hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
小児期のリポ蛋白異常と将来の動脈硬化性心疾患発症に関する研究

また若年成人においても同様の結果が得られており、中高年のCETP欠損症患者に認められる高HDL血症はCETP単独の関与ではなく、何らかの環境要因が加わる事により発症すると考えられた。ACATに関しては、最近の私達の研究で小児における存在が明らかになった家族性複合型高脂血症(FCHL)の原因遺伝子と考え世界に先駆け解析を行っている。ACATにはACAT-1、ACAT-2と二つのアイソフォームが存在しているが、ヒトにおける生理的意義は未だに不明である。進行中の解析データからはヒトの脂質代謝に関与するのは主としてACAT-1の様であり、今後遺伝子解析をリポ蛋白異常児・者について進めていく予定である。リポ蛋白異常が動脈硬化性心疾患(ACAD)の大きな危険因子であることは多くの疫学及び基礎研究から明らかである。我が国においても、欧米と同様に多くの小児に成人と同じリポ蛋白異常症が存在しており、将来のACADの発症の増加が危惧されている。本年度の研究で私達は(1)高脂血症及び肥満患者を対象としたACAT(Acyl-CoA : cholesterol Acyltransferase)遺伝子解析及び(2)非肥満児に於けるLDL粒子サイズの検討を行った。(1)については現在高脂血症患者の解析結果を投稿中である。私達はACATの二つのisoform(ACAT-1&ACAT-2)について検討し、多くの遺伝子変異を発見してきた。今年度の研究ではその変異のうち、ACAT-1の変異(-77G-A)が高脂血症、特に高TG血症患者で血中HDLレベルに影響を与えることを明らかにした。具体的にはこの変異を持つ患者では持たない患者に比べHDLが有意に高値を示した。正脂血者や小児ではこのような関係は認めなかった。今後、肝細胞で変異を持つACAT-1の活性の検討が必要である。(2)については非肥満児190名についてLDL粒子サイズを測定し、成人と同様男児のLDLサイズが女児に比べ小さいことを見いだしている。また、血中のパラメータとの関連では男女共に、HDL-C、アポA1に正相関を示し、血中インシュリン値に逆相関を有意差をもって示した。インシュリン抵抗性とLDLサイズの関連が非肥満児でも存在していることを明らかにした。今後、肥満児及び高脂血症患児に対象を拡げて検討していく予定である。我が国においても、欧米と同様に多くの小児に成人と同じリポ蛋白異常症が存在しており、将来のACADの発症の増加が危倶されている。昨年度と同様に本年度も私達は(1)高脂血症及び肥満患者を対象としたACAT(Acyl-CoA : cholesterol Acyltransferase)遺伝子解析及び(2)肥満児、非肥満児に於けるLDL粒子サイズの検討を行った。(1)については現在高脂血症患者の解析結果が欧文誌に受理された。今年度の研究ではその変異のうち、ACAT-1の変異(-77G/A)が高脂血症、特にIIa型高脂血症患者で血中HDLレベルに影響を与えることを明らかにした。
TIMP遺伝子導入による平滑筋細胞遊走抑制に関する研究

動脈硬化病変形成の基礎となる中膜平滑筋細胞の内膜への遊走には、1.中膜平滑筋細胞が自身の基底膜を分解し、束縛された構造から自らを開放する。2.細胞の微小環境を構築している細胞外マトリックスを分解し運動の障害となるマトリックス構築体を破壊する、というプロセスが必要である.本研究では、マトリックスメタロプロテアーゼ(MMPs)とMMPsに対するインヒビターであるマトリックスメタロプロテアーゼインヒビター(TIMPs)の遊走に果たす役割を解析し、以下の成果を得た.1.遊走平滑筋細胞の基底膜の分解にMMP-2(ゼラチナーゼA)が重要な役割を果たす.2.MMP-2の活性化は平滑筋細胞自身の産生する細胞膜貫通型MMP(MT-MMP)によって行われることが示唆された.3.遊走の場を構成する細胞外マトリックスの分解にMMP-1(間質型コラゲナーゼ)、MMP-2、MMP-9(ゼラチナーゼB)が重要な役割を果たす。4.MMP-1遺伝子導入平滑筋細胞は対照のTIMP-1遺伝子非導入細胞に比べて有意に遊走能が抑制された(実験群:3.8±1.3/対照群:10.3±2.9,P<0.001).5.免疫組織学的解析において、平滑筋細胞のMMP-1、MMP-2、MMP-9発現はTIMP-1遺伝子導入によって影響受けなかった。本研究によって平滑筋細胞の遊走におけるMMPsの役割が明らかになり、MMPsのインヒビターであるTIMO-1によって遊走が抑制されることが示された。今後、TIMP-2の解析に加えて更にMMPs-TIMPsの相互作用を解析し、遊走制御ひいては動脈硬化制御への道を開きたい.動脈硬化病変形成の基礎となる中膜平滑筋細胞の内膜への遊走には、1.中膜平滑筋細胞が自身の基底膜を分解し、束縛された構造から自らを開放する。今後、TIMP-2の解析に加えて更にMMPs-TIMPsの相互作用を解析し、遊走制御ひいては動脈硬化制御への道を開きたい.
高次脳機能における成体ニューロン新生の役割に関する研究

