hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
誘起的乱流逆利用によるプラズマ流ナノ粒子創製プロセス用新規制御デバイスの開発

・粒度分布・組成分布を定量的に数値予測できるようになった.結果として,工学的応用範囲が非常に広い金属-シリコン系,鉄-コバルト系,鉄-白金系などのナノ粒子群がプラズマ流端部において集団的成長するメカニズムを明らかにすることができた.さらに,プラズマ材料プロセスに内包される熱・物質移動,混相現象,移動境界を含む相変化といった複雑流動現象を基礎的なレベルから効率的にシミュレートするために,SPH法の適用範囲の拡張に努め,プラズマ流によって形成される溶融池の複雑熱流動計算にも成功した.また乱流遷移過程における流動不安定性に対して基礎過程を明確にしながら制御実験を行ってきたが,本年度は特に伸縮するピエゾセラミックアクチュエータ近傍の流れ場およびストリーク構造の不安定性に関する詳細な計測も行った.さらにキャビティ上部のせん断層に形成される渦構造と音波発生の関係についても,プローブ計測とPIV法による可視化計測により明示することができた.加えて3次元数値計算によっても詳細に解析することに成功し,実験計測とデータ補完することで,制御時の渦構造を含む複雑流動場と音波の関係が明らかとなった.
比較ゲノム解析視点による植物成長相制御機構の解析

さまざまな光照射条件下でゼニゴケの発生過程を観察したところ、1細胞の胞子から多細胞としてメリステムをもつ葉状体への発生や切断した葉状体からの再分化過程が赤色光で促進されることがわかった。顕微鏡を用いて容易に細胞の変化を追跡できることから実験材料として極めて扱いやすい。遠赤色光照射では細胞分裂が抑制され、発芽した胞子が伸長することや、赤色光照射直後に遠赤色光を照射することで赤色光の効果が打ち消されることから、この細胞分裂と分化を制御する光受容体はフィトクロムであることがわかった。ゼニゴケから赤色光-遠赤色光受容体フィトクロム、青色光受容体フォトトロピンとクリプトクロムに対する遺伝子を単離し、それぞれが1分子種である可能性が高いことを示した。単離した遺伝子をもとに、機能欠損型や機能獲得型の形質転換系統を作出し、今後の光応答実験に利用する材料を準備した。植物の発生を制御する主要な植物ホルモンであるオーキシンと葉状体の発生や切断面の再分化過程の関係を調べた。低濃度のオーキシンでは促進、高濃度のオーキシンでは抑制という植物の生長に与える基本的な応答をゼニゴケももつこと、オーキシン、アンチオーキシン、極性輸送阻害剤の添加実験が効果的であるなど、ゼニゴケがオーキシン生理応答の観察材料としても有望であるごとがわかった。オーキシン受容体であるTIR1、信号伝達因子である、AUX/IAA、転写因子であるARFのゼニゴケオルソログ遺伝子をそれぞれが1、1、2分子種単離し、ゼニゴケのオーキシン信号伝達が基本的なものであることを分子系統樹の解析から推定した。
近似計算の利用による性能を犠牲にしない省電力な処理方式とその開発を支援する技術

前年度に考案した加算器と乗算器の改良と,新たに積和演算器に関しての検討を行った.加えて,近似演算の応用面でも検討を進めており,3月の情報処理学会全国大会で発表したほか,福岡大学工学集報と技術情報協会発行の「センサフュージョン技術の開発と応用事例」でも成果を報告した.前年度に考案した回路が応用向きだったことが理由と思われる.引き続き演算器の検討を進める.特にAI(ディープラーニング)で多用される積和演算器について継続的に検討する.同時に,考案した近似計算回路を生成する手法についても継続して検討する.前者については考案した回路の評価が重要であり,このために評価には多大な作業と時間を要する.前年度に博士後期課程学生が卒業したため人的リソース不足を否めないが,学部生の協力を仰いで推進する.後者については研究代表者を中心に進める.近似計算処理を行う演算器に関して検討を行った.まず乗算器に着目した.最初に,消費電力を約60%削減しながら演算速度を約36%改善できる近似乗算器を考案した.この成果は昨年11月に開催されたInternational Conference on Computer Designで発表した.続いて,動作時に演算精度を変えることが可能な近似乗算器を考案した.選択された演算精度に応じて,消費電力を約4756%削減可能であり,同時に演算速度を約3060%改善できる.この成果は今年1月に開催されたAsia and South Pacific Design Automation Conferenceで発表した.この成果に対して回路構成を工夫することで,さらに消費電力を40%削減する構成を考案した.続いて加算器に取り組んだ.動作時に演算精度を変えることが可能な近似加算器を考案した.予備評価結果を昨年9月に開催された電子情報通信学会ソサイエティ大会で報告した.詳細な評価の結果,選択された演算精度に応じて,消費電力を0約55%削減可能であり,同時に演算速度を0約70%改善できることが明らかになった.この成果は,今年3月に開催されたInternational Symposium on Quality Electronic Designにて発表した.この成果に対して回路を工夫することで演算精度に高い優先度を置く構成を考案し,ほぼ同等のエネルギー利用効率で誤差距離を50%改善した.この成果は,今年3月に開催されたWorkshop on Synthesis and System Integration of Mixed Information Technologiesにて発表した.一方で,演算速度に高い優先度を置く構成も検討し,速度を57%改善した上に消費電力を43%削減出来た.効果的な回路を考案出来たことが理由と思われる.前年度に考案した加算器と乗算器の改良と,新たに積和演算器に関しての検討を行った.加えて,近似演算の応用面でも検討を進めており,3月の情報処理学会全国大会で発表したほか,福岡大学工学集報と技術情報協会発行の「センサフュージョン技術の開発と応用事例」でも成果を報告した.前年度に考案した回路が応用向きだったことが理由と思われる.引き続き演算器の検討を進める.特にAI(ディープラーニング)で多用される積和演算器を検討する.同時に,考案した近似計算回路を生成する手法についても検討を進める.前者については考案した回路の評価が重要であり,このために評価には多大な作業と時間を要する.そのため.博士後期課程学生を中心にしながらも,学部生の協力も仰ぎながら推進する.後者については研究代表者が方式の考案を担当し,それを実現するシステムの試作を博士前期課程学生が担当する.引き続き演算器の検討を進める.特にAI(ディープラーニング)で多用される積和演算器について継続的に検討する.同時に,考案した近似計算回路を生成する手法についても継続して検討する.前者については考案した回路の評価が重要であり,このために評価には多大な作業と時間を要する.前年度に博士後期課程学生が卒業したため人的リソース不足を否めないが,学部生の協力を仰いで推進する.後者については研究代表者を中心に進める.次年度の国際会議参加費とその旅費のための立て替え払いをしており,実質的には使用済みである.論文掲載の条件に参加登録があり,当該年度に参加費を支払う必要があった.ビザ申請の要件に航空券の所持があり,当該年度に航空券を購入する必要があった.今年度の成果について,採択済みで次年度に発表予定の国際会議があること,これも採択済みで次年度に公開予定のジャーナル論文誌があることから,そのための費用を繰り越した.
微小神経核の網羅的RNA発現解析と機能的ノックダウンによる体内時計同調機構の解明

