hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
キャピラリー電気泳動を用いる内分泌撹乱物質一斉分析システムの開発

平成13年度は内分泌撹乱物質:カテゴリー2(III)のキャピラリー電気泳動(CE)による高感度一斉分析法の確立を目的とし、ビスフェノールA、P-オクチルフェノール、P-ノニルフェノールを含むアルキルフェノール類:カテゴリー2(III)の紫外吸光検出法によるCEの開発を行った。CEの分離条件(MEKC、Zone)を再検討するとともに、CEによる分離、検出の各条件について最適化を図ることにより、各フェノール類を数10pg/ml単位の分析を行うことが出来た。さらに、ヒト血漿、精子、精漿等の生体試料からの内分泌撹乱物質抽出条件の標準化を行う目的で、妊婦および胎児の血液中のビスフェノールAおよびアルキルフェノール類の定量を行った。確立した条件下において、生体試料のCE分析を行うとともにGC-MS、HPLCおよびCE分析と、個々の感度、選択性を比較し、CE法の有用性を確認した。平成14年度は、産婦人科学、泌尿器科学領域において若年者の精液所見低下が指摘されていることから、泌尿器科患者より得られた64名の泌尿器科来院患者からインフォームドコンセントを行い得た、精液中のビスフェノールAおよびアルキルフェノール類の定量を行った。これらのデータは産婦人科学および泌尿器科学的な形状・数量的データとの比較も行い、前述した疫学検査データベースの構築を始めている。プラスチック原料に含まれる内分泌撹乱物質であるビスフェノールA及びアルキルフェノール類(特にノニルフェノール類)の血中及び精液中の濃度を測定することは、前出の内分泌撹乱物質の人体への影響を調べる上で重要な意味を持つ。この目的のために、近年、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)を上回る高分解能を持ち注目されている、キャピラリー電気泳動(CE)による高感度一斉分析法の開発を行った。ビスフェノールA及びアルキルフェノール類はミセル導電クロマトグラフィー(MEKC)により分離を行い、50×50μmキャピラリーに泳動液として20mMホウ酸塩緩衝液(pH8.0)に5mMγ-シクロデキストリン及び20mMドデシル硫酸ナトリウム(SDS)を用いた。この方法により各フェノール類を100μL血清を用いて0.6-2000μg/mLの範囲で測定できた(検出波長214nm)。さらに血清を2.0mL使うことにより1.0ngまで検出が可能であった。10μg/mL試料における変動係数は6.3-7.7%、血清試料からの添加回収率は91.8-93.0%であった。このCE分析法についてはBiomedical Chromatography,15(7),437-442に掲載された。現在このCE分析法と蛍光HPLC法を用いて、上記の内分泌撹乱物質による精子の減少、奇形及び男性不妊との影響を調査している。検体として、不妊相談に来院した男性の精液及び血液中の濃度を測定し、精液量、精子数、奇形率および他の疾病との影響について調べている。CEの分離条件(MEKC、Zone)を再検討するとともに、CEによる分離、検出の各条件について最適化を図ることにより、各フェノール類を数10Pg/ml単位の分析を行うことが出来た。
Imaging Mass Spectrometryによる神経細胞膜の評価

Imaging Mass Spectrometryによるマウス後根神経節神経細胞の観察系を構築中であった。単細胞での評価の前にまずは後根神経節自体でのリン脂質の動態を確認し、ある程度リン脂質の見当をつけて単細胞におけるリン脂質の解析をしていく方針とした。具体的にはC57B6Jマウス8週齢のオスを用いて左大腿を切開し坐骨神経を露出、切開し坐骨神経損傷モデルを作成した。坐骨神経損傷後5日で後根神経節を摘出し、左側のL3-5の後根神経節とコントロールとして右側のL3-5の後根神経節をCTBで包埋し、凍結した。次にCyostatを用いて凍結切片を作成しイオンコートされたスライドグラスに乗せた。その後、自動スプレー機を用いて凍結切片をスライドグラスごとDHBコーティングし、Imaging Mass Spectrometryによる解析を行った。解析の結果として坐骨神経損傷の後根神経節神経細胞においてm/z 772.5,と820.5が上昇する傾向がみられた。m/z772.5は甲状腺乳頭癌や濾胞リンパ腫で上昇し炎症に関係があるという報告があり、m/z 820.5もアラキドン酸含有リン脂質であり炎症に関係する。これらが坐骨神経損傷後に後根神経節神経細胞にて上昇するという傾向がみられた。今後は再現性を確認した上でTOF-SIMSを用いた後根神経節神経細胞における坐骨神経損傷後のリン脂質の変化および局在を調べていく予定であった。
農地再生事業による社会的包摂の試み―大阪近郊棚田地域におけるアクションリサーチ―

