hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
電磁パルス発振-弾性波受信に基づくコンクリート内部鉄筋の新しい非破壊評価方法

本年度は、昨年度の成果を踏まえ、内部鉄筋周辺にコンクリートはく離を模擬した供試体を新たに作製し、検討を行った。コンクリート表面近傍から電磁パルスにより内部鉄筋を振動させ、振動によって生じた弾性波をコンクリート表面の振動センサで記録し、解析した。その結果、はく離のない健全供試体において、供試体中央部以外のコンクリート表面で得られた波形エネルギは、ほぼ一定の値となることが確認された。また、はく離供試体において、「はく離部」と「健全部」との境界部の直上で得られた波形エネルギは、「健全部」直上で得られた波形エネルギよりも大きくなることが明らかとなった。さらに、コンクリート表面における複数の計測点で得られた弾性波の波形エネルギの分布状態から、はく離箇所の分布状態が把握できる見通しが得られた。一方、電食により内部の鉄筋を腐食させた鉄筋コンクリート供試体において上記と同様の計測を行った。その結果、鉄筋腐食による膨張圧により鉄筋とコンクリートとの間にはく離やひび割れが発生し、鉄筋の振動状況が変化し、コンクリート表面での受信振幅が変化することや、鉄筋腐食により断面積が減少することによる断面剛性の低下に起因する振動特性の変化などから、受信波の波形エネルギが変化する可能性があることなどが明らかとなった。本研究では、鉄筋コンクリートにおける鉄筋腐食による鉄筋-コンクリート間のはく離状況や鉄筋破断を的確に評価するための新しい非破壊評価方法として、電磁パルスによりコンクリート表面から遠隔で鉄筋自身を振動させ【電磁パルス発振】、この振動により生じた弾性波をコンクリート表面でとらえる【弾性波受振】新しいタイプの手法の検討を目的とする。具体的には、A.鉄筋周辺のコンクリートはく離の検知方法、B.鉄筋破断の検知方法に的を絞って、本手法の適用可能性について検討する。本年度は、上記を達成するための基礎的な研究を実施し、以下の結果が得られた。(1)鉄筋加振に用いる電磁パルス発生装置を試作し、コンクリート中に埋めこんだ鉄筋に十分な振動を生じさせるのに適した電磁パルスの条件について検討した。その結果、内部鉄筋の評価に有意な振動を得るための試験条件が設定できた。一方、弾性波受振については、AE計測装置を適用する手法が有効であることが明らかとなった。(2)鉄筋コンクリート供試体で実験を行い、鉄筋周辺でのはく離などの周辺状況の違いがコンクリート表面で得られる弾性波の周波数特性に与える影響は小さいことが把握できた。(3)鉄筋コンクリート供試体での実験で、埋設鉄筋のかぶりや直径などの条件を変化させて、はく離長さやはく離厚さが評価結果に与える影響について調べた。本実験の範囲内では、鉄筋のかぶりや直径は、鉄筋周辺状況の評価を行ううえで大きな問題とならないことがわかった。また、はく離長さが大きいほど、また、はく離厚さが大きいほど、鉄筋の振動により生じる弾性波エネルギーがコンクリートに伝播しにくくなることから、受振波の最大振幅値が小さくなることが明らかとなった。
義歯床下骨組織に吸収を惹起する持続的圧力の閾値に対する糖尿病の影響に関する研究

糖尿病ラットの口蓋を対象として、義歯床を介して義歯床下組織に対して持続的圧力を加えた場合に、義歯床下骨組織に破骨細胞による吸収を惹起する閾値を病理組織学的に観察し、健常ラットの口蓋を対象とした場合の研究結果と比較することによって、糖尿病が義歯床下骨組織に破骨細胞による吸収を惹起する持続的圧力の閾値に及ぼす影響について検討した。ストレプトゾトシンを用いて糖尿病を誘発した15週齢のウイスター系雄性ラット45匹の上顎臼歯に装着したメタル・フレームを利用して、可撤性の義歯床を臼歯部口蓋の左側に装着し、反対側を対照側とした。義歯床下組織に対して加える持続的圧力の大きさは0.05,0.10,0.20,0.30,0.40,0.50,0.60,0.70および0.80gf/mm^2の9種類とした。圧力の大きさは、二次元画像解析装置を用いて測定した義歯床の投影面積と義歯床を介して加えられる荷重量によって規定した。義歯床装着3日後に義歯床下粘膜ならびに義歯床の清掃を行った。義歯床装着6日後に実験動物を屠殺して口蓋組織を採取した。採取した組織は、各実験動物毎に通法にしたがって第1および第2臼歯部において頬舌的な6μmのパラフィン切片を約60μm間隔で50枚ずつ作製し、ヘマトキシリン-エオジン染色を施して光学顕微鏡下で観察した。破骨細胞あるいは吸収窩が観察された場合を骨吸収の認められた標本として、その標本数を各実験例の被検側および対照側毎に求めた。対照側の結果から1実験例の標本50枚中に骨吸収の認められた標本数は最大7枚であり、健常ラットの最大4枚に比較してやや多く観察された。被検側においては、0.60gf/mm^2以上の持続的圧力では、すべての実験例において破骨細胞による骨吸収が発現した。以上の結果は、健常ラットでは0.70gf/mm^2以上の持続的圧力が加えられた場合に、すべての実験例において破骨細胞による骨吸収が発現することが知られており、これと比較して、糖尿病は義歯床下骨組織に吸収を惹起する持続的圧力の閾値を下降させることを示唆するものである。
海水中のラジウムの高感度定量に関する基礎的研究-表面電離型質量分析計による手法-

