hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
転移におけるcluster形成『循環がん微小環境』の解明と標的治療としての可能性

腫瘍微小環境において、癌関連線維芽細胞(Cancer associated fibroblasts: CAFs)は癌悪性化の中心的役割を果たすと考えられている。本研究では食道扁平上皮癌においてCAFsの存在が、リンパ節転移を促進し、予後不良と関連することを明らかにする。まず、食道癌患者の臨床検体を用いて、(FAP) Fibroblast activation protein陽性の間質細胞を評価した。さらにヒトの癌細胞と線維芽細胞を用いてin vitroおよびin vivoで転移能の評価を行った。食道癌切除標本において間質のFAP陽性CAFsはリンパ節転移の数と有意な相関を示し、リンパ節転移の独立した危険因子であった。活性化されたCAFsによって刺激された癌細胞は細胞間癒着を失い、遊走能および浸潤能を獲得することが示された。また同所マウスモデルを用いた実験ではCAF刺激により、食道癌細胞はより多くの転移を形成した。特にリンパ節転移は全ての症例で認められており、その頻度が有意に高いことがわかった。また、リンパ節転移数を調べると、臨床検体の解析結果と同様に、CAF群では対照群よりもその数が多かった。FAP陽性CAFsの蓄積が食道扁平上皮癌のリンパ節転移を促進する可能性が示唆された。CAFsを標的とした治療は、将来の食道癌患者の転移を減らし、予後を改善することが期待できる。食道癌切除標本を用いた免疫組織学的検討では,CAFのマーカーであるFibroblast activation protein (FAP)の発現レベルが高い群ではOS,DFSともに有意に予後が不良であった.またリンパ節転移のある群とない群で比較を行うと,リンパ節転移ありgroupの方が有意にFAPスコアが高値であった.リンパ節転移数とFAPスコアの相関関係を検証すると,r=0.448でこれらには正の相関関係があることが示された.さらにFAP高発現群の予後が不良であった.食道癌細胞株とCAFのCluster作成および細胞生物学的検討では,正常線維芽細胞であるFEF3は癌細胞細胞株(TE1, TE4)の培養上清で刺激すると,CAFのマーカーであるSMAやFAPの発現が上昇することがわかったので,活性化されたFEF3をCAFとして使用した.CAF刺激群ではTE1およびTE4は上皮性の性質を失い,間葉系の性質を獲得することがわかった.すなわち,細胞同士の接着が疎になり,細胞極性を失い,より紡錘型の形態へと変化することがわかった.さらに癌細胞の遊走能および浸潤能は線維芽細胞で刺激していない癌細胞と比較して有意に亢進していることが示された. Western blot analysisではCAF刺激群のTE1およびTE4は,浸潤や転移に関わるとされるたんぱく質「MMP2」の発現レベルが上昇していた.In vivoでは食道同所に癌細胞を移植し,その転移の程度をルシフェラーゼ発光にて評価した.同所移植した癌細胞はリンパ節以外に,肝転移や腹膜播種も引き起こすことがわかった.Control群と比較するとCAF刺激群ではいずれの転移も多かったが,なかでもリンパ節転移は有意にCAF刺激群で多かった.リンパ節転移の個数の評価ではCAF刺激群で有意にその数が多かった.平成28年度に計画していた食道癌切除標本を用いたCAFsの臨床病理学的検討および食道癌とCAFsのCluster作成および生物学的検討もほぼ予定通りに遂行できており,それなりの成果を得ている.さらに,29年度に計画していたIn vivoの遠隔転移の検討も一部開始できているため.食道癌臨床検体を用いた免疫組織学的検討では,CAFのマーカーであるFibroblast activation protein (FAP)の発現レベル(FAPスコア)が高い群ではOS,DFSともに有意に予後が不良であった.またFAPスコアが高いほうがリンパ節転移転移の頻度が高くリンパ節転移数とFAPスコアのには正の相関関係が認められた.食道癌細胞株とCAFのCluster作成および細胞生物学的検討では,正常線維芽細胞であるFEF3は癌細胞細胞株(TE1, TE4)の培養上清で刺激すると,CAFのマーカーであるSMAやFAPの発現が上昇することがわかったので活性化されたFEF3をCAFとして使用した.CAF刺激群ではTE1およびTE4は上皮性の性質を失い,間葉系の性質を獲得することがわかった. Western blot analysisではCAF刺激群のTE1およびTE4は,浸潤や転移に関わるとされるたんぱく質「MMP2」の発現レベルが上昇していることも認められた.In vivoでは食道同所に癌細胞を移植し,その転移の程度をルシフェラーゼ発光にて評価した.同所移植した癌細胞はリンパ節以外に,肝転移や腹膜播種も引き起こすことがわかった.Control群と比較するとCAF刺激群ではいずれの転移も多かったが,中でもリンパ節転移は有意にCAF刺激群で有意にその数が多かった.また,この実験によりマウス食道同所移植は実際の癌患者の病態を模しており,リンパ節転移の評価を伴う実験を行う際には有用なモデルであることもわかった.29年度に計画していたIn vivoでのリンパ節転移および遠隔転移の検討も修了している.さらにその成果の論文も完成し,現在投稿中であるため.腫瘍微小環境において、癌関連線維芽細胞(Cancer associated fibroblasts: CAFs)は癌悪性化の中心的役割を果たすと考えられている。

さらにヒトの癌細胞と線維芽細胞を用いてin vitroおよびin vivoで転移能の評価を行った。食道癌切除標本において間質のFAP陽性CAFsはリンパ節転移の数と有意な相関を示し、リンパ節転移の独立した危険因子であった。活性化されたCAFsによって刺激された癌細胞は細胞間癒着を失い、遊走能および浸潤能を獲得することが示された。また同所マウスモデルを用いた実験ではCAF刺激により、食道癌細胞はより多くの転移を形成した。特にリンパ節転移は全ての症例で認められており、その頻度が有意に高いことがわかった。また、リンパ節転移数を調べると、臨床検体の解析結果と同様に、CAF群では対照群よりもその数が多かった。FAP陽性CAFsの蓄積が食道扁平上皮癌のリンパ節転移を促進する可能性が示唆された。CAFsを標的とした治療は、将来の食道癌患者の転移を減らし、予後を改善することが期待できる。癌細胞のみとCAFs共培養のCluster群の両群に対する抗がん剤刺激による生存率,EMTや幹細胞化,または薬剤耐性に関連する解析を行う予定である.可能であれば機構解析としてknockdown技術を用いて需要分子の同定も行いたい.さらに食道癌細胞に対してHER2を標的としたPITを用いて循環状態での近赤外線による同時治療も検討する予定である.さらに遠隔転移巣に循環CAFsが関与しているかを蛍光免疫染色など組織学的な検討を行い,CAFsの関与率を統計学的に解析する予定である.現在投稿中の論文がunder reviewの状況であるので,reviewerのコメントに基づいて追加実験等を考慮する.さらに,CAFをターゲットとする新規癌治療の研究開発を進める予定である.実験消耗品の購入が当初の予定より安くすんだため.(理由)実験消耗品の購入が当初の予定より安くすんだため.(使用計画)繰り越しとなった金額は,主に次年度の実験消耗品に用いる予定である.繰り越しとなった金額は,主に次年度の実験消耗品に用いる予定である.
長期入院精神障害者の退院および地域生活を促進する家族への援助に関する研究