社会的課題の解決に資する事業を起こすことにより労働参加機会を創出する必要があると考え,ホームレス高齢労働者や若年者就労支援事業体などとともに農地再生を試みるアクションリサーチを開始した.若年者就労支援に農作業を取り入れることは,利用者が自己肯定感を獲得したり,利用者の特性や適性を可視化したりするうえで有効である.ホームレス高齢労働者は若者を指導する役割を果たすことがある.しかし,農業労働の本質を踏まえなければ,単に現在の雇用環境に若者を適応させる結果に陥りかねない。農学と社会福祉学を架橋する必要がある.日本国内における貧困問題の閉塞状況を打破するためには,他の社会的課題と組み合わせて雇用創出を図る試みが必要である。本研究は,野宿者が多く生活している大都市近郊において,農地荒廃問題と貧困問題を組み合わせ,アクションリサーチという形で,農地再生事業による雇用創出を試みた。ひとつの成果として,農業労働の場を創出することの意義が明らかになりつつある。就労希望者は,人間関係を広げ収入を得ることができるのみならず,社会的要請に応えているという自信を得られ,特に若者の場合には,得意なことや苦手なことを発見して就労訓練の次の段階につなげることができた。また,年配の野宿者が,農作業の要領を得ず悩んでいる若者を激励したり指導したりする光景も見られ,高齢野宿者と若者の協働の可能性が垣間見えた。同時に,さまざまな課題も見えてきた。例えば第一に,基本的に農作業の大部分は暗黙知から成立している。指示内容を全て言語化することは非現実的であり,最初は最小限の指示を出し,作業中に各参加者ができていない点を指摘することになる。どうしても言い方が否定的になるため,中には気分を害したり自信を喪失したりする参加者が出てしまう。第二に,どのような作業が必要か,作物の状況を見ただけで判断できるリーダー的人材が不足しているため,持続可能性に問題がある。農地再生事業に対する農地所有者および就労希望者のニーズが今後一層顕在化する傾向にあることに鑑みれば,一時的な就労の場を提供するにとどまらず,長期的な視点で人材を育成するという方向性も必要である。結論として,農業分野における就労支援には固有の可能性と課題があり,これらを検証することためには,就労支援というものが何を目的とすべきなのかという根源的な問題を回避できないことが示唆された。事業性と社会性の両立を企図してきたNPOや社会的企業,コミュニティビジネスなどの取り組みにおける労働参加は,社会的包摂の現実的な手段として考えられる。耕作放棄地の増大が社会問題として認識されていることに鑑みれば,農地の再生および維持は労働参加の一形態として成立することになる。ただし,これまでの雇用政策から教訓を引き出すのであれば,単なる人手不足の解消策以上の意義を働き手が実感できるか否かが成功の鍵になる。これまでにも、農業分野における労働参加について,実践事例が数多く報告されてきたが,働き手の意見が取り上げられることは少ない。本研究は、野宿者が多い大都市近郊において,耕作放棄地の増大という社会的課題に着目し,高齢野宿者や若者対象の就労支援事業体などの参加を得つつ,農地再生により労働参加機会創出を試みるアクションリサーチを実施した。その結果,農業労働参加に参加者ごとに異なる意義を見出していることが明らかにされた。すなわち,野宿状態のまま就業できる,就労支援における「意欲喚起」に有効である,労働市場からの排除の予防に有効である,労働市場から排除されても生計を維持する方途となるなど多様である。近年の「自立支援」施策は「就労意欲喚起」に重きを置く傾向にあるが,むしろ求職者の就労意欲を可視化することが必要であり,そのうえで農業労働が有効であることが示唆された。最終年度には,インドの農民や研究者らと意見交換を行い,本研究が農村開発学に関する国際的な議論に関連付けることが可能か否かを検討した。インドにおいても,農民が主体的に獲得する知識や技能が農業技術発展の基盤を成してきたにも関わらず,それらに対する社会的な評価が低く,さらに日本のような転用規制がないため,離農や農地の改廃が進んでいる。農地を維持することの是非や意義,方法論などは国際的な議論に値する可能性がある。農学と社会福祉学を架橋する必要がある.2011年7月より,大阪府柏原市の耕作放棄地にて,農地再生事業を開始した。大阪市内の野宿者数名に日当を支払い,就労困難を抱える若者向けの就労支援を行う事業体の利用者などを受け入れ,2011年度は延べ200人以上が作業に参加した。その結果,約30aが農地として利用できるようになり,野菜や穀物の栽培を開始することができた。これにより,本研究を実行するための現場が完成した。また,大阪府や柏原市などの行政機関や教育機関,地域住民との連携関係が構築された。本研究期間内の目標は,参加者や潜在的参加希望者,一般市民などのニーズを明らかにし,それらのニーズのマッチングが可能であるか否かを実際に検討することである。

2011年度は,研究代表者と地権者や参加者のインフォーマルな対話の中から,さまざまなニーズを引き出すことができた。とりわけ重要な発見は,発達障害を抱える若者たちが安心して就労訓練を積むことができるという意義である。農作業体験を通して,働くことの自信を回復したり,得意あるいは苦手な動作を発見することにより,就職のためにどのような訓練が必要であるかを見出したりすることができた。また,就職した後に余暇を楽しむ場所として利用する者も現れた。農業労働の今日的な意義が明らかになりつつある。一方,日雇い建設労働から引退した高齢野宿者は,高齢者特別就労事業に次ぐ収入源として位置付けており,雇用創出というニーズも依然として重要である。地域住民や若者とともに創造的に働くことができることが本事業の特色である。本研究の特色であるボトムアップ型アクションリサーチという方法論が真価を発揮している。また,当初の想定を超えて,本事業には就職困難を抱える者のためのエンパワメントという位置づけが可能であることに鑑みれば,社会福祉学のみならず,教育学と農学諸分野が連携する機会を提供することができると考えられる。本研究の全体としての目的は,アクションリサーチという形で棚田再生事業による雇用創出を試みることを通して,ボトムアップ方式で社会的包摂を実現する過程のモデルを,次の2点に着目して提示することである。第一に,地権者や就労希望者,あるいは今後参加しうる可能性のある潜在的就労希望者や一般市民などの,事業に対するニーズを明らかにすること。第二に,それぞれのニーズマッチが可能か否か,事業を実際に運営しながら検討すること。本研究の結果,遊休農地を再生したい農政や農地所有者,仕事が欲しい高齢野宿者,就労訓練の場が欲しい若年就職困難者や就労支援事業体などの間で,ニーズを合致させることができた。社会的包摂と呼べる状態にどこまで近付けるかは議論の余地があるが,人材と財源さえあれば農地再生事業による雇用創出は可能であることが示された。さらに,想定外の成果として,高齢野宿者が若年就職困難者を指導する立場に立つことができ,さらにそのために若者が野宿者に対して抱いていた偏見を払拭することができるなど,高齢野宿者と若者の協働が可能であることも明らかにされた。また,農地再生は,就労支援の手段なのか,目的なのかという,就労支援とは何かをめぐる根源的な問題提起もなされている。2011年度計画のうち,(1)「過去の失敗事例の掘り起し」として,過去に農村に野宿者を研修生として受け入れる試みの失敗例から教訓を得ること,(2)事業経費の確保,(3)参加者に対する面接調査と参加者によるブレインストーミング,の3点が未完了である。(1)については,2011年度には成功事例も報告されており,得るべき教訓の内容が当初想定していたものほど単純ではないこと,また,本事業の趣旨が当初の想定から変化しつつあり,野宿者以外の就職困難者の比重が大きくなりつつあることのふたつの理由から,計画を立て直す必要が生じている。しかし,2011年度は勤務先である学生ボランティア支援室が多忙を極め,予定通りのエフォートを確保できなかったため,計画を立て直すには至らなかった。
糖尿病の脂質代謝異常および動脈硬化の成因にはたす血管内皮リパーゼの役割の解明