1.転写因子であるPax6のヘテロ接合体変異ラットの海馬スライス標本を用いて電気生理学的解析を行った。Pax6変異ラットでは海馬歯状回での成体ニューロン新生が減少していることがすでに明らかになっているため、野生型と変異型ラットより得られたスライス標本において、歯状回での長期増強(LTP)に異常がみられるかどうかを検討したが、GABA_A受容体を部分的にブロックした条件下での高頻度刺激によるLTPの誘導・発現には差がみられなかった。現在、膜電位感受性色素や多点記録電極を用いて、変異型ラットにおいて興奮の2次元的な広がりに異常が見られるかどうかを検討している。2.NMDA受容体のNR2Bサブユニットの細胞内ドメインのチロシン残基で最も強くリン酸化されるTyr1472をフェニルアラニンに置換したNR2Bサブユニットを発現するノックインマウスを作製し、その機能解析を行った。このノックインマウスでは、何も処理しない状態で扁桃体でのNR2Bのチロシンリン酸化の程度が5分の1程度に減少していた。このノックインマウスの扁桃体では、光学顕微鏡レベルでは構造的な異常は見られなかったが、電子顕微鏡レベルではNR2Bサブユニットの分布に異常が観察された。また、扁桃体スライス標本では、扁桃体外側核での通常のシナプス伝達そのものには異常がなかったが、LTPが顕著に障害されていた。さらに、個体レベルでは、音刺激による恐怖条件付けに異常が観察され、NR2BサブユニットのTyr1472のリン酸化がシナプス可塑性や恐怖学習に重要な役割を果たすことが明らかとなった。現在、このノックインマウスの海馬歯状回におけるニューロン新生と可塑性に異常があるかどうかを検討している。Pax6変異ラットでは海馬歯状回での成体ニューロン新生が減少していることがすでに明らかになっているため、野生型と変異型ラットより得られたスライス標本において、歯状回での長期増強(LTP)に異常がみられるかどうかを検討した。GABA_A受容体をブロックした条件下での高頻度刺激によるLTPの誘導・発現には差がみられなかった。また、LTPに対する抑制系の関与についても検討したが現在のところポジティブな結果は得られていない。今後は成体ニューロン新生を種々の方法で変化させ、シナプス可塑性と個体レベルでの記憶能力にどのように関与しているかを検討していく予定である。2.NMDA受容体のNR2Bサブユニットの最も強くリン酸化されるチロシン残基であるTyr1472をフェニルアラニンに置換したNR2Bサブユニットを発現するノックインマウスを作製し、その機能解析を行った。このノックインマウスでは、何も処理しない状態で海馬および扁桃体でのNR2Bのチロシンリン酸化の程度は4分の1以下の減少していた。したがって、Tyr1472をひとつ置換するだけで、脳内でのNR2Bチロシンリン酸化が激減することが明らかとなった。このノックインマウスでは、扁桃体の外側核でのシナプス伝達の長期増強が障害され、音刺激による恐怖条件付けに異常が観察され、NR2BサブユニットのTyr1472のリン酸化がシナプス可塑性と恐怖学習に重要な役割を果たすことが明らかとなった。
メダカ転移因子Tol-2による変異遺伝子タギング

メダカから単離されたDNA型転移因子Tol-2の転移の際に生じるDNAの切断が、相同組み換えを引き起こすかどうかを調べる系を構築した。Tol-2転移因子の両側に相同なくりかえし配列が存在する場合、Tol-2の切り出しによるDNA切断がそれらのくりかえし配列間の相同組み換えを誘発することが期待される。そこで、Tol-2の両側にLacZ遺伝子のN末端側約3分の2とC末端側約3分の2(互いに約600bpの部分が相同である)を配置した組み換えDNAを作成し、メダカ鰭繊維芽細胞由来の培養細胞OLHN1およびOL32に形質導入した。この組み換えDNA構造からTol-2が切り出されたあとLacZ遺伝子の部分で相同組み換えが起きると、全長のLacZ遺伝子が生成し、その細胞はβ-galactosidase活性を示す。得られた形質転換細胞にTol-2の転移に必要なtransposase遺伝子を導入したものとしなかったものについてβ-galactosidase活性を指標にして相同組み換えの頻度を調べたが双方共に全く組み換えが検出されなかった。
高度技術の進展とわが国の品質保証体系のパースペクティブ

本研究は高度技術の進展の下に変容しつつある社会における課題を品質保証の立場により検証し、かつ、これらを解決する上において重要と考えられる研究テーマについて研究を進め、多くの知見をまとめ、かつ、これらの成果を品質保証の体系として総括できるものとした。高度技術が急速に進歩するようになった1960年代より品質保証の概念とその体系が次第に形成されるようになって来た。しかし、品質保証に関する総合的な研究は十分に行なわれていないために、本研究においては、今後の品質保証の体系を明確にするために、(1)ソフトウェアの品質保証、(2)製品責任と製品安全技術の確立、(3)日本と米国の品質保証と信頼性技術の比較研究、(4)設備管理、などに重点をおいて研究を進めた。その結果、ソフトウェアの欠陥を防止する方法論を確立し、製品責任問題事例を分析して得られた知見にもとづいて、製品欠陥を未然に防止する製品安全技術のための品質保証の方法を検討し、また、設備の有効利用と設備の事故故障の防止のための最適方策を見出すなど、今後の品質保証の体系を構築する上に重要となる研究成果を得た。また、品質管理と品質保証はその概念と体系が各国の社会的文化的風土に依存して形成されているので、現在、品質保証の国際規格も制定されている。本研究では、このため日本と米国の品質保証と信頼性技術の比較研究をも行ない、この新しい動向に関する知見を与え、かつ、上にのべた課題(2)の研究をも補完している。高度技術社会においては環境・省資源問題や雇用・労働問題などがとり上げられているが、本研究の成果には、これらの課題に関連する所が少なくない。ここに得られた研究結果はまた社会的品質の立場により考察されることによって、今後の品質保証の体系を構成する上に重要な役割を果すことが期待される。
コンドーム使用時の羞恥感情の適応的機能とその制御によるコンドーム使用促進

