hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
X線結晶解析法によるフェレドキシンと亜硫酸還元酵素による電子伝達複合体の構造研究

一般にフェレドキシン(Fd)とFd依存性酵素間の電子の授受は電子伝達複合体を形成して行なわれることが知られている。共同研究者の大阪大学長谷教授グループによるFd改変体を用いた相互作用実験から、種々の還元酵素はそれぞれFdの異なったアミノ酸残基を認識しているという興味深い実験結果が報告されている(J.Biol.Chem.274,29399(1999))。電子伝達複合体の形成様式が電子を受け取る側の酵素の種類によって個別的であることは、炭素、窒素、硫黄の各代謝系へ光還元力を分配する位置にあるFdが構造のレベルで電子伝達を制御している可能性を示している。今回、本若手研究において硫黄同化において重要な役割を担う亜硫酸還元酵素とFdとの複合体の結晶構造解析に成功した。構造解析に成功したのは、正方晶系(P4_12_12,a=103.324,b=103.324,c=255.088Å,α,β,γ=90°)の結晶である。X線回折強度データ収集は高エネルギー加速器研究機構、物質構造科学研究所、放射光研究施設において行い、亜硫酸還元酵素とFdに含まれる鉄原子の吸収端近傍に於ける多波長異常分散法により構造解析した。鉄原子の異常分散差を係数とした差フーリエマップ上にシロヘム、4Fe-4Sクラスター、それにフェレドキシンの2Fe-2Sクラスターに含まれる鉄原子12個を確認している。現在、2.2Å分解能で分子モデルを構築中である。まだ分子モデルを構築中なので、現段階では正確な分子構造について考察することは出来ないが、シロヘム、4Fe-4Sクラスター、フェレドキシンの2Fe-2Sクラスターの3つの酸化還元中心間の距離は、それぞれ4.3,13.8Åである。高等植物のフェレドキシン(Fd)は、活性中心に[2Fe-2S]lクラスターを持つ電子伝達蛋白質である。このFdは光化学系Iから受け取った電子を複数の同化還元酵素群へと伝達する役割を担っている。FdとこれらFdに依存する酵素間での電子の受け渡しは、一般的に電子伝達複合体を形成した後に起こることが判っている。各還元酵素の活性は炭素、窒素、硫黄など無機酸化物の同化反応と直結しており、複合体形成と各還元酵素への電子の分配とに密接な相関があるものと思われる。実験責任者はFdとFd-NADP+還元酵素(FNR)との複合体結晶構造を明らかにしているが、この複合体構造中ではFd側の電荷を持ったアミノ酸による静電的な相互作用がFNRとの複合体形成に重要であることが見出された。さらに複合体を形成することによりFdとFNRの双方に構造変化が誘発されることも明らかにしている。しかしながら、FNR以外にFdとの複合体構造は報告されておらず、他の還元酵素の場合はどうであるかは不明のままである。本研究課題ではトウモロコシのFdとSiRとの電子伝達複合体を構造解析し、Fdの持つ複合体形成様式の多面性を原子レベルで明らかにしたいと考えている。亜硫酸還元酵素の単斜晶系の結晶化は再現性が悪く、重原子同型置換体結晶を作る事が困難であったため、鉄原子の異常分散効果を利用した多波長異常分散法による構造解析を目指し、高エネルギー加速器研究機構、放射光研究施設(KEK-PF)のビームラインNW12に於いて、鉄原子を用いたMAD法による測定を行った。測定中にX線強度が低下するという予期せぬアクシデントが発生したが、Peak波長(2.60Å,R=0.12)、edge波長(2.70Å,R=0.133)、remote波長(3.15Å,R=0.171)の三波長でデータ収集を行うことができた、現在鉄原子の異常分散効果による位相付けを試みている。亜硫酸還元酵素単体の構造が判明した暁には、すでに得られている亜硫酸還元酵素とFd複合体の結晶を使って、分子置換法により目的を達成する事が可能であると考えている。鉄原子の異常分散差を係数とした差

フーリエマップ上にシロヘム、4Fe-4Sクラスター、それにフェレドキシンの2Fe-2Sクラスターに含まれる鉄原子12個を確認している。現在、2.2Å分解能で分子モデルを構築中である。まだ分子モデルを構築中なので、現段階では正確な分子構造について考察することは出来ないが、シロヘム、4Fe-4Sクラスター、フェレドキシンの2Fe-2Sクラスターの3つの酸化還元中心間の距離は、それぞれ4.3,13.8Åである。
新規ガン抑制遺伝子産物RECKの生化学的解析

RECKは、活性化ras遺伝子で形質転換したマウス線維芽細胞に対して正常復帰誘導活性を有する遺伝子として、最近、単離同定されたガン抑制遺伝子である。悪性形質転換したガン細胞では、その発現が抑制されており、RECK cDNAを強制的に発現させると、軟寒天中でのコロニー形成や腫瘍転移活性が抑制される。分子内にKazalドメイン(セリンプロテアーゼインヒビター様領域)をもつ。本研究では、RECK遺伝子産物の性状を解析するため、抗体作製、分子量推定、細胞内局在性、構造モチーフの機能解析を行った。研究の結果の概要は以下の通りである。(1)RECK cDNAの一部を大腸菌で発現させ、組み換体タンパク質を調製し、精製後、マウスに免疫した。ELISA法によってハイブリドーマを選択し、モノクローナル抗体を取得した。(2)バキュロウイルス発現ベクターを用いた培養昆虫細胞でRECKを発現させ、取得したモノクローナル抗体を用いてウエスタンブロッティングを行うと、分子量は約10万と算出され、アミノ酸配列から推定される値によく一致した。糖鎖含量は少ないと思われる。(3)RECKはN末にシグナルペプチドをもち細胞膜外に輸送されるが、C末にも疎水性アミノ酸領域が存在し、膜上に存在する。C末の疎水領域を除去すると培養液中にも検出され、分泌された。また、この疎水性領域をヒスチジン6-merのタグと置換させ、アフィニティクロマトグラフィー法による分泌型RECKの精製方法を確立した。(4)Kazalドメインの反応部位(P1部位)に相当するアミノ酸残基はAspであり、caspase様酵素を阻害する可能性が考えられ、caspase-1に対する阻害効果およびgranzymeBとの相互作用を調べたが、いずれも結果は陰性であった。RECKは、最近、単離同定されたガン抑制遺伝子であり、ガン細胞の軟寒天中でのコロニー形成や、転移抑制作用をもつ。細胞外に分泌あるいは細胞膜上に存在すると思われる。本研究では,まず,RECKの生化学的性状を明らかにするために必要なモノクローナル抗体を作成することにした。抗原として、RECK遺伝子の一部を大腸菌で大量発現させて精製したタンパク質を用い、マウスに免役した。免疫感作マウス脾臓細胞とマウスミエローマ細胞との融合を行い、ハイブリドーマを樹立した。RECKモノクローナル抗体産生ハイブリドーマをELISA法およびウェスタンブロッティング法を用いてスクリーニングし、2つの陽性クローンが得られた。しかし、用いたRECK抗原は、不溶性の封入体を形成したものであるため、正しいフォールディングや、正しいS-S結合をもたず、得られた抗体が未変性のRECKタンパク質を認識するかどうかの判定に用いるのは適切ではなかった。そこで、バキュロウイルスベクターを用いた培養昆虫細胞でのRECK遺伝子の発現システムを構築した。発現したタンパク質の分子量は、得られたモノクローナル抗体によるウエスタンブロッティングによって約10万と推定され、アミノ酸配列から推定される値によく一致し、糖鎖含量は少ないと思われる。分泌産物は有意に免疫沈降させることができず、得られた抗体はSDSで変性したRECKを認識していると思われる。現在、未変性RECKタンパク質を認識する抗体を得るため、大腸菌内でもフォールディングが起こると思われる領域のみを発現させ、これを抗原として免役し、新たな抗体を得ることを計画している。RECKは、活性化ras遺伝子で形質転換したマウス線維芽細胞に対して正常復帰誘導活性をする遺伝子として、最近、単離同定されたガン抑制遺伝子である。

