hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
老化促進因子C1qによるWntシグナル活性化を基盤とした歯周炎発症機序の解明

本研究では、我々が確立した感作ラットを用いた歯周炎動物モデルを用いて、歯周炎の発症における老化促進因子C1qおよびWntシグナルの関与について明らかにすることを目的とした。補体分子であるC1qは、Wntシグナルを活性化することにより、骨格筋再生能低下を引き起こし、さらに心不全や動脈硬化、糖尿病などの老化関連疾患ヘの関与も示唆されている。しかしながら加齢と伴に罹患率が増加する老化関連疾患の一つである慢性歯周炎の発症における老化促進分子としてのC1qの働きについて調べた研究はないため本研究の着想に至った。我々が確立したラット歯周炎モデルでは、LPSにより感作したラットの歯肉溝へ高濃度LPSを10日間滴下し、歯周ポケット及び骨吸収を引き起こす。同モデルにおいて組織切片を作製し、C1q抗体を用いた免疫組織染色の結果、歯周ポケット周囲の上皮及び結合組織にC1qの発現を認めた。(Yoshinaga et al. 2012)さらにLPS抗体を作製し、LPSとLPS抗体をラット歯肉溝内へ交互に滴下すると前述の歯周炎モデルと同様に歯周ポケット形成と骨吸収が認められた。(Kuramoto et al. 2012)また本歯周組織においても歯周ポケット周囲組織にC1qの強い発現を認めたため、C1qの歯周ポケット形成及び歯槽骨吸収への関与が強く示唆された。さらに長い上皮性付着を誘導したラットを用いた研究においても、歯周ポケットが誘導されている組織切片において、C1qの強い発現が確認された。(Noguchi et al. 2017)本年度は、過去に報告したラット歯周炎モデル作製方法によって、感作ラットにE.coliを歯肉溝内に24時間毎に5日間もしくは10日間滴下し、顎骨を摘出してパラフィン切片を作製して、HE染色及びTRAP染色を行った。過去の報告通り5日目では歯周ポケット形成は認められなかったが、10日目には歯周ポケットが形成されていた。また5日目でも10日目でも口蓋側骨面に明らかなTRAP陽性細胞は認められなかった。実験計画ではマイクロCT似て骨形態についても測定する予定であったが、顎骨サンプルの採取は終了しているが、現在はマイクロCT測定条件等を決めている段階である。さらに血清中のC1q濃度の測定は、実験期間中に0日目、5日目、10日目にラットより採血を行い血清を分離してサンプルは保管済みである。現在はこの血清サンプルを用いてC1qの濃度をELISA法にて測定する方法を確立中である。また歯肉組織中のC1q発現の測定については、同モデルにおいて0日、5日、10日目にラット口蓋側歯肉を採取までは終了している。現在は歯肉組織を用いたC1qa、C1qb、C1qc、C1r、C1s遺伝子の発現をリアルタイムPCR法にて測定する方法を確立中である。計画では、健常者および歯周炎患者よりGCFをペーパーポイントにて採取しGCF中のC1qa、C1qb、C1qc、C1r、C1s遺伝子の発現を測定する予定であったが、現在実験スタートに向けて準備中である。顎骨サンプルや歯肉サンプルなどのサンプルの採取に時間がかかったため、研究がやや遅れ気味である。本年度は、in vivoの研究では過去に報告したE.coli LPSによるラット歯周炎モデルより採取した血清のC1q濃度をELISA法にて測定を行っている。さらに本モデルにおいて顎骨を採取し、組織切片を作製して、この組織切片を用いてC1qの抗体を用いた免疫組織化学染色により、広範囲の歯肉組織においてC1qの発現が観察された。C1qの発現が認めれる部位では、歯根面からの接合上皮の剥離が観察され、歯周ポケットの深化がみとめられた。さらに歯槽骨頂部付近の歯根膜側の骨面においてTRAP陽性の破骨細胞が増加しており、骨面は不規則に凹凸を示していた。in vitroの研究では、口腔上皮系HSC-2細胞を用いてC1q刺激による細胞増殖への影響を調べるためにMTTアッセイを行っている。C1qの濃度により細胞増殖への影響があると思われる結果が示されているが、経時的な変化や濃度による影響など、さらなる検討が必要である。さらに今後は、細胞増殖へのWntシグナルの影響を調べるためにWnt阻害剤sFRP3もしくはDKK1を添加してその増殖能への影響について検討する予定である。またヒトより採取した線維芽細胞におけるC1qの影響を検討するために現在、倫理審査委員会へ研究計画書を申請する準備を行っている。健常者および歯周炎患者よりGCFを採取してC1qの濃度測定を行うために、倫理審査委員会へ研究計画書を申請する準備を行っているところである。承認後に、検出を行えるようにその測定法についても条件等を検討中である。本年度は、研究をスタートする準備に時間がかかり当初予定していた研究がスタートできなかった。本年度は、昨年度に作製したラット歯周炎モデルの組織標本を用いてTRAP染色を行った。LPSを滴下した回数の増加とともに歯槽骨頂部付近の歯根膜則の骨表面にTRAP陽性細胞の増加が認められた。また実験期間中に採取した血清サンプルを用いてC1q濃度をELISA法を用いて計測中である。ラット尾静脈よりC1 elastase inhibitorを投与してラット歯周炎モデルにおけるC1qの働きについて検討する予定であったが、本実験手技の確立に時間を要しており、予定通り研究が進んでいない。

