hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
油脂酵母の油脂生産メカニズムの解明

次世代燃料のバイオディーゼル(BDF)は、主に可食植物油脂のエステル交換反応により生産されている。可食油脂のBDFの利用は食料と競合するため、しばしば論点となっている。そこで我々は非可食バイオマス由来の糖を資化し、油脂を細胞内に70%以上蓄積できるユニークな油脂酵母Lipomyces starkeyiに注目した。本研究では、L. starkeyiの実用化への課題の油脂生産性の向上のため、油脂高蓄積変異株を取得後、野生株と油脂蓄積変異株の遺伝子発現比較解析から油脂生産に関与する重要遺伝子を抽出した。その遺伝子を野生株で高発現させることにより油脂生産性の向上を評価した。日本の油脂は輸入に大きく依存しており、油脂自給率の向上は急務課題である。日本の国土を考えると広大な農地を開拓し、油糧作物の生産拡大は望ましくなく、陸上植物への依存だけでなく、幅広く油脂資源を確保しておくことが必要であり、本研究ではバイオマス由来の糖を資化して細胞内に油脂を蓄積する油脂酵母による油脂生産に注目している。油脂酵母Lipomyces starkeyiは、未利用木質系バイオマス由来のグルコースやキシロースなどの糖を資化して、細胞内に油脂(トリアシルグリセロール, TAG)を脂肪球に75%以上蓄積できるユニークな酵母である。L. starkeyiを産業利用し、食料廃棄物などから「イーストオイル」を生産することによって,上記の課題克服を目指している。そのための基盤として、L. starkeyiが油脂を蓄積する詳細な機構を理解することは重要である。そこで本研究では第一に油脂合成・分解に関与する遺伝子の発現解析を行った。脂肪酸合成経路の遺伝子(ACL1, ACC1, FAS1, FAS2)の発現量は対数増殖期初期に一過的に著しく上昇したものの、それ以降は時間の経過と共に低下した。中性脂質脂質合成経路のジアシルグリセロールからTGAを合成する酵素の遺伝子(DGA1, LRO1)は,前述の遺伝子群ほどの大きな発現量の変化は見られなかった。油脂分解経路のTAG分解酵素遺伝子(TGL3, TGL4)の発現量は培養を通して大きな変化は見られなかったため,油脂分解は定常的に起こっており,炭素源枯渇後の油脂量の減少は分解ではなく合成量が低下することに起因すると考えられた。以上のことから、脂肪酸合成経路の遺伝子を恒常的に高発現できれば、油脂量の増加に繋がるのではないかと推察している。また、遊離脂肪酸からアシルCoAを合成する酵素の遺伝子のFAA2や、β酸化を行う酵素の遺伝子POX1, POX2, POT1は炭素源枯渇後に発現が大きく上昇し、蓄積したTAGを分解して、エネルギーを獲得していると考えられた。初年度の目標としていた油脂酵母Lipomyces starkeyiの油脂合成・分解経路のリアルタイムPCRを利用した遺伝子発現解析系を構築し、油脂合成及び分解に関与する遺伝子の経時的な発現解析を実施し、油脂合成に大きく関与する遺伝子及び油脂分解に大きく関与する遺伝子を同定したため。新興国の成長などによるエネルギー、食糧等の資源需要増は、資源争奪、価格の乱高下の問題を引き起こしている。このような状況は、油脂でも同様で、需要、価格で大きな変動が起こっている。油脂自給率が13%しかない日本の油脂関連産業の維持と発展は、海外からの油脂資源確保に大きく依存するため、油脂自給率の向上は急務課題である。環境保護や日本の国土を考えると油糧作物の生産拡大は望ましくなく、国土の狭い日本にあった独自の油脂資源の確保法が求められる。本研究では、その一つの方法として様々なバイオマス由来の糖を資化して細胞内に油脂(トリアシルグリセロール, TAG)を蓄積する油脂酵母Lipomyces starkeyiによる油脂生産に注目した。L. starkeyiを産業利用し,油脂自給率の向上に貢献していくためには、油脂生産性の向上が必須であり、そのための基盤として,L. starkeyiが油脂を蓄積する詳細な機構を理解することは重要である。そこで本研究では油脂生産に関与する重要遺伝子の同定及び解析を行うことを目的とした。昨年度までに、油脂合成・分解経路の遺伝子の発現解析を行い、油脂合成及び分解に大きく関与する遺伝子を同定した。本年度はこれらの遺伝子を含め、油脂生産性の向上に重要な遺伝子を同定するために油脂高蓄積変異株を取得した。さらに同定した遺伝子の油脂生産性への寄与を明らかにするための技術として、昨年度開発した形質転換システム(スフェロプラスト-PEG法)の欠点であった遺伝子ターゲティング効率を、非相同的に遺伝子を導入するタンパク質遺伝子(LsLIG4, LsKU70, LsKU80)を欠失させることにより向上させることに成功した。油脂酵母Lipomyces starkeyiの油脂生産メカニズム解明及び油脂生産性の向上に大きく貢献可能な油脂高蓄積変異株の取得に成功したため。さらに、昨年度の結果から生じた課題であった遺伝子組換えシステムにおける遺伝子ターゲティング効率の改善に成功したため。世界人口の急増によるエネルギー、食糧等の資源需要増は、資源争奪、価格の乱高下などの問題が引き起こされ、このような状況は、油脂においても起こっており、日本の低い油脂自給率は大きな懸念材料となっている。油糧植物による油脂生産の向上は、環境保護や日本の状況を考慮すると望ましくなく、別の方法に期待がかかる。本研究では、1つの可能性として、非可食バイオマス由来の糖を資化して細胞内に油脂(トリアシルグリセロール, TAG)を蓄積する油脂酵母Lipomyces starkeyiによる油脂生産技術開発に注目した。L. starkeyiを産業的に利用するためには、油脂生産性の向上が1つの鍵となっている。