悪性形質転換したガン細胞では、その発現が抑制されており、RECK cDNAを強制的に発現させると、軟寒天中でのコロニー形成や腫瘍転移活性が抑制される。分子内にkazalドメイン(セリンプロテアーゼインヒビター様領域)をもつ。本研究では、RECK遺伝子物産の性状を解析するため、抗体作製、分子量推定、細胞内局在性、構造モチーフの機能解析を行った。研究結果の概要は以下の通りである。(1) RECK cDNAの一部を大腸菌で発現させ、組み換体タンパク質を調整し、精製後、マウスに免役した。ELISA法によってハイブリドーマを選択し、モノクローナル抗体を取得した。(2)バキュロウイルス発現ベクターを用いた培養昆虫細胞でRECKを発現させ、取得したモノクローナル抗体を用いてウエスタンブロッティングを行うと、分子量は約10万と算出され、アミノ酸配列から推定される値によく一致した。糖鎖含量は少ないと思われる。(3) RECKはN末にシグナルペプチドをもち細胞膜外に輸送されるが、C末にも疎水性アミノ酸領域が存在し、膜上に存在する。C末の疎水領域を除去すると培養液中にも検出され、分泌された。また、この疎水性領域をヒスチジン6-merのタグと置換させ、アフィニティクロマトグラフィー法による分泌型RECKの精製方法を確立した。(4) Kazalドメインの反応部位(P1部位)に相当するアミノ酸残基はAspであり、caspase様酵素を阻害する可能性が考えられ、caspase-1に対する阻害効果およびgranzymeBとの相互作用を調べたが、いずれも結果は陰性であった。
視覚系における色度チャンネルと輝度チャンネルの交互作用

1.ヒトの視覚系における色の情報を処理する色度チャンネルと,明るさの情報を処理する輝度チャンネルの交互作用を調べるために,下図のような刺激布置を用いて精神物理的な実験を行った.テスト刺激(図の黒部)の大きさは視角1°,その波長は450668mmまで7段階に変化し,その輝度は常に一定に保たれた.背景順応野(図の白部)の大きさは,テスト刺激と空間的に重なる布置(A)から同心円状の布置(D)まで変化し,その明るさは1cd/m^2の白色光であった.被検者にはテスト光の検出が要求され,検出されるまでの反応時間(RT)が測定された.多数の被検者を用いて実験を行ったが,その中の1名(HS)の結果を右図に示めす.グラフの縦軸はRT(単位msec),横軸は波長(単位mm)を表わす.(1)RTは布置Aの580mmで最大になり,背景光に水車型の形状を附加するにつれて(布置BよりD), RTは小さくなる.(2)このRT・波長曲線群は,布置Aで色度チャンネルが作用し,布置Dでは輝度チャンネルが作用していることを示唆する.(3)2チャンネルのベクトルモデルによるシミレーションも上述の結果を確認している.2.赤と緑の発光ダイオード(LED)を利用して,色刺激の時間的制御を可能ならしめるフリッカー発生装置を試作してみたが,十分に明るい輝度が得られなかった.光源と光学系に問題があるため,外口の研究(JOSA,1987)など参考にして,今後改良したい.3.現在使用中の3光路の光学装置を部分的に再構成することによって,より精密な実験の可能性が生まれた.1.ヒトの視覚系における色の情報を処理する色度チャンネルと,明るさの情報を処理する輝度チャンネルの交互作用を調べるために,下図のような刺激布置を用いて精神物理的な実験を行った.テスト刺激(図の黒部)の大きさは視角1°,その波長は450668mmまで7段階に変化し,その輝度は常に一定に保たれた.背景順応野(図の白部)の大きさは,テスト刺激と空間的に重なる布置(A)から同心円状の布置(D)まで変化し,その明るさは1cd/m^2の白色光であった.被検者にはテスト光の検出が要求され,検出されるまでの反応時間(RT)が測定された.多数の被検者を用いて実験を行ったが,その中の1名(HS)の結果を右図に示めす.グラフの縦軸はRT(単位msec),横軸は波長(単位mm)を表わす.(1)RTは布置Aの580mmで最大になり,背景光に水車型の形状を附加するにつれて(布置BよりD), RTは小さくなる.(2)このRT・波長曲線群は,布置Aで色度チャンネルが作用し,布置Dでは輝度チャンネルが作用していることを示唆する.(3)2チャンネルのベクトルモデルによるシミレーションも上述の結果を確認している.2.赤と緑の発光ダイオード(LED)を利用して,色刺激の時間的制御を可能ならしめるフリッカー発生装置を試作してみたが,十分に明るい輝度が得られなかった.光源と光学系に問題があるため,外口の研究(JOSA,1987)など参考にして,今後改良したい.3.現在使用中の3光路の光学装置を部分的に再構成することによって,より精密な実験の可能性が生まれた.
ナノチャンネルを有する有機無機複合材料の合成及びイオン交換特性

