hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
心血管系細胞におけるNaポンプ遺伝子の発現制御と病態への関与

Naポンプ(Na,K-ATPase)は、細胞内Na^+、さらに二次的にCa^<2+>濃度を制御する膜タンパクで、α鎖およびβ鎖の2つのサブユニットより構成される.さらに、α鎖には3種類のアイソフォーム(α_1,α_2,α_3)存在することが、ヒトおよびラットで知られている.Naポンプは、特に心筋細胞や平滑筋細胞において、その収縮性、興奮性、増殖性に重要であり、従来よりこれら細胞におけるNaポンプ活性が各種ホルモンやイオンにより制御さらることが知られている.一方、最近Naポンプの遺伝子がクローニングされ、Naポンプの発現制御について遺伝子レベルでの解析が可能となってきた.我々の研究課題は、(i)ラットの培養心筋細胞および血管平滑筋細胞を用い、各種ホルモンやイオンによるNaポンプ遺伝子(αおよびβ)の発現制御機構について明らかにすることである.平成7年度に予定していた研究目的はほぼ達成でき、新たに以下の知見が得られた.(ii)α3鎖の発現に関与する特異的転写因子を同定した(第60回日本循環器学会発表).Naポンプ(Na,K-ATPase)は、細胞内Na^+、さらに二次的にCa^<2+>濃度を制御する膜タンパクで、α鎖およびβ鎖の2つのサブユニットより構成される.さらに、α鎖には3種類のアイソフォーム(α_1,α_2,α_3)存在することが、ヒトおよびラットで知られている.Naポンプは、特に心筋細胞や平滑筋細胞において、その収縮性、興奮性、増殖性に重要であり、従来よりこれら細胞におけるNaポンプ活性が各種ホルモンやイオンにより制御さらることが知られている.一方、最近Naポンプの遺伝子がクローニングされ、Naポンプの発現制御について遺伝子レベルでの解析が可能となってきた.我々の研究課題は、(i)ラットの培養心筋細胞および血管平滑筋細胞を用い、各種ホルモンやイオンによるNaポンプ遺伝子(αおよびβ)の発現制御機構について明らかにすることである.平成7年度に予定していた研究目的はほぼ達成でき、新たに以下の知見が得られた.(ii)α3鎖の発現に関与する特異的転写因子を同定した(第60回日本循環器学会発表).一般研究(C)の助成を受け、Naイオンおよび甲状腺ホルモンによる心筋、血管平滑筋および腎メサンギウム細胞におけるNa,K-ATPase遺伝子の発現制御機構について解析し、以下の研究成果を得た。(1)ラット培養メサンギウム細胞では、Na,K-ATPase alpha_1およびbeta_1鎖アイソフォームが存在し、甲状腺ホルモンは転写レベルでalpha_1およびbeta_1遺伝子の発現を亢進した(Am J Physiol 265:F370-376,1993)。(2)ラット培養心筋細胞にウアバインを添加すると細胞内Na^+量が増加し、Na,K-ATPase mRNAおよびタンパク量が増加する。また、Na,K-ATPase遺伝子の5〓上流領域にNa^+の作用部位の存在する可能性が示唆された(J Clin Invest;92:1889-1895,1993)。尚、平成5年度に予定していた各種病態モデルにおけるNaポンプ遺伝子の発現については、既に高血圧自然発症ラットおよび心筋症ハムスターを用いえ開始しているが、その成果は平成6年度以降に達成される見込みである。平成6年度の研究実績については、当初の研究計画をほぼ達成でき、新たに以下の知見が得れた。(2)高血圧自然発症ラット(SHR)の各臓器におけるNaポンプ遺伝子の発現異常を明らかにし、病態への関与について示した.すなわち、SHRでは高血圧発症前の4週齢において、既に正常高血圧ラット(WKY)に比し、心臓、大動脈、腎において、Naポンプ遺伝子の発現亢進を認めた.(3)新たに、心筋細胞におけるNa/Ca交換系遺伝子の発現制御についても検討を始めた.甲状腺ホルモンは、細胞内Na^+濃度に影響することなくNa/Ca交換系遺伝子の発現を抑制した.一方、ウワバインの添加により細胞内Na^+を増加させると、Na/Ca交換系遺伝子の発現は著明に亢進した.Naポンプ(Na, K-ATPase)は、細胞内Na^+、さらに二次的にCa^<2+>濃度を制御する膜タンパクで、α鎖およびβ鎖の2つのサブユニットより構成される.さらに、α鎖には3種類のアイソフォーム(α_1,α_2,α_3)が存在することが、ヒトおよびラットで知られている.Naポンプは、特に心筋細胞や平滑筋細胞において、その収縮性、興奮性、増殖性に重要であり、従来よりこれら細胞におけるNaポンプ活性が各種ホルモンやイオンにより制御さらることが知られている.一方、最近Naポンプの遺伝子がクローニングされ、Naポンプの発現制御について遺伝子レベルでの解析が可能となってきた.我々の研究課題は、(i)ラットの培養心筋細胞および血管平滑筋細胞を用い、各種ホルモンやイオンによるNaポンプ遺伝子(αおよびβ)の発現制御機構について明らかにすることである.平成7年度に予定していた研究目的はほぼ達成でき、新たに以下の知見が得られた.(ii)α3鎖の発現に関与する特異的転写因子を同定した(第60回日本循環器学会発表).
並立連鎖強化スケジュール下のラットの選択行動に及ぼすリスク経験の違いの効果

