hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
セラミック複合材料の超高速飛翔体衝突による損傷模擬試験に適した小型装置の開発

本研究は、熟練を要しない技術者が一人で操作できる、高い安全性を有するセラミック複合材料に適した次の仕様を満たす衝撃損傷試験装置を開発することを目的をしている。具体的な検討項目は、次の4点であった。(1)推進薬駆動とする。(2)各種飛翔体との衝突を模擬するため、色々な材質の飛翔体の速度計測が行える。(3)広範なセラミック複合材料をターゲット材料として試験できる。(4)飛翔体寸法と速度は、飛翔体直径×速度=10mmkm/s以上とする。これらの基準で、タービンブレ-ド材あるいは外壁材と異物粒子との衝突模擬シミュレーションとして十分満足できる。本研究で開発した装置は、推進薬とヘリウムを利用しており、直径8mm×長さ20mmのナイロン製サボ-を秒速2.5km/sで繰り返し飛翔させることができる。また、球状飛翔体として、直径4mmのスチールならびにMn-Znフェライトセラミック球を試料に衝突させ、速度を計測することが可能である。飛翔体とセラミック基複合材料試料の衝突時に材料内部を通過する衝撃波速度、試料の歪みを測定できる計測系を有している。損傷過程の観察を可能とする観察系を有している。本装置は、研究者1人で操作でき、日に2回の実験が可能である。さらに、本装置を用いて複合材料の強化担体であるセラミック織物、炭素繊維強化炭素複合材料(C/C)、C/Cのマトリックスである各種炭素材料について飛翔体衝突試験を行い、多くの新事実を発見した。以上の様に、本研究で開発した装置は、当初計画の性能を有しており、今後、本装置を活用した数多くの有意義な研究成果が期待される。本研究は、熟練を要しない技術者が一人で操作できる、高い安全性を有するセラミック複合材料に適した次の仕様を満たす衝撃損傷試験装置を開発することを目的としている。(2)各種飛翔体との衝突を模擬するため、飛翔体材質によらない速度計測が行える。(4)飛翔体寸法と速度は、飛翔体直径x速度=10mm km/s以上とする。これらの基準で、タービンブレ-ド材あるいは外壁材と異物粒子との衝突模擬シミュレションとして十分満足できる。現在までに、得られた成果は次の通りである。サボ-直径x速度=20mm km/sを達成した。当初計画の2倍の性能を有する高性能装置となっていることを示唆している。飛翔体速度計測装置を改良し、フェライト球ならびにSUS球を飛翔体とする場合には、秒速3.5kmの飛翔体の速度計測が可能であることを確認した。また、飛翔体速度をデジタル情報として記録するための半自動計測システムを構築した。これらのシステムを用いて、複合材料の強化材料である各種織物の衝撃損傷挙動の基礎実験を行った。1.7km/sまでの速度においてサボ-と飛翔体の分離が可能な分離治具を開発した。この治具を用いて、C/C複合材料ならびに黒鉛材料をターゲットとして衝撃試験を行い、クレータ生成、スポール破壊、層間破壊の各現象を観察した。さらに、この挙動が飛翔体材質に大きく依存することを見いだした。これらのことは、本開発装置が、各種セラミック基複合材料ならびにモノリシックセラミックスの衝撃による材料固有の損傷特性を評価できる装置であることを意味している。

(4)飛翔体寸法と速度は、飛翔体直径×速度=10mm km/s以上とする。これらの基準で、タービンブレ-ド材あるいは外壁材と異物粒子との衝突模擬シミュレーションとして十分満足できる。本研究で開発した装置は、推進薬とヘリウムを利用しており、直径8mm×長さ20mmのナイロン製サボ-を秒速2.5Km/sで繰り返し飛翔させることができる。また、球状飛翔体として、直径4mmのスチールならびにMn-Znフェライトセラミック球を試料に衝突させ、速度を計測することが可能である。飛翔体とセラミック基複合材料試料の衝突時に材料内部を通過する衝撃波速度、試料の歪みを測定できる計測系を有している。損傷過程の観察を可能とする観察系を有している。本装置は、研究者1人で操作でき、日に2回の実験が可能である。さらに.本装置を用いて複合材料の強化担体であるセラミック織物、炭素繊維強化炭素複合材料(C/C)、C/Cのマトリックスである各種炭素材料について飛翔体衝突試験を行い、多くの新事実を発見した。以上の様に、本研究で開発した装置は、当初計画の性能を有しており、今後、本装置を活用した数多くの有意義な研究成果が期待される。
非好塩性病原ビブリオの病原因子に関する研究

ビブリオ属菌には海水を本来の生息域としているものが多いが、非好塩性のため淡水域に生息しているものもあり、淡水産の水産物や飲料水による感染にも注意が必要である。非好塩性ビブリオの内わが国に常在するVibrio cholerae non-01(ナグビブリオ)とV・mimicusについて病原因子の検討を行った。数年間に渡り河川、池、湖沼での生態調査を行って多くの分離株を得ているので、これらの株についてウサギ結紮腸管ループテストなどの系を用いて病原性の評価を行い、かなりの環境分離株が病原性を持つことを示した。V.mimicusの株の中にはウサギ結紮腸管ループテストで陽性を示すが、コレラ毒素や大腸菌耐熱性下痢毒に類似した毒素を産生しない株があるので、このような株の病原因子について検討した。まず、下痢因子の可能性のある溶血毒素(VMH)について作用機構の検討を行った。VMHは浸透圧性の溶血を示したが、同様に浸透圧性の溶血作用を示す他のビブリオの溶血毒素とは若干異なった性状を示した。またVMHの膜への結合部位はガングリオシドと考えられるが、ガングリオシドのオリゴ糖部分、特に還元末端のガラクトースならびにこの糖と結合する1個のシアル酸の存在が重要であることが示された。一方、プロテアーゼの皮膚血管透過性亢進作用や血球凝集活性を前年度に示したが、これ以外に高分子の血球凝集因子(VMHA-2)の存在を見いだした。VMHA-2は単独でウサギおよびマウスの赤血球を凝集させるが、ニワトリ赤血球の凝集にはプロテアーゼの補助作用を必要とした。菌の腸管内定着におけるVMHA-2の関与については現在検討中である。さらに、ガングリオシド結合-酵素免疫測定法を生態調査に応用した病原性のナグビブリオの分布調査と種々のパラメーターとの相関性の検討などを行い、これら非好塩性病原ビブリオの食品衛生に対する影響を考察する上での情報を得ることができた。ビブリオ属菌の多くは低度好塩菌であるので、海水を本来の生息域としているが、非好塩性のため淡水域に生息しているのもあり、淡水産の水産物や飲料水による感染に注意を払わなければならない。このような観点で本年度はVibrio mimicusについての病原学的検討を行った。すでに、数年間に渡り河川、池、湖沼での生態調査を行って多くの分離株を得た。さらに、これらの株についてウサギ結紮腸管ル-プテストなどの系を用いて病原性の評価を行い、かなりの環境分離株が病原性を持つことを示した。病原株の中にはV.cholerae01と同様な毒素を持つものもあるが、多くの株の病原因子は不明であったので、株によりかなりの多様性があると予想し、病原因子の検討を行った。そのような株の一つから病原性発現に重要な役割を持つと思われるプロテア-ゼを精製した。これに用いた株はコレラ毒素あるいは大腸菌耐熱性毒素に類似した毒素は認められないが、培養上清で下痢性を示す。この際プロテア-ゼが必要であるが、プロテア-ゼ自身には下痢原性がないので補助的な役割を果たしているものと思われる。

