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「ＥＳＤ」にアプローチする「地域・世界遺産教育」の創造

「ESD」は「21世紀における市民教育」(Citezensip Education)である。我々は、「ESD」のツールとして、新しく「世界・地域遺産教育」と云う概念を造り、「何処でも誰でも」実践ができる「教材事例集」を作成した。それは、研究協力者が日本の世界遺産の全てにフィールドワークを行い、授業実践にかけて作成したものである。それを使用すれば「何処でも、誰でも」ESDにアプローチ可能な内容になっている。また、日本の教育現場では、「グローバル・シティズンシップ教育」の概念は未知である。我々は、その概念を紹介して「多文化共生」の実践事例集付きの冊子を刊行した。本年度に成果は次の3点である。一つは、日本の16の世界遺産サイトに研究協力者を派遣して、それぞれの世界遺産センターの学芸員や専門家及び地域のボランティアガイドなどに依頼をして、それぞれの世界遺産をめぐる「物語=秘話」を聞くことができた。たとえば日光であるが、幕末の維新戦争で焼失の危機があった。幕府軍と「官軍」の間で戦端が開かれかけた。けれども、「官軍」の板垣退助と幕府軍の大鳥圭介との間で休戦交渉がまとまり、戦禍を免れた。そのような経緯で、日光東照宮の参道には板垣退助の銅像が建立されている。無血開城は、江戸城だけではなかったのである。このような「秘話」は世界遺産を守った人々として教材作成の重要な要素になる。また、教材キットの作成では写真の著作権問題が起こるが、今回の研究協力者が撮影した写真については、正当な使用権を持つことができた。二つは、ポーランドの世界遺産サイトである、「アウシュビッツ・ビルケナウのナチス・ドイツの強制絶滅収容所」を訪問して「記憶にとどめるべき遺産」の典型として「原爆ドーム」と比較する教材視点を得ることができた。さらに、「バエティカの岩塩鉱山」も訪問して、日本の世界遺産である石見銀山で働いた人々に共通する信仰心の深さが理解できた。三つは、「地域・世界遺産教育」の視点から、研究代表者の田渕が福山駅前の「岡倉天心像」を通して、天心が日本の伝統文化を守り、"The Book of Tea"(『茶の本』)を通して、世界に日本文化を発信した教材開発の基礎になる「核心」を得ることができた。本年度は、研究テーマに基づいて、研究協力者が授業実践を行い、授業モデルの有効性を検証した。特に、日本における世界遺産である「知床」と「屋久島」の授業実践記録が提出されて、観光客による生態系の破壊が進行している事実が確認された。その結果、改善策として、入所規制ないし入山規制が必要であることが提唱された。また、文化遺産である「姫路城」「日光の社寺」「白川郷・五箇山の合掌造りの集落」では、「石見銀山遺跡とその文化的景観」の授業モデル作成と授業実践が行われた。「姫路城」では、改修後に大量の観光客が押し寄せることが予測され、道路が踏みしめられて雨水が地中に浸透しなくなり周囲の樹木への被害が起った北京の紫禁城の前例に鑑み、木道など誘導路を設ける必要性などが提案された。「日光の社寺」の授業モデルづくりでは、現地に赴いた研究協力者により、新しい視点からの教材開発が行われた。すなわち「戊辰戦争」の戦場になり、焼失の危険があったが、維新側の総司令官の板垣退助と幕府側の大鳥圭介との叡智によって戦禍を免れた事実が発掘された。その意味では「姫路城」も「日光の社寺」も奇跡的に遺った経緯を確認することが、ESDに繋がる視点であることが確認できた。研究代表者は旧ユーゴスラビアのクロアチアにあるドブロブニクやボスニア・ヘルチェゴビニナを訪問調査して、セルビア軍が世界遺産であるが故に意図的に爆撃したこと、モスタルの橋のクロアチアの急進勢力が意図的に爆破した事実を確認し、メディアナショナリズムへの冷静なリテラシー育成がESDに繋がる教材化の視点が開けた。さらに、爆破されたブロックを市民がボランティアで修復した事実も確認できた。次年度は、それを授業モデルにして授業で検証をする予定である。23年度は、研究協力者を日本にある世界遺産サイトに派遣して、そこに住む住民や遺産の保護活動を行っている学芸員へのインタビュー調査を行った。そして『副読本』および「教材キット」刊行のための写真の著作権などを確保することができた。24年度は、直接取材した情報をもとにして、それらの世界遺産をESDの視点から教材化を行った。その文脈で本年度の成果は概略すれば、以下の3点としてまとめられる。第1は、研究協力者と研究分担者が、世界遺産サイトを直接訪問して得たサイトの教材化が行われて、指導案づくりが行われた。中には授業実践まで行い、試案教材の有効性を検証したものもある。

それらは、ユネスコ協会連盟が全国各地で開催した「ESD普及の出前講座」で発表された。鳥取県米子市立淀江中学教諭の山下欣浩氏は、白川郷の合掌造りを取り上げて人々の繋がりである「結」が持続可能な条件であった実践を岡山市で行った。奈良教育大学附属中学校主幹教諭は「知床」を「生物連鎖」を切り口にした実践報告を金沢市や大牟田市で行った。第2は、研究代表者の田渕が、大学生を対象にして、学生たちが地域の文化遺産へフィールドワークを行い、それを教材化した冊子『仲間たちとともに学びあった福山の歴史と文化遺産』(91ページ)を本研究の『中間報告書』として刊行した。第3は、研究分担者である五島政一氏が所属する国立教育政策研究所から『学校における持続可能な発展のための教育(ESD)に関する研究』が刊行されたが、その中心的役割を果たしたのが研究分担者の五島政一研究員であり『学校における持続可能な発展のための教育(ESD)に関する研究』の『抜粋版』が全国的に配布されてESDの浸透に貢献した。「『ESD』にアプローチする『地域・遺産教育』の創造」の意義は、地域の文化遺産や未来に遺したい景観を通してESDが可能であることを実践のフィルターを通して「ユネスコスクール」に発信することである。そして、以下の3点を具体的な目標に設定した。1日本における世界遺産の教材化を行う。2「ユネスコスクール」のネットワーク化を図って実践を持ち寄り、実践事例の中から、ESDに通じる「地域・世界遺産教育」の理論構築を行う。3「実践事例集」を刊行して、ESDの浸透を図ることであった。まず、初年度は研究協力者を通して日本の世界遺産地を訪問して教材化して、それを授業実践に附し、実践からの実践知を研究者間で共有した。2年度は、「ユネスコスクール」や世界遺産が存在するか、または世界遺産登録を目指す地方自治体のネットワーク化を行った。それが、24の地方自治体からなる「世界遺産学習連絡会議」で、「全国世界遺産教育サミット」を開催し本年で5回になり「概要版」を通して、実践成果を共有し合っている。また、研究代表者が地域の優れた文化遺産を掘り起こし実践に附した中間報告書(その1)『仲間と共に学び合った福山の歴史と文化遺産』(Å4版82頁)を刊行して、地域遺産の教材化の理論を共有化した。3年目は、研究協力者が地域の文化・自然遺産の教材化と実践成果の共有を行い、研究代表者が中間報告書(その2)『地域の文化遺産教材化』(Å4版127頁)を刊行した。最終年度は、二つの側面から研究を深化させた。一つは「地域・世界遺産教育」とESDを結び付けた指導案付の『実践事例集』の刊行で、27年6月刊行予定である。今一つは、ESDの重要要素のGlobal Citizenshipの理論構築である。2度の国際会議を経て研究分担者池野範男編『多文化と社会的包摂の視点から考えるシティズンシップ教育』(2015,3月に刊行された。26年度が最終年度であるため、記入しない。教科教育26年度が最終年度であるため、記入しない。今回のプロジェクトの最終-ゴールは、日本の全ての世界遺産についての教材キットを作成することであるが、研究代表者、分担研究者、研究協力者がすべての世界遺産サイト(小笠原諸島や平泉も含む)の直接訪問を終了して、教材キットの「本文解説」と映像を収集できた。
マルチスケールな時空間ニューロダイナミクスの計測と制御

