hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
酵母26Sプロテアソームの会合と活性の時間的・空間的制御

出芽酵母26Sプロテアソームの制御サブユニットを構成する遺伝子であるRPN2,RPN5,RPN7に関して、これまでに単離した温度感受性変異体に関して、制限温度下で検出される中間体の局在を観察した。その結果、制御サブユニットを構成するlidとbaseのふたつのサブユニットはそれぞれ独立に核移行しうることを示した。またインポーティンαの温度感受性変異体即1-49中ではbaseの局在は核から細胞質に拡散するのに対して、hdは制限温度下でも核に局在することを示した。またhd構成因子のうちRpn3,Rpn7,Rpn12,Rpn15が複合体に含まれていないと核移行は生じないことを示した。これらの結果から、26Sプロテアソームを構成するlid, base, CPの各サブユニットは互いに非依存的に形成、核移行できることを明らかにし、lidの核移行に必須な構成因子を示した。また、hdの中で唯一酵素活性を持つ構成因子として同定されているRpnllpと共通の活性ドメインであるMPN+ドメインを有する分子AMSHの解析をシロイヌナズナを用いた系で行った。大腸菌で発現させたシロイヌナズナAMSEはRpnllpと同様、脱ユビキチン化酵素活性を示し、その活性は基質であるユビキチン鎖のチェーンタイプによって異なった。シロイヌナズナAMSHはRpnllpとは異なり、モノマーでも酵素活性を示し、ゲル濾過を行った結果、AMSHは安定な複合体は形成しておらず、主にモノマーで存在することが明らかとなった。またAMSHのホモ欠損植物は著しい生育欠損を示し、葉緑体の分化も見られないことからAMSHによる脱ユビキチン化は植物の発生において必須の機能を担っていると考えられる。出芽酵母26Sプロテアソームの制御サブユニットを構成する遺伝子であるRPN5に関して、温度感受性変異体を単離し、rpn5-1と名付けた。制限濃度下のrpn5-1ではポリユビキチン化された蛋白質が蓄積することからrpn5-1はユビキチン-プロテアソーム系に欠損があることが示唆された。さらに、制限温度下で培養した細胞の粗抽出液をゲル濾過クロマトグラフィーによって分離すると検出した制御サブユニットのlid構成因子が全てモノマーとして存在していたことから、rpn5-1はlid形成に欠損があることが明らかとなった。過去に単離・解析を行ったrpn7-3,rpn6-1変異体ではそれぞれ5つ、4つから成る副次構造体が存在していたことが、rpn5-1ではいかなる副次構造体も見いだされなかったことから、Rpn5はlidのコア部を形成していることが推測される。本研究により今まで酵母two-hybridによってしか知られていなかったlid構成因子間の空間的配置について新たな知見が得られた。なお、rpn5-1株において、lidの構造が不完全でも制御サブユニットを形成するもうひとつのサブユニットbaseやコア・サブユニットの形成は完全であった。さらに、baseの温度感受性変異体ΔN rpn2を用いた解析結果から、lid, base,コア・サブユニットの形成はそれぞれ独立に起こりうることが示された。出芽酵母においては26Sプロテアソームは主に核に局在するが、rpn5-1変異体でもbaseとCPが核局在したこと、ΔN rpn2でbaseと結合していないlidも核局在したことから、それぞれのサブユニットの形成のみならず核移行も互いに依存しないことを変異体を用いた解析によって初めて明らかにした。
犯罪と裁判から見た清代モンゴルの社会史研究

平成30年度は、当初の予定通りに研究が進んだ部分と、予定通りには進まなかった部分とが、出てきている。予定通りに進んだ部分の概要を先に書く。まず、30年度、萩原は、5月に研究協力者である院生たちを連れて九州大学に出張し、満族史研究会にて萩原自身が、本科研の中心を為す「清代モンゴルにおける犯罪者捕獲の期限設定」と題する研究発表を行った。この論文は平成29年度末に書いて30年4月に法制史学会の『法制史研究』に投稿した。無事査読を通り31年3月25日付けで掲載されることが決まっている。3校も終え、日付けの上では既に出ていることになっている。また7月には野尻湖クリルタイに参加して、研究情報を収集して来た。9月には、例年通りモンゴル国立中央古文書館に出張し、「オドセルとナワーンの事件」のその後の展開に関する史料調査を実施した。また、ウランバートルで開催された国際シンポジウムにて人身売買問題の研究を発表した。研究協力者である院生たちには科研費と大学の研究費とを併用して、学会発表や現地文書館での調査を支援し、協力を受けた。その結果として、一人が『日本モンゴル学会紀要』にゴルロス前旗乾安県の測量・開発計画の論文を発表し、同県の土地売却手続きの研究を30年5月の日本モンゴル学会で発表して学術誌『日本とモンゴル』に掲載を確定させた。もう一人の研究協力者も、『日本とモンゴル』にオルドス・ダラト旗でのベルギー人宣教師たちによる布教活動について論文を発表し、学術誌『内陸アジア歴史文化研究』にもオルドス・オトク旗における布教トラブルについて論文を発表した。『日本モンゴル学会紀要』にもモンゴルへのキリスト教布教解禁通知が遅れた問題に関する論文の掲載を確定させ、また30年11月に萩原が開催を引き受けて神戸大学で開いた日本モンゴル学会にて4本目の研究を発表した。いずれも、社会史関連の研究である。前記『法制史研究』の犯罪者捕獲期限の論文は完全に予定通りに進めることができた。一方、ある論文集用に平成28年11月に提出しておいた清代モンゴルにおける人身売買問題の論文は本科研のメインテーマの論文としては最初に出るはずであったが、出版者側の事情で未出版のまま今も宙に浮いている。そこで熟慮した結果、発表が遅れてもかまわない部分のみを残して、本科研に直接関係する社会史関連の重要部分を取り出して拡充し、先に出版すべく平成30年度末に既に書き直した。31年5月頃にはいずれかの学会誌に投稿するつもりである。31年度中には、掲載されるであろう。さらにもう一点、本科研のメインテーマの一つである「オドセルとナワーンの事件」に関連する遊牧民の社会史の論文を、平成30年9月末締切で、ある雑誌の特集号に請われて既に投稿していたのであるが、他の原稿の遅れによってこれまたその特集号自体の刊行が大きく遅れてしまい、現在も未出版のままである。原稿がようやく出そろったという連絡が最近入ったので、こちらは31年の5月か6月には出そうである。当初の予定では、ウランバートルや内モンゴルの古文書館で史料調査を行い、1.清代モンゴルにおける人身売買問題、2.「オドセルとナワーンの事件」関連の犯罪者捕獲期限条文の起源と実効性の確定、3.「オドセルとナワーンの事件」に関連する遊牧民社会史の検討、という順番で専門性の高い論文を集中的に発表し、それらを踏まえて社会史関連の書籍を一冊出版する計画であった。その計画は現在も継続中であるが、2の論文を除いて、1も3も早々に原稿を提出したにもかかわらず、執筆者とは無関係の事情によって出版が遅れており、この分では平成31(令和元)年度いっぱいかかってようやく上記3点が出そろいそうな具合である。専門論文を先に発表してから書籍を出すという基本方針を覆すことはできないので、やむを得ず、書籍の出版を少し先延ばしにするという方針になりそうである。また、ウランバートルでの史料調査もほぼ順調ではあるが、その一方で、モンゴル国と内モンゴルから大量の古文書史料が出版され始めた。本科研でも、オルドスのジュンガル旗档案を平成29年度に約40万円かけて購入したが、その後も新たに『清朝後期理藩院満蒙文題本』(38万円余り)や同じオルドスのハンギン旗档案(現在までに30万円分ほどが出版)、庫倫弁事大臣衙門档案(約30万円)などが、次々と出版された。この内、『清朝後期理藩院満蒙文題本』は本科研と直接の関係があり、出版される日を以前から永らく待っていたのであるが、当然のことながら科研の研究計画とうまく一致するようなペースでは出版されない。それでも絶対に無視できない必要史料なので、平成31(令和元)年度に本科研の予算で購入しておき、可能であれば、これを利用して上記3点に加えてもう1、2本の専門論文を本科研にて執筆、発表しておきたい。それらを利用して、社会史関連の書籍を次の科研にて完成・出版したいと考えている。平成28年度の研究は大成功となった。移転のため閉鎖されていたモンゴル国立中央古文書館が無事開館されたためである。まず5月と7月に研究協力者の院生たちと共に国内の学会に出席して、研究情報を広く収集・共有した。

