hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
T-TMにより分子修飾されたHMGB1の測定法の確立と生体内ダイナミズムの解析

我々はこれまで、壊死細胞核由来のHMGB1が受容体; RAGE,TLR-2,-4を介して炎症性サイトカインとして働くこと、細胞外HMGB1はトロンボモジュリン(TM)のN末端に活性を失い、さらにトロンビンによって分解されdes-HMGB1が生成されること、このdes-HMGB1は受容体レベルでHMGB1と競合して、非炎症性に働くことを明らかにしてきた。そこで今回は、des-HMGB1の特異的ELISAと、これを用いたHMGB1のダイナミズムについて研究した。結果、des-HMGB1はDICやショックの患者の血清中に増加していた。特に遺伝子組換えTM治療でその傾向が強かった。現在、このdes-HMGB1値と治療効果、重症度、予後などとの関連を研究中である。我々はこれまで、壊死細胞核由来のHMGB1が受容体; RAGE, TLR-2,-4を介して炎症性サイトカインとして働くこと、細胞外HMGB1はトロンボモジュリン(TM)のN末端に活性を失い、さらにトロンビンによって分解されdes-HMGB1が生成されること、このdes-HMGB1は受容体レベルでHMGB1と競合して、非炎症性に働くことを明らかにしてきた。【研究の背景】本研究は申請者らのこれまでの観察、すなわち、i)内皮細胞上のトロンボモデュリン(TM)がそのN末端で核由来のサイトカインHMGB1を吸着し(J Clin Ivest 2005 115 : 1267)、N末端からアミノ酸10残基を切断して不活化すること(Arterioscler Thromb Vas Blol.2008 ; 28 : 1825)、そしてiii)この分解HMGB1(des-HMGB1と命名)が受容体レベルintact HMGB1と競合して、その活性を負に制御すること、などの応用発展編である。具体的にはこのdes-HMGB1の測定系を確立して、そのダイナミズムを解析して、その臨床意義を明らかにすることである。【研究実績】我々がこれまでに作製した抗HMGB1抗体、ならびに市販の抗体は全てdes-HMGB1とも反応する。したがって申請者らが確立したHMGB1 ELISAはdes-HMGB1をも計りこんでしまう。そこで、des-HMGB1のN末端その10残基を合成して、これを抗原として免疫して特異的モノクロナル抗体を作製し、特異的ELISA系を確立した。2.確立des-HMGB1測定系の特異性現在確立しているdes-HMGB1は約10%のintactHMGB1を計りこんでいた。従ってdes-HMGB1値は、des-HMGB1の値の90%がdes-HMGB1ということになる。3.des-HMGB1ダイナミズムの解析本測定系をもちいたこれまでの解析では、リコンビナントTM投与のDIC(播種性血管内凝固症候群)でdes-HMGB1は高値を示してい。これらの例の臨床病態は現在症例を増やして解析中である。またリコンビナントTM治療とは関係なく、腹水や関節液中に高値であった。現在、des-HMGB1の血中半減期やダイナミズム、des-HMGB1値とリコンビサントTMの効果、予後などとの関連を検討中である。
既存インフラストラクチャへの導入障壁を取り除く暗号技術

本研究では,既存インフラストラクチャに暗号技術を導入ときに予想される障壁を緩和できるような高度な機能を備えた暗号技術を実現することを目的に,暗号化できる平文を制限できる公開鍵暗号方式や,利用者のプライバシを保ったまま認証を行う技術であるグループ署名について,研究を進めてきた.そのような様々な高度な機能を備えた暗号技術の安全性を議論するためには,安全性要件と呼ばれる,暗号技術の利用される環境を抽象化したモデルを定義し,そのモデルの下で各々の技術の安全性を議論することがこれまで行われてきた.本研究では,このアプローチの欠点として,以下の2点に着目し,それらの欠点の克服にむけて研究を進めた:(1)異なる機能を持つ暗号技術がごとに異なる安全性要件を定める必要があるために,暗号技術の設計が機能ごとに各個撃破的になりがちであること,(2)一旦安全性要件を定めると,その安全性要件では捉えられない攻撃に対して注意が向けられない傾向があること.本研究では,種々の暗号技術の,特に既存インフラストラクチャへの導入障壁を取り除くために有用な機能を備えた高度な暗号技術の,安全性要件相互の関連性を整理することにより,上記2つの欠点を克服することを目標に研究を進めた.このように関連性を整理することで,高度な機能を持つ複雑な暗号要素技術について,どの部分が他の要素技術と共通し,どの部分が当該の要素技術特有であるのかを整理できる.そのような知見は,具体的な暗号方式の設計において有用な指針を与えると期待できる.また更に,安全性要件の関連性の整理から,ある暗号技術においては考慮されているにもかかわらず,他の暗号技術では考慮されていないような,未知の安全性上の懸念が発見できることも期待できる.そのような懸念は,一方の暗号技術において意味のあるものとして定義されている以上,他の暗号技術においても実用上重要な意味を持つと予想される.本研究ではこのようなアプローチにより研究を進め,得られた成果はいずれも権威ある英文論文誌・国際会議に採録されている.(抄録なし)本研究で目指す暗号技術は,通常の暗号技術で達成される高い安全性に加えて,既存インフラストラクチャへの導入障壁を取り除くことのできる有用な付加機能を持つ暗号技術である.本年度は,そのための重要な要素技術となる,暗号化できる平文を制限できる公開鍵暗号方式の設計に目標を定め,同内容を含む論文を電子情報通信学会英文論文誌に投稿し,採択となった.本成果は,グループ署名と呼ばれる匿名認証技術の証明書失効機能(認証を実行できる人物から認証実行の権限を剥奪する機能)に着目し,証明書失効機能を実現する技法を公開鍵暗号に取り込むことで得られた成果である.この2つの要素技術間の関連性について厳密な証明を得るには至っていないが,次年度はこの関連性の厳密な証明に取り組む計画である.また,それに関連して,同じくグループ署名の署名者特定結果の正当性の証明(ある認証実行の履歴から,その認証を実行した人物を特定する機能)という機能に着目し,その知見を公開鍵暗号に取り込むことで,別種の機能付き公開鍵暗号が得られるという成果も得ている.通常の公開鍵暗号は,復号結果が正当な復号手続きによって得られたものであること確信するためには実際に復号してみる他なく,そのため,受信者以外は復号結果の正当性を確認することはできないものであった.ここで得られた機能付き公開鍵暗号は,復号鍵自体を漏洩させることなく,復号結果が正当であることを(復号鍵を持たない)第三者に確信させられる機能を持つものである.本成果については,2つの要素技術間の関連性について厳密な証明が得られており,ここで得られた知見を使って,上記の「証明書失効機能」と「暗号化できる平文を制限できる公開鍵暗号」の関連性の証明に取り組む計画である.本研究では,既存インフラストラクチャに暗号技術を導入ときに予想される障壁を緩和できるような高度な機能を備えた暗号技術を実現することを目的に,暗号化できる平文を制限できる公開鍵暗号方式や,利用者のプライバシを保ったまま認証を行う技術であるグループ署名について,研究を進めてきた.そのような様々な高度な機能を備えた暗号技術の安全性を議論するためには,安全性要件と呼ばれる,暗号技術の利用される環境を抽象化したモデルを定義し,そのモデルの下で各々の技術の安全性を議論することがこれまで行われてきた.本研究では,このアプローチの欠点として,以下の2点に着目し,それらの欠点の克服にむけて研究を進めた:(1)異なる機能を持つ暗号技術がごとに異なる安全性要件を定める必要があるために,暗号技術の設計が機能ごとに各個撃破的になりがちであること,(2)一旦安全性要件を定めると,その安全性要件では捉えられない攻撃に対して注意が向けられない傾向があること.本研究では,種々の暗号技術の,特に既存インフラストラクチャへの導入障壁を取り除くために有用な機能を備えた高度な暗号技術の,安全性要件相互の関連性を整理することにより,上記2つの欠点を克服することを目標に研究を進めた.