本科学研究費補助金による本年度の研究実績は以下の3つにまとめられる。1.特殊な形状のフィラメントによるイオン化の検討昨年度に引き続きラジウムの効率の良いイオン化に必要とされる特殊な形状のフィラメントを成型しイオン化効率の検討を行った。通常のフィラメントに比べ僅かではあるがイオン化効率の向上(10%程度)が認められた。2.海水中のラジウムの分離精製法の検討海水試料からのラジウムの効率の良い分離精製法の検討を行った。ラジウムは海水にバリウム及び硫酸を添加して硫酸バリウムを形成させることで分離した。精製にはクラウンエーテルによる抽出クロマトグラフィーを用いた。その結果、ラジウムの回収率は高いがバリウムとの相互分離は必ずしも十分ではないことが確認された。現在、相互分離の効率を上げる手法の開発に取り組んでいる。3.海水中のラジウムの定量ラジウムと地球化学的挙動が類似している元素として同族(アルカリ土類元素)のバリウムが挙げられる。そこで、ラジウム(質量数226と228)とバリウムの定量を、白鳳丸のKH-96-5次航海(主にインド洋)で採水した試料について行った。ラジウムに関しては放射能測定、バリウムに関してはICP質量分析計を定量法に用いた。各々の地点のラジウム-226とバリウムの濃度の深さ方向のプロファイルは、従来の結果通りいずれも深さ方向に増加するいわゆる栄養塩型のものとなった。そして、ラジウム-226とバリウムの鉛直分布は極めて類似性していることが確認された。表面水のラジウム-228とバリウムの分布に関しては、ともにアンダマン海とベンガル湾で高い値を示すことがわかった。表面水のラジウム-228は大陸地殻から供給される物質の量の指標とみなされている。従って、上記両海域の表面水に関しては、バリウムもラジウム-228同様その大半が大陸地殻起源であることを示している。本科学研究費補助金による本年度の研究実績は以下の2つにまとめられる。1.特殊な形状のフィラメントを作成する治具の設計ラジウムの効率の良いイオン化には特殊な形状のフィラメントが必要である。こうしたフィラメントを作成する治具の設計を行い、実際に制作した。この治具で作成したタングステンフィラメント上にラジウムを塗布しイオン化を行うと、通常のフィラメントに比べ僅かではあるがイオン化効率の向上(10%程度)が認められた。2.海水中のバリウムの定量バリウムはラジウムと地球化学的挙動が類似しているものと考えられている.そこで、バリウムの定量を白鳳丸のKH-96-5次航海(主にインド洋)で採水した試料(5地点)及びタイのチャオプラヤ川の河川水試料(季節が異なる3種類のものを採取)に関して行った。尚、定量にはICP質量分析計を用いた。一部の試料に関しては別に200リットルの採水を行い、そこからラジウム-226を分離、精製し放射能測定による定量を行いバリウムの濃度との比較を行った。各々の地点のバリウムの濃度の深さ方向のプロファイルは、いずれも深さ方向に増加するいわゆる栄養塩型のものとなった。しかしながら表層と深層の濃度差については、典型的な外洋とアンダマン海や南シナ海に代表される閉鎖海盆では大きな相違が認められた。一方、河川水試料に関しては季節間の顕著な濃度変化が認められた。又、海水試料に関してはラジウム-226とバリウムの間には良い相関が認められる。これは従来の結果と調和的である。しかしながら、河川水試料に関しては両者の相関は殆ど認められなかった。これは、ラジウム-226とバリウムの挙動は海洋においては極めて類似しているが、河川においては大きく異なる事を示唆している。

表面水のラジウム-228は大陸地殻から供給される物質の量の指標とみなされている。従って、上記両海域の表面水に関しては、バリウムもラジウム-228同様その大半が大陸地殻起源であることを示している。
鋳造法との複合化による製品内面への耐磨耗硬質溶射皮膜の固定化技術

製品に設けられた狭い孔の内面への皮膜形成が困難な溶射法の限界を克服することを目的とし,溶射と鋳造の複合加工技術を応用する実験的研究がなされた.鋳造製品の孔内面への皮膜固定法として,予めその外表面へ所望の皮膜を溶射法によって形成した中子を準備し,それを鋳型に組込み,最終段階で鋳造品から同中子を除去し,製品の孔内面に耐磨耗硬質皮膜を残留させる溶射/鋳造複合化技術が考案,検討された.実験では先ず,高速フレーム溶射装置へ多量の燃料を液化させずに安定供給するために電子制御流量計を組込む改修を行い,以後,WC-12%Co皮膜の固定化に関し検討を行い,以下の結果を得た.1.高速フレーム溶射法により形成されたWC-12%Co皮膜は硬度Hv900以上を有し,アルミニウム合金鋳造製品の耐磨耗化に極めて有効である.2.レジンコーテッドサンド中子は,塑性変形能が小さいため,WC-12%Co粉末を直接溶射し成膜させることは困難であったが,予め,それにアルミニウム合金を汎用フレーム溶射により被覆処理すれば高速フレーム溶射の適用が可能となった.3.WC-12%Co溶射皮膜とAC4B鋳造製品とのせん断接合強度は510MPaであったが,WC-12%Co皮膜へのNi-10%A1の積層溶射,鋳型の余熱温度の上昇およびNi-10%A1積層皮膜表面への凹凸加工の実施により,それは1020Mpaに改善された.4.積層溶射材料として用いたZn及びCu-10%A1は接合性を向上させないこと,また,溶体化熱処理に対応して設定した真空熱処理も溶射皮膜とAC4B鋳造部材との拡散合金化反応を生じさせるには至らず,溶射皮膜とAC4B鋳造材との接合性の改善に有効でないことが判った.製品に設けられた狭い孔の内面への皮膜形成が困難な溶射法の限界を克服することを目的とし,溶射と鋳造の複合加工技術を応用する実験的研究がなされた.鋳造製品の孔内面への皮膜固定法として,予めその外表面へ所望の皮膜を溶射法によって形成した中子を準備し,それを鋳型に組込み,最終段階で鋳造品から同中子を除去し,製品の孔内面に耐磨耗硬質皮膜を残留させる溶射/鋳造複合化技術が考案,検討された.実験では先ず,高速フレーム溶射装置へ多量の燃料を液化させずに安定供給するために電子制御流量計を組込む改修を行い,以後,WC-12%Co皮膜の固定化に関し検討を行い,以下の結果を得た.1.高速フレーム溶射法により形成されたWC-12%Co皮膜は硬度Hv900以上を有し,アルミニウム合金鋳造製品の耐磨耗化に極めて有効である.2.レジンコーテッドサンド中子は,塑性変形能が小さいため,WC-12%Co粉末を直接溶射し成膜させることは困難であったが,予め,それにアルミニウム合金を汎用フレーム溶射により被覆処理すれば高速フレーム溶射の適用が可能となった.3.WC-12%Co溶射皮膜とAC4B鋳造製品とのせん断接合強度は510MPaであったが,WC-12%Co皮膜へのNi-10%A1の積層溶射,鋳型の余熱温度の上昇およびNi-10%A1積層皮膜表面への凹凸加工の実施により,それは1020Mpaに改善された.4.積層溶射材料として用いたZn及びCu-10%A1は接合性を向上させないこと,また,溶体化熱処理に対応して設定した真空熱処理も溶射皮膜とAC4B鋳造部材との拡散合金化反応を生じさせるには至らず,溶射皮膜とAC4B鋳造材との接合性の改善に有効でないことが判った.金属製品に設けられた狭く深い孔の内面を表面処理し,耐摩耗性や耐食性などの特性を向上させるため,新たに考案した溶射と鋳造の両技術の複合加工プロセスに関する基礎的研究を行った。すなわち,狭く深い孔の内面への皮膜形成が困難な溶射法の限界を克服する方法として,予め鋳造用中子の外表面へ所望の皮膜を溶射法によって形成しておき,それを鋳型内に組込むことにより,製品の孔内面に耐摩耗硬質皮膜を固定化する溶射/鋳造複合化プロセスを検討した.本研究では,先ず,高速フレーム溶射システムの改修を行い,対象とする超硬サ-メット材料(WC-CoおよびCr_2C_3-NiCr)の溶射に関し,装置の性能および安定性を検証し,引き続き,Zn合金およびレジンコーテッドサンド製の鋳造用中子へ高速フレーム溶射を実施した.本研究で得られた成果,問題点およびその対策等は以下に列挙する通りである.また,既に実用化を目標とした模型の設計・製作も並行し実施しており,次年度の研究に加え継続,検討する.(1)Zn合金中子は溶射および鋳造工程での利便性はかなり高く,耐摩耗硬質皮膜の固定化にも適する.しかし,溶解分離したZn合金中子材料がアルミニウム合金鋳物と接触反応して製品の形状不良を生じる原因にもなり,不適当な場合がある。

