hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
造岩物質の構造と物性の理論

特定研究「地球内部」理論班の最終年度はケイ酸塩結晶および融体の分子動力学計算に関して全力を傾けた.松井正典らはMgSiO_3系(結晶と融体)に対するポテンシャルMAMを導き,さらにこれを改良した. MAMは,ケイ酸塩についてかつて得られた最良の経験的ポテンシャルと評価できる.一方塚田・常行・松井(義)は, SiO_4, Si_2O_7クラスターのポテンシャル表面をパラメタ化して, SiO_2の事実上あらゆる多形を再現できる非経験的ポテンシャルを発見した.この仕事は, SiO_2における力の場が二体中心力モデルで表現され得ることを示した点,および二体中心力モデルが意外な表現能力を持っていることを示した点において物理学的に重要であり,ひいてはケイ酸塩の二体力による分子動力学計算に肯定的な希望を与えるものである.6配位のSiを持つ化合物におけるバルクポテンシャル的アプローチの目的で出発したFLAPW法によるSiO_2高圧多形の研究は,松井(義)と松井(正)よって予言された超高圧安定相,およびルチル型相(既知のため標準を与える),ホタル石型の3構造について寺倉によって進められ,予言された構造がたしかに安定であるとの結果を得た.この詳細は目下解析中である.分子動力学計算のアルゴリスムについては,松井(正),岡田らによって従来のミクロカノニカル集合に対するものにかわる,より現実的なカノニカル集合に対するものが導入され,ケイ酸塩系に好適なプログラムの整備がほぼ完了した.これによって,熱力学諸量を分子動力学計算から導く道が開拓されたことになる.本研究は,地球科学者と物理学者との共同研究がいかに生産的かの実例をなすものである.計画年次終了後もこの方向の一層の発展を計画している.特定研究「地球内部」理論班の最終年度はケイ酸塩結晶および融体の分子動力学計算に関して全力を傾けた.松井正典らはMgSiO_3系(結晶と融体)に対するポテンシャルMAMを導き,さらにこれを改良した. MAMは,ケイ酸塩についてかつて得られた最良の経験的ポテンシャルと評価できる.一方塚田・常行・松井(義)は, SiO_4, Si_2O_7クラスターのポテンシャル表面をパラメタ化して, SiO_2の事実上あらゆる多形を再現できる非経験的ポテンシャルを発見した.この仕事は, SiO_2における力の場が二体中心力モデルで表現され得ることを示した点,および二体中心力モデルが意外な表現能力を持っていることを示した点において物理学的に重要であり,ひいてはケイ酸塩の二体力による分子動力学計算に肯定的な希望を与えるものである.6配位のSiを持つ化合物におけるバルクポテンシャル的アプローチの目的で出発したFLAPW法によるSiO_2高圧多形の研究は,松井(義)と松井(正)よって予言された超高圧安定相,およびルチル型相(既知のため標準を与える),ホタル石型の3構造について寺倉によって進められ,予言された構造がたしかに安定であるとの結果を得た.この詳細は目下解析中である.分子動力学計算のアルゴリスムについては,松井(正),岡田らによって従来のミクロカノニカル集合に対するものにかわる,より現実的なカノニカル集合に対するものが導入され,ケイ酸塩系に好適なプログラムの整備がほぼ完了した.これによって,熱力学諸量を分子動力学計算から導く道が開拓されたことになる.本研究は,地球科学者と物理学者との共同研究がいかに生産的かの実例をなすものである.計画年次終了後もこの方向の一層の発展を計画している.
亜熱帯の高起伏衝突変動帯における地殻変動-気候変動-斜面変動関係史の解明

本研究は,ヒマラヤ山麓部での突発的地形変化を広域的に同じ時間軸上で議論することで,それら大規模土砂流出イベントが気候変化に対応したものであるか,大規模な古地震と関連した現象であるかを明らかにしようとするものである.さらに大規模な土石流の長距離流下に必要な土質・水理条件そして地震動を考慮した場合についてのシミュレーションも併せて行うことで,温暖化等の影響下にあって,近未来の発生が懸念される大規模な複合的要因・誘因による流域土砂災害の被災範囲予測の高度化をめざすものである.本研究は,ヒマラヤ山麓部での突発的地形変化を広域的に同じ時間軸上で議論することで,それら大規模土砂流出イベントが気候変化に対応したものであるか,大規模な古地震と関連した現象であるかを明らかにしようとするものである.さらに大規模な土石流の長距離流下に必要な土質・水理条件そして地震動を考慮した場合についてのシミュレーションも併せて行うことで,温暖化等の影響下にあって,近未来の発生が懸念される大規模な複合的要因・誘因による流域土砂災害の被災範囲予測の高度化をめざすものである.
トランスメンブランコントロ-ルの機序

本研究は、計画研究6班の総括班として、以下の活動を行った。1.総括班会議は平成2年8月と平成3年1月の2回東京で開催し、運営に関する諸問題を審議した。2.各計画研究班の最も著名な成果を中心に平成3年1月10日に東京でシンポジウムを開催し、約150名の参加を得て好評であった。3.本重点領域研究の包含する広範な分野を相互に紹介し理解と交流を深める目的で、班員の和文総説の別刷を選んで集録し、複写製本して班員に配布した。4.計画研究6班の班間にまたがる交流を促進するため、班間共同研究を公募し、非常に有意義と認められた5件を財政的に支援した。5.総括班員の創意により、長期的展望の下に、各計画研究班では実行の困難ないくつかの試行錯誤的研究を行った。以下に二、三の著るしい成果を挙げる。(1)橘は、細胞内情報伝達過程において従来ほとんど注目されていなかったMgイオンに注目し、蛍光色素magーfuraー2と蛍光顕微画像解析装置を用いて単一細胞内遊離Mgイオン濃度の測定法の確立に成功し、それを用いてマウスSwiss 3T3細胞をボンベシン+インスリン等で増殖刺激すると、30分から1時間以内に細胞内遊離Mgイオン濃度が上昇することを認めた。したがって細胞内遊離Mgイオン濃度の変化が修飾因子として細胞活動を規定している可能性が考えられ、今後のこの方向の発展が期待される。(2)三品はこれまで多くの研究者が試みて来たが誰も未だ成功していないグルタミン酸受容体の二種類のサブユニットのcDNAクロ-ニングとその発現に成功し、その機能を解析して、カイニン酸とキスカル酸の受容体は同一分子であること、グルタミン酸受容体は複数のサブユニットから構成されていることなど、非常に興味ある知見を明らかにしつつある。
窒素飢餓環境に対するイネの生存戦略

