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新しい理論的枠組みによる宇宙の時空構造の解析

(1)スペクトル情報による時空構造の研究。昨年度に引き続き、自明でない時空構造、特に重力崩壊におけるスペクトル発展の研究を集中的に行った。昨年度に一通り完成した、「回転圧効果を考慮した円筒対称重力崩壊時空」(z軸方向の対称性があるモデル)の研究を相当一般化し、軸対称重力崩壊時空(z軸方向に対称性を課さない、より一般性の高いモデル)を中心に分析を行った。このモデルは、重力崩壊の最終段階に関する未解明の予想(Hoop予想)の詳しい解析に極めて有効であり、学術的意義が大きい。基本的定式化と解析手法の開発が完成し、具体的な解の振る舞いとそのスペクトルによる記述の分析に取り組める段階まできた。現在も進行中である。(2)時空上の準正規モードの物理的意味を解明する研究。時空のスペクトル情報のより深い理解を進めるため、昨年度の研究成果をふまえながら、準正規モードの物理的意味の解明に取り組んだ。種々の一次元ポテンシャル・モデルを設定し、量子力学の枠組みの中で、数値解析を援用しながら具体的な解析的研究を行った。波束がポテンシャルで散乱されながら無限遠方に散逸していく過程への準正規モードの関与に着目した。昨年度、定常的なポテンシャルによる散乱過程には準正規モードが一切関与していないことを解明したが、本年度はこれをふまえて、時間変動するポテンシャルの散乱過程について詳しく解析した。その結果、初期条件に依存しない散乱波の振る舞いが見出され、準正規モードが関与していることがほぼ解明された。このことから、準正規モードは、非摂動的背景上のポテンシャルの時間変動により励起されることが解った。現在は、この結果の確認と、一般論による理論的説明に取り組んでいる。(3)スペクトル・スキームを活用した「宇宙論の平均化問題」の解析に着手した。これまでの理論形式を再検討し、基本的結果についてのまとめと拡張を行った。この問題は宇宙論の根幹に関わる非常に深遠な未解決問題のため、助成期間中だけで完結するわけにはいかないので、来年度以降は、これを最重要テーマとして取り組む予定である。(1)Hawking輻射のスペクトル距離による意味づけ。ブラックホール時空におけるHawking輻射が、無限過去領域と無限未来領域の間のスペクトル距離と解釈できることを明らかにした。ブラックホールの熱力学的振る舞いを、より一般の時空に拡張することは理論的に非常に興味深い。本研究の意義は、スペクトル・スキームの利用によって、そのような拡張の可能性を示したもので、引き続き追究したいと考えている。(2)重力崩壊や特異点を含んだ、自明でない時空構造をスペクトル情報で記述する研究。今回は、軸対称重力崩壊の時空の解析的な分析を行った。まず軸対称な一般の時空の幾何を簡明に記述出来る枠組みを構成し、時空の接続条件などの基本的関係式を導き出した。その過程で他者の研究結果の不備が明らかになった。今後、重力崩壊に伴うスペクトルの時間発展の詳しい解析、および摂動の時間発展とスペクトルの関係について詳細な分析を進める予定である。(3)時空上の準正規モードの研究。スペクトル情報の意義を明らかにするため、準正規モードの物理的意味の解明、及びスペクトル・スキームとの関係の分析を行った。準正規モードの役割・意義はまだ十分理解されていない。今回は扱いやすい種々のポテンシャルのモデルを設定し、具体的な解析的研究を行い、先行する種々の分析結果とも比較しながらその解釈を行った。関連して、トンネル現象における時間・不安定系の崩壊時間等を統一的に記述出来る新しい枠組みの構成にも取り組んでいる。(4)宇宙論においては、無限の時空幾何学の情報から有限の価値の高い情報を取り出す過程が本質的に重要であると考えられる。スペクトル・スキームはこれを観測スケールの関数として系統的に記述しようとするものであるが、無限量と有限量の関係のさらなる理解が必要とされる。今回は、最も根本にある集合論と論理に立ち返って、この点を再検討した。(1)時空構造をスペクトル情報で記述する研究。重力崩壊や特異点を含んだ、自明でない時空構造の場合の研究を昨年度に引き続き集中的に行った。具体的に扱いやすく内容が豊富なモデルとして、回転圧効果を考慮した軸対称重力崩壊の時空を中心に解析した。これについては(A)z軸方向に対称性を課したモデル、および(B)z軸方向に対称性を課さない、より一般性の高いモデル、の双方について分析を行った。(A)は、昨年度の段階で、先行する他者の研究結果の不備を明らかにし、回転圧効果により、一般に特異点が形成されないことを見出していたが、今回はこれに定理としての厳密な証明を与えて論文化し、最終的に決着をつけた。(最終結果をまとめた論文は現在審査中)。(B)は、物質分布をかなり自由に変更できるため、物質の初期配置と重力崩壊の最終段階との関係に関する研究に有用であると考えられる。モデル(A)の解析手法を拡張する形で、引き続き分析を行う計画である。スペクトル情報の意義を明らかにするため、準正規モードの物理的意味の解明に取り組んだ(この一部は、所属研究グループにおいて、博士後期課程院生も交えて共同研究の形で行った)。種々のポテンシャル・モデルを設定し、量子力学の枠組みの中で、具体的な解析的研究を行った。

波束がポテンシャルで散乱されながら無限遠方に散逸していく過程に準正規モードが関与していると当初予想したが、この現象には準正規モードが全く関係しないことが明らかになった。Rindler時空上でも同様の解析を行ったが結果は同じであった。このことは、準正規モードは、通常の散乱問題の範疇では捉えきれない物理現象と関連していることを示唆している。言い換えると、通常の枠組みを拡張する必要のある現象(トンネル時間・不安定系の崩壊時間等)をも視野に入れた解析が有効であることが予想される。このため、これらの現象を統一的に記述出来る新しい枠組みの構成も視野に入れながら、現在も研究を続行している。(3)スペクトル・スキームは、無限個の時空幾何学の情報を取捨選択して、有限個の価値の高い情報のみを抽出する枠組み、と捉えることもできる。このような幾何情報の取捨選択が、宇宙論にとってどのような意味を持つのかは非常に重要な問題だと思われる。昨年度に引き続き、集合論と論理、情報理論、カオス理論などを援用しながら、この点を検討した。(1)スペクトル情報による時空構造の研究。昨年度に引き続き、自明でない時空構造、特に重力崩壊におけるスペクトル発展の研究を集中的に行った。昨年度に一通り完成した、「回転圧効果を考慮した円筒対称重力崩壊時空」(z軸方向の対称性があるモデル)の研究を相当一般化し、軸対称重力崩壊時空(z軸方向に対称性を課さない、より一般性の高いモデル)を中心に分析を行った。このモデルは、重力崩壊の最終段階に関する未解明の予想(Hoop予想)の詳しい解析に極めて有効であり、学術的意義が大きい。基本的定式化と解析手法の開発が完成し、具体的な解の振る舞いとそのスペクトルによる記述の分析に取り組める段階まできた。現在も進行中である。(2)時空上の準正規モードの物理的意味を解明する研究。時空のスペクトル情報のより深い理解を進めるため、昨年度の研究成果をふまえながら、準正規モードの物理的意味の解明に取り組んだ。種々の一次元ポテンシャル・モデルを設定し、量子力学の枠組みの中で、数値解析を援用しながら具体的な解析的研究を行った。波束がポテンシャルで散乱されながら無限遠方に散逸していく過程への準正規モードの関与に着目した。昨年度、定常的なポテンシャルによる散乱過程には準正規モードが一切関与していないことを解明したが、本年度はこれをふまえて、時間変動するポテンシャルの散乱過程について詳しく解析した。その結果、初期条件に依存しない散乱波の振る舞いが見出され、準正規モードが関与していることがほぼ解明された。このことから、準正規モードは、非摂動的背景上のポテンシャルの時間変動により励起されることが解った。現在は、この結果の確認と、一般論による理論的説明に取り組んでいる。(3)スペクトル・スキームを活用した「宇宙論の平均化問題」の解析に着手した。これまでの理論形式を再検討し、基本的結果についてのまとめと拡張を行った。この問題は宇宙論の根幹に関わる非常に深遠な未解決問題のため、助成期間中だけで完結するわけにはいかないので、来年度以降は、これを最重要テーマとして取り組む予定である。
血清アルブミンを活用したシンプルながん指向性高分子化抗がん剤の開発

