hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
鎖骨頭蓋異形成症患者のCBFA1遺伝子変異のバリエーションに関する研究

また鎖骨頭蓋異形成症患者では一般的に歯の異常を伴い、乳歯の晩期残存や永久歯の萌出遅延、(過剰)埋伏歯なとを多く認めるが、今回の研究では、検体数が限られていたためCBFA1遺伝子の変異部位と乳歯の晩期残存、永久歯の萌出遅延、(過剰)埋伏歯といった歯の異常と明確な関連を見いだすことは出来なかった。これらの結果より(1)鎖骨頭蓋異形成症はCBFA1の変異により発祥することが追試できた。(2)CBFA1はその下流域にオステオカルシン以外にもいくつかのDNA結合領域をもつ可能性があることが示唆された。(3)CBFA1は骨形成以外にも歯牙形成や口唇・口蓋形成に関与する可能性があることが示唆された。鎖骨頭蓋異形成症患者7名よりの全血サンプルの提供を依頼し、そのうち1名分のサンプルについてのDNAシークエンシングを終了した。尚シークエンシングにあたっては、本人および肉親らの同意を得、プライバシーの保護に万全を期した。このサンプルではゲノムDNAを抽出しPCR法によりエクソン17の増幅をおこないABI377オートシークエンサーのよるDNAシークエンシングを行った。その結果をGENETYX MAC 8.0によりGene Bankに登録されたCBFA1とホモロジー検索した結果以下のことが証明された。1)エクソン3においてシトシン(C)からチミン(T)へのCBFA1ヘテロ置換を認めた。2)この置換によりCAA(グリシン)がTAA(ストップコドン)へと変異していた。3)これらはラントドメインの3'末域にストップコドンを形成した。この症例は臨床所見で大泉門の開存、左右鎖骨の完全欠損、乳歯の晩期残存、永久歯の萌出遅延を認めた。さらに口唇裂を認める特異な症例であった。1997年にCBFA1のへテロ変異により同疾患が引き起こされると報告されているが今回の結果はこれを肯定していた。しかしながらこれまで報告のある鎖骨頭蓋異形成症のCBFA1の変異の変異とは異なっており、歯形成異常とCBFA1の変異内容との関係ばかりでなく、口唇裂との関連はCBFA1の未知の機能を予想させる。今後他のサンプルの解析を進め臨床像とCBFA1遺伝子変異のバリエーションを精査する予定である。
デキストラン誘導体-磁性酸化鉄超微粒子複合体の生体応用に関する研究

人工血漿をはじめ医薬品に用いいられている水溶性多糖であるデキストラン及びその誘導体と、鉄フェライトであるマグネタイトFe_3O_4(=FeO・Fe_2O_3)超微粒子とからなる複合体(以下DMと略記)を合成し、生体応用に供することを意図して研究を行った。(1)分子量の異なるアルカリ処理デキストラン(ATD)及び置換度の異なるカルボキシメチルデキストラン(CMD)とマグネタイト超微粒子(コアサイズ3.510nm)が直接結合したDMの合成とその分画により、生物化学的に極めて安定で、かつ毒性が少ない生体適合性磁性流体を作製した。(2)ATDM及びCMDMの立体配座、デキストラン分子とコアとの結合数及び結合状態、疑似体液中での電化状態(ATDMは正、CMDMは負)が明らかとなった。ATDMのデキストラン分子の解離定数(20°C)は、10^<-6>オーダと小さく、コアと化学的に強く結合していることがわかった。(3)磁性酸化鉄(FeO・Fe_2O_3)コアにデキストラン官能基が結合することにより、大きな内部磁場をもつFe^<3+>成分が増え、その表面がよりバルク的な特質となることが、メスバウアー効果の測定より明らかとなった。(4)静脈内投与(ラット)したDMの血液からの代謝及び各種臓器(肝臓;脾臓;肺、胸腺、腎臓、心臓、十二指腸、大脳)への取り込みと代謝過程を調べた。(a)パルスNMRによるT1及びT2緩和時間の測定より、血液中のDMの濃度の代謝時間変化は、脾臓及び肝臓でのDM細胞内への著しい取り込みと関係して指数関数的に減少し、ATDMがCMDMより早いことがわかった。(b)電顕観察により、DMは主に脾臓及び肝臓に取り込まれ(前者ではマクロファージ、後者ではクッパー細胞)、それらのライソソーム中に存在すること、そして投与12週間後にはほとんど代謝消失される(一部はα-Fe_2O_3として残存していた。)DM投与後のMRI像(T1及びT2強調画像)より、DMの造影効果が明らかとなった。(6)DMの磁気及び構造の温度変化(室温←→830°C)を、空気中及びヘリウム雰囲気中で調べ、ATDとCMDの熱分解によって生ずる炭化還元層の形成状態の違いによって、コアFe_3O_4の構造変化(α-Fe_2O_3,γ-Fe_2O_3,α及びγFe,Fe_3O)と磁気特性が著しく異なることがわかった。デキストランン(ATD)及びカルボキシメチルデキストラン(CMD)と塩化第一及び第二鉄との直接反応による磁性流体(ATDM及びCMDM)の合成法の確立と、分画による磁性酸化鉄コア(410nm)の粒系分布とDM複合体のconformation(立体配座)を調べた。

