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空白の美術史、植民地期朝鮮における創作版画の展開についての研究

日韓両国の近代美術史を構築する研究において詳述されてこなかった、植民地期朝鮮(1910-1945)における創作版画の展開について、本研究では、日本人と朝鮮人の活動の双方を真正面から同時的に捉えることで、埋もれた植民地文化の一端が示された。すなわち、当時の新聞や雑誌、画集などの資料の発掘や蒐集、分析により、朝鮮における日本人美術家による版画創作や普及活動、及び朝鮮や日本本土における日本人との交流を通して展開した朝鮮人美術家による版画創作活動について解明した。植民地期朝鮮における創作版画の展開についての研究のうち、同地に居住する日本人美術家による京城を中心とした創作版画の活動と展開をたどった。朝鮮における唯一の創作版画団体である「朝鮮創作版画会」が発会する以前の同地における創作版画の展開、同会の中心的存在であった多田毅三の活動、そして1934年の同会の終焉の経緯について明らかにした。また『京城日報』(1934-1945)の分析により、朝鮮創作版画会の解散以降の1934年から1945年植民統治の終焉までの京城を中心とした創作版画の展開について解明した。1934年以降には、朝鮮創作版画会が普及を期した、同地を立脚地としてその風土を反映した創作版画ではなく、日本本土から日本的なるものとしての意義を負った「日本版画」の普及が企てられたことを明かした。研究成果は、「植民地期朝鮮における創作版画の展開(2)ー京城における日本人の活動と『朝鮮創作版画会』の顛末ー」「植民地期朝鮮における創作版画の展開(3)ー京城における『朝鮮創作版画会』解散後の展開と『日本版画』の流入ー」(ともに『名古屋大学博物館報告』No31)においてインターネット上で公開されている。今後は、政治、経済、文化の中心地とされた京城以外の地域において、創作版画がどのように展開していたかを明かしていく。またこれまで主に日本人の活動を中心に解明するなかで、朝鮮人の作品についても存在していることが確認された。彼らの間で創作版画がどのように展開していたかについて、現地調査を行う中で、植民地朝鮮に残された資料の発掘や現地研究者の知識の提供を受けながら解明する。昨年度は、国内における資料収集を中心として研究を進展させていたため、当該年度の所期の予定通り概ね遂行することができた。研究成果を年度内に論文執筆して公開できたことはそれを裏付けている。植民地期朝鮮における創作版画の展開のうち、平成28年度の課題とした、京城以外の地域における日本人による創作版画活動について明らかにした。具体的には、仁川における版画家佐藤米次郎の創作版画活動と時局下に佐藤が主宰した蔵書票展の開催について明らかにした。1940年に青森から同地に移住した佐藤は、積極的に創作版画の普及活動を同地を拠点として展開した。またその一環として主宰した蔵書票展では、日本の錚々たる版画家の作品を展示し、また佐藤が移住後に版画の創作活動を通して知己となった朝鮮在住の日本人による版画作品も展示したことを明かした。また、釜山における清永完治と日本人の趣味家ネットワークによる創作版画誌『朱美』の刊行の顛末と意義について明らかにした。1931年に釜山に移住した清永は、釜山郷土玩具同好会の機関誌に玩具表現の手段として版画を多用し、会員に創作版画を広めていった。清永はそこで形成した趣味家のネットワークを礎に、時局下に日本本土や朝鮮の日本人の版画家や玩具の愛好家からなる趣味家のネットワークによって『朱美』を刊行したことを明かした。彼らの活動には、朝鮮人の美術家は含まれておらず、当局側からは決戦下の国策に資する美術活動ではないと指摘された。これまで植民地期朝鮮の版画史における日本人の活動についての研究は断片的なものであったが、一連の研究過程で、日本人の創作版画活動については、現存資料に基づき時系列的実証的な版画史を概ね構築することができた。研究成果は、「植民地期朝鮮における創作版画の展開(4)ー仁川における佐藤米次郎の創作版画活動と時局下の蔵書票展の開催についてー」「同(5)ー釜山における清永完治と日本人の趣味家ネットワークによる創作版画誌『朱美』の刊行についてー」(ともに機関リポジトリ『名古屋大学博物館報告』No32)としてウェブ上で公開されている。当初予定では青森県における調査を念頭に置いていたが、研究対象である版画家佐藤米次郎及び佐藤とかかわりの深い版画家武藤完一の遺族等の協力により、関係資料の提供を郵送及びメールなどにより受けることができ、迅速に研究を進展させることができた。また前年度に鹿児島県歴史資料センター黎明館で蒐集した資料の精査を行い、今年度の研究に資することができたことでより実証的な研究成果をあげることができた。こうした研究成果を年度内に論文2篇に執筆して公開することができたことは、研究の進展が順調であったことを裏付けている。本研究は、植民地期朝鮮(1910-1945)における朝鮮人と日本人の活動の双方を真正面から同時的に捉えることで、埋もれた植民地文化の一端を歴史の表舞台に立たせ、両国の近代美術史の空白を埋めることを目的としている。そこで、まず同地における日本人の活動に焦点を当て解明した。首都京城(現ソウル)では、1930年前後には日本人美術家を中心とする創作版画団体である朝鮮創作版画会が結成され、朝鮮人の美術家も参加し、展覧会の開催や創作版画誌の刊行も確認されるなど、同地ならではの美術の構築を期して版画創作活動を展開していた。

