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概念知識に基づく母語からの理工系専門日本語習得方法に関する研究

本研究はアジア諸国からの理工系留学生のための日本語学習支援をし、多言語による学習システム構築を最終目的としている。本年度も前年度に引き続き学習者の母語での既得専門語概念知識を利用し、未知の表現形式としての日本語との対応関係を解明し、専門文献読解支援および文書作成支援のための辞書構築を行ってきた。第二言語学習理論・情報工学・教育工学の専門的な見地から中間言語理論および概念シラバス教育法への新しい知見を導入する学際的な研究を進め、理系特有の高頻度語に注目した。大学院レベルの日本語学習者は「専門の既知概念を新しい言語形式である日本語に対応させるプロセスを脳内で行っている。」という認知的仮説が考えられるが、この検証のために構文・意味の両面から分析し、概念と言語形式の関係を明らかにし、新たな言語学習理論の緒口を探った。学習者の母語で文章が理解できるようにするためのシステム構築の基礎研究をして、以下のことを行った形態素解析およびその結果から、対訳辞書ヘリンクさせる。昨年はタイ語を扱って、本年度はインドネシア語、中国語に重点をおいた。そこで生じる複雑な意味の多様性を解消する方法を探った。意味絞込みの手段として構文解析が有効な手段であり、構文解析による格情報は特に述語の意味の絞込みには有効である。目下は京都大学で開発されたJUMANによって形態素解析を行い、さらにKNPによって構文解析を行い、その解析結果の問題点を検討した。また本年度問題点として明示化されたこととしては研究対象の言語の中に日本語にある概念に相当する語がしばしばないということであった。本研究はアジア諸国からの理工系留学生のための目本語学習支援をし、多言語による学習システム構築を最終目的としている。本年度は最終年度での研究のまとめに当たり、引き続き学習者の母語での既得専門語概念知識を利用し、未知の表現形式としての日本語との対応関係を解明し、専門文献読解支援および文書作成支援のための辞書構築を行ってきた。第二言語学習理論・情報工学・教育工学の専門的な見地から中間言語理論および概念シラバス教育法への新しい知見を導入する学際的な研究を進めた。学習者の母語で文章が理解できるようにするためのシステム構築の基礎研究をして、以下のことを行った形態素解析およびその結果から、対訳辞書へリンクさせる。意味絞込みの手段として構文解析が有効な手段であり、構文解析による格情報は特に述語の意味の絞込みには有効であるという仮説に基づき、構文表示を見せて曖昧な解釈の成り立つ文の理解に関する学習評価実験を13年1月に行った。実験結果の解析で、さらなる検証が必要であると考え、再度実験を行う予定である。現在までの結果からは、中級レベル程度の学習者には、構文情報が役立つという仮説が指示される可能性が高いと言える。
光干渉断層法を用いた肺高血圧症の新規組織診断方法の確立

今回、慢性血栓塞栓性肺高血圧症(CTEPH)を対象に、バルーン肺動脈形成術(BPA)施行時に、病変部をOFDI(optical frequency domain imaging)を用いて観察し、病変形態の検討を行った。当院でBPAを施行した非手術適応のCTEPH患者31名を対象とし、92病変でOFDIによる病変形態の観察を行った。メッシュ様閉塞病変を63病変で、スリット状構造物を28病変で、壁在血栓を52病変で認めた。65病変(71%)は、2つ以上の病変形態を有し、14病変(15%)は3つすべての病変形態が混在していた。肺高血圧症において、病理組織の検討は、病変の重症度や肺静脈閉塞合併の有無を明らかにするための有用な検査方法だが、侵襲的で術後に肺高血圧症の増悪を来す恐れがあるため、一般的には行われていない。しかし、これらの情報は、予後の推定や治療方針の決定に有用であり、低侵襲の肺微細構造の評価方法の確立が必要と考えられる。そこで、これまで慢性肺血栓塞栓性肺高血圧症(CTEPH)の診断で用いてきた光干渉断層法(OCT)を使用し肺動脈周囲の微細構造を組織学的に診断する方法を新規に確立するため、本研究を計画した。まず、これまでデータの蓄積のあるCTEPH患者において収集したデータを解析し、肺動脈内および肺血管周囲の組織について検討を行った。これらの成果については、後述するように2015年の学会で成果を発表している。CTEPH 31症例、92病変でOCTおよびOFDIによる病変形態の観察が行われ、メッシュ様閉塞病変を63病変で、スリット状構造物を28病変で、壁在血栓を52病変で認めた。さらに、肺動脈周囲組織についても検討を行ったが、肺動脈周囲の静脈について、OCT(あるいはOFDI)を用いて解析を行う事が困難であり、肺動脈のリモデリングに焦点を当て、生命予後や、治療効果を予測するための形態的分類を発見できるように研究を継続する方針である。これまで収集した慢性血栓塞栓性肺高血圧症(CTEPH)患者において収集したデータを解析し、肺動脈内および肺血管周囲の組織について検討を行った。31症例、計330病変のOCT画像を解析し、肺動脈内の病変形態を詳細に分類した。さらに、肺動脈周囲組織についても検討を行ったが、観察可能な範囲の肺動脈径が予想以上に大きく、近赤外線の減衰により肺動脈周囲の静脈について、OCT(あるいはOFDI)を用いて解析を行う事が困難であった。肺動脈性肺高血圧症のOFDI所見では、肺静脈病変の検出が困難であったため、慢性血栓塞栓性肺高血圧症(CTEPH)において、肺動脈病変の観察と評価を行った。また、CTEPHにおける酸素化の改善とバルーン肺動脈形成術の関連についても評価を行った。BPA施行時は、肺動脈造影の所見から病変の有無やその範囲を診断することが一般的であり、血管内イメージングにより病変の形態を詳細に観察した報告は少ない。我々はBPA施行時に、病変部をOFDI(optical frequency domain imaging)を用いて観察し、病変形態の検討を行った。当院でBPAを施行した非手術適応のCTEPH患者31名(平均年齢63歳、女性27例(87%))を対象とし、330病変に対し治療を行い、そのうち92病変(28%)でOFDIによる病変形態の観察が行われ、メッシュ様閉塞病変を63病変で、スリット状構造物を28病変で、壁在血栓を52病変で認めた。OFDIにより、CTEPHの病変は複雑な形態を有していることが明らかになった。血管造影のみでは、病変の範囲を特定する事が困難な場合もあるため、OFDIは治療範囲の決定にも有用である可能性があり、さらに検討が必要であると考えられた。また、同様の患者を対象にBPAがシャント率に与える影響も検討している。術前後で比較すると平均肺動脈圧(前41±8、後26±7 mmHg, P<0.01)、6分間歩行距離(前372±120、後472±143 m、P<0.01)に加え、酸素飽和度(前87±5、後91±5 %, P<0.01)、A-aDO2(前48±10、後35±11 Torr、P<0.01)も有意に改善していた。さらに肺内シャント率も有意な低下を認めた(前24±7、後21±5 %、P<0.01)。また、肺内シャント率の減少は酸素飽和度の上昇と有意な相関を示した(r2=0.40, P<0.01)。BPAは、CTEPH患者の血行動態のみならず、酸素化も改善させることが示された。

