hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
頭頸部がんにおける表皮成長因子受容体ファミリー遺伝子の変異解析とその薬剤感受性

平成21年度は頭頸部扁平上皮がん82検体を用い、表皮成長因子受容体(EGFR)の全長について遺伝子変異の検索を行いました。その結果、6検体(7%)でEGFR遺伝子に変異を認めました。1つはL858Rといわれる肺がんで2番目に多い遺伝子変異でしたが、その他にこれまで報告のない4種の新しい遺伝子変異を認めました。そのうち3つはいわゆる一塩基置換によるアミノ酸置換(E709K、V765G、G1022S)で、残る1つは3塩基付加による1アミノ酸付加変異(ins770G)でした。興味深いことにこれらの変異は他のがん種でも高頻度に変異が認められた、エクソン19、21に位置し、これらのエクソンが機能上、がん化に強くかかわる活性部位であることがわかりました。逆に一部のがん種で報告されている細胞外ドメインのEGF結合部位の変異は1例も認めませんでした。これら新しく発見した変異型EGFRのベクターを作製し、Ba/F3細胞(増殖するためにインターロイキン2が必要な細胞株)に過剰発現させるようにウイルスを用いて導入したところ、V765G以外の変異型EGFRを導入したBa/F3細胞はインターロイキン2非存在下で増殖するようになりました。タンパク質レベルでEGFR下流の信号伝達系を検討すると、EGFRのリン酸化部位を常時リン酸化(活性化)し、さらに下流に位置するStat3を常時リン酸化(活性化)し、腫瘍原性を示すことがわかりました。次いで、これらの変異型EGFRを導入したBa/F3細胞に2種のEGFR阻害剤(erlotinibとCL-387,785)を投与したところ、これらの薬はEGFRのリン酸化を阻害し、さらにStat3のリン酸化をも阻害し、細胞増殖を阻止することがわかりました。つまり、これらの変異型EGFRはこれら阻害剤に程度の差はありますが感受性を示す変異であることがわかりました。平成22年度は頭頸部扁平上皮がん96検体を用い、表皮成長因子受容体(EGFR)の下流に位置し、重要な信号伝達ネットワークを形成しているK-Ras、B-Raf、PIK3CAについてその遺伝子変異検索を行いました。方法はそれぞれの遺伝子の遺伝子変異のホットスポット、K-Rasにおいてはエクソン1、2、B-Rafにおいてはエクソン15、PIK3CAにおいてはエクソン9、20について遺伝子変異の検索を行いました。その結果、6検体(6%)で変異を認めました。B-Rafエクソン15の遺伝子変異は今回の解析では認められませんでした。K-Rasの遺伝子変異は3検体から検出され、すべてエクソン1のG12Aというアミノ酸配列を変える一塩基置換でした。PIK3CAの遺伝子変異も3検体から検出されましたが、E454Kというエクソン9の一塩基置換が2検体から、またH1047Rというエクソン20の一塩基置換が1検体から検出されました。これらはすべて他のがん種においてすでに報告されている遺伝子変異でした。次いで、これら下流分子の遺伝子変異を認めた検体において、EGFRの状態について比較検討しました。その結果、全ての検体においてEGFR蛋白は過剰発現をしておりました。しかし、EGFR蛋白から下流への信号伝達の活性化の有無をEGFR蛋白リン酸化部位のリン酸化状態を用いて検討しましたが、1検体のみ過剰にリン酸化しておりましたが、多くではEGFRからの活性化シグナルは関与していないことが示唆されました。平成23年度は頭頸部扁平上皮がん患者の原発巣92検体及びそのうちリンパ節転移巣のある検体31ペアを用い、表皮成長因子受容体(EGFR)ファミリー遺伝子の遺伝子変異に原発巣と転移巣で差異があるか解析を行いました。具体的にはEGFRについては全長で変異解析、その他HER2、HER3、HER4についてはキナーゼドメインの変異解析を行いました。その結果、原発巣92検体中6検体でEGFR遺伝子の変異を認めました(6/92=6.5%)。これらはL858Rが2検体、E709Kが1検体、D770 ins Gが1検体で、これらにはリンパ節転移巣もありました。V765G、G1022Sが1検体ずつありますが、これらにはリンパ節転移巣はありませんでした。D770 ins Gの検出された検体からはHER2遺伝子変異(K716E)も検出されました。胃がんや乳がんの報告例に比べて低い陽性率(1/92=1.1%)でした。一方HER3、HER4の遺伝子変異は1検体も認められませんでした。リンパ節転移巣についてはHER2、HER3、HER4の遺伝子変異は1検体も検出されず、原発巣でL858Rの遺伝子変異がEGFRに認められた1検体においてのみ、同様にL858R遺伝子変異が検出されました。この検出率の乖離については、リンパ節組織というヘテロな細胞集団の中で腫瘍細胞の割合が低いことに起因しているのかもしれません。以上のようなEGFRファミリー遺伝子の遺伝子変異解析を行い、いくつかのこれまでに報告されていない遺伝子変異を発見しましたので、それらについてその腫瘍原性について、BaF3細胞を用いた実験系で解析いたしました。

その結果EGFRのE709K、D770 ins G変異は既報のL858R変異と同様にBaF3細胞をIL-3非依存性に活性化することができ、その機序にはEGFR及び下流のSTAT-3が常時リン酸化され活性化していることが関与していると考えられました。EGFR阻害剤に対する感受性は、E709Kは感受性を示しましたが、D770 ins Gは比較的耐性を示すことが判明しました。
アモルファスシリコン/結晶糸薄膜半導体タンデム太陽電池の基礎研究

アモルファスシリコン(a-Si)を上部セル、結晶系シリコンを下部セルとするタンデム太陽電池を設計、試作、およびグラフォエピタキシーによるGe薄膜成長実験を行い以下の成果を得た。1.タンデム型太陽電池について独自の設計プログラムを開発し、理論効率並びに最適構造を検討するとともに、これまでの設計法の相異について議論した。その結果、最適禁止帯幅は、上部セルが1,7ev1.8ev、下部セルが1.21.3evにあり、本研究でとり上げたa-Siとc-Siが理想的な組み合わせであることがわかった。次に下部セルの最適薄膜を求めるために行った計算の結果、上部a-Siセル厚さ0.5μmで約20μmを得、このときの理論変換率は、24.2%であった。2.理論効率を実現するための技術課題を明らかにするために、本年度は単結晶Sip-n接合を下部セルとしてタンデムセルを試作した。その結果、15.04%の変換効率(2端子タンデムセルで世界最高)を得ることができた。理論出力特性と比較したところ、さらに高効率化を行うためには、光電流を増加させる必要がありITO成長の低温化、光閉じ込め効果の利用、正孔拡散長の増加が今後の課題であることが分った。3.このような結晶性薄膜を作製する手法の開発をめざして、グラフォエピタキシー成長に関する基礎実験も合わせて行った。とくに、シリコン単結晶薄膜製造法の確立への可能性を探るため、Siと同族で結晶系が等しくより低温で成長が可能なGeをとり上げた。今回特にわれわれが独自に開発したピラミッド型基板を成長物質とのぬれ性を、各種金属を用いて制御することにより、成長結晶の配向性が大きく変化することがわかった。また、Geと共晶を作るAuおよびAlを合わせて堆積することにより、共結晶温度付近の温度でレーザ再結晶化することにより配向性が強まることを見い出した。
空間グラフの階層構造と代数的不変量の研究

