hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
アルコ-ル性肝障害における血清糖蛋白異常の病因論的意義

fucoseおよび^3Hーleucineを同時に注入し、肝細胞各分画および血清のTfへの転入状況を経時的に追跡した。A1ーPz肝炎ラットでは、コントロ-ルラットに比較して、血清Tfへのアイソト-プの転入率は明らかに低下していた。この低下は^<14>Cーfucoseで特に明瞭であった。肝細胞内のTfへの転入をみると、^3Hと^<14>Cのいずれ活性も15分で最高値を示し、120分には低値となったが、いずれの時点でもA1ーPz肝炎ラットの活性は有意に高かった。各分画の放射活性をみると、15分後では粗面小胞体とGolgi装置で、30分後ではGolgi装置での活性が高値を示したが、A1ーPz肝炎ラットでは15分後の粗面小胞体、30分後のGolgi装置での活性が有意に高かった。これらのことから、A1性肝障害における糖蛋白の分泌障害は肝微小管の減少に伴うGolgi装置の機能障害、特に糖蛋白のglycosilationの障害によるものであり、このことがA1性障害の発現の重要な役割を果たしていると明らかになった。<1.アルコ-ル(AL)性肝障害患者血清における糖蛋白微小変異の解析:>___ー血清transferrinの微小変異(DeーTf)を検出する簡便な方法を開発し、多数例についてその出現状況を分析した。Albumin除去後の血清を、狭いpH範囲で等電点電気泳動を行うと、DeーTfを容易に検出できたが、AL性肝障害80例では73%にDeーTfが陽性であり、陽性例は肝病変の進んだ例に多かった。一方、肝障害のない大酒家では陽性例はなかった。このように、DeーTfは大酒家のマ-カ-でなく、AL性肝障害を特異的に反映する異常と考えられた。非AL性肝障害患者80例では非代償性肝硬変でのみ陽性であった。Westernーblottingで分析すると、Tfのほかに、α_1ーantitrypsinでも明かな変異がみられた。血清をsialidaseで処理すると、正常者とAL性肝障害患者での電気泳動像はまったく同じで、微小変異はシア-ル酸の変異に由来しることが明かとなった。DeーTfに対する特異抗体は目下作成中であるが、簡便な検出法の開発で、その必要性は低くなった。<2.AL性肝障害と糖蛋白微小変異の関係:>___ー上述のごとく、DeーTfの出現はAL性肝障害を特異的に反映していることが明瞭になり、AL性肝障害ではTfはGolgi装置に蓄積していることが明かになっているので、肝の免疫電顕的分析は追加して行わなかった。<3.糖蛋白微小変異の出現機序の解析:>___ー^<35>Sーmethioninのpulseーchaseーchase labelling法で糖蛋白のkineticsを分析すると、Tfの分泌障害はその成熟の遅延によっていると推定された。<4.肝内糖蛋白の蓄積機序の解明:>___ーC^<14>標識asialoーTfの作成がきわめて困難であったので、別の面から検討した。非代償性肝硬変でのTfの微小変異のパタ-ンはAL性肝障害でのそれとは明かに異なり、sialidase処理によっても、異なったままであった。このことは、AL性肝障害でのTfの異常はその分泌障害によるもので、asialoproteinのreceptorの減少によるものではないことを示していると考えられた。
高機能接着性モノマーの開発とそのシステムの確立

日々の臨床において幅広く用いられている、セルフエッチングシステム中のリン酸系およびカルボン酸系機能性モノマーは接着能を左右する。しかし、それらの化学的性質と歯質接着性能の関連性については十分に明らかにされていない。そこで4-methacryloxyethl trimellitic acid(4-MET)、2-methacryloxyethyl phenyl hygrogen phosphate(phenyl-P)および10-methacryloxydecyl dihydrogen phosphate(10-MDP)の機能性モノマーを用い、歯牙硬組織主成分であるハイドロキシアパタイトとの化学的結合状態、さらに抜去歯牙を用い歯質との接着界面の観察および長期耐久性について引張り試験の値を指標に検討した。溶出カルシウム濃度は4-METCaでは1360±269 ppm、10-MDPCaでは6.79±0.43 ppm、Phenyl-PCaでは1910±137 ppmであり、10-MDPのカルシウム塩の値が他と比較して有意に小さく安定した接着が得られることが明らかとなり機能性モノマーの化学的性質の重要性を示すものと考えられる。走査および透過型電子顕微鏡による形態学的観察においては全ての機能性モノマーにおいて接着耐久性などに多大な影響を及ぼす樹脂含浸層の形成は数マイクロメータ程度であった。しかしながら、温度負荷(5°Cおよび55°Cの繰り返し)による長期耐久試験を行った結果、負荷回数0回においては各機能性モノマーにおいて有意差は認められなかったが、負荷回数が増加するに伴い、10-MDPと他の2つの機能性モノマーとの間に有意差が認められた。以上より、10-MDPは他の機能性モノマーより歯質接着能が優れていることが化学的に明らかとなり、さらに長期耐久性試験においても歯質接着性に優れていることが裏づけられた。X線光電子分光分析では、いずれにおいても歯芽硬組織主成分であるハイドロキシアパタイト表面と化学的に結合しているが、特に10-MDPは臨床を考慮した短時間においても高い吸着量を示した。さらに過酷な口腔内環境においてその化学結合の安定が接着耐久性に多大な影響を及ぼすことから、原子吸光分光分析法を用い、3つの接着性モノマーのカルシウム塩の溶出量を検討した結果、最も化学的に安定していたものは10-MDPであることも確認された。透過型電子顕微鏡を用い形態学的観察を行った結果、全ての接着性モノマーを応用した接着システムにおいて接着耐久性などに影響を及ぼす樹脂含浸層は数マイクロメータ程度のものであった。現在、接着性モノマーの3次元分子構造が歯牙への接着特性に影響を解明するため、接着性モノマーの歯質配向側におけるカルボキシル基の位置、数を変えた分子について、その硬組織接着機能を検討している。そこで4-methacryloxyethl trimellitic acid (4-MET)、2-methacryloxyethyl phenyl hygrogen phosphate (phenyl-P)および10-methacryloxydecyl dihydrogen phosphate(10-MDP)の機能性モノマーを用い、歯牙硬組織主成分であるハイドロキシアパタイトとの化学的結合状態、さらに抜去歯牙を用い歯質との接着界面の観察および長期耐久性について引張り試験の値を指標に検討した。