コンドーム使用時には羞恥感情が強く生起し,それがコンドーム使用を強く阻害することが指摘されている。そしてこの羞恥感情には適応的な機能もある。そのため,羞恥感情を感じていてもなお,コンドーム使用が可能になるようにする必要がある。平成30年度には,先行研究の展望ならびに【研究3;コンドーム使用時の羞恥感情の制御を目指した介入プログラムの効果研究】を行った。平成29年度までの調査および予備的な実験の結果をもとに,30秒間のビデオ映像を作成した。このビデオでは男性および女性が「コンドームを使う人はかっこいいと思います」「コンドームを使おうって伝えてくれる人はかっこいいと思います」「コンドームを使う人は信頼できます」「コンドームを使おうって伝えてくれる人は,自分たちのことを真剣に考えてくれていると思います」といったメッセージを含むものであり,これらのメッセージの後に「コンドームを使いましょう」という呼びかけがあった。452名の「コンドームを使っているが,常に使っているわけではない」成人男女を対象にしたインターネット経由での無作為化比較試験によって,本ビデオ映像の効果を検討した。事前測定の後にランダムに割り付けた半数の参加者に対して上記ビデオを視聴させ(介入群),もう半数には単純に「コンドームを使いましょう」という呼びかけだけのビデオを視聴させた(待機群)。その10日後に事後測定を行った。データ解析の結果,コンドーム使用時の羞恥感情およびコンドーム使用の自己効力感については介入の効果が見られなかったのに対し,女性の介入群における直近10日間でのコンドーム使用率については有意な増加効果が認められた(待機群58.10% vs.介入群72.97%,効果量d = .41)。すなわち,本研究において構成したビデオ映像が女性に関しては一定のコンドーム使用促進効果を持つことが示された。平成27年度には先行研究の展望ならびに【研究1:コンドーム使用時の羞恥感情の適応的機能に関する検討】を行った。コンドーム使用時には羞恥感情が強く生起し,それがコンドーム使用を強く阻害することが指摘されてきた(e.g.,樋口・中村, 2010,社会心理学研究; Moore, et al., 2006, Psychology, Health & Medicine)。したがってその羞恥感情の抑制が適切なコンドーム使用にとっては重要なことである。しかしながらそれは簡単ではない。なぜなら羞恥感情を感じることには何らかのメリットがあると考えられるからである。たとえばFeinberg, et al. (2012, JPSP)は,羞恥の表出が表出者に対する向社会的評価を高め,他者からの信頼獲得につながることを示した。またKeltner (1995)は羞恥に伴う赤面には他者からの制裁に対する緩和(appeasement)機能があることを示した。これらの研究結果は,羞恥の持つポジティブで適応的な社会的機能,すなわちメリットを明らかにしたものであると言える。そこで本研究課題では,羞恥感情による適応的社会的機能を明らかにし,それを制御した上でのコンドーム使用の促進を目指している。今年度はコンドーム使用時の羞恥に伴う社会的機能を明らかにすることを目的とし,まず文献研究を試みた。上述もその成果の一部である。しかし,コンドームと羞恥感情に関する研究はきわめて少なく,直接的にコンドーム使用時の羞恥感情の社会的機能を扱った検討はほとんど存在しない。そのため,広く健康行動とそのメリットに関する先行研究の展望を行った。こうした文献的検討を元に,コンドーム使用時の羞恥表出の機能を明らかにする研究1の準備を行った。当初予定していた文献研究は順調に進行している。一方で研究1の実施については若干の遅れがある。しかしその遅れは調査実施にかかる事務的手続き(調査委託業者の選定など)にかかるものであり,内容的に問題はない。既に研究実施の準備は完全に整っており,学内の倫理審査も通過している。平成28年度早々には実施・完了する予定である。平成28年度には先行研究の展望ならびに【研究1:コンドーム使用時の羞恥感情の適応的機能に関する検討】を行った。平成28年度は,男女各50名の成人(2025歳)を対象に調査を行い,セックスの際にコンドームを使用している人物のイメージの測定を試みた。コンドームを堂々と使用している男性あるいは女性、コンドームを恥ずかしそうに使用している男性あるいは女性についてそのイメージを自由に記述させ、さらにそのイメージについてネガティブ(1点)からポジティブ(7点)の次元上での得点化を求めた。その結果、それぞれの対象に対してネガティブ・ポジティブ両側面のイメージが付与されたが、その内容は対象に応じて大きく異なっていた(堂々ー女性には「慣れてそう」「下品」vs.堂々ー男性には「誠実」「当たり前」、恥ずかしそうー女性には「可愛らしい」「純情」vs.恥ずかしそうー男性には「気弱」「不慣れ」など)。

さらにその得点についても、各対象で違いが見られ、コンドームを堂々と使用する女性に対するイメージの得点(4.25)が堂々と使用する男性(4.86)や恥ずかしそうに使用する男性(4.57)、恥ずかしそうに使用する女性(4.84)よりも低いものとなっていた。これらの結果から、コンドーム使用時における羞恥表出のジェンダー差が重要なものであることが示された。研究1の完了までは順調に進展している。しかしながら参加者への侵襲性を低く保った状態での研究2の実施の困難性が新たに発見され,それに対する対応の検討に若干時間がかかっている。そのため,研究2および3の実施の遅れが予見されるが,より適切な形での研究の進行のためには不可欠な段階にあると認識している。平成29年度には先行研究の展望ならびに【研究2:コンドーム使用時の羞恥感情の適応的機能に関する実験的検討】を行った。コンドーム使用時には羞恥感情が強く生起し,それがコンドーム使用を強く阻害することが指摘されている。したがってその羞恥感情の抑制が適切なコンドーム使用にとっては重要なことである。しかしながらそれは簡単ではない。なぜなら羞恥感情を感じることには何らかのメリットがあると考えられるからである。そこで本研究課題では,羞恥感情による適応的社会的機能を明らかにし,それを制御した上でのコンドーム使用の促進を目指している。現在までの研究によって,コンドーム使用時における羞恥表出のジェンダー差が重要であることが示された。例えば具体的には,「恥ずかしそうにコンドームを使用している女性」に対しては“かわいらしい"“純情"といったポジティブイメージが,一方同じく「恥ずかしそうにコンドームを使用している男性」には“気弱"“不慣れ"といったネガティブイメージが付与されていた。すなわち,羞恥感情の表出は一意に一定のイメージを生むわけではないことがデータによって示された。すなわち羞恥表出による社会的機能には大きなジェンダー差が存在する。そこで,羞恥表出による社会的機能の性別での検討結果に基づいて予備的な実験を行った。男性参加者に対しては“誠実"“当然"“相手想い"といった単語を,女性参加者に対しては“かわいらしい"“純情"といった単語を用いてプライミングしたところ,男性参加者に対してはコンドーム使用意図が増加する傾向が見られた。一方女性参加者では明確な効果はなかった。どのような単語を利用したプライミングであれば,羞恥感情の低減効果,ひいてはコンドーム使用の増加効果が得られるのかをより十分に検討する必要性が明らかになった。しかしながら参加者への侵襲性を低く保った状態での研究2の実施の困難性が新たに発見され,さらに十分な効果を見込める実験条件の設定に時間がかかっている。そのため,研究2および3の実施が遅れているが,より適切な形での研究の進行のためには不可欠な段階にあると認識している。そしてこの羞恥感情には適応的な機能もある。そのため,羞恥感情を感じていてもなお,コンドーム使用が可能になるようにする必要がある。
陸上植物の祖先種とアツギケカビ目における菌根共生機構と共進化過程の解明

