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古代エジプト、青色彩文土器の生産と流通に関する考古学的研究

「3.青色彩文土器の集成」についても、当初の計画に沿って集成を実施している。研究成果については、国内学会を中心に、発表を実施した。平成30年度における研究では、エジプト南部における青色彩文土器の生産と流通の復元を目的とし、エジプト南部の遺跡(ルクソール西岸岩窟墓、アメンヘテプ3世神殿)から出土した青色彩文土器を主な対象とした。1.青色彩文土器の考古学的調査、2.青色彩文土器の化学分析、3.青色彩文土器の集成を行った。青色彩文土器の考古学的調査」では、それぞれの遺跡において、2018年12月17日から2019年1月16日、2019年3月9日から14日の期間にエジプト現地調査を実施し、青色彩文土器の実測、観察、写真撮影、3Dモデル作成などを含む土器の資料化を行った。「2.青色彩文土器の化学分析」では、研究協力者の阿部善也(東京理科大学・講師)とともに、前年度の分析結果、これまでの過去の分析結果の解析を行った。「3.青色彩文土器の集成」では、主にエジプト南部を対象とし、これまでに出版された青色彩文土器についての集成を行い、データベース化した。平成30年度の研究により、時期とともに生産・流通量が次第に増加し、それにより王や高官のみならず、社会の多くの人々に青色彩文土器が行き渡ることなどが明らかとなった。これまで青色彩文土器の生産、流通の変遷に関する研究はほとんどなく、新たな視点を提示することができた。その他、平成29年度に研究を実施したエジプト北部の遺跡(サッカラ北遺跡、アブ・シール南丘陵遺跡、ダハシュール北遺跡)でも、2019年1月19日から3月6日の期間に、補足の土器調査を実施した。研究成果については、日本オリエント学会などにおいて発表を行った。また平成30年度成果については、平成31年度にも日本オリエント学会、日本西アジア考古学会にて発表予定である。平成30年度では、「1.青色彩文土器の考古学的調査」について、当初の計画どおりにエジプト南部の遺跡(ルクソール西岸岩窟墓、アメンヘテプ3世神殿)において現地調査を実施することができ、土器資料を得ることができた。「2.青色彩文土器の化学分析」については、研究協力者の現地調査参加期間の都合により、分析関連の現地調査は実施せず、代わりに平成29年度および過去に取得した分析データの解析に終始した。これにより、これまでの研究成果をまとめることができ、また次年度の研究の方向性が明らかとなったため、進捗に問題はないと考える。研究成果については、国内学会において口頭発表を実施した。また、海外の学会でも現在、論文を投稿中である。平成29年度の研究を受けて、平成30年度では、当初の研究計画どおりに、エジプト南部から出土した青色彩文土器を主な対象とし、現地調査、研究を実施する計画である。そして、最終年度である平成31年度には、北部と南部を統合した研究のまとめを行う計画である。また、引き続き国内学会で発表、論文投稿を行うとともに、特に海外の学会における発表、論文投稿に重点を置き、海外の土器研究者からのフィードバックを得る予定である。平成29年度、30年度の調査研究により、エジプト南部と北部のデータを得ることができた。平成31年度では、当初の研究計画どおりに、北部と南部を統合した研究のまとめを行う計画である。
アジア海域社会の復興と地域環境資源の持続的・多元的利用戦略

2004年12月26日に発生したスマトラ沖地震・インド洋津波は,アジア海域社会に想像を絶する被害をもたらした。本研究では,壊滅的な打撃を受けた漁村と水産業を対象に,復興の現状と今後の方向性を明らかにしつつ,社会経済的な視点からどのような調査研究が必要かを検討した。対象地域は,タイ南部のパンガー県とクラビ県,スリランカの南部海岸地域,インドネシアのバンダ・アチェ及びその周辺地域である。持続的な資源利用に住民が長年にわたって取り組んでいたタイ南部では,津波被災後も諸制度が復活・機能している。インドネシアでは,パングリマ・ラウトと呼ばれる伝統的資源管理組織が機能不全に陥った地方行政に代わって,漁村復興の受け皿として役割を果たした。スリランカでは,NGOを主体とする様々な住民組織が設立されて参加型復興がめざされている。3つの国・地域での事例研究を踏えて,アジア海域社会の復興をめぐる研究課題は次のようになる。第1は持続的な資源利用について。津波以前からあった資源利用に関する地域ルールや組織がいまも機能しているか,漁民・養殖業者の漁業投資の動向(援助方法も含む)が資源にどのようなインパクトを与えたか,検討を要する。第2は漁村復興戦略のあり方をめぐってで,マイクロ・ファイナンスを軸にした生計手段の確保に加え,漁村という社会の復興が果たして可能かどうかという基本問題を議論しなければならない。第3は復興を支える地方自治体の役割と課題である。地方自治体が崩壊した地域が多く,そのなかで住民参加型の"Community-based Rehabilitation"をいかに展望するかが問われている。本研究の成果はシンポジウムを開催して報告した。国連食糧農業機関,国際協力機構,コンサルタント企業等から関係者の参加を得て意見交換をはかり,日本の国際協力のあり方を議論した。
第三世代シンクロトロン放射光を用いた酵素の極限状態X線結晶構造解析