(2)Zn合金中子を使用した場合における問題を回避するため採用したレジンコーテッドサンド中子は,塑性変形能が小さく,溶射粉末を機械的に打込み付着させることは困難で,直接,超硬サ-メットを高速フレーム溶射させることは不可能であったが,低融点で濡れ性を有する特殊アルミニウム合金を汎用ガス溶射により成膜し予処理すれば,高速フレーム溶射が可能となる.(3)製品孔内面に固定化されたWC-12%Co超硬サ-メット皮膜は硬度Hv1000以上を保持した.製品に設けられた狭い孔の内面への皮膜形成が困難な溶射法の限界を克服することを目的とし,溶射と鋳造の複合加工技術を応用する実験的研究がなされた.鋳造製品の孔内面への皮膜固定法として,予めその外表面へ所望の皮膜を溶射法によって形成した中子を準備し,それを鋳型に組込み,最終段階で鋳造品から同中子を除去し,製品の孔内面に耐摩耗硬質皮膜を残留させる溶射/鋳造複合化技術が考案,検討された.実験では先ず,高速フレーム溶射装置へ多量の燃料を液化させずに安定供給するために電子制御流量計を組込む改修を行い,以後,WC-12%Co皮膜の固定化に関し検討を行い,以下の結果を得た.1.高速フレーム溶射法により形成されたWC-12%Co皮膜は硬度Hv900以上を有し,アルミニウム合金鋳造製品の耐摩耗化に極めて有効である.2.レジンコーテッドサンド中子は,塑性変形能が小さいため,WC-12%Co粉末を直接溶射し成膜させることは困難であったが,予め,それにアルミニウム合金を汎用フレーム溶射により被覆処理すれば高速フレーム溶射の適用が可能となった.3.WC-12%Co溶射皮膜とAC4B鋳造製品とのせん断接合強度は510MPaであったが,WC-12%Co皮膜へのNi-10%Alの積層溶射,鋳型の余熱温度の上昇およびNi-10%Al積層皮膜表面への凹凸加工の実施により,それは1020Mpaに改善された.4.積層溶射材料として用いたZn及びCu-10%Alは接合性を向上させないこと,また,溶体化熱処理に対応して設定した真空熱処理も溶射皮膜とAC4B鋳造部材との拡散合金化反応を生じさせるには至らず,溶射皮膜とAC4B鋳造材との接合性の改善に有効でないことが判った.
インドールプレニル基転移酵素の動的立体構造基盤の確立と酵素触媒機能の拡張

CdpNPTは、ベンゾジアゼピンのインドール骨格3位をジメチルアリル化することにより、アスゾナレニンの生合成に関わると考えられている放線菌由来のインドールプレニル基転移酵素である。本酵素は溶液中で二量体を形成して約92 kDaの高分子量タンパク質となるため、NMR解析においては単量体化が必要であった。昨年度に引き続き、本酵素の2量体形成部位に位置するアミノ酸への変異導入を進めた結果、N152S/Q159S/R185S3重変異酵素とR136S/Q157S/D279G3重変異酵素が溶液中で単量体として存在できることを明らかにした。今後、これらをNMR測定に供することにより、CdpNPTの反応に伴う動的立体構造解析が可能になることが期待される。また、CdpNPTにβ-カルボリン類のハルモールをDMAPPとともに作用させると、その6位が3-ジメチルアリル化された新規化合物を生成することが判明した。さらに、CdpNPTとハルモールとの2者複合体X線結晶構造の取得にも成功した。その結果、ハルモールは、本来の基質とは異なった配向でCdpNPTの活性中心キャビティ内に取り込まれる可能性が示唆された。本酵素の機能改変に有用なあらたな知見が得られたものと考えている。26年度が最終年度であるため、記入しない。インドールプレニル基転移酵素(IPT)は、糸状菌が生産するエルゴットアルカロイドやテレキノンアルカロイドの生合成においてインドール骨格部位をジメチルアリル化する可溶性酵素群である。本研究では、CdpNPTと個々の基質との相互作用部位、基質認識の共通部位や基質毎の特異的認識部位を、NMRによりハイスループットスクリーニングする事で、基質結合やプレニル化反応における動的構造変化を解明する事を目的に、溶液NMRによる信号帰属を試みた。CdpNPTは溶液中で二量体を形成し、約92 kDaの高分子量タンパク質となる。分子量の制約によるNMR信号の重複と幅広化の減少を目的に、残基特異的部位特異的安定同位体標識試料を調製した。Lys側鎖に、13C安定同位体標識したメチル基を選択的に修飾導入した試料、およびAla側鎖メチル基を安定同位体標識した試料を調製し、920 MHz NMRを用いて13C-HSQCスペクトルを測定した。また、15N全標識CdpNPT試料の15N-HSQCスペクトルを測定した。その結果、Lys側鎖を修飾した試料の信号は、当初予測していたより分散度が低く、信号の大幅な重複が観測された。一方、Ala残基側鎖メチル基を標識した試料ではAla残基数が多いため、信号の重複が観測された。また、15N-HSQCの測定も試みたが、CdpNPTは2量体を形成し、見かけの分子量が大きいため、TROSY法を用いても信号の広幅化が生じ、良好な信号の取得は困難であることが判明した。そこで、この問題の解決のため、単量体で安定化する変異体の作成を試みた。その結果、77番目のヒスチジンをセリンに置換した変異酵素が単量体と二量体で平衡状態を保っていることが確認された。さらなる変異の導入またはNMR測定条件の検討により、CdpNPTの基質結合やプレニル化反応における動的構造変化の解明が期待される。平成25年度の計画においては、溶液NMR解析により、CdpNPTの基質結合やプレニル化反応における動的構造変化を解明する事を主たる達成目標としていた。CdpNPTが溶液中で二量体を形成して約92 kDaの高分子量タンパク質となるため、分子量の制約により、NMR信号の重複と幅広化が見られたが、現在では、その対策として、CdpNPTの単量体化にも成功しつつあり、おおむね順調に進展していると考えている。CdpNPTの単量体化およびNMR測定条件の検討をさらに進める。

また、同時に、CdpNPTと個々の基質との複合体結晶構造の取得にも取り組み、両解析法を用いてCdpNPTの基質結合やプレニル化反応における動的構造変化の解明に取り組む。一方、本研究の最終目標のひとつに機能改変酵素の創出があるが、NMRシグナル、および、先行研究において動的変化を示していると考えられるシグナルや二次構造が確認されている。CdpNPTのNMR解析とX線結晶構造解析を進めると同時に、これらの情報をもとに変異酵素を作成し、機能改変型酵素の創出を目指す。
JNKとp38キナーセ活性の可視化と操作によるストレス応答の特異性決定機構の研究

