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植物のオキシダテイブバーストと生体防御ネットワークの分子生理学的解明と応用

ジャガイモ疫病菌の感染に対するオキシダティブバースト(OXB)と防御応答ネットワークに関して次のことを解明した。1)感染防御応答の過程で即応答型の第1相のOXBと誘導応答型の第2相のOXBが発生し、それぞれが活性酸素生成NADPH酸化酵素のRbohAおよびRbohBに依存し、防御応答の発現誘導に決定的な役割を果たす。2)前者はCa^<2+>流入およびCDPKにより活性化し、後者はMAPKカスケードの制御下で発現し、生成したRbohBは第1相のOXBの発生と連動して活性化するリン酸化酵素により活性化される。3)MAPKKのMEKをアミノ酸置換により常時活性型にしたMEK^<DD>を一過的に発現すると、MAPKのSIPKおよびWIPKの活性化、RbohBの発現・誘導、OXBの発生およびHR型の防御応答が誘導される。4)活性化したMPK1は宿主のタンパク質(PPS18)をリン酸化し、その中のPPS3がRbohBおよびファイトアレキシン代謝系酵素の遺伝子(HMGRやPVS)の発現を誘導する。5)親和性レースの感染でもMAPKカスケードの活性化、RbohB、HMGRやPVSなどが発現し、PVS3プロモーター結合GUS遺伝子の形質転換ジャガイモは感染特異的にGUSを誘導する。6)第1相のOXBと共にNOが生成され防御応答に重要な役割を果たす。7)NO生成は誘導発現する硝酸還元酵素(NR)と他の未知NO生成系に依存する。8)局部的OXBは組織内部にCa^<2+>流入を伴う連鎖的細胞興奮を誘導し、これが伝達した組織表面で再びOXBが発生し、全身的獲得抵抗性(SAR)誘導の引き金となる。9)PVS3プロモーター結合MEK^<DD>で形質転換したジャガイモは、親和性疫病菌レースや夏疫病菌の感染に対してOXBを伴うHR型の防御応答を示し耐病性化する。植物の感染防御応答の始動と発現統御で重要な「オキシダティブバースト(OXB)の分子制御機構とそれに関連する動的生体防御系のネットワーク的解明をめざし、ジャガイモおよびベンサミアナタバコ植物を用いて、次の初年度の研究成果を挙げた。(1)植物組織は非親和性菌やエリシター(HWC)に応答し、常時発現性のStrbohA(NbrbohA)と誘導性のStrbohB(NbrbohB)に依存し二相性のOXBを起こるが、OXBとは無関係に遺伝子の発現とタンパク質生成は起こり、翻訳後に活性が制御されることを示唆した。(2)NbrbohAおよびNbrbohBの生成を、ウイルスベクターまたはAgrobacteriumを介したジーンサイレンシングで抑制した組織では、菌の接種またはHWC処理によるOXB、過敏感反応(HR)および抵抗性の発現が抑制された。(3)OXB系の活性化はリン酸化酵素により制御され、関連してrbohのN末端領域の二カ所をリン酸化する36kDaのリン酸化酵素を特定した。、(4)感染に応答し活性化される51kDaのタンパク質リン酸化酵素を純化・精製し、その諸性質からMAPK(StMPK)と同定した。(5)それを制御する上流のMAPKKのcDNA(StMEK)をクローニングし、その部位特異的塩基置換で常時発現型にしたStMEK^<DD>を発現させると、HR反応様応答が起こったが、予めrbohBをジーンサイレンシングした組織では起こらなかった。

(6)第1相のOXBが、全身獲得抵抗性の誘導起点となる全身的OXBを誘導するが、その情報伝達は全身シグナル発進因子の生成とその作用によるH^+-ATPasc依存のCa^<2+>インフラクスの細胞間の連鎖反応であった。(7)HR応答では、Ca^<2+>非依存性タンパク質リン酸化酵素に依存したNO生産性硝酸還元酵素遺伝子の発現が誘導され、連動しNO生成活性の増加を確認した。植物の感染防御応答の始動と発現を統御するオキシダティブバースト(OXB)を担う酵素のcDNAをジャガイモとNicotiana benthamianaタバコ植物からクローニングし、これを基盤にウイルス誘導性ジーンサイレンシング法(VIGS)によりOXBの発生が感染防御応答に決定的な役割をもつこと、また、感染誘導性のStrbohBおよびNbrbohBの発現制御は上流のMAPキナーゼカスケードが関与することを前年度に示唆したので、本年度はこの情報伝達系に関連し次のことを行った(1)MAPKK(NbMEK1)の活性化によりMAPK(NbMAP1)がリン酸化され,活性化されたNbMAP1によりリン酸化される8つのタンパク質を分離、cDNAをクローニングし、VIGSによりINF-1エリシター誘導性の過敏感反応誘導を抑制する3種のタンパク質を見出した。(2)NO生産酵素の一つである亜硝酸還元酵素の遺伝子NRをVIGSにかけて機能を解析し、NRは過敏感細胞死の発生に部分的に関与することを示した。(3)誘導性のStrbohBを親和性レースの感染でも発現を期待し、その菌の感染に伴って発現するVPS3のプロモーターをGUS遺伝子または常時活性型にアミノ酸を置換したStMEK1^<DD>に連結したキメラ遺伝子を構築し、それぞれをジャガイモにAgrobacteriumの感染を介して形質導入し、形質転換体を作出した。(4)前者では、VPS3プロモーターは親和性疫病菌レースの感染葉で発現し、傷などのストレスや根では発現しないことを確認した。(5)後者では、その親和性レースの感染で、OXBの発生ならびに過敏感反応様応答が起き、耐病性を示した。(6)宿主自身の内部遺伝子を組換え、おそらく全ての親和性レースの感染に対しても過敏感応答が発現すると思われるジャガイモ疫病菌耐性ジャガイモを世界で初めて作出した。植物の感染防御応答の始動と発現を統御するオキシダティブバースト(OXB)を担う酵素、rbohAおよびrbohBが感染防御応答に決定的な役割を持ち、それぞれ、常時発現型でCDPKによるリン酸化で活性化、およびMAPキナーゼカスケード下で遺伝子発現し、翻訳後のリン酸化制御により活性化されることを明らかにしてきた。さらにそのMAPキナーゼカスケードの下流ではファイトアレキシン(PA)代謝系の酵素遺伝子の発現誘導がかかり、非親和性レース感染特異的に翻訳後に活性が制御されることを明らかにしてきた。本年度の研究では、発現したrbohAおよびrbohBから合成された酵素は、原形質膜に局在化し機能すること、また、MAPキナーゼ(MAP1)を不活性化するタンパク質脱リン酸化酵素のcDNA(MAP1)をクローニングし、大腸菌で発現させたタンパク質脱リン酸化酵素(MP2C)の性質を解析し、これがMAP1を不活性化し、誘導抵抗性の発現制御に関与することを示した。
有機導電性繊維によるテキスタイルデバイス創成に関する研究