研究代表者が作製したPACAP遺伝子の欠損マウス(PACAP-KO)では、概日リズム位相の前進性/後退性の光同調のうち、前者のみが障害されている。本研究では、このような興味深い表現型を示すPACAP-KOと各種先端技術の利用により"位相前進性光同調に特異的に関わる新規分子同定"を行い、その視交叉上核(SCN)での機能解析から、光同調の分子基盤解明を目指す。平成19年度は以下の成果を得た。1)PACAP-KOにおいて、光照射に伴う腎臓交感神経の活性化や血中コルチコステロン濃度の増加反応が消失すること、一方で血糖値の上昇は野生型マウスと同程度認められることを見出した。2)PACAP-KOのSCNでは、光照射に伴うc-Fos発現が野生型マウスと比較して減弱しており、またCREB発現がほぼ完全に消失することを明らかにした。1)、2)より、生体内のPACAPは、SCN内遺伝子の転写促進を介して特定の光誘発性生理機能変化に関与することを示唆した。3)初年度より行ってきたSCN特異的な網羅的遺伝子発現解析等を完了させ、位相前進性の光同調に関わる新規分子として、リポカリン型プロスタグランジンD_2合成酵素(L-PGDS)を同定した。4)SCNにおける光誘発性L-PGDS発現増加について、位相後退を誘導する光刺激条件では全く認められないこと、上述のようにPACAP-KOで位相前進性光同調障害が認められるような照度条件(20lx,30min)でのみ認められることなど、本分子の発現制御機構に関するいくつかの知見を得た。5)プロスタグランジンD_2のII型受容体(CRTH2)拮抗薬の投与により、PACAP-KOと同様の位相前進特異的な光同調障害が見られることを見出した。以上3)5)より、PACAP-L-PGDS-PGD_2-CRTH2シグナルが位相前進性の光同調に特異的に関わる新規シグナル経路である可能性を導き出した。研究代表者らが作製したPACAP遺伝子欠損マウス(PACAP-KO)は、概日リズム位相の前進性/後退性光同調のうち前者を特異的に障害する唯一の動物である。本研究では、際立った異常表現型を示すPACAP-KOと各種先端技術の活用をアドバンテージとして、"位相前進性の光同調"に特異的に関わる新規分子を同定し、その視交叉上核(SCN)での機能解析により、光同調の分子基盤の解明を目指すことを目的として計画・実施し、平成18年度は以下の成果を得た。1)SCN特異的な網羅的遺伝子発現解析を完了させ、バイオインフォマティクス解析から位相前進性光同調に関与するクラスターを明らかにした。2)高純度SCNサンプルを用いた定量的RT-PCR解析から、これらクラスターに属する遺伝子のいくつかについて、光依存的発現誘導の再確認を行った。3)更に位相後退時における発現解析から、1つの遺伝子が野生型、PACAP-KOともに光依存的発現誘導を示さないことを見出し、本遺伝子が生体の位相前進性光同調に特異的に関与する最有力候補であることを示唆した。またこれらの発見により特許出願を行った。4)Per1-lucトランスジェニックマウス由来のSCNを用いたin vitroリズム解析系を構築した。更にPACAP-KOとの交雑で得たダブルミュータント由来のSCNを用いた検討により、PACAP-KOのSCNでは野生型とほぼ同等の周期および振幅を保持した概日リズムが認められることを明らかにした。5)明暗および恒暗条件において、PACAP-KOでは暗期移行時に認められる活動増加が、暗期移行の2時間前から先行して認められることを見出した。一方でSCNにおけるPer1、Prok2等の概日発現リズムには全く変化が認められないことを明らかにし、本機能の制御においても既知の光同調制御機構とは異なる分子機構が存在することを示唆した。

5)プロスタグランジンD_2のII型受容体(CRTH2)拮抗薬の投与により、PACAP-KOと同様の位相前進特異的な光同調障害が見られることを見出した。以上3)5)より、PACAP-L-PGDS-PGD_2-CRTH2シグナルが位相前進性の光同調に特異的に関わる新規シグナル経路である可能性を導き出した。
アクチン細胞骨格の乾燥ストレス応答機構に果たす役割