このように関連性を整理することで,高度な機能を持つ複雑な暗号要素技術について,どの部分が他の要素技術と共通し,どの部分が当該の要素技術特有であるのかを整理できる.そのような知見は,具体的な暗号方式の設計において有用な指針を与えると期待できる.また更に,安全性要件の関連性の整理から,ある暗号技術においては考慮されているにもかかわらず,他の暗号技術では考慮されていないような,未知の安全性上の懸念が発見できることも期待できる.そのような懸念は,一方の暗号技術において意味のあるものとして定義されている以上,他の暗号技術においても実用上重要な意味を持つと予想される.本研究ではこのようなアプローチにより研究を進め,得られた成果はいずれも権威ある英文論文誌・国際会議に採録されている.上記の通り、本研究課題の基盤となる要素技術である「暗号化された平文を制限できる公開鍵暗号」について一定の成果を得られており、実際に同成果は査読付き英文論文誌に採録ともなっていることから、順調に進展していると判断する。暗号化される平文を制限できる公開鍵暗号についてこれまでに得られている成果は、グループ署名方式の証明書失効機能を基にしているが、両者の厳密な関係、特に、基とするグループ署名方式がどのような条件を満たすときに暗号化される平文を制限できる公開鍵暗号が構成できるかについては明らかになっていなかった。次年度は、この点の解明に取り組み、本研究を完成させる計画である。これにより、今後新たな数学的構造に基づくグループ署名方式が出現した場合にも、そのグループ署名方式から暗号化できる平文を制限できる公開鍵暗号方式が構成できるかどうかが直ちに明らかになるため、本研究の成果の一層の活用が進むと期待される。(抄録なし)
蛍光標識アミノ酸の部位特異的導入によるタンパク質構造変化のFRET解析

本研究では、これまで開発してきた4塩基コドンなどを用いたタンパク質の部位特異的二重蛍光標識法をさらに発展させることで、タンパク質の立体構造やその変化をFRETにより解析する手法の確立を行なった。実際に、マルトース結合タンパク質などについて基質結合に伴う立体構造変化のFRETを用いた検出や、二重標識に有用なN末端特異的な非天然アミノ酸誘導体の導入法、高効率アンバーサプレッサーtRNAの開発などを達成した。モデルタンパク質としてマルトース結合タンパク質を使用し,まず4塩基コドンCGGGを15ケ所のチロシン部位に導入した遺伝子を作製した。これらの変異遺伝子のmRNAを,蛍光標識アミノ酸BODIPY FL-アミノフェニルアラニンを結合させ4塩基のアンチコドンを持つtRNAとともに,大腸菌由来無細胞翻訳系へ加え,蛍光標識タンパク質の合成を行なった。遺伝子のC末端に付加しておいたHisTagを利用して精製した後,マルトースの添加による蛍光スペクトル変化を測定したところ,Tyr210とTyr242に導入した場合には,マルトースの結合に伴って蛍光強度が大きく増加することが見い出された。これはマルトース非存在下ではBODIPYFLが近傍のトリプトファンにより消光されているが,マル1トースの結合による構造変化によってトリプトファンの位置が変化して,消光が起こらなくなったためだと考えられた。続いて,4塩基コドンを用いてTyr210部位にBODIPY558を導入しつつ,終止コドンUAGを用いてN末端部分にBODIPYFLを導入した二重蛍光標識タンパク質を合成した。その蛍光スペクトル変化を測定したところ,マルトースの結合を2つの蛍光強度比の変化をして計測できることが確認された。これは,BODIPYFLからBODIPY558への蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)が起きるとともに,Tyr210部位でのBODIPY558の蛍光消光の変化が起こり,その結果,蛍光強度比が大きく変化したと考えられた。また,蛍光標識されたリン酸化タンパク質を合成するために,終止コドンUAGを用いてリン酸化チロシン,4塩基コドンを用いて蛍光標識アミノ酸を導入することを試みた。しかしリン酸化チロシンの導入効率は低かったことから,tRNA配列の改良およびmRNAの周辺配列の改変によりその改善を試みたが,大きく改善するには至らなかった。モデルタンパク質としてマルトース結合タンパク質を使用して、マルトース結合部位近傍のTyr210あるいはTyr242に4塩基コドンによりBODIPY558標識アミノ酸を導入しつつ、N末端にアンバーコドンによりBODIPYFL標識アミノ酸を導入した場合に、FRETとトリプトファンによる蛍光消光により、マルトースの結合に伴うタンパク質の構造変化を計測できることを明らかにした。この際、トリプトファンを置換することで、蛍光消光に直接関与するトリプトファン残基を同定して、蛍光基とトリプトファンの相互作用がタンパク質構造の蛍光分析に有用であることを確認した。また、FRETのドナー・アクセプターの導入の影響を極力避けるために、小さなFRETアクセプターとしてNBD標識アミノ酸の使用を新たに検討した。マルトース結合タンパク質のN末端領域にローダミン誘導体の蛍光標識アミノ酸を導入しつつ、Tyr341にNBD標識アミノ酸を導入した場合、マルトースの結合に伴うタンパク質の構造変化によって、FRET効率が変化することを確認できた。今後は、種々の部位にNBD標識アミノ酸を導入することで、FRET効率を定量的に比較することを試みる。さらに、蛍光標識されたリン酸化タンパク質を合成するために、終止コドンUAGを用いて非天然アミノ酸を効率良く導入できるアンバーサプレッサーtRNAの開発を行なった。そのために、緑色蛍光タンパク質GFPにBODIPY558標識アミノ酸を導入する系を利用して、アンバーサプレッサーtRNAの翻訳活性をリアルタイム検出可能な手法を新たに開発した。今後、この手法を用いて様々なtRNAをスクリーニングすることで、リン酸化チロシンを効率良く導入することのできるtRNAの取得を試みる。本研究では、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)のドナーとアクセプターとなる非天然アミノ酸をタンパク質の特定部位へ導入することで、タンパク質の立体構造やその変化を解析する新規手法の確立を目指した。従来の方法では、やや大きな蛍光基をタンパク質内部の2ヶ所に導入する必要があったが、それによる立体障害の影響を極力避け、さらにアミノ酸主鎖と蛍光基との間にリンカーを含まないよう、NBD標識アミノ酸を設計した。また、同様にタンパク質に対する立体障害の影響を抑制するために、タンパク質のN末端に様々な蛍光基や標識分子を導入することのできる手法を開発した。これらを用いて、N末端に蛍光基を直接結合させた蛍光標識アミノ酸を、内部部位にNBD標識アミノ酸を導入したマルトース結合タンパク質をモデルタンパク質として合成した。蛍光スペクトル測定によるFRET変化から、マルトースの結合に伴うタンパク質の構造変化を計測することができた。さらに非天然アミノ酸の導入部位を変えることで、N末端と特定部位間の距離変化を推測することも可能になった。一方、シアル酸含有糖鎖に結合するタンパク質(レクチン)についても、基質の結合およびそれに伴う構造変化を、FRETを用いて計測することを試みた。

