hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ラット切歯萌出機序における循環系の役割に関する研究

歯の萌出過程における循環系の役割を調べるために以下の実験を行った。1)ラットを人工呼吸下でハロセン麻酔し、0.01、0.1、1および10μg/kgのアドレナリンを足背静脈あるいは頚動脈より投与し、正中尾動脈圧の変化および下顎切歯の長軸的な動き(萌出方向あるいは反対方向への動き)を測定した。動脈圧および歯の動きには用量ー反応関係が認められた。動脈圧はアドレナリン投与により、一過性の上昇、下降および回復を示した。切歯はアドレナリン投与により、一過性の萌出方向への動き、反対方向への動き、それに続く萌出方向への動きを示した。用量が等しい場合、血圧変動は静脈内投与の方が大きく、歯の動きは動脈内投与の方が大きかった。血圧の変動と歯の動きとの間には必ずしも同期性は認められなかった。0.01、0.1、1および10μg/kgのノルアドレナリンを用いた同様の実験においても、アドレナリン投与の場合と類似した結果が得られた。しかし、用量が等しい場合、一般に血圧上昇作用はノルアドレナリンの方が大きく、歯の動きに対する作用はアドレナリンの方が大きかった。イソプロテレノールを用いた同様の実験において、血圧上昇作用および歯の萌出方向への動きは認められなかった。しかし、血圧下降作用および反対方向への歯の動きは顕著であった。2)正常ラットにアルブミン添加墨汁あるいは血管鋳型作製用の樹脂を注入した後、下顎を透明化あるいは脱灰、脱有機した後、高解像実体顕微鏡で観察を行った。その結果、特に歯根膜内の静脈系に容量血管(capacitance vessels)と思われる構造の存在することが観察された。今後、歯髄、歯根膜内の微小血管の構造およびそれらの機能をさらに詳しく検索し、またアドレナリン作動性薬物等を投与した場合、血管構造にいかなる変化が生ずるかを調べる予定である。
イギリス型ソネットの成立過程に関する歴史的研究

イギリスのソネットの起源は、様式(表現方法)と主題(内容)の両面からみなければならない。様式については、カプレットをなして独立している結句に着目するのが有効である。古典期に生まれた短詩型のエピグラムは、ルネッサンス時のある段階まではソネットと同一視されていた。ワイアットは、ペトラルカからソネットを知る前に、セラフィーノのストランボット(エピグラムの一種)から、イギリス型ソネットの基本となる結句を学びとっていた。また、主題のうえでも、セラフィーノの世界とワイアットの世界は同趣であり、かくしてワイアットにとって、エピグラムとソネットは未だ分離してはいなかった。ワイアットがセラフィーノを移入したときとはちがって、サリーがマーシャルのエピグラムを移入したときは、厳正忠実な訳によった。これは様式の面で、エピグラムが異物として独立しはじめているのを意味する。さらに主題の面でも、サリーはマーシャルから、ワイアットのソネットにはない思索や田園趣味をとりいれ、これもまたサリーが、エピグラムをソネットと区別しはじめていたのを物語るであろう。二つの本格的な分離は、ソネット作者がエピグラムを書かなくなった、サリー以後におこった。その頃ケンダル編の『エピグラム詩華集』によって、マーシャルと『ギリシア詩華集』が本格的に移入され、イギリスのソネットは、これらのエピグラムをはっきり異物とみなしつつ、これまでのソネットにはなく、しかもイギリス人の心情に適った主題、すなわちvileness,fel,acetum,salを、とりいれていった。一方、様式の面では、この期のソネット作者たちがエピグラムから受けた影響は、多岐にわたり、次第に間接的となった。とくに『ギリシア詩華集』は、頭初予想していたようなワイアット、サリーとの直接の繋がりがないのが判明し、多岐にわたった諸詩人への影響を解明するのは、今後の課題として残された。
エンドセリン受容体を介する細胞内情報伝達の新しい調節機構の解析

(1) ETA及びETB受容体共発現細胞におけるET-1の結合及び機能特性の解析、ETA/ETB共存系では、ETBリガンドによりETBから置換遊離した[125I]ET-1がETAにトラップされ、ETBリガンドによる結合置換が認められない結果になることが示された。ウサギ肺動脈では、この過程でETAに結合したET-1が、ETAを介する作用を示したと考えられた。このことは、受容体と拮抗薬相互作用に新たな機序が存在することを示したものであり、循環器疾患治療薬として開発の進んでいるETB拮抗薬の臨床応用に際して、血管部位によりETA/ETBの存在量比が異なるために拮抗効果が部位により変化する可能性を示唆し、使用目的により十分な配慮をする必要があることを示したものである。(2)三量体G蛋白質シグナル調節蛋白質(RGS)による心血管系における7回膜貫通受容体シグナルの新しい調節機構の解析(a)血管平滑筋の収縮型から合成型への変化は、細胞増殖能の大きな変化と、血管作動性物質に対する受容体応答の変化を伴うが、この変動とRGS4、5の発現が密接に関与している可能性が考えられた。(b)約200残基のRGS蛋白質ファミリーであるRGSl、2、4、5、8、16、Z1.GAIPの発現はアゴニストによる細胞内Ca濃度の上昇能アッセイでは、ほほ同一の抑制傾向を示すことが判明した。(c)それらの抑制作用はRGSとG蛋白質αとの結合実験から、Gi.Go.Gq/11サブユニットを介して行われる。(d)細胞に発現するRGS蛋白質の発現密度に依存して、アゴニスト刺激による受容体シグナルは抑制される。(e)細胞に発現する受容体密度により、RGS蛋白質の発現による受容体シグナルの抑制効果は異なることが判明した。1.エンドセリンB受容体の脱感作機構の解明エンドセリン(ET)の機能発現においてET受容体の脱感作は重要な役割をもつと考えられる。しかし、その脱感作機構に関しては未だ解明されていない。本年度は、ETB受容体の脱感作が受容体のリン酸化に依存しているかを検討した。リン酸化部位を含むC末端部を欠損した複数のETB受容体の発現細胞を用いて、次の結果を得た。(1)C末端部欠損型ETB発現細胞は、カルシウム応答において野生型ETBと同程度に脱感作された。(2)ET-1刺激された野生型ETBはリン酸化されたが、C末端部欠損型ETBはリン酸化されなかった。(3)ETBをリン酸化するキナーゼはPKCでなくGRK2であった。(4)C末端部欠損型ETBとGRK2あるいはドミナントネガティブGRK2を共発現させたところ、IP3の産生は共に抑制された。以上より、本研究はC末端部欠損型ETBの脱感作がリン酸化に依存しないことを示し、さらにリン酸化非依存性の脱感作機構の存在を明らかにしたものである。2.ヒルシュスプルング病におけるETB受容体遺伝子の解析本邦における散発性ヒルシュスプルング病とETB受容体遺伝子異常との関係を明らかにするため、SSCP法によりETB受容体遺伝子の塩基変異の検索を行い、さらに同定した変異受容体の機能解析を行った。その結果(1)31人の患者より3人の遺伝子点変異を明らかにした。(2)機能解析の結果、N1041変異は多型の可能性が高く、S390R変異は細胞内シグナル伝達機能の障害を起こし、また、C109R変異は細胞膜への輸送障害があり、その結果として細胞膜上の受容体減少による機能障害を引き起こすことが明らかになった。

