hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
「職人歌合」に基づく日独生産文化の比較史的研究

主に二つに分類できる方向と題材を基に行い、以下のような研究の進展があった。A.「職人歌合」のもつ(1)伝統継承の側面と、(2)時代の社会構造的転換が詩的表現に反映されている様相に関して、(3)同時代ドイツの伝統詩の継承や表現様式等の変遷との「比較」を検討してきた。これには(4)詩歌の社会的担い手(文化と階層の関係)の問題が関連しており、平行的に調査を進めている。B.詩歌の伝統継承に深く関わる「伝統的な概念」や「モチーフ」の継承と変容過程に関して、主に、神話モチーフの継承と変容の面から研究を進め、一部成果を纏め発表した(研究発表欄に論文に関しては記載した。その他、04年9月に行われたラトヴィア大学シンポジウムでは口頭報告も行った)。A及びBを進展させる過程においては、特に、近年ドイツの文化史研究で研究方法上に大きな影響を与えている、エジプト学者、ヤン・アスマンによる『文化的記憶』の研究に注目してきた。類型化された固有の文化的伝統が形成される仕組み、更には或る文化特有の求心力をもつ「心性」が形成され、それによって今度は文化が方向付けられていく仕組み等の解明の方法を特に参考にしている。生産の基盤を成す共同労働の編成や労働価値意識の方向付けなどに与える文化の影響(生産文化)の在り方を考える上に重要だと思われる。このアスマンの研究方法が日本文化研究に関しても有用である事を証明した内容を「序論」とし、既発表論文を纏め直し、未発表論文を加えて全体を統一視点からドイツ語で纏めた著書原稿(当研究成果の一部)を「平成17年度科学研究費研究成果公開促進費(学術図書)」に応募している。A:11.研究発表(平成17年度の研究成果)に記載したハンブルク大学東洋学部に提出したHabilitation論文では、モチーフの継承を共通テーマとする7つの論文から成っている。これによって、イメージやメンタリティーが継承されて古代以来継承されてきた神話から多数のvariationが派生し、後世多くの詩歌や物語の表現素材となった過程を明らかにした。モチーフ伝承と後世のイメージや表現形成の関係を、主に(1)記号論と構造主義の理論/方法に拠り、(2)通時的な継承/変容の要素の分析、(3)(2)の仕組み、(4)主人公に各時代の新興社会階層を取り込みつつ、モチーフ継承に伴って思考構造やメンタリティーが時代の進展に伴って拡大する享受者層に継承され変容を繰り返していく仕組みの解明を試みた。11.研究発表記載の二つの口頭発表のテーマも、同様の観点に立ったものであり、モチーフの継承に伴う日本文化における伝統やメンタリティーの継承やアイデンテイテイー形成の問題を扱った。B:和歌作品を基礎にドイツ中世のMinneとの間で行っている表象と比喩表現に関する比較研究の為の調査を次の点に関して行った。1)三条西実隆を中心とする中世後期和歌における伝統継承の諸相に関する調査2)Aby M.Warburgが行った西洋伝統詩歌のイメージ連鎖の研究、彼の収集資料を基にしたその後の研究についての調査3)中世社会の文化と社会組織の継承と革新に関する日独の研究成果に関する調査の整理以上に加えて、ドイツ中世史研究(特にドイツ中世史に関するドイツでの研究)の文献収集、詩歌分析の方法論の勉強を行った。以下の5点に研究重点をおき調査研究を行った。(1)「七十一番職人歌合」の構造的特色とその和歌史的意味:比喩表現(Metapher)の構造に関して和歌史的調査を行い、Meistergesang(職匠歌)の場合との比較を行った。
視運動性眼振の皮質,皮質下経路の接点である視索核のシナプス結合に関する電顕的研究

視索核(NOT)は視運動性眼振(OKN)の第一中継核として知られ、大脳を経由するOKNの信号も脳幹に入る際、NOTを経由するすることが、判明している。OKNの皮質下経路には3つのルートが形態学的に証明されており、左右のNOTは大脳からのOKNの入力を受け、利得の制御を行っていることが示唆された(Watanabe et al,1993)。NOTのいかなる細胞が対側NOTから入力をもらい、その細胞が大脳からの信号を受けているのか、またそのうちのどのような細胞が下行して前庭核に到達し、OKNを駆動しているのか。今回、これを順行性、逆行性軸索移動物質を使用し、電顕的かつ組織化学的に検討してみた。Kato et al(1988)の方法に従って、全麻下にネコを固定し、マニトールを使用して、大脳鎌を剥離し、顕微鏡下に視葢前域を明視下におく。1)同定されたNOTに逆行性軸索移動物質であるHRPを注入し、大脳視覚領のどの部位が標識されるかを検討した。その結果、17、18、19野及び上シルビウス野が標識された。2)最も染まる視覚領は17、18、19野で、上シルビウス野も標識されていたため、まず、17野に順行性軸索移動物質であるビオチネイトデキストランを注入したところ、同側NOTを含んだ視葢前域、外側膝状体に及ぶ広範囲にしかも密に標識された線維と神経終末をもっていた。3)次いで、同側NOTに順行性トレーサーであるバイオサイチンを注入し、対側NOTの標識細胞をみた。その結果、注入部位の出血、壊死のためか、交連線維を通って同側NOTから対側NOTに向かう順行性標識線維と神経終末は極めて疎であり、逆行性標識細胞との関連を見出せなかった。目下、バイオサイチンを脳定位で打ち込む予定にしている。
Naxイオンチャンネルの生理機能

Na_xチャンネルは電位依存性ナトリウムチャンネルと構造的に相同性を有するが、チャンネル機能、生理的役割ともに不明であった。本研究ではこれらの解明のため、Na_xを一様に発現している脊髄後根神経節(DRG)細胞を野生型マウスとNa_x遺伝子欠損マウスから単離し、細胞外液のイオン濃度を変化させる実験を行った。野生型マウスの単離細胞では、10mM程度の細胞外ナトリウムイオンの上昇に応答する細胞内ナトリウムイオン濃度の上昇応答が見られたのに対して、Na_x遺伝子欠損マウス由来のDRG細胞では、まったく見られなかった。次に、Na_x発現ベクターを構築し、欠損マウス由来の細胞に導入すると、野生型マウス由来の細胞と同様の応答が出現した。また、塩濃度検出中枢である脳弓下器官の神経細胞を用いて同様の実験を行ったところ、Na_x発現ニューロンにおいて選択的に、同様の細胞内ナトリウムイオン濃度の上昇が認められた。以上の結果により、中枢における塩分濃度検出機構においてNa_xが重要であるとの確証が得られた。一方、Na_xが中枢神経系の脳室周囲器官に発現する細胞外ナトリウム感受性ナトリウムチャンネルであることに着目し、末梢器官での発現分布を細胞レベルで解析した。その結果、肺、心臓、腸、膀胱、腎臓、舌などの内臓の末梢神経束で一部のシュワン細胞が陽性だった。電顕での解析で、これらの細胞はミエリンを巻いていないシュワン細胞であった。肺では、肺胞2型細胞が陽性であった。以上の結果から、Na_xナトリウムチャンネルは、これらの細胞の細胞外ナトリウムレベルの制御に関わっているとの知見を得た。
空気圧を用いた介護用ロボットアームの開発