このプロテア-ゼをモルモットの皮膚に接種すると皮膚血管の透過性を亢進させ、これが血漿キニンーカリクレイン系の活性化に基づくことが示された。プロテア-ゼには血球凝集活性があり、菌の定着に関与することが推定されるが、これにはプロテア-ゼ以外の補助的なファクタ-も関与していることを見いだした。一方、ここに用いた株は高い溶血毒素活性を示すが、この溶血毒素はエルト-ルコレラ菌の溶血毒素と免疫学的共通性を示し、陽管液体貯留活性を示すので多くの株ではこれが腸管毒性の本体である可能性がある。また、この溶血毒は細胞膜上のガングリオシドに結合し、浸透圧溶血機構により溶血することが示され、腸管毒性発現の機構解明に役立つ情報を得た。ビブリオ属菌には海水を本来の生息域としているものが多いが、非好塩性のため淡水域に生息しているものもあり、淡水産の水産物や飲料水による感染にも注意が必要である。このような非好塩性ビブリオとしてはコレラ菌(Vibrio cholerae 01)が代表的であるが、わが国には常在しないので、V.cholerae non-01(ナグビブリオ)とV.mimicusに注意を払わなければならない。前年度の報告のように、V.mimicusの株の中にはウサギ結紮腸管ループテストで陽性を示すが、コレラ毒素や大腸菌耐熱性下痢毒に類似した毒素を産生しない株があるので、このような株の病原因子について検討した。まず、下痢因子の可能性のある溶血毒素(VMH)について作用機構の検討を行った。VMHは浸透圧性の溶血を示したが、同様に浸透圧性の溶血作用を示す他のビブリオ(V.parahaemolyticus, V.vulni-ficusなど)の溶血毒素とは若干異なった性状を示した。またVMHの膜への結合部位はガングリオシドと考えられるが、ガングリオシドのオリゴ糖部分、特に還元末端のガラクトースならびにこの糖と結合する1個のシアル酸の存在が重要であることが示された。一方、プロテアーゼの皮膚血管透過性亢進作用や血球凝集活性を前年度に示したが、これ以外に高分子の血球凝集因子(VMHA-2)の存在を見いだした。VMHA-2は単独でウサギおよびマウスの赤血球を凝集させるが、ニワトリ赤血球の凝集にはプロテアーゼの補助作用を必要とした。菌の腸管内定着におけるVMHA-2の関与については現在検討中である。さらに、ガングリオシド結合-酵素免疫測定法を生態調査に応用した病原性のナグビブリオの分布調査と種々のパラメーターとの相関性の検討などを行い、これら非好塩性病原ビブリオの食品衛生に対する影響を考察する上での情報を得ることができた。
糖転移酵素および関連蛋白質の光アフィニティーラベリング

本研究の目的は、糖転移酵素群の遺伝子レベル、分子レベルでの解明を指向した光アフィニティーラベルを、独自の光アフィニティープローブを用いて実施することにある。これに向け、当該年度は当初の研究計画にしたがって、光反応性の新規糖鎖型プローブを合成し、これを用いる光アフィニティーラベルを検討した。1.糖転移酵素として、シアリルトランスフェラーゼおよびガラクトシルトランスフェラーゼに特異的な糖鎖骨格をリガンド部分とし、これに独自に開発したジアジリン系の光反応基を導入することで、反応性の非常に強いカルベン発生型の試薬へ誘導した。さらに、試薬構造中にはビオチン部分を内蔵させ、アビジン-ビオチン相互作用系を利用して、ラベル蛋白質の高感度検出、単離精製の両段階が特異的に行なえる分子設計の光反応性新規糖鎖型プローブを合成した。2.糖鎖構造がさらに複雑なリガンドについて、その糖鎖部分の合成段階を効率良く行なう新しい方法を検討した。ラクトサミン構造を対象として独自に開発したN-トロフルオロアセチルアミノ糖を基質とする、新しい酵素的合成法の適用を試みた。この結果、糖鎖型プローブ合成に有用な種々のN-トロフルオロアセチルラクトサミン誘導体を、収率良く合成することができた。3.また1.で合成した試薬を用い、実際の応用段階を検討した。ガラクトシルトランスフェラーゼの光アフィニティーラベルを実施し、ラベル結果の解析にビオチンの化学発光検出法を利用することにより、ラジオアイソトープを用いないで、ラベル蛋白質の高感度検出に成功した。
変異体情報に基づく回転モーター固定子タンパク質の立体構造モデリングと機能解析