1.炎症時の低HDL-C血症にはたす血管内皮リパーゼ(EL)の役割ELノックアウトマウス、トランスジェニックマウスに対してLPSを腹腔内に投与し、ELの発現、脂質の変化について検討した。野生型マウスではLPS投与によって全身の炎症が生じ、ELの発現が亢進した。この際に、血液中のHDL濃度が低下した。一方、ELノックアウトマウスでは、全身の炎症は軽度であり、HDL濃度にも変化が認められなかった。さらに、死亡率を検討したところ。ELノックアウトマウスはLPSに対して抵抗性であり、死亡率は低下していた。これらの結果から、ELはHDL代謝を介して炎症の制御を行っており、ELを不活化することでHDLは増加し、炎症に対して抵抗性になると考えられた。2.ヒトELとHDL-Cおよび急性心筋梗塞との関連ヒト血中ELの測定系として、当院循環器内科に入院された患者150人のELを測定した。ヒト血中EL濃度は平均335ng/mlであり、年齢や性差との関係は認めなかった。また、血清中のHDL-Cと逆相関していた。一方、TGや総コレステロールやLDLコレステロール、中性脂肪との相関は認めなかった。さらに、ELの遺伝子多型(SNPs)と急性心筋梗塞の発症との関係を検討した。その結果、T alleleは急性心筋梗塞の発症リスクを低下させており、584C/T遺伝子多型がHDL-C値とは独立して急性心筋梗塞の発症に関与していることが明らかとなった。以上の結果より、ELはメタボリックシンドロームや2型糖尿病などの慢性炎症にともなう低HDL血症の成因に関与している可能性が考えられた。さらに、ELは動脈硬化をはじめとする血管病変の形成に重要な役割を果たしている可能性が考えられた。ELが炎症の制御にはたす役割を検討する目的で、ELノックアウトマウスに対してLPSを腹腔内に投与し、死亡率や組織の炎症の程度、炎症性サイトカインの誘導について検討した。野生型マウスではLPS投与によって全身の炎症が生じ、ELの発現が亢進していた。一方、ELノックアウトマウスでは、サイトカインの誘導は抑制されており、全身の炎症も軽度であった。また、ELノックアウトマウスの死亡率は野生型マウスに比べて低いものであった。ELノックアウトマウスではHDL濃度も高値のままで炎症によっても低下しなかった。また、これらのELの発現は抗炎症作用を有すると報告されているスタチンによって発現が抑制されることが明らかとなった。これらの結果から、ELはHL代謝を介して炎症の制御を行っており、ELを不活化することでHDLは増加し、炎症に対して抵抗性になると考えられた。2.ELの測定法の開発と脂質代謝にはたす意義ELがヒトの脂質代謝にどのように働いているかについて明らかにする目的でELに対するモノクローナル抗体を作成し、ELのELISAによる測定系を確立した。ヒト血液中のELの濃度は平均で約330ng/mlであり、総コレステロールやトリグリセリドとは相関していなかったが、HDL-C濃度とは逆相関していた。以上の結果より、ELはマウスだけではなくヒトのHDL代謝に重要な役割を果たしており、血管局所や組織での炎症の制御を行っていると考えられた。1.炎症時の低HDL-C血症における血管内皮リパーゼ(EL)の役割ELノックアウトマウス、トランスジェニックマウスに対してLPSを腹腔内に投与し、ELの発現、脂質の変化について検討した。一方、ELノックアウト

マウスでは、全身の炎症は軽度であり、HDL濃度にも変化が認められなかった。さらに、死亡率を検討したところ。ELノックアウトマウスはLPSに対して抵抗性であり、死亡率は低下していた。これらの結果から、ELはHDL代謝を介して炎症の制御を行っており、ELを不活化することでHDLは増加し、炎症に対して抵抗性になると考えられた。2.マクロファージにおけるELの発現調節と役割マクロファージではLPSによってELの発現が誘導され、それにはToll-like receptor 4が関係していた。また、発現したELはLDLの取込みを促進した。これらのELの発現やLDLの取込みはスタチンによって抑制された。3.ヒトELとHDL-Cおよび急性心筋梗塞との関連ヒト血中ELの測定系として、当院循環器内科に入院された患者150人のELを測定したところ、血清中のELはHDL-Cと逆相関していた。一方、TGや総コレステロールやLDLコレステロール、中性脂肪との相関は認めなかった。さらに、ELの遺伝子多型(SNPs)と急性心筋梗塞の発症との関係を検討した。その結果、T alleleは急性心筋梗塞の発症リスクを低下させており、584C/T遺伝子多型がHDL-C値とは独立して急性心筋梗塞の発症に関与していることが明らかとなった。以上の結果より、ELはメタボリックシンドロームや2型糖尿病などの炎症時の低HDL血症の成因に関与している可能性が考えられた。さらに、ELは動脈硬化をはじめとする血管病変の形成に重要な役割を果たしている可能性が考えられた。
ITS構想実現化へ向けての端末物流システムと都市交通計画に関する研究

本年度の研究概要は、昨年度までの調査実績から得られた結果をもとに、端末物流実態の現象解析を行った。特に、日別・業種別の利用台数などからみたポケット・ローディング・システムの利用特性の分析や、路上駐車との比較からみた導入効果の検討を行った。路上駐車車両と比較すると駐車時間、ヨコ持ち件数、ヨコ持ち距離ともにポケット・ローディングを利用した方が長く、ドライバーの取り締まり等への安心感を反映した結果となった。さらに、ポケット・ローディングをシステムとして構築するため、ITS技術の応用やコントロール・センターまで含めたポケット・ローディング・システムの全体構成の提案を行った。ポケット・ローディングは、1ヶ所の設置だけでも効果は認められたが、情報・予約などを組み込むことで、システムとして機能させるとさらなる効果が期待できる。また、各ポケット・ローディングをネットワーク化することにより、利用状況の情報提供、予約システムを構築し、システマチックに機能させれば、うろつき交通の排除、集配送の計画的配送が河能となる。総合評価の検討では、評価項目や評価主体を含めた評価方法の提案をすると同時に、その評価手法を用いた各評価主体ごとの総合評点の比較案の検討を行った。また、どのくらいの数のポケット・ローディングを設置すれば、荷さばきの伴う貨物車の路上から路外への転換ができるかといった検討も行う。本年度の研究概要は、福岡市天神地区における共同輸配送システムの調査、高松市における物流効率化のためのポケット・ローディング・システムの調査、そして東京都六本木地区におけるポケット・ローディング・システムのモデル実験の3つからなる。福岡市における調査では、まず共同輸配送会社の集配送システムとその現状を調査した。さらに、福岡市および福岡県警で行政側からの共同輸配送に対する支援や路上駐車規制等についてのヒアリング調査を行った。高松市においては、1996年12月から中央商店街に設置された路外荷捌き場(ポケット・ローディング)における利用実態の調査を行った。そして、東京都六本木地区におけるモデル実験については、1998年11月24日(火)から12月11日(金)の実験期間を設け、地区内に4カ所、7スペースのポケット・ローディングを配置した。この実験では、情報中央処理システムによる物流車自動管理システムの構築を行い、満空情報案内・予約システムを実験導入することで、路上での荷物のつみおろし駐車車両を路外へ誘導し、集配送活動実態の変化を現場実態調査を通してデータ収集および分析を行った。これまでの分析結果をまとめると、実験期間14日間のポケット・ローディング利用台数は147台で、うち荷捌き車両は127台で86.3%の実績を得た。さらに、駐車車両の50パーセンタイル値は、ポケット・ローディシグ利用車両で51.0分、路上利用車両で12.0分という駐車時間の差が確認できた。このように、ポケット・ローディング利用者は、路上駐車に比べて相対的に駐車時間が長く、ドライバーへのヒヤリングでも作業上の安全性の向上、荷物の運搬活動の効率化の点で変化がみられた。今後は、より詳細な解析データをもとに、ITSの実現化をふまえた新たな端末物流システムと都市交通計画の構築のための具体的な提案を行う。ポケット・ローディングは、1ヵ所の設置だけでも効果は認められたが、情報・予約などを組み込むことで、システムとして機能させるとさらなる効果が期待できる。また、各ポケット・ローディングをネットワーク化することにより、利用状況の情報提供、予約システムを構築し、システマチックに機能させれば、うろつき交通の排除、集配送の計画的配送が可能となる。

