hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
形態形成における全ゲノム転写制御ネットワークの高精度推定方法の開発

本研究ディープラーニングを応用した形態形成における全ゲノム転写制御ネットワークの推定方法を目的としており、研究計画として主に"A.四肢形成及びヒレ形成過程におけるATAC-seqを用いた制御配列候補の同定"、"B.ディープラーニングを応用した全ゲノム転写制御ネットワーク推定方法の確立"、の2つの課題を設定している。課題A.四肢形成及びヒレ形成過程におけるATAC-seqを用いた制御配列候補の同定この課題においてはすでに四肢形成におけるATAC-seqデータの取得に成功している。このデータは課題Bで使用する予定であるが、現在までに配列の進化的保存性や転写因子のモチーフの頻度の解析、時間的なダイナミクスを示す制御配列と定常的なものの違いなど様々な解析を遂行中である。ヒレ形成過程においては発生段階表の作成を終え、サンプル調整においての条件検討を行っている。課題B.ディープラーニングを応用した全ゲノム転写制御ネットワーク推定方法の確立この課題においては、"遺伝子制御配列の予測"および"遺伝子制御関係の予測"の2種類のソフトウェアの開発に取り組んでいる。前者では、遺伝子制御配列の特徴をディープラーニングを用いて解析し、どういった転写制御因子が制御に関わっているかを同定するものである。発表されている類似のソフトウェアのパフォーマンスを上回るものの開発に成功した。論文およびソフトウェアをプリプリントサーバーbioRxiv、githubにおいてそれぞれ公開し、現在、査読付き論文の投稿中である。後者では、制御配列とプロモーターの組み合わせを予測することにより、どの制御領域がどの遺伝子を制御しているのかを推定する取り組みであり、現在ソフトウェア開発に取り掛かっている。ほとんどの必要な実験データは取り終えているが、予定していたイヌザメのヒレ形成におけるエピジェノムデータの取得に技術的な問題が生じたのが、遅延している主な理由である。本研究で予定していたATAC-seqという、次世代シークエンサーを使用した遺伝子制御配列候補の同定するための手法において、細胞核を分離する際に、動物種特異的な問題が生じていることまではわかっているものの、条件を最適化するに至っていない。今後の研究計画では、現在までに得られている成果をまとめつつ、遅延の原因となっている実験手法についての見直しを行っていく予定である。問題が生じている技術に関して、代替となる実験手法の条件検討をすでに始めており、現在までに良好な予備データが得られている。このため、代替手法によるデータ取得の見通しが立っており、本研究計画の完了が見込まれる。課題A.四肢形成及びヒレ形成過程におけるATAC-seqを用いた制御配列候補の同定この課題においてはすでに四肢形成におけるATAC-seqデータの取得に成功しており、リプリケイツ間のバラツキも低く、データクオリティーは概ね良好である。データは課題Bにおいて開発予定のソフトウェアを用いて解析予定であるが、現在のところ配列の進化的保存性や転写因子のモチーフの頻度の解析、時間的なダイナミクスを示す制御配列と定常的なものの違いなど様々な解析を行っている。課題B.ディープラーニングを応用した全ゲノム転写制御ネットワーク推定方法の確立この課題においては、"ローカルなゲノム配列の特徴抽出"と"グローバルなゲノム配列の特徴抽出"といった2種類のソフトウェアの開発に取り組んでいる。後者では、制御配列とプロモーターの組み合わせを予測することにより、どの制御領域がどの遺伝子を制御しているのかを推定する取り組みである。"ローカルなゲノム配列の特徴抽出"については、すでに発表されている類似のソフトウェアのパフォーマンスを上回るものの開発に成功し、現在、論文の投稿準備を行っていおり、"グローバルなゲノム配列の特徴抽出"を行うソフトウェア開発に移行を行う予定である。ヒレ形成過程におけるATAC-seqデータの取得が遅れている。原因としては、イヌザメという海産生物のヒレを対象にしているため、サンプル調整時の浸透圧調整に難があることが考えられる。ATAC-seq自体は非常にシンプルな手法であり、哺乳類への応用は多数報告されている一方で、海産生物への応用は非常に少ない。解決方策としては、軟骨魚類の細胞培養に使われているリン酸バッファーなどを今後試していく予定である。

前者では、遺伝子制御配列の特徴をディープラーニングを用いて解析し、どういった転写制御因子が制御に関わっているかを同定するものである。発表されている類似のソフトウェアのパフォーマンスを上回るものの開発に成功した。論文およびソフトウェアをプリプリントサーバーbioRxiv、githubにおいてそれぞれ公開し、現在、査読付き論文の投稿中である。後者では、制御配列とプロモーターの組み合わせを予測することにより、どの制御領域がどの遺伝子を制御しているのかを推定する取り組みであり、現在ソフトウェア開発に取り掛かっている。ほとんどの必要な実験データは取り終えているが、予定していたイヌザメのヒレ形成におけるエピジェノムデータの取得に技術的な問題が生じたのが、遅延している主な理由である。本研究で予定していたATAC-seqという、次世代シークエンサーを使用した遺伝子制御配列候補の同定するための手法において、細胞核を分離する際に、動物種特異的な問題が生じていることまではわかっているものの、条件を最適化するに至っていない。課題Aについては、ヒレ形成過程におけるATAC-seqデータの取得をプライオリティとして取り組む。しかしながら、バックアッププラントして、HiCやChip-seqなど、代替となる手法に関しても検討をしていく。また、四肢形成過程のATAC-seqデータのみでも十分なインパクトがあると考えられるので、現状のデータのみでの論文投稿についても検討していく予定である。課題Bについては、第一段階としての"ローカルなゲノム配列の特徴抽出"を行うソフトウェアの論文投稿が終わり次第、プロモーターエンハンサー相互作用を予測するソフトウェアの開発に取り組む。今後の研究計画では、現在までに得られている成果をまとめつつ、遅延の原因となっている実験手法についての見直しを行っていく予定である。問題が生じている技術に関して、代替となる実験手法の条件検討をすでに始めており、現在までに良好な予備データが得られている。このため、代替手法によるデータ取得の見通しが立っており、本研究計画の完了が見込まれる。サンプル調整の条件検討が長引いているため、予定していた次世代シーケンサーを使用するための予算が未使用となっている。具体的には、軟骨魚類であるイヌザメ胚のヒレ形成過程において、ATAC-seq(次世代シーケンサーを用いる手法)用のサンプル調整の条件検討を現在行っているため、次世代シーケンサーを使用する段階に至っていない。
制度派農業経営学による日本・タンザニアの農家経済経営の比較分析