しかし日本の国体の変更に伴いそうした活動は確認されなくなり、代わって1935年前後から1942年前後まで、日本から日本文化の表象として日本版画が盛んに流入した。一方、仁川では版画家佐藤米次郎が、芸術として創作版画の普及に尽力し、また釜山では、郷土玩具の愛好家である清永完治の日本人ネットワークにおいて創作版画活動が展開していたことを明かした。最終年度には、これまでの研究で確認された朝鮮人美術家による版画創作活動を足掛かりとして、彼らによる日本本土や朝鮮で活動する日本人との交流を通して展開した版画創作活動について解明した。朝鮮人美術家による初めての創作版画作品集の刊行に、朝鮮における日本人美術家や、日本本土における出版家などとの交流がどのように結びついているか解明した。また創作版画の興隆期の日本における留学を経験した朝鮮人美術家が、帰国後に母校に赴任し、その校友会雑誌の表紙絵に創作版画を寄せ続けたことを、同誌の内容分析や同校を取り巻く環境などについて検討し、表紙絵の意図について明かした。また平壌に移住した版画家小野忠明が、戦後に朝鮮人の美術家により同世代の版画家と認知されていることについて、小野の版画作品や、その指導を受けた朝鮮人美術家の版画創作活動の分析により解明した。日韓両国の近代美術史を構築する研究において詳述されてこなかった、植民地期朝鮮(1910-1945)における創作版画の展開について、本研究では、日本人と朝鮮人の活動の双方を真正面から同時的に捉えることで、埋もれた植民地文化の一端が示された。すなわち、当時の新聞や雑誌、画集などの資料の発掘や蒐集、分析により、朝鮮における日本人美術家による版画創作や普及活動、及び朝鮮や日本本土における日本人との交流を通して展開した朝鮮人美術家による版画創作活動について解明した。これまで京城を中心とした創作版画の展開を解明したが、今年度は同地以外の地域における創作版画の展開について明らかにする。具体的には平壌の小野忠明らによる活動、釜山の清永完治が刊行した創作版画誌について、そして仁川に移住した版画家佐藤米次郎の創作版画活動について報告する。また佐藤が企画、実施した京城における本邦初とされる蔵書票展覧会の顛末について明らかにする。いずれも国内における調査では解明されない活動の詳細や未発見の資料などがあり、現地調査が必要と考えている。また研究を進展させる中で、朝鮮人の美術家による創作版画活動への参加が見られるが、それらがどのように展開したかは、目下のところ詳細はわかっていない。最終年度において現地における調査と現地の専門家の知識の提供を得ながら、朝鮮人の美術家への創作版画の展開についても解明すべき課題と考えている。今年度までの調査で未発見の佐藤米次郎が朝鮮で作成した版画作品及び蔵書票の調査を、仁川において実施したいと考えている。また、最終年度の課題とした朝鮮人の美術家による版画創作について、韓国語による研究資料の分析を踏まえて、現地における版画資料の実見と蒐集を行う予定である。さらに朝鮮人の美術家に影響を与えた日本人版画家小野忠明の活動についても、朝鮮人の活動を解明する中で明らかにしたい。東アジアの表象
液体内生体分子の放射線損傷における分子周辺で起こる素反応の解明

本研究では、生体分子の放射線損傷過程を原子レベルで理解するため、水中における生体分子の周辺で起こる素反応について、特に、生体分子損傷における液体の水分子の役割を明らかにする。真空内液体分子線法により作製した生体分子水溶液に、MeVエネルギーのイオンビームを衝突させ、液体から放出する生体分子の分解イオンを質量分析することで、分子の切断箇所を原子レベルで特定する。生体分子に水が配位することで、放射線による直接作用がどう影響されるかに注目し、放射線及び二次電子が生体分子にあたり分解が起こる際、周辺の水分子によりその分解がどのような機構になっているかを明らかにする。
診断困難な異常妊娠検体に対する画期的な染色体診断アルゴリズムの開発

流産や死産などのヒト発生異常試料には、母体由来組織の混入を高率に伴うため、通常の遺伝マーカーを用いた手法(マイクロサテライト解析やMLPA法等)では「診断不能」となる。そこで、事前に取得した両親の多型情報を基に解析対象試料中の児ゲノムと母ゲノムの混在比率を推定し、実測値から児ゲノムの解析結果を予測するモデル式の作成を試みた。これらの解析手法を用い、すでに網羅的一塩基多型解析まで行い、母体組織混入のために診断不能であったと考えられる過去症例の再検証を行ったところ、児の核型を推定診断し、異数性の診断に成功した。流産や死産など、ヒト発生異常の解析においては、様々な胎児あるいは絨毛の核型(正常二倍体、異数体、父アイソダイソミー、父ヘテロダイソミー、母アイソダイソミー、母ヘテロダイソミーなど)が想定され、さらにそれらのモザイク及びキメラ(母体組織混入を含む)も加わり、染色体診断が極めて困難な事が稀ではない。従来の分子遺伝学的な手法である遺伝マーカー検査やアレイCGHなどでは、これらを鑑別して診断することが困難である。しかし、網羅的定量的な一塩基多型解析を応用すれば、検体中に含まれるゲノムの由来と、複数のゲノムの混合率を判定可能である。本研究では、ヒト発生異常検体で想定され得る複数ゲノム混在の組み合わせと予想される一塩基多型頻度をモデル化し、実測値との比較により複雑なゲノム構成の染色体診断を可能とする、画期的なデジタルカリオタイピングアルゴリズムの開発を目的とした。具体的には、母体組織が混入した胎児組織を想定し、母と児のゲノムDNAを混合したモデルサンプルの網羅的一塩基多型解析を行った。その実測値を、混合率に応じて補正する計算式を検討し、最適な補正方法を確定した。実際にその補正方法を用い、これまで診断不能であった(母ゲノムDNAの混入のために核型判定ができかなかった)流産絨毛組織の網羅的一塩基多型情報を再解析し、異数性の同定に成功した。今後は、更に解像度の高いSNPアレイへの応用と、より解像度の高い染色体構造異常診断を試みる。初年度は、これまで網羅的一塩基多型解析を行ったデータを利用して、混入時の実測データ予想を行った。具体的には、illumina社HumanCytoSNP-12を用い、母体血と臍帯血を解析して得られた網羅的一塩基多型情報を用いた。得られたシグナル値を、ソフトウェアKaryoStudioを用い、各プローブのベータ値を算出した。ベータ値は、各プローブのシグナル値を補正し、マイナーアレル頻度の算出に利用される数値である。これらの数値を、母親と子供で様々な割合で融合させることで、ゲノムが混在した状態をシミュレートした。その結果、大変興味深いことに、理論値とは異なる分布を示すことが判明した。傾向強度の強いプローブ周辺では、おそらくその残像により、わずかな差の検出が難しいため、二つのゲノムが混在した場合では、理論値のように二つのピークを作らず、なだらかなピークが連続して示された。これらの結果をもとに、実際に母と子のゲノムを混在させて計測すると、蛍光強度の強いプローブでは分離が悪い傾向が予測通り認められた。これらの傾向は、便宜上の呼称であるminor homo領域に多いが、実際に集団中でその多型がmajorかminorかを反映したものではないので、例えば分離が悪いプローブが「真の」major alleleに多く存在し、診断が困難になるといった影響を懸念する必要はないと考えられた。今後はこれらの実測データを用い、診断アルゴリズムの微調整を行う。流産や死産などのヒト発生異常において、原因検索のために染色体検査が行われるが、このような検体は状態が不良で、生細胞を用いた分染法などの染色体解析が不可能なことが稀ではない。このような場合、ゲノムDNAを用いた分子遺伝学的な解析が有効であるが、その一方で、このような検体では母体由来組織の混入を高率に伴うため、従来の遺伝マーカーを用いた手法(マイクロサテライト解析やMLPA (Multiplex Ligation-Dependant Probe Amplification)法等)では、最大3種類の遺伝子型が様々な比率で混在するため、「診断不能」あるいは「誤診」につながる。そこで、事前に両親の多型情報を取得した上で、解析対象試料中の児ゲノムと母ゲノムの混在比率を想定し、実測値から児ゲノムの解析結果を予測すれば、ノイズの中から児由来のシグナルを抽出し、胎児の核型を確定診断することができる。そこで、予測モデルと実測値の検証のために、父、母、児の精製ゲノムDNAを用い、母ゲノムと児ゲノムを様々な比率で混合し、その実測値から最も効果的な予測モデル式の作成を試みた。その結果、別途取得した父母の一塩基多型情報から混合比率を推定したのちに、BAF(B allele frequency)を補正する手法が最も適切と判明した。