ヒト血清アルブミン(Human Serum Albumin; HSA)は、生体適合性、血中滞留性、がん標的性に優れ、抗がん剤運搬体として非常に有用な生体高分子である。このHSAに抗がん剤ピラルビシン(THP)を結合させ、がん組織集積後にがん組織内(酸性環境)でTHPを遊離する環境応答性高分子化抗がん剤(HSA-THP)を開発する。動物実験でHSA-THPのがん組織集積性やTHP遊離性、そして抗がん作用や副作用を検討することで、HSA-THPが高い治療効果を発揮する副作用の少ない高分子化抗がん剤となるか検証する。
脳活動の時空間パターン計測技術の開発とこれを用いた脳における言語処理過程の探求

本研究計画は,まず,脳磁界計測データから脳活動の時間・空間パターンを再構成する手法を開発し,さらに,これを用いて脳の言語処理過程の解明をめざした.脳活動の時空間パターン再構成技術に関しては,レーダーやソナーなどの軍事技術で用いられているアダプティブビームフォーマーと呼ばれる技術を基にした新しい再構成法を提案した.さらに提案法の性能を決める要因や誤差を生じる原因についての解析を中心にした研究を行なった.すなわち,まずこの再構成技術に関して,測定環境に存在する妨害磁場の影響,空間解像度の決定要因および多数のノイズ源からなる生理学的ノイズの影響などの解析を行なった.また,この方法において,信号源の向きの最適な(再構成結果において信号対雑音比を最大にするような)決定法を提案した.また,さらに脳活動の再構成結果の統計的優位性を評価する方法について研究を行い,ノンパラメトリック統計や,さらにブートストラップ法を組み合わせた方法について検討を行なった.また,研究成果をすべて含んだ信号源再構成手法をグラフィカルユーザインターフェースを加味し,使いやすいソフトウェアとして広く世界に公開する準備を進めている.本ソフトウェアはH16年度8月にオープンソースとして公開の予定である.また,脳の言語処理過程の探求に関しては,マカーク効果を基にした,話し言葉の処理に関するヒトの視覚と聴覚の相互作用現象が脳のどこで起こっているかを検証する実験を行いつつある.この実験においては,視覚と聴覚の相互作用を示唆する特別な周波数領域のみを取り出し,この周波数成分に対し,前述の信号源再構成手法を適用することで視覚と聴覚の相互作用が起こっている部位を特定し,話し言葉の脳内処理に関する新しい知見を得ることを目標として研究を進めつつある.本研究計画は,まず,脳磁界計測データから脳活動の時間・空間パターンを再構成する手法を開発し,さらに,これを用いて脳の言語処理過程の解明をめざした.脳活動の時空間パターン再構成技術に関しては,レーダーやソナーなどの軍事技術で用いられているアダプティブビームフォーマーと呼ばれる技術を基にした新しい再構成法を提案した.さらに提案法の性能を決める要因や誤差を生じる原因についての解析を中心にした研究を行なった.すなわち,まずこの再構成技術に関して,測定環境に存在する妨害磁場の影響,空間解像度の決定要因および多数のノイズ源からなる生理学的ノイズの影響などの解析を行なった.また,この方法において,信号源の向きの最適な(再構成結果において信号対雑音比を最大にするような)決定法を提案した.また,さらに脳活動の再構成結果の統計的優位性を評価する方法について研究を行い,ノンパラメトリック統計や,さらにブートストラップ法を組み合わせた方法について検討を行なった.また,研究成果をすべて含んだ信号源再構成手法をグラフィカルユーザインターフェースを加味し,使いやすいソフトウェアとして広く世界に公開する準備を進めている.本ソフトウェアはH16年度8月にオープンソースとして公開の予定である.また,脳の言語処理過程の探求に関しては,マカーク効果を基にした,話し言葉の処理に関するヒトの視覚と聴覚の相互作用現象が脳のどこで起こっているかを検証する実験を行いつつある.この実験においては,視覚と聴覚の相互作用を示唆する特別な周波数領域のみを取り出し,この周波数成分に対し,前述の信号源再構成手法を適用することで視覚と聴覚の相互作用が起こっている部位を特定し,話し言葉の脳内処理に関する新しい知見を得ることを目標として研究を進めつつある.本研究計画は,まず,脳磁界計測データから脳活動の時間・空間パターンを再構成する手法を開発し,さらに,これを用いて脳の言語処理過程の解明をめざすものである.脳活動の時空間パターン再構成技術に関しては,研究代表者の関原が本研究の海外共同研究者らと共にレーダーやソーナ等の信号処理の分野で開発されているadaptive beamformerと呼ばれる方法を基にした再構成手法を提案し,その有効性を示す基礎実験の結果を発表した.しかし、adaptive beamformerは本質的に時間的に相関を持った信号源活動が存在するとうまくいかないことが知られており,H13年度研究では主に信号源の時間相関が信号源再構成にどのような影響を与えるかについても理論的な解析を行なった.その結果,提案法は中程度の時間相関(相関係数0.6程度)に対しては大きな影響は受けないこと,高い時間相関を持つ信号源に対しては信号強度の減少と再構成した活動の時間波形に誤差を伴うことを見出した.この理論解析はそれを裏付ける計算機シミュレーションとともにIEEE Biomedical Engineering誌に論文投稿中である.さらにこの方法の有効性を示すため正中神経刺激および後部頚骨神経刺激によって測定した体性感覚誘発脳磁界に適用し,これら信号源の振る舞いに関し従来知られていない知見を得ることができた.この結果は2報の論文としてNeuroReport誌に発表した.海外共同研究者のMIT言語学部Marantz教授は人が言葉を見たり聞いたりした時,心の中のボキャブラリー(心的辞書)へアクセスするときの脳磁界信号を捕らえつつある.本研究の今後の展開として提案法を用いてこの脳磁界信号の信号源を再構成し,心的辞書に脳のどの部位が係わっているかを明らかにすることにより言語処理に係わる脳の機能部位の解明を目指す.本研究計画は,まず,脳磁界計測データから脳活動の時間・空間パターンを再構成する手法を開発し,さらに,これを用いて脳の言語処理過程の解明をめざすものである.