まず、基質結合部位のトリプトファン残基の近傍に蛍光標識アミノ酸を導入することで、糖基質の結合を蛍光消光の解消により検出することができた。続いて、それに加えてC末端部位にFRETのドナーとなる蛍光基を導入することで、糖基質の結合を蛍光消光とFRETの変化に伴う蛍光強度比によって計測することもできた。さらに、これらの実験を効率よく行なうために、終止コドンUAGを用いて非天然アミノ酸を効率良く導入できるアンバーサプレッサーtRNAの開発を行ない、従来と同程度の効率を保ちつつ、選択性の向上したtRNAを取得することができた。
磁性酸化鉄ナノ粒子の作製と新機能開発

鉄は地球上に豊富に存在する元素であるから安価であり、また、多くの生命体にとって必須元素である。工業的な用途も広い。例えば、室温で磁性を発揮する酸化物であるγ-Fe_2O_3やFe_3O_4、BaO・6Fe_2O_3などは、安価・安全・安定な磁気記録材料として永らく利用されてきている。酸化鉄は、また、触媒としての利用価値も高いが、これはFe^<2+>とFe^<3+>の間の酸化還元が容易に起こるためである。これらの機能は粒子サイズや形状により大きく変化するため、サイズ(サブミクロン程度)と形態(針状や板状など)の揃った微粒子を作製する技術は大いに進歩してきたが、さらに最近は、ナノメートルサイズへの展開が盛んである。本研究では、ナノメーターサイズの酸化鉄を作製して、(1)新規なリチウムイオン二次電池の正極材料の開発、および(2)(生体)高分子との複合化により遺伝子機能やタンパク質の解析に利用できる材料を開発することを目指すものである。本年度に主に水熱法などの方法により、機能性酸化鉄ナノ微粒子を作製し、合成条件についても詳しく検討した。合成した酸化鉄の微粒子はサイズと形態のそろった酸化鉄であり、面白い磁気性質を持つことが明らかにした。さらに合成温度や、反応時間や出発物質のpHなどを調整するにより酸化鉄微粒子のサイズや形状などを制御できる。最後に新規なリチウムイオン二次電池の正極材料の開発、および(生体)高分子との複合化により遺伝子機能やタンパク質の解析に利用できる材料を開発することを目指す。工業的な用途も広い。
ウイルスの遺伝子多様性を克服するオリゴアルギニン固定化高分子を用いた粘膜免疫誘導

インフルエンザウイルスの感染予防に対して、アジュバントを使用した経鼻ワクチンの研究が進められている。我々はこれまで、膜透過ペプチドのD-オクタアルギニンを非分解性高分子のポリ(N-ビニルアセタミド)に固定化したD-オクタアルギニン固定化ビニルポリマーを開発し、抗原としての不活化インフルエンザウイルスとマウス鼻腔内に共投与することにより、血中及び鼻粘膜上にそれぞれ免疫グロブリンG(IgG)及び分泌型免疫グロブリンA(分泌型IgA)が産生され、同マウスは投与抗原と同じウイルス株に対する感染防御能を獲得することを明らかにしてきた。さらに臨床応用の観点から、生体成分のヒアルロン酸にテトラグリシン-L-オクタアルギニンを固定化した生分解性アジュバントを創製し、同ヒアルロン酸誘導体はD-オクタアルギニン固定化ビニルポリマーと同等の免疫誘導効果を示し、安全性が優れることを明らかにしてきた。本研究の最大の関心事は、インフルエンザウイルス抗原とテトラグリシン-L-オクタアルギニン固定化ヒアルロン酸の経鼻投与により誘導された免疫が、投与株と異なる同じ亜型内のウイルス株に対する感染防御能を示すことを実証することである。抗原のみを経鼻投与されたマウスにおいては、血中にIgGが産生されたが鼻粘膜上に分泌型IgAは産生されず、ウイルス曝露後の感染に伴う重篤な体重減少がみられた。一方、抗原と同ヒアルロン酸誘導体の混合物を経鼻投与されたマウスにおいては、血中IgGとともに鼻粘膜上に分泌型IgAが多く産生され、ウイルス曝露後の体重減少はほとんどみられなかった。分泌型IgAが投与抗原と異なるウイルス株に交差反応したためと考えられた。以上の結果から、テトラグリシン-L-オクタアルギニン固定化ヒアルロン酸は、同一亜型内のインフルエンザウイルスの感染対策に有効な免疫を誘導する粘膜アジュバントであることが示された。研究代表者らは、膜透過ペプチドのオリゴアルギニンを側鎖に化学結合させた新規高分子を創製し、ウイルスや細菌の遺伝子多様性を克服する世界初の粘膜投与型ワクチンのアジュバントとしての同高分子の臨床応用を目指している。これまで、アルギニンのD体の8量体であるD-オクタアルギニンを生体非分解性のN-ビニルアセトアミドとアクリル酸の共重合体(PNVA-co-AA)に固定化した高分子を中心に研究を進め、インフルエンザウイルス抗原とともに同高分子をマウス鼻腔内に4回投与すると、血液中及び鼻粘膜上に抗原特異的なIgG及び分泌型IgAがそれぞれ誘導されること、同IgAは投与株以外のウイルス株に交差反応すること、免疫誘導されたマウスは投与株に感染しないこと、などを実証してきた。今年度はまず、本技術の臨床応用に際して障害となる2つの要素、すなわち、PNVA-co-AAが生体内で分解されないこと、4回投与は非現実的であること、の解決に取り組んだ。その結果、ブースティングのタイミングを最適化することにより、生体に含まれるヒアルロン酸を支持体とする生分解性のテトラグリシンL-オクタアルギニン固定化ヒアルロン酸とインフルエンザウイルス抗原の2回投与後に得られる抗体価は、D-オクタアルギニン固定化PNVA-co-AAと同抗原の毎週4回投与後に得られる抗体価と同レベルに達することを明らかにした。誘導された分泌型IgAは、ウイルス株の亜型を超えた交差反応性を示した。また、高分子支持体の変更により、細胞毒性が低下した。次に、D-オクタアルギニン固定化PNVA-co-AAによる免疫誘導機構の解明を試みた。その結果、同高分子は抗原の鼻粘膜滞留性を延長し、樹状細胞や粘膜上皮細胞による抗原の取り込みを促進することで免疫活性を増強することが示唆された。平成28年度の計画は、オリゴアルギニン固定化高分子による免疫誘導条件の最適化及び免疫誘導機構の解明である。前者については、同高分子の生体分解性材料への変更と投与回数の削減に成功し、免疫誘導条件を最適化するとともに、本技術の臨床応用に向けて大きく前進した。平成29年度に実施予定の感染実験では、当初、不活化インフルエンザウイルス株を抗原として用いる計画であったが、研究分担者の鹿児島大学難治ウイルス病態制御研究センターの馬場昌範教授と協議し、より早期の臨床応用を目指して、臨床で使用されているインフルエンザHAワクチンに変更する方向で調整することとなった。後者については、生体非分解性のD-オクタアルギニン固定化PNVA-co-AAによる免疫誘導機構に関する多くの知見を得た。今後、粘膜アジュバントを生分解性のテトラグリシンL-オクタアルギニン固定化ヒアルロン酸に変更して研究を進めることから、本ヒアルロン酸誘導体についても免疫誘導機構を同様に検証する予定である。助成初年度(平成28年度)、本技術の臨床応用への障害となる高分子プラットフォームの生体内非分解性と免疫誘導に必要な投与回数の多さ(毎週4回投与)の解決に取り組み、生体成分のヒアルロン酸を支持体とする生分解性のテトラグリシンL-オクタアルギニン固定化ヒアルロン酸(第2世代と定義)とインフルエンザウイルス抗原を4週間あけてマウス鼻腔内に2回投与することにより、目的とする抗体価が得られることを明らかにした。今年度は、感染実験(投与抗原と異なるウイルス株に対する感染実験)に用いる抗原の選定を行った。

