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西ドイツの大連立政権の東方政策に関する研究

本研究では、大連立政権期の東方政策に関して、外交交渉、政党政治、国内政治の三つの観点から検討した。研究の成果として、共著や雑誌論文の刊行、国際セミナーを含む学会報告などを行った。これらを通じて、大連立政権の東方政策が、政権を構成するキリスト教民主同盟/社会同盟とドイツ社会民主党の間の対立をはじめとする様々な制約の中で、後のブラント政権の東方政策による革新的要素を準備しつつも、それを政権期関内には実現できなかった背景を分析することができた。2年目に入り、ドイツでの現地調査や関連資料などの収集を引き続き行った。2013年9月のドイツでの現地調査では、コブレンツの連邦文書館、ボンの社会民主党文書館、ベルリンの外務省文書館において未公刊一次史料の調査を行い、またボン大学図書館などで関連資料や文献の収集を行った。このドイツでの調査に加えて日本でも関連文献の収集及び分析に取り組んだ。これらの現地調査や資料収集などに基づき、下記の「現在までの達成度」の項で述べるように大連立政権期の東方政策に関する時系列的整理に取り組む一方、研究実績としては次のような研究発表を行った。まず、当該研究テーマに関連して2013年9月にセルビア・ベオグラードの国際セミナーにて報告を行った。このセミナーの成果は論文集として刊行される予定である。次に2014年1月にドイツ現代史研究会の例会にて、大連立政権期に考案された外交構想を含む西ドイツ外交の分断克服への戦略に関する報告を行った。こうした研究発表と並行して、当該研究と時期的に重なるテーマを扱う冷戦史研究者の著作に関するコメンテーターとして報告し、同時期における西ドイツの東方政策を他の西側同盟国との関係の文脈で捉え直す点などで有益な示唆を得ることができた。以上の研究発表に加えて、前年度に国際セミナーにて発表したテーマに関する英語での論考を公表した。そこでは、「研究目的」でも触れたように、大連立政権期にも見られるドイツの国際社会での自己主張に注目してヨーロッパにおけるドイツの役割について考察した。初年度は、交付申請書に記載した計画に沿って、まず現地調査及び関連資料や文献の収集に取り組んだ。2012年8月9月のドイツでの現地調査では、第一次史料や文献について文書館等での史料調査を行った。当該研究テーマに関しては、既に史料集が公刊されているものの、それらは限定的な形であり、現地での未刊行史料を調査することで、公刊史料だけではうかがい知れない外交交渉や政党間の意見調整に関する貴重な知見を得ることができた。また現地調査の一環として、より効果的な史料収集のためにも、文書館の専門家や本テーマに関わる研究者とのコンタクトを図り助言を求めた。とりわけキリスト教民主同盟(CDU)の個人文書や党議事録が所蔵されるボン近郊アデナウアー財団の文書館において、当該研究テーマに関する重要な史料集の編集に携わる専門家とコンタクトが取れ、史料収集について有益なアドバイスを得ることができた。さらには、国際学会の報告のために訪れたクロアチアのザグレブにおいて、当該研究テーマに関して専門家から貴重なアドバイスを得ることができた。またドイツでの現地調査と並行して、日本において、研究目的で挙げた三つの視座に関連する文献の収集・分析を行った。これらの現地調査や日本での文献収集・分析に加えて、当該研究に関連するテーマについて国際学会等で研究成果を報告した。とりわけ2012年9月にセルビアのベオグラードとクロアチアのザグレブで行われた国際セミナーでは、当該研究テーマを含むドイツ外交に関する報告を行い、また日本国内でも研究会報告を行うなど研究成果を発表した。さらには当該研究テーマに関連して、戦後ドイツの国境問題と独米関係に関する論考を英語にて発表した。最終年度に入り研究成果をまとめる作業に取り組んだ。まず、大連立政権期の東方政策に関する現地調査を短期ではあったが9月に行った。そこでは、ボンの社会民主党文書館やコブレンツの連邦文書館で未公刊一次史料の収集を行うとともに、ボン大学図書館などで関連する資料や文献の調査を行った。またこうしたドイツでの調査に加えて、前年度までに引き続き日本でも関連文献の収集及び分析に取り組んだ。これらの調査や資料収集をもとに、前年度に引き続き大連立政権期の東方政策に関する時系列的整理に関して、申請書で述べた「外交交渉」「政党政治」「国内政治」の三つの視座から取り組んだ。この時系列的整理に基づき、研究実績としては次のような研究発表及び成果を公表した。まず、当該研究テーマに関連して、大連立政権期の核不拡散条約(NPT)政策に関する研究報告を、2014年9月にベオグラードの国際セミナーで行った。このセミナーの成果は2015年3月に論文集として刊行された。これに関連して、前年度の国際セミナーで発表した研究報告に関する論考も、2014年12月に論文集として刊行された。次に、大連立政権期の東方政策やNPT政策に関連して、2014年11月にドイツ・ヨーロッパ研究センター(DESK)主催の公開ワークショップ「日独外務省政策担当者秘密協議と日本の核武装」にて西ドイツの核政策の観点からコメンテーターを務めた。

さらには、同月本務校の法学研究所が主催する市民学生講座にて、当該研究テーマに関連して西ドイツとポーランドの関係に関して報告を行い、これは2015年3月に同研究所の発行する所報で公表された。加えて2014年11月には、大連立政権を構成していたドイツ社会民主党に関する論考も発表した。国際関係論上記の「研究実績の概要」の項で述べたように、研究計画に沿う形で、当該研究テーマに関する現地調査や資料収集などを行い、また関連テーマに関する研究発表を行った。資料収集については、前年度に現地の文書館で依頼した複写が許可されなかった理由がわかり、あらためて史料の複写を依頼することができた。本年度は当該テーマに関する現地調査を一度行ったが、これらを踏まえて最終年度に補完的な形で現地での調査を行う予定である。こうした現地調査や資料収集などと並行して、大連立政権期の東方政策に関する時系列的整理にも取り組んでいる。まず「研究目的」で挙げた研究視座の一つである「外交交渉」に関して、近年発表された先行研究や、未公刊史料及び刊行されている外交文書などに基づいて、1966年から1969年の東方政策の時系列的な整理を行っている。またこれも研究視座の一つである「政党政治」について、大連立政権を構成するキリスト教民主・社会同盟(CDU/CSU)と社会民主党(SPD)の二大政党の党内の意思形成過程に関する資料収集を行い読み進めている。そしてもう一つの研究視座である「国内政治」に関連して、いわゆる「1968年」に関する文献の収集などに取り組み、西ドイツ政府の東方政策との関係についても検討を進める予定である。以上の点から研究計画はおおむね順調に進展していると言える。初年度は交付申請書に記載した計画に沿って、まず現地調査及び関連資料や文献の収集に取り組んだ。具体的には2012年8月9月の現地調査で第一次史料や文献について次の文書館等での史料調査を行った。すなわち、ドイツ社会民主党(SPD)の代表的な政治家の個人文書や未刊行史料の所蔵されるドイツ・ボンのフリードリッヒ・エーベルト財団の文書館、政府関係者の個人文書や首相府等の省庁の未刊行文書が所蔵されるドイツ・コブレンツの連邦文書館、キリスト教民主同盟(CDU)の個人文書や党議事録が所蔵されるボン近郊アデナウアー財団の文書館、そして未刊行の外交文書が所蔵されるドイツ・ベルリンのドイツ外務省文書館や連邦文書館である。さらに申請者がかつて留学していたボン大学の図書館で文献収集及び複写を行った。また現地調査の一環として、文書館の専門家や本テーマに関わる研究者からアドバイスをいただき、より効果的な史料収集の一助とすることができた。SPDの文書館において複写を依頼していたいくつかの史料が複写許可を得られないなどの問題点はあったが、初年度の現地調査についておおむね順調に進展しているといえる。次に、日本での関連文献・資料の収集について、ドイツでの現地調査と並行して、日本において、研究目的で挙げた三つの視座に関連する文献の収集を行った。当該研究テーマについては近年一次史料に基づく研究成果が発表されており、それらの収集・分析に取り掛かっている。
残存資料の収集整理を基本とした炭鉱関連建造物に関する研究

