hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ケア現場の意思決定プロセスを支援する臨床倫理検討システムの展開と有効性の検証

すでに開発した臨床倫理の事例検討システムを、基本的考え方と個別事例検討法の両面にわたって、医療従事者と共同で改訂し、臨床現場における有効性を高めた。また、改訂の成果を、テキスト、ウェブ版説明、eラーニングとして公開した。本研究の意思決定プロセスについての情報共有-合意モデルを老年医学会の高齢者への人工的水分栄養補給に関する意思決定プロセスガイドラインに反映させた。また、高齢者の人工栄養、人工透析や、ALS患者の人工呼吸器装着等に関する本人・家族の意思決定を支援するツールを開発した。研究期間中に、全国各地で臨床倫理セミナーを現地の協力者と共同で48回開催し、延べ6700人の参加を得た。(1)臨床倫理検討システムの見直しを、現場に同システムを提供する観点で行い、研究代表者の関心ではなく、医療・介護従事者の関心に合わせて、より明快なものとする検討を行った。その成果は『臨床倫理エッセンシャルズ』(2012年春版)として刊行し、また、ウェブ上で使えるようにし、本研究として開催した臨床倫理セミナーで使用して、医療・介護従事者の使い勝手を調べた(清水・会田・竹内)。(2)高齢者ケア・介護チームは、清水と会田が、日本老年学会の企画に応じて、高齢者への人工的水分・栄養補給の導入をめぐる意思決定プロセスについてのガイドライン作りに参加したが、その際に、本研究の理論を実際の高齢者ケアの現場で活かすためにはどのようにガイドラインに反映させたらよいかの検討を本研究として行った(実際に本研究の理論を反映したガイドラインを老年医学会のワーキンググループとして公表した)。(3)本人・家族の意思決定チームは、(2)と連動して、高齢者における人工的水分・栄養補給の導入についての意思決定プロセスを本人・家族が適切に進むことができるよう支援するツール-意思決定プロセスノート(すでに22年度に試行版を作った)の改訂を進め、本研究として理論的側面の検討を行った。成果は、ガイドラインに併せて作成した『高齢者ケアと人工栄養を考える-本人・家族の選択のために』に反映している。また、ALS患者が人工呼吸器を着けるかどうかの選択を支援するツール制作に際して理論面の検討を本研究として行った。これらの制作・改訂に伴って、意思決定プロセスノート汎用版の構想の改訂を進めた。(4)がん治療・緩和ケアチームは、緩和医療学会の終末期の輸液についてのガイドライン改訂に協力し、本研究の考え方をその倫理面に反映させた。また、本人・家族の生活を支援するガイドブックの企画に、臨床倫理・臨床死生学の視点からの参加をしつつある(田代・清水)。1臨床倫理学+臨床死生学システムの再検討と教育カリキュラムの整備:本研究プロジェクトとして提唱する臨床倫理の考え方を、(1)倫理の理解、(2)臨床の倫理原則、(3)意思決定プロセス、(4)いのちの評価の4点にわたってまとめた。また、それを分かり易く表現する工夫と一般的研修および臨床倫理ファシリテータ養成のための教育カリキュラムの整備に反映させる作業をした。2高齢者ケア・介護チーム:継時的・包括的意思決定プロセスノートの構想を、現在から人生の最終段階のケアに到るプロセスを見通して、心積もりを前もって行う「心積りノート」として展開させ、一般市民を対象とする部分的試行をしながら、具体的な冊子へと作るプロセスの後半に入っている(平成26年度前半で完成見込み)。また、人工栄養をめぐる意思決定プロセスノートを模範にして、高齢者の人工透析をめぐるプロセスノート作りを志す看護師を中心としたグループの活動に本研究プロジェクトの成果を提供しもした。3がん治療・緩和ケアチーム:在宅での看取りについての検討を、上記1の臨床倫理事例検討および2の心積りノートに活かす方向に用いることとし、これらと合同の活動をした。4本人・家族の意思決定支援ツール開発:2の活動と合同で活動した。加えて、研究協力者が子宮内膜症をめぐる本人の意思決定プロセスノートの開発を始めたので、そこに本プロジェクトのこれまでの成果を提供し、合同で検討を進めた。5臨床倫理セミナー:札幌、仙台、東京、金沢、大阪、広島、松山など全国各地で計11回ほど、臨床倫理セミナーを開催し、本研究の成果を現場で活かす試みをアクション・リサーチとして続けた。また、臨床倫理ファシリテータ養成研修を、東京と大阪で試行した。6生命倫理学会大会において死生学と臨床倫理をテーマとするシンポジウムを企画・実行し、研究成果の一端を発表した。1前年度に行った臨床倫理検討システムの見直しに加えて、様々な問題を検討する際のより詳細な考え方の拡充と、医療・介護従事者の研修に適するカリキュラム化の検討を行った。その成果を清水+臨床倫理プロジェクト著『臨床倫理エッセンシャルズ』(2013年春版)として刊行し、本年1月以降のセミナーで活用し、使い勝手の検討を行った。

2前年度に清水と会田が高齢者への人工的水分・栄養補給導入をめぐる意思決定プロセスについてのガイドライン案作成に参加し、本臨床倫理プロジェクトの研究成果を反映させたが、これがほぼ原案通り日本老年医学会のガイドラインとして承認された(平成24年6月)。このことと並行して高齢者ケア・介護チームおよび本人・家族の意思決定チームは、老年看護専門看護師グループ(全約45名中35名の参加)等の全面的協力を得るなど、臨床現場の広範な支持と期待を得つつ、このテーマに特化した本人・家族の選択を支援する「意思決定プロセスノート」の再改訂を行い、『高齢者ケアと人工栄養を考えるー本人・家族の選択のために』(改訂第3版)を刊行した。これは現場からの関心も高く、冊子送付希望が沢山きており、現在、協力者たちによって試用中である。また、これを出発点とする包括的・継時的意思決定プロセスノート構想も進んでいる。3がん治療・緩和ケアチームは、国立がん研究センターや爽秋会岡部医院等の協力者と、人生最期のケアないし看取りケアについての意見交換を進めた。4臨床倫理セミナーを各地で開催し、臨床倫理システムとその教育カリキュラム化の成果を現場に還元するとともに、上記テキストの更なる改訂のために、参加者の使い勝手を調べつつある。セミナーは、本研究チームが主催、共催ないし後援を行ったものだけで12回(砺波、札幌(3回)、名寄、金沢、盛岡、東京、松山、大阪、飛騨高山、岡山)、延べ1700名の参加者があった。1臨床倫理学+臨床死生学システムの再検討と教育カリキュラムの整備:検討結果を『臨床倫理エッセンシャルズ2015春版』に反映させ、また、医療・ケア従事者に分かり易いウェブ版を公開した。eラーニングは企業の看護師向け企画にのせて発信した。分担者はファシリテータ教育カリキュラムを分担して、教育内容を作成した(田代:事例検討の難点と対応;会田:4分割法;霜田:事例検討のデータ蓄積;竹内:コミュニケーションとしてのケア;清水:事例検討法)2高齢者ケア・介護チーム:元気な時期から最期にわたる「心積りノート」の企画を展開したが、完成には到らなかった。また、本プロジェクトによる意思決定プロセスノートの考え方により、高齢者の人工透析をめぐるプロセスノート作りを専門の看護師・医師の協力を得て試行版刊行から協力者の試用とチェックを経て改訂し、完成版版下まで完了した(担当会田)。3がん治療・緩和ケアチーム:在宅での看取りについての検討に、上記1の臨床倫理の考え方および2の心積りノートの考え方を活かす方向で参加した(担当田代)。4本人・家族の意思決定支援ツール開発:2の活動と合同で活動した。加えて、研究協力者が子宮内膜症をめぐる本人の意思決定プロセスノートの開発を進め、学会等で発表した。5臨床倫理セミナー:札幌、仙台、東京、金沢、大阪、広島、松山、鹿屋など全国各地で計13回、臨床倫理セミナーを開催し(参加者計約2000名)、本研究の成果を現場の具体的・個別事例において活かす試みをアクション・リサーチとして続けた。また、臨床倫理ファシリテータ養成研修のカリキュラム検討を進め、札幌と大阪で、地元のグループと協働して試行した。
脳梗塞に対する骨髄幹細胞移植による脳のplasticity亢進による神経機能回復

