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ピッカリング・エマルションの制御理論

コロイド粒子や粉体粒子を用いて安定化されたエマルションを「ピッカリング・エマルション」という。本研究ではピッカリング・エマルションの制御を目指して、その構造形成、相挙動、ダイナミクスなどを理論的に調べた。その結果、球状粒子の液液界面への吸着において、粒子の接触角は界面の曲率に依らないが、吸着エネルギーは曲率に依存することを示した。また、コロイド粒子の濡れ性が界面吸着のダイナミクスに及ぼす影響を調べた結果、粒子吸着のプロセスが拡散律速で支配されていることがわかったコロイド粒子や粉体粒子を用いて安定化されたエマルションを「ピッカリング・エマルション」という。また、コロイド粒子の濡れ性が界面吸着のダイナミクスに及ぼす影響を調べた結果、粒子吸着のプロセスが拡散律速で支配されていることがわかった二種類の液体を混合すると、一方の液体が他方の液体に分散したエマルションが生成する。しかし、通常のエマルションは熱力学的に不安定であるため、時間の経過とともに自発的にドロップレットが合一し、やがて巨視的に分離してしまう。しかし、二種の液体間の界面に粉体粒子やコロイド粒子が吸着すると、エマルションが長時間にわたって安定化される場合がある。このようなエマルションのことをピッカリング・エマルションと呼ぶ。本研究の目的は、ピッカリング・エマルションの構造、相挙動、ダイナミクスを理論的に解明することである。本年度は球状粒子の液液界面への吸着について検討した。そこでは特に界面の曲率効果について調べた。界面が曲率をもつ場合、体積エネルギーを考慮することが重要である。その結果、粒子の吸着位置は古典的なヤングの式で与えられ、曲率には依存しないものの、粒子の吸着エネルギーには曲率依存性があることがわかった。さらに、平坦な液液界面は不安定であることが示された。我々は得られた吸着エネルギーを用いて、二つの液体と界面における粒子の分配を計算した。その結果、粒子の分配は液滴の曲率の強く影響を受けることが示された。我々は同様の解析を、球面の半分が親水的で、残りの半分が疎水的であるヤヌス粒子に対しても行った。ヤヌス粒子の場合には、液液界面が粒子表面の塗り分けの位置と一致する「アンカーリング」の状態がある条件で実現する。この場合には、粒子の吸着位置はヤングの式を満たさず、界面の曲率に依存することがわかった。さらに、均一な粒子とは異なり、平坦な界面が安定であることを示した。これらの結果を用いて、ヤヌス粒子が吸着した界面の曲率弾性定数と自発曲率を解析的に計算した。これら以外にも、粒子表面が凹凸構造をもつ場合の粒子の吸着について検討を行った。二種類の液体を混合すると、一方の液体が他方の液体に分散したエマルションが生成する。本年度は球面の半分が親水的で、残りの半分が疎水的であるヤヌス粒子に対して、球状粒子の液液界面への吸着について検討した。本年度はさらに、ピッカリング・エマルションにおける粒子の吸着ダイナミクスについての検討を行った。ワード・トルダイの式と界面での粒子濃度の時間発展方程式を連立させることにより、界面濃度や表面張力の時間依存性を求めた。その結果、粒子の吸着は拡散律束であることがわかった。これは、実験結果と良く一致している。油と水のように互いに非相溶な液体から成るエマルションの安定化には、通常、界面活性剤が用いられる。一方、コロイド粒子や粉体粒子を使ってエマルションを安定化することもできる。我々は、コロイド粒子の相対的な濡れ性が、界面吸着のダイナミクスにどのような影響を及ぼすかについて検討した。具体的には、二種類の液体間の水平な界面に、一方の液体中に含まれる球状コロイド粒子が拡散過程によって吸着する状況を記述するモデルを考案した。自由エネルギーを用いた定式化により、界面での粒子濃度とサブレイヤーでの粒子濃度に関する連立微分・積分方程式を導出した。そのうちの-つは古典的なワード・トルダイ方程式と呼ばれるものである。

他方の方程式は界面粒子濃度の時間発展を記述し、相対的な濡れ性パラメータが含まれる。我々は様々な濡れ性パラメータについて、これらの連立方程式を数値的に解くことによって、粒子吸着に要する特徴的時間を求めた。その結果、粒子の吸着性が強いほど吸着は速く進行することがわかった。その際の特徴的な時間はワード・トルダイ方程式の漸近形から導かれるものと一致し、フラムキンの吸着等温式で決まる平衡状態における界面粒子濃度の2乗に比例することがわかった。この結果は、粒子吸着のプロセスが拡散律速で支配されていることを示している。また、長時間の解析により、界面粒子濃度の平衡値からの差と、動的な界面張力は、それぞれ時間の-1/2乗に依存して減少することも見出した。さらに、界面張力と界面粒子濃度を関係付ける状態方程式は、非平衡状態でも一般に成り立つことを数値的に確認した。
経皮的iNOS遺伝子治療による心筋梗塞巣縮小効果の研究