脳活動の時空間パターン再構成技術に関しては,研究代表者の関原が本研究の海外共向研究者らと共に信号源の再構成手法を提案し,その有効性を示す基礎実験の結果を発表した.H14年度はH13年度に引続き提案法の性能を決める要因や誤差を生じる原因についての解析を中心にした研究を行なった.すなわち,H13年度研究では主に信号源の時間相関が信号源再構成にどのような影響を与えるかについても理論的な解析を行ない,この結果はIEEE Biomedical Engineering誌に発表した.H14年度はさらにこの手法に関して,測定環境に存在する妨害磁場の影響,空間解像度の決定要因および多数のノイズ源からなる生理学的ノイズの影響などの解析を行なった.これらの解析の1部はIEEE Biomedical Engineering誌に投稿中である.またこの方法の有効性を示すため正中神経刺激によって全頭型磁束系で測定した体性感覚誘発脳磁界に適用し脳磁界計測でははじめて小脳の活動を捉えることが出来た.この結果はJournal of Clinical Neurophysiology誌に投稿中である.共同研究者のメリーランド大学認知脳科学研究所のPoeppel教授は話し言葉の脳でどのように処理されていくのかを解明する事を究極の目的としてまず,ヒト聴覚野の周波数応答を計測している.このデータに提案した信号源再構成手法を適用したところヒトの1次聴覚野とその周辺領域でのインタラクティブな脳活動を見出す事が出来た.H15年度はさらにデータを積み重ねヒトの聴覚野の活動に関して新しい知見を得ることを目指す.本研究計画は,まず,脳磁界計測データから脳活動の時間・空間パターンを再構成する手法を開発し,さらに,これを用いて脳の言語処理過程の解明をめざすものである.脳活動の時空間パターン再構成技術に関しては,H15年度はH13・H14年度に引続き提案法の性能を決める要因や誤差を生じる原因についての解析を中心にした研究をまず行なった.すなわち,まずこの再構成技術に関して,測定環境に存在する妨害磁場の影響,空間解像度の決定要因および多数のノイズ源からなる生理学的ノイズの影響などの解析を行なった.また,こ方法において,信号源の向きの最適な(再構成結果において信号対雑音比を最大にするような)決定法を提案した.また,さらに脳活動の再構成結果の統計的優位性を評価する方法について研究を行い,ノンパラメトリック統計や,さらにブートストラップ法を組み合わせた方法について検討を行なった.また,H13年度からの研究成果をすべて含んだ信号源再構成手法をグラフィカルユーザインターフェースを加味し,使いやすいソフトウェアとして広く世界に公開する準備を進めた.本ソフトウェアはH16年度8月にオープンソースとして公開の予定である.また,このマカーク効果を基にした,話し言葉の処理に関するヒトの視覚と聴覚の相互作用現象が脳のどこで起こっているかを検証する実験を行なった.
鏡視下肝癌切除例の周術期血清抗ＳＥＲＥＸ抗体モニタリングの有用性に関する検討

癌特異抗原であるRalA, Sui1, p62の3種類の抗原ペプチドに対する自己抗体を検出するELISAキットを作成して、肝細胞癌患者の血清抗体価を測定した。健常者血清におけるELISA測定レベルの平均値+3SDを基準値として、基準値を上回る症例を陽性と診断した。その結果、肝細胞癌患者における血清抗体陽性率はRalA=17%, Sui1=6%, p62=9%であった。切除症例については、免疫染色の目的で切除標本から組織アレイを作成し免疫染色を行った。免疫染色強度と抗体価との関連性は、乏しかった。●RalAならびにSui1分子を標的として血清抗体を検出できるELISAキットを作成して診断的有用性を検討することを目標としている。平成23年度に試作したELISAキットの陽性率が十分でなかったため、ペプチド分離方法を工夫して再度ELISAキットを作成した。肝癌患者血清を用いて、血清SEREX抗体の存在の有無をウエスタンブロット法ならびに試作したELISAキットにて検討する。●平成24年度には、p53を含めた3種類のELISAキットを使用して、同一サンプルを解析してそれぞれの血清抗体価を測定した。健常者血清におけるELISA測定レベルの平均値+3SDを基準値とした。基準値を上回る症例を陽性と診断した。その結果、肝癌患者における血清抗体陽性率は、510%程度であった。●作成したELISAキットを利用して、前向きに血液サンプルを収集して、その性能を評価するための多施設研究を企画した。平成24年度内に、肝癌の血液サンプルを新たに合計約40症例を収集した。●平成24年度も研究計画とおりに、東邦大学医療センター大森病院で入院・加療した肝癌患者の血清を文書により本人の了解を得て収集保存した。解析対象の肝癌症例の血清は、治療前に採取し、血清分離後、マイナス80度にて研究開始まで凍結保存されたものを使用した。肝細胞癌における血清自己抗体を用いた新しい検査方法を確立することが目的である。平成23年には、標的分子を固相化したELISAキットを完成し、平成24年度は主としてその診断能力の評価を行った。平成25年度には、血清抗体陽性と陰性の症例での臨床病理学的因子との相関関係を検討した。●平成25年度も研究計画とおりに、東邦大学大森病院で入院・加療した肝細胞癌患者の血清を文書により本人の了解を得て収集保存した。解析対象の肝細胞癌症例の血清は、治療前に採取し、血清分離後、マイナス80度にて研究開始まで凍結保存されたものを使用した。●平成25年度には、RalA, Sui1, p62の3種類のELISAキットを使用して、同一サンプルを解析してそれぞれの血清抗体価を測定した。●作成したELISAキットを利用して、前向きに血液サンプルを収集して、その性能を評価するための多施設研究を実施して、平成25年度内に肝細胞癌の血液サンプルを合計70症例収集した。●切除症例については、免疫染色の目的で切除標本から組織アレイを作成した。●RalA, Sui1 cDNAの塩基配列をアミノ酸配列に変換し、MHCPredウェブサイト(http://www.jenner.ac.uk/MHCPred/)を用いてクラスII抗原部位を検索し、その領域を含むペプチドを人工合成する。アミノ末端にビオチンを付加しておき、予めアビジンを固相化したプレートを用いて合成ペプチドを特異的に結合させ、洗浄後に血清抗体と反応させ、ペルオキシダーゼ標識抗ヒトIgG抗体を用いて血清抗体レベルを測定する(ELISA)。健常者血清に比べ患者血清の抗体レベルが有意に高いペプチドを選択する。●作成したELISAキットの性能試験を実施し、健常者の基準抗体価を設定した。健常者血清におけるELISA測定レベルの平均値+3SDをカットオフ値として、陽性と診断される患者血清中のそれぞれの抗体において最低10%を上回った場合に診断用キットとして有用であると判断した。●平成23年度は研究計画とおりに、東邦大学医療センター大森病院で入院・加療した肝細胞癌患者の血清を文書により本人の了解を得て収集保存した。周術期の血液サンプルは、手術前、手術後1週間、2週間、3週間、4週間、3ヶ月の6ポイントである。

