hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
人種の表象と表現をめぐる融合研究

(2)共同研究の成果を、『人種の社会的リアリティ』(竹沢泰子編岩波書店)として2009年5月出版予定である。本書は、「人種とジェンダー・セクシュアリティ・階級の交錯」、「「見えない」人種の表象」、「科学言説の中の人種」、「21世紀を歩みだした対抗表象」という四つのテーマを軸に、多数の研究協力者が執筆し、人種と表象をめぐる新しい理論的枠組みを提言した。成果を出版することにより、長期的な学術的貢献を図った。(3)さらに現在は、シンポジウムの外国人研究者らによる論文と日本・アジアに関する論文の英語翻訳を英文の論文集として刊行する企画も進んでいる。2008年3月に京都大学学術出版会の理事会承認を得て、現在進行中である。(4)シンポジウムの報告書を2008年3月に刊行した。さらにシンポジウムの全内容をYouTubeで動画配信を行っている。また趣旨説明挨拶のテキスト、全報告のアブストラクト、写真等もHPで公開中である。(5)京都大学学部生向けのリレー講義を行った。このように2008年度は、当初の計画をはるかに上回り、高水準の研究成果を数多く上げることが出来た。また共同討議によって国内外の研究者の対話・ネットワークの構築、拡大に大きく貢献した。昨年度平成20年度には、12月に京都大学国際シンポジウム「変化する人種イメージ表象から考える」を主催し、3月にその報告書を刊行した。その後平成21年度には、5月に、学術的成果として、『人種の表象と社会的リアリティ』(岩波書店、328ページ)を刊行した。これは代表者と連携研究者ら12名が執筆したものである。その書評が、『移民研究年報』(日本移民学会編)、『読書人』にすでに掲載され、『人文学報』(人文科学研究所紀要)にも掲載予定である(印刷中)。このほか、全体の共同研究の成果としては、英文による学術書Racial Representations in Asiaを平成23年度内に、Kyoto University Pressから刊行することが決定している。さらに『人文学報』の第100号は、代表者が編者となり、「差異の表象」を特集号として刊行する。このように、日本語による学術書、英文による学術書、シンポジウム報告書、および紀要(査読付き)の特集号企画と、4冊図書を刊行することとなり、交付申請書や当初の申請時に記載した以上の成果を発表することができた。また代表者は、Encychlopedia Britannica's Guide to Black Historyの"Race in Asia""Japan's Minority Groups"を執筆した。これにより、それ以前、日本についてはアイヌはコーカソイドの特徴をもつなどといった誤った記述を書き直すことができた。今回連携研究者の成果は一部しか掲載していない。それらすべての成果もあわせると、予想以上の成果を発表することができたと考えている。
心肺同時移植における急性及び慢性拒絶反応の非浸襲的な超早期診断

本年度は特に、胸腔内移植対象患者の中で最も重篤で末期的な心肺不全に適応され、術後の両臓器の拒絶反応の診断・管理がその成功の鍵とされる心肺同時移植における拒絶反応の早期診断について検討した。雑種犬を用いて胸腔内心肺同時移植(working心肺モデル)を行い、移植心の心房に双極電極を装着した。術後、維持量の免疫制御療法(cyclosporine5-10mg/kg/day,prednisolone0.5-1.0mg/kg/day)を行い、毎週12回の心・肺生検と、同日に電気生理学的検査を中心とした心機能評価並びに放射線学的検査を中心とした肺機能評価を行った。採取した生検組織は、光学顕微鏡所見等により、国際心肺移植学会基準に基づいて移植心・肺の拒絶反応の病理組織学的重症度を判定した。Working移植心5例における刺激伝導系の有効不応期は術後経過中に約4050%延長し、心筋生検組織でIbIIIbの拒絶反応がみられた。Working移植肺5例では、吸入療法中のX線透視検査により、術後経過中に対側肺に比べてX線透過性が低下し、肺生検組織でIIaIVcの拒絶反応が認められた。以上の結果をコンピューターで解析したところ、心臓電気生理学的検査および肺機能検査のデータは、拒絶反応の病理組織学的重症度との間に相関関係を認め、基本的にはこれまでの心・肺単独移植の際のデータと同様の傾向を示した。現在生存中の2例に上記の検査を継続しつつ、さらに免疫抑制療法の追加による影響を検討している。
表面・界面でのスピンホール効果の特異な物性の研究

トポロジカル絶縁体(量子スピンホール系)の輸送特性について、2次元の場合にエッジ状態の熱電輸送特性を計算し、低温にするとエッジ状態が優勢になり、熱電変換性能指数が上昇することを見出した。またこうしたトポロジカル絶縁体と通常の絶縁体相との相転移を記述する相図を2次元・3次元の場合に得た。また白金の第一原理計算を行い、バンド交差によって白金のスピンホール効果が巨大になっていることを理論的に見出した。スピンホール効果における試料の形状や電極の効果について研究し、電荷の物理にはない、スピンの非保存性に根ざした新しい伝導現象の学理、スピン流の物理を確立する。金属・半導体でのスピンホール効果については、スピン流の電極・界面付近での変化を解明し、境界条件(試料界面、電極など)のコントロールにより、電極に誘起されるスピン流を大きくするという、「実空間でのデザイン」を行う。これと、ベリー位相の考察による「波数空間のデザイン」と併用してスピンホール効果の巨大化を目指す。また量子スピンホール相において、バルクで隠れていたトポロジカルな性質を、試料形状や界面の効果を利用して解明し、実証実験を提案する。金属の白金においては室温でも大きなスピンホール効果が実験的に観測されている。この起源を探るため、バンド構造に起因する内因性スピンホール伝導率を第一原理計算により計算した。その結果実験で観測されたものと同程度の大きなスピンホール伝導率が得られ、実験で観測された値は内因性と考えても矛盾がないことが判明した。またこの巨大なスピンホール効果は、フェニルミエネルギー付近に存在するバンド交差によるものであることが分かった。スピン軌道相互作用が同程度の他の金属ではバンド交差がフェルミエネルギー近傍にないため、スピンホール効果は白金ほど大きくないと予想され、これは大谷らの実験結果とも符合している。このように、バンド構造に起因したベリー位相が金属でのスピンホール効果に重要な役割を果たしていることが徐々に解明されてきている。このことはバンド構造のデザインにより、スピンホール効果を巨大化できることを意味し、デバイス形状のデザインと組み合わせることによりスピンホール効果の巨大化へと結びつくと考えている。また量子スピンホール系は、バルクでは絶縁体であるがエッジが金属的でありスピン流を運ぶと理論的に言われている新奇なトポロジカル相である。この物質探索等のために、量子スピンホール相と通常の絶縁相との間の量子相転移を一般的な枠組みで議論した。その結果、3次元系の場合には一般にこの間にギャップレスの相が挟まることが分かった。2次元の場合はそのようなことは起こらない。こうした相違は、3次元の場合にはギャップが閉じる点がモノポールというトポロジカルなものであることに起因している。本年は、スピンホール効果のうち特に興味深い現象である量子スピンホール効果についていくつかの興味深い成果を得た。第一の成果として、量子スピンホール系をどのように探索するかの鍵を得るため、何らかのパラメタを変化させたときに、通常の絶縁体と量子スピンホール系がどのように移り変わるかを解析した。その結果3次元の量子スピンホール系においては一般に、絶縁相との間で直接相転移が起こらずに、その間に金属相がはさまることが分かった。こうした成果は、量子スピンホール系に特有な新奇現象であって実験で観測できるとともに、量子スピンホール効果を示す物質を探索する場合にも役立つ。第二にビスマス薄膜が量子スピンホール系になるかどうかについて、第一原理計算により研究した。ビスマス薄膜のうち絶縁体になるものは(111)1-bilayerと{012}2-monolayerの2種類存在する。これらについてトポロジカルナンバーを計算し、この2種の薄膜のうち前者は量子スピンホール系、後者は通常の絶縁体になることが分かった。これらのエッジ状態についても計算し、上記の分類と合致することが分かった。また第三に、スピンホール効果の研究の一つとして、励起子系のスピンホール効果について研究した。Cu_2Oやアルカリハライドなどの励起子のバンド構造から、励起子状態での波数空間のベリー曲率を計算することにより、スピンホール効果がどの程度起こるかを見積もった。この励起子スピンホール効果は結晶に局所的な歪みを与えることにより起こる。励起子はある寿命の後に発光することから実空間での励起子の運動を知り、スピンホール効果を観測することができることを提案した。本年は、スピンホール効果のうち特に興味深い現象である量子スピンホール効果について以下の成果を得た。まず量子スピンホール系のエッジ状態・表面状態の侵入長(バルクにどのくらい侵入するかの長さ)がどのように与えられるかについて、バンド構造との関係を明らかにした。エッジ状態や表面状態はエッジや表面近くに局在しているといっても、その長さは系によってさまざまであるため、エッジ状態・表面状態の観測、利用などにはその侵入長の知識が不可欠である。この侵入長はエッジ状態の波数空間での広がりの逆数でほぼ与えられることを発見した。特に侵入長の短い例としてビスマス薄膜をとりあげ、その侵入長が格子間隔程度の短いものであることを明らかにした。また関連した効果として量子スピンホール系のエッジ状態による熱電輸送について研究した。