細胞のストレス応答を担うストレス応答キナーゼ(以下SAPK)活性化の動態を先鋭的な可視化手法で解明し、また、キナーゼ動態を人為的に操作することにより、ストレス依存的な細胞応答の特異性決定に「キナーゼ活性化を生じる場所やタイミング」という時空間的な情報がどのような役割を担うかを解明する目的で研究を行った。本研究では細胞への紫外線、タンパク合成阻剤等によるSAPK活性化の時・空間動態を解析することに成功した。その結果、刺激の種類によってSAPK活性を生じる場所およびタイミングに相違点があり、それぞれ特徴的な時空間パターンが存在することが明らかになった。また、SAPK活性をモニターしながら人為的に活性誘導する実験系を構築したところ、刺激の種類ごとに異なる細胞機能を発揮するメカニズムの一つがシグナルの時間動態に起因する可能性が示された。細胞内のストレス応答に関わる二つのキナーゼ活性化の動態を先鋭的な可視化手法で解明し、また、キナーゼ活性を任意に制御することで、ストレス依存的な細胞応答の特異性決定に「キナーゼのリン酸化シグナルを生じる場所やタイミング」という時空間的な情報がどのような役割を担うかを解明する目的で研究を行った。本年度はヒト由来培養細胞において、キナーゼ活性の可視化と同時に、活性を操作する実験系の作製を行った。特に、薬剤依存的な二量体形成誘導で活性化できる改変型p38キナーゼ分子を用いる実験系の構築に成功した。昨年までに各種ストレス(塩浸透圧、紫外線、サイトカイン、タンパク合成阻害剤)は細胞質において各ストレス応答キナーゼ活性を上昇させることを見いだしており、さらに、ストレス毎に細胞死の程度が大きく異なる結果を得ていた。今回、細胞質と細胞膜において人為的にp38経路活性化を生じさせる実験を試みたところ、場所に関わらずキナーゼ単独の作用では細胞死および細胞形態には大きな影響を及ぼさないことが分かった。次に、ストレス依存的なキナーゼの時間制御に着目して解析を行った。驚いたことに、細胞死を生じるストレスの場合には、キナーゼ活性化が10時間程度も持続してそのまま細胞死を生じるのに対し、細胞死を生じないタイプの刺激の場合にはほとんど一過性のキナーゼ活性化だけで、その後刺激前のそれに近い状態に戻っていた。この結果から細胞死とシグナルの時間的パラメータとの対応関係が示唆された。細胞機能とシグナルの時間情報との対応は生物学的にも重要な問題であるが、さらに医学的にも、例えば時間情報を応用して効率よく癌細胞を細胞死させる手法などに応用できれば有用である。これまで時間情報の効果はほとんど注目されておらず、本研究成果は各分野の新たな流れをつくるきっかけになるものと予想される。本年度は、細胞内のJNKおよびp38MAPK活性化の動態を先鋭的な可視化手法で解明し、さらにMAPK活性を任意に制御することで、ストレス依存的な細胞応答の特異性決定に「MAPKリン酸化シグナルを生じる場所やタイミング」という時空間的な情報がどのような役割を担うかを解明する目的で研究を行った。まず、p38MAPK活性可視化プローブの開発と性能評価を行った。蛍光共鳴エネルギー移動の原理に基づく新規の蛍光プローブ候補の発現用コンストラクトを複数作成し、培養細胞にこれを発現させる実験系を構築した。実際に細胞内にp38活性化を誘導する刺激を与えながら蛍光顕微鏡測定を行い、培養細胞レベルで十分にシグナルの検出感度が高いものを選別した。また、このプローブに変異を導入し、プローブの蛍光変化が細胞内のp38活性を反映することを確認した。次に、局在化配列を付けたプローブを(細胞膜、細胞質、核)細胞に発現させ、それぞれストレス刺激(高浸透圧、紫外線、サイトカイン、タンパク合成阻害剤)を行って細胞内の各場所でどのようにMAPK活性化を生じるのかを特定した。その結果、ほとんどの刺激で細胞質から強いシグナルが発生していることが明らかになった。トランスポゾン法でヒト由来培養細胞の細胞質に特異的に恒常的にこのプローブを発現する安定発現細胞株を得ることに成功したため、複数日にまたがる長時間の蛍光顕微測定をにも対応できるように、細胞を培養しながら細胞内FRETイメージングを行う自動顕微測定プログラムおよび測定装置を構築した。この実験系でストレスおよびサイトカイン刺激を行ったところ、弱い刺激ではサイトカインで生じるp38活性化は刺激後に一過的な上昇を見せた後活性が落ちてくるのに対して、多くのストレスの場合は活性が持続することが明らかになり、刺激の種類によって活性化の時間的な動態に違いがあることが示唆された。

本計画の中で、細胞に遺伝子発現を行う計画であったが、研究実施中にトランスポゾンを用いた新しい遺伝子組換えの技術が開発されて使用可能になったためこれを導入したところ、非常に簡便にかつ安価に細胞に遺伝子導入を行えるようになり、これまで困難であった蛍光プローブ安定発現株を得る事ができた。さらに、このプローブ安定発現株によって、予定していたよりも長時間の蛍光顕微鏡測定が可能になったために、実験装置の改善および測定用プログラムの改良にも力を入れる必要に迫られたが、その結果、一度に96サンプル程度を数日間にわたって非常にハイスループットに蛍光顕微鏡観察できる実験系を作成することができた。以上の経緯から当初の予定よりも桁違いに膨大なイメージングデータが得られる環境ができあがった。当初の計画ではここまでの規模の測定は想定していなかったものの、この新しい実験系でよりハイスループットな解析が可能になったことで、本研究の第一の目的のストレス刺激間の相違点が明確になってきたという点で、当初の計画以上の進展があったといえる。本計画の中で、細胞に遺伝子発現を行う計画であったが、研究実施中にトランスポゾンを用いた新しい遺伝子組換えの技術が開発されて使用可能になったためこれを導入したところ、非常に効率よくかつ安価に細胞に遺伝子導入を行えるようになったため、当初よりも細胞培養や分子生物学試薬にかかる費用を大幅に抑制する事が可能になった。この遺伝子組換え法により長時間の大量データ取得が可能になったために、翌年度は想定以上に長時間蛍光顕微鏡装置を作動させたり、大量のデータ解析を行う必要が生じてきた。長時間測定データ取得のための光学消耗品の追加や大量データを扱うための費用などの経費が追加で必要になると思われた。次年度経費は、プラスチック器具、分子生物学実験用試薬、細胞培養用試薬、光学機器用品として計画しているが、計画の方向性は全く変更がなく順調に実施できているので用途の変更はない。一方で、長時間のデータ取得に伴い、ランプなどの光学機器用品は当初よりも必要量がさらに増加する計画である。また、大量データを扱うためにコンピュータ機器とソフトウェアを追加で購入する必要がある。
ＪＡＫを阻害しない新規ＳＴＡＴ３阻害剤の作用機序解明と白血病幹細胞への効果の検討