イネは、窒素飢餓環境では茎数や種子数を減らして完熟種子を稔らせる応答を示すが、その分子機構は明らかではなかった。本研究では、1外界のNH4+の検知機構、2NH4+の同化・再利用機構、3代謝バランス、4穂への物質転流モデリングから、分子機構の解明を試みた。その結果、根におけるNH4+の初期同化や分げつの伸長に関わる要因や、種子数の決定に関わる窒素代謝要因を、逆遺伝学的に明らかにした。代謝バランスの崩壊が大きく影響していることを見いだし、また蔗糖転流の数理モデルを構築できた。これらの成果を、多くの国際学術誌の公表できた。還元状態の水田で成育するイネは、NH_4^+を主要な窒素源とする。窒素は、イネにとって最も不足する元素であると同時に、直接バイオマスや収量を規定する。一方、窒素同化代謝は炭素やエネルギー代謝と密接に関わるが、窒素欠乏や適正状態の情報の受容、その後の高次な同化代謝機構、固体としての応答機構に関わる分子実態はほとんど明らかではない。本研究では、窒素飢餓に対するイネの生存戦略の解明を目的とした。本年度は、下記の項目に焦点をあて研究を進め、成果を得た。1.NH_4^+情報の受容機構:NH_4^+情報を受容する可能性の高いACTPK1タンパク質に関して、遺伝子破壊変異体をTos17ミュータントパネルから獲得し、解析を進めた。まだ受容体である直接の証明はできていないが、ACTPK1タンパク質は、過剰のNH_4^+吸収を抑制する機能を持つことが推定された。2.逆遺伝学とメタボローム解析:サイトゾル型グルタミン合成酵素(GS1;1)遺伝子破壊変異体を供試してメタボローム解析を進め、野生型と比較した。その結果、変異体では窒素と炭素の代謝バランスが大きく崩れ、窒素代謝産物の大幅な減少と炭素代謝産物の増加が認められた。GS1;1は、窒素と炭素の代謝バランスの鍵を握る酵素であることが判明し、この成果を国際学術雑誌に公表した。また、他のGS1;2やGS1;3、またNADH-グルタミン酸合成酵素1(NADH-GOGAT1)とNADH-GOGAT2のすべての遺伝子破壊変異体を獲得することに成功した。NADH-GOGAT1に関して水田で収穫期まで栽培し、その表現型の解析などから、この酵素は根における初期同化と、地上部の分げつや穂の発達に重要な機能を持つことが示唆された。この成果も、国際学術雑誌に公表した。1.NH_4^+情報の受容機構:NH_4^+情報を受容する可能性の高いACTPK1タンパク質に関して、遺伝子破壊変異体をTos17ミュータントパネルから獲得して解析を進め、このタンパク質は過剰なNH_4^+の吸収抑制をする機能を持つことが判明し、現在、その成果の公表準備中である。2.逆遺伝学とメタボローム解析:NH_4^+の同化に関わるNADHグルタミン酸合成酵素2(GOGAT2)の遺伝子破壊変異体を供試して、種々の解析を進めた結果、このNADH-GOGAT2は老化器官からの窒素転流の主形態であるグルタミンの合成に関わることが判明し、一穂穎果数の減少による収量低下が認められた。この成果を国際学術雑誌に公表した。サイトゾル型グルタミン合成酵素1:1(GS1;1)遺伝子破壊変異体では、CとNの代謝バランスが大きく崩れている成果も公表し、現在、GS1;2遺伝子破壊変異体との違いを明確にするために、メタボローム解析を進めている。1)外界のアンモニウムイオンの過不足を検知する機構:イネのOsACTPK1は、過剰のアンモニウムイオン吸収を負に制御する。このリン酸化活性は、2-OGを含み有機酸で阻害された。また、AMT1;2との相互作用の可能性が、酵母で示唆された。ACTPK1-GFPでは、AMT1;2、GS1;2、NADH-GOGAT1と同様に根の表層細胞サイトゾルで蓄積することが示唆された。現在、成果をまとめて、論文を作成中である。2)アンモニウムイオンを同化・再利用する機構: GS1;2やNADH-GOGAT

1欠損変異体における分げつ数の減少は、内性ストリゴラクトンとは関連がないことが判明した。また、分げつ数の減少に関わる原因は、GS1;2の欠損によりリグニン合成が著しく阻害されることやGS1;2の分げつに連絡する維管束の師部で発現が高いことなどが判明し、リグニン合成過程でフェニルアラニンから放出されるアンモニウムイオンの同化ができないことが分げつ数の減少に影響している可能性が示唆される結果を得た。また、3つのGS1と2つのNADH-GOGATの機能についてまとめ、公表した。3)炭素や他の代謝バランスを図る機構: GS1;1欠損変異体イネ根では、光合成関連遺伝子や特定の転写因子を介すると思われる葉緑体発達が認められた。この成果を基に、論文を作成中である。4)イネ穂への窒素転流のモデリング:枝梗維管束SEM解析や窒素転流量の解析を継続し、モデリングのための結果を集積している。本年度は、1)外界のNH4+の過不足を検知する機構、2)NH4+を同化・再利用する機構、3)炭素や他の代謝バランスを図る機構を解明と、4)イネ穂への窒素転流のモデリングを試み、下記の成果を得た。1)外界のNH4+の過不足を検知する機構:イネのOsACTPK1は、過剰のNH4+吸収を負に制御する。このリン酸化活性は、クエン酸等の有機酸で阻害された。ACTPK1-GFPは、AMT1;2やGS1;2と同様に根の表層細胞で蓄積しており、酵母を用いた系では相互に結合することが示された。しかし、NH4+を検知する機構の解明には至っていない。2)NH4+を同化・再利用する機構: GS1;2やNADH-GOGAT1欠損変異体における分げつ数の減少は、内性ストリゴラクトンではなく、GS1;2の存在が重要であることが判明した。この成果を、国際学術誌に公表した。また、イネの根におけるアスパラギンの合成に、AS1が機能していることを初めて示し、その成果を国際学術誌に公表した。GS1;2欠損変異体の基部では、リグニンの減少やデンプン粒蓄積を伴い、C/Nバランスが大きく崩れていた。成果の公表準備中である。4)イネ穂への窒素転流のモデリング:枝梗維管束SEM解析やN転流量の解析を継続している。先だって、蔗糖の転流の数理モデルを構築し、その成果を国際学術誌に公表した。1)外界のNH4+の過不足を検知する機構:イネ根においてNH4+情報の伝達に関わる有力な候補遺伝子として着目したOsACTPK1は、NH4+供給充足下のイネ幼植物根で顕著に発現し、翻訳産物はサイトゾルと核に蓄積することが示唆された。レトロトランスポゾンTos17挿入によるOsACTPK1破壊イネ系統では、(1)根の伸長抑制と地上部の成長促進、(2)根のNH4+蓄積と高親和性NH4+吸収の促進、(3)全Nや遊離アミノ酸含量、(4)根のGS1やNADH-GOGATタンパク質含量の増加が認められ、またKやMn含量の減少が観察された。また、イネ幼植物根では、ACTPK1がNH4+利用の負の制御に関わる示唆を得た。2)NH4+を同化・再利用する機構:イネのNH4+同化は、3種のGS1(GS1;1-1;3)と、共役する2種のNADH-GOGATが触媒する。
知識依存知覚情報処理過程における脳波活動および眼球運動の特性

