍光を発する状態Bと蛍光を発しない状態Aの間を光励起によりスイッチングできる蛍光タンパク分子を用いて蛍光顕微鏡の空間分解能を向上させる研究を行った。光スイッチングにより状態Bの空間分布を非常に小さな領域に局所化することにより空間分解能を数倍向上させることに成功した。また、励起光強度が500W/cm^2以下の非常に低強度な条件において、光スイッチングを繰り返した分子を検出することによっても空間分解能を数倍向上できた。本研究は細胞小器官内における生命現象を可視化するために、フォトクロミック蛍光タンパク分子であるDronpaを標識分子として用いることにより、低強度で回折限界を超えた空間分解能を有する超解像イメージング技術を開発することを目的としている。Dronpaは488nmの光励起により蛍光を発する場合と蛍光を発することなく蛍光を発する状態Aから蛍光を発しない状態Bへと光スイッチングする場合がある。また、405nmの光励起により状態Bから状態Aへと戻すことが可能である。集光点における強度プロファイルのビーム中央で強度がゼロとなるドーナツ型ビームと回折限界の強度プロファイルを有するビームを2つの光スイッチングを誘起する励起光として用いることにより、蛍光を発する分子状態の領域を低強度で回折限界以下に制限することができる。この分子状態分布をプローブ光により検出し、回折限界を超えた空間分解能を実現する。本年度は、まず、2つの光スイッチング用の励起光とプローブ光の合計3つの励起光を用いた共焦点顕微鏡を試作した。次に、光スイッチング用の励起光の一方に、空間光変調器を用いて集光点においてドーナツ型の空間強度プロファイルとなるように空間位相変調を行った。集光点における強度分布を測定し、ドーナツ型の強度プロファイルとなる位相関数を決定した。現在、このドーナツ型ビームの強度を増加させることにより顕微鏡の空間分解能が向上することを確認しようと研究を進めている。また、繰り返し光スイッチングさせた後に発生する蛍光のみを測定する逐次的多光子励起顕微鏡の開発にも成功した。この技術も新しい超解像イメージング技術であり、共焦点顕微鏡の2, 3倍の空間分解能を低強度で実現した。近年、蛍光顕微鏡において、入射光強度がMW/cm^2オーダーの励起光による飽和励起を用いることにより、数10ナノメートルの空間分解能が得られるようになってきた。生体機能観測においては、生体試料への損傷を避けるために入射光強度を抑制する必要があるため、問題となっている。本研究課題では、近年開発された飽和強度がkW/cm^2オーダーの光スイッチング機能をもつ蛍光タンパク質分子Dornpaと空間位相変調技術を用いることにより上記の問題を解決することを目的としている。集光点における強度プロファイルのビーム中央で強度がゼロとなるドーナツ型ビームを光スイッチング用の励起光として用いることにより、蛍光を発する分子状態の領域を低強度で回折限界以下に制限することができる。この分子状態分布をプローブ光により検出し、回折限界を超えた空間分解能を得ることが可能である。本年度は、昨年度試作した光スイッチング用のドーナツビーム型ポンプ光と蛍光検出用のプローブ光、分子状態を元に戻すリバース光の合計3つの励起光を用いた共焦点顕微鏡を用いて、空間分解能を測定した。ドーナツ型ポンプ光の光強度を1.3kW/cm^2程度まで増加させると従来の共焦点顕微鏡に対して空間分解能が約2倍向上したことから低強度での空間分解能向上が確認できた。また、昨年度開発した逐次的多光子励起顕微鏡を用いてビーズのイメージングを行い、上記手法より低強度の100 W/cm^2以下の光強度で従来の共焦点顕微鏡より空間分解能が23倍高い像を取得することにも成功した。このような低強度の励起光であれば生体試料に損傷を与えることなく観察することが可能であると期待できる.