溶出カルシウム濃度は4-METCaでは1360±269ppm、10-MDPCaでは6.79±0.43ppm、Phenyl-PCaでは1910±137ppmであり、10-MDPのカルシウム塩の値が他と比較して有意に小さく安定した接着が得られることが明らかとなり機能性モノマーの化学的性質の重要性を示すものと考えられる。走査および透過型電子顕微鏡による形態学的観察においては全ての機能性モノマーにおいて接着耐久性などに多大な影響を及ぼす樹脂含浸層の形成は数マイクロメータ程度であった。しかしながら、温度負荷(5°Cおよび55°Cの繰り返し)による長期耐久試験を行った結果、負荷回数10回においては各機能性モノマーにおいて有意差は認められなかったが、負荷回数が増加するに伴い、10-MDPと他の2つの機能性モノマーとの間に有意差が認められた。以上より、10-MDPは他の機能性モノマーより歯質接着能が優れていることが化学的に明らかとなり、さらに長期耐久性試験においても歯質接着性に優れていることが裏づけられた。
背景色と照明色の変化に伴う液体の色知覚変化についての包括的測定とモデル化

照明光の透明物体への影響は物体表面への影響とは大きく異なるため、表面色への色恒常性の研究から液体などの色の見えについて理解することはできない。そこで、本研究では透明物体の色恒常性について、色みと透明度という指標により検討し、また、液体と物体表面への色知覚の違いについて検討した。結果から、液体の色知覚が、それが置かれた空間の照明の色や背景の色から影響を受けることが示唆された。このことは、視覚特性を考慮した透明物体に対する画像の再現や視環境の設定、また評価方法が必要なことを示唆している。私達が物を見るとき、物体の表面から光沢感、凹凸感、透明感などの様々な印象を受ける。さらに、私達は、これらの情報を元に物体の硬度や重量なども予測している。このように物体表面から受ける印象は、実生活でスムーズに行動するための重要な情報源である。これを反映して、近年、3次元ディスプレイやコンピューターグラフィクスによる実物に近い質感の再現についての様々な研究が行われている。本研究は、透明色知覚の一つである液体の色知覚に着目し、実空間に置かれた液体の色表現の為の刺激条件を調べる研究である。本年度は、任意の照明色、背景色を提示可能な実験ブースの作成と実験の条件設定、予備実験を行った。装置の作成については、スライドプロジェクタを天井に設置することで、上方からテーブル上の観測者の目線に置かれた液体を照明するようにし、また液体の背景色を変化させるために、壁の色紙が取替え可能な小箱を作成した。次に、実験で用いる照明の光色として、A光源とD光源を含めた7色を選定した。液体の色は、D光源下における液体の色度と赤、黄、緑、青、紫、A光源のそれぞれの照明光色下での色度差の大きな8色を選定した。予備実験としてカテゴリカルネーミングによる色名を用いた色知覚判定を行った結果、照明の光色の変化に伴う色カテゴリーの変化は、色度変化の方向への色変化として説明可能である傾向を示した。このことから、さらにエレメンタリーカラーネーミングにより、色知覚変化の方向と色知覚変化量のデータを収集し、照明の光色や背景色の変化に伴う物理的な液体の色度変化と、それに伴う知覚色の変化を比較する必要があることが分かった。さらに、このことから液体の色知覚変化を定量的に示すことが可能であることが示唆された。私達は生活の中で、飲料水や食品、化粧品などのような液体を扱う事が多い。これまでに固体である物体表面の色知覚に関しては、多くの研究が成されてきた。しかしながら、実物を用いた液体の色知覚に関しては、条件の制御などが困難な為、体系的な研究は成されていない。そこで本研究では、実空間において、照明光の色が変化した際の透明液体の色の印象評価を心理物理手法によって調査した。実験では赤、橙、黄、黄緑、緑、青、ピンク、紫、無色透明の9色の液体を刺激として、それが赤、黄、緑、青、紫、D光源とA光源に相当する照明光の7色のいずれかで照明される条件を設定した。被験者は、各照明光に順応した後、エレメンタリー・カラー・ネーミング法により液体の見えの色を判定した。この手法により、液体を照明する光色の変化による液体の色の変化を定量的に示すことが可能となる。解析には、被験者が透明と応答した液体の判定結果を使用した。結果から、例えば赤色液体が赤色照明で照明されるように、液体と照明が同じ色の場合に、彩度が低下して知覚されることが分かった。また、照明光色の変化によりxy色度図上ではほぼ同じ値(例えば、青色照明の下の黄色液体と黄色照明下の緑の液体)を示しても、知覚的には異なっていることが示された。これは、同じ物理特性を持つ刺激に対して、我々の視覚系が照明光色を差し引いて液体の色を見ている事を示している。本実験条件のような実環境おいては、物体色表面ほどではないが、人が液体の色に対しても色恒常性を示すことを示唆している。本年度は、照明光色の変化に伴う液体の色知覚変化と物体表面の色知覚との比較を行った。視覚刺激として、透明物体と物体表面を設定した。透明物体としては、直方体の容器に入った液体を、ある照明光色で照明した合計19種類の液体を採用した。物体表面としては、液体とおおよそ同じ測色値(輝度、色度)を持つマンセル色票を採用し、液体と同じ大きさとした。被験者の課題は、液体と色票に対して、エレメンタリーカラーネーミングによりカラフルネス(色みの割合)と色の割合、さらに、透明度をマグニチュード推定法により評価することであった。被験者全員が、全ての色票の透明度を0%と応答した。Schultzらの色恒常性指数の導出方法に基づいて、両刺激に対するエレメンタリーカラーネーミングの応答から色恒常性指数を導いた。