雄ウィスター系ラット6個体を、2レバ-のオペラント箱で、離散試行型並立連鎖スケジュールにさらした。初環で定比率(FR)強化スケジュールの比率1を行い、終環のFR25を満たした後の結果が異なる2つの選択肢間で選択する。2つの選択肢のうちリスク選択肢では確率0.5(別の個体では0.1、以下同)でペレット10個か確率0.5(0.9)でブラックアウト(BO)10秒、リスクレス選択肢では確率0.9でペレット5個か確率0.1でBO5秒であった。安定した選好を得るために、個体によって終環の比率が調整された。その後、上記の終環の結果が1回だけの非分割条件から、この条件での比率と強化量をそれぞれ1回あたり5分の1にして5回繰り返す分割条件に移行した。1セッションはその試行での選択肢が既定されている強制選択試行20回と、どちらでも選択できる自由選択試行(回数は体重維持に必要なペレット数の獲得に依存)の2つのタイプの試行から成る。非分割条件において、ペレットの出現確率が[0.5-0.9]の組み合わせ(以下同)では、4個体中2個体がリスクレス選択肢を選好した。残り2個体のうち1個体は比率を50に増加させるとリスクレス選択肢への選好がみられ、もう1個体は比率を100まで増加させたがリスク選択肢への選好がみられた。[0.1-0.9]では、全2個体がリスクレス選択肢への強い選好を示した。分割条件において[0.5-0.9]では選好の変動が大きく、安定した傾向が得られなかったが、[0.1-0.9]では全2個体がリスクレス選択肢への選好を示した。同様の手続きで終環に定間隔スケジュールを用いた先行研究に比べ、非分割条件では一貫した選好が得られた。先行研究との相違点は、強制選択試行で両ライトは点灯するが強制選択肢が確率0.5で既定される点と、1試行時間が選択肢間で等しくなるように試行間間隔を調整したことである。実験歴のない2カ月齢のオスのウィスター系ラット5匹を用い、2つのレバ-のあるオペラント箱でレバ-押し訓練後、2種類の条件の離散試行型並立連鎖スケジュールにさらす。ベースラインを与える単一条件では、餌は1つの試行で1回しか得られない。この時の離散試行型並立連鎖スケジュールの2つの選択肢は、片方は確立0.5で10個のペレット、確率0.5で10秒のブラックアウトが起こるリスク選択肢、もう一方は確率0.9で5個のペレット、確率0.1で5秒のブラックアウトが起こるリスクレス選択肢である。第1リンクは比率1の定比率強化(FR)スケジュール、第2リンクは2種類あり、被験体によりFR25もしくは間隔10秒の定間隔強化(FI)スケジュールである。その後、第2リンクでFR5を5回、もしくはFI10秒が5回の繰り返し条件にはいる。ここでは1回の試行で最大5回餌を得る可能性があるが、餌の最大量は単一条件と同じである。いずれも1回のチャンス毎にリスク選択肢では確率0.5で2個のペレットか2秒のブラックアウト、リスクレス選択肢では確率0.9で1個のペレットか0.1で1秒のブラックアウトとなる。試行間間隔はいずれの条件においても5秒である。単一条件では、第2リンクがFRスケジュールの場合にはリスク選択肢側を選択する傾向が、FIスケジュールの場合にはリスクレス選択肢側を選択する傾向が高い。

繰り返し条件は現在も実験継続中である。雄ウィスター系ラット6個体を、2レバ-のオペライト箱で、離散試行型並立連鎖スケジュールにさらした。初環で定比率(FR)強化スケジュールの比率1を行い、終環のFR25を満たした後の結果が異なる2つの選択肢間で選択する。2つの選択肢のうちリスク選択肢では確率0.5(別の個体では0.1、以下同)でペレット10個か確率0.5 (0.9)でブラックアウト(BO) 10秒、リスクレス選択肢では確率0.9でペレット5個か確率0.1でBO5秒であった。安定した選好を得るために、個体によって終環の比率が調整された。その後、上記の終環の結果が1回だけの非分割条件から、この条件での比率と強化量をそれぞれ1回あたり5分の1にして5回繰り返す分割条件に移行した。1セッションはその試行での選択肢が既定されている強制選択試行20回と、どちらでも選択できる自由選択試行(回数は体重維持に必要なペレット数の獲得に依存)の2つのタイプの試行から成る。非分割条件において、ペレットの出現確率が[0.5-0.9]の組み合わせ(以下同)では、4個体中2個体がリスクレス選択肢を選好した。残り2個体のうち1個体は比率を50に増加させるとリスクレス選択肢への選好がみられ、もう1個体は比率を100まで増加させたがリスク選択肢への選好がみられた。[0.1-0.9]では、全2個体がリスクレス選択肢への強い選好を示した。分割条件おいて[0.5-0.9]では選好の変動が大きく、安定した傾向が得られなかったが、[0.1-0.9]では全2個体がリスクレス選択肢への選好を示した。同様の手続きで終環に定間隔スケジュールを用いた先行研究に比べ、非分割条件では一貫した選好が得られた。先行研究との相違点は、強制選択試行で両ライトは点灯するが強制選択肢が確率0.5で既定される点と、1試行時間が選択肢間で等しくなるように試行間間隔を調整したことである。
ケモカインを介した癌の転移メカニズムの解明と治療への応用

【背景】1)消化器癌症例において腫瘍組織内への免疫担当細胞(NK細胞、Tリンパ球)の浸潤は一般に少ない症例が多い。3)癌におけるFractalkineの発現の報告はほとんどなく、大腸癌細胞株DLD-1における発現の報告を認めるのみで(Am.J.Pathol.,2001).癌組織におけるFractalkineの発現の意義は明らかではない。【目的】:消化器癌症例におけるFractalkineの発現を検索し、臨床病理学的因子との関係を明らかにする。癌組織内での発現局在およびリンパ球浸潤との関係を検討する。【方法と結果】:1)大腸癌症例86症例におけるFractalkine mRNAの発現をRT-PCR法にて半定量的に検討し、臨床病理学的因子との相関を解析した。2)大腸癌パラフィン包理切片において免疫組織染色を行い、Fractalkineの癌組織内の発現局在を検討した。大腸癌細胞のみならず正常大腸上皮細胞もFractalkine mAbで染色を認めた。3)大腸癌臨床症例におけるRT-PCR法によるFractalkine m-RNAの発現とHE染色によるリンパ球浸潤との相関を検討した。その結果Fractalkine mRNAの発現と腫瘍浸潤リンパ球は有意に相関し、腫瘍へのリンパ球浸潤の多い症例ではFractalkineが高発現していることが分かった。【考察と今後の方針】大腸癌臨床検体においてはFractalkine強発現症例では弱発現症例に比べ生存率は有意に良好であることが分かった。その理由としてFractalkine発現癌組織へのリンパ球浸潤が関与している可能性が示唆された。【背景・目的】ケモカインレセプターCCR7は成熟樹状細胞および一部のTリンパ球に発現しており、リンパ節に高い発現を認めるCCL21をリガンドとし、免疫担当細胞のリンパ節への走化因子として機能している。近年、乳癌細胞でケモカインレセプターCXCR4の発現が報告され、そのリガンドCXCL12の生体内での発現分布が乳癌の好発転移臓器と一致することから、ケモカインとそのレセプターの関連が乳癌における転移機構の一つとして考えられるようになった(Nature,2001)。一方、胃癌においてリンパ節転移は多くみられる転移形態であるが、ケモカインを利用した転移機構の可能性があるかは不明である。今回、胃癌におけるCCR7の発現とリンパ節への走化、転移との関連を検討した。【方法】胃癌切除標本64例、胃癌細胞株8株を用いてRT-PCR法、免疫染色法、flow cytometryでCCR7の発現を検索した。CCR7陽性胃癌細胞におけるCCL21刺激下での形態変化をレーザー顕微鏡で、細胞内Ca2+測定をflow cytometryで行った。また、CCL21への走化、浸潤能をmigration, invasion assayで行った。【結果】切除標本でCCR7の発現がRT-PCR法、免疫染色法ともに陽性だったのは42/64例(65%)であった。臨床病理学因子との相関ではCCR7陽性症例に有意にリンパ節転移、リンパ管浸潤が多く(p<0.001,p<0.001)、深達度においてはCCR7陽性症例に有意に粘膜下層を越える進行症例が多かった(p<0.01)。生存解析ではCCR7陽性症例はCCR7陰性症例に比して有意に予後不良であった(p<0.05)。また多変量解析によりリンパ節転移を規定する最も有意な独立因子としてCCR7の発現が選ばれた。次に胃癌細胞株でのCCR7の発現は5/8株に認め、CCL21の刺激でCCR7を介したシグナルによるアクチン再構築、細胞内へのCa2+流入を認めた。migration, invasion assayでは発現陰性株に比してCCL21に対する有意に高い走化・浸潤能を持っていた(p<0.05,p<0.05)。【結語】