そこで本研究では油脂生産に関与する重要遺伝子の抽出を行い、その遺伝子の油脂生産性への関与を明らかにすることを目的とした。昨年度までに、L. starkeyi油脂高蓄積変異株の取得と野生株の油脂合成・分解経路の遺伝子の発現解析を行い、油脂合成及び分解に大きく関与する遺伝子を予測した。さらに非相同的に遺伝子を染色体上に導入するタンパク質遺伝子を欠失させた株を活用することにより、高効率遺伝子相同組換えシステムの構築に成功した。本年度は、L. starkeyi油脂高蓄積変異株と野生株の油脂合成・分解経路の遺伝子の発現挙動比較解析を行い、油脂合成に大きく関与する遺伝子(アシルCoA合成系遺伝子)の抽出を行った。アシルCoA合成系遺伝子のL. starkeyi野生株への導入は、油脂生産性を向上させることを明らかにした。次世代燃料のバイオディーゼル(BDF)は、主に可食植物油脂のエステル交換反応により生産されている。可食油脂のBDFの利用は食料と競合するため、しばしば論点となっている。そこで我々は非可食バイオマス由来の糖を資化し、油脂を細胞内に70%以上蓄積できるユニークな油脂酵母Lipomyces starkeyiに注目した。本研究では、L. starkeyiの実用化への課題の油脂生産性の向上のため、油脂高蓄積変異株を取得後、野生株と油脂蓄積変異株の遺伝子発現比較解析から油脂生産に関与する重要遺伝子を抽出した。その遺伝子を野生株で高発現させることにより油脂生産性の向上を評価した。形質転換システムとして、スフェロプラスト-PEG法を構築したが、遺伝子ターゲティング効率が非常に低く、目的の染色体領域でなく、ランダムに非相同的に染色体領域に遺伝子が導入される問題を有する。目的の染色体領域に相同的に遺伝子を導入するため、非相同的に遺伝子を導入する蛋白質(Ku70, Ku80, Lig4)をコードする遺伝子をクローニングし、欠失させ、相同組換え効率を上昇させた変異株を取得し、今後の解析宿主とする。また、初年度に油脂合成に大きく関与する遺伝子としてACL1、油脂分解に大きく関与する遺伝子TGL3, TGL4を同定した。これらの遺伝子の欠失株を構築し、経時的に生育(菌体濁度及び菌体数)、グルコース消費、油脂生産、油脂含有率、油脂変換率を測定し、油脂生産に関する解析を行い、油脂合成及び分解メカニズムの解明に繋げていく。野生株と油脂高蓄積変異株の油脂生産性の比較を行い、油脂生産能の向上の程度を明らかにする。さらにそれぞれの株の油脂合成・分解経路のリアルタイムPCRを利用した遺伝子発現解析を行い、比較検討することにより、油脂生産性向上に貢献する重要遺伝子を同定する。得られた重要遺伝子の遺伝子破壊株や高発現株を作製し、その機能を明らかにする。応用微生物学獲得した油脂高蓄積変異株と野生株の表現型解析(菌数、糖消費、油脂量など)を解析する予定であったが、解析対象となる油脂高蓄積変異株の絞り込みに時間がかかり、その解析予定を次年度にしたため。
FISH法による造血幹細胞移植後の生着時期とGVHD発現に関する検討

造血幹細胞移植に伴う移植片対宿主病(graft versus host disease,GVHD)が重症化するか否かに関して予想するために、移植後早期の末梢血中提供者由来のリンパ球の発現の程度を調べGVHDの重症度との関連を調べ、さらにGVHDの発現の早期の指標となる可能性を模索した。実際の手法としては比較的簡便であり定量性のあるFISH法(fluorescence in situ hybridization)を用い提供者と患者が異性である場合に限って検索をおこなった。症例は1997年10月より2001年9月のまでの間に北海道大学医学部附属病院小児科にて異性間で骨髄移植を行った6例である。男児3例、女児3例で年齢は210歳、原疾患は急性リンパ性白血病3例、骨髄異形成症候群2例、Hunter症候群1例であった。いずれも移植後1222日後に生着を確認した。急性GVHDは3例にはみられず、gradeIIIIを3例に合併した。この6例の末梢血をXY probeをもちいてFISH解析を行った。いずれの症例においても、生着日にはdonorタイプが99100%を占めた。また移植後早期にもGVHD合併の有無にかかわらずdonorタイプは80%以上に増加する傾向があった。このため、当初の目的のGVHDとの関係は明確でないことが明らかとなった。しかしながら、後に再発した1例が他の症例と異なり移植後早期(13日)にrecipient typeが90%を占めており、今後再発との関係で注目される。重症のGVHDは骨髄回復より早く発現し、診断も困難である場合が多い。このため、重症GVHDは早期に提供者リンパ球が末梢血中に発現するという仮定の下に、末梢血中提供者由来のリンパ球の発現の程度を検索することによりGVHDの重症度との関連を調べ、さらにGVHD発現の早期の指標となる可能性を模索する研究を行った。実際には提供者と患者が異性である場合に限り患者末梢血をXY probeを用いたFISH法(fluorescence in situ hybridization)にてキメリズムの解析を行った。症例は5例で、年齢は210歳、性別は男3例、女2例であった。原疾患は急性リンパ性白血病3例、再生不良性貧血1例、Hunter症候群1例であった。移植はいずれも骨髄移植で、ドナーは血縁が2例、非血縁が3例でいずれも異性間であった。急性GVHDの発現は全くない0度が3例、II度が1例、III度が1例であった。これらの症例の末梢血を移植後1,5,8,12,15,22日目に採取・処理・保存した。これらの検体をXY probeを用いてFISHによる検索を行いキメリズムの有無を検討した。その結果は、GVHDの発現による両群が2例及び3例と症例数が少ないため現在のところ差を認めていない。
ガラス内部における微粒子のレーザマニピュレ－ション

