hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
哺乳類卵巣における卵胞退行とアポトーシス分子制御に関する研究

哺乳類の卵巣では、1%以下の卵母細胞のみが排卵に至り、他の99%以上の卵母細胞は消滅する。このような卵胞の選抜機構に卵胞構成細胞である顆粒層細胞の自殺死(アポトーシス)が重要であることがわかってきつつあるが、その分子機構などは未だ解明されていない。本研究ではまず、卵胞選抜における局所的な分子機構を精査するため、アポトーシス関連因子である腫瘍壊死因子α(TNFα)に着目した。TNFαは癌細胞での研究では細胞死誘導と細胞増殖誘導という相反するはたらきが知られているが、未だに生体内で恒常的に起こるアポトーシスへの関与は明らかではない。前年までにわれわれはブタの顆粒層細胞において増殖細胞密集部位とTNFαタンパクおよびmRNA局在部位が類似していることを明かとした。さらに本年度の研究では、TNFαの細胞内シグナルの分岐点で作用するTRAF2という細胞内シグナル分子について調べた。ブタ健常顆粒層細胞では、mRNAおよびタンパクレベルでTRAF2が発現していたがブタ退行顆粒層すなわちアポトーシスが出現している顆粒層細胞ではmRNAおよびタンパクレベルで消失していた。一方、TNFαは常に卵胞液中に存在していることから、本研究の結果はブタ卵巣顆粒層細胞においてTNFαシグナルは細胞内レベルで生存因子として調節されていることを示唆している。さらに、卵巣内においてアポトーシス細胞を指標に健常卵胞と退行卵胞とに分類したものを、さらにその隣接切片にてTRAF2検出してみたところ、アポトーシス細胞が出現し始める前の時期に、すでにその卵胞ではTRAF2が消失していた。また同一卵胞顆粒層には増殖細胞とアポトーシスのどちらも検出されることから、卵胞発達において顆粒層の細胞増殖と細胞死は非常に級密なバランスのもとに制御されており、TRAF2の発現はその指標として大いに期待のもてる因子であることが示唆された。
半導体デバイスのCu電極への超低荷重プロービングプロセスの開発

本年度は、前年度の電極用Cu膜の表面構造解析による知見をもとに、前年度開発したXPSに接続されたプロービングプロセス開発システムを用いて、Cu電極の超低荷重プロービングプロセスの開発に関する研究を行った。具体的には、電気的絶縁破壊の一種であるフリッティングおよび表面酸化膜の水素熱還元プロセスについて検討し、以下の成果が得られた。フリッティングプロセスの開発においては、Cu電極とプローブ間にかける電圧・電流、荷重の依存性を測定し、これら条件の最適化を行った。従来の機械的手法で必要とされる荷重の10分の1以下の荷重(2mN以下)でも、23Vの低電圧印加でフリッティングが起こることがわかった。また、フリッティング時に瞬間的に大きな電流を流すことによって接触抵抗を下げることが可能であることがわかった。Al電極とCu電極を比較すると、Cu電極の方がより低い電圧で絶縁破壊がおこり、低い接触抵抗が得られることが明らかとなった。熱還元プロセスでは、Cu電極を真空チャンバー内の水素雰囲気中で加熱した後、プロービングを行い、接触特性を測定した。260°C,以上で水素還元処理した電極は、処理しないものに比べて、接触抵抗が半分以下に下がることがわかった。また、フリティングと組み合わせることによってさらに低い接触抵抗が得られた。水素還元したCu電極を空気中に放置すると、再度酸化されるためにいったん下がった接触抵抗が徐々に上昇し、1数時間後に元の値に戻ることがわかった。XPSによって表面分析を行ったところ、還元されて接触抵抗が下がった電極は、表面の酸化膜Cu_2Oが還元されてCuとなっていることが明らかとなった。以上によって、Cu電極の超低荷重プロービングプロセスとして、フリッティングおよび水素による熱還元が有効であることが示された。本年度は、電極用Cu膜の表面構造の解析と中性原子ビーム照射を用いたプロービングプロセスの開発に関する研究を行い、以下の成果が得られた。1)電極用Cu膜の表面構造の解析・CMP直後のCu表面は、活性であり、大気放置すれば、表面の酸化などにより荒れが進行するが、BTAあるいはクエン酸薬液処理により、パッシベーションが可能である。・XPS解析により、クエン酸処理によってパッシベートしたCMP-Cu表面には、24nmの酸化膜層が形成されていることがわかった。・タングステン針プローブにより接触抵抗を測定した結果、水素還元した表面は、接触力1mNでも低抵抗接触が可能であり、この還元の効果は常温大気中で1時間程度維持される。・AFMで還元処理したCu表面を観察した結果、粒成長によって表面が滑らかになっていることが判明した。2)中性原子ビーム照射を用いたプロービングプロセスの開発・現有のXPSに、手動XY,自動Zステージを備えたプロービング室を設けるとともに、試料導入室に高速中性原子ビーム源(FAB)を増設して、プロービングプロセス開発用のシステムを実現した。・Niめっきマイクロカンチレバープローブの機械的特性およびフリッティング特性を調べ、AI膜に対しては10μNの接触力で1Ω程度の低抵抗接触が得られることがわかった。・荷重を一定にすることが可能な座屈モードで変形するNiプローブを開発し、その機械的特性と、Cu電極へのコンタクト特性を調べた。座屈荷重は10mNで設計したが、機械的接触のみでは低抵抗接触が得られないのに対し、フリッティング(瞬時最大電流300mA)を利用すれば、1Ω以下の低抵抗接触が安定に得られることが判明した。
微細空気泡の吹き込みによるボイルオーバー抑制に関する研究

