hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
アミノアシル-tRNA合成酵素に基質認識機構の解明と選択的阻害剤開発に関する研究

1 X-線結晶構造解析平成17年度は、以下の2点を計画した。(1)BsLysRSの反応中間体リジルアデニレート及びそのアナログとの複合体。(2)(1)にピロリン酸アナログを加えたもの。現在までに、(1)については、リジンスルファモイルアデニレートとの高解像度の結果が得られた。一方、(2)については、高解像度の結果は得られていない。しかし、L-リジンアミドとATPの三者複合体について高解像度の結果が得られた。これらの結果から、大腸菌LysRSで観測されていない構造変化を観察でき、BsLysRSの反応機構に関して新規な情報が得られた。2ピロリン酸アナログ及びヒドロキサメートの阻害機構の解析平成17年度は、以下の2点を計画した。(1)BsLysRSに加えて、Bacillus stearothermophilusのTrpRS(BsTrpRS)、大腸菌由来のTyrRSとTrpRS(EcTyrRSとEcTrpRS)、ヒト由来LysRS(hLysRS)におけるピロリン酸アナログの阻害を、ATP-PPi交換反応を用い反応条件を変化させて調べる。(2)ヒドロキサメートの阻害を、ATP-PPi交換反応を用い反応条件を変化させて調べる。(1)では、アナログ種とpHを変化させることにより、各酵素を選択的に阻害できることが明らかになった。(2)では、これら酵素が、特徴的な阻害をヒドロキサメートにより受けることが明らかになった。これらの結果から、各酵素の微細な活性部位での環境の差により阻害機構が大きく異なる可能性が示唆された。1.多様なアミノアシル-tRNA合成酵素のクローニングと発現本研究で新たに調製したものは、E.coli由来のTrpRSとTyrRS、B.stearothermophilus由来TrpRS、およびヒト由来のLysRSである。TyrRS以外はすべてC-末端にヒスチジンタグを付加した。電気泳動的に単一に精製し、ATP-PPi交換反応の速度論的パラメーターを算出した。これらの値は、すべてこれまでに報告されている値とよく一致した。2.X-線結晶構造解析クラスIIaaRSのモデルとして、B.stearothermophilus由来LysRS (BsLysRS)とL-リジン(及びアナログ)の複合体の結晶数例について解析を終了した。3.ピロリン酸アナログ阻害剤の探索phosphonoacetic acid、phosphonoformic acid、methylenediphosphate (Met-PPi)の阻害を検討したところ、Met-PPi以外の化合物は1mMまでで上記のaaRSを全く阻害しなかった。一方、Met-PPiはクラスIの酵素には1mMまでで阻害を示さなかったものの、クラスIIのBsLysRSに対しては顕著な阻害効果を示した。また、ヒト由来のLysRSに対しても阻害が確認された。ATPの代わりにβ,γ-methylene ATP (AMPPCP)を基質として用いたところ、BsLysRSではATPに比べて低いレベルではあるがL-リジンを活性化した。一方、BsTrpRS、E.coliTrpRSでは対応するアミノ酸の活性化を検出することができなかった。また、AMPPCPを阻害剤として反応系に添加した場合も、B.s.LysRSでは顕著なATPに対する拮抗阻害が確認されたのに対し、BsTrpRSでは1mMまでで活性の減少は有意には見られなかった。1 X-線結晶構造解析平成16年度は、以下の2点を計画した。(1)BsLysRS・L-リジン複合体+ATP(アナログ)。(2)BsLysRS・リジルアデニレート複合体+ピロリン酸アナログ。現在までに、これら結晶について高解像度の結果は得られていない。しかし、これまでに我々が報告しているBsLysRSの強い阻害剤、L-リジンヒドロキサメートと、ATPを共存させX-線結晶構造解析を行い、高解像度(解像度2.2Å)の結果を得た。この結果から、大腸菌LysRSで観測されていない構造変化を観察でき、L-リジンヒドロキサメートの強い阻害機構の一端が明らかになった。2ピロリン酸アナログ阻害剤の探索平成16年度は、BsLysRSによるβ,γ-メチレンATP(AMPPCP)依存的L-リジン活性化反応のエネルギープロファイルの決定を行った。(1)^<32>P-ピロリン酸存在下に、BsLysRS、L-リジン、AMPPCPを共存させ、^<32>P-ピロリン酸のATPへの取り込み反応を測定した。他の基質を大過剰にした条件で、AMPPCPのミカエリス定数(K_<m,AMPPCP>)と、k_<cat,AMPPCP>を決定した。これらの値は、ATPを用いた際のATP-PPi交換反応のK_<m,ATP>と、k_<cat>のそれぞれ約1/10、1/30であった。(2)^<32>P-ピロリン酸存在下のBSLysRSによるATP-PPi交換反応において、AMPPCPの阻害を調べると、条件によってはATPに対して拮抗阻害を示し、そのK_iは1のK_<m,AMPPCP>とほぼ一致した。(3)BsLysRSと、リジン、ArP、メチレンピロリン酸(MetPPi)を共存させ、生成するAMPPCPをHPLCで測定し、その最大速度を決定した。この値と、酵素初濃度から、k_<cat,PCP>を決定した。

この値は、k_<cat,AMPPCP>のほぼ10倍の値を示した。1 X-線結晶構造解析平成17年度は、以下の2点を計画した。(1)BsLysRSの反応中間体リジルアデニレート及びそのアナログとの複合体。(2)(1)にピロリン酸アナログを加えたもの。現在までに、(1)については、リジンスルファモイルアデニレートとの高解像度の結果が得られた。一方、(2)については、高解像度の結果は得られていない。しかし、L-リジンアミドとATPの三者複合体について高解像度の結果が得られた。これらの結果から、大腸菌LysRSで観測されていない構造変化を観察でき、BsLysRSの反応機構に関して新規な情報が得られた。2ピロリン酸アナログ及びヒドロキサメートの阻害機構の解析平成17年度は、以下の2点を計画した。(1)BsLysRSに加えて、Bacillus stearothermophilusのTrpRS(BsTrpRS)、大腸菌由来のTyrRSとTrpRS(EcTyrRSとEcTrpRS)、ヒト由来LysRS(hLysRS)におけるピロリン酸アナログの阻害を、ATP-PPi交換反応を用い反応条件を変化させて調べる。(2)ヒドロキサメートの阻害を、ATP-PPi交換反応を用い反応条件を変化させて調べる。(1)では、アナログ種とpHを変化させることにより、各酵素を選択的に阻害できることが明らかになった。(2)では、これら酵素が、特徴的な阻害をヒドロキサメートにより受けることが明らかになった。これらの結果から、各酵素の微細な活性部位での環境の差により阻害機構が大きく異なる可能性が示唆された。
円管内脈動流れの乱流構造に関する実験的研究