1.アツギケカビ目の基準種であるEndogone pisiformisと同定された標本には、形態的に異なる近縁種が存在することが示唆された。複数遺伝子の系統解析を実施した結果、近縁種はE. pisiformisの姉妹系統に位置する新種と判明した。そこで、本種をE. corticioidesとして国際誌上で新種記載した。本論文は、アツギケカビ目菌類の詳細な分類に、形態分類に加え、分子系統学的手法も取り入れる必要性を示した。2.昨年度得られたブナ科樹木にアツギケカビ目が形成し外生菌根について、形態記載および当菌類の系統学的位置付けを明らかにし、国際誌上で論文として発表した。本論文は、アツギケカビ目の外生菌根形成を、形態観察および分子同定の両手法に基づき証明した初めての報告となった。3.昨年度、原始的な苔類であるコマチゴケ属には、ケカビ亜門の複数系統とグロムス亜門が菌根様構造を形成していることを分子同定に基づき明らかにした。今年度は、分子同定された各菌類系統について、系統間での菌根様構造の差異を調査した。その結果、ケカビ亜門に属するアツギケカビ目とSphaerocreas-Densospora系統という二つの目レベルで異なる系統が、異なる菌根様構造を形成していることが判明した。4.祖先的苔類であるコマチゴケ綱のヒメトロイブゴケ属に菌根様構造を形成する菌類は全く解明されていない。そこで、山梨県内の亜高山帯において採集されたヒメトロイブゴケの配偶体を対象として、菌根様構造の観察と菌類の分子同定を行った。その結果、菌根様構造の形成が確認され、その構造はトロイブゴケ属に形成される構造と類似していた。分子同定の結果、共生菌はE. corticioidesと同定された。これは、ケカビ亜門の既知種と苔類との間における菌根様構造の形成を明らかにした初の事例となった。28年度が最終年度であるため、記入しない。陸上植物の起源に関わる植物と,菌根菌類の祖先と目されるアツギケカビ目の間の共生関係の解明に向けて,本目の分類学的検討や菌根構造の観察,菌根性植物に対する本目菌の接種試験を行った.また,原始的な陸上植物であるコマチゴケの共生菌の同定と,培養法の検討を行った.その結果,以下の成果を得た.(1)収集したアツギケカビ目菌の胞子果を顕微鏡観察した結果,本目は胞子形態に基づいて大きく3グループに分類できることが明らかとなった.この分類体系の妥当性は分子系統解析によって強く支持された.また,今回4既知種と3未記載種を南西諸島から北海道に至る広範囲から採集し,アジアにおける本目種の多様性が初めて示された.(2)純粋培養が困難なEndogone lactifluaの胞子果片を,アカマツ実生の根圏に直接接種した.その結果, 3-4ヶ月後には外生菌根が形成されることが明らかとなり,また,多数の胞子果を容器内で形成させることに成功した.(3)日本産コマチゴケの地下茎に形成された菌根構造の観察と,共生菌の分子同定を行った.その結果,アツギケカビ目がアツギケカビ目型の菌根を,グロムス門菌がアーバスキュラー菌根を形成していることが示唆された.コマチゴケ属はアツギケカビ目と特異的に共生すると報じられてきたが,グロムス門とも共生することが判明した.(4)無菌的に回収したコマチゴケの胞子を,無機塩類を含んだ寒天培地に接種する方法で,発達した植物体を形成させることに成功した.以上の結果から,アツギケカビ目の分類の基盤を築くとともに,菌根共生の一端が解明された.また,接種試験に基づいたアツギケカビ目-植物共生系の挙動を観察する基盤が整った.菌根菌類の中でもとりわけ祖先的な系統に属するアツギケカビ目の間の共生関係の解明に向けて、分類体系の構築、菌根形態の観察、ならびに接種試験を行った。その結果、以下の成果を得た。1.PCRプライマーの設計などの結果、アツギケカビ目胞子果のDNA配列の蓄積が飛躍的に進行し、本目では初めて、核・ミトコンドリアの複数遺伝子領域に基づく系統解析が可能となった。解析の結果は、胞子形態で識別できる複数系統の存在を強く支持した。また、既知種と形態は類似するが種レベルで異なる系統の存在が複数明らかになり、ハーバリウム標本などの再検討の必要性が示された。2.ブナ科樹種の外生菌根を天然土壌より採集し、形態観察と分子同定の両結果に基づき共生菌がアツギケカビ目であると同定した。温帯域の主要な樹種であるブナ科と菌根を形成するという事実は、外生菌根菌の多様性調査においてアツギケカビ目が長らく見過ごされてきたことを示唆しており、今回得られた形態的・分子的情報を考慮した解析により、外生菌根菌類の真の多様性解明に近づくと考えられる。3.陸上植物の中で最も祖先的な系統である、コマチゴケの内生菌の同定を昨年に引き続き行った。南西諸島から東日本に至る各地の試料を調べた結果、内生するアツギケカビ目の系統が試料間で一致するケースはほとんど見られず、コマチゴケに内生するアツギケカビ目の多様性は予想以上に高いことが示唆された。

4.アツギケカビ目の菌根形成が実生の成長に及ぼす影響を評価するためには、複数種かつ複数個体のアツギケカビ属について菌根苗を作出し、実生成長を比較することが必要であった。本年度にE. lactifluaとE. flammicoronaを計5個体接種試験に供試した結果、両種それぞれ2個体について菌根苗の作出に成功し、本試験の準備が整った。研究実績の概要に記載の1の成果の一部について、国際誌に論文が掲載された。また1、2、3の各内容についてそれぞれ国際学会または国内学会にて発表した。また4において次年度の実験の試料調製が完了し,ほぼ計画通りに進めることができた。その他、1および2の成果の一部については、論文の投稿準備中である。以上のことから,研究の進展は順調であると考える。1.アツギケカビ目の基準種であるEndogone pisiformisと同定された標本には、形態的に異なる近縁種が存在することが示唆された。複数遺伝子の系統解析を実施した結果、近縁種はE. pisiformisの姉妹系統に位置する新種と判明した。そこで、本種をE. corticioidesとして国際誌上で新種記載した。本論文は、アツギケカビ目菌類の詳細な分類に、形態分類に加え、分子系統学的手法も取り入れる必要性を示した。2.昨年度得られたブナ科樹木にアツギケカビ目が形成し外生菌根について、形態記載および当菌類の系統学的位置付けを明らかにし、国際誌上で論文として発表した。本論文は、アツギケカビ目の外生菌根形成を、形態観察および分子同定の両手法に基づき証明した初めての報告となった。3.昨年度、原始的な苔類であるコマチゴケ属には、ケカビ亜門の複数系統とグロムス亜門が菌根様構造を形成していることを分子同定に基づき明らかにした。今年度は、分子同定された各菌類系統について、系統間での菌根様構造の差異を調査した。その結果、ケカビ亜門に属するアツギケカビ目とSphaerocreas-Densospora系統という二つの目レベルで異なる系統が、異なる菌根様構造を形成していることが判明した。4.祖先的苔類であるコマチゴケ綱のヒメトロイブゴケ属に菌根様構造を形成する菌類は全く解明されていない。そこで、山梨県内の亜高山帯において採集されたヒメトロイブゴケの配偶体を対象として、菌根様構造の観察と菌類の分子同定を行った。その結果、菌根様構造の形成が確認され、その構造はトロイブゴケ属に形成される構造と類似していた。分子同定の結果、共生菌はE. corticioidesと同定された。これは、ケカビ亜門の既知種と苔類との間における菌根様構造の形成を明らかにした初の事例となった。研究実績の概要に記載の(1), (3)の内容についてそれぞれ国際,および国内学会にて発表した.また,(2), (4)は次年度の菌根共生系に関する実験の試料調製段階に相当し,ほぼ計画通りに進めることができた.以上のことから,研究の進展は順調であると考える.現在準備中である1および2に関する論文を投稿する。また、新種記載も継続して行い、アツギケカビ目の詳細な分類体系の確立し、論文を投稿する。3については、コマチゴケ類の他種についても観察と内生菌の同定・系統解析を行い、コマチゴケ類とアツギケカビ目の共進化について考察する。4については実験開始から5ヶ月後に苗の成長量を計測し、共生が宿主植物に与えた影響を評価する。また、菌根中に存在する共生菌の菌糸の状態を蛍光顕微鏡観察などによって視覚的に捉える方法を検討する。得られた結果をもとに、アツギケカビ目の菌根共生系の機能を解明する。
電離放射線の細胞への影響を細胞工学的手法でアッセイする系の開発