[背景]マウスに対する開胸下でのiNOS遺伝子心筋内注入が、iNOS蛋白を誘導しその活性を上昇させ心筋梗塞巣縮小効果をもたらし、その中ではiNOS蛋白のみでなくCOX-2蛋白も同時に誘導され、この心筋保護効果が二つの蛋白に依存していることが報告されている。[目的]臨床上実践的な方法としてウサギにおいて経カテーテル下によるiNOS遺伝子心筋内注入が同様に心筋梗塞巣縮小効果をもたらすかを検討した。[方法]Needles付きバルーンにより経カテーテル的に心内膜側にE1,E2aおよびE3部分を欠損させたアデノウィルス5をVectorとしたiNOS遺伝子を注入し72時間後に開胸し30分間冠動脈結紮24時間再灌流を行った。[結果]3x10^7pfuのiNOS遺伝子注入により、72時間後にiNOS活性生はLacZ注入後の心筋に比し34倍に増幅され、心筋内NOx濃度は約1.4倍に増幅されていた。しかしiNOS遺伝子心筋内注入ではCOX-2蛋白の合成は促進はなく、30分虚血24時間再灌流による心筋梗塞巣もLacZ注入後と差をみとめなかった。そこでiNOS遺伝子治療処理下のウサギの心筋梗塞作成時にプロスタグランジンE2(PGE2)を静脈内注入したところ心筋梗塞巣は約40%縮小した。iNOSが誘導されていない状態ではプロスタグランジンE2の効果はなく、またこの状態でPGE2とNO供与体を同時投与しても心筋保護効果は観察されなかった。[考察]iNOS遺伝子治療とPGE2全身投与により心筋梗塞巣縮小効果が観察され、NOとPGE2が協調して保護効果を発現していた。PGE2は外部からの投与で十分であったが、心筋内iNOS由来のNOは外因性NOでは代用されず心筋局所での活性化が必要であった。[目的]バルーン付きカテーテルによるウサギ心筋へのアデノウイルス注入法の確立。[方法]ニュージーランド白ウサギを麻酔下にて、ベンチレーターを用いて呼吸管理を行い、頚動脈を露出させ4フレンチの止血弁付きシースでカニュレーションし、透視装置下にて26ゲージ注射針が固定されたバルーン付きカテーテルを左心室内へ挿入、バルーン拡張によって心筋心内膜側に注射針を固定させた状態でLacZ遺伝子アデノウイルスを注入した。一連の操作の後覚醒させ、72時間後に再麻酔下で心筋を取り出し心筋切片標本を作製、X-gal染色を用いて心筋への遺伝子導入の程度を判定した。[結果]single needle付バルーンを用い、150μLのvirus(1.5x10^9 pfu)を心筋に注入したところ、約1015mm^3の心筋が貫壁性のtransfectionが確認された。Triple needles付バルーンを用いて、計450μLのvirus(4.5x10^9 pfu)を一回で心筋に注入したところ、8羽中6羽(75%)において、30mm^3の以上の領域のtransfectionに成功した。残り2羽では20mm^3以下であり心内膜と針との接触不十分が原因であった。[考察]複数のneedles付バルーンを用いた単回心筋内膜遺伝子注入により十分な領域のtransfectionが可能であり、今後の心筋梗塞の梗塞サイズ縮小に対する遺伝子治療への応用が期待できる。[背景]近年われわれは、マウスに対する開胸下でのiNOS遺伝子心筋内注入が、iNOS蛋白を誘導、活性を上昇させ心筋梗塞巣縮小効果をもたらすことを報告した。さらに、本治療はiNOS蛋白のみでなくCOX-2蛋白も同時に誘導し、心筋保護効果がCOX-2に依存していることを確認している。[目的]より臨床上実践的な方法としてウサギにおいて経カテーテル下でのiNOS遺伝子心筋内注入した際に、前研究同様に心筋梗塞巣縮小効果をもたらすかを検討した。[方法]昨年度の研究にて開発したtriple injection needles付きバルーンにより経カテーテル的に心内膜側にiNOS遺伝子注した。少ない炎症反応で十分な遺伝子導入のため、VectorとしてE1,E2aおよびE3部分を欠損させたアデノウィルス5を用いた。[結果]3x10^7pfuのiNOS遺伝子注入により、72時間後にiNOS活性はLacZ注入後の心筋に比し34倍に増幅され、心筋内NOx濃度は約1.4倍に増幅されていた。しかしながら、マウスにてみられたCOX-2蛋白の合成は促進されておらず、LacZ注入後と差を認めなかった。30分虚血24時間再灌流による心筋梗塞巣もLacZ注入後と差をみとめなかった。よって本モデルでは、iNOS遺伝子の経カテーテル注入によるiNOS活性上昇のみでは心筋梗塞巣縮小効果を寄与しない結果となった。[考察]前研究と今回の結果の乖離の原因には、種の違いのほかに、開胸状態での心筋内遺伝子注入と経カテーテル下注入という方法の違いが考えられる。来年度は、COX-2遺伝子またはiNOS+COX-2遺伝子導入にて梗塞巣縮小効果が得られるかを検討する。[目的]

臨床上実践的な方法としてウサギにおいて経カテーテル下によるiNOS遺伝子心筋内注入が同様に心筋梗塞巣縮小効果をもたらすかを検討した。[方法]Needles付きバルーンにより経カテーテル的に心内膜側にE1,E2aおよびE3部分を欠損させたアデノウィルス5をVectorとしたiNOS遺伝子を注入し72時間後に開胸し30分間冠動脈結紮24時間再灌流を行った。[結果]3x10^7pfuのiNOS遺伝子注入により、72時間後にiNOS活性生はLacZ注入後の心筋に比し34倍に増幅され、心筋内NOx濃度は約1.4倍に増幅されていた。しかしiNOS遺伝子心筋内注入ではCOX-2蛋白の合成は促進はなく、30分虚血24時間再灌流による心筋梗塞巣もLacZ注入後と差をみとめなかった。そこでiNOS遺伝子治療処理下のウサギの心筋梗塞作成時にプロスタグランジンE2(PGE2)を静脈内注入したところ心筋梗塞巣は約40%縮小した。iNOSが誘導されていない状態ではプロスタグランジンE2の効果はなく、またこの状態でPGE2とNO供与体を同時投与しても心筋保護効果は観察されなかった。[考察]iNOS遺伝子治療とPGE2全身投与により心筋梗塞巣縮小効果が観察され、NOとPGE2が協調して保護効果を発現していた。PGE2は外部からの投与で十分であったが、心筋内iNOS由来のNOは外因性NOでは代用されず心筋局所での活性化が必要であった。
音の参照・作業記憶過程における聴覚系と海馬系でのニューロン回路の変化

複数ニューロン間の機能的シナプス結合が、異なる2種類の機憶情報処理(参照記憶と作業記憶)に対応してどのように可塑的に変化するかについて、両記憶課題遂行中の複数ニューロン活動(ユニット)の相互相関解析(cross-correlation)を用いて検討した。被験体はアルビノラットであり、同一の刺激と時間変数のもとで、作業記憶課題と参照記憶課題を順次かつ短期間のうちに遂行させる方法をすでに確立してある。両課題遂行中の複数ユニットの同時記録を、海馬領域と聴覚皮質から行い、ユニットの各ペア間の相互相関ヒストグラム(コリログラム)を作成した。解析したユニットペアの総数は、聴覚皮質から23、海馬CA1から79、海馬CA3から40、歯状回から44である。まず、400ミクロン以上離れた電極間では、コリログラムのピーク、つまり機能的シナプス結合は全く見られなかった。200ミクロン以内の電極間や同一電極からのユニットペアでは、作業・参照記憶課題のドちらかでシナプス結合を示す例が、全ての部位で見られた。それらのうちでは、参照記憶ではなく作業記憶においてのみ結合を示す例がより多かった。また、作業・参照機憶課題の違いに関係なく固定的シナプス結合を示す例も見られ、それらは海馬領域に比べ聴覚皮質により多かった。個々のユニットの特異性との対応を調べた結果、作業記憶中にのみシナプス結合を示したユニットペアは、同じ特異性を持っているもの同士がほとんどであった。以上の結果は、記憶の種類に対応した動的な局所的回路(cell assembly)が存在すること、それらは約300ミクロンの範囲内にあること、それらが作業記憶でより機能すること、そこでの回路は同様に特異性を持ったニューロン同士によるpopulation codingを実現していること、新皮質は海馬領域に比べて固定的回路がより多いこと、などを示唆している。
DNAの脂質ナノチューブ電気泳動