総合評価の検討では、評価項目や評価主体を含めた評価方法の提案をすると同時に、その評価手法を用いた各評価主体ごとの総合評点の比較案の検討を行った。また、どのくらいの数のポケット・ローディングを設置すれば、荷さばきの伴う貨物車の路上から路外への転換ができるかといった検討も行う。
アラームシグナル細胞外RNAの制御による血管恒常性維持

RNase活性の発現が高い血管内皮細胞と比較して血球からのRNase活性発現が低いことを明らかにした。mRNAレベル、タンパク質レベルの発現において、血管内皮細胞が血球よりRNase 1の発現が明らかに高いことに対し、RNase inhibitor (RI)の発現は細胞間で大きな差がないことから、血球ではRIがRNase 1を抑制していることが推測できる。血管損傷部では高いRNase活性を持つ血管内皮細胞が損傷され、血小板、白血球が集まって血栓を形成することでRNase活性を低下させている機序が想定できる。炎症部位では活性化された血小板や白血球が病的な血栓形成を促進する可能性も考えられる。背景:細胞外RNAが血液凝固促進因子・血管透過性因子であることを我々は既に報告している.細胞外RNAはRNase 1により,分解されると考えられる.目的:血液と接触する細胞におけるRNaseとそのインヒビターであるRNase inhibitor (RI)の発現や局在を解析して,アラームシグナルとしての細胞外RNAの調節機構を探っている.方法:血球細胞におけるRNase 1とRIの発現,RNase活性の発現を,ヒト臍帯静脈血管内皮細胞株EAhy926細胞と比較し,ウェスタンブロット,免疫化学染色,透過免疫電顕,RNase活性テストを用いて解析している.抗腫瘍薬により,抗凝固作用のあるRNase 1発現への影響も検討している.結果と考察:RNase 1とRIタンパク質は血球細胞(単核球・多形核白血球・血小板)では,血管内皮細胞に匹敵する発現をみせているが,細胞外へ放出されるRNase 1活性は,血管内皮細胞で顕著に高かった.血管内皮細胞がRNase活性放出による抗凝固作用の主役を演じ,血球から放出されるRNase活性はRIの放出によりブロックされる機序が考えられた.血管内皮細胞は培養上清中のRNase活性を経時的に増加させていくが,トロンビン刺激は経時的に低下させてゆく.トロンビンによる凝固亢進への関与が考えられる.一方,多発性骨髄腫の治療薬として用いられているボルテゾミブは,血管内皮細胞におけるRNase 1の発現をmRNAレベルから低下させ,RNase活性の放出を低下させていく現象がみられた.ボルテゾミブによる血管透過性亢進による浮腫などの副作用の原因となることも考えられる.血管の損傷により細胞から放出される細胞外RNAは新しい凝固促進因子、血管透過性因子であり、RNaseによって阻害される。8種類のRNaseの中で、血漿中に最も多く、RNA分解作用を強く持つRNase 1は膵臓や血管内皮細胞に発現することが知られているが、血球における詳細な発現や局在に関しては明らかではない。血小板、単核球(MNCs)、多形核顆粒球(PMNs)、赤血球(RBCs)におけるRNase 1とその阻害因子であるRNase inhibitor (RI)のmRNAレベル、タンパク質レベルでの発現と局在、細胞内外のRNase活性を調べ、ヒト臍帯静脈内皮細胞株であるEAhy926と比較した。また、血小板活性化物質であるトロンビンによって刺激した血小板のRNase発現を調べた。血管内皮細胞が放出するRNase活性は血球が放出するRNase活性に比べて50倍高く(60分後)、また時間が経つにつれて活性が上がっていることを明らかにした。細胞溶解液中のRNase活性においても血管内皮細胞が血球の10倍と最も高い活性を保持していた(60分後)。RNase 1のmRNAレベルの発現は血管内皮細胞が血球の2.6倍で最も高かったが、RIのmRNAレベルの発現に大きな差は見られなかった。血管内皮細胞と血小板においてRNase 1がvon Willebrandfactor (VWF)と一部共局在している様子が見られた。免疫蛍光染色によりトロンビンを加えて活性化させた血小板中のRNase 1が活性化していない血小板より少なく見られたことから、トロンビン刺激した血小板内外のRNase活性を測定した。しかし細胞溶解液中のRNase活性が低下していることに対し、上清中のRNase活性に有意な差は見られなかった。RNase 1と共にRIが放出され、RNase活性を抑制している可能性が示唆された。また、mRNAレベルの発現においてRNase 1の発現がRIの発現より高いことから、RIがRNase 1を抑制していることが推測できる。従って血管損傷部では高いRNase活性を持つ血管内皮細胞が損傷され、血小板、白血球が集まって血栓を形成することでRNase活性を低下させている機序が想定できる。しかし炎症部位では活性化された血小板や白血球が病的な血栓形成を促進する可能性も考えられる。タンパク質レベルの発現においても血管内皮細胞から放出されるRNase 1の発現は血球に比べて高く、RIの発現に差は見られなかった。Post-embedding methodを用いて血管内皮細胞と血小板におけるRNase 1の局在を検討したところ、RNase 1がvon Willebrand