臨床で用いられているインフルエンザウイルスHAワクチン(ウイルスエンベロープのヘマグルチニン(HA)タンパク質からなる抗原)を優先して検討したが、同ワクチンで誘導された抗体は投与抗原に対する反応性は非常に強いものの投与抗原と異なるウイルス株に対する交差反応性に乏しいことが判明した。理由は不明であるが、この結果を受けて、不活化したウイルス全粒子を投与抗原に用いることに決定した。別に、本ヒアルロン酸誘導体の免疫誘導機構を検討した。その結果、非分解型のD-オクタアルギニン固定化ビニルポリマー(第1世代)と異なり、マウスにおける抗原の鼻粘膜滞留作用や樹状細胞などへの抗原の取り込み促進作用は見られなかった。本ヒアルロン酸誘導体は生分解性であることから、これらの動物/細胞実験中に分解が進行している可能性が示唆された。また、本ヒアルロン酸誘導体とD-オクタアルギニン固定化ビニルポリマーとの安全性をマウス鼻粘膜への刺激性で評価した結果、前者の生分解性材料の優れた安全性が確認された。平成29年度の計画は、テトラグリシンL-オクタアルギニン固定化ヒアルロン酸をアジュバントとして用いた感染実験であり、感染実験の成功を通して、投与抗原と異なるウイルス株に対する感染予防効果を実証する予定であった。本技術のより早期の臨床応用を目指して、臨床で使用されているインフルエンザHAワクチンを投与抗原として用いることを優先したが、同ワクチンの乏しい交差反応性を予測できず、結果として投与抗原の選定に時間を要し、平成29年度中に感染実験を実施できなかった。一方、非分解型のD-オクタアルギニン固定化ビニルポリマーに用いた方法で本ヒアルロン酸誘導体の免疫誘導機構の検討を行い、現時点では未解明であるが、従来法では評価が難しく、高感度な評価法を用いて抗原や本ヒアルロン酸誘導体の動態を評価する必要性を確認するに至った。あわせて、平成30年度の計画に含まれる本ヒアルロン酸誘導体の安全性を先行評価し、D-オクタアルギニン固定化ビニルポリマーよりも安全性に優れることを実証した。なお、感染実験については、既に委託先との最終調整段階に入っており、平成30年度上期中に実施する予定である。インフルエンザウイルスの感染予防に対して、アジュバントを使用した経鼻ワクチンの研究が進められている。我々はこれまで、膜透過ペプチドのD-オクタアルギニンを非分解性高分子のポリ(N-ビニルアセタミド)に固定化したD-オクタアルギニン固定化ビニルポリマーを開発し、抗原としての不活化インフルエンザウイルスとマウス鼻腔内に共投与することにより、血中及び鼻粘膜上にそれぞれ免疫グロブリンG(IgG)及び分泌型免疫グロブリンA(分泌型IgA)が産生され、同マウスは投与抗原と同じウイルス株に対する感染防御能を獲得することを明らかにしてきた。さらに臨床応用の観点から、生体成分のヒアルロン酸にテトラグリシン-L-オクタアルギニンを固定化した生分解性アジュバントを創製し、同ヒアルロン酸誘導体はD-オクタアルギニン固定化ビニルポリマーと同等の免疫誘導効果を示し、安全性が優れることを明らかにしてきた。
同種移植組織の至適な処理・管理と地域的Tissue BANK(組織銀行)の確立