空気圧シリンダを用いたリハビリ支援用ロボットアームを設計製作し,スティフネス制御を用いて立ち上がり動作をアシストする実験を行った.被験者の各関節の動きを画像計測し,膝で発生しているトルクを推定することで,アシスト力を定量的に評価した.また,被験者の体格差が及ぼす影響を調べた.その結果以下の知見を得た.・スティフネス制御が立ち上がり動作のアシストに有効な制御方法であることがわかった.しかし,アシストの割合を大きくするにつれて,アームの動きが速くなってしまう.・被験者の体重差が1.5倍あると,同一の制御パラメータではアシストの割合が2倍程度異なることがわかった.体重が重いほど,同一の条件下ではアシスト率が小さくなる.・上記の結果より,被験者の体重が既知である必要がある.本研究から地面に水平になるように制御されたアームに被験者がもたれかかった時,55kgから95kgの被験者に対して体重とシリンダにかかる力には比例関係があることがわかった.よって被験者の体重は自動に推定可能となった.・既知な体重の被験者が介助されながら立ち上がる時,シリンダが発する力が振動しないための比例ゲインを実験によって求め,良好な制御が行なえるようになった.・被験者の体重とアシスト率の関係を調べ,介助に必要なスティフネス制御の制御パラメータを導出可能な関係式を導いた.本年度は空気圧サーボ弁とシリンダで構成される立ち上がり動作を介助する2軸の空気圧ロボットアームを開発、制御実験を行い、以下のことを明らかにした。・空気圧シリンダの制御に使用する高速駆動が可能な直動型サーボ弁の静特性と動特性を報告者らが提案した等温化圧力容器を用いた流量計測法で計測した。その結果、空気圧サーボ弁がオーバラップ特性を有していることを明らかにした。また100Hzまでは十分駆動が可能であることが分かった。・空気圧サーボ弁のオーバラップ特性およびシリンダの摩擦特性はシリンダを正弦波状に駆動する場合に悪影響を及ぼすことを明らかにした。特に正弦波の山と谷で影響が大きいことが分かった。その改善方法として制御則に繰返し制御を用いることが有効であることを実験によって明らかにした。・空気圧シリンダを用いた2軸の介護用ロボットアームを設計製作した。シリンダの先端では最大600Nの力を発生できるように設計し、フレームの材質にはアルミを用い、アルミ溶接を多用することで部品点数の削減、軽量化を図った。・介護用ロボットの制御則としてスティッフネス制御を用いた実験を行った。健常者に対して1軸のみを駆動し立ち上がり動作をアシストする実験を行った。またその際に被験者の膝、腰の角度を測定し、膝で発生しているトルクを推定することでロボットの性能評価を行った。その結果、立ち上がり動作中、最大100%、平均80%までのアシストが実現できることを明らかにした。空気圧シリンダを用いたリハビリ支援用ロボットアームを設計製作し,スティフネス制御を用いて立ち上がり動作をアシストする実験を行った.被験者の各関節の動きを画像計測し,膝で発生しているトルクを推定することで,アシスト力を定量的に評価した.また,被験者の体格差が及ぼす影響を調べた.その結果以下の知見を得た.・スティフネス制御が立ち上がり動作のアシストに有効な制御方法であることがわかった.しかし,アシストの割合を大きくするにつれて,アームの動きが速くなってしまう.・被験者の体重差が1.5倍あると,同一の制御パラメータではアシストの割合が2倍程度異なることがわかった.体重が重いほど,同一の条件下ではアシスト率が小さくなる.・上記の結果より,被験者の体重が既知である必要がある.本研究から地面に水平になるように制御されたアームに被験者がもたれかかった時,55kgから95kgの被験者に対して体重とシリンダにかかる力には比例関係があることがわかった.よって被験者の体重は自動に推定可能となった.・既知な体重の被験者が介助されながら立ち上がる時,シリンダが発する力が振動しないための比例ゲインを実験によって求め,良好な制御が行なえるようになった.・被験者の体重とアシスト率の関係を調べ,介助に必要なスティフネス制御の制御パラメータを導出可能な関係式を導いた.
細胞表面シアル酸含有複合糖質の修飾による癌の転移抑制とその機作

我々が開発したシアル酸転移酵素阻害剤(KIー8110;シアル酸誘導体とヌクレオシドの化合物)は,細胞表面シアル酸代謝を阻害するとともにマウス結腸癌由来転移性癌細胞NLー17の肺への転移を抑制する.この癌転移抑制の機作を明らかにするために癌転移の各過程(NLー17細胞は静注した時に転移性を示すので本研究では癌細胞が血管に侵入した後に重要と考えられる過程)へのKIー8110の影響を調べた.細胞表面シアル酸の減少はその細胞の免疫原性を高め細胞障害性T細胞に攻撃されやすくなると考えられるが, NL細胞の細胞障害性T細胞に対する感受性は変化せず, KIー8110の転移抑制効果はNL細胞表面のシアル酸減少による免疫原性の上昇のためとは考えられなかった.細静脈毛細血管での癌細胞の捕捉と関連する癌細胞の血小板凝集能はKIー8110により抑制された.NL細胞をシアリダーゼ処理あるいはLimaxfluvas凝集素(シアル酸に特異的に結合するレクチン)処理した時にも同様な血小板凝集能の低下がみられた.またシアリルラクトース,牛顎下腺をNL細胞による血小板凝集の系に加えた時にも凝集能の抑制がみられたが, fetuinやアシアロ牛顎下腺ムチン存在下では凝集能の低下が見られず, NL細胞による血小板凝集には細胞表面のシアル酸含有複合糖質が関係しシアル酸の存在することが重要であると推測された.一方,癌細胞が宿主の標的部位で成長していく現象と関連する細胞成長因子に対する癌細胞の反応性の変化を調べたところ, KIー8110は血小板由来成長因子(PDGF)によるNLー17細胞の細胞成長を抑制した. KIー8110処理によりPDGFにより誘導されるPDGF受容体のリン酸化も抑制されたが,シアリダーゼ処理によっも同様の抑制が生じた.以上の結果, KIー8110は, NLー17細胞と宿主の血小板との相互作用を癌細胞表面のシアル酸含量を減少させることにより,少なくとも2つの過程で阻害し,この癌細胞の肺への転移を抑制するものと考えられた.我々が開発したシアル酸転移酵素阻害剤(KIー8110;シアル酸誘導体とヌクレオシドの化合物)は,細胞表面シアル酸代謝を阻害するとともにマウス結腸癌由来転移性癌細胞NLー17の肺への転移を抑制する.この癌転移抑制の機作を明らかにするために癌転移の各過程(NLー17細胞は静注した時に転移性を示すので本研究では癌細胞が血管に侵入した後に重要と考えられる過程)へのKIー8110の影響を調べた.細胞表面シアル酸の減少はその細胞の免疫原性を高め細胞障害性T細胞に攻撃されやすくなると考えられるが, NL細胞の細胞障害性T細胞に対する感受性は変化せず, KIー8110の転移抑制効果はNL細胞表面のシアル酸減少による免疫原性の上昇のためとは考えられなかった.細静脈毛細血管での癌細胞の捕捉と関連する癌細胞の血小板凝集能はKIー8110により抑制された.NL細胞をシアリダーゼ処理あるいはLimaxfluvas凝集素(シアル酸に特異的に結合するレクチン)処理した時にも同様な血小板凝集能の低下がみられた.またシアリルラクトース,牛顎下腺をNL細胞による血小板凝集の系に加えた時にも凝集能の抑制がみられたが, fetuinやアシアロ牛顎下腺ムチン存在下では凝集能の低下が見られず, NL細胞による血小板凝集には細胞表面のシアル酸含有複合糖質が関係しシアル酸の存在することが重要であると推測された.一方,癌細胞が宿主の標的部位で成長していく現象と関連する細胞成長因子に対する癌細胞の反応性の変化を調べたところ, KIー8110は血小板由来成長因子(PDGF)によるNLー17細胞の細胞成長を抑制した. KIー8110処理によりPDGFにより誘導されるPDGF受容体のリン酸化も抑制されたが,シアリダーゼ処理によっも同様の抑制が生じた.以上の結果, KIー8110は, NLー17細胞と宿主の血小板との相互作用を癌細胞表面のシアル酸含量を減少させることにより,少なくとも2つの過程で阻害し,この癌細胞の肺への転移を抑制するものと考えられた.
近赤外線分光測定を用いた高次脳機能の評価