海上に流出した原油を迅速に除去する方法の一つとして焼却法が考えられているが、これを実用する際にはボイルオーバーが問題となる。本研究では、ボイルオーバー抑制に関し、微細空気泡を液層内に吹き込み、これのもつ層内攪拌ならびに水層への伝熱量低減の効果を利用する方法を提案し、この方法の有効性を確認するための実験を行った。まず、耐熱ガラス製のカップ形バ-ナを用いて、燃料の種類(正ヘプタン、エチルベンゼンおよび正ドデシルベンゼンの三種)、燃料および水の初期液層厚さ、カップ径などによるボイルオーバー特性(ボイルオーバー開始時間、燃焼終了時間、燃焼速度など)への影響を調べた。ついで、得られた結果を基に、液層内に微細空気泡を送り込むためのバ-ナを設計・製作し、これを用いて空気供給時における液層内温度分布の径時変化および上記特性を測定し、ボイルオーバーに対する抑制効果を検討した。主なる結果は以下の通りである。1.ボイルオーバーは、水に比較して沸点の高いドデシルベンゼン(331°C)でのみ発生し、これの低いヘプタン(98°C)およびエチルベンゼン(136°C)では起こらない。2.ドデシルベンゼンのボイルオーバーについて(1)初期燃料層厚さおよび水層厚さが厚くなると発生時間は長くなるが、後者では徐々に飽和する。(2)カップ径が大きくなると発生時間は短くなるが、カップ径>60mmでは飽和する。(3)微細空気泡を適度に吹き込むと発生を抑制することができる。このとき燃料は穏やかではあるがほぼ完全に燃焼し、ボイルオーバー発生時にみられるような多量の燃料の燃え残りはない。ただし、予混合化による排煙量抑制についての効果は認められなかった。また、吹き込み量が過大になると途中で消炎することもある。海上に流出した原油を迅速に除去する方法の一つとして焼却法が考えられているが、これを実用する際に問題となるボイルオーバーの抑制に関し、微細空気泡を液層内に吹き込み、これのもつ層内撹拌ならびに水層への伝熱量低減の効果を利用する方法を提案した。本年度はボイルオーバーの基本特性を明確にすることを主とした実験を行い、燃料の種類(沸点が大きく異なる正ヘプタンと正ドデシルベンゼンの二種)、燃料および水の初期液層厚さ、初期温度、空気泡吹き込みなどのボイルオーバーへの影響を調べた。なお、実験にはA、B二種類のカップ形バーナ(いずれも内径65mm、深さ65mm)を使用した。Aは観察用で、円筒部が耐熱ガラス製、底部が黄銅製である。底部は円筒内をスライドでき、液層厚さは可変である。また、ここに取り付けられた多孔質円筒を介して液層内に空気を送り込める。Bは円筒部、底部ともに黄銅製で、中心軸上4mm間隔で張り渡した8本のK形熱電対により液層内の温度分布の経時変化が測定される。これにより以下のような結果を得た。1.ボイルオーバーは沸点の高いドデシルベンゼン(331°C)でのみ発生し、低いヘプタン(98°C)では起こらない。温度分布の履歴から、前者については時間とともに燃料層内部に高温層が形成されるのが確認された。2.ドデシルベンゼンのボイルオーバーについて(1)初期燃料層厚さが厚くなると発生時間は加速度的に長くなる。(2)初期水層厚さが厚くなると発生時間は長くなるが徐々に飽和する。(3)初期液層温度(燃料、水同温)を上昇させると発生時間は短くなる。

(4)微細空気泡を適度に吹き込むと発生を抑制することができる。このとき燃料は穏やかではあるがほぼ完全に燃焼し、ボイルオーバー発生時にみられるような多量の燃料の燃え残りはなかった。海上に流出した原油を迅速に除去する方法の一つとして焼却法が考えられているが、これを実用する際に問題となるボイルオーバーの抑制に関し、微細空気泡を液層内に吹き込み、これのもつ層内撹拌ならびに水層への伝熱量低減の効果を利用する方法を提案した。本研究目的は、ボイルオーバーの現象解明と、この方法の有効性を確認することにある。本年度は、初年度に使用したカップ型バ-ナに以下の改良を加えた。(1)カップ内径を65mmから80mmに変更し、また、底板を黄銅製から熱伝導率の小さいステンレス製とすることで壁面および底面による冷却の影響を極力抑えた。(2)液層内の温度測定に使用していたK形熱電対を裸線タイプからシースタイプに換え、液層温度の変化による素線の伸縮(測定距離間隔の変動)の問題を解決した。(3)発泡用の多孔質円筒を焼結金属製円板(濾過径5μm)とすることで液層内全面にわたり均一に微細空気泡を供給できるようにした。この装置を用い、水に比較して沸点の高いドデシルベンゼン(沸点331°C)を燃料とした実験を行い、ボイルオーバーに関して以下のような結果を得た。(1)カップ径の増大とともに発生時間は短くなるが、カップ径>70mmでは飽和する。(2)初期燃料層厚さまたは初期水層厚さが厚くなると発生時間は長くなるが、後者では飽和する。(3)微細空気泡を適度に吹き込むと発生を抑制することができる。このとき燃料は穏やかではあるがほぼ完全に燃焼し、ボイルオーバー発生時にみられるような多量の燃料の燃え残りはない。ただし、吹き込み量が過大になると途中で消炎することもある。(4)吹き込み空気量が微量であるため予混合化による排煙量抑制についての効果は認められなかった。
全身の造血活性を可視化する統合型FLT-PET/MRIによる骨髄不全症の病態解明

骨髄不全症は骨髄生検により診断されるが、検体不良例や感染リスクの可能性、全身骨髄の評価が出来ないという課題がある。近年チミジンキナーゼ1活性を反映するFLT-PETによる全身骨髄PETイメージングが注目されている。本研究では、骨髄不全症患者にFLT-PET/MRIを行い、PETによる全身骨髄と髄外造血巣の造血活性評価に加え、MRIによる細胞密度・脂肪髄・鉄沈着の程度を同時に画像化かつ定量化する。最適な生検部位の同定・鑑別診断・治療効果判定を行うとともに、PETとMRIの多角的画像データを骨髄病理・遺伝子情報・予後と合わせて網羅的に解析し画像特性から予測モデルを作成し、骨髄不全症の病態解明や個別化医療に繋げる。
熱弾性マルテンサイトの双晶モードと双晶界面構造を支配する諸因子の検討

表記の研究課題について3種のTi系形状記憶合金を中心に検討を行った.Ti-NiのB19'M(単斜晶)では結晶の対称性が低いため{11-1}、{011}第I種双晶、<011>第II種双晶及び(100)、(001)複合双晶が存在する.母相中に整合析出物Ti3Ni4が存在する場合、母相結晶粒径が数μm以下の場合、Ti2Ni化合物中に分散した数μm以下のTiNi粒子では(001)複合双晶が支配的な内部欠陥となる.また、強変形により新たに{20-1}複合結晶が導入されることが知られた.Ti-PdのB19(2H)マルテンサイト(斜方晶)では格子不変変形である{111}第I種双晶、それと共役な<121>第II種双晶に加えて{101}複合双晶が存在する.また、M相状態で時効を行うと、(001)積層欠陥が現れた.Ti-Pdの9Rマルテンサイト(単斜晶)ではTi-Pdの2Hマルテンサイトの3種の双晶と格子反応を持つ{11-4}第I種双晶と{59-1}第II種双晶及び{105}複合双晶が確認され、第II種複合双晶が支配的なモードであった.このことは単斜晶構造のマルテンサイトにおいては第II種双晶が格子不変変形として選択されやすいことを示唆している.上記の3つの合金で観察される第I種双晶及び複合双晶の界面は、K1面に関して鏡映対称にある原子配列が見られ、各々の結晶学的特徴を良く表していた.しかし後者の界面は前者ほど平滑ではなかった.第II種双晶のK_1面は無理指数面があることから、低有理指数面のledgeとstepとから構成されるというモデルとそれを支持する観察結果が報告されている.しかし、本研究ではEdge-on方位から観察した3種の合金の第II種双晶界面ではすべて数原子幅の不規則に湾曲したコントラストが見られるのみであった.これらのことから第II種双晶の界面は本質的に数原子幅の弾性的なひずみ緩和領域を伴ったものであると結論できる.表記の研究課題について3種のTi系形状記憶合金を中心に検討を行った.Ti-NiのB19'M(単斜晶)では結晶の対称性が低いため{11-1}、{011}第I種双晶、<011>第II種双晶及び(100)、(001)複合双晶が存在する.母相中に整合析出物Ti3Ni4が存在する場合、母相結晶粒径が数μm以下の場合、Ti2Ni化合物中に分散した数μm以下のTiNi粒子では(001)複合双晶が支配的な内部欠陥となる.また、強変形により新たに{20-1}複合結晶が導入されることが知られた.Ti-PdのB19(2H)マルテンサイト(斜方晶)では格子不変変形である{111}第I種双晶、それと共役な<121>第II種双晶に加えて{101}複合双晶が存在する.また、M相状態で時効を行うと、(001)積層欠陥が現れた.Ti-Pdの9Rマルテンサイト(単斜晶)ではTi-Pdの2Hマルテンサイトの3種の双晶と格子反応を持つ{11-4}第I種双晶と{59-1}第II種双晶及び{105}複合双晶が確認され、第II種複合双晶が支配的なモードであった.このことは単斜晶構造のマルテンサイトにおいては第II種双晶が格子不変変形として選択されやすいことを示唆している.上記の3つの合金で観察される第I種双晶及び複合双晶の界面は、K1面に関して鏡映対称にある原子配列が見られ、各々の結晶学的特徴を良く表していた.しかし後者の界面は前者ほど平滑ではなかった.第II種双晶のK_1面は無理指数面があることから、低有理指数面のledgeとstepとから構成されるというモデルとそれを支持する観察結果が報告されている.しかし、本研究ではEdge-on方位から観察した3種の合金の第II種双晶界面ではすべて数原子幅の不規則に湾曲したコントラストが見られるのみであった.これらのことから第II種双晶の界面は本質的に数原子幅の弾性的なひずみ緩和領域を伴ったものであると結論できる.
水稲多収品種における深層根の機能および遺伝解析

