hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
インフルエンザ感染重症化バイオマーカーFlu Alarminの検索と実証研究

インフルエンザ感染が重症化する患者では、エネルギー代謝破綻が直接的、間接的原因である。検索した各種バイオマーカーの中で、乳酸/ATP値が感染重症度を的確に示すことを、動物実験と臨床検体の測定から明らかにした。さらに、インフルエンザ脳症の発症リスク因子として脂肪酸代謝酵素のcarnitine palmitoyltransferase IIの熱不安定性遺伝子多型が関与していることを明らかにしてきた。このプロジェクトでは、SmartAmpを用いて30分以内にこの多型の保有者を判定できるシステムを開発した。インフルエンザの重症化は、血管透過性亢進による末梢循環不全・多臓器不全を伴う。そのため重症化に先立って生体が発信する危険信号を「Flu Alarmin」として、患者検体とモデル動物でAlarminの検索と重症化との因果関係を検証した。Flu Alarminとして、1感染気道上皮細胞が放出する物質群、2血管内皮細胞とその周囲組織が放出する物質群、3臓器の代謝不全シグナル物質群を検索した。平成25年度のインフルエンザシーズンでは重症化する患者が稀で検体収集が十分でなかったことから、解析は主に重症化し易い離乳直後の4週齢B6マウスを用いたモデル動物実験で実施された。インフルエンザウイルス株の中でもマウスが重症化しやすいPR/8/34(H1N1)株を用いて実施された。インフルエンザ感染後、ウイルスは3-4日をピークに増加して7-9日で肺から消失するが、血管内皮の透過性亢進と多臓器不全は感染後7日目以後に明確となった。この代謝不全を伴う重症化に先立つ早期の体内代謝の変化では、感染3日から肺、その他の臓器で急速に増加するPyruvate Dehudrogenase Kinase 4 (PDK4)が見出され、この増加に伴ってPyruvate Dehudrogenaseが低下して、エネルギー代謝不全が発生していることが判明した。生体が発信する危険信号「Flu Alarmin」としてPDK4が抹消血でも増加するかを、今後調査する。これらの体内代謝不全に先立って感染初期に観察されるFlu Alarminの候補に、肺、気道分泌液中のサイトカイン、TNF-alpha、IL-6、IL-1beta、IFN-alpha、IFN-beta、IFN-gamma、の急速な増加が認められ、Flu Alarminと同定された。インフルエンザ感染が重症化するリスクの高い患者として、糖尿病、肥満者、心不全、肺機能障害、腎機能障害患者が挙げられている。これらの患者では、エネルギー代謝破綻が直接的、間接的原因によっる共通障害因子であることが明らかになった。これ等患者の血中のSOSシグナル候補として、エネルギー代謝破綻の指標としての乳酸/ATP値(ATP-lactate energy risk score: A-LES)、各種炎症性サイトカイン、代謝中間体、ウイルス増殖サイクルに関与するTrypsin、MMP-9について評価を実施し、次の成果を得た。1)A-LES値は重症度を的確に示すリアルタイムマーカーである:上記のFlu Alarmin候補、例えば各種炎症性サイトカイン、代謝中間体、Trypsin、MMP-9は、インフルエンザ感染以外でも異常値を示すだけでなく、生体の複雑なネットワーク中間構成因子であるため、必ずしも重症度を直接示すとは言えないことが判明した。これらの中で、A-LES値は最終産物であるATPと代謝中間体のLactateを指標にするため、的確に重症度を示すことが、動物実験と臨床検体の測定から判明した。2)小児のインフルエンザ重症化にインフルエンザ脳症があるが、発症リスク因子として脂肪酸代謝酵素のcarnitine palmitoyltransferase II (CPT II)の熱不安定性遺伝子多型が関与していることをこれまでに明らかにしてきた。インフルエンザ脳症は、感染直後に発症することが多いため、リスク因子としてのCPT IIの遺伝子多型はできる限り早く診断する必要がある。このプロジェクトでは、理化学研究所が開発したSmartAmpのシステムに我々が見出した多型判定のためのCPT IIプライマーを組み合わせることで、30分以内にこの多型の保有者か否かを判定できるシステムを開発した。病態医化学研究平成25年度のインフルエンザシーズンは流行が軽度で重症化した患者検体の収集が困難であったが、感染モデルマウスを用いた実験は順調に進展して、「Flu Alarmin」の候補としてのバイオマーカーの同定が行われて、一定の成果がでた。今後これらの、「Flu Alarmin」バイオマーカーと発症機序との因果関係の解析が可能になったことは、今後に繋がる成果として評価できる。今後の研究は、血管透過性亢進による末梢循環不全・多臓器不全の発症に関して以下の3課題に絞って進める。1)感染モデル動物を用いた、さらなる「Flu Alarmin」の候補の検索。2)インフルエンザの感染者の血液検体、気道分泌液検体を用いた「Flu Alarmin」の候補の検索。

3)「Flu Alarmin」バイオマーカーと末梢循環不全・多臓器不全の因果関係に絞った重点的解析。予定していた感染動物実験が、感染動物舎が満室状態となって感染動物実験の時期を遅らせて実施しなければならなくなったたため、マウス購入予定にしていた経費が残額として残った。平成26年度の5月までに、感染動物舎への入荷が可能となることから、速やかに予定のマウスを購入して実験を実施する。
免疫系レパートリー形成における学体内外環境要因の役割と自己免疫反応誘発機序の解折