色票に対する色恒常性指数は0から1の範囲を示したが、液体の場合は、全応答の18%が負の色恒常性指数を示した。また、透明度が高く判断される場合は、液体は負の色恒常性指数をとり、カラフルネスが低下する傾向が示された。液体とその背景の輝度や色の差と透明度との間に相関があることから、液体の色の一部が背景色の属性として知覚されることが、カラフルネスの低下の原因になっていると考えられる。視覚刺激である液体の色の選択と結果の分析に時間を要している。解析では、特に液体や照明光の物理的な特徴と判定された見えの色との比較に関して、色空間の選定が問題となっている。24年度が最終年度であるため、記入しない。実験計画の刺激条件として,有彩色の乳濁状態の液体を設定する予定であったが,物理特性の設定が不安定であるため,刺激条件設定から除いた.24年度が最終年度であるため、記入しない。
新規合成ペプチドの作用機序の解明とそれに基づく新たな歯周組織再生創薬の開発

歯根膜幹細胞に合成ペプチドを作用させると、Platelet-derived Growth Factor Beta Polypeptide (PDGF-β)の遺伝子発現が有意に増加した。このPDGF-βはエムドゲインと同様の生理作用を示すことが知られている。PDGF-βの生理作用として、細胞増殖と細胞遊走を活性化すると報告されている。したがって、合成ペプチドは歯周組織再生のうえで重要な再生領域への細胞の増殖・遊走を活性化させる機能を有する可能性があることが示唆された。Microarray解析(網羅的遺伝子解析)では、歯根膜幹細胞に合成ペプチドを作用させると、Leucine-rich repeat-containing protein (LRR)の遺伝子発現がコントロール群と比較して35倍増強された。LRRは骨芽細胞に高く発現する遺伝子であるとされている。すなわち、合成ペプチドはLRRを介して歯根膜幹細胞の骨芽細胞分化を促進する可能性が示唆された。この発見は合成ペプチドがLRRを介して作用する新しい知見を発見することができたといえる。Western blot解析(シグナル経路解析)では、また歯根膜幹細胞と同様に、歯周組織再生に重要な細胞であるヒト間葉系幹細胞に合成ペプチドを作用させ、タンパクを抽出した。採取したタンパクをWestern blotを用いて、シグナル経路の解析を行った。エムドゲインはERKを介して生理活性を示すことが知られている。そこで、採取したタンパクを用いて、ERKの発現について検討した。その結果、合成ペプチドはERKの発現を有意に活性化することが示唆された。本研究では、未解明であった合成ペプチドの作用機序について検討を行い、その一部について解明することができた。しかしながら、今後の課題として、合成ペプチドについてはin vivo実験等のさらに詳細な検討が必要であると思われる。26年度が最終年度であるため、記入しない。
物質のゲージ理論とナノ系非平衝量子輸送現象

電荷電流の保存則は当然満たすべき基本的法則であるが、ナノ系量子輸送の電子相関効果を非平衡摂動論により計算を行うと電荷保存則を破る結果を得る。この問題を踏まえ、本研究課題は、非平衡系で電荷保存則を明示的に満たし、かつ強い電子相関効果を取り込むことのできる「動的複合粒子描像」に基づく手法を提案開発し、非平衡量子ドット系の電子相関効果を統一的に記述できることを明らかにした。また新たな知見として、局所相関系の経路積分の厳密評価法を考案するとともに、ナノ量子系の非平衡定常状態に対して、具体的に量子熱力学を構築し、輸送現象との関連を明らかにした。本研究課題は、ナノ系の非平衝量子輸送現象を物質ゲージ場の理論見地から再定式化することで、非平衝電流保存則を自然に保証する理論的枠組みを構築し、理論的扱いが困難な非平衝相関系に対し、ゲージ理論での強力な解析手段を活用することにある。本年度の研究実績は以下の通りである1.電荷自由度を記述する物質ゲージ理論(物質位相場)に着目し、ナノ系量子輸送現象の定式化を行った。非平衡量子輸送現象を扱うために、Keldysh理論と計数場統計の手法を組み合わせ、量子ドット系を流れる非平衝電流の生成関数を構成した。得られた生成関数は、電子相関のない極限では計数統計のLevitov-Lesovick公式を再現し、電子相関の影響は物質位相場の寄与として表される。特に有限バイアス下では、位相場の閉時間経路に沿う巻き付き数の効果が重要となることがわかった。2.従来の電子相関に関する非平衝摂動計算は、一般的なゲート電圧配置では非平衝電流が必ずしも保存されないことが知られている。本課題を遂行するにあたり、我々は改めて従来の摂動計算と電流保存の問題を見直したところ、これまで20年以上、数値積分に依り評価されてきた2次摂動自己エネルギーの寄与が、二重対数関数とよばれる特殊関数により厳密に評価可能であることがわかった(Phys. Rev. Bで発表済)。3.ナノ量子輸送の位相コヒーレンスを撹乱する効果としては、有限温度と有限バイアスが代表的であるが、両者は多くの類似する性質を持つ一方、理論的には前者は平衡系で可解、後者は非平衝系で非可解と大きく異なる。仮想的な多端子系を導入することで両者を連続的につなぐことができ、非平衡電子相関系の位相緩和効果を考察する上で、可解極限として平衡相関系を考え得ることを提案した(日本物理学会・米国物理学会にて発表済)。本研究課題は、ナノ系の非平衝量子輸送現象を物質ゲージ場の理論見地から再定式化することで、非平衝電流保存則を自然に保証する理論的枠組みを構築し、理論的扱いが困難な非平衝相関系に対しゲージ理論の強力な解析手段を活用することにある。前年度に引き続き、ナノ系の非平衡量子輸送現象の解析を進めた。本年度の研究実績は以下の通りである(いずれも日本物理学会にて発表済み、現在論文準備中)。1.単一準位アンダーソンモデル模型では、ハバード型相互作用を電荷型相互作用とみなすことができる。その為、電荷自由度を記述する可換位相場のみで系を記述可能であり、非零モードの寄与をガウス近似をせずゲージ不変性を満たすように高次まで取り込むと、近藤効果に相当する緩和定数の繰り込みが低温領域で現れることを示した。2.電子相関の非摂動効果を系統的に評価する方法を開発した。電子相関の非摂動的効果の代表的例は、相互作用量子ドット系の孤立極限である。その挙動は運動方程式の方法により解くことが可能であるが、電子自由度を完全に消去する物質ゲージ場の枠組みの中でその寄与を定量的に評価することは強結合領域の問題となるため困難である。そのため新たに電子の自由度を消去することなく位相場を電子に付加する「複合粒子描像」に基づく解析手法を開発した。Keldysh汎関数法によりドットの孤立極限を厳密に扱うことが可能となった。3.前述の複合粒子描像に依ると、フェルミ粒子/ボーズ粒子を問わず局所的相互作用を持つ複数準位系で厳密にKeldysh汎関数が評価可能となる一連もモデルを与えることがわかった。従来、経路積分の厳密評価は、特殊な例を除けばガウス積分型のみであり、得られた結果は新しい(非Fermi流体の)固定点理論の標準理論があることを示唆し、相関量子系の概念や理論手法にパラダイムシフトを起こし得る、興味深い結果である。本研究の目的は、ナノ系の非平衝量子輸送現象を解析するにあたり、系の正しい電荷・スピン対称性が明確な位相的自由度(=物質ゲージ場)による理論を構築・展開することである。これは、ナノ構造系の量子輸送を考察する際に標準的に用いられる非平衡摂動計算を行うと必ずしも電流保存則が保証されないという、非平衡相関系特有の問題を根本的に解消するためである。予算の支出は研究実施計画に則り、課題遂行に必要となった計算機・周辺機器等の購入、および研究課題に関する成果発表を行なった日本物理学会への参加・出張・滞在費である。前年度進めていたAmbegaokar-Eckern-Schoen模型と電荷位相自由度(=可換物質ゲージ場)による取り扱いを低温領域(近藤効果)を記述するためスピン自由度を含むように拡張しようとすると、幾つかの深刻な問題があることが判明した。

