hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
Elovl6による脂肪酸の質的変容が起こす多臓器代謝病態と脳行動異常のメカニズム

6は肥満にともなう脂肪組織の慢性炎症には重要ではないことが明らかとなったが、lipolysisやベージュ化に関与する可能性を示唆する結果が得られた。脳特異的Elovl6欠損マウスでは脳重量の増加や各種行動異常が認められ、これらの異常に重要な脳部位、脳機能、シグナル伝達経路を見出した。また、上記の各Elovl6コンディショナルKOマウスの脂質プロファイルの解析から、Elovl6の欠損により各臓器・細胞で共通して影響が認められる脂質クラスが明らかとなった。Elovl6がこの脂質クラスにおよぼす影響は、生活習慣病や高次脳機能のみならず、がんや免疫にも関与する可能性が示唆される。肝臓特異的Elovl6欠損マウスは高ショ糖食の給餌や肥満モデルob/obマウスとの交配により、対照マウスに比べてインスリン感受性が亢進した。肝臓のトランスクリプトーム解析およびリピドミクス解析により、Elovl6欠損およびインスリン感受性と相関する遺伝子Xおよび脂質Yを見出し、これらが肝臓のインスリン感受性を制御することを明らかにした。Elovl6欠損マウスを2型糖尿病モデルdb/dbマウスと交配すると、膵β細胞量とインスリン分泌量が増加することにより2型糖尿病の発症・進展が抑制されることを明らかにした。また、Elovl6欠損により神経新生が低下し、様々な脳機能異常が生じることを明らかにした。今後は肝臓、膵ベータ細胞、マクロファージ、脳におけるElovl6の役割とそれに重要な脂質を特定し、その機能を細胞および個体レベルでの解析により明らかにする。肝臓特異的Elovl6欠損マウスの解析については、これまでに見出した分子や脂質とElovl6によるインスリン感受性制御メカニズムをin vitroおよびin vivoの系で解析する。ベータ細胞特異的Elovl6欠損マウスについては、Elovl6によるベータ細胞機能の調節メカニズムを解析する。マクロファージ特異的Elovl6欠損マウスは、マクロファージのElovl6が熱産生機構に関与するか検討する。脳特異的Elovl6欠損マウスでは、脳において重要なElovl6の機能を、ニューロン特異的Elovl6欠損マウスおよびアストロサイト特異的Elovl6欠損マウスでも解析するとともに、prima初代培養やニューロスフェアのトランスクリプトーム解析および脂質メタボローム解析からも明らかにする。29年度が最終年度であるため、記入しない。代謝・内分泌学29年度が最終年度であるため、記入しない。
染色体部位特異的に大きなサイズの遺伝子を導入する新しい遺伝子治療技術の開発

野生型アデノ随伴ウイルス(AAV)はそのウイルスゲノムを第19番染色体AAVS1領域(19q13.3-ter)に特異的に組み込む性質を有しており、遺伝子治療用ベクターへの応用が期待されている。この部位特異的組込み反応は、AAV-Rep蛋白質とウイルスゲノム両端のITRを介するものと考えられている。そこで、RepとITRを利用したTVI(targeted vector integration)法が最近開発された。AAV-RepにはRep78,Rep68,Rep52,Rep40の4種類が存在するが、本研究ではTVI反応に関与するRepを明らかにするため、各々単独発現するプラスミドを構築し、ITRで挟んだneo^r遺伝子発現ユニットを持つベクタープラスミドと共に293細胞にトランスフェクションした。AAVS1領域への特異的組込みのアッセイ法としては、(1)AAVS1領域とITR領域の2ヶ所にプライマーを設定したPCRドットプロット法、(2)AAVS1プローブとneo^rプローブを用いたSouthern法、および(3)FISH法による分析を行った。その結果、Rep78とRep68がTVI反応に関与していることが確認できた。安定形質発現の効率はRep78を発現させた場合に高く、Rep68の効果は明瞭には認められなかった。また、Repの細胞傷害性に関する検討では、Rep78とRep68に強く認められ、Rep52,Rep40の場合は軽度であった。さらに、Rep蛋白質の部位特異的組込み活性ドメインに関して、多数のミュータントRep発現プラスミドを構築し、それぞれの組込み活性を検討した。各ミュータントRepのAAVS1領域への結合活性についてはGAGC繰り返し配列を用いたゲルシフトアッセイを行った。その結果、Arg107、Lys136、Arg138をそれぞれAlaに変換したミュータントRepではTVI活性とGAGCへの結合活性が失われた。これらの結果は、安全性が高く、大きなサイズの遺伝子を導入することが可能な染色体部位特異的遺伝子組込み法(TVI法)を確立していく上で、基礎となる重要な知見と考えられる。この部位特異的組込みには、ウイルス由来のRep蛋白質とウイルスゲノム両端のITR(inverted terminal repeat)を介すると考えられている。しかし現在用いられているAAVベクターではRep遺伝子を取り外してあり、この重要な特性を失われている。この点を解決する手段として、RepとITRを利用したTVI(targeted vector integration)法が最近開発された。AAV-RepにはRep78,68,52,40の4種類が存在するが、本研究では、どのRepがAAVS1領域への特異的組込み反応に必要とされるのかを明らかにするために、各々単独発現するプラスミドを構築し、AAV-ITRで挟んだneo^r遺伝子発現ユニットを持つベクタープラスミドと共に293細胞にトランスフェクションした。その後、AAVS1領域への特異的組込みの有無をPCR法にて検討した。

また、染色体への組込み効率の指標としては、G418存在下での培養により安定形質発現を調べ、その効率を比較検討した。その結果、Rep78,68を発現させると特異的組込みが認められたが、Rep52,40は無効であった。安定形質発現の効率はRep78を発現させた場合に高く、Rep68の効果は認められなかった。尚、Repの細胞障害性に関する検討では、Rep78,68に強く認められ、Rep52,40の場合は軽度であった。安全性の高い染色体部位特異的遺伝子導入法(TVI法)を確立していく上で、本研究結果は重要な知見と考えられる。今後の課題としては、細胞内に遺伝子を入れるステップにどのような方法を用いるか、細胞障害作用を有するRep蛋白質をどのように一過性に働かせるか、などといった点が挙げられる。野生型アデノ随伴ウイルス(AAV)はウイルスゲノムが宿主細胞の染色体DNAに部位特異的(19q13.3-terに存在するAAVS1領域)に組み込まれることから、その遺伝子治療用ベクターへの応用が期待されている。しかし、現在のAAVベクターは非構造蛋白質のRepが除かれているため、この重要な性質が失われている。本研究では、AAVS1領域への部位特異的組込み(TVI:targeted vector integration)に必要とされるRep蛋白質に関して、基礎的解析を行った。1.個々のAAV-Repと染色体部位特異的組込み頻度の関係:四種類のRep(Rep78、Rep68、Rep52、Rep40)の発現ベクターとITRの間にneo耐性遺伝子を挟んだプラスミドを293細胞にトランスフェクションし、第19番染色体AAVS1領域への特異的組込みの頻度について検討した。アッセイ法としては、(1)AAVS1領域とITR領域の2ヶ所にプライマーを設定したPCRドットプロット法、(2)AAVS1プローブとneo^rプローブを用いたSouthern分析法における再構成バンドの検討、および(3)FISH法による分析を行った。その結果、Tep78とRep68がTVI反応に関与していることが確認できた。2.Rep蛋白質の部位特異的組込み活性ドメインに関する検討:多数のミュータントRep発現プラスミドを構築し、それぞれの組込み活性を検討した。また、各ミュータントRepのAAVS1領域への結合活性についてはGAGC繰り返し配列を用いたゲルシフトアッセイを行った。その結果、Arg107、Lys136、Arg138のアミノ酸残基それぞれをAlaに変換したミュータントRepではTVI活性とGAGCへの結合活性が失われた。これらの結果は、新しい染色体部位特異的遺伝子組込み法の開発にとって重要は知見と考えられる。
濾胞樹状細胞からのプリオン神経侵入経路の解明

