hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
発光色制御が可能な高効率有機固体発光材料の探索

分子内水素結合部位を持つある種の有機色素化合物は、高分子マトリックスの極性で水素結合状態が変化し、分子内水素結合していない状態からの青色発光と分子内水素結合した状態からの黄緑色発光という二重発光を示すことを見いだした。そこで高分子マトリックスの極性の違いを利用してそれぞれの発光の比率を変えることにより、高分子薄膜中の有機色素の発光色を青色から橙色まで変化させることに成功し、新しい有機固体発光色の制御法となることを示した。分子内水素結合に依存した分子発光を示す2-(2'-ヒドロキシフェニル)イミダゾピリジン(HPIP)および置換HPIPを用い、媒体による分子内水素結合の状態変化で発光特性を制御するという新しい制御指針に基づき、種々の高分子フィルム媒体中でのHPIP誘導体の発光特性を解析した。その結果、以下に示すような知見を得た。1.HPIPに異なる置換基を導入した各種HPIP誘導体を合成し、いずれも固体状態においてのみ、可視領域に励起状態分子内水素移動(ESIPT)にともなう高効率ESIPT発光を示すことを明らかにした。さらに各誘導体の励起状態解析をおこない、ESIPT発光特性は置換基の電子特性から説明できることを明らかにした。2.すでに結晶多形に依存した異なる発光を示すことが明らかとなっている6-シアノHPIP(CN-HPIP)とHPIPを用い、極性の異なる高分子媒体中に混合(1 w%)して薄膜を作成したところ、極性の高い高分子媒体を用いた薄膜の固相発光は、固体で観測されるESIPT発光に加えて、分子内水素結合を形成していない種からの青色発光を示した。薄膜の発光色は青か橙まで高分子媒体の極性で大きく変化したが、これは分子内水素結合の状態が各種媒体中で異なるために、青色発光と緑から黄色のESIPT発光との比率が変わるためであることが判明した。3.また、媒体による分子内水素結合状態の変化がより大きいCN-HPIPでは、発光色変化がより顕著に表れること、およびHPIP誘導体/高分子の比率を変えることでも発光色変化が起きることを見いだした。以上の結果から、分子内水素結合の状態を媒体の極性で変化させて発光色を制御するという方法が有効であり、ESIPT発光を示すHPIP誘導体が発光制御可能な高効率有機固体発光材料となることを実証できた。基本骨格である2-(2'-ヒドロキシフェニル)イミダゾピリジン(HPIP)および置換HPIPを合成し、種々の高分子フィルムに混合した。それらのESIPT発光特性を詳細に検討し、固相でのESIPT励起状態に対する外場の効果を利用した発光色制御の実現に向けた基礎的な知見を得た。1.無置換HPIPと置換基の異なるHPIP誘導体を合成した。HPIP誘導体の励起状態解析をおこなったところ、発光に関わるESIPTおよびIPTのエネルギー準位が、置換基のドナー/アクセプター性パラメータであるHammett σに対して良い直線性を示したことから、ESIPT発光特性は置換基の電子特性から説明できることを明らかにした。2.無置換HPIPと、すでに結晶多形に依存した異なる発光を示すことが明らかとなっている6-シアノHPIPを選択し、極性の異なる高分子マトリクス(ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、ポリメタクリル酸メチル、ポリスチレン)中に混合(1 w%)し、キャスト法およびスピンコート法で薄膜を作成した。固体ESIPT発光を測定したところ、無置換HPIPは高分子の種類にほとんど依存しなかったのに対し、6-シアノHPIPは極性の増大にともない発光の長波長シフトが観測された。一方、加熱や外部電場に対してはいずれの薄膜についても明らかな発光変化は観察されなかったことから、マトリクスと外部場の相互作用の詳細な検討およびそれに基づく基材の選択/設計が必要であることが分かった。発光制御に向けて、外場の効果に関する基礎的な知見を収集することを目指した初年度の目的については、一部未達成ではあるものの、想定以上の成果を得られた部分もあり、おおむね達成することができた。1.置換HPIPの合成については、置換基の種類や導入位置を変えた各種置換体を合成し、初期の目的を達成した。2.高分子マトリックス場については、外場応答性を示すのに必要なHPIPの構造要因についても明らかにすることができ、初期の目的以上の成果が得られた、しかし、電場については、検討を行ったが現在のところ応答は確認できなかった。3.二重発光の発現については、その現象を確認し、白色発光の実現に向けた検討を現在進めている。発光色制御が可能な高効率有機固体発光材料の開発に向けて、以下の検討を継続して行う。1. 2-(2'-ヒドロキシフェニル)イミダゾピリジン(HPIP)および置換HPIPについて、高分子マトリックスの場による発光効率および発光色変化を整理し、高効率有機固体発光の制御法を確立する。2. HPIP以外の類縁体についても検討範囲を拡大し、ESIPT過程を外場で制御して、発光色や発光効率が制御可能な高効率有機固体発光材料の開発を目指す。3.現在効果が確認できていない外部電場の効果についても、引き続き検討を進める。
食道癌化学療法耐性における骨髄由来細胞の機能解明とそれを標的とした治療開発