次いで8月に私一人でウランバートルに出張し、「第11回国際モンゴル学者会議」に参加・発表した。発表内容は、「オドセルとナワーンの事件」と私が名付けて以前から法的背景を研究して来た19世紀外モンゴルにおける殺人事件である。今回は、逃亡した殺人犯であるオドセルを捕獲する義務を負わされたロプサンドルジという名の官員が犯人を捕獲できなかったために科された刑事罰に関して蒙古例の規定を検討し、この法の起源がモンゴル法や満洲人の法ではなくて明律・清律等の中国法であることを新たに証明した。この研究は29年度中にどこかに投稿する。またこの時、上記文書館開館の情報をモンゴル人研究者がくれ、数名の研究者と共に郊外へ移転した文書館をすぐ訪問した。ただし時間が無くて文書調査はできなかった。9月に予定通り神戸大学の日本人学生2名をモンゴル国立大学に引率する大学の公務が入り、滞在期間の合間を縫って幸運にも文書館での調査を開始することができた。29年度以降も調査を継続する。さらに幸運なことに、予定通りその滞在期間中に日本の東北大学とモンゴル科学アカデミー等が共催するシンポジウムがウランバートルで開催され、ここでもモンゴル語で研究発表できた。清朝の第二代目皇帝ホンタイジが八旗の兵士に向けて1638年に発布した軍律が蒙古例の中に入ったことを証明した研究である。こちらも29年度中にモンゴル語で書籍に掲載する。以上いずれも大学本部の承認を得た活動である。11月には人身売買に関する論文を書いた。29年度に出る。研究協力者の院生たちは、夏に内モンゴルや吉林省の古文書館で調査し、大量の情報をもたらしてくれた。本研究の科研を申請した直後の平成27年12月頃から、モンゴル国立古文書館が移転のために突然閉館となり、28年度初めの段階では本研究の見通しも、不透明な部分が多かった。古文書館がいつか移転・閉鎖されるかもしれないという危険性は実に数十年も前からいつも指摘されていて、一旦閉鎖となれば数年は閉まったままのはずだとも言われてきた。ただ実際にはそれにもかかわらず何十年もの間、都心から移転しなかったのである。そういう理由で、私は最悪の事態をも想定して内モンゴル各地にある日本人による閲覧が困難な古文書館にゼミの中国国籍の院生たちを研究協力者として派遣して研究対象の地域を広げて考えるという柔軟な計画を立てていた。院生たちの専門分野や彼ら自身による論文発表の機会をも考慮した計画である。ところが、概要の所でも書いたように、27年末に突然閉鎖された同古文書館が予想外に早く開館されることになったため、28年度初めの予想よりも文書調査をずっと大きく進展させることが可能となったわけである。この点、大変幸運であった。さらに、ウランバートルへ日本人学生を引率して行くという公務の機会を得たことやその期間中に偶然清代モンゴル史のシンポジウムが開かれると言った、私自身の努力や科研の研究と直接には関係のない二重、三重の幸運も重なった。以上のような幸運をうまく生かしたいと私は考えている。また、研究協力者である私のゼミの院生たちにも決して不利にならないように、彼ら自身による文書調査や研究をも、同時並行の形で進めていく。平成29年度は、当初計画していた研究をほぼ予定通りに実施することができた。28年度は想定外の大成功を収めたのであったが、29年度はほぼ計画通りといったレベルである。まず、昨年度に引き続いて、5月と7月に研究協力者である院生たちとともに国内での学会に参加して、研究情報を広く収集・共有した。また、内モンゴルから写真版で出版されている清代
細胞誘引能を有する自己組織化アミノ多糖を利用した新規薬物輸送システムの構築