これらの解析手法を用い、すでに網羅的一塩基多型解析まで行い、母体組織混入のために診断不能であったと考えられる過去症例の再検証を行った。その結果、児の核型を推定診断し、異数性の診断に成功した。産婦人科学流産や死産などのヒト発生異常において、原因検索のために染色体検査が行われるが、このような検体は状態が不良で、生細胞を用いた分染法などの染色体解析が不可能なことが稀ではない。このような場合、ゲノムDNAを用いた分子遺伝学的な解析が有効であるが、その一方で、このような検体では母体由来組織の混入を高率に伴うため、従来の遺伝マーカーを用いた手法(マイクロサテライト解析やMLPA (Multiplex Ligation-Dependant Probe Amplification)法等)では、最大3種類の遺伝子型が様々な比率で混在するため、「診断不能」あるいは「誤診」につながる。そこで、あらゆる組み合わせとゲノムの混在比率を想定して解析結果を計算予測し、実測値と最も近似する予測値を用いれば、ノイズの中から児由来のシグナルを抽出し、胎児の核型を確定診断することができる。そこで、予測モデルと実測値の検証のために、父、母、児の精製ゲノムDNAを用い、母ゲノムと児ゲノムを様々な比率で混合し、その実測値から最も効果的な予測モデル式の作成を試みた。その結果、別途取得した父母の一塩基多型情報から混合比率を推定したのちに、BAF(B allele frequency)を補正する手法が最も適切と判明した。現在本成果を投稿準備中である。当初は、既存の表計算ソフト等を用いた理論値をもとに解析を行っていたが、大量データ(各サンプルが、27万カ所のプローブすべてに、連続変数であるシグナル値や信号の信頼度と言った複数の情報を持つ)の網羅的な解析が難しかった。昨年度より、バイオインフォマティクスを専門とする研究者との連携が可能となったため、理論値、実測値をもとにした理論値、実測値、の三者を比較し、より実践的なアルゴリズムへの修正の道筋が立った。現在は異数性の診断以上の解像度まで到達していないが、今後は更に解像度の高いSNPアレイを用いた解析への応用および、より解像度の高い染色体構造異常診断を試みる。今年度は、さらに細かく実際の検体を用いた解析を行い、実践的なアルゴリズムを開発する。具体的には、研究実績の概要にも記したように、理論値と実測値のずれが示されたので、この部分の効果的な補正式を導き出す。また、モザイクやキメラの診断への応用を試みる。当初の仮説と現時点で得られている結果に齟齬はなく、期間内に十分目的を達成できると考える。論文投稿が次年度にずれ込むため、英文校正・投稿費用・再実験のための試薬代等を考慮し、次年度使用額とした。英文校正代金、投稿費用、査読後の追加実験費用として使用予定である。試薬代が966,820円で、およそ40検体分の解析に相当する。今年度は海外学会での成果発表と情報収集を予定しており、旅費800,000円を計上した。昨年度実績から、人件費400,000円を計上した。
グラフェンにおける量子輸送現象の理論

グラファイト(黒鉛)の原子層1層をグラフェンと呼ぶ。近年単層また少数層グラフェンが実験的に実現され、その性質に関する研究が世界規模で進められつつある。これらの物質の基礎的な性質である電気伝導特性、光吸収特性、反磁性効果(磁石を反発する効果)について詳細に研究し、層の数や積層様式に依存して様々に異なった性質を系統的に理解するとともに、通常の物質とは大きく異なった様々な新しい効果を見出した。多層グラフェンの電子特性について重点的に研究を行った。(i)多層グラフェンの電子構造の分割一般のN層のグラフェンの電子構造を考察し、系全体が里層または2層グラフェンに類似した小構造に分割できることを示した。これにより多層グラフェンの様々な物理量の計算が単層または2層のそれに帰結され、層数依存性の系統的な議論が可能になった。(ii)上記(i)の方法を用いて軌道反磁性を計算した。単層グラフェンはフェルミエネルギー零で大きな反磁性を持つことが知られている。多層グラフェンにおいては、層数が奇数の場合にのみ、単層グラフェンに類似したバンドが存在し、これが大きな軌道反磁性をもたらすことを示した。偶数層グラフェンとは一般に奇数層に比べ反磁性が小さくなるが、バンドの三角歪み効果(trigonal warp)が反磁性に一定の寄与をもたらすことが示された。(iii)同様の方法を用いて光学特性を計算した。2層グラフェンでは光の周波数が層間相互作用のエネルギーを超えたときに光吸収率が変化する。多層グラフェンは上述の通りいくつかの疑似的2層グラフェン構造を持ち、それぞれが類似の寄与を与えることを示した。疑似2層グラフェンの「層間相互作用」に相当する量はバンドごとに異なり、層の数とバンドのインデクスの単純な関数としてかけることを示した。これは光学吸収測定の周波数依存によって直接実験的に検出される重要な物理量である。さらに磁場中の電子構造を調べ、磁気光学特性を計算した2層グラフェンの電気伝導と局在効果に関して以下の研究を行った。単層グラフェンのバンド構造の特徴は電子バンドと正孔バンドが零ギャップで接していることであり、電荷中性点における電気伝導度は量子化伝導度程度の値を持つことが知られている。一方2層グラフェンのバンドも零ギャップであるが、単層のように線形ではなく有限の有効質量をもったバンドが接する形となる。さらに層と垂直方向に電場を印加することで電子正孔バンド間にギャップを与えることができ、外場による電子状態の制御方法として期待される。ギャップが開くと一見通常の半導体と同じような状況に見えるが、不純物中の局在効果に以下のような特異な性質を持つことを示した。2層グラフェンの電子状態はギャップの無い場合全て局在するが、電場を印加しギャップを零から大きくしていく過程で、必ず局在長が発散する点が存在する。これはバンドに内在する「ベリー位相」に関連した一種の量子ホール転移として理解することができ、磁場を使わずに電場のみで制御できる新しい量子相転移であることが示された。また、2層グラフェンにおけるゲート電場の遮蔽効果について以下の研究を行った。クーロン相互作用を取り入れた自己無撞着な計算により電場下でのバンド構造を決定した。これによりゲート電場は遮蔽効果により半分程度に減少することが明らかになった。さらにゲート電場が電子格子相互作用を通して格子振動に及ぼす影響を調べた。電場が上下層の間の対称性を破ることにより、格子振動の対称モード、反対称モードが強く混合することが示された。多層グラフェンの電子構造に関して以下のような研究を行った。グラファイトには通常のABA積層のほかにABC積層と呼ばれる構造が存在し、その電子構造は大きく異なる。ABA, ABC多層グラフェンに対してゲート電場下での遮蔽効果と電子構造への影響について詳しく調べた。ABCグラフェンにおいては表面状態に起因する価電子バンドと伝導バンドが低エネルギーの物理を支配する。これら表面バンドはフェルミエネルギー近傍で極めて大きな状態密度を持つため非常に強い分極効果をもたらし、外部電場を強く遮蔽することを示した。また電場を印加することにより本来接している価電子バンドと伝導バンドの間にギャップが開き、その幅は外部電場の大きさに対して非線形な依存性を示すことを明らかにした。外部電場によるギャップ制御はエレクトロニクスへの応用の観点から極めて重要である。また、多層ABCグラフェンに存在する様々な層間相互作用が電子構造へ及ぼす影響を分析し、その結果表面バンドは120度対称性をもって強く歪んでいること、また価電子バンドと伝導バンドは複数の接点(ディラック点)を介して複雑に接合していることが明らかにされた。一方、単層グラフェンの持つ強大な反磁性の起源を解明するべく、空間的に非一様な磁場の下でのグラフェンの電子応答を計算した。特定の長さスケールを持たない線形バンド構造に起因し、外部磁場と相似な磁場分布を誘起する磁場鏡像効果を見出した。
脳梗塞発症に関わる遺伝的バイオマーカー探索研究

