hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
肺癌における分子標的薬耐性機序の解明と治療戦略の開発

肺がんの分子標的治療の最大の難関は、耐性獲得である。これを克服するための新戦略を開発した。まず、ALK陽性肺癌において耐性獲得後も重要な細胞内シグナルを同定し、この経路を阻害することで耐性を克服することが可能となった。このシグナルはCrk-Srcシグナル系で、今回の我々の検討では、Srcシグナルを抑制する薬剤を併用することで、耐性にかかわるバイパス経路のチロシンリン酸化受容体を幅広く抑制することが示された。このSrc阻害薬とALK阻害薬の併用効果は、細胞実験のみならず、マウス皮下移植モデルにおいてもALK耐性細胞の増殖を完全に制御できた。本研究は今後臨床で使用することが期待される各融合遺伝子への薬剤に対する獲得耐性機序を解明することを目的としている。これまでの研究成果を以下に記載する。ALK,ROS1,RET耐性細胞に共通し、気管支肺胞上皮幹細胞に元来備わるEGFRやMETを含めた生存シグナルの内で耐性株特異的に活性化している分子を同定しその発現機構を探索するALK,ROS1,RET耐性状態において、がん細胞内で安定して生存シグナルを送るタンパクを同定することとした。これらのタンパクはHSP90のシャペロン分子である可能性が高いため、HSP90阻害の標的となる分子を検索した。ALK遺伝子再構成を有する細胞株H3122に対して、クリゾチニブ、アレクチニブ、セリチニブ耐性の細胞株を樹立。ROS1遺伝子再構成を有する細胞株HCC78に対して、クリゾチニブ耐性株は作成中。RET遺伝子再構成を有する細胞株LC2/adに対して、ヴァンデタニブ、アレクチニブ耐性株を樹立した。まず、H3122のアレクチニブ耐性株(H3122AFR)に対してもHSP90阻害薬が有効であることを確認し、HSP90阻害薬投与前後でタンパク発現量が変化したペプチド群を、マススペクトル解析(iTRAQ)を用いて同定した。この結果をさらにタンパク質の細胞内シグナルパスウェイ解析(David)を行い、FAK/paxilin/Src/CrlII/CrkL/p130Casシグナル系の変化を確認した。今後、このシグナル系を阻害することで、耐性株に対して感受性を持つ薬剤のスクリーニングを行っていく。肺がんの分子標的治療薬に対する薬剤耐性には、さまざまな機序が報告されている。チロシンキナーゼを標的分子とした薬剤の場合、その分子をコードする遺伝子変異によって、薬剤とATP結合部位の相互作用で、薬効が低下することが知られている。また、がん細胞内で、生存シグナルを持続するために、標的分子以外のタンパク質が活性化したり、タンパク質発現自体が増強したりすることが知られている。我々の本研究では、このバイパス経路が活性化する機序の解明を行った。まず、標的分子は遺伝子変異や融合遺伝子などで構成されており、正常細胞には見られない不安定なタンパクであることを利用した。こういったタンパク質が、分子シャペロンによるタンパクのフォールディング機能によって維持されているため、シャペロン分子阻害薬投与は、標的分子の分解を促進し抗がん活性がある。ALK阻害薬に対する薬剤耐性の細胞株において、このシャペロン阻害薬で分解される分子群を、質量分析法を用いてスクリーニングした。この候補タンパク群の細胞内シグナル経路解析を行うと、focal adhesion経路やIGFR経路が変動していることが分かった。Focaladhesion経路の、Src-Paxillin-CrkII経路に注目し、ALK薬剤耐性株にSrc阻害薬を併用する細胞実験・動物実験を行い、ともにALK阻害薬とSrc阻害薬の併用で耐性が克服されることを突き止めた。今後は、臨床試験として併用療法の効果・毒性について検討されることが望まれる。研究内容については、2016年米国癌学会において発表し、現在、英文論文として投稿中である。ROS1遺伝子再構成の細胞株HCC78の発育状況が悪く、耐性株を再度作成中で、当初の予定より遅れている。その他の蛋白質解析、治療標的は進展があり順調に進行している。分子標的治療我々が同定した治療標的に対する治療の有効性が、海外の他の研究グループから報告があり、より有効な治療開発ができるよう耐性機序の解明も併せて行っていく。当初予定していた遺伝子改変マウスの納入が遅れたため繰り越しました。遺伝子改変SV40マウス購入費に充てます。
二次代謝産物生産に適した糸状菌遺伝子発現システムの開発

