hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ニラのディプロスポリー系統に特異的に発現する遺伝子群の探索に関する研究

アポミクシスの発現は一般に,高次倍数性個体で認められ,低次倍数性個体では抑制されることが知られている.そこで,アポミクシスの一様式であるデイプロスポリーの発現様式解明を目的とし,ニラを用いた半数体の誘導ならびに同形質に関連する,特に単為発生期に発現する遺伝子(群)の単離を試みた.半数体獲得を目的として,既にアポミクシス率が報告されているニラ(2n=4X=32)の3品種('テンダーポール','フラワーポール'および'ワイドグリーン')を供試材料とし,未受粉の5,075胚珠をB5ホルモン無添加培地上で培養したところ,4.49%に相当する227胚珠で胚形成が認められた.胚形成頻度を各品種間ならびに由来種子(多胚性種子あるいは単胚性種子)で比較したところ品種間で有意な差異が認められ,'ワイドグリーン'で最も効率的な胚形成が確認された.その後,順化にまで至った個体の倍数性をフローサイトメーターにより調査したところ,それらは全て4倍体であり,倍数性を維持していたことが明らかとなった.このように半数体獲得には至らなかったため,特定の発育ステージに発現するmRNAを比較することで,単為発生期に発現する遺伝子(群)の単離を試みた.花ニラ用栽培品種である'テンダーポール'を供試し,胚形成が認められない開花直後,単為発生胚の形成が開始される開花4日後の胚珠および種子内の成熟胚からmRNAを抽出し,これらをサンプルとしてディファレンシャルディスプレィ法による単為発生期に特異的に発現する遺伝子(群)の探索を行うこととした.現在,上流プライマー24種,下流プライマー9種の計216組み合わせで反応を行い,増幅産物による比較を行っている.本研究では,アポミクシスの中でも研究報告例の少ないディプロスポリーを対象とし,本形質に関連する遺伝的子群の探索を目的として実験を行った.アポミクシスという現象は一般的に高次倍数性個体で認められ,倍数性の低下とともにその発現が見られなくなることが知られている.そこで,初年度の今年は,未受粉花の胚珠-胚培養によるニラの2倍性半数体個体誘導を試み,ディプロスポリー発現程度の異なる系統の作出を図ることとした.アポミクシス率が既に明らかにされており,さらに四季咲き性であることから,供試材料として花ニラ用栽培品種である'テンダーポール'および'フラワーポール'の2品種を選抜した.これら2品種は条件的アポミクトであるが,そのアポミクシス率は97%程度と非常に高いものである.これらの植物体から摘出した開花前の花蕾(未受粉花)を,7%ショ糖を添加したホルモン無添加のBDS培地で培養し,子房の成熟を促した.その後,成熟した個々の子房から胚珠を取り出し,3%ショ糖を添加したホルモン無添加のBDS培地に移植し胚の発育を誘導した.'テンダーポール','フラワーポール'からそれぞれ1767,1366個の胚珠を摘出し前述した手順で培養を行ったところ,2.72%,3.37%の頻度で植物体形成が認められ,合計94個体が得られた.現在得られた個体の育成を図りながら,フローサイトメーターおよび根端押しつぶし法により培数性の確認を行っている.アポミクシスの発現は一般に,高次倍数性個体で認められ,低次倍数性個体では抑制されることが知られている.そこで,アポミクシスの一様式であるデイプロスポリーの発現様式解明を目的とし,ニラを用いた半数体の誘導ならびに同形質に関連する,特に単為発生期に発現する遺伝子(群)の単離を試みた.半数体獲得を目的として,既にアポミクシス率が報告されているニラ(2n=4X=32)の3品種('テンダーポール','フラワーポール'および'ワイドグリーン')を供試材料とし,未受粉の5,075胚珠をB5ホルモン無添加培地上で培養したところ,4.49%に相当する227胚珠で胚形成が認められた.胚形成頻度を各品種間ならびに由来種子(多胚性種子あるいは単胚性種子)で比較したところ品種間で有意な差異が認められ,'ワイドグリーン'で最も効率的な胚形成が確認された.その後,順化にまで至った個体の倍数性をフローサイトメーターにより調査したところ,それらは全て4倍体であり,倍数性を維持していたことが明らかとなった.このように半数体獲得には至らなかったため,特定の発育ステージに発現するmRNAを比較することで,単為発生期に発現する遺伝子(群)の単離を試みた.花ニラ用栽培品種である'テンダーポール'を供試し,胚形成が認められない開花直後,単為発生胚の形成が開始される開花4日後の胚珠および種子内の成熟胚からmRNAを抽出し,これらをサンプルとしてディファレンシャルディスプレィ法による単為発生期に特異的に発現する遺伝子(群)の探索を行うこととした.現在,上流プライマー24種,下流プライマー9種の計216組み合わせで反応を行い,増幅産物による比較を行っている.
市町村単位での牛白血病対策プログラムの確立に向けた実証研究

日本の畜産業の生産性を向上させるためには、慢性感染症対策が欠かせない。牛白血病ウイルス(bovine leukemia virus: BLV)の感染を原因とする牛白血病は、2017年に最も報告数が多かった家畜の監視伝染病である。BLV感染は生涯持続するうえ、ワクチンや治療薬がないために、農場での地道な感染対策が重要である。本研究課題では、BLVの水平伝播に着目し、地域単位での牛白血病対策の実証試験を行った。本研究の結果、セットポイント期におけるプロウイルス量が500 copies/50 ng of genomic DNA以下の牛は、長期間におよび農場内で飼養したとしても、水平および垂直感染の感染源とならないことを明らかにした。そこで、500 copies/50 ngを超える牛を、地域が管理する共同農場に移動する戦略を実施したところ、宮崎県内のA地区では、2013年に4.9%であった感染率を0.47%にまで低減することに成功した。本研究の結果、プロウイルス量に基づいた地域単位で取り組む牛白血病対策が有効なことが示された。この方法は、農家の経済的負担、作業負担も軽減できるうえ、成功率が高い。今後は、プロウイルス量の定量をより簡易化し、誰でも簡単に感染源となる牛を摘発できるようにすることが重要と考える。本研究課題では、黒毛和種において、リンパ球数からプロウイルス量を推定する方法である「JCの鍵」の開発に取り組んだ。しかし、有意な相関関係は認められたものの、感度および特異度が低く、実用化は難しいことがわかった。日本では、約35%の牛がBLVに感染している。これまでのBLV対策は、全ての感染牛の淘汰もしくは農場内隔離であった。しかし、高い感染率や作業負担、隔離スペースなどの問題から対策を実行できない農場が多い。本研究は、プロウイルス量を多く持つ感染源リスクの高い牛に絞って、より効率的に対策を行なうものである。これまでに、“低リスク牛を用いたウイルス伝播試験"を実施し、日本の通常の飼養環境下で他の牛にBLVを伝播しない基準を明確にすることができた(Mekata et al, Jpn J Vet Res,採択済)。また、このプロウイルス量に基づいた対策を普及するため、安価かつ簡易な検査法である“従来型PCR機によるハイリスク牛検出法"と“黒毛和牛版ECの鍵"の開発に取り組んだ。“従来型PCR機によるハイリスク牛検出法"は、従来型のPCR機を使い、DNA抽出を省略する手法である。これまでに、学会発表を行い、論文投稿を準備している段階である。“黒毛和牛版ECの鍵"に関しては、全自動血液検査で高リスク牛を検出する手法であり、その基準値と感度を明確にすることができた(Mekata et al, J Vet Med Sci, 2018)。以上の研究成果を元にして、地域NOSAIやJAと地域単位での牛白血病対策を実施している。宮崎県内のA町では2013年に4.9%であった感染率を0.48%(15/3,071)まで減らすことができた。別地区の家畜市場でも、2017年度の感染率は0.86%(23/2,668)であり、プロウイルス量に基づいたBLV対策の普及の結果、BLV感染率は急速に減っている。今後は対策実施地域をさらに拡大していく。水平感染における感染リスクの基準を明確化し、これを原著論文として発表した。この作成した基準を複数の農場で適用したところ、陽転率の明らかな減少という成果が出ており、信頼できるものができたと考えている。また、簡易診断の手法についても原著論文として発表した。感染源リスクのある牛のプロウイルス量の基準を明確にできた。今後は、高リスクとして判定した牛の扱いを検討する必要がある。また、異なる飼養環境下でも同様の成果が得られるのかを検討する。
幼児・児童における養護性発達に関する心理・生態学的研究