本研究の目的は、長期入院している精神障害者の退院を促し、退院後の地域生活を促進するための患者・家族への看護援助を明らかにすることである。以下の2点を中心に研究を行った。第1に、長期入院精神障害者の家族の経験を明らかにして、長期入院精神障害者の退院および地域生活の促進に求められる家族への看護援助について検討するために、1年以上の入院経験のある統合失調症患者の家族17家族(20名)に対して半構成的面接を行った。その結果、家族の経験の中核は、1)病気に対する家族の態度、2)患者のことを思う、3)家族ケア、4)家族自身の人生、5)家族自身の人生の見通しの中でケアを考えるの5つのテーマから構成され、またそれらを経験の中核としながら、1)医療、2)家族会、3)地域資源、4)社会に関する経験をしていることが明らかになった。家族は、家族ゆえに患者に愛情を持ち、患者の人生を思いながら、患者の幸せを願っていた。一方でケアに大変さや困難を感じながらもケアに喜びを感じることもあり、家族の中でケアの役割分担をする等の工夫や療養上の多くの問題に対処しながら、ケアを行っていた。第2に、精神科病院及び精神科病棟において長期入院統合失調症患者の退院に向けた看護援助に焦点をあて、受け持ち看護師24名を対象に、患者および家族への援助内容と援助の特徴について把握するための面接調査を行った。質的分析の結果、患者と家族をつなぐケアとして、1)患者を含めて家族のアセスメントする、2)家族とともに生活するための支援をする、3)調整役として患者と家族の理解を深める、4)家族に情報を伝え患者への理解を深める、5)家族と患者の繋がりを絶たない工夫をする、6)病院に対する家族の信頼を得る、7)家族を地域の資源につなげる、8)家族を頼らない生活設計を構築するの8カテゴリーが抽出された。今年度は、以下の3点を中心に研究を行った。第1に、退院して地域で生活する統合失調症患者の家族から、入院中に退院に向けて看護師が行った援助の効果について検証するための調査を実施した。今年度は、調査対象フィールドの開拓ならびに家族会への参加による観察と聞きとり調査、インタビューの指針・インタビューガイドの設定を行い、研究計画の倫理委員会での了承を得た。そこで、退院の目処がたっている長期入院中の患者、あるいは長期入院をしていたか、すでに退院をした患者を持つ家族からインタビューを行い、入院中に退院に向けて看護師が行った援助の効果について明らかにするために、文書によるインフォームドコンセントの得られた協力者への面接調査を実施した。来年度も継続予定である。第2に、精神病院及び精神科病棟における看護師の行っている統合失調症患者を中心とした精神障害者の退院に向けた家族への援助に焦点をあてて事例を通して把握し、特に家族への援助内容と援助の特徴について明らかにするための調査の準備を行った。すなわち、文献検討、インタビューの指針・インタビューガイドの設定、プレテストの実施・インタビュー内容の修正等である。第3に、地域生活支援が実施されている米国マサチューセッツ州での退院および地域生活維持のための患者・家族支援、看護援助について聞き取り調査を行い、実態を把握した。

本研究の目的は、長期入院している精神障害者の退院を促し、退院後の地域生活を促進するための患者・家族への看護援助を明らかにすることである。今年度は、以下の2点を中心に研究を行った。第1に、入院中に退院や退院後の生活に向けて家族に役に立った看護援助について検証するために、1年以上の入院経験を有する統合失調症患者の家族を対象に、12時間の半構成面接調査を実施した。対象となった家族は20名、患者との関係は、母親15名、父親3名、姉1名とその配偶者1名であった。面接データを質的に分析した結果、家族自身の経験は、1)病気に対する家族の態度、2)患者のことを思う、3)家族による患者への援助、4)家族自身の人生、5)家族自身の見通しの中でケアを考えるという5つのテーマに分類された。第2に、精神科病院及び精神科病棟において統合失調症患者の退院に向けた看護援助に焦点をあて、受け持ち看護師を対象に、家族への援助内容と援助の特徴について把握するための面接調査を行った。語られた患者の平均入院期間4.0年(SD76.3)(127年)、初診からの期間15.5年(144年)、GAFは退院支援開始時ならびに退院時ともに50点台であった。面接データ分析の結果、患者と家族をつなぐケアとして、1)家族とともに生活するための支援、2)調整役として患者と家族の理解を深める、7)家族を頼らない生活設計等7項目が抽出された。本調査は来年度も分析を継続し、妥当性を高める予定である。なお、本研究は研究代表者の所属機関倫理委員会の承諾を得ており、上記それぞれの調査対象者には文書による研究への同意を得、分析においては、事例はID番号で整理し、プライバシーや匿名性の確保に努めた。以下の2点を中心に研究を行った。第1に、長期入院精神障害者の家族の経験を明らかにし、長期入院精神障害者の退院および地域生活を促進するために求められる家族への看護援助について検討した。その結果、家族の経験の中核は、1)病気に対する家族の態度、2)患者のことを思う、3)家族ケア、4)家族自身の人生、5)家族自身の人生の見通しの中でケアを考えるの5つのテーマから構成され、またそれらを経験の中核としながら、本研究の対象者である家族たちは、1)医療、2)家族会、3)地域資源、4)社会に関する経験をしていることが明らかになった。家族たちは、家族ゆえに患者に愛情を持ち、患者の人生を思いながら、患者の幸せを願っていた。一方でケアに大変さや困難を感じながらも、ケアに喜びを感じることもあり、家族の中でケアの役割分担をするなどの工夫をしながら、実際に療養上の多くの問題に対処しながら、ケアを行っていた。第2に、精神科病院及び精神科病棟において長期入院統合失調症患者の退院に向けた看護援助に焦点をあて、受け持ち看護師を対象に、患者および家族への援助内容と援助の特徴について把握するための面接調査を行った。分析の結果、患者と家族をつなぐケアとして、1)患者を含めた家族のアセスメント、2)家族とともに生活するための支援、3)調整役として患者と家族の理解を深める、4)家族に情報を伝え家族の理解を深める、4)患者と患者の繋がりを絶たない工夫、5)病院が患者の責任を持つ約束をする、6)家族を地域の資源につなげる、7)家族を頼らない生活設計の構築の7カテゴリー37項目が抽出された。
楽浪郡存続期における鉄器と玉類の流通網及び技術移転に関する包括的研究