食道癌化学療法後の切除サンプルを用いた免疫組織学的検討やマウスモデルの実験から、シスプラチンを用いた化学療法後に骨髄由来細胞(特にマクロファージ)が腫瘍間質に動員されることが確認された。また骨髄由来細胞の中のCD11b陽性細胞、c-kit陽性細胞、M2マクロファージの腫瘍間質における細胞数が化学療法の感受性と逆相関を示すことから、これらの骨髄由来細胞の腫瘍への動員が食道癌化学療法の耐性メカニズムに関係することが示唆された。(1)食道癌切除サンプルにおける骨髄由来細胞の評価当科にて外科切除を行った食道癌切除サンプル(手術単独例20症例、術前化学療法例20症例)を用いて骨髄由来細胞マーカーの発現を免疫組織学的に評価した。CD11b、c-kit、VEGFR1、CD34の抗体を用いて免疫染色を行ったところ、VFGFR1とCD34は腫瘍間質での登現がほとんど見られなかった。CD11bとc-kitは腫瘍間質において発現が認められ、手術単独症例に比べて術前化学療法症例で発現が増強する傾向がみられた。現在、手術単独100例、術前化療100例まで症例を増やして解析を行っている。(2)骨髄由来細胞と癌細胞の相互作用の解析骨髄由来細胞が癌間質に浸潤することで上皮-間葉転換(EMT)を惹起し化学療法耐性を獲得することを証明するため、上記(1)のサンプルを用いてE-cadherin、Vimentin、snailの免疫染色を行った。化学療法後の癌組織では手術単独に比べてE-cadherinが減弱するのに対して、vimentinとsnailの発現は増強しており、化学療法後に遺残する腫瘍ではEMTが起こっている可能性が示唆された。今後、上記(1)における骨髄由来細胞の浸潤との関係を解析する予定である。(3)化学療法前後の循環血液中の骨髄由来細胞の検出1.食道癌組織における骨髄由来細胞の解析当科で外科切除を施行された食道癌切除標本(術前化学療法93例、術前無治療例92例)を用いて、骨髄由来細胞の表面マーカー(CDllb, c-kit, VEGFR1,CD45)の発現を免疫染色にて評価した。術化学療法後遺残する腫瘍では術前無治療例に比べて、腫瘍間質におけるCDllbとc-kitの発現が有意に増加した。また術前化学療法症例ではCDllbとc-kitの発現は、化学療法の臨床効果、組織学的効果と逆相関を示した。VEGFR1とCD45の発現は化学療法の効果と相関しなかった。以上より、ヒト食道癌においてCDllbとc-kitをマーカーとする骨髄由来細胞が化学療法の耐性に関与する可能性が示唆された。2.骨髄由来細胞と癌細胞の相互作用の解析上記1のサンプルを用いてEMT(上皮間葉転換)マーカーであるE-cadherin、Vimentin、snail、β-catenin、ZEB1の発現を免疫組織学的に検討し、EMTマーカー発現と化学療法効果、骨髄由来細胞マーカー発現との関係を調べた。まず化学療法後遺残腫瘍では術前無治療例に比べて、E-cadherinが減弱し、snailとZEB1の発現が増強した。またE-cadherin発現の減弱とsnail発現の増強は化学療法非奏効例に有意に多くみられた。ZEB1と化学療法の効果に相関は見られなかった。さらに腫瘍間質にCDllbとc-kitを強発現する症例では、E-cadherin発現が減弱し、snail発現が増強していた。以上より、CDllbとc-kitをマーカーとする骨髄由来細胞が、化学療法後遺残腫瘍においてEMTを惹起する可能性が示唆された。骨髄由来細胞の一つの候補として腫瘍間質に浸潤するマクロファージに着目し、食道癌組織での免疫染色とマウスモデルを用いた検討を行った。1.食道癌組織におけるM1マクロファージとM2マクロファージの免疫染色食道癌切除標本(術前治療なし114例、術前化学療法施行108例)を用いて、CD68(M1+M2マクロファージ)、とCD163(M2マクロファージ)の免疫染色を施行した。術前治療なし症例と化学療法施行症を比較すると、腫瘍間質のM1マクロファージの発現には差がなかったが、腫瘍間質のM2マクロファージ発現は化学療法施行例で有意に増加していた。また腫瘍間質のM2マクロファージの高発現例では化学療法の臨床効果・組織学的効果がM2マクロファージ低発現例に比べていずれも低かった。一方、M1マクロファージの発現と化学療法効果との間に関連は見られなかった。術前化学療法施行例の予後は腫瘍間質M2マクロファージの高発現例で有意に予後不良であった。以上の結果より、食道癌化学療法において、腫瘍間質に浸潤するM2マクロファージが化学療法耐性に関与する可能性が示唆された。

2.マウスモデルでの化学療法施行例における腫瘍間質マクロファージの解析ヌードマウスに食道癌細胞株(TE3、TE8)を皮下移植したxenograftモデルを作成した後、マウスの腹腔内にシスプラチンを投与し、皮下腫瘍の間質に誘導されるマクロファージを免疫組織学的に検討した。CD11bとF4/80の抗体を用いて蛍光免疫染色を行ったところ、シスプラチン投与したマウスではコントロールマウス(生食投与)に比べて、皮下腫瘍周囲に浸潤するCD11b陽性細胞とF4/80陽性細胞が多かった。このことから、マウスモデルでシスプラチン投与により、腫瘍間質にマクロファージが動員されることが確認できた。
長鎖アルキル基をもつ希土類錯体の液晶ならびに分子性ガラスの光化学特性

金属錯体から成る分子性ガラスは,ガラス状態特有の透明性・均一性・加工性に加えて,反応特性や分子設計の観点からも優れており,機能性材料として期待できる。更に,分子構造と分子集合体の秩序・無秩序性との関連性を追及するという基礎科学的な立場からも意義深い。研究代表者はアシルアミノ酸の金属錯体が希土類やアルカリ土類の場合にはガラス状態を取りやすいこと,中心金属や単離法に依存して結晶化もしやすくなることを明らかにした。このような系は一方で液体状態では異方性を取りやすい,すなわち液晶になりやすい。この期間内では,特にランタノイド金属のうち,ランタン(III)を基本に据えて,発光性のユーロピウム(III)錯体について配位子の効果を調べた。配位子の幾つかは新たに合成した。アルキル鎖の長さの違いとガラス状態の取りやすさとは,アルキル鎖がC3-C7の中間領域が最もガラス化しやすく,それよりも短くなっても長くなっても結晶化する(異方性になりやすい)傾向にあることが分かった。また,極性基のアミノ酸について,アラニンをより嵩高いフェニルアラニンや水酸基のついたセリンにすると異方性が高まり異方性ガラスという興味深い状態をとることが分かった。これは,本プロジェクトのタイトルにふさわしく,液晶とガラス状態の中間的な状態である。また,同様にテルビウム(III)の分子性ガラスを創成し,溶液内での会合からガラス生成に至る過程を発光挙動ならびにNMR(常磁性緩和)から調べた。溶液内での等方的な会合が進んでガラス状態を生成することになる。この錯体が自己会合しやすいことから,更にマイクロエマルションや液晶中での界面活性剤との相互作用についても調べ,選択的相互作用に関する有意義な知見を得た。長鎖アルキル配位子として,系統的な研究に都合の良いアシルアミノ酸配位子が三つ配位したトリスアシルアミノ酸希土類(III)錯体を新たに合成し,その溶液内での会合挙動,溶液から固体を形成する際の液晶性あるいはガラス形成について詳細に調べた。まず,アシルアミノ酸のアシル基の長さがC6C12とわたって,固体状態でのアモルファス性のとりやすさを調べた。C6とC8とではあまり大きな違いが見られず,いずれも安定なガラス状態をとりやすかった。C12錯体が最も結晶化しやすかった。更に,安定なガラス状態を形成するオクタノイルアミノ酸錯体について,アミノ酸をこれまでのアラニンに替え,フェニルアラニン,セリンなどの極性基にして,固体状態におけるアモルファス性あるいは,異方性への影響について調べた。その結果,アラニンに比べてこれらのより複雑な構造の極性基を持つオクタノイルアミノ酸錯体はより異方性をとりやすく,しかも,一方で,ガラス転移点の存在も確認された。すなわち,状態として興味深い「液晶性ガラス」が形成されたものと考えられる。希土類金属としては,イットリウム,ランタン,そして発光性のユーロピウムを用いた。いずれの金属の錯体も安定なガラス状態を取りやすいが,有機溶媒中で水を添加して単離した固体については,ランタンの錯体が結晶化しやすい特徴があることも分かった。また,ユーロピウム錯体は発光特性を利用して,溶液内で会合体を形成し,そこからゲル,ガラス状態へと転移してゆく過程を発光強度ならびに発光寿命と関連づけて論じることができた。用いた測定手毅は,本研究費交付によりシステムを更新したDSC,本研究費により新たに購入した,熱天秤・示差熱分析装置のような熱測定を主体として,他に,X線散乱装置,異方性を検出する偏光顕微鏡,溶液内会合を調べるNMRなどである。すなわち,熱測定,構造化学の両面からアプローチしている。