我々はこれまで,ラット脳梗塞モデル(middle cerebral artery occlusion: MCAO)へ骨髄間葉系幹細胞(mesenchymal stem cell: MSC)を静脈内投与すると,治療効果が得られることを報告してきた.これまでに明らかにしてきた基礎研究の結果より,MSCによる治療効果のメカニズムは,1サイトカインによる神経栄養作用,2血液脳関門の安定化,3血管新生,4脱髄軸索の再有髄化,5脳のplasticityの賦活化など,と協奏的に発揮することによることが判明している.MSCの経静脈的移植により運動・感覚機能が回復する過程における脳のplasticityの変化を,動物用MRI(7Tesla)によるfunctional MRI(fMRI)を用いて解析した結果,脳のplasticityが変化することによって,脳内の神経回路のrewiringが賦活化され,神経機能の回復に寄与した可能性があると考えられた.MSCの経静脈的移植後に生ずる脳梗塞の運動機能の回復過程で,脳のplasticityの変化が重要な役割を果たしていることが示唆されたが,これまでのところ詳細な解明はなされていない.以上のように,補助金は補助条件に従って有効に使用されている.ラット脳梗塞モデル(MCAO)を作成し,MSCの経静脈的投与を行った後に,動物実験用MRI装置(7Tesla)を用いてEx vivo Diffusion Tensor Imagingを撮像し,神経回路の解析および神経トレーサーを用いた神経解剖学的解析や,免疫組織学的手法を用いて大脳皮質のplasticityの変化を解析している.ラット脳梗塞モデル(MCAO)を作成し,MSCを経静脈的に投与した後に,経時的に動物実験用MRI装置(7Tesla)を用いて,通常のT2強調画像や拡散強調画像に加えてEx vivo Diffusion Tensor Imagingを撮像し,神経回路の解析を行う.さらに,神経トレーサーを用いた神経解剖学的解析や,免疫組織学的手法を用いて大脳皮質のplasticityの変化を詳細に解析する予定である.我々はこれまで,ラット脳梗塞モデル(MCAO)へ骨髄間葉系幹細胞を静脈内投与すると,治療効果が得られることを報告してきた.これまでの基礎研究の知見より,MSCによる治療効果のメカニズムは,1サイトカインによる神経栄養作用,2血管新生,3脱髄軸索の再有髄化,4神経再生による脳の可塑性の調節,と多段階的に発揮することによることが判明している.骨髄間葉系幹細胞移植により運動・感覚機能が回復する過程における脳のplasticityの変化を,動物用MRI(7T)によるfunctional MRI(fMRI)を用いて研究した結果,脳の可塑性が変化することによって,脳梁を介する皮質ー皮質間,皮質ー線条体間,皮質ー視床間,皮質ー脊髄間の軸索が構築する神経回路のrewiringの増加が生じた結果,神経機能の回復に寄与した可能性があると考えられ,骨髄間葉系幹細胞移植による脳梗塞の運動機能の回復過程で,脳のplasticityの変化が重要な役割を果たしていることが示唆されたが,詳細な解明はなされていない.本申請では,脳梗塞モデルラットに骨髄間葉系幹細胞を経静脈的に投与した後に生じるこれらの脳の可塑性の変化を,Ex vivo MRI Diffusion Tensor Imagingおよび神経解剖学的および分子病理学的に解明し、新しい治療法の開発の基礎的なデータとすることを目的としている.現在までに,本研究費によってラット脳梗塞モデルを作成し,動物実験用MRI装置(7T)を用いてDiffusion Tensor Imagingを撮像し,神経回路の解析および免疫組織学的手法を用いて,大脳皮質の可塑性の変化を解析している.これらのデータは骨髄幹細胞移植を行った後の機能回復の程度を比較解析する際に重要なコントロールデータとなり得る.以上のように,補助金は補助条件に従って有効に使用されている.ラット実験的脳梗塞(中大脳動脈閉塞:MCAO)モデルを作成し,動物実験用MRI装置(7T)を用いてDiffusion Tensor Imagingを撮像し,神経回路の解析および免疫組織学的手法を用いて大脳皮質の可塑性の変化を解析している.我々はこれまで,ラット脳梗塞モデル(middle cerebral artery occlusion: MCAO)へ骨髄間葉系幹細胞(mesenchymal stem cell: MSC)を静脈内投与すると,治療効果が得られることを報告してきた.これまでに明らかにしてきた基礎研究の結果より,MSCによる治療効果のメカニズムは,1サイトカインによる神経栄養作用,2血液脳関門の安定化,3血管新生,4脱髄軸索の再有髄化,5脳のplasticityの賦活化など,と協奏的に発揮することによることが判明している.MSCの経静脈的移植により運動・感覚機能が回復する過程における脳のplasticityの変化を,動物用MRI(7Tesla)によるfunctional MRI(fMRI)を用いて解析した結果,脳のplasticityが変化することによって,脳内の神経回路のrewiringが賦活化され,神経機能の回復に寄与した可能性があると考えられた.MSCの経静脈的移植後に生ずる脳梗塞の運動機能の回復過程で,脳のplasticityの変化が重要な役割を果たしていることが示唆されたが,これまでのところ詳細な解明はなされていない.以上のように,補助金は補助条件に従って有効に使用されている.

