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高齢期うつ病の1次・2次予防に向けたBDNFのエピジェネティクス疫学の縦断的研究

高齢者コホートにおいて、脳由来神経栄養因子(BDNF)遺伝子のメチル化障害と精神科医が同定したうつ病の関連を疫学的に横断的/縦断的に検討した。横断的分析では、大うつ病性障害現在エピソードの者と生涯未発症者の間で、白血球DNAのBDNF遺伝子exon 1のプロモーター領域のCpGアイランドのメチル化率に差のあることを発見した。縦断的には、同じ年に把握した性と年齢をマッチした大うつ病性障害発症者と未発症者について、発症前の保存血液(未発症者では、発症者と同じ年に保存した血液)を分析し、両者のメチル化率に差があることを発見した。なお未発症者においてはメチル化率が年齢と相関することを見いだした。本研究は地域における高齢期のうつ病予防に向けてエピジェネティックな観点からの病態的特徴の検索と生物学的スクリーニング指標の開発を目指し、脳由来神経栄養因子(BDNF)遺伝子プロモーターのDNAメチル化障害と精神科医が同定したうつ病との関連を疫学的に縦断的および横断的に検討することを目的とする。平成27年度は、年度内に行う健康調査により得られるデータと、25年度に実施済みの調査データとを結合して遺伝子プロモーターのDNAメチル化分析を行う研究として計画された。健康調査は研究分担者の吉田、大渕との協力の下実施され、調査参加者は65歳以上の男女640人であった。健康調査会場で、うつ尺度陽性者全員と、無作為に選んだサンプルのうち健診に参加しかつうつ尺度陰性であった者とに後日行う医師面接調査への参加を依頼し、前者から48人、後者から59人の面接調査参加を得た。これらとは別に、平成23年に把握したうつ病だった6人も参加したので、計113人が医師面接調査に足を運んだことになる。なお、うち2人からはインフォームドコンセントを得られなかった。医師は残る111人についてStructured Clinical Interview for DSM-IVを用いて診断し、未治療のうつ病16人(大うつ病性障害7人と小うつ病性障害9人)と対照群となる健常者68人とを同定した。DNAメチル化分析については、血液サンプルが吉田により広島大学に送られ、上の27年度把握のうつ病のうち大うつ病性障害7人のDNAメチル化障害の分析を研究分担者の淵上と森信とが行った。また、平成25年度に把握済みの大うつ病性障害の7人についてもDNAメチル化障害が分析された。しかし、このうち8人から得たDNA鎖のアンプリコン上のEXON1ー1とEXON1ー4の解析が不良であった。再解析も行ったが結果は同じであった。研究分担者との共働により、当初の予定通り健康調査(疫学調査)を実施することが出来た。医師面接調査の参加者数は想定どおりであり、インフォームドコンセントを与えなかった者は2名のみであり高い参加率を得た。また、医師の診察により未治療のうつ病の者の把握も順調であり、見込みどおりに新規発症のうつ病の者を把握できた。この医師の診察は25年度と27年度との両年度とも同一の1人の精神科医により行われており、診断は高い信頼性を有する。うつ病の疫学研究で1人の精神科医の診断によるものは非常に希であり他に例をみない高い精度を本研究に与えることに成功している。他方、DNAメチル化解析は、解析数が伸びなかった。原因の一つは共同研究機関である広島大学における実験室の移動である。また一部EXON領域に系統的な測定不良があったことも遅れの原因の一つである。本研究は地域における高齢期のうつ病予防に向けてエピジェネティックな観点からの病態的特徴の検索と生物学的スクリーニング指標の開発を目指し、脳由来神経栄養因子(BDNF)遺伝子プロモーターのDNAメチル化障害と精神科医が同定したうつ病との関連を疫学的に縦断的および横断的に検討するものである。うつ病把握のため、本年度は、2008年設定のコホートで予定通り、また、2011年設定のコホートで追加的に、分担研究者の大淵と疫学調査を実施した。前者の調査参加者は320人で、健康調査会場で、うつ尺度陽性者全員と無作為に選んだサンプルのうちうつ尺度陰性であった者とに後日行う面接調査への参加を依頼し、それぞれから28人と43人の面接調査参加を得た。2011年コホートではうつ尺度陽性者に面接調査参加を依頼し23人の参加を得た(1人からはインフォームドコンセントを得られなかった)。面接調査では、Structured Clinical Interview for DSM-IVを用いた医師が、これまでの調査で把握していないうつ病を、2008年コホートから8人、2011年から7人を把握した。BDNF遺伝子のメチル化障害は、2008年コホートで2014年に把握済みの大うつ病性障害のうち2012年時調査で未発症だった8人中5人と、2011年コホートで2013年と15年に把握済みの大うつ病のうち2011年から2014年までの調査時に未発症だった15人中13人とについて、広島大学で保存血液の分析を開始した。昨年度までに分析済みの2人(2011年コホート)を加えると、計20人の大うつ病の発症前のメチル障害が分かることになる。また、これらの者の性と発症前の採血年齢をマッチした対照24人を設定し、メチル化分析済みの11人を除いた13人でのメチル化分析を開始した。

年度末現在、以上の分析を進めているところである。研究分担者との共働により、当初の予定通り健康調査(疫学調査)を実施し、また追加的な疫学調査も実施することが出来、前者では高齢者の中でも特に年齢の高い集団から医師の診察によりうつ病の者の把握を進めることができた。また、本研究でこれまで蓄積した診断データと保存した血液とを用いてうつ病のエピジェネティクス研究では世界で初めて、他疾患のエピジェネティクス研究でもはほとんど行われていない、疾病発症前のDNAメチル化の分析を軌道に乗せることが出来た。ただしメチル化障害の分析には、一筋縄ではいかない技術的な難しさがあり、メチル化障害測定の標的としているBDNF遺伝子プロモーターのEXON領域のprimer4で測定精度の低い部位が見つかり、PCRの手続きから再度測定を行う必要があり次年度にメチル化分析の再分析を持ち越すことになった。本研究は地域における高齢者のうつ病予防に向けてエピジェネティックな観点からの病態的特徴の検索と生物学的スクリーニング指標の開発を目指し、脳由来神経栄養因子(BDNF)遺伝子プロモーターのDNAメチル化障害と精神科医が同定したうつ病の関連を疫学的に縦断的および横断的に見当するものである。うつ病把握のために、本年度は、2011年に設定のコホートで予定通り、分担研究者の大渕と疫学調査を実施した。調査参加者は761人で、健康調査会場で、うつ尺度陽性者全員と、無作為に選んだサンプルのうちのうつ尺度陰性であった者とに、後日行う面接調査への参加を依頼した。調査会場には前者から36人と後者から40人とが来場したが、前者の2人からはインフォームド・コンセントを得られなかったので、最終的な医師面接参加者は74人であった。医師はStructured Clinical Interview for DSM-IVを用いて診断し、これまでの調査で把握していないうつ病15人(大うつ病性障害7人、大うつ病性障害部分寛解2人、大うつ病性障害寛解1人〔治療中〕、ダブルデプレッション2人、小うつ病性障害3人)を新たに把握した。これらのうち、大うつ病性障害7人について、凍結保存した血液を広島大学に送り、渕上と森信がBDNF遺伝子のエクソンI領域のCpGアイランドの39CpGについてメチル化分析を行った。また、これまでの医師面接調査で把握した非うつ病の者105人のメチル化率データと広島大学が有する若年コホートのメチル化率データを統合して、メチル化率と加齢との関係を分析した。これにより、加齢の影響を受けるメチル化部位を明らかにすることが出来た。現在、高齢者における大うつ病性障害と健常者のメチル化率について横断的、及び縦断的に分析しているところである。高齢者コホートにおいて、脳由来神経栄養因子(BDNF)遺伝子のメチル化障害と精神科医が同定したうつ病の関連を疫学的に横断的/縦断的に検討した。横断的分析では、大うつ病性障害現在エピソードの者と生涯未発症者の間で、白血球DNAのBDNF遺伝子exon 1のプロモーター領域のCpGアイランドのメチル化率に差のあることを発見した。縦断的には、同じ年に把握した性と年齢をマッチした大うつ病性障害発症者と未発症者について、発症前の保存血液(未発症者では、発症者と同じ年に保存した血液)を分析し、両者のメチル化率に差があることを発見した。なお未発症者においてはメチル化率が年齢と相関することを見いだした。当初の計画どおりに、次年度も疫学調査を実施し、新たな未治療の大うつ病性障害の把握に努めることで縦断研究に耐えるサンプル数の確保を行う。
有機ナノ結晶のサイズ・多形制御

