hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
モノクローナル抗体による固形癌由来細胞株の分化誘導に関する研究

乳癌由来の完全浮遊型非凝集性の細胞株YMB-Sに誘導される分化現象を細胞増殖抑制と細胞接着能獲得という2方向から研究した。細胞接着に関与している分子はα3,α5,αv,β1の各インテグリン分子とE-カドヘリンと考えられた。これらの発現量は、sodium bytyrate(NaB)による処理前に比べて処理後に有意に増加していた。細胞間にはE-カドヘリンとα3β1-インテグリンが局在し、細胞接着に関与しているものと推定した。その他のインテグリンとフィブロネクチン、ラミニン、コラーゲンなどの細胞外マトリックスはびまん性に細胞表面に存在し、細胞-基質間接着に関与していると推定できた。KL-6抗体はヒトMUC-1ムチンを認識することがわかった。in vitroでKL-6抗体存在下ではYMB-S細胞は数時間で細胞接着をおこし増殖を抑制した。細胞周期の解析によりGO/G1期に導入される細胞が多く、NaBによる変化と同様であった。ついで、in vivoにおけるKL-6抗体の抗腫瘍効果を検討した。ヌードマウスに2×10^7個のYMB-S細胞を皮下移植し、移植当日から1mgのKL-6抗体を7週間にわたって計14回投与した。対照のマウスモノクローナル抗体を投与した群と比べてKL-6抗体は腫瘍の増大を有意に抑制し、KL-6抗体がin vivoでも抗腫瘍効果を有することが明らかとなった。また、蛋白合成阻害薬であるcycloheximideは0.110μMの低濃度では、NaB,HMBA,dbcAMPによる細胞接着を阻害した。一方、mRNA合成阻害薬であるactinomycin Dは0.110nMの低濃度でHMBAによる細胞接着を抑制したものの、NaB,dbcAMPによる細胞接着は抑制しなかった。したがって、分化の誘導には新たなタンパク質の合成が必要であることが明かとなった。また、薬物間で分化誘導過程に差異が存在することが判明した。薬物によって、分化時の形態が異なる原因であろうと推察できる。さらに、分化による細胞表面抗原の変化を検討したところ、接着因子であるintegrinのうちα_3とβ_1の増加が最も顕著であった。α_3β_1はfibronectin,laminin,collagenに対する接着因子であるが、このような結果は、細胞周囲環境の認識能が分化後の細胞では増強していることを示しているものと考えられる。また、今年度の重要な発見として、免疫賦活薬として急性白血病の治療に使用されているアミノペプチダーゼ阻害薬のウベニメクスがYMB-S細胞に対して分化誘導作用を示すことが判明した。このウベニメクスの投与によりYMB-S細胞は増殖停止と細胞接着能の獲得を示したのである。この際、インテグリン分子の発現レベルを検討したところ、NaBによる分化現象でみとめられたのと同じく、a3、β1蛋白の発現が増強していた。このインテグリン分子の発現増強は、分化による細胞間相互作用の増強あるいは環境認識能の増強を意味するものと考えられるが、本年度にはこの分子の発現分布を確認するため、免疫細胞切片の超微形態学的検討を行い、インテグリンが接着面に増強していることを証明した。近年、ウベニメクスは免疫賦活作用のみでなく、慢性骨髄性白血病細胞に対する直接的抗腫瘍作用を有することが注目されてきている。したがって、今年度の私達の研究によって、ウベニメクスが固形癌に対しても直接作用を示すことが確認された事となる。固形癌治療の新たな手段の開発として、重要な現象として位置づけることができると考えている。また、来年度予定している、分化における細胞内シグナル伝達機構の変化を解明するため、myc,ras,src,erbB2などの癌遺伝子、癌抑制遺伝子のRB,DCC遺伝子のcDNAの供与を依頼した。平成5年度には、当初の計画通りYMB-S細胞の遺伝子レベルでの変異の有無とmRNA発現に及ぼす分化誘導物質の影響を検討した。

Southern blotting法によりc-myc,erb-B2,N-rasの癌遺伝子増幅がDNAに存在しているかどうかを検討したが、いずれも増幅していなかった。さらに、sodium butyrateによって誘導される分化、増殖抑制下において癌遺伝子の遺伝子発現が変化しているかどうかをNothernblotting法により検討した。しかし、c-myc,erb-B2,c-Ha-ras,erb-A,v-srcのmRNAレベルでの著変は認めなかった。したがって、YMB-S細胞に生じている変異には今回検討しえた癌遺伝子の関与は少ないものと考えられ、今後さらに多くの癌遺伝子の検討が必要であろう。一方、YMB-S細胞に誘導される接着現象に関与している機構の解明については大きな進歩がみられた。細胞間接着において最も重要な役割をはたしている接着分子はE-cadherinと思われた。細胞間接着面にE-cadherinが集積している像がとらえられ、また、YMB-S細胞に誘導される細胞接着をマウスモノクローナル抗E-cadherin抗体が完全に抑制したからである。α_3β_1 integrinも接着面に局在していたが、その結合部位に対する抗体によって細胞接着は阻害されず、E-cadherinの活性化がこの細胞の接着誘導の第1段階として不可欠のものと思われた。今年度の進歩として、KL-6抗体の認識する抗原であるKL-6がヒトムチンのうちMUC-1分子に属するムチンであることが明らかになった。したがって、抗MUC-1ムチン抗体が固形癌の分化を誘導可能であることが判明したのである。また、in vivoにおいて、ヌードマウス皮下に移植したYMB-S細胞の増殖に対して、KL-6抗体を腹腔投与することにより、有意に抑制することも判明し、in vitroでみられた分化現象がin vivoでも誘導される可能性が示された。
ウラン－鉛年代測定法の新展開：年代サイトメトリーに向けた次世代質量分析技術の開発