CCR7陽性胃癌細胞株でのCCL21に対する形態変化および走化・浸潤能は臨床検体でのCCR7陽性症例にリンパ節転移、リンパ管浸潤が多いという結果に合致した。胃癌におけるCCR7の発現はリンパ節に発現するケモカインCCL21と共にリンパ節転移の重要な機序として関与している可能性が示された。【背景】1)消化器癌症例において腫瘍組織内への免疫担当細胞(NK細胞、Tリンパ球)の浸潤は一般に少ない症例が多い。3)癌におけるFractalkineの発現の報告はほとんどなく、大腸癌細胞株DLD-1における発現の報告を認めるのみで(Am. J. Pathol.,2001)、癌組織におけるFractalkineの発現の意義は明らかではない。【目的】:消火器癌症例におけるFractalkineの発現を検索し、臨床病理学的因子との関係を明らかにする。癌組織内での発現局在およびリンパ球浸潤との関係を検討する。【方法と結果】1)大腸癌症例86症例におけるFractalkine mRNAの発現をRT-PCR法にて半定量的に検討し、臨床病理学的因子との相関を解析した。2)大腸癌パラフィン包埋切片において免疫組織染色を行い、Fractalkineの癌組織内の発現局在を検討した。大腸癌細胞のみならず正常大腸上皮細胞もFractalkine mAbで染色を認めた。3)大腸癌臨床症例におけるRT-PCR法によるFractalkine m-RNAの発現とHE染色によるリンパ球浸潤との相関を検討した。その結果Fractalkine mRNAの発現と腫瘍浸潤リンパ球は有意に相関し、腫瘍へのリンパ球浸潤の多い症例ではFractalkineが高発現していることが分かった。【考察と今後の方針】大腸癌臨床検体においてはFractalkine強発現症例では弱発現症例に比べ生存率は有意に良好であることが分かった。その理由としてFractalkine発現癌組織へのリンパ球浸潤が関与している可能性が示唆された。
第14番染色体長腕上のヒト腎細胞癌特異的刷り込み型癌抑制遺伝子の同定

【目的】腎細胞癌において、第14番染色体長腕(14q)は第3番染色体短腕(3p)に次いで頻度の高い染色体欠失部位であり、同領域に癌抑制遺伝子が存在する可能性が指摘されてきたが未だ明らかになっていない。今回われわれは14q32に存在する刷り込み遺伝子(imprinting gene)であるDLK1(Delta like homolog)に着目し、腎細胞癌における抗腫瘍効果と遺伝子不活化をきたすメカニズムについて検討した。【結果】DLK1は腎癌細胞株で93%(14/15)、腎癌組織78%(39/50)で発現が消失していた。Growth assayではSW839に細胞増殖抑制効果を認め、浮遊条件下では全てのDLK1導入細胞株でanoikis誘導能を認めた。またnude mouse背部に移植されたDLK1導入腎癌細胞による腫瘍形成能はcontrol群と比較して著しく乏しかった。DLK1のDMR(Differentially Methylated Region)はDLK1遺伝子領域ではなくその下流にあるGTL2の5'領域に存在した。腎細胞癌においてDMRはメチル化状態で、DMRの異常メチル化獲得がDLK1不活化の原因であると考えられた。【考察】今回の検討によりDLK1は腎細胞癌の新規癌抑制遺伝子であることが証明された。腎細胞癌におけるDLK1/GTL2とWilms腫瘍におけるIGF2/H19はnon-coding RNAの5'領域のDMRが異常メチル化を獲得するという共通点がある一方、その結果腎細胞癌ではDLK1が不活化され、Wilms腫瘍ではIGF2が過剰発現するという遺伝子発現の相違点があることが明らかになった。今後、DLK1のDMRがDLK1/GTL2の刷り込み制御において果たす生物学的役割については更なる検討が必要であると考えられた。【目的】腎細胞癌において、第14番染色体長腕(14q)は第3番染色体短腕(3p)に次いで頻度の高い染色体欠失部位であり、同領域に癌抑制遺伝子が存在する可能性が指摘されてきた。今回われわれは14q32に存在する刷り込み遺伝子であるDLK1(Delta like homolog)が腎腫瘍の増殖制御に関わる可能性について検討した。今後、DLK1の発現を制御する機構についての検討を行う予定である。前年度われわれは14q32に存在する刷り込み遺伝子であるDLK1(Delta like homolog)が腎細胞癌の新規癌抑制遺伝子であることが明らかとなった。今年度はさらに腎癌組織におけるDLK1遺伝子の不活化メカニズムについて検討した。【方法】腎癌由来細胞株15株、腎癌手術切除標本50例からDNAを抽出した。DNAメチル化パターンをbisulfite genomic sequencing法とTA cloning法にて検討した。【結果】

