hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
音声情報利用によるアクセシビリティ向上を目指した情報空間設計

本研究は,視覚障害者や視覚能力の低下した高齢者による情報アクセスを容易にすることを最大の目的としている.現状のWebページ設計は,視覚情報が中心であり,障害者・高齢者の利用を想定しているとは必ずしも言えない.そこで本研究は,音声情報を利用することにより,さらにアクセシビリティの高いWebページの実現を提案することを目的としている.視覚情報に関する先行研究により,Webページ設計時にJust Suggestive(JS)原則を守ることが理解を促進することが提案されていることから、これを拡張することで音声利用の利点や問題点を明らかにすることが可能である.最終的には,障害者・高齢者だけでなく,情報化社会をサポートする技術になることも視野に入れている.本年度は,実用場面におけるアクセシビリティを実験的に検証した.(1)実際に提供されている行政関係のホームページを被験者に呈示し,課題を遂行させることによって,どのような問題により課題遂行が遅れるもしくは課題遂行が行えないかを検討した.その結果,上位の情報が具体的でなかったり,下位情報に関する情報呈示がまったくなからたりすると,利用者が課題の遂行にとまどう傾向があることがわかった.(2)音声情報利用のひとつとして,現在普及している携帯電話をつかった実験を行った.携帯電話に備えられた音声読み上げサービスを使って,実環境における音声の印象と了解度の評価を行った.音声のみをヘッドホン経由で呈示した場合よりも携帯電話から呈示する方が総合的な印象が良い傾向にあった.了解度は聞き取りに問題のないレベルをクリアしたが,予備的な実験では,文の始まり部分で聞き誤りを起こすとその後の処理が行えず,結果的に全体を聞き取れない場合が多くあり,文頭での情報呈示に工夫が必要と考えられ,今後の検討事項とした.階段を昇降しながら携帯電話音声を聞き,その印象と了解度を評価した結果,印象評価では音質や総合的な良さに関する項目で評価が向上した.これは被験者の内的尺度の違いや発話している対象に関する想定のちがいなどの理由が考えられる.これらも今後の検討事項とする必要がある.了解度に関しては大きな差は見られなかった.本研究は,視覚障害者や視覚能力の低下した高齢者による情報アクセスを容易にすることを最大の目的としている.現状のWebぺージ設計は,視覚情報が中心であり,障害者・高齢者の利用を想定しているとは必ずしも言えない.そこで本研究は,音声情報を利用することにより,さらにアクセシビリティの高いWebページの実現を提案する.視覚情報に関する先行研究により,Webぺージ設計時にJust Suggestive(JS)原則を守ることが理解を促進することが提案されていることから,これを拡張することで音声利用の利点や問題点を明らかにすることが可能である.最終的には,障害者・高齢者だけでなく,情報化杜会をサポートする技術になることも視野に入れて,研究を遂行する.具体的な目的は,(1)視覚原則を聴覚原則へ応用した場合の問題点を明らかにする,(2)視覚と聴覚の違いをふまえたアクセシビリティ・ガイドライン(案)を作成する,(3)検証実験を通してアクセシビリティ・ガイドラインの改善を行う,(4)実用場面におけるアクセシビリティの検証を行う,の4点であるが,本年度は(1)の問題点を改善したWebページを試験的に作成し、音声読み上げソフトを用いて,聴覚実験を行った.この読み上げ結果を分析し,視覚特性と聴覚特性の違いを考慮したJS原則や情報空間デザインと情報探索および理解に向けたモデル提案のような観点から検討を行った.引き続き,対象被験者を増やし,実験的な検討を行うことで,視覚と聴覚のちがいをふまえたアクセシビリティ・ガイドラインの改善を行っていく.本研究は,視覚障害者や視覚能力の低下した高齢者による情報アクセスを容易にすることを最大の目的としている.現状のWebページ設計は,視覚情報が中心であり,障害者・高齢者の利用を想定しているとは必ずしも言えない.そこで本研究は,音声情報を利用することにより,さらにアクセシビリティの高いWebページの実現を提案することを目的としている.視覚情報に関する先行研究により,Webページ設計時にJust Suggestive(JS)原則を守ることが理解を促進することが提案されていることから、これを拡張することで音声利用の利点や問題点を明らかにすることが可能である.最終的には,障害者・高齢者だけでなく,情報化社会をサポートする技術になることも視野に入れている.本年度は,実用場面におけるアクセシビリティを実験的に検証した.(1)実際に提供されている行政関係のホームページを被験者に呈示し,課題を遂行させることによって,どのような問題により課題遂行が遅れるもしくは課題遂行が行えないかを検討した.その結果,上位の情報が具体的でなかったり,下位情報に関する情報呈示がまったくなからたりすると,利用者が課題の遂行にとまどう傾向があることがわかった.(2)音声情報利用のひとつとして,現在普及している携帯電話をつかった実験を行った.携帯電話に備えられた音声読み上げサービスを使って,実環境における音声の印象と了解度の評価を行った.音声のみをヘッドホン経由で呈示した場合よりも携帯電話から呈示する方が総合的な印象が良い傾向にあった.了解度は聞き取りに問題のないレベルをクリアしたが,予備的な実験では,文の始まり部分で聞き誤りを起こすとその後の処理が行えず,結果的に全体を聞き取れない場合が多くあり,文頭での情報呈示に工夫が必要と考えられ,今後の検討事項とした.階段を昇降しながら携帯電話音声を聞き,その印象と了解度を評価した結果,印象評価では音質や総合的な良さに関する項目で評価が向上した.

これは被験者の内的尺度の違いや発話している対象に関する想定のちがいなどの理由が考えられる.これらも今後の検討事項とする必要がある.了解度に関しては大きな差は見られなかった.
小口径血管移植時の閉塞機序と其の対策に関する研究-遠隔成績向上を目的として-