粒径のそろったDMコアと結合する分子1本の占有面積は、分子量が増すと増加し、同一分子量ではCMDの方がATDよりその傾向が大きく、立体障害が結合に影響することが明らかとなった(分子量2万のATD及びCMDを用いたDMでは、それぞれ6.33及び5.52nm_2)。メスバウアー効果の測定により、デキストラン分子と磁性酸化鉄超微粒子は直接結合していること、及び官能基とコア磁性酸化鉄との結合によって、大きな内部磁場を持つ成分(3価鉄原子)が増加すること見出した。ATDM及びCMDMの希釈溶液のT_1及びT_2緩和時間と、濃度及びコア粒径との関係を求めた。次に4種類のDMをラットに静注し、1時間後の34種類の臓器への取り込みをパルスNMRによるT_1及びT_2緩和時間の測定により調べた。特に、肝臓,脾臓,心臓,脳,肺など12種類の臓器については、定量的評価を行った。ATDMは肝臓及び脾臓に選択的に取り込まれることが明確となり、両臓器のMRI造影効果の著しいことが明らかとなった。また、CMDMはATDMと異なり血液中にかなり残留し、その生体内挙動について検討が進められている。摘出臓器について、光顕(鉄染色)及び電顕(切片)による観察を行い、組織または細胞内での存在状態の解明を行った。光顕観察では、鉄成分(Fe^<3+>)が肝臓組織全体に点存し、脾臓においては中心付近に局在していることがわかった。電顕観察では、DMが肝臓,脾臓ともに食細胞のライソゾームに取り込まれ、凝集していることが観察と分析の結果から確認された。本研究によるDMは、各種塩類・酸・アルカリに対して極めて安定で、温度に対しても充分な保存安定性のあることを確認した。分子量の異なるアルカリ処理デキストラン(ATD)及びカルボキシルメチルデキストラン(CMD)と、磁性酸化鉄超微粒子(コアサイズ3.810nm)からなる磁性流体DM(ATDM及びCMDM)について以下の研究成果を得たので報告する。(1)コア(芯)粒子分布の狭い(粒径の揃った)粒子の分画精製法を確立した。(2)動的光散乱法により求めたATDM及びCMDMの溶液中での平均的な全体径の結果は、ATDM(90nm)>CMDM(65nm)であり、in vitroにおける化学的性質及びin vivoでの生物化学的安定性をもとに、DM複合体のConformation(立体配座)を提示できた。(3)DMの磁気特性の温度変化(常温850°C)から、冷却過程の高温域では、空気及びアルゴン雰囲気ともに、酸化鉄の還元によりα-Feが生成される。即ち、ATDMでは820°Cで炭素(C)を固溶したγ-Feからα-Feが、CMDMでは723°Cで共晶反応によりα-FeとFe_3Cが生成されることが明らかになった。(4)水溶液等数種の溶媒中での、DMにおけるATDとCMDの解離定数が求められ、10^<-7>10^<-8>オーダと小さく、かつATD>CMDであり、両者の分子ともにコア酸化鉄と強く結合している。(5)パルスNMRによるT_1及びT_2緩和能力は、ATDM及びCMDMともコアサイズの大きいものほど大きくなる。又T_1、T_2緩和能力の温度変化(80°C)は、温度の上昇とともに直線的に減少し、DMコアの磁気特性よりもDMをとりまく水分子(自由水)の運動の温度変化と深く関係している。(6)DMのラットへの投与後1時間2週間にわたる各種臓器(肝臓、脾臓、腎臓、血液等)への取り込みと代謝の経過を、ATDM、CMDM及びそれぞれのコアサイズによって区分し、T_1及びT_2測定により追跡調査した。ATDMは、細胞内皮系臓器(特に肝臓及び脾臓)への取り込みが速く、代謝も速やかに行われる。一方CMDMは、1日近く血液中に滞留し、ゆっくりと代謝される(コア粒子径が小さい程長くなる傾向が認められた)。
細菌感染症におけるIL-17/IL-22産生制御機構の解明

本研究では細菌感染時におけるIL-17/IL-22産生制御機構を明らかにすべく、Th17細胞産生性サイトカインのレポーターマウスを用いて、細菌感染時におけるTh17細胞やIL-17/IL-22産生性自然免疫系リンパ球の時空間的挙動について解析した。またIL-17産生細胞およびIL-22産生細胞を用いたトランスクリプトーム解析を通じて遺伝子発現プロファイルを作成し、Th17細胞やIL-17/IL-22産生性自然細胞におけるIL-22遺伝子の発現制御に関わる因子の探索を試みた。Th17細胞は自己免疫疾患や感染防御に対して重要な役割を担っており、またIL-17/IL-22産生性自然免疫系細胞は初期の細菌感染防御に働くことが明らかになりつつある。近年Th17細胞研究の進展によりIL-17産生機構に関しては解析が進んだものの、IL-22産生制御機構に関しては不明な点が多い。そこで本研究ではサイトカインレポーターマウスを使用し、感染時におけるIL-17/IL-22産生細胞の制御機構および機能について研究を行った。Il17-GFPマウスを用いて黄色ブドウ球菌S. aureus感染モデルを確立し、マウス皮膚組織中のIL-22およびIL-17産生細胞の特性と時空間的動態を調べた。フローサイトメーターおよび免疫組織学手法により、細菌感染に応じて発生するIL-17産生細胞の多くはCCR6陽性RORγt陽性のαβT及びγδT細胞であることが判った。各種IL-22産生細胞とIL-17産生細胞を分離精製し、遺伝子発現解析及びin vitroにおける機能解析を通じて、各細胞種におけるIL-17/IL-22産生制御に関わる分子機構の解析を行った。また、マウスIl22遺伝子プロモーターを用いたレポーターベクターを用いて、RORγt等の既知のTh17細胞特異的転写因子がIl22遺伝子転写活性に与える影響を検討した。in vitroにて分化培養したIL-22Low Th17細胞とIL-22High Th17細胞からRNA及びタンパク質を精製し、トランスクリプトーム解析・プロテオーム解析を実施し、さらにデータベース解析によりIl22遺伝子座で進化的に保存された転写因子結合配列を調べ、Il22遺伝子制御に関与する候補遺伝子を選定した。今後レポーターアッセイおよび遺伝子欠損マウスの解析を計画しており、IL-17/IL-22産生制御に関わる上記候補因子の生理的意義を実証することを目指す。新規ヘルパーT細胞サブセット「Th17細胞」は関節リウマチ等の自己免疫疾患や感染防御に対して重要な役割を担っており、またIL-17/IL-22産生性自然免疫系細胞は初期の細菌感染防御に働くことが最近明らかになりつつある。これらの細胞はIL-17とIL-22を産生する点を特徴とするが、IL-17産生機構に関しては解析が進んでいるものの、IL-22産生制御機構に関しては不明な点が多い。そこで本研究では、IL-17とIL-22産生を個別に可視化できるマウスを作製し、感染炎症時におけるIL-17/IL-22産生細胞の制御機構および生理学的機能を解析する。・Il22-RFP, Il17a-GFPノックインマウスの作製:マウスのIl22遺伝子座にRFP遺伝子を組み込んだ遺伝子改変マウスの作製に向けて、ターゲティングベクターの構築に着手した。またIl17a遺伝子座にGFP遺伝子を組み込んだIl17a-GFP KIマウスは、BIOCYTOGEN社より購入し、現在順調に繁殖が進んでいる。・IL-22産生制御機序の解明:マウスIl22遺伝子プロモーターを用いたレポーターベクターを作製し、既知のTh17細胞特異的転写因子(RORγt、STAT3、Ahr、IκBζ)がIl22遺伝子の転写活性を誘導できるかをレポーターアッセイにより検討した。またIL-6/TGFβ刺激で分化誘導させたTh17細胞(IL-22Low)とIL-6/TGFβ/IL-23刺激で分化誘導させたTh17細胞(IL-22High)からRNAを精製し、IL-23刺激依存的に発現誘導が認められる遺伝子を探索した。またrVista databaseによりIl22遺伝子近傍のDNA領域上で進化的に保存された転写因子結合配列を同定した。上記の条件より候補遺伝子から選定し、過剰発現・RNAi実験、レポーターアッセイによる検証を行った。BIOCYTOGEN社からのIl17a-GFP KIマウスの購入手続きや、当該施設への搬入手続きに時間を費したが、マウスのクリーニング作業も完了し、現在順調に繁殖が進んでいる。またin vitroのヘルパーT細胞分化誘導培養系や組織切片を用いた免疫組織染色解析で、IL-17産生細胞が特異的にGFPタンパク質を発現していることも確認済みである。Il22-RFPノックインマウスのターゲティング