我々はアミノ酸変異情報に基づいてプロトン駆動型べん毛回転モーターMotA/B複合体の膜貫通部位の立体構造モデリングを行い、プロトン透過のメカニズムを分子シミュレーションから明らかにした。MotA/Bは内部に疎水性のチャネルを持ち、プロトンはこの内部をヒドロニウムイオンとして透過することが明らかになった。細胞質ドメインが剛体的に運動すると仮定するとプロトン化・非プロトン化のサイクルによって、ラチェット的動きを誘起できることも示した。この研究成果は、現在はProc Natl Acad Sci USAに印刷中である。本研究では、プロトン勾配で駆動される細菌べん毛モーターの固定子であるMotA/Bとこれにホモロジーを持ちナトリウムイオンで駆動されるモーター固定子PomA/Bの立体構造を変異体情報に基づいて構築し、大規模分子シミュレーションによって機能のメカニズムを解明する。具体的には。イオン透過のメカニズムを明らかにし、べん毛モーター全体の機能解明の端緒とすることで、膜タンパク質が持つ未知の原理を探求することを目指している。そのために当該年度は、(1)プロトン駆動型べん毛回転モーターMotA/Bの立体構造モデリングと(2)MotA/Bの機能シミュレーションとメカニズム解明を主な課題として研究に取り組んだ。(1)プロトン駆動型べん毛回転モーターMotA/Bの立体構造モデリングに関しては、主に膜貫通へリックス部位予測による2次構造情報、Cys変異により得られた残基間の遠近情報、Trp変異による機能の喪失情報を用いてモデリングを行った。距離拘束条件としては、Cys変異により得られた残基間の遠近情報のうち、収率20%以上を基準とすると4分の1である41ペアが対象となり、対称性も含めて83の残基間ペアに距離拘束を与えた。これにより初期のモデル構造を生成したのち、更に露わに脂質分子・溶媒の水分子とイオンを含めた原子レベルの分子動力学シミュレーションを行って立体構造を精密化した。これらの計算ののち、最も矛盾が少ない立体構造を選び出した。また、(2)MotA/Bの機能シミュレーションとメカニズム解明のために、更に長時間シミュレーションによって立体構造変化と安定性・構造揺らぎの特徴を中心に解析をおこなった。平成23年度秋にタイで発生した大規模な洪水により、ハードディスクが予定量導入できず繰越を行ったが、平成24年6月に納入が完了し、研究を予定通り遂行することができた。MotA/B複合体は1本の膜貫通へリックスとペプチドグリカン結合ドメイン(PBD)からなるMotBの2量体を中心に、4本の膜貫通へリックス(TM1-4)をもつMotAの4量体が取り囲んでいると考えられている。その膜貫通部位のモデリングの段階である目的(1)プロトン駆動型べん毛回転モーターMotA/Bの立体構造モデリングは、23年度で完成し、その後、目的(2)MotA/Bの機能シミュレーションとメカニズム解明に取り組んできた。25年度は24年度から開始した水・ヒドロニウムイオン・ナトリウムイオンの透過シミュレーションの自由エネルギー計算の計算精度を、アンブレラポテンシャルの数を増やす等、いくつかの改善策を用いて計算精度を上げることに成功した。その結果、水の透過では予測通り自由エネルギー変化はないが、ヒドロニウムイオン・ナトリウムイオンでは透過によって十分なエネルギーの低下があることが確かめられた。また多数回のSteered MDシミュレーションによってもイオン透過の時間経過についても詳細な解析を行った。イオンチャネルには親水性のアミノ酸残基は少ないが、上記のシミュレーション中ではヒドロニウムイオンの透過時にはいわゆるWater wireが形成されることが観察された。これは水分子を媒介にしてプロトンが輸送されるという透過メカニズムを示唆している。具体的には、(1)プロトン駆動型べん毛回転モーターMotA/Bの立体構造モデリング、(2)MotA/Bの機能シミュレーションとメカニズム解明、(3)ナトリウムイオン駆動型べん毛回転モーターPomA/Bの立体構造モデリングと機能解明を目標とする研究を行うことでイオン透過のメカニズムを明らかにし、べん毛モーター全体の機能解明の端緒とすることで、膜タンパク質が持つ未知の原理を探求している。その膜貫通部位のモデリングの第1段階である(1)プロトン駆動型べん毛回転モーターMotA/Bの立体構造モデリングは、23年度で完成し、その後(2)MotA/Bの機能シミュレーションとメカニズム解明に取り組んできた。その結果、MotA/Bがプロトンを透過する過程のシミュレーションを本格的に行い、そのメカニズムの解析を開始することができた。

さらに、水・ヒドロニウムイオン・ナトリウムイオンの透過シミュレーションの自由エネルギー計算をSteered MDおよびUmbrella Samplingを用いて、開始した。これまでの結果からはUmbrella Samplingを持ちいた方が計算精度が高いと考えられるが、自由エネルギー計算の計算精度がまだ不十分であった。そこでこの改善策を検討を進めている。MotA/B複合体は1本の膜貫通へリックスとペプチドグリカン結合ドメイン(PBD)からなるMotBの2量体を中心に、4本の膜貫通へリックス(TM1-4)をもつMotAの4量体が取り囲んでいると考えられている。目的(1)プロトン駆動型べん毛回転モーターMotA/Bの立体構造モデリングは、23年度で完成し、その後、我々は目的(2)MotA/Bの機能シミュレーションとメカニズム解明に取り組んできた。26年度は、イオンの選択性が1アミノ酸の変化によってもたらされるという実験的な解析を受け、シミュレーションによってどのような変化がみられるかを検討した。その結果、検討した二つのアミノ酸変異はイオンチャネルの一番狭い領域の半径を変化させることが明らかになった。これはアミノ酸変化があると小さなイオンしか透過しないという事実とよく対応していた。つまり、アミノ酸の違いによるイオンチャネル構造の変化がイオン選択性と密接にかかわっていることを示せた。また、プロトン結合部位のであるMotBのAsp32をプロトン化した場合、MotAのヘリックス構造が変化することがシミュレーションから明らかになった。細胞質ドメインは今回の構造モデルには含まれていないが、これが剛体的に運動すると仮定するとプロトン化・非プロトン化のサイクルによって、細胞質ドメインの想定される回転子結合部位は平均5Å(最大11Å)変化することができることが示唆された。このことはプロトン透過が固定子の細胞質ドメインのラチェット的動きを誘起できることを意味する。これまでの研究すべてを取りまとめた論文を現在投稿中であり、近日中に出版されることを期待している。目的(3)ナトリウムイオン駆動型べん毛回転モーターPomA/Bの立体構造モデリングと機能解明に関しては、まだモデリングシミュレーションが進行中であるが、今後もこの研究を進めていく予定である。26年度が最終年度であるため、記入しない。生物物理学、計算科学、情報生物学26年度が最終年度であるため、記入しない。MotA/Bの機能シミュレーションとメカニズム解明が予定より早く進行し、プロトン透過シミュレーションの準備段階までを年度内に行うことができたから。年度当初の計画通り、イオンの透過シミュレーションの自由エネルギー計算の計算精度を、アンブレラポテンシャルの数を増やす等の改善策を用いて計算精度を上げることに成功した。
電子受容性π共役骨格を持つ遷移金属錯体触媒を用いた分子変換反応の開発

