hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
非線形放物型偏微分方程式の自己相似構造と解の特異性

相似変換に関する不変性をもつ非線形放物型偏微分方程式および系に対して、自己相似解の解構造を解明すると共に、時間大域解あるいは有限時刻爆発解の漸近的性質における自己相似解の役割について考察を行った。とくに半線形熱方程式に対する自己相似解の構造、非線形熱方程式爆発現象における自己相似解の果たす役割、走化性方程式系における自己相似解の構造とその役割について重点的に研究を行った。まず非線形項の指数がSobolevの意味で劣臨界的あるいは臨界的な場合について、非線形楕円型偏微分方程式に対する変分的手法により正値解の多重存在性を示すことができた。とくに非線形性が臨界的な場合については、エネルギー汎関数がある値より小さい場合にはコンパクト性を回復することを示すことができ、それにより臨界的状況における解の繊細な構造をとらえることができた、非線形の指数が優臨界の場合については、非線形常微分方程式にたいする手法により、自己相似解の正値解の多重存在に関する結果が得られた。半線形熱方程式の爆発解に関して、解の後方時空における適当な放物領域で正値性を保つ爆発解は、必ずtype Iと呼ばれる自己相似的な速さで爆発することを示した。さらに空間次元が3の場合、ある条件を満たす速さで収縮する領域においては、type IIと呼ばれる特殊な速さで爆発する解が存在することを示すことができた。走化性を記述する放物型方程式系に対して、時間大域解が時間の経過と共に自己相似解に漸近すること、空間2次元の場合には、一般の解の爆発形状は自己相似的とは成り得ないことを示すことができた。相似変換に関する不変性をもつ非線形放物型偏微分方程式に対して、自己相似解の解構造を解明すると共に、時間大域解の漸近挙動における自己相似解の役割について考察を行った。とくに今年度は、半線形熱方程式に対する自己相似解の構造についての研究を重点的に行った。ここでは自己相似解がある楕円型偏微分方程式を満たすことに着目し、主に楕円型偏微分方程式論、常微分方程式論からのアプローチを試みた。まず、非線形項の指数がSobolevの意味で劣臨界的あるいは臨界的な場合について、非線形楕円型偏微分方程式に対する変分的手法により正値解の多重存在性を示すことができた。とくに非線形性が臨界的な場合については、エネルギー汎関数がある値より小さい場合にはコンパクト性を回復することを示すことができ、それにより臨界的状況における解の繊細な構造をとらえることができた。非線形の指数が優臨界の場合については、非線形常微分方程式にたいする手法により、自己相似解の正値解の多重存在に関する結果が得られた。ここではべき乗型の非線形項をもつ問題を考えているにも関わらず、その自己相似解の解構造が、Gelfand構造と呼ばれる指数型非線形問題(Liouville型問題)に特有と思われている構造をもつことを明らかすることができた。さらに走化性を記述する放物型方程式系に対しても、その解の自己相似的挙動について考察を行った。ここでは、解の積分表示を利用することにより解の長時間的挙動について考察を行い、とくにBilar(1998)により構成された時間大域解は、時間の経過と共に自己相似解に漸近することを示すことができた。相似変換に関する不変性をもつ非線形放物型偏微分方程式に対して、自己相似解の解構造を解明すると共に、時間大域解あるいは有限時刻爆発解の漸近的性質における自己相似解の役割について考察を行った。とくに今年度は、Sobolevの意味で臨界指数増大度の非線形項をもつ半線形熱方程式の解の爆発現象における自己相似解の果たす役割について研究を重点的に行った。最初に、楕円型偏微分方程式における手法である変分的手法により後方型自己相似解の構造を明らかにした。

非線形項がSovolevの意味の臨界指数増大度をもつために、一般にはPalais-Smale条件と呼ばれるcompact性を保証する条件が成立しないが、ここでは方程式に現れる重み関数のエネルギー汎関数への働きにより、このcompact性が回復することを見いだすことができた。このことにより空間次元が3である場合と4以上である場合とでは、その解構造が本質的に異なることを示すことができた。さらに常微分方程式論からの1次元的な手法により、空間次元3においては裾を引きずるかのような特殊な形の球対称解が存在することを示すことができた。次に零点数非増大則を援用した比較定理により、爆発解の速さに対する判定条件を与えた。とくに解の後方時空における適当な放物領域で正値性を保つ爆発解は、必ずtype Iと呼ばれる自己相似的な速さで爆発することを示すことができた。さらに空間次元が3の場合、ある条件を満たす速さで収縮する領域においては、type IIと呼ばれる特殊な速さで爆発する解が存在することを示した。この現象は、例えば領域の収束する速度の1次オーダーが異なるだけで、起こり得なくなるという意味でsensitiveなものである。相似変換に関する不変性をもつ非線形放物型偏微分方程式およびその系に対して、自己相似解の解構造を解明すると共に、時間大域解の漸近挙動における自己相似解の役割について考察を行った。とくに今年度は、半線形熱方程式および走化性方程式系における自己相似解の構造とその役割について研究を重点的に行った。1.Sobolevの意味で臨界的な増大度の非線形項をもつ非線形熱方程式の前向き自己相似解の存在および解の多重性について考察を行った。ここでは、楕円型偏微分方程式における手法である比較定理および変分的手法により解の存在を示した。とくに臨界指数増大度の非線形項をもつ方程式においては、一般にPalais-Smaile条件を満たさないことが知られているが、ここでは空間次元3,4,5の場合にコンパクト性が回復することを見い出すことができ、適当な初期条件に対してsecond solutionの存在を示すことができた。一方、空間次元6以上の場合には、Pohozaev型の恒等式を構成することによりsecond solutionの非存在を示すことができ、これにより解の一意性の結果を得た。2.走化性を記述する方程式系に対して、その自己相似解の構造と役割について考察を行った。前向き自己相似解については、解の挙動とL^<1^>ノルムとの関連を明らかにすることができた。また、技術的と思われる仮定を必要とするが一般の解の自己相似解への収束を示すことができた。後ろ向き自己相似解については空間2次元の場合には、適当なクラスの自己相似解は存在しないこと、そして一般の解の爆発形状も自己相似的とは成り得ないことを示した。空間3次元以上の場合には、可算無限個の解の存在が示されているが、それらの性質および役割については、さらに今後の研究で解明を目指したい。
慣性モーメント可変フライホイールの同期機への適用