近赤外線分光測定near-infrared spectroscopy(以下、NIRS)を用いて,大脳皮質領域における脳血液量及びその酸素化状態の変化と高次脳機能との関連性を明らかにする目的で以下の13の研究を行った.1.健常成人6例を対象に,覚醒・安静時に,聴性脳幹反応(ABR)を記録し,これと同時に側頭部において脳内酸化ヘモグロビン(Hb02),還元ヘモグロビン(HbR)および総ヘモグロビン(HbT)の濃度変化をNIRSを用いてモニターした.全例で正常なABR波形が記録された.6例中2例で軽度のHb02とHbTの増加が認められた.2.小児てんかん患者6例を対象に発作間欠期の睡眠時脳波と同時にNIRSを用いてHb02,HbR,HbTの濃度変化を連続的に測定した.Lennox-Gastaut症候群1例のびまん性棘波群発とWest症候群1例のburst-suppressionに一致して,NIRSではHb02とHbTの増加を認めたが,HbRは変化しなかった.この変化は脳組織PC02の増加による脳細動脈の拡張の結果であると考えられ,脳代謝の亢進したsubcl inicalな発作変化の可能性が示唆された.3.脳性マヒ患者6例で呼吸理学療法(呼吸介助法)を行い,携帯式呼吸代謝測定装置とNIRSを用いて呼吸代謝と脳循環動態を同時にモニターし,理学療法前後の各パラメータの変化について検討した.心拍数,呼吸数,分時換気量,酸素消費量など体循環の指標に有意な変化は認められなかったが,脳循環ではHb02とHbTの有意な増加と,HbRの軽度の増加がみられ,身体への刺激によって大脳機能が亢進し脳血流量が増加したと考えられた.以上13のことから,大脳機能または代謝の亢進による脳血流量の増加に伴い,NIRSではHb02及びHbTの増加という反応パターンをとると考えられた.また,NIRSでは大脳の全般的な変化はとらえられるのに対し狭い領域の変化の測定は困難であったことから,局所脳循環の測定法の確立が今後の課題になると考えられた.近赤外線分光測定near-infrared spectroscopy(以下、NIRS)を用いて,大脳皮質領域における脳血液量及びその酸素化状態の変化と高次脳機能との関連性を明らかにする目的で以下の13の研究を行った.1.健常成人6例を対象に,覚醒・安静時に,聴性脳幹反応(ABR)を記録し,これと同時に側頭部において脳内酸化ヘモグロビン(Hb02),還元ヘモグロビン(HbR)および総ヘモグロビン(HbT)の濃度変化をNIRSを用いてモニターした.全例で正常なABR波形が記録された.6例中2例で軽度のHb02とHbTの増加が認められた.2.小児てんかん患者6例を対象に発作間欠期の睡眠時脳波と同時にNIRSを用いてHb02,HbR,HbTの濃度変化を連続的に測定した.Lennox-Gastaut症候群1例のびまん性棘波群発とWest症候群1例のburst-suppressionに一致して,NIRSではHb02とHbTの増加を認めたが,HbRは変化しなかった.この変化は脳組織PC02の増加による脳細動脈の拡張の結果であると考えられ,脳代謝の亢進したsubcl inicalな発作変化の可能性が示唆された.3.脳性マヒ患者6例で呼吸理学療法(呼吸介助法)を行い,携帯式呼吸代謝測定装置とNIRSを用いて呼吸代謝と脳循環動態を同時にモニターし,理学療法前後の各パラメータの変化について検討した.心拍数,呼吸数,分時換気量,酸素消費量など体循環の指標に有意な変化は認められなかったが,脳循環ではHb02とHbTの有意な増加と,HbRの軽度の増加がみられ,身体への刺激によって大脳機能が亢進し脳血流量が増加したと考えられた.以上13のことから,大脳機能または代謝の亢進による脳血流量の増加に伴い,NIRSではHb02及びHbTの増加という反応パターンをとると考えられた.また,NIRSでは大脳の全般的な変化はとらえられるのに対し狭い領域の変化の測定は困難であったことから,局所脳循環の測定法の確立が今後の課題になると考えられた.
樹立した複数のヒト卵管由来細胞株と初期胚の共培養による胚発育促進物質の解析