本研究では,生分解性かつ細胞誘引能を有するアミノ多糖であるキトサン誘導体の自己組織化能に着目し,その機能を活用した薬物輸送システムへの応用を検討した.まず,基本原料として使用するキトサンの分子量制御法について検討し,水熱反応を利用することにより従来法では必須であった酸を使用することなく低分子化することが可能であることを見出した.さらに,この方法は様々なアセタール化合物の加水分解にも応用可能であることを明らかにした.また,糖質の水酸基を選択的に酸化することによるカルボン酸を有するキトサン誘導体の合成法,位置選択的なMannich反応を利用することによりフェノール性および疎水性側鎖の導入法を確立し,新規キトサン誘導体の合成を行った.さらに位置選択的反応による糖質の合成法も開発した.合成したキトサン誘導体のエマルジョン形成能を利用した薬物取込能を薬物モデルとして蛍光性のピレンを用いることにより検討した.キトサン誘導体を含むO/Wエマルジョンを急速凝固させることにより疎水性薬物を取り込んだ薬物含有キトサン誘導体を調製することができた.さらに,得られた試料を溶解させることにより薬物の徐放が可能であった.キトサン誘導体と生分解性高分子をブレンド材料化し,薬物徐放過程のキーステップとなるそれらの材料の生分解性について検討し,キトサンの機能を保持もしくは向上できることを見出した.本研究では,生分解性かつ細胞誘引能を有するアミノ多糖であるキトサン誘導体の自己組織化能に着目し,その機能を活用した薬物輸送システムへの応用を検討した.まず,基本原料として使用するキトサンの分子量制御法について検討し,水熱反応を利用することにより従来法では必須であった酸を使用することなく低分子化することが可能であることを見出した.さらに,この方法は様々なアセタール化合物の加水分解にも応用可能であることを明らかにした.また,糖質の水酸基を選択的に酸化することによるカルボン酸を有するキトサン誘導体の合成法,位置選択的なMannich反応を利用することによりフェノール性および疎水性側鎖の導入法を確立し,新規キトサン誘導体の合成を行った.さらに位置選択的反応による糖質の合成法も開発した.合成したキトサン誘導体のエマルジョン形成能を利用した薬物取込能を薬物モデルとして蛍光性のピレンを用いることにより検討した.キトサン誘導体を含むO/Wエマルジョンを急速凝固させることにより疎水性薬物を取り込んだ薬物含有キトサン誘導体を調製することができた.さらに,得られた試料を溶解させることにより薬物の徐放が可能であった.キトサン誘導体と生分解性高分子をブレンド材料化し,薬物徐放過程のキーステップとなるそれらの材料の生分解性について検討し,キトサンの機能を保持もしくは向上できることを見出した.本研究は,アミノ多糖であるキトサンに種々の疎水性置換基を導入した新規な疎水化キトサン誘導体を合成し,それらのミセル形成挙動、薬物取込・放出能に関する知見を得るとともに,in vivoへの応用を目指すものである.本年度は,キトサンにmethyl2,4-dihydroxybenzyl基を側鎖として導入したキトサン誘導体である2,6-DHMBn-chitosanを合成した.このキトサン誘導体は,メタノール可溶性であるため,両親媒性の性質を有していると考えられる.そこで,この誘導体の水溶液中における会合挙動を蛍光プローブ法と粘度法により検討した.その結果,アニオン性蛍光プローブであるANSでは明確な会合挙動は観測されなかったが,中性のプローブであるpyreneでは,キトサン誘導体溶液(pH5.6)の蛍光バンドの強度比I_3/I_1の値は,0.1g/L以上の濃度から急激に増加した.これは,キトサン誘導体が会合体を形成し、そこにpyreneが取り込まれたことによると考えられる.さらに,溶液中におけるキトサン誘導体鎖の広がりに関する知見を得るために粘度測定を行った.その結果,典型的な高分子電解質の挙動はみられたが,数値の再現性に乏しいため詳細な知見は現在のところ得られていない.糖質に長鎖アルキル基を導入した糖エステルは,両親媒性化合物が有する物質取り込み能を利用した薬剤輸送システムとしての応用が期待される.本年度は,キチンの構成単糖であるN-Acetyl-D-glucosamine(D-GlcNAc)の3位および6位水酸基にpalmitoyl基を導入したD-GlcNAc-3,6-Palを合成し,その基礎的物性評価として,蛍光プローブであるピレンを用いた物質取込能を検討した.その結果,一定ピレン濃度下で,D-GlcNAc-3,6-Palの濃度を増加させたところ,波長460470nm付近にピレンのエキシマー発光の増加が観測された.一方,未修飾のD-GlcNAcではそのようなエキシマー発光の増加は見られなかった.この結果より,D-GlcNAc-3,6-Palは溶液中で会合体を形成し,その中にピレンが取り込まれることが示唆された.さらに,キチン,キトサンを大量かつ中性に近い条件で加水分解可能な水熱分解法による分子量調整法について検討した.その結果,キチンやキトサンはその結晶性を低下させることにより,酸触媒を添加することなく低分子化されることがわかった.結晶性のキチンやキトサンでは,ほとんど低分子化されず,水熱条件下での分解は結晶性が大きく影響していることが明らかとなった.

非晶性のキチン,キトサンの分解では,還元末端基の増大から考えて加水分解的であり,その水熱条件下での水が触媒として作用したものと考えられる.側鎖に疎水性基を導入したキトサン誘導体のミセル形成能を評価したところ,ミセル形成を示唆する結果は得られたが,明確な証拠を得るには至らなかった.この理由として,誘導体が十分な水溶解性を持たないため,ミセルと不溶化による凝集の区別がつかないことが考えられた.そこで,エマルジョン形成による薬物包摂法について検討した.有機相(O)に薬物を溶解させ,水相(W)中でO/W型エマルジョンを形成させ,それをキトサンで安定化させることによりキトサン中に薬物を取り込むことが可能と考えた.水相に溶解させたキトサンはO/W型エマルジョンを一時的に安定化させたが,やがて溶媒は二相分離した.そこで,エマルジョンを形成させた直後にキトサンを不溶化させ,エマルジョンのまま析出させる方法について検討した.実験は薬物モデルとしてピレンを用い,クロロホルムに溶解させ,キトサンは酢酸水溶液に溶解させ,それらを激しく攪拌する事によりエマルジョンを形成させた.形成したエマルジョンに濃アルカリ水溶液を加えると,キトサンはエマルジョンのまま析出した.十分洗浄した析出物を酢酸水溶液に再溶解させ,ヘキサンで抽出することにより,キトサンに取り込まれたピレン量を評価した.その結果,この方法によりピレン(薬物)をキトサンに取り込むことが可能であり,キトサンの分解により放出可能であることを見出した.側鎖に糖質,カルボン酸,ビタミンを有する種々な新規キトサン誘導体を合成した.これらの中にはpH等の環境変化によりゲル化するものがあった.また,生物活性を有する糖質合成法として,炭素数3および4のケトースを用いた位置選択的合成法を確立した.
都市域大気中の高濃度汚染に及ぼす拡散のメカニズムに関する研究

