hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
核膜サブドメインを形成する分子基盤と形成機構の解析

真核生物が進化の過程で獲得した核膜は、遺伝子を封入して遺伝子機能を担う因子群を濃縮するだけでなく、高次クロマチン構築の足場として遺伝子機能を支える細胞内構造である。核膜とクロマチンの物理的・機能的繋がりを探るため、核膜に存在する最も顕著な構造体である核膜孔複合体に注目し、その挙動を調べた。その結果、核膜孔複合体の分布が細胞分裂終期に核膜が形成されるときに定まること、また、その分布がG1初期の細胞運命が決定される時期に崩れること、更に、核膜孔複合体の分布にlaminなどの核内膜因子が積極的に寄与することを明らかにしてきた。細胞機能に即して規則的に変化する核膜上のこの領域を核膜サブドメインと名付けた。膜貫通型の核膜孔複合体因子や異なるサブドメインに局在する核内膜因子の各々に、異なる蛍光タンパク質を付加して同時に2種タンパク質を安定に発現する細胞株を取得し、ライブ観察を行った。その結果、核膜形成初期に核内膜や核膜孔複合体などの因子群が染色体側部にまず集積し、その後、染色体上を局在化することでサブドメインが形成されることを確認した。この過程を生化学的に解析するため、取得した安定発現株の、分裂期のセミインタクト細胞を作成した。そのセミインタクト細胞に細胞抽出液とATPを添加すると、添加した因子に依存して、膜貫通型の核膜因子が染色体側部にターゲットし、更に、染色体上を局在化することがわかった。生細胞で見られる核膜形成初期反応を、in vitroで再構築できたことを示す結果である。蛍光チューブリンを加えると、この再構成では、紡錘体形成も再現され、核膜因子の局在化に関与することを示唆する結果を得ている。この系を利用することにより、核膜形成を担う可溶性因子や核膜因子の局在化機構、並びに、核膜因子を集積させる染色体側要素の、生化学的解析が可能になる。当初の研究目的を十分に達成したと考える。細胞分裂期抽出液から調整した膜画分をsucrose gradientで分画し、異なる核膜ドメインを形成するEmerinとLBRの特異抗体を用いて、それぞれが異なる膜小胞に乗っているか否かについて生化学的に検討した。その結果、EmerinとLBRが、重さの異なる膜小胞にのっていることが示された。これらの核膜前駆体と考えられる小胞が、分裂期染色体にターゲットして核膜が形成される過程の解析系を、以下の手順で構築しようとしている。まず、これらの小胞が、細胞膜を可溶化する界面活性剤ジギトニンで処理しても、分裂期細胞の中に保持されていることを確認した。そこで、ジギトニン処理で作製したセミインタクト分裂期細胞内に保持されている核膜前駆体小胞が、細胞抽出液やATP/GTPの存在に依存して、細胞分裂期進行過程のいつ、分裂期染色体上のどこにターゲットするのかを調べる計画をたてた。そのために、部位特異的組換え反応(Flp/FRT)と転写干渉を防ぐインシュレーターを組み込んで、複数のcDNAを効率よく同時に細胞内に導入して発現させるマルチ遺伝子発現システム(共同研究で開発)に、YFPとCFPを結合したEmerinとBRを導入して、2つの遺伝子を安定に発現する細胞株を取得した。今後、この細胞の、セミインタクト分裂期細胞を調整して、核膜前駆体小胞が分裂期染色体にターゲットして核膜が形成される過程を解析する予定である。同じく、セミインタクト分裂期細胞を利用した実験では、クロモキネシンKidが、importin betaと、低分子量GTPaseRanといった、2つの核一細胞質間輸送因子に依存してはじめて分裂期染色体にターゲットするという、全く思いがけない結果を得た。そのアナロジーが、核膜前駆体小胞の染色体へのターゲットにも適用できるかは、極め興味深い問題であると考えている。

蛍光チューブリンを加えると、この再構成では、紡錘体形成も再現され、核膜因子の局在化に関与することを示唆する結果を得ている。この系を利用することにより、核膜形成を担う可溶性因子や核膜因子の局在化機構、並びに、核膜因子を集積させる染色体側要素の、生化学的解析が可能になる。当初の研究目的を十分に達成したと考える。
室町幕府寺院政策の研究―寺院の人事と僧の動向を中心に―

本研究は、室町幕府の寺院政策を、寺院の人事や僧の動向から論じるものである。本年度は、以前から検討を進めていた寺社における祈祷の問題に加え、寺院に入室した足利将軍家子弟らの動向について検討した。本年度の研究成果は以下のとおりである。まず、以前より検討を進めていた「大徳寺十刹化の再検討ー至徳三年説をめぐってー」(『年報中世史研究』43号、2018年5月)、「室町期の臨時祈祷と公武関係ー足利義持・義教の政治的立場をめぐってー」(『日本歴史』847号、2018年12月)が公表された。また、研究報告として、1「室町前期における足利氏出身僧の立場と役割」(室町期研究会、2018年5月25日)、2「足利義満の祈祷に関する一考察ー研究史整理をかねてー」(東京大学中世史研究会、2019年2月13日)、3「戦国期における蔭凉職の展開ー足利義澄期以降の人事からー」(日本史研究会中世史部会、2019年3月19日)の口頭報告を行なった。このうち本研究の中核をなす1については、来年度ではあるが、改題のうえ、学術雑誌に掲載されることが決定している。これ以外の23の報告内容についても、論文化を進めている最中である。また、本年度は、博士論文「室町時代における政治秩序の形成と顕密・禅宗寺院の歴史的位置」を北海道大学に提出し、博士(文学)の学位を取得した。本研究課題に関わる論考を収めており、そのうち、4比丘尼御所の附弟選定や住持任免について論じたもの、5皇族や摂関家、あるいは足利将軍家子弟および猶子の門跡寺院入室の背景について論じたものについては、現在学術雑誌に投稿中である。本年度は、採用以前から取り組んでいた研究の成果が、『年報中世史研究』『日本歴史』に公表された。加えて、口頭報告を済ませた研究内容を論文化し、来年度ではあるものの学術雑誌に掲載されることが決まっている。いずれも査読付きの学術雑誌であり、特筆に値する成果であると考える。また、学会・研究会報告や論文投稿も順調に進められていること、予定より早く博士(文学)の学位を取得したことなどからも、おおむね順調に研究が進展したと考える。来年度は、学会報告を済ませた論考や、博士論文に収めた論文を、学術雑誌に投稿することに注力したい。また、来年度は、東京大学史料編纂所をはじめとする研究機関での史料調査を充実させ、未翻刻史料から得られる重要記事を拾い上げることで、新たな歴史像の構築を目指したい。本年度は、どちらかといえば顕密寺院関連の検討を中心に進めたが、来年度は禅宗寺院や禅僧の動向にも注目して研究を進める。さらに、本年度の研究では、寺院と各家がいかに密接な関係にあるかを再確認した。こうした視点をもちつつ、室町幕府の寺院政策を論じることを心掛けたい。