前年度の報告で、従来質が悪いために廃棄していた体外受精の余剰卵でもきわめて高率に胞胚blastocystに到達するヒト卵管由来細胞株の共培養系を確立したこと、電子顕微鏡により微絨毛microvilliの観察されること等を述べた。今年度はその細胞株NT/T-Sをさらに継代するとともに、卵割促進の理由の解析をすすめた。まず、細胞株NT/T-Sが上皮であることをさらに明らかにするために、免疫細胞染色法によりサイトケラチンの発現を証明した。つぎに、電子顕微鏡によりゴルジ装置が多数存在することより、エンザイム・イムノアッセイ(EIA)にて、初期胚の卵管内発育において注目されておりES細胞の維持に必要不可欠な白血病抑制因子leukemia inhibitoryfactor(LIF)をNT/T-Sの培養上清で測定した。その結果、極めて高い濃度で培養上清中にLIFを検出した。現在、その他のサイトカイン・増殖因子についても調べる準備をすすめている。そのうえで、未知の因子が関与している可能性がないかについても検討を始めている。研究の成果の一部は平成11年4月の日本産科婦人科学会で発表予定となっている。論文発表に関しては、この研究が生殖医学の基礎的分野で重要な要素を含んでいるだけでなく、体外受精を胞胚移植という一歩進んだ理想に近い形で実現するための影響力の大きい内容を含んでいるため、慎重にデータを蓄積してから行う予定でいる。SV40T抗原を遺伝子導入することにより樹立した複数のヒト卵管細胞株のうちの1つが、体外受精で余剰となった廃棄すべき初期胚との共培養において有意により良好な卵割を認めることを位相差顕微鏡による観察で認めた。その培養上清は現段階で十分な有意差が認められるだけの発育促進効果を示すに至っていない。したがって、当初予定していた培養上清の蛋白解析を後回しにして、卵管細胞と初期胚との接触による微小環境でのパラクリン的な作用の可能性を求めて、有効であった卵管細胞株の電子顕微鏡による解析をした。その結果、卵管上皮に特徴的に認められる微絨毛が、卵管細胞株にも認められた。この結果により共培養下における卵管細胞と初期胚との接触による微小環境でのパラクリン的な作用の可能性が示唆された。以上まとめると、研究の第一目的であったヒトの初期胚が卵割を繰り返していくようなヒト卵管由来細胞株の共培養系の確立という点に関しては、ほぼ達成できた。第二の目的であった胚発育促進因子に関しては、微小環境で作用しており検出困難なため、ボイデン・チャンバーを用いた実験や免疫細胞学的実験などの別のアプローチを今後必要とするようになってくると考えられた。体外受精で余剰となる初期胚が最近の症例数の減少と凍結率の増加で入手困難となってきてはいるためもう少し時間がかかることが予想されるが、この研究は重要な要素を含んでいると思われるので十分慎重にデータを積み重ねてから論文発表の形にもっていきたいと考えている。
病原性真菌カンジダ酵母の糖鎖合成に関わる遺伝子群の病原性への関与についての研究

糖鎖合成の原料となるGDP-マンノースの合成に関わる遺伝子について,Candida glabrataおよびC.albicansを用いて以下の3点を明らかにした.1.C.glabrataにおいて,GDP-マンノース合成経路の位置する酵素(PMM1:mannose phosphomutase, ALG1:mannosyl transferase, DPM1:,Dolicol-phosphate mannose synthase, YRG4:GDP-mannosetransporter)のプロモーターをテトラサイクリン応答性プロモーターに置換した変異株を作製した.テトラサイクリンの誘導体であるドキシサイクリンを加え,PMM1,ALGG1,DPM1およびVRG4遺伝子の発現を抑制したところ,グルコース,マンノース,グリセロール,それぞれを炭素源にしたいずれの培地でも菌の増殖は見られず,試験管内では生育に必須であることが分かった.今後,マウス体内での増殖の必須性について検討する.2.昨年度までの結果から,C.glabrataにおいてはGDP-mannose pyrophosphorylaseは2つ存在し(PSA1,PSA2),PSA1は,グルコースが炭素源のときのみ,生育に対して必須で,また,PSA2の発現はグルコースによって抑制を受けることが明らかとなった。今年度は,さらに培養条件を変えて,これら2遺伝子の発現量を調べたところ,嫌気条件下の培養ではPSA1の発現は増強され,PSA2の発現は抑制されていた.このことからも,PSA1とPSA2の発現は相補的であることが示唆された.また,嫌気条件下のpsa1欠損株が宿主体内と異なり,生育できなかったことから,宿主体内の培養を考える上では,嫌気条件だけでは不十分なことが示唆された。そのため,抗真菌剤のスクリーニングに使用する培地は検討が必要であろうと考えられた.3.C.glabrataと同様GDP-mannose pyrophosphorylaseを2遺伝子(CaPSA1,CaPSA2)もつC.albicansについて,炭素源を変化させ,これら2遺伝子の発現量を調べたところ,CaPSA1はグリセロール培地ではほとんど発現せず,グルコース培地での発現が一番高かった.また,CaPSA2はグルコース培地での発現が一番低かった.このように,C.glabrataと同様なこれら2遺伝子の発現は相補的になされていることが分かった.今後変異体を用いて,CaPSA1,CaPSA2の特徴づけを行う予定である.糖鎖合成の原料となるGDP-マンノースの合成に関わる遺伝子について,Candida glabrataを用いて以下の2点を明らかにした。1.GDP-マンノース合成経路の上流に位置する転移酵素PMI40(phosphomannose isomerase)のプロモーターをテトラサイクリン応答性プロモーターに置換した変異株を作製した。テトラサイクリンの誘導体であるドキシサイクリンを加え,PMI40遺伝子の発現を抑制したところ,試験管内では菌の増殖は見られなかったが,マウス体内では菌の増殖が観察された。このことから,PMI40は,試験管内では生育に必須であったが,マウス体内の増殖には必須でないことが分かった。2.C.glabrataでは,炭素源にグルコース以外のものを使用すると,GDP-マンノース合成酵素,VIG9の発現を抑えても菌の生育が見られ,新たなGDP-マンノース合成経路があることが示唆された。我々は,最近公開されたC.glabrataのゲノム配列より,VIG9と高い相同性を持つ遺伝子(84%の同一性,92%ホモロジー)が存在することを見つけたので,PSA2と名付け,その機能解析を開始した。vig9欠損株に,PSA2遺伝子(PSA2 promoter+coding sequence)をlow-copyで導入すると,グルコース培地での生育阻害が部分的に相補された。また,培養する炭素源の違いによるPSA2遺伝子の発現量の違いを調べたところ,炭素源がグルコースの場合は,マンノースやグリセロールにした場合に比べ,その発現が強く抑制されていることが分かった。このことから,PSA2の発現はグルコースリプッレションの支配を受けていることが示唆された。現在,psa2欠損株を作製し,宿主体内を含め,いろいろな培養条件での表現型を調べている。

今年度は,さらに培養条件を変えて,これら2遺伝子の発現量を調べたところ,嫌気条件下の培養ではPSA1の発現は増強され,PSA2の発現は抑制されていた.このことからも,PSA1とPSA2の発現は相補的であることが示唆された.また,嫌気条件下のpsa1欠損株が宿主体内と異なり,生育できなかったことから,宿主体内の培養を考える上では,嫌気条件だけでは不十分なことが示唆された。そのため,抗真菌剤のスクリーニングに使用する培地は検討が必要であろうと考えられた.3.C.glabrataと同様GDP-mannose pyrophosphorylaseを2遺伝子(CaPSA1,CaPSA2)もつC.albicansについて,炭素源を変化させ,これら2遺伝子の発現量を調べたところ,CaPSA1はグリセロール培地ではほとんど発現せず,グルコース培地での発現が一番高かった.また,CaPSA2はグルコース培地での発現が一番低かった.このように,C.glabrataと同様なこれら2遺伝子の発現は相補的になされていることが分かった.今後変異体を用いて,CaPSA1,CaPSA2の特徴づけを行う予定である.
糖鎖を分子プローブとしたDNA修復阻害活性ガン治療薬の創製