平成25年度には、血清抗体陽性と陰性の症例での臨床病理学的因子との相関関係を検討した。1年間の研究期間延長により、平成26年度は研究計画を上回る症例数の解析を行うことができた。解析対象は、東邦大学医療センター大森病院で入院・加療した肝細胞癌患者の血清を、文書により本人の了解を得て収集保存した症例である。平成26年度には、RalA, Sui1, p62の3種類のELISAキットを使用して、同一サンプルを解析して、それぞれの血清抗体価を測定した。健常者血清におけるELISA測定レベルの平均値+3SDを基準値とした。基準値を上回る症例を陽性と診断した。その結果、肝細胞癌患者における血清抗体陽性率はRalA=17%, Sui1=6%, p62=9%であった。作成したELISAキットを利用し、前向きに血液サンプルを収集し、その性能を評価するための多施設研究を実施して、平成26年度内に肝細胞癌の血液サンプルを合計85症例収集した。切除症例については、免疫染色の目的で切除標本から組織アレイを作成した。医歯薬学研究計画3年間の2年目であり、当初計画に基づく研究計画を予定通り実施した。研究計画3年間の3年目であり、当初計画に基づく研究計画を順調に実施しているが、最終解析のためには生存解析と免疫染色解析が残っており、平成26年度に延長して解析する予定である。本研究では、肝細胞癌の治療経過中の定期的な採血に合わせて解析するための血液サンプルを収集している。当初計画よりも、順調に症例登録が進んでいるため、既存の冷凍庫スペースが満杯となりつつある。さらに、平成23年夏の節電に伴い冷凍庫に負荷がかかったことが誘引となり、1台の冷凍能力が不調となっている。血液サンプルの正確な解析は本研究の生命線であり、マイナス80度保存は必要不可欠な研究前提である。そのため、最低限の冷凍スペースを確保する目的で、新規フリーザーを購入した。平成23年度は、血液検体のサンプリングとデータベース整備に集中することとし、血液検体の解析を平成24年度に繰り延べることで、消耗品を中心とする研究費を削減した。研究計画3年間の2年目であり、当初計画に基づく研究計画を予定通り実施できた。肝癌と慢性肝炎、肝硬変との鑑別を行うためには、相当数の症例数を用いた検討が必要であり、現在東邦大学ならびに関連施設と協力して症例収集に努めている。平成25年度は、引き続き症例数を追加する。3種類のSEREX抗原を固相化したELISAキットにより測定された血清抗体価と肝癌症例における、臨床病理学的因子との相関関係を検討する。また、化学療法施行症例においては、治療感受性との相関関係を検討する。再発症例においては、再発時期、予後との相関関係を検討する。本研究において、作製した多種抗原を標的とした血清抗体検査の臨床上の有用性を検討する。手術切除標本の免疫染色を行い、血清SEREX抗体価との相関関係を検討する。切除手術前後、化学療法前後などの治療経過中の血清SEREX抗体価モニタリングと臨床経過、治療効果との相関関係を検討する。研究計画3年間の3年目であり、当初計画に基づく研究計画を実施できた。
ヌード及び正常ラットマクロファージと細胞内寄生原虫との相互作用についとての研究

SpragueーDawley系の先天的に胸腺を欠損しているヌードラット(rnu/rnu)とそのリッターメイト(rnu/+)、及びそれらより得たマクロファージと細胞内寄生原虫、特にトリパノソーマ・クルジーとの間の相互作用に関し種々研究を行い、以下に述べる結果を得た。1.T.Cruziに対してはヌードラットは著しく感受性が高く、感染後2週間で死亡する。一方、リッターメイトは高い抵抗性を有し、虫体は完全に消失し、リッターメイドは全例生残する。2.ヌードラッド体内ではほぼ全ての臓器においてT.Cruziのアマステイゴートが見出されるが、虫体の増加率は心筋が最も高い。3.両種ラットより得た腹腔マクロファージにT.Cruziを感染させ、経時的に電顕的観察を行った結果、ヌードラット由来マクロファージにおいては細胞内侵入後の虫体の周囲にいわゆるParasitophorous Vacuole様の膜構造は観察されなかったが、リッターメイト由来のマクロファージでは長期間膜構造がみられ、虫体の変性像も観察された。4.ライソゾームをフェリチンラベルしたマクロファージを用いた場合ではリッターメイトの場合虫体周囲に直ちにラベルが入るのに対し、ヌードラットの場合は周囲の膜構造が保持されていても虫体周囲には、ラベルが入らないことが確認された。5.両種マクロファージに関しT.Cruzi感染時の化学発光をマーカーとしてスーパーオキサイドなどの産生を比較したが、コントロールとして用いたFMLPに対しても、又T.Cruzi、trypomasigote生虫体に対してもリッターメイト由来のマクロファージの方が10倍以上も発光量が高かった。他のリーシュマニアなどの細胞内原虫の場合も同様な結果を得ている。
持続可能なトライアングルモデルを用いた地理におけるESD授業開発