STATは細胞の増殖、分化の制御に関わる転写因子で、その異常が癌の発症に深く関わっている。今回我々は新規STAT阻害剤OPB-31121がSTAT3及びSTAT5のリン酸化を阻害し、種々の造血器悪性腫瘍細胞株の増殖を抑制する事を示した。本剤はBCR-ABL、FLT3/ITD、JAK2 V617Fなどの癌遺伝子を持つ白血病に特に効果が高く、これらの白血病に対する効果がヒト化マウス白血病モデルでも示された。本年度は本薬剤作用機序の解明、本薬剤適合癌種の選択、及びマウスモデルでの薬効確認を行った。HepG2,H1650など細胞内で、JAK2、Srcなど上流キナーゼの種類に関わらず、そのリン酸化を阻害する事無くSTAT3のリン酸化が阻害されている事を確認した。本薬剤が有効な癌種を同定するため、35種類の血球系細胞株で本薬剤の薬効を調べ、本薬剤が多彩な造血器悪性腫瘍に対し効果があり、中でもBCR-ABL、FLT3変異、JAK2変異を持つ腫瘍細胞は高率に本薬剤感受性である事を発見した。これらの変異では、その変異によりSTATの活性化が起こり、それが腫瘍細胞の生存に重要である事が、これまでの研究により確立されている。更にプライマリーの腫瘍細胞への本薬剤の効果を見るために、こうした変異を持つ白血病の患者より採取した白血病細胞をNOD/SCID/IL2-Rgammac-/- (NOG)マウスに移植したマウス白血病モデルを作成し(Ph+ALL 3例、CML-BC T315I変異陽性1例、FLT3/ITD陽性AML 1例)、これに対しOPB-31121(200300mg)を投与し著明な腫瘍退縮効果(T/C: 458%)を確認した。この実験では腫瘍細胞の減少と同時にマウス正常造血細胞の回復を認めたため、本薬剤が正常造血細胞には増殖抑制が少ないことが予想された。そこでヒト正常臍帯血を移植したマウスを作成し、これに対する薬効を調べ、本薬剤がヒト正常造血細胞にはほとんど抑制効果がないことを確認した。平成24年度は35種類の血球系細胞株で本薬剤の薬効を調べ、本薬剤が多彩な造血器悪性腫瘍に対し効果があり、中でもBCR-ABL、FLT3変異、JAK2変異を持つ腫瘍細胞は高率に本薬剤感受性である事を発見した。これらの癌遺伝子は、STAT3/5の活性化を起こす事、それが腫瘍細胞の生存に重要である事が確立されている癌遺伝子であり、これらをSTATaddictive oncokinase (SAO)と名付けた。またヒト正常臍帯血を移植したマウスを作成し、これに対する薬効を調べ、本薬剤がヒト正常造血細胞にはほとんど抑制効果がないことを確認した。平成25年度は本薬剤が他のキナーゼ阻害剤に対する治療抵抗性を克服する可能性について検討した。AMLの治療薬として開発中のFLT3阻害剤では白血病細胞自身、あるいは周辺細胞からのFLT3リガンドの分泌によりFLT3阻害剤抵抗性のSTATシグナルの活性化が生じ治療抵抗性につながる事が知られている。我々はMOLM13細胞(FLT3/ITD陽性)がFLT3リガンドを添加する事でFLT3阻害剤(Sunitinib)に対し治療抵抗性を示すのに対して、OPB-31121はFLT3リガンドの添加に影響されず抗腫瘍効果を示す事を示した。更にこれらのデータをまとめて海外雑誌に論文として発表した(Blood Cancer Journal,2013;3:e166)。今年度はインビトロでのOPB-31121の作用機序の解明とインビボでの薬効確認を行った。試験管内で蛋白合成したSTAT3をリコンビナントなJAK2またはLynを酵素としてインビトロキナーゼ反応を行い、その反応に対するOPB-31121の阻害活性を検討した。OPB-31121はキナーゼ反応を阻害できなかったが、基質をOPB-31121に暴露させたHepG2細胞の蛋白溶解液から免疫沈降されたSTAT3に変更した所、これはリン酸化を受けなかった(コントロールのHepG2から得られたSTAT3はリン酸化される)。いずれの反応においてもOPB-31121はJAK2のリン酸化を阻害することは無かった。これはOPB-31121がSTAT3に作用する事を示すとともに、細胞内にOPB-31121のSTAT3への作用を媒介する因子が存在する事を示唆するデータであった。また、AML細胞株HEL92.1.7に対しOPB-31121を添加し、その細胞溶解液を用いてウエスタンブロットを行った。抗リン酸化JAK2抗体、抗リン酸化STAT3抗体等を用いJAK2のリン酸化を阻害する事無くSTAT3のリン酸化が阻害されている事を確認した。NOD/SCID/IL2-Rgammac-/- (NOG)

マウスに白血病患者より採取した白血病細胞を経静脈的に移植し、細胞株にはない白血病細胞のheterogenityとニッシェ依存性を維持した、より実際の白血病に近いマウス白血病モデルを作成した(Ph+ALL 3例、CML-BC T315I変異陽性1例、AML 1例)。これに対し経口的にOPB-31121(200300mg)を1028日間投与し著明な腫瘍退縮効果(T/C: 458%)を確認した。薬剤の投与中に腫瘍細胞の減少と共に正常造血の回復が認められ、正常造血細胞への増殖抑制が軽度であると予想された。本薬剤の作用機序に関しては最終的な作用点に関する疑問は残ったが、上流キナーゼではなくSTAT(あるいはその複合体)に対する作用であることを確認した。細胞株による検討で、本薬剤の適合癌種を同定し、プライマリー白血病細胞を免疫不全マウスに移植したモデルで、同定した癌種に対して本薬剤が有効であることを確認した。更に当初の計画になかったことであるが、本薬剤が正常造血には増殖抑制の少ない安全性の高い薬剤である可能性が示唆されたため、それをヒト正常臍帯血を免疫不全マウスに移植した系を用いて確認した。白血病幹細胞に対する効果の検討もほぼ終了しており(結果については現時点では記載しない)、本研究は論文化を開始する段階になっている。インビトロのリン酸化反応の構築は順調に進み、細胞内にOPB-31121のSTAT3への作用を媒介する因子が存在するという予想外の結果が得られた。これを解明する事で未知のSTAT経路活性化機序を発見する事につながる可能性があり、予想以上の成果が得られる可能性が出てきた。マウス白血病モデルの構築も順調で、予想以上のOPB-31121の薬効が確認できた。特に本薬剤が正常造血を抑制しない事を示唆するデータが得られ、効果だけでなく本薬剤の安全性を示唆するデータも得られた。白血病幹細胞に対する効果を、免疫不全マウスにプライマリー白血病細胞を移植する系を用いて確認する。これまでのデータをまとめて論文を作成し、海外雑誌に投稿し、本年度中の採択を目指す。細胞内でOPB-31121のSTAT3への作用を媒介する因子の検索を進め、OPB-31121によるSTAT3抑制の作用機序を明らかにしていく。正常造血への抑制作用がないことを更に確認するために、ヒト正常臍帯血を移植したモデルマウスを作製し、これに対してOPB-31121を投与する事で正常造血への影響を検討する。OPB-31121耐性細胞株を作製し、耐性化に関わる遺伝子変異、遺伝子発現変化を検討する事で、本薬剤の作用機序の解明につなげる。免疫不全マウス購入、白血病幹細胞ソーティングに必要な試薬購入、論文投稿、掲載にかかる費用、海外学会での成果発表費用、および論文投稿に際して要求される追加実験に必要な費用として使用する予定である。次年度へ繰り越す研究費は無い。上記に示した研究方針に従い、マウスの購入、ヒト臍帯血の購入、マウスの飼育、各種細胞培養などに関わる消耗品などの購入を行う。また成果発表と情報収集を兼ねて、日本血液学会、および米国血液学会に参加する。
DNA増幅と金ナノ粒子を利用した目視超高感度免疫分析法の開発