今年度は4,4'-ビピリジル骨格を基盤とした多座配位子および、対応するレニウム錯体の合成を行った。金属配位部分と4,4'-ビピリジル骨格に別々に置換基を導入することで、金属への電子供与能と外部からの電子受容能を独立に調整することができた。これは従来のレニウム2,2'ービリリジル錯体ではできなかった触媒のなチューニング法であった。実際にその酸化電位、還元電位に応じて二酸化炭素の電気化学的還元反応の活性に違いが出ることを見出した。これらの結果は二酸化炭素還元触媒の設計に新たな指針を与えるものである。また、ジアザポルフィリン鉄錯体の合成を行い、アルカンの触媒的酸化反応も検討した。エチルベンゼン誘導体だけでなく、アダマンタンやシクロオクタンの酸化反応も速やかに進行することを見出した。興味深いことに、類似の骨格を持つポルフィリン鉄錯体と比較し、より高い触媒活性を持つことを明らかにした。これはジアザポルフィリンの高い電子受容性のため鉄上の電子密度の低下に由来し、オキソ種の反応性の向上が理由であると考えている。実際に電気化学的測定により鉄上の電子密度が低下していることを確認した。また、予備的な反応速度解析によりオキソ種によるアルカンからの水素引き抜きが律速段階であることも明らかにした。今後は鉄オキソ錯体の直接的観測や詳細な反応速度解析を行うことで反応機構を明らかにし、より高活性な触媒の設計へとつなげたい。29年度が最終年度であるため、記入しない。申請者らは最近、ジアザポルフィリン鉄錯体を用いたアルカンの触媒的酸化反応の開発に成功した。従来より知られているポルフィリン鉄錯体より高い触媒活性を示すことを明らかにした。これはジアザポルフィリンの高い電子受容性が効果的に作用した結果であり、当初設計した指針が妥当であったことを示している。また、遷移金属ピリジノファン錯体の合成も検討し、ニッケルやコバルトを導入することができた。得られた錯体と種々の酸化剤との反応によりオキソ錯体が形成したことを質量分析により明らかにした。ニッケル錯体を用いたアルカンの酸化反応を検討したところ、反応が進行し、水酸化体が選択的に得られた。ジアザポルフィリン錯体、ピリジノファン錯体いずれを用いた場合でもアルカンの酸化反応が進行することを見出したため。得られた知見を元に触媒活性の向上を目指す。また、現在用いている酸化剤(ヨードソベンゼン)の代わりに酸素や過酸化水素を用いた反応の開発も検討する。
肝疾患サンプルを用いた肝細胞の細胞極性の数理的解明

肝臓のミクロ構造に注目してみると、各肝細胞は、血管系と胆管系の異なる2種の管に接するよう3次元周期的に配置されている。この3次元周期構造の自発的な形態形成メカニズムの数理的な理解のために、肝疾患モデルラットを作成し、その観察3次元像を用いて、形態解析を行った。数理モデルを用いて作成した3次元形態と比較し、血管形態のフラクタル指数などを用いた定量的解析を行い、形態変化の物理的要因を検討してきた。肝臓の微細構造をみてみると,肝細胞が血管系である類洞と毛細胆管に接した配置をしていて,それぞれ, 3次元特有のネットワーク周期構造をとっている.この3次元配置の数理的な解析するために,次の3つの視点に立った研究を行うことが目的である.(1)観察立体像からの肝細胞の接着方向解析:動物肝臓片を共焦点レーザー顕微鏡により観察し,コンピュータ上で3次元再構築を行った像を用いて,上皮細胞である肝細胞の隣接する細胞との接着方向性を解析し,数理的指標を用いて表す.これは国際誌に投稿審査中である.(2)肝疾患モデルによる微細構造の形態変化解析:肝疾患ラットを作成し,微細3次元構造変化を観察し, (1)で作成した指標などを用いて解析し,正常時と肝疾患時のそれぞれの類洞-肝細胞-胆管の3次元配置の変化の解析を行う.現在肝疾患モデル動物を作成していて,試料採取中である.(3)数理モデルを用いて3次元形態の要因特定研究:生物学的,解剖学的知見や観察像から得られた情報に基づいて4変数の偏微分方程式を用いた形態形成モデルを作成し,形成された構造と観察像を(1)で作成した指標などを用いて比較検討を行ってきた.この結果をまとめて,研究会で発表し,研究会誌に投稿した.また,実験で見られる3次元周期構造の可能性の可否を数理モデルを用いて検証した.この結果を国際誌に発表した.肝臓の微細構造をみてみると、各肝細胞が血管系である類洞と毛細胆管に接した3次元特有の周期構造である3次元共連結構造を取っている。そのため、その数理的な性質を捉えるためには、3次元空間での構造解析が必要になる。具体的には、次の2つの研究を行ってきた。(1)肝疾患モデルによる微細構造の形態変化解析:特殊な餌を与えて、ヒト脂肪肝炎によく似た症状を呈する脂肪肝ラットモデルを作成し、肝臓片を採取した。肝臓サンプルの共焦点顕微鏡像を取得し、管中の空白部分も含めた構造抽出などの画像解析を、反応拡散系モデルを用いて行った。画像解析中、モデル方程式のフィティングパラメータが疾患進行度と統計的な差がみられることを見いだし、とりまとめ国際紙に投稿した。(2)数理モデルを用いて3次元形態の要因特定研究:ラット発生段階を観察し、作成した4変数の偏微分方程式系数理モデルで得られるパターンと比較し、形態形成の性質、特に、肝細胞と各管の配置方向性に注目して解析を行った。結果をまとめ国際紙に投稿した。また、内部リズムによる運動性に関する観察について、最もフィットする数理モデルを統計的に検証することでその性質を解析した。この結果を国際紙に発表した。前年度まで、微細周期構造の特徴を抽出するのに、空間相関などの手法を用いた物理的指標開発を重点的に行ってきた。しかし、生物のパターンにどうしてもみられる局所性が含まれるため、きれいな周期のピークとうがうまく抽出できずにいた。しかし、元画像を外場として与える反応拡散系モデルを用いた管構造抽出手法を新たに構築すると、そのモデルから得られる3次元パターンの周期に寛容性が含まれるため、生体パターンの局所性をも含めた特徴抽出が可能になった。このことを利用して、モデル式のパラメータの関係を利用して、疾患モデルラット肝臓片3次元像から疾患進行度を抽出する指標作成などができるようになってきた。肝臓の微細構造を調べると、血管系である類洞、毛細胆管、肝細胞の列が織りなす3次元共連結構造を構成している。この構造を数理的に理解するために、次の2つの研究に取り組み、3次元の数理的な言葉の理解へ結びつけようと研究を進めてきた。以下具体的な研究項目を示す。(1)肝疾患による微細構造の形態変化解析:脂肪肝ラットモデルを作成し、その肝臓片の3次元微細構造を解析した。前年度作成した反応拡散系モデルを用いた画像解析プロトコルの改定を行った。疾患進行度と統計的な差が見られる事をとりまとめ、国際学会で発表を行い、国際紙に掲載した。また、このプロトコルを用いて多色染色時の像の解析への応用を考え、そのモデル方程式である反応拡散モデルの解の挙動の解析、ならびに効率的なプロトコル作成に取り組んできた。(2)血管系のフラクタルモデルを用いた研究:類洞網の共焦点レーザー顕微鏡像を画像解析すると、3次元フラクタル構造を示すことを示し、この性質から類洞の管径がべき分布するというモデルをたて、計算できる管の面積、体積、分岐の個数などを調べた。また、東京医科歯科大学との共同研究により類洞の血流をin vivoで観測データをもとに、類洞の張り巡らされている形状が、血流を流すという点についてその適応性を調べた。