また、来年度は、東京大学史料編纂所をはじめとする研究機関での史料調査を充実させ、未翻刻史料から得られる重要記事を拾い上げることで、新たな歴史像の構築を目指したい。本年度は、どちらかといえば顕密寺院関連の検討を中心に進めたが、来年度は禅宗寺院や禅僧の動向にも注目して研究を進める。さらに、本年度の研究では、寺院と各家がいかに密接な関係にあるかを再確認した。こうした視点をもちつつ、室町幕府の寺院政策を論じることを心掛けたい。
建築物の構造解析と避難解析との双方向評価によるキーエレメントデザイン

最終年度においては、「構造シミュレータ」と「避難シミュレータ」の双方向検証に基づく人的被害軽減のための定量的評価のために、本研究で取組んできた非構造材の「損傷シミュレータ」を組込んだ統合シミュレーションを実施するための可視化ツールとしてAVS/Expressに追加機能を作成した。「損傷評価オブザーバ」機能と「損傷制御オペレータ」機能の妥当性について、統合シミュレーションの結果に基づき検証を行うとともに、本研究計画の総括を実施した。構造シミュレータの解析結果に基づきこれとリンクさせた「損傷シミュレータ」からの損傷度評価のアウトプットを初期条件として、「避難シミュレータ」による避難障害検証を連続して行う統合シミュレーションを実施した。その結果にもとづき、「損傷制御オペレータ」機能によるキーエレメントの特定に関するオペレーションを実施した。統合シミュレーション結果として得られた非構造材の必要仕様デザインについて、解析結果をユーザに示す可視化の方法、ならびに構造設計的な視点から、結果を工学的に説明するための検証を行った。なお、本解析結果について、コストの視点からの評価も併せて行い、実際の設計を想定した場合に、本研究で開発した解析解が妥当な結果を与えるかどうかについては今後の課題である。本研究で開発した損傷シミュレータは、今後、災害時の火災や煙などによる2次災害を防ぐために、安全な避難経路をリアルタイムで評価し、万一の場合には代替経路を滞在者に提示するような、オンラインでのサバイバル型避難誘導システムの実装開発を検討していく際にも、有効に応用できるものと考えている。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。非構造部材を類型化し、類型化した非構造部材の詳細モデルを作成するとともに、非構造部材が建物架構に設置される箇所を介して、非構造材に建物の地震応答を伝達するための外乱入力エレメントのモデル化を行う。今年度は非線形有限要素解析を用いて、ある特定の仕様の耐震天井の部材要素実験、天井ユニット実験結果を詳細な解析モデルにより再現することを試みた。想定建物の平立面形状に基づき、滞在者の利用形態に応じた地震発生時の避難シミュレータを作成した。避難シミュレーションでは、地震の発生時刻や建物内での様々なイベントを想定した滞在者の心理と行動パターンの差異により様々な状況想定が課題となる。こうした種々の条件設定でのシミュレーション結果のそれぞれについて、避難経路障害が生じた際に避難行動のロバスト性を著しく低くするような場合を検出し、影響度の高い障害発生を生じる箇所を特定できるような解析システムを構築する必要がある。今年度は、本研究は、大地震発生時の建築物の避難安全性を検証するため、非構造材等の損傷に起因する複数の経路障害を考慮したマルチエージェントシステムによる避難解析を行う手法を提案出来た。本研究課題で統合シミュレーションを実施する想定建物について、大規模詳細モデルによる「構造シミュレータ」を構築し、スーパーコンピュータにより「丸ごと」応答解析を行うための準備として、地震時の建築構造物の挙動をビデオで撮影された様子からデータ抽出する手法を開発した。初年度は、人的災害の定量的予測のための3つの評価レイヤーを構成する、1建物の構造シミュレータ、2非構造材の損傷シミュレータ、3避難シミュレータ、について、それぞれ解析精度の向上のために、テストモデル解析と実験・実測結果等との整合性について検証が進められているため。構造シミュレータ、損傷シミュレータ、避難シミュレータの相互リンクのためには、それぞれの解析結果を工学的な視点から検定できる可視化システムが不可欠である。特に非構造材の損傷状況は対象とする要素特性(壁、天井、窓、扉等)の相違に応じて、避難経路閉塞、人的被害など、想定される損傷による加害状況がそれぞれ異なる。従って、構造解析により得られた情報からから損傷度が適正に評価されているかを検定するための可視化システムの実装を行う。2年目においては、(A)構造シミュレータにより建物各部の応答を厳密に算定し、そこから非構造材の損傷度を可視化・評価する「損傷評価オブザーバ」機能の装備、ならびに(B)避難シミュレータにより、著しい避難障害の原因となる損傷個所を特定し、非構造材の重要度から、非構造材のキーエレメントデザインを行う「損傷制御オペレータ」機能の装備に取組んだ。「構造シミュレータ」と「避難シミュレータ」から新たに開発する「損傷シミュレータ」にリンクする2つの機能の開発に取組んだ。前年度に作成した「損傷シミュレータ」における非構造材の詳細モデルにより、種々の非構造材の部分モデルが設置される建物の部分応答を「構造シミュレータ」よりインポートして、建物各部での非構造材の損傷度分布を解析し、損傷状況とその影響度の可視化処理を経て、「損傷評価オブザーバ」の機能の構築・検証を行った。前年度に作成した「避難シミュレータ」による、建物の利用形態(主として地震発生時間と滞在者の活動状況)の想定により、各部分の非構造部材の重要度指標を算定するシステム開発を行っている。人的被害を低減するために、重要度指標の高い非構造部材を抽出してキーエレメント化すべき箇所として特定する「損傷制御オペレータ」を構築し、非構造材のキーエレメントデザインを提案するため、統合化可視化のための重ね合わせを開始した。2年目は、人的被害の定量的予測のための3つの評価レイヤーを構成する、1建物の構造シミュレータ、2非構造材の損傷シミュレータ、3避難シミュレータについて、それぞれの解析結果を統合可視化するための重ね合わせを開始し出せているため。