当院でBPAを施行した非手術適応のCTEPH患者31名を対象とし、92病変でOFDIによる病変形態の観察を行った。メッシュ様閉塞病変を63病変で、スリット状構造物を28病変で、壁在血栓を52病変で認めた。65病変(71%)は、2つ以上の病変形態を有し、14病変(15%)は3つすべての病変形態が混在していた。OFDIを用いた観察により、CTEPHの病変は複雑な形態を有していることが明らかになった。血管造影のみでは、病変の範囲を特定する事が困難な場合もあるため、OFDIは治療範囲の決定にも有用である可能性があり、今後さらに検討が必要である。さらに、肺動脈性肺高血圧症でも同様の画像解析を行い、今後は肺動脈のリモデリングに焦点を当て、生命予後や、治療効果を予測するための形態的分類を発見できるように研究を継続する方針である。循環器疾患、肺高血圧症
室温溶液中ナノリンク分子の電気伝導特性の第一原理計算

単一分子架橋構造の伝導特性は理論・実験両面から盛んに研究されてきたが、室温・溶液中で興味深い実験データが多数報告されているにもかかわらず、これに対応する理論解析はあまりされていなかった。そこで本研究では、室温・溶液中での単一分子架橋系の安定性・伝導特性を第一原理計算で解析して、その振る舞いと物理を明らかにすることを目標に研究を進めた。標準的な第一原理分子動力学計算とその結果得られた原子配置に対する非平衡グリーン関数法による伝導特性計算という方法で前年度に金電極間ベンゼンジチオール(BDT)分子の水中での構造および伝導度を解析したが、本年度はフェノールジチオール(PDT)単分子架橋について同様の解析を行い、同じ計算条件で得られたコンダクタンスヒストグラムの形状に大きな違いがあることを見出した。この違いの物理的な意味については検討中であるが、BDT分子が疎水性であるのに対し、PDT分子は親水性の水酸基(OH)を含んでいることと関係していると推測される。次に、非平衡グリーン関数法による分子動力学・伝導特性の一貫計算という、世界的にまだ報告例のほとんどない計算方法についても、水中の金電極間ベンゼンジチオール分子についての前年度の予備計算を踏まえ、計算をさらに進めた。バイアス電圧印加によるコンダクタンスヒストグラムの変化(高コンダクタンス側へのシフト)および分子位置のシフト(負極側S原子が電極から離れる方向へ、正極側S原子が電極に近づく方向へ)を見出した。また当初の計画外だが、領域内の実験グループのデータに刺激を受け、単一分子架橋系におけるスピンフリップ非弾性電流を簡単なモデルで解析し、フリップ確率が分子に含まれる金属原子種に大きく依存していることを明らかにした。単一分子架橋構造の伝導特性は理論・実験両面から盛んに研究されている。しかし室温・溶液中については、興味深い実験データが多数報告されているにもかかわらず、理論解析はあまりされていなかった。そこで本研究では、室温・溶液中での単一分子架橋系の安定性・伝導特性を第一原理計算により解析し、その振る舞いと物理を明らかにすることを目標に研究を進めた。本年度はまず、標準的な第一原理分子動力学計算とその結果得られた原子配置に対する非平衡グリーン関数法による伝導特性計算という方法により、金電極間ベンゼンジチオール分子の水中での構造および伝導度を解析した。その結果、水中と真空中とでは伝導度の平均値が異なるだけでなく、水中の方が伝導度の揺らぎ幅が小さくなることを見出した。さらに、伝導度ヒストグラムの副次的なピークの位置・数が真空中と水中とで異なっていることがわかった。また、これらの特徴が分子中のC-Sボンド長と相関していることを見出した。次に、非平衡グリーン関数法による分子動力学・伝導特性の一貫計算という、世界的にまだ報告例のほとんどない計算方法を試みた。水中の金電極間ベンゼンジチオール分子について予備的な計算を行い、正しく動作してこれまで用いた方法による結果と定性的に一致する振舞いが得られることを確認した。さらに、バイアス電圧を印加した計算も実行できることを確認した。多数の時間ステップにわたる本格的な計算は次年度に行う予定である。
村田春海自筆本の書誌・文献的研究

本研究は、村田春海自筆本を書誌・文献的に位置付けるべく計画されたものである。計画の実行に際して以下の経過、および結果を得た。1まず、自筆本のリスト・アップのために、自筆確定本を選定する作業からはじめた。(1)そのために伝本の確かなもの(天理大学春海文庫本)の中から、贋作が出来にくいもの(草稿本)を選び出し、『古今墨蹟鑑定便覧』などを用いて署名などにより、底本とする自筆本を確定した。その際執筆時期や使用する筆の問題などから2種類の底本を選んだ。(2)次にこの自筆確定本を原資料として字典を作成し、ほかの伝春海自筆本を鑑定した。その過程で春海の筆跡の特徴は把握できたが、同定の作業に客観性を持たせるため、あくまでも慎重に臨んだ。その結果、春海自筆と認定できたものと、存疑とせざるを得ないものに分類した。そのうち、前者について外形的特徴などの書誌データをパソコンにイン・プットした。2次にデータ入力するにあたり、形態的分類として次のような基準を設けた。(1)稿本、(2)写本、(3)校合書入本(含版本)、(4)書簡、(5)詠草の五つである。この分類基準は閲覧可能な自筆体全体を見渡した上での判断であるが、新たな自筆資料の出現にも対応できると思われる。これを内容的な側面からデータ分析を行なった結果、(1)稿本は、国語学関係のものが多く、(2)写本には備忘録が多く、(3)校合書入本には歌書・物語が多い、という結論を得た。(4)書簡は某宛春海書籍の謂であるから、受取人により内容はさまざまであり、(5)詠草は今だに懐紙・短冊ともに市場にも出回っているので、その確たる傾向をつかむには至らなかった。ただ、これらの特徴は飽くまでも残存資料による分析であるので、実像との隔たりは肝に銘じておく必要がある。
自然形成ビアホールを用いたSi基板上縦型AlGaNパワーFETの開発

