hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
最新技術による分子・個体レベルの統合的ヒスタミン研究と神経変性疾患への応用

本研究は十分に明らかにされていない中枢におけるヒスタミン系の役割を、最新技術による分子・細胞・動物個体レベルの研究を統合して研究した。明らかにした研究内容は以下の通り:1)H3受容体のシグナル伝達におけるC末の役割、2)膵β細胞におけるH3受容体、3)非特異的トランスポーターPMAT (plasma membrane monoamine transporter)によるヒスタミン取り込み機構、4)ヒスタミンH1H3受容体遺伝子ノックアウトマウスを用いた痛み受容、ストレス脆弱性、睡眠除去におけるヒスタミン受容体の役割、5)臨床用PETと小動物用PET/CTを用いたヒスタミンH1受容体アンタゴニストの脳内動態。本研究は十分に明らかにされていない中枢におけるヒスタミン系の役割を、最新技術による分子・細胞・動物個体レベルの研究を統合する薬理学で研究し、その成果を探索的臨床研究に結びつけることを最終目標としている。分子薬理学的研究:アルツハイマー病治療薬の標的分子として期待されているH3受容体について分子薬理学的研究を行った。ヒトH3受容体のC末を除去した変異H3受容体は、リガンド結合特性や総受容体および細胞表面のH3受容体には変化がなかったが、作動薬によるcAMP反応や[^<35>S]GTPγS結合が消失した。H3受容体のC末はH3受容体のシグナル伝達に重要であることが明らかになった。個体レベルの研究:痛みと拘束ストレスにおけるヒスタミン受容体の役割を明らかにするためにヒスタミンH1およびH3受容体遺伝子ノックアウトマウス(H1KOとH3KO)を用いて行動薬理学研究を行った。モルヒネ鎮痛効果はH3KOマウスで増強しており、野生型マウスにおいてモルヒネとチオペラミド(H3アンタゴニスト)を同時に脊髄腔内に投与した場合にもモルヒネ鎮痛効果が増強していた。また拘束ストレスにおいてH1KOはオープンフィールドでの行動で拘束ストレスの強い影響を受けるが、H3KOやH1KOとH3KOのダブルノックアウトマウス(DKO)は拘束ストレスの強い影響を受けない。ヒスタミンはストレス抵抗性に関与する因子であり、拘束ストレスによりH3受容体が強くダウンレギュレーションすることがwestern blotで明確になった。分子イメージング研究:アルツハイマー病におけるヒスタミン系の関与を明らかにするために、レビー小体型認知症(DLB)におけるH1受容体とアセチルコリンエステラーゼの測定を開始し、さらに鎮静性抗ヒスタミン薬でありアルツハイマー病の認知機能を改善すると報告されているdimeboneを炭素11で標識することを試みている。本研究は十分に明らかにされていない新しいヒスタミン系の役割を、最新技術による分子・細胞・動物個体レベルの研究を統合する薬理学で研究し、その成果を探索的ヒト臨床研究に結びつけることを最終目標としている。分子薬理学的研究:ヒスタミンの再取り込み機構についてヒトアストロサイトーマ由来細胞を用いて研究し、OCT(Organic cation transporter)以外にPMAT(plasma membrane monoamine transporter)が関与することを初めて明らかにした。さらに膵臓ランゲルハンス島β細胞由来MIN-6細胞にヒスタミンH3受容体が存在して機能することを証明して、H3受容体を介するインスリン遊離メカニズムを明らかにした。小動物の個体レベルの研究:トレッドミルを用いる新しい睡眠除去ラットモデルを作成して、睡眠除去がヒスタミン神経系とオレキシン神経系を同様に睡眠除去により活性化して、不安関連行動を増加させることを明らかにした。さらに小動物用PET/CTを用いてラット・マウス・モルモットを用いた薬理学的分子イメージング研究方法を確立した。ヒトを対象にした分子イメージング研究:前日の夜に鎮静性抗ヒスタミン薬を服用した場合に、12時間後の翌日までヒスタミンH1受容体を50%近く占拠することにより翌目残存効果(hangover)が起きることを証明した。さらに鎮静性抗ヒスタミン薬ケトチフェン含有点眼薬による鎮静作用の発生予測のために脳内H1受容体占拠率測定を行い、点眼により鎮静性抗ヒスタミン薬は脳内に移行することが明らかになった。セロトニントランスポーターやノルアドレナリントランスポーターはその神経系の恒常性維持に極めて重要な働きをしていることから、様々な薬剤がこれらを標的として開発されてきた。一方、シナプス間隙に放出された神経ヒスタミンの輸送メカニズムについては特異的トランスポーターが報告されていないために、ヒスタミン神経系の全容を解明する上で大きな課題となっていた。本研究では非特異的トランスポーターを含めてヒスタミンの輸送メカニズムを分子薬理学的に研究した。すなわちヒスタミンの再取り込み機構について初代培養ヒトアストロサイト細胞と腫瘍細胞ラインであるヒトアストロサイトーマ由来細胞を用いて研究し、PMAT(plasma membrane monoamine transporter)が関与することを詳細に明らかにした。

さらに膵臓ランゲルハンス島β細胞由来MIN-6細胞とマウスからにヒスタミンH3受容体が存在して機能することを証明して、H3受容体を介するインスリン遊離メカニズムを明らかにした。トレッドミルを用いる新しい睡眠除去ラットモデルを作成して、睡眠除去がヒスタミン神経系とオレキシン神経系を同様に睡眠除去により活性化して、不安関連行動を増加させることを明らかにした。さらに小動物用PET/CTを用いた薬理学的分子イメージング研究方法を確立した。今まで前臨床試験として行われていなかった抗ヒスタミン薬の受容体占拠率測定を[^<11>C]ドキセピンを用いて行った。レボセチリジン(1mg/kg,PO)がモルモットの脳内のH1Rにほとんど影響を及ぼさなかったのに対して、第一世代抗ヒスタミン薬であるジフェンヒドラミン(20mg/kg,PO)は多くの受容体を占拠していた。脳内移行性に関する小動物PET/CTを用いた分子イメージングは前臨床試験として有用な方法である。
生体内一粒子DDSイメージングと新生血管透過性制御による乳癌薬物治療の最適化