2.T細胞の胸腺内分化・成熟・選択機構を解析するために、胸腺上皮細胞株(SL10.3)、並びに、これに依存して増殖応答を示すT細胞株(N-9F)を得た。また、この増殖応答を阻止するモノクロナル抗体・抗血清を得た。N-9F免疫では100kdの蛋白を検出する抗体QR6.6を得た。100kd抗原は胸腺内の最も未熟な細胞に発現されており、SL10.3上での未熟胸腺細胞の増殖が抑制された。現在対応抗原の単離・精製と、その部分アミノ酸配列の決定を進めている。SL10.3免疫では、45kdと60kdの2種類の蛋白が同定できた。SL10.3cDNA libraryを抗血清でスクリーニングして、candidate cDNAが取れ、DNA sequenceの結果新しい遺伝子であることがわかっている。現在full-length cDNAの単離を急いでいる。またM104EやMAG遺伝子をSL10.3細胞に発現させ、中枢性の免疫寛容モデルの作成を試みている。免疫系のレパ-トリ-形成とその維持の機構を解析する目的で、BALB/cミエロ-マ、MOPC104E(M104E)が産生するミエロ-マ蛋白イディオタイプをモデル抗原として、イディオタイプ特異的T細胞の誘導のための基礎実験を行なった。M104E抗体重鎖cDNAを、発現ベクタ-pZIPNEO(SV)、pMTSNEO、BCMGSNEO等に組み込み、DBA/2マウス由来単球系細胞株P388D1にtransfectした。しかしpZIPNEO(SV)transfectantでは中間宿主細胞のpackaging efficiencyが悪いためか、十分な発現を示さなかった。一方pMTNEO transfectantに対してはBALB/c抗ーM104E T細胞応答は殆ど認められなかった。transfectantでのmRNA発現量が対照細胞M104Eの約1/10であるため、十分なT細胞応答が誘導できなかったことが考えられ、ベクタ-を高発現能を有するBCMGSNEOに変更して再度試みた。現在、M104Eに匹敵するmRNAを発現する細胞株が得られており、T細胞応答能の解析を急いでいる。細菌性ス-パ-抗原によるT細胞レパ-トリ-の偏倚現象の解析と自己反応性T細胞による自己免疫性変化の発現を調べるために、消化管常在細菌Klebsiellaoxytocaのマイトゲン活性を調べた。しかし培養上清、ホルマリン固定細菌いずれにもマイトゲン活性は認められなかった。Klebsiella pneumoniaeについて検索する計画である。T細胞の胸腺内分化・成熟・選択過程を解析する目的で、胸腺上皮細胞依存性T細胞株に対するモノクロナル抗体(QR6)を得た。QR6は胸腺上皮細胞依存性の増殖をほぼ完壁に抑制した。QR6抗原の胸腺細胞での発現は、マウス胎生16ー17日をピ-クに成熟するにつれ減少した。QR6抗体は分子サイズ92kDの蛋白を認識し、胸腺内での最も未熟な細胞にのみ発現される抗原を認識する。現在抗血清の作成を試みており、これを用いてQR6対応抗原の遺伝子クロ-ニングを計画している。T細胞の胸腺内分化・成熟・選択機構を解析するために、胸腺上皮細胞株(SL10.3)、並びに、これに依存して増殖応答を示すT細胞株(N-9F)が獲られている。N-9F免疫では100kdの蛋白が検出され、これが胸腺内の最も未熟な細胞に発現されていることがわかった。現在N-9Fを大量培養し、対応抗原の単離・精製と、その部分アミノ酸配列の決定を進めている。SL10.3cDNA libraryを抗血清でスクリーニングして、candidate cDNAが取れており、DNA sequenceの結果新しい遺伝子であることがわかっている。また、M104EやMAG遺伝子をSL10.3細胞に発現させ、中枢性の免疫寛容モデルの作成を試みている。
新規リチウム金属窒化物の探索と機能開拓

これまでにない簡便なLi_<3-x>Mn_xNの直接固相合成の確立を目的として研究を行った。新規合成法を探索するに当たって、逆蛍石構造とLi_3N型層状構造中でのMnの形式原子価の違いに着目した。Li_3N型層状構造中ではI価と低い形式原子価でMnが存在しているため、N_2を含まない雰囲気を用いて合成することによりLi_3N型層状構造化合物が安定に得られるのではないかと考えた。実際に、Li_3N型層状化合物と逆蛍石構造窒化物合成の焼成時に通常用いられるN_2やNH_3雰囲気ではなく、Arを焼成雰囲気に採用することで、700°Cでx=2/3の組成のほぼ単相のLi_<3-x>-Mn_xNを得ることに成功した。また、様々なLi/Mn比での合成を試みたが、X線回折におけるピーク位置の変化はみられず、全パターンフィッティングより求めたa,c軸ともにLi/Mn比に因らず、ほぼ一定の値を示した。このことより、Li_<3-x>Mn_xNはx=2/3の組成のみで得られる特異な組成選択性を持ち、連続固溶体を形成しない系であることが示唆された。XAFSによる局所構造解析ではMn原子同士が等間隔に存在していることが示され、Li_2[Li_<1/3>Mn_<2/3>]Nという組成からLiとMnが規則配列している可能性が示唆されたが、平均構造を反映するX線回折測定では超格子構造の証拠を掴むには至っていない。電極特性としてはLi_3Nでは観測されない可逆容量が観測され、初期酸化/還元容量はそれぞれ380,280mAh/g程度であり、この化合物がリチウム二次電池の電極として動作することを初めて提示した。また、充電過程で鉄やコバルトを含む遷移金属含有リチウム窒化物と同様に、結晶構造が崩壊しアモルファス化して充放電反応が進むことを確認した。Li-Fe-N系の安定相は逆ホタル石型のLi3FeN2が基本的には安定相であるといわれてきた。しかし、3d遷移金属系列のLi-M-N系において安定相が逆ホタル石構造から層状構造に切り替わるのはFe-Coの境界であり、Li-Fe-Nにおいては層状構造のものも、比較的容易に合成できるのではないかと考えた。19年度のLi-Fe-N系の探索研究の中で、これまで1000度以上の高温度で、かつ鉄容器で密閉した特殊な環境でしか合成できないといわれてきた、層状構造を有するLi_<1-x>Fe_xN_3を、シンプルな固相法によって、600度付近の低温で合成することに成功した。Li/Fe比を系統的に変化させることで、X線回折ピークの連続シフトやこれに対応する格子定数の直線変化から連続固溶を確認し、メスバウア分光、組成分析などから、現在x=0.3までの固溶を確認した段階である。これは、昇温過程における金属鉄の生成を昇温中の雰囲気を窒素に設定し、Li_<1-x>Fe_xN_3が安定化する600-700度でアルゴンに置換するユニークな合成条件設定にすることで実現したものである。生成条件の特定とその機構についてはほぼ完了しており、この知見をもとに固溶限界を広げる検討を推進している。この材料系列の機能開拓の一環として、リチウム電池負極特性を調べた。初期にリチウムを対リチウム1V付近で引き抜くことができ、その容量は550mAh/gと非常に大きいものであった。その後も、1V以下の電位領域で可逆的な充放電を行えることを確認している。今後の組成や電極、充放電条件の最適化により大幅な容量向上が期待でき、非常にインパクトのある機能材料としての可能性を秘めている。今後、特許出願、外部発表を行う。様々な3d遷移金属を含有する窒化リチウムは、リチウム二次電池の負極として機能することが知られている。特に、Li_<2.6>Co_<0.4>Nにおいて優れた負極特性が報告されており、Coより安価で豊富に存在する鉄やマンガンを用いることができれば低コストかつ高容量な負極材料の実現が期待できる。昨年度は、温度プロファイルと雰囲気制御を連動させることで、これまでにない簡便かつ低温でのLi_<3-x>Fe_xNの直接固相合成に初めて成功した。昇温時に金属鉄の生成を抑制するために窒素気流を採用し、600度付近の生成時には低価数の鉄を安定化するためにアルゴンガスを採用することが有効であった。この合成法について特許出願準備中である。本年度は、この新規合成法により合成したLi_<3-x>Fe_xNについて、Feの固溶量と電極特性の相関を追跡し、Feの固溶に伴う大きな可逆容量の出現と最適な鉄ドープ量がx=0.2-0.3付近であることを確認した。充放電中の構造変化、電子状態変化についても調査を行ったところ、初期充電中にアモルファス化が進行し、その後はその状態で可逆的な充放電が行われることや、鉄の価数変化だけでは大きな可逆容量が説明できないこと、などが愛らかになった。。さらに、Li_<3-x>Mn_xNの合成を同様な方法で試みたところ、やはり低温での直接固相合成が可能であることがわかった。