ヒト個体群の拡散に関する人口学的シミュレ-ション分析

今年度も個々の人間を最小の構成要素とする人口学的マイクロシミュレ-ションを実行した。具体的には、個々の人間が集まって形成される集落として正六角形のセルを想定し、それぞれの集落の人口支持力と人口増加速度を決めるパラメ-タとしてNRR(Net Reproduction Rate)を設定する。そして人口支持力とNRRを変化させることにより、集落の消滅ないし人口増加による他集落への移動の様子を経時的に観察した。これらの作業のなかで、演算速度が遅いことが問題となったため、今年度は主として昨年度までに作り上げたシミュレ-ションプログラムを改良する作業を行った。その結果、取扱い可能な集落数、総人口数、シミュレ-ト期間などの制約は実質上なくなり、演算時間も大幅に短縮することが可能になった。新たなプログラムにおいては演算時間は総人口にほぼ比例し、たとえば総人口6万人のとき1年分の演算時間は約1秒である。したがって、パ-ソナルコンピュ-タ自身の演算速度による制約は依然として残ることになる。現在このモデルを用いて、オセアニアのサル-フ大陸におけるモンゴロイドの拡散についてのシミュレ-ションを試みている。サル-フ大陸の地形図にセルをあてはめ、各セルに5つの水準の人口支持力を設定し、出産、死亡と人口支持力のパラメ-タを変化させることによりこの地域におけるモンゴロイドの拡散をシミュレ-トする。そしてこの地域における既存の知見と比較・検討する。
大規模数値シミュレーションによる円盤銀河の形成とハッブル系列の起源の研究

宇宙論的数値シミュレーションで得られた円盤銀河に着目しその形成史を調べた。特に、円盤銀河本体の形成後に、降着してきた矮小銀河の力学進化に着目した。このような矮小銀河は、ホスト銀河である円盤銀河に降着後、ホスト銀河の潮夕力により完全に崩壊し、円盤銀河のハロー成分の一部になった。この崩壊した矮小銀河の星成分の力学的性質を解析した結果、このような矮小銀河起源のハロー星は、空間情報は崩壊しても、元の矮小銀河の運動的性質を継承し、その特徴的な速度情報を保持することがわかった。これとは別に、高解像度数値シミュレーションにより、降着中の矮小銀河が、円盤銀河の銀河円盤に与える、重力的影響を調べた。結果として、太陽の200億倍の質量を持つ矮小銀河が、我々の銀河系の半径約15kpcの位置を通過すると、銀河円盤成分の端が大きく湾曲される(Warp)ことがわかった。この結果は、観測で知られている、ある高速度中性水素雲(Complex C)の分布を定性的に説明できることがわかった。しかし、このような軌道をもつ矮小銀河は観測されていないため、Complex Cがこのような起源で形成した可能性は低いことが示された。また、上記の質量の矮小銀河が降着すると、銀河円盤成分自体が、矮小銀河の潮夕力により壊されることもわかった。したがって、円盤銀河では、そのような矮小銀河の降着は円盤が形成した後には、起こらなかったことが結論された。最後にケーススタディとして、現在、我々の銀河系に降着しつつある矮小銀河の1つである小マゼラン星雲の進化史を詳しくしらべた。小マゼラン星雲のガス成分と星成分、さらに星形成を整合的にシミュレートした結果、観測される中性水素の分布や小マセラン星雲にみられる若い星の存在が、大マゼラン星雲および我々の銀河系との相互作用によるものとして説明できることがわかった。本研究は、円盤銀河の形成とハッブル系列の起源を明らかにすることを目的としている。この目的のため、独自に開発した化学力学進化を考慮した銀河形成数値シミュレーションコードを用いて、空間スケールの異なる二種類の大規模数値シミュレーション(宇宙論的スケール、単独銀河スケール)を行った。独自に開発した化学力学進化コードの詳細と、その性能評価を雑誌論文として発表した。