日本列島と朝鮮半島でガラス小玉が急増する前1世紀から1世紀には、草原地帯と東シナ海を通じた海のシルクロードの二つのルートが活性化しており、これらの交易網がどのように関わっているのかが議論の対象となってきた。そこで、本研究では海外にて蛍光X線分析を行い、確実性の高い交易網の復元に努めた。海のシルクロードに関しては、2016年度にベトナムで前3世紀頃から1世紀頃のガラス製品の理化学的分析を行ったので、今年度は草原地帯からのガラスを検討するため、モンゴルでガラス製品の理化学的分析を行った。分析の対象としたのは匈奴墓からの出土品であり、三角形垂飾や小玉の蛍光X線分析を試みた。その結果、ゴールドサンドウィッチグラスも含め、いずれもソーダガラスであり、植物灰ガラス、または植物灰ガラスとナトロンガラスの混合と推定される化学組成が示された。いずれも地中海周辺から西アジアで生産されたと考えうる「西のガラス」である。一方、インドから東南アジアで生産された「南方のガラス」と考えられる典型的なインド・パシフィックビーズも確認された。数は少ないものの、それらはカリガラス製であった。日本列島や朝鮮半島では紀元1世紀頃から紺色または淡青色で透明感の高いインド・パシフィックビーズが大量に流通するが、今回調査した匈奴墓からは類似の色調をもつ事例は確認されなかった。ただし、日本列島でみられる紺色と無色の重層構造の連珠や、包み巻きで製作された植物灰ガラス製の褐色ガラス小玉と関連性がうかがえる資料は含まれており、注目される。また、匈奴と楽浪郡及び朝鮮半島南部で共通してゴールドサンドウィッチグラスが副葬されており、近年、その中間に位置する鮮卑の墓でも確認されている。以上のことを考慮すると、日本列島や朝鮮半島へのガラス交易は、海のシルクロードを主体としつつも、草原地帯を通じても行われていたといえよう。本研究は東アジアにおいて広範囲の流通がみられる鉄器と玉類に着目し、それらを中心に流通網の復元と技術移転の様相を解明することを目的としている。平成27年度は最初の研究として、北部九州にて調査を行い、鉄剣の集成と変遷に取り組んだ。朝鮮半島東南部の資料も継続的に集成を行っている。韓国での資料調査については本年度にも行う予定であったが、玉類の分析に必要なポータブル蛍光X線分析装置の調整に時間がかかったため、来年度に行うことにし、日本国内の調査を優先して行った。玉類のうち、ガラスについては楽浪土城の資料を調査し、製作技法を中心とした検討を行った。また、研究分担者とともにガラス製玉類の種類を確認するため、オートラジオグラフィ分析も合わせて行った。他の玉類については、出流原遺跡、纏向遺跡などの出土資料を対象として蛍光X線分析を行った。以上の調査の結果、弥生時代後期後半(1世紀後葉)に、朝鮮半島東南部(弁・辰韓地域)の鉄器生産が成長することで、日本列島にこの地域の鉄剣が多く流通するようになることが判明した。それによって朝鮮半島東南部の政体が成長し、ガラス小玉が朝鮮半島南部に多量に流入するようになることも明らかにできた。また、楽浪郡のガラス小玉の数量的変化は、日本列島のガラス小玉の数量的変化と一致しており、ガラスの種類なども齟齬がないことから、ガラス製品は楽浪郡の領域を通じてから日本列島に流入すると推定された。一方で、碧玉や翡翠については、弥生時代後期後半には西日本全体で政体が成長し、多量保有する地域が増加することで、北部九州に集中していた状態から複数の集中保有地域が併存する状態になることもわかった。1世紀後葉に鉄器と複数の玉類の流通変化が楽浪郡より南の広範囲の地域で生じたといえる。ただし、理化学的分析の実施がまだ少ないため、正確な産地と消費の関係は来年度以降、明らかにしていく必要がある。鉄器の調査と集成については計画通り進んでいるが、研究実績の概要にて述べたように、玉類の分析に使うポータブル蛍光X線分析装置の調整に時間がかかったため、海外での分析を行うことができなかった。それを埋め合わせるため、来年度以降に予定していた日本国内の分析を、機器の調整と併行して行った。結果的には、現時点では全体的なスケジュールに遅れはでていない。また、分析の成果については、代表者、分担者ともにそれぞれ紀要などで報告してある。一方、玉類に関しては、ガラス、碧玉、翡翠を中心に当初の計画をたてていたが、本研究で調査を進めるうちに、水晶製の玉類が、環東シナ海での流通や技術移転を考える上で重要な遺物であることがわかった。そのうち、技術的な内容については、平成27年度末に論文化することができた。今後は、水晶製品の検討も含めて、本研究を進める予定である。また、本研究のテーマの一つである楽浪郡を中心とした交易の実態解明については、2015年7月にフランスで行われた15th international conference of the European Assn of Southeast Asia Archaeologists(EurASEAA)にて発表し、多くの研究者と議論を重ねることができた。同時に東南アジアでのガラス流通についても理解を深めることができたので、来年度以降の研究にこれらの知見を活かしたい。2016年度は、1朝鮮半島の鉄器の変化、2ガラス製品及び小玉の理化学的分析、3碧玉製管玉の分析を中心に研究を推進した。加えて、4長距離交易土器を扱い、それらを基に楽浪郡存続期の交易網とその変化の復元を試みた。

1については、鉄器の集成だけでなく、日本列島の鉄器生産にも関連する塊錬鉄による鍛造鉄器がいつ朝鮮半島に現れたのかの検討を行った。現時点で金属学的に分析された資料は2世紀後半以降の資料であるが、考古学的な脈絡と総合すると弁・辰韓(東南部)で1世紀後葉からそうした鉄器が出土する可能性が高い。これは弥生時代後期後半に該当し、朝鮮半島製とみられる鉄器の増加に一致しており、それ以前の楽浪郡経由の鉄器流通から弁・辰韓を中心とする交易に変わったことを意味している。2については、ベトナムにポータブル蛍光X線分析装置を持ち込み、前2世紀後2世紀のガラス製品の分析を行った。日本列島の資料との比較は現在遂行中であり、2017年度に結果が出る予定である。また、3については、弥生時代後期後半の最大の墳墓である吉備地域の楯築遺跡、鉄器を多くもつ丹後地域の大風呂南1号墓の碧玉製管玉の分析を行った。その結果、楯築遺跡では朝鮮半島産とともに但馬産が確認された。大風呂南1号墓では北陸産を中心とする結果が出ている。この時期は前述したように鉄器流通が大きく変わる時期であり、玉類の流通についても複雑化することが判明した。上記の結果に異なる視点を加えるため、4として環東シナ海・黄海で広域の流通する大型甕の集成と分析を行った。楽浪郡でみられる大型甕は1世紀中頃までは山東半島から流通する白色甕が中心であったが、2世紀には長江下流の江南地方の土器がもたらされるようになる。これらは日本列島まではもたらされないが、弥生時代後期後半には日本列島と朝鮮半島だけでなく、東アジア全体で流通に変化が生じることが確認された。鉄器の検討については資料を蓄積しつつ、併行して交流網の復元に努めた。鉄鉱石を産出する朝鮮半島南部の弁・辰韓の動向が歴史的に重要であるため、この地域の鉄器の変化を中心に分析を進めている。現在は、1原三国時代早・前期(楽浪郡成立前後)、2原三国時代後期、3三国時代という段階で副葬鉄器が変化すると認識している。1の段階では燕系統の鍛造、鋳造鉄器を大量に副葬するようになり、2の段階でおそらくは塊錬鉄からなる板状鉄斧を大量副葬するようになる。3の段階では板状鉄斧から鉄テイに型式変化し、やはり大量副葬がみられるだけでなく、武器、防具類も増加する。2の段階は日本列島でも鍛冶技術が大きく進歩する時期にあたり、弁・辰韓との関係が推定されるが、問題は塊錬鉄生産の技術の由来が不明瞭な点である。近年ではモンゴル高原の匈奴の製鉄が直接製鉄であることが明らかになったことから、楽浪郡の成立以降の遊牧民の動向を把握する必要が生じてきたといえる。鉄器自体を切断して分析することは困難であるので、分析の増加をまちつつ、別の遺物の流通から検討を深めることが今後の課題である。ガラスについては上述したようにベトナムでポータブル蛍光X線による分析を分担者とともに行った。対象としたのは、ベトナム北部のドンソン文化と漢墓出土資料、ベトナム中部のサーフィン文化出土資料である。まだ詳細な結果は出ていないが、紀元後1世紀から増加する朝鮮半島と日本列島のガラス小玉と共通するものがある一方、これらの地域にないものもみられる。正確な分析データが出たのちに、ガラスの流通についても復元を試みる予定である。
子宮平滑筋肉腫の治療標的であるAnnexin A4の機能解析