ガン細胞増殖抑制活性に必要なファーマコフォアを明らかにするためにリコテトラオサイドのアグリコ部分を替えた誘導体を合成、そのガン細胞増殖抑制試験を行った。【1】トマチナーゼの大量生産・・・トマト寄生カビFusarium oxysporumの中でもトマチナーゼ活性の強い菌株を選抜し大量培養を行い、合成原料として充分なトマチナーゼの調製が確立できた。【2】リコテトラオースの調製・・・トマト地上部より調製したαトマチンをトマチナーゼ溶液で処理し、リコテトラオースが75%の収率で得られた。【3】リコテトラオース糖供与体の合成・・・切り出されたリコテトラオースをアセチル化した後、ヒドラジン酢酸塩で還元末端のアノマー位のアセチル基を除去した。これをトリクロロアセトイミデート体(Schmidt法)及び、DAST処理しフルオライド体に変換した。【4】アグリコン部のライブラリーの合成・・・トリクロロアセトイミデート体を、シクロヘキサノール、グリチルリチン酸、コレステロール、ファルネソールの水酸基にグリコシル化、脱保護した後、生物活性用サンプルとした。イミデート体を用いるグリコシル化は収率が低いこと、非天然型のα配糖体が選択的に生成することからフルオライド体を用いてグリコシル化を行った。アグリコンにコレステロールを用いて実験したところ、収率が70%に向上した。しかし、イミデート体と同様にα配糖体が選択的に合成された。【5】ガン細胞増殖抑制試験・・・合成したリコテトラオサイドのヒト肺ガン細胞(NCI-H460)、ヒト大腸ガン細胞(HCT116)に対する増殖抑制効果を検討した。現在、コレステロール誘導体が対照薬のシスプラチンと同等のGI50値を持つことを確認している。今後、その他の化合物についても活性を測定し、構造活性相関を検討すると共に、DNA修復阻害活性試験を行い、作用メカニズムの解明に向けて研究を継続していく予定である。ガン細胞増殖抑制活性に必要なファーマコフォアを明らかにするためにリコテトラオサイドのアグリコ部分のライブラリーの構築を行う。そこで、本年度は14に記すように、糖鎖分子プローブ(リコテトラオース配糖体)の合成法の確立を行った。1.トマチナーゼの大量生産・・・トマト寄生カビFusarium oxysporumの中でもトマチナーゼ活性の強い菌株を選抜し大量培養を行った。得られた菌体をαトマチンにて刺激し、トマチナーゼの誘導を行った。培養液に溶出されてくるトマチナーゼを硫安沈殿、限外濾過にて濃縮してトマチナーゼ溶液を調製した。現在、1.5Lの培養液からトマチナーゼを含むタンパクが1mg得られる。2.リコテトラオースの調製・・・αトマチンとトマチナーゼ溶液を混合し、室温で一晩反応する。析出する沈殿を濾去、濾液をポリスチレンゲルに通して脂溶性成分を除き、分子篩クロマト(Sephadex LH20)にて脱塩しリコテトラオースを単離し、合成原料とした。3.リコテトラオース糖供与体の合成・・・切り出されたリコテトラオースをアセチル化した。次に,ヒドラジン酢酸塩で還元末端のアノマー位のアセチル基を除去し,トリクロロアセトニトリルとDBUで処理しトリクロロアセトイミデート体に変換した。4.リコテトラオース配糖体の合成・・・先ず、トリクロロアセトイミデート体とコレステロールとのグリコシル化を検討した。塩化メチレン中、三フッ化ホウ素エーテル錯体を活性化剤として反応を行った。2位のアセチル基による隣接基効果でβ結合体が得られるものと予想していたが、生成したのはα体のみであった。コレステロールの代わりにシクロヘキサノールを用いてもα体のみしか生成しないことから、リコテトラオースの立体的要因がグリコシド結合の選択性に影響していると予想された。来年度は、反応溶媒の検討、アセチル基に変わる保護基の検討を行って天然型のβ結合体も合成できるルートを開拓する。

しかし、イミデート体と同様にα配糖体が選択的に合成された。【5】ガン細胞増殖抑制試験・・・合成したリコテトラオサイドのヒト肺ガン細胞(NCI-H460)、ヒト大腸ガン細胞(HCT116)に対する増殖抑制効果を検討した。現在、コレステロール誘導体が対照薬のシスプラチンと同等のGI50値を持つことを確認している。今後、その他の化合物についても活性を測定し、構造活性相関を検討すると共に、DNA修復阻害活性試験を行い、作用メカニズムの解明に向けて研究を継続していく予定である。
日常生活状況、健康状態との関連性からみた老後の咀嚼機能維持に関する調査研究

介助を必要とせず日常生活を営んでいる成人男女約1,500人を対象として、口腔状況診査(歯の状況、CPITN、OHI、咀嚼)及び質問調査(日常生活状況、健康状態)を行い、1,296人から有効な成績を得た。この結果、統計的に差の有意性を認めたものは次のようである。9種の食品をあげ固くてかみにくいものの有無を調べたところ、それぞれの口腔状況が良好な者程無い者の割合が高く、無い者が80%以上を占めるのは、健全歯数20歯以上、未処置歯数1歯以内、喪失歯数1歯以内、CPITN値2以内などである。日常生活状況では、喫煙状況と口腔状況との間で最も関連性が認められた。男性では、CPITN値、OHI値、咀嚼能力が良好な者において、女性では喪失歯数が少なく咀嚼能力が良好な者においてすわない者が多く認められた。しかし、う歯数との間には認められなかった。健康状態に関しては、最近の健康状態(自覚症状)、健康診断の受診態度と口腔状況との間において関連性が認められた。男性では健全歯数が多く、OHI値が良好な者において健康状態が良い者が多く、CPITN値が良好な者において健康診断をよく受診しており、女性では喪失歯のない者においてよく受診している。今回の調査研究は一断面におけるもので十分な結論を得たとはいえないが、口腔状況の悪化は食べものの咀嚼に影響を与えており、口腔の健康の重要性が指摘される。また、老後の咀嚼機能維持には、喫煙状況や健康診断の受診状況と口腔内の現状(成人であるのでう蝕は過去の状況と考えられる)とに関連性が高く、日常生活において健康に関する態度行動が良好な者はすでに口腔の健康状態にも関心が及んでいると考えられる。
二次元モデル材料による超塑性変形機構の解明と実用材料への展開