本研究は実験による実証と,実規模装置の設計による実現可能性の検証の2つの部分からなる。1年目は,前者である実験による実証のための実験装置の設計・製作・発注に取り組んだ。今回の実験装置は,研究計画調書に記したように,1.発電電動機に誘導機でなく同期機を用いても充放電できることを実証すること,および2.慣性モーメント制御装置の仕組みを代えて効率化すること,を目的とする。1.に関しては,実験装置の容量に合う同期機を見つけ,それを発注した。ただし,極数に関しては必要な回転速度となるものを市販品では見つけられなかったため,減速機を付けて対応することとした。今後の実験では,減速機を用いた場合と,系統模擬電源を50Hzでない周波数で運転した場合に関して,実験を進める予定である。また,2.に関しては,ボールねじを用いた方法を採用することに決めて発注した。これら納品された実験装置を組み立て,主回路や計測装置の配線を行い,実験を行った。同期運転に関しては,同期機のみの場合は容易に行えるが,フライホイールを連結すると容易には行えない結果となった。理論的にも慣性が大きくなると同期引き入れが困難になるが,それだけではなく,トルクや電力に数Hzの脈動が生じており,それが運転を困難にしている。この問題は,来年度に解決していく予定である。また,慣性モーメントの制御をフライホイール自身の回転力で行うようにしたが,この場合のエネルギーバランスについては,上記の脈動の影響もあり,今年度はまだ高精度な解析が行えなかった。研究計画調書では,同期機の仕様決定や発注と,慣性モーメント制御装置の発注を行い,試作機の発注を行うところまでを2018年度の計画としていた。これに対し,上記をすべて完了し,組み立て・配線・試運転まで行った。ただし,当初計画していた学会発表には至らなかった。その理由は,同期運転に成功してから学会発表する予定であったが,そこに至らなかったためである。上記すべてを考慮し,おおむね順調に進展していると判断した。2018年度の研究において課題となった,同期運転に至らなかった点と,トルクや電力に数Hzの脈動が生じた点に関しては,より詳細な計測を行い,それらの原因を突き止め,解決することを目指す。これが解決した後に,本実験装置のエネルギーバランスについて,高精度な解析を行う。これらの成果が出たら,学会発表を積極的に行っていく。2018年4月に交付申請を行った後に,各種機器や材料の見積りを得たところ,若干のずれが生じ,その結果として5,769円の次年度使用額が生じた。翌年度は,この額を含めて特に詳細な計測環境の整備を行い,当初研究目標を達成することを目指す。
ビッグバンの起源を探る-最先端の超伝導技術と史上最大の望遠鏡群で挑むCMB測定

我々は、ビッグバンの起源として有力とされる初期宇宙インフレーションを探るべく、史上最大の宇宙マイクロ波背景放射観測用望遠鏡群となるSimons Observatory(SO)実験を遂行している。この実験において、インフレーションの信号が現れるとされる大きな角度スケール(210度)での測定精度を大幅に改善する「連続回転式低温半波長板」を中心とした研究を行う。具体的には、SOによるインフレーション探索の成否を決める低温半波長板システムを作成し、また半波長板システムに焦点を当ててデータ解析を行い、解析手法を確立する。これにより世界最高感度でのインフレーション探索に明確な道筋を示す。本研究はSimons Observatoryでの使用を念頭におき大口径の「連続回転式低温半波長板」を製作し、大角度望遠鏡4台に設置することによりインフレーション由来のCMB-Bモードの検出を目的とするものである。宇宙マイクロ波背景放射観測から、間接的ではあるが宇宙初期のインフレーション、ビッグバンからの重力波の存在を示せると期待され、極初期の宇宙の進化についての実証的理解に資することが期待される。
プロミネンス-コロナ境界層の分光学的研究

磁気中性線に沿って数ケ月も存在し続ける1万度の太陽プロミネンスは、その囲りは百万度を越えるコロナに囲まれている。皆既日食観測から、プロミネンスをとりまくコロナ域のプラズマ粒子密度は少ないことがわかっている。プロミネンス・プラズマの流出入、エネルギーの流れ等からプロミネンスの安定性を調べることを目的とする。更に、大気振動に従うプロミネンスの振動運動や、コロナ輝線の振動についても検出を試みる。この目的の為に、乗鞍コロナ観測所の25cmコロナグラフ付属の大型分光器カメラ部にCCDカメラを3台取りつけた。分光器の出力光が微弱であるため、光量積分時間を長くするので、CCDチップは、スロースキャンTV方式で有効に動作することが必要である。更に、感度が高く、青感度良く、ノイズが少なく、開合率高く、反射光バック、干渉縞、チップ欠陥の少ないという條件から、SANYO製を選んだ。CCDチップの暗電流を低く押えるため、CCD全体を冷却した。暗電流を無視できる程度に押えるためには+5゚Cに冷やせば露出時間が3秒、-3°Cなら10秒の露出時間が可能であることがわかった。プロミネンスの【H_2】線(6563【A!゚】)、【H_B】線(4861【A!゚】)やHe線(10830【A!゚】)では約3秒の露出時間でスペクトルの輪郭を得ることができる。コダック2415フィルムと比較して14倍感度が良いことがわかった。CCDカメラの出力は、512×480×8bitの分解能でA/D変換される。一画面の情報量は3台のカメラで720KBとなり、この多量のデータを記録するために光デイスクを使用している。セイコー製9100【II】Lコンピューターによって望遠鏡、イメージ・プロセッサー,光ディスクが制御される。プロミネンスの【H_2】線、【H_B】線、Ca【II】K線、Heの【D_3】線などのスペクトル観測を行い、速度場輝度変化等を解析している。太陽コロナに接しているプロミネンス境界領域における物質の流入・流出やエネルギー收支を調べるために、乗鞍コロナ観測所の25cmコロナグラフ附置の大型分光器に、多素子光電受光器をとりつけ、プロミネンスの分光観測を行うことを計画している。本年度は、多素子受光器部とそれの分光器への取付けや、冷却装置につき検討をし、実施した。分光器カメラ部では、視角1.5′′が60μに相当し、また線分散として0.3A/mmを使うと、60μが輝線巾1Km/Sに相当する。従って、多素子受光器の素子の大きさとして60μ×60μ以下のものが望ましい。また、カメラ部での輝度は弱く、出力光強度は0.1μJ/【cm^2】であるので、露出時間は数秒以上を必要とする。従って多素子受光器部を冷却しないと、暗電流のために飽和してしまう。暗電流は、温度を7°C低下させる毎に約半分になるので、このことから、約-20°Cに冷却することが必要となる。更に、異なる輝線スペクトル3本を同時に観測する為、3個の二次元受光素子を任意の位置に配置できるようにした。冷却機を外部に置き、冷却空気を受光部内にパイプで循環させる構造を採用した。二次元素子としては、RETICON社のImageSensorを第一候補としてテストを行った。素子数=256×256個,大きさ=40μ×40μ,飽和光量=0.4μJ/【cm^2】,平均暗電流=40ms露出で1%,受光面積=10.24mm×10.24mmで、これは大きい受光面積をもち、周辺回路が簡単なことが利点である。日本TI社のCCD素子もテスト中である。これは受光面積が8.9mm×6.6mmと小さいが、素子数が多く感度もやや高い。来年度には、乗鞍コロナ観測所でテストを行ない、最適な素子を採用する予定である。プロミネンスの【H_2】線(6563【A!゚】)、【H_B】

