hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
グラフの構造的特徴と効率の良い並列アルゴリズムに関する研究

本年度は,以下に示すネットワーク上におけるデータ収集問題を考えた.ネットワーク上において,各サイトはデータを持っており,その各データをすべてある一つのサイトに収集する必要がある.データ受信を行っているサイトは並列に送られてくるデータを同時に収集可能であるが,そのデータ収集を行っているサイトは同時にデータ送信はできない.この条件のもと,各サイトの持つデータをある一つのサイトに最小何時間でデータ収集可能であるか?本年度の研究ではまず最初に,このデータ収集時間が,グラフ理論での最小節点ランキング全域木問題を用いて定式化できることを示した.最小節点ランキング全域木問題とは,既に知られている最小節点ランキング問題を拡張した問題である.最小節点ランキングとは以下のように定義される.まず最初に準備として,グラフGのt-節点ランキングを定義する必要がある.写像r : V→{1,2,...,t}で,v≠wの節点ランキングがr(v)=r(w)ならば,vとwを結ぶいかなる路上にもr(x)>r(v)であるような節点xが必ず存在する.r(v)の値を節点vのランク,または,ラベルと呼ぶ.Gのt-節点ランキングの中で,節点の最大ランクtが最も小さくなるようなランキングをグラフGの最小節点ランキングといい,_X(G)で表す.最小節点ランキング問題とは,与えられたグラフGの最小節点ランキング_X(G)を求める問題である.更に,最小節点ランキング全域木問題とは,グラフGにおいて,節点ランキングが最小となる全域木Tを求める問題である.本研究ではグラフを区間グラフというクラスに着目し,区間グラフの構造的特徴を捉え,区間グラフ上における最小節点ランキング全域木問題を解く多項式時間アルゴリズムを示した.また,提案した多項式逐次アルゴリズムは動的計画法を用いており,このアルゴリズムを基に容易に効率の良い並列アルゴリズムが構築可能であることを示した.本年度は,路問題の一つである辺ランキング問題に取り組んだ.辺ランキング問題とは以下のような問題である.グラフG上で各辺e∈Eに対し,ランキングφ(e)を与える.ただし,それぞれランキングが等しい2つの辺a, b∈Eにおいて,aからbへのいかなる路上でも必ずφ(a)<φ(c)であるような辺cが存在しなければならない.このような条件のもと,各辺に与える最小ランキングを求める問題を辺ランキング問題という.この問題は,並列計算におけるプロセス実行のスケジューリング問題,VLSIデザインなどに適用でき,幅広い応用がある.しかし,一般のグラフでは,辺ランキング問題はNP困難であることが証明されており,効率の良い算法は存在しないと考えられる.そのため,グラフの形状に制限をおいて,多項式時間で解くアルゴリズムが種々開発されている.そこで,本年度の研究では,辺ランキング問題を多項式時間で解くことが可能なグラフのクラスを究明することを目的とし,外平面グラフ上での辺ランキング問題を解くアルゴリズムの開発に取り組んだ.外平面グラフ上では,まず,グラフをいくつかの部分グラフに分割し,各部分グラフでの解を得て,それらの部分結果を統合することで全体の解が求ることを明らかにした.つまり,動的計画法の考えで解を得ることが可能であることを解明した.更に,この考え方を基に外平面グラフ上での辺ランキング問題を解く多項式時間アルゴリズムを開発した.これらをまとめ,タイトル「An algorithm for finding edge-rankings on outerplanar graphs」で現在雑誌投稿中である.また,外平面グラフ上では,グラフ構造,および,グラフ特徴を利用することにより,数多くの問題で効率の良い並列アルゴリズムが開発可能であること,および,その技法について著書「アルゴリズム工学」の中で述べた.本年度は,以下に示すネットワーク上におけるデータ収集問題を考えた.ネットワーク上において,各サイトはデータを持っており,その各データをすべてある一つのサイトに収集する必要がある.データ受信を行っているサイトは並列に送られてくるデータを同時に収集可能であるが,そのデータ収集を行っているサイトは同時にデータ送信はできない.この条件のもと,各サイトの持つデータをある一つのサイトに最小何時間でデータ収集可能であるか?本年度の研究ではまず最初に,このデータ収集時間が,グラフ理論での最小節点ランキング全域木問題を用いて定式化できることを示した.最小節点ランキング全域木問題とは,既に知られている最小節点ランキング問題を拡張した問題である.最小節点ランキングとは以下のように定義される.まず最初に準備として,グラフGのt-節点ランキングを定義する必要がある.写像r : V→{1,2,...,t}で,v≠wの節点ランキングがr(v)=r(w)ならば,vとwを結ぶいかなる路上にもr(x)>r(v)であるような節点xが必ず存在する.r(v)の値を節点vのランク,または,ラベルと呼ぶ.Gのt-節点ランキングの中で,節点の最大ランクtが最も小さくなるようなランキングをグラフGの最小節点ランキングといい,_X(G)で表す.最小節点ランキング問題とは,与えられたグラフGの最小節点ランキング_X(G)を求める問題である.更に,最小節点ランキング全域木問題とは,グラフGにおいて,節点ランキングが最小となる全域木Tを求める問題である.本研究ではグラフを区間グラフというクラスに着目し,区間グラフの構造的特徴を捉え,区間グラフ上における最小節点ランキング全域木問題を解く多項式時間アルゴリズムを示した.また,提案した多項式逐次アルゴリズムは動的計画法を用いており,このアルゴリズムを基に容易に効率の良い並列アルゴリズムが構築可能であることを示した.
口腔癌の持つ接着分子と産生されるサイトカインによる浸潤能の昂進と転移に関する研究

1.マウス可移植性腫瘍細胞の中で、肝臓への遠隔転移能を有する腫瘍細胞:RL♂1を用いて、以下の転移抑制実験を行った。菌体成分であるLPS(Lipopolysaccharide)は、その投与によって、肝臓においてIL-1,IL-6,IL-12,TNF-αなどのサイトカインの産生が誘導されることが知られているが、腫瘍細胞接種の24時間前にLPSを腹腔内投与し、2週間後、肝転移形成を非投与群と比較した。非投与群は、著明な肝転移を形成し、正常な肝臓と比較して、その重量は4倍であるのに対し、LPS投与群は、若干の転移巣は認めたものの、その重量は正常な肝臓の1.18倍と、有意に肝転移を抑制した。また、LPSの代わりにIL-1,TNF-αを同時に投与したところ、肝転移の抑制は全く認められなかった。以上のことから、IL-1,TNF-α以外のサイトカインが関与しているのか、あるいはサイトカイン以外のファクターによるものなのか、現在検討中である。2.当病院を受診した口腔癌患者の組織を一部採取し、免疫組織学的にCD44の発現とその患者の予後について比較、検討した。採取された13症例(昨年報告した7症例を含む)の内、5症例は強陽性、4症例は弱陽性、4症例は陰性であった。13症例の内、4症例に遠隔転移を認めた。転移部位はいずれも所属頸部リンパ節で、3症例はCD44強陽性例、1症例はCD44の弱陽性例であった。現在のところ、CD44陽性例においてリンパ節転移が高頻度に認められているが、原発部位、治療内容(放射線療法、化学療法を行ったもの、外科治療法のみのもの)が症例によって異なるため、それらの要因も含めて追跡していく予定である。
微小環境物質の起源解明にむけた極微量多元素自動化学分離技術の開発

