hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
海馬苔状繊維の軸索誘導メカニズムの解明

研究代表者は、海馬切片培養法および海馬顆粒細胞分散培養法を利用して、側頭葉てんかん患者の海馬において発現量の上昇が確認されている脳由来神経栄養因子(BDNF)の、苔状繊維に対する作用を検証した。その結果、神経細胞の異常興奮活動に伴って発現が上昇するBDNFが苔状繊維の分枝を誘起し、これが異常発芽形成へとつながり、顆粒細胞のさらなる異常興奮性(てんかん様神経活動の獲得)を誘導することを示した。また、側頭葉てんかんにおいて特異的に観察される、「異常位置(歯状回門)に存在する顆粒細胞」に関して、同細胞が異常発芽を起こし、新たな異常興奮回路を形成する可能性を検証するため、培養海馬切片の歯状回門上に緑色蛍光蛋白質(GFP)陽性の顆粒細胞を分散して培養した。その結果、歯状回門上に存在する顆粒細胞由来の苔状繊維が約50%の確立で分子層へと侵入する様子が確認された。この結果は、異常位置に存在する顆粒細胞が異常発芽を形成する能力を有することを示すとともに、一度歯状回門上で分枝が誘起されると異常発芽が容易に形成される可能性を示唆し、異常発芽形成の初期段階(分枝形成)に関与するBDNFの重要性を示している。研究代表者は、BDNFによる苔状繊維の異常発芽誘導のメカニズムおよび側頭葉てんかんの新たな治療法開発への可能性に関する独自の理論を、平成17年度中に国内学会「第112回日本薬理学会関東部会」および国際学会「第3回武田科学振興財団薬科学シンポジウム」にて発表した。また、側頭葉てんかんにおけるBDNFの作用機序および、その同疾患治療への応用の可能性について詳細に考察して仮説を提示し、平成17年度中に総説として国際誌「The Neuroscientist」に発表した。研究代表者は、海馬顆粒細胞の軸索である苔状繊維の軸索誘導メカニズムを解明するため、ラットの脳より摘出した海馬切片の培養系および海馬顆粒細胞の分散培養系を利用し、正常時における苔状繊維の軸索誘導メカニズムが発達時期依存的に異なる軸索誘導を受けることを世界で初めて明らかにして、これを論文に纏めた。同論文は平成15年中に数度の改訂実験を経た後、平成16年に国際誌「Developmental Biology」に発表された。上記の結果は、側頭葉てんかんの患者における病理的特徴である「苔状繊維の誘導異常(異常発芽)」のメカニズムを解明し、これを防ぐ研究の為の礎となる重要な知見である。研究代表者は、苔状繊維の異常発芽に脳由来神経栄養因子(BDNF)が関与するという仮説を立て、ラット脳由来の海馬切片培養系および海馬顆粒細胞分散培養系を利用してこの検証に当たった。その結果、BDNFが異常発芽の初期段階に関与することを発見し、これを国際学会「第三十三回北米神経科学会年会」に発表した。本結果は、近年議論が活発な「てんかんにおけるBDNFの役割」に新たな知見をもたらすものである。研究代表者は、苔状繊維の軸索誘導メカニズムの解明が側頭葉てんかんの治療にどのような形で貢献しうるかを平成15年中に詳細に論じ、これを総説として纏めた。同総説は、平成16年に新たに創刊された国際誌「Current Neurovascular Research」に発表された。研究代表者は、ラットの脳より摘出した海馬の切片培養系及び顆粒細胞の分散培養系を利用し、正常時においては顆粒細胞の軸索である苔状繊維が発達時期依存的に異なる軸索誘導を受ける事を発見し、平成16年度中に国内学会「第19回学術集会・神経組織の成長・再生・移植研究会」及び国際学会「Pharmaceutical Sciences World Congress 2004」において発表した。研究代表者は、側頭葉てんかんにおいて海馬の異常興奮性上昇に関与する可能性が示唆されている「苔状繊維の異常発芽」における軸索誘導メカニズムを解明するため、ラットの脳より摘出した海馬の切片培養系及び顆粒細胞の分散培養系を利用してこの検証をおこなった。その結果、脳由来神経栄養因子(BDNF)が苔状繊維の分枝を誘発する事によって異常発芽の初期段階に関与して、顆粒細胞の異常興奮性に寄与する事を発見した。また、BDNFによる分枝誘発作用が、その受容体であるTrkB受容体のドミナントネガティブ体を分散顆粒細胞に強制発現させる事によって阻害される事を確認し、これらの結果を論文に纏め、数度の改定実験を経た後、平成16年度中に国際誌「The Journal of Neuroscience」に発表した。また、この内容を平成16年度中に国内学会「第27回日本神経科学大会」及び国際シンポジウム「International Symposium on "Adult neurogenesis in normal and pathological conditions"」において発表した。本結果は、BDNFが苔状繊維の異常発芽を誘発する事をin vitroの実験系を利用して軸索誘導の観点から世界で初めて示すと共に、側頭葉てんかんにおいて発現量が上昇するBDNFの作用に関する新たな知見を与えるものである。

また、側頭葉てんかんにおいて特異的に観察される、「異常位置(歯状回門)に存在する顆粒細胞」に関して、同細胞が異常発芽を起こし、新たな異常興奮回路を形成する可能性を検証するため、培養海馬切片の歯状回門上に緑色蛍光蛋白質(GFP)陽性の顆粒細胞を分散して培養した。その結果、歯状回門上に存在する顆粒細胞由来の苔状繊維が約50%の確立で分子層へと侵入する様子が確認された。この結果は、異常位置に存在する顆粒細胞が異常発芽を形成する能力を有することを示すとともに、一度歯状回門上で分枝が誘起されると異常発芽が容易に形成される可能性を示唆し、異常発芽形成の初期段階(分枝形成)に関与するBDNFの重要性を示している。研究代表者は、BDNFによる苔状繊維の異常発芽誘導のメカニズムおよび側頭葉てんかんの新たな治療法開発への可能性に関する独自の理論を、平成17年度中に国内学会「第112回日本薬理学会関東部会」および国際学会「第3回武田科学振興財団薬科学シンポジウム」にて発表した。また、側頭葉てんかんにおけるBDNFの作用機序および、その同疾患治療への応用の可能性について詳細に考察して仮説を提示し、平成17年度中に総説として国際誌「The Neuroscientist」に発表した。
棘皮動物の筋収縮調節機構に関する研究