本研究を通じて、再沈法におけるナノ結晶の生成メカニズムが、古典核形成理論で説明し得ることを初めて明らかにできた。また、再沈法において、ナノ結晶化の時間を短くすることにより、微小サイズの有機ナノ結晶を得られることが分かった。これらの知見を活かして、顔料化合物に関しては、サイズを約15nmにまで微小化できることを実証した。作製されたナノ顔料は、カラーフィルターの高品質化に繋がるコントラスト比の向上を示すことが示された。本年度では、ナノ結晶生成過程を速度論的に解析するために、再沈法における初期挙動の2次元画像解析を行う装置を本申請の研究費を利用して、自作することを試みた。その結果、ある程度は完成したが、未だに良好な結果を出せる段階まで到達できなかった。そこで、再沈法における初期挙動を同様に観測可能なストップトフロー分光装置を用いて、ペリレンを対象化合物として取り上げて、再沈法におけるナノ結晶化に要する時間を計測するとともに、制御することを行った。再沈法における実験条件の内、対象化合物の溶液の濃度、または溶液と貧溶媒の量比という実験因子を変えると、再沈処理直後のペリレン溶液の吸光度における減衰速度の時定数は、8.9S^<-1>から210S^<-1>までの範囲で変化することが観測され、ナノ結晶化に要する時間を制御可能であることを明らかにした。これは、対象化合物の過飽和度依存性に関与する結果ともいえるものであり、再沈処理直後の系内の過飽和度が増大すればするほど、ナノ結晶化の速度が向上することが分かった。その後の解析により、本実験結果におけるナノ結晶の生成メカニズムが、古典核形成理論で説明し得ることが判明した。再沈法におけるナノ結晶生成が、古典核形成理論で説明されたことはこれまでになく、本考察は非常に意義深いものであるといえる。また、ペリレン溶液の吸光度における減衰速度の時定数と生成したナノ結晶のサイズとの関係もまとめられた。その結果、減衰速度の時定数が増大すると、ナノ結晶形成速度がより速くなり、生成するナノ結晶のサイズが微小化する傾向が示された。この傾向は、これまでの経験的に得られた知見と同じものであるが、現在では古典核形成理論に基づく知見であるという認識を持つことができ、従来の経験則のみによる考察からの脱却が図れることになった。初年度に行ったペリレンのナノ結晶化の初期過程のストップトフロー分光測定に関する結果から、ナノ結晶化の時間の制御が短くできれば、サイズ制御が可能であることが分かった。そこで、1.場に造核剤を混合させた再沈法や2.再沈処理後に系を過激な条件におくことで、積極的に結晶化を促進するという結晶核の出現を誘発させた再沈法を検討した。2の方法に関しては、液体窒素等を用いた極低温下への再沈殿の実験を行った。本実験は、分光の同時解析が困難であり、明確な効果も得られなかった。その一方、1の方法においては、ペリレンの類似化合物であるペリレンビスイミドをペリレン溶液の中に混入させて、再沈操作を行うという実験を行った。実験において、ナノ結晶化の初期過程の分光測定を行い、結晶核の急速な出現を促す効果が出るかどうかがポイントであったが、解析の結果、ペリレンビスイミドのペリレンに対する量比が増大すればするほど、ナノ結晶化の生成時間は短くなり、サイズが微小化する傾向が認められた。これは、まさに構想通りの結果であり、本申請研究の構想自体が正しいことが証明できたともいえる。上記のような手法や解析の知見を活かして、極微小サイズに制御された顔料ナノ結晶の作製を行った。従来、30nm以下の顔料ナノ結晶を作製することは簡単ではなかったが、本研究では、30nm以下の顔料ナノ結晶を大量生産できるという見通しを得ることができた。さらに、得られた顔料のコントラスト比は、現行品等と比べて、数倍向上することが分かり、今後カラーフィルターの高品質化を達成できる可能性を示した。再沈法において、ナノ結晶化の時間を短くできれば、微小サイズの有機ナノ結晶を得られることが判明した。そこで、顔料系や薬剤系化合物に関して、本知見を活かし、ナノ結晶のサイズ・晶形制御を行った。薬剤系化合物に関しては、ステロイド系化合物や抗癌性化合物を対象として取り上げ、ナノ結晶のサイズを100nm以下に制御することができた。また、顔料に関しては、フタロシアニンやキナクリドンを対象に取り上げ、サイズを約15nmにまで微小化できることを実証した。また、サイズ分散の幅としては、20%以内に収めることができた。作製された顔料系に関しては、富士フイルム・宮下陽介主任研究員らとの共同研究により、コントラスト比や対候性評価に関するサイズ依存性を明らかにした。既に、約30nmのコントラスト比に関するデータは、昨年度得ているが、約15nmまでのコントラスト比のサイズ依存性に関して、初めて明らかにすることができた。

また、対候性に関しても、約15nmのナノ顔料のものとマイクロメーターオーダーのものでは、ほとんど変化がないことも確認された。これらの研究成果は、次世代カラーフィルターの高品質化に繋がると確信する。薬剤系ナノ結晶に関しては、ガン細胞の培地における細胞毒性を調査した。その結果、ナノ粒子のまま、細胞内に移行できることが分かり、ナノ薬剤としての特徴が見えてきた。今後、細胞毒性におけるサイズ依存性などを明らかにできれば、「副作用が低減化され、且つコスト低減が図られる抗癌性薬剤の開発」に繋がると考える。
新たな疾患概念「潜在性中枢性甲状腺機能低下症」の確立と病態の解析