極微量環境試料中の多元素を同時に分離することが可能な技術を確立することを目的とし、陰イオン交換分離法を用いた逐次分離法の最適条件を確立すると共に、全自動化学分離システムを構築した。得られた最適分離条件を用いて模擬環境試料を分離・定量分析を行い、開発した技術の性能を評価した。その結果、目的元素を6時間以内に回収率95%以上で完全に逐次分離することが出来た。この分離技術を用いることで500μg(粒径にして数μm)以上の微小試料が分析できる。本研究の目的は、極微量でも簡単な操作で多元素同時化学分離が可能な分離技術を確立することである。特に環境を汚染する大気浮遊じん等の環境物質の放出起源を解明する手段として有効な鉛、ウラン、トリウム、希土類元素に注目し、正確な定量・同位体比分析に供する試料を調製できる分離法を開発する。これにより今まで熟練した技術が必要であった煩雑な極微量化学分離処理を簡略化することができ、極微量分析技術の向上の面で学術分野に直接貢献できる。研究代表者がこれまでの研究によって開発した陰イオン交換樹脂を用いた逐次分離法を本目的に合うように小型化・自動化し、実試料を分離・分析して開発した技術の実用性を評価するまでを目標とする。本年度(22年度)は研究計画に基づき、簡単な分離システムを組み立ててイオン交換樹脂の粒径、カラムサイズ、流速などイオン交換分離条件を最適化した。濃度既知のICP-MS用校正溶液を試料として用い、既存のICP-MSで分離した溶液の元素濃度を分析することにより回収率や各元素の分離度を評価した。また、分離条件の最適化と併行して圧縮空気と切換バルブを用いた分離システムを構築するため、機器制御ソフトウェアを購入した。今までの研究成果から得られている溶離液組成の条件を基に、カラム容量が200300μLの小さなカラムを自作し、カラム樹脂の粒径や流速などの条件を変えて回収率や分解能を調べた。粒径および流速を小さくするにしたがって分解能は向上したが、分離にかかる時間が大幅に増加した。検討した研究成果は、日本放射化学討論会および微量分析技術に関する国際会議(ISEAC)で発表し、研究者に広く公開した。本研究では、環境を汚染する大気浮遊じん等の環境物質の放出起源を解明する手段として有効な複数の元素の定量・同位体比分析が極微量でも可能となる多元素同時化学分離技術を確立することである。しかも誰でも簡単に操作できる分離技術を目指す。分離・分析対象とする元素は鉛、ウラン、トリウム、希土類元素である。研究代表者がこれまでの研究によって開発した陰イオン交換樹脂を用いた逐次分離法を本目的に合うように小型化・自動化し、実試料を分離・分析して開発した技術の実用性を評価するまでを目的とする。本年度(23年度)は研究計画に基づき、窒素加圧式のテフロン製全自動化学分離システムを構築した。また、システムを制御するためのソフトウェアを独自に開発した。窒素ガスで系内を加圧して溶離液を流すこの分離システムで、ICP-MS校正溶液中の目的元素が正常に逐次分離されること、分離システムのソフトウェアが正常に動作することを確認した。更にイオン交換樹脂の粒径やカラムサイズ、流量などの分離条件を変えて回収率や分離性能の最適化を図った。分離条件の中で、イオン交換樹脂を細粒にすることが分離性能の向上には最も効果的であり、トリウムの溶離に対しては1.2cm/min.の線速度がこのシステムでは最適であった。検討した研究成果は、京都大学原子炉実験所専門研究会および第3回放射化学に関する国際会議(3rdINCC)で発表し、研究者に広く公開した。本年度(24年度)は前述した目的を達成するため、元素濃度の推奨値が明確な環境試料について本システムで分離し、ICP-MSで元素分析を行った。目的元素を6時間以内に回収率95%以上で完全に逐次分離することが出来た。500μgの試料(ウラン量にして0.8ng)以上の試料を正確に分析することが出来た。試料の分解から分析まで一連の操作で外部から混入するウランのブランク量は38pgであった。実試料の分析結果から評価すると、このシステムを用いることでμmサイズの粒子を分離分析することが可能である。

開発した全自動化学分離システムの概要、本法の特徴および有効性、その応用分析結果について、得られた結果をとりまとめ、「第8回原子力ならびに放射化学に関する国際会議(NRC8)」で発表し、研究者に広く公開した。交付申請書に記載したとおり、研究の目的に則して全自動化学分離システムの構築や分離条件の検討などが進展している。24年度が最終年度であるため、記入しない。当初の研究計画に則して、構築した全自動化学分離システムを用いて環境試料の極微量分離・分析を行い、本システムの特徴及び有効性を明らかにする。得られた結果を取りまとめて国内外の学会において研究発表を行う。
光熱変換免疫分析装置の試作研究-新たな簡易高感度汎用法の開発と実際分析への応用-

