hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
難治性乳がんの治療に資するナノキャリア型内用放射線治療薬剤の開発

本研究では、トリプルネガティブ乳がん(TNBC)の内用放射線治療を目的に、放射性薬剤をリポソームに封入することによって高い治療効果が期待できるナノキャリアの開発を行っている。前年度において、NQO1選択的阻害剤であるES936をベースにした放射性ヨウ素標識体のp-ヨードフェニル基の脱離を抑えるために、フェニル基上にメトキシ基やアルキル基を導入した誘導体を合成した。本年度ではまず、ES936誘導体の125I標識体を用いて代謝安定性の評価を行ったところ、メトキシ基やメチル基を持つ125I標識体において、NQO1に対する親和性を保持したままで代謝安定性が向上することがわかった。ヒト肺がん細胞A549を用いた検討においても、メチル基を持つ誘導体は、メチル基を持たない誘導体に比べて高い細胞内取り込みを示した。また、マウス体内動態の検討において、メチル基を持つ125I標識体では甲状腺や胃での集積は認められず、脱ヨウ素による分解は少ないことがわかった。テロメラーゼ阻害剤であるBIBR1532をベースにした125I標識体については、リポソームへの封入が可能か検討を行ったところ、高い封入率で製剤化できることがわかった。TNBC指向性を持つリポソームについては、前年度に選択したMucin-16に対して高親和性を有するペプチド(EVQペプチド)の機能性について評価した。EVQペプチドへの125I標識部位として、N末端と中間部位を選択し2種類の125I標識EVQペプチドを合成した。マウス乳がん細胞4T1を用いた検討において、EVQペプチドは高い細胞取り込みを示した。また共焦点レーザー顕微鏡による検討において、細胞内に集積していることが認められた。標的指向型リポソームについては、インテグリンαvβ3標的性のRGDをモデルリガンドして評価を行い、高い標的指向性を示すリポソームの開発に成功した。平成30年度についてもほぼ研究計画通りに研究を遂行した。NQO1標的放射性薬剤の合成については、合成した125I標識体において高い代謝安定性を示す誘導体の開発に成功した。テロメラーゼ標的放射性薬剤については、リポソームに封入が可能か検討を行い、高い封入率で製剤化できることを示した。TNBC指向性を持つリポソームに用いるリガンド(EVQペプチド)については、EVQペプチド自体の機能性を評価するために125I標識体を作製し、細胞を用いた検討において標的であるMucin-16を介して機能することが認められた。標的指向型リポソームについては、広く利用されているRGDペプチドをモデルリガンドとして用い、高い標的指向性を有することを明らかにした。今後の推進方策:リポソームに搭載する放射性薬剤については、ほぼ合成が終了しているため、次年度ではインビトロおよびインビボ実験において腫瘍集積性等の評価を行う。TNBC指向性を持つリポソームについては、RGDペプチドを用いたリポソームにおいても(SG)nスペーサーの有効性を実証できたことから、TNBC指向性のEVQペプチドを用いて標的指向型リポソームの開発を進める。EVQペプチド修飾リポソームを製剤化後、RIまたは蛍光を用いたインビトロおよびインビボ実験において、その有用性を明らかにし、TNBCに対する内用放射線治療薬剤の確立を目指す。次年度の研究費の使用計画:主に物品費として、試薬、溶媒、ガラス器具、細胞、動物等を計上している。また、学会発表や情報収集のための旅費や論文投稿に必要な経費を計上している。本研究では、トリプルネガティブ乳がん(TNBC)の治療に資する内用放射線治療薬剤を開発することを目的に、TNBCで発現が認められているNQO1とテロメラーゼを標的とする放射性薬剤を、乳がんへの標的性を高めたリポソーム型ナノキャリアに搭載することにより、TNBCへの細胞選択的な内用放射線治療薬剤の開発を行う。これまでにNQO1選択的阻害剤であるES936のフェニル基上に放射性ヨウ素を導入した薬剤において、p-ヨードフェニル基が脱離してしまうことが問題であった。そこで代謝安定性を高めるために電子供与基であるメトキシ基を導入したところ、インビトロでの安定性の向上がみられた。また、マウスでの体内動態評価においても、脱ヨウ素による分解は認められなかった。一方で血中から速やかに消失したことからさらに安定性を高めるために、アルキル基、アミノ基等の電子供与基を導入した誘導体を設計・合成し、それぞれコールド体の合成を完了している。テロメラーゼ標的放射性薬剤としては、テロメラーゼ阻害剤であるBIBR1532をベースにした放射性ヨウ素体を設計した。ブロモナフタレンより3ステップで合成したナフタレン誘導体と5-ヨードアントラニル酸メチルの反応より、コールド体である収率22%で合成することに成功した。標識前駆体としては、放射性ヨウ素の導入と精製が容易トリブチルスズ体を設計し、コールド体より収率47%で合成に成功した。TNBC指向性を持つリポソームについては、TNBCに高発現しているMucin-16に対して高親和性を有するペプチドを選択し、Fmoc固相合成法により合成を行った。さらに、リポソームのPEG層の外にリガンドを効率的に提示するために新規の非ヘリックス性スペーサーペプチド(SG)nの有用性を検証し、リポソームの作製に成功した。平成29年度はほぼ研究計画に従い研究を遂行した。