潜在性甲状腺機能低下症は、血清遊離T4値が基準値内であるが、軽度血清TSH値が上昇した病態で心脳血管障害の発症危険因子として注目されている。これまで潜在性甲状腺機能低下症は、甲状腺自体の障害によるものばかりであったが、私たちは「潜在性中枢性甲状腺機能低下症」という新たな病態が存在する可能性を発見し、動物モデルのTRHノックアウトマウスを用いてその病態を解析した。潜在性甲状腺機能低下症は、血清遊離T4値が基準値内であるが、軽度血清TSH値が上昇した病態でメタ解析などにより心脳血管障害の発症危険因子として注目されている。これまで潜在性甲状腺機能低下症は、甲状腺自体の障害によるものばかりであったが、私たちの多数例の下垂体腫瘍の検討から「潜在性中枢性甲状腺機能低下症」という新たな病態が存在する可能性を発見した。本研究では、新たな疾患概念「潜在性中枢性甲状腺機能低下症」を確立するため、さらに症例数を増加させ詳細を検討を進めている。一方、動物モデルとしてTRHノックアウトマウスのホモ接合体は、甲状腺ホルモンが約60%の軽度の甲状腺機能低下症になるが、血清TSH値は生物学的活性が低下しむしろ軽度増加することが判明している。本年度は野性型、TRHKOホモ接合体並びにヘテロ接合体の下垂体よりmRNAを抽出し、マイクロアレイ法とK-means法解析により網羅的にTRH欠損状態の程度により変化する遺伝子群について検討し、NR4A1(Nur77)がTRH依存性の遺伝子であり、さらにNR4A1はTSHβ遺伝子をin vitroの実験系で、プロモーター領域にリクルートされることにより転写活性を増強していることが判明した。従って、TRHのTSHβ遺伝子制御機構には、これまでの報告にあるpit1やGATA2といった転写因子群に加えて、NR4A1が重要な役割をしていることが判明し、NR4A1異常による中枢性甲状腺機能低下症という病態も存在する可能性がある。本年度は摂食による中枢性の甲状腺機能への検討を行うため、野生型マウス並びにTRHノックアウトマウスを絶食にし、経時的に血清甲状腺ホルモン値、TSH値、さらに下垂体TSHb mRNAレベルを検討した、さらにレプチンによる効果を絶食時に腹腔内投与することにより検討した。野生型マウスでは、絶食にすると経時的にFT4レベルは低下し、16時間で約90%まで低下した。同時に測定したTSHも経時的に低下した。また、FT4の低下はレプチンの投与により完全に回復した。TRHノックアウトマウスでも絶食により甲状腺ホルモン並びにTSHは低下したが、レプチン投与による甲状腺ホルモンへの影響は消失した。従って、レプチンの視床下部ー下垂体ー甲状腺系への作用にはTRHが必須であることが明らかとなった。潜在性甲状腺機能低下症は、高LDLコレステロール血症や心脳血管障害の発症危険因子として注目されている。この病態は、主に橋本病などによる甲状腺自体の障害に基づいている。一方、甲状腺機能低下症の原因として、視床下部や下垂体レベルでの障害による中枢性甲状腺機能低下症もある。私達は、多数例の下垂体腫瘍の検討から「潜在性中枢性甲状腺機能低下症」という新たな病態が存在する可能正を発見した。本研究では、新たな疾患概念「潜在性中枢性甲状腺機能低下症」を確立し、その病態をTRHノックアウトマウスやIGF-1受容体ノックアウトマウスなどのモデル動物を用い解明し、診断法を確立し生活習慣病への関与を検討することを目的とした。本年度は1)臨床疫学的データーベースの発展させるため下垂体腫瘍の術前術後の甲状腺ホルモン値、TSH値、腫瘍の大きさ、病理像や甲状腺機能の最も鋭敏な指標となるコレステロールついて追加検討した。また、2)TRHノックアウトマウスのホモ接合体は、甲状腺ホルモンが約60%の軽度の甲状腺機能低下症になるが、血清TSH値は生物学的活性が低下しむしろ軽度増加することが判明している。本年度は野性型、TRHKOホモ接合体並びにヘテロ接合体の下垂体よりmRNAを抽出し、マイクロアレイ法とK-means法解析により網羅的にTRH欠損状態の程度により変化する遺伝子群について検討する。

現在までにTRHにより強く制御される因子としてNR4A1(Nur77)があることが判明し詳細な検討を進めている。臨床疫学的データーベースでは下垂体腫瘍の術前術後の甲状腺ホルモン値、TSH値、腫瘍の大きさ、病理像などについてさらに追加した。また、基礎的な検討のTRHノックアウトマウスを用いた検討では、TRHの下垂体TSHβ遺伝子制御にNR4A1が関与することを確立し報告した。臨床疫学的データーベースの追加症例については順調に症例数が増えている。また、基礎的な検討のTRHノックアウトマウスを用いた検討では、下垂体のcDNA microarray解析が終了し、TRH依存性遺伝子としてNR4A1が単離され、TSH遺伝子制御機構への関与を検討している。昨年度は動物の繁殖が悪く、動物実験にかかる経費に残額が生じた。今年度にそのプロジェクトもあわせ推進して行く予定である。また、臨床疫学的データーベースの追加症例については症例数をさらに増やし、病態の確立を目指す。TRHノックアウトマウスを用いた検討では、より生理的な状態での絶食負荷などによる血中甲状腺ホルモンやTSHならびにTSHβmRNAレベルへの影響などを検討する。臨床疫学的データーベースの追加症例については症例数をさらに増やす。また、基礎的な検討のTRHノックアウトマウスを用いた検討では、下垂体のcDNA microarray解析にて単離されたNR4A1について、免疫組織化学的検討にてTSH産生細胞との共存やTRHノックアウトマウスにおける制御を証明する。また、細胞培養系においてNR4A1を強制発現させTSHbeta遺伝子プロモーターやNR4A1遺伝子プロモーターへの影響などを検討する。その他の基礎的な検討として野生型マウスとTRHノックアウトマウスにおいてレプチンの視床下部ー下垂体ー甲状腺系への関与も検討する。上記の研究計画のため、疫学的データーを解析するためのコンピュータープログラムのアップデイトや動物関連、DNA関連、免疫組織化学関連の消耗品費として使用する。上記の研究計画のため、動物関連、DNA関連、免疫組織化学関連の消耗品費として使用する。
自閉症児の治療的教育に関する臨床心理学的研究