ベクターの構築作業は少々時間を費やしているが、キメラマウス作製に至る手配は既に進めており、ターゲティングベクターが完成でき次第、早急にマウス作製に着手できる予定である。一方、IL-22遺伝子プロモーターを用いたレポーターベクターの作製は完了しており、およびIL-22発現制御に関わる候補遺伝子のスクリーニングは計画通り順調に進行している。現在、興味深い制御因子をいくつか絞り込んでおり、今後更なる詳細な解析を重ねて、その重要性を確認していく予定である。Il22-RFP, Il17a-GFPマウスを用いた黄色ブドウ球菌S. aureusを感染モデルを確立し、マウス組織内のIL-22産生細胞およびIL-17産生細胞動態を、Flowcytrometerおよび免疫組織学手法により、時間的・空間的に解析する。細菌感染に応じて発生するIL-17/IL-22産生細胞の発生経路と細胞特性を明らかにする。さらにCell SorterによりIL-22産生細胞とIL-17産生細胞を分離し、トランスクリプトーム解析およびin vitroにおける機能解析を通じて、細菌感染性のIL-17/IL-22産生性自然免疫系細胞の系統特異的マーカーを選定する。初年度に引き続き、Il22遺伝子発現制御に関わる遺伝子の同定に取り組み、その発現調節メカニズムを明らかにすることで、低分子化合物などを用いたIL-22発現制御法の確立を目指す。平成24年5月より、申請者の所属が東京医科歯科大学大学院医歯学総合研究科から、東京大学医学系研究科に異動となるため、研究実施施設の移動の必要性が生じる。そのため、特にマウスの感染実験に関しては潤滑に実験環境が整えられるかどうか現時点では見通しがたっていない。したがって、当初の計画では複数の細菌感染実験を予定していたが、当面は黄色ブドウ球菌S. aureusの感染実験一種類に集中して解析を行う予定にし、随時実験内容を拡張していく。なお他の実験に関しては、設備環境などの問題は生じていない。研究課題提案書通り、本研究において必要な大型解析機器や組織切片作製装置、細胞培養設備は、当教室ならびに異動後の教室においても既に備えられており使用可能な環境にある。従って、新規に設備備品を購入する計画はない。本研究は大量の実験用マウスを使用するため、次年度においても、実験用マウスの購入や、解析用試薬、特に免疫染色抗体や分子生物学実験用の酵素の購入を計画している。
口腔組織再生誘導のためのＤＤＳ徐放性コラーゲンスポンジの調製と機能評価

コラーゲンスポンジは構造安定化のため化学架橋としてGAを用いることが多いが,残留した未反応のGAの生体為害性が懸念される.そこで本研究では同等の架橋作用が期待されるEDCにて化学架橋を施し,濃度,架橋時間を変化させて架橋状態を比較検討したところ,EDC架橋は有用である結果が得られた.また,アルギン酸が多価金属と架橋してゲル化する性質に注目し,Ca,Fe架橋にて作製したフィルムから,物理的強度の課題は残るものの,低分子量体で作製されたフィルムの有用性が確認された.適切な分子量の架橋性高分子を選択することにより,フィルム製剤として薬剤徐放スピードの制御が可能になる技術に応用できると考えられる.再生医療で使用される膜材料には,生体適合性に優れる性質のほかに,それ自体が細胞接着を促進させるような生理活性機能と,薬物を徐放する機能の双方が求められる.本研究では,アルギン酸が多価金属イオンにより架橋してゲル化する性質に着目し,架橋したアルギン酸ゲル薄膜にヒト歯根膜線維芽細胞を播種して細胞の接着,伸展を検討し,細胞培養基質に資するか評価した.多価金属イオンには2価金属塩にCaCl2,3価金属塩にFeCl3を用いた.また,この材料に成長因子を徐放する機能を付与することを目指し,その予備的な実験として色素系のモデルドラッグ(アクリフラビンおよびメチレンブルー)を含有させ,その放出挙動を分光法で評価した.その結果,1.Ca架橋により作製されたアルギン酸ゲル薄膜上で,ヒト歯根膜線維芽細胞の増殖が認められ,細胞培養基質として資することが確認された.2.Ca架橋,Fe架橋により作製されたアルギン酸ゲル薄膜を培養液に3日間浸漬し,クエン酸ナトリウムにて溶解して銀染色を施すと,どちらの試料からも培地に含有される血清タンパク質が検出された.従ってアルギン酸ゲル薄膜にタンパク質が浸潤していることが確認された.3.低,中,高分子量のアルギン酸ナトリウムを用いてアルギン酸ゲル薄膜を作製し,モデルドラッグによる放出挙動を比較をしたところ,低分量のアルギン酸ナトリウムにて作製したゲル薄膜は色素の放出能が高いという結果が得られたことから,適切な分子量の架橋性高分子を選択することにより,膜材料として適切な徐放スピードのコントロールが可能になる技術に応用できると考えられる.再生医療の細胞培養足場材料として用いられるフィルム製剤は,高分子化合物をベースに調製され,生体適合性・生分解性に優れた性質であることに注目されているが,生体環境を考慮した機械的特性を把握することも必要である.本研究では,アルギン酸が多価金属イオンにより架橋してゲル化する性質に着目し,前年度架橋したアルギン酸塩フィルムに薬物除放性のモデルドラッグとして色素を含有させたところ,放出挙動を確認したことから,その機械的特性とフィルム厚を測定した.機械的特性評価には,短冊状試験片での引張試験を行った.試料には,分子量が異なる3種のアルギン酸ナトリウムをCaCl2,FeCl3にて架橋し,得られたアルギン酸塩フィルムを用いた.その結果,1.短冊状試験片での引張試験は,チャック部の応力集中で破断することが多く,適正な試料の作製が困難であった.再生医療のフィルム製剤は通常湿潤環境で用いられることを考慮すると,特にFe架橋で得られたアルギン酸塩フィルムは湿潤状態で脆さを有することから,機械的特性に対する測定方法の改善を再検討する必要がある.2.水平固定したマイクロメーターにより厚さを測定したところ,Ca架橋で得られたアルギン酸塩フィルム厚は,分子量が高くなるにつれて大きくなる傾向が見られた.前年度得られたモデルドラッグ色素の放出挙動では,低分子量のアルギン酸塩フィルムは高分子量のアルギン酸塩フィルムと比較して,除放の度合いが高い結果を得ていることから,アルギン酸ナトリウムの分子量が低く,フィルム厚が小さいほど薬物除放性が高い傾向になると考えられる.Fe架橋により得られたアルギン酸塩フィルムは,分子量の高低に差は見られなかった.コラーゲンスポンジは構造安定化のため化学架橋としてGAを用いることが多いが,残留した未反応のGAの生体為害性が懸念される.そこで本研究では同等の架橋作用が期待されるEDCにて化学架橋を施し,濃度,架橋時間を変化させて架橋状態を比較検討したところ,EDC架橋は有用である結果が得られた.また,アルギン酸が多価金属と架橋してゲル化する性質に注目し,Ca,Fe架橋にて作製したフィルムから,物理的強度の課題は残るものの,低分子量体で作製されたフィルムの有用性が確認された.適切な分子量の架橋性高分子を選択することにより,フィルム製剤として薬剤徐放スピードの制御が可能になる技術に応用できると考えられる.コラーゲンスポンジは、口腔組織再生を誘導する生体吸収性足場材料の中で細胞が増殖・分化するのに適した材料である。物性の向上、構造安定化のため作製過程でグルタルアルデヒド(GA)を用いた化学架橋を施すことが多いが、残留した未反応GAの生体為害性が懸念される。よって本研究では、GA代替として同等の架橋作用が期待される1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(EDC)を用いてブタ皮由来のI型コラーゲン溶液をゲル化させ、凍結乾燥して得られたコラーゲンスポンジにEDC架橋を施し、その架橋度を測定した。架橋が導入されるとコラーゲン中のフリーアミノ基が減少することを利用し、コラーゲンの架橋率はフリーアミノ基の減少率で評価した。