エッジ状態は非磁性不純物に対して弾性散乱を受けないため、弾道的な伝導となり、それを生かすことができれば輸送に大きく寄与すると予想される。通常の試料形状ではバルクキャリアがエッジキャリアに比べて断然多いためエッジの輸送はなかなか優勢になりえない。そのため幅がナノメータサイズのリボン状の系を考えて、バルクキャリアとエッジのキャリアが共存する状況で計算を行ったところ、低温になるとエッジ状態が優勢になってきて、エッジ状態による熱電輸送が十分観測にかかることを理論的に見出した。こうしたエッジ状態による熱電輸送は、エッジ状態の非弾性散乱長が長くなるほど顕著になってくることを見出した。
天然マクロライドを基盤とした新規多発性骨髄腫治療剤の創製研究

多発性骨髄腫は、形質細胞が骨髄内で異常増殖し、免疫抑制とともに破骨細胞の活性化と骨髄間質細胞の骨芽細胞への分化抑制が同時に起こることで広範な骨破壊性病変が形成される難治性疾患である。本研究課題では、多発性骨髄腫に対して顕著な治癒効果を示した天然マクロライドLL-Z1640-2を基盤として、不斉全合成によってLL-Z1640-2及びその誘導体を合成し、プローブ化による標的タンパク質同定を目指した。その結果、閉環メタセシス反応を鍵段階としてLL-Z1640-2とその全二重結合異性体の合成を達成した。また、本合成経路から多発性骨髄腫細胞に対して強力な細胞傷害活性を示す誘導体も獲得した。超高齢化社会を迎えた日本において、加齢により罹患リスクが高まる多発性骨髄腫治療薬の開発は急務である。本研究では、多発性骨髄腫に抗腫瘍活性を示す天然マクロライドLL-Z1640-2を基盤として、次のような研究を展開する。1,独自の収束的全合成法を駆使して1及びその関連マクロライド誘導体の網羅的合成を達成する。2,本合成経路から創出される各種マクロライド及び代謝関連化合物の蛍光標識体を用いて真の生体内活性化合物を探索する。3,光クロスリンク法を活用し、標的タンパク質の同定ならびに活性代謝化合物の作用機序を解明する。これにより新規多発性骨髄腫治療剤開発を目指した基盤研究を確立することを最終目的とする。平成27年度においては本研究課題において、初期目標であるLL-Z1640-2の不斉全合成を達成し、これまでに合成されていなかった天然物誘導体の合成にも成功した。また、この全合成中間体の生物活性評価を精査したところ、LL-Z1640-2と同様に多発性骨髄腫細胞に強力な活性を示す化合物を見出した。本化合物は非常に短段階で合成可能であり、大量スケールでの供給も可能なことから、新たな有望医薬品シード分子として期待される。初年度は、当初の予定通り市販の化合物を出発原料に、三つのフラグメントの合成を検討を行った。その結果、短段階でのフラグメント合成には成功したものの、その後のパラジウム触媒を用いたカップリング反応の効率に問題があり、違う合成経路にてLL-Z1640-2の不斉全合成を目指した。その結果、低温分子内ring closing metathesisを用いることでLL-Z1640-2の炭素骨格を得ることに成功した。続いて、生物活性に重要とされるcis-enone部位の構築も選択的に行うことが出来た。未だ立体化学について改善の余地を残すものの、当初予定していたLL-Z1640-2の類縁体を網羅的合成法を確立した。化合物の分析データに加え、合成したLL-Z1640-2の生物活性評価を行った結果、これまでの結果と良い一致を示したことからも正確に目的物を得ることができたと考えている。現在、類縁体のin vitroでの多発性骨髄腫細胞障害活性ならびにキナーゼ阻害活性を測定中である。また、全合成の過程において、その中間体及び誘導体の生物活性評価も行ったところ、LL-Z1640-2と同等の活性を有する構造簡略化合物の獲得にも成功した。以上の理由から、本研究課題がおおむね順調に進展していると考えられる。【概要】超高齢社会を迎えた日本にとって、加齢により罹患リスクが高まり、健康寿命を著しく低下させる多発性骨髄腫治療薬の開発は急務の課題と言える。本研究では多発性骨髄腫において顕著な治癒効果を示した天然マクロライドを基盤とし、新規の多発性骨髄腫治療薬の創製研究に着手した。【結果】平成27年度に、当初設定していた標的化合物であるLL-Z1640-2の不斉全合成を達成した。しかしながら本全合成経路は多量の触媒を使用しなければならない点、工程数が長い等の問題点があった。平成28年度では、課題の一つであった合成終盤での変換効率を向上させるべく、新たな合成経路を立案した。すなわち、鍵段階となる閉環メタセシス反応で用いた基質を一部変更したところ、二重結合の幾何選択性に課題は残すものの、反応収率の大幅な向上と触媒量の低減に成功した。さらに、合成終盤での工程数の削減にも成功し、これにより大量合成時における問題点を改善することに成功した。また、本研究課題では全合成経路から網羅的に類縁化合物を供給することを目指していたが、全合成経路からLL-Z1640-2を含む異性体及び誘導体を新たに5種合成することができた。現在、骨髄腫細胞及び各種がん細胞を用いた細胞傷害活性を調査中であり、LL-Z1640-2と共に一つの新規誘導体については担癌モデルマウスを用いたin vivo試験も実施中である。平成27年度に、本全合成経路から見出した構造簡略型の新規誘導体にも強力な細胞傷害活性があることが明らかとなったが、本化合物は破骨細胞前駆細胞から破骨細胞への分化を抑制する活性を有していることが明らかとなった。その標的分子を明らかにすべく、分子プローブを作成し、現在標的分子の釣り上げ実験を実施予定である。