1.脈動周波数fが平均バースト周波数f_Bに比べて約1けた小さい脈動流れに着目し、4象限分類に基づく条件付抽出法により乱流構造を調べた。乱れは断面平均速度U^^ーmの変動に追づいして定常流の乱れと同じ組織的構造に基づいて壁近傍で発生し、減衰しながら半径方向に伝ぱする。このとき減衰の程度は定常流の場合と同じである。2.軸方向乱れ成分U′のrms値U′rmsの基本波とU^^ーmの基本波に着目したとき、両者の間にはΔtの時間遅れが存在し、U′rmsはU^^ーmに遅れて変動する。ここではΔtの最も小さい値をΔtgと表記し、その半径位置を乱れの発生位置Ygと定義した。この位置はY^+g〓20と表される。3.乱れの半径方向伝ぱ時間(ΔtーΔtg)は非定常性の影響を受けない。しかしΔtgはfが高いほど大きくなる。(ΔtーΔtg)とΔtgは時間平均レイノルズ数の増加とともに減少する。4.乱れの生成領域近傍の伝ぱ時間(ΔtーΔtg)は内部パラメータのU^^ー_*,taとνで整理できる。U^^ー_*,taは時間平均摩擦速度、νは動粘性係数である。5.管中心近傍の(ΔtーΔtg)はU^^ー_*,taと管半径Rを用いて整理できる。6.乱れの伝ぱ時間(ΔtーΔtg)に対して二つの実験式(壁近傍,管中心側)を提案した。両領域の境界は両式の交点とする。7.脈動流れのレイノルズ応力と総括うず動粘性係数のモデルを提案した。8.fを高くしていくと圧縮性の影響が現われ、時間的加速度だけでなく場所的加速度の影響の下で流れの再層流化が起こる。このときの組織的構造は定常乱流の構造と顕著に異なっている。9.圧縮性が乱流構造に及ぼす影響をみるために、乱流過渡流れの乱れの発生と伝ぱの特性を調べ、圧力波の重要性を指摘した。1.脈動周波数fが平均バースト周波数fBに比べて約1けた小さい脈動流れでは,乱れは断面平均速度Umの変動に追づいして定常の乱れと同じ組織的構造に基づいて壁近傍で発生し,その後減衰しながら半径方向に伝ぱする.このとき減衰の程度は定常流の場合と同じであり,また組織的構造に及ぼす非定常性(脈動周波数と速度振幅)の影響はほとんどないと考えられる.2.軸方向乱れ成分U′のrmsの基本波とUmの基本波に着目したとき,両者の間にはΔtの時間遅れが存在し, U′rmsはUmに遅れて変動する.ここではU′rmsのUmに対する遅れが最も小さいときをΔtgと表記し,その半径位置を乱れの発生位置ygと定義した.この位置はy^+g(コード)A2E220と表される.3.乱れの伝ぱ時間(Δt-Δtg)は非定常性の影響を受けない.しかしΔtgは非定常性の影響を受け,脈動周波数が高いほどΔtgは大きくなる. (Δt-Δtg)とΔtgは時間平均レイノルズ数の増加とともに減少する.

4.乱れの生成領域近傍の伝ぱ時間(Δt-Δtg)は内部パラメータのU_*, taとVを用いて整理できる.ここでU_*, taは時間平均摩擦速度, Vは動粘性係数である.5.管中心近傍の(Δt-Δtg)はU_*, taとRを用いてかなりよく整理できる. Rは管半径である.6.乱れの伝ぱ時間(Δt-Δtg)に対して,二つの実験式(壁近傍,管中心例)を提案した.両領域の境界は上記実験式の交点とする.7.脈動流れのレイノルズ応力と総括うず動粘性係数のモデルを提案した.今後の計画脈動周波数fを平均バースト周波数fBにできるだけ近づけて実験を行い,非定常性が乱流構造に及ぼす影響をより明確にしたい.可変速モータを用いて、試験管路の下流に取り付けたバタフライバルブを回転させ、脈動流れを発生させた。この方式によって脈動周波数をおよそ20Hzまで高くでき、バースト周波数にかなり近づけることができる。また脈動振幅はバフタライ弁の直径を変えて変化させうる。従来の実験における脈動周波数は2Hzまでであり、長さ5mの試験管路内の流れはほぼ非圧縮性流れとみなすことができたが、20Hzにもなると圧縮性の効果がでて管内には定在波が存在するようになる。このため、脈動周波数が低いときに比べて流れ場は非常に複雑になり、現在のところ乱流構造に関する実験結果を系統的に整理するまでにはいたっていない。そこで現時点で得られた成果をまとめると以下のようになる。(1)脈動周波数の増加につれて乱れの存在する場所は時間的にも空間的にも局所化される傾向が強くなる。すなわち時間的加速度だけでなく、場所的加速度の効果も加わった流れの再層流化現象がみられた。(2)上記再層流化過程における乱れの生成に関しては乱れの組織的構造が定常流の構造とどのように異なるのかを4象限分類に基づく条件付サンプリングにより調べた。流れが再層流化していく過程における乱れの生成に関してはSweepとOutward interactionが、一方乱れが発生する過程においてはEjectionとWallward interactionが重要な役割を演じていることがわかった。(3)入口近傍における乱流スラグの発生に及ぼす圧縮性の影響を詳しく調べた。具体的には電磁弁を用いて空気の乱流過渡流れのスラグの初生と伝ぱの機構を探った。最初のスラグの前縁の伝ぱ速度は従来定常流や脈動流で報告されている値よりもはるかに大きい。これは圧力波の伝ぱ特性に関係していると思われる。
癌転移開始細胞におけるCD280の生物学的役割の解明と癌転移診断や治療への応用