虚血部位における新生血管観察のため、VEGF(血管内皮細胞増殖因子)と量子ドット(aQDs)によるVEGF-aQDsとマウス虚血モデルを作成した。in vivo1粒子蛍光イメージングにてVEGF-aQDsはaQDsと比較して新生血管壁に対し約3. 3倍の結合を確認した。またVEGF-aQDsは新生血管壁に対して通常血管壁の約2. 4倍の結合が認められた。新生血管壁におけるVEGF-R分布を解析した。先行研究では蛍光ナノ粒子を1粒子レベルで生体内を観察する技術を利用し、新生血管に特異的なDDSを実現するにあたりenhanced permeability and retention (EPR)効果を利用しうる粒子の大きさを一分子レベルで検討し位置と粒径によって動態が大きく異なることが分かった(Kawai M, Breast Cancer Res, 2009)。血管新生因子の動態観察のため、ビオチン化VEGF(Vascular Endothelial Growth Factor,血管内皮細胞増殖因子)とストレプトアビジン結合量子ドット(avidin conjugated Quantum dots:aQDs)を結合させたVEGF-aQDs複合体の作製並びにVEGFR(VEGF Receptor,血管内皮細胞増殖因子受容体)発現マウス血管内皮細胞MS1-VEGFに対する結合作用の検討を行い、新生血管のイメージングを可能にするプローブを作成した。今回は虚血型モデルの確立としてマウス肢虚血モデルを外科的に作成し、レーザードップラー還流イメージング装置を用いて血流を確認した。正常肢の血流を基準とした虚血肢の相対的血流量は、手術直後には0.08±0.01と有意に減少し(p<0.05)、21日目までに0.34±0.11まで回復した。腓腹筋の組織血管密度は、正常肢では観察日間で有意差を認めなかった。虚血肢では7日目、14日目、21日目、28日目で、それぞれ血管密度が有意に上昇していた。現在は虚血肢に対して血管透過性調節を行い、VEGF-aQDs複合体を投与してin vivoでのイメージングを行っている。プローブ分布の定量化を行い、更に一分子の挙動を詳細に観察し定量化する予定である。in vivo1粒子蛍光イメージングでは、VEGF-aQDs-8はaQDsと比較して、虚血肢の血管壁に対して約3.3倍の結合が認められ、正常肢においては1.8倍の粒子の結合が認められた。また、aQDsは、正常肢と虚血肢に対する結合数に有意差がなかったが、VEGF-aQDsは、虚血肢に対して、正常肢の約2.4倍の有意な結合が認められた。さらに、血管の配行の違いによるVEGF-aQDsの分布はVEGF-aQDs-8は直線部に比べ、分岐部に対して約2.9倍の個数の蛍光粒子が有意に結合していたが正常肢における結合には有意差がなかった。分岐部の血管においては新生された血管の一部を観察している可能性がある。当研究では、独自に作成したVEGF量子ドット複合体を虚血モデルマウスに投与し、生体内のangiogenesisを誘導した虚血組織において、VEGF-Rの分布を定量的に解析することに成功した。
希土類元素を含むワイドギャップ半導体の階層構造制御

希土類元素は蛍光体の発光中心として不可欠である。プラズマディスプレーなどの新しい表示デバイスでは、励起波長が従来よりも短波長である147nmの真空紫外光であり、新たな高輝度蛍光体が求められている。本研究では可視部に吸収のないワイドバンドギャップ半導体に注目して、希土類元素をドープもしくは主成分の一つとして含有する新化合物の創製を目的とした。酸窒化アルミニウム(AION)、AINやBaMgAl_<10>O_<17>などのAl化合物は耐熱性や広いバンドギャップを有し、高輝度の蛍光体ホストとして期待される。Eu添加率Eu/(Al+Eu)が0,0.5,1.0,3.0,7.7,10mol%となるよう硝酸アルミニウム及び硝酸ユーロピウムを蒸留水に溶解し、クエン酸またはグリシンを加えて加熱熟成した。これを大気中350°C、1時間仮焼して得た前駆体を、さらにアンモニア気流中750°C及び1000°Cで10時間窒化した。アンモニア窒化した生成物を粉砕混合した後、高周波誘導加熱装置を用い、窒素気流中1500°Cで5分間アニールして結晶化した最終生成物を得た。クエン酸をゲル化剤とした場合、750°Cでアンモニア窒化した生成物はアモルファス、1000°Cではわずかにγ-Al_2O_3が結晶化した。これらを窒素気流中1500°Cでアニールすると黒色のAlONが生成し、AINとα-Al_2O_3が混在した。クエン酸の代わりにグリシンをアルミニウムに対して1.2mol倍量加え、1000°Cでアンモニア窒化した後、アニールすると、白色で粒径が1μm程度のAlON単一相Al_<22.03>□_<1.97>O_<29.91>N_<2.09>が生成した。ガリウム及びインジウムよりもイオン性が強いため、酸素含有率が多いスピネル型構造をとると考えられた。次に、ユーロピウムイオンを共存してゲル化窒化合成すると、添加率0.5mol%でA1ONと共にマグネトプランバイト(MP)型のEuAl_<12>O_<19>と思われる相が生成した。添加量が増すとMP相が増え、逆にAIONは減少して添加率7.7mol%で完全に見られなくなった。添加率3.0mol%までで生成したMP相ではc幅員が0.025nm伸長しており、窒案配位による影響が考えられた。生成物の発光スペクトルは添加率によって変化し、複数の発光が見られた。475及び520nmの員波長側の発光は、生成物中に導入された窒素によりEu周りの共有結合性が増大した効果と考えられた。本研究では可視部に吸収のないワイドバンドギャップ半導体に注目して、希土類元素をドープもしくは主成分の一つとして含有する新化合物の創製を目的としている。本年度は、窒化ガリウムをワイドバンドギャップ半導体として選択した。硝酸ユーロピウム、硝酸ガリウム、クエン酸を水溶液中で混合して得たゲルを仮焼した前駆体を、アンモニア気流中で窒化した。生成する酸窒化ガリウムはガリウム欠損をもち、ユーロピウムを2モル%程度しか置換固溶できなかった。それ以上の添加量では、ユーロピウムオキシシアナミドが生成した。その発光波長は窒化ガリウムの波長とは異なっていた。そこでランタンおよびガドリニウムについても、同様な合成法を用いてユーロピウムをドープしたオキシシアナミドを合成した。3%程度のドープ量で濃度消光を示した。またランタンオキシシアナミドの方が、ガドリニウムオキシシアナミドよりも結晶性が良いことを反映して、発光強度が高かった。

これらを窒素気流中1500°Cでアニールすると黒色のAlONが生成し、AINとα-Al_2O_3が混在した。クエン酸の代わりにグリシンをアルミニウムに対して1.2mol倍量加え、1000°Cでアンモニア窒化した後、アニールすると、白色で粒径が1μm程度のAlON単一相Al_<22.03>□_<1.97>O_<29.91>N_<2.09>が生成した。ガリウム及びインジウムよりもイオン性が強いため、酸素含有率が多いスピネル型構造をとると考えられた。次に、ユーロピウムイオンを共存してゲル化窒化合成すると、添加率0.5mol%でA1ONと共にマグネトプランバイト(MP)型のEuAl_<12>O_<19>と思われる相が生成した。添加量が増すとMP相が増え、逆にAIONは減少して添加率7.7mol%で完全に見られなくなった。添加率3.0mol%までで生成したMP相ではc幅員が0.025nm伸長しており、窒案配位による影響が考えられた。生成物の発光スペクトルは添加率によって変化し、複数の発光が見られた。475及び520nmの員波長側の発光は、生成物中に導入された窒素によりEu周りの共有結合性が増大した効果と考えられた。
iPSを用いた難病Moyamoya病に対する慢性炎症の関与に関する基礎研究