このコードは、銀河の力学進化に加え星形成に伴う重元素生成循環過程(化学進化)を整合的に組み込み、化学進化の面で世界的に最も洗練されたコードとなった。論文では、このような詳細な化学進化の計算を、観測データと比較することで、より詳細な銀河形成史を探ることができることを示した。宇宙論的スケールのシミュレーションでは、様々な形態の銀河(円盤銀河や楕円銀河)が得られたが、ここではまず、楕円銀河に注目した。計算コードの特徴のおかげで、楕円銀河のX線と可視光の両方で知られている観測的性質を、初めて同時に調べることが可能となった。その結果、X線観測を説明するために必要となる輻射冷却の機構が、可視光観測で問題を起こすことが明らかになった。3.単独銀河スケールのシミュレーションによる、低金属量の星の運動の研究(Brook et al. 2003)単独銀河スケールの円盤銀河形成シミュレーションを用いて、低金属量の星の運動を細かく調べた。シミュレーション結果と太陽近傍の星の運動の観測を比較したところ、観測でみられた高離心率かつ低金属量の星の集団が、小さな銀河の降着過程ではぎ取られた星の名残である可能性が高いことがわかった。

4.マゼラン銀河のシミュレーション(Yoshizawa & Noguchi 2003)マゼラン銀河と銀河系の相互作用のシミュレーションを、世界で初めて、星形成も含んだコードを用いて行った。観測で検証可能な多くの予想を立てた。宇宙論的数値シミュレーションで得られた円盤銀河に着目しその形成史を調べた。特に、円盤銀可本体の形成後に、降着してきた矮小銀河の力学進化に着目した。このような矮小銀可は、ホスト銀可である円盤銀河に降着後、ホスト銀河の潮夕力により完全に崩壊し、円盤銀河のハロー成分の一部になった。この崩壊した倭小銀河の星成分の力学的性質を解析した結果、このような矮小銀河起源のハロー星は、空間情報は崩壊しても、元の矮小銀河の運動的性質を継承し、その特徴的な速度情報を保持することがわかった。これとは別に、高解像度数値シミュレーションにより、降着中の矮小銀河が、円盤銀河の銀河円盤に与える、重力的影響を調べた。結果として、太陽の200億倍の質量を持つ矮小銀河が、我々の銀河系の半径約15kpcの位置を通過すると、銀河円盤成分の端が大きく湾曲される(Warp)ことがわかった。この結果は、観測で知られている、ある高速度中性水素雲(Complex C)の分布を定性的に説明できることがわかった。しかし、このような軌道をもつ矮小銀河は観測されていないため、Complex Cがこのような起源で形成した可能性は低いことが示された。また、上記の質量の矮小銀河が降着すると、銀河円盤成分自体が、矮小銀河の潮夕力により壊されることもわかった。したがって、円盤銀河では、そのような矮小銀河の降着は円盤が形成した後には、起こらなかったことが結論された。最後にケーススタディとして、現在、我々の銀河系に降着しつつある矮小銀河の1つである小マゼラン星雲の進化史を詳しくしらべた。小マゼラン星雲のガス成分と星成分、さらに星形成を整合的にシミュレートした結果、観測される中性水素の分布や小マゼラン星雲にみられる若い星の存在が、大マゼラン星雲および我々の銀河系との相互作用によるものとして説明できることがわかった。
シアニン色素のメソ位に電子供与部を組み込んだ高感度太陽電池増感剤の開発