頭蓋内主幹動脈狭窄による脳梗塞の発症予測の予防的治療確立を目指して、基盤的遺伝子解析研究を行った。1200名を越える様々な脳血管疾患患者からなるDNAサンプルと臨床情報を兼ね備えた、コホートを構築した。RNF213 c.14576G>Aを有する頭蓋内主幹動脈狭窄の特徴を報告した。発症に関わる新たな遺伝子同定に向けて、基盤となる網羅的な遺伝子解析を行なった。今後のさらなる研究の発展が期待される。我々は脳卒中関連遺伝子変異RNF213 c.14576G>Aが脳卒中の主たる原因である頭蓋内狭窄に大きな関連を持つことを明らかにしたてきた。さらに詳細な検討を加えRNF213上の他の遺伝子変異と比較しても強い疾患関連性をもつことが明らかにした。RNF213変異(c.14576G>A)は日本人の一般集団の2%と比較的高頻度に認められるが明らかとなっており、一方で頭蓋内狭窄の有病率は約1000人に1人程度(全体の0.1%程度)あり、RNF213 c.14576G>Aの保因者(全体の2%程度)がすべて発症するわけではない。疫学的な解析の結果、この変異の1/80程度の人が発症することが示唆する結果となった。そこで、我々はRNF213 c.14576G>Aを持っていても、頭蓋内狭窄の発症の有無、重症度に関わるさら別の遺伝子変異が存在する可能性が高いと考えられる。このような疾患発症の決定因子となる新たな遺伝的変異(遺伝子多型)を明らかにすることを目的とした。予定したサンプル収集を順調にすすでおり、一部においては全ゲノム領域の遺伝子解析を行っており、解析を進めている。我々は脳卒中関連遺伝子変異RNF213 c.14576G>Aが脳卒中の主たる原因である頭蓋内狭窄に大きな関連を持つことを明らかにしてきた。本年度の成果として、以下の2つの成果を得た。RNF213 c.14576G>Aを有する頭蓋内主幹動脈狭窄に関して詳細な検討を加え、狭窄血管の血管外径が縮小するnegative remodelingを起こしていることを明らかにし投稿論文が採択された。また、狭窄血管は頭蓋内主幹動脈の内頚動脈や中大脳動脈といった前方循環に特異的に発症していることを明らかにした。対比として椎骨動脈や脳底動脈といった後方循環の血管には発症していなかった。この血管に関して論文査読中である。また、RNF213 c.14576G>Aに加えて、発症に関わる別の遺伝子変異の検索を行っている。Wholeexome sequence、target resequenceの結果、候補となる遺伝子変異を絞り込み、validationを行っている。実際には、RNF213 c.14576G>Aを有する血管狭窄と有しない血管狭窄で、脳梗塞発症に関わる危険因子(遺伝子変異)が異なるという興味深い結果であった。頭蓋内主幹動脈狭窄でもRNF213 c.14576G>Aの有無によって脳梗塞発症の予防の戦略に違いが生じる可能性を秘めており、脳卒中の個別化治療につながる可能性があると考えられる。さらなるサンプル収集を継続しており、同時にRNF213 c.14576G>Aのスクリーニングを継続している。さらにサンプル収集を進め、遺伝子解析を行っていく。解析が終了次第、case-controlの関連解析を行って候補となる遺伝子変異の絞り込みを行う。脳神経外科学本年度はサンプル収集に専念し、遺伝子解析に関しては次年度以降の行う予定としたため。収集したサンプルに関して全ゲノム領域の遺伝子解析を進める予定である。
細菌の環境での生き様の理解による有用細菌の実環境利用への展開

有用細菌の実環境利用における問題の主因は、細菌の環境での生き様が十分に理解されていないことによる。本研究では、環境汚染物質分解細菌株をモデルとして、極貧栄養条件下での適応・増殖戦略と、当該物質分解コミュニティに共在するが分解能を持たない他細菌株との関係性に着目し、環境細菌の実環境での生き様の理解を深める。さらに、分解細菌の効果を最大限に発揮するための具体的接種方法を提示し、実環境での有用細菌株の効率的利用のための理論的基盤を構築する。
筋肉部位間に香りの差をもたらす香気成分の特定と生成機構の解明