DLK1は刷り込み遺伝子であることから50%メチル化であるDMR(Differentially Methylated Region)が存在することが予想された。しかしDLK1の発現にかかわるCpG islandのメチル化はDLK1のpromoter, gene bodyには認められず、DLK1の3'側90kbに存在する相補的刷り込み遺伝子GTL2の1.3kb上流に認めた。このDMRは正常腎では50%メチル化状態であるのに対し腎癌細胞・腎癌組織では100%メチル化状態であった。【考察】腎癌発生過程においてDLK1の相補的刷り込み遺伝子GTL2の上流にあるDMRが異常メチル化を獲得することがDLK1を不活化につながっていることが明らかとなった。【目的】腎細胞癌において,第14番染色体長腕(14q)は第3番染色体短腕(3p)に次いで頻度の高い染色体欠失部位であり,同領域に癌抑制遺伝子が存在する可能性が指摘されてきた。H17年度われわれは14q32に存在する刷り込み遺伝子であるDLK1(Delta like homolog)が腎細胞癌の新窺癌抑制遺伝子であることが明らかにした。さらに前年度までの検討によりDLK1の相補的刷り込み遺伝子GTL2の約1.8kb上流にあるDMRが異常メチル化を獲得することがDLK1不活化の主たる原因であることが判明した。本年度は14q LOHがDMRを含む場合にone hitでDLK1の不活化をきたすのかを腎癌組織を用いて検討する。【方法】腎癌由来細胞株15株,腎癌手術切除標本50例からDNAを抽出した。DNAをメチル化感受性制限酵素Nar Iで消化しDMRとD14S985をまたぐprimerでPCRし,この産物をさらにD14S985でPCRで増幅した後フラグメント解析した。その結果LOHをきたしているアレルアレルのメチル化状態が判別可能となる。【結果】われわれの有する腎癌組織においてD14S985でLOH+が判定可能な症例は50例中8例であった。この8例中メチル化アレルにLOHをきたしていたものが3例(3/8,非メチル化アレルのLOHが5例であった。【考察】腎癌発生過程:において諮いてDLK1の発現に関わるDMRが14q32のLOHにより欠失状態となりone hitでDLK1の発現が消失する可能性が示唆された。
高集積植物を用いた亜鉛・カドミウム含有坑廃水処理法の開発

本研究では亜鉛とカドミウムの高集積植物であるハクサンハタザオの水耕栽培系を用い、亜鉛・カドミウム共存下での両元素の吸収挙動を解明して、カドミウムが亜鉛濃度の影響を受けずに吸収されることを示した。また、ハクサンハタザオを用いた水耕栽培方式による模擬および実坑廃水の水質浄化を実証するとともに、カドミウム含有坑廃水処理プラントの基本設計を行い、このシステムが実際のカドミウム坑廃水処理に適用可能なことを明らかにした。本研究ではハクサンハタザオを利用した新たな亜鉛、カドミウム含有坑廃水の処理方法を提案することを目的としている。本年度は亜鉛とカドミウムの高集積植物であるハクサンハタザオの水耕栽培系を用い、亜鉛・カドミウム共存下での両元素の吸収挙動の解明と、水耕栽培方式による坑廃水の水質浄化についての実証を行った。亜鉛とカドミウムを含む溶液を用いた回分吸収試験において、0から2mg/Lの範囲の亜鉛が共存しても0.005 mg/Lの濃度に設定したカドミウムの優先的な吸収が生じ、その吸収速度は一次反応で整理され、亜鉛濃度には依存せず、また速度定数はほぼ一定であることが示された。自然界では一般に亜鉛はカドミウムの100倍のオーダーで存在しているが、そのような状況においても亜鉛よりカドミウムが優先的に吸収除去できていることから、ハクサンハタザオを用いたプロセスの実用性は高いと評価できる。また山形県内の休廃止鉱山から流出する坑廃水をベースにして作成した模擬坑廃水(カドミウム濃度:0.005,0.01,0.02 mg/Lの3水準、亜鉛濃度はいずれも1 mg/L)を用いて連続吸収試験を行ったところ、平均滞在時間の2倍程度の時間が経過したところでほぼ定常状態に達し、その時点でのカドミウム濃度は0.0015 mg/L以下となっており、カドミウムの水質環境基準値の0.003 mg/Lを十分に下回るものであった。この結果を基に試算すると、毎時1000Lの流量の坑廃水を処理するためには、10m×25mで深さ0.2mの水槽を用いれば良いことになり、坑廃水処理プロセス設計のためのひとつの目安を示すことができた。当初計画では28年度に予定していた連続試験の一部を27年度中に実施し、またその結果に基づき処理プロセス設計の見通しを示すなど、当初計画を大きく上回るペースで研究を実施している。それらの成果としてすでにプロセス設計の目安が示されており、28年度に実施される試験での目標値も明確となっている。これらの事から、当初計画以上に研究が進展していると判断される。本研究では、休廃止鉱山の坑廃水処理や一般の工業排水処理に適用可能な亜鉛とカドミウムの超集積植物ハクサンハタザオを利用した新たな亜鉛、カドミウム含有坑廃水の処理方法を提案することを主目的としている。本年度はハクサンハタザオの水耕栽培系を用い模擬廃水の水質浄化についての実証を行うとともに、坑廃水処理プラントの基本設計の実施、植物体中に集積された亜鉛とカドミウムの再生資源としての机上評価を行った。ハクサンハタザオの水耕栽培苗を設置した容器中にカドミウム濃度を0.05mg/L、亜鉛濃度を1.0mg/Lの溶液を希釈率0.0125(1/hr)で連続供給したところ、容器出口のCd濃度は0.025mg/L、亜鉛濃度は0.6mg/L程度まで低下した状態で500時間以上安定して処理され、カドミウムの排水基準以下まで低減させることができた。またカドミウム濃度を2倍と1/2倍として同様の実験を行ったところ、いずれも初期濃度の約1/2の濃度までカドミウム濃度を低下させた状態で安定した処理が行われた。この結果をもとに0.09mg/Lのカドミウムを含む鉱山廃水の処理プラントを設計した場合、処理水のカドミウム濃度を排水基準値の1/3である0.01mg/L程度まで低下させるためには水深30cmで広さ1200m2(400m2×3基)の処理槽が必要になると試算された。また処理プラントから発生するカドミウムと亜鉛を含むハクサンハタザオを焼却処理することにより、亜鉛品位10%程度の焼却灰が得られ、含有されるカドミウムを含め亜鉛製錬所で金属として回収可能であることが示された。以上の結果より、従来のアルカリ中和-逆中和の代替となりうる亜鉛とカドミウムを含む坑廃水に対する植物を利用した処理方法の基礎が確立できたと結論づけられた。平成28年度は以下の4項目を中心に研究を進める予定である。1回分試験による亜鉛・カドミウムの吸収を阻害する成分の解明2連続試験による坑廃水の水質浄化についての実証3坑廃水処理プラントの基本設計の実施

4植物体中に集積された亜鉛とカドミウムの再生資源としての評価研究全体としては予定を上回るペースで進捗しているが、まだ学術論文の公表が少ないため、その作成に精力的に取り組む。環境科学
デザイン型ヨウ素化合物を触媒とする酸化的カップリング反応の開発