1.多数のDNA修復経路の変異細胞株を樹立した。具体的には、Rad51ファミリー5種類の変異細胞株、Rad51ファミリーの一つXrcc3とRad52との二重変異株、DNA-2.DT40変異細胞でのLOHのアッセイを確立するため、HPRTのヘテロ変異細胞を樹立した。6TG選択下に、ヘテロ細胞のコロニー形成を行い、LOHの出現頻度を調べようとした。確かに有る頻度でコロニーが出現するが、このコロニーはそれ以上成長せず明らかに異常であり、これらのコロニー細胞がLOHを起こしているかどうか調べることが不可能であった。核酸代謝の種特異的、あるいは細胞特異的な問題によってこういった結果となったと考えている。現在APRTを使用することを計画し、そのクローニングの準備中である。3.遺伝研深川博士らはDT40において使用できる染色体ペインティングプローブを開発した。かれらと共同でDT40変異細胞における染色体をペインティングによって検索する方法を確立した。今後各変異細胞でペインティングによる染色体数や転座などの検索を行う。4.Jasinらによって開発された人工組みかえ基質を挿入したDT40を作成した。この細胞にI-Sce lを発現させ、相同組換えと非相同末端結合の出現頻度を測定することが可能となった、この系を応用してKu70欠損におけるDNA組換え活性を測定する事が出来た。今後リアルタイムで修復をモニターすることを目的として、I-Sce IをTAT配列と融合させた人工蛋白として細胞外から導入することを検討中である。実際TAT配列をつけたGFP蛋白は非常に効率よくDT40に導入可能であった(未発表データ)。具体的には、Rad51ファミリー5種類の変異細胞株、Rad51ファミリーの一つXrcc3とRad52との二重変異株、DNA-PK/KU70二重変異株、DNA-PK/Rad54二重変異株などである。こららの株を用いて、Rad51ファミリーが一つの機能的複合体としてはたらくこと、Xrcc3とRad52が合成致死であること(したがって、Rad52の機能をXrcc3が相補していることが示唆された)、ku複合体が相同組換えの機能を抑制する活性を持つことを示した。2.HPRTのへテロ変異細胞を樹立した。現在6TG選択下に、LOHの出現頻度を調べている。かれらと共同でDT40変異細胞における染色体をペインティングによって検索する予定である。深川博士らの検索によればRad51ファミリーにおいてはあまり変化が見られていない。この細胞にI-Sce Iを発現させ、相同組換えと非相同末端結合の出現頻度を測定することが可能となった。しかし、リアルタイムで修復をモニターすることはこのままの系ではむつかしい。I-SceIの発現に工夫することでそれが可能となるかもしれない。具体的には、Rad51ファミリー5種類の変異細胞株、Rad51ファミリーの一つXrcc3とRad52との二重変異株、DNA-PK/KU70二重変異株、DNA-PK/Rad54二重変異株、Rad18変異株、Rad18/Rad54二重変異株などである。2.DT40変異細胞でのLOHのアッセイを確立するため、HPRTのヘテロ変異細胞を樹立した。

確かに有る頻度でコロニーが出現するが、このコロニーはそれ以上成長せず明らかに異常であり、これらのコロニー細胞がLOHを起こしているかどうか調べることが不可能であった。核酸代謝の種特異的、あるいは細胞特異的な問題によってこういった結果となったと考えている。現在APRTを使用することを計画し、そのクローニングの準備中である。3.遺伝研深川博士らはDT40において使用できる染色体ペインティングプローブを開発した。かれらと共同でDT40変異細胞における染色体をペインティングによって検索する方法を確立した。今後各変異細胞でペインティングによる染色体数や転座などの検索を行う。4.Jasinらによって開発された人工組みかえ基質を挿入したDT40を作成した。この細胞にI-Sce lを発現させ、相同組換えと非相同末端結合の出現頻度を測定することが可能となった。この系を応用してKu70欠損におけるDNA組換え活性を測定する事が出来た。今後リアルタイムで修復をモニターすることを目的として、I-SceIをTAT配列と融合させた人工蛋白として細胞外から導入することを検討中である。実際TAT配列をつけたGFP蛋白は非常に効率よくDT40に導入可能であった(未発表データ)。
文化財情報の構造分析と情報資源の流通に関する基礎的研究-文化財情報の書誌コントロールにむけて-

本研究は、文化財に関わるネットワーク上の情報資源の有用性を明らかにし、流通基盤の整備について検討するために、書誌コントロールという側面からアプローチするものである。平成17年度は、画像情報管理の長い歴史をもつドイツの博物館での事例を調査した。ドイツでは以前よりMIDASという情報モデル(目録規則)に基づいたシステムが採用され、更にDISKUSという国内の文化財情報を集積した総合目録を運営しているが、現在はメタデータ標準の適応も可能なシステムを構築中である。一方国内では、CIDOC情報カテゴリーおよびデータモデルを参考にしたデータベース構築の事例を確認した。以上の実態調査と並行して、各種メタデータ標準についてその内容を重点的に調査し、相関関係を明らかにした。これらの調査結果を踏まえて、本研究にあわせて構築した文化財情報のデータベースに各種メタデータ標準を適応させ、情報モデルの構築を試みた。その結果、CRMが有用ではあるものの、メタデータ標準は各々に異なる特質があり、一つに収束させるよりも、情報資源の流通の促進のためには、メタデータ標準間を仲介するようなインターフェイスあるいは、クロスレファレンスツールの構築が有用であるという結論に達した。今年度は、依然個別的であり、総合的な検討もなされていない文化財に関わるネットワーク情報資源について、実態の解明に取り組んだ。まず、日本よりも情報資源の蓄積・公開が進んでいる海外における動向について、博物館等の関連機関で既に公開されている事例の調査を重点的におこない、全体の把握に努めた。その結果、米国と東アジアの一部(韓国)における進捗状況について、大枠の見通しを得ることが出来た。その結果は下記の通りである。学術研究の拠点である大学の附属美術館では、その設置状況を反映して、館内のデータベースだけでなく、大学図書館を中心とした情報資源の保存・公開プロジェクトにも参加しており、より広い視野に立った対策がとられていることが明らかになった。書誌コントロールに関わる基準の導入についても、先進的な事例が見られた。独立した研究機関では、情報技術の面においても様々なツールや基準の開発・普及に取り組むなど、この分野をリードすると推測される活動が展開されていた。また、他の美術館では、技術的な面においてはさほど先進的ではないが、情報そのものの蓄積について大きな労力を費やしているという事例も見られた。情報公開に関わる部分に限定して適切な新技術を導入することで、人的経済的に大きな負担を強いる基幹システムの大幅な改変を避けるという点も効果的に作用していた。また、韓国の国立博物館では、文化財の情報に関しては、構造・内容とも統一的な情報システムが導入され、一貫した管理対策が講じられており、日本・欧米とは全く異なる様相が見られた。書誌コントロールに関しては、文化財に関連するデータ標準について、ダブリン・コア、RDF、CIDOCのガイドラインおよびデータ・モデル、EAD等の内容と相互関係を重点的に調査した。次年度には、日本も含めた実見調査をさらに加え、データ標準の普及・導入状況についても詳しく調査し、より細かい相互比較をおこなうことで、ネットワーク情報資源の特質と有効性を明らかにしたい。
FPGAに対応した多重論理設計誤りの自動診断・修正

