hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
空間的ドラッグデリバリーシステムによる成長因子複合移植法の開発

さらに、平成26年度はスキャホールドを内径300μmのハニカム構造にして細胞誘導性を検索したところ、成長因子を配合しなくても、本来再生しないはずの新生セメント質の形成量、新生骨の形成量がコントロール群に比べて多く認められて、ハニカム構造の組織誘導性を確認した。平成27年度は、このハニカム構造のコラーゲンを担体として、我々の考案したDouble layer法を用いてBMPとFGFの移植を行ったところ、スポンジ状のコラーゲンを担体として用いた場合に比べて、歯冠側方向への再生が早く導かれる可能性が示唆された。これらのデータは、水平性骨欠損の再生療法の1つとして、成長因子の組み合わせのDouble Layer法とハニカム構造のスキャホールドを用いる方法について開発研究を進めることが重要であることを示唆した。本研究では、歯周組織再生量の増大をはかる目的で、成長因子の担体の構造が歯周組織再生に与える影響及びBMPとFGF、EMDの新規併用法(Double layer method)の有効性を検索した。その結果、内径200400μmのハニカム構造を有するコラーゲンは、トンネル方向が細胞増殖を調整する可能性が示唆された。さらに、BMPとFGFならびにBMPとEMDのDouble layer methodは、混合または単独の場合よりも、新生骨と新生セメント質の形成量の増大がみられ、異常治癒を抑制した。以上の結果から、Double layer methodが歯周組織再生に有効である可能性が明らかになった。本研究課題では、BMPとFGFあるいはEMDとを組み合わせて移植する治療法の開発に取り組む研究を行っている。申請期間では1.成長因子の組み合わせ、2.組み合わせる方法、3.成長因子を配合するバイオマテリアルの検証を予定している。1.成長因子の組み合わせ、2.組み合わせる方法については、昨年度までに、BMPとFGF、BMPとEMDの組み合わせはいずれも有効であること、各成長因子は混合せずに層状に移植する方法として考案したdouble layer constitute method(DL法)が有効であることを解明した。3.バイオマテリアルについては、内径300μmのトンネル構造は、そのトンネルの入口付近の組織が内部へ増殖するとともに、それ以外の周囲組織がトンネルの外壁に阻まれ内部へ侵入しないことを昨年度までに解明した。この結果をもとに、本年度は歯周組織再生に有効な歯根膜と骨組織近傍にトンネルの入口を配列して、歯肉の侵入を外壁で排除すれば、欠損部(再生スペース)に有効な細胞を集積できるのではないかと考え、ハニカム構造に着目し検証を行った。欠損底部の既存骨、歯根膜からハニカム構造に沿って細胞と血管が歯冠側方向へ増殖して新生セメント質および新生骨の形成が促進される可能性が示唆された。またFGF,EMDは細胞増殖と分化に、BMPは主に細胞分化に作用することを考慮すると、各成長因子の作用期間をコントロールする方法を構築することが出来れば、組織修復再生反応を現在の方法よりも強力に促進できるのではないかと発案した。本年度は先ず有効な作用期間を過ぎた成長因子を除去する方法を考案し、温度感応性ポリマーに着目した。
インスリン・シグナル伝達機構

インスリン受容体などのチロシン・キナーゼ活性をもつ受容体の場合情報伝達の中間段階については全くといいほどわかってない。特にインスリンについては確固としたセコンドメッセンジャーは見出されてない。本研究ではインスリン受容から糖輸送活性上昇に至る情報伝達をとりあげ、情報伝達におけるインスリン受容体と糖輸送体の動態を中心にラット脂肪細胞を用いて調べ以下の結果を得た。1)糖輸送体に対する抗体を用い、粗ミクロゾーム分画中の小胞に存在する糖輸送体とインスリン受容体の局在性を免疫沈澱により調べた。糖輸送体をもつ小胞の80%以上が沈澱する条件で、インスリン受容体の40%以上が共沈した。非特異的な共沈でないことはコントロールIgGにより沈澱しないこと、加える抗糖輸送体IgG量に対し飽和現象があり40%以上は沈澱しないこと、再び糖輸送体小胞を加え免疫沈澱を行なっても受容体は沈澱しないことから確めた。2)このようにして沈澱した小胞は特異的なタンパク質を持っていることが、SDS電気泳動像からわかった。この特異的なタンパク質はインスリンを加えると減少し、糖輸送体小胞にあると考えられる。3)キモトリプシン基質アナログであるBTEE及びATEEがインスリン受容体のチロシンリン酸化を阻害し、情報伝達の初期過程に働いていることがわかった。受容体の内在化及び糖輸送活性の上昇も0.2-0.6mMが50%阻害濃度であった。4)トリプシン阻害剤のTLCKがインスリンによる糖輸送活性の上昇を阻害したがチロシンリン酸化は阻害せず、阻害の場所はATEE、BTEEと異なっていた。以上インスリン作用の細胞内情報伝達の初期過程について多くの情報をうることができ、以後の過程の研究に重要な手がかりを得た。
慢性紛争下における栄養問題の二重負担：克服の鍵としてのヘルスリテラシー