本研究は、機能性繊維を部品として用い接触・感覚・温感等の五感をセンシングできるテキスタイルデバイスの創成を目的とし、無機物を含まない有機導電性繊維および導電性繊維を使ったテキスタイルデバイスの開発を行った。繊維は一次元状の構造体であり、柔らかい・編織により二次元および三次元形状化が可能・風合い・違和感がないなどの特徴をもつ。繊維一本が機能をもち、様々な機能を持つ繊維からテキスタイルを作成し、人体に対して違和感ない多機能ソフトデバイスの創成が可能であることを示すことができた。本研究は、機能性繊維を部品として用い接触・感覚・温感等の五感をセンシングできるテキスタイルデバイスの創成を目的とし、導電性高分子の一種であるボリチオフェン誘導体の繊維化および得られた有機導電性繊維を用いたデバイス創製に関する研究を行った。これまでに問題となってきた導電性繊維の機械的強度を向上させるためのポリビニルアルコールとの複合紡糸を実施した。ポリビニルアルコールを混合したジメチルスルホキシド溶液を紡糸溶液として用いることにより、連続的かつ安定な紡糸が可能となった。さらに、得られる導電性繊維の機械的および導電性は、複合紡糸におけるポリビニルアルコールの分子量および混合比によって大きく具なることが明らかとなった。ポリビニルアルコールとの混合比の最適化を行ったことにより、導電性45S/cmおよび編織プロセスに展開できる有機導電性繊維を得ることができた。繊維の熱処理によって、湿度および温度に対する安定性が1大幅に向上し、実際のテキスタイルデバイスのデバイス再現性に目処をたてることができた。手織りでの導電性布帛の作製を行い、通電による加熱および感触センサとしての可能性を確認した。これらの成果をもとに、人体に対して違和感ない多機能ソフトデバイスについて次年度検討を進める。機能を持つ繊維・テキスタイル・制御の階層性が可能となれば、人体に最も近い部分で人体とコミュニケーションできるソフトインターフェースになり、QOL(Quality of Life)向上および身近な危険から守る安全・安心を得ることができるデバイスを創出することができる。本研究は、機能性繊維を部品として用い接触・感覚・温感等の五感をセンシングできるテキスタイルデバイスの創成を目的とする。繊維-本が機能をもち、様々な機能を持つ繊維からテキスタイルを作ることができれば、人体に対して違和感ない多機能ソフトデバイスを創ることができる。PEDOT/PSS溶液を用いた湿式紡糸において繊維特性を左右する紡糸原液の濃度(粘度)、凝固浴成分および温度について詳細に検討を行ったところ、これまでに市販のPEDOT/PSS水溶液から直径100マイクロメーター以上の繊維の紡糸に成功した。また、導電性も100S/cm程度であり、PEDOT/PSS本来の導電性を保ったまま繊維化することができた。繊維径の太い繊維を紡糸できたことから、手織りのテキスタイルを試作し二枚の布の接触による感触センサを試作した。このテキスタイルセンサは、接触による導通および加重変化による導電性の変化を示したことから感触センサとしての可能性を示すことができた。しかしながら、得られる繊維強度が低く機械による編織はできないため、繊維強度を高める紡糸プロセスが課題であったため、ポリビニルアルコールを混合した溶液を調製し湿式紡糸法によるPEDOT/PSSの繊維化を行った。導電性、繊維強度、繊維紡糸スピードの向上が得られ、様々プロセスに対応可能な有機導電性繊維を創出することができた。さらに導電性繊維の表面に有機半導体層をコーティングし、光電変換できる太陽電池繊維の試作も行った。
感音難聴の予防・治療戦略を指向した内耳薬理学研究

当該研究の目的は、1各種感音難聴モデル動物の作製、2感音難聴の発症メカニズムの解明、3感音難聴の予防薬及び治療薬のリード化合物の探索、4薬理学研究分野の中に「内耳薬理学研究」分野の確立を通して、最終的には感音難聴の薬物治療戦略の確立を目指すことであった。当該研究では、強大音響曝露によるの聴覚(音響外傷性難聴)の発症メカニズムに、蝸牛内の4-hydroxynonenalおよびperoxynitriteの過剰発現、mitogen-activated protein kinase(MAPK)の活性化を介したNa+-K+-ATPase活性やギャップ結合機能の低下、線維細胞障害が関与することを解明した。また、この難聴がラジカル消去薬、一酸化窒素合成酵素阻害薬、カルパイン阻害薬、p38MAPK阻害薬により抑制されることを見出した。また、他の難聴モデルとして慢性騒音暴露誘発性難聴モデル動物を作成し、その病態が老年性難聴に類似することを見出した。慢性騒音暴露誘発性難聴の発症には上記の音響外傷性難聴とは異なり、過剰酸化ストレスやカルパインの関与はみられず、蝸牛外側壁のギャップ結合の機能低下もみられなかった。この難聴モデルの発症には、シクロオキシゲナーゼおよび活性化マクロファージによる内有毛細胞と蝸牛神経の間のシナプスの減少が関与することが明らかとなった。また、このモデルの予防薬として、ファイトケミカルであるクルクミン、レスベラトロール、クロロゲン酸が有効であり、これらはすべて内有毛細胞ー蝸牛神経間シナプスの減少を抑制することが判明した。以上の結果は、老年性難聴と類似病態をもつ慢性騒音誘発性難聴の発症メカニズムの解明とその予防薬候補物質の発見であり、騒音性難聴や老年性難聴などの増悪性聴覚障害の予防薬の開発に大きく貢献するものである。感音難聴研究には有毛細胞保護作用を示す薬物が多数報告されているが、有効な治療薬の開発に至っていないのが現状である。本研究では蝸牛外側壁のイオン透過・輸送システムであるギャップ結合機能に注目し、新規難聴治療薬の開発の可能性について検討した。感音難聴の一つである強大音響曝露マウス(8 kHz octave band noise、110 dB、1時間、音響外傷性難聴動物)では、音響曝露直後から少なくとも7日後まで持続的な聴覚障害が引き起こされた。しかしながら、蝸牛有毛細胞死は曝露直後ではなく、曝露後2日以降に遅発性に起こることが判明した。このことより、有毛細胞死が聴覚障害の直接的要因ではないことが考えられることから、音響曝露初期段階の蝸牛内変化を解析した。音響曝露直後から蝸牛外側壁に脂質過酸化物4-ヒドロキシノネナール(4-HNE)付加タンパク質の増加、カルパインの活性化が認められ、続いて、外側壁のギャップ結合機能の低下、外側壁のギャップ結合構成タンパク質のコネキシンの減少がみられた。カルパイン阻害薬PD150606を内耳内投与したところ、強大音響曝露によるカルパインの活性化、ギャップ結合機能の低下および聴覚障害はいずれも改善された。次いで、蝸牛外側壁らせん靭帯線維細胞培養系のギャップ結合に対する4-HNEの影響を解析したところ、4-HNE曝露は、ギャップ結合機能の著明な低下、コネキシンの細胞内移行および分解、カルパインの活性化を引き起こし、これらの現象はいずれもPD150606により完全に消失した。以上の結果より、蝸牛外側壁障害が感音難聴治療のプライマリターゲットであり、カルパイン阻害薬が感音難聴の新規治療薬の候補となることが示唆される。当初の仮説である「カルパイン阻害薬の難聴治療効果」が音響外傷性難聴モデルで確認でき、順調に研究は進展している。さらに、強大音響外傷性難聴モデルに加えて、弱音の継続曝露による難聴(騒音性難聴)モデルの作成に成功して、その新規モデルにおいてもカルパイン阻害薬が有効であることも見出している。カルパイン阻害薬に加えて、クルクミンやクロロゲン酸が騒音性難聴に対して予防効果があることも見出している。以上のことから、本研究がおおむね順調に進展していると考える。感音難聴は、高齢者に最も高頻度に発症する身体障害の一つとされており、大部分が内耳蝸牛障害に由来する。原因不明の突発性難聴やメニエール病を除くと、環境騒音による内耳障害の蓄積による進行性の聴力悪化であり、自覚する頃には補聴器や人工内耳治療に頼らざるを得ない状況となることが少なくない。この現状を打開するためには感音難聴に対する予防薬の開発が強く望まれている。本研究では、騒音反復曝露による感音難聴モデル動物を用いて、不可逆的な聴力損失に対するクロロゲン酸の効果について検討した。5-6週齢BALB/cCr雌性マウスに、騒音刺激(8 kHz、90 dB)を1日1回、1時間曝露し、この曝露を5日間反復した。クロロゲン酸(10 mg/kg)は、初回騒音曝露の3日前より最終騒音曝露日まで1日1回、経口投与した。聴力は、聴性脳幹反応を用いて測定した。初回騒音曝露1日後に蝸牛を摘出し、固定後、Myosin7a、CtBP2およびGluA2の免疫染色により内有毛細胞ーらせん神経節細胞間シナプス数を解析した。騒音反復曝露は、曝露回数に依存して周波数12・20 kHzの聴力が悪化させた。