本年度の進捗は以下のとおりである1モヤモヤ病小児患者からの血液サンプル取得:モヤモヤ病小児患者35名から同意の元、血液サンプルを取得している。サンプルの白血球と血漿を分離後保存し北大病院Biobankにて保管している。これらを以降の実験に使用している。2ピロリ抗体、CagA抗体の検討:ELISA法(ピロリ:Eプレート“栄検"H.ピロリ抗体II、CagA:Human helicobactoer pyloricytotoxin-associated gene A protein IgGキット)で上記35名の感染既往を評価した。3遺伝子型の確認:上記35名および追加の2名においてRNF213の遺伝子多型を確認するためにDNA抽出、サンガー法によるGenotypingを行った。4研究期間中に手術治療を行った患者においては浅側頭動脈の採取を行った。結果、35名中1名のみがピロリ抗体陽性で、他は陰性であった。ただこの患者はCagA抗体陰性であった。また1名ピロリ抗体陰性であったがCagA抗体陽性となった。遺伝子検索では、RNF213正常GGが13名、変異型AGが23名、変異型AAは1名のみであった。STAはHE染色が終了し今後特殊染色に進む方針であるこれらの結果からモヤモヤ病発症にピロリ菌感染およびピロリ菌によるCagA産生が強く関わっているという仮説は否定される傾向が認められた。しかし今後も当初の研究計画に則り血漿内エクソソームの解析と浅側頭動脈の変性についての研究を進める。これらは今まで研究されていない分野で有り本研究が新たな病態解明に繋がると推測される。予定している検体の採取は終わり、ELISA法でピロリ菌抗体およびCagA抗体の検索および遺伝子変異のGenotypingが終了しているため結果が当初予想されているよりもピロリ菌およびCagA抗体陽性患者が少なかった。これに対しては当初の予定通り、エクソソームの抽出を行う予定である。当初の予定通り研究を遂行するため。エクソソーム抽出にかかる費用を算定。
アルデヒド分解酵素の組織特異的発現解析とファンコニ貧血細胞における機能の解明

日本人ファンコニ貧血(FA)患者においてアセトアルデヒド分解酵素ALDH2の遺伝子型は、骨髄不全に進行に重大な影響を持ち、特に活性のないAA型においては極度に重症である。これはFA病態におけるアルデヒドの中心的役割を示唆するものである。しかし、アルデヒド分解酵素は19種類と数多く、ALDH2以外のこれらの酵素のFA病態における役割はよくわかっていない。本研究では、ALDH2以外のアルデヒド分解酵素の組織特異的発現をしらべた。また、ファンコニ貧血類似だが、染色体脆弱性を示さない症例5例に、あらたにあるアルデヒド分解酵素のbiallelic変異を見出した。新規病態と考え検討中である。ファンコニ貧血(FA)はまれな小児の遺伝性疾患で、奇形、白血病、進行性骨髄不全を特徴とする。FAの原因遺伝子は「FA経路」と呼ばれるDNA損傷修復経路を形成し、その欠損は、未修復の損傷をゲノム上に蓄積し、臨床症状を来すものと理解されている。最近、細胞内でFA経路が実際に修復している損傷が内因性アルデヒドによることが示された。FAにおける造血幹細胞を中心とした組織特異的な症状発現は、アルデヒドの細胞内蓄積が組織特異的な因子によって影響されていることを示唆する。今年度は、アルデヒド分解酵素の5種類のアイソザイム(ALDH1A1、ALDH1A2、ALDH1A3、ALDH1B1、ALDH2)の発現を、real time PCR法で、CD34陽性骨髄細胞、胎盤、成人肝臓、胎児肝臓4種類のヒト組織/細胞で検索した。面白いことに、CD34陽性で主に造血幹細胞ないし前駆細胞を含むと思われる細胞では、ALDH1A3が最も高いレベルで発現し、次にやや少ないがALDH1A2が主に発現しており、ALDH2の発現はかなり低いらしく認められなかった。肝臓ではALDH2の発現が最も高いアイソザイムであった。胎盤ではいずれのアイソザイムの発現も低いことが判明した。モデルマウスの研究では、FAかつALDH2欠損の仔マウスは、ALDH2欠損母マウスからは産まれないことが示唆され、胎児+母体がユニットとしてALDH2による内因性アルデヒド分解が機能しないと発生に重大な影響を与えるとされている。しかし、東海大矢部博士らとの共同研究で、我々は今年度FA患者の母親に高頻度にALDH2バリアントホモを見出した。他のアイソザイムの発現が胎盤ではどうなのか等、追加実験が必要である。1.東海大矢部博士らとの共同研究で、ファンコニ貧血患者の母親のALDH2の遺伝子型を調べたところ、ALDH2-AAの患児の母親に同じくALDH2-AA型が複数例認められた。マウスにおける検討では、ALDH2/FAダブルノックアウトマウスの母マウスは少なくとも一つの健常ALDH2健常アレルをもっていないと胎児が致死となることがわかっており、ヒトでは全く状況が違っていた。2.ALDH酵素群の転写レベルの発現を、Realtime PCRによって、各種細胞で検討した。CD34陽性の造血プロジェニター細胞、胎盤細胞、ヒト成人肝細胞、胎児肝細胞を用いた。様々なパターンでの発現が認められ、(1)CD34陽性細胞で発現が高いのは、ALDH1A2/1A3であり、ALDH1A1も発現みられる。特に1A3はCD34できわめて発現が高い。(2)ALDH1B1, 2は成人の肝臓で最も高く、胎盤でもわずかに発現していた。3.ファンコニ貧血類似だが、染色体脆弱性を示さない症例数例にフォルムアルデヒド分解酵素ADH5遺伝子のbiallelic変異を見出した。新規の再生不良性貧血の病態と考えられ、今後の検討が必要である。4.今後、ファンコニ貧血の病態において最も重要な内因性アルデヒドとその分解酵素についてのより詳細な検討が必要である。分解酵素として、少なくともヒト再生不良性貧血病態の解析から、ALDH2とADH5が重要であることがうかびあがりつつある。real time PCR法を確立し、生体内で重要と思われる組織細胞のRNAを入手し測定することができた。しかし、まだまだ多数のアイソザイムの測定が残っており、やや遅れているとした。分子生物学、分子放射線生物学すでに細胞等の入手が完了したので、以後の実験はスムースに進行することが期待できる。siRNAによる検討も、細胞周期のマーカーで進行することが期待される。一方、実際のFA患者と母親のALDH2遺伝子型の研究から、マウスとはかなり違う生理的機能が浮かびあがっている。この点をきちんと解釈できるデータが得られるか、まだ不明である。対応策としては、実際の生体内でのアルデヒドの測定があげられる。今後の検討を要する。理由は、本年度の検討で予想外の結果を得たため、研究計画の見直しをしたためである。