タンザニア・キリマンジャロにおける調査研究を通して、制度派農業経営学の分析枠組み(「混成性の経営目標形成モデル」に基づく経営目標の仕分け→「農家経済経営の概念図」に基づくモノ・カネ・ヒトの流れの把握→両者をからみ合わせた、それぞれの経営目標に基づくものとしての「モノ・カネ・ヒトの流れ」の特徴の解釈)を構築した。その分析枠組みを京都府綾部市の主食米・酒米生産農家に適用すると、私的利益追求の経営目標の下に、「山田錦・五百万石・日本晴などの酒造会社直接販売連鎖」[総価値(売上)の55%]、さらに高収益の「コシヒカリの消費者・小売店などへの直接販売連鎖」(総価値の35%)の経営行動(およびその成果)がありながら、収益が劣る「コシヒカリ・祝・京の輝きの農協出荷連鎖」(総価値の10%)についても、産地全体の発展への貢献という経営目標の下で維持していることがわかる。私的利益追求の「酒造会社直接販売連鎖」については、支え合い関係の下にある1酒造会社にのみ直接販売している。高めの価格での全量買取という買い支えの下で、離農者の農地を積極的に受け入れ(必ず購入してもらえる酒米を増産し)、農地・景観を守るという経営目標も実現している。同様に山形県遊佐町の主食米・飼料米生産農家に適用すると、生活クラブ生協による買い支えがゆえに、「私的利益追求」と「産地全体の発展への貢献」の経営目標が重なっている「共同開発(遊々)米の生活クラブ生協への生産部会経由販売連鎖」を見い出せる。さらに和歌山県みなべ町の梅生産農家に適用すると、相互扶助を重視する当地の伝統的価値観に引っ張られ、すべてを「私的利益追求」の下の「梅干加工直接販売連鎖」にせず、産地全体の総価値に資する「青梅農協出荷連鎖」や、出荷会の仲間との連帯感や同地区の活性化を目的とする「完熟梅のメルシャンへの出荷会経由販売連鎖」も重視されているのがわかる。私的利益の最大化目標・行動のみならず、社会制度依拠の目標・行動にも焦点を当てる「制度派農業経営学」の分析枠組み(構築過程にあり、暫定的なもの)に基づいて、タンザニア・キリマンジャロ山中の農家経済経営の構造を解明した上で、経営分析を試みたところ、利益最大化の経営目標の下にある「男性産物」(コーヒー、仔牛など)については損失が生じている一方、「女性産物」(バナナ、牛乳など)は家計安全保障の経営目標をしっかり果たしている。経営構造の変化はこの「男性産物」経営の不振、特に教育経費をコーヒーの販売収入で満たせなくなったことから生じ、過去に「女性産物」であったトウモロコシの「男性産物」化(バナナにもその傾向を確認できる)、農業の縮小・兼業化、街への出稼ぎ[農業における雇用や(拡大)家族の労働者の増加]が進んできた。ところがコーヒーのフェアトレード・プロジェクトにより、その販売収入が改善しつつあり(教育経費が確保されつつあり)、「男性産物」と「女性産物」のバランスがとれた過去の経営構造に戻りつつある。以上の農家経済経営のレジリエンス(耐久力・復元力)の高さは、「女性産物」と相互扶助システムによる家計安全保障(キリマンジャロにおける伝統的社会保障システム)がしっかり機能しているからである。今後、タンザニアとの比較のため、日本の農家経済経営を分析する際、多様な経営目標・行動の解明とともに、コメの販売収入の減少が経営構造に与える影響、経営構造の変化を促すその他の要因の解明、産消提携プロジェクトによる買い支えの意義と限界、新たな換金用農産物と自給用農産物の動向、レジリエンスと政府助成金の関係などに焦点を当てるのが望ましい。平成27年度(1年目)は、タンザニア・キリマンジャロ山中の農家経済経営構造の特質の解明と経営分析を研究目的としており、おおむね予定通り、そのための参与観察・聞き取り調査を、キリマンジャロ山の西斜面にあるルカニ村において実施した。しかし大雨・停電・断水が重なるという想定外の状況下で、調査課題の一部を終えられず、平成28年度(2年目)も短期(1週間程度)のキリマンジャロでの調査を予定している。また3年間で、「制度派農業経営学」の分析枠組みの構築を完了したいが、それは前研究からの継続課題でもあり、おおむね順調に進展している。最初に「混成性の経営目標形成モデル」に基づき、実際は混成している経営目標を、「最大化計算」か「社会制度依拠」かという目標形成の過程や、「私的利益追求」か「コミットメント」か「共感」かという目標内容などに着目して、理念的に仕分けをする(課題1)。次に大槻の農家経済経営の概念図に基づいて、実際は混在している農家経済の内部と外部の、そして農家経済を構成する家計と経営の間での、モノ・カネ・ヒトの流れを把握する(課題2)。さらに「混成性農家経済経営モデルに基づく経営目標・成果の分析視角」の下で、課題1と課題2を絡み合わせ、「モノ・カネ・ヒトの流れ」(経営行動)の特徴を、それぞれの経営目標に基づくものとして解釈する(課題3)。最後に、それぞれの経営行動が経営目標に達しているか評価する。特に自由な達成を妨害する「ケイパビリティ」の欠如と経営リスク、それらを自力で改善できるか否かに焦点が当てられる(課題4)。以上のタンザニア・キリマンジャロの農家経済経営構造の特質の解明と経営成果・農村開発の評価のために構築した、「制度派農業経営学」の分析枠組みを、和歌山県みなべ町清川地区で南高梅を生産するA農家に適用すると、下記の農家経済経営構造の特質が浮かび上がってくる。