本研究は、日本の近代化を支えた炭鉱に関連する建造物の調査及び現存しない建造物の図面や古写真等の資料の収集・整理を通して炭鉱関連建造物の実態を明らかにするための基礎的な研究である。対象としたのは炭鉱主の住宅、社宅、倶楽部、事務所、病院である。図面として、麻生家の本家・分家・別邸、貝島家の本邸・別邸、三井三池鉱業所の病院・倶楽部、三井山野鉱業所の倶楽部が比較的残っている。三井鉱山各鉱業所では沿革史に図面が添付され、他の会社に比べ建造物の実態が把握できる。倶楽部は職員と従業員とに別れており、三井鉱山の場合、職員倶楽部は接待・宿泊に供され、従業員倶楽部は日々の娯楽を主としたものであった。数は少ないが社宅管理台帳から三井鉱山・住友石炭鉱業・麻生商店の社宅の間取が確認できる。従業員社宅では大正中頃から2室式が造られ、昭和になって2室式が普及し、3室式へと改良が進められていった。三井鉱山では2階建が推進された。職員社宅でも居室の南面化・台所の北面化等で改良が見られる。現存していた社宅は建て替えが進んでおり、炭鉱を象徴する景観の一つであった連続して建ち並ぶ社宅を残すのも僅かである。古写真は、図面が少なかった事務所に多く、炭鉱主の住宅・倶楽部・病院は少ない。事務所・倶楽部・病院とも外観を洋風とすることで共通する。事務所は機能が多岐に亘り、本部事務所以外に商社的な機能を主とした港に建つ支店がある。平面的に拡がった本部事務所に対して、支店は海からの視線を考慮した造形である。炭鉱関連建造物は徐々に少なくなっているが、北部九州におけるそれらの大きな特色は、地元資本の炭鉱主の多様な邸宅であり、近代和風大邸宅に関する研究において炭鉱主の住宅は重要な位置を占めると考えられる。実測調査を予定していた建物は所有者の都合等により調査が出来なかった。実際に実測を行ったのは解体予定で緊急性を要した、旧三井山野鉱業所(福岡県嘉穂郡稲築町)葉月社宅の2階建社宅1棟(昭和16年)と旧三井田川鉱業所(福岡県田川市)松原社宅(昭和12年)1棟、現在、ダイヤ機械(株)福岡製作所の社宅として使用中である旧三菱飯塚炭礦(福岡県嘉穂郡穂波町)の中野社宅3棟(昭和16年)である。後者に関しては、収集した『社宅台帳(見取図)』(ダイヤ機械(株)福岡製作所所蔵)に基づきながら平面構成について日本建築学会九州支部研究報告会で講演を行った。九州大学石炭研究資料センター所蔵の旧三井山野鉱業所の倶楽部の設計図、大牟田市立図書館所蔵の旧三井三池鉱業所の倶楽部の設計図、明治鑛業の『北九州版炭礦圖皇紀二千六百年』(昭和16年)、『株式會社麻生商店二十年史』(昭和13年)をはじめとする各会社の社史や写真帳所載の倶楽部や労使協調機関の会館の写真等の資料、直方市石炭記念館所蔵の『筑豐石炭鑛業組合月報』(昭和2年5年)の記事等に基づきながら従業員用慰安娯楽施設の特徴について考察を行った。三井文庫所蔵の『三池鑛所沿革史』の中から重要文化財指定の万田坑の図面、『三井鑛山五十年史稿』から三井田川鉱業所の従業員社宅の間取図等の資料を収集した。九州大学石炭研究資料センター

所蔵の麻生家文書の中の工事日誌等から住宅の建設・改修に関わる事項を拾いあげている。炭鉱関連の資料収集は、主として九州大学石炭研究資料センター所蔵の「麻生家文書」と三井文庫寄託の『三池鉱業所沿革史』で行った。「麻生家文書」の建築関係の資料の中で特筆されるのは、明治28年の「石炭坑場竪楼用檜木材取調書」、明治35年の「麻生商店職工舎宅平面図」、同年の「役員舎宅弐軒續壱棟建築積り書」、明治30年代後半以降の「豆田坑所長宅」平面図、大正元年の「病院舎宅建築仕様書」などである。明治27年度から昭和8年度までの麻生家の『日誌』の中から建築に関する事柄を抽出しているところである。『三池鉱業所沿革史』の中の資料では、職員社宅の標準化が昭和13年に完成し、甲乙丙丁と区別された社宅の間取りが、甲には7種類、乙には9種類、丙には12種類、丁には2種類あり、多様であったことが今まで知られていなかった。その他、沿革史から社宅以外の建築関連の図面や写真等の資料を収集した。三井田川・三井山野・住友忠隈の各炭鉱に関する従来までに収集していた資料及び今年度収集した資料に基づいて「筑豊における昭和期の炭鉱住宅について」を執筆した。「麻生家文書」は膨大な量であり、三井文庫には他の鉱業所の沿革史等があり、来年度も調査を継続する予定である。建築の調査では麻生本家の実測調査と大牟田市内の悉皆調査を実施した。麻生本家では室内展開を主とした調査を行った結果、他の炭鉱主の住宅を含めた室内意匠の分析が可能なデーターが備わり、今後考察を行う予定である。平成9年3月の三井三池炭鉱の閉山から5年が経過した時点での炭鉱関連施設の残存状況を調査したが、文化財以外には主要なものはないことが把握され、古写真の収集を並行して行った。三井文庫寄託の『三池鑛業所沿革史』『田川鑛業所沿革史』『山野鑛業所沿革史』『本洞鑛業所沿革史』『松島炭礦沿革史』『砂川鑛業所沿革史』『芦別鑛業所沿革史』『三井美唄鑛業所沿革史』『珊瑠鑛業所沿革史』等から炭鉱関連施設に関する記録と図面を収集した。図面は社宅が主で、珊瑠鉱業所の役員倶楽部・共愛倶楽部、美唄鉱業所・松島炭礦の所長社宅の図面は珍しい。それらの資料の一部を用いて『三井鉱山(株)各鉱業所における二階建従業員社宅について」を執筆した。『三菱社誌』からは炭鉱関連施設の建設に関わる記事を収集した。尚、施設に関する記事は明治中期から大正期にかけてのものが主であった。九州大学石炭研究資料センター所蔵の麻生家文書の中から工事日誌や建設にかかわる文書、間取図等を収集した。例えば、間取図では明治35年の「役員舎宅弐軒續壱棟」や明治36年の「立岩家」等で、いずれも貴重な原資料である。麻生セメント(株)所蔵の職員社宅の管理台帳には131棟(1戸建62棟・1戸建二階建7棟・2戸建62棟)と寮・倶楽部が含まれている。殆どの社宅が現存しておらず、貴重な資料ではあるが、間取図だけで詳細なデーターはない。大規模な二階建社宅が他の炭鉱の社宅と比べて特殊である。現存する建造物の調査は、旧中島邸(佐賀県多久市)、旧高取新宅(佐賀県唐津市)、旧高取邸(重文、唐津市)、旧貝島太助邸茶室(福岡県鞍手郡鞍手町)、旧貝島家友泉亭別邸(福岡市)、旧三菱上山田炭鉱二階建社宅(福岡県山田市)で実施した。これらの中で、旧中島茂邸では主要な5部屋の展開を実測し、旧貝島太助邸茶室では平面と展開を実測した。旧三菱上山田炭鉱の二階建社宅は昭和3年の建設で、筑豊における貴重な二階建社宅であり平成15年12月の解体前に平面の実測を行った。旧高取邸(唐津市)は保存修理工事中であったが、居室棟の大正7年(墨書)建設を確認した。
肺胞洗浄液中サイトカイン分析による急性呼吸不全の発症・重症化機序の解明