「損傷評価オブザーバ」機能と「損傷制御オペレータ」機能の妥当性について、統合シミュレーションの結果に基づき検証を行うとともに、本研究計画の総括を実施した。構造シミュレータの解析結果に基づきこれとリンクさせた「損傷シミュレータ」からの損傷度評価のアウトプットを初期条件として、「避難シミュレータ」による避難障害検証を連続して行う統合シミュレーションを実施した。その結果にもとづき、「損傷制御オペレータ」機能によるキーエレメントの特定に関するオペレーションを実施した。統合シミュレーション結果として得られた非構造材の必要仕様デザインについて、解析結果をユーザに示す可視化の方法、ならびに構造設計的な視点から、結果を工学的に説明するための検証を行った。なお、本解析結果について、コストの視点からの評価も併せて行い、実際の設計を想定した場合に、本研究で開発した解析解が妥当な結果を与えるかどうかについては今後の課題である。本研究で開発した損傷シミュレータは、今後、災害時の火災や煙などによる2次災害を防ぐために、安全な避難経路をリアルタイムで評価し、万一の場合には代替経路を滞在者に提示するような、オンラインでのサバイバル型避難誘導システムの実装開発を検討していく際にも、有効に応用できるものと考えている。今後は、(A)構造シミュレータにより建物各部の応答を厳密に算定し、そこから非構造材の損傷度を可視化・評価する「損傷評価オブザーバ」機能の装備、ならびに(B)避難シミュレータにより、著しい避難障害の原因となる損傷個所を特定し、非構造材の重要度から、非構造材のキーエレメントデザインを行う「損傷制御オペレータ」機能の装備に取組む。「構造シミュレータ」と「避難シミュレータ」から新たに開発する「損傷シミュレータ」にリンクする2つの機能の開発に取組む。1損傷評価オブザーバの構築種々の非構造材の部分モデルが設置される建物の部分応答を「構造シミュレータ」よりインポートして、建物各部での非構造材の損傷度分布を解析し、損傷状況とその影響度の可視化処理を経て、「損傷評価オブザーバ」の機能の構築・検証を行う。2損傷制御オペレータの構築各部分の非構造部材の重要度指標を算定するシステム開発を行う。人的被害を低減するために、重要度指標の高い非構造部材を抽出してキーエレメント化すべき箇所として特定する「損傷制御オペレータ」を構築し、非構造材のキーエレメントデザインを提案する。今後は、「構造シミュレータ」と「避難シミュレータ」の双方向検証に基づく人的被害軽減のための定量的評価のために、本研究で取組んできた非構造材の「損傷シミュレータ」を組込んだ統合シミュレーションを実施する。「損傷評価オブザーバ」機能と「損傷制御オペレータ」機能の妥当性について、統合シミュレーションの結果に基づき検証を行うとともに、本研究計画の総括を行う。
特発性心筋症ハムスター病態生理と細胞障害の解明

細胞外マトリックス蛋白は細胞構築に重要であり,又最近は細胞内の情報伝達においても重要な働きを担っているとされている。しかし,種々の病態において,この細胞外マトリックス成分がどのように変化しその病態の維持に対応しているのか不明である。本研究は心筋症発症ハムスターであるBio14,6およびBio53,58を用いて,その心筋障害の発症過程において心筋線維化に重要な物質であるコラーゲン,フィブロネクチンなどの分子生物学的検討を行なった。同時に免疫組識学的手法を用いて形態的変化についても併せて検討した。その結果,(1)心一体重比はBio14,6が対照であるFIBに比し生后5週齢より有意に増加を示した。しかし,Bio53,58は生后週齢を除きFIBのそれを有意な差を認めなかっため。(2)心筋コラーゲン含有量は両心筋症モデル共に生后20週齢より増加を示した。この増加は週齢の増加に正比例した。(3)コラーゲン蛋白の遺伝子および蛋白発現について検討した。I型コラーゲンは心筋症の進展に対し変化を示さなかったのに比し,III型コラーゲンは両モデル共に20週齢より増加を示した。しかし,不全期である生后40週齢ではBio53,58の方がBio14,6に比べてその発現量は強かった。また,この変化は蛋白の発現においても同様の結果を示した。(4)フィブロネクチンおよびラミニンのこの蛋白発現は心筋症の両モデル共に差を認めなかった。(5)アンギオテンシン転換酵素阻害剤であるエナラプリル(10mg/kg)を生后10週齢より20週齢迄経口投与した場合,Bio14,6はコラーゲン含有量遺伝子発現共にFIBのそれらと差を認めなかった。しかしBio53,58は薬剤の投与に対して有効性を認めることができなかった。心筋症の進展にはコラーゲンタイプIIIの異常代謝にはコラーゲンタイプIIIの異常代謝による線維化が強く示唆され,この防御に対してエナラプリルの投与がBio14,6には有効であった。このことからモデル動物の障害機構が異なると推察される。心筋症の発生において細胞外マトリックス(ECM)がどのように変化し、又、心筋症の形成に関与しているのか充分に解明されていない。本研究では、ECMは細胞内情報伝、系に重要な役割を担っているとされていることから、心筋症発症ハムスタ-のECMについて組織学的かつ分子生物学的手法を用いて検討した。心筋症ハムスタ-としてBioー14.6およびBio53.58の5週齢および30週齢を用いた。対照としてF_1Bを用い比較した。免疫組織学的検討ではコラ-ゲンタイプ(I),(III)およびフィブロネクチン(FN)の各々のポリクロ-ナル抗体を用いた。組織学的にはHEおよびMasson染色法で検討した。又、各々モデル動物の心臓よりRNAを抽出しコラ-ゲンFNに対するcDNAを用いてノ-ザンブロトVmRNAの発現を検討した。その結果、Bio系の両モデル共に蔽在性に炎症細胞の浸潤と心筋壊死並びに石灰化巣を認めたが,両者の差は認めなかった。

免疫組織学的にはBio14.6,53.58の両モデルにコラ-ゲンTypeIIIの沈着を認めた。一方コラ-ゲンTypeIは血管周囲に強く認めたがF_1Bとの差はなかった。mRNAの発現は5週齢では変化なかったが、20週齢ではコラ-ゲンα_2(I)とα_1(III)の発現を両心筋モデルに認めた。以上の結果より、心筋症ハムスタ-の細胞外マトリックスはコラ-ゲおよびフイブロネクチンに変らかな変化を認めることが出来た。今后、蛋白レベルの増加とその防御効果に対する影響を検討する計画である。細胞外マトリックス蛋白は細胞構築に重要であり、又最近は細胞内の情報伝達においても重要な働きを担っているとされている。しかし、種々の病態において、この細胞外マトリックス成分がどのように変化しその病態の維持に対応しているのか不明である。本研究は心筋症発症ハムスターであるBio14.6およびBio53.58を用いて、その心筋障害の発症過程において心筋線維化に重要な物質であるコラーゲン,フィブロネクチンなどの分子生物学的検討を行なった。同時に免疫組織学的手法を用いて形態的変化についても併せて検討した。その結果、(1)心一体重比はBio14.6が対照であるFIBに比し生后5週齢より有意に増加を示した。しかし、Bio53.58は生后5週齢を除きFIBのそれと有意な差を認めなかった。(2)心筋コラーゲン含有量は両心筋症モデル共に生后20週齢より増加を示した。この増加は週齢の増加に正比例した。(3)コラーゲン蛋白の遺伝子および蛋白発現について検討した。I型コラーゲンは心筋症の進展に対し変化を示さなかったのに比し、III型コラーゲンは両モデル共に20週齢より増加を示した。しかし、不全期である生后40週齢ではBio53.58の方がBio14.6に比べその発現量は強かった。また、この変化は蛋白の発現においても同様の結果を示した。(4)フイブロネクチンおよびラミニンの蛋白発現は心筋症の両モデル共に差を認めなかった。(5)アンギオテンシン転換酵素阻害剤であるエナラプリル(10mg/Kg)を生后10週間齢より20週齢迄経口投与した場合、Bio14.6はコラーゲン含有量遺伝子発現共にFIBのそれらと差を認めなかった。しかしBio53.58は薬剤の投与に対して有効性を認めることができなかった。心筋症の進展にはコラーゲンタイプIIIの異常代謝による線維化が強く示唆され、この防御に対してエナラプリルの投与がBio14.6には有効であった。このことからモデル動物の障害機構が異なると推察される。
マグネシウムとヒト血管内皮細胞刺激応答の変化について-遺伝子発現との関連-

