hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
光架橋したポリマーブレンドの弾性歪と発現した高秩序性モルフォロジーとの相関

ポリスチレン/ポリビニルメチルエーテル(PS/PVME)ブレンドを相溶する領域でPS鎖のみを架橋するために、PS鎖に少量の光架橋剤アントラセン(平均44の繰り返し単位に1コ)をラベルした。さらに、架橋反応に伴う弾性歪を除去するために、体積変化によって相分離を引き起こせる光異性化のスチルベンもラベルした(平均20の繰り返し単位に1コ)。アントラセンとスチルベンをラベルしたPS鎖をそれぞれ(PSA)および(PSS)とする。光反応は高圧キセノン・水銀ランプ(500W)を用いて行われ、さらに形成した相分離構造は位相差光学顕微鏡および画像解析システムによって観測された。1)PSA/PVMEブレンドの相溶する領域内で光架橋すると混合系は相分離する。最初は等方的な共連続構造が見られ、次第に大きくなると共に等方性から異方性に転移した。すなわち、架橋反応が進行することによって、弾性歪が集積され、長距離相互作用として働き、等方性→異方性転移を引き起こし、相分離構造の秩序化をもたらした(A.Harada and Q.Tran-Cong,Macromolecules,30,in press)。2)一方、PSS/PVMEブレンドを同様に相溶領域で光照射して相分離を引き起こす場合、相分離は起こるが、構造が成長しながら秩序化すると共に自然停止していくことが観測された(Q.Tran-Cong et al.Phys.Rev.Lett.,submitted1997)。すなわち、非反応性ポリマーブレンドの相分離と全く異なり、化学反応が伴う場合では、長波長の不安定なモードが抑制されるため、反応の途中に相分離は停止することが実験的に観測された。この結果は、Time-Dependent Ginzburg-Landau(TDGL)方程式に可逆的に反応を導入する場合、線形安定解析から得られたSoft-Modesの抑制という予測を裏付けられたと結論できる。3)可逆反応に及ぼす混合系の熱力学を考慮する場合、上記したTDGL方程式を安定解析すると、可逆反応が必ずしも相分離過程を抑制しない理論計算の結果が報告されている。この問題を検討するため、上述したアントラセンの架橋反応(二分子反応)とスチルベンの光異性化反応(一分子反応)の動力学を追跡した結果、アントラセンの場合では、反応が強くブレンドの熱力学に影響されるのに対して、スチルベンの場合では、熱力学の影響はあまり顕著でないことがわかった。すなわち、長距離にわたる拡散を必要としない分子内反応を用いて相分離させる場合、その動力学は近似的に上記したTDGLで記述できることが判明された。
沿岸海域における、懸濁性汚濁成分の直接浄化手法に関する研究

沿岸海域においては富栄養化にともなう植物プランクトンの増殖およびそれらの沈降した有機底泥の再浮上によって懸獨性汚濁成分の濃度が高く、透明度が非常に低下した状態であるところが多い。この原因は沿岸域に人工が集中し、また高度利用が進められる中で流入負荷が増大したことおよび自浄能力を持つ砂浜・干潟等の消失に許し考えられる。本研究では富栄養化により増加した懸濁性汚濁成分を除去するために、直接浄化手法として海岸線に建設されている土木構造物に浄化能力をもたせた人工海岸浄化システムの開発を試みた。具体的には自然の砂浜の持つ浄化能を応用し、防波堤などのコンクリート構造物を砂れき等を材料として透過型の構造に改変した。実験はおよそ1年間にわたって行ったが、砂れきによって構成された海浜により、懸濁物質の有効な捕捉、その中の有機性汚濁成分の分解・無機化が生じること、硝化が起こること、リンを除去できることなどが明らかとなった。また、透明度は上昇し清澄な水質の水環境を創造できる可能性が示された。このような現場実験の知見から、人工海浜浄化システムのシュミレーションモデルを構築し、設計に関する諸元としての海浜の材料(砂・れき等)形状(斜面勾配、サイズ等)に関する合理化のための検討を行った。その結果、材料として砂を用いる場合には水の透過が浄化能を律速し、粒径を大きくした場合には反応律速になり、最適な粒径範囲が存在すること、および斜面を持つ形状が浄化能に対して有効であることが示された。
ヒトにおけるmicroRNAマシナリーによる翻訳抑制の作動原理の解明

miRNAは、Agoタンパク質と複合体(miRISC)を形成し、標的mRNAのpoly(A)鎖の分解と翻訳抑制という二つの経路を介して、遺伝子発現を抑制する。我々は、miRNAによる翻訳開始抑制時に、翻訳開始過程のどのステップが標的とされているのか、またどのような因子を標的としているのかを、ヒト培養細胞抽出液を用いた独自のin vitro翻訳系およびmRNA-タンパク質複合体(mRNP)pull-down法を用いて解析した。そして、miRNA存在下においては、翻訳開始複合体eIF4Fの構成因子であるeIF4A(eIF4AI、eIF4AII)が、eIF4F複合体から除外されていることを直接的に証明している。しかしながら、miRNA反応マシナリーがどのようにしてeIF4Aを翻訳開始複合体より解離させているのかについては依然不明である。我々はこれまでに、CCR4-NOT複合体の構成因子がmiRNAに誘導される翻訳開始抑制にどのように寄与するかを、各構成因子のノックアウトMEF(Mouse Embryonic Fibroblast)細胞を用いて解析を進めてきた。その結果、TNRC6タンパク質のmiRNAによる翻訳抑制への寄与をはじめ、これまで報告されてきたCCR4-NOT複合体を中心とする分子機構では説明がつかない結果を得たので報告する。さらに、ヒト培養細胞抽出液によるin vitro翻訳系を用いたmRNA pull-down法により、miRISCが形成された標的mRNA上のみに存在するタンパク質を精製し、質量分析によりmiRISCによる翻訳抑制に必要であると考えられる因子Xを同定した。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。miRNAが行う遺伝子発現制御機構には、mRNAのpoly (A)鎖を分解することでmRNAを不安定化させ分解する経路と、翻訳開始複合体中のeIF4Aを標的とすることで直接的に翻訳を抑制する経路が存在する。poly (A)鎖の分解機構がその素過程まで解析されている一方、miRNAが誘導する翻訳抑制機構においてどのように標的mRNA上からeIF4Aを解離させているかについては未だ不明である。miRNAは、Agoタンパク質との複合体であるmiRISCを形成することで機能を持ち、このmiRISCと様々な因子が相互作用することで翻訳抑制が引き起こされるといわれている。しかしながら、様々なモデル生物および実験系を用いて得られた結果をもとにした仮説が次々と提唱され、議論が混沌としている。そこで私は、miRISCを形成したAgoタンパク質が直接翻訳抑制を引き起こしているのではないかと考え、miRNAによる翻訳抑制機構に対するGW182タンパク質の必要性を検証した。GW182タンパク質は、ヒトではTNRC6A、TNRC6B、TNRC6Cの3種類が存在し、miRISCや、様々な因子と結合し足場として働くと考えられており、miRNAが引き起こす翻訳抑制機構に必要であると考えられてきた。しかし、ショウジョウバエの細胞では、GW182タンパク質非依存的にmiRNAが翻訳抑制を引き起こすという報告があり、ヒトの細胞でも同じ機構が存在する可能性があるのではないかと考えた。そこで、GW182タンパク質との結合性を失ったヒト変異体Ago2の、miRNAが誘導する翻訳抑制効果への影響を観察した。このヒト変異体Ago2が、GW182タンパク質との結合性を失い、標的配列を認識する機能を持ち、標的mRNA上でmiRISCを形成することは確認した。このヒト変異体Ago2が発現した細胞抽出液中では、miRNAによる翻訳抑制効果は観察されなかった。この結果から、ショウジョウバエの細胞とは異なり、GW182タンパク質非依存的なmiRNAの翻訳抑制機構はヒトには保存されていないことが示唆された。本年度の研究では、miRNAがどのようにして翻訳抑制能を発揮しているのかという作動基盤について、GW182タンパク質を探り針として研究を進めた。その結果、これまでショウジョウバエを用いた生化学実験系で提唱されていたモデルとは異なり、ヒトではmiRNAによる翻訳抑制にはGW182が必須であることが明らかになった。今後、in vitro翻訳系の応用により、GW182タンパク質を中心としたmRNA-タンパク質複合体の解析を実施することで実行役を明らかにできる可能性を提唱できた。また、miRNAによる遺伝子発現抑制機構と同様CCR4-NOT複合体を介した遺伝子発現制御を行うことが知られているARE結合タンパク質を対照とした生化学実験よりmiRNAとARE結合タンパク質では、抑制様式が異なるものであることが明らかになった。これは、miRNAによる遺伝子発現抑制の作動基盤を明らかにする上で大きな知見である。