EDC濃度0.125,0.25,0.5,1.0%、架橋時間1,3,5日の架橋処理を施した結果、1.EDC濃度に依存して架橋率が増加していることが確認された。また、低濃度では架橋率にばらつきが見られ不安定な傾向があり、高濃度ほど架橋率の値が安定してくることが確認された。2.EDC濃度1.0%で1日架橋処理すると約60%程度の架橋率が得られることから、低いEDC濃度で長時間架橋するよりも高い濃度で短時間架橋する方が架橋効率がよいと考えられる。3.同条件で粘度測定も行ったところ、架橋率同様濃度に依存して粘度も上昇していることが確認され、架橋形成の促進が示唆された。粘度は8時間以内で平衡に達したことから、架橋もこの時間で完了している可能性が高いと推測される。本研究の今年度の目的は,作製した生体材料(アルギン酸ゲル薄膜)に対する細胞の接着,伸展,増殖の傾向を観察することであるため,Ca架橋したアルギン酸ゲルにヒト歯根膜細胞を播種して観察し,その増殖傾向を確認できたことは研究がおおむね順調に進展していると考えられる.また,培養液に浸漬した薄膜を溶解することにより,銀染色にて血清タンパク質の検出を確認することもできた.予備実験ではあるが,DDSの検討としてモデルドラッグに色素を用い,アルギン酸ゲル薄膜からの放出挙動を計測し,その傾向を確認することができた.本研究の第一過程は、生体材料として機能的なコラーゲンスポンジの調製の確立をすることを目的としている。従来架橋剤として用いられてきた化学試薬のグルタルアルデヒド(GA)に代替して、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(EDC)を用いることにより、GA同様の架橋効果を期待してコラーゲンスポンジを調製してきたが、吸光光度計によるフリーアミノ基の減少率の測定により、EDCの架橋を確認することができた。EDC濃度は0.125%1.0%、架橋時間は15日間で架橋処理を行い、それぞれの架橋率を測定したところ、EDC濃度1.0%で1日架橋処理すると約60%程度の架橋率が得られ、それ以上架橋時間を長くしても急激な架橋率の上昇は認められないことから、高濃度で短時間の架橋処理が効率的なことが分かった。SEMによる形態観察では、コラーゲンスポンジとして必要な緻密な多孔性を有しており、形態学的にも適していることが確認された。以上のことから、コラーゲンスポンジとEDCとの調製についてはおおむね順調に進展していると思われる。アルギン酸ゲル薄膜が足場材料として機能するためには,生体内で細胞成長因子を徐放し,細胞の増殖・分化を促進できなければならない.塩基性繊維芽細胞増殖因子(bFGF)や血管内皮増殖因子(VEGF)は,未分化間葉系細胞の増殖能を高めて血管や骨の新生を促進し,歯周組織の再生を誘導することが報告されていることから,今後の計画としては細胞成長因子を作製したアルギン酸ゲル薄膜に担持させ,DDSとしての機能性を持たせる実験を進めていく予定である.昨年度予備実験として行ったモデルドラッグ(色素)の放出挙動では,低分子量のアルギン酸ナトリウムにより作製されたアルギン酸ゲル薄膜が徐放能が高いという結果を得ていることから,同様に細胞成長因子の徐放による放出挙動を計測する予定である.また,Fe架橋により作製されたアルギン酸ゲル薄膜上でのヒト歯根膜線維芽細胞の接着,進展,増殖の観察を行い,Ca架橋との比較検討を行う予定である.
ブナ科樹木萎凋病原菌に対する宿主の抵抗性に関わる因子の解明