申請者らは,ガラスの片面に金属膜を成膜し,反対側からガラスを通して金属膜にレーザ光を照射した際,金属膜が溶融し球状の微粒子となって,ガラス内部に入る現象を見出した.本研究では,この移動メカニズムの解明を行い,表面張力のよる力が支配的であることを明らかにした.さらに,画像認識を用い,微粒子の位置を把握,ステージを制御することで,同じ速度で移動させることを実現した.(1)移動メカニズムの解明:昨年度おこなった温度計算を利用し,温度と界面張力の関係式から,微粒子とガラスの界面における温度の不均質によって生じる界面張力を微粒子表面の各地点において,算出し,この界面張力を積算することで,界面張力によって微粒全体に加わる力を計算した.さらに,移動に伴って発生する抗力についても,熱流体解析を行うことで,ガラスの粘度の温度依存性を考慮に入れて算出した.この界面張力と抗力は,おおむね一致していた.このことから,移動を引き起こす原因としては,界面張力が支配的であることを明らかにした.(2)ガラスと金属の種類,膜厚・形状の影響:ガラスは組成を変えることで性質を大幅に変化でき,多種多様なガラスが市販されている.そこで,様々なガラス,および金属の組み合わせで実験を行い,金属微粒子の移動の可否とその移動中の様子を観察,評価した.その結果,ガラス,金属の種類によっては移動により金属成分がガラス中に拡散することを明らかにした.(3)マニピュレ-ション手法の確立:今までは,カメラで観察しながら,人手によりステージを移動させたり,レーザの出力を制御し,所望の位置に微粒子が到達したらレーザ照射をやめたりすることで微粒子を配置してきた.これに対して,画像認識ソフトを作成し,カメラの情報をもとに,微粒子の位置を把握し,移動しても焦点近傍に微粒子を維持する手法を開発し,所望の距離移動させる方法を実現した.申請者らは,ガラスの片面に金属膜を成膜し,反対側からガラスを通して金属膜にレーザ光を照射した際,金属膜が溶融し球状の微粒子となって,ガラス内部に入る現象を見出した.本研究では,この移動メカニズムの解明を行い,表面張力のよる力が支配的であることを明らかにした.さらに,画像認識を用い,微粒子の位置を把握,ステージを制御することで,同じ速度で移動させることを実現した.(1)ガラス流動の観察:移動中の金属微粒子と周囲のガラスの流動を観察することで,ドライビングフォース解明のヒントを得た.熱放射や加熱用レーザ光の散乱により,この微粒子が発光する問題から,これまで,微粒子近傍のガラスの流れを観察できていなかったが, CCDカメラに対し金属微粒子の背面から440nm付近に波長ピークをもつメタルハライドランプを照射し,中心波長440nmのバンドパスフィルタを介しシャドーグラフ法により撮影した照明用の光源,フィルタなどを組み合わせることで,移動中の様子を観察できた.(2)温度解析:金属微粒子および周囲のガラスの温度状態が重要なパラメータだと考えられる.そこで,伝熱計算により微粒子およびガラスの温度計算を行い,温度状態の推定を行った.微粒子の表面とその近傍のガラスには数百K以上の温度勾配があることが明らかになった.温度依存性のある物性値として表面張力,粘性力が挙げられる.表面張力の大きさは高温>低温であるため,微粒子とガラスの界面において表面張力により微粒子の進行方向に力が働く.特に温度勾配のある状況下において,表面張力>粘性力となった場合,流体表面に微粒子の進行方向と反対向きのマランゴニ対流が発生する.これらの状態から微粒子の移動を引き起こすドライビングフォースの定性的に明らかにした.来年度,より厳密な数値解析を行い,この表面張力を定量的に解析することで移動する微粒子のドライビングフォースを定量的に明らかにできると考えられる.温度計算に手間取り,やや進行が遅れているが,目処はついており,新年度挽回できると考えている.次年度では,本年度で取得したデータをまとめ,その後,本手法で実現できるデバイスを試作する.(4)照射条件,温度条件:2つのレーザ光を異なる方向から微粒子に照射したり,試料全体をヒータで加熱したりすることで温度状態を変化させて,移動の様子を観察する.(5)移動メカニズムの解明:昨年度までのデータをまとめ,微粒子の移動を引き起こしているドライビングフォースを定量的に明らかにする.(6)マニピュレ-ション手法の確立:今までは,カメラで観察しながら,所望の位置に微粒子が到達したらレーザ照射をやめることで微粒子を配置してきた.これに対して,上記までの結果から,所望の位置に微粒子を配置するための最適な手法,条件を選定し,移動中に観察することなく,微粒子を数ミクロン程度の誤差で所望の位置に配置するマニピュレ-ション手法を確立する.消耗品として,実験試料の購入成果報告用に,各学会への参加,論文投稿,校閲などの費用に充当する予定である.
反回神経の再生における標的特異性と過誤神経支配に関する基礎的研究

運動神経線維再生の方向は本来の標的筋に優位に再生するのかを検証するため、ラットにY字チューブを埋め込み反回神経末梢側断端と反回神経中枢側断端、頚神経ワナ中枢側断端をチューブのそれぞれの端に縫合固定し、一定期間後に神経のつながりを評価した。Y字チューブがラットの体格に対して大きく、またシリコンに対する異物反応のために瘢痕を生じ、有意な結果は得られなかった。動物種やチューブの素材の検討が必要である。ウサギ四肢筋を用いた研究で、本来の支配神経を切断・移植すると他の筋の支配神経を移植するよりも優位に再生することが報告されている(Elsberg CA, Science 1917;45:318-320)。本研究では、運動神経線維再生の方向はランダムに決まるのか、もしくは本来の標的筋に優位に再生するのかを、反回神経と頸神経ワナを競合させる動物モデルで検討することとした。まず実験に必要な細径のY型シリコンチューブが市販品で入手可能かどうかを検討したところ、本研究に用いることのできるチューブは市販されていないことがわかった。そこで、チューブの試作が可能な会社((株)塚田メディカル・リサーチ)と交渉し昨年末に実験に用いることのできる試作品が完成した。実験にはWistar系ラット、メス8週齢を用いた。声帯運動が正常なことを確認した後、輪状軟骨下端から10mmで左反回神経を切断し即時に末梢側断端をY型チューブの内腔に1mm挿入し9-0ナイロン糸でチューブに縫合固定した。Y型チューブ二股側の内腔には反回神経中枢側断端と頸神経ワナ中枢側断端をそれぞれ1mm挿入し末梢側と同様に9-0ナイロン糸で縫合固定した。反回神経末梢側断端と反回神経中枢側断端あるいは頸神経ワナ中枢側断端との距離は2mmとなるようにY型チューブを作製した。現在までに5匹の動物モデルを作製した。内、操作後12週を経過した2匹を安楽死させてY型チューブを除去したところ、1匹では反回神経中枢側断端と反回神経末梢側断端の間が神経線維を含むと思われる結合組織でつながっていたが、頸神経ワナ中枢側断端から反回神経末梢側断端に連続する組織は認めなかった。他の1匹では反回神経中枢側断端および頸神経ワナ中枢側断端から伸びた組織が1本となって反回神経末梢側断端に連続していたが、手術顕微鏡下に見ると非常に細かった。ウサギ四肢筋を用いた研究で、本来の支配神経を切断・移植すると他の筋の支配神経を移植するよりも優位に再生することが報告されている。平成26年末に研究に用いるY型シリコンチューブを(株)塚田メディカル・リサーチに作製依頼し、実験に使用可能な物品が入手できるようになった。実験にWistar系ラット(メス8週齢)を使用した。輪状軟骨下端から10mm尾側のレベルで反回神経、頸神経ワナの枝を切断し、Y型チューブの内腔に反回神経末梢側断端を1mm挿入し、9-0ナイロンで縫合した。また、Y型チューブの二股の部分に反回神経中枢側断端と頸神経ワナ中枢側断端をそれぞれ同様に縫合した。これまでに10匹の動物モデルを作製した。処置後12週を経過したモデル2匹を安楽死させてY型チューブを除去したところ、1匹では反回神経中枢側断端と反回神経末梢側断端側が結合組織でつながっていたが、頸神経ワナ中枢側断端と反回神経末梢側断端をつなぐ結合組織を認めなかった。他の一匹では反回神経中枢側および頸神経ワナ中枢側断端から伸びた組織が一本となって反回神経末梢側断端に連続していたが、非常に細かった。また、処置後42週を経過したモデル2匹を安楽死させてY型チューブを除去しようと試みた。2匹とも反回神経ワナと頸神経ワナは瘢痕に埋もれており、同定が不可能であった。肉眼的にY型チューブの内腔は3方向において結合組織で満たされていたが、非常に脆く、Y型チューブを除去する際に損傷した。ラットを用いた手術手技は向上し、安定した動物モデルを作製できるようになった。しかし、術後長期経過した動物モデルを観察すると、頸部のほとんどの部分が瘢痕に覆われている結果となり、各神経の同定とチューブ内の組織の観察が困難であった。これは、Y型チューブの大きさが実験動物(ラット)に対して大きいためと考えられ、解決するにはY型チューブの変更または動物モデルの再選定が必要と考えられる。前年度の結果を踏まえて、動物種の変更が必要と考えらえた。他の研究にフェレットを用いており、本研究にも使用可能ではないかと考えた。声帯瘢痕の研究にフェレットを用いてきたが、フェレットでは反回神経麻痺モデルの作製は未経験であったため、まずは反回神経麻痺モデルを作製した。フェレットの反回神経も他の動物種と同様に気管傍を頭側に向かって走行しており、同定は容易であった。反回神経を切断後に声帯運動を確認すると左声帯麻痺を生じており、切断した神経が反回神経で間違いないことが確認できた。