視覚情報の知覚過程に知識や経験がどのような影響を与えるのかを調べるために実験課題に将棋を用い、将棋の棋力と駒組の認識に関わる脳波活動の関係を調べた。将棋において意味のある駒組を上級者に提示したところ、約200ミリ秒の潜時で頭頂部に活動が現れた。このような活動はデタラメな駒組に対しては現れず、また初心者は意味の有無に関わらず300ミリ秒の潜時で活動を示した。この結果は知識が知覚情報処理を促進することを意味する。視覚情報の知覚過程に知識や経験がどのように関わっているのかを調べるために実験課題に将棋を用い、棋力と将棋の局面を見た時の脳波活動の関係を解析した。被験者は上級者(アマ四段程度)、中級者(アマ初段程度)、初級者(アマ六級程度)の3グループから構成されている。実験では10枚程度の駒から構成された定跡形(将棋において意味のある駒組)とデタラメ形をそれぞれ50回ずつ提示した。被験者は将棋の局面が提示された5秒間で駒組を記憶し、その後モニタに現れた将棋盤と駒を使って提示された駒組の再現を試みた。定跡形を提示した時の記憶の正確さは被験者の棋力と高い相関があり、本課題の遂行には課題についての知識や経験が重要な役割を果たすことを確認した。次に脳波解析の結果についてであるが、本研究では駒組の記憶より知覚過程に興味があるので、将棋の局面が提示された直後の脳波活動に重点を置いて解析を行った。得られた結果は以下の通りである。被験者が上級者の場合は、定跡形が提示されると約150ミリ秒後に頭頂部のアルファ波帯域で位相固定指標の値が増加した。この位相固定指標は試行間での位相の再現性の高さを評価する指標であり、このことはアルファ波が高い再現性を持って知覚過程に関連していることを示唆している。また、この位相固定指標の増加は中級者や初級者では観察されず、さらに将棋において意味のないデタラメな駒組が提示された場合も現れないので、将棋の知識を活用した知覚情報処理過程を反映したものであると考えられる。視覚情報の知覚過程に知識や経験がどのような影響を与えているのかを調べるために実験課題に将棋を用い、将棋の棋力と駒組を見た時の脳波活動の関係を解析した。実験参加者は上級者(アマ四段程度)、中級者(アマ初段程度)、初心者の3グループから構成されており、10枚程度の駒から構成された定跡形(将棋において意味のある形)とそれをデタラメにした駒組をそれぞれ提示した。脳波活動を時間周波数領域上における振幅変化で評価したところ、初心者は駒組提示後300-400ミリ秒後に5HZ帯域の活動を頭頂部と前頭部で示した。この活動は定跡条件とデタラメ条件では違いはなく、初心者は定跡とデタラメを区別するほどの将棋の知識を持ち合わせていないことを脳波活動のレベルで示唆している。一方、中級者・上級者と棋力が高くなるにつれ頭頂部の活動の潜時は早くなった。これは将棋の知識が知覚情報処理を促進することを示唆している。また前頭部の活動は、中級者は初心者と同様の活動を示したが、上級者はデタラメ条件では活動を示さなかった。将棋に関する知識と経験が豊富になるとデタラメな駒組に対して違和感を感じるようになるが、このような違和感を感じる刺激に対しては前頭部は反応しないことを示唆している。昨年度の研究では、時間周波数領域上における位相固定指標で脳波を評価すると上級者の頭頂部は定跡形に対して選択的に約150ミリ秒の潜時で反応することを示した。これらの結果を総合すると、将棋に関する知識と経験を十分に有する上級者はそうではない中級者・初心者とは駒組の知覚過程が異なることが明らかになった。
2次元有機・無機材料を用いたMIS界面創出とノーマリオフMoS2 FETの実現

平成30年度はSAMの電気双極子を用いた閾値電圧の制御を先ず行った。素子作製には従来のプラズマ酸化と溶液への浸漬プロセスを用いた。本研究では電気双極子による内部電界を発生させるために、フッ素原子(F)を含むSAMをAlOx上に形成した。これまでに使用してきたSAM分子の水素原子(H)をフッ素原子(F)で置換した化学構造である。フッ素原子(F)の電気陰性度はポーリングスケールを用いると4であり、炭素原子(C)は2.5であることから、F-C間の電気陰性度差は1.5になる。一方、水素原子(H)は電気陰性度が2.1であり、従来のSAM分子を構成するH-C間の電気陰性度差は0.4になる。SAMの電気双極子は、この分子間の大きな電気陰性度の差によって発生する。フッ素原子(F)から成るSAM分子内では電気陰性度の大きいフッ素原子(F)近傍に電子分布が偏るため、SAMの表面が負に帯電した分極を発生する。SAM表面が負に帯電するため、n型半導体であるMoS2層内には空乏層が広がる。つまり仮想的に負の電圧が印加されている状態である。MoS2層の表面に電子を蓄積するためには、ゲート電圧を印加しSAMの分極による内部電界を打ち消す必要がある。その結果、閾値電圧が正側へ移動する。フッ素原子(F)からなるSAMの評価には、金属-絶縁膜-金属(MIM)キャパシタを作製し容量値とリーク電流を測定する。従来の水素原子(H)から成るSAMとの比較を通して、閾値電圧の変化量を評価する。本研究プロジェクトの初年度において、既に最大の目的であった閾値電圧制御と正の閾値電圧の実現に成功することができ、研究プロジェクト自体は当初の予想よりも非常に進展していると考えている。しかし、今年度に取り組んだSAMの電気双極子を用いた閾値電圧の制御に関して、SAMとAlOxの界面に正に帯電した固定電荷の存在を示唆する実験結果が得られており、この固定電荷がSAMの電気双極子の影響を打ち消してしまうため、SAMを吸着させるAlOxの検討が必要と考えられる。一般的に、異種材料界面には電荷捕獲サイトや固定電荷が存在することから、今後はこの界面制御に取り組む必要があることが分かった。これまでの実験では酸素プラズマ照射やRFスパッタによるAlOxをゲート絶縁膜の一部に使用してきたが、界面電荷の問題から原子層堆積法(ALD)によるAl2O3やさらに誘電率の高いHfO2の使用を計画している。ALDによるAl2O3やHfO2は、シリコン技術の発展の中で既に成熟した手法になっており、RFスパッタよりも質の高い絶縁膜を作製することができる。さらに、今後はMoS2表面上に絶縁膜を形成するトップゲート構造に展開することを計画している。平成29年度はゲート電極の仕事関数による閾値電圧制御を集中的に行った。閾値電圧を大きく正方向に移動させるために、仕事関数が5 eV以上の金属を選択した。金属材料の候補として、仕事関数が5.3 eVのPtを用いた。Ptの堆積には、プロセスダメージが比較的低い電子線蒸着装置を用いた。SiO2/Si基板上にPtを電子線蒸着によって堆積し、リフトオフプロセスによってゲート電極を作製した。電子線蒸着によって堆積したPt電極とSiO2/Si基板との密着性を向上させるためにCrを用いた。堆積したPt電極上に反応性RFスパッタリングによってゲート絶縁膜のAlOxを堆積した。アルゴンと酸素の比率を変えることで、堆積レートや被覆性、絶縁性といったプロセス条件や電気特性の最適化を行った。同時にAlOxをSiO2/Si基板上にも堆積し、MOSキャパシタを作製した。MOSキャパシタの容量-電圧特性から堆積したAlOxの膜厚を計算した。さらに、電流-電圧特性から絶縁破壊電界を調べた。AlOx上に自己組織化単分子膜を形成し、この積層ゲート絶縁膜上にMoS2を転写し、FETの作製と閾値電圧を評価した。同時に、Alをゲート電極に用いたMoS2 FETも参照試料として作製し、閾値電圧の変化量がゲート金属の仕事関数と一致しているかを検討した。実験結果より、Pt電極によって閾値電圧0.16Vの正の値を実現することができた。参照試料のAlをゲート電極に用いたMoS2 FETと比較して、約1V程度の正側への閾値電圧シフトを観測した。これは、ゲート電極材料の仕事関数差に対応しており、ゲート金属によって閾値電圧を制御している実験的な証拠と考えられる。本研究プロジェクトの初年度において、既に最大の目的であった閾値電圧制御と正の閾値電圧の実現に成功することができ、当初の予想よりも非常に進展していると考えている。初年度の結果をもとに、今後は更にデバイス特性の向上やデバイス物理の理解へと展開していくことが期待できる。初年度ながら予想よりも良い結果を得ることとができたと考えている。