平成23年度は、最終年度として大きく分けて2つの実験を遂行した.それぞれの試験の目的と結果の概要は以下の通り.1.水稲多収品種の登熟期の落水時期が生育反応に及ぼす影響水稲作での登熟期の落水時期は地耐力の向上と関連し,収穫機械の作業効率に大きな影響を及ぼす.そこで、圃場での登熟期の早期落水が稲の登熟や収量に及ぼす影響を前年に引き続き検討し,年次変動や品種間差の再現性について検討した.出穂後15,25日での落水条件を設定して登熟期のサンプリング調査を実施した結果、(1)早期落水により千粒重が低下する傾向があるものの明確な収量差は生じないことや、(2)登熟期の窒素分配において早期落水が穂への窒素分配を促進すること、などが年次を超えて確認された.窒素分配の変化については,落水処理による登熟の促進や玄米の窒素含有率と関連する重要な形質と考えられる.2.インド型多収品種の染色体部分置換系統を用いた根貫入力に関与する遺伝領域の特定約40系統のCSSLsの検定により,親品種であるコシヒカリや他のCSSLsと比較して根の貫入率が高く,下層根の比率(乾物重割合)が高い2系統が確認された.これらの系統は,いずれも第1染色体の一部がタカナリの染色体に置換されたもので,本染色体領域に関連するQTL情報を検索した結果,これまでに嫌気条件での根の深根性に関与することを報告しているKamoshitaら(2001)のQTLと一致した.この結果は,この遺伝領域に深根性に関与する作用性の比較的高い遺伝子が存在することを示唆するもので,同遺伝子の特定や機能の解明への研究進展につながるものである.これまで、水稲多収研究では、主として葉身の光合成能や稈・葉鞘中の非構造性炭水化物の動態など地上部形質の評価や解析が行われてきているが、地下部の形質と多収性との関連については、深根の機能の重要性についての詳細は不明のままとなっている。研究期間の開始時期にあたる今期は、多収品種の根系の形態特性や養水分吸収に関する深根機能の品種間差について解析を行うための予備試験を実施した。深根の機能を評価するための手法として根圏の中層をパラフィンとワセリンの混合物で作成した円盤状の板(ディスク)を用いて根圏の上部と下部を分割し、ディスクを貫通した根で構成される下層の根(深層根)とディスク上部に分布する根(上層根)の空間に分割して、窒素や水分の吸収能と根系分布との関係を明らかにすることを計画している。このためには、根のディスクへの貫入力の品種間差を明確にするとともに、ディスクの固さと貫入程度との関係を明らかにする必要がある。そこで、タイプの異なる3品種(コシヒカリ;普通品種、べこあおば;中間型多収品種、タカナリ;インド型多収品種)を用いてディスクの組成や培地の種類が根の貫入程度に及ぼす影響について検討を行った。その結果、(1)ディスクの組成としてはパラフィンに対するワセリンの比率を高めることで根の貫入数が増加し、ワセリンの混合率50%程度が根圏の分割に適当であること、(2)品種間ではインド型品種のタカナリにおいて根の貫入数が多く、貫入力に品種間差があること、(3)砂と土壌を用いた培地の比較では両者の差は認められず、培地の種類が貫入力に及ぼす影響は小さいこと、などが明らかとなった。これらの知見をもとに、ディスクの組成と培地を決定し、現在養水分吸収の評価のためのモデル試験を開始している。平成22年度は、大きく分けて2つの実験を遂行した。それぞれの試験の目的と概要は以下の通り。<試験I>:湛水条件での稲の根の下層土への伸長と下層根の機能については未知の部分が多い。一方、インド型多収品種は根の下層土への貫入力が大きいことを前年度の試験で明らかにしている。そこで、インド型多収品種の下層根における窒素吸収特性を明らかにするために、根圏の中層をパラフィンとワセリンの混合物で作成した円盤状の板(ディスク)を用いて根圏の上部と下部を分割して、15Nで標識した肥料を層別に施用した。その結果、(1)施肥窒素の利用率は基肥では下層が高く、追肥では表層が高いこと、(2)インド型品種のタカナリは下層根での吸収窒素の葉身への分配が高まること、などが明らかになるとともに、(3)根の下層への貫入力の品種間差が再確認された。(3)の形質については遺伝解析を実施予定。<試験II>:水稲作での登熟期の落水時期は地耐力の向上と関連し,収穫機械の作業効率に大きな影響を及ぼす。そこで、圃場での登熟期の早期落水が稲の登熟や収量に及ぼす影響を検討した。出穂後15,25,35日での落水条件を設定して登熟期のサンプリング調査を実施した結果、(1)早期落水により千粒重が低下する傾向があるものの明確な収量差は生じないことや、(2)登熟期の窒素分配において早期落水が穂への窒素分配を促進すること、などが明らかとなった。窒素分配の変化については,落水処理による登熟の促進や玄米の窒素含有率と関連する重要な形質と考えられる。本試験については、年次変動を解析するため、本年度も同様の試験を実施予定。