我々はこれまでに、CCR4-NOT複合体の構成因子がmiRNAに誘導される翻訳開始抑制にどのように寄与するかを、各構成因子のノックアウトMEF(Mouse Embryonic Fibroblast)細胞を用いて解析を進めてきた。その結果、TNRC6タンパク質のmiRNAによる翻訳抑制への寄与をはじめ、これまで報告されてきたCCR4-NOT複合体を中心とする分子機構では説明がつかない結果を得たので報告する。さらに、ヒト培養細胞抽出液によるin vitro翻訳系を用いたmRNA pull-down法により、miRISCが形成された標的mRNA上のみに存在するタンパク質を精製し、質量分析によりmiRISCによる翻訳抑制に必要であると考えられる因子Xを同定した。miRNAが誘導する翻訳抑制機構では、GW182タンパク質がAgoタンパク質と結合することが必須であることが明らかになった。この結果から、GW182タンパク質が翻訳抑制を引き起こす実行因子である可能性と、GW182タンパク質を介して結合する因子が翻訳抑制を引き起こす可能性が考えられる。前者の可能性に関しては、多くの研究者がGW182タンパク質の解析を行ってきたなかで、足場として働くという見方が強い。したがって、GW182タンパク質が翻訳抑制を引き起こす実行因子であると考えるより、GW182タンパク質を介してリクルートされる因子が翻訳抑制機構の中心を担っているのではないかと考えた。今後は、標的mRNA上でmiRISCを形成している状態で、GW182タンパク質と結合している複合体の解析を行い、miRNAが誘導する翻訳抑制を引き起こす候補因子を検証していく予定である。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
CD36欠損症における心筋症の発症機序解明と治療法開発

CD36欠損マウス(以下KOマウス)における心負荷時の心不全発症の検討では、KOマウスでは心筋に対する圧力負荷時により強い心肥大・心筋線維化を呈しやすく、左室収縮不全から心不全に至ることが明らかとなった。患者iPS細胞由来心筋細胞を用いた検討では、4例のCD36欠損患者、5例の健常人からiPS由来を樹立した。iPS細胞から心筋細胞を作製し、心筋細胞の表現型を比較検討し、心筋症を有するCD36欠損症の心筋異常を改善させうる薬剤の開発を目指している。これらの実験から得られた成果を、国際学会・国内学会で発表し、また英文原著論文として現在論文投稿中である。脂肪酸トランスポーターであるCD36を欠損するCD36欠損症における心筋症の発症機序解明と治療法の開発を目的として、CD36欠損マウス(以下KOマウス)あるいはCD36欠損症患者iPS由来心筋細胞を用いた検討を行った。A. KOマウスにおける心負荷時の心不全発症の検討:野生型マウス(以下WTマウス)とKOマウスを対象とし大動脈縮窄手術(以下TAC)を実施し、心負荷による心不全発症を検討した。TAC後12週間経時的に心エコーで観察すると、左心室壁肥厚の程度はWTマウス,KOマウス間で同等であり、左心室内腔は、WTマウスでは経時的拡大は認められなかったもののKOマウスでは徐々に内腔が拡大し、TAC後12週においてKOマウスではWTマウスに比し有意に左心室収縮率の低下を認めた。TAC後12週の肺重量はKOマウスではWTマウスに比して有意に重く、左室収縮不全による心不全を認めた。TAC後12週において、心重量はKOマウスでWTマウスに比して有意に重く、心筋肥大のマーカーであるANP・BNPの遺伝子発現がKOマウスではWTマウスに比較して有意に亢進していた。またTAC後12週において、線維化マーカーの遺伝子発現がKOマウスでWTマウスに比し亢進しており、組織学的でもKOマウスでは有意に強い線維化を認めた。これらの所見からKOマウスは、心負荷時に、より強い心肥大・心筋線維化を呈しやすく、左心室収縮不全から心不全に至ることが明らかになった。B.患者iPS細胞由来心筋細胞を用いた検討:計4例のCD36欠損症患者(心筋症なし2例、心筋症あり2例)を対象とした。心筋症の合併がないCD36欠損症患者(1例)由来iPS細胞、および拡張型心筋症合併CD36欠損症患者1例のiPS細胞樹立を完了している。その他の2例のCD36欠損症患者については末梢血T細胞のストックは作成済である。CD36は血小板、単球・マクロファージ、骨格筋、心筋などに於ける長鎖脂肪酸のトランスポーターであり、ヒトのCD36欠損症では心筋症を合併する頻度が高いことを我々は見出しているが、心筋症発症の機序は明らかではなく、特異的介入方法も検討されていない。本研究では、CD36欠損症における心筋症の発症機序解明と治療法開発を目的として、CD36欠損マウス(以下KOマウス)あるいはCD36欠損症患者iPS由来心筋細胞を用いた検討を行った。A. KOマウスにおける心負荷時の心不全発症の検討:野生型マウス(以下WTマウス)、KOマウスを対象として、大動脈縮窄手術(以下TAC)による心負荷を施行した。TAC後の生存率はWTマウスに比してKOマウスで有意に低かった。TAC後の左心室内腔は、WTマウスでは拡大は認められなかったもののKOマウスでは徐々に内腔拡大し、TAC12週後においてKOマウスではWTマウスに比し有意に左心室収縮率の低下を認めた。分子生物学的解析、組織学的解析所見から、KOマウスは心筋に対する圧力負荷時に、より強い心肥大・心筋線維化を呈しやすく、左心室収縮不全から心不全に至ることが明らかになった。B.患者iPS細胞由来心筋細胞を用いた検討:計4例のCD36欠損症患者(心筋症なし2例、心筋症あり2例)と健常人5例を対象とした。心筋症の合併がないCD36欠損症患者(2例)由来iPS細胞、および心筋症合併CD36欠損症患者(2例)のiPS細胞を樹立した。一方、健常人5例からiPS細胞を樹立した。今後は計4例のCD36欠損症患者(心筋症なし2例、心筋症あり2例)および5例の健常人iPS由来心筋を作成し、その表現型について比較検討し、心筋異常を改善させうる薬剤のスクリーニングを行う。医学循環器内科今回の検討によりCD36欠損状態では、心負荷時に心肥大および心筋線維化を来しやすく、左心室収縮不全に至ることが明らかになった。