NQO1標的放射性薬剤の合成については、代謝安定性を高めた各種誘導体を設計し、それぞれコールド体の合成を行った。テロメラーゼ標的放射性薬剤では、種々のDNAポリメラーゼやHIVの逆転写の酵素を阻害しない特異性の高いテロメラーゼ阻害剤として知られている低分子量の化合物BIBR1532をベースに放射性ヨウ素化合物を設計し、コールド体の合成および標識前駆体の合成を行った。TNBC指向性を持つリポソームについては、TNBCに高発現しているMucin-16への高い親和性を有するペプチド修飾リポソームの作製を行った。また、リガンドをリポソームのPEG層へ効率的に提示するスペーサーの機能について、がん細胞を用いた検証を行い、第12回日本分子イメージング学会および第7回日本バイオマテリアル学会九州ブロック講演会で報告した。本研究では、トリプルネガティブ乳がん(TNBC)の内用放射線治療を目的に、放射性薬剤をリポソームに封入することによって高い治療効果が期待できるナノキャリアの開発を行っている。前年度において、NQO1選択的阻害剤であるES936をベースにした放射性ヨウ素標識体のp-ヨードフェニル基の脱離を抑えるために、フェニル基上にメトキシ基やアルキル基を導入した誘導体を合成した。本年度ではまず、ES936誘導体の125I標識体を用いて代謝安定性の評価を行ったところ、メトキシ基やメチル基を持つ125I標識体において、NQO1に対する親和性を保持したままで代謝安定性が向上することがわかった。ヒト肺がん細胞A549を用いた検討においても、メチル基を持つ誘導体は、メチル基を持たない誘導体に比べて高い細胞内取り込みを示した。また、マウス体内動態の検討において、メチル基を持つ125I標識体では甲状腺や胃での集積は認められず、脱ヨウ素による分解は少ないことがわかった。テロメラーゼ阻害剤であるBIBR1532をベースにした125I標識体については、リポソームへの封入が可能か検討を行ったところ、高い封入率で製剤化できることがわかった。TNBC指向性を持つリポソームについては、前年度に選択したMucin-16に対して高親和性を有するペプチド(EVQペプチド)の機能性について評価した。EVQペプチドへの125I標識部位として、N末端と中間部位を選択し2種類の125I標識EVQペプチドを合成した。マウス乳がん細胞4T1を用いた検討において、EVQペプチドは高い細胞取り込みを示した。また共焦点レーザー顕微鏡による検討において、細胞内に集積していることが認められた。標的指向型リポソームについては、インテグリンαvβ3標的性のRGDをモデルリガンドして評価を行い、高い標的指向性を示すリポソームの開発に成功した。平成30年度についてもほぼ研究計画通りに研究を遂行した。NQO1標的放射性薬剤の合成については、合成した125I標識体において高い代謝安定性を示す誘導体の開発に成功した。テロメラーゼ標的放射性薬剤については、リポソームに封入が可能か検討を行い、高い封入率で製剤化できることを示した。TNBC指向性を持つリポソームに用いるリガンド(EVQペプチド)については、EVQペプチド自体の機能性を評価するために125I
Gq蛋白質共役型受容体と細胞内情報伝達の脱感作/再感作機構に関する研究

アゴニスト刺激に伴うGq蛋白質共役型受容体の脱感作/再感作機構として、ヒト・アストロサイトーマ細胞におけるヒスタミンH_1受容体の細胞内移行とCa^<2+>シグナリング系によるフィードバック制御機構について解析した。その結果、(1)H_1受容体をヒスタミンで刺激すると、受容体刺激に伴い活性化されたCa^<2+>/カルモジュリン(CaM)が受容体の細胞内移行を阻害し、そのため受容体は細胞内Ca^<2+>濃度変化に対応して細胞表面に維持されること、(2)このCa^<2+>/CaMによる細胞内移行抑制機構には、CaM依存性燐酸化/脱燐酸化酵素であるCaMキナーゼII/カルシニューリンは関与していないことが明らかとなった。さらに、当該研究では、アゴニスト刺激に伴うH_1受容体の親和性変化を解析し、(1)H_1受容体にはヒスタミンに対して高親和性及び低親和性の少なくとも二種類の結合部位(状態)が存在し、ヒスタミン刺激に伴い高親和性結合部位は低親和性結合部位に変換されること、(2)H_1受容体のヒスタミンに対する親和性変化の初期機構にはCaMキナーゼII/カルシニューリンが関与するが、刺激後期の親和性変化には関与しないこと、(3)刺激後期のヒスタミンに対するH_1受容体の親和性変化は受容体の細胞内移行によって誘発されること、が判明した。即ち、刺激初期においては、CaMキナーゼII/カルシニューリンによってH_1受容体のヒスタミンに対する親和性が細胞膜上において制御され、一方、刺激後期においては、細胞内Ca^<2+>濃度の低下によってH_1受容体の細胞内移行が開始し、細胞内へ移行したH_1受容体はヒスタミンに対して低親和性となることが判明した。以上のように、Gq蛋白質共役型受容体の機能・分布の制御機構として、Ca^<2+>/CaM系によるフィードバック機構のOn/Off状態が深く関与していることが明らかとなった。これまで我々は、ヒト・アストロサイトーマ細胞を用い、アゴニスト刺激に伴うGq蛋白質共役型ヒスタミンH_1受容体の細胞内移行について解析した。その結果、(1)ヒスタミンH_1受容体をヒスタミンで刺激すると、受容体刺激に伴い活性化されたCa^<2+>/カルモジュリンが受容体の細胞内移行を阻害し、そのため受容体は細胞内Ca^<2+>濃度変化に呼応した形で細胞表面に維持されること、(2)このCa^<2+>/カルモジュリンによる細胞内移行抑制機構には、カルモジュリン依存性燐酸化/脱燐酸化酵素であるCaMキナーゼII/カルシニューリンは関与していないことが明らかとなった。当該年度は、ヒスタミンH_1受容体機能の調節機構に注目し、特に、アゴニスト刺激に伴うヒスタミンH_1受容体の親和性変化とその分子機構を解析した。その結果、(1)ヒスタミンH_1受容体にはヒスタミンに対して高親和性及び低親和性の少なくとも二種類の結合部位(状態)が存在すること、(2)ヒスタミン刺激に伴い高親和性結合部位は低親和性結合部位に変換されること、(3)この受容体親和性の変化はCaMキナーゼIIによって誘発されることが明らかとなった。即ち、アゴニスト刺激に伴い活性化されたCa^<2+>/カルモジュリンは、受容体を細胞表面に保ち、その一方では、CaMキナーゼIIを介して受容体のアゴニスト親和性を低下させると考えられる。

これらの新知見は、アゴニスト刺激に伴うGq蛋白質共役型受容体の分布及び機能の調節機構にCa^<2+>/カルモジュリン系が深く関与していることを示唆する。アゴニスト刺激に伴うGq蛋白質共役型ヒスタミンH_1受容体の脱感作/再感作機構として、ヒト・アストロサイトーマ細胞におけるH_1受容体の細胞内移行とCa^<2+>シグナリング系によるフィードバック制御機構について解析してきた。その結果、(1)H_1受容体をヒスタミンで刺激すると、受容体刺激に伴い活性化されたCa^<2+>/カルモジュリンが受容体の細胞内移行を阻害し、そのため受容体は細胞内Ca^<2+>濃度変化に呼応して細胞表面に維持されること、(2)このCa^<2+>/カルモジュリンによる細胞内移行抑制機構には、カルモジュリン依存性燐酸化/脱燐酸化酵素であるCaMキナ-ゼII/カルシニューリンは関与していないことが明らかとなった。当該研究では、アゴニスト刺激に伴うH_1受容体の親和性変化を解析し、(1)H_1受容体にはヒスタミンに対して高親和性及び低親和性の少なくとも二種類の結合部位(状態)が存在すること、(2)ヒスタミン刺激に伴い高親和性結合部位は低親和性結合部位に変換されること、(3)H_1受容体のヒスタミンに対する親和性変化の初期機構にはCaMキナーゼIIが関与するが、刺激後期の親和性変化にはCaMキナーゼIIは関与しないこと、(4)刺激後期のH_1受容体の親和性変化は受容体の細胞内移行によって誘発され、H_1受容体の細胞内移行が抑制された条件下では、受容体はヒスタミンに対して正常な結合能を有していること、(5)H_1受容体拮抗薬であるメピラミンの親和性は、受容体の細胞内移行によって影響を受けないこと、が判明した。即ち、刺激初期においては、細胞膜上のH_1受容体はCaMキナーゼIIによってアゴニストに対して低親和性状態となるが、刺激後期においては、細胞内Ca^<2+>濃度の低下によってH_1受容体の細胞内移行が開始するためH_1受容体のアゴニストに対する親和性が低下することが初めて明らかとなった。
弱酸カリ/活性炭系および関連触媒による炭酸ジメチル合成の研究

