hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
関節リウマチにおける新規ｍｉｃｒｏＲＮＡの機能解析

本研究は関節リウマチ(rheumatoid arthritis, RA)におけるmicroRNA (miRNA)の機能を明らかにすることを目的としている。これまでにRAにおける血球系細胞や滑膜細胞におけるmiRNAの発現解析が行われてきたが、その機能については十分に明らかにされていない。近年、次世代シークエンシングによりmiRNAの発現だけでなく、塩基の付加や変換なども検出することができる。そこで、RA滑膜において発現に変化があり、塩基の変換(A-to-I RNA editing)が誘導されているmiRNAを検出することにした。A-to-I RNAeditingはアデノシンがイノシンに変換される反応であるが、miRNAの場合、生合成の過程において塩基が変換され、ターゲット遺伝子が変化することが知られている。前年度までの結果より、RA由来滑膜細胞を用いてA-to-I RNA editingによる塩基の変換がmiRNAの機能を変化させることが明らかとなった。そして、約5,000遺伝子を含む新規レポータリブラリーを用いてそれらの機能を制御しているターゲット遺伝子を特定することができた。そこで、平成29年度は動物モデルを用いてmiRNA mimicを投与した治療実験を行った。miRNAmimic投与により関節炎を抑制することができ、新規レポーターライブラリーを用いて特定できた遺伝子の発現の低下を確認することができた。また、miRNAの滑膜細胞に対する細胞増殖の抑制等がmiRNAmimic投与実験における免疫組織化学により示された。これらの結果より、本研究によって検出されたmiRNAはA-to-I RNA editingの制御を受けており、ターゲット遺伝子が変化することにより関節炎を制御していることが示された。29年度が最終年度であるため、記入しない。本研究は関節リウマチ(RA)におけるmicroRNA(miRNA)の機能を明らかにすることを目的としている。関節リウマチ滑膜に関する3つの課題を定めており、1、新規miRNAの解析、2、miRNAエディティングの解析、3、滑膜を構成する血球系以外の細胞のmiRNAによる分類である。1、2に関しては次世代シークエンシングを用いて、miRNAの検出を行った。1、RAと対照群である変形性関節症(OA)の滑膜より得られたRNAからデータベースにない新規miRNAが発見され、OAとの比較により1種類がRA滑膜において発現が高いことが明らかとなった。2、次世代シークエンシングによりRA/OA間にて発現差のある既知miRNAを抽出した。その中から関節炎動物モデルの滑膜でも発現の低下していたmiRNAについて解析を進めている。特に、miRNAの生合成の過程において塩基変換(エディティング)が誘導されるmiRNAが検出されてきており、本年度はその機能を明らかにすることを重点的に行った。注目したmiRNAは滑膜において塩基変換により3種類の成熟miRNAが生合成されていることが示された。In situ hybridization法により、注目したmiRNAは滑膜表層または表層下に存在する細胞であることが明らかとなったため、滑膜より滑膜細胞様繊維芽細胞(FLS)を単離し、機能に関する実験を行った。また、miRNAミミックを投与することによる関節炎モデルに対する治療実験を行っている。3、FLSを軟骨分化させることによりこれまでに報告されたmiRNAの発現が増加する事が確認された。RAにおけるmiRNAの機能の解析は解析技術やその特性から十分でなく、本研究がRAにおける未知のmiRNA機能を明らかにする可能性がある。本年度は小目標3つのうち、2番目のmiRNAエディティングについて中心に研究を行った。細胞を用いてmiRNAの機能を解析でき、最終的に関節炎におけるmiRNAエディティングの影響を解析中である。1、3の課題においても解析が進んでいるため、おおむね順調に進展していると考えられる。当研究は関節リウマチ(RA)におけるmicroRNA(miRNA)の機能を明らかにすることを目的とし、大きく分けて3つの小目標を定めている。1、滑膜における新規miRNAの発現細胞の同定とそのターゲット特定及びRAにおける役割の解明。3、滑膜細胞のmiRNAによる分類。このうち、平成28年度は2の研究について主に解析を行った。本研究のこれまでの結果より、次世代シークエンシングによってmiRNAエディティングが4種類検出されており、miRNAエディティングが誘導されているmiRNAはRA滑膜に特異的に発現が低いことが明らかとなっている。4種類のうち2種類は1つのmiRNAのシード配列に誘導されており、wild type (WT)、edit1、edit2をそれぞれ滑膜細胞に過剰発現させ機能を解析した。その結果、WTとedit1は細胞遊走、edit1とedit2は細胞増殖を抑制することが明らかとなり、動物モデルに治療効果がある事が明らかとなった。しかしながら、これら3つのタイプのmiR-381のターゲット遺伝子は従来の予測ソフトでは特定が難しかったため、5000遺伝子のルシフェラーゼレポーターベクターを用いてターゲット遺伝子の特定を行った。このベクターは遺伝子の5' UTR (untranslated region)、CDS (coding sequence)、3'UTRを含んでおり、従来考えられてきたmiRNAの結合領域3'UTRに加えて、近年報告がある5'UTRやCDSが含まれる新しいスクリーニングシステムである。この手法により、注目するmiRNAの機能がさらに明らかになると考えられる。5000遺伝子のレポーターベクターを384 wellに滴下し、miR-381(empty/WT/edit1/edit2)発現ベクターとトランスフェクション試薬、細胞の順に滴下し、ルシフェラーゼアッセイを行った。