3次元球面に埋め込まれたグラフの幾何学的性質を低次元トポロジーの立場から調べる空間グラフ理論について,基礎及び応用研究を行なう.本研究では,空間グラフの大域的階層構造を具体的に計算可能な代数的不変量を用いて解明する.特に代数的トポロジーに根ざした不変量に着目する点,そして化学における分子トポロジーへの応用を想定する点が大きな特徴である.具体的には,1空間グラフの補空間の基本群の間の全射準同型の存在性に基づく階層構造とねじれAlexander不変量の研究, 2線形空間グラフの結び目内在性に基づく階層構造とホモロジー不変量の研究,の2つを柱に据え,空間グラフの大域的階層構造の深い理解を目指す.3次元球面に埋め込まれたグラフの幾何学的性質を低次元トポロジーの立場から調べる空間グラフ理論について,基礎及び応用研究を行なう.本研究では,空間グラフの大域的階層構造を具体的に計算可能な代数的不変量を用いて解明する.特に代数的トポロジーに根ざした不変量に着目する点,そして化学における分子トポロジーへの応用を想定する点が大きな特徴である.具体的には,1空間グラフの補空間の基本群の間の全射準同型の存在性に基づく階層構造とねじれAlexander不変量の研究, 2線形空間グラフの結び目内在性に基づく階層構造とホモロジー不変量の研究,の2つを柱に据え,空間グラフの大域的階層構造の深い理解を目指す.
成炭酸塩の凝集同位体を用いた気温復元

本研究は,申請者が所属する研究室で近年運用を開始した炭酸凝集同位体温度計(Carbonate clumped isotope thermometry)を,鍾乳石の一種である石筍や河川性炭酸塩堆積物(トゥファ)試料などの陸上炭酸塩堆積物に適用し,過去数万年間の日本陸域における気温変化史とそれに伴う降水現象変動史を定量的に解明することで,本邦陸域における標準的な気候変動記録を提示することを目的としている。また,他複数の論文を作成し,投稿準備中である。これらの成果公表に並行して,岐阜県郡上市からすでに採取された石筍試料の分析を行っている他,国内関東地方を中心に,新たな石筍試料の採取も行った。既存試料の分析から計画時の期待以上の結果が得られたために,順調に成果公表を行えている。また,新規試料の採集や分析も順調である。現在までに得られているデータについて,国内外の学会で報告する他,国際誌への投稿を順次行う予定である。これらの公表作業に加え,未分析試料及び追加試料の分析作業を順次行う予定である。本研究は,欧米を中心に発展し,申請者が所属する研究室でも近年運用を開始した炭酸凝集同位体温度計(Carbonate clumped isotope thermometry)を,石筍やトゥファなどの陸上炭酸塩堆積物に適用し,過去数万年間の日本陸域における気温変化史とそれに伴う降水現象変動史を定量的に解明することで,本邦陸域における標準的な気候変動記録を提示することを目的としている。広島県高原町・新潟県糸魚川市・三重県大紀町・岐阜県郡上市から採取された石筍試料は,U-Th法によって形成年代が与えられ,過去数万年スケールでの安定酸素同位体プロファイルが整備された。1試料で4時間程度を要する炭酸凝集同位体の測定は,それぞれの石筍試料あたり2050点でおこない,測定結果の絶対温度キャリブレーションには,361 °Cの安定温度下で人工的に析出させたカルサイトと,沈殿温度が毎月観測された天然のトゥファ(岡山県下位田・愛媛県城川)を用いた。石筍の凝集同位体測定結果には,氷期と間氷期の明瞭な気温差などが示されており,現在,酸素同位体プロファイルとの相互比較から,本邦陸域における気温と降水量の共変動史を復元している。今後は石筍試料中の凝集同位体測定の時間的解像度を増し,さらに詳細な気温変動史の解明を目指すほか,追加試料の採取・分析を予定している。現在までの研究成果は,地質学会と日本地球惑星科学連合大会で公表しており,一編の論文を国際誌に投稿中,また複数の論文を作成中である。既存試料の分析から計画時の期待以上の結果が得られており,当初の計画では二年目以降に予定していた成果の公表を既に始めることができている。既に分析をおこなっている石筍試料について,凝集同位体の測定点を増やすほか,未分析試料及び追加試料を順次分析する。また,現在までに得られている成果を,引き続き国内外の学会や論文で公表していく予定である。既存試料から,今年度の研究に充分な分析と成果の報告ができたことから,試料採取にかかる国内旅費,試料年代決定のための国外旅費がかからなかったことが主たる理由である。翌年からは追加試料の採取及び年代分析を行う計画であり,旅費の計上が大幅に増える見込みである。既存試料から,今年度の研究に充分な分析と成果の報告ができたことから,試料採取にかかる国内旅費,試料年代決定のための国外旅費が予定よりかからなかったことが理由である。翌年度は,九州大学での凝集同位体分析や台湾大学での年代分析のため旅費の計上が増える見込みである。
アルキニルおよびアルケニルホスフィンを出発物質とする新配位子群の創製とその利用