ラット脳梗塞モデル(MCAO)を作成し,MSCの経静脈的投与を行った後に,動物実験用MRI装置(7Tesla)を用いてEx vivo Diffusion Tensor Imagingを撮像し,神経回路の解析および神経トレーサーを用いた神経解剖学的解析や,免疫組織学的手法を用いて大脳皮質のplasticityの変化を解析している.ラット実験的脳梗塞(中大脳動脈閉塞:MCAO)モデルを作成し,骨髄間葉系幹細胞を経静脈的に投与した後に,経時的に動物実験用MRI装置(7T)を用いて,通常のT2強調画像や拡散強調画像に加えてDiffusion Tensor Imagingを撮像し,神経回路の解析を行う.さらに,免疫組織学的手法を用いて大脳皮質の可塑性の変化を解析する予定である.ラット脳梗塞モデル(MCAO)を作成し,MSCを経静脈的に投与した後に,経時的に動物実験用MRI装置(7Tesla)を用いて,通常のT2強調画像や拡散強調画像に加えてEx vivo Diffusion Tensor Imagingを撮像し,神経回路の解析を行う.さらに,神経トレーサーを用いた神経解剖学的解析や,免疫組織学的手法を用いて大脳皮質のplasticityの変化を詳細に解析する予定である.昨年度はラットを用いた脳梗塞モデルを作成し,動物実験用MRI装置,免疫組織学的手法などを用いて神経可塑性の変化を解析したが,予定していたよりも少ない額で研究が遂行できたため,880,969円の余剰が生じた.(使用計画)次年度使用額については,昨年度に引き続きラットを用いた実験的脳梗塞モデルに対して骨髄幹細胞を移植し,治療効果の検討ならびに神経可塑性の変化の解析を継続するために使用する予定である.昨年度はラット脳梗塞モデル(MCAO)を作成し,動物実験用MRI装置(7Tesla),免疫組織学的手法などを用いて脳のplasticityの変化を解析したが,予定していたよりも少ない額で研究が遂行できたため,1,189,430円の余剰が生じた.(使用計画)次年度使用額については,昨年度に引き続きラット脳梗塞モデル(MCAO)に対してMSCを移植し,治療効果の検討ならびに脳のplasticityの変化の解析を継続するために使用する予定である.
筋疲労における筋力変調の作用点:スポーツ医学への応用を目指して

筋収縮活性化は、細いフィラメント上のトロポニンへのカルシウムの結合と、それに続くアクチンへのミオシン結合による活性化過程に分けられる。この後半の過程は自己増殖的であるため、疲労筋での筋パフォーマンス低下の重要な作用点である可能性がある。そこで本研究ではこの自己増殖的活性化過程に焦点をしぼり、本過程に対する筋張力の関与を、リン酸アナログであるフッ化アルミニウムを用いて解析することを主目的とした。X線回折法とNMR法により、フッ化アルミニウムを結合したミオシンの性質を調べたところ、フッ化アルミニウムを結合したミオシンは可動性が低く、ミオシンバックボーンのまわりでらせんを描いて拘束されていることがわかった。またこのらせん構造が失われる過程は初期張力から見積もった収縮張力回復過程と一致していたため、フッ化アルミニウムを結合したミオシンはアクチンと相互作用後すぐにアナログを解離し、収縮サイクルに入ることがわかった。このことからアナログ解離の律速段階はアクチンとの結合ステップであることが確かめられた。また張力を発生しない外来性のアクチンを加えるとアナログ解離は活性化されたが、その大きさは線維を引き伸ばしても増大しなかった。アクチンによるミオシンのアナログ解離過程の活性化に、細いフィラメントにかかる歪みが深く関わっていることがわかった。これらのことから、アクトミオシンによる自己増殖的筋活性化機構の実現には、細いフィラメントにかかる歪みがアクトミオシン結合を促進することが重要であることが示唆された。筋疲労に関わる因子としてこれまで種々のものが提唱されてきているが、張力減少による負の効果が自己増殖的に働くことがこれらの因子の作用を増強している可能性が考えられる。疲労筋モデルを作成してその張力抑制効果が(1)Ca2+イオンによる収縮活性化過程と(2)クロスブリッジの自己触媒的な結合による活性化過程のそれぞれに対してどれだけ強く及ぶかを調べている。活性化の程度はミオシン-ADP-Piの安定なアナログであるミオシン-ADP-フッ化アルミニウム(AlFx)の解離過程を力学測定、X線回折、NMRで観測することによって、定量評価している。1)力学測定フッ化アルミニウムAlFx存在下で、骨格筋スキンドファイバーを収縮させて、ミオシン-ADP-AlFxアナログを形成させた。±Ca2+硬直液と最大活性化収縮液中でこのファイバーを活性化させたところ、それぞれについてのアナログの解離経過がスチフネスと収縮初期張力によって見積れることがわかった。各活性化因子の作用の強さを、数学ソフトMapleを使ったシミュレーションで解析している。2)X線回折フッ化アルミニウムを取り込んだミオシン頭部の超分子形態を、X線回折法で調べた。高分解能での測定をSPring8の放射光施設を用いて実施することができた。比較の対象として、ゲルゾリンでアクチンを除去したスキンドファイバー中のミオシン頭部の状態も調べた。温度、イオン強度、二価イオン濃度を変えたときのミオシン頭部の赤道面上での分布状態は、フッ化アルミニウムを取り込んだスキンドファイバーと、アクチンを除去したスキンドファイバーとでよく似通っていた。今回測定したミオシン頭部の動きとの違いとして、活性化の程度を評価できることがわかった。ファイバー内のミオシン-ADP-AlFxの化学状態を調べるために、フッ素に対して強い感度を持っ新規プローブが導入されたので、フッ化アルミニウムを取り込んだスキンドファイバーでの測定に向けて調整を行った。目的)筋疲労による張力抑制効果の作用点の(1)カルシウムによる収縮活性化過程、(2)クロスブリッジの自己触媒的な結合による活性化過程のうち、(2)の自己触媒作用が筋節構造内を伝播する力を介した自己

媒効果かクロスブリッジの結合そのものによる化学的な効果かを分けるために、外来性のアクチン(ウサギから精製)を加えることにより力発生のないクロスブリッジ相互作用を実現し、張力測定・mmR解析およびX線回折により筋活性化の程度をみつもる。結果)溶液状態の外来アクチンの添加により、筋節内での力伝播がなくてもクロスブリッジ相互作用による筋の活性化がみられた。このことから、クロスブリッジによる筋の自己触媒的活性化には筋節内を力が伝播することは必須ではないことがわかった。次に、異なる筋節長で外来アクチン溶液を作用させることで、静止張力の大きさが自己触媒作用にあたえる影響を調べたところ、筋節長による活性化は明らかでなかった。これらのことから、クロスブリッジによる自己触媒的活性化作用では力発生による筋節内のひずみの寄与はあまり大きくないことが示唆された。意義)骨格筋の重要な性質として伸展による筋活性化(「ストレッチアクティベーション」)が知られているが、この機構はクロスブリッジの自己触媒的活性化を介するものではなさそうであることがわかった。このことは、弱い力でもクロスブリッジの化学状態を制御することで高い筋活性化状態を実現し、効率的な収縮を起こし疲労を抑制することができる可能性を示す。
次世代ストカスティックコンピューティング回路のための3つの要素技術とCAD技術