次に非可換物質ゲージ場を非線形シグマ模型によって解析する手法を適用したが、くりこみのフロー解析は可能であるものの、電流等の定量的な評価を行うには不十分であることがわかった。そのため、電子の自由度を消去して物質ゲージ場のみで解析を進めるという当初の方針を改め、物質ゲージ場をフェルミ流体描像に付加してゲージ不変性を保証しつつ定量的な評価も行うことが可能な「動的複合粒子描像」に基づく理論解析法を新たな解析手法として開発することになった。別の要因として、当初研究協力者として予定していた大学院生が体調不良により休学したこともある。以上の経緯により、研究実施計画に若干の遅れが出ることになった。ただし、今回開発した「動的複合粒子描像」は複数準位系や量子ビットを実現する複数個量子ドット系に容易に適用可能であるなど、幾つかの優れた利点を備えており、本研究課題に新たな可能性をもたらすものである。本研究課題は、ナノ系の非平衝量子輸送現象を物質ゲージ場の理論見地から再定式化することで、非平衝電流保存則を自然に保証する理論的枠組みを構築し、理論的扱いが困難な非平衝相関系に対しゲージ理論の強力な解析手段を活用する。現在、相互作用の効果を動的位相自由度として電子に付加する「動的複合粒子描像」に基づく手法を主軸に、研究を進めている。本年度の研究実績は以下の通りである(いずれも日本物理学会および米国物理学会にて発表済)。1.動的複合粒子描像を単一準位量子ドット系に適用すると、動的位相自由度による電子部分への繰り込みという観点から非平衡量子ドット系を統一的に理解可能である。特に低温における大きな動的位相揺らぎによる繰り込み効果を扱うため、位相演算子の手法をKeldysh経路積分に取り込み、電子の自己エネルギー部分の解析的近似形を得た。2.1.で得られた解析的近似の妥当性を定量的に評価するため、(1)一体スペクトルの総和則の確認、および、(2)数値繰り込み群による線形コンダクタンス結果との比較、を行った。(1)当初、低温において最大10%程度、総和則からの逸脱が見られたが、波動関数くりこみ因子により解決した。(2)線形コンダクタンスの温度依存性を数値繰り込み群の結果と比較検討し、高温から近藤温度程度の温度領域に対して定量的にもかなり良い一致を示すことが確認できた。3.動的複合粒子描像に基づく解析法が柔軟な拡張性を持つことを示すため、二重量子ドット系(「サイド結合T字型二重量子ドット系」)への適用を行った。「動的複合粒子描像」に基づく近似により各ドットのスペクトル関数および線形コンダクタンスを評価でき、相互作用により低温では2個の量子ドット間でスペクトル関数の乗り移りが起き、量子輸送に反近藤効果と呼ばれるコンダクタンス減少が現れる、という妥当な結果を得た。本研究の目的は、ナノ系の非平衝量子輸送現象を解析するにあたり、系の正しい電荷・スピン対称性が明確な位相的自由度(=物質ゲージ場)による理論を構築・展開することである。これは、ナノ構造系の量子輸送を考察する際に標準的に用いられる非平衡摂動計算を行うと必ずしも電流保存則が保証されないという、非平衡相関系特有の問題を根本的に解消するためである。本年度予算の主な支出は研究実施計画に則り、研究課題に関して研究代表者および研究協力者が成果発表を行なった日本物理学会および米国物理学会への参加・出張・滞在費である。
mTORを介した栄養環境感知システムの機能異常と病態