この聴力の悪化は、最終曝露後にも自然回復しなかった。クロロゲン酸(10 mg/kg)投与は、騒音反復曝露による聴力の悪化を有意に軽減させた。また、騒音曝露1日後では、内有毛細胞ーらせん神経節細胞間シナプス数が曝露前と比較して有意に減少したが、クロロゲン酸投与は騒音曝露誘発性のシナプス数の減少をほぼ完全に抑制した。以上の結果より、クロロゲン酸投与は、騒音曝露による不可逆的な聴力損失に対する聴力保護に有用であることが示唆される。また、本条件下で作製した騒音反復曝露による聴力低下メカニズムに、内有毛細胞ーらせん神経節細胞間シナプスの減少が少なくとも一部は関与することが推察される。上記のように、クロロゲン酸が騒音性難聴の予防に有効であることが明らかとなったことに加えて、カルパイン阻害薬、クルクミンやコンドロイチン硫酸も難聴予防に有効であることも明らかにしている。また、そのメカニズムについても有益なデータを得ており、今年度中に論文作成に着手する予定である。当該研究の目的は、1各種感音難聴モデル動物の作製、2感音難聴の発症メカニズムの解明、3感音難聴の予防薬及び治療薬のリード化合物の探索、4薬理学研究分野の中に「内耳薬理学研究」分野の確立を通して、最終的には感音難聴の薬物治療戦略の確立を目指すことであった。当該研究では、強大音響曝露によるの聴覚(音響外傷性難聴)の発症メカニズムに、蝸牛内の4-hydroxynonenalおよびperoxynitriteの過剰発現、mitogen-activated protein kinase(MAPK)の活性化を介したNa+-K+-ATPase活性やギャップ結合機能の低下、線維細胞障害が関与することを解明した。また、この難聴がラジカル消去薬、一酸化窒素合成酵素阻害薬、カルパイン阻害薬、p38MAPK阻害薬により抑制されることを見出した。また、他の難聴モデルとして慢性騒音暴露誘発性難聴モデル動物を作成し、その病態が老年性難聴に類似することを見出した。慢性騒音暴露誘発性難聴の発症には上記の音響外傷性難聴とは異なり、過剰酸化ストレスやカルパインの関与はみられず、蝸牛外側壁のギャップ結合の機能低下もみられなかった。この難聴モデルの発症には、シクロオキシゲナーゼおよび活性化マクロファージによる内有毛細胞と蝸牛神経の間のシナプスの減少が関与することが明らかとなった。また、このモデルの予防薬として、ファイトケミカルであるクルクミン、レスベラトロール、クロロゲン酸が有効であり、これらはすべて内有毛細胞ー蝸牛神経間シナプスの減少を抑制することが判明した。以上の結果は、老年性難聴と類似病態をもつ慢性騒音誘発性難聴の発症メカニズムの解明とその予防薬候補物質の発見であり、騒音性難聴や老年性難聴などの増悪性聴覚障害の予防薬の開発に大きく貢献するものである。本研究では、カルパイン阻害薬、クルクミン、クロロゲン酸などが難聴治療・予防作用があることが明らかになったので、今後はそのメカニズムの解明を進める予定である。また、新規難聴モデル(老年性難聴、薬剤性難聴など)を開発し、それらの難聴に対する効果も解析すべきであると考える。さらに、臨床研究へのアプローチも模索していきたい。クロロゲン酸、クルクミン、コンドロイチン硫酸、カルパイン阻害薬が騒音性難聴において予防効果を示すことが明らかとなり、そのメカニズムの探求を進めるとともに、老年性難聴に対する効果やそのメカニズムの解明を進める予定である。現在は、老年性難聴のモデル動物の作成に着手しており、ほぼ確立している。
子宮体癌細胞の増殖、進展における脂肪細胞の役割とその制御の解明