過剰発現によりルシフェラーゼ活性の低下したもののうち、それぞれ低下率上位の遺伝子259個を抽出した。さらに384 wellを用いて259遺伝子について4回ルシフェラーゼアッセイを行い、2回以上同じ傾向が得られた遺伝子を52個抽出した。次にスケールをアップし、96 wellにて同様の結果が得られた遺伝子を23個抽出した。23遺伝子のうち、滑膜細胞を用いた実験でmiR-381 (WT/edit1/edit2)過剰発現により発現が低下している遺伝子は17遺伝子ある事が明らかとなった。遺伝子AについてはWTとedit1により発現が抑制されることによって細胞増殖に影響を与えている事が明らかとなり、遺伝子Bについてはedit1とedit2により発現が抑制されることによって細胞増殖影響を与えていることが明らかとなっている。これらの結果より、本研究はおおむね順調に進展していると考えている。本研究は関節リウマチ(rheumatoid arthritis, RA)におけるmicroRNA (miRNA)の機能を明らかにすることを目的としている。これまでにRAにおける血球系細胞や滑膜細胞におけるmiRNAの発現解析が行われてきたが、その機能については十分に明らかにされていない。近年、次世代シークエンシングによりmiRNAの発現だけでなく、塩基の付加や変換なども検出することができる。そこで、RA滑膜において発現に変化があり、塩基の変換(A-to-I RNA editing)が誘導されているmiRNAを検出することにした。A-to-I RNAeditingはアデノシンがイノシンに変換される反応であるが、miRNAの場合、生合成の過程において塩基が変換され、ターゲット遺伝子が変化することが知られている。前年度までの結果より、RA由来滑膜細胞を用いてA-to-I RNA editingによる塩基の変換がmiRNAの機能を変化させることが明らかとなった。そして、約5,000遺伝子を含む新規レポータリブラリーを用いてそれらの機能を制御しているターゲット遺伝子を特定することができた。そこで、平成29年度は動物モデルを用いてmiRNA mimicを投与した治療実験を行った。miRNAmimic投与により関節炎を抑制することができ、新規レポーターライブラリーを用いて特定できた遺伝子の発現の低下を確認することができた。また、miRNAの滑膜細胞に対する細胞増殖の抑制等がmiRNAmimic投与実験における免疫組織化学により示された。これらの結果より、本研究によって検出されたmiRNAはA-to-
シナプスプルーニング仮説に基づくiPS細胞由来神経培養系での統合失調症病態解明

奈良県立医科大学精神科に通院・入院中の統合失調症患者11名、および本研究に賛同を得た健常対照者12名から、書面にて研究参加の同意を得た。全例の上腕内側部のパンチバイオプシーから得られた皮膚線維芽細胞を培養し保存した。このうち8名の検体からエピソーマルプラスミドベクターを用いた方法(Okita K. et al., Nat Methods., 8(5):409-12、2011)でiPS細胞を樹立し、保存した。我々の細胞培養系でiPS細胞から分化誘導される神経細胞は、そのほとんどがvGlut1陽性で大脳皮質のLayer marker陽性の、大脳皮質の錐体細胞と同等の細胞である。これまでに、この培養神経細胞においてシナプス前蛋白であるSynapsin1の発現をqRT-PCRで認め、免疫染色法ではSynaptophysinと興奮性のシナプス後蛋白であるPSD95の発現を認め、一部は重なり合いシナプスを形成していると考えられた。パッチクランプ法を用いた電気生理学的解析を行うと、活動電位を生じる機能的な神経であることが確認でき、さらには、自発性シナプス後電流(Post synaptic current)も記録され、シナプスの形成が機能的にも確認できた。次に、健常対照者1名の培養神経細胞を用いて、補体および補体制御因子の発現をqRT-PCR法にて調べたところ、継時的な発現上昇を認めた。これは、シナプス蛋白の継時的な発現変化と相関していると考えられ、シナプス形成の進展に伴って発現量が増加していると考えられた。統合失調症双子不一致症例由来のiPS細胞から神経細胞を分化誘導し同様に解析したところ、補体制御因子の発現に変化が認められた。この神経細胞を、市販のマウス由来ミクログリア細胞株と共培養を行ったところ、ヒト神経細胞と同様の培養条件でミクログリア細胞株は共培養可能であることが確認できた。ヒトiPS細胞由来神経細胞の培養実験系に関しては、安定して確立できた。また、同培養系において、本研究のターゲットとなる補体および補体制御因子の発現についても確認できた。次に、マウス由来細胞株ではあるが、ミクログリアと神経細胞との共培養が可能であることも確認できた。以上の様に、本研究遂行の前提となる培養実験系については、おおむね確立できたと考える。

この神経細胞を、市販のマウス由来ミクログリア細胞株と共培養を行ったところ、共培養可能であることが確認できたが、同細胞株は貪食脳が強く、神経細胞の死滅を招いたため、その他のミクログリア細胞を用いる方法を検討中である。ヒトiPS細胞由来神経細胞の培養実験系に関しては、安定して確立できた。また、補体および補体制御因子の発現も確認できた。しかし、ミクログリア細胞株の選択に関しては、まだ検討の余地があり、この点で遅れを生じている。培養実験系と補体制御因子の発現に関しては、健常者由来サンプルのみではなく、統合失調症患者由来サンプルでも確認はできている。奈良県立医科大学精神科に通院・入院中の統合失調症患者11名、および本研究に賛同を得た健常対照者12名から、書面にて研究参加の同意を得た。全例の上腕内側部のパンチバイオプシーから得られた皮膚線維芽細胞を培養し保存した。このうち8名の検体からエピソーマルプラスミドベクターを用いた方法(Okita K. et al., Nat Methods., 8(5):409-12、2011)でiPS細胞を樹立し、保存した。我々の細胞培養系でiPS細胞から分化誘導される神経細胞は、そのほとんどがvGlut1陽性で大脳皮質のLayer marker陽性の、大脳皮質の錐体細胞と同等の細胞である。これまでに、この培養神経細胞においてシナプス前蛋白であるSynapsin1の発現をqRT-PCRで認め、免疫染色法ではSynaptophysinと興奮性のシナプス後蛋白であるPSD95の発現を認め、一部は重なり合いシナプスを形成していると考えられた。パッチクランプ法を用いた電気生理学的解析を行うと、活動電位を生じる機能的な神経であることが確認でき、さらには、自発性シナプス後電流(Post synaptic current)も記録され、シナプスの形成が機能的にも確認できた。次に、健常対照者1名の培養神経細胞を用いて、補体および補体制御因子の発現をqRT-PCR法にて調べたところ、継時的な発現上昇を認めた。これは、シナプス蛋白の継時的な発現変化と相関していると考えられ、シナプス形成の進展に伴って発現量が増加していると考えられた。統合失調症双子不一致症例由来のiPS細胞から神経細胞を分化誘導し同様に解析したところ、補体制御因子の発現に変化が認められた。共培養下におけるシナプス動態の観察は今後行う予定である。次に、補体制御因子のノックダウンベクターについては、ベクター作製に必要なコンストラクトは手に入れており、条件設定中である。神経細胞への導入について、力価の面でまだ不足があるため、今後手法を再検討して十分な条件を探る。生体マウス由来のミクログリア細胞の分離・培養については、予備実験は済んでおり、神経細胞との共培養を試みていく。適切なミクログリア細胞株の同定に努める。共培養が継続して可能となれば、既に作製可能となっている補体制御因子のノックダウンベクターを利用して、同因子や補体がシナプス形成に与える影響を検討していく。また、健常者と統合失調症患者サンプルとの比較で、差異を同定していく。
グアニン酸化損傷から生じる点突然変異の回避機構の解明