棘皮動物の筋肉はほとんどが平滑筋であり、その収縮は、他の動物の平滑筋のように、ミオシン軽鎖のCa2+依存的なリン酸化によって制御されると考えられてきた。本研究では、ウニの筋肉において、高等動物の横紋筋で知られるトロポニンによる制御機構も存在する可能性が示された。また、ウニのトロポニンの構造上の特徴から、脊椎動物のトロポニンとは異なる作動機構によって収縮が調節されると考えられた。(1)キタムラサキウニ顎骨間筋トロポニンI(SN-TnI)のcDNAを発現ベクターに組み込んでリコンビナントSN-TnIを調製し、その特性を検討した。SN-TnIは、他動物のトロポニンIとは異なり、ウサギ再構成アクトミオシンのMg-ATPase活性をわずかしか阻害しなかった。また、SN-TnIは、ウサギのトロポニンCまたはキタムラサキウニ・カルモジュリンに対し、Ca2+依存的に強く結合したが、ロブスターおよびアカザラガイ・トロポニンCに対する結合は見られなかった。さらに、SN-TnIをウサギに免疫して抗血清を作製し、顎骨間筋アクトミオシンのウェスタンブロッティングを行った結果、分子量60から100 kDaの複数のタンパク質が陽性反応を示した。(2)マナマコ体壁縦走筋およびキタムラサキウニ顎骨間筋から調製したアクトミオシンのMg-ATPase活性は非常に低かったが、カルモジュリンとニワトリ砂嚢筋ミオシン軽鎖キナーゼを添加すると、この活性はCa2+依存的に増大した。従って、これらの棘皮動物の筋肉は、他動物の平滑筋と同様にミオシン軽鎖のCa2+依存的なリン酸化による収縮調節を受けると考えられた。(3)マナマコ体壁縦走筋を低塩濃度緩衝液でホモジナイズすると、他動物の場合とは異なり、大部分のアクチンフィラメントが遊離し可溶性画分に回収された。このアクチンフィラメントをウサギのミオシンに添加しても、Mg-ATPase活性の促進は全く見られす、ミオシンに対する結合を抑制する因子の存在が考えられた。アクチンフィラメント画分のSDS-PAGEと質量分析により、この因子が主要卵黄タンパク質(MYP)である可能性が示唆された。さらに、MYPを主成分とする体壁からの抽出物が、ウサギ再構成アクトミオシンのMg-ATPase活性を強く阻害することを確認した。アメリカムラサキウニ・ゲノムデータベースの情報に基づくRT-PCRによって、キタムラサキウニ顎骨間筋に、筋収縮調節タンパク質であるトロポニンT(TnT)およびトロポニンI(TnI)の他、アクチンの遺伝子が発現していることを確認した。特に、TnIに関しては、翻訳領域の630塩基の配列を決定し、N端側に軟体動物と同様に大きな伸長領域が存在する一方、C端側は他に類を見ないほど短縮し、トロポニンC(TnC)結合部位を欠く、などの特徴が明らかとなった。一方、顎骨間筋からアクトミオシンを抽出し、SDS-PAGEと質量分析で主要な構成タンパク質を分析した結果、ミオシン重鎖および軽鎖、パラミオシン、アクチン、トロポミオシン、カルポニンの他、芳香族アミノ酸に富んだ未同定タンパク質が確認された。しかし、TnIおよびTnTは確認されなかった。以上の結果から、顎骨間筋において、トロポニンは発現しているものの発現量は少ないと考えられた。また、マナマコ体壁縦走筋を低塩濃度緩衝液でホモジナイズ・洗浄して筋原繊維を調製したが、これは、パラミオシンとミオシンを主成分とし、アクチンをほとんど含んでいなかった。また、縦走筋を高塩濃度の緩衝液でホモジナイズすると、アクトミオシンが抽出されたが、その塩濃度を低下させると、かなりのアクチンフィラメントが沈殿せずに上清に残存した。これらの結果は、マナマコのアクチンフィラメントとミオシンフィラメントの相互作用が、他動物に比べて弱いことを示唆している。得られたマナマコ・アクトミオシンはわずかなCa-ATPase活性を示したが、Mg-ATPase活性は皆無だった。また、アクチンフィラメントは、ウサギミオシンに加えても全くMg-ATPase活性を促進しなかった。従って、アクチンフィラメントには、アクチンの筋収縮活性化作用を阻害する因子が付随していると考えられた。(1)平成25年度に大腸菌発現系を構築したキタムラサキウニ・トロポニンI(TnI-long)について、N末端に存在する伸長領域を欠損させた変異体(TnI-short)についても発現系を構築した。これらのTnIを大腸菌発現・精製し、ウサギ・アクトミオシン-トロポミオシンのMg-ATPase活性に及ぼす効果を比較したところ、TnI-shortはTnI-longよりも強くATPase活性を阻害した。従って、N末端伸長領域に、TnI-shortの領域に存在する筋収縮阻害作用を減弱する機能が存在する可能性が考えられた。また、F-アクチンに対する結合性を共沈実験によって検討したところ、これらのTnIはいずれも、脊椎動物トロポニンIと同様に、F-アクチンに結合することが確認できた。(2)これらのTnIをそれぞれ担体に固定化してアフィニティークロマトグラフィーを行い、平成25年度に作成した抗キタムラサキウニ・トロポニンIウサギ血清から抗TnI-long並びに抗TnI-short抗体を精製した。

精製抗体はいずれもキタムラサキウニ顎骨間筋ホモジェネートに微量ながら存在する約70kDaおよび80kDaのタンパク質と反応し、それらはトロポニンIであると考えられた。また、マナマコ体壁縦走筋ホモジェネート中には、交差反応性を示すタンパク質は見出されなかった。両抗体を用いて、キタムラサキウニ顎骨間筋、二又骨上挙筋、食道、精巣、並びに、瓶嚢の組織切片について、免疫染色とローダミン-ファロイジンによるアクチン染色の二重染色を行ったところ、いずれの器官においても、抗原はアクチンフィラメントと同じ部位、または、アクチンフィラメントの周辺部位に存在することが確かめられた。(4)トロポニンTのcDNAをキタムラサキウニの腸管からクローニングした。(3)マナマコの体壁縦走筋からミオシンの単離・精製を行った。最終年度は、キタムラサキウニ・トロポニンT(TnT)を大腸菌発現で調製し、試験管内で機能を調べた。ウニのTnTは、脊椎動物のTnTと同様にトロポミオシンと結合することが共沈実験によって確認された。また、前年度までに調製したトロポニンI(TnI)の収縮阻害作用を増強する特性を持っていた。さらに、TnT、TnIおよびキタムラサキウニ・カルモジュリン(CaM)を1:1:1のモル比で混合すると、脊椎動物トロポニンと同様に、アクトミオシンのMg-ATPase活性をCa2+依存的に活性化した。このことから、棘皮動物のトロポニンは、筋収縮の調節を行えること、さらに、Ca2+結合サブユニットとして、トロポニンC(TnC)ではなくCaMを構成因子とし得ることが明らかになった。また、キタムラサキウニTnIのC末端が短く、TnC結合部位やアクチン結合部位として知られる領域が存在しない特徴を前年度までに報告したが、それにもかかわらず調節能が認められたことは、ウニのトロポニンが、従来から知られるものとは異なる分子作動機構によってアクチンとミオシンの相互作用を調節することを示唆していた。一方、キタムラサキウニ顎骨間筋、マナマコ体壁縦走筋、およびマヒトデ管足から天然アクトミオシンを調製し、特性を調べた結果、いずれもニワトリ砂嚢ミオシン軽鎖キナーゼとCaMの存在下で、Ca2+依存的にMg-ATPase活性が増大した。また、ウニのアクトミオシンのみトロポニンを含むことがウェスタンブロッティングによって示されたが、その存在量は微量であった。これらの結果から、棘皮動物の筋肉の収縮調節は、脊椎動物の平滑筋と同様、ミオシン軽鎖のCa2+依存的なリン酸化によって行われ、トロポニンの寄与は大きくないと推測された。棘皮動物の筋肉はほとんどが平滑筋であり、その収縮は、他の動物の平滑筋のように、ミオシン軽鎖のCa2+依存的なリン酸化によって制御されると考えられてきた。本研究では、ウニの筋肉において、高等動物の横紋筋で知られるトロポニンによる制御機構も存在する可能性が示された。また、ウニのトロポニンの構造上の特徴から、脊椎動物のトロポニンとは異なる作動機構によって収縮が調節されると考えられた。平成26年度は、キタムラサキウニ・トロポニンIについて、欠損変異体を作成して野生型と特性を比較し、一次構造と機能の相関に関する若干の知見を得ることができた。また、トロポニンIがアクチンとの結合能を持ち、生体内で筋収縮の阻害など、脊椎動物トロポニンIと同様の役割を果たしている可能性を示した。さらに、精製した抗体を用いてウェスタンブロッティングや免疫染色を行い、反応の特異性を高めることができた。
iPS細胞由来視細胞による多層化人工網膜の作成とその移植応用