プリオン感染防止策を考える上で、末梢からのブリオンの神経侵入経路の解明は大きな課題として残されている。リンパ濾胞の濾胞樹状細胞に集められたプリオンがどうやって末梢神経に侵入するのかを解明することが本研究の目的であった。今回われわれはエピトープ・タグで標識された異常型プリオン蛋白を接種材料にして、末梢感染から神経侵入までのプリオンの動態を免疫組織化学・免疫電顕法により経時的に追跡することを目指した。標識にはプリオン蛋白の異常化に影響を与えることがなく、なおかつ抗体の親和性も高い3F4抗体のエピトープ・タグを用いた。このエピトープ・タグはマウスプリオン蛋白の2ヵ所のアミノ酸をヒトプリオン蛋白の配列に置換するだけで形成される(L108M,V111M)。さらに、3F4抗体での検出系がうまく働かない場合にそなえ、T41抗体のエピトープ・タグ(V214I,Q218E)も用意した。われわれはまず、3F4エピトープ・タグあるいはT41エピトープ・タグを導入したマウスプリオン蛋白を発現するノックインマウスを作製し、これらのノックインマウスにスクレイピープリオンを感染させた際に脳内に蓄積する標識異常型プリオン蛋白が本研究の接種材料として利用できるかを検討した。3F4抗体を用いた免疫組織化学的検索ではオートクレープによる抗原賦活化処理をおこなえば標識異常型プリオン蛋白を検出できることが明らかになった。T41抗体についても同様の条件検討をおこなったところ、やはりオートクレープ処理をおこなった場合のみ異常型プリオン蛋白の検出が可能であった。これらの結果から、エピトープ・タグ標識異常型プリオン蛋白追跡のためにはオートクレープによる抗原賦活化処理が必須であることが明らかになった。しかし、オートクレーブ処理は当初の予定に含まれていた免疫電顕法には適さず、別の手段を講じる必要があることが示唆された。なお本研究課題は平成22年12月15日、研究代表者の休職にともない補助事業の廃止を申請した。
異常リン酸化認知症Tauの新規定量解析による発病機構の解明

アルツハイマー病を含むタウオパチーの病理的特徴は異常リン酸化タウを含む凝集体である。本研究では定量的リン酸化かつ組み合わせ解析可能なPhos-tag法を用い解析を行なった。培養細胞強制発現タウを解析したところ、12の異なるリン酸化アイソタイプが存在し、主な部位はThr181, Ser202, Thr231,Ser235,Ser404であった。これはマウス脳タウと同様であった。ヒト脳を用いた解析では予想外に非リン酸化タウの存在率が高いこと、病理進行程度でリン酸化の更新がみられたが可溶性タウでは異常リン酸化は見られなかった。このことより凝集タウが積極的にリン酸化を受けることが明らかになった。タウオパチーはTauの凝集体を病理とする一群の神経変性疾患でありアルツハイマー病(AD)、皮質基底核変性症(CBD)、進行性核上性麻痺、ピック病などがある。凝集Tauは異常リン酸化されており異常リン酸化を解明することはその毒性及び病理の解明につながると考えられる。本研究ではリン酸化の組合せと総量を定量可能なPhos-Tag法を用いin vitro、ADモデルマウス、タウオパチー患者脳内におけるTauのリン酸化解析を行った。培養細胞を用いTauの主要リン酸化酵素であるCdk5によるTauのリン酸化解析を行なった結果、13ヶ所と報告されていたリン酸化部位の主要部位が3箇所であることが分かった。次にリン酸化Tauバンドを同定しデーターベースを作る為にCdk5リン酸化部位の非リン酸化型変異体とリン酸化抗体を組み合わせる事で主要部位を同定した。更にタウオパチーの一つであるFTDP-17(R406W)型TauはS404A(S404非リン酸化型)とほぼ同じリン酸化パターンを取ることからS404部位のリン酸化消失が確認された。次にADモデルマウスを用いた解析では、JNPL3(P301L型)マウスのサルコシル不溶性画分でTauの高リン酸化が確認されたが、可溶性画分ではWTと同等のリン酸化であった。ヒト脳内では0N3R,0N4R Tauにおいて非リン酸化量が17.9%,14.1%と予想以上に高い事、AD脳内ではBraak stage VIではVに比べてリン酸化程度が高という違いがあるが、サルコシル可溶性画分ではAD(Braak stage V,VI),CBD患者脳内でのリン酸化は健常者と同等である事が分かった。ここからTauの高リン酸化はTauの凝集後に起こるのでないかと考えられる。これらの結果からPhos-tag SDS-PAGE法はTauのリン酸化解析に有用であり今後の解析に期待できる。ADモデルマウス、タウオパチー患者脳を用いたin vivo解析結果は2016年1月にThe American Journal of Pathology誌に掲載された。またin vitroの解析結果についてもScientific Reports誌に投稿中である。タウは脳で発現する微小管タンパク質であり、またタウオパチーと呼ばれる一群の神経変性疾患では凝集体を形成し、疾患の原因ではないかと考えられている。タウの微小管結合能(生理的役割)はリン酸化によって制御されている。一方、凝集タウ(病理)は異常リン酸化されている。タウのリン酸化は生理的にも病理的においても重要な問題である。タウのリン酸化についてはこれまで多くの研究が行われてきたが、細胞内でどのようなリン酸化状態で存在するのかは明確になっていなかった。本研究内ではリン酸化部位の組み合わせと定量可能なPhos-Tag SDS-PAGE法を用いて解析を行った。培養細胞に強制発現させたタウは12のリン酸化の異なるアイソタイプとして存在した。主なリン酸化部位はThr181,Ser202,Thr231,Ser235,Ser404であり、それらの組み合わせで12のリン酸化アイソタイプとなっていた。そのリン酸化パターンはマウス脳内のタウと同様であり、培養細胞内での解析がin vivoリン酸化の解明につながると考えられた。前頭側頭葉認知症のR406W変異タウは変異のすぐN末側にあるSer404のリン酸化に影響を与えた。Ser404のリン酸化消失がどのような病理的意義を持つか今後の課題である。タウには微小管結合領域が3つの3リピートタウと、4つの4リピートタウがある。タウオパチーの種類によって凝集するタウのリピートが異なる。タウのアイソフォームによりリン酸化が異なるかについても解析を行った。培養細胞にリピート数の異なるタウを発現させたところ、リピート数によってリン酸化状態に違いが見られた。以上の結果から、タウのアイソフォーム、細胞内に置ける存在状態によりリン酸化が異なると考えられる。今後どのような状態においてタウのリン酸化が亢進し、疾患タウへと変化していくのか明らかにしていきたいと考えている。