筋肉部位間における香気成分の違いを明らかにすること及び香気成分の違いに影響を及ぼす因子の解明を目的として本研究を行った。5種類のブタ骨格筋(中間広筋、横隔膜、大腰筋、胸最長筋、半腱様筋)を用いて、ガスクロマトグラフ質量分析(GC-MS)による揮発性物質の同定および定量を行った。GC-MSの結果、約100ピークを検出し、14種類の揮発性物質を同定した。揮発性物質総量は、半腱様筋および胸最長筋において中間広筋よりも多かった。揮発性物質総量と遅筋型ミオシン重鎖量との間に有意な負の相関がみられた(r = -0.56, P < 0.01)ことから、揮発性物質総量に対する筋線維型の関与が示された。筋肉部位間で異なる香気成分の生成機構の解明のため、加熱後の食肉からの揮発性物質の抽出条件の検討を行った。揮発性物質の抽出は、固相マイクロ抽出(Solid phase micro extraction:SPME)ファイバーを用いた動的サンプリングで行った。最初にSPME法で使用するSPMEファイバーの抽出相の検討を行った。4種類のSPMEファイバー(「75 μm Carboxen/PDMS」,「50/30μm DVB/CAR/PDMS」,「85μm polyacrylate」,「65μm PDMS/DVB」)を用いて検討を行い、抽出された揮発性物質数が最も多かった「65μm PDMS/DVB」をその後の解析に用いた。供試豚肉は、2種類の筋肉部位(中間広筋(モモ)および胸最長筋(ロース))とし、と畜7日目に枝肉より採取し、分析まで-30°Cで凍結保存した。前処理は、調理法として「煮る」を想定し、真空包装下で90°C・30分の加熱を行った。抽出した揮発性物質に対し、ガスクロマトグラフィー-質量分析(GC/MS)を実施した。GC/MS分析の結果、約100ピークを検出し、標準物質の保持時間およびマススペクトルパターンとの比較により十数種の物質を同定した。同定した物質は両筋肉に存在し、1-pentanal, 1-hexanal, 1-heptanal, 1-octanal, 1-nonanalおよび1-octen-3-olの合計量が、検出された揮発性物質の総量の50 %以上を占めていた。また、未同定物質の大部分についても、保持時間およびマススペクトルパターンから両筋肉に存在することを確認した。これらより、揮発性物質の種類については筋肉間で大きな違いがないと考えられた。揮発性物質総量の80 %以上を占める47物質の量比を用いて主成分分析を行ったところ、筋肉で異なる傾向がみられた。前年度の結果より、2種類の筋肉(中間広筋および胸最長筋)間において揮発性物質の量に差がみられたことから、その差をもたらす要因として筋線維型に着目して本年度は研究を行った。揮発性物質と筋線維型との関係を明らかにするため、筋線維型構成が異なるとされる5種類の筋肉(中間広筋、横隔膜、大腰筋、胸最長筋、半腱様筋)より揮発性物質を抽出した。揮発性物質の抽出条件は、前年度の検討をふまえ65μmPDMS/DVBのSPMEファイバーを用いた動的ヘッドスペース法により行った。抽出した揮発性物質の同定は、ガスクロマトグラフィー質量分析(GC/MS)により行った。筋線維型の分析は、ミオシン重鎖の遅筋型アイソフォーム(MyHC-slow)抗体を用いたELISAにより行った。筋肉部位間で異なる香気成分の生成機構の解明のため、加熱前の食肉中の低分子化合物についてメタボローム解析を行った。生体重約90 kgのLWDの雌豚3頭を供試した。と畜後、枝肉を2°Cで168時間貯蔵した。168時間の貯蔵を行った枝肉より、速筋型筋肉である腰最長筋(longissimus lumborum: LL)および遅筋型筋肉である中間広筋(vastus intermedius: VI)を採取し、液体窒素で凍結した後-80°Cで保存した。採取した骨格筋組織よりメタノールおよびクロロフォルムを用いて代謝物質の抽出を行い、キャピラリー電気泳動ー飛行時間型質量分析計により測定を行った。測定は陽イオン性代謝物質および陰イオン性代謝物質について行った。検出されたピークは、自動積分ソフトウエアを用いて自動抽出し、ピーク情報として質量電荷比、泳動時間、ピーク面積を得た。検出されたピークの質量電荷比および泳動時間の値を基に候補化合物のデータベース検索を行い、188化合物を検出した。

188化合物の内、解糖系・糖新生、ペントースリン酸経路、クエン酸回路に関係する代謝物質が27種、尿素回路とアミノ酸代謝(Glu,Gln,His,Pro)に関係する代謝物質が25種、アミノ酸代謝(Gly,Ser,Cys)に関係する代謝物質が17種、アミノ酸代謝(Asp, Ala,Lys)に関係する代謝物質が13種、分枝鎖アミノ酸代謝に関係する代謝物質が4種、芳香族アミノ酸代謝に関係する代謝物質が4種、プリン代謝、ピリミジン代謝に関係する物質が22種、ニコチン酸およびニコチンアミド代謝に関係する代謝物質が3種検出された。また、と畜168時間後において、VIでのみ検出された物質は14物質であり、LLでのみ検出された物質は13物質であった。本研究では、食肉の各部位に特徴的な香気成分を特定すること、およびその香気成分の生成機構を解明することを目的として、異なる筋肉部位における加熱前の代謝関連物質のメタボローム解析と加熱後の揮発性物質の測定を行うこととしている。本年度は加熱後の揮発性物質の測定条件の検討を行い、その条件を用いて異なる筋肉部位における揮発性物質の測定を行ってきた。しかし、研究用ヘリウムガスの供給停止により揮発性物質の測定を一時中断せざるを得なかったため、必要なデータの収集が完了しておらず、研究がやや遅れている状況である。本年度は加熱前の代謝関連物質のメタボローム解析を行い、異なる筋肉部位における代謝化合物の差異について明らかにしていることから、研究の目的に対しておおむね順調に進展していると評価できる。今年度に検討した揮発性物質の測定条件を用いて、次年度は引き続き筋肉部位間での揮発性物質の差異を明らかにするための分析を継続し、必要なデータの収集を完了する。これらの揮発性物質の分析結果を基に、食肉の各部位に特徴的な香気成分を特定する。前年度に得た加熱前における代謝関連物質のメタボローム解析結果、および、今年度および次年度で得る予定である加熱後の揮発性物質の分析結果を基に、筋肉部位に特徴的な香気成分の生成機構の解明をする。次年度において、加熱後の食肉からの揮発性物質測定のための条件決定を行い、異なる筋肉部位間での揮発性物質の差異を明らかにする。これらの揮発性物質の測定結果を基に、食肉の各部位に特徴的な香気成分を特定する。本年度で得た加熱前における代謝関連物質のメタボローム解析結果、および、次年度で得る予定である加熱後の揮発性物質の測定結果を基に、香気成分の前駆物質候補の探索を行い、筋肉部位に特徴的な香気成分の生成機構を解明する。次年度使用額200,000円は、平成24年秋以降、国内での研究用ヘリウムガスの確保が困難となったことによる分析中断に対し、ヘリウムガスの供給が回復する平成25年3月以降に分析を再開するための経費であり、研究計画遂行のために使用する。本研究の推進のため、次年度の研究費は交付申請時の計画どおり使用する。なお、次年度使用額223,261円は、研究費を効率的に使用して発生した残額であり、次年度に請求する研究費と合わせて研究計画遂行のために使用する。
血流と血管内皮・平滑筋細胞の相互作用に関する分子生物学的・生体工学的研究

平成5年度に於いては流れ負荷による血管内皮細胞の機能変化に関する実験を中心に行った。とくに内皮細胞の産生する血管拡張物質である一酸化窒素(NO)およびリンパ球との接着現象の面から流れずり応力の作用を検討した。その結果、内皮細胞にずり応力が働くと細胞内cGMP上昇するが、この上昇はNO合成阻害薬があるL-NMAで消失することからずり応力によりNOが産生されることが示された。またずり応力のレベルを変えた実験でこのNOの産生量がずり応力の強さに依存することが判明した。この事実は従来in vivoで観察されてきた血流増加に対する血管の急性拡張反応のメカニズムに血流に起因するずり応力とその刺激によるNO産生が関与する可能性を示していると思われた。また内皮細胞は血流中のリンパ球と接着を介して相互作用を営んでおり、それはリンパ球のホーミング現象や組織の炎症・免疫反応と深く関連する。マウスのリンパ節から培養した内皮細胞に流れを負荷するとリンパ球に対する接着性が明らかに低下するのが観察された。種々の接着分子に対するモノクローナル抗体を用いたフローサイトメトリーの結果VCAM-1の発現が有意に減少しているのが示された。このVCAM-1の減少はずり応力依存性であり、かつ可逆性であった。また細胞のRNAをRT/PCRで検索したところずり応力でVCAM-1mRNAの発現も減少することが判明した。以上の結果から流れ負荷が遺伝子レベルに影響を及ぼし、接着蛋白の発現減少を引き起こすことが内皮細胞のリンパ球に対する接着性を低下させると考えられた。
生体内遷移金属イオンセンサーの開発と蛍光レシオイメージングへの応用