デジタル回路で確率的に演算を行うストカスティックコンピューティング(SC)用回路の設計に必要な3つの要素技術とSC回路の設計に必要なコンピュータ支援設計(SC-CAD)に関する研究を行っている.本年度は3つの要素技術(1)(3)の中で,(1)のSC回路の耐故障設計技術に関して研究成果を得た.具体的には,線形有限状態機械(線形FSM)に基づくSC回路の耐過渡故障性に着目し,SC回路の耐過渡故障性を向上するために線形FSMの状態をストカスティック数(SN)で符号化する手法を提案した.さらに回路規模の増加を抑えるために,線形FSMの一部の状態遷移を近似することで,状態遷移関数を簡単化する手法も提案した.マルコフ連鎖による解析により,ニューラルネットワークなどで利用される双曲線正接関数を実現するSC回路の耐過渡故障性を向上できることが明らかになった.この成果は電子情報通信学会のディペンダブルコンピューティング研究会で報告した.さらに,関連する派生テーマとして,SC回路の1つのアプリケーションであるSC回路に基づくニューラルネットワークの研究を行った.本研究では,積の正負分離とシグモイド関数近似を用いたSCに基づくニューラルネットワークに着目し,その演算精度について考察した.計算器実験によって,SCニューロンの演算精度に与える要因を明らかにし,ニューラルネットワークの認識精度に与える影響について議論した.さらに,その要因の影響を小さくするために,ストカスティック数を生成するために必要な乱数生成器の共有が有効であることを実験的に示した.研究成果はFTC研究会で報告を行った.本年度は2つの要素技術について取り組み,一方の技術について一定の進歩を得ることができたため.また派生テーマに対しても成果を得ることができたため.要素技術(1)と(3)はさらに研究を推し進め,論文誌などの形でまとめる.また,派生テーマはさらに研究を続け,一定の成果を得る.要素技術(2)とCAD技術は本計画から除外し,次期の研究計画の一部として取り組む.デジタル回路で確率的に演算を行うストカスティックコンピューティング(SC)用回路の設計に必要な3つの要素技術とSC回路の設計に必要なコンピュータ支援設計(SC-CAD)に関する研究を行う.(1) SCは確率的な演算であるため原理的にエラーに強いが,SC回路にはエラー耐性がない部分もある.そこでエラーに弱い部分のエラー耐性を高めたSC回路の耐故障設計技術を開発する.(2) SCに用いる確率の表現方法(ストカスティック数)を工夫することにより,短時間で高精度な演算が可能となる新しいSC演算技術を開発する.(3) SCでは乱数列を用いるが,その乱数発生源の規模が大きいことが1つの問題である.この問題を解決するために,実装が容易でかつ高精度演算を可能とする乱数発生法を確立する.(SC-CAD)これらの要素技術を組み込むことが可能なSC回路設計支援システム(SC-CAD)を構築する.3つの要素技術に対して,当初の予定どおり以下の成果を得た.(1)線形順序機械(FSM)を用いたSC回路の耐故障化設計法の開発を行った.この線形FSMを用いたSC回路は,回路の状態を2進数を用いて保持しているが,この部分のエラー耐性が非常に低い.そこで,初年度は状態割当が耐故障性に与える影響について解析し,故障耐性を高めるための状態割当アルゴリズムを開発した.(2) SC回路を用いた反復法において,2進数への変換をできるだけ必要しない演算方法を検討した.具体的には,顔認識システムに利用される行列積を対象に,短時間で高精度な演算が可能な演算回路を設計した.(3)乱数発生源を別途必要としない(つまり面積がかなりコンパクトな)SC回路構成を提案した.また,内部信号線を適切に選択するアルゴリズムも開発した.3つの要素技術に対して,想定した成果をほぼ得ることができたため.また,この成果を以下のように国内外の研究会で報告することができたため.(1)国際会議2件(1件は平成29年9月に発表予定),(2)国内研究会1件,(3)国内会議1件,国際会議1件(さらにもう1件,平成29年6月に投稿予定)デジタル回路で確率的に演算を行うストカスティックコンピューティング(SC)用回路の設計に必要な3つの要素技術とSC回路の設計に必要なコンピュータ支援設計(SC-CAD)に関する研究を行う.(1) SCは確率的な演算であるため原理的にエラーに強いが,SC回路にはエラー耐性がない部分もある.そこでエラーに弱い部分のエラー耐性を高めたSC回路の耐故障設計技術を開発する.(2) SCに用いる確率の表現方法(ストカスティック数)を工夫することにより,短時間で高精度な演算が可能となる新しいSC演算技術を開発する.(3) SCでは乱数列を用いるが,その乱数発生源の規模が大きいことが1つの問題である.この問題を解決するために,実装が容易でかつ高精度演算を可能とする乱数発生法を確立する.(SC-CAD)これらの要素技術を組み込むことが可能なSC回路設計支援システム(SC-CAD )を構築する.3つの要素技術のうち(1)と(3),そしてCAD技術(SC-CAD)に対して,以下の成果を得た.(1)線形順序機械(FSM)を用いたSC回路の耐故障化設計のための状態割当アルゴリズムの改良を行った.改良したアルゴリズムはシンプルではあるが十分な耐故障性の向上が見られた.成果は国際会議ITC-Asiaで発表した.(3)乱数発生源を他の論理回路に求めるSC回路構成法の実験的評価とその評価に基づく改良を行った.

これにより,乱数発生源に応じた回路構成が可能となる.成果の一部は国内会議で発表し,論文誌投稿を行った.(SC-CAD)SC回路を効率的にシミュレーションするためにマルチプロセスによる並行シミュレーション環境を整備した.要素技術(1)と(3)に対しては一定の成果を得ることができたが,全体としては当初の計画より遅れている.特に要素技術(2)に関してはほとんど進めることができなった.計画が遅れている理由の1つに,当初予定していた研究計画者が減ったことが挙げられる(大学院生・学部生4名を予定していたが,1名に減ってしまった).デジタル回路で確率的に演算を行うストカスティックコンピューティング(SC)用回路の設計に必要な3つの要素技術とSC回路の設計に必要なコンピュータ支援設計(SC-CAD)に関する研究を行っている.本年度は3つの要素技術(1)(3)の中で,(1)のSC回路の耐故障設計技術に関して研究成果を得た.具体的には,線形有限状態機械(線形FSM)に基づくSC回路の耐過渡故障性に着目し,SC回路の耐過渡故障性を向上するために線形FSMの状態をストカスティック数(SN)で符号化する手法を提案した.さらに回路規模の増加を抑えるために,線形FSMの一部の状態遷移を近似することで,状態遷移関数を簡単化する手法も提案した.マルコフ連鎖による解析により,ニューラルネットワークなどで利用される双曲線正接関数を実現するSC回路の耐過渡故障性を向上できることが明らかになった.この成果は電子情報通信学会のディペンダブルコンピューティング研究会で報告した.さらに,関連する派生テーマとして,SC回路の1つのアプリケーションであるSC回路に基づくニューラルネットワークの研究を行った.本研究では,積の正負分離とシグモイド関数近似を用いたSCに基づくニューラルネットワークに着目し,その演算精度について考察した.計算器実験によって,SCニューロンの演算精度に与える要因を明らかにし,ニューラルネットワークの認識精度に与える影響について議論した.さらに,その要因の影響を小さくするために,ストカスティック数を生成するために必要な乱数生成器の共有が有効であることを実験的に示した.研究成果はFTC研究会で報告を行った.本年度は2つの要素技術について取り組み,一方の技術について一定の進歩を得ることができたため.また派生テーマに対しても成果を得ることができたため.特に計画の変更は無い.当初の予定どおり,3つの要素技術(1), (2), (3)のさらなる開発,そして,新たにSC-CADの実現に向けたCAD技術を開発する.今年度も学部学生2名の研究協力しか見込めないため,以下のように研究計画を変更する予定である.・比較的順調に進んでいる要素技術(1)と(3)に関する研究を主として進める(要素技術(2)の研究は計画を遅らせて,次年度以降に成果を求める)
Micrococcus luteusの細胞壁外層分離酵素の精製