factor (VWF)と一部共局在している様子が見られた。VWFは血管内皮細胞ではWeibel-Palade bodies (WPB)と呼ばれる分泌小胞に、血小板ではα顆粒に局在することが知られているが、この方法では細胞小器官をはっきりと観察することはできなかった。そこでPre-embedding methodを用いたところ、Post-embedding methodよりも鮮明な像を得ることができた。以上よりRNase 1はVWFと血管内皮細胞ではWPBで、血小板ではα顆粒で一部共局在していることを明らかにした。免疫蛍光染色により、血小板にトロンビンを加えて活性化させることで、血小板中のRNase 1の発現が活性化していない血小板より低下している様子が見られた。そこでトロンビン刺激した血小板上清中のRNase 1、RIのタンパク質レベルでの発現を刺激していないものと比べると、RNase 1、RI共に発現が増加することがわかった。しかしRNase活性に有意な差は見られなかった。RNase 1と共にRIが放出されたことで、RIがRNase活性を抑制している可能性が示唆された。RNase活性の発現が高い血管内皮細胞と比較して血球からのRNase活性発現が低いことを明らかにした。mRNAレベル、タンパク質レベルの発現において、血管内皮細胞が血球よりRNase 1の発現が明らかに高いことに対し、RNase inhibitor (RI)の発現は細胞間で大きな差がないことから、血球ではRIがRNase 1を抑制していることが推測できる。血管損傷部では高いRNase活性を持つ血管内皮細胞が損傷され、血小板、白血球が集まって血栓を形成することでRNase活性を低下させている機序が想定できる。炎症部位では活性化された血小板や白血球が病的な血栓形成を促進する可能性も考えられる。正常各血球細胞におけるRNase 1とRNase inhibitorのmRNA,タンパク質発現や,細胞外への活性放出の,おおまかな評価を血管内皮細胞と比較しながら,手がけることができた.血管内における血管内皮細胞、血球細胞による、細胞外RNA/ RNAase/ RNase inhibitor発現を明らかにしつつあるため、細胞内血液凝固・血管透過性調節機序について、より詳細な解析を継続してゆく。トロンビンやその他の血小板凝集惹起物質、炎症性サイトカイン、抗腫瘍薬などの薬剤によるRNase活性の変化にも注目してゆく。それらは、血管内恒常性維持に関与するアラームシグナルとしての柴葉王がRNA放出とその調節機序を明らかにする、と考えられるからである。血液凝固調節血管内における血管内皮細胞,各血球細胞による,細胞外RNA/ RNase/ RNase inhibitor発現を明らかにし,細胞内血液凝固・血管透過性調節機序に関して,より詳細な解析を持続していく.トロンビンやサイトカイン,抗腫瘍薬などの薬剤によるRNase活性の変化にも注目してゆく.それらは,血管内恒常性維持に関与するアラームシグナルとしての細胞外RNA放出とその調節機序を明らかにする,と考えられるからである.
口腔前癌病変と扁平上皮癌の細胞診断およびHPV検査システムの構築

扁平上皮癌あるいは前癌病変が疑われる症例の細胞診の依頼は約100件あり、細胞診断を行った結果、陽性例はすべて扁平上皮癌であり、陰性例はすべて良性病変であった。また、そのうち50例についてDNAを抽出しHPVの検出を行ったが、陽性症例はなかった。また、細胞二重免疫染色の有用性を確認するために、p53,p16二重染色を行った。p53陽性例はすべて扁平上皮癌で、扁平上皮癌以外の症例はすべて陰性であったが、検出感度は30%と低かった。p16に関しては感度・特異度ともに有意な結果は得られなかった。口腔癌において、タバコとアルコールが重要なリスクファクターであるが、近年はヒトパピローマウイルスも発癌の原因の一つであるといわれている。一方、口腔領.域における細胞診の普及率はまだまだ低いが、擦過細胞診による口腔癌検診も日本各地で行われはじめている。これまで我々が、子宮頸部病変の解析をもとに口腔病変におけるヒトパピローマウイルス感染を同定する方法を検討した結果から、少なからずヒトパピローマウイルスが口腔癌の発生に関与する可能性が考えられた。本研究では細胞診にもそれを応用し、細胞診断およびヒトパピローマウイルス検出システムを構築することを目的とし、具体的には、口腔白板症と扁平上皮癌症例からえられた検体を用いて細胞診の診断基準を確立し、また、同時にヒトパピローマウイルス遺伝子の解析を行い発癌との関連について調べた。今年度、研究分担者が所属する診療科から、扁平上皮癌あるいは前癌病変が疑われる症例の細胞診の依頼は6件あった。ブラシを用いた擦過材料から、パパニコロウ染色標本を作製し、細胞診断を行った。また、ブラシに付着した残りの検体からDNAを抽出し、コンセンサスプライマーを用いたPCR法と、倉敷紡績株式会社に依頼して行ったHPV typing法によりヒトパピローマウイルスの検出を行った。細胞診に関しては、後に行った組織診との間に食い違いはみられなかった。ヒトパピローマウイルスに関しては、今までの症例は全て陰性である。今後は、症例を迫加し検討を加えていく。一方、口腔領域における細胞診の普及率はまだまだ低いが、擦過細胞診による口腔癌検診も日本各地で行われはじめている。今年度までに、研究分担者が所属する診療科から、扁平上皮癌あるいは前癌病変が疑われる症例の細胞診の依頼は約50件であった。ブラシを用いた擦過材料から、パパニコロウ染色標本を作製し1、細胞診断を行った。細胞診断に関しては、後に組織診を行った症例について結果を比較したところ、大きな違いが認められたものはなかった。HPVについては、コンセンサスプライマーを用いたPCR法でもHPV typing法においても陽性所見が得られた症例はなかった。今年度までに、研究分担者が所属する診療科から、扁平上皮癌あるいは前癌病変が疑われる症例の細胞診の依頼は約100件であった。ブラシを用いた擦過材料からパパニコロウ染色標本を作製し細胞診断を行った結果、陽性例はすべて扁平上皮癌であり、陰性例はすべて良性病変であった。

また、そのうち50例について、ブラシに付着した残りの検体からDNAを抽出し、コンセンサスプライマーを用いたPCR法とHPV typing法によりヒトパピローマウイルスの検出を行った。HPVについては、コンセンサスプライマーを用いたPCR法でもHPV typing法においても陽性症例はなかった。また、細胞二重免疫染色の有用性を確認するために、免疫染色可能な細胞診標本があり組織診断が確定している32症例についてp53,p16二重染色を行った。p53陽性例はすべて扁平上皮癌で、扁平上皮癌以外の症例はすべて陰性であったが、検出感度は30%と低かった。p16に関しては感度・特異度ともに有用な結果は得られなかった。細胞診の精度は上がってきており、検体数も安定している。HPVの検査を行った症例数も50症例を越え、目標としていた数は達成できた。24年度が最終年度であるため、記入しない。HPVが検出される症例は少ないと予想していたが、これまで50症例あまり検討したにも関わらず、1例も検出されなかった。この結果から、口腔癌の発生にHPVはほとんど関与しないことがわかったので、今後は細胞診断の精度を上げるために、主に免疫組織化学的な手法を用いて診断法を検討する。
都市河川河口域の底泥中での石油系炭化水素の分解浄化能力の評価

