hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
房水流出機構の分子基盤の解明に基づく新しい眼圧下降治療の創出に関する研究

原発開放隅角緑内障(狭義)の病態は、眼圧上昇と特徴的な視神経症により構成されている。我々は、眼圧上昇の治療する目的として、眼圧上昇の病態に重要な生理的房水流出抵抗に関する研究をおこなった。まず、生理的房水流出抵抗を改善するROCK阻害薬の薬理作用を検証し、ROCK阻害薬が、隅角線維柱帯組織の細胞接着の増強、細胞骨格の弛緩、細胞外マトリックスの構究造変化をもたらすことをしめした。さらに、ROCK阻害薬の点眼薬の臨床試験をおこない、正常ヒト眼で良好な眼圧下降を示すことを報告し、また重篤な副作用もみられなかった。ウサギ眼を用いた実験では、ROCK阻害薬には、代表的な緑内障手術である濾過手術後の眼圧維持を促進する作用があることを示した。以上のように、我々は、新しい眼圧下降治療として、ROCK阻害薬を創出し、生理的房水流出路からの眼圧下降治療という新しい薬物治療概念を提唱することが出来た。一方、生理的房水流出路の障害によって生ずる続発緑内障の病態に関する研究をおこない、ステロイド緑内障の眼圧上昇の危険因子を国内多施設で解析し、眼科で現在広く用いられているトリアムシノロンの眼局所投与では、若年者、高いベースライン眼圧、硝子体内への注射、大量注射がリスクファクターであることを報告した。最後に、熊本県に集積する遺伝性疾患である家族性アミロイドーシスによる続発緑内障の手術治療で好発する合併症についてまとめ、報告した。従って、眼圧上昇の詳細な機序の解明は、原発開放隅角緑内障(狭義)の病態を理解する出発点であり、視機能を維持するために必要な生理的眼圧恒常性の機構解明につながる。我々は、眼圧上昇の機序に重要な生理的房水流出機構について、分子基盤を解明する研究をおこなった。サル眼からシユレム管内皮細胞を単離し、シユレム管内皮細胞の安定した培養細胞系を確立した。血管やリンパ管の内皮における細胞タイプマーカーであるLYVE-1(Lymph Vessel Endothelial HA receptor-1)、FLT4/VEGFR-3(Vascular endothelial Growth Factor Receptor-3)、CD54(ICAM-1)、CD31/PECAM、CD34などの免疫染色実験をおこない、その免疫染色性を認めた。今後、単離培養されたシュレム管内皮細胞のin vitroでの評価系を用いて分子レベルの眼圧上昇機序の解明を行う。また、房水流出路異常に基づく臨床研究として、トリアムシノロン誘発性眼圧上昇に関する危険因子について検討をおこなった。40mgのトリアムシノロンをテノン嚢下に注入すると、22.6%の症例で、24mmHg以上の眼圧上昇が生じ、特に若年者は眼圧上昇の危険因子になることを示した。現在、トリアムシノロン投与の至適条件を検証するために、さらに多施設での研究調査を進めている原発開放隅角緑内障(狭義)や続発緑内障における緑内障性視神経症の原因は、生理的房水流出路における房水流出抵抗の増大による眼圧上昇に起因している。本年度は、生理的房水流出路からの房水流出を改善させ、眼圧を下降させる新しい薬剤であるROCK阻害薬の動物実験およびヒトを対象とした臨床試験をおこなった。点眼薬として使用可能なROCK阻害薬Y-39983(SNJ-1656)は、室温で安定した性質を有しており、従来のROCK阻害薬では不可能であった点眼薬として保管可能な薬剤である。ウサギ眼とサル眼において、この点眼薬は、良好な眼圧下降作用をしめした。一方、ヒトの臨床試験では、第1相臨床試験として、健常男性のボランティアにROCK阻害薬SNJ-1656を点眼し、その眼圧下降作用と安全性を検討した。SNJ-1656は、良好な眼圧下降作用を示し、重篤な副作用がみられず、今後の第2相臨床試験をおこなううえで、有望な結果を得ることが出来た。

また、ウサギ眼を用いた濾過手術にROCK阻害薬を投与したところ、濾過胞の形成が促進され、手術後の眼圧下降の維持に役立つことがわかった。さらに、続発緑内障の研究として、ステロイド緑内障の研究をおこなった。最近、眼科治療で広く用いられている徐放性ステロイド薬であるトリアムシノロンを眼局所に投与すると眼圧上昇をきたしステロイド緑内障を発症することがある。その眼圧上昇の危険因子が、若年者、高いベースライン眼圧、硝子体内への注射、大量注射がリスクファクターであることを報告した。
歴史教育を通した国民国家像の形成－モンゴルにおける中学校歴史教科書を事例に－

本研究は、普通教育学校の歴史教科書分析および教育関係者への聞き取り調査の分析を軸に、現代モンゴルにおける歴史教育を通した国民国家像形成の変遷を読み解こうとするものである。民主化直前および民主化以降3度発行されたモンゴル史教科書の内容を比較分析し、現場教師の実践例をくわえモンゴル史教育のあゆみを分析した。これらを総合的に検討し実態を明らかにすることで、民主化を転機としてモンゴルがめざした自国史教育による国民国家像形成の本質を導き出すことができる。最終年度である本年度は、現地調査と研究成果の発表を中心に研究を進めた。国内で3度の発表をおこなった。8月にウランバートルでの国際シンポジウムで発表し、現地調査を実施した。この成果を「1990年代前半時期モンゴルにおける歴史教育実践ーO教師のライフヒストリーにみる教師観・歴史観の形成ー」としてまとめ、日本モンゴル青年フォーラム論文集『日本とモンゴルー過去から未来へ』に採録が決定した。9月には内モンゴル自治区のモンゴル人学校を視察した。自国史教育は中国の歴史となるが、副教材としてモンゴル民族の歴史と文化をつづった教科書が発行されており、これを収集することができ、歴史(民族史)教育の比較調査の手がかりを得た。3月のウランバートル調査では、民主化後初となる1998年発行のモンゴル史教科書の執筆者や編者の証言を得ることができ、政府文書の収集に成功した。民主主義国家としての「モンゴル国」像形成への関与が明らかである。現在、1980年代後半の「歴史の見直し」作業開始から民主化をへて1998年の教科書発行へといたる過程を精査しており、「1998年版モンゴル史教科書の成立過程」について論文の執筆を進めている。26年度が最終年度であるため、記入しない。本研究は、普通教育学校の歴史教科書分析および教育関係者への聞き取り分析を軸に、現代モンゴルにおける歴史教育を通した国民国家像の形成の変遷を読み解こうとするものである。本年度は、学校教育において不可欠の教科書に関する制度政策および実態の解明、1980年代から1990年代の民主化移行期における歴史教育政策の精査、歴史・社会科教師として民主化を経験した人物への聞き取り調査と分析に従事した。これまでの蓄積された調査データをもとに、7月5-7日に開催された日本比較教育学会第49回大会において「モンゴルにおける教科書制度に関する現状と課題ー教科書と子ども・教員をとりまく環境に焦点をあててー」として口頭発表し、現地調査において確認された点を照合し、論文「モンゴルにおける普通教育学校の教科書供給の現状と課題ーウランバートル市の実態調査からー」(『言語・地域文化研究』第20号、2014年1月)を発表した。8月から9月にかけて約4週間、12月に約3週間、3月に10日間の現地調査を実施した。1度目の調査は、普通教育学校の視察および教務主任への聞き取り、教科書の収集を行った。またモンゴル国立中央公文書館、モンゴル国立中央図書館、教育研究所において資料収集した。2度目の調査は、1980年代の歴史教育政策の解明のため、モンゴル国立中央公文書館において資料を収集した。また、ライフヒストリー研究として、社会主義時代に歴史・社会科教師となり民主化を経験したベテラン教師への聞き取り調査を行った。3度目の調査は、モンゴル人民革命党公文書館所蔵の資料を収集し、教師への聞き取りの継続調査を行った。これらの調査により、1990年の民主化直前直後における歴史教育政策と教育現場の実態の両面を具体的に分析することが可能になった。特に当事者の証言は、歴史教科書が発行されなかった1990年代前半の歴史教育の実態解明において重要なてがかりとなる。