上記2試験の結果については、前者は昨年の試験結果と合わせて研究論文としての投稿準備中である。また、後者(圃場試験)については、本年度の試験を加えて取りまとめ予定である。平成23年度は、最終年度として大きく分けて2つの実験を遂行した.それぞれの試験の目的と結果の概要は以下の通り.1.水稲多収品種の登熟期の落水時期が生育反応に及ぼす影響水稲作での登熟期の落水時期は地耐力の向上と関連し,収穫機械の作業効率に大きな影響を及ぼす.そこで、圃場での登熟期の早期落水が稲の登熟や収量に及ぼす影響を前年に引き続き検討し,年次変動や品種間差の再現性について検討した.出穂後15,25日での落水条件を設定して登熟期のサンプリング調査を実施した結果、(1)早期落水により千粒重が低下する傾向があるものの明確な収量差は生じないことや、(2)登熟期の窒素分配において早期落水が穂への窒素分配を促進すること、などが年次を超えて確認された.窒素分配の変化については,落水処理による登熟の促進や玄米の窒素含有率と関連する重要な形質と考えられる.2.インド型多収品種の染色体部分置換系統を用いた根貫入力に関与する遺伝領域の特定約40系統のCSSLsの検定により,親品種であるコシヒカリや他のCSSLsと比較して根の貫入率が高く,下層根の比率(乾物重割合)が高い2系統が確認された.これらの系統は,いずれも第1染色体の一部がタカナリの染色体に置換されたもので,本染色体領域に関連するQTL情報を検索した結果,これまでに嫌気条件での根の深根性に関与することを報告しているKamoshitaら(2001)のQTLと一致した.この結果は,この遺伝領域に深根性に関与する作用性の比較的高い遺伝子が存在することを示唆するもので,同遺伝子の特定や機能の解明への研究進展につながるものである.
麹菌の細胞内ポリリン酸代謝とストレス応答等における機能の解明

Aspergillusoryzaeは、醸造・食品産業で麹菌として用いられる重要な微生物である。担当者らは、麹菌のポリリン酸の各種培養条件における消長を解明すると共に、麹菌のポリリン酸代謝遺伝子群破壊株のポリリン酸蓄積、重金属塩や酸化等のストレス負荷培養環境における生育に与える影響を明らかにした。特に、特定のストレス条件下においてポリリン酸蓄積量が増加し、ストレス応答にポリリン酸が関与すると考えられた。本研究により、糸状菌でほとんど知られていなかったポリリン酸に関する新たな知見が得られた。当該年度では、麹菌ゲノム情報(http://www.bio.nite.go.jp/dogan/project/view/AO)から抽出した、酵母のポリリン酸代謝に関わる酵素遺伝子のオルソログ(相同遺伝子)について、麹菌の当該遺伝子破壊株を取得することを目的とした。ポリリン酸の合成酵素遺伝子(ポリリン酸ポリメラーゼ)としては、出芽酵母においてvacuolar transporter chaperone(VTC complex)内部にポリリン酸ポリメラーゼドメインが含まれていることを受けて、AO090012000979 (vtc2及びvtc3のオルソログ)、AO090011000795 (vtc4オルソログ)、AO090012000916(vtc1オルソログ)の3種類を対象とする。また、ポリリン酸の分解酵素遺伝子として、AO090102000550{ppx1 (エキソポリホスファターゼ)オルソログ}及びAO090038000274{ppn1 (エンドポリホスファターゼ)オルソログ}の2種類を対象とした。これら5種類の遺伝子の破壊株候補を、麹菌のPEG法による形質転換により取得した。具体的には、pyrGマーカー遺伝子により標的遺伝子を置換するため、標的遺伝子のコーディング領域範囲外の領域を両端に有し、その間をマーカー遺伝子で置換した遺伝子破壊カセットをフュージョンPCR法により作製した。その後、当該DNAを形質転換により導入し、遺伝子破壊株の取得を試みた。得られた破壊株候補について、選択培地上で継代培養を行うことで株を純化した後、ゲノムDNAを抽出し、各遺伝子の保有の有無、遺伝子破壊領域の確認をPCR法等により実施した。その結果、5種類のポリリン酸代謝関連遺伝子それぞれについて、遺伝子破壊株の取得に成功した。そこで、形質転換株取得の際に、最少培地におけるプレート培養での生育速度や胞子形成力の観察を行った。その結果、これらの特性は対照株と同等であった。このことから、生育速度や胞子形成力といった麹菌の基本的な特性はポリリン酸代謝関連遺伝子の破壊により変化しないことが考えられる。当該年度では、栄養条件やストレス負荷条件による麹菌の培養を行い、同菌のポリリン酸含有量の動態解明を行うことを目的として研究を実施した。まずポリリン酸定量に用いる出芽酵母エキソポリホスファターゼ(Ppx1p)の大腸菌生産系を確立した。大量精製した当該組み換え酵素を用いて、Wernerらの方法(2007)により麹菌菌体からのポリリン酸の抽出、定量が可能であることを確認した。また、その改変法による分生子からの抽出法を確立した。液体培養においては、最少培地、完全培地いずれにおいても培養開始24時間程度でポリリン酸の蓄積量は最大となり、その後減少していくことが明らかとなった。プレート培養(寒天培地による半固体培養)では経時的に緩やかに増加した。培地中のリン酸濃度の増加に伴いポリリン酸蓄積量も増加するが、過剰量になると減少に転じた。また、リン酸濃度を変化さた培地から回収した分生子の蓄積量もそれと同様の変化を示した。これらの回収分生子の液体培養、プレート培養における増殖に関しては、培養に供した培地のリン酸濃度による大きな違いは観察されなかった。また計画外の成果として、固体培養についても検討の結果、米麹ではほとんどポリリン酸の蓄積は見られなかったが、ふすま培養ではポリリン酸の蓄積が確認できた。なお出芽酵母と同様、「polyphosphate “overplus"」現象の発生が観察された。次に、液体培養時の各種ストレスによるポリリン酸蓄積量の変化について検証した。浸透圧ストレス条件下においてはアカパンカビにおける知見(Yang, 1993)と矛盾しない結果が得られた。高温ストレス条件下においては、37°Cでは顕著な変化はなかったが、42°Cにおいては蓄積量に増加が見られた。金属ストレス条件下では、金属種によりポリリン酸蓄積量に異なる変化が見られた。昨年度、酵母のポリリン酸代謝に関わる酵素遺伝子のオルソログ(相同遺伝子)について、麹菌の当該遺伝子破壊株を取得した。