日常生活の中に、石油化学製品が広く入ってきている現在、都市河川での石油系炭化水素の汚濁は避けられない状況下にある。一方、都市河川における石油系炭化水素の底泥中の微生物による分解浄化についての知見はほとんど集積されていない。都市河川である多摩川河口域底泥において、石油系炭化水素の最大分解速度を検討することを目的とした。多摩川で大師橋直下で採取した底泥は、底泥:河川水=1:1(v/v)に混合して底泥スラリーを調製した。この底泥スラリー10mlに石油系炭化水素を添加し、一定期間培養後、ガスクロマトグラフィーあるいは分光光度計で定量した。初年度においては、嫌気条件下で最大分解速度を評価する場合、疎水性のヘキサデカン、フェナントレンおよびアントラセンは振盪分解培養よりも静置分解培養によって評価した方が適切であることを見いだした。次年度は以上の結果をふまえ、疎水性の石油系炭化水素である1-ヘキサデカノールおよび水溶性のρ-クロロフェノール、m-アミノ安息香酸の最大分解速度を従来の振盪分解培養と静置分解培養とで比較検討し、静置培養において高い値を得た。振盪分解培養が過小評価される原因として、振盪による菌体の損傷や基質との短い接触時間によるものではなく、培養条件が馴養の一要因となって分解過程が影響されることが明かとなった。そこで底泥をコア状に詰め、分解過程を検討したところ、ヘキサデカンは深さ方向では分解率の差異は見いだされなかったが、フェナントレンにおいては、深さ方向に比例して分解率は低下していった。日常生活の中に石油化学製品が広く入ってきている現在、都市河川での石油系炭化水素の汚濁は避けられない状況下にある。多摩川で採取した底泥は、底泥:河川水=1:1(v/v)に混合して底泥スラリーを調製した。この底泥スラリー10mlに石油系炭化水素を添加し、一定期間培養後、ガスクロマトグラフィーで定量した。その結果感潮域である大師橋直下の底泥について、嫌気的条件下で振盪培養および静置培養でヘキサデカンおよびアントラセンの微生物分解速度を把握した。底泥の最大分解速度を評価する上において、従来好気培養の場合と同様振盪培養で評価していたが、本実験の結果から嫌気条件下において静置培養で評価した方が最大分解速度としては適切であることが明らかになった。本実験結果をさらに確認するために、低い振盪回数の条件で同様に検討した結果、低振盪の条件では、静置と振盪の中間に曲線が位置していた。本実験と並行して、分解菌数を計測したところ、分解菌数も分解速度同様に振盪、低振盪、静置の順に菌数が高くなっていた。さらに最大分解速度と分解菌数は嫌気条件下では、振盪培養よりも静置培養の方が大きな値を得ることができることを確認した。この底泥スラリー10mlに石油系炭化水素を添加し、一定時間培養後、ガスクロマトグラフィーあるいは分光光度計で定量した。

昨年度においては、嫌気条件下で最大分解速度を評価する場合、疎水性のヘキサデカン、フェナントレンおよびアントラセンは振盪分解培養よりも静置分解培養によって評価した方が適切であることを見いだした。今年度は以上の結果をふまえ、疎水性の石油系炭化水素である1-ヘキサデカノールおよび水溶性のρークロロフェノール、mーアミノ安息香酸の最大分解速度を従来の振盪分解培養と静置分解培養とで比較検討し、静置培養において高い値を得た。振盪分解培養が過小評価される原因として、振盪による菌体の損傷や基質との短い接触時間によるものではなく、培養条件が馴養の一要因となって分解過程が影響されることが明らかとなった。そこで底泥をコア状に詰め、分解過程を検討したところ、ヘキサデカンは深さ方向では分解率の差異は見いだされなかったが、フェナントレンにおいては、深さ方向に比例して分解率は低下していった。
結核の潜在化機構の解析と、潜在化を利用した新しい結核制圧戦略の提案

結核は、2014年にも150万人が死亡したように現在も最大級の細菌感染症である。結核菌のすみかは人であり、無症候感染者の5-10%において、潜伏感染菌の再増殖が生じ、結核が発症する。したがって活動性結核に加え、無症候感染に対処することが結核の制圧につながる。本研究では、疾患の潜在化の機構解明を目指すとともに、結核の潜在化の維持や誘導による、新しい感染制御法を提案することを目的として実施した。成果として、動物において潜伏感染と再燃のモデルを作成した。また、結核菌の増殖抑止分子の人為的な誘導発現系を作成して菌の増殖を停止させ、増殖制御による治療法開発の可能性を示した。結核菌のすみかはヒトであり、感染者の5-10%で、潜伏菌の再増殖が生じ結核が発症する。したがい活動性結核に加え、潜在性結核に対処することが結核の制圧につながる。潜在期において結核菌は、増殖を停止した休眠状態にある。これまでに申請者は、Mycobacterial DNA-binding protein1 (MDP1)などの結核菌蛋白質を同定し、それが休眠のバイオマーカーとなることを明らかにしている。これまでの研究成果を基に、疾患の潜在化の機構解明をベースに結核の潜在化の維持や誘導による感染制御法を提案する。休眠結核菌の確認として、イソニアジド(INH)とメトロニダゾル(MTZ)に対する薬剤感受性試験を行った。増殖菌はINH処理に感受性で、MTZ処理に、抵抗性を示した。しかし休眠菌では反対にINH処理で抵抗性で、MTZ処理に感受性を示した。休眠菌の脂質成分の構成を、薄層クロマトグラフィーを用いて解析した。その結果、休眠菌でトリアシルグリセロールの増加とTrehalose dimycolate (TDM)とTrehalose mono mycolate (TMM)の減少が観察された。上記の結果をもとに、蛋白質の二次元電気泳動で、増殖菌と休眠菌の産生蛋白質の相違を観察した。その結果、トリアシルグリセロール合成酵素の産生増強や、TDMやTMM合成に関わるAg85 complexの産生の減衰が観察された。一方、生体内結核菌潜在下好気的呼吸において電子のアクセプターなどとして働く鉄に、結核菌の増殖が依存していることから、鉄キレーターの作用を検討した結果、増殖の抑止に働くとともに、休眠に関わるMDP1の発現量の変動を誘導することが分かった。活動性結核に加え、潜在性結核に対処することが結核の制圧につながる。これまでに申請者は、MDP1などの結核菌蛋白質を同定し、それが増殖抑止活性など休眠現象や潜在性結核の成立に強く関与することを明らかにしている。本研究では、これまでの研究成果を基に、疾患の潜在化の機構解明をベースに結核の潜在化の維持や誘導による感染制御法の提案を目指している。試験管内でマウス骨髄由来マクロファージに低酸素環境下で作成した休眠菌と対照として増殖菌を感染させ、産生される炎症性サイトカイン量を測定した。その結果、休眠菌は、増殖菌よりも炎症性サイトカイン産生能が低下していることが分かった。また各種ノックアウトマウスで同様の試験を行った結果、炎症性サイトカインの産生はほぼToll-like recptor 2に依存していることが判明した。また分担研究者の阿戸等は、ストレプトマイシン依存的に増殖する結核菌を用いて、マウスでの潜伏感染と再燃のモデルを構築した。ストレプトマイシン投与を停止した菌は、抗菌薬に対して抵抗性であることを確認した。増殖期抗原のESAT6やCFP10の産生や休眠マーカーのAcrや結核菌の増殖抑止分子であるMDP1の産生を免疫組織学的に解析を行っている。また、潜在時と再燃時での宿主応答の違いを検討している。MDP1の未発症者肺での発現を免疫組織学的に検討した。結核種であることが判明した健常者由来の肺組織切片を、HE染色、抗酸性染色、抗MDP1抗体でそれぞれ染色を行った。その結果、結核腫中央部が抗酸性染色に濃染し、同部位をMDP1抗体が強く染色することが分かった。本結果から、潜在期の結核で、実際にMDP1が産生されていることが判明した。結核は、2013年に150万人が死亡したように現在も最大級の細菌感染症である。結核菌のすみかはヒトであり、感染者(潜在性結核)の5-10%で、潜伏菌の再増殖が生じ結核が発症する。したがい活動性結核に加え、潜在性結核に対処することが結核の制圧につながると申請者は考え、潜在性結核のメカニズムを解析している。潜在期において結核菌は、増殖を停止した休眠(dormant)状態にある。これまでに結核菌の増殖停止の鍵となる蛋白質MDP1を同定し、それがヒト潜在性結核のバイオマーカーとなることを明らかにしている。これまでの研究成果を基に、疾患の潜在化の機構解明を目指すとともに結核の潜在化の維持や誘導による新しい感染制御法を提案することを目的としている。結核潜在化の鍵分子の一つであるMDP1の発現を制御する宿主ーベクター系の構築を試行した。