1.MTは、トリプシンを添加しなくても、培養条件により対数期付近においてPacketsを形成することがわかったので、活性測定系は当初の方針を変更した。多数の標品の活性を測定できるように培養プレートを容器として利用した培養系に標品を加え、一定時間後にMT細胞を抜き取り、位相差顕微鏡でPackets形成の有無を観察して、活性を定性的に+-で判定することにした。2.IFO 3333の培養上清を限外濃縮し、濃縮液をpH6.0で平衡化したQ-Sepharose FFイオン交換カラムにかけ、食塩濃度01.0Mの濃度勾配の緩衝液を流した。活性蛋白質は、食塩濃度0.38M付近で溶出された。3.活性画分を濃縮し、pH6.0で平衡化したSephacryl S-200 HRゲル濾過カラムにかけた。活性蛋白質は、排除体積付近に溶出された。4.得られた最終標品をポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけると、215%ゲルで一本のバンドが見られた。SDS存在下のゲル(420%)電気泳動では、分子量約20万の位置に一本と約3万以下の位置に数本のバンドが見られ、更にメルカプトエタノール存在下では、分子量約8万以下の位置に数本のバンドが見られた。5.ほぼ純品に近く精製されたと思われるが、精製方法には改良の余地があり、今後は方法の確立をめざす。6.活性物質を加えて培養することによりPacket形成が阻止されたMT細胞を、走査型電顕で観察すると、細胞表面に均一に多数の粒状物質が認められた。活性物質の作用機序の解明は、今後の興味ある研究課題である。Micrococcusluteus野性株IFO 3333の培養上清から、細胞壁外層を切り離す酵素を精製する計画である。活性測定は容易だと考えていたが、そうではなかった。その活性測定系を工夫した。1.当初、活性を定量的に測定するために、変異株MTより誘導されるPacketsを加熱処理し、緩衝液に懸濁したものを基質とし、その濁度変化を指標にすることを考えていた。培養上清を硫安沈澱して得た画分(粗酵素標品)は、Packetsを切り離さなかった。2.加熱処理しないPacketsも、粗酵素標品は切り離さなかった。3.MTをトリプシン添加培養するとPacketsが形成されるが、濾過滅菌した粗酵素標品を一緒に加えるとPacketsは形成されない。Packets形成阻止を指標に定性的に+-で活性を判定しようとしたが、再現性に乏しかった。IFO 3333の目的とする酵素はトリプシンに安定だと考えていたが、それほど安定でもないようである。4.MTをゆるやかに振とう培養すると、トリプシンを添加しなくても、対数期付近においてPacketsを形成することがわかった。粗酵素標品を一緒に加えるとPackets形成は阻止された。粗酵素標品の代わりにIFO 3333を加えてもPackets形成は阻止された。粗酵素標品によるMTのPackets形成阻止は、今のところ再現性がある。この系で活性を定量的に測定するには、粒度分析計等が必要であるが、ないので、光学顕微鏡でPackets形成の有無を観察して、活性を定性的に+-で判定する予定である。今後、精製を目指す予定である。前年度に確立した活性測定系を用い、今年度は、Micrococcus luteus変異株MTのPacket形成を阻止する活性を有する物質を、野性株IFO3333の培養上清から精製することを試みた。

1.M.luteus IFO3333の培養上清を限外濃縮し、活性が存在することを確認した。2.濃縮液をイオン交換カラムにかけた。Q-SepharoseFFカラム(2.2×31cm)を5mM酢酸アンモニウム緩衝液pH6.0で平衡化し、濃縮液を加え、食塩濃度01.0Mの濃度勾配の同緩衝液を流した。活性蛋白質は、食塩濃度0.38M付近で溶出された。3.活性画分を濃縮したゲル濾過カラムにかけた。Sephacryl S-200 HRカラム(1.5×169cm)を50mM酢酸アンモニウム緩衝液pH6.0で平衡化し、試料を加え、同緩衝液を流した。活性蛋白質は、排除体積付近に溶出された。4.得られた最終標品をポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけると、420%ゲルではバンドは検出されず215%ゲルで一本のバンドが見られた。SDS存在下のゲル(420%)電気泳動では、分子量約20万の位置に一本と3万以下の位置に数本のバンドが見られ、更にメルトカプトエタノール存在下では、分子量約8万以下の位置に数本のバンドが見られた。5.ほぼ純品に近く精製されたと思われるが、精製方法には改良の余地があり、今後は方法の確立をめざす。6.活性物質を加えて培養することによりPacket形成が阻止された変異株細胞を、走査型電子顕微鏡で観察したところ、細胞表面に均一に多数の粒状物質が認められた。活性物質の作用機序については、今後の興味ある研究課題である。
キナーゼ間クロストークの解明へ向けたキナーゼドメイン間相互作用の構造基盤の解明