ヒト脳を用いた解析では予想外に非リン酸化タウの存在率が高いこと、病理進行程度でリン酸化の更新がみられたが可溶性タウでは異常リン酸化は見られなかった。このことより凝集タウが積極的にリン酸化を受けることが明らかになった。培養細胞を用いて作り上げたリン酸化バンドデーターベースを基にし、タウオパチー患者脳内Tauのリン酸化を解析する。疾患によりに発病部位が異なため、前頭葉、側頭葉、中心前回など部位別の解析も行う。リン酸化凝集形成などと関係づけるため、生化学的実験と組織染色も同時に行う。その後各タウオパチー発症に関連するTauキナーゼを推測し、タウオパチーモデルマウスを使用し、推定されたTauキナーゼの働きを阻害剤やsiRNAにより抑制することでTauのリン酸化および疾患の進行を抑制出来るか解析する。その際AD, CBD, PSP, PiD, FTDP-17のモデルマウスを使用する。神経化学
小児癌由来遺伝子材料を基盤とした疾病関連遺伝子の探索と病態解明への応用

神経・肝の発生分化における遺伝子発現ネットワークの解明と、神経芽腫・肝芽腫の発生および疾患メカニズムの解明を目指し、本年度は以下を進めた。(1)小児癌チップに対する独自データベースの構築これまでに同定した神経芽腫の予後の異なるサブセット間で発現量に差のある700個の遺伝子から、さらに重要なものを絞り込むため、小児癌チップを用いて、神経分化・細胞死の誘導時の発現プロファイルや、発現の組織特異性を検討し、データベース化した。神経系組織特異的に発現を示す遺伝子を156個同定し、マウス組織切片を用いた各発生段階の発現パターン解析を進めた。(2)遺伝子の絞り込みと機能解析上記700個の遺伝子のうち、今年度はLIM-only proteinのLMO3について詳細な解析を行い、増殖能の強い神経芽腫で有意に発現が上昇していること、bHLH蛋白質であるHEN2との結合により、神経芽腫において細胞増殖を亢進させOncogene様に機能すること、またこれら2つの遺伝子の高発現が、新たな予後不良因子として利用できることを示した。さらに、神経芽腫予後良好群で高い発現を示す新規遺伝子BMCC1の同定と神経芽腫の細胞死における機能についての解析を行った。その結果BMCC1は神経芽腫の分化・増殖の制御に関わっている可能性が示唆された。(3)臨床検体を用いた発現解析とチップの臨床応用本研究で作製したチップを臨床に活用するため、神経芽腫患者の予後と発現が強く相関する遺伝子を発現プロファイルから統計的に抽出し、上位200遺伝子を搭載した診断用チップを作製した。新規腫瘍サンプルの解析から本システムは約90%の予測効率を示したので、本年度は臨床における試行を開始し、約40症例について受託を行った。(4)遺伝子発現プロファイルの特徴抽出神経芽腫症例の発現プロファイルデータについて、進行度の異なる各サブセットのクラスターを抽出し、統計的手法を用いて神経発生・分化に関わるMASH1やMYCN等の転写因子群の発現パターンと同様のプロファイルを示す遺伝子群の探索を進めた。
光により制御された高密度電子正孔系における超流動現象と非線形光学効果

レーザー光で半導体などを励起すると、電子と正孔の束縛状態である励起子が生成されるが、励起子のボ-ズ粒子的な性質のため、超伝導や超流動に類似な興味深い光学現象を示す。本研究課題では、特に強いレーザ光により生成さた高密度電子正孔系における巨視的量子状態の性質を明らかにするために、(1)自然放出光スペクトルの解析、(2)ポンプ・プローブ光学応答の解析、を行った。平均場からの揺らぎを考慮するために、超伝導に対してアンダーソンが適用した、一般化された乱雑位相近似(GRPA)を用いた。超伝導の場合と異なり、繰り込まれた自己エネルギーやギャップ関数の運動量依存性と周波数依存性を十分精度良く取り込んだ。その結果、(1)自然放出光スペクトルには、密度の揺らぎと位相の揺らぎの両方が関与するが、ポンププローブ分光のスペクトルには、位相揺らぎ(アンダーソンモード)だけが反映され事が示された。また、(2)比較的粒子数密度が低い場合に生ずる励起子-励起子相互作用によるPスペクトル線と、高密度状態でのBCSギャップ端でのスペクトルのピーク構造とのクロスオーバーが明らかにされた。Pスペクトル線の従来の解析は、単に2励起子の少数自由度の問題であったが、本課題においては多体問題理論による取り扱いのため、高密度状態への漸近的振る舞いが初めて解明された。これらの結果は、The 2^<nd> International Conference on Excitonic Processes in Condensed Matterと、the 9^<th> International Conference on the Dynamics of Excited States of Solidsで発表された。
超音波励起ラジカル生成を利用したチタン合金ステント内再狭窄抑制法の開発