本研究の目的は、環境・経済・社会のバランスある発展の方向性(目標)を示すドイツの「持続可能なトライアングルモデル(Dreieck der Nachhaltigkeit)」を用いた地理におけるESDの授業理論並びに授業開発を行うことである。そのために本研究では、ドイツにおける地理カリキュラム・教科書単元の検討、現地での授業見学を通じて、地理学習における「持続可能なトライアングルモデル」を用いた学習効果およびその意義について明らかにしたうえで、授業開発に取り組む。2年目である平成30年度では、昨年度に引き続きドイツにおける「持続可能なトライアングルモデル」、ESD、地理教育等の文献収集および文献研究を実施するとともに、平成29年度に実践したモデルを用いた地理授業実践について論文化を進めた。「持続可能なトライアングルモデル」あるいは3観点(環境・経済・社会)に政治もしくは文化を加えた4観点のモデルについて、ドイツの中等地理教科書の分析から、1)教科書では地理的・社会的事象を持続可能性の視点から考える際の思考ツールとして、あるいは学習内容として示されていること、2)モデルの種類(3あるいは4観点のモデル)は教科書会社や単元によって異なることを明らかにした。加えて、ユネスコが作成した報告書Textbooks for Sustainable Development: AGuide toEmbeddingの分析から、思考ツールとしての4観点モデル(持続可能性のコンパス)の特徴を整理した。そして「持続可能なトライアングルモデル」を用いた地理授業の振り返りから、モデルを用いた授業の意義を示した。本研究の成果は、学会誌や紀要等に論文を投稿し、掲載された。また「ESD先進国ドイツにおける地理教育の特徴」というテーマで現職教員向けの講演も実施でき、現場教員に対する情報提供をすることができた。現地における授業見学および簡単な聞き取りを実施するとともに、平成29年度に実施した「持続可能なトライアングルモデル」を用いた授業実践を論文化することができ、研究は順調に進んでいる。授業開発を中心にしながらも、「持続可能なトライアングルモデル」の学習における位置づけを現地での授業見学、文献研究を通してさらに整理・検討を試みる。初年度である平成29年度では、ドイツにおける「持続可能なトライアングルモデル」、ESD、地理教育等の文献収集および文献研究を中心に研究を実施した。ドイツでは、持続可能な開発を考える際に、環境・経済・社会の3観点を基本に持続可能性を捉えている(持続可能なトライアングルモデル)が、これ以外にも、3観点に政治もしくは文化を加えた4観点、環境をベースとして経済および社会が成り立つモデルなど、多様なモデルが存在し、これらのモデルの特質をまとめることができた。加えて、ラインラント=プファルツ州、バーデン=ヴュルテンベルク州のカリキュラム・地理教科書を分析し、これらにおいての持続可能なトライアングルモデルが学習においてどのように活用されているかについても分析・整理を行った。また当初の計画では現地において授業見学、地理教育・ESDの専門家への聞き取り調査を3月に予定していたが、研究代表者の所属機関異動の時期と重なったため断念した。しかしながら聞き取りを予定していたラインラント=プファルツ州の地理教育カリキュラム作成責任者でESDの専門家が訪日されたことから、日本においてドイツのESD、地理教育に関する聞き取りを行うとともに、ESDに関する資料・情報、持続可能なトライアングルモデルを用いた授業実践資料の提供を受けることができた。当初計画をしていた現地における授業見学はできなかったが、持続可能なトライアングルモデル等に関する文献の収集、モデルの整理といった文献研究を計画通り実施することができ、その研究成果を国際・国内学会および学会誌において順調に公表することができた。

現地における授業見学および簡単な聞き取りを実施するとともに、平成29年度に実施した「持続可能なトライアングルモデル」を用いた授業実践を論文化することができ、研究は順調に進んでいる。次年度は平成29年度に実施できなかった現地での授業見学、資料収集を実施するとともに、文献研究の継続、持続可能なトライアングルモデルを用いた授業理論研究および開発を実施する。また高専の地理授業で持続可能なトライアングルモデルを用いた実験授業を実施したこともあり、その成果を学会発表等で公表する。授業開発を中心にしながらも、「持続可能なトライアングルモデル」の学習における位置づけを現地での授業見学、文献研究を通してさらに整理・検討を試みる。次年度に2回、ドイツ(ラインラント=プファルツ州、バーデン=ヴュルテンベルク州)において授業見学、聞き取り調査を実施する予定であり、そのための旅費等として支出する予定である。また、調査対象であるバーデン=ヴュルテンベルク州のカリキュラムが改訂され、それに伴い新たな地理教科書が販売されたため、その教科書および関連書籍の購入のための費用としても使用する予定である。H30年度に参加し発表した国内学会の多くが、長距離の移動や宿泊を必要としない近畿(大阪・奈良・京都・和歌山)で開催され、旅費に関する出費が当初予定していた額に比べて少なかったため。
YhhP蛋白質の構造の安定性に及ぼす新規N-キャップモチーフCPxPの配列効果

本研究の目的はYhhP蛋白質の共通配列ChxPに焦点をあて,その生物学的および構造的役割を明らかにすることにある.その目的のために,CPxPを含む6残基LRCPEPに点変異を導入し,多数のYhhP変異蛋白質を作成した.まず,これらの変異体の機能を調べるためのバイオアッセイ,CD-meltingによる熱安定性,塩酸グアニジンおよび尿素に対する安定性の測定,さらに分子動力学計算による検討を行った.また,そのいくつかのものについてはNMRによる構造決定も行った.次の研究成果を得た.CPxPの機能的役割:機能的に完全に欠損した変異YhhPはC19SとP20A/P22A,部分的に欠損したものはE21Kであったこと,また,変異体C19Sは構造ならびに安定性についても野生型(Wt)と同じであったことより,CPxPは機能的および構造的に重要であることが明らかになった.CPxPのN-cap motif構造的役割:NMRによる三次元構造の解析によれば,変異体P22Aのa1-helixは野生型にくべて2残基伸びたのに対して,P20Aでは1残基だけ短縮した.このような蛋白質の安定性および立体構造の考察からβ1とα1間のターン領域にあるLRCPEPが新規のN-capモチーフであることを提唱した.平成15年度では,電荷残基間の静電的相互作用の効果について検討した.YhhP点変異タンパク質の作成:6配列LRCPEPにおけるR18およびE21に対して逆電荷または中性の残基で直換した8種の点変異体及び2種の三点変異体も作成した.構造安定性に及ぼす静電相互作用の影響:温度,塩酸グアニジンおよび尿素よる変性曲線の解析から融解温度Tm,塩酸グアニジンおよび尿素による変性中点濃度Cmなどの熱力学量を得た.Double mutant cycle法による解析結果から,R18とE21はYhhPの構造安定性に大きく寄与していた.本研究の目的はYhhP蛋白質の共通配列ChxPに焦点をあて,その生物学的および構造的役割を明らかにすることにある.その目的のために,CPxPを含む6残基LRCPEPに点変異を導入し,多数のYhhP変異蛋白質を作成した.まず,これらの変異体の機能を調べるためのバイオアッセイ,CD-meltingによる熱安定性,塩酸グアニジンおよび尿素に対する安定性の測定,さらに分子動力学計算による検討を行った.また,そのいくつかのものについてはNMRによる構造決定も行った.次の研究成果を得た.CPxPの機能的役割:機能的に完全に欠損した変異YhhPはC19SとP20A/P22A,部分的に欠損したものはE21Kであったこと,また,変異体C19Sは構造ならびに安定性についても野生型(Wt)と同じであったことより,CPxPは機能的および構造的に重要であることが明らかになった.CPxPのN-cap motif構造的役割:NMRによる三次元構造の解析によれば,変異体P22Aのa1-helixは野生型にくべて2残基伸びたのに対して,P20Aでは1残基だけ短縮した.このような蛋白質の安定性および立体構造の考察からβ1とα1間のターン領域にあるLRCPEPが新規のN-capモチーフであることを提唱した.平成15年度では,電荷残基間の静電的相互作用の効果について検討した.YhhP点変異タンパク質の作成:6配列LRCPEPにおけるR18およびE21に対して逆電荷または中性の残基で直換した8種の点変異体及び2種の三点変異体も作成した.構造安定性に及ぼす静電相互作用の影響:温度,塩酸グアニジンおよび尿素よる変性曲線の解析から融解温度Tm,塩酸グアニジンおよび尿素による変性中点濃度Cmなどの熱力学量を得た.Double mutant cycle法による解析結果から,R18とE21はYhhPの構造安定性に大きく寄与していた.本研究の目的はYhhP蛋白質の共通配列CPxPに焦点をあて,その生物学的および構造的役割を明らかにすることにある.さらに,PDBなどのデータベースに基づき統計的観点からCPxPのN-capモチーフとしての存在を確立することにある.その目的のために、CPxPを含む6残基LRCPEPに点変異を導入し、10種のYhhP変異蛋白質を作成した.まず,これらの変異体の機能を調べるためのバイオアッセイ,CD-meltingによる熱安定性および塩酸グアニジンに対する安定性の測定,さらに分子動力学計算による検討を行った.また,そのいくつかのものについてはNMRによる構造決定も行った.つぎのような結果が得られた.(1)機能的に完全に欠損した変異YhhPはC19SとP20A/P22A,部分的に欠損したものはE21Kであった.これら以外の変異はYhhPの機能には影響を与えなかった.変異YhhPの安定性に関して,塩酸グアニジンに対する安定性はP22Aに対してもっとも高く,P20Aは野生型にくらべ低かった.電荷を逆転した変異体E21KおよびR18Eはもっとも不安定であった.CD-meltingの結果は変性剤に対する安定性と高い相関が見られた.NMRによる三次元構造の解析によれば,野生型にくらべて変異体P22Aのα1-helixは2残基伸びたのに対して,P20Aでは1残基だけ短縮したことが明らかになった.