近年、嵩高いリン配位子が遷移金属触媒反応の配位子として有用であるとして注目を集めている。しかしながらその一般的な合成法は限られており、合成できるリン配位子にも制限がある。したがって新たな嵩高いホスフィンの合成法の開発は重要かつ魅力的な研究課題である。この背景のもと、1-アルキニルホスフィン誘導体を出発物質とする嵩高いヘテロアリールホスフィンの合成法の開発を目指して種々の反応の検討を行った。その結果、パラジウム触媒と塩基の存在下、レアルキニルホスフィンスルフィドにN-アルキル-2-ヨードアニリンを作用させると環化反応が進行し、2-インドリルホスフィンスルフィドが高選択的に良好な収率で得られることを見いだした。得られたホスフィンスルフィドはラジカル脱硫条件下において容易に対応する三価のホスフィンに誘導することができる。生成物はリン原子に隣接する位置に1-アルキニルホスフィンスルフィド由来の置換基を有しておりリン原子周りが非常に嵩高くなっている。従来ヘテロアリールホスフィンはヘテロ芳香族化合物のリチオ化とそれに引き続くクロロホスフィンに対する求核置換反応によって合成されている。この方法ではリン原子の導入前にあらかじめヘテロ芳香族化合物を合成する必要があり3位に導入できる置換基にかなりの制限があった。これに対し今回見いだした方法はヘテロ芳香環の構築とリン原子の2位への選択的導入ならびに3位への置換基の導入が同時に起こるという特徴を有しており、これまでに導入が困難であった置換基の3位への導入が可能となった。また、この方法を用いて新たに合成したホスフィンが電子豊富な塩化アリールの鈴木-宮浦カップリング反応の配位子として有用であることも明らかにした。1-アルキニルホスフィン誘導体を用いた新規ホスフィンの合成を目的として以下の二つのテーマについて研究を行った。1.ロジウム触媒を用いた1-アルキニルホスフィンスルフィドと1,6-ジインとの形式的[2+2+2]環化付加反応近年、リン原子周りが嵩高い有機ホスフィンが遷移金属触媒反応における有用な配位子として注目を集めている。そこで、1-アルキニルホスフィン誘導体と1,6-ジインの形式的な[2+2+2]環化付加反応が進行すれば新たな嵩高いホスフィン類の合成法になると考え研究に着手した。その結果、カチオン性ロジウム触媒を用いることにより1-アルキニルホスフィンスルフィドと1,6-ジインの形式的な[2+2+2]環化付加反応が進行し、リン原子のオルト位に置換基を有する嵩高いアリールホスフィンスルフィドが得られることを見いだした。この反応で得られるアリールホスフィンスルフィドはトリス(トリメチルシリル)シランを用いたラジカル還元反応により容易に3価のホスフィンに還元できる。この手法により合成される嵩高いアリールホスフィンは他の方法では合成が困難であり、新たな嵩高い配位子としての利用が期待される。2.ロジウム触媒を用いた1-アルキニルホスフィンと水との反応1-アルキニルホスフィンを基質として用いた新規合成反応の開発を目的として検討を行っていたところ、ジオキサン/水混合溶媒中、1-アルキニルホスフィンに対してロジウム触媒を作用させ加熱還流すると、1-アルキニルホスフィンと水が反応し、E体の1-アルケニルホスフィンオキシドが得られることが明らかとなった。この反応では炭素-リン結合の開裂という現象が起こっており興味深い。有機ホスフィンは、反応剤、遷移金属錯体の配位子、高機能性有機材料として用いられ、有機化学において必要不可欠な化合物群である。有用な新規有機ホスフィンの合成を目的とし、1-アルキニルホスフィン誘導体に対する窒素求核剤の付加反応について検討を行った。その結果、炭酸セシウム触媒存在下1-アルキニルホスフィンスルフィドに対して種々のアミドを作用させると位置および立体選択的に付加反応が進行することを見いだした。この反応はE選択的に進行し、再結晶をすることにより容易にE体のみを単離することができる。またこの反応によって得られるホスフィンスルフィドはトリス(トリメチルシリル)シランを用いたラジカル還元反応によって容易に三価のホスフィンに変換することが可能である。本反応は分子間反応だけでなく分子内反応にも適用可能である。分子内にアミド部位を有するアルキニルホスフィンスルフィドに炭酸セシウム触媒を作用させると速やかに環化反応が進行し、ピロリジン誘導体を収率よく得ることができた。またこの反応における生成物の二重結合部分の不斉水素化も試みた。検討の結果、常圧の水素雰囲気下カチオン性イリジウム錯体および光学活性二座ホスフィン配位子を触媒として用いることによって目的とする不斉水素化が高収率かつ高選択的に進行することが明らかとなった。この反応によって得られる新規ホスフィンは、新たな光学活性二座配位子として有用であると考えられる。

その結果、パラジウム触媒と塩基の存在下、レアルキニルホスフィンスルフィドにN-アルキル-2-ヨードアニリンを作用させると環化反応が進行し、2-インドリルホスフィンスルフィドが高選択的に良好な収率で得られることを見いだした。得られたホスフィンスルフィドはラジカル脱硫条件下において容易に対応する三価のホスフィンに誘導することができる。生成物はリン原子に隣接する位置に1-アルキニルホスフィンスルフィド由来の置換基を有しておりリン原子周りが非常に嵩高くなっている。従来ヘテロアリールホスフィンはヘテロ芳香族化合物のリチオ化とそれに引き続くクロロホスフィンに対する求核置換反応によって合成されている。この方法ではリン原子の導入前にあらかじめヘテロ芳香族化合物を合成する必要があり3位に導入できる置換基にかなりの制限があった。これに対し今回見いだした方法はヘテロ芳香環の構築とリン原子の2位への選択的導入ならびに3位への置換基の導入が同時に起こるという特徴を有しており、これまでに導入が困難であった置換基の3位への導入が可能となった。また、この方法を用いて新たに合成したホスフィンが電子豊富な塩化アリールの鈴木-宮浦カップリング反応の配位子として有用であることも明らかにした。
合体する中性子星連星からの重力波と電磁波放射に対する研究