悪性腫瘍による閉塞性黄疸に対しての金属性ステントを用いた姑息的減黄術はtumor ingrowthによるステント閉塞の問題が増加している。本研究では、チタン合金ステントに超音波を照射し、ラジカルの産生を利用したステント内再閉塞を予防・改善するための無侵襲的治療法の確立を目的とした。チタン合金に対し1MHzの超音波を30秒0.3 W/cm2照射し超音波のみと比較したところ、チタン合金で高いフリーラジカルの発生が確認され殺細胞効果も最も高かった。悪性腫瘍ステントモデルでは、1MHz、0.3W/cm2、10分の超音波照射を行った。超音波照射群でステントへのingrowth抑制が確認された。悪性腫瘍による閉塞性黄疸に対しての金属性ステントを用いた姑息的減黄術は、化学療法の発達により長期生存が得られる症例もあり、tumor ingrowthによるステント閉塞の問題が増加している。二酸化チタンは超音波を照射することによりフリーラジカルが発生することが報告されており、本研究は、胆管ステントに用いられている金属製ステントがチタン合金製であることに着目し、ラジカルの産生を利用したステント内再閉塞を予防・改善するための無侵襲的治療法の確立を目的とした。今年度は、悪性腫瘍ステントモデル(免疫不全マウスの背部皮下にA431 cells、1.0x106)を注入し、一定の大きさになった時点で金属ステントを埋め込んだモデル)を用いて、腫瘍の成長に伴ったステント内へのがん細胞が進展及びステント閉塞を観察、伊藤超短波のUS-710を用いて1MHz、0.5W/cm2、10分の超音波照射によりステントへのingrowthが抑制された。悪性腫瘍による消化管狭窄モデルは、同じ部位に一か所だけ狭窄が起きること、ステントが挿入可能な径の部位であることが必要である。Gan mouse (K19-Wnt1/C2mEマウス、Oshima H etal. Gastroenterology. 2011;140:596-607.)は,100%の確立で胃癌が発生し、その狭窄による摂食障害にて約60週で死に至る。Gan mouseの腫瘍部位にステントを挿入し、生存期間への影響を検討した。ステント挿入後5か月間生存した。ラジカル生成の評価(in vitro試験)はAPF法にて行った。チタン合金ステントに対し1000 kHzの超音波を、種々の強度0 - 5 W/cm2にて所定時間照射し、生成したラジカルの量を測定した。細胞に対する傷害効果の評価(in vitro試験)は、モデル培養細胞として、類上皮がん細胞株A431を用いた。チタン合金製ステント上で培養し、1000 kHzの超音波を、種々の強度0 - 5 W/cm2にて所定時間照射した後、細胞の死滅率を取りパンブルー法にて測定した。悪性腫瘍ステントモデル動物は免疫不全マウス(BALB/ cAJcl-nu/nu)の背部皮下に固形腫瘍細胞(A431 cells、1.0x106)を注入し、ここに金属ステントを埋め込み、腫瘍の成長に伴ったステント内へのがん細胞が進展及びステント閉塞を観察した。予備実験では,超音波照射によりステントへのingrowthが抑制されているのが確認できた。Gan mouse (K19-Wnt1/C2mEマウス、Oshima H etal. Gastroenterology. 2011;140:596-607.)は、

100%の確立で胃癌が発生し、その狭窄による摂食障害にて約60週で死に至る。処置数が少ないため、超音波の治療には至らなかったが、ステント挿入モデルを確立することができ生存期間の延長が示唆された。悪性腫瘍ステントモデル(免疫不全マウスの背部皮下にA431 cells、1.0x106)を注入し、一定の大きさになった時点で金属ステントを埋め込んだモデル)では、伊藤超短波のUS-710を用いた1MHz、0.5W/cm2、10分の超音波照射を行った。ingrowthした面積を測定すると、コントロール群では4.84±7.58mm2であったのに対し、超音波照射群では0.88±1.89mm2であり、ステントへのingrowth抑制が確認された。遺伝性高脂血症を呈し動脈硬化が誘導されるWHHLMIウサギの大動脈をフォガティーカテーテルで擦過し、2週間後に大動脈を観察したところ強度の狭窄が確認された。擦過後2週間目にナイチノールステントを挿入し、1か月後の大動脈を採取、樹脂包埋切片を作製しての検討では再狭窄はいまだ見られず、6カ月後の標本でも著しい再狭窄は見られなかった。外科学悪性腫瘍ステントモデルを作製し、治療実験を行うに至った。Gan mouseを用いてステントを挿入するモデルが完成した。in vitro実験が終了し、動物モデルでの結果も一部出ている。酸化被膜ステントと通常のステントを用い、血管ステントおよび悪性腫瘍ステントの再狭窄抑制効果の比較・評価を行う。Gan mouseを用いステントを挿入し、超音波を照射して生存期間への影響を検討する。悪性腫瘍による消化管狭窄モデルは、同じ部位に一か所だけ狭窄が起きること、ステントが挿入可能な径の部位であることが必要である。Gan mouse (K19-Wnt1/C2mEマウス、Oshima H etal. Gastroenterology. 2011;140:596-607.)は,100%の確立で胃癌が発生し、その狭窄による摂食障害にて約60週で死に至る。生後30週目のGan mouseの腫瘍部位にステントを挿入し、超音波照射による再狭窄抑制効果、さらには体重、生存期間への影響を検討する。未使用額の発生は、効率的な物品調達を行った結果であり、翌年度の消耗品購入に充てる予定である。効率的な物品調達により、25年度の研究費に未使用額が生じたが、26年度に樹脂包埋標本作製を追加することにより使用予定である。試薬・消耗品費、動物飼育費、実験補助員給与として使用予定である。
局面学習を中核としたバレーボールの効果的な指導法の開発

本研究は,バレーボールの学習指導において局面学習を中核とした指導法を究明することで,状況に応じた適切な動きを自ら創り出すことを目的とする。ボールゲームは「ボール操作」と「ボールを操作しない動き」で成り立っている。ゲーム中の状況に応じた動きを高めていくには,ボールを操作しない時に「いつ」「どこへ」動けばよいのかを適切に判断することが大切である。しかしながら,ボール操作やボールを操作しない時の動きが身に付いていない以上に,ゲームの中でそれらは「何のために」行うものなのかが分かっていない生徒も多くいるのではないだろうか。さらに,バレーボールは生徒自身がボールを保持する時間を全くもてず,ボールに接触することだけでゲーム遂行されるという点で,より一層難しさが増しているのである。本研究は,このもっともな事実に着目し,勝敗を決める「攻防の局面」を視点にバレーボールを捉え直し,その具体的で客観的な楽しさとそこで対象となる技能を,不可分の「内容」として主体的に学習させることを目指しており,その指導法を究明することで状況に応じた適切な運動能力を効果的に高められるのではないかと考えて実践するものである。研究の成果1 3つの局面における技術構造の明確化・「ボールを落とさないようにする」「ボールを整えて組み立てようとする」「ボールを敵陣に落とそうとする」という3つの局面における技術構造を明らかにし,学習過程を捉え直すことができた。2生徒自らが戦術的な課題を意識できる指導の在り方を明らかにできたこと・ICT機器を活用し,運動場面(局面)を提示することで戦術的課題を強く意識させることができた。3状況に応じた動きをより効果的に身に付けるための指導法を明らかにできたこと・タブレット型端末を活用し,視覚的な即時的フィードバックを取り入れた戦術トレーニングにより,状況に応じた適切な運動能力を効果的に高めることができた。・ボール操作しない時の動きを習得させるドリルゲームやタスクゲームを効果的に位置付けられた。・生徒の動きの分析をもとに,いつどこでどのような指導援助すべきなのかを明確にすることができた。
せん断加工における破壊過程の微視的調査および剛塑性有限要素解析への適用