しかし、x=0.66付近の組成の試料のみが選択的に得られることから、リチウムの周囲にマンガンが6個配位した形の超構造を取って安定化している可能性が示唆された。負極特性も発現するが、Li_<3-x>Fe_xN系に比べると容量はかなり小さい。単一相を得るための合成条件の抽出と、結晶構造の精密化を進めている。これまでにない簡便なLi_<3-x>Mn_xNの直接固相合成の確立を目的として研究を行った。新規合成法を探索するに当たって、逆蛍石構造とLi_3N型層状構造中でのMnの形式原子価の違いに着目した。Li_3N型層状構造中ではI価と低い形式原子価でMnが存在しているため、N_2を含まない雰囲気を用いて合成することによりLi_3N型層状構造化合物が安定に得られるのではないかと考えた。実際に、Li_3N型層状化合物と逆蛍石構造窒化物合成の焼成時に通常用いられるN_2やNH_3雰囲気ではなく、Arを焼成雰囲気に採用することで、700°Cでx=2/3の組成のほぼ単相のLi_<3-x>-Mn_xNを得ることに成功した。また、様々なLi/Mn比での合成を試みたが、X線回折におけるピーク位置の変化はみられず、全パターンフィッティングより求めたa,c軸ともにLi/Mn比に因らず、ほぼ一定の値を示した。このことより、Li_<3-x>Mn_xNはx=2/3の組成のみで得られる特異な組成選択性を持ち、連続固溶体を形成しない系であることが示唆された。XAFSによる局所構造解析ではMn原子同士が等間隔に存在していることが示され、Li_2[Li_<1/3>Mn_<2/3>]Nという組成からLiとMnが規則配列している可能性が示唆されたが、平均構造を反映するX線回折測定では超格子構造の証拠を掴むには至っていない。電極特性としてはLi_3Nでは観測されない可逆容量が観測され、初期酸化/還元容量はそれぞれ380,280mAh/g程度であり、この化合物がリチウム二次電池の電極として動作することを初めて提示した。また、充電過程で鉄やコバルトを含む遷移金属含有リチウム窒化物と同様に、結晶構造が崩壊しアモルファス化して充放電反応が進むことを確認した。
樹上性カタツムリを指標とした森林の分断化影響評価

本研究の目的は、樹上性の希少カタツムリであるサッポロマイマイ(Euhadra brandtii sapporo)を対象に、森林の分断化が与える影響を定量化することである。そのため、本研究では北海道苫小牧市において、(1)本種の密度の把握、(2)操作実験による捕食圧の定量化、(3)捕食者相の把握、の3つを実施した。また、比較のために、地表性のカタツムリであるエゾマイマイ(Ezohelix gainesi)についても同様の調査を実施した。私達はまず都市域の孤立林から連続性の高い自然林まで、面積と周囲の開発の状況が異なる9地点に3か所ずつ調査区を設置し、両種の生息密度を比較した。するとエゾマイマイは都市域の孤立した森林ほど高い密度で生息していた。一方、サッポロマイマイは、森林の連続性の高い地点ほど高密度で生息し、都市孤立林では出現しなかった。また調査地点に糸を結びつけた個体を設置したところ、エゾマイマイは、自然林の林床ではタヌキによる捕食がみられたが、都市孤立林ではそれが見られず調査期間中ほぼ100%の生存率を保っていた。地表に固定したサッポロマイマイも自然林で生存率が低下したが、樹上に固定した個体は都市孤立林と自然林ともに生存率が高かった。。これらの結果から、地上性のエゾマイマイは都市域において捕食圧が緩和され個体数が増加するが、樹上性のサッポロマイマイにはその現象がみられず、都市化による森林の分断化によって個体数が減少している可能性が示された。動物センサーカメラとピットフォールトラップによる調査から、都市化によって捕食者相の個体数が増加する傾向はみられなかった。サッポロマイマイとエゾマイマイは、分布域を共にする陸産貝類であるが、都市化に対する応答は反対の傾向を示することが明らかとなった。本研究課題は順調に進展している。開始時の計画では、樹上性のサッポロマイマイ1種のみを調査対象とする予定であったが、同所的に分布する地表性エゾマイマイも解析に加えることができたこと、またこの種が、サッポロマイマイとは正反対の都市化応答をしていたことなど、予期していなかった新しい知見を得ることができた。本研究の独創的な点の一つに、操作実験によって、樹上と地表でのカタツムリに対する捕食圧力を定量化することがある。この作業は、カタツムリに糸をつけて、生存率を調べたり、捕食の状況をビデオで記録するといったものであるが、安全かつ順調に作業を実施することができ、良質なデータを得ることができた。さらに、季節を変えて2回実験を実施できたこと、苫小牧市内では記録のなかった外来生物を発見することができたことなどの成果があった。本研究の成果は、現在、学術論文としてまとめているところである。また、今夏に開催される国際学会においても発表の予定である。上記の調査を行った際、私たちの研究チームでは、補足データとしてカタツムリの捕食者と考えられるオサムシ亜科と哺乳類・鳥類の分布データを採集した。これらは、都市化の進度によって生息状況が異なっており、それがカタツムリ2種に対してどのような影響を与えているのかについて考察をすることができた。複数の捕食者グループを対象として、捕食圧や都市化への影響を把握しようとした研究はこれまであまり例がなく、本研究の独創性を高める成果が得ることができた。さらに、都市域において外来生物の出現確率が高いことがわかり、調査対象地域である苫小牧市の生物多様性の保全管理を考えていく上でも有用な情報が得られた。このように、当初の研究計画に対する直接的な答えに加え、予想していなかった事象についても情報を得られた点で研究は順調に進展していると考える。ここまで得られたデータを論文にまとめ、学術雑誌に投稿することが当面の目標となる。これについては順調に進められているので、できるだけ早く発表できるようにしたい。地域の生物多様性保全上の課題についてもリンクさせ、アウトリーチ活動も充実させたい。林冠は豊かな生物多様性を持ちながらも観察が困難で、保全情報の乏しい生態系である。そこで本研究は、樹上性カタツムリであるサッポロマイマイを指標として、森林の分断化が樹上生物に与える影響を明らかにし、林冠部を含めた生息地の保全に寄与することを目的とする。サッポロマイマイは、北海道に固有の準絶滅危惧種のカタツムリで、動きが緩慢であるため、生息地である森林の消失や分断化の影響を受けやすい生物と予測される。2017年度は、本プロジェクトの主たる調査フィールドとして、北海道苫小牧市内に9か所の調査地点を設置した。これらは、都市域の孤立した森林(以下孤立林)から、人為的な攪乱をあまり受けていない森林が連続的に広がる自然林(以下自然林)まで、様々なタイプの森林を含むようにした。秋には、これらの調査地において、一定サイズの調査プロットを、一つの調査地点あたりに複数個所設置し、林床の落葉層を踏査して陸産貝類の種組成と個体密度を明らかにした。その結果、サッポロマイマイは自然性の高い連続的な森林に多く分布し、都市域内の孤立林ではまったく生存が確認できなかった。上記9か所の調査地点のうち、6か所において、糸を結び付けた個体を樹上と地表に固定したところ、樹上に固定したサッポロマイマイは、都市孤立林と自然林の両方で生存率が高かったが、地表に固定した個体は自然林ほど生存率が低下した。地表での死亡要因は主にタヌキやオサムシ類(オサムシ亜科に属する甲虫)による捕食であった。