時間的には約10桁、空間的には約3桁に渡る極めて広いマルチスケールな時空間ニューロダイナミクスの計測と制御を行うことを目標に、多電極アレイ上で神経細胞を長期に渡って培養し、インパルスの信号検出およびネットワークの形成過程の観察を行う実験手法を構築し、得られたデータの解析を行うこと目的とした。その結果、多電極アレイ上で、ほぼ安定して数ヶ月以上の長期に渡る神経細胞培養の手法を確立した。また、培養したニューラルネットワークから、長期間連続して、インパルスが計測できるシステムを構築し、さらに、免疫蛍光染色によって、数ヶ月に渡ってネットワークの成長過程を、ニューロンの主要構成要素の変化として計測できる手法を確立した。ニューラルネットワークの基本問題に取り組むためのウェットな実験的研究基盤を独自に構築することが一つの大きな目標であったが、本研究で目的とした実験系の構築は達成され、さらにそれを適用し、重要な結果が得られた。本研究によって構築されたシステムおよび方法に対して、さらに改良を加えることで、時空間ニューロダイナミクスの基本的理解・解明と応用への展開が期待できる。脳の情報処理は、空間的に広がりのあるニューロンのネットワーク中を、電気信号のインパルスが行き交う、時間と空間の極めて広いマルチスケールで生じる時空間ダイナミクスを基盤としている。ばらばらの単体ニューロンが、知覚・運動・記憶・学習を通して、互いに結合しながらネットワークを構築し発達・成長する過程で、個々のニューロンのインパルスがどのようにネットワーク中を伝わっているのかは、脳情報処理の解明・応用を目指す多くの研究者に共通した極めて本質的かつ重要な問題であるにも関わらず、ほとんど解明されていない。本研究では、この問題に取り組むための研究基盤を構築することを目指し、時間的には約10桁、空間的には約3桁に渡る極めて広いマルチスケールな時空間ニューロダイナミクスの計測と制御を目標とする。具体的には、多電極アレイ上で神経細胞を長期に渡って培養し、インパルスの信号検出およびネットワークの形成過程の観察を行う実験手法を構築し、得られたデータの解析を行う。今年度は、研究実施計画に沿って、主に以下の2つのシステムに関する研究を行った。さらに、研究目的達成に必要な、実験条件の検討および理論的検討を進めた。1.長期神経細胞培養システム長期に渡って神経細胞を培養できるシステムの設計・予備実験を行った。ペリスタポンプで、メディウム培養液を多電極アレイ上の神経細胞へ供給し、さらに廃棄機構を設けて還流可能とした。メディウム培養液は、インキュベータ内で5%CO2ガスを十分吸収させ、交換の手間を解消するために、1ヶ月間自動補給可能とするよう設計した。また、培養液の導入経路および廃棄経路は、インパルス計測のノイズ源の一つになることから、ノイズカットのためにシールド対策を施すことにした。予備実験によって、その有効性・問題点を明らかにした。2.時間ダイナミクス(インパルス)計測システム多電極アレイ測定系を最大8個並列化し、64極の電極から電気信号を最長1年に渡って計測可能とするシステムを、ハード・ソフト両面から検討し、まず一ヶ月間の連続測定が可能な並列システムを構築した。多電極アレイはMEDシステム(アルファメドサイエンス社製)を用い、並列化可能な制御系の設計・製作を新たに行い、科学研究費基盤B(2005年度-2007年度)により構築した可変入力培養神経回路システムを、ハード・ソフト共に大幅に増強した!ウェットな培養系は、個体から細胞を採取する時点でのバラツキが大きい。よって、同一個体から採取された複数の培養細胞に対して同一の現象が起きていることを保証することが必要となる。また、初期分散密度などの異なる培養条件下でも再現性のある実験データを取得することが重要になる。今年度行った上記2つのシステムは、これらの要求を満たすと期待される。研究実施計画に沿って、前年度に着手した、長期神経細胞培養システムの構築に加えて、空間ダイナミクスの計測システムの構築を行った。さらに、インパルスの時系列データに対する理論的検討を進めた。以下に、それぞれについてまとめて記述する。1.長期神経細胞培養システムの構築昨年度に続いて、長期にわたって神経細胞を培養するシステムに関する実験を行った。特に、培養液、多電極アレイおよびカバーガラスへのコーティング物質について検討を加えた。その結果、ほぼ安定した、一ヶ月以上の長期に渡る培養の手法を確立した。ただし、多電極アレイについては、カバーガラスに比べ、統計的なデータとするには回数が限定されているので、さらに実験を積み重ねる必要がある。