CD36欠損状態において心臓圧負荷を行った際の心機能変化を詳細に解析した報告はこれまでになく、CD36欠損症患者の予後改善を目指すために有用な情報となる。しかしながら現段階では様々な代謝的・機能的メカニズムの集合体である心機能がどのように変化したかについてその機序の解明は十分とは言えず、心筋代謝評価などを中心とした、より詳細な解析を行う必要がある。また、患者iPS由来心筋細胞を用いた実験は、4名のCD36欠損症患者をエントリーし、2名のiPS細胞樹立に成功している。しかし、心筋への分化誘導、さらに得られた心筋細胞の解析を実施する必要があり今後も引き続き研究の継続が必要である。KOマウスにおける心負荷時の心不全発症の検討:今後も継続的に様々な視点からCD36欠損マウスで圧負荷時に高度の心機能低下を呈するメカニズムの解明を行う。具体的な方法としては、脂肪酸・糖代謝を小動物用PETにより解析する。また心筋のエネルギーリザーブを表す心筋組織内のクレアチンリン酸, ATP,ADP,AMPの含量を、高速液体クロマトグラフィーを用いて定量し評価する予定である。さらにメタボローム解析を行い心筋代謝産物の解析を行う。また、心肥大、心筋代謝に関連した経路のタンパク、リン酸化をウェスタンブロット法で解析する。これらの解析結果を統合し、CD36欠損マウス心筋での脂肪酸代謝変化に伴う心不全の病態解明を目指す。さらに代謝性心筋障害に対する治療の介入点を明らかにする。患者iPS細胞由来心筋細胞を用いた検討:現在までに樹立ができていない2名のCD36欠損患者のiPS細胞樹立を行い、これまでに樹立が成功している2名のiPS細胞を含めて、分化転換技術を利用し心筋への分化を行う予定である。心筋細胞への分化が完了した後、CD36欠損の病態を反映しているかどうか、すなわち脂肪酸の取り込み低下がみられるかどうかについてラジオアイソトープを用いた実験で評価する。また心筋症合併の有無によりそれぞれのiPS由来心筋細胞の表現型にどのような差があるかを、分子生物学的解析、電気生理学的解析などで検討する。さらにiPS由来心筋細胞に低分子化合物ライブラリーを添加し、心筋症合併患者iPS由来心筋細胞の異常を改善しうる化合物をスクリーニングし、CD36欠損症の心筋症患者の治療法開発を目指す。これらの解析から得られた成果を国内学会だけではなく国際学会でも積極的に報告し、広く社会に発信する。
地球流体力学の知見情報をインターネット上に集積公開して行くための調査研究

予備的な国内検討会を実施後,米国への調査旅行を企画し,UNIDATAならびPrinceton大のGFDL/NOAAを訪問,情報技術の進展とそれによる当該分野の教育・研究活動への影響等に関して意見交換を行った.調査の結果を受け,さらに国内検討会を開催し,現在の情勢と当該分野でなされるべき今後の対応について議論を進めた.これらの資料は「地球流体電脳倶楽部」のWEBサーバ上に掲載し公開されており,http://www.gfd-dennou.org/arch/davis/workshop/から適宜たどることができる.UNIDATAは1983年に設立され,米国の大気科学関連大学連合によって運営される,当該分野の研究教育のための情報基盤を支えるための組織である.データのアーカイブ,必要となるファイル形式の提供(netCDF),データハンドリングと可視化ツールの開発と提供で知られており,また,様々な情報技術開発のコーディネーションを行う.現在,UNIDATAが中心となって,各地に分散しているデータサーバをインターネット上に統合,一つの仮想的なデータベースとして機能せしめ,情報をリアルタイムで提供(OPeNDAP/THREDDS),数値予報モデルと有機的に組み合わし,研究のみならず教育の現場で利用する実験が進められている.残念ながらわが国では気象業務法の縛りがあり,かつ,気象庁が研究教育活動に対してデータを提供する枠組の整備が不十分で,同種の試みを実行することは不可能である.様々な制度がインターネット以前の時代のままであることが問題であり,情報基盤構築をリードするUNIDATAのような組織がないことが状況の改善を困難にしている.予備的な国内検討会を実施後,米国への調査旅行を企画し,UNIDATAならびPrinceton大のGFDL/NOAAを訪問,情報技術の進展とそれによる当該分野の教育・研究活動への影響等に関して意見交換を行った.調査の結果を受け,さらに国内検討会を開催し,現在の情勢と当該分野でなされるべき今後の対応について議論を進めた.これらの資料は「地球流体電脳倶楽部」のWEBサーバ上に掲載し公開されており,http://www.gfd-dennou.org/arch/davis/workshop/から適宜たどることができる.UNIDATAは1983年に設立され,米国の大気科学関連大学連合によって運営される,当該分野の研究教育のための情報基盤を支えるための組織である.データのアーカイブ,必要となるファイル形式の提供(netCDF),データハンドリングと可視化ツールの開発と提供で知られており,また,様々な情報技術開発のコーディネーションを行う.現在,UNIDATAが中心となって,各地に分散しているデータサーバをインターネット上に統合,一つの仮想的なデータベースとして機能せしめ,情報をリアルタイムで提供(OPeNDAP/THREDDS),数値予報モデルと有機的に組み合わし,研究のみならず教育の現場で利用する実験が進められている.残念ながらわが国では気象業務法の縛りがあり,かつ,気象庁が研究教育活動に対してデータを提供する枠組の整備が不十分で,同種の試みを実行することは不可能である.様々な制度がインターネット以前の時代のままであることが問題であり,情報基盤構築をリードするUNIDATAのような組織がないことが状況の改善を困難にしている.
一酸化窒素によるカルシウム放出機構の骨格筋における機能的意義