本課題は、修正Gurson型降伏条件式を用いて定式化を行った剛塑性有限要素解析コードに微小空孔発展式を導入することによって延性破壊を考慮したせん断打抜き加工の予測を行う。また、空孔発展式のパラメーターを簡便な実験によって決定する手法を確立することを目的とした。空孔生成パラメーターに及ぼす応力場の影響を実験的に調査し、それを定式化し解析コードに導入した。各種材料の空孔生成が起こるひずみ値、空孔合体および空孔合体に相当する空孔率をモデル化し、その材料定数を簡単な平滑引張試験と平滑部に曲率半径1.3mmの切欠きをつけた切欠き付引張試験を行うことによって決定した。これによって応力状態を応力三軸度で表現し、破断ひずみと応力場の関係式を求め、空孔発展式に導入できた。また他の破壊パラメーターは、同様のFEM解析を破断ひずみおよび変位-荷重曲線が一致するように変更しながら繰り返し行うことによって決定した。以上の手法によって決定したパラメーターを用いてせん断解析を行ったところ、その結果はだれ量やせん断面長さおよびバリ高さについて実験結果とよい一致が見られた。また、材質による亀裂の発生時期や破断時期の違いが解析できた。さらに、パンチ-ダイス間クリアランスが狭い場合では、加工中に亀裂の成長が停留する現象が解析され、さらなる改良を加えることによってこれまで困難であった二次せん断面の解析が行えることが分かった。また、これらの結果を応力分布、ひずみ分布および応力三軸度パラメーターによって説明できることが分かった。当初の目的を達成し、これまで困難であった非定常でかつ延性破壊を伴う加工の有限要素解析手法を確立し、固有のパラメーターを簡便に求める実験方法を提案した。また、本システムを応用し、せん断加工の変形解析を行うことによって、亀裂生成および進展について高精度な解析結果が得られた。本課題は、修正Gurson型降伏条件式を用いて定式化を行い微小空孔発展式を導入することによって延性破壊を考慮した剛塑性有限要素解析コードを用いて、せん断打抜き加工の予測を行う事を目的とする。また、空孔発展式のパラメーターを簡便な実験によって決定する手法を確立することを最終目的としている。これまでに空孔生成パラメーターに及ぼす応力場の影響を実験的に調査し、それを定式化し解析コードに導入することに成功している。各種材料の空孔生成が起こるひずみ値と空孔合体および破断に相当する空孔率を、引張試験の実験および解析結果を比較して算定した。試験は平滑引張試験と平滑部に曲率半径1、3mmの切欠きをつけた切欠き付引張試験をS60C・S45C・SPCCについて実施し、破断ひずみを測定した。中心部応力場を応力三軸度で表現し、破断ひずみと応力場の関係式を求め、空孔発展式に導入した。また他の破壊パラメーターは、各試験のFEM解析を破断ひずみおよび変位-荷重曲線が一致するように変更しながら繰り返し行うことによって決定される。破断ひずみおよび変位-荷重曲線が実験結果と一致したときのパラメーターを用いてせん断解析を行ったところ、せん断加工部におけるだれ量やせん断面長さおよびバリ高さについて実験結果とよい一致が見られた。また、解析において材質による亀裂の発生時期や破断時期の違いが見られ、これらは実験結果と定性的・定量的に一致していた。この結果から材質の違いによるせん断挙動の予測が行えたといえる。平成13年度においては、空孔発生ひずみ以外の破壊パラメーターについての実験的決定方法の検討を行ってゆく。
オリゴマー形成阻害を標的としたポリグルタミン病の新規治療薬の開発

ポリグルタミン病変異蛋白の重合体形成を阻害する新規薬剤の開発を目的として,既に実施した大規模化合物スクリーニングにおいて50%以上の重合体形成阻害効果を示した化合物について,以下の方法でその有効性を検証し,複数(15)の有望な薬剤を明らかにした.[1]Proteinfragmentcomplementationassay(PCA)法を応用した細胞系を用いた薬剤スクリーニング:蛍光蛋白-PCA細胞系の確立と有用性の検討,薬剤の有効性の検討,[2]ポリグルタミン病モデル線虫を用いた薬剤スクリーニング:野生型と比較したモデル線虫の特性解析,薬剤の治療効果の検討,[3]病態研究・創薬研究のためのMJD患者由来iPS細胞の樹立.今後,モデル動物やiPS細胞を用いて薬剤の治療効果の検討を進める.ポリグルタミン(polyQ)病は,原因遺伝子内のCAGリピートの異常伸長により生じる遺伝性神経変性疾患であり,有効な病態抑止療法は未だない.PolyQ病では,異常伸長polyQ鎖を持つ変異蛋白が自己重合して凝集体を形成するが,その中間体である可溶性重合体に強い細胞障害性があることが多くの基礎研究で示されている.本研究では,polyQ病変異蛋白の重合体形成を阻害する新規薬剤の開発を目的とし,以下のことを実施した.(1) Protein fragment complementation assay法を用いて,培養細胞内でpolyQ病変異蛋白の重合体形成を蛍光値として検出できる培養細胞系を樹立した.本細胞系を用いて薬剤の重合体形成阻害効果を調べた.その結果,50の化合物において50%以上の重合体形成阻害効果を認めた.(2) polyQ病変異蛋白を発現するモデル線虫を用いて,培養細胞系において効果を示した候補薬剤の有効性を調べた.その結果,17-AAGを含む4種の薬剤において,TG線虫の封入体数の減少,運動能の改善,寿命延長効果を認めた.また,生化学的に検出される重合体量の減少を認めた.(3) 2例の患者および2例の健常者由来の線維芽細胞からiPS細胞の樹立を試み,現在樹立中である.脊髄小脳変性症における臨床試験が成功しない最大の要因の一つが,小脳失調の定量的評価法がないことにある.本研究では,小脳失調の定量的評価法を開発することを目的に,iOS上で作動する検査プログラムを独自開発した.半定量的評価尺度であるSARAや他の臨床項目との比較,経時的変化から,本検査法で得られる「等速反復運動における速度の変動係数」がSARAと高い相関性を示すばかりでなく,データの安定性,鋭敏性が高いこと,評価者内・評価者間誤差が小さいこと,さらに検査の簡便性,機動性が高いことを明らかにした.ポリグルタミン病変異蛋白の重合体形成を阻害する新規薬剤の開発を目的として,既に実施した大規模化合物スクリーニングにおいて50%以上の重合体形成阻害効果を示した化合物について,以下の方法でその有効性を検証し,複数(15)の有望な薬剤を明らかにした.[1]Proteinfragmentcomplementationassay(PCA)法を応用した細胞系を用いた薬剤スクリーニング:蛍光蛋白-PCA細胞系の確立と有用性の検討,薬剤の有効性の検討,[2]ポリグルタミン病モデル線虫を用いた薬剤スクリーニング:野生型と比較したモデル線虫の特性解析,薬剤の治療効果の検討,[3]病態研究・創薬研究のためのMJD患者由来iPS細胞の樹立.今後,モデル動物やiPS細胞を用いて薬剤の治療効果の検討を進める.ポリグルタミン(polyQ)病は,原因遺伝子内のCAGリピートの異常伸長により生じる遺伝性神経変性疾患であり,病態を抑制する有効な治療法の開発が切望されている.異常伸長polyQ鎖を持つ変異蛋白は自己重合する特性を有し,可溶性の重合体には強い細胞障害性がある.本邦で最多のpolyQ病である脊髄小脳変性症3型の原因蛋白の二量体形成を阻害する薬剤の開発を目的とし,以下のことを実施した.(1) Protein fragment complementation assay法を用いて,培養細胞内での変異polyQ蛋白の二量体形成を蛍光値として検出できる細胞解析系を樹立した.本細胞系を用いて候補薬剤の二量体形成阻害効果を調べた.Doxycyclineにより変異蛋白を発現誘導し,24時間後に培養液中に薬剤を投与し,細胞の蛍光値により薬剤の二量体形成阻害効果を解析した.細胞株の樹立に時間を要したため今年度は少数の薬剤を解析したのみだが,少なくとも3剤において有効性を確認した.(2)蛍光標識した異常伸長polyQ鎖を発現するpolyQ病モデル線虫の特性を明らかにした.また,分子シャペロン調節薬の効果を,本TG線虫を用いて明らかにした.具体的には,TG線虫の運動能は野生型と比べ幼虫期にいったん亢進したが,成虫になると急激に低下した.TG線虫の封入体数は日齢8で最大数となり,その後プラトーとなった.弱変性条件下でのアガロースゲル電気泳動により分離されるpolyQ蛋白の重合体は日齢6で最大となった.17-AAGはTG線虫の成虫期の運動能を改善し,封入体数を減少させ,寿命を延長させた.また,成虫期の重合体量を減少させた.候補薬剤にはすでに臨床使用されている薬剤を多数含んでおり,臨床応用可能な新たな治療薬が開発できる可能性が高い点で意義が大きい.(1) Protein fragment complementation assay法を用いた,細胞解析系による変異polyQ蛋白の二量体形成阻害効果の検証については,細胞解析系の樹立に難渋し予想以上に時間を要した.