医学薬学をはじめ化学関連分野で重要な放射免疫分析法や酸素免疫分析法など従来法の免疫分析法の性能は限界にあると言われて久しく、原理的に新しい免疫分析法が切望されている。我々は光熱変換分光法と新たな抗原抗体反応系を用いた独自の光熱変換免疫分析法(PIA)を創案し、血清でpgレベルの分析に成功し、従来法より1桁以上感度にも優れることを示した。しかし、夾雑物との分離に多大な時間を要し、実用的には課題が残る。本研究では、我々独自の反応系を新たな着想のもとに発展させ、分離系を極力簡単にしてより高感度で実用的なPIAを開発し、臨床試料や法医学的実試料へ適用証することを目的とする。本法は、化学的にも光にも安定でかつ抗体の活性を奪わない金超微粒子をラベルとして標識抗体を試作し、表面を免疫化学的に修飾したポリスチレン微粒子を抗原抗体反応固相、光熱変換分光法を検出法とする。ポリスチレン微粒子を血清などに加えて分析目的の抗原を吸着させ、さらに標識抗体を加えてポリスチレン微粒子上に吸着した抗原に結合させる。3年計画の第1年度では、この手法を活かし、高速高効率の分離と高感度測定を実現させるため、以下の装置を試作した。(1)分析対象の抗原抗体複合体を吸着している微粒子をキャピラリー電気泳動法を用いて蛋白などの夾雑物や未反応試薬から分析対象の抗原抗体反応体を数分程度で分離する装置を作成した。(2)分離体の高感度検出器として、我々が開発したレーザー誘起キャピラリー振動法を適用したシステムを製作した。(3)コンピュータ制御の微動ステージと光学系、信号処理装置を組み込んだPIAシステムを試作した。(4)免疫グロブリンを標準試料として、システムの性能を評価し、設計通りの性能を確認した。
へき地診療所に派遣される看護師に対する教育研修システム構築のための基礎的研究

へき地診療所に派遣される看護師対象の教育研修プログラムのコアとなる教育内容・支援内容を明らかにすることを目的とし、第13段階に分けた調査を計画している。第1段階である全国のへき地医療拠点病院からへき地診療所への看護師派遣の実態及び課題を明らかにするための調査を平成28年度に実施した。その調査結果の一部を、平成29年度に看護職派遣経験のない施設の看護管理者が認識するへき地の看護職派遣における課題として学会で報告した。第1段階における調査結果の全体を論文としてまとめている段階であり、学会誌投稿を予定している。この調査報告により、へき地医療に携わる看護職への支援体制を検討する資料となり、支援体制の構築に繋がるものと考える。また、第2段階の調査に向け、へき地診療所に派遣された看護師の派遣される上で必要と感じた教育内容や支援内容等を把握するための基礎調査として文献レビュー、関連学会に参加した。研究課題に関連した文献レビューでは、看護職がへき地診療所で実践している看護業務を調査した報告が少ないことや診療所内の看護業務に留まらず幅広く看護活動を実践していた。また、看護職の教育ニーズ関連のワークショップに参加し、参加者と今後の課題や対策について検討した。教育ニーズを把握や教育方法の工夫、大学教育からへき地と関連づけた教育内容の必要性など様々な視点から現状からニーズが見出された。現場を離れ教育を受けることが可能なシステムがない看護師にも看護師版のシステムを整えることの必要性と社会に向けて提言することが示された。現在、第2段階の調査への協力依頼、方法の検討等、準備段階である。研究以外の業務が重なり、第1段階の研究成果を学会誌で発表すること、第2段階の調査準備に時間を要しているものの、進行している。第2段階の調査対象者の選定段階である。本研究課題の目的を明らかにするため、第2段階でのへき地診療所に派遣された看護師の体験を通して、看護師が派遣される上で必要と感じた教育内容や支援内容等を把握するための面接調査を予定している。本研究課題採択時と状況が変わり、予定していたへき地に派遣される看護職を対象とした調査が難しい状況となった。しかし、へき地診療所で短期間ながら看護業務に従事した経験のある看護師や、へき地診療所に勤務して数ヶ月の看護師等に似た条件の看護師を対象にすることで調査可能と思われる。対象への依頼を行っている状況であり、今年度中に調査を実施していく予定である。その結果をもとに全国調査予定である。当研究は、3段階に分けた研究を実施していくことで、へき地診療所に派遣される看護師を対象とした教育研修プログラムのコアとなる教育内容および支援内容を明らかにすることを目的としている。今年度は、第1段階である全国のへき地医療拠点病院からへき地診療所へ派遣される看護師派遣の実態及び課題を見出すための準備を行った。基礎調査からへき地への看護支援の現状として、いくつかの都道府県がへき地の看護への取り組みを考えている、へき地の医療施設への出向や派遣を実践研修として取り組んでいる施設もあることなどが分かった。しかし、第11次へき地保健医療計画策定以降の全国的なへき地への看護支援としての看護師派遣の現状は明らかにならなかった。調査票作成は、当初は看護師派遣の実績があるへき地医療拠点病院のみを対象とした内容であったが、研究計画検討委員会の意見を得て、派遣実績がない施設の現状も明らかにするための質問項目を加え、修正した。H28年3月に、本学の倫理審査会にて研究計画の承認を得た。全国のへき地医療拠点病院を対象とした郵送調査法による実態調査を行えるよう郵送準備を行う。H28年6月には発送を終え、年度内にデータ分析の実施予定である。また、第2段階の実施に向け、へき地診療所に派遣された看護師が必要と感じた教育内容や支援内容等の把握するための調査準備を実施していく。へき地でのフィールド調査ができなかったが、第1段階の「全国のへき地医療拠点病院のへき地診療所への看護師派遣の実態および課題」に関する量的調査に向け、調査票作成は年度内に完成できた。本研究の目的は、3段階の研究によりへき地診療所へ派遣される看護師対象の教育研修プログラムのコアとなる教育内容・支援内容を明らかにすることである。第1段階として全国のへき地医療拠点病院に対し、へき地診療所への看護師派遣の実態及び課題を明らかにするための調査を実施した。全国のへき地医療拠点病院の看護部責任者等294人を対象に自記式調査票を郵送し、回収率は21.8%であった。SPSSで統計処理を行い、自由記載は、内容分析してカテゴリー化した。29.7%がへき地の看護職支援を行っており、支援内容は派遣と研修・相談であった。支援の役割と必要性については、それぞれ93.7%と93.8%が「ある」と回答した。また、17.2%が無床診療所に看護職を派遣しており、その内、派遣前研修(オリエンテーションを含む)は63.6%が実施していた。看護職派遣の課題には【人員不足等よる支援困難】【連携および支援体制の整備の難しさ】【へき地医療の情報・知識の少なさ】が挙げられた。