1.mTORを介した細胞内シグナルの分子基盤の解明:Raptorに結合する新規蛋白としてPRAS40を見出した。PRAS40はmTORによって直接しリン酸化される生理的基質であることが判明した。2.mTORシグナル改変モデルマウスの解析:膵β細胞特異的にmTORC1経路が活性化されたマウスを作製し解析した。このマウスは良好なインスリン分泌能を示し、膵β細胞の破壊や肥満によって引きおこされる糖尿病の発症を抑制していた。1.mTORを介した細胞内シグナルの分子基盤の解明mTORに対するscaffold蛋白Raptorと生理的に結合している蛋白PRAS40を見出した。本蛋白はRaptorを介してmTORによってリン酸化され、Ser183がそのリン酸化部位であることを明らかにした。mTOR阻害剤であるラパマイシンによる処理やアミノ酸の除去によってそのリン酸化が阻害される一方、mTORの上流の活性化分子であるRhebの発現によりそのリン酸化は亢進した。PRAS40はRaptorを介したmTORの生理的リン酸化基質であると考えられた。(J. Biol. Chem. 282; 20329-20339)2.Rheb発現トランスジェニックマウスの解析Rhebをインスリンプロモーターの下流につないだtransgeneを持つマウスを作成した。このマウスは糖負荷に対して、良好な耐糖能を示し、それは良好なインスリン分泌によってもたらされるものであった。組織学的解析にて、膵β細胞の領域が増加していることが示され、それは主に細胞増殖の亢進ではなく、細胞サイズの増加であることが明らかとなった。更にストレプトゾトシン処理や肥満によって引き起こされる高血糖に対しても、Rheb発現トランスジェニックマウスは良好な耐糖能をもたらすことが明らかとなった。以上から、膵β細胞におけるmTORシグナルの活性化はβ細胞の成長を促すことで良好なインスリン分泌をもたらすことが明らかとなり、将来糖尿病治療のひとつの標的となりうると考えられた。1.mTORシグナルに関わる新規分子の同定単離したmTORとraptorをin vitroで単独で反応させても、再結合は見られず、既知のmTORシグナルに関与する分子やシグナル伝達に関わる脂質を共存させてもmTORとRaptorの再構成は確認できなかった。しかし、細胞抽出液存在下では、再構成が観察できた。そこでmTORとRaptorの複合体が再構成される際に共存する蛋白を、SDS-PAGEで同定し、複数の候補蛋白を見出した。mTORとRaptorの複合体形成に第3の蛋白が必要であるということはこれまで知られておらず、この蛋白の機能解析はmTORシグナルの全貌の解明とその機能異常がもたらす病態を明らかにする上で、非常に重要な治験をもたらすものと思われる。現在その蛋白を質量分析装置にかけ、蛋白質の同定を行っている。2.膵臓β細胞におけるmTORシグナルの役割膵臓β細胞特異的にRhebを発現させたトランスジェニックマウスにおいては、良好なインスリン分泌を示し、肥満やストレプトゾトシン誘導糖尿病の発症を抑制した。その機序として、膵β細胞の増殖の亢進やアポトーシスの抑制には有意な差が認められなかったのに対し、膵β細胞の成長がトランスジェニックマウスで有意に亢進していた。一方、mTOR阻害剤ラパマイシンでマウスの処理を行うと、耐糖能異常が出現し、インスリン抵抗性に対する代償性のβ細胞の増大が抑制されている可能性が考えられた。またRheb発現によって得られた良好なインスリン分泌能が抑制されていた。mTORシグナルは全身のインスリン抵抗性と膵β細胞の代償性過形成の両方に関与している可能性が考えられた。
超微粒子球状シリカ系改良材の液状対策への実用化のための基礎的研究