ようやく細胞系を確立し,少数の化合物について二量体形成阻害効果を確認することができたが,予定よりも達成度は遅れた.次年度は,本システムを用いて30の薬剤の有効性を調べる計画である.(2) polyQ病TG線虫を用いた候補薬剤の有効性の検討については,今年度は野生型との比較によりTG線虫の特性を明らかにし,既にpolyQ病のモデル動物において有効性が示されている分子シャペロン調節薬の有効性を明らかにすることができた.これにより,本TG線虫が二量体形成阻害薬のスクリーニングに利用可能であることが明らかになった.新規薬剤の効果判定を行えなかった点で達成度は遅れたが,次年度は本TG線虫を用いて新規候補薬剤の有効性の検討を行う計画である.(1)上述の細胞解析系を用いて,約50の化合物について変異polyQ蛋白の二量体形成阻害効果を検証する.調べる化合物の選定は,既にルシフェラーゼ-PCA法を用いたHigh throughput screeningにより約2200の化合物の中から二量体形成阻害効果が確認できた化合物の中で,臨床応用可能と考えられるものを選定した.具体的には,Doxycyclineで発現誘導し24時間後から培養液中に化合物を加え,薬剤濃度と反応時間を振って,細胞の蛍光値の変化をフローサイトメーターを用いて定量的に解析する.濃度・時間依存的に効果を示し,かつ有意な細胞毒性を示さない薬剤を選定する.(2) (1)で用いた薬剤の中で,細胞解析系において二量体形成阻害効果が確認できた薬剤を中心に,polyQ病TG線虫を用いて薬剤の有効性を検証する.TG線虫は摂氏20°Cで同調培養し,餌に薬剤を混合して培養し,変異polyQ蛋白の封入体数,線虫の運動能,生存率を測定する.また,弱変性条件のアガロースゲル電気泳動により重合体を検出し,薬剤による変化を解析する.(3)候補薬剤が個体において神経変性を改善するかを明らかにするために,ヒトAT3(Q84)を発現するYACトランスジェニックマウスを用いて薬剤の有効性を検討する.具体的には,ホモ,ヘテロ,野生型の3群を,生後2週目から24週間隔て体重測定,運動能評価,歩容・肢位異常などの観察を行う.生後5週目から25週目まで生理食塩水に溶解した薬剤を週1回腹腔内投与するか,または週3回経口投与する.経時的にマウス全脳を採取し,神経変性の程度,封入体数について病理学的に解析する.また,凍結脳組織を用いて,変異polyQ蛋白量や重合体量を生化学的に解析する.研究課題の遂行においては,現在の設備備品の使用を想定しているため,研究費は(1)消耗品,(2)旅費,(3)その他に対して使用する.(1)消耗品:細胞培養試薬や遺伝子工学用試薬,TG線虫の維持や解析のための試薬,マウスの飼育や病理学的検索に関わるものが中心となる.(2)旅費:研究成果発表および情報収集のための旅費である.(3)その他,研究成果を論文発表する際にかかる諸費用である.
不斉触媒反応開発を基盤とした医薬短工程合成

キラルホスフィン配位子は、様々な不斉触媒のキラル源として極めて重要な位置を占める。しかしながらその合成は非常に困難で、エナンチオ選択性の最適化のために多様なキラルホスフィン配位子を簡便に合成できる方法論の開発が急務である。特に我々の研究室で開発したキラル1価銅触媒は、アリル化、アルドール反応、アルケニル化、アリール化、アルキニル化、シアノメチル化等の様々な有用炭素骨格構築反応を促進するものの、多くの場合エナンチオ選択性が8090%ee程度に留まっていた。市販の配位子のスクリーニングのみではこの状況を打破することができなかったために、独自のキラルホスフィン配位子の多様合成法の確立に着手した。基本となるコンセプトは、銅に配位し触媒活性部位を構築するホスフィンモジュールと、キラリティー発現モジュールを分離して、これら2つのモジュールを簡単な反応で連結するというものである。このコンセプトを基盤として、セミシクロファンをホスフィンモジュールの基本骨格に、容易に合成可能なキラル源であるアミノアルコールをキラリティー発現モジユールとして、これら二つを脱水縮合により連結する新規ホスフィン配位子を設計、合成した。現在までのところ、ケトンの触媒的不斉アリル化反応において最高で83%eeを発現する独自の不斉配位子を見出している。今後、両モジュールの最適化により、一般的に高い(90%ee以上)エナンチオ選択性を与える不斉配位子を構築していく予定である。
人間味のある音声レスポンス