本研究課題では、多発性骨髄腫に対して顕著な治癒効果を示した天然マクロライドLL-Z1640-2を基盤として、不斉全合成によってLL-Z1640-2及びその誘導体を合成し、プローブ化による標的タンパク質同定を目指した。その結果、閉環メタセシス反応を鍵段階としてLL-Z1640-2とその全二重結合異性体の合成を達成した。また、本合成経路から多発性骨髄腫細胞に対して強力な細胞傷害活性を示す誘導体も獲得した。平成28年度は、当初の研究計画に従い、LL-Z1640-2及び強力な生物活性を有する誘導体に光標識残基及び蛍光分子を導入し、多発性骨髄腫細胞中での局在および標的タンパク質の同定に迫る。蛍光残基等の導入部位に関しては、詳細な構造活性相関研究を行う必要があることから、化合物供給における合成経路の最適化も同時に行う。また、LL-Z1640-2全合成中間体が強力な生物活性を有していることが判明したことから、本化合物の作用機序についての検討を行う。現在、クリックケミストリーに必要なアルキン体誘導体の合成を完了しており、本化合物の生物活性を詳細に調査した後、標的タンパク質を釣り上げることを試みる。有機合成化学当初予定していた20th Natural Products Society in Philippines Annual Conference(マニラ・フィリピン)への参加・渡航滞在費用を加算していたが、所属研究機関の若手研究者支援予算を利用することができたことからこのような差額が生じた。その他に関しては概ね予定通りの使用であったと考えている。計画は当初の予定通り順調に進んでいる。平成28年度では合成した天然マクロライドLL-Z1640-2をはじめ、その誘導体の生物活性評価をさらに行っていくことから、実験動物の購入等に当該助成金を当てたいと考えている。
X線光電子分光法と固体NMR法による酸化物ガラス中の硫黄の状態分析

オキシスルフィド系ガラスは、通常の溶融急冷法で系内に多量に硫黄を含有する事ができる系として知られており、酸化物ガラス中での硫黄の追跡に最適な系である。ガラス工学上よく取り上げられる酸化物系組成を基本にして、最初にアルカリ硫化物とガラス網目構成酸化物による二成分系ガラス:R_2S-MxOy(R=Li, Na, K ; MxOy=SiO_2,B_2O_3,GeO_2)の作製を試みた。作製した試料は組成に対応した着色の変化が系統的に観察され、ガラス中への硫黄の残存が確認された。また本系ガラスは、対応する酸化物系ガラス組成と比較して、高アルカリ領域までガラス化が可能である事が判明した。ガラス化範囲はGeO_2系>SiO_2系>B_2O_3系の順で高アルカリ領域まで拡大しており、ガラス中への硫黄の残存量もこの順序で多くなることが認められ、このことはHSAB理論から予想される傾向と一致することが確認された。各系試料のXPS測定から、S2pスペクトルのシグナルは161eV付近に観測され、ガラス中の硫黄は単体の硫黄結晶より低原子価の硫黄として存在している事が判明した。このS2p Binding Energy値はNa_2Sにおける値とほぼ等しく、本系ガラス中での硫黄はイオン結合性の強いsulfideに近い電荷密度を持った状態で存在していることが判明した。更に、本系ガラスのOlsスペクトルの面積強度比から求められる非架橋酸素の割合は、高アルカリ領域で酸化物系ガラスと比較して小さくなっている事が分かり、本系ガラス中の硫黄は非架橋酸素部位を選択的に占有している事も判明した。また、R_2S-SiO_2系ガラスの^<29>Si MAS-NMR測定から、硫黄を配位したシリコン原子の存在が確認でき、ガラス中の硫黄は一部が酸素と置換してガラス網目構成成分となっている事が判明した。R_2S-B_2O_3系ガラスの^<11>B MAS-NMR測定からは、ガラス中の硫黄は大部分がポリスルフィドイオン(:Sx^2)である事が判明した。上記の二成分系ガラスの結果をもとにして、硫黄を含有したボロシリケート系ガラスとソーダライム系ガラスの三成分系ガラスの作製を試み、ガラス化範囲を決定することができた。XPSとMAS-NMR測定から、ガラス中に非架橋酸素部位が存在するときにSi-S結合が生成し,それらの結合がガラスの着色に影響を及ぼすことが判明した。ガラス工学上よく取り上げられる酸化物系組成を基本にして、最初にアルカリ硫化物とガラス網目構成酸化物による二成分系ガラス:R_2S-MxOy(R=Li,Na,K;MxOy=SiO_2,B_2O_3,GeO_2)の作成を行った。作成した試料は、組成に対応した着色の変化が連続的に観察され、ガラス中への硫黄の残存が確認された。各試料のXPS測定から、S2pスペクトルのシグナルは161eV付近に観測され、ガラス中の硫黄は単体の硫黄結晶より低原子価のS^<2->として存在している事が判明した。このS2p Binding Energy値はNa_2Sにおける値とほぼ等しく、本系ガラス中での硫黄はイオン結合性の強いS^<2->として存在していることが考えられる。また、Na_2S-SiO_2系ガラスの^<29>SiMAS-NMR測定から、硫黄を配位したシリコン原子の存在が確認でき、ガラス中の硫黄は一部が酸素と置換してガラス網目構成成分となっている事が判明した。更に、本系ガラスのO1sスペクトルの面積強度比から求められる非架橋酸素の割合は、高アルカリ領域で酸化物系ガラスと比較して小さくなっている事が分かり、本系ガラス中の硫黄は非架橋酸素部位を選択的に占有している事も判明した。今後はこれら二成分系ガラスの結果をもとにして、硫黄を含有したボロシリケート系ガラスやソーダライム系ガラス等の三成分系ガラスを作成し、ガラス構造に硫黄が与える影響について検討を行う予定である。各系試料のXPS測定から、S2p