免疫分析はその特異性の高さから最も主要な検査方法である。検査の簡便化のためには高感度に目視検出できることが強く望まれている。無機材料である金ナノ粒子と生体分子であるDNAの複合体と酵素用いて、免疫分析を行う基盤技術を確立した。効果的な反応場である固相基板を作成すること、DNA修飾した抗体を作成すること、検出する金ナノ粒子が速やかにDNA増幅産物に結合するような条件を見つけることを目的に検討した。[研究項目1]DNA伸長・増幅産物の金ナノ粒子による検出法の開発申請者らは固相表面でのDNAの伸長・増幅法を確立しているが、今までは蛍光プローブDNAを用いて検出をしていた。そのプローブをDNA修飾金ナノ粒子に変更した。配列によりハイブリダイズの起こりやすさが異なっていることが予想された。そこで、配列をいくつか検討したところ、DNA修飾金ナノ粒子への結合が早い配列を見つけることができた。[研究項目2]PLAの金ナノ粒子による検出法の開発2-1DNA修飾抗体の作製:PLAに使用するDNA修飾抗体を作成した。抗体とDNAの結合は、抗体のアミノ基とチオール化DNAを結合することで達成した。ゲル電気泳動で抗体にDNAが修飾されていることが確認できた。[研究項目3]全行程の固相化固相化法としての確立を目指し、抗体の固定化法と非特異吸着を防止する方法について検討した。アビジンは非特異吸着が容易に起こることが示された。市販のブロッキング剤を使用することで、非特異吸着は減少した。RCAに適する基板の検討として、ガラス表面にDNAを結合した場合、ポリスチレンビーズに結合した場合、アガロースビーズに結合させた場合の3条件について、RCAを行い、生成物を蛍光プローブで標識し数を比較したところ、アガロースを用いた場合に最もRCA産物が生成した。基板の性質がDNAのハイブリダイズや酵素の結合を阻害することが予想された。本年度は、固相化Padlock RCAの定量分析を中心に行った。固相として、直径20 μmのポリスチレンビーズ、34 μmのアガロースビーズを用いて、ビーズに固相化したDNAを標的とするPadlock probeを用いてRCAを行った。1ビーズあたりのRCA産物数を比較したところ、アガロースビーズではポリスチレンビーズの10倍ものRCA産物が検出できたことから、今後はアガロースビーズを使用することとした。定量分析のモデル実験としてPadlock probeを01.5 nMの濃度にして、前述と同じビーズに固相化したDNAを標的配列にするRCAを行った。その結果、濃度に依存したRCA産物数が観察され、定量分析に用いることが可能なことが示唆された。次にサルモネラ菌の配列を持つオリゴヌクレオチドをサンプルにみたて、その濃度を1 nMに固定し、Padlock probeの濃度を1 nM10 μMにして最適な濃度を検討した。その結果、サンプルの100倍である100 nMのときに、最も良い値が得られた。次にPadlock probeの濃度を100 nMに固定して、サンプルDNAの濃度を01.5 nMにしてRCAを行ったところ、濃度に依存したRCA産物数が観察され、定量分析に用いることが可能なことが示された。このときの検量線の傾きは、ビーズに固相化したDNAを標的配列にするRCAのときと同じであった。検出限界は0.05 nMであり、菌から抽出したDNAを用いてRCAをするのには、さらに一桁低い値を検出する必要があった。そこで、ビーズ10個あたりのRCA産物数で検量線を作ったところ、10 pMから直線性を確認できた。24年度が最終年度であるため、記入しない。
導入遺伝子の長期発現増強法を用いた転移性癌の遺伝子治療法の開発

癌抗原関連遺伝子が同定されていない癌に対し、PEGや電気穿孔法を用いた癌細胞と樹状細胞の融合法が抗腫瘍免疫誘導に有効であること報告されている。しかし、不活性化HVJはそれよりも再現性高くまた高効率に(PEGの数十倍)融合させることが可能であった。融合細胞をマウス皮下に1週間隔で2度免疫し10日後に脾細胞を取り出し、癌細胞で刺激したときに分泌されるIL-12を測定した。樹状細胞と癌細胞の混合したもので免疫したものよりも高いサイトカイン分泌を得た。融合細胞だけをソーティングしてもしなくてもサイトカイン分泌は変わらなかった。この融合細胞により癌の抗原の多くが提示されると考えられるが、その後でNaive T細胞を成熟させて細胞傷害性T細胞として機能させるため、アジュバンド作用のある物質が必要である。そこでCpGオリゴヌクレオチドを用いることにした。CpGオリゴヌクレオチドを融合細胞と混合したところ、CD80,CD86,MHC-class IIの発現でみられる樹状細胞の成熟がさらに増強され、IL-12,TNF-alphaの分泌もCpGオリゴヌクレオチドを用いない場合の2倍以上であった。そこでX線照射したマウスメラノーマとマウス樹状細胞の融合細胞をCpGオリゴヌクレオチドと混合してマウスに2度投与し、10日後に脾細胞を取り出してメラノーマに対する細胞傷害性T細胞の活性を測定したところ、CpGオリゴヌクレオチドの併用により著しい活性の増強をみた。しかしこの細胞傷害性T細胞は同じ系統のマウス異なる腫瘍であるリンフォーマ細胞EL4には反応しなかった。免疫後に腫瘍を移植したところこの方法により癌生着の完全抑制、高いマウス生存率(80%)が得られた。マウス腎癌細胞RENCAを用いた場合も同様のワクチン効果が得られた。腫瘍ができなかったマウスに再度同じ腫瘍を移植しても完全に拒絶がおこった。癌遺伝子治療の効果が低いのは、癌組織に対する遺伝子導入効率・発現効率が低い事に起因している。今回の研究では、導入遺伝子の発現の長期化のために、Epstein-Barr virusのレプリコンベクターを用いることにより、癌組織における転写活性の維持に成功した。サザンブロットを用いてEBVレプリコンの効果の原因を調べてみると、EBVレプリコンの効果は遺伝子の維持ではなく、発現の遷延化をもたらすことが明らかになった。またトランスポゾンとトランスポゼースの併用により、マウス骨格筋における30日以上の遺伝子発現が可能であった。またヒストン脱アセチル化阻害剤であるFR901228をマウス悪性黒色腫の皮下腫瘍に導入すると外来遺伝子発現を10-50倍増強することが可能となった。マウス悪性黒色腫に対してHSV-TK遺伝子をマウス癌組織に注入し、ガンシクロビル投与による自殺遺伝子治療を行った。この際FR901228をHSV-tk遺伝子と併用すると悪性黒色腫のアポトーシスを優位(1%から4%)に増大させた。反復投与が可能なHVJ-cationic liposomeを用いて4-6回3日毎の投与を行うことでマウス悪性黒色腫の完全消退がおこり、併用群で生存率は約60%であり、完全緩解を得ることができた。さらに自殺遺伝子治療において悪性黒色腫を処置されたマウス個体では悪性黒色腫に対する宿主免疫すなわちgp100やTRP2に対する抗体価の大幅な上昇(6400-12800倍)とそれら抗原に対する遅延型過敏反応(DTH)の増強が認められた。これにより悪性黒色腫の腫瘍関連抗原に対する腫瘍免疫を著明に誘導し、マウス悪性黒色腫の再接種によっても、約50%のマウスが腫瘍を拒絶した。導入遺伝子発現の維持のために染色体ゲノム内への組み込み効率を上げる研究を行った。魚類のトランスポゾンとトランスポゼース(Sleeping Beauty)の共導入システムを利用しトランスポゾンの2つの配列の間にルシフェラーゼ遺伝子を挿入したプラスミド(SV40 promoter)とCMVプロモーターによってトランスポゼースを発現するプラスミドを作成し、HVJ-anionic liposomeによってマウス骨格筋に導入した。経時的にルシフェラーゼ活性を測定したところトランスポゼースのプラスミドを用いないと2-3週間でルシフェラーゼ発現が低下したが、トランスポゼースを用いると6ヶ月にわたって発現が低下せず1週間後のレベルが維持された。しかし6ヶ月の時点での挿入の確認がまだ得られていない。導入遺伝子発現の増強のために、ヒストン脱アセチル化酵素(HDAC)の阻害剤である抗癌剤FR901228を用い、この薬剤が癌自殺遺伝子治療の効果を増強できることを示すことができた。メカニズムの1つはアポトーシスの増強である。FR901228は血中での半減期が87分と不安定であるので安定に徐放化するためにポリ乳酸にFR901228を封入することにより腫瘍組織内で約3日間にわたって優位な導入遺伝子発現増強効果を得ることができた。遺伝子導入法については新たに開発したHVJ envelope (HVJ-E) vectorが癌組織への遺伝子導入においてもHVJ-liposomeと比較して同等以上の導入効率を有することが明らかになった。このベクターを静脈内注入すると脾臓へ遺伝子導入することができ、中でも抗原提示細胞の多いmarginal zoneに集中することがわかった。