オキサゾロン(Oz)はグアニンの酸化により生成する損傷であり、これまでの研究から様々なDNAポリメラーゼが共通してOzの相補部位にグアニンを取り込むことが明らかとなっている。そのため、OzはG→C点突然変異を引き起こすグアニン酸化損傷であると考えられる。DNAポリメラーゼ(Pol)η、ι、κ、ζ、REV1は損傷乗り越えNDA合成を担うDNAポリメラーゼとして知られており、昨年度は今まで未解析であったPolι、κ、ζのうち、PolιとPolκのOzに対する反応を解析した。本年度はPolζのOzに対する塩基の取り込みおよび損傷乗り越え反応解析を行い、その結果、Polζは正確な取り込みは行わないが非常に効率良くOzを乗り越えてDNAを合成できることを明らかにした。その効率は天然のGの場合とほぼ同程度であった。さらに、グアニンの連続配列はグアニン単体の場合に比べ、酸化電位が低くなり、酸化されやすくなることが知られている。そして、グアニン連続配列の酸化により、Ozの前駆体であるイミダゾロンの連続配列が生成することが明らかとなっており、Oz連続配列も容易に生成すると考えられる。そのため、Oz連続配列に対するDNAポリメラーゼの反応を解析することが必要となった。Oz連続配列を含む鋳型・プライマー配列を作製し、Polα、β、ζ、η、ι、κ、REV1、Klenow Fragment exo-を用いて損傷乗り越え反応および塩基の取り込み解析を行った。その結果、Oz連続配列はPolζ以外のDNAポリメラーゼによるDNA合成反応を阻害することを明らかにした。一方、PolζはOz連続配列の場合も効率良く乗り越えてDNA合成を行うことが明らかとなった。Ozが単体か連続配列かに依存せず、Polζが効率良くOzを乗り越えられることから、PolζはOzの損傷乗り越えDNA合成において重要な役割を担っていることが示唆された。27年度が最終年度であるため、記入しない。これまでの研究からグアニン酸化損傷であるオキサゾロン(Oz)は様々なDNAポリメラーゼに共通して相補鎖側にグアニンが取り込まれることが明らかとなっており、G→C点突然変異を引き起こすグアニン酸化損傷である。また、Ozを含むDNAの複製において突然変異が生じないのはグアニン酸化損傷であるOzに対してシトシンが挿入された場合であるが、これまでOzに対してシトシンを優位に挿入するDNAポリメラーゼは見つかっていない。本研究はこのOzから生じるG→C点突然変異の回避機構を明らかにすることを最終目的としており、その可能性を秘めたDNAポリメラーゼとしてREV1に着目した。このREV1は天然塩基やアベーシックサイトを始め様々なDNA損傷に対してシトシンを優位に取り込むDNAポリメラーゼであり(Nature, 1996, 382, 729)、Ozに対してもシトシンを優位に取り込むかを解析する必要があった。本年度はREV1のリコンビナントを作製し、Ozに対する塩基の取り込み解析を行った。その結果、Ozに対してシトシンが非常に優位に取り込まれることを明らかにした。また、速度論解析を行った結果、代表的なグアニン酸化損傷である8オキソグアニン(8oxoG)よりもOzに対して効率よくシトシンを取り込んだ。8oxoGよりもOzの方がグアニンと構造が大きく異なるにも関わらず、シトシンの取り込み効率はOzの方が天然のグアニンに近い結果となり、非常に興味深い。今後さらなる考察が必要である。以上より、REV1がOzに対してシトシンを優位に取り込むことを明らかにし、Ozから生じるG-C点突然変異を回避する機構において重要な役割を担っている可能性が示唆された。これまでの研究からグアニン酸化損傷であるオキサゾロン(Oz)は様々なDNAポリメラーゼに共通して相補部位にグアニンが取り込まれることが明らかとなっており、G→C点突然変異を引き起こすグアニン酸化損傷であると考えられる。損傷塩基を含むDNAの複製を担うDNAポリメラーゼとしてPolη、Polι、Polκ、Polζ、REV1が知られているが、これらのDNAポリメラーゼはそれぞれ損傷乗り越え複製で得意とする損傷の種類が異なっている。それ故、これらのDNAポリメラーゼのOzに対する反応を解析し、Ozを含むDNAを効率良く複製できるDNAポリメラーゼを明らかにすることは、Ozから生じるG→C点突然変異の発生機構の解明において重要である。昨年度はREV1がOzに対してシトシンを取り込むこと、シトシンを取り込んだ後は伸長反応が停止することを明らかにした。本年度は、Ozに対する塩基取り込みおよび損傷乗り越え複製が解析されていないPolι、Polκについて、大腸菌発現系を用いてリコンビナントタンパクを作製し、これらの解析を行った。作製したPolιとPolκを用いてOzに対する塩基の取り込み解析を行った結果、Polιは天然のGでは見られなかったグアニンとアデニンの取り込みが増加し、シトシンの取り込みが減少した。また、PolκはOzに対して主にグアニンとアデニンを取り込んだ。一方、Ozを含むDNAを用いて損傷乗り越え複製を解析した結果、PolιはOzに対して1塩基取り込んだ後は伸長反応が停止し、PolκはOzに塩基を挿入した後も複製を続けたがその効率は非常に悪いことを明らかにした。このことから、PolιとPolκはOzに関して誤りがちな複製を行うが、損傷乗り越え複製の停止または効率の悪さから、Ozの損傷乗り越えにおいては重要な役割は担っていないと考えられる。