同種組織移植を臨床的に推進する目的で、同種組織(特に同種骨)の至適処理方法と安全な管理を検討し、その結果に基づいて院内Bone (Tissue) Bankのみならず地域的なBone (Tisue) Bankの確立を目標として研究を行った。1)同種組織を安全に管理・保管する方法を検討する目的で、BNラットから摘出した各組織を(1)2重の清潔ポリ袋に包装(採取日等を記載)、(2)3重の清掃ポリ袋に包装(採取日等を記載)(3)清潔な瓶(採取日等を記載)に入れて、ポリ袋にて包装、の3群において-80°C冷凍保存を行い、6ヶ月経過後に起炎菌の検出を行い、Lewisラットに同種移植した。いずれも起炎菌は証明されなったし、移植の生着はほぼ良好であったが、保管の観点からは(1)群がスペースと繁雑さの面では有利であり、(2)群は持ち運びの安全性では有利であることが判明した。2)地域的な組織銀行(Tissue Bank)の確立に向けて、先ずは院内の体制を確立した。同種組織の採取にあたり、微生物検査と血液検査を行い、安全性を確認し、2重以上のポリ袋に保管し、-80°C冷凍保存することとした。現在では患者の同意を得て、同意書に署名のうえ、同種移植の臨床的経験を積み重ねている。また、他の病院との連携をはかる目的で数回の協議を重ねており、現在は当院にて採取した同種組織を漸次他の病院にても活用し始めており、さらに将来的には他病院にて採取した組織を当院において仕様することとしており、それによって広い地域でのTissue Bankのシステムを確立する方針である。同種組織の誘導能を可及的に温存し、抗原性を減少する至適処理(冷凍、凍結乾燥、加温後冷凍保存)の方法を検索し、その処理組織を長期にわたり清潔状態を安全に保存・管理する方法を検討する。さらに簡便にして確実なtissue bank(組織銀行)を確立し、地域的なtissue bankシステムを創世する。1)骨を対象とし、同種骨の-80°C単純冷凍保存法(従来法)と段階的緩徐冷凍保存法と加温後冷凍保存法の3群において骨誘導能と抗原性の度合いを比較検討した。同系のラット(40匹)において各群10匹で、上記3種類の処理後、下腿骨に同所性に同系移植を行い、骨形成能をX線的および組織学的に継時的に観察し、抗原性はMixed Lymphocyte Cultureにて観察した。各処理法別に骨形成能と抗原性に優位な差は認めなかった。同様な方法で靱帯と神経についても同種移植実験をおこなっている。2)各種のポリ袋を用いて長期に組織(骨、靱帯、神経)を保存し、容器別に起炎菌の検出率を求めた。単純冷凍法の同種組織(骨、靱帯、神経)(BNラット20匹)を各種包装、容器にて長期(3カ月、6カ月、12カ月)保存し、起炎菌の検出率を求めた。ポリ袋の機械的刺激による破損がなければ、各種包装別に優位な差は認めなかった。3)地域的なBone Bankシステムの確立に努めた。現在の保険制度では、骨銀行に関する諸検査の費用は認められておらず、同種骨採取の際の微生物検査(一般細菌、真菌、嫌気性菌)やHIV-I,IIとATLの血液検査を行い、より安全なBone Bankシステムの確立に努めた。同種組織移植を臨床的に推進する目的で、同種組織(特に同種骨)の至適処理方法と安全な管理を検討し、その結果に基づいて院内Bone(Tissue)Bankのみならず地域的なBone(Tissue)Bankの確立を目標として研究を行った。

1)BNラットの骨、靱帯、神経組織を清潔下に摘出し、(1)-80°C冷凍保存、(2)段階的緩徐冷凍保存(プログラミング・フリーザ-による)、(3)加温後冷凍保存の3群を作製した。各種冷凍保存3ヶ月後にLewisラットに同種移植し、骨癒合状態をX線学的・組織学的にて検討した。各処理方法別には明らかな差異はみられなかった。2)同種組織を安全に管理・保管する方法を検討する目的で、BNラットから摘出した各組織を(1)2重の清潔ポリ袋に包装(採取日等を記載)、(2)3重の清潔ポリ袋に包装(採取日等を記載)、(3)清潔な瓶(採取日等を記載)に入れて、ポリ袋にて包装、3群において-80°C冷凍保存を行い、6ヶ月経過後に起炎菌の検出を行い、Lewisラットに同種移植した。いずれも起炎菌は証明されなったし、移植の生着はほぼ良好であったが、保管の観点からは(1)群がスペースと繁雑さの面では有利であり、(2)群は持ち運びの安全性では有利であることが判明した。3)地域的な組織銀行(Tissue Bank)の確立に向けて、先ずは院内の体制を確立した。同種組織の採取にあたり、微生物検査と血液検査を行い、安全性を確認し、2重以上のポリ袋に保管し、-80°C冷凍保存することとした。現在では患者の同意を得て、同意書に署名のうえ、同種移植の臨床的経験を積み重ねている。また、他の病院との連携をはかる目的で数回の協議を重ねており、現在は当院にて採取した同種組織を漱次他の病院にても活用し始めており、さらに将来的には他病院にて採取した組織を当院において使用することとしており、それによって広い地域でのTissue Bankのシステムを確立する方針である。
実験動物におけるMRSA感染の疫学調査及び分離された菌の病原性

近年、人医領域における術後感染等における日和見感染の起因菌として、MRSA(methicillin resistant Staphylococcus aureus)感染が問題になっている。私は、病院と動物実験施設が同一敷地内に併設されている事、しかも動物実験を行う研究者が病院内の入院患者と実験動物の両者と頻繁に接触している事実から、実験動物領域でもMRSA汚染が起きていないかを検討する事とした。そこで、病院と同一敷地内の動物実験施設について、各種実験動物、これらの動物にかかわるヒト、及び周辺環境を対象にしてMRSAの疫学調査を実施し、次に、分離されたMRSAの病原性について検討を加える事とした。まず初めに、動物実験施設内のヒト、環境及び実験動物から、すなわち、(1)ヒト:飼育を担当している飼育者の鼻腔のスワブ、(2)環境:一部の飼育室内の飼育器材や床面などを拭き採ったスワブ、(3)実験動物:施設内で飼育中のマウス、ラット、ウサギ、サル、イヌ、ブタ及びヤギの新鮮糞便と被毛のスワブを対象として、本菌の分離を行った。その結果、これらのいずれからもMRSAが全く分離されなかった。また、実験動物由来のSA(Staphylococcus aureus)について、オキサシリンを用いて試験管内で耐性菌の作出を試みたが、MRSAを得ることはできなかった。そこで、ヒトの病巣由来のMRSA株を用いて感染実験を行ったところ、本菌の動物間での伝搬が成立し、さらに陽性マウスから生まれた仔にも伝搬が認められた。また、これらのヒト病巣由来MRSA株陽性マウスを取り扱った手袋及び周辺環境にも汚染は拡大した。次に、試験管内でヒト由来のSA株について各種消毒薬の効果を検討した結果、アルコール類、第4級アンモニウム塩、フェノール代用物は著しい殺菌効果が認められた事から、これらの消毒薬はMRSAに対しても有効と思われた。実験動物領域でメチシリン耐性黄色ブドウ球菌(MRSA)による汚染が起きていないかを検討することを目的として、動物実験施設内の実験動物、環境及び飼育者から本菌の分離を試み、出現頻度の検討をおこなった。検索箇所は、(1)ヒト:飼育を担当している飼育者の鼻腔のスワブ、(2)環境:一部の飼育室内の飼育器材や床面などを拭き採ったスワブ、(3)動物:施設内で飼育中のマウス、ラット、ウサギ、サル、イヌ、ブタ及びヤギの新鮮糞便と被毛のスワブを対象とした。その結果、6/12例の飼育者、3/8例の実験台、4/18例の床面、14/25例のケージ、5/26例の飼育棚、90/131例のラット、25/292例のマウス、1/52例のウサギ、2/6例のサル、14/82例のイヌから黄色ブドウ球菌が分離された。つぎに、これらの黄色ブドウ球菌がMRSAであるか否かの確認をおこなうために、4%食塩加ミューラーヒントン寒天培地にoxiacillinを6μg/ml添加したMRSAスクリーン培地、seftizoximeを用いたディスク試験により検討したところ、すべてメチシリン感受性株であった。そこで、抗生物質を投与された経緯のあるマウスを対象にさらに検討をおこなった結果、2/18例からMRSAが分離された。以上の成績より、動物実験施設内で飼育されていた実験動物では、抗生物質の投与を受けた経緯のある動物からはMRSAが検出されるが、その他の一般の実験動物にはMRSA汚染が無いことがわかった。