本年度は前年度に引き続き、以下の如く、フィールドにおける実測、野外模型実験、風洞模型実験、数値解析の各手法を用いて、都市、街区、建物近傍の各スケール毎に、高濃度汚染を引き起こす現象に焦点を合わせた研究を行い、併せて汎用性のある数値解析プログラムの開発を行った。1.都市スケールの拡散現象に関する研究では、前年度までの成果を踏まえ、都市境界層内部における汚染質の拡散現象を捉えることを目的として、(1)乱流ゾンデ、係留気球等を用いた気象要素の垂直分布の測定、(2)タワーを用いた乱流測定と高速度応答測定器による汚染質と温度の垂直プロフィルの測定、(3)トレーサーガスを用いた拡散実験を行った。実測期間中、上空に温度逆転層が形成されており、トレーサー実験結果を解析することにより都市スケールでの拡散現象を解明できると考えられる。2.街区スケールの拡散現象の研究では野外模型実験の濃度・風速データを基に風洞実験による中立状態の平均濃度分布の予測精度について検討し、高い精度の予測が可能であることが示された。また、平均風速、乱流エネルギー、乱れの長さスケール、渦動粘性係数、トレーサー濃度等の分布の詳細な測定を風洞模型実験にて行った。さらにレーザーライトシートによる気流の可視化法を考案した。3.建物近傍スケールの拡散現象については、前年度提案した準定常モデルによる建物近傍濃度変動の予測手法の妥当性に関する検討を行うため、屋外拡散実験と風洞模型実験を行い、実測データと予測結果の相関について解析した。4.数値解析による研究では、一般化された数値解析プログラムを用いて境界条件に改良を加え、安定大気条件下で以下の様な各スケールにおける拡散場を解析した。(1)独立建物から排出される排ガスの拡散、(2)並んだ建物の一方から排出される排ガスの拡散、(3)ストリートキャニオン内から排出される自動車排ガスの拡散本年度は前年度に引き続き、以下の如く、フィールドにおける実測、野外模型実験、風洞模型実験、数値解析の各手法を用いて、都市、街区、建物近傍の各スケール毎に、高濃度汚染を引き起こす現象に焦点を合わせた研究を行い、併せて汎用性のある数値解析プログラムの開発を行った。(1)独立建物から排出される排ガスの拡散、(2)並んだ建物の一方から排出される排ガスの拡散、(3)ストリートキャニオン内から排出される自動車排ガスの拡散
DNAアーキテクチャによるナノ組織体構築

ナノスケールの電子デバイスは,化学者にとって真に挑戦的である.DNAは,ナノサイズの集合体を構築するのに良い候補である.ところで,DNAの電子伝導性は極めて低い.従って,DNA上に電子を流す能力のある機能性分子を配列させることは重要である.著者らはナフタレンジイミドの両置換基末端にフェロセンを導入したフェロセン化ナフタレンジイミド型リガンドを合成し,DNAセンサへの応用を検討してきた.センサは以下のようにして達成できた.まず,DNAプローブ(検出したい遺伝子と相補的な配列を有するDNA断片)を電極に固定化する.このDNAプローブ修飾電極にDNAサンプルとでハイブリダイゼーションを行う.もし,サンプル中に目的遺伝子が存在すると電極上で二本鎖DNAが形成される.リガンドをこれに加えれば電極上の二本鎖DNA部位に効果的に濃縮される.この電極を用いてサイクリックボルタモグラムを測定すると電極上の二本鎖形成量に応じた強度のリガンドの酸化還元シグナルが得られた.これによってサンプル中の目的遺伝子を定量できた.ところで,リガンドのDNAへの結合によってDNAの主溝と副溝にフェロセン分子が配列された複合体の形成が示唆される.その際,インターカレーションを伴うのでDNA複合体は堅い棒状構造を形成される.言い換えれば,これは一次元DNAマトリックスを支持体としてポリフェロセンが形成されたと見なせる.当該年度は,この棒状ポリフェロセンが実際形成され得ること,また,形成された複合体の方末端から他の末端への電子移動を仲介できることを証明した.ナノスケールの電子デバイスは,化学者にとって真に挑戦的である.DNAは,ナノサイズの集合体を構築するのに良い候補である.ところで,DNAの電子伝導性は極めて低い.従って,DNA上に電子を流す能力のある機能性分子を配列させることは重要である.著者らはナフタレンジイミドの両置換基末端にフェロセンを導入したフェロセン化ナフタレンジイミド型リガンドを合成し,DNAセンサへの応用を検討してきた.センサは以下のようにして達成できた.まず,DNAプローブ(検出したい遺伝子と相補的な配列を有するDNA断片)を電極に固定化する.このDNAプローブ修飾電極にDNAサンプルとでハイブリダイゼーションを行う.もし,サンプル中に目的遺伝子が存在すると電極上で二本鎖DNAが形成される.リガンドをこれに加えれば電極上の二本鎖DNA部位に効果的に濃縮される.この電極を用いてサイクリックボルタモグラムを測定すると電極上の二本鎖形成量に応じた強度のリガンドの酸化還元シグナルが得られた.これによってサンプル中の目的遺伝子を定量できた.ところで,リガンドのDNAへの結合によってDNAの主溝と副溝にフェロセン分子が配列された複合体の形成が示唆される.その際,インターカレーションを伴うのでDNA複合体は堅い棒状構造を形成される.言い換えれば,これは一次元DNAマトリックスを支持体としてポリフェロセンが形成されたと見なせる.当該年度は,この棒状ポリフェロセンが実際形成され得ること,また,形成された複合体の方末端から他の末端への電子移動を仲介できることを証明した.
抗酸化因子セレンの生理学的役割の解明-セレン蛋白質発現に特異性を示すモルモットを用いて-

本研究では、微量元素セレンが抗酸化因子として果たす役割を解析するため、多くの動物種で最も存在量の多いセレン蛋白質であるcellular glutathione peroxidaseの活性が著しく低いモルモットに注目して実験を行った。モルモットは、ヒトと同様ビタミンCを生合成できない、という特徴も持っている。初年度の検討で、肝臓ではリン脂質の過酸化物を基質とすることのできるPHGPxの活性が他の動物種と同程度に認められること、この活性が確かにPHGPxの遺伝子発現に由来していることを見いだしている。一方、最近セレン蛋白質であることが明らかにされたthioredoxin reductase(TR)は、酸化型のビタミンCであるdehydorascorbic acid(DHA)の還元能を有する、という報告がある。そこで、モルモットのTR活性を調べたところ、肝臓、腎臓よりも副腎における比活性が最も高いことを見いだした。副腎はビタミンC濃度の最も高い組織であることから、DHAの還元に関与している可能性を探った。モルモット副腎の可溶性画分をADP affinity columnで分離したところ、TR活性、セレンのピークと一致してDHA還元活性が認められた。ラットをセレン欠乏食で8週間飼育したところ、肝臓中のTR活性の変化とDHA還元能は並行して減少したが、モルモットをセレン欠乏食で飼育しても、肝臓中のセレン濃度は減少するものの、TR活性、DHA還元能はわずかしか減少しなかった。副腎については、セレン欠乏にしても、TR活性DHA還元能ともにまったく変化しなかった。従って、モルモットのTRは、DHA還元に関与しており、しかも、ラットとは異なり、セレン欠乏の影響を受けにくいことがわかった。今後、TRの各アイソザイムのcDNAをクローニングし、発現調節機構を検討する必要がある。モルモットの肝臓中にphospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase(PHGPx)の活性が認められ、肝臓の電気泳動によりPHGPxの分子量に相当する18kDaのセレン蛋白質のバンドも確認された。そこで、既知のPHGPxの塩基配列を元にprimerを設計し、モルモット肝臓のmRNAからPCRによりPHGPxのcDNA断片をcloningし、塩基配列を決定した。その結果、マウス、ラットときわめて相同性の高いPHGPxのmRNAが発現していることがわかった。また、Northern blot分析により、肝臓以外の臓器にもmRNAが検出できた。従って、他の動物において主要なセレン蛋白質であるcellular GPxの活性がほとんどないモルモットにおいても、PHGPxの遺伝子は発現しており、活性を持つ蛋白質として臓器中に確かに存在していることが分かった。一方、マウスやラットと異なり、モルモットはVitaminCを生合成できないが、近年、酸化されたVitaminC(dehydro ascorbic acid)を還元する酵素の一つがセレン酵素であることがわかった。そこで、モルモットをセレン欠乏にした場合のVitaminCレベル、およびVitaminC欠乏にした際のセレンレベルについて検討した。その結果、VitarminC欠乏による組織中セレン濃度の変化は観察されなかったが、セレン欠乏によって、副腎のVitaminCレベルが低下していた。次年度以降、酸化されたVitaminCの還元に関与しているとされるthioredoxin reductaseの活性がモルモットにおいてどのような制御を受けているのか検討する予定である。