1.時分割X線結晶解析(高時間分解能解析)トロピノン還元酵素について、結晶内で酵素:基質複合体ができる状態に保ちつつ、ラウエ法を用いてX線回折データを収集するとともに、そのデータを解析して、基質(NADPHとtropinone)に相当する電子密度を得ることに初めて成功した。酵素:生成物複合体との構造比較から、本酵素は、基質と生成物の結合位置を微妙に制御することにより、最も反応に適した立体配置を達成していることが判明した。2.超高分解能解析(高空間分解能解析)ポリガラクツロナーゼの立体構造を、X線と中性子線を用いて結晶構造解析を行った。その結果、0.7Å分解能のX線解析構造と1.5Å分解能の中性子線解析構造を決定することができた。超高精度の電子密度図と核密度図が得られており、水素を含めたタンパク質の立体構造を精密に調べることが実現した。3.解析困難な状況のX線結晶解析トウモロコシ由来のピルビン酸リン酸ジキナーゼのX線結晶構造解析を行い、反応に伴い中央ドメインが回転することを構造的に実証した。次いで、神経特異的なミリスチル化タンパク質であるCAP-23/NAP-22のミリスチル化ドメインとその結合タンパク質であるカルモジュリンとの複合体のX線結晶構造解析から、タンパク質の脂質修飾の一つであるミリスチル化がタンパク質間相互作用に直接関わることを分子レベルで初めて解明した。さらに、高等植物の光合成における酸素発生に関わるタンパク質PsbPのX線結晶解析に初めて成功し、PsbPがRun-GTPase結合タンパク質Mog1Pとよく似た立体構造であることを明らかにした。1.時分割X線結晶解析(高時間分解能解析)トロピノン還元酵素について、結晶内で酵素:基質複合体ができる状態に保ちつつ、ラウエ法を用いてX線回折データを収集するとともに、そのデータを解析して、基質(NADPHとtropinone)に相当する電子密度を得ることに成功した。2.超高分解能解析(高空間分解能解析)リンゴ銀葉病菌由来エンドポリガラクツロナーゼの0.95Å分解能でのX線結晶構造解析を行い、同酵素の三次元構造を決定した。その際、プログラムARP/wARPを用いることにより、ほぼ自動的に構造モデルを構築させることができ、構造精密化の作業を、従来に比べ、遥かに短時間で終了させた。また、生成物であるモノガラクツロン酸との複合体結晶の調製にも成功し、基質結合部位を同定することにも成功した。3.解析困難な状況のX線結晶解析大腸菌のγグルタミルシステイン合成酵素について、結晶化能を上昇させる変異を導入することにより、X線結晶構造解析に適した結晶を調製することに成功した。ABCトランスポーターについては、ガンの多剤耐性の原因となるMDR1の遺伝子を用いてバキュロウイルスをベクターにした昆虫培養細胞(Sf-9)による発現系を構築した。1.時分割X線結晶解析(高時間分解能解析)トロピノン還元酵素について、ラウエ法を用いてミリ秒以下の時間分割測定を行い、反応開始直前の酵素基質複合体を捉えることに成功した。ルシフェラーゼについては、すでに合成した中間体アナログアデニル化デヒドロルシフェリンを用いて複合体を作成してX線結晶解析を行い、その結果をもとに活性中心残基を予想し、タンパク質工学的な変異を導入することにより、発光色制御に関わるアミノ酸残基の同定を試みた。2.超高分解能解析(高空間分解能解析)ポリガラクツロナーゼの反応に関わる活性中心付近の立体構造を、原子分解能(1Åを越える分解能)にて、決定することに成功した。さらに、中性子線解析を用いて、反応に関わるプロトンを捉えるための予備実験を行った。

3.解析困難な状況のX線結晶解析ピルビン酸リン酸ジキナーゼでは、トウモロコシ由来の酵素について、X線結晶構造解析を行い、全体構造の成り立ちを明らかにした。ABCトランスポーターについては、ガンの多剤耐性に関わるMDR1について、すでに作成した昆虫細胞を用いた大量発現系を用いて電気泳動的に均一な膜タンパク質を精製するための方法を確立した。1.時分割X線結晶解析(高時間分解能解析)ゲンジボタル・ルシフェラーゼと中間体アナログ、アデニル化デヒドロルシフェリンの複合体を作成してX線結晶解析を行い擬似反応中間体の構造を明らかにした。これは、本来短寿命の分子種を化学的な手法により捕捉することに成功したものである。その結果、ルシフェリンのアデニル化に関わる酵素の活性中心残基を初めて同定することに成功した。2.超高分解能解析(高空間分解能解析)ポリガラクツロナーゼの立体構造を、X線と中性子線を用いて結晶構造解析を行った。その結果、0.7Å分解能のX線解析構造と1.5Å分解能の中性子線解析構造を決定することができた。超高精度の電子密度図と核密度図が得られており、水素を含めたタンパク質の立体構造を精密に調べることが実現した。3.解析困難な状況のX線結晶解析トウモロコシ由来のピルビン酸リン酸ジキナーゼのX線結晶構造解析を行い、反応に伴い中央ドメインが回転することを構造的に実証した。次いで、神経特異的なミリスチル化タンパク質であるCAP-23/NAP-22のミリスチル化ドメインとその結合タンパク質であるカルモジュリンとの複合体のX線結晶構造解析から、タンパク質の脂質修飾の一つであるミリスチル化がタンパク質間相互作用に直接関わることを分子レベルで初めて解明した。さらに、高等植物の光合成における酸素発生に関わるタンパク質PsbPのX線結晶解析に初めて成功し、PsbPがRun-GTPase結合タンパク質MoglPとよく似た立体構造であることを明らかにした。
ワイドギャップ層状半導体超格子の光学的性質の研究

ホットウォール法を用いて、層状重金属ハライド半導体PbI_2,CdI_2の超格子を作成した。特に本年度は成長途中に中断時間を導入することで、界面揺らぎが1分子層程度の急峻な超格子界面が得られ、膜厚が28A(4層)までの超格子が得られた。作成された超格子の構造性についてはX線回折スペクトルのサテライトピークの観測により確認し、超格子のそれぞれの層の膜厚については、この回折スペクトルを解析することで得た。種々の超格子の光吸収スペクトルを77Kで測定した結果、井戸層PbI_2の膜厚の減少とともにPbI_2/CdI_2超格子の励起子遷移エネルギー位置は高エネルギー移動するという量子閉じ込め効果に特徴的な変化を示した。電子・正孔が有限井戸に閉じ込められていると仮定した解析により実験結果はよく再現でき、また解析により、還元質量μ=0.14m_0(m_0は自由電子の質量)が得られた。これらの結果より作成したPbI_2/CdI_2超格子はtypeI量子井戸構造を形成することが結論される。また、低温・超高圧印加装置を用いて、超格子の吸収スペクトルの圧力依存性を77Kで1.5GPaまでの圧力範囲で測定した結果、励起子遷移エネルギー位置の圧力係数はバルク試料のそれよりも小さな負の圧力係数を示した。また超格子試料の中ではPbI_2膜厚の薄い試料の方が小さな圧力係数を示した。この結果は圧力印加で井戸幅が減少させられることにより、量子井戸の離散準位の幅が増大することにより引き起こされることで説明される。以上の研究成果は日本物理学会、応用物理学会等で報告し、論文についても投稿中である。
レーザー捕捉・顕微計測法による過冷却エアロゾル液滴の物性研究

水やジメチルスルホキシド等の単一マイクロメートル液滴をレーザー捕捉法により空気中に浮遊・静止させた状態で冷却する事により,バルク液体の凍結温度以下において過冷却状態を生成させることが可能である。これまでの研究成果を踏まえ,1)各種エアロゾル有機液滴の過冷却状態生成および,粘性・極性・酸塩基性度等の溶液物性を明らかにするとともに,2)これらの溶液物性の温度や液滴サイズ依存性を明らかにすることにより溶液物性の任意制御を試みる。さらに,3)エアロゾル有機液滴の過冷却状態を新たな物質相とする化学の展開を図る。
神経保護・軸索保護に基づく新規脳内出血治療薬創出に関する研究