酸・塩基触媒触媒の分野では、既に、有機分子触媒が従来の金属錯体触媒を凌駕しつつある。しかし、その一方で、遷移金属の特徴である酸化・還元機能をもったキラル有機分子触媒の開発は遅れている。現在、遷移金属の代替元素として注目されているのがヨウ素である。我々は、ヨウ素の超原子価の特徴を活かし、ヨウ素化合物を有機分子触媒に用いる環境低負荷型酸化的カップリング反応の開発及び不斉ヨウ素触媒の開発に成功した。触媒前駆体にはヨードアレンまたは第四級オニウムヨージドを、共酸化剤には過酸化水素や過酸化アルコールを用い、反応系に一切の毒性の強い物質を用いないことを特徴としている。本研究では、光学活性ヨウ素化合物を新規分子設計し、それらを有機分子触媒とする不斉酸化反の開発を行った。(1)次亜ヨウ素酸塩触媒:キラル第4級アンモニウムヨージドと過酸化水素又はアルコールの過酸化物からin situで調製されるキラル次亜ヨウ素酸塩触媒を用い、ヒドロキシケトンの酸化的環状エーテル化反応による光学活性2-アシルテトラヒドロフランの不斉合成を検討した。その結果、CHPを酸化剤として用いて高濃度で反応を行うと、目的の生成物が高い化学及び不斉収率で得られた。また、イミダゾリル補助基は容易にカルボン酸へ変換でき、テラゾシン等2-アシルTHF骨格を含む多くの医薬品の不斉合成が可能となった。(2)超原子価ヨウ素(III)触媒:フェノール類の酸化的脱芳香族化では、ortho位又はpara位で反応が起こり、それぞれ2,4-又は2,5-シクロヘキサジエノン骨格が生成し、どちらも生物活性物質の合成中間体として重要であるが、para位での高エナンチオ選択的酸化的脱芳香族化反応は未だ報告例がない。本研究では、両末端に嵩高いアミド基を有する超原子価ヨウ素(III)触媒を新規分子設計し、また、ortho位に嵩高いシリル基を有する基質を用いることで、2,5-シクロヘキサジエノン類を高い化学及び不斉収率で得ることに初めて成功した。(3)超原子価ヨウ素(V)触媒を用いるフェノール類のバイオミメティック酸化反応:超原子価ヨウ素(V)触媒を用いたフェノール類の酸化反応による1,2-キノールの合成に初めて成功した。具体的には、化学量論量のOxone存在下、2-ヨードベンゼンスルホン酸塩(pre-IBS)を触媒前駆体に用い、様々な2-置換フェノールの2位選択的酸化反応によって、対応する1,2-キノール及びその二量体の効率的合成に成功した。(1)次亜ヨウ素酸塩触媒による脂肪族アルコールの化学選択的酸化的カップリング反応を開発し、多くの医農薬品に含まれる2-アシルTHF骨格の新しい不斉構築法の確立に成功した。(2)フェノール類のパラ位でのエナンチオ選択的酸化的脱芳香族化反応は、反応点が触媒の不斉中心から遠いため高い不斉発現は困難とされていたが、本研究では新規機能型超原子価ヨウ素(III)触媒を設計することで、これまでにない高いエナンチオ選択性を達成できた。本研究では、ヨウ素化合物をを有機分子触媒とする酸化的変換反応の開発を行った。(1)次亜ヨウ素酸塩触媒:触媒量のヨウ化物と過酸化水素あるいはアルキルヒドロペルオキシドからin situで調製される次亜ヨウ素酸塩触媒を用いるフェノール類の酸化反応を検討し、過剰量のTBHPを酸化剤かつ求核種に用いることで、フェノール類の非金属系過酸化的脱芳香族化反応の開発に初めて成功した。(2)超原子価ヨウ素(III)触媒:キラル超原子価ヨウ素(III)触媒を分子設計し、ortho-及びpara-ヒドロキノン誘導体のエナンチオ選択的酸化的脱芳香族化反応を開発し、対応するキノンモノケータル体を高い化学及び不斉収率で得ることに成功した。特に、分子内水素結合を特徴とする立体配座が柔軟な本触媒では、触媒末端の立体電子遠隔効果により高い不斉誘起が可能になった。(3)超原子価ヨウ素(V)触媒:超原子価ヨウ素(V)触媒を用いた世界初のフェノールの高位置選択的酸化反応の開発に成功した。本研究では、非含水条件で高活性を示すIBS/Oxone触媒システムを用いることで、2-置換フェノールからは1,2-キノール及びその二量体を効率よく得ることに成功した。特に非対称な2-置換フェノールの酸化反応では、これまでにない高位置選択的な酸化反応により対応する1,2-キノール及びその二量体が高収率で得られた。加えて、基質のオルト位にシリルメチル基を導入することで、さらに位置選択性が向上することを見出した。シリル基はさらなる化学変換が可能であり、様々な有用骨格の合成に応用することにも成功した。(1)次亜ヨウ素酸塩触媒では、非金属系触媒によるフェノール類の過酸化的脱芳香族化反応に初めて成功し、様々な有用化合物に変換可能なシクロヘキサ-2,4-又は-2,5-ジエノン骨格の新たな構築法を開発した。(2)超原子価ヨウ素(III)触媒では、分子内水素結合を鍵とするデザイン型触媒を用いることで、これまでに非常に困難とされてきた(エナンチオ選択的酸化が未報告)、ortho-及びpara-ヒドロキノン類の初めてのエナンチオ選択的酸化的脱芳香族化反応に成功した。これにより、様々な天然物や生物活性物質の不斉合成が可能になる。(3)超原子価ヨウ素(V)