メソポーラスシリカ合成時にアミノ基を有するシランカップリング剤を添加することによって,細孔内をアミノ基で修飾したメソポーラスシリカを合成し,その構造及びイオン交換能を検討した。シリカ骨格の大きさは固定化アミノ基量に依存せず,約40Åで一定であった。一方,細孔径はアミノ基量の増加に伴い大きく減少し,アミノ基量が15mol%(仕込み量)の時,21Åとなった。特に興味深いのは細孔容積の変化であり,アミノ基を導入しない場合,900mm3/gであったが,15mo1%のアミノ基を導入すると300mm3/gまで減少した。この減少量は導入したアミノ基の体積のみを考慮しても説明できず,アミノ基が細孔内に固定化されることによって生じる死空間の存在を考慮しなければならないことが明らかとなった。この複合体中のアミノ基は酸性溶液中で4級アンモニウムとして存在しているため,陰イオン交換体として作用する。その陰イオン交換能を検討するため酸塩基滴定を行った結果,(1)イオン交換容量は細孔内に固定化したアミノ基量の増加に伴い増加し,約1.5mmol/gまで増加したこと,及び(2)陰イオン交換能を示すpH領域は固定化アミノ基量に依存しないことが明らかとなった。次にメチルオレンジのイオン交換実験を行った。メチルオレンジ吸着量は溶液のpHによって大きく変化することがわかった。酸性溶液中では仕込んだメチルオレンジの90%以上が吸着した。溶液のpHを上昇させるとpH5付近からイオン交換量は減少し始め,中性領域(pH8付近)では全く吸着しないことが明らかとなった。この溶液pHに対するイオン交換量の変化は滴定曲線にほぼ一致したことから,4級アンモニウムの対イオン(本研究ではCl^-)とのイオン交換が進行していることが明らかとなった本年度は種々のサイズのナノチャンネルを有するメソポーラスシリカを合成するために以下の3点について検討した。1.鋳型となる界面活性剤の合成。分子鎖中にエステル結合及び分子末端にアルコキシシリル基を有する新規界面活性剤を合成した。分子長を変えるために、オクタノール(C8)からオクタデカノール(C18)までのアルコールを使用した。その結果、C8C16については目的とした界面活性剤が合成できた。しかし、C18については界面活性を持たない生成物しか合成できなかった。2.ゾルーゲル法による有機無機複合体の合成。C8C16の界面活性剤を鋳型として用いて、有機無機シリカハイブリッドをゾルーゲル法により合成した。生成物のIRスペクトルから界面活性剤はシリカ骨格内に取り込まれていることが分かった。また、XRD構造解析の結果から、全ての生成物が六方晶系に帰属され、それらの(100)面間隔はC8の場合の約29ÅからC16の場合の約45Åまで合成に使用したアルコール炭素数の増加に伴い大きくなることが分かった。合成した界面活性剤の構造を分子軌道法により求めると、「く」の字型に折れ曲がった構造をとることが分かった。この構造から推算される(100)面間隔はXRDから求めた面間隔とほぼ一致した。3.加水分解によるナノチャンネルの生成。THF中で有機無機複合体中に存在しているエステル結合の塩酸による加水分解を試みた。反応は室温から80°Cまでの所定温度で8時間行った。80°Cで反応を行うとシリカ骨格が壊れることがXRDパターンから分かった。しかし、それよりも低温での反応による生成物については、窒素表面積測定からナノチャンネルを有しないことが分かった。従って、反応条件の見直しが必要である。本年度は昨年度に引き続き種々のサイズのナノチャンネルを有するメソポーラスシリカを合成することを目的とした。しかしながら、当初考えていた合成法では有機無機複合体が生成しなかったため、アミノプロピルトリエトキシシラン(APTES)をシリカ源であるオルトケイ酸テトラエチル(TEOS)と同時に混合することによりアミノプロピル基含有メソポーラスシリカを得た。合成時に添加するAPTES量や界面活性剤の炭素鎖長を変えることによって以下の知見を得た。1.APTES添加量の影響。界面活性剤として炭素鎖長16の臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウムを用いAPTESをTEOSに対して5から15mo1%加えて有機無機複合体を合成した。XRD測定の結果から全ての試料が六方晶系に帰属され、それらの(100)面間隔はAPTES添加量の増加に伴い増加することが分かった。IR測定及び元素分析の結果からAPTES添加量の増加に伴いメソポーラスシリカ内のアミノ基量が増加することが分かった。細孔分布測定の結果から、添加したAPTES量の増加に伴い、細孔径は2.7nmから2.1nmへと減少することが分かった。2.界面活性剤の鎖長の影響。C10C16の界面活性剤を鋳型として用い、アミノプロピル基含有メソポーラスシリカを合成した。XRD測定の結果から、C10の場合はかなり結晶性は低かったが、それ以外の試料についてはいずれも六方晶系に帰属され、それらの(100)面間隔は約30Aから約42Aまで炭素数の増加に伴い大きくなることが分かった。細孔分布測定の結果、界面活性剤の炭素数の増加に伴い、細孔径が増加することが分かった。以上の結果、添加APTES量及び界面活性剤の炭素数を変化させることで、メソポーラスシリカの細孔径を制御できることが分かった。

メソポーラスシリカ合成時にアミノ基を有するシランカップリング剤を添加することによって,細孔内をアミノ基で修飾したメソポーラスシリカを合成し,その構造及びイオン交換能を検討した。シリカ骨格の大きさは固定化アミノ基量に依存せず,約40Åで一定であった。一方,細孔径はアミノ基量の増加に伴い大きく減少し,アミノ基量が15mol%(仕込み量)の時,21Åとなった。特に興味深いのは細孔容積の変化であり,アミノ基を導入しない場合,900mm3/gであったが,15mo1%のアミノ基を導入すると300mm3/gまで減少した。この減少量は導入したアミノ基の体積のみを考慮しても説明できず,アミノ基が細孔内に固定化されることによって生じる死空間の存在を考慮しなければならないことが明らかとなった。この複合体中のアミノ基は酸性溶液中で4級アンモニウムとして存在しているため,陰イオン交換体として作用する。その陰イオン交換能を検討するため酸塩基滴定を行った結果,(1)イオン交換容量は細孔内に固定化したアミノ基量の増加に伴い増加し,約1.5mmol/gまで増加したこと,及び(2)陰イオン交換能を示すpH領域は固定化アミノ基量に依存しないことが明らかとなった。次にメチルオレンジのイオン交換実験を行った。メチルオレンジ吸着量は溶液のpHによって大きく変化することがわかった。酸性溶液中では仕込んだメチルオレンジの90%以上が吸着した。溶液のpHを上昇させるとpH5付近からイオン交換量は減少し始め,中性領域(pH8付近)では全く吸着しないことが明らかとなった。この溶液pHに対するイオン交換量の変化は滴定曲線にほぼ一致したことから,4級アンモニウムの対イオン(本研究ではCl^-)とのイオン交換が進行していることが明らかとなった
エストニア・ラトヴィアにおけるロシア系住民の歴史と現状に関する総合的研究