自閉症児の治療的教育においては、損なわれている認知機能を軽減ないし発達させる指導法を考えることが重要であると思い、本研究を計画した。本研究では、示範法・プロンプト法・強化法を併用した個別・集団指導を自閉症児症例に実施して、自閉症児における認知機能や社会的行動の発達促進を試みることを目的とした。特に、平成3年度においては、前年度までの研究計画に基づいて、生活年齢(CA)615歳の自閉症児5例および同一CAの精神遅滞児5例を新たに加えて継続指導を行った。また、本年度が最終年度にあたるために,3年間の研究結果をまとめて、その成果の報告書を作成した。幾つかの基礎的実験研究の結果から、自閉症児においては、自閉症児においては、言語音と文字の連合(聴覚ー視覚クロス・モデリティ)が形成されにくいことが分かった。そのため、視覚・運動的な手がかりを考慮した教材と指導を考案することが重要であり、それによって課題に対する注意が持続し、かつ課題遂行に関する動機づけが促されることが示唆された。また、話し言葉の指導の結果から、自閉症児においては、離散型およびフリ-オペラント型の指導を症例の行動的特徴に合せて弾力的に用いることが臨床的には有効であることが示唆された。役割行動をトレ-ニングした効果は、ル-ルに従って行動の発達を促したが、社会的行動スキルの学習という側面では、症例によって相違が認められた。今後、指導方法や指導場面を構造化するなどの研究を深める中で、社会的行動スキル訓練の研究を進める予定である。なお、自己刺激・自傷行動に関する研究については、時間的制約から資料収集・分析途中の段階に止まった。今後に残された課題として検討を続ける。自閉症の心理臨床および教育では、損なわれている認知機能を軽減ないし発達させる指導法を開発することが重要であると考える。そのために、本研究は3年計画のもとに、以下の3点を検討することを目的とした。1.示範法・プロンプト法・強化法を併用した個別指導を実施して、自閉症児における認知機能の発達促進を試みる。2.示す範法・プロンプト法・強化法を併用した集団指導を実施して、自閉症児における社会的行動の発達促進を試みる。3.自己刺激や自傷行動の発生メカニズムを検討し、社会的行動との関連について検討する。そのために、平成元年度に実施した研究計画は次の通りであんた。対象児については、生活年令(CA)615才の自閉症児10例および同一CAの精神遅滞児10例であった。個別指導では、日常生活で用いる物の具体物・半具体物・線画などを使用した対応づけ学習・弁別学習・分類学習を行った。集団指導では、集団の中で遊具操作やル-ル行動の学習指導を行った。それらの指導を実施するにあたって、ビデオ録画装置と資料集計・処理装置を使用した。各対象児に対して、原則として一週一回の間隔で、合計28回の個別指導(一回30分間×28回×20名)および集団指導(一回60分間×3グル-プ×28回)を実施した。得られた資料を、言語・認知および対人行動の発達、自己刺激出現様相、さらに自傷行動出現様相の3点から分析・整理した。本研究の目的を十分に検討するためには、時間見本法や行動描写法に加えて、出現行動の持続時間の測定や標的行動に関する詳細な機能分析を行って、得られた資料を多角的に分析する必要のあることが分った。また、応答行動を検討する際には、行動観察によって得られる資料の他に、生理心理学的手法によって得られる資料、例えば心拍変動、指先容積脈波、皮膚電気反応における反応様相などから得られる情報についても検討を加えることの意義について考察した。

そのために、本研究は3年計画のもとに、以下の3点を検討することを目的とした。1.示範法・プロンプト法・強化法を併用した個別指導を実施して、自閉症児における認知機能の発達促進を試みる。2.示範法・プロンプト法・強化法を併用した集団指導を実施して、自閉症児における社会的行動の発達促進を試みる。3.自己刺激や自傷行動の発生メカニズムを検討し、社会的行動との関連について検討する。そのために、平成2年度に実施した研究計画は次の通りであった。対象児は、生活年令(CA)615歳の自閉症児10例および同ーCAの精神遅滞児10例であった。個別指導では、日常生活で用いる物の具体物・半具体物・線画などを使用した対応づけ学習・弁別学習・分類学習およびフリ-オペラント法による発話指導を行った。集団指導では、集団の中で遊具操作やル-ル行動の学習指導を行った。それらの指導を実施するにあたって、ビデオ録画装置と資料集計・処理装置を使用した。各対象児に対して、原側としてー週一回の間隔で、個別指導および集団指導を実施した。得られた資料を言語・認知および対人行動の発達、自己刺激出現様相、さらに自傷行動出現様相の3点から分析・整理した。それらの結果、言語・認知機能を発達させるためには、対応づけ学習・弁別学習・分類学習が有効であるが、認知発達における個人差に応じた学習材料を採用することが必要であることや、学習材料の提示や教示の方法に系統性を持たせることが重要であることが分かった。また、遊具操作やル-ル行動を指導することによって、社会的行動や技術に一定の向上が見られることも分かった。しかし、それらの向上と対人・情緒的関係の発達との関連性を自己刺激自傷行動様相を基にしながら検討する必要性が残された。自閉症児の治療的教育においては、損なわれている認知機能を軽減なしい発達させる指導を考えることが重要であると思われる。本研究は示範法・プロンプト法・強化法を併用した個別・集団指導を自閉症児症例に実施して、自閉症児における認知機能や社会的行動の発達ないし促進を試みることを目的とした。平成3年度は、前年度までの研究計画に基づいて、新たに生活年齢(CA)615歳の自閉症児5例および同一CAの精神遅滞児5例を加えて継続指導を行った。また,本年度が最終年度にあたるために,3年間の研究結果をまとめて研究成果の報告書を作成する作業を行った。幾つかの基礎的実験の結果から、自閉症児においては言語音と文字の連合(聴覚ー視覚クロス・モダリティ)が形成されにくいために、視覚・運動的な手がかりの存在を考慮した教材およびそれによる指導を考察することが重要であり、それによって課題への注意が持続し、かつ課題遂行に関する動機づけが促されることが示唆された。また、弁別や記憶課題においても,それらの要因が有効に機能することが示唆された。話しことばの指導においては、離散型およびフリ-オペラント型のオペラント指導を症例に合わせて適宜併用することが臨床的には有効であることが考えられた。さらに、役割行動のトレ-ニング効果は、ル-ル行動の発達において認められたが、社会的行動スキルの学習に関しては症例によって相違をみた。今後、指導方法や場面の構造化に関する研究を深める必要があると考えられる。
GFPにより可視化した非相同末端結合蛋白質によるDNA損傷認識機構に関する研究