過剰炎症反応の結果としての敗血症性肺障害と臓器/末梢血中サイトカイン(IL-6,IL-8,IL-10)との相関について、2年間に亘り検討を加えた。1。サイトカイン測定用検体としての普通吸引喀痰の有用性:(1)過剰炎症反応が生じている症例での各サイトカインの普通吸引喀痰/血中濃度比がそれぞれ、TNFa≒80倍前後,IL-6≒800倍前後,IL-8≒1500倍前後、IL-10≒20倍前後という成績が得られた。従って、普通吸引喀痰でのサイトカイン成績は肺での炎症病態を十分に反映していると考えられる。(2)肺胞洗浄液(BALF)は連続数回の採取がルーチンとされているが、連続3回のBALFをそれぞれ独立の検体としてサイトカインを測定したところ、特にIL-8は第2回目以降の検体で激減することが判明したため、BALFは初回の検体のみで検討すべきであり、この事実からも普通吸引喀痰で充分と考える。2。lL-10の成績による予後予測の可能性:前述のように、順調な術後経過を辿る食道癌根治術症例でも、IL-6やIL-8の喀痰/血中濃度比は極めて大きかったが、種々の疾患・病態でIL-10の測定値が3桁となった症例の殆どが死の転機をとった。IL一10が低値を推移した症例は、たとえIL-6やIL-8が高値となっても、救命できている。従って、抗炎症性サイトカインといわれているIL-10の作用機序は決して単純ではなく、今後の更なる検討を要する。3。喀痰、BALF検体の濃度補正:肺水腫液中サイトカインはやはり異常高値を示すが、その中のBUN値は血中のそれと極めて近似していた。従って、喀痰やBALFを生理食塩水で適当に希釈しても、BUNの濃度比から喀痰やBALFの希釈倍率を推測できる。1。2。3。過剰炎症反応の結果としての敗血症性肺障害と臓器/末梢血中サイトカイン(IL-6,IL-8を中心に)との相関について更なる検討を続けている。1。臓器障害におけるサイトカインの作用の「場」についての検討(1)経気管内チューブ普通吸引喀痰での成績:ARDSが肺全体に対する炎症作用とすれば、あるいは部分的な肺炎でも喀痰量が多ければ当該部由来のものが十分に含まれていると考えられるので、普通吸引喀痰中のサイトカイン量を検討した。誤嚥性肺炎症例では、各サイトカインの喀痰/血中濃度比がそれぞれ、TNFα≒80倍,IL-6≒800倍,IL-8≒1500倍,IL-10≒20倍(CRP=12.5mg/dL)という成績が得られた。また、膵頭十二指腸切除術後のまだ感染が認められない第一病日の喀痰では、TNFα=75pg/mL,IL-6=490pg/mL(CRP=10mg/dL)であった。

(2)肺胞洗浄液(BALF)採取時の問題:BALFは連続数回の採取がルーチンとされているが、連続3回のBALFをそれぞれ独立の検体としてサイトカインを測定したところ、特にIL-8は第2回目以降の検体で激減することが判明したため、BALFは初回の検体のみで検討すべきと考える。2。喀痰、BALF検体の濃度補正の検討敗血症・肺炎での肺水腫液中サイトカインはやはり異常高値を示すが、その中のBUN値は血中のそれと極めて近似しており、喀痰ゃBALFを生食で希釈した検体の濃度補正に利用しうることを再確認した。過剰炎症反応の結果としての敗血症性肺障害と臓器/末梢血中サイトカイン(IL-6,IL-8,IL-10)との相関について、2年間に亘り検討を加えた。1。サイトカイン測定用検体としての普通吸引喀痰の有用性:(1)過剰炎症反応が生じている症例での各サイトカインの普通吸引喀痰/血中濃度比がそれぞれ、TNF_α≒80倍前後,IL-6≒800倍前後,IL-8≒1500倍前後、IL-10≒20倍前後という成績が得られた。従って、普通吸引喀痰でのサイトカイン成績は肺での炎症病態を十分に反映していると考えられる。(2)肺胞洗浄液(BALF)は連続数回の採取がルーチンとされているが、連続3回のBALFをそれぞれ独立の検体としてサイトカインを測定したところ、特にIL-8は第2回目以降の検体で激減することが判明したため、BALFは初回の検体のみで検討すべきであり、この事実からも普通吸引喀痰で充分と考える。2。IL-10の成績による予後予測の可能性:前述のように、順調な術後経過を辿る食道癌根治術症例でも、IL-6やIL-8の喀痰/血中濃度比は極めて大きかったが、種々の疾患・病態でIL-10の測定値が3桁となった症例の殆どが死の転機をとった。IL-10が低値を推移した症例は、たとえIL-6やIL-8が高値となっても、救命できている。従って、抗炎症性サイトカインといわれているIL-10の作用機序は決して単純ではなく、今後の更なる検討を要する。3。喀痰、BALF検体の濃度補正:肺水腫液中サイトカインはやはり異常高値を示すが、その中のBUN値は血中のそれと極めて近似していた。従って、喀痰やBALFを生理食塩水で適当に希釈しても、BUNの濃度比から喀痰やBALFの希望倍率を推測できる。
ブルーカラー職種における男女混合職化の進展