この3次元周期構造の自発的な形態形成メカニズムの数理的な理解のために、肝疾患モデルラットを作成し、その観察3次元像を用いて、形態解析を行った。数理モデルを用いて作成した3次元形態と比較し、血管形態のフラクタル指数などを用いた定量的解析を行い、形態変化の物理的要因を検討してきた。共焦点レーザー顕微鏡観察像から3次元立体再構築像を用いた構造解析について,胆管ネットワーク配置は,結晶構造のような物理的にきれいな結果が出ず,どのように数理的に取り扱うかを注目した.肝細胞ネットワークやそのネットワークの界面に注目すれば,統一的な理解が可能であることがわかってきた.また,形態数理モデル作成では,解剖学的所見で言われてきている肝臓の基本単位である肝小葉内の部位性を数理モデルにさまざまな形で導入し,その影響を考え,解析し,肝細胞の研究者らから好評を得た.研究は順調に進んでおり当初の研究計画にそって進める予定である。とくに今年度作成してきた構造抽出のための画像解析手法において用いる反応拡散モデルのパラメータ利用について進展が見込めそうである。これは予定していなかった部分だがぜひすすめたい。数理生物学研究は順調に進んでおり当初の研究計画にそって進める予定である.とくに,類洞3次元ネットワーク構造についてボロノイ多面体との類似についてはこれから進展が見込めそうである.これは予定していなかった部分だが是非すすめたい.今年度開発してきた反応拡散系モデルを用いた画像解析手法から、そのモデル中のパラメータを用いて疾患モデルラットの疾患進行度を抽出する指標を作成した。現在用いられている染色による判定法やこれまで言われてきた指標と私たちの提案している指標とを比較、検証することが必要であるし、本研究遂行に重要であった。そのため、1部計画していた実験が後回しになってしまった。26年度の京都府立医科大学教養校舎の校舎移転のため,実験場の許可が下りるのが遅れた.そのため,形態観察のために必要な抗体選定が遅れた.肝臓片の観察は当初から27年度本格的に始める予定であったが,その準備のために計上していた金額が多少次年度使用に持ち越しとなってしまった.27年度末から類洞構造抽出のため、血管鋳型作成をはじめてきている。順次、観察、そしてその構造の解析を行っていく予定である。26年度末から疾患モデル動物を作成しだした.順次,肝臓片の摘出,観察を行っていく予定である.
肝臓でのアミノ酸シグナルによる代謝臓器間ネットワークの解明

メタボリックシンドロームの病態は、肥満を共通基盤として糖・脂質の代謝バランスの調節異常が寄与している。アミノ酸は、糖・脂質と共に三大栄養素であるが、肥満の形成過程で糖・脂質代謝といかなる連携や制御異常を来すのか、また代謝臓器間ネットワークに及ぼす影響に関して解明されていない。本研究では、遺伝子工学的手法に基づき、組換えアデノウイルスを用いて肝臓でのアミノ酸代謝とその下流のシグナル経路を活性化させたモデルマウスを作製する。現時点では、このモデルマウスの解析の中で、肝臓のアミノ酸代謝及びその下流のシグナル経路を活性化すると、全身の脂質代謝に変化を認める結果が示唆された。1,アミノ酸トランスポーター及びmTOR経路活性化因子Rhebを遺伝子組換え法にて組み込んだアデノウイルスの維持ー(1)課題番号23791011において作製したアミノ酸トランスポーター(SNAT2)を組み込んだアデノウイルスを培養細胞を用いて系統維持を継続した。(2)課題番号23791011において作成したmTOR経路活性化因子Rhebを組み込んだアデノウイルスを培養細胞を用いて系統維持を継続した。2,SNAT2及びRhebアデノウイルスを肝臓に発現したモデルマウスの解析ー(1)SNAT2、Rhebアデノウイルスを用い、後天的に肝臓に過剰発現したモデルマウスを作製した。(2)モデルマウスにおいて、実際に肝臓でのアミノ酸含有量は増加しており、また肝臓におけるmTOR/S6K経路は活性化していた。また、代謝パラメーター解析の中で、対象群に比べて血清脂質プロファイルに変化を認めた。3,他の組織・臓器に及ぼす影響の検討ー上記にて認められた、脂質代謝に変化を及ぼす関連遺伝子の変化の中でリポ蛋白リパーゼ(LPL)に注目した。LPLの産生部位には、心筋や骨格筋といった筋組織や、白色脂肪の脂肪組織などが列挙され、前者では特に発現変化は認めなかったが、後者では発現の低下を認めた。4,白色脂肪組織でのLPL変化についての機序の検討ー遠隔の脂肪組織での変化を考えるうえで、肝臓から脳への求心性の神経系の関与を想定した。前もってマウスの迷走神経肝臓枝の選択的な切断術を施行し、そこに肝臓に遺伝子導入を行ったモデルマウスを作製した。このマウスでは対象手術群に比べて、白色脂肪組織でのLPLの発現の減少がキャンセルされていた。1.肝臓へのSNAT2及びRheb発現による糖・脂質・エネルギー代謝状態に与える影響の解析ー肝臓への組換えアデノウイルス投与により、肝でのアミノ酸代謝と下流のmTOR経路を変化させたモデルマウスの解析から、食後の血中中性脂肪とカイロミクロンの上昇を認めた。脂肪組織でのリポタンパクリパーゼ(LPL)の発現減少を認めたことから、本年度は、実際の血中の中性脂肪加水分解の程度を検討したところ、減少していた。2.肝臓へのSNAT2及びRheb発現による脂肪組織LPLに与える影響の解析ー昨年度は、肝臓から脳への迷走神経を切断することを行い、本年度は求心性神経線維を選択的に遮断できる薬剤を用いて薬理学的に遮断することを行った。どちらにおいても、肝臓から脳への神経経路への介入により、肝臓への遺伝子導入後の脂肪組織でのLPLの発現減少が抑制された。3.メタボリックシンドロームの病態形成への関与の検討ー過栄養や肥満の状況では、血液中及び肝でのアミノ酸含量が増加していること、肝臓でのmTOR/S6K経路が活性化していることが報告されている。本年度は、この点に着目して、遺伝的肥満病態モデルマウスを用い、dominant negative S6Kinaseアデノウイルスを用いて肝臓のmTOR/S6K経路を抑制した場合の代謝変化を検討した。その結果、preliminaryながら血清中性脂肪の減少を認めた。今後は、その機序や病態生理学的意義に関して検討を行う予定である。医歯薬学平成25年度の研究実績と現在の進行状況に関して、当初の研究計画書の内容に即して簡潔に記載した。現在、研究は進行中であるが、肝臓への局所的な遺伝子導入がmTOR経路を変化させ、迷走神経を介して遠隔臓器の脂肪組織へ影響を及ぼすという有望な研究結果を得ている。平成26年度は、この遠隔臓器への影響の詳細なメカニズムに迫ることを中心に考え、検討を進めていく予定である。平成26年度は、上記の研究実績に委細の、肝臓への局所的な遺伝子導入による遠隔臓器への影響の詳細なメカニズムの解明を主目的に据えて研究を継続する予定である。第一に、求心性神経繊維の選択的な遮断剤を用い、迷走神経周囲に処置を行うことで、求心性神経経路の遮断を試みる。