本研究は、栄養問題の二重負担が多くの途上国で顕在化している背景を受け、特にパレスチナ自治区のヨルダン川西岸地区・ラマッラー行政区域において、長期化する紛争とグローバル化が子どもの栄養状態に与える影響を明らかにすることを目的としている。そして慢性紛争下にあっても栄養問題の二重負担を含む健康上の問題点や苦難を克服できるツールとして、健康情報の有効活用を可能とするヘルスリテラシーを測定し、栄養状態との関連を特定することを目指し、2016年度から実施してきた。研究手法としては、質的研究と量的研究の双方を用いる混合研究法を用いて進めている。2016年度にヘルスリテラシーに関する質的研究のために収集されたデータを基に、2017年度から論文の執筆を開始し、2018年度に完成した。その結果について、2019年3月にヨルダン・アンマンで開催された国際学会「第10回ランセットパレスチナ保健連合会議」において採択され、ポスター発表した。その結果、ベストポスター賞を受賞し、パレスチナ及び中東、欧米のパレスチナ保健に関わる研究者から高い評価を受けた。また、英文原著論文として投稿し、出版することができた。量的研究に関しては、2017年度に、栄養の二重負担、ヘルスリテラシー、紛争下におけるWell-Being等について、収集したデータに関して、データの質を確認し、分析に用いられる状態になるように検討した。2017年度から取り組んだ質的研究の論文執筆について、共著者間で議論を重ねるなかで、質的研究データをコンテンツ分析法に基づいて再分析し再構成することになり、この部分に注力したが、論文完成までに時間がかかった。2017年度に量的研究において、栄養の二重負担、ヘルスリテラシー、紛争下におけるWell-Being等についてのデータ収集を行った。特に、青少年のヘルスリテラシーはパレスチナにおいて初めての研究であり、質的研究の結果に基づきながら、量的研究データ分析を進める計画としていたため、量的研究結果の分析に遅れが生じた。量的研究結果に関しての論文執筆や論文投稿、及び質的研究と量的研究の結果を踏まえての総括には到達できなかった。ヘルスリテラシーに関しては、既存の青少年ヘルスリテラシー尺度(英語)を本研究において翻訳したアラビア語版尺度や質的研究に基づいて作成したヘルスリテラシーの質問内容に関しての妥当性と信頼性について検討し、論文にまとめる。栄養問題の二重負担についての研究は、ヘルスリテラシーの影響を踏まえたデータ分析を進め、結果を論文としてまとめて国際学術誌に投稿する。さらに、Well-beingに関連する要因の分析も計画しており、この分析もまとまり次第、論文投稿を予定している。質的研究と量的研究の結果を踏まえ、本研究の最終的な総括を行う。紛争が長期化した社会において求められているのは、紛争を迅速にやめさせる手段だけではない。紛争下であっても、いかによりよく生きることができるかという方法もまた同様に重要である。紛争が長期化するパレスチナにおいて、子どもが今直面している問題の一つに「栄養問題の二重負担」がある。いわゆる肥満と低栄養が同一国や同一共同体の中で同時に存在している状態のことである。本研究は、栄養問題の二重負担が多くの途上国で顕在化している背景を受け、特にパレスチナ自治区のラマッラー行政区域において、長期化する紛争とグローバル化が子どもの栄養状態に与える影響について、比較研究を行う。加えて、慢性紛争下にあっても栄養問題の二重負担を含む健康上の苦難を克服できるツールとして、健康情報の有効活用を可能とするヘルスリテラシーを測定し、栄養状態との関連を特定することを目指す。研究初年度である平成28年度には、予定通り、パレスチナ自治区・ビルゼイト大学地域保健研究所を共同研究機関として研究を開始した。研究計画の具体的な内容の検討、倫理審査手続き、パレスチナ自治政府教育省・国連パレスチナ難民救援機関(UNRWA)との学校を拠点とした研究に関する手続きを終えた。調査対象学校の選定、対象校におけるインタビュー調査も実施した。ヘルスリテラシー尺度の開発や紛争の影響に関する質問項目についても検討した。平成28年度に、学校を拠点とする調査について所轄機関の了承が得られたので、対象校を決定することができた。調査対象校については、パレスチナ自治政府教育省が管轄する公立学校4校(都市部:男子学校1校・女子学校1校)、私立共学校1校を選定した。選定された対象7校において、生徒〈12歳15歳)、教師、保護者の代表を対象にインタビュー調査を実施した。インタビュー調査結果は、現在、データの文章化及びアラビア語ー英語翻訳が終了し、質的手法を用いて分析を進めている。ヘルスリテラシーに関してはヘルスリテラシー尺度に基いた文献レビューを実施し、対象年齢・研究目的に適合する尺度の開発を進めた。紛争の影響に関しての質問項目や尺度については、ビルゼイト大学が先行研究で用いたことのある信頼性及び妥当性がある尺度について、本研究の対象・目的に適合するかどうかの検討した。平成28年度中に得られたインタビュー調査データの内容を精査すると共に、得られた情報をもとに、尺度の開発を進めている。2016年度にヘルスリテラシーに関する質的研究のために収集されたデータを基に、論文の執筆を行った。2018年度に投稿予定である。また、栄養問題の二重負担に関する量的研究のためのデータ収集を2017年9月末までに完了した。当初はパレスチナ内の学校を拠点としたアンケート調査・栄養調査を計画していたが、調査が夏期休業に重なってしまったため、学校には児童がおらず、調査の拠点をコミュニティに変更した。各家庭を訪問し調査をする作業に、移動が加わったため、必要人数のデータを収集するのに当初の予定より長い時間がかかった。

2017年11月には東京大学にてシンポジウムを開催し、研究分担者であるビルゼイト大学のRita Giacaman教授、UNRWAの清田明宏医師、中京大学の今野泰三准教授他を招いてパレスチナにおける健康の現状や国際的課題を紹介してもらい、討論を行った。パレスチナの健康状況の周知と問題に関する理解を深める目的が達成された。質的研究のデータ分析が予定通り進み、学術誌へ投稿する論文の執筆がほぼ完成した。現在著者の間で最終的な確認が行われている。また、量的研究のデータ収集も当初の予定より遅れたものの、平成29年度中に完了し、分析も順調に進んでいる。シンポジウムや国際ワークショップも開催し、パレスチナにおける健康の状況周知や課題への理解を深めることができた。本研究は、栄養問題の二重負担が多くの途上国で顕在化している背景を受け、特にパレスチナ自治区のヨルダン川西岸地区・ラマッラー行政区域において、長期化する紛争とグローバル化が子どもの栄養状態に与える影響を明らかにすることを目的としている。そして慢性紛争下にあっても栄養問題の二重負担を含む健康上の問題点や苦難を克服できるツールとして、健康情報の有効活用を可能とするヘルスリテラシーを測定し、栄養状態との関連を特定することを目指し、2016年度から実施してきた。研究手法としては、質的研究と量的研究の双方を用いる混合研究法を用いて進めている。2016年度にヘルスリテラシーに関する質的研究のために収集されたデータを基に、2017年度から論文の執筆を開始し、2018年度に完成した。その結果について、2019年3月にヨルダン・アンマンで開催された国際学会「第10回ランセットパレスチナ保健連合会議」において採択され、ポスター発表した。その結果、ベストポスター賞を受賞し、パレスチナ及び中東、欧米のパレスチナ保健に関わる研究者から高い評価を受けた。また、英文原著論文として投稿し、出版することができた。量的研究に関しては、2017年度に、栄養の二重負担、ヘルスリテラシー、紛争下におけるWell-Being等について、収集したデータに関して、データの質を確認し、分析に用いられる状態になるように検討した。2017年度から取り組んだ質的研究の論文執筆について、共著者間で議論を重ねるなかで、質的研究データをコンテンツ分析法に基づいて再分析し再構成することになり、この部分に注力したが、論文完成までに時間がかかった。2017年度に量的研究において、栄養の二重負担、ヘルスリテラシー、紛争下におけるWell-Being等についてのデータ収集を行った。特に、青少年のヘルスリテラシーはパレスチナにおいて初めての研究であり、質的研究の結果に基づきながら、量的研究データ分析を進める計画としていたため、量的研究結果の分析に遅れが生じた。量的研究結果に関しての論文執筆や論文投稿、及び質的研究と量的研究の結果を踏まえての総括には到達できなかった。
チャンネル代替法のための人工膜貫通キャリアの開発と分析