このような蛋白質の安定性に及ぼすアミノ酸置換の効果は水素結合の生成と破壊をともなったα-helix長の伸縮に基づいて説明できた.これらの結果はCPxPモチーフが生物学的および物理学的に重要な役割を果たしていることが明らかになった(日本蛋白質科学会年会,名古屋;国際学会XXth ICMRBS, Canadaにて発表).申請者らは,YhhP蛋白質の立体構造の考察からβ1とα1間のターン領域にあるLRCPEPが新規のN-capモチーフであることを提唱した.この配列LRCPEPに種々の点変異を導入し,構造変化はNMR法により解析し,構造安定性については熱融解測定,尿素および塩酸グアニジン変性によって検討した.平成15年度では,電荷残基間の静電的相互作用の効果について検討した.構造安定性に及ぼす静電相互作用の影響:作成した変異タンパク質10種すべてについて,温度,塩酸グアニジンおよび尿素の濃度の関数としてCD測定を行い,それらの変性曲線の解析から融解温度T_m,塩酸グアニジンおよび尿素による変性中点濃度C_mなどの熱力学量を得た.Double mutant cycle法による解析結果から,R18とE21の相互作用エネルギーΔG_<int>は0.2kcal/molと小さな値が得られた.R18とE21はYhhPの構造安定性に大きく寄与しているが,電荷-電荷相互作用および電荷-helix dipole相互作用にそれぞれ独立に関与していることが明らかとなった.変性剤に対する安定性:各変異タンパク質の安定性と静電相互作用を調べるために,変性剤として塩酸グアニジンと尿素を用い,両者の変性濃度の間での相関性を調べた結果,高い相関が認められた.いわゆる"二倍の法則"が成立した.それゆえ,塩酸グアニジンの効果が一般に誘電率の変化よりも主としてタンパク質内部の水素結合や疎水結合の破壊にあると推察された.
世界と日本のエリートスポーツ選手におけるゲノムワイド関連解析

本研究課題の主要な目的は、世界と日本のエリートスポーツ選手の競技力に関連する新規のミトコンドリアおよび核遺伝子多型を探索することであった。ケニア人長距離走選手、ジャマイカおよびアメリカの短距離走選手および日本の瞬発系/パワー系および持久系トップアスリートを対象に、ミトコンドリアDNAの全塩基配列の決定および約75万の核遺伝子多型を解析ターゲットとする全ゲノム関連解析により、世界および日本のアスリートの運動能力に関連する遺伝子多型を多数同定した。なかでも、日本人の短距離走選手および中長距離選手を対象としたゲノムワイド関連解析から、運動能力に関連する新規の遺伝子多型を5種同定した。国際大会に出場している96名のケニア人長距離ランナーを対象に、16,569塩基対のミトコンドリアDNA(mtDNA)全塩基配列を決定した。mtDNA多型のセットで規定されるミトコンドリアハプログループL0は持久系運動能力と関連することを既に報告しているが、このL0を規定する4つの多型を同定した。このうち、2つの多型は非同義置換3808A>G(Thr168Ala,NDDH脱水素酵素サブユニット1遺伝子)および15317G>A(Ala191Thr,チトクロームb遺伝子)であった。今後、このタンパクをターゲットとしたトレーニング方法の開発が望まれる。また、日本人のオリンピック選手141名においてもミトコンドリアハプログループを解析した結果、ハプログループG1は持久系の運動能力に、ハプログループFは瞬発系の運動能力に関連することが明らかになった。ミトコンドリアハプログループあるいはmtDNA多型が瞬発系運動能力に関連するという知見は世界で初めてである。さらに、瞬発系の運動能力を規定する核DNA多型を網羅的に解析するために、ジャマイカ人トップスプリンター48名ならびにそのコントロール48名の計96名を対象に、核DNAにける100万の一塩基多型および6万のコピー数多型を解析した。その結果、スプリント能力に強く関連する3つの多型を同定した。これら3つの多型はアフリカ人特異的であった。これらの多型はアフリカ人スプリンターが世界で好成績を残す遺伝的要因の一部である可能性がある。今後さらに解析数を増やして検討するとともに、アフリカ人と日本人の遺伝的背景の相同・差異を明らかにしてトレーニング方法の開発に貢献したい。世界で活躍しているジャマイカ人およびアメリカ人のアフリカ系トップスプリンターのミトコンドリアDNAハプログループを解析した。その結果、ジャマイカ人スプリンターと一般のジャマイカ人の間でハプログループの頻度分布に差は認められなかったが、アフリカ系アメリカ人のスプリンターは一般のアフリカ系アメリカ人と異なるハプログループの頻度分布を示した。さらに、瞬発系の運動能力を規定する核DNA多型を網羅的に解析するために、アフリカン・アメリカ人トップスプリンター48名ならびにそのコントロール48名の計96名を対象に、核DNAにける100万の一塩基多型および6万のコピー数多型をillumina社製のOmni1-Quad BeadChipを用いて解析した。その結果、スプリンター群とコントロール群の間で有意な多型は10個の多型を同定した(p<0.00001)。まこれらの多型はアフリカ人スプリンターが世界で好成績を残す遺伝的要因の一部である可能性がある。昨年度、解析したジャマイカ人スプリンターの結果と統合し、世界的に好記録を残しているアフリカ系スプリンターの遺伝的特性を解明した。また、日本人の一流長距離選手に多型解析にも着手した。運動能力との関係で最も注目されているACTN3遺伝子におけるR577X多型を解析した。その結果、これまで持久的運動能力関連すると考えられていたXX型の頻度は国際級の日本人の一流長距離走選手で頻度が低く、これまでの先行研究とは一部異なる結果であった。今後、さらに日本人において解析し、アフリカ人と日本人の遺伝的背景の相同・差異を明らかにしてトレーニング方法の開発に貢献したい。本研究課題は、世界および日本のトップアスリートにおける核ゲノムおよびミトコンドリアゲノム(mtDNA)多型を網羅的に解析し、筋・骨格系や循環器系・代謝系の能力などを規定する遺伝子多型を明らかにすることが目的である。特に、今年度は、日本人のトップアスリートの競技力を規定する遺伝子多型を明らかにすることであった。そこで、瞬発系・パワー系および持久系運動能力を規定する遺伝子多型の全貌を明らかにするために、国際大会出場経験のある短距離走選手48名および長距離走選手48名の計96名を対象として、全ゲノム関連解析(GWAS)を実施した。GWASは、ヒトゲノム上に点在する75万種の遺伝子多型を網羅的に解析するHumanOmni1Express-12BeadChipを用いた。解析した75万多型の頻度をx2検定で比較すると、両群間で極めて大きく頻度が異なる5種の遺伝子多型を同定した(P<0.00001)。