本年度は我々の開発した導電性AlNバッファー層を用いたAlGaN縦型素子を実現することを目的にその要素技術の開発並びに実際の縦型AlGaN素子の実現を目指した。具体的には、1.Si基板のオーミック電極形成、2.窒化物半導体のレーザー誘起オーミックコンタクト形成、3.ビアホールを用いたSi基板上縦型ショットキーダイオードの形成に関する研究を行った。1.我々の素子は将来のシリコンオンチップ素子も視野に入れたSi基板上の縦型素子であるためにSi基板へのオーミックコンタクトも重要な要素技術である。我々は0.02Ωcmの低抵抗n型Si基板を用いているがそこへのオーミックコンタクト形成条件を明らかにした。その結果、Agを650nm蒸着し2L/minの窒素雰囲気中で800°C、30秒のシンタリングが良いオーミック条件を与えることがわかった。2.また素子を形成するためにはリソグラフィー技術に頼らないドライなプロセスが望まれる。我々は波長193nmのエキシマーレーザを用いて局所的にMgドープGaNを任意の場所でp化できる事を示してきたが同様に355nmのレーザーを用いてオーミックコンタクトが形成できる事が今年度の研究でわかった。これによりレジストプロセスによらない縦型素子形成の可能性が開けた。3.我々は今回の実験で実際に自然形成ビアホールを用いた縦型ショットキー素子の形成を試みた。その結果Si基板上に世界ではじめてMOCVDエピタキシャル成長のみでAlGaNショットキー素子実現に成功した。電極直径は400μm、電極はNi/Tiを用いた。得られた結果は±20Vでの順逆方向電流比は約1E4倍、オン抵抗は17V(5mA)で約1900mΩ・cm2であった。具体的な素子を作ることに成功したことにより、自然形成ビアホールを用いた縦型FETをSi基板上に形成できる可能性が明確になった。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。AlGaNを用いた電子デバイスはSi,SiCやGaNを用いた電子デバイスに比べて高耐圧特性を持ち、周波数特性もよい。従って、AlGaNを用いた高耐圧、高周波、高出力電子デバイスが実現できれば、次世代型デバイスを実現できる事になる。我々はAlGaN-FETを世界で始めて実現し、またSi基板上に自然形成ビアホールを作製することで導電性AlNバッファー層の開発に成功し、Si基板上縦型深紫外LED並びに縦型深紫外光センサーを実現してきた。本研究は我々が新たに開発したAlGaN-FET作製技術並びに自然形成ビアホール形成技術を駆使し、Si基板上縦型パワーAlGaN-FETの実現可能性を原理実証することを目的とする。今年度は上記の目的を達成するために、本研究の根幹である自然形成ビアホールの形成過程並びにそのビアホールを通しての電気伝導の制御の方法を明らかにする事がまず必要であることが解り、本年度はその問題解決に取り組んだ。その結果Si基板上のAlNにおける自然形成ビアホールの形成は結晶成長時に行うAl先出によるAlSi合金とSi基板との表面エネルギーの違いにより選択的にAlNがSi基板上に成長しAlN層にビアホールが形成されることが解った。この結果Alの先出量並びにその時の温度によりビアホールの数、大きさが制御できることが解りそれに従い導電性の高いビアホールを形成されたAlN層を実現できる展望が開けた。またビアホール上に堆積するAlGaN結晶成長においてその成長モードを制御することにより、クラックのない平坦なAlGaNエピタキシャル層が実現できることがわかった。導電性AlNを実現しそれを制御するために、その形成機構を明らかにする必要があることが解り、本年度はまずそれに取り組み所望の成果を得ることができた。またそれを用いてデバイスを実現する過程において、所持している有機金属結晶成長装置が15年位たっているために老朽化に伴う装置故障(水素純化装置の故障、炉の温度調節装置の故障、成長モニター装置の故障、窒素供給装置、排気系ロータリーポンプ等)が続出しその修理と保全に多くの時間をとられ、デバイス化に向けての研究が遅れた。現在は完全に復旧し結晶成長が再開できる状態になっており、デバイス化に向けて結晶成長を再開している。本年度の研究計画は1vーAlN層の結晶成長を素子実現の視点で最適化する。2高性能素子を実現するためにAlGaNの高品質化を図る。3縦型素子を実現するために新たなGaN,AlGaNの局所pー化の方法を開発する。4実際に縦型素子の作成を試み、その動作可能性を明らかにする、であった。これらの研究計画に基づき本年度は以下の成果を上げた。1.Si基板上にクラックフリー、かつ反りのほとんどないAlGaN結晶を作成できる事がわかった。結晶成長におけるキャリアガスの水素、また原料ガスのアンモニア純度が結晶成長に大きく影響することも明らかになり、これらを制御することの重要性が高品質AlGaN結晶成長に於いて重要であることがわかってきた。2.エキシマーレーザ(193nm)を用いMgドープGaNにレーザを局所的に照射することにより、Mg:GaNを局所pー化できる事がわかった。またその空間分解能はKFM測定よりを約1ミクロンときわめて高く、またレーザ照射により試料に全くダメッジが入らない条件があることもわかった。

これは縦型FETを形成する上で最大の問題である局所p層の形成によるキャリアブロック層の形成における結晶中断、パターン形成、結晶再成長という従来の複雑な工程をとることなく直接キャリアーブロック層をレーザ照射のみで形成し簡便なプロセスで縦型素子を実現できる可能性を示唆しており重要な研究結果である。3.Si基板上に自然形成ビアホールを用いて形成した導電性AlN上にn-AlGaN層を形成しショットキー電極による縦型ショットキー素子実現の実験に取り組んだ。これは我々の開発した自然形成ビアホールが実際に電子素子実現にも十分対応しえることを示したもので、上記レーザによる局所pー化法と組み合わせるもので本研究の狙いである。本研究によりエキシマレーザによる「レーザ局所pー化法」を新たに開発しその空間分解能が1ミクロン相当であることがわかった。従来、縦型窒化物半導体縦型素子実現に必要不可欠であるp型キャリアブロック層形成は、主に結晶の再成長法によりなされていた。しかし本研究で開発できた「レーザ局所pー化法」では結晶の再成長は必要なく簡便な方法で縦型電子素子を作ることができる可能性を示しており、画期的な縦型デバイス作成法となり得る。これは当初予期していなかったことであり、予想以上の新たな進展と言える。本年度は我々の開発した導電性AlNバッファー層を用いたAlGaN縦型素子を実現することを目的にその要素技術の開発並びに実際の縦型AlGaN素子の実現を目指した。具体的には、1.Si基板のオーミック電極形成、2.窒化物半導体のレーザー誘起オーミックコンタクト形成、3.ビアホールを用いたSi基板上縦型ショットキーダイオードの形成に関する研究を行った。1.我々の素子は将来のシリコンオンチップ素子も視野に入れたSi基板上の縦型素子であるためにSi基板へのオーミックコンタクトも重要な要素技術である。我々は0.02Ωcmの低抵抗n型Si基板を用いているがそこへのオーミックコンタクト形成条件を明らかにした。その結果、Agを650nm蒸着し2L/minの窒素雰囲気中で800°C、30秒のシンタリングが良いオーミック条件を与えることがわかった。2.また素子を形成するためにはリソグラフィー技術に頼らないドライなプロセスが望まれる。我々は波長193nmのエキシマーレーザを用いて局所的にMgドープGaNを任意の場所でp化できる事を示してきたが同様に355nmのレーザーを用いてオーミックコンタクトが形成できる事が今年度の研究でわかった。これによりレジストプロセスによらない縦型素子形成の可能性が開けた。3.我々は今回の実験で実際に自然形成ビアホールを用いた縦型ショットキー素子の形成を試みた。その結果Si基板上に世界ではじめてMOCVDエピタキシャル成長のみでAlGaNショットキー素子実現に成功した。電極直径は400μm、電極はNi/Tiを用いた。得られた結果は±20Vでの順逆方向電流比は約1E4倍、オン抵抗は17V(5mA)で約1900mΩ・cm2であった。具体的な素子を作ることに成功したことにより、自然形成ビアホールを用いた縦型FETをSi基板上に形成できる可能性が明確になった。前年度の研究で導電性AlNの形成機構並びに制御方法が明らかになったので、この結果に基づいて本年度は研究を行う。
放射線アポトーシスにおけるミトコンドリア膜透過性の制御機構