本研究の目的は、男女間賃金格差の主要因のひとつである性別職域分離が形成維持されてきた背景を解明し、それを解消するための要件を実証することにある。本研究では、男女の職域が統合しつつある職場において、職域分断が融解していく過程を明らかにし、それを推し進めている条件を探ることによって分析をすすめている。本年度は、男女混合職化が進展している職場へのヒアリング調査と性別職域分離に関する文献資料の収集をおこなった。ヒアリング調査は、鉄道業と自動車産業を中心としている。調査をおこなった多くの事例は、1990年代前半から男女混合職化がすすんできており、現在約10年が経過している。本年度の調査では、この間の女性労働者の勤続傾向を調べ、それに企業内制度がどのように対応しているのかを検討してきた。調査の結果としては、男女混合職域で働く女性は、男女分断型の職域で働く女性と比較して、長期勤続傾向にあることが明らかとなった。女性の勤続は、女性労働者の職業意識の高さ、労働時間の長さおよび労働時間の弾力性(突発的な残業)の低さ、作業負荷の大きさと深い関連がある。また女性労働者の勤続が、経営者の目論見以上に長期化してきたことに対して、1999年に施行された労基法改正以後、女性のキャリア体系を変更させている職場が多い。変更の方向性は2つに分かれ、性による職域分断を深める場合と、分断解消へとすすむ場合がある。注目すべき点は、本研究の事例のなかでは、後者のケースが、多数みられることである。分断を解消し、統合を推進するために、いくつかのケースでは、従来男性に適用してきた長期勤続を前提としたキャリア体系を修正させている。本研究ではこれを「修正された長期的キャリア」と名付け、性別職域分離の縮小に向けたひとつの道筋と考えている。また、実態調査以外では、先進諸外国の性別職域分離についての事例研究・統計研究を中心に文献資料を収集し、性別職域分離の定義と構造を整理するのに役立ててきた。以上の研究成果を論文にまとめ、『労使関係の新世紀』(日本労働研究機構)の第4章で報告している。本年度は、主として資料収集と国内調査をおこなった。資料収集としては、日本の性別職域分離研究のみならず、先進諸外国における先行研究を検索し、日本及び諸外国での職域分離の変遷と現状、統計分析に基づく性別職域分離研究の論文を集めた。結果として、当初設定した仮説のいくかを修正が必要となる。例えば、先行研究では、性別職域分離は、相対的に賃金格差が小さい北欧諸国で大きく、アメリカ・イギリスで小さいことが指摘されてきたが、本研究が対象としている鉄道業、自動車産業等のブルーカラー職種をみると、必ずしもそうとも言えない現状にあることがわかった。来年度は、引き続き、これらの先進諸外国の職域分離の現状について、文献を中心に調べるとともに、その要因を探っていきたい。また、これまで調査をおこなってきた企業に対して、追跡調査をおこなった。本年度は主に鉄道業に調査対象を絞りこんだ。1999年の改正労基法の施行以後、鉄道業では本格的な女性労働者の参入が始まっており、採用された男女労働者、企業制度上同一の技能形成・キャリア形成が適用されていることがわかった。また、女性労働者の長期勤続傾向は続いており、今回の調査では育児休業制度を利用し、勤務を続ける女性が多数誕生していることがわかった。鉄道業のなかでは、女性の長期勤続傾向を受けて、従来の男性労働者のキャリアパターンを変更して、男女同一化を図っている事例もあった。その一方で、不況の影響を受けて、従業員数の削減を進めるとともに、実質的に女性労働者の採用を停止している企業もあった。女性採用停止の背景についてもヒアリング調査をおこない、その要因を現在分析している。来年度は、自動車産業への追跡調査を進めていく予定である。

分断を解消し、統合を推進するために、いくつかのケースでは、従来男性に適用してきた長期勤続を前提としたキャリア体系を修正させている。本研究ではこれを「修正された長期的キャリア」と名付け、性別職域分離の縮小に向けたひとつの道筋と考えている。また、実態調査以外では、先進諸外国の性別職域分離についての事例研究・統計研究を中心に文献資料を収集し、性別職域分離の定義と構造を整理するのに役立ててきた。以上の研究成果を論文にまとめ、『労使関係の新世紀』(日本労働研究機構)の第4章で報告している。
生体内ヒトアレルギー応答を可能にしたヒト化マウスの開発

本研究ではヒトマスト細胞、好塩基球が生体内で分化するNOG IL-3/GM-CSF Tgマウスを用い、ヒトアレルギー反応を起こすモデルマウスの確立を目的としている。スギ花粉症患者血清と花粉抽出液によるPCA試験を行ったところ、Tgマウスの皮膚組織においてヒトマスト細胞の脱顆粒に伴う顕著な反応が見られた。また当該TgマウスにさらにIL-5遺伝子を導入したIL-3/GM/IL-5トリプルTgマウスを作製し、これらの気管内にHDMを投与したところ、肺組織への好酸球浸潤を認めた。以上の結果から、本ヒト化マウスは抗アレルギー薬開発の前臨床モデルとして有効である可能性が示唆された。本研究ではヒト造血幹細胞にて免疫系を再構築したヒト化マウスを用いて、様々なアレルゲンに対するアレルギー反応を起こすヒトアレルギーモデルの開発を目的としている。申請者が開発したNOG human IL-3/GM-CSF Tgマウス(NOG hIL3/GM-Tg)は、造血幹細胞移植後にヒトマスト細胞、好塩基球への分化効率が高く、in vivoでこれらの脱顆粒を惹起できるヒト化マウスである。平成25年度は、抗原特異的IgEを含む花粉症患者の血清と花粉抽出液をヒト化NOG hIL3/GM-Tgマウスへ投与し、受動皮膚アナフィラキシー(PCA)反応が惹起されるかを検討した。その結果、ヒト化NOG hIL3/GM-Tgマウスの皮膚において、極めて顕著な脱顆粒が観察された。一方、ヒト化nonTgマウスでは少量の脱顆粒が起こる程度であり、非ヒト化NOGマウスでは脱顆粒は全く観察されなかった。以上の事から、hIL3/GM-Tgマウスはin vivoでヒトアレルギー応答を再現できるモデルであり、抗アレルギー薬の薬効や安全性を評価する系として有用である可能性が示された。また、本TgマウスにさらにヒトIL-33遺伝子を導入したトリプルTgマウスを作製し、高感度アレルギーモデルの作出を計画している。平成25年度は、既に得られているファウンダーをNOGマウスにバッククロスし、NOGマウス背景のトリプルTg系統を樹立した。本研究ではアレルギー関連細胞の分化に重要なサイトカインであるヒトIL-3およびGM-CSFを遺伝子導入したトランスジェニックNOGマウス(NOG hIL3/GM-Tg)を開発し、このマウスをベースとして更なる遺伝子改変を加えたヒト化マウスを作製し、生体内でヒトアレルギー応答の解析が可能であるか検討することを目的としている。平成26年4月中旬から平成27年3月までの間、米国へ研究留学をしていたため当該年度の研究テーマの進捗はほとんど無かった。しかしながらトランスジェニック動物の維持、管理に関しては、当研究所の動物開発部門にて系統の育成および管理を行っており、平成27年度の早期から実験開始できるよう準備されていること、また平成25年度の進捗が極めて順調であったことから、本研究計画全体の進捗への影響は軽微である。本研究ではマスト細胞、好塩基球などアレルギー関連細胞の分化に重要なサイトカインであるヒトIL-3およびGM-CSFを遺伝子導入したトランスジェニックNOGマウス(NOG hIL-3/GM-Tg)を用い、生体内アレルギー応答を再現するアレルギーモデルマウスの作製を目的とした。平成25年度の成果としては、ヒト化したNOG hIL-3/GM-Tgマウスへ花粉症患者血清および花粉抽出液を投与し、皮膚組織へのエバンスブルー血管外漏出を指標としたPassive Cutaneous Anaphylaxis (PCA)反応を行った。その結果、Tgマウスの皮膚にて顕著な色素漏出が認められ、マスト細胞の脱顆粒亢進が示唆された。さらに本TgマウスへHLA-DR, IL-5, IL-33遺伝子をそれぞれ導入した複合型Tg NOGマウスを作製し、より高感度にヒト臨床病態を反映することが期待されるアレルギーモデルマウスを作製した。HLA-DR, IL-33遺伝子による複合型マウスは、最終年度に系統化を完了し、現在ヒト造血幹細胞(HSC)移入によるヒト化を行っている。ヒト好酸球を効果的に誘導するIL-5 Tgと掛け合わせたIL-3/GM/IL-5トリプルTgマウスはすでに系統化を終えており、最終年度にヒト化とハウスダストマイト(HDM)気管内投与によるアレルギー性喘息誘導を試みた。その結果、有意差は得られなかったものの、トリプルTgマウスにおいて肺組織へのヒト好酸球浸潤が認められた。今後、HDM投与量、投与間隔、ヒト化後の実験適齢を検討し、前臨床応用可能なヒト化マウスモデルの確立を目指す。