超微粒子球状シリカ系改良材を浸透注入により液状化対策に用いた際の改良地盤の一軸圧縮強さや改良体の半径の推定手法を提案した.まず,一次元浸透実験を実施し,改良材の濃度,供試体の土粒子の粒径,試料の密度,一軸圧縮強さの関係を調べた.次に一次元浸透をモデル化した移流分散方程式を立式し,有効成分が土粒子に吸着された量を計算し,改良材の濃度,試料の密度や粒径,一軸圧縮強さとの相関を調べた.これらの結果を総合し,改良体の半径と一軸圧縮強さを推定する方法を提案した.提案した手法により推定した一軸圧縮強さと改良体半径について,模型実験,原位置試験の結果と比較したところ,概ね一致した結果となった.平成26年度は,超微粒子球状シリカ系改良材を用いた一次元浸透実験を行い,この実験結果を元に,原地盤に浸透注入を行った際の改良体の大きさと一軸圧縮強さを推定する方法を検討した。この結果により,土粒子の粒径,相対密度,改良材の水セメント比に応じて,実地盤に形成した改良体の大きさと一軸圧縮強さの推定方法を提案した。また,ドラム缶を用いた模擬地盤浸透注入実験を行い,推定手法と実験結果の整合性を調べた。一次元浸透実験は,試料としてケイ砂の5号から7号の試料を用いた。異なる相対密度でアクリル管に作製した土層について,超微粒子球状シリカ系改良材の浸透注入実験を行った。注入時は,上部から排出される溶液を採取し,排出液に含まれる固形成分の質量を計測した。供試体は60日間養生後にアクリル管から切断して一軸圧縮試験を行い,注入孔からの距離と一軸圧縮強さの関係について調べた。この実験結果を元に,一次元移流方程式を用いて改良材注入時の遅延係数を求め,固形成分の吸着量の分布と一軸圧縮強さの関係を調べた。その結果,供試体中の固形成分質量と一軸圧縮強さには比例関係が見られた。この実験結果を元に,地盤に浸透注入した際に球状に形成される改良体の大きさと一軸圧縮強さを,球対称問題における移流方程式を利用して推定する方法を検討した。次に,ケイ砂試料を用いたドラム缶を土槽として用いた浸透注入実験を行い,推定手法と実験結果の比較を行った。ドラム缶内に5号から7号のケイ砂試料で模型地盤を作製し,注入管を設置して地盤を模擬した注入実験を行った。注入後60日程度経過後に改良体を掘り出し,改良体の形状の計測と供試体の作製および一軸圧縮試験を行った。この結果と,提案した手法を用いて計算した改良体の大きさと一軸圧縮強さの比較を行った。その結果,あまり一致しているとは言い難い結果となった。今後は,推定精度の向上が課題となる。本年度は,極超微粒子セメント系改良材と,水ガラスにカオリンを混合した改良材について,一次元浸透実験と一軸圧縮試験を行った。極超微粒子セメント系改良材の一次元浸透実験は,ケイ砂5号,6号,7号の試料を用いた。異なる相対密度でアクリル管に作製した土層に対して,浸透注入実験を行った。14日間養生後に一軸圧縮試験を行った。排出液の時間と濃度の関係から,一次元移流方程式を用いて固形成分の吸着量の分布を求め,一軸圧縮強さとの関係を調べた。試料の粒径が小さく,相対密度が大きく,改良材の水セメント比が小さいほど改良後の一軸圧縮強さは大きくなった。また,供試体内の固形成分の質量と一軸圧縮強さに比例関係がみられた。水ガラスにカオリンを混合した改良材の一次元浸透実験では,5号ケイ砂と6号ケイ砂を試料として用いた。相対密度は60%とした。一次元浸透実験後に28日間養生し,一軸圧縮試験を行った。水ガラスにカオリンを混合することにより一軸圧縮強さが増加すること,その増加量は土粒子の粒径やカオリンの混合量,水ガラスの濃度の影響を受けることがわかった。また,強度増加には適切な混合量が存在する可能性があることがわかった。これらの実験により,懸濁型改良材では,懸濁物質である固形成分が土粒子に吸着される量が強度の増加に影響を与えていることがわかった。ただし,固結しないカオリンを混合した場合に,なぜ強度が増加するのか,適切な混合量と合わせて考察を行う必要がある。また,実際の地盤では,土の不均一性が室内実験よりも大きな影響を与えると予想される。地盤の不均一性をどのように考慮するかが今後の課題である。一昨年は,超微粒子球形シリカ系改良材の一次元注入実験の結果から,移流方程式を利用して遅延係数を求め,地盤に浸透注入した場合の固形成分の吸着量の分布から,改良体の大きさと一軸圧縮強さを推定する手法を提案した。本年度は,懸濁型改良材と,水ガラスにカオリンを混合した改良材について,移流方程式から固形成分の吸着量を推定し一軸圧縮強さを求めるという同様の手法が適用できるかを確認した。その結果,この二つの改良材についても,固形成分の土粒子の吸着量と一軸圧縮強さの関係が求められた。現状では,懸濁液型の改良材の土粒子への吸着と一軸圧縮強さの関係については,相関性がみられこと。

その関係には相対密度や改良材の濃度が影響を与えることがわかっている。ただし,極超微粒子セメント系改良材と水ガラスにカオリンを混合した改良材については,相対密度や平均粒径を変えた実験をさらに行い,データを集める必要がある。また実施の地盤は室内実験で制作した土層よりも不均一であることから,この実験データをそのまま原位置地盤に適用することは現状では難しい。現状では,原位置地盤の不均一性が改良体の形成に与える影響についての考察が不足していると思われる。本年度は,昨年度に引き続いて,極超微粒子セメント系改良材と,水ガラスにカオリンを混合した改良材について,一次元浸透実験と一軸圧縮試験を行った。極超微粒子セメント系改良材の一次元浸透実験は,ケイ砂5号,6号,7号の試料を用いた。異なる相対密度でアクリル管に作製した土層に対して,浸透注入実験を行った。注入時は,上部から排出される溶液を採取し,排出液に含まれる固形成分の質量を計測した。14日間養生後に一軸圧縮試験を行った。排出液の時間と濃度の関係から,一次元移流方程式を用いて固形成分の吸着量の分布を求め,一軸圧縮強さとの関係を調べた。本年度の結果に加え,これまでの研究成果も総合的に考察した.その結果,吸着された極超微粒子セメントの質量と一軸圧縮強さは比例関係にあり,その比例関係は土粒子の粒径や相対密度によって異なることが分かった。水ガラスにカオリンを混合した改良材の一次元浸透実験では,5号ケイ砂と6号ケイ砂を試料として用いた。相対密度は60%とした。一次元浸透実験後に28日間養生し,一軸圧縮試験を行った。水ガラスにカオリンを混合することにより一軸圧縮強さが増加すること,その増加量は土粒子の粒径やカオリンの混合量,水ガラスの濃度の影響を受けることがわかった。ただし,これらの実験結果を整理し,懸濁型改良材を地盤に注入した際に形成される固結体の半径や一軸圧縮強さを推定するという当初の目的までは達することができなかった.十分な実験量があるので,まずはこれらの実験結果を整理して考察し,改良材を浸透注入する際の適切な配合設計方法を確立させるという当初の目的に対して,引き続いて研究を行っていく予定である.超微粒子球状シリカ系改良材を浸透注入により液状化対策に用いた際の改良地盤の一軸圧縮強さや改良体の半径の推定手法を提案した.まず,一次元浸透実験を実施し,改良材の濃度,供試体の土粒子の粒径,試料の密度,一軸圧縮強さの関係を調べた.次に一次元浸透をモデル化した移流分散方程式を立式し,有効成分が土粒子に吸着された量を計算し,改良材の濃度,試料の密度や粒径,一軸圧縮強さとの相関を調べた.これらの結果を総合し,改良体の半径と一軸圧縮強さを推定する方法を提案した.提案した手法により推定した一軸圧縮強さと改良体半径について,模型実験,原位置試験の結果と比較したところ,概ね一致した結果となった.超微粒子シリカ系改良材の一次元注入実験の結果から,移流方程式を利用して遅延係数を求め,地盤に浸透注入した場合の固形成分の吸着量の分布から,改良体の大きさと一軸圧縮強さを推定する手法を提案した。また,ドラム缶を用いた模擬地盤浸透注入実験を行い,球対称の移流方程式から固形成分の吸着量を推定し,一軸圧縮強さを求める手法を提案した。さらにこの推定結果と実験結果の整合性を調べるところまでを実施した。当初予定では,H26年度中に一次元浸透試験,H27年度でドラム缶を用いた注入実験,H28年度に実地盤に対する注入実験を行う予定であった。現在は,当初の予定が前倒しされ,H28年度実施予定であった原位置試験のデータが整理可能な状況となっている。
新奇行動獲得の神経基盤