近年、人医領域における術後感染等における日和見感染の起因菌として、MRSA(methicillin resistant Staphylococcus aureus)感染が問題になっている。私は、病院と動物実験施設が同一敷地内に併設されている事、しかも動物実験を行う研究者が病院内の入院患者と実験動物の両者と頻繁に接触している事実から、実験動物領域でもMRSA汚染が起きていないかを検討する事とした。前年度は各種実験動物、ヒト(飼育管理者)及び環境からMRSAを分離したが全例陰性であった。そこで本年度は、まず初めに実験動物由来SA(Staphylococcus aureus)についてオキサシリンを用いてMRSAの作出を試み、次にヒトの病巣由来のMRSA株を用いて、動物相互間、周辺環境、ヒトへの伝搬、さらに消毒薬の効果について検討した。その結果、実験動物(マウス、ラット)由来のSA株について、オキサシリンを用いてのMRSAの作出はできなかった。そこで、ヒトの病巣由来のMRSA株(MR170)を用いて以下の感染実験をビニールアイソレータ内で行った。まず、MR170汚染マウスとSA陰性マウスを同居させたところ本菌の動物間での伝搬が成立し、さらに陽性マウスから生まれた仔にも伝搬が認められた。また、これらの陽性マウスを取り扱った手袋及び周辺環境にも汚染は拡大した。これらから分離されたMRSA株の化学療法剤に対するMICはもともとのMR170株とほぼ同じで、感受性に変化は認められなかった。次に、試験管内でヒト由来のSA株について各種消毒薬の効果を検討した結果、アルコール類、第4級アンモニウム塩、フェノール代用物は著しい殺菌効果が認められた事から、これらの消毒薬はMRSAに対しても有効と思われた。これまでの成績により、現在のところ実験動物にはMRSA汚染が認められない事、実験動物由来のSA株からは試験管内でMRSAを作出できない事、実験的には動物相互間及び周辺環境にMRSA汚染が起きる事、ヒト由来SA株についてはアルコール等の消毒薬が有効である事が明らかとなった。
日本語母音長対立の知覚における学習者の手がかりの選択と母語の関係の実験研究

本研究の目的は、第二言語学習者による音韻対立の知覚の際の不適切な手がかりや第二の手がかりの使用と学習者の母語との関係を明らかにすることである。ピッチの高低や音節内ピッチ下降の役割が異なる言語を母語とする日本語学習者を対象として知覚実験を行い、日本語の母音長対立の知覚に、ピッチの高低(日本語学習者による不適切な手がかり)、音節内ピッチ下降の有無(日本語母語話者が使用する第二の手がかり)を利用するか否かについて、学習者の母語におけるこれらの音響情報の役割との関係を分析・考察している。平成30年度は、これまでに引き続き刺激音・実験プログラムを用いてフランスにおいて日本語学習者に対する知覚実験を実施しデータを収集した。研究協力者の協力を受けて実験参加者のリクルートを行い、フランス語を母語とする日本語初級学習者23名の参加を得た。学生1名につき約1時間の実験セッション(知覚実験3種類+言語学習暦や実験使用語の語彙知識に関するアンケート記入)をおこなった。収集した知覚実験データに対し、母音長対立の同定判断の正答率、知覚境界値へのピッチの高低およびピッチ下降の有無の影響を簡易的に分析したところ、ピッチ下降についてはフランス語におけるピッチ下降の役割から予測できるように母音長対立の知覚の手がかりとして使用していない傾向が顕著だが、ピッチの高低に関しては多くは予測通り使用していない傾向を呈するものの、予測に反して手がかりとして使用していると思われるデータもわずかだが見られた。この後者のデータが特定の言語学習歴等と関係があるのか、それとも個人差の問題であるかについての考察を含め、母語のピッチの高低・ピッチ下降の役割と第二言語での知覚の手がかりとしての使用について、より注意深い分析・考察が必要であることが示された。研究機関の異動による多忙化により、本研究に必要十分な時間を確保することが困難となった。また、2018年2-3月で実施計画を立てていたデータ収集が異動準備のために遂行できず、2019年に変更せざるを得なくなった(2019年2月にデータ収集終了)。このような背景から補助事業期間の延長申請をするに至った。遅れはあるものの当初予定していた通り4ヵ国でのデータ収集はすべて終了し、当初の計画よりも若干多い人数のデータを集めることができた。次年度が最終年度となるため、これまでに収集したデータに対する統計分析および考察を行い研究成果として発表できるようにとりまとめる。具体的には、母語が異なる日本語学習者を対象とする知覚実験を行い、日本語の母音長対立の知覚に、ピッチの高低(日本語学習者の不適切な手がかり)、音節内ピッチ下降の有無(日本語母語話者の第二の手がかり)を使用するか否かについて、学習者の母語におけるこれらの音響情報の役割との関係を分析・考察する。平成28年度は、これまで同種の研究に使用してきている刺激音・実験プログラムに問題がないことを確認した上で、中国およびタイの2カ国において日本語学習者に対する知覚実験を実施しデータを収集した。研究協力者の協力を得て、中国では27名、タイでは23名の日本語初級学習者の参加を得た。収集した知覚実験データに対し、母音長対立の同定判断の正答率、知覚境界値へのピッチの高低およびピッチ下降の有無の影響を簡易的に分析したところ、学習者の母語において語の弁別に役立つ音響情報を、第二言語である日本語の母音長対立の知覚においても用いている可能性が示された。具体的には、母音長対立の知覚に中国語母語話者、タイ語母語話者ともにピッチ下降の有無を利用したのに対し、タイ語母語話者だけがピッチの高低を利用した。これらの類似・相違は共に各言語でのピッチの高低・ピッチ下降の有無の役割との関連によって説明できる可能性が高い。一方で、タイ語話者によるピッチの高低の影響の方向性は予測と異なるもので、現段階では説明が難しい。今後タイ語におけるピッチの役割についてより詳細に調べる予定である。平成28年度中に3カ国での知覚実験実施・データ収集を予定していたが、調査日程の調整が難しく2カ国でのみの実施となった。しかし、その一方、研究協力者の協力もあり、当初想定したいたよりも多くの学習者のデータを2カ国で収集することができた。第二言語学習者のデータはある特定の個人の影響を大きく受ける場合があるが、より多くのデータを分析・考察に用いることでこのような問題をより抑えることが可能だと考えられる。母語が異なる日本語学習者を対象とする知覚実験を行い、日本語の母音長対立の知覚に、ピッチの高低(日本語学習者による不適切な手がかり)、音節内ピッチ下降の有無(日本語母語話者が使用する第二の手がかり)を利用するか否かについて、学習者の母語におけるこれらの音響情報の役割との関係を分析・考察している。平成29年度は、昨年度に引き続き刺激音・実験プログラムを用いて韓国(ソウル)において日本語学習者に対する知覚実験を実施しデータを収集した。研究協力者と学生助手の協力を受けながら韓国語(ソウル方言)を母語とする日本語初級学習者21名の参加を得た。学生1名につき約1時間の実験セッションを持った。