脳内出血病態に対する新規の有効な薬物治療戦略を確立することを目指し、前年度より開始した好中球走化因子であるロイコトリエンB4(LTB4)の脳内出血病態への関与についての検討を引き続き進めた。コラゲナーゼを脳内に微量投与して作製した脳内出血モデルマウスにおいて、出血惹起24時間後まで脳組織中のLTB4含量が増加していた。LTB4受容体(BLT1)は主に好中球表面に発現しており、好中球の遊走に強く関わることが報告されている。そこでBLT1欠損マウスを入手し(順天堂大横溝岳彦教授より供与を受けた)脳内出血病態の解析を行った。BLT1欠損マウスでは野生型マウスと比較して好中球の浸潤が抑制されており、出血後に観察される運動機能障害の程度も軽度であった。以上のような結果をもって、脳内出血の病態形成過程において脳内でのLTB4産生および好中球の浸潤が重要な役割を担うことを示した。また、BLT1遮断作用を有する低分子量化合物ONO-4057(小野薬品工業より供与を受けた)が脳内出血発症後の投与で病態(好中球の浸潤、ミクログリア活性化、神経軸索への傷害、運動機能障害)を改善することを示した点は、新たな薬物治療標的としてのBLT1の可能性を提示したものであり、特に重要な知見である。好中球表面に発現しているBLT1が治療標的となりうるということは、難治性中枢神経疾患である脳内出血に対して末梢経由での薬物介入が治療として有効であることを示唆しており、今後の当該分野の臨床・前臨床研究の展開に先鞭をつけるものとして高く評価できる。27年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では、脳内出血時の運動機能障害等の病態進行の要因として、内包領域を通る大脳皮質脊髄路の傷害を予想した。そこで順行性トレーサーで標識した皮質脊髄路が脳内出血惹起によって損傷を受けるか評価したところ、出血惹起によってBDA陽性領域の減少がみられた。さらに、軸索の指標であるneurofilament Hに対する免疫染色を施すことで、出血惹起6時間後から軸索形態の変性がみられた。しかしながら、脳内出血時の運動機能障害は出血惹起3時間後には観察されるため、運動機能障害をもたらす要因が他にも存在することが考えられた。その要因として着目したのが軸索輸送阻害である。Amyloid precursor protein (APP>は軸索輸送されるタンパク質であり、軸索の損傷に伴い蓄積することが知られている。APPに対する免疫染色の結果、出血惹起3時間後にはAPPの蓄積が観察され、軸索輸送阻害が起きていることが示された。そこで、軸索輸送阻害薬であるcolchicineを内包に投与したところ、出血惹起時と同様の運動機能障害がもたらされた。また、colchicine投与により軸索形態の変性も観察されたことから、脳内出血時には軸索輸送阻害が起こることで軸索傷害および運動機能障害がもたらされることが分かった。脳内出血時には、血中の様々な成分が病態形成に関わるが、今回は血液凝固因子のひとつであるトロンビンに着目した。トロンビンを内包に投与したところAPPの蓄積および軸索形態の変性がもたらされた。トロンビン受容体を刺激するペプチドの投与によってはAPPの蓄積および軸索形態の変性は見られなかったため、脳内出血病態形成にはトロンビンの受容体非依存的作用が関わることが示された。本結果は初めて皮質脊髄路の傷害に着目し、その過程を示した点で今後の脳内出血病態に対する理解を深める重要な知見であると考えられる。脳内出血とは脳実質内への血液の漏出による疾患であり、非常に重篤な病態を示す。近年の研究により、血腫の形成に伴い浸潤してくる多数の白血球の中で、特に好中球が軸索の損傷や髄鞘の脱落に関与することが報告されており、好中球の浸潤を抑えることが脳内出血に対する新たな治療戦略として注目されている。一方で我々も好中球の遊走を促す因子であるCXCL2ケモカインの発現量が脳内出血時に増加することや、その受容体であるCXCR1/2アンタゴニストの投与により病態の改善が見られることをすでに報告している(Matsushita, Hijioka et al., 2014)。今回は脂質メディエーターであり、強力な走化性因子として知られているロイコトリエンB4 (Leukotriene B4: LTB4)に新たに着目した。LTB4の生合成はアラキドン酸の代謝によってもたらされるが、その過程には数種の酵素が存在する。まずは脳内出血時に各種酵素の発現量が変化するか調べたところ、5-リポキシゲナーゼ(5-LOX)および5-リポキシゲナーゼ活性化タンパク質(FLAP)のmRNAレベルが著明に増加していた。さらに5-リポキシゲナーゼ阻害薬であるZileutonを連日投与し、5-LOX阻害条件下で脳内出血病態を観察した。連日のzileuton投与により、脳内出血惹起72時間後の血腫内におけるmyeloperoxidase陽性好中球数が有意に減少した。また、zileuton投与によって血腫の大きさには影響は与えなかったものの、歩行機能や四肢の反射等を評価した際のスコアが軽減された。

以上の結果から、脳内出血時にはLTB4が生合成されることで好中球の遊走が促進され、病態進行が悪化することが示唆された。脳内出血病態に対する新規の有効な薬物治療戦略を確立することを目指し、前年度より開始した好中球走化因子であるロイコトリエンB4(LTB4)の脳内出血病態への関与についての検討を引き続き進めた。コラゲナーゼを脳内に微量投与して作製した脳内出血モデルマウスにおいて、出血惹起24時間後まで脳組織中のLTB4含量が増加していた。LTB4受容体(BLT1)は主に好中球表面に発現しており、好中球の遊走に強く関わることが報告されている。そこでBLT1欠損マウスを入手し(順天堂大横溝岳彦教授より供与を受けた)脳内出血病態の解析を行った。BLT1欠損マウスでは野生型マウスと比較して好中球の浸潤が抑制されており、出血後に観察される運動機能障害の程度も軽度であった。以上のような結果をもって、脳内出血の病態形成過程において脳内でのLTB4産生および好中球の浸潤が重要な役割を担うことを示した。また、BLT1遮断作用を有する低分子量化合物ONO-4057(小野薬品工業より供与を受けた)が脳内出血発症後の投与で病態(好中球の浸潤、ミクログリア活性化、神経軸索への傷害、運動機能障害)を改善することを示した点は、新たな薬物治療標的としてのBLT1の可能性を提示したものであり、特に重要な知見である。好中球表面に発現しているBLT1が治療標的となりうるということは、難治性中枢神経疾患である脳内出血に対して末梢経由での薬物介入が治療として有効であることを示唆しており、今後の当該分野の臨床・前臨床研究の展開に先鞭をつけるものとして高く評価できる。本年度は昨年度までとは異なる視点から軸索傷害メカニズムの探索に着手した。脳内出血時の病態進行因子として新たにロイコトリエンB4に着目し、その産生に関わる酵素である5-リポキシゲナーゼ阻害条件下で脳内出血時の運動機能が軽減されることを主に見出した。このことは脳内出血に対する新たな治療ターゲットの創出につながる情報を提供したものと評価できる。また、前年度に得た軸索障害関連の知見についても、学会発表や論文投稿による外部公表が順調に進んでいる。27年度が最終年度であるため、記入しない。今年度の研究結果を元にさらに詳細な検討を行う予定である。今年度はロイコトリエンB4 (LTB4)の標的は好中球であると仮定し、研究を進めていた。しかし、過去の報告によるとマクロファージや他の細胞においてもLTB4が作用しうることが示されている。そこで脳内出血時のLTB4の役割として様々な細胞種への影響を観察する。さらにLTB4受容体をターゲットとした、脳内出血治療薬候補化合物の探索も行う予定である。当初申請書に記したin vitro系での軸索傷害メカニズムの解明には至っていないものの、次年度に予定していたin vivo実験系において、脳内出血時に軸索傷害が起こる過程を示すことができた。本結果は現在投稿準備中である。研究計画では初年度に見出した治療ターゲット候補分子の発現抑制を行うことで病態改善が見られるか検討する予定だった。しかし、初年度の研究結果では脳内出血病態の形成が非常に早期におこることから、治療困難であることが懸念される。そこで、2年目では出血病態に伴う周辺症状(うつ様症状や認知機能)の発症メカニズムの解明および治療薬の探索、さらに脳内出血によって損傷した神経回路の再構築に関して研究を行う。
積雪の酸素同位体比から復元される気温推定の再考察