小口径血管手術後の長期開存率は極めて不良であり,本研究では臨床応用可能な小口径人工血管の作製と,閉塞原因としての仮性内膜肥厚などの出現機転の解明を目的として実験的臨床的に検討した.試作した人工血管は優れた抗血栓性を示す2-methacryl-oxyethyl phosphoryl-choline(MPC)ポリマーとsegmented polyurethane(SPU)の混合溶液を直径2mmのDacr on人工血管に吸着させて作製し,長径2cmのMPC人工血管を,micr osur ger yによって家兎頚動脈に移植した.対象としてSPUのみを吸着させた人工血管を作製して,同様に移植した.コントール人工血管の内腔は移植90分で既に赤色血栓が形成され,全例3日以内に閉塞した.一方,MPC人工血管では,移植5日後の内腔面には血栓形成は認められず,移植1週後には内腔全体は薄いフィブリン様の膜で被われ,移植2ヶ月後には新生内膜の形成が認められ,直径2mmと極小口径であるにもかかわらず,移植後早期の開存率は良好であった.本人工血管は,仮性内膜のanchoringを改善することにより,臨床応用への可能性が示唆された.一方,閉塞原因としての仮性内膜肥厚は動脈壁に対する損傷の治癒過程であり,抗PDGF作用を有する薬剤の投与で抑制されたこと,異なるePTFE人工血管で内膜肥厚度に相違が見られるなど,薬剤投与とグラフト構造の改良により,遠隔成績の向上が示唆された.臨床例では晩期閉塞例の検討から,新たな閉塞機序として仮性内膜剥離が問題となる点が示唆された.本研究の課題は世界的にも活発な研究が進められており,今後,更に検討を要するものと考えられる.小口径血管手術後の長期開存率は極めて不良であり,本研究では臨床応用可能な小口径人工血管の作製と,閉塞原因としての仮性内膜肥厚などの出現機転の解明を目的として実験的臨床的に検討した.試作した人工血管は優れた抗血栓性を示す2-methacryl-oxyethyl phosphoryl-choline(MPC)ポリマーとsegmented polyurethane(SPU)の混合溶液を直径2mmのDacr on人工血管に吸着させて作製し,長径2cmのMPC人工血管を,micr osur ger yによって家兎頚動脈に移植した.対象としてSPUのみを吸着させた人工血管を作製して,同様に移植した.コントール人工血管の内腔は移植90分で既に赤色血栓が形成され,全例3日以内に閉塞した.一方,MPC人工血管では,移植5日後の内腔面には血栓形成は認められず,移植1週後には内腔全体は薄いフィブリン様の膜で被われ,移植2ヶ月後には新生内膜の形成が認められ,直径2mmと極小口径であるにもかかわらず,移植後早期の開存率は良好であった.本人工血管は,仮性内膜のanchoringを改善することにより,臨床応用への可能性が示唆された.一方,閉塞原因としての仮性内膜肥厚は動脈壁に対する損傷の治癒過程であり,抗PDGF作用を有する薬剤の投与で抑制されたこと,異なるePTFE人工血管で内膜肥厚度に相違が見られるなど,薬剤投与とグラフト構造の改良により,遠隔成績の向上が示唆された.臨床例では晩期閉塞例の検討から,新たな閉塞機序として仮性内膜剥離が問題となる点が示唆された.本研究の課題は世界的にも活発な研究が進められており,今後,更に検討を要するものと考えられる.平成5年度ではまず小口径人工血管移植時の閉塞モデル作成を企図した。家兎(New Zealand White Rabbit雄)を用い、移植操作2週間前に血管内皮細胞を剥離損傷することにより晩期閉塞の病態の主座と考えられている筋性内膜肥厚をあらかじめ宿主側血管に作成し、その後、内径3mm、長さ1.5cm、線維長30μのテクノ型ePTFEグラフトを移植し、コントロール群(剥離損傷操作非施行)との間で吻合部内膜肥厚形態の相違について比較検討した。結果は我々の予想に反し対照群の吻合部に有意な肥厚は認められなかった。むしろ吻合部では内皮剥離損傷操作のみの影響によると思われる宿主側遠位部に比べ肥厚程度は軽度の傾向にあり、ePTFEグラフト上への平滑筋細胞群の伸展も殆ど認められず、吻合部に近づくにつれ徐々に薄くなった宿主血管上の筋性肥厚内膜が吻合部を境に途絶したような形態を示した。一方コントロール群では当然操作の加わらない遠位部では殆ど内膜肥厚は呈さず、一部に吻合部に局在した些少の反応性内膜肥厚を認めたが、この部をHHF35(抗平滑筋アクチンモノクローナル抗体)染色で観察すると肥厚部内膜の細胞は非染色体で平滑筋細胞成分の増殖によるとの判断を積極的に示唆する所見は認められなかった。これらの結果に対し以下の考察を加えた。すなわち、損傷操作2週後の吻合ではすでに血管内腔は再内皮化されている可能性があり、その状態で吻合操作による内皮損傷が些少であると仮定すると再生内皮が諸々のchemical factor(平滑筋細胞遊送増殖促進因子)の内皮下への透過のbarrierとなり内膜での平滑筋細胞の遊走を促し得ず、またたとえ平滑筋細胞が遊走したとしても上記因子の持続的影響の少ない元では剥離損傷操作2週後の平滑筋細胞の活性レベルはほぼPlateauで、増殖分化度はむしろ低下傾向にある可能性もある。

そこで我々は再内皮化する前の移植群(損傷操作施行直後に移植を行う群)を加え現在検討中である。平成5年度実験結果をもとに、小口径人工血管移植時の閉塞モデルを作成した。家兎(New Zealand White Rabbit)総頸動脈に内径3mm,長さ1.5cm,繊維長30μmのePTFEグラフトを移植し、以下の4群に分け比較検討した。I群;血管内皮細胞を剥離損傷直後に人工血管を移植、II群;内皮細胞剥離後2週間の高コレステロール食負荷後に人工血管を移植、III群;コントロール群・内膜剥離操作非施行群,(以上の3群はテクノ型ePTFEを使用)、IV群;Gore-Tex型ePTFE移植・内膜剥離非施行群。結果はIIII群間には明らかな差異を認められず、IV群で内膜肥厚が高度に認められた。この肥厚した仮性内膜はHHF-35染色陽性で、平滑筋細胞由来であることが示唆された。異種グラフトによる内膜肥厚の相違は興味が持たれ、現在、繊維長の異なるePTFEグラフト、抗血栓物質(Heparin,MPCなど)吸着グラフトによる同様の実験を試行している。臨床的検討では、吻合部閉塞を来した人工血管と宿主血管を再手術時摘出し、筋型アクチン,Mφ,増殖細胞関連抗原(Ki67),エラスチンなどの免疫染色を行った。吻合部血栓を生じた部位は肥厚した仮性内膜を認める例のみならず、仮性内膜内で平滑筋細胞が途絶した部位に血栓形成が認められる例が認められた。即ち、強いレオロジー因子の影響する吻合部で仮性内膜の剥離が重要な因子であることが示唆され、小口径人工血管の遠隔開存向上のための内皮化促進の方向性を追求する際に留意する必要があると考えられた。本研究最終年度である平成7年度は、これまでの人工血管閉塞機序や新生内膜増殖抑制に関する実験成果をもとに、新たな小口径人工血管を作製して実験的に検討し、臨床応用への可能性を追求した。人工血管は優れた抗血栓性を示す2-methacryl-oxyethyl phosphoryl-choline(MPC)ポリマーとsegmented polyurethane(SPU)の混合溶液を直径2mmのDacron人工血管に吸着させて作製した。長径2cmのMPC人工血管を、micr osur geryによって家兎頚動脈に移植し、移植後最長7ヶ月まで経時的に摘出して、開存の有無と内腔面を肉眼的・走査顕微鏡的に観察し、更に摘出標本を病理組織学的に検討した。対象としてSPUのみを吸着させた人工血管を作製して、同様に移植した。コントール人工血管の内腔は移植90分で既に赤色血栓が形成され、全例3日以内に閉塞した。一方、MPC人工血管では、移植5日後の内腔面には血栓形成は認められず、移植1週間後には内腔全体は薄いフィブリン様の膜で被われ、移植2ヶ月後には新生内膜の形成が認められ、移植後早期の開存率は良好であった。しかし、移植後6ヶ月では、新生内膜の人工血管へのanchoringが不十分と考えられる晩期閉塞例も認められた。これまで報告された小口径人工血管は早期閉塞が高率に認められており、本実験で使用した人工血管の直径は2mmと極小口径であるにもかかわらず早期血栓性閉塞が極めて少ない成績は、強い抗血栓性を有するMPCポリマー人工血管の有用性を示すもので、anchoringの改善により臨床応用への可能性が示唆された。
日中戦争期における香港文学者と日本・中国文学者の関係図