太陽電池として現在実用化されているものとしてアモルファスシリコンを用いるものが知られている。しかし将来的には低コストで環境に優しい材料の開発が望まれる。その第一候補として酸化チタン半導体を用いる色素増感太陽電池が着目されている。色素太陽電池の代表的な増感剤はルテニュウム錯体であるN3である。これを用いたグレッエル型湿式セルの変換効率は10%程度であると言われている。しかし2つ問題点がある。第一はルテニュウムが高価であること、湿式セルは液漏れを防ぐ為にコストが嵩むことである。これらの欠点を克服する為に写真増感剤として知られているシアニン色素を用いる事とした。シアニン色素の特徴は分子吸光係数が大きく、可視光から近赤外まで幅広く吸収帯を持つので太陽光を有効に利用できる点である。さらに湿式セルの欠点を克服する為に固体型セル(CuI)の可能性を探ることとした。そこでメソ位に電子供与性の高いユロリジル基を導入したものや、電子供与基であると同時にCuIとの相互作用の高いメチルチオフェニル基を導入したシアニン色素を合成し、湿式セルと固体型セルを作成し性能試験を行った。その結果固体型セルを用いた場合基準として用いたN3と同程度の太陽電池になることを明らかにした。湿式セルを用いた場合は殆ど性能が出なかった。将来Ru金属を使わない色素太陽電池の実用化への可能性を開いた。我々はこれまで分子の機能に着目し,機能を組み合わせることで新しい機能特に超機能を発現させる方法論を模索しているところである。たとえば化学発光能と金属取り込み能を組み合わせると応答能が発現することをしめした。この基本概念をシアニン色素と電子供与能の高いユロリジル基を組み合わせて反応性の高い電子の発生を可視光照射で可能にする太陽電池増感剤の開発を開始した。我々の開発した光増感重合系(SS増感剤)をTiO_2表面に吸着するためのアンカー基としてスルホ基をもつSS増感剤、カルボキ基を側鎖に持つものにした。酸化チタンとこの色素を組み合わせて太陽電池にするグレチェルの湿式セルでの性能を調査したが、期待はずれであった。(静岡大学)の昆野らの協力を得て固体セルでスルホ基をもつSS増感剤を測定したところルテニウム系の色素以外としては高い効率を示す色素であることが判明した。固体セルではEff効率1.9%を記録した(非ルテニウム錯体色素としては高い効率)。これは電子供与部と電子受容部が捻れるために逆電子移動が阻害されるため反応性の電子がTIO_2の導電帯に移動し効率を高めているものと考えられる。問題点はいろいろあるが、ヨウ化銅と色素との接触も気になる点である。ヨウ素との接触を高めるために硫黄を含む官能基を導入してみたいまた波長域が近赤外にまで及ぶシアニン色素についても検討を加える予定である。今年度報告にまでたどり着いた成果は超機能発現の基本概念の確認に留まっているが、研究会ではSS増感剤が太陽電池として期待の持てるものであることを示してきた。
加速器ニュートリノ実験の新たな展開

この研究では、(1)世界に先駆けて開始されたつくば・神岡間250kmのK2K長基線ニユートリノ振動実験、(2)東海村に建設中のJHF(大強度陽子加速器)を用いる次期長基線ニュートリノ振動実験の検討・立案、(3)将来の強力なニュートリノ源として有力視されているニュートリノファクトリーに関して、我が国での実現方策の調査検討を行った。(1)については、最終的な目標(10^<20>個の陽子をニュートリノ生成標的に照射)の約半分のデータを既に発表した。その結果は、スーパーカミオカンデが大気ニュートリノの観測で得たν_μ→ν_τ、振動と良く一致し、単なる統計的変動でこのように見える確率は1%以下である。今後、平成16年度末までに実験の最終的目標に到達する予定である。(2)については、JHF大強度陽子加速器を用いる、東海から神岡への距離295kmの次期ニュートリノ振動実験計画の検討・立案を行い、国際共同実験チーム(12ヶ国から150名)からのLetter of Intentとして提出した。このLOIは、JHFでの初期の実験提案を審査する委員会で既に審査され、物理の意義が高く評価され、早期推進の勧告を得ている。本研究の目的を簡略に述べると、(1)世界に先駆けて開始されたK2K長基線ニュートリノ振動実験を進め、その結果を国際的に発信すること;(2)長基線ニュートリノ振動実験に関する調査及び情報交換;(3)ニュートリノファクトリーに関する調査検討である。