2種のETB受容体遺伝子変異を見出し、それぞれ異なった機序によりヒルシュスプルング病を引き起こすことを示したものである。(1) ETA及びETB受容体共発現細胞におけるET-1の結合及び機能持性の解析ETA/ETB共存系では、ETBリガンドによりETBから置換遊離した[125I]ET-1がETAにトラップされ、ETBリガンドによる結合置換が認められない結果になることが示された。ウサギ肺動脈では、この過程でETAに結合したET-1が,ETAを介する作用を示したと考えられた。このことは、受容体と拮抗薬相互信用に新たな機序が存在することを示したものであり、循環器疾患治療薬として開発の進んでいるETB拮抗薬の臨床応用に際して、血管部位によりETA/ETBの存在量比が異なるために拮抗効果が部位により変化する可能性を示唆し、使用目的により十分な配慮をする必要があることを示したものである。(2)三量体G蛋白質シグナル調節蛋白質(RGS)による心血管系における7回膜貫通受容体シグナルの新しい調節機構の解析(a)血管平滑筋の収縮型から合成型への変化は,細胞増殖能の大きな変化と、血管作動性物質に対する受容体応答の変化を伴うが、この変動とRGS4、5の発現が密接に関与している可能性が考えられた。(b)約200残基のRGS蛋白質ファミリーであるRGS1、2、4、5、8、16、Z1、GAIPの発現はアゴニストによる細胞内Ca濃変の上昇能アッセイでは、ほぼ同一の抑制傾向を示すことが判明した。(c)それらの抑制作用はRGSとG蛋白質αとの結合実験から、Gi、Go、Gq/11サブユニットを介して行われる。(d)細胞に発現するRGS蛋白質の発現密度に依存して、アゴニスト刺激による受容体シグナルは抑制される。(e)縮胞に発現する受容体密度により、RGS蛋白質の発現による受容体シグナルの抑制効果は異なることが判明した.
べん毛モーター固定子複合体の相互作用・イオン透過・構造変化の解析

細菌は好む環境に集合し、好まざる環境から逃避する性質(走性)を示し過酷な環境を生き抜く。これは環境を認識する受容体(レセプター)と運動器官(べん毛モーター)により担われる。本研究ではレセプター研究での経験を生かし、べん毛モーター研究(相互作用・イオン透過・構造変化)に踏み出した。今年度は以下のことに取り組んだ。2) PomA-FliG間の定量的相互作用解析:PomA-FliGの化学量論比・解離定数を求める定量的相互作用系を確立を試みた。溶液NMR法を用いた解析から、1)の成果による^<15>Nラベル化試料の調製・相互作用に伴う信号消失から、結合パラメーターを算出した。3)チャネル複合体(PomA/PomB)の構造変化・イオン透過機構:構造変化・イオン透過機構解析は、NMR法とFTIR法の2つに力を入れた。FTIRにおいて、Na^+存在下・非存在下での差スペクトルから、PomBのAsp24がNa^+との結合部位であることを証明した[Biochemistry 2009]。1)PomA、PomB、FliGの発現・精製:前年度に行ったPomBの発現系を発展させ、PomA、FliGについて様々な発現系・精製系の立ち上げを試み、純度の高い標品を得た。これにより、以下の2)3)の測定が可能となった。2)PomA-FliG間の定量的相互作用解析:PomA-FliGの化学量論比・解離定数を求める定量的相互作用系を確立を試みた。溶液NMR法を用いた解析から、^<15>Nラベル化試料の調製・相互作用に伴う信号消失を見出し、結合残基・パラメーターを算出した。また、変異体を用いてその妥当性を検討した。FTIRにおいては、前年度にNa^+存在下・非存在下での差スペクトルから、PomBのAsp24がNa^+との結合部位であることを証明した。今年度は他にAsp31(PomA)がNa+結合に関与することを見出した。また、変異体を用いて、イオン結合に伴う構造変化と機能の相関を解析した。
蛋白質の溶液構造決定法の開発とペプチド性成長因子(IGFー1)への応用

我々は、70残基のアミノ酸よりなるヒトのインスリン様成長因子IGFーI(ソマトメジンC)の溶液中での構造解析をNMRとディスタンスジオメトリ-法を併用することにより行ってきた。^1HーNMRを用いた解析を行っていく過程でこの分子は“やわらかい"構造をとり、ヘリックス構造の存在は示唆されるがβーシ-ト構造などは見られないことが分った。そこで、本研究所では^1HーNMRのみでなく、^<13>Cや^<15>N核といったNMRに活性である安定同位元素を用いてIGFーIをラベルし、種々の異核相関二次元NMR法を用いて、^1HーNMRを三次元に展開しようと試みた。共同研究者である丹羽らはすでに大腸菌を用いる融合蛋白質法によるIGFーIの大量産出系を確立していたので、栄養源として^<15>NH_4Clと^<13>Cエンリッチグルコ-スを用いて、蛋白質の同位体ラベルを得ようとした。しかしこのような無機塩類のみを用いた培養系では、いままで用いてきた保護ペプチド遺伝子を継いだ大腸菌中でのIGFーI遺伝子の発現は極端に低下し、また可溶画分が容易には得られなかった。NMRを用いた構造解析には蛋白質が単量体として単分散と存在することが前提であるため、得られた大溶画分を可溶化する条件を探した。その目的のため、分子量分布の測定が必要となり超遠心分析法の改善につとめ、装置をコンピュ-タとオンライン化した。解析プログラムやその他周辺機器の整備を行い、世界で初めて広い依存域(5mg/mlー30mg/ml)での分子量解析のシステムを確立できた。このシステムは、今後多くの方面で、用が期待される。IGFーIの構造確定に関しては同位体ラベルを待つ間に^1HーNMRでの解析をさらに進め、種々のパルス系列を援用することにより、世界にさきがけて^1HーNMRのみでその三次元構造を提出した。同位体ラベルについては今後も研究を続け、IGFーIがリセプタ-との相互作用をする状態での構造解析し利用しようと目論んでいる。
粒子沈降により生じる一様乱流場と振動格子乱流の相互作用に関する研究