26年度が最終年度であるため、記入しない。3度の現地調査を行うことができ、計画に即して一次資料の収集と調査対象者の証言を得ることができた。その過程で、次に調査すべき対象者等の絞り込みができた。現地の各機関の利用可能期間の変更等に左右され、予想以上に資料収集に時間を要することもあったが、研究自体はおおむね順調に進んだといえる。本年度は、先行研究の渉猟とともに、これまでに収集した資料、証言の分析作業を進め、論文にまとめ研究成果の発表を積極的に行う。具体的には、1986年以降、段階的に発表されたモンゴル人民革命党中央委員会、政府による決議がその後の歴史教育政策、特に歴史教科書の記述内容におよぼした影響について言及したい。また、昨年度に引き続き現地調査を重視した研究を進めていく。現地調査では、一次資料の発掘と教師のライフヒストリー研究を継続して行う。あらたな聞き取り調査の対象として歴史教科書執筆者を予定しており、当時の歴史教科書作成に関する貴重な証言が得られると期待される。
生体エネルギー変換系活性中心の人工的構築による反応機序解明

チトクロームP-450_<CAM>の活性中おける酸素分子活性化機構の解明のために"Single-"および"Twin-coronet"ポルフィリン鉄(II)錯体における酸素分子配位ポケット内に水酸基を有する酵素活性モデル分子を合成しその酸素配位特性、O_2/CO配位選択性、O_2,CO配位・解離速度の解析をモデル錯体を用いて行うことを目的として不斉2,2'-ビ(ヒドロキシナフタレン)基を結合したポルフィリン["single-coronet"ポルフィリン]を新たに合成した。これはナフトール水酸基をポルフリン上のキャビティー内に持ち、分子力場計算によりヘムに配位した酸素原子に水素結合可能な水酸基を持つことを特徴とする。この鉄(II)錯体に対する一酸化炭素配位能は通常のミオグロビンモデル錯体と同等であり可逆的な付加/脱離を行う。一方、酸素付加体を一旦形成すると、窒素ガス吹き込み等で酸素の脱離を起こすことは出来ず、非可逆的に酸素錯体形成を行うことが明らかになった。酸素雰囲気下において容易に一酸化炭素付加体は酸素付加体へと変換され「一酸化炭素中毒を起こさないヘム」が合成された。チトクロームcオキシダーゼにおける酸素活性化機構の解明のために、活性部位Cu_B-hemea_3のモデル錯体としてこの二種の金属イオン間距離を調節した二核錯体を合成した。特に、酵素と類似の構造を持つ還元型錯体[Cu^I(NCMe);Fe^<II>]においては酸素分子と室温で安定な錯体を形成し、各種スペクトルによりペルオキシ型錯体と同定された。電気化学的な水の4電子酸化触媒として有効である、マンガンイオン間距離の短いマンガンポルフィリン二量体を窒素塩基共存下で過酸酸化することにより、酸化活性種と推定されている、2つのポルフィリン面により形成される空隙内に選択的にMn^VあるいはMn^<IV>オキソ錯体の形成に成功した。
高速ビデオ画像解析による水面波の破綻的変形の研究

鉛直2次元断面内の流速分布の把握に向けて,高速カラービデオ画像の平面相関解析技術を整備し,これを応用して砕波および越波といった急激かつ非可逆的な流体運動の内部機構を調べた.可視化におけるトレーサとしては,ポリスチレンビーズを用いた.ビーズの色,混入量,撮影におけるシャッター速度,照明の量と方向,画像解析におけるフィルター処理の方法,同定のためのテンプレートの大きさ,相関検定範囲等,多くの要因について試行錯誤を行い,現時点のハードウェア配置の下で最適な画像取得および解析の条件を追求した.得られた画素情報を統計的に分析すると,色相の変化は予期したほどではなく,可視化技術には改良の余地がありそうである.ここでは,カラー化により増大した情報量を活かして,3色それぞれの平面相関とそれらの総和から総合的に連続する画像間で流体要素の同定を行い,流速検出の信頼度を高める工夫をした.こうして描かれた速度ベクトル場の精度と信頼性は,連続式の残差を評価することによって確認した.実験水槽内に斜面を設置し,孤立波を砕波させて内部流速分布を調べた.これから圧力場および渦度の分布を算定し,波頂近傍に圧力勾配の著しく低下する領域を検出した.これは,Lagrange表記に基づく数値解析によっても追認され,砕未現象の本質に関わるものと思われる.波頂背後の水面下方に強い渦度が観察されたことも1つの収穫である.越波の内部機構に関しては,堤体隅角部近傍で天端より上の高流速域からこれに隣接する堤体前面の低流速域にかけて強い渦度が検出され,剪断流が形成される様子が観察された.越流流域は当然のことながら波頂付近で大きくなり,一般に水表面より少し下層で最大流速が生じる.これらは,数値解析における境界条件の設定等,今後の研究に向けて有用な知見を与えるものである.鉛直2次元断面内の流速分布の把握に向けて,高速カラービデオ画像の平面相関解析技術を整備し,これを応用して砕波および越波といった急激かつ非可逆的な流体運動の内部機構を調べた.可視化におけるトレーサとしては,ポリスチレンビーズを用いた.ビーズの色,混入量,撮影におけるシャッター速度,照明の量と方向,画像解析におけるフィルター処理の方法,同定のためのテンプレートの大きさ,相関検定範囲等,多くの要因について試行錯誤を行い,現時点のハードウェア配置の下で最適な画像取得および解析の条件を追求した.得られた画素情報を統計的に分析すると,色相の変化は予期したほどではなく,可視化技術には改良の余地がありそうである.ここでは,カラー化により増大した情報量を活かして,3色それぞれの平面相関とそれらの総和から総合的に連続する画像間で流体要素の同定を行い,流速検出の信頼度を高める工夫をした.こうして描かれた速度ベクトル場の精度と信頼性は,連続式の残差を評価することによって確認した.実験水槽内に斜面を設置し,孤立波を砕波させて内部流速分布を調べた.これから圧力場および渦度の分布を算定し,波頂近傍に圧力勾配の著しく低下する領域を検出した.これは,Lagrange表記に基づく数値解析によっても追認され,砕未現象の本質に関わるものと思われる.波頂背後の水面下方に強い渦度が観察されたことも1つの収穫である.越波の内部機構に関しては,堤体隅角部近傍で天端より上の高流速域からこれに隣接する堤体前面の低流速域にかけて強い渦度が検出され,剪断流が形成される様子が観察された.越流流域は当然のことながら波頂付近で大きくなり,一般に水表面より少し下層で最大流速が生じる.これらは,数値解析における境界条件の設定等,今後の研究に向けて有用な知見を与えるものである.高速カラービデオ画像の平面相関解析により,斜面上の砕波や堤防天端の越波の内部流速分布を調べるのが本研究の目的である.この目的を達成するために,当初計画に沿ってビデオカメラを購入し,(1)実験水槽内で直立壁による波の遡上現象を発生させる,(2)ポリスチレンビーズを用いて内部の水粒子運動を可視化する,(3)適切な照明の下にビデオ撮影を行う,(4)画像データ解析のためのソフトウェアを整備する,といった一連の作業を順調に進めた.試行錯誤により最も精度および信頼性の高い解析法を追究するという中心課題に関しては,カメラの不調のために作業が遅れ気味である.現時点の解析成果は,モノクロ画像に基づくこれまでの成果とほぼ同等の水準にある.奇数列ピクセルおよび青色の階調検出が不十分というカメラの問題点は,工場での再調整により解消されよう.カラー化による信頼性と分解能の向上のためには,さらに下記の技術改良が必要である.1.カラー化の利点を活かす上で,可能な限り3原色に近い色調のビーズが望ましい.色見本を用いてカメラのプリズムの特性を把握し,より適切な可視化材料を入手する必要がある.ビーズの最適密度については,経験的に検討して行く.2.現在,強い照明灯1基と弱い照明灯3基を用いているが,可視化領域に影の部分を生じさせないためには,少なくとも強い照明灯を1基増強する必要がある.3. 2つのフレーム画像の相関を表現するパラメータとして,通常の相関係数を用いると,各ピクセルのデータに重みがかかってしまう.対応する階調値の差の絶対和もしくは自乗和等のパラメータを用いることも検討に値する.