以上の測定系におよぼす、thrombin、bradykinin、cyclic AMP、インターロイキン(IL)1αなどの種々の刺激物質の影響、High Density Lipoprotein(HDL)等の脂質の影響、およびangiotensin converting enzyme阻害剤(captopril,enarapril)などの降圧剤の影響について検討した。その結果thrombin、bradykinin、IL1α刺激によりPLA_2およびPGHS1のmRNA発現は亢進するが、亢進する時間はそれぞれの刺激物質によって異なることが判明した。HDL刺激によりPLA_2のmRNA発現は亢進するが、およびPGHS1のmRNA発現は抑制される。cyclic AMP、およびcaptopril,enaraprilなどのangiotensin converting enzyme阻害剤はPLA_2のmRNA発現は亢進するが、PGHS1のmRNA発現は抑制されることが示されたが、この機序にはCa^<++>あるいは細胞内pHの関与を介さずに生じると考えられた。
β-ヘアピンペプチドとSurvivin結合分子を融合した内用放射線治療薬剤の開発

本研究では、ほぼすべてのがんに適応し、がん組織へ高選択的に効果を示すsurvivinを標的とした内用放射線治療薬剤の開発を目指した。そこで、がん細胞標的ペプチドのカチオン性ベータ-ヘアピンペプチド(CHPs)を担体としたsurvivin標的ペプチドの開発を試みた。研究期間内に、全く新しいメカニズムにてsurvivinに結合するペプチド分子の開発に成功し、既存の低分子化合物よりも強い抗腫瘍活性を有するr9-INC-7cを見出した。また、がん細胞への選択性の高いSVS-1誘導体の開発を行った。今後は、SVS-1誘導体とsurvivin結合分子を融合させた内用放射線治療薬へと展開していく。本研究では、ほぼすべてのがんに適応可能で、がん組織に特異的かつ強力に殺傷効果を示す内用放射線療法の実現を目指し、最もがん特異的な蛋白の一つであるSurvivinを標的とした放射性薬剤の開発を目指した。また、Survivinは細胞内蛋白であるため、膜を透過する必要があることから、Survivin結合分子に膜透過性ペプチドを融合した分子の開発も併せて行った。今年度の研究より、Survivin蛋白を標的とした7-19残基のペプチド分子を数十種類合成した。また、QCMを用いた評価により、それらの合成ペプチドはSurvivin蛋白に結合親和性を示し、Kd= 91-255 nMであった。また、最も高い親和性を有するペプチド分子をFITCにて標識して、各種細胞株を用いた結合評価を行ったところ、Survivinの発現に相関した集積を示した。従って、今回開発を行った新規ペプチド分子がSurvivin結合分子として機能しうることが示された。膜透過性ペプチドとして、既存のSVS-1をFITC標識した誘導体(FITC- Ahx-KVKVKVKVpPTKV-KVKVK-NH2)およびFITC-3KV (FITC-Ahx-VKVKVpPTKVKVK- NH2)を開発し、KB細胞を用いた取り込み評価と蛍光染色評価を行ったところ、どちらも良好な取り込みを示したが、FITC-SVS-1の方がより取り込み効率が高かった。また、共焦点レーザー顕微鏡にて結合部位を特定したところ、細胞膜内部への滞留が確認された。以上の結果より、SVS-1がSurvivin結合分子に導入する膜透過性ペプチドとして機能しうることが示唆された。新たな結合機序に基づくSurvivinに高親和性を示す新規ペプチド分子を見出した。また、膜透過性ペプチドユニットの構築に関する基礎検討も順調に行うことができた。本研究では、がん組織を選択的に攻撃できる内用放射線治療薬剤として機能しうる、最もがん選択的な蛋白の一つであるsurvivin (サバイビン)を標的とした放射性薬剤の開発を目的とした。前年度までに新たな結合メカニズムにてsurvivinに結合性を示すペプチド誘導体の開発に成功した。本年度は、さらに高親和性、高い代謝安定性を有するペプチド誘導体の開発を試みた。その結果、特殊アミノ酸を導入した7-22残基の新規ペプチド誘導体がsurvivinに強い親和性を有することを見出した。さらに、高親和性を有するペプチド誘導体に関して、MDA-MB-231細胞を用いた抗腫瘍効果をMTTアッセイにて評価したところ、1.0 μMで10-15%、10 μMで30-40%の強い増殖抑制効果が認められ、既存のsurvivin蛋白を標的とした低分子化合物(S12)よりも高い抗腫瘍活性を有することが示された。また、survivinが細胞内蛋白であるため、survivin標的分子のがん細胞内への透過を狙った膜透過性ペプチドを結合させた新規ペプチド誘導体を開発したところ、survivinに対して母体ペプチドと同程度の親和性を有することが見出された。現在、種々のペプチド誘導体のメカニズムを含めた抗腫瘍活性の評価を行っているところである。Survivin蛋白に高親和性を有する非天然アミノ酸を含んだペプチド分子の開発を達成した。また、得られた高親和性ペプチド誘導体が既存の低分子化合物に比べて高い抗腫瘍活性を有することを見出した。前年度開発したsurvivin高親和性ペプチド(r9-INC7)の抗腫瘍活性を行い、既存の低分子survivin結合分子のS12よりも高い抗がん活性を有することをMTTアッセイにて確認した。また、r9-INC7はsurvivinの退縮も伴うことが明らかになり、抗腫瘍活性は、survivinの機能阻害が関与していることが示唆された。続いて、これまでに開発したsurvivin標的ペプチドのさらなる改良を行い、環状ペプチドや特殊アミノ酸を含む様々なアミノ酸にて置換したペプチド誘導体を開発し、いくつかのペプチド分子はsurvivinへの高親和性を示し、今後の内用放射線治療薬剤への展開が期待される。また、がん細胞に殺傷性を示すことが報告されているSVS-1の67Ga標識誘導体である67Ga-NOTA-SVS-1を合成し、種々の細胞への取り込み評価を行ったところ、正常線維芽細胞である3T3-L1細胞と比較してがん細胞であるKB細胞とHeLa細胞への有意に高い細胞内取り込みを示し、高いがん細胞選択的な集積が認められた。従って、SVS-1はsurvivin標的分子などに導入することで、がん選択性の高い内用放射線治療薬剤やイメージング剤として展開できることが示唆された。