1子宮平滑筋肉腫細胞に特異的に発現する膜蛋白質の解析子宮平滑筋肉腫(LMS)の予後が不良な要因の一つとして、プラチナ製剤が無効であることがわかっている。LMSにおいてどの様なプラチナ排出トランスポーターが発現しているかを解析するために、LMS細胞株であるSK-LMS、SK-UT1、SKN細胞株を用いiTRAQ法にて細胞膜表面に発現する蛋白質を網羅的に解析した。その際に、複数個のプラチナトランスポーターを同定するとともに副次的に、子宮平滑筋肉腫細胞に特異的に発現するCD70を同定した。2CD70の発現抑制は子宮平滑筋肉腫細胞株の増殖を抑制したiTRAQ法にて同定されたCD70が実際にLMS細胞において発現するかをWestern Blotting法を用い検討したところSK-LMS、SKN細胞株で発現を認めた。SK-LMS細胞株に対しCD70のsiRNAを遺伝子導入し発現を抑制したところ、7日目の解析において72%の増殖抑制を認めた。そのため、CD70がLMS細胞株の増殖において重要な役割を有していることが示された。3CD70の中和抗体は子宮平滑筋肉腫細胞株の増殖を抑制したCD70の中和抗体を、SK-LMS細胞株に投与したところ7日目において、28%の増殖抑制が認められた。そのため、CD70に対する中和抗体はLMSの治療標的になると考えられた。CD70の発現の抑制や、中和抗体の投与がどの様な機序でSK-LMS細胞株の増殖を抑制したかを解析するために、MAPK、PI3K、mTORシグナルを初めとした様々なシグナル解析を行ったが、siRNAの遺伝子導入前後やCD70中和抗体の投与前後において変化を認めなかった。引き続き、どの様な機序で増殖が抑制されたかを検討していく予定とした。1子宮平滑筋肉腫におけるAnnexin A4の発現の検討我々は婦人科癌でキードラッグであるプラチナ製剤が、子宮平滑筋肉腫において有効でないのは子宮平滑筋肉腫においてAnnexin A4 (以下、Anx A4)が発現しているからと仮定している。Anx A4は、子宮平滑筋肉腫細胞株3株のうち、2株において発現を認めた。臨床検体における評価では20例の検体のうち、12例(66.7%)と発現を認めていることが確認できた。2Anx A4の発現の子宮平滑筋肉腫における役割の検討Anx A4を発現する子宮平滑筋肉腫細胞株SK-LMS細胞株において、Anx A4の発現をsiRNAを用いて抑制したところ、シスプラチンの50%阻害濃度が17μMから6μMと有意にプラチナ耐性が改善した(p<0.05)。これらのことから、子宮平滑筋肉腫において発現するAnx A4が、プラチナ耐性獲得のメカニズムにおいて重要であることが示唆された。3Anx A4の発現を抑制した株と親株との間のシスプラチン暴露後の細胞内プラチナ蓄積量の比較SK-LMS細胞株10万細胞とsiRNAを用いAnx A4の発現を抑制した状態のSK-LMS細胞株10万細胞に対して、シスプラチン50μMに24時間暴露後細胞を回収した。その回収した細胞をICP-MS法を用いた細胞内総プラチナ蓄積量の解析を行ったところ、無処理の細胞株が11.2ngであったのに対し、Anx A4の発現を抑制した状態のSK-LMS細胞株は30.6ngとプラチナ蓄積量の有意な増加を認めた。これはAnx A4の発現抑制により、細胞内のプラチナ排出が低下したためだと考えられた。28年度計画はほぼ終了している。細胞接着・細胞間相互作用・細胞移動について評価を行っていないのは、Anx A4の発現抑制が効果的にプラチナ耐性改善を示しており、こちらの機序解明を優先させるべきと考えられたためである。1Anx A4が細胞内プラチナ蓄積量を減少させた機序の解明我々は過去の検討からAnx A4がプラチナトランスポーターの働きを促進し、プラチナ排出量が増加することを見いだしている。子宮平滑筋肉腫細胞株においてどの様なトランスポーターが発現しているかを解析するために、子宮平滑筋肉腫細胞株であるSK-LMS、SK-UT1、SKN細胞株を用いiTRAQ法にて細胞膜表面に発現する蛋白質を網羅的に解析した。その際に、複数個のプラチナトランスポーターを同定するとともに副次的に、子宮平滑筋肉腫細胞に特異的に発現する膜蛋白質Xを同定した。2膜蛋白質Xの発現抑制は子宮平滑筋肉腫細胞株の増殖を抑制したWestern Blotting法を用い、子宮平滑筋肉腫細胞株での膜蛋白質Xの発現を検討したところSK-LMS、SKN細胞株で発現を認めた。SK-LMS細胞株に対し、膜蛋白質XのsiRNAを遺伝子導入し発現を抑制したところ、7日目の解析において72%の増殖抑制を認めた。そのため、膜蛋白質Xが子宮平滑筋肉腫細胞株の増殖において重要な役割を有していることが示された。3膜蛋白質Xの中和抗体は子宮平滑筋肉腫細胞株の増殖を抑制した膜蛋白質Xの中和抗体を、子宮平滑筋肉腫SK-LMS細胞株に投与したところ7日目において、28%の増殖抑制が認められた。そのため、膜蛋白質Xに対する中和抗体は子宮平滑筋肉腫の治療標的になると考えられた。29年度計画はほぼ終了している。