1.目的:幼児・児童における養護性(nurturance)の発達の様相とそれに結びつく要因を発見するために,幼児・児童集団の横断的比較を行うこと,および,子どもの養護性発達にとって重要な意味をもつきょうだい間の養護行動を縦断研究サンプルにおいて調べ, 3年3年半以前に調べた結果との結び付きを探ることの2つが,本研究の目的である.2.方法:上記の目的1に関しては, 5歳・8歳・11歳児合計557(男児276,女児281)名の親を対象とした質問紙調査を行った.質問項目は,フェイス・シート項目のほかに,子どもの一般的な養護的態度を調べる多面的項目,対象別の養護行動(弟・妹,ペット,老人,大人等との接触とその世話)を調べる多面的項目,そして養護行動と関連をもつと予想される日常生活のパターンを調べる項目からなる.目的2に関しては,約3年半および約3年以前,第2子が10か月時と15か月時に面接・観察を行った縦断サンプルのうち39組のきょうだいを対象として,養護行動を中心とした多面的な質問紙調査を行った.3.主要な結果:(1)援助・世話を必要としている存在に関心をもち,それを助け育てようとする態度としての「一般的養護性」という基本的次元が幼児・児童を通して存在することが確認された.(2)弟・妹;他の年少の子ども;ペット;おとなといった4種類の対象毎にある程度分化した,対象別養護行動が存在することが見出された.そして,養護行動を多く示す子どもは,他の行動(スポーツ,友人と過す,学習,家事)も多く示す子どもであった.(3)大部分の養護的態度・行動は,その現れが幼児期から小学校高学年にかけて減少した.(4)きょうだい間では,上の子の小学校入学以降きょうだいへの養護行動が減少することと, 23歳間隔のそれで正・負両面の相互作用が目立つことが分った.1.目的:幼児・児童における養護性(nurturance)の発達の様相とそれに結びつく要因を発見するために,幼児・児童集団の横断的比較を行うこと,および,子どもの養護性発達にとって重要な意味をもつきょうだい間の養護行動を縦断研究サンプルにおいて調べ, 3年3年半以前に調べた結果との結び付きを探ることの2つが,本研究の目的である.2.方法:上記の目的1に関しては, 5歳・8歳・11歳児合計557(男児276,女児281)名の親を対象とした質問紙調査を行った.質問項目は,フェイス・シート項目のほかに,子どもの一般的な養護的態度を調べる多面的項目,対象別の養護行動(弟・妹,ペット,老人,大人等との接触とその世話)を調べる多面的項目,そして養護行動と関連をもつと予想される日常生活のパターンを調べる項目からなる.目的2に関しては,約3年半および約3年以前,第2子が10か月時と15か月時に面接・観察を行った縦断サンプルのうち39組のきょうだいを対象として,養護行動を中心とした多面的な質問紙調査を行った.3.主要な結果:(1)援助・世話を必要としている存在に関心をもち,それを助け育てようとする態度としての「一般的養護性」という基本的次元が幼児・児童を通して存在することが確認された.(2)弟・妹;他の年少の子ども;ペット;おとなといった4種類の対象毎にある程度分化した,対象別養護行動が存在することが見出された.そして,養護行動を多く示す子どもは,他の行動(スポーツ,友人と過す,学習,家事)も多く示す子どもであった.(3)大部分の養護的態度・行動は,その現れが幼児期から小学校高学年にかけて減少した.(4)きょうだい間では,上の子の小学校入学以降きょうだいへの養護行動が減少することと, 23歳間隔のそれで正・負両面の相互作用が目立つことが分った.
多人数が同時に操作する対話ロボットを用いた授業参加支援システムの開発

多数の生徒が協力してロボットを操作して質問できるようにすることによる講義参加行動の促進効果を詳細に調査し、講義状況下で講師-生徒間対話を促進するメカニズムの理解と生徒の話す力の向上を目指す。このために生徒が互いに賛意を与えながら質問を協調的に選択する機能および、ロボットを発言させる講義中の適切なタイミングを決定する識別器を開発し、模擬授業や実許育現場での実験を通じて有用性を評価する。
環境同位体,浸透能測定とリモートセンシングによる北東アジアにおける土地荒廃の評価