このような問題を遺伝子学的にではなく、化学的に解決する研究を本テーマでは行う。つまり、様々な病理に関与する細胞膜を通してのアニオン輸送を人為的にコントロールするような合成アニオン輸送分子を開発することが本研究の主目的である。そのため、本研究では、何種類かのtriaryldipyrrole型オリゴマーを、新たに開発された2,5-diarylpyrrole誘導体の合成手法を応用することによって合成した。また、この合成分子に対してアニオンに対する認識機能を紫外可視吸収スペクトルや核磁気共鳴スペクトルによって検討した。本年度は、有機合成において大きな進歩があり論文発表に至った。具体的には、homopropargyl sulfonamidesを段階的に脱保護しつつ5-endo-dig環化反応を行うことによって、非対称修飾型の2,5-diarylpyrroles分子の合成法を確立した。また得られた化合物の誘導体分子を用いて、イオン認識に関する研究も行っており論文を作成しているところである。キーとなる分子の合成にも成功し、イオン認識の研究も順調に進んでいる。JSPSフェローは交流のある研究室に就職し、研究交流が続いている。共同研究として本研究を継続している。生命活動を維持するためには、細胞を通してのイオンの選択適当かによる細胞内環境の保持は極めて重要である。そのため、細胞膜に存在するイオンチャネルに対して遺伝子欠損を持つ患者は、重大な病態を引き起こすことが知られている。特に、生体中の代表的な陰イオンであるクロライドイオンのチャネルの欠損は社会的にも大きな問題となっている。これを救うものとして、人工的なイオンチャネル分子を合成し、それが膜を介して円滑にクロライドイオンを糖化させるような系を開発することは意義深い。本研究では、そのようなイオンチャネル物質あるいはキャリア分子を新規に開発するため、カリックスピロール分子の合成をおこなった。この環状分子は、N-H基の共同作用によりクロライドイオンを選択的に結合することが知られている。この新規化合物に対する生体に由来するさまざまなアニオン種の結合を1H-NMR法により検討した。それと並行して、この分子の脂質二分子膜への分配を検討した。いずれにおいても、見通しの立つ結果が得られており、研究開始後半年にもかかわらず、きわめて順調な成果が得られている。特に、プロトンとクロライドイオンの共輸送挙動が示唆される結果が得られていることは注目に値する。ホスト機関である物質・材料研究機構には、さまざまな分析装置がそろっており、本現象の詳細な検討を進めると同時に、新規人工チャネル分子の有機合成をさらに進める予定である。生体膜を通しての塩素イオンや炭酸水素イオンの透過の異常は、致死的遺伝病である嚢胞性線維症(cystic fibrosis)の原因となる。これは、cystic fibrosis transmembrane conductance regulator(CFTR)型の塩素イオンチャネルの遺伝子変異によるものである。また、水素イオンと塩素イオンの共輸送の欠損はアポトーシスの引き金にもなる。このように、生体膜を通してのアニオン輸送は様々な病理に関与しており、それを人為的にコントロールするような合成アニオン輸送分子を開発することが急務となっている。この課題に取り組むため、何種類かのtriaryldipyrrole型オリゴマーを、新たに開発された2,5-dialylpyrrole誘導体の合成手法を応用することによって、合成した。Sonogashira反応を含むこの合成ルートにより、重要なキー分子である非対称型の2,5-diarylpyrrole誘導体の合成が容易になされることがわかった。現在、合成されたいくつかのtriaryldipyrrole型オリゴマーへの様々な(生体機能にとって重要な)アニオンの結合挙動をUV/Visスペクトルおよび^1H-NMR法によって検討している。初期的な結果であるが、塩素イオンと炭酸水素イオンの結合挙動に優位な選択性が得られており、今後のバイオ応用および臨床応用への適用がきたいされている。さらに、得られたデータをもとに、構造のデザインの再検討や新しい合成アニオン輸送分子を合成することにより、さらなる結合定数の向上および選択性の改善を図るつもりである。研究期間がまだ短いため成果の評価は時期尚早と考えるが、おおむね良好に進行していると判断することができる。合成アニオン輸送分子が困難を極めたが、その後のアニオンの選択結合実験が非常にうまくいき、全体として順調な進展が得られている。特に大きな問題はなく、研究計画どおりに研究を進める。その一方で、計画以外の思わぬ収穫が得られることも期待したい。

化合物の合成開発という困難なステップを乗り切ったため、これからは非常に順調な研究がなされることが期待できる。JSPS期間を終えても新たなポストで研究を継続する容易を積極的に進める必要がある。JSPSフェローは交流のある研究室に就職し、研究交流が続いている。共同研究として本研究を継続している。
オニヤブソテツ有性生殖型における高自殖性進化の集団ゲノミクス解析