初年度の検討で、肝臓ではリン脂質の過酸化物を基質とすることのできるPHGPxの活性が他の動物種と同程度に認められること、この活性が確かにPHGPxの遺伝子発現に由来していることを見いだしている。一方、最近セレン蛋白質であることが明らかにされたthioredoxin reductase(TR)は、酸化型のビタミンCであるdehydorascorbic acid(DHA)の還元能を有する、という報告がある。そこで、モルモットのTR活性を調べたところ、肝臓、腎臓よりも副腎における比活性が最も高いことを見いだした。副腎はビタミンC濃度の最も高い組織であることから、DHAの還元に関与している可能性を探った。モルモット副腎の可溶性画分をADP affinity columnで分離したところ、TR活性、セレンのピークと一致してDHA還元活性が認められた。ラットをセレン欠乏食で8週間飼育したところ、肝臓中のTR活性の変化とDHA還元能は並行して減少したが、モルモットをセレン欠乏食で飼育しても、肝臓中のセレン濃度は減少するものの、TR活性、DHA還元能はわずかしか減少しなかった。副腎については、セレン欠乏にしても、TR活性DHA還元能ともにまったく変化しなかった。従って、モルモットのTRは、DHA還元に関与しており、しかも、ラットとは異なり、セレン欠乏の影響を受けにくいことがわかった。今後、TRの各アイソザイムのcDNAをクローニングし、発現調節機構を検討する必要がある。
３Dプリンターによるブリッジパターンの製作と寸法精度に関する研究

最近広く工業界において普及しつつある付加造型法は、歯科に応用されつつあり、3Dプリンターを用いた有機材料による歯科応用を目指し研究を行った。本研究では特に溶融積層法とモノマーの光重合による積層造形法を用いた成形法により作製したブリッジの寸法精度について検討を行うことを目的として研究を行った。過年度においては、この目的を果たすため、3Dスキャナによるデジタル印象採得を行い、印象精度についての検討を行い、この結果、精度の高い光学印象のデータを得ることが可能となった。この結果を受けて、小臼歯と大臼歯を支台とした1歯欠損を想定したブリッジ支台金型(以下、金型)について、スキャンデータからSTLデータを作成し、溶融積層式とレーザー光造形式の2種類の3Dプリンターを用いてパターンを造形し、これらのパターンと金型の適合性の検討を行い、セメントスペースを付与することにより、パターンの適合状態を改善できることが明らかとなった。本年度は、これらの結果を受けて下顎5,6番歯欠損について検討を行った。すなわち、このような欠損に対する補綴装置として4番7番歯を支台とするブリッジについて検討した。2歯欠損の支台に相当する金型を用いて、光学的スキャンを行ってSTLデータを得、続いて、溶融積層式とレーター光造形式の3Dプリンターにより補綴装置を作製した。この作製時にセメントスペースを付与したものについても適合性を比較検討した。この結果、セメントスペースなどの調整により適合性を向上できることが明らかとなった。これらの結果は、3Dプリンターをブリッジなどの補綴装置の鋳造用パターンとして用いることの有効性を示していると考えられ、今後の歯科応用が有望であると言える。今後の発展が予測されるCAD/CAM技術として3Dプリンターの歯科応用を目指し、積層造形法を用いた成形法により作製したブリッジの寸法精度について検討を行うことを目的として研究を行った。この目的を果たすため、スキャナによるデジタル印象採得を行い、印象精度についての検討を行った。次いで、CAD/CAMソフトによる設計を行い、3Dプリンターによりパターンを作製し、この時点での寸法精度を調べ、続いて鋳造を行い鋳造物の寸法精度を調べ、これらの寸法精度について検討するという一連の研究を行う。本年度は、1歯欠損ブリッジ用のマスター金型を作製し、これを用いて3Dスキャナ(DAVID)によるデジタル印象を試みた。しかし、金属の反射による影響で模型全体のスキャンが困難となった。このため、マスター金型をシリコーンゴム印象材により印象採得し、石膏模型を複製した。これらの模型複製を4回行い、これらの模型について3Dスキャナーによる光学スキャンを行った。同時にデジタルノギスによる模型の測定を行い、光学スキャンから得られたSTLデータとデジタルノギスによる計測から得られた寸法精度データの比較を行った。この結果、高さ方向ではスキャナのスペックを上回る精度が得られたが、水平方向の寸法精度は100μmのオーダーであり精度に問題があることが明らかとなった。この精度に関しては、STLの再構築法や距離測定法などの問題が考えられるため、現在、この解決法について検討し、水平方向の寸法精度を向上させるべく、ソフトの改良に取り組んでいる。また、今後は、マスター金型からレジン系模型材で作製した模型を用いて実験を進める予定である。この模型について、スキャンデータと比較するため、接触式の3次元座標測定器にて測定したデータとスキャンデータとのマッチングを調べ、スキャン方法やソフトの改良を試みて測定精度を向上させる必要がある。本年度の予定では、一歯欠損の模型を3Dスキャナによりスキャンし、得られたデータをCAD/CAMソフトにより3Dプリンティング可能なSTLデータに変換し、積層造形(熱溶融式と光造形法)によりブリッジパターン(567)を作製し、鋳造まで実施する予定であった。しかし、金型のスキャン時にトラブルに見舞われて、当初予定より実験が進捗しなかった。理由は、スキャナ本体が海外製品であり、発注後の生産のため納品まで多大な時間を要したことに加え、金属製金型のスキャン時に金属光沢による光の映り込みにより3次元スキャンが正常に行えないというものであった。このため、金属光沢を抑えるための二酸化チタン粉末の噴霧等も考えたが、寸法精度という点からはあまり好ましくないと考え、金型の材質を変更することとした。本年度は石膏により模型を複数個作製し、これらの模型をスキャンすることにより金属光沢の影響を取り除き、これによって得られたSTLデータと実測値の比較を行った。しかし、スキャンによる精度をデジタルノギスでの実測値と比較した時、水平方向の寸法精度に若干の低下が認められ、この解決法を検討するため、多くの時間が費やされる結果となった。水平報告の寸法精度を上げるためには、スキャン方法を変更するなどの必要があり、既存の3Dスキャナとの寸法精度について比較する必要があると考えられるため、次年度はまず、寸法精度の高い3Dスキャン法について確立する予定である。当初の予定より大きく遅れているが、精度の高いスキャンデータを得ることが出来れば、これ以降は、問題なく当初予定の研究を進めることが可能と考えられる。金属粉末を用いたSLSなど既に、歯科に応用されつつある3Dプリンターについて、有機材料について歯科応用を目指し、積層造形法を用いた成形法により作製したブリッジの寸法精度について検討を行うことを目的として研究を行った。平成29年度は、この目的を果たすため、3Dスキャナによるデジタル印象採得を行い、印象精度についての検討を行った。