超塑性変形を支配する粒界すべり,緩和機構,動的組織形成について,以下の3点を明らかにし,学術的かつ実用的に重要な諸現象の素過程を理解した。(1)領域IIIでの転位緩和を伴う粒界すべりと連続動的再結晶:粒界すべりと転位運動が重畳して生じる領域IIIで,粒界すべりに伴う転位運動が,粒界近傍の「マントル」だけではなく,粒中心部の「コア」にまで侵入し,塑性緩和と動的組織形成を担うことを,二次元モデル材料であるODS (酸化物分散強化型)フェライト鋼において明らかにした。また,本メカニズムを超塑性Al-Mg-Mn合金へと展開し,実用的に注目を集めている「高速温間成型」に,粒界すべりによる高延性と,連続動的再結晶による高強度化が応用できる可能性を示した。(2)領域IIでの拡散緩和を伴う粒界すべり:低応力・低ひずみ速度の領域IIでは,粒界すべりによる結晶粒の相対移動を緩和するため,拡散が働き,局所的な圧縮応力が働く粒界から,局所的な引張応力が働く粒界への物質移動が生じていることを,二次元モデル材料で明らかにした。この体積移動を支配するのは,結晶粒の剛体移動(Rachinger粒界すべり)に引き起こされるミクロな内部応力であり,マクロな主応力に支配される古典的な拡散クリープとは明確に分離できることを示した。(3)領域IIでの異方的変形誘起粒成長:超塑性Al-Mg-Mn合金における変形機構,動的組織形成を観察し,「異方的変形誘起粒成長」が,粒界すべりと結晶粒回転によって生じており,結晶粒の巨大な延伸にも関わらず,転位運動の寄与がほとんど見られないことを示した。また,超塑性変形後のミクロ組織は,等軸型と伸長型のバイモーダルな結晶粒からなることから,粒界すべりと結晶粒回転に基づく確率的な結晶粒合体メカニズムが粒成長を担うことを提言した。29年度が最終年度であるため、記入しない。超塑性を支配する粒界すべりと緩和機構の相互作用を調査した。当該年度における本研究の成果は以下の二点である。(1)二次元モデル材料であるODSフェライト鋼を使用し,低温・高ひずみ速度の領域IIIにおいて「マントル(粒界近傍)での転位運動を伴う粒界すべり」,「コア(粒中心部)での転位運動を伴う粒界すべり」を直接観察し,粒界すべりと転位緩和の相互作用機構を解明した。(2)先述の成果を三次元実用材料であるアルミニウム合金に展開し,領域IIIにおいて生じる連続動的再結晶が,変形初期にはマントル,変形中期以降にはコアで生じることを示した。(1)ODSフェライト鋼は,一方向に伸長した柱状結晶粒からなり,粒の伸長方向と垂直に変形を与えると二次元的な粒界すべりが生じた。領域II(最適超塑性域)から領域IIIまでの比較的広い範囲で「マントルでの転位運動を伴う粒界すべり(Gifkins, 1976)」が直接観察された。マントルを運動した転位はコア/マントル境界に蓄積し,動的回復することでマントル部を亜結晶粒化させた。これは連続動的再結晶の初期過程にあたる。また,領域IIIでは「コアでの転位運動を伴う粒界すべり(Ball and Hutchison, 1969)」が直接観察された。粒内応力場と結晶学的すベリ系の幾何学関係に応じて,転位が粒内から抜け出す場合と粒内に留まる場合とがあり,後者の時に結晶粒全体が連続動的再結晶を起こした。(2)Al-Mg-Mn合金は等軸微細粒組織からなる材料である。本材料は,領域IIIにおいても200%以上の巨大変形を示す条件が存在し,ここでは三次元的な粒界すべりが観察された。本条件において引張試験をひずみ0.25ごとに中断しながら組織形成過程を観察すると,変形初期にはマントルの連続動的再結晶,変形中期以降にはコアでの連続動的再結晶が観察された。当初の計画では,当該年度に「マントルにおける転位緩和(Gifkins, 1976)」に基づいて変形機構および組織形成機構をモデル化する予定であった。実際には,本項目の整理が完了しただけではなく,これに加えて「コアにおける転位緩和(Ball and Hutchsion, 1969)」を直接観察することに成功し,変形条件に応じた転位緩和機構と組織形成機構の遷移を示すことができた。また,当初は次年度に計画していた三次元材料への展開として,当初は予定していなかったアルミニウム合金を利用することで新たな知見を得ることに成功した。

(2)領域IIでの拡散緩和を伴う粒界すべり:低応力・低ひずみ速度の領域IIでは,粒界すべりによる結晶粒の相対移動を緩和するため,拡散が働き,局所的な圧縮応力が働く粒界から,局所的な引張応力が働く粒界への物質移動が生じていることを,二次元モデル材料で明らかにした。この体積移動を支配するのは,結晶粒の剛体移動(Rachinger粒界すべり)に引き起こされるミクロな内部応力であり,マクロな主応力に支配される古典的な拡散クリープとは明確に分離できることを示した。(3)領域IIでの異方的変形誘起粒成長:超塑性Al-Mg-Mn合金における変形機構,動的組織形成を観察し,「異方的変形誘起粒成長」が,粒界すべりと結晶粒回転によって生じており,結晶粒の巨大な延伸にも関わらず,転位運動の寄与がほとんど見られないことを示した。また,超塑性変形後のミクロ組織は,等軸型と伸長型のバイモーダルな結晶粒からなることから,粒界すべりと結晶粒回転に基づく確率的な結晶粒合体メカニズムが粒成長を担うことを提言した。当初の研究計画では,今後はチタン合金を用いて三次元的な超塑性変形機構の調査を行う予定であった。但し,当該年度の成果として,複相組織を有するチタンよりも準単相組織を有するアルミニウム合金の方が,これまでの成果を展開するにあたってより適当であることが示された。すなわち,今後の推進方策としては,アルミニウム合金における三次元的な超塑性変形挙動を分析し,領域IIIで生じる連続動的再結晶と領域IIで生じる動的粒成長のメカニズムを解明してゆく。これには,SEM/EBSD法を援用した内部マーカー法を用いることが妥当かつ有効であろうと考えられるため,これを軸に本研究課題を推進してゆく。29年度が最終年度であるため、記入しない。
界面活性剤の識別吸着による金属ナノ結晶のゼロエミッション型元素精製