本研究では、日中戦争期とその前後の時期、つまり1930年代から1940年代、日本、中国、香港の文学者がどのように交流し、創作を行ったか、特に香港での交流を中心に、資料を収集し、整理を行った。研究の対象を詩人や詩の創作に絞り、日本の文学者では詩人の草野心平を軸に研究と考察を行った。またこの時期に上海から香港に移り住み、創作活動を行った「現代派」の詩人・戴望舒について、作品の手法・技法という面での影響だけでなく、文学者としての精神や彼の行動、存在が後の香港の文学者にとって重要な意味を持ったことを確認した。香港における詩の創作のその後の展開については研究を継続し、まとめていきたいが、日中戦争期の香港における文学者の交流、状況を明らかにすることで、「文学空間」としての香港の意味がより詳細に見えてきたと考えている。本年度は、研究の基礎となるデータの収集を行った。海外での調査としては、2007年8月に香港での調査を行い、香港大学図書館で、同大学の香港コレクション所蔵の新聞、雑誌、書籍などの資料の閲覧、複写をした。また2007年3月には、上海(上海図書館等)、北京(北京図書館等)で今後の資料調査のための予備調査を行った。そのほか、香港大学図書館、香港中文大学図書館、香港嶺南大学図書館等がWEB上で提供しているデータベースを検索し、関連資料について調査した。日中戦争が大陸ではげしくなっていくころに大陸から香港に移動した作家たちが、香港でどのような作品を執筆、発表したか、またどのような活動をしたか、作家どうしがどのようなつながりを持っていたか、という点について調査した。まだ調査途中であり、次年度も継続して調査を予定しているが、すでに得られたデータについては、エクセルなどで入力し、整理を進めている。国内での調査は、草野心平記念館(いわき市)など関係の図書館、資料館で資料を閲覧したほか、関連の書籍を収集、購入した。人物に関する年表などを作成するために内容整理や、作品、回想録などを分析している。また、先行研究、関連の論文に学ぶとともに、本研究に関係のある文学者を研究している研究者に指導、示唆を受けた。本年度は香港、中国の作家、それも比較的メジャーな作家の調査が中心になったので、次年度は、もう少し対象を広げて調査を続けることを考えている。また日本の文学者の調査も進めて、両方の調査によって得られたデータを重ね合わせていき、考察を深めたい。本年度は、初年度に引き続き、データの収集とその整理、分析を中心に、研究を進めた。海外での調査としては、2008年1月に香港での調査を行い、香港大学図書館で、同大学の香港コレクション所蔵の新聞、雑誌、書籍などの資料の閲覧、複写を行い、前年度の調査データを補うとともに、新たな資料の発掘に努めた。そのほかに、やはり前年度に引き続き、香港大学図書館、香港中文大学図書館、香港嶺南大学図書館等がWEB上で提供しているデータベースを利用したり、書籍の購入等を行った。これらの調査で、上海から香港に移ってきた作家・詩人と香港在住の作家たちの日中戦争中およびその後の活動についてまとまった知見を得ることができ、考察を進めていくための基礎資料が準備できた。収集したデータについては、論文の執筆のために分析、考察を行うとともに、目録およびデータベースとして公開していくための整理作業を進めた。国内での調査は、2008年2月に、日本現代詩歌文学館で調査を行うなど、主に日本の詩人の戦争中の作品、動向について調査し、関連の書籍を収集、購入した。また、先行研究、関連の論文に学ぶとともに、本研究に関係のある研究会に出席し、参加者より指導・示唆を受けた。昨年度の基礎的な調査と研究をもとに、本年度は対象を広げて、あまりメジャーでない作家・詩人や文献の調査と研究を行ったが、それにより日本・中国・香港の、特に詩人たちに、考察の対象をしぼりこむことができた。研究全体の方向としては、日中戦争前後の香港がどのような「文学空間」として機能し、それがどのようにその後の香港文学の展開につながっていったかという視点から考察を行ってきた。来年度は総括となる研究成果にまとめたい。本年度は、研究をまとめるため、データの収集と整理、その分析、考察を行った。2008年4月に香港で調査を行い、香港大学図書館で同大学香港コレクション所蔵の新聞、雑誌、書籍等を調査、閲覧した。その後は、香港中文大学図書館、香港嶺南大学図書館等がWEB上で提供しているデータベースや資料を利用したほか、書籍の購入などを行った。

調査結果は、資料目録と年表の形で整理し、公開のための準備を行っている。日中戦争期およびその前後の時期、中国と日本の文学者がどのように香港を訪れ、滞在し、活動・交流したか俯瞰でき、「文学空間」としての香港の位置を明らかにしていく上で重要な資料となると考えている。研究は、特に中国の詩人と日本の詩人の交流、中国の文学者が香港で行った、詩を中心とした創作活動というテーマについて考察を進め、2008年12月、お茶の水女子大学中国文学会で、検討中の課題も含めて発表を行った。そこで受けたアドバイスや示唆をもとに、さらに関連の文献や先行研究等を利用して研究を継続している。本課題の研究を通じ、香港文学史における詩のジャンルの重要性とその意義について、より関心が強まった。香港の詩人として中心的な存在である文学者・也斯について、小説作品のほか詩や詩論に関する研究にも取り組み、日中戦争期の文学者の交流がどのような形で吸収されて香港文学が展開していったのかという視点で、引き続き、研究していきたい。
糖尿病性合併症を有する患者のQOLに関する研究-糖尿病性腎症保存療法期にある患者の自己管理に焦点を当てて-