分析技術の進歩にともない年代情報の質や量は飛躍的に向上し、今では高品質かつ大量年代情報が議論の客観性・信頼性を左右するまでに至っている。本研究では、最も精密な絶対年代情報を与えるウランートリウム-鉛年代測定法に注目し、年代データのさらなる高精度化と、適用年代範囲・適用可能試料種の拡大を図る。この目的のために、本研究ではウラン-鉛同位体比測定の高感度化・高精度化が可能な新しいイオン検出器(デイリーイオン検出器)の開発と、年代データの系統誤差の原因となる放射非平衡の補正法の開発を並行して進め、さらに実際の地質イベントに応用することで地質年代学への展開を図ってきた。具体的には本研究を通じて小型デイリーイオン検出器を独自に開発し、従来は計測ができなかった1000万カウントを越える強いイオン信号でも正確な計測が可能となった。さらに開発したデイリーイオン検出器3基を多重検出器型ICP質量分析計に応用することで、年代測定の適用範囲の拡大と、分析精度の飛躍的な向上が達成できた。また本研究では年代データの系統誤差の原因となる放射非平衡に対し、独自の補正法報の開発し、これまで分析応用例が殆どなかった“若い"ジルコン(年代値が50万年よりも若いもの)からも正確な年代データを引き出すことが可能となった。本研究を通じて実用化した年代測定法(ハードウエア、ソフトウエア、年代計算法)は、既に様々な地質現象の解明に応用しており、本研究で提案した“年代サイトメトリー"の概念とともに、その有用性と高い汎用性が高く評価されはじめている。本研究に得られた研究結果は、20報を超える国際誌に論文として報告することもでき、年代学の発展に大きな貢献が果たせた。また国際会議(第7回アジアー太平洋地域プラズマ分光分析国際会議)を主催し、研究の意義と波及効果を広く国内外の研究者に知らせることができた。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。分析技術の進歩にともない年代情報の質や量は飛躍的に向上し、今では年代情報の質が議論の客観性・信頼性を左右するまでに至っている。本研究では、最も精密かつ正確な絶対年代情報を与えるウランートリウム-鉛年代測定法に注目し、年代データのさらなる高精度化と、適用年代範囲・適用可能試料種の拡大を図る。この目的のために、本研究ではウラン-鉛同位体比測定の高感度化・高精度化に加え、年代データの系統誤差の原因となる放射非平衡の補正法の確立を目指す。本年度は207Pb/206Pb同位体分析の分析精度の向上と分析の高速化を目的に、小型デイリーイオン検出器を独自に製作した。当初の計画では、イオン検出効率を高める目的で大型の光電子増倍管の利用を想定していた。しかしイオン検出器が干渉し分析に影響を与える可能性が生じたため、デイリー検出器を小型化するとともに散乱イオン用遮蔽板を大型化した。この改良により光電子像倍管の小型化と大幅な低コスト化が図れた。製作したデイリー検出器をプラズマイオン源質量分析計(京都大学既有設備)に取り付け、基礎的性能評価を行った。本年度の結果では、従来のイオン検出器と比較して長時間安定性が向上した。さらにデイリー検出器はノイズと信号の差別化が容易であることから、イオン信号の数え落としが少なく、約2倍の高感度化が図れた。安定性およびイオン検出感度のデータから、本研究で開発したデイリーイオン検出器の基本性能の高さを示すことができた。さらに本年度は放射非平衡の補正法の開発を行った。本年度は、目的試料と共通の起源をもつガラスを用いて補正定数を推定した。ここで求めた補正係数を用いて若いジルコン(<50万年)の年代測定を行ったところ良好な結果が得られ、補正手法と補正係数の信頼性の高さを示すことができた。放射非平衡の補正に関しては、すでに国際学術雑誌に論文投稿を行った。この目的のために、本研究ではウラン-鉛同位体比測定の高感度化・高精度化が可能なイオン検出器の開発と、年代データの系統誤差の原因となる放射非平衡の補正法の確立を目指す。この目的のために、本研究では2個の小型デイリーイオン検出器を独自に製作し、同時イオン検出を試みる。しかしイオン検出器同士が光干渉し、分析に影響を与える可能性が生じたため、デイリー検出器を小型化するとともに散乱イオン用遮蔽板を大型化した。この改良により干渉の低減と光電子像倍管の小型化、さらに制作コストの大幅な低減が図れた。開発した検出器ではノイズと信号の差別化が容易であることから、イオン信号の数え落としを最小限に抑えることができ、約2倍の高感度化が図れるとともに、従来の高感度イオン検出器と比較して長時間安定性の向上に成功した。安定性およびイオン検出感度のデータから、本研究で開発したデイリーイオン検出器が高精度同位体分析に応用可能な高い基本性能を有することが実証できた。

さらに本年度は放射非平衡の補正法の開発を行った。本年度は、製作した2個のデイリーイオン検出器を多重検出器型ICP質量分析計に装着し、イオン信号の検出と基礎的分析性能を行った。長時間安定性や、検出器のイオン計測位置感応性、応答性(不感時間の測定)、バックグラウンドの安定性に関する基礎データを蓄積した結果、従来の高感度イオン検出器と比較して、きわめて高い安定性と出力再現性が得られることがわかった。さらに長時間(10時間以上)に及ぶ、連続分析試験を繰り返し行った結果、長時間の過酷な条件下での測定でも、同位体比(207-Pb/206-Pb比)の測定変動を0.4%以下に抑えるこることができた。この測定変動は、本研究の主題であるウランー鉛年代測定においては、年代誤差約10万年に相当するものであり、本研究の目的とする年代精度と同等あるいはそれ以下の十分な性能をもつことがわかった。また、本研究で開発したイオン検出器は、信号とノイズの区別がつけやすく、ダイナミックレンジの改善にも寄与し、その結果1000万cpsを越える強い信号でも計測できることが明らかとなった。これは従来の高感度検出器の10100倍の信号強度まで計測が可能であることを意味する。その一方で、本研究で開発したデイリーイオン検出器のバックグラウンドが想定したものより若干高いことも明らかとなった。原因特定を行ったところ、この高いバックグラウンドは光電子増倍管によるものであることがわかり、英国製のものを日本製のものに交換した。その結果、バックグラウンドは1/100程度にまで低減することができた。さらに本年度は年代測定に関する実践分析も始め、従来にない高い空間分解能での年代分析が可能となった分析技術の進歩にともない年代情報の質や量は飛躍的に向上し、今では高品質かつ大量年代情報が議論の客観性・信頼性を左右するまでに至っている。本研究では、最も精密な絶対年代情報を与えるウランートリウム-鉛年代測定法に注目し、年代データのさらなる高精度化と、適用年代範囲・適用可能試料種の拡大を図る。この目的のために、本研究ではウラン-鉛同位体比測定の高感度化・高精度化が可能なイオン検出器の開発と、年代データの系統誤差の原因となる放射非平衡の補正法の確立を目指す。これまでの研究により3個の小型デイリーイオン検出器を開発し、プラズマイオン源質量分析計(MC-ICPMS装置)に装着し、同位体分析に対する基礎的性能評価を行うとともに、並行して長期安定性(シンチレーターの劣化等)の評価も進めている。開発したデイリーイオン検出器は、ノイズと信号の差別化が容易であることから、イオン信号の数え落としを最小限に抑えることが可能であるうえ、さらにその補正に際してパラメーター設定が容易な「非拡張型補正法」が適用可能であることも明かとなった。デイリーイオン検出器を用いることで、従来は計測ができなかった1000万カウントを越える強いイオン信号でも正確な計測が可能となり、年代測定の適用範囲の拡大が図れた。さらに本年度は、本研究を通じて実用化した「放射非平衡の補正法」により、非常に若い形成年代をもつジルコン(<50万年)からも正確な年代情報を引き出すことに成功した。これらの研究成果はいずれも国際学会で発表するとともに、国際誌への公表も行った。
第二次世界大戦勃発の国際政治経済学的考察