本年度は、子宮体癌細胞株(HEC-151およびHEC-265細胞)とラット由来脂肪組織片を用いたコラーゲンゲル3次元混合培養系を作成した。10日間の培養を行い、子宮体癌の増殖、浸潤、遊走能に関する検討を行った。【内容】皮膚培養に用いる2重皿培養法を改良し、子宮周囲脂肪組織層を脂肪組織片で再現するコラーゲンディスクを作製した。その上層に子宮体癌細胞を播種することで、三次元的な体癌組織を再構築した。加えて、子宮体癌細胞と脂肪組織をそれぞれ別々のコラーゲンディに包埋することで、腫瘍組織および脂肪組織ディスクを作製した。それぞれの組織discを一部で物理的に接着させ、細胞間の距離が及ぼす影響を解析した。結果、子宮体癌細胞単独培養と比較し、脂肪組織との3次元混合培養条件下では、BrdU labeling indexを用いた増殖能の評価において、体癌細胞の増殖能は有意に増加した。また、脂肪組織ディスクの表面に体癌細胞を播種した混合培養系では、脂肪組織内への浸潤が一部で観察された。【意義】臨床疫学的に、肥満と子宮体癌の悪性度には関連が示唆されているが、詳細は不明である。本研究では、in vitroで子宮体癌細胞への増殖促進作用を脂肪組織が持つ事が明らかとなった。興味深い事に、この増殖作用は脂肪組織と子宮体癌細胞との細胞間距離に依存しており、距離の拡大と共に効果の減弱が見られた。この知見より、サイトカインに依存するパラクライン作用の存在が示唆される。一定の結果は得られた。今回用いたモデルでは、体癌細胞の浸潤性を明瞭に再現出来ず、評価系の改良を必要とする。今年度は、初年度であり、試行錯誤の面もあったため、わずかながら次年度繰越が発生した。来年度以降は、実験系の改善を行いながら研究を進めていく予定である。
配線容易性志向フロアプラン手法の研究

VLSIチップのレイアウト設計工程は,VLSIの性能を最終的に決定する大切な工程である.そのうち困難な工程が,部品の座標を決定する配置工程と,それに続く部品間の電気的接続要求を実現する配線工程である。配線工程の質(総配線長,最長配線長等)がVLSIの最終性能に大きく影響するが、配線工程で出来上がるレイアウトの質は、配置工程の結果に大きく依存する。したがって、「配線しやすい配置」を得るフロアプラン手法の開発がこの研究の内容である。前年度はフロアプランの2部屋の隣接関係を区別して表現するデータ構造として、S-Sequenceを採用し研究を行ってきたが、本年度は、他大学の研究者から意見をいただき、S-Sequenceよりもコード効率が良く、直感的に分かりやすいフロアプランの表現手法をEQ-Sequenceを開発した。EQ-Sequenceは、表現できるフロアプランのクラスはS-Sequenceと同じであるにもかかわらず、コード長はS-Sequenceの60%程度で収まることが判った。またh、EQ-SequenceはS-Sequenceに比べ、2部屋の隣接関係の判定が若干複雑になってしまうが、コード効率が良いため、実用に耐えうると考える。数種類のベンチマーク回路を実際にフロアプランした結果、1から2分程度でフロアプランを得ることに成功した。また、実際に配線長を評価尺度として、取り入れてフロアプランしたところ、従来と同程度の品質のフロアプランを約10分の1の時間で得ることができた。本年度は、「配線で結ばれる部品をなるべく同じ直線に隣接(「配線資源隣接」と定義)するよう配置する手法の開発」をテーマに掲げた。こうすれば、部品間を一直線で配線することが可能なので、簡単に配線することができ、折れ曲がりの発生が抑えられる。フロアプランを表現するデータ構造として、S-Sequenceを採用し、任意の2つの部屋が配線資源隣接しているかどうかをS-Sequence上で速やかに判断する手法を開発し、配線資源隣接率を評価に入れ「配線しやすい配置」を探索する手法を開発した。本年度に得られた知見を以下に述べる。本年度に開発した手法を用いて、数種類のベンチマーク回路を実際にフロアプランした結果、1から2分程度でフロアプランを得ることに成功し、本研究の方向性の正しさを確認した。
眼内血管・瞳孔平滑筋に対する生理:薬理学的研究

平成11年度、白色家兎後毛様動脈の血管トーヌスは収縮に関与する交感神経、弛緩に関与する一酸化窒素(NO)を神経伝達物質とする2つの神経に支配されていること、さらにムスカリン受容体作用薬であり古典的緑内障治療薬であるピロカルピンは血管内皮依存的に同血管を拡張させ血流改善作用を持つことを報告した。本年度さらに最新の緑内障治療薬であるLatanoprost(prostaglandin=PGF2α誘導体)、さらにPGE2,I2,F2α,sarafotoxin(SRTXc)S6c(endothelin=ETB受容体選択的作用薬)を摘出白色家兎後毛様動脈に作用させ同血管に及ぼす影響を検討した。同様に高カリウム溶液で前収縮(100%)させた血管はPGE2(100μM)で52%、PGI2(10μM)で78%、SRTXc(10μM)で90%に抑制された。しかしPGF2αそのものでは弛緩は見られずむしろ高濃度(10μM)にてわずかながら収縮を示した。以上の結果より緑内障治療薬であるLatanoprostは強力な眼圧降下作用のみならず優れた血管拡張作用を有し眼血流の改善を生ずることが推測された。今後さらにその弛緩のメカニズムを研究する予定である。視神経乳頭を養う後毛様動脈の血管トーヌスを測定するため摘出白色家兎後毛様動脈を用い薬理学的に当尺性収縮を記録した。今回、血管周囲に白金板を設置しフィールド刺激(50Hz,0.8msec in duration,50 V in strength)を加え同血管の神経支配、さらにムスカリン受容体作用薬であり古典的緑内障治療薬であるピロカルピンを作用させ同血管に及ぼす影響を検討した。摘出動脈はα-交感神経作用薬(フェニレフリン)により濃度依存的に、さらにフィールド刺激により収縮を示し、両反応ともα-受容体拮抗薬(ブナゾシン)にて抑制された。しかしβ-交感神経作用薬は全く効果を示さなかった。ゆえに同血管にはα-受容体は存在するものの、β-受容体はほとんど存在しないと考えられた。高濃度ヒスタミンにて前収縮させピロカルピンを投与すると濃度依存的に弛緩を示した。この反応は内皮の機械的除去、アトロピン前投与にて抑制されたため内皮依存性のNO(一酸化窒素)の放出が考えられた。さらに前収縮状態でフィールド刺激を加えると一過性の弛緩を示した。この弛緩はNO合成阻害剤であるN-ニトロ-L-アルギニンメチルエステルで抑制され、L-アルギニンの投与により再増加したが、一方、内皮除去にて変化を認めなかったため一酸化窒素(NO)合成酵素を含む神経線維の存在が示された。以上の結果よりウサギ後毛様動脈には収縮に関与する交感神経、弛緩に関与するNOを神経伝達物質とする2つの神経に支配されていることが判明した。また古典的緑内障治療薬であるピロカルピンは血流改善作用を持つことが考えられた。臨床的に緑内障、虚血性視神経症の治療に今後応用が期待され更に詳しい実験を推進して行く予定である。
三量体型G蛋白を介する細胞死誘導機構の解明

