hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
矯正力により牽引側に誘導される破骨細胞形成阻止因子発現機構の解析

昨年度の本研究で、私は、培養骨芽細胞様細胞に神経由来ペプチドであるCGRPを作用させると破骨細胞形成阻止因子(Osteoprotegerin, OPG)の発現が亢進することを明らかにした.そこで、今年度は、実際に歯を移動した際の牽引側で、CGRP含有神経の分布の変化及び、一酸化窒素合成酵素(NOS)の発現変化とOPGの発現との関連を検討した.橋本らの方法に従い、5週齢Wistarラットの第1臼歯を近心に移動し、切片を作製した.まず、抗CGRP抗体、神経を特異的に認識する抗NFP抗体を用いて、牽引側のCGRP含有神経の分布の変化を検討した.牽引側のCGRP陽性反応は、歯の移動1日後に著明に減少した.しかし、抗NFP抗体陽性神経線維は、歯の移動後もこの部位に認められることから、神経線維はこの部位に存在していることが示唆された.つまり、歯の移動後、牽引側では、神経線維よりCGRPが放出されている可能性が示唆された.次に、in situ hybridization法で牽引側のOPGの発現変化を検討した.OPGの発現は歯の移動前では、ほとんど認められなかった.その後、歯の移動1日目からOPGの発現が認められ、2日目にピークとなった.これらのことから、実際に歯を移動した牽引側では、神経線維より放出されたCGRPがOPGを誘導している可能性が考えられた.牽引力を負荷した際にどのような機構でCGRPが、神経より放出されるのか、OPGの発現を亢進するCGRP以外の分子の検索などは今後の課題である.歯に矯正力をかけると,牽引側では骨芽細胞が出現することおよびこれと同じ時期に破骨細胞形成阻止因子(OPG)が発現すること,さらに,牽引側では一酸化窒素(NO)合成酵素の発現やCalcitonin gene related peptide(CGRP)含有神経の分布が著明に変化することなどが,明らかにされている.本研究では,牽引側におけるOPG誘導機構を明らかにすることを目的とし実験を行った.可能性のある因子としては骨芽細胞の増殖および分化に作用することが報告されている分子を選んだ.そこでNOおよび神経由来ペプチドであるCGRPにOPG誘導能があるかをマウス頭蓋冠由来骨芽細胞様細胞を用いて調べた.まず,骨芽細胞様細胞を10^<-8>M Vitamin D3存在下で培養し,10^<-7>MのCGRPを添加した.その後,これらの細胞からRNAを抽出し,RT-PCRおよびノーザンブロティング法を行い,OPGならびにRANKLの発現を検索した.その結果,骨芽細胞様細胞において,Vitamin D3はRANKLの発現を著明に増加し,OPGの発現を低下させた.この低下したOPGの発現は,CGRPの添加によって増加することが認められた.また,CGRP単独の添加の場合にも,OPGの発現は増加した.これらの結果とCGRPトランスジェニックマウスでは骨量が著しく増加すること,また,牽引側ではCGRP含有神経が著明に変化することを考え合わせると,CGRPが牽引側において,OPG誘導因子の1つとして機能している可能性が示唆された.昨年度の本研究で、私は、培養骨芽細胞様細胞に神経由来ペプチドであるCGRPを作用させると破骨細胞形成阻止因子(Osteoprotegerin, OPG)の発現が亢進することを明らかにした.そこで、今年度は、実際に歯を移動した際の牽引側で、CGRP含有神経の分布の変化及び、一酸化窒素合成酵素(NOS)の発現変化とOPGの発現との関連を検討した.橋本らの方法に従い、5週齢Wistarラットの第1臼歯を近心に移動し、切片を作製した.まず、抗CGRP抗体、神経を特異的に認識する抗NFP抗体を用いて、牽引側のCGRP含有神経の分布の変化を検討した.牽引側のCGRP陽性反応は、歯の移動1日後に著明に減少した.しかし、抗NFP抗体陽性神経線維は、歯の移動後もこの部位に認められることから、神経線維はこの部位に存在していることが示唆された.つまり、歯の移動後、牽引側では、神経線維よりCGRPが放出されている可能性が示唆された.次に、in situ hybridization法で牽引側のOPGの発現変化を検討した.OPGの発現は歯の移動前では、ほとんど認められなかった.その後、歯の移動1日目からOPGの発現が認められ、2日目にピークとなった.これらのことから、実際に歯を移動した牽引側では、神経線維より放出されたCGRPがOPGを誘導している可能性が考えられた.牽引力を負荷した際にどのような機構でCGRPが、神経より放出されるのか、OPGの発現を亢進するCGRP以外の分子の検索などは今後の課題である.
炭素ー水素結合の活性化による分子変換

本研究も2年目が終り、各分担者によりCーH結合活性化に関する優れた研究成果が得られている。以下にその概要を述べる。1.芳香族CーH結合の活性化を経る合成反応の開発Pd(OAc)_2/フェナントロリン/CO(15気圧)/O_2(15気圧)系によりベンゼンが水酸化されて一段階でフェノールを与える反応を見いだしており、この反応で^<18>O_2やd_6ーベンゼンを用いることにより、O_2による直接酸化であることを確認した。さらに、反応条件の検討によりO_2とCOを1時間ごとに補充するとフェノールの収率が向上し、触媒ターンオーバー数1015が得られた。ベンゼンの他、トルエンや安息香酸メチルでも同様な水酸化が起こり相当するフェノール誘導体が得られることも明らかにした。またFeCl_3/カテコール/ピリジン/ヒドロキノン/O_2(1気圧)系でも芳香環の水酸化が起こることも見いだした。2.ルテニウム錯体によるアミンCーH結合活性化を経る合成反応の開発低原子価ルテニウム触媒により第3メチルアミンをt-BuOOHで酸化するとメチル基のC-H結合がt-ブチルジオキシ化されることを明らかにし、反応経路及び合成反応への応用について検討し、脱メチル化、環化、イミン合成等が容易に行なえることも明らかにした。3.アルデヒドC-H結合及びアセチレンC-H結合活性化を経る合成反応RuH_2(PPh_3)_4触媒により芳香族アルデヒドのC-H結合が活性化されて二量化しエステルを与える反応を見いだした。さらに、有機ケイ素化合物のエチニルメチルジフェニルシランをRh触媒で処理することにより位置及び立体特異的に1,4ージシリルエンインが得られることも見いだした。4.ヘテロポリ酸によるアルカンC-H結合活性化反応ピロリン酸バナジル触媒によるブタンから無水マレイン酸への選択的酸化反応を見いだし、その触媒作用機構を物理化学的手法で解明した。
不斉オキサゾリン配位金属錯体による炭素移動反応