本研究では、「降雪タイプ(擾乱性降雪と局地性降雪)の寄与率変化が南極地域における酸素同位体比分布を形成している」という作業仮説の検証に取り組む。そして、降雪タイプの分類には、宇宙線生成核種であるHTOを使った水循環解析というユニークな手法を用いる。本年度は、降雪タイプ分類を行うために必要な環境整備に取り組み、具体的には、(1)南極大陸の広域における積雪観測の実施、(2)採取した積雪試料の宇宙線生成核種(HTO, 7Be, 10Be)分析、そして(3)その分析結果を定量的に解釈するための数値モデリング実験を行った。実施した研究を時系列にそって以下に説明する。採択後(7月から)は、第59次南極観測隊によって採取された積雪試料のHTO分析に着手し、HTO濃度が、南極内陸域に向かって高まるともに、ドームふじ基地周辺で急激に上昇していることを明らかにした。さらに、研究協力者のStepan Poluianov氏(Oulu大学)が開発した宇宙線スペクトル予測モデルを用いて南極地域におけるHTO生成量の計算を行い、観測された地理的特徴の定性的な解釈に取り組んだ。解析結果は、次年度に国内外で行われる研究集会にて報告する予定である。年度の後半(10月以降)からは、研究代表者が第60次南極観測隊に参加し、昭和基地近くの沿岸域からドームふじ基地までのルート上で積雪採取を行った。第59次で採取された積雪試料では、採取時期の違いに応じてHTO濃度の大きな差異がみられたことから、表層積雪だけでなく、降雪試料から表層20cmの浅層コア試料まで様々な試料を採取し、国内に持ち帰った。本年度は、3年計画の初年度であり、南極地域におけるHTOおよび酸素同位体の地理的特徴を把握するための積雪試料採取、および関連データ採取に取り組むことを計画していた。計画通り研究代表者が第60次南極観測隊の内陸旅行に参加し、沿岸域からドームふじ基地がある氷床内部までのルート上で積雪試料を採取し、数値モデルの検証に必要な中性子線観測データを取得することができた。さらに、第59次隊にて採取した積雪試料を使ったHTO分析、数値モデル実験結果との相互比較を通じて予備解析を実施するなど、当初の計画よりも順調に研究を遂行できている。次年度(令和1年)は、南極観測にて採取した試料の化学分析を進める。化学分析では、HTOだけでなく、7Beや10Beといった他の宇宙線生成核種の分析にも取り組み、その結果を宇宙線スペクトル予測モデルの最適化に利用する。特に、7Beは半減期が53日と短いため、5月中には分析を完了させる。そして、最適化した宇宙線スペクトル予測モデル使って南極周辺域におけるHTO生成量分布を見積もり、その結果を使って総観規模降雪と局地性降雪のHTO濃度を推定するとともに、観測したHTO分布を使って各降雪タイプの寄与率を計算する。また、研究成果報告についても適宜行う。

特に、7Beは半減期が53日と短いため、5月中には分析を完了させる。そして、最適化した宇宙線スペクトル予測モデル使って南極周辺域におけるHTO生成量分布を見積もり、その結果を使って総観規模降雪と局地性降雪のHTO濃度を推定するとともに、観測したHTO分布を使って各降雪タイプの寄与率を計算する。また、研究成果報告についても適宜行う。本年度は、第59次隊で採取した積雪試料の10Be分析を行う予定であったが、10Be分析に利用する予定だった東京大学タンデム加速器トラブルが発生したため、実験を次年度へと延期した。また、当初予定では、代表者が3月末に南極観測から帰国後に帰国報告会を行うことを計画していたが、分担者が年度末で所属移動する可能性があることが判明したため、報告会の開催を次年度へ延期した。これらの理由から次年度使用額が生じた。
農村青年の生活史と社会構造-戦前・戦中期の農村社会史-

茨城県南部の農村をフィールドにして、第二次大戦の戦前・戦中期-特に193040年代-にその地で暮らしていた一人の農村青年の日記を資料として、その生活史を社会構造の変容に重ね合わせながら明らかにした。そこでは従来のような統合論や農民支配論だけでは論じきれない農村青年の主体性と煩悶が見出され、またそれが社会構造の変容、ひいては20世紀全般の農村社会構造の歴史のなかでどのように位置づけられるのかを明らかにしたのである。本研究課題にとって最も核となるのは、何といっても茨城県内の農村に住んでいた一農村青年がほぼ毎日附けていた詳細な日記である。そのため平成19年度においてはそのデータベース化をはかるためパソコンへの入力作業を行なった。その際、申請者が作業を行なったのはむろんだが、学生にもアルバイトとして依頼して作業をしてもらった。これは単に作業の補助をしてもらったばかりでなく、一個人の日記という極めてユニークなテクストを読解するためには、申請者が一人で読むのではなくて少しでも多くの眼で読んだ方が多様な問題設定が可能だからという理由も含まれている。事実、アルバイトを依頼した学生らからは1930年代の青年像についての新鮮な意見が提供されて申請者の問題意識を重層化してくれた。ついで文献上の村落研究のため、農村社会学や経済史の先行研究の図書を購入・読書して戦前・戦中期の農村社会史の整理に務めるとともに、しばしば茨城県水戸市の県立図書館と県立歴史館に行って史料の複写を行なってきた。これらによって1930年代の日本農村の全体像のようなマクロな視点を持ちながら茨城県南西部という地域的特質に基づいた視点を得ることができた。とりわけ近世村落を対象にした生活史研究からは多くのことを学ぶことができた。ただし遺憾だったのは、この青年が住む自治体所蔵の史料が市史編纂後整理されておらず、見ることができなかったことである。20年度は市と相談して見せてもらえるよう努力したいと考えている。もっとも、この青年が居住していた集落(地区)にはしばしばフィールドワークを行なって、主として親族、遺族の方々や同じ集落内の人たちからの聞き取り調査は行なうことができた。次年度はこのミクロな調査を特に心がけていきたく考えている。本年度においては、前年度に引き続いて研究対象である小自作農家の青年の日記のテキスト入力につとめた。昨年度と同じアルバイト学生に依頼したのでそれなりに進展したものの、膨大な全体量に比すればまだほんの一部分にしか過ぎない。しかしこの青年の日記は単なる農事日誌の類いではなく日々の個人的な悩み事や家庭での出来事、戦中期の銃後の風景なども豊富に書かれており、貴重なデータ化が進んだということができる。また本研究対象の青年は地元の茨城県で農業従事の後に産業組合に就職しており、本年度は産業組合就職前後のこの青年の心性を明らかにすることにつとめた。通常、戦前戦中期の茨城県の農村青年というと橘孝三郎や血盟団事件などの思想や加藤完治らの満洲農業移民やいわゆる農本思想で語られることが多く見られるが、本青年の視線は遥かに現実的であり、産業組合を中心とした販売・購買事業の共同化を通じていえ・むらの経済更正を志向するものであった。結果的に産業組合は戦時体制下で非常に大きな役割を担うことになり、この青年も産業組合もろとも戦時体制に組み込まれていくのであるが、しかしそうしたなかに単にイデオロギー上の理由で入っていくのではなく、それが小自作農家の経済的上向をともなうものであったことを明らかにできた。このように、茨城県内での史料収集、産業組合関係の文献収集、現地でのフィールドワークなどを通じて、個人の生活史の観点から1930-40年代の農業・農村の変容と社会構造を明らかにすることができた意義は大きいものがあったと考えられるものである。社会科学
循環不全モデルマウスにおける前庭小脳機能障害が前庭神経核に及ぼす影響の解明