癌転移開始細胞(Metastasis-initiating cell,以下MIC)は、原発癌に巣喰う微量な細胞集団で、癌転移を積極的に仕掛ける。「MICの制圧」は癌転移抑止に必須であるが、MICの特異抗原が不明である等、未解明な点が多い。我々は独自のスキルス胃癌株の正所性移植癌転移モデルの解析から「CD280がMIC特異抗原の候補」である予備知見を得た。この成果を基に以下の3点を目的に掲げる。1様々な癌種からMICを単離し、そのCD280をゲノム編集でKOし、癌転移におけるCD280の生物学的意義を解明する、2CD280がin vivoで癌転移抑止の分子標的と成り得るか否かを検討する、3癌患者の血中循環癌細胞を対象にCD280が癌転移予測のバイオマーカーと成り得るか否かを検討する。以上の3点を明らかにするところまでを目的とする。昨年度から今年度前半までの検討で、各種癌患者組織からMICを単離することに成功した。前立腺癌や胃癌を中心に、術後癌組織を出発材料にして、MICを単離出来た。MICを単離後、以下の検討を行った。すなわち、ヒト前立腺癌MIC又はヒト胃癌MICにおけるCD280の発現上昇を見出したので、ゲノム編集手法にて、CD280ノックアウトを試みた。数種のガイドRNAの候補を設計し、ゲノム編集ベクターに組込む実験をし、ゲノム編集で有効性を示す1種のガイドRNAを決定することに成功した。今後、CD280をノックアウトしたMICを用いて、CD280の癌転移における意義解明を行う予定である。また、患者癌臨床検体におけるCD280の意義解明のため、患者癌組織や血液検体採取の体制づくり(倫理委員会等の審査を含む)も合わせて実施した。本年度(平成29年度)において、おおよそ研究実施計画書に記載した実験をひとつずつ実施した。粘り強く条件設定が必要な実験もあったが、それらを何とかクリアし、研究課題を軌道に乗せて、遂行している。平成30年度においても、研究実施計画書に記載した内容になるべく従い、実験を進めていく予定である。臨床検体におけるCD280の意義解明やCD280陽性MICのシングルセル解析など、科学的興味が高い実験を予定している。本年度の検討では、我々が確立した独自の手法で、各種患者癌組織からMICを単離することから着手した。前立腺癌や胃癌患者の癌組織を出発材料にして、MICを単離した。即ち、癌組織をコラゲナーゼ等で分散させた後、癌幹細胞専用培地(米国ProMab社)で培養後(いわゆるSphere culture)、BALB/c nude mouseに対して正所性に移植した。その後、転移巣からMICを樹立した。転移確率を上げるため、正所性移植を反復した。続いて、各種癌種由来のMICについて、CD280をゲノム編集でKOする作業を開始した。現在、CD280をKOするためのsgRNAを決定し、ゲノム編集効果確認の締めの実験(シークエンス解析)を行っているところである。本年度において、研究実施計画書に記載した実験をひとつずつ実施し、おおむね良好な実験結果を得ている。

数種のガイドRNAの候補を設計し、ゲノム編集ベクターに組込む実験をし、ゲノム編集で有効性を示す1種のガイドRNAを決定することに成功した。今後、CD280をノックアウトしたMICを用いて、CD280の癌転移における意義解明を行う予定である。また、患者癌臨床検体におけるCD280の意義解明のため、患者癌組織や血液検体採取の体制づくり(倫理委員会等の審査を含む)も合わせて実施した。本年度(平成29年度)において、おおよそ研究実施計画書に記載した実験をひとつずつ実施した。粘り強く条件設定が必要な実験もあったが、それらを何とかクリアし、研究課題を軌道に乗せて、遂行している。平成29年度において、研究実施計画書に記載のとおり、ゲノム編集でCD280をKOしたMICのフェノタイプ解析に進み、データを積み上げていく予定である。平成30年度においても、研究実施計画書に記載した内容になるべく従い、実験を進めていく予定である。臨床検体におけるCD280の意義解明やCD280陽性MICのシングルセル解析など、科学的興味が高い実験を予定している。
学習者の表出動作から心的状態を推定し集計・フィードバックするシステムの開発

議論時にリアルタイムで参加者の表出データを取得するために次のような実験装置を開発した.実験装置は,議論の当事者自身がポジティブ/ネガティブな心的状態かどうかを自己申告するためのワイヤレス押しボタン(bluetooth接続)とそれを収集・記録・集計するためのスマホアプリ,頭部の動きを検知するモーションセンサーと瞬きを検知する眼電位センサーを内蔵する眼鏡型デバイス(JINS MEME)とそのデータを収集・記録・集計するためのスマホアプリ,心電位計とモーションセンサーを内蔵する心拍センターとそのデータを収集・記録・集計するためのスマホアプリ,および動作主の表情をとらえるビデオカメラ(スマホ)からなる.上記実験装置を用いて研究討議の場面からデータを取得し,分析した.動作主の顔動画から人手でポジティブ/ネガティブと分類した表出データと,動作主本人が押しボタンによって申告したポジティブ/ネガティブの心的状態との一致度を調べたところ,評価基準を甘めに見積もっても7490%程度の一致率しかなく,自己申告データを機械学習のための教師データとして用いるには精度が不十分だということが判明した.しかも,押しボタンを押すという行為が議論への没頭の妨げになり,押すか押さないかの判断やタイミングもむずかしいということが分かった.このため,自己申告データではなく,表情を分析するソフトを用いてポジティブ/ネガティブの判断ができるかどうかを検証してみることにした.今後は表情分析ソフトまたは人手による解析データを教師データとして,主として眼鏡型デバイスから動作主のポジティブ/ネガティブの状態を推測することを目標に研究開発する.データ収集システムを構築し,実際にデータを収集して自己申告による心的状態と表出との関係について明らかにした.その結果,自己申告では表出の推定精度が低いことが分かったが,その可能性はもともと想定していた.実用化を考えた場合,討議や授業を行っている間,常にカメラで表情の動画撮影を行うということはあまり現実的ではないので,帽子や眼鏡などに取り付けたモーションセンサーから得られる頭部動作のデータからリアルタイムで表出(ポジティブ/ネガティブ)の認識を行うことを目標とする.それを学習させるために,教師データとして正しい表出のラベル付けを行う必要があるが,当初想定したボタン押下による表出の自己申告の基づくラベル付けでは十分な精度が得られず,また実際の運用が困難であることが分かったため,表情認識ソフトウェアを利用して表出のラベル付けをすることを試みる.表情認識ソフトウェアでも精度が不十分だった場合には,手作業によって認識精度を高める方策を考える.議論時にリアルタイムで参加者の表出データを取得するために次のような実験装置を開発した.実験装置は,議論の当事者自身がポジティブ/ネガティブな心的状態かどうかを自己申告するためのワイヤレス押しボタン(bluetooth接続)とそれを収集・記録・集計するためのスマホアプリ,頭部の動きを検知するモーションセンサーと瞬きを検知する眼電位センサーを内蔵する眼鏡型デバイス(JINS MEME)とそのデータを収集・記録・集計するためのスマホアプリ,心電位計とモーションセンサーを内蔵する心拍センターとそのデータを収集・記録・集計するためのスマホアプリ,および動作主の表情をとらえるビデオカメラ(スマホ)からなる.上記実験装置を用いて研究討議の場面からデータを取得し,分析した.動作主の顔動画から人手でポジティブ/ネガティブと分類した表出データと,動作主本人が押しボタンによって申告したポジティブ/ネガティブの心的状態との一致度を調べたところ,評価基準を甘めに見積もっても7490%程度の一致率しかなく,自己申告データを機械学習のための教師データとして用いるには精度が不十分だということが判明した.しかも,押しボタンを押すという行為が議論への没頭の妨げになり,押すか押さないかの判断やタイミングもむずかしいということが分かった.このため,自己申告データではなく,表情を分析するソフトを用いてポジティブ/ネガティブの判断ができるかどうかを検証してみることにした.今後は表情分析ソフトまたは人手による解析データを教師データとして,主として眼鏡型デバイスから動作主のポジティブ/ネガティブの状態を推測することを目標に研究開発する.データ収集システムを構築し,実際にデータを収集して自己申告による心的状態と表出との関係について明らかにした.その結果,自己申告では表出の推定精度が低いことが分かったが,その可能性はもともと想定していた.実用化を考えた場合,討議や授業を行っている間,常にカメラで表情の動画撮影を行うということはあまり現実的ではないので,帽子や眼鏡などに取り付けたモーションセンサーから得られる頭部動作のデータからリアルタイムで表出(ポジティブ/ネガティブ)の認識を行うことを目標とする.それを学習させるために,教師データとして正しい表出のラベル付けを行う必要があるが,当初想定したボタン押下による表出の自己申告の基づくラベル付けでは十分な精度が得られず,また実際の運用が困難であることが分かったため,表情認識ソフトウェアを利用して表出のラベル付けをすることを試みる.表情認識ソフトウェアでも精度が不十分だった場合には,手作業によって認識精度を高める方策を考える.
フィリピンにおける生活困難層の子どもへのケアサポートに関する研究