本研究計画の大きな柱は、ファンコニ貧血患者細胞におけるALDHアイソザイムの網羅的ノックダウンによる検討にある。網羅的ノックダウンを行う細胞として、FANCA遺伝子の欠損患者GM6914を選び、これをFANCAで相補された細胞とペアとし、それぞれをGFPとmcherry遺伝子を発現させ、混合のうえ、MMC感受性を細胞増殖で検討した。予想外に、FANCAの欠損細胞がMMCによる細胞増殖低下がひくく、むしろ相補細胞が増殖をはっきりと低下させた。この結果は、こういった細胞のペアで増殖をリードアウトにsiRNAスクリーニングを行うことが適切でないことを示している。現在、次善の策として、細胞周期マーカーを導入し、FAの表現型を細胞周期変化として捉えることを試みている。昨年度使用しなかった研究費については、この後、siRNAスクリーニングの消耗品費として主に使用することとなる。
高速原子間力顕微鏡を用いたウイルス転写複合体の微細構造解析

インフルエンザウイルスのvRNPは、マイナス鎖一本鎖ゲノムRNA、核タンパク質NP、RNAポリメラーゼ複合体から構成されており、mRNA合成(転写)およびcRNA合成(複製の第一段階)を担う。ウイルス粒子から精製したvRNPは二重らせん構造を形成しているが、mRNAあるいはcRNA合成中のvRNPの構造については全く解明されておらず、これらのRNAがどのようにして合成されるのかも分かっていない。そこで本課題では、高速原子間力顕微鏡(AFM)を用いてRNA合成中のvRNPを解析することにより、微細構造学的観点からインフルエンザウイルスゲノムの転写・複製機構を明らかにすることを目的とした。昨年度までに、in vitro RNA合成中のvRNP複合体は、1二重らせん構造を維持した状態で二次構造を形成したRNAと結合、あるいは、2二重らせん構造が崩れた状態で二次構造を取らないループ状RNAと結合、のいずれかの状態で存在することを高速AFMにより明らかにした。さらに興味深いことに、ループ状RNAは二本鎖RNAであることを明らかにし、その構成鎖の5'末端がリン酸化されていることが明らかとした。すなわちループ状RNAは、de novo合成されるcRNAを含んでいる可能性が高い。さらにこの二本鎖ループ状RNAは、インフルエンザウイルスNS1タンパク質によってマスクされることを高速AFM観察により明らかとした。これはインフルエンザウイルスが二本鎖RNAのマスキングにより宿主の自然免疫応答から逃れている可能性を示唆しており、新たな研究の展開が期待される。最終年度は、高速AFMによるライブイメージングを行い、正電荷に富んだ脂質膜を用いることで基板上でのvRNPによるRNA合成が可能であることを見い出した。今後はRNA合成効率を高めることで、より詳細なvRNPの構造変化について検討したい。インフルエンザウイルスのゲノムRNAは、核タンパク質NPやポリメラーゼとともにvRNPを形成する。ウイルス粒子から精製したvRNPは二重らせん構造を持つことが明らかとなっているが、mRNAあるいはcRNA合成中のvRNPの構造については全く解明されておらず、また、これらのRNAがどのようにして合成されるのかも分かっていない。そこで本研究では、高速原子間力顕微鏡(AFM)を用いて機能的な状態のvRNPを解析することによって、微細構造学的観点からインフルエンザウイルスのゲノム転写・複製機構を明らかにすることを目的とした。初めに、ウイルスより精製したvRNPを用いてin vitro RNA合成反応を行い、qRT-PCRによりmRNAおよびcRNAが合成されることを確認した。続いて、in vitro RNA合成中のvRNP複合体を高速AFMで観察した結果、1二重らせん構造を維持したvRNPが二次構造を形成したRNAと結合している様子が認められた。さらに、2二重らせん構造が崩れたvRNPが二次構造を取っていないループ状RNAと結合している様子も観察された。まず、二次構造を形成したRNAについては、核酸アナログを用いた実験からvRNPにより合成されたRNAであることを確認した。一方で、二次構造を取らないループ状のRNAも同様にvRNPにより合成されたRNAであることを確認したが、興味深いことに、二本鎖RNAであることが明らかとなった。今回の結果から、vRNPによるRNA合成には上記1と2の2パターンが存在することが分かったが、これらがmRNA合成とcRNA合成の違いを表しているのかどうかを明らかにすることが今後の課題である。インフルエンザウイルスvRNPによるループ状RNAの形成に関しては、vRNPにより新規に合成されたRNAであることを確認したことに加え、二本鎖RNAであることを新たに明らかにした。またループ状RNAとは別に、二次構造を形成したRNAが合成されることも明らかとなった。これらの成果はインフルエンザウイルスゲノムの転写・複製機構を考えるうえで新たな知見となり、それにより当初の想定以上に学術的に意義のある結果が得られたと考えている。一方で、ライブイメージングのための基板の検討については時間を割くことができなかったため、全体としてはおおむね順調に進展していると考える。ウイルス粒子から精製したvRNPは二重らせん構造を形成しているが、mRNAあるいはcRNA合成中のvRNPの構造については全く解明されていない。さらに、これらのRNAがどのようにして合成されるのかも分かっていない。そこで本研究課題では、高速原子間力顕微鏡(AFM)を用いてRNA合成中のvRNPを解析することによって、微細構造学的観点からインフルエンザウイルスゲノムの転写・複製機構を明らかにすることを目的とした。さらに興味深いことに、ループ状RNAは二本鎖RNAであることを明らかにした。本年度は、酵素学的手法を用いてループ状RNAの5'末端について解析し、その5'末端がリン酸化されていることが明らかとした。これらの結果は、インフルエンザウイルスは複製(cRNA合成)