光学活性アミノ酸,特にL-バリンを還元して得られるL-バリノールを基本骨格とした不斉源により配位子ビスオキサゾリンピリジン類を数種合成し,ルテニウム錯体とすることができた。この配位ルテニウム化合物の構造を解析するとともに,以前より進めてきた不斉シクロプロパン化の触媒による炭素移動反応に成功した。さらに中間体であるカルベン錯体の単離に成功した。カルベン錯体からはさらにオレフィンへのカルベン移動が不斉誘導を伴って進行することを発見した。また,錯体が触媒的にジアゾ化合物やシクロプロペン化合物からオレフィンへの炭素移動反応を起こすことも見いだした。又、配位ビスオキサゾリンピリジンのピリジン骨格4位に置換基導入したものを合成し同じ反応を起ったところ,電子求引性置換基が触媒の活性を上げる作用を有することを発見した。ハメットプロットを行うことにより不斉触媒反応の電子調整法の良い例であることを示した。
船上離着陸型宇宙往還機の知的ロバスト着艦制御

平成19年度は、着陸フェーズにおける耐故障性やロバスト性を有する誘導・制御方式および自律型協調知的制御方式を提案した。宇宙往還機は、3次元空間における不安定系かつ非線形ダイナミカル・システムであり、多くのパラメータは不確定性を含む。さらに、アクチュエータやコントローラの故障時には、アンダーアクチュエーションの状態に陥ると共に、飛行中常に十分な精度で状態量に関する情報を取得できるとは限らない。特に着陸時においては、センサノイズ、波や風などの外乱を受けるが、このような状況においても、適切な機体の沈下速度や空間内での位置、船上離着陸補助システムとの相対速度・位置を保たなければならないため、高精度かつ高い自律性と頑健性を兼ね備えたシステム設計が必要となる。本研究では、制御工学、ダイナミカル・モデリング、ソフトコンピューティング手法の分野に注目し、各分野からのアプローチを有機的に組み合わせ、様々な機能間のバランスを確保した上で高次機能を有する新しいシステム技術の構築を目指す。提案する誘導・飛行方式では、申請者らがこれまでに研究を行ってきた多次元構造型知的制御手法を導入する。提案する協調方式では、システムは常に内部状態を評価し、自己の評価情報に基づいて、適切な方策を状況に応じて自律的に決定する。6自由度非線形数学シミュレーションにより提案手法の有効性を検証した。その結果、アクチュエータ故障時と突風時を適切に判別し、状況に応じて飛行経路および制御目標を変更することによって、墜落することなく、着艦が可能であることを確認した。
博物館体験を共有するパーソナル・ポートフォリオ学習の実践

本研究は、博物館体験という視点に立脚し、来館者自身による展示室での「デジタル写真記録」が展示室での体験を省察するためのよい手法・ツールになることを明らかにするとともに、このツールを活かした学習プログラムを開発し、学校団体等による展示見学活動に新たな視点をあたえることを目的としている。また、来館者自身が博物館体験コンテキストを把握・認識することが学びになるという仮説を立て、実践的に検証を行う。そのために、来館者の展示見学における博物館コンテキストを認識するツールとしてデジタルカメラによる撮影と画像を用いたポートフォリオ作りを開発・構築し、学習の実践をすすめた。本研究は、博物館体験という視点に立脚し、来館者自身による展示室での「デジタル写真記録」が展示室での体験を省察するためのよい手法・ツールになることを明らかにする。また、このツールを活かした学習プログラムを開発し、学校団体等による展示見学活動に新たな視点をあたえることを目的としている。そのために、来館者の展示見学における博物館コンテキストを認識するルールの開発・構築と、そのツールを活かした学習の開発をすすめることが研究の目的である。研究初年度である平成26年度は、計画通り、デジタルカメラを用いた記録を併せた展示見学の検討作業をすすめることができた。具体的には、生命の星・地球博物館の地球展示室および生命展示室において、デジタルカメラ記録法の試行と展示見学ポートフォリオ作成の試行を積み重ねた。ツール開発の一環として、共同研究者のメンバーによる試行、高校化学部メンバーによる試行、中学生による試行を実施した。外部協力により、生徒による試行を積み重ねることができたことは大きな成果である。試行の都度、ツール開発に改善を加えることができた。現時点では、小学校高学年、中高生、数名の体験学習として、デジタルカメラ記録法&展示見学ポートフォリオづくりの実践が可能なレベルとなっている。また、展示学習から立脚し、個々の展示物と展示コーナー全体との関係性を見出すための方策を検討した。「部分」と「全体」の関係性をどのように認識させるかという命題である。企画展「恐竜の玉手箱」を通じて、体験アクティビティを用いての試行をすすめることができた。そのために、来館者の展示見学における博物館コンテキストを認識するツールの開発・構築と、そのツールを活かした学習の開発をすすめる。研究2年目となる平成27年度は、小学生、中学生、大学生、教員を対象に、デジタルカメラを用いた記録を併せた展示体験のポートフォリオづくりの試行を重点的にすすめた。具体的には、生命の星・地球博物館の地球展示室および生命展示室での見学を基に、親子向け講座の実施、校外学習での中学生による展示見学ポートフォリオ作成、博物館実習における学生による展示見学、教員向け講座の実施などを行った。従来の展示見学実習を派生させ、外部協力により児童・生徒・学生によって展示見学ポートフォリオ作成を試行できたことは多様な実践パターンの把握につながった。10名程度を対象とした3時間の展示体験学習プログラムとして、デジタルカメラ記録法&展示見学ポートフォリオづくりの実践が可能なレベルとなっている。また、展示学習をより主体的なものとするために、見学者自身による「問い」と「気づき」の認識と、その支援方法を課題としている。方策のひとつとして展示室での来館者の言葉(つぶやき)に注目し、展示室での参与観察を試行した。展示室での「デジタル写真記録」の試行、検証は、共同研究者と協議しながら、児童・生徒、さらには教員による試行などの機会を得て、順調にすすんでいる。展示室でのデジカメ記録、写真プリント、写真ドキュメンテーション、ポートフォリオ作成までの手順についてプログラを確立できたが、多人数を対象とする場合の方策は未着手である。ひきつづき、写真ドキュメンテーションの読み解きや展示室体験を省察させる手立てについて、展示と見学者の「問い」と「気づき」を基に、開発・検討をすすめ、展示見学ポートフォリオ学習のプログラムとする必要がある。そのために、来館者の展示見学における博物館コンテキストを認識するツールの開発・構築と、そのツールを活かした学習の開発をすすめた。最終年は、主な取り組みとして、(1)ポートフォリオづくりのツール改善・整備、(2)見学実習等でのポートフォリオづくりの導入、(3)小学校等との連携による実践、をすすめた。展示見学ポートフォリオづくりは、生命の星・地球博物館の地球展示室および生命展示室での見学をふまえ、デジタルカメラによる撮影画像を時系列に並べたシートに自分自身のメモを記し体験を振り返るものである。そのシートをもとにした仲間との対話は、さらなる気づきや問いを促すものとなっている。