昨年度は、求愛行動時に活性化する神経回路を観察する目的で行うカルシウムイメージングのためのコンストラクトを作成した。このうち、Gal4/UAS発現システムに適用するため、UAS配列の下流にGCaMP6(f-typeとs-typeの2種類のうちのいずれか:N末にスペーサーを介してtdTomatoをフューズしてある)をつなげたテナガショウジョウバエ用の形質転換用ベクター(マーカーとしてvermilionを使用)については正しくテナガショウジョウバエのattP系統に導入されていることを確認し、ホモ接合化して系統を樹立することができた。一方、これらのコンストラクトを汎神経系で発現させるためのGal4ドライバーとして作成したnSyb-Gal4ベクターについては、テナガショウジョウバエに正しく導入できていないことが分かったため、胚にインジェクションするところからやり直すことになった。何回かの失敗の後、ようやく正しい形質転換体を得ることができ、ホモ接合化をほぼ完了するに至った。昨年度完成したと思われていたnSyb-Gal4形質転換体が実際には正しく構築されておらず、途中から作成作業をやり直すこととなった。このためこれらの形質転換体を用いた神経活動の観察のステップに進むことができなかった。しかし最終的には正しい形質転換体を得ることができたので、次年度はこれを用いた実験を行うことができる。カルシウムイメージング用のテナガショウジョウバエ形質転換系統が完成したので、これを用いて求愛行動時における神経活動の状況を観察する。特に、脚の動きを制御する胸部神経節における神経回路を重点的に調べる。また、派生的ではあるが関連した研究課題として、メス性フェロモンがどのように受容されているかを調べることも行う。これは、種特異的な求愛行動が行われる前段階に当たるが、ここにおいてもテナガショウジョウバエに特有の神経機能の進化が観察される可能性があると考えている。進化発生学(Evo-Devo)は、モデル生物で発達した発生遺伝学の手法を非モデル生物に取り込むことにより、生物の多様な形態がいかにして生じたのか、その至近的メカニズムを多数明らかにしてきた。対して、行動の進化についての我々の理解は依然として限られている。本研究では、進化の過程で近縁種に見られない特徴的な求愛行動を獲得したテナガショウジョウバエに、キイロショウジョウバエで用いられる神経行動学の手法を導入して、どのような神経回路が新奇行動の獲得に関わっているのかを明らかにする。今年度は、求愛行動時に活性化する神経回路を観察する目的で行うカルシウムイメージングのためのコンストラクトを作成した。Gal4/UAS発現システムに適用するため、UAS配列の下流にGCaMP6(f-typeとs-typeの2種類のうちのいずれか:N末にスペーサーを介してtdTomatoをフューズしてある)をつなげたテナガショウジョウバエ用の形質転換用ベクター(マーカーとしてvermilionを使用)を作成した。また、これらのコンストラクトを汎神経系で発現させるためのGal4ドライバーとしてnSyb-Gal4ベクターも合わせて作成した。この際、プロモーター配列は種ごとに機能分化している可能性があるため、nSybのプロモーターはテナガショウジョウバエからクローニングしたものを使用した。これらのコンストラクトをattP系統にインジェクションし、形質転換体を得た。計画通り、カルシウムイメージング用のコンストラクトを作成し、テナガショウジョウバエに導入できた。形質転換体はまだホモ接合化できておらず、したがってまだ動作確認は行っていないが、次年度の早いうちに系統として樹立できるものと思われる。求愛行動時のカルシウムイメージングを可能にするためには、装置へのマウント方法について検討・最適化をする必要がある。こちらについても並行して行っていく。

これは、種特異的な求愛行動が行われる前段階に当たるが、ここにおいてもテナガショウジョウバエに特有の神経機能の進化が観察される可能性があると考えている。内定時期が遅かったため、形質転換体の完成が年度終盤となり、今年度中の飼育資材の使用量が少なくなった。その分は次年度以降に必要となってくるので、使用目的を変更せずに支出する予定である。前年度に、内定時期が遅かったことによる飼育資材の使用量減があり、未使用額が生じた。さらに、本年度はnSyb-Gal4系統を作成し直すことになり研究に遅れが生じた。この2つの理由により次年度使用額が生じたが、次年度は神経活動の観察に移れるので、そのための装置構築に要する部品の調達に使用する予定である。
マクロファージによるアポトーシス細胞の認識及び貪食の分子機構

