hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
教師の適切な児童生徒理解を促すコンサルテーションの開発

本研究では,児童生徒についての教師の推測理解パターンを忠実に描き出し,その個人差を明確にする基準も備えた心理検査を開発した。また,適切な検査実施および迅速な検査結果フィードバックのためのオンライン化プログラムを開発した。さらに,適切な児童生徒理解を教師に促すことを目的に,検査結果にもとづくコンサルテーション・プログラムを提案し,事例検討を行った。本研究は,小中学校の教師の適切な児童生徒理解促進を主目的とし,それを基盤として教師の学級経営や生徒指導の改善をも支援するコンサルテーション・プログラムを開発する。本研究では,第一に教師個々人の児童生徒理解や推測のパターンをできる限り忠実に抽出する査定方法を開発する(目的A)。それによって,推測理解パターンの自覚化を促す資料を教師に提供する。第二には,教師が一般に用いている推測理解パターンを小中別・経験差別に抽出し,パターンの個人差をより明確にする基準を作成する(目的B)。第三に,査定結果を適切にフィードバックするオンライン化プログラムを,当研究グループが開発した暗黙の人格観検査をベースにして開発する(目的C)。第四に,検査者が教師とともに査定結果を検討していく過程を含めた推測理解パターン自覚化を支援する効果的なコンサルテーション・プログラムを開発する(目的D)。当該年度は,教師の推測理解パターンの一般的特徴と個人差の検討(上記「研究目的」の目的Aと目的B)に着手した。小中学校の教師を中心とした33名の教師を対象に,児童生徒の推測理解パターンの一般的特徴を明らかにする目的で,児童生徒の性格特徴についての自由記述による資料を収集した(分析中)。さらに,上記33名中15名の教師に,暗黙の人格観検査をインターネット経由で実施し,推測理解パターンの一般的特徴ならびに個人差の予備的検討を行った。その結果,一般の人々の推測理解パターンと符合するものと,教師に特徴的な推測理解パターンおよび個人に特徴的な推測理解パターンと考えられるものとがほぼ同数認められ,教師用の個人差識別基準を新たに作成する必要性が示唆された。また,特徴的な推測理解パターンを示す教師についての事例的検討により,教師に既に自覚されている推測理解パターンを手がかりにした推測理解パターン全体の自覚化の可能性が示唆された。第三に,査定結果を適切にフィードバックするオンラインヒプログラムを当研究グループが開発した暗黙の人格観検査をベースにして開発する(目的C)。第四に,検査者が教師とともに査定結果を検討していく過程を含めた推測理パターン自覚化を支援する効果的なコンサルテーション・プログラムを開発する(目的D)。当該年度は,教師の推測理解パターンの一般的特徴と個人差の予備的検討(上記「研究目的」の目的Aと目的B)を終え,各々について学会発表を行った(結果概要は,昨年度報告済)。また,簡略版査定方法の着想も含め,教師の推測理解パターンの個人差を抽出する査定方法のいくつかの可能性について学会にて提案を行った(目的A)。こうした結果も踏まえ,ソフトウエア開発会社との打ち合わせを行い,オンライン化プログラム開発についての構想を固めながら,検査結果分析に必要なサーバを準備した(目的C)。さらに,推測理解パターンの自覚化を支援するコンサルテーション・プログラムについては,中学校教師1名の事例を得て,検討に着手したところであり,平成23年度にはさらに事例を増やしながら効果的なコンサルテーション・プログラムを提案する予定である(目的D)。,本研究は,小中学校の教師の適切な児童生徒理解促進を主目的とし,それを基盤として教師の学級経営や生徒指導の改善をも支援するコンサルテーション・プログラムを開発する。当該年度は,昨年度までの教師の推測理解パターンの一般的特徴と個人差の予備的検討,ならびに教師の推測理解パターンの個人差を抽出する査定方法検討(上記「研究目的」の目的Aと目的B),さらには推測理解パターンの自覚化を支援するコンサルテーション・プログラム検討(目的D)に基づき,オンライン化プログラムを開発し,サーバへのプログラム移植を行うことに力を注いだ(目的C)
確率過程の理論統計と極限定理の研究

有限時間高頻度観測における確率回帰モデルのボラティリティの疑似尤度解析において,確率場の非退化性を保証する解析的および幾何学的判定条件を与え,擬似最尤推定量および擬似ベイズ推定量の漸近混合正規性と積率収束を証明した.有限時間非同期高頻度観測下で疑似尤度解析を構成した.極限が混合正規となるマルチンゲールの漸近展開が確立した.これは伝統的な漸近展開理論の枠を越える新しい極限定理である.応用としてp-変動の漸近展開が導出された.マイクロストラクチャーノイズ除去を伴う分散推定量の漸近展開の研究が進展した.情報量規準sVICや,ソフトウエア開発のための基礎理論研究を行った.有限時間高頻度観測における確率回帰モデルのボラティリティの疑似尤度解析において,疑似尤度比確率場の大偏差的性質が本質的になり,そのために,ある統計的確率場のパラメータに関する一様な非退化性が重要となる.確率場を定める関数の零点集合が正則多様体でない場合に非退化性を保証する判定条件を見つけた.この結果はStochasticProcessesand their Applications(SPA)のInternational Year of Statistics記念特別号に,内田雅之氏との共著論文として掲載予定である.極限が混合正規となるマルチンゲールの漸近展開は,有限時間高頻度データに基づくボラティリティ推定問題において,推定量の分布の高次近似を得るために不可欠である.これは伝統的な漸近展開理論の枠を越える新しい極限定理であるが,筆者によって最近導出された(SPA20120n-line).応用として,realized volatilityの漸近展開が得られる.p-変動への応用は,MPodolskij氏との共同研究で結果が得られた.時間局所的にWiener-Ito展開を持つ汎関数に対して,adaptive random symbolを特定し,漸近展開公式を得た.また,マルチンゲール展開の精密化の研究を進めた.ボラティリティの推定問題はとくに非同期観測におけるパラメトリック推定は結果が皆無と言える.荻原哲平氏との共同研究で,有限時間非同期高頻度観測下で,疑似尤度解析を構成し,推定量の漸近混合正規性を与えた.推定量の漸近挙動の記述には,非同期観測から決まる観測区間のアソシエーション行列のレゾルベントの漸近挙動が本質的になることを示した.C.Laredo氏らと確率ボラティリティモデルの汎関数の経験分布関数に対して,高頻度長期観測下における分布の漸近展開について研究した.筆者が提唱した漸近展開によるオプション評価法(J.Japan Statistical Society 1992,PTRF 1992)は,期待値の超高速計算法として金融機関等で広く用いられている.学習理論の導入により確率数値計算における新しいスキームの確立を目指し,東京大学と早稲田大のグループで研究を行ってきたが,様々な非線形判別(学習機械)による試行の中で,ランダムフォレストによる誤差の予測において有望な特徴量が明らかになってきた.確率過程のシミュレーションおよび統計解析のための大規模RソフトウエアYUIMAに関して,フラクショナル・ブラウン運動で駆動される確率微分方程式,非同期共分散推定,CARMA過程等のモジュール構成において進展があった.点過程のモジュールの構築に関して研究が進んでいる.有限時間離散観測におけるセミマルチンゲールの分散共分散推定量は一般に混合正規極限を持つ.漸近展開は全く知られていなかったが,最近筆者によって与えられ(SPA 2013),非エルゴード的統計学でも高次漸近理論の可能性が開け,応用として,リアライズド・ボラティリティやpー変動の漸近展開が得られた.さらに,マイクロストラクチャーのある場合のノイズ除去を伴う分散推定量の漸近展開の研究が進行している.非エルゴード的統計におけるモデル選択問題すなわち情報量規準の構成は未解決の問題である.有限時間離散観測におけるボラティリティの非線形パラメトリックモデルに対して,スポットボラティリティ情報量規準sVICを提案し,予測分布と真の分布の乖離が補正されることを理論的に保証した.基本的な道具は,ボラティリティに関する疑似尤度解析と混合型マルチンゲール展開であり,最新の理論統計と確率論の成果が直接使われている.シミュレーション実験と金融データへの適用を行い,ボラティリティ項の指数に関して新たな知見を得た.マルチンゲールに対する漸近展開は,混合型中心極限定理の精密化に発展し,その方法は,ボラティリティの推定のような非エルゴード的統計学で基礎的である.リアライズドボラティリティの漸近展開はその例であるが,その一般化であるp-変動の漸近展開,さらにマイクロストラクチャーノイズに対するプレアべレージングをしたボラティリティ推定量の漸近展開の研究の深化を図った.有限時間高頻度観測下のボラティリティ・パラメータの擬似尤度解析の結果と,非エルゴード系に対するマルチンゲール展開の結果を使い,推定量の漸近展開の導出を行っている.また,エルゴード的および非エルゴード的点過程に対する擬似尤度解析の構築を行っている.マルチンゲール展開の新しい応用に関して当初の計画以上の進展があった.本課題のテーマの一つであった擬似尤度解析の発展研究に関して,ボラティリティのパラメトリック推定や,点過程への応用が進み,これも予定していた以上の成果があった.