スペクトルのシグナルは161eV付近に観測され、ガラス中の硫黄は単体の硫黄結晶より低原子価の硫黄として存在している事が判明した。このS2p Binding Energy値はNa_2Sにおける値とほぼ等しく、本系ガラス中での硫黄はイオン結合性の強いsulfideに近い電荷密度を持った状態で存在していることが判明した。更に、本系ガラスのOlsスペクトルの面積強度比から求められる非架橋酸素の割合は、高アルカリ領域で酸化物系ガラスと比較して小さくなっている事が分かり、本系ガラス中の硫黄は非架橋酸素部位を選択的に占有している事も判明した。また、R_2S-SiO_2系ガラスの^<29>Si MAS-NMR測定から、硫黄を配位したシリコン原子の存在が確認でき、ガラス中の硫黄は一部が酸素と置換してガラス網目構成成分となっている事が判明した。R_2S-B_2O_3系ガラスの^<11>B MAS-NMR測定からは、ガラス中の硫黄は大部分がポリスルフィドイオン(:Sx^2)である事が判明した。上記の二成分系ガラスの結果をもとにして、硫黄を含有したボロシリケート系ガラスとソーダライム系ガラスの三成分系ガラスの作製を試み、ガラス化範囲を決定することができた。XPSとMAS-NMR測定から、ガラス中に非架橋酸素部位が存在するときにSi-S結合が生成し,それらの結合がガラスの着色に影響を及ぼすことが判明した。
二波長のモード機能を有するOCTを用いた初期齲蝕病変の検出

本研究は,1310nmおよび830nmの2種類の波長を有するOCT装置を用いて,初期齲蝕病巣の検出を行うことを目的とし行った。試片としてヒトエナメル質を用い,人工初期齲蝕領域を作成し,計測を行った。その結果,1310nm, 830nmの波長ともに,エナメル質表層に作成した人工初期齲蝕領域の脱灰部位を,健全部に比べ輝度の高い領域として検出した。特に,830nmの波長は分解能に優れるため,エナメル質表層直下の信号検出に有効であった。以上のことから,初期齲蝕等の白班病変におけるエナメル質の脱灰程度を非侵襲的に検出するモダリティとしてOCTは有効であることが示された。本研究の目的は,近赤外線領域に二つの測定波長(1310nm・830nm)を持つ試作光干渉断層画像診断装置を応用して,その光学的特性の差異から,エナメル質の脱灰,石灰化の状態を非破壊,非接触にて定量化し,その客観的資料から,エナメル質の白班病変等における脱灰の程度を検討することによって,介入の指標とし,非侵襲的手法による初期齲蝕の検出評価法を臨床的に確立し,治療方針を立案することである。実験では,近赤外光の干渉原理を応用したOCT装置を用い,健全エナメル質と脱灰を行った部位の信号強度分布を比較した。白班部は,初期齲蝕に認められるホワイトスポット等結晶構造が周囲と異なるため,光の屈折率に差が生じ,その結果として現れるものである。本実験の結果,光干渉断層画像装置から得られた情報では,脱灰傾向にあるエナメル質は,OCTの信号強度は増幅傾向にあることがわかった。さらに,830nmの波長を用いたOCTは1310nmに比べ,表層直下の信号強度に差が生じることがわかった。さらに,アルゴリズムとして1/e2幅を用いた解析では,1310nmと830nmでは,差が生じることが分かった。その詳細は,1310nmの光源では,波形は深部に及ぶ信号強度分布を示し,830nmを用いた光源では,その値は表層に限局していた。これらの結果から,白班病変部はエナメル質表層数μmの領域に発現するため,その詳細を解析するには,分解能の高い波長である830nmの光源を応用することが妥当であることがわかった。さらに,1310nmの光源は,深部への透過性が高いため,深部の断層画像を得るには1310nmの光源を用いる方が有利である事がわかった。これらのことから,エナメル質の脱灰,再石灰化における状況を定量化することによって,光干渉断層画像法を初期齲蝕等の診断に用いる事が可能である事が示された。本研究の概要は,非侵襲的手法による初期齲蝕の検出評価法を臨床的に確立し,治療方針を立案することを目的としている。方法としては近赤外光の干渉原理を応用したOCT装置を用い,得られたデータから歯質の脱灰状況を評価するものである。初期齲蝕等に認められる脱灰病変は周囲の健全エナメル質と結晶構造が異なるため光の屈折率の差として現れる。そのため,初期齲蝕の検出には,非破壊,非接触による定量化が可能なOCT装置を応用することが有効である。実験では,健全エナメル質と脱灰を行った部位の信号強度分布を数値データとして得た。その数値をアルゴリズムとして1/e2幅を用い,解析を行い,積分値を算出した。本年度の実験ではヒトエナメル質を試片として用いた。本実験の結果,光干渉断層画像装置から得られた情報では,脱灰傾向にあるヒトエナメル質は,OCTの信号強度は増幅傾向にあることがわかった。さらに,1/e2幅は増加することがわかった。830nmの波長を用いたOCTは1310nmに比べ,表層直下の信号強度に差が生じることがわかった。これらのことから,ヒトエナメル質の脱灰,再石灰化における状況を定量化することによって,光干渉断層画像法を初期齲蝕等の診断に用いる事が可能である事が示された。

26年度が最終年度であるため、記入しない。歯学26年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では,歯質の脱灰状況とOCT像の関連性を探るため,脱灰試片における波長1310nmおよび830nmによって得られたOCT像を観察するとともに,信号強度分布等,基礎的データを収集した。さらに初期齲蝕病巣モデルに対して再石灰化療法を行った場合の変化を,波長1310nmおよび830nmのOCTを用いて観察するとともに,信号強度分布の経時的変化等,基礎的データを収集した。これらから得られた基礎的画像データ,信号強度分布の結果を定量化し,脱灰および再石灰化傾向の指標とした。これまで実験は滞りなく進行し,超音波縦波音速の測定実験との相互補完的に考察が可能である。実験によって得られたOCT像から,信号強度分布およびピーク波形を解析,定量化を行い,脱灰および再石灰化における信号強度分布を,1310nmおよび830nmにおける経時的変化を比較,検討する。さらに,1/e2を応用することによって表層の信号と深部の信号を分離し,初期齲蝕の表層下脱灰の程度を,非破壊的に検討する。また,超音波パルス法により,歯質の縦波音速を測定し,非破壊的手法の比較・検討を行う。また走査型電子顕微鏡観察を行い,得られた断層像と比較・検討し相互補完的に考察する。以上を今後の実験課題とする。
アテローム血栓症におけるポドプラニン／ＣＬＥＣー２の関与