変色域の形成程度により, Raffaelea quereivoraの宿主樹木に対する病原力は菌株間で異なると指摘されているが,枯死の程度や枯死に関わる非通水域の形成程度による評価は行われていない.また,非通水域の拡大に関与する材内における本菌の菌糸伸長と病原力との関連も明らかではない.そこで本研究では, R. quercivora菌株間の病原力の差異と,その差異と材内における菌糸伸長との関連を明らかにすることを目的とした.変色域の形成に関わるタンナーゼとラッカーゼ活性を,タンニン酸かABTS添加培地における変色程度で評価した.日本全国から採取した32菌株の中から,両酵素活性が異なる4菌株と9菌株を選抜し,それぞれミズナラ苗木に多点,成木の枝に1点接種を行い,枯死率と横断面に占める非通水域の割合を算出した.さらに, 1点接種においては材内における菌糸伸長量を計測した.その結果,菌株間で両酵素活性と枯死率,非通水域の割合,菌糸伸長量は有意に異なった.さらに,両酵素活性と枯死率,非通水域の割合との間に関連はみられなかったが,菌株間の菌糸伸長量の違いは,枯死率や非通水域の割合の違いと一致する傾向にあった.以上より,本菌の病原力は菌株間で異なるが,両酵素活性の関与は極めて低いと示唆された.さらに,菌株間の病原力の差異には,材内における菌糸伸展の程度が関与すると示唆された.現在までに行った研究の一部を,博士論文として取りまとめた.(抄録なし)ブナ科樹種間のRaffaelea quercivoraに対する感受性の差異の指標は,本菌の伸展に対して形成される非通水域の大きさであると示唆されている.現在までの接種試験の結果から,本菌の伸展には,環孔材か放射孔材という樹種間の道管配列の違いが関与すると考えられるが,両者の関連に関する研究は行われていない.そこで本研究では,樹木の道管配列がR. quercivoraに対するブナ科コナラ属樹種の感受性に与える影響を明らかにすることを目的とした.そのため,環孔材のミズナラ,放射孔材のアラカシとともに環孔材の外国産コナラ属3樹種の苗木,組織構造をそのまま保持した滅菌材片に接種を行い,非通水域の面積の計測,材内の菌糸の伸展状況を調べた.その結果,ミズナラとQ.coccinea接種木の非通水域の割合は,その他の接種木,対照木に比べて,有意に高く,供試した外国産環孔材樹種の接種木間でその割合に有意差があった.このことから,環孔材樹種間においてもR. quercivoraに対する感受性に差異があると示唆された.また,接種木における菌糸の伸展距離は樹種間で有意に異なり,非通水域との間に有意な正の相関が認められた.このことから,非通水域の形成程度には材内におけるR.quercivora菌糸の伸展程度が密接に関与すると示唆された.さらに,滅菌材片における菌糸の伸展距離は樹種間で有意に異なっていたが,その違いは接種木における菌糸の伸展距離,非通水域の割合の差異と一致しなかった.以上のことから,樹種間の道管配列の違いは,材内における菌糸の伸展や非通水域の形成の差異に及ぼす影響,さらに感受性の差異に及ぼす影響も小さいと考えられた.ブナ科樹種間のRaffaelea quercivoraに対する感受性の差異の指標は,本菌の感染後に形成される非通水域の大きさであると示唆されている.さらに,非通水域の形成には,本菌の菌糸伸展が密接に関与することが示唆されている.現在までの接種試験の結果から,菌糸伸展には,樹種間の組織構造,特に道管配列の違いが関与すると考えられていたが,外国産コナラ属樹種を用いた接種試験では,両者の間に関連はみられなかった.材内における本菌の伸展は,道管以外にも放射組織や道管放射組織間壁孔を経由することが示唆されている.そこで本研究では,樹木の組織構造,特に放射組織や道管放射組織間壁孔の構造がR.quercivora菌糸の伸展に与える影響を明らかにすることを目的とした.そのため,環孔材のミズナラとコナラ,放射孔材のアラカシとスダジイ苗木を用いて,組織構造をそのまま保持した滅菌材片に本菌の接種を行い,材内の菌糸の伸展距離と,放射組織と道管放射組織間壁孔の大きさ,密度の測定を行った.その結果,樹種間における菌糸の伸展距離には有意差は認められなかった.また,樹木個体間の組織構造の違いは,放射組織の構造と,道管放射組織間壁孔と道管配列によって判別された.さらに,放射組織の大きさと菌糸の伸展距離との間には有意な正の相関が認められた.以上のことから,R.quercivoraの菌糸伸展には放射組織の大きさが関与すると考えられたが,樹種間の本菌に対する感受性の差異には,組織構造は関与しないと考えられた.変色域の形成程度により, Raffaelea quereivoraの宿主樹木に対する病原力は菌株間で異なると指摘されているが,枯死の程度や枯死に関わる非通水域の形成程度による評価は行われていない.また,非通水域の拡大に関与する材内における本菌の菌糸伸長と病原力との関連も明らかではない.

そこで本研究では, R. quercivora菌株間の病原力の差異と,その差異と材内における菌糸伸長との関連を明らかにすることを目的とした.変色域の形成に関わるタンナーゼとラッカーゼ活性を,タンニン酸かABTS添加培地における変色程度で評価した.日本全国から採取した32菌株の中から,両酵素活性が異なる4菌株と9菌株を選抜し,それぞれミズナラ苗木に多点,成木の枝に1点接種を行い,枯死率と横断面に占める非通水域の割合を算出した.さらに, 1点接種においては材内における菌糸伸長量を計測した.その結果,菌株間で両酵素活性と枯死率,非通水域の割合,菌糸伸長量は有意に異なった.さらに,両酵素活性と枯死率,非通水域の割合との間に関連はみられなかったが,菌株間の菌糸伸長量の違いは,枯死率や非通水域の割合の違いと一致する傾向にあった.以上より,本菌の病原力は菌株間で異なるが,両酵素活性の関与は極めて低いと示唆された.さらに,菌株間の病原力の差異には,材内における菌糸伸展の程度が関与すると示唆された.現在までに行った研究の一部を,博士論文として取りまとめた.おおむね順調に進展しており,各実験における病原菌の接種試験を行い,実験のひとつは解析まで終えている.おおむね順調に進展しており,すべての実験における病原菌の接種試験を終え,今後の作業はデータの解析とその取りまとめのみとなった.おおむね順調に進んでおり,今後も解析を進めていくとともに,投稿論文の作成を進めていく.おおむね順調に進んでおり,今後は解析を進めていくとともに,投稿論文の作成を進めていく.(抄録なし)
教科指導力の可視化指標に基づく教育実習支援に関する基礎的研究