本年度では、当該遺伝子破壊株のポリリン酸量、遊離リン酸量、総リン酸量を各種培養条件で明らかにすると共に、各種ストレス負荷培養条件が遺伝子破壊株の生育に与える影響について解明することを目的とした。ポリリン酸合成酵素遺伝子3種類(vtcA、vtcB、vtcD)、ポリリン酸分解酵素遺伝子2種類(ppxA、ppnA)の各遺伝子破壊麹菌株について、11mMリン酸含有液体培地で振とう培養後、各リン酸量を測定した結果、合成酵素遺伝子3種類の破壊株はポリリン酸の蓄積が見られず、総リン酸量が対象株の約2倍となった。次に、ポリリン酸分解酵素遺伝子破壊株では、ppnA破壊株でポリリン酸量が対照株と比較して極めて低下していた。一方、ツァペックドックス寒天培地上にコロニー形成をさせたところ、vtcB破壊株のみが対照株と比較して有意にコロニー径が大きくなり、他の破壊株は対照株と同等であった。したがって、麹菌におけるポリリン酸合成酵素VtcBは、出芽酵母と異なる機能を有し、菌糸伸長に関与することが示唆された。次に、重金属塩、あるいは酸化剤を添加したツァペックドックス寒天培地上にコロニー形成をさせたところ、合成酵素遺伝子破壊株3種では重金属塩存在下で対象株よりも生育が良く、重金属塩に対する耐性を示した。また合成酵素遺伝子のうちvtcAとvtcDの破壊株が過酸化水素に対して耐性を示した。分解酵素遺伝子ppnA破壊株では重金属塩のうち塩化ニッケル、また過酸化水素存在下で生育が対象株よりも低下し、感受性が増加していた。以上のことから、麹菌におけるポリリン酸代謝関連遺伝子群は、出芽酵母の同遺伝子群とは異なる特性を有することが示唆された。応用微生物学当該年度においては、酵母のポリリン酸代謝に関わる酵素遺伝子のオルソログ(相同遺伝子)について、麹菌の当該遺伝子破壊株を取得すると共に、生育速度や胞子形成力等の観察を行い、既知の情報と比較を行う計画としていた。計画のとおり、5種類のポリリン酸代謝関連遺伝子の破壊株を取得し、当該破壊株の最少培地におけるプレート培養での生育速度や胞子形成力の観察を行った結果、これらの特性は対照株と同等であった。麹菌は醸造産業における酵素生産のスターター微生物として利用されるため、生育速度や胞子形成力は麹菌の基本的な特性であると共に、産業上の重要な形質である。上述した遺伝子破壊により細胞内ポリリン酸蓄積量が変動している可能性が考えられ、当該遺伝子破壊とポリリン酸量の関係については、平成26年度で明らかにする。また、遺伝子破壊による、酸化等のストレス応答への影響の有無についても、併せて解明する。このように、当該年度における計画にしたがって研究を実施し、一定の結果が得られたため、現在までの達成度はおおむね順調に進展していると判断した。当該年度においては、栄養条件やストレス負荷条件において麹菌の培養を行い、細胞内ポリリン酸含有量の動態解明を行う計画としていた。そこで、麹菌におけるポリリン酸の定量が可能であることを確認し、その定量法を確立した。そして、最少培地、完全培地を用いた液体培養、及びプレート培養で経時的にポリリン酸量を測定した。その結果、液体培養においては培養開始後24時間で一過的にポリリン酸が増加蓄積する一方、プレート培養では経時的に緩やかな増加がみられ、培養形態によりポリリン酸蓄積状況が異なることを明らかにした。
乳化食品中で高い抗酸化性・乳化安定性を示すペプチド画分の調製

食品タンパク質酵素分解物を等電点および疎水性に基づいて分画し,乳化安定性および抗酸化性を評価・検討した.得られたエマルション中の油滴の平均粒径,粒径分布,ゼータ電位等の測定によってペプチド画分の乳化安定性を評価した.酸化抑制能はチオバルビツール酸反応生成物(TBARS)分析法を用いて評価した.分取用逆相クロマトグラフィーを用いて分画した小麦グルテンタンパク質酵素分解物の疎水性画分は高い乳化安定性を示した.また,その疎水性画分はエマルション中の油脂の酸化を抑制する効果を示した.平成25年度は食品タンパク質酵素分解物を出発材料とし,疎水性に基づくペプチド分画物の乳化安定性に及ぼす等電点の影響を検討することを目的とした.出発試料は,大豆タンパク質分解物,グルテンタンパク質分解物,カゼインタンパク質酵素分解物とし,分画には分取用逆相クロマトグラフィーを用いた.アミノ酸ごとの疎水性度に基づき,4画分にまとめ,凍結乾燥後,粉末試料として実験に用いた.ペプチド画分(1%・0.2%)を含むリン酸緩衝液(pH 7.0)とコーン油(5%)を用い乳化させた.得られたエマルションを室温下で静置し,分離・凝集を観察した.また各タンパク質酵素分解物の疎水性画分について,Autofocusing装置を用いた等電点電気泳動法により再分画を行い,画分に含まれるペプチドの等電点分布を調べた.さらに,大豆タンパク質分解物の疎水性画分を再分画したものを用い,水相のpH条件を弱酸・弱塩基性に変え乳化試験を行った.いずれのタンパク質分解物も疎水性画分で高い乳化安定性を示し,出発材料により乳化安定性は大きく異なった.特に大豆タンパク質分解物の疎水性画分において安定なエマルションが調製でき,1週間程度乳化状態が維持された.また,大豆タンパク質分解物の疎水性画分の再分画物を乳化試験に用いた結果,酸性環境でも安定なエマルションが調製できた.タンパク質分解物の乳化安定性には,等電点より疎水性の方が寄与が大きい可能性が示唆された.食品タンパク質酵素分解物を等電点および疎水性に基づいて分画し,乳化安定性および抗酸化性を評価・検討した.得られたエマルション中の油滴の平均粒径,粒径分布,ゼータ電位等の測定によってペプチド画分の乳化安定性を評価した.酸化抑制能はチオバルビツール酸反応生成物(TBARS)分析法を用いて評価した.分取用逆相クロマトグラフィーを用いて分画した小麦グルテンタンパク質酵素分解物の疎水性画分は高い乳化安定性を示した.また,その疎水性画分はエマルション中の油脂の酸化を抑制する効果を示した.本研究では,食品タンパク質酵素分解物を材料とし,分画による乳化安定性の向上を目的とし,ペプチド分画物のもつ乳化安定性を評価・検討した.さらに、ペプチド分画物を乳化剤として用いることで得られる酸化抑制効果についても検討を行った.10 %タンパク質分解物溶液を遠心分離し,上清を等電点または極性について分画を行った.ペプチドの分画には,水のみを溶媒とする自己等電点電気泳動(Autofocusing)装置,および分取用逆相クロマトグラフィーを用いた.得られた画分を凍結乾燥し以下の実験に用いた.ペプチド画分を乳化剤として全体の1%となるよう添加し,エマルションを調製した.得られたエマルション中の油滴の平均粒径,粒径分布,ゼータ電位の測定,目視での観測によってペプチド画分の乳化安定性を評価した.また、上記の実験で乳化安定性を示したペプチド画分を用い、O/Wエマルション中での酸化抑制能について分析を行った.比較にはモノ脂肪酸エステル系乳化剤を同量添加し乳化したエマルションを用いた.酸化抑制能はチオバルビツール酸反応生成物(TBARS)分析法により過酸化脂質分解物であるマロンジアルデヒド(MDA)の生成を調べた.酸化はAAPHにより惹起した.試験期間は七日間とし室温下で保存した.分画前のペプチドでは安定なエマルションを得ることはできなかったが,分画後のペプチド群を添加することで,比較的安定なエマルションが得られた.これらの一つの要因として界面張力の低さが考えられる.また、モノ脂肪酸エステル系乳化剤で乳化した場合と比べ酸化が抑制された.本研究において、ペプチドを分画することにより乳化安定性が比較的高くエマルション中の油滴の酸化を効果的に抑制する食品に応用可能なペプチドを調製することができた.以上の結果はペプチド系乳化剤の有用性を示唆する.食品タンパク質の酵素分解物をAutofocusing法およびAmberchromeを用いた調製用逆相クロマトグラフィーにより分画し、等電点と疎水性の異なる画分を調製した。油脂と水に各画分を加え、モデル乳化食品を作成し、油滴サイズ、ζ電位、濁度等を測定し、乳化力及び乳化安定性を評価した。さらにモデル乳化食品中での酸化抑制効果についても分析を行った。これらは当初の計画通り順調に進展している。また、ペプチド画分をマヨネーズ等に添加し、冷蔵、室温で一定時間保存後、食品中での抗酸化能を評価中である。その他についても,当初の計画通り順調に進展している。