本年度は研究を開始した初年度に当たるので、史料および参考文献の収集を中心に行った。第二次世界大戦の勃発というテーマはある面で古くて新しいテーマであり、近年も新たな研究が着実に公刊されている。そうした最近の研究を網羅的に収集すること自体意義のあることであり、特にこの科研のメンバーはアメリカ、ドイツ、イタリア、ソ連、それに理論研究の分野に広がっているので参考文献の収集には比較的成果が挙げられたのではないかと考えている。ただし、そのうえでの問題は経済条件に対する経済政策の選択、またそのいずれかの経済政策を推進する政治勢力、それに政治勢力間の競合という四つのレベルを関連付けながら各国別の分析をし、それが国際政治の場裡で第二次世界大戦の勃発をいかにもたらしたのかと、国際経済から一旦各国の状況を経由して再び国際政治へと因果関係を辿る作業を行なわねばならず、この点での実証研究は今後の課題として残されている。もっとも、それと平行して作業仮設を作るために五十嵐が主としてCharles P Kindleberger、The World in Depression 1929-1939に依拠しながら理論化の作業を行ったが、いまだ最終的な結論を導き出すには至っていた。小林は本科研のテーマそのものとはいえないにしても民主政の挫折の過程も念頭に置いて、「政治的シンクレティズムの動態」と題する力作を助手論文として完成したが、ナチズムゃファシズムの抬頭を説明するのに示唆的であり、本科研のテーマを究明するうえでも有益といえる。このように本年度で研究自体を完成させることはできなかったものの、将来の研究にとって大きな地歩を築けたと考えている。
大脳基底核と関連する中脳橋被蓋ニューロンの分布と特性

大脳基底核の出力部は、周知のように、主として淡蒼球と黒質によって形成されている。この両部位からは視床核、手綱核、上丘および中脳橋被蓋などに投射が送られている。特に視床をめぐり大脳皮質に回帰する神経連絡の機能構成については多くの所見が報告されている。しかし、大脳基底核が投射支配する脳部位として最も尾側にあり、下位運動ニューロンとの関連が予測される、中脳橋被蓋の神経連絡については報告が少ない。大脳基底核疾患の発生機序を考察する際に、視床を経由し大脳の運動性皮質に影響を与える機構のほかに、大脳基底核から中脳橋被蓋を経由し下位運動ニューロンに影響を与える機構を調べる必要がある。本研究はその基礎的なデータを提供することを目的とした。実験動物として、軽いネンブタール麻酔下のネコを用いて、黒質網様部の電気刺激に応答する中脳橋被蓋ニューロンの正確な局在分布と形態的特徴を細胞内HRP染色法により解析した。黒質刺激により、抑制性シナプス後電位(IPSP)を生じる被蓋ニューロンは、脚橋被蓋核、楔状核、結合腕傍核および中心灰白質に存在した。脚橋被蓋核と結合腕傍核ニューロンに生じるIPSPの方が楔状核および中心灰白質ニューロンに生じるものより長いことが判明した。さらに、細胞内HRP注入によって染色された被蓋ニューロンは、いずれも形態学的には広汎な樹状突起の広がりを示すものであった。黒質に関連する中脳橋被蓋ニューロンの下行性投射は、大部分が腹側橋延髄網様体、すなわち網様体脊髄路の起始部に終止すると考えられている。したがって、大脳基底核の出力は黒質-中脳橋被蓋部-網様体-脊髄へと連絡されることが予測されるが、これらの投射系の機能的意味付けについては、さらに詳細な今後の研究の結果をまたなけばならないと思われる。
海馬形成の細胞構成解析

本研究では、海馬皮質の各部位の細胞構成、その構成要素の各部位に機能分子はどのように局在しているかを、免疫細胞化学的・形態学的に、可能な限り定量的に明らかにしてきた。特に、マウス、ラットの海馬各部位において、免疫細胞化学的に同定できるGABAニューロン群及び他のニューロン群の、光学顕微鏡、共焦点レーザー顕微鏡でのdisector法によるステレオロジー定量解析、共焦点レーザー顕微鏡、電子顕微鏡連続切片再構築法による3次元構造解析を進めた。更に、ラットとマウスとの間でカルシウム結合蛋白分布やニューロン群の構成の顕著な差、特に、歯状回mossy cellの化学的、生理的性質の差異を発見し、脳の分子生物学的解析の中心であるマウス脳が必ずしもこれまでの解析の中心であったラット脳の所見に基づいて解釈できないことを明らかにした。更に、歯状回mossy cellの化学的、形態的性質の差異をその他の齧歯類(ハムスター、スナネズミ等)、海馬の生理学的研究によく用いられるモルモット、食虫類についても比較検討した。また、海馬GABAニューロンの主サブポピュレーションであり、主ニューロン出力部を制御しているいわゆるbasket cell,chandelier cellの主要メンバーであるカルシウム結合蛋白parvalbumin含有ニューロンを重点的に定性、定量解析し、それらが、樹状突起間ギャップ結合及び、化学シナプスで相互に密な結合をし、GAD65が特異的に低いことを明らかにした。樹状突起間ギャップ結合に関しては、海馬表面全体を覆うかのようにst.Albeusとst.Oriensの境界付近を水平方向に広がる突起のネットワーク間の結合を発見し機能的な重要性を示唆した。更に、同様の化学的性質を示す局所回路ニューロンの脳部位での差異を比較するため嗅球での解析も進めた。本年度は主に、1)海馬各部位のニューロン構成のstereologyによる定量解析及び2)マウス歯状回hilusのmossy cellの形態学的、免疫細胞学的解析、更に、電気生理的解析を進めた。1)蛍光抗体法で染色した40-50μm厚のスライスを共焦点レーザー走査顕微鏡(現有)で観察検討し、少なくとも細胞体レベルで免疫染色浸透性が均一な条件を確立した。そのような染色条件を満たす切片標本を用いていわゆる非錘体細胞をいくつかの免疫細胞学的に同定できる化学的マーカーに基づいて分類しそれらをdisector法で解析し、各部位のさらに、層による細胞構成の差異を明らかにした。2)カルシウム結合蛋白であるcalretininの海馬形成での分布を歯状回においてラットとマウスで比較し、著しい種差を明らかにしたが、その最も大きな差異を示したhilar mossy cellの解析を更に進め、以下のことを明らかとした。ラットではcalretinin陰性のhilar mossy cellがマウスではcalretinin陽性であり、このようなcalretinin陽性mossy cellが背側歯状回門には見られず、腹側歯状回門に集中している。また、背側歯状回門には、腹側歯状回門よりかなり少数ではあるが、mossy cellと同定できるcalretinin陰性細胞が存在している。すなわち、マウスではcalretinin含有の点で、mossy cellは多様であり、背側部と腹側部で異なっていた。さらに、構造的にも背側部と腹側部ではthorny excresencesの複雑さで異なっていた。また、スライスを用いた電気生理的解析により、マウスhilar mossy cellはラットhilar mossy cellと異なった電気生理的性質を持っていることを明らかにした。本年度は主に、1)昨年度のラット梅馬に続きマウス海馬各部位のニューロン構成特に、GABA