こうして作製されるモデルマウスに、前年度と同様に、アデノウイルスを用いて肝臓に選択的に遺伝子導入を行うことで、対象処置群に比較していかなる差異を生み出すか、主として検討する。
微小電極間に架橋した単一分子のスピン輸送特性の解明

本研究では単一機分子のスピントロニクスデバイスとしての可能性に着目し、機械制御破断接合(MCBJ)法を用いて単一分子のスピン輸送特性を実験的に明らかにする研究を行った。まず極低温にてニッケル電極間にベンゼンジチオール(BDT)単分子が架橋した単分子接合を形成し、磁場強度を0Tから0.25Tの範囲内で変化させながら接合のコンダクタンスを統計的に求めた結果、磁場強度のスイープ方向の違いによる抵抗変化のヒステリシスが観測された。これは外部磁場の印加により両電極の磁化方向が平行、および反平行な状態が実現し、それに応じて抵抗が変化していること、すなわち単分子接合がスピンバルブとして機能していることを示している。また得られた磁気抵抗率は80%150%であり、これらの値は非磁性層がトンネル障壁であるスピンバルブにおいて観測されている磁気抵抗率の値よりもはるかに大きい。このことはπ共役性の単分子接合に対して理論的に予想されていた特徴的な磁気抵抗特性と定性的に一致している。さらに個々の接合の電流-電圧(I-V)特性の観測にも成功し、印加磁場の強度によってI-V特性の非線形性が異なることが明らかになった。この結果はπ共役性分子を用いた単分子接合において、理論的に予想されていたような電極の磁化方向による接合の電子透過スペクトルの形状の変化が確かに生じることを実験的に示すものである。単分子接合におけるスピン輸送特性の詳細を実験的に調べた研究例はこれまでに殆ど見られない。本研究により得られた結果は、従来の分子エレクトロニクスとスピントロニクスが融合した分子スピントロニクスと呼ばれる新しい分野の発展の礎となることが期待される。
爬虫類、鳥類、哺乳類における大脳皮質の進化：グルタミン酸ニューロンによる証明

本年度は鳩の脳内に存在するグルタミン酸作動性神経細胞を形態的に調べ、その神経連絡回路を解明することとした。実験の結果、聴覚神経節にvGluT2 mRNAが発現しており、AMPA型、カイニン酸型とMNDA型の3種類のグルタミン酸受容体も聴覚神経節細胞に発現していた。蝸牛核も3種類の受容体が強く発現していることから、聴覚神経節細胞はグルタミン酸作動性神経細胞の可能性が高い。vGluT3発現神経細胞は脳では縫線核に、網膜ではアマクリン細胞に発現している事を見出した。これらの結果をこれまでに得られたデータと総合すると、鳥類の神経系ではvGluT2とvGluT3が存在していることがわかった。本年度は昨年に引き続きは鳥類の脳内のグルタミン酸作動性神経細胞を形態的に調べ、その神経連絡回路を解明した。グルタミン酸作動性神経細胞を同定するために、VGLUT-2あるいはグルタミン酸受容体のmRNAをin situ hybridization法により研究を進めた。in situ hybridizationではグルタミン酸作動性神経細胞の細胞体の局在を調べることができるが、投射先は追跡できない。それ故、逆行性トレーサーを利用した神経路標識法も合わせて行った。今年の研究は鳩では聴覚系と嗅覚系を調べ、ゼブラフィンチでは脳全体に発現しているVGLUT-2mRNAを検索した。研究成果は以下の学会でポスター発表を行った。2.阿閉泰郎:鳩における前梨状皮質の投射様式。第36回日本神経科学大会2013.本年度は鳩の脳内に存在するグルタミン酸作動性神経細胞を形態的に調べ、その神経連絡回路を解明することとした。【目的】鳥類の大脳外套の投射神経細胞の基本は哺乳類大脳皮質と同様グルタミン酸作動性である。本研究は鳥類の脳内のグルタミン酸作動性神経細胞を形態的に調べ、その神経連絡回路を解明することである。グルタミン酸作動性神経細胞を同定するために、2型小胞性グルタミン酸トランスポーター(VGLUT-2)あるいはグルタミン酸受容体のmRNAを利用したin situ hybridization法により研究を進めた。in situ hybridizationではグルタミン酸作動性神経細胞の細胞体の分布を観察できるが、その投射先は確認できない。そのため、順行性と逆行性の性質を有するトレーサーを利用した神経路標識法も合わせて行った。【成果】今年の研究は鳩では聴覚系と嗅覚系を調べ、ゼブラフィンチでは脳全体を検索した。(学会発表蘭参照)本年度は昨年に引き続き、鳩の脳内に存在するグルタミン酸作動性神経細胞を形態的に調べ、その神経連絡回路を解明することとした。また末梢神経である聴覚神経節(哺乳類のラセン神経節に相当)と網膜のグルタミン酸作動性神経細胞を調べた。グルタミン酸作動性神経細胞を同定するためには2型小胞性グルタミン酸運搬体(vesicular glutamatetransporter 2, vGluT2)を選び、またグルタミン酸受容体細胞を確認するためにイオンチャネル型グルタミン酸受容体(AMPA, kainate, NMDA型)のmRNAを利用したin situ hybridization法により研究を進めた。これに加えて、3型小胞性グルタミン酸運搬体(vGluT3)の解析も同時に行った。実験の結果、聴覚神経節にvGluT2 mRNAが発現しており、またAMPA型、カイニン酸型とMNDA型の3種類のグルタミン酸受容体も聴覚神経節細胞に発現していた。脳幹の蝸牛核にも同様に3種類の受容体が強く発現していることから、聴覚神経節細胞はグルタミン酸作動性神経細胞の可能性が高い。鳩の聴覚系でのグルタミン酸作動性神経細胞の分布を把握することができた。哺乳類ではvGluT1, 2, 3が存在していることから、鳥類ではvGluT2が哺乳類のvGluT1とvGluT2の役割を果たしていると考えられる。しかしながら海馬-中隔核のグルタミン酸投射路を証明する逆行性トレーサーを利用した神経路標識法では、解析に必要なデータが十分に得られなかった。神経解剖学鳩とゼブラフィンチの脳でグルタミン酸作動性神経細胞の分布を把握することができ、両種で比較することができた。