以下の4つの研究課題を研究代表者、分担者、共同研究者が協働で遂行した。1:前年度に引き続き、合体直前の連星中性子星の高精度シミュレーションを多数実行し、精度がこれまでになく高い重力波の波形を導出し、重力波テンプレートの作成のベースとした。2: GW170817の電磁波観測を受け、電磁波観測に無矛盾な連星中性子星モデルを調べた。具体的には、観測結果を説明するのに十分な質量を放出するモデルを制限した。この研究は論文にまとめ投稿中である。3:連星中性子星の合体に対し、数値相対論によるニュートリノ輻射流体シミュレーションをまず行った。その合体後の結果を抽出し、前年度に引き続き軸対称の粘性入り輻射流体計算を長時間行い、合体後に誕生する大質量中性子星がどのように進化するのか、どの程度質量放出を行うのか、どのような元素が合成されるのかについて調べた。その結果、中心に大質量中性子星が残れば、大量の質量放出が起きることや放出物質の中性子過剰度が低くなり質量数の大きな元素があまり作られないこと、さらに結果が中性子星の状態方程式や系全体の質量にあまり依存しないことを示した。この成果に関しては論文執筆中である。4:研究3で得られた質量放出に関する結果を用いて、電磁波放射について調べた。今後の観測に応用するために幅広いモデルを採用し、輻射流体計算を行い、電磁波の光度曲線等をモデル化した。この研究成果については現在論文執筆中である。計画通りに研究は進んでいる。2018年度は重力波観測が行われず、新しい観測結果もなかったので、2019年から再開される重力波観測に向けた準備研究に努力が払われた。2019年4月かadvanced LIGOとVIRGOによる重力波観測が再開される。連星中性子星の合体現象も観測されると期待されるが、その観測に必要な理論研究を着々と進めると同時に、観測が出た場合に素早く観測結果の解釈を行う予定である。以下の4つの研究課題を、代表者、分担者、連携・協力研究者が協働で遂行した。1:中性子星に対する多様な状態方程式と幅広い質量を採用し、連星中性子星に対して、これまでにない高解像度の数値相対論的シミュレーションを多数実行した。そして精度の高い重力波波形を系統的に導出し、解析的なモデルの作成を行った。これは連星中性子星から重力波が観測された際に、テンプレートして利用できるものである。ブラックホール・中性子星連星に対しても、少数ながらシミュレーションを実行し、解析的モデル作成のための重力波サンプルを増やした。2:課題1で得られた連星中性子星用の重力波テンプレートを用いて、重力波データ解析研究に着手した。この研究は最近観測された重力波GW170817に対して、現在進行中であるが、中性子星の潮汐変形率に一定の制限を付けられることがすでに解った。3:数値相対論的輻射流体計算および輻射粘性流体計算を行ない、中性子星連星の合体に伴って放出される物質の総量、速度、温度、組成を、現実的と考えられる状態方程式に対して調べた。その結果をベースに、輻射輸送計算を行ない、放出物質から放射される電磁波の光度曲線やスペクトルを求める研究がGW170817の電磁波対応天体に対して、現在進行中である。4:課題3で行った計算の結果をベースに、ガンマ線バースト発生機構を考察した。その結果、総質量の小さい連星中性子星の合体ではガンマ線バーストが起きない可能性があるという予想に達した。この予想を今後精査していく予定である。予定している4つの課題を順調にこなしているため。今後連星中性子星からの重力波が続々と観測されると予想されるが、それを理論的に解釈するための準備が、着実に進んでいる。以下の4つの研究課題を研究代表者、分担者、連携協力者が協働で遂行した。1:合体直前の連星中性子星の高精度シミュレーションを多数実行し、精度がかつてなく高い重力波の波形を導出し、重力波テンプレートの作成のベースとした。中性子星の状態方程式、2つの天体の質量、シミュレーションの解像度を変化させて合計で100ほどシミュレーションを行い、収束性の極限を取ることにより15程度の高精度重力波波形を導出した。この結果は、論文にまとめて発表した。2:研究1で求めた高精度重力波波形とeffective onebody(EOB)法と呼ばれる凖解析的な手法で求めた波形を組み合わせて、ハイブリッド重力波波形をまず導出した。EOB法は,合体15周以前の波形を導出するのに採用した。その後、ハイブリッド波形をフーリエ変換し、フーリエスペースで重力波テンプレートを構築し、論文に発表した。運よくadvanced LIGOが連星中性子星からの重力波を検出したので、公開された重力波データに対し、独自のテンプレートを用いてパラメータ推定を実行中である。結果はH30年度に発表予定である。その合体後の結果を抽出し、軸対称の粘性入り輻射流体計算を長時間行い、合体後に誕生する大質量中性子星がどのように進化するのか、どの程度質量放出を行うのかについて調べた。その結果、中心に大質量中性子星が残れば、大量の質量放出が起きることを示した。これについては論文に発表した。4:研究3で得られた質量放出に関する結果を用いて、元素合成計算や電磁波放射について調べた。

その結果、最近重力波望遠鏡で観測されたGW170817の電磁波対応天体は、数値相対論で解明された質量放出過程、およびその後の重元素合成を起源とする電磁波放射で非常に整合的に説明できることが解った。これについては現在論文執筆中である。連星中性子星の合体による重力波GW170817が発見されたため、これまでの理論研究が大いに活用され、理論研究の正しさが立証された。観測結果は数値相対論研究と概ね整合的であり、我々の研究が優れていたことが証明された。以下の4つの研究課題を研究代表者、分担者、共同研究者が協働で遂行した。1:前年度に引き続き、合体直前の連星中性子星の高精度シミュレーションを多数実行し、精度がこれまでになく高い重力波の波形を導出し、重力波テンプレートの作成のベースとした。2: GW170817の電磁波観測を受け、電磁波観測に無矛盾な連星中性子星モデルを調べた。具体的には、観測結果を説明するのに十分な質量を放出するモデルを制限した。この研究は論文にまとめ投稿中である。3:連星中性子星の合体に対し、数値相対論によるニュートリノ輻射流体シミュレーションをまず行った。その合体後の結果を抽出し、前年度に引き続き軸対称の粘性入り輻射流体計算を長時間行い、合体後に誕生する大質量中性子星がどのように進化するのか、どの程度質量放出を行うのか、どのような元素が合成されるのかについて調べた。その結果、中心に大質量中性子星が残れば、大量の質量放出が起きることや放出物質の中性子過剰度が低くなり質量数の大きな元素があまり作られないこと、さらに結果が中性子星の状態方程式や系全体の質量にあまり依存しないことを示した。この成果に関しては論文執筆中である。4:研究3で得られた質量放出に関する結果を用いて、電磁波放射について調べた。今後の観測に応用するために幅広いモデルを採用し、輻射流体計算を行い、電磁波の光度曲線等をモデル化した。この研究成果については現在論文執筆中である。計画通りに研究は進んでいる。2018年度は重力波観測が行われず、新しい観測結果もなかったので、2019年から再開される重力波観測に向けた準備研究に努力が払われた。これまで通り、研究計画に記載した研究を進めるが、今後連星中性子星からの重力波が続々と観測された場合には、その理論解釈に重点をおいた研究にシフトする予定である。今後、連星中性子星の合体現象が続々と発見されることは疑いないので、観測に備えて、理論解釈のための研究をこれまで同様推進する。2019年4月かadvanced LIGOとVIRGOによる重力波観測が再開される。連星中性子星の合体現象も観測されると期待されるが、その観測に必要な理論研究を着々と進めると同時に、観測が出た場合に素早く観測結果の解釈を行う予定である。
宇宙物質中の生体関連有機物の光学異性体比の超高感度分析法の開発

