hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
FGFR3インヒビターの局所投与による骨伸長促進効果の検討

軟骨無形成症(achondroplasia: ACH)は骨伸長の抑制因子であるFGFR3の活性化により発症し、長管骨の長軸成長が障害され低身長を呈する骨系統疾患である。研究代表者らは、メクロジンが新規FGFR3インヒビターであると同定し、ACHマウスモデルへの全身投与により骨伸長を促進したことを報告した。本研究ではFGFR3インヒビターの局所投与による骨伸長促進効果を検討する。幼弱動物の片側関節内や骨端部にFGFR3インヒビターを局所投与し、マイクロCTで骨長を経時的に測定して非投与側と比較する。成長軟骨板の組織学的検討、骨端および骨幹端の骨量や骨梁に対する骨形態学的検討も加える。
pIClnによるネフロンのClチャネル開閉の調節機構

重要な発見があったので、以下に箇条書きにする。1)pIClnを大腸菌に発現させると、菌の低浸透圧耐性は有意に増強する。2)菌の浸透圧耐性増強に必要なアミノ酸配列は、酸性領域を含む46アミノ酸-ペブチドで十分である。3)有核細胆(PPL-K1)では、低浸透圧に曝されるとpIClnは核周辺から細胞質内へ広がる。4)骨格筋内のpIClnは、すべて一定サイズのアクチンーオリゴマー(6または7量体)と結合して存在する。過去の研究報告を合わせて考察すると、ii)その分子に作用するのは、pIClnの酸性領域を含む限られたドメインで十分である。iii)pIClnが作用する分子は細胞内部(特に細胞質)に存在する。(1) pICln結合タンパクの検索: pIClnの細胞内分布は、腎、脳、骨格筋、心、精巣において異なり、腎においてはほとんど全て不溶画分に存在するのに対して、骨格筋では可溶画分に存在していた。骨格筋の可溶画分に存在するpIClnに結合するタンパク検討したところ、全て一定の長さのF-actinであった。pICln-actinの大きさは約34万でありpICln対actinの量比は約1:7であった。骨格筋においてpIClnは、F-actinの大きさを規定し、筋の収縮-弛緩による細胞容量の変化に対応して機能していることを推定できた。なお、コンビナントpIClnをF-actinと結合させることはできなかったので、この複合体形成には何らかの介助機構があるものと推定された。(3) pIClnの細胞防御機能の観察: pIClnのcDNAをE.Coliに挿入すると、E.Coliが低浸透圧耐性を獲得することを観察した。そこで、pICln分子中のどの部位が生理機能発現に不可欠かcDNAの断片を用いて検討したところ、意外にも細胞膜に親和性のある部分を除去した特定部位の極めて短い断片の発現でも低浸透圧耐性を賦与できた。pIClnは、塩素イオンチャネルを構成するのではなく、細胞外低浸透圧の情報伝達に機能していること、および、pIClnを生理的には保有していない細菌でもpIClnの機能を発揮するという興味深い結果を得た。1)ほ乳類由来のpIClnを大腸菌に発現させると、菌の低浸透圧耐性は有意に増強する。2)菌の浸透圧耐性増強に必要なアミノ酸配列は、酸性領域を含む46アミノ酸-ペプチドで十分である。3)有核細胞(PPL-K1)では、低浸透圧に曝されるとpIClnは核周辺から細胞質内へ広がる。4)骨格筋内のpIClnは、すべて一定のサイズのアクチン-オリゴマー(6または7量体)と結合して存在する。過去の研究報告と合わせて考察すると、ii)その分子に作用するのは、pIClnの酸性領域を含む限られたドメインで十分である。pIClnが作用する分子は細胞内部(特に細胞質)に存在する。
火星の海および表層氷の進化史：火星隕石の地球化学的解析からの制約

我々は,火星誕生から約4億年の間に火星表層の初期水量の50%以上が大気を通じて宇宙空間へ流出し、また残りの水の大部分は火星の気候変動により氷となって現在でも火星の地下に存在する可能性があることを突き止めた。水が大気を通じて宇宙空間に流出した場合、残存する水の水素同位体比の変化としてその履歴が残ることに着目し、火星隕石に含まれる水の高精度水素同位体分析データを用いた理論計算によって水が失われた時期や量を明らかにした。火星が水を失った歴史を突き止めたことは、今後の火星探査計画への示唆や、地球型惑星が生命誕生にとって重要な海を持つ条件の理解につながると期待される。本研究では、45億年から近過去(<2 Ma)までの様々な時代情報を保持する火星隕石に含まれる水の水素同位体比を求め、得られた水素同位体比の時代変化から火星の表層水の総量および状態(液体水・氷・水蒸気)の変遷を明らかにすることを目的とする。研究計画1:平成26年度においては,41億年の形成年代を持つ火星隕石(ALH 84001)に含まれる炭酸塩の解析を行った。鉱物・岩石記載および主成分元素組成の同定は,走査型電子顕微鏡(Hitachi S-3400N,東工大)を用いた。二次イオン質量分析計(Cameca NanoSims 50L,カーネギー研究所)を用いた水素同位体分析に関しては,平成27年度前期に予定している。水素同位体分析に先立ち,本年度は炭酸塩の炭素・酸素同位体を行った。研究計画2:火星隕石から得られた水素同位体データを入力パラメターとする水散逸モデルを用い,表層水の総量の変遷を見積もった。結果,火星の初期水量の半分以上が火星誕生後4億年間で宇宙空間へ流出したことを明らかにした。研究計画3:表層水に加え,地下氷を考慮に入れた水散逸モデルを構築した。結果,現在確認されている量を遥かに上回る大量の氷が火星の地下に存在する可能性を示した。業績:本科学研究費に関連した平成26年度の研究実績として,査読付き原著論文3本(Usui et al. 2015, Kurokawa et al. 2014, Usui and Miyamoto, 2014),2つの招待講演を含む5回の学会発表を行った。研究計画1:二次イオン質量分析計(Cameca NanoSims 50L,カーネギー研究所)を用い,41億年の形成年代を持つ火星隕石(ALH 84001)に含まれる炭酸塩の水素同位体分析をおこなった。H27年度の水素同位体分析に先立ち,H26年度は炭酸塩の炭素・酸素同位体を行った。研究計画2:火星隕石から得られた水素同位体データを入力パラメターとする水散逸モデルを用い,表層水および地下氷の総量の変遷を見積もった。業績:本科学研究費に関連した平成27年度の研究実績として,査読付き原著論文2本(Usui et al. 2015, Kurokawa et al. 2016)の発表を行った。隕石試料の配分や機器分析にトラブルがなく,また連携研究者の精力的な協力もあり,当初の計画通り研究目的が達成された。宇宙地球化学昨年度に分析が終了しなかった,炭酸塩の水素同位体比分析をH27年度の前半に行い,後半はデータ解析および論文の執筆を行う。現状,研究計画の変更はない。
オランダ・ベルギーにおける初期印刷本の研究