2.空間ダイナミクス(ネットワーク)計測システムの構築共焦点レーザー顕微鏡を導入し、免疫蛍光染色による、培養ニューロンネットワークの3次元計測に関する実験を進めた。免疫蛍光染色は、細胞核(Hoechst 33342,N-21485)、樹状突起(MAP2)、軸索(NF)、グリアを多重染色する手法を確立した。また、光学顕微鏡の分解能を補完するために、SEM(走査電子顕微鏡)を用いて、さらに高分解能画像を取得する方法について検討した。免疫蛍光染色については、異なる培養日数で定点観測を行い、発現量を定量化すること、およびシナプスの染色を行うことが次の課題として残った。また、光学顕微鏡と電子顕微鏡(SEM)のスケールをスムーズに接続するためには、さらに予備実験を積み重ねる必要がある。3.理論的検討時間ダイナミクス(インパルス)計測システムによって得られたインパルスの時系列データをもとに、ネットワークの同期バーストについて理論的な解析を行い、同期バーストを生ずるモデルを導出した。前年度までに構築した、長期神経細胞培養、時間ダイナミクスの計測、空間ダイナミクスの計測の3つのシステムを用いて、同期バーストの発生に必要なニューロン及びネットワークのサイズに関する実験および解析を行った。多電極アレイ上で、ラット胎児大脳皮質由来の培養ニューラルネットワークの同期発火の有無を計測後、免疫蛍光染色によりニューロンを識別することにより、同期活動に必要なニューロン数を計測した。実験データの解析によって、同期バーストの発生に必要最低限の初期密度がある事を明らかにした。研究成果の一部は、多電極アレイに関する最大規模の国際会議(MEA Meeting 2010、ドイツ、参加国数20,2010年7月)において発表され、数多くある候補の中から論文中の蛍光染色イメージの一つが"the most impressive image"としてProceedingの表紙に採択された。また、同期バーストに必要なネットワークの最小サイズに関する論文としてまとめられ(Neuroscience 171,50-61,2010.)、論文中の蛍光染色イメージの一つが、Neuroscience誌の表紙を飾った。ニューロンの同期発火は認知・記憶・学習等の高次情報処理に強く関わっていることが示唆されているが、同期活動に必要なニューロン数は、生体内で計測することは不可能であり、本研究で構築した、時空間ダイナミクス計測システムで初めて実験的に可能となった研究である。また、時間ダイナミクス(インパルス)計測システムによって得られた実験データをもとに、リターンマップによる時系列データ解析を進めた。その結果、ネットワーク発達期には、各ニューロンが異なる発火パターンを持つ複数の種類に分類できる可能性を見出し、同期バーストに至るネットワーク形成過程の理解につながると期待される。最終年度であることから、これまでの研究をさらに進めつつ、残された課題についてまとめる作業を主に進めた。
次世代半導体リソグラフィー用極端紫外光源のスズデブリ除去過程に関する研究

本年度は、EUV光源におけるスズデブリの水素による除去に関する研究の第1段階として、小型チャンバーで発生させたVHF水素プラズマでスズを分解して分解量を定量化する検討と、スズターゲットにYAGレーザーを照射してEUV光を発生させ、それによって水素ガスがどのようにプラズマ化するかを調査した。VHFプラズマによるスズ分解実験では、まず試験のためのサンプルとして、15mm角で厚み0.6mmのシリコン基板に100 nm程度の厚みのスズの膜を形成したものを準備した。ガス圧依存性をまず見るため、20sccmのガス流量のもとで、ガス圧を15Pa、35Pa、70Pa、150Paと変化させた。プラズマ照射後のスズの残留量を、XRFで測定した。その結果、35Paでのスズ分解が最も早く、20分のプラズマ照射でほぼすべてのスズが分解除去された。他方、150Paでは、サンプル上の一部でスズの量が増加し、再堆積を示唆する現象が見られた。ガス流量を10sccmと半分にすると、35Paでも再堆積が現れた。すなわち、水素プラズマの密度を高くしてスズの水素化を早くしても、十分なガス流れがなければ、スズが再堆積して、スズ分解は進展しないことが確認された。EUV光による水素のプラズマ化の実験では、YAGレーザー照射によるEUV光発生点から50mm離れた位置での、プラズマの密度・温度をレーザートムソン散乱法で測定した。EUV光のフラックスは、0.4mJ/cm^2程度と評価された。この条件下で、トムソン散乱信号を検出することに成功し、水素ガス圧100Paの条件においてEUV光発生開始後の時刻30ns程度で電子密度は、最大値4×10^17 m^-3となり、100ns程度の時間プラズマが保持された。電子温度は、1 eV程度であったが、ミラーを模擬したシリコン板の前面では、5 eV程度の高温成分も検出された。スズの水素プラズマによる分解過程の基本的な部分を、実際にVHFプラズマで観測することに成功した。スズの残留量をXRFで測定したときの、測定誤差は±10%程度であった。初年度は、スズ残留量の定量化を可能としただけで、まだ測定は一部の条件下で行っただけであり、今後、広い条件化での測定が必要である。EUV光による水素プラズマのトムソン散乱計測は、初年度にして成功したことは望外の成果であった。しかし、測定の再現性の確認や、幅広い条件下での測定が必要である。スズ分解測定をより広い条件下で実行していく。それをもとに、スズ分解過程のモデル化を行う。サンプルそのもののスズの量が必ずしも均一ではないことも、スズ分解能の定量化をはかる上で困難性の1つとなっている。これは、シリコン基板を購入する業者と、それにスズの製膜をする業者と十分に打合せて、出来るだけ均一なサンプルを入手できるようにする。また、VHFプラズマのパラメータの測定にも着手し、水素イオンのフラックスをパラメータとした実験を行う。EUV光による水素プラズマの定量化も、幅広い条件下での測定を実行する。水素ガスの気相で、EUV光により直接解離や電離を受ける成分と、ミラーを模擬する材料の表面において、2次電子により電離する成分を分離して測定することも検討する。この場合、ミラーのキャップ材の材質の影響も調査する。これらの2つの方向から、水素ガスによるミラー表面スズデブリの分解過程を定量化していく。

スズの残留量をXRFで測定したときの、測定誤差は±10%程度であった。初年度は、スズ残留量の定量化を可能としただけで、まだ測定は一部の条件下で行っただけであり、今後、広い条件化での測定が必要である。EUV光による水素プラズマのトムソン散乱計測は、初年度にして成功したことは望外の成果であった。しかし、測定の再現性の確認や、幅広い条件下での測定が必要である。スズ分解測定をより広い条件下で実行していく。それをもとに、スズ分解過程のモデル化を行う。サンプルそのもののスズの量が必ずしも均一ではないことも、スズ分解能の定量化をはかる上で困難性の1つとなっている。これは、シリコン基板を購入する業者と、それにスズの製膜をする業者と十分に打合せて、出来るだけ均一なサンプルを入手できるようにする。また、VHFプラズマのパラメータの測定にも着手し、水素イオンのフラックスをパラメータとした実験を行う。EUV光による水素プラズマの定量化も、幅広い条件下での測定を実行する。水素ガスの気相で、EUV光により直接解離や電離を受ける成分と、ミラーを模擬する材料の表面において、2次電子により電離する成分を分離して測定することも検討する。この場合、ミラーのキャップ材の材質の影響も調査する。これらの2つの方向から、水素ガスによるミラー表面スズデブリの分解過程を定量化していく。
高校情報科学教育におけるPBL作品集の作成とその郊果の検証

筆者は,情報科学教育とPBL(問題解決学習)を有機的に融合した新しい高等学校の情報科学教育カリキュラムISEC-SET (Information Science Education Curriculum Based on PBL with Squeak Etoys)を2003年から開発し,実践研究を進めてきた。ISEC-SETでは,生徒が自分自身で研究課題を設定し,その課題をプログラミング等を用いて分析.考察し,その過程および成果を論文などの形式にまとめて,発表・討論することを最終到達目標としている。本研究では,過去の授業実践における生徒の優秀な成果(論文(レポート)およびSqueak Etoysのプロジェクトファイル)等を収録した「PBL作品集」を作成することを目的とした。この作品集は,単に研究成果を掲載するだけではなく,どのように研究を進めたかが分かるようなラーニングポートフォリオとしての学習プロセスの可視化を行っている。生徒がこれを参照することにより,自分自身で研究課題を設定するの際の大きなサポートとなることが期待できるとともに,この作品集自体を他の学校教員がPBL型の情報科学の教材としても活用することも可能である。本研究では,これまでの生徒作品のオーサリングとラーニングポートフォリオの整理を行った(12月)。その後,プロトタイプを完成させ,これを生徒に配布して評価を行って,その効果を検証した(2月)。その後,再度改良作業を加え,印刷物(約120ページ)とCD-Rから成る「PBL作品集」を完成させることができた(3月)。
光と遷移金属触媒の協同的な作用による反応の開発