歯周外科時に採取したヒトの歯肉組織より歯肉上皮細胞および歯肉線維芽細胞を分離し、細胞培養を行い、C1複合体の増殖能への影響やWntシグナルの影響を調べる予定であったが、現在歯肉組織からの細胞の分離の確立に時間を要しており、当初予定したように研究が進んでいない。そのため代替え方法としてHSC-2細胞を用いてC1複合体の上皮細胞の増殖能への影響について、BrdU取り込み試験を行い、検討中である。また今後はWnt阻害剤sFRP3やDKK1を添加することにより、C1複合体による増殖活性の変化に対するWntシグナルの影響について検討する予定である。マウスの大腿骨の骨髄から採取した細胞を用いて、M-CSFとRANKLによる破骨細胞培養系を作製し、破骨細胞形成におけるC1qの影響やWntシグナルの関与をTRAP活性やカテプシンKの発現などにより検討中である。関連した研究結果に関して第60回春季日本歯周病学会学術大会にて発表を行った。申請者が、研究機関を移動となったため、研究環境を整えるのに時間を要しているため。本研究では、我々が確立した感作ラットを用いた歯周炎動物モデルを用いて、歯周炎の発症における老化促進因子C1qおよびWntシグナルの関与について明らかにすることを目的とした。補体分子であるC1qは、Wntシグナルを活性化することにより、骨格筋再生能低下を引き起こし、さらに心不全や動脈硬化、糖尿病などの老化関連疾患ヘの関与も示唆されている。しかしながら加齢と伴に罹患率が増加する老化関連疾患の一つである慢性歯周炎の発症における老化促進分子としてのC1qの働きについて調べた研究はないため本研究の着想に至った。我々が確立したラット歯周炎モデルでは、LPSにより感作したラットの歯肉溝へ高濃度LPSを10日間滴下し、歯周ポケット及び骨吸収を引き起こす。同モデルにおいて組織切片を作製し、C1q抗体を用いた免疫組織染色の結果、歯周ポケット周囲の上皮及び結合組織にC1qの発現を認めた。(Yoshinaga et al. 2012)さらにLPS抗体を作製し、LPSとLPS抗体をラット歯肉溝内へ交互に滴下すると前述の歯周炎モデルと同様に歯周ポケット形成と骨吸収が認められた。(Kuramoto et al. 2012)また本歯周組織においても歯周ポケット周囲組織にC1qの強い発現を認めたため、C1qの歯周ポケット形成及び歯槽骨吸収への関与が強く示唆された。さらに長い上皮性付着を誘導したラットを用いた研究においても、歯周ポケットが誘導されている組織切片において、C1qの強い発現が確認された。(Noguchi et al. 2017)サンプルの採取は終わっているものが多いため、今後はサンプルを用いた測定を行っていく段階であるため、十分に研究の遂行は可能だと思われる。今後は、研究をスタートできる準備が整いつつあるため、予定していた研究を進めていく予定である。ラット尾静脈よりC1 elastase inhibitorを投与する方法の確立を継続して行っていく。またヒト歯肉組織からの上皮細胞および線維芽細胞の分離方法を確立も継続して行っていく。
在宅医療・看護の質の確保に関する法的研究

1994年度には農山村地域の典型たる島根県鹿足郡日原町において,また1995年度には都会地の典型として東京都江戸川区において,高齢在宅患者の自宅を訪問して実態調査を行った。その成果を比較検討をするごとを通して,わが国の在宅医療・看護の質を確保するための問題点を探り,その解決の方策を検討した。主な結果は次の通りである。(1)在宅医療を完結させるためには,実は施設の充実が不可欠である。(2)在宅医療という形態の選択,継続の意思の決定の為には,特別の手続と特別の訓練を受けた人を必要とする。(3)現在の在宅医療は女性,とりわけ嫁への負担が大きい。これを当然とする社会情況を問い直してゆくとともに,現に担われている負担を軽減する方策が緊急に必要である。(4)在宅医療の本格的な展開のためには,住宅対策を基本的に見直す必要がある。(5)民間企業が本当に必要とされている地域また領域に拡大してゆくためには,行政庁の指導の統制といった強力な介入が求められる。(6)施設と利用者の関係を,行政庁による措置制度から自由契約に移すという主張にはにわかに賛成しえない。現行の措置制度が陥っている欠陥を改善する必要は高いが,措置というものが本来的に備えている長所をこそ生かしてゆくことが必要である。(7)個別的論点として:痴呆性高齢者のために特別の施設が必要である。リバビリテーションの拡充の必要性は高い。カウセリングの機能の充実が,ケアの改善・精神的安定に有用であるばかりでなく,行政庁の施策改善のために有用である。患者・介護者からの苦情申し立ての制度も同様である。本年度の我々の研究計画は二つの方法からなっていた。それぞれについて本年度の実績を報告する。1)比較法的検討の方面では、わが図の高齢者の保健・福祉制度ことに在宅医療・看護、日常生活用具および在宅医療機器の給付・貸与制度、医療関係者の業務等につき現状と法的問題の把握に務めるとともに、アメリカにおけるナ-ジングホームの最近の制度改革、ナ-スプラクティショナ-制度および末期医療の法的問題、イギリスの地域看護論、ドイツの成年後見の制度などの点につき、担当を定め鋭意検討し随時報告会を開いてきた。その幾つかは別紙のような成果を見ているが、その大半は公表には至っていない。2)実態調査については、まずその前提として東京都・神奈川県・島根県の3都県およびそのうちの全市町村の関係資料を取り寄せ、その比較検討をした。当初の計画では年度内に上記3都県の全てにおいて、在宅医療のさまざまな形態毎の実態調査をする子定であったが、検討の結果、調査対象は高齢者に限定すること、調査地域を本年度は島根県内の特定町村に限定することが適切であろうとの結論に達した。結局、1995年3月の末に島根県日原町を研究班員および若干の補助者が訪れ、30名程の在宅老人患者とその家族、病院・保健福祉関係施設・者、地方行政当局者などの面接調査を5日間にわたり行うこととなった。そこでは、在宅高齢患者に現実に提供されている医療サービスの質をいくつかの指標をもって評価するとともに、地方に大幅に移譲されたサービス提供制度の問題点を、健康に対する住民の権利という観点から探ることを目的とする。昨年度、われわれは農村地区の一例としての島根県日原町において実態調査をしたのに引きつづいて、本年度は都会地の代表としての東京都江戸川区において実態調査を実施した。同区は、熟年者介護手当、全額公費負担の重厚な訪問看護制度、公費負担の住宅改造手当、介護用具給付など在宅医療・看護を支えるための制度をきわめて豊富に備えている。

地域性が喪なわれたため、住民は自分の郷土感をもたず、近隣の相互援助も得られない都会地において在宅医療を進めて行く上で、おそらくわが国の現状ではこれ以上のサービスは望めないだろうと思われるほどのものであった。にもかかわらずサービスを受けている患者の医療・看護の質という点から見るとき、客観的にも主観的にもとても十分とは言い得ない、とわれわれには判断された。この結果は調査に当たった我々にとっても意外なことであった。その後、われわれはこの意外な結果についての検討に努めた。その結果、それは在宅医療の基盤を形づくる住宅の貧困・不適、在宅看護・介護を現に担っている介護者の社会的・精神的不安定、在宅化の背景にあってこれを支えるべき施設の貧困といった、いわば外枠の不十分さに由来するところ大であろう。との結論に達した。さらにこの調査結果を踏まえて、在宅医療・看護の質の確保のための法的検討につとめ、在宅医療開始決定手続き、患者・住民の意見の聴取、介護者の権利の保護などの諸点につき具体的提案に努めた。
電子ポートフォリオを利用した英語教師の学びと成長:ナラティブ生成と授業改善の支援