15世紀末から16世紀にかけて、狐のライナールトを巡る物語は、印刷術の発達とともにヨーロッパ各地に伝播していった。ゴーダの印刷業者であったヘラールト・レーウが1479年に印行した『狐ライナールト物語』がその出発点となった。この物語ではじめて見出しが設けられて、本文は従来の韻文から散文へと変更されている。こうした現代の書籍にも見られる見出しの設定は、まだ本を読む習慣がなかった不特定多数の読者に対して、本文の内容をより理解しやすくするための工夫であることが今年度の研究によって判明した。その後、この物語はアントウェルペンにおいて再び韻文による物語として同じ印刷業者から印行された。その後、この物語が再びオランダ・ベルギーで刊行されるのは、1564年になってからで、70余年の空白期間がある。新たに刊行された民衆本『狐ライナールト』は、印刷業者ペーター・ファン・ケールベルヘンがクリストッフェル・プランティンに依頼して活字を組んでもらったもので、活字は当時デザインされたいわゆるフランス書体、別名シヴィリテ書体という特殊な書体によるものである。今年度の研究において、この特殊な書体を用いた他の作品と民衆本『ライナールト物語』を比較して、当時のアントウェルペンの出版業界の実情と、特殊にペーター・ファン・ケールベルヘンの印刷業者としての特性を明らかにすることができた。当時の出版界を詳細に描写できたのは一つの大きな成果だと考える。当初はフランス書体を研究する必要ができたために、やや進度が遅れたために、一年間の研究活動の延期を申請した。その後、フランス書体の研究も進み、もとの進度に戻ったので、現在では3分の2以上研究が進んだと考えている。残すところは、総まとめまでの個々の研究成果の調整だと考える。1564年の民衆本『ライナールト物語』とその後に続いた民衆本について、ベルギーおよびオランダ、すなわちカトリック教会が優勢であった地域とプロテスタントが優勢となった地域で、どのように本の内容が変化したのかを明らかにする。それと同時に、書籍の検閲がその後の本の内容にどう影響を及ぼしたのかを考察する。オランダ・ベルギーにおける初期印刷本の考察を研究テーマとして、とくに1500年以前に印刷・刊行された揺籃本(インキュナブラ)の成立過程を考証した。研究の方法として、1、インキュナブラ総目録の入手、2、印刷術関連の書籍の入手、3、インキュナブラのプリントアウト作業の三つの作業を中核にして研究日程を作成した。インキュナブラとは、1500年以前に印刷された書籍を指し、グーテンベルクが印刷術を発明したのが1450年以降とされるので、およそ50年間という期間に印刷された書籍をこう呼んでいる。ただその間に印刷された書籍は膨大な数に上る。オランダ・ベルギーのインキュナブラの総数は2025点を数え、初期印刷本の研究には、まず個々のインキュナブラに番号を付した総目録が必須であった。初期印刷術の研究に不可欠の総目録は第一にキャンベルによるもので、それは1874年に刊行された(M.F.A.G.Campbell, Annales de latypographie neerlandaise au XVe siecle. La Haye 1874)。それ以外の総目録についても、およそオランダ・ベルギーの印刷術に関する限り、入手可能な目録はできるだけ収集して研究の基礎資料に充てた。研究の過程で、オランダ・ベルギーには刊行地また刊行年、印刷業者名の記載のない初期印刷本が多数依存しているのが判明した。これらは専門的には原活版印刷本(Prototypography)と称されている。代表的なものが最初期のインキュナブラである『人類救済の鑑Speculum humanae salvationis』である。こうした原活版印刷本と印刷業者ヘラールト・レーウが当時どのような関係にあったのかがある程度明らかになった。以上のことは本邦では全く知られておらず、日本初の研究の成果であるといえる。初期印刷本の研究途上で、原活版印刷本という予想外の事例に出くわしたために、それへの対処に少しばかり手間取った。この問題は、19世紀以来多くの研究者を悩ませ、またさまざまな学問的論争を引き起こしたテーマであり、これを論じた非常に多くの文献を19世紀にまで遡って渉猟することにやや時間をとられたのが理由である。とはいえ、この問題に関しては整理がついたので、まとめの作業をしているのが現状である。狐のライナールトを主人公とする一連の動物譚が、盛んに印刷されて出版されたのは15世紀後半であった。当時発明されたばかりの、しかし瞬く間にヨーロッパ全土に普及した印刷術を土台にして、多くの印刷業者が各地で職業としての印刷業を確立し、自らが印刷して刊行する本の題材をあらゆる分野から集めていた時代である。当時の低地諸州を代表する印刷業者であったヘラールト・レーウも、散文版と韻文版のライナールト物語を印刷していた。その中でアントウェルペンで1487年に印行された韻文版は、その後1564年に刊行された『狐ライナールト』に影響を与えると同時に、低地ドイツ語版の『狐ラインケ』の直接の典拠となった点で重要である。今期では、断片しか残っていない韻文版を中心に検討を加えた。

「ケンブリッジ断片」と称されるこの韻文版の検討によって、ヘラールト・レーウが当時の国際商業都市であったアントウェルペンの言語に依拠しながらも、潜在的な読者層として想定していたのが、フランス・フランドルの宮廷の貴族層であることが判明した。より多くの読者に本を販売するため、言語はだれにとっても理解できるもの、しかし読者の関心を惹くためには、宮廷文学の伝統に依拠せざるを得ないという印刷業者ヘラールト・レーウのディレンマを明らかにした。本邦ではこれまで誰も取り上げなかったテーマであり、これを発信していくことは西洋史研究および出版文化の研究にとって非常に重要だと思われる。調べれば調べるほど興味深い事実が出てきて、それらすべてを俎上に載せて検討しているせいで、やや時間をとられているものの、進捗状況は概ね順調である。今後は検討すべきテーマの取捨選択をより緻密に行い、テーマを厳選して研究したい。15世紀末から16世紀にかけて、狐のライナールトを巡る物語は、印刷術の発達とともにヨーロッパ各地に伝播していった。ゴーダの印刷業者であったヘラールト・レーウが1479年に印行した『狐ライナールト物語』がその出発点となった。この物語ではじめて見出しが設けられて、本文は従来の韻文から散文へと変更されている。こうした現代の書籍にも見られる見出しの設定は、まだ本を読む習慣がなかった不特定多数の読者に対して、本文の内容をより理解しやすくするための工夫であることが今年度の研究によって判明した。その後、この物語はアントウェルペンにおいて再び韻文による物語として同じ印刷業者から印行された。その後、この物語が再びオランダ・ベルギーで刊行されるのは、1564年になってからで、70余年の空白期間がある。新たに刊行された民衆本『狐ライナールト』は、印刷業者ペーター・ファン・ケールベルヘンがクリストッフェル・プランティンに依頼して活字を組んでもらったもので、活字は当時デザインされたいわゆるフランス書体、別名シヴィリテ書体という特殊な書体によるものである。今年度の研究において、この特殊な書体を用いた他の作品と民衆本『ライナールト物語』を比較して、当時のアントウェルペンの出版業界の実情と、特殊にペーター・ファン・ケールベルヘンの印刷業者としての特性を明らかにすることができた。当時の出版界を詳細に描写できたのは一つの大きな成果だと考える。当初はフランス書体を研究する必要ができたために、やや進度が遅れたために、一年間の研究活動の延期を申請した。その後、フランス書体の研究も進み、もとの進度に戻ったので、現在では3分の2以上研究が進んだと考えている。残すところは、総まとめまでの個々の研究成果の調整だと考える。オランダ・ベルギーにおける原活版印刷本について成果をまとめた後、本研究の中核である印刷業者ヘラールト・レーウと原活版印刷本との関係を考察する。レーウの初期の出版活動とユトレヒトにおける他の印刷業者の活動とを比較し、どの程度レーウがユトレヒト、とくにユトレヒト司教区の影響を受けていたのかを考察する。つぎに動物叙事詩『狐ライナールト物語』が系譜上どのように16世紀の民衆本に継承されていくのかを考察し、廉価な文学作品がどんな理由で庶民に受容されたのか、またそこに宗教上の思惑が存在したのかを考察する予定である。テーマに関する資料はほぼ揃ったと思われるので、テーマを絞りながら研究を進めたい。
遺伝性腫瘍に関する知識普及のための看護教育プログラムの開発と評価