線(4861【A!゚】)やHe線(10830【A!゚】)では約3秒の露出時間でスペクトルの輪郭を得ることができる。コダック2415フィルムと比較して14倍感度が良いことがわかった。CCDカメラの出力は、512×480×8bitの分解能でA/D変換される。一画面の情報量は3台のカメラで720KBとなり、この多量のデータを記録するために光デイスクを使用している。セイコー製9100【II】Lコンピューターによって望遠鏡、イメージ・プロセッサー,光ディスクが制御される。プロミネンスの【H_2】線、【H_B】線、Ca【II】K線、Heの【D_3】線などのスペクトル観測を行い、速度場輝度変化等を解析している。
第二言語の韻律習得の音響的考察とモ研究課題名

第二言語としての日英語間相互の韻律習得の問題を検証した。日本語話者の英語発話では、強勢の有無と母音の質の習得が上級者でも不完全である例が多かった。英語話者の日本語発話では、語アクセントとピッチおよびモーラ長に相関関係がみられる話者が多く、またフレーズ発話時にも語アクセントを用いるため、フレーズ全体でダウンステップ現象が起き、語の平板化現象が顕著な日本語話者のフレーズイントネーションとの違いが際立った。今年度は日本語話者と英語話者による日本語と英語の発話データの収集と、先行研究の検証をすることにより、データ分析の手法を確立することを中心とした。英語話者のデータはアメリカのカンザス大学の言語学科と東アジア言語文化学科の協力を得、アメリカ中西部英語母語話者の発話データを収集した。日本語話者のデータは早稲田大学国際教養学部の学生に依頼し、英語習得レベルが異なるデータを収集した。現在、両言語話者の英語の発話のうち、単語の分析を行っている。分析は単語を音素に分け、ストレス及びアクセントの有無による各母音、拍、音素の(1)継続時間、(2)音圧、(3)基本周波数、(4)音圧、(5)第一、第二フォルマンとの測定を進めている。これまでの分析結果だけに関しては、英語話者の英語の発話には、ストレスの有無と音圧に相関関係が見られるが、日本語話者の英語の発話には、ストレスと音圧とに顕著な関係が見られていない。発話リズムの音響分析、特に継続時間に関する分析手法に関しては、これまでさまざまな手法がとられてきたが、異なる言語間のリズムを完全に客観的に比較する手法は、筆者の知る限りまだ確立されていないが、近年の先行研究ではintervocalic interval,inerconsonantal interval,また両者の標準偏差などが広く用いられているため、これらの単位を用いたリズムの検証も行う予定である。この研究を始める前に、試験的に行った小規模の実験では、被験者の数が非常に少なかったため、確実性は低いものの、英語話者の日本語の発話の韻律に母方言の差が見られた。今年度の実験ではアメリカ中西部方言話者のデータしか収集していないが、来年度はオーストラリア英語話者のデータを収集し、英語の方言で日本語の韻律に差が生じるかどうか、小規模実験の結果を検証する予定である。今年度は、昨年度に引き続きデータの収集を中心に行い、並行して昨年度収集したデータの分析に取り掛かった。今年度はオーストラリアのグリフィス大学の日本語学科の学部生を中心にオーストラリア英語話者の日本語の発話データを収集した。合わせて英語話者の日本語のデータの比較のため、及び日本語話者の英語の発話との比較のために、英語の発話データも収録した。データ収集の仕方は先にデータ収集を行った米カンザス大学でのデータ収集の方法をそのまま採用し、テキストも同じものを使用した。データの分析は、最初に日本語話者の英語の発話の分析から始めた。結果の一部は昨年9月に早稲田大学で開かれたThe 2nd lnternational Workshop on Language and Speech Scienceと2009年3月に米国イリノイ大学で開かれた10th Generative Approaches to Second Language Acquisitionで発表し、論文を現在執筆中である。日本語話者の英語の発話の分析は、ストレスの有無による英語のテスト語の各母音と音節の(1)継続時間、(2)音圧、(3)基本周波数、(4)第一、第二フォルマント値を測定した。日本人被験者は英語圏に在住経験のある早稲田大学国際教養学部の学生で一般的な日本の大学の学部生と比べて英語の運用能力が高い。その被験者のストレスの有無による英語の母音の分析結果は、母音の継続時間、音圧、基本周波数では英語話者の発話と比較して有意な差が見られなかったが、第一・第二フォルマントの値には有意な差が見られた。つまり、英語話者の発話ではストレスがおかれない音節で母音の弱化が起きているが、英語能力が高い日本語話者の発話ではストレスがおかれない音節の母音の弱化が見られなかった。この結果の理論的裏付けを今後検証する予定である。最終年度は、特に英話話者の日本語の韻律、特にアクセントとイントネーションについて、前年度に収集したデータをもとに検証を行った。日本語母語話者の日本語発話では、単語、複合語、フレーズ等、異なる音韻単位ごとにそれぞれのアクセント規則が適用され、単語のレベルではあらわれていた語彙アクセントは、フレーズレベルではフレーズアクセント規則が適応され、異なる位置に移動するか消えることが少なくなかった。フレーズ全体のイントネーションとしては、アクセントフレーズごとにアクセントが現れるのが一般的なイントネーションであるが、実際の発話で顕著だったのは、俗に言う平板化現象で語アクセントがなくなったために、フレーズ全体ではダウンステップが起こらず、自然下降のイントネーションしか現れない発話が少なくなかった。一方、英語話者の日本語発話では、アクセントの起きる音韻単位が日本語母語話者の日本語発話での単位よりも小さく、話者によっては各単語ごとにアクセントが現れ、極端な話者では、「私は」の[「は」、「風邪を」の「を」など、助詞一つ一つがアクセントフレーズを形成する例も少なからずみられた。

この現象は英語話者の日本語発話に極端なダウンステップを引き起こす原因となっていると思われる。これは裏を返すと、最近日本語で浸透している単語レベルの平板化現象がフレーズレベルでダウンステップを引き起こさないのと逆の現象であり、英語話者の日本語発話が英語訛りと認識される原因の一つとなっていると思われる。異なる韻律単位の現象が、別の韻律単位の現象の原因となる一例といえよう。これらの結果をもとに、今後英話と日本語の母語話者及び学習者の発話コーパス構築のための発話テキスト作成へのデータの応用に取り掛かっている。
超臨界流体を含む混合系の高圧相挙動に関する研究