まずは生後20日年齢のラットを用いて、前庭神経核を含む脳幹の急性スライス切片を作成し、スライスパッチクランプシステムを用いて前庭神経核の神経細胞にホールセルパッチクランプを行う。その上で、前庭神経細胞における膜電流変化を記録した。-60 mVの膜電位固定下では、自発性興奮性シナプス後電流(sEPSCs)が記録され、+40 mVの膜電位固定下では自発性抑制性シナプス後電流(sIPSCs)が記録された。前者はkynurenic acidにて抑制され、後者はpicrotoxinで完全に抑制されたことから、sEPSCsはグルタミン酸受容体を介する興奮性入力を、後者はGABAA受容体を介した抑制性入力を反映した電流であることが分かった。自発性電流の発生頻度は興奮性入力で少なく、抑制性入力に多く記録され、これは作成した脳幹スライスにおいて抑制性のinter-neuronとの連絡が興奮性入力に比べ優位に保持されていると解釈できた。これまでの形態学的研究でも、前庭神経核に対する興奮性入力は遠方の様々な領域からの投射によるが、抑制性入力は同一位前庭神経核に存在する抑制性神経細胞が、対側前庭神経核から投射を受け、同側前庭神経核に投射する対側抑制の投射回路が示されている。すなわち、今回使用した脳幹スライスでは、この対側抑制が局所回路として保持された状態で記録できていることが示された。前庭神経核における対側抑制の経路は、前庭神経核自身の興奮性を決定する上で最重要な経路であり、これを保持した実験がパッチクランプ下にて確立した事は重要である。脳幹スライス切片には、当然ながら多様な神経核と連絡線維が存在しているため、標的となる前庭神経核を同定、それらの神経細胞から確実に電気記録をとることが、研究の第一歩である。解剖学的な位置に加え、先の論文方向と照らし合わせたときに、細胞膜容量や電気応答など機能的な面で前庭神経核と同定するに矛盾の無い電気記録であった。次に、本実験系において、生理的シナプス結合を保持しているかどうかが、大変重要となる。この点に関しては、自発性興奮性シナプス後電流および、自発性抑制性シナプス後電流いずれも、本年度の実験において確実な電気応答として確認された。それぞれ、選択的ブロッカーによって活性化された受容体が確認された。以上から、機能的シナプス結合を保持したスライス標本であることが確認され、今後の研究のベースとなる実験系が確立したと考えられた。これまで前庭小脳における実験系で、無酸素無グルコース(Oxygen-GlucoseDeprivation; OGD)細胞外液還流による一過性虚血刺激実験にて、前庭小脳プルキンエ細胞における自発性興奮性シナプス後電流の増加が観察された。従って、本実験系の前庭神経核神経細胞において、OGD刺激によって、膜電位に度膿瘍な変化が生じるかを観察する。電流固定化のカレントクランプモードで、自発発火の変化を記録する。自発発火は神経細胞の興奮性の指標となり、生理的機能的変化を考察するうえで重量な現象である。一方、同様に、る前庭神経核膜電位固定化における自発性興奮性シナプス後電流および自発性抑制性シナプス後電流が、OGD刺激によってどのように変化するかを観察する。抑制入力が増強すれば、膜電位は過分極へ移行し、膜の興奮性は下がる一方、興奮性入力が増強すれば膜電位は脱分極へ向かい、活動電位が出やすくなる。ODGによる一過性極性変化でいずれの変化が生じるかは興味深い。まずは、OGDによって誘導されるこのような膜特性変化を記録し、最終的にはそのメカニズムを考察する実験へと移行予定である。

脳幹スライス切片には、当然ながら多様な神経核と連絡線維が存在しているため、標的となる前庭神経核を同定、それらの神経細胞から確実に電気記録をとることが、研究の第一歩である。解剖学的な位置に加え、先の論文方向と照らし合わせたときに、細胞膜容量や電気応答など機能的な面で前庭神経核と同定するに矛盾の無い電気記録であった。次に、本実験系において、生理的シナプス結合を保持しているかどうかが、大変重要となる。この点に関しては、自発性興奮性シナプス後電流および、自発性抑制性シナプス後電流いずれも、本年度の実験において確実な電気応答として確認された。それぞれ、選択的ブロッカーによって活性化された受容体が確認された。以上から、機能的シナプス結合を保持したスライス標本であることが確認され、今後の研究のベースとなる実験系が確立したと考えられた。これまで前庭小脳における実験系で、無酸素無グルコース(Oxygen-GlucoseDeprivation; OGD)細胞外液還流による一過性虚血刺激実験にて、前庭小脳プルキンエ細胞における自発性興奮性シナプス後電流の増加が観察された。従って、本実験系の前庭神経核神経細胞において、OGD刺激によって、膜電位に度膿瘍な変化が生じるかを観察する。電流固定化のカレントクランプモードで、自発発火の変化を記録する。自発発火は神経細胞の興奮性の指標となり、生理的機能的変化を考察するうえで重量な現象である。一方、同様に、る前庭神経核膜電位固定化における自発性興奮性シナプス後電流および自発性抑制性シナプス後電流が、OGD刺激によってどのように変化するかを観察する。抑制入力が増強すれば、膜電位は過分極へ移行し、膜の興奮性は下がる一方、興奮性入力が増強すれば膜電位は脱分極へ向かい、活動電位が出やすくなる。ODGによる一過性極性変化でいずれの変化が生じるかは興味深い。まずは、OGDによって誘導されるこのような膜特性変化を記録し、最終的にはそのメカニズムを考察する実験へと移行予定である。
呼吸器悪性腫瘍における自家がん特異的免疫応答を利用した新規腫瘍抗原の同定