作成したベクターを弱毒のMycobacterium smegmatisに導入したが、MDP1の発現にともない増殖が顕著に抑制され、ベクターの改良が必要であることがわかった。現在、よりタイトに制御可能な宿主ベクター系を作成しており、結核菌の組み換え実験の大臣承認後、組み換え実験を実施する。一方、結核菌感染者におけるMDP1を含めた結核菌抗原に対する抗体とT細胞応答を検出した。その結果、ESAT6やCFP10などの結核菌抗原に対する抗体・T細胞応答は活動期において顕著であるのに対し、MDP1やHrpAに対する応答は、潜在性結核で顕著であることが判明した。IFN-gamma産生Th1細胞に加え、IgA応答が非発症者で旺盛であることが判明し、本結果の論文発表を行った。また結核肉芽腫においてMDP1の発現部位に顕著に産生される宿主分子を同定した。試験管内の検討において本宿主分子は、結核防御に重要なサイトカインIFN-gammaの作用に関わるとともに、菌が細胞内増殖に利用する炭素源量を低下させる活性があり、結核の潜在化に関与する可能性が示唆された。結核は、2014年にも150万人の死亡が報告されたように現在も脅威的な細菌感染症である。結核菌のすみかは人であり、非発症感染者(潜在性結核や陳旧性結核)の5-10%において、潜伏感染菌の再増殖が生じ、疾患が発症する。したがって活動性結核に加え未発症者に対処することが結核の制圧につながると申請者は考え、結核菌の潜伏感染機構を解析している。潜伏期において多くの結核菌が増殖を停止した休眠(dormant)状態にあるが、申請者は結核菌の増殖停止の鍵となる蛋白質MDP1を同定し、それが非発症感染者のマーカーとなることを明らかにしている。本研究では、これまでの研究成果を基に、疾患の潜在化の機構解明を目指すとともに、結核の潜在化の維持や誘導による、新しい感染制御法を提案することを目的としている。MDP1を抗酸菌で誘導発現する系を構築した。抗酸菌由来アセトアミダーゼ遺伝子を、pSO246プラスミドに挿入し、そのプロモーター下流に、結核菌およびM. smegatis由来MDP1遺伝子を挿入した。これらのプラスミドにより、MDP1欠失M. smegmatisと結核菌(Mycobacterium tuberculosis H37Rv株)の形質転換体を得た。アセトアミドの添加によって、MDP1の発現が誘導され、さらに菌の増殖が停止することが判明した。さらに、増殖を停止した菌は、生存しており、イソニアジド抵抗性であることを確認した。本結果から、MDP1の発現により、休眠に類似の状態が再現できることが分かった。本結果を、現在組み換え結核菌を用いて確認している。MDP1の発現を増強し、潜在化を誘導する物質のスクリーニングを開始した。MDP1を発現する大腸菌に、放線菌由来のライブラリーを加え、増殖抑制の有無で、効果を判定している。結核は、2014年にも150万人が死亡したように現在も最大級の細菌感染症である。結核菌のすみかは人であり、無症候感染者の5-10%において、潜伏感染菌の再増殖が生じ、結核が発症する。したがって活動性結核に加え、無症候感染に対処することが結核の制圧につながる。本研究では、疾患の潜在化の機構解明を目指すとともに、結核の潜在化の維持や誘導による、新しい感染制御法を提案することを目的として実施した。成果として、動物において潜伏感染と再燃のモデルを作成した。
ナノ粒子化活性酸素消去剤による脳虚血再灌流障害の神経血管ユニット保護療法の開発