収集した知覚実験データに対し、母音長対立の同定判断の正答率、知覚境界値へのピッチの高低およびピッチ下降の有無の影響を簡易的に分析したところ、予測通りピッチの高低を利用する傾向が見られ、母語におけるピッチの高低役割との関連による説明をサポートできる可能性が示唆された。一方で、ピッチの高低の影響の方向性について今後より詳細な検討が必要であることも示された。また、昨年度および今年度の実験参加者に対して実験時に行っている言語学習背景等に関するアンケートて結果の集計も進めている。平成29年度は2カ国での知覚実験実施・データ収集を予定していたが、調査日程の確保と日程調整が難しく1カ国でのみの実施となった。本研究の目的は、第二言語学習者による音韻対立の知覚の際の不適切な手がかりや第二の手がかりの使用と学習者の母語との関係を明らかにすることである。ピッチの高低や音節内ピッチ下降の役割が異なる言語を母語とする日本語学習者を対象として知覚実験を行い、日本語の母音長対立の知覚に、ピッチの高低(日本語学習者による不適切な手がかり)、音節内ピッチ下降の有無(日本語母語話者が使用する第二の手がかり)を利用するか否かについて、学習者の母語におけるこれらの音響情報の役割との関係を分析・考察している。平成30年度は、これまでに引き続き刺激音・実験プログラムを用いてフランスにおいて日本語学習者に対する知覚実験を実施しデータを収集した。研究協力者の協力を受けて実験参加者のリクルートを行い、フランス語を母語とする日本語初級学習者23名の参加を得た。学生1名につき約1時間の実験セッション(知覚実験3種類+言語学習暦や実験使用語の語彙知識に関するアンケート記入)をおこなった。収集した知覚実験データに対し、母音長対立の同定判断の正答率、知覚境界値へのピッチの高低およびピッチ下降の有無の影響を簡易的に分析したところ、ピッチ下降についてはフランス語におけるピッチ下降の役割から予測できるように母音長対立の知覚の手がかりとして使用していない傾向が顕著だが、ピッチの高低に関しては多くは予測通り使用していない傾向を呈するものの、予測に反して手がかりとして使用していると思われるデータもわずかだが見られた。この後者のデータが特定の言語学習歴等と関係があるのか、それとも個人差の問題であるかについての考察を含め、母語のピッチの高低・ピッチ下降の役割と第二言語での知覚の手がかりとしての使用について、より注意深い分析・考察が必要であることが示された。研究機関の異動による多忙化により、本研究に必要十分な時間を確保することが困難となった。また、2018年2-3月で実施計画を立てていたデータ収集が異動準備のために遂行できず、2019年に変更せざるを得なくなった(2019年2月にデータ収集終了)。このような背景から補助事業期間の延長申請をするに至った。中国語、タイ語母語話者のデータに対する統計分析および考察、さらに、タイ語におけるピッチの役割に関する文献研究を進める。また、韓国、フランスにおいて、韓国語またはフランス語を母語とする日本語学習者に対する知覚実験を実施しデータを収集する予定である。一方で、世界情勢が不安定であることから、日本への留学生を対象とする日本国内でのデータ収集も検討している。データに対する統計分析および考察、さらに韓国語におけるピッチの役割に関する文献研究を進める。
保健事業の効果測定-費用負担のあり方と便益-