1)鳩AMPA型とMNDA型のグルタミン酸受容体は蝸牛神経節細胞に発現しており、また蝸牛核にも同受容体が強く発現していることから、蝸牛神経節細胞はグルタミン酸作動性神経細胞の可能性が高い。また3型小胞性グルタミン酸トランスポーター(VGLUT-3)を発現している神経細胞を検索し始めた。2)ゼブラフィンチグルタミン酸作動性神経細胞は脳内に広く分布しており、特に歌回路に多くかかわっていることが確認できた。VGLUT-2が終脳外套に発現し、基底核に発現しない事が判明し、これは鳩との所見と同じであることがわかった。鳩とゼブラフィンチの脳でグルタミン酸作動性神経細胞の分布を把握することができた。この成果はまだ一部ではあるが、計画が一歩前進した。1)鳩蝸牛神経節細胞がグルタミン酸作動性神経細胞の可能性が高く、またグルタミン酸作動性神経細胞が関与すると思われる嗅皮質を同定することができた。予測される神経連絡の一部が解明できたが、まだ広範囲な部位で手着かずのままである。グルタミン酸受容体の分布も一部しか解明できていない。今後はin situ hybridizationに使用するvGluT2と受容体のプローブの精度を挙げることでより詳細で、広範囲でグルタミン酸作動性神経細胞の神経回路を見出せるものと考える。in situ hybridizationと線維連絡法を組み合わせる2重染色を行うことで、手始めに海馬ー中隔路を解析する予定である。またin situ hybridizationと線維連絡法を組み合わせることで、より確実な成果を得ることが期待できる。研究費の使用計画1)消耗品:in situ hybridizationと線維連絡法で使用する試薬、ガラス器具を購入。2)旅費:研究成果を発表するための国内学会旅費(日本解剖学会、日本神経科学学会)
地上分光撮像観測による金星大気化学・力学過程の研究

金星大気の謎を解明するため地上から赤外分光観測を行った。最大の力学的謎は大気の「超回転」と呼ばれるもので、惑星本体の60倍の速さで大気が回転している。分光観測から大気中の波を検出し、それらによる運動量輸送の考察から超回転維持機構解明を試みた。また最大の化学的謎は「CO2大気安定性問題」と呼ばれるもので、主成分であるCO2が安定に再生され96%に保たれている過程が解らない。分光観測によりHCl・COなど微量成分半球分布を測定し、Cl触媒サイクルなどによるCO2再生経路を検討した。雲上のCO混合比を導くため、次の2ステップの操作を行なった。(1)CO_2線の吸収等価幅の観測値と計算値が一致するようにモデル大気中での雲高を調整し、最適高度偏差を決定する。雲モデルにはPollack他(1993)を修正したものを用いた。(2)得られた雲高偏差を考慮しつつ、CO線の吸収等価幅の観測値と計算値が一致するように、雲上でのCO混合比を決定する。この測定の代表高度は60-65km。この方法では副産物として雲高偏差の半球分布が得られる。緯度50度付近から雲高が下がりはじめ、極(70度以上)では赤道に比べ5-10km低いという分布が得られた。この傾向はこれまでの他の観測とおおむね一致する。CO混合比の半球分布に関しては、特徴的構造はなくほぼ一様という結果を得た。緯度分布に関しては過去に一測定例があるが、半球分布に関しては類例がない。雲下では高緯度で赤道に比べ数割多いという分布が得られており、子午面循環中での化学反応により説明されているため、雲上でも類似の分布を予想していたが、はずれた。今回得られた一様な半球分布は速い水平渦拡散の結果と解釈することができる。この結果を論じた報告はICARUS誌に受理され、12月22日にはweb上で公表された。平成22年8月の東方最大離角時における、ハワイ・マウナケアNASA・IRTFでの観測申請が受理され、現地時間8月2-9日の8タを割り当てられた。申請タイトルは"Detection of waves in the Venus'atmosphere by mapping the CO_2 absorption"だったが、この観測では副産物として雲上HDO混合比の定量にも成功した。主に1.7μm域と2.3μm域で分光撮像を行い、CO_2 P24 5838cm^<-1>線およびCO_2 R12 4426cm^<-1>線付近のスペクトルを昼半球全面にわたりドリフト・スキャンを用いて観測した。冷却システムのトラブルなどもあったが、天候は良好でほぼ8日分のデータを得ることができた。HDOは4116cm^<-1>域で測定した。CO_2吸収に関しては吸収等価幅を求めて緯度・経度座標に展開し、8日分をつなぎ合わせてからフーリエ的に解析した結果、周期5.5日波数1の波を見出した(代表高度は60-65km)。この高度域は紫外でみえる高度70kmと夜側赤外でみえる高度50kmの中間となっており、波検出の前例はない。HDOに関してはS/N比をかせぐため経度固定・緯度3区分で観測した。顕著な緯度分布は見られなかった(代表高度は62-67km)。D/H比に関しては地球標準値の140倍となり、最近話題となっているD/H比の高高度増大(雲下30kmで100倍、高度90kmで240倍)を裏付ける結果となった。CO_2吸収による大気波動検出は修士論文となり、4月の欧州地球科学連合で発表予定。現在投稿論文準備中。HDOに関しては投稿論文をほぼ完成し、現在英文添削中。また金星探査機「あかつき」搭載カメラの実行可能性を検討した論文(Takagi and Iwagami, 2011)はEarth Planets and Space誌に受理された。平成23年度には金星の観測好機はなかったが、成果の解析・発表が進展した。平成22年8月に観測成功した金星雲上のHDO混合比の論文はICARUS誌に掲載された。この結果と欧州の金星探査機Venus Express搭載の分光装置SOIRとの間の整合性に疑問が生じたため、院生をSOIRチームの本拠ブラッセルに1か月派遣して情報収集を行い、矛盾はないことを確かめた。この結果は彼の修士論文にまとめられた。同時に観測したCO_2吸収を利用した大気波動検出はICARUS誌に投稿し、現在は査読者の意見を受けて改稿中。査読者の強い要請に従って、放射輸送・スペクトル解析の手法を改良した結果、高度60km付近における大気波動の姿がさらに明らかになってきた。