北東アジア地域における土地の荒廃について、現地調査およびリモートセンシングによって調査を行った。土地荒廃の理由としては、伐採、リターの採取、プランテーション、過放牧と様々な土地改変が行われており、それによる表面被覆の低下による土壌の浸透能の低下が激しい土壌侵食を引き起こし、土地荒廃の直接的な引き金になっていると考えられる。一方で、中国においては、植林の進展につれて、浸透能の増加、および土壌侵食量の減少も報告されている。本研究においては、現地と協力した詳細な現地調査および、リモートセンシングによって、表面被覆が回復すると浸透能が増加し、土壌侵食量が減少したことがあきらかとなった。また、リモートセンシングによって、NDVIの解析により東アジア全体における荒廃度の変化について、MAPを作成することができた。本年度は,土地荒廃の実態の状況確認と今後の研究の方針を立てることを主眼として調査を行った。まず。2009年5月に,中国成都を訪問し,中国における土地荒廃の実態と放射性核種およびリモートセンシングからの研究について,中国科学院山地災害研究所のZhang Xinbao氏らと現場調査を行い,議論を行った。その結果,中国においては,放牧地域はチベット問題等あるため調査は難しく,むしろ耕作地の森林化による土砂流出量の減少についてとらえた方が良いのではないかという意見を得た。また中国においては,多くの水土砂流出プロットがあることがわかり,その既存データを利用することにより,散水実験の代わりとなる可能性が得られた。そこで,2010年3月に中国科学院地理科学研究所の宋教授を訪問し,今後の水土砂流出プロットを用いた共同研究を提案し,受諾された。また,韓国については,2009年7月および2009年12月の2回訪問し,散水試験の適地を選定した。また,リモートセンシングを用いた韓国・北朝鮮の浸透能推定については,韓国地質科学院のヤン教授の協力を得られることとなった。また散水試験時の流量・水質モニタリングのために,流量・水質モニタリングプローブを購入し,散水実験の準備を行った。中国,北京近郊において,表面流流出プロットのデータを収集し,表面被覆と表面流出量の関係についてのデータを得た。また,近年,森林化が進行している中国四川省塩亭付近の湖沼の土壌サンプリングを行うとともに,斜面における土壌サンプリングを行い,Cs-137,Pb-210exデータを算出し,畑から森林への変換に伴う侵食量の変化について算定した。このような,土地被覆のへんかは,土壌浸透能に強い影響を及ぼすことが予想される。そのため,耕地から林地への転換によって土壌浸透能の回復可能性が示されている。研究対象地域(中国四川省塩亭地区)における2時期のLandsat/TM衛星画像(90年7月及び07年5月)を分類した結果、森林の面積は14.6%から28.4%まで増加したことがわかり,今後のリモートセンシングを利用した浸透能評価に道を開いた。一方,モンゴルにおいては、土壌荒廃評価の基本となる、水収支、河川水、湧水、地下水等の現地調査ならびに、試料収集を行うとともに、北東アジア地域における降雨量データの解析を行った。また,過放牧が進行しているモンゴル東部チョイバルサン地域において,地下水データ,湖沼の堆積物サンプリングを行い,土壌侵食量変化について調査をおこなっている。中国,北京近郊において,表面流出プロットのデータを収集し,表面被覆と表面流出量の関係についてデータを得た。また,近年,森林化が進行している中国四川省塩亭付近の湖沼の土壌サンプリングを行うとともに,斜面における土壌サンプリングを行い,Cs-137,Pb-210exデータを算出し,畑から森林への返還に伴う侵食量の変化について算定した。このような,土地被覆への変化は,土壌浸透能に強い影響を及ぼすことが予想される。研究対象地域(中国四川省塩亭地区)における2時期のLandsat/TM衛星画像(90年7月及び07年5月)を分類した結果,森林の面積は14.6%から28.4%まで増加したことが分かり,今後のリモートセンシングを利用した浸透能評価に道を開いた。一方,モンゴルにおいては,土地荒廃評価の基本となる,水収支,河川水,湧水,地下水等の現地調査ならびに,試料収集を行うとともに,東北アジア地域における降雨量データ,湖沼の堆積物サンプリングを行い,、土壌侵食量変化について調査を行っている。現地調査に基づいて浸透能と土壌侵食料を明らかにすることにより北東アジア地域の様々な気候帯における土地荒廃の実態を明かした。1)恩田・辻村及び学生と共同で中国において既存の流出試験区のデータを集め、表面被覆と浸透能の関係について解析した。

その際試験場所の選定にあたっては、辻村を中心に既存の水文データを解析し、またASTERの衛星画像データを参考にして設定した。恩田を中心に中国四川省放牧地において、土地荒廃状況の異なる各地において、浸透能試験を実施した。位置の選定にあたっては、ASTERの衛生画像データを参考にして設定した。また、中国科学院地理研究所の既存の流出プロットに異なった植生を植え、植生被覆が流出及び土砂流出に及ぼす影響を調査した。2)辻村を中心として、モンゴル、中国、韓国における雨量データ収集を精力的に行い、近年の降雨頻度の変化について解析する事によって、地球温暖化に伴う降雨量・強度の変動シュミレーションを行った。3)松下を中心に、モンゴル、中国および韓国の土壌侵食量・浸透能の現地調査と衛星画像解析からリモートセンシングをもちいて現地浸透能マップを作成した。浸透能と土壌侵食量との関連を明らかにすることにより、広域的に土地荒廃度を評価する手法を開発した。調査は中国を中心に行った。4)恩田を中心に韓国の既存の流出プロットのデータを取得し、表面被覆と浸透能の関係について解析し、北東アジアの土地荒廃状況を浸透能から把握する方法を開発した。昨年度までに,中国,四川省塩亭付近の湖沼の流域内において,斜面土壌と湖底堆積物のサンプリングを行った。Cs-137とPb-210exの放射性同位体分析の結果から,調査地では,退耕還林政策による土地被覆の変化により,耕作地から森林への転換からの経過年数に応じて,斜面の土壌侵食量が減少していることが明らかになった。一方,モンゴル東部のステップ草原の湖沼で採取した湖底堆積物について,現在,放射性同位体分析を行っている。このように,昨年度までに,中国およびモンゴルの湖沼で得られた流域内の土壌侵食履歴の解明のための調査および解析を行った。その他に,中国北京近郊の調査サイトでは,地表被覆が異なる斜面プロットの設置が完了しており,来年度より行う水・土砂流出の観測の準備が整った。24年度が最終年度であるため、記入しない。今後は,モンゴルで採取した湖底堆積物の放射性同位体分析に基づいて,モンゴル草原における土壌侵食・堆積履歴の推定を行う。また,現地で収集した調査地域の水収支,河川水,湧水,地下水等の長期データ,および衛星画像の解析を行い,湖底堆積物による土壌侵食履歴との関連性について考察を行う。同時に,中国および韓国に設置した様々な被覆からなる実験斜面において,自然降雨条件下における水・土砂流出データを観測する。それらのデータに基づいて,地表被覆,土壌物理性が異なる土壌の浸透能と土壌侵食の関連を明らかにする。また,リモートセンシングによって地表面の被覆状況を推定し,浸透能マップを作成するとともに,土壌侵食を指標として広域的な土地荒廃度の評価を行う。
生体膜局在型H2O2センサーの開発および炎症モデルへの応用