概要で述べたように約1年間弱の研究留学を行っていたため、当初の研究計画に比べて少し遅れが生じている。免疫学平成27年度は、これまで作製したヒト遺伝子トランスジェニックマウスの評価を行い、アレルギーモデルとして利用可能か否か検討する。具体的には、ヒト化IL-3/GM-CSF/IL-5 Tgマウスへのハウスダストマイト吸入によるヒト好酸球性喘息モデルの確立およびこれらヒト化マウスへのヒトIL-33投与によるアレルギー応答の解析を行う。さらに既に樹立済みのIL-3/GM-CSF/IL-33 Tgマウスを用い、高感度アレルギーモデルの作出も行う。平成25年度は主に以下の計画にて研究を遂行した。1)hIL3/GM Tgマウスを用い、花粉症患者血清および花粉抗原によるPCA反応が見られるか検討する。13の全てにおいて、申請書に記載した計画通りに進んでいるため、本研究は概ね順調に進展していると言える。なお、1)の成果を含めた研究内容に関しては、Journal of Immunologyに投稿し、アクセプトされた。約1年の期間を海外留学に費やしたため、今年度の使用実績は無しとする。平成25年度で樹立した2系統のトリプルTgマウスの評価を行う。1.各トランスジェニックマウスへヒト造血幹細胞を移入し、好塩基球・マスト細胞の分化を確認した後、PCA試験を行う。2. hIL3/GM-CSF/HLA-DR4 Tgマウスへ花粉、ダニ、ハウスダストなどのアレルゲンを免疫してIgE抗体の測定を行い、鼻粘膜、眼粘膜への当該アレルゲンの滴下によりアレルギー症状が惹起されるか検討する。3. PCA試験または粘膜へのアレルゲン滴下によりアレルギー症状が観察された系統を用いて減感作療法を行う。当該のアレルゲンを飲水または食餌に混在させてマウスに継続的に与え、経口免疫寛容によるアレルギー反応の抑制が起こるか検討する。また最近新たな系統として、hIL-5 Tgマウスを作製し、hIL3/GM/IL5トリプルTgマウスを樹立した。本系統はヒト好酸球が効率よく分化するため、これを用いた好酸球性喘息モデルの開発にも着手する。次年度の実験動物を含めた消耗品、旅費などに費やす。申請段階では2回分の国際学会の旅費を支出に含めた計画を立てていたが、これらが他の研究費にて支出可能であったため、当該の旅費分は今年度使用しなかった。次年度以降の実験動物を含めた消耗品費および旅費としての使用を計画している。
疾患モデル作製に向けた骨髄様組織培養法の確立

本年度は、(1)異なる培養条件下における骨髄様組織内血球細胞割合の解析、(2)ヒト骨髄細胞の採取方法の検討およびヒト骨髄様組織作製とその解析に取り組んだ。(1)については、生体外での培養条件を比較する目的で、平面培養した骨髄細胞と三次元培養した骨髄様組織内細胞の割合をフローサイトメーターを用いて比較した。骨髄様組織の一部の血球細胞について、平面培養よりも生体内骨髄を模倣した結果や生体内や平面培養とは異なる三次元培養特有の結果が得られた。さらに骨髄様組織の長期生存率向上を目的として、複数の細胞外マトリクス(ECM)薄層充填による生存率に与える影響を検討した。マトリゲルや脱細胞化組織由来等のECMを検討した結果、非ECM充填サンプルと比較していくつかのECMで生存率が上回る傾向が見られた。(2)について、昨年度末に倫理委員会で承認を得たヒト骨髄細胞を用いた実験に取り組んだ。骨髄穿刺とは異なり外科手術中に得られる細胞を使用するため、採取部位や細胞調製過程の検討を詳細に行った。得られた骨髄細胞を用いて、マウス骨髄細胞と同様に骨髄様組織作製および組織化に成功した。本年度2件の外部発表を行い、いずれも優秀演題賞と優秀演題賞を受賞した。所属機関の倫理委員会承認を得た、ヒト骨髄細胞を用いた骨髄様組織の作製に着手した。本年度において採取部位の検討や採取後の細胞調整手順を確立し、マウス由来細胞同様にヒト由来細胞で三次元骨髄様組織を作製可能であることを明らかとした。ヒト骨髄様組織を利用した毒性試験などの種々のアッセイ系への応用が期待される。来年度では、培養培地変更に伴いグルコーストランスポーター(GLUT1)が発現誘導されているか定量化を行う予定である。さらに、遊走を伴った炎症評価系の構築とヒト骨髄様組織内血球細胞の詳細なFACS解析を目指す。本年度は、マウス骨髄細胞を用いて、血球細胞を保持したまま長期間の培養が可能な骨髄様組織の作製に取り組んだ。我々は以前より、非接着性の骨髄細胞を三次元的に組織化させることが可能であることを報告してきた。しかし、培養7日目には骨髄様内部に存在する血球細胞の減少が確認されていたため、血球細胞の減少を抑制する培養条件の確立が必須であった。そこで本年度は培養条件の検討を行い、骨髄様組織内に血球細胞を長期間保持することが可能な培養条件の探索に取り組んだ。幾つかの条件検討の結果、骨髄様組織内に少なくとも培養7日目まで血球細胞を保持することが可能な培養条件を見出した。さらに本年度見出した培養条件で作製した骨髄様組織について、フローサイトメーターを用いて血球細胞組成の解析にも取り組んだ。作製した骨髄様組織内には採取直後の骨髄細胞と同程度のリンパ球・単球・顆粒球等の白血球細胞群が存在していることが明らかとなり、今後は長期培養した際の血球細胞組成の解析にも取り組む。本年度末には所属機関倫理委員会の承認を得ており、来年度からヒト骨髄細胞を用いた研究にも着手する予定である。本年度得られた研究成果については外部発表を行った。骨髄様組織を用いた様々なin vitroアッセイ系への応用を可能にするためには、長期間にわたって血球細胞が骨髄様組織内に保持されている必要がある。本年度の研究成果から、様々な培養条件の検討を行うことで少なくとも培養7日目までは骨髄様組織内に血球細胞を保持することが可能であることを示し、アッセイ系への応用を可能にするための第一歩となったと考えている。本年度末には、所属機関の倫理委員会から、医学部付属病院の整形外科手術の際に得られるヒトサンプルを用いた研究を行う承認を得た。来年度はヒト骨髄細胞を用いて、マウス骨髄細胞と同様に骨髄様組織の作製が可能か検討を行う。