この結果、金型からレジン模型を複数個作製し、これらの模型をスキャンすることにより金属光沢の影響を取り除き、これによって得られたSTLデータと実測値の比較を行い、精度の高い光学印象のデータを得ることが可能となった。この結果を受けて、本年度は、小臼歯と大臼歯を支台とした1歯欠損を想定したブリッジ支台金型(以下、金型)に適合するようにブリッジ型レジンパターンのSTLデータを3D CADソフトを用いて作成し、セメントスペースとして0、50、100、150 μmの空隙をクラウン内面に付与した。造形は、熱溶融積層式3DプリンターおよびUVレーザーをガルバノ方式で照射して造形を行う光造形式3Dプリンターの2つの造形方式の小型3Dプリンターを用いた。比較対照としてUV硬化積層法を用いたマルチジェット式3Dプリンターおよび半導体励起固体レーザー光造形式3Dプリンターの2つの造形方式の大型3Dプリンターを用いてパターンを造形した。これらのパターンを金型に適合させ、適合性の検討を行った結果、セメントスペースを付与することにより、パターンの適合状態を改善できることが明らかとなった。しかし、セメントスペースを変化させても浮き上がりの変化量には差がみられなかったことから、ブリッジ型のパターンでは支台間距離に合わせたさらなる微調整が必要であると考えられる。ほぼ予定通り、研究は進行している。現在、2歯欠損のブリッジ金型を用いて、3Dスキャンを行い、STLデータを作成して、3Dプリンターでパターンを作製中であり、研究の目標達成まで1年を残し、ほぼ計画通り進行していると評価できる。最近広く工業界において普及しつつある付加造型法は、歯科に応用されつつあり、3Dプリンターを用いた有機材料による歯科応用を目指し研究を行った。本研究では特に溶融積層法とモノマーの光重合による積層造形法を用いた成形法により作製したブリッジの寸法精度について検討を行うことを目的として研究を行った。過年度においては、この目的を果たすため、3Dスキャナによるデジタル印象採得を行い、印象精度についての検討を行い、この結果、精度の高い光学印象のデータを得ることが可能となった。この結果を受けて、小臼歯と大臼歯を支台とした1歯欠損を想定したブリッジ支台金型(以下、金型)について、スキャンデータからSTLデータを作成し、溶融積層式とレーザー光造形式の2種類の3Dプリンターを用いてパターンを造形し、これらのパターンと金型の適合性の検討を行い、セメントスペースを付与することにより、パターンの適合状態を改善できることが明らかとなった。本年度は、これらの結果を受けて下顎5,6番歯欠損について検討を行った。すなわち、このような欠損に対する補綴装置として4番7番歯を支台とするブリッジについて検討した。2歯欠損の支台に相当する金型を用いて、光学的スキャンを行ってSTLデータを得、続いて、溶融積層式とレーター光造形式の3Dプリンターにより補綴装置を作製した。この作製時にセメントスペースを付与したものについても適合性を比較検討した。この結果、セメントスペースなどの調整により適合性を向上できることが明らかとなった。
ミクロデータに基づく企業活動の多角化・国際化・ソフト化に関する定量分析

この研究は、日本企業の特性を事業分野の多角化・国際化(多国籍企業化)・ソフト化(イノベーション)の観点から明らかにした上で、それぞれの特性を規定する要因および相互の関連性を分析することを目的としている。平成9年度における研究テーマは、(a)企業間関係と技術知識フローに関する分析、(b)企業間関係と投資金融フローに関する分析、(c)企業の多角化に関する分析である。(a)企業間関係と技術知識フローに関する分析では、研究開発と企業間関係に注目し、資本関係を有する企業の間での技術フローの存在とその結果が研究開発活動にどのような影響を有するかを、平成4年・平成7年の2時点での日本の電気機械産業1889社のミクロデータをもとに実証分析を試みた。この結果、親企業からの技術情報のフローをうける企業は自社の研究開発費の支出が減少し、子会社へ技術情報を流出する企業は自社の研究開発費の支出を増加させていること、また、研究開発費に対して与える影響の程度は、親企業からの技術情報のフローを受ける企業の研究開発費比率は0.4%の低下・子会社への技術情報の流出をともなう企業の研究開発費比率は0.5%の上昇となり、平均的な研究開発費の比率(約1%)の約2分の1に達していることなどから、企業間の技術知識フローは決して少ないものではないことが示される。また(b)企業間関係と投資金融フローに関する分析では、資本取引と財の取引との相互関係に注目した子会社の投資行動に関する研究、(c)企業の多角化に関する分析では、企業の多角化を促進する誘因の解明に向けた研究を行っている。
モデル動物など多角的研究方法によるアルツハイマー病関連遺伝子の同定とその機構解明

