hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
レコンビナントSERAによるマラリアワクチンの開発

このことは、SE36蛋白質がヒトのマラリア防御抗体に対するエピトープを効果的に提示していることを示している。さらに、この蛋白質に対する免疫応答について試験するため、水酸化アルミニウムゲルに吸着させた試作ワクチンを作製し、3頭のチンパンジーに対して免疫試験を行った。その結果、SE36蛋白質は免疫原性が高く、他のIgGサブクラスとともにIgG3抗体価の上昇が確認された。チンパンジー血清よりIgG分子をプロテインGカラムで精製し、ヒト血中のモノサイト(1x10^5cells/well)とともに熱帯熱マラリア原虫の培養液に加えたところ、免疫前のIgG分画は原虫の増殖を阻害しなかったが、免疫後のIgG分画はマラリア原虫の増殖を顕著に抑制した。これらの結果はSE36試作ワクチンがマラリア防御免疫を誘導したことを示し、また、ヒトにおいても同様の防御効果を与えることを強く示唆するものである。昨年度の研究により、熱帯熱マラリア原虫SERA蛋白質のN-末端ドメイン(47kd))を改変したSE36蛋白質と水酸化アルミニウムゲルによる試作ワクチンが、チンパンジーにおいて強い免疫原性を持つことを示した。さらに、チンパンジー血清よりIgG分子をSE36カラムでアフィニティー精製し、ヒト血中のモノサイトとともに熱帯熱マラリア原虫の培養液に加えたところ、免疫前のIgG分画は原虫の増殖を阻害しなかったが、免疫後のIgG分画はマラリア原虫の増殖を顕著に抑制した(ADCI ; antibody dependent cellular inhibition of P. falciparum)。一方、我々はこれまでに抗SERA・N-末端ドメイン抗体を含むマラリア高度流行地域住民の血清が、抗体依存的に培養マラリア原虫の増殖阻害を行なうことを報告してきた。この増殖阻害効果の機構はADCIとは異なると考えているが、マラリア免疫を獲得したヒト血清からSE36蛋白質カラムから抗SE36-抗体を除去し、これに、アフィニティー精製したチンパンジー抗SE36-抗体を加えたところ、培養マラリア原虫の増殖阻害活性が回復した。これらの結果は、試作ワクチンによってチンパンジーで誘導された抗SE36-抗体が流行地域に住むマラリア免疫を獲得した人々の抗SE36-抗体と同等の防御能力を持つことを強く示唆するものである。また、マラリア原虫の増殖阻害には抗SE36-抗体とともに血清成分中の未知の因子が関与する可能性が示され、我々はこの効果をADCIに対して、ADSI(Antibody Dependent Serum Inhibition of P. falciparum)と呼ぶことを提唱する。我々は熱帯熱マラリア原虫の主要な抗原蛋白質であるSERA (Serine repeat antigen, SERA5)をもとにマラリアワクチンの開発を進めている。SERAのN-末端ドメインを改変した組換え蛋白質、SE36、は(財)阪大微生物病研究会との共同研究として、臨調治験薬としての生産が進められている(GMP条件による生産)。本年度の成果としては、〔1〕水酸化アルミニウムに吸着させ凍結乾燥させたSE36蛋白質は、チンパンジーにおいて強い抗原性を示すことを示したが、今回、その抗体価が一年を越えて維持されること、また2年を経過した後にブースト接種を施したところ、一週間以内に最高値まで抗体価が上昇することが観察された。これはワクチン効果の持続性についての重要な知見である。
分光ミュラー行列偏光計によるナノ形状計測

分光ミュラー行列偏光計によるナノ形状計測法を提案した.一般に光は回折限界があるため波長以下の空間的な形状計測は困難である.ここではナノ形状よる偏光状態の変化を検出することで波長以下の形状計測を可能とした.偏光情報の波長特性を高精度に実時間でかつその場評価法の確立とナノ構造を偏光計測結果とRCWAの数値解析と比較することによって従来にない光による超高精度なナノメートルオーダの形状計測システムの開発した.分光ミュラー行列偏光計によるナノ形状計測法を提案した.一般に光は回折限界があるため波長以下の空間的な形状計測は困難である.ここではナノ形状よる偏光状態の変化を検出することで波長以下の形状計測を可能とした.偏光情報の波長特性を高精度に実時間でかつその場評価法の確立とナノ構造を偏光計測結果とRCWAの数値解析と比較することによって従来にない光による超高精度なナノメートルオーダの形状計測システムの開発した.平成19年度は3次元ナノ構造から反射散乱光の偏光状態を計測するために分光ミュラー行列偏光計の構築とこのナノ構造によって生じる反射散乱光を厳密結合波解析(RCWA)と時間領域差分法(FTDT)によって数値解析を行うことによって偏光計測の指標を求めることを目標として研究を推進した.偏光情報,つまり,複屈折,旋光,二色性,円二色性,偏光解消特性を高精度に実時間でかつその場評価を可能とする偏光計を構築するため,ここでは検出器にライン型分光器を用いた解析システムを構築した.白色光源としてストークスパラメータとミュラーマトリックスにより偏光解析を実際の実時間スペクトルミュラーマトリックス偏光計が完成した.また,三次元ナノ構造からの反射散乱光をシミュレーションするために,厳密結合波解析(RCWA)と時間領域差分法(FTDT)によって数値解析法を確立した.ここでは従来の解析に用いられている2つの要素のエリプソパラメータではなく,ストークスパラメータとして4つのパラメータを扱うことで,ナノ構造がほんのわずかに変化するだけで偏光の変化を捉えることが可能となった.これより従来にない偏光解消をも考慮した偏光計測の指標を求める開発でききた.同時に,ナノ形状の標準サンプルを用いてAFMによる3次元形状計測を行うことによって真のデータを得て,この構造と数値解析法の結果と比較することでキャリブレーション法を提案した.平成20年度は3次元ナノ構造から反射散乱光の偏光状態を計測するために分光ミュラー行列偏光計の構築とこのナノ構造によって生じる反射散乱光を厳密結合波解析(RCWA)と時間領域差分法(FTDT)によって数値解析を行うことによって偏光計測の指標を求めることを目標として研究を推進した.昨年度完成したミュラー行列偏光計測システムによって偏光情報,つまり,複屈折,旋光,二色性,円二色性,偏光解消特性を高精度に実時間でかつその場評価を可能となったため,ここでは高速化,分光計測,さらには,デコンボジッションによる偏光パラメータの分離などのソフトウエアの充実をはかった.また,三次元ナノ構造からの反射散乱光をシミュレーションは昨年に引き続き,厳密結合波解析(RCWA)と時間領域差分法(FTDT)によって数値解析法を確立した.ここではミュラー行列の16個のパラメータを扱うことで,ナノ構造がほんのわずかに変化するだけで偏光の変化を捉えることが可能を示した.さらに,偏光解消についても取り扱うことができるようになった.本研究は光によるナノ形状計測を可能とするために,分光ミュラー行列偏光計による光波反射散乱光計測法を目的とした.一般的に光は回折限界があるため波長以下の空間的な形状計測は困難である.特に,波長以下の構造になると高次の回折光が発生しない.しかしながら,ナノ形状よる生じる散乱光の偏光状態が変化することが知られている.ここでは偏光情報,つまり,複屈折,旋光,二色性,円二色性,偏光解消の波長特性を高精度に実時間でかつその場評価を可能とする分光ミュラー行列偏光計によって,この反射散乱光検出法を確立するものである.さらに,このナノ構造によって生じる反射散乱光を厳密結合波解析(RCWA)と時間領域差分法(FTDT)によって数値解析を行うことによって偏光計測の指標と偏光特性の波長依存性,つまり複屈折分散と偏光解消を計測することにより,従来にない光による超高精度なナノメートルオーダの形状計測システムの開発を目指した.平成21年度は,実際にナノ三次元構造の評価を行った.ライン型分光器を用いて,偏光情報,つまり,複屈折性,旋光性,二色性,円二色性および偏光解消性を高精度,実時間でかつその場分光計測を可能とする分光ミュラー行列偏光計を構築した.サンプルへの入射角,方位角,波長情報から3次元ナノ構造の計測する.同時に,厳密結合波解析(RCWA)と時間領域差分法(FTDT)によって数値解析から得られたストークスパラメータからナノ構造の決定法を確立する.数ナノメートルの構造をとらえるためにはミュラー行列の各要素で1/100以下にする必要があることがわかった.
界面ストレン工学を基盤とした動力学協奏制御と高速立体転写の機能追求