本研究は,英語教師が綴ったナラティブを研究者と教師が協働的に解釈し,教師の成長過程を明らかにする研究である。危機的出来事(critical events)等の教育実践を巡る教師の経験が,ナラティブとして言語化され,ネット上に構築された電子ポートフォリオに蓄積された。その後,教師自身と研究者によって共有され,社会文化的理論に基づいて解釈・分析され,英語教師と研究者の対話を通した学びと成長の過程が明らにされた。本研究は,教育や学習の質的な研究の枠組み基づき,英語教師が綴った「ナラティブ」をデータとし,それを解釈する研究である。学校教育現場で教える英語教師に研究協力者として参加してもらい,電子ポートフォリオに,教育実践をめぐるナラティブを綴ってもらい,これをデータとし,社会文化的理論に基づいて解釈,分析することで,教師の学びと成長の過程を明らかにし,その後の教師の成長と授業改善へ結びつけることを大きな目的としている。今年度は,特に,ナラティブ生成を支援する電子ポートフォリオの開発・改善を行った。ウェブアプリケーションとして,Google Apps for Educationを活用し,ここにプライベートなナラティブを蓄積し,一部をメンバー内で共有し,批評し合う仕組みを構築した。さらに,綴られたナラティブに省察を加え,誰もが閲覧できるようにするため,ウェブアプリケーションの一つであるWordPress MUを導入し,ナラティブを公開する仕組みを整えた。今年度は,研究の基盤整備に加え,ナラティブ研究についての知見を広めるための学会セミナーを関西英語教育学会および広島大学の柳瀬陽介氏が代表を務める科学研究費補助金基盤研究費(C)一般(「第二言語教育に特化した教師ナラティブ研究の理論的・実証的展開」)との共催で「ナラティブが英語教育を変える?!ナラティブの可能性」として2009年10月11-12日に神戸ユニティにて開催した。1日目は異なる立場から教師、研究者が今の英語教育について発言する形式、2日目は教師が自身の内面の声を言語化することの意味を考え,英語教育研究におけるナラティブの意味を議論する格好の機会を提供した。学校教育現場で教える英語教師に研究協力者として参加してもらい,電子ポートフォリオに,教育実践をめぐるナラティブを綴ってもらう。収集したナラティブをデータとし,社会文化的理論に基づいて解釈,分析することで,教師の学びと成長の過程を明らかにし,その後の教師の成長と授業改善へ結びつける。具体的には,(1)英語教育研究におけるナラティブ・アプローチの研究手法の精緻化,(2)ナラティブ生成を支援する電子ポートフォリオの開発・改善,(3)教師のナラティブ・アプローチの経験と教室での授業実践の変容の相互作用の解明,という課題の解決を目指している。昨年度は,ナラティブ生成を支援する電子ポートフォリオの開発・改善を行ったが,今年度はこの仕組みを活用し,研究協力者となっている中高の英語教員がナラティブデータの蓄積をおこなった。Google Apps for Educationの機能を活用し,メンバー内でデータを共有し,ディスカッションを進めた。学校教育現場で多忙を極める教員にとって,ナラティブデータを蓄積することは容易ではなかったが,一次データとしてのナラティブの蓄積はある程度進んでいる。次年度は,この一次データを質的に分析し,英語教師が自らの教室での経験や成長をどのように綴っていて,ポートフォリオがそれをどのように支援しているかを分析していく。さらに,ナラティブを綴る経験が授業実践どのような影響を与えるかについて研究を進める。なお,本研究の成果の一部は,学会や書籍所収論文の中で発表した。本研究の目的は,(1)英語教育研究におけるナラティブ・アプローチの研究手法の精緻化,(2)ナラティブ生成を支援する電子ポートフォリオの開発・改善,(3)教師のナラティブ・アプローチの経験と教室での授業実践の変容の相互作用の解明,であったが,研究期間の最終年度となる本年度は,特に,(3)について研究推進し,最終的な成果のとりまとめを行った。具体的には,研究協力者となった中学及び高等学校の英語教師が作成したナラティブ・データを分析し,教師の英語教育実践の経験がどのようなメタファーや言語によって意味づけされているのか,また,教師自身の実践に対する認識や洞察が,ナラティブの中でどのように変容するかを社会文化的理論の見地から明らかにすることであった。研究の性質上,大量のナラティブ・データの収集はしなかったが,実践について綴るといった行為及びその質的な分析を通じて,教師自身の認識が変容し,そのことが教室での生徒とのインタラクションや指導法の変化に結びつくことが明らかになった。その際,研究者や教師教育者がナラティブを介して教師と対話的な活動に従事することで,教師自身の認識の変容を促進することも示された。このことは,社会文化的理論の枠組みでは,教師教育者と教師の間に適切な発達最近接領域が生成されたことを示すものとして説明される。
粘土地盤上の有限厚さの砂層の支持力・変形特性に関する研究

本研究では、下部に弱層である粘土層を有する比較的層厚の小さな砂層の支持力・変形問題を取り上げ、次元解析によって抽出した、この種の現象に影響を及ぼす無次元パラメータの影響を遠心模型実験によっって詳細に調べ、より合理的な設計法の確立に資する有用な知見を得ることを目的としてる。この種の地盤の支持力に影響を及ぼす無次元パラメータとして、砂層厚さHと基礎幅Bの比H/B、無次元化した下部粘土の支持力cu/γB、無次元化した上載圧p0/γBを取り上げ、これらの及ぼす影響を遠心模型支持力実験によって詳細に調べた。また支持力の1/4から2/3程度の一定荷重を砂層表面上の円形基礎に作用させ、圧密特性を調べる実験も併せて行った。その結果得られた主な知見は以下の通りである。(1)二層地盤の無次元化した支持力2qf/γBはH/B、cu/γB及びp0/γBが大きいほど大きくなる。またH/Bが一定であればcu/γB及びp0/γBの増加と共に直線的に増大する。(2)二層地盤の支持力は半無限砂地盤の支持力より大きくなることはないので、H/Bがある程度大きくなると砂地盤の支持力と等しくなる。砂地盤の支持力と等しくなるH/Bは粘土強度の減少と共に大きくなるが、粘土が軟弱な場合でも円形基礎では約2程度、帯基礎では、約4程度となる。(3)二層地盤の変形破壊挙動は基礎の形状にはよらずほぼ同様のものとなり、破壊メカニズムは支持力が砂地盤と等しくなるH/Bを境に変化する。すなわち、支持力が砂地盤より小さな場合は、基礎直下に基礎と共に挙動する砂のブロックが形成され、これが粘土層に押し込まれて地盤が破壊するのに対し、支持力が砂地盤と等しい場合には砂層内で砂が全般せん断破壊を起こし、粘土層の変形は小さなものとなる。(4)二層地盤の圧密沈下量はほぼ載荷量に比例して増加する。また圧密沈下量と載荷重と支持力の比q/qfの関係はH/Bによらずほぼ1本の曲線となる。粘土層上の砂層の支持力問題は、基礎幅B、砂層厚H、粘土層の強度cu、砂の密度γ及びせん断抵抗角φ'、砂層の深さD等、多くのパラメータの影響を受ける複雑な現象である。本研究は遠心模型実験により、この種の地盤の支持力・変形特性を種々の条件の下で詳細に調べることを目的としており、本年度は特に下部粘土層と上部砂層からなる二層地盤上の根入れの無い基礎を対象とした一連の実験を行い、以下の結果を得た。則ち、(1)砂の密度が一定の場合、二層地盤の支持力は基礎幅に対する相対的な砂層厚H/B及び粘土層の支持力c_uN_cと換算基礎幅γBの比c_uN_c/γBによって決まり、これらが大きい程大きくなる。H/Bが一定ならば、c_uN_c/γBの増加と共に無次元化した支持力係数2q_f/γBは直線的に増加する。(2)二層地盤の支持力は半無限砂地盤の支持力より大きくなることはなく、H/Bがある程度大きくなると砂地盤の支持力と等しくなる。