近年の分子遺伝学の発展により、遺伝性腫瘍の存在が明らかになってきた。そのような遺伝性腫瘍の可能性のある家系の方々に対して適切な情報提供を行うために、看護師の遺伝に関する知識向上の教育プログラム案を開発した。開発した教育プログラム案を用いて看護師を対象に勉強会を開催した結果、新しい知識であり難しいが、もっと勉強したいと意欲的であった。今後は、得られた意見をもとに教育プログラムの内容を適宜修正し、広く提言していく予定である。近年の分子遺伝学の発展により、がん患者や家族をとりまく医療は急速に変化している。しかし、わが国では看護基礎教育において遺伝学や遺伝性腫瘍、遺伝看護などに関して統合されたカリキュラムが提供されている教育機関はほとんどないため、がん医療に携わる看護師が遺伝性腫瘍やそのような家系の患者や家族へのケアに精通しているとは言い難い。そこで、遺伝性腫瘍の医療の均てん化を目指すために、看護師に対する遺伝性腫瘍の知識の普及のためのがん遺伝看護教育プログラムを開発することを目的としている。本年度は、プログラム案を作成するために、医療職の遺伝性腫瘍に関する関心度や国内外の文献検討により必要と思われる教育項目の抽出を行った。国立がんセンターがん対策情報センターが主催しているがん診療連携拠点病院の相談支援センター相談員基礎研修会で「家族性腫瘍の患者および家族への対応」の講義を聴講した90名(看護職38名、ソーシャルワーカー38名、臨床心理士など4名)全員が、家族性腫瘍に関する知識の必要性や関心度の高さを述べていた。CHINAHL、PubMed、医中誌を用い、キーワードに「家族性腫瘍」、「教育カリキュラム」、「看護」をかけあわせて文献検索を行った結果、1.家族性腫瘍の基礎知識(A.遺伝性腫瘍と原因遺伝子、B.生殖細胞と体細胞の遺伝形式の特徴、C.遺伝性腫瘍の特徴および疫学)、2.腫瘍遺伝学(A.家族性大腸がん、B.網膜芽細胞腫、C.多発性内分泌腺腫症、D.家族性乳がん・卵巣がん)、3.遺伝に関する情報を活用した看護実践と遺伝カウンセリング、4.倫理的・法的・社会的諸問題への対応、の4項目が抽出された。今後は、得られた項目の内容検討、プログラム素案の作成と実施、と引き続き行っていく予定である。近年の分子遺伝学の発展により、遺伝性腫瘍の患者や家族をとりまく医療が急速に変化してきている。大学院教育において少しずつ取り入れられるようになってきたが、わが国では看護基礎教育において遺伝学や遺伝性腫瘍、遺伝看護などに関して統合されたカリキュラムが提供されている教育機関は数少なく、現任教育も不十分である。そのため、がん医療に携わる看護師が遺伝性腫瘍やそのような家系の患者や家族へのケアに精通しているとは言い難い。そこで、遺伝性腫瘍の可能性のある家系の方々が適切な医療を受けるためには、看護師の遺伝に関する知識の向上が必要である。本研究は、遺伝性腫瘍の医療の均てん化を目指すために、看護師に対する遺伝性腫瘍の知識の普及のためのがん遺伝看護教育プログラムを開発することを目的としている。本年度は、プログラム案を作成するために、ミニ勉強会を開催し、遺伝性腫瘍に関する知識と教育内容の検討を行った。遺伝相談外来の開設直後の2つの施設において、看護師を対象に遺伝性腫瘍に関してミニ勉強会を開催した。参加者は、両施設とも15名前後と関心をもっている看護師は多かった。勉強会の内容は、昨年度の結果をもとに遺伝性大腸がんや遺伝性乳がんに関するものを中心に、現在明らかになっている遺伝性腫瘍に関する情報、家系図の取り方、遺伝子変異の意味、治療方法に関する考え方、患者や家族のサポート方法などを含めた。その結果、今までの臨床経験を思い返すと出会っていたと思うが、当時は知識がなく遺伝性腫瘍としての対応はできていなかったと述べる看護師が幾人もいた。また、用語や内容は難しいが、今後は必要となる知識であるため更に勉強したいと希望するものも多かった。今後は、得られた意見をもとに勉強会の内容を適宜修正し、勉強会の回数を重ね洗練させていき、看護教育プログラム試案を作成し実施・評価する予定である。本年度は、昨年度作成したプログラム案の内容を洗練させるため検討を重ねた。

遺伝相談外来の開設直後の施設の看護スタッフに対して、勉強会を開催し、知識の普及および教育プログラム案の内容についてディスカッションを行った。新しい知識であり、遺伝や遺伝子のことは難しいという先入観があるため戸惑いも見られたが、これからの医療においては必要な知識であることを認識し、今後も勉強を行っていくと述べていた。また、看護系大学院のがん看護学特論を担当した際に、プログラム案の内容を含めて講義を行った。その結果、がん看護CNSを目指す院生も、今後は必要になる知識と認識していた。今後は、得られた意見をもとに教育プログラム案をさらに評価・修正し、現任教育や大学院教育、そして看護基礎教育の教育プログラムとして活用してもらえるような提案を行っていく予定である。
肺癌の新しい転移制御遺伝子の検索-癌転移の抑制による治療を目指した検討