さらに、SVS-1よりもさらに腫瘍への集積性や選択性の高いペプチド分子の探索を行い、いくつかのSVS-1のリシン残基をアルギニンを変換させたペプチド分子は、SVS-1と同程度あるいはそれよりも高い腫瘍への集積性を示した。今後はさらなる検討を行い、survivin標的分子に導入することで、内用放射線治療薬剤への展開を目指す。本研究では、ほぼすべてのがんに適応し、がん組織へ高選択的に効果を示すsurvivinを標的とした内用放射線治療薬剤の開発を目指した。そこで、がん細胞標的ペプチドのカチオン性ベータ-ヘアピンペプチド(CHPs)を担体としたsurvivin標的ペプチドの開発を試みた。研究期間内に、全く新しいメカニズムにてsurvivinに結合するペプチド分子の開発に成功し、既存の低分子化合物よりも強い抗腫瘍活性を有するr9-INC-7cを見出した。また、がん細胞への選択性の高いSVS-1誘導体の開発を行った。今後は、SVS-1誘導体とsurvivin結合分子を融合させた内用放射線治療薬へと展開していく。今後はさらにSurvivinへの結合性を向上させた種々のペプチド誘導体の合成とSurvivin蛋白への結合親和性評価を行っていく。さらに、上記検討で見出した高親和性ペプチドの種々の構造変換による、親和性、代謝安定性や膜透過性を向上させたペプチドミメティクスへと誘導化、続いて膜透過ペプチドおよび蛍光分子(基礎検討用)あるいは放射性核種を導入した内用療法薬剤の開発を行っていく。続いて、Survivin発現レベルの異なる種々の細胞株における蛍光標識したペプチドミメティクスの集積部位とSurvivin蛋白の発現部位との比較検討や放射性ペプチドミメティクスの細胞株へのアポトーシス誘導作用やDNA損傷作用の評価およびSurvivin発現レベルとの相関性に関する評価を進めていく予定である。有望なリガンドが得られれば、担癌マウスを用いた代謝安定性を含めた生体内分布評価およびPET/SPECT/CT装置によるin vivoイメージング(123/125/131Iあるいは68Ga標識リガンド)を行った後、担癌マウスへの作用メカニズムを含めたがん退縮効果や正常組織への毒性に関する検討(125/131Iあるいは90Y標識リガンド)を行っていく予定である。さらにsurvivinへの高親和性を有し、優れた抗腫瘍活性を有する新規ペプチド誘導体の開発を引き続き行っていく。また、得られたsurvivin標的ペプチド誘導体に90Yや131Iなどの放射性核種を導入し、がん選択的な内用放射線治療薬剤へと展開していく。放射線科学購入試薬の価格変動により、残高が発生した。消耗品の価格変動や研究の進行状況により、残高が発生した。次年度の消耗品購入に使用を予定している。
中国の伝奇小説と日本の物語文学に関する比較文化的研究

日本の物語文学が、同時代の中国の伝奇小説とどのような関わりをもって成立したかを考察し、東アジアという大きな視野の中にその成立を位置づけることが本研究の目的であったが、考察の結果、『遊仙窟』という作品が平安時代の日本文化全般に大きな影響を与え、また同時に中国中唐期の伝奇小説にも大きな影響を及ぼしていることが明らかになった。『遊仙窟』を中心にしたひとつの大きな文化圏の存在が確認できたと考えている。『伊勢物語』のような歌物語の出現とその後の展開が、中国の伝奇小説とどのような関わりを持っていたかについて、具体的・かつ総合的に考察することが、本年度の目的だが、まずは平成19年8月2223目にカナダのブリティッシュ・コロンビア大学で行われた「国際伊勢物語ワークショップ」において「『かいまみ』の背景-仙女譚から『伊勢物語』へ-」と題した口頭発表を行った。同発表では、歌物語の先蹴ともされる『万葉集』巻十六の題詞をまず取り上げ、その内容と『伊勢物語』の間に大きな違いがあることを確認して、その相違が、中国の仙女課やその流れを受ける伝奇小説の影響によって生まれたと考えられることを述べた。その内容は平成20年度中に刊行される予定である。さらに9月に、永井和子編の論集『源氏物語へ源氏物語から中古文学研究24の証言』に論文「中国の色好み-韓寿説話と伊勢物語」を発表した。同論文では、塀を乗り越えて女性の所に通うという、『伊勢物語』第五段ときわめて類似した趣向を持つ、中国の美男子韓寿にまつわる説話をはじめて紹介し、その相手役の女性がきわめて積極的に振る舞っていることに注目して、その点においても『伊勢物語』と類似していることを述べた。12月には、国立台湾大学の招待によって台湾に行き、本研究のテーマにもかかわる数度の講演を行うとともに、陳明姿教授をはじめとする台湾の研究者とも交流して、今後の協力体制の基礎を構築することができた。また、平成20年2月1325目には、アイルランド・ダブリンのチェスター・ビーティー図書館を訪ね、『竹取物語』や『伊勢物語』などの日本の絵入り本、および中国の絵入り本の調査を行い、絵入り本も含めた今後の研究のための基礎的知見を得た。平安時代の日本に『伊勢物語』のような歌物語が出現し、それが『源氏物語』などに発展していったことが、ほぼ同時代の中国の伝奇小説とどのような関わりを持っていたかについて、前年度に引き続き具体的かつ総合的に考察することが、本年度の研究のひとつの目的だったが、それに関連して、平成20年9月3日に台湾大学で行われた「和漢比較文学会台湾特別研究発表会」において「『伊勢物語』初冠考」と題する口頭発表を行った。同発表では、従来日本古来の成人儀礼と結びつけて考えられてきた『伊勢物語』初段の主人公の「初冠」すなわち元服について、それが奈良時代から平安時代初頭にかけて次第に普及した中国伝来の、むしろ新しい儀礼であることを指摘し、さらに、元服直後の主人公が登場する伝奇小説『歩飛烟』が『伊勢物語』初段の成立に大きな影響を与えた可能性があることを述べた。その内容は、再考を経たうえで、平成21年度中に文章化して発表したいと考えている。『遊仙窟』が平安時代文学に与えた影響については、『王朝文学と東アジアの宮廷文学』『伊勢物語虚構の成立』の2冊の論集に、それぞれの論点から具体的な考察を発表することができた。また、物語・伝奇の絵画を含めた享受の有様を比較することも課題のひとつだったが、平成20年8月30日に慶應義塾大学中之島キャンパスで行われた「奈良絵本・絵巻国際会議大阪大会」で「伊勢物語の絵巻・絵本と絵入り版本」と題する講演を行った。これは、『伊勢物語』の中世の絵巻・絵本から江戸時代の絵入り版本への図柄の連続性を確認して、今後の『伊勢物語』享受史研究の方向性を示したものであり、日中比較研究を展開するための基礎研究のひとつでもある。『伊勢物語』『源氏物語』などの日本の物語文学が、同時代の中国の伝奇小説とどのような関わりをもって成立したかを考察し、東アジアという大きな視野の中に物語文学の成立を位置づけることが本研究の目的であったが、最終年度である今年度は、前年度までの考察をさらに進めるとともに、3年間の研究をひとまずまとめることに主眼をおいて、雑誌掲載や単行本分担執筆の形で5編の論文を発表し、また学会発表や講演を6回行うなど、さまざまな活動をおこなった。中でも、9月に行われた和漢比較文学会の第28回大会で行われたシンポジウム「唐代伝奇と平安朝物語」において、3人のパネラーの一人として「『遊仙窟』文化圏構想は可能か-「かいまみ」と「女歌」-」と題して行った基調講演は、本研究3年間の成果をまとめて提示したものであり、そのうえにたって学界に大きな問題提起をなしえたと考えている。当日は、その問題提起に対して多くの意見が示され、有意義な議論を行うことができた。