プログラムの試行実践として、博物館実習における学生による展示見学、教員向け講座の実施、見学実習授業などを行った。従来の展示見学実習を派生させ、外部協力での児童・生徒・学生による展示見学ポートフォリオ作成の試行は多様な実践パターンの把握につながった。30名程度を対象とした場合、4時間の展示体験学習プログラムとして、デジタルカメラ記録法&展示見学ポートフォリオづくりが可能である。小学校との連携として、近隣小学校2校と展示見学ポートフォリオづくりを取り入れた授業実践をすすめた。1時間程度の展示見学と学校教室でのポートフォリオづくりという組み合わせでの実践となった。本研究は、博物館体験という視点に立脚し、来館者自身による展示室での「デジタル写真記録」が展示室での体験を省察するためのよい手法・ツールになることを明らかにするとともに、このツールを活かした学習プログラムを開発し、学校団体等による展示見学活動に新たな視点をあたえることを目的としている。また、来館者自身が博物館体験コンテキストを把握・認識することが学びになるという仮説を立て、実践的に検証を行う。そのために、来館者の展示見学における博物館コンテキストを認識するツールとしてデジタルカメラによる撮影と画像を用いたポートフォリオ作りを開発・構築し、学習の実践をすすめた。展示室での「デジタル写真記録」の試行、検証は、共同研究者と協議しながら、生徒による試行などの機会を得て、順調にすすんでいる。展示見学者による物理的な作業、すなわち、展示室でのデジカメ記録、写真プリント、写真ドキュメンテーション、ポートフォリオ作成までの手順がひとつのパターンとして蓄積できた。一方、写真ドキュメンテーションを読み解き、展示室での体験を省察する手立ては、さらなる活動アクティビティの開発・検討をすすめ、展示見学ポートフォリオ学習のプログラムとする必要がある。これまでの成果をふまえ、展示室での個々の博物館体験を基にした学習プログラムの開発・検討を行う。ひきつづき、博物館主催の講座として教員向け実践講座をすすめる予定である。また、学校団体による展示学習をふまえて、1クラス(40人)で実戦可能な学習プログラムの開発として、利用機器の検討、指導プログラムの検討などの検討をすすめる。あわせて、学校現場の先生方との試行をすすめる予定である。博物館学研究初年度の成果をふまえ、展示室での個々の博物館体験を基にした学習プログラムの開発・検討を行う。具体的には、博物館主催の講座としてプログラム実践をすすめる予定である。デジタルカメラ記録法の実践のための機器類(とくにデジタルカメラ)の追加調達を予定していたが、1クラス40名分など一括大量購入は避けることにした。
濃度依存性ナトリウムチャンネルNax

Naxが発現する脳室周囲器官の細胞を単離し、イオンイメージングを行った。細胞外ナトリウムを525mM上昇させると、細胞内ナトリウム濃度の上昇が野生型マウス由来の細胞で観察された。Nax遺伝子欠損マウス由来の細胞ではこの反応は消失していた。すなわち、Naxは細胞外ナトリウム濃度の上昇に応じて活性化されるナトリウムチャンネルであることが示唆された。次にNaxの発現誘導をすることのできる細胞株を確立した。本細胞にNaxの発現を誘導すると、微弱な応答ではあるがNax由来の細胞内へのナトリウムイオン流入が観察することができた。よって、Naxは細胞外ナトリウム濃度依存性ナトリウムチャンネルという全く新しい特性を有するナトリウムチャンネルであることが明らかとなった。次に遺伝子欠損マウスの塩分摂取行動の基本特性に関して、飲水量自動計測装置を利用して脳のナトリウムセンシング機構について解析を行った。脳室内にカニューレを挿入し高張ナトリウム溶液によってNaxが発現している脳室周囲器官を直接刺激した。その結果、野生型マウスは脳室内のナトリウム濃度の上昇に伴ってナトリウムの摂取行動が抑制されたが、遺伝子欠損マウスでは抑制が全く見られなかった。さらに、Nax発現ベクターによって遺伝子欠損マウスの異常行動をレスキューすることに成功した。これらの結果から、Naxは体内のナトリウム恒常性に必須のセンサーチャンネル分子であることが明らかとなった。Naxイオンチャンネルは、培養系での機能的発現ができないために生理的役割が不明な分子であった。我々はNa_xの生体内での機能解明を目指して遺伝子欠損マウスを作製した。その結果、Na_x遺伝子欠損マウスは高張塩水を異常摂取することが判明した。中枢神経系におけるNa_x遺伝子発現は、脳弓下器官、終板脈管器官といった脳室周囲器官及び一部の神経核に特異的であった。c-fosの発現を目安に、遺伝子欠損マウスの中枢神経系における神経細胞活動レベルを解析したところ、これら脳室周囲器官に過剰な活動が検出された。これらの器官は体液塩分濃度の中枢受容部位であり、食塩摂取行動を制御していると考えられている。すなわち、Na_xは脳室周囲器官の塩分濃度検出機構に密接に関与しており、塩分摂取行動の中枢制御に重要な働きをしていると考えられる。さらにイオンイメージング法を用いることによって、細胞外液のNa^+濃度を515mM上昇させた場合に、Na_xによると思われる細胞内Na^+濃度増大がNa_xを発現している神経細胞に観察された。細胞内Na^+濃度増大は、浸透圧刺激では引き起こされることのないことから、細胞外ナトリウムに特異的な現象であった。また遺伝子欠損マウスの細胞では、このような現象は観察されなかった。遺伝子欠損マウスの細胞にNa_x発現ベクターを導入すると、こうしたナトリウム感受性が回復した。これらの結果から我々は、Na_xは「細胞外ナトリウム濃度依存性」という全く新しい特性を有するナトリウムチャンネルであり、中枢神経系において体液ナトリウム濃度を感知するナトリウムセンサー分子であると推察している。今後、細胞培養系でNa_xのさらなる詳細なチャンネル特性の解明に当たりたい。初めに遺伝子欠損マウスの塩分摂取行動の基本特性に関して、飲水量自動計測装置を利用して脳のナトリウムセンシング機構について解析を行った。動物は脱水状態になると体内のナトリウム濃度が上昇し、新たな塩分の摂取行動は回避する。以前の結果から、遺伝子欠損マウスは脱水時でも塩分摂取回避行動をとらないことがすでに判明している。今回は、脳室内にカニューレを挿入し高張ナトリウム溶液によってNaxが発現している脳室周囲器官を直接刺激した。さらに、Nax発現ベクターを遺伝子欠損マウスの脳室周囲器官に投与したところ、野生型マウスに近い行動を示すようになった。このことは脳で発現しているNaxが体液中のナトリウム濃度検出に必須であることを示している。

本細胞にNaxの発現を誘導すると、微弱な応答ではあるがNax由来の細胞内へのナトリウムイオン流入が観察することができた。さらに、Nax誘導細胞をサイトカインで刺激しておくとNax由来のナトリウムイオン流入が増強された。すなわちNaxは、細胞外のナトリウム濃度だけではなく、循環性のサイトカインによっても活性が制御されていることが示唆された。以上の結果から、Naxは細胞外のナトリウム濃度やサイトカイン濃度に応じて活性化が制御されており、体内のナトリウム恒常性に必須のチャンネル分子であることが明らかとなった。
心臓部位特異的発現遺伝子群のカタログ化とその医学的意義に関する研究