生体の環境ストレスに対する応答は生物の種類で大きく異なる。研究代表者がこれまで扱ってきた真正粘菌Physarrum polycephalumは飢餓、温度変化、光、化学物質等に対して応答を示す。本研究では、様々なストレスの中でPhysarum変形体が示す耐乾燥機構に注目した。スライムによって取り囲まれた多核のアメーバ状である変形体は乾燥を極度に嫌い、乾燥条件下では約1日かけてスクレロチウムと呼ばれる耐乾燥体を形成する。このスクレロチウムは非常に安定で数年間の休眠が可能であるが、その形成機構や細胞内のタンパク質保存機構については全く解っていない。昨年度は、変形体のアクチンは未修飾であるのに対し、スクレロチウムの全アクチンは60-70%がリン酸化を受けており、Thr-203が唯一のリン酸化部位であることを明らかにした。またリン酸化アクチンは重合能を失っていることもわかり、Thr-203がF-アクチンに重合する際に他のアクチン分子と接触する部位であることと矛盾しない。本年度はアクチンのリン酸化の生理的意義をさらに明らかにするために、このリン酸化が生活環のどこで起こるかを調べた。変形体は乾燥状態に置かれると、箱胞に仕切を形成しマクロシストとなり、これが完全に乾燥するとスクレロチウムとなる。一方、変形体は通常約20°Cで増殖するが、4-5°Cの低温に置かれるとスフェルールという低温耐性のマクロシストを形成し、室温に戻すと再度活動を始める。このスフェルールに含まれるアクチンを解析したところ、アクチンはリン酸化を受けていなかった。このことは、アクチンのリン酸化がマクロシスト形成において細胞が細かく区切られる過程ではなく、乾燥ストレスに特異的な耐性機構で働いていることを示している。さらに、スクレロチウムに水分を与えると急激なアクチンの脱リン酸化が起こるが、その活性は高イオン強度下において顕著な抑制がかかることも明らかとなった。このことはスクレロチウムから変形体への転換機構を探る大きな手がかりとなる。これまで扱ってきた真正粘菌Physarum polycephalumは飢餓、温度変化、光、化学物質等に対して応答を示す。本研究では、様々なストレス応答の中でPhysarum変形体が示す耐乾燥機構に注目した。多核の巨大アメーバである変形体は、乾燥条件下では約1日でスクレロチウムと呼ばれる耐乾燥体を形成する。このスクレロチウムは非常に安定で数年間の休眠が可能であるが、その形成機構やタンパク質保存機構については全く解っていない。本年度は変形体とスクレロチウムの構成タンパク質の組成と翻訳後修飾の比較を行い、その違いとスクレロチウム形成機構との関連を考察した。その結果、通常のSDS-PAGEではタンパク質の組成における顕著な変化が認められなかったが、2次元電気泳動による解析ではスクレロチウムの多数のタンパク質の電荷がマイナスに(酸性側)シフトしていた。更に酸性側にシフトしたタンパク質のもっとも含有量の多いものをアクチンと同定した。驚くべき事にスクレロチウムでは全アクチンの60-70%が酸性側にシフトしていた。その酸性アクチンを精製し、アルカリフォスファターゼ処理を行うとアクチンの電荷は本来のものに戻ったので、酸性アクチンはリン酸化状態にあることが示された。次にリン酸化部位を決定したところThr-203が唯一のリン酸化部位であることが判明した。この部位はアクチンの重合に関与する位置であることが分かっているので、リン酸化及び非リン酸化アクチンの重合能を調べた。その結果リン酸化アクチンは重合能を持たないことが明らかとなった。これらのことからスクレロチウムの形成過程ではアクチンのリン酸化をはじめとする細胞骨格の劇的な変化が起こっていることが予想され、耐乾燥メカニズムを明らかにする糸口を掴むことが出来た。

このことは、アクチンのリン酸化がマクロシスト形成において細胞が細かく区切られる過程ではなく、乾燥ストレスに特異的な耐性機構で働いていることを示している。さらに、スクレロチウムに水分を与えると急激なアクチンの脱リン酸化が起こるが、その活性は高イオン強度下において顕著な抑制がかかることも明らかとなった。このことはスクレロチウムから変形体への転換機構を探る大きな手がかりとなる。
植物の重金属ストレスに対する応答システム、特に無害化機構の分子生理学的解析

シロイヌナズナを用い、カドミウム(Cd)処理に伴う硫黄代謝系および各重金属リガンドの生合成系に関与する酵素遺伝子13個の発現量とリガンド生成量について検討したところ、Cd処理濃度で最も高発現している遺伝子は、フィトケラチン(PCs)合成酵素遺伝子(PCS1)であった。システイン合成能を強化した形質転換体ではPCS1遺伝子の高発現と同時にPCs含量が増加し、カドミウムによる生育抑制が顕著に軽減された。重金属汚染土壌の浄化に用いる植物は、重金属耐性で高集積能が不可欠であり、その分子育種や利用技術開発には、生態学的特性や耐性機構の生理学的解析など基礎的な研究が重要である。本研究では、-SH基を含有する各種重金属リガンドの植物体内における機能と役割を総合的に解析するため、-SH基合成の基点となる硫黄代謝系および重金属リガンドの生合成系と重金属の無害化機能の関係について、生理学的および分子生物学的な手法で解析した。実験にはシロイヌナズナを用い、カドミウム(Cd)処理に伴う硫黄代謝系および各重金属リガンドの生合成系に関与する酵素遺伝子13個の発現量とリガンド生成量について検討したところ、生育阻害が現れるCd処理濃度で最も高発現している遺伝子は、フィトケラチン(PCs)合成酵素遺伝子(PCS1)であったが、リガンドの主要構成成分であるシステイン(Cys)の合成酵素遺伝子(OAS)の発現は、Cd処理直後の微増以外は殆ど変化しなかった。このことは、PCS1が高発現しても同時にCys含量が増加しないとPCs含量が増えないためCdを無害化できないことを示唆していると考え、Cys合成酵素合成遺伝子CS3Fを導入してCys合成能を強化したシロイヌナズナの形質転換体を作成して同様の検討を行ったところ、PCS1遺伝子の高発現と同時にPCs含量が増加し、Cdによる生育抑制が顕著に軽減された。以上の結果から、植物、特にシロイヌナズナのCd無害化機構にはPCsが大きな役割を果たしており、その生合成系はCysによって制御されるという新知見が証明できた。本年度は、シロイヌナズナを用い、Cd,Ni,Zn処理に伴うフィトケラチン(PCs)の生成量とその種類の差異について検討した。その結果、Cd処理によって約14KDaのペプチドが生成し、これがPCsと思われた。このPCsは、Cdの処理濃度を高めても生成量は増加しなかった。また、NiおよびZnを処理した場合でも、ほぼ同じ約14KDaのペプチドが生成した。しかし、ペプチドの生成量はNiやZn50μM処理の場合の方が多かった。このことから、シロイヌナズナの場合、Cd,Ni,Znの過剰処理に対する応答は同じであることが示唆された。一方、同じアブラナ科植物(Brassicaceae)にCdを処理した場合のPCsの生成量を比較検討した。供試植物は、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)の他、タカネグンバイ(Thlaspi japonica v. glauca)、ミヤマハタザオ(Arabis lyrata ssp. Kamtschatica)、アリッサム・モンタナ(Alyssum Montana)、ハクホウナズナ(Draba kitadakensis)を用いた。その結果、Cdを処理した場合、Arabidopsis属の場合はA. thaliana、A. lyrataとも6500DaのPCsが生成したが、Thlaspi属、Alyssum属、Brabarea属、Draba属植物では、1649DaのPCsが生成した。このことから、同じアブラナ科植物(Brassicaceae)でも応答が異なることが示され、重金属に対する応答システムが異なることが明らかとなった。

実験にはシロイヌナズナを用い、カドミウム処理に伴う硫黄代謝系および各重金属リガンドの生合成系に関与する酵素遺伝子13個の発現量とリガンド生成量について検討したところ、生育阻害が現れるカドミウム処理濃度で最も高発現している遺伝子は、フィトケラチン(PCs)合成酵素遺伝子(PCS1)であったが、リガンドの主要構成成分であるシステイン(Cys)の合成酵素遺伝子(OAS)の発現は、カドミウム処理直後の微増以外は殆ど変化しなかった。このことは、PCSIが高発現しても同時にCys含量が増加しないとPCs含量が増えないためCdを無害化できないことを示唆していると考え、Cys合成能を強化した形質転換体を作成して同様の検討を行ったところ、PCS1遺伝子の高発現と同時にPCs含量が増加し、カドミウムによる生育抑制が顕著に軽減された。以上の結果から、植物のカドミウム無害化機構にはPCsが大きな役割を果たし、その生合成系はCysによって制御されるという新知見が証明できた。
糖尿病患者に対する血糖管理強化療法が冠動脈不安定粥腫の安定化に与える効果の検討