本研究では軽沸点成分の超臨界領域から、三重点付近までの広範な温度領域での二成分混合系の固相を含む高圧相挙動を明らかにし、こうした相挙動データの蓄積を計る。また相挙動の分類法を検討し、混合系の相挙動の特徴を生かした新しい技術開発の可能性を探る。first freezing point法により各混合系の三相共存点・四相共存点ならびに臨界軌跡を実測した。またn-alkanesとCO2混合系では液液の相密度逆転現象をが生じる温度圧力を測定した。H20とCO2混合系では温度サイクル法により水和化合物を生成する混合系の四相共存点と各種三相共存曲線を測定した。1.n-alkanes-CO2,C2H6混合系の高圧相挙動C17,C18とCO2,C2H6の各二成分混合系の高圧相挙動を実測した結果、CO2を含む混合系は先に報告した相挙動分類のtype2"に属し、C17-C2H6混合系はtype1、C18-C2H6混合系はちょうどtype1とtype1'の遷移混合系であることを確認した。またn-alkanesとCO2の混合系では液液共存領域において相密度の逆転現象が現れるが、その温度と圧力に興味ある関係が存在することを確認した。さらに相挙動分類においてきわめて重要な情報である四相共存点に着目した考察から、n-alkanesの炭素原子数の"oddeven effect"と四重点温度との関連、あるいはn-alkanesの結晶構造との関連を示唆する結果を得た。2.H20-CO2混合系(gas-hydrateを含む混合系)の高圧相挙動この系はgas-hydrate(CO2・6H2O)と呼ばれる反応物を生成する。本研究では四種類の三相共存曲線と一つの四相共存点と臨界終点を実測した。hydrate-H2O liquid-C02 gas or CO2 liquidの二つの三相共存曲線に対して吸着モデルを適用し実測値の相関を試みた。CO2分子の形状因子を変数とする相関ではhydrateの平均配位数を含め良好な結果を得た。
胃粘膜細胞におけるストレス関連遺伝子とその転写調節機構

ストレス蛋白質遺伝子の発現調節機構について平成7年度では、細胞内のグルタチオンレドックスを介するストレス蛋白質遺伝子転写因子(HSF1)の活性化についての研究を行い、細胞内グルタチオンはストレッサーを関知する細胞内センサーとして働くとともに、HSF1の活性化に関与することを明らかにした(J.Clin.Invest.,1996に発表)。さらに、胃粘膜に安全に、かつ有効にストレス蛋白質を誘導し、ストレス性胃粘膜傷害を予防するといったストレス蛋白質の臨床応用の可能性についても検討した。このため、いくつかの化合物について検討したが、非環状テルペン化合物であるgeranylgeranylacetone(GGA)に注目し、検討した。培養胃粘膜細胞を用いて、GGAはHSF1の活性化を引き起こし、HSP70 mRNAの発現と、ストレス誘導性のストレス蛋白質を誘導することを見いだした。このGGAによるストレス蛋白質の誘導作用については、in vivoでも確認した。ラットにGGAを胃内投与すると、HSP70mRNAの発現とHSP90,HSP70,HSP60の発現を引き起こし、さらに水浸拘束を負荷すると、これらのストレス蛋白質の誘導を増強しストレス潰瘍を抑制した。このように、本所究を通じて、初めて安全なストレス蛋白質誘導剤を初めて報告した(Gastroenterology,1996に発表)。平成7年と8年の研究を通じて、胃粘膜細胞に発現しているNF-κBのコンポーネントと酸化ストレスに関与するコンポーネントの同定を行った。モルモット胃底腺より調整した初代胃粘膜培養細胞を用いて、過酸化水素とジアミドにより活性化されるNF-κBのコンポーネントを、ゲルシフト法、UV-クロスリンク法、免疫沈降法、および免疫組織化学法により検討した。この結果、p50とp65のへテロタイマーが酸化ストレスに反応するコンポーネントであることを明らかにした。さらに、NF-κBの活性化を介した遺伝子発現としてp105と誘導性NO合成酵素のmRNAの発現誘導を明らかにした(論文投稿中)。モルモット胃底腺より調整した培養胃粘膜細胞を用いて,酸化ストレスに誘導されるストレス関連蛋白質の解析とその遺伝子発現の研究の中から、胃の粘液分泌細胞は、NF-κB様の活性を持つことを見いだした。本年度は、さらにNF-κBのコンポーネントの同定を行った。p105,p65,p50,及びc-Relの抗体を用いて、Western blottingにより胃粘膜細胞はこれらすべてのコンポーネントを発現している事を確認した。酸化ストレスにより出現してくるNF-κB活性は、p65とp50のヘテロダイマーにより行われていることをゲルシフトアッセイのsupershift実験により確認し、cross linkingによりNF-κBモチーフに結合するNF-κBのコンポーネントとして、p65とp50を確認した。さらに、免疫組織染色を行い、p65とp50の存在を確認し、酸化ストレスにより細胞質から核内への移行も確認した。p50の前駆体蛋白質であるp105のmRNAの発現と蛋白質の誘導を確認したが、p105はオートレギュレーションすることが知られており、NF-κBの活性化に伴う遺伝子発現として、まず、酸化ストレスによりp105のオートレグギュレーションをmRNAと蛋白質レベルで確認した。このように、NF-κBの活性化機構については多くの成果を上げることができ、現在論文作成中である。2.p43の精製と同定酸化ストレスにより誘導される新しいストレス蛋白質としてp43を見いだし、その精製と同定の作業を行った。