長鎖アルキル配位子として,系統的な研究に都合の良いアシルアミノ酸を用い,その希土類(イットリウム,ランタン,ユーロピウム,テルビウム)錯体を新たに合成して,溶液内での会合挙動,その結果生じるガラス状態,結晶状態などの固体状態について,熱測定,X線散乱,NMRなどを用いて構造特性を調べた。とりわけ,発光性を示すユーロピウムならびにテルビウム錯体については,更に発光強度や発光寿命を測定し,それらの結果と構造特性とを関係づけて議論した。また,極性基部分の効果を見るために,基本的なアラニンの替わりにフェニルアラニンやセリンを用いた錯体を合成して,アラニン錯体との違いを見た。今年度得られた興味ある知見は次のようである。1)極性基をセリンにすると金属錯体となってもアラニンに比べて親水性が高まり,溶液内で錯体同士が会合しやすくなり,また会合の際に異方性を取る傾向になった。しかし,固体状態の熱分析ではガラス転移点が明確に現れ,この状態をユニークな「液晶性ガラス状態」と結論づけた。2)発光特性により溶液内の会合形成,脱溶媒和,ガラス状態形成の過程を明確に追跡することができた。3)X線小角散乱測定から,メタノール溶液内で二分子層の会合体がまず形成され,濃厚になるにしたがってむしろ一分子層の会合体が優勢になり,ガラス状態では,一分子層が主に形成されていることが分かった。これは,通常の会合過程とは異なった傾向である。4)固体NMR測定により,結晶状態に比べてガラス状態でのアルキル鎖のゴーシュランダム構造が示された。5)希土類金属のEXAFS測定の結果,濃厚溶液からガラス状固体にわたって金属の配位数は8と変化しなかった。これらの錯体の分子構造が明確に反映された相挙動の研究には,本科研費で購入した,TG-DTA装置ならびに制御システムを本科研費で更新したDSC装置が基本的な測定機器として重要な役割りを果たした。低分子量の金属錯体から成るガラス状態は,ガラス特有の透明性・均一性・加工性に加えて反応特性や分子設計の点からも優れており,機能性材料として期待できる。しかし低分子量金属錯体は一般に結晶化しやすく,その報告例はかなり限られている。研究代表者は数年前に,希土類のアシルアミノ酸錯体がガラス状態を取りやすいことを見出した。亜鉛・銅・ニッケルのような遷移金属や,極性基が単にカルボン酸の場合には結晶化しやすい。中心金属の希土類ならびに配位子のアシルアミノ酸の双方を系統的に変化させて効果を見るのに都合がよく,わずかな構造の違いが,分子集合体として無秩序なガラス状態形成とどのように関連するか,調べてきた。最終年にあたる本年度は発光性のユーロピウムならびにテルビウム錯体に絞って研究した。ユーロピウム錯体については,特にアルキル部分をこれまでのオクタノイル(C8)以外にアセチル(C2),ブタノイル(C4),ヘキサノイル(C6),デカノイル(C10),ドデカノイル(C12),テトラデカノイル(C14)の誘導体を合成し,炭素数が小さい場合と大きい場合には結晶化しやすく中間の場合にガラス化しやすいことを見出した。また極性基の効果について,フェニルアラニンやセリンの誘導体では,液晶性ガラスとよばれる異方性ガラス状態を取ることも見出した。
音楽演奏の生理学的効果解明と臨床応用－機能性腸・膀胱障害に対する音楽療法の試み－

背景・目的】近年音楽療法が注目されているが、その効果機序に関しては、不明な点が多い。そこで、音楽の生体影響を、生理学的に検討することにした。【対象・方法】音楽が趣味の大学生、音楽大学の学生を対象に、心電図と呼吸を記録しながら弦楽器を演奏させた。演奏中の呼吸数、心拍数、心電図RR間隔周波数解析で求めた交感神経機能(LF/HF)、副交感神経機能(HF)を比較検討した。【結果】音楽演奏は、脳幹呼吸中枢・循環中枢に影響して、自律神経機能を修飾することが疑われた。また音楽鑑賞は、自律神経機能はじめ生体に直接影響することはないが、気分を改善すると考えられた。音楽大学在学中、同大学院在学中の被験者16人を対象に、モーツァルトEine Kleine Nachatmusik4楽章と、Divertimento3楽章演奏中の呼吸数、心拍数、心電図RR間隔周波数解析から求めた交感神経機能LF/HF、副交感神経機能HFを測定した。演奏中の呼吸数は、演奏者全員で30/分程度で、演奏の間の休憩時間には被験者固有の呼吸数に復した。同様の現象は、心拍数、副交感神経機能HFにおいても確認された。交感神経機能LF/HFにおいては確認できなかった。これより、演奏者は、演奏中に呼吸数でリズムを合わせて合奏していることが示唆された。随意的に調節された呼吸数が、脳幹呼吸中枢から循環中枢に呼吸数の情報を伝えることで心拍数が、半随意的に調節されていることが示唆された。また、循環中枢から心臓ペースメーカに至る情報の経路は副交感神経神経であることが予想された。曲の速さ、拍子などのカテゴリー差はこの現象に影響しなかった。以上より他者と息の合った演奏をすることで、その呼吸リズムを基礎としたリズムを副交感神経に支配されている臓器に伝えることが可能であることが分かった。つまり、楽器演奏のように他者と呼吸リズムを合わせる行為を行うことで、自律的に調節されている内臓に、何らかの随意的調節を加えることが可能になると考える。この現象は、自律神経機能不全がもたらす神経因性膀胱、過敏性大腸症候群、気管支喘息、胃十二指腸潰瘍などの内臓障害の治療に応用可能と考える。本研究は、携帯ゲームの音楽演奏ゲームプレー中の学生において、心拍数が同期する現象が確認されたため、音楽演奏には、自律神経機能を修飾する効果が有ると考え行った者である。初めに音楽大学大学院生、音楽大学生を対象に、弦楽器合奏中の自律神経機能を測定した。大学院生において、弦楽器合奏中に、合奏者同士で呼吸数・心拍数の同期を認めた。大学生においては、明確な動機を認める群と認めない群が存在した。呼吸は、随意的に調節できる機能であることから、楽器演奏中に呼吸数を随意的に調節する事から間接的に心拍数が調節されると考えた。この現象は、楽器演奏の熟練者において著明に表れることが示唆された。さらに、本年度は、さまざまなリズムを一般人に聞かせることで、リズムによって同期が起きやすい場合と、起きにくい事が有ることを確認した。つまり、音楽を演奏あるいは鑑賞することで、自律神経機能を修飾することは可能であるが、その効果は音楽演奏に十分に熟練するか、鑑賞している音楽が日常的に聞きなれた物である場合、十分に表れることが示唆された。今回の研究結果より、自律神経機能障害を背景とするさまざまな疾患において、音楽演奏、音楽鑑賞を補助的に治療に応用することが可能ではないかと考えた。これまでも、音楽鑑賞が、パーキンソン病患者の歩行を改善する等の報告があり、申請者は今回の結果をさらに発展させ臨床応用に向けて研究したいと考えている。ストレス科学研究の目的を十分に理解し、専門的な知識によるアドバイスも提供してくれる被験者と出会うことができ、予想以上の明確な結果を得ることができた。使用した機材も、研究の目的に十分な情報を与えてくれるもので、被験者に与える負荷も最小限で、良い結果につながったと考えている。平成26年度は、研究の最終年度である。以下の2項目を研究の目標としてあげる。(1)平成25年度に行った研究と同様の研究を、被験者数をさらに増やし、課題負荷時間も長くして再度行い、研究結果の裏付けを行いたい。また、研究結果の雑誌投稿のための論文作成も行う予定である。(2)臨床応用の開始。研究申請時のテーマである神経因性膀胱、過敏性大腸症候群に対する音楽演奏の効果を検討したい。平成25年度の研究結果より、楽器自体の演奏より呼吸を合わせることに意義がある印象もあり、楽器演奏のほかに他の手段で呼吸数を合わせる方法なども検討したい。