光干渉断層画像(OCT)を用いて不安定冠動脈粥腫の分布に糖尿病患者と非糖尿病患者間で相違があるのかを検討。さらに、血糖コントロールが冠動脈不安定粥腫の安定化に与える影響について調査したところ、厳格な血糖コントロールを行っても冠動脈プラークの体積、繊維性被膜厚、脂質塊のサイズに変化は認めなかった。しかし、本研究で冠動脈不安定粥腫は生体内で検出可能であり、それらは糖尿病患者において責任病変以外にも多数分布していることが証明された。高い画像解像度を有するOptical Coherence Tomography (OCT)を用いて用尿秒患者に多いが、今まで検出が困難とされてきた不安定冠動脈粥腫の主体である、脂質コアの正確な検出と薄い繊維性被膜を定量的に測定し、それら将来の急性冠症候群発症に寄与すると推測される冠動脈プラーク成分が積極的血糖値コントロールにてどのまうに変化するかを調べる目的で本研究を行っている。現在のところ70人の急性冠症候群患者を登録し、冠動脈責任病変以外の冠動脈3枝すべてにOCTおよび血管内超音波検査(IB-IVUS)を施行することができ、解析可能なOCTおよびIB-IVUSデータを得ることができた。また、全ての登録患者の血中high sensitive CRP濃度やInterleukin 6濃度を測定することができた。Baselineの手技で得られたOCTデータを解析すると、70人の急性冠症候群患者に合計162の薄い繊維性被膜を有する冠動脈不安定プラーク(Thin-cap fibroatheroma : TCEA)を検出した。TCFAの冠動脈内分布を糖尿病患者と非糖尿病患者で比較検討したところ、責任病変におけるTCAFの頻度は糖尿病患者と非糖尿病患者で差はないものの、非責任病変におけるTCEAは糖尿病患者において非糖尿病患者に比べ有意に多く分布していた。これらの内、22人の糖尿病患者を積極的血糖コントロール群(HbA1c<6,5%)と通常コントロール群に無作為に振り分けて現在18ヶ月後のFollow-upが始まるところである。本年度は登録した患者全てに対して18カ月後に再度OCTおよびIB-IVUSを行い、プラーク体積、繊維性被膜厚、Lipid poolの最大角度の変化を観察する予定である。平成22年に登録した22名の糖尿病罹患患者の治療法を無作為に2群に振り分けた(11人の積極的血糖コントロール群(HbA1c<6.5%を目標)と11人の通常血糖コントロール群(目標HbA1cを設定せず))。18か月のFollow-up観察期間中、1名が非心臓死、1名がFollow-up時のIB-IVUSおよびOCT検査を拒否にてFollow-up不可能となったが、残りの20名に対して登録から18か月後にFollow-upのOCT(光干渉断層画像)およびIB-IVUS(血管内超音波)検査を施行した。18か月後、積極的血糖コントロール群と通常血糖コントロール群でLDLコレステロールを含む脂質profileの変化率に有意な差を認めなかった。また、high-sensitive CRPやinterleukin-6をはじめとする血中のバイオマーカーにも有意な差を認めなかったが、HbA1cの変化率には有意な差を認めた(-1.6±1.1%versus 0.3±0.4%,p=0.03)。空腹時血糖値の変化率には差を認めなかった。IB-IVUSで計測した冠動脈プラーク体積や脂質リッチプラークの占有率に関しても積極的血糖コントロール群と通常血糖コントロール群で差を認めなかった。また同様に、OCTで計測された繊維性被膜厚の変化(2.6±8.1vs. 3.9±6.9μm)、Lipid pool最大角度の変化(21±32vs.18±19°)にも両群間で有意な差を認めなかった。昨年度と本年度の結果を総合的に判断すると、急性冠症候群を発症した糖尿病患者は非糖尿病患者に比べ、責任病変部位以外の冠動脈にも将来血管イベントを起こす可能性の高い冠動脈不安定粥腫を多数有していた。しかしながら、これらの不安定粥腫を18か月間かけて厳格な血糖管理を行っても、これら不安定粥腫を安定化させることはできない。よって、過去の大規模臨床試験でも示されたように、糖尿病患者においては冠動脈疾患発症後に厳格な血糖コントロールを行う意義は少なく、冠動脈疾患を発症させない管理が必要であると考える。
発症の徴候に着眼した小児期・思春期神経性やせ症の新たなアセスメント方法の開発

本研究の目的は、神経性やせ症患者の主養育者が観察可能な発症の徴候についてまとめ、新たなスクリーニング方法を開発することである。2018年度は研究協力者と共に対象者への調査に向けた準備を行った。本研究の対象者は神経性やせ症患者の主養育者であるため、対象者が想起しやすく、必要な情報を得るために必要な質問内容と対象者の限定条件の検討を行った。特に、神経性やせ症では、罹患率に地域差があることが報告されているため、対象者数の地域差が出ないようなリクルート方法について検討を行った。また、神経性やせ症患者やその養育者からの情報や関連文献をまとめる中で出てきた、神経性やせ症の発症の徴候として考えられる身体イメージの認識障害について、当事者に認識の調査を行い、得られたデータの一部を学会で報告した。結果は、使用した機材では、健常者と患者の間では認識の差が明らかになったため、今後作成するアイテムプールに、その結果を反映させる必要がある。また、研究協力者との情報交換の中で、患者の主養育者からの情報に加えて、臨床的な知見も加味しながら多面的に徴候もとらえることで、潜在的には意識しながらも主養育者が気づきにくかったものも徴候として明らかにされると考えられたため、スクリーニング方法を開発する段階では、対象者からのインタビュー結果だけではなく、臨床家からの情報収集についても必要があり、対象者へのインタビューと並行して、情報収集を行っていく。本研究の当初の予定では、初年度に患者家族へのインタビューを開始する予定としていた。しかし、そのことに関する倫理審査の承諾を得るための期間が予定より長期化したこと、身体イメージの障害についても調査の必要性が生じたことから、データ収集の開始は次年度となった。昨年度データ収集を開始できなかったため、今年度は速やかにデータ収集を開始する。また、対象者の絶対数が少ないため、対象者のリクルートとして、患者や関連の方を対象とした集会での方法を検討している。加えて、得られた結果をもとに、発症の徴候についての分析作業を進め、スクリーニングのための質問紙案の作成を行う。当該年度に対象者へのデータ収集を行う予定であったが、年度内のデータ収集開始には至らなかったため、データ収集に関連した謝金等の余剰が生じた。今年度はデータ収集及び分析作業を進めるため、余剰額を使用する予定である。
飲酒事故におけるアルコール鑑定法の確立