へき地医療拠点病院の看護管理者は、へき地に対する役割や支援の必要性を認識し、その支援に取り組む意思も示されたが、第11次へき地保健医療計画策定以降も看護職を派遣している施設が増えているとは言えず、医師派遣と比べ支援体制は十分でないことが示唆された。へき地の看護職派遣のシステム作りには,へき地医療拠点病院に勤務する看護職が常にへき地医療・看護と関わりを持つような働きかけが重要となる。国や行政が積極的に介入し,看護職派遣を見越した人員配置と,派遣を含めたへき地への支援をシステムとして整えていくことが重要である。第1段階の調査から多くのデータが得られ、分析・解釈および論文作成に時間がかかった。また、研究以外の業務が重なったことも、やや遅れを招いた。へき地診療所へ派遣される看護師対象の教育研修プログラムのコアとなる教育内容・支援内容を明らかにすることを目的とし、第13段階に分けた調査を計画している。第1段階である全国のへき地医療拠点病院からへき地診療所への看護師派遣の実態及び課題を明らかにするための調査を平成28年度に実施した。その調査結果の中から、看護職派遣経験のない施設の看護管理者が認識するへき地の看護職派遣における課題について学会で報告した。へき地の看護職の支援については、ほとんどの回答者がへき地医療拠点病院の役割や支援の必要性を認識し、支援に取り組む意志が示されていた。しかし、看護職派遣を実施している施設は2割に届かず、その背景には、派遣元となるへき地医療拠点病院の人員不足、へき地の情報が少なく、へき地のニーズを把握できないことにより、看護管理者の葛藤となっていることが推測された。へき地の看護職派遣のシステムづくりには、へき地医療拠点病院に勤務する看護職が常にへき地医療・看護と関わりを持つような働きかけが重要となる。そのためには国や行政による介入も必要と思われる。第1段階の調査結果については、今回の学会での発表で報告できていない結果も報告していく予定である。また、第2段階として、へき地診療所に派遣された看護師の派遣される上で必要と感じた教育内容や支援内容等が把握するための基礎調査を継続しながら、実施に向けた計画準備をはかっていく。研究以外の業務が重なり、第1段階の研究成果をまとめるのに時間を要している。また、第2段階に向けての準備が遅れている。へき地診療所に派遣される看護師対象の教育研修プログラムのコアとなる教育内容・支援内容を明らかにすることを目的とし、第13段階に分けた調査を計画している。その調査結果の一部を、平成29年度に看護職派遣経験のない施設の看護管理者が認識するへき地の看護職派遣における課題として学会で報告した。第1段階における調査結果の全体を論文としてまとめている段階であり、学会誌投稿を予定している。この調査報告により、へき地医療に携わる看護職への支援体制を検討する資料となり、支援体制の構築に繋がるものと考える。また、第2段階の調査に向け、へき地診療所に派遣された看護師の派遣される上で必要と感じた教育内容や支援内容等を把握するための基礎調査として文献レビュー、関連学会に参加した。研究課題に関連した文献レビューでは、看護職がへき地診療所で実践している看護業務を調査した報告が少ないことや診療所内の看護業務に留まらず幅広く看護活動を実践していた。また、看護職の教育ニーズ関連のワークショップに参加し、参加者と今後の課題や対策について検討した。
乳癌におけるリキッドバイオプシー法の開発と臨床応用への取り組み

Liquid biopsyの代表格であるcell-free DNA(以下cfDNA)から得られる遺伝子情報は、腫瘍全体から統合された結果を示していると考えられており、時々刻々と変化するがんの様子をいち早く知ることができる可能性を秘めている。Estrogen Receptor (以下ER)陽性乳癌で高頻度に認められるPIK3CA変異、及び、ER陽性再発乳癌における内分泌療法耐性化機序の一つとして注目されているESR1変異は、cfDNAにおいてもその存在が確認され,バイオマーカーとしての重要性が報告されてきている。我々は,ER陽性初発、再発乳癌症例を対象に、両変異を、当院で治療を行った術前内分泌療法施行の初発乳癌73例(133検体)および再発乳癌68例(118検体)で検討し、早期治療ラインではPIK3CA変異が、後期治療ラインではESR1変異が治療予測因子であることを見出し、その臨床学的重要性を明らかにした。また、乳癌組織におけるHER2(human epidermal growth factor receptor 2)の評価は、再発乳癌などでは転移病巣の組織採取が困難である場合もあり、初発検体のHER2判定に基づいて治療を決定する。しかし、再発治療時の遺伝子異常を治療に反映させるためには、Liquid biopsyが重要である。我々は、cfDNA中のHER2 Copy Number (CN) assayを試み、血清HER2蛋白測定結果と比較検討した。結果、HER2 CN assayでは血清HER2蛋白と比較して、腫瘍のHER2状況の評価や術前治療効果との関連が低いことが示唆された。この相違は内部コントロールの選択など、測定法に起因することも考えられるが、さらにHER2 CN高値例の長期予後との関連など別の臨床病理学的因子との関連を検討する必要がある。研究の目的は、“ER陽性乳癌患者の血液検体および組織検体から抽出された遺伝子を用いて、内分泌療法耐性化にかかわる遺伝子異常をmultigene assayやdigital PCR法を使用し、治療効果予測および治療効果モニタリングとしてのctDNAの臨床的意義を解明する"であった。我々は、ER陽性転移再発乳癌で内分泌療法耐性化にかかわる遺伝子異常として脚光を浴びているESR1変異およびPI3K/AKT経路の異常活性化を引き起こすPIK3CA変異の臨床的意義を、以下の様に論文にまとめた。ER陽性乳癌86症例185血液検体を対象とした研究において、ESR1変異、または、PIK3CA変異陽性症例群では、全内分泌療法投与期間が有意に短かった。治療経過中の遺伝子変異のモニタリングの意義を検討した研究では、治療経過中に64.2%の症例でESR1変異が陰性化し、それらの群は、ESR1変異陽性群より、全内分泌療法有効期間が有意に長かった。PIK3CA変異は、3例のみの陰性化であった(Oncotarget 2017)。また、ER陽性乳癌患者128症例251血漿検体を対象とし、PIK3CAおよびESR1変異の臨床学的意義を治療ライン別に検討した研究において、治療ラインが進むにつれ、PIK3CA変異およびESR1変異は23%から41.9%と頻度が増加した。さらに治療早期群と治療後期群に分け、後治療の治療成功期間(TTF)を検証した結果、治療早期群では、PIK3CA変異陽性症例は、TTFが有意に短縮し、治療後期群では、ESR1変異陽性症例は、TTFが有意に短縮した。AKT1変異は、初発、再発を通じて低発現であったため、その予後への影響は不明であった(Molecular Cancer 2018)。本研究は、上記変異の計測が治療戦略上重要な意義がある可能性を示した重要な研究である。治療内容が明らかとなっているER陽性再発乳癌患者の連続的に採取された血液検体から抽出された遺伝子を用いて、内分泌療法耐性化にかかわるESR1変異およびPIK3CA変異が、治療効果予測および治療効果モニタリングツールとして臨床的に重要であることを明らかにし、【研究実績の概要】で示したように、論文化することができた。また上記テーマを検証するにあたって、cfDNA中の核遺伝子変異は、治療薬や癌の進行具合によってその動態が異なるため、組織内とcfDNA中の遺伝子変異は必ずしも一致しないことや(Translational Oncology 2017)、ESR1変異の1つであるE380Qの頻度は日本人ではrareであることを明らかにし、論文化することができた(BMC Cancer 2017)。