自ら「梅干し」に加工して消費者などに直販することが私的利益になる。しかし清川地区は昔から、相互扶助の価値観が強いという在来性に引っ張られ、すべてを「梅干し」に加工して私的利益を追い求めようとせず、「青梅」(未熟段階の実)「完熟梅」(生理落下したものを拾い集め、洗浄選果して即座に出荷する実)を出荷会の仲間と協力してJA出荷し、地区・産地全体の発展に資することが同等に重視されている。「青梅」の販売代金は、特に盆と正月の買い物や梅収穫の労賃(季節雇用)用。毎月定期的に入ってくる「梅干し」直販の代金は、常勤の労賃と運転資金、生活費用。平成27年度(1年目)のタンザニア・キリマンジャロ山中での参与観察・聞き取り調査について、大雨・停電・断水などで調査課題の一部を終えられなかったため、昨年度(2年目)も短期のキリマンジャロでの調査を実施した。また本年度(3年目)に「制度派農業経営学」の分析枠組みの構築を完了する予定であったが、2年目の和歌山県みなべ町での最初の調査で同枠組みの有効性を実感できたため、分析枠組みの構築については早めに完了し、その成果も含む『キリマンジャロの農家経済経営』という単著での研究成果の公表(本年6月刊行予定)に力を入れた。そのため、キリマンジャロの農家経済経営との比較分析をする国内の農家経済経営の調査が遅れている。昨年度は山形県遊佐町での調査を予定していたが、調査対象者との日程調整がうまくいかず、本年度に予定していた和歌山県みなべ町での調査を先に実施した。しかし同じく日程調整がうまくいかず、当初は1週間の予定であったが3日間の調査にとどまった。タンザニア・キリマンジャロの主に2農家を事例として構築した「制度派農業経営学」の分析枠組みにおいてはまず、「混成性の経営目標形成モデル」に基づき、実際は混成している経営目標を、「最大化計算」か「社会制度依拠」かという目標形成の過程や、「私的利益追求」か「コミットメント」(社会経済的目標)かという目標内容に着目して、理念的に仕分けをする。次に「農家経済経営の概念図」に基づいて、実際は混在している農家経済の内部と外部の、そして農家経済を構成する家計と経営の間での、モノ・カネ・ヒトの流れを把握する。さらに両者をからみ合わせて、「モノ・カネ・ヒトの流れ」(経営行動)の特徴を、それぞれの経営目標に基づくものとして解釈するというステップになる。以上の分析枠組み(経営行動は価値連鎖として表現)を、綾部市小畑集落で主に主食米・酒米を生産するB農家に適用すると、下記の農家経済経営構造の特質が浮かび上がる。私的利益追求に貢献するのは、「酒造会社直接販売連鎖」[総価値(売上)の55%]、さらに高収益の「コシヒカリの消費者・小売店などへの直接販売連鎖」(総価値の35%)である。残りの総価値10%の「コシヒカリ・祝・京の輝きの農協出荷連鎖」については、収益は劣るが、産地全体の発展に貢献したいという経営目標の下で維持している。利益追求の「酒造会社直接販売連鎖」については、父親が急逝して経営を引き継いだ当初から、親子のような支え合い関係を結んでくれている伏見の1酒造会社(同社社長)にのみ直接販売している。高めの価格での全量買取という買い支えの下で、離農者の農地を積極的に受け入れ(同社が必ず購入してくれる酒米を増産し)、農地を守ると社会経済的目標を達成できている。また栽培時期がずれる多様な米の品種を組み合わせ、労働者(家族2名と雇用者1名)や農業機械を有効利用する費用削減(範囲の経済)も企図している。
Influencing human behavior with whole-body emotional humanoid robot

本研究の基本的な妥当性を裏付けるものであった。社会的妥当性を裏付けるものであり、ヒューマンロボットインタラクションにおける研究成果の新しい応用方法を提案する形となった。情動的歩行に関する研究であり、感情の変化が歩容に与える影響とロボットの情動的歩行が人間に与える精神的影響に関して報告した。感情の変化が人体、特に歩容に与える影響を解析することから始まり、その結果をヒューマノイドロボットへ応用する情動的歩行のパターン生成法を考案し,実際にそれをロボットに実装し評価した。知能機械学・機械システム
クロストリジウム属細菌におけるIV型線毛を介した温度依存的な付着制御の解析

ウェルシュ菌は芽胞のみならず微生物集合体であるバイオフィルムを形成することによって種々の環境ストレスに耐性を獲得している。本研究の微生物の細胞外構造体であるIV型線毛が本菌のバイオフィルム形成やバイオフィルム形態制御および基質への付着性に関与することが明らかとなった。IV型線毛遺伝子の発現は温度によって制御されており、宿主体内温度ではその発現が増強し、付着活性が増す一方で、低温条件下ではその発現が減少し、バイオフィルムマトリクス産生が増強することによってストレス耐性能が上昇した。つまり、本菌は外界の温度を感知して、IV型線毛の発現を厳密に制御することによって環境適応していることが示唆された。ウェルシュ菌は芽胞だけでなくバイオフィルムと呼ばれる微生物集合体を形成することによっても様々な環境ストレス耐性を得る。我々は感染シグナルの一つである温度変化(37°C及び25°C)によって、そのバイオフィルム形態が大きく変化することを見出している。つまり、宿主体内温度である37°Cでは本菌は基質に付着した密なバイオフィルム(付着型バイオフィルム)を形成するが、環境中の温度である25°Cでは細胞外マトリクスに富んだ厚く疎なバイオフィルム(膜状バイオフィルム)を形成する。IV型線毛構成成分をコードするpilA2遺伝子欠損株では付着活性が低下し、37°C条件下において付着型バイオフィルム形成量が減少した。さらにpilA欠損株では膜状バイオフィルム形成が促進された。そこで野生株とpilA2破壊株間においてマイクロアレイを用いて網羅的な遺伝子発現解析を行ったところ、破壊株において顕著に発現が上昇する遺伝子群を同定した。これらの遺伝子群の破壊株を作成し、バイオフィルム形態の解析を行った結果、これらの遺伝子群はバイオフィルム形態に関与する細胞外マトリクスタンパク質に関与することが明らかとなった。IV型線毛のPilinをコードするpilA2遺伝子はその他のIV型線毛関連遺伝子と共にオペロンとして転写されたのち、pilA2 mRNA単独が切り出され、蓄積する。タンパク質は線毛の主要構成成分であるため、オペロン中のpilA2のみの発現量を上昇させる機構が存在することが示唆された。さらに、上述のpilA2 mRNA切断には必須エンドリボヌクレアーゼであるRNase Yの関与が明らかとなった。IV型線毛は本菌のバイオフィルム構造決定に深く関与することが明らかとなり、さらにその構成成分であるpilA2発現は転写後制御によって厳密に調整されていることが示唆された。ウェルシュ菌は芽胞のみならず微生物の集合体であるバイオフィルムを形成することによって種々の環境ストレス(酸化ストレスや抗生物質)に対する耐性を得ている。これまでに申請者は宿主体内温度(37°C)と環境中の温度(25°C)間の温度変化によってウェルシュ菌のバイオフィルム構造が大きく変化することを見出した。37°CではIV型繊毛構成成分PilA2を用いることによって基質への付着活性が増強し、付着型バイオフィルムを形成する。一方25°CではpilA2遺伝子の発現が減少し、さらにバイオフィルムマトリクス産生が増強することによって膜状バイオフィルムを形成する。種々の解析の結果、pilA2の発現にはリボヌクレアーゼRNase Yが関与することが明らかとなり、pilA2発現は転写後制御によって厳密に制御されていることが明らかとなった。また、マイクロアレイ解析およびトランスポゾン変異株のスクリーニングを行い、膜状バイオフィルム形成に必須なバイオフィルムマトリクス産生遺伝子を同定した。バイオフィルムマトリクス遺伝子の欠損株では種々のストレスに対する耐性が低下したことから、同定したバイオフィルムマトリクス遺伝子は本菌のストレス耐性能に寄与すると考えられた。さらにpilA2欠損株におけるマイクロアレイ解析の結果、温度に関係なくバイオフィルムマトリクス遺伝子の発現が増強することが明らかとなった。つまり、IV型繊毛の形成が周囲の環境に応答したバイオフィルムマトリクス遺伝子の発現制御に関与することが示唆された。現在までにIV型線毛遺伝子のpilA2と温度に応答したウェルシュ菌バイオフィルム形態変化についてJournal of Bacteriologyに報告した。さらに本年度の目標であったpilA2欠損株における網羅的遺伝子発現解析とトランスポゾンを用いたランダム変化株の解析によって、バイオフィルムに関連する細胞外マトリクスをコードする遺伝子の同定に成功した。以上のことから本研究はおおむね順調に進展していると考えられる。分子微生物学同定した細胞外マトリクスタンパク質は自己多量化能をもっており、ポリマーとして細胞外に局在することが明らかとなっている。そこで、本タンパク質がどのように細胞外に分泌され、自己凝集かするのかを明らかとする。細胞外マトリクスタンパク質をコードする遺伝子は周辺の遺伝子と共にオペロンとして転写されることが明らかとなっているため、周辺遺伝子の欠損株を作成し、マトリクスタンパク質の発現や局在、多量化の解析を行う。