心血管系疾患の病因候補遺伝子として、心筋に強く発現する新規遺伝子の単離を行い、その全長cDNA構造、ゲノム構造、組織特異的発現性等を解析し、また機能が予測されるものについては機能解析を行った。H452は心筋と骨格筋に特異的に発現し、5エクソンのゲノム構造で、155アミノ酸をコードし、第4染色体にマップされた。一方、H660は心筋、脳、骨格筋に発現し、12エクソン構造で、504アミノ酸をコードし、第3染色体にマップされた。これら2種は既知遺伝子と全く相同性がないものであった。これに対してH5は、心筋と脳に特異的に発現し、16エクソン構造をとり16p13にマップされたが、転写開始とスプライシングの違いにより、3種のアイソフォームをコードするものであり、細胞増殖の制御に関連するNdrファミリーの一員と考えられた。これらとは別に、最も詳細な解析を行ったのはH602(心筋特異的ミオシンファスファターゼM21サブユニット)であるが、これは非筋型M130サブユニット(MYPT1)に結合し、心筋および平滑筋で収縮のカルシウム感受性を亢進させた。さらにin vivoでの機能解析を目的として、この遺伝子をマウスαミオシンプロモーター下に連結しトランスジェニックマウス(TGM)を作製した。3系のTGMが作られたが、最も高発現系であったF0マウスは心肥大と徐脈を来たして死亡した。一方、残る2系統の子孫でも一部に徐脈と突然死が観察されているため、このTGMは肥大心に伴う不整脈の動物モデルとなると考えられた。なお、M21サブユニット遺伝子およびM130サブユニット遺伝子の全域にわたる変異検索を行ったが、特発性心筋症患者に特異的な変異は見出されなかった。
形状記憶合金の変態温度を予測する手法の確立とそのＴｉ基形状記憶合金への適用

本研究の目的は、形状記憶合金の変態温度を予測する手法の確立及び、その手法のTi基形状記憶合金への適用と合金設計である。本年度の研究実施以前から、変態温度と母相ーマルテンサイト相(M相)間のエネルギー差の間に粗い比例関係が成立し、母相-M相間のエネルギー差を用いて変態温度が予測できることを明らかにしている。そのため本年度は、当初の計画であった形状記憶合金の変態温度を予測する手法のTi基形状記憶合金への適用と合金設計に加え、デバイモデル及び機械学習を用いた予測手法構築による変態温度の予測精度の向上を行った。デバイモデルを用いて母相及びM相の振動エントロピー項を考慮した自由エネルギーを算出し、得られた母相及びM相の自由エネルギーが等しくなる温度から算出した変態温度は、本年度の研究実施以前から用いていた母相-M相間のエネルギー差から算出した変態温度よりも予測精度を大きく向上させることができた。また、第一原理計算と機械学習を併用した変態温度の予測手法では、デバイモデルを用いた自由エネルギーの第一原理計算から算出した変態温度よりもさらに予測精度を向上させることができた。さらに、構築した変態温度の予測手法を適用しTi基形状記憶合金の合金設計を行った。まずTi-Nb-X合金について、変態温度が室温となる条件下で、ω相を抑制しかつより変態ひずみを大きくする、Ti-Nb基形状記憶合金の特性改善に最も有効な元素はAlであった。そこで、Ti-Nb-Al合金について自由エネルギーの変態温度の予測手法を適用し、合金組成の最適化を行った結果、室温で形状記憶特性を発現し、8%の高い変態ひずみを有しかつω相を抑制することができる最適な合金組成を設計できた。今後の研究では、開発した形状記憶合金の変態温度を予測する手法をTi基形状記憶合金以外の合金系へ適用し、形状記憶合金設計の新たな指針を提案する。本年度は、変態温度予測精度の向上と、形状記憶合金の変態温度を予測する手法のTi基形状記憶合金への適用及び合金設計を行った。まず、第一原理計算によりTi-Nb合金の弾性率を算出し、デバイモデルを用いて母相とマルテンサイト相(M相)の振動エントロピー項を考慮した自由エネルギーを算出し、その自由エネルギー差が0となる温度から変態温度を算出した。その結果、母相-M相間のエネルギー差から算出する手法よりも高い予測精度が得られた。さらに、第一原理計算と機械学習を併用した変態温度の予測手法も検討した。変態温度が既知の合金について、第一原理計算で得られた母相-M相間のエネルギー差および体積弾性率を説明変数、変態温度の実験結果を被説明変数とした人工ニューラルネットワークを構築した。機械学習を行った結果、デバイモデルを用いた手法よりさらに高い予測精度が得られた。機械学習による予測手法は優れた予測精度を持つが、変態温度と各パラメータとの物理的因果関係が明らかではなく、実験研究者が合金設計に活用するには信頼性に欠ける。そこで、母相-M相間のエネルギー差もしくはデバイモデルを用いた自由エネルギーの第一原理計算から変態温度を予測する手法を適用しTi基形状記憶合金の合金設計を行った。まず、Ti-Nb-X合金について、46種類の第三元素Xのうち、母相-M相間のエネルギー差から変態温度が室温となる条件を算出し、その条件下でω相を抑制しかつより変態ひずみを大きくする第三元素Xを探索した結果、Alが最も有効な元素であった。そこで、Ti-Nb-Al合金について自由エネルギーの第一原理計算から変態温度を予測する手法を適用し、変態温度、変態ひずみ、ω相安定性に及ぼすNb濃度とAl濃度の影響を評価した結果、室温で形状記憶特性を発現し、8%の高い変態ひずみを有しかつω相を抑制することができる最適な合金組成を設計できた。今後は、現在までに開発した形状記憶合金の変態温度を予測する手法を、Ti基形状記憶合金に限らず、より幅広い合金系へ適用することによって網羅的に合金探索を行い、新規形状合金の合金設計を行う。Ti基形状記憶合金と同様に母相にbcc基調の構造を持つ合金に着目し、新規形状記憶合金の探索を行う。具体的なターゲット合金は3つである。第一に、Ti基形状記憶合金と同様の変態である母相に不規則bcc構造、マルテンサイト相(M相)にorthorombic構造を有するbcc-orthorombic型変態、第二に、Cu基形状記憶合金に代表される母相にD03構造、M相に2H構造を有するD03-2H型変態、そして第三にAu-Cdに代表される母相にB2構造、M相にB19構造を持つB2-B19型変態である。合金探索の手法としては、まず母相に不規則bcc構造、D03構造、B2構造を有する二元系合金をICSD及びNIMSのデータベースから抽出し、対象の合金についてそれぞれの母相及びM相の形成熱を第一原理計算から算出する。形状記憶効果の発現のためには母相がM相よりも高温相である必要があるため、第一原理計算により得られた母相及びM相の形成熱の計算結果を用いて、0Kにおいて母相よりもM相が安定な合金のみに絞り込む。さらに、競合相がある場合、目的のM相へのマルテンサイト変態を阻害する可能性があるため、形状記憶効果の発現に必要なM相以外の競合相が報告されている合金についてはその競合相についても計算を行い、M相よりも競合相のほうが安定であった合金については除外する。なお、既知の合金については以上の条件を満たすことを確認している。