本研究では、発話内容や状況に合った、人間らしい話し方ができる音声対話システムを実現するため、(1)自発的な対話音声を収集し、音声対話において重要なパラ言語情報を付与した大規模なコーパスを構築すること、および(2)収集した音声に対してイントネーション・持続時間長・フォルマントなどの音響分析を行い、それらの音響的特徴と言語情報・パラ言語情報・談話情報との関係をモデル化すること、を目的とする。本年度は、上記(1)として音声対話コーパスの構築作業を昨年度に引き続き行い、その成果を「宇都宮大学パラ言語情報研究向け音声対話データベース」として公開した。このデータベースは国立情報学研究所音声資源コンソーシアムを通じて音声・言語研究者に広く配布されている。また、上記(2)として、基本周波数や強度などの韻律パラメータ、喉頭音源由来の声質に関わる音響パラメータ、ならびにフォルマント周波数と、知覚されるパラ言語情報との関係を分析した。韻律パラメータについては重回帰分析によりほとんどの話者において精度良くモデル化が行えた。一方、声の気息性やフォルマント周波数に関わる音響パラメータについてはパラ言語情報との関連が話者に強く依存することが明らかになった。また、単純な線形回帰モデルによっても声の気息性が不快の程度を反映することが示唆されていたが、同じ語でもその支配-服従の程度によりカテゴリを細分化することにより、服従的な発話では気息性の程度と不快の程度の相関がより顕著になることがわかり、非線形なモデル化の有効性が明らかとなった。さらに、快と知覚される音声では実効声道長の変化によりフォルマント周波数が上昇する傾向を持つ話者が存在することが初めて示された。本年度は、(a)自発的な対話音声データを数多く収録し、同時に音響分析を行ってコーパスを作成すること、(b)収録した音声の書き起こし作業を行い、さらに談話タグを付与すること、を当初計画としていた。当初計画の(a)については、同一話者による多数回の録音を含め、12セッション分を新たに収録した。音響分析については、自然な対話音声に対して当初計画していたARX法に基づく音声分析法における初期パラメータの設定が容易ではないため、本年度はその解明に注力することとし、音響分析は次年度の課題とした。(b)については、新たに収録した音声を含め、全ての音声の書き起こしデータを作成した。また、一部のセッションに談話タグを付与するとともに、談話タグとパラ言語情報の付与作業との関係について予備的な検討を行った。以上の実績に加え、本年度では、音響パラメータとパラ言語情報の知覚との関係について、自然な対話音声の音響パラメータ操作による知覚実験、および音声波形からのパラ言語情報の認識について検討を行った。本年度は、複数の評定者に収集した対話音声を聴取させ、知覚されたパラ言語情報を記述させる作業を行うことを当初計画としていた。当初計画では評定者は3名程度としていたが、過去の心理実験の調査などから、安定した評定結果を得るためには評定者の選別が重要であることがわかった。このため、本作業に先立って評定者選別のためのスクリーニングテストを設計し実施した。スクリーニングにおいては同一発話を複数回評価した場合の評定者内一致度、多数評定者の平均評定値との相関、評価項目の理解の3基準を元にしたテスト方式を開発した。6名の評定者に対して上記のテストを実施し、合格した3名を本作業の評定者とした。本作業では、約4000発話に対するパラ言語情報の評定を24回に分け、約4ヶ月の時間をかけて完了した。また、平成19年度に実施予定の音響的特徴とパラ言語情報との関係のモデル化のための準備段階として、韻律情報およびフォルマントの音響分析を行った。声質の変化に対応するため、基本周波数情報の抽出が困難な箇所を人手でマーキングし、今後のモデル化がスムーズに行えるようデータを整える作業を行った。

韻律パラメータについては重回帰分析によりほとんどの話者において精度良くモデル化が行えた。一方、声の気息性やフォルマント周波数に関わる音響パラメータについてはパラ言語情報との関連が話者に強く依存することが明らかになった。また、単純な線形回帰モデルによっても声の気息性が不快の程度を反映することが示唆されていたが、同じ語でもその支配-服従の程度によりカテゴリを細分化することにより、服従的な発話では気息性の程度と不快の程度の相関がより顕著になることがわかり、非線形なモデル化の有効性が明らかとなった。さらに、快と知覚される音声では実効声道長の変化によりフォルマント周波数が上昇する傾向を持つ話者が存在することが初めて示された。
腫瘍ターゲティング能を有した過酸化チタンナノ粒子による放射線増感治療の基礎研究