昨年度に引き続き、光と遷移金属触媒の協同作用による反応の開発を行った。その結果、ジアリールケトンが光酸化還元触媒として働き、ニッケル触媒による芳香族ハロゲン化物のホモカップリング反応が進行することを見出した。この反応は、これまで用いられてきた貴金属を中心とする光酸化還元触媒と同様の触媒作用を、安価で入手容易なケトンによっても得られることを示した点で意義深い。さらに、フローシステムを用いることで、大スケールの反応に応用することができた。ニッケル触媒の還元に着目して研究を進めたところ、ピナコール誘導体が還元剤として利用できることを見出した。すなわち、ニッケル触媒による有機ハロゲン化物の還元的カップリング反応が、ピナコール誘導体の存在下進行することがわかった。これにより、これまで用いられてきた亜鉛やマンガンといった金属還元剤に代えて、ピナコール誘導体を利用できることが明らかになった。また、このピナコール誘導体は、ケトンのイソプロピルアルコール溶液に紫外光を照射することで容易に合成できる。さらに、光照射下ニッケル触媒を用いることで、トルエン誘導体のベンジル位炭素ー水素結合を芳香族臭化物によってアリール化できることを見出した。これは、これまで困難であった単純なトルエン誘導体のベンジル位炭素ー水素直接アリール化反応であるとともに、触媒としてニッケル錯体のみを必要とするシンプルな反応例である。前述の反応と同様に、高価な光酸化還元触媒を必要としない点で優れている。28年度が最終年度であるため、記入しない。当初の計画通り、光とコバルト触媒によるオルトトリルケトンとアルデヒドの付加環化反応の検討を行った。すなわち、オルトトリルケトンに紫外光を照射すると生じるオルトキノジメタンが、コバルト触媒と反応してメタラサイクルを形成したのち、アルデヒドと反応してラクトンを与えるのではないかと想定して、様々なオルトトリルケトンを反応させた。しかし、アルデヒドの分解により、目的のラクトンを高収率で得ることはできなかった。そこでアルデヒドに代えて、イミン、二酸化炭素などを用いて検討を行ったが、目的の生成物は得られず実験計画を見直すこととした。続いてオルトブロモトルエンと一酸化炭素からベンゾシクロブテノンを合成する手法を着想した。すなわち、ブロモトルエンが遷移金属触媒に酸化的付加したのち、一酸化炭素が挿入してアシル金属種が発生する。これが光の作用によりオルトキノジメタンとなり、閉環してシクロブタン環を形成する。最後に金属が脱離してベンゾシクロブテノンが生成するのではないかと考えた。そこでアシルパラジウム錯体を合成して、その反応性を調査した。紫外光の照射は錯体の分解を促進するのみであったが、塩基の存在下で亜リン酸ジエステルを作用させるとアシルホスホン酸が生成することを見出した。この反応についてさらに検討を行い、芳香族ヨウ化物からアシルホスホン酸を触媒的に得る反応を開発した。次にN-アリルグリオキシルアミドからジヒドロピリドンを合成する手法の開発に取り組んだ。まず、N-アリルグリオキシルアミドの光環化反応について検討したところ、高い収率でβラクタムを与えることがわかった。得られたβラクタムにロジウム触媒を作用させたところ、その骨格の再構築が起こってジヒドロピリドンが得られた。さらに不斉配位子の検討を行ったところ、Josiphosを配位子としたときに高い収率および鏡像体過剰率を示すことがわかった。昨年度に引き続き、銅およびケトンを用いた光によるアリル位炭素ー水素結合のカルボキシル化反応に関して、研究を進めた。本反応の鍵となるケトン触媒を検討した結果、キサントンが効率よく目的生成物を与えることを見出した。また、さらなる最適化のため、さまざまなケトンを合成し、反応条件に付したところ、3,6-ジフェニルキサントンを用いたときに、もっとも高い収率で生成物のカルボン酸を与えることがわかった。これを最適条件とすることで、天然物であるβ-ピネンを含むさまざまなアリル化合物に本反応を適用することができた。(Chem. Eur. J., in press)次に、上記の反応から発展させ、光と遷移金属触媒の協同作用によるベンジル位の炭素ー水素結合カルボキシル化反応に着手した。さまざまな遷移金属と基質の組み合わせを検討した結果、2-メチルベンゾフェノンを用いた際に、ベンジル位炭素ー水素結合のカルボキシル化体が観測された。さらに詳細な検討の末、本反応は遷移金属のみならず、塩基や還元剤の添加さえも必要としないことが明らかになった。さらに、本反応は太陽光で進行することも明らかにした。(J. Am. Chem. Soc. 2015, 137, 14063-14066)続いて、トルエン誘導体のベンジル位炭素ー水素結合のカルボニル化を目標とし、紫外光を照射しながら、さまざまな遷移金属触媒の存在下、カルボキシル化反応の検討を行った。その結果、ニッケル触媒を用いたときに反応が進行することを見出した。具体的には、p-キシレンに対し、ニッケル触媒およびケトン触媒としてキサントンを用い、ベンゼン溶媒中1気圧の二酸化炭素雰囲気下、365nmの紫外光を2時間照射したところ、p-トリル酢酸が72%の収率で得られた。詳細な反応機構と基質適用範囲に関する検討を現在行っている。当初の計画通り、銅触媒と光の協同作用によるアリル位炭素ー水素結合の直接カルボキシル化反応に関する検討を行い、完成させ、国際化学会誌に報告した。