以上のようにして合金を絞り込み、最終的に残った合金から、室温近傍もしくは室温より高温において形状記憶効果を発現する変態温度を持ち、かつ既知の合金に匹敵する大きな変態ひずみを持つ新規合金を探索する。本研究の目的は、形状記憶合金の変態温度を予測する手法の確立及び、その手法のTi基形状記憶合金への適用と合金設計である。本年度の研究実施以前から、変態温度と母相ーマルテンサイト相(M相)間のエネルギー差の間に粗い比例関係が成立し、母相-M相間のエネルギー差を用いて変態温度が予測できることを明らかにしている。そのため本年度は、当初の計画であった形状記憶合金の変態温度を予測する手法のTi基形状記憶合金への適用と合金設計に加え、デバイモデル及び機械学習を用いた予測手法構築による変態温度の予測精度の向上を行った。デバイモデルを用いて母相及びM相の振動エントロピー項を考慮した自由エネルギーを算出し、得られた母相及びM相の自由エネルギーが等しくなる温度から算出した変態温度は、本年度の研究実施以前から用いていた母相-M相間のエネルギー差から算出した変態温度よりも予測精度を大きく向上させることができた。また、第一原理計算と機械学習を併用した変態温度の予測手法では、デバイモデルを用いた自由エネルギーの第一原理計算から算出した変態温度よりもさらに予測精度を向上させることができた。さらに、構築した変態温度の予測手法を適用しTi基形状記憶合金の合金設計を行った。まずTi-Nb-X合金について、変態温度が室温となる条件下で、ω相を抑制しかつより変態ひずみを大きくする、Ti-Nb基形状記憶合金の特性改善に最も有効な元素はAlであった。そこで、Ti-Nb-Al合金について自由エネルギーの変態温度の予測手法を適用し、合金組成の最適化を行った結果、室温で形状記憶特性を発現し、8%の高い変態ひずみを有しかつω相を抑制することができる最適な合金組成を設計できた。今後の研究では、開発した形状記憶合金の変態温度を予測する手法をTi基形状記憶合金以外の合金系へ適用し、形状記憶合金設計の新たな指針を提案する。本年度は、変態温度予測精度の向上と、形状記憶合金の変態温度を予測する手法のTi基形状記憶合金への適用及び合金設計を行った。まず、第一原理計算によりTi-Nb合金の弾性率を算出し、デバイモデルを用いて母相とマルテンサイト相(M相)の振動エントロピー項を考慮した自由エネルギーを算出し、その自由エネルギー差が0となる温度から変態温度を算出した。その結果、母相-M相間のエネルギー差から算出する手法よりも高い予測精度が得られた。さらに、第一原理計算と機械学習を併用した変態温度の予測手法も検討した。変態温度が既知の合金について、第一原理計算で得られた母相-M相間のエネルギー差および体積弾性率を説明変数、変態温度の実験結果を被説明変数とした人工ニューラルネットワークを構築した。機械学習を行った結果、デバイモデルを用いた手法よりさらに高い予測精度が得られた。機械学習による予測手法は優れた予測精度を持つが、変態温度と各パラメータとの物理的因果関係が明らかではなく、実験研究者が合金設計に活用するには信頼性に欠ける。そこで、母相-M相間のエネルギー差もしくはデバイモデルを用いた自由エネルギーの第一原理計算から変態温度を予測する手法を適用しTi基形状記憶合金の合金設計を行った。
蝸牛感覚上皮予定領域におけるAtoh1発現の時空間的変化と有毛細胞分化制御

本研究では、有毛細胞を含む蝸牛感覚上皮の発生過程につき研究し、有毛細胞再生医療への応用を目指している。有毛細胞・支持細胞共通の前駆細胞が運命決定なされる過程で、有毛細胞分化促進因子であるAtoh1発現様式がダイナミックに変化することに着目し、2蛍光色3Dタイムラプス撮影により個々の前駆細胞におけるAtoh1発現様式の時空間的な変化および有毛細胞・支持細胞分化への関与を明らかにする。また、光照射依存的Atoh1発現制御法を開発し前駆細胞のAtoh1発現様式を再現することによって、蝸牛感覚上皮の再生を誘導することを目標としている。当該年度においては、Atoh1陽性細胞のリアルタイム追跡(培養蝸牛の2蛍光色3Dタイムラプスイメージング)法によって得られた蝸牛感覚上皮予定領域内における個別の前駆細胞の2蛍光色輝度・位置情報・時間情報のデータを詳細に分析し、前駆細胞のトラッキングを行なった。その結果、内有毛細胞と外有毛細胞が蝸牛感覚上皮予定領域のそれぞれ内側端と外側端で誘導されることを明らかにした。さらに、このような内有毛細胞と外有毛細胞分化の特殊な誘導パターンは、ヘッジホッグシグナルとBmp4シグナルが関与しておりこれらの阻害剤を用いると消失することがわかった。また、このような有毛細胞分化誘導パターンは内・外の有毛細胞を最初に峻別するメカニズムであり、そのことがヘッジホッグシグナル欠損マウス蝸牛では外有毛細胞列のなかに内有毛細胞が出現するという表現型が生じる理由であることが示唆された。H30年度中に英文誌に投稿したが2回rejectされた。タイムラプスイメージングで得られたデータの定量的解析が不十分であったと考え、データを追加しまた最適な解析方法を模索するのに時間を要した。問題点を改善し、再度別の英文誌に投稿した。現在major revision中である。当該年度においては、Atoh1陽性細胞のリアルタイム追跡(培養蝸牛の2蛍光色3Dタイムラプスイメージング)法を確立し、蝸牛感覚上皮予定領域内における個別の前駆細胞の2蛍光色輝度・位置情報・時間情報につき膨大なデータを得た。さらにImarisソフトウエアを用いて前駆細胞のトラッキングを行ない、個別の細胞の2蛍光色輝度・位置の変化を測定した。その結果、前駆細胞のうち有毛細胞に分化する細胞ではAtoh1発現量が急上昇し、このAtoh1急上昇は時期に応じて限られた場所で起こることがわかった。まず蝸牛感覚上皮予定領域の内側端で起こり、内有毛細胞へと分化し、次いで蝸牛感覚上皮予定領域の外側端で起こり、外有毛細胞へと分化した。また、Atoh1急上昇が起こると、細胞核が上皮頂端面に移動し、外有毛細胞の場合には頂端面へ動きつつ内側寄りへ移動することがわかった。さらに、蝸牛感覚上皮予定領域の外側端でのAtoh1急上昇の限定には、ヘッジホッグシグナルが関与していることがわかった。当該年度においては、Atoh1陽性細胞のリアルタイム撮影・追跡法を確立し、蝸牛感覚上皮予定領域内における個別の前駆細胞の2蛍光色輝度・位置情報・時間情報につき膨大なデータを得た。そのデータはまだ解析しきれていないが、撮影像の質が良いために信頼性の高い結果が得られてきている。