本研究は小・中学校教員の養成・初任研修で育成が求められる理科の教科指導に関する資質・能力の構成要素を規定し、それらへの理解ある行動を促すことで教科指導の質的向上を図るという目的で、到達を目指す資質・能力とそのレベルを明示した可視化到達指標とその評価基準を開発するとともに、モバイル機器による実習指導支援システムにより遠隔地の個別指導下でも教員等の学びを質的に保証するための教師教育教材を開発した。本研究は小・中学校教員の養成・初任研修時に確かな育成が求められる「理科の教科指導に関する資質・能力」を取り上げ、(1)教員志望者等の理解ある行動を促す、可視化到達指標とその評価基準を開発すること、(2)(1)に基づき、モバイル機器による実習指導支援システムの開発・試行によって、遠隔地個別指導下での教員志望者の主体的な活動でも質的な学びを保証する教師教育の教材開発を推進することが目的である。この目的達成の手順として、(A)理科教科指導に関する資質・能力の育成目標を調査して共通性・多様性を把握する、(B)規準達成の必要性が理解でき行動できる可視化到達指標を作成してその評価基準を開発する、(C)モバイル機器でのコンテンツ提供・実践記録・評価機能を活かした教育実習指導支援システムの開発・試行を展開することとしている。研究2年目である平成25年度は、(手順A-2)教師教育を専門分野とする台湾と日本の理科教育研究者等と意見交換を続けて実習期間中の資質・能力の確認に関して示唆を得たり、理科教育に関わる国際学会での成果発表を通じて意見交換を行ったほか、(手順B-1)可視化指標試案の立案を進めること、さらには、(手順B-2)本学所属の小・中学校理科の実習生の実習期間が1週間短縮されたことを踏まえて、実習実施後の彼らの感想内容から評価指標に掲げる項目やレベルに関して適正さを再検討し修正を図ることを行った。また、前年度同様に、(手順C-3)モバイル機器の使用感や管理方法を確認するとともに、それを踏まえたシステム構築のあり方やコンテンツ提供のあり方の検討を継続した。研究初年度である平成24年度は、(手順A-1)国内外の初等・中等教育教員養成カリキュラムにおける理科教科指導に関する資質・能力の育成目標について調査し、特に理科教育法科目や教育実地研究科目での育成目標を調査して分析すること、(手順A-2)教師教育を専門分野とする台湾(国立新竹教育大学張美玉教授)と日本の理科教育研究者に理科教科指導に関する資質・能力に関してインタビュー調査を行い、可視化指標の項目を検討することを中心に展開した(但し、海外渡航費は本件支出ではない)。さらに、(手順B-1)教員志望者に求められる到達規準レベルを検討し、彼らに必要性が理解できる可視化指標や評価規準の試案作成の試みに着手した。また、モバイル機器の特性を分析・理解するため、(手順C-3)モバイル機器を購入したうえで機器の使用感を確認するとともに、システム構築のあり方やコンテンツ提供の検討を進めた。この目標達成の手順として、(A)理科教科指導に関する資質・能力の育成目標を調査して共通性・多様性を把握する、(B)規準達成の必要性が理解でき行動できる可視化到達指標を作成してその評価基準を開発する、(C)モバイル機器でのコンテンツ提供・実践記録・評価機能を活かした教育実習指導支援システムの開発・試行を展開することとしている。研究3年目の平成26年度は、(手順A-2)教師教育に関わる国際学会(International Science Education Conference 2014)でのポスター発表や国内学会(日本教科教育学会)での口頭発表を通じて指標や基準の立案に関わる意見交換を行うことで研究方法論について価値解釈を行ったほか、(手順B-1・2)可視化指標・評価基準の試案の更なる検討を継続するとともに、科学教師教育に関して知見を持つ米国人研究者(元Association for Science Teacher Education会長)を招聘して研究内容の批評を受けたほか、(手順C-1・2)モバイル機器向けの資料コンテンツの作成や、実習指導支援のための各種実践記録の収集を行った。

本研究は小・中学校教員の養成・初任研修時に確かな育成が求められる「理科の教科指導に関する資質・能力」を取り上げ、1:教員志望者等の理解ある行動を促す、可視化到達指標とその評価基準を開発すること、2:1に基づき、モバイル機器による実習指導支援システムの開発・試行によって、遠隔地個別指導下での教員志望者の主体的な活動でも質的な学びを保証する教師教育の教材開発を推進することが目的である。この目標達成の手順として、(A)理科教科指導に関する資質・能力の育成目標を調査して共通性・多様性を把握する、(B)規準達成の必要性が理解でき行動できる可視化到達指標を作成してその評価基準を開発する、(C)モバイル機器でのコンテンツ提供・実践記録・評価機能を活かした教育実習指導支援システムの開発・試行を展開することとしている。本年度(平成27年度)は、(A-2)米国の理科教師教育学会ASTEの会長経験がある理科教育学者と面会して理科教員養成プログラム内での育成評価の在り方に関する意見交換を行うとともに本研究に関連して進める国際共同研究の打合せを行ったほか、(B-1・2,C-1)可視化到達指標と評価基準、その他各種指導用の説明資料を開発するとともに、到達指標・評価基準に関しては国内の学会等で発表して意見交換を行うとともに、これらを基に教育実習生対象の調査を実施して彼らの自己評価データの収集・分析を実施した。所属機関での業務増加、並びに他に進めている共同研究での成果取りまとめへの対応や親族対応などによって想定以上の負荷が発生したため、本研究の進捗が計画に比べて遅延したことによる。当初研究期間内での成果とりまとめが難しくなったと判断して、期間延長承認申請を行ったところ、承認された。本研究は小・中学校教員の養成・初任研修で確かな育成が求められる理科の教科指導に関する資質・能力を取り上げ、1:教員等に理解ある行動を促すために獲得をめざす資質・能力やそのレベルを明示した可視化到達指標とその評価基準を開発すること、2:モバイル機器による実習指導支援システムにより遠隔地の個別指導下でも教員等に質的な学びを保証する教師教育教材を開発することを目的として推進した。研究方法は、(手順A)理科教科指導に関する資質・能力の育成目標の調査、(手順B)可視化到達指標とその評価基準の開発、(手順C)コンテンツ提供・実践記録・評価機能を含む教育実習指導支援システム開発で構成した。期間延長して実施した本年度の研究は、(手順B-2)可視化指標・評価基準を教育実習生に使用させて収集したデータから内容妥当性や教育効果を確認するとともに、(手順C-2・3)指導実践記録、自己評価アンケート等を取り入れた指導支援システムの開発試行を行った。補助事業期間全体を通じて実施した研究の成果を手順ごとに示すと次の通りである。(手順A)国内及び国外(アメリカ・台湾等)の理科教育研究者や現職教員との意見交換から、実験活動を組み込む学習指導が基盤の日本では教員に必要な資質・能力は多岐にわたるが主体的・協働的な学びから科学的理解へ向かわせる効果を大切にすべきことが示唆された。(手順B)教員が行う学習指導の行動要素から8タイプ選択し、さらに各タイプに難易レベル4段階の方法行為(単純教授スキルから生徒間コミュニケーション創出スキルまで)を用意することで到達指標を策定し、出現頻度を評価基準にあてて回答させることで、教員志望者の実習期間中での資質・能力の変化が捉えられるようになった。
集水域マスバランス方程式による日本森林土壌の生成速度の推定