網膜は光情報受容の主体である神経網膜と網膜色素上皮から構成されている。神経網膜は発生学的に中枢神経系由来の組織であり一旦障害を受けるとその修復は困難である。マウスiPS細胞にpax6を導入し作成した視細胞前駆細胞株は高純度に杆体視細胞あるいは錐体視細胞に分化する。温度感応性ポリマーを応用して高純度視細胞をシート状に培養して、より生体に近い網膜神経層の再構築を行なった。その結果、杆体視細胞と錐体視細胞が混在した細胞シートが作成できた。安定した視細胞前駆細胞シートを作成してさらに各種の成長因子と培養することで、成熟視細胞に網膜神経節細胞がシナプス形成した、人工網膜シートの作成に成功した。網膜組織は中枢神経系由来のために再生能を持たない。各種の幹細胞から視細胞を分化誘導して移植することで視覚の再獲得が報告されているが、多くは細胞浮遊液を損傷網膜に注入するため2次元画像を再生網膜上で再構築することは難しい。我々は視細胞前駆細胞株を樹立して、これを用いて成熟視細胞シートを作成することに成功している。この成熟視細胞シートは、種々のケモカインと培養する、あるいは網膜神経前駆細胞と重層培養することでBetaIIItubulin陽性の長い軸策をもつまでに成熟分化する。そこではある種のケモカインが、その分化調節と軸索延長に重要に関わることを見出した。同様に、ある種のケモカインの受容体の選択的な阻害薬では網膜幹細胞からRhodopsin陽性視細胞とGreen opsin陽性視細胞への分化を抑制した。一方、ある種のケモカイン培養系への添加はRhodopsin陽性視細胞とGreen opsin陽性視細胞への分化を、それぞれ別々に強く増強した。これらのケモカインを応用することで高純度のRhodopsin陽性視細胞のシートを作成することに成功した。一方、Green opsin陽性視細胞での細胞シートは作製に成功していない。生体内では、網膜組織ではRhodopsin陽性視細胞とGreen opsin陽性視細胞が網膜上の局在に応じて異なる比率で存在するが、現在の問題点としては、この局在に応じた細胞の分布をもたらすことが出来ていない。我々はこの再生神経網膜組織シートをマウス網膜損傷モデルに移植してその生着と視力の回復を目指している。網膜損傷モデルへのシート移植後に再生網膜上で二次元画像を再生することを最終目標として現在実験を進めている。我々はこれまでに温度感応性ポリマーを応用して皮質運動神経細胞シート作成の経験(特許出願中)がある。ここでは高純度視細胞をシート状に培養して高度なシナプス再形成を行わせて、より生体に近い網膜神経層ことに視細胞層の再構築を行なった。この視細胞前駆細胞株を各種の成長因子や遊走因子と培養することで杆体視細胞と錐体視細胞が混在した細胞シートが作成できた。このシートではシナプシンやシナプトフィジンが発現しており、ベータIIIチュブリン陽性のおそらく網膜神経節細胞に相当あるいは類似した細胞とシナプス形成している事が示された。中枢神経系由来の組織である網膜組織は再生能を持たない。これまでに各種の幹細胞から視細胞を分化誘導して移植することで視覚の再獲得が報告されている。しかし現在用いられている浮遊細胞の注入移植方法では2次元画像を再生網膜上で再構築することは難しい。我々は視細胞前駆細胞株を樹立した。この視細胞前駆細胞株は、種々のケモカインと培養することでBetaIIItubulin陽性の長い軸策をもつまでに成熟分化する。この細胞を用いて網膜視細胞シートを作成することができる。即ち、このiPS細胞由来の細胞株は当初βIIItubulin陽性の神経細胞で特定の培養条件下で高純度に杆体視細胞と錐体視細胞に分化する。具体的には、SDF1存在下での培養により視細胞前駆細胞マーカーであるCD73を発現する(陽性率93%)。培養終了時(mature)には細胞質は楕円形から長方形となりRhodopsinは核から離れた細胞質全体に存在する。現時点で精製した場合Rhodopsin陽性細胞群はRhodopsin50%程度陽性Green opsin陽性細胞群はGreen opsin45%程度陽性を得られる。これまでに我々は温度感応性ポリマーを応用して神経細胞シートを作成した経験(特願2012-165108「神経細胞シート及びその製造方法」発明者:鈴木登)があり、これを網膜視細胞に応用した。高純度視細胞をシート状に培養して高度なシナプス再形成を行わせて、より生体に近い網膜神経層ことに視細胞層の再構築を行うことが可能になった。今後は、この再生神経網膜組織シートをマウス網膜損傷モデルに移植してその生着と視力の回復を目指す。実際には、まず安定した視細胞前駆細胞シートを作成しこれにSDF1を添加して培養することで、長い軸索を保った単層の成熟視細胞シートが作成できた。移植実験を行うのに必要な軸索を保った成熟視細胞シートは作成できた。今後はin vitroでこの細胞シートが光刺激に反応することを確認する。網膜組織は中枢神経系由来の組織で再生能を持たない。各種の幹細胞から視細胞を分化誘導して移植することで視覚の再獲得が報告されている。しかし現在用いられている移植方法では2次元画像を再生網膜上で再構築することは難しいと考えられている。