また、このような有毛細胞分化誘導パターンは内・外の有毛細胞を最初に峻別するメカニズムであり、そのことがヘッジホッグシグナル欠損マウス蝸牛では外有毛細胞列のなかに内有毛細胞が出現するという表現型が生じる理由であることが示唆された。現在投稿論文準備中(英文校正中)である。哺乳類蝸牛有毛細胞の発生において、いかにして内有毛細胞・外有毛細胞が作り分けられるかは、未解明の重要課題であった。当該年度においては、Atoh1陽性細胞のリアルタイム撮影・追跡法によって得られたデータを解析したところ、ヘッジホッグシグナル・Bmp4シグナルの相互作用によって内有毛細胞と外有毛細胞分化が別々に誘導にされることが示唆され、内有毛細胞・外有毛細胞の作り分けのメカニズムを解明する手がかりが得られた。本研究では、有毛細胞を含む蝸牛感覚上皮の発生過程につき研究し、有毛細胞再生医療への応用を目指している。有毛細胞・支持細胞共通の前駆細胞が運命決定なされる過程で、有毛細胞分化促進因子であるAtoh1発現様式がダイナミックに変化することに着目し、2蛍光色3Dタイムラプス撮影により個々の前駆細胞におけるAtoh1発現様式の時空間的な変化および有毛細胞・支持細胞分化への関与を明らかにする。また、光照射依存的Atoh1発現制御法を開発し前駆細胞のAtoh1発現様式を再現することによって、蝸牛感覚上皮の再生を誘導することを目標としている。当該年度においては、Atoh1陽性細胞のリアルタイム追跡(培養蝸牛の2蛍光色3Dタイムラプスイメージング)法によって得られた蝸牛感覚上皮予定領域内における個別の前駆細胞の2蛍光色輝度・位置情報・時間情報のデータを詳細に分析し、前駆細胞のトラッキングを行なった。その結果、内有毛細胞と外有毛細胞が蝸牛感覚上皮予定領域のそれぞれ内側端と外側端で誘導されることを明らかにした。さらに、このような内有毛細胞と外有毛細胞分化の特殊な誘導パターンは、ヘッジホッグシグナルとBmp4シグナルが関与しておりこれらの阻害剤を用いると消失することがわかった。H30年度中に英文誌に投稿したが2回rejectされた。タイムラプスイメージングで得られたデータの定量的解析が不十分であったと考え、データを追加しまた最適な解析方法を模索するのに時間を要した。Atoh1陽性細胞のリアルタイム撮影を繰り返し行ない、外有毛細胞が選別される過程はほぼ描出された。今内有毛細胞が選別される過程の撮影回数が少ないので、今後は内有毛細胞に注力したい。同時に、光照射依存的にAtoh1の発現動態を人工的にコントロールできる実験系を確立したい。哺乳類の蝸牛において、有毛細胞は内有毛細胞・外有毛細胞という形態・機能が異なるサブタイプの細胞に分化しており、聴覚再生医療への応用という観点でこれらのサブタイプの生じる条件を明らかにすることは重要である。本研究はこれまで、いくつかのシグナル伝達系の相互作用によりこれらのサブタイプの細胞が誘導されることを明らかにしたが、今後はシグナル伝達系上流・下流のより詳しい分子メカニズムにつき解明していく予定である。問題点を改善し、再度別の英文誌に投稿した。現在major revision中である。(次年度使用額が生じた理由と使用計画)
慢性腎臓病の発症進展におけるエピジェネティック制御機構の関与と新治療戦略

食塩感受性高血圧発症モデルのDahl salt-sensitive rat(DS rat)を用いて、腎硬化症の発症進展とヒストン修飾の関連を検討した。高塩分食投与により、糸球体硬化と間質線維化、ヒストンアセチル化亢進を認めた。ヒストンアセチル基転移酵素阻害薬であるクルクミン投与により、6週後の腎障害は抑制された。高塩分食投与投与群では、ヒストンアセチル化によりIL-6の遺伝子発現が増強しており、尿中IL-6の発現も増加していたことから、DS ratの腎硬化症発症進展には、ヒストンアセチル化に伴うIL-6の発現増加が関与する可能性が示唆された。腎硬化症の発症進展には、動脈硬化とともに慢性炎症の関与も示唆されている。一方、ヒストン修飾等のエピジェネティクスは様々な疾患との関連が報告されているが、腎硬化症では明らかでない。そこで、今回我々は、腎硬化症モデルのDahl salt-sensitive rat(DS rat)を用いて、腎硬化症とエピジェネティクスの関連を検討したところ、高塩分食負荷8週後の腎組織では、通常塩分食投与群に比べて、有意にH3K9アセチル化細胞、H3K27トリメチル化細胞が増加していたことから、Dahl食塩感受性ラットにおける高塩分食負荷が惹起する腎障害の進展過程にヒストンアセチル化ならびにメチル化の関与が示唆された。その中でもヒストンアセチル化に着目し、6週齢のDS ratを(i)正常食(NS)群、(ii)高塩分食(HS)群、(iii) HS+ヒストンアセチル化酵素阻害剤のクルクミン(C)群の3群に分けて塩分負荷開始6週後に腎組織を採取し、形態学的変化、浸潤マクロファージ数、ヒストン修飾等を評価した。NS群と比べてHS群とHS+C群は投与開始2週後より収縮期血圧が上昇した。HS群は6週後に血清Cr値が有意に上昇したが、HS+C群は上昇が抑制された。HS群は糸球体硬化と間質線維化、マクロファージ数の増加を認め、ヒストンアセチル化も亢進したが、HS+C群では、ヒストンアセチル化が抑制され、線維化やマクロファージの浸潤も軽減した。HS群では、ヒストンアセチル化によりIL-6の遺伝子発現が増強しており、尿中IL-6の発現も増加していた。DS ratの腎硬化症発症進展には、ヒストンアセチル化に伴うIL-6の発現増加が関与する可能性が示唆された。Dahl食塩感受性ラットに8%塩分含有食投与を8週間行い、高血圧ならびに高血圧性腎障害を発症させ、腎硬化症モデルラットを作成した。高塩分食負荷8週後に採取した腎組織を用いて、マッソントリクローム染色を行ったところ、高塩分食負荷群では、糸球体硬化ならびに間質の線維化が惹起されていることを確認した。また、Type IVコラーゲン、線維芽細胞のマーカーであるfibroblast specific protein-1(FSP-1)、コラーゲン産生細胞である筋線維芽細胞のマーカーであるalpha-smooth muscle actin (alpha-SMA)の発現を免疫組織学的手法を用いて検討した。その結果、高塩分食負荷群では、通常塩分食投与群に比べて、有意に腎障害の進行とともにType IVコラーゲン陽性面積は増大し、FSP-1ならびにalpha-SMA陽性細胞数は増加していた。また、ヒストンH3のアセチル化及びメチル化動態の解析に関して、ヒストンH3K9のアセチル化並びにK27トリメチル化を検出する特異抗体を用いて免疫組織化学で検討したところ、高塩分食負荷8週後の腎組織では、通常塩分食投与群に比べて、有意にH3K9アセチル化細胞、H3K27トリメチル化細胞が増加していた。また、DNAのメチル化を5メチルシトシンに対する特異的抗体を用いて免疫組織学的に検討したところ、通常塩分食投与群と高塩分食投与群間では、その陽性細胞に有意差は認めなかった。以上より、Dahl食塩感受性ラットにおける高塩分食負荷が惹起する腎障害の進展過程にヒストンアセチル化ならびにメチル化の関与が示唆された。そこで、今回、腎硬化症モデルのDahl salt-sensitive rat(DS rat)を用いて、腎硬化症とヒストン修飾の関連を検討した。6週齢のDS ratを(i)正常食(NS)群、(ii)高塩分食(HS)群、(iii) HS+ヒストンアセチル化酵素阻害剤のクルクミン(C)群の3群に分けた。塩分負荷開始6週後に腎組織を採取し、形態学的変化、浸潤マクロファージ数、ヒストン修飾等を評価した。