植生や母岩の異なる集水域から得られた観測データを基に、関西圏に位置する森林生態系の土壌生成速度(SFR)を求めることができた。また、当初計画にはなかった既存データの再解析によって、SFRの推定精度を検討できた。これらの結果から長期にわたって集水域マスバランスデータの解析が可能となる米国ハバードブルック長期生態系モニタリングサイトにおける調査の必要性が生じ、関連データを入手し解析を進めることになった。総評として、本研究によってSFRの測定手法を完全に確立するまでには至らなかったが、集水域マスバランス法の信頼性や実用性の一部検証を完了でき、今後の研究へつながる成果を得ることができた。本研究課題は、土壌生成速度の定量的測定法は、土壌研究における根幹テーマの一つでありながら、未だ確立されていない。これまでに集水域スケールで地球化学元素のマスバランスを計算することにより、土壌生成速度および岩石風化速度を同時に推定する手法が考案されているが、その理論実証が不十分であるだけでなく、適用事例が不足していることから信頼性や実用性について十分に検討されていない。本研究課題では、このマスバランス式を適用して、日本各地の森林土壌の土壌生成速度を推定・比較する。また、環境条件の異なる二つの集中モニタリングサイトで質量ともに測定データを増やすことで最適な推定手法の開発と精度の向上を目指す。そして、集水域に改良法を適用し、その適応範囲や算出精度について検証する。2016年度は、奈良県の春日山および矢田丘陵に位置する植生および母岩の異なる2つの集水域から得られた観測データを基に、土壌生成速度(+岩石風化速度)を算出、相互に比較したところ、算出結果に母岩の違いを主因にすると思われる土壌生成速度(+岩石風化速度)の差が確認できた(論文投稿中)。また、当初計画にはなかった既存データの再解析によって、土壌生成速度(+岩石風化速度)の推定精度を検討できた(論文準備中)。2017年度は、これら二つの集水域におけるモニタリングを継続するとともに、全国各地の森林土壌の調査を進めて、本法の適用性あるいは実用性について更に検討を進め、集水域マスバランス法による土壌生成速度の推定手法の更なる発展を目指したい。奈良県春日山および矢田丘陵における観測データから、本手法によって求めた土壌生成速度(+岩石風化速度)が隣接する集水域では母岩の違いをより強く反映している可能性が高まった。また、当初予定していなかったが、既存データの再解析によって(+岩石風化速度)の推定精度を検討できたのは大きな進展であるように思う。他方、県外の森林土壌の調査については若干遅れているが、総じて順調に進展していると思われる。本研究は、集水域スケールで地球化学元素のマスバランスを計算することにより、土壌生成速度を推定する手法(集水域マスバランス法)について、日本の森林集水域を対象としてその信頼性や実用性を検討し、土壌生成速度の測定法を確立することを目的としている。奈良県の春日山および矢田丘陵に位置する母岩の異なる2つの集水域(片麻岩vs.花崗岩)から得られた観測データを基に、土壌生成速度(+岩石風化速度)を算出し、相互に比較すした。結果として、母岩の違いを主因にすると思われる土壌生成速度(+岩石風化速度)の差がみられたが、当初期待していたほど大きな差ではなかった(論文投稿ち中)。また、春日山においては、植生の違いに着目して土壌調査を行い、データ解析を進めている(一部データはすでに論文として投稿中)。更に京都府大江山において、地質条件の異なる隣接する森林集水域(堆積岩vs.蛇紋岩)を調査し、土壌生成速度(+岩石風化速度)を求めることができた。これら結果の一部は学会で発表することができた。他方、当初計画にはなかった既存データの再解析によって、土壌生成速度(+岩石風化速度)の推定精度を検討できた。また、この結果から長期にわたって集水域マスバランスデータの解析が可能となる米国ハバードブルック長期生態系モニタリングサイトにおける調査の必要性が生じ、関連データを入手するとともにデータ解析を進めている。総評として、研究目的であった集水域マスバランス法の信頼性や実用性の検証は一部達成できたが、土壌生成速度の測定手法を完全に確立することはできなかった。本研究を進めていく過程で、質・量ともに更に広範囲かつ集中的な調査・モニタリングとデータ解析や他の土壌生成速度測定法(例えば、宇宙線生成核種計測法)との比較が必要になることが確認できたことから、本研究の結果をもとに今後継続して研究を進めていく予定である。春日山と矢田丘陵におけるデータ観測を継続するとともに、集水域研究の蓄積のある北米ハバードブルック集水域のデータを解析することにより、土壌生成速度の推定精度について更に詳細な検討を進めていく。また、並行して日本各地にある森林土壌の調査を進めていきたいと思う。土壌学本研究課題で必要となった物品はすでに研究室に配備してあったものでカバーできたため、物品費を使用せずに研究を実施できた。
肝・胆道・膵癌の発生と進展における免疫回避機構の解明

我々は,肝細胞癌におけるFas発現の減弱が,宿主の免疫機構から逃れる一因であることを見出した(Hepatology,1999)。Fas発現には、p53の正常機能が必要であることも報告したが、p53が正常でもFas発現が減弱している症例を認めた。そこで、Fas発現を増強すると言われているIFN-γとの関連を検討した。すなわち凍結切片上で、肝細胞癌におけるIFN-γ受容体の発現とIFN-γ陽性リンパ球を検討した。硬変肝細胞におけるIFN-γ受容体の発現は、正常肝細胞に比べて増強していた。肝細胞癌44例中、IFN-γ受容体陽性肝癌は29例であり、陰性例は15例であった。real time RT-PCRによりmRNA levelでの発現を検討したところ、転写の段階で既にIFN-γ受容体発現は減弱していた。また、IFN-γ受容体の糖化の程度がIFN-γとの親和性に関与するとされているので、western blottingにより、糖化の状態を検討したが、正常肝・硬変肝・肝細胞癌の間には差はみられなかった。臨床病理学的因子との関連では、IFN-γ受容体陰性例は有意に腫瘍径が大きく、肝内転移・遠隔転移が高率であった。Fas発現との関連においては、Fas陽性肝癌14例は、全例IFN-γ受容体陽性であり、Fas陰性30例中IFN-γ受容体陰性例は15例であった(p=0.001)。IFN-γ陽性リンパ球浸潤とFas発現との間には、関連はなかった。また、IFN-γにより誘導されるMHC class-Iの発現を検討したところ、IFN-γ受容体とMHC class-I発現との間には有意な相関を認めた。従って、IFN-γsignalの異常が肝細胞癌における免疫回避機構の主因である可能性が示唆された(Hepatology,2000)。また、細胞増殖活性としてKi-67染色を行ったところ、陰性例で有意にKi-67が高値であった。従って、IFN-γsignalの異常が肝細胞癌における免疫回避機構の主因である可能性が示唆された。
六方晶窒化ホウ素へのリチウムインターカレーションによる新物性の発現