-凍死の病態生理とアルコールの影響-1)アルコール経口投与をともなう凍死ラットモデルの作成偶発的低体温症(凍死)を誘発する要因の一つとして、アルコールが大きく関わっており、凍死と診断された症例において、血液中からアルコールが検出されることがしばしば経験される。そこで寒冷環境下におけるアルコール摂取の影響を調べるため、アルコール経口投与をともなう凍死モデルラット作成の検討を行った。ラットに20%アルコール(3g/kg)を経口投与した後、直ちに寒冷環境下(4°C)で氷上暴露を行った。ラット死亡確認のため、直腸温を経時的に測定し、死亡確認後、GC/MSにて血液中アルコール濃度の測定を行ったところ、致死濃度以下であった。アルコール経口投与を除く同条件で処置したラットにおいては死亡まで至らなかった。以上よりアルコールが凍死を誘導する要因の一つであると考えられ、この条件で作成したモデルを凍死モデルとした。2)凍死モデルラットの視床下部・前頭葉および褐色脂肪組織におけるmRNA発現以前報告した凍死モデルラットの視床下部・前頭葉において、体温調節や凍死経過中に観察されることがある異常行動の原因遺伝子と示唆されたmRNA発現(Umehara et al. 2011)に加え、凍死特異的と考えられた遺伝子を、1)で作成したモデルの視床下部・前頭葉で確認したところ、それらの遺伝子において有意な発現は確認されなかった。しかし、アルコール処置後、寒冷暴露による死亡までの経過時間と遺伝子発現量の相関を検討したところ強相関を示した遺伝子が確認された。このことからアルコール投与及び寒冷環境下での遺伝子発現はその暴露時間に強く影響を受けることが考えられた。また同モデルラットの肩甲骨間の褐色脂肪組織において熱産生に関連する遺伝子の発現を検討したところ、寒冷特異的に発現する遺伝子を同定した。1)アルデヒド脱水素酵素2の多型の違いによるアルコール代謝の検討単位時間当たりの血液中アルコール濃度の減少率は、アルデヒド脱水素酵素2の多型である1/1型に比べ1/2型では低値が得られ、1/2型ではその値のばらつきが大きかった。1/2型はアルコール代謝活性が低いため、他の代謝経路が作用した可能性が示唆され、更なる検討を行う予定である。2)異なる環境下における生前摂取アルコールと死後産生アルコールの判別法の確立2-1)凍死ラットモデルの作成偶発的低体温症(凍死)を発生する条件として、アルコール摂取が大きく関わっており、実際の凍死者においてもしばしばアルコールを摂取していることがある。そこで寒冷環境下におけるアルコール摂取の影響を調べるため、凍死ラットモデル作成の検討を行った。ラットは全て腹腔内に送信機植え込み手術を施し、経時的に心電図・深部体温の測定を行った。腹腔内へネンブタール投与後、ネンブタールを追加しながら寒冷暴露(410°C)した群(I群)、腹腔内へのネンブタール投与後、ラットの剃毛を行い寒冷暴露した群(II群)、腹腔内へのネンブタール投与後、ラットの剃毛を行い、剃毛した部分をアルコールで濡らし、寒冷暴露した群(III群)について検討したところ、I群では約6時間で死亡が確認され、II群ではラットは生存し、III群では約20150分の範囲で死亡が確認された。今後このIII群の凍死モデルを用いてアルコール投与実験を行う予定である。2-2)血液中腐敗成分の高感度定量法の確立検出されたアルコールが生前摂取によるものか、腐敗によるものかを判断するための指標として血液中の腐敗成分の分析法を検討した。対象の腐敗成分としてβ-フェネチルアミン、トリプタミン、チラミンの3化合物を選択、これらを血液中から高感度で定量可能な分析法を確立するため添加回収実験を行った。その結果、Focusカラムを用いて抽出し、アセチル化を行うことで、良好に定量可能なことが判明した。現在精度向上のための内部標準物質の検討を行っている。-異なる環境下における生前摂取アルコールと死後産生アルコールの判別法の確立-1)凍死モデルラットの作製偶発的低体温症(凍死)を発生する条件として、アルコール摂取が大きく関わっており、実際の凍死者においてもしばしばアルコールを摂取していることがある。そこで寒冷環境下におけるアルコール摂取の影響を調べるため、凍死モデルラット作製の検討を行った。腹腔内へのネンブタール投与後、ラットの剃毛を行い、剃毛した部分をアルコールで濡らし、寒冷暴露した群について検討したところ、アルコールの体表面暴露により経時的な体温の低下を誘導し、約40150分の範囲で死亡が確認された。また低体温症時に観察されるという一時的な心拍数の増加も確認できたため、この条件で作製したモデルを凍死モデルとした。2)凍死モデルラットの視床下部・前頭葉におけるmRNA発現凍死モデルラットの視床下部・前頭葉におけるmRNA発現を確認したところ、体温調節や凍死経過中に観察されることがある異常行動の原因遺伝子と示唆されたmRNA発現が確認された。他にも凍死特異的と考えられるmRNAの発現が確認された。3)アルコール投与実験20%アルコールのラット腹腔内投与を検討した。20%アルコール腹腔内投与を行った場合、腹腔内へのアルコールの多量投与や20%アルコール投与のための腹膜刺激など、凍死者におけるアルコールの影響として考えられる以外のストレス要因の影響が懸念された。