ニューロン全体のstereologyによる定量解析及び2)カルシウム結合蛋白S100蛋白ファミリーであるS100A6(calcyclin)のラット中枢神経系における分布の解析を進めた。1)GABA込合成酵素GAD67に対する特異的抗体を用いて、蛍光抗体法で染色した50mm厚のスライスを共焦点レーザー走査顕微鏡で観察検討し、細胞体レベルで免疫染色浸透性の程度を確認し、解析の条件を確立した。そのような切片標本を用いてGAD67陽性ニューロンいわゆるGABAニューロンをdisector法で解析し、各部位の差異、層による細胞構成の差異を明らかにした。2)カルシウム結合蛋白S100蛋白ファミリーであるS100A6(calcyclin)の分布を免疫組織化学的に検討した。これまで、ニューロンに特異的だと報告されていたが、今回の検討で、S100A6はニューロンだけでなくグリア細胞、上衣細胞にも含有されることを明らかにした。しかし、注目すべきことに、S100A6は、極めて限られた一部のニューロン(嗅受容細胞、辺縁系の一部のニューロン三叉神経節、後根神経節ニューロン等)、一部のグリア細胞、一部の上衣細胞にしか存在しなかった。このような所見は今後の機能的解析の基礎となると考えられる。本年度は、マウスの海馬各部位において、免疫細胞化学的に同定できるGABAニューロン群及び他のニューロン群の、光学顕微鏡、共焦点レーザー顕微鏡でのdisector法によるステレオロジー定量解析を進め、マウスの海馬各部位、各層のニューロン構成を特に、GABAニューロン全体、及び、NO合成酵素含有GABAニューロンの海馬各部位、各層での分布密度、背腹方向での差異を明らかにした。更に、ラットとマウスの間で顕著な差があった、歯状回mossy cellの化学的、生理的性質を更に解析をすすめた。更に、歯状回mossy cellの化学的、形態的性質の差異をその他の齧歯類(ハムスター、スナネズミ等)、海馬の生理学的研究によく用いられるモルモット、食虫類についても比較検討した。また、海馬GAGBニューロンの主サブポピュレーションであり、主ニューロン出力部を制御しているいわゆるbasket cell,chandelier cellの主要メンバーであるカルシウム結合蛋白parvalbumin含有ニューロンを重点的に定性、定量解析し、樹状突起間ギャップ結合、特に、海馬表面全体を覆うかのようにst.albeusとst.oriensの境界付近を水平方向に広がる突起のネットワーク間の結合を発見し機能的な重要性を示唆した。更に、同様の化学的性質を示す局所回路ニューロンの脳部位での差異を比較するため嗅球での解析も進めた。
三大都市圏における都市農地の現状と有効利用に関する研究

研究目的1の「三大都市圏の関係都府県等における生産緑地の動向および問題点の把握」のため、関係都府県・市区等でヒヤリング調査を行うとともに、関連資料を収集した。そのことにより、(1)生産緑地面積は1992年の地区指定後5年間にほとんど変化が見られない、(2)生産緑地面積はほぼ維持されているが、市街化区域内農地面積が相当量減少したため、生産緑地率は5年間に8.5ポイントも上昇し40%弱になっている、(3)生産緑地の追加指定はいくつかの都府県・市区で行われているが量的には僅少である、(4)生産緑地の適正管理・保全を阻害する諸問題が拡大している等が明らかになった。研究目的2の「「宅地化農地」の動態把握」のため関係都府県・市区等でヒヤリング調査・資料収集を行うとともに、大阪府内3市の農家にアンケート調査を実施した。これにより、(1)「宅地化農地」は二区分化後の5年間に約1万ha減少した、(2)しかし、最近「宅地化農地」の減少が量・率とも鈍化している、(3)諸般の事由により「宅地化農地」を当分の間農地として保有する意向の農家が相当いる等が明らかになった。研究目的3の「建設省、関係自治体等の生産緑地関連施策の実施状況」把握に関しては関係市区でヒヤリング調査を行うとともに、関連資料を収集した。そのことにより(1)関係市区では、独自に生産緑地関連施策を実施しているが、実施件数、予算とも少ない、(2)国レベルの都市計画制度、土地利用調整制度、都市農業政策等の改革と拡充・強化なしに自治体だけで対応するのは限界がある等が明らかになった。研究目的4の「土地税制の適用状況の把握」については、大阪府内3市の農家にアンケート調査を実施し実態把握に努めた。そのことにより、(1)関係農家は二区分化の時のみならずその後も農地の固定資産税に強い関心をもっている、(2)「宅地化農地」を保有している農家は宅地並み課税の納税のために様々な対応を迫られている等が明らかになった。本年度は、(1)三大都市圏の関係都府県および特定市における生産緑地の動向と管理・利用実態、(2)「宅地化農地」の動態、(3)関係都府県・特定市等による生産緑地関連施策の実施状況、(4)都市農地に対する土地税制の適用状況についてそれぞれ首都圏、中部圏、近畿圏ごとに分担して調査するとともに、関連資料・データの収集・整理を行った。その結果、つぎのような知見および成果を得ることができた。(1)生産緑地地区は、指定後5年間に15,070haから15,399haへ微増した。増えたのはほとんど首都圏で中部圏は横ばい、近畿圏は微減した。しかし、当該特定市の市街化区域内農地面積が1万ha以上も減少したため生産緑地率は当初の30%から39%へと上昇した。生産緑地の管理・利用については、概ね良好であるが、農業の担い手の高齢化・不足、周辺生産環境の悪化等により適正な管理・利用が妨げられているケースもかなり見られる。(2)「宅地化農地」は、二区分化措置後の5年間に33,358haから23,627haへと1万ha近くも減少した。減少面積の半分強は首都圏が占めているが、減少率が最も大きいのは近畿圏である。年次別には当初は対前年比8%を超える減少率であったが、最近は45%台に落ちている。