今後、フェレットを用いてY字チューブ留置の検討を行う予定としているが、ラット用に作成したY字チューブはサイズが小さく、フェレットに用いるには再度作成のし直しが必要と考えられ、フェレット用のYチューブ作成にはまだ至っていない。また、ラットでの検討では長期モデルにおいて瘢痕形成が見られたが、これはシリコンチューブに対する異物反応が原因である。現在臨床応用されている神経再生誘導チューブ(ナーブリッジ&reg;)はポリグリコール酸、コラーゲンなど生体内で分解誘導されやすい素材であり、神経伸長の足場となる製剤である。こうした生体での親和性が高い素材を用いたチューブを使用することでより確実な研究を行うことが可能かもしれない。フェレットを用いた場合もシリコン製のチューブでは瘢痕によって評価が困難となる可能性が高い。より生体への親和性の高い素材をもちいた足場となるY字チューブの作成が必要であると考えている。これまでの結果を踏まえて本研究を進めていきたい。運動神経線維再生の方向は本来の標的筋に優位に再生するのかを検証するため、ラットにY字チューブを埋め込み反回神経末梢側断端と反回神経中枢側断端、頚神経ワナ中枢側断端をチューブのそれぞれの端に縫合固定し、一定期間後に神経のつながりを評価した。Y字チューブがラットの体格に対して大きく、またシリコンに対する異物反応のために瘢痕を生じ、有意な結果は得られなかった。動物種やチューブの素材の検討が必要である。実験に用いることのできるY型シリコンチューブを安定して入手できるようになるまでに時間を要したので動物実験は今年になって始めることとなった。そのため、モデル動物1を12匹作製した段階である。少数例における準備的な検討であるが、頸神経ワナ中枢側よりも反回神経中枢側のほうが反回神経末梢側に向かって伸張する可能性が示唆された。現在使用しているY型チューブより細いものは存在しない。また、存在しても小さすぎてこれまでと同様の手術操作を行うことは困難と考えられる。そのため、長期モデルの作製には動物種の再選定が必要である。当科はフェレットを用いた喉頭科学研究も行っており、動物操作に習熟したスタッフが在籍する。フェレットは体長40-50mとラットの体長(20cm程度)より大きく、また、頸部も長い。長期モデルについては、今後は、フェレットを用いて、同実験系を進める予定である。短期モデルについては引き続きラットを用いて実験を進める。喉頭科学手術操作手技を安定させるためにモデル動物の個体数を増やす。手術顕微鏡下に観察される神経断端間の所見が安定した時点から、それぞれの断端の神経とチューブ内組織の免疫染色(抗Neurofilament抗体、抗Myelin Basic Protein抗体)を行いチューブ内に再生した神経線維数、髄鞘の再生程度を評価する。また、喉頭を摘出し、甲状披裂筋内神経線維数、神経終末数、アセチルコリン受容体数を定量的に評価する。異なる筋を支配する神経線維よりも本来の神経線維が内喉頭筋の再支配において標的特異性を有するかどうかを検討する。さらに機能的な観点から誘発筋電図検査を行い潜時と振幅を比較する。ラットを用いた動物モデルで異なる神経間に標的特異性の存在することが示唆されれば神経再生の方向性にかかわる遺伝子を検討する。多量のRNAを必要とするため実験にはビーグル犬を用いる。total RNA採取から遺伝子データ解析までは外注で行う。上述の研究遂行には多数の小動物、少数ではあるが高価なビーグル犬、多量の各種抗体、および外注費用が必要なので本研究費を用いて購入する。
植物ホルモン非要求性脱分化の分子機構と内生植物ホルモンの役割