昨年度得られた培養条件を基に、高い生存率で血球細胞を内部に保持した骨髄様組織の作製に取り組む。具体的な方策としては、細胞外マトリクス(ECM)の利用や他種細胞との共培養を行う。ヒト骨髄細胞については、マウス骨髄細胞と同様に骨髄様組織の作製が可能かどうかを検討し、作製した骨髄様組織内部の様子について薄切切片やフローサイトメーターを用いて検討を行う予定である。来年度では、培養培地変更に伴いグルコーストランスポーター(GLUT1)が発現誘導されているか定量化を行う予定である。さらに、遊走を伴った炎症評価系の構築とヒト骨髄様組織内血球細胞の詳細なFACS解析を目指す。
焼結ダイヤモンド埋込型アンビルの試作と超高圧高温の発生

超高圧高温実験は、地球・惑星科学においてだけでなく、新物質開発においても不可欠の技術である.現在の超高圧実験には超硬合金製のアンビルが広く用いられているが、その材料強度から発生圧力には限界がある.本研究では、より硬い素材であるダイヤモンド焼結体を用いてアンビルを試作し、より高い圧力を発生させて、超高圧高温実験法を確立することを目的とした.まずダイヤモンド焼結体を超硬合金アンビルの中央に埋め込んだ構造のブリジマンアンビル(先端径26mmと20mmの2種)を試作した.またこのブリジマンアンビルを加圧するための一軸圧縮プレス(常用600トン)を製作した.これらの装置を用いて得た主要な成果は以下の通りである.1.室温において約20.5GPaまでの圧力発生に成功した.これは従来の超硬合金製ブリジマンアンビルでの最高圧(約14GPa)を大きく上回るものである.さらに高圧下で最高1400°Cまでの高温を発生させて定常的に相転移実験を行う技術の確立に成功した.2.この技術を用いて、以下の結果を得た.2)CaAl_2O_4カルシウムフェライト相の安定領域を決定した.3)CaFeSi_2O_6単斜輝石がCaSiO_3ペロブスカイト+Fe_2SiO_4スピネル+SiO_2に分解する相境界を決定した.これらの高圧相転移は、下部マントルの絋物構成を抽定する上で重要である.3.関連する研究として、TiO_2のルチル型→αPbO_2型転移の平衡相境界を高圧高温x線回折技術を用いて決定した.この相境界線は高温における圧力較正点に用いられる.超高圧高温実験は、地球・惑星科学においてだけでなく、新物質開発においても不可欠の技術である.現在の超高圧実験には超硬合金製のアンビルが広く用いられているが、その材料強度から発生圧力には限界がある.本研究では、より硬い素材であるダイヤモンド焼結体を用いてアンビルを試作し、より高い圧力を発生させて、超高圧高温実験法を確立することを目的とした.まずダイヤモンド焼結体を超硬合金アンビルの中央に埋め込んだ構造のブリジマンアンビル(先端径26mmと20mmの2種)を試作した.またこのブリジマンアンビルを加圧するための一軸圧縮プレス(常用600トン)を製作した.これらの装置を用いて得た主要な成果は以下の通りである.1.室温において約20.5GPaまでの圧力発生に成功した.これは従来の超硬合金製ブリジマンアンビルでの最高圧(約14GPa)を大きく上回るものである.さらに高圧下で最高1400°Cまでの高温を発生させて定常的に相転移実験を行う技術の確立に成功した.2.この技術を用いて、以下の結果を得た.2)CaAl_2O_4カルシウムフェライト相の安定領域を決定した.3)CaFeSi_2O_6単斜輝石がCaSiO_3ペロブスカイト+Fe_2SiO_4スピネル+SiO_2に分解する相境界を決定した.これらの高圧相転移は、下部マントルの絋物構成を抽定する上で重要である.3.関連する研究として、TiO_2のルチル型→αPbO_2型転移の平衡相境界を高圧高温x線回折技術を用いて決定した.この相境界線は高温における圧力較正点に用いられる.本年度は、まず第一に超高圧実験に用いる700トン-軸圧縮プレスを設計し、その製作を泉陽株式会社に依頼した。この装置に、試作した新型ブリジマンアンビルを組み込み、高圧発生実験が行われ、プレスが所期の性能を有することを確認した。第二に、このプレスが納入される前に新型ブルジマンアンビルを用いて、当教室既設の200トン一軸圧縮プレスにより高圧発生及び高温高圧発生実験が行われた。このブリジマンアンビルは超硬合金アンビルの中央部にダイヤモンド焼結体を埋め込んだ構造をしており、アンビル先端の直径は26mmである。このアンビルによって、ZnS(15.5GPa)とGaAs(18.3GPa)の絶縁体-金属転移を室温で検出した。従来から使用されてきた超硬合金だけから成るブリジマンアンビル(先端径は同一)ではGaAsの転移は全く報告されておらず、今回の実験で最も高い圧力が発生されたことが確認された。これは、超硬合金よりも硬い焼結ダイヤモンドをアンビル中央部に用いたことによる。一般に室温での圧力値と高温での圧力値は、アンビルにかかる荷重が同一であっても異なることが多い。そのため高温における圧力較正の方法の確立が、精度の高い高温高圧実験のためには、不可欠となってくる。本年度は、この考えに立って、熱力学計算に基づく相境界線を高温での圧力スチ-ルとして用いるための研究を行った。ZnSiO_3の輝石-イルメナイト転移及びNi_2SiO_4スピネルのNiOをステイショバイトの分解反応に関して、これらの転移エンタルピ-を測定した。そのデ-タに基づいて、これらの相境界線が熱力学的に計算され、前者はP(GPa)=8.9+1.7×10^<-3>T(K)、後者はP(GPa)=17.6-6.3×^<-4>T(K)を決定された。平成2年度には,前年度に引き続き,焼結ダイヤモンド埋込型ブリジマンアンビルを用いて,超高圧高温実験を行なった。