G蛋白質共役型受容体を介する細胞死誘導機構解明のため、エンドセリン受容体(ETAR、ETBR)及びソマトスタチン受容体(SSTR2、SSTR3、SSTR5)の安定発現株をF11細胞を用いて作成し、受容体刺激後細胞死が起こるか否か検討したが、細胞死は引き起こされなかった。一般に細胞死誘導蛋白質の安定発現株が得にくいことから考えると、原因としては安定発現株を得る際に細胞死誘導機構のどこかに欠陥のある細胞株もしくは細胞死拮抗因子の過剰発現株を選択的に単離してしまったという可能性が考えられる。アンギオテンシン受容体に関しては、N末端にリガンドを結合した恒常活性型変異受容体の作成を試みたが、現在までのところ活性のあるものは得られていない。単一細胞におけるカスペース活性化をより精度よく観察する目的で二波長の蛍光を有する改良型のカスペースのインジケータを作成した。この改良型カスペースインジケータは、従来のインジケータのSrcの膜結合シグナルと各種カスペースとの間にDsRedが挿入されており、そのカスペースが活性化、すなわち限定分解されると、C端側に連結されている核移行シグナルをもったEGFPが核に移行することにより細胞膜が赤、核が緑の蛍光を発するというものであった。しかしながらこのインジケータは概して赤、すなわちDsRedのシグナルが弱く、ほとんど従来のカスペースのインジケータを用いた場合と変わらなかった。DsRedは四量体で発色団を形成することから、カスペース及びEGFPと融合し、更に細胞膜にアンカリングさせたことにより立体障害がおこり、蛍光を発し難くなってしまったことが考えられる。従って今後更に改良を加えるため、細胞膜側と限定分解後核に移項する側の蛍光蛋白を入れ替えるか、もしくはECFP,EYFPなど単量体で発色団を形成できるタイプの蛍光蛋白を用いて二波長で検出するタイプのインジケータを作成する事を計画している。G蛋白質共役型受容体を介する細胞死誘導機構解明するため、ロドプシンおよびその恒常活性型変異体、エンドセリンAおよびB受容体を、まず一過性に発現し、単一細胞における細胞死の検討を試みた。しかしながら、トランスフェクションによる細胞の傷害や、個々の細胞での発現量の差異といった要因により解析が困難であったため、細胞死の特色の検討は安定発現株を用いてのみ行うこととした。現在までにエンドセリン受容体(ET_AR、ET_BR)、ソマトスタチン受容体(SSTR2、SSTR3、SSTR5)を安定に発現したF11細胞を作成中である。アンギオテンシン受容体に関しては、野生型の受容体の他に、昨年CRF受容体やPTH受容体で報告された、受容体のN末端にリガンドを結合した恒常活性型変異受容体の作成を試みており、これが成功した場合、エクダイソンによる誘導発現系を用い、この遺伝子によって引き起こされる細胞死の解析を行う。カスペース活性化の検討を行うため、各種カスペースのインジケータを安定に発現するF11細胞の作成を行った。その一方でこのカスペースのインジケータの精度を更に向上させるため、二波長の蛍光を有する改良型のカスペースのインジケータを作成した。この改良型カスペースインジケータは従来のインジケータのSrcの膜結合シグナルと各種カスペースとの間にDsRedが挿入されており、そのカスペースが活性化、すなわち限定分解されると、細胞膜が赤、核が緑の蛍光を発するというものある。これを用いることにより、神経細胞などのように細胞体が小さく、細胞膜と核が接近している細胞でもカスペースの活性化が生きたままで観察できると期待される。
嚥下関連筋におけるサルコペニアの診断法の確立

嚥下関連筋のサルコぺニアは嚥下障害を引き起こす。嚥下障害により栄養状態が悪化すると、サルコぺニアもさらに進行するという悪循環が起こる。そのため、嚥下障害に関連するサルコぺニアの早期診断が求められる。そこで今回は、嚥下関連筋の指標として、舌骨の嚥下時の運動速度を測定し、加齢の影響を調査した。対象は健常成人女性10名と健常高齢女性10名とした。一口量を5mlと20mlの2種類に規定し、一口で嚥下させ、嚥下造影検査で撮影した。高齢者と成人で舌骨の運動速度を比較したところ、5ml・20mlともに高齢者において有意に小さい値を示した。低下する舌骨の運動速度がサルコぺニアの兆候となる可能性が示された。超高齢社会を迎えた日本において、老年症候群であるサルコペニアは避けられない問題である。サルコペニアによって嚥下障害が惹起されると、低栄養・廃用によりさらにサルコペニアが進行する。この悪循環を断ち切るために、嚥下関連筋におけるサルコペニアの早期発見が望まれる。そこで申請者は、嚥下において重要な筋であり、サルコペニアの影響を受けやすい抗重力筋である舌骨上筋群に着目し、舌骨上筋群の収縮速度を反映する舌骨の速度を測定し、サルコペニアによる影響があるかどうかを検討した。平成24年度には、健常高齢者20名を対象に、嚥下造影検査を行った。被験食はバリウムの液体とし、一定量を口腔内に含み、一度に嚥下させた。サルコペニアに影響すると考えられる、加齢・栄養状態との関連を調べることを目的に、年齢、既往歴、身長・体重(BMI)、握力を記録した。舌骨運動は性別によって差があることが報告されているため、まず撮影した20名のうち、高齢女性10名の舌骨の移動距離と速度を解析した。解析に使用した画像は、過去に申請者が健常成人にて同様の研究を行った際に、最も大きな速度を必要とした20ml嚥下時のものとした。健常成人女性と健常高齢者の2群で、舌骨の移動距離・最大速度で比較した。舌骨の移動距離においては健常高齢者群で大きな値を示した。これは、加齢による安静時の舌骨位置の下降による影響と思われた。舌骨の最大速度では、健常成人群で、大きな値を示す傾向にあった。これは、最大速度を発揮するための筋力が高齢者において低下していることを示唆している可能性があると考えられた。上記の結果は国際嚥下学会であるdysphagia research societyにて発表した。老年症候群であるサルコぺニアによって嚥下障害が惹起されると、低栄養・廃用により嚥下障害が進行し、さらにサルコぺニアが進行する危険性がある。この悪循環を招かないためには、サルコぺニアの早期診断が重要であると考えられる。そこで申請者は、嚥下関連筋の中で、最も嚥下機能の指標となると考えられる舌骨上筋群に着目し、その収縮速度を反映する舌骨の運動速度を測定した。サルコぺニアの因子として、最も基本となる加齢の影響を見るために、健常高齢者20名および健康成人20名を対象に、嚥下時の舌骨の運動速度を測定した。舌骨は解剖学的・運動学的にも性差の影響が大きいとされているため、女性の運動の解析を進めた。健常成人女性10名、健常高齢女性10名における、嚥下時の舌骨の移動距離および舌骨の運動速度を比較したところ、移動距離では差がなく、運動速度で有意差を認めた。また、高齢者は一口量が大きくなるとより誤嚥を呈しやすくなるという報告があるため、健常成人・高齢女性における舌骨運動に対する一口量の影響を調査した。その結果、一口量が少ない場合に高齢者と成人で有意差を認めるという結果になった。一方、サルコぺニアの因子のひとつである栄養の評価のため、BMIと舌骨運動で関連をみたところ、明らかな相関は認められなかった。こういった結果が出た理由として、対象人数が少ないことの影響が考えられた。また、今回対象とした健常高齢者は嚥下障害や歩行障害を認めていないADLの自立した方々であり、BMIに大きく差がなかったことも栄養面の影響を見るには適さなかった可能性が考えられた。