通常の粘土層の強度の範囲では、砂地盤の支持力と等しくなるH/Bの値は円形基礎で2以下、帯基礎では4程度である。(3)二層地盤の変形破壊挙動は基礎の形状によらずほぼ同様のものとなり、破壊メカニズムは支持力が砂地盤と等しくなるH/Bを境に変化する。則ち、支持力が砂地盤より小さな場合は、基礎直下に基礎と共に挙動する砂柱が形成され、これが粘土層に押し込まれて地盤が破壊するのに対し、支持力が砂地盤と等しい場合には、砂層内で砂が全般せん断破壊を起こし、粘土層の変形は非常に小さなものとなる。(4)二層地盤の初期地盤反力係数は、支持力と同様にH/Bの増加と共に増加するが、半無限砂地盤のそれと等しくなるH/Bは支持力に比べ大きく、円形基礎で約3であり、帯基礎ではH/Bが4でも地盤反力係数は砂地盤の約半分程度である。本研究では、下部に弱層である粘土層を有する比較的層厚の小さな砂層の支持力・変形問題を取り上げ、次元解析によって抽出した、支持力に影響を及ぼす無次元パラメータの影響を遠心模型実験によって詳細に調べ、より合理的な設計法の確立に資する有用な知見を得ることを目的としてる。この種の地盤の支持力に影響を及ぼす無次元パラメータとして、砂層厚さHと基礎幅Bの比H/B、粘土の強度cuを砂の有効単位体積重量γとBで無次元化したcu/γB、基礎の根入れ比に対応する無次元化した上載圧p0/γB及び基礎の縦横比を取り上げ、これらを比較的広い範囲に変化させた支持力実験を40gまたは50gの遠心加速度場にて行った。またH/Bが1、1.5及び2の場合には支持力の1/4から1/2程度の一定荷重強度を砂層表面に作用させ、地盤の圧密特性を調べる実験も併せて行った。その結果得られた主な知見は以下の通りである。(1)砂の密度が一定であれば、二層地盤の無次元化した支持力2qf/γBはH/B、cu/γB及びp0/γBによって決まり、これらが大きいほど大きくなる。またH/Bが一定であればcu/γB及びp0/γBの増加と共に直線的に増大する。(2)二層地盤の支持力は半無限砂地盤の支持力より大きくなることはなく、H/Bがある程度大きくなると砂地盤の支持力と等しくなる。砂地盤の支持力と等しくなるH/Bは粘土強度の減少と共に大きくなるが、粘土が軟弱な場合でも円形基礎では約2程度、帯基礎では約4程度である。(3)二層地盤の変形砂壊挙動は基礎の形状にはよらずほぼ同様のものとなり、破壊メカニズムは支持力が砂地盤と等しくなるH/Bを境に変化する。すなわち、支持力が砂地盤より小さな場合は、基礎直下に基礎と共に挙動する砂のブロックが形成され、これが粘土層に押し込まれて地盤が破壊するのに対し、支持力が砂地盤と等しい場合には砂層内で砂が全般せん断破壊を起こし、粘土層の変形は小さなものとなる。(4)二層地盤上の基礎の圧密沈下量はほぼ載荷重に比例して増加する。また載荷重強度qと支持力の比q/qfと基礎の圧密沈下量の関係はH/Bによらずほぼ1本の曲線となる。
自閉症の情動的コミュニケーションにおける音声分析学的研究-情動の変容と言語認知機能の獲得の関連性に焦点を当てて-

われわれはこれまで幼児期の自閉症圏障害を関係性の障害の視点に立って母子治療を試みてきた。その中で自閉症児と養育者との間のコミュニケーション障害に対してまずは情動的水準での改善を試みることによって、母子間でのコミュニケーションは短期間で著明な改善を示し、状況に適切な発語が多くの例で認められた。本研究では、自閉症圏障害への治療実践を通して、情動的コミュニケーションの進展過程と母子双方の音声活動がどのように変容していくか、相互の関連性を検討することを試みた。具体的にその手始めとして、母子相互間の情動的コミュニケーションの進展過程を良好群と不良群に分けて、そこでの母親のvocal markerの生起数を比較検討した。その結果、良好群ではvocal markerの出現頻度は全体的に増加傾向を示していた。ただその増加の度合いは症例による個人差が非常に大きいことが明らかとなった。また不良群でへはvocal markerの生起数の変化よりもpseudo-vocal markerの生起数の多さが治療介入前後を通して一貫して多い傾向にあった。今回の結果はいまだ予備的段階の研究ではあったが、vocal markerが情動的コミュニケーションの進展過程において重要な役割を担っていることが推測された。さらに情動的コミュニケーションが進展しがたい症例において一見vocal markerと類似しているが実は質的に大きな違いがあるpseudo-vocal marker、すなわち子どもの動きとは連動せず、養育者主導の音声活動であるため音声そのものが子どもの意図とはずれているという特徴をもった音声活動が主に出現していることを確認された。最後にvocal markerが象徴的コミュニケーションへの進展過程において果たす役割を知覚様態の特徴との関連性でもって考察した。
ＣＶＤ表面修飾粉体の急速加熱焼結による緻密ダイヤモンドベース複合体の合成