本研究ではまず、マイクロマニピュレーターを用いた脂質ナノチューブのマニピュレーションを行った。マニピュレーションしたチューブを電子顕微鏡により観察したところ、マニピュレーションされたチューブが、単離された一本のチューブであることが示された。すなわち、この方法を用いることで、一本の脂質ナノチューブを任意の方向に配置することが可能であり、脂質ナノチューブの応用を考えた場合、非常に重要な技術であるといえる。次に、脂質ナノチューブへのDNAインジェクションを試みた。まず、酢酸ウラン溶液が導入されている様子を電子顕微鏡観察により確認した。さらに、DNAの導入を試み、光学顕微鏡による明視野観察、および蛍光観察による像の様子から、短いDNA鎖の場合には、チューブ内にDNAが挿入されていることが示唆された。そこで今度は、長いDNA鎖を用いて同じ事を試みた結果、DNA挿入が示唆される観察結果は得られなかった。これは、チューブの内径よりもDNA鎖の広がりが十分大きかったことによるものと考えられる。以上のことから、ナノチューブ内へのDNAの挿入が可能であることが確認された。さらに目指したのが、一本のDNA鎖にターゲットを絞り込んだ電気泳動による、長いDNAインジェクションの実現である。具体的には、パッチクランプ法などで用いる、マイクロ電極のマニピュレータシステムを利用する。これにより、テスターによる電流・電圧測定と同様の要領で、ある特定のターゲット(例えば、DNA一本鎖)にのみ、交流を含む外部電場を局所印加することが可能となる。最終年度までに、このシステムの構築と球状コロイドでの有用性実証まで行った。本研究では、一定の内径をもつ脂質ナノチューブ(糖脂質の自発的集積化により生成される、内径が10nm程度の長いシリンダー状集合体)をマトリックスとした、DNAの電気泳動に関する基礎的知見を得ることを目指している初年度である本年度は、脂質ナノチューブやDNAの光学顕微鏡による直接観察、ならびに、ナノチューブを電気泳動用マイクロチップ(マイクロスケールの流路を有するガラス基板)上の微小溝に固定配列を行った。まず最初に、ナノスケルオーダの脂質ナノチューブやDNAを光学顕微鏡上で可視化できるようなシステムの開発を行った。具体的には、電気増幅回路と画像解析ボード(三啓・C5510 ARGUS-20s)を顕微鏡に付置することで、ビデオ強化顕微鏡システムを構築した。これにより、一本の脂質チューブやDNA鎖をモニター上で識別することが可能となった。この観察により、脂質ナノチューブが、mm程度の持続長、および、水溶液中での糖表面同士の選択吸着性を有することが明らかになっている。従って、ミクロンスケールの試料注入口および展開場を用いることで、脂質チューブの配向・凝縮の物理的誘導が可能となるものと期待される。そこでさらに、エッペンドルフ社製のマイクロインジェクターシステムを用いた、脂質ナノチューブの配列固定法の検討を行った。その結果、注射針をXYZの3軸方向に精密制御した上で、500nm程度の針先から空気圧でチューブ溶液を押し出すことが可能なこのシステムを用いて、チューブの濃厚溶液を0.1mm程度の溝を持つ電気泳動チップ内に導入すると、溝に沿って脂質ナノチューブが配向した上で充填されることが確認された。本研究ではマイクロマニピュレーターを用い、脂質ナノチューブのマニピュレーションを行った。次に、このマニピュレーション技術および、フォトリソグラフィーを用いることで、光硬化性樹脂にチューブを埋め込んだ基板作成を試みた。脂質ナノチューブは現像液によって乾燥状態においてもチューブ・ベシクル転移を起こすことがわかった。

そこで、チューブを鋳型に用い、チューブの外径程度のサイズを持ったトンネル構造を作ることを試みた。光学顕微鏡観察、電子顕微鏡観察の結果から、そのような構造の作製が可能であることが示された。さらに、脂質ナノチューブへのインジェクションを試み、酢酸ウラン溶液が導入されている様子が電子顕微鏡観察により確認できた。さらに、DNAの導入を試み、光学顕微鏡による明視野観察、および蛍光観察による像の様子から、短いDNA鎖の場合には、チューブ内にDNAが挿入されていることが示唆された。そこで今度は、長いDNA鎖を用いて同じ事を試みた結果、DNA挿入が示唆される観察結果は得られなかった。これは、チューブの内径よりもDNA鎖の広がりが十分大きかったことによるものと考えられる。以上のことから、ナノチューブ内へのDNAの挿入が可能であることが確認された。本研究ではまず、マイクロマニピュレーターを用いた脂質ナノチューブのマニピュレーションを行った。マニピュレーションしたチューブを電子喪微鏡により観察したところ、マニピュレーションされたチューブが、単離された一本のチューブであることが示された。すなわち、この方法を用いることで、一本の脂質ナノチューブを任意の方向に配置することが可能であり、脂質ナノチューブの応用を考えた場合、非常に重要な技術であるといえる。次に、脂質ナノチューブへのDNAインジェクションを試みた。まず、酢酸ウラン溶液が導入されている様子を電子顕微鏡観察により確認した。さらに目指したのが、一本のDNA鎖にターゲットを絞り込んだ電気泳動による、長いDNAインジェクションの実現である。具体的には、パッチクランプ法などで用いる、マイクロ電極のマニピュレータシステムを利用する。これにより、テスターによる電流・電圧測定と同様の要領で、ある特定のターゲット(例えば、DNA一本鎖)にのみ、交流を含む外部電場を局所印加することが可能となる。本年度は、このシステムの構築と球状コロイドでの有用性実証まで行った。
EEGモニタリングによる脳活動システム変化の検出