今後は投与するアルコール濃度の検討、また経口投与など投与経路の検討を行う予定である。-凍死の病態生理とアルコールの影響-1)アルコール経口投与をともなう凍死ラットモデルの作成偶発的低体温症(凍死)を誘発する要因の一つとして、アルコールが大きく関わっており、凍死と診断された症例において、血液中からアルコールが検出されることがしばしば経験される。そこで寒冷環境下におけるアルコール摂取の影響を調べるため、アルコール経口投与をともなう凍死モデルラット作成の検討を行った。ラットに20%アルコール(3g/kg)を経口投与した後、直ちに寒冷環境下(4°C)で氷上暴露を行った。ラット死亡確認のため、直腸温を経時的に測定し、死亡確認後、GC/MSにて血液中アルコール濃度の測定を行ったところ、致死濃度以下であった。アルコール経口投与を除く同条件で処置したラットにおいては死亡まで至らなかった。以上よりアルコールが凍死を誘導する要因の一つであると考えられ、この条件で作成したモデルを凍死モデルとした。2)凍死モデルラットの視床下部・前頭葉および褐色脂肪組織におけるmRNA発現以前報告した凍死モデルラットの視床下部・前頭葉において、体温調節や凍死経過中に観察されることがある異常行動の原因遺伝子と示唆されたmRNA発現(Umehara et al. 2011)に加え、凍死特異的と考えられた遺伝子を、1)で作成したモデルの視床下部・前頭葉で確認したところ、それらの遺伝子において有意な発現は確認されなかった。しかし、アルコール処置後、寒冷暴露による死亡までの経過時間と遺伝子発現量の相関を検討したところ強相関を示した遺伝子が確認された。このことからアルコール投与及び寒冷環境下での遺伝子発現はその暴露時間に強く影響を受けることが考えられた。また同モデルラットの肩甲骨間の褐色脂肪組織において熱産生に関連する遺伝子の発現を検討したところ、寒冷特異的に発現する遺伝子を同定した。
断続的飢餓による寿命延長を制御する転写ネットワークの解明

昨年度までの結果から、飢餓による遺伝子発現の変化の多くは、飢餓にさらされてから6時間と9時間の間に急激に起こるということが分かり、飢餓にさらされてから12時間以内に発現変化する遺伝子には、寿命やストレス応答に関する遺伝子が優位に濃縮されていることが分かった。そしてそれらの遺伝子発現を制御している転写因子を、プロモーター解析により同定した。我々が同定した転写因子DAF-16(線虫フォークヘッド型転写因子)とJUN-1/FOS-1(線虫AP-1)は、前者は6割、後者は8割の飢餓による遺伝子発現の誘導を抑制することが分かった。また、二つのシグナル伝達経路によって制御されている遺伝子は大きく重複していることから、二つのシグナルが共通の遺伝子を制御していることが考えられた。qPCRによって検討した結果、確かに、二つのシグナル経路は共通のターゲットの遺伝子発現の上昇に必要であることが分かった。さらに、飢餓によって引き起こされる遺伝子発現の変化の中で、実際に抗老化作用を実行する因子の同定を試みた。二つのシグナル経路の因子の欠失変異体で、飢餓により誘導される変化が観察されない遺伝子の中に、ユビキチンプロテアソームシステムの一つであるSkp1-Cullin-F-boxprotein (SCF) E3 ligase complexの構成因子であるSkp1related proteinが多く含まれていることが分かった。そのことから、SCF E3 ligase complexのうち最も数の少ない線虫Cullinタンパク質をすべてノックダウンを行い食餌制限による寿命延長が見られるかについて検討を行った。その結果、cul-1-6のうちcul-1のノックダウンした時においてのみ寿命延長の抑制が見られることが分かった。さらに、cul-1をノックダウンした時に、食餌制限をしたときに見られる、老化と共に蓄積される酸化タンパク質であるカルボニル化されたタンパク質の蓄積の減少が見られなくなることが分かった。この結果からSCF E3 ligase complexが食餌制限時に酸化タンパク質を分解することによって老化の遅延を行っている可能性が示唆された。線虫が飢餓にさらされてからの遺伝子発現の変化の全体像を明らかにするために、DNAマイクロアレイを用い検討を行った。線虫を飢餓にさらしてから、3,6,9,12,18,24,36,48時間後にRNAを回収し、DNAマイクロアレイにかけた。その結果、飢餓による遺伝子発現の変化の多くは、飢餓にさらされてから6時間と9時間の間に急激に起こるということが分かった。興味深いことに、飢餓にさらされてから12時間以内に発現変化する遺伝子には、寿命やストレス応答に関する遺伝子が優位に濃縮されていることが分かった。飢餓にさらされてから12時間以内に起きる遺伝子発現の変化に関与している可能性のある転写因子を、プロモーターを用い解析を行った。その結果、フォークヘッド型転写因子と、AP-1 (activator protein1)がそれらの遺伝子群を制御する転写因子の候補に挙がった。この結果は、私たちが明らかにした、DAF-16(線虫フォークヘッド型転写因子)とJUN-1/FOS-1(線虫AP-1)が断続的飢餓による寿命延長に必要であるという結果と一致する。さらに、野生型N2、変異体(kgb-1, jun-1, daf-16)に対しても飢餓にさらしてから48時間後の遺伝子発現の変化を、DNAマイクロアレイを用い検討を行った。その結果から飢餓による遺伝子発現の変化の多くはKGB-1/AP-1のシグナル伝達経路とDAF-16の経路に依存していることが分かった。断続的飢餓による寿命延長はマウスやラットなどでも確認されており、飢餓を繰り返すことによってラットにおいてJNKが活性化されることが知られている。私たちが明らかにした飢餓による遺伝子発現に係る転写因子は、哺乳類まで広く保存されており、今回の研究で明らかにした寿命延長に必要なシグナル経路は哺乳類に至る多くの生物で同様の働きをしていることが期待される。

さらに、cul-1をノックダウンした時に、食餌制限をしたときに見られる、老化と共に蓄積される酸化タンパク質であるカルボニル化されたタンパク質の蓄積の減少が見られなくなることが分かった。この結果からSCF E3 ligase complexが食餌制限時に酸化タンパク質を分解することによって老化の遅延を行っている可能性が示唆された。
移植腎の拒絶反応に動員されるT細胞抗原受容体の解析