本研究ではエラストマー弾性体に『界面不安定性』ストレイン工学に基づく表面座屈を誘起し、周期的微細凹凸構造『しわ・リンクル』を構築する。ダイナミックな環境応答を示す植物に習い、リンクルフィルムの表面形状に同調した弾性毛管力フォールディング(流体の自動内包)をインクジェット塗布により誘起し『高速立体転写』から、機能を付与した多彩な3D造形を実現する。
台風の強度・構造に対するエアロゾルの影響

台風は、海から流入した水蒸気が中心付近で凝結して生じる運動エネルギーで駆動する。即ち、中心付近に存在する眼の壁雲で常に水蒸気が凝結する必要がある。凝結(水滴の形成)には、凝結核が必須であり、大気中に浮遊するエアロゾルが凝結核となる。さらに凝結核の数によって、対流雲の構造が変化することが提唱されている。つまり、エアロゾルの数濃度によって眼の壁雲での凝結分布が変化し、台風に影響すると考えられる。そこで本研究では、台風の強度・構造に対するエアロゾルの影響を包括的に理解することを目的とする。
肺静脈周囲の心房筋走行に関する立体構築化の試み

剖検心を用い、生前に心房細動などの心房性不整脈を有した群と、心房性不整脈の既往のない群に分け検討した。方法は、心外膜を注意深く剥離し、左心房および肺静脈周囲の心筋の走行を肉眼的に観察した後、組織標本を作製し検討した。また連続切片を用い、コンピュータによる三次元立体構築を施行した。検索したほとんどの肺静脈周囲には心房筋が洋服の「袖」のように肺門方向へ延びており、一部には肺門部まで達しているものも見られた。その長さの平均値では左上肺静脈が14.5mmと最も長く、下肺静脈より上肺静脈の方が長かった。肺静脈開口部の横径は左下肺静脈を除いて心房性不整脈を有した群で有意に拡大していた。心筋の走向は多くは肺静脈開口部から肺門へ向かって筋束が整然と輪状に積み重なって延びるが、なかには輪状の筋束に加え左心房後壁から肺静脈上に斜走あるいは縦走したりする筋束を認め、互いに交差したり、筋束の分岐・融合が複雑となり著しく走向の乱れたものもあった。この部位を組織学的に観察すると横走する心筋層と縦走、斜走する心筋層が入り組んでいるのを認めた。三次元立体構築でもやはり走向は多様で心筋の配列が錯綜するのを確認した。しかしこれらの所見は、心房性不整脈の有無にかかわらずヒトの肺静脈に共通に認められる特徴であった。組織学的検討では肺静脈末梢側で心筋紳胞が結合織に囲まれて小集団をなし島状に散在しているのがみられ、肺静脈末梢ほど心筋細胞の膨化、筋原線維の粗鬆化、線維化を多く認めた。また肺静脈末梢側に細胞横径の小さい心筋細胞が小集塊を形成して洞結節類似の構造を呈したり、細胞が個々に解離し、散在して存在するのを認めた。肺静脈周囲の心筋は走行のみならず組織学的にも多様な形態を呈しており、心房筋の不均一な筋走向や心房筋細胞のheterogeneityが不整脈発生に関与している可能性が示唆された。

心筋の走向は多くは肺静脈開口部から肺門へ向かって筋束が整然と輪状に積み重なって延びるが、なかには輪状の筋束に加え左心房後壁から肺静脈上に斜走あるいは縦走したりする筋束を認め、互いに交差したり、筋束の分岐・融合が複雑となり著しく走向の乱れたものもあった。この部位を組織学的に観察すると横走する心筋層と縦走、斜走する心筋層が入り組んでいるのを認めた。三次元立体構築でもやはり走向は多様で心筋の配列が錯綜するのを確認した。しかしこれらの所見は、心房性不整脈の有無にかかわらずヒトの肺静脈に共通に認められる特徴であった。組織学的検討では肺静脈末梢側で心筋細胞が結合織に囲まれて小集団をなし島状に散在しているのがみられ、肺静脈末梢ほど心筋細胞の膨化、筋原線維の粗鬆化、線維化を多く認めた。また肺静脈末梢側に細胞横径の小さい心筋細胞が小集塊を形成して洞結節類似の構造を呈したり、細胞が個々に解離し、散在して存在するのを認めた。肺静脈周囲の心筋は走行のみならず組織学的にも多様な形態を呈しており、心房筋の不均一な筋走向や心房筋細胞のheterogeneityが不整脈発生に関与している可能性が示唆された。
光形態形成およびブラシノステロイド活性の青色光による制御と機構解明