(1)については、平成12年度においてK2K実験は予定通り着々とデータを蓄積し、中村が平成12年6月にカナダのSudburyで行われたニュートリノ2000国際会議、作田が平成12年7月に大阪で行われた高エネルギー物理学国際会議、石田が平成12年5月にカナダで行われた素粒子・原子核境界領域に関する国際会議でそれぞれK2K実験の途中結果を発表したのを始め、この他数カ所の国際会議でも発表し、世界の注目を集めた。(2)については、中村、小林、早戸が米国、カナダ、韓国で国際会議に出席し、情報交換を行い、それらの情報に基づいて、建設が認められた日本の大強度陽子加速器を用いる長基線ニュートリノ振動実験計画を、作田、その他の協力者とともに、立案を進めている。(3)については、森、久野、中村が米国で開催された第2回ニュートリノファクトリーワークショップに参加して調査を行い、米国とヨーロッパの計画を進めている研究者と情報交換を行った。その結果、平成13年5月に第3回のワークショップを日本で開催することとなった。また、森と久野は日本のニュートリノファクトリー構想としてFFAG加速器を用いるユニークな方式を立案して欧米の研究者から注目を集めるとともに、FFAGの開発研究を進めた。平成12年度は、当初の研究目標を十分に達成することができた。本研究の目的は、(1)世界に先駆けて開始されたK2K長基線ニュートリノ振動実験を進め、その結果を国際的に発信すること;(2)長基線ニュートリノ振動実験に関する調査及び情報交換;(3)ニュートリノファクトリーに関する調査検討である。(2)については、13年5月につくばで「JHFニュートリノ実験国際ワークショップ」を開催して日本の大強度陽子加速器を用いる長基線ニュートリノ振動実験計画を中心に議論し、また14年1月にCERNで行われた次世代ニュートリノ検出器のワークショップに中村と小林が出席してJHFでのニュートリノ実験計画について報告した。(3)については、森、久野、中村が中心となって13年5月につくばでニュートリノファクトリーに関する第3回目の国際ワークショップ「NuFact02」を開催した。また、森と久野は日本のニュートリノファクトリー構想としてFFAG加速器を用いる方式を立案して欧米の研究者から注目を集め、現在150MeV FFAGの開発研究が進められている。本年度は、各研究項目毎の国際ワークショップ開催など、活発に研究活動を展開した。

(1)については、平成13年11月に発生したスーパーカミオカンデの光電子増倍管大量破損事故からの復旧作業に協力し、平成14年10月には当初の光電子増倍管数の約半分を再配置した部分復旧が完了し、同年12月からK2K実験の後半を開始した。物理の成果としては、平成13年夏までの結果を取りまとめK2K実験の第2論文として、Physical ReviewLettersに発表した。この段階で99%以上の確率でニュートリノ振動を肯定する結果が得られており、世界的に注目されている。また本年度も各種国際会議で実験の途中結果を招待講演として発表した。さらに、13年12月にシリーズの第1回がKEKで開催された国際会議の2回目が「The Second International Workshop on Neutrino-Nucleus Interactions in the Few GeV Region」としてカリフォルニア大学アーバイン校で開催され、中村、作田、石田、早戸が参加し、K2K前置検出器によるニュートリノ反応の測定結果を公表した。(2)については、これまでの調査結果を反映して建設中の大強度陽子加速器を用いる次世代ニュートリノ振動実験計画を立案し、Letter of Intentとして原子核素粒子実験施設委員会に提出し、早期実現を図るとの提言を得ている。