粒子混入による乱流変調機構については、近年のLDVの開発・応用により定性的な傾向については明らかになってきている。しかしながら、定量的に明らかになったことといえば、粒子径と乱流との長さスケールの比率に関する乱流抑制と増幅の敷居値程度であり、予測手法に援用し得るような実験データは皆無である。また、粒子混入の影響を導入した数値計算等も実施されているが、乱れの抑制増幅を表示し得るような機構的なモデルは提案されていない。粒子と乱流の相互作用は平均流動の変化を介した間接的な相互作用と直接的な相互作用に分類できると考えられる。両者の影響が混在する流動では粒子乱流の相互作用を定量化することが困難になる。本研究でではこのような状況に鑑み、粒子と乱流の直接的な相互作用を抽出するために、振動格子乱流中に固体粒子を一様に沈降させて、乱流変調機構を検討することを試みた。水理実験を実施して、振動格子乱流は乱流拡散と乱流エネルギーの散逸が釣り合う場であることから、平均せん断の存在しない乱流場においても、既往の実験結果と同様な乱流の抑制増幅の変調が生じることを確認した。振動格子乱流の積分長さスケールをL_eと粒径をdとして、概ねd/L_e=0.1が乱流強度の増幅抑制の敷居値となることが確認され、既往の実験結果の傾向と一致した。また、粒子の混入は乱れの異方性の増加に貢献することがわかった。Parthasarathyらの理論を基礎として粒子混入の影響を表示した付加項を提案した。レイノルズ応力モデルによる数値計算により実験結果の傾向を良好に再現した。
加齢黄班変性の発症リスクと遺伝子多型

加齢黄斑変性の発症には多数のリスク因子が関与するとみなされるが実態は不明である.網膜の光酸化毒性防御機構や解毒機構にかかわるさまざまな酵素の中から、10種類以上の生体酸化や外来化合物の代謝に関与する酵素遺伝子を取り上げて、その多型(genetic polymorphism)の実際を多数の加齢黄斑変性症例で調べて健常群と比較した.その結果、manganese superoxide dismutase(MnSOD), microsoal epoxy hydrase(mEPHX)のアリル多型頻度が加齢黄斑変性と健常者群との間で相違することが判明した.ことに、MnSODの多型に顕著な差異がみられた.MnSODのシグナルペプチド翻訳領域にはVal/Val, Val/Ala, Ala/Alaという多型がみられる.加齢黄斑変性99例では、Val/Val 89.6%, Val/Ala 31.3%, Ala/Ala 9.1%であり、健常者197例ではそれぞれ67.5%,31.5%,1.0%であり、両者の間に有意の差異がみられた.MnSODは網膜色素上皮細胞に発現して有害酸素の除去のために機能していることが実証されている.mEPHXについても同じような結果であった.遺伝子型と酵素機能との間の関連については今後の検討課題であるが、加齢黄斑変性の発症リスクにこうした酵素が関連することを示唆する知見である.MnSOD, mEPHX以外には、今回取り上げた酵素遺伝子の多型頻度には有意な増減はなかったが、さらに別の多数の遺伝子を検討して複合的なリスク因子を明らかにしていくことが今後に残された課題である.なお、加齢黄斑変性に類似した臨床像を示すSorsby fundus dystrophyを我々は本邦ではじめて確認したが、その原因遺伝子tissue inhibitor proteinase-3は加齢黄斑変性では異常がなかった.したがって、加齢黄斑変性に対する罹病性(susceptibility)には、単一の遺伝子ではなく、多数の遺伝要因と環境要因とが複雑にからみあうとみなされる.今後はこうした視点から多面的に遺伝的要因を明らかにしていくことが大切であろう.加齢黄斑変性の発症には多数のリスク因子が関与するとみなされるが実態は不明である.網膜の光酸化毒性防御機構や解毒機構にかかわるさまざまな酵素の中から、10種類以上の生体酸化や外来化合物の代謝に関与する酵素遺伝子を取り上げて、その多型(genetic polymorphism)の実際を多数の加齢黄斑変性症例で調べて健常群と比較した.その結果、manganese superoxide dismutase(MnSOD), microsoal epoxy hydrase(mEPHX)のアリル多型頻度が加齢黄斑変性と健常者群との間で相違することが判明した.ことに、MnSODの多型に顕著な差異がみられた.MnSODのシグナルペプチド翻訳領域にはVal/Val, Val/Ala, Ala/Alaという多型がみられる.加齢黄斑変性99例では、Val/Val 89.6%, Val/Ala 31.3%, Ala/Ala 9.1%であり、健常者197例ではそれぞれ67.5%,31.5%,1.0%であり、両者の間に有意の差異がみられた.MnSODは網膜色素上皮細胞に発現して有害酸素の除去のために機能していることが実証されている.mEPHXについても同じような結果であった.遺伝子型と酵素機能との間の関連については今後の検討課題であるが、加齢黄斑変性の発症リスクにこうした酵素が関連することを示唆する知見である.MnSOD, mEPHX以外には、今回取り上げた酵素遺伝子の多型頻度には有意な増減はなかったが、さらに別の多数の遺伝子を検討して複合的なリスク因子を明らかにしていくことが今後に残された課題である.なお、加齢黄斑変性に類似した臨床像を示すSorsby fundus dystrophyを我々は本邦ではじめて確認したが、その原因遺伝子tissue inhibitor proteinase-3は加齢黄斑変性では異常がなかった.したがって、加齢黄斑変性に対する罹病性(susceptibility)には、単一の遺伝子ではなく、多数の遺伝要因と環境要因とが複雑にからみあうとみなされる.今後はこうした視点から多面的に遺伝的要因を明らかにしていくことが大切であろう.加齢黄斑変性の罹病性素因を探るべく、生体内酸化や外来化合物の代謝に関連する8種類の酵素群についてDNA多型を検討した.MnSODのDNA多型はシグナルペプチド翻訳領域のアミノ酸置換(Val/Ala)を伴う.遺伝子型を同定できた加齢黄斑変性群99例のうち、59例(59.6%)がVal/Val型、31例(31.3%)がVal/Ala型、9例(9.1%)がAla/Ala型であった.対照群197例では、133例(67.5%)がVal/Val型、62例(31.5%)がVal/Ala型、2例(1.0%)がAla/Ala型であった.対照群と比較して、加齢黄斑変性群ではAla/Ala型の頻度およびAlaのアリル頻度が有意に高かった(p=0.0005).mEPHX遺伝子の多型についても、加齢黄斑変性と対照との間に有意な差異がみられた.これらの酵素群は加齢黄斑変性の発症リスクの有力な候補として今後さらに検討していく予定である.加齢黄斑変性の発症には多数のリスク因子が関与するとみなされるが艶態は不明である.網膜の光酸化毒性防御機構や解毒機構にかかわるさまざまな酵素の中から、10種類以上の生体酸化や外来化合物の代謝に関与する