とくに、ここ12年は大都市圏における土地・住宅情勢を反映して「宅地化農地」の宅地への転用の動きは鈍くなっている。(3)生産緑地に対する関係都府県・特定市等の施策展開は、注目すべき施策も見られるが、各自治体の財政事情等の制約もあり全体として弱い。また、建設省関連の施策も限られたものであり、生産緑地を活用し良好な都市環境を形成するまでに至っていない。(4)都市農地に対する土地税制については事例調査の段階にとどまっており、土地流動化等に与える効果については予断を許さない。次年度は、本年度の知見と成果を踏まえ、都市農地の保全と利活用のあり方と具体的方策について研究する。研究目的1の「三大都市圏の関係都府県等における生産緑地の動向および問題点の把握」のため、関係都府県・市区等でヒヤリング調査を行うとともに、関連資料を収集した。そのことにより、(1)生産緑地面積は1992年の地区指定後5年間にほとんど変化が見られない、(2)生産緑地面積はほぼ維持されているが、市街化区域内農地面積が相当量減少したため、生産緑地率は5年間に8.5ポイントも上昇し40%弱になっている、(3)生産緑地の追加指定はいくつかの都府県・市区で行われているが量的には僅少である、(4)生産緑地の適正管理・保全を阻害する諸問題が拡大している等が明らかになった。研究目的2の「「宅地化農地」の動態把握」のため関係都府県・市区等でヒヤリング調査・資料収集を行うとともに、大阪府内3市の農家にアンケート調査を実施した。これにより、(1)「宅地化農地」は二区分化後の5年間に約1万ha減少した、(2)しかし、最近「宅地化農地」の減少が量・率とも鈍化している、(3)諸般の事由により「宅地化農地」を当分の間農地として保有する意向の農家が相当いる等が明らかになった。研究目的3の「建設省、関係自治体等の生産緑地関連施策の実施状況」把握に関しては関係市区でヒヤリング調査を行うとともに、関連資料を収集した。そのことにより(1)関係市区では、独自に生産緑地関連施策を実施しているが、実施件数、予算とも少ない、(2)国レベルの都市計画制度、土地利用調整制度、都市農業政策等の改革と拡充・強化なしに自治体だけで対応するのは限界がある等が明らかになった。研究目的4の「土地税制の適用状況の把握」については、大阪府内3市の農家にアンケート調査を実施し実態把握に努めた。そのことにより、(1)関係農家は二区分化の時のみならずその後も農地の固定資産税に強い関心をもっている、(2)「宅地化農地」を保有している農家は宅地並み課税の納税のために様々な対応を迫られている等が明らかになった。
人工根粒バイオデバイスを用いた新空中窒素固定システム創生のための基礎研究

根粒菌がダイズ根粒のシンビオソームでバクテロイドに変化する制御機構を解明するため、根粒シンビオソーム溶液の解析を行った。ダイズ根粒よりシンビオソームを単離し、低張液中で破壊し、内容物を抽出することでシンビオソーム中の溶液を単離した。(1)その溶液を、分子量10000でゲル濾過分画した結果、分子量10000以上の高分子画分は菌の増殖抑制を示さないこと、低分子画分は菌の増殖を抑制した。(2)シンビオゾーム溶液に菌を懸濁し、28°C微好気・好気条件下で2時間培養し全RNAを抽出後、ダイズ菌USDA110株の全ゲノムを3960のDNA断片としてナイロン膜に貼り付けた高密度マクロアレイ膜とハイブリ実験を行い、網羅的な転写物の解析を行った。微好気下では、742遺伝子領域がシンビオゾーム溶液処理で転写上昇を示した。そのうち、48クローンは新規発現活性を示した。さらに、共生領域の47遺伝子領域の転写が増大していた。一方、好気条件下でも、無処理区のものより3倍以上転写が上昇した遺伝子断片が151個見出された。(3)微好気下のシンビオソーム溶液で培養した菌から経時的に全タンパク質を抽出し二次元電気泳動解析を行い、バクテロイドの全タンパク質のpI値とMWに基づいた分布図と比較した。バクテロイドのタンパク質分布パターンは単生根粒菌とは大きく異なり、138のタンパク質の存在量を減少させていた。これは探知したタンパク質(831個)の17%を占めた。一方シンビオソーム溶液中で培養した菌では、138個のうち、1時間で20個、2時間で14個、4時間で27個、8時間で19個の同一タンパク質の存在量が減少し、シンビオソーム溶液はバクテロイド化に特徴的なタンパク質総数の減少化を誘導した。一方、シンビオソーム溶液の影響で存在量が増大したタンパク質は、バクテロイド完成時に認められる増大タンパク質とは異なった。このタンパク群の一部をMALDI-TOF-MASSで解析した結果、転写因子を見出した。根粒菌がダイズ根粒のシンビオソームでバクテロイドという窒素固定器官に変化する制御機構を解明するため、根粒シンビオソーム溶液の解析を行った。ダイズ根粒よりシンビオソームを単離し、低張液中で破壊し、内容物を抽出することでダイズシンビオソーム中の溶液(Peri Bacteroid Space溶液の略号としてPBS溶液と以後呼称する)を単離した。次に、ゲル濾過用カラムを用い分子量10000でまず溶液を分画し、アミノ酸、糖成分等をPBS溶液と同じにした人工PBS溶液に各画分を加え、根粒菌を添加して4日培養し希釈平板法を用いて、各画分の根粒菌の増殖に与える影響を評価した。その結果、生のまま根粒菌に投与すると、(1)根粒菌の生育が抑制され静菌状態になること。