我々は、ヌードマウスの異所性移植にて転移するヒト肺癌細胞株HALから、選択・分離した高転移性株HAL-8と非転移株細胞HAL-24を研究材料に、サブトラクション法を用いて新しい転移制御遺伝子の検索を行った。このHAL両細胞間にてこの法を実施して、高転移性株HAL-8に発現している遺伝子断片を得、これをプラスミドベクターに組み込み大腸菌に発現させた後、DNAを抽出して塩基配列決定し、データーベースにてこれらの遺伝子の検索した。発現の検出された遺伝子断片はチトクロームオキシダーゼ等のミトコンドリア遺伝子、リボゾーマル蛋白関連の遺伝子、肺サファクタント、乳酸脱水素酵素、エンドブレビン、マウス筋蛋白、血小板活性因子、ラミニンレセプターおよび既存の遺伝子と一致しない未知の遺伝子断片を得た。後者の遺伝子は胎盤絨毛に弱い相同性を有する全く新しい遺伝子であった。受精卵が絨毛細胞を経て胎児形成にたどる過程は癌細胞の転移と酷似のものであることから大変興味があり、これを解析することで新たな癌転移機構を解明するのに有益な情報が提供できるものと思われる。多くの過程より成る癌の転移機構に、我々はこれまで肺癌で転移を接着分子と癌細胞の産生するサイトカインを中心に検討してきたが、このうち接着分子CD-44にはいくつかのスプライシングバリアントが存在し、肺癌細胞ではこれらが外的な刺激により誘導、促進されることを見い出した。そこで、CD44のリガンドの一つヒアルロン酸(HA)に対する結合能は,バリアントの存在とHAへ結合性が見られた。オステオポンチンは別のCD44の受容体で、これを過剰発現する細胞は転移能が高いと報告されておりが、骨軟部腫瘍細胞株の5株(30%)および肺癌細胞株2株(14%)でmRNAの発現を認め、このうちの1例は骨転移巣から樹立した株である。ヒト骨軟部肉腫患者の多くは肺転移にてて亡くなる。さらにヒト線維芽肉腫のヌードマウスでの自然肺転移腫瘍細胞にプラスミノーゲンアクチベーター(PAI)の増加とuPAの減少が報告されている。そこで、このPAIとuPA mRNAの発現をヒト骨軟部腫瘍細胞および肺癌細胞株で検索ではPAIはおのおの87%、70%で、また、uPAは肺癌の70%で認められた。さらに癌細胞の接着、遊走、浸潤、血管新生に関わっているが蛋白トロンボスポルジン-1(TSP-1)は癌細胞のPAIとuPAを促進するとされており,肺癌細胞株でのTSP-1 mRNAの発現は78%の細胞で確認されたことより、これらを遺伝子を発現する細胞が転移に積極的に関与いるると考えられた。最近、転移制御遺伝子として報告されているKiSS-1 mRNAの発現は肺癌株の50%と骨軟部腫瘍の60%で認められた。ヒトの癌転移を解析する唯一のin vivoモデルとしてヌードマウスがあるが、このモデルの異所性移植では、一搬に,肺転移は生じないが、然しながらこのモデルで自然肺転移する肺癌細胞株をわれわれは樹立し、転移制御遺伝子の検索をする準備中である。癌の治療上の最も重要な課題は癌転移を制御することであり、多くの過程を経て成立する癌転移の各々を解明していくことは、癌治療で最も重要である。我々は肺癌細胞と骨軟部腫瘍細胞株を使用したサイトカイン、血管新生因子、接着因子等の解析を通じて、転移を制御するには、これらの物質の遺伝子そのもの、あるいはこれらを制御する因子の遺伝子を制御すれば可能で、これらの遺伝子が転移制御遺伝子であろうとの仮定から、この遺伝子を検索することにした。そこで、我々はこれらの遺伝子を得るため以下の計画を企てた。一搬に、ヒトの癌転移をヌードマウスの皮下へ異所性移植では多くのバリアーがあり、殆ど癌転移は生じないとされている、然しながら、異所性移植にこそヒト癌転移関連の遺伝子の存在するとの考えから、異所性移植にて転移する肺癌細胞株をから、選択・分離した高転移性株と非転移株細胞の間でサブトラクション法により、新しい転移制御遺伝の検索を行った。両細胞間でこの法を実施して、転移株に発現している遺伝子断片を得、これをプラスミドベクターに組み込み大腸菌に発現させた後、DNAを抽出して塩基配列決定し、データーベースにて遺伝子の検索した。

発現の検出された遺伝子はチトクロームオキシダーゼ等のミトコンドリア遺伝子が4個、リボゾマル蛋白関連のものが2個、肺サファクタント、乳酸脱水素酵素、エンドブレビン、マウス筋蛋白、血小板活性因子、ラミニンレセプターと既存の遺伝子と一致しない末知の遺伝子が4個得られた。この内未知のニつのものについてcDNAライブラリーを作製して、この遺伝子を単離を試みている。
魚類における新規グレリン受容体の同定とその作用連関の解明

本研究において、キンギョの脳から大きく2種類に大別される機能的なグレリン受容体(GHS-R1a,2a)と、それぞれの受容体のサブタイプ(GHS-R1a-1[構成アミノ酸数360アミノ酸(aa)],1a-2[360aa], 2a-1[366aa],2a-2[367aa])、計4種類の受容体cDNAを同定した。それぞれの受容体は組織特異的な遺伝子発現を示し、組織特有の生理作用に関わっていることが示唆された。魚類以外の脊椎動物では1種類のグレリン受容体(GHS-R1a)のみが知られているが、本研究で同定されたGHS-R2aは新しいタイプの受容体であり、これに対する新規リガンドの存在が想定された。キンギョの脳や腸の抽出物を用いて新たなリガンドを探索したが、本研究の期間ではその発見には至らなかった。本研究では、グレリンによる成長ホルモン分泌および摂食亢進作用が明らかとなっており、実験魚として凡庸されているキンギョを用いて、グレリンと生理作用を結びつけるために重要な「受容体」の構造を決定し、その生体内分布や受容体機能の解明を主な目的として、研究を遂行した。研究申請時に、塩基レベルで75%、アミノ酸レベルで82%のホモロジーを示すGHS-R1aの特徴を有した2つのcDNAフラグメント(688bpと692bp)を同定していたが、本年度の研究の結果、その全長を明らかにすることができた。また、2種類あると推定していたcDNAは、それぞれに変異体が存在し、計4種類のcDNAを同定した。692bpのcDNAフラグメントからは、全長が1083bpからなる2種のcDNAが同定された。また、688bpのcDNAフラグメントからは、全長が1101bpあるいは1104bpからなる2種のcDNAが同定された。それぞれのcDNAにコードされているタンパク質のアミノ酸配列は、ゼブラフィッシュのグレリン受容体GHS-R1aおよびGHS-R2aに、それぞれ95%の類似性を示した。次に、その受容体タンパク質部分をコードしているcDNAを哺乳類細胞に強制発現させ、受容体の機能解析をした。その結果、同定した全てのグレリン受容体様受容体がキンギョグレリンあるいはGHSに反応することを見いだした。この結果は、同定したcDNAにコードされているタンパク質がグレリン受容体であることを示しており、そのアミノ酸配列の特徴からキンギョGHS-R1a、GHS-R2aと名付けた。本研究は、キンギョにおいて、グレリン受容体の遺伝子配列を決定し、その遺伝子の生体内分布や受容体の機能性を調べ、キンギョにおけるグレリンの生理作用と受容体との連関を明らかにすることを目的としている。本研究申請時にGHS-R1aの特徴をもつ2つのcDNAフラグメントを同定していたが、20年度にそれらのcDNAの全長を明らかにするとともに、それぞれに対して95%の類似性を示す変異体を同定し、GHS-R1a-1、1a-2、2a-1、2a-2と名付けた。その受容体タンパク質の機能解析をした結果、2a-2以外の受容体タンパク質はキンギョグレリンやGHSに反応することを見いだし、同定した2a-2以外はグレリン受容体であることを確認した。また、その感度は2a-1の方が1a-1や1a-2より良いが、反応性は1a-1や1a-2の方が2a-1より大きいことがわかった。本年度は同定した4つのcDNAがキンギョのゲノム上に存在するかを調べた。その結果、4つのゲノム遺伝子を同定し、タンパク質をコードしている部分のゲノムの長さはそれぞれ1722bp(1a-1)、2059bp(1a-2)、2012bp(2a-1)、2859bp(2a-2)であり、それに含まれるひとつのイントロンの長さはそれぞれ640bp(1a-1)、977bp(1a-2)、909bp(2a-1)、1759bp(2a-2)であった。また、それぞれの遺伝子がどの組織に発現しているのかを調べた結果、1aは終脳、迷走葉、精巣に多く、肝臓、腸、卵巣にも発現が見られたが、1a-2は特に肝臓と精巣で多かった。2a-1は終脳、間脳、迷走葉、精巣に多く、腎臓や卵巣にも存在した。また2a-2は受容体機能が不明であるが、脳組織での遺伝子発現が認められた。