麹菌を宿主として複数の遺伝子を効率的に導入するシステムとして、変異型loxP配列を用いた自己切断型選択マーカーカセットによるマーカーリサイクリング方法の開発に成功した。このシステムを利用することにより、多重遺伝子導入および多重遺伝子破壊を容易に行うことが可能になった。高発現用カセットを複数持つ発現用ベクターを構築し、麹菌宿主株への生合成遺伝子群の効率的な導入を可能にした。アフィディコリン生合成酵素とGFPを融合したタンパク質を麹菌で発現させ、それぞれの酵素の細胞内局在を観察するとともに、コウジ酸とアフィディコリンの排出トランスポーターの高発現が生産性向上に重要であることを明らかにした。(1)麹菌を宿主にして二次代謝化合物生合成系の複数の遺伝子を効率的に導入するシステムとして、Cre/loxPシステムを用いた選択マーカーの新規なリサイクリング方法を開発した。Cre/loxPシステムでは、通常loxP配列に挟まれた断片の除去にはCreリコンビナーゼ遺伝子を外部から導入して発現させるが、除去操作をより簡便に行うため、Creリコンビナーゼを直接宿主細胞内に導入することを試みた。その結果、Creリコンビナーゼと一緒にDNA断片を麹菌のプロトプラストに細胞融合と同様な手法で導入することによって、染色体に組み込まれているloxP配列に挟まれた選択マーカー遺伝子を除去することが容易にできることを認めた。(2)糸状菌由来の二次代謝化合物生合成酵素の細胞内局在を解析するための対象として、甜菜じゃのめ病菌のPhoma betaeのアフィディコリン生合成遺伝子クラスターのin silico解析を行った。生合成遺伝子クラスターは6個の遺伝子からなり、4個の生合成酵素遺伝子に加えて転写因子とトランスポーター遺伝子が存在するが、生合成酵素のうち、P450の1個は膜貫通領域を持ち、もう一方はシグナルペプチド様の配列を持つことから、これらの酵素が膜またはオルガネラに局在する可能性が考えられた。(3)麹菌のDNAマイクロアレイを利用して、麹菌の生産する二次代謝化合物である麹酸の生合成に関わる遺伝子を探索した。生産条件と非生産条件下における遺伝子の発現プロファイルを比較することで抽出された9種類の遺伝子の破壊株を作製し、麹酸の生産を調べたところ、オキシドレダクターゼとトランスポーター遺伝子の破壊株で生産量が減少することが分かった。この2種類の遺伝子はゲノム上で転写因子遺伝子を挟んで存在しており、この転写因子を破壊すると同様に麹酸生産量の顕著な減少が認められ、これら3種類の遺伝子が麹酸生合成のクラスターを構成していることが明らかとなった。(1)複数の二次代謝化合物生合成系の遺伝子を選択マーカーをリサイクリングしながら同一の宿主株に導入するために、変異型loxP配列を利用したシステムを開発した。当初、前年度に確立したCre酵素を直接菌体核内に導入することによりloxP配列に挟まれたマーカー遺伝子を除去する方法を用いたが、変異型loxP配列はCre酵素による組換え反応を受けにくいため、in vivo反応では効率よく除去反応を起こさせることができなかった。そこで、チアミンによって抑制を受けるチアミン合成酵素遺伝子(thiA)のプロモーターを用いてCre酵素を条件的に発現制御する発現カセットを作製し、このカセットをあらかじめ宿主株に導入した。この株に変異型loxP配列をもつ発現プラスミドを導入し、得られた形質転換体をチアミンフリーの培地で培養することにより効率良く除去反応を起こさせることができた。(2)甜菜じゃのめ病菌Phomabetaeのアフィディコリン生合成遺伝子クラスターに含まれる4個の生合成酵素に緑色蛍光タンパク質(GFP)を連結した融合タンパク質を作製し、麹菌に導入して蛍光顕微鏡観察を行った。一方、局在部位の確認を目的にして、麹菌の各オルガネラを可視化するためのオルガネラマーカーとして、膜融合因子であるSNAREタンパク質にRFPを連結させた融合タンパク質を発現するプラスミドを作製した。蛍光顕微鏡観察の結果、生合成酵素のうち、2種類のP450はいずれも小胞体に局在する可能性が考えられた。(3)麹菌の麹酸生合成遺伝子クラスターを構成している3種類の遺伝子のうち、転写因子を除くオキシドレダクターゼとトランスポーターの2つの遺伝子を高発現するプラスミドを、(1)で開発した選択マーカーリサイクリングシステムを利用して麹菌に順次導入した。2つの遺伝子の高発現により、麹酸生産量の飛躍的な上昇が認められ、特にトランスポーター高発現の効果が非常に高いことが明らかとなった。1.大腸菌内でのCre発現を抑えるためにCre遺伝子内に人為的にイントロンを挿入したところ、目的とするプラスミドが取得できた。

さらに、Cre発現のための条件的発現プロモーターとしてアオカビ由来のxylP遺伝子プロモーターを使用することにより、非相同領域への挿入が抑えられ、得られた形質転換体をグルコースおよびキシロースを炭素源とした培地で培養後、ゲノムPCRを行った結果、Cre誘導条件でadeAマーカーと同時にCre発現カセットも脱落していることが確認された。構築したシステムを用いて麹菌の持つコウジ酸生合成酵素の遺伝子kojA、kojT導入株とα-1,3-グルカン合成酵素遺伝子(agsA, agsB, agsC)の三重破壊株を作製し、それぞれをゲノムPCRにより確認した結果、kojA、kojTが導入されたこととα-1,3-グルカン合成酵素の三つの遺伝子がすべで破壊されたことが示された。このように、構築したシステムを用いて多重遺伝子導入株と多重遺伝子破壊株が容易に作製できることが分かった。2.アフィディコリンの炭素骨格を合成する2つの可溶性酵素は細胞質に局在し、生合成反応の最終段階に関わる2種類のシトクロームP450は小胞体に局在していることが示された。P450による水酸化反応が小胞体の内外どちらで起こるのかを調べたところ、どちらも触媒ドメインは細胞質側に存在していることが明らかとなった。トランスポーターは発現量に応じて小胞体から細胞膜へと局在を変える様子が観察された。そこでアフィディコリン生合成に必要な4遺伝子を導入した麹菌とこれにトランスポーターも導入した麹菌の培養液からアフィディコリンを抽出し、TLCによって簡易的に生産量を検定したところ、トランスポーターも発現する株のほうがアフィディコリン生産性が向上しているという結果を得た。選択マーカーリサイクリングシステム用いることにより、麹菌染色体上に存在する3種類のα-グルカン合成酵素遺伝子をいろいろな組み合わせで容易に破壊することができた。得られた破壊株は寒天培地上では野生株とほとんど差のない生育状態を示したが、液体培養時に野生株とagsA、agsC遺伝子破壊株がペレット状になるのに対して、agsB遺伝子破壊株ではパルプ状または非常に小さなペレット状の形態を示した。細胞壁のα-グルカン量の測定を行ったところ、agsB破壊株ではほとんど細胞壁にα-グルカンが含まれていないことが明らかとなった。また、麹菌が分泌生産するα-アミラーゼはagsB破壊株では培養初期から細胞壁に吸着されることから、アミラーゼなどのタンパク質の細胞壁吸着を阻害する因子がα-グルカンである可能性が示唆された。一方、麹菌の生産する二次代謝化合物であるコウジ酸は、agsB破壊株ではほとんどの生産されなかった。しかし、コウジ酸生合成に関わるkojAを高発現させると、agsB破壊株では野生株よりも高い生産性を示し、agsB破壊株の有用物質高生産用の宿主としての有用性が示された。一方、高発現カセットをタンデムに2個搭載したベクターをそれぞれargBとsCを選択マーカーとして2種類作製し、これらのベクターに生合成酵素遺伝子を挿入して麹菌にco-transformationで複数個導入するシステムを構築した。このシステムを利用して、麹菌においてアフラトレムとベタエノンの生合成に成功した。また、同様に麹菌を宿主として各種発現ベクターを利用して多数の生合成酵素遺伝子を導入することにより、ペニトレムの全生合成経路の反応ステップを解明することができた。
胃癌の新しい癌抑制遺伝子RUNX3の細胞分化・癌化機構の解明と予防・診断への応用