一酸化窒素による細胞内カルシウム放出機構(NICR)を中枢神経系で発見し、これが神経細胞死に関与していることを明らかにした。本研究では、骨格筋において、NICRの生理的および病態生理的意義を解明することを目的とした。悪性高熱症等で報告されているリアノジン受容体変異遺伝子を培養細胞に安定発現させ、Ca2+濃度測定、分子動力学計算法によるシミュレーションを行い、機能的変異を多角的、定量的に解析する方法を開発した。また、NICRを阻害した小動物の骨格筋初代培養細胞を用いて、骨格筋幹細胞の増殖速度及び、多核骨格筋細胞への分化過程について差異が認められない事を示した。一酸化窒素(NO)によるCa上昇は、細胞内小胞体にあるリアノジン受容体を介するCa放出機構(NICR)によるものであり、これが神経細胞死に関与していることを明らかにした。本研究では、神経細胞と同様に神経型NO合成酵素とリアノジン受容体が共発現している骨格筋において、NOによるCa放出機構の生理的および病態生理的意義を解明する。H25年度は、CaによるCa放出機構(CICR)が亢進している悪性高熱症発症患者のリアノジン受容体遺伝子変異におけるカルシウムシグナル機能の解析法を確立した。野生型リアノジン受容体から10種類の悪性高熱症発症患者変異遺伝子を作成してヒト胎児由来腎臓細胞を用いて安定発現細胞株を作成した。悪性高熱症変異にはCICR活性およびNICR活性が亢進する機能的変異とCICR活性およびNICR活性には影響を与えない変異があることが明らかになった。いくつかの悪性高熱症変異は野生型に比べて静止時のCa濃度が上昇したことより、リアノジン受容体のチャネル構造に影響を与え小胞体からカルシウムが漏れやすくなっている可能性が示唆された。一酸化窒素(NO)によるCa2+上昇は、細胞内小胞体にあるリアノジン受容体を介するCa2+放出機構によるものであり、これが神経細胞死に関与していることを明らかにした。本研究では、神経細胞と同様に神経型NO合成酵素とリアノジン受容体が共発現している骨格筋において、NOによるCa2+放出機構の生理的および病態生理的意義を解明することを目的とした。平成26年度は前年度に引き続いてCa2+によるCa2+放出機構が亢進している悪性高熱症患者で報告されているリアノジン受容体遺伝子変異におけるCa2+シグナルを解析した。Ca2+シグナルの解析に加えて分子動力学計算法を用いたシミュレーションを行った。これより、分子動力学計算法を用いたシミュレーション結果とCa2+シグナルによる機能解析に相関が認められた。また、NICRを阻害した動物(リアノジン受容体がS-ニトロシル化を受ける3636番目のシステイン残基をアラニンに変えたRyR1-C3636Aノックインマウスを)の繁殖が可能になった。一酸化窒素(NO)が細胞内カルシウム(Ca2+)上昇を引き起こすことを中枢神経系で発見した。NOによるCa2+上昇は、細胞内小胞体にあるリアノジン受容体を介するCa2+放出機構によるものであり、これが神経細胞死に関与していることを明らかにした。本研究では、神経細胞と同様に神経型NO合成酵素とリアノジン受容体が共発現している骨格筋において、NOによるCa2+放出機構(nitric oxide-induced calcium release; NICR)の生理的および病態生理的意義を解明することを目的とした。前年度から引き続いてCa2+によるCa2+放出(calcium-induced calcium release; NICR)が亢進している悪性高熱症感受で報告されているリアノジン受容体遺伝子変異におけるカルシウムシグナルを解析した。野生型および悪性高熱症変異型リアノジン受容体遺伝子をHEK細胞に安定発現した系を用いてCICR活性、NICR活性、静止時細胞質Ca2+濃度測定、及び分子動力学計算法によるシミュレーションを行い、機能的変異を多角的、定量的に解析する方法を開発した。これより、分子動力学計算法の用いたシミュレーションの結果とカルシウムシグナルによる機能解析に相関が認められた。前年度から繁殖させている、NICRを阻害した小動物(リアノジン受容体がS-ニトロシル化を受ける3636番目のシステイン残基をアラニン残基に置換したRyR1-C3636Aノックインマウス)の骨格筋初代培養細胞を用いて、骨格筋幹細胞の増殖速度及び、多核の骨格筋細胞への分化について差異があるか検証したところ、野生型とRyR1-C3636Aノックインマウスには有意な差が認められなかった。これより、これらの過程にはNICRの寄与が少ないことが明らかになった(論文投稿中)。筋損傷における。NICRの寄与については解析中である。NICRを阻害するCA変異RyR1ホモ動物(RyR1-C3636Aノックインマウス)の増産が予定通りに進行している。

医歯薬学前年度から繁殖させているRyR1-C3636Aノックインマウスを用いてNICRが骨格筋機能に及ぼす影響を明らかにする。除神経や脊髄神経の損傷により神経支配が消失すると骨格筋は萎縮することが知られている。MRIおよびCTを用いて骨格筋の損傷や萎縮の程度を解析する。野生型マウスとRyR1-C3636Aノックインマウスで解析を行い差異があるかを調べることによって、NO産生増加の下流の経路にNICRが関与するかを明らかにする予定である。悪性高熱症発症患者のリアノジン受容体遺伝子変異におけるNOによるCa放出機構の研究は、論文投稿の可能性がある状態になので、できるだけ早急に論文投稿に向けて進める。年度末(3月下旬)に開催された学会に参加したため、旅費の精算が次年度になりました。カルシウムシグナル機能解析結果を踏まえて、細胞内Ca濃度およびを小胞体内腔Ca濃度を測定して野生型と悪性高熱症発症患者の変異体とで比較して解析する。カルシウムシグナル亢進のメカニズムとしてリアノジン受容体チャネル構造の変化が考えられるので、カルシウムシグナル機能解析から得られた結果に分子動力学を用いたシュミレーション解析を加えて機能的変異を同定する。できるだけ早急に論文投稿する予定である。学会が3月下旬であったため、学会終了後旅費の精算を行うことになり、4月に未使用額を使用しました。学会発表のための旅費は別の研究費で支出した。細胞内Ca濃度と小胞体内腔Ca濃度の同時測定を行うため、励起波長が複数必要になる。このため、波長に合わせた蛍光フィルターを購入する。学会発表における国内旅費として支出する。また、論文作成の最終段階なので、英文校閲料に使用する。
仮骨延長術の分子メカニズムに関する研究 メカニカルストレスが骨形成に及ぼす影響