この反応は、これまで困難であった炭化水素の直接カルボキシル化反応であり、遷移金属と光の協同作用による反応という研究指針が有用であることが証明された。続いて、同様にベンジル位の炭素ー水素結合カルボキシル化反応に着手した。さまざまな遷移金属と基質の組み合わせを検討した結果、2-メチルベンゾフェノンを用いた際に、ベンジル位炭素ー水素結合のカルボキシル化体が観測された。さらに詳細な検討の末、本反応は遷移金属のみならず、塩基や還元剤の添加さえも必要としないことが明らかになった。この結果は、当初予期していなかったが、光のみを駆動力として進行する新しいカルボキシル化反応であり、有機合成分野において非常に大きな成果である。また、添加剤を使用しない利点を活かして、ワンポットで生物活性物質に見られるベンゾジアゼピン骨格を合成することに成功している。さらに本反応は太陽光でも進行し、これまでに例の無いきわめてクリーンなカルボキシル化反応である。以上より、本反応は、有機合成分野にとどまらず、さまざまな分野で応用されることが期待される。最近では、より単純なトルエン誘導体のカルボキシル化反応を目指し、さまざまな遷移金属触媒と光による反応を検討した結果、ニッケル触媒を用いた際に、効率よくカルボキシル化が進行することを見出した。さらなる検討を行い、反応の有用性を確かめていく予定である。これらの結果から分かるように、本研究課題において当初計画していた以上の大きな進展が見られる。昨年度に引き続き、光と遷移金属触媒の協同作用による反応の開発を行った。その結果、ジアリールケトンが光酸化還元触媒として働き、ニッケル触媒による芳香族ハロゲン化物のホモカップリング反応が進行することを見出した。この反応は、これまで用いられてきた貴金属を中心とする光酸化還元触媒と同様の触媒作用を、安価で入手容易なケトンによっても得られることを示した点で意義深い。さらに、フローシステムを用いることで、大スケールの反応に応用することができた。ニッケル触媒の還元に着目して研究を進めたところ、ピナコール誘導体が還元剤として利用できることを見出した。すなわち、ニッケル触媒による有機ハロゲン化物の還元的カップリング反応が、ピナコール誘導体の存在下進行することがわかった。これにより、これまで用いられてきた亜鉛やマンガンといった金属還元剤に代えて、ピナコール誘導体を利用できることが明らかになった。また、このピナコール誘導体は、ケトンのイソプロピルアルコール溶液に紫外光を照射することで容易に合成できる。さらに、光照射下ニッケル触媒を用いることで、トルエン誘導体のベンジル位炭素ー水素結合を芳香族臭化物によってアリール化できることを見出した。これは、これまで困難であった単純なトルエン誘導体のベンジル位炭素ー水素直接アリール化反応であるとともに、触媒としてニッケル錯体のみを必要とするシンプルな反応例である。前述の反応と同様に、高価な光酸化還元触媒を必要としない点で優れている。
授業スタイルの形成と学校文化-ライフヒストリー的アプローチを用いて

研究成果についてはおよそ三つのパートに分けることができる。一つ目は、授業研究としてのライフヒストリー的なアプローチの確立である。授業研究の方法論としては、従来一時間単位、あるいは長くても単元単位の授業分析が主であったが、通授業的な授業者の授業スタイルは、短い単位の授業研究では必ずしも明らかにはされてこなかった。授業スタイルの形成と変容を明らかにするためにライフヒストリー的アプローチの有効性を一定明らかにすることができた。二つ目は、奈良女子大学附属小学校における授業研究、およびライフヒストリーインタビューのさらなる展開である。小幡肇との協働はアクションリサーチとして行われた。また新しく転任してきた教師へのインタビューを行い、授業スタイルの形成にとって学校文化がかなり大きな役割をはたしていることが明らかになった。三つ目は、いくつかの周辺的なモノグラフづくりである。公立の学校のみでなく、日本語学校において教師がどのように授業スタイルを形成しているか、上と同じ方法論で分析、解釈を行い、また学校文化だけではなく、サークル等を含めた教師文化が授業スタイルの形成にいかにかかわっているか、河崎かよ子氏を対象にしてライフヒストリーインタビューを行い、授業づくりから授業観のレベルを含めて授業スタイルの形成に教師文化がどのようにかかわっているかを明らかにすることができた。授業スタイルの形成について、学校文化がどのように影響しているのか、個々の教師たちが学校における「教え」と「学び」の文化との出会いによってどのように授業スタイルを構築(再構築)していったのか、授業観察、インタビューを用いて明らかにすることが今年度の研究目的であった。奈良女子大学附属小学校においては、12人の教師にインタビューを行い、学校文化が確かに個々の教師に授業スタイルの再構築を促していることが確認された。奈良女子大学附属小学校においては、大正時代から綿々と受け継がれた学習法が、子どもたちの「おたずね」「お伝え」また独自・相互・独自学習として伝承されている。各々の教師のこの学習法との出会いは、カルチャーショックのような出会い、あるいは自分のこれまで行ってきたことの延長線上に位置付いた出会い、など多様だが、いずれにしろ、教師自身がこの学校においける自分の授業スタイルをつくりあげていく契機になる、という意味で大きなエポックメイキングとなっている。今年度転任してきた教師にも5月にインタビューを行い、これ以降定点的にインタビューをさらに行いながらその変化を追っていく予定である。堀川小学校においては、まだ十分個々の教師のインタビューをとれていない状況だが、重松鷹泰主事の大きな影響を受けて学校文化を成立させたという点においては、奈良女子大学附属小学校と共通点を持ちつつも、学校の伝統を引き継ぐ研修のシステムはずいぶんと異なっている。それは附属と公立という大きな枠組みの違いもあるが、きわめて周到なシステムを構築している。奈良の場合は一人一人の教師の「学び」に基本的には委ねられるのに対して、堀川においては、転任してきた教師は、年間20回に及ぶ学級公開授業、研究授業の中で、さまざまな指導やコメントを受けながら授業スタイルを構築していくのである。堀川の場合も基本的な共通理念を持ちながら、個々の教師の味を活かして授業スタイルが構築されていく。次年度は何人かの教師のライフヒストリーインタビューを行いながら個々の教師がその経験をどのように意味づけているのか明らかにしていく予定である。一つ目は,授業研究としてのライフヒストリー的なアプローチの確立である。授業研究の方法論としては,従来一時間単位,あるいは長くても単元単位の授業分析が主であったが,通授業的な授業者の授業スタイルは,短い単位の授業研究では必ずしも明らかにはされてこなかった。二つ目は,奈良女子大学附属小学校における授業研究,およびライフヒストリーインタビューのさらなる展開である。また新しく転任してきた教師へのインタビューを行い,授業スタイルの形成にとって学校文化がかなり大きな役割をはたしていることが明らかになった。三つ目は,いくつかの周辺的なモノグラフづくりである。

公立の学校のみでなく,日本語学校において教師がどのように授業スタイルを形成しているか,上と向じ方法論で分析,解釈を行い,まだ学校文化だけではなく,サークル等を含めた教師文化が授業スタイルの形成にいかにかかわっているか,河崎かよ子氏を対象にしてライフヒストリーインタビューを行い,授業づくりから授業観のレベルを含めて授葉スタイルの形成に教師文化がどのようにかかわっているかを明らかにすることができた。
介護保険報酬債権の担保化・証券化に関する研究