移植腎の拒絶反応にどのようなT細胞集団が動員されるのかを知ることを目的として、本研究では、腎浸潤T細胞の抗原レセプター(TCR)の多様性を解析した。研究は、大きく分けて次の3段階で進められた。すなわち、1)方法の確立、2)in vitroモデルでの検証、3)臨床材料を用いた解析、である。【1.TCR解析法の確立】少数のT細胞から効率良くTCR-cDNAの解析を行うためには、PCRによる遺伝子増幅法が必須であるが、上流配列(TCRV遺伝子)が未知であるという問題点を克服する必要があった。種々の検討を重ねた後、cDNA上流に合成のanchorを結合させてPCRの標的配列として利用するanchor-ligated PCR法を開発した。さらにその後、V遺伝子共通プライマーを考案し、より簡便なTCR解析法も確立した。【2.混合リンパ球培養反応(MLR)に動員されるTCRの解析】同体免疫反応のin vitroモデルとして、MLRに動員されるTCRの解析を行った。その結果、1)刺激細胞・応答細胞間でHLA-DR分子上のたった1個のアミノ酸しか違わない場合も、極めて多様なTCRを持つT細胞集団が動員されること、2)DR分子のアミノ酸の違いによってTCRの多様性の程度に差は検出されないことが明らかになった。【3.移植腎浸潤TCRの解析】拒絶反応後の摘出腎が入手できた1例につき、コラゲナーゼ処理、パーコール比重遠沈法により浸潤リンパ球を回収し、さらにCD25^+(活性化Tマーカー)T細胞画分を分離し、CD25^+Tおよび未分画全浸潤細胞におけるTCRの多様性を検討した。その結果、CD25^+T細胞および未分画浸潤細胞とも上述のin vitroMLRで動員されたT細胞集団に比べ、明らかなオリゴクロナリティーが観察され、またその程度は、CD25^+Tにおいてより顕著に認められた。このように移植腎拒絶反応には、比較的限られたTCRを持つT細胞集団が動員されたことがわかった。1.HLA認識に関与し活性化したT細胞を分離するのには抗CD25抗体+免疫ビ-ズが有用である。2.用いるT細胞の数は10^410^5個と非常に少なくて良い。3.ポリdCプライマ-を用いるanchored PCRより、我々が新しく開発した、ポリマ-を用いないanchorligation PCRの方が特異性・再現性においてすぐれている。などの点が明かとなった。現在まで、MLRにおいて同種HLA認識(Dw13 anti DKT2)に動員された、16種のTCRα鎖cDNAおよび28種のTCRβ鎖cDNAについて、それらの塩基配列を決定した。そのなかには、12種のVα、11種のJα、12種のVβ、8種のJβが含まれていた。特に、Vβ8.1、Vβ12.2、Jβ2.1、Jβ2.7が高頻度に見られた。このように、少数のT細胞からPCRを利用してTCRcDNAの塩基配列決定を行う方法を確立することができた。現在、これを移植腎浸潤T細胞に応用すべく、腎からのT細胞の回収を行っている。移植腎に対する拒絶反応には、ドナ-のHLAーDR抗原が重要であることが知られている。

本年度では、昨年度にひき続き、試験管内同種免疫反応である混合リンパ球培養反応(MLR)において、DR抗原認識に動員される下細胞抗原受容体(TCR)の解析を進めるとともに、腎からのT細胞分離法の確立を行った。MLRの応答細胞、刺激細胞としてDRB1*0403/*1201およびDRB1*/0406ホモ接合体を選び、DR分子上の1個のアミノ酸残基( ^<37>Y)のみを認識するT細胞集団を誘導した。昨年度までに確立したAnchorーLigation PCR法にてTCRB鎖cDNAの塩基配列を決定した。解析した27個のcDNAMLRで得られた結果が、in vivo同種免疫反応である移植腎拒絶反応においてもあてはまるか否かを検討するため、以下の予備実験を行った。剖検腎からバイオプシ-用針で少量の腎組織を採取し、ハサミ細断の後室温で1時間コラゲナ-ゼ処理を行った。リンパ球の損傷、腎細胞との分離を調べるため、人為的に末梢血リンパ球を混入させた試料についても検討を行った。その結果、0.5mg/mlのコラゲナ-ゼ処理がリンパ球に損傷を与えず腎組織を効果的に分解すること、又、腎細胞とリンパ球は、比重遠心法によりほぼ完全に分離できることがわかった。移植腎の拒絶反応にどのようなT細胞集団が動員されるかを知るため、親子間腎移植の後拒絶反応を受け摘出に至った腎臓を入手し、浸潤T細胞の抗原レセプター(TCR)の解析を行った。摘出腎の約1/10をハサミによる細断後、コラゲナーゼ処理、パーコール比重遠沈法にて浸潤リンパ球を分離した(収量:6x10^5 cells)。抗CD25抗体と磁気ビーズを用いてCD25^+活性化T細胞画分(全浸潤細胞の約2.5%)を分離し、mRNAを調製した。また比較対照として、未分画の全浸潤細胞からもmRNAを分離した。cDNAを合成後、Vβ共通プライマーとCβプライマーによる30サイクルのPCRによりTCRβ鎖cDNAを特異的に増幅した。プラスミドベクターに組み込んでクローニングの後、DC25^+および未分画浸潤細胞画分それぞれについて31個および35個のTCRβ鎖cDNAの塩基配列決定を行った。その結果、CD25^+T画分については、7種のVβ遺伝子ファミリーが検出され、未分画浸潤細胞で検出された12種のVβファミリーに比べて少なかった。Jβについては、CD25^+T、未分画浸潤細胞にそれぞれ8および9種が検出された。またCDR3配列も全く同一のcDNAが、CD25^+T細胞画分にVβ6.9-Jβ1.2で6個、Vβ3.1-Jβ2.1で3個、Vβ3.1-Jβ2.7、Vβ5.6-Jβ2.5、Vβ12b-Jβ2.3で2個ずつ検出され、限られたT細胞クローンから構成されていることがわかった(オリゴクローナリティー)。但しCDR3が同一のcDNAは、未分画浸潤細胞でも見られ、Vβ8.1-Jβ2.1で3個、Vβ3.1-Jβ2.1、Vβ5.2-Jβ1.3、Vβ5.2-Jβ2.7、Vβ7.1-Jβ2.7で2個ずつ検出された。in vitroMLRに動員されるTCRの場合は、30個前後のcDNA解析では、同一のCDR3配列はほとんど検出されないことを考慮すると、浸潤T細胞の場合、未分画画分でも相当程度のオリゴクーナリティーが存在し、CD25^+画分では、それがより顕著であったと言えるだろう。今後例数を積み重ね、一般化してゆくことが重要である。
骨髄間葉系幹細胞移植を用いた難治性てんかんに対する新規治療法の開発

我々は既に、けいれん重積後にてんかんを生じる動物モデルに対して、けいれん重積後早期に骨髄幹細胞(mesenchymal stem cell: MSC)を経静脈的に移植することにより、てんかん発症を予防できることを明らかにした。本研究では、この成果をさらに発展させ、より臨床に近い既に完成された慢性期のてんかんに対するMSCの有効性を検証する。1けいれん重積後にてんかんを発症したモデル動物の慢性期、2遺伝てんかんモデル動物の慢性期、にMSCを経静脈的に移植することで、MSCのてんかんの治療効果、認知機能への改善効果の検討、および形成されたてんかん回路を正常化するメカニズムを解明する。
誤り訂正符号理論