また、乳癌組織におけるHER2(human epidermal growth factor receptor 2)の評価は、再発乳癌などでは転移病巣の組織採取が困難である場合もあり、初発検体のHER2判定に基づいて治療を決定する。しかし、再発治療時の遺伝子異常を治療に反映させるためには、Liquid biopsyが重要である。我々は、cfDNA中のHER2 Copy Number (CN) assayを試み、血清HER2蛋白測定結果と比較検討した。結果、HER2 CN assayでは血清HER2蛋白と比較して、腫瘍のHER2状況の評価や術前治療効果との関連が低いことが示唆された。この相違は内部コントロールの選択など、測定法に起因することも考えられるが、さらにHER2 CN高値例の長期予後との関連など別の臨床病理学的因子との関連を検討する必要がある。科研費申請時、内分泌療法耐性化に関わる遺伝子の有用性を前向きにかつ連続的に収集された検体で検証し、効果的な内分泌療法を行うための治療効果予測およびモニタリングツールを開発することを謳ったが、先日、第III相無作為化試験においてそれが検証され、論文発表された(Nature Communications 2018)。恐らくその他のphase III試験でも取り組まれ始めており、このまま少ない症例で検証してもimpactは少ないものと思われる。代替案として、組織とマッチした血液検体を用いて、まだ検証されていない標的遺伝子のamplificationの臨床学的意義を追求することとした。また標的遺伝子のamplificationとmutationの関係も不明であり、それらがどう内分泌耐性化に関わっていくかを明らかにすることは、先に示した計画以上に臨床学的意義を有する可能性がある。
免疫抑制剤による培養系骨粗鬆症モデルの開発と骨吸収メカニズムの分子生物学的解析

本研究では、免疫機能と骨粗鬆症の関係解明と培養細胞実験モデルの確立や骨粗鬆症原因遺伝子解析を明らかにすることを目的とした。骨代謝マーカーでの検討8週齢SD系雄性ラットに,実験群にはFK506(1mg/kg)を,対照群には生理食塩水を5週間連日腹腔内投与した。投与開始時,開始後1,3,5週後の血清および尿を経時的に採取し,Ca濃度,骨代謝マーカーとして血中オステオカルシン(BGP),ピリジノリン(PYD)とデオキシピリジノリン(Dpd)の和を測定し骨代謝の指標とした。また,骨吸収促進因子である血中PTH,TNFα,IL-6を測定した。FK506投与によって,血清Ca濃度は両群ともほぼ一定で正常範囲内を維持したが,尿中Ca濃度はFK投与群では有意な上昇が認められた。骨代謝マーカらのうち,血中BGP値はFK投与群において1週目に有意に増加したが以後減少し,対照群と差は認められなくなった。尿中PYDとDpd総和は投与期間中を通してFK投与群では有意な増加を示した。骨吸収促進因子のうち血中PTHは,FK投与群では対照群と比較し3週目以降,有意に増加した。破骨細胞分化系の確立7週齢雄性ICRマウスに実験群にはFK506を,対照群には生理食塩水を連日腹腔内投与した。投与1週間後に大腿骨を採取し、M-CSF,s-RANKLの添加により破骨細胞へと分化誘導した。破骨細胞数は、TRAP染色を行い,破骨細胞の吸収活性(pit assay)は象牙質片を入れて培養を行い,破貪食された面積を画像解析により計測することで吸収活性を評価した。FK506投与マウスの方が,破骨細胞の形成と吸収窩は対照群と比較し有意に増加した。microarrayによる遺伝子発現解析7週齢雄性ICRマウスに実験群にはFK506を,対照群には生理食塩水を連日腹腔内投与した。投与1週間後に大腿骨を採取し、実験群と対照群における骨髄内遺伝子発現の差異を,mouse development oligo microarrayによる20371個の遺伝子について発現解析を行い,FK506投与によりup regulatedあるいはdown regulatedされた遺伝子を検索し、遺伝子発現解析を行った。マイクロアレイ解析の結果、FK506を一週間連日投与することにより生じた骨髄内への影響について,対照群と比較し2倍以上の発現差が認められたのは、2487個の遺伝子であった。解析結果,免疫と骨に関連の深い遺伝子を認めた。平成15年度は、免疫機能と骨粗鬆症の関係を解明するためにヌードマウスを用いた骨粗鬆症原因遺伝子の検索を目的に研究を行った。

ヌードマウスとワイルドタイプのマウスに免疫抑制剤FK506を連日28日筋肉注射(1mg/kg)し骨粗鬆症モデルマウスを作製した。まず、3次元マイクロCTと組織切片にて観察した。その結果ワイルドタイプのマイクロCT画像観察では、コントロールとFK投与群に骨梁幅の変化はないが、FK投与群はコントロール群に比べて骨梁の数が減り、骨髄腔は広がっていた。骨質パラメーターはFK投与群では、BV/TV:50.44±0.90%、Tb.S:0.0522±0.053μm.コントロール群では、BV/TV:65.28±0.70%、Tb.S:0.0358±0.052μmでFK投与群に有意な骨梁減少による骨髄腔の広がりを認めた。組織切片による観察では、FK506による実験群の骨吸収はenchondral ossificationより下方でtrabecula boneの減少が認められた。しかし、ヌードマウスではenchondral ossificationより下方での骨吸収はほとんどなく、コントロールと変化がないことから、免疫抑制剤による骨粗鬆症は、T細胞が関係していることが示唆された。次に骨代謝マーカーでの検討を行った。投与開始後1,3,5週後の血清および尿を経時的に採取し,Ca濃度,骨代謝マーカーとして血中オステオカルシン(BGP),ピリジノリン(PYD)とデオキシピリジノリン(Dpd)を測定し骨代謝の指標とした。また,骨吸収促進因子である血中PTH, TNFα,IL-6を測定した。血清Ca濃度は両群ともほぼ一定で正常範囲内を維持したが,尿中Ca濃度はFK投与群では有意な上昇が認められた。骨代謝マーカーのうち,血中BGP値はFK投与群において1週目に有意に増加したが以後減少し,対照群と差は認められなくなった。尿中PYDとDpd総和は投与期間中を通してFK投与群では有意な増加を示した。骨吸収促進因子のうち血中PTHは,FK投与群では対照群と比較し3週目以降,有意に増加した。TNFα,IL-6は両群で有意な差は認められなかった。以上からFK506長期単独投与により高代謝回転型骨粗鬆症様症状が引き起こされることが確認された。投与後初期には骨形成,骨吸収はともに亢進し,以後の骨吸収亢進には全身的要因の一因としてPTHの関与が示唆された。平成16年度は、免疫と骨の関係および骨粗鬆症出現の原因追求への足がかりになることを目的に,その第一段階として,FK506投与骨粗鬆症マウスを用いて骨髄内関連遺伝子動態の解明を行うこととした。研究成果:実験群にはFK506を,対照群には生理食塩水を連日腹腔内投与した。投与1週間後に大腿骨を採取し、M-CSF, s-RANKLの添加により破骨細胞へと分化誘導した。破骨細胞数は、TRAP染色を行い,破骨細胞の吸収活性(pit assay)は象牙質片を入れて培養を行い,破貧食された面積を画像解析により計測することで吸収活性を評価した。FK506投与マウスの方が,破骨細胞の形成と吸収窩は対照群と比較し有意に増加した。次に実験群と対照群における骨髄内遺伝子発現の差異を,mouse development oligo microarrayによる20371個の遺伝子について発現解析を行い,FK506投与によりup regulatedあるいはdown regulatedされた遺伝子を検索し、遺伝子発現解析を行った。その結果,対照群と比較し2倍以上の発現差が認められたのは、2487個の遺伝子であった。
古い指紋の顕在化と経時変化メカニズムの解明