心筋梗塞や脳梗塞などのアテローム血栓症は、粥状動脈硬化巣(プラーク)の破綻に伴う血栓形成により発症する。本研究では、アテローム血栓症の発症における血小板凝集促進因子Podoplanin/CLEC-2の関与について、剖検例の冠動脈と狭心症・心筋梗塞患者の冠動脈アテレクトミー標本および吸引血栓を用いて臨床病理学的検討を行う。さらに血栓イメージング法、動物実験により、Podoplanin/CLEC-2システムのIn vivoにおける血栓促進作用の検討を行い、アテローム血栓症の治療ターゲットとしての可能性を探る。ヒトの病理組織標本を用いて冠動脈プラークにおける病理組織所見とポドプラニン/CLEC-2蛋白・遺伝子発現を臨床データと併せて解析した。(1)宮崎大学医学部附属病院および教育関連病院で施行されたDCA標本50例、心筋梗塞患者の冠動脈から採取される吸引血栓・血液サンプル50例およびヒト剖検症例冠動脈標本20例を用いて、冠動脈プラークと非プラークにおけるポドプラニン/CLEC-2蛋白発現の局在を免疫組織化学的に検討し、動脈硬化巣の組織所見との関連を明らかにした。(2)DCA標本、吸引血栓・血液およびヒト剖検症例冠動脈標本でのポドプラニン/CLEC-2蛋白/mRNA発現とその局在および蛋白定量の結果と臨床所見(不安定狭心症vs.安定狭心症、再狭窄の有無・程度との関連)を比較検討し、アテローム血栓症発症におけるポドプラニン/CLEC-2の関与について検討した。また、糖尿病、高脂血症、高血圧、喫煙などの危険因子との関連性についても検討した。上記(1)と(2)の結果の詳細についてポドプラニン発現は健常血管(非プラーク)ではごく少数のマクロファージで認めるのみであり、平滑筋細胞、内皮細胞、リンパ球では認められなかった。進行性プラーク内ではマクロファージを中心に一部の平滑筋細胞にもみられた。また、ポドプラニンの発現は炎症性サイトカインINFgammaやMMP 9の発現と相関していた。したがって、様々な危険因子の集積による血管壁炎症反応の亢進がポドプラニンの発現亢進につながり動脈硬化の進展に関与する可能性が示唆された。CLEC-2発現については、特異性のある抗体が使用できず詳細な検討は困難であるが、一方、冠動脈プラーク内におけるCLEC-2結合蛋白質について現在検討を進めている。(1)宮崎大学医学部附属病院および教育関連病院で施行されたDCA標本100例、心筋梗塞患者の冠動脈から採取される吸引血栓・血液サンプル200例およびヒト剖検症例冠動脈標本40例を用いて、冠動脈プラークと非プラークにおけるポドプラニン/CLEC-2蛋白発現の局在を免疫組織化学的に検討し、動脈硬化巣の組織所見との関連を明らかにした。上記(1)と(2)の結果の詳細についてポドプラニン/CLEC-2発現は健常血管(非プラーク)では認められず、進行性プラーク内でマクロファージを中心に一部の平滑筋細胞にもみられた。また、ポドプラニン/CLEC-2の発現は炎症性サイトカインやMMP 9の発現と相関していた。したがって、様々な危険因子の集積による血管壁炎症反応の亢進がポドプラニン/CLEC-2の発現亢進につながり動脈硬化の進展に関与する可能性が示唆された。特に、プラーク内でのポドプラニン/CLEC-2発現の亢進と関連する危険因子は糖尿病と高脂血症である可能性が示唆された。ヒトの病理組織標本を用いて冠動脈プラークにおける病理組織所見とポドプラニン/CLEC-2蛋白・遺伝子発現を臨床データと併せて解析する。(1)DCA標本50例、心筋梗塞患者冠動脈から採取された吸引血栓50例および剖検例冠動脈10例を用いて、冠動脈プラークにおけるポドプラニン/CLEC-2蛋白発現の局在を免疫組織化学的に検討し、同時にポドプラニンmRNA発現量をリアルタイムPCR法で定量する。(2)ポドプラニン/CLEC-2蛋白/mRNA

発現の結果と臨床所見(不安定狭心症vs.安定狭心症、再狭窄の有無・程度との関連)を比較検討し、アテローム血栓症発症におけるポドプラニン/CLEC-2の関与について検討する。また糖尿病、高脂血症、高血圧などの危険因子との関連性についても検討する。(3)ラット頸動脈の内皮細胞傷害モデルを用いて血栓形成に対するポドプラニンの作用を検討する。(結果と考察)ポドプラニンの発現は平滑筋細胞とマクロファージに認め、動脈硬化の進行度に従い過剰発現を示した。また進行性プラークでは主にマクロファージに発現しており、またマクロファージに発現するポドプラニンには糖鎖の付加が起こり血小板凝集能が亢進している可能性が示唆された。ポドプラニンの発現は炎症性サイトカイン(ING gamma)やMMP9の発現と相関していた。したがって、種々の危険因子の集積による動脈壁の炎症反応亢進がポドプラニンの過剰発現につながり、また動脈硬化の進展と血栓傾向に関与する可能性が示唆された。CLEC2の発現はマクロファージに認めると考えられプラークの進展におけるCLEC2の関与の検討が待たれる。また動脈壁にはCLEC2結合タンパク質が存在しその分子の同定を行った。CLEC2結合タンパク質は動脈壁の平滑筋細胞の分化マーカーであった。病理学心筋梗塞や脳梗塞などのアテローム血栓症は、粥状動脈硬化巣(プラーク)の破綻に伴う血栓形成により発症する。本研究ではる。(2)さらに細胞培養、血栓イメージング法、動物実験により、プラーク局所でのポドプラニン/CLEC-2の発現調節機序の解明とポドプラニン/CLEC-2の結合阻害による血栓抑制作用の検討を行い、アテローム血栓症における予防・治療のターゲットとしてのポドプラ現在までのところ、(1)については概ね目的に到達しているが、さらに症例数を増やして現象の確からしさを検討したい。(2)については培養実験には着手しているが、CLEC-2抗体の特異性に問題があり、また動物実験におけるポドプラニン過剰発現モデルの作製が困難で現在、新たな手法を模索している。心筋梗塞や脳梗塞などのアテローム血栓症は、粥状動脈硬化巣(プラーク)の破綻に伴う血栓形成により発症する。本研究では(2)さらに細胞培養、血栓イメージング法、動物実験により、プラーク局所でのポドプラニン/CLEC-2の発現調節機序の解明とポドプラニン/CLEC-2の結合阻害による血栓抑制作用の検討を行い、アテローム血栓症における予防・治療のターゲットとしてのポドプラニン/CLEC-2の可能性を探る。現在までのところ、(1)については概ね目的に到達しているが、さらに症例数を増やして現象の確からしさを検討したい。(2)については平成25年度に行う予定であり、まだ着手してない。(今後の推進方策)(1)引き続き症例の収集を重ねてDCA標本、吸引血栓・血液およびヒト剖検症例冠動脈標本の病理学的解析と臨床所見との比較検討をすすめる。(2)プラーク内におけるポドプラニン/CLEC-2の発現調節機構を解明するために、プラークを構成する平滑筋細胞や内皮細胞、マクロファージのヒト培養細胞におけるポドプラニン/CLEC-2発現を検討する。特に、これらの細胞が産生・分泌する種々のサイトカインによるポドプラニン/CLEC-2の発現調節について検討する。(3)冠動脈プラーク内におけるCLEC-2結合蛋白質について検討を進める。(4)ポドプラニン過剰発現モデルの作製
難治性慢性疼痛における遺伝子のエピジェネティック制御機構の病態解明