なお、基調講演を含むシンポジウムの内容は、『和漢比較文学研究』44号に掲載されている。また、9月にはベルギーのルーバンカトリック大学で「日本の物語文学と「かいまみ」」と題して講演し、年度末の3月には、フィラデルフィアで行われたAASの大会に、伊勢物語の注釈史をテーマにしたパネルチームの一人として参加した。また、同じ3月末には、ニューヨークのコロンビア大学でハルオ・シラネ教授の招請によって、「伊勢物語の享受と絵画-第24段の場合-」と題する講演を行った。この講演は、物語文学の成立と伝来を絵画をも含めた視点から考えるという、本研究のもう一つのテーマに沿った研究成果を発表したものであり、当日は米国の日本文学・日本美術の研究者から多くの質問や意見が寄せられ、有意義な研究交流の場とすることができた。
生体過酸化脂質の生成と制御に関する食品科学的研究

生体の脂質は酸化されると過酸化脂質(脂質ヒドロペルオキシド)を生じる。これが細胞や臓器機能の低下、動脈硬化、認知症の要因になることを、化学発光分析、質量分析、培養細胞試験、動物実験、ヒト血液分析で証明した。食品からの、ビタミンE、ポリフェノール、カロテノイドの摂取は、これらの脂質過酸化を抑制し、老化性の疾病予防に有効なことを明らかにした。過酸化脂質は食品油脂の酸化劣化として古くから研究されてきていたが、申請者は、生体内とくに生体膜脂質の過酸化が細胞老化や生活習慣病あるいは老化性疾患に関与すると考え、食品領域の研究を生体系に発展させる研究を進めてきている。本研究は、(1)生体に生じる過酸化脂質(脂質ヒドロペルオキシド)の精密構造解析と一斉網羅的定量(2)過酸化脂質分析法(CL-HPLC法とLC-MS/MS法)の改良と抗体作成(ELISA法)による汎用化(3)細胞障害と疾病(動脈硬化症、糖尿病、癌、認知症)に関わる過酸化脂質の関与分子機構の解明(4)食品による生体内の過酸化脂質の生成抑制と疾病予防について、これらの基盤的な理解を得ることを目的に研究を推進する。過酸化脂質は食品油脂の酸化劣化として従来研究されていたが、ヒトの体内とくに生体膜脂質の過酸化が細胞老化、生活習慣病、老化性疾患に深く関与すると考え研究を展開してきた。本研究では、過酸化脂質の生成と疾病の関係を化学的定量的に究明することの重要性に着骨し、生体過酸化脂質の精密一斉網羅的構造解析、過酸化脂質分析法の改良と高選択な抗体作成による汎用化、細胞障害・疾病に関わる過酸化脂質の分子機構の解明、食品による過酸化脂質の生成制御と疾病予防、これらに関する下記6課題の解明を目的とした。(1)ビニルエーテル化合物による高純度で安定な過酸化脂質標準品の調製技術の改善と統一標準品の内外研究者への供給では、種々の脂質クラスのヒドロペルオキシド標準品の調製技術を開発した。(2) LC-MS/MSによる生体試料(ヒト血漿、赤血球、等)の全過酸化脂質の一斉網羅的構造解析による.分子種レベルでの構造全貌の解明と過酸化脂質データベースの充実では、LC-MS/MS法の解析条件の一層の最適化を行っている。(3)臨床応用できる簡便で選択性の高いヒドロペルオキシド型過酸化脂質の免疫定量法の開発では、抗血清を得た。(4)高脂血症、糖尿病、認知症における過酸化脂質の生理活性と関与分子機構の解明では、疾病モデル動物で過酸化脂質の生理活性と分子機構を評価している。(5)高血糖下で発見されたアマドリ型糖化脂質の簡便な免疫定量法の開発と応用では、高選択性の抗体の選定を進めている。(6)食品成分による過酸化脂質の生成と蓄積の制御による疾病予防の可能性の評価では、抗酸化物質トコトリエノールの抗血管新生阻害機能の解明と、食品キサントフィルの赤血球脂質過酸化抑制を介した認知症の進展の緩和作用を見出した。このように本研究は、計画通り順調に推移している。その成果は、過酸化脂質の化学生物学的特性の理解につながり、食品の新しい機能発見や疾病予防に役立つので、社会的意義と波及性が大きいといえる。本研究では、過酸化脂質の生成と疾病の関係を化学的定量的に究明することの重要性に着目し、生体過酸化脂質の精密一斉網羅的構造解析、過酸化脂質分析法の改良と高選択な抗体作成による汎用化、細胞障害・疾病に関わる過酸化脂質の分子機構の解明、食品による過酸化脂質の生成制御と疾病予防、これらに関する下記6課題の解明を目的とした。(1)ビニルエーテル化合物による高純度で安定な過酸化脂質標準品の調製技術の改善と統一標準品の内外研究者への供給では、合成した種々の脂質クラスのヒドロペルオキシド標準品について、長期保存が可能な条件を検討し確立した。(2)LC-MS/MSによる生体試料(ヒト血漿、赤血球、等)の全過酸化脂質の一斉網羅的構造解析による分子種レベルでの構造全貌の解明と過酸化脂質データベースの充実では、LC-MS/MS法を活用して、動脈硬化、糖尿病、認知症における生体内酸化ストレスを最も鋭敏に反映できる過酸化脂質の脂質クラスと分子種の特定を進めている。(3)臨床応用できる簡便で選択性の高いヒドロペルオキシド型過酸化脂質の免疫定量法の開発では、高選択性な抗体の取得を目指した。(5)高血糖下で発見されたアマドリ型糖化脂質の簡便な免疫定量法の開発と応用では、高選択性の抗体の選定を進めた。