従来、緻密なダイヤモンド多結晶体を得るためには、GPaレベルの超高圧下での焼結プロセスを必要とした。本研究では、化学気相析出を援用した粉体表面修飾技術(回転CVD)によりダイヤモンド粉末をSi基セラミックス膜で表面修飾し、これを放電プラズマ焼結(SPS)することで、ダイヤモンドが準安定な低圧力環境下で緻密化することを目的とした。回転CVD法によりコア(ダイヤモンド)/シェル(SiC)構造のナノコンポジット粉末が得られ、これをSiO2粉末と100 MPa以下でSPS焼結することにより、相対密度が94%、ビッカース硬さが39 GPaのダイヤモンド基SiC-SiO2複合体の作製に成功した。緻密なダイヤモンド多結晶体を得るためには、GPaオーダーの超高圧環境が必要とされてきた。本研究では、化学気相析出(CVD)を利用した粉体コーティング技術と放電プラズマ焼結(SPS)法を組み合わせることにより、緻密なダイヤモンド基コンポジットの合成プロセスを構築する事を目的とした。平成25年度は、前年度までに確立した回転CVDによるSi系セラミックス膜の粉末表面修飾プロセスを用い、ダイヤモンド粉末表面をSiCやSiO2のナノ膜でコーティングし、ダイヤモンド/SiC(SiO2)のコアシェル構造のコンポジット粉末を合成した。まず、回転CVDプロセスにおける成膜温度や炉内圧力、反応ガスなどの成膜条件が形成相、微細組織や膜厚などの膜構造に及ぼす影響を精査した。CVD原料にはHexamethyldisilaneを用い、成膜温度が965-995 K、炉内圧力が400 Paで10-100 nmの非晶質SiC膜でダイヤモンド粉末表面を被覆でき、コア(ダイヤモンド)/シェル(SiC膜)構造のダイヤモンド基コンポジット粉末を得た。このダイヤモンド基コンポジット粉末をSPSにより焼結体を合成した。ダイヤモンド粉末単体を焼結した場合、約1700Kでグラファイトへ相変態し、この温度領域では緻密な焼結体は得られない。一方、本研究で作製したSiCのナノ膜で被覆したダイヤモンド基コンポジット粉末は1873 Kでも相変態しなく、ダイヤモンド単体に比べて150 K以上の高温焼結を可能にした。本研究では、このダイヤモンド基コンポジット粉末にSiO2を混合してSPS焼結することで、相対密度が95%以上の緻密で、ビッカース硬さが35 GPa以上を有するダイヤモンド基焼結体を作製することに成功した。緻密なダイヤモンド多結晶体を得るためには、相変態を伴わない熱的安定領域の超高圧(GPa)環境が必要とされてきた。本研究では、Si系セラミックス分散と高速焼結プロセスが焼結促進と相変態・粒成長抑制を可能にする点に着目し、化学気相析出による回転式粉体コーティング技術と放電プラズマ焼結法を組み合わせ、緻密なダイヤモンド基複合体の低圧合成プロセスを構築することを目的とする。SiCやSiO2などの硬質セラミックス分散膜コーティングをダイヤモンド粒表面に行い、急速加熱焼結することで、緻密なダイヤモンド基複合体の合成を金属バインダレスかつ100 MPa以下で行う。平成24年度は、先ず、回転式CVDによるSiC、SiO2およびダイヤモンド粉末基材表面のSi基セラミックス(SiO2およびSiC)コーティングプロセスに焦点をあて、成膜温度や炉内圧力などの各種合成条件が、コーティング膜の結晶相、微細構造および膜厚に及ぼす影響を調べた。ダイヤモンド粉末へのSiC膜コーティングでは、CVD原料にHMDSを用い、成膜温度996 Kのとき、厚さ約10 nmのSiC膜をダイヤモンド粒表面に合成することに成功した。また、SiC粉末へのSiO2膜コーティングでは、CVD原料にTEOSを用い、成膜温度948 Kで、膜厚約60 nmのSiO2膜を合成できることを見出した。これらSi基コーティング膜は非晶質であり、平均粒径が数ミクロンの基材粒子表面には均質で滑らかな形状のナノ膜が形成された。回転式CVDにより得られたSi基セラミックス被覆コンポジット粉末をプラズマ放電焼結法を用いて焼結した。SiO2膜/SiC粉末コンポジット粉末は、焼結温度1923 Kで相対密度97 %に達し、ビッカース硬さおよび靱性はそれぞれ17.1 GPaと8.4 MPam1/2と高い機械的強度を示すことがわかった。本研究は化学気相析出による回転式CVD技術と放電プラズマ焼結法を組み合わせ、緻密なダイヤモンド基複合体の低圧合成プロセスを構築することを目的とするが、初年度の平成24年度は、回転式CVDによるSi基セラミックスの粉末コーティングプロセスの確立を主眼に置いた。SiC膜の合成条件を広範に精査することにより、均質かつ一様なナノ膜を数ミクロンの微粒粉末表面に合成することを可能にした点は、当初の計画を十分に満足している。

さらに、SiO2膜コーティングでは60 nm以上に及ぶ膜厚の制御を可能しており、SiO2とSiCの異なる材質で様々な膜厚のSi基セラミックス分散膜をダイヤモンド微粒上に合成できる点は、平成26年度のダイヤモンド焼結条件を広範な条件で探索することを可能とする。また、SiO2膜/SiC粉末コンポジットでは機械的特性に優れる緻密体を合成できており、得られた知見はSi基セラミックス膜/ダイヤモンド粉末に応用できるものと考える。平成24年度で確立した回転式CVDによる粉末コーティング技術とプラズマ放電焼結法を組み合わせ、SiC膜/ダイヤモンドおよびSiO2膜/ダイヤモンド粉末コンポジットの緻密体を合成することを目的とする。SiO2やSiC膜の合成条件や膜厚がダイヤモンドの焼結挙動に及ぼす影響を明らかにする。また、焼結温度、印加圧力および焼結時間などの焼結条件がダイヤモンド焼結体の密度、微細構造、硬さや靱性に与える影響を精査し、緻密で機械的特性に優れるSi基セラミックス-ダイヤモンド複合体を合成する。SiO2膜/SiC粉末コンポジットでは緻密体を合成することに成功しており、SiC膜/ダイヤモンド粉末またはSiO2膜/ダイヤモンド粉末の焼結では緻密化が困難である場合は、SiC膜/ダイヤモンド粉末にSiO2膜の積層コーティングを行い、SiO2膜/SiC粉末に擬似化することで緻密なダイヤモンド複合体を合成する。等の国内外学会や論文投稿により発表する。消耗品は主にダイヤモンド粉体やコーティング原料の各種有機金属錯体、反応用高純度ガスである。CVD原料には、SiCやSiO2のSi原としてHexamethyldisilaneやEthylsilicateを計上する。また、回転式CVDやSPS装置の日常的なメンテナンスに必要な交換部品を計上する。具体的には、配管部品、バルブ、チャンバー窓材、油回転式ポンプ等の真空機器、リボンヒーターやカーボンパンチ・ダイスなどである。旅費等の項目では、得られた研究成果を対外発表するための国内外における学会参加費、渡航費および論文投稿料を計上した。年間2回の国内学会発表と、1回の国際学会発表を予定とする。論文投稿は3報を目標とする。その他、透過電子顕微鏡や電界放出形走査電子顕微鏡などの分析に必要な装置使用料を計上する。
骨髄線維化進展における乳酸シャトル現象の役割解明とその制御方法の開発