超高頻度データ解析の基礎となる点過程に対する擬似尤度解析の構成と擬似尤度推定量の漸近挙動を明らかにした.有限時間高頻度観測における伊藤過程のボラティリティのパラメトリックモデルに対して,擬似尤度解析(Uchida and Yoshida SPA2013)と,混合極限の場合のマルチンゲール展開(Yoshida 2013)の結果を用いて,擬似尤度推定量の漸近展開を導いた.摂動された確率微分方程式の解の汎関数に対する漸近展開を計算する高次元アルゴリズムの構成とその実装に関して研究の進展があった.有限時間高頻度観測における確率回帰モデルのボラティリティの疑似尤度解析において,確率場の非退化性を保証する解析的および幾何学的判定条件を与え,擬似最尤推定量および擬似ベイズ推定量の漸近混合正規性と積率収束を証明した.有限時間非同期高頻度観測下で疑似尤度解析を構成した.極限が混合正規となるマルチンゲールの漸近展開が確立した.これは伝統的な漸近展開理論の枠を越える新しい極限定理である.応用としてp-変動の漸近展開が導出された.マイクロストラクチャーノイズ除去を伴う分散推定量の漸近展開の研究が進展した.情報量規準sVICや,ソフトウエア開発のための基礎理論研究を行った.摂動モデルに対する汎関数の期待値の漸近展開による高次近似計算に関して,学習理論による誤差評価の問題に対して多くの知見を得た.この研究は漸近展開公式のさらなる一般化と表裏であり,両者の追求が重要である.点過程に対する擬似尤度解析の構築は,応用上重要であるばかりでなく,エルゴード性の証明や非エルゴード的状況での極限定理の導出など,極限定理としても研究課題がある.27年度が最終年度であるため、記入しない。確率統計学極限が混合正規の場合のマルチンゲール展開は伝統的な漸近展開理論に収まらないものであり,それが成り立つための十分条件をすこし弱めるといった技巧的なレベルでの精密化の可能性がまだ残されている.その追求に研究の一部が向かったためスケジュールはタイトになったが,この成果の上,全体的にはおおむね順調に研究は進行した.摂動系における漸近展開の計算の自動化の基礎となる,一般摂動モデルに対する高次展開公式の生成,実装,および学習理論による誤差制御に関して新たな方向が見出され,それにともなう実験と解析を行う.分布論的漸近展開の方法の深化を図る.27年度が最終年度であるため、記入しない。出張等により,研究者との共同研究,成果発表と議論,および情報収集を行う.本課題はかなり大規模な領域を対象としており,得られた理論的な結果を計算機実装に結びつけるにはより人的資源が必要と思われる.プロジェクトの拡大も含めて方策を検討する必要が起きてくるかもしれない.マイクロストラクチャーのある状況で,修正されたpー変動の分布の漸近展開が進んでいる.ジャンプ過程および疑似尤度比確率場の様々な分離性の下での,確率場の裾確率評価を含めた強い意味の疑似尤度解析の構築は課題である.計算機実装とデータ解析も発展させる.広い分野から海外の研究者を招へいし,統計的漸近理論に関する情報を収集し,本課題の研究に役立てる。プロジェクトに協力してもらっている外部の研究者や,大学院生の協力が予想以上に大きく,計算機実装および研究補助のための人件費が押さえられた.大学院生の就職等のため,マンパワーの確保が別途必要である.
膜融合制御に基づく機能性超分子マイクロリアクターの設計