中に二本鎖を形成する可能性があるが、この二本鎖RNAが宿主の自然免疫を引き起こさないようにNS1でマスクするというメカニズムを備えていると考えられる。複製の際にインフルエンザウイルスが二本鎖RNAを作りえるということだけでも興味深い発見であったが、それに加えてその二本鎖RNAがウイルスタンパク質NS1によってマスクされることを見いだした。このことはインフルエンザウイルスが自然免疫を逃れるメカニズムについて新たな知見を与え、さらなる研究の発展につながると考え当初の計画以上に進展していると判断した。インフルエンザウイルスのvRNPは、マイナス鎖一本鎖ゲノムRNA、核タンパク質NP、RNAポリメラーゼ複合体から構成されており、mRNA合成(転写)およびcRNA合成(複製の第一段階)を担う。ウイルス粒子から精製したvRNPは二重らせん構造を形成しているが、mRNAあるいはcRNA合成中のvRNPの構造については全く解明されておらず、これらのRNAがどのようにして合成されるのかも分かっていない。そこで本課題では、高速原子間力顕微鏡(AFM)を用いてRNA合成中のvRNPを解析することにより、微細構造学的観点からインフルエンザウイルスゲノムの転写・複製機構を明らかにすることを目的とした。昨年度までに、in vitro RNA合成中のvRNP複合体は、1二重らせん構造を維持した状態で二次構造を形成したRNAと結合、あるいは、2二重らせん構造が崩れた状態で二次構造を取らないループ状RNAと結合、のいずれかの状態で存在することを高速AFMにより明らかにした。さらに興味深いことに、ループ状RNAは二本鎖RNAであることを明らかにし、その構成鎖の5'末端がリン酸化されていることが明らかとした。すなわちループ状RNAは、de novo合成されるcRNAを含んでいる可能性が高い。さらにこの二本鎖ループ状RNAは、インフルエンザウイルスNS1タンパク質によってマスクされることを高速AFM観察により明らかとした。これはインフルエンザウイルスが二本鎖RNAのマスキングにより宿主の自然免疫応答から逃れている可能性を示唆しており、新たな研究の展開が期待される。最終年度は、高速AFMによるライブイメージングを行い、正電荷に富んだ脂質膜を用いることで基板上でのvRNPによるRNA合成が可能であることを見い出した。今後はRNA合成効率を高めることで、より詳細なvRNPの構造変化について検討したい。インフルエンザウイルスvRNPによって合成されるループ状RNAと二次構造を形成するRNAについて、それぞれが示す意味について明らかにする。すなわち、どちらがmRNA(転写)、cRNA(複製の第一段階)を示したものなのかを明らかにするために、qPCRなどを組み合わせた方法により研究を推進していく。また、ライブイメージングについても同時に研究を進めていき、脂質膜上でのRNA合成反応が可能な条件を決定し、リアルタイムでvRNPがRNAを合成する様子を観察していきたいと考えている。
リンK殻吸収端単色X線によるDNA損傷の研究

電離放射線の生物細胞に対する致死及び突然変異誘発作用における標的分子はデオキシリボ核酸(DNA)と考えられる.生成する分子損傷はエネルギー付与の非選択性のため多岐にわたっている.その中で糖とリン酸からなるDNA主鎖の切断は生物的に最も重要と考えられており,その生成機構及び修復過程について詳しい研究が望まれるが,主鎖切断を効率よく,かつ選択的に作り出す方法がなかった.しかしながら近年利用可能になったシンクロトロン放射単色軟X線を用いるとリンK殻共鳴吸収ピークを狙うことによってDNAの主鎖を構成しているリン原子に放射線のエネルギーを吸収させることができる.内殻電離したリン原子はオージェ過程を経て多価イオンになるのでDNA主鎖切断が効率よく生成すると期待できる.一方,酵母菌の致死及び突然変異誘発を指標とした場合には,共鳴吸収単色軟X線が他の波長の単色軟X線にくらべて効率よくそれらの生物効果を誘発したので,共鳴吸収単色軟X線による分子損傷がDNA主鎖切断であろうと強く示唆されていた.そこで酵母菌の主鎖二本鎖切断を修復できない株(修復欠損株)に単色軟X線を照射した場合には,リン原子の共鳴吸収の効果がDNA主鎖切断の結果としてより大きく観測されることが期待された.高エネルギー物理学研究所放射光実験施設を利用して,延べ千回,修復欠損株と野性株にリンK殻共鳴吸収付近の単色軟X線を照射した.その結果,致死作用を指標とした場合には,共鳴吸収ピーク単色軟X線の他の波長の軟X線に対する生物効果比は,修復欠損株と野性株とで変わりなかった.この理由として,リン原子内殻電離による主鎖切断(一本鎖切断)が,酵母菌の持つ二本鎖切断修復系以外の経路で修復されていることが考えられた.今後,一本鎖切断を反映した生物効果をみつけて,それを指標とした実験を行い, DNA主鎖切断の生成についての実験を行う方針である.電離放射線の生物細胞に対する致死及び突然変異誘発作用における標的分子はデオキシリボ核酸(DNA)と考えられる.生成する分子損傷はエネルギー付与の非選択性のため多岐にわたっている.その中で糖とリン酸からなるDNA主鎖の切断は生物的に最も重要と考えられており,その生成機構及び修復過程について詳しい研究が望まれるが,主鎖切断を効率よく,かつ選択的に作り出す方法がなかった.しかしながら近年利用可能になったシンクロトロン放射単色軟X線を用いるとリンK殻共鳴吸収ピークを狙うことによってDNAの主鎖を構成しているリン原子に放射線のエネルギーを吸収させることができる.内殻電離したリン原子はオージェ過程を経て多価イオンになるのでDNA主鎖切断が効率よく生成すると期待できる.一方,酵母菌の致死及び突然変異誘発を指標とした場合には,共鳴吸収単色軟X線が他の波長の単色軟X線にくらべて効率よくそれらの生物効果を誘発したので,共鳴吸収単色軟X線による分子損傷がDNA主鎖切断であろうと強く示唆されていた.そこで酵母菌の主鎖二本鎖切断を修復できない株(修復欠損株)に単色軟X線を照射した場合には,リン原子の共鳴吸収の効果がDNA主鎖切断の結果としてより大きく観測されることが期待された.高エネルギー物理学研究所放射光実験施設を利用して,延べ千回,修復欠損株と野性株にリンK殻共鳴吸収付近の単色軟X線を照射した.その結果,致死作用を指標とした場合には,共鳴吸収ピーク単色軟X線の他の波長の軟X線に対する生物効果比は,修復欠損株と野性株とで変わりなかった.この理由として,リン原子内殻電離による主鎖切断(一本鎖切断)が,酵母菌の持つ二本鎖切断修復系以外の経路で修復されていることが考えられた.今後,一本鎖切断を反映した生物効果をみつけて,それを指標とした実験を行い, DNA主鎖切断の生成についての実験を行う方針である.
動脈硬化プラーク破綻におけるレニン・アンジオテンシン系の役割に関する研究