HVJ-Eは初代培養細胞への導入効率は従来法のどれよりも高く、マウス骨髄由来の樹状細胞への遺伝子導入効率は99%であった。抗腫瘍免疫誘導による癌遺伝子治療法の開発については、我々が新たに開発したHYJ envelope(HVJ-E)vectorを用いて遺伝子導入を試みた。HVJ-Eベクターをマウス尾静脈より注入すると脾臓のmarginal zoneに遺伝子導入できることがわかった。蛍光オリゴヌクレオチドを封入したHVJ-Eを尾静脈に注入すると蛍光を取り込んだ細胞の約20%がCD11c陽性の樹状細胞であることがわかった。そこでメラノーマの腫瘍関連抗原遺伝子の1つであるTRP2を封入したHVJ-Eを静脈内投与するとマウスメラノーマに対するCTLが誘導され担癌マウスの生存率を有意に高めることができた。しかしHVJ-Eの静脈内投与により赤血球の溶血がおこり一過性に血液凝固能の低下が見られた。またHVJ-Eの融合活性の低下がおこり遺伝子発現が阻害された。一方、蛋白を封入したHVJ-Eをマウス皮内に投与することによりTh1優位に免疫系をシフトさせることに成功し、このとき赤血球の溶血も血液凝固能の低下もおこらなかった。そこでメラノーマの腫瘍関連抗原遺伝子であるTRP2をHVJ-Eに封入しマウス皮内に投与することによりメラノーマ特異的なCTLを誘導することに成功した。この方法でマウスを免疫後、メラノーマを皮内接種することにより腫瘍の増殖を有意に抑制することができた。しかし腫瘍を接種して腫瘤形成後にこの遺伝子ワクチンを注入しても腫瘍抑制効果が再現性よく得られなかった。そこでアジュバンドとしてIL12遺伝子を併用することによりメラノーマに対するCTLを増強することができ、メラノーマ接種後にワクチンを注射しても腫瘍の抑制効果が得られ、生存率の延長を起こすことができた。TRP2のペプチドをHVJ-Eに封入して同様の実験を行ったが、ペプチドによってもCTLを誘導でき効果的な抗腫瘍ワクチンとなりうることがわかった。癌抗原関連遺伝子が同定されていない癌に対し、PEGや電気穿孔法を用いた癌細胞と樹状細胞の融合法が抗腫瘍免疫誘導に有効であること報告されている。しかし、不活性化HVJはそれよりも再現性高くまた高効率に(PEGの数十倍)融合させることが可能であった。融合細胞をマウス皮下に1週間隔で2度免疫し10日後に脾細胞を取り出し、癌細胞で刺激したときに分泌されるIL-12を測定した。樹状細胞と癌細胞の混合したもので免疫したものよりも高いサイトカイン分泌を得た。融合細胞だけをソーティングしてもしなくてもサイトカイン分泌は変わらなかった。この融合細胞により癌の抗原の多くが提示されると考えられるが、その後でNaive T細胞を成熟させて細胞傷害性T細胞として機能させるため、アジュバンド作用のある物質が必要である。そこでCpGオリゴヌクレオチドを用いることにした。CpGオリゴヌクレオチドを融合細胞と混合したところ、CD80,CD86,MHC-class IIの発現でみられる樹状細胞の成熟がさらに増強され、IL-12,TNF-alphaの分泌もCpGオリゴヌクレオチドを用いない場合の2倍以上であった。
脱リン酸化酵素PP4c欠損による中枢神経変性のメカニズム解明

微小管は中心体を起点とした細胞骨格および細胞内物質輸送のレールとして機能し、神経細胞では特に発達している。近年、当研究室では中心体に局在するSer/Thr脱リン酸化酵素Protein Phosphatase 4 catalytic subunit (PP4c)が増殖細胞の分裂間期において微小管のダイナミクスを制御することを突き止めた。そこで中枢神経系の成熟ニューロンにおけるPP4cの機能解明のため、ニューロン特異的PP4c欠損マウスを作製したところ、海馬の選択的かつ進行性の萎縮が認められた。そこで本研究課題では、PP4cの基質を同定し、PP4c欠損による海馬萎縮のメカニズムを明らかにする。
EGFR変異肺癌のキナーゼ阻害剤耐性機序の解明とその克服に向けた新規治療への展開