ここでは、この60kmという高度に意味がある。これまで、大気波動の観測は昼面の紫外光による高度70kmと、夜面の赤外光による高度50kmに限られていた。それらの中間高度にあたる60kmにおける大気波動の検出は、このような波が大きな役割を担っていると予想される大気超回転現象の加速メカニズム解明に貴重な情報をもたらしうる。また、同じく同時に観測していた雲上方のもや層に関しても、あてにしていた「あかつき」からのデータが数年間入手できなくなったため、これもSOIRからのデータを代用することとし、院生をブラッセルに3か月派遣して情報収集にあたらせた。この結果は4月の欧州地球科学連合大会で発表予定。前回2010年8月に観測したCO2吸収を利用した大気波動検出はICARUS誌に投稿し、今年4月に受理された。査読者の要請に従って、放射輸送・スペクトル解析の手法を改良した結果、高度60 km付近における大気波動の姿が明らかになってきた。この60 kmという高度に意味がある。これまで、大気波動の観測は昼面の紫外散乱光による高度70 kmと、夜面の赤外熱放射光による高度50 kmに限られていた。それらの中間高度にあたる60 kmにおける大気波動の検出は、このような波が大きな役割を担っていると予想される大気超回転現象の加速メカニズム解明に貴重な情報をもたらしうる。また、同じく同時に観測していた雲上方のもや層に関しても、あてにしていた「あかつき」からのデータが数年間入手できなくなったため、これも欧州の金星探査機Venus Express搭載のSOIR分光計からのデータを援用することとし、院生をブラッセルに3か月派遣して情報収集にあたらせた。この結果はその院生が4月の欧州地球科学連合大会で発表した。このSOIRデータにおける発見部分を軸として、この院生の博士論文としようとしたが、各種の不充分点が指摘され、現在はそれらの検討・対策を進めており、今年末に再挑戦を予定している。平成24年度には内合後の7月にハワイ・マウナケア山頂のNASA・IRTFを用いて金星夜面の大気光による大気波動検出と昼面散乱光による酸素同位体比の測定を試みた。さらに次の内合前の平成25年11月に再度の観測をすべく提案書を3月に提出した。2012年7月のマウナケアIRTFにおける観測データのうち、酸素同位体異常に関してはδ17Oとδ18Oの同時定量に成功し、金星におけるδ17Oのδ18Oに対するプロットが地球・月システムのそれと誤差範囲で一致することを世界で始めて示した。このことは原始太陽系雲中での物質輸送・攪拌に関し重要な意味を持つと思われる。この件は2013年6月のイタリア・カターニャにける国際金星会議で発表し、さらに雑誌投稿した結果2014年10月に受理された。院生の高木聖子をブラッセルに派遣して収集した欧州VEX衛星SOIRセンサの金星上部もや層データからは「高度90km以上でもや混合比が増えている」という新発見があり、これを軸として高木は2014年3月に学位を得た。この高高度もや増大は一見不自然だが、SO・SO2混合比にも類似現象が指摘されており、金星大気化学において現在解決すべき最重要問題を提起していることになる。2014年5月にはマウナケアIRTFにおいて60km波動をねらって10日間の観測を行い、1.7μmのデータを取得した。
軟骨細胞における代謝リプログラミングのメカニズムと役割の解明

本研究では、関節軟骨細胞の変性におけるmetabolic reprogrammingの意義と代謝経路の機能解析を行い、炎症下における嫌気性解糖(glycolysis)の亢進の抑制をもたらす薬剤の検討、更には新たな変形性関節症発生抑制の可能性を探っている。昨年度までに我々のin vitro実験系における解糖系代謝リプログラミングを細胞外フルックスアナライザー(Agilent Technologies社製)で評価する方法を確立した。牛関節軟骨細胞における過剰メカニカルストレスモデルとしてGSK101を添加することでglycolysisが亢進していることを確認した。またこれまでに我々はglycolysis阻害剤の一つである2-Deoxy-D-glucose (2-DG)が軟骨細胞の変性を抑制することを確認しているが2-DG以外のglycolysis阻害剤の有用性についての検討としてヒアルロン酸(HA)を使用した。牛関節軟骨細胞をIL-1βで刺激すると細胞外フルックスアナライザーにおいてglycolysisが亢進するがHAはこれを抑制することを認めた。同時にRT-PCR法でglycolysis関連遺伝子であるGlut1、LDHAの発現亢進を確認した。HAのレセプターの一つであるCD44を同時添加するとHAのglycolysis抑制作用は消失した。これによりHAの効果はCD44を介していることを確認した。次にGlycolysis阻害剤である2DGの新たな作用機序としてAMPKの挙動を確認したところ軟骨細胞にIL-1βで刺激すると活性型AMPKは低下し、2DGはこれを維持することが明らかとなった。以上に加えて今後さらなる解析を進める予定である。本研究の主題である軟骨変性モデルにおけるmetabolic reprogrammingのメカニズムの検討については細胞内の活性型AMPKの低下を認め、2DGはこれを阻害することを確認できた。炎症以外の軟骨変性である過剰メカニカルストレスモデルとしてメカノレセプターのTRiPV4を刺激するGSK101がglycolysisを亢進させることが確認できておりメカニカルストレスが軟骨におけるmetabolic reprogrammingを誘発することを強く示唆された。以上より次に変形性関節症モデルマウスを用いた実験を行う必要があり、現在準備をすすめており本年度開始する予定である。またin vitroで軟骨保護作用を確認できたglycolysis阻害剤である2DGを変形性関節症モデルマウスを用いて検討する予定である。本年度までに上記検討を行ってきたことより、来年度はin vitro、in vivoの各々の研究を進める予定である。In vitroとして2-DGより選択性の高いglycolysis阻害剤としてPDK-1阻害剤であるdichloroacetic acid (DCA)を使用してその効果を変形性関節症軟骨細胞モデルで検討することである。またメカニカルストレスモデルとしてストレッチチャンバー上で培養し、伸展刺激を加えて過剰ストレス環境を作成して検討する。いずれにおいてもこれまでの検討の延長上に進行していく。またin vivoとして変形性関節症モデルマウスを作成してglycolysis阻害剤である2DGやDCAについて検討を進めていく予定である。In vitroとして2-

DGより選択性の高いglycolysis阻害剤としてPDK-1阻害剤であるdichloroacetic acid (DCA)を使用してその効果を変形性関節症軟骨細胞モデルで検討することである。またメカニカルストレスモデルとしてストレッチチャンバー上で培養し、伸展刺激を加えて過剰ストレス環境を作成して検討する。いずれにおいてもこれまでの検討の延長上に進行していく。またin vivoとして変形性関節症モデルマウスを作成してglycolysis阻害剤である2DGやDCAについて検討を進めていく予定である。(理由)in vitroの細胞外フルックスアナライザーを用いた実験を多数施行予定であったが予想したよりも順調にデータを出すことが出来たため、残金が生じた。(使用計画)来年度以降も、in vitroおよびin vivoの検証実験を行っていくため、主に物品費として使用する計画である。