また、この研究の国際的展開を図るため、平成14年9月に京都大学で「International Workshop on Nuclear and Particle Physics at 50-GeV PS」が開催された機会に世界各地から参加希望者が集まり、計画の検討を精力的に行った。(3)については、森が中心となって日本のニュートリノファクトリー構想の中心であるFFAG加速器の開発研究を進めた。現在150 MeV FFAGの製作が行われているまた、森、久野、中村は14年7月にロンドンで開催されたニュートリノファクトリーに関する第4回目の国際ワークショップ「NuFactO2」に参加し、世界の状況を調査した。
放射線耐性の克服に向けたミトコンドリア研究の新展開

X線照射及びドセタキセル(DTX)処理後、親株ではミトコンドリア(mt)由来の活性酸素種(ROS)が検出されたが、臨床的放射線耐性(CRR)細胞では検出されなかった。過酸化水素耐性細胞は、X線及びDTXに耐性であった。SAS及びHeLa細胞から樹立したmtDNA欠失細胞であるρ0細胞は、X線(10 Gy)照射及びDTX(100 ng/ml)処理後、mt由来のROSは検出されず、両者に耐性を示した。以上から、ミトコンドリア由来のROSがCRR形質及びDTX耐性に関与していることが強く示唆された。本研究では、標準的放射線療法である2Gy/日のX線を30日以上照射しても増殖を続ける臨床的放射線耐性(clinically relevant radioresistant; CRR)細胞とその親株を解析に用いた。CRR細胞は化学療法剤のうち、ドセタキセル(DTX)に交叉耐性であった。X線もDTXも殺細胞効果に活性酸素種(ROS)が関与していることが知られている。そこで、交叉耐性の背景としてカタラーゼの活性化による代謝亢進が考えられたが、カタラーゼ活性からだけでは説明できなかった(24年度)。そこでミトコンドリア(mt)の電子伝達系がCRR細胞のDTX耐性に中心的な役割を果たしているのではないかと推測し、今年度はmtDNA欠失細胞であるρ0細胞の樹立を目指した。臭化エチジウム処理により、mtDNA欠失細胞であるρ0細胞の樹立を試み、SAS及びHeLa細胞からの樹立に成功した。SAS-ρ0及びHeLa-ρ0細胞のX線感受性をHigh density survival (HDS) assayで解析すると、親株に比べて耐性を示した。また、DTX感受性をHDS assayで解析してもρ0細胞は親株に比べて耐性を示した。さらに、X線(10 Gy)を照射して、mtからのROSの検出を試みたが、ρ0細胞はCRR細胞と同様に、mtからのROSは検出されなかった。同様の結果は、DTX処理後にも認められた。以上からCRR細胞のX線とDTXへの交叉耐性はmt由来のROS産生が抑制されていることに起因していることが示唆された。ROSはmtの電子伝達系からのリークによると考えられるため、今後は電子伝達系のどの複合体が関与しているかを解析する。HepG2細胞(親株)に10GyのX線を照射又は100ng/mlのドセタキセル(docetaxel; DTX)を処理すると、細胞内にROSの発生が認められた。しかし、CRR細胞では認められなかった。ミトコンドリア(mt)に由来するROSを特異的に検出する蛍光色素を用いて解析を行うと、同様の結果が得られた。さらに、H2O2を特異的に検出する蛍光色素を用いて解析すると、X線照射又はドセタキセル処理後、親株では細胞内にH2O2の増加が認められたのに対して、CRR細胞では認められなかった。CRR細胞がDTX及びX線に耐性を示すのは、生じたH2O2が効率よく分解されているためであると推測した。H2O2の分解に中心的役割を果たすことが知られているカタラーゼ遺伝子(CAT)の発現をRT-PCRで解析すると、CRR細胞では親株に比べて有意に発現の上昇が認められた。しかし、CRR細胞のCATをsiRNAで発現抑制すると、X線感受性に変化は見られなかったものの、DTXへは感受性になった。