我々の研究目的の1つは最終的には符号の同値性の有効な判定法を見いだすことであった。その問題を重さ分布の計算,同値性の判定,既約性の判定の3つに分けた。今回の研究においては既約性の判定に関する1つの結果を得た。その結果は以下の通りである。符号Cの標準的な生成行列Gをとる。Gは単位行列の横にある行列Bをおいた形をする。その行列B=(b_<ij>)に対して,b_<ij>=0ならばb^^_<ij>=0,b_<ij>≠0ならばb^^_<ij>=1とおき整数環上の行列B^^=(b^^_<ij>)を得る。B^^は行の位置Vと列の位置Wをbipartitionに持つreduced adjacency行列になる。Γ_B=({V,W},B^^)をbipartite graphと考える。このとき,Cが既約であるための必要十分条件はΓ_Bが連結であることである。この結果の応用として,Bの各行の成分がすべて0でなくある行の成分がすべて0でなければCは既約であることが示される。また,成分がすべて0とは異なる列をBが持てばCは既約であることも示される。また,次のような既約性の判定アルゴリズムも得た。ただし,ここに書いたのはおおざっぱなアルゴリズムである。1.B^^が,成分がすべて0の列を持てばそれらをすべて削除する。2.B^^が重さ1の行を持たなければ3へ行く。そうでなければ重さ1の行を削除して1へ行く。3.B^^=(b^^_<ij>)とする。b^^_<1t>=b^^_<1u>=1となるt≠uがある。i∈{1,...,n}に対してB^^_<it>=b^^_<iu>=0ならb^^_<iu>=0とおき,そうでなければb^^_<iu>=1とおく。u番目の列に0があればt列を削除して1へ行く。そうでなければCは既約である。

B^^は行の位置Vと列の位置Wをbipartitionに持つreduced adjacency行列になる。Γ_B=({v,w},B^^)をbipartite graphと考える。このとき,Cが既約であるための必要十分条件はΓ_Bが連結であることである。この結果の応用として,Bの各行の成分がすべて0でなくある行の成分がすべて0でなければCは既約であることが示される。また,成分がすべて0とは異なる列をBが持てばCは既約であることも示される。また,次のような既約性の判定アルゴリズムも得た。ただし,ここに書いたのはおおざっぱなアルゴリズムである。1.B^^が,成分がすべて0の列を持てばそれらをすべて削除する。2.B^^が重さ1の行を持たなければ3へ行く。そうでなければ重さ1の行を削除して1へ行く。3.B^^=(b^^_<ij>)とする。b^^_<1t>=b^^_<1u>=1となるt≠uがある。i∈{1,...,n}に対してB^^_<it>=b^^_<iu>=0ならb^^_<iu>=0とおき,そうでなければb^^_<iu>=1とおく。u番目の列に0があればt列を削除して1へ行く。そうでなければCは既約である。
エイズ患者に合併する日和見真菌感染症の分子病態に関する研究

我々は、エイズ合併日和見真菌感染症の分子病態を明らかにするために、動物モデルを用いて真菌に対する感染防御機構について検討を行っている。本研究では、各種遺伝子欠損マウスなどを用いてCryptococcus neoformans (Cn)感染防御におけるNK、NKT、γδT細胞といった自然免疫リンパ球の役割について詳細な解析を行ってきた。Cnを肺内に感染させると肺及び所属リンパ節にこれらの細胞が集積すること、またその集積にはNK、NKT細胞がMCP-1を必要とすること、γδT細胞はMCP-1非依存的であることを明らかにした。NKT細胞の役割として、この細胞を遺伝的に欠損したマウスを用いて、Cnに対するTh1反応及び感染防御の成立にNKT細胞が重要であることを見出した。一方、γδT細胞についてはマウスに抗体を投与することでこの細胞を除去してその影響を検討したところ、Th1反応の誘導を抑制的に制御している可能性を示す結果を得ており、さらに詳細な解析を行っている。また、東南アジアにおいてエイズに合併する重要な日和見感染真菌であるペニシリウム・マルネッフェイによるTh1反応誘導過程におけるオステオポンチンのIL-12産生誘導作用についてヒトの末梢血単核球を用いて明らかにしてきた。本研究を通して真菌に対する自然免疫から獲得免疫に至るプロセスを明らかにすることができ、今後のエイズ合併真菌感染症に対する対策を構築する上で基礎的研究を通した貢献ができたと考えている。本研究で我々は、動物感染モデルを用いてCryptococcus neoformans(Cn)に対する感染防御機構について検討を行っている。各種遺伝子欠損マウスを用いた研究で、Th1系サイトカインであるIFN-γ、IL-12、IL-18がこの順番でCnの感染防御に重要な役割を担うことを明らかにした。IL-18KOマウスでは、IFN-γ産生が減少し、併せてCnに対する遅延型過敏反応が低下した。また、IL-12産生欠如状態においてもCn感染後のIFN-γ産生は完全には消失しなかったが、抗IL-18抗体を投与するとほとんどみられなくなり、感染防御はIFN-γKOマウスと同程度に減弱した。感染IL-12KOマウス由来の脾細胞は再刺激によってIFN-γを全く産生せず、IL-18の投与もこれを回復させなかった。一方、感染IL-18KOマウス由来の脾細胞では、再刺激によるIFN-γ産生は低下しているものの明らかに検出され、IL-18投与によってほぼ完全に回復した。このことから、IL-18自身はCn特異的なTh1細胞の分化を誘導できないが、IL-12による誘導を増強する作用を有することが明らかになった。一方、Cn感染防御におけるNKT細胞の役割を調べるために、Cn静脈感染マウスにNKT細胞の特異的活性化物質であるα-galactosyl ceramide(α-GalCer)を投与してその影響を調べた。α-GalCer投与によってCn感染マウスで脾細胞中にTh1細胞が誘導され、血清中のIFN-γ産生が著明に増強した。その結果、脾及び肺内の生菌数が減少し感染防御の誘導が観察された。これらの反応は、NKT-KOマウスでは消失した。また、感染初期のIFN-γ産生はNK細胞などの自然免疫細胞、後期はTh1細胞によることも明らかにした。次年度では、NKT細胞、NK細胞による自然免疫の成立におけるIL-12やIL-18の役割、さらには獲得免疫の誘導におけるこれら細胞の役割について検討していきたい。本研究ではエイズに合併する日和見真菌感染症の分子病態を明らかにするために、動物モデルを用いてCryptococcus neoformans(Cn)に対する感染防御機構について検討を行っている。今年度は、真菌感染後獲得免疫が誘導するまでに作動する自然免疫の中でのNK細胞、NKT細胞、γδT細胞の役割について解析を行った。これらのprimitive immune cells、特にVα14+NKT細胞とγδT細胞はCn感染後経時的に肺内で著明な増加を示した。