生体内における金属イオンの動的挙動を解析するためのツール分子として種々のセンサー分子の開発を行った。その結果、銀、カドミウム、亜鉛、および水銀などの金属イオンに対して特異的な応答を示す分子の開発に成功した。中でもカドミウムイオンセンサーを用いることで、レシオ法による細胞内カドミウムの濃度変化を世界で初めてイメージングすることに成功した。生体内において金属イオンは様々な生理的反応に関与しており、必須なものであると同時に、その種類や濃度によっては有害な働きを示すものもある。そのため、生体内では金属イオン濃度は精密にコントロールされ、生命活動が維持されている。蛍光プローブは細胞内外に作用する分子の働きを生きたままの状態で捉え生体内のダイナミクスを可視化し解析できるツールであり、各種金属イオンに対応するプローブ分子の開発が重要な研究課題となっている。平成19年度は、各種蛍光プローブの合成と機能評価を中心に研究を進め、次のような研究成果が得られた。まず、カドミウム蛍光プローブでは、7-メチル-4-アミノクマリンを蛍光骨格として有する6座配位子CadMQの合成を行った。CadMQは、水溶液中においてカドミウムと結合し、20nmもの大きな短波長シフトが観測された。高い蛍光量子収率やカドミウムイオンに対する強い親和性、およびカドミウムイオンの選択性などから、CadMQは生体応用するうえでの十分な機能を有していることがわかった。また、平成19年度は銀イオンの蛍光プローブの開発にも着手した。チオエーテル配位子を有するロサミン型蛍光プローブを合成し、物性の評価を行ったところ、銀イオンに対し特異的に蛍光応答を示し、配位に伴って蛍光強度が約35倍強くなることがわかった。また、銀錯体の結晶構造やNMRスペクトルの解析から、金属中心の配位環境を明らかにした。これらの成果は、次年度の研究計画である「生細胞を用いた蛍光イメージング」に繋がるものである。蛍光プローブは細胞内外に作用する分子の働きを生きたままめ状態で捉え生体内のダイナミクスを可視化し解析できるツールであり、各種金属イオンに対応するプローブ分子の開発が重要な研究課題となっている。平成20年度は、前年度に引き続き、各種蛍光プローブの合成と機能評価を中心に研究を進め、次のような研究成果が得られた。まず、前年度に合成したカドミウムプローブCadMQを用いた細胞内カドミウムの蛍光イメージングを行った。CadMQは細胞膜透過性を有しており、共染色実験からCadMQは細胞内酸性オルガネラに局在化していることがわかった。また、CadMQを用いることで細胞内カドミウムの濃度変化の蛍光イメージングに世界で初めて成功した。次に、金ナノクラスターを用いた水銀イオンセンサーの開発に着手した。トリエチレングリコールを担持した金クラスターに水銀イオンを作用させると、溶液の色は赤から青色へと変化することがわかった。この変化は水銀イオンに特異的であり、その選択性はエチレングリコール側鎖の長さに依存していることがわかった。透過型電子顕微鏡やエレクトロスプレーイオン化質量分析による詳細な検討から、本反応は水銀イオンによる金-硫黄結合の開裂とそれに続く金クラスター間の凝集に起因していることを明らかにした。このような反応機構の提唱は初めてであり、水銀イオンセンサーとして更なる発展が期待されるものである。
ルテニウム錯体を反応場とするニトリルとケトンの新規反応に関する研究

1.β-ケトイミン(β-イミノケトン)のキャラクタリゼーションアセトニトリル配位ルテニウム錯体[Ru^<II>(acac)_2(CH_3CN)_2]を、アセトン溶媒中空気下室温付近で長時間反応させることにより、ニトリルとケトンが反応して炭素-炭素結合を生じ、β-ジケトンのO原子の1つがNH基に置き換わった、β-ケトイミンが配位した錯体が得られる。有機ニトリルとケトンの種類をそれぞれ変えて同様の反応を行って得られた各種β-ケトイミナト環の構造を単結晶X線構造解析により詳細に調べることができた。その結果、NH基のトランス効果をはじめするβ-ケトイミン環の共通する特徴をβ-ジケトナト錯体と対比させながら明らかにすることができた。電気化学的測定においては、NH基の電子供与性の増大による中心金属上の電子密度の上昇により、酸化および還元電位はともに負電位方向にシフトした。2.副反応による多様な反応性の解明上記の反応を酸化的条件で行うことにより、有機ニトリルの加水分解が起こることがわかった。この反応機構を検討するための参照実験として、ケトンの代わりに第三級アルコールを用いた反応を行ったところ、アセチルアセトンおよび三座架橋酸素原子で架橋した三核錯体および四核錯体が生成することがわかった。この反応は、酸素原子による中心金属の酸化と有機ニトリルの脱離、金属-炭素結合の生成とが協奏的に進む、大変興味深い反応であることを意味するが、その機構は検討中である。これら錯体の酸化状態および電極反応について電気化学測定を中心とした詳細な検討を行っているところである。1.β-イミノケトンのキャラクタリゼーションアセトニトリル配位ルテニウム錯体[Ru^<II>(acac)_2(CH_3CN)_2]を、ケトン溶媒中空気下室温付近で長時間反応させることにより、ニトリルとケトンが反応して炭素-炭素結合を生じ、βジケトンの酸素原子の1つがNH基に置き換わった形の新規β-イミノケトンが配位した錯体を得ることができた。単結晶X線構造解析の結果、この錯体はβ-ジケトナト錯体に比べ、OがNHに置き換わった以外はほぼ同じ構造であることがわかった。プロトンNMR測定では錯体は常磁性を示し、中心金属はIII価であることがわかった。またβ-位の置換基効果はβ-ジケトナト錯体と全く同様であった。このことは、新規にできたβ-イミノケトン環はβ-ジケトンと等電子構造であることを意味する。2.β-イミノケトン類を生成する反応機構の解明上記の反応は有機ニトリルとケトンの種類をそれぞれ変えても同様に反応が進行して対応するβ-イミノケトン環を生成し、この反応は一般性があることがわかった。反応は、配位状態にある有機ニトリルの三重結合炭素とケトンのα位炭素との間に新規炭素-炭素結合が生成することから生じる。また、β-イミノケトン錯体は中心がIII価であるにも関わらず、有機ニトリル錯体は中心金属がIII価のものからは反応せず、II価のものからしか反応が進行しないことがわかった。このことは、ケトンからのプロトン解離と中心金属の酸化とが協奏的に進む、大変興味深い反応であることを意味するが、その詳細な機構は検討中である。
医用画像保管システムの効率的な画像保管および閲覧を実現するログ解析手法の研究