オニヤブソテツの二倍体有性生殖型は、北方型のヒメオニヤブソテツ(以下ヒメオニ)と南方型のムニンオニヤブソテツ(以下ムニン)の二亜種に分類される。ヒメオニの集団間には、配偶体の性表現に関してS-type(造精器と造卵器の分離形成型)と、M-type(造精器と造卵器の同時形成型)という多型が存在する。本研究ではヒメオニ7集団のマイクロサテライト解析を行い、1)佐渡の1集団を除き、中間的な自殖性(FIS: 0.200.79)を示す事、また2)自殖適応と推定されるM-type集団(FIS: 0.63)の方が、S-type集団(FIS: 0.21)より自殖性が高い事、そして3)ABC法で推定された有効な集団サイズもM-type集団(169-328)が、S-type集団(465-846)の半分以下である事を明らかにした。ゲノムワイドSNPsの解析では、佐渡のヒメオニは、遺伝的にはムニンに近く、佐渡を除くヒメオニ集団が単系統となると判明した。従って、S-typeで他殖性の祖先集団(ムニン)から、高頻度に自殖を行う系統(ヒメオニ)が派生的に進化したと想定される。EBSP等の解析では、ヒメオニにおいて最終氷期に明確なボトルネックが検出され、自殖の進化との関連が示唆された。S-typeのムニンとM-typeのヒメオニの人工F1雑種の配偶体を分離集団として、RAD-seqおよびMIG-seqによって得られたSNPsを用いて連鎖地図を作製した。結果として、521SNPマーカーを用い、42個の連鎖群から構成される連鎖地図を作製した。マーカー間平均距離は3.7 cMであった。分離集団におけるS-typeとM-typeの性表現分離データを用いてQTLマッピングを試みたが、有意な相関は検出できなかった。従って、この二亜種間の性表現は比較的多数の遺伝子座で支配されていると考えられる。松本(2003)は、オニヤブソテツの2倍体有性生殖型を、北方型のヒメオニヤブソテツと南方型のムニンオニヤブソテツに分類している。ヒメオニヤブソテツ内には、配偶体の性表現型(Separate (S) -type, Mix (M) -type)の変異が存在する。新規に開発した8遺伝子座のマイクロサテライトマーカーによる解析の結果、ヒメオニヤブソテツのS-type集団(伊豆、佐渡)と、M-type集団(北海道、和歌山)は、それぞれ近交係数(F)が0.208と0.626となった。これは、性表現型に対応した自殖率の集団間分化が存在することを示している。また、低自殖性のS-type集団と高自殖性のM-type集団の間では、遺伝的多様性や有効な集団サイズに関しても有意な違いが存在した。この結果について投稿中である。次に、次世代シーケンサーを用いたRad-seqによりSNPの検出を行い、オニヤブソテツの2倍体有性生殖型の集団間の遺伝的関係を解析した。約8000個のSNPを用いたRAxMLによる個体単位の系統樹では、ヒメオニヤブソテツのうち佐渡集団は、他のヒメオニヤブソテツ集団と大きく離れ、むしろムニンオニヤブソテツに近い事が示された。これは、佐渡だけが他殖性(F = -0.1)であった事実と符合する。和歌山・伊豆・北海道のヒメオニヤブソテツは明確なクラスターを形成した。これらの集団は、中間的な自殖率を持つ混合交配集団である事や、配偶体単離実験により、近交弱勢が非常に低い事が特徴である。この結果については、学会発表を行った。ヒメオニヤブソテツとムニンオニヤブソテツの遺伝的関係については、計画では核遺伝子の塩基配列決定により行う予定であったが、Rad-seqによるSNP解析に切り替えた。その結果、大きな進展があり、他殖性のムニンオニヤブソテツから混合交配型のヒメオニヤブソテツが派生してきた事が示唆された。今後、Approximate Bayesian Computation(ABC)により、この分岐イベントの年代や、分岐時にボトルネックイベントがあったかどうかを解析していく。初期の第一目標である、配偶体の性表現型の分離を利用した、自殖遺伝子の連鎖地図へのマッピングについては、実行が遅れている。これは、配偶体の生殖器の観察方法と時期について試行錯誤を行ったためである。培養中に培地から取り出し、形態観察を行うと、傷が出来た場合に形態が異常になる。これを考慮し、新たな実験計画を立てる。オニヤブソテツの2倍体有性生殖細胞型は、北方型のヒメオニヤブソテツ(以下ヒメオニ)と南方型のムニンオニヤブソテツ(以下ムニンオニ)に区別できる。北方型のヒメオニは、配偶体上での生殖器(造精器と造卵器)の形成の仕方(性表現)に集団間変異がある。他殖に適応した性表現のS-type(造精器と造卵器の分離形成型)と、自殖に適応したM-type(造精器と造卵器の同時形成型)である。一方、南方型のムニンオニは他殖に適応したS-typeに固定している。このオニヤブソテツ2倍体有性生殖集団が、同型胞子シダ植物における、交配様式の進化のモデル実験系として最適であると考え、多方面からアプローチを行っている。

マイクロサテライトを用いて、ヒメオニのS-type集団とM-type集団の交配様式を調べたところ、共に中間的な近交係数を示すが、M-type集団(FIS=0.626)の方が、S-type集団(FIS=0.208)より自殖率が高い事が示唆された。配偶体での性表現型の違いが野外集団の自殖率に反映していることを示した最初の事例であり、論文化した(Imai et al. 2016.PLoS ONE 11(10): e0163683).RAD-seqによって得たSNPデータの解析からは、ヒメオニでは約2万年前に、顕著なボトルネックを経験したと示唆された。高自殖性の進化に歴史的なボトルネックイベントが関与した可能性があり、興味深い。この結果は投稿準備中である。S-typeのヒメオニ個体とM-typeのムニンオニ個体のF1雑種を用いた連鎖地図の作成と、性表現決定遺伝子の地図へのマッピングについても進行中である。RAD-seqによって予備的に連鎖地図の作成を行ったが、1:1に分離する579個のSNPを42個の連鎖群に配置できる事を確かめた。野外での交配様式の変異のマイクロサテライト解析および、集団間の系統解析は出版および論文作成中であり順調である。しかし、ヒメ×ムニンの雑種個体の配偶体の性表現型の認識方法について、試行錯誤を行ったため、性表現型の連鎖地図へのマッピングの作業が遅れている。連鎖地図作製のためのマーカーとしてRAD-seqによるSNPsが妥当かどうか検討を行った。その結果、約1万個のコンティグが得られ、エラーを除いた結果1183個のSNPが残った。1:1の分離比から有意にずれていない者を残し、最終的に579 SNPsを42個の連鎖群に配置することが出来た。全連鎖群の総長は2475cMとなった。これは、729個のマーカー(368RFLP, 358AFLP, 3Allozyme)を使ったミズワラビの連鎖地図(2179cM)にほぼ規模が匹敵し(Nakazato et al. 2006)、RAD-seqによって極めて簡便に連鎖地図が作成可能であると判明した。松本(2003)では、ヒメ×ムニンの雑種個体から得た配偶体集団においては、S-typeの配偶体とM-typeの配偶体が1:1に分離すると述べている。最終的に松本(2003)にほぼ等しい手法で培養を行い、デジタルマイクロスコープで115個体の配偶体を観察した結果、S-typeが51個体、M-typeが64個体となり、再現性を確かめることが出来た。今後、この分離集団を材料に、連鎖地図を作成し、性表現型のマッピングを行う予定である。オニヤブソテツの2倍体有性生殖細胞型は、北方型のヒメオニヤブソテツ(以下ヒメ)と南方型のムニンオニヤブソテツ(以下ムニン)に区別できる。北方型のヒメは、配偶体上での生殖器(造精器と造卵器)の形成の仕方(性表現)に集団間変異がある。他殖に適応したS-type(造精器と造卵器の分離形成型)と、自殖に適応したM-type(造精器と造卵器の同時形成型)である。一方、ムニンは他殖に適応したS-typeに固定している。このオニヤブソテツ2倍体有性生殖集団を同型胞子シダ植物における交配様式の進化のモデル実験系としてとらえ、多方面からアプローチを行っている。マイクロサテライト解析により、ヒメオニのS-type集団とM-type集団の交配様式を調べた結果、共に中間的な近交係数を示すが、M-type集団(FIS=0.626)の方が、S-type集団(FIS=0.208)より自殖率が高い事が示唆された。
悪性脳腫瘍の根治を目指したCAR-T細胞とがん治療用ウイルスの併用療法