HS群は6週後に血清Cr値が有意に上昇したが、HS+C群は上昇が抑制された。HS群は糸球体硬化と間質線維化、マクロファージ数の増加を認め、ヒストンアセチル化も亢進したが、HS+C群では、ヒストンアセチル化が抑制され、線維化やマクロファージの浸潤も軽減した。HS群では、ヒストンアセチル化により遺伝子発現が影響を受けるものをクロマチン免疫沈降法を用いて検討したところ、IL-6の遺伝子発現が亢進しており、尿中IL-6の発現も増加していた。HS+C群では、IL-6の遺伝子発現亢進は認めず、尿中IL-6の発現も抑制されている傾向を認めた。また、クルクミンには、酸化ストレス軽減作用も報告されていることから、尿中8OHdGを調べたところ、HS群では、尿中8OHdGは増加していたが、HS+C群では増加は認めなかった。DS ratの腎硬化症発症進展には、ヒストンアセチル化に伴うIL-6の発現増加が関与する可能性が示唆された。さらにクルクミンは、ヒストンアセチル化抑制作用を介したIL-6発現抑制並びに抗酸化作用により腎硬化症の進展を抑制する治療薬としての可能性が期待された。腎臓内科学Dahl食塩感受性ラットにおける高塩分食負荷が惹起する腎障害の進展過程にヒストンアセチル化ならびにメチル化の関与が示唆された。さらに、ヒストンアセチル化により、その発現に影響を受ける因子としてIL-6が同定され、慢性炎症との関連が示唆された。Dahl食塩感受性ラットに8%塩分含有食投与を8週間行い、腎硬化症モデルラットを作成し、これまでの報告と同様、腎障害ならびに線維芽細胞が線維化進展に関与していることを確認した。また、ヒストンのアセチル化ならびにメチル化動態についても腎障害進展とともにヒストンのアセチル化ならびにメチル化が増強していることが明らかとなり、Dahl食塩感受性ラットにおける高塩分食負荷が惹起する腎障害の進展過程にヒストンアセチル化ならびにメチル化の関与が示唆された。平成25年度の研究結果から、Dahl食塩感受性ラットにおいて高塩分食負荷が惹起する腎障害の進展家庭にヒストンアセチル化の関与が示唆された。今後の推進方策として、更に、アセチル化と慢性炎症、線維化をつなぐ機序についても免疫組織学的手法やウエスタンブロットなどにて検討予定である。次年度は、引き続きヒストンアセチル化と線維化進展関連因子に注目し、引き続き免疫組織化学的手法を主体に研究を推進する。さらに定量化を行うためウエスタンブロットやreal-time RT-PCRなどの手法も交えた検証を行う。したがって前年度同様、各特異的抗体の購入や必要物品の購入が研究費の主な使用用途になると考えている。また、前年度に得られた研究結果については、国内外での学会発表や論文化も予定しており、出張旅費や論文校正費にも充てる予定である。平成24年度の研究結果から、Dahl食塩感受性ラットにおいて高塩分食負荷が惹起する腎障害の進展家庭にヒストンアセチル化ならびにメチル化の関与が示唆された。今後の推進方策として、上記ラット腎硬化症モデルに薬剤によりヒストンアセチル化並びにメチル化を修飾することによって腎障害進展に与える影響を検討する。
スロヴァキア人民党初期の研究

報告者は、2009年12月2010年8月および2011年3月にスロヴァキア共和国に滞在し、研究課題であるスロヴァキア人民党成立期の研究に従事した。本年度はとくに、地域レベルでの政治状況の把握に努め、その中でスロヴァキア人民党が民衆層の支持を獲得していくプロセスの分析を試みた。報告者がとりわけ興味深い事例を見出したのは、スロヴァキア地方中央部の都市ルジョムベロクである。同市およびその周辺の町村からスロヴァキア人民党系の新聞に寄せられた通信記事からは、同地の地域社会の抱える様々な問題をめぐって住民同士の対立が生じ、それがやがて国会や県議会、市町村会の選挙等を通じて、特定の政治党派への支持へと結び付いた状況を跡づけることが可能である。そこからさらに、1906年ごろに同市において明白な趨勢となったスロヴァキア人民党への支持拡大が、同党の掲げるナショナリズムへの共感や、あるいはナショナル・アイデンティティの民衆層への浸透といった理由からのみ説明できるものではない、という点が明らかとなった。すなわち、スロヴァキア人民党の伸長を可能にした住民間の政治的対立の深化は、地域行政、市の財政や課税をめぐる問題、自治体役職の選出をめぐる個人的な軋轢や有力者間の派閥闘争、そしてとくに農村部の住民層に大きな影響力を及ぼしていた在地の聖職者の意向など、民衆層の日常生活にとってより身近な争点と深く関わるものであった。こうし見解を得られたことで、スロヴァキア人民党への民衆層の支持をナショナル・アイデンティティの拡大と直接的に結び付けてきた従来的な見方への批判として、同党による地域政治的文脈における利害対立の利用が、支持獲得の大きな要因として見過ごしえないという結論を見出すにいたった。研究代表者の研究課題は、「スロヴァキア人民党」の設立期の動向を詳細に把握し、ナショナリズムを基調とするその政治的影響力が一般民衆に及んでいく過程を検証することであった。2009年度は研究指導委託措置により、主としてスロヴァキア共和国の首都ブラチスラヴァにおいて研究活動を行った。当地では受入研究者であるコメニウス大学哲学部のロマン・ホレツ教授の指導のもとに、人民党をはじめとする20世紀初頭のスロヴァキア系政治党派による新聞・雑誌等の刊行物や、関係人物の残した書簡等の一次資料に加え、先行研究文献等の解読に従事した。同年度前半期においては、人民党をはじめとするスロヴァキア・ナショナリズム勢力にみられる反ユダヤ主義的傾向を研究対象の中心に据え、その特徴と機能の分析をテーマとした報告を10月31日の日本ユダヤ学会学術大会において行った。年度後半期においてとくに注目したのは、各政治党派の刊行する新聞に寄せられた一般の読者による投稿記事である。ここでは、北部ハンガリー(スロヴァキア)各地の都市や農村において、とりわけ選挙等による政治的状況の現出を端緒として住民同土の対立関係が先鋭化していく事例が数多く報告されている。ここから読み取れるのは、スロヴァキア系が住民の大多数を占める地域において、スロヴァキア人民党支持者が自らを「スロヴァキア・ナショナリスト」と位置づけ、スロヴァキア人としてのナショナルなアイデンティティを重視していたのにたいし、その対立政党の支持者は、同じくスロヴァキア系であるにもかかわらず、「ハンガリー愛国者」や「カトリック教徒」といった前者とは異なる次元のアイデンティティを拠り所にしていたという事実である。従来のスロヴァキア史学においては、スロヴァキア・ナショナリズムはハンガリー王国の支配民族であるマジャール人の抑圧にたいする抵抗運動として評価され、スロヴァキア人-マジャール人というナショナルな対立構造が歴史叙述の前提とされてきた。しかし実態としては、同一のエスニック・グループ内のアイデンティティの多様性に起因する、ナショナリスト-非ナショナリストという対立構造の方がより支配的であったいうのが、現在のところ得られた結論である。