保健事業の実施主体に関する情報を収集し、および予防関連事業について比較分析を行った。特に、医療・保健を取り巻く環境、国保を含む自治体の財政等について、統計分析のみならず関係者と意見交換をすることで現状を把握し、課題を明らかにした。具体的には、自治体病院が広大な面積をカバーしつつ地域医療を担う道北地域の中で2次医療圏の枠組みを超えた広い圏域を対象に、議論を整理し、中核病院である名寄市立総合病院や中頓別町国保病院などでヒアリングを実施し、当事者らと議論を行った。これらの知見は論文「地域医療を考える-中頓別町にて-」他としてまとめ、学会他で報告した。保健事業の実施主体に関する(医療・保健を取り巻く環境、国保を含む自治体の財政等)情報を収集し、予防関連事業についての調査(A)、国民健康保険を含む各健康保険の前期高齢者年齢階級別医療費実績のデータセット構築(B)を主として行った。(A)予防関連保健事業の基本的実態の把握。1)現在実施されている予防関連保健事業を、制度別に調査した。2)過去に実施された予防関連保健事業を、過去に遡って調査した。3)予防関連保健事業への参加状況について、自身も参加し、参加者らにヒアリングした。(B)前期高齢者世代の年齢階級別医療費の把握。1)制度別の医療費の推移について、年齢階級別に整理した。2)制度別・地域別に医療費実績に差があるかどうかについて検証した。また、「地域医療における自治体病院のあり方」と題した2008年1月の議論を踏まえ、自治体病院が広大な面積をカバーしつつ地域医療を担う道北地域の中で、通常の医療が完結する単位とされる2次医療圏の枠組みを超えた広い圏域を対象に、各町村の首長、医師などに出席を呼びかけて2008年9月に「持続可能な地域医療のあり方を考える」第1回中頓別会議シンポジウムを実施した。事前に該当地域の医療機関・町村を訪問しヒアリングを実施し、本番では医療現場や行政現場の抱える課題を抽出するとともに、問題認識の共有、さらには、中核病院との連携、診療機関相互の連携の可能性など、課題解決に向けた具体的方策などについて、当事者らと率直に議論を行った。また、有識者らによる「保健事業について考える」講演会を3回実施するなど議論を行い、知見を蓄積した。保健事業地域医療自治体病院地域ニーズ道北地域地域中核病院国民健康保険財政前年度行った保健事業の実施主体に関する情報収集、および予防関連事業についての調査および分析の精緻化を図り、比較分析を行った。特に、医療・保健を取り巻く環境、国保を含む自治体の財政等について、統計分析をし、関係者と意見交換をすることにより研究の精度を高めた。具体的には、自治体病院が広大な面積をカバーしつつ地域医療を担う道北地域の中で2次医療圏の枠組みを超えた広い圏域を対象に、前年度に実施したシンポジウムでの議論を整理し、センター病院である名寄市立総合病院や中頓別町国病院などでヒアリングを実施し、当事者らと改めて議論を行った。(病院や行政の担当者との議論が、住民による「中頓別の地域医療を考えるフォーラム」開催につながり、ゲストの1人として住民らとの意見交換もできた。)これらの知見は論文「地域医療を考える-中頓別町にて-」他としてまとめ、生活経済学会他での報告を予定している。当研究の知見を広大な面積を有する中国の医療制度に当てはめた共同研究の成果は国際医療経済学会(北京、2009年7月)で報告した。重要テーマのうち1年目で取り組めなかった諸外国の予防関連保健事業の実施状況については、来日したタイや中国の研究者らと長時間にわたり情報交換した他、国際医療経済学会で情報収集し、各国の実務家および研究者と積極的に情報を交換した。効率性格差の是正と社会保障給付の衡平性確保のためには、将来的なた病気の発症を抑える(遅らせる)ための健康管理(予防や是正等)を提供するような保健事業を医療サービスとともに活用していく体制を地域が選択し構築することが、行財政面からも人々の健康面からも現実的で望ましい。継続的な調査の地盤を構築できたので、成果の公表につとめるとともに、健康保障の枠組みについて検討を続ける。
治療効果を指標とした新規抗生物質探索法の確立

カイコモデルでの探索によって見いだされたライソシンEのメカニズム解析を行った。また、ライソシンEの抗菌活性を促進する血清中の因子を精製し同定した。さらに、ライソシンEは種々の動物の血清、及びカイコの体液によっても抗菌活性が促進されることがわかった。さらに本研究では、臓器に感染した黄色ブドウ球菌の網羅的な遺伝子発現変動を解析する手法を確立し、発現上昇している遺伝子群を同定した。その中の機能未知遺伝子は病原性発揮に必要であることがわかった。以上の結果は、本研究の目的である治療効果を指標とした新規抗生物質探索法に関する原理を確立できたと考えられる。カイコ黄色ブドウ球菌感染モデルにおける治療効果を指標とした探索により同定された新規抗生物質カイコシンは、通常の培地下に比べ、血清存在下での抗菌活性が高く、マウスでの治療活性が高いというユニークな特長を有する。本研究では、その血清存在下で活性が上昇するメカニズムを明らかにするとともに、病原性細菌の宿主内での増殖に必要な因子を明らかにし、新たな感染症治療薬の標的を同定することを目的とする。本年度において、我々はカイコシンの標的を同定できた。また、本標的がカイコシンの膜破壊活性において決定的な要因であることを、人工リボソームを用いて明らかにした。さらに、血清中のカイコシンの抗菌活性を促進する因子の精製を実施し、低分子量のタンパク質が、カイコシンの活性促進活性と同じ挙動でカラムから溶出されることが分かった。現在、本タンパク質についてアミノ酸分析による同定を行っており、その活性化メカニズムについて解析を行う予定としている。また、新学術領域研究ゲノム支援のご支援を受け、病原性因子の宿主増殖に必要な因子の探索・同定を目的とした、宿主因子存在下での試験管内で培養した黄色ブドウ球菌、及び、マウスに感染させた黄色ブドウ球菌の網羅的な遺伝子発現解析を実施した。その結果、黄色ブドウ球菌の遺伝子発現は、培地条件と比較し、宿主因子存在下、及び宿主内ではエネルギー生産経路や毒素生産、鉄取り込み経路を中心に大きく変動していた。また、試験管内での黄色ブドウ球菌の培養において宿主因子の添加により、発現上昇する遺伝子の中から、マウスに対する病原性に必要な因子の同定に成功した。さらに、黄色ブドウ球菌以外の病原性細菌の病原性因子、及び宿主側の免疫応答についても解析を実施した。本研究の当該年度において、カイコシンEの抗菌活性促進因子を血清より精製し、同定することに成功した。さらに、血清によるカイコシンEの抗菌活性が促進されるのは、一部の菌であることがわかり、菌側の要因も絡んでいることを明らかにした。一方、カイコシンEの標的因子について、その生産遺伝子を破壊しカイコシンEに対する感受性を検討したところ、カイコシンEに高度耐性を示した。従って、遺伝学的にもカイコシンEの標的が同定できたと考えられる。さらに、カイコシンEと標的の結合をマイクロカロリメトリーで解析し、1:1で結合していることを見いだした。次に、本年度もゲノム支援による支援を受け、病原性因子の宿主増殖に必要な因子の探索・同定を目的とした、マウスに感染させた黄色ブドウ球菌の、次世代シークセンサーを用いた網羅的な遺伝子発現解析を実施した。当該年度においては、腎臓における生菌数が少ない、肝臓における黄色ブドウ球菌の網羅的遺伝子発現解析にも、成功した。また、病原性が高いCA-MRSAについても解析を行った。これらの解析により、臓器間、及び株間で、で共通して発現上昇する遺伝子を同定した。また、複数の発現上昇する遺伝子について破壊株を作成し、マウスにおける病原性が低下していることを見いだした。さらに、黄色ブドウ球菌に感染したマウス臓器側の遺伝子発現変動についても網羅的な解析を行った。前年度までに、マウスに感染させた黄色ブドウ球菌の臓器における遺伝子発現解析法を確立し、肝臓及び腎臓における遺伝子発現変動を解析した。本年度においては、感染1日目のマウスの黄色ブドウ球菌感染モデルから摘出した、心臓における黄色ブドウ球菌の網羅的遺伝子発現に成功した。そして、これらの臓器間で共通して有意に発現上昇する215遺伝子を同定した。それらの中には、これまで試験管内での血清添加条件での解析では見いだすことができなかった、発現上昇する遺伝子が認められた。また、感染宿主における黄色ブドウ球菌は、試験管内での解析とは異なる病原性遺伝子群の発現パターンを示しており、未知の制御機構の存在が示唆される。さらに複数の共通した機能未知遺伝子が有意に発現上昇していた。