細胞内におけるH2O2の局所生成、および、酸化シグナル生成に伴うグルタチオン酸化について時空間解析を可能とする為に、生体膜局在型H2O2センサー、グルタチオン酸化センサーの開発を行い、消化管炎症と細胞内酸化還元環境の相関について検討した。作成したセンサーは反応性、局在ともに良好な結果を示し、実際にライブセルイメージングによる時空間解析を行い、この点の研究目標は十分に達成された。本解析により、細胞質内でのH2O2生成とグルタチオン酸化はともに、局所的な反応として進行し、両シグナルの空間分布が細胞質内で高度の不均一性を有することが初めて明らかになった。上記の成果はRedox Biology誌(2018)に掲載された。さらにセンサーを特定のオルガネラ膜にターゲティングすることを目指し、コンストラクトを複数作成し、この点について概ね計画は完了した。作成したセンサーの反応性と局在を検討した結果、共に良好な特性が認められたのは中間径フィラメントおよび小胞体膜局在型センサーのみであった。これらのセンサーについては、予備実験としてHeLa細胞での解析を完了しており、細胞周辺部(細胞膜付近)よりも細胞深部(内部)の方がより酸化レベルが高いことが明らかになった(成果発表準備中)。その他のセンサーについてはコンストラクトを再設計しなおし、特性の確認を進めている。センサーの消化管炎症モデルへの導入にあたっては、センサーの長期発現が培養腸上皮細胞の分化能に与える影響が懸念される結果が得られた。その為、計画を修正して誘導型発現ベクターへの系の切り替えを行い、既に系の確立を完了している。今後、新たに確立した発現系を用い、消化管炎症モデルにおけるH2O2とグルタチオン酸化の時空間解析を行う予定である。本研究では、炎症と酸化ストレスの関連を明らかにすることを目的として、細胞内レドックス環境の新規解析ツールの開発を進めている。これまでGFPをベースとして、多様なH2O2センサーおよびグルタチオン酸化センサーが開発されてきたが、細胞質内での自由拡散の為に十分な空間分解能が得られていなかった。そこで本研究では、現行のH2O2センサー(roGFP2-Orp1)およびグルタチオン酸化センサー(Grx1-roGFP2)にパルミトイル化配列を導入し、生体膜に細胞質側からセンサーを係留することを試み、自由拡散の問題の解消を図った。パルミトイル化グルタチオン酸化センサーをHeLa細胞で発現したところ、センサーは細胞膜や小胞の生体膜の細胞質側に正確にターゲティングされ、グルタチオン酸化・H2O2に対して良好な反応性を示した。この新規センサーを用いて通常培養条件下における細胞内グルタチオン酸化・H2O2動態を解析した結果、一部の小胞の生体膜近傍において高度のグルタチオン酸化・H2O2産生が検出された。これまで、細胞質は恒常的に還元的な状態に維持されていると考えられてきたが、本研究の結果はその認識に検討の余地があることを明確に示すものであった。以上の成果は、Redox Biology誌14号679頁(2018年)に掲載され、その成果の一部を8th International Congress on Stress Response in Biolgoy & Medicine (Finland, Truku)および2017年度生命科学系学会合同年次大会(神戸)で発表した。また、本研究で開発したパルミトイル化グルタチオン酸化センサーおよびH2O2センサーは広く海外研究機関(米国Boston Children's Hospitalなど)に対して供与するなど、当該研究分野への貢献を果たしている。本研究の成果の一部は既に論文(Redox Biology誌14号679頁)として発表されている。研究計画書に従って複数の生体膜標的型センサーの作成を進めており、そのうち細胞膜局在型、中間径フィラメント局在型、ペルオキシソーム局在型、ゴルジ体局在型の作成は完了している。その中で、ゴルジ体局在型センサーを用いた実験から、ゴルジ体生体膜で特異的に、且つ、高度のグルタチオン酸化が起こっていることが判明した。引き続き、まだ未完成の生体膜局在型センサーについても作成を進めている。作成したセンサーを導入して解析を行う対象として、THP-1細胞およびCaco-2細胞を使用する予定である。THP-1細胞については、ホルボールエステル処理によるマクロファージへの分化誘導を実施するが、分化誘導条件については既に検討済である。また、Caco-2細胞についても、分化誘導条件検討(トランスウェル上での培養)および分化段階の評価(経上皮抵抗値の測定とアルカリフォスファターゼ活性測定)などを実施済である。以上の進捗は概ね研究計画書に示した予定に沿っており、進展は順調であると考える。

作成したセンサーの反応性と局在を検討した結果、共に良好な特性が認められたのは中間径フィラメントおよび小胞体膜局在型センサーのみであった。これらのセンサーについては、予備実験としてHeLa細胞での解析を完了しており、細胞周辺部(細胞膜付近)よりも細胞深部(内部)の方がより酸化レベルが高いことが明らかになった(成果発表準備中)。その他のセンサーについてはコンストラクトを再設計しなおし、特性の確認を進めている。センサーの消化管炎症モデルへの導入にあたっては、センサーの長期発現が培養腸上皮細胞の分化能に与える影響が懸念される結果が得られた。その為、計画を修正して誘導型発現ベクターへの系の切り替えを行い、既に系の確立を完了している。今後、新たに確立した発現系を用い、消化管炎症モデルにおけるH2O2とグルタチオン酸化の時空間解析を行う予定である。ゴルジ体局在型センサーを用いた実験より、ゴルジ体生体膜上における高度のグルタチオン酸化が明らかになった。今後、他の生体膜局在型センサーについても作成を進める一方、ゴルジ体局在タンパク質の酸化修飾についても検討を進めるべきであるとの考えに至った。このような着想のもと、本学に新たに導入されたMALDI-TOFを利用してゴルジ体タンパク質の酸化修飾について網羅的な解析を行うことを予定している。これにより、細胞内のグルタチオン酸化の時空間パターンおよびH2O2動態が明らかになるだけでなく、それがゴルジ体上のどのようなタンパク質に影響を及ぼすかが明確になると期待される。本研究では、1年目に酸化還元センサーの作成を行い、2年目にセンサーを用いた解析および成果発表を行うものとして研究計画を立てている。その為、平成30年度に必要な経費として、解析に要する消耗品のコストと、論文掲載料を計上している。
海上における異種ネットワークの連携・併用による多重経路通信制御方式

本研究は、遠隔操船や自動運航船の実現に向けて世界的に急速な研究・開発が進められている海洋工学分野において、海上で広く用いられている従来の無線通信手段ではなく、IP網との親和性が高く大容量データの伝搬に適した携帯電話網を用いた通信制御方式の実現を目標とする。海上における通信は陸上と異なり極めて厳しい接続環境になるため、安定積な接続性と場所固有の通信環境を考慮した効率的な通信制御を可能とする異種ネットワーク連携併用型の多重経路制御技術を開発する。開発技術は理論面の有効性の実証と、大学所有の船舶を用いた実践的評価の両面から実用性を示す。
ヒト薬物代謝酵素を応用した化学物質の体内動態予測の基盤に関する研究