二次元電気泳動法による分離と、ニトロセルロース膜に転写したp43のN末端アミノ酸シークエンスを行ったが、N末端がブロックされており同定できなかったのでプロテアーゼにより切断したペプチドのシークエンスの解析作業を行っている。この作業が、来年度の重要な作業となる。ストレス蛋白質遺伝子の発現調節機構について平成7年度では、細胞内のグルタチオンレドックスを介するストレス蛋白質遺伝子転写因子(HSF1)の活性化についての研究を行い、細胞内グルタチオンはストレッサーを関知する細胞内センサーとして働くとともに、HSF1の活性化に関与することを明らかにした(J.Clin.Invest.,1996に発表)。さらに、胃粘膜に安全に、かつ有効にストレス蛋白質を誘導し、ストレス性胃粘膜傷害を予防するといったストレス蛋白質の臨床応用の可能性についても検討した。このため、いくつかの化合物について検討したが、非環状テルペン化合物であるgeranylgeranylacetone(GGA)に注目し、検討した。培養胃粘膜細胞を用いて、GGAはHSF1の活性化を引き起こし、HSP70 mRNAの発現と、ストレス誘導性のストレス蛋白質を誘導することを見いだした。このGGAによるストレス蛋白質の誘導作用については、in vivoでも確認した。ラットにGGAを胃内投与すると、HSP70mRNAの発現とHSP90,HSP70,HSP60の発現を引き起こし、さらに水浸拘束を負荷すると、これらのストレス蛋白質の誘導を増強しストレス潰瘍を抑制した。このように、本研究を通じて、初めて安全なストレス蛋白質誘導剤を初めて報告した(Gastroenterology,1996に発表)。平成7年と8年の研究を通じて、胃粘膜細胞に発現しているNF-κBのコンポーネントと酸化ストレスに関与するコンポーネントの同定を行った。モルモット胃底腺より調整した初代胃粘膜培養細胞を用いて、過酸化水素とジアミドにより活性化されるNF-κBのコンポーネントを、ゲルシフト法、UV-クロスリンク法、免疫沈降法、および免疫組織化学法により検討した。この結果、p50とp65のヘテロダイマーが酸化ストレスに反応するコンポーネントであることを明らかにした。さらに、NF-κBの活性化を介した遺伝子発現としてp105と誘導性NO合成酵素のmRNAの発現誘導を明らかにした(論文投稿中)。
球状骨髄間葉系幹細胞集塊から3D構築された立体組織移植による歯周組織再生療法開発

申請者らの研究室では、これまでに、間葉系幹細胞(MSCs)とMSCs自身が産生する細胞外基質(ECM)を用いて、間葉系幹細胞集塊(Clumps of MSCs/ECM complexes (C-MSCs))を樹立した。C-MSCsは、人工足場材料を用いずに移植可能で、骨再生を達成する。本研究ではC-MSCs培養技術を応用することで、効果的な歯周組織再生療法のための基盤技術を開発することを目的とした。その結果、C-MSCsは歯周組織再生能を有していること、複合化による任意の大型組織を作成できること、免疫制御能を向上させ異種移植拒絶を逃れること、凍結保存可能であることを見出した。本研究は骨髄間葉系幹細胞(MSCs)を利用して、ex vivoにて立体臓器を作成し移植する新規歯周組織再生療法の開発である。研究初年度の成果として、MSCs自身が産生する細胞外基質を利用して3次元細胞集塊Clumps of MSCs (C-MSC)を作成することに成功した。このC-MSCは細胞自身が産生したタイプIコラーゲンを主とするECMで形作られた細胞集塊であり、多分化能を保持しており、さらには足場材料を必要とせずに欠損部分に直接移植し細胞をとどまらせることが可能で、従来の人工担体を用いたMSCs移植方法と比較してより効果的に骨再生を示すことを確認した。またex vivoにて石灰化誘導を施すことが可能であり、石灰化誘導されたC-MSCの移植が、ラット頭蓋冠大規模骨欠損モデルに対して劇的な骨再生能を発揮することを見出し、論文発表に至った(Cytotherapy, Kittaka et al., 2015)。さらに、C-MSCは前述したようにコラーゲンを主としたECMで形作られているため、複数のC-MSCsを接触した状態で培養すると複数のそれらが接合し、さらに大きな細胞集塊を形成できることを見出した。現在はこの接合できることを利用し意図した複雑な形態を付与するために、3Dプリンターを用いて様々な培養皿を作成し、立体化させる研究を開始している。研究初年度に、予定通り人工足場材料不要の細胞移植方法としてC-MSCが作成でき、論文発表に至っているため。研究初年度に、MSCsと細胞自身が産生する細胞外基質(ECM)を利用することで間葉系幹細胞集塊Clumps of MSCs/ECM complex(C-MSC)を作成した。本年度はヒトC-MSCの免疫調節能を向上させる培養方法を樹立し、そのマウス頭蓋冠欠損モデルに対する異種移植が効果的な骨再生を示すことを明らかにした(Stem Cell Res Ther, Takeshita et al., 2017)。この結果は他家移植でも有用な可能性を示唆し、再生医療全般に貢献できる。また、C-MSCはI型コラーゲンを中心としたECMで形づくられているため、C-MSC同士が接触した状態で培養すると、24時間後には結合するという所見を得ている。このことは、培養皿に隙間なくC-MSCを設置して培養すると、培養皿の形態と一致する立体的な細胞塊を作成できることを示しており、実際に、円形などの単純な形態の賦与にすでに成功している(未発表データ)。実際の臨床で遭遇する歯周炎は、より複雑かつ大規模な歯周組織破壊を示す。そこで、この欠損形態に合致するような細胞塊を得るため、3Dプリンターを用いて、複数個のC-MSCを結合させ、任意の形態に賦形する培養方法の開発に着手している。研究初年度に樹立した間葉系幹細胞集塊C-MSCの組織再生効果を確認でき、論文発表に至っているため。今後、この組織再生能を有するC-MSCを複数個結合させ任意の形態を賦与する培養方法の樹立が、本研究遂行の要となる。研究初年度に、MSCsと細胞自身が産生する細胞外基質(ECM)を利用することで間葉系幹細胞集塊Clumps of MSCs/ECM complexes (C-MSCs)を作成し、その骨組織再生効果を示した。研究2年目にはビーグル犬を用いた大型動物実験を行い、C-MSCsが歯周組織再生効果を有していることを報告し、さらにC-MSCsの免疫制御能を向上させることで安全な他家移植に利用できる可能性を見出している。さらに、本年度は、C-MSCsが凍結保存後もその細胞性質を損なわず骨再生能を維持できることを見出し、論文発表を行っている(Stem Cell Res Ther, Motoike et al., 2018)。さらに、この凍結保存技術を特許出願し、企業との共同研究などを模索している。以上の成果から、C-MSCsは凍結保存による備蓄が可能で、他家移植も行えることから、実際の臨床応用に向けて着実に前進しているといえる。また、立体臓器作成の観点では、バイオ3Dプリンターを用いてC-MSCsを複数個、任意の形で接合させることで大型組織をex vivoで作成可能となっている。(未発表データ)現在、これらの成果に基づき、実際の臨床で遭遇するような複雑な形の歯周組織欠損に適合する細胞移植体の作成に着手し、良好な成果を得ている。