1.半構成質問紙よる聞き取り調査:糖尿病性腎症(以下腎症と略す)保存療法期の患者5名に対し,腎症の認識および自己管理の取り組み状況について聞き取り調査をした結果(1)ネフローゼ状態で浮腫といった自覚症状があり,腎症を認識している患者でも,それが自己管理の動機とはなっていない。(2)将来への不安として,腎症の悪化よりも他の合併症の悪化や再発をあげていた。(3)主体的に自己管理に取り組み,自ら問題解決を図るというよりは「医師にお任せ」と考えている患者が2名いた。また他の患者にもその傾向が見受けられた。(4)現段階でQOLの低下を訴える患者はいなかったが,身体的にも社会的・心理的にも将来はQOLが著しく低下することが予測された。2.アンケート調査:聞き取り調査の結果に基づき,セルフモニタリング機能に焦点を当て,アンケート調査を実施し,対象患者22名中14名より回答を得た結果(1)多くの患者は診察時の血糖値やHbA_<1c>の値と生活を関連づけて考えることができており,SMBGも6割の患者が実施し,自己管理に活用していた。(2)腎症の認識については,医師から腎症だと説明されている患者を対象にしたにも関わらず,半数の患者が自分は腎症ではないと回答していた。(3)蛋白質制限食を実践している患者は2名のみで,糖尿病食からの切り替えの難しさを示していた。以上の結果より,腎症は自分の問題として認識しにくいこと,また認識していても自己管理の動機とはなりにくいことから,将来への見通しを含めて患者が腎症だと理解できるように援助する必要性が示唆された。今後はさらに腎症患者の自己管理の特徴とその要因について明らかにするとともに,今回は対象者が少なく十分な検討ができなかった蛋白質制限食の継続のための援助を開発する必要がある。今年度は半構成質問紙を作成し面接により聞き取り調査を行う計画であったが,より研究目的にそくした質問項目を設定するために,1.文献概観および2.一事例を対象に面接と参加観察により食事療法の実施状況や実施に関わる要因などのデータ収集を行った。1.文献概観からは,以下の様な知見を得た。(1)糖尿病性腎症患者の看護については,透析を受ける患者を中心に研究が進められており,保存療法期に着目した報告はほとんどみられない。(2)糖尿病性腎症の患者に対しては、腎症であることを知らせていく取り組みが必要であるが,腎症であることを認識しても自己管理に変化をもたらすとは限らない。(3)糖尿病性腎症患者は自己概念が低下し,自己管理に前向きに取り組めないでいる患者が多い。(4)蛋白質制限食は腎症の進展を遅らせるために有効であるが,実践は困難であるため栄養士や医療者などの専門家の支援が必要である。2.入院中の患者を対象に面接および参加観察により食事療法の実施状況や実施に関わる要因などのデータ収集を行った。その結果(1)食事療法の必要性はわかっているが,継続の自信がもてない。また自営業のため仕事上の付き合いによる飲酒の機会が増えてしまうので食事療法が実行できない状況にある。(2)透析導入の説明に対しては,ショックは感じているものの,実際に透析の現場を見学する機会がなかったために現実感が乏しい。(3)腎症以外にも神経障害,狭心症,脳梗塞といった合併症を程度の差はあるものの有しており,医師・看護婦から繰り返し自己管理の必要性を説明され,医療者との関係は悪化し自己防衛も強い。(4)上記(1)(3)より患者は身体的・心理的・社会的制約を受け著しくQOLを障害されていると思われた。従って,患者のできる自己管理を患者とともに見出し実行することで患者に自信がつき,それがQOLの改善の一助になるのではないかと考えられた。

以上の結果より,腎症は自分の問題として認識しにくいこと,また認識していても自己管理の動機とはなりにくいことから,将来への見通しを含めて患者が腎症だと理解できるように援助する必要性が示唆された。今後はさらに腎症患者の自己管理の特徴とその要因について明らかにするとともに,今回は対象者が少なく十分な検討ができなかった蛋白質制限食の継続のための援助を開発する必要がある。
エネルギー応答を指標とする角膜内皮障害の創薬標的と早期診断基盤技術の開発

培養ヒト角膜内皮細胞亜集団がエネルギ代謝を異にすること、幹細胞様増殖性亜集団が解糖系代謝に偏諱し、細胞相転移(CST)細胞でPyruvate→Lactate経路が高進する。成熟分化細胞ではミトコンドリア依存性のOXPHOSが主たるエネルギ代謝経路となることが判明した。培養ヒト角膜内皮細胞の分化度は主としてCD44の発現強度と逆相関し、成熟分化段階ではCD44発現は陰性化し未分化細胞では強陽性である。ピルビン酸も乳酸も成熟分化細胞の比率に負相関し、未分化CST細胞の構成比に正相関する。アミノ酸代謝においても亜集団間に階層性が認められた。成熟分化細胞ではSer, BCAAの消費が高い。報告者らは、ヒト角膜内皮細胞(HCEC)培養において敷石状配列の分化成熟細胞形態を保持した成熟分化細胞への長期培養を撹乱させる一因が、培養HCECが形質を異にする細胞亜集団で構成されていることにあることを見出している。本年度の研究により、内皮間葉系移行を介するc-Myc陽性未分化幹細胞様増殖性細胞経路への相転移〔相転移1、脱分化〕とSA-β-Gal陽性老化細胞〔相転移2〕への経路が分岐すると推定される結果を得た。主たる判断根拠は相転移2細胞亜集団と成熟分化細胞亜集団は、Rock阻害剤により可塑的に形質を返還することが判明したことである。ミトコンドリア呼吸vs解糖系というエネルギー産生経路の違いが分化成熟細胞〔エフェクター細胞〕と相転移細胞1と2の間に認められることが、メタボローム解析により判明した。相転移細胞1,2ではグルタチオンの生合成系が顕著に低下し、酸化ストレスの亢進が想定された。解糖系上流産物が高値を示し、糖取り込み及び解糖系代謝が亢進していることが判明した。グルコース(Glu)、グルタミン(Gln)代謝経路を活用しての細胞亜集団の選別は、Glu飢餓では相転移2細胞が除去できることが判明したが、Gln飢餓には効果は全く認められなかった。今後は、免疫染色法を駆使してc-Myc・P53・CD44・酸化ストレスの機能発現の差の視点から相転移の分子動態を解明するとともに、分泌産物についてのメタボローム解析も実施する。角膜内皮障害の病態について、細胞内代謝の側面から斬新な臨床評価科学視点を提供する。本27年度の継続主題「幹細胞様増殖性細胞亜集団において発現するCD44のグルコース(Glu)代謝経路優位のエネルギー産生と本亜集団のStemness様細胞増殖機能の対応付け」についてはほぼ終了。CD44がc-Mycにより誘導されmiR34aの幹細胞様増殖性細胞亜集団導入で発現抑制すること、SASP因子産生が抑制されることも確認した。逆に、CD44陰性細胞にmiR導入で成熟分化細胞に相転移の生じることも判明した。CD44陽性、陰性亜集団の含有割合の異なる培養細胞集団を検索し、解糖系最終産物の乳酸の産生が抑制され、ミトコンドリア呼吸系産物が増えることについても、CD44の発現との対応が確認された。別主題の「Glu、グルタミン(Gln)代謝経路の人為的調節により培養ヒト角膜内皮細胞において成熟分化細胞のみを選別する方法の確立」についても、終了した。Gluを欠乏した培地において、特定亜集団が選択的に除去されることは確認されたが、CD44陽性の4亜集団の一部の除去にとどまること、成熟分化細胞にも相転移細胞の一部にもグルコーストランスポーターGlut1は高発現することが確認された。Gln欠損では亜集団除去効果はないことも判明した。CD44が角膜内皮の成熟分化過程に重要な機能を果たすこと、その機能がRhoA回路の活性化によるアクチン脱重合を介する細胞骨格の変化によるものであるとの発見は世界初のもので、ヒトの角膜内皮機能不全の病態解明や、より実践的な培養法の開発手段に重要な知見を提供するものである。平成28年度予定の主題、1成熟分化内皮細胞亜集団の相転移の抑制方法の創出(2フックス角膜内皮ジストロフィー患者由来検体にて上記知見を検証し、診断への応用可能性を探る。3前房水・血液成分により相転移経路に係る可溶性因子測定についても予想以上に進展した。1CD44のGlu代謝経路優位のエネルギー産生とCD44陽性細胞亜集団の幹細胞様細胞増殖機能の対応付けは世界で初めての知見である。米国でのARVO meeting2016でも大きな注目を集めた。ミトコンドリア呼吸経路が抑制され、解糖系が亢進されていることを確認できたこと、その制御にエピジェネティック因子としてmiR34が係ること、逆に、相転移細胞では、解糖系のエネルギー代謝経路が主経路となること、其処に関与するmiR分子種を同定できたことは大きい。2エネルギー代謝系を異にする成熟分化細胞と相転移細胞亜集団が産生する老化関連サイトカインプロファイルにおいて、PAI-1/Serpin1, IL-6, IL-8, MCP-1などが異なることも判明し、これらにもmiR-CD44経路によるエネルギー代謝経路が係ることが示された意義は大きい。328年度に予定していた、フックス角膜内皮ジストロフィー(FECD)患者由来の検体において、Guttata陽性進行病態患者では培養における相転移細胞同様にmiR34aの発現が低下することは、本病態進行に上記1の知見が関与することを示す重要な知見である。