以上より、ADLの自立した高齢者においても、加齢により舌骨の運動速度が低下している可能性が示された。舌骨の運動速度の低下は、嚥下障害の顕在化よりも先行し、スクリーニングとして利用できる可能性が考えられた。摂食嚥下口腔機能健常高齢者群としては、男女共に10名程度の協力を得ることが出来た。そこから、女性における加齢変化によるサルコペニアの影響と思われる舌骨の運動速度の低下を明らかにすることが出来た。しかしながら、健常高齢者の嚥下造影検査の撮影は、放射線被爆という問題から、研究の協力になかなか同意が得られないことがあった。加齢の影響を見るためには、被験者数をより多く確保することが重要と考えられるため、当初は、対象群を年齢別に細かく、50歳代、70歳代、90歳代に分類し、解析を行う予定にしていたが、そこは方針を変更しなければならないと思われた。健常高齢者と健常成人におけるデータの比較を継続して行うこととする。加齢との関連を見る上でも、被験者数はより多いことが望まれるため、撮影協力のお願いは継続して行う。また、サルコペニアについて言及するためには、加齢のみならず、廃用の程度や低栄養の有無についても解析することが必要である。介入として嚥下関連筋の訓練が行えないか、その点に関しても協力のお願いをする予定である。また、現在撮影を終了している画像についても、順次解析を進めていく必要があるため、その作業が円滑に行えるように研究補助なども利用したいと考えている。可及的に早く解析を進めて、BMIや握力などの情報との関連の有無について、検討を行う。概ね予定通りに使用したが、誤差で10,171円のみ残った。被験者数を増やすために、実験時の撮影や解析のために人件費に使用する予定である。
骨粗鬆症における3次元的骨梁配置及び骨基質の生化学的性状と力学的強度に関する研究

目的:QCT法によりヒト新鮮死体脊椎骨椎体の海綿骨骨密度を計測し、この計測値とその生体力学的圧縮強度との関連を明らかにすることを目的とした。材料・方法:ヒト新鮮死体より採取した腰椎、10椎の椎体部分のみの骨塩量をQCT法にて計測した。スライス幅を1cmとし、ROIを1cm平方に設定することによって1椎体当たり812個の立方体の海綿骨骨塩量を求めた。更にこの椎体のROI設定箇所と同一部をbone sawにて正確に切り出し1cm立方の海綿骨標本を作成した。合計で95個の標本が得られたが、これらに対して万能力学試験機を用い上下方向からの圧縮試験を行った。圧縮負荷は毎分5mmの速度で標本海綿骨の破壊が生じるまで加えたが、得られた荷重変形曲線から最大圧縮強度、最大歪み、更に圧縮弾性係数、を求めた。力学試験の後、各試験片の乾燥重量を計測し、さらに試験片を灰化し原子吸光法にてCa含量を計測した。結果:QCT法にて1cm立方の海綿骨標本の骨塩量はCaCO_3相当量178mg/cm^3であった。海綿骨の最大圧縮強度、圧縮弾性係数は平均で各々、24.1kgf/cm^2、4.31kgf/mm^2であり、最大圧縮強度とQCT法による骨塩量は直線回帰による正の相関を示し相関係数は0.63(p<0.01)であったが、圧縮弾性係数とQCT法による骨塩量は直線回帰による相関では相関係数0.49(p<0.01)であった。単位体積当たりのCa含量は最大圧縮強度と直線回帰による正の相関を示し相関係数は0.67(p<0.01)であった。
なぜ流動性の罠が生じるのか？その原因と予防、対処法に関する研究

名目金利がゼロに達し、それ以上金利の下げられない状態である「流動性の罠」の原因および対処法について主に研究を進めた。その結果、金融市場の不完全性が存在する下では自然利子率が大きく低下し流動性の罠に陥る可能性が高いこと、内生的成長モデルにおいては従来考えられてきた最適金融政策よりも生産量の変動の緩和が重要であることを示した。また、マクロ経済モデルに外国為替市場のマーケットマイクロストラクチャーを明示的に導入することで、量的緩和政策が為替レートの変化を通じてマクロ経済に与える影響の重要性を認識した。論文Endogenous Alleviation of Overreaction Problem by Aggregate Information Announcementは、中央銀行をはじめとした政策当局の望ましい情報の公開方法について考察した論文である。本論文において我々は、民間の経済主体が政策当局の公開する情報に過剰に反応してしまうような状況では、政策当局は個別地域の情報を細かく公開するよりも複数の経済地域の情報を集計したもののみを公開するほうが民間の過剰反応を防ぐことにより経済厚生を上昇させる可能性があることを理論的に示した。ディスカッションペーパーEndogenous Information Acquisition and Partial Announcement Policyは、上記の過剰反応を防ぐ一つの方法として先行研究で提案されている「一部の民間主体にのみ情報を公開する」政策を、当局が有料で情報を公開することによって実現することが可能であるか理論的に考察した論文である。我々は、政府の情報は定額料金で公開するのではなく、希望者の人数に合わせて料金を設定することによってこの政策が可能になることを示した。1.研究実施計画の『論文4:金融市場の不完全性を導入.金融危機と流動性の罠の関係性を分析』について研究が進行した。具体的には以下のとおりである。金融市場の不完全性が流動性の罠の原因となるか否かという問題を考察するため、借入-担保比率の変化を導入したマクロ経済モデルを構築し、分析を行った。担保として土地がモデルに組み込まれていることが大きな特徴である。分析の結果、金融市場で借入-担保比率が一時的に上昇するようなショックが存在する際、借入-担保比率が元に戻る時に不況が発生するメカニズムを解明した。一時的な正の金融ショックによってその後の不況を説明したことが本研究の貢献である。このことから、金融市場のショックは自然利子率を低下させ、流動性の罠を生じさせる一つの要因であることがわかった。この結果は現在論文執筆中であり、本課題の研究期間中に発表する予定である。2.研究実施計画の『論文5:情報の不完備性を導入.情報公開と流動性の罠の関係性を分析.』について研究が進行した。政府の情報公開政策に関する研究について、政府が経済内の一部の主体のみに情報を公開するための方法についての分析を行った。既存研究では「政府がどれだけの割合の経済主体に情報を公開するか選択することが可能である」という前提の下で研究が行われてきたが、我々の研究では、その割合を政府がコントロールすることは必ずしも容易ではなく、単純な方法では不可能であることを理論的に示した。この研究は中央銀行の情報公開政策について示唆を与えるものであり、本研究課題の研究の基礎にもなる研究である。本課題の研究期間中に学会発表が決定しており、論文も現在執筆中である。金融市場の不完全性と情報の不完備性が流動性の罠に与える影響を調べるために、2014年度は特に情報の不完備性下において政府の情報公開が民間主体の行動にどのような影響をもたらすのかというより基礎的な問題について、理論と実験の両アプローチを用いて研究を行った。一つは、政府の情報公開を適切な範囲に限定して行うことができるか否かについての理論的アプローチを2013年度から引き続いて行い、政府が民間主体に対して情報を売却する状況においては、情報売買の均衡が不安定になり、政府が適切な範囲への情報公開を行うことが難しい場合が存在することを示した。この論文は引き続き国際雑誌への掲載を目標として改訂中である。もう一つは、情報を受け取ることによって経済主体の行動がどのような影響を受けるかという問題を実験経済学的なアプローチによって解明する研究である。本研究では、人々がお互いの予想を予想し合うような状況においては公共情報と私的情報の重要性に違いが生じることを利用して、人々のどの程度のレベルでの合理性を持って行動するのかを調べることができる。この研究は合理性を仮定した理論研究の結論と現実の間に生じる乖離を説明するために重要な研究である。本研究は現在実験データの解析中であり、2015年度中に論文にまとめる予定である。結果として、2014年度は流動性の罠が生じるメカニズムの基礎づけに関して有益な研究を行うことができた。平成27年度は外国為替市場における情報の不完全性と流動性の罠との関係について研究を行った。先進各国において名目金利がゼロに近く国際間金利差が非常に小さくなっている状況下において、名目為替レートが大きく変動していることはカバー無し金利平価による為替レートの決定理論では説明がつかない。そこで、外国為替市場で生じうる情報の不完全性を明示的に考慮したマーケットマイクロストラクチャー理論をマクロ経済モデルに導入することで、この状況を説明し為替レートの変動がマクロ経済に与える影響を分析した。マーケットマイクロストラクチャーの分野では、情報の不完全性によって為替レートが外国為替市場におけるオーダーフローから影響を受けることが理論的、実証的に示されており、それが為替レートについてのパズルを解決する可能性が指摘されている。