炭酸ジメチル(DMC)合成の製造プロセスの開発に関して、本研究では、初年度に、まず塩基触媒による炭酸エチレン-メタノール系のトランス・エステル化実験研究を行なった。この反応は、炭酸エチレンが酸化エチレンとCO_2から安価に得られる点で注目され、マグネシアやハイドロタルサイトのような固体塩基が有効であるが、微量の水分で基質が分解し、発生CO_2によって触媒が失活する。そのため、本研究では、炭酸またはこれより僅かに強い酸のカリウム塩、すなわち、炭酸カリ、リン酸二水素カリ、酢酸カリおよび関連触媒について比較試験を行ない、所期の成果を挙げた。この経路では、トランス・エステル化で副生するエチレングリコールが蓄積するので、第2年度(平成11年度)は、エチレングリコールの酸化的カルボニル化による炭酸エチレン再生の研究を行なった。エチレングリコールに塩化銅(I)を懸濁、攪拌すると分子状酸素を吸収して銅(II)グリコキシド錯体を形成し、この銅(II)錯体は10atm程度の加圧COで還元されて炭酸エチレンを生成する。そこで、反応圧を15kg/cm^2に維持しながらO_2/CO=1/2の混合ガスを補給して連続試験を試みたところ、銅(II)が繰返し銅(I)に還元再生され、レドックス系を形成して触媒機能を発揮していることがわかった。以上の研究成果をもとに、エチレングリコールの酸化的カルボニル化による炭酸エチレンの生成と各種のアルコールとのトランスエステル化を組合わせると、エチレングリコールを循環体として任意の炭酸エステル合成プロセスへの応用展開が期待され、炭酸ジメチルに限定することなく、含酸素系の燃焼助剤として適切な引火点とすぐれたアンチノック性を具えた混合エステルの製造プロセスが考えられる。炭酸ジメチル(DMC)は、猛毒のホスゲン代替試薬、携帯電話やパソコンなどに普及の著しい4V級リチウム・イオン二次電池の溶媒応用、ルーム・エアコン用の非ハロゲン冷凍機油、潤滑油のほか、MTBEとともに含酸素系オクタン・ブースター、すなわちガソリンまたは軽油の燃焼性向上のための助剤として大量消費が見込まれており、新しいプロセスの開発が望まれている。本年度は、塩基触媒による炭酸エチレン-メタノール系のトランスエステル化の実験研究を行なった。そのため、特許例には触媒の高温焼成や原料の含水率を厳しく指定したものが多い。本研究では、炭酸またはこれより僅かに強い酸のカリウム塩、すなわち炭酸カリ、リン酸二水素カリウム、酢酸カリおよび関連触媒について比較活性試験を行なった。市販のマグネシアは、そのままでは殆んど活性を示さないが、500°Cで焼成すると活性発現が見られる。CO_2の存在でも塩基性を示す炭酸カリは微量で高活性を示し、すみやかに平衡値に達した。この値から見かけの平衡定数を求め、系に少量の水を加えたときの平衡変化率を計算したところ、実測値とよく一致した。基質の炭酸エチレンが水と反応して分解し、CO_2が発生してエチレングリコールが増加するが、活性は低下しない。カルボン酸は炭酸にくらべてかなり強いので、酢酸カリや弱酸性イオン交換樹脂のアルカリ処理体は、塩基触媒としてはあまり活性ではないことがわかった。リン酸カリは、アルコールに不溶または難溶で、塩基強度も適当であり、すぐれた性能を示した。炭酸ジメチル(DMC)合成の製造プロセスの開発に関して、本研究では、初年度に、まず塩基触媒による炭酸エチレン-メタノール系のトランス・エステル化の実験研究を行なった。

この反応は、炭酸エチレンが酸化エチレンとCO_2から安価に得られる点で注目され、マグネシアやハイドロタルサイトのような固体塩基が有効であるが、微量の水分で基質が分解し、発生CO_2によって触媒が失活する。そのため、本研究では、炭酸またはこれより僅かに強い酸のカリウム塩、すなわち、炭酸カリ、リン酸二水素カリ、酢酸カリおよび関連触媒について比較試験を行ない、所期の成果を挙げた。この経路では、トランス・エステル化で副生するエチレングリコールが蓄積するので、第2年度(平成11年度)は、エチレングリコールの酸化的カルボニル化による炭酸エチレン再生の研究を行なった。エチレングリコールに塩化銅(I)を懸濁、撹拌すると分子状酸素を吸収して銅(II)グリコキシド錯体を形成し、この銅(II)錯体は10atm程度の加圧COで還元されて炭酸エチレンを生成する。そこで、反応圧を15kg/cm^2に維持しながらO_2/CO=1/2の混合ガスを補給して連続試験を試みたところ、銅(II)が繰返し銅(I)に還元再生され、レドックス系を形成して触媒機能を発揮していることがわかった。以上の研究成果をもとに、エチレングリコールの酸化的カルボニル化による炭酸エチレンの生成と各種のアルコールとのトランスエステル化を組合わせると、エチレングリコールを循環体として任意の炭酸エステル合成プロセスへの応用展開が期待され、炭酸ジメチルに限定することなく、含酸素系の燃焼助剤として適切な引火点とすぐれたアンチノック性を具えた混合エステルの製造プロセスが考えられる。
生物集団の年齢構造と空間伝播に着目した非線形反応拡散方程式の解析