標準治療では根治が目指せない悪性脳腫瘍に対して免疫療法の一つであるCAR-T細胞療法が注目されている。既存のCAR-Tにおける、正常細胞への傷害性を示す可能性や固形癌に対して腫瘍内までT細胞が効率よく到達できないという問題点を克服する必要がある。そのため癌細胞と同様な抗原が正常細胞に存在する場合も、癌細胞の抗原のみを認識する癌特異的モノクローナル抗体を基としたCARーT細胞を作成する。その有効性及び安全性をマウスモデルにおいて検証する。また、既に臨床実績のあるがん治療用ウイルスと併用することによって、ウイルス感染がTリンパ球を引き寄せるため、CAR-Tとの相乗効果が得られる可能性が高い。
曲率効果に起因する心筋細胞でのラセン波形成機構

培養した心筋細胞を用い、特に障害領域を興奮波が通過する際の挙動について、実験ならびに理論の面から検討した。伝播の様式は細胞の興奮性に大きく依存し、興奮波の不安定化による自発的な端点形成も確認された。また、光感受性物質を混在させておくことによって外部からの光照射によって細胞活動を可逆的に制御したり、微細繊維を用いることで配向性の高い細胞培養手法を確立したりすることを可能とした。興奮性媒体において伝播する興奮波は、鋭角となっている非興奮領域の周辺や、狭い興奮領域を通過する際、正の曲率が大きくなりすぎるために伝播ができなくなる場合がある。この現象は様々な興奮系で知られており、実際の心臓でのラセン波形成機構の一つと考えられている。このことから、モデルとしての培養心筋細胞系において、興奮波が伝播できない阻害領域を意図的に作り、その領域を通過する興奮波の形状や不安定性について、実験ならびに理論の両面から議論する。当該年度においては、培養細胞に対し、「ゲート状」となるよう、細胞の存在しない領域を部分的に作った。主としてゲート間距離を変えることによる興奮波の通過の成否を始めとし、ゲート周辺での興奮波の形状変化やゲート内外での引き込み挙動などについて調べた。興奮波は、自発的な発生の他、電気刺激によって誘起させた。ゲート部分を通過する興奮波の挙動は、ゲートの幅が80ミクロン程度以下では興奮波はゲートを通過できずに消滅し、150ミクロンを越えるとゲートに到達した興奮波がそのまま通過した。この間の領域では、複数回に一回の割合でゲートを通過するという挙動について確認することができた。また、細胞興奮を抑制するナトリウムチャンネル阻害剤や、興奮後の不応期を長く保つカリウムチャンネル阻害剤を用いるなどし、細胞の興奮性を変えた場合についても同様に検討した。この結果、ナトリウムチャンネルを阻害した場合で興奮波のパターンが顕著に変化するなど、基礎的なデータを収集することができた。これらの実験結果を基に、興奮性を示す最も簡単な反応拡散方程式の一つとしてのFitzHugh-Nagumoを用い、実際のスケールを踏まえた上で各イオンチャンネル挙動を考慮して数値計算を行い、実験結果を定性的に説明できた。当該年度においては、主として、新しい伝播阻害領域の作成方法の開発、ならびに、細胞膜電位の測定による機構の解明を行った。これまでは、培養細胞群の興奮性を部分的に抑制するために、培養細胞プレートに傷をつけるなどして、細胞の存在しない領域を部分的に作ってきた。この場合、細胞の活動を不可逆的に停止させてしまうという欠点があった。この問題を回避するため、光感受性の物質を混在させておき、照射する光の波長に応じて可逆的に細胞活動を制御する手法を開発した。この方法においては、光の照射領域や照射強度に応じて細胞活動を可逆的に制御できることが可能であり、従って実験条件を自由に変えることができる。また、前年度に得られた、ナトリウムチャンネルやカリウムチャンネルの阻害剤を添加した場合について、ホールセルクランプ法によって、細胞膜電位の変化を調べた。数値計算においては、これまでと同様、興奮性を示す最も簡単な反応拡散方程式の一つとしてのFitzHugh-Nagumoを用い、実験結果を定量的に議論する準備を進めた。当該年度においては、従来通りの培養細胞に損傷を与えて阻害領域をつくる方法に加え、前年度に見出した、心筋細胞活動の光制御系についてさらに研究を進めた。培養細胞において、作成したギャップ幅に応じた、興奮波のギャップの通過あるいはギャップ部位での停止について実験的に明らかにした。また、ギャップ前後での興奮波の引き込みについても明らかにすると同時に、鋭角に旋回する際に興奮波に端点が生じてラセン波が形成することを実験的に明らかにした。これらの結果は、数値計算によって、定量的な議論を行っている。また、光感受性物質を混在させることによる細胞の興奮性の制御については、照射する光の形状をプロジェクターを用いて任意に変え、この照射パターンに応じて興奮波の阻害や端点形成が可能であることを明らかにした。