我々はラット大腿骨の延長モデルを使用して仮骨延長術における骨形成メカニズムを観察してきた。本研究においては延長仮骨における骨形成因子(BMP)の遺伝子発現をin situ hybridizationおよびnorthern blot analysisにて観察し興味深い実験結果を得た。生後11週の雌ラット(体重約400g)の大腿骨を骨切りし小型創外固定器で固定した。術後7日目より毎日0.5mmづつ牽引すると骨切り部には仮骨が形成さけ続ける。延長初期には内軟骨性骨化が、延長後期には膜性骨化が中心に見られ、その過程において第3の骨形成のメカニズムとも呼ぶべき類軟骨性骨化がみられることが分かっている。BMP-2およびBMP-4は骨切り後4日目の幼若な仮骨に一過性に発現を認めたが術後7日目までに一旦消失した。術後7日目より延長を開始するとBMP-2およびBMP-4遺伝子の発現は劇的に上昇した。発現誘導は骨芽細胞や軟骨細胞だけでなく線維芽細胞様の紡錐形の細胞にも幅広く認められた。延長を停止するとBMP-2,BMP-4の発現は速やかに消失した。これらの結果はBMP-2,BMP-4遺伝子の発現は牽引メカニカルストレスにより誘導されることを示唆している。BMP-2およびBMP-4遺伝子のpromotor領域にはtension-stress responding elementが存在することが推測される。本研究は,臨床的にすでに多く経験され良好な治療成績が得られでいる仮骨延長法につき,延長中の骨形成,牽引メカニカルストレスが骨形成に及ぼす影響の機序を,分子レベルで解明するために行った.ラット大腿骨に延長器を装着し骨幹部で骨切りし,術後7日間の待機期間をおいた後に0.25mm/12hの速度で延長を行う.延長開始後21日(約1cm延長)で延長を停止する.その後,延長中に形成された軟骨が骨に置換され骨癒合が完成する.その経過を通じて,軟骨細胞が産生する細胞外マトリックスのうちの主要な構成成分であるII型コラーゲン遺伝子の発現と,骨芽細胞が産生する細胞外マトリックスのI型コラーゲン遺伝子の発現,さらにオステオポンチン,オステオカルシン,マトリックスグラプロテイン,オステオネクチンの遺伝子発現を, in situhybridization法を用いて解析した.その結果,軟骨から骨に置換される過程において,軟骨コラーゲンであるII型コラーゲンと,骨のコラーゲンでうあるI型コラーゲンの両方の遺伝子発現を同時に行っている細胞かあることがわかり,このことは,軟骨がら類軟骨を経て骨へと連続して形成されるという,類軟骨性骨化(trans-chondoroid bone formation)が行われているという概念を生み出した.この類軟骨性骨化は,従来骨形成の過程で示されてきた内軟骨性骨化と膜性骨化についで,新しい第3の骨化様式として理解されるべきものであり,現在さらにこの新しい概念と,仮骨延長術における骨形成のメカニズムを解明するために,肥大軟骨,破骨細胞の機能について解析を行っている.我々はラット大腿骨の延長モデルを使用して仮骨延長術における骨形成メカニズムを観察してきた。術後7日目より毎日0.5mmずつ牽引すると骨切り部には仮骨が形成され続ける。延長初期には内軟骨性骨化が、延長後期には膜性骨化が中心に見られ、その過程において第3の骨形成メカニズムとも呼ぶべき類軟骨性骨化がみられることが分かっている。

延長を停止するとBMP-2,BMP-4の発現は速やかに消失した。これらの結果はBMP-2,BMP-4遺伝子の発現は牽引メカニカルストレスにより誘導されることを示唆している。BMP-2およびBMP-4遺伝子のpromotor領域にはtension-stress responding elementが存在することが推測される。
卵巣摘出ラット痛覚過敏の発現機序 -In vivoパッチクランプ法による解析-

脊髄スライス標本を用いた解析から、骨粗鬆症モデルである卵巣摘出ラットに生じた痛覚過敏は、脊髄内C線維終末のセロトニン受容体数が減少し、下行性セロトニン抑制作用が減弱して発現すること、カルシトニンはセロトニン受容体数を回復して鎮痛効果を現すことを見出した。しかし、どの種の痛みが影響されるか、これらの現象が生理的条件下で起こりうるか否かは不明であった。そこで、卵巣摘出(OVX)ラット、カルシトニンを投与した(OVX+CT)ラットおよびShamラットを作製し、新たに開発したin vivoパッチクランプ法を用いて皮膚刺激によって誘起される脊髄シナプス応答およびセロトニンの抑制作用を3群で比較した。Shamラットに対してOVXラットでは、機械的痛み刺激による興奮性シナプス応答の振幅が有意に増大したが、触覚応答には有意差は見られなかった。カルシトニンを投与すると、この痛み応答の増大が減少した。次に、これらシナプス応答に対するセロトニンの抑制作用を比較するために、脊髄表面に直接セロトニンを与えた。セロトニンは、Shamラットでは機械的痛みおよび触刺激によって誘起されたシナプス応答を抑制したが、OVXラットでは触刺激によって誘起された応答のみを抑制し、機械的痛み刺激によって誘起されたシナプス応答をセロトニンは抑制しなかった。OVX+CTラットでは、再びセロトニンによって機械的痛み応答が抑制された。このことは、卵巣摘出によって機械的痛みの伝達が増強されること、また、カルシトニンはセロトニンによる抑制機能を回復してこの痛みの増強をもとに戻す作用があることを示すものである。以上のin vivo標本を用いた実験結果から、スライス標本で見出したセロトニン抑制系の異常は、痛み応答を伝えるC線維終末に発現するセロトニン受容体の変化によって惹起されるものと結論づけられた。閉経後の骨粗鬆症に伴う腰痛等の発生機序を明らかにするため、骨粗鬆症モデルである卵巣摘出ラットを用い、電気生理学的に痛覚伝達系に惹起される可塑的変化を調べた。卵巣摘出ラットは痛覚過敏を示し、それは骨粗鬆症治療薬のカルシトニンによって抑制された。次に脊髄スライスに後根を付した標本を用い、後角細胞からパッチクランプ法で後根誘起のEPSCを記録し、モデルラットのそれと比較検討した。その結果、卵巣摘出ラットでは、C線維終末のセロトニン受容体数が減少し、痛覚入力の抑制が消失して痛覚過敏が起こることが明らかになった。また、カルシトニンはセロトニン受容体数を回復し、鎮痛作用を示すことを明らかにした。これらの実験ではC線維がどのような感覚情報を伝えているかを知ることは出来ない。そこで、in vivo標本を用いて同様の実験を行った。人工呼吸下に両側の気胸、腰部椎弓切除を行い、脳脊髄固定装置にセットした。後角細胞から記録を行い、皮膚に触刺激および痛み刺激を加えるとEPSCの著明な増強が見られた。両者のEPSCの振幅および頻度には有意差が見られなかった。ところが、卵巣摘出ラットでは痛み刺激の応答が触刺激のそれと比較して明らかに増大していた。以上の結果から、卵巣摘出ラットでは痛覚を伝えるC線維終末のセロトニン受容体数が減少し、痛覚情報が脊髄に多く入力すること、また、カルシトニンはセロトニン受容体数を回復しその鎮痛作用を示すことが明らかになった。閉経後によく見られる腰痛などの慢性痛には、微細骨折などの関与が考えられていたが、カルシトニン製剤が骨量を回復する前に鎮痛作用を示すことから、その痛みの発生とカルシトニン製剤の鎮痛作用には別の機序が示唆されていた。