ゼニゴケの葉状体を切断し、頂端を含む断片(頂端断片)と含まない断片(基部断片)に分けて植物ホルモンフリー培地で培養すると、基部断片の切断面においてだけ葉状体の再生がみられる。頂端断片はそのまま頂端からの成長を続け、切断面から再生は起こらない。以上のことから、頂端で産生される拡散性物質により細胞の脱分化が抑制され、その物質が植物ホルモン・オーキシンであるとの仮説を立て、検証している。実際、オーキシン含有培地では再生は抑制される。前年度までに、切断後のオーキシン濃度低下に依存して発現変動する転写因子TF-A(仮称)を同定した。TF-Aの機能誘導株を作出したところ、誘導依存的にオーキシン含有培地においても再生芽形成を促進できることがわかった。逆に、SRDXリプレッサードメインを融合したTF-Aの誘導株を作出したところ、通常培地での再生芽形成が誘導依存的に遅延することが明らかとなった。これらの結果から、TF-Aは基部断片においてオーキシン濃度低下に依存して発現が誘導され、再生芽形成を促進する機能を持つ転写因子であることが示唆された。しかしながら、TF-Aの単独変異体を作出したところ再生に大きな異常はみられなかったため、TF-Aと冗長的に機能する遺伝子の存在が示唆された。そこで、切断後に基部断片において発現が上昇する転写因子遺伝子に着目した。TF-Aと同じ転写因子ファミリーに属するものに関しては、TF-A遺伝子の変異との二重変異体を作出しているところである。また、いくつかの転写因子遺伝子についてはオーキシン含有培地で発現が抑制されるか調べたものの、そのような遺伝子は見つけられなかった。さらに網羅的に調べるため、オーキシン含有培地における再生過程のサンプルを用いてRNA-seq解析を行った。これらの解析により、TF-Aと冗長的な機能をもつ遺伝子を同定する。論文投稿を準備中である。ゼニゴケの葉状体切断片からの再生は、頂端側断片からは起こらず、基部側断片からのみ起こる。これまでに再生芽形成がオーキシン含有培地では阻害されることが示されていたことから、傷に由来するシグナルだけでなく、オーキシンレベルの低下が再生に必要であるという仮説が考えられていた。平成28年度はまず、オーキシンが細胞周期再開の前後どちらの過程を抑制するのかについて調べた。EdUアッセイを行ったところ、葉状体切断後18ー24時間に起こる表皮細胞のG1期からS期への移行がオーキシン添加により阻害されることが明らかとなった。このことから添加オーキシンは細胞周期再開よりも前の過程で再生を抑制することがわかった。次に葉状体切断から細胞周期再開の過程における内生のオーキシンとサイトカイニンの量を経時的に定量した。その結果、基部側断片において、インドール酢酸(IAA)が切断後3時間で一過的に減少しその後再び上昇すること、サイトカイニン前駆体が大きく減少すること、さらに活性型サイトカイニンも若干低下することが明らかとなった。さらに同様のサンプルを用いて、RNA-seq解析により切断後の経時的な遺伝子発現の変動を調べた。細胞周期関連遺伝子の発現は12時間目まで一定で24時間目で上昇したことから、実験は成功したと判断した。解析の結果、オーキシン生合成遺伝子の発現も切断後3時間で一過的に減少しその後再び上昇することがわかった。サイトカイニンに関しては、生合成遺伝子と不活化酵素遺伝子のどちらもが発現上昇した。以上のことから、切断後に起こる一過的なオーキシンレベルの低下とサイトカイニンの合成と代謝の活発化が、再生の制御に関わっている可能性が示唆された。また、RNA-seq解析において基部断片特異的に変動する転写因子やエピジェネティクス関連因子などが見出された。平成28年度に予定していた主要な解析は行うことができた。外部オーキシン添加により再生芽形成が抑制されることから、基部側断片においてオーキシンレベルが低下することが予測されていたため、RNA-seq解析とホルモン定量解析によりそれが一過的に起こることが示された意義は大きい。ゼニゴケの葉状体を切断し、頂端を含む断片(頂端断片)と含まない断片(基部断片)に分けて植物ホルモンフリー培地で培養すると、基部断片においてだけ葉状体の再生がみられる。以上のことから、頂端から産生される拡散性物質により細胞が脱分化が抑制されており、その物質が植物ホルモン・オーキシンであるとの仮説を立て、検証している。昨年度は、ゼニゴケ葉状体を切断後に経時的にサンプリングを行い、植物ホルモンの定量とRNA-seq解析を行った。植物ホルモン定量の結果、基部断片における一過的なオーキシン濃度の低下とサイトカイニン代謝速度の上昇が明らかになった。本年度はまず、オーキシン信号伝達経路の関与を調べた。ゼニゴケのAUXIN RESPONSEFACTOR遺伝子の破壊株や、非分解型AUX/IAAの核蓄積を誘導できる株では、オーキシン含有培地でも再生芽形成が見られたことから、オーキシン依存的な遺伝子発現が再生抑制に関わっていることが明らかとなった。またRNA-seqのデータ解析を行い、オーキシン濃度が低下したタイミングで、頂端断片に比べて基部断片において有意に発現変動する遺伝子が約3,000個あることを明らかにした。

それらの中から、オーキシン濃度低下に依存して発現変動するある転写因子遺伝子を見出すことができた。この遺伝子の発現は切断後1時間で基部断片においてのみ誘導されたが、オーキシン添加条件では誘導が抑制された。また、これを過剰発現すると未分化な細胞が増加したことから、細胞のリプログラミングに関与する遺伝子であることが示唆された。しかしながら、この遺伝子をCRISPR/Cas9系を用いて破壊しても、再生に顕著な異常は見られなかった。冗長的に機能する転写因子の存在が示唆された。本研究の目的を達成すべく、地道ではあるが着実に進展していると判断している。ゼニゴケの葉状体を切断し、頂端を含む断片(頂端断片)と含まない断片(基部断片)に分けて植物ホルモンフリー培地で培養すると、基部断片の切断面においてだけ葉状体の再生がみられる。頂端断片はそのまま頂端からの成長を続け、切断面から再生は起こらない。以上のことから、頂端で産生される拡散性物質により細胞の脱分化が抑制され、その物質が植物ホルモン・オーキシンであるとの仮説を立て、検証している。実際、オーキシン含有培地では再生は抑制される。前年度までに、切断後のオーキシン濃度低下に依存して発現変動する転写因子TF-A(仮称)を同定した。TF-Aの機能誘導株を作出したところ、誘導依存的にオーキシン含有培地においても再生芽形成を促進できることがわかった。逆に、SRDXリプレッサードメインを融合したTF-Aの誘導株を作出したところ、通常培地での再生芽形成が誘導依存的に遅延することが明らかとなった。これらの結果から、TF-Aは基部断片においてオーキシン濃度低下に依存して発現が誘導され、再生芽形成を促進する機能を持つ転写因子であることが示唆された。しかしながら、TF-Aの単独変異体を作出したところ再生に大きな異常はみられなかったため、TF-Aと冗長的に機能する遺伝子の存在が示唆された。そこで、切断後に基部断片において発現が上昇する転写因子遺伝子に着目した。TF-Aと同じ転写因子ファミリーに属するものに関しては、TF-A遺伝子の変異との二重変異体を作出しているところである。また、いくつかの転写因子遺伝子についてはオーキシン含有培地で発現が抑制されるか調べたものの、そのような遺伝子は見つけられなかった。さらに網羅的に調べるため、オーキシン含有培地における再生過程のサンプルを用いてRNA-seq解析を行った。これらの解析により、TF-Aと冗長的な機能をもつ遺伝子を同定する。論文投稿を準備中である。平成29年度は、オーキシンで処理した切断片サンプルを用いてRNA-seq解析を行うとともに、候補遺伝子について定量的RT-PCRを行うことにより、オーキシン低下に応答して基部断片特異的に発現が低下する遺伝子を同定する。さらにRNA-seq解析により基部断片特異的に発現上昇することが見出された遺伝子についても、定量的RT-PCRを用いてより詳細に発現変動およびオーキシン応答性を調べる。特に興味深い変動を示す遺伝子について、CRIPSR/Cas9ゲノム編集法を用いて機能欠損株を作出していく。植物ホルモンの信号伝達や代謝に関わる遺伝子の逆遺伝学的な解析は、必要な株の作出を進めており、今後順次実験を行っていく。
胎盤におけるグルコース輸送担体(グルコーストランスポーター)の制御に関する研究