酵素遺伝子を取り上げて、その多型(genetic polymorphism)の実際を多数の加齢黄斑変性症例で調べて健常群と比較した.その結果、manganese superoxide dismutase(MnSOD),microsomalepoxy hydrase(meEPHX)のアリル多型頻度が加齢黄斑変性と健常者群との間で相違することが判明した.ことに、MnSODの多型に顕著な葦異がみられた.MnSODのシグナルペプチド翻訳領域にはVal/Val, Val/Ala, Ala/Alaという多型がみられる.加齢黄斑変性99例では、VaI/Val 89.6%, Val/Ala 31.3%, Ala/Ala 9.1%であり、健常者197例ではそれぞれ67.5%, 31.5%, 1.0%であり、両者の間に有意の差異がみられた.MnSODは網膜色素上皮細胞に発現して有害酸素の除去のために機能していることが実証されている.mEPHXについても同じような結果であった.遺伝子型と酵素機能との間の関連については今後の検討課題であるが、加齢黄斑変性の発症リスクにこうした酵素が関連することを示唆する知見である.MnSOD, mEPHX以外には、今回取り上げた酵素遺伝子の多型頻度には有意な増減はなかったが、さらに別の多数の遺伝子を検討して複合的なリスク因子を明らかにしていくことが今後に残された課題である.なお、加齢黄斑変性に類似した臨床像を示すSorsby fundus dystrophyを我々は本邦ではじめて確認したが、その原因遺伝子tissue inhibitor proteinase-3は加齢黄斑変性では異常がなかった.したがって、加齢黄斑変性に対する罹病性(susceptibility)には、単一の遺伝子ではなく、多数の遺伝要因と環境要因とが複雑にからみあうとみなされる.今後はこうした視点から多面的に遺伝的要因を明らかにしていくことが大切であろう.
自己免疫疾患老化モデルにおけるp16の解析

老化に伴い発症頻度の高くなる自己免疫疾患の病態形成のメカニズムを解明する目的で、サイクリン依存性キナーゼインヒビターp16との関連性を解析した。P16は当初多種類の癌細胞にその遺伝子変異が認められたことから、癌抑制遺伝子として注目された分子であり、そのメカニズムは細胞に老化を誘導することで、増殖の制御を行っていることが判明している。シェーグレン症候群モデルNFS/sldマウス10週齢および17ヶ月齢各臓器におけるp16の発現をWestern blot法で解析した結果、17ヶ月齢マウス脾臓に強い発現を認め、10週齢マウスでは検出されなかった。この結果は個体の老化とp16の発現の相関を示唆する所見と考えられた。その他の臓器での発現は認められず、顎下腺および耳下腺に軽度の発現を認めた。免疫組織学的解析において、顎下腺、耳下腺に軽度のCD3陽性Tリンパ球の浸潤が認められたことから、p16は浸潤リンパ球由来であると考えられた。一般に、末梢T細胞は抗原刺激を受けた後、その表現形をナイーブ型からメモリー型へ変化させる。モデルマウス脾細胞より分離したT細胞を解析した予備的検討の結果、p16の発現はナイーブ型に較べメモリー型T細胞に強く認められた。以上の結果より、p16の発現は個体の老化に伴って亢進すること、さらに、リンパ球の活性化に伴って亢進することが明らかになった。今後は、末梢Tリンパ球におけるp16の発現と病態との関連性を詳細に解析することにより、病態を把握するための診断の一助に成り得るか否かを検討する。
リモートセンシングに基づく面的地盤データの抽出と地震被害想定モデルに関する研究

開発途上国において地震被害想定のあり方を考える場合、日本で行われているような精度が高くかつきめ細かい地震被害想定は必ずしも必要ではなく、まずは被害想定を実施するためのコストを考慮し、ある程度の精度を確保した被害想定を早期に策定し,どの地域の何に重点的に限られた防災資源を投入するかを考えることが必要である。このような観点から、平成16年度は横須賀市をモデル地区として選び、この研究グループが提案したディジタル標高データ(DEM)を用いる地形分類手法に基づき、スペースシャトル飛行で得られた合成開口レーダー(SAR)画像をDEMに加工したものであるSRTM-3 (Shuttle Radar Topography Mission,地球の両極を除く約80%、全人口密集地の約95%をカバーしている)を用いて、地形分類を行なった。その結果、既存のデータである500mメッシュの地形分類や土地条件図と比べて、平坦化された地形が台地として分類されるなど改善の余地はあるものの、谷筋がよく表現されるなど、空間的に詳細な分類結果を得ることができることが分かった。また、分類された結果を用いて松岡・翠川の方法に基づき地形区分ごとの地盤増幅度を推定し、既存のデータによる増幅度と比較した結果、空間的に殆ど同じ傾向を示すことを確認した。しかし、限られた地域でのケーススタディーだったため、平成17年度はフィリピンのマニラを中心にこの研究グループが提案した手法を適用した結果、地震被害想定のための基盤データが殆ど整備されていない国・地域においても適用可能であることを確認した。今後はより多くの国・地域におけるケーススタディーを通じ、本研究で提案した手法の有用性を確かめていく予定である。このような観点から、平成16年度は横須賀市をモデル地区として選び、この研究グループが提案したディジタル標高データ(DEM)を用いる地形分類手法に基づき、スペースシャトル飛行で得られた合成開口レーダー(SAR)画像をDEMに加工したものであるSRTM-3(Shuttle Radar Topography Mission,地球の両極を除く約80%、全人口密集地の約95%をカバーしている)を用いて、地形分類を行なった。しかし、現段階においては得られた増幅度分布の精度に対する十分な検証が出来ていないことなどから、今後は得られた増幅度の精度検証を行なうとともに、より多くの国・地域におけるケーススタディーを通じ、本研究で提案した手法の有用性を確かめていく予定である。
アクチンと微小管をつなぐ新たな分子の細胞内制御機構及び生体内機能の解明