本研究では、エストニア・ラトヴィアにおけるロシア語話者住民処遇問題(国籍、言語、就労、教育、アイデンティティ等)を眼前で動きつづけるリアルタイムなものとして追跡・考察するとともに、それをたんに現下の国内的な政策問題としてだけではなくて、地域に固有の歴史的文脈に配慮し、さらに国際関係的な視点をもまじえて、包括的総合的な観点から調査・分析し、以下のような成果を得た。(1)エストニア・ラトヴィア両国で毎年実施したフィールドワーク(インタヴュー、外国人共同研究者による社会調査)などにより、両国のロシア語話者住民をめぐる政策転換(「統合」政策への移行)が進むとともに、ロシア語話者内部の階層分化などの社会変容が促進され、かつての「民族問題」的次元ではなく、より社会問題的な次元への転換が進んでいることが確認された。(2)他方で、ラトヴィアの教育改革問題に典型的に見られるように、軽微とはいえ紛争化しかねない問題がなお存続していることも確認された。(3)欧州連合(EU)、欧州審議会(COE)、全欧安全保障協力機構(OSCE)等の国際機関への調査を介して、問題の性格転換においてEUのみならずその他の欧州国際機関の果たした役割を明らかにするとともに、2004年にEU加盟の果たされた後は、EUが当該問題に関与する可能性がむしろ少ないことを明らかにした。(4)両国に居住するロシア語話者住民の文化史について相当の蓄積を得た。(5)研究期間を通じて、エストニアで数度に及ぶ研究会を開催したのに加えて、最終年度には日本国内で他機関の協力もえてエストニア・ラトヴィア等から8名の研究者を招聘し、国際シンポジウム等を開催した。(6)毎年の調査結果について中間報告書を3冊刊行するとともに、国際シンポジウムの報告内容については欧文プロシーディングを刊行して、当該問題についての国際的な議論の場に素材として供した。・6月に日本側研究分担者に研究協力者小森宏美(早稲田大学非常勤講師)を加えて第一回の研究会を開催し当該テーマに関する諸外国での研究動向の整理、今年度調査計画などの検討を行った。・9月初旬から研究分担者および研究協力者小森宏美がエストニア、ラトヴィアおよびノルウェーを訪問して、関連資料調査・収集を行った。・9月13・14日の両日、エストニア共和国タルト大学において海外共同研究者および一般参加者を加えたカンファレンスを行い、日本側からは研究代表者が本共同研究の目的と実施計画について提案した。また、イサコーフ教授、ヴィハレンム助教授がそれぞれ「エストニアにおけるロシア人コミュニティの歴史とその諸段階」、「エストニアにおけるロシア系住民の集合的アイデンティティ形成」と題した研究報告を行った後、参加者による討論を行った。・エストニア、ラトヴィア両国政府機関(エストニア共和国民族問題担当相事務所、ラトヴィア共和国大統領府民族問題担当補佐官その他)、両国駐在国際機関(OSCEミッションその他)、両国の大学および研究機関、人権問題関係NGO(エストニア人権法律情報センター、ラトヴィア人権・民族研究センターなど)において両国のロシア系住民問題の現状および関係諸機関の活動状況について20件以上の聞き取り調査を行った。・11月に日本側の研究会を開催し、9月調査時の聞き取り調査の内容確認を行った・これらをふまえて研究代表者の橋本が別記論文を執筆するとともに、研究分担者の溝端も別記の関連論文等を執筆した。さらに、聞き取り調査の結果とイサコーフ教授の研究報告とを京都大学経済研究所からディスカッション・ペーパーとして刊行準備中である。(1)前年度における研究成果を「中間報告書」として取りまとめ、京都大学経済研究所ディスカツションペーパー・シリーズとして刊行した。(2)欧米およびロシアにおける「ロシア・デイアスポラ」問題に関する研究動向の検討を行った。(3)EUその他

国際機関、欧州の研究機関およびエストニアの政党・研究機関・学校等を訪問して、資料調査・聞き取り調査を行った。主要調査対象は以下の通り。ヤーン・トニッソン研究所、政党「祖国」、同「穏健党」、同「中央党」IT関連企業Elcote、アンネリン・ギムナジウム、タルト大学社会学部、同外交政策研究所、ユーロ大学国際関係学部、エストニア経済省、未来研究所所長、欧州・社会問題研究所、ストツクホルム商科大学移行経済・東欧経済研究所、ストツクホルム大学バルト研究センター、ストックホルム国際問題研究所、スウェーデン防衛研究庁他(4)エストニア国立文書館において外国人共同研究者を含めたカンファレンスを行った。報告題目は以下の通り。タチャーナ・ショール「エストニアのロシア人社会1802-1940」、ボリス・ラヴディン「ラトヴィアのロシア系住民の現状」、溝端佐登史「エストニア・ラトヴィアにおけるロシア系住民問題の経済的側面」(5)エストニア・ラトヴィアにおける教育改革動向に関する動向およびバイリンガル教育導入について現地調査および文献研究を行った。(6)エストニア議会(リーギコグ)総選挙(2003年3月)における争点やロシア系政党の消長、選挙結果等について現地調査を行った。(7)以上の研究成果について、次年度5-6月頃をめどに「中間報告書II」として刊行することとし、そのための編集作業等を行った。(1)前年度における研究成果を「中間報告書]として取りまとめ、京都大学経済研究所ディスカッションペーパー・シリーズとして刊行した。(2)ラトヴィアにおける社会統合政策の策定及び実施過程について、現在日本留学中のアグネセ・コルネーエヴァ氏(元ラトヴィア共和国司法省、外務省職員)を招聰して、研究会を開催した。(3)エストニア、ラトヴィアでEU加盟に関する国民投票の行われた9月から10月にかけて現地調査を実施し、国民投票の実施状況視察とその分析を行った。この成果は、『中間報告書III』(平成16年5月頃に京都大学経済研究所よりディスカッション・ペーパーとして刊行予定)に掲載予定である。(4)エストニア、ラトヴィア両国における言語政策担当者に対する聞き取り調査を実施するとともに、これらの担当者から寄せられた原稿を『中間報告書III』に掲載することとした。(5)今年度は特にラトヴィアの状況把握に重点を置き、2004年度からロシア語話者を対象とした中等教育で実施予定のラトヴィア語を主としたバイリンガル教育への移行をめぐる状況とその問題点についての調査を実施した。その際に、リーガとダウガウピルスの学校調査を行い、授業参観とあわせて生徒との対話により意識状況把握に務めた。(6)地方都市の状況把握のためロシア語話者人口の多いベンツピルス、ダウガウピルスでの聞き取り調査を実施した。(7)外国人共同研究者であるトリーン・ヴィハレンム氏はロシア語話者住民のアイデンティティに関する社会学的調査研究を引き続き実施しており、その成果を『中間報告書III』に掲載することとした。(8)エストニア、ラトヴィアのロシア語
有限資源を用いた連続変数の量子鍵配布