さらに、これまでと同様、ホールセルクランプ法による膜電位の測定を続けており、活動阻害領域での心筋細胞の状態についても検討を進めている。今年度においては、心臓組織損傷モデルとして、培養細胞層に対して人為的に物理的な損傷を与えて「ゲート」を作成し、そのゲートの幅と、そこを通過する興奮波の通過の様子について調べた。特に、細胞の興奮性調整するため、不整脈治療でも用いられるいくつかの薬剤を混入し、「ゲート」近辺の興奮波の挙動を蛍光顕微鏡によって可視化して調べた。興奮波がゲートを通過するか遮断されるかはゲートの幅に依存し、幅が広い場合には興奮波はゲートを問題なく通過するが、ゲート幅が狭くなると興奮波が完全にブロックされた。ここで特徴的な事は、このような「通過」と「遮断」の中間の領域において、興奮波が通過と遮断とを交互に繰り返す「2:1モード」が起こることを見出し、そのような特殊な状態が生じる領域を決定した。また、同じ通過幅であっても、添加した薬剤の種類とその濃度によって、興奮波のゲート通過の特性が変化することも明らかにした。さらに、ゲート周辺の興奮波の挙動は、興奮波を発生させるために与えた刺激の周期にも大きく依存することも明らかにした。一般に、不整脈や細動が生じている時、興奮波は通常よりも早い周期で発生し伝播していくことから、興奮波の不安定性を議論する基礎データとなる。この結果に関して、細胞の興奮性を取り入れた反応拡散方程式を用いて数値計算を行い、実験結果を再現できることを示した。これらの結果を、論文ならびに学会において発表した。研究内容的には,申請書に記載した計画に沿って順調に進展していると考えている。理論的な面において興奮性阻害領域近傍での不安定性についての解析がやや遅れているが、光感受性物質を用いた興奮性の可逆的制御手法の新規開発に成功するなど、申請時には想定できなかった新しい展開もあった。この手法によって、実験と理論との比較が行ないやすくなるため、今後は理論的な観点からの研究も大きく進展すると考えられる。従って、全体として「おおむね順調」とした。24年度が最終年度であるため、記入しない。実験においては、個々の細胞、あるいは、細胞集団での特定領域の興奮性を光で制御する実験系の開発を中心に据え、理論については、その阻害領域周辺で生じる興奮波の不安定性について解析を進める。膜電位測定も同時に行っており、各イオンチャンネル特性や、実際のスケールを基にした、より現実的な興奮波について解析を進めていきたい。特に細胞の光制御系に関しては、新規研究テーマとしての発展性についても検討していく予定である。
経皮的冠動脈形成術後の細胞増殖とその抑制に関する組織細胞化学的検討

[目的]前年度まで,経皮的冠動脈形成術後,冠動脈ステント植え込み術後の細胞増殖の病理組織学的特徴を検討してきたが,今年度は,ステント植え込み術後の細胞増殖の抑制効果を抗血小板薬(シロスタゾール)を用いて検討した。[方法]去勢雄性ブタの冠動脈前下行技にバルーン傷害を加え,その14日後に同部位にPalmatz-Schatzステントを植え込んだ。シロスタゾール群にはシロスタゾールを30mg/kg/dayを経口投与した。ステント植え込み28日後にステント植え込み部位を採取した。冠動脈をステントを含めて薄切し,光顕,電顕観察し,各々内腔,内膜,中膜,外膜,%stenosisを形態計測した。[結果]シロスタゾール群は対照群と比較し,内腔面積は有意に大きく%stenosisは有意に小さかった。[総括]抗血小板薬(シロスタゾール)は,冠動脈ステント植え込み術後の再狭窄抑制に有効である可能性が示唆された。その機序は,初期の血栓形成を抑制することにより,血栓からの様々なサイトカインの分泌を抑制することによると推測された。[今後の展望]前年度までの検討で,経皮的冠動脈形成術後,冠動脈ステント植え込み術後の内膜増殖部に一致してプロテインキナーゼC(PKC)活性が認められ、PKCが内膜増殖のシグナル伝達系に関与していると考えられた。そこで,今後は,特異的PKC inhibitorをdrug delivery balloonにより局所投与することにより、再狭窄の防止ができるかどうかを検討する。(目的)経皮的冠動脈形成術(PTCA)は、虚血性心疾患では確立された治療であるが、その高い再狭窄率(40%)は臨床上未解決の問題である。PTCA後の血管内腔肥厚は、中膜平滑筋細胞(VSMC)の内膜への遊走と、その過剰増殖が主な原因であるが、そのメカニズムは、多種の増殖因子により刺激が伝わり、プロテインキナーゼ(PKC)が活性化され、その結果細胞内の遺伝子発現を引き起こすことによると考えられている。そこで、ブタ冠動脈にPTCAあるいはPTCAに加えステントを植え込み、その再狭窄形態の違いを検討するとともに、PKCの内膜増殖に対する関与を中心に検討する。(結果)1.PTCA施行群では、外膜増殖が認められ、PTCA後14日が最大であった.2.PTCA施行群では、新生内膜は、7日から14日目に収縮型平滑筋が合成型に、28日目には再び収縮型に形質交換していた.3.PTCA施行群では、内膜増殖部に一致してPKC免疫反応が認められ、western blotでもPKC活性が証明された.4.ステント植え込み群では、外膜増殖はほとんどみられなかった.5.ステント植え込み群では、内腔側に収縮型平滑筋細胞、中膜側に合成型平滑筋細胞が主に認められた。6.ステント植え込み群では、ステント周囲にマクロファージと伴に好酸球の浸潤が認められた.7.ステント植え込み群では、内膜増殖部に一致してPKC免疫反応が認められ、western blotでもPKC活性が証明された.(総括)1.PTCA施行群、ステント植え込み群のいずれにおいても内膜増殖部に一致してPKC活性が認められ、PKCが内膜増殖のシグナル伝達系に関与していると考えられた。2.ステント植え込み群では、PTCA施行群と再狭窄形態に違いがみられ、その増殖には異物反応の関与も推測された。
短波長コヒーレント放射光発生のためのRF電子銃・アルファ電磁石最適化コード開発

短波長コヒーレント放射光を得るために必要な短い電子バンチを発生する方法の研究を計算機シミュレーションを用いて行なった。電子銃、RF加速空洞、アルファ電磁石及びスリット配置を最適化するのためのシミュレーションコードならびにコヒーレント放射光のスペクトルを計算するコードを開発した。このコードを用いた電子ビームのバンチング・シミュレーションおよび阪大産研のLバンドライナックを用いた実験により、短バンチ化の過程で、電子ビーム自身のウェーク場が電子ビームのエネルギースペクトルに影響を与えるという知見を得た。この問題点を解決するために、RF電子銃とアルファ電磁石の組合わせの替わりに、通常の熱陰極型電子銃とRFチョッパー・アルファ電磁石の組合わせたシステムを用いるという手法を考えた。この方法を用いることにより、ウェーク場と加速電場の勾配が打ち消しあうように、バンチの形状を制御することが可能であることを示した。また、このシステムを多段に用いることにより、段階的にバンチ圧縮と加速を行うことができることを示した。その結果、従来の加速器よりも短いバンチ長で、なおかつエネルギー広がりも1桁以上小さい良質のビームが得られることわかった。また、コヒーレント放射光のスペクトルを計算するコードは、長波側で問題となる受光角の補正や金属ダクト等の導体境界による抑止効果も計算できるようになっており、従来よりもより実際の実験条件に近いコヒーレント放射光のスペクトルが計算可能になった。
染色体DNA標的部位のin vivo配列改変技術