(6)食品成分による過酸化脂質の生成と蓄積の制御による疾病予防の可能性の評価では、トコトリエノールの抗血管新生阻害機能、食品キサントフィルの赤血球脂質過酸化抑制を介した認知症進展緩和、これらについてのメカニズム解析を重点的に進めた。このように本研究は、概ね順調に推移している。その成果は、過酸化脂質の化学生物学的特性の理解につながり、食品の新しい機能発見や疾病予防に役立つので、社会的意義と波及性が大きいといえる。生体に生じる過酸化脂質の精密構造解析、高純度標品の合成、過酸化脂質分析法の抗体作製による汎用化、細胞障害・疾病の発生への過酸化脂質の分子機構の解明、食品成分による過酸化脂質の生成制御と疾病予防、こうした「生体過酸化脂質と疾病の全貌解明」を目的に、下記の研究を進めた。(1)ビニルエーテル化合物による高純度で安定な過酸化脂質標準品の調製技術の改善と統一標準品の内外研究者への供給では、種々の脂質クラスのヒドロペルオキシド標準品の調製技術を開発し、今年度は、このヒドロペルオキシド標準品を原料とした還元物(脂質ヒドロキシド)の高純度標品の調製技術をほぼ確立した。(2)LC-MS/MSによる生体試料の全過酸化脂質の一斉網羅的構造解析による分子種レベルでの構造全貌の解明と過酸化脂質データベースの充実では、全過酸化脂質の網羅的解析条件を確定し、動脈硬化、糖尿病、認知症における酸化ストレスを最も鋭敏に反映できる過酸化脂質は生体膜リン脂質由来の過酸化脂質(過酸化リン脂質)であることを確認した。現在、過酸化リン脂質の分子種別にデータベース化を進めている。(3)臨床応用できる簡便で選択性の高いヒドロペルオキシド型過酸化脂質の免疫定量法の開発では、抗血清を得たものの、昨年度同様、高選択性な抗体は得られなかった。抗体作製は運次第の面もあるため、来年度も挑戦し、簡便かつ選択性の高い免疫定量法の開発を目指す。(4)抗過酸化脂質抗体による細胞内過酸化脂質の可視化イメージング技術の開発は、(3)で抗体ができ次第取り組む。(5)高脂血症、糖尿病、認知症における過酸化脂質の生理活性と関与分子機構の解明では、疾病モデル動物を用いて過酸化脂質の蓄積を確認し、この脂質過酸化に関わりが深い遺伝子を幾つか明らかにした。(6)高血糖下で発見されたアマドリ型糖化脂質の簡便な免疫定量法の開発と応用では、免疫定量法の開発を進めるとともに、脂質グリケーションを抑えるピリドキサールリン酸を見出し、その作用を動物実験で確定した。(7)食品成分による過酸化脂質の生成と蓄積の制御による疾病予防の可能性の評価では、共役トリエン型脂肪酸の脂質過酸化誘発を介する抗血管新生作用は、血管内皮細胞のシグナル伝達に深く関わることを確証した。このように、ほとんどの課題で研究は順調に進んだといえる。「生体過酸化脂質と疾病の全貌解明」を目的に、下記の研究を進めた。(1)高純度脂質ヒドロペルオキシドを合成し、これを出発物質(原料)にして、還元物(脂質ヒドロキシド)やアルデヒドなどの分解物(酸化二次生成物)の高純度標品調製技術を確立した。(2)CL-HPLC法とLC-MS/MS法での生体試料(ヒト血漿、赤血球、等)の過酸化脂質の一斉分子種定量法を確立し、過酸化脂質データベースを構築中である。抗体作製については、運次第の面もあるため、引き続き挑戦し、ELISA法による簡便かつ選択性の高い過酸化脂質の免疫定量法の開発を目指す。(4)抗過酸化脂質抗体による細胞内過酸化脂質の可視化
活性化B細胞に発現する新しいZnフィンガー蛋白の免疫系における機能解析

平成10年度から11年度にかけて、引き続きCD40Lによって特異的に誘導される新規遺伝子の検索を行った。その結果、CD40Lによって誘導される6種類の新規遺伝子Clast-6(CD40ligand-activated specific transcripts)を単離した。これらの遺伝子の各免疫担当細胞における発現様式は様々であるが、B細胞分化並びに活性化の過程、さらにはアポトーシスの過程において、これらの遺伝子の発現が増強あるいは低下している事が判明した。すなわち、Clast遺伝子群とリンパ球の分化、活性化が強い相関を示すことが推察される。とりわけ、解析が進行しているClast1遺伝子に関して、以下のことが判明した。(1)塩基配列から推定すると、263個のアミノ酸からなり、4つの膜貫通ドメインをもと膜型蛋白である。(2)その発現は、成熟B細胞に限定され、未熟B細胞、T細胞および繊維芽細胞等ではその発現は検出されない。(3)高親和性IgEレセプターβ鎖(FcεRβ)とアミノ酸レベルで約37%の相同性を有し、しかもN末端の細胞質ドメインに活性化シグナルを抑制するITIM(immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif)モチーフが存在する。(4)CD40L刺激によるClast1遺伝子の発現様式を検討したところ、正常脾B細胞では、その発現はCD40L刺激で誘導され、さらにこの発現誘導が抗IgM抗体処理によって抑制される。(5)未熟B細胞株WEHI231にClast1を強制発現させた形質転換株では、抗IgM抗体によるアポトーシスが著しく生じやすくなっている。したがって、Clast1はCD40と抗原受容体からのシグナル伝達に関与し、B細胞のアポに深く関与する分子と推察された。(6)RT-PCR法を用いて、Clast1遺伝子の発現を検討したところ、B220陽性PNA陽性の胚中心B細胞においてその発現が低下することが判明した。(7)Clast1の細胞外ドメインに対するペプチド抗体を作製した。(8)Clast1cDNAを免疫グロブリン遺伝子のポロモーターとエンハンサー(Eμ)をもつ発現ベクター(PBSVE6BK)に導入し、これを用いてトランスジェニックマウスを作製した。現在までに6系統のFounderマウスが得られたところである。平成10年度は、zincfingerモチーフをもつ新規転写因子のクローニングとその基本的性質について解析してきた。その結果、新規核蛋白は587アミノ酸のopen reading frameをもち、C末にはDNA結合ドメインと思われる15個のzincfingerと、N末には酸性アミノ酸を多く含んだ転写活性化ドメインに特徴的な構造をもっていることが判明した。Bリンホーマ株WEHI279細胞でこの遺伝子産物を強制発現させると、Fas依存性アポトーシスに対する感受性が著しく上昇することを見い出した。さらに、CD40Lによって特異的に誘導される新規遺伝子の検索を行った結果、263のアミノ酸からなる4つの膜貫通ドメインをもつ膜型蛋白のクローニングに成功した。相同性検索の結果、同じく4つの膜貫通ドメインをもつ高親和性IgEレセプターβ-鎖(FcεRβ-)並びにPan B細胞抗原であるCD20にアミノ酸レベルで約37%の相同性が認められた。