今年度は、昨年度までの研究によって得られた量子メモリー効果を考慮した不確定性関係を応用することによって、サイズ効果・量子メモリー効果が存在するより厳しい状況においても安全な連続変数の量子鍵配布を保証する量子鍵の生成レートを求めるための研究を行った。特に現在のテクノロジーにおいて15km以上の距離における安全な量子鍵配布を保証する、という現実的な設定の解析を行った。統計的解析の改善と、実験設定に対応するエネルギーのカットオフ定理の適応による量子測定の出力の値域制限によって、より精密な安全性証明が可能となった。その結果、現実的な状況下において26km程度の距離までの安全な量子鍵配布を保証する、より高い量子鍵の生成レートを得ることができた。さらに、非二値のLDPC符号という量子誤り訂正符号を量子鍵配布プロトコルに用いることで得られる最適化の解を求め、安全な量子鍵配布が保証される距離をより伸張させることができることを示した。この結果は、非二値のLDPC符号を量子鍵配布プロトコルに用いた世界初の結果であると考える。これらの理論的解析の結果に基づいて、対応する連続変数系を用いた量子鍵配布実験がハノーヴァー大学において進行中であり、この実験の理論部分を担当している。量子暗号(連続変数の量子鍵配布)に関する研究に加えて、まったく新しいテーマとして、トポロジカルな量子系として最近注目を集めているエニオン系のエンタングルメントの情報理論的な解析について研究を進めた。特に、操作論・情報論的な観点からエニオン系におけるエンタングルメント測度の定式化を行い、エンタングルメント希釈とエンタングルメント抽出に関して操作論的に意味のあるエンタングルメント測度を定義し、トポロジカル相の研究において提案されていたトポロジカルエンタングルメントテントロピーとの関連を示した。26年度が最終年度であるため、記入しない。量子暗号は、量子力学に基づいて安全な通信を保証する、新しい暗号処理の方法である。現在広く用いられている古典的な公開鍵暗号の安全性は、特定の計算問題の複雑性に基づくものであるが、量子暗号では、鍵の情報を量子状態に符号化することで、計算問題の複雑性に頼ることなく物理学の原理から任意の盗聴からの安全性を保証することができる。量子系の高速かつ信頼できる通信手段として、電磁波の強度の自由度を用いる方法がある。しかし、電磁波の強度は連続変数であり無限の自由度を持つため、この系での安全性を厳密に証明するのは困難であった。近年、拡張された不確定性原理に基づいた新しい証明手法により、電磁波強度を通信手段として用いた場合の一般的な盗聴に対する安全性に関して、初めて定量的な解析が成された。しかしながら、暗号鍵生成の効率や、安全性をどこまで保証できるかといった問題は未だ残されたままである。我々は、拡張された不確定性原理を、連続変数の場合に対してより詳細に調べることでこの問題の解決に取り組んだ。この拡張された不確定性原理は、被測定系と量子もつれにある観測者が、2つの相補的な観測量を測定する際の統計的なゆらぎを評価する関係式を与える。我々は、ロスのない場合の適切な状況下では、この不確定性関係が等号達成可能であることを理論的に示した。また、ロスのある場合の効率についても数値計算により解析を行った。我々は更に、このような量子暗号処理を実装する実験を想定し、ある制限されたクラスの盗聴に対する安全性の解析を行った。将来的にはこの解析を更に進め、一般的な盗聴に対して安全な暗号処理を実験で実装する方法の考案を目指す。ハイゼンベルクの不確定性原理は、量子状態の準備や測定の際には2つの相補的な観測量に必ず揺らぎが生じる事を表している。近年、観測者が被測定系と量子相関を持っている場合に対しても、量子状態の準備に関する不確定性原理が拡張された。この不確定性原理は、量子暗号における量子鍵配送での任意の盗聴に対する安全性証明に用いることができ、特に電磁波の強度を用いた連続変数の量子系を用いた量子暗号の解析に有効である。今年度の研究では、量子相関がある場合の連続変数の不確定性関係を、更に一般的な数学を用いて拡張することに成功した。得られた不確定性関係は、場の量子論に対しても適用することが可能であり、量子暗号や量子情報のみならず、より広い分野への発展可能性を持つため重要である。さらに、より一般的な盗聴に対して安全性を保証する、拡張された不確定性原理に基づく連続変数の量子暗号を実験で実装するための研究も進め、強い相関を持つ非二値の暗号鍵を効率よく生成するための、実験の状況に合った情報整合の方法を考案した。この情報整合は、相関を利用して発生したエラーを訂正する第1段階と、非二値の符号処理からなる第2段階で構成されている。さらに、量子系の測定に関するトレード・オフを記述する不確定性原理についても研究を進めた。量子状態の準備に関する不確定性関係はこれまでにも多くの研究がなされてきたが、エントロピーを用いた操作論的な観点からの測定に関する不確定性関係は未解明であった。我々は、測定に関する誤差と擾乱のエントロピーを用いた不確定性関係を明らかにし、量子ビットの系で等号達成可能であることを示した。この関係式は、位置の測定の精度と運動量の擾乱の強固な特徴付けを可能とするという点で大きな意義をもつ結果である。

今年度は、昨年度までの研究によって得られた量子メモリー効果を考慮した不確定性関係を応用することによって、サイズ効果・量子メモリー効果が存在するより厳しい状況においても安全な連続変数の量子鍵配布を保証する量子鍵の生成レートを求めるための研究を行った。特に現在のテクノロジーにおいて15km以上の距離における安全な量子鍵配布を保証する、という現実的な設定の解析を行った。統計的解析の改善と、実験設定に対応するエネルギーのカットオフ定理の適応による量子測定の出力の値域制限によって、より精密な安全性証明が可能となった。その結果、現実的な状況下において26km程度の距離までの安全な量子鍵配布を保証する、より高い量子鍵の生成レートを得ることができた。さらに、非二値のLDPC符号という量子誤り訂正符号を量子鍵配布プロトコルに用いることで得られる最適化の解を求め、安全な量子鍵配布が保証される距離をより伸張させることができることを示した。この結果は、非二値のLDPC符号を量子鍵配布プロトコルに用いた世界初の結果であると考える。これらの理論的解析の結果に基づいて、対応する連続変数系を用いた量子鍵配布実験がハノーヴァー大学において進行中であり、この実験の理論部分を担当している。量子暗号(連続変数の量子鍵配布)に関する研究に加えて、まったく新しいテーマとして、トポロジカルな量子系として最近注目を集めているエニオン系のエンタングルメントの情報理論的な解析について研究を進めた。特に、操作論・情報論的な観点からエニオン系におけるエンタングルメント測度の定式化を行い、エンタングルメント希釈とエンタングルメント抽出に関して操作論的に意味のあるエンタングルメント測度を定義し、トポロジカル相の研究において提案されていたトポロジカルエンタングルメントテントロピーとの関連を示した。26年度が最終年度であるため、記入しない。当初計画した通り、連続変数の量子暗号処理の効率に関する問題を明らかにすることができた。ロスのない場合に関して効率の上限が達成可能な条件を明らかにしただけではなく、更にロスのある場合に対しても、数値計算による複数の解析を行つた。この結果は計画を上回る成果と言える。当初の計画通りに、量子状態準備に関する拡張された不確定性関係を更に一般の量子系に対して拡張することに成功した。また、実験による連続変数の量子暗号の実装に向けて、理論的に十分効率のよい情報整合の方法を考案した。この理論を元にした実験は既に開始しており、2014年4月末に終了する予定である。さらに、測定に関するエントロピーを用いた操作論的意味を持つ明確な不確定性関係を示し、異なる測定の誤差に対してもより良い理解を与えるという、非常に重要な結果を得た。我々の研究により連続変数の暗号処埋の効率が十分高いことが明らかになったため、今後は実験で実際にこの量子暗号処理を実際に実装することが目標となる。そのためには、実験に合うように調整された情報整合方法の導出が必要となる。不確定性関係はその概念自体も興味深く、連続変数を用いた量子情報への更なる応用も考えられる。そこで今後は、この解析を更に進めることによって、一般的な盗聴に対して安全な暗号処理を実験で実装する方法の考案を目指す。我々が得た測定に関する不確定性関係の状況設定は、逆方向の情報整合による量子鍵配送の状況と合致している。
エピジェネティクス制御される神経幹細胞の動態解析