こうし見解を得られたことで、スロヴァキア人民党への民衆層の支持をナショナル・アイデンティティの拡大と直接的に結び付けてきた従来的な見方への批判として、同党による地域政治的文脈における利害対立の利用が、支持獲得の大きな要因として見過ごしえないという結論を見出すにいたった。
難治性白血病の幹細胞に存在する抗アポトーシス分子を標的とする治療法の開発

成人の難治性の白血病患者を治癒に導くためには、幹細胞レベルで白血病細胞を死滅させることが重要であると考えられる。抗アポトーシス分子SurvivinおよびMcl-1は難治性白血病の幹細胞において発現が亢進している。これらの分子の発現量を低下させ、かつ休止期にある幹細胞を死滅させることが可能な薬剤を同定、発見することが本研究の目的である。従来型の抗がん薬の多くのものが、DNA合成阻害、RNA合成阻害を、その主たる作用としており、休止期にある幹細胞に対しては充分な効果を発揮できない。そのため、難治性白血病症例の場合、以前から存在する通常の抗がん薬による化学療法を繰り返し実施しても、白血病性幹細胞が残存して最終的には再発すると考えられる。難治性白血病幹細胞で高発現している1) Survivin, Mcl-1のそれぞれ、または両方を低下させ、かつ2)休止期にある幹細胞に対して強い殺細胞作用を発揮する薬剤を同定、発見することが本研究の目標であるが、本年度は、HSP90阻害剤ゲルダナマイシンの白血病性幹細胞に対する殺細胞効果の検討をおこなった。白血病細胞としてKBM5使用した。我々はG0/G1期に誘導した培養白血病細胞KBM5を用いて検討を実施したところ、ゲルダナマイシンは強い殺細胞効果を発揮することがわかった。その際には、Mcl-1の発現が強く抑制されることが判明した。ゲルダナマイシンによりSurvivinの発現も低下した。ゲルダナマイシンによりミトコンドリアの膜電位の急速な低下も認められた。Go/G1に誘導した白血病細胞に対してYM155が抗腫瘍効果を発揮することは興味深い。今後は、YM155がなぜ、Mcl-1を急速に分解するのか、そのメカニズムについて検討したい。また、最近開発された、幾つかの新規のMcl-1阻害剤が、Go/G1に誘導した白血病細胞に対して抗腫瘍効果を発揮するのかどうかについて検討する。難治性白血病幹細胞で高発現している1) Survivin, Mcl-1のそれぞれ、または両方を低下させ、かつ2)休止期にある幹細胞に対して強い殺細胞作用を発揮する薬剤を同定、発見することが本研究の目標であるが、本年度は、Survivin阻害剤の白血病性幹細胞に対する殺細胞効果の検討をおこなった。白血病細胞としてKBM5を使用した。Survivin阻害剤としてYM155が存在しているが、休止期(G0/G1)にある白血病性幹細胞に対して殺細胞効果を発揮するのかに関しては、未だに報告されていない。我々はG0/G1期に誘導した培養白血病細胞KBM5を用いて検討を実施したところ、YM155は強い殺細胞効果を発揮することがわかった。Mcl-1はproteasomeによって分解されて発現量が低下すると考えられた。YM155によりSurvivinの発現も低下するが、その抑制効果は弱かった。Mcl-1阻害剤A-1210477の白血病性幹細胞に対する殺細胞効果の検討がまだ実施できていない。また、STAT3/5阻害剤AG490, AZD1480, Pyrimethamineによる白血病性幹細胞に対する殺細胞効果の検討もまだ実施できていない。難治性白血病のモデルとして、代表的な難治性白血病であるFLT3-ITD変異陽性の白血病細胞株MV4-11を用いる。0.1% FBS存在下に培養を実施してG0/G1期(休止期)に誘導する。この休止期の細胞に対してMcl-1阻害剤A-1210477がどの程度、殺細胞作用を発揮するか検討をおこなう。

我々はG0/G1期に誘導した培養白血病細胞KBM5を用いて検討を実施したところ、ゲルダナマイシンは強い殺細胞効果を発揮することがわかった。その際には、Mcl-1の発現が強く抑制されることが判明した。ゲルダナマイシンによりSurvivinの発現も低下した。ゲルダナマイシンによりミトコンドリアの膜電位の急速な低下も認められた。Go/G1に誘導した白血病細胞に対してYM155が抗腫瘍効果を発揮することは興味深い。【平成29年度の研究計画】1 HSP90阻害剤による白血病性幹細胞に対する殺細胞効果とメカニズムについての検討。我々が、事前に積み重ねてきた実験データでは、HSP90阻害剤は興味深いことに、Mcl-1およびSurvivinの両分子を分解することが可能である。特にMcl-1を急に分解することができる。HSP90阻害剤としてはGeldanamycinおよびNVP-A YU922を使用する。1)休止期にある細胞に対して各薬剤を添加し、どの程度SurvivinおよびMcl-1蛋白の発現抑制効果が認められるかWestern Blotを用いて検討する。2)休止期の細胞に対して各薬剤を加え、細胞死を測定する。方法としてはFlow cytometryでのAnnexin-V/PI assayを使用する。3) Mcl-1分子に注目して、Mcl-1分子の発現量がHSP90阻害剤の感受性規定因子になるかどうかについて以下のように検討する。まず。Mcl-1のcDNAをヌクレオフェクターを用いて細胞内に導入してMcl-1の過剰発現細胞株を作成する。親株、およびMcl-1の過剰発現細胞株の両者に、HSP90阻害剤を加えて、薬剤感受性について検討する。【平成30年度の研究計画】1 HSP90阻害剤による白血病性幹細胞のミトコンドリア障害に関する検討。Mcl-1はミトコンドリアの膜に分布して基本的にはミトコンドリアの機能維持に重要な役割を果たしている。HSP90阻害剤は、特にMcl-1を急に分解することができるという特徴がある。そこで申請者は、HSP90阻害剤はミトコンドリア機能を強く障害する可能性を考えている。今後は、YM155がなぜ、Mcl-1を急速に分解するのか、そのメカニズムについて検討したい。また、最近開発された、幾つかの新規のMcl-1阻害剤が、Go/G1に誘導した白血病細胞に対して抗腫瘍効果を発揮するのかどうかについて検討する。必要としていた試薬が当初予想より安価であった。また、実験の進展が予定より遅れたため次年度使用額が生じた。平成29年度は試薬類が予想していたものより安価で購入できたことなどがあげられる。今年度は、外注で実験を依頼する予定もあり、今年度、支出する予定である。平成28年度に進行が遅れたためできなかった実験を実施するために使用する予定である。