本研究では、高い触媒性能を発揮しうる金属ナノ結晶供給への寄与を目指し、ナノ結晶の構成金属元素を効率的にコントロールする新たな方策の樹立を行う。これに向けて、湿式合成により作製した貴金属ナノ結晶を、金属元素の違いから非水溶媒中へと分離抽出し精製する手法の構築に着手した。研究初年度においては、長鎖炭化水素鎖とアミノ基を有する界面活性剤が示す結晶表面への可逆的な吸着作用に着目し、これを貴金属ナノ結晶の表面保護として用いることで、元素を識別した吸着機構の構築に取り組んだ。親水部にアミノ基とカルボキシ基をあわせ持つ両イオン性構造を導入することで、この界面活性剤が金基板表面と銀基板表面とで異なる吸着特性を発現することを見出した。銀表面では金表面よりも界面活性剤の親和性が高い傾向があることが示され、特に、疎水部の炭化水素鎖長が短いものであるほど元素間での違いが顕著に現れた。これは、金属表面への界面活性剤の吸着配向が金表面と銀表面で大きく異なることを示唆している。さらに、水中と非水中での金属表面吸着特性をそれぞれ検討することで、非水中においても銀表面への吸着が優勢に起こること、ならびにpHをはじめとした種々の外部条件に応じて吸着状態を自在にコントロールできることを確認した。つまり、この界面活性剤を貴金属ナノ結晶の表面保護剤として用いることで、一方の金属元素のナノ結晶のみを非水溶媒中へ抽出する手法への展開が可能となった。金属元素ごとのナノ結晶選り分けを目指すための重要かつ基幹的な知見を得るため、研究初年度では、結晶表面の保護剤となる界面活性剤の元素識別吸着機能の評価に注力した。種々の分子スクリーニングを経て、金属元素を識別しながら吸着する分子構造の類型と条件を導くことができた。特に、当初期待したpH応答以外にも複数の外部刺激応答によって元素識別吸着機能が誘起されることを見出し、これをトリガーとしたナノ結晶抽出が見込まれるようになったことは今後の研究展開において大きな意味を持つ。次年度以降のナノ結晶の水ー非水溶媒間移動による分離抽出に向けて、必要な条件検討を十分に行うことができた。研究期間の中間期にあたる令和2年度では、貴金属ナノ結晶を分離しながら非水溶媒中へと抽出していく具体的な制御手法の構築をはかる。このためにまず、前年度より行ってきた界面活性剤による吸着作用の対象を、貴金属のバルク結晶基板から10ナノメートル程度の直径を有するナノ結晶へと拡張する。研究初年度で得られた金属元素ごとの吸着状態制御に関する知見が、金や銀といった貴金属ナノ結晶においてどのように再現されるかを、主にナノ結晶分散性の観点から精査していく。ここでは特に、種々の外部条件や添加物質の影響によって引き起こされる吸着状態の変化と、金属元素それぞれでもたらされる差異に注目する。この段階では、金属元素ごとに明瞭な分散状態の違いをもたらす条件の策定を目標とする。これらの結果をベースとしてつぎに、金、銀それぞれのナノ結晶を水から非水溶媒へと相間移動させる実験に着手する。界面活性剤の単層吸着によって結晶表面を疎水化修飾することで、特定金属元素のナノ結晶を水中から非水溶媒へと移動させる。元素組成ごとのナノ結晶の分別を達成するために、この相間移動のスイッチングが特定元素に対してもたらされる外部条件の策定を行う。分離効率の最大化を狙うため、ナノ結晶の凝集を抑制する因子の検討についても行う。

研究期間の中間期にあたる令和2年度では、貴金属ナノ結晶を分離しながら非水溶媒中へと抽出していく具体的な制御手法の構築をはかる。このためにまず、前年度より行ってきた界面活性剤による吸着作用の対象を、貴金属のバルク結晶基板から10ナノメートル程度の直径を有するナノ結晶へと拡張する。研究初年度で得られた金属元素ごとの吸着状態制御に関する知見が、金や銀といった貴金属ナノ結晶においてどのように再現されるかを、主にナノ結晶分散性の観点から精査していく。ここでは特に、種々の外部条件や添加物質の影響によって引き起こされる吸着状態の変化と、金属元素それぞれでもたらされる差異に注目する。この段階では、金属元素ごとに明瞭な分散状態の違いをもたらす条件の策定を目標とする。これらの結果をベースとしてつぎに、金、銀それぞれのナノ結晶を水から非水溶媒へと相間移動させる実験に着手する。界面活性剤の単層吸着によって結晶表面を疎水化修飾することで、特定金属元素のナノ結晶を水中から非水溶媒へと移動させる。元素組成ごとのナノ結晶の分別を達成するために、この相間移動のスイッチングが特定元素に対してもたらされる外部条件の策定を行う。分離効率の最大化を狙うため、ナノ結晶の凝集を抑制する因子の検討についても行う。(次年度使用額が生じた理由)界面活性剤の元素識別的な吸着制御手法を複数検討する中で、当初予想していなかった補助物質の添加による吸着状態の制御に関する知見が得られ、研究期間2年目における検討項目が当初予定よりも増えた。そのために、研究機関内での研究費配分バランスを見直し、次年度使用額を確保した。pHといった外部条件による吸着状態制御と併行して、補助添加物質による分子認識的な制御も行うことができれば本研究目的の遂行に極めて有意義なものになると考えている。(使用計画)貴金属ナノ粒子表面と界面活性剤ならびに補助添加物質におよぶ分子間相互作用評価のための物品費のほか、研究成果発表のための旅費に用いる。
潰瘍性大腸炎に対する新しい遺伝子デリバリーシステムを用いたBcl-XL遺伝子治療

新しい遺伝子デリバリーシステム(アデノウイルス・キトサン複合体)を開発し、消化管への遺伝子導入を試みた。消化管特異的な遺伝子発現が得られたが、発現の程度は微弱であった。さらにBcl-XL発現アデノウイルス・キトサン複合体によるマウス潰瘍性大腸炎モデル(DSS腸炎)に対する発症予防・治療効果を検討した。注腸投与にて、発症予防効果を認めたが、発症後の治療効果は認めなかった。アデノウイルス・キトサン複合体による消化管への遺伝子デリバリーシステムとしての可能性が示唆された。同時に、遺伝子発現性の向上を中心とした更なる改良の必要性が明らかとなった。本研究では、マウス潰瘍性大腸炎モデルであるDSS腸炎に、Bcl-XLアデノウイルス・キトサン複合体を経口あるいは注腸投与し、DSS腸炎の発症予防・治療効果を検討する。平成19年度は、lacZアデノウイルス・キトサン複合体を作製し、lacZアデノウイルス・キトサン複合体の経口あるいは注腸投与にてマウスにおける腸管ならびに各臓器における遺伝子発現性を検討した。lacZアデノウイルスベクターを精製し、フリーズドライ製法にて粉末化した。酢酸を用いてキトサン溶液を作製し、粉末化したlacZアデノウイルスベクターを加え、凍結乾燥させた。さらにメタノール溶媒中で無水酢酸にてアセチル化を行い、再度凍結乾燥させ、アデノウイルス・キトサン複合体を作製した。C57/BL6マウスに、lacZアデノウイルス・キトサン複合体を経口あるいは注腸投与し、X-gal染色にて、lacZの発現性を検討した。経口投与では、胃にごく微量な遺伝子発現が見られたが、小腸・大腸では遺伝子発現は認められなかった。注腸投与では、大腸にごく微量な遺伝子発現が見られたが、アデノウイルスベクターの注腸投与に比較すると、遺伝子発現の程度は有意に低かった。アデノウイルスベクターの粉末化、キトサン溶液への溶解中、アデノウイルス・キトサン複合体の凍結乾燥化、アセチル化、あるいは再度の凍結乾燥化の過程のいずれかで、アデノウイルスベクターの力価の減弱が生じている可能性が高く、現在、改良中である。本研究では、マウス潰瘍性大腸炎モデルであるDSS腸炎に、Bcl-XL遺伝子発現アデノウイルス・キトサン複合体を経口あるいは注腸投与し、DSS腸炎の発症予防・治療効果を検討した。まずlacZ遺伝子アデノウイルス・キトサン複合体を作製し、経口あるいは注腸投与にてマウスにおける腸管ならびに各臓器における遺伝子発現性を検討した。経口投与では、胃および上部小腸に遺伝子発現が認められたが、大腸では遺伝子発現は認められなかった。注腸投与では、大腸に特異的な遺伝子発現が認められた。しかしアデノウイルスベクターの注腸投与に比較すると、遺伝子発現の程度は弱かった。DSS腸炎に対するBcl-XL遺伝子発現アデノウイルス・キトサン複合体の経口投与では、発症予防効果・発症後治療効果は認められなかった。一方、注腸投与では粘膜障害の程度が軽く、発症予防効果を認めた。しかし、アデノウイルスベクターの注腸投与に比較すると、発症予防効果は弱かった。またアデノウイルス・キトサン複合体、アデノウイルスベクターの双方において、発症後治療効果は認めなかった。以上の知見から、アデノウイルス・キトサン複合体の経口投与にて上部消化管に、注腸投与にて大腸に各々臓器特異的な遺伝子発現が微量ながら得られることが明らかとなり、消化管への安全な遺伝子デリバリーシステムとしての可能性が示唆された。しかしながら、疾患モデルの予防・治療効果を得るには、潰伝子発現力が弱いことが判明した.
ＩＦＮγ・ＳＴＡＴ１・ＰＡＩ－１シグナル抑制による緊急手術後腸管癒着予防法の開発