同様に、28年度に予定していたがFECD患者を含む角膜内皮移植患者において、前房水中に相転移細胞の培養上清で確認された老化関連サイトカインの著明な更新が3ー6割の患者において認められるという知見を約80例の患者データより入手した。EndoEMT→Stemness経路→成熟分化、もしくは、細胞老化→Guttata形成の病態経路を示唆する重要な知見である。28年度中に本研究課題を追加申請する方向を考えたい。4当初予定の亜集団の混在する培養系において、細胞内還元型グルタチオン量の分布を比較するという課題は着手できないままであるが研究の予期しない進展の結果である。培養ヒト角膜内皮細胞は階層的に細胞相転移(CST)状態を変化させることが判明した。その分化度は主としてCD44の発現強度と逆相関した。CD44発現は成熟分化段階では陰性化し、増殖性未分化細胞では強陽性である。ピルビン酸も乳酸も成熟分化細胞の構成比率に負相関し、未分化CST細胞の構成比率に正相関することが明確となった。CST細胞で高産生される乳酸が老化関連分泌経路(SASP)産物のIL-8産生を増強する可能性が推定されるに至ったが、分化細胞比率と正相関傾向のあるPDGF-bbについては、産生細胞の階層性は未だ不明確である。成熟分化細胞以外のCD44medium発現の前駆細胞様の細胞からも産生されることが判明した。培養ヒト角膜内皮細胞の代謝産物に係るメタボローム解析を、細胞内産物並びに細胞培養上清について実施することで、階層性のある培養細胞亜集団間の主たる代謝関連特性を明らかにすることができた。内皮細胞の環境適応を標的に、斯かる視点で研究を展開している例は国際的にも皆無である。今後、角膜内皮機能不全の細胞分子病態、就中、細胞分化における環境適応戦略としての代謝リプログラミングの階層性の研究の深化が不可欠である。代謝リモデリングを誘導する分子機構も代謝リモデリングの結果、どの様な細胞機能が制御されるかは、当該分野を超えて、癌研究の世界ですら端緒に就いたところである。アミノ酸組成の変化、抗酸化応答や分化を誘導する化合物などを含む培養微小環境、SASP、代謝産物、Cargoとしてのパラクリン作用の明らかになりつつある細胞外小胞体粒子(EVs)などの働きを、世界で初めて明らかにした培養ヒト角膜内皮細胞亜集団についてかなり明確に示し得た。培養ヒト角膜内皮細胞亜集団がエネルギ代謝を異にすること、幹細胞様増殖性亜集団が解糖系代謝に偏諱し、細胞相転移(CST)細胞でPyruvate→Lactate経路が高進する。成熟分化細胞ではミトコンドリア依存性のOXPHOSが主たるエネルギ代謝経路となることが判明した。培養ヒト角膜内皮細胞の分化度は主としてCD44の発現強度と逆相関し、成熟分化段階ではCD44発現は陰性化し未分化細胞では強陽性である。ピルビン酸も乳酸も成熟分化細胞の比率に負相関し、未分化CST細胞の構成比に正相関する。アミノ酸代謝においても亜集団間に階層性が認められた。成熟分化細胞ではSer, BCAAの消費が高い。1酸化ストレス→GluやGln代謝経路→同化作用の促進(Mitsuishi Y, Cancer Cell, 2012)経路との係りの解明について、分子レベルでの解析には到達しなかったが、細胞の播種密度を下げることで、細胞空間が拡大すること対応して細胞老化指標
電磁回転（EMS）システムによる粘性測定標準法構築への挑戦