【目的】脊椎疾患、脊髄損傷などで続発する神経障害性疼痛は難治性であり、臨床の現場で治療は困難を極めている。これまでの研究では神経障害性疼痛の原因を坐骨神経結紮モデルにより解析し、Noggin遺伝子の発現低下がみられた。今回の研究の目的は坐骨神経結紮によりNoggin遺伝子が減少することがわかったが、タンパクレベルでの発現はどうか。減少したNogginをくも膜下腔から投与し、アロディニアの改善が得られるかどうか。正常ラットにNogginのアンタゴニストであるBMP4を投与することにより、アロディニアを惹起するかどうか。【方法】Western blot : CCI後2週の時点で腰膨大部からタンパクを抽出。抗体は以下を使用した。【結果】Western blot : pSmad1, Noggin, BMP4について行った。Nogginのタンパクレベルでの減少はなく、BMP4の増加もなかった。pSmadlはCCIでむしろ減少していた。正常ラットくも膜下腔へのBMP4投与:正常ラットくも膜下腔にAlzet pump2週用を用いて、BMP4を投与した。PSS, BMP4投与、いずれもvon Freytestで5.46以上であり、アロディニアを誘発しなかった。なおCCI 1週間後のデータは平均4.88であった。CCIラットくも膜下腔へのNoggin投与:CCI後2週経過時点でNogginをAlzet pump(2週用)にいれて、くも膜下腔にチューブを留置した。Noggin濃度は10nanoから10microgram/mlまでとし、PBSをコントロールとした。10nano,2micro,10microgram/mlでアロディニアの軽減がみられたので、3濃度について、Nを増やして実験を行った。脊椎疾患、脊髄損傷などで続発する神経障害性疼痛は難治性であり、臨床の現場で治療は困難を極めている。今回の研究では神経障害性疼痛の原因を坐骨神経結紮モデルにより解析し、アストロサイトのグリオーシスを含むシグナル伝達機構のより上流を明らかにしたうえで、そのシグナルを阻害することにより疼痛軽減が得られるか検討したいと考えた。第一に坐骨神経結紮モデルラットと、コントロールを比較してマイクロアレイによる網羅的遺伝子発現解析を行った。3アレイ実験ですべて2倍以上の差異がある遺伝子、またはt-testにおいて有意であった遺伝子の中でグリオーシスや炎症細胞に関係する遺伝子をピックアップした。マイクロアレイデータをコンファームするためup-regulated遺伝子7個、down-regulated遺伝子5個をピックアップしReal-time RT-PCRを行った。更に、BMP2/3, Smad1, P-smad1, Opioid receptor-like1, NogginについてWestern blotを行いRNA実験と相関があるか検討した。IGF-1, PAP, Timp3, Aquaporine4, CD38, CD68の4遺伝子が発現増加で、Opioid receptor-like1, Nogginの2遺伝子が発現低下でReal-time PCRにおいてコンファームされた。発現増加遺伝子はアストロサイトや免疫細胞に関する遺伝子であり、発現低下遺伝子のNogginはBMPのアンタゴニストであることから、BMPシグナルの相対的活性化からグリオーシスが促進され神経障害性疼痛につながったと考えた。Western blotは現在結果を解析中である。マイクロアレイ実験、RNA実験は終了し、現在Western blotを行っている。それぞれの実験で有意な遺伝子候補が得られており、今後の解析が期待できる。DNAのメチル化については、有意な遺伝子候補がDNAのメチル化に関与していないという結果が得られており、やや遅れていると考えている。

マイクロアレイ、RT-PCRで有意な遺伝子候補であるNoggin, Opioid receptor like-1, CD38, CD68, Aquaporin4, IGF-1はCpGアイランドを有さないつまり、メチル化には直接関与しない遺伝子であるということがわかったため、メチル化についての今後の実験を修正する必要がでてきた。候補遺伝子の中でNogginはグリオーシスや軸索伸展に関与するBMPの拮抗物質であり、当遺伝子の発現量が減少したということは、相対的にBMPが増加したと考えられ、今後の研究でBMP発現の増減を明らかにしたいと考える。坐骨神経結紮モデルラットにおける遺伝子発現を突き詰める上で、Noggin、BMP4、BMP4の細胞内転写因子であるSmad1の蛋白発現について、Western blot法にて調べる。特にRNA発現が低下していたNoggin蛋白が減少しているかどうか、レセプターアンタゴニストのBMP4が増加しているかどうかは興味深い。抗体はAnti-Noggin(Santa Cruz)、Anti-BMP4(Santa Cruz)、Anti-p-Smad1(Cerotec)を用いて行う。Nogginの局在については坐骨神経結紮後、2週時点で還流固定し、組織切片を作成、蛍光免疫染色にて調べる。定量はオリンパスのFSX100蛍光顕微鏡を用いて定量する。上記たんぱく質の局在にもよるが、正常ラットのくも膜下くうにAlzet pumpを使用してNoggin, BMP4蛋白を持続注入し、アロジニアが生ずるかどうか調べる。これらの結果により、坐骨神経結紮モデルラットにBMP4かNogginどちらを注入すべきか判断する予定。
アンジオテンシンII受容体欠損マウスにおける遺伝子発現のプロファイリング

レニン・アンジオテンシン系(RAS)を阻害する薬物は心不全や心筋梗塞、腎不全の治療に極めて有効であることが近年の大規模臨床試験により明かとなってきた。従ってRASの最終産物であるアンジオテンシンIIが心血管系や腎臓においてどのような遺伝子発現を制御するかを明らかにすることは、循環器疾患や腎疾患の発生や進展の機序を理解するために極めて重要な課題と考えられる。本研究の目的はアンジオテンシンIIが発現制御に関与する遺伝子を包括的に検討することである。実験動物にアンジオテンシンIIの直接投与を行うと、投与方法、投与期間、投与濃度などにより、いろいろな違いが生じる可能性がある。そこで、心血管系に主に存在するアンジオテンシンII受容体であるタイプ1受容体のノックアウトマウスにおける遺伝子発現を正常対照と比較した。クロンテック社のアトラスを用いて、約2300個の遺伝子発現について解析した(n=12)。クロンテック社のメンブレンアレイを用いてノックアウトマウスと正常マウスとの間で2倍以上発現が変化している遺伝子を同定した。その結果タイプ1受容体のノックアウトマウスの心臓において発現が亢進している遺伝子47個、低下している遺伝子104個を同定した。タイプ1受容体のノックアウトマウスの腎臓において発現が亢進している遺伝子20個と、低下している遺伝子125個を同定した。アンジオテンシンIIによって生じる心血管病変の形成にこれらの遺伝子発現が関与していると考えられた。タイプ1受容体のノックアウトマウスでは血圧が正常対照に比し、3040mmHg低下している。したがって同定した遺伝子発現の変化は血圧低下に依存している可能性は否定できない。現在正常マウスにヒドララジンを投与し血圧をタイプ1受容体のノックアウトマウスと同等に低下させた場合に心臓や、腎臓の遺伝子発現がどのように変化するか検討中である。
非対称な結晶チャンネル中でのプロトンポンプ