以上の結果は、キンギョには4つのグレリン受容体が存在し、それらは中枢や末梢器官に存在して生理作用を仲介していること示している。これまでの哺乳類を中心としたグレリンの研究では、1種の受容体と、そのリガンドであるグレリンが1種類同定されている。一方、ゼブラフィッシュやキンギョには、アミノ酸配列や性質の異なる2種のグレリン受容体1a、2aが存在する。このことは、キンギョを用いた研究からその各々2種の受容体に対するリガンド、すなわち第2のグレリンが同定できる可能性、また生体における新しいグレリンシステムの存在を示すことができる可能性を示唆する。22年度は、21年度までに同定した4種類のキンギョグレリン受容体(gfGHS-R)1a-1、1a-2、2a-1、2a-2のうち、キンギョグレリンに対して親和性の低かった1a-1、1a-2に対する新しい内在性リガンドの存在を想定し、そのペプチド性リガンドの同定を目指して研究を遂行した。ペプチドホルモンの多い脳およびグレリンの存在する腸の組織抽出物からペプチド画分を得、イオン交換クロマトグラフィーで強塩基性画分を調整し、ゲル濾過HPLC、CMイオン交換HPLC、逆相HPLC等、各種クロマトグラフィーで展開したペプチド分画をgfGHS-R1a-1、1a-2、2a-1ならびにラットグレリン受容体(rGHS-R)を発現させた細胞に処理し、細胞内Caイオン濃度の上昇を指標に新規グレリンを追跡した。その結果、グレリンに高親和性のgfGHS-R2a-1ならびにrGHS-Rでは同定済みのキンギョグレリンを検出し単離できたが、gfGHS-R1a-1および1a-2に対して高親和性に反応するペプチド分画を得ることはできなかった。以上の結果から、少なくとも脳と腸には第2のグレリンが存在していない可能性が高いと結論された。一方、既知のキンギョグレリン遺伝子は脾臓でも高い発現が認められる。従って、脾臓に想定するペプチドが存在する可能性は残っているが、本年度はその実験を遂行することができなかった。
金属ポルフィノイド-14族元素間の結合形成と反応性を支配する配位子効果の評価

平成19年度は、ポルフィリンの構造異性体であるポルフィセンについて4そのコバルト錯体と種々のヒドリド試薬との反応を行った。その結果、Co(II)種とトリブチルスズヒドリド(Bu_3SnH)との反応は非常に遅いが、Co(III)種との反応は低温でスムーズに進行し、紫外可視吸収スペクトルにおいて吸収バンドのレッドシフトが観測された。10-メチルアクリジニウムの添加により吸収スペクトルの回復が見られたことから、Bu_3SnHとの反応によりポルフィリγでは観測不可能なヒドリド錯体が生成したものと考えられる。しかし、NMR測定の高濃度条件では、不溶性のCo(II)種が大量に生成し水素ガスの発生も確認された。そこで、よりヒドリド性の高いスーパーヒドリド試薬(LiHBEt_3)との反応を試みたところ、^1HNMRにおいて、Co-Et結合の生成を確認した。これは、いったん生成したヒドリド錯体に対して、トリエチルボランが生成し、β脱離が起こったものと推察される。本反応は、コバルト上でのβ脱離の反応例として珍しく興味深い。一方、トリフルオロメチル基を有するポルフィセンを合成し、ヒドリド試薬との反応におけるLUMOエネルギーレベルの効果を検討した。紫外可視吸収スペクトル、分光電気化学測定により、Bu_3SnHとの反応では、水素移動ではなく一電子移動により、ポルフィセンπラジカルアニオン種の生成が確認された。また、配位子による中心金属の反応性の劇的な効果を観測するために、20πポルフィセン配位子の合成を行い、NMRおよびX線結晶構造解析により同定した。20πポリフィリノイドは一般に単離が困難であり、本研究結果は、ポルフィリン化学においてユニークなものであると位置づけられる。
オオムギ属植物における二次代謝の進化のメカニズムとその生態学的意義