介護保険事業の運営は、多額の施設・設備整備費を必要とする施設系サービスを中心に、借入金に依存する構造にある。こうした資金調達事情の下、介護保険報酬債権の証券化・担保化のニーズは高い。護保険報酬債権の証券化・担保化に当たり考慮すべきリスクを整理すると、1)査定、返戻等、2)代理受領の要件に係る瑕疵、3)指定取消処分、4)倒産である。それぞれ請求済み債権、将来債権に共通するリスクであるが、リスクが現実化した場合に損害が大きい3)指定取消等処分および4)倒産については、特に将来債権の問題として検討しなければならない。今後、担保が実行された場合の事業運営、ひいては入所者・利用者への影響を考慮した規制とともに、投資者の立場から見た債権回収リスクへの対応を個別に検討する必要がある。初年度のため、介護保険に関する制度理解と知識の共有化を図ることを第一目標とした。このため、新潟大学社会保障研究会において、以下のようなテーマで3回の研究報告を行った。(1)2009年8月24日【新潟大学社会法判例研究会】報告者:加藤タイトル「介護保険をめぐるヒト・カネの動き-「介護保険報酬債権の担保化・証券化に関する法的枠組み」の一資料-」(2)2009年12月19日【新潟大学社会法判例研究会】報告者:石畝タイトル「介護保険契約規制の課題」(3)2010年2月26日【新潟大学社会法判例研究会】報告者:石畝タイトル「介護保険制度の私法的構造」これらの研究報告は以下のように要約することができる。まず、医療保険における当事者関係と介護保険における当事者関係の比較検討を通じて、診療報酬と介護報酬の流れに関する異同を考察した。次に、介護保険契約に関する法規制の内容を分析し、この分析を前提に、介護保険に関連する具体的な当事者関係と介護報酬の流れを制度枠組の中で考察した。これらの検討は、介護保険契約における介護報酬の動きを社会保障法制および民事法分野から分析するもので、理論的には介護報酬の証券化・担保化は可能であるとの仮説を得た。そして次年度は、具体的な事例の検討も視野に入れることが確認された。介護保険の介護報酬債権について、その担保化・証券化は可能であるとの仮説に基づき、平成21年度の研究会を通して得られた研究の枠組に従い、各分担者の分担項目につき個別に研究を深めた。研究会での議論を通して、医療保険及び介護保険に関する社会保障法学と民法との間に、基本的な共通認識に欠けることが認識されたため、共通認識を獲得するための情報交換を行うことが確認された。平成22年度当初に策定した実施計画に基づき、研究代表者である加藤は、(a)地域における介護保険報酬債権を用いた資金調達に対する需要測定に関連して、医療保険における診療報酬の審査状況を検討するとともに、(b)自治体・事業者等、介護保険関係当事者において認識されている問題点等に関する実態把握に関連して、札幌市所在の医療法人に対する聞き取り調査を行った。また、「地域保険(介護保険、国民健康保険等)の保険者の機能と枠組み-保険者自治と民主的統制(租税法律主義等)の観点からの考察-」(報告者:岩井勝弘氏)というテーマで、2010年9月15日(水)新潟大学で研究会を開催した。その後、平成22年度の研究成果に関する情報交換を目的とした研究会は、東北関東大震災の影響により、2011年4月2日に新潟大学で実施された。そこでは、「介護保険事業の資金調達に関する制度的課題」というテーマで岩井勝弘氏が報告したあと、議論した。なお、本研究の成果の一部として、加藤が、日本社会保障法学会第58回大会において、「医療保険制度の変容と保険者のあり方」というテーマで学会報告を行った。本研究の総括として、2011年11月26日、「保険医療機関指定の法的性質と診療報酬請求権再論」(報告:加藤智章、於:新潟大学)というテーマで研究会を開催した。この研究会での議論とその後の各自の研究成果に関する意見交換を通して、以下のように要約することができる。介護保険事業者の収入は、基本的に自己資金、補助金等収入、利用者負担及び介護報酬により構成される。その中でも主たる収入源は介護報酬である。しかし、主たる収入源である介護報酬が月単位の短期的収入であるのに対し、施設・設備整備に係る費用などは長期にわたり償却される費用を一時期に支出する必要があることから、その財源は借入金に依存することとなる。また近年、補助金や交付金が減少しているため、資金計画に占める借入金の割合が高まっている。

こうして事業の種類によって程度の差はあるものの、常態的に多額の借入金ニーズがあること、特に、介護保険報酬債権は一般的に信用力が高いため、介護保険報酬債権の証券化・担保化のニーズが高いと考えられる。実際、独立行政法人福祉医療機構などが、貸付事業を展開しているが、介護報酬債権を証券化・担保化する際、リスクが現実化した場合に損害が大きい・指定取消等処分および・倒産については、特に将来債権の問題としてなお検討すべき問題であろう。また、社会保障法学と民法との基本的認識の共有化という課題も、本研究を通じて明らかになった。具体的には、診療報酬債権と介護報酬債権をそれぞれ将来債権とみるか請求済み債権とみるかという問題などが検討すべき論点となろう。以上のような経過を経て、石畝剛士「介護保険契約の規制枠組-序論」(法政理論・2012年)、加藤智章「公的医療保険と診療報酬政策」日本社会保障法学会新講座第1巻所収予定(法律文化社、2012年5月予定)が、本研究の研究成果として、刊行される予定である。
配位力の弱いオレフィン基質の触媒的不斉水素化の研究

掲題の下に2-〔α-(メトキシカルボニルアミノ)ベンジル〕アクリル酸メチル(1)のジアステレオ面選択水素化を行った.アリルアミン官能基による立体制御を期待して, 1の水素化をRh(COD)(DPPB)^+CLO^-_4, Ru(OCOCF_3)_2(PPh_3)_2を触媒として,水素圧30atm,室温で行ったところ,ほぼ完全なanti選択でトレオ生成物(2)を与えた(式1).これはβ-アミノ酸として有用.さらに一般のα-アミノアルキルアクリル酸誘導体についても,上記Rh触媒で水素化を行ったが,ジアステレオ選択性に一定の傾向はなかった.不斉Ru触媒にらる速度論的分割:触媒的不斉合成による光学分割は理想的な手段である. Ru(OAc)_2〔(S)-BINAP〕を触媒として1の水素化を行ったところ,非常に効果的な速度論的分割が起こり,反応率60%で回収した1の光学純度はほぼ100%eeに達し,この水素化での相対速度比がK_R/K_S=17であった.フェニル基でなく,メチル基ではトレオ/エリトロ比が78:22と著しく低下するものの,相対速度比はK_R/K_S=14とあまり変わらなかった.掲題の下に2-〔α-(メトキシカルボニルアミノ)ベンジル〕アクリル酸メチル(1)のジアステレオ面選択水素化を行った.アリルアミン官能基による立体制御を期待して, 1の水素化をRh(COD)(DPPB)^+CLO^-_4, Ru(OCOCF_3)_2(PPh_3)_2を触媒として,水素圧30atm,室温で行ったところ,ほぼ完全なanti選択でトレオ生成物(2)を与えた(式1).これはβ-アミノ酸として有用.さらに一般のα-アミノアルキルアクリル酸誘導体についても,上記Rh触媒で水素化を行ったが,ジアステレオ選択性に一定の傾向はなかった.不斉Ru触媒にらる速度論的分割:触媒的不斉合成による光学分割は理想的な手段である. Ru(OAc)_2〔(S)-BINAP〕を触媒として1の水素化を行ったところ,非常に効果的な速度論的分割が起こり,反応率60%で回収した1の光学純度はほぼ100%eeに達し,この水素化での相対速度比がK_R/K_S=17であった.フェニル基でなく,メチル基ではトレオ/エリトロ比が78:22と著しく低下するものの,相対速度比はK_R/K_S=14とあまり変わらなかった.
イオンおよび極性分子の摩擦係数に対する液相クラスター化の影響