しかし、親株と同等の感受性までにはならなかった。以上から、DTX耐性にCATが関与しているがCRR細胞のDTX耐性にCATのみが関わっているわけではないことが示唆された。現在、mtの電子伝達系がCRR細胞のDTX耐性に中心的な役割を果たしているのではないかと推測し、mtDNA欠失細胞であるρ0細胞の樹立に取り組んでおり、一部の細胞株からはその樹立に成功している。また、CRR細胞は親株に比べてmt電子伝達系阻害剤に高感受性を示すことを明らかにしている。平成24年研究実施計画はほぼ全て達成したため。平成25年度の研究実施計画に基づいて研究を進める。既に、京都大学原子炉実験所の共同利用申請は受理されており、ホウ素中性子捕獲は滞りなく進めることが出来る。該当なし
mutant Fas ligand遺伝子導入による同種角膜移植の検討

前眼部は免疫抑制環境であり、そのため同種角膜移植は他の臓器移植に比較し拒絶率が著しく少ないことが良く知られている。前眼部の免疫抑制環境を構成するひとつの重要な因子であるFas ligand(FasL)をドナー角膜に遺伝子導入し、過剰発現させることにより、移植片のさらなる生着率の向上を試みた。Adenovirusを用いてC57BL/6マウス角膜にFasLのcDNAを導入し、BALB/cマウスに移植を行った。導入したFasLはsoluble formを生じないように変異させたmutantを使用した。mutant FasLを導入した同種角膜移植片は無処置の角膜移植片と比較し、高率にかつ迅速に拒絶され、mutant FasLの遺伝子導入が角膜移植片の生着をむしろ悪化させる結果が得られた。更には、FasLのレセプターであるFasを欠乏させたドナーあるいはホストを用いて同様の検討を行ったところ、ホストがFasを欠乏している場合にのみFasLによる高率な移植片拒絶が抑制されたため、mFasL遺伝子導入における移植片拒絶はドナーではなくホストのFasを介した機序であると考えられた。以上のことより、mFasL遺伝子導入では角膜移植片の生着を向上させることはできず、soluble formのFasLあるいは変異させないwild typeのFasLが生体内での角膜移植拒絶防止に役割を果たしている可能性が示唆された。研究目的:重傷化したocular surface疾患に対する新しい概念の外科的治療法として「拒絶されにくい」角膜移植片の開発を目的とし、遺伝子操作による角膜移植片の作製の可能性を検討した。研究方法:マウスを用いて全層角膜移植を施行した。ドナー角膜にsoluble Fas ligandを生じないmutant Fas ligandをアデノウィルスベクターを用いて遺伝子導入し、生着率を検討した。ウィルスベクターは高濃度(10^8pfu/ml)と低濃度(10^5pfu/ml)の2種類で検討した。各々の濃度における遺伝子導入効率をβ-ガラクトシダーゼ遺伝子を組み換えたアデノウィルスベクターを用いて確認した。研究結果:アデノウィルスベクターでの角膜組織への遺伝子導入は高濃度ベクター溶液で7090%の、低濃度ベクター溶液で3050%の角膜内皮細胞においてその発現が認められた。これらのドナー角膜組織を用いて同種異系角膜移植を行ったところ、高濃度遺伝子導入では、術後早期に移植片の混濁が認められ、またこの混濁は同系ドナー角膜を用いても同様に認められた。低濃度遺伝子導入では、術後早期の混濁は認められなかったが異系移植片の生着において遺伝子非導入群と有意な差を認めなかった。考察:mutant Fasligandのドナー角膜組織への遺伝子導入は異系角膜移植片の生着を促進せずむしろ、高濃度では移植片の早期混濁をきたすと考えられた。結論:1)アデノウィルスベクターを用いることによりドナー角膜組織に効率良く遺伝し導入すること可能である。2)mutant Fasligandの遺伝子導入は移植片の生着を促進することはできず、過剰な発現によりむしろ移植片破壊を促進することが示唆された。