また、本菌の付着能をより詳細に解析するため、トランスポゾンを用いた変異株ライブラリーより付着能を欠失した変異株の取得を目指す。以上の解析より、本菌の付着能とバイオフィルム形成メカニズムの詳細を明らかとする。
カタラーゼ遺伝子変異マウスの初代培養肝細胞を用いた環境化学物質評価法の開発

ヒドロキノン(hydroquinone)、ローソン(lawsone)等日常生活によく使われる化学物質を初代培養肝細胞に曝露し、高濃度になるにつれて、カタラーゼ遺伝子正常(Cs^a)及び変異(Cs^a)とともに肝細胞生存率が有意に低くなる傾向がみられた。各曝露濃度においては、カタラーゼ活性の低いマウス(Cs^b)の肝細胞の生存率がカタラーゼ活性正常のマウス(Cs^a)に比し著しく低下した。特に美白クリームの主成分であるヒドロキノンの添加により、肝細胞のアポトーシス(細胞死)がみられ、酸化ストレス関連薬物代謝酵素CYP 2E1のmRNA及び蛋白質とともに発現が増加したことが分かった。この研究ではカタラーゼ遺伝子変異マウスの初代培養肝細胞を用いた酸化ストレス誘発有害物質のスクリーニングを簡便に行う手法の開発とその実用化を目指している。今年度は以下の成績を得た。1.カタラーゼ遺伝子正常及び変異マウスを用い肝臓組織の分離・灌流について様々な条件下で繰り返しを検討し、現在、トリパンブルー排除試験で85%以上の生存率を示す肝細胞集団を得ることができ、マウスを用いた肝臓組織の分離・灌流法を確立した。得られた細胞を無血清培地で培養し、培養24時間後に、肝細胞は島状の単層が形成され、実験に供することとした。2.得られた細胞を同定するため、ゲノムDNAを抽出し、PCRを用いて制限酵素処理の処理によって、カタラーゼ遺伝子正常及び変異マウスの肝細胞であることを確認した。3.薬物代謝酵素誘導剤を用いて、両種マウスの肝細胞におけるCYP 2E1が誘導されることがわかった。4. Lawsone、hydroquinone等の化学物質を両種マウスの肝細胞に曝露させると濃度依存的に細胞障害が引き起こされ、しかもカタラーゼ活性の低いアカタラセミアマウスの肝細胞の方がこられの化学物質に対する感受性が高く、カタラーゼ活性とは関連があることが明らかとなった。また、その結果を、これまでに得られているカタラーゼ変異遺伝子導入大腸菌を用いた曝露結果と照らし合せ、両者の一致性も明らかとなった。5.蛍光色素Hoechst 33342を用いてヘンナ系染毛剤の主要成分であるLawsoneの曝露で両種マウスの肝細胞アポトーシスを検出した。特に200μMのLawsoneでは細胞に48時間を曝露すると、カタラーゼ活性の低いアカタラセミアマウスの肝細胞の方がクロマチン凝集の割合が高く、細胞核の断片化が顕著であった。本研究によって得られた両種マウスの初代培養肝細胞を、化学物質に曝露させることより生ずる生存率の差異或いはアポトーシスの有無から、毒性発現が酸化的ストレスによるか否かを評価することに役立つと思われる。1.過酸化水素に対する感受性:カタラーゼ遺伝子正常(Cs^*)及び変異マウス(Cs^b)の肝細胞に様々な濃度のH_2O_2を曝露させ、H_2O_2による細胞毒性が濃度依存的であることが分かった。また、その影響はCs^b>Csの傾向が示され、カタラーゼ活性に依存していたことを示唆した。2.美白クリームの主成分であるhydroquinoneの細胞毒性の検討:Hydroquinoneを両種マウスの肝細胞に曝露させると濃度依存的に細胞障害が引き起こされ、しかもカタラーゼ活性の低いCsbマウスの方がhydroquinoneに対する感受性が高く、カタラーゼ活性とは関連があることが明らかとなった。その結果を、これまでに得られているカタラーゼ変異遺伝子導入大腸菌を用いた曝露結果と照らし合せ、両者の一致性も明らかとなった。また、蛍光色素Hoechst 33342を用いてhydroquinoneの曝露で両種マウスの肝細胞アポトーシスを検出した。特に400μM hydroquinoneの曝露によるクロマチン凝集の割合が両種マウスの肝細胞とも高く、細胞核の断片化が顕著であった。ただし、両種マウスの肝細胞の間では有意な差異が見られなかった。4.抗酸化物質レスベラトロールのhydroquinone細胞毒性の抑制効果:Hydroquinoneによる細胞毒性がレスベラトロールの添加によって著しく低減され、レスベラトロールがhydroquinone細胞毒性の予防に有効であることを示した。1.初代培養肝細胞のカタラーゼ活性:アカタラセミアマウスCs^bの肝細胞カタラーゼ活性は、正常マウスCs^aのそれに比し有意に低値を示した。