4.他分野の画像解析において,3色の階調値のレベルでデータを1元化することが提案されているが,色毎に同定を行うか,少なくとも相関値のレベルで和を作ることにしなければカラー化の意義が半減する.鉛直2次元断面内の流速分布の把握に向けて高速カラービデオ画像の平面相関解析技術を整備し,急激かつ非可逆的な流体運動のメカニズムを調べることが本研究の目的である.本年度前半にハードウェアの再調整を行ない,可視化・照明等の技術も向上した結果,画像の質は大幅に改良された.得られた流速場の精度および信頼性は,連続式の満足度から確認された.3年計画の最終年度を控え,現時点で暫定的に到達している結論を列記すると,次の通りである.(1)解析に適したカラー画像を得るには,多色のビーズの投入による可視化が望ましく,併せてかなり強度の照明が必要である.(2)3色のデータを有効に活かすには,各色個別の相関値を総合するより,ピクセル毎のデータの段階で3色直列に結合して部分画像のデータセットとし,全体同志の相関値を判定基準として用いる方が信頼性が高くなる.(3)階調データ段階でのフィルター操作は,精度と信頼性の両面で一長一短の効果があるが,実用上は行なわざるを得ない.(4)圧力勾配の著しく低下する領域が波頂付近に現れる.これは,Lagrange表記に基づく数値解析によっても追認され,砕波現象の本質に関与するものと推定される.(5)異なる入射波および地形条件下での砕波現象を比較すると,上記領域の分布に差があり,これが砕波形態の差異に結びつく可能性が高い.(6)得られた流速場から渦度の分布を算定したところ,波頂背後の水面下に大きな渦度が検出された.現時点ではこの結果に確信が持てず,公表を躊躇したが,昨年末の関連学会で長尾らにより類似の試算図が提示された.この点については,次年度も引き続き検討して行きたい.2次元水路内に直方体の堤体模型(厚さ12cm,幅10cm,高さ15cm)を設置し,孤立波を発生させてその越波の状況を上記VTR装置により撮影した.鉛直断面内の流れを可視化するため,トレーサとして橙,緑,青,白の4色のポリスチレンビーズ(直径0.451.88mm)を用いた.さまざまなな試行錯誤の結果,最適な画像取得および解析の条件として,1)多色のトレーサを混合して用いる,2)シャッタースピードは1/500sとする,3)近傍3×3画素単位の加重平均フィルター処理を行う,4)テンプレートの大きさは13×13画素とする,5)パターンマッチングにおける検索範囲は原位置から10画素以内とする,等の結論が得られた.得られた画像の画素ごとの情報を統計的に分析したところ,色相の変化は予期したほどではなく,トレーサや照明といった可視化技術には改良の余地がありそうである.ここでは,モノクロ画像に比して増大した情報量を活かして,3色それぞれの平面相関とそれらの総和から総合的に連続する画像間で流体要素の同定を行い,速度ベクトル検出の信頼度を高める工夫をした.こうして描かれた速度ベクトル場の精度と信頼性は,連続式の残差を評価することによって確認し,併せて渦度の分布をも算定した.越波の内部機構に関しては,堤体隅角部近傍で天端より上の高流速域からこれに隣接する堤体前面の低流速域にかけて剪断流が形成される様子が観測された.そこでは強い渦度が生じ,流速ベクトルの検出が困難となる.また堤体天端上の越流断面内流速が平面分布の形で得られた.
マウス片側後肢血流遮断直後の中枢神経系の活動増強とNOの関連性の解明