Anx A4の発現抑制は効果的なプラチナ耐性改善を示していたが、膜蛋白質Xの解析を優先したのは、膜蛋白質Xが子宮平滑筋肉腫の有望な治療標的であることが示されたためである。Anx A4の発現を抑制する方法は現時点では開発できておらず、中和抗体がある膜蛋白質Xの解析を優先する方針とした。1子宮平滑筋肉腫細胞に特異的に発現する膜蛋白質の解析子宮平滑筋肉腫(LMS)の予後が不良な要因の一つとして、プラチナ製剤が無効であることがわかっている。LMSにおいてどの様なプラチナ排出トランスポーターが発現しているかを解析するために、LMS細胞株であるSK-LMS、SK-UT1、SKN細胞株を用いiTRAQ法にて細胞膜表面に発現する蛋白質を網羅的に解析した。その際に、複数個のプラチナトランスポーターを同定するとともに副次的に、子宮平滑筋肉腫細胞に特異的に発現するCD70を同定した。2CD70の発現抑制は子宮平滑筋肉腫細胞株の増殖を抑制したiTRAQ法にて同定されたCD70が実際にLMS細胞において発現するかをWestern Blotting法を用い検討したところSK-LMS、SKN細胞株で発現を認めた。SK-LMS細胞株に対しCD70のsiRNAを遺伝子導入し発現を抑制したところ、7日目の解析において72%の増殖抑制を認めた。そのため、CD70がLMS細胞株の増殖において重要な役割を有していることが示された。3CD70の中和抗体は子宮平滑筋肉腫細胞株の増殖を抑制したCD70の中和抗体を、SK-LMS細胞株に投与したところ7日目において、28%の増殖抑制が認められた。そのため、CD70に対する中和抗体はLMSの治療標的になると考えられた。CD70の発現の抑制や、中和抗体の投与がどの様な機序でSK-LMS細胞株の増殖を抑制したかを解析するために、MAPK、PI3K、mTORシグナルを初めとした様々なシグナル解析を行ったが、siRNAの遺伝子導入前後やCD70中和抗体の投与前後において変化を認めなかった。引き続き、どの様な機序で増殖が抑制されたかを検討していく予定とした。Anx A4のプラチナ耐性に関わるメカニズムの解析Anx A4の発現抑制による子宮平滑筋肉腫のプラチナ耐性の改善は既に証明できたが、その機序が十分に評価できなかったため、機序解明を進める予定である。また、SK-LMS細胞株とSK-LMS-A4株を用いたXenograftモデルを作成し、in vivoにおけるシスプラチンの感受性試験を行う予定である。膜蛋白質Xの機能解析(1)SK-LMS細胞株に対して膜蛋白質XをsiRNAの遺伝子導入により抑制し、親株と発現を抑制した細胞株とを比較、検討する。Western Blotting法によりどのシグナルが抑制された結果、増殖が抑制されたかを解析する。(2)膜蛋白質Xに対する中和抗体を投与した場合、siRNAを遺伝子導入した際と同様のシグナルが抑制されるかを検討する。(3)SK-LMS細胞株を用いて、Xenograftモデルを作成し、膜蛋白質Xに対する中和抗体の投与によりin vivoにおいても増殖が抑制されるかを検討する。Western Blotting法によるAnx A4の評価、siRNAを用いたAnx A4の発現を抑制した実験、細胞内プラチナ定量など今年度は十分量の実験を行うことができたが、これらの実験に時間を要したため、物品の購入が滞った。マウスモデルやAnx A4のshRNAを遺伝子導入した細胞株の作成のために、残額は次年度以降、繰り越しとした。
低域混成周波数近傍のパラメトリック崩壊不安定性と高周波加熱

1.低減混成波のプラズマへの供給トパラメトリック崩壊不安定性、円柱プラズマの周囲にリング状電極からなる遅波回路を設置し、磁場方向の波数kおよび周波数fを制御することにより、低減混成波の伝播を制御した。印加する高周波電力をパラメ-タ-として、パラメトリック崩壊不安定性の生起条件を詳細に調べた。また、f-スペクトル、k-スペクトルを観測することにより、サイドバンド波及び低周波モ-ドがそれぞれ、低域混成波及びイオンサイクロトロン波であることを検証した。2.不安定性の制御とプラズマ中心への高周波電力の供給、上記の単一周波数の場合とは対照的に、供給電力のf-スペクトラムに幅を持たせ、電力の総和を一定にして、周波数幅を広げることによって、パラメトリック不安定性実効的なしきい値を高くすることを試みた。その結果、総電力一定のもとで不安定性を制御することができ、周辺プラズマの加熱を抑えて、プラズマ中心へ高周波電力を供給することができた。3.プラズマ中心における局所加熱および加速、不安定性を制御することによって、プラズマ中心にまで伝播した低域混成波が、プラズマ電子を捕促することにより、加速し電子にビ-ム成分が観測された。また、初期の段階に生じるポテンシャルの空間的な変動により、ビ-ム状のイオンが発生するのが観測された。不安定性の結果生じるポテンシャルの空間的な変動により、ビ-ム状のイオンが発生するのが観測された。不安定性の結果生じるサイドバンド波及びその高調波によって電子が加熱されることを、プロ-ブ測定と分光により測定によって確認した。以上の研究結果は低域混成波によるトカマク・プラズマの電流駆動及びプラズマ加熱のモデル的な研究としての意義をもつものであり、今後、この観点から検討する必要がある。トカマク・プラズマの追加熱として有望視され、これまでにも精力的に研究の行われてきた低域混成波による加熱には、プラズマ密度に対する厳しい制限があることが知られている。その原因の一つは、プラズマ表皮で起きるパラメトリック不安定性により、入力電力がプラズマ表面で消費され、プラズマ中心に到達できないことによる。本研究では、この不安定性のモデル実験を行ない、不安定性を抑制する方法を提案し、入力電力をプラズマ中心にまで伝播させ、プラズマ中心での加熱及び電流駆動に対する目途を得ることを目的とする。63年度には、以下に示す成果が得られた。1.低域混成波のプラズマへの供給とパラメトリック崩壊不安定性の観測;プラズマ柱の周囲に設置した16個のリング状電極からなる遅波回路によって、低域混成波をプラズマ中へ供給した。入力波の波数と周波数を変えることによって、プラズマ中での励起波の伝播を制御した。入力波の電力が、しきい値を超えると、パラメトリック不安定性の生起が観測される。励起される低周波は、高磁場では、イオン・サイクロトロン波、低磁場では、イオン音波となる。入力波の高調波近傍にも、同様の現象(サイドバンドの生起)が観測され、この場合のしきい値は、基本波のしきい値に比して小さいことがわかった。2.不安定性の抑制とプラズマ中心への高周波電力の供給;周波数の異なる複数個の高周波電力を同時に加えることにより、電力の総和を一定にして、しかも各々の電力は不安定性のしきい値以下にすることによって不安定性を抑制し、プラズマ中心にまで高周波電力を供給することができた。3.プラズマ中心における局所加熱及び加速;プラズマ中心でのパラメトリック不安定性の生起による加熱を観測し、(プローブ測定)光学測定による結果と比較検討中である。またビーム状の電子が観測されており、トカマクの電流駆動との比較を行なっている。