近年グルコース輸送を担う担体(グルコーストランスポーター、以下GLUT)の蛋白構造が決定され、分子生物学的手法を用いて、その蛋白量のみならず遺伝子レベルの解析が可能となった。胎盤は母子間の物質輸送にとって重要な臓器であり、中でもグルコースは胎児のエネルギー源として最も重要である。胎盤はGLUTを始め、種々の担体を発現するが、その制御は不明なことが多い。今回の研究の目的は、胎盤におけるGLUTの妊娠週数に伴うその蛋白・mRNAレベルの変動と、その局在の変化を明らかにすることであった。GLUT1蛋白、mRNAレベルは、妊娠週数に伴い増加することを、結合実験、ウエスタンブロット解析、ノザンブロット解析により明らかにした。また、GLUT3mRNAレベルは、逆に妊娠週数に伴い減少することをノザンブロット解析により明らかにした。初期胎盤のGLUT結合量は、糖尿病合併症では、対照に比し有意な差は認められなかった。これらの結果は、国内学会で発表の上European Journal of Endocrinologyに発表予定である。GLUT1は、主にsyncytiotrophoblastに局在することを免疫組織染色を用いて明らかにした。またGLUT1は、妊娠初期にapical membraneに発現し、妊娠中、後期には、basal membraneに発現していた。またGLUT3は主にcytotrophoblastに局在し、妊娠初期に主にその発現がみられることを明かにした。この胎盤のGLUT1、3の局在の妊娠週数に伴う変化は、初めての知見で、国内学会発表の後、英文誌に投稿中である。
アト秒電子ビーム発生・計測手法の確立

当該年度は、前年度までの研究成果を基に、本研究の主たる目的であるアト秒電子ビームの発生と計測を試みた。また、採用最終年度であるため、当該年度までに得られた研究成果のまとめを実施した。以下では、具体的に実施した研究内容について記載する。前年度までに実施したGeneral Particle Tracer(GPT)を用いたビーム軌道計算から求めた電子ビーム圧縮条件に基づいて、磁気パルス圧縮器を構成する電磁石の磁場を調整し、最短パルス電子ビームの発生を試みた。電子ビームパルス幅の測定は、電子ビームがアルミミラーと真空の境界面で放射したコヒーレント遷移放射(Coherent Transition Radiation, CTR)をフーリエ分光することで実施した。本研究で構築したパルス幅測定系は、2つの異なる検出器(ボロメータとMCT検出器)を備えているため、両検出器でCTRを同時測定することにより、広帯域なCTRの周波数スペクトルを得た。超短パルス電子ビーム発生実験時には、空間電荷効果によるエミッタンスやパルス幅の増大を低減するために、電荷量をピコクーロンオーダーに設定して実験を実施した。実験結果として、preliminaryではあるが、電荷量0.7 pCで1 fsの電子ビームの発生と計測に成功した。本研究の目的であるアト秒電子ビームの発生には至らなかったものの、本研究を通じて得られたフェムト秒領域の電子ビームの発生と計測に関する知見は、今後の超短パルス電子ビーム発生・計測や超短パルス電子ビームの応用実験に寄与するものであると考える。29年度が最終年度であるため、記入しない。本研究の目的は、アト秒電子ビームの発生及び計測手法を確立することである。当該年度は、ビームトラッキングシミュレーションによるビーム圧縮条件の検討と電子ビームパルス幅測定手法の高度化に取り組んだ。ビームトラッキングシミュレーションにはGeneral Particle Tracer (GPT)というシミュレーションソフトウェアを使用し、既存のレーザーフォトカソードRF電子銃ライナックシステムに関してバンチ長やエミッタンスといった電子ビームを特徴付けるパラメータについて検討を行った。現状、GPTのインプットファイル及びPoisson Superfishによるフィールドマップの作成が完了し、加速器全体をシミュレートできる環境が整ったため、今後、アト秒電子ビーム発生のために具体的なパラメータを探索していく予定である。電子ビームのパルス幅測定は、電子ビームが放射するコヒーレント遷移放射(CTR, Coherent Transition Radiation)のインターフェログラムをマイケルソン干渉計で計測し周波数解析を行うことにより実施するが、測定系の周波数帯域が測定可能なパルス幅の制限となる。そのため、本研究では、電子ビームパルス幅測定手法の高度化を行い、二つの検出器からのシグナルを同時検出することで測定周波数帯域の拡張を図った。本研究の成果として、これまでに最短5フェムト秒の電子ビームの計測に成功している。今後はより短パルスの電子ビーム発生に取り組み、サブフェムト秒・アト秒電子ビームの発生と計測を実施する予定である。当該年度は、General Particle Tracer (GPT)を使用したビームトラッキングシミュレーションと電子ビームのパルス幅測定の高度化を実施した。現状、目標とするアト秒電子ビーム発生・計測の前段階であるフェムト秒電子ビームの発生と計測に成功したため、研究目標であるアト秒電子ビームに向け、研究を推し進める予定である。また、シミュレーション・実験の両面に関して、平成28年度の目標である、アト秒電子ビーム発生に向けた実験的・理論的な知見を得ることへの研究環境が概ね整ったと考えている。本研究の主たる目的である、アト秒電子ビーム発生を達成するためには、電子ビーム圧縮条件の最適化が不可欠である。当該年度は、前年度に実施した電子ビームパルス幅測定系を用いて、電子ビームの最適な圧縮条件について実験に検討を行った。電子ビームはパルス幅が短くなるほど、高周波数・高強度の輻射(コヒーレント放射)を行うことができる。この特性を利用して、電子ビームが真空とアルミミラーの境界面で輻射するコヒーレント遷移放射を赤外検出器で計測すると、圧縮条件が最適なほど(パルス幅が短いほど)検出器からのシグナル強度が増加する。ゆえに、磁気パルス圧縮器を構成する電磁石の条件を変化させながら、測定を実施することで、圧縮条件の最適値を知ることができる。本研究の成果として、阪大産研の磁気パルス圧縮器の場合、アクロマティック条件(収色性条件)を満たした際に、電子ビームが最も圧縮されることがわかった。さらに、アクロマティック条件を満たす場合であっても、電磁石の漏れ磁場等による高次効果の影響は、磁気パルス圧縮器を構成する電磁石の条件によって変化することがわかったため、圧縮器直前のビームパラメータを考慮して圧縮器の電磁石の磁場を設定することにより、より短パルスの電子ビームが発生可能であると考える。また、実験と並行して、ビームトラッキングシミュレーションを用いた圧縮条件の最適化を実施し、両者が概ね一致することを確認した。当該年度は、アト秒電子ビーム発生の前段階として、圧縮条件の検討を行い、実験・シミュレーションの方法の観点から、圧縮条件の最適値について検討をつけることができた。これまでに、フェムト秒電子ビームの発生と計測には成功しているため、本研究の目的である、アト秒電子ビーム発生・計測を実施するための土壌が整ってきたと考えている。