平成24年度の結果から得られた乳化安定性および抗酸化性を持つペプチド画分を用い、これら画分の乳化食品モデルおよび実際の乳化食品中での抗酸化活性メカニズムについて検討する。具体的には、ヒドロキシラジカル消去能、ペルオキシドラジカル消去能・フェントン反応の阻害、キレート作用、DPPHラジカル消去能を測定する。そして、いずれの活性が食品中での抗酸化能と相関するかを明らかにすることで食品中での抗酸化メカニズムを明らかにする。さらに食品中の脂質の1・2次酸化物の検出を行い、ペプチド画分がどの酸化過程を抑制しているかを明らかにする。該当なし
Establishing the pipeline for 3D reconstruction of neurophysiological and anatomical maps of the nonhuman primate brain

脳による行動の制御や意思決定に関わる大規模な回路機構を理解するために、代表申請者の伊佐が、米国Cold Spring Harbor研究所のPartha Mitra及びベルギーのLeuven Katholic大学のWim Vanduffelらのグループと共同し、機能的MRIによって得られる(1)安静時結合マップ及び(2)光刺激の効果マップと、Mitraらが開発した(3)全脳レベルでの解剖学的結合マップとを同一個体で重ね合わせる手法を開発する。最初の2年はマーモセットで解剖学的結合マップの構築を完成させ、2年目の途中からマカクザルを対象として生理学的マップとか解剖学的マップの重ね合わせパイプラインを構築する。
トリクロロ酢酸とフェノールの皮膚組織への傷害性と臨床応用に関する研究

1.トリクロロ酢酸とフェノールの人皮膚に及ぼす影響トリクロロ酢酸とフェノール塗布後の皮膚を経時的に生検して、ケラチン6,7,10,16、インテグリン、カドヘリン等の免疫染色を行い、創傷治癒の過程の動態をみた。その結果、今まで同じ作用として考えられていた2つの試薬の機序が異なることを明らかにした。TUNEL法、第VIII因子、caspase-3、Fasを用いてアポトーシス誘導を免疫組織学的に検討した。フェノールの作用と、特に血管内皮細胞への早期のアポトーシス誘導が示唆され,一方、60%TCAによる組織障害には、アポトーシスの関与は否定的と考えた。2.皮膚悪性腫瘍に対するケミカルピーリング治療の効果外科的処置が出来ない皮膚癌の患者に治療として行った。治療後14年の経過観察で、完治が可能であると考えられるのは、日光角化症、ボーエン病、表在性の基底細胞癌の患者であった。また、その中で治療を中止し、外科的処置の必要性を認めた4症例(日光角化症2例、ボーエン病2例)を病理組織的に検討した。その結果、日光角化症の1例、ボーエン病の2例はすべて多発性症例で、免疫組織学的検討の結果、初診時生検組織像より癌抑制遺伝子のp-53が腫瘍細胞に強く発現していた。3.その他通常、ざ瘡や日光性色素斑などのいわゆる"しみ"治療に用いられているグリコール酸の効果を検討した。試薬の作用を人皮膚で確認するために、同じ濃度、pHに調節した、グリコール酸、乳酸、クエン酸、酢酸を長期塗布し、組織学的及び免疫組織学的に検討した結果、グリコール酸と乳酸で、表皮肥厚、メラニンの減少、真皮膠原線維の増加、コラーゲン1、プロコラーゲン1の増加を確認した。以上より、臨床効果を裏付けるような試薬の人皮膚への有効性が確認された。1:ケミカルピーリングにおけるグリコール酸の効果ケミカルピーリングの機序として、皮膚のバリア障害により生じるサイトカインによる作用と、試薬のメラノサイトや線維芽細胞への直接作用がin vitroの実験で報告されている。2:トリクロロ酢酸とフェノールの人皮膚に及ぼす影響塗布することによる皮膚への進達度や組織学的変化を、成人皮膚を用いて検討した。塗布後、2時間,6時間,12時間,1,2,7日目に皮膚を生検して、ケラチン6,7,10,16、インテグリン、カドヘリン等の免疫染色を行って、創傷治癒の経過をみた。TUNEL法で、真皮血管や表皮細胞のアポトーシスの動態をみた結果、フェノールでは早期より、真皮血管内皮細胞に発現し、トリクロロ酢酸では表皮細胞に発現したことから、今まで同じ作用として考えられていた2つの試薬の機序が異なることを明らかにした。なお、トリクロロ酢酸は、日常的に頻用される40または60%を用い、フェノールは、無水性のものを用いた。3:皮膚悪性腫瘍に対するケミカルピーリング治療の効果外科的処置が出来ない皮膚癌の患者に治療として行い、経過を観察した。

治療後13年の経過観察で、完治が可能であると考えられるのは、日光角化症、ボーエン病、表在性の基底細胞癌の患者で、また、その中で治療を中止し、外科的処置をする必要性を認めた4症例(日光角化症2例、ボーエン病2例)を病理組織学的に検討中。1.昨年度、トリクロロ酢酸とフェノール塗布後の皮膚を経時的に生検して、ケラチン6,7,10,16、インテグリン、カドヘリン等の免疫染色を行い、創傷治癒の過程や、TUNEL法で、アポトーシスの動態をみた結果、フェノールでは早期より、真皮血管内皮細胞に発現し、トリクロロ酢酸では表皮細胞に発現したことより、今まで同じ作用として考えられていた2つの試薬の機序が異なることを明らかにした。今年度、両者のアポトーシスの動向に注目し、TUNEL法、第VIII因子、caspase-3、Fasを用いて免疫組織学的に追加検討した。その結果、2時間後のフェノールでは、caspase-3は、表皮角化細胞、真皮血管内皮細胞に強陽性に発現し、真皮血管内皮細胞はTUNEL法でも同様に発現を認めた。また、表皮角化細胞は、12時間後に、caspase-3、TUNEL法ともに発現した。以上より、フェノールの作用として、特に血管内皮細胞への早期のアポトーシス誘導が示唆された。一方、60%TCAは、TUNEL法では、表皮角化細胞は2時間1日後まで、真皮血管内皮細胞は212時間後まで発現したが、caspase-3は、表皮では612時間後に基底細胞に部分的に発現し、真皮では6時間1日後まで真皮血管内皮細胞や線維芽細胞に不均一に発現した。以上より、60%TCAによる組織障害には、アポトーシスの関与は否定的と考えた。2.皮膚悪性腫瘍に対するケミカルピーリング治療の効果外科的処置が出来ない皮膚癌の患者に治療として行い、経過を観察した。治療後14年の経過観察で、完治が可能であると考えられるのは、日光角化症、ボーエン病、表在性の基底細胞癌の患者で、また、その中で治療を中止し、外科的処置をする必要性を認めた4症例(日光角化症2例、ボーエン病2例)を病理組織学的に検討した。その結果、日光角化症の1例、ボーエン病の2例はすべて多発性の症例で、免疫組織学的検討の結果、初診時生検組織像より癌抑制遺伝子のp-53が腫瘍細胞に強く発現していたことより、患者の素因が関与している可能性が示唆された。
父親と母親の産後のメンタルヘルス向上のための教育プログラムの開発