方向性をもった細胞移動は発生・がん転移や炎症反応など生体現象のさまざまな局面で重要である。この現象では、移動先端にフォスファチジルイノシトール3リン酸(PI(3,4,5)P3)が集積し、極性をもたらす一つの責任分子として働く。我々はLL5β、フィラミンAさらにはSHIP2が移動先端膜上およびその近傍で、時空間的に活性制御ならびに局在制御を受け、移動に重要な役割を担っていることを見出した。我々は、形成期の大脳皮質脳室帯において、フィラミンAの分解が制御され、その制御をもとに脳室帯からの細胞移動開始がコントロールされる仕組みを見いだした。さらに、LL5分子がフィラミンAに結合すること、そしてLL5のノックダウンにより大脳皮質神経細胞の移動停止が起こること、さらにはその移動停止はフィラミンAの同一細胞内強制発現によりレスキューされることを見いだした。これらの事実はLL5の大脳皮質神経細胞移動の調節機構は主にフィラミンAの発現量によっていることを示唆する。一方、LL5は、フォスファチジルイノシトール3リン酸PIP_3に高い特異性で結合しうるpleckstrin homology domain(PH domain)をその分子内にもつ。このことは、LL5が細胞膜上のPIP_3に依って、細胞内にて時間空間的に制御されていることと考えられる。以上を踏まえ、以下の実験を行った。実験:神経細胞におけるフォスファチジルイノシトール分子によるLL5の活性制御機構の検討・PIP_3に親和性の高いPH domainに蛍光タンパクを融合させた分子を大脳皮質神経細胞に発現させ、移動神経細胞についてPIP_3分布を時空間的に解析したところ、移動神経細胞の先端方向の突起に、PIP_3の局在を見いだした。なお、LL5の本来のPH domainを別の分子由来の、異なるフォスファチジルイノシトール分子へ親和性の高い、PH domainと置き換えての検討については、現在変異分子を作成中である。実験:LL5の結合分子からみた細胞内局在・機能制御の解明LL5のフィラミンAとの結合部位が、従来とは異なる部位であることを見いだした。さらに、LL5の新たな結合分子を、数種同定し、その解析を進めた。さらにLL5分子がフィラミンAに結合すること、そしてLL5のノックダウンにより大脳皮質神経細胞の移動停止がおこること、さらにその移動停止はフィラミンAの強制発現によりレスキューされうることを見出した。一方、LL5はフォスファチジルイノシトール3リン酸に高い特異性で結合しうるドメインを分子内にもつ。このことは、LL5が細胞膜上のフォスファチジルイノシトール3リン酸によって、その活性を制御されていることと考えられた。以上を踏まえ、昨年に引き続き、以下の実験を行った。実験:神経細胞におけるフォスファチジルイノシトール分子によるLL5の活性制御機構の検討特に今年は、フォスファチジルイノシトール分子への親和性の異なる幾つかのアミノ酸配列とLL5の本来の配列とを置き換えて検討した。その親和性の差に応じて、移動動態の変化を観察した。実験:LL5の結合分子からみた細胞内局在・機能制御の解明LL5の結合分子にはどのような分子がふくまれるか精査し、フォスファチジルイノシトールにてその局在が制御される分子やフォスファチジルイノシトールの動態そのものに関わる分子が含まれることを見出した。実験:CLASP分子とのクロストークに関する検討CLASP分子をクローニングし、LL5の機能に及ぼす影響を検討した。現在さらに、その意義について実験を進めている。実験:大脳皮質機能異常の検討今回検討の対象としている分子が、同様に神経伝達に関わる可能性がある事実を見出した。
下垂体特異的遺伝子の単離による検査法の開発

本年度は下垂体疾患における下垂体で発現する既知の遺伝子に対する自己抗体を検討した。ホルモンプロセシング酵素と関連蛋白に対する自己抗体の診断的価値を検討した(Tatsumi, Tanaka et al. 2003, Endocrine)。対象症例は、自己免疫性視床下部下垂体炎患者14例、ACTH単独欠損症10例、TSH単独欠損症4例、Sheehan症候群3例、非機能性下垂体腺腫11例。PC1/3、PC2、CPE、7B2に対する抗体価を、それぞれのcDNAを用いたラジオリガンド法により検討した。PC2とCPEに対する自己抗体は全症例陰性であった。PC1/3に対する自己抗体は自己免疫性視床下部下垂体炎患者2例と非機能性下垂体腺腫5例で、7B2に対する自己抗体はリンパ球性自己免疫性視床下部下垂体炎患者2例、Sheehan症候群1例と非機能性下垂体腺腫6例で陽性で出現した。抗PC1/3抗体と抗7B2抗体の2種の抗体陽性例を合わせると、非機能性下垂体腺腫で11例中10例で陽性となり、LHで11例中4例で陽性であったのに比し有意に陽性率が高くなった。従って、抗PC1/3抗体と抗7B2抗体は組織破壊に伴い二次的に出現しやすいと考えられ、目的とは逆の結果であるものの、非機能性下垂体腺腫とLHの鑑別診断に有用である可能性がある。非機能性下垂体腺腫で高率に陽性になった理由としては、腫瘍組織の壊死や下垂体組織浸潤による下垂体抗原の提示が自己抗体の生成に働いたと考えられる。この他、α-enolaseは組織特異性は無いものの、最近、Crockらが自己免疫性視床下部下垂体炎で自己抗体を50%と健常人や下垂体腫瘍に比べ高頻度に認めた下垂体細胞質分画の49kDa蛋白抗原として報告したのでα-enolaseに対する自己抗体も測定した(Tanaka, Tatsumi et al. 2003, Endocr J)。抗α-enolase抗体はリンパ球性下垂体前葉炎1例、リンパ球性漏斗下垂体後葉炎3例、Sheehan症候群2例と非機能性下垂体腺腫3例で認めた。従って、α-enolaseはCrockらが1998年までに報告したイムノブロッテイング法の主要抗原とは異なると考えられた。先天性下垂体ホルモン複合欠損症の病因遺伝子の解明や、自己免疫性下垂体炎の自己抗原の解明を進めていく一つの方法として下垂体に特異的に発現する遺伝子を明らかにし、検査法の開発を目指す。本年はBodyMap法を用いて明らかにしたヒト下垂体特異的に高頻度に発現しているcDNAの3'末端配列をプローブにして、ヒト下垂体cDNAライブラリーよりcDNAをスクリーニングすることにより、下垂体に特異的に発現する2つの新規遺伝子、PGSF1(pituitary gland specific factor 1)、PGSF2を明らかにした。

PGSF1は1kb前後の2つのsplice variantのcDNAあり、129と92アミノ酸の蛋白、PGSF1aとPGSF1bがコードされ、このうち40アミノ酸が細菌のproteaseと40%一致した。Northernでは下垂体特異的な発現が認められた。酵素は自己抗原となることも多く、自己免疫性下垂体炎の診断のマーカーになる可能性がある。PGSF2は1.8kbのcDNAに243アミノ酸の蛋白がコードされている。データベースでは4.4kbで3'末端が異なるIGSF1/IGDC1がX染色体のゲノム解析より報告されていた。特徴は免疫グロビン様ドメインを持つことで、PGSF2には2つ、IGSF1/IGDC1には12個認められた。更にシグナルペプチドがあり、PGSF2は分泌蛋白と想定された。NorthernではPGSF2は3'プローブでは下垂体特異的な発現が認められたが、5'プローブでは4.5kbのbandも得られ、IGSF1/IGDC1として,もスプライスされているようである。IGSF1/IGDC1は膜貫通部位があり、細胞の局在に関わる可能性がある。本年度は、昨年度同定した下垂体特異的に高頻度に発現している新規遺伝子PGSF1(pituitary gland specific factor 1)、PGSF2に対する自己抗体が自己免疫性視床下部下垂体炎の血清中に出現するか否かを検討した。まず、自己抗体の検査法を確立するため、下垂体の自己抗体の可能性が示唆されているGHに対してラジオリガンド法を施行した。標識抗原(ラジオリガンド)を作製するために、下垂体特異的遺伝子のcDNAをin vitroの転写翻訳系用のvectorに組込み、試験管内でreticulocyte lysateを用いたin vitroの転写翻訳システムにより35S-Met標識した抗原を作製、カラム精製する。作製した標識抗原を血清中の自己抗体と反応して抗体価を計測する。指標としては、陽性血清(抗体)に対する指標に比べ、NPSに対する指標(NPS index)がより再現性が高く、カットオフ値近くを判定するには、NPS indexを使用することが適切であった。抗GH抗体は自己免疫性視床下部下垂体炎患者17例中1例、ACTH単独欠損症10例中1例に認め、健常人40例中には認めなかった。陽性検体の特異性を調べるため、recombinant human GHによる競合実験を行ったところ、全ての陽性検体はrecombinant human GHによる抑制実験によって陰性へと移行したが、陰性コントロールのovalbuminでは抑制されなかったので、本法の特異性も確認された。次に、PGSF1、PGSF2に対する自己抗体を同様にラジオリガンド法で検討した。抗PGSF1抗体は自己免疫性視床下部下垂体炎17例中1例に認め、他の下垂体ホルモン欠損症(ACTH単独欠損症10例、TSH単独欠損症4例、Sheehan症候群3例)でも2例認めた。抗PGSF2抗体は17例中2例に認め、他の下垂体ホルモン欠損症17例には認めなかった。以上の成績から、抗GH抗体と抗PGSF2抗体については陽性率が低いながらも疾患特異性が高く、自己免疫性下垂体炎の補助診断に役立つ可能性があると示唆された。本年度は下垂体疾患における下垂体で発現する既知の遺伝子に対する自己抗体を検討した。ホルモンプロセシング酵素と関連蛋白に対する自己抗体の診断的価値を検討した(Tatsumi, Tanaka et al.2003,Endocrine)。
脂肪組織幹細胞移植による難治性皮膚潰瘍の治療法の開発