15年度までに樹立した細胞株を用いて、DNA二重鎖切断誘導後の野生型と変異型Ku80蛋白質の局在変化を、融合した蛍光蛋白質(GFP)を指標に経時的に観察することにより、放射線照射後のKu蛋白質がDNA切断点に結合するか否かを可視化により観察した。樹立した細胞株を蛍光蛋白質が観察できる様に蛍光物質を含まないガラス底の培養皿に一晩培養し良く接着させた後、電離放射線発生装置でX線(0-10Gy)を照射し、DNAの二重鎖切断を誘導した。まず、DNA二重鎖端が誘導されているか否かを確認するために、誘導されたDNA二重鎖端に既知のDNA修復蛋白質(H2AX蛋白質)が結合していることを照射した細胞を固定後に免疫細胞化学染色法により可視化し確認した。次いで、高感度の倒立型の共焦点レーザー顕微鏡の鏡台上で37度条件下で培養しながら経時的に蛍光蛋白質(正常型及び変異型Ku80)の局在変化を観察した。しかしながら、細胞核内にDNA二重鎖端が誘導されているにもかかわらず、Ku80蛋白質は顕著な局在変化を示さなかった。さらに、野生型のKu80とDNAに結合できない変異型Ku80の局在を一つの細胞内で発現させた細胞株について、異なる波長で励起される2種類の蛍光蛋白質の局在を比較検討を行ったが、その間に顕著な差は認められなかった。従って、本研究の結果、H2AX蛋白質が、DNA損傷部位に集合する条件下で、GFP融合型のKu80蛋白質は、DNA損傷部位に集合しないことが示された。本研究では、ほ乳類細胞内のKu蛋白質複合体が、放射線照射後のDNA切断点に結合するか否かを明らかにすることを目的に研究を進めている。これまでに、下記の様にほぼ計画に従って解析は進行した。1)GFP融合Ku80蛋白質発現ベクターの作成計画に従って、野生型、あるいは、変異型Ku80蛋白質をGFP融合蛋白質として発現する様に遺伝子発現ベクターを構築した。2)Ku80欠損細胞への遺伝子発現ベクターの導入と細胞株の樹立発現ベクターは、Ku80欠損細胞の中に導入した。そして、一晩培養後、抗生物質による選別培地に交換し、恒常的に融合蛋白質を発現する細胞株を複数樹立した。細胞株選択の指標は、(1)蛍光蛋白質の蛍光強度が明るく、細胞核への局在をとる、(2)正常な細胞形態をとる、(3)期待されるGFP融合Ku80を発現している、こととした。3)樹立したGFP融合Ku80発現細胞株のDNA修復能GFP融合蛋白質は、GFP自体が大きな蛋白質であるので、機能や局在変化に影響を与える可能性がある。予備実験の結果から、Ku80のDNA修復能には影響を与えないことが確認されているが、念のため、(1)樹立した細胞株のDNA修復能に関しては、電離放射線照射後の細胞増殖数と増殖能(コロニー形成法)により解析した。また、野生型Ku80のDNA修復能には、Ku70と複合体を形成し、Ku70を安定化させて、核に局在化させることが必須である。そこで、(2)Ku70の安定化をKu70の蛋白質量を調べる(ウエスタン法)ことで、(3)Ku70とKu80の結合の有無を免疫沈降法で、(4)Ku70の細胞内局在を免疫細胞化学法で確認した。予想どうり変異型Ku80を導入させた細胞株では、変異型Ku80の局在は野生型Ku80と同様であるにもかかわらず、Ku70の安定化や変異型Ku80とKu70の結合は無かった。
心不全の基礎疾患と病期を考慮した新しい包括的心不全治療法の開発

心不全の病態の多様性に対応するために、虚血性および非虚血性心不全モデルの双方において内因性ストレス感受性因子(AMPK)活性化剤の投与を心不全発症前(予防)と心不全発症後(治療)の双方のタイミングで行い、その効果を血行動態、心機能および遺伝子発現変化から多面的に検討した。その結果、AMPKの活性化が心不全の発症や進展を抑制し、その効果は虚血性や非虚血性などの病因や病期にかかわらず認められることが明らかとなった。心不全の病態の多様性に対応するために、本年度は前年度に実施した高頻度ペーシングによる非虚血性心不全モデルおよび陳旧性心筋梗塞による虚血性心不全モデルの双方において得られた心筋サンプルを用いて、DNAマイクロアレイ法による網羅的な遺伝子発現の解析を行った。その結果、非虚血性心不全モデルの心筋において代償性心不全期に2倍以上発現が増加した遺伝子は、多彩な心血管保護作用を有する内因性生理活性物質であるBNPやアデノシン産生酵素(ecto-5'-nucleotidase)を含めて184個認められた。その一方で、1/2以下に発現が低下した遺伝子はアデノシン分解酵素(adenosine kinaseおよびadenosine deaminase)を含めて121個認められた。また、心不全回復期において2倍以上の発現増加が認められた遺伝子は38個と代償性心不全期に比して少なく、BNPやアデノシン産生酵素は、代償性心不全期に発現が増加し、回復期には低下することが明らかになった。さらに非虚血性心不全モデルにおいて、内因性ストレス感受性因子であるAMP-activated protein kinase(AMPK)を活性化する薬剤(AICAR)を投与することによりにより、左室系の拡大と左室駆出率の低下が抑制されたが、AICAR投与により2倍以上発現が増加した遺伝子は、AMPKを含めて38個認められた。その一方で、1/2以下に発現が低下した遺伝子は51個認められた。また、陳旧性心筋梗塞による虚血性心不全モデルでは、ICAM-1、IL-6、VEGF receptorsの発現増加が特徴的であった。DNAマイクロアレイ法により発現変化を認めた遺伝子群については、Tag man probeを用いた定量PCRで発現の変動を確認した。本年度は、虚血性(陳旧性心筋梗塞)および非虚血性心不全(高頻度右室ペーシング)モデルの双方において、内因性ストレス感受性因子であるAMP-Activated Protein Kinase(AMPK)の活性化剤(AICAR)の心不全発症後(治療)投与による心筋の遺伝子発現の変化を検討し、BNPやアデノシン産生酵素などの発現亢進を確認した。心不全の病態の多様性に対応するために、虚血性および非虚血性心不全モデルの双方において、AICARの投与開始を、心不全発症前(予防)と心不全発症後(治療)の双方のタイミングで行い、その効果を血行動態、心機能および遺伝子発現変化から多面的に検討した。虚血性モデルにおいては左室径が拡大し、左室駆出率が低下したが、AICAR予防投与により、左室径の拡大と左室駆出率の低下が抑制された。また、AICAR治療投与でも、左室径の拡大と左室駆出率の低下が抑制された。一方、非虚血性モデルにおいても虚血性モデルと同様の結果が認められた。虚血性および非虚血性心不全モデルの双方において得られた心筋サンプルを用いて、DNAマイクロアレイ法による網羅的な遺伝子発現の解析を行った。その結果、非虚血性心不全モデルの心筋において代償性心不全期に2倍以上発現が増加した遺伝子は、多彩な心血管保護作用を有する内因性生理活性物質であるBNPやアデノシン産生酵素などが認められた。AICAR投与により、2倍以上発現が増加した遺伝子はAMPKを含めて38個認められた。上記の結果より、AMPKの活性化が心不全の発症や進展を抑制し、その効果は虚血性や非虚血性など病因や病期にかかわらず認められることが明らかとなった。新しい包括的心不全治療法を開発するにあたり、心不全の病態の多様性に対応するために、本年は、虚血性および非虚血性心不全モデルの双方において、内因性ストレス感受性因子であるAMP-Activated Protein Kinase(AMPK)の活性化剤(AICAR)の投与開始を、心不全発症前(予防)と心不全発症後(治療)の双方のタイミングで行い、その効果を検討した。虚血性(陳旧性心筋梗塞)モデルによる検討においては、無投薬群では左室径が拡大(4週後:35mm、6週後:37mm)し、左室駆出率が低下(4週後:45%、6週後:40%)したが、AICARの隔日投与を心不全発症前(心筋梗塞作成前)から行うことにより、左室径の拡大が抑制され(4週後:32mm、6週後:34mm)、左室駆出率の低下も抑制された(4週後:57%、6週後:55%)。