高分解能NMR装置を使って、溶液中の硝酸イオンの回転摩擦係数を水、アセトニトリル、メタノール、エタノール、プロパノール中で、凝固点から沸点までの広い範囲で研究し、連続媒体モデルに基づくHubbard-Onsagerの誘電摩擦理論と比較し、モデルの信頼性の範囲と限界を明確にした。連続体モデルで考慮されていないイオン内の電荷分布とこれに応答する溶媒分子の原子サイト上の部分電荷との静電的相互作用の役割が大きいことを明らかにした。中性・無極性のベンゼン分子と極性の水分子の回転摩擦係数に対応するτ_<2R>の研究を行い、溶解度が低いために実験が困難と考えられていた疎水性水和のダイナミクスについての研究を実現した。次の点を明らかにした。(1)ベンゼン分子のτ_<2R>は-20°C付近でジャンプして約1/3に低下する。(2)-20°Cから-50°Cの相はベンゼンのclathrate hydrateと考えられる。(3)ゆらぎの大きい溶液の水和殻中でのベンゼンの回転の活性化エネルギーは温度の低下とともに増大するが、clathrate hydrateの相では約半分程度に低下する。(4) Arrheniusプロットは純水のものと約15°C付近で交差し、低温領域でより大きなベンゼン分子の回転がより小さな水分子より回転し易くなる。(5)水和殻中の水に対して正のB_τが求まり、これは疎水性分子のまわりの水の構造のenhancementを明確に示す。(6)-18°Cの過冷却領域では、水和殻中の水分子の回転相関時間はバルクの値の約4倍に達し、過冷却を利用した研究によって疎水性分子のまわりの水の構造化が事実起こっていること確認することができた。溶質の疎水性による水の再構造化による安定化は疑いの余地がない。
樹状細胞由来破骨細胞を中心とした歯周炎病態形成機構の＂骨免疫学＂的視点からの解明

ESTファミリー転写因子PU.1は主に骨髄球系前駆細胞に発現し、成人型造血における細胞の運命選択に重要な役割を果たす。しかし、PU.1遺伝子の発現が転写因子ネットワーク内でどのように同細胞の分化を制御しているのか、そのメカニズムは十分に解明されていない。本研究の目的は、転写因子PU.1を中心とするゲノムワイド転写因子マップを作成することで、そのため標的ゲノム編集技術であるTALEを用いてPU.1のエンハンサーの修飾を試みた。この修飾によりPU.1遺伝子の発現レベルを変化させることで生じる転写因子ネットワークの変化を単一細胞レベルで解析することとした。本研究においては、まず造血幹細胞および造血前駆細胞の運命を決定づける転写制御の分子機構を明らかにするのに必要なTALEを用いた解析法の開発に取り組んだ。ES細胞のPU.1の転写開始点下流14kbに存在するエンハンサーにTALEを用いて転写活性化ドメインVP64あるいは転写抑制ドメインKRABをコードするDNAを導入し、EB(EB:胚様体)を形成させた。導入したDNAにはドキシサイクリン標識を行い、PU.1およびそれに隣接した遺伝子群の発現に及ぼす影響と造血細胞分化へ及ぼす効果を解析した。その結果、TALEを用いた標的ゲノム編集と単一細胞レベルでの遺伝子発現プロファイリングを組み合わせた方法が、遺伝子レベルでの細胞分化調節ネットワークの解析に有用であることが明らかとなった。本研究で実施したTALEを用いたPU.1-14kbの活性化によって細胞表面抗原の発現量は変化し、造形細胞への運命決定が促進されることが示された。すなわち、単一細胞遺伝子発現解析の結果、PU.1-14kbの活性化は同細胞内の転写因子ネットワークが内皮系から造血系へと推移させた。本研究はPU.1-14kbの造血細胞分化に果たす重要性を明らかにしたばかりでなく、遺伝子ネットワーク解析におけるTALEを用いた標的ゲノム編集の有用性を示した。26年度が最終年度であるため、記入しない。IKKシグナルソーム-p63シグナル経路上の因子の樹状細胞の維持、分化制御における機能及び、TALEを制御する造血・骨髄系転写調節因子の活性化・不活性化が多能性状態へ導く連続するステップ、階層的な遺伝子発現制御機構の変化の情報を得て、転写因子ネットワークの特性を利用した過剰な骨破壊に起因する疾患の新規治療法の開発を目指す。本年度の研究遂行の結果、課題1)では、LPS刺激に対する細胞応答細胞培養系を用いE.coli菌LPSが細胞に与える影響を検討した。樹状細胞を用いて、LPS刺激によるTLRシグナル伝達に果たすMyD88依存・非依存性経路の機能を調べたところ、LPS刺激により未分化なマウス樹状細胞から成熟細胞へ分化誘導すると、TLR4転写産物を介してTAp63βの上昇が認められた。このことより、癌抑制遺伝子p53ファミリーp63が、樹状細胞成熟の分子機構に関与していることがわかった。機能発現に際して内因性の標的遺伝子の誘導だけでなく、同分子がアポトーシスの促進に伴い安定的に発現した場合、増殖が抑制されると考えられる。課題2)では、rtTAを発現するマウスES細胞株は、未分化な段階で造血幹細胞関連の抗原が13%検出されていたが、DOXY添加による特定TALE標的遺伝子を発現誘導すると、ES細胞株から調製した胚様体(EB)の分化誘導8日目にはその発現量が20%まで上昇した。EBのCFU法の分析でも、残存未分化な細胞集団CFU-GMおよびCFU-GEMの形成量の顕著な上昇が観察された。これらより、p63βを用いることで効率的に樹状細胞の成熟化を誘導するばかりでなく、樹状細胞のアポトーシスがプログラミングされることを明らかにした。また、EBにおけるTALE標的遺伝子誘導では発現量に相違のある細胞は残存未分化な細胞集団をなし、CFUの面でも異なる性質を示すことが明らかとなった。平成25年度における研究成果本申請課題では、造血幹細胞および造血前駆細胞の同一性と運命を決定づける転写制御の分子機構を明らかにするために、TAL (Transcription activator-like : Tal)エフェクターを用いた解析法の開発に取り組んだ。この技術は最も簡便で成功率が高いばかりでなく、多くの生物や細胞種に応用可能な標的ゲノム編集技術である。標的細胞としてヒト血液細胞株K562、マウス血液細胞株416BとマウスES細胞株Ainv18を用いた。単純ヘルペスウイルス由来タンパク質16 (VP16)に由来する最小の転写活性化ドメインまたはクリュッペル付随ボックスをもつZincfingerタンパク質(KRAB)と融合させることで、非常に初期の造血細胞分化に関与するScl/Tal1またはPU. 1を標的とした転写エンハンサーを作製した。まずこれらをSclの転写開始点上流40kbまたはPU. 1の転写開始点下流14kbにTALエフェクター転写調節因子を用いて組み込むことで、Scl/Tal1およびPU. 1と、さらに隣接する遺伝子であるMAP17とScl39a13の発現誘導の検討を行つた。次に、造血転写因子ネットワークと細胞の運命決定について、特定TALエフェクター標的遺伝子を用いた集積流体回路技術(lntegrated Fluidic Circuit : IFC ; BioMarkシステム)を応用することで、単一細胞から定量的RT-PCR解析を行い、造血細胞の特性を規定する遺伝子群および転写因子の同定を試みた。