植物は病原菌の感染に対し、抗菌性の防御物質を用いた防御機構を有する。オオムギ属植物は、4つのクレード(H、Xu、XaおよびIクレード)に分類される。これまでにオオムギ属植物の防御物質を調べたところ、XaとIクレードに属する種はベンゾキサジノン類(Bx類)を蓄積する一方で、栽培オオムギを含むHとXuクレードの種はホルダチン類などの桂皮酸アミド二量体類を蓄積することが明らかとなった。この防御物質の変化は桂皮酸アミドを二量化する酵素遺伝子の獲得により生じたと考えられる。しかし、ホルダチンなどの生合成に関わる遺伝子は特定されていない。またBx類と桂皮酸アミド二量体の生理活性の違いはわかっておらず、防御物質の変化の意義は不明である。そこで、本研究の目的を「オオムギ属植物における二次代謝の進化のメカニズムと意義の解明」とし研究を行なった。オオムギ由来の粗酵素を用いたラッカーゼの反応により、ホルダチンが生成されることがわかった。またホルダチンの蓄積には第2染色体の末端領域が関わることがわかっている。そこで、この領域に存在するラッカーゼ遺伝子を調べ、2つの遺伝子を候補とした。タバコにおいて候補遺伝子を異種発現させ、組換え酵素を得た。組換え酵素の機能解析を行なったところ、HS活性を示すことがわかった。オオムギにおける候補遺伝子の遺伝子発現量はHS活性およびホルダチンの蓄積量と同じ動態を示した。これらの結果より、候補遺伝子がホルダチンの生合成に関与することが示唆された。桂皮酸アミド二量体類とBx類の生物活性の評価を行なった。桂皮酸アミド二量体類は糸状菌の病原菌に対して、強い抗菌活性を示した。一方で、細菌の病原菌に対しては、Bx類の方が強い抗菌活性を示した。これらのことから、オオムギ属植物の進化における桂皮酸アミド二量体類の獲得は糸状菌の病原菌に対する防御機構に関与していると考えられる。ホルダチンは、オオムギ芽生えに特異的に蓄積する抗菌性物質である。ホルダチン合成酵素の発見、および酵素遺伝子の単離および生物活性の評価を目標に研究を行なった。困難が予想された研究であるが、着実に成果を積み重ねることができ、昨年度の進展は非常に大きい。まず、オオムギ染色体断片置換コムギを用いた探索から候補遺伝子を含む染色体領域を絞り込んだ。さらにこの領域に座乗している遺伝子をデータベースで解析し、2種のラッカーゼ遺伝子を候補として選抜した。これらの遺伝子をアグロバクテリウム・インフィルトレーション法でタバコに導入し発現させた。タバコから酵素を抽出しp-クマロイルアグマチンを基質として酵素反応を行うと、ホルダチンAが生成した。このホルダチンAは天然物と同一の立体配置であった。立体特異的なフェノール性物質の二量化反応を触媒する酵素を発見することに成功した。また桂皮酸アミド二量体類とBx類の生物活性の評価を行なった。桂皮酸アミド二量体類は糸状菌の病原菌に対して、強い抗菌活性を示す一方で、細菌の病原菌に対しては、Bx類の方が強い抗菌活性を示した。これらの結果から、桂皮酸アミド二量体類の獲得は糸状菌の病原菌に対する防御機構として獲得されたものであると推察された。多くの病原菌を扱うことから、それぞれの培養および抗菌活性の測定条件を確立する必要があったが、最適な条件を見出し、生物活性を評価することができた。そして、最終的には各化合物の意義を明らかにできた。以上のことから、本研究課題は順調に進展していると考える。前年度までに経皮酸アミド二量体類とBx類の生物活性の違いを明らかにした。オオムギの粗酵素からHS活性を見出し、ホルダチンの蓄積量に関わる染色体領域からHS遺伝子の候補遺伝子を推定した。加えて、アグロバクテリウム・インフィルトレーション法を用い、タバコにおいて候補遺伝子を異種発現し、機能解析を行なった。その結果、HS活性を有していた。しかしながら候補遺伝子の欠損植物の作成は達成されていない。本年度は、候補遺伝子の欠損植物の作成を引き続き行う。得られた欠損植物の確認には、シーケンス解析を行い、配列の変異を明らかにする。そして、ホルダチンの蓄積を有無を調べることで、候補遺伝子のホルダチン生合成への関与を調べる。他のオオムギ属植物におけるHSオルソログの機能解析を行う。特にHordeum murinumは、桂皮酸アミド二量体であるムリナミド類を蓄積することから、HSと類似したオルソログを発現していると考えられる。H. murinumをはじめとしたオオムギ属植物におけるHSオルソログの有無を明らかにする。HSオルソログを有する場合、遺伝子発現発現量やタバコを用いた異種発現を行う。得た組み換えタンパク質の基質特異性などの性状解析を行い、HSとの比較を行う。H. murinumの有するHSオルソログの機能と配列の比較を行うことで、どの領域がホルダチン類とムリナミド類の生成を区別しているのかを明らかにする。以上の研究を行うことで、ホルダチンの生合成酵素および遺伝子を同定することができる。加えて、オオムギ属植物の進化の過程で生じた経皮酸アミド二量体類の獲得がどんな変異によってもたらされたものかを明らかにする。これらにより、オオムギ属植物の進化過程における二次代謝の変動のメカニズムを示すことができると考える。

植物は病原菌の感染に対し、抗菌性の防御物質を用いた防御機構を有する。オオムギ属植物は、4つのクレード(H、Xu、XaおよびIクレード)に分類される。これまでにオオムギ属植物の防御物質を調べたところ、XaとIクレードに属する種はベンゾキサジノン類(Bx類)を蓄積する一方で、栽培オオムギを含むHとXuクレードの種はホルダチン類などの桂皮酸アミド二量体類を蓄積することが明らかとなった。この防御物質の変化は桂皮酸アミドを二量化する酵素遺伝子の獲得により生じたと考えられる。しかし、ホルダチンなどの生合成に関わる遺伝子は特定されていない。またBx類と桂皮酸アミド二量体の生理活性の違いはわかっておらず、防御物質の変化の意義は不明である。そこで、本研究の目的を「オオムギ属植物における二次代謝の進化のメカニズムと意義の解明」とし研究を行なった。オオムギ由来の粗酵素を用いたラッカーゼの反応により、ホルダチンが生成されることがわかった。またホルダチンの蓄積には第2染色体の末端領域が関わることがわかっている。そこで、この領域に存在するラッカーゼ遺伝子を調べ、2つの遺伝子を候補とした。タバコにおいて候補遺伝子を異種発現させ、組換え酵素を得た。組換え酵素の機能解析を行なったところ、HS活性を示すことがわかった。オオムギにおける候補遺伝子の遺伝子発現量はHS活性およびホルダチンの蓄積量と同じ動態を示した。これらの結果より、候補遺伝子がホルダチンの生合成に関与することが示唆された。桂皮酸アミド二量体類とBx類の生物活性の評価を行なった。桂皮酸アミド二量体類は糸状菌の病原菌に対して、強い抗菌活性を示した。一方で、細菌の病原菌に対しては、Bx類の方が強い抗菌活性を示した。これらのことから、オオムギ属植物の進化における桂皮酸アミド二量体類の獲得は糸状菌の病原菌に対する防御機構に関与していると考えられる。ホルダチンは、オオムギ芽生えに特異的に蓄積する抗菌性物質である。ホルダチン合成酵素の発見、および酵素遺伝子の単離および生物活性の評価を目標に研究を行なった。困難が予想された研究であるが、着実に成果を積み重ねることができ、昨年度の進展は非常に大きい。まず、オオムギ染色体断片置換コムギを用いた探索から候補遺伝子を含む染色体領域を絞り込んだ。さらにこの領域に座乗している遺伝子をデータベースで解析し、2種のラッカーゼ遺伝子を候補として選抜した。これらの遺伝子をアグロバクテリウム・インフィルトレーション法でタバコに導入し発現させた。タバコから酵素を抽出しp-クマロイルアグマチンを基質として酵素反応を行うと、ホルダチンAが生成した。このホルダチンAは天然物と同一の立体配置であった。立体特異的なフェノール性物質の二量化反応を触媒する酵素を発見することに成功した。また桂皮酸アミド二量体類とBx類の生物活性の評価を行なった。桂皮酸アミド二量体類は糸状菌の病原菌に対して、強い抗菌活性を示す一方で、細菌の病原菌に対しては、Bx類の方が強い抗菌活性を示した。これらの結果から、桂皮酸アミド二量体類の獲得は糸状菌の病原菌に対する防御機構として獲得されたものであると推察された。
血管性ニッチを応用した徐放型幹細胞療法の開発