フィリピンにおける生活上の困難を抱える子どもへの教育と社会的ケアサポートに関する実情を把握し、問題解決への展望と課題を見出すことを目的としている。フィリピンのデイケアセンター(保育所)、養護児童施設、高齢者と子どもとの混合型施設や、養護者のいない子ども達への教育とケア実践をしているNPO等、訪問実績のある子どもの事業所、施設、団体等を中心に再訪し、保育士やケアスタッフ、ケアラー等に対するインタビュー、アンケート調査を実施する。また、先進諸国での子どもの教育とケアに関する文献研究や、国内の子ども・子育て支援に関するインタビュー調査も実施し、分析、検討する。その調査結果も踏まえ、社会発信する。
脊柱管狭窄症の新しい動物モデル ―病態解明、臨床症状も判断可能なラットモデル―

腰椎の変性、不安定性などに起因する腰部脊柱管狭窄症(狭窄症)は腰痛や下肢痛を主訴とする高齢者に多い疾患である。疼痛のために日常生活に支障をきたし、超高齢社会を迎えた日本においては社会的損失が非常に大きいものである。要因のひとつである黄色靭帯の肥厚メカニズムなどはいまだ解明されておらず有効な薬物療法が開発されていない。本研究の目的は行動解析により疼痛を客観的に判断することのできるラットを用いて狭窄症の動物モデルを確立することである。動物モデルで脊柱管狭窄を誘導し、脊柱管狭窄、黄色靭帯肥厚のメカニズムを究明する。本モデルは臨床症状を評価でき、薬剤の臨床前試験など創薬の開発への応用が期待される。
近世日朝間における漂流民送環の研究-実態分析を通じた送還制度の史的再検討と漂流民送還過程にみる日朝相互認識

池内敏「近世朝鮮人漂着年表(稿)15991872」(1996年、私家版)の改訂版「近世日朝漂着年表」を作成した。すなわち、調査を通じて新たに知りえた史料等により各漂着事件に関するデータを更新し、たとえば近世朝鮮人の日本列島漂着事件数を総数971件9768人と改めた。また、漂流民送還に携わった漂流民護送使の人名確定を進め、漂流海域の推定作業を行って漂流・漂着の相互関係について旧稿よりも精度を高めた。さらに旧稿には無かった近世日本人の朝鮮漂着関係年表を付した。今後の研究の基礎データとした。
プログラムのデータベースに関する研究

プログラムを例にとって、問題解決の方法など複雑かつ抽象的な知識を共有し再利用する仕組みについて研究を行なった。このような知識共有メカニズムに一般的に要求される性質として、解決すべき問題ないしは仕様から所望の知識を特定/検索できること(検索可能性)、その解決方法の妥当性(検証可能性)得られた解決方法が具体的な問題に適用可能であること(適用可能性)、の3点を特定し、そのプログラムの領域における例としてプログラムのデータベースの実現ついて検討した。1.検索可能性:プログラムをその仕様とともに蓄積し、仕様をキーとして蓄積データから検索することを考案した。具体的にはHoare論理にもとづく仕様記述を抽象コード断片に付与して蓄積することで実現する。2.検証可能性:Hoare論理にもとづく仕様記述はプログラムの構文要素ごとに付与することで検証証明となり得ることを利用し、検索結果出力に証明を付与する。証明はプログラム利用者の検査器を通じて検査できる。これにより仕様を充足することの検証可能性を提供する。3.適用可能性、抽象コードは変数名、型の調整を含めて所望の具体的コードに変換される。これにより具体的なプログラムとして使用可能になる。以上を基本方法として、さらに次の拡張を行なった。適合するプログラムコードが蓄積されていなかったときに、Hoare論理の合成規則の逆にしたがって仕様を部分プログラムの仕様に分解し,得られるもの(部分仕様)を新たな検索キーとして検索するという動作を再帰的に繰返し、コードが見つかった場合には、そのコードを分解時の規則を用いて再構成し、当初の検索キーに適合するコードとして出力することを提案した.新たに得たプログラムを蓄積データとしてフィードバックすることで利用ごとに強化されるWeb2.0的特徴を具備し得る。プログラムコードを蓄積/再利用する方法について報告する.プログラムコードのデータベースは従来から提案されてきたがいずれも,蓄積プログラムに関する属性記述が限定されており,特に意味から検索することはできなかった.また蓄積データ自体も特定の言語で書かれたプログラム専用であるうえに得られたプログラムの安全性についての保証は何もなかった.今回報告する方法は1.所望の意味をもつプログラムを容易に検索できること(意味検索可能性)2.検索の結果得られたプログラムが容易かつ安全に再利用できること(再利用可能性)の2つを目的とする.提案方法では,データ構造の集合論解釈と意味仕様に関する検証証明を蓄積プログラムに添付する.加えて,プログラム記述には「抽象コード」とよぶ,抽象的に計算を記述する方法を用いる.今回は「抽象コード」用の言語として「帰納的定義つき型理論」を選びこれに対してホーア論理にもとづく検証系を新たに開発した.リスト型データを集合と解釈する機構および抽象コードで書かれたプログラムおよび証明(木)をXMLで保存する様式と,Java言語への翻訳規則を定義した.これらによりクエリとして所望の仕様を集合論論理式で入力すればデータベース内の該当意味のプログラムを検索しJavaプログラムに翻訳して出力するシステムが実装可能となった.蓄積用の検証証明作成は,現在手作業作成で行なっているが本方法の実用性を高めるには既存のプログラムの(半)自動データ化の技術の確立が急務であることがわかった.実用的なプログラムの中には今回利用した型理論の記述力を越えるものも多くあり,型理論自体を蓄積データとして記述可能にする必要性が明らかになった.プログラムのデータベースの検索利用モデルの研究・実験に先だって実験用データベースの構築が急務である.今年度は既存のプログラム資源を再利用してプログラムコードのデータベースを構築する方法について検討した.本研究が提案するプログラムのデータベースの利用モデルはHoare論理による検証を基礎としており,検証の証明を仕様からの検索に利用するものである.データベース構築時にはしかし,証明を手作業で添付するには膨大な手間がかかり現実的ではない.既存のコード資源に関しては,仕様書は通常存在せずあったとしても満たしている保証はない.