平成29年度の研究により、FGFR4が、FGFR1のキナーゼドメイン内にある活性化ループのチロシン残基をリン酸化することを明らかにした。また、in vitroのリン酸化実験により、FGFR4-FGFR1間のキナーゼドメイン間ヘテロ2量体構造が、これまでに我々が報告しているFGFR1-FGFR1間のキナーゼドメイン間ホモ2量体構造と類似していることが示唆されていた。そこで、平成30年度はクロスリンク実験による距離情報とリン酸化実験による相互作用面情報に基づき、FGFR1-FGFR4間のキナーゼドメイン間2量体構造モデルの計算を行った。その結果、head-to-head型とhead-to-tail型の2通りの構造が得られた。head-to- tail型の2量体構造では、活性化ループの長さが不十分であり、リン酸化部位が触媒残基に届かないことが明らかとなった。一方、head-to-head型の場合には、リン酸化部位と触媒残基の距離が十分に近接しており、活性化ループのリン酸化に関わる2量体構造として妥当であることが示唆された。次に、FGFR4-FGFR1間のヘテロ2量体構造の形成によりFGFR4にどのような変化が生じるかについて明らかにするために、安定同位体標識したFGFR4のキナーゼドメインに非標識のFGFR1もしくは非標識のFGFR4を添加する実験を行った。その結果、安定同位体FGFR4に非標識のFGFR4を添加してもスペクトルの変化は見られなかったが、非標識のFGFR1を添加した際には、FGFR4が部分的に活性型の構造に変化することが明らかとなった。以上の結果より、FGFR1が結合することでFGFR4のキナーゼドメインが部分的な活性型構造に変化し、部分的に活性化されたFGFR4がFGFR1をリン酸化することでFGFR4によるシグナリングが開始されることが示唆された。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。受容体型チロシンキナーゼは、ホモ2量体形成を基軸としてキナーゼドメイン同士が近接し、互いにリン酸化し合うことで活性化される。受容体型チロシンキナーゼの一種である線維芽細胞増殖因子受容体(FGFR)にはFGFR 14の4種類がある。これらのうち、FGFR13についてはホモ2量体形成を介して活性化されることが明らかにされていた。一方、FGFR4についてはFGFR4とのホモ2量体形成では活性化されず、FGFR13との間のヘテロ2量体形成を介して活性化されることが2008年にKwiatkowskiらによって明らかにされた。本研究課題の目的は、FGFR1とFGFR4の間のキナーゼドメイン間ヘテロ2量体構造、およびFGFR2、FGFR3のホモ2量体構造を解析し、キナーゼドメイン間相互作用面を比較することでFGFRファミリーの活性化機構に関する知見を得ることである。最初に、FGFR1とFGFR4のうち「どちらのキナーゼが」、「どちらのキナーゼを」リン酸化し活性化するかについて明らかにする必要がある。そこで、キナーゼ活性を欠失したFGFR1およびFGFR4を基質として、in vitroのリン酸化実験を行った。その結果、FGFR4がFGFR1をリン酸化し活性化するのではなく、FGFR1をFGFR4がリン酸化し活性化することを明らかにした。次に、キナーゼ活性を欠失したFGFR1に対して変異を導入したタンパク質を基質として用いたリン酸化実験を行った。その結果、これまでに明らかにしていたFGFR1-FGFR1間のキナーゼドメイン間ホモ2量体構造と、FGFR1-FGFR4の間のヘテロ2量体構造が類似することを示唆するデータが得られている。概ね順調に推進していると言える。FGFR1-FGFR4キナーゼドメイン間ヘテロ2量体の構造情報の取得を目的として、Cys変異体を用いた架橋実験を試みていた。しかし、FGFR4のCys変異体の多くについてタンパク質の性状が悪化し、十分な数の構造情報を取得することができなかった。そこで、キナーゼ活性を欠失したFGFR1を基質として変異を導入し、これを用いたin vitroのリン酸化実験を先行して行うことで、以前に報告したFGFR1-FGFR1間のキナーゼドメイン間ホモ2量体構造の相互作用面と同様であることを示唆するデータが得られている。

次に、FGFR4-FGFR1間のヘテロ2量体構造の形成によりFGFR4にどのような変化が生じるかについて明らかにするために、安定同位体標識したFGFR4のキナーゼドメインに非標識のFGFR1もしくは非標識のFGFR4を添加する実験を行った。その結果、安定同位体FGFR4に非標識のFGFR4を添加してもスペクトルの変化は見られなかったが、非標識のFGFR1を添加した際には、FGFR4が部分的に活性型の構造に変化することが明らかとなった。以上の結果より、FGFR1が結合することでFGFR4のキナーゼドメインが部分的な活性型構造に変化し、部分的に活性化されたFGFR4がFGFR1をリン酸化することでFGFR4によるシグナリングが開始されることが示唆された。平成29年度の研究により、FGFR4のキナーゼドメインがFGFR1のキナーゼドメインの活性化ループのチロシン残基をリン酸化すること、また、FGFR4とFGFR1のキナーゼドメイン間ヘテロ2量体構造が、これまでに報告しているFGFR1のキナーゼドメイン間ホモ2量体構造と類似していることがin vitroのリン酸化実験により示唆された。FGFR1とFGFR4の間で、相互作用部位周辺で異なるのは1残基だけである。この残基を入れ替えた実験を行い、この残基のFGFRファミリーのチロシンキナーゼの活性化における役割について、in vitroのリン酸化実験による生化学的観点から、さらには、NMRを用いた構造生物学的観点から明らかにする。また、FGFRファミリーの相互作用面のアミノ酸がVEGFR2においても保存されていることを確認している。そこで、VEGFR2を調製しリン酸化実験を行うことで、キナーゼドメイン間相互作用面の保存性とキナーゼドメインの活性化の関係を明らかにする。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
人為起源微量汚染物質のモニタリングデータを活用した公共用水域の管理に関する研究

本研究の目的は、我が国における医薬品や日用品(PPCPs:Pharmaceuticals and Personal Care Products)による公共用水域の汚染実態の解明と、人の日常生活や水産業、畜産業などで使われ、特異的な起源を持つPPCPsの環境中挙動から汚濁水塊の由来を推定する新規水域汚濁評価手法の確立とその応用である。平成20年度は以下について調査・研究を進めた。(1):日本国内におけるPPCPsの研究事例を精査し、既往の下水処理過程における除去率が高い成分、中程度の成分、低い成分を抽出した。さらに、日本の下水処理水および水環境中で高頻度かつ高濃度で検出されるPPCPsについてとりまとめ、人為起源分子指標となりうるPPCPsの候補を提案した。(2):(1)で抽出した人為起源分子指標の候補となるPPCPsを含む約70種のPPCPsについて、新しい研究機関における分析精度を確認するとともに、既報では分析対象とされることが少なかった懸濁粒子および底泥試料中のPPCPsの分析手法についても検討を行い、下水処理施設にて調査を行った。(3):(2)までに検討されたPPCPsの河川における検出濃度および頻度と、各河川の流域人口や下水道普及率などの流域情報との関係を明らかにするため、淀川流域と、浄化槽設置地域を流れる小河川において2回調査を行った。その結果、下水処理過程において低い除去率を示した一部のPPCPsの負荷量は、流域人口と相関関係があることが明らかとなった。一方、除去率が高い一部のPPCPsの負荷量は、流域における公共下水道の普及率と比例することが示唆され、これらのPPCPsが調査流域における公共下水道未普及家庭からの排水の混入の指標となりうることが示された。
黒斑病菌毒素の宿主認識機構に関する研究