また、各濃度(0.2mM、0.4m)の美白クリームの主成分であるhydroquinone(HQ)の添加により、Cs^a及びCs^b共に、高濃度になるにつれて、細胞カタラーゼ活性は減少傾向がみられ、アカタラセミアマウスCs^bの肝細胞カタラーゼ活性は、正常マウスCs^aのそれに比し有意に低値を示した。2.Hydroquinone(HQ)の曝露による酸化ストレス関連因子への影響:H22年度の研究では、HQを両種マウスの肝細胞に曝露させると濃度依存的に細胞障害が引き起こされ、しかもカタラーゼ活性の低いCs^bマウスの方が細胞生存率が低く、カタラーゼ活性とは関連があることが明らかとなった。H23年度では、さらにHQ曝露による酸化ストレス関連因子への影響を検討した。そこて、0.4mMのHQが24時間曝露後において、Cytochrome P450 CYP2El mRNAの発現は、カタラーゼ活性の低いCs^bではCs^aより1.5倍増え、HQの曝露によって誘発された酸化ストレスが細胞毒性に関与したことが示唆された。一方、CYP2Bl mRNAの発現は、Cs^bではCs^aより弱く、カタラーゼ活性とは関連があることが明らかとなった。3.Hydroquinone曝露による細胞内グルタチオンレベルの変化:Hydroquinoneを24時間曝露後では、酸化型グルタチオン(GSSG)レベルがカタラーゼ遺伝子正常のCs^a初代培養肝細胞に比し、Cs^bのほうが有意に上昇したことが分かった。本研究は薬物代謝の主要な場である肝細胞の初代培養系を用いて、酸化ストレス誘発有害物質のスクリーニングを簡便に行う手法の開発とその実用化を目指している。今年度は以下の成績を得た。1)Hydroquinone(HQ)曝露による細胞内還元型グルタチオン(GSH)と酸化型グルタチオン(GSSG)比率の変化:HQ曝露24時間後、200μM HQ添加群の肝細胞内のGSH:GSSGの比率は、有意な差異が認められなかった。また、400μM HQ添加群のGSH:GSSGの比率は、対照群より約30%有意に減少した。2)HQ曝露による蛋白質発現の変化:Western blotting法により、200μM HQ、400μM HQ曝露群の肝細胞内のCYP2E1蛋白質の発現量は、対照群より有意に高くなった。また、200μM HQ曝露群のCYP2E1発現量は400μM HQ曝露群の発現量に対して有意な差異が認めなかった。3)ビタミンCの添加によるLawsone細胞毒性への影響:染毛剤に使われているLawsoneは量依存的肝細胞障害を起こすことが我々の研究で既に分っている。肝細胞を0.6mMのLawsoneに曝露する前にビタミンCで2時間処理することによって細胞生存率が約20%を増えたことが分かった。4)Cumenehydroperoxide(CH)の細胞毒性及び抗酸化物質Troloxの抑制効果:Csa及びCsbの肝細胞に様々な濃度のCHを曝露させ、CHによる細胞毒性が濃度依存的であることが分かった。その結果を、これまでに得られているカタラーゼ変異遺伝子導入大腸菌を用いた曝露結果と照らし合せ、両者の一致性も明らかとなった。また、細胞毒性はTroloxの前処理によって著しく低減され、TroloxはCHの細胞毒性の予防に有効であることを示した。
KNOX型ホメオボックス遺伝子の機能解析

申請者は以前にイネKNOXタンパク質OSH15と他のKNOXタンパク質が相互作用する事を明らかにしていた。そこで申請者はKNOXタンパク質同様に非典型的なホメオドメイン(HD)を有するOsWUSやOsPRSといったHDタンパク質も同じタイプのHDを有するタンパク質同士相互作用することを明らかにした(論文準備中)。OsWUSおよびOsPRSは茎頂分裂組織周辺部発現し、これらのタンパク質はホモ二量体だけでなくヘテロ二量体形成し機能する事が推測されたが、in situハイブリダイゼーションの結果、OsPRSは葉原基の周縁部に発現していたことから、これらの遺伝子は専らホモ二量体で機能する事が推測された。OsPRSに関してはその発現パターンが興味深かったので、過剰発現体およびドミナントネガティブ形質転換体などを作成し、その機能解析を行った。結果、OsPRSは葉の大きさを制御する遺伝子である事が示唆された。現在、OsPRSに関しては、さらに解析を進めている。また、申請者はKNOX遺伝子の上流因子であるSHO1,SHL2遺伝子の解析を行っている。SHO1,SHL2遺伝子はRNAiに関連するタンパク質をコードしており、これらの変異体ではOSH1の発現領域が小さくなる等といった茎頂分裂組織の機能が異常になった表現型を示す。さらに、これら変異体において、茎頂分裂組織の一部分でしか発現しないタイプのKNOX遺伝子が過剰発現している事を明らかにした。SHO1,SHL2遺伝子はRNAiに関わる遺伝子である事から、microRNAのbiogenesisあるいは機能発現に機能するものと当初は考えていたが、これらの機構に影響を与えない事を明らかにした。現在、申請者はこれらの遺伝子は内在性のsiRNAのbiogenesisに関与するものではないかと考え、解析を進めている。申請者は以前にKNOXホメオドメインタンパク質のOSH15と他のKNOXホメオドメインタンパク質が相互作用することを明らかにしていたが、KNOXホメオドメインタンパク質以外の転写因子とも相互作用し茎頂分裂組織形成に関与する可能性を考え、OSH15およびイネにおけるWuschel遺伝子ホモログ(シロイネナズナでは、茎頂分裂組織の幹細胞維持に必要だと考えられているが、KNOX遺伝子との関係は未解明)と相互作用する遺伝子をTwo-hybrid法により探索することを試みた。OSH15と相互作用する因子は、以前からKNOXタンバク質相互作用が報告されていたBELタンパク質であり、一方、今まで相互作用が報告されていないOsWUSCHELと相互作用するタンパク質は、OsWUSCHEL自身およびOsWUSCHELと類似したホメドメイン構造をもつOsPRSであった。これらの相互作用はBurglin(1998)がKNOXおよびBELタンパク質が含まれるTALE familyで提案したモデル(共通の祖先であるホメオドメインタンパク質が互いにホモ二量体ができた場合、進化の過程でduplicateした遺伝子も互いに特定のパートナーと相互作用する)がWUSCHELおよびそのホモログが形成するfamilyにおいてもあてはまる事が示唆している。さらに、OsWUSCELとOsPRSのホモおよびヘテロ二量体形成に必要なドメインの同定を行った。OsWUCHELのホモ二量体形成はホメオドメインよりもC末端側で相互作用するのに対し、OsWUSCHELとOsPRSのヘテロ二量体形成では、OsWUSのC末端側とOsPRSのホメオドメインであった.詳細には、OsPRSのホメオドメインは典型的なホメオドメインにはない4アミノ酸挿入されている部分があり、その領域が相互作用ドメインとして機能している事が明らかとなった。family内での相互作用でありにもかかわらずOsWUSCHELのホモ二量体形成とOsPRSとのヘテロ二量体形成は相互作用の様式が異なるため、OsWUSCHELはホモ二量体形成時とヘテロ二量体形成時では機能が異なることが考えられた。今後は、現在進行中のOsWUSCHELおよびOsPRSの発現領域の同定をin situ hybridizationで明らかにし、いつどの組織でヘテロ二量体が形成しうるのかを明らかにしていく予定である。SHO1,SHL