細胞をアポトーシスに導くBaxという蛋白質とアポトーシスを抑制するBcl-xLという蛋白質について多量体化とアポトーシスの関係を明確にするため,目的蛋白質を大量に得られる系を確立し,光散乱測定を計画した.また,同蛋白質を哺乳類細胞で発現させ,ミトコンドリアヘの局在化を確認した.1.遺伝子操作による目的蛋白質の大量発現大腸菌によってBaxおよびとBcl-xLを高い純度で得られる発現系と精製系を確立した.遺伝子操作は,PCR装置と遺伝子導入装置を用いて行い,構築した大きなサイズを持つプラスミドを効率よく菌内に導入した.N末の多量体化への関与が報告されたため,BaxとBcl-xLはC末にT7・Tagを付加した蛋白質とN末にHis・tagを付加した蛋白質を発現させた.N末のHis・tagは蛋白質精製後thrombinでtagを切断して野生型の蛋白を得られるようにした.シークエンサーでDNA配列を確認後,蛋白質を発現させた.2.光散乱測定光散乱をDynaPro801にて測定するため蛋白の調製と測定条件の検討を進めている.モノマーの測定はSoybean trypsin (23kDa)をスタンダード蛋白質として用いることとし,多量体についてはnOG, Triton, Tweenの界面活性剤を加えることによってポジティブコントロールとすることにした.今後BakのBH3 domain, BidのBH3 domainを加え多量体化の有無を観察する予定である.本年度は細胞をアポトーシスに導くBaxという蛋白質とアポトーシスを抑制するBcl-2,Bcl-x_Lという蛋白質についてその役割を明確にするため,目的蛋白質を大量に得られる系を確立し,同蛋白質を哺乳類細胞で発現させ,ミトコンドリアへの局在化を確認した.1.遺伝子操作による目的蛋白質の大量発現大腸菌によってBaxおよびBcl-2とBcl-x_Lを高い純度で得られる発現系と精製系を確立した.遺伝子操作は,PCR装置と遺伝子導入装置を用いて行い,構築した大きなサイズを持つプラスミドを効率よく菌内に導入した.Bcl-2とBcl-x_LはHis6-tagとグリーンフルオレッセンスプロテイン(GFP),BaxはHis6-tagとブルーフルオレッセンスプロテイン(BFP)とのフュージョン蛋白質の形で発現させ,後の精製や膜への局在化の観察に有利なように工夫した.シークエンサーでDNA配列を確認後,蛋白質を発現させた.BaxとVDACというミトコンドリア上の蛋白質の相互作用が予測されたため,VDACの変異体および大量発現系の確立を計画し,進行中である.2.Bcl-2の野生型の哺乳類細胞における発現Bcl-2の野生型を蛍光標識蛋白質GFPと融合した形で哺乳類細胞中で大量発現させ,そのミトコンドリアへの局在化を蛍光顕微鏡により確認した.現在,Baxの発現とVDACとの結合に重要なドメインを明らかにするため変異体を作成中である.細胞をアポトーシスに導くBaxという蛋白質とアポトーシスを抑制するBcl-xLという蛋白質について多量体化とアポトーシスの関係を明確にするため,目的蛋白質を大量に得られる系を確立し,光散乱測定を計画した.また,同蛋白質を哺乳類細胞で発現させ,ミトコンドリアヘの局在化を確認した.1.遺伝子操作による目的蛋白質の大量発現大腸菌によってBaxおよびとBcl-xLを高い純度で得られる発現系と精製系を確立した.遺伝子操作は,PCR装置と遺伝子導入装置を用いて行い,構築した大きなサイズを持つプラスミドを効率よく菌内に導入した.N末の多量体化への関与が報告されたため,BaxとBcl-xLはC末にT7・Tagを付加した蛋白質とN末にHis・tagを付加した蛋白質を発現させた.N末のHis・tagは蛋白質精製後thrombinでtagを切断して野生型の蛋白を得られるようにした.シークエンサーでDNA配列を確認後,蛋白質を発現させた.2.光散乱測定光散乱をDynaPro801にて測定するため蛋白の調製と測定条件の検討を進めている.モノマーの測定はSoybean trypsin (23kDa)をスタンダード蛋白質として用いることとし,多量体についてはnOG, Triton, Tweenの界面活性剤を加えることによってポジティブコントロールとすることにした.今後BakのBH3 domain, BidのBH3 domainを加え多量体化の有無を観察する予定である.
テラヘルツ顕微鏡による量子ホール素子からのサイクロトロン発光イメージング