産後1か月の夫婦を対象とした「産後に夫婦が直面する生活の変化や役割の理解を促す教育プログラム」を作成し、兵庫県の出産施設で出産した産後1か月の夫婦18組に実施し、産後4か月に自己記入式質問紙調査とグループフォーカスインタビューで評価を行い、プログラムを修正して完成させる。次に、完成したプログラムを産後1か月の夫婦に実施する。1回のプログラムへの参加は10組とし、介入群には開発したプログラム、対照群は育児技術に関する教育プログラムを実施する。産後4か月の介入群と対照群のうつ状態と夫婦関係満足度についてt検定およびカイ2乗検定により分析しプログラムの父親と母親の産後うつ病の予防効果を検証する。
近似アルゴリズムの研究

戸ヶ崎光敬,山崎浩一:"R上のpropre区間表現をZ上のunit区間表現へ変換するアルゴリズムについて",概要:区間グラフの区間表現において,区間の長さが全て等しいならばunit区間グラフと言い,また,どの区間も他の区間に真に含まれることがないとき,proper区間グラフと言う.数値線上の議論でproper区間グラフとunit区間グラフが等しいことは示されているが区間の長さを抑えた区間の両端点が整数になるような配置での証明はまだない.そこで我々は,実数上でのproper区間表現から,区間の端数が整数かつ区間の長さが高々n(nは頂点数)のunit区間表現を出力する,O(n^2)時間アルゴリズムを示した.戸ヶ崎光敬,山崎浩一:"Pathwidthがk,strong pathwidthがkのグラフに対するページナンバー",概要:pathwidthが高々kのグラフの集合に対するページナンバーがkであることと,strong pathwidthが高々kのグラフの集合に対するページナンバーは(3(k-1))/2と3[k/2]の間にあることを示した.長島弘幸,山崎浩一:概要:2次元直方体におけるintersection graphの最大独立点集合問題に対し,何も制限がつかない場合はNP困難でO(log n)近似可能,弱非包含の制限がつくと定数近似可能,サイズが全て等しいという制限の下では,PTASを持つことが知られている.弱非包含の制限の下で,PTASを持つか否かはまだ知られていない.本論分で,3次元において弱非包含の制限の下でもPTASを持たないことを示した.以下の2つの研究結果を得た:パス距離幅に関する研究独立点集合に関する研究最大次数が高々Δである重み付きグラフ全体の集合をg_Δで表し,グラフGの頂点υの次数をd_G(υ),重みをW_G(υ)で表す.(W_G(υ))/(d_G(υ)+1)が最大となる頂点を独立点集合として選んでゆくアルゴリズムと(W(υ))/(d_G_i(υ)(d_G_i(υ)+1))が最小となる頂点を削除してゆくアルゴリズムに対し,近似率がともにΔ+1以下であることを示した.すなわち,2つの貪欲アルゴリズムは最悪でも最適解1/(Δ+1)以上の解を出力することを今回示した.また,これら2つの貪欲アルゴリズムの並列化も行なった.戸ヶ崎光敬,山崎浩一:"R上のpropre区間表現をZ上のunit区間表現へ変換するアルゴリズムについて",概要:区間グラフの区間表現において,区間の長さが全て等しいならばunit区間グラフと言い,また,どの区間も他の区間に真に含まれることがないとき,proper区間グラフと言う.数値線上の議論でproper区間グラフとunit区間グラフが等しいことは示されているが区間の長さを抑えた区間の両端点が整数になるような配置での証明はまだない.そこで我々は,実数上でのproper区間表現から,区間の端数が整数かつ区間の長さが高々n(nは頂点数)のunit区間表現を出力する,O(n^2)時間アルゴリズムを示した.戸ヶ崎光敬,山崎浩一:"Pathwidthがk,strong pathwidthがkのグラフに対するページナンバー",概要:pathwidthが高々kのグラフの集合に対するページナンバーがkであることと,strong pathwidthが高々kのグラフの集合に対するページナンバーは(3(k-1))/2と3[k/2]の間にあることを示した.長島弘幸,山崎浩一:概要:2次元直方体におけるintersection graphの最大独立点集合問題に対し,何も制限がつかない場合はNP困難でO(log n)近似可能,弱非包含の制限がつくと定数近似可能,サイズが全て等しいという制限の下では,PTASを持つことが知られている.弱非包含の制限の下で,PTASを持つか否かはまだ知られていない.本論分で,3次元において弱非包含の制限の下でもPTASを持たないことを示した.
メタボリックシンドロームの臓器障害治療における抗酸化ペプチドの可能性