ピットフォールトラップを設置してオサムシ類の生息密度を調べたところ、都市孤立林と自然林の間に有意な違いはみられなかった。これらの結果から、サッポロマイマイは、都市孤立林の樹上において生息できる潜在力がありながら、実際には生息していないため、森林の分断化によって移入が妨げられている可能性が示唆された。全体として、本研究はおおむね順調に進展していると考えられる。まず本研究では、サッポロマイマイが都市化や森林の分断化によってどのように分布密度を変化させるのかを明らかにすることが、1年目の大きな目標であった。この点については、共同研究者らで協力しあいながら、システマティックに密度調査を進めることができた。これにより、定量的解析に耐えうる、信頼性の確保されたデータを得ることができたことが成果である。また都市域では、調査可能な(すなわち、陸産貝類を探索することが可能な)森林を見つけることが難しい状況も予測されたが、幸い、調査地候補であったほとんどの森林所有者から、調査許可をいただくことができ、無事に研究をスタートさせることができた。これらの地点は、過去の航空写真の情報が公開されていたため、土地利用の変化や森林に対する攪乱の有無(すなわち森林の履歴)についても情報を得ることができた。密度調査に加え、本研究では操作実験を行う予定としていた。これについては、夏季に2週間程度実施し、安全面も含めてスムーズに必要なデータを取得することができた。特に面積の小さい孤立した森林では、地表にいるカタツムリ相を捕食する動物相の一部がいなくなるため、それらによる捕食圧が変化しうることが明らかになった。これは当初、予測していなかったことで、新たな成果として位置づけられる。この2つの調査については順調に進んだが、遺伝子解析と、学会などでの成果発表についてはあまり顕著な進捗を得ることができなかった。2年目以降は、1年目に成果を得られた部分を確実に論文などにまとめるとともに、ほかの部分についてもできるだけ研究が進むよう努力したい。特に学会発表については、本分野について知識や経験の豊かな研究者から、意見やアドバイスをもらう必要があり、できるだけ多くの場で研究を発表することをこころがけたい。本研究の目的は、樹上性の希少カタツムリであるサッポロマイマイ(Euhadra brandtii sapporo)を対象に、森林の分断化が与える影響を定量化することである。そのため、本研究では北海道苫小牧市において、(1)本種の密度の把握、(2)操作実験による捕食圧の定量化、(3)捕食者相の把握、の3つを実施した。また、比較のために、地表性のカタツムリであるエゾマイマイ(Ezohelix gainesi)についても同様の調査を実施した。私達はまず都市域の孤立林から連続性の高い自然林まで、面積と周囲の開発の状況が異なる9地点に3か所ずつ調査区を設置し、両種の生息密度を比較した。するとエゾマイマイは都市域の孤立した森林ほど高い密度で生息していた。一方、サッポロマイマイは、森林の連続性の高い地点ほど高密度で生息し、都市孤立林では出現しなかった。また調査地点に糸を結びつけた個体を設置したところ、エゾマイマイは、自然林の林床ではタヌキによる捕食がみられたが、都市孤立林ではそれが見られず調査期間中ほぼ100%の生存率を保っていた。
社会主義ポーランドにおける政治・社会変動のダイナミクス―カトリック教会を事例に―

本年は、1950年代を中心とした社会主義期のポーランドにおける、カトリック教会を中心とした社会変動と、そのような社会の変化が党や政府に与えた影響について、これまでの研究に加え、国内での地域ごとの特色や、国外のアクターとの関係に着目しつつ、研究論文を執筆した。4月27日から5月24日まで、ワルシャワの国家公文書館にて資料収集を行った。特に、社会主義期に見られる社会における諸活動と、それに対するワルシャワの中央政府や共産党幹部の反応や対応について、地方ごとの差異や特色に留意しながら、議会の議事録や党の内部文書等の記録を読み解く作業を行った。また、「民主化」を構成するダイナミクスを、これまで地方と中央、国家と社会の関係を通じて分析して来たが、本年の調査では、地方政府、企業、学校、宗教団体・移民団体などの各種団体を通じた国外とのつながり等、重層的な関係性の中から読み解く作業を行った。10月には、「宗教と社会」学会の分科会である宗教とツーリズム研究会にて、「負の文化遺産とツーリズム『アウシュヴィッツ』は誰のものか」という題にて研究報告を行った。現在、戦争遺産は、国家(国民)の記憶や追悼・慰霊、戦争責任をめぐる問題として広く取り上げられている。一方で、その戦争遺産と「共に暮らす」地元住民が、国家や、国外に拠点を持つ諸団体、国際社会(多国籍メディアや国連組織等)によって語られる「歴史」や博物館、そこへやってくる「観光客」をどのように認識しており、また、各人の歴史認識にどのようなギャップがあるかという視点から報告を行った。報告内容については既に論文にまとめており、次年度、発表予定である。また、本年の業績として、次年度刊行予定の書評がある。本年は、これまで地方都市(クラクフ)をサンプルとして明らかにして来た党・政府と教会の関係や、地方での政治や社会の変動が、中央(ワルシャワ)の政治状況とどのような関係を持っていたか、という点に力点をおきながら研究を行った。2度にわたり短期(4週間と2週間)の現地調査を行い、特にワルシャワのArchiwum Akt Nowychを中心に資料を収集した。具体的な成果としては、(1)戦後に建設が始まったコンビナート都市へ人々が集まる(動員される)過程を、エスニック・マイノリティの「ポーランド社会」への同化という視点から分析した。特に、ロマの同化政策について、前年度の調査で得たクラクフの郡・市・県レベルでの資料と、本年度の調査で得た中央政府や他県の資料を対照しながら、『現代史研究』に論文を発表した。(2)地方のコンビナート(団地)における教会建設要求の過程において、従来、暴力的な「事件」として記録されてきた出来事が実際にはどのように構成されたものであったかという視点から分析を行った。成果は日本ロシア・東欧学会の研究大会にて報告し、『ロシア・東欧研究』に論文を発表した(校正済・印刷中)。(3)ポーランドにおけるアジア研究誌に、日本におけるポーランド現代史に関する研究史を紹介する小論文を執筆した(校正済・印刷中)。現在は、上記(1)のテーマをさらに深化させるため、引き続きロマの同化に関する資料や文献を収集すると共に、戦後のユダヤ人の動員に関する研究・調査を平行して行っている。また、(2)のテーマについて研究論文を執筆している。本年は、1950年代を中心とした社会主義期ポーランドにおける社会変動と、その上うな社会の質的変化が党や中央政府に与えた影響について、これまでの研究を総括し、後の体制移行へとつながる可能性を示す研究論文の執筆を進めた。また、56月に2ヶ月間の現地調査を行い、ワルシャワのArchiwum Akt Nowychを中心に以下2点に関する資料を収集し、分析を行った。1、これまで研究してきた地方都市の住民の教会建設要求について、その上うな活動に対する党の対応、特にワルシャワの中央政府や共産党幹部の反応や対応について、議会の議事録や党の内部文書等の記録から読み解く作業を行った。成果については、一部、後述するフォーラム・ポーランドにおいて発表した。残りの成果については、研究論文として来年度中に発表する。2、昨年まで、戦後直後の経済復興・重工業化(冶金コンビナート建設)構想に力点を置いてきたが、本年より、コンビナート建設と同様に国威発揚を目指した首都ワルシャワの復興と都市計画について調査を開始した。ソ連からの援助と都市再興の具体的な計画に着目しながら、首都と地方の差異や、「伝統」の維持と創造に関わる問題について、投稿論文を執筆中である。本年度の業績としては、フォーラム・ポーランドにて、口頭発表「社会主義期ポーランドのカトリック教会:新興工業都市における教会をめぐる諸活動」を行い、また、パネルディスカッション「ポーランドのカトリックと現在」に3人のパネラーの1人として参加した。前者では、地方都市のカトリック教会を中心とした社会変動に関して説明し、後者では、現在のポーランドの若者の宗教意識やカトリック教会との関わり方について紹介した。上記の内容を基にしか論説は『フォーラム・ポーランド2008年会議録』に収録される。