そこで既存のコード資源を再利用して仕様保証プログラムのデータベースを構築するには,(1)コードから自動的に仕様を抽出し,同時に(2)その正しさを保証する検証証明を得る必要がある.ただしここで要求する仕様は製作意図としての本来の仕様ではなく検索時に利用できる程度の弱いものでよい.本研究では部分プログラムごとにHoare論理で保証できるだけの仕様を割り当てこれを再帰的に累積することでもとのプログラム全体の仕様を推定する方法を検討した.現在までに複合文,条件文について仕様推定方法が得られており,現在繰返し(while)文についていわゆるループ不変量の抽出方法を検討している.本方法はまた型推定とも関係があることが指摘されており検討を始めている.プログラム検証は本来厳密な要求仕様を与えて充足性検査をすることが目的であり検索という見地から応用を検討されたことはなかった.この見地からすれば検索用仕様に限定することである程度自動化できる可能性が出てきた.その一方で現在の方法で推定して得られた仕様は予想よりも複雑なものになり得ることが明らかになった.プログラムのデータベースの検証実験および運用性向上のため,(1)既存コード資源からのプログラムデータベース自動構築方法と(2)再生産により共有資源を増大させる方法について検討した.まず自動構築法では仕様抽出の理論的困難としてwhile文のループ不変量の抽出があるが,近年算術領域においては代数手法,とくにGroebner基底による方法が見出された.代数的方法の一種であるKovacs (Johannes Kepler大)らの方法は実用上有望であるが算術領域に限定されている.今年度はこの方法を演繹的方法に変換のうえ一般化することで(帰納的)データタイプなど算術以外の領域に拡張することを検討した.代数手法と演縄手法が密接に関係する分野としては幾何学自動証明がありその成果は検討に値する.再生産を容易にする方法としては,利用時の結果およびこれを部品として得られたコードを利用アプリケーション(クライアント)から蓄積サーバに自動的に返信・再登録する機構を設けて共有資源に寄与するしくみを検討した.これによって利用そのものが自動的に再生産につながり資源が爆発的に増大することが見込まれる.前年度までに得られた方法はプログラムを仕様とともに蓄積し,所望の仕様を問い合わせとして蓄積データとしてのプログラムを検索/取得するものであった.しかしながらこの方法では(1)検索にヒットするコードは蓄積されたコードがそのまま論理的仕様に完全に合致するものだけに限られる。この結果、蓄積したプログラムを組み合わせ、少し加工することで所望のプログラムが得られるはずであるにも関わらず、仕様に直接適合しないがゆえに棄却されてしまうという問題が生じる.利用度の観点からは、そのままでは仕様に適合していなくでも、わずかの加工で所望の論理的仕様に適合するようになるプログラムを見い出して、再利用する方法が望まれる。
マウス大腿骨骨折モデルを用いた軟骨の体内時計の機能の解明