F344近郊系ラットの鼠径部脂肪塊から酵素処理により脂肪組織幹細胞(Adipose derived Stem cells、以下ASC)を獲得し10%FBS添加DME培地内で培養、継代を繰り返した。皮膚潰瘍モデルを用いた実験に先立ち、第3継代ASCをトリプシン処理後、細胞浮遊液を作成し、直径1.5cmのコラーゲンスポンジ1個あたり1x10^6個播種した後、再度100mmディッシュ内で培養を継続後、1,3,5,7日後にコラーゲンスポンジ内の細胞数をカウントし増殖曲線を作成したところ、7日目までは比例的に細胞増殖することを確認できた。次に同系ラットに直径1.5cmの背部皮膚欠損創を作成後、濃度1mg/mlのマイトマイシンCを塗布して作成した難治性皮膚潰瘍モデルに対し、コラーゲンスポンジに組み込んだASC(以下ハイブリッド型コラーゲンスポンジ)を移植し、移植後7および14日後に肉芽組織の増殖の程度や新生血管の程度を組織学的に評価した。その結果コントロール群と比較して経時的に有意に創傷治癒促進効果が確認された。また周囲の健常皮膚からの創傷治癒効果を除外するため、移植直前にシリコンチャンバーを潰瘍周囲に装着したモデルにおいても同様の結果が得られた。最後に、創傷治癒機転が潜在的に不良な糖尿病モデル動物を用い、同様の治癒効果が得られるかを検討するため、糖尿病マウス(db/dbマウス)の鼠径部皮下脂肪組織からASCを獲得し、細胞培養を行うことなくアテロコラーゲンスポンジに1個あたり1x10^6個播種し、同一個体の糖尿病マウスの背部皮膚欠損創に移植した。その結果、移植後7および14日ともに創傷の上皮化率(面積比)は実験群において有意に優っており、組織学的にも肉芽組織の厚さおよび毛細血管密度が有意差をもって増加していた。以上よりASC含浸ハイブリッド型コラーゲンスポンジは難治性皮膚潰瘍に対し創傷治癒促進効果を有する可能性が示唆された。F344近郊系ラットの鼠径部脂肪塊より我々がこれまでに報告してきた脂肪組織由来幹細胞(Adipose derived Stem cells、以下ASC)精製プロトコールに従ってASCを獲得する。この初代ASCを10%FBS添加DME培地内で培養、継代を繰り返す。第3継代ASCをトリプシン処理後、細胞浮遊液を作成し、直径1.5cmのシリコン付アテロコラーゲンスポンジ1個あたり1x10^6個播種する。播種後この再度100mmディッシュ内で培養を継続後、1,3,5,7日後にコラーゲンスポンジ内の細胞数をカウントし増殖曲線を作成したところ、7日目までは比例的に細胞増殖することを確認できた。次に、同系ラットの背部皮膚に直径1.5cmの肉様膜を含めた全層皮膚欠損層を作成した後濃度1mg/mlのマイトマイシンCを皮膚欠損創に10分間塗布し難治性皮膚潰瘍モデルを作成した。そこに上記条件のASC組み込みコラーゲンスポンジを移植し。移植後7および14日後に標本を採取しパラフィン標本を作成しHE染色による形成肉芽組織の形態学的評価、特に肉芽組織の増殖の程度や新生血管の程度を評価した。対象群はアテロコラーゲンスポンジ単独移植群とした。

その結果、移植後7日目における肉芽組織の厚さはコントロール群と比較して実験群において有意に増大しており、移植後14日目においても有意差は認めなかったものの、実験群のほうが良好な肉芽組織の形成を誘導することが出来た。また1視野あたりの新生血管数を計測したところ、いずれの時期においてもコントロール群と比較して実験群において有意に増加していた。以上よりASC含浸コラーゲンスポンジは創傷治癒促進効果を有する可能性が示唆された。今後は走査電子顕微鏡による微細な形態学的評価ならびに各種サイトカインの定量を試みる予定である。昨年同様、F344近郊系ラットの鼠径部脂肪塊より我々がこれまでに報告してきた脂肪組織由来幹細胞(Adipose derived Stem cells、以下ASC)精製プロトコールに従ってASCを獲得した。この初代ASCを10%FBS添加DME培地内で培養、継代を繰り返す。第3継代ASCをトリプシン処理後、細胞浮遊液を作成し、直径1.5cmのシリコン付アテロコラーゲンスポンジに1個あたり1x10^6個播種する。播種後この細胞を再度100mmディッシュ内で培養を継続しASC-コラーゲンスポンジ複合体を作成した。次に、同系ラットの背部皮膚に直径1.5cmの肉様膜を含めた全層皮膚欠損層を作成した後濃度1mg/mlのマイトマイシンCを皮膚欠損創に10分間塗布し難治性皮膚潰瘍モデルを作成した。そこに上記条件のASC組み込みコラーゲンスポンジを移植し、移植後4、7および14日後に標本を採取しパラフィン標本を作成しHE染色による形成肉芽組織の形態学的評価、特に肉芽組織の増殖の程度や新生血管の程度を評価した。なお、本年度は上記に示すごとく作成した難治性潰瘍が周囲の健常皮膚からの創傷治癒が進まぬよう、移植直前にシリコンチャンバーを潰瘍周囲に装着し移植組織の創治癒効果のみを検討した。対象群はアテロコラーゲンスポンジ単独移植群とした。その結果、移植された部分の肉芽組織の厚さおよび毛細血管数は経時的に増加し、それぞれ移植後4、7および14日後の段階においてもコントロール群と比較して実験群において統計学的有意差をもって増加していることが確認された。以上よりASC含浸コラーゲンスポンジは創傷治癒促進効果を有する更なる可能性が示唆された。平成17年度まではF344近郊系ラットに濃度1mg/mlのマイトマイシンCを皮膚欠損創に10分間塗布して作成した難治性皮膚潰瘍モデルを用いて、シリコン付アテロコラーゲンスポンジに組み込んだ脂肪組織由来幹細胞(Adipose derived Stem cells、以下ASC)の創傷治癒に果たす役割について検討してきた。本年度は創傷治癒機転が潜在的に不良な糖尿病モデル動物を用い、昨年までと同様の治癒効果が発揮できるかどうかを検討した。糖尿病マウス(db/dbマウス)の鼠径部皮下脂肪組織からこれまでと同様の精製プロトコールに従ってASCを獲得した。このASCを、細胞培養を行うことなく直径1.5cmのシリコン付アテロコラーゲンスポンジに1個あたり1x10^6個播種した。その後同一個体の糖尿病マウスの背部に皮膚欠損創を作成し自家ASCを播種したコラーゲンスポンジ(ハイブリッド型コラーゲンスポンジ)を移植した。コントロール群としてASCを播種しないコラーゲンスポンジ単独移植も同時に実施した。
低電圧動作強誘電体ゲート不揮発FET作製プロセスの研究