当初予定していた被験者に対する負担軽減費が、被験者人数の現象で、減額されたため。平成26年度、消耗品購入に使用する予定である。
核酸アプタマー選抜系への粒子支援型キャピラリー電気泳動の導入と検証

申請者は現在までに可溶性タンパク質であるトロンビンを標的とし、MACEを分離・洗浄工程として導入した核酸アプタマー選抜(MACE-SELEX)に成功している。本研究課題では、MACE-SELEXを用いて低分子量化合物、中分子量化合物(短鎖ペプチド)、非可溶性膜タンパク質(プロテオリポソーム)を標的分子としてMACE-SELEXを実行し、各標的分子に対する核酸アプタマーを獲得することを目的としている。本年度は、本研究目的を遂行する過程で、以下の5つの研究成果が得られた。【1】獲得した核酸アプタマーの高次構造解析(パラレル型Gカルテット構造の同定)を、従来法の放射性同位体標識を用いる手法を用いずに、分光学的手法のみで測定できる手法を考案した(Analyst, 143, 4022, 2018)。【2】標的分子と結合すると大きな蛍光強度変化を示す蛍光修飾DNAアプタマーのスクリーニング法を確立した(Anal.Sci.,35,113, 2019)。【3】蛍光性小分子に結合するRNAアプタマーの構造最適化に成功した。塩基変異を導入した三又構造が、RNAセンシングに有益な高次構造であることを明らかとした(RNA, 25, 590, 2019)。【4】MACE-SELEXで獲得したDNAアプタマーを用いる血液凝固制御/中和アプタマーシステムを構築した。獲得したアプタマーとtoeholdを導入した中和剤配列を併用し、血液凝固抑制を迅速に解除・制御するアプタマーシステムを構築した(Mol. Ther. Nucleic Acids, 16, 348, 2019)。各標的分子実験系においてMACE separationが達成されるためには、標的分子のマイクロ粒子表面への適切な固定化法の選択、さらに使用するマイクロ粒子表面の化学的特性の理解が肝要となる。非結合性の核酸を極限まで排除し、核酸アプタマー/粒子複合体を初回ラウンドから高感度に検出・分取するためには、(1)利用する粒子と分子固定化法の組み合わせの最適化、(2)適切な表面化学修飾による粒子の分散安定化、(3)標的分子の固定化密度の最適化、(4) MACEで最大の分離効率を達成できる電気泳動条件の最適化、などを調査・検討する必要がある。今年度は、トロンビン、TNFa、低分子化合物などに対するMACE-SELEX、さらに非天然型ライブラリーへの検討を行い、様々な有益な知見が得られた。その成果として、5報の論文を報告することができたため。粒子として、表面に官能基やタンパク質が修飾された市販のマイクロ粒子に加え、リポソーム上に膜タンパク質を発現させたプロテオリポソームを利用する。この場合、創薬分野で非常に大きな注目を集めているGタンパク質共役型受容体に標的を設定し、獲得した細胞膜タンパク質に対する各種アプタマーを用いて内皮細胞の血管網形成阻害効果や幹細胞の分化制御など、細胞の生死や形質変化を制御・誘導する核酸アプタマーの獲得を併せて目指す。蛍光性分子、におい分子、麻薬分子などの低分子化合物に対する核酸アプタマーの獲得、また、RNAライブラリーのMACE-SELEXへの適用、獲得したアプタマーのヌクレアーゼ耐性の付与、血中滞留性の付与のための各種アプローチを検討する。非結合性の核酸を極限まで排除し、核酸アプタマー/粒子複合体を初回ラウンドから高感度に検出・分取するためには、(1)利用する粒子と分子固定化法の組み合わせの最適化、(2)適切な表面化学修飾による粒子の分散安定化、

(3)標的分子の固定化密度の最適化、(4) MACEで最大の分離効率を達成できる電気泳動条件の最適化、などを調査・検討する必要がある。今年度は、トロンビン、TNFa、低分子化合物などに対するMACE-SELEX、さらに非天然型ライブラリーへの検討を行い、様々な有益な知見が得られた。その成果として、5報の論文を報告することができたため。粒子として、表面に官能基やタンパク質が修飾された市販のマイクロ粒子に加え、リポソーム上に膜タンパク質を発現させたプロテオリポソームを利用する。この場合、創薬分野で非常に大きな注目を集めているGタンパク質共役型受容体に標的を設定し、獲得した細胞膜タンパク質に対する各種アプタマーを用いて内皮細胞の血管網形成阻害効果や幹細胞の分化制御など、細胞の生死や形質変化を制御・誘導する核酸アプタマーの獲得を併せて目指す。蛍光性分子、におい分子、麻薬分子などの低分子化合物に対する核酸アプタマーの獲得、また、RNAライブラリーのMACE-SELEXへの適用、獲得したアプタマーのヌクレアーゼ耐性の付与、血中滞留性の付与のための各種アプローチを検討する。
造血器腫瘍細胞の細胞周期停止とアポトーシス制御のシグナル伝達機構の解明