今年度作成したモデルはオーダーフローによる為替レート決定をマクロ経済モデルに導入することによって、名目利子率がゼロ近辺で留まっている二国間の為替レートの変動を説明することを目的としている。分析の結果として、為替レートとマクロ経済との関係は、マクロ経済のどのファンダメンタルズが外国為替市場のオーダーフローに影響を与えるかについての想定および外国為替市場の構造についての想定によって大きく異なることが示された。当該研究は現在論文執筆中であり、完成後はディスカッション・ペーパーとして公開するとともに、国際査読付き学術雑誌に投稿予定である。名目金利がゼロに達し、それ以上金利の下げられない状態である「流動性の罠」の原因および対処法について主に研究を進めた。その結果、金融市場の不完全性が存在する下では自然利子率が大きく低下し流動性の罠に陥る可能性が高いこと、内生的成長モデルにおいては従来考えられてきた最適金融政策よりも生産量の変動の緩和が重要であることを示した。また、マクロ経済モデルに外国為替市場のマーケットマイクロストラクチャーを明示的に導入することで、量的緩和政策が為替レートの変化を通じてマクロ経済に与える影響の重要性を認識した。当初とは論文の執筆順序等に変更が生じたものの、申請時には発見できなかった課題に対処するなど、全体として本課題に対して、理論・実験的な基礎づけを持った解明が進んでいると考えている。マクロ経済学申請時には想定していなかった課題の発見や論文の改訂等により、補助事業期間の2015年度までの延長を申請し認められた。2015年度はこれまでの研究の成果を国際雑誌に発表するとともに、それを土台にして本研究課題についてまとめた論文を執筆する。今年度行った一連の研究は、情報の不完備性と流動性の罠の間の関係について理論的な基礎を提供する可能性のある研究であり、次年度の研究の土台として重要である。研究実施計画において執筆を計画した5本の論文のうち、『論文4:金融市場の不完全性を導入.金融危機と流動性の罠の関係性を分析』、『論文5:情報の不完備性を導入.情報公開と流動性の罠の関係性を分析』について研究が進み、査読付き国際雑誌への投稿に向けた論文執筆も順調し進んでいる。上述の2本の論文は計画上は平成25年度、26年度に執筆予定としており、計画した5本の論文の執筆順序に変更が発生した。しかし、執筆本数としては予定通りであり、本課題の研究期間中には全体としても予定通りの成果を達成できる見込みである。流動性の罠と経済成長の関係についてのシミュレーション手法に誤りを発見したため、予定していた海外学会の報告を行わなかったため次年度使用額が生じた。次年度は、内生的経済成長モデルと流動性の罠との関係について論文を完成させるとともに、今年度行った情報公開についての研究を動学一般均衡モデルに導入することにより、情報の不完備性が流動性の罠の原因足りえるかについての考察を行う。
脳腫瘍遺伝子治療 : アデノウイルスベクターを利用したインデクリンによる中和抗体の発現