前年度に引き続き、水素結合により形成されるマイクロメーターサイズの巨大ベシクルを利用し、水系で機能する超分子マイクロリアクターの設計・開発に向けた検討をおこない、以下の成果を得た。1.グアノシン系マイクロカプセル先導例として我々が見出したグアノシン系化合物を利用したマイクロカプセルについて、さらに検討を加えた。まず、ベシクル作成条件を種々検討した結果、非イオン界面活性剤の共存下で単層膜ベシクルの作成に成功した。単層膜ベシクルは中性条件下で大きな負のゼータ電位を示すため、分散安定性が高く、遠心分離器によるベシクルの沈降操作の後も、ほぼ定量的に再分散された。また、酸性pH領域ではゼータ電位の減少によるベシクルの凝集が起きること、さらに非イオン界面活性剤の添加により、ゼータ電位が減少して凝集ではなくベシクル融合が起きることが判明した。これにより、pHによるベシクルの凝集・分散制御、非イオン界面活性剤をトリガーとするベシクル融合を引き起こすことが可能となり、マイクロカブセルおよびマイクロリアクターとしての有用性を示すことができた。2.スルファミド系マイクロカブセル昨年度見出したスルファミド系化合物による水素結合性マイクロカプセルについて、その作成条件や機能性などについてより詳細に検討した,具体的には、二次元水素結合ネットワークを水中で保護する被覆部位の構造や物性を合成化学的に変化させ、ベシクル形成能との関連を系統的に検討し、非対称誘導化がベシクル形成の分子設計として有効であることを明らかにした。また、透過型電子顕微鏡観察などから、ベシクルは二次元シートを貼り合わせた特異な構造であること、さらにベシクルが種々の条件下で安定に存在することなど、スルファミド系がグアノシン系ベシクルより堅い二次元膜を形成し、強固な膜で囲まれたマイクロリアクターとなることを確認した。以上の成果から、「膜融合制御に基づく機能性超分子マイクロリアクター」の実現に向けた材料設計指針を示すことができた。マイクロリアクターは、微小空間での基質の反応で目的物を効率よく生成させ、分離回収が容易なシステムとなることから注目を集めている。水素結合は方向性のある強い分子間結合でありながら、非共有結合であるため可逆性を持つ。本研究は、安定性と可逆性という水素結合が示す特徴を最大限に引き出すことが可能な超分子ポリマーを用い、膜融合制御に基づく機能性超分子マイクロリアクターを設計・開発することを目的とする。本年度は以下の成果を得た。1.水素結合性超分子マイクロカプセルの評価、外部刺激による膜融合誘起とベシクル合一水素結合性マイクロリアクターの先導例として、グアノシン誘導体を用いて蛍光プローブを内包した多層膜マイクロカプセルを作成し、水素結合性マイクロカプセルの基質内包能についてさまざまな環境下で評価した。その結果、pH、温度、イオン強度などの幅広い条件下でカプセルは一定の形状や大きさ保ち、カプセルの融合や崩壊、蛍光プローブの漏出はなかった。一方、これらの条件を調節してカプセルの崩壊を誘起し、内包基質を放出させることに成功した。またマイクロカプセルの分散溶液中に非イオン性界面活性物質を加えたところ、カプセルの融合が確認された。以上より、水素結合性超分子マイクロカプセルがマイクロリアクターとしての基本的な要求を満たしており、適切な外部条件によって「安定性」「可逆性」という水素結合の特性を制御可能なことを実証した。2.新規水素結合性超分子膜の作成と機能評価二次元水素結合ポリマーを形成できるスノファミド系化合物を中心として、これまでに確立した水素結合部位と保護・被覆部位とのサイズフィットという分子設計指針に従って、水素結合性マイクロカプセルを作成することができた。今後、作成条件や機能性等についてより詳細に検討していく。

また、透過型電子顕微鏡観察などから、ベシクルは二次元シートを貼り合わせた特異な構造であること、さらにベシクルが種々の条件下で安定に存在することなど、スルファミド系がグアノシン系ベシクルより堅い二次元膜を形成し、強固な膜で囲まれたマイクロリアクターとなることを確認した。以上の成果から、「膜融合制御に基づく機能性超分子マイクロリアクター」の実現に向けた材料設計指針を示すことができた。
白血病細胞におけるトロンボモジュリン・組織因子発現の研究

急性白血病は、播種性血管内凝固症候群(DIC)合併頻度の高い疾患で、白血病細胞中の凝固促進物質としては、組織因子(TF)(従来の組織トロンボプラスチン)が主とされている。また、特に急性前骨髄球性白血病(AML M3; APL)では、DICがほぼ必発であることはよく知られている。最近、APLに対する画期的な治療法として、ビタミンA誘導体であるオールトランスレチノイン酸(ATRA)による分化誘導療法が臨床の場に導入されつつある。当大学の患者さん逹においても、原疾患の改善はもちろん、抗凝固療法なしで極めて早期のDICの改善を認めた。そこで、我々は、ATRAにより早期に白血病細胞中TFのダウンレギュレーションが起きるのではないかと推察した。一方、インターロイキン1、腫瘍壊死因子などは、内皮細胞上のTFのアップレギュレーション、及び内皮細胞上の抗凝固糖蛋白トロンボモジュリン(TM)のダウンレギュレーションを対照的に起こすことが知られていたため、白血病細胞中TFとTMの発現を併せて検討しようと考えた。各種細胞株を用いて、体系的に白血病細胞のTF、TMの発現を検討すると、ATRAは、APL及び単球性白血病細胞では、細胞表面及び細胞溶解液中のTF抗原・活性の発現を速やかに著明に減少させ、TM抗原・活性の発現を著明に増加させて、細胞の凝固活性を減少させることが見出された。またこの変化は遺伝子転写レベルでもたらされることが判り、これらの成果をBloodに発表した。実際、患者さんの血液から分離した新鮮な白血病細胞を用いて検討を続けているが、同様な機序が確認されている。本研究の成果は、レチノイン酸による遺伝子転写レベルでのDIC治療の可能性を示唆するとともに、広く血栓症の発症機序解明・治療への応用につながる可能性があり、更により詳細なレチノイン酸の作用機序の解明を続けている。
骨軟部腫瘍における転移診断バイオマーカーの同定と治療応用可能な融合遺伝子の探索

我々は骨軟部腫瘍における、融合型キナーゼのような癌化にも関連する融合遺伝子を同定し、転移診断、さらに新しい治療標的の確立を目指している。中でも、これまで融合遺伝子が同定されていない類上皮肉腫における融合遺伝子の同定を行った。保存液にて保存している類上皮肉腫組織からRNAを抽出し、次世代シークエンスを用いた融合遺伝子解析を行った。解析に用いた機器はイルミナ社cBOT, HiSeq2500を用いた。シークエンス解析は、イルミナ社指定のフローセルを使用しシークエンスを行った。Read lengthは101bpで、Paired-end, Multiplex法で行った。バイオインフォマティクス解析はリードデータのクオリティチチェック、クリーニングを行い、poly-A/T tailを除去しdeFuseとFusion Hunterを用いて融合遺伝子候補を予測した。deFuseで75融合遺伝子、Fusion Hunterで2融合遺伝子を同定した。これらの中で共通していたのは1融合遺伝子のみであった。この1融合遺伝子に関して、break pointを含む領域でRT-PCRにおいて真正性を確認を行ったが、目的となる遺伝子は検出できなかった。このため共通していない計75の融合遺伝子候補に関して、3つの類上皮肉腫細胞株を利用して、これら融合遺伝子候補の真正性の確認を進めて、融合遺伝子の同定を目指している。治療標的になりうる軟部肉腫における融合遺伝子の同定は順調に進行しているが、プロテオミクス解析を用いて転移バイオマーカーを同定の実験が遅れている。今後候補融合遺伝子の真正性確認として、候補となる融合遺伝子の発現をRT- PCR法を用いて、数種の類上皮肉腫細胞株で確認する。さらに融合遺伝子の肉腫形成能の確認として、候補融合遺伝子を導入した3T3細胞を、ヌードマウスの皮下に移植し肉腫形成を確認する。プロテオミクス解析を用いて転移バイオマーカーを同定実験を進める。プロテオミクス解析を用いて転移バイオマーカーを同定実験が今年度は行えなかった。次年度に解析を予定している。
超原子価炭素種の創製:結合生成と相互作用に関する研究