また、採用最終年度であるため、当該年度までに得られた研究成果のまとめを実施した。以下では、具体的に実施した研究内容について記載する。前年度までに実施したGeneral Particle Tracer(GPT)を用いたビーム軌道計算から求めた電子ビーム圧縮条件に基づいて、磁気パルス圧縮器を構成する電磁石の磁場を調整し、最短パルス電子ビームの発生を試みた。電子ビームパルス幅の測定は、電子ビームがアルミミラーと真空の境界面で放射したコヒーレント遷移放射(Coherent Transition Radiation, CTR)をフーリエ分光することで実施した。本研究で構築したパルス幅測定系は、2つの異なる検出器(ボロメータとMCT検出器)を備えているため、両検出器でCTRを同時測定することにより、広帯域なCTRの周波数スペクトルを得た。超短パルス電子ビーム発生実験時には、空間電荷効果によるエミッタンスやパルス幅の増大を低減するために、電荷量をピコクーロンオーダーに設定して実験を実施した。実験結果として、preliminaryではあるが、電荷量0.7 pCで1 fsの電子ビームの発生と計測に成功した。本研究の目的であるアト秒電子ビームの発生には至らなかったものの、本研究を通じて得られたフェムト秒領域の電子ビームの発生と計測に関する知見は、今後の超短パルス電子ビーム発生・計測や超短パルス電子ビームの応用実験に寄与するものであると考える。今後の研究の推進方策として、下記の項目について研究を行う予定である。(1)アト秒電子ビーム発生に向けた理論的検討昨年度に整えた加速器全体をシミュレートできる環境を用いて、アト秒電子ビーム発生条件について詳細を検討する。(2)アト秒電子ビーム発生実験構築したパルス幅測定装置を用いて、電荷量や加速位相、エミッタンスなどのビームパラメータについて最適な電子ビーム圧縮条件を実験的に検証する。得られた結果についてシミュレーションとの比較を行い、アト秒電子ビーム発生に向けた実験的な知見を得る。今後の研究推進方策として、下記の項目を実施する予定である。(1)アト秒電子ビーム発生・計測実験前年度までに得たビームパラメータや圧縮条件に関する知見を活かして、実験的にアト秒電子ビームの発生と計測を行う。また、アト秒電子ビームが発生・計測できた場合には、アト秒領域でしか観測できない放射線誘起現象の観測に研究を展開する。29年度が最終年度であるため、記入しない。
極微量組織由来cDNAライブラリーを用いたイネ受粉・受精時期特異的遺伝子の単離

受粉・受精・胚発生時期について遺伝子発現制御機構の解明を目指し、人口光式植物育成装置内で、年間を通して受精・種子形成のプロセスが進行するイネの栽培条件を検討すると共に、花器官の極微量組織からイネの受粉・受精時期特異的なcDNAライブラリーの作製を試み、受粉・受精時期特異的に発現する遺伝子の単離を目的とした。イネ種子形成期の組織分化・器官形成の分子機構を明らかにする為に、これまでに登熟過程のイネ種子1/3粒由来の胚乳およびアリューロン層から微量組織特異的cDNAライブラリーを作製し、アリューロン層特異的に発現する遺伝子を効率良く単離した。本研究では、特定時期(開花後数時間など)の微量な組織を狙えば、効率良く目的の遺伝子を取得可能と考え、以下の実験計画を立てて研究を進めた。1)人口光式植物育成装置内で、年間を通じて常時、受精、種子形成のプロセスが進行するイネ(矮性イネ)を選抜し、栽培条件を確立した。2)イネ種子の重複受精、種子形成過程における細胞分化の状況を検討するため、胚乳細胞および胚芽におけるマーカータンパク質(貯蔵タンパク質、トリプシンインヒビターなど)に対する抗体を用い、共焦点レーザー走査蛍光顕微鏡による形態観察を行った。3)イネ種子開花直前、直後、2時間後、6時間後、12時間後等の各時期のイネ種子(子房部分)より、組織切片を作製し、レーザーメスを用いて、卵細胞や極核部分の切り出しを行った。4)受粉・受精時期特異的に発現する遺伝子を単離するために、イネ種子cDNAライブラリーをスクリーニング用プローブを微小組織由来mRNAからcDNAを合成することにより調製した。
ヒメトビウンカ細胞質不和合集団の分布・動態・遺伝子交流に関する研究

Wolbachia属の細菌は、多くの昆虫の生殖腺細胞質に共生して、細胞質不和合性現象を誘起する。日本のヒメトビウンカには、西日本の集団と東日本の集団の間に一方向の細胞質不和合性現象がみられる。まずO'Neill et al. (1992)の方法にならい、PCR法によりウンカ1頭ずつWolbachia感染を診断する系を確立し、実験室系統に関して、予想されたとおりに西日本産ヒメトビウンカ集団はWolbachiaに感染しているが、東日本産集団は非感染であることを確認した。野田(1984)の研究より、東西両集団の地理的境界は関東平野に存在すると予想された。しかし、1994年に関東地方各地のヒメトビウンカを採集しPCR法により分析したところ、東西両型の地理的境界は東北地方南部に存在すると考えられた。また、関東地方では最近10年ほどの間に細胞質がWolbachia非感染型から感染型に変化したと思われるヒメトビウンカ集団も発見された。従って、Wolbachia感染は東日本のヒメトビウンカ集団中に拡大していると考えられた。そこで感染の地理的パターンを詳細に検討するために、1995年には、北は盛岡近郊から南は栃木県北部に至るまで13地点から数百頭のヒメトビウンカを採集し生殖線のDNAを抽出した。現在それら試料についてWolbachia感染を診断している。現時点で、Wolbachia感染率は、1)北方へ向かうとおよそ低下する傾向があるが、2)東北地方北部でも感染率0%ではないらしく、3)福島盆地を挟んで大きく異なり、4)郡山では感染型細胞質が1年間で大きく増加したこと、が推定されている。
計算機シミュレーションによる破壊現象のダイナミックス