実験動物との種差の問題から、ヒト由来の組織、培養細胞又はヒト酵素遺伝子発現系を用いてヒトにおける代謝反応を明らかにすることが必要となっている。第1相の薬物代謝反応において大きな役割を果たすチトクロムP450酵素(以下CYP又はP450)を中心にいくつかのヒトの薬物代謝酵素が試薬として製造あるいは輸入販売されている。最近市販されているP450関連試薬では、P450だけでなく、NADPHからの電子伝達に必須なNADPH-P450還元酵素(NPR)を同時に発現させた、いわゆる共発現系のミクロゾームが主流になっているが、各種発現系の選択とその結果の解釈に議論がなされている。我々は、ヒト肝に存在する薬物代謝型の主要分子種であるP450についてNPRとの共発現pCWュプラスミドを大腸菌に導入し、その膜画分の調製した。さらに大腸菌膜を用いたP450共発現系にさらにNPRやチトクロームb_5(b_5)を添加して触媒活性の至適条件を検索し、市販のリンパ芽球、バキュロウイルス発現系やヒト肝ミクロゾームの薬物酸化酵素活性と比較した。発現機構が未解明である薬物相互作用の一つにフェニトインとテガフールがある。抗てんかん薬フェニトインと抗癌剤テガフールを併用することによりフェニトインの血中濃度が上昇し、意識障害などのフェニトイン中毒と思われる臨床症状が現れることが報告されている。そこで本研究では、これらの薬物相互作用の発現機序を解明するために、ヒト肝P450によるテガフールとフェニトインの代謝について検討を行った。ヒト肝ミクロソームによる5-FU生成は、主にCYP1A2、CYP2A6およびCYP2C8によって触媒され、これらのP450の寄与の程度はヒト肝P450の組成比に依存して個人差が認められることが示された。ヒト肝において、定常血中濃度(100μM)付近のテガフールからの5-FU生成は主にミクロソーム画分の酵素(P450)によって触媒され、テガフール濃度が高い場合にはサイトゾル画分のチミジンホスホリラーゼにより触媒されることを示した。ヒト肝ミクロソームによるフェニトイン酸化活性は肝サイトゾルの添加によって増加し、サイトゾル存在下の3′,4′-diHPPH生成活性は主代謝物である4′-HPPH生成活性と同レベルであった。4′-HPPH生成には主にCYP2C9、一部CYP2C19が関与した。一方、3′,4′-diHPPH生成には主にCYP2C9、CYP2C19およびCYP3A4が関与しており、これらのP450の寄与の程度はヒト肝P450の組成比に依存して個人差が認められることを明らかにした。実験動物との種差の問題から、ヒト由来の組織、培養細胞又はヒト酵素遺伝子発現系を用いて、ヒトにおける代謝反応を明らかにすることが必要となっている。最近市販されているP450関連試薬では、P450だけでなく、NADPHからの電子伝達に必須なNADPH-P450還元酵素(NPR)を同時に発現させたいわゆる共発現系のミクロゾームが主流になっているが、各種発現系の選択とその結果の解釈に議論がなされている。我々は、ヒト肝に存在する薬物代謝型の主要分子種であるCYP3A4についてNPRとの共発現pCW'プラスミドを大腸菌に導入し、その膜画分の調製した。さらに大腸菌膜を用いたCYP3A4共発現系にさらにNPRやチトクロームb5(b5)を添加して触媒活性の至適条件を検索し、市販のリンパ芽球、バキュロウイルス発現系やヒト肝ミクロゾームのテストステロン水酸化活性と比較した。大腸菌膜共発現系のCYP3A4とNPRの発現量は培養条件によって異なり、このモル比がCYP3A4当たりの触媒活性に影響を与えた。ヒト肝ミクロゾームと同程度の触媒活性はCYP3A4:NPR:b5=1:2:1に調製した場合に認められた。B5のCYP3A4活性促進効果はb5発現大腸菌膜及び各種精製標品に認められたが、添加した精製NPRの作用にはb5とコール酸が必要であった。以上のことから、従来の精製CYP3A4再構成系での至適条件が共発現系にも適応できることが示唆された。

さらに大腸菌膜を用いたP450共発現系にさらにNPRやチトクロームb_5(b_5)を添加して触媒活性の至適条件を検索し、市販のリンパ芽球、バキュロウイルス発現系やヒト肝ミクロゾームの薬物酸化酵素活性と比較した。発現機構が未解明である薬物相互作用の一つにフェニトインとテガフールがある。抗てんかん薬フェニトインと抗癌剤テガフールを併用することによりフェニトインの血中濃度が上昇し、意識障害などのフェニトイン中毒と思われる臨床症状が現れることが報告されている。そこで本研究では、これらの薬物相互作用の発現機序を解明するために、ヒト肝P450によるテガフールとフェニトインの代謝について検討を行った。ヒト肝ミクロソームによる5-FU生成は、主にCYP1A2、CYP2A6およびCYP2C8によって触媒され、これらのP450の寄与の程度はヒト肝P450の組成比に依存して個人差が認められることが示された。ヒト肝において、定常血中濃度(100μM)付近のテガフールからの5-FU生成は主にミクロソーム画分の酵素(P450)によって触媒され、テガフール濃度が高い場合にはサイトゾル画分のチミジンホスホリラーゼにより触媒されることを示した。ヒト肝ミクロソームによるフェニトイン酸化活性は肝サイトゾルの添加によって増加し、サイトゾル存在下の3′,4′-diHPPH生成活性は主代謝物である4′-HPPH生成活性と同レベルであった。4′-HPPH生成には主にCYP2C9、一部CYP2C19が関与した。一方、3′,4′-diHPPH生成には主にCYP2C9、CYP2C19およびCYP3A4が関与しており、これらのP450の寄与の程度はヒト肝P450の組成比に依存して個人差が認められることを明らかにした。実験動物との種差の問題から、ヒト由来の組織、培養細胞又はヒト酵素遺伝子発現系を用いてヒトにおける代謝反応を明らかにすることが必要となっている。第1相の薬物代謝反応において大きな役割を果たすチトクロムP450酵素(以下CYP又はP450)を中心にいくつかのヒトの薬物代謝酵素が試薬として製造あるいは輸入販売されている。最近市販されているP450関連試薬では、P450だけでなく、NADPHからの電子伝達に必須なNADPH-P450還元酵素(NPR)を同時に発現させた、いわゆる共発現系のミクロゾームが主流になっているが、各種発現系の選択とその結果の解釈に議論がなされている。我々は、ヒト肝に存在する薬物代謝型の主要分子種であるP450についてNPRとの共発現pCWュプラスミドを大腸菌に導入し、その膜画分の調製した。
独自のin vivoイメージングによる生体内でのネクローシスの生理的役割の解明