本研究の初年度である昨年に,我々は、より中心元素と両側の配位子の相互作用が強くなることを期待し、7員環を2つ縮環した新規3座配位子を初めて合成することができたが,配位原子が酸素であったことから,エノールエーテル部分が不安定で,中心に炭素原子を導入することはできなかった。本年度は,この臭素化物をn-BuLiによりリチオ化した後、種々のベンゾフェノンと反応させることで、中心に炭素原子を導入することができた。この付加体であるアルコールを,トリチルカチオンで処理することにより,中心炭素から水酸基を引き抜くことができた。生成したカチオンは,各種NMRおよびエックス線解析によって構造を決定した。中心炭素の置換基によって4配位か5配位かが決まっていることがわかった。また,van Koten型酸素配位子を新たに合成し,5配位炭素アニオンの合成を目指した。新規配位子の合成には成功したが,まだアニオン系の5配位の合成には成功していない。近年当研究室ではアントラセン骨格、またはvan-Koten骨格を有する超原子価5配位炭素及び、ホウ素化合物の合成、単離に成功した。それらの化合物のX線構造解析などの実験及び、理論計算により、中心元素とアピカル方向にある二つの酸素配位子の間には相互作用があることを証明してきた。しかし比較的相互作用の強いアントラセン系においても、中心元素の高配位化によるNMRの高磁場シフトは観測されなかった。そこで我々は、より中心元素と両側の配位子の相互作用が強くなることを期待し、7員環を2つ縮環した新規3座配位子を合成した。新規3座配位子の骨格そのものも合成例がなかったが、種々検討の結果、2-ブロモ-m-キシレンから5段階、収率9%でテトラエステル体を合成し、続いて分子内クライゼン縮合、酸処理する事で目的の骨格を有するケトン体を得ることができた。次にKH,(MeO)_2SO_2,DMFの条件下、エノールエーテルを構築し、新規3座配位子の合成に成功した。この臭素化物はn-BuLiにより定量的にリチオ化でき、続いてB(OMe)_3と反応させることで、収率90%で中心にホウ素原子を導入することができた。各種NMRにおいて対称なシグナルを示し、5配位構造を有している可能性が高いと考えている。しかし架橋部分の自由度のためか、この系においても、^<11>B NMRにおいて高配位化による高磁場シフトは観測されなかった。現在、さらに二重結合を導入した剛直な7員環の系の構築を検討している。この付加体であるアルコールを,トリチルカチオンで処理することにより,中心炭素ら水酸基を引き抜くことができた。新規配位子の合成には成功した。
ヒトPD-1発現T細胞保有マウスの作製と抗PD-1抗体薬の効判定システム構築

担がんマウスから分取した腫瘍浸潤リンパ球(Tumor Infiltrating Lymphocyte:TIL)と、腫瘍細胞を共培養し、抗PD-1抗体薬を添加することで抗PD-1抗体薬の薬効判定がin vitroで可能か検討した。抗PD-1抗体薬はある一定の患者に対して高い有効性を示す一方、非常に高価であること、一部重篤な副作用が生じることが問題視されている。さらに近年その適応範囲が拡大しつつある中、患者選択が非常に重要であることが言われている。この問題を解決するためのシステムをin vitroで構築することが本研究の目的である。蛍光タンパクGFP/iRFPを遺伝子導入し、かつPD-L1が強発現しているLLC細胞と、担がんマウスから分取したTILを共培養し、死細胞染色色素SYTOXで染色することで、in vitroで抗PD-1抗体薬の薬効判定システムが構築できるか検討した。担がんマウスから分取したLLC細胞はフローサイトメーターを用いてTILを回収した。回収したTILは腫瘍細胞の10%程度であった。このTILとPD-L1強発現LLC細胞またはLLC細胞と共培養し、そこに抗PD-1抗体薬を添加しTILによるLLCへの細胞傷害効果を検討した。抗PD-1抗体薬添加後の細胞傷害性はPD-L1強発現またはLLC細胞で差は見られなかった。分取したTILに腫瘍細胞を傷害するT細胞が含まれているか、CD4/CD8をフローサイトメーターで解析したところ、CD4陽性は0.88%、CD8陽性は42.5%であった。薬剤効果判定システムが十分機能しなかった要因として、1CD4/CD8陽性細胞数が不十分であること、2共培養時のTILの細胞数が腫瘍細胞に比べ相当量必要であること、3添加する抗PD-1抗体薬の種類が示唆された。担がんマウスから分取したT細胞と、PD-L1強発現LLC細胞を共培養し、PD-1抗体薬を添加することでPD-1抗体薬の薬効判定システム構築を検討した。2015年に薬事承認された抗PD-1抗体薬はある一定の患者に対して高い有効性を示す一方、非常に高価であること、一部重篤な副作用が生じることが問題視されている。蛍光タンパクであるGFPとiRFPが発現しており、かつPD-L1を強発現したLLC細胞と、担がんマウスから分取したT細胞を共培養し、死細胞染色色素SYTOXで染色することで、in vitroで抗PD-1抗体薬の薬効判定システムが構築できるか検討した。抗PD-1抗体薬の効果はPD-L1と結合するだけでなく、他の抗原抗体反応も関与することが多く報告されている。そこで本年度はヒト化マウスの作製は行わず、in vitroの共培養系で薬効判定システムが構築できるか検討し、可能であれば臨床検体を用いた検討を行うこととした。本研究では対象群としてPD-L2強発現LLC細胞も作製し、検討を行った。T細胞は担がんマウスの腫瘍部から採取した。ハサミを用いて腫瘍を粥状にした後、1時間の酵素処理を行うことで腫瘍組織から細胞を抽出した。さらに比重遠心法を用いることで、対象とする腫瘍浸潤リンパ球(TIL)を回収した。回収したTILは目的とする位置に層を形成していなかったが、この細胞を検討に使用した。担がんマウスの腫瘍から分取したTILとPD-L1またはPD-L2共発現LLC細胞を共培養したところ、腫瘍細胞に及ぼす細胞傷害性に差は見られなかった。さらに共培養系に抗PD-1抗体薬を添加した場合でも差は見られなかった。薬効判定システムの構築を目的に、TILと腫瘍細胞の共培養系の構築を試みた。PD-L1細胞の蛍光量が減少したため、リクローニングを行った。また比較群としてPD-L2に蛍光タンパクを発現させた。LLCをC57BL/6Jマウスに移植することで担がんマウスを作製した。Percollを用いた比重遠心法でTILの回収を試みたが、目的とする位置にTILは存在しなかった。別の層の細胞を回収し共培養したが、PD-L1とPD-L2強発現細胞の生存率に差は見られなかった。