我々は、世界に先駆けてRunx3ノックアウトマウスを作製し、その解析よりRUNX3遺伝子が胃粘膜の発生や分化に重要な役割をはたしており、この異常が胃粘膜の脱分化や異常増殖や癌化に関連することを示した。さらに胃癌の発生母地である慢性胃炎粘膜や腸上皮化生におけるRUNX3の解析や胃癌の転移浸潤におけるRUNX3の関与を明らかとし、将来的にはこれらに基づく胃粘膜の発癌リスク予測や胃癌の転移予測などの遺伝子診断や遺伝子治療を目指しており、胃癌の発癌予防や消化管粘膜再生にも応用しうると考えている,またRUNX3遺伝子の関与する疾患は主に胃癌と考えられていたが、我々は、肝細胞癌、膵臓癌、大腸癌においてもRUNX3遺伝子の関与の可能性を示唆するデータを得ており、これらの癌においてもRUNX3遺伝子の異常を指標とした遺伝子診断や遺伝子治療への応用を試みる予定である。さらにYeast two hybrid system等により、RUNX3と結合する分子を同定し、これを含む複合体または分子経路を解明することにより、これらの中にドラッグデザインしやすい分子標的の見つかる可能性も十分あり、将来の治療応用を視野に入れて研究を進めている。最終的には、RUNX3を分子標的とした癌予防と治療により国民健康の増進と医療費の抑制にも寄与しうると考えている。
昆虫による空間認知の神経機構:カマキリにおける餌情報の脳内表現

本年度は、空間情報を伝達する下降性ニューロンが運動中に果たす役割の解明を試みた。運動中に神経応答を記録する方法の一つとして埋込電極を用いるものがある。そこで、カマキリを対象に埋込電極による細胞外記録法を確立した。実験では、脳と胸部神経節をつなぐ神経繊維の束である腹髄に小型のフック電極を埋め込んだ。そして、複数の下降性ニュ-ロンの動き刺激に対する電気的応答を細胞外記録した。動き刺激として、移動する四角形や縞模様を提示した。その結果、スパイク頻度解析に十分適した記録が埋込電極により得られた。記録からは複数のユニット(ニュ-ロン)のスパイク応答が分離でき、ユニットの視覚刺激への応答は大きく二種類にわけられた。ユニットの多くは、物体が接近する刺激(looming)に強い応答を示した。後退刺激や点滅刺激にはあまり応答しなかったことから、急速に拡大するイメージに反応していると推測された。また、一部のユニットは方向選択性を示し、ある特定の方向の動きに興奮し反対方向の動きで抑制された。このユニットは縞模様の動きに強く興奮したことから、背景全体が動くような広域の動き刺激に反応すると推測された。これらの応答は、前年度に行った通常の細胞外記録法の実験結果と一致するものであった。この結果は、埋込電極による細胞外記録法の有効性を示すものであり、運動中のカマキリにおいて下降性ニューロンの応答を記録するのに適用できることが明らかになった。昆虫における空間認知の神経機構を解明するために、本年度は下降性ニューロンにおける空間情報のコード化および伝達様式を調べた。研究材料として、カマキリを用いた。脳と胸部神経節をつなぐ神経繊維の束である腹髄から、複数の下降性ニューロンの動き刺激に対する電気的応答を細胞外記録した。その結果、腹髄からの記録はスパイクの形から3、4種類のユニットに分離することができた。ユニットの視覚刺激への応答は大きく二種類にわけられた。(1)DS(direction-sensitive)タイプは方向選択性を示し、ある特定の方向の動きに興奮し、反対方向の動きで抑制された。また、視野全体をカバーするような大きな動きによく反応した。このタイプは、昆虫自身が移動する時に生じるオプティックフロー刺激の情報を伝達することで、ターンや移動方向の制御に関与すると考えられる。(2)LS(looming-sensitive)タイプは物体が接近する刺激(looming)に強い応答を示した。このタイプは、物体の衝突のタイミングをカマキリに知らせる役割を持ち、回避行動に関与すると考えられる。同様な衝突検知ニューロンは、バッタで報告されている。LSタイプの中にはカマキリの餌となる昆虫と同程度のサイズの正方形に強く興奮するものがあった。このユニットはSF(small-field motion-sensitive)タイプとして別に分類するのが適切な可能性もある。
エピジェネティック制御によるヒトTERT遺伝子制御機構と細胞不死化獲得機構の解明

テロメラーゼ逆転写酵素(TERT)は幹細胞における高い自己増殖能を支える重要な分子である。しかし、ヒトTERT遺伝子の細胞・組織特異的な発現制御機構に関わるエピジェネティック制御は不明である。本研究では、ヒトTERT遺伝子のDNAメチル化可変領域(TERT-DMR)を同定し、TERT-DMRの高メチル化がTERT発現維持・獲得に重要であることを明らかにした。さらにヒトiPS細胞ではH3K4me3修飾が、体細胞ではH3K27me3修飾および、HP-1αの結合が有意に認められた。DNA高メチル化が遺伝子発現に促進的に働くというエピジェネティック制御の新たな機構を明らかにした。体細胞から人工多能性幹細胞(iPS細胞)への形質転換時における細胞不死化はテロメア伸長に関わるTERT遺伝子の発現獲得と大きく関係している。我々はヒトTERTプロモーター領域にヒト多能性幹細胞特異的DNAメチル化可変領域(TERT-DMR)を同定したが、ヒトiPS細胞樹立時におけるTERT-DMRと発現獲得機構の関連については明らかとなっていない。本研究では、TERT遺伝子のエピジェネティック発現制御機構の解明を目的とし、平成28年度は、クロマチン構造解析、Hyper sensitive assay、メチル化EMSAを行った。ヒストン3リジン4のトリメチル(H3K4me3)およびヒストン3リジン27のトリメチル(H3K27me3)修飾を解析した結果、H3K4me3がヒトiPS細胞において豊富に認められた。また、ヘテロクロマチン蛋白、HP-1αがTERT非発現のTERT-DMRに認められ、TERT発現では認められなかった。ヒトES、iPSおよび体細胞におけるDNase I Hypersensitive assayのデータを解析した結果、TERT発現細胞のTERT-DMRにHyper sensitive siteが存在し、オープンクロマチンであることが明らかとなった。さらに、TERT-DMRに結合する蛋白の探索を行ったが、TERT-DMRのメチル化に特異的に結合する因子は検出されなかった。我々はヒトTERTプロモーターの遠位領域にヒト多能性幹細胞特異的DNAメチル化可変領域(TERT-DMR)を同定したが、ヒトiPS細胞樹立時におけるTERT-DMRと発現獲得機構の関連については明らかとなっていない。本年度では、昨年度に蓄積した結果を基にさらにTERT遺伝子のエピジェネティック発現制御機構の解明を進めた。TERT-DMR特異的メチル化コンストラクトを作成し、TERT-DMR特異的メチル化コンストラクトを用いたレポーターアッセイをヒトiPS細胞3株と体細胞を用いて実施し、TERT-DMRのDNAメチル化による発現活性への影響を明らかにした。また、TERT-DMRおよび転写開始点近傍におけるクロマチン構造を解析するために、ヒトES細胞および、体細胞のATAC-Seqデータを用いたin silicoによる解析を行った結果、ヒトiPS細胞におけるTERT-DMRは高メチル化状態であるのにかかわらずオープンクロマチンであることを明らかにした。さらにTERT遺伝子と同様のDNAメチル化と発現パターンを示す遺伝子を、網羅的メチル化データと発現データを用いたin silico解析により探索した結果、ヒトiPS細胞においてTERT遺伝子の他に高メチル化、高発現をする遺伝子をいくつか同定した。幹細胞生物学実験の進捗状況および消耗品の使用状況から、次年度に消耗品費を購入するために260,885円を繰り越すことが適切であると判断したため。消耗品費として使用する。
評価の信頼性を高めるための教師研修用プログラムの研究開発