青色光の情報伝達について光シグナルの受容から形態分化誘導にいたる過程を物質レベルで追求し、その制御機構解明の基礎資料を得ることを目的とした。本研究では、イネの葉身屈曲と粘液細菌のフルーティングボディ形成の二つの光形態形成に焦点をあて研究を行った。暗黒下で栽培した黄化イネは、植物ホルモンであるブラシノステロイド(以下BSと略記)の処理を受けるとラミナジョイント(第2葉の葉身と葉鞘の基部)を支点にして著しい葉身屈曲が起き、同じ現象は青色光照射によってももたらされた。青色光照射は、黄化イネ体内の葉身屈曲活性を著しく増加させるが、屈曲活性に占める内生BS(ティーステロン,タイファステロール,カスタステロン,ブラシノライド)の量は増加しなかった。増加は、BSに相乗的に働くBS共力物質の作用によるものと判断された。非照射イネには共力物質の作用を阻害する物質が存在し、クロマトグライ-で除去すると照射イネと同じ屈曲活性に回復することがわかった。青色光の照射は、共力阻害物質の作用を取り除く役割を担っていると想定される。青色光の効果は、3時間照射でも、48時間照射でも同じであった。共力物質、阻害物質は、共に極めて微量で、光に不安定な物質であることから同定に至らなかったが、予想される共力物質のモデル化合物をいくつかの合成化合物の中に見いだすことができた。原核生物で最も進化した粘液細菌のライフサイクルの中で、フルーティングボディを形成するときに青色光を必要とし、その際カロチノイド生合成の活性化が不可欠であった。カロチノイド生合成が阻害されると光照射下でも形態分化が起きず、カロチノイドと形態分化の正の相関が確認された。本菌は、青色光によって初めて形態形成できる特徴を有し、しかも光受容体となりうる植物色素が重要な要素をもっていると考えられるので、今後植物の光形態分化の青色光による制御機構を解明する上で有益な情報を提供してくれるだろう。1.イネ内生ブラシノステロイドの同定本実験に供試したイネ(品種コシヒカリ)の内生ブラシノステロイド(以下BSと略記する)の同定を行った。暗所で9日間栽培後、2日間自然光に置いた幼植物から地上部を切り取り、エタノール抽出、アセトニトリル/ヘキサン液々分配、アルミナおよび逆層分配型ボンドエルートカラムクロマトにより精製、最後に高速液体クロマトグラフィー(HPLCと略記する)により最終的に得られた活性フラクションをガスクロマトグラフィー/マススペクトロメトリーにかけ分析した。その結果、内生BSとしてティスアステロンとカスタステロンを同定した。この他に、ブラシノライドとタイファステロールの存在も確認された。2.青色光照射と内生BS活性促進との相関BS活性は青色光照射3時間で約10倍に増加した、照射48時間でほぼ同等を維持した。しかし、照射で促進された活性にしめる既知BSの割合は10%程度であった。3.BS活性促進物質およびBS活性抑制物質の検索活性促進物質は照射でも非照射でも生産された。非照射のものではHPLC精製によって活性が増加する活性抑制物質の存在が確認された。この現象は照射のものには見られないため、照射下では生産されないかあるいは分解されるものと考えられる。

4.青色光照射によるカロチノイド代謝の活性化BS活性促進物質およびその抑制物質の検索の一環として、青色光照射によるカロチノイド代謝が活性化され、その結果形態分化が誘起されると想定される新規微生物(粘液細菌)の培養法とカロチノイドの分析法を確立した。青色光リセプターの探索にも最適なものと考えられる。1.黄化イネ幼植物の葉身屈曲とブラシノステロイド作用の青色光による制御黄化イネ幼植物に含まれる総BS活性量は著しく増大したが、内生BSであるティアステロン、カスタステロン、ブラシノライド、タイファステロールの真の含量は増加せず、総BS量の7/6は相乗物質の作用によるものであった。この物質は光りに無関係に生合成されてBSに作用するが、暗黒下で栽培した植物では相乗物質の作用が抑制されている。抑制物質は光によって抑その作用が阻害された。逆相HPLCで阻害物質は保持されて溶出不可能、さらに微量で、不安定な物質で、精製が困難であった。相乗物質も同様に精製に手間取っている。BS精製過程やHPLC上でBSと同じ挙動を示し、かつBS相乗物質として初めてステ-ルグルコシドを合成物の中から見付けた。葉身屈曲試験やインゲン下胚軸伸長試験でブラシノライドとの顕著な相乗的共力作用を示した。2.粘液細菌の形態分化とカロチノイド生合成の青色光による制御グラム陰性の原核生物の中で最も進化した粘液細菌が形態形成(フルーティングボディ)が青色光によって誘導されることを明らかにした。光のシグナルが本細菌の栄養細胞内のカロチノイド生合成系を活性化させ、形態分化を誘起すると想定された。カロチノイド生合成を阻害してやると、光シグナルの伝達が阻害されるので形態形成が完全に抑制されるものと推察できた。BS活性促進物質およびその抑制物質の検索の一環として、青色光照射によるカロチノイド代謝が活性化され、その結果形態分化が誘起されると想定される新規微生物(粘液細胞)の培養法とカロチノイドの分析法を確立した。青色光リセプターの検索にも最適なものと考えられる。黄化イネ植物中のBS共力物質とその抑制物質の解明に役立つことだろう。
オリゴ糖を利用した酵素阻害剤関連擬似糖鎖類の合成研究

本研究では、N,N′-ジアセチルキトビオースを鍵出発物として用い,癌転移との関わりで注目を集めているグリコサミノグリカン分解酵素等に対して阻害の期待される擬似2糖の合成研究を行うことを目的としている。特に、還元末端糖残基部分を、活性発現に重要なコアとなる、5員環アミノシクリトールならびにノジリマイシン誘導体へ変換する新規合成法の開発を中心に研究を進めた。1.キトビオースから、還元末端側が鎖状となったジオールを合成し、窒素官能基の導入のため位置選択的なスルホニル化を検討した。しかし、N-アセチル基のままではこの反応は困難であることが判明した。そこで、位置選択的なN-アセチル基の除去法を開発することで、この問題点を克服し、アジド基の導入を達成した。さらに、分子内アミノ環化反応を利用することでノジリマイシン誘導体を還元末端に含む擬似2糖の合成に成功した。2.単糖のオキシム誘導体を用いた5員環シクリトールへのラジカル環化反応はいくつか報告されているがオリゴ糖への適用例は皆無であった。そこで、各水酸基がベンジル化されたキトビオース誘導体を用いてこの反応を検討した。キトビオースの還元末端側が鎖状のオキシムを合成し、ラジカル環化反応を行うと、還元末端糖残基が5員環シクリトールに置き換えられた化合物が異性体混合物として得られた。さらに、主生成物を用いて環状アミジン、グアニジンの構築を種々検討したが、環状チオウレアを経るルートでグアニジンが構築できることがわかった。この方法論を利用して、環状グアニジンを有する新規な擬似2糖の合成を行った。保護基や反応条件を検討することで、立体選択的なラジカル環化を行わせることがこれからの課題である。
グローバル化社会で変容するアイデンティティーと言語変異の因果関係の理論モデル構築