予後不良の呼吸器悪性腫瘍に対する新たな治療法としての免疫療法の開発には、実際に癌患者に生じている自家がん特異的免疫応答を解析していくことが重要と考えられる。本研究では、肺癌患者の自家リンパ球を用いたautologousの実験系により、新たに複数のCTLを得た。そのうち大細胞癌患者から樹立したCTL cloneは、自家がん細胞株、腺癌株、扁平上皮癌株をHLA-A24拘束性に認識した。cDNA発現クローニング法によりCTLの認識する抗原をコードするcDNAを単離した。このように実際に癌患者生体内で生じた癌特異的免疫応答の解析は、今後の新たな診断や治療を開発する上で有用な情報となり得ると考えられる。本研究では、呼吸器悪性腫瘍患者の自家がん特異的免疫応答を利用した新規腫瘍抗原の同定・解析を行うことにより、新たな診断、治療の標的となる分子の探索を行う。特に自家がん特異的免疫応答を利用するため、実際に癌患者生体内で生じている生体防御機構の解明にもつながる。平成23年度は、研究計画1)-3)に対して以下の結果を得た。1)新たな肺大細胞癌の自己リンパ球-自己腫瘍細胞システムを用いて、リンパ球-腫瘍細胞混合培養を繰り返し、自家がん特異的細胞障害性T細胞のlineを誘導した。このbulk CTLから限界希釈法でCTL cloneを得られた5クローンの内、Clone 2-4を用いて、抗腫瘍活性を検討したところ、自家肺癌細胞に特異的に細胞障害性を示し、また他家の肺腺癌、肺扁平上皮癌を認識し、これらの活性は抗HLA-A24抗体で阻害された。2) Clone 1を用いてcDNA発現クローニングの結果、陽性反応を示すcDNA cloneのアミノ酸配列から、HLA-A2402拘束性bindingmotifを有する5種類のアミノ酸を合成し、CTLとの反応性を検討した。Peptide1に反応性の上昇を認めたが、反応が弱いため、別の候補ペプチドを合成している。3)肺腺癌からわれわれが同定した癌精巣抗原である、KK-LC1の新規エピトープの探索のために、日本人に頻度の高いHLA-A2, A24にbinding scoreの高いHLA-A2ペプチドとHLA-A24ペプチドを、同患者の自己の末梢血単核球から誘導した樹状細胞にpulseし、凍結保存しておいたリンパ節リンパ球をresponderとして、共培養を繰り返したところHLA-A2拘束性のbulk CTLが誘導された。平成25年度は、研究計画に対して以下の結果を得た。によるスクリーニングを開始した。2)肺大細胞癌患者から樹立した自家肺癌細胞株特異的CTL Clone 1を用いてcDNA発現クローニングの結果、陽性反応を示すcDNA cloneのアミノ酸配列から、HLA-A2402拘束性bindingmotifを有する複数のアミノ酸を合成し、CTLとの反応性を検討した。腫瘍細胞との反応と同程度の反応を示すpeptideは現時点では認められないため、minigeneからのアミノ酸配列絞り込みを進めている。3)肺腺癌からわれわれが同定した癌精巣抗原である、KK-LC1の新規エピトープの探索のために、日本人に頻度の高いHLA-A2, A24にbinding scoreの高い4種のHLA-A2ペプチドと2種のHLA-A24ペプチドを、同患者の自己の末梢血単核球から誘導した樹状細胞にpulseし、凍結保存しておいた自家リンパ節リンパ球をresponderとして、共培養を繰り返し、HLA-A2拘束性のbulk CTLが誘導され自己肺腺癌株に細胞障害性をしめし、HLA-A2ペプチド1に反応しサイトカイン産生を示した。本研究では呼吸器悪性腫瘍患者の自家がん特異的免疫応答を利用した新規腫瘍抗原の同定・解析を行うことにより、新たな診断、治療の標的となる分子の探索を行う。平成23年度は研究計画1)-3)に対して以下の結果を得た。このbulk CTLから限界希釈法で5個のCTL cloneを得た。

増殖の良いClone 1を用いて、抗腫瘍活性を検討したところ、自家肺癌細胞に特異的に細胞障害性を示し、また他家の肺腺癌、肺扁平上皮癌を認識し、これらの活性は抗HLA-A24抗体で阻害された。Clone 1のTCR &#61537;, &#61538;を解析し、単一のT細胞クローンであることを確認した。2) Clone 1を用いて自家腫瘍細胞株から作成したcDNA libraryを用いてcDNA発現クローニングを行ったところ、陽性反応を示すcDNA cloneを単離し、1600bpであった。CTL cloneは本cDNA cloneとHLA-A24 cDNAの両者を293 EBNA細胞にtransfectionしたときのみ、CTL cloneの反応が得られた。3)肺腺癌からわれわれが同定した癌精巣抗原である、KK-LC1の新規エピトープの探索のために、日本人に頻度の高いHLA-A2, A24にbinding scoreの高いHLA-A2ペプチドとHLA-A24ペプチドを、同患者の自己の末梢血単核球から誘導した樹状細胞にpulseし、凍結保存しておいたリンパ節リンパ球をresponderとして、共培養を繰り返しbulk CTLの誘導を行っている。新たな自家がん特異的CTLクローンの樹立、およびcDNA発現クローニング法で陽性のcDNA cloneが単離までが進み、抗原ペプチドの選定の課程まで進んでいるため。新たな自家がん特異的CTLクローンの樹立、およびcDNA発現クローニング法で陽性のcDNA cloneが単離までが進んでいるため。当初の予定である平成25年度の計画書に従い進めていく。1)自家がん特異的CTL cloneの認識する腫瘍抗原の同定および機能解析2)既知腫瘍抗原の自家がん特異的免疫応答を利用した新規抗原ペプチドの同定3)浸潤B細胞由来の腫瘍特異的lgGの認識する抗原の探索および解析CTLの誘導・培養、sequence解析、エピトープペプチド同定などに必要な、ディスポ製品試薬・抗体、RI、動物の購入費、成果発表に使用する。CTLの誘導・培養、sequence解析、エピトープペプチド同定などに必要な、ディスポ製品試薬・抗体、RI、動物の購入費、成果発表に使用する。
自然条件下での大気汚染による生体影響とバイオマーカーの探索