特に、社会主義期に見られる社会における諸活動と、それに対するワルシャワの中央政府や共産党幹部の反応や対応について、地方ごとの差異や特色に留意しながら、議会の議事録や党の内部文書等の記録を読み解く作業を行った。また、「民主化」を構成するダイナミクスを、これまで地方と中央、国家と社会の関係を通じて分析して来たが、本年の調査では、地方政府、企業、学校、宗教団体・移民団体などの各種団体を通じた国外とのつながり等、重層的な関係性の中から読み解く作業を行った。10月には、「宗教と社会」学会の分科会である宗教とツーリズム研究会にて、「負の文化遺産とツーリズム『アウシュヴィッツ』は誰のものか」という題にて研究報告を行った。現在、戦争遺産は、国家(国民)の記憶や追悼・慰霊、戦争責任をめぐる問題として広く取り上げられている。一方で、その戦争遺産と「共に暮らす」地元住民が、国家や、国外に拠点を持つ諸団体、国際社会(多国籍メディアや国連組織等)によって語られる「歴史」や博物館、そこへやってくる「観光客」をどのように認識しており、また、各人の歴史認識にどのようなギャップがあるかという視点から報告を行った。報告内容については既に論文にまとめており、次年度、発表予定である。また、本年の業績として、次年度刊行予定の書評がある。
トランジット法による系外惑星探しを通じた新たなる天文文化の普及

研究目的:これまで太陽以外の恒星のまわりに250個以上の惑星(系外惑星)が発見されている。系外惑星の発見は惑星系形成の様子を解明するための一助となる。系外惑星の発見方法にトランジット法がある。トランジット法とは系外惑星がその主星を掩蔽するときに起こる主星のわずかな減光を検出する方法である。この方法による観測は特別な機材は必要とせず、アマチュア天文家も実施可能である。そこで自ら観測システムを構築し、系外惑星観測を行うとともに、アマチュア天文家向けの系外惑星研究会を開催し、トランジット法による系外惑星探しを通じた新たなる天文文化の普及を行うことを目的とした。研究方法と成果:観測システムの構築のため、使用しなくなった望遠鏡とCCDを貰い受け、改修を行った。当初、観測用ドームの故障が発生し、設置場所を改めて探す状況となったが、幸いにも美星天文台公園内に別の観測場所を設けることができた。観測は、すばる望遠鏡で系外惑星観測を行っている研究グループから有力な系外惑星候補天体の情報を得て、その情報を元に観測を行えるようになり、予定していた観測システムを構築することができた。その後、目標天体を精度良く追尾するためのガイドシステムの導入や望遠鏡の振動を抑える工夫を行っている。ただし、新たな系外惑星の検出には至っていない。またアマチュア天文家向けの研究会を7月21日に美星天文台で開催した。研究会には、全国から20名の参加者があり、私を含め5名の講演者により、系外惑星検出の方法、観測報告といった内容の講演が行われた。参加者の中には定年退職後に天体観測を始めようとしている方もおり、新たな天文文化の普及の第一歩を踏み出せたのではないかと考えている。研究会の様子は天文雑誌「星ナビ10月号、アストロアーツ社」や一般科学書「宇宙は"地球"であふれている、技術評論社」で取り上げられている。
電子サイクロトロン加熱の入射条件の最適化