PACSシステムから画像閲覧のアクセスログを収集し解析することで、どのようなシーンでどのようなユーザが、どの患者のためにどのような画像を閲覧しているか、確認することが可能となるシステム構築を行った。このシステムから得られるデータを元に、半自動的に画像をユーザに表示する画像Viewerの開発が可能となる。診療支援に利用することで、医療の質向上に貢献できると考えている。電子化が定着した医用画像は医療機器の進化に伴いその発生容量が大幅に増加し続けている。保管に用いるハードディスクの価格が下がり大容量の画像が保管可能となっているが、大容量が故に表示速度の遅延が臨床現場での許容範囲を超えるようになってきている。また保管されている画像は画一的に保管され、その重要性や優先度などは人間が肉眼で判断する必要がある。本研究の目的は、画像を如何に保管するかという一定の方法論を導き出すことである。これをシステムログ、アクセスログを解析することであるべき法則を見いだし、それに応じて保管場所を決定する。また現場のニーズに応じた画像表示方法も定まった法則がない。そこでシステムのログ情報を元にニーズに応じた画像表示方法論を導き出し、ユーザが望む形で画像や表示機能が提供できれば、画像診断の効率化、ひいては医療の質向上に貢献できるものと考えられる。この各種のログを収集し解析するためにアクセスログ収集システムを構築した。ログ収集対象システムとして、PACSサーバにおけるDAS(DICOM Application Sever)、STS(Short Term Storage)、EA(Enterprise Archive)+LTA(Long Term Archive)がある。またViewerを構成するシステムのサーバとして、iDIR(Matrix View)、K-Web(Kawanaka Web Viewer)、Cweb(Centricity Web Viewer)、WebDx(いずれも商品名)がそれぞれある。これらのシステムにログ収集用スクリプトを開発し、ログ収集専用端末にインストールした。各種ログはこの端末にネットワークを介して収集できるように構築した。計7つのシステムに半年間をかけてこれらのシステムを構築した。本研究の目的は、現存の医用画像保管・閲覧システムからシステムログ、アクセスログを簡便に収集するシステムを開発すること。さらに収集したログを解析し、大容量の画像に対して臨床現場での重要度に応じた優先度を自動的に付与、優先度に応じて画像表示速度を改善するためのシステム構築理論を確立することである。初年度は医用画像保管システムの画像のアクセスログを収集するシステムを開発し、2年目である昨年度には、これに加えて電子カルテ側のアクセス情報、ユーザ情報なども取得し、各キーイベントに対するキー情報がどのようなものなのかを解析するためのデータベースを作成した。これによって、必要なときに必要な画像を選択し、最適な場所に配信するための情報を得ることが可能となった。現在病院情報システム化から発生する日々の情報を、随時DBに蓄積しているところである。最終年度では、この情報を元にシステムの完全自動化を検討している。昨今の医療機器の進歩は目覚ましく、画像診断装置においても例外ではない。高機能な撮影装置では、ミリ単位の詳細な画像を撮影することが出来、病変の早期診断、早期治療に有用である。また生体の機能をトレースすることが出来る機能画像診断分野も長足の進歩を遂げ、医療における画像診断の占める役割はますます重要となってきている。しかしこうなると同時に発生する画像容量は膨大なものとなり、その大量の画像を効率よく保管し、必要なときには迅速に閲覧できる仕組み作りが重要となる。通常の医用画像保管システム(PACS: Picture Archiving Communication System)では、高速にアクセスできる短期保管領域と大容量の画像を保管する長期保管領域に分けて構成されることが多い。短期保管領域では、ここにデータがあれば比較的高速に画像を閲覧することが可能であるが価格は非常に高額である。また長期保管領域では比較的安価に大量の画像が保管できるがアクセス速度は短期保管領域に劣る。PACSではこれらのメリットを組み合わせ構成されることが一般的である。つまり、ある一定期間は高速な短期保管領域に画像が存在するが、それを過ぎると長期保管領域にしか画像が存在せず、長期間の後に画像閲覧が必要なときには、一旦比較的低速な長期保管領域から画像を高速な短期保管領域に移動し、これを画像参照ビューアにて閲覧する必要がある。こうなると一検査あたりに当該画像が大容量であった場合、必要なときに迅速に画像を閲覧ことが出来ず、多忙な臨床現場では支障が出ることとなる。これを解決するためにシステムのログ情報を元にニーズに応じた画像表示方法論を導き出し、ユーザが望む形で画像や表示機能が提供できる様な理論を導き出すことで医療に貢献する事を目指し、新規にシステム構築を行った。

研究計画書に記載したスケジュール通りに、目的の解析やシステム開発を行う事が出来ている。また国内学会発表、海外研究発表も昨年度には行う事が出来、順調に計画が推移している。今年度もこの流れで最後の成果が出るまで継続して注力していきたいと考えている。医用画像情報システム今後のテーマとしては、これまで解析してきたデータベースの精緻化、開発したシステムとの自動化連携、実環境への実装の検討を残している。それぞれ順調に進んでいるので、このペースを守って最終年度に計画が完遂できるように再度スケジュール確認をしたい。引き続き、研究生、大学院生とともに、問題整理をしながら進めていきたい。H25年度計画した内容はほぼ達成している。解析用にAccessを使用する予定であったがデータ量が膨大となったため、使用するデータベースソフトとしてMySQL、解析ソフトにMatlabを使用する事に変更した。MySQLはフリーのソフトウェアであり、Matlabは既に教室に保有していたソフトウェアであったため、本研究の計画資金に影響はない。今年度構築したシステムに収集したログを、来年度の計画推進に備えて呼び解析を行った。当初予想していたログは十分収集できており、予定通り来年度の解析を行えるものと考えている。初年度にシステム開発とともに保守費用が必要であった。次年度も同様の保守費用が発生したが、研究が順調に進んだことにより、想定よりも保守作業の回数を減らすことが可能であった。このため、開発・保守を担当している企業に対し、保守費用の見直しを依頼したところ、減額を実現できたため次年度使用額が発生した次第である。来年度は、適切な画像保管のための理論、臨床上適切な画像表示理論を構築する事を目指す。最適化理論が構築できた後、システムベンダーの協力の下テスト環境を構築し、この理論を実装して動作確認することを予定している。臨床現場でのそれぞれのシーンに応じて、理想的なワークフローを考案し、このフローが最適化理論によって実現できているかどうか検証を行う。臨床応用のためには相当数のシーン解析が必要と考えており、今年度中および次年度にかけて数多くのデータを蓄積して行く予定である。予備実験は診療各科、あるいは臓器別グループごとに行っていく必要があると考えられる。これを全診療科でシステム上シミュレーションし、データ蓄積、解析後、最適化理論を構築することで、本番環境への実装準備が整うと考えている。本研究により、これまで蓄積するだけであった医用画像を、ニーズに応じて効率よく保管し、閲覧できる環境が整うと考えている。最終年度も保守費用を計上していたが、これも減額となる見込みのため、現在生じた「次年度使用額」と合わせ、余裕の出来た予算は開発したシステムを実の病院情報システムへ実装する際の費用として活用したいと考えている。
小腸幹細胞Organoid Unitを用いた人工小腸作製