小論文(essay)の評価の信頼性を高めるための方策を中心に研究を進めた。作文の評価に関しては、評価の「ものさし」となるルーブリックが欧米では開発されていて、そのルーブリックを教師と生徒が共有することにより、作文の質の向上に繋がったり、ある程度、評価の一貫性が確保されたりすることが報告されている。しかしながら、問題がないわけではない。ルーブリック自体は必ずしも客観的で首尾一貫した評価を保証しているわけではないからである。やはり評価者を対象にしたルーブリックを使用した評価者のトレーニングが必要となる。米国では大学入学の合否に大きな影響を有するSATというテストがあるが、2005年からはSATが新しくなり、小論文が導入されている。この小論文の評価にあたり、どのような評価の信頼性を高める方策がとられているか調査した。また、学習者に大量の文章を書かせることが一つの特徴にもなっている国際バカロレア機構のディプロマ・プログラムの中から、TOK(知識の理論)を採り上げ、その小論文に求められている課題、作成要領及び評価方法を調査した。上記の調査は、我が国の評価者のトレーニングに先立ち、どのような資料を用意して、どのような手順で研修を進めれば客観的で首尾一貫した評価ができるようになるかの参考になるものと考える。実際に研修で使用され効果を上げている例として、NWRELの論文(「コミュニケーションの問題:オーラル・コミュニケーションの有効性、適切性、反応性(EAR)を教室で指導、評価するための手引き」)、米国における高校生が授業等で書くことがどれだけ要求されているか、その実態を報告している、ライティングについての全米委員会の論文(「無視されている"R"-ライティング・レボリューションの必要性-」)をそれぞれ翻訳し、参考資料として紹介した。作文やレポートを書かせることが重要であることは教師の間でも異論はない。しかし、評価に時間がかかる、客観的な評価が難しい、評価に信頼性がない、などと言った理由から、児童生徒にある程度の長さの文章を書かせ、提出させるということは非常に少ない。このような書くことに関して諸外国ではどのようにしているのか。米国において、最近、報告されたレポートと国際バカロレアのプログラムで要求されるものを手がかりに実態を調べてみた。これらのレポートでは、児童生徒に書かせることが少なくなっていることへの危機感が報告され、書かせることの重要性が強調されていた。国際バカロレアのプログラムでは、Extended Essay(課題論文)とTheory of Knowledge(知識の理論)を採り上げた。それぞれのレポートで必要とされる字数、どのくらいの質が要求されているか、どのようなテーマで書くのか、書かれた作品はどのように評価されるのか、と言ったことを中心に調べた。また、国際バカロレアのプログラムの運営に関して、特に教師研修のシステムについては、National Research Councilによる報告書(Learning and Under-standing,2002)により調べた。

また、学習者に大量の文章を書かせることが一つの特徴にもなっている国際バカロレア機構のディプロマ・プログラムの中から、TOK(知識の理論)を採り上げ、その小論文に求められている課題、作成要領及び評価方法を調査した。上記の調査は、我が国の評価者のトレーニングに先立ち、どのような資料を用意して、どのような手順で研修を進めれば客観的で首尾一貫した評価ができるようになるかの参考になるものと考える。実際に研修で使用され効果を上げている例として、NWRELの論文(「コミュニケーションの問題:オーラル・コミュニケーションの有効性、適切性、反応性(EAR)を教室で指導、評価するための手引き」)、米国における高校生が授業等で書くことがどれだけ要求されているか、その実態を報告している、ライティングについての全米委員会の論文(「無視されている"R"-ライティング・レボリューションの必要性-」)をそれぞれ翻訳し、参考資料として紹介した。
介護施設入所高齢者の排泄障害に対する排泄行動援助プログラムの有効性

施設高齢者の排泄障害の特徴を明らかにするとともに、排泄障害の原因に応じた援助プログラムを実施し、その有効性を検証した。尿失禁は、膀胱機能の低下ではなく、自発的に尿意が訴えられないことが関連していた。尿意を訴えず失禁しており、膀胱機能が維持されている対象者に、尿意を定期的に確認し尿意に基づいたトイレ誘導を実施した結果、尿意の伝達が可能になり失禁が減少した。また、泥状や水様の便を失禁している対象者には、下剤の内服量を減量した結果、便が有形になり便失禁は消失した。排泄行動に障害が認められる施設高齢者を対象に排泄行動能力や排泄障害に応じた援助プログラムを作成・実施し、その効果を検証することを目的に研究を行っている。今年度は、意思疎通はできるにも関わらず、尿意の知覚と伝達能力が低下しており尿意の訴えがないため、定期的にトイレでの排泄を試みているが常に尿失禁がみられる入所者を対象に、援助プログラムを実施した。プログラム実施前に1日の排尿回数、1回排尿量、および残尿率を調べ、膀胱機能を評価し、膀胱機機能が著しく低下している対象者は除外した。そして、23時間の間隔でトイレへの誘導を行い、誘導の際には必ず尿意の有無を確認し、対象者に尿意の有無に関する訴えがあればそれに応じてトイレへの誘導を行った。9名の対象者に4週間の援助プログラムを実施した結果、尿失禁率は、実施前61.9%、実施後25.0%で有意(p<0.05)に低下した。確実に尿意を訴えた回数は、1日あたり実施前01回で、実施後は3回となり、確実な尿意を訴えた回数は有意(p<0.05)に増加した。自発的な尿意が認められ、高齢者自身の訴えに応じたトイレ誘導が可能になった者が2名、援助者の意図的な尿意の確認は必要であるが、確認すれば確実に尿意の有無を訴えることができた者が5名おり、対象者9名中7名が定時誘導から個々の排尿間隔に応じた排尿援助に変更することができた。以上のことから、尿意を訴えない高齢者に対しても尿意を確認し、尿意に対して意識を向けるとともに、訴える機会を確実に提供すること、そして、訴えがあった揚合はその訴えを尊重し高齢者自身のコントロール感を高めることで、尿意を訴えるという能力を再獲得することができる可能性が示唆された。高齢者施設で排泄行動に援助を必要とし、排泄障害を有する高齢者を対象に、排泄障害の種類とその原因について分析を行った。調査内容は、排尿状態(1回排尿量、残尿量、尿失禁の有無、1回失禁量、総排尿量)、膀胱機能、そして排尿行動として、尿意の訴えと排尿動作について調べた。さらに、援助方法として、随時誘導、定時誘導かについて調査した。対象者35名のデータを分析した。尿失禁に関しては、失禁率が50%を超える者(高い者)が16名(45.7%)で、低い者が19名(54.3%)であった。失禁率が高い者と低い者の2群で、膀胱機能と排尿行動との関係を分析した結果、失禁率は膀胱機能とは関係が認められず、尿意の訴えと有意(P<0.01)な関係が認められ、尿意の訴えがない者に失禁率が高い者が多かった。さらに、尿意を訴えない者は、すべての対象者が定時誘導を受けており、高齢者自身の尿意の訴えに依存した排尿援助が実施されていることが明らかになった。残尿の結果を、残尿率30%未満、残尿量50mlを「正常」として分類すると、残尿が常に正常である者は4名(11.4%)と少なく、常に残尿量の異常が確認できた者は11名(31.4%)であった。これらの対象者には、施設職員を通じて泌尿器科受診を勧めた。受診の結果、定期的な導尿や内服薬の処方が行われ、症状が改善した者では活動性の向上など生活行動の変化が認められた。常にではないが、残尿が観察される対象者は、20名(57.1%)と高率であり、どのような状況で残尿が多くなるのか検討することが課題である。1日の排尿回数が8回以上を頻尿とすると、頻尿の者が12名(34.3%)であった。また、総排尿量に対する夜間排尿量が35%以上を夜間多尿とすると、夜間多尿でない者は1名であり、夜間に50%以上の排尿が認められる者も23名(65.8%)と高率であった。以上の排尿障害の原因、関連などについてさらに分析する必要がある。排泄障害が認められる施設高齢者を対象に排泄行動能力や排泄障害に応じた援助プログラムを作成・実施し、その効果を検証することを目的に研究を行っている。