社会における感染症の流行ダイナミクスをはじめとする様々な生物現象に対する数理モデルとして、各種非線形微分方程式システムを構築し、その定性的解析を行った。特に、集団の年齢構造や空間伝播の影響を考慮できる非線形反応拡散方程式システムをはじめとした多くの構造化人口モデルに対して、基本再生産数Roやそれに相当する閾値を導出し、その大小と各平衡解の存在や漸近安定性などの各種数学的性質との関係を明らかにした。その解析を通じて、関連するリャプノフ関数の理論の様々なモデルへの適用および拡張を行った。平成25年度は生物集団の数理モデルとして、特に感染症の流行動態を表す微分方程式系を構築し、その解析を行った。年齢構造を含む数理モデルとしては、季節性インフルエンザや媒介生物感染症などの季節毎の感染症の再帰的な流行をモデル化する上で有用となる、時間周期的な係数を持つSIR感染症モデルを構築し、その解析を行った。結果として、次世代作用素のスペクトル半径として導出される基本再生産数Roが、感染症の持続的な流行を意味するエンデミックな周期解の存在を左右する閾値となること、すなわちRo > 1であればそのような周期解が存在するが、Ro < 1では存在しないことを示した。その結果は、近年、周期系のモデルに対する一般的な定義の与えられた基本再生産数Roが、感染症の流行規模を予測する上で有用な指標値となり得ることを数学的に厳密な立場から保証するものである。また、各個体の空間伝播を考慮に入れた感染症モデルとして、平成25年度では区分的な各集団(パッチ)間を移動する個体の挙動を考慮に入れた多集団SIS感染症モデルの研究を行った。そこでは上述のモデルと同様に、感染症の流行規模を予測する上での指標としての基本再生産数Roに着目した研究を行ったが、特にこのモデルの場合、Ro > 1であれば感染症が定着する状況を意味するエンデミックな平衡解が大域的に漸近安定となり、Ro < 1であれば感染症が駆逐される状況を意味する自明平衡解が大域的に漸近安定となることが示された。この結果は、感染症の将来的な流行挙動を決定付ける意味で、基本再生産数Roが大きな役割を担うことを改めて示すものである。その他、共同研究として、マラリアやコンピュータ・ウイルスを対象とした数理モデルの解析を行った。当該年度は、各個体の年齢や位置、性別などの異質性を考慮することが出来る各種構造化感染症モデルとしての非線形偏微分方程式システムを中心に研究を行った。特に、基本再生産数Roの導出と、その閾値的性質に関する解析を研究の焦点とした。具体的な一結果として、非線型反応拡散方程式系として記述される空間構造と年齢構造を含むSIS感染症モデルに対し、確率論に現れるファインマン・カッツの公式を利用した基本再生産数Roの定式化を行い、Roが1以下であれば感染症の無い状況に対応する自明平衡解のみが存在する一方、Roが1より大きければ感染症の定着する状況に対応するエンデミックな非自明平衡解が存在することを証明した。その他、感染後の経過時間としての齢構造を含むSVEIR感染症モデルやHIV細胞モデルなどに対し、適切なリャプノフ関数を構成する上で必要となる解軌道の相対コンパクト性や、一様パーシステンスの証明を行った。結果として、Roが1以下である場合の自明平衡解の大域的な漸近安定性と、Roが1より大きい場合の非自明平衡解の大域的な漸近安定性を示すためのリャプノフ関数の構成に成功した。それらの結果は、複雑な構造を持つモデルであっても、基本再生産数Roが解の性質を決定付ける閾値としての役割を果たすことを理論的に保証するものであり、その疫学的指標としての有用性を改めて示すものであった。26年度が最終年度であるため、記入しない。応用数学・数理疫学・数理生物学26年度が最終年度であるため、記入しない。年齢構造や空間構造を持つ複数の感染症モデルを構築し、それらに対する数学的に厳密な解析結果を得ることに成功したため。特に、時間周期的なモデルや多状態モデルに対し、今後の研究に適用可能となることが期待される解析手法を構成することに成功したため。今後は特に、連続的な空間構造を持つようにモデルを一般化し、それらに対して、平成25年度までに得られた解析結果を拡張することが可能かという観点から研究を進めたい。特に従来の個別のモデルに対して得られた結果を基にして、それらを包括する形でのより一般的な解析理論の構成を目指し、研究を進めたい。
金属酵素の不安定中間体を観測するための高速溶液混合実験システムの開発

平成12年度はペルオキシターゼの活性中間体であるCompound Iの生成機構を検討するため,独自に開発した高速混合装置を用いて,西洋ワサビペルオキシターゼ(HRP)と過酸化水素との反応を追跡した。装置としては,本研究者らが開発した高速混合装置を改良することにより,時間分解能50マイクロ秒で可視紫外吸収スペクトルことに成功した。この装置を用いて,上記反応を追跡したところ,HRPの休止状態からCompound Iへのスペクトル変化が,ほぼ等吸収点をとりながら観測できた。このことは休止状態からCompound Iの変化において中間体が存在しないことを意味しているが,過酸化水素の濃度に対するCompound I生成速度の依存性は,速度論的な中間体が存在する明らかに飽和現象を示し,Michaelis-Menten型の解析をすることで,その寿命(半減期)が約10μ秒であることが明らかとなった。さらにこの値をもとに,このような寿命を持つ中間体を仮定したモデルを考え,反応後50マイクロ秒後の中間体の存在割合を求めたところ,約15%と見積もられ,その推定される紫外可視スペクトルは休止状態に類似した鉄3価高スピン型であった。このことは,Compound I生成の中間体として,従来想定されていた3価のヘム鉄にアニオン化した過酸化水素(HOO^-)が結合した鉄3価低スピン型ではなく,中性の過酸化水素(HOOH)が結合した状態であると推定できた。このような中間体を形成する反応機構として,中性の過酸化水素がヘム鉄に結合できるように,ヘム近傍の遠位ヒスチジンと遠位アルギニンが同時に過酸化水素と相互作用しているモデルを新たに提出した。平成11年度は、時間分割吸収スペクトル装置に装着する高速液体混合装置の改良と、ヘム酵素のひとつである西洋ワサビペルオキシターゼの反応中間体を捕捉するための変異体、R38L(Arg38-〉Leu)の作成を試みた。従来の高速液体混合装置では捉えきれなかった種々の反応中間体を捕捉するため、より高時間分解能を実現する混合装置を考察し、流路の断面が従来の装置より細い200μm四方である混合装置を製作した。その時間分解能を測定したところ、混合後、約200μ秒後には均一な混合が得られることが示され、混合後、ミリ秒以下の領域でも良好なスペクトルが得られる可能性が明らかとなった。試料からの透過光を検知する部分には、高時間分解能、高感度のCCD素子を使用し、200から800μ秒の領域での波長幅約200nmの過渡スペクトルの測定に成功した。この装置を用いて天然の西洋ワサビペルオキシターゼと過酸化水素の反応を追跡したところ、反応開始後、200μ秒後においても反応中間体としては従来から捕捉されているcompound Iしか観測できず、compound Iの前駆体で、ペルオキシターゼ反応でのもうひとつの反応中間体であると想定されているcompound 0は同定できなかった。そこで、西洋ワサビペルオキシターゼのアミノ酸変異体の中で、そのcompound Iの生成速度が極端に遅いと報告されているR38L(Arg38-〉Leu)の作成を試みた。現在、この変異体の大量精製の段階であり、来年度以降も引き続いて本年度成功しなかったcompound 0の捕捉についてこの変異体を用いて検討し、更に天然型酵素でのcompound 0の捕捉を目指して、流路を細くすることや流速を上げることで時間分解能のより一層の向上を試みる予定である。
マイクロダイヤモンド工具の高精度化と実用化に関する研究