また、PBS溶液を分子量10000で区分し、各画分を別々に根粒菌に与え増殖効果を調べた結果、(2)分子量10000以上の高分子画分は増殖抑制を示さないこと、(3)低分子画分を根粒菌に投与すると全く増殖しないことを見いだした(市田紗智子東京農工大学大学院農学教育部修士論文、2005)。つまり、シンビオソーム中で根粒菌は低分子未知物質と高分子未知物質の2つの物質が相互作用することで静菌状態に置かれていることが推定されてきた。また、(4)PBS溶液を処理し2時間経過したダイズ根粒菌USDA110株と根粒中でバクテロイド化したUSDA110株から全RNAを抽出し、各種mRNAの転写変動を全ゲノムを網羅したマクロアレイ膜を用いて網羅的に解析した結果、両者の遺伝子応答が非常に類似していることを見いだした。両方で転写が増大した遺伝子を選びその遺伝子を破壊すると共に、その遺伝子の転写変動をモニター可能なレポーター組み換え体を作成し、作成した遺伝子破壊組換体は、PBS溶液を添加するとβ-ガラクトシダーゼを生産し、PBS溶液中に未知遺伝子誘導物質が存在することが分かった。1)ダイズ根粒より単離したシンビオゾーム溶液にB.japonicumUSDA110を懸濁し、28°C微好気条件下(1%酸素分圧下)で2時間培養し全RNAを抽出し^<33>P標識cDNAを調整した。これを、B.japonicumUSDA110株の全ゲノムを3960のDNA断片としてナイロン膜に貼り付けた高密度マクロアレイ膜とハイブリダイゼーションを行い、網羅的な転写物の解析を行った。742遺伝子領域がシンビオゾーム溶液処理で転写上昇を示した。そのうち、48クローンは新規発現活性を示した。さらに、共生領域の47遺伝子領域の転写が増大していた。2)ダイズ根粒菌をシンビオソーム溶液に処理後、経時的(28°C、0,1、2、4、8時間)に全タンパク質を抽出し二次元電気泳動解析を行い、根粒バクテロイドから抽出した全タンパク質のpI値とMWに基づいた分布図と比較した。バクテロイド化した根粒菌のタンパク質の分布パターンは単生根粒菌とは大きく異なり、138のタンパク質の存在量を減少させていた。これは探知したタンパク質(831個)の17%を占めた。一方シンビオソームを処理された根粒菌では、138個のうち、1時間処理で20個、2時間処理で14個、4時間処理で27個、8時間処理で19個の同一タンパク質の存在量が減少し、シンビオソーム溶液はバクテロイド化に特徴的なタンパク質総数の減少化を誘導した。一方、シンビオソーム溶液の影響で存在量が増大したタンパク質は、バクテロイド完成時に認められる増大タンパク質とは異なった。このタンパク群の一部をMALDI-TOF-MASSで解析した結果、転写因子を見出した。3)シンビオソーム溶液を分子量分画し、高分子画分と低分子画分の溶液がダイズ根粒菌の生育に与える影響を評価した結果、低分子画分はダイズ根粒菌の増殖を厳しく停止させる何らかの物質が存在していることがわかった。
脳情報の成分分析とヒューマノイドへの情報伝達

この研究計画は,次のような成果を得て,平成16年度に終了した.(1)この研究により,人体モーション,そのアニメーション,そしてヒューマノイドの動作の同一化(ユニフィケーション,unification)を行うことができた.このとき,人体モーションを認識して言語レベルに抽象化する機構の構築が鍵となることを指摘し,これを実現した.そしてその発表論文に対して,2004年度APNNA Best Paper Award for Application Oriented Researchを受賞した.(2)この研究により,ヒューマノイドの動作指令において言語レベルの抽象化を行うことが可能になったので,その指令を,形態の異なる複数のヒューマノイドに同時発行することが可能になった.すなわち,ヒューマノイド間の機械独立性を得ることができた.(3)脳の活動状態を推定してヒューマノイドを動作させる場合,現在の計測技術では分解能がまだ低いので,多種類の信号を発することはできない.ただし,上記(2)の信号を「上書き」するような緊急信号の発生に用いることは可能で,この方式は有用である.(4)脳の活動状態の推定法において,従来の推定法を特例として含むf-ICAを,理論的に,そしてソフトウェアとして開発した.この方法は脳信号の推定に限るものではなく,広く一般の情報源に適用可能なものである.その実例としてはディジタル画像やDNA配列があり,これらに対する成果も併せて発表した.この研究計画は,次のような成果を得て,平成16年度に終了した.(1)この研究により,人体モーション,そのアニメーション,そしてヒューマノイドの動作の同一化(ユニフィケーション,unification)を行うことができた.このとき,人体モーションを認識して言語レベルに抽象化する機構の構築が鍵となることを指摘し,これを実現した.そしてその発表論文に対して,2004年度APNNA Best Paper Award for Application Oriented Researchを受賞した.(2)この研究により,ヒューマノイドの動作指令において言語レベルの抽象化を行うことが可能になったので,その指令を,形態の異なる複数のヒューマノイドに同時発行することが可能になった.すなわち,ヒューマノイド間の機械独立性を得ることができた.(3)脳の活動状態を推定してヒューマノイドを動作させる場合,現在の計測技術では分解能がまだ低いので,多種類の信号を発することはできない.ただし,上記(2)の信号を「上書き」するような緊急信号の発生に用いることは可能で,この方式は有用である.(4)脳の活動状態の推定法において,従来の推定法を特例として含むf-ICAを,理論的に,そしてソフトウェアとして開発した.この方法は脳信号の推定に限るものではなく,広く一般の情報源に適用可能なものである.その実例としてはディジタル画像やDNA配列があり,これらに対する成果も併せて発表した.平成15年度においては,脳の活動パターンを抽出するための独立成分分析アルゴリズムの開発を行い,ヒューマノイドへの情報伝達のためのネットーワーク環境を作成した.まず,第1項目である脳の活動パターンを抽出するための独立成分分析については,次のような成果が得られた.(1)一般化された対数,すなわちlog-omeを最適化することによって,高速な独立成分分析法を得た.(2)そのアルゴリズムをさらに拡張して教師信号を受け付けられる形とした.これにより,fMRIによる脳の活動パターンの推定値に,被験者が受けている刺激を正しく反映させられるようになった.(3)fMRIは優れた空間分解能を有しているが,脳の活動パターンをリアルタイムで通信ネットワークに送ることは,今のところ現実的ではない.そこで,分解能は劣るが独立成分分析が可能でリアルタイム性のある光トポグラフィー装置を用いる方式に着手した.次に,抽出した情報の受け手と通信経路については,以下のような進展が得られた.(4)脳情報の受け手となるヒューマノイドを,ネットワーク環境下で動作させることを可能とした.(5)脳の活動パターンとヒューマノイドとの中間を受けもつネットワーク環境を,エージェントを用いて構築した.これにより,ヒューマノイドを,パソコンや携帯電話と同じように,単なる端末の一つとして取り扱うことへの目処を付けることができた.以上の各項目はいずれも,国際的レベルでの報告物や学術誌において発表されている.平成16年度においては,人間,ヒューマノイド,そしてそれらのアニメーション(映像中の人物的キャラクタ)の動作に対する同一化(単一化,ユニフィケーション,unification)を行うシステムを発案かつ作成し,その内容を特許申請した.また,その結果を,ICO NIP国際会議において論文として発表し,Best Paper Award for Application Oriented Researchを受賞した.得られた成果の内容は次の通りである.まず,動作を監視する対象を次の3種類とした.(1)単独あるいは複数の人間(ヒューマン).(2)単独あるいは複数の実機ロボット(ヒューマノイド型であっても,そうでなくてもよい.複数の異機種であってもよい).(3)アニメーション(人間あるいはロボットの代理となるソフトウェアキャラクタ).このとき,(1)と(3)は柔軟な動作を実行できるが,ハードウェア実機である(2)はそれよりも柔軟性が少ない.そこで,本研究においては,(1)や(3)の運動を認識し,それを情報圧縮および認識した運動パターンを(3)の実機に実現させるという方式を発案しかつ実現した.なお,この研究における認識部としては,まず,多様な命令語,すなわち圧縮された多様なパターンを実時間で認識・伝送可能な隠れマルコフモデルを用いた.そしてその後,ベイジアンネットワークによる高度化も行った.