1.低域混成波のプラズマへの供給とパラメトリック崩壊不安定性、円柱プラズマの周囲にリング状電極からなる遅波回路を設置し、磁場方向の波数kおよび周波数fを制御することにより、低域混成波の伝播を制御した。印加する高周波電力をパラメ-タ-として、パラメトリック崩壊不安定性の生起条件を詳細に調べた。また、f-スペクトル、k-スペクトルを観測することにより、サイドバンド波及び低周波モ-ドがそれぞれ、低域混成波及びイオンサイクロトロン波であることを検証した。2.不安定性の制御とプラズマ中心への高周波電力の供給、上記の単一周波数の場合とは対照的に、供給電力のf-スペクトラムに幅を持たせ、電力の総和を一定にして、周波数幅を広げることによって、パラメトリック不安定性実効的なしきい値を高くすることを試みた。その結果、総電力一定のもとで不安定性を抑制することができ、周辺プラズマの加熱を抑えて、プラズマ中心へ高周波電力を供給することができた。3.プラズマ中心における局所加熱および加速、不安定性を抑制することによって、プラズマ中心にまで伝播した低域混成波が、プラズマ電子を捕捉することにより、加速し電子にビ-ム成分が観察された。また、初期の段階に生じるポテンシャルの空間的な変動により、ビ-ム状のイオンが発生するのが観測された。不安定性の結果生じるサイドバンド波及びその高調波によって電子が加熱されることを、プロ-ブ測定と分光による測定によって確認した。以上の研究結果は、低域混成波によるトカマク・プラズマの電流駆動及びプラズマ加熱のモデル的な研究としての意義をもつものであり、今後、この観点から検討する必要がある。
質的評価を含む物質収支を用いた土木事業のゼロエミッション化に関する研究

セメントコンクリート副産物の再利用率は比較的高いが、セメントコンクリート自身へは再利用されていないのが現状である。また、セメントコンクリートに係る環境負荷を削減する試みとして、セメント原料や骨剤に他産業からの廃棄物を利用したり骨材に石灰石を用いる方法などが考案されているが、それぞれ品質や環境負荷量に違いがあり、またユーザーの希望品質の問題から再生品の利用は進んでいない。本研究では、他産業廃棄物の利用とセメントコンクリート副産物のセメントコンクリートへの再生利用による環境負荷削減効果に注目し、各プロセスにおける物質とエネルギーの収支及びエミッションの定量化と品質データに関するデータベースを作成し、利用上の要求品質との関係で、機能を損なわずに最も環境負荷を削減できるような再利用方法の適正分配を模索することを考え、研究を行った。セメントコンクリート副産物を再生骨材として利用することは、再生処理プロセスに伴う新たな環境負荷を生じるものの、最終処分場の延命や自然資源の節約、自然環境破壊の抑制に効果があると考えられる。しかし、セメントコンクリート副産物の発生量に対し再生骨材の年間生産量は極めて少なく、また発生するセメントコンクリート副産物全てを再生骨材に再利用しても、セメントコンクリートの生産に必要な骨材のせいぜい5%程度しか賄いきれず、原料のほとんど全てを天然資源に依存しているのが現状である。
メカニカルストレスによって生じる関節組織と神経組織との相互作用を検証する

1、変形性関節症(OA)のモデル検証のため化学的にOAを誘発するモデルと外科的にOAを誘発する4つのモデルを検証した。膝関節内側半月脛骨靱帯のみを切除する侵襲の少ないDMMモデルは他のモデルに比べ進行が緩徐であり、予防的運動療法の効果を検証するために組織学的には有用であることを示した。しかしビームセンサー式自発運動量測定装置による自発運動量は手術の有無で差が見られなかった。今後運動量をコントロールして観察していく必要がある。2.機械的刺激に対する滑膜細胞の受容メカニズム解明に向けて、滑膜細胞の機械的刺激に対する細胞内カルシム反応をマウスとヒト間で比較した。正常マウス滑膜細胞、正常ヒト滑膜細胞を実験に用いた。マウスおよびヒトにおける滑膜細胞の細胞内カルシウム濃度を、Fluo-3AMを負荷し測定した。細胞外カルシウム存在下では、機械的刺激によって、マウスおよびヒト両方の滑膜細胞において細胞内のカルシウム濃度の上昇反応を起こした。これらの反応は外液カルシウムが存在しない条件においても残存した。以上の結果から、マウスおよびヒトにおける滑膜細胞の応答が細胞内ストアからのカルシウム放出に関与している可能性を示唆した。滑膜細胞へのメカニカルストレス(MS)に対する情報伝達経路:滑膜組織へのMSは滑膜組織から神経組織へカルシウム依存性の情報伝達を行うことを明らかにした。また、滑膜細胞の反応には小胞体からカルシウムの遊離、TRPV4チャネルが関わっている可能性があることを示した。さらに正常マウス滑膜細胞におけるCRACの有無について検証した。MSに対する滑膜細胞の反応はCRAC阻害剤であるYM58483投与しても変化が見られなかった。さらに細胞外カルシウムが無い状態でタプシガルギンを投与した後、灌流液カルシウム濃度を2mMに変化させても細胞質へのカルシウム流入は観察されなかった。これらの結果から、正常マウス滑膜細胞ではCRACが発現していない、もしくは活性化されない可能性が示唆された。早期OAモデルの作成と検証:14週齢および10ヶ月齢の正常マウスを対象に、自発運動量を比較検討した。自発運動量の計測は、ビームセンサー式自発運動量測定システム(PanLab社製)を用いた。その結果、14週齢における24時間当たりの総自発運動量は34,188±1,172回、10ヶ月齢の総自発運動量は19,410±448回となり、加齢により自発運動量の低下が認められた。次に10ヶ月齢のマウスにDMM手術を施行し自発運動量を計測した、外科的操作翌日の総自発運動量は7,860±245回、1週後で13,733±861回、8週後で18,815±889回であった。外科的操作直後は自発運動量の低下が認められたが、時間経過とともに活動量は増加した。滑膜細胞のメカニカルストレスに対する神経細胞との相互作用の検証においては条件設定に難渋しているが、カルシウムイオン依存性の情報伝達経路については概ね結論を導くことができた。滑膜細胞は効率性を重視し購入した細胞を使用していたが、生産中止となった。組織から単離した細胞に変更することになり、条件設定を再考することになった。早期関節症モデルの作製と組織学的検証に関して、最適なOAモデルの確立に向けて検証は進んでおり、次のステップの研究を始めている。変形性膝関節症(以下,OA)に対する理学療法効果を検証するために適したモデルを検討することを目的に,5つのラットOAモデルを組織学的に比較した。Wistar系雄ラット10匹を用い,薬剤により化学的にOAを誘発するモデルと,膝関節の靭帯等の切除により外科的にOAを誘発する4つのモデル(内側側副靭帯切除,内側半月脛骨靭帯切除,内側半月板切除,前十字靭帯切除の各モデル)をそれぞれ2匹ずつ作成し,4週間後の膝関節軟骨の状態を比較した。その結果,化学的誘発モデルでは膝関節の内外側広範にわたる軟骨基質の染色性低下と軟骨細胞数の減少を認めた。外科的誘発モデルでは,内側側副靭帯切除モデル以外の全てのモデルで軟骨破壊所見を認め,内側半月板切除と前十字靭帯切除のモデルでは,部分的な軟骨下骨の露出まで至っていた。組織本来の修復力に依存する理学療法の介入効果を検証するためには,進行が緩徐な内側半月脛骨靭帯切除モデルが適していることが示唆された。また、3ヶ月齢、6ヶ月齢、12ヶ月齢、18ヶ月齢のWistar系雄ラットに対し内側半月脛骨靭帯を切除した内側半月脛骨靭帯切除モデルを作成し4週間の通常飼育を行った。膝関節を採取し光学顕微鏡下の観察を行い軟骨変性スコアを比較した。いずれの週齢においても半月板先端周囲の限局した範囲において、軟骨基質の染色性の低下、軟骨表層の不整、Fibrillationを認めた。週齢の違いによる組織所見の著明な差は認めず、軟骨変性スコアの有意差も認められなかった。軟骨変性の程度が年齢の影響を受けないほど軽度である可能性が示唆された。滑膜細胞のメカニカルストレスに対する神経細胞との相互作用に関する検証は、使用細胞の変更に伴う条件設定が必要となったため検証に時間を要した。単に比較検証を行うだけでなく、関節組織内の細胞である骨芽細胞にも焦点を当て、骨芽細胞の機械刺激感受性の調節に関しても実験を進めた。