そこで、骨粗鬆症のモデルである卵巣摘出(OVX)ラットを用い、OVXラットにみられる痛覚過敏の発生機序とカルシトニン製剤の鎮痛機序をin vivoパッチクランプ記録法を用いて検討した。スライス標本を用いた結果から、OVXラットではC線維終末に発現するセロトニン受容体が減少することが示唆されたので、皮膚への触および痛み刺激によって誘起されるシナプス応答に対するセロトニンの作用を検討した。皮膚に触および痛み刺激を加えると、正常ラットではその応答の振幅には有意差がみられなかったが、OVXラットでは痛み刺激による応答は触刺激のそれより有意に振幅が大きかった。これは痛みを伝えるC線維終末のセロトニン受容体が減少したため、グルタミン酸放出の抑制が消失したためと考えられた。次に、セロトニンを脊髄表面に投与すると、正常ラットではどちらの応答も同様に抑制されたが、モデルラットでは、触応答は減少したが痛み応答の抑制はわずかであった。これらの結果を基に、OVXラットにカルシトニンを3週間以上投与した標本を用いて同様の検討を行った。カルシトニン投与ラットでは、正常ラットと同様に痛み応答と触応答に有意な違いはみられなくなった。また、セロトニンを投与すると痛みおよび触応答は同じ程度に抑制された。以上の結果から、OVXラットでは痛みを伝えるC線維の終末に発現しているセロトニン受容体が減少し、グルタミン酸放出の増大が起こり痛覚過敏を引き起こしていること、また、カルシトニン製剤を前もって投与したラットでは、再びセロトニン受容体発現が回復し鎮痛作用を示したものと考えられた。
力学的負荷による骨形成促進におけるFos family遺伝子の役割

(研究結果の概要)1.力学的負荷によるδfosB及びIL-11の発現誘導機構の解析(1)力学的負荷によるδfosB及びIL-11の誘導はBAPTA並びにERK阻害薬(UO126)存在下ではほぼ完全に抑制された。従ってfluid shear stress (FSS)による両者の誘導はCa及びERKに依存することが示された。また各々のプロモーター領域を用いたluciferase assayによる解析から、δfosB/IL-11の誘導は転写段階であること、さらにδfosBはAP-1配列を介してIL-11遺伝子の転写活性を促進することを明らかにした。2.力学的負荷並びにIL-11の生物学的作用(In vitro)(1)新生児マウス頭蓋骨由来の初代培養系骨芽細胞(POB)において、troglitazoneは脂肪細胞分化を誘導したが、この作用は間欠的なFSS刺激(10分/時間)を断続的に与えることでほぼ半分に抑制された。またこの作用はIL-11中和抗体により解除された。(2)同様の細胞系でFSSあるいはIL-11はdexamethasone (Dex)によるアポトーシスを抑制すること、さらにFSSの有する抗アポトーシス作用はIL-11作用を介することを見いだした。(3)IL-11はBcl-2の発現をmRNA、タンパクレベルで誘導することを見いだした。IL-11 transgenicマウスに対する尾部懸垂の効果を見たところ、重力免荷による骨量減少がIL-11の過剰発現により抑制される傾向が見られた。またDex投与による骨量減少に対しても同様であった。(総括)力学的負荷は骨芽細胞系においてAP-1(δfosB)/IL-11経路の活性化を介して生理的な骨形成並びに骨量を椎持していることが示唆された。本経路の解明は不動、あるいはステロイド過剰により惹起される骨量減少(骨粗鬆症)の病態解明並びにその有効な治療薬の解明につながるものと期待される。
植物の高次生命現象における小胞輸送の機能解析