本研究課題では、生理的な条件下におけるネクローシス型細胞死の存在を明らかにし、その役割を明らかにすることを目的に、独自に開発した細胞死のin vivoイメージング法を用いてマウス胚発生期において誘導されるネクローシス型細胞死の同定とその分子機構の解明および役割について解析を行った。この解析において昨年度までに、いくつかの発生時期および部位において、時空間的に制御されたネクローシス型細胞死が誘導されていることを見出した。これらの新たに同定した細胞死について、アポトーシスのマーカータンパク質による解析やアポトーシスに必須の遺伝子の欠損マウスを用いた解析を行った結果、その多くがアポトーシスの機構により実行された細胞死(二次的ネクローシス)であることが示唆された。しかし一部の組織においては、アポトーシスの機構とは独立したネクローシス型の細胞死である可能性が示唆された。これらのネクローシス型細胞死が誘導された領域の多くは、研究代表が以前に同定し報告している骨形成領域で観察されたが、それ以外の領域においても一部で観察された。そこで、それらの細胞死の役割を知るための手がかりとして、それらの制御機構の解析を行った。しかし、ネクロプトーシスやオートファジー依存的細胞死など既知の細胞死との一致は見られなかった。このことは、未知の制御されたネクローシス型細胞死機構が生理的条件下において誘導されていることを示唆するが、近年in vitroの解析において新しい制御されたネクローシス型細胞死の機構が同定されている。今後、それらの新たに同定されたネクローシス型細胞死機構のマーカーとなる因子を同定し、これらの細胞死についても同様に解析し、これらの細胞死の実行メカニズムとその役割を明らかにする必要がある。本研究課題では、独自に開発した細胞死のin vivoイメージング法を用いて、生理的な条件下において誘導されるネクローシス型細胞死を同定し、その役割を明らかにすることを目的としている。そこで今年度は、このイメージング法を用いて胎齢E11.5E14.5のマウス胎仔において誘導される細胞死(特にネクローシス型細胞死)を網羅的に探索した。その結果、これまでに私が発見し報告しているE14.5マウス胎仔の骨形成領域におけるネクローシス型細胞死以外にも、いくつかの発生時期および部位において、時空間的に制御されたネクローシス型細胞死が誘導されていることを見出した。これらの新たに同定した細胞死について、アポトーシスのマーカータンパク質の免疫染色およびアポトーシスに必須の遺伝子の欠損マウスを用いた解析から、その多くはアポトーシスの機構により誘導されるが、マクロファージなどの食細胞による貪食除去が行われずに、細胞膜が破綻してネクローシス型細胞死に至っているもの(二次的ネクローシス)であることが示唆された。しかし、一部の組織においては、アポトーシスの機構とは独立したネクローシス型細胞死が誘導されている可能性が示唆された。そこで、現在はその細胞死がネクロプトーシスなどの既知の制御されたネクローシス型細胞死であるか、それらの細胞死固有のマーカーの解析やそれらの細胞死に必須の遺伝子の欠損マウスを用いた比較解析を行い、既知の細胞死であるかの確認とその分類を行っている。当初の研究計画の通り、独自のin vivoイメージング法を用いて生理的条件下において誘導される新規のネクローシス型細胞死を同定することに成功ている。さらに、そのネクローシス型細胞死の実行経路について既知の細胞死の実行経路との比較解析を行った結果、新たなネクローシス型細胞死であることを示唆する結果を得ている。このことから、概ね順調に進展していると判断した。今年度の研究において見出した生理的条件下において誘導されるネクローシス型細胞死の実行経路の解析を行い、その細胞死を制御する遺伝子の同定を行う。

遺伝子の同定が成功した場合には、その細胞死を制御する遺伝子のノックアウトマウスを入手または作製し、細胞死を欠損したマウスの表現型を解析することで、その細胞死の生理的な役割を明らかにする。今年度はデータの収集に重点を置いたため、データ解析用のワークステーションの購入を次年度に延期した。そのため、次年度に繰り越した研究費でデータ解析用のPCを購入する。
鍛造シミュレータにおけるネットワークパラレルの適用

鍛造シミュレータでは大規模な非線形方程式を収束計算で解くため,この部分に要する計算時間は非常に多くなる.本研究では,この部分に注目して並列化の可能性を検討した.非線形方程式を解く部分は大きく分けると3つのサブルーチンから構成されている.つまり,マトリックス(剛性方程式)の係数計算,剛性方程式の求解(連立1次方程式の求解),解の補正係数計算の3つである.このうち,3次元解析などの大規模解析においてもっとも時間を要するサブルーチンは剛性方程式の求解部である.従って,本研究では剛性方程式の求解部分に注目し,その並列化を試みた.剛性方程式の求解部分を並列化する方法として,共役勾配法を直接並列化する方法を開発し,ネットワークで接続されたワークステーションを並列計算機として使用した.その結果,1マスタ・4スレーブ型では解折領域の要素分割18×18×18において,ほぼ理想値に近い3.7倍のSpeed-upを得ることができる.しかし,さらにスレーブ数を増やすとSpeed-upは飽和し,著しく解析効率が低下する.この原因はマスタのデータ転送によるオーバーヘッドの増加とそれによるスレーブのidle状態時間の増加である.そのため,解折効率を向上させるにはマスタのデータ転送時間を削減しなければならない.今回並列計算機として用いたネットワーク結合型の並列計算機における転送速度は専用の並列計算機に比べて一桁以上劣る.そのため,本研究で開発した並列処理プログラムを実機の並列計算機上に実装すればさらに良好な解析結果が得られるものと考えられる.鍛造シミュレータでは大規模な非線形方程式を収束計算で解くため,この部分に要する計算時間は非常に多くなる.本研究では,この部分に注目して並列化の可能性を検討した.非線形方程式を解く部分は大きく分けると3つのサブルーチンから構成されている.つまり,マトリックス(剛性方程式)の係数計算,剛性方程式の求解(連立1次方程式の求解),解の補正係数計算の3つである.このうち,3次元解析などの大規模解析においてもっとも時間を要するサブルーチンは剛性方程式の求解部である.従って,本研究では剛性方程式の求解部分に注目し,その並列化を試みた.剛性方程式の求解部分を並列化する方法として,共役勾配法を直接並列化する方法を開発し,ネットワークで接続されたワークステーションを並列計算機として使用した.その結果,1マスタ・4スレーブ型では解折領域の要素分割18×18×18において,ほぼ理想値に近い3.7倍のSpeed-upを得ることができる.しかし,さらにスレーブ数を増やすとSpeed-upは飽和し,著しく解析効率が低下する.この原因はマスタのデータ転送によるオーバーヘッドの増加とそれによるスレーブのidle状態時間の増加である.そのため,解折効率を向上させるにはマスタのデータ転送時間を削減しなければならない.今回並列計算機として用いたネットワーク結合型の並列計算機における転送速度は専用の並列計算機に比べて一桁以上劣る.そのため,本研究で開発した並列処理プログラムを実機の並列計算機上に実装すればさらに良好な解析結果が得られるものと考えられる.
新型ガス検出器を用いた世界最高精度での中性子寿命測定実験