興味深いことに、N末端の細胞質ドメインに活性化シグナルを抑制するITIM(Immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif)モチーフが存在することが判明した。このことから、新規膜型蛋白は、CD40からのシグナルを負に調節する機能をもつのではないかと推測された。これらの新規蛋白はT-B相互作用をはじめとするダイナミックな免疫応答のrcgulationに関与し、免疫系の基幹に関わる分子と推察される。現在、この2つの新規遺伝子の免疫系とくにB細胞の活性化とアポトーシスにおける機能について、in vitroとin vivoの両方から、解析を進めているところである。平成11年度は、引き続きCD40Lによって特異的に誘導される新規遺伝子の検索を行った。その結果、CD40Lによって誘導される6種類の新規遺伝子Clast1-6(CD40ligand-activated specific transcripts)を単離した。これらの遺伝子の各免疫担当細胞における発現様式は様々であるが、B細胞分化並びに活性化の過程、さらにはアポトーシスの過程において、これらの遺伝子の発現が増強あるいは低下していることが判明した。すなわち、Clast遺伝子群とリンパ球の分化、活性化が強い相関を示すことが推察される。とりわけ、解析が進行しているClast1遺伝子は、263のアミノ酸からなる4つの膜貫通ドメインをもつ膜型蛋白で、同じく4つの膜貫通ドメインをもつ高親和性IgEレセプターb鎖(FceRb)並びにPan B細胞抗原であるCD20にアミノ酸レベルで約37%の相同性が認められた。このことから、Clast1は、CD40からのシグナルを負に調節する機能をもつのではないかと推測された。Clast1-6遺伝子の機能を解析するために、まずB細胞株にこれらの遺伝子を、レトロウイルスベクターを用いて強制発現させた安定形質転換株を作製し、B細胞の活性化とアポトーシスにおける役割を検討している。また、生体におけるこれらの遺伝子の機能を解析する手段として、まずB遺伝子でClast1を発現させたトランスジェニックマウスを作製し、現在までに6系統のFounderマウスが得られたところである。
人工核酸修飾オリゴヌクレオチドによる3本鎖DNA形成を基盤とした核酸医薬への検討

化学修飾したオリゴヌクレオチドは、特定の遺伝子の発現過程に直接作用して制御することができ、「核酸医薬」として臨床応用に向けた研究がなされている。多様な機能を有するRNAは、遺伝子発現制御には画期的な標的であるが、RNA調節機構の複雑さから、今後はRNA制御の根幹となるDNAを標的とした創薬開発の重要性が再認識されると考えられる。申請者はこれまでに、2本鎖DNA標的に配列特異的に3本鎖DNAを形成可能な独自の人工核酸を創製し展開してきた。本研究では、「3本鎖DNA形成による遺伝子発現制御法を基盤とした核酸医薬」の構築を目的とし、3本鎖DNA形成オリゴヌクレオチドの細胞内での安定性や利用率を高めるための化学修飾を施した機能性補助核酸の創製と人工核酸技術と融合させ、核酸医薬の基盤構築を目指した。本年度までの研究により、合成が終了してた化合物の機能評価を行うことにより天然型の核酸では認識することができないTA塩基対を認識可能な人工核酸を見いだす事に成功した。さらに、CG塩基対認識人工核酸の構造の最適化を行い、これまでの人工核酸の機能をしのぐ優れた人工核酸の創製に成功した。また、申請者が立案したブースター核酸(オリゴ核酸を効率的に細胞内に導入し、さらに特異的な酵素と相互作用することにより機能性オリゴ核酸を細胞質内あるいは核内に放出することが可能な修飾核酸)を実際の細胞に導入することにより、本研究の目的の一つであるアンチジーン核酸の効率的な核内輸送に成功した。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。今年度は、TA塩基対のTのカルボニル基と一カ所の水素結合により人工核酸を固定し、追加の水素結合サイトを導入する事で安定性の向上を行い、TA認識分子を分子設計した。合成は、ヨードウラシルのクロロ化、糖部との縮合反応、位置選択的なアミノ化反応により水素結合ユニット(アミノピリミジン)の導入を行い目的物を得ることに成功した。この水素結合ユニットを種々変更することで、様々な誘導体合成が可能である。アンモニア-メタノールを用いたアミノ基の導入し、塩基部分のアミノ基の保護と、糖部分の水酸基をホスホロアミダイト化することによりDNA自動合成装置に導入可能な誘導体へ変換しオリゴヌクレオチドに組み込んだ。3本鎖形成能の評価により、配列に依存するがTA塩基対の選択的な認識に成功した。初年度はTA塩基対認識分子を新たに見いだし、その機能の確認に成功した。分子設計や合成に成功し期待以上の結果が得られている。一方で、計画しているブースター核酸の基礎検討で興味深い結果を得ている状況でとどまっているため、全体としてはおおむね順調に進呈している。本年度までの研究により、天然型では認識できないCG塩基対に加えてT塩基対を認識可能な人工核酸の基本骨格を見いだす事に成功した。。具体的には、TA塩基対のTのカルボニル基と一カ所の水素結合により人工核酸を固定し、追加の水素結合サイトを導入する事で安定性の向上を行い、TA認識分子を創製すること目的とした化合物により、TA認識人工核酸の基本骨格の構築に成功した。また、申請者が立案したブースター核酸(オリゴ核酸を効率的に細胞内に導入し、さらに特異的な酵素と相互作用することにより機能性オリゴ核酸を細胞質内あるいは核内に放出することが可能な修飾核酸)を用いた試験管内でのこれまでの検討により、予想通りに上手く機能することを見いだした。本研究は、計画通りに進んでいるので、進捗状況としては、おおむね順調に進展している。

化学修飾したオリゴヌクレオチドは、特定の遺伝子の発現過程に直接作用して制御することができ、「核酸医薬」として臨床応用に向けた研究がなされている。多様な機能を有するRNAは、遺伝子発現制御には画期的な標的であるが、RNA調節機構の複雑さから、今後はRNA制御の根幹となるDNAを標的とした創薬開発の重要性が再認識されると考えられる。申請者はこれまでに、2本鎖DNA標的に配列特異的に3本鎖DNAを形成可能な独自の人工核酸を創製し展開してきた。本研究では、「3本鎖DNA形成による遺伝子発現制御法を基盤とした核酸医薬」の構築を目的とし、3本鎖DNA形成オリゴヌクレオチドの細胞内での安定性や利用率を高めるための化学修飾を施した機能性補助核酸の創製と人工核酸技術と融合させ、核酸医薬の基盤構築を目指した。本年度までの研究により、合成が終了してた化合物の機能評価を行うことにより天然型の核酸では認識することができないTA塩基対を認識可能な人工核酸を見いだす事に成功した。さらに、CG塩基対認識人工核酸の構造の最適化を行い、これまでの人工核酸の機能をしのぐ優れた人工核酸の創製に成功した。また、申請者が立案したブースター核酸(オリゴ核酸を効率的に細胞内に導入し、さらに特異的な酵素と相互作用することにより機能性オリゴ核酸を細胞質内あるいは核内に放出することが可能な修飾核酸)を実際の細胞に導入することにより、本研究の目的の一つであるアンチジーン核酸の効率的な核内輸送に成功した。順調に進んでいる計画と進んでいない計画がある。そのため、今後は進んでいない方の計画で報告ができる結果が得られるように研究を進めていく予定である。今後は、新規に見出したTA塩基対認識人工核酸の構造の最適化を行い、配列依存性を克服した新規人工核酸の創製を行う計画をしている。また、蛍光標識など機能を付加したブースター核酸を化学合成して用いることにより、細胞内での分布さらには機能性オリゴ核酸の性能の検証を同時に行ってブースター核酸の概念の確立を行う計画をしている。これらを明らかにすることにより、本研究の目的を達成する予定である。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。