我々はマウスiPS細胞から杆体視細胞と錐体視細胞へと分化できる安定した株化網膜前駆細胞を樹立し、これを用いて成熟視細胞シートを作成することに成功した。この視細胞前駆細胞シートにさらに双極細胞、網膜神経節細胞を重層化することにマウスでは成功した。ここでは視神経挫滅マウスへの再生神経網膜組織シートの移植後に再生網膜上で二次元画像を再生することを最終目標として研究を実施した。眼発生に重要に関わる転写因子pax6をマウスiPS細胞に遺伝子導入後に、株化した網膜前駆細胞はcrx,rx,nrlなどの網膜視細胞分化に関わる一連の転写因子を発現してケモカインSDF1存在下にロドプシン発現細胞に分化する。一方、この細胞株からは比較的少数ながらBrn3陽性の網膜神経節細胞も内在している。PCRレベルではPKC陽性で双曲細胞も内在していると考えられる。この細胞株を温度感応性ゲルを用いて、増殖因子存在下に培養することで、網膜神経節とロドプシン発現細胞から構成される細胞シートを作成することが出来た。これまで我々は網膜神経前駆細胞を視神経乳頭近傍に移植することで、マウスの視力回復をもたらすことを報告した。今後は、この細胞シートを移植することがマウスの視力回復もたらすことが出来るのか、そしてそれは2次元画像を再生網膜上で再構築しているのか検討する必要がある。網膜は光情報受容の主体である神経網膜と網膜色素上皮から構成されている。神経網膜は発生学的に中枢神経系由来の組織であり一旦障害を受けるとその修復は困難である。マウスiPS細胞にpax6を導入し作成した視細胞前駆細胞株は高純度に杆体視細胞あるいは錐体視細胞に分化する。温度感応性ポリマーを応用して高純度視細胞をシート状に培養して、より生体に近い網膜神経層の再構築を行なった。その結果、杆体視細胞と錐体視細胞が混在した細胞シートが作成できた。安定した視細胞前駆細胞シートを作成してさらに各種の成長因子と培養することで、成熟視細胞に網膜神経節細胞がシナプス形成した、人工網膜シートの作成に成功した。我々の作成した細胞シートでは杆体視細胞と錐体視細胞のみが孤立して存在するのではなく、驚いた事にはベータIIIチュブリン陽性の軸索をもつ、おそらくは網膜神経節細胞相当あるいは類似の細胞とシナプス形成していた。おそらくこのシートの視細胞は、受け取ったシグナルを軸索を介して出力できる可能性が高い。予想以上の成果であるが、その進行は、ほぼ計画に沿った進行状態である。我々の樹立した視細胞前駆細胞株は株化されていて均質である事とSDF1やMCP1などのケモカインを応用する事で視細胞として90-95%以上の純度への精製が可能となった。そこで本研究の一部では我々のiPS細胞由来視細胞前駆細胞を用いて各種のケモカイン、増殖因子、細胞外マトリックスやそれらの抗体・siRNAを用いて成熟視細胞へと分化するメカニズムを解明する。成熟視細胞は既にシート化することが可能で論文発表を行った。今後は網膜の機能回復に神経節細胞や双極細胞の再生も必要である。そこでES細胞やiPS細胞から誘導した網膜神経前駆細胞を特定の条件で培養することで双極細胞を含む神経網膜全体の再生を目指す。
機械センサー活性化におけるマイクロ・ナノ機械の解析

あらゆる細胞は、機械刺激を受容して様々な応答を示す。この性質は、細胞の容積や運動の調節、循環器調節や重力感知に関わる極めて重要な機能である。その分子機構は長らく謎であったが、近年メカノセンサーの実体として、機械受容(MS)チャネルが発見され、急速に研究が展開している。本計画では、これらの成果を土台に、1)MSチャネルの活性化機構、機械受容における2)細胞骨格と3)接着斑の役割の解明を目標とした。主要な結果は以下の通りである。1.機械受容チャネルの活性化機構:高次構造が判明し、最も研究の進んでいる細菌機械受容チャネルMscLの膜張力による活性化のナノ機構を解明することを目指した。点突然変異の導入とパッチクランプ,および分子動力学シミュレーションの組み合わせにより,膜と溶液の界面近傍に位置する特定のアミノ酸残基が張力感知部位であることを特定し,これを含む膜貫通ヘリックスが膜張力によって徐々に膜面方向に倒れながら,互いにスライドしてイオン透過孔(ポア)が開くことを明らかにした.2.機械刺激の感知における細胞骨格(ストレス線維)の役割:培養血管内皮細胞を材料に,セミインタクトモデル,in-vitroモデルを開発し,レーザーピンセットによるナノ操作を組み合わせて,ストレス線維の主要構造であるアクチン線維が,張力の減少に応じて,F-アクチン脱重合因子であるコフィリン依存的に崩壊する全く新しい型のメカノセンサーであることを発見した.3.機械刺激の感知における接着斑の役割:培養上皮系細胞のセミインタクト細胞を用いて伸展刺激依存性のアクチン骨格/接着斑の成長における接着斑の役割を解析し、接着斑蛋白質である、zyxinが機械刺激感知とアクチン骨格/接着斑の成長に必須のシグナル分子であることを発見した。この性質は、細胞容積の調節、細胞分裂周期の調節、細胞形態・運動の調節、重力感知、あるいは心肥大、不整脈、組織再生などの重要な生命現象に関わる重要な機能である。その中心となるのは、近年明らかになってきた機械受容(SA)チャネルやインテグリンなどの機械センサー分子であるが、機械刺激がどのようにしてこれらを活性化するのかという仕組み(活性化機構)はまったく謎である。本研究の目標は、1)これらの機械センサー分子の活性化機構を細胞膜や細胞骨格などのマイクロスケールの構造との相互作用に注目して明らかにするとともに、2)機械センサー活性化の下流にあるシグナル機構を解析し、機械刺激の受容から応答に至る主経路の同定を行うことである。本年度は、立体構造既知の細菌SAチャネル(MscL)と、我々が最近クローニングしたトリ心筋SAチャネル(SAKCA)の機械刺激感知ドメインの同定を主目標にした。その結果、1)細菌SAチャネルMscLの機械刺激感知ドメインは、細胞膜外葉の油水界面近くに位置する疎水アミノ酸残基であることが判明した。これは、脂質膜の中で最も剛性の高いグリセロールの位置と一致しており、グリセロールと疎水アミノ酸との疎水相互作用というきわめて合理的な仕組みが力伝達の実体であることが示唆された。2)心筋SAチャネルSAKCAの機械感知にはC末端に含まれる59アミノ酸からなるSTREX配列中のわずか3残基が重要であることが分かった。しかしこの部位は細胞質に露出しているために、細胞への機械刺激で生じる膜の張力を直接感じることはできない。そこで、膜張力をこの感知部位に媒介する膜蛋白質の存在を想定し、前述の3アミノ酸残基を含む7残基を用いたアフィニティカラムを作成して、その候補分子を検索した。その結果、分子量約50Kdaの細胞骨格結合性の膜蛋白質を同定することができた。