末梢の虚血による伝導遮断によって脊髄で一酸化窒素(NO)が産生され、神経活動増強に寄与することをこれまでフラビン蛋白蛍光イメージング法と蛍光色素を用いたin vivoイメージングで視覚的に評価してきた。平成30年度は神経細胞でNOを産生時に活性化する神経型一酸化窒素合成酵素(nNOS)と神経障害性疼痛との関連性が認められているII型代謝型グルタミン酸受容体(GroupIImGluR)との関連性について検証した。nNOSの抗体およびgroupIImGluRを構成するmGluR2/mGluR3の抗体を用いて行った二重蛍光免疫染色では、双方の細胞が末梢組織からの刺激を入力する脊髄後角に存在することが分かった。さらに、同一細胞における両者の関連性を調べるため、in situ hybridizationを行ったところ、nNOSの半数近くにmGLUR2のmRNAが存在することが分かり、mGluR3についても、1割程度の関連性が認められた。さらに、groupIImGluRのアゴニストを投与したマウスでは、末梢を虚血にしてもnNOSの光量増強を認めなかった。以上の結果から、末梢の伝導遮断は早期より脊髄におけるnNOSを活性化し、NO産生を誘発すること、持続的に産生されたNOが両側性に拡散することで神経活動を増強し、GroupIImGluRの機能を抑制することが示唆された。また、GroupIImGluRの失活は神経障害性疼痛を誘発することが分かっており、神経障害性疼痛形成において、この超早期のNO産生が足掛かりになる可能性のあることが示唆された。以上の結果について、平成30年度に得られた結果と併せて論文をJournal of Physiologyに投稿し、受理された。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。マウス片側後肢血流遮断直後より生じる両側中枢神経系の応答増強に一酸化窒素(NO)の関与が強く示唆される現象について、脊髄レベルに存在する神経型一酸化窒素合成酵素(nNOS)の関与を調べるため、nNOSノックアウトマウスとwild typeマウスの両群間で体性感覚野および脊髄のフラビン蛋白蛍光応答を調べた結果、nNOSノックアウトマウス群では、血流遮断時の応答増強が有意に抑制された。また、脊髄レベルで産生されるNOを視覚化するため、NOの蛍光標識物質であるジアミノフルオレセイン-FM(DAF-FM)を脊髄を被覆する形式で投与したところ、片側後肢を虚血状態としたマウスにおいて蛍光応答の増強を認めたが、Sham群のマウスでは蛍光しなかった。また、虚血状態としたマウスでは、いかなる時間帯でも虚血側の蛍光応答が非虚血側と比較して有意に増強して認められた。以上より、片側後肢の血流遮断後の両側蛍光応答増強には脊髄レベルに存在するnNOSが関与していること、またNOの高い拡散性など何らかの機序で両側性に神経活動を増強させていることが強く示唆された。これまでの実験結果をまとめ、2017年11月にWashington D.C.で開催されたSociety for Neuroscienceにおいてその成果を発表した。また現在は、nNOSと血流遮断中の神経応答増強に関与があると過去に報告されたII型代謝型グルタミン酸受容体(GroupIImGluR)との組織学的関与を調べるため、蛍光免疫染色の抗体を選別し、実験に取り掛かっている。平成29年度に計画した実験内容については概ね想定内の結果を得られたこと、また平成30年度に実験予定であった内容について一部着想、実験に取り掛かれていることから、おおむね順調に進展していると考える。現在実験中の組織学的検索の成果を上半期中に取りまとめられそうである。

その進捗と並行して論文の作成に取り掛かり、なるべく早期に成果を発表したいと考えている。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
口腔乾燥症に用いる生薬配合口腔内潤滑補助剤の開発

本研究では口腔乾燥症治療効果がある生薬に注目し、これらの生薬エキスを試作口腔内潤滑補助剤に配合することにより、口腔乾燥症治療効果を持つ義歯床のぬれが改善できる試作口腔内潤滑補助剤の開発を目的とした。本研究では、口腔乾燥症の治療効果がある生薬から抽出したエキスを使用し、これらの成分の生体に与える毒性の質的および量的解明および唾液分泌量に及ぼす影響、セリシンを含む化学組成成分が試作口腔内潤滑補助剤の理工学的性質に及ぼす影響について検討を行った。実験項目は生薬エキスがラット耳下腺管腔膜のAQP5の分布および量に及ぼす影響、組成成分が試作材料の粘度、粘着強さに及ぼす影響などについて測定を行った。その結果、口腔内潤滑補助剤の組成成分を適切に組み合わせることにより、耐久性が改善でき、さらに口腔乾燥症に有効である生薬成分の配合も可能で、口腔乾燥症に用いる生薬成分配合口腔内潤滑補助剤の開発が可能であることが示唆された。本研究は古くから民間療法で使用していた生薬およびシルクの成分の一つセリシンに注目し、これらの成分を含有する口腔内潤滑補助剤の開発を目的とした。本年度は口腔乾燥症の治療効果がある生薬から抽出したエキスを使用し、これらの成分の生体に与える毒性の質的および量的解明および唾液分泌量に及ぼす影響の検討、セリシンを含む化学組成および構造因子が試作口腔内潤滑補助剤の理工学的性質に及ぼす影響について検討を行う目的で以下のとおり実施した。1.カルボキシメチルセルロース、ヒアルロン酸、ポリグリセリルメタクリレート、セリシン、ワセリン、流動パラフィンなどを使用し、試作口腔内潤滑補助剤の粘度、操作性、粘着力および成分溶出に関する検討をRheometer、高速液体クロマトグラフHPLCLC-21などを用い行い、適切な成分組み合わせの特定ができた。2.試作口腔内潤滑補助剤の保湿度および義歯床のぬれに及ぼす影響について検討を行い、保湿成分の適切な配合比を特定できた。3.6種類の生薬から抽出したエキスを使用し、ネズミおよび老齢ラットを用い、これらの成分の一般毒性、唾液分泌量に及ぼす影響について検討を行い、適切な成分の特定ができた。このようなデータの結果を踏まえ、来年度は生薬成分の配合と試作口腔内潤滑補助剤の理工学的性質との関係を解明するため、材料の粘度および耐久性試験、保湿性試験、成分溶出試験、溶出成分の毒性試験などについてさらに検討を進めて行きたい。前年度は口腔乾燥症の治療効果がある生薬から抽出したエキスを使用し、これらの成分の生体に与える毒性の質的および量的解明および唾液分泌量に及ぼす影響の検討、セリシンを含む化学組成および構造因子が試作口腔内潤滑補助剤の理工学的性質に及ぼす影響について検討を行う目的で実験を行い、適切な成分組み合わせ、保湿成分の適切な配合比および生薬の適切な成分の特定ができた。今年度は生薬成分の配合と試作口腔内潤滑補助剤の理工学的性質との関係を解明するため、以下のとおり実施した。1.生薬成分配合試作口腔内潤滑補助剤を作製し、初期粘度およびその耐久性の検討を行い、適切な成分の組み合わせが特定できた。2.生薬成分配合試作口腔内潤滑補助剤の保湿度および義歯床のぬれに及ぼす影響について検討を行い、適切な成分の組み合わせが特定できた。3.生薬成分配合試作口腔内潤滑補助剤の生薬成分の溶出実験を行い、適切な成分組み合わせにより、生薬成分の徐放性が可能な材料試作が可能であることを確認した。このようなデータの結果を踏まえ、来年度は生薬成分配合試作口腔内潤滑補助剤からの溶出した生薬成分が人歯肉線維芽細胞に及ぼす毒性試験、ラット耳下腺管腔膜のAQP5の量に及ぼす影響に関する実験などについてさらに検討を進めて行きたい。前年度は生薬成分の配合と試作口腔内潤滑補助剤の理工学的性質との関係を解明する目的で実験を行い、初期粘度および耐久性、保湿度および義歯床のぬれに及ぼす影響などの観点から適切な成分の選定ができた。本年度は生薬成分が異なる3種類の試作口腔内

潤滑補助剤の臨床効果を検討するため、以下の通り実施した。1.生薬配合試作口腔内潤滑補助剤を塗布した義歯装着者の咬合力、咀嚼能率および義歯の口腔内維持力の測定を行い、適切な生薬成分の含有量が特定できた。2.試作口腔内潤滑補助剤の粘度および耐久性、操作性をRheometerを用いて分析を行った。3.試作口腔内潤滑補助剤の溶出性を高速液体クロマトグラフHPLCを用い分析を行った。4.試作口腔内潤滑補助剤からの溶出成分が老齢ラット耳下腺管腔膜でのAQP5の量および分布に及ぼす影響について分析を行った。5.試作口腔内潤滑補助剤の保湿性、義歯の維持力、におい、味などの項目において、Visual analogue scalesによる使用者満足度の分析を行った。6.試作口腔内潤滑補助剤のJIS規格試験を行った。以上の結果から、生薬成分配合口腔内潤滑補助剤の適切な成分および含有量の特定ができた。
拡張型心筋症における心筋ミオシン反応性T細胞クローンの同定