1.ニューラルネットワークを用いたシステム変化検出機構の解析いくつかの線形離散時間システム及び非線形離散時間システムが発生する時系列データを学習させた移動平均型ニューラルネットワークが,それらのシステムの広範なパラメータ範囲においてその変化を検出できることを明らかにした。この変化検出には,ニューラルネットワークの結合荷重空間を用いた。この機構を臨床データに適用した場合において,従来手法の周波数スペクトルに基づいた方法と比較し,本方法が優れていることを確認した。2.脳波計測による脳活動システム変化検出機構の開発ある時間間隔の脳波データごとに誤差逆伝搬学習を行った移動平均型ニューラルネットワークの,荷重ベクトルの成す角度を指標として脳活動システムの変化を推定するシステムを開発・改良した。さらにその性能を向上させるため,瞬目などによって混入するアーチファクトを除去することを目的として,独立成分分析を用いる方法及びニューラルネットワークを用いる方法を開発し,その有効性を確認した。3.脳波モニタリングシステムの開発国際10-20システムに基づいた16電極配置から得られるEEG計測による脳機能モニタリングシステムの開発,性能改善,高度化を行った。さらにシステムのソフトウェアの改良を重ね,動作の高速化を実現し,移動平均型ニューラルネットワークによる時系列データの学習,システム変化のリアルタイム推定を行うプログラムを組み込んで,本システムの汎用性を高めた。(1)ニューラルネットワークを用いたシステム変化検出機構の解析(長篠)本研究手法の有効性を一般的に検討する第1段階として,2次線形離散時間システム,非線形離散時間システムの例としての指数的ARモデルとMackey and Glassモデルのパラメータ変化を検出できる条件としてニューラルネットワークの構造(層数,ユニット数等),学習に用いる時系列データの個数,間隔等を明らかにした。(2)脳波計測による脳システム変化検出機構の開発(木内)(1)の解析結果を応用してネットワークの構造等を工夫し,(3)で開発されたシステムを用いて手術中や視覚刺激等を加えた場合のEEG(脳波)を計測し,患者あるいは被験者の脳の状態変化をネットワークの荷重ベクトルの変化によって推定するシステムを構築した。ある時間間隔のデータごとにBPNNの学習を行い,2つのネットワークの荷重ベクトルの成す角度を指標として脳活動システムの変化を推定した。(3)脳波モニタリングシステムの開発(芥川)すでにEEG計測により脳機能の状態をモニタするため汎用機器を用いて構成し,リアルタイムで周波数分析などある程度の情報処理が可能なシステムを開発していた。しかし,上記(2)のようなBPNN学習による推定をリアルタイムで行うためには,さらに性能を向上させなければならない。本研究ではこれを実現するため,より高性能のコンピュータを用いるとともに,システムのソフトウェアにおいても高速化を図った。手術中のEEGモニタリングに広く用いられている国際10-20システムに基づいた16電極配置から得られる電位を入力とし,脳波の経時変化,2次元脳電図(Topography),周波数帯域ごとの電位変化が視覚的に捉えやすい変化率2次元脳電図も実装した。これらは本研究によるシステム変化検出に加えて,従来から行われているモニタリングの手法も利用できるようにすることにより,本システムの汎用性を高めた。(1)ニューラルネットワークを用いたシステム変化検出機構の解析(長篠)平成16年度に本研究手法の基本的な有効性を明らかにしたが,今年度はその適用範囲を検討するため,非線形離散時間システムの例であるMackey and Glassモデルの広範なパラメータ範囲においてその変化を検出できることを確認した。ニューラルネットワークの構造(層数,ユニット数等),学習に用いる時系列データの個数,間隔等を変化させて解析した。(2)脳波計測による脳システム変化検出機構の開発(木内)平成16年度に開発した,ある時間間隔のデータごとにBPNNの学習を行い,2つのネットワークの荷重ベクトルの成す角度を指標として脳活動システムの変化を推定するシステムに,(1)の解析結果を応用してネットワークの構造等を工夫するなどの改良を加え,(3)で開発されたシステムを用いて,更に種々の手術中や視覚刺激等を加えた場合のEEG(脳波)を計測し,患者あるいは被験者の状況に応じて用いる最適な電極の位置あるいはその組合せを検討した。その結果,患者あるいは被験者の脳の状態変化を推定するシステムの有効性を確認した。(3)脳波モニタリングシステムの開発(芥川)

平成16年度までに開発,性能改善を行った国際10-20システムに基づいた16電極配置から得られるEEG計測による脳機能モニタリングシステムの能力を更に高度化して,リアルタイムでの周波数分析などの情報処理が十分実用に耐えるシステムにするため,システムのソフトウェアの改良を重ね,動作の高速化を実現し,本システムの汎用性を更に高めた。1.ニューラルネットワークを用いたシステム変化検出機構の解析(長篠)平成1617年度に時系列データの変化の基本的な有効性及び非線形離散時間システムの例であるMackey and Glassモデルの広範なパラメータ範囲においてその変化を検出できることを明らかにした。本年度はこのシステムを臨床データに適用した場合において,従来手法の周波数スペクトルに基づいた方法と比較し,本システムが優れていることを確認した。2.脳波計測による脳システム変化検出機構の開発(木内)平成1617年度に開発・改良した,ある時間間隔の脳波データごとに誤差逆伝搬学習を行った移動平均型ニューラルネットワークの,荷重ベクトルの成す角度を指標として脳活動システムの変化を推定するシステムの性能を向上させるため,眼球運動,瞬目,筋電図,心電図,体動などによって混入するアーチファクトを除去することを目的として,独立成分分析を用いる方法及びニューラルネットワークを用いる方法を開発し,その有効性を確認した。3.脳波モニタリングシステムの開発(芥川)平成1617年度に,国際10-20システムに基づいた16電極配置から得られるEEG計測による脳機能モニタリングシステムの開発,性能改善,高度化を行ったが,本年度は更にシステムのソフトウェアの改良を重ね,動作の高速化を実現し,移動平均型ニューラルネットワークによる時系列データの学習,システム変化のリアルタイム推定を行うプログラムを組み込んで,本システムの汎用性を更に高めた。
精神医療の信頼を高める治療同意能力評価プログラムの開発

本研究では、患者の治療同意能力と精神症状との関連性を評価し、民法や医事法などの法学的観点からも社会への実装を検討した治療同意能力の包括的評価プログラムを開発することを目指している。本年度は、前年度に遅延していたフィールド調査について、各施設の倫理委員会の承認を得て、調査を開始することが出来た。これまでに20症例以上の参加者を得ており、当初計画の遅延を回復できたものと考える。調査実施体制整備のため、学会などの機会を活用し、共同研究者との打ち合わせを行うとともに、新たな調査協力者を得たことも、調査計画推進に寄与したと考えられる。また、集積してきた先行研究の到達点について実施したReviewが年度内にFront Psychiatry誌に受理されたことも大きな前進であった。このReviewでは、認知機能障害により同意能力を説明できる可能性が高いと考えられている現状を明らかにしているが、次年度に実施する統計学的解析において、新たな知見が得られることを期待したい。なお、当初の計画していた法学専門家を交えた学会シンポジウムについても本年度中に企画を進め、次年度は公開の場において包括的評価プログラム開発を目指し、治療同意能力をめぐる討論を行う予定である。今後も統計学的検出力を確保できるよう調査協力者の確保に努め、最終年度の総括を行いたい。そのために必要な場合、次年度にも調査実施の協力施設や研究協力者を拡充・整備をはかるなど、必要な対応を積極的に行いたい。前年度、調査実施を延期した反省から、フィールド施設に在籍する共同研究者の臨床的負担を考慮した上で、新たに調査協力者を得た。この上で、各施設の倫理委員会の承認を得て、既に20症例以上の参加者を得ている。こうしたフィールド調査推進に向けたエフォートに加え、投稿したReviewの査読にも対応し、論文受理の成果を得た。加えて、当初計画に合った法学専門家を交えたシンポジウム開催についても、企画を進め、次年度の開催予定となっている。以上の状況からみて、前年度の計画遅延分を回復した上で、フィールド調査以外の計画についても進捗が認められ、概ね当初の到達目標を達成しつつある状況と考える。フィールド施設に在籍する共同研究者の臨床的負担には今後とも配慮して、調査を進める予定である。必要な場合、次年度にも調査実施の協力施設や研究協力者を拡充・整備をはかる。また、次年度は最終年度であるため、フィールド調査、シンポジウムなどの場面を通して本計画の総括を行う。本研究では、患者の治療同意能力と精神症状との関連性を評価し、調査時点の入院・外来などの処遇実態を考慮の上、民法や医事法などの法学的観点から社会への実装を検討した治療同意能力の包括的評価プログラムを開発することを目指す。当初は本年度中の調査実施を計画していたが、フィールド施設の状況に合わせ、次年度以降に調査実施を行うこととしたため、計画に若干の遅延を生じている。本年度は、実施体制や調査スケールの整備を行うとともに、集積してきた先行研究の到達点についてReviewを実施し、その成果を投稿中である。また、先行研究について実施したReviewでは、主に認知機能障害と治療同意能力について検討を行い、現時点における到達点として、陽性症状や陰性症状よりも認知機能障害の方がより同意能力を説明できる可能性が高いと考えられていること、しかし、認知ドメインによって同意能力との関連性が異なるか否かについては結論が出ていないことを明らかにし、この成果については現在、論文を国際誌に投稿中である。当初は本年度中の調査実施を計画していたが、フィールド施設に在籍する共同研究者の臨床的負担増を背景に、当初予定していたエフォートをさけず、次年度以降に調査実施を行うこととしたため、計画に若干の遅延を生じている。また、先行研究についてReviewを実施した。主に認知機能障害と治療同意能力について検討を行い、現時点における到達点として、陽性症状や陰性症状よりも認知機能障害の方がより同意能力を説明できる可能性が高いと考えられていること、しかし、認知ドメインによって同意能力との関連性が異なるか否かについては結論が出ていないことを明らかにし、この成果については現在、論文を国際誌に投稿中である。