フッ素原子(F)の電気陰性度はポーリングスケールを用いると4であり、炭素原子(C)は2.5であることから、F-C間の電気陰性度差は1.5になる。一方、水素原子(H)は電気陰性度が2.1であり、従来のSAM分子を構成するH-C間の電気陰性度差は0.4になる。SAMの電気双極子は、この分子間の大きな電気陰性度の差によって発生する。フッ素原子(F)から成るSAM分子内では電気陰性度の大きいフッ素原子(F)近傍に電子分布が偏るため、SAMの表面が負に帯電した分極を発生する。SAM表面が負に帯電するため、n型半導体であるMoS2層内には空乏層が広がる。つまり仮想的に負の電圧が印加されている状態である。MoS2層の表面に電子を蓄積するためには、ゲート電圧を印加しSAMの分極による内部電界を打ち消す必要がある。その結果、閾値電圧が正側へ移動する。フッ素原子(F)からなるSAMの評価には、金属-絶縁膜-金属(MIM)キャパシタを作製し容量値とリーク電流を測定する。従来の水素原子(H)から成るSAMとの比較を通して、閾値電圧の変化量を評価する。本研究プロジェクトの初年度において、既に最大の目的であった閾値電圧制御と正の閾値電圧の実現に成功することができ、研究プロジェクト自体は当初の予想よりも非常に進展していると考えている。しかし、今年度に取り組んだSAMの電気双極子を用いた閾値電圧の制御に関して、SAMとAlOxの界面に正に帯電した固定電荷の存在を示唆する実験結果が得られており、この固定電荷がSAMの電気双極子の影響を打ち消してしまうため、SAMを吸着させるAlOxの検討が必要と考えられる。一般的に、異種材料界面には電荷捕獲サイトや固定電荷が存在することから、今後はこの界面制御に取り組む必要があることが分かった。当初の計画ではRFスパッタによるAlOxをゲート絶縁膜の一部に使用する計画であったが、AlOxよりも誘電率の高いハフニウム酸化物(HfO2)も導入することを検討する。これによりゲート容量の向上による更なるデバイス特性の向上が期待できる。さらに、RFスパッタではなく原子層堆積法(ALD)によるAl2O3やHfO2の使用を計画している。ALDによるAl2O3やHfO2は、シリコン技術の発展の中で既に成熟した手法になっており、RFスパッタよりも質の高い絶縁膜を作製することができる。これまでの実験では酸素プラズマ照射やRFスパッタによるAlOxをゲート絶縁膜の一部に使用してきたが、界面電荷の問題から原子層堆積法(ALD)によるAl2O3やさらに誘電率の高いHfO2の使用を計画している。さらに、今後はMoS2表面上に絶縁膜を形成するトップゲート構造に展開することを計画している。
マイトファジー誘導時に駆動されるミトコンドリア分裂の分子基盤

これまでの研究で、ミトコンドリア特異的オートファジー(マイトファジー)に重要な新規因子として、ミトコンドリア外膜タンパク質Om14を見出した。興味深いことに、Om14欠損細胞ではマイトファジー誘導時に起こるミトコンドリアの断片化が強く抑制され、マイトファジーの効率も部分的に低下する。本研究では、Om14とその相互作用因子がいつ・どこで・どのように、マイトファジーを促進するためのミトコンドリアの断片化を制御しているかについて、明らかにすることを目的とした。平成29年度においては、Om14-HA発現株から単離したミトコンドリア濃縮画分を可溶化し、その中に含まれOm14-HAとその相互作用タンパク質をHA抗体結合アガロースを用いたアフィニティークロマトグラフィーにより精製、質量分析にて解析した。その結果、ミトコンドリア外膜タンパク質Por1(電位依存性陰イオンチャネルタンパク質)が同定された。そこで、HA抗体結合アガロースを用いた免疫共沈降アッセイを行い、Om14-HAとPor1の相互作用を確認することができた。次に、Por1の欠損変異体を作成し、マイトファジー誘導時のミトコンドリアの形態変化とマイトファジーへの影響を調べたところ、ミトコンドリアが肥大化し、マイトファジー効率も顕著に低下していることがわかった。これらの表現型は、Om14 Por1二重欠損変異体でさらに強くなることも判明した。さらに、ブルーネイティブゲル電気泳動法/ウェスタンブロッティングを用いた解析により、Om14-HAがPor1と高分子量複合体を形成している可能性が示唆された。以上の結果から、Om14とPor1は互いに相互作用することで、マイトファジー誘導時のミトコンドリア断片化に寄与していると考えられる。平成29年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では、Om14とその相互作用因子がいつ・どこで・どのように、マイトファジーを促進するためのミトコンドリアの断片化を制御しているかについて、明らかにすることを目的とする。平成28年度においては、ウェスタン解析のためのHAタグをOm14に付加した発現系の確立を試みた。その結果、N末端やC末端へのダギングはOm14のミトコンドリア断片化機能を損なうことがわかった。Om14は3つの膜貫通ドメイン(TMD)をもつと予測されているタンパク質である。そこで、N末端側から1番目と2番目のTMD、および2番目と3番目のTMDの間のループ部分にHAタグを挿入したところ、後者のタギングでOm14の機能が保持されることを見出した。一方、内在性プロモーターおよびターミネーター部分を含むOM14遺伝子発現カセットをプラスミドにクローニングし、これをOm14欠損細胞に導入したが、ミトコンドリア断片化機能は回復しなかった。このため、プラスミド発現系ではなく、染色体上のOM14遺伝子座にノックインする手法を確立し、野生型タンパク質と同様の機能をもつOm14-HA発現株を構築した。さらに、マイトファジー誘導前後のOm14-HAの発現パターンをウェスタン解析で調べたところ、誘導前の発酵性培養時に比べ、誘導後の非発酵性培養時には発現量が10-20倍増加していることがわかった。これまでの解析により、Om14の2番目と3番目のTMDの間のループ部分でタンパク質の機能を損なうことなくHAタグを付加できることが明らかとなった。また、プラスミド発現系ではom14欠損変異体のミトコンドリア断片化不全を相補できないこと、その解決策として染色体OM14遺伝子座へのノックインが有効であることを見出した。これらの改善策を実行するため、当初予定していたリン酸化部位変異体の解析や細胞内局在イメージングなどの実験は次年度の計画として行うこととなった。一方、ノックインOm14-HA発現株を用いて、Om14のトポロジーアッセイの再検討を試みた。具体的には、Om14-HA発現株よりミトコンドリアを単離し、これにAlexa488蛍光色素結合HA抗体を加えて蛍光抗体のミトコンドリアへの結合をマイクロプレートリーダーで検出した。その結果、HAタグ挿入部位はミトコンドリアの外側に露出していること、N末端は外側、C末端はミトコンドリア膜間スペースに露出したトポロジーをとることが示唆された。さらに、OM14遺伝子に含まれる一つのイントロンの重要性について調べるため、イントロンを持たないOM14(-intron)-HAを染色体OM14遺伝子座へノックインし、タンパク質発現パターン・ミトコンドリア断片化・マイトファジーを解析した。その結果、イントロンそのものはOm14の機能発現に必ずしも重要ではないことが明らかとなった。このように、当初予定していた実験の代わりに、今後の解析に重要な実験系を確立できただけでなく、タンパク質のトポロジーとイントロンについて新たな知見も得ることができたことから、本研究計画はおおむね順調に進展していると考えている。