今年度の主な研究実績は、中性子の寿命測定に用いるガス検出器の開発および製作である。本研究では1テスラ程度の磁場を用いるため、検出器はアルミニウムなどの非磁性の材質で構成されている。磁場によって隔離された背景事象を、中性子ビームに起因する信号事象と区別するために、多層の電場構造を持つ特殊な構造の検出器を設計・製作した。設計に先立って信号事象と背景事象のシミュレーションを行い必要な検出器のサイズや形状を決定した。自ら引いた図面に基づいてフレームを製作してもらい、1本1本張力をかけながら総計800本のワイヤー張りを完成させた。「ワイヤーの張力による検出器の歪み」「印加した高電圧の放電」「検出器の発するノイズ」「部材からのアウトガスによる真空度の悪化」などの基礎的な困難に対処しながら製作を進めた。要求に対して十分なゲインとエネルギー分解能を有する検出器であることが放射線源や宇宙線を用いた性能評価から明らかになっている。また、検出器開発と同時にその周辺の装置も整備しており、ASICを用いたアンプやキャリブレーション用線源駆動台、宇宙線検出用のシンチレータ、ガス検出器のサポート治具やインストール治具を備えている。中性子ビームラインの準備として、超伝導磁石の冷媒用ヘリウムガス回収系の工事や漏れ磁場のシミュレーションとその対策の鉄の遮蔽体の設計が進んでおり、ビーム試験および測定データ収集に向けた体制を整えている。今年度の大きな目標である検出器の開発が一通り完了しているため、概ね順調に進展していると言える。予想外の大きな問題には見舞われていないが、予想内の問題でも対処には時間を費やすことを痛感させられた。今後の研究ではいよいよ超伝導磁石の磁場中でガス検出器を動作し性能の変化が期待通りかどうか調査する。中性子ビームラインでのビームテストも計画されており、中性子のベータ崩壊や3ヘリウムによる吸収反応の信号事象の振る舞いを確認することが重要な研究課題である。
プラーク接着エコー・コントラスト剤による不安定プラークの診断およびその安定化評価

急性冠症候群は、冠動脈プラークが不安定化・破綻し、破綻部位への血栓形成の結果、冠動脈閉塞をきたすことにより生じる病態である。そこで、プラークの非侵襲的な評価は、臨床上極めて重要な意義を有する。心エコー法は、簡便な非侵襲的検査法として臨床で普及しているが、近年、コントラスト・エコー法を含めた各種新技術の開発が行われおり、エコー・コントラスト剤を用い、各種画像記録法・解析法を駆使することで、心エコー法によるプラーク評価が期待される。しかし、この領域でのエコー装置・画像記録法・画像解析法について、十分に検討はされていない。そこで本研究では、エコー・コントラスト剤を用いて、エコー画像でプラークを描出ための、エコー装置の各種設定や各種画像貴記録法・各種画像解析法の基礎的検討を行った。今回の研究により、心エコー法による新技術を含めた各種画像記録法および解析法を試み、本法による質的解析・定量的解析の可能性が示され。また、各方法の利点とともに、各方法の限界等も示された。これらの検討結果をふまえて、心エコー法によるプラーク評価をさらに発展させていくべく、今後の研究を計画する予定である。プラークの不安定化には、内皮細胞の高度障害、血小板の活性化・凝集、好中球浸潤、マクロファージ集積、酸化LDLの増加、細胞外基質分解酵素(MMP)の発現亢進、などが関与するとされている。また、マクロファージ集積には、接着分子(VCAM-1)やケモカイン(MCP-1)が関与しており、やはりプラーク不安定化の要因となりうる。不安定プラークにこれら物質が関係している点に注目すると、それら抗体をエコー・コントラスト剤に付着させて血管内に投与すれば、そのコントラスト剤は不安定プラークに接着し、エコー画像にてプラークが明らかに描出できる可能性がある。そこで、本研究の目的は、エコー画像にて不安定プラークを描出するための基礎的検討を行うことであった。今年度の検討としては、不安定プラークに接着するエコー・コントラスト剤作成のための各種基礎検討を行った。さらに、投与されたコントラスト剤を有効に描出するための、エコー画像記録方法について、各種基礎的検討を行った。特に、血管のプラークを精度高く描出するための各種技術を比較検討することにより、有効と思われる画像記録法を確立することができた。また、記録されたエコー画像を解析する技術を各種検討し、精度高く、かつ再現性の高い計測方法を確立することができた。今年度の検討としては、前年度に引き続き、不安定プラークに接着するエコー・コントラスト剤作成のための各種基礎検討、および投与されたコントラスト剤を有効に描出するための、エコー画像記録方法について、各種基礎的検討を行った。特に、エコーの最新技術を用いることで、有効な画像記録法の検討を行った。また、記録されたエコー画像を解析する技術を各種検討し、精度高く、かつ再現性の高い計測方法の検討を行った。
受動的で可動機構なしの自律的熱制御材の研究

本研究は、強磁性材料であるペロブスカイト構造Mn酸化物に多層薄膜を施し、太陽光吸収率が小さく、かつ全半球放射率の温度依存性の優れた新しい放射率可変型ラジエータSRD(Smart Radiation Device)を提案・開発することを目的としている。このラジエータは従来のサーマルルーバと異なって機械的な要素がなく、かつ軽量化が期待できるものである。研究の主な成果は次の通りである。まず、既存装置に科研費によって準備された光学反射装置と検出器を設置し、ペロブスカイト型Mn酸化物の1100μmの分光反射率を173293Kの温度範囲で測定した。その結果から、Kramers-Kronig(K-K)の関係により、光学定数の温度依存性を算出した。次ぎに、ペロブスカイト型Mn酸化物の機能性を高めるため、っまり全半球放射率の温度依存性の性質を失うことなく、かつ太陽光吸収率を小さくすることをねらって、遺伝的アルゴリズムを用いて、光学定数に基づいた多層薄膜設計の最適化を試みた。これらの結果、光学定数は、室温以上では光学フォノンに依存し、絶縁体と同じような振舞いをすること、一方、室温以下では光学フォノンによる性質が徐々に失われ金属的な振舞いをすることが分かった。この現象から全半球放射率の温度依存性の理解が進んだ。多層薄膜の設計では、基材Mn酸化物の界面・表面粗さ、光学異方性等が多層膜に及ぼす影響について評価を行った。3種類9層の薄膜材料を組合せることにより、太陽光吸収率が0.81から設計で0.24、実際には0.28と小さくなり、かつ全半球放射率も本来の特性を失わない、という結果が得られた。遺伝的アルゴリズムによる多層薄膜の設計が有効であることが確認された。熱制御素子としての機能を高めることが可能であることから、放射率可変型ラジエータとして極めて有望なものが実現できると考えられる。
半月板損傷後の修復プロセスの解析に基づいた再生医療実現可能性の検証