ナシ,イチゴ,カンキツ(タンジェリン)の黒斑病菌はそれぞれAK,AF,ACT毒素を放出して宿主植物に寄生する。これらの構造が極めて類似しており,その生合成過程も極めて近いことを見出してきた。本研究ではこれらの毒素の宿主認識機構を解明することを目的として研究を進め,主として次の3点の研究成果を得た。1)黒斑病菌の大量培養法の確立。この種の菌はタンク培養条件では毒素が得られず,静置培養条件下でのみ毒素類が得られる。そのために,大量培養は困難であったが,今回各種の静置培養条件を検討した結果,ナシ黒斑病菌などの数百リットル単位での大量培養に成功し,この培養液からAK毒素の約0.5gを得た。この方法の確立で,今後の研究が大巾に進展すると期得できる。2)ナシ黒斑病菌培養液中のAK毒素関連化合物の検索。大量培養により得た粗抽出物中の微量物質を詳細に検索して新たに毒素の生合成に密接に関連する化合物3種を得た。この構造解析により,毒素の生合成過程がより詳細に明らかとなり,黒斑病菌の病原性獲得機構・失活機構が毒素の生合成に関わる鍵酵素の活性化と欠落により説明できるようになった。3)毒素の反応性に関する研究。毒素と宿主植物レセプタ-との結合が非可逆的である可能性を知る目的で,毒素の化学的諸性質を検討した。その結果,毒素は非常に不安定であり,特異な反応性を示すことを見出した。現在,この特異反応と宿主認識機構との関係について研究を進めている。
融合的な手法に基づく星間方向族炭化水素の性質の理解

本研究では、量子化学計算に基づく理論的な星間有機物分子の研究において活躍する外国人特別研究員(研究分担者)が、その見知を受入研究者(研究代表者)が提供する観測天文学および実験天文学の研究基盤に融合させ、宇宙に普遍的に存在する大型の有機物である星間芳香族炭化水素の性質を調べる。これまでの共同研究を踏まえつつ、理論、実験、観測の融合的な研究手法に基づき、(1)星間芳香族炭化水素の重水素含有量に対して定量的な見知を得ること、(2)星間芳香族炭化水素の窒素含有量およびその化学結合状態に見知を得る事、の2つの研究テーマを行う。
オルガネラ分解の分子機構から異種タンパク生産へのアプローチ

メタノール酵母単膜系オルガネラであるペルオキシソームと液胞は細胞内体積の大部分を占めているオルガネラである。我々はメタノール資化性酵母を用いて、強力な異種遺伝子発現系の開発に成功しているが、このような一連の研究過程で細胞内容量の30%を占める巨大なオルガネラであるペルオキシソームが液胞に取り込まれて分解されることを見いだし(Y.Sakai et al.,J.Cell Biol.,141,625(1998)オルガネラでの異種タンパク生産性向上を妨げていると考えている。しかるに、オルガネラの分解は、タンパク分解とは異なって細胞にとって容易な作業ではなく、液胞膜によって選択的にペルオキシソームを取り囲むという大変ダイナミックな細胞内膜のダイナミズムをともなう興味深い細胞現象である。この生命現象の分子機構を解明するために、前年度、同定したいくつかのPAZ遺伝子について、解析をを行った。PAZ6及びPAZ7は、これまで機能の知られていない未知のORFであったが、本年度の成果により、PAZ6では、マクロオートファジー、ミクロオートファジー及び液胞へのタンパク質輸送経路である両者に必要な遺伝子であったのに対し、PAZ7は、ミクロオートファジーと液胞へのタンパク質輸送経路であるCVT経路の三者ともが欠損していたのに対し、PAZ7は、マクロオートファジーには必要ないことがわかった。従って、PAZ7は選択的オートファジーにのみ必要な分子であるいことがわかった。また、細胞観察の過程で、単純に液胞がペルオキシソームを取り囲むのでなく、液胞が分断化を繰り返しながら、ペルオキシソームを取り囲んでいく様子をリアルタイムで捉えることに成功した。一方、ペルオキシソーム内に蓄積させるための有用な異種遺伝子産物として、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ(FLOD)のみならず、アセチルスペルミジンオキシダーゼ、D-アミノ酸オキシダーゼなど、オキシダーゼ一般にペルオキシソーム内での有用タンパク質生産に有効であることが明らかとなった。我々はメタノール資化性酵母を用いて、強カな異種遺伝子発現系の開発に成功しているが、このような一連の研究過程で細胞内容量の30%を占める巨大なオルガネラであるペルオキシソームが液胞に取り込まれて分解されることを見いだし(Y.Sakai et al.,J.Cell Biol.,141,625(1998)オルガネラでの異種タンパク生産性向上を妨げていると考えている。しかるに、オルガネラの分解は、タンパク分解とは異なって細胞にとって容易な作業ではなく、液胞膜によって選択的にペルオキシソームを取リ囲むという大変ダイナミックな細胞内膜のダイナミズムをともなう興味深い細胞現象である。この生命現象の分子機構を解明するために、本年度は、メタノール酵母Pichia pastorisにおける新規なプラスミド遺伝子挿入変異法を開発し、これを用いてペルオキシソームが液胞へと輸送されない100株以上のpag変異株を取得した。さらに得られたpag変異株よリ変異に用いたプラスミドDNAを回収し、挿入遺伝子周辺領域の遺伝子構造を解析することにより、これまでに30種近くのPAG遺伝子を同定することに成功した(第22回分子生物学会年会プログラム・講演要旨集W2A-5,)。現在、その中のいくつかのPAG遺伝子について、精カ的に解析を進めているところである。一方、ペルオキシソーム内に蓄積させるための有用な異種遺伝子産物として、糖尿病診断に有効なカビ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ(FLOD)について検討した。本cDNAを大腸菌内で発現させると細胞毒性を示し、高い生産性を得ることができなかった。この毒性を膜内に閉じこめて回避するために、メタノール資化性酵母のペルオキシソーム内で、FLODを効率よく生産することにも成功した。今後、pag変異株を用いて、さらなる生産性の向上について検討の予定である。

また、細胞観察の過程で、単純に液胞がペルオキシソームを取り囲むのでなく、液胞が分断化を繰り返しながら、ペルオキシソームを取り囲んでいく様子をリアルタイムで捉えることに成功した。一方、ペルオキシソーム内に蓄積させるための有用な異種遺伝子産物として、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ(FLOD)のみならず、アセチルスペルミジンオキシダーゼ、D-アミノ酸オキシダーゼなど、オキシダーゼ一般にペルオキシソーム内での有用タンパク質生産に有効であることが明らかとなった。
脳梗塞に対する幹細胞療法のシナプス増生のメカニズムの解明