興味深いことに、Om14欠損細胞ではマイトファジー誘導時に起こるミトコンドリアの断片化が強く抑制され、マイトファジーの効率も部分的に低下する。本研究では、Om14とその相互作用因子がいつ・どこで・どのように、マイトファジーを促進するためのミトコンドリアの断片化を制御しているかについて、明らかにすることを目的とした。平成29年度においては、Om14-HA発現株から単離したミトコンドリア濃縮画分を可溶化し、その中に含まれOm14-HAとその相互作用タンパク質をHA抗体結合アガロースを用いたアフィニティークロマトグラフィーにより精製、質量分析にて解析した。その結果、ミトコンドリア外膜タンパク質Por1(電位依存性陰イオンチャネルタンパク質)が同定された。そこで、HA抗体結合アガロースを用いた免疫共沈降アッセイを行い、Om14-HAとPor1の相互作用を確認することができた。次に、Por1の欠損変異体を作成し、マイトファジー誘導時のミトコンドリアの形態変化とマイトファジーへの影響を調べたところ、ミトコンドリアが肥大化し、マイトファジー効率も顕著に低下していることがわかった。これらの表現型は、Om14 Por1二重欠損変異体でさらに強くなることも判明した。さらに、ブルーネイティブゲル電気泳動法/ウェスタンブロッティングを用いた解析により、Om14-HAがPor1と高分子量複合体を形成している可能性が示唆された。以上の結果から、Om14とPor1は互いに相互作用することで、マイトファジー誘導時のミトコンドリア断片化に寄与していると考えられる。今後の研究計画として、(1)Om14-HA発現株から単離したミトコンドリア濃縮画分を可溶化し、その中に含まれるOm14-HAとその相互作用タンパク質をHA抗体結合アガロースを用いたアフィニティークロマトグラフィーにより精製、質量分析にて同定する。(2)免疫共沈降アッセイを用いて、得られた候補因子とOm14-HAとの相互作用を確認する。(3)相互作用が確認された因子の欠損変異体を作成し、マイトファジー誘導時のミトコンドリアの形態変化とマイトファジーへの影響を調べる。(4)Om14-HA発現株から単離したミトコンドリア濃縮画分をブルーネイティブゲル電気泳動法/ウェスタンブロッティングを用いて解析し、Om14-HAが高分子量複合体を形成しているかどうか調べる。(5)同様の方法でOm14相互作用因子の高分子量複合体形成を解析するとともに、相互作用因子の欠損変異体から単離したミトコンドリア濃縮画分におけるOm14-HAの高分子量複合体形成を調べる。平成29年度が最終年度であるため、記入しない。研究室ホームページ
植民地下朝鮮からの女子内地留学生の研究

植民地下朝鮮にあった高等女学校を卒業後、内地に留学した経験を持つ7名の朝鮮人女性にインタビュー調査を実施し、留学の経緯及び内地での留学生活に関する具体的証言を得た他、11校分の高等女学校史の翻訳、主要人物の伝記等の翻訳により、高等女学校毎の内地留学の実態を把握した。また、「鴻嬉寮」(主に李王妃が創設した淑明高等女学校と進明高等女学校からの内地留学生のために、李王家が東京市渋谷区若木町に開設した寮)に関する文献や入寮者2名に対するインタビュー調査により、鴻嬉寮の概要を究明した。植民地下朝鮮にあった高等女学校を卒業後、内地に留学した朝鮮人女子学生の実態調査に焦点を当て、留学体験者にインタビュー調査を実施するとともに、関連する諸文献・統計資料等の収集に努めた結果、以下の研究実績を得た。1)淑明高等女学校、進明高等女学校、京畿高等女学校、梨花高等女学校などの各学校史の中、卒業生の進路等に関する記述を翻訳・整理することにより、各高女における留学生数の変動、卒業後の進路・職業等、朝鮮からの内地留学生の動向を概ね把握した。2)帝国女子専門学校(現、相模女子大学)に留学した張晶玉(進明高等女学校卒)、崔粉金(進高等女学校卒)に対して、内地留学の動機、授業、寮・日常生活・交友関係、卒業後の進路などに関するインタビュー調査を実施し、内地での留学生活に関する具体的証言を得た。3)ユ・ジョンホ『僕の解放前後(1940-1949)』(全297ページ)を翻訳し、同時代の男子学生の勉学状況、植民地下での日常生活・意識、卒業後の進路・職業観などを女子学生の状況と比較・検討した。4)『培花高等女学校100年史』の戦前の部の翻訳を完了し、内容の検討を行なうとともに、他のキリスト教系高等女学校の教育目的、教育内容、卒業後の進路等と比較した。5)「鴻嬉寮」(淑明高等女学校と進明高等女学校からの内地留学生のために、李王家が東京渋谷区若木町に建設した寮)に関する資料の収集、入寮者(張晶玉、尹瑞石)に対するインタビュー調査等により、鴻嬉寮の概要を把握した。6)上記の成果の一部を、論文「植民地下朝鮮の女学生-進明高等女学校を中心に-」にまとめ、『岐阜大学留学生センター紀要2006』に発表した。昨年に引き続き、植民地下朝鮮にあった高等女学校を卒業後、内地に留学した朝鮮人女子学生の実態調査に焦点を当て、留学体験者にインタビュー調査を実施するとともに、学校史の関連記事を翻訳した。諸文献・統計資料等の収集にも務め、以下の研究実績を得た。1)京畿高等女学校(公立で朝鮮人のみ在籍)、培花高等女学校(キリスト教系私立で朝鮮人のみ在籍)からの内地留学生に関し、学校史の関連記事の翻訳を行ない、留学先、留学生数、卒業後の進路等、全般的動向を把握し、調査済みの諸学校と比較・検討した。2)京畿高等女学校の卒業生及び内地留学生に関しては、これまでに実施したアンケート調査・インタビュー調査の結果等も援用しながら論文にまとめた。また、同校に関しては、これまでに得た研究成果の一部を刊行するため作業を進めている(「春風社」より刊行予定で、現在初校を終了)。3)戦前、朝鮮から80人以上の留学生が在籍した帝国女子専門学校(現・相模女子大学)における留学生の全体像を把握し、その成果を論文にまとめた。4)柳宗鎬『僕の解放前後(19401949)』の日本語訳を完了し、筆者と面談した。同書日本語版の出版に向け、作業を進めている(「春風社」より刊行予定で、現在段組み終了)。5) 2008年3月15日(土)に「歴史を複眼で見る-朝鮮の高等女学校の思い出」というテーマで、元京畿高等女学校教師吉田重氏(97歳)とともに公開セミナーを行なった(於:岐阜市めいてつギャラリー、62名参加)。6)誠信女子大学(女子美術専門学校に留学した李淑鍾が創設)、中央女子高等学校(日本女子大校に留学した黄信徳が創設)及び創設者に関する資料を収集した。植民地下朝鮮にあった高等女学校を卒業後、内地に留学した朝鮮人女子学生の実態調査に焦点を当て、留学体験者に補足インタビューを実施するとともに、関連する諸文献・統計資料等の収集を行ない、本研究最終年のまとめに努め、以下の実績を得た。1.京畿女子高等女学校卒業生及び同校元教師へのインタビュー結果を、研究代表者は『海峡を越えて-京畿高等女学校の思い出』(2008年9月、春風社)としてまとめ出版した。2.植民地における高等女学校教育の実態を小・中学校の教育と比較するため、柳宗鎬『僕の解放前後1940-1949』の日本語訳を行ない、刊行した(白燦訳、太田孝子日本語校閲、2008年10月、春風社)。