オキサゾロン(Oz)はグアニンの酸化により生成する損傷であり、これまでの研究から様々なDNAポリメラーゼが共通してOzの相補部位にグアニンを取り込むことが明らかとなっている。そのため、OzはG→C点突然変異を引き起こすグアニン酸化損傷であると考えられる。DNAポリメラーゼ(Pol)η、ι、κ、ζ、REV1は損傷乗り越えNDA合成を担うDNAポリメラーゼとして知られており、昨年度は今まで未解析であったPolι、κ、ζのうち、PolιとPolκのOzに対する反応を解析した。本年度はPolζのOzに対する塩基の取り込みおよび損傷乗り越え反応解析を行い、その結果、Polζは正確な取り込みは行わないが非常に効率良くOzを乗り越えてDNAを合成できることを明らかにした。その効率は天然のGの場合とほぼ同程度であった。さらに、グアニンの連続配列はグアニン単体の場合に比べ、酸化電位が低くなり、酸化されやすくなることが知られている。そして、グアニン連続配列の酸化により、Ozの前駆体であるイミダゾロンの連続配列が生成することが明らかとなっており、Oz連続配列も容易に生成すると考えられる。そのため、Oz連続配列に対するDNAポリメラーゼの反応を解析することが必要となった。Oz連続配列を含む鋳型・プライマー配列を作製し、Polα、β、ζ、η、ι、κ、REV1、Klenow Fragment exo-を用いて損傷乗り越え反応および塩基の取り込み解析を行った。その結果、Oz連続配列はPolζ以外のDNAポリメラーゼによるDNA合成反応を阻害することを明らかにした。一方、PolζはOz連続配列の場合も効率良く乗り越えてDNA合成を行うことが明らかとなった。Ozが単体か連続配列かに依存せず、Polζが効率良くOzを乗り越えられることから、PolζはOzの損傷乗り越えDNA合成において重要な役割を担っていることが示唆された。9の研究実績の概要に示したように、本研究では損傷乗り越え複製を担うDNAポリメラーゼのうちPolιとPolκのOzに対する塩基の取り込みおよび、損傷乗り越え反応を解析した。その結果、他のDNAポリメラーゼと同様にグアニンの取り込みが共通していることを明らかにした。また、PolιはOzに対して塩基を取り込んだ後は伸長が停止し、Polκの伸長効率は非常に低いことも明らかにした。しかし、Polιのリコンビナント作製ではHisタグを用いた場合はポリメラーゼ活性をもったPolιのリコンビナントが得られなかった。そこで、GSTタグに変更することで、ポリメラーゼ活性のあるPolιを得ることができた。このPolιのリコンビナント作製に時間を要したので、やや遅れている。本年度に解析できなかった、もう一つの損傷乗り越え複製のDNAポリメラーゼであるPolζについては現在解析中である。27年度が最終年度であるため、記入しない。これまでの結果に加え本年度の研究により、損傷乗り越え複製を担うDNAポリメラーゼのうちPolζ以外に関しては、Ozに対して取り込む塩基および損傷乗り越え伸長反応が明らかとなった。しかし、PolιやPolκはREV1のようなOzに対する優位なシトシンの取り込みは見られなかった。
核内レセプターと基本転写装置をつなぐコアクチベーターネットワークの解析

核内レセプターはDNA結合性の転写調節因子であり、リガンドの存在の有無により転写のスイッチをオンにしたりオフにしたり出来ることから、真核生物の転写機構を研究するのに適している。遺伝子の転写は、クロマチン構造の弛緩に始まる多くの段階を経て達成されるが、これには転写調節因子、基本転写因子群、コアクチベーター等、多くの因子が関与している。核内レセプターを介する転写調節に関し、最近多くのコアクチベーターの関与が示唆されているが、その詳細な分子機構は不明である。そこで、我々は核内レセプターの一種であるビタミンDレセプター(VDR)について、これらコアクチベーターの転写活性化における役割について検討した。これまでにクローニングされているコアクチベーターについて、培用細胞の系でVDRを介する転写活性化に対する効果を調べ、SRC1が促進的にRIP140が抑制的に働き、PCAFはSRC1の作用をさらに増強することを明らかにした。しかし、培養細胞では内因性のコアクチベーターが大量に発現しており、コアクチベーターの効果を正確に判定することが難しい。この問題を克服するためには、内在性の因子を完全に除いた状態で、コアクチベーターの転写活性化における役割を調べるなければならない。そこで今年度は、in vitroでのヌクレオソーム再構成系と培養細胞での遺伝子ノックアウト系の製作のための基礎検討を行った。
非貴金属を活性中心に有する高活性二酸化炭素還元触媒の設計と開発

本研究は大きく分けて、(1)非貴金属元素からなる活性中心を有する触媒の合成とその構造解析、及び(2)高活性化のための設計指針の確立、という2点からなる。合成した触媒の構造解析は、放射光や透過型電子顕微鏡を始めとした手法により行い、二酸化炭素還元活性の評価はガスクロマトグラフィーやイオンクロマトグラフィーにより行う。また、近年電極触媒分野で用いられる第一原理計算を用いることで、二酸化炭素還元の反応中間体の吸着エネルギーを計算し、反応メカニズム解析を行う。
両親媒性多糖類の超分子形成と機能

生体系では、複数の分子あるいは高分子が水溶液中で超分子を形成することで、それぞれ単独では得られない様々なユニークな機能が発現している。最近、工学、薬学や医学分野での応用と関連して生体類似の両親媒性高分子の水溶液中での自己会合とその機能発現に関する研究が行われている。我々は、水溶性天然多糖類に疎水基を部分的に置換した種々のリポ多糖類似の疎水化多糖類を合成し、その会合特性を検討してきた。特に、コレステロール基置換多糖類は水溶液中で分散させるだけで、自己会合により非常にサイズのそろった約20nmの球状の安定な超微粒子を形成することを見いだした。本年度は多糖の分子量、疎水基の構造、その置換度を種々変えた疎水化多糖を合成し、その会合特性を静的および動的光散乱法、蛍光分光法、排除クロマトグラフィーにより検討した。その結果、微粒子はナノスケールのヒドロゲル構造を有すること、その大きさ、糖密度、さらにヒドロゲル網目のポアサイズを、主に疎水基の置換度を変えることで制御し得ることが明らかになった。近年、種々の方法でナノ微粒子が合成され、バイオテクノロジー分野で幅広く応用されている。しかし、このように内部構造が比較的よく解析された50nm以下の単分散なヒドロゲル微粒子はいままでにほとんど報告例がない。両親媒性多糖の超分子形成能を利用することではじめて可能になったものといえる。また、種々の疎水性物質およびアドリアマイシンなどの薬物を強く取り込む不斉な疎水場が形成されていることも分かった。さらに、このヒドロゲル微粒子は種々の球状タンパク質をそのゲルマトリックス内部にしっかりと取り込むことを見いだした。取り込まれたタンパク質は熱に対してきわめて安定化された。
舌・下顎の運動解析に基づく自然音声の合成