マウス半月板切除後の再生過程の組織学的評価では、切除後3日で、切除部位近傍の滑膜組織へのマクロファージの浸潤、2週後に切除領域近傍の滑膜組織の増生と切除領域への線維芽細胞の浸潤、軟組織の形成が観察される。この軟組織は、切除後4週で軟骨へと分化し、6週で正常半月板とほぼ同等の形態を有する組織へと成熟することを私たちは報告している。半月板切除部位近傍の滑膜における炎症反応が、その後の一連の再生プロセスにおいてどの様な生物学的意義を有するかを検討するため、本研究では、切除後早期に抗炎症剤を投与しその後の再生過程を組織学的に観察した。C57BL/6マウス(8週、雄)の左膝内側半月板前方1/2切除を行い、1日目(急性期群)または10日目(細胞浸潤期群)にトリアムシノロン(ケナコルト, 2.8μg/7μl)の注射を行った。術後3日、2、6週に屠殺し、半月板の再生過程の組織学的検討を行った。また、同様の実験でケナコルト注射後、2-4日後に滑膜を採取し、14日間dish上で培養し、滑膜細胞のoutgrowthを評価した。急性期にケナコルトを注射した群においては、その後の切除部位への線維芽細胞の浸潤が非常に強く抑制された。細胞浸潤期にケナコルトを注射した群においては、細胞浸潤ならびに6週で観察される軟骨分化の双方が強く抑制された。滑膜細胞のOutgrowthの評価では、急性期に投与した群では、滑膜組織からDishへの細胞浸潤がほぼ完全に消失したのに対し、細胞浸潤期群においては、浸潤抑制効果は限定的であった。半月板切除後に観察される炎症反応は、急性期では滑膜組織から切除部位への線維芽細胞の浸潤の賦活化、その後は切除部位において再構築された間葉組織の軟骨分化誘導に必須の働きをしていると考えられる。半月板切除後に観察される炎症反応は、急性期では滑膜組織から切除部位への線維芽細胞の浸潤の賦活化、その後は切除部位において再構築された間葉組織の軟骨分化誘導に必須の働きをしていることを示唆するデータを得た。本実験結果は、当初の仮説を検証することにつながり、概ね順調に進捗していると考えている。炎症反応が、半月板の再生に重要な機能を果たしている可能性を示唆するデータを得た。そこで、次年度以降は、内在性のマクロファージを欠失したマウスを用いて同様の検証を試みる。これまでの私の解析から、半月板切除部位に隣接する滑膜におけるCellularityの増加が観察される以前に、同部位へのマクロファージの著明な浸潤が観察されたことから、滑膜における炎症の場の形成にマクロファージが深く関与していると考えている。そこで、Lysosome Mプロモーターの制御下DTR(Diphtheria Toxin Receptor)を発現するトランスジェニックマウス(lysM-Cre/DTR, Goren et al. Am J Pathol 175(1):132-47, 2009)を用いて、Diphteria Toxin投与により単球、マクロファージを欠損させたマウスに対して半月板欠損モデルを作成し、再生過程の検証を行う。今年度以降、切除部位に形成された肉芽組織の軟骨分化を制御する因子の同定を目的として、半月板切除後に半月板領域に形成される組織における遺伝子発現解析を行なっていく。4週目までに半月板欠損部位に形成された軟組織の軟骨分化が6週にかけて観察されるが、集積した線維芽細胞の軟骨分化がどの様な分子メカニズムで一義的に制御されているかは未知である。そこで、術後3週、4週、5週の時点で再生過程にある組織を採取し、RNA-seq法を用いて、網羅的に遺伝子発現のパターン変化を比較する。Gene Ontology解析を行なって、どのシグナル経路の活性化が生じているかの解析を行う。

滑膜細胞のOutgrowthの評価では、急性期に投与した群では、滑膜組織からDishへの細胞浸潤がほぼ完全に消失したのに対し、細胞浸潤期群においては、浸潤抑制効果は限定的であった。半月板切除後に観察される炎症反応は、急性期では滑膜組織から切除部位への線維芽細胞の浸潤の賦活化、その後は切除部位において再構築された間葉組織の軟骨分化誘導に必須の働きをしていると考えられる。半月板切除後に観察される炎症反応は、急性期では滑膜組織から切除部位への線維芽細胞の浸潤の賦活化、その後は切除部位において再構築された間葉組織の軟骨分化誘導に必須の働きをしていることを示唆するデータを得た。本実験結果は、当初の仮説を検証することにつながり、概ね順調に進捗していると考えている。炎症反応が、半月板の再生に重要な機能を果たしている可能性を示唆するデータを得た。そこで、次年度以降は、内在性のマクロファージを欠失したマウスを用いて同様の検証を試みる。これまでの私の解析から、半月板切除部位に隣接する滑膜におけるCellularityの増加が観察される以前に、同部位へのマクロファージの著明な浸潤が観察されたことから、滑膜における炎症の場の形成にマクロファージが深く関与していると考えている。そこで、Lysosome Mプロモーターの制御下DTR(Diphtheria Toxin Receptor)を発現するトランスジェニックマウス(lysM-Cre/DTR, Goren et al. Am J Pathol 175(1):132-47, 2009)を用いて、Diphteria Toxin投与により単球、マクロファージを欠損させたマウスに対して半月板欠損モデルを作成し、再生過程の検証を行う。今年度以降、切除部位に形成された肉芽組織の軟骨分化を制御する因子の同定を目的として、半月板切除後に半月板領域に形成される組織における遺伝子発現解析を行なっていく。4週目までに半月板欠損部位に形成された軟組織の軟骨分化が6週にかけて観察されるが、集積した線維芽細胞の軟骨分化がどの様な分子メカニズムで一義的に制御されているかは未知である。そこで、術後3週、4週、5週の時点で再生過程にある組織を採取し、RNA-seq法を用いて、網羅的に遺伝子発現のパターン変化を比較する。Gene Ontology解析を行なって、どのシグナル経路の活性化が生じているかの解析を行う。本年度は、次年度以降使用予定しているTGマウスの維持費用が、予定よりも少額となった。次年度以降TGマウスのコロニー構築と実験を行なっていくための費用として次年度繰越を行なった。