グローバル化の最先端で劇的な社会変化が進行する地域社会において、土着方言の共時的変異・変化に話者の土着アイデンティティーがどのように関与しているのか、社会心理学的方法論を加味した計量的分析と質的洞察を融合しつつ、複眼的観点から因果関係の解明を試みた。研究成果として、土着アイデンティティーは、グローバル化に対するイデオロギー、自己観、土着方言や共通語に対する意識的、及び、潜在的言語態度などの社会心理的要因から複合的に構成される実在であり、アンケート調査で回答される方言使用の自意識と日常語における方言の無意識的使用の揺れとの間に見られる乖離が土着アイデンティティーで説明しうることを立証した。本年度(26年度)は、特に社会言語学のみならず社会心理学などの隣接分野における先行研究のレビューを行い、話者のアイデンティティーや土着イデオロギーを多元的尺度から捉えるための質問紙やアンケート調査の草稿の作成に取り組んだ。また、これまでの研究成果を発表する場として、The Sociolinguistics of Globalization 2015(於香港大学、2015年6月3-5日)での口頭発表に応募し受理された。今年度の後半はその発表に向けた分析作業および成果のとりまとめ、発表準備を行った。当該発表では、主に過去の類似の研究成果を概観した上で、社会生活の急速なグローバル化に対する住民の態度やイデオロギーと方言使用意識の関連、および自然発生的な談話に観察される話題ごとの規則的変異に着目し、明示的な方言使用意識と自然談話における話題に依拠した変異性には隔たりがあり、話者の土着アイデンティティーと言語変異との関係性を論じるには、異なるモードでの言語データの収集と精査が不可欠であることを実証する予定である。最後に、被験者から得られた回答の点数化や自然発生的発話に観察される変異を従属変数として、独立変数の貢献度を測定する多変量解析プログラム(Rbrul)のワークショップに参加する機会を得た。これによりこれまで課題となっていた「土着志向性」「言語態度」「言語イデオロギー」などを名目変数ではなく、より適切と思われる連続変数として捉えることができ、統計的解析に含めることが可能になったことは本研究計画上の大きな進展となった。本年度(27年度)は、社会心理学分野および言語態度研究における文献レビューを行い、調査地であるニセコ地区での実施に適合するかたちで、話者の文化的自己観(アイデンティティー)、土着志向性、および共通語や地域方言に対する言語イデオロギーなどを調査するための調査票の作成を完了した。また、言語態度研究の文献レビューから得られた知見を元に、マッチドガイズ手法の応用型であるバーバルガイズ手法を採用することとし、音声による話者評価実験のための音声刺激と調査票の作成を完了した。さらには、申請者が別プロジェクト(基盤B、分担者)で行ってきた札幌市方言名詞アクセントの共通語化に関する実時間パネル調査と連動させるために、名詞アクセントの変異・変化を調査するための調査票も準備した。札幌市方言実時間調査との連携により、北海道の中心都市(札幌)で観察される変異・変化の動態とニセコ地区でのそれとを比較をすることができ、調査結果の考察により有益となる。本年度の後半は、上記の各種調査票を用いたフィールドワークを再開し、現在までのところ、新規で2名の住民との調査を完了している。また、昨年度までに調査済みである20名のニセコ住民に対し、再調査の依頼の文書を送付し、近日中に再調査を予定している。これまで収集してきた発話データの分析も同時進行で行ってきた。特にカ行子音の有声化に焦点をあて、各被験者が社会言語学インタビューにおいて話す様々な話題に関連した規則的変異を見極め、地域社会の急速なグローバル化に対する話者のイデオロギーの在り方をこの規則的変異の重要な動機付けの一つとして議論した。上記分析作業においては、統計的解析における新たな進展もあった。Rを用いた多変量解析(Rbrul)に精通することができ、混合効果を考慮したより精緻な分析が可能となった。年度当初の目的であった各種調査票の開発と制作、及び、それらを用いたフィールドワークを開始することができた。また、既存の発話データの分析も継続的に行っており、特にRを用いた多変量解析プログラム(Rbrul)による混合効果モデルの活用が可能となり、統計的解析における新たな次元が開けた。分析結果の一部は、本年度(27年度)6月に開催されるSociolinguistics Symposium 21(スペイン・ムルシア大学)において口頭発表を行う予定である。本年度(28年度)は、前年度に作成を完了した話者の文化的自己観(アイデンティティー)、土着志向性、共通語や地域方言に対する質問紙による顕在的言語態度とバーバルガイズ方式による潜在的言語態度を調査するための調査票を用いた実地調査を開始した。一昨年度までに調査が完了していた18名のニセコ町住民に再度接触し、上記の各種調査票を用いた再調査を行った。その際、追加調査として、昨年度までに別プロジェクトで調査を完了していた札幌市方言の語彙アクセントの共通語化調査の際に用いた調査票を改良して、上記18名のニセコ被験者より名詞アクセント音声を収集、および自然談話音声も追加で収集することができた。研究成果としては、自然談話音声の中から特にカ行子音の有声化を従属変数として、言語内的要因、話題の種類、グローバル化に対する土着イデオロギー等を独立変数とした多変量解析を行い、急激な社会変化に対して住民が持つ土着イデオロギーの種類によって、話す話題がカ行子音の有声化に異なった影響力を及ぼすというスタイル的変異が明らかになった。