骨髄増殖性腫瘍(MPN)細胞は、低酸素環境では低酸素応答転写因子(HIF)を介して、乳酸の細胞外移送に関わるMCT1/MCT4の発現が上昇し、細胞外に乳酸を排出させることを明らかにした。一方、糖代謝センサーAMPKを活性化させることにより、過剰な蛋白合成が抑制され、その結果として小胞体ストレス応答が低下し、最終的には線維化の進行に関わる酵素lysyl oxidaseの発現が抑制されることも見出した。さらに、MetforminはPP2Aの活性化を介して、MPNの発症に中心的な役割を果たしている変異型JAKキナーゼ(JAK2V617F)の機能を抑制し、MPN細胞の増殖を抑制していた。本年度は、骨髄増殖性腫瘍細胞株HELおよびSET-2を用いたin vitroの解析を中心に研究を進めた。この過程において、以下の研究成果を得た。(1)乳酸シャトル現象に係る鍵となる分子MCT-1およびMCT-4の発現について解析を行い、低酸素環境での培養(1%02 ;72時間)により、これらの分子の発現が増強することが確認された。(2)また、この低酸素環境によるMCTの発現誘導が低酸素応答転写因子(HIF-1)に依存するものかについて検証するために、HIFの機能抑制剤であるechinomycinを用いた。echinomycinを用いることにより、低酸素環境でのMCT1およびMCT4の発現誘導が見られなくなることが分かった。すなわち、MCT1およびMCT4の発現誘導にはHIFが必要であると考えた。(3)糖代謝酵素の発現についてみると、細胞内のグルコール取り込みに係るGLUT-1の発現が誘導されていることが確認された。(4)低酸素環境において、HELおよびSET-2細胞における乳酸産生が増加するかについて、細胞上清中に分泌された乳酸についても解析した。1%O2環境での培養により、これらの細胞での乳酸産生が増加することが確認された。以上の結果より、in vitroレベルにおいて、低酸素環境下では骨髄増殖性腫瘍細胞において、糖代謝シフトと乳酸の細胞外排出に係るMCTファミリータンパクの発現誘導がおこること、またこれらの変化に伴って、実際に細胞外環境に乳酸の排出がおこっている事が確認できた。当初の計画において、本年度は培養細胞を用いて、骨髄増殖性腫瘍細胞と骨髄間質細胞との間で乳酸シャトル現象が見られるかを確認することを第一の目標としていた。このうち、骨髄増殖性腫瘍細胞側では、低酸素における糖代謝シフトおよび乳酸の排出に係るMCTの発現誘導、さらには実際に細胞外への乳酸排出などを確認することができ、当初の計画通りの進捗があった。一方、骨髄間質細胞についての解析は現在進行中の状況である。これまでの研究において、骨髄増殖性腫瘍細胞では、乳酸トランスポーターMCT1/MCT4の発現を認めることや、培養上清中への乳酸産生など、糖代謝が解糖系にシフトしていることを明らかにした。この成果に基づいて、本年度は、乳酸代謝経路にも影響を及ぼすビグアナイド系薬剤Metforminを用い、糖代謝経路の改変が骨髄増殖性腫瘍細胞株において生物学的及び生化学的にどのような影響を及ぼすかについて研究を進めた。以下の事項を明らかにすることができた。1. Metforminは用量依存性に骨髄増殖性腫瘍細胞の増殖を抑制し、アポトーシスを誘導した。この抗腫瘍効果は、metforminが糖代謝系を抑制し、エネルギーセンサーであるAMPK経路を活性化するのみでなく、骨髄増殖性腫瘍のドライバー変異であるJAK2V617Fの活性を直接的に抑制していることがわかった。2. metforminによるJAK2V617F活性の抑制には、タンパク質フォスファターゼであるPP2Aの活性調節が関与していた。PP2Aの中でもB56αサブユニットがJAK2V617Fの抑制に関わっていた。一方、活性酸素除去剤により、metforminによるJAK2V617F抑制効果が減弱した。この結果からは、metforminによる代謝シフトのために細胞内で活性酸素の産生が増加し、JAK2V617Fの機能抑制に関わっていることが推察された。3.現在骨髄増殖性腫瘍の治療剤として実臨床でも使用されている、JAK2阻害剤であるruxolitinibとの併用により、metforminは相乗的にJAK2の活性を抑制し、抗腫瘍効果を発揮した。骨髄増殖性腫瘍細胞株を用いた解析では、昨年度に乳酸排出酵素の発現及び乳酸産生亢進が実際に現象として認められることを明らかにしている。本年度は、この解析結果をもとに、糖代謝調節の改変を目的としてmetforminを用いた。その結果、当初の予測以上に興味深い結果として、metforminによる直接的なJAK2V617Fの抑制現象を見出した。この結果は、想定外であったが今後の新たな研究としての発展、そして新たな骨髄増殖性腫瘍の治療法の開発へとつながることが期待される。なお、骨髄系間質細胞HS-5細胞を用いた解析については、現時点では線維芽細胞マーカーや酵素の発現レベルについての基礎的な解析を進めている段階である。平成28年度までの解析において、骨髄増殖性腫瘍(MPN)細胞株に対して、ビグアナイド系薬剤metforminが、MPNの主要なドライバー変異産物であるJAK2V617Fのキナーゼ活性を抑制しうること、その機序としてPP2Aの活性化があることを明らかにしている。本年度は、さらにこの機序についての解析をさらに発展させた。

さらにmetofrominが細胞外マトリクスタンパクの発現を制御し、骨髄線維化進行に大きな役割を果たす酵素の一つであるLysyl oxidase (LOX)の発現制御に関わるかについても検討を行い、以下の結果を得ている。1. MPN細胞株では、ERストレスタンパク経路の活性マーカーであるGRP78の発現上昇や、その上流であるeIF2の活性化を認めた。Metformin処理により、これらのERストレスマーカーの抑制が見られることを明らかにし得た。また、metforminはMPN細胞におけるLOXの発現を抑制した。一方、JAK2阻害剤では、ERストレスマーカーやLOXの発現抑制を認めなかったことより、metforminはJAK2抑制以外の機序により、ERストレスおよび線維化を抑制していることが示唆された。2.骨髄間質細胞株である、HS-5を低酸素環境下で処理することにより、LOXの発現が上昇することを確認した。HS-5をTGF-βで処理した場合にも、同様にLOXの発現が上昇することが分かった。3. Metforminは、HS-5においてTGF-βによるSMAD2の活性化を抑制した。以上の結果より、metforminはMPN細胞および骨髄間質細胞の双方に作用し、ERストレスを抑制しうること、また骨髄線維化進行に関わるLOXの発現を抑制しうることが明らかとなった。骨髄増殖性腫瘍(MPN)細胞は、低酸素環境では低酸素応答転写因子(HIF)を介して、乳酸の細胞外移送に関わるMCT1/MCT4の発現が上昇し、細胞外に乳酸を排出させることを明らかにした。一方、糖代謝センサーAMPKを活性化させることにより、過剰な蛋白合成が抑制され、その結果として小胞体ストレス応答が低下し、最終的には線維化の進行に関わる酵素lysyl oxidaseの発現が抑制されることも見出した。さらに、MetforminはPP2Aの活性化を介して、MPNの発症に中心的な役割を果たしている変異型JAKキナーゼ(JAK2V617F)の機能を抑制し、MPN細胞の増殖を抑制していた。本年度は、骨髄間質細胞を用いた解析をまず進行させる。具体的には、骨髄間質細胞が乳酸の取り込みに係るMCTの発現を認めるか、さらには低酸素状態においてMCTの発現および機能がどのように影響を受けるかを調べる。また、低酸素環境あるいは乳酸の作用により骨髄間質細胞が線維芽細胞としての形質を獲得するのかについても、検討を進めて行く。当初の計画として、骨髄間質系細胞HS-5を用いて、細胞外の乳酸レベルの変化により線維芽細胞への形質転換が誘導されるかを検討する予定である。同時に、コラーゲン合成酵素の発現レベル、細胞外へのコラーゲン分泌への影響についても解析を進める。一方、今回見出したmetforminの作用についての研究も発展させる計画である。具体的にはHS-5において、乳酸を用いて解析する予定の上述のパラメーターについて、metformin処理後の変化を検討する計画である。
17-19世紀日本・朝鮮・中国三国関係史の研究―相互の阻害と連結に留意しながら―