サイトカイン受容体およびインテグリンからのシグナルや癌遺伝子の発現によって、化学療法剤による造血器腫瘍細胞の細胞周期停止とアポトーシス誘導機構がどのような制御を受けるかを検討し以下の成果を得た。まず、Burkittリンパ腫細胞株Daudiにおける検討で、topoisomerase II阻害剤etoposideは、細胞周期のG2/M期での停止を誘導すると供に、Daudi細胞に活性酸素種(ROS)の増加をもたらすことにより、ミトコンドリア膜電位の低下からcaspase経路の活性化を経てアポトーシスを誘導することが判明した。Daudi細胞に悪性リンパ腫発症に関与するBCL6を誘導的に発現させると、etoposideによるROSの産生増加は抑制され、アポトーシスも抑制されたが、細胞周期の停止には影響を認めなかった(Kurosu et al.,Oncogene,2003)。一方、Daudi細胞をetoposideで処理するとROS産生増加を介してMAPキナーゼp38が活性化されたが、優性抑制型のp38変異体を誘導的に発現させた細胞では、etoposideによるCdc2のTyr-15のリン酸化によるキナーゼ活性の阻害およびG2/M期での細胞周期停止は抑制され、アポトーシスは亢進した(Kurosu et al.,投稿準備中)。以上より、etoposideによるROSの産生増加は、アポトーシスを誘導すると供に、p38活性化を介してCdc2の活性を阻害しG2/M期での細胞周期停止をもたらす機構を活性化することによりアポトーシスの抑制にも寄与するものと考えられる。また、p38の活性化には低分子量G蛋白であるRacの活性化が関与するが、造血サイトカイン受容体やインテグリンからのシグナルと供に、etoposide等の化学療法剤によってもRac活性化を生じることを見いだした(Kanda et al.,BBRC,2003;Yamaguchi et al.,投稿準備中)。また、サイトカインや白血病発症に関わるBCR/ABLがChk1の発現とetoposideによる活性化を供に促進し、Cdc2活性の抑制とG2/M期での細胞周期の停止を誘導することを見いだし、その意義を検討している。化学療法剤処理にて造血器腫瘍細胞に細胞周期の停止やアポトーシスを誘導するシグナル伝達機構を解明し、さらに、造血器腫瘍細胞の増殖を調節するサイトカインや癌遺伝子産物および細胞接着等による種々のシグナル伝達機構との関連を明らかにする目的で研究を行った。悪性リンパ腫細胞株DaudiにTetracycline依存性にp38の優勢抑制型変異体を誘導的に発現する系を構築し検討を行ったところ、Etoposide等の化学療法剤はG2期での細胞周期の停止をもたらし、この細胞周期停止は優勢抑制型p38により抑制されると供に、アポトーシスは更新することが見出された。また、Etoposide等の化学療法剤は低分子量G蛋白Rac依存性にp38の活性化をもたらすことも観察されたので、これらの結果より化学療法剤によるp38の活性化は、細胞周期のG2期における停止をもたらしアポトーシス誘導に抑制的に機能すると考えられる。また、Etoposide等の化学療法剤はチロシンキナーゼLynやAblを活性化したが、サイクリン依存性キナーゼCdc2は細胞内でLynと結合し、活性化されたLynによりTyr15がリン酸化を受けることにより活性が抑制されることが示された。このシグナル伝達機構により、造血器腫瘍細胞のG2期での細胞周期停止が誘導されるものと考えられるが、やはりLynによりチロシンリン酸化を受ける細胞内アダプター蛋白CrkLは、この機構に抑制的に機能した。IL-3やエリスロポエチン等の造血サイトカインおよび慢性骨髄性白血病をもたらすBCR/ABLキナーゼは、化学療法剤によるChk1活性化とCdc2のチロシンリン酸化を亢進させることにより、細胞周期停止に促進的に機能しアポトーシスを抑制したが、β1インテグリンを介した細胞接着はこれらと逆の影響をもたらした。

以上より、etoposideによるROSの産生増加は、アポトーシスを誘導すると供に、p38活性化を介してCdc2の活性を阻害しG2/M期での細胞周期停止をもたらす機構を活性化することによりアポトーシスの抑制にも寄与するものと考えられる。また、p38の活性化には低分子量G蛋白であるRacの活性化が関与するが、造血サイトカイン受容体やインテグリンからのシグナルと供に、etoposide等の化学療法剤によってもRac活性化を生じることを見いだした(Kanda et al.,BBRC,2003;Yamaguchi et al.,投稿準備中)。また、サイトカインや白血病発症に関わるBCR/ABLがChk1の発現とetoposideによる活性化を供に促進し、Cdc2活性の抑制とG2/M期での細胞周期の停止を誘導することを見いだし、その意義を検討している。
動物細胞のG2期細胞周期制御の分子機構

分裂酵母を宿主とした異種生物間遺伝子相補クローニング法を用いて、動物細胞G2期制御機構の解析を進めている。今年度は、以下に述べる成果を得た。1、G2期進行の制御に欠損のある分裂酵母のweel・mikl二重変異株を相補する遺伝子としてヒト線維芽細胞cDNAライブラリーよりWosl(W1-1)と名付けた遺伝子を単離した。この遺伝子は、スプライシングの違いにより2種(WoslA、WoslB)存在する。いずれも、酵母のG2変異株を相補できる。Woslの発現は、静止期のG0期と細胞周期のS-G2期で起こる。WoslA、B共に蛋白リン酸化酵素をコードしており、WoslBは、これまで知られているHRIと同一で、eIF2-αのリン酸化能を有するが、WoslAにはこのような活性はない。2、同様のスクリーニングでWoslAと構造的のも機能的にも類似している分裂酵母のホモローグ遺伝子の単離に成功した。この遺伝子の破壊株は、通常の増殖は野生株と変わりないが、熱ショッツで増殖停止がおきないことが判明した。ホモローグ遺伝子の発現が熱ショッツによって一過性に誘導されることから、この遺伝子は、熱ショッツによる細胞周期停止に重要な役割を果たしている因子であると考えられる。WoslAの機能を解明するうえで極めて重要な手掛かりが得られるものと期待される。
質量分析計を用いたヒトRNAにおけるシュードウリジン化修飾同定法の開発