今年度は、便失禁が認められる対象への援助を実施した。対象者は、1日1回数回、泥状水様便の便失禁が認められた。対象者はいずれもトイレ動作は自立しているか介助により可能であったためトイレでの排泄行動は行っていたが、便意の訴えがない者が3名、便意でトイレに行っても間に合わず失禁している者2名であった。対象者自身が便意を感じている場合でも間に合わないことから、便の形状が水様であることが失禁の主な原因であると考えられた。すべての対象者が緩下剤(カマグ)を内服しており、さらに、刺激性下剤を併用している者もいたため、個々の対象者の内服量に応じて、下剤の減量を試みた。5名中4名が3週間くらいで有形便を排出できるようになり、便失禁が消失した。便意がなかった3名のうち有形便が排出されるようになってから、便意を訴えることができるようになった者が1名、あとの2名はスタッフによる誘導でトイレに行った際に排便ができるようになった。排便間隔は、対象者によってまちまちであり、本来の排便周期で排泄できていることが推察された。失禁が完全になくならなかった1名は、下剤を減量しても便の性状は変化しなかったが、朝食後すぐにトイレ誘導することで、失禁の回数は減少した。便失禁が認められる施設高齢者は、トイレで排泄する動作自体は援助されていたが、便意が不明であったり、あっても間に合わなかったりすることによってトイレでの排泄が困難になっており、そのことは、下剤の内服によって便が水様化することによって生じていることが推察された。したがって、便の形状が軟化し便失禁している施設高齢者には、有形便の排出を目標に下剤の内服量を減量し、本来の排便周期での排便を援助する必要性が示唆された。
ポリエステル膜により被覆された血管用金属ステントによる内膜過形成の制御

Palmaz stent(P294)に3cm長の極薄ポリエステル膜を、7-0ナイロンにて和上に逢着しcoveredstent(CS)を作成した。次にこのCSを直径6mmのPTA用バルーンカテーテルに装着し、次に述べる経皮的挿入のために8Frのシース内に納めた。miniture pig(n=10)の両側大腿動脈に9Frのスシースを挿入した。レントゲン透視下に大動脈分岐部近傍の腸骨動脈を8mm PTA balloonにて3回過伸展させることにより内皮細胞を傷害し、内膜過形成モデルを作成した。一側腸骨動脈には先に作成したCSを挿入した。対側膓骨動脈には被覆されていないPalmaz stentを留置し対照とした。ステント留置術は全例成功した。術直後に血管造影を施行し、ステント近位部、中央部、遠位部の内径を測定した。その結果、CS群では各々5、7±0.3mm、5.6±0.3mm、5.7±0.2mm、では対照群では各々5.9±0.2mm、6,0±0.3mm、5.8±0.2mmであった。ステント留置後3ヵ月目に血管造影を施行し、動脈の開存性および上記内径を測定した。CS群および対照群に各々5.2±0.4mm、5.5.±0.4mm、5.1±0.3mm、対照群では各々5.3±0.3mm、5.3±0,5mm、5.2±0.3mmであった,術直後の内径測定と比して、CS群の中央管以外は統計学的に有意に狭小化していた(P<0.05)。次いで、圧付加潅流固定を旋行あい、両側腸骨動脈を採取し、組織切片を作成し、内膜過形成の肥膜度を測定した。その結果、ステント近位部、中央部,遠位部の肥厚度は、CS群では各々220±55μm,25±15μm,180±45μm,対照群では各々235±661μm、242±35μm、.l98±35μmであり、血管造影剤所見と一致した。以上の結果から、CSはステントp中央部はステント中央部の内膜過形成を有為に抑制することが示唆された。しかしながら、ステント近位部と遠位部では月対照群と同様に内膜過形成がみられ、今後の課題と考えられる。Palmaz stent(P294)に3cm長の極薄ポリエステル膜を、7-0ナイロンにて輪状に縫着しcovered stent(CS)を作成した。全身麻酔下にminiture pig(n=8)の両側大腿動脈を経皮的に穿刺しガイドワイヤーおよび9Frのシースを挿入した。レントゲン透視下にガイドワイヤーを大動脈分岐部近傍の腸骨動脈に進め、同部を8mmPTAballoonにて3回過伸展させることにより内皮細胞を傷害し、内膜過形成モデルを作成した。一側腸骨動脈には先に作成したCSを透視下に挿入し、ステントの装着してあるバルーンカテーテルはそのままに、8Frの外套のみ引き抜いた。次いでPTAバルーンを拡張させ、CSを障害部に留置した。対側腸骨動脈には被覆されていないPalmaz stentを留置し対照とした。ステント留置術後3日目に動物を犠牲死させ、両側腸骨動脈を採取した。標本を縦割りし一方は免疫組織学的検討に、他方は走査型電子顕微鏡に供えた。免疫組織学的検討では、抗PC、NA抗体を用いて単位面積当たりの増殖期にある中膜平滑筋細胞数を計測した。その結果、CS側の中膜平滑筋細胞の増殖率は7.5±5%と対照側の12.4±6%に比して低い傾向にあった。一方、走査型電子顕微鏡による検索では、血小板の付着凝集している面積比率をもとめたが、その結果、CS側では20±8%と対照側の55±12%に比して有意に低かった。(p<0.05)。これまでの実験で、CSはステント留置部における血小板凝集を抑制し、その結果中膜平滑筋細胞の増殖を抑制している可能性が示唆された。来年度は慢性実験を施行し、実際にステント閉塞の原因となる内膜過形成が予防されるか否かを検討する予定である。