磁気浮上によりグラファイト円板を気体中に保持し、気体の粘性測定を行うシステムを開発した。このシステムにより気体の種類が粘性測定によって同定できることが確認された.さらに高精度測定を目指すため、浮上のための磁石による磁場の空間的な不均一が、回転するプローブに対して制動をかける効果について実験により検証した。さらに高真空状態にすることで見かけの粘性を小さくして測定を行った。この測定により到達した粘性の大きさはおよそ純水の1/100,000であり、原理的にはこの制度で粘性測定が可能であることを実証した。本研究の目的は、申請者らが独自に開発し現在では様々な工業分野での粘性計測に用いられているEMS(電磁回転式)粘性測定システムを高性能化し、標準物質を必要としない粘性の絶対値の計測手法を構築すること、さらにその精度を向上させて世界の粘度計測の標準とするための要素技術を開発することにある。初年度においては現有の磁気浮上型EMS粘度測定システムを用いて、粘性の絶対値測定の原理検証を行った。具体的には、現在開発中の真空槽内磁気浮上EMSシステムを用いて、粘性の絶対値測定の誤差要因となるプローブ回転時のエネルギー散逸機構を検討した。現在の毛細管式粘度計を超えるスペックを実現するためには、例えば純水の粘性を測定する場合の相対精度として1/1000を達成する必要がある。システムの高性能化により標準状態にある気体の粘性を0.1%の精度で計測することが可能となり、かつ全く同一の構成で液体の粘性までそのダイナミックレンジを拡張することに成功した。現在、ばらつき等による相対的な誤差は10 nPa・s以下であり、当初の目的を達成した。また他の要因による粘性の絶対値測定への誤差要因を実験的に検証するために、試料槽内の気体を排気して理想的なゼロ粘性の環境を実現した。ゼロ粘性極限に近い環境を実現して絶対値の校正を行うためには、回転プローブの巨視的サイズと分子の平均自由行程が同程度となる低圧環境を生成する必要があるが、真空チャンバー中での実験によりこれを実証することができた。本研究の目的は、申請者らが独自に開発し現在では様々な工業分野で粘性計測に用いられているEMS(電磁回転式)粘度測定システムを高精度化し、標準物質を必要としない粘性の絶対値の計測手法を構築すること、さらにその精度を向上させて世界の粘度計測の標準とするための要素技術を開発することにある。本年度においては現有の磁気浮上型粘度測定システムに加え、回転子の回転軸と試料容器の底部が接触する新しい機構を開発した。磁気浮上型に比べ接触部の機械摩擦は増加するものの、装置構成が極めて簡便になり多くのユーザーに容易に供給できる構成となった。実際に純水の粘度測定においてその精度を確認したところ、EMS粘度計としてすでに市場に供給されている先行機に対して10倍以上の精度が確認できた。さらにレオロジー測定において問題となる粘性のずり速度依存性を簡便な機構で測定するための手法として、平行平面円板により構成された粘度プローブのずり速度と見かけの回転トルクから、真の流動曲線を演算により逆計算で求める手法を開発した。この手法によれば、これまで高い工作精度が要求されていた円錐型の回転子に替えて、きわめて加工が容易な平板型の回転子で従来のレオロジー計測と等価の情報を得ることができる。さらにこれら技術を組み込んだ高性能試作機を完成させ、これまで計測が困難であったバイオ関連材料、特にヒト血液粘性のずり速度依存性の測定実験を開始した。粘性測定の標準化を目指す上で、粘性のずり速度依存性の取り扱いは必須に開発するべき技術であるが、円板型プローブで得られた測定値から微分演算により解析的に真の流動曲線を開発することができ、工作精度の問題、あるいは製造コストの問題の解決に向けて大きな進展を図ることができた。本年度は昨年開発した自立型回転しプローブをさらに高精度化し、粘度標準として純水の粘性測定精度を向上させる試みを行った。本手法では試料を密閉環境に置いたまま粘性測定を行うことができるため、温度や湿度などの環境制御が非常に容易である。粘性の測定精度を向上させるため、試料の温度を0.1度以上の精度で制御するコントローラーを作製した。温度を変化させながら計測した結果、低粘性物質の代表である純水の粘性を0.1%以上の精度で安定して、かつ再現性良く測定できる能力を確認した。さらに試料をさらに低粘性の液体に拡張し、その精度の確認を行っている。またこの装置の応用分野を開拓するために、ヒト血液を模した高濃度のコロイド分散液の粘性のずり速度依存性を高精度で計測した。この試料の作製には我々が独自に開発したインクジェットマイクロ分散体加工プロセスを用いている。コロイドの体積分率10%40%の領域で得られた結果はこれまでに測定されているヒト血液の流動特性をほぼ再現しており、この結果から血管内の血液流動を数値シミュレーションで予測するための基本的な情報を得ることができた。

当初の目的であった粘度標準としての達成目標であった0.1%精度をすでに実現し、標準の構成のみならずこれを工業プロセスへと展開する試みも開始している。本研究の目的は、申請者らが独自に開発し現在では様々な工業分野で粘性計測に用いられているEMS(電磁回転式)粘度測定システムを高精度化し、標準物質を必要としない粘性の絶対値の計測手法を構築すること、さらにその精度を向上させて世界の粘度計測の標準とするための要素技術を開発することにある。本年度は磁気浮上型回転子プローブを作製し、粘度標準として気体の粘性測定を試みた。回転子として導電性を有しかつ反磁性を示すグラファイトの円板を用いることにより、円形磁石の組み合わせによってこれを空中に磁気浮上させることができる。このグラファイト円板に、さらに回転磁場を与えると電磁駆動の原理により空中で回転を駆動することができる。この方式は機械摩擦が完全に排除され周囲の媒質の粘性のみを検出することが可能な究極の微小粘性測定システムとなる。実験では空気、アルゴン、窒素、水素などの純気体について粘性測定を行い、それらが文献値と非常に良い精度で一致することを確認した。さらに印加トルクと回転数の関係を詳細に調べて結果、磁場の回転方向の微小な具均一性が回転子の制動に寄与することが明らかとなった。この効果を計算によって定量的に評価し、気体の粘性測定においてその精度を向上させることに成功した。また気体の導入および排出口を有することにより容易に内部の気体を置換することができるセルを作製し、迅速な気体粘性の測定を可能にするシステムを構築した。これに加えて昨年度までに作製した液体試料用の自立型回転子に改良を加え、純水の測定において1%以上という高い粘性測定精度を実現した。磁気浮上によりグラファイト円板を気体中に保持し、気体の粘性測定を行うシステムを開発した。このシステムにより気体の種類が粘性測定によって同定できることが確認された.さらに高精度測定を目指すため、浮上のための磁石による磁場の空間的な不均一が、回転するプローブに対して制動をかける効果について実験により検証した。さらに高真空状態にすることで見かけの粘性を小さくして測定を行った。この測定により到達した粘性の大きさはおよそ純水の1/100,000であり、原理的にはこの制度で粘性測定が可能であることを実証した。当初、研究計画に記載した事項については本年度の研究により達成することができた。均一な磁場を生成するヘルツホルムコイルについても所要の性能については評価できたが、定常回転による粘性測定という従来法に加え、振動回転による粘性測定という新たな着想を得た。このいずれが粘性の標準測定法として有利かを実験的に検証することは今後の成果にとって重要な要因となるため、これを計画に加えて検証することとした。これまで同様に真空環境における低圧気体の粘性測定、あるいは気体種による粘性の気圧依存性の測定については従前の計画通りに遂行する。さらに今後粘性測定の標準化が最も期待される低粘性液体領域、すなわちヒト血液粘度の領域について特に高精度化をはかるために、今年度開発した軸接触型についても、その適用範囲の拡大を目指す。高濃度マイクロゲル分散体のレオロジー計測の成果を活かし、さらにこれを実際の生体材料の粘弾性計測へと応用する試みを進める。ナノレオロジー工学真空環境における低圧力気体の粘性測定、あるいは気体種による粘性の気圧依存性の測定しについて従前の計画通りに遂行する。
西太平洋域における対流圏窒素酸化物・オゾンの輸送と光化学収支の解明