RNAが機能性を獲得するためには、DNAから転写された後にさまざまな修飾を受ける必要がある。転写後修飾のひとつとして、ウリジン残基の異性化によるシュードウリジン化が挙げられる。修飾の多くを占めるシュードウリジン化は、核小体低分子RNA(snoRNA)-タンパク質複合体により行われる。修飾部位の決定には、修飾の標的となるウリジンの近傍と相補的な配列を有するsnoRNAがガイドRNAとして関与することが明らかにされている。これまで100種類にも及ぶsnoRNAが同定された。一方で、snoRNAの配列情報だけではシュードウリジン化サイトの推定に留まり、確定することができない。本研究ではsnoRNAの導きにより、一体どのウリジンがシュードウリジン化修飾を受けるのかを明確にする方法の開発を目指す。ヒトRNAにおけるシュードウリジン化修飾を簡便に、かつ網羅的に同定する方法の開発を目指し、本年度はヒト培養細胞より抽出したRNAをRNaseで断片化し、質量分析計を用いてRNA断片の質量電荷数比(m/z)を検出し、データベースサーチAriadneを用いてシュードウリジン化サイトの同定を試みた。実際に、ヒトリンパ芽球TK6細胞のウリジン一リン酸(UMPS)新合成経路を阻害したΔUMPS株の培養液に5,6-d2ラベルウリジンを添加し、ウリジンに比べて重水素2個分(2Da)だけ質量が増加したtotal RNAを抽出し、そこからさらに核内RNA(snRNA)を精製した。精製したsnRNAをRNase T1またはRNase Aで断片化し、質量分析計によりシュードウリジン化修飾の有無で変化するRNA断片のm/zを検出した。得られた結果は既報のシュードウリジン化サイトを同定するものであり、本方法がシュードウリジン化サイトを同定できる方法であることが明らかになった。ヒトリンパ芽球TK6細胞ΔUMPS株を用いて、既報の核内RNA U1、U2、U4、U5、U6 snRNAについて既知の全てのシュードウリジン化サイトを同定した。それぞれのsnRNAをRNase T1またはRNase Aで消化し、質量分析を行った。RNase T1はグアノシンの3'側を特異的に切断し、RNase Aはピリミジンの3'側を特異的に切断する酵素である。これらの消化酵素を用いてRNAを消化することにより、修飾有無を分析する対象RNAの全塩基を100%カバーした解析を実現した。これまで本方法を用いて、U2 snRNAにおける新規シュードウリジン化サイトを明らかにした。実際にU2に未知修飾があることを確認するために、U2 snRNA発現ベクターを構築し、13Cラベルを用いたSILNAS法による検証を行う予定である。また、シュードMS3法でシュードウリジンを含む可能性があるがその場所が不明瞭なU3 snoRNAについて解析を進める予定である。5,6-d2ラベルウリジンを取込ませたΔUMPS株から抽出したtotal RNAよりU3 snoRNAを精製し、RNase消化の後に質量分析を行う。U3 snoRNAに新規シュードウリジン化サイトが同定された場合には、U3発現ベクターを作製し、SILNAS法を用いて修飾サイトを同定することで、本研究で見出した新規シュードウリジン化サイトが擬陽性でないことを検証する。

RNase T1はグアノシンの3'側を特異的に切断し、RNase Aはピリミジンの3'側を特異的に切断する酵素である。これらの消化酵素を用いてRNAを消化することにより、修飾有無を分析する対象RNAの全塩基を100%カバーした解析を実現した。これまで本方法を用いて、U2 snRNAにおける新規シュードウリジン化サイトを明らかにした。実際にU2に未知修飾があることを確認するために、U2 snRNA発現ベクターを構築し、13Cラベルを用いたSILNAS法による検証を行う予定である。また、シュードMS3法でシュードウリジンを含む可能性があるがその場所が不明瞭なU3 snoRNAについて解析を進める予定である。5,6-d2ラベルウリジンを取込ませたΔUMPS株から抽出したtotal RNAよりU3 snoRNAを精製し、RNase消化の後に質量分析を行う。U3 snoRNAに新規シュードウリジン化サイトが同定された場合には、U3発現ベクターを作製し、SILNAS法を用いて修飾サイトを同定することで、本研究で見出した新規シュードウリジン化サイトが擬陽性でないことを検証する。2018年前期は、すでに研究室に購入されていた細胞培養用培地や試薬等を用いて実験が可能であった。また2018年11月の出産に伴い、2018年10月中旬から産前・産後および育児休業を取得しているため、次年度使用額が生じた。次年度は計画通り、細胞培養用培地・分析用試薬・消耗品等の購入、論文の投稿を行う予定である。
抗うつ薬・気分安定薬およびBDNFによる脳内ミクログリア活性化の制御機序解明

うつ病を含む気分障害発症の背景に、海馬での神経新生の障害が指摘されており、抗うつ薬と気分安定薬の治療効果には、脳由来神経栄養因子(BDNF)産生放出の増加と神経新生の促進が関与する可能性が示唆されている。一方、脳内マクロファージ(ミクログリア)活性化はBDNFのほか、炎症性サイトカインやフリーラジカル等の神経細胞障害因子を放出し、神経新生に大きく影響する。本研究は抗うつ薬・気分安定薬およびBDNFによるミクログリア活性化の制御メカニズムを解明することにより、気分障害の病態把握と治療薬開発に資することを目的とした。ミクログリアにおけるBDNFの細胞内Ca2+動態への作用については過去に報告がなかったが、申請者らはミクログリアにおいてBDNF投与数秒以内に[Ca2+]iが持続的に上昇する現象を見出し、BDNFによる[Ca^<2+>]i持続的上昇にtransient receptor potential channel (TRPチャネル)を介したCa^<2+>流入が関与する可能性およびBDNFによるミクログリア活性化抑制効果を報告した(Mizoguchiら,J Immunol.2009)。本研究は抗うつ薬・気分安定薬およびBDNFによるミクログリア活性化の制御メカニズムを解明することにより、気分障害の病態把握と治療薬開発に資することを目的とする。これまで報告のなかったBDNFのミクログリアへの直接作用について、Fura-2AMによる細胞内カルシウムイオンイメージングを用い検討した。BDNFはミクログリアにおいて細胞内カルシウムイオン濃度を持続的に上昇させた。BDNFのミクログリアにおける細胞内カルシウムイオン濃度上昇にはTruncated-typeのTrkB受容体活性化、PLC系のリン酸化、さらにTRPチャネルの活性化が関与することを見出した。また免疫染色とRT-PCRによりミクログリアにおいてTruncated-typeのTrkB受容体が発現していることも確認した。Griess法によりNO放出測定を実施した結果、BDNFはミクログリア活性化を抑制し、抗炎症作用をもつ可能性が示唆された。さらに今回、抗うつ薬を前投与したミクログリアにおいて、BDNFによる細胞内カルシウムイオン濃度上昇が増強されることも見出した。抗うつ薬にはミクログリア活性化抑制作用があり、抗炎症作用を発揮することが知られている。抗うつ薬あるいは気分安定薬によるミクログリア活性化の抑制作用の細胞内メカニズムとして、薬剤によるBDNFシグナリングの制御とくに細胞内カルシウムイオン動態の制御が関与する可能性が高い。ミクログリアにおけるBDNFの細胞内Ca^<2+>動態への作用については過去に報告がなかったが、申請者らはミクログリアにおいてBDNF投与数秒以内に[Ca^<2+>]iが持続的に上昇する現象を見出し、BDNFによる[Ca^<2+>]i持続的上昇にtransient receptor potential channel (TRPチャネル)を介したCa^<2+>流入が関与する可能性およびBDNFによるミクログリア活性化抑制効果を報告した(Mizoguchiら,J Immunol. 2009)。TRPチャネルはCa^<2+>透過性が高く、細胞内Ca^<2+>シグナリングにおいて重要な役割を担い、ミクログリア活性化を含む炎症過程のほか気分障害の病態との関与においても注目されている(Niliusら,PhysiolRev 2007、Kato T, Cell Calcium 2008)。申請者らはさらに、SSRIあるいはリチウムを前処置したミクログリアにおいて、BDNFの[Ca^<2+>]

i上昇効果が増強することを見出しており(SfN 2009 in Chicagoで発表)、今後[Ca^<2+>]i持続的上昇の細胞内機序を、とくにTRPチャネルに着目して解明することが、抗うつ薬および気分安定薬の作用機序を解明する上でも重要である。
ネットワークリスクの動的変化と避難行動チェインの解明