そのために必要な場合、次年度にも調査実施の協力施設や研究協力者を拡充・整備をはかるなど、必要な対応を積極的に行いたい。前年度、調査実施を延期した反省から、フィールド施設に在籍する共同研究者の臨床的負担を考慮した上で、新たに調査協力者を得た。この上で、各施設の倫理委員会の承認を得て、既に20症例以上の参加者を得ている。こうしたフィールド調査推進に向けたエフォートに加え、投稿したReviewの査読にも対応し、論文受理の成果を得た。加えて、当初計画に合った法学専門家を交えたシンポジウム開催についても、企画を進め、次年度の開催予定となっている。以上の状況からみて、前年度の計画遅延分を回復した上で、フィールド調査以外の計画についても進捗が認められ、概ね当初の到達目標を達成しつつある状況と考える。フィールド施設に在籍する共同研究者の臨床的負担増を背景に、当初予定していたエフォートをさけず、次年度以降に調査実施を行うこととしたため、調査実施の協力施設や研究協力者を拡充することで調査実施体制の整備をはかる。また、最終的な実施体制を含めた細部まで決定された研究計画について倫理委員会での審査を行い、調査にとりかかるようにする。フィールド施設に在籍する共同研究者の臨床的負担には今後とも配慮して、調査を進める予定である。必要な場合、次年度にも調査実施の協力施設や研究協力者を拡充・整備をはかる。また、次年度は最終年度であるため、フィールド調査、シンポジウムなどの場面を通して本計画の総括を行う。フィールド施設に在籍する共同研究者の臨床的負担増を背景に、当初予定していたエフォートをさけず、次年度以降にフィールド調査実施を行うこととしたため、残金が生じた。次年度以降のフィールド調査に係る支出に充てる予定である。当初計画より遅延していた時期があった影響で、残金が生じた。次年度以降のフィールド調査およびシンポジウム等、研究総括の参考資料に係る支出に充てる予定である。
アジア-アフリカ大乾燥地域の動態

本研究は、アジア-アフリカ大乾燥地域の陸面状態に及ぼす気候変動の役割と陸面状態の変化が気候に及ぼす影響を、植生-大気相互作用という視点から、解明することを目的とした。平成9年度は、アジア-アフリカ大乾燥地域のなかの中国北部/モンゴル、中央アジア、サヘルの3地域を対象として、植生-大気境界層間相互作用の実態を、衛星データ・客観解析した上層気象データなどの統計解析により検討した。上記の3地域を比較すると、各地域の季節変化の違うため「陸面状態→大気」の作用も異なってくる。すなわち、中央アジア・中国北部/モンゴルでは夏季に植生の平年からの偏差が現れても冬季には雪に覆われるため、植生の大気への影響は続かない。一方、サヘルでは短い雨季に雨の多寡によって形成された植生の備差は、引き続く長い乾季に減衰しつつも継続する傾向があり、乾季の後半「植生→大気」の作用が強まることが統計解析で示された。サへルのニジェールにおいて、現業観測がない土壌水分を1995年から自記計により観測し、計3年間に渡る毎時の体積含水率データが取得できた。これにより、土壌水分の日変化から季節変化、経年変化までの現象が解析できるようになった。その結果、雨季の雨の多寡で形成された土壌水分の偏差は乾季に減衰してゆきその終わりにはほとんど解消することがわかった。
レプチンシグナルを介する新たなメカニズムを持つインスリン依存性糖尿病治療薬の開発

Protein Tyrosine phosphatase-1B(PTP1B)は、レプチンシグナルを阻害する酵素であり、PTP1B欠損下ではレプチンシグナルが亢進する。本研究の目的は、PTP1Bの欠損もしくは抗PTP1B薬による内因性レプチンシグナルの亢進により、インスリン依存性糖尿病(IDDM)マウスにおいてインスリンシグナルとは独立をして糖代謝を改善する可能性及びメカニズムを明らかにすることである。野生型マウス(WT)およびPTP1B欠損マウス(KO)にストレプトゾシン(STZ)を投与してIDDMを作成後、浸透圧ポンプを用いてレプチン0.25μg/日もしくは20μg/日を皮下へ持続投与した群、レプチン0.25μg/日を脳室内へ持続投与した群それぞれにおいて投与後12日間、各dark cycle終了時の血糖値を測定し群間内で比較検討した。結果、IDDM KOは、レプチン20μg/日の皮下投与群およびレプチン0.25μg/日の脳室内投与群ともにIDDM WTと比較して有意な血糖値の改善を認め、STZ非投与のWTと同等のレベルまで改善した。また、レプチン0.25μg/日の皮下投与はIDDM KOおよびIDDM WTともに血糖値の改善を認めなかった。このことより、レプチン投与において、IDDM KOでは外因性のレプチン作用が増強し、インスリンシグナルとは独立して糖代謝を改善する可能性が示唆された。また、脳室内投与群は、皮下投与では高血糖改善に効果のない少量にて改善効果を得たことより、IDDM KOにおけるレプチンの血糖降下作用は中枢を介している可能性が示唆された。当初の実験計画であるレプチン脳室内投与による血糖降下作用の検討において、脳室内投与群は、皮下投与では高血糖改善に効果のない少量にて改善効果を得たことより、IDDM KOにおけるレプチンの血糖降下作用は中枢を介している可能性が示唆されたことを証明した。このことから当初遂行する予定であった計画は概ね順調に進展していると考えられた。しかしながら中枢での作用機序を判明するために摂食調節ペプタイド特異的にPTP1Bを欠損したマウスを使用して同様の実験を予定しているが、マウスの作成が当初よりは遅れている状況である。今後以下の実験を予定している。IDDMマウスに、抗PTP1B薬を投与して、非投与群との血糖降下作用を比較検討する。次に抗PTP1B薬による血糖降下作用が十分ではない場合は、レプチンを併用して検討する。これらのことから、抗PTP1B薬単独もしくはレプチン併用によりIDDMを治療できる可能性を明らかにしていく。2PTP1B欠損及び抗PTP1B薬による末梢臓器への糖の取り込みの評価PTP1B欠損及び抗PTP1B薬によるIDDMマウスへの血糖値を改善するメカニズムは明らかになっていない。先行研究よりIDDM KOマウスは、GTTにて耐糖能の改善を認めたことより、末梢臓器(褐色脂肪細胞、筋肉など)への糖の取り込みが改善したと考えられる。そこで私たちは、研究で使用したマウスに2DGを腹腔内投与し、速やかに臓器を摘出し測定キットを用いて末梢臓器へ糖の取り込みを比較検討することで、メカニズムを明らかにしていく。