回収したTILは腫瘍細胞の10%程度であった。このTILとPD-L1強発現LLC細胞またはLLC細胞と共培養し、そこに抗PD-1抗体薬を添加しTILによるLLCへの細胞傷害効果を検討した。抗PD-1抗体薬添加後の細胞傷害性はPD-L1強発現またはLLC細胞で差は見られなかった。分取したTILに腫瘍細胞を傷害するT細胞が含まれているか、CD4/CD8をフローサイトメーターで解析したところ、CD4陽性は0.88%、CD8陽性は42.5%であった。薬剤効果判定システムが十分機能しなかった要因として、1CD4/CD8陽性細胞数が不十分であること、2共培養時のTILの細胞数が腫瘍細胞に比べ相当量必要であること、3添加する抗PD-1抗体薬の種類が示唆された。比重遠心法を用いたTILの回収が困難であったことから、平成30年度はフローサイトメーターを用いたTILの回収を目指す。担がんマウス作製後、マウスから腫瘍組織を分取する。1時間の酵素処理後、腫瘍組織から細胞を抽出する。得られた細胞はCD45で分取し、TILを回収する。得られたTILとPD-L1またはPD-L2強発現LLC細胞を共培養することで、薬効判定システムが構築できるか検討する。さらに末梢血のT細胞を用いることでも薬効判定が可能か検討する。
障害児をもつ家族のエンパワメントを高める介入プログラムの開発-祖父母を含めて-

目的障害のある子どものいる家族へのエンパワメントを考えるとき、障害のある子どもが双子の場合が多いことや、双子の妊娠及び育児には不安やストレスが高く、様々な問題が起こりやすいことが明らかとなっているので、双子および双子に障害児がいる家族を対象に、調査を進めた。ストレスが高い状況の母親が、就労を希望する場合にどのような状況であるのか、双子を育てる母親の就労状況と家族の協力の実態を明らかにした。結果対象者は524名で、その平均年齢は40.4±5.1才であった。母親の就労状況は、常勤・パート等の仕事にかかわっている者は31名(48.4%)であり、無職の者は30名(46.9%)であった。出産前から働いている者は12名(18.8%)であった。一時退職し、その後再就職した者の辞めた理由は、双子の妊娠のため11名、育児のため8名、勤務の融通5名、預ける場所がない4名、病気に戸惑いがある4名などであった、再就職した理由は、子どもの状態が安定11名、子どもの入学、入園など13名、済的理由12名、働きたかった10名であった。母親達の就労支援のためにも、子どもの健康管理面のサポートと、妊娠時からの安心した子育て環境づくりの必要性が示唆された。面接では、障害児が就学するときに障害があり、母親が就労していることに学校の理解がない、学校への待機を依頼され、健常児の世話にあるので、苦労であったことが話された。1.研究目的本研究では、障害児の誕生や発症した初期の段階での家族支援を明確にし、心理教育的介入プログラムの作成し、その評価を行う。そのため障害児に対する保健・医療・福祉施策は地域により異なるので、先ず研究対象地域の特性を明らかにする。また、母親のエンパワメントとストレングスを高めると考えられる就労の継続について、その促進因子の父親の家事・育児協力を検討した。2.実施と研究方法(1)研究対象地域及び施設の選定のための地域特性の把握研究代表者が所属を変更し、研究対象地域及び施設が変わらざるを得なくなったため、地域の障害児者の保健・医療・福祉施策等の把握が必要となった。(2)障害児をもつ家族への支援方法についての調査実施(3)障害児をもつ母親への就労継続に関する調査の実施3.研究対象施設と参加者(1)所属県の資料および学齢期の障害児を訪問している訪問看護ステーションでの看護師(2)全国組織の双子に障害児をもつ母親のネットワーク(3)障害児をもつ家族及び双子の一方に障害児をもつ家族4.結果研究対象県には、障害児をもつ家族が仲間をつくったり、集えるサービスは、市町村の通所施設および県立の肢体不自由児施設で個人的な仲間づくりが見受けられるだけであり、全県的に組織された地域療育など身近なサービスの整備はみあたらなかった。障害のある子どもをもつ母親の就労の継続は、子どもが意思の疎通ができると促進されていた。また就労の形態がパートや非常勤群は、母親だけが行う家事項目が常勤群よりも有意に高かった。このことは、パートや非常勤の勤務形態をとることによって、家族内役割と調整していると考えられる。全国組織の双子に障害児をもつ親のネットワークが行っている仲間作り支援集会を参考に、次年度は、対象県での支援の仲間作りを検討する。1.研究目的障害のある子どもの家族のエンパワメントを高める支援の1つの要因として、昨年度の調査から母親の就業があげられた。本年度は、その結果のまとめと、双子の一方に障害児がいる場合と、健常な双子である場合での母親の就労への影響を検討することとした。母親を中心に父親や祖父母などの家族をどのように支援する場よいのかを方向性を検討している。2.本年度の活動と調査実施内容(1)障害児のいる母親への就労継続に関する調査の結果のまとめと発表