金属/強誘電体/絶縁体/半導体のゲート積層構造を有する電界効果トランジスタ(MFIS FET)は有望な次世代不揮発性半導体メモリ素子として知られるFeFETのひとつである。このMFIS FETについて、強誘電体材料の強誘電性を十分に引き出すための高温アニールを敢えて行うことを選択しながらも絶縁体層とシリコン半導体界面遷移層の実効的な換算膜厚を小さく抑えることを期待して、金属/強誘電体/絶縁体積層の製膜前にシリコン半導体表面を窒化および酸窒化処理し、それらの処理条件の最適化を行った。その結果、最適な処理条件の基に絶縁体層とシリコン半導体界面遷移層の実効的な換算膜厚を小さく抑えられることが示唆された。今後この成果を応用することで強誘電体層の薄膜化が可能になり、MFIS FETの動作電圧低減と素子の微細化を実現できる。本研究課題では、MFIS FET実用化研究の一環としてMFISFETの微細化とそれに伴う動作電圧の低減をめざしている。現在報告されている中でも最長のデータ保持時間33.5日の実績を持つ当研究室のPt/SBT/HAO/Si構造MFISFETでは、現状で強誘電体SBT膜厚400nm、絶縁体HAO膜厚10nm、書き込み電圧の振幅7Vである。今回科学研究費の交付を受けて、MFIS FETの良好な保持特性は維持したままSBT膜厚200nm、HAO膜厚5nmと現在の半分程度にし、その結果として書き込み電圧の振幅も低減することを目標としている。SBTの強誘電性を得るための高温アニールによりSiOx低誘電率遷移層が形成されるため、単純にSBT層とHAO層を薄膜化してもMFIS FETの動作電圧を下げることは出来ない。従ってまず、このSiOx低誘電率遷移層の換算膜厚を下げる必要がある。平成18年度はこの目的に適したSi表面処理条件を得るための基礎実験を行い、その結果を元に、減圧ガス雰囲気中でSi表面をアニール処理する装置の仕様を入念に検討し、購入・立ち上げまでの作業を行った。新規導入した装置は、大気中から導入したSi基板を速やかに超高真空下に置くことができ、アンモニアを含むプロセスガス3系統を備え、脱ガスの少ない清浄環境で急速加熱することが可能で基板面内の温度分布も小さい。平成19年度以降は、この装置を活用してMFISFETのゲート絶縁膜全体の換算膜厚を小さくし、書き込み電圧の低減を図る。当該年度は,SiOx低誘電率遷移層を含めたゲート絶縁膜全体の換算膜厚を小さくすることを目的として平成18年度に導入した超清浄減圧アニール装置を用いたSi基板表面の窒化処理を行い,その上にPt/SBT/HfO2積層を製膜したMFIS FETを作製し電気的特性を評価した。具体的にはまず局所熱酸化膜による素子分離パターン付20mm角Si基板の洗浄直後に上記アニール装置を用いてアンモニア雰囲気中での急速加熱処理により,800°Cから1190°Cの温度範囲でSi表面の窒化処理を行い,その後,PLD製膜装置を用いてHfO2薄膜,続いてSBT薄膜を積層させ,最後に電子ビーム蒸着装置でPtを製膜した。FETのゲート電極およびソース・ドレインコンタクトホールはフォトリソグラフィーとイオンミリングまたはプラズマエッチング装置によって形成した。半導体パラメータアナライザを用いて電気的特性を測定した。断面構造を透過電子顕微鏡または走査透過電子顕微鏡により観察した。その結果,掃引電圧振幅5V時に1.3Vのメモリウィンドウを示しゲート絶縁膜全体の換算膜厚を小さくすることができたと考えられる窒化処理条件が得られた。また,当該年度はSi基板の初期洗浄に必要な超純水製造装置一式を購入し上記アニール装置およびPLD製膜装置が設置してあるのと同じクリーンルーム内に設置したことで,MFIS FETの作製を効率的に行うことができるようになった。当該年度は、SiO_x低誘電率遷移層を含めた絶縁層全体の換算膜厚が小さくかつデバイス特性のよいMFIS FETを作製することを目的として、洗浄済みの素子分離パターン付20mm角Si基板を酸化処理後に窒化処理することでチャネル領域上に酸窒化膜を形成した。この実験のために平成18年度に導入した超清浄減圧アニール装置を用いた。酸窒化膜の形成条件を変えたSi基板上に同一条件でPt/SBT/HfO_2積層を製膜し、MFIS FETを多数作製した。

これらの電気的特性を評価した結果、ドレイン電流-ゲート電圧特性において酸化のみ、窒化のみ、または、処理なし、のいずれの場合よりもサブスレッショルドスウィング値を小さくできる酸窒化の条件が得られた。この条件により作製されたMFIS FETは5V以下の低電圧動作時にも広いメモリウィンドウを示し、MFISFETの膜厚方向の微細化に有効であることが分かった。本成果は頑在、論文投稿準備中である。また、MFISFETのゲート長1μm以下の微細化のためにはICPドライエッチング装置によりゲートスタックを形成し、自己整合的にソース・ドレインのイオン注入を行うことが有効であることが分かった。なお、当該年度はリフトオフ等、MFISFET作製の後工程に必要なエッチングチャンバードラフト装置を購入して電極パッド形成のための電子ビーム蒸着装置と同じクリーンルーム内に設置したことで、MFIS FETの作製をより効率的に行うことができるようになった。
ヒアルロン酸レセプターCD44の断片化阻害による、軟骨細胞の脱分化抑制効果