我々は、グリオーマ特異的モノクロナール抗体を樹立し、その後、その抗体が認識するタンパク質を精製し、マイクロシークエンス法にて、N末端より25アミノ酸残基を決定した。そして、それがインテグリンα3であることを証明した。そして、human integrinnまた、northern blotの過程で、インテグリンα3のexpected bandと更に短いバンドが出現した。それは、悪性度とある程度、正の相関を示している。PCRにて、そのsplice variantと予想しているbandをcDNAより、cloningし、sequenceした。すると、cytoplasmic domainのリン酸化部位がdeletionしており、何らかのシグナル伝達を阻害して、正常の細胞接着を乱し、浸潤能を高めていることを確認した(in submission)。我々は、グリオーマ特異的モノクローナル抗体を樹立し、その後、その抗体が認識するタンパク質を精製し、マイクロシークエンス法にて、N末端より25アミノ酸残基を決定した。そして、それがインテグリンα_3であることが判明した。そして、human integrinn α_3のcDNAを東大薬学部辻本先生より供与していただき、各種腫瘍組織にて、northem blot、western blot、そして、immunohistochemistryを施行したところ、グリオーマでかなり強く発現しているのを確認した。我々の樹立したグリオーマ特異的モノクローナル抗体(GA17)は、integrin α_3の中和抗体である可能性もあり、現在、in vitroでグリオーマ細胞の接着を阻害しアポトーシスを誘導するか確認しているところである。また、northem blotの過程で、インテグリンα_3のexpected bandと更に短いバンドで出現した。それは、悪性度と比較している様にも思われた。現在、PCRにて、そのsplice variantと予想しているbandをcDNAより、cloningし、sequenceして、どの部分がdeletionを受けているか、そのことによって、リン酸化部位がどのように影響を受け、シグナル伝達がどのように変化し、gliaがgliomaになるのか解析しているところである。そして、human integrinn α3のcDNAで、各種腫瘍組織にて、northern blot、我々の抗体及び市販の抗体にて、western blot、そして、immunohistochemistryを施行したところ、グリオーマでかなり強く発現しているのを確認した(in submission)。我々の樹立した特異的モノクロナール抗体(GA17)は、integrin α3の中和抗体である可能性もあり、現在、in vitroでグリオーマ細胞の接着を阻害しアポトーシスを誘導する。DNA ladderingを確認した。また、northern blotの過程で、インテグリンα3のexpected bandと更に短いバンドが出現した。現在、PCRにて、そのsplice variantと予想しているbandをcDNAより、cloningし、sequenceした。すると、cytoplasmic domainのリン酸部位がdeletionしており、何らかのシグナル伝達を阻害して、正常の細胞接着を乱し、浸潤能を高めている様に思われ、現在、更に、解析中である。そして、human integrinnα3のcDNAで、各種腫瘍組織にて、northern blot、我々の抗体及び市販の抗体にて、western blot、そして、immunohistochemistryを施行したところ、グリオーマでかなり強く発現しているのを確認した。我々の樹立したグリオーマ特異的モノクロナール抗体(GA17)は、integrin α3の中和抗体である可能性もあり、現在、in vitroでグリオーマ細胞の接着を阻害しアポトーシスを誘導する。DNAladderingを確認した。
自然免疫系におけるエンドカンナビノイドシステムの役割の解明

本研究では、ヒトナチュラルキラー細胞のガン細胞に対する細胞傷害活性におけるカンナビノイド受容作動薬や阻害薬の影響について調べることにより、ナチュラルキラー細胞の細胞傷害の機構にエンドカンナビノイドシステムが関与している可能性を示した。さらに、マウスの腫瘍生着モデルに対するCB2受容体阻害薬の影響についても調べ、CB2受容体が少なくともマウスにおける腫瘍免疫において重要な役割を演じている可能性を示した。本年度は、エンドカンナビノイドシステムが自然免疫系においてどのような役割を担っているのかを明らかにすることを目的として、ナチュラルキラー細胞の細胞傷害活性における各種カンナビノイドの影響について検討した。その結果、カンナビノイド受容体アゴニストがヒトナチュラルキラー細胞株の白血病細胞株に対する細胞傷害活性を有意に促進し、これがカンナビノイドCB2受容体を介して起こることを明らかにした。また、ヒトナチュラルキラー細胞株の無刺激時の細胞傷害活性がCB2受容体アンタゴニスト処理により低下することから、ナチュラルキラー細胞の細胞傷害の機構にエンドカンナビノイドシステムが関与している可能性が示唆された。興味深い事に、大麻の主要活性成分であるΔ^9-テトラヒドロカンナビノール(Δ^9-THC)もナチュラルキラー細胞の細胞傷害活性を減弱させることから、これがΔ^9-THCの免疫抑制作用の一部を説明するものと考えられた。一方、第3のカンナビノイド受容体である可能性が近年指摘されていたオーファンGタンパク質共役型受容体であるGPR55の内在性リガンドが、エンドカンナビノイドの2-アラキドノイルグリセロールやアナンダミドではなく、リゾホスファチジルイノシトールであることを見出した。GPR55は、脳だけでなく脾臓などの免疫組織にも分布するとの報告があるため、リゾホスファチジルイノシトールとGPR55の免疫系における役割についても興味が持たれる。前年度は、カンナビノイド受容体アゴニストがヒトナチュラルキラー細胞株の白血病細胞株に対する細胞傷害活性を有意に促進し、これがカンナビノイドCB2受容体を介して起こることを明らかにし、エンドカンナビノイドシステムがナチュラルキラー細胞の細胞傷害の機構に関与していることを明らかにした。本年度は、エンドカンナビノイドシステムが実際に腫瘍免疫に関わっているか否かを確かめるために、マウスの腫瘍生着モデルに対するCB2受容体アンタゴニスト(SR144528)の影響について調べた。同種同系の腫瘍細胞(Colon-26細胞)をSR144528処理または無処理のBalb/cマウスの皮下に移植し、腫瘍サイズの経時的な増加を調べると、SR144528処理群で有意に促進された。また、SR144528には腫瘍細胞の増殖を促進させる作用は認められなかった。これらのことから、CB2受容体が少なくともマウスにおける腫瘍免疫において重要な役割を演じていることが示唆された。一方、前年度にリゾホスファチジルイノシトールがオーファン受容体GPR55のアゴニストであることを見出したが、本年度では構造活性相関の詳細な検討により、リゾホスファチジルイノシトールが最も強いGPR55の内在性リガンドが、リゾホスファチジルイノシトールであることを明らかにした。
9,13位修飾レチナ-ル類の合成

計画書に提出した計画案を実施し、その成果を4つの論文に報告した。以下に概要をまとめる。1)本合成計画の鍵となる含ハロゲンC4+Xユニットの立体選択合成に成功し、これより生合成類似の合成ルートにより9-Cl,Br,I-レチナ-ル誘導体を合成した。(C.P.B.1996)2)1)で得られた結果をもとに、それに代わりうる相補的な9位修飾レチナ-ル誘導体合成ルートを開発し、これより9-F-レチナ-ル誘導体の合成を達成した。(Synlett 1995)3)含ハロゲンレチナ-ル誘導体のタンパク機能解析ツールとしての評価をバクテリオロドプシンにおける再構成実験により行い、全ての誘導体が天然レチナ-ルと変わりなく取り扱える事を明らかにした。(C.P.B.1996, Synlett 1995)4)上述の合成誘導体に加え、幾つかの9位修飾レチナ-ル誘導体を用いたバクテリオドプシンにおけるFTIRによる機能解析を進め、トリプトファン残基と9位メチル基との分子レベルでの相互作用仮説を裏付ける知見を得た。(Biochemistry 1995)5)本合成研究において用いた、二酸化マンガンの穏和な酸化力に着目し、それがオキシムからカルボニル化合物への変換に有用であることを初めて明らかにした。(Tetrahedron Lett. 1995)(まとめ)研究目的の大半を達成すると共に、その合成研究の途中で新反応を見いだした。本研究では含ハロゲン誘導体のみならず多様な誘導体のデザインと合成が可能であり、未発表ながら現在進行中のタンパク質レベルでの研究結果も併せて、さらなる展開が今後期待できる。