本研究は、各種の極微細加工用の高精度ダイヤモンド工具の開発とマイクロ・ナノスケール加工への実用化を目的としている。まず、シリコンモールド作製技術と、ダイヤモンドCVD技術を駆使して、高精細のダイヤモンド切れ刃を作製し、それを工具シャンクに高強度で精度よく装着するマイクロ工具作製装置を構築した。また、作製したダイヤモンド工具の切れ刃形状を集束イオンビームにより変化させ、適切な工具形状について検討した。本研究では、極微細加工に有用なダイヤモンド工具の高精度化と生産性の向上とマイクロ・ナノスケール加工への応用化を目的としている。ダイヤモンドの高速成膜と高緻密化を図るため、ダイヤモンド成膜装置を試作し、以下の結果を得た。成膜は,超硬丸棒(直径φ3mm,長さ40mm)に対して,試料温度820900°C,フィラメント電流3050A,成膜時間10h,メタン濃度0.51%の条件で熱フィラメント法により行った.成膜後の試料表面を観察したところ、試料温度が高くなるにともない,ダイヤモンド粒径が大きくなった.また,試料温度が900°Cのものは粒径が大きいだけでなく,成膜後すぐにはく離してしまった.以上の結果より,成膜時の試料温度は820°Cが適当であると考える.成膜速度は,現状では1μm/hであり,次年度は,より高速度で成膜可能な条件について検討を行っていく.成膜後の超硬丸棒に対してレーザ照射することにより,ダイヤモンドを直接加工し,ダイヤモンド工具の作製を行い,以下の結果を得た.表面前処理として超硬丸棒にショットブラストを施すことで,ダイヤモンド膜の密着性が向上した.また,レーザ出力を低く,かつモータ回転数を大きくするほど良好な溝の形状が得られた.レーザ照射条件がレーザ出力6.0W,モータ回転数8.5rpmのとき,ピッチ180μm,溝幅20μm,溝深さ6μmの工具が得られた.本研究では、極微細加工に有用なダイヤモンド工具の高精度化と生産性の向上とマイクロ・ナノスケール加工への応用化を目的としている。まず、シリコンモールドにCVDダイヤモンドを合成する方法で作製したダイヤモンド切れ刃をシャンクに精度よく簡便に接合するマイクロダイヤモンド工具作製装置を試作した。この装置を用い、ダイヤモンドツールを作製したところ、数μmの精度で、シャンク端面にダイヤモンド切れ刃を位置決めでき、また、接合強度も十分なものが得られた。つぎに、集束イオンビームを用いて、シャンク先端に装着したダイヤモンド切れ刃の加工を行い、マイクロ加工に適した切れ刃形状の検討を行った。作製したダイヤモンド工具は、逃げ角0°の四角柱形状の切れ刃を有するツールA、逃げ角5°の四角柱形状の切れ刃を有するツールB、逃げ角5°の三角柱形状の切れ刃を有するツールCの3種類である。これらの工具を用いてマイクロミリング加工実験を行い、加工面性状や切削抵抗の観点から、作製したツールの有用性について検討した。加工実験には立形マシニングセンタに高速スピンドルを装着し、主軸回転数20000rpm、送り1mm/min、切込み5μmで、被削材は単結晶シリコンである。その結果、加工面は、ツールA、ツールB、ツールCの順に滑らかな加工面になった。また切削抵抗は、逃げ角5°(ツールB、C)の切削抵抗は逃げ角0°(ツールA)のそれよりも小さくなった。
遺伝子プロファイルと新規DNAメチル化検出法を用いた幹細胞分化機構の解明

テロメラーゼ遺伝子の導入によって不死化し、さらにクローン化したヒト間葉系幹細胞約20種のクローンのうち、骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞のすべてに分化誘導可能な高分化型クローンNo.12、あるいはラット胸腺から分離した問葉系幹細胞様細胞クローンを用いて、遺伝子発現プロファイルを全ゲノム型DNAチップによって解析した。その結果、骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞の各分化方向に特徴的な遺伝子発現パターンが見られた。この幹細胞分化とDNAメチル化の関わりについて調べるため、これら幹細胞クローンの骨芽細胞および脂肪細胞への分化過程におけるグローバルなメチル化の変化について、CpGメチル化アレイを用いて調べた。その結果、ヒトについては骨芽細胞分化について11個、脂肪細胞分化について4個の遺伝子を、分化に伴ってメチル化状態が変化する遺伝子の候補として同定した。さらに本研究において、従来のBisulfate法を大幅に改良して、短時間でメチル化部位の同定が可能な画期的なDNAのメチル化検出手法の開発に成功し、本法の使用により、全ゲノムレベルで幹細胞分化に伴ってDNAメチル化のレベルが変動する82個の遺伝子を単離することに成功した。これらは幹細胞分化の制御やメチル化再構成に関わる鍵となる遺伝子と考えられた。現在、幹細胞分化におけるエピジェネティック変化の実体や詳細は全く不明であるので、この研究は、幹細胞分化機構の解明に重要な手がかりを与えると考えられ、さらに、このメチル化の制御によって幹細胞に任意の分化を誘導することも可能と思われることから、この研究成果は幹細胞研究や再生医療に大きなインパクトを与えると予想される。テロメラーゼ遺伝子の導入によって不死化し、さらにクローン化したヒト間葉系幹細胞の遺伝子発現プロファイルを全ゲノム型DNAチップによって解析した。その結果、約20種のクローンのうち、骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞のすべてに分化誘導可能な高分化型クローンNo.12においては、分化マーカーとなるような遺伝子の発現が他のクローンに比較して亢進しており、その他にも特徴的な遺伝子発現パターンが見られた。特に注目されるCCNファミリー遺伝子について、クローンNo.12の骨芽細胞分化に伴う発現変化を調べたところ、特に結合組織成長因子CTGFの発現に大きな変化が見られた。即ち、未分化状態の細胞では、CTGFの発現は非常に高く、他の低分化型クローンと比較しても最も発現量の差が大きい遺伝子の一つであったのに対して、細胞が分化するにつれてこのCTGFの発現はしだいに低下した。CTGF以外のCCN遺伝子については、分化途中での過剰発現はむしろ幹細胞分化を抑制するとの報告もあり、CTGFについても、幹細胞の形質維持あるいは細胞分化のコミットメントには重要であるが、細胞分化の進行には重要な役割を果たしていないことが示唆された。また、この幹細胞分化とDNAメチル化の関わりについて調べるため、これら幹細胞クローンの骨芽細胞および脂肪細胞への分化過程におけるグローバルなメチル化の変化について、CpGメチル化アレイを用いて調べた。その結果、骨芽細胞分化について11個、脂肪細胞分化について4個の遺伝子を、分化に伴ってメチル化状態が変化する遺伝子の候補として同定した。またクローンに固有のメチル化変化も見つかった。これらは幹細胞分化の制御やメチル化再構成に関わる鍵となる遺伝子と考えられ、今後その役割について解明を進める予定である。テロメラーゼ遺伝子の導入によって不死化し、さらにクローン化したヒト間葉系幹細胞約20種のクローンのうち、骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞のすべてに分化誘導可能な高分化型クローンNo.12、あるいはラット胸腺から分離した間葉系幹細胞様細胞クローンを用いて、遺伝子発現プロファイルを全ゲノム型DNAチップによって解析した。その結果、骨芽細胞、歓骨細胞、脂肪細胞の各分化方向に特徴的な遺伝子発現パターンが見られた。