あらゆる細胞は、機械刺激を受容して様々な応答を示す。この性質は、細胞容積の調節、細胞分裂周期の調節、細胞形態・運動の調節、重力感知、あるいは心肥大、不整脈、組織再生などの重要な生命現象に関わる重要な機能である。その中心となるのは、近年明らかになってきた機械受容(SA)チャネルやインテグリンなどの機械センサー分子であるが、機械刺激がどのようにしてこれらを活性化するのかという仕組み(活性化機構)はまったく謎である。本研究の目標は、1)これらの機械センサー分子の活性化機構を細胞膜や細胞骨格などのマイクロスケールの構造との相互作用に注目して明らかにするとともに、2)機械センサー活性化の下流にあるシグナル機構を解析し、機械刺激の受容から応答に至る主経路の同定を行うことである。本年度は、立体構造既知の細菌SAチャネル(MscS)の機械刺激感知ドメインの同定と細胞骨格/接着斑の機械センサーとしての可能性を探ることを主目的にした。その結果、1)細菌SAチャネルMscSの機械刺激感知ドメインは、細胞膜外葉と内葉の油水界面近くに位置する疎水アミノ酸残基であることが判明した。これは昨年同定したMscLと共通する結果であり、脂質グリセロール基と疎水アミノ酸との相互作用が力伝達の共通機構であることが示唆された。2)内皮細胞のストレス線維を対象に、伸展-弛緩のいずれがストレス線維の脱重合に重要かを検討した結果、弛緩時に細胞内に豊富に存在するコフィリンが結合して脱重合することが判明した。すなわち、細胞骨格であるストレス線維そのものがメカノセンサーとして機能する強い証拠が得られた。この性質は、細胞の容積や運動の調節、循環器調節や重力感知に関わる極めて重要な機能である。その分子機構は長らく謎であったが、近年メカノセンサーの実体として、機械受容(SA)チャネルが発見され、急速に研究が展開している。本計画では、これらの成果を土台に、1)SAチャネルの活性化機構、2)機械受容における細胞骨格の役割、および3)細胞内メカノシグナリング機構の解明を目標としている。本年度は、特に、2)と3)を中心に研究を進め、以下の成果を得た。1)stress依存的なストレス線維崩壊のナノ機構:我々はセミインタクト細胞を用いて、ストレス線維が周期伸展刺激の弛緩相で速やかに崩壊するという驚くべき事実を発見するとともに、この崩壊には、アクチン線維切断因子であるcofilinが必要十分な因子であることを見出している。そこで、本年度はin vitroでアクチン線維を調整し、様々なstrain(stress)を負荷した条件下でcofilinを添加し、その切断活性がstress依存的であること、即ちストレス線維自体がメカノセンサーであるということを発見した。2):stress依存的なストレス線維形成のナノ機構:ストレス線維の形成における機械刺激の役割を、Gアクチンを含まないセミインタクト細胞を用いて調べた。その結果、機械刺激によってFアクチンからストレス線維への組織化が促進されるという証拠を得、その分子モデルを提出した。
香りを付加した足浴の睡眠導入効果に関する研究

足浴に用いる「香りの違い」による入眠促進効果を明らかにするため、3種類の香りの比較検討を行った。被験者は、健康な女性8名であり、脳波(16ch)、皮膚温(右手掌、胸部、左上腕、左下腿、左下肢)、血圧、心拍数を指標とした。実験は、室温(25-27°C)、湿度(50-60%)に維持した実験室で行い、閉眼安静15分間の後、10分間の足浴を行い、その後30分間閉眼にて安静状態を維持した。足浴は湯温40°Cで外踵がつかる程度の湯量とした。足浴中は香り提示システムにより、被験者がわずかに自覚する程度の香りをマスクから流した。提示した香り条件は、(1)ラベンダー、(2)オレンジ、(3)サンダルウッドの3条件である。脳波の分析は、全てのデータをFFTにより周波数解析し、θ波、α波、β波の周波数帯域別にパワー値を算出した。それらのデータから、α波が50%以上消失し、低振幅θ波が出現する睡眠段階1を入眠期とし、入眠期の出現時間と持続時間を出した。皮膚温、血圧、心拍数は、5分間の平均値を算出し、比較した。脳波の結果から、3つの香り条件を比較したところ、入眠期の出現時間、および持続時間には香りによる有意な差は認められなかった。また、脳波以外の指標でも条件間に有意な差は認められなかった。いずれも香りでも足浴終了後、5-20分後に入眠期を迎えていたが、これは前年度行った研究での足浴のみ条件と同様の結果であった。被験者それぞれを見ると、入眠期が最も短い香りは3つの香りで偏りはなく、被験者による反応の違いが考えられた。今回の脳波の結果より、香りを付加した足浴の入眠促進効果は足浴と同様に認められるものが多かったが、香りによる違いは確認できなかった。しかし、入眠期の出現が短縮する香りは被験者により異なり、何らかの個人差が認められる可能性が考えられた。足浴に香りを付加した場合の入眠促進効果を検討するため、(1)足浴のみ、(2)香りのみ、(3)香りを付加した足浴の3条件を比較検討した。被験者は健康な男性7名であり、脳波(16ch)、皮膚温(右手掌、胸部、左上腕、左下腿、左下肢)、血流量(右手掌)、心拍数を指標とした。実験は、室温(2527°C)、湿度(50-70%)に保った実験室で行い、閉眼安静15分間の後、条件(1)、(3)では10分間の足浴(条件(2)では、足浴時と同様の体位を取るのみ)を行い、その後30分間閉眼にて安静状態を維持した。条件(2)、(3)では、香り提示システムにより、被験者がわずかに自覚する程度の香りをマスクから流した(オレンジオイル0.05ml、流量60-70ml、条件(1)ではマスクを付けるのみとした)。皮膚温、血流量、心拍数は、5分間の平均値を算出し、比較した。脳波の結果からは、足浴を行った条件(1)、条件(3)では足浴終了の2分3分後に入眠期をむかえる者が多く、従来の研究と同様に足浴が入眠を促すことが考えられた。条件(1)と(3)の間には差はなく、足浴に香りを付加することによる相乗効果は確認できなかった。また、条件では、香りの吸入後1分3分で入眠期をむかえる者が多かった。しかし、香りの吸入後15分以上経ってから入眠期をむかえるものもおり、香りによる入眠促進効果に個人差がある可能性が考えられた。皮膚温、血流量、心拍数には、条件間に有意な差は認められなかった。今回の脳波の結果から、足浴では入眠促進効果が期待できるが、香りのみあるいは香りを付加した足浴では、被験者により入眠促進効果に差がある可能性が考えられた。

それらのデータから、α波が50%以上消失し、低振幅θ波が出現する睡眠段階1を入眠期とし、入眠期の出現時間と持続時間を出した。皮膚温、血圧、心拍数は、5分間の平均値を算出し、比較した。脳波の結果から、3つの香り条件を比較したところ、入眠期の出現時間、および持続時間には香りによる有意な差は認められなかった。また、脳波以外の指標でも条件間に有意な差は認められなかった。いずれも香りでも足浴終了後、5-20分後に入眠期を迎えていたが、これは前年度行った研究での足浴のみ条件と同様の結果であった。被験者それぞれを見ると、入眠期が最も短い香りは3つの香りで偏りはなく、被験者による反応の違いが考えられた。今回の脳波の結果より、香りを付加した足浴の入眠促進効果は足浴と同様に認められるものが多かったが、香りによる違いは確認できなかった。しかし、入眠期の出現が短縮する香りは被験者により異なり、何らかの個人差が認められる可能性が考えられた。
呼吸器M細胞の分化機構と疾患における機能の解明