この5種の多型は、TGFB2、CNTNAP4、SVEP4、PROC遺伝子領域で見つかり、一般的に細胞の分化や増殖、細胞接着、細胞間連携、および血液粘性などに関わることで知られている遺伝子であった。この中には筋線維組成やヘマトクリット値などを決定する重要な遺伝子が含まれている可能性がある。また、国際大会出場経験のある日本人トップアスリート146名のmtDNA全塩基配列を決定し、すでに解析を終えている日本人672名のデータと比較検討した。その結果、持久系の運動能力に関連する7種の多型、ならびに瞬発系の運動能力に関連する9種の多型を同定した。これらの多型は、主にミトコンドリアハプログループG、G2a、D4e2およびD4gを規定する多型やミトコンドリアの量を規定する制御領域の多型であった。これらの知見は、遺伝情報を元にした適性種目の選択やオーダーメードトレーニング方法の開発のための基礎となる可能性がある。
超音波による軟骨変性の早期診断システム

1.超音波パルスの反射波をウェーブレット変換して軟骨を計測するシステムを構築した。2.超音波計測とその他の力学計測を併用して軟骨の動剛性、密度、音速、内部損傷を計測し、反射波の強度が主として軟骨の動剛性を反映し、反射波の持続時間が軟骨の表面及び内部の損傷を反映することを明らかにした。3.軟骨が変性すると、動剛性、音速、密度が低下し、ついで、反射波の持続時間が増加するとともに、内部からの反射波が生じる事を明らかにした。4.コラーゲナーゼ処理によって関節軟骨を変性させた試料を超音波で測定した結果、変性が進行するほど表面からの反射波最大強度が低下することを確認した。5.ウサギの膝関節の靭帯と半月版を切除した不安定膝モデル及び膝関節にコラーゲナーゼを注入した軟骨変性モデルについて超音波による測定を行った結果、まず、大腿顆部内側の軟骨が変性し、続いて外側顆部の軟骨が変性し始めることが明らかになった。6.圧電セラミックを用いる超音波トランスデューサーに加えて圧電ポリマーによる薄型のトランスデューサーを製作して膝関節、股関節、手根関節、脊椎の臨床診断に使用できることを確認した。7.ウサギの膝関節における軟骨欠損部に骨と軟骨の複合体を移植した後の軟骨を超音波によって評価した結果、移植部の境界に再生した軟骨の動剛性は本来の関節軟骨の動剛性よりもやや低いが、日常生活には十分耐えられることを確認した。8.体外における培養によって再生させた関節軟骨の動剛性は正常な軟骨に比べてかなり低かった。9.軟骨の再生治療において、軟骨欠損部から骨髄までドリリングした場合と骨髄細胞をスキャフォールドに注入した場合には反射波強度が比較的高い軟骨を再生させることができた。これより、骨髄細胞は高い確率で腕軟骨細胞に分化させうると考えられる。1.ブタの膝関節から採取した骨・軟骨複合体を試料として、インデンテーション試験、応力ひずみ試験、比重計測を行い、軟骨の力学特性と超音波の軟骨表面における反射特性との関係を調べた。その結果、反射波強度は軟骨表面直下の圧縮弾性率及び密度によって決まることを検証した。これらの量はいずれも軟骨変性を反映しているので、超音波による計測法が関節軟骨の診断と評価に有効であることが示された。2.ブタの膝関節から採取した軟骨をコラーゲナーゼ処理させる実験を行った結果、コラーゲン線維によって拘束されていたプロテオグリカンが膨潤、溶出するに伴って反射波強度が低下した。これは超音波計測法が硝子軟骨の変性に伴う軟骨の構造破綻による内部圧力の低下を高精度で検出できる方法であることを示している。3.ウサギの膝関節内にコラーゲナーゼを注入する実験を行った。注入後1週間で変性が生じて反射波強度の低下、含水率の増加、Aggregate Modulusの低下が見られた。また16週になると軟骨の変性はある程度回復した。軟骨が変性すると、コラーゲン線維とプロテオグリカンの結合構造の破綻により内部の膨張圧力が低下して負荷支持能力を喪失する。本研究においてこのような軟骨の変性に伴う軟化を超音波によって高精度で検出し、定量化できることを示した。また再生、移植軟骨の荷重支持能力を評価するための優れた方法であることを実証した。4.ウサギの膝関節の内側半月板を切除し、前後十字靭帯と内側側副靭帯を切断することにより膝関節を不安定化したモデルを作製して軟骨の変化を調べた。手術後軟骨の変性が徐々に進行し、それに伴って超音波の反射率が低下し、4週間後には軟骨表面が破壊されることにより反射波の持続時間が増加した。このように軟骨の変性により、表面形状が変化する以前に超音波法による早期発見が可能であることを示した。