またクローンに固有のメチル化変化も見つかった。これらは幹細胞分化の制御やメチル化再構成に関わる鍵となる遺伝子と考えられた。さらにゲノム全体のDNAメチル化(overall methylation)の状態と、個々の遺伝子におけるメチル化状態を分化の前後で比較した結果、特異的分化に関与する遺伝子群と幹細胞の表現系を維持するのに重要な遺伝子群を分離同定することができた。これら遺伝子群による、組織特異的分化における遺伝子発現制御の解明は、今後、癌研究、再生医療研究に大きく寄与するものと考えられる。
ベータセクレターゼによるアミロイドベータ蛋白の分解機構

老人斑はアルツハイマー病(AD)脳に特異的であり、その主たる構成成分はアミロイドベータ(Aβ)である。従ってAβの産生及び分解機構を解明することはADの治療に直接結びつく可能性がある。我々はアミロイドベータ前駆体蛋白(βAPP)から、ガンマセクレターゼの基質であるCTF-βを切り出すβセクレターゼ(BACE)がAβ自体を基質として認識し、Y10とE11部位の間およびL34とM35部位の間で切断することを見出した。切断された短縮型AβはAβ全長に比較してin vitroで凝集しにくく、BACEがAβの分解を促進している可能性を示唆した。Y10とE11部位の至適pHとL34とM35部位の至適pHは異なり、前者の切断はより酸性のコンパートメントで起こっていることが示唆された。さらに重要なことに、BACEは非常に凝集しやすい性質を持つ病原性物質であるAβ42も同様に切断した。我々はBACEのこの性質を利用してBACE活性やAβ産生を減じることができるのではないかと考えた。そこでAβは切断するが、βAPPの切断効率の低いBACE1の変異体を得る目的で、各種変異体を数十種類作製し、それらを恒常的に発現する細胞を樹立した。これらの細胞から分泌されるsAPPβの量を定量したところ、BACEのC末端部分、膜貫通部位を欠く変異体でβAPPの切断効率が低いことが明らかになった。次いでこの変異体が野生型と比較してAβの切断効率がどれほど保たれているか検討した。細胞から分泌されるBACEにより切断を受けたAβ34の定量をAβ34特異的断端抗体を用いて正確に定量を行った。その結果膜貫通ドメインを欠くBACEはβAPPの切断活性が比較的低く、Aβの分解能は保持している結果が示唆された。従ってBACEのAβ切断能を利用してAβの凝集や分解を促進する手法の開発が可能であることが示唆された。我々はアミロイドベータ前駆体蛋白(βAPP)から、ガンマセクレターゼの基質であるCTF-βを切り出すβセクレターゼ(BACE)の解析を行い、その過程で、驚くべきことにBACEがAβ自体を基質として認識し、切断することを見出した。BACEが主として細胞内でAβをY10とE11部位の間およびL34とM35部位の間で分解することをcell-freeガンマセクレターゼassay及びリコンビナントBACEを用いたin vitro assayの両者の系で明らかにした。またさらに重要なことにBACEは病原性・凝集性が極めて高いAβ42も切断することを明らかにした。BACEが膜蛋白であるβAPPやニューレギュリンなどの基質とAβペプチドを切断するときのメカニズムに関して違いはないかどうか検討を進めている。

両者の違いを明らかにすれば、よりAβペプチド選択的に分解する酵素のを同定し、ADの新たな治療法開発に繋げることを期待する。老人斑はアルツハイマー病(AD)脳に特異的であり、その主たる構成成分はアミロイドベータ(Aβ)である。従ってAβの産生及び分解機構を解明することはADの治療に直接結びつく可能性がある。我々はアミロイドベータ前駆体蛋白(βAPP)から、ガンマセクレターゼの基質であるCTF-βを切り出すβセクレターゼ(BACE)の解析を行い、その過程で、驚くべきことにBACEがAβ自体を基質として認識し、切断することを見出した。我々はBACEのこの性質を利用してBACE活性やAβ産生を減じることができるのではないかと考えた。BACEが主として細胞内でAβをY10とE11部位の間およびL34とM35部位の間で分解することをcell-freeガンマセクレターゼassay及びリコンビナントBACEを用いたin vitro assayの両者の系で明らかにした。Y10とE11部位の至適pHとL34とM35部位の至適pHは異なり、前者の切断はより酸性のコンパートメントで起こっていることが示唆された。またさらに重要なことにBACEは病原性・凝集性が極めて高いAβ42も切断することを明らかにした。BACEの各種突然変異体を作製し、スクリーニングを行ったところ膜貫通ドメインを欠くBACEはβAPPの切断活性が比較的低く、Aβの分解能は保持している結果が示唆された。この性質を利用しADの新たな治療法開発に繋げることを期待する。
ウイルスの普遍的分子パターンを認識する植物の新規免疫反応の解明