昨年度、可視ハイパースペクトルイメージャ(HSI)と365nm UV LEDを用いて2重指紋の可視化実験を行い、主成分分析を用いることで、従来の四則演算による手法より鮮明に分離できることを報告した。しかし、2重指紋のうち、最初に押捺された指紋(第一指紋)の重畳部分に関しては不鮮明な指紋しか得られていなかった。そこで本年度は、多変量解析法の一つである多変量波形分解法-繰返し最小二乗法(MCR-ALS)を適用したところ、第一指紋の重畳部分についても鮮明な指紋像を得ることができた。このことから、上書きされた指紋も検出可能であることが示唆された。この解析過程で得られたローディングベクトルは、原理的に指紋からの発光スぺクトルであると考えられることから、分離された指紋ごとのローディングを推定できれば、指紋成分の経時変化の仕方についての知見が得られると期待される。指紋を顕在化するときに532nmの高出力レーザーを励起光として用いて得られたハイパースぺクトルデータに対しても、MCR-ALSが適用できるようにプログラムの開発・最適化を行った。指紋の主成分であるアミノ酸の経時変化を調べるために、調製直後のものと調製後1年経過したものついて、LC-MSを用いて質量数の変化を調べた。その結果、トリプトファン等の一部のアミノ酸において、質量数が変化すること分かった。今後、変化した物質を明らかにするために追加実験を行う予定である。また、量子化学計算を行って時間経過に伴う試料の色の変化を説明できる根拠を検討する予定である。予定通り以下の実験を行った。以下に具体的な結果を示す。2重指紋の分離実験を行った。多変量解析法の一つである多変量波形分解法-繰返し最小二乗法(MCR-ALS)を適用したところ、従来よりも鮮明な指紋像を得ることができた。指紋の主成分であるアミノ酸の経時変化を調べ、時間が経つと他の物質に変化する場合があることが分かった。その時、アミド結合のみによる重合とは異なる反応経路の存在が示唆された。一部とはいえ、アミノ酸の変性過程が多様であることがわかり、量子化学計算における出発分子の選択を再検討することとした。昨年度に引き続き、様々な環境下での指紋の経時変化の測定、指紋成分分子の経時変化の計算機シミュレーション及びHSIによる指紋の分離を行う。それに加えて以下の実験を行う。1検出が困難な指紋の顕在化従来法で指紋検出が困難な素材として、モルタル、漆喰、レンガ、石などの多孔質物質がある。手を触れた直後は指紋成分が表面に留まっているため従来法でも検出できるが、ある程度時間が経過すると成分が染み込んでしまうため検出が困難であった。そこで、高出力グリーンレーザとHSIを用いて多孔質物質上の指紋の顕在化を行う。多孔質物質にレーザ光を照射すると、一部は空孔を通って試料内部に到達するため、染み込んだ成分も励起され発光すると考えられる。指紋を光及び温度条件を変化させ約一か月保存し、指紋の蛍光スペクトル測定を行った。283nm励起では350nm付近の蛍光が観られ時間経過と共に減少したが、365nm励起では450nm付近の蛍光が時間経過と共に増大した。両者の蛍光強度比の変化と保管環境との関係を調べた。暗条件よりも明条件、室温よりも高温の比率変化が大きくなり、劣化との関係性が分かり、指紋の印象時期推定のための一助となった。経時変化した指紋の可視化では、時間が経つほど指紋が鮮明になっていった。これを利用することで、古い指紋の可視化や初めは分離できなかった重畳指紋が時間とともに分離できる可能性があることを示した。可視HSIの検出器を、冷却CMOSから高感度冷却CCDに換装し、微弱光を検出できるように改良した。感度の向上に加えて計測時間を短縮することができた。可視HSIと365nm UV LEDを用いて2重指紋の分離を行った。これまでの結果と同様に減算及び除算でも分離することができたが、主成分分析を行ったところ、より鮮明に分離することができた。また、3重指紋について、主成分分析の一形態でありかつスペクトルの概念を保存する方法であるFARMSを適用して指紋の分離を試みた。3指紋として分離はできなかったが、少なくとも2つまでは、鑑識レベルで指紋データベースと照合可能であることが分かった。アミノ酸水溶液の経時変化による褐変現象について、三量体までの対象分子のエネルギー最安定構造を同定し、第一原理計算を用い吸収端を計算した。同種アミノ酸の脱水重縮合による単、二、三量体をモデルとした。残基に環状構造かつ=NHを持つものに対しては、それらとC-末端が脱水重縮合し長鎖化して多量体を形成すると仮定して計算した。その結果、吸収端が長波長化し、褐変現象の定性的機序として残基環状構造を介した多量体での電子の非局在化が考えられた。予定通り、様々な環境下での指紋の経時変化の測定及び可視化を行い、また重畳指紋の分離を行った。環境による指紋スペクトルの変化を測定した。365nm励起の場合、時間が経つほど指紋像が鮮明になっていき、古い指紋も可視化できる場合があることを示した。