梗塞モデルでの幹細胞療法後のホストの梗塞部周囲peri-infarct areaにおける環境変化:細胞移植後はシナプスの増生、特に興奮性シナプスの増加が確認された。`VGLUT1, VGLUT2, VGLUT1/2に分類されるがその中でもVLUT1シナプスの増加を認めた。Peri-infact areaのPCRでの検討では細胞移植後にTGF-β2, GluAが非投与群と比較し上昇しておりsynapse増加に関与している因子として考えられる。その他、細胞移植療法でドナーの年齢に着目し、脳梗塞後細胞移植の治療効果への影響とそのメカニズムについて検討を行った。加齢に伴いヒト骨髄間葉系幹細胞は液性因子の分泌が減少していた。その分泌因子が脳梗塞に対する幹細胞治療では治療効果に影響をきたしている可能性が示唆された。若年群では投与細胞からのBDNFやPDGFの分泌量が多いことで、脳梗塞周囲層でのペリサイトに覆われた新生血管増加は脳血液関門の保全に関与し、ミクログリアの浸潤抑制に寄与していると考えられた。脳梗塞に対する細胞移植療法においてドナーの年齢の影響は大きいと考えられる。ホストの梗塞部周囲peri-infarct areaにおける環境変化についての検討:細胞移植後はシナプスの増生、特に興奮性シナプスの増加が確認された。In vivoとin vitroで同様の結果が得られた。しかしながら興奮性シナプスの増加と細胞移植後の機能回復メカニズムには言及できていない。SiRNAの検討でターゲットの分泌を抑制すると細胞移植による機能回復の抑制及びシナプス増加の抑制があるのかを検討する必要がある。SiRNAの検討には追加実験を要する。シナプス増生のメカニズムの解明shRNAを用いてknockdownを行った幹細胞を移植し通常の幹細胞移植と比較して機能回復が抑制されるかを検討する。さらにシナプスの増生が抑制されていることが証明出来ればシナプス増生のメカニズムが同定される。さらに発展的には樹状突起構築:Golgi-Cox染色を用いた樹状突起の可視化,軸索伸長:順行性トレーサーであるBDAを対側皮質に注入したのちに脳を摘出し,蛍光免疫染色で定量を行う。1.脳梗塞モデルの確立:梗塞モデルとしてdistal MCA occlusion modelを作成。MCA凝固切断+一側総頸動脈30分閉塞にてMCA領域皮質の梗塞を作成。梗塞範囲もほぼ一定のモデルとなった。梗塞サイズには細胞移植群と差は認めなかった。皮質第2-3、5層でのGlutamateシナプス、GABAシナプスの比率、synaptic densityを明らかにする。前シナプスマーカーと後シナプスマーカーのcolocalizationのあるものをシナプスと定義しグルタミン酸シナプスとGABAシナプスの定量化を行った。synapsinとPSDのcolocalizationのあるものをグルタミン酸シナプスと定義した。移植後4週間後に梗塞周辺部のシナプスの定量化を行い,グルタミン酸シナプスの増加を認めた。一方でGABAシナプスは増加していなかった。この変化は移植1週間後には認めなかった。機能回復が得られる移植4週間後にグルタミン酸シナプスの増加を認め,グルタミン酸シナプスが機能回復に寄与していることが示唆された。脳梗塞モデルの完成1.脳梗塞モデルの確立適切な梗塞巣をもつモデルを確立する。梗塞モデルとしてdistal MCA occlusion modelはMCA凝固切断+総頸動脈30分閉塞する。2.脳実質内投与の確立3. Functional recovery,脳梗塞サイズの変化,幹細胞の生存率の検討,シナプスの定量化。高解像度イメージングであるarraytomographyを用いて,シナプスの定量化を行った。移植後1, 4週間後にperiinfarctの組織を抽出。70nmの連続30-40切片とし蛍光顕微鏡を用いて3D再構成を行う。解析(シナプスのカウント)にはMat Labを使用しコンピュータープログラムで定量化を行った。以上は概ね達成された。今後はホスト環境の変化につき主に組織学的に評価する。脳実質内投与の確立:ヒト由来幹細胞をperi-infarct areaへの定位的脳実質内投与を行う。peri-infarct areaに計4箇所の投与を行った。梗塞1週間後にヒト神経幹細胞を患側大脳皮質に定位移植(1×105 cells/site, 3-4 sites)し, 1週毎に機能評価を行った。定位移植3週-4週間後に細胞移植群で機能回復を来した。脳梗塞モデルでの幹細胞療法後のホストの梗塞部周囲peri-infarct areaにおける環境変化:細胞移植後はシナプスの増生、特に興奮性シナプスの増加が確認された。また同領域のPCRにてsynapseの増生に関与する分泌因子はTGF-β2, GluAが挙げられた。それにより脳梗塞に対する骨髄間葉系幹細胞治療では治療効果に影響をきたしている可能性が示唆された。young群では投与細胞からのBDNFやPDGF-BBの分泌量が多いことで、脳梗塞周囲層でのペリサイトに覆われた新生血管増加は脳血液関門の保全に関与し、ミクログリアの浸潤抑制に寄与していると考えられた。

おおむね順調に進展している。ホストの梗塞部周囲peri-infarct areaにおける環境変化についての検討:細胞移植後はシナプスの増生、特に興奮性シナプスの増加が確認された。in vitroではsynapseの増生に関与する分泌因子はTGF-β2, GluAに絞られておりメカニズムの言及が可能である。その他、細胞移植療法でドナーの年齢に着目し、脳梗塞後細胞移植の治療効果への影響とそのメカニズムについて検討を行い加齢に伴いヒト骨髄間葉系幹細胞は液性因子の分泌が減少していた。脳梗塞に対する細胞移植療法においてドナーの年齢の影響は大きいと考えられる。以上のことが明らかとなり研究は概ね順調に経過している。梗塞モデルでの幹細胞療法後のホストの梗塞部周囲peri-infarct areaにおける環境変化:細胞移植後はシナプスの増生、特に興奮性シナプスの増加が確認された。`VGLUT1, VGLUT2, VGLUT1/2に分類されるがその中でもVLUT1シナプスの増加を認めた。Peri-infact areaのPCRでの検討では細胞移植後にTGF-β2, GluAが非投与群と比較し上昇しておりsynapse増加に関与している因子として考えられる。その他、細胞移植療法でドナーの年齢に着目し、脳梗塞後細胞移植の治療効果への影響とそのメカニズムについて検討を行った。加齢に伴いヒト骨髄間葉系幹細胞は液性因子の分泌が減少していた。その分泌因子が脳梗塞に対する幹細胞治療では治療効果に影響をきたしている可能性が示唆された。若年群では投与細胞からのBDNFやPDGFの分泌量が多いことで、脳梗塞周囲層でのペリサイトに覆われた新生血管増加は脳血液関門の保全に関与し、ミクログリアの浸潤抑制に寄与していると考えられた。In vivoとin vitroで同様の結果が得られた。しかしながら興奮性シナプスの増加と細胞移植後の機能回復メカニズムには言及できていない。SiRNAの検討でターゲットの分泌を抑制すると細胞移植による機能回復の抑制及びシナプス増加の抑制があるのかを検討する必要がある。SiRNAの検討には追加実験を要する。ここでsynapseの増生に関与する分泌因子を5-10程度に絞る。シナプス増生のメカニズムの解明shRNAを用いてknockdownを行った幹細胞を移植し通常の幹細胞移植と比較してfunctional recoveryが抑制されるかを検討する。