呼吸は生命維持に必要な活動です。呼吸器は鼻からはじまり気管を通して肺へとつながります。空気の通り道である気道には空気中の病原菌、アレルギーの原因となるアレルゲンが大量に存在し、呼吸とともに体内へと入ってきます。そのため、呼吸器では免疫系が発達しています。M細胞は腸管で研究がすすむ、粘膜免疫応答に重要な細胞です。一方で、呼吸器におけるM細胞については不明な点が多く残されています。本研究計画では呼吸器M細胞の性状、機能、呼吸器疾患との関係を明らかにすることを目的としています。
ナノ複合材料の設計を目的としたセルロースナノフィブリル材料の構造と特性解析

再生産可能な天然高分子である木材セルロースは、幅3-4nmの伸びきり鎖からなる繊維状の結晶構造を有しているためナノ材料として補強材や包装材料等の様々な応用が期待されている。これまでの研究で、木材セルロースへの表面酸化と軽微な解繊処理により得られる幅3nmのセルロースナノフィブリルから透明で高い酸素バリア性を有する膜の調製に成功した。乾燥下の酸素透過係数は石油由来のガスバリア高分子であるエチレンビニルアルコールの約10分の1である。本研究ではセルロースナノフィブリルの膜内における自己組織化が膜のガスバリア性に与えるメカニズムを明らかにするため、結晶性、配向性、空隙サイズ等の構造と酸素バリア性を評価し、それを再生セルロースや合成高分子の挙動と比較することで結晶性ナノフィブリルから成るセルロース材料の構造と特性を明らかにすることを目的とした。さまざまな長さ、表面組成を有するナノフィブリル膜のナノ空孔を産業技術総合研究所の協力のもと陽電子消滅法により評価したところ、酸素分子の膜内での拡散遅れがガスバリア性の原因であり、その拡散遅れは、ナノフィブリルのサイズに起因するものとナノフィブリル間の空孔の大きさに依存する2種類の遅れがあることが明らかになった。またナノファイバー膜の空孔は再生セルロース膜や合成高分子よりも小さく、結晶性ナノファイバーが層状に積層し、分子運動が抑制された膜の構造が優れたガスバリア性をもたらすことがわかった。本成果によりガスバリア性発現メカニズムにおける石油由来の高分子と天然高分子ナノファイバー膜の違いが明らかとなり、天然高分子の利用拡大を目指した基礎的知見を得ることができた。本成果は国内学会・研究会にて既に発表され、国際的な科学雑誌に投稿する予定であり、高機能バイオマス材料の有効利用が加速されることが期待される。(抄録なし)再生産可能な天然高分子である木材セルロースは、幅3-4nmの伸びきり鎖からなる繊維状の結晶構造を有しているためナノ材料として補強材や包装材料等の様々な応用が期待されている。(抄録なし)
衝撃超高圧下でのTi-Al-Cr系L1_0型/L1_2型合金の傾斜機能組織

Ti-Al-Cr系合金において、軽量耐熱材料の開発のための基礎的資料を得るため,1273K1573Kの5種類の温度でのTi/Ti-Al-Cr, Ti-Al/Ti-CrおよびTi-Al-Cr(L1_0/Ti-Al-Cr(L1_2)系合金の拡散対法による組織の傾斜化と相互拡散実験およびTi-Al、Ti-CrおよびTi-Al-Cr各種合金の高速衝撃実験により、以下のような結果を得た.(1)各温度、各拡散対において傾斜組織が観察された.1373Kおよび1473Kでの拡散対Ti/Ti-Al-Crにおいて、Matano界面付近で、最高硬度を有するTi-Al-Cr系合金のマルテンサイト組織を形成し、終端組成の合金側では残留β相を形成し軟化する.(2)本系合金のCrの拡散距離はAlのそれに比べて少し長い.また、拡散路S字型を呈する.(3)各温度において、2元系Ti-AlおよびTi-Cr系合金の相互拡散係数Dには、顕著な濃度依存性は有しないが、Ti-Cr系のDの方がTi-Al系のDよりも大きい.また、本3元系合金の相互拡散係数においても顕著な濃度依存性は有しないが、2元系のよりも小さいことが分かった.(4)1473K、24h保持後におけるTi-38.1Al-4.8Cr(組成at%)系合金の(L1_0材)の組織および硬さの変化は冷却速度に大きく依存する.1473Kでのホットプレスによる(L1_0)/(L1_2)拡散対実験により、この合金ではAlの拡散距離が、Crのそれより長いことが分かった.(5)各種Ti基合金の高速衝撃実験により、Ti-14.3AlにはTi_3Alの生成が示唆され、非常に複雑な変形組織が観察された.Ti-4.8Cr合金では高速衝撃変形のみで微細な再結晶粒が観察され、傾斜機能組織の形成に関する有用な知見が得られた.Ti-Al-Cr系合金において、軽量耐熱材料の開発のための基礎的資料を得るため,1273K1573Kの5種類の温度でのTi/Ti-Al-Cr, Ti-Al/Ti-CrおよびTi-Al-Cr(L1_0/Ti-Al-Cr(L1_2)系合金の拡散対法による組織の傾斜化と相互拡散実験およびTi-Al、Ti-CrおよびTi-Al-Cr各種合金の高速衝撃実験により、以下のような結果を得た.(1)各温度、各拡散対において傾斜組織が観察された.1373Kおよび1473Kでの拡散対Ti/Ti-Al-Crにおいて、Matano界面付近で、最高硬度を有するTi-Al-Cr系合金のマルテンサイト組織を形成し、終端組成の合金側では残留β相を形成し軟化する.(2)本系合金のCrの拡散距離はAlのそれに比べて少し長い.また、拡散路S字型を呈する.(3)各温度において、2元系Ti-AlおよびTi-Cr系合金の相互拡散係数Dには、顕著な濃度依存性は有しないが、Ti-Cr系のDの方がTi-Al系のDよりも大きい.また、本3元系合金の相互拡散係数においても顕著な濃度依存性は有しないが、2元系のよりも小さいことが分かった.(4)1473K、24h保持後におけるTi-38.1Al-4.8Cr(組成at%)系合金の(L1_0材)の組織および硬さの変化は冷却速度に大きく依存する.1473Kでのホットプレスによる(L1_0)/(L1_2)拡散対実験により、この合金ではAlの拡散距離が、Crのそれより長いことが分かった.(5)各種Ti基合金の高速衝撃実験により、Ti-14.3AlにはTi_3Alの生成が示唆され、非常に複雑な変形組織が観察された.Ti-4.8Cr合金では高速衝撃変形のみで微細な再結晶粒が観察され、傾斜機能組織の形成に関する有用な知見が得られた.所定の寸法に切断された各試料は,石英管中に真空封入し,購入した高速昇温電気炉を用いて1200°C,96h均質化焼鈍後,氷水中にて急冷した.焼鈍前(As cast)と急冷後(WQ)の各試料を研摩・琢摩の後,それらの組織を光学顕微鏡およびEPMAにより観察した.L1_0構造のTi-38 at%Al-4.8at%Cr合金において,As castの試料ではlamellar組織[α_2(Ti_3Al)/γ(TiAl)層状組織]が観察され,水冷後の試料では,massive組織であった.一方,L1_2構造のTi-60 at%Al-14 at%Cr合金においては,As castの組織は,L1_2相をマトリックスとし,第2相が分布したdendrite組織であったが,均質化焼鈍後,その組織は消失した.しかし,延性低下の原因と考えられる微小なボイドが多く観察された.Ti-630 at%AlおよびTi-5 at%Cr2元系合金のおける硬さにおいて,1200°C焼鈍・急冷後.いずれもマルテンサイト変態のため硬化した.しかし,L1_0,L1_2相領域になると,いずれも少し軟化することが分かった.なお,L1_0型/L1_2型合金拡散対を用いた,通常のクランプ法およびHIPによる拡散実験は行ったが,クランプとTi合金が反応してしまったので,現在,反応防止のためのW板を購入して,再実験中である.