2遺伝子はRNAiに関わる遺伝子である事から、microRNAのbiogenesisあるいは機能発現に機能するものと当初は考えていたが、これらの機構に影響を与えない事を明らかにした。現在、申請者はこれらの遺伝子は内在性のsiRNAのbiogenesisに関与するものではないかと考え、解析を進めている。
脱ユビキチン化酵素によるDNA損傷応答抑制機構の解明

DNA二本鎖損傷応答に必須の翻訳後修飾であるヒストンユビキチン化を抑制する分子としてOTUB1を同定した.OTUB1がヒストンユビキチン化を抑制する分子機構は,驚くべきことに脱ユビキチン化ではなく,ヒストンユビキチン化を担うE3であるRNF168とともに機能するE2ユビキチン結合酵素UBC13の活性阻害による抑制であると判明した.また,OTUB1はヒストンユビキチン化の調節によりDNA修復を制御していることも明らかとした.この研究によりOTUB1がDNA損傷応答を制御することを世界で初めて示すとともに,脱ユビキチン化酵素による脱ユビキチン活性非依存生のユビキチン化反応抑制という新たな分子機構を世界で初めて示した.また,OTUB1とUBC13との結合がDNA損傷応答を増強するための薬剤標的となり得ることも示した.DNA二本鎖損傷応答に必須の翻訳後修飾であるヒストンユビキチン化を抑制する分子としてOTUB1を同定した.OTUB1がヒストンユビキチン化を抑制する分子機構は,驚くべきことに脱ユビキチン化ではなく,ヒストンユビキチン化を担うE3であるRNF168とともに機能するE2ユビキチン結合酵素UBC13の活性阻害による抑制であると判明した.また,OTUB1はヒストンユビキチン化の調節によりDNA修復を制御していることも明らかとした.この研究によりOTUB1がDNA損傷応答を制御することを世界で初めて示すとともに,脱ユビキチン化酵素による脱ユビキチン活性非依存生のユビキチン化反応抑制という新たな分子機構を世界で初めて示した.また,OTUB1とUBC13との結合がDNA損傷応答を増強するための薬剤標的となり得ることも示した.細胞の活動はゲノム情報に支配されており,その正常な機能を保つために,細胞はゲノムの恒常性を保たなくてはならない.ゲノム恒常性維持において,重要な役割を果たしているのがDNA damage checkpointとDNA損傷修復機構である.DNA損傷応答(DNA damage response:DDR)の異常は,DNA damage checkpointの活性化やDNA損傷修復を妨げ,ゲノム不安定性を誘導する.ゆえに,両者の制御機構を解明することは,発癌や老化といった普遍的な生物学的医学的問題の理解に重要である.我々は,DNA損傷応答において生じるヒストンのユビキチン化に着目し,その反応を抑制する脱ユビキチン化酵素として同定していたOTUB1の機能解析を行った.OTUB1は過剰発現により,ヒストンのユビキチン化を妨げ,また,ノックダウンによって,DNA損傷時のヒストンユビキチン化を過剰に活性化した.OTUB1によるヒストンユビキチン化の抑制は,その脱ユビキチン化活性に依存しておらず,OTUB1はヒストンの脱ユビキチン化を行っていないと考えられた.我々は,OTUB1の標的を同定するため,OTUB1の免疫沈降物をマススペクトロメトリーにより,解析し,結合タンパクとしてUbc13を同定した.in vitroアッセイにより,OTUB1は,Ubc13/Uev1a依存性に起こるユビキチン鎖の形成を阻害することを明らかにした.このようなタンパクユビキチン化制御の分子メカニズムは,これまでに全く知られていなかったものであり,ユビキチンを用いたシグナル伝達の解明に大きなインパクトをもたらすと考えられる.DNA損傷依存性のクロマチンユビキチン化抑制因子を発見するために,我々はRNA干渉法を用いてさまざまな脱ユビキチン化酵素の発現抑制を試みた.その結果,OTUB1をノックダウンすると,DNA損傷部位におけるユビキチン鎖形成やその下流となる53BP1のDNA損傷部位への集積が長時間遷延することがわかった.一方,OTUB1を過剰発現すると,放射線照射によるユビキチン鎖形成および53BP1やBRCA1のDNA損傷部位への集積が阻害された.驚くべきことに,脱ユビキチン化酵素の活性中心を破壊したC91Sを過剰発現しても野生型を過剰発現させたときと同様に,ヒストンユビキチン化が阻害された.一方,OTUB1の脱ユビキチン活性を担うOTUドメインのcatalytic triadの変異体およびOTUドメインには含まれないN末を欠く変異体にはヒストンユビキチン化の阻害効果は認められなかった.これらの結果は,OTUB1が脱ユビキチン活性非依存性に,しかしN末および完全な形のOTUドメインに依存してヒストンユビキチン化を抑制的に制御していることを示していた.リコンビナントタンパクを用いたin vitro ubiquitination assayおよび細胞を用いた共免疫沈降実験の結果,OTUB1はDNA損傷応答において必須のE2ユビキチン結合酵素であるUBC13に結合し,その活性を脱ユビキチン活性非依存的に抑制していることが判明した.また,OTUB1の発現を抑制した状態では,DNA損傷応答の最上流遺伝子ATMの抑制によるDNA相同組換え修復の異常が回復することが示された.これらの結果から,OTUB1はDNA損傷応答を抑制的に制御し,OTUB1とUBC13の結合を阻害することでDNA損傷応答が増強されることが示された.
管腔移行を伴う協調的な泌尿器-生殖器-消化器発生過程のイメージング解析