本研究ではヒト拡張型心筋症における自己免疫機序の関与を検討するために、最終的に心筋ミオシン特異的T細胞クローンの同定を試みることを計画した。計画実施の前段階として継続検索を行っていたラット自己免疫性心筋炎モデルからのT細胞株樹立の手法確立についてであるが、従来諸家の報告していた通り原因は不明であるがwhole myosinの抗原形では培養での増殖を図れないと最終的に結論付けた。そこで、これまでに報告のある心筋ミオシン内心筋炎惹起ペプチドに注目しこれを人工的に作成することにより、ペプチド特異的T細胞株の樹立を目指すこととした。その結果心筋炎惹起能を有するCM2(1539-1555)特異的CD4陽性T細胞株(サイトカイン産生でIFN-γ産生能を有しTh1タイプと判定)の樹立に成功した。さらにはbulk culture細胞株を段階希釈法を用いて細胞株をクローン化することが可能であることも判明した。このようなT細胞株樹立の様々な方法論を確立したことを踏まえ、現在ヒト拡張型心筋症の末梢血検体を用いエピトープ人工ペプチドや心筋ミオシン切断混合物を用いたT細胞株樹立の可能性について検討を進めている。さらには、同一患者の心筋生検標本での浸潤T細胞のcharacterizationを進めている。これらの検索を進めることで、ミオシン関連T細胞が拡張型心筋症発症の病態形成に関与している事実を比較証明できると考えられ、現在両検索を進めている。本研究ではヒト拡張型心筋症における自己免疫機序の関与を検討するために、最終的に心筋ミオシン特異的T細胞クローンの同定を試みる。計画実施の前段階として、自己免疫機序解明の目的で作成された自己免疫性心筋炎モデルからのT細胞株樹立の手法の確立を目指した。心筋ミオシン免疫により心筋炎が惹起されたルイスラットからリンパ節および末梢血を採取し、抗原(ミオシンおよび心筋炎惹起ペプチド)と抗原提示細胞、さらにIL2添加により培養を繰り返した。リンパ節細胞から特異性判別試験によりミオシン特異的と判断されたT細胞株が得られ、細胞表面抗原ではCD4陽性でIFNγ分泌能を有しTh1細胞であることが確認された。しかし、このT細胞株の受動移入実験では心筋炎は惹起できなかった。現段階では2種類のT細胞株が得られたにすぎず結論付けることはできないが、ミオシン特異的T細胞クローンの心筋組織内移行には何らかの活性化要素が必要である可能性やクローン種による心筋炎惹起能が異なることなどが想定され、現在検討を続けている。一方、ヒト拡張型心筋症では末梢血を材料としてT細胞クローン確立を目指さねばならないが、ラット末梢血からのT細胞株樹立に成功していない。したがって、末梢血を材料として用いる場合通常の手法をさらに発展させる必要があると考えられた。手技手法の確立の後、ヒト検体を用いての計画実施を企画する。
薬物の臓器特異的移行機構の解明とその薬効・動態制御への応用

臓器・細胞・分子・遺伝子レベルで薬物動態・薬効の臓器普遍性または臓器特異性を明らかにし、これを合理的に制御する方法を開発することを目的とし、本研究班構成員14名の2年間の研究により、次に示す成果を得た。1.薬物の口腔・消化管からの吸収・分泌、肝・腎排泄、脳などの臓器分布・排出に関与するトランスポータ(TP)群の存在の示唆及びそれらの化学構造認識・輸送特性の解明、PepT1, PepT2, MCT1, cMOAT, OATK1, OCT2などのTP群のクローニングとその機能解析、及びこれらのTP群の組織分布性を明らかとした。また、P-糖蛋白質が脂溶性薬物の小腸からの吸収や脳移行を制限するバリアー機能を演じていることを明らかとし、吸着介在エンドサイトーシスによってペプチドを脳に送達する道を開いた。2.グリコシド化、粘膜接着性、パイエル板のエンドサイトーシス活性、イオントフォレ-シスの利用あるいは細胞間隙拡大物質による低・高分子薬物の吸収促進機能を解明した。3.分画へパリンのスカベンジャーレセプター及び血漿蛋白質が介在する肝移行制御、ガラクトース修飾蛋白質の肝特異的分布性の調節、活性酸素やNOラジカルが病態制御因子として重要な役割を演じることをつきとめ、部位指向性SODを標的病態臓器に集積させることに成功した。また、腫瘍臓器血管内皮細胞に対するモノクロナール抗体を利用した斬新な癌ミサイル療法の道を開いた。4.α_1受容体をモデル系として、ヒト薬物受容体のクローニングとその細胞内情報伝達機構を解析した。また、脳内および抹消組織には、それぞれN^3-フェナシルウリジンおよびウリジンと強い親和性を有するレセプターの存在を示唆する新規な結果を得た。ペンタゾシンをラットに投与後の血漿中・脳内濃度と鎮痛効果の時間推移を薬物動態学的に解析し、神経活動の制御機構を解明する方法を開発した。以上の成果により、本総合研究は初期の目的をほぼ達成することができた。本研究においては薬物動態と薬効・毒性発現に影響するトランスポーター、レセプター、組織・細胞特異的糖鎖・蛋白質など諸因子について解析し、合理的な薬物動態及び薬効制御法の開発を試みている。本年度は薬物の消化管・口腔粘膜からの吸収、肝・腎排泄、脳などへの組織分布に関与する数種のトランスポーターの存在の示唆及びそれらの機能特性の解明、PepT1、PepT2、MCT1などのトランスポーターをコードする遺伝子のクローニングとその機能解析、及びこれらトランスポーターの組織分布特性を明らかにした。また、パイエル板のエンドサイトーシス活性や、高分子化合物の細胞表面糖鎖との相互作用による消化管上皮細胞間経路拡大作用を利用した薬物の消化管吸収性促進についても示すことが出来た。また、組織分布性制御法として、ガラクトース修飾した蛋白質の肝特異的分布性の調節、SODの様々な誘導体化による脳、心臓など種々組織集積性の増大、分画へパリンの肝実質、及びクッパー細胞への移行におけるスカベンジャーレセプター関与のエンドサイトーシス機構の寄与などの示唆、及び腫瘍標的化研究に必要な腫瘍血管様特性を有する培養細胞の確立を行った。さらに、薬効・毒性発現に直接関連するα1-アドレナリンレセプターB型サブタイプに対する抗体の作製と抹消組織におけるウリジンセレプターの探索を行うとともに、中枢性鎮痛薬の血漿中・脳内濃度と鎮痛効果の時間推移を測定し、その関係について解析した。今後はこれらの薬物動態・薬効に関する個々の情報を統合できる生理学的薬物速度論を確立し、個体レベルでの薬物の動態・効果の合理的制御システムの確立を試みる。ペンタゾシンをラットに投与後の血漿中・脳内濃度と鎮痛効果の時間推移を薬物