統計的手法を用いて、HSIで撮影された重畳指紋をより鮮明に分離することができた。さらにFARMSを用いることで、3重指紋が少なくとも2つまで分離することができた。また、HSIのカメラを換装し、高感度化及び高速化を図った。アミノ酸の褐変現象について、第一原理計算を用いて計算し、吸収端が長波長化することと、褐変現象が残基環状構造を介した多量体での電子の非局在化によりもたらされることが示唆された。昨年度、可視ハイパースペクトルイメージャ(HSI)と365nm UV LEDを用いて2重指紋の可視化実験を行い、主成分分析を用いることで、従来の四則演算による手法より鮮明に分離できることを報告した。しかし、2重指紋のうち、最初に押捺された指紋(第一指紋)の重畳部分に関しては不鮮明な指紋しか得られていなかった。そこで本年度は、多変量解析法の一つである多変量波形分解法-繰返し最小二乗法(MCR-ALS)を適用したところ、第一指紋の重畳部分についても鮮明な指紋像を得ることができた。このことから、上書きされた指紋も検出可能であることが示唆された。この解析過程で得られたローディングベクトルは、原理的に指紋からの発光スぺクトルであると考えられることから、分離された指紋ごとのローディングを推定できれば、指紋成分の経時変化の仕方についての知見が得られると期待される。指紋を顕在化するときに532nmの高出力レーザーを励起光として用いて得られたハイパースぺクトルデータに対しても、MCR-ALSが適用できるようにプログラムの開発・最適化を行った。指紋の主成分であるアミノ酸の経時変化を調べるために、調製直後のものと調製後1年経過したものついて、LC-MSを用いて質量数の変化を調べた。その結果、トリプトファン等の一部のアミノ酸において、質量数が変化すること分かった。今後、変化した物質を明らかにするために追加実験を行う予定である。また、量子化学計算を行って時間経過に伴う試料の色の変化を説明できる根拠を検討する予定である。予定通り以下の実験を行った。以下に具体的な結果を示す。2重指紋の分離実験を行った。多変量解析法の一つである多変量波形分解法-繰返し最小二乗法(MCR-ALS)を適用したところ、従来よりも鮮明な指紋像を得ることができた。指紋の主成分であるアミノ酸の経時変化を調べ、時間が経つと他の物質に変化する場合があることが分かった。その時、アミド結合のみによる重合とは異なる反応経路の存在が示唆された。一部とはいえ、アミノ酸の変性過程が多様であることがわかり、量子化学計算における出発分子の選択を再検討することとした。昨年度に引き続き、様々な環境下での指紋の経時変化の測定及び指紋成分分子の経時変化の計算機シミュレーションを行う。それに加えて以下の実験を行う。1古い指紋の可視化科警研及び警察庁には過去に実験を行った試料が多数保管されており、少なくとも510年以上前のものも存在している。それらの試料をHSIを用いて顕在化を試みる。HSIは可視域における各波長ごとの画像を一度に取得できるため、古い指紋の成分のスペクトル情報を元に統計的な分析法を利用し顕在化を行う。2 HSIによる指紋の分離重なった指紋の蛍光スペクトルをHSIで計測し、多変量解析により単独の指紋を抽出する。個人由来の成分の違いを利用し異個体(別人)による違いを調べる。経時変化による成分の変性を利用し、不明指紋とフレッシュな指紋の違いを調べる。
生命科学への展開を目指した新世代人工複合糖質高分子の設計

プラスミド(pTRI-β-ACTIN-MOUSE, pQBI T7 sgGFP Vector)とラクトース誘導体とのコンジュゲート(糖導入率約10%)を合成した。このコンジュゲートはラクトース結合性レクチン(RCA_<120>)と複合体を形成することが、ゲルシフトアッセイおよび表面プラズモン共鳴(SPR)測定により確認され、その結合定数はラクトースあたりで2.47.5x10^5M^<-1>であった。β-actinプラスミド-ラクトースコンジュゲートのin vitro転写、およびsgGFPプラスミド-ラクトースコンジュゲートのin vitro遺伝子発現に対するRCA_<120>の添加効果を調べた。転写レベルを転写されるmRNAの電気泳動によるバンドの濃さとして観察した。RCA_<120>はnative plasmidの転写および発現に対してはほとんど影響を及ぼさないのに対し、コンジュゲートの転写・発現は制御することが分かった。次にこのレクチンによる転写・発現抑制系にシグナルとしてラクトースを加えることにより、転写・発現が誘導されるかどうかを検討した。ラクトースもしくはラクトース担持リポソーム、ラクトース担持ポリマー(PVLA, PNLac)を1mM-Lac加えることにより転写・発現がnative Plasmidの値近くまで誘導されることが分かった。抑制・誘導の過程におけるコンジュゲートとレクチンとの複合体構造をAFMおよびTEMにより詳しく観察したその結果、抑制条件においてコンジュゲートとレクチンとは複数分子同士の大きな複合体を形成していることが分かった。さらに、非抑制条件下では複合体構造が緩んでいる様子も観察された。このことからコンジュゲートとレクチンとが複雑な複合体を形成することで遺伝子発現は抑制され、ラクトースなどの添加によりその結合が緩和され、遺伝子発現が誘導されるということが考えられる。(1)糖鎖を導入したオリゴDNAを固相合成機械を駆使して合成した。明確な構造の糖鎖結合オリゴDNAを用いて、コンホメーション、融解挙動、ヌクレアーゼ耐性などの特性解析を行った。糖鎖によるレクチンの認識を蛍光スペクトル法により解析するとともに、半分ずらした相補DNAとのハイブリダイゼーションを利用すると認識機能がかなり高進することを明らかにした。(2)人工複合糖質高分子による糖鎖間相互作用の解析。糖鎖がクラスター状に高密度に配列している人工複合糖質高分子を用いると、糖鎖間相互作用が大幅に増幅して現れてくる。表面積-表面圧等温線および表面プラズモン共鳴(SPR)を用いて、より定量的な解析を進めた。糖脂質の糖鎖構造がほんのわずか変えるだけで、相互作用が大幅に変動することを明らかにし、Gg3三糖とGM3三糖との間の糖鎖間相互作用について考察した。(3)複雑な枝分かれ糖鎖を単純な糖鎖モジュールにいったん分解してから、共重合により再構築した。シアリルルイスx型4糖を、フコースと3-硫酸化ガラクトースの結合体および6-硫酸化GalNAcに分割し、それぞれのアノマー部分をアクリルアミド誘導体化してから共重合を行って、E-,L-,およびP-セレクチンとの結合機能を明らかにした。プラスミド(pTRI-β-ACTIN-MOUSE,pQBI T7 sgGFP Vector)とラクトース誘導体とのコンジュゲート(糖導入率約10%)を合成した。このコンジュゲートはラクトース結合性レクチン(RCA_<120>)と複合体を形成することが、ゲルシフトアッセイおよび表面プラズモン共鳴(SPR)測定により確認され、その結合定数はラクトースあたりで2.47.5×10^5M^<-1>であった。β-actinプラスミド-ラクトースコンジュゲートのin vitro