本研究課題では、骨折部において治癒過程に形成される軟性仮骨(軟骨)における体内時計について検討した。この目的でマウス大腿骨骨折モデルを作成し、時計遺伝子の発光レポーターの活性を指標として、発光イメージングの手法で骨折治癒部に体内時計が存在することを示した。加えて、骨折治癒部の体内時計が副甲状腺ホルモン(PTH)投与により位相変位すること見出した。また、軟骨における体内時計の機能に迫る目的で、軟骨細胞のモデル細胞として知られるATDC5細胞株を用いた体内時計のアッセイ系を構築した。このモデル細胞においても、PTH投与で体内時計の位相変位が誘導できることを見出した。大腿骨骨折部の体内時計の存在を確認するためにマウス大腿骨骨折モデルを作成した。この目的で、体内時計の状態をホタルルシフェラーゼ(Luc)遺伝子を用いて可視化するレポーター遺伝子を導入したマウス(PER2::Lucノックインマウス)を用いた。発光イメージング装置を用いた観察により、骨折治癒部の軟骨組織に明瞭な概日リズムを示す発光を認めた。細胞レベルの評価ができるようにするため、軟骨細胞のモデルであるATDC5細胞を用いた検討を行った。初めに、未分化状態のATDC5細胞に、ゼオシン耐性マーカーと時計遺伝子Bmal1のプロモーター領域にLuc遺伝子をつないだBmal1:Luc遺伝子をもつプラスミドを導入した安定導入株を樹立した。この細胞を株化細胞で概日リズムを惹起することが知られていたデキサメタゾンで刺激した結果、明瞭な発光の概日振動が惹起された。ATDC5は、インスリン・トランスフェリン・亜セレン酸ナトリウム存在下に軟骨細胞に分化する。そこで、分化培地に置き換えて0、7、14、21日目の細胞の軟骨細胞のマーカー遺伝子(Col2a、Aggrecan、Col10a1)の発現量をリアルタイムPCR法により確認したところ、経日的にマーカー遺伝子の発現量が増加することを確認した。また、21日目のATDC5細胞を軟骨基質を染めるアルシアンブルーで染色したところ、明瞭な陽性反応を観察した。さらに、分化0、7、14、21日目それぞれの時点で、ATDC5細胞に明らかな概日リズムを認めた。これまでに、大腿骨を器官培養し、成長軟骨部に体内時計があり、副甲状腺ホルモン(PTH)によって位相変位する(時刻が変わる)ことを示した。そこでATDC5細胞に対し、PTHを投与して影響を評価したところ、Bmal1:Lucの発光リズムに位相変位が認められた。この反応の大きさはPTH投与タイミング依存的だった。以下に述べる通り、大腿骨骨折モデルを確立し、骨折治癒過程で軟骨に体内時計が存在することを明らかにした。また、骨折治癒部の体内時計の詳細の評価に重要な、軟骨細胞の体内時計を評価するための系を構築した。このことから、研究はおおむね順調に進展していると考える。具体的には、創外固定器を利用したマウス骨折モデルを確立し、組織レベルで観察が可能な発光イメージングシステムを駆使することで、骨折治癒部の軟骨に体内時計が存在することを見出した。骨折治癒部の軟骨における体内時計の生理的意義の評価を進める上で、組織レベルでの検討では、組織量や材料の均質性に関する問題が生じることが懸念された。このため、細胞レベルの評価系の準備が重要であると考えられた。ATDC5細胞を用いた実験系で体内時計による発光の概日リズムが観察できたこと、特に、軟骨に分化させた状態で概日リズムを観察できたことは、軟骨の体内時計の意義の理解を進める上で重要なステップであると考える。ATDC5細胞に対し、PTHを投与した場合に、体内時計の時刻依存的な位相応答が観察された。器官培養下の大腿骨においても、同様のPTHによる時刻依存的な位相応答が観察されており、軟骨細胞の体内時計の理解の目的でATDC5細胞を用いる妥当性を支持する結果だと考える。体内で約24時間周期を刻む体内時計は、様々な生理機能の日内変動をもたらす。体内時計の挙動を可視化することのできPer2::Lucノックインマウスを用い、骨折治癒過程に生じる軟骨における体内時計の概日振動を確認した。さらに、より生体内の状態を反映した培養系を確立する目的で、一部の腱は切除し、大腿骨、腓骨や橈骨を、膝関節を維持したまま採取し、発光イメージングすることを試みた。この結果、脱臼させて採取した大腿骨と同様に、成長軟骨板に強い概日リズムを認めた。さらに、膝関節部の関節軟骨にも明瞭な概日リズムを観察することに成功した。また、前年度に報告した軟骨細胞モデル(ATDC5)での細胞レベルでの体内時計のアッセイ系の発展として、骨芽細胞のモデル細胞であるMC3T3ーE1細胞で、温度に対する応答を検討した。MC3T3ーE1細胞にBmal1プロモータによって誘導されるホタルルシフェラーゼ遺伝子を体内時計のレポーター遺伝子として導入した細胞株を作成した。この細胞に対し、一過性の温度変化を加えたところ、体内時計の位相が温度依存的に変位する(時刻が変わる)ことを見出した。さらに12時間おきに温度を変えた場合には、温度リズムに同調した発光リズムが形成されることを見出した。重要なことに、温度を変えるパターンを逆にした場合には、発光リズムは逆転した。これらのことは、MC3T3ーE1の体内時計が、外部温度リズムに同調したことを示していた。

本研究課題では、骨折部において治癒過程に形成される軟性仮骨(軟骨)における体内時計について検討した。この目的でマウス大腿骨骨折モデルを作成し、時計遺伝子の発光レポーターの活性を指標として、発光イメージングの手法で骨折治癒部に体内時計が存在することを示した。加えて、骨折治癒部の体内時計が副甲状腺ホルモン(PTH)投与により位相変位すること見出した。また、軟骨における体内時計の機能に迫る目的で、軟骨細胞のモデル細胞として知られるATDC5細胞株を用いた体内時計のアッセイ系を構築した。このモデル細胞においても、PTH投与で体内時計の位相変位が誘導できることを見出した。今後、骨折治癒部の体内時計に関し、組織レベル、細胞レベルの解析を発展させたい。骨折モデルに関しては、体内時計の機能解析を進めるために、より適切な条件を検討する。軟骨の体内時計の生理的意義を議論するためには、体内時計に摂動を加え、出力に与える影響を検討することが重要だと考える。この目的で、PTHに加え、他の体内時計に影響を与える因子の同定を試みる。一例として、温度刺激を考える。体内時計の刻む一日の長さは、例えば高緯度の低温地帯でも、赤道部の高温地帯でも、ほぼ同じである。一方で、体内時計は外界の周期的な温度変化に対応してリズムを同調させることができる。体温リズムには明瞭な概日振動が知られることから、体温変化は、末梢組織(例として大腿骨軟骨部)に存在する体内時計を、体全体のリズムに同調させる因子の一つであると考えられる。体内時計の温度刺激に対する反応性について、組織レベル、細胞レベルで、検討を進めていく考えである。環境生理学適切な支出を心がけ、必要に応じた支出を行った結果、少額の未使用額が生じた。実験計画に大きな変更はなく、最終年度分と合わせ、適切に支出する。
元素分析AFM装置XANAMの開発