合成音の品質向上,特に自然性を高くするためには,調音運動の解析に基づいた合成方法を確立する必要がある.本研究では,調音器官(舌,下顎)の運動計測に基づいて音声の持つ言語情報が,どのような過程を経て生成されるかを明らかにすることを目的としている.本年度では,調音器官の運動計測システムの開発を行い,母音および半母音の生成過程の解析を行った.1.圧電フィルム曲率センサを用いた舌面形状の計測圧電フィルムに発生する電圧から曲率が計測できることを示し,曲率関数から形状を推定するアルゴリズムを導出した.そして,本センサを用いて,舌の形状計測を行った.その結果,母音および子音発生時の舌先の微妙な動きを捕えることができ,本法の有効性を明らかにした.2.頬(ほお)部間電気インピーダンスを用いた下顎運動の計測下顎の開大度と頬部間電気インピーダンスとの関係を解剖学的知見に基づいたモデルにより記述し,頬部間電気インピーダンスから下顎開大度が推定できることを示した.頬部間電気インピーダンスは表面電極を用い無侵韻的に計測でき,話者の自然発生を妨げることなしに下顎開大度が計測できることが明らかとなった.3.母音および半母音の生成過程の解析舌・下顎の調音運動の計測を行い,連続母音と半母音との調音方法の違いを調べた.その結果,半母音と連続母音調音との違いは,舌運動と下顎運動との間に生じる位相差にあることが明らかになった.また,このような調音運動の特長と音声のホルマント周波数(F_1, F_2)との対応関係を明らかにした.すなわち,半母音発生時では,舌運動と下顎運動との間に位相差が生じ,これがF_1とF_2の遷移時定数の差となって現われることが明らかとなった.合成音の品質向上,特に自然性を高くするためには,調音運動の解析に基づいた合成方法を確立する必要がある.本研究では,調音器官(舌,下顎)の運動計測に基づいて音声の持つ言語情報が,どのような過程を経て生成されるかを明らかにすることを目的としている.本年度では,調音器官の運動計測システムの開発を行い,母音および半母音の生成過程の解析を行った.1.圧電フィルム曲率センサを用いた舌面形状の計測圧電フィルムに発生する電圧から曲率が計測できることを示し,曲率関数から形状を推定するアルゴリズムを導出した.そして,本センサを用いて,舌の形状計測を行った.その結果,母音および子音発生時の舌先の微妙な動きを捕えることができ,本法の有効性を明らかにした.2.頬(ほお)部間電気インピーダンスを用いた下顎運動の計測下顎の開大度と頬部間電気インピーダンスとの関係を解剖学的知見に基づいたモデルにより記述し,頬部間電気インピーダンスから下顎開大度が推定できることを示した.頬部間電気インピーダンスは表面電極を用い無侵韻的に計測でき,話者の自然発生を妨げることなしに下顎開大度が計測できることが明らかとなった.3.母音および半母音の生成過程の解析舌・下顎の調音運動の計測を行い,連続母音と半母音との調音方法の違いを調べた.その結果,半母音と連続母音調音との違いは,舌運動と下顎運動との間に生じる位相差にあることが明らかになった.また,このような調音運動の特長と音声のホルマント周波数(F_1, F_2)との対応関係を明らかにした.すなわち,半母音発生時では,舌運動と下顎運動との間に位相差が生じ,これがF_1とF_2の遷移時定数の差となって現われることが明らかとなった.
ネマティック配列構造を有するセルロースからの音響デバイスの創製

本課題では、研究代表者らが開発したネマティック配列構造を持つセルロース、ネマティックオーダーセルロース(NOC)の音響用デバイスとしての適性と、さらにはNOCの改質による高性能音響デバイス化への可能性を探ることを目的としている。昨年度までの結果から、NOCは極端な力学異方性、つまり延伸方向の弾性率が横方向の弾性率と比較して極度に高い値を有していることが明らかとなった。また、この強度異方性の低減には二軸延伸法か有効なことを示した。続いて本年度は、このセルロースフィルムの音響性能を向上させる目的として、延伸セルロースフィルムの結晶化を行ない、高次構造特性ならびに音響特性の指標となる弾性率と内部損失を測定し、それらの相関を解析した.NOCフィルムおよび二軸延伸セルロースフィルムの結晶化は、マーセル化の手法を適用し、水酸化ナトリウム水溶液を用いて行なった。その結果、両フィルムはともにセルロースIIの結晶形で結晶化し、結晶化度もともに45%まで増加し、初期の約3倍となった。そしてX線回折を用いた高次構造解析から、フィルム表面に対するグルコース環の配向に関して、結晶化NOCはランダム配向、結晶化二軸延伸セルロースフィルムは(1-10)面配向していることがそれぞれ明らかとなった。いっぽう音響特性(力学物性)に関しては、両フィルムとも結晶化前後で変化が見られなかった。これは、形成した結晶子のサイズが小さく分散しているため、力学物性の増大につながらなかったものと考えられた。よって音響特性の向上に対して結晶化は影響を与えないことがわかった。これまでの結果から、ネマティック配列構造を有するセルロースから、透明でフレキシブル、生分解性があり、高性能な音響特性を有する音響デバイスを開発する指針が得られた。本課題では,研究代表者らが開発した新規構造を持つセルロース,ネマティックオーダーセルロース(NOC)の音響用デバイスとしての適性と,NOCの改質による高性能音響デバイス化への可能性を探ることを目的としている。本年度は,NOCの音響デバイスとしての適性を評価するため,NOCの力学(音響)特性およびその高次構造を解析した。NOCの延伸方向に対して平行方向な動的弾性率は16.4GPを示し,普通紙の弾性率の5倍以上の値となった。また内部損失の値は0.05で,内部損失に関しても普通紙より高い値が得られた。以上の結果から,NOCは高性能音響デバイスとしての特性を備えていることが分かった。しかしながら,湿潤(飽水)状態におけるNOCの動的弾性率は,気乾状態での値の10%までに低下することが明らかとなった。一方,剛性率に関して,その値は0.09GPaとなり,弾性率に比較して極端に低い値が得られた。また水分の影響に対して,弾性率と同様の現象が剛性率にも認められ,気乾状態値の5%程度まで低下した。これに対して,水接触角は高い値を示し,NOC表面は疎水性に近いことが推定された。これら従来のセルロース材料には見られない特異的な物性は,NOCの高次構造に起因するものと考えられた。そこで,偏光および原子間力顕微鏡を用いてNOCの形状観察を行なったところ,延伸方向に平行に並んだ組織構造が観察された。この構造が高弾性率・低剛性率を生じさせたと考えられた。またNOCの水による膨潤異方性を検討した結果,横方向(延伸方向に垂直)に大きく水膨潤することが分かった。これはグルコース環が表面に対して,水酸基を平行にして配列していることを示唆している。この配列構造が表面疎水性に寄与しているものと推定された。本課題では,研究代表者らが開発した新規構造を持つセルロース,ネマティックオーダーセルロース(NOC)の音響用デバイスとしての適性と,さらにはNOCの改質による高性能音響デバイス化への可能性を探ることを目的としている.昨年度までの結果からNOCは極端な力学異方性,延伸方向の弾性率が横方向と比較して極度に高い値,を有していることが明らかとなった.そこで本年度は,このセルロースフィルムの力学異方性を低減させる目的として,セルロースに二軸延伸法を適用し,二軸延伸セルロースフィルムの高次構造特性と力学物性を解析した.二軸延伸フィルムのX線回折および固体NMRスペクトルはブロードなプロファイルを示し,二軸延伸セルロースも一軸延伸のNOC同様,非結晶性であることがわかった.また3方向X線回折像から,セルロース長鎖軸がフィルム面に対して平行に配向していることが明らかとなった.さらにAFMによるフィルム表面解析から,未延伸フィルムおよびNOCと比較して,二軸延伸セルロースは表面が平滑であることが判明した.以上の結果から,二軸延伸法は,セルロースフィルムを透明な状態のまま結晶化させずに分子配向状態を変化させることが可能で,加えて,表面粗さを改質することができることを示した.一方,力学物性において二軸延伸セルロースフィルムは,縦(延伸方向)と横方向に関して同等の弾性率・引張り強度ならびに伸び値を示し,力学物性のバランスを有した力学等方的なフィルムであることが明らかとなった.以上のように,二軸延伸法はセルロースフィルムの構造および力学物性の改質に対して非常に有効であることがわかった.本課題では、研究代表者らが開発したネマティック配列構造を持つセルロース、ネマティックオーダーセルロース(NOC)の音響用デバイスとしての適性と、さらにはNOCの改質による高性能音響デバイス化への可能性を探ることを目的としている。