この成果は、2016年6月にムルシア大学(スペイン)で開催されたSociolinguistics Symposium 21において口頭発表を行った。その後、年度末までには、上記の各種アンケート調査の結果を加味した多変量解析のための準備作業を開始した。本年度の後半にかけて病気を患い、外科手術と入院のため、年度当初予定していた実地調査の遂行に著しく遅延が生じた。1年間の補助事業期間延長願いを提出し承認済みである。本年度(29年度)は、前年度からの継続で、話者の文化的自己観、土着志向性、共通語や地域方言に対する顕在的言語態度、バーバルガイズ方式による潜在的言語態度などを調査するための4種類の調査を行った。結果的に、当初予定していた被験者のうち、転居等で連絡のつかなかった4名を除く、19名に対する面接調査を完了した。また、本調査開始時以降、ニセコ町が地域社会としてどのように変容したのかを把握するために、最新の人口統計資料(2017年5月発行版)を町役場の協力により入手した。また、ひらふ地区を中心とした、外客誘致・観光関連商業施設の看板や広告、街角の案内掲示等を含めた言語的景観の変化を把握した。研究の成果として、本研究プロジェクトの主題である「土着アイデンティティー」の複合性とそれと因果関係にある方言変異の実態が把握できた。土着アイデンティティーは、1)地域社会のグローバル化に対するイデオロギー(反対派・賛成派・中立派)、2)文化的自己観(個の認識と主張・評価懸念・独断性・他者への親和と順応)、3)土着方言や共通語に対する言語態度(連帯感・威信・標準意識・方言意識)などの社会心理的要因から複合的に構成されると見なされるべきであり、それらの構成要素が、方言使用に関するアンケート調査などから明らかになる意識的言語態度と因果関係にあることが判明した。(一方、道産子意識といったマクロな尺度でのアイデンティティーの数値化では、言語使用意識との規則的相関は見いだせなかった。)また、現在までのところ一部の被験者の分析結果に基づいた判断ではあるが、自然談話に観察される無意識的な方言使用の変異性には、特にグローバル化に対するイデオロギーとの因果関係があり、反対派住民ほど土着アイデンティティーが焦点化される話題において、方言的音声への無意識的なスタイルシフトによる方言誇示の傾向が観察された。グローバル化の最先端で劇的な社会変化が進行する地域社会において、土着方言の共時的変異・変化に話者の土着アイデンティティーがどのように関与しているのか、社会心理学的方法論を加味した計量的分析と質的洞察を融合しつつ、複眼的観点から因果関係の解明を試みた。研究成果として、土着アイデンティティーは、グローバル化に対するイデオロギー、自己観、土着方言や共通語に対する意識的、及び、潜在的言語態度などの社会心理的要因から複合的に構成される実在であり、アンケート調査で回答される方言使用の自意識と日常語における方言の無意識的使用の揺れとの間に見られる乖離が土着アイデンティティーで説明しうることを立証した。フィールドワークで使用する調査票を完成することができなく、調査開始時期が当初の予定よりも遅延した。
ハプスブルク帝国の近代化と地方社会 〜ダルマチアを中心に〜

ハプスブルク帝国の一地方であるダルマチアの事例を取り上げ、近代化過程における地方社会の変容を解明した。ダルマチアの近代化は当地の民族間関係を悪化させ、地方社会の分断化を助長したという仮説を提示し、その実証を試みた。近代化とは国民原理に基づく諸制度の一元化を伴うものであったが、ハプスブルク帝国は雑多な歴史的・民族的背景を持つ諸地方の連合体であり、帝国全域で国民的統一を実現するのは困難であった。むしろ、国民社会の形成は地方(州)単位で進行し、それらは小規模の国民国家的存在となっていった。ここで注目されるのは、それぞれの地方社会にも雑多な歴史的・民族的要素が混在しており、近代化に伴う伝統社会の再編、すなわち国民社会の形成は容易に実現しなかったことである。統一国家の伝統がなく、国民統合の核を持たないダルマチアでは、その傾向は顕著であった。ダルマチアの場合、19世紀半ばまで支配階層は同地の独自性を主張し、ダルマチア・ナショナリズムとも呼ぶべき方向性を提示したが、住民の多くは国民的志向において曖昧な部分が大きく、必ずしもこの立場を支持しなかった。これに対して、1860年代、同地の併合を国民的要求として掲げるクロアチア、セルビア、イタリアという周辺諸国のナショナリズムがダルマチアにも急速に浸透し、その三つの方向での社会の分断化が進展していった。政党はクロアチア人の民族党、セルビア人のセルビア民族党、イタリア人の自治党に三分され、各種の文化団体も同様に分裂していった。オーストリア政府はこうした状況を利用し、少数派を優遇する分断統治の手法でダルマチアの一体化を阻害した。結論として、近代化に伴う伝統社会の再編は各集団の対立を顕在化させ、地方社会に軋轢を生じさせる契機となったと考えられる。ハプスブルク帝国における国家(=中央)と地方の関係を、法的・制度的地位と実際面での政治的・経済的関係の両面から再検討し、以下の諸点を明らかにした。この帝国はハプスブルク帝国を共通の君主として戴く諸王国・諸領邦の緩い連合体であり、各地方は各々の伝統に従った広範な自治的権限を保持していた。しかし、18世紀に始まる近代化の流れの中で、政府は中央集権化を志向し、各地方の自治的権限を制限しようと試みた。とくに革命運動が沈静化した1850年代には、そうした試みが一定の成果をおさめ、地方行政制度の統一が実現したが、永続的なものとはならなかった。一方、各地方は一貫して中央集権化に反対し、自らの自治的権限の保持・拡大のために帝国の連邦国家として再編を志向していた。各地方は言語的・民族的にも異質であったから、各地方の動きは同時に排他的なナショナリズムを喚起した。帝国の細分化によって成立するであろう新たな国民国家の母体となるべく、それぞれの地方ごとに文化的・政治的活動が繰り広げられたのである。典型的な多民族国家であるハプスブルク帝国にとって、こうした動きは致命的なものとなった。伝統的社会では階級的差異が決定的であり民族的差異は重視されなかったが、近代化の過程でその関係は逆転した。それは多民族の平和的共存の伝統を脅かすものであった。近代化は地方社会を民族的に統合する一方で、各地方・各民族間に不和をもたらし、国家としての一体化、その成員を包括する「国民」の形成を大きく阻害したといえる。こうした枠組みにおいて、今後は帝国の一地方としてダルマチアの事例を取り上げ、近代化が地方社会にもたらした影響、そして国家(=中央)と地方の関係の変容の具体的な分析を行なう。
脳神経損傷に関与する脳内抑制系神経受容体のPETを用いた定量に関する研究

ネコ中大脳動脈一過性閉塞モデルでの、動物PETによる神経受容体定量に関する実験を完了した。13匹の成猫13匹を使用し経眼窩的に右中大脳動脈を一過性に閉塞させた後再潅流した。東京都老人総合研究所ポジトロン医学研究施設既設の動物PETカメラ(SHR-2000浜松ホトニクス社)に虚血前、虚血時及び再潅流直後の脳血流を定量した。これに引き続きアデノシンA1受容体結合能、中枢性ベンゾディアゼピン受容体結合能、ブドウ糖代謝に関し定量的計測を行った。計測終了までに脳の腫張が生じたネコはこの時点で屠殺し脳を取り出した。腫張のない個体は覚醒させ鎮痛剤、抗生剤投与下に様子を観察し体調に問題ないものは2週間後、2ヶ月後に上記計測に加え末梢性ベンゾディアゼピン受容体の定量をも行った。2ヶ月followした後、屠殺し潅流固定の上病理変化を検証した。PET画像はネコのMRI画像(Varian社、4.7T)に重ね合わせ脳局所の定量値の経時的評価を行った。計測結果は正常ネコ6匹より得られた結果と対比検討した。直後から脳腫脹に至る重篤な虚血を生じた個体では、再潅流直後からアデノシンA1受容体結合能の広範な低下が生じていた。また生存したネコの梗塞巣に関し病理学的検討を加えると全ての個体で充分な虚血病巣が形成されているもののその個体差が大きいことが判明した。そしてこの個体差を判別する最も鋭敏な因子がアデノシンA1神経受容体結合能の定価であることを統計学的にも明らかにした。一方でこれほど鋭敏ではないものの中枢性ベンゾディアゼピン受容体結合能の低下がこれに次ぐ判別能を持ち、虚血時血流、再潅流時血流、再潅流後脳代謝はでは全く判別不能であることも明らかにした。この結果は第19回国際脳循環代謝シンポジウムで発表した上で論文投稿予定である。一方同一手法をてんかんモデルに応用するためのシステムセットアップは行ったが実際の実験の開始は次年度に持ち越すことになった。今年度は、ネコ中大脳動脈一過性閉塞モデルでの、動物PETによる神経受容体定量に関する実験を完了した。東京都老人総合研究所ポジトロン医学研究施設既設の動物PETカメラ(SHR-000浜松ホトニクス社)に虚血前、虚血時及び再潅流直後の脳血流を定量した。腫張のない個体は覚醒させ鎮痛剤、抗生剤投与下に様子を観察し体調に問題ないものは2週間後、2ケ月後に上記計測に加え末梢性ベンゾディアゼピン受容体の定量をも行った。2ケ月followした後、屠殺し潅流固定の上病理変化を検証した。PET画像はネコのMRI画像に重ね合わせ脳局所の定量値の経時的評価を行った。