本研究期間において、主としてスタチン製剤によるCD44の断片化抑制効果と、その作用機序についての解析を進めることが出来た。スタチン製剤は効果的にCD44の断片化を抑制し、その作用機序としてはLipid raftの構成成分であるコレステロールの生成抑制のみならず、Ras経路やRac/Rho経路の関与が強く示唆される結果であった。膜型MMPとしてMT1-MMP、ADAM10/17が関与するが、単独ではなく各MMPの相互作用によるものと考えられた。主要なヒアルロン酸(HA)レセプターであるCD44の機能性は、関節軟骨の恒常性維持に極めて重要である。CD44は酵素的断片化によりレセプターとしての機能を喪失し細胞内断片(ICD)を生ずる。CD44の断片化はCell-HA結合の喪失につながり、予想されるICDの転写因子としての機能と共に、軟骨細胞の脱分化に関わっている可能性があると考えて検討を進めている。本研究では、脱分化軟骨細胞を変形性関節症モデルと位置づけ、関節軟骨細胞の脱分化におけるCD44断片化の意義とICD自体の機能解析を行い、断片化抑制による脱分化制御の可能性を探る予定であるが、同時に遺伝学的に均一であるcell lineにおけるCD44の断片化モデルを確立することは、当研究を進めるに当たり重要である。そこで我々は第一に、HCS細胞(ヒト軟骨細胞様細胞株)において検討を進めている。CD44の断片化阻害はMMP阻害剤の使用やCD44のLipid raftへの移行を阻害することで可能であるが、特に本年度は既に臨床で使用されているHMG-CoA還元酵素素材薬であるSimvastatinを用いた断片化阻害効果を中心に検討した。IL-1β刺激によるCD44断片化はSimvastatinにより効果的に阻害された。またこの阻害効果はコレステロール生成阻害のみならず、RasやRac/Rhoシグナル阻害が関与していることを確認した。さらに、SimvastatinはCD44断片化に関わる膜型MMPの発現を抑制したが、siRNAによるRNA干渉実験系において、MT1-MMPやADAM10/17の単独ノックダウンはCD44の断片化を抑制せず、ダブルノックダウンにおいて断片化抑制効果を確認出来たことから、断片化には複数の膜型MMPが相互作用的に関与していることが示唆された。そこで我々は第一に、HCS細胞(ヒト軟骨細胞様細胞株)においては無刺激下においてもNaturally occurring ICDが軽度発現していることを、CD44のC末端に対する特異的抗体を用いたwestern blottingにより確認した。牛・ヒト関節軟骨細胞においてはIL-1β刺激により、CD44の断片化とICD発現が亢進することは発表済みであるが、HCS細胞においても同様の現象が確認された。CD44の断片化の導入は細胞膜上のChoresterol-rich domainであるLipid Raftにおいて膜型MMPsにより開始されるため、広域スペクトルMMP阻害剤であるGM6001処理や、CD44のLipid raftへの移行を阻害することで断片化は抑制される。そこで高コレステロール血症治療薬でHMG-CoA還元酵素阻害薬であるSimvastatinを用いて、IL-1β刺激によるCD44断片化の抑制効果を検討したところ、Simvastatinは用量依存的にCD44の断片化を抑制することが確認された。当初研究計画においては初代牛関節軟骨細胞を用いて全ての研究を計画したが、大量安定供給が若干困難であり、HCS細胞株を用いたCD44の断片化モデルの確立を第一に行う必要があった。このモデルにおいて、関節軟骨細胞初代培養系と同様にサイトカイン刺激によりCD44の断片化が亢進することが確認された。このHCS細胞株におけるCD44断片化モデルは、以後の断片化抑制研究において重要なツールとなる。CD44のChoresterol-

rich domainであるLipid Raftにおける断片化導入の抑制効果を、広域スペクトルのMMP阻害剤であるGM6001(Calbiochem)や、γ-セクレターゼ阻害剤であるDAPT(N-[N-(3,5-diflurophenyl-acetate)-L-alanyl]-(S)-phenylglycine t-butyl ester、Calbiochem)を使用して検討する予定であったが、それらに加えてより一般的に使用されているstatin製剤を用いることを考えた。これまでにSimvastatinによるCD44の断片化抑制効果が確認されたことから、以後軟骨細胞におけるCD44の断片化抑制効果と脱分化抑制効果の検討をする際には、Simvastatinの効果についても検討することとした。Cell lineを用いたCD44の断片化モデルを構築することに時間を要したことと、新規アイデアとしてstatin製剤の使用を追加したことから、当初の研究計画における具体的な実験計画の消化速度はやや遅くなっているが、初代培養系細胞に加えてCell lineも実験モデルとして使用して比較的容易に研究を進めることが出来ることを鑑みて、現在のところ概ね順調に研究計画を達成していると考えている。スタチン製剤は現時点でも高脂血症治療薬として臨床で使用されており、その安全性も確立されている。そのためスタチン製剤によるCD44の断片化抑制効果と軟骨細胞の脱分化抑制効果が確認できれば、今後の臨床応用の可能性が開ける。SimvastatinによるCD44の断片化抑制効果がHCS細胞株において確認されたが、これを関節軟骨細胞において再確認する必要がある。またSimvastatinによるCD44断片化抑制効果がsqualeneを介するcholesterol産生抑制によるものなのか、Farnesyl pyrophosphate(FPP)やGeranylgeranyl pyrophosphate(GGPP)を介するRasなどの細胞内シグナル経路抑制に基づくものなのか、その作用機序を明らかにする必要があり、これらの添加によるSimvastatinの作用変化を検討する。我々の最終目標はCD44の断片化抑制による軟骨細胞の脱分化抑制である。脱分化とは2型コラーゲンやアグリカンなどの発現量低下、それに伴う細胞外マトリックスの減少、またBMPなどのanabolic cytokineに対する反応性低下を指標として用いている。低密度単層培養による軟骨細胞脱分化導入モデルに対する、Statin製剤添加による遺伝子発現変化を検討することと、仮に遺伝子発現変化が認められなかった場合でも、anabolic cytokineに対する反応性が増加していれば、statin製剤とBMPのcombination therapyの有効性と可能性について検討する。牛関節軟骨細胞の単離の際に使用するPronase/collagenaseの購入、CD44-ICDプラスミドの遺伝子導入に用いるエレクトロポレーション用バッファー、Western blottingやPCRに用いるゲルや試薬など、培養消耗品(培養液、培養皿など)と試薬の購入費が主な使用目的となる。一方で今年度は研究結果を発表していく必要があり、学会での成果発表のための国内および外国旅費と、最終的には論文投稿のための外国語校正費、その他として印刷費と論文投稿料が必要である。