1、変形性関節症(OA)のモデル検証のため化学的にOAを誘発するモデルと外科的にOAを誘発する4つのモデルを検証した。膝関節内側半月脛骨靱帯のみを切除する侵襲の少ないDMMモデルは他のモデルに比べ進行が緩徐であり、予防的運動療法の効果を検証するために組織学的には有用であることを示した。しかしビームセンサー式自発運動量測定装置による自発運動量は手術の有無で差が見られなかった。今後運動量をコントロールして観察していく必要がある。2.機械的刺激に対する滑膜細胞の受容メカニズム解明に向けて、滑膜細胞の機械的刺激に対する細胞内カルシム反応をマウスとヒト間で比較した。正常マウス滑膜細胞、正常ヒト滑膜細胞を実験に用いた。マウスおよびヒトにおける滑膜細胞の細胞内カルシウム濃度を、Fluo-3AMを負荷し測定した。細胞外カルシウム存在下では、機械的刺激によって、マウスおよびヒト両方の滑膜細胞において細胞内のカルシウム濃度の上昇反応を起こした。これらの反応は外液カルシウムが存在しない条件においても残存した。以上の結果から、マウスおよびヒトにおける滑膜細胞の応答が細胞内ストアからのカルシウム放出に関与している可能性を示唆した。細胞実験においては初期培養した滑膜細胞と神経細胞の共培養における条件設定をすすめ、神経ー滑膜の相互作用メカニズムの検証を行う予定である。早期関節症モデル作成に関しては高齢マウスおよび術後長期経過後のマウスを使用し、運動および組織の状態を検証する予定である。理学療法の効果検証のためのモデル条件が確立できつつあるため、運動量や負荷刺激について検討を行う。また、作成したモデル動物の滑膜細胞および神経細胞を使用した病態共培養モデルを用いての検証を行う予定である。予想以上に消耗品が安く購入できたので、わずかな残金が発生した。実験条件再設定により実験の進行が遅れ一部成果発表が行えなかった。今年度は成果発表に使用する。消耗品には時期により金額が変化する場合があるので、状況をみながら使用する。
酸化物超伝導体/酸化物半導体の界面構造及びジョセフソン素子応用に関する研究

酸化物超伝導体YBa_2Cu_3O_<7-δ>(YBCO)と,非超伝導体PrBa_2Cu_3O_<7-δ>(PBCO)が良好な接合界面を形成することは近年よく知られており,両者を用いたデバイスの作製が盛んに行われている。本研究では,PBCOの伝導機構に関して調べることでYBCO/PBCO/YBCO型ジョセフソン接合の持つ特異性を検討し,またPBCOの特性を利用してデバイス化を試みた.具体的には,YBCOとPBCOの混晶系である,(Pr_xY_<1-x>)Ba_2Cu_3O_<7-δ>(PYBCO)薄膜について非超伝導状態から超伝導状態への転移を観測し,PBCOの伝導機構を考察した.また,YBCOとPBCOを用いた超伝導3端子素子を作製し,電界効果特性を調べた.はじめに,PYBCO薄膜の伝導特性について調べた.PBCOはホッピング(VRH)伝導を示すことが知られているが,これは100〔K〕以下の低温域で起こるもので,高湿領域ではキャリアが活性化エネルギーを得て不純物半導体と同様のバンド伝導に転移することが示された.PBCOのPrをYと置換すると不純物密度が増加し,ついには縮退半導体となるために金属伝導に転移することが観測された。さらに,光照射に対するPBCOとPYBCOの反応の違いから,PBCOの伝導面がCuO鎖に存在し,YBCOのようにCuO_2面にはないことが証明された.また,YBCO/PBCO/YBCO構造を用いた3端子素子を作製した.接合PBCO部分をゲートとしてゲートに電界を印加すると,素子の抵抗値が変化した.この変化は100〔K〕以上の高湿域でのみ観測され,低温領域では電界効果が現れなかった.原因は,PBCOの伝導機構が100〔K〕前後で転移することから説明できた.酸化物超伝導体YBa_2Cu_3O_<7-δ>(YBCO)と,非超伝導体PrBa_2Cu_3O_<7-δ>(PBCO)が良好な接合界面を形成することは近年よく知られており,両者を用いたデバイスの作製が盛んに行われている。さらに,光照射に対するPBCOとPYBCOの反応の違いから,PBCOの伝導面がCuO鎖に存在し,YBCOのようにCuO_2面にはないことが証明された.また,YBCO/PBCO/YBCO構造を用いた3端子素子を作製した.接合PBCO部分をゲートとしてゲートに電界を印加すると,素子の抵抗値が変化した.この変化は100〔K〕以上の高湿域でのみ観測され,低温領域では電界効果が現れなかった.原因は,PBCOの伝導機構が100〔K〕前後で転移することから説明できた.
昆虫変態のタンパク質リサイクルシステムの解明