神経幹細胞の性質変化を司るエピジェネティクス解明を目的として、Gcm1/2およびRnf20遺伝子の機能を解析した。Gcm1/2発現によって神経前駆細胞がGFAP強陽性になること、それにはGFAP遺伝子のプロモーターDNAのメチル化率の減少が重要であることが分かった。一方、ヒストンH2BのE3ユビキチンリガーゼであるRnf20のノックダウンによって、神経幹細胞の未分化性が亢進するとともに細胞周期が延長し、分化のタイミングが遅れることが判明した。ChIP-seq法による網羅的エピゲノム解析により、Rnf20が発現修飾して神経幹細胞の未分化性維持や細胞周期の制御に関わる遺伝子群を明らかにした。神経幹細胞は、発生期の脳においてまず指数関数的に増殖し、次いで大量の神経細胞を産生する。その後、胎生後期から生後にかけて、オリゴデンドロサイトやアストロサイトといったグリア細胞を順次産み出すことが知られる。また、成体脳においても脳室下層や海馬歯状回において神経幹細胞は維持されるが、その分子メカニズムには不明な点が多かった。本研究は、神経幹細胞の性質変化を司っているエピジェネティクスを解明するものである。これまでに、Glial cells missing(Gcm)遺伝子は神経幹細胞の発生期にHes5遺伝子プロモーターをDNA脱メチル化することを報告したが、その後の発生や成体脳における機能の解析は進んでいない。平成24年度は、胎仔脳にin utero electroporation法によってGcm7/2を強制発現させ、神経前駆細胞がGFAP強陽性になることを確認した。GFAP遺伝子のプロモーター領域にはleukemiainhibitoryfactor(LIF)シグナルを受け取るSTAT3結合領域があり、結合領域内とその周囲に存在するCpGがメチル化を受けることが知られている。そこで、in utero electroporation法によってGcm7/2を強制発現(同時にGFP発現ベクターも共発現させる)させた細胞をFACSによって回収し、GFAP遺伝子プロモーター領域のメチル化率を計測した。同様に、アストロサイト系譜細胞に特異的に発現するS100βやGLASTなどの遺伝子や、オリゴデンドロサイト系譜細胞に特異的に発現するPDGFRα,CNPaseなどの遺伝子についても、その発現調節にDNAメチル化/脱メチル化が関与しているかどうか検討を開始した。一方、ヒストンH2BのE3ユビキチンリガーゼであるRing finger protein 20(Rnf20)については、in utero electroporation法によってRnf20やそのドミナントネガティブ体を強制発現させ、機能喪失や過剰発現の表現型を解析した。その結果、Rnf20のノックダウンによって神経前駆細胞の分化や細胞移動が抑制されることが判明した。また、ノックアウトマウスや神経細胞にRnf20を発現するトランスジェニックマウスの作製を開始した。一方、ヒストンH2BのE3ユビキチンリガーゼであるRing finger protein 20 (Rnf20)については、平成25年度までにノックアウトマウスや神経前駆細胞特異的にRnf20を発現するトランスジェニックマウスの作製を終了し、現在表現型の解析を進めている。神経幹細胞は、発生期の脳において増殖や分化の性質を変化させることが知られるが、本研究は、神経幹細胞の性質変化を司っているエピジェネティクスを解明するものである。平成25年度までに、胎仔脳にGcm1/2遺伝子を強制発現させると神経前駆細胞がGFAP強陽性になることを見出したことから、GFAP遺伝子発現に関与するエピゲノム修飾の解析を進めた。GFAP遺伝子のプロモーター領域にはLIFシグナルを受け取るSTAT3結合領域があり、結合領域内とその周囲に存在するCpGがメチル化を受けることが知られる。そこで、子宮内電気穿孔法によってGcm1/2を強制発現させ、GFAP遺伝子プロモーター領域のメチル化率を計測したところ、Gcm1の強制発現ではメチル化率は変化なく、Gcm2の強制発現ではメチル化率が減少することが分かった。これらの結果から、Gcm1とGcm2が必ずしも同じ働きを共有するのではなく、別々の役割をもって協調的にGFAP遺伝子の発現を制御していると考えられた。一方、ヒストンH2BのE3ユビキチンリガーゼであるRnf20については、平成25年度までにノックアウトマウスの作製を終了し、さらにRnf20 KO ES細胞を樹立できたことから、平成26年度にはこれらノックアウト胚やES細胞の表現型の解析を行った。