Rab GTPaseは,GTP型とGDP型の構造変換を通し,輸送小胞が標的膜へと輸送される際の分子スイッチとして機能している.一般的に,GTPを加水分解しGDP型となったRab GTPaseは,再びGTP型へと活性化され,次のGTPase cycleをまわることになるが,この際のヌクレオチド交換反応には,GDP/GTP交換因子(GEF)と呼ばれる分子が必要であることが知られている.そこで,シロイヌナズナにおけるRab5グループの機能を明らかにするため,まずRab5のGEFの機能解析を試みた.他の生物において,Rab5のGEFはVps9 domainと呼ばれる保存された構造を持つことが報告されている.シロイヌナズナゲノム中でVps9 domainを有するタンパク質を探索したところ,Vps9 domainを有するタンパク質をコードする二つの遺伝子が見いだされた.そのうち,発現が確認された一つの遺伝子(AtVps9a)をクローニングし,精製タンパク質を用いてAra7に対するGEF活性を測定したところ,非常に強いGEF活性が検出された.また,in vitroでのpull-down assayにより,AtVps9がAra6,Ara7,Rha1の全てと結合することも明らかとなった.このことから,シロイヌナズナのRab5関連タンパク質は,その構造上の特異性に反し,いずれの分子もが同一のGEFにより制御されていることが示唆された.これが事実であれば,AtVPS9遺伝子が破壊された植物においては,Rab5グループの全ての分子が不活化していると考えられ,この変異体を解析することにより,植物におけるRab5グループの機能をその総和として解析することが可能であると期待される.現在この変異体の解析を進めているが,予備的な解析において胚発生のかなり初期より細胞形態に異常が見られることから,この遺伝子産物が発生の初期から必須の働きを担っているものと予測される.今後の生化学的,遺伝学的解析を通して,AtVps9の機能をさらに明らかに出来るものと期待している.atvps9変異体の解析に加え,各rab5変異体の解析も順調に進行している.既にara6,rha1変異体については戻し交雑を終え,2重変異体の作出も完了している.平成15年度は,エンドサイトーシスを担うオルガネラであるエンドソームについて,その構造的,及び機能的分化の解析をこころみた.動物細胞においては,初期エンドソーム,後期エンドソーム,リサイクリングエンドソーム等,機能的に分化した複数のエンドソームの存在が知ちれている.一方,植物細胞においては,エンドソームに機能的な分化が存在するか否かは全くわかっていなかった.我々はこれまでに,Ara6,Ara7,Rha1といったエンドサイトーシス経路で機能するRab5関連タンパク質が,植物細胞内で一部のエンドソームにのみ局在することを報告している.そこで,これらのRab GTPaseが,それぞれ異なったエンドソームに局在するのか,それとも同一のエンドソームに局在するのかを検討したところ,Ara7,Rha1は同様の細胞内局在を示すのに対し,Ara6は部分的に重複しながらも他のRab5ホモログとは異なるエンドソームの集団に局在することが明らかとなった.このことから,シロイヌナズナのエンドソームには少なくとも2種類の集団が存在することが示唆された.さらに,この2種類のエンドソーム間における機能的分化の存在が,gnom細胞を用いた実験により明らかにされた.GNOMは,エンドソームから細胞膜へとAtPinタンパク質をリサイクリングする際に機能するArfGEFで,gnom変異体の細胞中では,Ara7が局在するエンドソームが肥大し,空胞化する.これと同様のエンドソームの変形が,GFP,Rha1とGFP-AtVamp727を発現させた時にも観察された.一方,Ara6-GFPやGFP-AtPep12を発現させた際にはそのような変形エンドソームは観察されず,AtTlg2a(TGN),AtSed5(Golgi)といった他のオルガネラマーカーの局在にも変化は見られなかった.以上の結果より,植物細胞には,Ara6-richなものとAra7/Rha1-richなものの少なくとも二種類のエンドソームが存在しており,Ara7/Rha1-richエンドソームが,GNOMに依存した細胞膜へのリサイクリングを担う場所であることを明らかにできた.Rab GTPaseは,GTP型とGDP型の構造変換を通し,輸送小胞が標的膜へと輸送される際の分子スイッチとして機能している.一般的に,GTPを加水分解しGDP型となったRab GTPaseは,再びGTP型へと活性化され,次のGTPase cycleをまわることになるが,この際のヌクレオチド交換反応には,GDP/GTP交換因子(GEF)と呼ばれる分子が必要であることが知られている.そこで,シロイヌナズナにおけるRab5グループの機能を明らかにするため,まずRab5のGEFの機能解析を試みた.他の生物において,Rab5のGEFはVps9 domainと呼ばれる保存された構造を持つことが報告されている.シロイヌナズナゲノム中でVps9 domainを有するタンパク質を探索したところ,Vps9 domainを有するタンパク質をコードする二つの遺伝子が見いだされた.そのうち,発現が確認された一つの遺伝子(AtVps9a)をクローニングし,精製タンパク質を用いてAra7に対するGEF活性を測定したところ,非常に強いGEF活性が検出された.

また,in vitroでのpull-down assayにより,AtVps9がAra6,Ara7,Rha1の全てと結合することも明らかとなった.このことから,シロイヌナズナのRab5関連タンパク質は,その構造上の特異性に反し,いずれの分子もが同一のGEFにより制御されていることが示唆された.これが事実であれば,AtVPS9遺伝子が破壊された植物においては,Rab5グループの全ての分子が不活化していると考えられ,この変異体を解析することにより,植物におけるRab5グループの機能をその総和として解析することが可能であると期待される.現在この変異体の解析を進めているが,予備的な解析において胚発生のかなり初期より細胞形態に異常が見られることから,この遺伝子産物が発生の初期から必須の働きを担っているものと予測される.今後の生化学的,遺伝学的解析を通して,AtVps9の機能をさらに明らかに出来るものと期待している.atvps9変異体の解析に加え,各rab5変異体の解析も順調に進行している.既にara6,rha1変異体については戻し交雑を終え,2重変異体の作出も完了している.
日本の学校経営政策の変容要因に関する研究

「校内責任体制の確立」を基調とする日本の学校経営の原型は、1980年代以降の学校経営政策によってその基調を大きく変容・転換してきた。その変容要因を解明するのが本研究の目的であった。研究によって解明し得た変容要因としては、(1)規制緩和を改革原理とする行政改革、(2)公教育運営の制度疲労、(3)公教育目標の変化、(4)教育問題の深刻化、(5)学校への参加・参画要求、であった。基調の変容はこれらの要因が促したものであるが、行政改革の力は最も強く作用した要因であった。自律的学校経営は行政改革が指向する自己責任・自己決定の原理と学校教育が抱える様々な問題や課題を解決する現実的必要が相まって導き出された構想である。これらの要因が、どのように関係しあって新たな基調の形成へと結びついているかについて解明し得たことも成果であった。日本の学校経営の原型は、1956年制定の地方教育行政の組織及び運営に関する法律(地方教育行政法)によりその法制的な枠組みが形成され、1971中教審答申(いわゆる46答申)によって学校の内部組織の整備が図られることによって完成した。脆弱な経営基盤と「校内責任体制の確立」を基調とするこうした我が国の学校経営は、1980年代の教育改革により、とりわけ90年代の行政改革により、自律的学校経営の実現へと大きくその姿を変容・転換を促した。こうした変容・転換を促した要因について解明することを目的とする本研究の平成10年度の実績は次の通りである。(1)地方教育行政法の立法過程とその展開について、「木田文書」(国立教育研究所)により、「56年体制」の学校経営政策がどの様に形成されていったかを明らかにする作業をおこなった。「木田文書」の目録が作成されたばかりであり、本格的解明は今後に残されている。(2)愛知県などの地方文書などにより、56年体制以前の学校経営秩序やそれを支えた行政体制がどのように形成されていったかを明らかにする作業を行った。(3)本年度は主として地方在住の関係者へのインタビューを行い、本研究の妥当性、56年体制の受け止め方などについて明らかにする作業を行った。(4)以上の他、日本の学校経営政策の基調が形成される過程と政策の基調を理論的に明らかにする作業を行った。
ヒト脳由来環状化ヌクレオチドホスホジエステラーゼの構造機能解析