しかしながら中枢での作用機序を判明するために摂食調節ペプタイド特異的にPTP1Bを欠損したマウスを使用して同様の実験を予定しているが、マウスの作成が当初よりは遅れている状況である。今後以下の実験を予定している。IDDMマウスに、抗PTP1B薬を投与して、非投与群との血糖降下作用を比較検討する。次に抗PTP1B薬による血糖降下作用が十分ではない場合は、レプチンを併用して検討する。これらのことから、抗PTP1B薬単独もしくはレプチン併用によりIDDMを治療できる可能性を明らかにしていく。2PTP1B欠損及び抗PTP1B薬による末梢臓器への糖の取り込みの評価PTP1B欠損及び抗PTP1B薬によるIDDMマウスへの血糖値を改善するメカニズムは明らかになっていない。先行研究よりIDDM KOマウスは、GTTにて耐糖能の改善を認めたことより、末梢臓器(褐色脂肪細胞、筋肉など)への糖の取り込みが改善したと考えられる。そこで私たちは、研究で使用したマウスに2DGを腹腔内投与し、速やかに臓器を摘出し測定キットを用いて末梢臓器へ糖の取り込みを比較検討することで、メカニズムを明らかにしていく。
子宮内胎児外科手術における内視鏡画像マッピングシステム

双胎間輸血症候群におけるレーザ治療を目的とし,狭視野の胎児内視鏡画像を三次元超音波画像上にマッピングし広範囲の術野画像を得る,内視鏡画像マッピングシステムを構築した.本システムは実用的なシステムを実現すべく,高価な外部センサを用いず,通常治療で用いられる内視鏡と超音波画像のみを利用している。胎盤模型による精度評価では、血管分岐部等の特徴点間の距離誤差が20フレーム後にRMS誤差1.1mmとなり,高精度なマッピングが可能であった.またサル摘出胎盤による評価では胎盤のおおよそ半分の領域でのマッピングが可能であった.さらにハイパースペクトルカメラを用い狭帯域画像を取得し胎盤上の血管強調を図った.本研究では、双胎間輸血症候群におけるレーザ治療を目的として、狭視野の胎児内視鏡画像を三次元超音波画像上にマッピングし広範囲の術野画像を得る、内視鏡画像マッピングシステムを構築する。本年度は基本的なシステム構築として超音波画像と内視鏡画像のレジストレーション、内視鏡画像の超音波画像上への2次元画像マッピングを行った。超音波画像と内視鏡画像のレジストレーションにおいては、内視鏡に棒状マーカを取り付け、超音波画像のコントラストより内視鏡位置姿勢検出を行った。内視鏡が挿入孔においてピボット運動を行うことを仮定し、平均1.63±0.97 mm, 0.93°±1.3°の誤差にてレジストレーションが可能であった。内視鏡画像の2次元マッピングにおいては、血管の分岐部等の特徴点をコーナー抽出法により検出し、画像の張り合わせを行った。さらに2次元での広範囲内視鏡画像を作成後、3次元超音波モデルへの投影を行った。シミュレーションによる検討では、内視鏡を120°動かした場合、1.08±0.38, 1±0.37, 0.84±0.07 mmの誤差となった。水槽内の胎盤ファントムにおいてマッピング精度を検証した結果、80frameまでの画像張り合わせにおいて、血管の相対位置誤差が2.38±1.88mmであった。また、マッピングにおける計算時間は汎用PCにおいて1.4 frame/sであった。また、実際の胎盤画像は画像が不鮮明であるため、マッピング精度向上を目的とした画像コントラスト向上法についての基礎的検討を行った。今年度は、初年度に行った超音波モデルと内視鏡画像のレジストレーションにおける基礎的検討結果を元に、3次元超音波画像への内視鏡画像マッピングシステムを構築した。本システムは超音波画像による内視鏡初期位置計測、ビジョンベーストラッキング、画像張り合わせ、テクスチャマッピングという4つの構成要素からなる。超音波画像による位置決めにおいては主成分分析法を用いることにより、内視鏡先端部でのアーチファクトによる誤差の影響を軽減するアルゴリズムを提案した。画像張り合わせ技術においては、特に特徴点検出が困難な胎盤画像に対して、特徴点の分布によるエラー検出法を提案することにより安定した特徴点検出を提案した。ビジョンベーストラッキングにおいては、三次元超音波モデル上に対応する内視鏡画像上の特徴点を配置することにより、従来用いられていた外部のトラッキングセンサを用いることなく、内視鏡位置計測を実現した。開発したシステムにおいて胎盤ファントムによる誤差評価を行った結果、血管分岐部等の特徴点間の距離誤差が、20フレーム後にRMS誤差1.1mmとなり、高精度な位置決めが可能であることを確認した。摘出したサル胎盤による定性的な評価を行った結果、広範囲の内視鏡マップが作成可能であった。また、胎児内視鏡による胎盤画像の低い視認性の問題に対し、狭帯域画像を利用した血管強調画像作成法を提案した。具体的にはサルの摘出胎盤に対し、ハイパースペクトルカメラで分光撮影し、血管と胎盤組織のスペクトルを取得後、胎盤と血管のコントラストが高くなる波長帯を選択し画像化した。これにより画像の輝度値の分散がRGB画像より1.86倍高くなる結果を得た。昨年度に引き続き、ビジョンベースドトラッキングの精度向上及びコントラストの向上についての研究を進めた。特に、昨年度提案したハイパースペクトルカメラによる分光画像を用いた血管と胎盤のコントラスト向上についての詳細な検討を行った。具体的には、内視鏡光源による輝度ムラを削除した後、主成分分析法により血管のみを強調する波長を選択し、内視鏡画像を作成する手法を提案した。サル摘出胎盤に対し、空気中で内視鏡より観察する方法と、羊水にみたてた生理食塩水に浸したあと内視鏡により観察する方法にて実験を行った。その結果RGB画像の輝度値の分散より、1.62.5倍向上し血管強調が可能となった。また、胎盤上の血管に自動的に位置決めするロボットシステムの初期検討を行った。4自由度位置決めロボットを胎盤血管に対して位置決めをするシステムの構築を行った。胎盤模型による精度評価では、血管分岐部等の特徴点間の距離誤差が20フレーム後にRMS誤差1.1mmとなり,高精度なマッピングが可能であった.またサル摘出胎盤による評価では胎盤のおおよそ半分の領域でのマッピングが可能であった.