アンコ-ル文明・マヤ文明の盛衰と環境変動

研究目的は新メソドロジイ(研究方法論)の構築にある。時間的・空間的に成立過程が異なる文明の比較研究には鋭い視角と精緻な研究方法論が組み立てられなければならない。つまり、類似同質性および異質特殊性を看破し、その成立過程の検証と同質・異質の内的構成要素の精査が伴わなければならない。さらに時間・空間的吟味に加えて、それを立脚・形成・成立させた基盤(文化環境と自然環境)を考察した。新方法論を組み立てるために、史料・資料の比較検討などを中心にしながら両文明の類似同質性と異質特殊性を各専門分野から比較検討事項を提起した。第1は、文化環境と自然環境の枠組みから検討をはじめ、特に気象変動と両文明の成立の関係を概略的に討論し、文明の成立条件を文化と自然の両環境から考察した。特に劣悪な衛生環境とこれの対処技術など、居住地のひろがりと人口問題などのかかわりをとりあげて検討した。そのために机上シュミレイション作業と同時に日本国内の類似地形検証の調査研究が必要であった。第2は、両文明の基盤である農業問題を検討した。特に農耕地の自然環境条件、特に「水」の問題をめぐって土地利用と食糧生産問題とのかかわりを考察し、河川・地下水問題貯水池の問題も重要であった。同じく地図上にこの問題をおとし、自然環境と農作業カレンダ-も検討し、現在の両地域の生活も併せて調査報告した。このために20種のランドサット写真図・地形図が必要となり専門的解析研究も併せて行なった。第3は視聴覚資料・スライド等により、現勢地形・および土地利用図などを入手し、集中討論を行ない、両文明の類似点と相違点と相違点を明らかにする作業を進め、両地域にまたがる基本的事項の解明に全力を尽すと同時に、各自の専門分野におとして研究報告を組み立てた。
組換えウイルスを用いたウマヘルペスウイルス1型の病原性遺伝子の解析

ウマヘルペスウイルス1型(EHV-1)の毒HH1株をウシ腎臓(BK)細胞で長期間連続的に継代して弱毒化したBK343株では1番遺伝子(機能不明),24番遺伝子(テグメントタンパク)および71番遺伝子(膜糖タンパク)に変異のあることをこれまでの研究で明らかにした。さらに、これらの遺伝子のうち71番遺伝子の変異と病原性の関係を組換えウイルスを作出して解析したところ、71番遺伝子を不活化すると病原性の低下を示すことを見い出した。本研究では1番遺伝子の変異と病原性との関連を調べるために3種類の1番遺伝子の組換えウイルスを作出して、その病原性をマウスモデルを用いて解析した。組換えウイルスは相同組換えにより、HH1株の1番遺伝子内にβ-ガラクトシダーゼ(β-gal)遺伝子を挿入したもの(β-1株)とβ-1株の1番・β-gal結合遺伝子をBK343株の1番遺伝子あるいはHH1株の1番遺伝子に置き換えたもの(それぞれ、3F-1株、Res-1株)を作出した。これらのウイルスの構成タンパクをSDS-ポリアクリルアミド電気泳動とHH1株に対するウサギ高度免疫血清を用いてウェスタンブロットで解析したところ、親株HH1との間に大きな差異は認められなかった。培養細胞におけるウイルス増殖性を検討したところ、組換えウイルスとHH1株に大きな差異はみられなかった。これらのウイルスをマウスに経鼻接種し、マウス肺でのウイルス感染価を測定したところ、β-1株、3F-1株とRes-1株の感染価は強毒のHH1株とほぼ等しかった。BK343株の感染価はHH1株の約1/100であった。以上の成績より、1番遺伝子産物はEHV-1の主要なウイルス構成タンパクではないこと、そして培養細胞ならびにマウス肺における増殖性に直接関与しないことが示唆された。現在、24番遺伝子について同様の検討を進めている。