直後から脳腫脹に至る重篤な虚血を生じた個体では、再潅流直後からアデノシンA1受容体結合能の広範な低下が生じていた。また、生存した個体においても脳梗塞に陥る部分は再潅流直後よりアデノシンA1受容体結合能低下により最も鋭敏に予測できた。一方でベンゾディアゼピン受容体結合能の低下は脳梗塞を来す部分で経時的に低下が進行するのが特色であった。脳血流値やブドウ糖代謝の低下部位は、一時的な梗塞部よりは遥かに広範であった。この結果は第19回国際脳循環代謝シンポジウムに縁台採用され発表予定である。また、てんかんモデルを用いて上記と同じく見合わせで神経受容体の経時的変化を計測するため扁桃体へのカイニン酸局所注入モデル制作を進めた。次年度はこのモデルの計測を中心に行う予定である。今年度は、ネコ中大脳動脈一過性閉塞モデルの、動物PETによるアデノシンA1神経受容体定量に関する実験を前年度での結果解析をふまえた上で追加実験を行い完了させた。これに伴い対象とするための正常ネコに関するトレーサーの動態解析に関し対比検討した。モデル動物作成と実験法はこれまで通りであり経眼窩的に右中大脳動脈を一過性に閉塞させた後再潅流し、東京都老人総合研究所ポジトロン医学研究施設既設の動物PETカメラ(SHR-2000浜松ホトニクス社)にて虚血前、虚血時及び再潅流直後の脳血流を定量した。これに引き続き再潅流後のアデノシンA1受容体結合能を測定し続いて測定した中枢性ベンゾディアゼピン受容体結合能、ブドウ糖代謝と対比しその意義を検証した。計測終了までに脳の腫張が生じたネコはこの時点で屠殺し脳を取り出した。腫張のない個体は覚醒させ鎮痛剤、抗生剤投与下に様子を観察し体調に問題ないものは2週間後、2ヶ月後に上記計測に加え末梢性ベンゾディアゼピン受容体の定量をも行った。2ヶ月followした後、屠殺し潅流固定の上病理変化を検証した。PET画像はネコのMRI画像に重ね合わせ脳局所の定量値の経時的評価を行った。また病理学的検討を加えることで全ての個体で充分な虚血病巣が形成されているもののその個体差が大きいことが判明した。そしてこの個体差を判別する最も鋭敏な因子がアデノシンA1神経受容体結合能の定価であることを統計学的にも明らかにした。一方でこれほど鋭敏ではないものの中枢性ベンゾディアゼピン受容体結合能の低下がこれに次ぐ判別能を持ち、虚血時血流、再潅流時血流、再潅流後脳代謝はでは全く判別不能であることも明らかにした。この結果は第19回国際脳循環代謝シンポジウムで発表した上で論文投稿予定である。一方同一手法をてんかんモデルに応用するためのシステムセットアップは行ったが実際の実験の開始は次年度に持ち越すことになった。
教育実践と省察を軸とした教師教育実践プログラムの開発と普及