その結果、CS群では各々5、7±0.3mm、5.6±0.3mm、5.7±0.2mm、では対照群では各々5.9±0.2mm、6,0±0.3mm、5.8±0.2mmであった。ステント留置後3ヵ月目に血管造影を施行し、動脈の開存性および上記内径を測定した。CS群および対照群に各々5.2±0.4mm、5.5.±0.4mm、5.1±0.3mm、対照群では各々5.3±0.3mm、5.3±0,5mm、5.2±0.3mmであった,術直後の内径測定と比して、CS群の中央管以外は統計学的に有意に狭小化していた(P<0.05)。次いで、圧付加潅流固定を旋行あい、両側腸骨動脈を採取し、組織切片を作成し、内膜過形成の肥膜度を測定した。その結果、ステント近位部、中央部,遠位部の肥厚度は、CS群では各々220±55μm,25±15μm,180±45μm,対照群では各々235±661μm、242±35μm、.l98±35μmであり、血管造影剤所見と一致した。以上の結果から、CSはステントp中央部はステント中央部の内膜過形成を有為に抑制することが示唆された。しかしながら、ステント近位部と遠位部では月対照群と同様に内膜過形成がみられ、今後の課題と考えられる。
微多孔シリカ膜の開発と脱水プロセスへの応用－膜開発・性能評価・分子透過機構－

本研究では、諸耐性に優れたシリカ膜による高性能分離プロセスを開発することを目的とする。3つの視点((1)高選択透過性シリカ膜の設計・開発、(2)各種分離系における分離性能評価、(3)透過機構のモデリング)から、バランスよく、相互にフィードバックを行いながら、透過特性の制御と解明を進める。膜開発の視点からは、水の高透過率化を目指す。性能評価の視点からは、膜構造と得られた分離性能の関連を明らかにし、各分離系における高性能膜分離プロセスの指針を得る。透過機構の視点からは、水分子の熱力学透過モデルの構築を行い、透過性能の予測を可能にする。
分子モーター蛋白質のエネルギーランドスケープ理論の構築

ミオシンがアクチンフィラメントに結合したさいに、ミオシンがアクチンフィラメントから解離しないままモータードメインが複数回に分かれた一方向的なステップ状運動を行うことが、一分子実験により観測されている(Kitamura et al., Nature 397,129-134(1999))。われわれはその運動が、アクトミオシンが弱い結合状態から強い結合状態へ向かうときにミオシンが隣のサブユニットに移動する方が移動しない場合よりも自由エネルギー障壁が低くなっているものとして解釈できることを示した(Terada et al., PNAS 99,9202-9206(2002))。われわれはさらに、立体構造の連続的変化としてどのようなことが起こっているのかを調べるため、アミノ酸レベルで粗視化しアクトミオシン系の立体構造を用いてGo-likeなLennard-Jones相互作用のもとで分子動力学計算を行い、滑り運動を可能にする条件を探ってきた。今年度はミオシン尾部の高さに加えて向きを固定するとともに、相互作用の強さを以前より弱めに調整することにより、浮いてしまう事象や固定したまま動かない事象を大幅に減らすことができた。また、従来と同様に後ろ方向よりも前方向に滑りやすい傾向が見られたが、新たに静電相互作用を表現するポテンシャルを導入することにより、2ステップ分の距離にわたり一方向的に移動する事象が得られた。さらに、滑る事象においてはしばしば、ミオシンがアクチンに特定の向きで結合していることが新たに観察された。これまでに分子モーター蛋白質の構造変化の反応座標をごく少数に縮約してエネルギーランドスケープの形状を直接指定するモデルを用いて、エネルギーランドスケープの形状の設計により一方向的な運動が起こる可能性の存在を指摘し、アクトミオシン系の一方向的な滑り運動を生み出すメカニズムとしての有効性を確認してきた。今年度はそのようなシナリオがより具体的な分子構造の上で実現される事例を探すべく、ミオシン頭部とアクチンフィラメントからなるアクトミオシン系について、全原子計算を行う代わりにアミノ酸1個をCα炭素原子1個に粗視化して、相互作用は郷モデルをベースとしたものを用いて分子動力学計算を行っている。これまでに分子動力学計算のコードの開発はほぼ終了しており、アミノ酸残基間の相互作用として、特異的な相互作用をあらわすGo-like Lennard-Jonesポテンシャル、非特異的な引力をあらわすLennard-Jonesポテンシャル、静電相互作用を組み合わせたものを用い、またそのほかに非特異的な引力の特異的な引力に対する相対的な強さ、温度、ミオシンのアクチンフィラメントへの接近のさせ方、ミオシン尾部の固定のさせ方など、様々な条件を変化させている。現在までに行った計算で、ミオシン頭部がアクチンフィラメントの上を滑り運動するような事象を作り出すことができた。しかし、ミオシンがアクチンフィラメントから解離してしまう事象の割合が大きく、滑り運動が起こる事例は存在するもののまだ非常にまれであるといわざるを得ない。特にその一方向性について統計的な議論を行うためには、より頻繁に滑り運動が起こるような条件の組み合わせをさらに探していく必要がある。これまで、アミノ酸レベルで粗視化したアクトミオシン系の立体構造に対して、フォールディング機構の記述に一定の成功を収めているGo-likeなLennard-Jonesポテンシャルを用いることにより分子動力学計算を行い、滑り運動を可能にする条件を探ってきたが、今年度は統計量を稼ぐ目的でさらに大量の計算を行い、その結果を解析した。これまでの計算の結果、1080トラジェクトリのうち5割程度で最初の結合位置から滑らず、4割程度でミオシンがアクチンから解離したが、残りの1割程度は結合を保ったままアクチンフィラメントに沿って前後に滑った。実験においても滑った事象のみを取り出して観測しているため、試行回数全体に対する滑る事象の数の少なさは実験とは矛盾しない。注目すべきことに、1ステップ程度にわたって滑った事象の数は、後方向は4トラジェクトリに対して前方向は30トラジェクトリで、明らかに前方向へ向かう事象の方が多く存在した。このことは、等方的な熱揺らぎのランジュバンダイナミクスによる分子動力学シミュレーションにおいて、ラチェット模型のような非平衡の導入をすることなく、ミオシンの構造変化の一方向性のためにすべり運動の一方向性を得ることができることを示している。しかしながら、現状ではほとんどの場合およそ1ステップ分しか滑っておらず、現在は計算時間節約のため固定しているアクチンフィラメントの構造を動かすことや、ポテンシャルエネルギーの改善など、さらなるモデルの改変を計画している。