動的リスクの回避行動と避難行動チェインの記述するため,不確実状況下における避難開始の意思決定に着目し,将来効用を考慮した動的避難開始選択モデルを構築した.求解性に優れた解法を用いることで,時々刻々と変化する複雑な避難行動に影響を与える要因を正確に推計できるモデル開発に成功した.一定の状況下で将来効用が避難開始選択に与える影響が大きくばらついており,事前教育や情報伝播等の対策により,バラつきを抑えることで早期避難が可能となりうることを示した.次に,空間上の実リスクと個人の事前リスク教育や災害情報に応じたリスク認知に着目した避難開始の意思決定モデルを構築した.これにより,リスク教育や情報発信などの避難開始早期化対策の効果を空間を考慮いして評価することを可能とした.人的ネットワークの動的変化と避難開始時刻への影響の記述するため,社会的ネットワークの中に現れる協調行動に着目し,モデル構築を行った.モデルにより避難確率の低い災害弱者世帯との協調行動形成によって避難確率の低下現象(同調バイアス)が起こっていることを明らかにした.さらに災害弱者の率先避難によって全体避難が促進されることを定量的に明らかにし,ネットワーク形成と避難行動メカニズムを考慮したシミュレーションモデルを実装し,地域における避難評価の枠組みを提案できたことは大きな成果とである.他者支援(共同避難)を考慮した動的ネットワーク制御を行うための基礎的研究を行った.共同避難を考慮したネットワーク制御の方法に着目し,最適制御モデルの構築とそのためのシンプルな分析を行った.共同避難による避難促進/避難遅れの影響を踏まえ,共同避難の動的制御方法を提案した.共同避難意向が強い地域で長時間の共同避難を許容してしまうと,混雑による避難遅れが発生することが明らかにした.27年度が最終年度であるため、記入しない。27年度が最終年度であるため、記入しない。リスクの動的変化と避難行動チェインの記述を行った.リスクの動的変化の記述のため,将来行動の予測を考慮した動的離散選択モデルの構築を図った.また,将来行動の予測・将来リスクの回避にあたっては,行動時間の記述が必要である.そこで,活動継続時間を可変化させた動的選択行動の定式化を行った.また,避難以外の選択肢を近距離目的地/遠距離目的地と設定し,活動時間とあわせた避難行動チェインの構築を図った.これらにより,小規模の都市における避難時の時間帯別OD表を得ることができる.災害時のネットワークの動的変化とその影響についての記述を行った.集落全体の状況からの影響を考慮したネットワーク形成モデルの構築を行った.その際には空間的特徴の類似を考慮するために誤差項の相関を導入した.また,他者の避難選択が与える影響を評価するため,local interactionを考慮した避難開始選択モデルを構築した.これにより,高齢者の非避難により避難選択されにくいこと等が定量化でき,事前インタラクションの形成ルール構築への示唆が得られた.避難交通流の動的ネットワーク配分を行った.情報の認知構造を仮定した動的ネットワーク配分を行い,一方通行制御による避難完了時刻への影響を明らかにした.災害避難時の旅行時間情報認知による混雑への影響を明らかにした.また,交差点部の流出入制御については,完了時刻が固定されていない場合も計算可能である最大値原理を用いた最適制御の定式化を行い,容量制約と避難時混雑の関係を明らかにした.動的リスクの回避行動と避難行動チェインの記述するため,不確実状況下における避難開始の意思決定に着目し,将来効用を考慮した動的避難開始選択モデルを構築した.求解性に優れた解法を用いることで,時々刻々と変化する複雑な避難行動に影響を与える要因を正確に推計できるモデル開発に成功した.一定の状況下で将来効用が避難開始選択に与える影響が大きくばらついており,事前教育や情報伝播等の対策により,バラつきを抑えることで早期避難が可能となりうることを示した.次に,空間上の実リスクと個人の事前リスク教育や災害情報に応じたリスク認知に着目した避難開始の意思決定モデルを構築した.これにより,リスク教育や情報発信などの避難開始早期化対策の効果を空間を考慮いして評価することを可能とした.人的ネットワークの動的変化と避難開始時刻への影響の記述するため,社会的ネットワークの中に現れる協調行動に着目し,モデル構築を行った.モデルにより避難確率の低い災害弱者世帯との協調行動形成によって避難確率の低下現象(同調バイアス)が起こっていることを明らかにした.さらに災害弱者の率先避難によって全体避難が促進されることを定量的に明らかにし,ネットワーク形成と避難行動メカニズムを考慮したシミュレーションモデルを実装し,地域における避難評価の枠組みを提案できたことは大きな成果とである.他者支援(共同避難)を考慮した動的ネットワーク制御を行うための基礎的研究を行った.共同避難を考慮したネットワーク制御の方法に着目し,最適制御モデルの構築とそのためのシンプルな分析を行った.共同避難による避難促進/避難遅れの影響を踏まえ,共同避難の動的制御方法を提案した.共同避難意向が強い地域で長時間の共同避難を許容してしまうと,混雑による避難遅れが発生することが明らかにした.リスクの動的変化の記述については,基本的な定式化と次期避難を仮定したシンプルな計算と行動シミュレーションまではできている.さらに,時間軸の部分についての記述の精緻化を図るために,活動継続時間の表現を追加している.