1.ブタ膝関節から採取した軟骨の力学特性を圧縮試験,インデンテーション試験,密度測定,厚さ測定によって調べた。力学試験と超音波計測を比較した結果,反射波強度が軟骨の動剛性と強い相関があることを明らかにした。2.反射波強度を正確に測定するためには軟骨表面とトランスデューサーの平行度を1度以下に保つ必要があるので,平行度を保つためにトランスデューサーの周囲にシュラウドを固定した形式のプローブを試作し,関節鏡の操作に熟練しなくても正確な測定ができることを可能にした。3.変形性関節症の診断と治療法を開発するため,ウサギ膝関節の靭帯と半月板の一部を切除した不安定膝モデルを作製し,超音波計測と摩擦試験によって軟骨の変性過程を調べた。その結果,軟骨の変性に伴って荷重部で反射波強度が低下し,摩擦係数が増加することを確認した。4.ウサギの大腿顆部軟骨に骨軟骨移植術を行った後に超音波測定を行った結果,移植部周囲に軟骨が再生する。しかしその軟骨の反射波強度が低いことから,この部位に再生した軟骨は線維性であると推定された。5.ウサギの大腿顆部の軟骨を切除した後にドリリングによって骨髄液を欠損部に導入すると軟骨が再生した。超音波測定によって再生軟骨は線維軟骨と硝子軟骨の中間的な性質を有することがわかった。一方,軟骨の欠損部に骨膜を移植した後に再生する軟骨は繊維性であった。6.ウサギの膝軟骨の欠損部に間葉系細胞を含むスキャフォールドを移植した後に再生した軟骨を超音波で測定した結果,線維軟骨と硝子軟骨の中間的な性質を有することがわかった。以上より,良好な関節軟骨を再生させるためには欠損部に軟骨細胞に分化しうる細胞を封入する必要があることを明らかにした。1.超音波パルスの反射波をウェーブレット変換して軟骨を計測するシステムを構築した。2.超音波計測とその他の力学計測を併用して軟骨の動剛性、密度、音速、内部損傷を計測し、反射波の強度が主として軟骨の動剛性を反映し、反射波の持続時間が軟骨の表面及び内部の損傷を反映することを明らかにした。3.軟骨が変性すると、動剛性、音速、密度が低下し、ついで、反射波の持続時間が増加するとともに、内部からの反射波が生じる事を明らかにした。4.コラーゲナーゼ処理によって関節軟骨を変性させた試料を超音波で測定した結果、変性が進行するほど表面からの反射波最大強度が低下することを確認した。5.ウサギの膝関節の靭帯と半月版を切除した不安定膝モデル及び膝関節にコラーゲナーゼを注入した軟骨変性モデルについて超音波による測定を行った結果、まず、大腿顆部内側の軟骨が変性し、続いて外側顆部の軟骨が変性し始めることが明らかになった。6.圧電セラミックを用いる超音波トランスデューサーに加えて圧電ポリマーによる薄型のトランスデューサーを製作して膝関節、股関節、手根関節、脊椎の臨床診断に使用できることを確認した。7.ウサギの膝関節における軟骨欠損部に骨と軟骨の複合体を移植した後の軟骨を超音波によって評価した結果、移植部の境界に再生した軟骨の動剛性は本来の関節軟骨の動剛性よりもやや低いが、日常生活には十分耐えられることを確認した。8.体外における培養によって再生させた関節軟骨の動剛性は正常な軟骨に比べてかなり低かった。
ナノテクノロジーによる超微小HPLCの作製とプロテオーム高速解析系への適用

既知のDNA情報を機能タンパク質に変換したり、ランダムなDNA情報からこれまでに存在しなかったタンパク質を創製したりする潜在的な能力のある技術である細胞表層デイスプレイという分子ツールを開発し、これを用いたコンビナトリアル・バイオエンジニアリングを展開してきた。遺伝子のコードするタンパク質のこれまでの発現系は、タンパク質を純粋にとりだすためには、細胞を破砕したり濃縮したり、種々のカラムクロマトグラフィー操作も必要とする。一方、細胞の表層にタンパク質を発現デイスプレイする系では、デイスプレイされた細胞を一つの支持体として、提示されたタンパク質の機能解析ができ、タンパク質のアミノ酸配列分析を待たずに、PCR法などの併用により、導入されたDNAの配列から提示されたタンパク質のアミノ酸配列が決定できる。このように、細胞表層デイスプレイの手法は、DNA情報と機能タンパク質との解析のいわゆる距離を一気に短縮させた。また、ナノテクノロジーによって開発されたゾル・ゲル法によるシリカ一体型モノリス担体がHPLCをキャピラリー化できることがわかったので、この特性を利用して微小化HPLCの作製を行い、ハイスループットデバイスを作製した。一方、種々の細胞のmRNAから作製したcDNAなどを鋳型にして、ランダムなプライマーやエラーの多いポリメラーゼを用いてランダムなDNAライブラリーを作製し、【酵母細胞表層デイスプレイ(Cell Surface Engineering)】技術を用いて、細胞表層に機能性タンパク質分子ライブラリーとして提示した、いわゆるタンパク質ライブラリーを調製することに成功した。このタンパク質ライブラリーの活性検索を微小化HPLCで行うための最適化を行なった。
HDLの抗動脈硬化作用におけるELの機能解析

高比重リポ蛋白(HDL)は抗炎症作用を有するが、炎症などの状態においては「悪玉=dysfunctional HDL」として働くことが知られている。本研究では、血清HDL値の制御因子である血管内皮リパーゼ(EL)阻害によって上昇したHDL-Cの質的変化を検討した。EL欠損マウスから採取したHDLは、野生型マウスのHDLと比べて抗炎症および抗炎症作用が同等または強く、敗血症性マウスの炎症を強力に改善する作用を示した。以上のことから、EL阻害で上昇するHDLは、動脈硬化や炎症などの病態を軽減する可能性が示唆された。高比重リポ蛋白コレステロール(HDL-C)は動脈硬化に対して抑制的に働くことが知られている。しかしながら、善玉であるはずのHDL-Cが炎症や何らかの病的状態においては、その善玉としての作用が失われ、むしろ「悪玉」として働きうることが明らかになっている。血管内皮リパーゼ(EL)はHDL-C濃度を規定しており、EL阻害により血中HDL-Cが上昇する。本研究では、EL阻害により上昇したHDL-Cの質的変化を検討し、ELが動脈硬化の抑制にむけたHDL増加療法のターゲットとなりうるかを検討した。EL阻害することにより増加したHDL粒子の抗動脈硬化性が明らかにするため、我々の作製したEL欠損マウスから採取精製したHDL(EL-/-HDL)と、野生型マウスから採取したHDL(EL+/+HDL)を用いて、EL完全不活性化状態のHDLの質的変化を、種々の細胞実験を用いて検討した。リポポリサッカライド(LPS)の中和効果はEL-/-HDLの方がEL+/+HDLよりも強かった。炎症性サイトカイン刺激による接着分子の発現抑制効果、LDLの酸化抑制効果、HDL関連酵素活性、コレステロール逆転送系は、EL-/-HDLとEL+/+HDLとの間で有意差は認められなかった。以上のことから、EL-/-HDLはEL+/+HDLと比べて同等またはより強い抗炎症作用を有していることが明らかとなった。すなわち、ELを阻害して上昇するHDLは少なくともin vitroの系においては「善玉」であることが示唆された。とくに、本年度は、HDLは心筋細胞に対しても抗炎症・抗酸化・抗アポトーシスなどの保護効果を有することを明らかにした。また、EL遺伝子改変マウスを用いて、高あるいは低HDL血症を合併する心不全モデル作成し、HDLが心不全の発症・進展に保護的に作用するか検討する。以上のことから、EL不活性化状態で上昇するHDLは、抗炎症・抗酸化・抗アポトーシスが保たれており、動脈硬化や心不全などの病態を軽減する可能性が示唆された。