(2)双子をもつ母親への就労継続に関する調査表の作成(3)上記(2)全国型の双子の会に協力してもらい、アンケートの配布を行い、郵送での回収を行った。3.結果障害のある子どもをもつ母親の就労の継続は、子どもが意思の疎通ができると促進されていた。また就労の形態がパートや非常勤群は、母親だけが行う家事項目が常勤群よりも有意に高かった。このことは、パートや非常勤の勤務形態をとることによって、家族内役割と調整していると考えられる。前述の調査に関して、国際学会で発表を行った。この結果を参考に、双子と双子の一方が障害児の場合を比較し、母親の就労継続ができ、エンパワーメントされる要因を明らかにする調査を行った。調査票の配布は1500部、回収数は500部であった。回収率は33.3%であった。現在データの集計を行っているところである。1.研究目的障害のある子どものいる家族へのエンパワメントを考えるとき、障害のある子どもが双子の場合が多いことや、双子の妊娠及び育児には不安やストレスが高く、様々な問題が起こりやすいことが明らかとなっているので、本年度は、双子および双子に障害児がいる家族を対象に、調査を進めた。ストレスが高い状況の母親が、就労を希望する場合にどのような状況であるのか、双子を育てる母親の就労状況と家族の協力の実態を明らかにすることを目的とした。2.本年度の活動と調査18歳以下の双子のいる母親の会の会員に調査を依頼した。回答のあった527人のうち、子どもに慢性疾患や障害のない453人を分析対象とした。調査票は会報に同封して配布し、郵送による返送を依頼した。1)双子が健常である家族の集計2)双子の一人あるいは両方に障害児がいる家族の集計3)1)2)の比較検討4)上記の結果を踏まえての面接計画の立案3.結果「双子を育てる母親の就労に関する調査」結果:回答数は528人、対象の母親の平均年齢は40.2歳(SD5.2)、父親42.7歳(SD5.8)、双子は8.7歳(SD4.9)であった。双子が健常は464人、障害児がいる場合は、64人であった。双子が健常児では、現在281名(62.0%)の母親が就労し、勤務形態は「常勤」98名、「パート・内職」141名、「自営」42名であった。双子に障害児がいる母親では、現在就労している者は31人であり、出産前から働いている者は12名(18.8%)であった。一時退職し、その後再就職した者の辞めた理由は、双子の妊娠のため11名、育児のため8名、勤務の融通5名、預ける場所がない4名、病気に戸惑いがある4名などであった、再就職した理由は、子どもの状態が安定11名、子どもの入学、入園など13名、経済的理由12名、働きたかった10名であった。母親達の就労支援のためにも、子どもの健康管理面のサポートと、妊娠時からの安心した子育て環境づくりの必要性が示唆された。上記の結果を踏まえ、母親の就労プロセスを詳細に明らかにするために、次年度は半構成面接を予定している。目的障害のある子どものいる家族へのエンパワメントを考えるとき、障害のある子どもが双子の場合が多いことや、双子の妊娠及び育児には不安やストレスが高く、様々な問題が起こりやすいことが明らかとなっているので、双子および双子に障害児がいる家族を対象に、調査を進めた。ストレスが高い状況の母親が、就労を希望する場合にどのような状況であるのか、双子を育てる母親の就労状況と家族の協力の実態を明らかにした。2.結果双子に障害児がいる場合は64人であった。
小型霊長類コモンマーモセットES細胞を用いた新規輸血療法開発の為の前臨床研究

本年度は特にコモンマーモセット(CM)ES-tall/scl細泡株からの血小板分化誘導系に重点を置き、1.巨核球・血小板産生系における最適培養条件の検討、及び2.電子顕微鏡法を用いた形態学的解析を試みた。1-(1)培養液の検討:分化誘導後14日目のCD41陽性細胞数を指標とし、最適培養液の検討を行った。その結果、従来使用していた血清入りの培養液よりもビタミンB_<12>・葉酸等を添加した無血清培地の方がより効率良く分化誘導が行えること力明らかとなった。1-(2)巨核球・血小板関連遺伝子導入による検討:tall/scl遺伝子に加えて巨核球・血小板関連遺伝子であるgatal,nf-e2,runxlc各遺伝子をES細胞分化誘導時に同時導入し、巨核球・血小板産生能の検討を行った。しかし昨年度行った単一遺伝子導入時と同様に、巨核球・血小板産生能の顕著な効率化は観察されなかった。2-(1)電子顕徴鏡法を用いたCM末梢血血小板の形態学的解析:予備実験として、CM末梢血血小板を用いた電子顕微鏡解析を行った。ヒト末梢血血小板での報告をもとに各種条件設定(血小板分離方法、電子顕微鏡解析用固方法血小板活性化試薬の条件等)を検討し、ヒトと類似したCM血小板構造を観察した。また、抗vWF抗体を用いた免疫電子顕微鏡解析を行い、ADP及びトロンビン刺激により活性化する血小板像を観察した。2-(2)電子顕微鏡法を用いたCM ES細胞由来血血小板の形態学的解析:上記の条件を用いてCMES細胞由来血小板様構造物の電子顕微鏡解析を行った。その結果、血小板様の構造は観察されたものの、免疫電子顕微鏡解析や細部にわたる構造解析においてCM血小板と同定するまでには至らなかった。【まとめ】CMES細胞分化誘導系において血小板様の産生物が確認できたが、現段階では産生効率が悪く、今後さらなる高効率分化誘導系の構築が必要である。平成17年度までに樹立したtal1/scl遺伝子を恒常的に発現するCM ES細胞(CM ES-tal1/scl細胞)株を用いて、効率的な赤血球・血小板産生系の検討を行った。1.遺伝子導入法を用いた赤血球・血小板産生系の検討CM ES-tal1/scl細胞株を接着培養法により分化誘導し、分化誘導後4日目あるいは7日目にレンチウィルスベクターを用いてGFP, gata1,nfe2,runx1c遺伝子(赤血球・血小板分化に重要な転写因子群)をそれぞれ過剰発現させた。分化誘導後14日目にメイ・ギムザ染色及びヘモグロビン(Hb)・CD41抗体染色を行ったところ、いずれの場合においてもHb陽性赤芽球や核数2N-4Nから成るCD41陽性巨核芽球が確認された。しかしながら、脱核した細胞や8N以上に多核化した細胞は観察されず、全Hb・CD41陽性細胞数にも顕著な相違は見られなかった。このことから、さらなる分化誘導条件の検討が必要であると考え、現在、遺伝子導入時期及び多重感染実験の検討を行っている。2.CM ES-tal1/scl細胞株由来巨核球・血小板に対する検出系の検討本研究において巨核球・血小板マーカーとして用いているCD41抗体は近年、個体発生初期において造血前駆細胞マーカーとしても機能するとの報告があることから、より正確にES細胞由来巨核球・血小板を検出するためにはさらなる検出系の確保が必要である。このような視点から、まずCM骨髄細胞を用いてvon Willebrandfactor (vWF)抗体染色を行った。その結果、骨髄中の巨核球と予想される多核化した巨細胞が強く染色された。またCM末梢血を用いて電子顕微鏡解析を行い、CM血小板の形態学的解析を行った。今後は、先の分化誘導条件の検討と共に、CD41抗体を用いた解析、vWF抗体染色、電子顕微鏡解析を組み合わせ、詳細を検討していく予定である。ヒト