また,研究の最終段階においては,以上のように構成したシステムに対して,人間側からの生体信号をネットワーク経由でヒューマノイドに伝送して,緊急動作のトリガーにできるための基本構成を得ることができた.
深海熱水噴出域細菌叢のメタエピゲノム解析から迫るDNAメチル化システムの進化史

細菌・古細菌におけるゲノム中の塩基のメチル化修飾は、生理生態学的に重要な役割を担っているが、単離されていない微生物のDNAメチル化観測は実験的に困難なため、環境細菌叢におけるDNAメチル化の普遍性や多様性は全く不明であった。本課題では、深海熱水噴出域の様々な環境細菌叢を対象にメタエピゲノム解析を行い、DNAメチル化の系統網羅的な観測を行う。さらにDNAメチル化酵素の同定と実験的検証、及び既知配列との比較系統解析から、DNAメチル化酵素の進化史を紐解くことで、原核生物から真核生物に至るエピジェネティクスの進化の包括的理解に貢献する。
離島と大学の教育を相互に支援する交流システムの実践マニュアルの開発に関する研究

本研究では、鹿児島大学教育学部と鹿児島県内離島の学校をインターネット及びテレビ会議システムで結んで、相互に支援する交流システムにおいて、それを活用・普及させるための実践マニュアル(以下「活用マニュアル」)を開発することを行い、次のような成果を得ることができた。1.交流のノウハウに関する資料収集鹿児島県与論町内小中学校を訪問し、離島校の情報活用環境と教育課題等を調査した。また、鹿児島県と同様に離島を抱える長崎県の実情を調査するため、長崎大学を訪問し、離島校との交流の状況や、テレビ会議システムの利用状況を調査した。これらにより、離島校との交流を促進するためのノウハウに関する資料を得ることができた。2.テレビ会議システムを用いた交流の実践研究テレビ会議システムを用いて、次の3つの交流実践を行った。(1)鹿児島大学教育学部と鹿児島県大島郡名音小中学校との交流、(2)鹿児島大学教育学部と鹿児島県志布志市の小学校との交流、(3)鹿児島大学教育学部と福岡市「海の中道海洋生態科学館」との交流。これらの実践から、活用マニュアルの作成に必要な資料が得られた。3.活用マニュアルの作成これまでの実践や上記の1、2を通して、テレビ会議システム活用の意義、実践例、テレビ会議を行う方法、その際の留意点などをまとめた、活用マニュアルを作成した。作成にはプレゼンテーションソフトを利用し、必要に応じて動画やナレーションを挿入するなどの工夫をした。4.離島校と大学間の交流促進方策の提案2年間にわたる研究を活かし、今後の交流を促進させる方策を検討した結果、次の4点を挙げることができた。(1)活用マニュアルの利用(2)「活用事例集」の作成と利用(3)活用講座の実施(4)ネットワークの活用本研究では、鹿児島大学教育学部と鹿児島県内離島の学校をインターネット及びテレビ会議システムで結んで、相互に支援する交流システムにおいて、それを活用・普及させるための実践マニュアル(以下「活用マニュアル」)を開発することを行い、次のような成果を得ることができた。(1)活用マニュアルの利用(2)「活用事例集」の作成と利用(3)活用講座の実施(4)ネットワークの活用本研究では、鹿児島大学教育学部と鹿児島県内離島の学校をインターネット及びテレビ会議システムで結んで、相互に支援する交流システムにおいて、それを普及させるための活用マニュアルを開発することを行っている。18年度までの2年間の研究計画であるが、今年度は以下のことを行った。1.テレビ会議システムを用いた交流の実践研究テレビ会議システムを用いて、離島校との交流を行った。交流校は、鹿児島県大島郡大和村名音小中学校(奄美大島)である。この交流では、(1)研究分担者の一人が名音小中学校を訪問して離島校の現状を調査するとともに授業を撮影し、(2)後日教育学部の授業の中でそれを学生に視聴させ、(3)その後学生と名音小中学校の教員とがテレビ会議システムを通してQ&Aや情報交換を行った。2.交流に関する調査研究研究代表者が与論町内小中学校を訪問し、離島校の情報活用環境と教育課題等を調査した。3.活用マニュアルの試作と評価これまでの実践研究や上記の1、2を通して、交流する際の機器の設定、交流手順や、交流時のノウハウをまとめた「活用マニュアル」の作成を企画し、機器設定についてはデジタル版マニュアルを試作した。さらにそれを教員に評価してもらい、今後のマニュアル作成に役立つ資料を得た。本研究では、鹿児島大学教育学部と鹿児島県内離島の学校をインターネット及びテレビ会議システムで結んで、相互に支援する交流システムにおいて、それを普及させるための実践マニュアル(以下「活用マニュアル」)を開発することを行った。17年度からの2年間の研究であるが、今年度は以下のことを行った。1.テレビ会議システムを用いた交流の実践研究テレビ会議システムを用いて、次の3つの交流実践を行った。(1)鹿児島大学教育学部と鹿児島県大島郡名音小中学校との交流、(2)鹿児島大学教育学部と鹿児島県志布志市の小学校との交流、

(3)鹿児島大学教育学部と福岡市「海の中道海洋生態科学館」との交流。これらの実践から、活用マニュアルの作成に必要な資料が得られた。2.活用マニュアルの作成これまでの実践や上記の1を通して、テレビ会議システム活用の意義、実践例、テレビ会議を行う方法、その際の留意点などをまとめた、活用マニュアルを作成した。作成にはプレゼンテーションソフトを利用し、必要に応じてナレーションを挿入した。3.離島校と大学間の交流促進方策の検討2年間にわたる研究を活かし、今後の交流を促進させる方策を検討した結果、次の4点を挙げることができた。(1)活用マニュアルの利用(2)「活用事例集」の作成と利用(3)活用講座の実施(4)ネットワークの活用
ビブリオ・バルニフィカス敗血症の制御に関する研究