今年度はミオシン尾部の高さに加えて向きを固定するとともに、相互作用の強さを以前より弱めに調整することにより、浮いてしまう事象や固定したまま動かない事象を大幅に減らすことができた。また、従来と同様に後ろ方向よりも前方向に滑りやすい傾向が見られたが、新たに静電相互作用を表現するポテンシャルを導入することにより、2ステップ分の距離にわたり一方向的に移動する事象が得られた。さらに、滑る事象においてはしばしば、ミオシンがアクチンに特定の向きで結合していることが新たに観察された。
生命システムのアドホックな進化

生物は概日リズムと呼ばれる約24時間周期の活動リズムを示す。システム内外に変動がある場合にも機能を維持できる性質はロバストネスと呼ばれる。細胞内には様々な変動があるにも関わらず、概日リズムは安定して維持される。つまり、概日リズムはロバストである。我々は、生物の概日リズム発振機構がロバストネスを最大化する構造ではないことを明らかにし、概日リズム発振機構がアドホックな進化を通して獲得された局所解であるという仮説を立てた。本研究の目的はこの仮説を証明することである。我々は、これまでに生化学システムのダイナミックモデルのロバストネスを定量化するために、疑似マルチパラメータ感度(QMPS: Quasi-MultiParameter Sensitivity)解析を開発している。これを概日リズムのシンプルモデルに適用し、そのシステム構造の違いが振動のロバストネスに与える影響を調べた。その結果、デュアルフィードバックとリダンダントフィードバックは2つの同一のフィードバックを持つ場合にロバストな振動を生み出すことが明らかになった。次に、概日リズムのシンプルモデルに周期的な光刺激を与えたときに同調が起きるか調べた。その結果、デュアルフィードバック構造は、明暗サイクルの周期が24時間から離れている場合や光が強い場合にも正常に同調することができた。ショウジョウバエと哺乳類の概日リズムに見られるインターロックフィードバック構造はデュアルフィードバックとセミデュアルフィードバックが組み合わされた構造である。セミデュアルフィードバック構造から出発し、そのロバストネスや光応答性を補うためにデュアルフィードバックが獲得された結果、インターロックフィードバック構造が得られたと予想される。我々は、多数のパラメータセットを得るための探索法Two-phase search法とロバストネスの正確な指標Quasi-multiparameter sensitivityを開発した。そして、これらを用いることで、概日リズムの生体分子ネットワークが獲得される過程の一端を明らかにした。Two-phase search法は従来法よりも少ない計算コストで多数のパラメータセットを探索することができる。同様に、Quasi-multiparameter sensitivityは少ない計算コストでロバストネスを定量化することができる。しかし、それでも大規模な生体分子ネットワークのダイナミックモデルを扱うことができない。現在、これを解決するために分割統治法と組み合わせた手法を開発中である。今年度の成果は、生化学システムのロバストネス解析法と多目的最適化手法の開発である。我々は、生化学システムのダイナミックモデルのロバストネスを定量化するために、疑似マルチパラメータ感度(QMPS : Quasi-MultiParameter Sensitivity)解析を開発した。これによって従来より少ない計算コストでロバストネスを定量化することが可能になった。これに加えてQMPSは、どのシステム構造がロバストネスを向上させるかについて理論的な説明を与える。ロバストネスと光応答性という2つの観点から概日リズムの進化シミュレーションを行うには、生化学システムの多目的最適化技術が必要である。我々は、生化学システムのパラメータ最適化手法IPES (Integrative and Practical Evolutionary Search)を開発した。IPESは、定性的な挙動を扱う目的関数、モジュール分割統合、多目的最適化を特徴とするパラメータ最適化手法である。我々は、出芽酵母の細胞周期ダイナミックモデルの最適化を通してIPESの有効性を示した.生物は概日リズムと呼ばれる約24時間周期の活動リズムを示す。

そして、これらを用いることで、概日リズムの生体分子ネットワークが獲得される過程の一端を明らかにした。Two-phase search法は従来法よりも少ない計算コストで多数のパラメータセットを探索することができる。同様に、Quasi-multiparameter sensitivityは少ない計算コストでロバストネスを定量化することができる。しかし、それでも大規模な生体分子ネットワークのダイナミックモデルを扱うことができない。現在、これを解決するために分割統治法と組み合わせた手法を開発中である。
C型肝炎ウイルスの脂肪滴形成機構