また、心不全発症後(心筋梗塞作成4週間後)よりAICARの隔日投与を行っても、6週後における検討で左室径の拡大と左室駆出率の低下の抑制効果が認められた。一方、非虚血性(高頻度右室ペーシング)モデルによる検討においては、無投薬群では左室径が拡大(4週後:36mm、6週後:39mm)し、左室駆出率が低下(4週後:35%、6週後:24%)したが、AICARの隔日投与を心不全発症前(ペーシング開始前)から行うことにより、左室径の拡大が抑制され(4週後:33mm、6週後:35mm)、左室駆出率の低下も抑制された(4週後:45%、6週後:37%)。また、心不全発症後(ペーシング4週後)よりAICARの隔日投与を行っても、6週後における検討で左室径の拡大と左室駆出率の低下の抑制効果が認められた。上記の結果より、AMPKの活性化が心不全の発症や進展を抑制し、その効果は虚血性や非虚血性など病因にかかわらず認められることが明らかとなった。先に提出した交付申請において、当該研究課題である「心不全の基礎疾患と病期を考慮した新しい包括的心不全治療法の開発」を遂行するために、平成23年度は、大動物実験プロトコールとして、1)非虚血性心不全モデル(右室高頻度ペーシング)におけるAMPK活性化剤の心不全改善効果の検討、2)虚血性心不全モデル(陳旧性心筋梗塞)におけるAMPK活性化剤の心不全改善効果の検討の2項目を実施計画に掲げ、平成24年度は平成23年度に得られた心筋サンプルを用いて、DNAマイクロアレイ法による網羅的な遺伝子発現の解析を実施計画に掲げた。現在までに、前述の研究実績の概要に示すように、当初の計画通り、大動物(ビーグル犬)を用いた右室高頻度ペーシングによる非虚血性心不全モデルおよび陳旧性心筋梗塞による虚血性心不全モデルの双方のプロトコールを実施し、AMPK活性化剤が双方のモデルにおいて心不全の発症や進展を抑制することを明らにし、さらに双方のモデルにおいて心不全の進展・回復の各時相とAMPK活性化剤の投与における遺伝子発現の変化を明らかにできたことから、おおむね順調に進展していると評価した。先に提出した交付申請において、当該研究課題である「心不全の基礎疾患と病期を考慮した新しい包括的心不全治療法の開発」を遂行するために、平成23年度は、大動物実験プロトコールとして、1)非虚血性心不全モデル(右室高頻度ペーシング)におけるAMPK活性化剤の心不全改善効果の検討、2)虚血性心不全モデル(陳旧性心筋梗塞)におけるAMPK活性化剤の心不全改善効果の検討の2項目を実施計画に掲げた。現在までに、前述の研究実績の概要に示すように、当初の計画通り、大動物(ビーグル犬)を用いた右室高頻度ペーシングによる非虚血性心不全モデルおよび陳旧性心筋梗塞による虚血性心不全モデルの双方のプロトコールを実施し、AMPK活性化剤が双方のモデルにおいて心不全の発症や進展を抑制することを明らにしたことから、おおむね順調に進展していると評価した。平成23年度及び平成24年度の研究計画はおおむね順調に進展している状況である。当該研究課題である「心不全の基礎疾患と病期を考慮した新しい包括的心不全治療法の開発」を遂行するために、平成25年度は、特定遺伝子のプロファイリングを行う予定である。具体的には、発現変動が確認された遺伝子群が既知の遺伝子の場合、心不全やAMPK、BNP及びアデノシンとの関連があるかをゲノムブラウザーで検索する。
含水メルトの弾性波速度測定による地震波速度低速度異常の解明

本年度は,(1)含水ケイ酸塩を溶融可能な高温条件下での弾性波速度測定技術の開発.(2)メルトをカプセルに封入した状態での弾性波速度測定技術の開発を行った.(1)においては,高圧実験セル内部に断熱の良いジルコニアを用いて,高温高圧発生実験のテストを行った.さらに,弾性波を伝搬させるためのロッドを,これまでの研究で用いていたアルミナから断熱の良いジルコニアに変更して弾性波測定実験を行った.その結果,最高1700°C条件下において弾性波測定を行うことに成功した,この温度は,上部マントル圧力条件下において含水ケイ酸塩を溶融させることが可能な温度であり,この測定技術を用いることにより,含水ケイ酸塩を溶融させた状態での弾性波速度測定を行うことが可能になると考えられる.そこで,この技術を用いて,さらに(2)のメルトをカプセルに封入した状態での弾性波速度測定技術の開発を行った.その結果,圧力約5GPa,温度最大1600°C条件下において,MORB組成メルトをBNカプセルに封入した状態での弾性波測定を行うことに成功した.MORB組成が溶融を開始する約1400°C以上の高温条件下において,試料の溶融とともにS波信号は消滅した.一方,P波信号は強度が弱くなるが,最大1600°Cまで信号は観察され,その伝搬時間が非常に遅くなる現象が観察された.このような高圧条件下における溶融した岩石の弾性波測定は世界でも初めての実験であり,観測されている地球内部の地震波速度低速度異常を理解するために必要なマグマやそれを含む部分溶融した岩石の弾性波速度の解明に大きく貢献すると考えられる.本年度は,(1)含水ケイ酸塩を溶融可能な高温条件下での弾性波速度測定技術の開発.(2)メルトをカプセルに封入した状態での弾性波速度測定技術の開発を行った.(1)においては,高圧実験セル内部に断熱の良いジルコニアを用いて,高温高圧発生実験のテストを行った.さらに,弾性波を伝搬させるためのロッドを,これまでの研究で用いていたアルミナから断熱の良いジルコニアに変更して弾性波測定実験を行った.その結果,最高1700°C条件下において弾性波測定を行うことに成功した,この温度は,上部マントル圧力条件下において含水ケイ酸塩を溶融させることが可能な温度であり,この測定技術を用いることにより,含水ケイ酸塩を溶融させた状態での弾性波速度測定を行うことが可能になると考えられる.そこで,この技術を用いて,さらに(2)のメルトをカプセルに封入した状態での弾性波速度測定技術の開発を行った.その結果,圧力約5GPa,温度最大1600°C条件下において,MORB組成メルトをBNカプセルに封入した状態での弾性波測定を行うことに成功した.MORB組成が溶融を開始する約1400°C以上の高温条件下において,試料の溶融とともにS波信号は消滅した.一方,P波信号は強度が弱くなるが,最大1600°Cまで信号は観察され,その伝搬時間が非常に遅くなる現象が観察された.このような高圧条件下における溶融した岩石の弾性波測定は世界でも初めての実験であり,観測されている地球内部の地震波速度低速度異常を理解するために必要なマグマやそれを含む部分溶融した岩石の弾性波速度の解明に大きく貢献すると考えられる.
補体因子はプリオン病初期の病態形成に影響を与えるか