動態学的に解析し、神経活動の制御機構を解明する方法を開発した。以上の成果により、本総合研究は初期の目的をほぼ達成することができた。本研究においては、薬物動態と薬効・毒性発現に影響するトランスポータ、レセプター、臓器・細胞特異的な糖質・蛋白質など諸因子について総合的に解析し、合理的な薬物動態及び薬効制御法の開発を目指した。本年度では、次に示す結果を得た。1.薬物の消化管からの吸収・分泌、肝・腎排泄、脳などの臓器分布・排出に関与するトランスポータ(TP)群の存在の示唆及びそれらの化学構造認識・輸送特性の解明、_cMOAT,OAT-K1,OCT2などのTP群のクローニングとその機能解析、及びこれらのTP群の組織分布性を明らかとした。また、吸着介在エンドサイトーシスによってペプチドを脳に送達する道を開いた(辻、杉山、乾、玉井)。口腟における薬物動態に関し、ヒト口腟粘膜還流セルを用いて受動輸送と特殊輸送において部位間差があることを明らかにした(木村)。2.グリコシド化、粘膜接着性、イオントフォレ-シスの利用あるいは細胞間隙拡大物質による低・高分子薬物の消化管吸収促進機構を解明した(粟津、林)。3.分画ヘパリンの血漿蛋白質が介在する肝移行制御(渡辺)、糖鎖認識機構に基づいたレセプター介在性エンドサイトーシスを利用した肝細胞内選択的送達法を確立した(橋田)。虚血性心脳血管障害などの各種疾患に活性酸素やNOラジカルが病態制御因子として重要な役割を演じていることをつきとめた(井上)。また、腫瘍臓器血管内皮細胞に対するモノクロナール抗体を利用した斬新な癌ミサイル療法の道を開いた(真弓)。4.ヒト_<α1>受容体のクローニングとその細胞内情報伝達機構を解析した(辻本)。また、脳内および抹消組織には、それぞれN^3フェナシルウリジンおよびウリジンと強い親和性を有するレセプターの存在を示唆する新規な結果を得た(山本)。中枢性鎮痛薬の血漿中・脳内濃度と鎮痛効果の時間推移を薬物動態学的に解析し、神経活動の制御機構を解明する方法を開発した(花野)。
病児対応型保育施設の偏在に関連する人口学的、医学的、財政学的要因の特定

乳幼児はかぜなどの急性疾患にかかりやすいものの、一般の保育所のほとんどは37.5度以上の熱のある子どもの登園を認めていない。このため、国・都道府県・市町村の補助により、軽症の急性疾患罹患児の保育を行う病児対応型保育施設が医療機関などに併設されるようになってきた。しかし、全国的な偏在が認められる。本研究では、全国的な病児対応型保育施設の偏在に関連の深い要因を明らかにすることを目的とし、そのために、病児対応型保育施設の有無、保育定員や年間利用者数を、さまざまな要因によって表す独自の数式モデルを構築し、影響の大きい要因を特定する(多変量解析)。
前立腺癌の発症・進展に関与するメチル化によって制御される遺伝子の検索

申請計画に基づき、前立腺癌組織のみにメチル化を伴ったDNA断片を同定するため、臨床検体として得られた前立腺癌組織と良性前立腺組織を用いてMCA/RDA法を施行したが、目的とされるDNA断片が満足に得られなかった。その原因としてはMCA/RDA法が制限酵素処理/PCR処理を頻回に必要とし、克つ条件設定が難しく複雑な方法であるためと考えられる。そのため、種々の処理過程の条件設定(組織から抽出するDNA量の増量や、PCRの際のアニーリング温度やサイクル数の再設定など)の再検討を行ったが、困難であった。また、本メチル化研究に関連して、本研究者は前立腺癌組織のみにDNAメチル化をきたす遺伝子としてCycloxygenase-2(COX-2)に注目した。この遺伝子の上流域のメチル化は胃癌を始め様々な癌組織中に認められていることが報告されている。本研究者は前立腺癌細胞株LNCaP,DU145,PC3においてCOX-2遺伝子の発現制御領域のCpG islandにおいてBisulfite Sequence法、COBRA法にてメチル化の解析を施行した。その結果、上記3種の前立腺癌細胞株において高頻度のメチル化を確認した。一方、良性前立腺組織においてはメチル化を認めなかった。この現象はCOX-2遺伝子が前立腺癌組織中においてメチル化により発現が制御され、なんらかの働きを担っていることが考えられる。従って、癌組織中のCOX-2遺伝子のメチル化の有無と臨床情報との関係を明らかにする事により、前立腺癌に対する診断、治療方針の決定、予後の予測など臨床的に応用できる可能性があると考えられる。以上、今回の研究により一定の成果を挙げることができた。研究途中の部分に関しては継続を、また、明らかになったものに関しては結果の報告を施行予定である。申請計画に基づき、前立腺癌組織のみにメチル化を伴ったDNA断片を同定するため、臨床検体として得られた前立腺癌組織と良性前立腺組織を用いてMCA/RDA法を施行中であるが、現在のところ目的とされるDNA断片が未だ得られていない状況である。そのため、現在、種々の処理過程の条件設定(組織から抽出するDNA量の増量や、PCRの際のアニーリング温度やサイクル数の再設定など)の再検討を行い、施行している段階である。これらが克服されれば目的のDNA断片を抽出することが可能であると思われる。また、本メチル化研究に関連して、本研究者は前立腺癌組織のみにDNAメチル化をきたす遺伝子としてCycloxygenase-2(COX-2)に注目している。本研究者は前立腺癌細胞株LNCaP,DU145,PC3においてCOX-2遺伝子の発現制御領域のCpGislandにおいてBisulfite Sequence法、COBRA法にてメチル化の解析を施行した。この現象はCOX-2遺伝子が前立腺癌組織中においてメチル化により発現が制御され、なんらかの働きを役割を担っていることが考えられる。今後もMCA/RDA法による前立腺癌組織のみにメチル化を伴う遺伝子の同定を進めていくことに平行して、前立腺癌組織中におけるCOX-2遺伝子のメチル化について解析を進めていく方針である。
液体リチウム中トリチウムの濃縮と分離回収