絶縁体表面にも適用可能な非接触原子間力顕微鏡と放射光X線を組み合わせた新しいナノスケール元素分析・化学状態分析法、X線支援非接触原子間力顕微鏡(X-ray Aided Noncontact Atomic forcemicroscopy, XANAM)の開発を行ってきた。これは探針-試料間の相互作用を試料原子の内殻電子励起が可能なX線で人為的に変化させることで、探針直下の元素種の同定や化学状態識別を可能とする手法であり、相互作用のX線による変化を詳細に調べ、また信号の高感度化、高空間分解能化に取り組み、探針によって元素種の識別が可能であることを示した。我々は絶緑体試料にも適用可能な原子レベル表面観察手法である非接触原子間力顕微鏡(NC-AFM)と放射光X線の組み合わせによる、元素選択性を有する走査プローブ顕微鏡、X線支援原子間力顕微鏡法(XANAM : X-ray Aided Noncontact Atomic ForceMicroscopy)の開発を行ってきた。我々はこれまでに(若手研究B(No.16750057),平成16-17年度等)、結合性あるいは反結合性軌道にX線で内殻の電子をたたき上げることで、NC-AFM探針と試料表面間の原子間力をコントロールしようとすると、試料のX線吸収端エネルギーでのみ、NC-AFM探針と試料間で原子間力の変化が生じる事を見出した。XANAMはこの現象を利用して、探針直下の元素種を識別し、2次元に元素マッピングを実現する手法である。一方で現有装置は原理実証を目的とした安価な装置である。そこで本研究では、試料調製機構、およびAFMプローブを改良して力場相互作用検出を高精度・高感度化し、空間分解能を向上させることを目的として実験を進めてきた。以上の改良により、表面の原子レベル化学マッピングが可能なXANAM法を確立することで、局所元素分析観察からナノデバイスへの応用展開が期待している。本年は二次元画像化をより詳細に検討するため、装置分解能向上を目的とした大きく2つの装置改良を行った。1、現有装置のピエゾ積層薄膜レバーは半導体プロセスにより作成されるためNC-AFM探針先端が鋭くなりにくい。そこで音叉型水晶振動子に金属細線を取り付けたQTF型AFMプローブに変更すれば格段の性能向上が期待できる。QTFは市販の32kHz音叉型水晶振動子(CMAC製φ2mm×6mm)を使用して、水晶振動子部分のパッケージングを除去し、音叉の片側に細線15μmの金属細線をマイクロマニピュレータで取り付けることで、新しいNC-AFMプローブを製作した。また新規に32kHz音叉型水晶振動子に適合するプリアンプも新調した。またQTFは試料と共に測定装置内を可搬できなくてはならないので、既存の搬送機構と出力信号電気配線を活かしたQTF用AFMプローブフォルダを新規設計・自作した。サイズは、15×12×8mm^3の非常にコンパクトな設計であり、これまでのピエゾ積層薄膜レバーと同等の可搬性を実現した。2、測定試料その場調製、表面処理装置の整備、試料冷却シュラウドシステムの自作等既存装置には直接内部で試料調製できる機構がなく、それまでは試料調製を別途行う必要があった。そこで真空層内で直接試料調製が行えるようクヌードセンセル蒸着源と水晶振動子式膜厚測定計の追加を行った。これにより微細に蒸着量をコントロールした金属・半導体部分蒸着基板試料を作成することが可能になった。また長時間試料位置を安定させるための、試料冷却シュラウドシステムを自作した。これでより安定に長時間の信号積算が可能となりS/N(信号・ノイズ)比の向上を行うことができた。また、他に試料としてNi_2P単結晶表面等の異種元素混合表面の検討を行った。以上より、本課題の根幹である異種原子混在表面のナノレベル表面元素分析を行う準備が整った。本年は昨年に引き続き、二次元画像化をのための装置改良を行った。1、QTF型AFMプローブに変更すれば格段の性能向上が期待できると考え、変更改良を行った。QTFは市販の32kHz音叉型水晶振動子(CMAC製φ2mm×6mm)を使用して、水晶振動子部分のパッケージングを除去し、音叉の片側に細線15□mの金属細線をマイクロマニピュレータで取り付けることで、新しいNC-AFMプローブを製作した。また新プローブを、名古屋大学と高エネルギー加速器研究機構で検査するためのテストシステムの作成を行った。しかし、本年度は以上の改良にもかかわらず、残念ながら分解能を向上したデータを出ることができなかった。この原因は金属細線の取り付けと先端処理が最適にできなかったためと分析した。本年度の予定が遅れてしまったが、本研究の根幹であることから、来年度引き続き行うものとする。具体的には、金属細線の前処理過程の改良を行う。

2、これまで測定試料の作成は、外部の別装置を用いて行う仕様であった。また金属蒸着ソースも一つしかなく、一回の実験では一つの元素種のみの実験が行える仕様であった。今年度はこれを改良し、新たに3元蒸着系の取り付けをおこなった。3.これまでの蒸着試料に加え、新たな方法でXANAM試料を作成した。イオン液体という室温でも液体である塩に対してプラズマ蒸着を行うと均一粒径を持つナノ粒子がイオン液体中に生成する。このナノ粒子をHOPG、TiO2単結晶基板に固定化して、試料として使用した。これまでのところ、粒径が5nm程度であるため、分解能評価に有利に有利な試料であることが判明した。2の試料と合わせ、XANAM試料として今後の研究に使用する事にした。本年は昨年に引き続き、二次元画像化の高分解能化を目指した装置改良を行った。1、昨年度に改良を施したQTF型AFMプローブにて2次元画像化測定を開始した。作成法は、昨年度と同様にQTFは市販の32kHz音叉型水晶振動子(CMAC製φ2mm x 6mm)を使用して、水晶振動子部分のパッケージングを除去し、音叉の片側に細線15・mの金属細線をマイクロマニピュレータで取り付けることで、新しいNC-AFMプローブを製作した。しかしながら、本年度も、分解能を向上したデータ取得には今一歩であった。この原因は金属細線の取り付けと先端処理が最適にできなかったためと分析した。本研究の根幹であることから、来年度引き続き行うものとする。具体的には、金属細線の前処理過程の改良を行う。さらに、これまで個別に操作を行っていたX線制御系とAFM操作系をできるだけ統合する操作系の改良を行うため、日本ナショナルインツルメンツ社製のPXIコントローラとLabViewを購入しプログラム構築作業を開始した。最終年度である来年度で、統合した制御モジュールを作成し、既存のコントローラ系に導入することで、人為的に操作ミスを防止し、汎用性・効率性の高い操作系の実現を目指す。2.これまでの蒸着試料に加え、新たな方法でXANAM試料を作成した。イオン液体という室温でも液体である塩に対してDCスパッタによる金属蒸着を行うと均一粒径を持つ金属および酸化物ナノ粒子がイオン液体中に調製できる。これらのナノ粒子としてAu、In、W、Mo等のナノ粒子を調製しHOPG、TiO_2単結晶基板に固定化して、試料として使用した。こうして作成した試料は粒径が5nm程度のナノ粒子基板上に吸着・分布しており、XANAM分解能評価に使用して上記の実験を行った。本年は昨年に引き続き、二次元画像化の高分解能化を目指した装置改良、およびより評価に最適な試料調製を行った。1.大部分の装置改良は前年度までに終了したが、残る課題として空間分解能を評価するためのXANAM測定に適した探針の作成法は未だ歩留まりが悪く改良が必要であった。そこでまず、探針作成の歩留まりを向上するシステムの構築を行い測定の高効率化をはかった。評価は、これまでと同様に、XANAMスペクトル測定や元素選別、化学状態選別マッピング像の取得を行った。
口腔癌の癌遺伝子、癌抑制遺伝子の解析と診断への応用