アンジオテンシンII1型(AT_<1a>)受容体遺伝子欠損マウスでは、対照マウスに比し動脈硬化プラークの破綻率が有意に抑制されており、プラーク内の脂肪沈着、マクロファージ浸潤、酸化ストレス、細胞外基質分解酵素活性の低下を伴っていた。AT_<1a>受容体刺激は動脈硬化巣における炎症、酸化ストレス、細胞外基質分解酵素の活性化を引き起こし、動脈硬化プラークの脆弱化に重要な役割を果たしていることが明らかになった。AT_<1a>受容体遮断によって、動脈硬化プラークの破綻を抑制できる可能性が示唆された。ApoEKO、ApoE/AT_1 double KO、ApoE/AT_2 double KOマウスの総頸動脈分岐部直下を結紮し、4週後に結紮した総頸動脈の近位部に内径0.58mm、長さ2mmのポリエチレンカフを留置することで動脈硬化プラーク破綻モデルを作製した。組織学的検討の結果、ApoEKOマウスでは約50%にプラーク破綻が確認されたが、興味深いことにApoE/AT_1 double KOマウスにおけるプラーク破綻率は約15%と、ApoE KOマウスに比べその頻度は有意に低下していた。現在のところ、ApoE KOマウスとApoE/AT_2 dodble KOマウスのプラーク破綻率に有意な差は認められていない。また、マウス腹腔マクロファージを用いたin vitro研究の結果、LPS刺激によるLOX-1、TNF-α、MMP-2、MMP-13 mRNAの発現が、ApoE Kマウスに比べApoE/AT_1 double KOで有意に低下していることが確認された。これらの結果は、AT_1受容体がマクロファージの酸化LDL受容体、炎症性サイトカイン、MMPの発現を介してプラークの不安定化にはたらいている可能性を示唆している。平成21年度は、既に採取・凍結保存しているプラーク組織における炎症性細胞浸潤、スカベンジャー受容体、炎症性サイトカイン、MMPなどのmRNA発現、蛋白発現を免疫組識染色、Real Time PCR、Western blotによって解析し、AP_1受容体の関与を検討していく予定である。さらに、マウス腹腔マクロファージを用いて、AT_1受容体がマクロファージの遊走能や貪食能に与える影響についても検討する。これらの研究により、プラーク破綻におけるマクロファージ機能やレニン-アンジオテンシン系の役割が明らかとなり、プラーク破綻機構の解明や動脈硬化の治療戦略を確立する上で大きな意義を持つものと期待される。
微小管およびその関連蛋白質と細胞機構に関する研究

本総合研究は微小管をはじめとする細胞骨格による多様な細胞機能の制御機構を明らかにする目的で行われた。主に6つの研究計画を軸として行ったので、個々の成果を以下に記す。1.有糸分裂と微小管-ダイニン系の機能。顕微操作により、染色体運動の原動力は染色体近くの半紡錘体部に局在していることが分かった。T-1によるタル型紡錘体の形成は微小管形成果粒が分散する結果であると考えられた。微小管結合蛋白質MAP1は【G_o】期に細胞骨格微小管、【G_1】期に核に結合していることが知られた。2.細胞骨格蛋白繊維と細胞運動系。微小管は試験管内で自発的に重合・脱重合を繰り返していることが分かった。テトラヒメナの中間径繊維が接合後の減数分裂、核交換の過程に関っていることを示した。またテトラヒメナアクチンのアミノ酸配列を遺伝子レベルで解明した。リンホーマ細胞に発現する重合能の低いβ-チューブリンのアミノ酸配列を遺伝子レベルで解明した。3.軸索内における微小管の動態。ニューロフィラメントの分子量200K成分はリン酸化され、通常のニューロフィラメントの数倍の速さで輸送されることを見い出した。イカ巨大軸索中でアクソラニンが微小管と共に分布していることを確かめた。またアクチンが膜の内側に結合していることを初めて観察した。4.細胞骨格調節蛋白質の分子機能。卵細胞より分子量100Kのアクチン繊維切断蛋白質を発見した。受精後、卵表層においてアクチンの重合がおこること、α-アクチニンの濃縮がおこることを観察した。5.神経興奮と微小管の役割。カルモジュリン阻害剤がNa電流を抑制することを発見した。6.細胞機能と細胞骨格。筋細胞において筋原繊維が付く形質膜域の裏打ち構造を明らかにした。また星状膠細胞における中間径繊維の細胞膜付着域の構造をも明らかにした。以上のように2年間で多くの成果があげられ、班員同士の共同研究も活発になり、今後の発展の基礎が築れた。
パリ民事籍簿復元事業の実証的研究―近代国家の政治社会史