転写、およびsgGFPプラスミド-ラクトースコンジュゲートのin vitro遺伝子発現に対するRCA_<120>の添加効果を調べた。転写レベルを転写されるmRNAの電気泳動によるバンドの濃さとして観察した。RCA_<120>はnative plasmidの転写および発現に対してはほとんど影響を及ぼさないのに対し、コンジュゲートの転写・発現は抑制することが分かった。次にこのレクチンによる転写・発現抑制系にシグナルとしてラクトースを加えることにより、転写・発現が誘導されるかどうかを検討した。ラクトースもしくはラクトース担持リポソーム、ラクトース担持ポリマー(PVLA,PNLac)を1mM-Lac加えることにより転写・発現がnative plasmidの値近くまで誘導されることが分かった。抑制・誘導の過程におけるコンジュゲートとレクチンとの複合体構造をAFMおよびTEMにより詳しく観察した。その結果、抑制条件においてコンジュゲートとレクチンとは複数分子同士の大きな複合体を形成していることが分かった。さらに、非抑制条件下では複合体構造が緩んでいる様子も観察された。このことからコンジュゲートとレクチンとは複雑な複合体を形成することで遺伝子発現は抑制され、ラクトースなどの添加によりその結合が緩和され、遺伝子発現が誘導されるということが考えられる。
犬と猫の骨格筋由来因子マイオカインの分子構造と肥満に伴う変動の解析

イヌFibroblast growthfactor (FGF) 21の分子構造は他種と高い相同性を示し、調べた全ての臓器で発現していた。健常犬15頭における血中FGF21濃度は平均値0.21ng/mL(最大値0.011-1.1 ng/mL)で、雌雄差、年齢差、日内および日差変動、食事の影響は見られなかった。ビーグル犬を最大速度7 km/hで計10分間、2週間運動(2日間の休み)させたところ、大きな変動は認められなかった。臨床例で血中FGF21濃度を測定したところ、腫瘍、炎症、肝臓疾患群で有意に高値を示した。FGF21は、イヌにおける新たな臨床検査項目としての応用が期待される。イリシンは骨格筋から分泌される生理活性物質マイオカインの1つであり、膜貫通タンパク質(FNDC5)の一部が切り出され、血中に放出されたものである。運動刺激でFNDC5が増加すれば、白色脂肪細胞が褐色脂肪細胞(またはベージュ細胞)に変わり、UCP-1の発現が促進される。UCP-1はエネルギーの消費を増加させグルコース代謝を促進するため、体重減少効果や糖尿病治療への応用が期待されている。しかしイヌにおいてマイオカインについての研究報告は無く、イリシンの存在も明らかにされていない。本研究ではまず、イヌ骨格筋由来のcDNAを用いて逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)法でFNDC5を増幅し、解読した塩基配列をゲノムデータベース上のものと比較した。PCR産物を精製しデータベース上の配列と比較すると、FNDC5の塩基配列と一致していることが確認された。このことから、イヌにおいても骨格筋でFNDC5が発現しており、イリシンが分泌されていると推測された。得られたFNDC5塩基配列で他の動物種との相同性比較を行うと、食肉目において最大95%と相同性が高い傾向があり、系統的に近い種のFNDC5は相同性が高いことが確かめられた。次に、肺・肝臓・胃・十二指腸・空腸・回腸・大腸・腎臓・前頭葉・海馬・視床下部・脊髄・皮膚・脂肪・骨髄から抽出されたRNAを用いてRT-PCRを行い、組織別発現分布を解析した。その結果、皮膚以外の15の組織でバンドの発現が確認された。そのため、体内の様々な場所でFNDC5が発現し、イリシンが産生されている可能性が示唆された。ただし今回使用したプライマーはFNDC5を構成する異なるvariantsの共通範囲を指定しており、他の組織では骨格筋で発現するイリシンとは別の働きを持つものが発現している可能性も考えられた。イヌにおいてイリシンが存在し、少なくとも転写レベルで発現していることが確かめられた。イヌやネコはヒトとは代謝が異なるため、本研究はマイオカインがイヌの体内で産生されているかどうかも不明な所からの出発であった。しかし代表的なマイオカインであるイリシンが確認できたことによって、2年目以降の研究が予定通り継続できる見通しを立てることができた。また、骨格筋以外の多くの臓器でイリシンの発現が認められたことは予想外の結果であったが、これまで知られてきた以上にイリシンの生理的役割が幅広いことを示すデータととらえることもできる。いくつかのsplicing variantsの存在がゲノムデータベース上で知られているが、本研究では共通部分にプライマーを設計したため、これら全てを検出している可能性がある。各variantごとの機能の違いという方向性も今後視野に入れることが適切かも知れない。イリシンは骨格筋から分泌される生理活性物質マイオカインの一つであり、肥満・糖尿病治療への応用が期待されている。今回、市販のELISAキットのうち、Irisin (Human,Rat,Mouse)-ElISA Assay Kit (PHOENIX PHARMACEUTICALS,INC,USA)が犬の血中イリシン濃度を測定するのに有効であることが確かめられた。そこで、まず健常ビーグル犬20頭(雄10頭雌10頭、19歳)を使用して、健常犬における血中イリシン濃度の基準範囲を明らかにした。その結果、平均値は615.0 ng/ml、最大値は1599.8 ng/ml、最小値は339.2 ng/ml、反復切断法により決定した基準範囲は318.4777.6 ng/mlとなった。また、雌雄間においてP値は0.93であり有意差はみられなかった。次に、イリシンの日内変動について確認するため、3頭のビーグル犬(雄3頭、48歳)を前日17:30から絶食させ、試験当日の7,10,12,14,15,16、18,20時に頸静脈より採血して血中イリシン濃度を測定した。その結果、犬の血中イリシン濃度に日内変動は見られないことが確かめられた、即ち、運動その他の影響を調べる際に、実施時間等を限定する必要は無いと考えられた。最後に、これら3頭のビーグル犬に犬用トレッドミル(株式会社シエルジャパン、特注品)を用いて運動負荷をかけた際の反応を調べた。運動による血中グルコース濃度の急激な低下を考慮して本研究での運動開始時刻は食事を与えてから5時間半後と定め、運動強度は時速8 km/hで30分間とした。運動開始直前、直後、1、2時間後の計4ポイントで血中イリシン濃度を測定したところ、この条件で明確な変動は認められなかった。