末梢血血小板での報告をもとに各種条件設定(血小板分離方法、電子顕微鏡解析用固方法血小板活性化試薬の条件等)を検討し、ヒトと類似したCM血小板構造を観察した。また、抗vWF抗体を用いた免疫電子顕微鏡解析を行い、ADP及びトロンビン刺激により活性化する血小板像を観察した。2-(2)電子顕微鏡法を用いたCM ES細胞由来血血小板の形態学的解析:上記の条件を用いてCMES細胞由来血小板様構造物の電子顕微鏡解析を行った。その結果、血小板様の構造は観察されたものの、免疫電子顕微鏡解析や細部にわたる構造解析においてCM血小板と同定するまでには至らなかった。【まとめ】CMES細胞分化誘導系において血小板様の産生物が確認できたが、現段階では産生効率が悪く、今後さらなる高効率分化誘導系の構築が必要である。
災害対策に必要な捕捉損失のない固体降水量計測機器の実用化に関する研究

原理的に捕捉損失がない光学式固体降水測定機器を作製した。災害を起こす降雪は比較的狭い領域で起きることも少なくないため、この機器は多数の観測点地点に設置するためにメンテナンス性が良いことも考慮した。研究で一般的に用いられている光学式の機器は、受光と発光が向かい合った透過型が多いがここでは同方に向いた反射型としメンテナンス性を高め、その代わりに測定の不定要素を統計とバックエンド処理で解決した。短期間の観測結果ではあるが、雪片とあられの判別は十分可能であった。また、降水量推定についても、相関係数0.50.7とそれほど高くないが可能であり、さらに積分時間が長いほど適合性も良くなることがわかった。測定機器の作製については、既存の融雪パイプコントローラーのセンサを入れるパッケージに、受光・発光素子それぞれ5個を水平に2列に並べた最終形に近いものを作製し、新しく設計したAD変換ソフトによりPCでデータ収録を行った。場所は新庄市にある雪氷防災研究センターの降雪実験棟と長岡市の雪氷防災研究センターで、他の機器との比較観測を行った。その結果、降雪を捉えるには十分な性能を確認したが、弱い雪を計測するには若干ノイズレベルが高い結果となった。ノイズの少ない回路の導入については次年度以降検討する。また、今年度は陸別と上越での観測は見送り、同程度かそれ以上の比較機器が揃っている長岡での観測に専念した。その結果、確実な計測ができ、かつ、比較データも多数取得することができた。これから詳細な解析を行う予定だが、従来機器と同様、雪片とあられの判別は少なくとも可能であるようだ。次に、実験室にて粒径ごとの観測可能領域の測定を行った。粒径を3種類選び、測定可能領域をマッピングし、今後に向けた基礎データを取得した。実験機器の数値シミュレーションモデルの作成については、幾何光学的な反射を基本とするモデルを構築した。擬似降雪モデルについては計画通りに完成したが、これに与える粒径分布の作成についてはいくつか作成しているが、統計的な議論ができるだけの数はまだ処理していない。受光・発光素子1組の反射モデルについても完成している。今年度の計画には入れていなかったが、透過型粒子判別機器についても実験の実施と考察を行った。この種の機器は反射型よりも粒子判別機器として扱いやすく、考察もしやすいという利点があった。既販の機器と同等な透過型粒子判別機器を使う機会を得たので、既販の機器では取れない信号の生データを取得して解析した。今後、その知見を反射型機器の信号処理アルゴリズムに取り入れることにした。昨年度に引き続き、反射型測定機器の改良を行った。前年度はノイズ対策が課題だったので、その対策として微分・積分回路を組み込んだ機器へ注力したが、受光強度の取得には問題ないが、光照射領域を通過する時間を計るのが困難であることがわかり、不採用とした。そのかわり、同期検波を改良した方法でさらに試作機を作成したが、この方式でも、通過時間をハードウェア処理で正しく再現するのは難しいため、後段をソフトウェア処理として困難を回避する方法を考案した。明るい箇所で受光信号が飽和する問題は抜本的に改善されていないが、感度を絞り、さらにSN比を高めることにより解決しようとしている。粒子の同時計測などの補正に使うシミュレーションモデルについては、新方式に切り替えたことから、改良を進めている。特筆する改良点としては、降雪強度、降雪種別ごとに与えなければならない粒径分布に関して、任意の降水強度と種別を与えることによって粒径分布を推定する一般式を構築した点である。これにより、観測された実際の複数の粒径分布を代表する分布を得ることができ、重複率等のデータベースの作成に一定の普遍性を与えることができる。また、前年度に導入した透過型測定機器についても統計学的な考察を進め、計測した粒径分布を補正する手法を考案した。これについては、今年度の冬に実地計測した事例があるため、その分析と解析を行うとともに、反射型にも応用していく予定である。なお、計測機器の作製が完了していない状況が続いているため、他地域での実地計測は行っていない。しかし、本プロジェクトの予算で人工降雪施設を利用し、実用を踏まえた測定実験を増やした。(1)反射型測定機器については、新規測定機器の作製など一歩後退した後に進んだ部分もあるが、当初から予定していたマイコン搭載のソフトウェア処理形式の機器であり、進展があると判断する。(2)シミュレーションモデルについては、入力する粒径分布の問題はかねてから問題であったことなので、著しい進展があったと言える。モデル本体についての進展は多くないが、今後の方針に変更はない。(3)実地計測については、引き続いて防災科学技術研究所雪氷防災研究センターにて、他の測定機器と並べて計測しており、比較材料は豊富である。またこれも引き続いて人工降雪施設も利用し、冬季を待たずに実地計測の予備計測を行っている。最終年度も同じ体制を維持できるため、順調に進むことが期待できる。(4)反射型測定機器の測定アルゴリズム開発については、新規機器の作製・導入ということになり、当初の予定通りに完成しているわけではないが、個々のコンポーネントについては進展しており、問題ないものと判断する。また昨年度に引き続き、透過型機器の統計的考察も行っており、この問題に関しては実験計画以上の進展があると判断する。昨年度に開発した新しい機器は、前段をパルス発光、後段でソフトウェアによる直接AD変換とし、比較的明るいところでも機能する装置となったが、滑らかな信号ではなかった。