本年度はテラヘルツ分光顕微鏡の更なる高分解能化に必須である、近接場光学の本顕微鏡への応用に関して基礎的技術の研究・開発を行った。理論的には分解能の飛躍的向上が期待され、量子ホール系についてならばエッジチャネルにおける非平衡分布の詳細やホットスポットにおける緩和過程をより明白に明らかにする事が可能となる。また、テラヘルツ帯域でのメージング・分光技術自体は極めて汎用性の高い技術であり、量子ホール系に限らず多くの分野への応用が期待される。現在開発している顕微鏡は、光源の近傍に局在する振動電磁場をアンテナを用いて抽出・検出する事で光学系の回折限界を超えた分解能を実現する事を目指している。これまでにテラヘルツ分光顕微鏡の焦点に、電子線描画装置を用いて作成したμmオーダーのサイズの平面アンテナを取り付け、ピエゾ素子を用いた高精度XYステージ上の量子ホール素子の表面をスキャンする事に成功している。現在、二次元電子系のある試料表面のスキャンを行う事に起因して、二次元電子系に異常が生じるという問題に直面している。だがそれは保護膜等によって解決可能であり、今後の大きな進展が期待される。磁場中2次元電子系に生じた非平衡電子は再結合時にサイクロトロン発光を生じる。そこでその発光を検出することが可能なテラヘルツ顕微鏡の開発及び改良を行い、非平衡電子の空間分布を明らかにする測定を行ってきた。この手法は、これまでの伝導度測定や外部からの摂動に対しての応答からを探るという間接的なアプローチとは異なり、直接量子ホール系における電子のダイナミクスを明らかにする事が可能であるという点において画期的である。これまでに、電子の注入・抽出に伴う非平衡電子分布である"ホットスポット"の存在や、エッジに生じた非平衡電子等を明らかにする事に成功した。さらに本研究では上に述べたような局所的なサイクロトロン発光に対する分光技術の開発及び測定を行った。伝導帯バンドの非放物線から、GaAs/AlGaAsヘテロ接合面に生じる2次元電子系はランダウ準位が等間隔ではない。それは、分光を行うことで電子のエネルギー分布を明らかにすることが可能である事を意味する。これまではその発光強度が極めて弱いことが大きな制約となっていたが、本研究おける検出器の改良によって分光測定が初めて可能となった。現在までに、ホットスポット及びエッジにおけるサイクロトロン発光スペクトルの電流依存性を測定した。エッジにおける発光は電流によらず一定のローレンチアン型のスペクトルを得られる対し、ホットスポットでは電流が増加するにつれて非対称になる、つまりより高次のランダウ準位に非平衡電子が分布していることが確認できた。これは両者の非平衡電子の生成メカニズムが異なっていることを示している。また、その結果からホットスポットにおける電子温度の見積もりを行い、50μAで約100K・300μAで200Kという結果を得た。このとき、格子温度及びバルクの2次電子元系はほぼ4.2Kであり、極めて対照的である。さらに今年度は量子ホール効果崩壊現象に伴う非平衡電子分布に関しての研究を行い、比較的周期的な縞状の電子温度分布を実験的に示すことができた。さらにコルビノと呼ばれるホットスポットの存在しない試料や、大きさの異なる試料等での測定も行った。これらの実験の結果、この縞は電子系が熱力学的双安定状態にあることに起因すると考えられ、現在はその理論的検証を行っている。また現在、顕微鏡の改良も行っている。これまではレンズを組み合わせた光学系を使用していたため、回折によって分解能の上限は制限されていた。そこで、近接場光を利用することで、回折限界に囚われない高分解能の顕微鏡の開発を行っている。
ウシラクトフェリンを用いたトキソプラズマ原虫の生体機能の解明

トランスフェリンファミリータンパク質であるラクトフェリン、トランスフェリン、オボトランスフェリンはそれぞれ哺乳類、鳥類などの生体内に分泌される分子量約80,000の鉄結合性タンパク質である。そこで本研究の目的は、トキソプラズマのラクトフェリン、トランスフェリン、オボトランスフェリン結合タンパク質を解析する事によって、原虫の鉄代謝機構を解明することこである。さらに本研究の成果は、抗生物質とは異なった新しい抗原虫病治療薬やワクチンの開発へつながるものと期待できる。そこで、我々はトキソプラズマ原虫のトランスファミリータンパク質に対する結合性タンパク質を解析するために、far Western blot法によって鉄結合性タンパク質とトキソプラズマ原虫の結合性について実験を行った。その結果、ウシラクトフェリン、ウシトランスフェリン、オボトランスフェリンは互いにトキソプラズマ中の同じ可溶性タンパク質に結合すること、その分子量は約42kDaであった(投稿準備中)。また興味深いことに、トランスフェリンレセプターを持つことが知られているトリパノソーマ原虫を用いて同様な実験を行ったところ、ウシラクトフェリン、ウシトランスフェリン、オボトランスフェリンは互いにトリパノソーマ中の同じ分子量約40、43kDa付近の2つのタンパク質と結合することが分った。これらの結果から、同じ原虫であっても、鉄結合性タンパク質に反応するタンパク質は原虫の種類によって異なることが分った。また、40kDaのラクトフェリン結合タンパク質についてN末端アミノ酸配列を決定したところ、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼであった。現在43kDaのラクトフェリン結合タンパク質についてはN末端アミノ酸配列を解析しているところである(投稿準備中)。今後はこれらのタンパク質の機能について検討するつもりである。そこで本研究の目的は、トキソプラズマのラクトフェリン、トランスフェリン、オボトランスフェリン結合タンパク質を解析する事によって、原虫の鉄代謝機構を解明することである。さらに本研究の成果は、生体内に含まれるこれらのタンパク質を利用する事によって、抗生物質とは異なった新しい抗原虫病治療薬やワクチンの開発へつながるものと期待できる。そこで、我々はトキソプラズマ原虫のトランスファミリータンパク質に対する結合性タンパク質を解析するために、Far Western blot法によって鉄結合性タンパク質とトキソプラズマ原虫の結合性について実験を行った。その結果、ウシラクトフェリン、ウシトランスフェリン、オボトランスフェリンは互いにトキソプラズマ中の同じ可溶性タンパク質に結合すること、その分子量は約43、41kDa付近の2つのタンパク質と結合することが分った。これらの結果から、同じ原虫であっても、鉄結合性タンパク質に反応するタンパク質は原虫の種類によって異なることが分かった。現在は、これら鉄結合性タンパク質の原虫由来タンパク質に対する結合の特異性、糖鎖関与の有無、結合タンパク質の分離・同定について検討を行っているところである。
RNA干渉を適用したニワトリヒナの摂食行動とその成長