生命の起源を考える上で、アミノ酸の光学異性体の選択がどこで生じたのかが重要な課題の一つになっている。特に、近年、宇宙環境においてこの選択が生まれたと考えられるようになってきているが、これを明らかにするためには、多くの宇宙試料中のアミノ酸の光学異性体比を明らかにする必要があり、極微量の宇宙試料中の分析を可能にするための分析技術の確立が必要である。そこで、超高感度分析技術の開発を行ない、数十ミクロンの炭素質コンドライト粒子の分析ができることを確認した。炭素質隕石、宇宙塵中のアミノ酸などの光学異性体比を測定するための超高感度分析法を開発し、生命の起源を考える上で不可欠な光学異性体の偏りが宇宙からもたらされた有機物に起因するのか否かを明らかにすることである。このために、H22年度は超高感度検出器の開発、極微量試料のハンドリングシステムの構築、分析上の汚染防止技術の検討を行った。超高感度検出器については、含有量が著しく異なる物質を分析する必要があるため、当初のCCD検出器1基でカバーするのではなく、2基の光電子増倍管を有することでよりダイナミックレンジの広い青色レーザー励起の検出器の製作を行った。さらに、遅延蛍光の影響を除いて測定ができるチョッパー装置を有する励起用光学系を組み込んだ。極微量試料のハンドリングシステムについては、加水分解処理と誘導体化処理を一括して行うために表面弾性波による液体と粉体の同時輸送を検討し、粉体と液体の双方がオンチップで構成可能となる見通しを得ることができた。分析感度の向上に伴い、より一層試薬や溶媒などからのアミノ酸の混入の影響が大きくなってきた。そこで、まず少量の隕石試料を扱う場合、使用する試薬と溶媒の体積を減じることが有効と考え、反応用のガラス容器・分注器具などの小型化、操作手順の見直しなどを試み、汚染量の減少と安定な分析を行えるようになった。今年度の目標は、昨年度、設計・製作した装置の最適化をはかり、サブmg以下の炭素質阻石の分析を実際に試みることであった。回転式チョッパーを備えたレーザー励起型の蛍光検出器で、回転式チョッパーで明状態と暗状態の信号値の差分をとることで、蛍光物質が流れていない時のノイズに相当する信号値を大幅に低減することに成功した。さらに、回転式チョッパーの回転数を、500Hz以上に上げることで数十倍の感度上昇を達成した。また、既にバルクでアミノ酸分析が報告されている南極隕石Y-791191(CM2)を粉末化し、その約50μmの粒子を1粒(大凡100ng)をとり、アミノ酸分析を実施したところ、グリシン、アラニン、α-アミノイソ酪酸、イソバリンを検出し、アラニンがほぼラセミ体であることを確認することに成功した。ただ、イソバリンについては夾雑ピークとの分離に課題が生じ、ラセミ体であることの確認が十分には行えなかった。試薬では問題にならなかったことから、試薬などの純度の問題ではなく、カラムの分離能に問題があることがわかった。さらに、はやぶさの回収した粒子の分析も実施したが、はやぶさ粒子からは有意なアミノ酸は検出されなかった。一方、マイクロマシンシステムを応用したハンドリングシステムでは、放射光ドライエッチングと熱圧着によりPTFE製流路を作製し、スライド式バルブの送液試験では125kPaの荷重で液漏れなく送液可能なことを確認することができ、PTFEの薄層フィルターもほぼ設計性能が得られることを確認できた。炭素質隕石、宇宙塵中のアミノ酸などの光学異性体比を測定するための超高感度分析法を開発し、生命の起源を考える上で不可欠な光学異性体の偏りが宇宙からもたらされた有機物に起因するのか否かを明らかにすることが、本研究の目的であり、超高感度検出器の開発、極微量試料のハンドリングシステムの構築、分析上の汚染防止技術の確立を行い、複数の炭素質隕石などに含まれるアミノ酸の光学異性体比測定を実施し技術の実証を目指した。特に、amol超微量有機物分析技術の確立という世界でも最高感度の有機物の光学異性体比分析技術を確立することであり、超微量試料ハンドリングのためのナノーマイクロ微細加工技術の利用、超高感度検出器の開発、2次元HPLCシステムの利用など、様々な最先端技術を融合させる。最終年度である今年度は、最終目標である分析感度が達成できるかどうかの検証を行った。標準試料を用いたアミノ酸の分析では、数十amolまで達成することができた。実際の炭素質隕石を用いた場合、グリシン、アラニンなどのタンパク質アミノ酸は分離上の支障がなく分析が可能であったが、隕石のアミノ酸として特徴のあるα-アミノイソ酪酸やイソバリンでは共溶出するピークが存在するために、アミノ酸の検出そのものは可能であったが、光学異性体比を正確に求めることは困難となる課題が残された。

微小試料ハンドリングのための自動化装置開発を目指した試料の処理方法改善として、マイクロマシン技術を応用した自動化に向けた開発を行い、極微量の粉末試料輸送という点においては実現可能性の目処を得ることができた。しかし、固体酸触媒の利用という面では、十分効率的な手法を確立するには至らず、課題が残された。国際宇宙ステーションの暴露部を使用した宇宙実験「たんぽぽ」計画での模擬粒子の分析などを行い本研究で得られた成果が実試料分析に適用できることを確認した。約50μmの炭素質隕石粒子を1粒(大凡100ng)使ったアミノ酸分析を行い、アラニンを光学分割でき、ほぼラセミ体であることを確認することができた。このことは、目標値のサブmgの阻石試料のアミノ酸分析を達成するという目標をクリアーしたことになる。一方で、試薬では問題にならなかった夾雑ピークが限石試料では多数見られたので、分離に関する改善が必要であることが明らかになった。24年度が最終年度であるため、記入しない。今後は、当初の計画に従い、炭素質阻石などの分析例を増やし、本分析装置の活用事例を増やしていくと共に、アミノ酸の分離能の向上に努める。
文法性判断のずれ及びぶれの発生メカニズムの解明および解消方法（発展）