本研究では昨年度に引き続き、2001年春に行われたNASA航空機観測キャンペーンTRACE-Pで研究員自身が測定を行った窒素酸化物の組成データや、他の研究グループから提供される大気成分データを用いることで、窒素酸化物の収支について解析を行った。その結果、西太平洋域の大気境界層(高度0-2km)及び下部自由対流圏(高度2-6km)で観測された総窒素酸化物(NO_y)は個々に測定された気相の窒素酸化物成分の総和と比べて系統的に10-20%高く、考えうる気相成分以外の成分がNO_y測定へ寄与していることが示唆された。そこで、同時測定された微小モードの硝酸エアロゾルと、この差を詳細に比較した。その結果、NO_y測定器が微小モードの硝酸エアロゾルを検出していたことが明らかになり、そのほとんどが硝酸アンモニウムの形態で存在していたと推定された。NO_y測定器による硝酸エアロゾルの直接測定は過去の航空機観測では報告されておらず、本研究による報告が初めてである。これらの結果は硝酸の大気中における寿命、さらには対流圏オゾンやエアロゾルの収支を考える上で非常に重要である。さらに他の物質との相関解析や後方流跡線解析から、東南アジアでのバイオマス燃焼と中国での化石燃料の燃焼が、微小モード硝酸エアロゾルの主要なソースであることが明らかになつた。微小モード硝酸エアロゾルのNO_yへの寄与は高度0-4kmで最も大きく、10-20%を占めたことが明らかになった。また、航空機搭載型の二酸化窒素(NO_2)測定器の高精度化のための室内予備案験を行った。具体的には、測定時の干渉成分除去や冷却等によるNO_2光解離システムの安定化を行った。その結果、測定の不確定性を18%以下、検出下限を6pptv(体積混合比1兆分の6)までに抑えることに成功し、航空機観測におけるNO_2のより高精度での測定が実現可能になった。本研究では、2001年春のNASA航空機観測キャンペーンTRACE-Pで研究員自身が測定を行った窒素酸化物の組成データや他の研究グループから提供される大気成分データ、及び気象・人工衛星データを用いて解析を行い、春季の西太平洋域における窒素酸化物等の物質組成分布と光化学変換過程、観測時の気象条件との対応を詳細に調べた。その結果、温帯低気圧に伴う温暖コンベアーベルトが東アジアの陸域境界層から自由対流圏への気塊の上方輸送過程として重要である、ということが明らかになった。航空機観測点において同定された温暖コンベアーベルトにおいて硝酸ペルオキシアセチル(PAN)が窒素酸化物の支配的な成分であることが明らかになった。これはバイオマス燃焼、都市大気といった排出源の近傍で生成されたPANが自由対流圏へ輸送されてきたと考えられ、窒素酸化物の貯留成分としてのPAN輸送の重要性を示す結果である。一方、他の総窒素酸化物のうち硝酸の占める割合は相対的に低く、その大部分は温暖コンベアーベルトに伴う降水により除去されていることがわかった。観測値とアジア大陸における排出量比の推計値との比較より、温暖コンベアーベルトによって排出源領域から自由対流圏まで輸送された総窒素酸化物の割合(輸送効率)を定量化したところ、10-20%と見積もられた。これらの結果は大陸間規模の物質輸送に伴う、全球規模の対流圏オゾンの光化学収支を考える上で極めて重要であり、成果は国際学術雑誌Journal of Geophysical Researchに投稿、査読後校正済みである。また、航空機搭載型の二酸化窒素(NO2)測定器の高精度化のための室内予備実験(測定時の干渉成分除去やNO2光解離システムの安定化)を行った。その結果、測定の不確定性を20%以下、検出下限を7pptv(体積混合比1兆分の7)までに抑えることに成功した。

具体的には、測定時の干渉成分除去や冷却等によるNO_2光解離システムの安定化を行った。その結果、測定の不確定性を18%以下、検出下限を6pptv(体積混合比1兆分の6)までに抑えることに成功し、航空機観測におけるNO_2のより高精度での測定が実現可能になった。
rRNA遺伝子上での包括的なDNA-タンパク相互作用情報の抽出基盤の構築

代表者は自ら開発してきたePICh法(配列特異的クロマチンプロテオミクス法)を用い、リボソームRNA遺伝子上での包括的なDNA-タンパク相互作用情報の抽出基盤を構築するために、ターミネーターとエンハンサーに対するePICh法(配列特異的クロマチンプロテオミクス法)ためのプローブを合成した。留学先で合成していた人工核酸LNAに代わり、異なる2つの人工核酸(ENAと2'-FluoroRNAオリゴ核酸)を東京工業大学清尾先生の協力の元、自ら合成した。それぞれの人工核酸が標的DNA配列をプルダウンし濃縮できるかを試験管内で調べたところ、ENAはLNAと同じように効率よく標的DNAを濃縮できたが、2'-Fluoro RNAはプルダウン効率が1/10程度であった。現在、両方の人工核酸とクロマチン抽出液を混ぜてエンハンサーとターミネーターのクロマチンの精製を試みている。プロジェクトの遅延に備えてバックアッププランとして用意した、プロモーター領域に結合しているクロマチン構成因子の中から、転写に関わる新規因子に着眼し、それらの機能解析(CIRH1AとTHUMPD1)を遂行した。CIRH1Aはプロモーター配列に対するePICh法を用いることで、転写阻害剤であるアクチノマイシンDを処理し、転写を阻害した時にのみ、プロモーターに結合する新規因子として同定した。アクチノマイシンD処理後rDNA領域を安定に維持することに関与している。また、これまでプロモーター配列に結合する因子として同定したものの中で、siRNAを用いたスクリーニングによる網羅的にノックダウンすることで、転写活性に必要な新規因子としてTHUMPD1を見出した。内在性のTHUMPD1遺伝子のC末端にゲノム編集を用いGFPタグを挿入し、その局在を調べたところ、核全体に分布し、かつ核小体内により有意に蓄積していた。28年度が最終年度であるため、記入しない。代表者は自ら開発してきたePICh法(配列特異的クロマチンプロテオミクス法)を用い、リボソームRNA(rRNA)遺伝子上での転写の各過程が起こっている現場にいる多数のタンパク群を網羅的に同定し、転写サイクルの一面を理解することを試みている。平成27年度において、リボソームRNA(rRNA)遺伝子上での包括的なDNA-タンパク相互作用情報の抽出基盤の構築にむけて、以下の3つ結果を得た。(i)留学先で代表者が自ら開発したプロモーター領域に結合しているタンパク群の精製法が現所属先でも再現できることを確認した。rRNA遺伝子上での包括的なDNA-タンパク相互作用情報の抽出基盤を構築するための大前提であり、必要なパイプラインが揃ったことを意味している。(ii)これまで受託に頼ってきた質量分析計によるタンパク同定の過程を、所属する研究機関に設置されてある質量分析計により、自前でタンパク同定できるようになった。このプロセスはクロマチン精製のデータの最終的なアウトプットの部分なので、結果を解釈するために、重要である。自ら行う事で、質量情報からタンパク情報に変換する際の計算過程の理解を深めることで、コンタミタンパクを除き、潜在的に機能性タンパクを選び出すことができる。(iii)今後得られるDNA-タンパク相互作用情報から、転写サイクルの鍵となりうる因子を選びするための実験系を作成した。具体的には、プロモーター領域に結合しているタンパクをコードする各遺伝子に対してsiRNAを作成し、ノックダウンした後、核小体内のエチニルウリジンの取り込みを定量した。その結果、新生rRNAの転写量が減少する2つの新規因子が選び出すことができた。rRNA遺伝子上での包括的なDNA-タンパク相互作用情報の抽出基盤を構築するためには、3つのステップに分けられる。1人工核酸プローブの合成、2精製系の確立、3精製した溶出液の中から質量分析計によるタンパクの同定の3つのステップに分けられる。23に関しては、一定の進歩があったが、1については、エンハンサー、コーディング、ターミネーターは異なる塩基配列をコードしているため、各制御配列に対する人工核酸LNAオリゴプローブが必要であった。平成27年度に予定していたプロジェクトの根幹に関わる部分の一つであるが、目的の人工核酸が国外産であるため、円安や物価の高騰により、現状の予算内では、入手困難となっていて進まなかった。