近年、中国の経済発展に伴う環境中の粒子状物質(Particulate Matter)の濃度の上昇による健康被害は中国国内の問題にとどまらず、大気の流れによる日本への越境汚染と健康被害が懸念されている。しかし、日本では自然環境下で大気汚染研究ができるような環境ではなく,これまで大気汚染の生体に及ぼす影響は,細胞培養を使ったIn vitroの研究や臓器ごとへの影響の研究にとどまり、自然条件下での大気汚染による生体全体に対する影響やゲノムワイドな研究報告は見られなかった。本研究は、北京市内の自然環境下でのPM2.5の生体に対する影響を健常及び病態マウスを用いて、組織の病理学的解析と遺伝子発現レベルに対する影響を網羅的に解析することによりPM2.5のバイオマーカーを見出すことを目標としている。これによって、日本への越境汚染が原因となる疾患の予防や診断と治療に有益な情報を提供しようとするものである。本年度は、病態下での大気汚染により生体内の変化を検討するために卵白アルブミン(OVA)誘発アレルギー疾患モデルマウスを作成した。これらのマウスを2群にわけ、1群はSPFの空気清浄の環境下に飼育し、他の群は北京でのPM2.5のピークの季節に野外で飼育した。1ヶ月飼育後、血液と鼻や肺、脾臓、心臓を採集し、肺の免疫組織染色を行った。PM2.5の暴露のマウスでは肺および気管支の組織に変化が見られた。また、PM2.5の非暴露・暴露マウスの血液と肺から調製したtotal RNAを用いて、マイクロアレイの解析を行った。大気汚染非暴露正常マウスに対する大気汚染暴露マウス及び大気汚染暴露アレルギーマウスの遺伝子発現解析を行ったところ,発現量が変動する遺伝子をいくつか見いだしている。本年度の研究実施計画に従って、モデル動物を作成し、自然環境下での暴露実験を行った。大気汚染による遺伝子の発現変化をマイクロアレイ解析した結果,いくつかの候補遺伝子を見出すことができた。大気汚染により発現変動する遺伝子のネットワークの解析および分子生物学的解析を行う。
居住地の持続可能性からみた人口減少過程での都市空間発展モデルの検討

本研究は、人口減少、高齢化に直面している我が国の都市地域における持続可能な都市形態について、都市形態論、都市空間論の視点から明らかにすることを目的としている。(1)我が国および西欧の都市形態論にかかわる理論、研究、論争をコンパクトシティ論も軸に整理・検討した。日本とヨーロッパにおいて、文献、現地調査によって都市再生と都市形態・都市圏計画との関連性を、都市圏計画と政策、複合機能・環境共生型の再生事業、居住地再生などを対象に調査した。(2)国土レベルにおける、知識基盤サービス産業の立地特性と地域空間構造との関連性を、統計解析により明らかにし、いくつかの類似したグループを抽出できた。(3)統計データを用いて、名古屋都市圏の都市空間構造を解析し、中心性、成長性、成熟性などの特徴によって、都市類型化を行った。また、名古屋市の都市空間構造の特性を、人口・家族・住宅などの国勢調査データとパーソントリップ調査データを用いて、小学校区レベルで多変量解析によって類型化を行った。(4)人口減少、高齢化が進む名古屋都市圏の郊外団地の実態を、空き地空き家に着目して調査した。可児市、多治見市の住宅団地(入居開始後20年以上経過した約40地区)を対象に、空き地空き家の所在、利用状況、団地の開発時期、規模、立地条件、住環境水準、人口動向、地価動向を把握・解析した。主要な住宅団地の将来人口予測を行った。さらに、典型的な住宅団地の住民アンケート調査を実施した。広島都市圏においても、典型的な住宅団地の実態調査を行った。(5)以上のような調査研究を元に、人ロ減少と急速な高齢化を迎える我が国における持続可能な都市形態のあり方を総合的に考察・検討した。研究成果は、2007年12月に単著『コンパクトシティの計画とデザイン』として学芸出版社から出版した。本年度は、下記のような調査研究を進めた:(1)我が国及び海外(EU,イギリスなど)における都市形態論、特にコンパクトシティ論とその政策、計画の動向を把握した。EUにおいては、新たな地域戦略の中で、持続可能なアーバンデザインとして、コンパクトシティ論を発展させようとしていることがわかった。また白山市のコンパクトシティ論に基づく都市形成の効果の定量化研究に参加した。スプロール型市街地と比べて、都市インフラの整備・管理費、生活の利便性などで、コンパクトな都市形態の優位さを示すことが出来た。ただし、田園的な地域でもコンパクトシティコンセプトがどのように有効か、などについては検討課題となっている。(2)可児市、多治見市の住宅団地における空き地空き家調査を実施した。入居開始後20年以上経過した約50カ所の住宅団地を対象に現地調査を行い、空き地空き家の所在、利用状況を把握した。併せて、団地の開発時期、規模、立地条件、住環境水準、人口動向、地価動向を把握して、空き地空き家との関連を解析した。今後の急速な高齢化によって、定住継続の困難性が予測されるが、現在の所、まだ危機的な状況は見られない。また、空き地空き家は、大規模団地で利便性の高い立地では少ないことがわかった。また衰退指標としての意味だけではなく、住環境改善の空間資源としての役割も有していることがわかった。さらに自治会活動の実態を把握するために、対象団地に対しアンケート調査、インタビュー調査を実施した。(3)統計データを用いて名古屋都市圏の都市空間構造を把握するための研究を進めた。クラスター分析によって、中心性、成長性、成熟性などの特徴によって、類型化が出来た。しかし、成果はまだ初歩的であり、今後産業構造や職住関係の分析を進める必要がある。(4)東海3県の各地域間の通勤通学状況72市を対象として雑誌に関連論文を発表した。