ヒト癌は正常細胞に複数の癌遺伝子・癌抑制遺伝子の変異が多段階でおきた結果と考えられる。本研究では口腔扁平上皮癌(SCC)に焦点をあて、その発癌機構の解明と診断への応用を目標として、rasとEGFR癌遺伝子活性化とp53癌抑制遺伝子の不活化について解析した。ras活性化の解析:29例のSCC手術材料のNー,Hー、Kーrasの12、13、61番目のコドンの変異をPCR増幅ーオリゴヌクレオチドプロ-ブ法、PCRー1本鎖DNA構造多型性解析(SSCP)法を用いて検索したが、2つの細胞株を除いて変異ま見いだせなかった。さらにHーrasの活性化を見いだした細胞株について病理切片を用いて検討したところ、1例では初診時の原発巣で既に活性化がおきていた。一方白板症を経てSCCを発症した他の例では細胞株樹立の際の、SCCには変異が見られたが、白板症、非癌部に変異は見いだせなかった。口腔SCCにおけるras遺伝子活性化の頻度(6%)は大腸、肺等の線癌で見られる頻度(40ー90%)と比較し有意に低く、従ってrasの活性化はSCC発症にとって重要ではないと思われる。p53遺伝子不活化の解析:15のSCC樹立細胞株についてcDNAーSSCP,exonーSSCP法を用いて変異の有無を解析した。その結果、14株に変異を検出し、変異の内容を決定した。変異はコドン126から305にわたって見つかりまたホットスポットとしてコドン248が3例、エキソン6のsplicing donor変異が2例見つかった。点突然変異は13例でそのうち10例はmissense変異であった。上皮成長因子受容体(EGFR)の解析:4例の口腔SCCについて調べたところEGF結合能がいずれも上昇していた。従ってp53遺伝子変異とEGF結合能の上昇は口腔SCC発症に深く関わり、SCC診断のマ-カ-となりうる事が明らかとなった。34例の口腔腫瘍組織(扁平上皮癌29例、腺様襄胞癌3例、エナメル上皮腫3例)及び5例の口腔扁平上皮癌細胞株のDNAについて、N-、H-、K-ras遺伝子で活性化の見いだされている12、13番目と61番目のコドンを含む領域をそれぞれ約10億倍増幅した。増幅したDNAについて、合成オリゴヌクレオチドを用いてコドン12、61の活性化を検索した。その結果以前にトランスフェクション法、RFLP解析で異常が確認された1例の細胞株においてcーHーrasー1のコドン12にglyからserへの置換が見いだされたが、他の検体では認められなかった。現在nonーdenaturing gelによる点突然変異の有無の検出法の検討を行っている。II.トランスフェクション法によるras以外の活性化癌遺伝子の検索NIH3T3細胞による口腔扁平上皮癌DNA及び骨肉腫細胞DNAのトランスフェクションを試みたが、第2次、第3次トランスフォ-マントで共通のalu DNA断片を検出できなかった。またSHOCK細胞でのトランスフォ-メ-ション効率を各種癌遺伝子で比較したが、NIH3T3細胞とほぼ同様であった。以上の理由でこの方法によるras以外の癌遺伝子の検出は困難と考えた。III.骨肉腫における癌抑制遺伝子の解析5株のヒト

骨肉腫細胞株についてRbおよびp53癌抑制遺伝子の構造、発現を解析したところ、Rbは3株にp53は4株にDNA、RNAレベルでの異常を検出し、タンパク質レベルではRbは上記3株に、p53は5株の全てに発現の喪失あるいは構造異常を認めた。口腔扁平上皮癌(SCC)における<ras>___ー遺伝子活性化の解析:29例のSCC手術材料のNー,Hー、Kー<ras>___ーの12、61番目のコドンの変異をPCR増幅ーオリゴヌクレオチドプロ-ブ法を用いて検索し、変異が見いだせなかった(前年度報告)。本年度においては、PCRー1本鎖DNA構造多型性解析(SSCP)法を用いてコドン13の変異を検索したが、変異は同様に見いだせなかった。一方、HOC313、ZAの細胞株ですでにHー<ras>___ーのそれぞれコドン12、13に変異を見いだしているが、細胞株樹立の際の病理切片について検討したところ、同じ変異を検出できたことから、2細胞株の変異は細胞株樹立の段階以前に生じたものと考えられた。この2例と前者の29例の結果から、口腔SCCにおける<ras>___ー遺伝子活性化の頻度(6%)は大腸、肺等の腺癌で見られる頻度(40ー90%)と比較し有意に低い。なおHOC313では原発巣の病理切片に変異が見いだされ、前癌病変とされている白板症を経過してSCCを生じたZA症例では、白板症部分に変異はこれまでのところ見いだされていない。癌抑制遺伝子の解析:本学歯学部で樹立した細胞株17についてRb、p53の癌抑制遺伝子の構造・発現異常をPCR増幅ーSSCP解析、免疫沈降、アデノウイルスE1A蛋白質との複合体形成法を用いて検討した。その結果、Rb蛋白質に異常は見いだされなかったが、p53遺伝子の構造・発現については全例に異常を認めた。以上の結果はこの遺伝子の構造・発現異常がSCC発症に深い関わりをもつことを示唆し、SCCの病理診断の有力なマ-カ-となるものと思われる。なおE1A蛋白質と結合し癌抑制性機能を持つと考えられている107K,300K蛋白質の発現異常は上記扁平上皮癌、5つの骨肉腫細胞株のいずれにも見いだされなかった。口腔癌の約90%をしめる扁平上皮癌(SCC)について、ras癌原遺伝子の活性化は腺癌等に比べて低頻度であるが、p53癌抑制遺伝子の発現異常が高頻度で見られる事を、これまでの研究で明らかにした。本年度においてはこれらの2つの遺伝子異常に焦点をあて研究を行い以下の成果を得た。(1)樹立細胞株でHーras遺伝子の活性化の見つかったHOC313及びZAの2症例について活性化がいつどの部位で生じたかを手術材料・病理切片を用い、活性化変異部位を含むDNA断片をPCR増幅し、オリゴヌクレオチドプロ-プ、制限酵素多型法により検討したところ、HOC313については初診時の原発巣で既に活性化がおきていることが判明した。一方前癌病変と考えられている白板症を経てSCCを発症したZAの症例については細胞樹立の際のSCCを含む手術材料で活性化が見いだされたが、白板症及び非癌部では変異が見いだされなかった。この事実からras遺伝子はSCC発症の際に生じたものと考えられ、白板症病変が直接SCCとなる直接の証明はできなかった。(2)p53の発現異常を認めた15のSCC樹立細胞株についてcDNAーSSCP,exonーSSCP法を用いて変異の有無を解析した。その結果、14株にp53遺伝子変異を検出し、変異の内容をPCR増幅DNA断片を用いた直接DNA塩基配列法で決定した。変異はコドン126から305にわたって検出され、ホットスポットとしてコドン248が3例、エキソン6のsplicing donor変異が2例見つかった。点突然変異は13例でそのうち10例はmissense変異であった。