このアンビルを600トン一軸圧縮プレスに組み込んで,以下の物質について,約15GPa,1200°Cまでの圧力・温度範囲で実験を行なった。カルシウムフェライト型構造は,地球深部での3価のイオンを含むA^<2+>B^<3+>_2O_4化合物の取り得る構造として重要な意義を持っている。CaAl_2O_4は超高圧下でカルシウムフェライト構造を取るとの報告がなされていたが,その安定領域は明らかにされていなかった。今回CaAl_2O_4の相転移を15GPa,1200°Cまで調べた。その結果CaAl_2O_4は一気圧相(充填トリディマイト構造)から,構造未知の3種の中間相を経て,約8GPaでカルシウムフェライト型に転移すること,その勾配が負になること等が明らかになった。平成3年度には、超硬合金の中央に焼結ダイヤモンド(径15mm,高さ12mm)を埋め込んだ構造の先端径20mmの新しいブリジマンアンビルを試作した.このアンビルを用いた実験によって、以下の成果が得られた.1.このアンビルの圧力較正実験では、室温で21GPa程度の圧力が発生していることが確認された.さらに、高温用アセンブリ-を組み込み、高圧下で800-1000°C、1時間程度の実験を行う技術を確立した.また800°Cでの圧力較正に基づくと、最高約17GPaの圧力が発生していると推定された.この先端径20mmのブリジマンアンビルを用いた実験では、平成2年度までに用いていた26mm径のブリジマンアンビルよりも20%程度圧力発生効率が向上している.2.このアンビルを用いて、以下の実験を行った.(1)CaFeSi_2O_6単斜輝石がCaSiO_3ベロブスカイト+Fe_2SiO_4スピネル+SiO_2スティショバイトに分解する相境界線が800-1000°C、13-14GPaで決定された.(2)KAISi_3O_8-NaAISi_3O_8系の相関係が1000°C、約14GPaで調べられ、この系でホランダイト固溶体が形成されることが確認された.さらに、超高圧高温実験の高精度化を目的として、TiO_2のルチル→αPbO_2転移の平衡相境界線が、高温高圧x線回折法でP(GPa)=3.5+3.8×10^<-3>T(°C)と決定された.この境界線は高温における圧力較正に用いられる.
遺伝性多発外骨腫症モデルマウスを用いた骨軟骨腫発生に関するヘパラン硫酸の機能解析

多発性外骨腫症(MHE)は,骨幹端部の多発骨軟骨腫を特徴とする遺伝性疾患で,EXT1・2が主原因遺伝子である.本研究の目的は,Prx1CreERT; Ext1flox/floxマウス(Creマウス)を用い骨軟骨腫発生機構について検討する事である.本研究では,MHEで骨軟骨腫が好発する成長軟骨板周囲の軟骨膜組織に注目した.Prx1CreERT transgeneに注目した.同Creマウスに対し,出生後にtamoxifenを注射した後,四肢関節形態を観察すると、軟骨膜からEXT1が欠損する事で、四肢に骨軟骨腫を形成されることが確認できた。研究成果(1)多発性外骨腫症(MHE)マウスモデルラインの樹立:Prx1CreERT EGFP; Ext1 flox/floxマウスは、正常に妊娠・出産が可能であり、成長はExt1 flox/floxマウスとほぼ同等であった。(2)病理学的検討: Prx1CreERTEGFP;Rosa26Reporterマウスを用いてマウスの出生後のPrx1の発現部位を確認した。P28の時点で成長軟骨板辺縁の軟骨細胞でPrx1が発現していた。Prx1CreERT EGFP; Ext1 flox/floxマウスは生後6週までは、四肢、関節軟骨の状態はExt1 flox/floxマウスと明らかな差は認められなかった。生後7週で四肢骨の短縮と、長幹骨骨幹端の膨隆が認められた。病理学的検討で、膝関節と手関節のSafranin O & Fast green染色を行ったところ、成長軟骨板の側方への延長が認められ、特に大腿骨遠位端において骨軟骨腫同様の異所性軟骨塊形成が認められた。また、膝関節の関節軟骨内に肥大型軟骨細胞塊の出現を認めた。(3) ATDC5を用いたin vitroでの軟骨細胞分化過程におけるヘパラン硫酸の役割の検討: ATDC5をインスリンとヘパラン硫酸拮抗体であるSurfenを同時に投与する事でchondrogenesisが阻害された。qPCRで軟骨細胞分化のmaster遺伝子であるSox9の発現が、Surfen投与によって遅延し、さらに軟骨細胞分化のkey regulatorであるIndian hedgehogの発現が促進していた。本研究により、マウスの出生後の四肢骨の成長軟骨板からExt1が一部欠失し、骨軟骨腫が形成され、関節軟骨内に異常な肥大型軟骨細胞が出現する事が明らかになった。多発性外骨腫症(MHE)は,骨幹端部の多発骨軟骨腫を特徴とする遺伝性疾患で,EXT1・2が主原因遺伝子である.本研究の目的は,Prx1CreERT; Ext1flox/floxマウス(Creマウス)を用い骨軟骨腫発生機構について検討する事である.本研究では,MHEで骨軟骨腫が好発する成長軟骨板周囲の軟骨膜組織に注目した.同部位でのExt1の機能を解析するため,Prx1CreERT transgeneに注目した.Prx1CreERT;Rosa26 reporterーマウスを作成、生後1・2日にtamoxifenを腹腔内注射し,LacZ染色を行った.次にCreマウスに対し,生後1・2日にtamoxifenを注射した後,四肢関節形態をSafranin O/Fastgreen染色,X-ray撮影で検討した.更にSox9,βcateninの免疫組織染色を用いて,軟骨膜での同蛋白発現について確認した.In vitroで,マウス間葉系細胞のC3H10T1/2に対し,Ext1発現を抑制後,βcateninの発現をqPCRとIFにて確認後,骨分化についてAlp活性を測定した.結果として、mLacZ染色で,Prx1CreERT transgeneが成長軟骨板周囲軟骨膜に発現している事を確認した.Creマウスは,生後3週で四肢に骨軟骨腫を形成した.同マウスは骨軟骨腫形成前に,軟骨膜でβcateninの発現が低下し,同部位に異所性軟骨細胞が出現していた.C3H10T1/2はExt1発現を抑制する事で,βcateninの発現が低下し,骨分化が抑制された.今回,我々は,Creマウスを用い,出生後に成長軟骨板周囲の軟骨膜からExt1を欠損させる事で,骨軟骨腫形成が誘導された.同所見は,MHEでの骨軟骨腫形成において,軟骨膜組織が重要である事を示唆する.多発性外骨腫症(MHE)は,骨幹端部の多発骨軟骨腫を特徴とする遺伝性疾患で,EXT1・2が主原因遺伝子である.本研究の目的は,Prx1CreERT; Ext1flox/floxマウス(Creマウス)を用い骨軟骨腫発生機構について検討する事である.本研究では,MHEで骨軟骨腫が好発する成長軟骨板周囲の軟骨膜組織に注目した.Prx1CreERT transgeneに注目した.同Creマウスに対し,出生後にtamoxifenを注射した後,四肢関節形態を観察すると、軟骨膜からEXT1が欠損する事で、四肢に骨軟骨腫を形成されることが確認できた。骨関節疾患新たな多発性外骨腫症モデルマウスとしてPrx1CreERT EGFP; Ext1 flox/floxマウスを樹立することができた。しかし、骨軟骨腫形成メカニズムとその治療ターゲットに対する検討がまだ行われておらず、今後残りの期間で検討していく予定である。今年度、新たな多発性外骨腫症モデルマウスとしてPrx1CreERT EGFP; Ext1 flox/floxマウスを樹立することができた。

今後、骨軟骨腫形成に関わるシグナル(BMP、Wnt、Ihh、PTHrP、FGF)などを組織染色、in situ hybridizationなどを行い検討していく予定である。また、骨軟骨腫形成に重要と予想されるシグナルの拮抗剤などをマウスに投与し、骨軟骨腫形成予防効果も検証していく予定である。当初の予定に必要であった実験器具を購入したが、差額として4872円残ってしまった。次年度の物品購入費に使用する予定である。
フィトエストロゲンの骨作用―尾部懸垂ラットモデル並びに培養骨芽細胞を用いた検討