本研究では、変態期における幼虫表皮タンパク質のリサイクルといった視点から、1)生合成系、2)分解系、3)リサイクル系の3つの系について解析を進めることで、変態の分子機構の解明を目指した。エリサンの幼虫期、幼虫→蛹への変態期、蛹期における体液、皮膚、中腸内容物および脱皮液中のタンパク質成分についての総合的な解析を行った。BBP抗体による解析と遺伝子発現解析の結果から、BBPは、幼虫の真皮細胞で合成され、体液および表皮に分泌されることが明らかになった。特に幼虫体液中に2種類(BBP-I, BBP-II)が存在し、表皮中にはBBP-IIのみが存在するが、幼虫体色の異なる2系統(青色・黄色)間でBBPの存在について比較したところ、黄色系統では体液中にBBP-IとIIに加えて新規のBBP(BBP-0)が存在し、表皮でもBBP-IIに相同するタンパク質が存在した。これら結果は、幼虫体色に体液中のBBPは直接関係ないことを示すもので、体液のBBPが真皮を横切って表皮に蓄積するのではないことを強く示唆した。BBPを指標タンパク質として、変態にともなう幼虫皮膚タンパク質の動態を調べると、それらのタンパク質は蛹脱皮の約72時間前あたりから分解が始まり、いったん液状の脱皮液中に蓄積した。その後、蛹化にともない中腸内へ移行することが確認され、成虫化にともなって中腸内で分解された。全ての幼虫皮膚タンパク質は、成虫化に利用されていることが明らかになった。さらにBBP-I、BBP-IIの全アミノ酸配列を決定した。また、幼虫表皮に存在する48kDaのヘモリン様タンパク質が高濃度で存在することが、このタンパク質は幼虫期では表皮の生体防御に関係し、蛹期では中腸に移行することで、期間の初期段階では中腸内環境の安定化に関与し、後半の成虫化にともない成虫組織の形成のために分解・利用されるものと考えられた。本研究では、変態期における幼虫表皮タンパク質のリサイクルといった視点から、1)生合成系、2)分解系、3)リサイクル系の3つの系について解析を進めることで、変態の分子機構の解明を目指している。本年度は、ヤママユガ科のエリサン5齢幼虫の発育期での表皮タンパク質の生合成系について、皮膚組織におけるビリベルジン結合タンパク質(BBP)の動態を中心に解析を進めた。変態にともなう形態変化とBBPの吸収過程をモニタリングしてステージ分けを行い、5齢幼虫発育ステージ(5齢0日目蛹化0日目)の経日変化と変態期(蛹化24時間前蛹化24時間後)の経時的変化を、7ステージに分けてタイムテーブルを作成した。また、蛹脱皮直前の幼虫体節を結紮することでの脱皮液の吸収と脱皮液中の表皮タンパク質が選択的に吸収されるか調べるため、外来タンパク質(BSA等)を脱皮液中に注入し、それらの吸収を調べた。これらの結果から、幼虫表皮は最外皮を脱皮殻として脱皮するほかは、ほとんど脱皮液とともに蛹の体内に吸収されることが明らかになった。5齢幼虫発育ステージおよび変態期における各組織のBBPおよび構成タンパク質の量的・質的変動をSDS-ポリアクリルアミド電気泳動(SDS-PAGE)により調べた。特に変態期は、幼虫外皮、脱皮液、中腸内容物の構成タンパク質とマーカータンパク質のBBPの挙動を比較解析することで、それぞれの組織間での動態について明らかにした。

エリサンBBPのN末端アミノ酸配列からディジェネレイトプライマーを用いて真皮細胞由来のcDNAライブラリーを作成してBBPの全長cDNAを得た。ノーザンハイブリダイゼーション解析などによりmRNAの発育ステージ特異的および組織特異的発現動態については現在解析中である。本研究では、変態期における幼虫表皮タンパク質のリサイクルといった視点から、1)生合成系、2)分解系、3)リサイクル系の3つの系について解析を進めることで、変態の分子機構の解明を目指している。本年度は、エリサン5齢幼虫期のビリベルジン結合タンパク質(BBP)の生理機能と幼虫から蛹への変態期における脱皮液中のタンパク質成分についての解析を行った。BBPは、幼虫体液中に2種類(BBP-I, BBP-II)が存在し、表皮中にはBBP-IIのみが存在することが明らかになった。エリサン幼虫体色の異なる2系統間でBBPの存在について比較したところ、体色が青くない系統においても体液中に2種類のBBPが存在した。この結果から幼虫体色と体液中のBBPは直接的には関係ないことが考えられる。また、体液と表皮のBBPはいずれも真皮細胞で合成され分泌されると考えられるが、体液に分泌されたBBPが真皮を横切って表皮に蓄積するのではないことが強く示唆された。変態期の脱皮液中のBBPおよび構成タンパク質の量的・質的変動をSDS-ポリアクリルアミド電気泳動(SDS-PAGE)により調べた。幼虫表皮のBBPは、前蛹の脱皮液中に吸収された後、最終的には蛹の中腸内容物中に移行した。他の表皮構成タンパク質も同様の挙動を示し、特に48kDaの分子量をもつヘモリン様タンパク質が高濃度で存在することが明らかになった。このタンパク質は幼虫の生体防御に関わるものと考えられるが、現在、その局在と動態について解析を進めている。さらに、BBPに加えてこのタンパク質の遺伝子解析として、その発現についてノーザンハイブリダイゼーション解析およびリアルタイムPCR解析を行っている。本研究では、変態期における幼虫皮膚タンパク質のリサイクルといった視点から、1)生合成系、2)分解系、3)リサイクル系の3つの系について解析を進めることで、変態の分子機構の解明を目指している。本年度は最終年度であることから、エリサンの幼虫期、幼虫→蛹への変態期、蛹期における体液、皮膚、中腸内容物および脱皮液中のタンパク質成分についての総合的な解析を行った。BBP抗体による解析と遺伝子発現解析の結果から、BBPは、幼虫の真皮細胞で合成され、体液および表皮に分泌されることが明らかになった。特に幼虫体液中に2種類(BBP-I,BBP-II)が存在し、表皮中にはBBP-IIのみが存在するが、幼虫体色の異なる2系統(青色・黄色)問でBBPの存在について比較したところ、黄色系統では体液中にBBP-IとIIに加えて新規のBBP(BBP-0)が存在し、表皮でもBBP-IIに相同するタンパク質が存在した。これら結果は、幼虫体色に体液中のBBPは直接関係ないことを示すもので、体液のBBPが真皮を横切って表皮に蓄積するのではないことを強く示唆した。BBPを指標タンパク質として、変態にともなう幼虫皮膚タンパク質の動態を調べると、それらのタンパク質は蛹脱皮の約72時間前あたりから分解が始まり、いったん液状の脱皮液中に蓄積した。その後、蛹化にともない中腸内へ移行することが確認され、成虫化にともなって中腸内で分解された。全ての幼虫皮膚タンパク質は、成虫化に利用されていることが明らかになった。