水素イオン(プロトン)などのイオンを一つの向きのみに輸送することは平衡状態におけるランダムな熱運動では不可能である。微少な(エコノミック)外部刺激により、人工的にイオンを一つの向きのみに輸送することができれば、効率が高い「人工イオンポンプ」を創成でき、学術的に極めて重要であると同時に応用の路も開ける。本研究では、右向きと左向きの坂道勾配が異なるナノサイズのトンネル構造を持つ一連の結晶中で、プロトンを一方にのみ運ぶ基礎研究を行った。その結果、温和な条件で、これまでの物質以上にプロトンが動きやすい物質群を見いだし、また一方にのみプロトンを運ぶ実質的な手がかりを得た。非対称な一次元チャンネル中に陽イオン(X)および水分子が一次元に配列した構造を持つ一連の物質{(X)_2[Fe^<III>_2(ox)_2(μ-O)H_2O]_n(X=Na,NH_4,MeNH_3および(X)_2=(EtNH_3)(H_3O))を合成し、粉末成形ペレットについて誘電緩和およびインピーダンス測定を行った。複素誘電率はCole-Coleプロットでよく再現でき、緩和時間は物質により多少異なるが294Kで120μsであることを見出し、また活性化エネルギーは6066kJ/molとあまり物質に依存しないことを見出した。これはいずれの物質でも水分子やプロトンの動きが誘電応答の原因であるためと考えられる。さらに室温(294K)における複素インピーダンスの相対湿度依存性を測定した結果、複素インピーダンスのCole-Coleプロットから求められる電気抵抗率は相対湿度が0%から大きくなるにつれて急激に小さくなることを見出した。熱重量分析の結果から、相対湿度0%では室温でもチャンネル中の水分子が一部抜けることが観測され、これが低湿度状態での電気抵抗の増大をもたらすと考えられる。さらに室温で相対湿度60%でも電気抵抗率は1035kΩcmと極めて小さいことも見出した。X=NH_4の物質の重水素化物について、固体重水素核NMRスペクトルは極めて鋭く、アンモニウムイオンも水分子もチャンネル内で大きな熱運動をしていることを確認した。今後、外部電圧変調によりプロトンを一つの向きへ運ぶ現象の検出を試み、その条件の探究を進めていく。1.プロトン伝導の温度および湿度変化(温度090°C、相対湿度090%)を同時に測定できる装置を構築し、非対称な結晶チャンネルにNH4+イオンとH20分子が一次元に配列した錯体[(NH_4)_2[Fe(III)_2(ox)_2(μ-0)H_2O]nの粉末ペレットについて、プロトン伝導度の温度および湿度変化の詳細な測定を行った。その結果、プロトン伝導度の温度変化は単純なアレニウス式では表せないことが解った。これは、温度変化により結晶チャンネル中の水分子の数が変化するためと考えられる。これは、温度と湿度の条件により、プロトンがジャンプする距離を変えることができることを示唆している。プロトン伝導度はNafionに匹敵する。2.一次元のチャンネル方向のプロトン伝導度を精査するため、上記物質のできるだけ大きい単結晶を作る条件をさまざま試した結果、一辺が0.3mm0.6mのブロック状の単結晶を得ることができた。ただし、単結晶は低湿度下(大気中)で劣化しやすいことを見いだしたため、劣化を防止しつつ、単結晶のプロトン伝導を測定するために装置の改良を行った。3.この結晶では低湿度下では、プロトン伝導は押さえられ、局所的な運動のみになることを見いだした。今年度購入した高速バイポーラ電源(HSA4051)を用いて、対称中心を持たないこの結晶の分極のヒステリシスを測定するための回路およびプローブの構築を進めた。1.昨年度までに、プロトン伝導度がNafionに匹敵することを見いだした非対称な一次元結晶チャンネルにNH_4+イオンとH_2O分子が一次元に配列した錯体(NH_4)_2[Fe(III)_2(ox)_2(μ-0)H_2O]nについて、さらに詳細な測定を行ったところ、交流伝導度を連続して繰り返し測定すると、その値がどんどん小さくなっていくことを新たに見いだした。この傾向は交流伝導度測定時の印可交流電圧が大きいほど(2V)顕著であり、印可電圧を小さくすると(0.01V)目立たなくなる。これはまさに、本挑戦的萌芽研究で目指した室温近傍における非対称な一次元結晶チャンネルにおける微弱外場変調によるプロトンポンプが実現していることを示すと考えている。つまり、微弱交流電場を印可することによって、非対称な一次元結晶チャンネルの両方の向きに同等にプロトンが移動するのではなく、連続した繰り返し測定により一方にプロトンがたまってくるため、見かけ上、交流伝導度が小さくなってくると考えている。

2.アンモニウムイオンの代わりにリチウムイオンLi+を置換した同型の結晶においては、さらに伝導度が高く、外場の相対湿度依存性などはアンモニウム塩と同様な傾向を示すことも新たに見いだした。3.これらの結果はインパクトのある研究成果であり、次の研究ステップへの大きな道を開いたと考えている。さらに、単結晶を用いた確固たる検証実験を行った後に、インパクトのある学術論文誌に、成果発表を行う。それまでは伏せておく予定である。
各地無型アクセント方言の韻律的特徴と教育

昨年度に引き続き、福島県白河市・会津若松市・茨城県日立市、熊本県熊本市、沖縄県における無型アクセント調査研究と韓国人日本語学習者に対する日本語アクセント指導の試行を行い、また今年度新たに、愛媛県大洲市を調査対象に加え、研究を行った。詳しくは次の通りである。(1)福島県白河市・会津若松市を対象にした研究では、昨年度収録した自然談話の音調符合付きの文字化を約1時間分進めている。また、今年度語アクセントと文アクセントの調査を行い、世代差や場面差によるアクセントの違いがあるのではないか、と仮定し分析を進めている。(2)茨城県日立市を対象にした研究では、昨年度収録した自然談話の文字化約30分分を終えた。今年度は語アクセント・文アクセントの調査を行った。(3)熊本県熊本市対象の調査では、自然談話収録と文アクセントの調査を終え、文型によってそのイントネ-ションパタ-ンが異なるのではないか、イントネ-ションが意味的機能(話し手の表現意図・モダリティ・丁寧さ)を持つのではないか、と仮設を得、更に分析を進めている。(4)愛媛県大洲市の研究では、本年度自然談話の収録を行い、その調査分析を進めている。(5)沖縄県の研究では、宮古狩俣方言の音声・音韻・13拍語のアクセント調査を終え、音韻の面では特に無声化現象や有声音化と脱落現象の要因の究明を進めている。また一型アクセントの史的変遷についても研究している。(6)韓国人に対する日本語アクセント指導の試行では、学習者の習得度調査を実施後実験クラスを開設し、学習者をアクセントの規則を明示的に教えるクラスと、反復練習を中心とするクラスに分けたが、現在のところこの二つのクラスに目立った差異はない。なお、(1)(5)までの調査地点での調査結果は相互に照らし合わせ、比較検討中である。
ニッケル酸化物における電荷整列の研究