触媒:IBS触媒を用いる非対称な2-置換フェノールの酸化反応では、これまでにない高位置選択的な酸化反応により対応する1,2-キノール及びその二量体が高収率で得られた。その際、反応点の正電荷のさらなる安定化を目指し、オルト位にシリルメチル基を導入した基質を設計し、β-ケイ素効果によって高い位置選択性を発現するだけでなく、反応活性も大幅に向上することを新たに見出した。本研究では、ヨウ素化合物を有機分子触媒に用いる酸化反応を開発した。(1)次亜ヨウ素酸塩触媒システム:安価なアジ化ナトリウムを用いるカルボニル化合物の酸化的α-アジド化反応に成功した。第四級アンモニムカチオンを新規分子設計することで、高活性触媒の創製に成功した。また、本触媒システムを用いるフェノール類の酸化によるキノンメチドの新規in situ生成法と、それに伴うタンデム反応の開発に成功した。さらに、キラル第四級アンモニウム次亜ヨウ素酸塩触媒を用いて、不飽和ケトンとラセミ体ジアミン類との1,4-付加反応とエナンチオ選択的酸化的アミノ環化反応の連続反応による2-アシルピペラジン誘導体の不斉合成に成功した。(2)キラル超原子価ヨウ素(III)触媒システム:酸化剤としてm-CPBA存在下、in situで調製されるキラル超原子価ヨウ素(III)触媒を用いて、脂肪族カルボン酸を側鎖に持つナフトール類のエナンチオ選択的酸化的スピロラクトン化反応に成功した。さらに、本手法をアルノチンI由来のビアリールヒドロキシカルボン酸に応用したところ、抗生物質として期待される天然物であるアルノチンIIの高収率かつ高エナンチオ選択的な合成に成功した。(3)超原子価ヨウ素(V)触媒システム:酸化剤としてOxone存在下、触媒量の2-ヨードベンゼンスルホン酸からin situで調製される2-ヨードキシベンゼンスルホン酸(IBS)を触媒とするアルコールの酸化反応において、添加剤を用いることで、室温での選択的酸化反応に初めて成功した。酸・塩基触媒触媒の分野では、既に、有機分子触媒が従来の金属錯体触媒を凌駕しつつある。しかし、その一方で、遷移金属の特徴である酸化・還元機能をもったキラル有機分子触媒の開発は遅れている。現在、遷移金属の代替元素として注目されているのがヨウ素である。我々は、ヨウ素の超原子価の特徴を活かし、ヨウ素化合物を有機分子触媒に用いる環境低負荷型酸化的カップリング反応の開発及び不斉ヨウ素触媒の開発に成功した。触媒前駆体にはヨードアレンまたは第四級オニウムヨージドを、共酸化剤には過酸化水素や過酸化アルコールを用い、反応系に一切の毒性の強い物質を用いないことを特徴としている。研究体制は平成28年度と同じ人数を予定している。平成28年度は、平成27年度の研究を継続し、発展的に推進する。具体的には、(1)次亜ヨウ素酸塩触媒システム:本酸化系は分子内環化反応においては高いエナンチオ選択性は発現しているが、カルボニル化合物の分子間α-カップリング反応は不斉制御が困難なため、高い不斉誘起は発現できていない。本研究では、これまでの知見を生かし、α-ヒドロキシ化のようなカルボニルの不斉α-官能基化の開発を目指す。(2)超原子価ヨウ素(III)触媒システム:これまでの知見を基に、超原子価ヨウ素触媒を用いて、ビアリールヒドロキシカルボン酸のエナンチオ選択的酸化的脱芳香族化反応を開発し、天然物arnottin IIやその類縁体の不斉合成を目指す。
内部水冷式針を用いた肺スリガラス結節に対する媒体注入下マイクロ波凝固療法の構築

マイクロ波凝固療法(PMCT)は急激な温度上昇による炭化のため、凝固範囲がラジオ波焼灼療法(RFA)よりも狭くなることが欠点であった。近年、穿刺針の内部冷却式システムの開発により凝固範囲は拡大し、RFAより血流や周囲構造の影響によるheat sinkeffectを受けにくい特徴が注目されている。肺腫瘍に対しても有用性が期待されているが、空気が多い肺組織では、熱伝導性が低下して凝固が阻害される可能性がある。本研究では肺のPMCTにおける含気の影響を解明し、肺胞腔内を置換する媒体及び凝固範囲について検証する。初年度はex vivoで肺体外灌流モデルの構築を行った。豚(雌)の摘出した肺を用いて人工呼吸器を使用して換気を行った。また、同時に肺動脈の灌流も用手的に行った。肺の換気は通常の豚の麻酔時と同様のプロトコールで可能であった。一方で灌流は死後から時間が経過した肺では注入した薬液の還流は確認できなかった。また、肺モデルは摘出時に心臓を切り離しているため、灌流用のチューブを肺動脈、肺静脈と接続する必要があった。この際に灌流液が血管外へ漏出しないための装置の構築も必要であることが判明した。次年度は人工呼吸器を購入し、ポンプを用いた潅流を行うことで生体に近い環境に近づけることを計画している。また、肺に注入する媒体を検討し、ex vivoにてCTで注入した媒体の確認が容易となるモデルの構築も予定している。研究代表者及び協力者が異動時期に重なったこともあり、研究準備・検討や開始が計画よりも遅延した。遅延している研究を含め、引き続き研究を遂行。適宜国学会にて報告する予定である。次年度は人工呼吸器を購入する予定である。実験の進行が良好であれば灌流装置も購入し、肺灌流モデルの完成を目指す。また、肺に注入する媒体を決定するため、媒体の購入が必要となる。さらにマイクロ波についての知見向上及び実験結果の報告のため、学会参加を予定している。
石炭生物脱硫のチオ-ルペプチド促進吸着を利用した効率化

チオ-ルペプチドの代表として,グルタチオンを対象とした。グルタチオンの定量はEllman法に従った。チオジグリコ-ル等12種のチオ-ル化合物について,あらかじめ予備調査によって確立した手続きに従って、グルタチオン合成酵素活性並びに還元再生酵素活性が誘導されるか否かを調査した。その結果,グルタチオン還元酵素活性は、調べたチオ-ル化合物の範囲では,チオジグリコ-ル(5mM)、DMSO(5、50mM)、FAMSO(0.55mM)により誘導された。またブルタチオン合成酵素活性は,大腸菌では硫化ナトリウムでは誘導されたが,チオ-ル化合物で誘導するものは認められなかった。これに対し,Thiobacillus versutusではDMSOによって,活性は約4倍増大し,その産物であるグルタチオンはほとんど細胞外に分泌されていた。このことは,当面の目標である吸着促進に対して,正の効果を持つ。これら誘導処理の,石炭脱硫速度への影響調査が,次の課題となった。次いで,吸着細菌のin situ検出については,うさぎからのポリクロナ-ル抗体は,アジュバント法を用いては調製できなかった。そこで,抗原を耳静脈に負荷限界きで直接注入し,特異抗体を調査した。この特異抗体により,Thiobacillus versutusの蛍光顕微鏡下での検出と同定が可能となった。また,色調分解法を用いることで,二値画像処理へ展開できることを示唆する実験結果も得た。しかし,抗原の性状から考えると,上記調製法で特異性を満たす抗体を得ることは,偶然に支配されるところがあるため,マウスBALB/cCrSlcの睥臓細胞とミエロ-マ細胞P3/NS1/1ーAg4ー1のハイブリド-マによる抗体産生細胞をThiobacillus intermediusについて調製した。出現した各ハイブリド-マコロニ-について,それらの産生するモノクロナ-ル抗体の種特異性検証が,次の課題となった。
ヒトパルボウイルスと慢性関節リウマチに関する研究