申請者らの研究室では、これまでに、間葉系幹細胞(MSCs)とMSCs自身が産生する細胞外基質(ECM)を用いて、間葉系幹細胞集塊(Clumps of MSCs/ECM complexes (C-MSCs))を樹立した。C-MSCsは、人工足場材料を用いずに移植可能で、骨再生を達成する。本研究ではC-MSCs培養技術を応用することで、効果的な歯周組織再生療法のための基盤技術を開発することを目的とした。その結果、C-MSCsは歯周組織再生能を有していること、複合化による任意の大型組織を作成できること、免疫制御能を向上させ異種移植拒絶を逃れること、凍結保存可能であることを見出した。今後は、3Dプリンターを利用して作成するさまざまな形態の培養皿を利用して、立体組織化C-MSCsを作成していく。予定より早くこの立体組織化が達成された場合は、すみやかにビーグル犬歯周組織欠損モデルに移植し、その再生効果を検討していく。前述したように、直径1mmほどの細胞集塊C-MSCは十分な組織再生能を有している。そこで、このC-MSCをを複数個結合させ任意の形態を賦与する培養方法の樹立をめざす。さらに、そのC-MSCを立体組織化させる方法を確立したのちに、ビーグル犬1壁性歯周組織欠損モデル(4mm x 4mm x 4mmの立法型の欠損)にたいし、欠損形態に合致する立体組織をC-MSCを用いて作成・移植し、その組織再生効果を検討していく29年度が最終年度であるため、記入しない。再生医療29年度が最終年度であるため、記入しない。
新規な多座配位子系の設計と合成―典型元素・遷移金属元素化学への展開―

本研究では立体的に堅固な配位子を新規に合成し、これを用いて、今まで実験的に構造を明らかにした例は存在しなかった超原子価5配位炭素化合物の合成と構造解析に成功した。さらに同周期の典型元素であるホウ素についても5配位化合物の合成と構造解析を行い、これらの化合物の構造の系統的な比較を行うことでいくつかの新しい知見を得ることができた。1.剛直なアントラセン骨格を持つ新規平面性3座配位子の合成:アントラセン骨格の1,8-位に非共有電子対(酸素・窒素・リン)を持ったヘテロ原子を配位原子として有する平面3座配位子をデザインし、完全新規ルートによりそれらの合成に成功した。2.超原子価5配位炭素化合物の合成とその構造:合成した1,8-位に酸素原子を有する3座配位子から、Pd触媒によるCO雰囲気下でのエステル化反応を行った。さらに、エステル体をMeerwein試剤と反応させることにより目的の対称的なカチオンの生成に成功した。カチオンは黄色の板状結晶として単離でき、単結晶X線構造解析によりその構造を明らかにすることができた。炭素周りは典型的なsp2混成でアントラセン上の2つのメトキシ基の酸素原子と合わせると、他の5配位典型元素化合物に見られるtrigonal bipyramidal構造をとっていることが明らかになった。中心炭素とapical方向の酸素原子との距離は2.43(1),2.45(1)Åであった。このC-O相互作用の程度を具体的に見積もるために計算化学によるアプローチも行った。これらの実験および計算結果によりこのカチオンは初めて構造決定された超原子価5配位炭素化合物であることが確認できた。3.超原子価5配位ホウ素化合物の合成と構造:同様の方法で、対応するホウ素化合物を合成し単結晶X線構造解析によりその構造を明らかにすることができた。ホウ素上にメトキシ基を有する化合物は前述の超原子価5配位炭素化合物のC-O距離と同様のB-O距離を有しているほぼ対称な5配位構造であった。フッ素置換化合物はB-O距離の明らかな短縮が観測でき、tightな5配位構造であることがわかり、結合から相互作用の連続性の一端を観測できた。本研究では、9-位に臭素原子(または、トリフルオロメタンスルホニルオキシ基)を有し、1,8-位に供与性配位原子(酸素、窒素、リン)を有する新規アントラセン骨格の合成に初めて成功し、OMe基を配位子とする5配位超原子価炭素化合物の合成に初めて成功した。X線解析の結果、それぞれのOMe基の酸素O1,O2のlone pairは中心炭素C19の空のp軌道に相互作用していると考えられ、C19周りのgeometryは少し歪んだ三方両錐(TBP)構造となっていることがわかった。

2つのC-O(C19-O1,C19-O2)の距離はほぼ同じ(2.43(1)Å,2.45(1)Å)であり、C-O共有結合距離(1.43Å)より長いがvan der Waals半径の和(3.25Å)よりは短いことから、中心炭素と2つの酸素原子間には、明らかに求引的相互作用が存在すると結論できた。また、この相互作用の存在は、東京都立大の永瀬先生による密度汎関数法(DFT)のAIM解析により確認した。さらに中心にホウ素を導入した5配位ホウ素化合物の合成にも成功した。1)超原子価第2周期典型元素化合物の構造における置換基効果これまでの研究で合成に成功した配位子1,8-ジメトキシ-9-ブロモアントラセンをn-BuLiと反応させて発生させた対応するリチオ体をそれぞれ種々のホウ素試剤と反応させて3種類のホウ素誘導体[B(OMe)2,BF2,BC12]を合成し、その構造を明らかにすることができた。B(OMe)2誘導体に関しては既に報告した超原子価5配位炭素のC-0距離[av.2.44(1)Å]と同様のB-O距離[av.2.44Å]を有しているほぼ対称な5配位構造であった。BF2誘導体はB(OMe)2誘導体と同様の対称な構造であったが、B-0距離[av.2.294Å]の明らかな短縮が観測でき、B(OMe)2誘導体に比べてtightな5配位構造であった。BC12誘導体はB(OMe)2誘導体、BF2誘導体とは大きく異なり、一つの酸素原子からのみ配位を受けた非対称な4配位ボラート構造であった。このようにホウ素に直接結合した置換基によりlooseな5配位、tightな5配位、4配位構造の間で変化が見られた。2)窒素、リン原子を有する新規平面性3座配位子の合成とその応用これまでにその剛直な骨格の有用性を示すことのできた酸素系配位子の配位原子を15族の窒素、リンに変換した配位子の合成に成功した。これらの配位子にcatecholateboryl基を導入したホウ素誘導体を合成したところいずれも非対称な4配位構造をとることが明らかになった。これらの誘導体の低温における1HNMRスペクトルはいずれも対称な構造を示し、合成した配位子が遷移状態の5配位構造を安定化していることを示していた。また、これらの配位子には遷移金属を導入することも可能であり、10族の遷移金属(Ni, Pd)等を導入した錯体を合成し、その構造を明らかにすることができた。いずれも平面4配位構造を有しており、中でもリン配位子を持つPd錯体はHeck反応の触媒として応用可能であった。
ヒト多能性幹細胞維持における細胞間コミュニケーションの役割と新規情報伝達機構解析