1.目的液体Li中に溶存する水素同位体を分離回収することを目的とし、そのために先ず必要な金属窓材の開発と、電解用固体プロトン導伝体の候補材の熱的安定性に関する基礎的検討を行った。2.成果(1)金属窓材の開発高水素透過性金属膜にNb,Zrを選び、液体Li中でそれらの高透過能を長時間維持させるためにRFスパッタ法で厚さ2μm以下のFe保護膜を付した試料を作製し、液体Li中での試験に先立って、水素雰囲気下でそれらの透過能を測定した。その結果、Fe被覆膜厚が十分に小さい場合にはFe被覆によって試料膜の水素透過能がむしろ増大した。このことからFe被覆はNb,Zrの表面酸化の抑止に有効であることが判明した。また、Nb,Zrの比較からむしろZrの方が窓材に適するものと判断された。従って現在、0.1μm程度のFe被覆Zr膜を作製するための条件および、その薄膜の健全性についての検討を行っている。(2)リン酸ジルコニウムの熱安定性液体Li中より水素同位体を直接電解抽出するため400500°Cで使用可能なプロトン導伝性固体電解質の選定が必要であり、リン酸ジルコニウムを選び、これを合成してその熱的安定性を調べた。TGA分析により合成体の110°C加熱により良好なプロトン導伝体であるZrO【(H_2PO_4)_2】が得られた。しかし2001000°Cの範囲では一定組成で示し得る安定な化合物は見出し難く、徐々に分解(脱水)が進行する。従って非晶質化等による合成法の改良または他の候補材(ペロブスカイト型)についての検討が必要となった。以上の結果から、RI実験室内に新たに大型フードを設け、Fe薄膜被覆試料による試験を行うべく、液体Li実験系を組立てた。
学校における長期欠席現象を規定する社会的要因の解明

本研究では、都道府県レベルの学校基本調査における長期欠席者統計を用いたパネルデータ分析によって、個々の子どもや親、学校の問題をめぐって対立しがちとなる長期欠席問題について、人口密度、教員生徒比、経済的豊かさ、離婚率など多様な社会的要因が複合的に長期欠席現象を規定している点を実証的に明らかにするとともに、長期欠席と関連性の深いひきこもり問題・いじめ問題についても理論的検討を行った。1970年代半ば以降に増加をはじめた中学生の長期欠席率は現在3.6%に達しており、都道府県レベルで長期欠席者が最も多い大阪府では、40人学級のうち2人は長期欠席者(5.5%)という状態に至っている。この問題をめぐっては、1本人の発達障害や鬱病、非行に原因を見る本人病理説、2親の育て方の問題などに原因を見る家庭病理説、3受験競争、いじめ、教師の資質など学校に原因を見る学校病理説等が一般に語られるが、長期欠席は社会現象であり、個々の事例の下手人捜しに終始していては問題の解決に至ることができない。そのため本研究では、地域統計の分析を通じて都市度、教員生徒比、経済的豊かさ、離婚率など多様な社会的要因が複合的に長期欠席現象を規定している点を実証的に明らかにし、根本的な支援策を提案することを目的としている。本目的を達成するために、平成24年度は1データ構築体制の整備、2入手容易なデータの収集、3第一次データベースの構築の3つを課題とした。9月の課題採択以降、約半年の短い期間ではあったが1データ構築体制の整備、2入手容易なデータの収集を完了することができた。第一次データベースの構築については予算不足のため部分的に未完了の箇所があるものの、他方で入手困難なデータの収集が想定以上に進んでおり、総体的に見れば計画以上の進度を保っている。また理論的検討も計画以上に進んでおり、本年度中に複数の論考を発表できる見通しである。さらに数理社会学会での活動を通じてマクロパネルデータの分析手法について情報交換を行うことができた。これによって懸念となっていたマクロパネルデータの扱いに関する問題に解決の目途がついたことも大きな収穫だったといえる。今年度も現状のペースを維持して研究を進めたい。平成25年度は1入手困難なデータの収集、2第二次・第三次データベースの構築、3データ分析が課題であった。1については、前年度に収集できなかった統計資料について、図書館を訪ねて統計データの収集を行った。2については、1とも連動してトリプルチェックの作業を進めた。3については、平成25年6月中に第一次データを用いてプレ分析を行い、専門家によるアドバイスを受けつつ新たな変数の追加等を進めた。また、実証的分析と並行して、不登校の主観的主要因のひとつである「いじめ・人間関係の不調」についての理論的検討を行い、3件の論考を発表した。実証分析については、予定どおり教育社会学会への投稿の準備中である。前述のとおり統計資料のデータ化作業に部分的遅延がみられるが、これは早期にキャッチアップ可能である。むしろ計画以上に入手困難なデータを入手できていること、分析法の面でも問題解決が進んでいること、想定外に理論的検討が進み、本年度中に複数の論考を公刊できる見通しが立っていることなどを総じてみれば、研究は当初の計画以上に進展しているとみなすことができる。25年度が最終年度であるため、記入しない。計画通り2013年6月のプレ分析、2014年度の学会論文投稿を目指して研究を進める。しかし1年半の研究期間では構築したデータベースの豊穣な潜在的価値を完全に享受するには短すぎる。構築したデータベースにいかなる可能性があるのか、本研究の先を見据えて検討を行っていきたい。
急性肺損傷における新規生理活性脂質リゾホスファチジン酸の役割解明

LPAはリゾリン脂質の一つで、多様な作用を持つ新世代の生理活性脂質である。本研究では急性肺損傷の病態におけるLPAの役割を解明することを目的とした。代表研究者は気管支肺胞洗浄液中のATX酵素活性が誤嚥性肺炎モデルである塩酸惹起急性肺損傷モデルで著名に上昇していることを発見した。さらに抗体によるATX活性の抑制は塩酸惹起肺損傷における肺血管透過性の亢進と炎症細胞集積を減弱させることを発見した。本研究によりATXおよびLPAは塩酸惹起急性肺損傷の病態に関与していることが判明した。急性肺損傷(ALI)およびその重症型の急性呼吸促迫症候群(ARDS)は、肺における過剰な炎症と肺血管透過性亢進を特徴とする急性呼吸不全を呈する症候群である。ALI/ARDSは依然40%以上の高い死亡率を有し、治療法の更なる進歩が必要とされている。リゾボスファチジン酸(LPA)は酵素オータキシン(autotoxin, ATX)により産生されるリゾリン脂質の一つで、多様な作用を持つ新世代の生理活性脂質である。代表研究者はこれまでに、各種急性肺損傷モデルマウスにおける血中・気管支肺胞洗浄液中のATX酵素活性を検討し、気管支肺胞洗浄液中のATX酵素活性は各急性肺損傷モデル群において有意に上昇しており、特に誤嚥性肺炎モデルである塩酸惹起急性肺損傷モデルで著名に上昇していることを発見した。今回代表研究者はLPAおよびATXの急性肺損傷における役割を明らかにするために、抗ATX抗体を投与により全身のATX活性が抑制されたマウスを用意し、塩酸投与、肺炎球菌またはLPSにより急性肺損傷を惹起、コントロール抗体投与マウスと肺損傷の程度を比較した。ATX活性が抑制されたマウスにおいて、塩酸投与24時間後および48時間後の気管支肺胞洗浄液中の蛋白濃度、48時間後の気管支肺胞洗浄液中の好中球数がコントロール群に比し有意に低下していた。LPS惹起急性肺損傷モデルおよび肺炎球菌肺炎モデルでは48時間後の気管支肺胞洗浄液中の蛋白濃度、および気管支肺胞洗浄液中の好中球数がコントロール群に比し有意に低下していた。一方、肺炎球菌のクリアランスについてはコントロール群に比し有意な変化は認められなかった。本年度の研究により、各種急性肺損傷モデルにおいてATXおよびLPAが透過性の亢進および炎症細胞の集積に寄与していることを明らかになった。リゾホスファチジン酸(LPA)はリゾリン脂質の一つで、細胞増殖・細胞遊走・サイトカイン産生・血管透過性亢進・組織線維化など多様な作用を持つ新世代の生理活性脂質である。本研究ではLPAに着目し、肺血管透過性の亢進・組織傷害後の線維化などALIの病態におけるLPAの役割を解明することを目的とした。今回、代表研究者はLPAの肺損傷惹起のメカニズムの解明のためにエンドトキシン肺損傷モデルにおいて、LPA産生酵素オータキシン阻害薬による、肺サイトカイン・ケモカインの発現解析を行った。阻害薬投与により、変化したケモカインとしてCXCL-12が明らかになった。以前の研究にて急性肺損傷後期において肺に集積した好中球上CXCR4の発現が上昇しており,CXCL12/CXCR4シグナル経路が好中球集積に関与していることを報告した.そこで今回,CXCR4発現上昇の機序および好中球集積に対する役割をLPS肺損傷モデルにおいて検討した。血管内肺好中球はCXCR4をほとんど発現していない一方,血管外肺好中球では発現が上昇しており,血管外遊走後に発現が上昇すると考えられた.L-selectinのligandであるsulfatideで末梢血中の好中球を刺激するとCXCR4の発現が上昇したことから,L-selectinがCXCR4の発現上昇に関与していると考えられた.さらにex vivo実験により,CXCL12はCXCR4を高発現した肺好中球に対し抗アポトーシス作用を持つことが新たに判明した。CXCL12/CXCR4シグナル経路は,走化作用だけでなく抗アポトーシス効果を介して急性肺損傷における肺好中球集積に関与していることが明らかとなった。LPAはCXCL-12の発現を亢進させ、急性肺損傷における肺好中球集積に関与していることが示唆された。
膜輸送システムと金属結合分子からみた植物細胞の自律的イオン濃度調節機構の解明