本年度に行った研究の成果は次の2点に分類できる1.三次元系の破壊のシミュレーションこの研究ではhexagonal close packed格子を使い、破壊のシミュレーションを行い、二次元三角格子のシミュレーションとの比較を行った。原子間ポテンシャルは切断されたハ-モニックポテンシャルを用いた。系に掛かるストレスと原子間ポテンシャルの深さをパラメ-ラとし、パラメ-ラの値を色々変えながらシミュレーションを行った。その結果、亀裂の進展する速度は外部ストレスでスケールされた原子間ポテンシャルの深さ(これをとりあえずθと置く)によって決まることが分かった。しかも二次元と三次元では亀裂進展速度はθのほとんど同じ関数であらわされることが分かった。2.大きい二次元系の破壊のシミュレーション上の研究で、三次元と二次元の亀裂進展の法則は大変よく似ていることが分かったので、二次元三角格子の亀裂進展を詳しく調べた。その結果次のような多くの重要な事実が明らかとなった。亀裂進展速度は上のθの関数としてあらわしたとき、かなり幅の広い領域に存在する三つの異なったブランチが存在することが分かった。それらはθの小さい値、中間の値、大きい値で分類することができ、それぞれ亀裂進展速度が音速を越える、縦波音速に等しい、および横波音速に等しい領域であることが分かった。またその理由も明らかになった。ただし、横波音速に等しい領域の広さは系の幅に依存する。これらの結果は異なった原子間ポテンシャル、異なった外部条件によっても確認され、一般的な事実であることが分かった。上の三つの主なブランチのほか、外部ストレスの小さい場合、亀裂のパターンがジグザグな一本の線状となる極めて狭いθの領域が存在することが分かった。この領域では亀裂進展速度が横波音速のほぼ半分である。またジグザグな亀裂面のフタクタル次元はほぼ0.7前後であった。これは多くの人によって議論された結論を裏付けるものである。またこの領域における亀裂の動いたパスの長さから計算した亀裂面に添った亀裂進展の早さは音速以下であった。このことよりこの領域の亀裂進展のメカニズムは単純な音速によるものではないことが分かった。
酸化リン脂質分解酵素による生理活性脂質の産生・作用機構の解明

本研究において、以下の結果が得られた。(2)PAFAH2のDTNB感受性を担うアミノ酸残基として、種間で保存性の高いCys83を同定し、Cys83が修飾されることによりPAFAH2の活性が制御されうることが示唆された。(3)PAFAH2の膜移行を細胞染色により検出する実験系を構築した。(4)PAFAH2欠損マウスはマスト細胞の脱顆粒不全により即時型アレルギー反応が減弱することを明らかにした。(5)PAFAH2欠損マウスから得た骨髄由来培養マスト細胞はIgE依存的脱顆粒反応が減弱することを明らかにした。II型PAFアセチルハイドロラーゼ(PAF-AH2)は酸化リン脂質を選択的に分解するホスホリパーゼA2である。申請者はPAF-AH2のノックアウト(KO)マウスの解析からPAF-AH2は生体膜中に生じた酸化リン脂質を選択的に加水分解するとともに、生理活性を有する酸化脂肪酸を生成する酵素であることが示唆された。本研究では、PAF-AH2 KOマウスおよび培養細胞を用いて、酸化ストレス時に非酵素的に産生される「生理活性を持つ酸化脂肪酸」の産生経路および作用機構を分子レベルで解明することを目的とする。本年度においては、PAF-AH2による「生理活性を持つ酸化脂肪酸」の産生機構の解明を目的として、PAF-AH2細胞膜への移行メカニズムの解析を行った。申請者は、培養細胞において、酸化ストレス時にPAF-AH2が細胞膜へ移行することを見出している。そこで、PAF-AH2の細胞膜への移行が、動物個体においても起こるかを検討した。その結果、LPSを腹腔投与したマウスの腎臓において、PAF-AH2の膜画分への移行が起こることを見出した。またPAF-AH2と相互作用するタンパク質を同定するために、293細胞に発現させたPAF-AH2を免疫沈降し、共沈降物をLC-MS/MSにより解析した。その結果、PAF-AH2と相互作用する分子としてペルオキシレドキシン2など複数のタンパク質を同定した。LPSはToll-like receptor 4を介して、NFκBやMAPキナーゼなどの細胞内シグナル伝達を活性化させる。これらのシグナル経路がPAF-AH2の膜移行に関与しており、その下流で「生理活性を持つ酸化脂肪酸」が機能している可能性が考えられる。これらの点について、同定したPAF-AH2相互作用タンパク質との関連を含めて、さらに解析を行っていく予定である。本年度においては、PAF-AH2による「生理活性を持つ酸化脂肪酸」の生体内における役割の解明を目的として、PAF-AH2 KOマウスの表現型の解析を行った。マウスにおけるPAF-AH2の発現解析を行う中で、申請者は、PAF-AH2がマスト細胞に高発現していることを見出した。そこで、マスト細胞におけるPAF-AH2の役割を調べるために、IgE依存的なマスト細胞の脱顆粒反応を個体レベルで評価する事ができる受動皮膚アナフィラキシー反応(PCA反応)をPAF-AH2 KOマウスに対して行った。その結果、PAF-AH2 KOマウスでは野生型マウスに比べてPCA反応が減弱しており、PAF-AH2がマスト細胞のIgE依存的な脱顆粒反応を促進する因子であることが示唆された。マスト細胞膜上の高親和性IgE受容体であるFcεRIがIgEを介して抗原により架橋化されると,受容体直下のチロシンキナーゼが活性化し、その下流で細胞内シグナル伝達経路の活性化することで脱顆粒に至る。今回の結果はこの一連のシグナル経路の活性化にPAF-AH2が産生する「生理活性を持つ酸化脂肪酸」が重要な役割をしていることを示唆しており、今後更なる解析を進めていく予定である。