研究代表者は、ヒトES細胞のトランスクリプトーム解析を進める中で、神経ガイダンス因子SEMA6AがヒトES細胞で高発現していること、また多能性の喪失に伴い発現がドラスティックに低下することを見いだした。前年度に引き続き、ヒトES細胞におけるSEMA6Aの機能を明らかとするために、先行研究(Chen Y et al, Cell Stem Cell, 2015)のストラテジーに微調整を加えながら、SEMA6Aコンディショナルノックアウト(SEMA6A cKO)ヒトES細胞の樹立を試みた。前年度は、前述の論文に従って。ヒトSEMA6Aローカス中のエクソン2をflip標的配列で挟んだゲノム編集株を作成し、タモキシフェン誘導型Flipase(ERT2-FLP)によるエクソン2欠損誘導を試みたものの、報告されている様な高効率のKO誘導は認められなかった。そこで、Flipaseの組替え効率に難がある可能性を考え、Cre標的配列に置き換えるとともに、Creの活性制御をより精密に行うため、Creタンパク質を両末端からERT2で挟み込んだERT2-Cre-ERT2を採用した。それに伴い、薬剤耐性遺伝子カセットの除去にはFlipaseを用いることとし、以上の変更を加えたターゲッティングベクターを作り直した。ノックイン株の樹立、樹立株からの薬剤耐性遺伝子カセットの除去、およびAAVS1サイトへの人工ホルモン誘導型Cre(ERT2-Cre-ERT2)のノックインは、前年度と同様の2ステップストラテジーで実施し、SEMA6A cKO細胞株を5クローン樹立、それぞれのゲノム改変はPCR及びシークエンスにて確認した。現在は、タモキシフェン誘導体によるCreの活性化と、エキソン2の欠損誘導が上手く動くかどうかの動作確認を進めている。ターゲッティングベクターの再構築、Cre変異体の作成など、1からのやり直しとなる作業も多く、また2重のノックインクローンの作成には約6ヶ月を要するため、計画はほぼ一年遅れとなってしまっている。ただし、この過程で、KI効率を大幅に向上させる実験条件を見出しており、今後は細胞調整のスピードアップが期待できる状況に至ったことは予定外の成果といえる。調整を終えたcKO細胞株の動作確認を急ぎ、SEMA6Aの必要性の是非に答えを出す。また、新たにCRISPR interference法の導入を試みており、こちらも発現誘導系に置き換えたのち、KO法とは異なるアプローチでの内在性Semaphorinシグナルの必要性確認を進める。そこで、ヒトES細胞におけるSEMA6Aの機能を明らかとするために、先行研究(Chen Y et al, Cell Stem Cell, 2015)のストラテジーに従いSEMA6Aコンディショナルノックアウト(SEMA6A cKO)ヒトES細胞の樹立を試みた。まず、ヒトSEMA6Aローカス中のエクソン2をflip標的配列で挟んだ相同組換えターゲッティングベクターを作成した。またエクソン2前後のイントロン中に適切なgRNAペアを決定し、それぞれのgRNA発現ベクターを構築した。これらを、Cas9発現ベクターとともにヒトES細胞株KhES-1に導入し、薬剤選択の後、片アレルを欠損、もう片アレルが相同組替え起こした変異株(SEMA6A deltaE2/flip)3ラインをクローニングした。各ラインに対し、薬剤耐性遺伝子カッセットの除去、AAVS1サイトへの人工ホルモン誘導型FLIP(ERT2-FLIP)のノックインを行い、SEMA6A cKO細胞株を得た。それぞれのゲノム改変はPCR及びシークエンスにて確認した。これらを人工ホルモン4-OHTで処理し、エクソン2の欠損が誘導できるかどうかを確認したところ、いずれも先行研究にあるような高効率な遺伝子欠損誘導が認められなかった。現在、その原因を探っているところである。先行研究をもとに誘導型ノックアウトの系を構築してみたものの、原因は現在不明だが、論文通りに上手く機能しなかった。

現在は、タモキシフェン誘導体によるCreの活性化と、エキソン2の欠損誘導が上手く動くかどうかの動作確認を進めている。ターゲッティングベクターの再構築、Cre変異体の作成など、1からのやり直しとなる作業も多く、また2重のノックインクローンの作成には約6ヶ月を要するため、計画はほぼ一年遅れとなってしまっている。ただし、この過程で、KI効率を大幅に向上させる実験条件を見出しており、今後は細胞調整のスピードアップが期待できる状況に至ったことは予定外の成果といえる。リコンビナーゼ分子の変更等、先行研究ストラテジーの一部に考えられる改善を加えてつつ、再度細胞調製を試みる。調整を終えたcKO細胞株の動作確認を急ぎ、SEMA6Aの必要性の是非に答えを出す。また、新たにCRISPR interference法の導入を試みており、こちらも発現誘導系に置き換えたのち、KO法とは異なるアプローチでの内在性Semaphorinシグナルの必要性確認を進める。前年度は研究代表者の異動に伴う研究室引越作業と異動先のセットアップのため、一時期実験ができない期間が生じたため。前年度分の繰り越し分は、前年度の結果から生じた研究方法の改善に向けた実験マテリアルの新規購入などに充てる予定である。細胞調整に手間取ってしまったため、計画していた質量分析やオミックス解析に充てる費用が次年度繰越となったため。ノックアウト細胞の動作確認を終え次第、予定していたこれらの解析に進みたい。
会計不正を防ぐための企業統治の仕組みの解明