18年度は下記のような調査研究を進めた。(1)郊外住宅団地の持続可能性研究-昨年度実施した空き地空き家調査(可児市、多治見市)の解析を、都市住宅学会中部支部住宅市場研究会を中心に進め、都市住宅学会大会に審査論文として発表した。引き続き、可児市の住宅団地の人口予測を行い、『都市情報学研究』に発表した。(2)日本の大都市圏構造の研究-大都市圏の人口を指標とした地域空間構造とその変化を、統計資料により解析した。(3)ヨーロッパにおける都市再生と都市形態・都市圏計画の研究-2006年9月にイギリス(マンチェスター、バーミンガム)、スウェーデン(ストックホルム、マルメ、ルンド)、デンマーク(コペンハーゲン)、ハンガリー(ブダペスト)において、最新の複合機能・環境共生型の再生事業、居住地再生、都市圏計画等を調査した。(4)英語論文の発表-上記の調査を中心として、都市圏の人口推移と空間構造・計画に着目して論文をまとめ、2007年1月にバンコクで開催されたUPE7、第7回Urban Planning and Environment大会で発表した。(5)コンパクトシティと中心市街地の活性化政策-2006年度に都市計画法、中心市街地活性化法が改正され、都市再生がめざすべき都市像として、コンパクトシティを政府が方向づけた。各地で中心市街地活性化や郊外のスプロール規制が次第に具体的になってきており、現地調査(長野、飯田、高松)などを実施した。(6)アーバンデザインの理念、手法、政策などの欧米における展開状況を文献を中心にして研究した。(7)コンパクトシティ政策を我が国で具体化するための考え方、手法などをあきらかにするために、引き続いて調査研究を進め、特に文化との関連で中心市街地の役割を明らかにして、共著としてまとめた。3ヶ年の研究の期間の最終年度として、下記のように研究を進めた。1.近年の我が国および西欧の最新の都市形態論にかかわる理論、研究、論争をコンパクトシティ論も含めて整理・検討した。具体的には、都市形態論・アーバンデザイン論について、日本とヨーロッパの学問分野および政策・計画分野、最新開発プロジェクトも対象にして、整理・考察した。2.国土レベルにおける、知識ベースのサービス産業の立地特性から、いくつかの類似したグループを抽出して地域空間構造を明らかにした。さらに、日韓比較を行い、知識サービス産業空間構造特性の類似性と相違性を明らかにした。3.典型的な住宅地の空間構造と住民意識調査によって居住地の持続可能性を、主として住環境とライフスタイルの視点から明らかにするために、名古屋都市圏における郊外住宅団地住民へのアンケート調査を実施した。アンケート結果から、人口減少過程での衰退の危険性の端緒が見える郊外居住地を、持続可能性の視点から、考察を行った。4.名古屋市の都市空間構造の特性を、人口・家族・住宅などの国勢調査データとパーソントリップ調査データを用いて、小学校区レベルで多変量解析によって類型化を行い、特徴的なグループにとりまとめることができた。
時計タンパク質CRYの安定化と分解という拮抗作用を導く2種類のE3リガーゼ

FBXL3とFBXL21は互いに最も近縁なF-boxタンパク質であるが、それぞれCRYの分解促進と安定化という拮抗的な作用を示す。本研究では、これら2種のE3リガーゼが形成するCRYのポリユビキチン鎖の結合様式やユビキチン化部位の違いに着目し、この拮抗作用をスイッチする可能性のある分子としてUSP7を同定した。さらに、CRYとの相互作用分子として新しくTDP-43を同定した。TDP-43の過剰発現はCRYを安定化して細胞時計の振動周期を短縮し、機能阻害はCRYを不安定化して時計の周期を延長した。このように、CRYの安定性制御に関わる因子の機能解析を通じ、概日時計における時計タンパク質の安定性制御の重要性を示すことができた。私共はこれまで、CRY2のSer557がDYRK1Aキナーゼによりリン酸化されるとSer553がGSK3betaにより二次リン酸化されてプロテアソーム依存的に分解されることを報告した。本研究では、このリン酸化依存的なCRY2分解の生理的意味を理解するためSer557をAlaに置換したノックインマウスを作製した。その結果、この分解系は、細胞質においてCRY2の過剰蓄積を抑制するように働き、マウスの行動リズムを強く制御していることを明らかにした(MCB, 2014)。また本研究では、時計タンパク質BMAL1をユビキチン化して分解に導くE3リガーゼUBE3A/E6APを同定した。UBE3Aは正常細胞においてBMAL1分解を介して時計振動に重要な役割を果たすことを示すと共に、HPV感染時にはE6依存的に活性化されたUBE3AがBMAL1を過剰分解して時計振動を停止させることを見出した(NAR, 2014)。さらに、時計タンパク質DBPのリン酸化部位とユビキチン化部位を同定し、相互作用するリン酸化酵素とE3リガーゼを同定した。今後これらの機能解析を通じて、DBPタンパク質の安定性と転写活性の時刻依存的な制御機構を明らかにしたい。26年度が最終年度であるため、記入しない。F-box型E3リガーゼFBXL21は時計タンパク質CRYをポリユビキチン化して安定化する。本年度は、FBXL21によるユビキチン化のユニークな分子特性を理解するための第一歩として、in vitroユビキチン化反応の構築を目指した。SCF複合体の構成因子であるSKP1・CUL1・RBX1に加えてFBXL3あるいはFBXL21とCRY1やCRY2を昆虫細胞発現系を用いて合成し精製した。現状ではSCF複合体の可溶化効率が低く、引き続き条件検討が必要であるが、FBXL3やFBXL21と共に働くE2酵素の同定を目指すと共に、ユビキチン化反応条件を探っている。一方、CRY1およびCRY2の網羅的相互作用解析によって同定された脱ユビキチン化酵素USP7を遺伝子クローニングし、CRY2と共発現させた細胞内においてCRY2とUSP7が結合していることを確認した。さらにin vitroユビキチン化したCRY2をUSP7が脱ユビキチン化することを示した。また、分解アッセイにおいてUSP7の共発現によりCRY1やCRY2の発現量が増え、CRYタンパク質が安定化されることを見出した。USP7の生理的役割を探るため、培養条件下での細胞リズムに対するUSP7の効果を解析した。Bmal1-lucで細胞リズムを可視化する系を用いて、USPの過剰発現が細胞リズムの概日周期を増大し、Usp7のノックダウンにより細胞時計の周期が短縮することを明らかにした。USP7はFBXL3によるCRYの分解と拮抗して安定化すると結論した。一方、CRY1およびCRY2の相互作用分子として同定したFBXO30についても解析を進めたが、FBXO30はCRY1やCRY2の安定性の制御には寄与していないと結論した。

UBE3Aは正常細胞においてBMAL1分解を介して時計振動に重要な役割を果たすことを示すと共に、HPV感染時にはE6依存的に活性化されたUBE3AがBMAL1を過剰分解して時計振動を停止させることを見出した(NAR, 2014)。さらに、時計タンパク質DBPのリン酸化部位とユビキチン化部位を同定し、相互作用するリン酸化酵素とE3リガーゼを同定した。今後これらの機能解析を通じて、DBPタンパク質の安定性と転写活性の時刻依存的な制御機構を明らかにしたい。26年度が最終年度であるため、記入しない。本研究プロジェクトは、F-box型E3リガーゼFBXL21が時計タンパク質CRYを安定化するという予想外の現象に対して、その分子的なメカニズムの解明を目的としてスタートした。本年度にはまず、CRYのin vitroユビキチン化反応系の構築に向けてその準備が整った。また、CRYタンパク質とのインタラクトーム解析により脱ユビキチン化酵素USP7を同定し、CRYのユビキチン化様式の相互転換スイッチとしてUSP7が機能する可能性を示した。このように当初の計画の通りおおむね順調に進展している。FBXL21がCRYを安定化するメカニズムの解明を目指して研究を展開する。FBXL21によるCRYユビキチン化の結合様式を決定するとともに、USP7を切り口にCRY安定性の制御機構を解き明かす。さらにこれと並行して、BMAL1やDBPなどの時計タンパク質の安定性制御メカニズムにも分子レベルで切り込みたい。