また、この強度異方性の低減には二軸延伸法か有効なことを示した。続いて本年度は、このセルロースフィルムの音響性能を向上させる目的として、延伸セルロースフィルムの結晶化を行ない、高次構造特性ならびに音響特性の指標となる弾性率と内部損失を測定し、それらの相関を解析した.NOCフィルムおよび二軸延伸セルロースフィルムの結晶化は、マーセル化の手法を適用し、水酸化ナトリウム水溶液を用いて行なった。その結果、両フィルムはともにセルロースIIの結晶形で結晶化し、結晶化度もともに45%まで増加し、初期の約3倍となった。そしてX線回折を用いた高次構造解析から、フィルム表面に対するグルコース環の配向に関して、結晶化NOCはランダム配向、結晶化二軸延伸セルロースフィルムは(1-10)面配向していることがそれぞれ明らかとなった。いっぽう音響特性(力学物性)に関しては、両フィルムとも結晶化前後で変化が見られなかった。これは、形成した結晶子のサイズが小さく分散しているため、力学物性の増大につながらなかったものと考えられた。よって音響特性の向上に対して結晶化は影響を与えないことがわかった。これまでの結果から、ネマティック配列構造を有するセルロースから、透明でフレキシブル、生分解性があり、高性能な音響特性を有する音響デバイスを開発する指針が得られた。
石炭タール, ピッチから得られる超微小球状炭素体の焼結法と新材料への応用

本研究は,まず出発原料である石炭タール,ピッチ類を化学的に改質,あるいは炭素化反応を制御して,数ミクロンの真球状の炭素質粒子を得ること,又炭素小球体の焼結特性の検討を目的として行なわれた.その結果多環芳香族系重質油またはピッチと,それと対照的な直鎖パラフィンを加圧炭化することにより粒径の均質な炭素小球体が生成することを見いだした.炭素球体の生成機構を明らかにする目的でさきに,開発した,高温,高圧^1H-NMR法を応用した.この手法が,炭素小球体の生成機構に解明に有効であることが確認できた.この結果,炭素小球体が高温で超臨界状態に近い密度の高いガス中で生成していることが明かとなった.又高温,高圧ESRを用いて炭素小球体生成時のラジカルの挙動について検討したけっかn-パラフィン/ピッチの混合重量比が大きい程,熱分解,重合反応時のラジカル濃度の経時変化は,高温側にシフトすることが明かとなった.また炭素小球体製造の原料となる重質炭化水素類の組成をHPLC, GC-MS法などの方法を組合せ化合物タイプの分布として定量的表示できた.オートクレーブを用いn-パラフィンを600°C,初圧50kg/cm^2の条件で熱処理したときに得られる小球体の径は数μm10μmの範囲にある.オートクレーブへの原料仕込比を調整することにより粒子径を制御できることが明かとなった.仕込比の減少と共に粒径分布は小さい方へ移行していることが判った.このようにして得られた炭素小球体を高温電気炉において800°Cにおいて炭化した結果,焼結が可能であることが判った.しかし大量の小球体を大学における実験室では製造出来ないので詳細な研究は今後に残されている.本研究は,まず出発原料である石炭タール,ピッチ類を化学的に改質,あるいは炭素化反応を制御して,数ミクロンの真球状の炭素質粒子を得ること,又炭素小球体の焼結特性の検討を目的として行なわれた.その結果多環芳香族系重質油またはピッチと,それと対照的な直鎖パラフィンを加圧炭化することにより粒径の均質な炭素小球体が生成することを見いだした.炭素球体の生成機構を明らかにする目的でさきに,開発した,高温,高圧^1H-NMR法を応用した.この手法が,炭素小球体の生成機構に解明に有効であることが確認できた.この結果,炭素小球体が高温で超臨界状態に近い密度の高いガス中で生成していることが明かとなった.又高温,高圧ESRを用いて炭素小球体生成時のラジカルの挙動について検討したけっかn-パラフィン/ピッチの混合重量比が大きい程,熱分解,重合反応時のラジカル濃度の経時変化は,高温側にシフトすることが明かとなった.また炭素小球体製造の原料となる重質炭化水素類の組成をHPLC, GC-MS法などの方法を組合せ化合物タイプの分布として定量的表示できた.オートクレーブを用いn-パラフィンを600°C,初圧50kg/cm^2の条件で熱処理したときに得られる小球体の径は数μm10μmの範囲にある.オートクレーブへの原料仕込比を調整することにより粒子径を制御できることが明かとなった.仕込比の減少と共に粒径分布は小さい方へ移行していることが判った.このようにして得られた炭素小球体を高温電気炉において800°Cにおいて炭化した結果,焼結が可能であることが判った.しかし大量の小球体を大学における実験室では製造出来ないので詳細な研究は今後に残されている.炭素小球体は高強度の等方性の高密度炭素材、液体クロマトグラフの充填剤、プラスチックの導電用充填剤等の特殊炭素材として優れた効果が期待されている。本研究は、まず出発原料である石炭タール、ピッチ類を化学的に改質、あるいは炭素化反応を制御して、数ミクロンの真球状の炭素質粒子を得ること、又炭素小球体の焼結特性の検討を目的として行なわれた。その結果多環芳香族系重質油またはピッチと、それと対称的な直鎖パラフィンを加圧炭化することにより粒径の均質な炭素小球体が生成することを見い出した。又申請者らが先に開発、製作した高温、高圧【^1H】-NMRが有効であることが確認できたので、それらの手法を用いて炭素小球体の生成機構について考察した。この結果、炭素小球体が高温で超臨界状態に近い密度の高いガス中で生成していることが明らかとなった。又高温、高圧ESRを用いて炭素小球体生成時のラジカルの挙動について検討した結果n-パラフィン/ピッチの混合重量比が大きい程、熱分解、重合反応時のラジカル濃度の経時変化は、高温側にシフトすることが明らかとなった。又オートクレーブの空間の容積と試料の仕込量が炭素小球体の粒径に対して重要な因子であることも明らかとなった。現在、生成した炭素小球体の表面構造に関してフーリエ変換赤外分光法等を用いて検討を行なっている。又このようにして得られた炭素小球体を高温電気炉において炭化した結果、焼成できることが明らかとなった。
グリア細胞におけるＲＮＡ制御機構の意義の解明