幹細胞を用いた組織再生療法には、幹細胞の維持と再生組織構成細胞の持続的な産生のバランスが非常に重要である。血管内皮細胞は、骨髄組織において造血幹細胞の維持と前駆細胞の産生バランスを保つための微小環境が存在し、血管性ニッチとよばれている。しかしながら、この血管性ニッチが、血管内皮細胞から分泌される様々な因子によって、機能維持されている詳細なメカニズムは不明な点が多い。我々は血管性ニッチにおいても重要な役割を演じていると考えられているWntおよびヘッジホッグシグナルに注目し、未分化間葉細胞における両分子シグナルを解析することにより、効率的な骨芽細胞誘導能を示す新規小分子化合物を発見した。組織内に存在する幹細胞を応用した再生研究が、歯科医学研究の中でも注目を集めている。組織障害や損傷部に幹細胞を用いた治療を考えた場合、患部に応用した幹細胞が必要な細胞集団に分化し、元の組織へ再構築することが現在の再生療法である。しかしながら、組織修復後に再度何らかの障害が生じた場合には、新たに幹細胞を調整し再注入する必要があると考えられる。マウス間葉系幹細胞の細胞株であるC3H10T1/2細胞に、幹細胞誘導薬剤BIO(GSK3beta inhibitor IX)を添加(2 uM)し実験を行い、幹細胞マーカーであるNanog, Oct3/4などの発現が増強し、骨芽細胞分化を誘導しない低濃度(20 ng/ml)のBMP2を添加により骨芽細胞に効率に分化することを見いだした。このメカニズムを解明するため、細胞内シグナル分子のスクリーニングを行った。その結果、BIO処理されたC3H10T1/2細胞において、多くの組織の幹細胞の維持、器官構成細胞の分化などを制御しているソニックヘッジホッグの標的分子、Gliを増強していることが明らかとなった。つまり、間葉系幹細胞であるC3H10T1/2細胞において、WntシグナルとShhシグナルの細胞内クロストークが行われていることが強く示唆された。本年度はマウス間葉系幹細胞の細胞株であるC3H10T1/2細胞に、幹細胞誘導薬剤BIO(GSK3beta inhibitor IX)を添加(2 uM)し実験を行った。BIOを添加すると線維芽細胞様形態をしていたC3H10T1/2細胞は、より細長い紡錘形の細胞形態へと変化した。また、幹細胞マーカーであるNanog, Oct3/4などの発現が増強した。このことから、マウスの組織から得られた初代培養細胞に幹細胞誘導薬剤BIOを添加することにより、幹細胞の性質を保持した細胞群を効率に作成できる可能性が考えられた。また、興味深いことに、BIOで処理したC3H10T1/2細胞に、通常では骨芽細胞分化を誘導しない低濃度(20 ng/ml)のBMP2を添加し、骨芽細胞への分化能を評価した。骨芽細胞分化の指標は、アルカリフォスファターゼ活性を指標とした。BIO単独および低濃度のBMP-2を添加した細胞群では、細胞のALP活性は有意に増加しなかった。一方、BIOで処理をした細胞群に低濃度のBMP-2を添加した細胞群のALP活性が強力に誘導された。このことから、骨芽細胞以外にも軟骨、脂肪、線維芽細胞への分化能を有するC3H10T1/2細胞がBIOで処理されたことにより、より効率よく分化方向の決定が行われた事が示唆された。我々は血管性ニッチにおいても重要な役割を演じていると考えられているWntおよびヘッジホッグシグナルに注目し、未分化間葉細胞における両分子シグナルを解析した。幹細胞を用いた組織再生療法の臨床応用には、生物由来の蛋白などを用いることなく、化学合成可能な小分子化合物が有用であると考えられている。そのため実験にはWntシグナル、ヘッジホッグシグナルのアゴニストをそれぞれ用いた。

Wntアゴニスト、BIO(GSK3beta阻害剤)をマウス間葉系幹細胞細胞株C3H10T1/2に添加すると、幹細胞マーカーであるNanog, Oct3/4等の発現が増強した。さらに、C3H10T1/2細胞にBIOを作用させた後、骨芽細胞分化誘導因子である骨形成蛋白BMP2を添加すると、非常に効率よくさらに短期間で骨芽細胞に分化誘導できることを見出した。また、ヘッジホッグシグナルのアゴニストとして、現在開発段階であるHH-Ag1.3およびHH-Ag1.7を用いた。C3H10T1/2細胞にHH-Ag1.3およびHH-Ag1.7を添加すると、両アゴニストは細胞のアルカリホスファターゼ活性を増加させ、未分化間葉系細胞を骨芽細胞に誘導する事が明らかとなった。そこで骨芽細胞後期分化でみられる基質石灰化を検討してみると、BMP2存在下にて、HH-Ag1.3の石灰化誘導能が低いのに対し、HH-Ag1.7は強力に基質の石灰化を誘導させる能力がある事が明らかとなった。また、HH-Ag1.7の石灰化増強作用は、Runx2遺伝子の下流のOsterixの発現増強に起因することも明らかとなった。医歯薬学マウス多能性間葉系幹細胞であるC3H10T1/2細胞は、骨芽細胞、軟骨細胞、線維芽細胞、脂肪細胞などに分化能を有する。この細胞に、幹細胞誘導剤であるBIOを添加することにより、BIOの標的であるWntシグナルだけでなく、Shhシグナルの細胞内クロストークが起こっていることを見いだした。この結果は、BIOという小分子化合物の新たな活性経路の発見に繋がるのみならず、複数の相乗的なシグナル伝達を可能にし、再生医療に用いる薬剤として、より効率的な応用法の樹立に繋がると考えている。マウス多能性間葉系幹細胞であるC3H10T1/2細胞は、骨芽細胞、軟骨細胞、線維芽細胞、脂肪細胞などに分化能を有する。この細胞に、幹細胞誘導剤であるBIOを添加することにより、幹細胞マーカー発現が上昇した。この知見は、臨床応用を考えた場合、少量の細胞ソースから、効率に幹細胞誘導を実現化する手法として極めて有用であると考える。初年度で、このような知見を得たことから、本研究の進展は順調であると判断する。1、2年の研究により、血管性ニッチの維持に重要な役割を演じているWntシグナルのアゴニストが、間葉系幹細胞であるC3H10T1/2細胞のBMP感受性を増強する能力がある事が判明した。また、その作用機序のひとつに、Shhシグナルとのクロストークが起こっていることが強く示唆された。本年度は、この細胞内シグナルクロストークのメカニズムを明らかにし、研究結果をインパクトファクターが付与されている国際誌に発表する。1年目の研究により、マウス多能性間葉系幹細胞であるC3H10T1/2細胞は、幹細胞誘導剤であるBIOを添加することにより、より幹細胞され、骨芽細胞への分化誘導効率も、劇的に上昇した。この手法が普遍的であるか否かを本年度はマウス歯胚より調整したマウス間葉細胞およびマウス歯髄幹細胞を用いて検討する。未分化状態の評価の為に、あらかじめ薬剤誘導型歯髄幹細胞にOct3/4およびNanogプロモーターGFP発現ベクターを遺伝し導入し、未分化状態が維持されている場合には、GFP陽性となり、分化した細胞はGFP陰性になるような遺伝子操作をあらかじめ行っておく。
微細藻類のゲル封入培養法の構築と脂質蓄積促進のメカニズムの解明