研究代表者の以前の研究により、一塩基置換変異の修復(TGA配列のTCA配列への修復)においては、一本鎖DNAの3'-末端付近にオリゴヌクレオチドをアニールさせて作製した5'-tailed duplex、一本鎖DNAの5'-末端付近にオリゴヌクレオチドをアニールさせて作製した3'-tailed duplex、及び、一本鎖DNAの3種を比較した場合、5'-tailed duplex>3'-tailed duplex>一本鎖DNAの順に効率が高いことが明らかにされている。そこで、tailed duplexesの一塩基挿入変異や一塩基欠失変異の修復効率を培養細胞を用いて調べた。標的遺伝子は、一塩基フレームシフト変異を有するHyg-EGFP(ハイグロマイシン耐性遺伝子とEGFP遺伝子の融合遺伝子)遺伝子を用いた(TCGA、TA配列のTCA配列への修復)。その結果、tailed duplexesは挿入変異・欠失変異を修復できること、及び、tailed duplexesの方が一本鎖DNAよりも両変異の修復効率が高い傾向にあることを明らかとした。しかし、一塩基フレームシフト変異の修復効率は一塩基置換変異の修復効率の数十分の一であった。また、5'-tailed duplexと3'-tailed duplexの序列については、明らかではなかった。1.改良型td DNAの作製:申請者の以前の研究により、一本鎖DNAにアニールさせるオリゴヌクレオチドとして、DNA20merよりも糖部修飾核酸ENAオリゴマー(20mer)が優れていること、DNAオリゴマーの場合には配列変換効率は鎖長に依存することが明らかにされていた。そこで、20merのENAオリゴマー2本を隣接して一本鎖DNAにアニールするように設計し、培養細胞を用いて配列変換効率を調べた。しかし、配列変換効率に顕著な上昇は観察されなかった。また、一本鎖DNA部の3'-末端をエキソヌクレアーゼから保護するためにループを形成させたDNAオリゴマーをアニーリングさせると、配列変換効率が向上することが明らかにされていた。そこで、ループを形成するDNAオリゴマー(30mer)とDNAまたはENAオリゴマー(20mer)をアニーリングさせ、培養細胞を用いて配列変換効率を調べた。rpsL遺伝子が染色体DNAに組み込まれているマウス細胞を作製し、この細胞に浸透圧法及びエレクトロポレーション法により、様々なモル比でRAD51又はRAD52蛋白質とtd DNAを共導入して配列変換効率を測定した。しかし、配列変換が観察されなかった。さらに、RAD51/RAD52蛋白質の両者とtd DNAを共導入した場合も同様の結果であった。
個人差・多要因・効果量を重視した応用科学独自の研究法：教育領域における活用

実践領域への応用が可能な科学的知見を得るには、個人差と多変量を重視した応用科学独自の研究方法を構築する必要がある。本研究者らは、アウトカムを予測可能な“包括的媒介変数"を指標として、各個人が、それぞれの能力発揮に適した状態にコンディションを自己調整する個性対応型“身心の自己調整システム"を開発した。今回は、青少年を対象とした5つの研究を行い、このシステムの教育領域での活用の有効性を確認するとともに、新たな応用科学的研究の実施方法を具体的に示した。研究代表者らは、各個人が自分の身心の状態をモニタリングし、軽運動や自律訓練法などの身体技法を活用して、目的とする課題の遂行に適した状態に自己調整する「個性対応型“身心の自己調整システム"(2009年特許取得:第4378455号)」を開発し、これまでスポーツ領域でのパフォーマンス発揮を中心に、その有効性を検証してきた。本研究は、このシステムの教育領域における活用を可能にするため、認知課題及び学習課題の遂行成績の向上に関して、青少年を適用対象としてその有効性を検証することを目的とした。本年度は、まず、心身の状態を調整する方法の有効性を確認するため、各種の軽運動や音楽及びリラクセーション技法の心理的効果の特徴を、二次元気分尺度を用いて比較検討した。次に、大学生を対象として、起床時や疲労時に動的運動(アクティベーション)および自律訓練法(リラクセーション)を実施することによって心理状態が調整され、数的処理・注意力測定課題の遂行成績が上昇することを確認した。さらに、小・中学生を対象として、各児童・生徒が姿勢を調整することによって、心理・生理状態(心理的活性度及び交感神経活動)の活性度が高まり、その活性度の変化に応じて計算課題及び聞き取り課題の遂行成績が向上することを確認した。スポーツの競技成績に限らず、勉強や仕事の課題成績や作業能率など、多様なアウトカムに対して「身心の自己調整システム」の活用が有効であることが確認されれば、スポーツや教育現場だけでなく教育・産業・保健・福祉などの幅広い領域において、有益な成果をもたらすことが期待できる。本研究の目的は、個人差に応じたコンディションの自己調整によって学習課題や運動のパフォーマンス向上を目指す「個性対応型“身心の自己調整システム"(特許第4378455号)」の学校教育領域における活用を可能にするため、児童や生徒を対象としてその有効性を検討することと、実践現場におけるアウトカムの向上に役立つ新たな応用科学的研究の方法論を、実際の研究の遂行を通して具体的に提示することであった。リラクセーション技法とアクティベーション技法による心理状態の調整と学習成績の向上効果を検証した、昨年度の基礎的研究の成果(研究1・2・3)に基づき、本年度は、小学生(研究4)および高校生(研究5)を対象とした介入研究を実施した。研究4では、小学6年生を対象に、サッカーボールのキック力を競うテスト場面において、各児童が高いパフォーマンスを発揮する際の心理状態を二次元気分尺度(坂入・他,2009)を用いて確認し、個人差に応じて自己調整するために適した動作や呼吸の方法を選択して実施し、その有効性を検討した。結果として、動作や呼吸法を実施することで、テスト場面の心理状態を各自のパフォーマンス発揮に適した状態に自己調整できることが確認された。研究5では、高校生弓道部員を対象に、各生徒にとって最適な弓道パフォーマンス前の心理状態を二次元気分尺度を用いて測定した。最適心理状態の個人差が大きかったので、アクティベーションが必要な選手には運動を中心とした技法を、リラクセーションが必要な選手には筋弛緩を中心とした技法を指導して3ヶ月間実施した結果、各生徒の心理状態がパフォーマンス発揮に適した状態に近づくとともに、練習時のチーム的中率が統計的に有意に上昇した。以上の研究成果を踏まえ、個人差を重視した新たな応用科学的研究の方法論に関して、日本理論心理学会など複数の学会において講演を行い、研究成果を発信した。本研究の目的は、これまでスポーツ領域で活用されてきた「身心の自己調整システム」の有効性を教育領域への適用に関して検証することと、それらの研究の推進を通して応用科学独自の新たな研究方法を提示することである。研究計画では、今年度は大学生を対象に研究を推進し、児童生徒を対象とした研究は次年度に実施する予定であったが、すでに小中学生を対象とした研究を実施しており、その点では当初の計画以上に進展している。しかし、応用科学のための新たな研究方法の提案の基礎となる包括的媒介変数(心理状態)によるパフォーマンス(課題成績)の変動の個人別予測については、十分に進展しているとは言えない状態にある。そのため、全体的な評価としておおむね順調に進展していると判断した。心理学軽運動やリラクセーション技法を活用した身心の状態の自己調整が、青少年の心理状態を課題に適した快適な状態にし、認知課題や学習課題の遂行成績を向上させることが、全体的な効果として確認できている。