慢性関節リウマチ(RA)の発症にはウイルスなどの微生物の関与が挙げられている。我々は、臨床的観察に基づき、RAでのヒトパルボウイルスB19(B19)の関与について検索を行った。その結果、以下が判明した。(1)B19はRAの活動病変を持つ関節滑膜組織において陽性であった。すなわち、PCR法により33例中24例にB19DNAが陽性とされた。この中で21例は組織学的に活動性RAとされたが全例でB19DNAが陽性であった。一方RA活動所見の乏しい12例では3例のみ陽性を示した。対照とした変形性膝関節症(OA)10例、関節外傷性10例では滑膜組織でのB19PCRはすべて陰性であった。(3)RA関節滑膜組織を細切後、コラ-ゲナーゼ処理して得た細胞(SVC)あるいはRA由来の骨髄細胞(BMC)を分離チャンバーを用いてB19陰性のBMC、マクロファージ細胞株U937、THP-1と混合培養した。BMC、U937、THP-1においてVp-1陽性細胞が出現した。(感染性B19の証明)。これはOA由来のSVCを用いた系ではすべて陰性であった。(4)(3)においてRA由来のSVCと混合培養したマクロファージ細胞よりIL-6、TNFαの分泌が認められた。これは培養系への抗B19抗体の添加により抑制された。以上の知見はRAに特異的に認められ、RA発症因子としてのB19の役割を示す。(1)急性ヒトパルボウイルスB19(B19)感染症例の解析の結果、これまでに報告されていた、赤芽球、巨核球系細胞の他に免疫系(リンパ球、単核球)細胞が及び骨髄ストローマ細胞B19感染のターゲットとなりうることを見出した。(2)慢性関節リウマチRA例20例中16例の滑膜組織においてB19-DNA及びB19蛋白VP-1が存在することをin situ hybridization及び免疫組織化学法により見い出した。非RA例関節滑膜組織では陰性所見を得ている。RA例ではB19が持続感染していることが判明した。(3)RA例より得たB19DNAにつきヌクレオチド配列を決定した。RA例由来を決定した。RA例由来では、B19生物活性を担うNS-1蛋白を規定する領域のヌクレオチド配列において、非RAの急性B19感染例より得たB19DNAヌクレオチド配列とは異なるアミノ酸置換を伴う変異を有していた。(4)(3)にもとづきRA由来及び非RA由来のそれぞれB19DNAの細胞導入による細胞障害性、IL-6、TNFの遺伝子への関与様式を追求し、RA発症との関連で検討している。慢性関節リウマチ(RA)の発症にはウイルスなどの微生物の関与が挙げられている.我々は,臨床的観察に基づき,RAでのヒトパルボウイルスB19(B19)の関与について検索を行った.その結果,以下が判明した.(1)B19はRAの活動病変を持つ関節滑膜組織において陽性であった.すなわち,PCR法により33例中24例にB19DNAが陽性とされた.この中で21例は組織学的に活動性RAとされたが全例でB19DNAが陽性であった.一方RA活動所見の乏しい12例では3例のみ陽性を示した.対照とした変形性膝関節症(OA)10例,関節外傷例10例では滑膜組織でのB19PCRはすべて陰性であった.(3)RA関節滑膜組織を細切後,コラ-ゲナーゼ処理して得た細胞(SVC)あるいはRA由来の骨髄細胞(BMC)を分離チャンバーを用いてB19陰性のBMC,マクロファージ-細胞株U937,THP-1と混合培養した.BMC,U937,THP-1においてVp-

1陽性細胞が出現した(感染性B19の証明).これはOA由来のSVCを用いた系ではすべて陽性であった.(4)(3)においてRA由来のSVCと混合培養したマクロファージ-細胞よりIL-6,TNFαの分泌が認められた.これは培養系への抗B19抗体の添加により抑制された.以上の知見はRAに特異的に認められ,RA発症因子としてのB19の役割を示す.
光学活性なサレン誘導体の金属錯体を利用する複合系反応試剤の開発

本研究ではC3,C3^1ー置換基およびC8,C8^1ー位に不斉炭素を持つ光学活性なさレン錯体(1,2,3,4)を合成して、新たな不斉反応場を構築し新規不斉合成反応を開発することを試みた。なかでも不斉合成化学において最も困難な課題の一つである近傍官能基を持たないオレフィン類のエナンチオ面選択的変換反応、特に不斉エポキシ化反応について検討した得られた結果を表に示す。これらの結果よりCー3とCー3^1置換基上の不斉とCー8とCー8^1位の不斉の相対立体配置およびCー3とCー3^1置換基上の不斉中心のコンホメ-ションが不斉誘起に影響を与えることが明らかとなった。これらの知見を基にさらに軸配位子の効果を調べたところ、検討したそれぞれの基質で金属触媒エポキシ化としてはこれまでに報告されたなかで最も高い不斉収率を達成することができた(エントリ-1と4、括弧内の値)。以上のように的確に設計された光学活性なサレン錯体は近傍官能基を持たない基質のエナンチオ面選択的反応を有力な手段を与えることを明かにすることができた。
ヒマラヤの氷河からの融解量算定モデルの開発

ヒマラヤの氷河縮小は、近年地球上で最も顕著であり、氷河の融解水を水資源としている現地国にとって深刻な問題となっている。そこで氷河の融解量を適切に算定し、将来の水資源変動を予測して、合理的な水の管理・利用を計画していく必要があるが、ヒマラヤには大小さまざまな氷河が分布しながら気象・水文データは極めて限られているので、簡便な方法で、より正確に氷河の融解量を算定するモデルの開発を研究目的とした。これまで、ヒマラヤのなかでもデータが比較的多く得られている氷河について、正の日平均気温の積算値に対するその期間の融解量との比である融解係数を得ているが、ネパールのランタン・ヒマールやチベット高原の氷河についても可能なかぎり融解係数を求めた。さらに下流部が岩屑に覆われた大型氷河についても、既存のデータから融解係数を求めた。融解係数は日射条件によって変化することが判明しているので、日射による影響の考察を加えた。ヒマラヤの大型氷河は下流部表面が岩屑に覆われており、水資源の多くは岩屑下の氷の融解によるが、観測が困難でデータが限られている。その融解量を算定する簡便なモデルを、岩屑の熱的影響を効果的に取り込んで改良した。ランタン・ヒマールでは、岩屑に覆われた大型氷河がある二つの流域について、岩屑の熱的性質を考慮した融解モデルを作成した。それをもとに計算した融解量と雨量の和が観測された流出量とほぼ一致し、この方法に見通しが得られた。研究分担者外国人特別研究員はヨーロッパ地球物理学連合総会(ニース、4月)に出席し、これまでの成果を発表し有意義な討論ができた。また、これらの成果を論文にまとめ、学術誌に発表した。
児童・生徒の造形的な「みたて」能力の調査と「みたて」の造形教材および指導法の開発