本研究では、17ー19世紀国家間の正式な外交のない日本・中国の間における朝鮮王朝の介した間接的な政治繋がりに着目し、その繋がりを具体的に実証し、グローバル・ヒストリーの手法を用いて東アジア国際関係史の再構築を目指す。日朝関係と中朝関係という複数の二国間関係を積み重ねるのではなく、日朝中の三国間関係を同時に取り扱うことにチャレンジする。本研究は従来日本で行われてきた対外関係史研究では見えなかった日朝中の絡まり合った多様な関係の解明が、朝鮮を媒介項とする日中関係史という新たな歴史像の構築を介して果たされるものである。
ヒッププロテクタの骨折予防効果評価試験法の確立

大腿骨頸部骨折の予防に真に有効なヒッププロテクタを選別する評価システムを構築するため,転倒時の骨折機序解明やプロテクタによるその防止効果を検討するとともに,その成果を反映した評価システムとヒッププロテクタを実際に設計・製作し,報告者らのプロテクタを含む市販のプロテクタを評価した.またしりもち転倒の危険性を評価する解析を行い,歩行時転倒よりも危険性が高い可能性を示した.このほか,転倒シミュレーションの精度を高めるための骨格筋の損傷特性の整理やその構成式モデルの開発も行った.大腿骨頸部骨折の予防に真に有効なヒッププロテクタを選別する評価システムを構築するため,転倒時の骨折機序解明やプロテクタによるその防止効果を検討するとともに,その成果を反映した評価システムとヒッププロテクタを実際に設計・製作し,報告者らのプロテクタを含む市販のプロテクタを評価した.またしりもち転倒の危険性を評価する解析を行い,歩行時転倒よりも危険性が高い可能性を示した.このほか,転倒シミュレーションの精度を高めるための骨格筋の損傷特性の整理やその構成式モデルの開発も行った.この研究は,大きな社会問題となっている高齢者の転倒による大腿骨頸部骨折の予防装具である、ヒッププロテクタの有効性評価方法を確立することを目的とする。まず,ヒッププロテクタ評価のための予備研究として,全身各部の集中質量を剛体で結合したモデルと精密な大腿部有限要素モデルとを組み合わせた簡易全身モデルに様々なプロテクタを装着し,転倒シミュレーションを行った。これにより,様々なプロテクタに対してシミュレーションが可能であることを確認するとともに,併せて最適なヒッププロテクタの設計条件と装着条件が明らかとなった。すなわち,プロテクタの厚さ,プロテクタに設けた穴の大きさ,位置,数,プロテクタ材料によって,骨折防止効果がかなり異なること,プロテクタ装着時の位置のずれの影響が明らかとなった。次に,転倒時に作用する境界条件をより忠実に反映する,マルチボディ-大腿部有限要素複合モデルを作成し,ヒッププロテクタを装着して,歩行時に生じうる種々の転倒条件を再現するシミュレーションに取組んだ。しかし,大腿部上部での変形挙動に疑問が生じたため,ヒッププロテクタ評価のための大腿部有限要素モデルの妥当性を検討した。従来の大腿部モデルを上方に延長し,大腿骨を完全に覆うように改良したモデルを作成し,従来モデルと改良モデルの結果を比較した。その結果,大腿骨近位部における応力値が両モデルで大きく異なることがわかり,実際の大腿部をより忠実に再現している改良モデルを以後用いることとした。以上の結果を踏まえ,簡易全身モデル並びにマルチボディ-大腿部有限要素複合モデルに改良した大腿部を組込んで解析に取組んでいる。この研究は,転倒による大腿骨頸部骨折の予防装具である、ヒッププロテクタの有効性評価方法を確立することを目的とする。昨年度,全身各部の集中質量を剛体で結合したモデルと精密な大腿部有限要素モデルとを組み合わせた簡易全身モデルに様々なプロテクタを装着して転倒シミュレーションを行い、プロテクタ厚さ,プロテクタに設けた穴の大きさ,位置,数,プロテクタ材料が骨折防止効果に及ぼす影響を検討した。それと同時に、転倒時に作用する境界条件をより忠実に反映する,マルチボディ-大腿部有限要素複合モデルの改良モデルを作成し、従来モデルよりも格段に精度が向上することを明らかにした。今年度はこの改良モデルを用い、種々のヒッププロテクタを装着して,歩行時に生じうる種々の転倒条件を再現するシミュレーションを行った。そして簡易全身モデルの解析結果の妥当性を検証するとともに、プロテクタ評価の基準となり得る最も危険な転倒条件の抽出を試みた。その結果、マルチボディ-大腿部有限要素改良モデルを用いた場合、簡易全身モデルに比べて応力値が大幅に下がり、骨折を生じる場合は極めて限られること、従って健常人では骨折はほとんど生じず、骨粗鬆症等による骨強度の低下を考慮することが重要であることがわかった。またプロテクタによる骨折防止効果も簡易全身モデルの結果から予想するよりも小さいという結果を得た。以上の解析結果を忠実に再現でき、かつ簡便に評価できるプロテクタ評価システムの構築を試みた。加速度計、ロードセル、動ひずみ計等を用い、人造骨に転倒を模擬した衝撃荷重を負荷して、各種出力を評価する予備実験を実施した。次年度は、このシステムの改良に取り組み、評価システムを完成させる。昨年度は危険な転倒条件抽出を目的として,マルチボディー大腿部有限要素複合改良モデルを用い、歩行時に生じうる種々の転倒条件を再現するシミュレーションを行った。その結果、健常人では骨折はほとんど生じず、骨粗鬆症等による骨強度の低下を考慮することが重要であり,また骨や骨格筋の力学モデルや大腿骨等の有限要素モデルの再現精度を向上させて,解析精度をより一層向上させることが本質的に重要であることが明らかとなった.今年度はまず,骨格筋の力学特性に対する実験結果を整理し,精度の高い骨格筋改良モデルの構築を行うとともに,骨モデルの改良を行った.また骨盤モデルを追加したマルチボディー大腿部-骨盤有限要素複合モデルを新たに構築し,従来の転倒条件に加えて尻餅転倒のシミュレーションを実施した.