しかし、この効果を最大化するためには、二次元気分尺度を用いて測定される心理状態を包括的媒介変数としてパフォーマンスの変動を予測し、各個人の特性や状態に応じた柔軟な自己調整技法の活用を可能にする必要がある。今後は、各課題の遂行に適した心理状態のエリアを個人ごとに明らかにした上で、包括的媒介変数を指標として適した自己調整技法を選択実施できる状況での研究を推進する。研究の遂行に際して、心理指標・生理指標・行動指標を用いた測定を実施する予定であったが、生理・行動指標に関しては包括的媒介変数としての活用が不十分だったため、初年度は心理指標を中心に活用して研究を実施し、次年度の課題とした。そのため、生理・行動測定に関連する消耗品やデータ分析等にかかる費用について未使用額が生じた。次年度の研究の遂行に際して、初年度に実施が不十分だった生理・行動測定指標を活用するので、それらの測定に必要な消耗品やデータ分析等にかかる費用として使用する。
リボソームRNA前駆体のプロセシング制御と核小体ストレス応答をつなぐ分子機構

高等真核生物におけるリボソーム構築の異常は、核小体ストレス応答を誘導し、p53経路を経て細胞増殖の抑制へと至る。しかし、これらの過程を結ぶ分子機構については、不明な点が多く残されている。申請者らは、シャペロン様AAA-ATPase NVL2の制御下において、MTR4-Exosome複合体(RNAヘリカーゼとエキソヌクレアーゼよりなる)が、rRNA前駆体のプロセシングに機能することを明らかにしたした。この複合体を基質RNAへとリクルートするアダプターとして、酵母ではNop53が見出された。またヒト細胞では、核小体ストレス応答を制御するがん制御因子PICT1がこれに対応する分子であると考えられた。本研究では、MTR4-Exosome複合体とPICT1の相互作用に着目し、rRNAプロセシングの異常と核小体ストレス応答を結ぶ品質管理機構について、これらの因子が果たす役割の解明を目的とした。まず、MTR4-Exosome複合体、PICT1およびNVL2の分子間相互作用を解析するために、ヒト細胞を用いて、各因子をノックダウウンし、共免疫沈降により各分子間の結合を解析した。その結果、PICT1はMTR4との結合を介してRRP6を含む核エキソソームと結合していることが示された。また、酵母Nop53においてMtr4との結合に重要なアミノ酸配列(AIMモチーフ)がPICT1でも保存されていたことから、これらに変異を導入し、MTR4との結合を解析した。その結果、PICT1においても、AIMモチーフがMTR4との結合に重要な役割を果たしていることが示された。MTR4、核エキソソーム、PICT1、NVL2の相互作用について、ヒト細胞を用いた免疫沈降により確認することができた。また、PICT1への部位特異的アミノ酸置換の導入により、それらの結合の性質について確認することができた。以上のことより、本研究は当初の計画に沿って、概ね順調に進行しているといえる。リボソーム生合成におけるPICT1の機能を中心に解析を進める。また、MTR4-Exosome複合体が、リボソーム前駆体粒子の成熟過程において、特定の段階で適切にリクルートされるために、PICT1が果たすアダプター機能についてさらに検証を行う。まずPICT1をノックダウンし、rRNA前駆体のプロセシングにおける機能について、パルス-チェイス法およびノーザンブロッティングにより検討する。また、これまでの研究で作成した変異型PICT1を発現させ、ドミナントネガティブ変異体としての働きを検証する。さらに、PICT1を構成因子に含むリボソーム前駆体粒子を、ショ糖密度勾配遠心および共免疫沈降の併用により特異的に分離し、質量分析により構成成分を明らかにする。さらに、核小体ストレス応答におけるNVL2およびMTR4-Exosome複合体の機能解析を行う。PICT1の発現低下は、ユビキチンリガーゼMDM2とリボソームタンパク質との結合を促進させ、p53の安定化を導くとされている。この核小体ストレス応答において、NVL2およびMTR4-Exosome複合体の関与を、各因子のノックダウンにより検討する。核小体ストレス応答は、MDM2とリボソームタンパク質の結合を測るレポーターシステム、またはウエスタンブロッティングによるp53の検出により検討する。また、プロテオーム解析で新たに見いだしたPICT1結合タンパク質についても、ノックダウンを通して同様の解析を行い、この経路にかかわる新たな核小体ストレス応答の制御因子を明らかにする。

また、MTR4-Exosome複合体が、リボソーム前駆体粒子の成熟過程において、特定の段階で適切にリクルートされるために、PICT1が果たすアダプター機能についてさらに検証を行う。まずPICT1をノックダウンし、rRNA前駆体のプロセシングにおける機能について、パルス-チェイス法およびノーザンブロッティングにより検討する。また、これまでの研究で作成した変異型PICT1を発現させ、ドミナントネガティブ変異体としての働きを検証する。さらに、PICT1を構成因子に含むリボソーム前駆体粒子を、ショ糖密度勾配遠心および共免疫沈降の併用により特異的に分離し、質量分析により構成成分を明らかにする。さらに、核小体ストレス応答におけるNVL2およびMTR4-Exosome複合体の機能解析を行う。PICT1の発現低下は、ユビキチンリガーゼMDM2とリボソームタンパク質との結合を促進させ、p53の安定化を導くとされている。この核小体ストレス応答において、NVL2およびMTR4-Exosome複合体の関与を、各因子のノックダウンにより検討する。核小体ストレス応答は、MDM2とリボソームタンパク質の結合を測るレポーターシステム、またはウエスタンブロッティングによるp53の検出により検討する。また、プロテオーム解析で新たに見いだしたPICT1結合タンパク質についても、ノックダウンを通して同様の解析を行い、この経路にかかわる新たな核小体ストレス応答の制御因子を明らかにする。研究用試薬の使用を節減できたため、その分の費用を次年度の試薬購入に充てることとした。