今年度はLa_<2-x>Sr_xNiO_4系のうちcommensurateな電荷整列を起こすx=1/3,1/2以外の組成の試料を作製し、その抵抗率、ホール係数、光学スペクトルの温度変化、ラマン散乱スペクトルなどを測定した。x=1/3から組成をずらすことによって電荷整列相転移にともなう抵抗率の異常が小さくなることがわかった。ホール係数の測定からはx=1/3前後の組成でキャリアの符号が反転し、x=1/3からのずれの分が余剰キャリアとして振る舞っていることを見いだした。x=1/3の組成で電荷整列転移温度以下で低エネルギー部分の光学伝導度が減少し、10Kにおいては0.26eVのギャップが開くことが我々の測定によって明らかにされていたが、x=1/3前後の組成、すなわちx=0.30,0.39の組成においても電荷整列転移温度以下でギャップ的な構造が成長することを見いだした。しかし最低温においてもそのギャップ構造はx=1/3に比してなまっており、この結果はホール係数の測定より得られた結論、すなわちx=1/3からのずれの分が余剰キャリアとして振る舞う、という描像と合致するものである。またラマン散乱スペクトルの測定から、電荷整列転移温度以下で電子ラマン散乱強度が急速に抑制され、2-マグノンによる散乱ピークが2本現れることを明らかにした。また、電荷整列にともない格子の対称性が低下フォノン散乱によるピークが活性化されるが、このフォノンピークは電荷整列転移温度以上から現れ始め、電荷整列転移の揺らぎをラマン散乱というダイナミカルなプローブによって観測した。
レンチウイルスベクターを用いた遺伝性角膜疾患に対する根治的遺伝子治療の開発

本研究では、遺伝性角膜疾患に対する根治的治療として、レンチウイルスベクターを用いた遺伝子治療の確立を目指した。レンチウイルスベクターは非分裂細胞、分裂細胞の両者に効率よく遺伝子導入ができ、永続的な発現が得られるベクターであり、近年、その安全性も飛躍的に向上している。本研究の結果、以下の成果が得られた。(1)角膜発現特異的プロモーターを開発した。我々がクローニングした斑状角膜ジストロフィの原因遺伝子CHST6のプロモーター部分を解析し、角膜特異的転写を促進するエンハンサー部位を発見した。このエンハンサープロモーター部位を用いることにより、導入遺伝子の角膜特異的発現を行うことができることを示した。(2)原因遺伝子CHST6のノックアウトマウスを作製し斑状角膜ジストロフィの動物モデルを作製した。(3)遺伝子導入を併用した培養角膜上皮シート移植法を開発した。ヒトの角膜上皮幹細胞を培養し、移植できる重層化した培養角膜上皮シートを作成・回収することに成功するとともに、レンチウイルスベクターによってeGFP遺伝子を全層性に導入した培養角膜上皮シートを作製できることを示した。(4)レンチウイルスベクターによってex vivo角膜内皮細胞へ遺伝子導入を行うことができることを示した。特に本研究の大きな成果として、遺伝子導入を併用した角膜移植と自己培養角膜上皮シート移植法を開発したことが挙げられる。後者は患者の自己の角膜上皮幹細胞を採取し、in vitroで欠損遺伝子を導入して培養角膜上皮シートを作製し、この培養角膜上皮シートを患者に自家移植する治療法である。遺伝性角膜疾患に対する根治的遺伝子治療の開発のため、まず、角膜発現特異的プロモーターの開発に取り組んだ。我々がクローニングした斑状角膜ジストロフィの責任遺伝子CHST6のプロモーター部分には角膜特異的転写を促進するエンハンサー部位が存在していたので、このエンハンサー部位とコアプロモーターを連結しGFPを下流につなげたコンストラクトを作製した。また、このエンハンサー部位を含むプロモーター部位とGFPを下流につなげたコンストラクトを作製した。現在は、これら2つのコンストラクトを用いたトランスジェニックマウスを作製中である。このマウスを解析して2つのプロモーターの各組織における発現パターンを検討し、角膜発現特異的プロモーターとして利用可能かを検討する。つぎに、eGFPを導入遺伝子としたレンチウイルスベクターを作製し、ヒト培養角膜上皮細胞シートに遺伝子導入を行った。その結果、eGFPが培養角膜上皮シート全層に発現していることが確認され、培養角膜上皮細胞移植を利用した遺伝子治療の臨床応用の可能性を証明することができた。またヒトex vivo角膜内皮にレンチウイルスベクターでeGFPを導入遺伝子としたところ、角膜内皮細胞に効率よく遺伝子導入することができた。全層角膜移植を利用した角膜内皮疾患に対する遺伝子治療の臨床応用の可能性も証明することができた。遺伝性角膜疾患に対する根治的遺伝子治療の開発のため、以下の研究を実施した。遺伝子導入を併用したヒト角膜上皮シートを作成した。まず、培養角膜上皮シートを作成する技術の確立のため、正常な角膜上皮幹細胞をヒト角膜輪部(移植に使用したUSAアイバンクアイの残り)より単離し、温度応答性の培養皿に播種した。2週間培養後に、低温度処理することにより、培養角膜上皮シートの回収に成功した。つぎにレンチウイルスベクターによりeGEP遺伝子導入を行なった後、培養角膜上皮シートを作成した。MOI=1,10,100で行った結果、ウイルスタイターが増すごとに導入効率が増加し、MOI=100では培養角膜上皮シートを構成するほぼ全細胞にeGFPの発現がみられた。この結果、遺伝子導入を併用したヒト角膜上皮シートの作成に成功した。また、遺伝子治療研究には動物モデルが必要である。

今回、遺伝性角膜疾患の1つである斑状角膜ジストロフィの動物モデル作成のため、その原因遺伝子CHST6のノックアウトマウスを作成した。これまでの解析の結果、電子顕微鏡レベルで角膜実質のコラーゲンの構築に異常が生じていることがわかった。この動物モデルを用いて、レンチウイルスベクターによる遺伝性角膜疾患に対する根治的遺伝子治療の開発を行うことが可能となった。