3.明治から始まった日本人女性の留学の歴史を,女子内地留学生と比較するため、連携研究者は『つながりあう知』(2009年3月、春風社)にまとめ、出版した。4.淑明高等女学校学校史(『淑明70年史』)の1906年1953年、及び年表の全訳を完成し、研究テーマに該当する内容の検討・協議を重ねるとともに、すでに翻訳済みの同校『淑明90年史』とも比較し、同校の学校史の概要を詳細に把握した。(韓国における反日感情の動きは、学校史の記述にも如実に反映し、記述にかなりの相違がみられる。)5.女子美術学校に留学後、誠信女学校及び誠信女子実業初級大学(現・誠信女子大学)を創設した李淑鍾の伝記を翻訳し,李淑鍾の留学体験と帰国後の社会参加の在り方を検討した。6.誠信女学校史(『誠信25年史』)を翻訳、同校の教育目的、教育内容、卒業生の進路等を把握し、すでに翻訳済みの諸女学校と比較・検討した。7.大邱高等女学校、金泉高等女学校卒業生各1名にインタビュー調査を実施し、女学校教育の回想、卒業後の進路(福岡女子専門学校)と同校の教育内容、朝鮮生まれの日本人にとっての「内地」での学校生活に関する具体的証言を得た。
タキソ-ルの全合成

1.計画1でB環形成の鍵反応となるのはSmI_2によるカルボニルの一電子還元で生じたケチルラジカルがもう一つのカルボニルと、炭素-炭素結合を作る反応である。(1)γ-ヒドロキシ-γ-(2-シクロヘキサノンイル)-ブタナ-ルをSmI_2で処理すると2個のカルボニル基より生じたケチルラジカル同士が分子内で結合し、デカリントリオールを与えるが、この際、溶媒としてHMPAを加えるか否かにより生成物の立体化学が逆転する現象を見いだした。本反応はSm(III)にγ-OHが配位して反応が始まると考えられるが、HMPAの存在する時はアルデヒドの還元と6員環ケトンのシクロヘキサンの還元が別々に起き、双極子同士の反撥でこれらがトランス配置となりトランス-ジオールを生ずる。また、HMPAが存在しない時は一個のSm(III)に三個の酸素官能基が配位するため、シス-ジオールを生ずると考えられる。(2)アルデヒドをSmI_2で還元して生成したケチルラジカルは分子内の塩化アリル基と反応し、二重結合とC-C結合を作ると共に塩素は還元され、収率良くB環に相当する8員環を生成することを見いだした。2.計画2ではAB環生成をシクロヘキサジエノンに対する二重結合の(5+2)反応によって生ずるビシクロ[3.3.0]オクタン環の開裂で合成する。そこで基質となる3-[2-(1-アルコキシエテニル)-ベンジル]-2-ヒドロキシ-4,4,6-トリメチルシクロヘキサ-2,5-ジエノンをイソホロンから合成中である。3.計画3ではC環を分子内ジ-ルズ・アルダー反応で組み立てる。現在その基質となる2,5-アルコキシペンター2,4-ジエノールの3-メチルフマ-ル酸エステルを合成中である。
地理空間データを活用した高精度衛星測位の精度向上手法に関する研究

測位衛星は現行のGPS、GLONASSに加えQZSS、Galileoなどの衛星配備が予定され、衛星数が過多になりつつある。高精度衛星測位ではマルチパスや伝搬遅延に起因する誤差の大きい衛星電波を受信した場合に精度劣化が予想される。そこで、観測点と周辺地物の3次元位置・形状データ及び各衛星の位置との関係から、各衛星毎のマルチパスの有無と伝搬遅延誤差を推定し、観測点での各衛星電波の誤差を予測する手法を理論的・実証的に検討した。そして、マルチパスによる誤差の大きい衛星電波を除外するとともに、衛星の幾何的な組合せの良否も考慮して測位に最適な組合せの衛星電波を選択する手法を構築した。そこで、観測点と周辺地物の3次元位置・形状データ及び各衛星の位置との関係から、各衛星毎のマルチパスの有無と伝搬遅延誤差を推定し、観測点での各衛星電波の誤差を予測する手法を理論的・実証的に検討する。そして、誤差の大きい衛星電波を除外するとともに、衛星の幾何的な組合せの良否も考慮して測位に最適な組合せの衛星電波を選択する手法を構築する。本年度は下記の内容を実施した。1本実験の実施:前年度実施した予備実験の結果を踏まえて、複数の建物と道路から構成される街区を対象として道路面・建物面の3次元位置・形状を3次元点群データとして取得しモデル化した。また、街区内に設定した多数の観測点で干渉測位を実施し衛星電波観測データを収集した。これらの実験データに基づき、観測点と周辺地物の3次元位置・形状データとの関係からマルチパスの有無を推定できるかを検討した。その結果、衛星から送信される二つの搬送波を用いた衛星・受信機間の距離変化を夫々観測しその差を指標として用いることで、マルチパスの影響を受ける衛星電波の判別が可能であることを確認した。さらに、本指標を用いて利用衛星を選択することで、高精度解(Fix解)の取得率が増加することを確認した。実施内容としては、複数の建物と道路から構成される街区を対象として道路面・建物面の3次元位置・形状を3次元点群データとして取得しモデル化した。これらの実験データに基づき、観測点と周辺地物の3次元位置・形状データとの関係から衛星の可視・不可視の状況と実際の電波受信状況を比較することにより、マルチパスの有無を推定できるかを検討した。その結果、衛星から送信される二つの搬送波の衛星・受信機間の距離変化を夫々観測しその差を指標として用いることで、マルチパスの影響を受ける衛星電波の判別が可能であることを確認した。さらに、本指標を用いて利用衛星を選択する手法を構築した。これは、種々の条件下の観測データに基づいてマルチパス検知に関する本指標の閾値を設定し、それを超える衛星電波についてはマルチパスの影響を受けていると判断して除外して測位計算を行う方法である。検証実験の結果、従来の方法ではセンチメートル精度の高精度解(Fix解)がほとんど得られない高層街路上でも、本手法により高精度解の取得率が大幅に向上することを確認し本手法の有効性を検証した。