本研究では、上場企業の会計報告と企業統治の関係性についての実証研究を中心として、いくつかの研究を推進している。特に、昨年度の研究では、日本の企業統治の特徴の一つであるメインバンク制に着目した研究を行ってきた。企業の財務報告において、会計不正につながるような問題を少なくするためには、会計保守主義(Accounting Conservatism)の適用が重要とされている。しかしながら、上場企業において、会計保守主義が十分に機能せずに、財務報告上の問題が発生する場合もある。このような場合には、会計保守主義の代替的な企業統治メカニズムが重要になると考えられる。そのような観点から、本研究では、メインバンク制と会計保守主義の関係性について検証を行う実証研究を行った。これらの国際学会での報告の終了後に、国際学会で受けたコメント等を反映させ、2018年9月には、Discussion Paperとして発行すると同時に、学術誌に投稿を行い、現在、リバイスのコメントを受け修正中である。その他にも、前年度からの継続論文などについて、銀行業の企業統治に関する実証研究や親子上場の問題などに関する研究を公刊することができた。今後の研究の推進方策としては、現在、リバイス要求を受けている論文について、修正を行い、学術雑誌への公刊を目指すことが、第一となる。第二に、現在までの研究を報告する過程で、現状の研究に関連する追加的な研究の可能性があることが明らかになりつつある。追加研究では、多くの新たなデータ分析が必要になることから、それらのデータベースについて、購入・整備後に追加研究を進めることを計画している。本年度の研究活動では、企業の利益管理活動と日本の企業の利益管理についての実証分析を行ったことがメインの研究実績となると考えられる。第一に、学術雑誌に掲載された論文では、メインバンクによる株式所有自体が、上場企業経営者に対する規律付け機能を果たすのか否かといった点からの分析を行った。メインバンク自体の株式所有が減少する現状ではあるものの、日本の企業統治の特徴としては、メインバンクやメインバンク関係による資本調達を中心とした銀行型企業統治であるということは、現状でも変化していないことから、メインバンク関係がどのような影響を与えるのかといった点を明らかにする意義は大きいと考えられる。そのような観点から、実証研究を行っている。第二に、メインバンク関係が実際に企業経営者に及ぼす影響として、その金融知識を専門家として生かせるかどうかといった視点も重要である。したがって、そのような視点から行った実証研究について、国際学会等で報告を行うと同時に改善を行っている状況である。加えて、その他にも企業統治と関係する研究活動を行った。具体的には、日本企業の企業統治の特徴の一つである系列企業集団内に存在するParent Controlの問題が、企業統治として健全に機能しているのかどうかといった点についての実証研究を行った。同内容については、国際学会で論文報告を行うと同時に、学術雑誌に投稿・掲載許可を得ることができた状況である。本年度の研究計画では、第一に利益管理についての研究論文の内、一本を英文学術雑誌に出版することができた。また、もう一本の論文についても国際学会での研究報告を行うことで、今後の発展に期待できるコメントを得ることができた。第二に、企業統治に関する研究として、Parent Controlに関する論文を国際学会で報告するとともに、学術雑誌からアクセプトされた。又、その他の関連研究についても進んでいることから、おおむね順調に進捗していると判断される。本研究は、現在までに行っている途上の研究の延長を行っていくことを計画している。その際に、実証分析の性質上、データ分析方法自体あるいは得られた実証結果からどのようなインプリケーションを引き出すかといった点が非常に重要になる。したがって、そのような知見を得るために、国際会議等での報告を行い、他の研究者からのコメントを参考にして、論文内容を改善させていく。同時に、現実社会での動きが激しく、国際学会等でも多様な議論が行われていることから、そのような最新の議論を理解し、自身の論文に反映させることを目指す。
エストロゲンシグナルの検出モデル動物の開発と周生期脳インプリンティング機構の解明

環境化学物質の内分泌撹乱作用スクリーニングは、クリアランスや代謝的活性化機構、さらに臓器・細胞別の受容体活性化機構をも含めた、個体レベルでの毒性スクリーニング手法の確立が不可欠である。そこで、本研究では、エストロゲン結合サイト下流にレポーター遺伝子を結合し、ゲノムに導入することで、エストロゲンによる転写活性化を個体レベルで検出することができるトランスジェニック動物を作成し、環境化学物質に関して、これらの要素を含めた個体レベルでのレポーターアッセイを行う系を確立することを目的とした。今回、エストロゲン結合サイト-ルシフェラーゼ遺伝子を導入し、ジエチルスチルベストロールなど合成エストロゲンを投与し、そのシグナルの誘導について調べ、phenotypingを行った。エストロゲンによって転写活性が個体レベルで検出できる1 lineを得た。周生期におけるエストロゲンについて、in vivo、ex vivoによりシグナル検出を行った。また、シグナルの検出のために、ルシフェリン以外に、蛍光を用いたin vivoイメージングについても検討した。Qdot800やAlexa750を含む様々な波長を持つ蛍光色素をラット新生仔あるいはマウスに取り込ませ、個体in vivoにおけるイメージングを試みた。胎生仔・新生仔期では、精巣からテストステロンが一時的に分泌され、脳に到達し、CYP19(アロマターゼ)によってエストラジオールに変換され、脳の性分化を引き起こすさまざまな変化がmRNA、蛋白合成レベルで起こることが報告されている。そこで、Gene Chip(マイクロアレイ)を用いて周生期の脳において、テストステロンシャワーによって引き起こされるmRNAプロファイルの変動のスクリーニングや、それらが環境化学物質によってどのように変動するか、その影響を調べた。エストロゲンはCYP分子種の一つ、アロマターゼ(CYP19)によって生合成される。オスでは、精巣から分泌されたテストステロンが脳のアロマターゼでエストロゲンに変換され、脳がエストロゲンによってインプリンティングされ、性成熟後に性行動がオス化する。メスでは、この時期に体幹でエストロゲンがトラップされるため、エストロゲンは脳へは運ばれないことも分かっており、脳内アロマターゼは「エストロゲンの産生→インプリンティング→成熟後の正常な性行動・性ホルモン分泌」を決定付ける重要な酵素である。申請者は、昨年度までの研究において、この時期のimprintingへの影響をin vivoでスクリーニングする系を確立するため、1)トランスジェニック動物の作成、2)脳神経系におけるエストロゲン標的遺伝子のスクリーニングの影響、を計画し、以下の結果を得た。1)トランスジェニック動物の作成エストロゲンに特異的に感受性の高いERE単純繰り返し配列の連結クローンをERE-レポーター遺伝子カセットに組み込み、転写活性化について、培養細胞を用いてベクターの条件設定を行った。2)脳神経系におけるエストロゲン標的遺伝子のスクリーニングマイクロアレイ解析法を用いて、周生期にテストステロンに曝露したメスラットの脳において、発現レベルが変動する遺伝子群のスクリーニングを行った。テストステロンシャワーによるimprintingのモデルとして、本来ならばimprintingの起こらない生後4時間以内の新生メスラットにテストステロン0mg、0.1mg、1mgを皮下投与し、72時間後の視床下部を採取した。視床下部より抽出したmRNAは、アフィメトリックス社のgene chip(RN-U34、約1300遺伝子)を用いてスクリーニングした。また、得られた結果について、リアルタイムRT-PCR法でその変動を確認した。エストロゲンはP450(CYP)分子種の一つ、アロマターゼ(CYP19)によって生合成される。そこで、この時期のimprintingへの影響をin vivoでスクリーニングする系を確立するため、トランスジェニックラットを作製した。バックグラウンドの低下やin vivo可視化のために、最終的にBRE単純繰り返し配列の連結クローンにレポーター遺伝子を組み込んだカセットを作成した。レポーター遺伝子としてlacZとルシフェラーゼを組み込んだカセットを作製した。視床下部より初代培養細胞を得、前述のレポーターカセットをトランスフェクションして、バックグラウンドについて調べた。トランスジェニックラット作製のために、バックグラウンドの低いルシフェラーゼをレポーターとして選択した。ERE-ルシフェラーゼカセットを制限酵素で切断し、得られたDNAフラグメントを卵400個へ導入し、14匹のfounderラットを得た。14匹のfounderラットからF1を作製し、約300匹のラットについてgenotypingを行った。得られたトランスジェニックラットにDESを曝露し、レポーターシグナルの誘導について調べ、phenotypingを行った。