第2年次(平成10年度)の成果は、以下の三点に集約される。第一は、第1年次(平成9年度)におこなわれた「みたて」能力の実態に関する第一次調査の結果を分析し、調査方法と問題を改善するとともに調査対象を広げ、第二次調査を実施したことである。また同時に、「みたて」の造形作品に対する児童・生徒や現職教師の関心や態度なども調査し、「みたて」の造形に対する意識の違いを明らかにしようと試みた。調査は、高知県公立小中学校と大阪府公立小学校、および富山県公立小学校に協力を依頼し実施した。調査対象人数は、総数713人である。質問項目に対してO×で答えたり、回答を選択する形式による統計学な調査が目的ではなく、個々の描く図像の傾向を分析する審美的な調査を目的とするため、調査の実施にも結果の分析にも多大な時間を要したが、一定の成果を得ることができた。第二は、各地でおこなわれている「みたて」の造形行事の現地調査の結果、「みたて」の造形が古来よりの民衆造形として、わが国の造形文化に深く根付いていることが確認できたことである。第三は、以上の成果を踏まえて、教材の開発と指導法の改善についての考察をおこなったことである。実際に小中学校の現場において授業実践がなされ、その適否が検証されることが望まれる。これらの成果として、平成10年10月に滋賀大学教育学部で開催された第37回大学美術教育学会における「児童の造形的な「みたて」能力の実態」と題する研究発表、およびそれをまとめた論文(平成11年2月大学美術教育学会誌第21号)があげられる。平成9年度の研究実績は、以下の三点に集約される。第一は、「みたて」の造形教材および指導法開発のための基礎研究として、想の形成過程を視点として、現行の小学校図画工作科教科書題材(教材)を分析したことである。現行の教科書は、絵や工作などの表現形態によって題材(教材)が構成されている。「みたて」は想の形成に関わる作用であることから、表現形態からは「みたて」の造形性が捉えにくい。学習過程における「みたて」の関与の有無・強弱、想の形成に関する「みたて」の果たす役割などを明らかにするために、すべての教科書題材(教材)を「みたて」の視点から分析し、再構造化した。なお詳細は、『美術教育学』第19号等に発表済みである。第二は、児童・生徒の造形的な「みたて」能力の実態に関する予備調査をおこなったことである。探索過程における「みたて」の基礎能力を、1.意味やイメージを見つける力(発見と意味づけ)2.意味やイメージを広げる力(拡張と多様化)3.意味やイメージを重ねる力(分類と選別)と捉え、1.2.3.それぞれについて調査問題を作成し調査をおこなった。結果については、分析中である。第三は、児童・生徒がおこなう「みたて」の造形と我が国の「みたて」文化との接点について考察するため、各地でおこなわれている「みたて」の造形行事(「みたて」祭り)を現地調査した。「一式飾り」「見立て細工」「つくりもん」など、呼び名はさまざまであるが、各地で「みたて」祭りが継承されていることが判明した。予想外に多くの地方でおこなわれていることが判明したため、調査回数も増え、資料の分析にも時間を費やしたが、地域の独自性と一定の共通項が見出せた。現地調査は、次年度も継続する予定である。
ホーミングを応用したデリバリーシステムによる血管新生阻害因子PEDF遺伝子治療

野生型のBalb/cマウスより末梢血を採取し、MACS(Magnetic Cell Sorting)を用いで樹状細胞(DC)を分離・破棄した後、再度MACSを用いてリンパ球分画を分離する。分離したリンパ球を適切なサイトカイン環境の下で培養し、別途調製したLv-PEDFを感染させてPEDFの遺伝子導入を施行した。PEDF遺伝子と同時に発現されるGFPによって識別・分離が可能であるが、血球細胞への遺伝子導入効率がきわめて不良であったためFACSで分離が不能であった。導入方法を従来法から、新規に開発したTAT-pKペプチド併用に変更し、数%の導入細胞が得られたが、これらからPEDF産生リンパ球の純粋培養は成功しなかった。対照として、GFP単独で遺伝子導入した場合は遺伝子導入リンパ球を分離し純粋に培養することが可能であった。以上を踏まえ、癌細胞株をリンパ球に見立て、これを材料として擬似的な実験系が機能するかどうかを検証したと同時に、癌を移植する部位とは異なる部位の正常組織にLv-PEDFを感染させてPEDFの遺伝子導入が可能であるかどうかを調べた。過去に実績のある食道癌細胞株であるHEC46にPEDFの遺伝子導入を行ってPEDF発現細胞株(HEC46-PEDF)を樹立し、共培養した血管内皮細胞の増殖や遊走などが低下すること、これをマウスに移植してできた腫瘍における血管内皮前駆細胞(EPC)の数が少ないことなどを確認したと同時に、同腫瘍とは離れた部位に移植した他の癌細胞株の腫瘍増殖が抑制される現象を見いだした。一方で、血中に分泌されていると予想されるPEDFの検出をELISA法で試行したが、検出限界内での値は存在せず、同時におこなった正常組織への遺伝子導入でも検出されないことが判明した。クローニングしたPEDFのcDNAを導入したレンチウイルスベクター(Lv-PEDF)を用い、PEDFを過剩発現する食道癌細胞株(TE8PEDF、HEC46PEDF)を樹立した。これら細胞株は培養における増殖能に変化はなかったが、培養上清にはELISA法およびWestern blot法によってPEDFタンパクの存在が確認され、血管内非細胞の増殖および遊走を抑制することが示された。これは既に報告済みの膵癌細胞株と同様の結果であった。一方で、これら細胞株をヌードマウスに移植した場合に、TE8PEDFは膵癌細胞株と同様に腫瘍の増大が抑制されたが、HEC46PEDFは抑制されなかった。さらにTE8PEDF腫瘍を再度培養した後に移植を行うと、その腫瘍は増大が抑制されないことが明らかになった。つまり、これらの細胞株には血管新生阻害因子に対する耐性が存在することが判明した。しかし、それぞれのマウスにおいては血中の単核球成分(PBMC)が著名に減少し、同時に血管内非前駆細胞(EPC)も減少していることが明らかになった。つまりPEDFは骨髄に作用し、PBMCおよびEPCの双方の増殖を阻害していると考えられた。一方、研究の問題点として、ヒト血清中のPEDFはELISA法で検出可能であったのに対し、マウス血清中のPEDFはELISA法およびWestern blot法での検出が困難であることが判明した。さらに、ホーミングを利用したデリバリーシステムを構築するために、採取したマウスPBMCにLv-PEDFをトランスフェクションしたが、癌細胞株と異なり、遺伝子導入効率がきわめて不良であり、PEDFを過剰に発現する血球細胞の樹立が困難であることが判明した。これは、先に得られた結果から、血球細胞が産生するPEDFが血球細胞自身の増殖を阻害しているためである可能性が考えられた。