(1)HCVcc感染Huh-7.5細胞でSPG20が切断される。(2)HCV NS3/4Aを一過性にhuh-7細胞に発現させるとSPG20が切断される。(3)不活化型NS3/4Aを発現させてもSPG20は切断されない。(4)NS3/4A阻害剤でSPG20の切断が抑制されるが、NS5A阻害剤では変化がなかった。(5)HCVcc感染細胞Huh-7.5にNS3/4A阻害剤を投与すると脂肪滴の大きさも縮小した。以上よりHCV感染細胞においてはNS3/4AプロテアーゼがSPG20を切断し、脂肪滴の巨大化を促進することが示された。HCVの粒子形成は脂肪滴近傍の小胞体膜上で起こり、脂肪滴形成がウイルス産生にきわめて重要である。HCV感染に伴う脂肪滴形成にはウイルス蛋白質Core, NS5Aや、宿主因子DGAT1, TIP47, ApoB, ApoEが重要とされるが、未だ全貌は明らかでない。近年、脂肪滴形成の制御機構の解明が進み、宿主因子SPG20,ユビキチンリガーゼAIP2/AIP4/AIP5, Adipophilinが重要な調節因子として同定された。そこで、本研究では、HCV感染における脂肪滴形成にSPG20, AIP2/AIP4/AIP5, Adipophilinなどの宿主因子が果たす役割を解析した。HCV J6/JFH1をHuh7.5細胞に感染させ、AIP4の蛋白質量,リン酸化Itch, JNK1, c-Jun,リン酸化c-Junの量の変化を各種抗体を用いたウエスタンブロット法で解析した。以前に我々が報告しているようにHCVcc感染後、JNK1が活性化された。これにはROS産生が関与していると考えられた。また、HCVcc感染後、JNK1が活性化に伴い、AIP4のリン酸化が亢進した。また、脂肪滴結合蛋白質であるAdipophilinの量が減少し、SPG20の発現量も減少した。SPG20は脂肪滴の大きさの調節に関与することが報告されている。HCVcc感染細胞と非感染細胞をBodipyで脂肪滴の染色を行い、大きさを比較したところ、HCVcc感染により脂肪滴の肥大化が認められた。HCVcc感染に伴うJNK1やAIP4のリン酸化の変化が脂肪滴形成の促進に関与する可能性が示された。HCV粒子形成は脂肪滴近傍の小胞体膜上で起こり、脂肪滴形成がウイルス産生にきわめて重要である。HCV感染に伴う脂肪滴形成にはウイルス蛋白質Core, NS5Aや宿主因子DGAT1, TIP47, ApoB, ApoEなどが重要であると考えられているが、未だ全貌は明らかでない。そこで、本研究ではHCV感染に伴う脂肪滴形成のウイルス蛋白質の役割と重要な宿主因子について解析を進めた。今年度の解析の中でHCV NS5A蛋白質に結合する新規宿主因子として脱ユビキチン化酵素OTUD7Bを同定した。OTUD7BはNF-kB経路を負に調節する因子として知られている。NS5Aはdomain IでOTUD7Bと相互作用することを免疫沈降法で明らかにした。また、NS5AはOTUD7Bと細胞質で共局在した。さらにNS5AとOTUD7Bを共発現させるとOTUD7Bの脱ユビキチン化酵素活性を促進することから、NS5Aは相互作用を介して、OTUD7Bがユビキチン化を調節する宿主因子の安定性に関与する可能性が示された。次に、HCV感染によりSPG20が減少することを見いだし、HCV感染によりSPG20の切断が促進されることを見いだした。SPG20は脂肪滴の大きさの調節に関与することが知られており、SPG20の切断と脂肪滴形成機構に機能的な関連がある可能性が示唆された。今後はSPG20切断に関与する因子をウイルス因子と宿主因子の両方から解析して明らかにしていきたい。平成27年度はHCV NS5Aの新規結合因子OTUD7Bを同定した。NS5AとOTUD7Bの相互作用がOTUD7Bの脱ユビキチン化酵素活性を促進することから、OUTD7Bの活性亢進と脂肪滴形成の関与が示唆された。また、HCV感染によるSPG20減少の機序が蛋白分解酵素による切断である可能性が示された。この分子機序を明らかにできれば、脂肪滴形成を阻害できる新規治療法につながる可能性があり、おおむね順調に進展していると考える。肝細胞内の脂肪滴がHCV粒子産生の中心的役割を果たすことが知られている。本研究ではHCV感染による脂肪滴形成機構について解析した。ヒト遺伝性皮質脊髄系神経変性疾患Hereditary spastic paraplegia(HSP)の研究でSPG20遺伝子が原因遺伝子として同定された。SPG20の細胞内機能が解析され、脂肪滴サイズ調節の制御因子であることが明らかにされた。SPG20は脂肪滴に結合する宿主蛋白質でPPxYmotifを有し、AIP4などのHECT型ユビキチンリガーゼのWWdomainと結合し、脂肪滴近傍へとリクルートする。そして、脂肪滴に結合したアディポフィリンをユビキチン化し、プロテアソーム依存性に分解し、脂肪滴巨大化を静止させる。

つまり、アディポフィリンが存在する間は脂肪滴が大きくなり続け、アディポフィリンが分解されると脂肪滴の形成は停止しやがて消退する。我々はSPG20に注目し、これまでにHCV NS3/4AプロテアーゼがSPG20を切断し、脂肪滴巨大化を誘導することを示唆する実験結果を得た。これまでに1)HCVcc感染Huh-7.5細胞でSPG20が切断される、2) HCV NS3/4Aを一過性にHuh-7細胞に発現させるとSPG20が切断される、3)不活化型NS3/4AではSPG20は切断されない、4) NS3/4A阻害剤でSPG20の切断が抑制されるが、NS5A阻害剤では変化がないことから、HCV NS3/4AプロテアーゼがSPG20切断する活性であることが強く示唆された。以上のようにNS3/4AプロテアーゼによるSPG20の切断と脂肪滴巨大化における役割について解析した。(1)HCVcc感染Huh-7.5細胞でSPG20が切断される。(2)HCV NS3/4Aを一過性にhuh-7細胞に発現させるとSPG20が切断される。(3)不活化型NS3/4Aを発現させてもSPG20は切断されない。(4)NS3/4A阻害剤でSPG20の切断が抑制されるが、NS5A阻害剤では変化がなかった。(5)HCVcc感染細胞Huh-7.5にNS3/4A阻害剤を投与すると脂肪滴の大きさも縮小した。以上よりHCV感染細胞においてはNS3/4AプロテアーゼがSPG20を切断し、脂肪滴の巨大化を促進することが示された。平成26年度はHCV感染細胞における脂肪滴調節系への影響を解析した。実験系としてはHuh-7.5細胞にHCV J6/JFH1を感染させ、AIP2/AIP4/AIP5, Adipophilinの蛋白質量およびリン酸化状態をウエスタンブロット法で定量した。また、細胞内脂肪滴の観察を行い、HCV感染細胞と対照細胞をBodipy染色で脂肪滴を染色し、Biozero BZ-9000で観察し、計測画像処理モジュールで脂肪滴サイズを比較した。脂肪滴とAIP4, Adipophilin, SPG20の細胞内局在をBodipyと各抗体を用いて免疫蛍光染色法にて脂肪滴と各蛋白質の細胞内局在を解析しており、概ね順調に進展している。今後はSPG20の切断を担う因子をウイルス側因子(NS3/4Aプロテアーゼ、NS2プロテアーゼ)や宿主側因子(NS3/4Aなどで活性が変化する細胞内プロテアーゼ)を明らかにしていく。HCV感染によるSPG20, AIP2/AIP4/AIP5, Adipophilinの量的変化について解析する。SPG20の切断酵素を阻害した場合の脂肪滴肥大化への抑制効果を各種阻害剤、siRNAなどを用いて解析していく。ウイルス学今後は、Adipophilinの蛋白質半減期解析を行う。HCV感染細胞と非感染細胞でAdipophilinの半減期をCycloheximide chase実験にて行う。HCV感染によるSPG20, AIP2/AIP4/AIP5, AdipophilinのmRNA量をreal time PCR法で解析する。また、SPG20のリン酸化、メチル化、モノユビキチン化、SUMO化などの翻訳後修飾を各種抗体にて解析する。各HCV蛋白質の関与について解析する。さらに各genotypeのキメラウイルスを用いて脂肪滴制御蛋白質への影響を検証し、特異性を解析する。さらに初代ヒト肝培養細胞(primary human hepatocyte)を用いた解析を進める。今年度は旅費を予定より少額しか使用しなかった。