多くのRNA結合タンパク質は細胞/組織特異的に発現することにより、細胞/組織特異的なトランスクリプトームを産み出すことに寄与していると考えられる。そのようなRNA結合タンパク質の一つであるQuaking5(Qki5)は、胎生期マウス中枢神経系において、神経幹細胞に特異的に発現し、ベータカテニンシグナル関連分子の選択的スプライシングを調節することにより、神経幹細胞の細胞接着及び極性を制御し、幹細胞の維持に必須であることを明らかにした(Hayakawa-Yano et al, Genes Dev 2017)。神経幹細胞におけるQki5の発現は、Tbr2陽性中間型前駆細胞に分化すると急激に減弱する。以前の報告から、Nineinタンパク質は神経幹細胞では2kb以上ある巨大な選択的exon18を含みセントロソームに局在し、一方、神経細胞に分化するとexon18は選択されず、Nineinは細胞質に局在し軸索の成長に関わるという制御機構が存在する。そこでexon18の制御機構について解析したところ、神経幹細胞ではQki5がexon18の下流イントロン領域に結合し、選択的スプライシングに促進的に働くことを明らかにした。即ちQki5はNineinの選択的exonの制御を介して神経幹細胞ー神経細胞の分化遷移に寄与していることを明らかにした(Hayakawa-Yano and Yano, Int J Mol Sci 2019)。Qki5は胎生後期になるとオリゴデンドロサイト(OLs)細胞系譜にも強く発現する。そこで、OLs分化に伴って変動するOLs特異的exonをOLego-Quantasにて明らかにし、OLs特異的exonにおけるQki5標的RNA部位の寄与率を検証した。今後、Qkノックダウン培養OLsを用いたmRNA-seq解析によりQkiによる制御機構を明らかにし、論文として発表する。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。Qkコンディショナルノックアウトマウス(cKO)を作製するため、申請者らはこれまでにQk遺伝子のexon2をflox配列で挟んだQk-floxマウスを作製した(脳研究所細胞神経生物学分野による包括脳モデルマウス作製支援)。昨年12月に凍結胚(F0世代)の融解移植を行い、動物施設にマウスの導入を行った。産仔の中にQk-floxヘテロマウスを得ることはできたが、残念ながらneo耐性遺伝子が除かれたマウスがいなかったため、現在、Actb-FLPeマウスと交配しneo耐性遺伝子の除去を行っている。<マウス神経系におけるQk蛋白質の発現解析>Qk蛋白質はQk-5, Qk-6, Qk-7と選択的スプライシングにより3つの異なるアイソフォームが知られている。そこで、各々に特異的な抗体を用いて免疫染色を行い、発生期神経系におけるQk蛋白質の発現パターンを詳細に解析した。Qk-5は胎生10.5日目にはすでに未分化神経前駆細胞の存在する脳室帯(VZ)に強い発現が見られ、nElavls陽性のニューロン前駆細胞では発現が減弱し、ニューロンに運命決定してゆく過程で発現が抑制されることがわかった。一方でQk-6, Qk-7は発現が弱いかもしくは検出感度以下であった。その後、胎生13.5日目にはVZだけでなく、Olig2陽性のオリゴデンドロサイト前駆細胞(OPC)およびNova1/2陽性の分化したニューロンの一部にもQk-5が発現することを明らかした。胎生13.5日目にはQk-6がSZおよびOPCに発現が強く見られた。Qk-7は発現開始時期が遅いながらもQk-6と似たパターンであった。よって、神経前駆細胞ではQk-5が強く発現し、オリゴデンドロサイトへ分化していく過程で、Qk-6, Qk-7が優位になっていく発現のスイッチングが起きていることがわかった。H27年10月より本研究を開始し、半年が経過した。Qk-floxマウスの作製については、100%キメラの凍結胚を仮親に移植を行ったところ、産仔数が少なく、当初の予定より数ヶ月遅れがあった。しかしながら、年度内にF0世代を得ることができ、現在はActb-FLPeマウスと掛け合わせneo耐性遺伝子を除去する段階まで進んでいるので、やや遅れが見られたものの、概ね順調に進んだと言える。さらに、その間に、神経系におけるQk蛋白質の発現についてアイソフォーム特異的な抗体を用いて詳細に調べ、Qk-5, Qk-6, Qk-7の異なる発現パターンを知ることができ、今後の研究のベースとなるデータを得ることができたため、一定の評価ができると考えている。胎生期神経幹細胞におけるQkiの機能を明らかにするために、平成28年度は作製済みであったQk-floxマウスをNestin-creマウスと交配させることによって、神経系特異的なQkコンディショナルノックアウトマウス(cKO)を得た。以前に行った、Qki5蛋白質-RNA相互作用をトランスクリプトームワイドに解析するHITS-CLIP法で同定された892個の標的RNA群を元にパスウェイ解析を行うと、細胞接着に関連するシグナルパスウェイのみが有意に抽出された。