本研究は、核融合プラズマにおいて有望な外部加熱法の一つである電子サイクロトロン加熱(ECH)の入射条件の最適化を目指すものである。昨年度まではECHの入射偏波に対してリアルタイム制御を行うことで、時間変化する電子密度分布に対して最適な入射偏波を実現し、高効率加熱の長時間維持に成功した。一方で、カットオフ密度の半分程度の高密度プラズマにおいては、屈折の効果により、一回通過吸パワーの減少が観測された。入射偏波に加えて、デポジション位置の制御による一回通過吸収効率の改善が必要であることが明らかになった。そこで今年度は入射ターゲット位置も制御するリアルタイム制御系を構築した。様々な入射ターゲット位置と様々な電子密度分布に対するデポジション位置と吸収効率を、開発・改良した光線追跡コードを用いて評価し、その結果に関するデータベースを構築し、FPGA(Field Programmable Gate Array)を用いたリアルタイム制御系に実装した。電子密度分布は、磁気軸位置での密度、LCFS位置での密度、そしてホロー分布の肩の位置での密度で特徴付けられるとした。大型ヘリカル装置(LHD)において、デポジション位置のリアルタイム制御の実証実験を行った。数秒の放電パルスの間にガスパフにより、平均密度がカットオフ密度の半分程度まで増加するようなプラズマに対して制御を行った。入射アンテナのミラーの向きは2軸のモータにより変えられるようになっている。モータ回転速度の範囲内でアンテナは指令値に追随した。制御により、カットオフ密度の半分以下の密度領域で、制御が無い場合に比べて高効率加熱をより長く維持できていることが分かった。また電子サイクロトロン放射計測の変調信号成分の解析により、デポジションのピーク位置をプラズマ中心側により長く維持できていることも分かった。本研究は、核融合プラズマにおいて有望な外部加熱法である電子サイクロトロン加熱(ECH)の高効率化を目的としている。大型ヘリカル装置(LHD)プラズマにおいて、電子密度分布が電子サイクロトロン(EC)波の正常波(O)モードあるいは異常波(X)モードの純粋励起に与える影響を数値的に調べた。その結果、主に周辺プラズマ領域においてEC波のO/Xモード結合が発生することを見出した。これは電子密度分布に応じた入射ミリ波偏波の最適化が必要であることを示している。この結果に基づいて、FIRレーザー干渉計による電子密度分布を用いた入射ミリ波偏波のリアルタイム制御系を構築した。ホストコンピュータに依存しないスタンドアローンな制御システムをFPGA (Field Programmable Gate Array)を用いて構築することで長時間パルス放電にも対応可能なものとした。磁気面上における電子密度分布をリアルタイムで算出し、高速回転可能な偏波器をECHの伝送系に備えることで、0.5 Hz程度の密度変調信号にも最適な偏波が追随して入射することができる。放電後に得られるトムソン散乱計測による電子密度分布と比較して、制御に影響が発生する差異は発生していないことを確認した。LHDプラズマ実験における初期結果として、放電中に電子密度を緩やかに増加させると、制御を行わない場合はプラズマへのパワー吸収率は低下するだけだったのに対して、制御を行うことにより、高効率を維持することに成功した。これは電子密度分布に応じて、最適な偏波をリアルタイムで算出して偏波器を回転制御することで、加熱するモードが純度良く励起されたことを示している。研究実施計画に基づいて研究が進展していると考えている。LHDプラズマにおいて、電子密度分布と磁気シアがEC波のO/Xモード結合に与える影響を定量的に調べることで、入射ミリ波の最適化制御のためのモデルを構築することができた。それから実際に、FIRレーザー干渉計による電子密度分布を用いた入射ミリ波偏波のリアルタイム制御系をFPGAを用いて実装することができた。この制御システムはLHDプラズマの電子密度分布の時間変化に十分追随して入射偏波の制御が可能になっている。LHDプラズマ実験における初期的なデモンストレーションに成功し、電子密度分布の変化に応じて入射ミリ波偏波が制御され、ECHの加熱効率を高い状態に維持することができた。この制御はパルス時間に依らず可能であり、定常実験や長時間パルス放電にも適用できるため、将来の核融合プラズマのECHによる立ち上げ時にも活用できることを示すことができた、という点において研究が順調に進展していると判断している。本研究は、核融合プラズマ実験におけるプラズマ加熱法の一つである電子サイクロトロン加熱(ECH)の入射条件の最適化を目指すものである。大型ヘリカル装置(LHD)において、ECHの入射偏波をFPGA (Field Programmable Gate Array)を用いてリアルタイムで制御するシステムを開発し、LHD実験において原理実証を行った。放電中に時間発展する電子密度分布に対して最適な入射偏波をリアルタイムで計算し、偏波器を制御することで、実験的に加熱効率を最大化することができた。放電後に得られるトムソン散乱計測結果とプラズマ平衡の情報を元に、正常波(O)モードと異常波(X)モードの励起率について解析した結果、制御モデルの基となっている数値計算モデルの有効性を示すことができた。入射偏波だけでなく入射方向をリアルタイム制御し、時間発展する電子密度分布や電子温度に対して、目的の加熱位置を実現するための制御系ハードウェアを構築した。また制御対象である入射アンテナの動作時間特性を調べた。上記制御系の応用として、入射インターロックシステムを開発し、電子密度や不純物発光ラインを用いたプラズマ状態監視を行うことで、非効率な加熱条件時にジャイロトロンをON/OFF制御できるようにし、プラズマ加熱の安定的なオペレーションを可能とした。

3次元full waveシミュレーションコードを開発し、入射偏波が電子サイクロトロン波の伝搬に与える効果について初期結果を理論的に示した。円偏波の回転の向きによって、伝搬軌道が異なることを示した。この初期結果は光のスピン角運動量と軌道角運動量の相互作用から生じる効果(光のスピン・ホール効果)であることを、磁化プラズマ中におけるプラズマ波動の伝搬においても示したことを意味する。研究実施計画に基づいて研究が進展していると考えている。LHDプラズマにおいて、ECHの入射系をFPGAを用いてリアルタイムで制御するシステムを順調に開発することができている。放電中にリアルタイムで利用できる限られた計測から、ECHの入射偏波の最適化を求めて制御した結果と、放電後に得られる計測から再計算した結果とが良い一致を示しており、制御モデルの有効性を示すことができている。FPGAを用いたリアルタイム制御のやり方を入射方向や入射インターロックの制御にも応用しているところである。よりモデル精度の高い3次元full waveシミュレーションコードを開発したことで、入射偏波が電子サイクロトロン波の伝搬軌道に与える効果について初期結果を理論的に示したことは予想していなかった結果である。この効果がLHDプラズマのような磁化プラズマにおいてECHの入射条件の最適化にどの程度寄与するのか、という新たな課題が発生したが、本研究全体として見れば、研究が順調に進展していると判断している。本研究は、核融合プラズマにおいて有望な外部加熱法の一つである電子サイクロトロン加熱(ECH)の入射条件の最適化を目指すものである。昨年度まではECHの入射偏波に対してリアルタイム制御を行うことで、時間変化する電子密度分布に対して最適な入射偏波を実現し、高効率加熱の長時間維持に成功した。一方で、カットオフ密度の半分程度の高密度プラズマにおいては、屈折の効果により、一回通過吸パワーの減少が観測された。入射偏波に加えて、デポジション位置の制御による一回通過吸収効率の改善が必要であることが明らかになった。そこで今年度は入射ターゲット位置も制御するリアルタイム制御系を構築した。様々な入射ターゲット位置と様々な電子密度分布に対するデポジション位置と吸収効率を、開発・改良した光線追跡コードを用いて評価し、その結果に関するデータベースを構築し、FPGA(Field Programmable Gate Array)を用いたリアルタイム制御系に実装した。電子密度分布は、磁気軸位置での密度、LCFS位置での密度、そしてホロー分布の肩の位置での密度で特徴付けられるとした。大型ヘリカル装置(LHD)において、デポジション位置のリアルタイム制御の実証実験を行った。数秒の放電パルスの間にガスパフにより、平均密度がカットオフ密度の半分程度まで増加するようなプラズマに対して制御を行った。
卵巣顆粒膜細胞の黄体化に関与する転写因子に関する検討