(1)仔マウスから小腸を採取し、TESIを作成した。(2)Lgr5-EGFPマウスの小腸より上皮幹細胞を分離し培養を行った。(3)培養された上皮幹細胞を、TESI作成手順と同様に移植したところ、腸管上皮様の構造、分化が確認されたが筋層構は認めなかった。(4)仔マウス小腸から腸管間質系幹細胞を分離し培養を行った。それらを同様に移植したが、腸管上皮構造は得られなかった。まずはマウス小腸からのTESI作製を当教室において再現できることを確認した。これは仔マウスから小腸を採取し、片化した後に酵素処理を行いOrganoid Unitを作製、これを生体内吸収性のScaffoldに充填し、NOD/SCIDマウスの大網へ移植。4週後にそれを採取し成長、分化を組織学的、免疫組織化学的に検討した。技術の習熟により、安定してTESIが作製できることが可能となった。次いでT Satoらのプロトコル(Nature, 459, 263-365. 2009)に則り、Lgr5-EGFPマウスの小腸より上皮幹細胞を分離し、in vitroでの培養を試みた。これは培養液に必要な成長因子を加え、3次元培養を行うもので、mEGF、Noggin、そしてStanford大より取り寄せたcell lineより生成したRspolなどを混合したMatrigelを用いる。上皮幹細胞の増殖が確認された。それら培養された上皮幹細胞を、TESI作成手順と同様にNOD/SCIDマウス大網に移植したところ、腸管上皮様の構造が認められた。次いでT Satoらのプロトコル(Nature, 459, 263-365. 2009)に則り、Lgr5-EGFPマウスの小腸より上皮幹細胞を分離し、in vitroでの培養を行った。培養液にmEGF、Noggin、そしてStanford大より取り寄せたcell lineより生成したRspolなどを混合したMatrigelを用い培養、継代を行い、上皮幹細胞の増殖が確認された。それら培養された上皮幹細胞を、TESI作成手順と同様にScaffoldに充填しNOD/SCIDマウス大網に移植したところ、培養を介さず作成したTESIと同様の構造が形成された。それらは組織学的に腸管上皮様の構造を呈しており、免疫組織化学染色にてはパネート細胞、内分泌細胞、杯細胞や吸収上皮細胞の存在が確認された。また陰窩付近で活発な細胞分裂がみられ、成長、分化が確認された。しかし上皮幹細胞のみの移植では腸管筋層構造が確認されなかった。続いて、仔マウス小腸から腸管間質系幹細胞を分離し、継代培養を行った。それらを同様に単独でScaffoldに充填しNOD/SCIDマウス大網に移植したが、腸管上皮構造は得られなかった。現在、培養した上皮幹細胞と、培養した腸管間質系幹細胞とを混合したものをScaffoldに充填しNOD/SCIDマウス大網に移植しTESIを作成する試みを継続している。外科学一般・消化器外科学マウスの入手、繁殖に時間を要した。今後はさらに培養精度を高め、少量の組織より大量の腸管上皮幹細胞を得ることで、効率よく代替腸管を作製することを目指し、より一層研究を推進させ、最終的には自らの小腸より採取した細胞から作成した代替腸管を自家移植することで、拒絶の問題から解放され免疫抑制剤を使用することなく短腸症候群の軽減に寄与できることを期待する。研究の進捗状況が滞り、試薬などの購入が当初の予定通り行えなかったため。研究の進行に合わせ、必要物品を購入し、学会発表、論文投稿を行う際の費用として使用する予定である。
嗅覚系におけるOlfactoryEnsheathingCellの分子生物学的解析

嗅覚系を構成するグリア細胞である01 factory Ensheathing Cell (OEC)の加齢による細胞動態を研究した。OECの細胞密度は加齢によらず一定であるが、細胞増殖能は著しく減少することが明らかとなった。ただし、OECの増殖labelingindexは嗅神経そのもののlabeling indexに比べると極めて低値であった。また、OECだけでなく嗅覚系の重要な神経栄養因子であるFGF-2の分布を免疫染色によって調べた。FGF-2は嗅粘膜粘膜固有層において嗅神経束の内部に存在するOECの核に発現がみとめられたが、OECにはFGF-2が陽性のものと陰性のものが存在することが明らかとなり、その比率は加齢により変化しないことがわかった。OECは細胞密度や増殖活性、栄養因子といった面で静的な安定した細胞動態をとることが明らかとなり、これらの特徴は生涯にわたり神経再生や軸索延長を繰り返す嗅覚系においてOECの生物学的安定性が重要な役割を担っていることを示していると思われた。また、電子顕微鏡的研究で、加齢により嗅神経の軸索径が減少する一方、神経密度は一定であることも明らかになった。このことは、嗅神経を取り巻くOECの細い突起が加齢により増加する可能性があることも示している。
メラトニン投与による魚類の繁殖制御

本研究においては,魚類の生殖年周リズムおよび日周リズムをメラトニン投与により制御するため,キンギョを用いて実験を行なった。(1)キンギョの光周性の発現におよぼす松果体・眼球除去の影響キンギョは,秋季に光周性を発現し,24°Cでは生殖腺の発達は短日下で抑制,長日下で促進される。そこで,本実験においては雄キンギョの光周性発現におよぼす松果体・眼球除去の影響について検討した。その結果,14L/24°Cで飼育した松果体除去群,眼球除去群の血中生殖腺刺激ホルモン(GTH)濃度は偽手術群よりも有意に高い値を示した。しかしながら,松果体除去群と眼球除去群の血中GTH濃度,生殖腺体重比,ならびに排精持続期間に有意な差は認められなかった。(2)キンギョの排卵時刻決定におよぼすメラトニンの影響キンギョなどコイ科魚類の排卵は,生物時計に支配されており,明暗条件下では暗期に同期的に起こるが,恒明条件下ではランダムに起こることが知られている。そこで本実験においては,排卵時刻同調におけるメラトニンの役割を検討するため,恒明条件下で水温上昇により排卵を誘発し,メラトニンの定時経口投与,定時注射により排卵時刻が同期するかどうか調べた。その結果,水温上昇の前から7日間連続してメラトニンの経口投与,あるいは腹腔内注射を行なってもGTHサージのタイミングと排卵時刻は同期しなかった。以上、本研究においてはメラトニン投与により魚類の生殖リズムを人為的に制御することを試みた。今後さらに実験条件や投与法を改善して検討を続けていく必要があると思われる。