肛門直腸奇形(Anorectal malformation: ARM)は、雄性にも雌性にも起こりうるが、雄性仔の場合の発症メカニズムが総排泄腔が泌尿器側と腸管側に分かれていく段階の異常であると説明されうる。しかし雌性においては、腸管と女性生殖器、あるいは泌尿器と腸管と女性生殖器が同一の管腔に開口する場合がありその原因メカニズムの説明は十分になされているとは言えない。平成30年度は、マイクロCTを用いて網羅的に野生型雌性マウスの器官形成期-新生仔期サンプルの画像のCT採取し画像解析をおこなった。この解析により、総排泄腔分割後の胎生後期において女性生殖器が膀胱基部側に結合し、次第に体外側に移行していく管腔の移動を視覚的に明らかにすることができた。また、ARMの症状を呈する条件付きShh遺伝子改変マウス、内胚葉特異的b-catenin機能獲得マウスの採取を行い、マイクロCT解析を行った。また、尿管芽由来組織の欠損によって生じる総排泄腔-膀胱の形態への影響を解析するため、遺伝学的細胞除去マウス胎仔を採取し、マイクロCT解析を行った。これらの解析の結果、三次元的な管腔構造の異常を見出した。加えて、薬剤誘導型遺伝子改変マウスを用いて、Cre組換え酵素の薬剤非依存的な活性化を利用した細胞集団解析を2系統の薬剤誘導型Creマウスを用いておこなった。CAGGS-CreERTM、Rosa26-CreERT2のどちらの系統を用いても外生殖器原基において基部側から先端側にかけて分布する細胞集団が観察され、外生殖器形成時の細胞の流れが存在する可能性が示唆された。これらの結果は、今後肛門直腸奇形の発症メカニズムを解明する上で重要な基盤となると考えている。平成29年度は、複合遺伝子改変マウス系統の作製と実際のサンプリングを開始した。Cre組換え酵素依存的に細胞が死滅する系を使用し、泌尿器原基において細胞死を誘導することで腎管の形成不全を呈するマウスを作製し、腎管の形成が総排泄腔の形態に与える影響を解析した。表現型にバリエーションがあるものの、水尿管、腎臓の無形成等の表現型を呈し、総排泄腔由来器官に関しては膀胱の形成異常・低形成を見出しつつある。当該遺伝子改変マウス胚サンプルについてさらなる個体の採取を行い、マイクロCT等を用いて解析する予定である。また、同様に胎仔後端領域を含む上皮組織をCre組換え酵素依存的に除去し、その内胚葉組織に与える影響も解析を試みた。当該マウス胚も表現型に個体差が大きく解釈に注意が必要なものの、外生殖器隆起、あるいは下肢領域全体の形成に影響が生じていることを見出しつつある。また、Cre組換え酵素による反応依存的に蛍光タンパク質を発現するマウス系を利用して、総排泄腔上皮由来組織と周辺間葉における細胞の動きをライブイメージングできるように工夫を行った。まず、黄色蛍光タンパク質YFP発現マウスを用いて解析を試みたが、YFPではイメージング途中での退色が著しく、かつ蛍光強度も弱かった。そこで使用するマウスを赤色蛍光タンパク質mCherry発現マウスに変更し、Creマウスとの複合改変マウスの作製し、ある程度のマウスコロニーを確保できた。組織培養を最適化し長期のイメージングを行うために、いくつか条件を試みたが、改善には至らなかった。加えて、総排泄腔分割に異常を呈するマウス系統であるGli3-/-マウスと内胚葉特異的b-catenin機能獲得マウスは継続して個体数を増やす段階にある。本年度は、研究代表者の所属変更があったが、和歌山県立医科大学遺伝子制御学研究部との密な連携により、解析を遂行することができた。特に遺伝学的細胞除去の系を用いて、尿管、腎臓の形成異常が膀胱に及ぼす影響と、外胚葉の異常が内胚葉組織に与えうる影響の個体レベルでの解析を開始できたのは進展であった。胎齢を網羅するには至っていないので、これから解析個体数をさらに増加する予定である。これらの遺伝子改変マウス胚をイメージングの手法を用いて解析することでより多くの知見を得ることができると考えられる。併せて、遺伝子発現解析も本格的に行う予定である。ライブイメージングに関しては、実験条件(蛍光タンパク質、また培養条件)の検討を行い、代替となる実験系の考案も視野に入れる必要が出てきている。

これらの解析の結果、三次元的な管腔構造の異常を見出した。加えて、薬剤誘導型遺伝子改変マウスを用いて、Cre組換え酵素の薬剤非依存的な活性化を利用した細胞集団解析を2系統の薬剤誘導型Creマウスを用いておこなった。CAGGS-CreERTM、Rosa26-CreERT2のどちらの系統を用いても外生殖器原基において基部側から先端側にかけて分布する細胞集団が観察され、外生殖器形成時の細胞の流れが存在する可能性が示唆された。これらの結果は、今後肛門直腸奇形の発症メカニズムを解明する上で重要な基盤となると考えている。前年度、遺伝学的細胞除去マウスに関してはマウスコロニーを調整し、ある程度の個体数を解析した。結果として、隣接する臓器間の相互作用が正常な形態形成において重要であることが示されつつある。平成30年度も和歌山県立医科大学遺伝子制御学研究部との連携を継続し、さらにサンプリングを継続することにより、各胎齢を網羅して経時的に解析する。また、平成28年度の解析と同様に女性生殖器分割部位における細胞死等の組織学的解析を行い、総排泄腔由来器官の形態形成異常の原因を検討する。培養実験は継続して条件の検討と短時間培養でのデータをとりつつ、代替実験として個体での少数細胞標識実験等を行う予定である。本年度は、研究代表者の異動の影響により本課題の遂行のための時間が予定よりも少なかった。このため、遺伝子発現解析のための支出が少なく、学会での成果発表も見送ったことにより未使用額が生じた。マウス組織解析、遺伝子発現解析のための抗体・酵素類の購入と、個体サンプルの保存に用いるプラスチック器具類等の購入を予定している。
思春期心性に起因する不登校生徒に関わる地域の人的資源の組織化に関する基礎的研究