近年、持続可能なエネルギー資源として、微細藻類がもつ高い脂質・炭化水素生産に期待が集まっている。そこで、微細藻類の大規模な培養技術が試験的に試みられているものの、微細藻類の大量培養を行った場合、約十マイクロメートルの小さな藻類細胞の回収が困難であるだけでなく、微生物のコンタミケーションにより培養に失敗するといった問題がある。そこで申請者は、微細藻類をハイドロゲル内に封入することで、回収やコンタミネーションの問題を解決するだけでなく、藻類オイルの生産性を上げることのできる特殊な環境を構築できると考えた。本研究では、アルギン酸ゲルに微細藻類クラミドモナスデバリャーナを封入したところ、培養開始後、ゲルが透明な状態からだんだんとクロロフィル由来の緑色に変化することを確認した。またゲル内では、球状の細胞凝集体を形成し、細胞増殖速度が高まることを見出した。細胞数を比べると、92時間の段階で、ゲルに封入された細胞数は、通常培養を行った際の細胞数に比べて、6倍も高いことが明らかとなった。また脂質蓄積について評価すると、ゲルに封入することにより168時間の段階で、2.5倍、312時間の段階で1.3倍トリアシルグリセロール蓄積量が高まることを見出した。また脂肪酸組成について調べると、ゲルに封入することにより一価不飽和脂肪酸量が増大することを確認した。これらの結果から、ハイドロゲル内という特殊な環境が微細藻類の形態を制御するだけでなく、細胞内の代謝にも影響を与えることが明らかとなった。現在、論文投稿準備準備中の段階である。今後は、RNAseqなどを行うことで、ゲル封入培養による細胞増殖促進の機構などを明らかにする。本年度、粘弾性測定装置を購入する予定であったが、他の研究室の装置を使用させていただくことができ、購入しなかった。翌年度分として、当初の予定であったガスクロマトグラフィーをアップグレードして購入する予定である。
口腔癌の悪性度の定量的指標とその診断と治療への応用

口腔癌における細胞動態を,核DNAとRNA量の多重顕微蛍光測光および,AgーNORs,BrdUやPCNA(proliferating cell nuclear antigen)などの核内増殖関連因子の組織学的,免疫組織学的検索により解析し、その解析結果と臨床、病理的因子との多変量解析により,口腔癌悪性度の定量的指標を求めた。1.口腔癌の細胞動態解析.核DNAとRNAの量的変化は口腔癌細胞の細胞動態を反映していた.放射線外照射,PEPやCDDPの治療課程での核DNAーRNAサイトグラムの変化と細胞像との関係では,効果の高いものでは,早期から高いDNA量とRNA量をもった細胞が増加し(G2M期ブロック),それとともに,変性細胞も増加した.逆に治療効果の低いものでは,核DNA量,RNA量ならびに細胞像とも変化が少なく,核DNAーRNAサイトグラムは治療効果,感受性の指標となることが確認された.また,核小体内AgーNORs数は細胞増殖活性と正の相関があり,その消失は細胞活性の消失ないし細胞死の課程と考えられた.PCNA標識細胞は概ね,BrdU標識細胞と一致し,S期細胞の検出に有用であることが確認された.2.口腔癌周辺上皮の細胞動態,DMBAに誘発されたハムスタ-頬嚢の周辺には,さまざまな程度の上皮異形成や乳頭状の上皮増殖が認められ,核DNA量の分散、4C以上の細胞頻度は癌に類似した.臨床例の癌周辺異常上皮でも,核DNA量がaneuploidy patternを示したり,また核DNA量の分散,4C以上の細胞頻度が癌の最低値を越えるものが多くみられ,これら上皮は癌の母組織として悪性化の可能性が高いことが示された.3.多変量解析の結果,リンパ節転移には原発巣の大きさ,部位,視診型,組織学的悪性度,核DNAーRNAサイトグラムパタ-ンが,放射線,化学療法効果には核DNA量,RNA量と増殖関連因子が寄与することが明らかにされた.口腔癌における細胞動態を,核DNAとRNA量の多重顕微蛍光測光および,AgーNORs,BrdUやPCNA(proliferating cell nuclear antigen)などの核内増殖関連因子の組織学的,免疫組織学的検索により解析し、その解析結果と臨床、病理的因子との多変量解析により,口腔癌悪性度の定量的指標を求めた。1.口腔癌の細胞動態解析.核DNAとRNAの量的変化は口腔癌細胞の細胞動態を反映していた.放射線外照射,PEPやCDDPの治療課程での核DNAーRNAサイトグラムの変化と細胞像との関係では,効果の高いものでは,早期から高いDNA量とRNA量をもった細胞が増加し(G2M期ブロック),それとともに,変性細胞も増加した.逆に治療効果の低いものでは,核DNA量,RNA量ならびに細胞像とも変化が少なく,核DNAーRNAサイトグラムは治療効果,感受性の指標となることが確認された.また,核小体内AgーNORs数は細胞増殖活性と正の相関があり,その消失は細胞活性の消失ないし細胞死の課程と考えられた.PCNA標識細胞は概ね,BrdU標識細胞と一致し,S期細胞の検出に有用であることが確認された.2.口腔癌周辺上皮の細胞動態,DMBAに誘発されたハムスタ-頬嚢の周辺には,さまざまな程度の上皮異形成や乳頭状の上皮増殖が認められ,核DNA量の分散、4C以上の細胞頻度は癌に類似した.臨床例の癌周辺異常上皮でも,核DNA量がaneuploidy patternを示したり,また核DNA量の分散,4C以上の細胞頻度が癌の最低値を越えるものが多くみられ,これら上皮は癌の母組織として悪性化の可能性が高いことが示された.3.多変量解析の結果,リンパ節転移には原発巣の大きさ,部位,視診型,組織学的悪性度,核DNAーRNAサイトグラムパタ-ンが,放射線,化学療法効果には核DNA量,RNA量と増殖関連因子が寄与することが明らかにされた.1.細胞培養系(ヒト歯肉癌由来培養細胞CA9ー22)における細胞動態解析について1)PEP,CDDPでは濃度の増加、時間の経過とともにG2M期ブロックとRNA量の著明な増大(unbalance block)がみられた。これらの細胞群は核、細胞質および核小体の腫大したものが多く、なかには変性像を示すなど、大部分は細胞死の過程をとると思われた。5FUではS期ブロックがみられるが、RNAの増加、細胞質等の腫大はみられなかった。2)NORの検索法としてHOWELL&BLACKのone step法に改良を加え銀粒子のconntami,を除去することができた。今後は個々の細胞ごとに粒子数を算出し、細胞増殖との関連性を検索する予定にしている。2.口腔粘膜誘発癌における細胞運態解析について1)ハムスタ-頬嚢DMBA塗布により、癌は8ー16週で、多中心性に発生し、その周辺にはさまざまな程度の上皮異形成や乳頭状の上皮増殖が認められた。2)癌周辺上皮にはDNA量、核面積およびBrodUの分布状態などからすでに癌の細胞動態に類似したものがみられ、このような部分はいずれ浸潤癌に移行すると考えられた。3.口腔癌臨床例の細胞動態解析について1)口腔扁平上皮癌のDNAーRNA量サイトグラム型およびその変動様式はin vitroの結果と相応し、放射線や化学の癌法の効果と密に関連して、治療法選択の1指標となっている。