本研究では,ウイルスが持つ普遍的な分子パターンにより誘導される,新規免疫機構の解明を目指した.その結果,コモウイルスにコードされるヘリカーゼ(Hel)タンパク質のアミノ末端領域に,新たな免疫誘導領域を見出した.当該領域には,ウイルスの複製に関わる両親媒性ヘリックスが予測され,両親媒性ヘリックスが免疫誘導に重要であることが示唆された.また,当該領域による免疫誘導活性は,ウイルス複製において両親媒性ヘリックスが担う宿主細胞膜の変性活性と相関することを明らかにした.本研究では,ウイルスが持つ普遍的な分子パターンにより誘導される,新規免疫機構の解明を目指した.その結果,コモウイルスにコードされるヘリカーゼ(Hel)タンパク質のアミノ末端領域に,新たな免疫誘導領域を見出した.当該領域には,ウイルスの複製に関わる両親媒性ヘリックスが予測され,両親媒性ヘリックスが免疫誘導に重要であることが示唆された.また,当該領域による免疫誘導活性は,ウイルス複製において両親媒性ヘリックスが担う宿主細胞膜の変性活性と相関することを明らかにした.本年度は、以下の3項目を実施した。1.ポテックスウイルス属ウイルスのHelタンパク質による細胞死に関する解析:タバコ属植物において細胞死を引き起こすポテックスウイルス属ウイルスについて、細胞死誘導の原因となるウイルスタンパク質の探索を行った。その結果、複製酵素に含まれるHelタンパク質が細胞死誘導活性を有することがわかった。さらに、Helタンパク質による細胞死は、ウイルス感染時の細胞死と同様に、活性酸素の生成を引き起こすことが明らかになった。2.ポテックスウイルス属ウイルスのHelタンパク質による細胞死に関わる宿主因子:Helタンパク質による細胞死が植物の免疫反応である過敏感反応(HR)と類似した特徴を有することに着目し、細胞死誘導に関わる宿主因子について検討を行った。その結果、HRに必須なSGT1をサイレンシングした植物において、Helタンパク質による細胞死が抑制された。3.コモウイルス属ウイルス接種系の構築:タバコ属植物に感染し細胞死を引き起こすコモウイルス属ウイルスについて、感染性cDNAクローンの構築を行った。作製したcDNAクローンの接種により、コモウイルス属ウイルスの病徴が再現された。また、各種ウイルスタンパク質の抗体を作製し、感染植物においてウイルスタンパク質の検出を行った。以上の解析により、ポテックスウイルス属ウイルスによる細胞死の原因となるウイルスタンパク質を同定し、この細胞死が既知の免疫反応であるHRと類似した特徴を有することを示した。本年度は、以下の3項目を実施した。1.コモウイルスHelタンパク質の細胞死誘導領域の特定:タバコ属植物において細胞死を引き起こすコモウイルスについて、Helタンパク質が細胞死を誘導することを見出した。また、およそ600アミノ酸からなるHelタンパク質のうち、両親媒性ヘリックスを含む74アミノ酸からなる領域(nHel領域)が、細胞死誘導活性に重要であることを明らかにした。さらに、nHelによる細胞死は複数のコモウイルスおよび近縁なウイルス属でも共通することを見出した。2.nHelによる細胞死誘導のシグナル伝達経路の解析:nHelによる細胞死の特徴を明らかにする目的で、植物の既知抵抗性反応である過敏感反応との比較を行った。その結果、nHelによる細胞死の誘導に伴って、活性酸素種の生成、防御応答遺伝子群の発現上昇等が観察された。また、過敏感反応のシグナル伝達に関わる宿主因子SGT1を機能抑制した植物では、nHelによる細胞死が抑制された。このことから、nHelによる細胞死は過敏感反応と類似した特徴を持つことが示唆された。3.nHelによる細胞死に関与する宿主側の反応:nHel領域について様々なアミノ酸変異を導入し、共焦点レーザー顕微鏡を用いて植物細胞内での動態を調べたところ、当該領域が示す細胞死誘導活性は宿主膜を変性させる活性と相関することが示唆された。さらに、膜変性阻害剤であるセルレニンを処理することにより、nHelによる膜変性活性を抑制した場合に、細胞死誘導も抑制されることを明らかにした。以上の実験により、コモウイルスとその近縁なウイルスにおいて、nHel領域が共通して細胞死を誘導することを見出し、nHelによる細胞死が宿主細胞の膜変性と強く相関することを明らかにした。植物病理学本年度は、ポテックスウイルス属ウイルスにおいて、細胞死誘導の原因となるウイルスタンパク質を同定し、さらにその細胞死誘導に関わる宿主因子を明らかにした。また、コモウイルス属ウイルスについては再現性の高い接種系の構築を行うことで、次年度以降の基盤構築を行った。概ね計画通りに研究が進んでいるため、次年度も当初計画の通りに研究を推進する。具体的には、コモウイルス属ウイルスを用いて、細胞死誘導の原因となるウイルスタンパク質の探索を行い、細胞死誘導に必須な領域の特定を目指す。また、細胞死誘導に関わるシグナル伝達経路に関する解析を行う。さらに、細胞死の原因となるウイルスタンパク質について、植物細胞内における動態を共焦点レーザー顕微鏡などを用いて捉える。本年度に実施した項目のうち、ポテックスウイルス属ウイルスのHelタンパク質に関する解析では当初想定より順調に進んだ。一方で、コモウイルス属ウイルスを用いた解析では、再現性のよい接種系の構築・検討が必要となり、これを優先的に実施した。以上の2つの理由から、当初想定より主に物品費の支出が減った。次年度は、コモウイルス属ウイルスで構築した接種系に基づき、免疫反応誘導に関わるウイルスタンパク質領域の探索ならびに機能領域の特定を進める計画であり、ここに先年度予算の残額を物品費として充てる予定である。その他は、当初計画どおりに進める予定である。
人工細胞システムによる細胞情報クロストークの実現と細胞動態解析