本年度は下記の内容を実施した。1マルチパス、衛星電波伝搬誤差推定に関する既存技術の調査GPS測位におけるマルチパスの推定については、鏡面反射による単純なモデルによるものが多い。また、測位計算により得られる精度評価は、単独測位、DGPSの利用を想定しており、RTK等の高精度測位ではあまり行われていない。電離層での伝搬誤差については、L1、L2の異なる周波数帯のデータを用いることで、遅延の要因となる電子数の推定が可能である。2予備実験の実施衛星電波伝搬誤差の推定とマルチパスの発生源を特定するため、周辺に遮蔽物が存在する観測点と、遮蔽物のない観測点で同時にGPSとGLONASSの2周波データを取得した。また、遮蔽物の形状を表現するため、周辺に遮蔽物がある観測点を中心として、地上型レーザスキャナによる3次元点群データの取得を行った。まず、遮蔽物のない観測点でデータの解析を行った結果、伝搬誤差推定に関しては2周波で得られる距離変化の差は衛星高度が高くなるほどゼロに近くなり、衛星高度が低い場合は衛星の方位角によって差が見られた。これらの点は測位に用いる衛星の組合せを選定する際に考慮すべき事項と考えられる。前年度実施した予備実験の結果を踏まえて本実験を行い、その結果を解析した結果、目標としているマルチパスの影響を受ける衛星電波の判別を有意に行える指標を設定できた。予備実験の遮蔽物がある場合の解析が遅れており、受信信号強度や搬送波位相計測値などのデータからマルチパスの有無、衛星電波誤差を推定するところまで至っていない。また、周辺地物の地理空間データを用いたマルチパス、衛星電波誤差推定の理論的な検討が遅れている。測位に最適な組合せの衛星電波を選択する手法の検討を行う。マルチパスの有る衛星電波、誤差の大きい衛星電波を除去することと、衛星の幾何的な組合せの良否の双方を考慮して、測位精度が最高となる組合せの衛星電波を選択する方法を検討する。1周辺に遮蔽物を含む観測点で取得したデータの解析を行い、観測された衛星の位置と、遮蔽物の3次元点群データからマルチパスの有無、衛星電波誤差について検討する。2周辺地物の地理空間データを用いたマルチパス、衛星電波誤差推定の理論的な検討:観測点と周辺地物の3次元位置・形状データ及び各測位衛星の位置との関係から、各衛星毎のマルチパスの有無を推定する方法を理論的に検討する。また、観測点の標高(または楕円体高)を与えた場合、衛星電波の誤差を推定できるかを理論的に検討する。3本実験の実施:複数の建物と道路から構成される街区を対象として道路面・建物面の3次元位置・形状を3次元点群データとして取得しモデル化する。また、街区内に設定した多数の観測点でRTK測位を実施し衛星電波観測データを収集する。これらの実験データに基づき、観測点と周辺地物の3次元位置・形状データとの関係からマルチパスの有無を推定できるかを検討する。また、観測点の標高を与えた場合に衛星電波の誤差を推定できるかを検討する。4測位に最適な組合せの衛星電波を選択する手法の検討:マルチパスの有る衛星電波、誤差の大きい衛星電波を除去することと、衛星の幾何的な組合せの良否の双方を考慮して、測位精度が最高となる組合せの衛星電波を選択する方法を検討する。該当なし1本実験実施のための機材(GNSS受信機、3次元レーザースキャナ等)の使用料に使用する。
職業専門家たる監査人のコーポレート・ガバナンスにおける役割の国際比較

一般に,職業専門家たる監査人による財務諸表監査の基本的機能は,企業が公表する財務諸表の質を保証することにより,財務諸表利用者が当該財務諸表によってミスリードされることを防止することであると考えられている。しかしながら,財務諸表監査によって保証される財務諸表の質とはいかなるものかという点は明らかにされていない。特に,近年の監査人に対する社会的期待の拡大に起因して生じている期待ギャップへの対応の観点から議論されることの多い内部統制の評価,不正の取扱い,ゴーイング・コンサーンの評価といった問題が,財務諸表の質の保証とどのように関係しているのかについて十分な理論的説明がなされているとはいえない。そこで,これらの問題を議論するに当たり,財務諸表監査が保証する財務諸表の質として,従来取り上げられてきた信頼性に加えて,目的適合性をも含めて考察し,それらを保証することの意義およびその保証に伴う問題を検討し,財務諸表監査が財務諸表の信頼性と目的適合性を保証すると考える場合の立証構造を示した。特に,ゴーイング・コンサーン問題については,目的適合性の保証の枠組みの中で位置づけられ,その場合に監査人による情報提供がいかに正当化されるかを,目的適合性の保証に伴う問題への対処の観点から明らかにした。さらに,今日の監査人によるコーポレート・ガバナンスヘの関与が,こうした保証に伴う問題に対処する方策として位置づけられることを示した。こうした分析を行うに当たっては,主としてイギリス監査制度を題材とし,そこから得られた知見に基づいて,わが国監査制度の改善点を示唆した。なお,本研究の成果を博士学位請求論文としてまとめ,現在審査を受けているところである。公表の方法については検討中である。職業専門家たる監査人に今日求められている役割には、財務諸表の質の保証に加えて、それとは区別されるべき役割あるいはそれとの関係が明確でない役割もある。こうした役割は全体としてコーポレートガバナンスの中で位置づけられなければならないが、そのための前提として、監査人の役割の各々がどういう意味をもち、相互にどのような関係にあるのかを明らかにしておく必要がある。監査報告書に記載される説明区分もそうした考察を必要とする役割の1つである。これまでの研究では、ゴーイング・コンサーン問題および未確定事項にかかる説明区分に注目し、アメリカにおけるその導入の経緯およびこれらの説明区分の実態を検討することを通してその意義を検討した。具体的には、監査報告書を含めたアニュアル・リポートの財務諸表部分を収めたデータベースNAARSで説明区分の設けられている監査報告書を検索し、該当したものを詳細に検討した。その結果、説明区分は「警報」を発信することを目的とするものであり、その目的を有効に実現するために、監査人の発すべき警報の性質およびその際の記載のあり方を論じることが重要であると考えることが適切であることを示した。ゴーイング・コンサーン問題および未確定事項にかかる説明区分を警報と考えるということは、その記載が形式的にいかなる方法を採ろうとも、その実質は「警報」という新たな情報を提供するものであるということを意味する。そして、そこでは監査人が「どのような警報」を「どのような原因」のために発信するのか、さらにはそれらを明らかにできる記載のあり方とはいかなるものかが問題となるのである。こうした知見が他国の場合にも当てはまるものであるかどうかを比較検討するとともに、特定のガバナンス・システムの中でどのように位置づけられるのかを考察することが今後の研究課題である。
新規実験系による血栓形成の制御分子の解析