教育実践と省察を軸とした実践的教師教育プログラムの開発と普及を目指し、そこに顕在化する課題について具体的・実践的な方策を開発していくことを目的に研究を進めた。まずVELON(オランダ教師教育者協会)、PABO(オランダ初等教員養成機関)、ATE(全米教師教育者協会)など海外における教師教育者養成プログラムの検討し紹介した。24年度には、全国公立小学校(5%無作為抽出)を対象に調査を実施し、教育実習生並びに若手教員の指導を担当する教員に求められる資質・能力や必要とする支援・研修について明らかにした。その上で、理論と実践の往還を図るための方法として「省察」を軸としたプログラムの開発を進めた。本研究の目的は、教育実践と省察を結びつけたプログラムの開発にある。本年度の研究成果は以下のとおりである。124年6月に、全国の公立小学校のうち5%を無作為抽出し、教育実習生や若手教員の指導にあたる教員にかかる調査を実施した。これは、実習指導教員および初任者等指導教員がどのような基準で選ばれ、どのような指導力量が期待されているのかを質問紙調査により実態把握し、大学での教員養成で重視されている要件と学校現場で教育実習生や初任者および若手教員を指導する教員に求められている指導力量との連携上の課題を明らかにすることを目的としたものである。調査の結果、指導者に期待される資質能力は、教育活動に意欲的であり、学級経営や子ども理解に関する実績的な知識技能を有していること、さらに後進の成長に意欲的であるといった人物像として抽出された。一方、少数ではあるものの、教育実習生および初任者・若手教員の指導者の選定にあたって、省察を重視している学校が存在し、それらの学校における支援・研修ニーズは他の学校群に比べて高いことが明らかになった。223年11月・24年3月に実施した海外調査の結果を基に、9月には日本教師教育学会において「教師教育者の位置づけと役割ーオランダ・デンマーク・アメリカとの比較を通じてー」として報告を行った。オランダ・デンマーク・アメリカにおける教師教育者の位置づけ及びスタンダードをもとに、日本における教師教育者養成の現状と課題について問題提起を行った。325年3月には、オランダ、ベルギーにおける教師教育者の育成にかかる調査を実施するとともに、北欧教育学会(アイスランド大学)で、日本の社会的変化に伴う学校教育及び教師教育施策の動向を報告した。本研究のテーマは、省察と実践を軸とした実践的教師教育プログラムの開発と普及であり、最終年度にあたる今年は主に以下の研究に取り組んできた。1教師教育者の資質能力や必要とする支援等にかかる検討として、まず、24年度に実施した教育実習生や若手教員の指導を担当する教員(教師教育者)を対象としたアンケート調査(全国公立小学校から無作為に5%抽出)の分析結果をもとに、聞き取りによる追跡調査を実施した。その結果については、日本教師教育学会(9月佛教大学)、NERA Congress(3月Lillerhammer University College, Norway)において成果発表を行った。また、信州大学教育学部研究論集第7号(3月)に論文投稿し、掲載された。2教師教育プログラムやメンターティチャーの育成・活用等について、アメリカ・オハイオ州(9月オハイオ州立大学)、オランダ・ノルウェー(3月主に小学校・中学校)において訪問調査を実施した。3学生や現職教員を対象とした、省察を軸とした教師教育プログラムを検討し、帝京大学霞が関キャンパスでの「授業実践リフレクション」の公開授業(10月)、東京都教職員研修センターでの現職教員研修(11月)において試行した。43年間の研究経過及び成果を研究報告書としてまとめた。教育実践と省察を軸とした教師教育実践プログラムの開発をめざし、本年度はプログラムを実際に実行・運用する「教師教育者」に焦点を当て、調査研究を進めてきた。11月にはアメリカにおいて、ATE本部(教師教育者協会)・NBPTS本部(優秀教員の認定およびトレーニングに携わる組織)・フェアファクス教育委員会等を訪問し、教師教育者スタンダードの作成経緯や運用実態、さらには優秀教員制度について聞き取り調査を行った。また3月にはオランダにおいてVELON(教師教育者協会)やロッテルダムPABO(初等教員養成機関)において、学校における教師教育者(主に教育実習を担当する指導教員)のスタンダードや機関・大学から提供される支援について聞き取りを行った。これら取り組みが教育実習の質保証とともに、教員養成機関における実務家教員の確保にも効果を発揮していることが明らかになった。さらにデンマークでは、大学等でトレーニングを受けた教育実習コーディネーターが学校に配置されるなど、実習指導の充実が重要な課題になっていることが明らかになった。ただし、コーディネーター育成の拡大には様々な課題があることなども把握することができた。3月には、デンマークDPUで開催された北欧教育学会において、教育実習生の成長発達の契機について、授業研究・教育実習リフレクションという2つの取り組みから発表を行った。今年度の取り組み成果は「教育実習の質保証をめぐる今日的課題

『教師教育者』という視点から」として整理し、帝京大学教職大学院年報第3号に投稿した。我が国の養成教育において懸案となっている教育実習生や若手教員の指導者の選定や位置づけについて、全国5パーセントの公立小学校を対象に、量的調査を実施することができた。また、本調査の分析により得られた結果をもとに、教師教育者の位置づけと役割について、アメリカ、オランダ、デンマークと対比させつつ、提案を行った(日本教師教育学会24年9月)。24年3月に実施した海外調査(オランダ教師教育者協会における教師教育者スタンダード、オランダ、デンマークの教育実習の現状や課題等)の成果については、論文により公表することができた(帝京大学教職大学院年報第3号)。本年度は、教師教育の充実・改善を「教師教育者」という視点からとらえ直すため、アメリカ、オランダ、デンマークにおいて広く情報収集を行った。訪問調査を行った国では、学校現場において教育実習を担当する教員も教師教育者として認められており、スタンダードの制定や大学・機関からの支援が講じられている事実を把握することができた。日本における教師教育者スタンダード開発や育成のためのモデルプラン開発にとって有益な情報を得ることができたと考えている。また、中央教育審議会答申教員の資質能力向上特別部会基本制度ワーキンググループ報告案(2012年3月)においても、教育実習を充実させるための仕組みや連携体制の構築が課題として示されており、本年度収集した情報は、こうした課題に対しても具体的な方策を提供することが可能である。25年度は、研究最終年度に当たることから、以下の3点に重点を置いて研究を推進する。1教師教育者にかかる量的調査から抽出された問題点に対して、学校や教育委員会を対象とした質的調査を実施する。その上で、日本における教師教育者養成(主に、教育実習生や若手教員の指導を担当する教員を対象)のモデルプログラムの開発を試みる。2教育実践と省察を結びつけた教師教育プログラムの開発を行う。3オランダ、アメリカ、デンマークにおける教師教育者養成の現状と課題について整理を行う。43年間の研究のまとめを行い、学会発表並びに論文投稿を通じて公表を行う。本研究では、教師教育者を大学等で教員養成に携わる教員だけでなく、学校現場で実習生や若手教員の指導に当たる教員も含めてとらえている。そこで24年度は、学校で実習指導に当たる指導教員、急増する若手教員の指導に当たる中堅教員に焦点を当て、必要とされる資質能力や具体的な支援策について、質問紙による調査を実施する。調査は、小学校(全国の小学校から抽出)を対象に実施し、その後教育委員会にも依頼する予定である。また、24年度後半には調査結果を分析し、学校現場等における教師教育者養成のためのモデルプランを検討していく予定である。研究推進の方策に基づき、主に以下のように研究費を使用する。1学校、教育委員会等を対象とした調査
動植物酵素の異種宿主における可溶性発現技術の開発とそれらの有用物質生産への利用