EGFR遺伝子変異を有する肺癌はEGFRキナーゼ阻害剤(ゲフィチニブ、エルロチニブ)に高い感受性を有する。しかし、約1年以内の獲得耐性の出現はほぼ必発であり、その分子機序の理解や耐性の克服が課題である。そこで我々は、以前の解析[Suda K, et al. Clin. Cancer Res. 2010]で用いたEGFR変異・KRAS変異・MET遺伝子コピー数についてのデータがそろっている6名のEGFRキナーゼ阻害剤獲得耐性症例(33病変)および以前の解析で作成したin vitro獲得耐性細胞株モデル(HCC827ER, HCC827EPR, HCC4006ER)について、さらなる解析をおこなった。まず、獲得耐性に関わる可能性が指摘されたCRKL分子について遺伝子コピー数を解析した。その結果、獲得耐性症例および細胞株モデルの両者において、CRKL遺伝子コピー数の増加は認めず、獲得耐性におけるCRKLの関与は低い可能性が示された。一方、アポトーシス関連タンパクであるBIMの多型・遺伝子発現とEGFRキナーゼ阻害剤感受性との関連も近年報告され、注目を集めている。そこで我々は、多くの施設でも実施可能な免疫組織染色法によるBIMタンパク発現解析でもEGFRキナーゼ阻害剤感受性の予測が可能かを調べるため、上記とは別の30名のコホートを用いて検討をおこなった。その結果、BIM遺伝子多型を有する患者ではBIMタンパクの発現は低いものの、BIMタンパク発現とEGFRキナーゼ阻害剤の感受性には関連を認めなかった。不可逆的EGFRキナーゼ阻害剤に対する獲得耐性株の樹立も試みたが、高濃度の薬剤下でも生存可能な耐性株の樹立には至っていない。今後は、他のEGFRキナーゼ阻害剤を用いて獲得耐性株の樹立を試みるとともに、症例を増やして上記分子異常の獲得耐性における役割をさらに検討することを計画している。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。
C型肝炎ウィルス遺伝子発現によって生じる抗原提示樹状細胞の機能異常が発生する機序

我々はHCVトランスジェニックマウスを用いて骨髄より単離した未成熟なDCにHCV遺伝子を発現させ、HCV発現によるDCの機能低下を報告してきた。さらに、マウス骨髄より未成熟なDCを単離し、HCVを発現させ、DCの成熟に伴う影響について検討した。その結果、HCV発現によりDC表面のMHC class-I(とりわけH-2D)の発現が低下することを報告してきた。今回は、さらにその発現低下の機序を探るため、DCの成熟に伴うH-2Dの細胞内局在の変化を共焦点レーザー顕微鏡を用いて観察した。HCVが発現したDCでは、樹状細胞内のH-2D,lamp-2の局在に変化が見られ、DC内の蛋白輸送障害を引き起こしている可能性が考えられた。以上よりHCVがDCのMHC class-I蛋白発現を阻害し、抗原提示機能を障害している可能性が示唆された。
海洋中・深層における低次食物網構造の解明：細菌で結ぶマリンスノー食物網

(1)ゲル添加型セジメントトラップを作製・導入した。実体顕微鏡下で直接観察可能な採集カップ部を備えた筒部と、筒部を垂直に保つ支持部を持つ構造のゲル添加型セジメントトラップを作成し、試験を2航海に亘って行なった。問題点を改善した2回目の試験で運用可能であることが確認され、通常のセジメントトラップでは採集困難な脆弱な構造のマリンスノーの採集に成功した。(2)本研究で対象海域とする南大洋での試料採集を行なった。東京海洋大学練習船海鷹丸による2019年1月の南大洋航海において、水深50mから500mにかけて3層にゲル添加型セジメントトラップを設置した漂流系を24時間漂流させた。各層よりマリンスノーは計画通りに採集され、画像解析のため船上で速やかに捕集面の撮影を行なった。水深50mの表層では大型の糞粒が大きな割合を占めていたが、深度が深くなるにつれ、不定形の粒子の割合が増加していた。加えて同一測点で各種ネットによる動物プランクトンの採集を行なった。試料は分析のため凍結保存して持ち帰った。(3)セジメントトラップ試験時に採集した試料を用い、採集したマリンスノー各種およびデトリタス食性カイアシ類Scolecithrix danaeの消化管内容物のメタ16S,18S解析および顕微鏡観察を行なった。その結果Scolecithrix danaeの試料間で細菌叢は極めて類似していたが、マリンスノー中に組成の類似したものは無く、顕微鏡観察においても同様に該当する組成のマリンスノーは見られなかった。マリンスノーの解析数が少なかったためS.danaeの摂食するマリンスノーのタイプがカバーされていなかったことが考えられ、今後行う南大洋で採集した試料の分析ではセジメントトラップ1試料あたりの分析数を増やすことを検討している。(1)初年度に予定していた、ゲル添加型セジメントトラップの作製、試験、導入、およびゲル充填型セジメントトラップを用いた南大洋における試料採集を達成することが出来た。また、これまで採集が困難であった脆弱な構造のマリンスノーの採集に成功し、予備的な実験ではDNA抽出および次世代シーケンサーによる解析にも成功している。(2)予備的な分析ではデトリタス食性種の消化管内容物と同様の組成のマリンスノーは未だ検出できていない。平成30年度に南大洋航海で採集できた試料を用いて、分析作業を進める。現場で取得済みのゲル添加型セジメントトラップ捕集面の画像を解析し、形状に基づくタイプ分けと各タイプの占める割合を明らかにする。一方で、固定試料を用いて動物プランクトンのソーティングを行い、セジメントトラップを設置した各層における主要種を求め、分析の対象とする動物プランクトン種を決定する。その後、分析対象種の消化管内容物とマリンスノー各タイプについて、顕微鏡観察、メタ16S,18S解析を行い、細菌叢・真核生物相等の組成の比較を行い、動物プランクトン各種が摂食するマリンスノーのタイプを求め、本研究の目的であるマリンスノーと動物プランクトン間における食物網構造を明らかにする。特に、予備的な解析では特定の細菌が甲殻類遺骸で構成されるマリンスノーの摂食の指標にできる可能性が示されており、この点にも着目しつつ研究を進める予定である。

(2)予備的な分析ではデトリタス食性種の消化管内容物と同様の組成のマリンスノーは未だ検出できていない。平成30年度に南大洋航海で採集できた試料を用いて、分析作業を進める。現場で取得済みのゲル添加型セジメントトラップ捕集面の画像を解析し、形状に基づくタイプ分けと各タイプの占める割合を明らかにする。一方で、固定試料を用いて動物プランクトンのソーティングを行い、セジメントトラップを設置した各層における主要種を求め、分析の対象とする動物プランクトン種を決定する。その後、分析対象種の消化管内容物とマリンスノー各タイプについて、顕微鏡観察、メタ16S,18S解析を行い、細菌叢・真核生物相等の組成の比較を行い、動物プランクトン各種が摂食するマリンスノーのタイプを求め、本研究の目的であるマリンスノーと動物プランクトン間における食物網構造を明らかにする。特に、予備的な解析では特定の細菌が甲殻類遺骸で構成されるマリンスノーの摂食の指標にできる可能性が示されており、この点にも着目しつつ研究を進める予定である。ゲル添加型セジメントトラップの作製に予定より多くの費用がかかり、このために予備的分析を縮小したことで分析外注費が縮小したため。次年度ではメタ16S, 18S解析に使用する試薬類の購入に充当する予定である。