我々はアルツハイマー病の中心病理である脳内Aβ蓄積量がマウスストレイン間で大きく異なることを見出した。マウスストレインの差異をトランスクリプトーム解析するというこれまでにない研究戦略を立案実行し、Aβ蓄積修飾因子KLC1 splice variant E(KLC1 E)の同定に成功した。Klc1とAβ蓄積の関係はマウスのゲノム解析でも確認された。マウスにおいてDBA/2由来のKlc1アレルを持つとKlc1E発現量が低く脳内アミロイドβ蛋白蓄積量も低くなることが解明された.アルツハイマー病(AD)のリスク遺伝子など関連遺伝子の道程は重要であるが、そのためには超大規模GWASなど極めて多大な研究リソースが必要になる。大規模GWASにおいてもごく少数のリスク遺伝子しか同定されないことが近年明らかになってきた。これらの問題をいくらかでも解消するため、我々はヒト個人差の代わりにマウスストレイン差を、GWASまたはQTL解析の代わりにトランスクリプトミクスを用いることでAD修飾遺伝子どうていを試みた。まずマウス系統のうちDBA系統がB6やSJL系統に比べADの中心病理である脳内Aβ蓄積量が3分の一から4分の一であることを見出した。次にストレイン間での遺伝子発現プロファイルを比較しDBAで発現が有意に異なる遺伝子群を抽出した。次に背景遺伝子を混合させたADモデル動物で脳内Aβ蓄積量を相関する遺伝子群を抽出しKlc1を得た。QPCRでKlc1 splice variant EがAβ蓄積量と相関しており、Klc1領域のゲノム解析でもAβ蓄積修飾遺伝子であることが支持された。次にmouse-to-human translationが検討され、ヒトAD剖検脳の発現解析が行われた。KLC1 splice variant EはADで対照群よりも高値であった。抹消リンパ球での発現プロファイルが脳の類似しているという報告があるため、リンパ球の発現解析も行うとAD(n=47)で対照(n=17)よりもKLC1 variant Eは高値であった(+25%、p=0.0014)。KLC1の機能解析にも着手しておりマウスneuroblastomaにKlc1 variant Eを発現させるとAβ産生量が増加していた。アルツハイマー病の中心病理は脳内でのAβの蓄積である。Aβ蓄積の抑制または除去はアルツハイマー病の根治的治療になると考えられ、多くの大規模な臨床研究が行われている。しかしながら、これらすべてのアルツハイマー病根治療法の臨床研究は失敗に終わっている。マウスにおいてDBA/2由来のKlc1アレルを持つとKlc1E発現量が低く脳内アミロイドβ蛋白蓄積量も低くなることが解明された.我々はすでに極めて有力な候補遺伝子kinesin light chain 1 (Klc1)をモデル動物とtranscriptomicsの組み合わせというユニークな戦略により同定している。その候補遺伝子としての確実性を多角的に検証し、またそのメカニズムも探索するのが本研究の目的である。23年度は発現アレイ解析で得られた結果をもとにKlc1の各種スプライシングヴァリアント特異的な定量的PCRアッセイ系(real-time QPCR)を構築した。アレイ解析に用いた動物に加え、合計58匹に増やした背景遺伝子を混合させたAPP Tgマウスを用いて、Klc1 splice variant Eの発現量と脳内Aβ蓄積量が相関していることを確認した(R2=0.33, p<0.0001)。Aβ蓄積のないインブレッドマウスにおいてもDBAが他の2つストレイン(SJL-38.0% Tukey-Kramer HSD test p=0.0006)とB6(-48.8% Tukey-Kramer HSD test p<0.0001)よりもKlc1 splice variant Eの発現が低いことがQPCRで確認した。一方、Klc1の全体量はAβ量との相関も、ストレイン間の発現差もみられなかった。ヒト検体を用いた検討では約800名のDNA検体を用いたゲノム解析ではアルツハイマー病とKLC1の関連を認めなかった。剖検脳(n=24)を用いたtranscript解析ではKLC1全体量は変化ないが、KLC1 splice variant Eがアルツハイマー病で高値(+30.7%, p=0.0096 Student's t-test)であった。この結果はモデル動でみられた結果と一致する。common complex diseaseのリスク遺伝子の探索方法として、これまでにない戦略(ヒト個人差と発症の代わりにマウスストレインの差異とモデルマウスにおけるAβ蓄積量、GWASやQTL解析などゲノム解析の代わりにトランスクリプトミクス)を用いている。そのためうまくいくかどうかのリスクは高く、事前に研究戦術および予備実験を入念に行った。

これまでのところマウストランスクリプトーム、マウス遺伝子解析、ヒトトランスクリプト解析がいずれもKlc1の結果を支持している。さらに培養細胞を用いた機能解析も現在のところ結果を支持し、新たな示唆を加えている。Transcriptomics解析結果がQPCRで確認できた。スクリーニングでもちいたselection criteriaはfalse discoveryrate=0.001など極めて厳しいものを用いている。QPCRの確認実験でもBonferroni's correctionなど厳しい多重検定を用いている。異なる測定方法と厳しい検定でもKlc1がアミロイド病理に関与していることが強く支持された。一般に行われている他のomics研究よりも、本研究の候補遺伝子は信頼性はかなり高いと考える。さらにはヒトtranscript解析においてもKLC1 splice variant Eのアルツハイマー病への関与が示唆された。このようにmouse-to-humantranslational approachも期待が持てる状況である。以上のようにおおむね順調に研究は進捗しているし、今後の発展が期待できる状況である。1Klc1はマウスを一年加齢させた状態でのAβ蓄積量を説明する遺伝子である。その機能に関してはさまざまな可能性がありうる。現在の機能解析についてはKlc1 variant EがAβの産生段階で影響を与えているというものであるが、他の可能性を否定するものではない。現在の結果の確認の実験も行いながら、他のバリアントはどうか、Aβ産生以外の表現型はどうかということも確認していく。神経細胞死、突起進展の評価を行う。予備的結果が得られたら、安定発現細胞の構築も目指し結果の信頼性を問う。2mouse-human translationについてはトランスクリプトレベルでは高い支持が得られる結果が得られたが、より確信度を高めるためにはヒトゲノムレベルで支持される結果がえられるかどうか研究する必要があると考える。信頼性の高い研究がしやすいモデル動物を研究の出発点としているが、最優目標はヒトのアルツハイマー病である。今後はこれまでえられた信頼性の高いデータをもとにmouse-to-human translational approachを強化していく。ヒト研究に加え、もう一つの研究の柱はKLC1の機能解析になる。Conventionalなgenomicsに比べ、我々の行っているtranscriptomicsは発現差が病態に含まれていることが最初から分かっているという利点がある。機能解析は簡単な仕事ではないが、この利点を十分生かしながら研究を展開する。上記1について。マウスおよびヒトneuroblastomaにKlc1のvariant Eだけでなく他のvariatntも発現させ、Aβ賛成だけでなく神経細胞死や突起の進展への影響も評価していく。
水田土壌中における鉄還元の微生物学的機構とそのメタン生成阻害