課題1 1.大腸菌で不溶性にしか発現しないβシートが豊富な酵素として微生物のPeptide: N-glycosidase Fを選択しホットスポット(Asn17)を見出した。2. 7種類の酵素遺伝子のTat-Split法による可溶性発現を試み、新しく3種類の可溶性変異体を見いだし変異部位を特定した。3.「α-ヘリックス則」とINTM-SAlignと効率的に連結できるようにした。4.他大学と可溶性発現を検討した。5.多くのヤスデ由来のHNL構造と可溶性発現への影響を検討した。5.本法の有効性の逆証明のため、可溶性酵素のINTMS-Alignにより不溶性化変異をデザインした。6. INTMS-Alignの出力結果と立体構造に基づく安定化変異点探索ソフトウェアPyRosettaを融合し、新たな可溶性変異点探索ツールを開発した。MeHNLをモデルとして探索を実施し、Met103Leuに加えてLys176Pro, Lys199Pro, Lys224Proについても可溶性ホットスポットとして予測できることが判明した。課題2 1. 2017年秋に大発生したヤスデDNAについてゲノム解読作業を継続して行った。2.大腸菌では遺伝子発現が認められないヤスデ酵素について、Pichia pastorisに対してコドン最適化を行い、ジスルフィドイソメラーゼを共発現させたところ、遺伝子発現が認められた。3.反応機構からHNLが新規なストレッカー反応の触媒に最適と考え、研究室が有する植物由来HNL7種とヤスデ由来HNLでアミノニトリルの分解反応と合成反応を検討した。2-アミノ-3-フェニルプロパンニトリル、ピロリジンー2ーカルボニトリル、2-メチルアミノ-2-フェニルアセトニトリルを有機合成し、分解及び合成活性測定した結果、いくつかのHNLで2mPANの合成を触媒することが確認できた。課題1 1.β-シート構造においてもα-helixruleと同様にアミノ酸残基の親水性・疎水性が重要な因子であると考えられる。2.Tat-split-GFP法では、多様な可溶性変異体が見いだされる。例として、βターン付近やα-ヘリックス付近のアミノ酸残基が置き換わっていた。3.α-ヘリックス構造の親水性面と疎水性面の判別を自動で行うことのできるエクセル形式のファイルを作成できた。4.他大学でも、可溶性発現の改善が見られた。5. INTMS-Alignにより不溶性化変異を予測できた。6.可溶性ホットスポット探索に関して新しくタンパク質立体構造ベースで変異点探索が可能となるなど、応用の幅が拡がった。課題2 1.ヤスデのゲノムシークエンスデータをアッセンブルし、112のスカフォールド(N50 16.6 Mbp, Total size 148.7 Mbp)からなる、ドラフトゲノムを得た。また、ヤスデ各組織のRNA-seqデータを利用して、ヤスデゲノム上の遺伝子を推定し、13235遺伝子を得た。ヤスデのシアン化水素発生に関与するChuaHNL遺伝子は多くのChuaHNL-like遺伝子とクラスターを形成していたことから、ChuaHNLの祖先遺伝子がゲノム上で多重化していく過程でHNL活性を獲得したと推察された。2.まず、大腸菌では遺伝子発現が認められなかったヤスデ酵素について、酵母Pichia pastorisに対してコドン最適化を行い、ジスルフィドイソメラーゼを共発現させたところ、酵母での遺伝子発現が認められた。3.世界で初めて酵素でアルデヒドからアミノニトリルを合成することを明らかにした。様々なアミノニトリルを用いることで、アミノニトリルを合成しやすいHNLとの組合わせを明らかにした。課題1 1. β-シート構造中の可溶性変異について、新しい法則性と合理的説明法を見出すことが必要である。Tat-Split法の有用性が示された一方で改善の余地も残されている。今後は本プロトコルの改良を行い、本スクリーニング法の適用範囲を広げる。2. INTMS-Alignとの効率的な連結のため、さらに改良を行う。3.良好な結果を得ている部分については、さらに可溶性発現を向上させるためのホットスポットの解析を行う。4.各大学から報告をまとめ、変異部位の解析を行う。実験分担を再考する。5.ヤスデ由来のHNLの大量生産を行い、応用範囲を広げる。6.新たにモデルタンパク質を選択し、さらに本手法の有効性を検証する。7.開発したHiSol2法を用いて、不溶化タンパク質を可溶化させる実験を実施する。具体的にはRhodococcus由来L-amino acid oxidaseなどに本手法の適用を行う。課題2 1.ヤスデゲノム解読作業からヤスデのシアン代謝やその他の特徴を見出す。ChuaHNL-like遺伝子の機能解析を行う。また、マンデロニトリルの生合成に関与するシトクロムP450の同定を行う。2.ヤスデ由来HNL類の結晶構造解析を進め、有用光学活性シアノヒドリン合成に適用する。3.アミノニトリル自体が不安定な化合物のため、ニトリラーゼやニトリルヒドラターゼとカップリングさせることで、より速やかにアミノニトリルをアミノ酸やアミドに変換させる。構造情報のあるHNLに対し、基質認識ポケットに変異を導入し、より立体選択的に作用する酵素に改変する。課題

1 1.大腸菌で不溶性にしか発現しないβシートが豊富な酵素として微生物のPeptide: N-glycosidase Fを選択しホットスポット(Asn17)を見出した。2. 7種類の酵素遺伝子のTat-Split法による可溶性発現を試み、新しく3種類の可溶性変異体を見いだし変異部位を特定した。3.「α-ヘリックス則」とINTM-SAlignと効率的に連結できるようにした。4.他大学と可溶性発現を検討した。5.多くのヤスデ由来のHNL構造と可溶性発現への影響を検討した。5.本法の有効性の逆証明のため、可溶性酵素のINTMS-Alignにより不溶性化変異をデザインした。6. INTMS-Alignの出力結果と立体構造に基づく安定化変異点探索ソフトウェアPyRosettaを融合し、新たな可溶性変異点探索ツールを開発した。MeHNLをモデルとして探索を実施し、Met103Leuに加えてLys176Pro, Lys199Pro, Lys224Proについても可溶性ホットスポットとして予測できることが判明した。課題2 1. 2017年秋に大発生したヤスデDNAについてゲノム解読作業を継続して行った。2.大腸菌では遺伝子発現が認められないヤスデ酵素について、Pichia pastorisに対してコドン最適化を行い、ジスルフィドイソメラーゼを共発現させたところ、遺伝子発現が認められた。3.反応機構からHNLが新規なストレッカー反応の触媒に最適と考え、研究室が有する植物由来HNL7種とヤスデ由来HNLでアミノニトリルの分解反応と合成反応を検討した。2-アミノ-3-フェニルプロパンニトリル、ピロリジンー2ーカルボニトリル、2-メチルアミノ-2-フェニルアセトニトリルを有機合成し、分解及び合成活性測定した結果、いくつかのHNLで2mPANの合成を触媒することが確認できた。課題1 1.β-シート構造においてもα-helixruleと同様にアミノ酸残基の親水性・疎水性が重要な因子であると考えられる。2.Tat-split-GFP法では、多様な可溶性変異体が見いだされる。例として、βターン付近やα-ヘリックス付近のアミノ酸残基が置き換わっていた。3.α-ヘリックス構造の親水性面と疎水性面の判別を自動で行うことのできるエクセル形式のファイルを作成できた。4.他大学でも、可溶性発現の改善が見られた。5. INTMS-Alignにより不溶性化変異を予測できた。6.可溶性ホットスポット探索に関して新しくタンパク質立体構造ベースで変異点探索が可能となるなど、応用の幅が拡がった。課題2 1.ヤスデのゲノムシークエンスデータをアッセンブルし、112のスカフォールド(N50 16.6 Mbp, Total size 148.7 Mbp)からなる、ドラフトゲノムを得た。また、ヤスデ各組織のRNA-seqデータを利用して、ヤスデゲノム上の遺伝子を推定し、13235遺伝子を得た。ヤスデのシアン化水素発生に関与するChuaHNL遺伝子は多くのChuaHNL-like遺伝子とクラスターを形成していたことから、ChuaHNLの祖先遺伝子がゲノム上で多重化していく過程でHNL活性を獲得したと推察された。