顆粒膜細胞・莢膜細胞の黄体化は哺乳類の生殖に極めて重要な役割を果たす現象である。その調節にはgonadotropinのみならず、prostagrandins・cytokines・lowmolecilar weightpeptideなどが複雑に関与することが近年明らかにされつつある。しかしながら、黄体化に関与する細胞内因子・分化制御因子に関する研究はほぼ皆無である。そこで我々は、細胞分化に関与するHOMEO-BOX遺伝子のうち特に細胞分化の最終分化過程に関与することが報告されているPOU domain遺伝子群に視点を当て、顆粒膜細胞・莢膜細胞の黄体化過程において発現量が変動するPOU domain遺伝子群のcDNAクローニングを試みた。遺伝子群に保存されたアミノ酸配列を基に合成された混合プライマーを用いて関連配列を増幅しpCRIIベクターにサブクローニングしdideoxy法により塩基配列を決定した。Oct-2,Oct-1,SCIP等の該当部位の配列に一致するクローンを得た。さらに、未熟ラットの排卵誘発モデルを用いてOCT-2,SCIPにつき発現動態を検討した。残念ながら、現在まだはっきりとした結論を出すには至っていない。
マウス嗅覚系におけるCO2センサー細胞の発達と機能の分子機構

マウスは嗅覚により大気中のCO_2濃度の微妙な変化を感知して、忌避的に行動することが知られている。これまでに嗅上皮に存在するCO_2センサー細胞の実体として、炭酸脱水酵素をセンサーとして持つ嗅細胞サブタイプの存在が報告されていた。私達の研究により、マウス嗅上皮にはさらに複数種類の、新規CO_2応答細胞が存在することが明らかとなった。マウスはこれらの細胞を組み合わせることにより、CO_2濃度やその原因となる周囲の状況を判断していると考えられる。マウスは嗅覚を用いて大気中のCO_2濃度を感知し、忌避的に行動する。マウス嗅上皮には、CO_2に反応する嗅細胞のサブタイプ(Car2細胞と略称)が存在し、センサーである炭酸脱水酵素Car2と独自のcGMPシグナル経路を持つ。しかしながら、通常の嗅細胞とCar2細胞との間で、センサーやそのシグナル経路も含めたシステムの違いがどのように生み出されるのか?という点は、これまで全く研究されていない。私達は最近、形態形成因子BMP7と転写因子Pax6が、共にCar2細胞特異的に発現することを見出している。そこで本年度の本研究では、レンチウイルスや遺伝子改変マウスを用いて、これらCar2細胞特異的な遺伝子を通常の嗅細胞に発現させ、その影響を検討した。しかしながら、これらの遺伝子の異所発現により、Car2細胞の細胞分化や神経回路形成過程に顕著な変化は見られず、BMP7やPax6はCar2細胞の発達過程には関与しないと考えられる。現在、これらの遺伝子がCO_2感知などの機能面に寄与する可能性を、Ca2+イメージング法により解析している。また非常に興味深いことに、本年度の私達の研究において、マウスの嗅上皮にはCar2細胞以外にも新規のCO_2応答細胞が複数種類存在することを見出した。この結果は、マウスが複数のCO_2応答細胞の組み合わせにより、CO_2濃度やその原因となる周囲の状況を判断している可能性を示唆している。今後、これらの新規CO_2応答細胞の解析も同時に行い、哺乳類の嗅覚系におけるCO_2感知システムの全体像を明らかにすることを目指す。マウスはその鋭敏な嗅覚により、大気中のCO_2濃度の微妙な変化を感知して、忌避的に行動することが知られている。マウスの嗅上皮には、CO_2に反応する嗅細胞のサブタイプ(Car2細胞と略称)が存在し、センサーである炭酸脱水酵素Car2と独自のcGMPシグナル経路を持つことがこれまでに報告されている。私達の昨年度の本研究により、マウス嗅上皮には既知のCO_2応答細胞であるCar2細胞以外に、複数種類の新規CO_2応答細胞の存在が明らかとなった。そこで本年度は、マウスの嗅上皮に存在するこれら複数種類のCO_2応答細胞について、CO_2やそれ以外の匂い物質に対する反応性の差異や、CO_2センサーの実体について研究を行った。その結果、Car2陰性のCO_2応答細胞は、直接CO_2に反応するタイプと、CO_2濃度の上昇に伴うpH変化に反応するタイプに分けられることが明らかとなった。さらに、新規のCO_2応答細胞の半分は、炭酸脱水酵素阻害剤によりCO_2への応答が阻害され、Car2以外の炭酸脱水酵素をCO_2センサーとして持つことが予想された。また、cAMPシグナル経路で働くアデニル酸シクラーゼの活性化剤であるフォルスコリンで処理すると、Car2陰性のCO_2応答細胞の活性化が見られた。Car2細胞はcGMPシグナル経路を持つことが知られているが、私達が見出した新規のCO_2応答細胞はCar2細胞とは異なり、cAMPのシグナル経路を持つことが明らかとなった。以上の研究から、マウスは嗅上皮に複数種類のCO_2応答細胞を持ち、それらを組み合わせることにより、CO_2濃度やその原因となる周囲の状況を判断している可能性が示唆された。
EF-ハンド蛋白質ALG-2の核内および生体膜におけるカルシウム応答反応制御機構