補体因子はプリオン感染マウスの脳で感染初期からミクログリアにおいて発現が増加するが、病態形成における補体因子の機能は不明であった。H29年度までの成果により、補体因子はプリオン感染初代培養神経細胞の細胞膜の透過性を亢進させ、異常型プリオンタンパク質(PrPSc)を減少させること、プリオン感染神経細胞・アストロサイト混合培養系においてアストロサイトを活性化させることが示唆されており、補体因子がプリオン病において神経細胞・グリア細胞のクロストークを制御している可能性が考えられた。H30年度はプリオン感染マウスの感染初期、中期、後期にC1qa遺伝子をノックダウンし、脳内でのPrPScの沈着およびアストロサイトの活性化に与える影響を検討した。プリオン感染初期、中期、後期に、マウスの右側視床にC1qa遺伝子に対するshRNAをレンチウイルスベクターにより導入した。感染初期及び中期では、左右の視床でC1qa遺伝子の発現が有意に減少したが、後期では導入側のみで遺伝子発現が有意に減少した。PrPSc量をウェスタンブロットにより解析すると、感染中期ではC1qa遺伝子ノックダウンにより左右の視床でPrPSc量が有意に増加したが、感染後期では左右の視床ともに変化がなかった。GFAPの発現を免疫染色で解析したところ、感染中期ではC1qa遺伝子ノックダウンにより左右の視床でGFAP発現が減少したが、感染後期では左右の視床ともに変化がなかった。以上の結果より、補体因子C1qはin vivoのプリオン感染においてもPrPScの蓄積を減少させ、アストロサイトを活性化させることが示唆された。神経細胞およびアストロサイトでC1qにより誘導される細胞シグナル経路の解析に用いるために、293T細胞を用いてリコンビナントC1qを産生する系を立ち上げた。今後はrC1qをプリオン感染神経細胞・アストロサイト混合培養系に作用させ、細胞シグナル経路の解析を行っていく。プリオン感染マウス感染の異なる時期にレンチウイルスベクター導入によりC1qA遺伝子をノックダウンし、PrPSc量とアストロサイトの活性化を解析することができた。この実験はH3031年度に行う予定であった。一方で、H30年度に行う予定であった、細胞シグナリングの検討は十分に行えなかった。しかしながら、細胞シグナリング経路を解析するための神経細胞・アストロサイト混合培養系とrC1qの作製系は確立できているため、H31年度で当初の実験計画を行うことができると考えている。プリオン感染神経細胞・アストロサイト混合培養系にrC1qを反応させ、細胞内シグナル経路の解析を行う。p38MAPK、NF-kB、CREB1、IRF5、SMAD4、STAT1、STAT3などの因子の活性化をウェスタンブロット、免疫染色により解析する。また、これらの因子の阻害剤やドミナントネガティブ分子の発現が、rC1qの効果にどのような影響を与えるかを解析する。補体因子はプリオン感染マウスの脳で感染初期から発現が増加するが、病態形成における補体因子の機能は不明であった。補体因子はプリオン感染初代培養神経細胞の細胞膜の透過性を亢進させ、異常型プリオンタンパク質(PrPSc)を減少させることから、補体因子がプリオン感染神経細胞に何らかのシグナル伝達を誘導する可能性が考えられた。また、アルツハイマー病モデルマウスでは、補体因子C1qはミクログリアによるアミロイドβの貪食を亢進すること、アストロサイトのNFκB経路を活性化することから、補体因子はプリオン病でも神経細胞・グリア細胞間のクロストークを担う伝達物質として機能する可能性が考えられた。まず補体因子がプリオン感染神経細胞に誘導するシグナル経路を解析した。プリオン初代培養神経細胞にMAPK経路阻害剤存在下または非存在下で補体因子を作用させたところ、p38MAPK経路阻害剤存在下で補体因子による細胞膜の透過性亢進が阻害された。しかしながら、阻害剤処理そのものでPrPSc量が減少したため、阻害剤を用いた実験では補体因子の効果を評価することが困難であると考えられた。補体因子がプリオン病において神経細胞・グリア細胞間のクロストークを担う伝達物質として機能する可能性を検討するために、プリオン感染神経細胞・アストロサイト混合培養系にプリオン感染マウス脳より分離したミクログリアを加えると、アストロサイトマーカーであるGFAPの発現が増加した。これはミクログリアのC1q遺伝子発現をノックダウンすると観察されなくなった。プリオン感染マウスの脳でC1q遺伝子発現をノックダウンしても、GFAPの発現増加が抑制された。以上の結果からミクログリアから分泌されるC1qは、1. p38MAPK経路を介してプリオン感染神経細胞の膜透過性を亢進する可能性、2.アストロサイトを活性化させる可能性が示唆された。平成29年度の研究計画は補体因子がプリオン感染初代神経細胞に誘導するシグナル伝達経路を明らかにことであった。PathScan Signaling Nodes Multi-Sandwich ELISA Kitでシグナル伝達関連因子のリン酸化状態の解析を試みたが、リン酸化レベルが検出限界以下であった。MAPK経路阻害剤を用いた実験により、補体因子によるプリオン感染神経細胞の細胞膜透過性の亢進にはp38MAPK経路が関与する可能性が示唆されたが、阻害剤自体がPrPSc量に影響を与えたため、目的に適した実験系ではないと判断した。

平成2930年度には、補体因子がプリオン病において神経細胞・グリア細胞間のクロストークを担う伝達物質として機能する可能性を検討することを研究計画としており、平成29年度は初代培養神経細胞とプリオン感染マウス脳より分離したアストロサイト、ミクログリアの共培養の条件検討を行った。マウス脳から分離したアストロサイトは培養系で維持することが困難であった。また、神経細胞とミクログリアの共培養では、非感染マウスの脳から分離したミクログリアを用いても、神経細胞が死滅した。そこで、マウス胎仔脳より調整した神経細胞とアストロサイトの混合初代培養系にプリオン感染マウス脳より分離したミクログリアを加えた培養系を用いて解析を行った。共培養系が当初の計画通りに確立することが困難であったことから、平成3031年度に計画していたin vivoの実験を前倒しで行った。平成29年度に行う予定の実験の一部は遅れているが、平成30年度に行う予定の実験を前倒しで行ったことから、概ね順調に進展していると判断した。補体因子はプリオン感染マウスの脳で感染初期からミクログリアにおいて発現が増加するが、病態形成における補体因子の機能は不明であった。H29年度までの成果により、補体因子はプリオン感染初代培養神経細胞の細胞膜の透過性を亢進させ、異常型プリオンタンパク質(PrPSc)を減少させること、プリオン感染神経細胞・アストロサイト混合培養系においてアストロサイトを活性化させることが示唆されており、補体因子がプリオン病において神経細胞・グリア細胞のクロストークを制御している可能性が考えられた。H30年度はプリオン感染マウスの感染初期、中期、後期にC1qa遺伝子をノックダウンし、脳内でのPrPScの沈着およびアストロサイトの活性化に与える影響を検討した。プリオン感染初期、中期、後期に、マウスの右側視床にC1qa遺伝子に対するshRNAをレンチウイルスベクターにより導入した。感染初期及び中期では、左右の視床でC1qa遺伝子の発現が有意に減少したが、後期では導入側のみで遺伝子発現が有意に減少した。PrPSc量をウェスタンブロットにより解析すると、感染中期ではC1qa遺伝子ノックダウンにより左右の視床でPrPSc量が有意に増加したが、感染後期では左右の視床ともに変化がなかった。GFAPの発現を免疫染色で解析したところ、感染中期ではC1qa遺伝子ノックダウンにより左右の視床でGFAP発現が減少したが、感染後期では左右の視床ともに変化がなかった。以上の結果より、補体因子C1qはin vivoのプリオン感染においてもPrPScの蓄積を減少させ、アストロサイトを活性化させることが示唆された。神経細胞およびアストロサイトでC1qにより誘導される細胞シグナル経路の解析に用いるために、293T細胞を用いてリコンビナントC1qを産生する系を立ち上げた。今後はrC1qをプリオン感染神経細胞・アストロサイト混合培養系に作用させ、細胞シグナル経路の解析を行っていく。プリオン感染マウス感染の異なる時期にレンチウイルスベクター導入によりC1qA遺伝子をノックダウンし、PrPSc量とアストロサイトの活性化を解析することができた。この実験はH3031年度に行う予定であった。
新規不妊カースト＂ユニック＂－存在検証と系統における保存性－