その結果,尻餅転倒による骨折の危険性が極めて高く,予防装具開発のための想定転倒条件に加えることが不可欠であることが明らかとなった.他方,前年度に転倒シミュレーション結果を再現でき、かつ簡便に評価できるプロテクタ評価試験機の構築を試みたが,今年度は,以上の結果をより忠実に再現できる本格的な落錘型ヒッププロテクタ有効性評価システムを構築した。人工骨に転倒を模擬した衝撃荷重を負荷して、加速度計、ロードセル、動ひずみ計等により各種物理量の出力を評価できるようにしたものである.各種ヒッププロテクタを装着して試験を実施し,有効性の評価を行った.今後データを追加した上で,成果をまとめて報告する予定である.
枯草菌の転写因子DegUによるポリグルタミン酸の生産制御に関する研究

γポリグルタミン酸は、枯草菌の近縁種である納豆菌のつくる粘りを持つ物質の本体であり、その合成酵素はpgsB遺伝子にコードされている。この遺伝子の発現制御に多機能性転写因子DegUが関わっていると予想し、その詳細の解明を目指した。DegUはリン酸化されて転写を活性化するが、DegU-PのpgsB制御領域への結合部位を塩基レベルで解明した。また、pgsBを正に制御するにはDegU-Pの細胞内濃度が非常に高くなる事が必要と分かった。さらに、DegU-Pを特異的に分解するプロテアーゼとしてClpCP複合体を同定し、試験管内で、ClpCPがDegU-Pを分解する事を示した。枯草菌の持つ2成分制御系のレスポンスレギュレーターDegUは,枯草菌のmotility,外来DNA取り込み能,分泌性プロテアーゼ生産,バイオフィルム形成、ポリグルタミン酸合成などを制御するグローバルな制御因子である。最近、DegUはリン酸化DegU(DegU-P)による自己制御性プロモーターを有する事が示された。本研究では、footprint実験と点変異プロモーターを持つlacZ fusionを用いて、DegU-PのdegUに対する結合部位を明らかにした。Footprint解析で、DegU-Pのみが転写開始点上流-106から-75塩基に弱く、-72から+7領域に強く結合した。前者も後者も、DegU標的配列GNCATTTAのdirect repeat、それぞれDR1とDR2、を含んでいた。EMSA分析で、これらの領域のDegU-Pに対する結合親和性を測定したところ,DR1は親和性が弱く,DR2は高かった事は、footprint実験の結果と良く一致した。次に、各種の点変異や欠失を持つdegU-1acZをamyEに導入した菌株を作製した。これらを用いて、野生型DegUとリン酸化が亢進する変異型タンパク質をコードするdegU32変異の2種の遺伝的背景でLacZ解析を行った。その結果、DR1は野生型DegUのもとではdegU転写に貢献せず、DegU32にのみ応答した。この事はDR1のDegU-Pに対する親和性が低い事と良く一致した。DR2は双方の遺伝的背景でdegU転写に重要だった。また、DR2に点変異を持つように染色体上のdegUプロモーター領域を改変した菌株を作製し、degU転写を測定したところ,ほとんど発現していなかった。この事はDR2のdegU転写における重要性を示している。γポリグルタミン酸合成酵素をコードするpgsBのCampbell型lacZ fusionを作製し、多コピーdegQと野生型swrAを導入した実験室株で発現を確認した。HisタグDegUを用いたDNA結合実験で、DegUはpgsBプロモーターの-35領域のすぐ上流に特異的に結合した。転写開始点より上流-44から-39塩基を取り除くと、DegUのpgsBへの結合とpgsB-lacZ発現がなくなったので、DegUはpgsBの活性化因子である事が判明した。従って、pgsB発現を理解するためには、DegU自身の発現制御を理解する事が重要である。DegUはDegU-Pで活性化されることが最近明らかにされているので、degU制御領域のどこにDegU-Pが結合するのかを調べた。その結果、転写開始点上流-39から-56塩基のdirect repeatにDegU-Pが結合し転写を活性化することが分かった。degU-lacZの発現解析とDegU抗体を用いたタンパク量の測定から、DegU-Pが選択的に分解されている可能性が示唆された。DegU-P分解に関わるプロテアーゼを特定するため、内因性プロテアーゼ遺伝子破壊株におけるDegUタンパク量を測定し、ClpCPを見いだした。クロラムフェニコール添加により、タンパク合成を停止させると、DegUタンパクは1時間でほぼ分解されたが、clpP, clpC破壊株では安定であった。さらに、DegUのリン酸化部位を別のアミノ酸に置換した株では、DegUタンパクは安定化されたので、DegU-Pが選択的に分解されていることが強く示唆された。DegUのリン酸化を亢進させる遺伝子degQとswarming motilityに必須な遺伝子swrAを実験室菌株に導入すると、PGA生産が起きることが既に知られている。そこで、DegUのリン酸化を亢進させる変異として知られているdegU32とswrAあるいはdegU32単独でPGA生産がどの程度起きるかを検討した。具体的には、pgsB-lacZ発現を測定し、遺伝子発現とPGA生産が比例して増大しているかどうかを調べた。

その結果、転写自体はdegU32単独で起きたが(およそ100ミラー単位)、検出可能な水準のPGAは生産しなかった。degU32とswrAが共存した場合、転写は単独に比べて3倍程度になり、PGAも5g/l程度生産した。多コピーdegQとswrAが共存した場合、転写は1000ミラー単位を超えたが、PGA生産は6g/l程度だった。PGA生産には、swrAがpgsB転写以外の何らかの理由で必須である事が分かった。次にDegUの能動的タンパク分解について検討した。DegUをIPTG依存的に発現させる系を用いて、N末端側のアミノ酸とC末端側のアミノ酸あわせて10残基をそれぞれ側鎖の短いアラニン残基に置換した変異型DegUを枯草菌に発現させた。この系で発現した変異DegUの中から、ClpCPプロテアーゼに抵抗性のDegUをWestern解析にて検索した。その結果、N末端側のアミノ酸変異(V4AとN5A)によりタンパク安定性が増大した。この変異型DegUを持つ菌株はDegUが制御する形質の一つである運動性(swimming motility)が増大していた。