救命救急センターにおける腹部緊急手術は外傷・急性腹症がほとんどで腹腔内は強い炎症があり、手術で救命できた場合も高頻度に術後腸管癒着が発生し、臨床的に大きな問題となっている。しかしながら、腸管癒着に対する予防法、予防薬は未だ確立されていない。近年、癒着形成に関する免疫学的要因が提唱され、その分子生物学的メカニズムが解析されてきた。今回、我々は癒着形成メカニズムの重要因子であるPAI-1とSTAT1の発現を抑制するPAI-1 siRNA vectorとSOCS1 expression vector(特異的にSTAT1を抑制する)を作製しこれらを用いて、マウス腸管癒着モデルで予防効果と安全性を詳細に検討する。PAI-1 siRNA HVJ Envelopevectorの作製:PAI-1に対するsiRNA配列を様々な情報源から10種類以上ののsiPAI-1を合成し、そのノックダウン率の検定するためsiRNA発現ベクターをDC-nanoparticleに包埋してからマウス正常腸管細胞株にtransfectionしリアルタイムPCR法並びにWestern blot法で行ったがどうしても十分なPAI-1発現抑制が得られなかった。そこで予備実験の段階ではあるがHVJ Envelope vector Kit (GenomONE-Neo:石原産業株式会社)を用いて、このsiRNAをtransfectionを行った結果、約40-60%の発現抑制効果を認めるsiRNA配列を同定できた。救命救急センターにおける腹部緊急手術は手術で救命できた場合も高頻度に術後腸管癒着が発生するが、腸管癒着に対する予防法、予防薬は未だ確立されていない。今回、我々は癒着形成メカニズムの重要因子であるPAI-1とSTAT1の発現を抑制するPAI-1 siRNA vectorとSOCS1 expression vector(特異的にSTAT1を抑制する)を作製しこれらを用いて、マウス腸管癒着モデルで予防効果と安全性を詳細に検討した。AI-1に対する5種類のsiPAI-1を合成し、そのノックダウン高率の検定を行うことで最適なssiRNAを決定した。本研究では、HVJ Envelope vector Kitを用いて、このsiRNAをtransfectionすることでsiPAI-1 HVJ Envelope vectorを作製した。続いて、SOCS1 cDNA plasmid vectorを用いて、SOCS1 expression HVJ Envelope vectorを作製した。作製したそれぞれのvectorをマウス正常腸管細胞株にtransfectionし、SOCS1の増強・STAT1の低下・PAI-1の低下をリアルタイムPCR法並びにWestern blot法で行うことでIn vitroにおける作製vectorの発現効率は動物実験に使用できるレベルにあると確認した。PAI-1 siRNA HVJ Envelopevectorの作製が予定より約1年遅れたことがまず理由に挙げられる。腸管癒着予防効果の動物実験は、マウス盲腸をバイポーラ凝固鉗子で1秒間焼灼することで1週間後に強度の腸管癒着を形成するマウスモデル(Nat Med, 14: 437, 2008)を用いる。現在、安定してscore 5の強度な癒着が形成される技術を習得する様トレーニングを重ねるているが、まだ安定したモデル作成ができていないのが現状で有り、動物実験による評価までまだ時間を要する見込みである。まず、PAI-1発現を抑制するsiRNA配列を同定するのに困難を極めていて、PAI-1 siRNA HVJ Envelopevectorの作成ができていないのが大きな理由である。次に、研究分担者が途中で退職したたため、BALB/cマウスを用いた術後腸管癒着形成モデルの安定した作成がまだできていない状況である。現時点では新たな分担者によるモデル作成が行われており、本年度後半には動物実験が開始できる予定である。1)癒着の程度と組織像の検討:屠殺後、腹腔内を観察し癒着の程度をscore化する。その後、焼灼部位を中心とした癒着腸管を取り出し、病理切片を作成しHE染色、シリウスレッド染色で病理学的に癒着の強度を評価する。2)相対的mRNAレベルと発現蛋白レベルの検討:取り出した腸管からAI-1, STAT1, SOCS1, IFN-γのmRNAをリアルタイムPCR法で相対的mRNA発現量を測定する。また、それぞれの発現タンパク量を免疫組織染色で評価する。3)Vector投与による全身状態への影響の検討:マウス尾静脈から採血し、骨髄機能や肝腎機能における副作用のレベルを各群間で検討する。また、血漿のPAI-1とtPAも測定し、評価する。最終年度となり、in vivo実験での研究費使用がほとんどとなる。しかしながら、動物実験で結果の出ない可能性も当然ながらあり、その場合は再びin vitro実験に研究費を必要となる。また、現時点で安定した動物モデルが確立されていないため、動物モデルの変更も念頭に置いて実験を進めていく予定である。平成23年度の研究達成度は低い結果となったが、研究費の繰り越しは多い状況である。また、in vitroの実験設備はほぼ整い、後は消耗品のみの研究費使用となる。in vivoの実験はまだ開始したばかりで今後、研究費使用のほとんどを占めることになると考える。予定では残りの研究費で十分に研究をまとめ、論文作成を行えるが、本年度で研究の進行が得られない場合は本研究の縮小も考えていくつもりである。