通常のシロアリのコロニーでは,雌雄の繁殖虫の片方もしくは両方がコロニーから消失した場合,欠けた性の繁殖虫を補うようにして幼型二次生殖虫(ネオテニック)を生産することで繁殖機能を回復する.沖縄島に生息する乾材シロアリの一種,コウシュンシロアリN. koshunensisでは生産されるネオテニックがオスのみであることや,この雄ネオテニックの繁殖能力に疑問がもたれるなど,他のシロアリと大きく異なる繁殖システムを持つことが示唆されていた.本研究ではコウシュンシロアリの繁殖および社会システムを解明することを目的としている.平成28年度は既に得られているデータの解析と論文執筆をすすめ,日本学術振興会特別研究員PDである小林和也博士(京都大学大学院農学研究科昆虫生態学研究室)との共同研究により、本種が末端型オートミクシスによる単為生殖能力を保持していることを,遺伝子マーカーを用いて確認した.また,本種の単為生殖の孵化率は約50%程度と,単為生殖種と非単為生殖種の中間的な性質を示したことから,本種が生物の単為生殖能力進化の重要な材料生物となりえることを示した(Kobayashi and Miyaguni, Scientific Reports 2016).また、同博士との共同研究により,性特異的な遺伝マーカーを開発し,シロアリでは初となる一次性を解明した.本種では雄にバイアスした性投資を行っていることを明らかにするなど,性比理論においても有用な研究材料となる可能性が示された.また,日本学術振興会特別研究員DCである野崎友成氏(京都大学大学院農学研究科昆虫生態学研究室)および京都大学大学院農学研究科特定研究員である矢代敏久博士(昆虫生態学研究室)ともに,シロアリでは初となる,体の左右で性表現が異なるGynandromorph現象を発見するともに,その発生メカニズムについての仮説を提示した.28年度が最終年度であるため、記入しない。28年度が最終年度であるため、記入しない。(1)遺伝マーカーの開発:日本学術振興会特別研究員PDである小林和也博士(京都大学大学院昆虫生態学研究室)との共同研究として,沖縄島のコウシュンシロアリの遺伝マーカーの作成に取り組んだ.その結果,遺伝子型多型があり,集団遺伝学的解析など実用に耐えうるマイクロサテライトマーカーを合計9本開発した.(2)単為生殖能力の確認:沖縄島で採集したコウシュンシロアリを幼体から雌雄を分けて飼育することで,完全未交尾の有翅繁殖虫を研究室で育成した.この有翅繁殖虫を用いてメスだけのコロニー創設を行わせたところ,多数のコロニーで産卵および孵化が確認されるなど,本種が単為生殖能力を持つことが確認された.(1)で作成した遺伝マーカーを用いてコロニーの雌生殖虫と幼虫および卵の遺伝子型を解析したところ,親がヘテロ接合の遺伝子型をもつ遺伝子座においても幼虫と卵の遺伝子型は全てホモ接合になっていることから,本種はヤマトシロアリや高等シロアリなどにみられる単為生殖形式と同様に,末端型オートミクシスによる核相回復を行っていることが示唆された.(3)オス幼生生殖虫の生殖能力の検証:コウシュンシロアリにおけるオス幼生生殖虫の生殖能力の有無を検証するために,オス幼生生殖虫とメス有翅繁殖虫のコロニーを研究室で創設させた.観察期間中に産卵および幼虫の孵化が確認され,これらをサンプルとして保存した.遺伝マーカーによる解析を27年度初頭に行い,この課題についての結論を出す.(4)コウシュンシロアリ種群の分類学的な種の再考:京都大学大学院農学研究科特定研究員である矢代敏久博士(昆虫生態学研究室)との共同研究として,コウシュンシロアリ種群の分類の再考を行い,これまでコウシュンシロアリとしてひとくくりにされていた本種が3種のシロアリに分類されることを明らかにした.本研究では〈コウシュンシロアリの雄ネオテニックは新規の不妊カーストである〉という作業仮説を中心として,コウシュンシロアリの繁殖および社会システムを解明することを目的としている.本研究の中心課題である雄ネオテニックの不妊仮説を検証するため,雄ネオテニックと雌翅アリのペアと雄翅アリと雌翅アリペアでコロニーの創設実験を前年度より継続して行った.これらのペアの産卵傾向及び卵・幼虫の遺伝解析を用いて両雄生殖虫の繁殖能力の比較を行った.その結果,雄ネオテニックの繁殖能力は翅アリ型生殖虫の繁殖能力に及ばないものの存在することが確認された.日本学術振興会特別研究員PDである小林和也博士(京都大学大学院農学研究科昆虫生態学研究室)との共同研究として前年度より継続していたコウシュンシロアリの単為生殖能力の調査と解析では,本種の単為生殖能力が確認され,通常の偶発的単為生殖と比較して非常に高い孵化率を示すことが明らかになった.この結果は本種が今後,単為生殖の進化的道筋を検討する上で重要な材料生物となる可能性を秘めている.これらの結果の一部については現在論文を投稿中(Kobayashi, K and Miyaguni, Y. Scientific Reportsへ投稿中)である.京都大学農学部昆虫生態学研究室助教である土畑重人博士とともにコウシュンシロアリの生殖虫置換パターンについて調査を行った.その結果,本種の生殖虫置換パターンは既知である社会性膜翅目のパターンと異なることが明らかになった.中心課題である雄ネオテニックの不妊仮説については,飼育実験および遺伝解析の結果より否定された.