2年間にわたる科学研究費補助金研究の成果の要点は次のように要約できる。青少年期の対人関係の発達の観点から考えると、学校不適応つまり登校拒否は、学校において人間的関わりを拒否しているという現象であり、思春期危機の一つの現象である。このような危機にある青少年が学校という場で彼らの人格形成上重要な意味を持つ「意味ある他者」(Signific ant Others)である教師との断絶状態にあるとき、これに代わって彼らの生活において影響力を持つ人物がどのように変化してきているかを明らかにした。まず登校拒否に関するチェックリスト及び「人間的関わりに関する調査」の信頼性をチェックし診断に有効であることを確認した。学校適応児童生徒は、学校不適応とされた児童・生徒に比べて、家庭、学校、地域いずれの人物とも関わりが希薄であること、人間の成長にとって大事な意味がほとんど伝達されていないことを明らかにした。またそれを補償するものとしてマスメディアを通しての特に活動性の低い人物との仮想的な関わりに逃避する傾向があること、学校不適応児童生徒は過保護と人間関係の空白が生み出した無欲求と学校嫌いとして特徴づけられることを明らかにした。しかしその中でも家族ではなく親戚(おじ、おば、いとこ)さらに地域の中では「医者・看護婦」「おまわりさん」「近所の店の人」等がいくつかの大切な意味で重要な他であることが明らかになった。これらの重要な他者は、親でもなくかといって他人でもなく、いわば「社会的オジ」として位置づけられ、しかもこれらの人物は学校不適応児童・生徒に対して様々に関係を操作泰できる人物であること、またそれらの人物が親戚や地域に存在し、これを組織することが有効であることを実証した。本年度は以下の3点について研究成果を得た。(1)登校拒否・不登校生徒に関して資料の収集と分析を行った。他大学、機関の研究者との情報交換の結果、特に登校拒否・不登校に至るプロセスの分析が必要であるとの認識から、茨城県内の小・中学校(とくに中学校)のうちから120校を抽出して、その中で年間50日以上休んでいる生徒の全部について、半年前に遡って欠席・遅刻・早退の増加のプロセスを分析した。現段階では登校拒否・不登校に至るプロセスは、大体45つのタイプに分けられること、それが学校活動の年間の流れと一定の相関があることがほぼ明らかになった。さらにそれを教師の指導の態様、教科、友達関係、地域の状態、親子関係、生徒の健康状態等の要因と関わらせて分析することを現在試みつつある。(2)特にわれわれの主たる関心事は、地域風土特性及び家庭環境(家庭の生活スタイル、親子関係等)特性との関連を探るための分析具であるMIPT(「意味-人物対応調査票」)の開発・適用・修正を試みることである。この開発に関して、他大学・機関の研究者との情報交換の結果有意義な知見を得ることができた。それに基づいて現在MIPTの開発を行っているが、従来われわれが作成したMIPTでは、登校拒否・不登校生徒と社会が含むさまざまの人的資源とをつなぐ「つなぎの人物」の存在が不可欠であるということ、例えば隣り近所の大人・同じ隣り近所のさまざまの趣味的活動グル-プの大人・メディアの登場人物等が考えられることが明らかになった。(3)すなわち(2)との関連でMIPTが含む「実質的・価値的意味-人物」と「手段的・媒介的意味-人物」のうち、登校拒否・不登校生徒を社会的ネットワ-クの中に導くには、後者の意味での「つなぎの人物」が有効であることが明らかになってきている。青少年期の対人関係の発達の観点から考えると、学校不適応つまり登校拒否は、学校における人的関わりを拒否しているという現象であり、いわゆる思春期危機の一つの現象である。

このような危機にある青少年達が学校という場における、彼らの人格形成上重要な意味を持つ「意味ある他者」(significant others)である教師との断絶状態にあるとき、それに代わって彼らの生活において影響力を持つ人々が、地域の中やマスメディアを通じて接触する人物やキャラクタ-になっていることを明らかにした。まず登校拒否に関する自己評価チェックリストの結果と教師評価による学校適応児童・生徒,不適応児童・生徒の評価点との相関を検討した結果、一応かなりの相関が見られたので、教師による学校適応,不適応の評価を受けた児童・生徒を対象に「人間的関わりに関する調査」との関係を検討した。その結果は、学校適応児童・生徒は家庭や地域の人々との人格形成上重要な人間的関わりを持っているにの対し、学校不適応とされた児童・生徒は家庭,学校,地域いずれの人物との関わりが希薄であり、それを補償するものとしてマスメディアを通じて(特に活動性の低い人々)との仮想的な関わりに逃避する傾向があることが明らかになった。しかしその中でも、家族ではなくて親戚(おじ・おば・いとこ)、また地域の中では「医者・看護婦」「おまわりさん」「近所の店の人」等がいくつかの意味で意味ある他者、重要な他者となっていることが明らかになった。これらの意味ある他者は、親でもなくかといって他人でもない、いわば「社会的オジ」として位置づけられ、さらに社会的オジは四つの類型があり、それぞれの類型が持つ役割に相当する人物が親せきや地域に存在し、これらを組織することが問題解決に有効なことを実証した。
T細胞の胸腺内での分化と成熟-胸腺細胞で観察されるDNA切断現象との関連において-

胸腺内では自己反応性T細胞を除去する機構が存在するものと予想されている。その機序の1つとして、本研究ではDNA切断を介した細胞死の機構が働いているかを検討した。その結果、次のような成果が得られた。(1)無処置群では約20%のDNA切断が観察されるのに対し、ホルボルエステルやCa^<2+>イオノホアの存在下では約80%のDNA切断と細胞死が観察され、しかも、この切断死はほとんどCD4^+8^+細胞でのみ観察された。(2)レセプタ-を介するシグナルのモデルとして、抗CD3抗体でコ-トしたプレ-トを用い、胸腺細胞を刺激した結果、対照群に比し約20%のDNA切断率上昇が観察された。(3)このDNA切断率上昇はC-キナ-ゼ阻害剤であるH-7や蛋白質合成阻害剤であるシクロヘキシミドで抑制された。(4)抗CD3抗体でDNA切断の観察される胸腺細胞はCD4^+8^+に属する亜集団であることが、抗CD3抗体存在下で培養後回収した細胞のFACSによる解析や、胎生18日目の胸腺細胞を用いた結果から明らかとなった。(5)しかし、抗CD4抗体と抗CD8抗体を用いて分離したCD4^+8^+細胞単独を抗CD3抗体で処理してもDNA切断率の上昇が観察されず、このとき、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IFN_γを共存させても、DNA切断率上昇の回復は観察されなかった。さらに、レセプタ-を介したシグナルによるDNA切断現象を解析するモデルとして、抗CD3抗体やF23.1抗体で処理して死に至るハイブリド-マをいくつか樹立した。これらのハイブリド-マを用いて、DNA切断の方がトリパンブル-で判定する細胞死に先行すること、このDNA切断にはCaイオンの流入と、新しい蛋白の合成が必要なこと、最終的にはエンドヌクレア-ゼが作用するであろうことなどが明らかにされた。