本研究は、先の若手研究(B)『文法性判断のずれ及びぶれの発生メカニズムの解明および解消方法』(課題番号24720181)の発展として行われた。まず、日本語とシンハラ語のWH疑問文の統語的・意味的分析に関して、インターベンション効果が観察される環境が日本語とシンハラ語で同一であった。次に、名詞句接続詞の「か」と「も」についてで、疑問詞に「か」または「も」をつけると数量詞に変化する。本研究では、韓国語のケースも含めて、名詞句接続詞の統語的・意味的構造を明らかにした。最後に、インターベンション効果自体について、疑問詞が島内にある場合の解決方法は言語間で異なりうることがわかった。本プロジェクト1年目であるが、先のプロジェクトの発展ということで、初年度から口頭発表などで成果を発表した。前プロジェクトで得られた知見をもとに、日本語のWH疑問文は潜在的な移動を伴っていることを示すことが主な目的である。このことに関しては、韓国語やドイツ語での研究が盛んに行われていたが、日本語の分析から新たな知見が得られ、アメリカの学会とうで発表を行った。また、日本語WH疑問文における潜在的移動は、大規模な移動もあり、数量詞疑問文の場合は、節全体が移動することもあることをシンハラ語と比較しながら明らかにするのが研究目的のひとつであるが、それに関しては一通りの実績を示せたと思う。上記の研究に加えて、日本語のWH句に「か」や「も」を付けると存在数量詞や普遍数量詞になりうる。また、「か」は文末に置くと、疑問を尋ねる助詞にもなるが、これらの意味的側面について、ヨーロッパで研究発表をし、好評をえた。このことをきっかけに新たな発見が生まれそうである。研究成果をアメリカの韓国語の学会(シカゴ大学)で1回、オーストリアの学会(グラーツ大学、ウィーン大学)で2回、韓国で1回、国内(日本言語学会、FAJL)で2回、計6回行い、いずれの発表でも高い評価を得られたため。特に、intervention effectsという現象について、もともと日本研究者が発見したものであるが、その後、韓国語またはドイツ語での研究が中心になり、忸怩たる思いをしていたが、日本語で得られた知見を韓国語の学会(また、先のプロジェクトではドイツでの学会)で発表し、韓国の雑誌にも投稿することができたことはとても大きな進展と思われる。平成28年度の4月から8月は、1年目からの研究成果として、国際ジャーナルにおいて投稿していた論文が受理された。残りの期間は、ほぼ在外研究期間と重なり、海外で過ごした。その間は、研究に没頭でき、また、研修先で新たな知見に触れられたこともあり、新たな研究トピックがいくつか生まれたことは、とても有意義であった。具体的に、前半はアメリカのボストンのMIT/ハーバード大学で研究を行い、本研究分野において著名な、Seth Cable氏(マサチューセッツ大学), Norvin Richards氏(MIT)、Yimei Xiang氏(ハーバード大)との面談を通じて、研究内容を深めることができた。後半は、ノルウェーのトロムソ大学に籍を置き、Gillian Ramchand氏などと共同研究を開始し、興味深い現象が発見でき、継続中である。また、研究内容をMITおよびトロムソ大学で発表する機会を得た。MITでは、本研究から派生した新たな研究分野で、名詞句の接続詞について、日本語と韓国語の比較を公に初めて発表した。初めての発表にもかかわらず、高評価を得ることができ、これを基にした発表を平成29年6月末に、ヘルシンキ大学の韓国語の国際学会で発表する予定である。トロムソ大学では、本研究の中核的トピックである、日本語とシンハラ語の潜在的WH移動について発表を行い、Gillian Ramchand氏、Peter Svenonius氏(トロムソ大学)、Tarald Taraldsen氏(トロムソ大学)などより、高く研究内容を評価してもらうとともに、貴重な意見や指摘をいただいた。この研究については、現在、論文をジャーナルに投稿中である。また、関連したトピックについて、内容を発展したものを平成29年6月初旬に台湾の中央研究院で発表する予定である。1年目からの研究内容として、WH疑問文において、ある種の語句が疑問詞の前に置かれると非文、又は解釈に制限を及ぼす、インターベンション・イフェクトがあるが、本年度は、研究対象を日本語・シンハラ語・韓国語から、英語・ドイツ語・中国語・トルコ語に対象を広げた。いずれの言語も、主節においてインターベンション・イフェクトを示すが、埋め込み節(特に島と呼ばれる節)内において、言語間に違いが見られることがわかった。英語・ドイツ語・中国語・トルコ語などでは、同現象が主節同様に観察されるのに対し、日本語・シンハラ語・韓国語などでは見られないことがわかった。これから、疑問詞が埋め込み節にある場合の統語的処理方法が二つのグループで異なっていることがわかる。Kotek (2014 MIT dissertation)に見られるよう統一的な説明ではうまく説明できないことが分かったのが大きな発見である。これについて、平成29年6月台湾で研究発表する。もう一つは、日本語・シンハラ語のWH疑問文における、数量疑問文についての研究である。在外研究先で受けたハーバード大学での疑問文の意味についての講義が非常に有効で、形式意味論的側面を強化することができた。この研究については、既にジャーナルに投稿した。以上より、研究課題はおおむね順調に進展していると言える。ただし、海外拠点ということで、学会にはあまり応募できなかった。

次年度は学会での研究成果発表をもっと行いたい。本研究は、先の若手研究(B)『文法性判断のずれ及びぶれの発生メカニズムの解明および解消方法』(課題番号24720181)の発展として行われた研究で、3つの分野において研究が進行した。一つ目は、日本語とシンハラ語のWH疑問文の統語的・意味的分析に関して、大きな進展が見られた。具体的に、インターベンション効果が本来出現するはずの状況で観察されない環境が日本語とシンハラ語で同一であった(例WH島を除く島、how many/much NPなどの数量疑問文)。この発見から、両言語とも疑問詞が島の中にある場合には、島ごとWH移動(Pied-piping)が起こるとの主張を支持することができた。これに関しては、海外雑誌(JEAL)に投稿中で、既に査読者からコメントを頂き、修正中である。二つ目は、名詞句接続詞の「か」と「も」について、研究が進んだ。この点についても日本語とシンハラ語は似ており、疑問詞に「か」または「も」をつけると数量詞に変化する。両言語とも、それらを名詞句接続に使用できるところも同じである。本研究では、韓国語のケースも含めて、名詞句接続詞の統語的・意味的構造を明らかにした。最終年度に、ヘルシンキの韓国語の学会で発表し、大学院の紀要で論文となっている。最後に、インターベンション効果自体について、ドイツ語と英語において、他の研究者(Kotek and Erlewine 2016など)が本研究と異なる分析をしているが、それと比較をし、それらの主張は日本語やシンハラ語に適用できず、そのことから、疑問詞が島内にある場合の解決方法は言語間で異なりうることがわかった。このことについては、最終年度に、台湾で口頭発表し、学部の紀要に投稿した。本研究は、先の若手研究(B)『文法性判断のずれ及びぶれの発生メカニズムの解明および解消方法』(課題番号24720181)の発展として行われた。まず、日本語とシンハラ語のWH疑問文の統語的・意味的分析に関して、インターベンション効果が観察される環境が日本語とシンハラ語で同一であった。次に、名詞句接続詞の「か」と「も」についてで、疑問詞に「か」または「も」をつけると数量詞に変化する。最後に、インターベンション効果自体について、疑問詞が島内にある場合の解決方法は言語間で異なりうることがわかった。今年度に関しては8月から3月にかけて長期学外研究に行く予定。具体的に8月から12月はアメリカのMITで、残りをノルウェーのトロムソ大学に滞在して、研究を進める予定で、教育負担が多少軽減されるので、研究が一層すすむことを期待している。研究の具体的な内容として、オーストリアのウィーン大学および三重大学で発表した内容が深まりを示しているので、それを続けていきたいと考えている。先に述べたように、既に学会発表が二つ決まっており、それについて準備を行い、貴重な意見や指摘をもとに論文に発展させることを目標とする。
有機ー無機複合体ミクロカプセルを用いた微小空間における生理活性物質の合成