本研究はビブリオ・バルニフィカス敗血症の制御を目指したものであるが,以下に述べるような研究成果が得られ,有効な新規制御方策の確立へ向けた礎を築くことが出来た。まず,本菌敗血症の特徴である浮腫性の皮膚障害に関して検討した。この皮膚障害には金属プロテアーゼ(VVP)が関与しているが,VVPはN末側の触媒ドメイインを介して肥満細胞の受容体に結合し,ヒスタミンの開口分泌応答を惹起させた。またVVPは,血液凝固カスケードの第XII因子および血漿プレカリクレインを限定分化して活性型に変換させ,浮腫形成因子であるとともに発痛因子でもあるブラジキニンをキニノーゲンから遊離させた。本研究の特筆すべき研究成果の一つは,VVPの産生調節の仕組みを遺伝子レベルで解明したことである。つまり,ビブリオ・バルニフィカスがフェロモン様の調節因子を分泌しており,この因子の蓄積が引き金となって,グローバルな遺伝子発現調節系が機能しはじめること,その結果,転写レベルにおいて,VVPをはじめとする数多くの毒性因子の産生が開始されることが明らかとなった。さらにVVPと並ぶ重要な毒性因子である細胞溶解毒素(VVH)に関しても多くの新規知見が得られた。すなわち,主としてウナギに病原性を示す低病原性株のVVHが,ヒトにのみ病原性を示す高病原性株のものとは生理的条件下での安定性などの諸性状において異なること,この性状の違いが毒素分子のC末側の3アミノ酸残基の変化に基づくことが示された。さらには,高病原性株の毒素遺伝子が共通の型(1型)であることも明らかとなり,この遺伝子に基づいた高病原性株の簡便なスクリーニングが可能であると考えられた。ビブリオ・バルニフィカス感染症を制御するためには,この病原ビブリオの自然界での分布状況を正確に把握しておく必要がある。今年度は,この目的の達成において有用であると思われる「ビブリオ・バルニフィカスを特異的に検出する手段」を開発した。1.ビブリオ・バルニフィカスは,その全ての菌株が赤血球等の細胞を破壊する細胞溶解毒素を分泌している。しかしながら,ヒトにのみ病原性を示す菌株(L-180株)の毒素は,ヒトとウナギに病原性を示す菌株(CDC B-3547株)のそれとは,生化学的性状等において異なっていた。この性状の違いを分子レベルで解明するため,各々の毒素遺伝子の塩基配列を決定し,推定される毒素蛋白質の一次構造を比較した。その結果,毒素蛋白質を構成する471個のアミノ酸残基のうち,C末側の3残基において相違が認められ,これらのアミノ酸の置換が性状の違いを生じさせていると推察された。2.両菌株の細胞溶解毒素遺伝子について全塩基配列を解析したところ,不一致率の高い領域が存在することが明らかとなった。そこで,この領域をプライマーセットとしたPCR反応を行い、当該毒素遺伝子の種類に基づいた型別を行った。ヒトの臨床分離株(14株),ウナギの臨床分離株(15株),および環境分離株(14株)について,保有する細胞溶解毒素遺伝子の種類を調べた。その結果、(1)ヒトにのみ病原性を示す菌株は,その殆どがL-180株と同じ種類の毒素遺伝子を保有すること,(2)ヒトとウナギに病原性を示す菌株は,その全てがCDC B-3547株と同じ種類の毒素遺伝子を保有すること,(3)環境分離株は,その多くが後者の毒素遺伝子を保有することが明らかとなった。今年度の研究により,ビブリオ・バルニフィカスが細胞溶解毒素遺伝子の種類により2つに型別されること,しかも各々の型の菌株が異なる病原性を示すことが明らかとなった。

したがって,今回開発した型別方法を様々な環境試料に対して適用すれば,自然界における本菌の分布状況の把握が可能となり,本菌感染症の制御に関する重要な疫学上の情報が得られると期待される。当初は金属プロテアーゼに関する研究,ヘム獲得系に関する研究を行う予定であったが,昨年度十分な検討が行えなかったクォーラム・センシング(QS)調節系に関する研究を集中的に遂行した。そして,次に述べる研究成果を得た。1.被験菌を最適生育温度である25°Cで培養し,対数増殖期中期と後期,および定常期前期に菌体を回収した。そして,毒素遺伝子(vvh, vvp)の発現量,つまりmRNA量をRT-PCR法により定量した。vvh mRNAは対数増殖期中期には多量に存在していたが,菌の増殖にともない次第に減少し,定常期前期にはその量が半減した。これに対して,vvpは定常期前期において発現量が2倍に増加した。一方,37°Cで培養した場合には,vvhは増殖の全時期において多量に発現し,他方のvvpは対数増殖期後期以降に発現量が増加した。つまり,37°Cでは明確な菌密度に依存した毒素遺伝子の発現調節が観られなかった。2.被験菌を25°Cおよび37°Cで培養し,定常期前期に培養上清を回収した。そして,分泌されたフェロモン様物質の活性をレポーター株に対する生物発光の誘導活性により測定した。25°Cで培養した上清では5,870RLUの発光が誘導されたが,37°Cの培養上清ではわずか580RLUの発光しか誘導されなかった。よって,フェロモン様物質が37°Cでは少量しか産生されないことが示された。以上より,食品を介して経口感染したビブリオ・バルニフィカスは,QS調節の支配を受けることなく細胞破壊毒素を産生し,腸管および血管の細胞層を破壊して体内へ侵入するが,温度が少し低い問質組織まで侵入すると,QS調節の支配を受けて金属プロテアーゼを産生し,血泡や紫斑などの皮膚障害を形成すると考えられる。よって,腸管内においてQS調節を活発にさせれば,本菌敗血症の制御が可能になると期待される。ビブリオ・ブルニフィカス敗血症に対する適切な制御方策を確立するためには,毒素をはじめとする毒性因子の産生調節の仕組みを分子レベルにおいて解明しなければならない。よって本年度は毒性因子の産生を一括して調節するクォーラム・センシング(QS)調節系について,遺伝子と蛋白質の両面から研究した。また,ヘム獲得系を逆利用した新規抗菌薬開発に関する基礎的な研究についても進展させた。1.QS調節系に関する研究本菌はフェロモン様分子の介在する遺伝子発現調節系であるQS調節系を備えている。そして,この調節系のオン・オフのスイッチを切り替えることによって,多種類の毒性因子の産生を転写段階で自己調節している。本年度はQS調節系の全体像を明らかにするため,この調節系の機能を人為的に破壊した変異株を作成し,変異株のプロテオームを野生株のものと比較解析した。その結果,QS調節系の支配を受ける新たな細菌蛋白質,つまり新現の毒性因子候補を複数個見つけだすことができた。2.ヘム獲得系を逆利用した新規抗菌薬の開発に関する研究本菌は細胞表面に存在する受容体蛋白質を介してヘム(鉄-ポルフィリン)を細胞内へ能動的に輸送し,鉄源として利用している。本年度はヘム受容体蛋白質について,基質認識の特異性等を検討した。その結果,ヘムにオリゴペプチドを結合させ,分子サイズを大きくし,かつ親水性を高めた場合でも細菌細胞内へ輸送されること等,受容体蛋自質の基質認識性が低いことを示す知見が得られた。