小胞体からゴルジ体への蛋白質の初期分泌過程において、小胞体出芽部位へのALG-2のCa2+依存的集積は、COPII小胞外殻構成因子Sec31AとアネキシンA11をCa2+依存的に結合させ、モデル積荷膜蛋白質の輸送を遅延させ、またTFG蛋白質の多量体化に関与することを明らかにした。ALG-2とSec31Aペプチド複合体のX線結晶構造解析および両蛋白質の変異体解析による結合配列の精査により、新規ALG-2結合モチーフを提唱した。このモチーフ含有蛋白質の探索により、ER膜を貫通した新規ALG-2相互作用因子を発見した。ALG-2がCa2+応答性転写因子NFATの活性を抑制することを見出した。我々は、5つのEF-ハンド(ヘリックス-ループ-ヘリックス型Ca2+-結合モチーフ)をもつALG-2が二量体を形成し、相互作用因子同士を連結させるCa2+依存的アダプター機能をもつこと、そして、相互作用因子のALG-2結合モチーフが2種類に大別されることを明らかにしてきた。本研究は、動物細胞内において核内ならびに内膜系におけるALG-2依存的カルシウム応答制御機構に焦点をあて、ALG-2と新規相互作用因子が果たす役割を分子レベルで明らかにすることを目的としている。小胞体(ER)からゴルジ体に輸送されるタンパク質は、ER膜上の特定の部位からCOPII小胞が出芽するが、COPII小胞外殻タンパク質複合体の構成成分Sec31AはALG-2のアダプター機能によってER膜上のannexinA11と結合することが明らかになった。一方、Sec31AペプチドとALG-2のX線結晶構造解析および変異体解析により分子認識機構を明らかにした。そして結合配列を精査することにより新たな結合モチーフを提唱した。そしてこのようなモチーフの条件を満たす膜貫通あるいは核内タンパク質を含む10以上のタンパク質をデータベースより抽出し、cDNA断片を緑色蛍光タンパク質発現ベクターに挿入し、動物細胞で発現させ、ALG-2との相互作用を共免疫沈降およびファーウェスタン解析を行った結果、いくつかの陽性クローンが得られた。一部のものについては、全長クローンを取得し、共焦点レーザー顕微鏡による細胞内局在解析を行った。内在性タンパク質を認識するとされる市販抗体は感度が悪く、本研究に供することができなかったため、今後は特異性の高い抗体を自前で取得することが必要である。結合モチーフをもつにもかかわらず、ALG-2との結合が検出されないクローンも存在したため、モチーフをさらに精査する必要がある。我々は、5つのEF-ハンド(penta-EF-hand)をもつALG-2が二量体を形成し、相互作用因子同士を連結させるCa2+依存的アダプター機能をもつことを明らかにしてきた。本研究は、動物細胞内において核内ならびに内膜系におけるALG-2依存的カルシウム応答制御機構に焦点をあて、ALG-2と新規相互作用因子が果たす役割を分子レベルで明らかにすることを目的とした。前年度までの研究で、PLSCR3およびSec31Aに存在する2型結合配列を精査することにより新たな結合モチーフを提唱した。本年度はこのようなモチーフの条件を満たす膜貫通あるいは核内タンパク質を含む10以上のタンパク質をデータベースより抽出し、cDNA断片を緑色蛍光タンパク質(GFP)発現ベクターに挿入し、動物細胞で発現させ、ALG-2との相互作用を共免疫沈降(CoIP)およびファーウェスタン(FW)解析を行った結果、膜貫通タンパク質を含めいくつかの陽性クローンが得られたが、モチーフをもつにも関わらず有意な結合が検出されなかったものも存在した。ALG-2との結合はモチーフの存在とともに、結合モチーフが天然変性領域に存在するか否か、構造的柔軟性の高さが重要である可能性が示唆された。一方、転写因子NFAT1の制御領域にALG-2結合モチーフ様配列が存在するため、ALG-2との結合能を調べた。GFP融合NFAT1はCa2+依存的にALG-2と結合することが判明したが、2型モチーフ様配列を欠損させるとALG-2の結合能が低下するものの、依然として結合能が残存するため、複数の部位に結合、あるいは間接的に結合する可能性が示唆された。また、ALG-2の過剰発現はNFAT1応答性プロモーターの転写活性化能を減少させる傾向にあり、ALG-2結合と機能との間に相関が有るか否かが今後の検討課題である。さらにMISSL、CDIP1、TFGがALG-2と結合することを明らかにし、小胞輸送、細胞死への関与を検討した。新規ALG-2相互作用因子探索において、結合モチーフに基づいたデータベース検索は有効であったが、結合の強弱はモチーフのみならず、周辺領域を含めた構造的柔軟性が大きく影響し、天然変性領域予測を加味することで信頼度が増すことが判明した。今後は新規相互作用蛋白質として、小胞体膜貫通蛋白質として報告されている3種類の因子と核内で作用する転写因子1種類について機能を含めて解析する方向性が定まったモチーフに基づきALG-2の新規相互作用因子を探索し、動物細胞内において核内ならびに内膜系におけるカルシウム応答制御機構に焦点をあて、以下の研究成果を得た。(1) 2型結合モチーフ含有蛋白質のcDNA断片を緑色蛍光タンパク質発現ベクターに挿入し、動物細胞で発現させ、高輝度ルシフェラーゼを融合させた組換体ALG-2を調製し、これをプルダウンして発光活性を測定する新たな定量的結合解析方法を確立した。この結果、ALG-2との結合にはモチーフの存在だけでは不十分であり、モチーフおよび前後の領域が天然変性領域に存在することが重要であることが示唆された。

小胞体膜貫通蛋白質SARAFの特異的抗体を調製し内在性のSARAFがALG-2と相互作用することを共免疫沈降法により明らかにした。(2)NFAT3にもALG-2結合モチーフ様配列が存在するため、ALG-2との結合能を調べた結果、ALG-2との相互作用が確認された。NFAT応答配列をもつルシフェラーゼレポーター系を用いた実験において、ALG-2を過剰発現させると転写が抑制された。しかし、1型あるいは2型モチーフとは結合しないALG-2変異体によっても阻害効果が観察され、従来とは異なる相互作用様式が示唆された。(3)ALG-2はTFGとカルシウム依存的に結合し、TFGを重度に多量体化することが判明した。(4)ALG-2と相互作用するMISSLが分泌性アルカリフォスファターゼを用いたモデル実験において、ALG-2とともに分泌制御していることが強く示唆された。(3)国際共同研究により、ALG-2との相互作用因子であり、リン脂質と結合するannexinA11の遺伝的変異は、細胞内で凝集体を形成したり、S100A6との結合能が低下し、家族性や孤発性の筋萎縮性側索硬化症(ALS)の原因の一つとなっていることが判明した。小胞体からゴルジ体への蛋白質の初期分泌過程において、小胞体出芽部位へのALG-2のCa2+依存的集積は、COPII小胞外殻構成因子Sec31AとアネキシンA11をCa2+依存的に結合させ、モデル積荷膜蛋白質の輸送を遅延させ、またTFG蛋白質の多量体化に関与することを明らかにした。ALG-2とSec31Aペプチド複合体のX線結晶構造解析および両蛋白質の変異体解析による結合配列の精査により、新規ALG-2結合モチーフを提唱した。このモチーフ含有蛋白質の探索により、ER膜を貫通した新規ALG-2相互作用因子を発見した。ALG-2がCa2+応答性転写因子NFATの活性を抑制することを見出した。COPII小胞外殻構成因子であるSec31AペプチドとALG-2複合体のX線結晶構造の精密化を行い、また変異体解析により結合モチーフの精査を行った。この結果は学術専門雑誌に投稿し、受理され既に公開された。本研究ではこの精査した結合モチーフをもとに、新たなデータベース検索により得られた候補の発現産物のALG-2結合能解析を行い、新規相互作用蛋白質候補を5つに絞ることまで進んだ。これらの因子の幾つかは膜貫通領域をもっており、オルガネラ膜を貫通した状態で機能すると考えられ、今後の細胞内局在解析と機能解析に価値ある知見が得られた。しかし、結合モチーフをもつにもかかわらず、ALG-2との結合が検出されないクローンも存在したため、モチーフをさらに精査する必要性が生じた。また、研究分担者はSec31AがアネキシンA11とALG-2を介して結合するが、アネキシンA11とALG-2ともにER-Golgi輸送制御に関わっていることをモデル積荷タンパク質の細胞生物学的、生化学的解析により明らかにし、学術専門雑誌に掲載した。