CIRH1Aはプロモーター配列に対するePICh法を用いることで、転写阻害剤であるアクチノマイシンDを処理し、転写を阻害した時にのみ、プロモーターに結合する新規因子として同定した。アクチノマイシンD処理後rDNA領域を安定に維持することに関与している。また、これまでプロモーター配列に結合する因子として同定したものの中で、siRNAを用いたスクリーニングによる網羅的にノックダウンすることで、転写活性に必要な新規因子としてTHUMPD1を見出した。内在性のTHUMPD1遺伝子のC末端にゲノム編集を用いGFPタグを挿入し、その局在を調べたところ、核全体に分布し、かつ核小体内により有意に蓄積していた。円相場や物価の動向を見ながら、必要な人工核酸(LNA)と国内生産である別の人工核酸(ENA)の各アミダイドを購入する。人工核酸合成の専門家である東京工業大学清尾博士の協力を取り付けたので、そちらに赴き、専門家のサポートの下、自ら合成する。また、プロジェクトが遅れているのでバックアッププランとして、すでにプロモーター領域に結合している因子として同定されており、かつsiRNAスクリーニングによって選びだされた2つの新規因子を解析し、転写のどのステップに寄与しているかを明らかにする。28年度が最終年度であるため、記入しない。
膜蛋白のプロテオーム解析による神経膠芽腫浸潤関連分子の同定と機能解析

1,神経膠芽腫細胞初代培養細胞と神経膠芽腫細胞株から高浸潤細胞と低浸潤細胞の分離抽出神経膠芽腫10例の手術材料から初代培養細胞を確立した。当教室で確立されているin vitro細胞遊走assayを用いて、上記の初代培養細胞と世界的に広く使用されている7種類の神経膠芽腫細胞株(U87, U251, T98G, SNB19, U118, SF 767, G112)からそれぞれ高遊走細胞と非遊走細胞を収集した。2,細胞膜蛋白の分離とプロテオミクス解析による浸潤細胞特異的膜蛋白の同定過去の報告(Nunomura K, et al, Mol Cell Proteomics 2005)に倣い、細胞膜蛋白の抽出を行う。すなわち、上記で回収した細胞の細胞膜を細胞膜不透過性型ピチオンでラベリングし、細胞を溶解、アビジンカラムを用いて細胞膜のみ分離抽出した。得られた細胞膜蛋白はmassfingerprintingとMALDI(Matrix-assisted laser desorption/ionization,マトリックス支援レーザ脱離イオン化)-TOF(Time-of-flight/飛行時間型)analysisにより網羅的なアミノ酸解析から蛋白プロファイルを作成した。高遊走細胞と非遊走細胞で発現に差がある膜蛋白の同定中であり、浸潤細胞で機能している候補膜蛋白を特定中である。神経膠芽腫初代培養細胞と神経膠芽腫細胞株で共通し、新規性の高い10個の候補分子を優先分子とした。また、非遊走細胞と比較し、高遊走細胞で高い発現を示す膜蛋白と低い発現を示す膜蛋白を同定した。当教室で確立されているin vitro細胞遊走assayを用いて、上記の初代培養細胞と世界的に広く使用されている7種類の神経膠芽腫細胞株(U87,U251,T98G, SNB19,Ull8,SF 767,G112)からそれぞれ高遊走細胞と非遊走細胞を収集した。2,細胞膜蛋白の分離とプロテオミクス解析による浸潤細胞特異的膜蛋白の同定過去の報告(Nunomura K, et al. Mol Cell Proteomics 2005)に倣い、細胞膜蛋白の抽出を行う。得られた細胞膜蛋白はmassfingerprintingとMALDI(Matrix-assisted laser desorption/ionization,マトリックス束援レーザ脱離イオン化)-TOF(Time-of-flight/飛行時間型)analysisにより網羅的なアミノ酸解析から蛋白プロファイルを作成した。高遊走細胞と非遊走細胞で発現}と差がある膜蛋白の同定中であり、浸潤細胞で機能している候補膜蛋白を特定中である。また、非遊走細胞と比較し、高遊走細胞で高い発現を示す膜蛋白と低い発現を示す膜蛋白を同定し、過去の論文報告と詳細に検討し、以後の実験への優先分子を決定中である。当教室で確立されているin vitro細胞遊走assayを用いて,上記の初代培養細胞と世界的に広く使用されている7種類の神経膠芽腫細胞株(U87,U251、T98G,SNB19,U118、SF767,G112)からそれぞれ高遊走細胞と非遊走細胞を収集した。2.細胞膜蛋白の分離とプロテオミクス解析による浸潤細胞特異的膜蛋白の同定過去の報告(Nunomura K, et. al.,Mol Cell Proteomics 2005)に倣い,細胞膜蛋白の抽出を行う。すなわち,上記で回収した細胞の細胞膜を細胞膜不透過性型ピチオンでラベリングし,細胞を溶解,アビジンカラムを用いて細胞膜のみ分離抽出した。高遊走細胞と非遊走細胞で発現に差がある膜蛋白の同定中し,浸潤細胞で機能している候補膜蛋白を特定した。神経膠芽腫初代培養細胞と神経膠芽腫細胞株で共通し,新規性の高い10個の候補分子を優先分子とした。また,非遊走細胞と比較し,高遊走細胞で高い発現を示す膜蛋白と低い発現を示す膜蛋白を同定し,過去の論文報告と詳細に検討し,以後の実験への優先分子を決定中である。当教室で確立されているin vitro細胞