六方晶窒化ホウ素(h-BN)とLiをモリブデン管に封入し、1000-1500°Cで熱処理することで、Liをh-BNの層間にインターカレートしたh-BN(Li-h-BNIC)を作製することができた。本研究成果であるh-BNへのLiインターカレーションを他のアルカリ金属元素やアルカリ土類金属元素のインターカレーションへ発展させることにより、「h-BNIC」という新しい研究領域が創出できると考えられる。六方晶窒化ホウ素(h-BN)はグラファイトと同様の構造を持つ層状物質である。グラファイトでは数多くの元素がグラファイト層間にインターカレートされ、層間化合物(GIC)を形成することが知られているが、h-BNではh-BN層間化合物(h-BNIC)に関する報告例はほとんどない。本研究では、通常行われる石英管への封入ではなく金属管に試料を封入し、1300°Cの高温で熱処理することで、Liをインターカレートしたh-BN(Li-h-BNIC)の作製に成功した。SPring-8のBL02B2ビームラインにて、作製した試料の粉末X線回折測定を行ったところ、Liインターカレーションにより、これまで実験室系のX線で確認できていた(002)面のピークだけでなく、(100),(110),(102)面のピークも低角側にシフトしていることが確認され、作製した試料のXRDパターンが格子定数の伸びたh-BNの構造でフィッティングできた。GICと比較すると、層間距離はLiC_6と同程度の伸び率を示していたが、a軸がGICよりも大きく伸長していることが確認された。代表的なGICの構造であるKC_8, LiC_6におけるインターカラントの配置を参考にしてLiの面内構造を検討したが、計算で予測されるいくつかのピークが実験では観測されておらず、まだわかっていない。また、TEM観察を行った結果、電子線回折図形が6回対称性を残しつつデバイ・シェラー環状になっていたことから、Liインターカレーションに伴う層間距離の増大によってBN原子層の層間相互作用が弱まりBN層の積層が乱層化していることが示唆された。昨年度の研究から、試料の最適作製条件がわかったため、今年度は良質な試料を作製し、物性測定を行う予定である。Liインターカレーションによる金属転移が過去の研究から予測されており、超伝導の発現も期待できる六方晶窒化ホウ素(h-BN)はグラファイトと同様の構造を持つ層状物質である。また、昨年度の結果から、Li-h-BNICの構造を求めることができた。h-BNは絶縁体であるが、Liインターカレーションにより室温での電気伝導率が8桁向上したことがわかった。また、その温度依存性は可変領域ホッピング伝導を示していた。昨年度の結果から、Liインターカレーションによる乱層化が示唆されており、可変領域ホッピング伝導が生じたことは構造の乱れに由来していると考えられる。また、電気伝導測定は表面に敏感であるため、試料そのものではなく表面に析出した不純物相に由来している可能性もある。また、試料のXRDパターンでは、h-BNの(002)のピーク強度が強く、インターカレーションが試料の表面付近だけで起こっていることが示唆された。Li-h-BNICの磁化率を測定した結果、常磁性を示すことがわかった。また、2Kまで超伝導は観測されなかった。インターカレーションによるパウリ常磁性の変化から金属転移について検討したが、試料中に含まれる不純物が多いため、Li-h-BNに由来する磁性のみを取り出すことができなかった。より純良な試料を作製し、測定を行う必要がある。
イオン液体による有機金属触媒のソフト固定化法の開発

1. Pd-nanoSILCの開発と鈴木-宮浦反応への展開すでに我々は、イオン液体で酢酸パラジウムをアモルファス固体担体の細孔内に固定化した固定化触媒Pd-SILCが、不均一系触媒として鈴木-宮浦反応において高い活性とリサイクル性を示すことを明らかにしてきた。本研究では、末端にアミノ基を有する第3世代のナノシリカゲルデンドリマーに、酢酸パラジウムをイオン液体[bmim]PF_6により固定化した新規触媒Pd-nanoSILCを調製した。本固定化触媒は流動性があり、また各種有機溶剤に均一に分散した。TEM観測の結果、ジメチルアミノ基を有するPd-nanoSILCは規則的なクラスター構造を持ち、高い活性を示すことが分かった。鈴木-宮浦反応に用いたところ、50% aq.EtOH中において平均収率93%、簡単な遠心分離操作のみで5回のリサイクル使用に成功した。反応は配位子を加えること無く、空気中、室温で進行した。本触媒の活性は高く、TONは170,000に達した。また基質一般性も広く、特にオルト置換体、トリフレート体に対応するのが従来のPd-SILCに無い新しい特徴である。2. MacMillan触媒固定化Mac-SILCの開発と不斉Diels-Alder反応への展開MacMillan触媒は、温和な条件で様々な不斉変換反応を高収率、高エナンチオ選択的に進行させる汎用性の高い触媒である。その一方で、触媒としては使用量が多い事、回収再使用が出来ない事などの問題点がある。これらの問題点を解決すべく、MacMillan触媒を20wt%の[bmim]NTf_2で無定形シリカゲルに取り込ませたMac-SILCを調製した。このMac-SILCを用いDiels-Alder反応を検討したところ、t-Amylalcohol中、平均化学収率81%、エンド体およびエキソ体の平均光学収率をそれぞれ87%ee、80%eeで、6回のリサイクル使用に成功した。基質一般性は広く、ルイス酸触媒を用いても反応しない電子豊富な桂皮アルデヒドにも適用することが出来た。Grubbsによって開発されたRuカルベン錯体は、従来法ではきわめて困難であったオレフィンメタセシス反応に絶大な威力を発揮する。この触媒は中性条件下二重結合とのみ反応し、他の官能基に影響する事も無く影響される事も無い。特に、従来困難とされていた大環状化合物の合成を行える点に特徴がある。そのため、現代の有機合成化学の方法論を一変させた触媒として、'有機化合物のみならず高分子合成などの分野でも用いられている。しかしこの素晴らしいGrubbs触媒にも、不安定である事、触媒回転数が低い事、リサイクル性の無い事、分子量が大きい事、高価格である事などの問題点がある。本研究では、これらの諸問題、なかでも触媒活性の維持とリサイクル性の発現を解決するため、Grubbs触媒のSILC化(Ru-SILC)とオレフィンメタセシス反応への展開を目的とした。SILC法は、イオン液体で液相固定化した均一系有機金属触媒をさらに無機固体担体に固定化する方法であり、これまでPd触媒の固定化に大きな威力を発揮してきたソフトな触媒固定化法である。Grubbs触媒の固定化条件を種々検討した結果、無定形の塩基性アルミナにイオン液体[hmim]PF_6を用いて固定化する事が出来た。さらにRu-SILCを用いメタセシス反応条件を検討した結果、ベンゼン中でのジアリルマロネートの5員環閉環メタセシス反応において、少なくとも6回のリサイクル使用を実現し、耐久性の改善に大きく貢献した。触媒回転数は、比較的大きな150を示した。また、これまでの固定化Ru触媒と異なり、5あるいは7などの小員環化合物のみならず14, 15, 16などの大環状化合物の合成にも適用可能であった。このRu-SILCの大環状合成能を利用して、ジャコウシカの分泌物で医薬および香料成分として貴重な15員環ケトンである光学活性ムスコンの全合成に成功した。2. MacMillan触媒固定化Mac-SILCの開発と不斉Diels-Alder反応への展開

MacMillan触媒は、温和な条件で様々な不斉変換反応を高収率、高エナンチオ選択的に進行させる汎用性の高い触媒である。その一方で、触媒としては使用量が多い事、回収再使用が出来ない事などの問題点がある。これらの問題点を解決すべく、MacMillan触媒を20wt%の[bmim]NTf_2で無定形シリカゲルに取り込ませたMac-SILCを調製した。このMac-SILCを用いDiels-Alder反応を検討したところ、t-Amylalcohol中、平均化学収率81%、エンド体およびエキソ体の平均光学収率をそれぞれ87%ee、80%eeで、6回のリサイクル使用に成功した。基質一般性は広く、ルイス酸触媒を用いても反応しない電子豊富な桂皮アルデヒドにも適用することが出来た。