siRNAiによるin vitroでの受容体ノックアウトを試み、in vivoでの適用により摂食行動および成長への影響を検討した。(1)細胞内へのsiRNAの導入の効果(in vitro):COS-7細胞をもちいてsiRNAの導入を行なったところchLEPR mRNA及びタンパクの一過性の発現抑制が観察された。ニワトリレプチン受容体安定発現細胞株(CHO-chLEPR)において、レプチン添加(125ng/ml)3時間後のルシフェラーゼ活性はsiRNA処理区が対照区に比べ有意に低かった。レプチン処理24時間後のルシフェラーゼ活性はsiRNA処理区と対照区で有意な差は認められなかった。以上の結果より、作成したchLEPRに対するRNAiは培養細胞においてそのmRNA及びタンパク発現を効果的に抑制することが明らかとなった。さらにその結果、レプチン受容体を介した情報伝達を一過性に抑制することが明らかとなった。(2)siRNA中枢投与の効果(in vivo):(1)で効果の認められたsiRNAを白色レグホン(♂:4-5日齢)に中枢投与し、その後の摂食量および増体量を測定した。投与15および24時間後の間脳chLEPR mRNAではsiRNA投与区と対照(scrRNAおよび導入試薬のみ)区に大きな違いは示されなかった。摂食量に関してもその変動に違いはあるものの有意差は認められなかった。また、増体量においても著しい差は示されなかった。(3)アンチセンスオリゴヌクレオチド中枢投与の効果(in vivo):RNA干渉の有効性を検討する目的でchLEPRに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを白色レグホン(♂:4-5日齢)に中枢投与し、その後の摂食量および増体量を測定した。siRNA投与の場合と同様に著しい変化は認められなかった。しかしながら、NPY-Y1受容体に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド投与では、投与後15時間においてそのmRNAが減少することが認められ、アンチセンスオリゴヌクレオチドによるノックダウンが有効であることが示された。本年度は導入RNAiの設計と導入効率について検定するとともに、RNAi導入の予備的試験としてホルモン分泌阻害物質を使用して行動観察および体脂肪測定を以下のとおり実施した。(1)導入RNAiの設計と導入効率:アンチセンス効果検証に、哺乳動物細胞でcLEPRを発現させるベクターを作成し、CHO細胞を用いてcLEPR安定発現細胞株を作出し、抗cLEPR抗体を用いたウエスタンブロットによりタンパク質の発現を確認することができた。現在、この細胞に設計したRNAiを導入し、そのcLEPR発現抑制効果についてウエスタンブロットによる確認を遂行中である。(2)RNAi導入後期待されるホルモン分泌の抑制についての準備実験として、オピオイドペプチドの1つであるβ-エンドルフィンの分泌阻害物質グリシルグルタミンの中枢投与の効果を検証した。その投与後、過活動などの異常行動は認められないもののニューロペプチドYによる摂食亢進効果は抑制されることが見出された。このことから、β-エンドルフィンはニューロペプチドYによって分泌が促されるとともにその摂食亢進効果の一部を担っていることが明らかとなった。しかし、グリシルグルタミンの効果は短期的なものであること、体脂肪測定装置を用いたニワトリヒナの体脂肪変化においては大きな違いが示されなかった。RNAi導入時には長期的に行動および体脂肪含量に変化が認められることが期待される。

現在、RNAi導入時の緩衝剤(有機溶媒)投与の影響を調査中である。本年度は、siRNAiによるin vitroでの受容体ノックアウトを試み、in vivoでの適用を実施した。COS-7細胞をもちいてsiRNAの導入を行なったところchLEPR mRNA及びタンパクの一過性の発現抑制が観察された。ニワトリレプチン受容体安定発現細胞株(CHO-chLEPR)において、レプチン添加(125ng/ml)3時間後のルシフェラーゼ活性はsiRNA処理区が対照区に比べ有意に低かった。レプチン処理24時間後のルシフェラーゼ活性はsiRNA処理区と対照区で有意な差は認められなかった。以上の結果より、作成したchLEPRに対するRNAiは培養細胞においてそのmRNA及びタンパク発現を効果的に抑制することが明らかとなった。さらにその結果、レプチン受容体を介した情報伝達を一過性に抑制することが明らかとなった。(1)で効果の認められたsiRNAを白色レグホン(♂:4-5日齢)に中枢投与し、その後の摂食量および増体量を測定した。投与15および24時間後の間脳chLEPR mRNAではsiRNA投与区と対照(scrRNAおよび導入試薬のみ)区に大きな違いは示されなかった。摂食量に関してもその変動に違いはあるものの有意差は認められなかった。また、増体量においても著しい差は示されなかった。(3)アンチセンスオリゴヌクレオチド中枢投与の効果(in vivo)RNA干渉の有効性を検討する目的でchLEPRに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを白色レグホン(♂:4-5日齢)に中枢投与し、その後の摂食量および増体量を測定した。siRNA投与の場合と同様に著しい変化は認められなかった。しかしながら、NPY-Y1受容体に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド投与では、投与後15時間においてそのmRNAが減少することが認められ、アンチセンスオリゴヌクレオチドによるノックダウンが有効であることが示された。
光学異性体のクロマト分離ー超臨界流体および液化ガスの溶媒特性ー

本研究は、光学異性体のクロマト分割における移動相として超臨界酸化炭素および液化プロパンを用いたときの分離特性を化学工学的に解明したものである。実験には不斉識別能のあるセルロース誘導体の担持カラムを、光学異性体にはトランススチルベンオキシドおよび1ー(9ーアンスリル)ー2、2、2ートリフルオロエタノールを用いた。得られた知見を以下にまとめる。(1)液体ヘキサン、液化プロパン、超臨界二酸化炭素の順に光学異性体のカラム分離度が大きくなる。これは流体の拡散係数が大きくなるためと考えてよい。(2)容量化(保持時間)はどの溶媒についてもアルコールの添加によって大きく減少するが、超臨界流体では圧力の増加でも減少する。これは溶質の保持機構が溶質と溶媒の競争吸着によるものと考えれば説明できる。(3)光学異性体の分離係数は、容量比を変えても余り変化しないといえるが、移動相流体および添加アルコールの種類と濃度による変化は無視できない。分離係数に一番大きな影響を与えるのは温度であり、低温ほど分離係数が大きい。不斉識別が吸着相でのみ行われることを考えると、鏡像体の吸着安定性を決めるのは第1に溶質とポリマー間の相互作用、第2に吸着相内の溶質と溶媒間のファンデルワールス力である。(4)超臨界流体の圧力を増加させると鏡像体の分離係数は若干大きくなるが、これは吸着相のアルコール濃度が減少することを示している。(5)分子拡散と流体混合が支配的な低流速域では、ポリマーを担持したシリカゲルの方がシリカゲルだけよりも物質移動総括抵抗が若干小さいが、粒内拡散が支配的な高流速域では逆にポリマー担持カラムの総括抵抗が大きくなる。この理由としては、【○!1】ポリマーの担特による粒子内の屈曲度の増加、あるいは【○!2】粒子外に付着したポリマよる粒子の凝集、の二つが考えられる。ポリマー担持法に関する基礎研究がカラム性能の改善にとって必要であろう。(1)本研究の目的は,光学異性体のクロマト分割における溶離液として,超臨界流体および液化ガスを用い,その分離性能と溶媒特性との関係を実験的に明らかにし,クロマト分離技術の新しい可能性を探ることであった.(2)既存の拘束液体クロマトグラフを改造し,超臨界流体を流せるようにした.改造したクロマトグラフを用いて次の系に対する溶媒効果を検討した.カラム:セルローストリフェニルカルバメートをシリカゲルに担持.溶質:トランススチルベンオキシド(1__), 1-(9-アンシリル)-2, 2, 2-トリフルオロエタノールのラセミ体.溶離液:液化プロパン(0, 25, 40°C)および超臨界二酸化炭素(40°C),液化二酸化炭素(0, 25°C)にエントレーナーとしてアルコールを混合.(3)プロパンおよび二酸化炭素は表面への吸着力が弱く,単独溶媒では溶質が強く保持されて溶出してこない.どの場合もアルコール濃度を増やすと保持容量(k′)が短くなり,分離係数(α)は若干小さくなったが,これはヘキサンナアルコール系の溶離特性とほぼ同じであった.(4)カラム圧力を10MPaから25MPaに上げると,プロパン+アルコールおよびCO_7+アルコール系ではどちらもk′がかなり小さくなり, αは若干小さくなる.保持容量k′の圧力依存正は,予期されたように, CO_7の方が大きかったが,これは溶質の溶解度が圧力とともに増加するためである.