本研究の目標は、受容体の情報が伝達され応答として現れる系を構築することである。インテグリン(ITG)、細胞骨格関連タンパク質からなる経路、または、環状ヌクレオチド感受性陽イオンチャネル(CNG)などを、人工膜へ再構成することをめざしている。H30年度は、前年度までの実施状況を踏まえつつ、ひきつづき、CNG導入・ITG導入リポソーム等を評価できるよう、GUVプロテオリポソームの改良に取り組むとともに、それに類する人工細胞モデルの構築も検討してきた。H30年度の実施内容は、つぎの通りである。前年度までに本研究でバキュロウイルスを用いた組換え膜タンパク質導入の方法が適用できることを示した界面通過法(droplet transfer method)により作製したGUVを用いて、イオン透過の経過観察を行いチャネル機能評価のための準備をした。また、同じく前年度報告した逆相遠心法によって多数(大量)のGUVを効率的に調製したのち、バキュロウイルス出芽ウイルス粒子との膜融合試験に供し、GUVプロテオリポソーム作製に利用可能であることを示した。また、前年度に引き続き、自由な膜からなるベシクルにこだわらない人工膜に対して組換え膜タンパク質をバキュロウイルス出芽粒子との混合により導入する方法の検討を進め、GPCR等の組込みに成功した。細胞モデルとなるミクロコンパートメントとして最近注目されている、異なる水性高分子溶液に現れるミクロ液滴を用いて、その内部に細胞骨格タンパク質(ここではアクチン)や核酸などを封じ込める実験も並行して行った。そして、細胞情報伝達系のモデル構築のために有用な知見を得た。以上について、プログレススナップショットとして学会で発表を行い、また一部は論文化している。1)界面通過法により作製したGUVに対する、バキュロウイルス(エンベロープ型DNAウイルス)の出芽ウイルス粒子(BV)の膜融合を用いてCNGチャネル評価のためのイオン透過性試験法の検討を前年度に引き続いて進めてきた。その基準となる、脂質膜のカルシウムイオンのイオン透過の経時変化を、イオノフォアを用いて単一GUVレベルの観察で追跡することが出来た。今後H29年度に上記方法で得たGUV膜へ組換え膜タンパク質の導入を行っているので、CNGを導入した人工膜を作りその活性の評価を試みて行く。2)H29年度に、GUVの大量調製の方法を、逆相法をベースに再検討し逆相遠心法として改良し論文公開した。本方法で得たGUVへの組換えタンパク質導入を行うため、BVとの融合実験を行い、比較的効率よく多数のGUVがBVと融合する条件を、脂質組成、融合誘起のためのpH等の試験から、見出してきている。高頻度で目的受容体等を組込んだプロテオGUVが得られる条件は本課題の遂行に役立てられる。3)昨年度までに(H29年度)膜脆弱性を回避するため、自由膜で無い、球状人工細胞膜の作製条件を追試験し、BVに発現提示したインテグリンなどの膜タンパク質を上記に埋め込む条件を得てきている。今年度は、特に情報伝達に重要なGタンパク質共役受容体をモデルにその作製条件、および、人工脂質膜への提示を特異的な抗体結合でアッセイできる条件について、ともに検討を進め、これら条件を見定めつつある。4)GUVと同様に細胞サイズのモデルミクロコンパートメントとして注目を集めつつある水性二相分離系の水/水ミクロ液滴内へ、細胞骨格タンパク質であるアクチンを捕捉し、その局在性を検討し、細胞情報伝達系のモデル構築のために有用な知見を得た。1)4)の進捗から、概ね順調に計画は運んでいると考える。上述の本課題に関連する研究成果について論文・学会発表等を次年度に予定している。そのため、本研究課題の期間の延長を既に申し出て、認められている。また、本課題に関するテーマをさらに発展させた新規課題が採択されており、引き続きそちらを推し進めていく。本研究全体の課題「GPCRから環状ヌクレオチド感受性陽イオンチャネル(CNG)開放へ至る経路と、インテグリン(ITG)と細胞骨格関連タンパク質からなる経路を、再構成する」を実施するために、本年度は、主に、研究代表者の改良するリポソーム作製方法と、開発に携わってきた組換えバキュロウイルス/リポソーム膜融合によるプロテオリポソーム作製法とを、基盤技術として本課題の遂行に使用できるようにさらに調整することを目標の中心に据えた。平成28年度の具体的な実施目標は、第一は、アドレナリン受容体(ADRB)、CRF受容体(CRHR)の促進性GPCR、Gタンパク質、アデニル酸シクラーゼ(ADCY)を発現して再構成する場合にcAMPの産生を捉えうる環状ヌクレオチド感受性陽イオンチャネルCNG(4量体)の人工細胞膜への再構成である。外部Mg2+,Ca2+の流入の程度をイオンプローブで顕微評価することを試みた。このとき、人工脂質膜ベシクルには巨大リポソーム(Giant Unilamellar Vesicle、GUV)を利用し、その作製法には、界面通過法(droplet transfer method)を採用した。この方法は内容物の封入を容易にするが、静置水和法と作製したGUVを用いた場合とリン脂質膜とバキュロウイルスの膜融合後の性状に違いがあることが、本研究の基礎実験で分かり、より良い評価法を考案するためのデータも得られたので、年度後半に論文投稿した。ITGと細胞骨格

関連タンパク質の再構成についても、人工脂質膜ベシクル(リポソーム)と組換え膜タンパク質発現バキュロウイルス出芽粒子との混合を利用した、膜融合法や脱水再水和法により、比較的温和な液性条件での作製条件を探っているところであり、進捗結果のスナップショットを学会発表した。今回、CNGの再構成ならびに環状ヌクレオチドを感受し開放するゲート活性をGUV上で検出する試みに取り組むにあたって、バキュロウイルスによる発現方法とウイルス粒子に調製方法、GUVの作製方法、条件設定、画像情報の取得と処理、データ解釈などに関する、これまで総合的に行ってきた研究の中に位置づけながら、実施してきた。GUVを用いる利点は、個々のGUVについて、顕微鏡観察によって情報を取得できることである。一方で、本質的に取得できるデータに、比較的小さくないばらつきが伴う。本年度は、界面通過法で作製したGUVとモデルとして選んだ野生型ウイルス、ならびにRFP融合GPCR(CRHR1)発現ウイルスとの融合を検討し、本方法で作製したGUV膜へのウイルスの融合挙動が、脂質標識では均一拡散するが、膜タンパク質標識ではパッチ状が顕著となることを明らかにした。微妙な性状比較を簡便に行えるよう、多数のGUV個々に個別番号を振り、それぞれについてサイズや詳細な蛍光輝度情報を得ることによって、同一条件のGUVでのばらつき具合を把握し、膜融合を制御するpHの各値での変動を統計的に解釈することで、GUVのサンプルであってもより明瞭にウイルスとの膜融合挙動を捉えられることを実証し、研究分担者とともに論文投稿している。このスタンスでの評価が確立したことで、本課題への今後の取り組み方が明瞭となった。本研究の目標は、受容体の情報が伝達され応答として現れる系を構築することである。インテグリン(ITG)、細胞骨格関連タンパク質からなる経路、環状ヌクレオチド感受性陽イオンチャネル(CNG)などを、人工膜へ再構成することをめざす。H29年度は、H28年度の実施状況を踏まえつつ、CNG導入リポソーム、ITG導入リポソーム、を具体的に評価できるよう、ひきつづき、GUVプロテオリポソーム作出方法のさらなる改良に取り組んでいく。H29年度の具体的な実施内容は、つぎの通りである。H28年度後半に、物質の内包に適した界面通過法(droplet transfer method)により作製したGUVを用いて、リン脂質膜とバキュロウイルスの膜融合後を行い、静置水和法GUVのケースとの間に差異があること、ウイルス成分の膜上の分布、特にGUV膜へ取り込まれた膜受容体の膜上分布から、融合・組込みを統計的有意に検出できること、などを明らかにし投稿したが、今年度採択され原著論文として公開された(DOI: 10.1016/j.colsurfb.2017.04.027)。当該論文は、ある程度のGUV集団情報のばらつき具合の変動を統計的に追跡することが重要であることを示しており、それに役立つ多数(大量)GUVの効率的調製方法の開発も進めた。その結果、広い脂質組成、溶液条件に適用できるGUV調製方法として、新たに逆相遠心法を開発した。本成果は原著論文として公開された(DOI: 10.1016/j.colsurfa.2018.02.060)。