1.誤り追跡入力の生成部作成:論理検証の結果,機能仕様と設計された論理回路の不一致が検出された場合,その条件を表す二分決定グラフをもとに,誤り追跡入力を生成するソフトウェアを開発した。論理診断部作成:可制御性の評価,誤りの種類を特定しないシミュレーションなどの手法を用いて,誤り追跡入力に含まれるプール変数Xを外部出力に伝搬させるように修正可能なLUTの組合せを求め,さらに各誤り追跡入力についてXが外部出力まで伝搬するようにLUT内部の論理関数の候補を絞り込み,最終的な結果を誤り候補とするソフトウェアを開発した。各LUTの組合せについて,ブール変数Xを外部出力まで伝搬させるためのLUT内部の論理関数の集合をドントケアを含んだ真理値表で表現することで,コンパクトなデータ表現を実現した。3.自動修正/論理再検証部作成:2.の結果得られた設計誤りの候補をもとに自動的にもとの回路を修正し,再度論理検証を行うことによって,最終的な設計誤りと修正された回路を設計者に提示するソフトウェアを開発した。修正しても機能仕様と一致しない誤り候補が存在する場合,不一致の条件を示す論理関数を二分決定グラフで表現し,再度1.の誤り追跡入力の生成処理を実行する。追加生成された誤り追跡入力を,もとのパターンと合わせて誤り追跡に利用することで,高い限定効果を実現した。4.システムの性能評価:実験により,実際に人手で設計された種々の回路に対する誤りの追跡・修正能力を評価した。その結果,挿入したすべての誤りの診断が可能であることを確認した。とくに,従来は不可能であった同一パス上の複数のLUTに生じる設計誤りに対しても適用可能であることから,本手法の高い修正能力が実証された。
接着喪失によるp21^<Cip1>転写活性化機構とがん転移抑制への応用

本課題では、細胞を浮遊状態におくと、細胞周期阻害因子p21^<cip1>が転写レベルで誘導されるメカニズムの解明、およびこの接着応答性を利用して、転移過程(特に体循環中)にあるがん細胞に選択的細胞死を誘導する手段の開発を試みた。p21^<cip1>プロモーター上に存在する接着喪失に応答する領域を特定し、当該領域に働きかける転写因子として、KLF4およびRunx1を同定した。また、KLF4のDNAへの結合に細胞接着斑-核シャトル蛋白質Hic-5が関与していることを明らかにした(Runx1は別蛋白質による制御)。KLF4のリクルートには、Hic-5の核マトリックスへの結合が重要であった。さらに、がん転移抑制への応用を視野に入れるため、がん細胞およびその多くが由来する上皮細胞での脱接着応答性を検討したが、同定した配列は応答しなかった。そこで、上皮細胞、がん細胞で脱接着に応答して発現が変化する遺伝子群を網羅的に検索し、両細胞で発現が変化する56遺伝子、上皮細胞のみで変化する184遺伝子、がん細胞のみで変化する258遺伝子を同定した。1脱接着応答領域の同定:様々な長さのp21ciplプロモーター領域を含むルシフェラーゼレポーターを構築し、p21ciplプロモーター上流2.okbp付近に存在する接着喪失応答配列を同定した。さらに、転写に必要な最小限度のプロモーターに当該配列を繋げたレポーターを構築したところ、接着喪失に伴う転写活性化はこの領域のみで十分であった。2脱接着応答領域に働きかける転写因子の同定:当該領域に働きかける因子の同定をデータベース検索およびRNAi法で行い、浮遊状態での転写活性化に働くKLF4、Hic-5、および接着状態で抑制的に働くRunx1、CRP2を見出した。なお、p53結合配列は含まれていなかった。現在、同定した因子の応答配列への結合とその接着依存性について、クロマチン免疫沈降法により解析中である。3 Hic-5と脱接着応答性転写因子の関連性の解明:浮遊状態でのp21cipl転写活性化に関与するHic-5は浮遊状態で核、特に転写因子の足場となる核マトリックス核分に移行することを細胞分画法により見出した。さらに、Hic-5をkncokdownすると、KLF4の核局在が浮遊状態で減少したため、Hic-5は核マトリックスでKLF4や転写共役因子を呼び込み、転写因子複合体形成を介してp21cipl転写活性化に働く可能性が考えられた。4細胞内レドックスによる制御:接着喪失によるp21cipl遺伝子発現はNADPHoxidase阻害剤(アポサイニン)、ミトコンドリア呼吸鎖阻害剤(ロチン)、およびMnSOD発現系の導入により抑制され、ミトコンドリア、NADPH oxidaseに由来する活性酸素種により仲介されることが示唆された。Hic-5に存在する核外排出シグナル(NES)はレドックス感受性であることから、Hic-5のNES機能の修飾、核機能発現について、今後検討する予定である。がん転移過程は接着状態の劇的な変化が伴い、転移過程のがん細胞は正常な接着状態を喪失しているか、浮遊状態にあると考えられる。一方、正常細胞は、接着喪失下では増殖停止や細胞死を誘導し、浮遊状態での細胞増殖/生存を積極的に阻止する。これは、接着喪失を感知して応答するシステムが備わっているためと考えられる。最近、細胞を浮遊状態におくと細胞周期阻害因子p21cip1が転写レベルで誘導され、そこに細胞接着斑蛋白質Hic-5が関与することを見出した。本課題では、正常細胞に備わっている接着喪失応答性に関する新たな機構を解析し、正常細胞とがん細胞を比較することで、がん細胞における破綻の原因を探り、最終的に応答領域を利用して、転移過程にあるがん細胞に選択的細胞死を誘導する手段の開発を目指す。1)p21eip1プロモーター上に存在する接着喪失に応答する領域、及び応答性を担う転写因子を同定するため、luciferase reporterを作製し、脱接着応答領域を特定した。さらに、当該領域に働きかける転写因子として、KLF4およびRunx1を同定し、DNAへのKLF4の結合にHic-5が関与していることを明らかにした(Runx1は別蛋白質による制御であった)。KLF4のリクルートには、Hic-5の核マトリックスへの結合が重要であり、活性酸素の関与は必須ではなかった。