本研究では、我々が開発したナノ粒子化フリーラジカル消去剤RNP (Nitroxide Radical-containing Nanoparticles)を、閉塞脳動脈の再開通時にカテーテルより直接脳虚血領域へ動脈投与することで、効果的にROSを消去し、脳虚血再灌流障害による出血性合併症や脳梗塞拡大を抑制する、新たな脳保護療法の開発を目指している。2018年度は、1RNP至適投与量の検証、2脳内分布の評価、3既存薬エダラボンとの比較試験、を行った。1RNPの至適投与量をDose response curveで評価したところ、9mg/kg (17mM)が最も生存率が高く、濃度依存性に脳梗塞体積を縮小し、神経症状を改善させることを明らかにできた。2ローダミン標識したRNPを用いたRNPの脳内分布の評価では、脳梗塞周辺部のペナンブラ領域において、RNPは脳血管内皮、及び、神経細胞内の細胞質に最も多く分布していることを明らかにした。このことは、RNPは破綻した血液脳関門を通過し、虚血環境にある神経細胞ではRNPは細胞膜から細胞質に取り込まれ、ミトコンドリアの酸化ストレスを制御している可能性を示唆した。3既存薬エダラボンとの比較試験では、マウス一過性中大脳動脈閉塞(1時間虚血)再開通後に、RNP9mg/kg(n=20)またはエダラボン3mg/kg(n=20)を投与した。その結果、マウスの生存率は、RNP群が有意に高かった。Longa scoreによる神経症状の評価では、RNP群において有意に神経症状が軽度であった。本研究により、RNPは脳主幹動脈閉塞症などの重症脳梗塞の脳虚血再灌流障害を抑制し、死亡率を低下させ、神経症状を軽減する可能性を明らかにした。予定していた1RNP至適投与量の検証、2脳内分布の評価、3既存薬エダラボンとの比較試験の研究は順調に進展したためRNPの脳内分布、及び神経血管ユニット保護効果ついて、血管内皮、血管周皮、神経細胞、アストロサイト、ミクログリアの酸化ストレス評価と解剖学的、形態学的評価の解析を進める。特に、RNPは血管周囲のアストロサイト、及びミクログリアへの周囲に集積も認めた。前者ではRNPがアストロサイト終足を含めた血液脳関門の保護効果を発揮している可能性を示唆し、後者では、RNPが神経障害型ミクログリア(M1)と神経保護型(M2)と言われているミクログリアの極性転換に影響を及ぼしている可能性があり、今後、更なる解析を行う予定である。また、RNPで治療した脳梗塞組織の抗酸化能を、電子スピン共鳴法(EPR)による脳の各種活性酸素種(・O2-,・OH,・ROO,・RO,⊿1O2)に対する抗酸化能測定により行い、エダラボンと比較する。将来的には、GMP基準のRNPの製造開発及び品質管理システムを構築すること、RNPの非臨床POCを確立すること、非臨床試験にてRNPの安全性を確立すること、これらの基礎研究とその後の治験・実用化戦略のために企業との連携、共同研究契約を行うことも目標としている。2018年10月18日PMDARS総合相談を実施しており、First in Human試験に向けて、十分なRNPの安全性と有効性を確立すること、企業とのマッチング、連携を進めることを確認した。RNPを再灌流直後に頚動脈カテーテルより直接動脈投与することで効果的にRNPを脳虚血巣で働かせる脳保護療法の開発は、脳梗塞に対する急性期再開通療法後の虚血再灌流障害による脳梗塞増悪や出血性合併症を解決し、Therapeutic time windowを拡大できる新たな治療法として期待できる。脳主幹動脈閉塞急性期における血栓回収療法の有効性は明らかだが、再開通療法後に発生する活性酸素による脳虚血再灌流障害は、脳梗塞拡大や出血性合併症を起こし、治療転帰を悪化させる。その為、脳虚血灌流障害を防ぐための新たな脳保護療法の開発が必要である。本研究では、ナノ粒子化活性酸素消去剤(RNP: Radical containing nanoparticles)を、一過性中大脳動脈閉塞モデルに頸動脈投与し、神経血管ユニット保護効果とその作用機序、用量反応関係評価、既存薬(エダラボン)との比較試験を行った。【方法】マウス一過性中大脳動脈閉塞モデルにおいて、再開通20分後に薬剤を頸動脈投与した。24h後にRNPの脳梗塞巣における分布、容量反応関係評価とRNPの至適投与量の検討、エダラボンとの有効性を比較した。【結果】RNPの脳内分布の評価では、RNPは、脳血管壁のみならず、血管外腔への分布し、神経細胞、アストロサイト、ミクログリア周囲に集積を認めた。用量反応関係から得られる至適投与量の検討では、RNPは濃度依存性に脳梗塞を抑制し、神経症状を改善させた。至適投与容量は9mg/kgであった。エダラボンとの比較試験は、エダラボンの至適投与量を検討し、3mg/kgが指摘であった。比較試験は実施中である。【まとめ】脳虚血再灌流後に頸動脈投与されたRNPは、血管外腔の中枢神経細胞周囲への分布を認めており、脳虚血部の血液脳関門を通過して、神経血管ユニット保護効果を発揮している可能性が示唆された。用量反応関係評価では、RNPは濃度依存性に効果を発揮し、至適投与量を決めることができた。

脳虚血再灌流後に頚動脈から直接脳虚血部にRNPを動注することは、血栓回収療法後の脳虚血再灌流障害を抑制する新たな神経血管ユニット保護療法としての可能性が期待された。今年度の研究計画は、1RNPの脳血管壁及び血管外腔への分布の検証。2血液脳関門、中枢神経細胞の保護効果の検証。3脳虚血再灌流領域における神経血管ユニット構造の評価であった。1については、ローダミン標識RNPによりRNPの脳内分布を解剖学的に評価し、RNPの中枢神経細胞周囲への集積を確認できた。2については脳血管内皮保護効果、神経保護効果を蛍光抗体法により証明することができた。3については、次年度以降の評価とし、その代わりに、平成31年度に予定していた4既存薬エダラボンとの比較試験を開始した。RNPが既存薬と比べて有効かどうか、また脳梗塞のどのような病態を改善させる可能性があるのかについて検証を開始した。現在、エダラボンの至適投与量を確定させ、RNPとの比較試験を継続している。よって、平成29年度の研究進捗としてはおおむね順調に進展していると考えている。本研究では、我々が開発したナノ粒子化フリーラジカル消去剤RNP (Nitroxide Radical-containing Nanoparticles)を、閉塞脳動脈の再開通時にカテーテルより直接脳虚血領域へ動脈投与することで、効果的にROSを消去し、脳虚血再灌流障害による出血性合併症や脳梗塞拡大を抑制する、新たな脳保護療法の開発を目指している。2018年度は、1RNP至適投与量の検証、2脳内分布の評価、3既存薬エダラボンとの比較試験、を行った。1RNPの至適投与量をDose response curveで評価したところ、9mg/kg (17mM)が最も生存率が高く、濃度依存性に脳梗塞体積を縮小し、神経症状を改善させることを明らかにできた。2ローダミン標識したRNPを用いたRNPの脳内分布の評価では、脳梗塞周辺部のペナンブラ領域において、RNPは脳血管内皮、及び、神経細胞内の細胞質に最も多く分布していることを明らかにした。このことは、RNPは破綻した血液脳関門を通過し、虚血環境にある神経細胞ではRNPは細胞膜から細胞質に取り込まれ、ミトコンドリアの酸化ストレスを制御している可能性を示唆した。3既存薬エダラボンとの比較試験では、マウス一過性中大脳動脈閉塞(1時間虚血)再開通後に、RNP9mg/kg(n=20)またはエダラボン3mg/kg(n=20)を投与した。その結果、マウスの生存率は、RNP群が有意に高かった。Longa scoreによる神経症状の評価では、RNP群において有意に神経症状が軽度であった。本研究により、RNPは脳主幹動脈閉塞症などの重症脳梗塞の脳虚血再灌流障害を抑制し、死亡率を低下させ、神経症状を軽減する可能性を明らかにした。予定していた1RNP至適投与量の検証、2脳内分布の評価、3既存薬エダラボンとの比較試験の研究は順調に進展したため平成30年度は、1RNPの脳内分布の評価について、より詳細な解剖学的解析を行う。また、RNPの作用機序についてどのような中枢神経細胞の保護効果が高く、神経血管ユニットを保護しているのか、明らかにする。4RNPとエダラボンの比較試験を終了させて、RNPを血栓回収療法後の脳保護薬としての開発することの必要性を明らかにする。