平成30年度は、おもに復元事業局の文書の調査と閲覧をおこなった。同局は、パリ市に設置され、1872年から97年まで25年かけて、焼失した民事籍簿の約3分の1、記録件数にして269万件(出生142万件、婚姻35万件、死亡92万件)の復元を実現した。同局の文書は、パリ文書館にV9E系列として保存され、台帳7冊と史料箱119個からなる。そこには、局や関連委員会における議論と決定、省庁・議会・民間団体などとの書簡、住民から提出された文書の審査記録などが含まれている。本年度は、8月下旬から3週間かけて、これらをほぼすべて閲覧し、必要部分の撮影をおこなった。これをもって、本研究に用いる刊行史料と文書史料のうち、当初閲覧する予定であったものについては、すべて確認したことになる。現在は復元事業局文書の読解、分析の途上であり、全体的な結論を出すには至っていない。ただ、現時点で得られている知見は、基本的には昨年度と同様である。すなわち、復元事業をめぐる議論の多くは、技術的・財政的な問題に関わるものであり、制度の是非やあり方についての根本的な議論は少なかった。その一方で、パリの住民の反応については、復元事業に関しても民事籍簿制度そのものに関しても、広範な議論が起こった形跡は見つかっていない。本年度は、上記文書の分析を終え、これまで収集した他史料と照合せねばならないが、復元事業をめぐる議論や世論のあり方が上記のようであったとすれば、そのことの意味について、さまざまな角度から検討することが必要になる。復元事業局の文書は、劣化のため閲覧できなかった数点を除き、すべてを調査することができた。ただし、住民の意見を反映するような内容が少なかったため、この点を補う調査が必要になる。それ以外は、全体として順調に進んでいるといえる。基本的には当初の予定通りおこなう。平成28年度は、(1)関連研究の調査、(2)フランスでの史料調査、の二つを実施した。関連研究については、日本史・東洋史や社会学などを中心に調査を進めた。またフランスでの史料調査は、8月末から9月上旬と、3月中旬の二度にわたりおこなった。申請時に想定していなかった夏期の調査を実施したのは、関連研究が予想より少なかったことのほか、刊行史料の分析を先に終えてから主要史料であるパリ市文書館の「V9E系列」の分析に取りかかるという狙いからである。その結果、主要な刊行史料(パリ市議会の議事録・報告書、国会の議事録・報告書)はほぼ収集できた。加えて、パリ警視庁文書館(DA1,DA23)と国立公文書館(BB30/1607-1609)において復元事業関連の史料を見いだすことができ、それらも一通り撮影した。今後は、平成29年度の夏の調査までにそれら史料を分析することで、主要史料の閲覧に備える所存である。ここまでの分析で言えることは、民事籍簿の復元をめぐっては技術的・財政的な議論が相当の部分を占めており、制度の必要性についての議論は目立たなかったということである。当時の主要紙の一つであるLe Temps紙をみるかぎり、事業への言及は少ない。また、議会内での議論についても、法制定時の1873年前後に集中的におこなわれており、事業開始後はその是非を根本から問うような議論は沈静化している。その理由や意味は現時点では不明であるが、事業の意義が広く理解されていなかった可能性もある。一方、平成28年度の調査では、市民の間での事業の認識にまでは迫ることができなかった。この点については、29年度以降の課題である。関連研究が予想より少なかったものの、その分の時間をフランスでの史料調査に充てることができ、全体として順調に進んでいるといえる。平成29年度は、前年度に引き続き、(1)行政による個人同定・管理をめぐる研究の調査、(2)パリ民事籍簿復元事業に関する史料の分析、の二つを実施した。(1)について、近年、人口移動の著しい活発化と、共同体への帰属意識の流動化・複雑化を背景に、国家による個人の同定と管理については社会的な関心が高まっており、学術研究もさかんになっている。本研究に関しても、西洋史のほか日本史・政治学・歴史社会学などにも視野を広げて文献を入手できた。それらの分析は途上であるが、現時点では、本研究が当初に定めた視角や方法を変更する必要はないと考えている。(2)について、平成29度中に二度にわたる資料調査を実施し、本研究の主要史料であるパリ文書館V9E系列の文書を閲覧する予定であったが、事情により、これを実施できなかった。現時点で得られている知見は、質的には、昨年度と基本的に大きく変わっていない。すなわち、民事籍簿復元事業をめぐる議論の多くの部分は、技術的・財政的な問題に関わっており、民事籍簿という制度の是非やあり方についての根本的な議論は目立つものではなかった。他方、パリの住民の反応については、手稿史料の分析がまだ進められていないものの、ここまでに閲覧した新聞などをみる限り、広範な議論が起こった形跡はない。今後は、主要紙のほか、区単位でのコミュニティ紙的な刊行物、さらにはカトリック教会の教区週報などにも調査の範囲を広げて、情報の収集に努める必要がある。

先行研究や関連研究は一通り入手し、一次史料についても、パリ文書館所蔵のものを除き撮影を済ませているが、上記「研究実績の概要」で述べたように、復元事業の担当部局の文書の閲覧に着手するには至っていない。また、ここまで撮影した史料の分析も途上である。平成30年度は、おもに復元事業局の文書の調査と閲覧をおこなった。同局は、パリ市に設置され、1872年から97年まで25年かけて、焼失した民事籍簿の約3分の1、記録件数にして269万件(出生142万件、婚姻35万件、死亡92万件)の復元を実現した。同局の文書は、パリ文書館にV9E系列として保存され、台帳7冊と史料箱119個からなる。そこには、局や関連委員会における議論と決定、省庁・議会・民間団体などとの書簡、住民から提出された文書の審査記録などが含まれている。本年度は、8月下旬から3週間かけて、これらをほぼすべて閲覧し、必要部分の撮影をおこなった。これをもって、本研究に用いる刊行史料と文書史料のうち、当初閲覧する予定であったものについては、すべて確認したことになる。現在は復元事業局文書の読解、分析の途上であり、全体的な結論を出すには至っていない。ただ、現時点で得られている知見は、基本的には昨年度と同様である。すなわち、復元事業をめぐる議論の多くは、技術的・財政的な問題に関わるものであり、制度の是非やあり方についての根本的な議論は少なかった。その一方で、パリの住民の反応については、復元事業に関しても民事籍簿制度そのものに関しても、広範な議論が起こった形跡は見つかっていない。本年度は、上記文書の分析を終え、これまで収集した他史料と照合せねばならないが、復元事業をめぐる議論や世論のあり方が上記のようであったとすれば、そのことの意味について、さまざまな角度から検討することが必要になる。復元事業局の文書は、劣化のため閲覧できなかった数点を除き、すべてを調査することができた。ただし、住民の意見を反映するような内容が少なかったため、この点を補う調査が必要になる。それ以外は、全体として順調に進んでいるといえる。今後の推進方策について、現時点では申請書記載の工程に沿っておこなう考えである。下に記載した史料調査時期の変更を除き、申請書記載の通りにおこなう考えである。基本的には当初の予定通りおこなう。(理由)おもに史料調査を実施できなかったことによる。(使用計画)実施すべきであった調査は、平成30年夏と31年春におこなう予定である。(理由)平成30年夏と31年春の二度にわたりおこなう予定であった調査を、30年夏の一度で終えることができたため。(使用計画)補足的な調査および史料収集を、31(令和1)年夏に実施する。
小児特発性ネフローゼ症候群の病態解明：発症機序における自己抗体の役割

2018年度は、ELISA法によって小児特発性ネフローゼ症候群患者血中の抗サイトカイン自己抗体の検出系を開発した。これにより、小児特発性ネフローゼ症候群の患児の血中抗サイトカイン自己抗体のサブクラスのプロファイルは患者ごとに異なることが明らかになった。また、小児ネフローゼ症候群患者血中の抗サイトカイン自己抗体は、当初1種類と考えられていたが、基礎検討の段階で他のサイトカインについても検討した結果、複数存在する可能性があることが示唆された。さらに患者血中にはサイトカイン以外にも自己抗体が反応する自己抗体標的物質があることが示唆され、この物質はこれまで提唱されてきたネフローゼ症候群における糸球体係蹄からの蛋白漏出機序仮説を裏付けるものである可能性が示唆された。一方、研究当初は直接ELISA法で抗サイトカイン自己抗体の検出系を構築したが、再現性にばらつきがあることが明らかになった。現在サンドイッチELISA法での検出や、ウェスタンブロットによる検証作業を行っている。本来は自己抗体が認識するエピトープ検索のため、今年度中にプロテインアレイ解析を行う予定であったが、現在は当初の計画を一旦中断し、再現性を含めた信頼度の高いアッセイを再構築しているところである。これまでに当施設で集めたネフローゼ患者の検体で、発症時・寛解時・再発時・疾患消失後2年における自己抗体を計測したが、これらは各病期で特に有意な変動はないことが判明した。したがって、ネフローゼ症候群発症には抗サイトカイン自己抗体以外にもトリガーとなりうる機序が存在する可能性が考えられた。抗サイトカイン自己抗体検出系の再現性が不良であり、より信頼性の高い検出系を構築しているため。また、自己抗体が反応する物質は当初の予定とは異なり、複数存在することが本研究で明らかになったことから、標的物質をピックアップをしているため。上記の理由により当初の計画を一旦中断しており、当初予定していたプロテインアレイによる抗体の標的物質同定作業を延期しているため。抗サイトカイン自己抗体検出系の再現性の向上のため、より信頼性の高い検出系を構築する。また、自己抗体が反応する物質が複数存在するため、患者血中の自己抗体量の測定と並行し、自己抗体が標的とする他の物質のスクリーニングをすすめる。そのうえで、最もネフローゼ症候群の病勢(=発症・寛解・再発)と関連する自己抗体を選出した後、プロテインアレイによって自己抗体が認識するエピトープを同定する。エピトープ同定後、腎オルガノイドを用いてオルガノイド上で発現している部位を、上記で判明したエピトープに結合する抗体で同定する。同時に、抗体結合後におきる、シグナル経路を明らかにする。2018年度に予定していたプロテインアレイによる解析実験を翌年度へ繰り越したこと、成果発表を翌年度に行うため、今年度の旅費を翌年度以降に繰り越したこと、が次年度使用額が生じた主な理由である。
受精カルシウム波の伝播を担う新規チャネルの同定とカルシウム波の生理的意義の解明