自家ノイズ(受光と発光の素子が光学的に正しく分離していない)が多いことが分かっていたので、金型を作製して内部の透過や反射の影響を極力排除した。また、RC回路で軽く平滑化し、正弦波を仮定した補正により振幅に相当する1粒子当たりの最大受光強度を後段(ソフトウェア)で求める方式に変更した。この2つの改良により前回の機器よりも良い効果を得た。さて、実機では測定できない粒子の同時計測などの、シミュレーションを用いた頻度解析については、数値実験に与える粒径分布の任意性が残っていたので、従来から稼働している粒子判別機器を用いた降雪粒子計測結果を用いて、雪片とあられの2つの場合に分けて、降水量の関数とし粒径分布の推定を行った。地域により異なることが予想されるが、今後収集するデータとの比較解析には有用であると考えられる。また、実機の測定空間範囲と降雪強度の関係から、それほど粒子の重複に関する影響が大きくないことがわかり、詳細な検討は基礎的な検討後に行うことにしたが、今年度は大雪の事例が1回しかなく、しかも機器の改良の途中でその観測もできなかったこともあり、今後必要になることは十分に考えられる。比較対象として測定を並行して行ってきた透過式の機器については、粒径分布の推定、粒子判別、積雪深との比較による積雪速度の評価など、反射型に応用可能な手法について様々な検討を行った。今年度も長岡市での計測を主として行ったが、十日町市での観測を加えた。また、通信機器でつながった路上の融雪パイプ制御器のポンプの稼働情報を収集する別プロジェクトが始まったこともあり、降水量に相当する値を収集させるために、実機を路上に設置して実働することを確認した。原理的に捕捉損失がない光学式固体降水測定機器を作製した。災害を起こす降雪は比較的狭い領域で起きることも少なくないため、この機器は多数の観測点地点に設置するためにメンテナンス性が良いことも考慮した。研究で一般的に用いられている光学式の機器は、受光と発光が向かい合った透過型が多いがここでは同方に向いた反射型としメンテナンス性を高め、その代わりに測定の不定要素を統計とバックエンド処理で解決した。短期間の観測結果ではあるが、雪片とあられの判別は十分可能であった。また、降水量推定についても、相関係数0.50.7とそれほど高くないが可能であり、さらに積分時間が長いほど適合性も良くなることがわかった。(1)反射型計測機器の作製:観測可能な機器を作製した。まだノイズレベルが高い問題があるが、おおむね順調である。(2)実機のシミュレーションモデル:任意の粒径分布に従った大きさの固体降水粒子をランダムに落下させるモデルは完成した。測定システムとして発光・受光素子が1組のモデルは完成し、実機で測定した信号と比較可能な状態まで作成した。今後の課題は、実機の信号処理と同じ手法を取り入れること、複数組の発光受光素子を配置できることである。なお、モデルで用いる粒径分布は作成中であり、大規模な連続集計を行う手前の状態まで到達している。問題なのは一定の降水種別の継続時間が短く、単純に集計してよいかを確かめる必要があることである。
腸管病原性大腸菌の宿主特異的感染の分子機構の研究

腸管病原性大腸菌EPECの感染は極めてヒト特異的であり未だに実験動物を用いた感染モデル系が確立できていない。本菌の感染成立には腸管上皮細胞表層への付着が重要である。培養細胞を用いたin vitro付着実験によってもEPECに特徴的な局所的な微小集落の形成および本菌密着によるattaching and effacing(A/E)障害が再現される。本研究課題においてはEPECのヒト特異的細胞付着が培養細胞を用いた付着実験系でも再現されること、さらに細胞をホルマリン処理することによりヒト以外の細胞で観察される非特異的付着が完全に消失することを見いだした。すなわちEPECの細胞付着にはホルマリンに修飾され難いヒト特異的細胞側受容体とホルマリンにより修飾され易い他種細胞にも存在する受容体の少なくとも2種類の受容体が関与していることが示唆された。ヒト特異的付着にはEPECの束状線毛が必須でありさらにその主要構成蛋白質BfpAが直接結合することを明らかにした。束状線毛は菌-菌間の結合を仲介していることが知られているが、直接宿主細胞との付着に関与していることを明らかにした。また初期付着後は細胞上での集落の拡大に伴い経時的に消失していくことを見いだした。しかし束状線毛による初期段階の付着は後期付着段階に必須のEsp蛋白質の分泌効率に大きく影響し、宿主細胞との密着形成に重要であることが示された。すなわちEPECの付着に関与する因子の発現は細胞へ付着後順次変化し、細胞付着刺激によらEPECの付着様式が順次変化していくことが示唆された。細胞付着による付着因子発現の変化はその遺伝子の転写量の変化として同様に観察できることも明らかとなり、EPECは細胞付着後も病原性遺伝子の発現を付着段階に応じて調節していることが示唆された。病原性大腸菌EPECの上皮細胞に対する付着は、ヒト由来上皮細胞に対しては局所付着し微小集落を形成するが他の種由来の細胞に対しては付着効率および付着様式に相違がみられる。この付着の種特異性は、細胞をフォルマリン処理することにより非特異的付着と明確に区別できることを見いだした。また、この種特異的付着は菌の束状線毛の発現に依存していることを明らかにした。さらに、精製した束状線毛の主要構成蛋白質がヒト由来細胞に特異的親和性を持つこと、EPECの付着を阻害することを示した。この精製した主要構成蛋白質を用い宿主細胞側の受容体分子の同定を試みた結果、約55,65 kDaの2種類の細胞膜に存在する蛋白質分子が分離された。一方、付着様式の変化を経時的に追跡した結果、束状線毛は主に付着初期の段階に直接細胞との付着に関与しておりその後の微小集落形成には必要ではなく消失していくことが明らかとなった。また、EspA,EspB蛋白質の菌体外への分泌は付着後活性化するがその後4-6時間で消失した。それに伴い、EPEC集落の形態は初期の立体的な菌塊から平面的に上皮細胞上を拡散しており、菌-細胞間の相互作用が経時的に変化していることが確認できた。本菌の感染成立には腸管上皮細胞表層への付着が重要であることは明らかである。培養細胞を用いたin vitro付着実験によってもEPECに特徴的な局所的な微小集落の形成および本菌密着によるattaching and effacing (A/E)障害が再現される。本研究課題においてはEPECのヒト

特異的細胞付着が培養細胞を用いた付着実験系でも再現されること、さらに細胞をホルマリン処理することによりヒト以外の細胞で観察される非特異的付着が完全に消失することを見いだした。すなわちEPECの細胞付着にはホルマリンに修飾され難いヒト特異的細胞側受容体とホルマリンにより修飾され易い他種細胞にも存在する受容体の少なくとも2種類の受容体が関与していることが示唆された。ヒト特異的付着にはEPECの束状線毛が必須でありさらにその主要構成蛋白質BfpAが直接結合することを明らかにした。束状線毛は本菌の自己凝集形成にも必須の役割を果たしているが、宿主細胞との付着とそれに続く細胞上での集落形成の付着段階のなかでは主に初期付着に重要であることが明らかになった。この結果は束状線毛の発現が細胞付着後経時的に消失していく免疫染色による観察の結果と一致した。一方後期付着段階に必須のEsp蛋白質の分泌は付着後活性化され、細胞付着刺激によりEPECの付着様式が順次変化していくことが明らかとなった。細胞付着による付着因子発現の変化は転写段階でも観察できることも明らかとなり、EPECは細胞付着後も病原性遺伝子の発現を付着段階に応じて調節していることが示唆された。