ヒト及び動物実験でフィトエストロゲンと総称される大豆イソフラポンが、エストロゲン欠乏によって引き起こされる骨量減少防止に有効であると報告されている。本研究では尾部懸垂ラットモデル後肢骨細胞並びに骨芽細胞(ROS17/2.8)の遺伝子発現に及ぼすエストロゲン(E2)、ビタミンD3(D3)とゲニスティン(Ge:大豆種子中に存在するイソフラボンの一種)の影響を検討した。(1)成長期雌ラットの卵巣を摘除後、2週間E2を補充した群(OVX-E2群)と非補充群(OVX群)に尾部懸垂を負荷し、後肢骨のRNAを用いてVDR並びにOCmRNA量をノザンブロット法で定量した。(2)ラット骨芽細胞株ROS17/2.8を10^<-8>M VD3、10^<-9>M E2の濃度で、VD3(-)E2(-)、VD3(+)E2(-)、VD3(-)E2(+)、VD3(+)E2(+)の4群で培養し、12時間後にRNAを抽出して(1)と同様にVDR、OCmRNAを定量した。E2の替わりにGeを用いて同様の実験を実施した。(1)ではOVX-E2群でOVX群に比し、VDRmRNAの発現は増加し、OCmRNAの発現は有意に低下した。このOVX-E2群でのOCmRNAの低下にはグルココルチコイド分泌の増加が関与している。(2)ではVD3(-)E2(-)群に比しVD3(+)E2(+)群では、VDRmRNAの発現は約2倍、OCmRNAの発現は1.5倍に増加した。VDRmRNAの発現はVD3かE2のいずれか一方のみでも発現が増加したが、VD3(+)E2(+)群に比べるとその発現は低かった。一方、OCmRNAはVD3かE2のいずれか一方のみでは増加しなかった。Geでもほぼ同様な結果が認められた。この発見はフィトエストロゲンによる骨粗鬆症予防がVDRmRNAの発現増大を介して関与していることを示唆した。老人の骨折の原因は骨粗鬆症によることが多く、その予防にエストロゲンの補充療法が有効であると認められている。また最近ではフィトエストロゲンと総称されるイソフラボンの摂取量と骨粗鬆症の関係が注目されている。ところがフィトエストロゲンの骨代謝に及ぼす内分泌およびその骨損失抑制機構との関連についての研究は皆無に等しい。そこで、本年度はラット由来の培養骨芽細胞株を用いてエストロゲンとビタミンD_3の骨粗鬆症に果たす役割について検討し、以下の結果を得た。骨芽細胞(ROS17/2.8)においてtotal RNAを抽出し、オステオカルシン、ビタミンD_3受容体などのcDNAをプローブとしてmRNAの遺伝子発現に及ぼすエストロゲンの影響を検討した結果、ビタミンD_3を添加した細胞(ROS17/2.8)でエストロゲン添加の有無に関わらず、ビタミンD_3受容体やオステオカルシンmRNAの発現が増大することが明らかになった。さらに、ROS17/2.8細胞にエストロゲンを10^<-12>10^<-9>Mの濃度で添加しビタミンD_3の受容体やオステオカルシンmRNAの発現に及ぼす影響を検討中である。

また、カルシウム結合蛋白であるカルビンディンcDNAのプローブの作成に成功しているので来年度以降に小腸腸管上皮細胞においても検討したい。今年度実施予定であったラット由来の骨芽細胞(ROS17/2.8)にフィトエストロゲン(ゲニスチン)を添加して、オステオカルシン、ビタミンD_3受容体などのcDNAをプローブとしたmRNAの遺伝子発現に及ぼすフィトエストロゲンの影響については来年度以降検討する予定である。骨粗鬆症患者の骨量減少の原因として腸管での活性型ビタミンD_3依存性のCa吸収の低下が指摘されている。従って、閉経後のエストロゲン欠乏は、腸管上皮、骨芽細胞などビタミンD_3受容体量の減少を引き起こす可能性が考えられる。本研究では尾部懸垂ラットモデル後肢骨細胞並びに骨芽細胞(ROS17/2.8)の遺伝子発現に及ぼすエストロゲンとビタミンD_3の影響を検討した。成長期雌ラットの卵巣を摘除(OVX)後、2週間エストロゲンを補充した群(OVX-E_2群)と非補充群(OVX群)に、尾部懸垂を負荷し、後肢骨のオステオカルシン(OC)、ビタミンD_3(VDR)mRNAを測定したところ、OVX群のVDRmRNAは懸垂開始直後低下し、OCmRNAは懸垂開始後には上昇を認めたが、以後懸垂期間中低下した。一方OVX-E_2群のVDRmRNAは変化が認められなかったが、OCmRNAはOVX群と同様の傾向を示した。しかし懸垂開始前のOCmRNAはOVX群が有意に高値であった。またROS17/2.8骨芽細胞にラット血清で培養、VD_3添加又は無添加でE_2を10^<-9>Mの濃度で添加して、経時的にmRNAを測定しところ、E_2投与後12時間ではVDR、OCmRNAの発現は増加したが、経時的に発現が抑制された。特にOCの発現抑制は著明であった。一方、VD_3或いはE_2のいずれも無添加の場合VDR、OCmRNAの発現は低くいが、ラット血清で培養した場合はE_2添加によりVDRmRNAの発現は増大し、OCmRNAでは添加24時間までは抑制傾向が認められた。従って、骨芽細胞にラット血清を添加して培養するとVDRmRNAは、VD_3添加によりその発現が増大するが、E_2の欠乏でVDRmRNAの発現は有意に低くOCmRNAmRNAは発現が上昇傾向を示し、尾部懸垂実験で得られた結果とよく一致した。なお、同様の実験をフィトェストロゲンを用いて実施中である。老人の骨折の原因は骨粗鬆症によることが多く、その予防にエストロゲンの補充療法が有効であると認められている。また最近ではフィトエストロゲンと総称されるイソフラボンの摂取量と骨粗鬆症の関係が注目されており、日本女性に骨粗鬆症の少ないのは大豆食品の摂取量が多いことであるとされている。また動物実験でも大豆イソフラボンがエストロゲン欠乏によって引き起こされる骨量減少防止に有効であると報告している。そこで、本年度はラット由来の培養骨芽細胞株を用いてフィトエストロゲンとビタミンD_3の骨粗鬆症に果たす役割について検討し、以下の結果を得た。骨芽細胞(ROS17/2.8)においてtotal RNAを抽出し、ビタミンD_3受容体のcDNAをプローブとして同受容体の遺伝子発現に及ぼすフィトエストロゲン(ゲニスチン)の影響を検討した。私達はこれまでビタミンD3添加によりROS17/2.8細胞でビタミンD3受容体mRNAの発現が増大することを明らかにしている。さらに今回ROS17/2.8細胞にゲニスチンを10^<-11>10^<-7>Mの濃度で添加しビタミンD_3の受容体mRNAの発現に及ぼす影響を検討したところ、用量依存的にビタミンD_3受容体mRNAの発現が増大することが明らかになった。またこの作用はゲニスチン単独でも10^<-8>MビタミンD3存在下でも同様な結果が認められた。