キトサンにケイ酸化学種を分子レベルで修飾し皮膜の物質透過性を制御したミクロカプセルを創製し,カプセル内部の微小空間において生理活性物質を合成することが目的である。皮膜あるいはカプセル内にカルシウムイオンを導入し,それらのアパタイト形成能を確認した。またカプセル作成時に細胞や生理活性物質を内包すると,その後の洗浄過程等で死滅したり失活する為,カプセル作成後にインジェクションによって内部に生理活性物質を導入することを試み,通常の吸着法では担持できない量の薬剤を包括可能であることを明らかにした。本年度は,昨年に引き続き皮膜あるいはカプセル内にカルシウムイオンを導入し,それらのアパタイト形成能を確認した。またキトサンの溶媒種を変え,できるだけ中性付近でカプセルを作製することを試みた。本年度は,皮膜あるいはカプセル内にカルシウムイオンを導入し,それらのアパタイト形成能を確認した。またマイクロ流路を用い,キトサンーケイ酸ヒドロゲルミクロ粒子を作製し,その粒径を制御した。(1)ミクロカプセルの創製:キトサン-ケイ酸ゾル溶液にカルボキシメチルセルロースナトリウム(CMC)溶液をを滴下した。さらにゾル溶液あるいはCMC溶液に塩化カルシウムを導入した。導入する塩化カルシウムの量,溶液のpHを変化させた。得られたカプセルをリン酸塩水溶液あるいは擬似体液に浸漬し,アパタイト形成能を確認した。リン酸塩水溶液への浸漬時間が長いほど,析出したアパタイト量は増加した。一方,リン酸塩水溶液浸漬したカプセルを擬似体液に浸漬するとさらにアパタイトの析出量が増した。塩化カルシウムを皮膜あるいは芯部のどちらに導入した場合にも,皮膜表面にのみにアパタイトが析出している様子が観察された。これより,カプセル内部ではなく,カプセルから溶出したカルシウムイオンが,カプセルの皮膜表面でリン酸イオンと反応し,アパタイトを形成したと考えられる。現条件では,皮膜全面をアパタイトで覆うには至っていないため,カルシウム導入方法とその後のリン酸イオンとの反応条件を検討する必要がある。(2)ミクロ粒子の創製:流路の幅および深さを制御したマイクロ流路を用い,350μm1mmまで粒径分布が±10μmのキトサンーケイ酸ヒドロゲルミクロ粒子を作製できた。このミクロ粒子に非水溶性分子を導入すると,ケイ酸の含有量によってその放出量を抑制することができた。さらにミクロ粒子に塩化カルシウムを導入すると,リン酸塩水溶液中でアパタイト形成することが分かった。またカプセル作成時に細胞や生理活性物質を内包すると,その後の洗浄過程等で死滅したり失活する為,カプセル作成後にインジェクションによって内部に整理活性物質を導入することを試みた。生体材料化学(1)ミクロカプセルの創製キトサン-ケイ酸ゾル溶液にカルボキシメチルセルロースナトリウム(CMC)溶液を滴下した。浸漬条件および導入カルシウムイオン量を変化させて,昨年度よりも表面に析出するアパタイト量は増加したが,そのカプセル形状を乾燥後に保てなかった。(2)キトサン溶液の溶媒種の検討カプセル内での細胞培養を試みたが,カプセル作製時の操作時間によって,溶媒である酢酸が細胞と触れやすくなり,成長を妨げた為,溶媒種を検討した。生体内に存在しできるだけ中性付近で皮膜の強いカプセルを作製可能にする為,アスコルビン酸とグルタミン酸を用いると,pH6付近でカプセルを作製することが可能であった。平成24年9月に,前職より現職に異動した。

そのため,空の実験室を立ち上げるところから始めざるを得ず,細胞培養に関する検討を行うことができなかった。そのため,カプセルへのカルシウムイオン導入によるアパタイト形成能の確認など,次年度検討事項を前倒しで進めた。平成26年度は,異なる溶媒種を用いたカプセルを用い細胞包括に関する実験を進める。骨芽細胞および繊維芽細胞をカプセル内部に包括し,カプセル内部での細胞増殖・分化活性を調べる。カプセル壁面への細胞の接着形態を細胞骨格(アクチンフィラメント)および接着斑(ビンキュリン等)の蛍光標識による蛍光顕微鏡観察より詳細に調べる。さらに骨髄由来間葉系細胞を同様に包括させ,カプセル内部での骨石灰化能を観察する。一方,化学反応を用いたアパタイト形成に関しては,カプセルの乾燥条件を検討し,カプセルを鋳型としたアパタイトミクロ粒子の創製を目指す。平成25年度は,24年度に滞っていた細胞包括に関する実験を進める。またカプセルから溶出するケイ酸種がカプセル内外に存在する細胞に及ぼす影響を調べる。カプセル壁面への細胞の接着形態を細胞骨格(アクチンフィラメント)および接着斑(ビンキュリン等)の蛍光標識による蛍光顕微鏡(設備備品として要求)観察より詳細に調べる。一方,平成2年度に検討した,化学反応を用いたアパタイト形成に関しては,カルシウムイオンの導入方法およびリン酸イオンとの反応条件をより詳細に検討し,カプセルあるいはヒドロゲル粒子を鋳型としたアパタイトミクロ粒子の創製を目指す。平成24年と同様,研究経費に掲げたものは全て消耗品,旅費,謝金に充当する。旅費については,本研究内容に関して2度の学会発表(国内1回,海外1回)を予定している。謝金は,試料作製の実験補助として830円/時間週1回5時間を予定している。その他,表面分析のための装置利用費,研究成果発表として論文投稿費に使用する。
中国伝統文化からみた龍門石窟という「造形の場」についての研究

初盛唐期を中心とした龍門石窟という造形の「場」と「場の機能」を中国伝統文化から明らかにしようとするのが本研究の目的である。研究方法は、拙著『唐代龍門石窟の研究-造形の思想的背景について-』中央公論美術出版、2011年で全て訓読した唐代龍門造像記を基礎資料とし、「場」と「場の機能」に関する造像記中の文言を抽出し分析した。その結果、唐代造像記に刻まれた伊闕龍門への想いとして(1)伊闕龍門が紀元前から繰り返し都となった洛陽の南郊外に位置する、(2)中国の山河は萬が切り開き、伊闕龍門もまた禹がつくった山と谷である、(3)伊閣龍門の地をインドの山河に重ねる、(4)石の固さに永遠性をみて、法身による永久の救済に結びつける、(5)造像による回向の意識といった特徴が明らかになった。次に、造像記から得られた唐代龍門に仏像をつくった人々の想いを中国伝統文化から考察した。北魏の〓道元が著した『水経注』には、中国の山河は禹が切りひらき、崑崙山から河を通じて中国各地に気がもたらされるとある。禹萬がつくった伊闕龍門は、石窟前を流れる伊水から気がもたらされ、気の充実した土地であり、造像による回向の場としてふさわしいと考えられていたと推察した。伊闕龍門は、北の〓山から洛陽城を真っ直ぐ南へ貫く南北軸線上の南の先に位置する。陰陽五行説では北は陰、死を象徴し、南は陽、生を象徴する。またこの南北軸線は、洛陽城の南郊外で天を祀った円丘、南郊を有する王朝儀礼の軸線でもあった。伊闕龍門は洛陽城の南郊にあって、亡者の魂が生天、往生するにふさわしい天に近い場と考えられていた可能性を指摘した。唐代に入り伊闕龍門には地婆訶羅、善無畏らインドから来朝した高僧たちの墓が多くつくられる。洛陽人たちは、伊闕龍門を天に近い、生天、往生にふさわしい場と考え、またインドの山河と重ね考えていたからこそ、インドから来た高僧たちを手厚く葬る場としてこの地を選んだと推察した。
動物工場を用いた魚類生殖腺刺激ホルモンの大量生産