さらにハイパースペクトルカメラを用い狭帯域画像を取得し胎盤上の血管強調を図った.当初の目的であった、高価な3次元位置計測装置を用いない、3次元超音波画像への内視鏡画像マッピングシステムを構築し、精度評価および摘出胎盤での検証を行った。また内視鏡画像のコントラスト向上手法の検討も行い、一定の成果を得た。よって順調に進展していると判断した。医用精密工学最終年度は、これまで構築したシステムを用い術者に対するナビゲーションシステムを作成する。可能であれば動物実験を行い、胎動の検証、システムのロバスト性、精度評価など有用性検証を行う。コントラスト向上を目的とした胎盤分光画像取得については、より定量的な手法を検討し、実用性を評価する。当初の目的であった、内視鏡画像と超音波画像のレジストレーション、超音波画像上への広域画像マッピングを実現し、シミュレーション、ファントムによる精度評価を行っているため、順調に進展していると判断した。画像コントラスト向上のためのカメラ等を購入予定であることと、動物実験のための経費を用意している。内視鏡画像マッピングの精度向上が課題である。次年度においては、より高精度なマッピングを実現するために特徴点抽出法の再検討、画像を基にした内視鏡位置同定の精度向上を行う。さらに初年度基礎的検討を開始した、画像コントラスト向上の検討を進め、定量的な評価を行う。カメラ等の消耗品の購入および動物実験のための諸費用に用いる予定である。画像コントラスト向上のためのカメラやフィルター等を購入予定で有り、そのための消耗品代を用意している。カメラ、フィルター等の消耗品の購入及び動物実験のための諸費用に用いる予定である。
神経ステロイド代謝酵素を標的とする医薬品の開発

3α-および20α-ヒドロキシステロイド脱水素酵素(3αHSDと20αHSD)は、動物脳では神経ステロイドや男性ホルモンの生成・代謝に関与するとされている.ヒトでは、1種の20αHSDと3種の3αHSD(1-3型)が存在し、神経ステロイド代謝における意義は不明であるが、臨床的には神経ステロイドがいくつかの神経疾患に関係すると示唆されている。木研究では、ヒトの両酵素を標的にして神経疾患の医薬品の開発を最終目標として、次の6点について研究を行った。(1)神経ステロイド代謝における両酵素の役割。ヒト脳では20αHSD体は神経ステロイドおよび前駆体のプロゲステロンの不活性化に、3αHSD3型が神経ステロイドの生合成に重要であることを明らかにした。(2)阻害剤と活性化剤の探索。3αHSD1型のみがいくつかの薬剤とチロキシンで活性化された。各酵素の特異的な阻害剤を見出したが、このうち20αHSDを特異的かつ強く阻害するペンズプロマロンとその類縁体は神経機能調節薬や妊娠維持薬の開発のリード化合物となりえることが示唆された。(3)酵素の構造と機能の相関。部位特異的変異法により、20αHSDと3αHSD1型の機能アミノ酸および活性化剤と阻害剤の結合に関与する残基または領域を明らかにした。20αHSDの結晶構造解析は進行中である。(4)遺伝子発現の調節。エタクリン酸が多くの細胞で、3αHSD1型を除く酵素を誘導した。3αHSD1型の肝特異的発現に関係する転写因子を同定した。(5)遺伝的多型性。発現mRNAおよぴ染色体DNA分析により3α:HSD1型の変異遺伝子を同定し、その変異による酵素活性への影響を明らかにした。(6)酵素や遺伝子を導入した培養細胞および動物における候補薬物の評価系の確立・細胞を用いた評価系はできたが、遺伝子の動物への導入では脳機能に影響が出るほどの各酵棄の高発現動物を作製できなかった。動物モデルの作製は今後検討する予定である。(5)遺伝的多型性。ヒトの3α-および20〈-ヒドロキシステロイド脱水素酵素(3αHSDと20αHSD)は、神経ステロイドや5α-ジヒドロテストステロンのの生成・代謝に関与する。本研究では、両酵素を標的とした新規な精神機能調節薬および前立腺疾患治療薬の開発を目標として、1)両酵素の構造と機能の相関研究、2)細胞および遺伝子導入動物における評価系の確立、3)各酵素の特異的阻害または活性化剤、遺伝子発現調節の物質の創製を行う。また、4)遺伝子異常と疾患或いはストレスに対する感受性の個人差との関連を解明するため、両酵素の遺伝的多型性を解析する。本年度に得られた成果を以下に要約する。1.構造と機能の相関研究。部位特異的変異酵素及びアイソザイム間で領域を交換したキメラ酵素の解析により、基質や拮抗阻害剤の結合部位の構成に重要なアミノ酸残基と領域を明らかにした。2.阻害・活性化剤とその結合部位。

3αHSDのI型アイソザイムに特異的な活性化剤として2-アリルプロピオン酸系抗炎症薬と甲状腺ホルモン、また20αHSDに比較的特異的な阻害剤としてベンゾジアゼピン系薬物を認め、速度論的活性化・阻害機構及び結合部位を明らかにした。3.遺伝子発現調節物質の検索。ヒト由来のいくつかの細胞においてエタクリン酸がI型を除く3αHSDアイソザイムおよび20αHSDのmRNA発現を誘導することを認めた。4.遺伝子解析。本来の活性が半減する3αHSDのI型アイソザイムの変異遺伝子を同定した。無作為な検体におけるアリル頻度0.088であった。現段階では、遺伝子発現調節領域を含めてその他の変異遺伝子は認められていない。5.遺伝子導入。アデノウイルスベクターでは成功しなかったが、レトロウイルスベクターを用いて、ラットの3αHSD、ヒトの3αHSDの各アイソザイムおよび20αHSDを導入した細胞を作製した。ヒトの3α-および20α-ヒドロキシステロイド脱水素酵素(3αHSDと20αHSD)は、神経ステロイドや男性ホルモンの生成・代謝に関与する。本研究では、両酵素を標的とした新規な精神機能調節薬および前立腺疾患治療薬の開発を目標として、1)両酵素の構造と機能の相関研究、2)細胞および遺伝子導入動物における評価系の確立、3)各酵素の特異的阻害または活性化剤、遺伝子発現調節物質の創製を行う。また、4)遺伝子異常と疾患或いはストレスに対する感受性の個人差との関連を解明するため、両酵素の遺伝的多型性を解析する。本年度に得られた成果を以下に要約する。1.阻害・活性化剤の設計と合成。20αHSDに特異的かつ非常に強力な阻害剤(阻害定数5 nM)としてベンズブロマロンを見出した。その誘導体を合成し阻害特異性を検討した結果、ベンゾフランの3位に疎水性基があることが阻害度を高めるのに寄与していることが判明した。2.阻害・活性化剤の結合部位。部位特異的変異酵素の速度論的解析により、3αHSD-I型のHis-216が活性化剤の結合に、20αHSDの活性部位の形成に関わるLeu-54とC-末端末端領域の残基がベンズブロマロンの結合に重要であることを認めた。3.遺伝子発現調節物質および遺伝子解析。11年度に見出した以外の新たな発現調節物質および変異遺伝子は見出せなかったが、3αHSD-I型の調節領域を解析した。4.脳内移行性試験。ベンズブロマロンは脳内に移行することが知られている。また、これに勝る強い誘導体が合成できていないので、本試験は実施しなかった。5.遺伝子導入。3αHSDおよび20αHSDを導入した細胞における代謝試験では、20αHSDは3αHSD活性も示し、神経ステロイドの不活性化に最も重要であることが判明した。また、細胞レベルでもベンズブロマロンは100nMで代謝を阻害した。本研究では、両酵素を標的とした新規な精神機能調節薬および前立腺疾患治療薬の開発を目標として、両酵素の構造と機能の相関研究、細胞および遺伝子導入動物における評価系の確立、各酵素の特異的阻害または活性化剤、遺伝子発現調節物質の検索、両酵素の遺伝的多型性を解析した。20αHSDに特異的かつ強力な阻害剤のベンズブロマロンの構造類縁体について検討した結果、フェノールフタレインのフェニル基がブロム化された誘導体も同等な特異性と阻害度を示すことが明らかになった。
細胞イオン代謝異常による心筋機能不全発症機序の研究