本研究は、過酸化チタンナノ粒子(TiOxNPs)を用いた新しい放射線増感治療法の開発と臨床応用するための基盤の確立を目的とする。本年度は昨年度に引き続き、広く研究されている金ナノ粒子と比較して生成される活性酸素種(ROS; Reactive Oxygen Species)量およびその種類を評価した。ナノ粒子のみの実験系では、X線照射によりTiOxNPsからヒドロキシラジカルの生成が確認されたが、その生成量は金ナノ粒子と比べて有意に少なかった。一方で、過酸化水素(H2O2)に関しては金ナノ粒子からはその生成は確認されず、TiOxNPsではX線照射の有無に関わらずH2O2が生成されていることがわかった。膵がん細胞株を用いたin vitro実験においても同様にTiOxNPsではナノ粒子濃度に依存した細胞内でのH2O2の増大がみられた。コロニーアッセイ法による細胞生存率の評価では、金ナノ粒子よりTiOxNPsとX線照射の併用群が最も大きな放射線増感効果が示した。さらにマウスを用いた動物実験ではTiOxNPsとX線照射の併用群で最も大きい抗腫瘍効果が得られたとともに、腫瘍内でのカタラーゼおよびグルタチオンの有意な増加を確認した。これらのことからH2O2が放射線増感効果に大きく影響していることが示唆される。放射線増感効果の評価とともにナノ粒子の腫瘍ターゲティングを評価するためにナノ粒子の体内でのイメージ化が課題として挙げられる。そこでTiOxNPsの原料であり、同じ結晶構造をもつ二酸化チタンナノ粒子(TiO2NPs)を用いてコンピューター断層撮影(CT)および核磁気共鳴画像法(MRI)でのイメージングを検討した。その結果、MRIのT2強調画像においてTiO2NPs濃度に応じたコントラストの差が見られた。今後ナノ粒子の腫瘍集積を評価するツールとして利用できることが示唆される。本研究は過酸化チタンナノ粒子を用いた新しい放射線増感治療法の開発と臨床応用するための基盤の確立を目的とする。これまでの研究から過酸化チタンナノ粒子はX線照射によって活性酸素種(ROS; Reactive Oxygen Species)を生成する特性を持っており、細胞・動物実験においてX線照射との併用でX線照射単独と比べて十分な放射線増感効果が得られることを示した。本研究計画では臨床応用に向けてこの効果をさらに展開させるため、腫瘍ターゲティング性能を付加させた過酸化チタンナノ粒子の増感効果の評価、粒子線など種々の放射線照射下における増感効果の検討、他の金属ナノ粒子との増感効果の比較評価を行う。本年度は抗体修飾ナノ粒子を作成し動物実験でその増感効果と体内分布を調べた。膵癌細胞株を移植した担がんマウスにEGFR抗体修飾過酸化チタンナノ粒子を尾静脈から投与し一定時間後にX線照射を行ったところ、処置後の腫瘍体積の変化では抗体未修飾の過酸化チタンナノ粒子と比べて有意な差は見られなかった。ナノ粒子投与後の体内分布を調べた結果、正常臓器では肝臓に最も多く集積しており、腫瘍には一部集積が見られたが時間とともに大きく減少していることがわかった。腫瘍へのナノ粒子の集積の向上と投与からX線照射までの時間の検討が必要である。一方で過酸化チタンナノ粒子の特性評価として、増感効果をもつナノ粒子として広く研究されている金ナノ粒子との比較試験を行った。粒子のみの実験系でX線を照射したところ、最も酸化力が強いROSであるヒドロキシラジカルは過酸化チタンナノ粒子より金ナノ粒子の方が多く生成していることがわかった。この結果から過酸化チタンナノ粒子の抗腫瘍効果には過酸化水素やスーパーオキシドアニオンといった他のROSの関与が考えられ、今後は生成されるROSの種類の同定を進める。本年度は研究計画に従い、抗体修飾ナノ粒子を作成し動物実験でその増感効果と体内分布を調べた。詳細な組織学的評価等はまだ実施できておらず、これらは次年度以降に遂行する。また金ナノ粒子との比較評価の第一段階としてX線照射により生成されるROSの定量比較を行った。本研究は、過酸化チタンナノ粒子を用いた新しい放射線増感治療法の開発と臨床応用するための基盤の確立を目的とする。これまでの研究で過酸化チタンナノ粒子はX線照射によって活性酸素種(ROS; Reactive Oxygen Species)を生成する特性を持っており、細胞実験および動物実験において過酸化チタンナノ粒子とX線照射の併用でX線照射単独と比べて十分な放射線増感効果が得られることを示した。昨年度、抗体修飾ナノ粒子を作成し動物実験でその増感効果を調べたものの、腫瘍体積の変化では抗体未修飾の過酸化チタンナノ粒子と比べて有意な差は見られなかった。より効果的な腫瘍ターゲティングに向けて現在検討を行っている。そこで本年度は、主に過酸化チタンナノ粒子の特性評価として、増感効果をもつナノ粒子として広く研究されている金ナノ粒子との比較試験を中心に行った。粒子のみの実験系でX線を照射したところ、最も酸化力が強いROSであるヒドロキシラジカルは過酸化チタンナノ粒子より金ナノ粒子の方がはるかに多く生成されていた。その一方で、生成されるROS種の同定において過酸化チタンナノ粒子は粒子自身から過酸化水素を除放していることが新たにわかり、この過酸化水素によってX線照射の効果が増強されているのではないかと考えられる。そこで担癌マウスを用いた動物実験を行ったところ、過酸化チタンナノ粒子はX線照射によるヒドロキシラジカル量が金ナノ粒子よりも少ないにも関わらず、金ナノ粒子と比べて有意な抗腫瘍効果を示した。

金ナノ粒子をはじめ、他の金属ナノ粒子にはそのような性質はなく、過酸化チタンナノ粒子は過酸化水素をデリバリーできるこれまでにないナノ粒子としてさらなる応用が期待できる。その反面、今後はその毒性評価を慎重に検討する必要がある。本年度は研究計画に従い、金ナノ粒子との比較による過酸化チタンナノ粒子の特性評価、生成される活性酸素種の同定を行った。次年度はこれらの結果を踏まえて、抗体修飾粒子の評価や毒性評価を遂行する。本研究は、過酸化チタンナノ粒子(TiOxNPs)を用いた新しい放射線増感治療法の開発と臨床応用するための基盤の確立を目的とする。本年度は昨年度に引き続き、広く研究されている金ナノ粒子と比較して生成される活性酸素種(ROS; Reactive Oxygen Species)量およびその種類を評価した。ナノ粒子のみの実験系では、X線照射によりTiOxNPsからヒドロキシラジカルの生成が確認されたが、その生成量は金ナノ粒子と比べて有意に少なかった。一方で、過酸化水素(H2O2)に関しては金ナノ粒子からはその生成は確認されず、TiOxNPsではX線照射の有無に関わらずH2O2が生成されていることがわかった。膵がん細胞株を用いたin vitro実験においても同様にTiOxNPsではナノ粒子濃度に依存した細胞内でのH2O2の増大がみられた。コロニーアッセイ法による細胞生存率の評価では、金ナノ粒子よりTiOxNPsとX線照射の併用群が最も大きな放射線増感効果が示した。さらにマウスを用いた動物実験ではTiOxNPsとX線照射の併用群で最も大きい抗腫瘍効果が得られたとともに、腫瘍内でのカタラーゼおよびグルタチオンの有意な増加を確認した。これらのことからH2O2が放射線増感効果に大きく影響していることが示唆される。放射線増感効果の評価とともにナノ粒子の腫瘍ターゲティングを評価するためにナノ粒子の体内でのイメージ化が課題として挙げられる。そこでTiOxNPsの原料であり、同じ結晶構造をもつ二酸化チタンナノ粒子(TiO2NPs)を用いてコンピューター断層撮影(CT)および核磁気共鳴画像法(MRI)でのイメージングを検討した。その結果、MRIのT2強調画像においてTiO2NPs濃度に応じたコントラストの差が見られた。今後ナノ粒子の腫瘍集積を評価するツールとして利用できることが示唆される。研究計画に従い実験項目を遂行する。抗体修飾ナノ粒子を用いた検証において抗体未修飾ナノ粒子と比べて有意な増感効果が得られなかったため、これに関しては条件の変更など今後検討が必要である。並行して過酸化チタンナノ粒子に対して粒子線や放射光といったX線以外の放射線照射によるROS生成の評価やそこから生成されるROSの種類の同定を行う。抗体修飾ナノ粒子を用いた抗腫瘍効果実験において抗体未修飾ナノ粒子と比べて有意な増感効果が得られておらず、これに関しては今後検討が必要である。また、これまでの結果を踏まえて過酸化チタンナノ粒子の毒性評価や組織学的評価を行う。未使用額はごく僅かであり、適切な用途がなかったため。未使用額は僅かであるため、計画の大きな変更予定はない。