ホットプレス法,HIP処理,超高速衝撃試験による実験も早急に行う予定である.Ti-Al-Cr系合金において、軽量耐熱材料を開発するための基礎的資料を得るため,1373Kおよび1473KでのTi/Ti-Al-Cr, Ti-A/Ti-CrおよびTi-Al-Cr(L1_0)/Ti-Al-Cr(L1_2)系合金の拡散対法による組織の傾斜化と相互拡散実験を行い、以下のような結果を得た。(1)1473K,24h保持後におけるTi-38.1Al-4.8Cr(以下すべてat%)系合金(L1_0材)の組織および硬さの変化は冷却方法(速度)に大きく依存する。すなわち、水冷材で明瞭な(α_2+γ)混合組織となる。一方、Ti-59.61Al-14.1Cr系合金(L1_2材)については、空冷および水冷後の組織および硬さにおいて大きな変化はない。(2)各拡散対において傾斜組織が観察されたが、1473Kでの拡散対T2(Ti/Ti-7.7Al-7.0Cr)においては、Matano界面付近で、最高硬度を有するTi-Al-Cr合金のマルテンサイト繊を形成し、終端組織の合金側では残留β相を形成し軟化する。(3)本合金系におけるCrの拡散距離はAlのそれに比べて少し長い。また、本合金系の拡散路はS字型を呈する。(4)2元系Ti-Al合金の相互拡散係数においては濃度依存性を有するが、Ti-Cr系合金のそれらには殆ど濃度依存性を有しない。本3元系合金における直接相互拡散係数は2元系のそれらの値より少し小さいが、顕著な濃度依存性は有しない。(L1_0)/(Ll_2)拡散対実験においては,酸素ゲッター(Ti)共に高真空にし,Ar置換し封入して実験を行ったが,それらの試料は接合していなかった.従ってホットプレスによる接合実験を行い,現在,組織観察を行っている.各合金の高速衝撃実験は実験続行中であり,X線回折,SEM観察を行う予定である.Ti-Al-Cr系合金において、軽量耐熱材料の開発のための基礎的資料を得るため、1273K1573Kの5種類の温度でのTi/Ti-Al-Cr, Ti-Al/Ti-CrおよびTi・Al-Cr(Ll。)/Ti-Al-Cr(Ll_2)系合金の拡散対法による組織の傾斜化と相互拡散実験を行い、以下のような結果を得た.さらにはTi-Al、Ti-CrおよびTi-Al-Cr各種合金の高速衝撃実験を行いX線的および組織学的知見を得た.(1)各拡散対において傾斜組織が観察された.1373Kおよび1473Kでの拡散対Ti/Ti-Al-Cr(Tシリーズ)において、Matano界面付近で、最高硬度を有するTi-Al-Cr系合金のマルテンサイト組織を形成し、終端組成の合金側では残留β相を形成し軟化する.この傾向は他の温度も同様である.(2)本系合金におけるCrの拡散距離はAlのそれに比べて少し長い.また、本系合金の拡散路S字型を呈する.これらの傾向は他の実験温度においても同様である.(3)各温度において、2元系Ti-AlおよびTi-Cr系合金の相互拡散係数Dには、顕著な濃度依存性は有しないが、Ti-Cr系のDの方がTi-Al系のDよりも大きい.また、本3元系合金の相互拡散係数においても顕著な濃度依存性は有しないが、2元系のよりも小さいことが分かった.(4)1473K,24h保持後におけるTi-38.1Al-4.8Cr(組成at%)系合金の(L1_0材)の組織および硬さの変化は冷却速度に大きく依存することを報告したが(H13年度)、この傾向は、程度の差はあるが、他の温度でも同様な傾向があることを確認した.1473Kでのホットプレスによる(Ll_0)/(Ll_2)拡散対実験により、この合金ではAlの拡散距離が、Crのそれより長いことが分かった.
線虫を用いた「がんの匂い」の同定

本課題はがんの匂いの検出器として従来の人工機器ではなく、線虫(C. elegans)の嗅覚を活用して線虫が感じるがんの匂いを特定することを目指した。特定を目指すがんの匂い成分は臨床検体中には微量しか含まれていないことが想定される。したがって、分量が限られた臨床検体からがんの匂いを特定可能量まで取得することは非現実的である。そこで、がん患者の尿と同様に線虫が誘引されるがん細胞の培養液に注目した。培養するがん細胞としては、すい臓がん由来株Panc-1を用いた。Panc-1培養液に対し、C. elegans N2株はがん患者の尿と同様に正の走性行動を示す。そこで正の走性行動を指標として分取ガスクロマトグラフィーによる候補成分の絞り込みを行った。各画分を化学走性解析試験に供したところ、複数の画分に対して線虫は正の走性行動を示した。このことから、Panc-1培養液は線虫に正の走性行動を引き起こす誘引物質を複数含有していることが示唆された。次にスケールアップの前検討として10mLスケールでの蒸留による目的物質の捕集および有機溶媒による抽出を試みた。Panc-1培養液の蒸留物および有機溶媒抽出物を適宜希釈した結果、線虫は正の走性行動を示したため、目的とする誘引物質は蒸留および有機溶媒による抽出が可能であった。今後は実際にがん細胞Panc-1で10Lスケールの大量培養を行い、その培養液から目的とする誘引物質=がんの匂いの精製を目指す予定である。
スキャンロンの契約主義による道徳的不一致現象の解明―理由に基づく倫理学の視角から