アドレノメデュリンはCSKのリン酸化を介して、c-Srcのリン酸化を抑制することによりアンジオテンシンによって活性化されるNADPHoxidaseの活性化を抑制した。また、糖やアルドステロンによって活性化されるNADPHoxidase活性も抑制した。これらの結果からアドレノメデュリンの抗酸化作用の一部が明らかとなった。一方、in vivoの検討として、アドレノメデュリンノックアウトマウスを用いた検討では、LPSによる肝障害が著明であり、これに対しdominant negative IkBを用いて酸化ストレスの情報伝達を抑制すると肝障害が抑制された。また、メタボリックシンドロームのモデルとしてdB/dBマウスにアンジオテンシンを負荷した際の心血管病変についても検討した。強力な抗酸化物質で、経口投与可能な白金ナノコロイドを用いて治療すると、このモデルにおいても、心血管病変が著明に改善した。白金ナノコロイドは従来のビタミンCなどとは異なり、強力に酸化ストレスを除去し、且つその作用が触媒作用によるため、長期にわたって酸化ストレスを抑制できることがわかった。これらのことより、酸化ストレスをターゲットにした治療は今後、臓器障害を予防する上で有効である可能性が示唆されたが、安全性など今後検討すべき点は残されている。加齢アドレノメデュリンノックアウトマウスの骨格筋の検討から、酸化ストレスによるインスリン抵抗性の発現はインスリンシグナリングの上流部分特にPI3Kの活性の抑制にあることが明らかになった。また、外因性にアドレノメデュリンあるいはNFkBの阻害を目的としてdominant negative IKBを投与することによりインスリン抵抗性を改善することができた。また、その際にはPI3Kの活性も一部改善した。一方、ビタミンC、Eの同時投与ではこのような改善効果は認められなかった。また、アドレノメデュリン、dominant negative IKBの治療でも肥満を改善することはなく、アドレノメデュリン欠損と肥満との関連は不明である。また、メタボリックシンドロームでは炎症が臓器障害のきっかけとなることが知られており、アドレノメデュリンノックアウトマウスでも、LPSによる炎症が肝臓、腎臓にたいし障害を起こすことが確認された。特に肝臓ではクッパー細胞の浸潤が著明で、アドレノメデュリンあるいはdominant negative IKBの投与により病変を改善することができた。同時に測定した炎症性サイトカイン、ALTの値もLPSにより上昇したが、アドレノメデュリン、dominant negative IKBにより抑制された。腎臓においても蛋白尿、クレアチニンの上昇を抑制した。この実験系でもやはりビタミンC、Eでは効果を認めなかった。NADPHoxidaseの阻害を遺伝子レベルで行うべくsiRNAの設計を行い、培養血管平滑筋、培養血管内皮細胞で検討を行ったが、NADPHoxidaseの発現の抑制が不十分であり、siRNAの設計あるいは導入に問題があると考えられた。AM欠損マウスでは脳室内高張食塩水投与に対する血圧上昇・腹部交感神経活性亢進反応は亢進し、これは抗酸化物質tempolで抑制された(Hypertension 2005;45:1165)。また、このマウスの摘出視床下部は高張食塩水添加時のROS増加反応が増強していた。これらのことから、アドレノメデュリンの中枢での欠損が酸化ストレスを介して交感神経活動に影響することで、肥満を引き起こす可能性が示唆された。加齢、アンジオテンシンに加え、メタボリックシンドロームの重要な因子である糖、あるいはアルドステロンは血管平滑筋、腹膜中皮細胞において酸化ストレスを産生させた。AMはこれらの負荷による酸化ストレスの産生に対しても抑制的に働くことが明らかとなった。血管平滑筋に対してアルドステロンはnon-genomic,genomic effectの双方で酸化ストレスを増大させるのに対し、腹膜中皮細胞ではgenomic effectのみが観察された。AMの作用はいずれにも効果があり、AMの作用がcAMPを介する従来の作用以外にもあり、抗酸化剤として強力な作用を有する可能性が示唆された。
肺の間質・気道の線維化および発癌・進展に関与する循環線維細胞の分子病態とその制御

肺線維症患者の循環線維細胞は分離・同定中に細胞が分化し、薬物耐性や感受性の検討に適さない為、環線維細胞を制御する影循環血液中micro-RNAの病態に関して、マウスブレオマイシン肺障害をもちいて検討した。その結果143個のmiRNAが肺障害によって大きく変動し、miR-322,miR-874,miR-155が線維化期に肺組織と血清中で共に上昇することを見出した。これらのmiRNAは新たな線維化マーカーとしてのみならず新しい線維化抑制療法として期待される。本年度は主に進行性肺線維症患者の肺組織を用いた病理的な解析を開始した。特発性肺線維症(IPF)患者肺においては線維化病変において毛細血管密度が著しく減退し、むしろ小葉の内部の毛細血管が増殖していることからしても、患者血液中の循環線維細胞はまだ線維化の進んでいない小葉間隔壁、および胸膜下組織に浸潤することで線維化が亢進していく。一方、肺胞壁自体が線維化していく線維性非特異性間質性肺炎(f-NSIP)では小葉内の肺胞毛細血管から循環線維細胞が浸潤して線維化が亢進する。さらにIPF患者肺では線維化病変内のリンパ管が消退することから、肺内線維化の情報が血液を介しては伝わらないのに対し、f-NSIPでは毛細血管から浸潤した循環線維細胞が筋線維芽細胞に分化して変化する産生物が、残存するリンパ管を介して骨髄に伝達される可能性を示した。これらの結果は、患者末梢血中のmiRNAなどからも患者肺の病態の情報を得る本研究課題の有効性を示唆している。患者検体や動物疾患モデルマウスから得られる循環線維細胞やmiRNAの解析に関しては、学内の倫理委員会の承認も得られ、順次検体の解析準備を整えた。疾患マウスを用いた間質性肺炎とメタボリックによる慢性炎症の検討も進行中である。本年度は喫煙による肺気腫病態形成に関連があると報告されたmTOR抑制因子Rtp801の発現(Nat Med 2010,16:768)が、肺気腫患者肺だけでなく、気腫合併肺線維症の線維化病変にも発現するのみならず、IPFやfNSIPなどのような進行性肺線維症患者肺や移植摘出肺などで得られた非喫煙者の線維症患者肺にも強発現することを見出した。このことはRtp801が慢性炎症機序に重要な因子である可能性を示唆しており、本研究課題とも大きく関連することであり、さらに検証を継続する。学内の倫理委員会の承認を得たプロトコールに従って同意を得た患者から採血をおこない、様々な臨床状態における間質性肺炎患者の末梢血中の循環線維細胞(circulating fibrocyte)の同定とその疾患病態との比較を開始した。実際にはFicolを用いてmesenchymal cellの細胞を分離、一部は培養し、CD45 PE-Cy7により染色後、Cytoperm処理を行い、Anti-collagen-biotinとStreptavidin-FITCにより染色をほどこし、FACSにより同定した。その結果、正常対照者群にくらべ患者群ではばらつきが大きく、安定状態にある間質性肺炎患者では正常群に近いものの、急性増悪を起こした患者では3-7倍程度に循環線維細胞が増加し、ステロイド治療後にはまた減少する。さらに肺幹細胞の性質をもつCD45+CD133+細胞の同定をして比較すると、増悪後よりもむしろその治療後に増加していることを示す傾向が観察された。しかしその同定された細胞の組織における分布は、分化が亢進することによって評価できないことを確認した。これらの臨床上の評価は困難であることから、マウスを用いたブレオマイシン肺傷害モデルをもちいた実験系における循環線維細胞のみならず末梢血中のmiRNAと組織のmiRNAの肺線維化形成病態における変化が、新たな病態指標としてのバイオマーカーになりえないか、あらたに開発されたマウスSP-D抗体による値との比較や病理学的評価との比較もしつつ検討をおこない、臨床応用を試みた。これらの臨床・基礎的研究は、さらに継続して行う予定である。これまでの循環線維細胞(circulating fibrocyte)に関する研究結果に基づき、本年度の研究としては末梢血液中のmicroRNA(miRNA)の線維化病態との関連を、マウスブレオマイシン肺を対象として、肺内miRNAの変化との関連も加えて研究を行った。また、間質性肺炎の臨床において病態評価に広く利用されている血清サーファクタント蛋白D (SP-D)を、マウスSP-Dに対する新しいモノクローナル抗体を用いて測定し、マウス肺線維症モデルでのSP-Dの詳細な検証と、肺線維化を反映する新たな指標としての循環miRNA(circulating miRNA)の変化との対比を検討し、新しいバイオマーカーとしてのcirculating miRNAの可能性を検討した。