Rnf20 KOマウスは、胎生5.5日以降には観察されず、胎生早期致死(胎生3.5日5.5日)であることが分かった。ノックアウトマウスでは神経発生を解析することは困難であったため、Rnf20 KO ES細胞を用いて神経(幹)細胞の誘導実験を行った。Rnf20 KO ES細胞は、野生型やRnf20ヘテロES細胞と比べて細胞増殖が極めて悪く、また、神経幹細胞への誘導効率も非常に低かった。マイクロアレイ解析では、胎生初期に重要な働きをしている遺伝子群に発現異常が認められ、Rnf20がこれらの遺伝子発現に重要な働きを果たしていること、胚発生に必須の遺伝子であることが示唆された。26年度が最終年度であるため、記入しない。神経科学、幹細胞生物学26年度が最終年度であるため、記入しない。既にノックアウトマウスが存在するGcm遺伝子の解析は予定通り進んでいる。Rnf20遺伝子のノックアウトやトランスジェニックマウスなどの遺伝子改変動物の作製は現在進行中である。従って、本研究はおおむね順調に進展していると考えている。Gcm1, Gcm2ノックアウトマウスを用いた、Gcm1/2遺伝子によるDNA脱メチル化の解析は予定通り進んでいる。Rnf20遺伝子についても、ノックアウトマウスや神経前駆細胞特異的にRnf20を発現するトランスジェニックマウスの作製を終了しており、本研究はおおむね順調に進展している。Gcm遺伝子がGFAP遺伝子などのグリア細胞特異的遺伝子群の発現制御をしている分子メカニズムについて、グリア細胞特異的遺伝子群の発現誘導とプロモーター領域のDNAメチル化などを中心に、Gcm2遺伝子ノックアウトマウスを用いて解析する。また、Rnf20ノックアウトマウスや神経細胞特異的Rnf20発現トランスジェニックマウスの表現型およびヒストン修飾の網羅的解析を行う。Gcm遺伝子の過剰発現やノックアウトによって、ゲノム上のどのような部位が脱メチル化を受けるか(あるいは阻害されるか)、次世代シーケンサーを用いて、reduced representation bisulfite sequencing法による網羅的DNAメチル化サイトの解析を予定している。Rnf20遺伝子については、ノックアウトマウスや神経前駆細胞特異的にRnf20を発現するトランスジェニックマウスの解析を行う。
パルス状GnRH分泌を制御する弓状核キスペプチンニューロン神経活動制御機構の解明

弓状核キスペプチンニューロン神経系は、GnRH/LHのパルス状分泌を制御すると考えられ、このニューロン群の同期発火がパルス状分泌のトリガーであると推察されるが、その同期発火機構は不明である。本研究では、形態学的および電気生理学的手法を用いて研究を行い、1)弓状核キスペプチンニューロン群が互いに神経線維によるネットワークを形成していること、また、2)左右両側に存在する弓状核キスペプチンニューロン群の活動が同期して起こっていることを明らかにした。これらの結果から、弓状核キスペプチンニューロンは、互いに神経ネットワークを形成しており、このネットワークを用いて多数のニューロンの神経活動が同期している可能性が考えられた。弓状核キスペプチンニューロン神経系は、GnRH/LHのパルス状分泌制御の中枢と考えられており、このニューロン群の周期的同期発火がパルス状GnRH/LH分泌を引き起こすと考えられるが、その機構は不明である。本研究課題では、このパルス状GnRH/LH分泌を発生させるための神経活動制御機構を解明することを目的とした。本研究において、弓状核キスペプチンニューロンがNeurokinin B (NKB)およびDynorphin (Dyn)陽性線維によって神経ネットワークを形成することを示す研究結果が得られた。また、ほぼ全ての弓状核キスペプチンニューロンがNKB受容体(NK3R)を共発現することを示した。これらの結果と、これまでのシバヤギ弓状核神経活動記録手法を用いた解析結果から、弓状核キスペプチンニューロンは神経ネットワークを形成し、そのネットワーク内でNKBが作用して互いのキスペプチンニューロンが同期発火すると想定された。本年度は、この神経ネットワークを更に詳細に解析するため、左右両側に存在する弓状核の片側に順行性トレーサーを局所投与し、弓状核キスペプチンニューロンの神経投射を解析した。また、左右両側の弓状核より神経活動を同時に記録する手法を確立し、両側における神経活動を解析した。この結果、弓状核キスペプチンニューロン由来の神経線維は、同側だけでなく反対側に存在するキスペプチンニューロンの細胞体にその投射を持つことが示された。また、左右両側のキスペプチンニューロン近傍から記録される神経活動は、同期して起こることが示された。これらの結果から、弓状核キスペプチンニューロン群は互いに神経ネットワークを持っており、パルス状GnRH/LH分泌を起こすためにNKB/NK3Rシグナリングを介して同期した神経活動を行っていると考えられた。弓状核キスペプチンニューロン神経系は、性腺刺激ホルモン放出ホルモン(GnRH)/黄体形成ホルモン(LH)のパルス状分泌を制御すると考えられており、このニューロン群の周期的な同期発火が、パルス状GnRH/LH分泌を引き起こす根源であることが示唆されているが、その制御機構は不明である。本年度は、1)多数の弓状核キスペプチンニューロン間に、同期発火を可能とする神経回路が存在し、2)弓状核キスペプチンニューロンに共発現しているNeurokinin B (NKB)およびDynorphin (Dyn)によってこの同期発火活動が制御されている、という仮説を検証するための研究を行った。弓状核における神経回路の形態学的解析を行った。弓状核キスペプチンニューロンは密集して存在しており、各細胞間に多数のキスペプチン陽性線維が存在することが明らかとなっている。そこで、ヤギ弓状核組織切片を用いて、キスペプチンニューロン細胞体をin situ hybridization(ISH)で検出し、NKBおよびDynを、免疫組織化学染法で同時に検出した。その結果、NKBあるいはDyn陽性線維がキスペプチンニューロン細胞体周囲を密に取り囲む像が観察された。従って、NKBおよびDynは、キスペプチンニューロン間の相互連絡に重要な役割を持つと考えられる。更に、NKBの受容体であるNK3Rとキスペプチンの二重ISH法を確立し、その発現パターンを解析した結果、大多数の弓状核キスペプチンニューロンがNK3Rを共発現することが明らかとなった(90.4%)。これまでのシバヤギ弓状核神経活動記録手法を用いた解析結果と考え合わせると、NKBは、キスペプチンニューロン間の神経ネットワーク内でシグナル伝達因子として作用し、互いの弓状核キスペプチンニューロンを同期発火させると考えられた。平成23年度の研究計画では、弓状核のスライスを用いて単一のニューロン細胞体にトレーサーを注入し、その樹状突起及び軸索走行パターン等の形態を解析する予定であったが、単一のニューロンへのトレーサー注入法の確立が遅れたため、当初の研究計画通りの成果が得られていない。