受精カルシウム波は動植物界に保存された胚発生を開始させるシグナルである。受精カルシウム波の伝播は一般にIP3受容体によって担われていると考えられているが、線虫C. elegansにおいては、新規のチャネルが関与することが示唆されていた。そこで本研究では線虫の受精カルシウム波伝播を担うチャネルを同定することを目的とした。我々はまず、蛍光カルシウムインジケーターであるGCaMP6sを生殖腺特異的に発現するトランスジェニック線虫系統を樹立した。feedingRNAi干渉法により網羅的にチャネルの機能阻害を行い候補遺伝子を複数同定した。より効率的にスクリーニングを行うため、線虫の受精時に生じるカルシウム波の観察手法の改良を行った。これによりサンプルの準備にかける時間が飛躍的に減少した。さらに感度が向上したことにより微妙な差が検出しやすくなると期待された。また卵細胞の形質膜を赤色蛍光タンパク質により標識することで、その後の画像処理による卵細胞の認識が高速かつ簡便になった。322のチャネル遺伝子のうち、Ortiz et al (2014)およびHobert (2013)を元に、生殖腺で発現し、かつカルシウムを透過することが予想される42のチャネル遺伝子をリストアップした。このうち37についてRNA干渉による遺伝子破壊を行い、その際の受精カルシウム応答の観察を行った。この際に、新しい観察手法においても精子のTRP-3の遺伝子破壊により局所波に異常が生じることを確認した。一方、予想外のカルシウム波パターンを示す個体もあったが、大域カルシウム波が特異的に減少するかを突然変異体により確認する段階には至っていない。今後は観察動画を定量的に評価していく予定である。また計画に記した胚性致死を指標としたスクリーニングを行う。一方で、来年度以降に行う予定であった局所波と大域波の関係の解析を一部前倒しで行った。これは局所カルシウム波の発生を担う精子TRP-3チャネルの発現量を遺伝子組み換え技術を用いて調節することに成功したためである。この手法を用いて局所波と大域波の関係を解析した。その結果、精子のTRP-3チャネルが多いほど、受精後に生じる局所波が大きく、また大域波が素早く生じることが見出された。この局所波と大域波の関係は、カルシウム誘導カルシウム放出機構により説明できることがシミュレーションを用いた解析によりわかった。大域カルシウム波を担うチャネル遺伝子の同定には至っていないものの、第二段階の確認に至るべき遺伝子の候補は挙げられた。また観察手法とその後の定量化手法が大幅に改善された。昨年度に行った局所波と大域波の関係の解析およびカルシウム波のシミュレーション結果を、それ以前に行った精子TRP-3チャネルの解析結果と合わせて論文として報告した(Takayama and Onami, 2016)。また、昨年度までに樹立した新しい観測法を用いて得られた動画像に対し、画像処理方法を確立し、定量化を行った。さらに、より高速で簡便な定量法を考案した。また、得られた定量データを直感的に把握する可視化手法を考案し、異常検出に役立てることに成功した。昨年度までに、生殖腺で発現しかつカルシウムを透過すると予想される42のチャネル遺伝子をリストアップし一部解析を終えていたが、本年度はその解析を完了した。その結果、リアノジン受容体をコードするunc-68遺伝子を破壊すると、局所波および大域波の両方が減弱することが示唆された。同様の表現型はunc-68遺伝子の機能減弱変異であるunc-68(kh30)を用いた実験でも観察された。次に、unc-68(kh30)の雌雄同体と、野生型の雄を掛け合わせて受精カルシウム応答を観測した。その結果、前述の自家受精の実験と同様の表現型が観察された。したがって、unc-68変異体における受精カルシウム応答の異常は精子が原因ではないことが示唆された。以上の結果および、それ以前の解析結果をふまえ、精子のTRPチャネルと卵のリアノジン受容体の相互作用により、受精カルシウム波が惹起されるという仮説を考案した。ただしunc-68変異体の異常が、発育不全などに由来している可能性は否定できていない。一方、unc-68の発現部位を同定するため、CRISPR-Cas9法の実験系を確立した。この実験系を用いて、GFP融合UNC-68タンパク質を発現する線虫系統を樹立した。観察の結果、頭部の筋肉と、生殖腺体細胞に発現が見られたが、卵で明確な発現は見られなかった。昨年度までの成果を一部含む論文が出版された。またスクリーニングを終え、定量化・可視化手法を樹立した。さらに候補遺伝子の絞り込みが行われ、変異体を用いた解析、およびその後のより詳細な機能解析まで行った。以上のことからおおむね順調に進展していると判断した。昨年度までに線虫における受精カルシウム波のパターンに影響を及ぼす遺伝子を同定するためのRNAiスクリーンを行った。RNAiスクリーンの結果複数の遺伝子が同定されたが、本年度はgtl-1遺伝子の機能解析を行った。gtl-1遺伝子はTRPMチャネルをコードすることが知られている。gtl-1をRNAiにより機能阻害したgtl-1(RNAi)個体では、受精前の卵におけるカルシウム蛍光強度が顕著に上昇し、またカルシウム波にもパターンの異常が見られた。このカルシウム波の異常は受精前のカルシウム濃度昂進に起因すると考えた。そこで、受精前のカルシウム蛍光強度の上昇という未踏の表現型の解析に着手した。