温室効果ガスの一つであるメタンは、湛水水田土壌を含む様々な還元的な環境下において、絶対嫌気性細菌であるメタン生成細菌によって、酢酸またはH_2+CO_2を主たる基質として生成される。近年、各種水圏の底泥等からH_2や酢酸を電子供与体として鉄やマンガンを還元する嫌気性細菌が分離されてきている。湛水後の水田土壌中における還元過程において、鉄還元はメタン生成より優位にあるが、メタン生成の基質である酢酸やH_2の鉄還元の電子供与体としての消費は、メタン生成の抑制という点でも重要である。本研究では湛水水田土壌中の鉄還元の微生物学的機構とメタン生成との関係を明らかにするための検討を行い、以下の結果を得た。1.水田土壌中における鉄還元細菌の分布やその密度を知るために、鉄還元細菌の計数方法の検討を行い、好気的および嫌気的方法による最確値法とコロニー計数の方法をほぼ確立した。最確値法で計数した水田土壌中の鉄還元細菌数と2価鉄量の間には高い正の相関があり、それぞれ明確な季節変化を示した。それぞれ5月の湛水後から7月までは顕著に増加し、中干し後で水管理が間断灌漑となった7月下旬から9月までは減少し、刈り取り後はあまり変化しなかった。水稲根上にも鉄還元が検出され、その密度は顕著な季節変化を示した。2.水田土壌のメタン生成活性も2価鉄量とほぼ同様の季節変化を示し、水田土壌中の2価鉄量はメタン生成活性の指標となるものと思われた。鉄還元細菌数とメタン生成活性の間にも相関があった。3.土壌および水稲根を試料として酢酸、乳酸、フマ-ル酸さらにH_2を電子供与体とする嫌気性鉄還元細菌の集積培養を行い、酢酸以外の電子供与体については、鉄還元と電子供与体の減少が対応する集積培養を得た。これより鉄還元能を示す嫌気性細菌を分離した。
頭頸部癌におけるＥＳＲＰ分子の発現と分子細胞学的意義と臨床応用

ESRP1/2はEMT関連RNAスプライシングを調節する因子であり、今回我々は頭頸部扁平上皮癌におけるESRP1/2の機能解析および発がんおよび浸潤・転移過程における発現プロファイルを調べた。ESRP1/2は頭頸部正常扁平上皮内でほとんど発現していなかったが、異形成、浸潤癌において高発現していたが、間質への浸潤先端部分においてESRP1/2発現は低下しており、発現の可塑性が存在していた。さらに頭頸部扁平上皮癌細胞株を用いて機能解析を行ったところ、ESRP1はRac1b発現を抑制する事で運動能を抑制し、ESRP2はEMT関連転写因子の発現を抑制する事で運動能を抑制している事を明らかにできた。今年度はsiRNAを用いてESRP1をノックダウンした。SAS、HSC4、Ca9-22細胞のノックダウン効率は90-92%と良好であった。まず細胞形態について、ESRP1ノックダウンにて若干細胞同士の接着が弱くなり、scatteringが起こっていた。続いて、ESRP1のターゲット遺伝子であるCD44とMenaのisoformスイッチを確認したところ、ESRP1 knockdownにてCD44 variant⇒standard isoformへ、Mena 11a(+)⇒Δ6の変化が起こっていた。つづいてWound healing assayにてESRP1が癌細胞の運動能にどう影響するか調べたところESRP1ノックダウンしたSASおよびHSC4細胞において運動速度が有意に上昇した。E-cadherinの発現量および局在を確認したところ、ESRP1ノックダウンSASおよびHSC4細胞ではE-cadherinのmRNA量が若干低下するがタンパク量は明らかな低下が見られなかった。局在変化も膜局在のままであった。しかしながらPhalloidin染色により、ESRP1ノックダウンした細胞においてlong fillopodiaの形成が促進されており、細胞の運動能を調整するSmall Gタンパクの一つ、Rac1のスプライシングバリアントである腫瘍特異的Rac1bが上昇していた。PAK-GST pulldown assayにてESRP1をノックダウンすることで活性型Rac1bが上昇してくることも明らかにできた。続いてRac1bを選択的にsiRNAを用いてノックダウンすることでESRP1ノックダウンで上昇した癌細胞の運動能の増加がキャンセルされた。以上からESRP1は選択的スプライシングによりRac1bの発現を抑制することで癌細胞の運動を抑制することが分かった。当該年度の研究は主にヒト頭頸部扁平上皮癌細胞株を用いたin vitroで行った。頭頸部扁平上皮癌細胞株であるSAS細胞、HSC3細胞、HSC4細胞、Ca9-22細胞、Gun-1細胞、KUMA1細胞の6つのcell lineを用いて、mRNAレベルおよびタンパクレベルでのESRPタンパクの発現の有無を確認した。まずmRNAではすべての細胞株でESRP1遺伝子の発現を認めた。ESRP2遺伝子の発現はほとんど見られなかった。続いてSDS-PAGEウエスタンブロッティングにてESRP1タンパクの発現を確認したところいずれの細胞株で発現を認めた。以上より頭頸部扁平上皮癌細胞株でESRP1が何らかの影響を及ぼしている可能性が示唆された。他の論文よりESRP1が頭頸部癌幹細胞のマーカーの一つであるCD44のisoformの変化に関わっていることが示唆されており、具体的に6つの細胞株でのCD44isoformについて発現を検討したところ、いずれの細胞でもCD44 standard formの発現が乏しく、variant formの発現が有意に高かった。これはESRP1とCD44variant formの挙動が一致するという報告に一致する結果であった。増殖因子との調節の関係を調べたところTGFβ刺激で、SAS細胞およびGun-1細胞でCD44 isoformの変化およびESRP1の発現低下を確認できた。続いて、ESRP1のヒトでの組織局在を実際の舌癌症例の手術標本を使って免疫組織学的に確認したところ舌癌15症例中14例に発現を確認できた。さらに転移リンパ節内にも同様にESRP1発現があった。これはEMTを起こした癌細胞がリンパ節内では再度METを起こしている可能性が示唆された。今年度はin vitroに加えてin vivoでのESRP1タンパクの発現を確認することができた。最終年度の研究は、主に頭頸部扁平上皮がん細胞株を用いたESRP1およびESRP2の機能解析を行った。SAS細胞、HSC4細胞、Ca9-22細胞においてsiRNAを用いてESRP1およびESRP2をそれぞれ遺伝工学的手法で発現抑制を試みた。mRNAおよびタンパク発現が抑制された事を確認して、実験に用いた。