そこで、胎生14日目マウスの組織学的解析を行うと、パスウェイ解析で予期されたように、cKOの神経幹細胞ではベータカテニンやN-カドヘリンなど細胞間接着に必須の蛋白質の発現低下または極性消失が見られ、神経幹細胞が脳室下帯/中間帯に分散する異常が見られた。またcKOマウス脳由来、またはマウス脳由来の培養神経幹細胞を用いて分子生物学的解析を行った結果、Ptprz, Tnc, Pkmなど神経幹細胞の維持に重要な分子の選択的スプライシング制御が異常になっていることが明らかになった。よって、Qki5は選択的スプライシング制御を介して、神経幹細胞の細胞間接着を調節する重要な因子であることがわかった。また、上記の内容の論文を執筆し、ハイインパクトジャーナルに投稿を行なった。平成28年11月の時点ではコンディショナルノックアウトマウスの繁殖の問題により、少々研究計画の遅れが見られたが、繰越による研究計画の変更により、平成29年5月末の時点では遅れを取り戻すことができた。また、Qki5の胎生期神経幹細胞における新規機能の同定に関する論文に必要なデータを収集、論文を執筆し、投稿することができた点において、概ね順調に研究を進めることができたと言える。さらに研究を発展させ、グリア細胞を含む神経系細胞における非常に重要だと考えられるQkiの新規機能がさらに明らかになりつつあり、分子生物的解析、組織学的解析を進めている。論文の概要は以下のようである。1)Qk遺伝子をノックダウンしたマウス培養神経幹細胞を用いたmRNA-sequence解析により、Qki5が神経幹細胞の幹細胞性維持に寄与していることを明らかにした。2)胎生期マウス脳を用いたQki5 HITS-CLIP解析により、トランスクリプトームワイドにQki5が直接結合するRNA部位を明らかにし、結合部位を一塩基解像度で解明した。さらに、1)2)を統合的に解析することにより、Qki5が直接制御する選択的エクソンを同定し、選択的スプライシングの制御ルールを同定した。3)2)により得られた892個の標的RNA群のパスウェイ解析を行うと、細胞間接着に関するパスウェイのみが有意に得られた。4)Qkを神経系特異的に欠損させたマウス(cKO)の脳を組織学的に解析した。その結果、パスウェイ解析で予期されたようにcKOマウスの神経幹細胞ではb-カテニンなど細胞間接着に必須の蛋白質の発現低下や極性の消失が見られ、神経幹細胞が脳室下帯/中間帯に分散し、さらに神経細胞が脳室帯に異所的に存在するなどの異常が起きることがわかった。また、cKOマウス脳由来のmRNAではb-カテニンの上流制御分子群の選択的スプライシング異常が見られた。以上のように、Qki5は選択的スプライシング制御を介して、神経幹細胞の細胞間接着を調節する重要な因子であることを解明した。多くのRNA結合タンパク質は細胞/組織特異的に発現することにより、細胞/組織特異的なトランスクリプトームを産み出すことに寄与していると考えられる。そのようなRNA結合タンパク質の一つであるQuaking5(Qki5)は、胎生期マウス中枢神経系において、神経幹細胞に特異的に発現し、ベータカテニンシグナル関連分子の選択的スプライシングを調節することにより、神経幹細胞の細胞接着及び極性を制御し、幹細胞の維持に必須であることを明らかにした(Hayakawa-Yano et al, Genes Dev 2017)。神経幹細胞におけるQki5の発現は、Tbr2陽性中間型前駆細胞に分化すると急激に減弱する。
ヒト腎細胞癌のMN/CA9発現における、低酸素状態、低メチル化、VHL異常の役割

我々は腎細胞癌の90%に発現している癌関連抗原MN/CA9の遺伝子発現にプロモーター領域の低メチル化が重要であることを明らかにしてきた。腎癌におけるMN/CA9遺伝子発現に、低酸素応答を介した系とVHLの異常を介した系の存在が考えられる。本研究では、まず、腎癌におけるMN/CA9の発現とそのプロモーターのメチル化およびVHL異常について検討した。MN/CA9陽性腎癌の臨床検体では10例中9例にプロモーター領域のメチル化を確認した。また、培養細胞での検討では、MN/CA9の発現にかかわらず、VHL異常が認められた。次に、培養細胞を用いて、低酸素状態およびVHL蛋白異常とMN/CA9発現の関係について検討した。6種類の腎癌培養株(SK-RC1,7,10,12,14,44)およびコントロールとしてMN/CA9陰性/VHL正常の細胞株(U87MG)を用いてpVHL異常とMN/CA9発現の関係について検討した。6種類の腎癌細胞株すべてVHL遺伝子異常があったが、MN/CA9発現はSK-RC1,10,44の3種類であった。そこでSK-RC1に注目しwild type VHL geneを遺伝子導入するとこれまでの報告どおりMN/CA9はdown regulationした。また、この遺伝子導入細胞(SK-RC1/VHL)やU87MG(VHL正常)をhypoxia下に培養するとMN/CA9を再び誘導したが、親株(SK-RC1)はhypoxiaにても変化がなかった。一方、VHL異常があるにも関わらずMN/CA9発現のないSK-RC14にwtVHLを導入してもhypoxia状態にしてもMN/CA9の発現は認められなかった。これらから、MN/CA9陰性の細胞では、VHLの異常にかかわらず、VHL-HIF1 pathwayはmainでなく他のpathwayが存在することが示唆された。平成14年度は下記の2つの点について検討した。腎摘除術で得られた腎細胞組織(13症例)より抽出キットを用いてゲノムDNA、total RNAを抽出。MN/CA9cDNAのexon1からexon3に至る495bpを増幅するプライマーを用いてRT-PCR法によりMN/CA9発現を評価した。淡明型の11例中10例に発現を認め、非淡明型の2例において発現を認めなかった。次にbisulfite genomic sequencingprotocol法によりMN/CA9プロモーター上の6つのCpGサイトにおけるメチル化状態を調べた。MN/CA9発現腎細胞癌10例中9例において、プロモーター領域の低メチル化を確認した。MN/CA9非発現腎細胞癌3例には低メチル化を認めなかった。2.ヒト腎細胞癌培養細胞株におけるMN/CA9発現とVHL異常、MN/CA9プロモーターのメチル化状態われわれは腎細胞癌の90%に発現している癌関連抗原MN/CA9の遺伝子発現にプロモーター領域の低メチル化が重要であることを明らかにしてきた腎細胞癌におけるMN/CA9遺伝子発現に、低酸素応答を介した系とVHLの異常を介した系の存在が考えられる。