遺伝子発現解析の結果から発現にばらつきのある遺伝子群を同定し、各々特定のTALIエフェクター標的遺伝子を持つ細胞を用いたクラスタリング解析を行い、細胞の種類による亜集団の分類や各集団に属する細胞の割合を調べた。以上の結果から、PU.1転写開始点下流14kbのTALIエフェクター標的遺伝子がPU. 1の発現を調節するばかりでなく、確立された細胞株よりも単一細胞レベルでES細胞から分化誘導した造血細胞集団にきわめて強力な分子制御作用を与えることを明らかにした。ESTファミリー転写因子PU.1は主に骨髄球系前駆細胞に発現し、成人型造血における細胞の運命選択に重要な役割を果たす。しかし、PU.1遺伝子の発現が転写因子ネットワーク内でどのように同細胞の分化を制御しているのか、そのメカニズムは十分に解明されていない。本研究の目的は、転写因子PU.1を中心とするゲノムワイド転写因子マップを作成することで、そのため標的ゲノム編集技術であるTALEを用いてPU.1のエンハンサーの修飾を試みた。この修飾によりPU.1遺伝子の発現レベルを変化させることで生じる転写因子ネットワークの変化を単一細胞レベルで解析することとした。本研究においては、まず造血幹細胞および造血前駆細胞の運命を決定づける転写制御の分子機構を明らかにするのに必要なTALEを用いた解析法の開発に取り組んだ。ES細胞のPU.1の転写開始点下流14kbに存在するエンハンサーにTALEを用いて転写活性化ドメインVP64あるいは転写抑制ドメインKRABをコードするDNAを導入し、EB(EB:胚様体)を形成させた。導入したDNAにはドキシサイクリン標識を行い、PU.1およびそれに隣接した遺伝子群の発現に及ぼす影響と造血細胞分化へ及ぼす効果を解析した。その結果、TALEを用いた標的ゲノム編集と単一細胞レベルでの遺伝子発現プロファイリングを組み合わせた方法が、遺伝子レベルでの細胞分化調節ネットワークの解析に有用であることが明らかとなった。本研究で実施したTALEを用いたPU.1-14kbの活性化によって細胞表面抗原の発現量は変化し、造形細胞への運命決定が促進されることが示された。すなわち、単一細胞遺伝子発現解析の結果、PU.1-14kbの活性化は同細胞内の転写因子ネットワークが内皮系から造血系へと推移させた。本研究はPU.1-14kbの造血細胞分化に果たす重要性を明らかにしたばかりでなく、遺伝子ネットワーク解析におけるTALEを用いた標的ゲノム編集の有用性を示した。26年度が最終年度であるため、記入しない。本申請課題より、p63βアイソフォームを用いることで効率的に樹状細胞の成熟化を誘導するばかりでなく、樹状細胞のアポトーシスがプログラミングされることが明らかとなった。また、胚様体(EB)におけるTalエフェクター標的遺伝子誘導では発現量に相違のある細胞は残存未分化な細胞集団をなして、CFU法の面でも異なる性質を示すことが明らかとなった。この研究成果については、国際高血圧学会(ISH)(抄録本文:確定抄録)での発表予定であり、現在学術論文^<1)>として投稿準備中である。
細胞老化における新しいＳＡＳＰ誘導機構の解明

近年、我が国では平均寿命の延長に伴い、がんの罹患率が増加している。この原因の一つとして、加齢とともに体内に蓄積する老化細胞が様々な炎症性蛋白質を分泌するSASPと呼ばれる表現型が関与している可能性が指摘されている。私たちはこれまでに、老化細胞では細胞質にゲノムDNA断片が蓄積することを報告してきた。細胞質DNA断片は細胞質DNAセンサーに認識されて自然免疫応答を起こすことから、SASPの誘導機構の一つとして働くことが明らかとなっている。そこで本研究では、細胞質に蓄積したDNA断片によるSASP誘導機構について解析し、その制御方法を探索し、加齢性疾患の制御を目指すことを目的とする。具体的には1細胞質にDNA断片が蓄積する分子メカニズムを解明し、2細胞質DNAセンサーを介した新たなSASP誘導機構を明らかにし、3細胞質DNAセンサーを介したSASP誘導機構が生体内で加齢性疾患の発症へ関与している可能性を検討する。平成30年度は上記1、2に関して解析を行った。細胞老化において細胞質にDNA断片が蓄積するメカニズムを解析するために、ヒト正常線維芽細胞を用いて細胞老化を誘導しRNAを回収しRNA-seq解析を実施した。その結果、ゲノムの安定化に関わる分子群の遺伝子発現が老化細胞で低下していることを見出した。その中で特にゲノムDNAの切断と細胞質への蓄積に関わることが示唆された候補分子を同定し、これは細胞老化で発現が低下する分子であったので、その発現制御メカニズムの解析を行った。そしてクロマチンIPやプロモーター解析の結果から、転写レベルでこの遺伝子発現が制御されていることを見出した。様々な解析の結果、この候補分子の発現低下により細胞質にDNA断片が蓄積し、細胞質DNAセンサーを介してSASP因子の発現誘導に関与することが示唆されたため、今後個体レベルでの解析を実施する予定である。本年度実施予定であった細胞老化で細胞質にゲノムDNA断片が蓄積するメカニズムに関与する候補分子を同定した。さらにこの因子の遺伝子発現の低下によりゲノム不安定性が誘導されるため、今後ゲノム安定性についての解析も行っていく。さらに、遺伝子改変マウスを作製して個体レベルでの解析の準備も進めている。前年度までに老化細胞で細胞質にDNA断片が蓄積する分子メカニズムに関わる候補分子を同定し、老化細胞における遺伝子発現制御機構を明らかにしてきた。そこで次年度も継続して、DNA修復経路、転写経路に関わる分子、老化細胞で発現の増減のある分子などをsiRNAによってノックダウンするか、過剰発現させるかして細胞質DNA断片の増減とSASP因子の発現変化を解析することを計画している。さらに、ゲノム上のどの領域から細胞質にDNA断片が蓄積しているのかを明らかにするために次世代シークエンサーを用いた解析を実施する。一方で個体レベルでの解析を行うために、老化細胞で細胞質にDNA断片が蓄積する分子メカニズムの解析の中で同定した新規SASP制御の候補因子のノックアウトマウスを作製し、早老症や炎症性疾患等の表現型を詳細に観察する予定である。