2)がん細胞およびその多くが由来する上皮細胞では、当該脱接着応答配列は応答せず、細胞種によってHIC-5/KLF4が標的とする遺伝子が異なることが考えられた。そこで、上皮細胞、がん細胞で脱接着に応答して発現が変化する遺伝子群を網羅的に検索し、両細胞で共通して発現が変化する56遺伝子、上皮細胞のみで変化する184遺伝子、がん細胞のみで変化する258遺伝子を同定した。
癌組織の低酸素環境を標的とする、新規の時間遺伝子治療法の開発

癌組織内では正常組織と比較し、新生血管の構造異常や間質圧上昇によって低酸素環境下におかれている。そのため癌組織は、低酸素環境下に適応し生存、増殖を可能とするための様々な因子を発現する。低酸素環境下にある細胞内では、転写促進因子(HIF)と遺伝子のプロモーター上に存在する低酸素応答配列(HRE)による低酸素環境下特有の遺伝子発現機構が存在する。また、この転写機構には日周リズムが存在し、癌組織の恒常性を制御し癌の進行を促している。本研究では、癌組織での低酸素遺伝子発現リズム機構を応用し、癌組織への選択性また発現増強を指向した遺伝子発現システムを構築する。そして癌を標的とする新規の時間遺伝子治療法の開発を行う。実験計画として癌組織の低酸素環境応答性の遺伝子発現ベクターの作製および機能評価の検討および至適投与方法の構築をめざした。これまでに癌細胞の低酸素環境下において、発現が充進する遺伝子を数種同定している。これら遺伝子の上流に存在するHRE配列を合成し、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーターの上流に挿入し、低酸素感受性遺伝子発現ベクター(HRE-CMV-vector)を作製した。機能評価を行った結果、低酸素においてプロモーター活性が増強された。また新規ベクターにshRNA配列を導入したベクターを作成し、抗腫瘍効果が認められるか否かを、腫瘍移植モデルマウスを用いて評価した。その結果、低酸素応答配列を有しないコントロールベクターと比較し、低酸素応答ベクターの抗腫瘍効果は増大した。また、抗癌タンパクNK4の低酸素感受性遺伝子発現ベクターを作製し、抗腫瘍効果を測定した結果、低酸素応答ベクターの抗腫瘍効果は増大した。本研究より、新規の低酸素応答ベクターは、通常の発現ベクターと比較し、抗腫瘍効果を増強できることを初めて立証し、低酸素環境の時刻依存的な変化に対応した遺伝子治療を可能とするツールを開発した。平成22年度実験計画課題として癌組織の低酸素環境応答性の遺伝子発現ベクター(低酸素感受性遺伝子発現ベクター)の作製および機能評価の検討をした。これまでに癌細胞の低酸素環境下において、発現が亢進する遺伝子を数種同定している。また、作製したベクターの機能評価を培養細胞および腫瘍移植モデルマウスにより評価した。その結果、低酸素においてプロモーター活性が増強された。また、新規ベクターにshRNA配列を導入したベクターを作成し、抗腫瘍効果が認められるか否かを、腫瘍移植モデルマウスを用いて評価した。本研究より、新規の低酸素応答ベクターは、通常の発現ベクターと比較し、抗腫瘍効果を増強できることを初めて立証した。

次年度は、抗腫瘍タンパク発現低酸素感受性ベクターを作成し、してき投与方法の確立を行う予定である。癌組織内では正常組織と比較し、新生血管の構造異常や間質圧上昇によって低酸素環境下におかれている。そのため癌組織は、低酸素環境下に適応し生存、増殖を可能とするための様々な因子を発現する。低酸素環境下にある細胞内では、転写促進因子(HIF)と遺伝子のプロモーター上に存在する低酸素応答配列(HRE)による低酸素環境下特有の遺伝子発現機構が存在する。また、この転写機構には日周リズムが存在し、癌組織の恒常性を制御し癌の進行を促している。本研究では、癌組織での低酸素遺伝子発現リズム機構を応用し、癌組織への選択性また発現増強を指向した遺伝子発現システムを構築する。そして癌を標的とする新規の時間遺伝子治療法の開発を行う。実験計画として癌組織の低酸素環境応答性の遺伝子発現ベクターの作製および機能評価の検討および至適投与方法の構築をめざした。これまでに癌細胞の低酸累環境下において、発現が亢進する遺伝子を数種同定している。これら遺伝子の上流に存在するHRE配列を合成し、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーターの上流に挿入し、低酸素感受性遺伝子発現ベクター(HRE-CMV-vector)を作製した。機能評価を行った結果、低酸素においてプロモーター活性が増強された。また新規ベクターにshRNA配列を導入したベクターを作成し、抗腫瘍効果が認められるか否かを、腫瘍移植モデルマウスを用いて評価した。その結果、低酸素応答配列を有しないコントロールベクターと比較し、低酸素応答ベクターの抗腫瘍効果は増大した。また、抗癌タンパクNK4の低酸素感受性遺伝子発現ベクターを作製し、抗腫瘍効果を測定した結果、低酸素応答ベクターの抗腫瘍効果は増大した。本研究より、新規の低酸素応答ベクターは、通常の発現ベクターと比較し、抗腫瘍効果を増強できることを初めて立証し、低酸素環境の時刻依存的な変化に対応した遺伝子治療を可能とするツールを開発した。
血中の循環粒子を標的とした慢性疲労の画期的診断マーカーの開発