(5)光学分割に用いたカラムの光学識別は吸着エネルギーの大小によって支配されており, 40°Cよりも0°Cの方がαが大きくなる.したがってαを大きくするために温度を下げ,溶離時間を早めるために圧力を上げれば,分離度を下げずに分析時間を短縮することができる.1.光学識別能のあるセルローストリフェニルカルバメートをシリカゲルに担持したカラム(担持率0、10、20、30wt%)のクロマト分離特性を研究した。昨年度は保持容量(k')および異性体の分離係数(α)という吸着平衡特性について研究したが、本年度は物質移動特性である理論段相当高さ(H)について研究し、平衡と移動特性を総合した分離能(Rs)の予測まで検討した。2.基本物性が入手しやすいヘキサンとイソプロパノール(10vol%)を溶離液として、液体クロマトグラフィーによるHの測定を数種の溶質についておこなった。その結果、Hの測定値はKnoxの式によってうまく相関されることがわかり、さらに充填剤の粒子内物質移動低抗について次の知見を得た。1)使用した大孔径シリカゲル(直径20μm)の屈曲係数は23である。2)ポリマーの担持率が増加すると粒子内物質移動低抗が大きくなり、30wt%担持カラムではOwt%のものに比べ1020倍に増加する。これは【○!1】シリカゲル内の屈曲係数がポリマー担持により増大したか【○!2】シリカゲル表面に付着したポリマーが圧着されてみかけ上粒子径が大きくなったかのいずれかと推定される。3.二酸化炭素を溶離液とする超臨界および亜臨界クロマトグラフィーでは、前項の液体クロマトグラフィーに比べてHが小さくなり、カラム効率がすべて上昇した。測定したHはKnoxの式で相関することができ、溶質の拡散係数が40°C、10MPaで約4.5倍、25°C、10MPaで約3倍大きくなると推定できる。また、メタノールを添加すると若干効率がおちる。4.光学異性体の分離能(Rs)はHとk'によって予測でき、ヘキサンよりも超臨界二酸化炭素を用いる方が約2倍だけ分析時間を短縮できる。本研究を通じてセルロース誘導体を担持した充填カラムのHとk'、αに及ぼす因子が明らかとなり、分離能の制御に関する知見が得られた。
子どもへの聴き取りで用いる補助物（人形）の特徴が報告内容に及ぼす影響

子どもの性被害・性的虐待における被害内容の聴き取りでは,アナトミカル・ドール(anatomical doll; anatomically detailed dolls;以下,ADとする)と呼ばれる人形を用いることがある。ADは,解剖学的に正確に作られており,性器や胸のふくらみなどが備わっている。被害にあった身体部位の特定や被害の詳細(体勢,動きなどを含む)についての聴取において,思い出す手がかりとしての役割を果たすと考えられてきた(Saywitz, Goodman, Nicholas & Moan, 1991)。体験した出来事の内容についての聴き取りにおいて,ADを用いることの問題には大きく分けて2つの要因が影響すると考えられる。1つ目は,人形側の要因である。ADを用いることによって,子どもが実際には体験していない行為を(例,子どもがADの性器の穴に指を入れるという行為を実演してしまうなど)誘発する可能性がある。また,その子どもの報告を評価する側の大人に対しては,実際の正確性や情報量に関係なく,単なる言葉による報告に比べて,ADを用いた報告では,報告内容がより具体的であると感じられ,信用性がより高く評価される可能性がある。2つ目に,報告する側(子ども,言葉での報告に難しさがある人々など)の要因があげられる。人形を用いた報告では,人形を自分に見立てて(人形が自分の象徴であることを理解し)実演,再現することが求められる。つまり,自分自身を他者の視点で,メタ的に観察・理解し,実際に自分が行なった行動を再現する必要がある。人形を用いた報告は,報告する側の認知発達の問題の影響を大きく受ける可能性がある。今年度は,「人形側の要因」,そして,「報告する側の要因」の2つの側面から文献レビューを実施し,現在レビュー論文を執筆中である。2つ目に,研究1で使用する人形の選定・再検討を行った。現在,データ収集に向け準備を進めている。進捗状況の遅れの原因として,2つあげられる。1つ目には,実験で使用する人形の選定に時間がかかってしまっている点があげられる。研究1では,人形の持つ特徴が子どもの出来事の報告に及ぼす影響について検討することを目的としていた。研究計画当初は,実験の中で実際にADを用いることについて,倫理的な問題があると考えられていたため,代替案として,キワニス・ドールという医療現場で用いられる布製の人形を使用する予定をしていた。しかし,さらなる文献レビューを進め,ADの特徴が性的虐待への聞き取りの中で,実際には体験していないけれども,体験していたとしてもおかしくないような行為を誘発してしまう可能性がある(例:実際には性器を触られていないけど,子どもがADの性器部分に指を入れる行為を実演するなど)という点が大きな問題となると考えた。そのような実験状況をキワニス・ドールで作り出すための工夫が必要になり,現在,過去に収集したキワニス・ドールを用いた実験のデータを参照しながら,キワニス・ドールをベースにして本実験用の人形の作成を進めている。2つ目には,参加者募集の問題がある。2017年に移動を経験し,現在の所属先の周辺地域でのフィールドの開拓を進めている。参加者募集において,協力を仰げる幼稚園,保育園,小学校等の選定に時間を要している。研究1については,人形の選定・作成を進め,今後データ収集の段階に移行する予定である。また,現在進めているレビュー論文の内容の一部について,2019年度実施する実務家等への研修において,情報提供を行う予定をしている。研究1については,2019年度中にデータ収集とデータのコーディング作業を終え,2020年度に学会発表,論文執筆を進めたいと考えている。また,研究1のデータ収集を終え次第,得られた面接映像を編集し,研究2の実験刺激の作成を進める。