本研究は、組換えGTHをカイコ幼虫あるいはニジマス受精卵を動物工場として遺伝子工学的に大量生産し、これらのホルモンを用いて新しい魚類の催熟技法を確立することを目的としている。脳下垂体では、2種類のGTH(濾胞刺激ホルモン、FSHと黄体形成ホルモンLH)が産生され、それぞれ2つのサブユニット(FSH:α鎖とFSHβ鎖,LH:α鎖とLHβ鎖.α鎖は両GTHに共通)から構成される。平成15年度の成果は、以下のとおりである。・カイコによる発現系1.GTHの2つのサブユニット(α鎖とβ鎖)を共感染法によりカイコで発現させたものを雌雄のキンギョに投与し、FSHおよびLHともにメスにおけるエストラジオール(E)産生、雄におけるテストステロン(T)産生促進作用があることを確認した。2.2つのサブユニットを結合した1本鎖GTHをカイコに接種して発現させた。また体内でのタンパク質の分解を抑制させると言われているCTPペプチドをC末端に付加したβ鎖およびα鎖を共感染法によりカイコで発現させた。これらのGTHを雄キンギョに投与し、1本鎖FSH、LHおよびCTP付加FSH、LH、すべて排精誘起作用をもつことを確認した。・ニジマスによる発現系1.ニジマス4日胚で作製したキンギョの組換えLHおよびFSHは、ともにin vitroでキンギョ卵巣のEおよびT合成を促進した。また、両GTHはキンギョ精巣に対してもT合成を促進した。2.ニジマス4日胚で作製したヒスチジンタグを付加した組換えLHは、ニッケルカラムを用いることで約120倍にまで濃縮することが可能であり、この粗精製ホルモンはキンギョ精巣のT合成を促進した。3.ニジマス4日胚で高レベルで発現する遺伝子をEST解析により探索した結果、熱ショックコグネイト71がもっとも発現量が高いことが明らかとなった。さらに、本遺伝子のプロモーター領域はニジマス4日胚で非常に活性が高いことを見出した。脳下垂体では、2種類のGTH(濾胞刺激ホルモン、FSHと黄体形成ホルモンLH)が産生され、それぞれ2つのサブユニット(FSH:α鎖とFSHβ鎖,LH:α鎖とLHβ鎖.α鎖は両GTHに共通)から構成されている。平成14年度に行った成果は以下のとおりである。・カイコによる発現系1.当初GTHの2つのサブユニット(α鎖とβ鎖)を共感染法によりカイコで発現させていたが、今回、2つのサブユニットを結合した1本鎖GTHの遺伝子を構築し、カイコに接種して発現させた。2.体内でのタンパク質の分解を抑制させると言われているCTPペプチドをGTHβ鎖のC末端に付加した遺伝子を構築し、α鎖遺伝子とともに共感染法によりカイコに接種して発現させた。なお、作成された組換えGTHの生物活性を調べる予定である。・ニジマスによる発現系1.ニジマス受精卵で生産した組換えGTHの生物活性を、in vitroにおけるキンギョ生殖腺の性ホルモンの産生により調べた。両組換えGTHともに精巣では、テストステロン(T)の産生を、卵巣ではTおよびエストラジオール-17βの産生を促進し、両GTHの生物活性が確認された。

2.ニジマス初期胚において、より強く遺伝し発現を促す受精卵用のプロモーターを探索中である。受精後4-5日のニジマス胚盤を用いたEST解析により、初期胚において遺伝子発現を強く促すプロモーターを現在までに150クローン得て、それらのクローンの塩基配列を解読した。3.初期胚からのGTHの精製を容易にするために、Hisタグ付き組換えFSH、LHをニジマス受精卵を用いて生産した。本研究は、組換えGTHをカイコ幼虫あるいはニジマス受精卵を動物工場として遺伝子工学的に大量生産し、これらのホルモンを用いて新しい魚類の催熟技法を確立することを目的としている。脳下垂体では、2種類のGTH(濾胞刺激ホルモン、FSHと黄体形成ホルモンLH)が産生され、それぞれ2つのサブユニット(FSH:α鎖とFSHβ鎖,LH:α鎖とLHβ鎖.α鎖は両GTHに共通)から構成される。平成15年度の成果は、以下のとおりである。・カイコによる発現系1.GTHの2つのサブユニット(α鎖とβ鎖)を共感染法によりカイコで発現させたものを雌雄のキンギョに投与し、FSHおよびLHともにメスにおけるエストラジオール(E)産生、雄におけるテストステロン(T)産生促進作用があることを確認した。2.2つのサブユニットを結合した1本鎖GTHをカイコに接種して発現させた。また体内でのタンパク質の分解を抑制させると言われているCTPペプチドをC末端に付加したβ鎖およびα鎖を共感染法によりカイコで発現させた。これらのGTHを雄キンギョに投与し、1本鎖FSH、LHおよびCTP付加FSH、LH、すべて排精誘起作用をもつことを確認した。・ニジマスによる発現系1.ニジマス4日胚で作製したキンギョの組換えLHおよびFSHは、ともにin vitroでキンギョ卵巣のEおよびT合成を促進した。また、両GTHはキンギョ精巣に対してもT合成を促進した。2.ニジマス4日胚で作製したヒスチジンタグを付加した組換えLHは、ニッケルカラムを用いることで約120倍にまで濃縮することが可能であり、この粗精製ホルモンはキンギョ精巣のT合成を促進した。3.ニジマス4日胚で高レベルで発現する遺伝子をEST解析により探索した結果、熱ショックコグネイト71がもっとも発現量が高いことが明らかとなった。さらに、本遺伝子のプロモーター領域はニジマス4日胚で非常に活性が高いことを見出した。
赤血球型AMPdeaminaseアイソザイムの完全欠損について

AMP deaminaseにはヒトでは赤血球型の【E_1】,【E_2】、筋型のM、肝型のLの4型が存在する。1978年米国のFishbeinらによってM型の欠損症が報告されたが我々は世界で最初に赤血球型アイソザイムの完全欠損例を発見し、これまでの研究で以下の結果を得た。1.約25000の血液検体をスクリーニングし、これまでに5例、家族調査から1例、計6例の完全欠損を発見した。欠損例には血液学的異常は認めず、すべて健康である。血清尿酸値は正常値の下限である。2.解糖系への影響を考え2、3、diphosphoglycerate(DPG)とATPレベルを測定したところ、DPGには差を認めないが、ATPレベルは明らかに高値を示し、コントロールの約50%増であった。3.アデニンヌクレオチドの代謝を検討したところ、欠損例ではアデニンヌクレオチドの分解が非常におそくなっていた。従って欠損例の赤血球は、アデニンヌクレオチドプールを効率よく維持していると考えられる。4.欠損は赤血球型のアイソザイムのみにおこり、L型のアイソザイムを持つ單核球や血小板の活性は正常である。5.完全欠損例2例でEBウィールスでトランスホームしたB-リンパ芽球株を樹立しえた。将来、遺伝子レベルでの欠損メカニズムの解析に有用である。6.家系調査から、この酵素欠損の遺伝型式は常染色体劣性遺伝であることが明らかになった。変異遺伝子の頻度は高く、30人に1人の割合でヘテロが発見できる。この頻度は日本全国,ソール,台北で同じであった。イスラエル,ベルギーではこの割合でヘテロが発見できないとの連絡をえているので、この欠損は東洋人に特異である可能性がある。7.遺伝子レベルでの欠損メカニズムの解明を目標に、抗体をつくりつつある。