慢性疲労は、ウイルスを含む何らかの外的なストレスを原因として神経内分泌-免疫系の異常が生じその結果として「疲労」という言葉に代表される諸症状により、パフォーマンスの低下が起こっている。疲労を主訴とする代表的な疾患である慢性疲労症候群では脳内グリア細胞の発現異常があり、またその原因に何らかの炎症がかかわっていることは様々な先行研究より明らかとなっている。しかしながら、血中で測定可能なバイオマーカーは同定されていない。本研究では、疲労に特異的なバイオマーカー探索を実施したので報告する。慢性疲労は、何らかの外的なストレスを原因として神経内分泌-免疫-炎症系の異常が生じ、その結果として疲労という言葉に代表される諸症状を引き起こす。現在までに慢性疲労症候群における血中の粒子マーカーの上昇を確認している。この疾患と慢性疲労者・症状に似た点が認められるうつ病との差異を明らかにすることを目的に研究を実施した。本年度実施した項目は以下の3つ1.現在までに明らかになっている慢性疲労症候群・慢性疲労のバイオマーカーである、酸化ストレス等と粒子バイオマーカーの関連を探索した。酸化ストレスマーカーについては慢性疲労(急性・亜急性)、慢性疲労症候群において共通で使用できるバイオマーカーである。特に抗酸化力と酸化ストレスの組み合わせで、これらの異なった疲労の病態を層別化してみることに適しており、本年度論文としてまとめアクセプトされた(Biological Psychology in press)。これらの酸化ストレスマーカーと粒子マーカーとの相関を確認した。また、慢性疲労者のバイオマーカー開発に向けて、質問票における慢性疲労得点・うつ得点と粒子バイオマーカーの相関解析を実施した。粒子マーカーの成分の一部はうつ得点とのみ関係し、今後、慢性疲労を有するうつ病患者、慢性疲労者を対象とした研究の展開の糸口をつかんだといえる。2.平成28年度の本格実施にむけて、うつ病、慢性疲労者を対象とした臨床フィールドでの臨床検体の収集を実施した。3.粒子成分の同定を部分的に実施した。粒子成分の同定を行いバイオマーカーとしての特異性を探索は行ったが、様々な疾患の新規バイオマーカーに関しては平成28年度に本格的に実施する。慢性疲労は、何らかの外的なストレスを原因として神経内分泌-免疫-炎症系の異常を生じ、その結果として疲労という言葉に代表される諸症状を引き起こす。しかしながら、現時点で主観的な診断に勝る有効な診断マーカーがなく、また類似症状を示す疾患との差異を検出する方法も見つかっていない点に問題があった。本研究では、慢性疲労症候群・慢性疲労・うつ病の対象から血液を採取し、血中の循環微小粒子を測定するとともに、微小粒子中のプロテオミクスを測定し、新規の診断法につなげる目的で研究を実施した。今年度は、慢性疲労者(過労等で来院するが、うつ病とも慢性疲労症候群とも診断されない対象)、うつ病対象からの血液を14名採取した。健常と慢性疲労症候群では循環微小粒子の数が異なることは既に明らかになっているが、慢性疲労症候群と類似の症状を示すうつ病や慢性疲労での差を検出することで、新規の診断マーカーとできるとともに現在、疲労に効果があると市販されているOTC医薬品やサプリメント、医療機器などの慢性疲労への効果判定に利用可能である。効果判定が可能となれば、慢性疲労に効く新しいサプリメント・医療機器・身体的運動法等の開発が促進され、60%の国民が感じる疲労を軽減できることが期待される。現在、鋭意解析中である。また、微小粒子中のプロテオミクスは、慢性疲労症候群と健常でその量に差異があるところまでが明らかとなっており、今後も引き続き解析を実施する。研究協力者の江口暁子(現三重大学)とも協力し、新規に収集したサンプルを対象とし粒子マーカーの検証を実施する。健康科学・予防医学サンプル解析費用の発生が平成28年度実施となったため。サンプル解析費用、関連消耗品、学術集会発表関連旅費として使用する
糖鎖改変マウスを用いた、シアル酸分子種変化によるB細胞活性化調節機構の解明

研究代表者はこれまでに、T細胞依存性抗原による免疫後に生じる胚中心の活性化B細胞において、主要シアル酸分子種が大きく変化することを明らかにしてきた。本研究では、この活性化依存的なシアル酸分子種の発現変化がもたらす生理的意義の解明を目的とし、研究代表者らが作製した、シアル酸分子種変化の抑制が期待される糖鎖改変マウスのB細胞における解析を行った。この糖鎖改変マウスにおいても胚中心の形成が見られたことから、さらに抗体産生能について検討した。研究代表者はこれまでに、非活性化B細胞においてはN-グリコリルノイラミン酸(Neu5Gc)が主要なシアル酸分子種として発現するが、胚中心の活性化B細胞ではNeu5Gcの生合成に必須の酵素、Cmahの発現抑制により、Neu5Gcの発現が特異的に抑制されることを明らかにしている。本研究では、この胚中心におけるシアル酸分子種変化の生理的意義の解明を目的として、研究代表者らが作製した、B細胞が活性化してもNeu5Gcの発現が抑制されないことが期待される2種類の糖鎖改変マウスについて、特に胚中心反応に注目して解析を行っている。胚中心B細胞で特異的に発現するActivation-induced cytidine deaminase(AID)遺伝子のプロモーターを使用した、胚中心B細胞特異的な導入遺伝子発現が期待されるトランスジェニック(Tg)マウスについては、導入したCmah遺伝子の発現の確認を行った。B細胞特異的なプロモーターとして実績のある免疫グロブリン遺伝子の可変領域(IgVH)プロモーターを用いたTgマウスは、すでに導入遺伝子を異なる発現強度で発現する複数の系統を確立していたため、当該年度においては表現型の解析を開始した。まず、脾臓B細胞をin vitroでLPSにより活性化させたときに、Neu5Gcの発現が期待通り減少しないことを確認した。その上で、免疫系の発達、特にB細胞の分化・成熟について解析を行った。研究代表者はこれまでに、B細胞の活性化に伴い、主要シアル酸分子種がN-グリコリルノイラミン酸(Neu5Gc)からN-アセチルノイラミン酸へと変化すること、また、この変化が、Neu5Gcの生合成に必須の酵素、Cmahの発現抑制によるものであることを明らかにした。本研究は、この活性化依存的なシアル酸分子種変化の生理的意義を明らかにすることを目的としており、研究代表者らが作製した、B細胞が活性化してもNeu5Gcの発現が抑制されない糖鎖改変マウスのB細胞応答について、特に胚中心反応に注目して解析を行った。胚中心は、T細胞依存性抗原による免疫後に二次リンパ器官内に形成される組織構造であり、胚中心反応を経て、抗体のクラススイッチや体細胞突然変異が生じ、活性化B細胞は抗体産生細胞や記憶細胞へと分化していく。B細胞の活性化を負に制御していると考えられるNeu5Gcの発現を抑制できない糖鎖改変マウスでは、T細胞依存性抗原に対する応答が減少していることが期待される。まず、脾臓凍結切片の染色により胚中心の形成について調べたところ、糖鎖改変マウスにおいてもT細胞依存性抗原による免疫後に胚中心の形成が見られた。そこで、抗体産生について検討を行ったが、特に大きな変化は認められなかったため、抗体産生細胞や記憶B細胞への分化に影響があるか、検討を行っている。さらに、細胞レベルでの応答についても、増殖に差が見られるか等の検討を進めている。