今年度は,「人形側の要因」,そして,「報告する側の要因」の2つの側面から文献レビューを実施し,現在レビュー論文を執筆中である。2つ目に,研究1で使用する人形の選定・再検討を行った。現在,データ収集に向け準備を進めている。進捗状況の遅れの原因として,2つあげられる。1つ目には,実験で使用する人形の選定に時間がかかってしまっている点があげられる。研究1では,人形の持つ特徴が子どもの出来事の報告に及ぼす影響について検討することを目的としていた。研究計画当初は,実験の中で実際にADを用いることについて,倫理的な問題があると考えられていたため,代替案として,キワニス・ドールという医療現場で用いられる布製の人形を使用する予定をしていた。しかし,さらなる文献レビューを進め,ADの特徴が性的虐待への聞き取りの中で,実際には体験していないけれども,体験していたとしてもおかしくないような行為を誘発してしまう可能性がある(例:実際には性器を触られていないけど,子どもがADの性器部分に指を入れる行為を実演するなど)という点が大きな問題となると考えた。そのような実験状況をキワニス・ドールで作り出すための工夫が必要になり,現在,過去に収集したキワニス・ドールを用いた実験のデータを参照しながら,キワニス・ドールをベースにして本実験用の人形の作成を進めている。2つ目には,参加者募集の問題がある。2017年に移動を経験し,現在の所属先の周辺地域でのフィールドの開拓を進めている。参加者募集において,協力を仰げる幼稚園,保育園,小学校等の選定に時間を要している。研究1については,人形の選定・作成を進め,今後データ収集の段階に移行する予定である。また,現在進めているレビュー論文の内容の一部について,2019年度実施する実務家等への研修において,情報提供を行う予定をしている。研究1については,2019年度中にデータ収集とデータのコーディング作業を終え,2020年度に学会発表,論文執筆を進めたいと考えている。また,研究1のデータ収集を終え次第,得られた面接映像を編集し,研究2の実験刺激の作成を進める。当該年度の未使用額が生じた主な理由としては,研究1のデータ収集が遅れているため,研究参加者への謝金,分析のための費用が未執行であったことがあげられる。
幹細胞制御分子Lgr4によるCML幹細胞の抗がん剤抵抗性機構の解明

慢性骨髄性白血病(CML)患者の生命予後はチロシンキナーゼ阻害剤(TKI)の開発によって飛躍的に改善されたが,TKI治療後の再発が臨床上の重大な問題となっている.近年,このようなCMLの再発の原因となる細胞として大量のCML細胞を生み出すもとになるCML幹細胞が注目されている.このCML幹細胞の未分化性の制御にはWnt/beta-cateninシグナルが重要な役割を担うことが報告されているが,その活性を制御するメカニズムは明らかでない.研究代表者は,RNAシークエンスによりCML幹細胞において高発現している遺伝子の探索を行い,Wnt/beta-cateninシグナルの活性制御に関わるLgr4が高発現していることを発見した.本研究では,CML幹細胞の未分化性やTKI抵抗性の制御における幹細胞制御分子Lgr4の役割の解明を目的とした研究を実施している.H29年度,Lgr4の発現を抑制するshRNAの導入によりCML幹細胞のin vitroでのコロニー形成能が低下することを見出した.H30年度,生体内でのCML幹細胞の制御におけるLgr4の役割を明らかにするため,Lgr4遺伝子の発現レベルが10%に低下しているLgr4遺伝子トラップマウスとテトラサイクリン制御型CMLモデルマウス(Scl-tTAマウス・tetO-BCRABL1マウス)との交配を行なって,Lgr4遺伝子トラップCMLマウスモデルを樹立した.今後,Lgr4遺伝子トラップCMLマウスモデルを用いて,CML幹細胞の未分化性の維持,並びにTKI治療抵抗性におけるLgr4の役割を解析する.また,Lgr4を標的とすることでCML幹細胞を根絶する新規治療薬の開発を目指す.H30年度,熊本大学荒木喜美博士よりLgr4遺伝子の発現レベルが10%に低下しているLgr4遺伝子トラップマウスの供与を受け,CMLマウスモデルの構築を試みた.従来のLgr4遺伝子のノックアウトマウスは胎生期成長遅延や出生後致死となるため,in vivoでの機能解析が困難である.そこで, Lgr4遺伝子の発現レベルは低下しているが生存可能であるLgr4遺伝子トラップマウスを用い,テトラサイクリン制御型CMLモデルマウスとして知られているScl-tTAマウスとtetO-BCRABL1マウスとの交配を行なって,Lgr4遺伝子トラップCMLマウスを樹立した.テトラサイクリン制御型CMLモデルマウスはテトラサイクリンの誘導体であるドキシサイクリンDoxの投与によってCMLの発症を抑え,投与を中止することでCML幹細胞の発生を誘導できるCMLマウスモデルである.今後,Lgr4遺伝子トラップCMLマウスモデルを用いて,in vivoでのCML幹細胞の制御におけるLgr4の役割を解析する計画である.一方,Wnt-beta-catenin経路を阻害することでCML幹細胞を抑制する化合物のin vitroでの探索を実施した.CMLマウスモデルより骨髄単核細胞を分離し,マウスCML幹細胞をソーティングした.このCML幹細胞を,生体内環境を模倣した低酸素環境下メチルセルロース培地中で培養して,Wnt-beta-catenin経路を阻害する化合物の処理を行なった.その結果,LGK974がCML幹細胞のコロニー形成能を抑制できることを見出した(LGK974は,Wnt3aのSer209のパルミトイル化により活性化を行なうPorcupinを阻害することが知られている化合物である).1) Lgr4遺伝子トラップCMLモデルマウスを用いたCML幹細胞の機能解析上記のLgr4遺伝子トラップCMLマウスへのDox投与を中止し,CMLの発症誘導の有無,並びに生存期間を解析する.これらのマウスよりCML幹細胞を純化し,放射線照射を行なったレシピエントマウスに移植を行なって,生体内でのCML幹細胞の自己複製能の維持におけるLgr4の機能を解析する.また,Lgr4遺伝子トラップCMLマウスにイマチニブの投与を行なった後,残存するTKI抵抗性CML幹細胞の解析を行う.2) Lgr4遺伝子トラップCML幹細胞の遺伝子発現解析Lgr4遺伝子トラップCML幹細胞における遺伝子発現をRNAシークエンスにより解析し,Lgr4の下流の標的遺伝子を解明する.次いで,Lgr4標的遺伝子を標的とするshRNAの導入を行い,CML幹細胞の維持における標的遺伝子の機能を明らかにする.3) In vitro,並びにin vivoでのLgr4を標的とするCML幹細胞の治療薬の候補化合物の探索マウスCML幹細胞に対して,Lgr4遺伝子トラップCMLマウスモデルで抑制の見られたシグナルを標的とする阻害剤の処理を行なって,in vitroでのCML幹細胞の治療薬の候補化合物の探索を行なう.また,この候補化合物,並びにH30年度見出したCML幹細胞を抑制するLGK974をCMLマウスモデルに対して投与し,in vivoでのCML幹細胞への抑制効果を検証する.さらに,CMLマウスモデルに対してこれらの化合物とImatinibの併用投与を行ない,TKI抵抗性CML幹細胞に対する治療効果を明らかにする.慢性骨髄性白血病(CML)患者の生命予後はチロシンキナーゼ阻害剤(TKI)の開発によって飛躍的に改善されたが,TKI治療後の再発が臨床上の重大な問題となっている.近年,このようなCMLの再発の原因となる細胞として大量のCML細胞を生み出すもとになるCML幹細胞が注目されている.このCML幹細胞の未分化性の制御にはWnt/beta-