筋変性疾患発症の分子機序の研究を行い、その過程において、ストレッチ刺激に反応して、生理的条件下で細胞内へCa^<2+>イオンを流入させる非選択性カチオンチャネルTRPV2/GRCを同定した。このチャネルは、哺乳類で初めて同定されたstretch-activated cation channelであるばかりではなく、心筋症・心不全、筋ジストロフィー症の病態発症に関与するものである可能性が高い(JCB 161:957-967,2003)。すなわち、ジストロフィン複合体遺伝子の異常をもつ筋ジストロフィー又は拡張型心筋症患者および心筋症モデル動物の心筋、骨格筋では、このチャンネルは常に形質膜に高発現し、活性化された状態にあることが示唆された。このチャネル遺伝子を心臓特異的に発現させたTgマウスは著明な心肥大、心筋細胞壊死、繊維化を示す。一方、遺伝性心筋症と筋ジストロフィーを発症するBIO14.6ハムスターの大腿骨格筋にこのチャネルのアンチセンスcDNAまたはドミナントネガティブ変異体を発現させた場合、筋細胞変性の組織病変と筋細胞アポトーシスは有意に抑制された。また、本研究では、心肥大・心不全等の心筋の病態との関連性が指摘されるNa^+/Ca^<2+>交換輸送体(NCX)およびNa^+/H^+交換輸送体(NHE)の構造・機能・病態に関する研究を行った。前者に関しては、今回、NCXが心肥大シグナル伝達のキーとなる分子であるカルシニューリンの新しい標的分子であることが明らかになった(投稿中)。カルシニューリンは、肥大・不全心筋においてNCXに直接結合し、NCXを強く阻害することにより心筋細胞内Ca^<2+>濃度上昇をもたらし、それが心筋細胞変性を引き起こす可能性が高いと結論された。また、NHEに関しては、Ca^<2+>結合タンパク質であるカルシニューリンB様タンパク質(CHP)によるその調節機構を明らかにした。本研究の目的は、心筋症・心不全の発症に最も重要な細胞反応である筋細胞の形質転換とそれに続く細胞変性を引き起こす細胞過程を同定し、病態発症におけるその役割を明らかにすることである。そのため、ジストロフィン複合体成分サルコグリカン異常により遺伝性心筋症および骨格筋ジストロフィーを発症するBIO14.6ハムスターを主として用い、以下の成果を得た。1)心筋症ハムスター培養骨格筋細胞においては、正常細胞と比べて、細胞外からの高い異常なCa^<2+>流入活性を示すこと、2)筋細胞をシリコン膜上に培養しcyclic stretch刺激を加えると、この細胞系は容易に高いクレアチンキナーゼ(CK)活性を外液中に放出し機械的な刺激に対する顕著な脆弱性を示すこと、3)電気生理学的検討から、この細胞系にはCa^<2+>を透過させ且つイオン選択性が比較的低いstretch-activatedcation chanel活性が有意に増大していることが判明した。そこで、4)いくつかの関連イオンチャネルに共通なアミノ酸配列を利用して作成した多重プライマーを用いてPCRクローニングを行い、このカチオンチャネルの候補遺伝子を得た。この候補チャネル蛋白は、心筋症ハムスター心筋および骨格筋、他の心不全モデル動物心筋およびヒト心不全心筋の筋細胞膜に高発現しており、また、これに対するアンチセンスオリゴを導入した心筋症ハムスターの培養筋細胞では、このチャネル蛋白量の減少と共に上述のCa^<2+>流入異常およびCK遊離異常が抑制された。

また、このチャネル蛋白量をCHO細胞に強制発現させたところ、観察されたチャネル活性の諸性質は、阻害薬感受性を含め、心筋症ハムスター培養筋細胞におけるチャネルの性質と著しく類似していた。5)この候補チャネル蛋白質を心筋特異的に発現するトランスジェニックマウスを作成したところ、心臓は拡張型心筋症の病態を呈し、細胞壊死、それに伴う繊維化が観察され、著しい心機能低下が認められた。従って、今回見出されたこのチャネルは、初めてのstretch-activated cation chanelであるばかりではなく、心筋症・心不全、筋ジストロフィーの病態発症に大変重要なものである可能性が高い。筋変性疾患発症の分子機序の研究を行い、その過程において、ストレッチ刺激に反応して、生理的条件下で細胞内へCa^<2+>イオンを流入させる非選択性カチオンチャネルTRPV2/GRCを同定した。このチャネルは、哺乳類で初めて同定されたstretch-activated cation channelであるばかりではなく、心筋症・心不全、筋ジストロフィー症の病態発症に関与するものである可能性が高い(JCB 161:957-967,2003)。すなわち、ジストロフィン複合体遺伝子の異常をもつ筋ジストロフィー又は拡張型心筋症患者および心筋症モデル動物の心筋、骨格筋では、このチャンネルは常に形質膜に高発現し、活性化された状態にあることが示唆された。このチャネル遺伝子を心臓特異的に発現させたTgマウスは著明な心肥大、心筋細胞壊死、繊維化を示す。一方、遺伝性心筋症と筋ジストロフィーを発症するBIO14.6ハムスターの大腿骨格筋にこのチャネルのアンチセンスcDNAまたはドミナントネガティブ変異体を発現させた場合、筋細胞変性の組織病変と筋細胞アポトーシスは有意に抑制された。また、本研究では、心肥大・心不全等の心筋の病態との関連性が指摘されるNa^+/Ca^<2+>交換輸送体(NCX)およびNa^+/H^+交換輸送体(NHE)の構造・機能・病態に関する研究を行った。前者に関しては、今回、NCXが心肥大シグナル伝達のキーとなる分子であるカルシニューリンの新しい標的分子であることが明らかになった(投稿中)。カルシニューリンは、肥大・不全心筋においてNCXに直接結合し、NCXを強く阻害することにより心筋細胞内Ca^<2+>濃度上昇をもたらし、それが心筋細胞変性を引き起こす可能性が高いと結論された。また、NHEに関しては、Ca^<2+>結合タンパク質であるカルシニューリンB様タンパク質(CHP)によるその調節機構を明らかにした。