2005年に我々が決定したヒト脳由来環状化ヌクレオチドホスホジエステラーゼの触媒フラグメント(CNP-CF)の立体構造を基にした基質候補の推定と基質認識及び反応機構の解明を行った。また、Kozlovらにより上記の立体構造をモデル構造にしたラットCNPase、金魚RICHの立体構造がNMRにより解明され、これらの立体構造との比較を通じて、基質認識について解析についても行った。オリゴデンドロサイトに局在する酵素であるヒト脳由来膜結合型2'3'-環状ヌクレオチド3'-ホスホジェステラーゼ(2',3'-Cyclic Nucleotide 3'-Phosphodiesterase,以下CNPと略)は神経軸索中に見出されるタンパク質であるが、生理的機能の手がかりについての知見はほとんど得られていない。2003年にCNP遺伝子を欠損したマウスが作製された。このマウスのミエリン鞘は正常に形成され成体にまで成長するものの加齢に従って神経軸索が消失していくことが病理的解剖結果から示唆された。(Lappe-Siefke et al., Nature genetics,2003)これらのことから、CNPは神経軸索の形成ではなく、神経軸索の維持またはエネルギー供与のような機能に関与していることが考えられる。本酵素の立体構造を明らかにし、生命現象の一端を解明すべくX線結晶構造解析を進めている。本研究では神経軸索の維持に関与するCNPについて、多発性硬化症などの神経性疾患との関連性を分子レベルで検討し、その知見から生命現象の一端である神経軸索維持機構の解明及び神経性疾患の新たな治療法開発等に役立てるため、CNPに関する構造生物学的研究を行う。具体的には、(1)膜結合領域を含めたCNP全長の立体構造を決定する。これらの立体構造に基づき、(a)2量体蛋白質であるCNPと細胞膜とのインターフェースにおける相互作用。(b)触媒ドメインと膜結合領域の相対配置、立体構造を基にした、CNPの分子機構。(c)種々の阻害剤との結合情報に基づいた詳細な触媒機構(d)オリゴデンドロサイトの神経軸索維持機構を明らかにする。これまでに、CNP触媒フラグメントの立体構造を明らかにした。CNP全長の結晶化条件の探索を行ない、微小結晶が得られたものの、回折データ収集に十分な大きさと分解能、結晶性に優れた結晶が得られておらず、さらなる結晶化条件の探索を行っている。我々は、オリゴデンドロサイトに局在する酵素であるヒト脳由来膜結合型2',3'環状ヌクレオチド3'-ボスポジエステラーゼ(2',3'-Cyclic Nucleotide 3'-Phosphodiesterase、以下CNPaseと略)の触媒フラグメントの立体構造を解明した。近年、このヒトCNPaseの立体構造を初期モデルとして他の2Hホスポジエステラーゼスーパーファミリーの酵素のNMRによる立体構造解析が行われた(2007ratCNP:PDB ID 21LX、gRICH:PDB ID 2I3E)。今年度は、これらの新しく決定された類縁酵素の立体構造とヒトCNPaseの立体構造とを併せて解析した。我々がヒトCNPaseの立体構造を基にして作成した基質結合モデルにより塩基の結合に重要であると推定していたPhe235とVal321の立体構造上の位置とMRにより構造決定された金魚由来gRICHのPhe239とVal332の立体構造上の位置が等価な位置に保存されていることがわかった。このことから我々の基質結合モデルの推定の正しさとこれらのアミノ酸残基が塩基の結合に重要な役割を果たしていることが改めて示された。オリゴデンドロサイトに局在する酵素であるヒト脳由来膜結合型2', 3'-環状ヌクレオチド3'-ホスホジエステラーゼ(2', 3'-Cyclic Nucleotide 3'-Phosphodiesterase、以下CNPaseと略)の触媒フラグメントの立体構造を解明した。近年、このヒトCNPaseの立体構造を初期モデルとして他の2Hホスホジエステラーゼスーパーファミリーの酵素のNMRによる立体構造解析が行われた(2007ratCNP : PDB ID 2ILX、gRICH : PDB ID 2I3E)。今年度は、昨年に引き続き、これらの新しく決定された類縁酵素の立体構造とヒトCNPaseの立体構造との比較解析を行った。我々がヒトCNPaseの立体構造を基にして作成した基質結合モデルにより塩基の結合に重要であると推定していたPhe235とVa1321の立体構造上の位置とNMRにより構造決定された金魚由来gRICHのPhe239とVa1332の立体構造上の位置が等価な位置に保存されていることがわかった。また、膜結合ドメインを含む全長の新たな発現系についてはQIAGEN human CNPase expression kitを導入した。
脳組織構築分子基盤解明のための哺乳類胚操作技術の開発

記憶、学習、情動といった脳の高次機能は、領域特異的な種々のニューロンとその間に複雑に張り巡らされた神経回路網によって担われており、脳の組織構築機構を統合的に理解することは、神経科学における最も重要な課題のひとつである。哺乳類における脳組織構築を分子レベルで解析するためには、領域特異的な分子をさらに探索するとともに、神経管が形成される胎生中期から後期の特定の時期に、特定の領域を標的として遺伝子操作を行い、胚発生をさらに進行させる新規技術の開発が不可欠であるといえる。そこで本研究では脳組織構築の分子基盤解明のために1)長期生存を維持しうる哺乳類胎生中期後期胚操作技術の開発2)哺乳類胎生中期後期胚大脳に対する細胞移植法の開発3)哺乳類胎生中期後期胚大脳に対する遺伝子導入法の開発を行うことを目的とする。本年度は以下のような研究成果が得られた。1)長期生存を維持しうる哺乳類胎生中期後期胚操作技術の開発母獣への麻酔条件などを検討し、胎生中期後期哺乳類胚に実験的操作を加え、末期まで発生を維持できるin vivo胚操作技術である「超音波ガイド子宮内手術法」を確立することができた。2)さらに細胞移植や遺伝子導入を行うための予備実験として、側脳室内への色素注入などの技術開発を試みた。1)長期生存を維持しうる哺乳類胎生中期後期胚操作技術の開発胎生中期後期哺乳類胚に実験的操作を加え、末期まで発生を維持できるin vivo胚操作技術として「超音波ガイド子宮内手術法」を行うための超音波生物顕微鏡の機種や条件の検討を行った。その結果、50MHzの周波数の場合に50ミクロンの解像度で5mmの深度までの良好な画像が得られることが明らかになった。2)遺伝手導入のための効率の良い発現ベクターの開発を試み、CMVエンハンサーとbeta-actinプロモーターを有するpCAXベクターが哺乳類胎児脳での遺伝子発現誘導に適することが分かった。