インテグリンαIIbβ3は血栓形成の中核を形成し、その機能は病的環境においてダイナミックに変化する。本研究では、申請者が開発したCMK細胞システムを用いてその分子機構を解析した。CMKにおけるαIIbβ3活性化は、CHO細胞とは異なりtalin-1 head domain(THD)を強制発現させるのみでは活性化せず、血小板と同じくアゴニスト刺激が不可欠であり、talin-1およびkindlin-3依存性であった。種々のtalin-1変異体を用いた解析により、talinとβ3のmembrane proximalregionとの結合がαIIbβ3活性化に極めて重要であることが明らかになった。血小板インテグリンαIIbβ3は血栓形成の中核をなすタンパク質であり、その機能は病的環境においてダイナミックに変化しており、ポジティプあるいはネガティブに制御されている。本研究は、申請者らが新たに確立したCMK細胞システムを用いて、血小板インテグリン機能をポジティプあるいはネガティブに制御する分子に関して、その分子機構の詳細を明らかにすることを目的としている。αIIbβ3はアゴニスト刺激によるinside-outシグナルにより瞬時に活性化型に変化し血小板凝集を惹起する。最近αIIbβ3活性化にはtalin-1およびkindlin-3が必須であることが明らかとなってきた。現在までCHO細胞に異所性に発現させたαIIbβ3が用いられていたが、αIIbβ3CHOはアゴニスト刺激に反応せず、CHO細胞にはkindlin-3を発現していない等の欠点を有する。この欠点を補い、αIIbβ3のより生理的な解析を行うため内因性αIIbβ3を発現するヒト巨核球系細胞株CMKを用いた実験系を構築した。ダイナミックに変化するαIIbβ3活性化を的確に検出するため、PAC1の結合速度(initial velocity assay)を用いて解析すると、CMKではPARIペプチドによる刺激によりαIIbβ3が一過性に活性化する。CMKにおけるαIIbβ3活性化は、CHO細胞とは異なりtalin-1のヘッドドメイン(THD)を強制発現させるのみでは活性化せず、血小板と同じくアゴニスト刺激が不可欠であり、talin-1およびkindlin-3依存性であった。種々のtalin-1変異体を発現させαIIbβ3活性化におけるtalin-1の機能部位を解析すると、talin-1とβ3膜近傍領域の結合が極めて重要でありtalin-1とこの部位との結合を障害するとαIIbβ3の活性化は完全に消失したが、この部位より遠位にあるβ3のNPxY領域との結合を障害してもαIIbβ3の活性化は消失しなかった。以上よりtalin-1とβ3膜近傍領域の結合がαIIbβ3活性化に必須であることが強く示唆された。ダイナミックに変化するαIIbβ3活性化をて的確に検出するため、PAC1の結合速度(initial velocity assay)を用いて解析すると、CMKではPARIペプチドによる刺激によりαIIbβ3が一過性に活性化する。今年度の成果として、RNAiにてCMKにおける内因性talin-1やkindlin-3をノックダウンすると、それぞれのノックダウン細胞において、PAR1により惹起されたαIIbβ3の活性化は著しく障害されること、CMK細胞系はタリンのヘッドドメイン(THD)を強制発現さるのみでは活性化せず、血小板と同様にアゴニスト刺激が必要であることを明らかにした。さらに種々のtalin-1変異体を発現させαIIbβ3活性化におけるtalin-1の機能部位を明らかにした。

インテグリンαIIbβ3(GPIIb-IIIa)は血小板機能の中核をなす蛋白であり、血小板と血小板の結合、すなわち血小板凝集に必要不可欠な接着蛋白である。世界の多くの研究者は、現在までαIIbβ3活性化機構を解析する有効な実験系が無いため、αIIbβ3を異所性に293T細胞やCHO細胞に発現させ機能解析しているが、これらの系で得られた成果が血小板にそのまま応用し得るかは疑問が多い。事実kindlin-3は血小板機能に必須であるがCHO細胞にはkindlin-3は発現しておらず、またCHO細胞に発現させたαIIbβ3は血小板と異なりアゴニスト刺激では活性化しない。本研究では、αIIbβ3活性化機構の詳細を解析するために、新たにヒト巨核球系細胞株CMK細胞システムを開発した。CMK細胞システムはαIIbβ3がアゴニスト反応性に活性化する実験系であり、さらに新たにPAC1抗体を用いた短時間反応系のαIIbβ3活性化測定法も開発し、リアルタイムに近い形でαIIbβ3活性化を把握しうるように改善した。RNAiと過剰発現を用いてtalin-1とkindlin-3の遺伝子改変を行いその影響を検討した。Talin-1およびkindlin-3をノックダウンするとαIIbβ3の活性化は著しく障害された。THD、talin-1全長およびkindlin-3の過剰発現にてαIIbβ3活性化は有意に増加したが、CHO細胞とは異なりCMK細胞ではTHD過剰発現のみではαIIbβ3は活性化せずアゴニスト刺激を必要とした。Talin-1の自己抑制を解除する変異体やβ3との結合部位変異などのtalin-1変異体およびレスキュー実験により、talin-1とkindlin-3の重要性と両者の相補的な役割が示唆された。特ににtalinのmembrane proximal regionとβ3の結合がαIIbβ3活性化において極めて重要であることが明らかになった。血栓・止血本研究は、申請者らが新たに確立した血小板インテグリンを生理的に活性化しうるCMK細胞システムを用いて、血小板インテグリン機能をポジティプあるいはネガティブに制御する分子に関して、その分子機構の詳細を明らかにすることを目的としている。前年度のCMKを用いた解析結果をさらに発展すべく、本年度では、talin-1によるインテグリンαIIbβ3の活性化の分子機構の詳細を明らかにできた。CMKは巨核球系の細胞株のため、遺伝子のノックダウンがCHO細胞に較べると困難であり、またその形質の維持にも熟練を要した。一方、過剰発現系での解析は極めて順調であり、αIIbβ3の活性化に関してtalin-1のfull-length、talin head domain(THD)、さらにはこれらの変異体を発現させることにより、talin-1とβ3膜近傍領域の結合が極めて重要であることが明らかとなり、従来のαIIbβ3発現CHO細胞系との相違を明らかにすることに成功した。Talin-1は血小板活性化に伴い、まず高親和性の結合部位であるβ3のNPxY領域に結合し、その後β3の膜近傍領域に結合すると考えられている。CHO細胞の解析結果では、膜近傍領域よりもNPxY領域がより重要との成績であった。