これについては,将来期待値の計算が複雑になるが,MPEC型の計算方法により解決する.活動継続時間の表現の部分は想定した以上に進展している.ネットワークの動的変化の解明は,モデルの構築・説明変数の充実化といった部分は想定通り進展している.また,人的ネットワークの具体の影響を評価するためにlocal interactionを導入した避難開始選択モデルを構築した.これにより,ネットワークの特性による影響を定量化することができた.この部分は想定していなかった内容であり,期待以上に進展している.行動チェインの記述については,活動時間と目的地(遠方・近傍)を設定したモデルをリスクの動的変化とあわせて行っている.具体の目的地選択については導入できておらず,課題となっている.陸前高田市における日常行動と人的ネットワーク,目的地選択に関する調査は,現在詳細の企画を行っているところであり,やや遅れている.動的ネットワーク配分については,情報の認知による動的交通流の変化についての記述と一方通行制御の影響を明らかにした.避難時混雑と容量の関係を記述するため,交差点の動的制御モデルを構築した.完了時刻未定の状況でも計算可能な最大値原理を導入し,定式化した.避難時においては交通流の記述とともに制御が必要であることをレビューからも明らかにしたうえで,従来にない理論導入の提案を行っている.理論部分については,想定していなかった内容であり,順調に進捗している.27年度が最終年度であるため、記入しない。これまでに行ってきたリスクの動的変化,人的ネットワークの動的変化に関するモデルを用いて,具体の対策評価を行う.また,両者を統合することで行動チェインの評価可能なモデルを構築し,実道路ネットワーク上での評価を行う.また,実道路ネットワークでの評価のために,目的地選択モデルを陸前高田市の避難行動データより行う.また,陸前高田市において実施する調査により,これまでに検討した人的ネットワークの動的変化のモデリングが日常の行動についても適用可能であるかを実証(又は適用可能な形に更新する)し,より一般的なモデル構築を図る.動的ネットワーク配分については,現在は1交差点での動的流入制御のモデル化までを行っており,今後は複数交差点での動的流入制御のモデル化を行う.モデルをシミュレーションモジュールとして組み込み,情報認知とあわせて,実道路ネットワーク上での計算と施策評価を行う.27年度が最終年度であるため、記入しない。
RNA-蛋白質相互作用の系統的解析

1、翻訳状態のモニタリングに関する検討結果昨年度、アフィニティ精製したポリソームRNAとトータルRNA間でGATC-PCRによる定量比較解析を行った結果、遺伝子毎に様々なポリソームRNA/トータルRNAのシグナル強度比が得られた。本年度は、遺伝子のプロモータ配列を大腸菌のβガラクトシダーゼと融合する系統的手法を開発し、それぞれのプロモータ配列の転写活性と翻訳活性を併せた総合的な活性をβガラクトシダーゼの活性として測定する一方、それぞれの遺伝子に関してmRNAの発現量をGATC-PCRによって測定するという作業を行った。βガラクトシダーゼ活性からmRNAの絶対量を差し引いた値は翻訳の効率を指し示すもうひとつの指標になりうると考えたが、これらの値とポリソームRNA/トータルRNAのシグナル強度比の間には有効な相関は見られなかった。2、転写開始点の決定に関する成果出芽酵母はゲノム構造情報とは対照的にcDNA構造情報は乏しく、一部の遺伝子以外では転写開始点に関する知識が乏しい。そこで、GATC-PCRの開発過程で確立された遺伝子特異的プライマー設計アルゴリズムを転写開始点を捉えためのRACE法のプライマー設計に応用し、系統的転写開始点決定を試みてきた。既に20を超える遺伝子に関して転写開始点を決定し終えている。一方で、より効率的な転写開始点同定のため、出芽酵母の完全長cDNAライブラリを作製した。理化学研究所ゲノム科学総合研究センターの協力を得て、既に3万クローン以上のワンパスシーケンシングを終えており、1000を超える遺伝子に関して転写開始点の情報を蓄積することが出来た。この成果は、出芽酵母における転写開始点のデータベースの規模としては世界に類を見ないものであり、RNA-蛋白質間相互作用を研究するコミュニティーのみならず、他分野にわたって有効な情報を提供するものと考えられる。1.ゲノムワイドなGATC-PCRによる絶対定量法の確立一般化アダプター付加競合PCR法では、ゲノムDNAとcDNAのような異種核酸同士の競合増幅が可能である。つまり、全ての遺伝子を等コピー含むゲノムDNAを標準に、cDNA中に含まれるそれぞれの遺伝子の絶対定量を行うことが可能である。そこで、出芽酵母ゲノムの9割に相当する遺伝子に対してデザインされた遺伝子特異的プライマーを用い、出芽酵母トランスクリプトームの絶対定量を行った。この結果、(1)栄養豊富な培地中で対数増殖期における出芽酵母単位細胞当たりの総mRNA数は約10000であること。(2)その発現のオーダーは細胞当たり0.01コピーから1000コピーまで、およそ6桁にも及ぶこと。(3)その発現様式は、Power Lawに従うことなどが判ってきた。このようなゲノムワイドな絶対定量プロファイルを既に20セット収集し終えており、システムの基盤が整ったことが確認できた。2、ポリソームのアフィニティ精製2002年秋にInada等によって、ポリソームのアフィニティ精製法が発表された。リボソーム構成因子のRpl25pのC末端にFlagタグを付加し、アフィニティ精製を行うことで容易にポリソームを精製することが可能であるという。しかし、原法は融合Rpl25pをプラスミド上から発現させているため、例えば栄養飢餓、栄養過剰等の様々な培養条件下で常に融合タンパクの発現を維持することはプラスミド維持の観点から困難だと予測された。そこで、ゲノム上のRPL25遣伝子3'末端に直接Flagタグを導入し、培養条件の影響を受けずに済む系でのポリソーム精製を試みた。この結果、ポリソームを容易に精製することができた。このことから翻訳中の転写物と全転写物の量的関係、換言すればmRNAとリポソーム間の相互作用情報を様々な条件下でプロファイルする基盤が整った。1、翻訳状態のモニタリング昨年度、蛋白質-RNA間相互作用の代表例として、リボソームとmRNA間の相互作用に注目し、Inada T等(2002)のRp125pのC末端にFlagタグを付加したポリソームのアフィニティ精製法を改良した。本年度は、この系を利用し、精製ポリソームと並行して精製されたトータルRNAをそれぞれGATC-PCR用鋳型に変換し比較定量を行った。得られたcDNA量は双方のサンプルでほぼ同量であったが、これらを競合増幅してみるとそのシグナル強度は1対1ではなく、遺伝子毎にさまざまなバリエーションが確認された。全RNAに対するポリソームRNAのシグナル強度比は、各遺伝子の翻訳の状態の強度を示していると考えられ、この値が低い遺伝子は、転写されていながら翻訳が行われていない遺伝子を示唆していると考えられる。現在、これらの結果について検討中である。2、転写開始点の決定GATC-PCR法の開発過程で非常に特異的なPCRプライマーを設計する技術を開発しており、この技術を応用するとRACE法をゲノムワイドに展開することが可能になる。そこで、この技術と転写開始点を捉えることのできるRACE用鋳型作成法であるCapSelect法と組み合わせ、出芽酵母の各遺伝子の転写開始点を系統的に決定する作業を開始した。従来、出芽酵母の転写開始点は、30塩基程度といわれてきたが、既に300から400塩基の長い5'-UTRを有する遺伝子がいくつか見出されている。こういった長い5'-UTR配列は、RNAが特殊構造を形成し翻訳を制御する上で重要な働きをすることが知られており、また、RNA-タンパク質問相互作用の格好の場であると考えられる。今後は対象遺伝子を拡大し、データベースの構築を進め、翻訳状態のデータと合わせて検討を進める予定である。1、翻訳状態のモニタリングに関する検討結果