植物細胞は金属イオンの濃度を調節しつつ生命活動を維持している。その調節に関わるイオン膜輸送系、濃度感知装置に焦点を当て、以下の成果を得た。1)液胞膜Zn輸送体MTP1の細胞質側のHisに富んだ領域が、細胞質イオン濃度を感知し、低濃度では細胞質Zn濃度を維持するため活性を抑制する役割をもつことを証明した。2)新規亜鉛輸送体MTP12がMTP5とヘテロ多量体を形成し、ゴルジ装置に局在することを解明した。3)細胞膜のCa結合タンパク質PCaP1について、金属結合による構造変化、培地銅イオン過剰による発現増大、遺伝子欠失株での銅感受性増大、気孔の閉口機能への寄与等の生理機能を解明した。細胞は、必須金属イオンを過不足なく細胞質での濃度を調節し利用している。この点を、細胞膜の金属イオン輸送系と濃度感知システム、液胞の金属イオン集積機能とそれを支えるプロトンポン、金属結合タンパク質に焦点を当て、分子素子とシステムの自律的なイオン調節機構を解明することを目的とし、本年度は、下記の成果を得た。(1) H+-PPaseの構造と機能調節機構:H+-PPaseの特定アミノ酸残基に変異導入することにより、その変異型酵素の機能を定量し、原子レベルでの立体構造の中で、個別アミノ酸残基の機能を推定した。とくに、基質加水分解機能とプロトン輸送機能の共役に関わる残基、プロトン輸送に直接関わる残基等を新規に特定することができた。(2) H+-PPaseからみた液胞形態のダイナミズム:酵素欠失株に自プロモータ制御下で発現するGFP- H+-PPase導入植物の作出に成功したので、各組織・細胞における液胞の形態的、機能的なダイナミズムを解明した。合わせて、GFP付加による人為的な細胞構造の出現も明確にし、GFP利用のリスクを論文として世界に発信した。(3) Zn輸送体(MTP分子種):Znは必須微量元素であるが過剰濃度では毒性を示す。過剰Znは液胞に隔離・蓄積されるか、細胞外に排出される。液胞膜亜鉛輸送体AtMTP1分子に注目し、分子内のHisループ(Hisを多く含む領域)の生理機能の解析を進めた。とくにHisループは細胞質亜鉛濃度を感知し、AtMTP1のZn輸送機能を調節する可能性があると推測し、この領域を欠失した変異型MTP1導入株でのイオンバランスを定量的に解析し、個別変異株の生理的特性を解析し、結論として、Hisループが細胞質亜鉛濃度が低い場合はAtMTP1のZn輸送活性を抑制するセンサー機能を果たしていることを明らかにした。植物細胞は、必須金属イオンを過不足なく、細胞質での金属イオン濃度を調節しつつ生体反応と構造維持しつつ利用している。この点を、細胞膜の金属イオンイオン輸送系と濃度感知システム、液胞の金属イオン集積機能、ならびにその集積機能をエネルギー的に支えるプロトンポンプ、金属結合タンパク質に焦点を当て、分子素子とシステムの自律的なイオン調節機構を解明することを目的として、主としてシロイヌナズナを対象に研究を実施し、2015年度は下記の成果を得た。いずれの成果も、学術論文として公表した。(1)細胞内亜鉛輸送体としてMTP12に注目し、その分子の存在様式、局在部位を解析し、MTP12がMTP5とのヘテロ多量体を形成し亜鉛輸送能を発揮していること、さらに、この複合体MTP12/MTP5がゴルジ装置に局在することを明らかにした。(2)液胞膜亜鉛輸送体MTP1は、細胞質側のHisに富んだ領域の一部を欠落することで亜鉛輸送機能が10倍以上に増大する知見を得ていた。これは酵母細胞に発現させて得た知見であるが、この変異型MTP1を正常なMTP1を欠失した株mtp1に導入したところ、低亜鉛条件では、根に多量の亜鉛を蓄積し、地上部に配分できず、亜鉛欠乏状態に強い感受性を示した。これは、His領域が低亜鉛濃度では、亜鉛輸送を抑制するブレーキ役を果たしているためと判断した。亜鉛輸送分子自身が亜鉛濃度を感知し輸送活性を調節する機能をもつことを明確に示す知見となった。(3)カルシウム等を結合するタンパク質PCaP1に注目し、PCaP1が細胞膜に安定して局在すること、培地の銅イオン過剰条件で遺伝子発現が増大し、さらに遺伝子欠失株は、過剰な銅に感受性が高くなり、かつ気孔の閉口機能に障害が生じていることなど、PCaP1の生理機能の一端を解明した。(1)MTP12に関する成果:局在と機能が不明であり、生物界でも最も大きな分子サイズをもつMTP12について、研究を進めた結果、これがゴルジ装置に存在し、なおかつ、それ自身の多量体ではなく、通常サイズのMTP5とのヘテロ多量体(おそらくヘテロダイマー)を形成することで亜鉛輸送機能を発揮することを実験的に証明できた。分子サイズが大きく、遺伝子操作が困難かつ、存在量も多くはない分子について局在、機能複合体の存在を明らかにできたことは、当初予測していなかった成果である。(2)MTP1分子については、酵母での実験から、細胞質Hisリッチ領域は、亜鉛輸送のブレーキ役を果たしていると推定した。この点を確認するために、変異型MTP1として植物に組込み亜鉛濃度等を解析した。