最終年度である本年度は、スキャンロンの契約主義の関係論的性格を明らかにすることを通じて、スキャンロンの契約主義が、人々が有する多様な価値へのコミットメントに起因する道徳的不一致を適切に理解し、調停するための有効な視角を与えうる理論であることを明らかにした。スキャンロンの契約主義は、しばしば関係論的性格を有するとされる。しかし、スキャンロンが想定する道徳的関係とはいかなるものであるのか、明確に理解されてきたとはいえない。これに対して本研究は、スキャンロンの契約主義は、次の二つの関係を想定する点で、「関係論的」であると指摘した。第一の関係とは、理由応答的存在者の間に成立する関係である。我々は、こうした関係に我々と立つ他者に対して、理にかなった仕方で拒絶しえない原理に基づいて行為する理由がある。第二の関係とは、相互承認の関係である。この関係は、理由応答的存在者同士の関係に立つ我々が、互いに対して理にかなった仕方で拒絶しえない原理に基づいて行為することに成功したときに成立する価値ある関係である。上記の研究を通じて明らかにされた契約主義の関係論的性格は、契約主義が次の二つの点において、価値の多元性に起因する道徳的不一致に取り組むための有効な視角を提示しうることを示している。第一に、契約主義によれば、我々が価値づける理由のある多様な関係やプロジェクトから生じる規範は、道徳的関係の規範と対立しうる。契約主義は、こうした対立の可能性を認めうる点において、多様な規範がどのように関連しあうのかについての直観的に説得的な記述を与えることができる。第二に、契約主義はなぜ道徳的関係の規範が、こうした多様な関係性の規範に対して通常の場合は優先するのかを正当化することができる。そのためスキャンロンの契約主義は、多様な関係の規範の間の衝突を調停するための有効な視角を与えうる理論であるということができる。29年度が最終年度であるため、記入しない。本研究は、T.M.スキャンロンが『我々が負いあうもの』において提唱した契約主義的道徳理論の説得力を、その(1)理由・価値についての説明、(2)道徳的推論の説明、及び(3)道徳的動機付けの説明、という三つの観点から包括的に検討するものである。当該年度は主に2)に該当する、契約主義による道徳的推論の説明を検討した。具体的には、契約主義が前提とする価値(ないし善)の構想とはどのようなものかを明らかにしたうえで、「正しさ」の観念と「価値(ないし善さ)」の観念が、契約主義的な道徳理論の過程においてどのように関連付けられているのかを考察し、「正しさ」についての契約主義的推論への批判の妥当性を検証した。本研究の当該部分については、次年度中に海外ジャーナルに投稿する予定である。当該年度では以上の研究に加えて、冒頭で述べた(1)契約主義が前提とする理由・価値の理論、及び(3)契約主義の動機付けの説明についても、関連する文献の収集・読解及び分析を進めた。(1)については、本年度は主にスキャンロン自身が提示する価値論に近い価値論を展開している理論家(E.アンダーソン等)のテキストの読解と分析を行った。また、(3)との関連でとりわけ重要な文献として、S.ダーオルのThe Second-Person Standpointの読解を行った。ダーオルは、スキャンロンの契約主義と概ね親和的な道徳理論を提示しつつも、スキャンロンの契約主義では、なぜ「正しさ」に関する理由がその他の諸理由に優先するのかを説明することができないとする批判を提出している。こうしたダーオルの立場を詳細に確認することにより、今後における研究の見通しを得ることできた。当該年度の研究では、契約主義における道徳的推論の説明の考察を中心に研究を行った。また、その他の課題に関しても、関連文献の収集及び検討を進めるとともに、研究の今後の方向性に関する考察を深めることができた。ただし、今後の課題として以下の二点が挙げられる。第一に、当該年度は契約主義倫理学と比較的親和性の高い理論家を中心に検討を進めてきたため、次年度以降は契約主義に批判的な帰結主義陣営の理論家に対するより詳細な検討が求められる。第二に、当該年度は主に関連文献のサーベイ及び論文草稿の執筆に当てられた。そのため、次年度はあらたに得られた研究成果の公表と並行して、当該年度の成果も順次アウトプットしていく。本年度は、スキャンロンの契約主義による道徳的動機付けの説明、及び、スキャンロンの契約主義による道徳的推論の説明に関して、それぞれ検討を行った。まず、スキャンロンによる道徳的動機付けの説明を検討した。スキャンロンの契約主義において、道徳的に推論するということは、他者の正統な主張を不偏的な仕方で考慮することとして理解される。しかし、不偏的な道徳の構想には、現実の人々が支持する多元的な価値やコミットメントの重要性を十分に認めることができないため、我々の道徳的経験の記述として不適切であるという批判が、B.ウィリアムズなどの論者によって提起されている。本研究では、契約主義によるこうした道徳的動機付けの説明は、道徳的考慮事項がその他の考慮事項と衝突した際における我々の経験を正確に記述しうるため、ウィリアムズらの批判は当たらないことを明らかにした。また同時に、なぜ道徳的考慮事項は(少なくとも通常の場合において)その他の考慮事項に対して優先するといえるのかという問題に対して、契約主義は説得的な解答を与えうることを論じた。

また、道徳に関する思考を「理に適った拒絶可能性」のテストとして定式化する道徳的推論の契約主義的説明を検討した。この説明には、何が理に適った仕方で拒絶しうるかを同定する際に、契約主義理論から独立した道徳的直観に依拠せざるをえないため、道徳的推論の説明として不適切であるという批判がある。本研究では、こうした契約主義的推論に対する批判は、「適理性(reasonableness)」の観念に関する不適切な理解に基づいているため、妥当ではないことを指摘した。また、「適理性」という実質的観念ではなく「熟慮的合理性」という手続き的観念を用いて契約主義を再定式化しようと試みるN.サウスウッドの理論を批判することによって、スキャンロンの契約主義の利点を明らかにした。本年度は、スキャンロンの契約主義の理論的支柱である、道徳的動機付けの説明と、道徳的推論の説明の両方に関して考察を行い、どちらのテーマに関しても国内学会等で発表を行うなど、進捗がみられた。また、本年度の9月2日には、スイスのベルン大学において開催されたスキャンロンの思想に関するシンポジウムに参加し、スキャンロン本人と直接対話をする機会を得た。このことによって、スキャンロンの契約主義に関する理解をさらに深めることができただけでなく、今後の研究の方向性に関しても重要な示唆を得ることができた。以上の理由から、本研究課題はおおむね順調に進展しているといえる。最終年度である本年度は、スキャンロンの契約主義の関係論的性格を明らかにすることを通じて、スキャンロンの契約主義が、人々が有する多様な価値へのコミットメントに起因する道徳的不一致を適切に理解し、調停するための有効な視角を与えうる理論であることを明らかにした。スキャンロンの契約主義は、しばしば関係論的性格を有するとされる。しかし、スキャンロンが想定する道徳的関係とはいかなるものであるのか、明確に理解されてきたとはいえない。これに対して本研究は、スキャンロンの契約主義は、次の二つの関係を想定する点で、「関係論的」であると指摘した。第一の関係とは、理由応答的存在者の間に成立する関係である。我々は、こうした関係に我々と立つ他者に対して、理にかなった仕方で拒絶しえない原理に基づいて行為する理由がある。第二の関係とは、相互承認の関係である。この関係は、理由応答的存在者同士の関係に立つ我々が、互いに対して理にかなった仕方で拒絶しえない原理に基づいて行為することに成功したときに成立する価値ある関係である。上記の研究を通じて明らかにされた契約主義の関係論的性格は、契約主義が次の二つの点において、価値の多元性に起因する道徳的不一致に取り組むための有効な視角を提示しうることを示している。第一に、契約主義によれば、我々が価値づける理由のある多様な関係やプロジェクトから生じる規範は、道徳的関係の規範と対立しうる。契約主義は、こうした対立の可能性を認めうる点において、多様な規範がどのように関連しあうのかについての直観的に説得的な記述を与えることができる。第二に、契約主義はなぜ道徳的関係の規範が、こうした多様な関係性の規範に対して通常の場合は優先するのかを正当化することができる。そのためスキャンロンの契約主義は、多様な関係の規範の間の衝突を調停するための有効な視角を与えうる理論であるということができる。