同様に、スライスを用いたカルシウムイメージング法の確立については、カルシウムインジケーターのスライス切片への効果的な充填法に問題が生じており、カルシウム濃度を指標とした神経活動の解析法の確立が困難な状況となっている。一方、弓状核キスペプチンニューロン同期発火機構の形態学的解析については、当初の計画以上の成果が得られた。特に、次年度に実施を計画していたNK3Rの弓状核内における発現パターンの解析や、これまで手技的に困難であったキスペプチンとNK3Rの共染色法の確立が既に完了している。これらの点を踏まえて、研究計画全体としての達成度はやや遅れていると自己評価した。弓状核スライスを用いたカルシウムイメージング法の確立および、単一キスペプチンニューロンへのトレーサー注入法の確立を引き続き行う。また、トレーサー注入法による単一ニューロンの可視化と平行して、共焦点レーザー顕微鏡を用いた弓状核キスペプチンニューンの線維の走行パターンの解析を行うことで、キスペプチンニューロン間の神経回路の形態学的特徴を明らかにする計画である。また、弓状核キスペプチンニューロンにおけるNK3RおよびKappa opioid receptorの発現解析を行うことで、NKBおよびDynの弓状核キスペプチンニューロン内の役割を形態学的に解析する。平成23年度は、カルシウムイメージングおよび単一細胞へのトレーサー注入実験が、計画通りに遂行できなかったため、計画していたこれらの実験に必要となる消耗品購入費を使用しなかった。今年度は、弓状核スライスを用いたカルシウムイメージング法の確立のために、カルシウムインジケーター等の試薬、また単一ニューロン可視化のためのトレーサー等の試薬を購入する。また、神経回路の形態学的解析を行うために、ISHプローブ作製用試薬、ISH法に用いる試薬類、抗体、およびシグナル可視化の為のチラミドシグナル増感キット等を主に購入する予定である。
歯周組織再生のためのタンパク質性足場材料の設計

間葉系幹細胞と生体分解性足場材料を用いた歯周組織の再生治療法において、骨の増成速度を向上させることが課題である。そこで、足場材料に組み込む最適な増殖因子を探索した。その結果、足場材料にBMP-2を単独で担持するのが有効であることがわかった。さらに、増殖因子をポリ乳酸系足場材料と複合化することを想定し、足場材料に親和性のあるペプチドを探索した。その結果、特定の配列をもつペプチドが足場材料に親和性を示すことがわかり、足場材料へ増殖因子を担持するためのアダプター分子として効果的であることが示された。歯周組織の再生治療法として、間葉系幹細胞(MSC)を組み合わせた組織工学的手法が注目されている。しかしながら、現在、その治療技術は決して満足できるレベルではない。とくに、MSCを用いる歯周組織再生では骨の増成速度を向上させることが最も重要との認識の下、足場材料に組み込む最適な増殖因子の探索を中心に研究を進めた。そこで本年度は、各種のタンパク質性因子、およびそれらの組み合わせについてそれらの骨芽細胞誘導促進効果を調べた。分析にはヒト由来不死化MSCを用い、種々の増殖因子を添加した分化培地中、2週間培養した。その後、骨分化に伴うカルシウムの沈着を調べるためアリザリンレッド染色を行うとともに、骨分化マーカーであるアルカリフォスファターゼ、オステオポンチン、オステオカルシンのmRNAの発現をリアルタイムRT-PCR法により分析した。その結果、増殖因子としてBMP-2あるいはBMP-2とNT-4を添加した場合にカルシウムの沈着がとくに亢進することがわかった。一方、ALP、OPN、OCNのmRNAの発現は、BMP-2/NT-4を混合した場合より、BMP-2単独で加えたほうが多かった。以上の結果から、機能性スキャホールド開発においては、簡便性の点も考慮して、骨分化を促進したい部位へBMP-2を単独で担持するのが適当であると考えた。さらに、上記のスクリーニングによって選択された増殖因子をポリ乳酸系足場材料と複合化することを想定し、足場材料に親和性のあるペプチドを探索した。その結果、ある種の配列をもつペプチドが、ポリ乳酸系足場材料に親和性を示すことがわかり、そのような足場材料へ増殖因子を担持するためのアダプター分子として融合する方向が効果的であることが示された。本研究では、タンパク質工学の技術を利用して、MSCを用いた歯周組織の再生のための足場材料の設計を目的とする。とくに、MSCを用いる歯周組織再生では骨の増成速度を向上させることが最も重要との認識の下、最適な増殖因子を組み込んだ足場材料を開発する。本年度は、MSCによる骨形成を促進する最適な増殖因子カクテルを見出すことを第一の目的として、タンパク質アレイ分析を用いたバイオアッセイに取り組んだ。タンパク質アレイの作製には、各種の増殖因子(bFGF、IGF-1、PDGF、EGF)、ケモカイン(CCL12)神経栄養因子(BDNF、NGF、CNTF、GDNF)を単独あるいはコンビネーションとして一つの基材上に配列固定し、その上でMSCの培養を行った。一定期間(13週間)の培養後、分化マーカー(アルカリフォスファターゼ)の発現やカルシウムの沈着(アリザリンレッド染色)についてパラレル分析を行い、細胞の骨分化をもっとも強力に促進する因子の組み合わせ見出すことを試みた。2,3の因子に関して特徴的な結果が得られているが、再現性の高いデータを取得するため、さらに実験を繰り返している。当初は、タンパク質アレイ分析によって、骨形成を促進する最適な増殖因子カクテルを見出し、その情報を活用して、最適な増殖因子を組み込んだ足場材料を作製することを平成24年度の目標としていた。しかしながら、研究に用いる適切な細胞の選択およびその骨分化条件の設定に手間取り、研究が遅延した。平成24年度の後半になってようやく、タンパク質アレイを用いた分化アッセイを行えるようになった。昨年度に引き続き、タンパク質アレイ法によって骨分化促進因子の探索を引き続き進める。次に、最適な因子を組込んだ因子複合化ゲルの設計を行う。そのさい、以下の2つの点を実現するため、遺伝子組換え技術および大腸菌発現系を駆使してタンパク質性因子を修飾する。(i)移植部位において十分な因子濃度を一定期間維持するため、ベースとなるゲル材料(コラーゲンを用いる)に親和性のあるポリペプチド(コラーゲン結合ペプチド)を融合し、因子の急激な消失を防ぐ。(ii)プロテアーゼの作用によって消化・切断を受ける分解性ペプチドを増殖因子とコラーゲン結合ポリペプチドの間に挿入することによって、ゲル内での増殖因子の徐放速度をコントロールする。

また、ゲルの分解吸収が骨再生・歯周組織再生と連動して起こることを狙って、コラーゲンへの架橋の導入について検討し、最適な生体内分解速度をもつコラーゲンゲルを作製する。最後に、因子複合化ゲル内でMSCの三次元培養を行うことによって、開発した足場材料の機能を評価する。すなわち、一定期間培養後の細胞の生存率、増殖性、分化、骨様組織の新生について調べる。設備・備品の購入は行わない。物品費はおもに遺伝子組換え、タンパク質発現、細胞培養用、分化アッセイ等に用いる生化学試薬、およびタンパク質アレイの作製や細胞培養等に用いる実験器具などの購入に充てる。また、研究成果発表のための旅費、および、論文投稿・別刷料を計上する。人件費および謝金としての支出は予定していない。