私たちは、マクロファージによるアポトーシス細胞の貪食過程を定量化する実験系を樹立し、マクロファージとアポトーシス細胞を結びつけ貪食を誘導する分子を同定した。この分子は、MFG-E8(Milk Fat Globular Protein EGF-8)と呼ばれる因子で、活性化されたマクロファージによって分泌される糖タンパク質であった。このたんぱく質は、アポトーシス細胞上に露出されるリン脂質ホスファチジルセリンと特異的に結合することにより、アポトーシス細胞のみと結合した。次いで、本来アポトーシス細胞を貪食しないマウスの繊維芽細胞にMFG-E8を加えたところこの細胞はアポトーシス細胞を効率良く貪食した。これらの結果により、MFG-E8がアポトーシス細胞と食細胞をリンクする因子であることを示した。しかしながら、マクロファージの中には、MFG-E8を発現しなくとも効率よくアポトーシス細胞を貪食するものも存在する。そこで、これらのマクロファージにおいて、MFG-E8にドメイン構造が非常によく似た相同因子Del-1が発現していることを示した。Del-1は血管新生関連因子として同定された蛋白質であるが、MFG-E8とアミノ酸配列において約50%の相同性を有している。Del-1は、MFG-E8と同様に、ホスファチジルセリンを介してアポトーシス細胞に特異的に結合し、インテグリン発現細胞と結びつける働きがある事を示した。しかしながら、各種マクロファージによけるMFG-E8とDel-1の発現を検討したところ、マクロファージは、どちらか一方のみを発現し、その機能や局在により使い分けている可能性があることを示した。生物の形態形成や恒常性維持の過程では、細胞の増殖が進む反面、相当数の細胞が死滅している。アポトーシスはプログラムされた細胞死であり、生体にとって、不要になった細胞、害となる細胞を取り除く細胞死の機構である。アポトーシスを起こした細胞は白血球の中のマクロファージや好中球などの食細胞に速やかに貧食処理される。この貧食処理の仕組みによって、死細胞から炎症を引き起こす分子の放出を防いでいる。マクロファージはアポトーシス細胞を負食するが、生きている細胞を貧食することはない。このメカニズムは、アポトーシス細胞が細胞表面に、"eat me"シグナルをマクロファージに対して提示し、これをマクロファージが認識し、貧食していくと考えられている。今回、我々のグループは、マクロファージがアポトーシス細胞を特異的に認識し、これとマクロファージをリンクさせる分子を同定した。この分子は、MFG-E8(Milk Fat Globular Protein EGF-8)と呼ばれる因子で、463個のアミノ酸からなる蛋白質で構成されている。MFG-E8は母乳中に多く含まれ、乳腺の皮膚細胞から分泌される糖たんぱく質として1990年に同定されたが、その生理作用は全く不明であった。本研究では、アポトーシスを起こしたマウス胸腺細胞を貧食するマクロファージの解析から、活性化されたマクロファージによってMFG-E8が分泌されることを見いだした。そしてこのたんぱく質の組換え体はアポトーシス細胞を特異的に認識した。細胞膜を構成するリン脂質、ホスファチジルセリンは増殖している細胞中では細胞の内側に存在するが、アポトーシスが起こると細胞の外側に提示される。MFG-E8はこのホスファチジルセリンを特異的に認識してアポトーシス細胞に結合した。次いで、本来アポトーシス細胞を貧食しないマウスの繊維芽細胞(NIH3T3)にMFG-E8を加えたところこの細胞はアポトーシス細胞を効率良く貧食した。この結果はMFG-E8がアポトーシス細胞と食細胞をリンクする因子であることを示している。
マクロファージの貧食/アポトーシスにおけるDNA分解機構の解明

我々は平成17年度の研究成果により、DNaseXがMφの分化、DNaseγがIFN-γやIL-4などのサイトカインによるMφの活性化、それぞれの過程に於いて強く発現誘導されることを見いだした。本年度の研究はこれらのDNaseの役割を明らかとし、Mφに於けるDNA分解機構を包括的に理解することを目標に行われた。Mφに於けるDNaseXの局在を蛍光抗体法を用い解析、DNaseXがMφの細胞膜表面に強く発現することを見いだした。DNaseXの膜結合様式を調べ、当該タンパクがGPIアンカーにより膜結合するecto型DNaseであることを明らかとした。さらにラテックスビーズの貪食に伴う局在変化を調べ、DNaseXが初期ファゴソームに局在し、ファゴソーム成熟過程でDNaseIIと入れ替わることを明らかとした。Mφによる外来DNA分解に於けるDNaseXの役割を明らかとするため、siRNAによるノックダウンの影響を調べた。DNaseXノックダウンMφでは、貪食したDNA分解の初期に観察される3'-OH末端形成が強く抑制された。以上の研究成果により、Mφに於けるDNA消去について以下のことが明らかとなった。1)貪食作用により取り込まれた外来DNAの消去過程は、DNaseXに依存する初期段階とDNaseIIが担当する後期段階からなる。2)アポトーシスに於けるMφ自身のDNA消去に於いては、その活性化状態によりCADとDNaseγが使い分けられている。我々はDNaseI様エンドヌクレアーゼであるDNaseXがMφの分化、DNaseγがMφ活性化、それぞれの過程に於いて強く発現誘導されることを見いだした。本研究はこれらのDNaseの機能を明らかとし、Mφに於けるDNA分解機構の包括的理解を目標としている。以下に平成17年度の研究成果の概要を述べる。哺乳動物DNaseXの一次構造を比較検討し、ヒトDNaseI様DNase群に於いてDNaseXに特徴的と考えられていたC末端疎水ドメインが種を超えて保存されることを示した。さらにcDNAの塩基配列解析より、ブタ及びウシDNaseXタンパク合成に於けるnon-AUG型translation initiationを明らかとした。ファゴサイトーシスに伴うDNA分解に於けるDNaseXとDNaseIIの役割分担を明らかとするため、抗DNaseIIモノクローナル抗体の作製を行った。組み替えヒトDNaseIIタンパクをマウスに免疫、目的とする抗体を産生するハイブリドーマを得た。MφDNA分解に於けるDNaseXの役割を明らかとするため、siRNAによるノックダウンを試み、その有効性をウェスタンブロット法により確認した。現在より安定な表現形を得るため、miRNA安定発現系の構築を行っている。Mφ活性化にともなうDNaseγ発現誘導がどのようなシグナルの下流で起こるかを明らかとするため、各種サイトカイン刺激によるDNaseγ発現誘導を調べた。Mφに於けるDNaseγ遺伝子発現は、IFN-γ、さらにalternative activationを惹起することで知られるIL-4によって強く誘導されることを見いだした。
プロテインキナーゼＮｒｋを介した胎盤による分娩誘発の分子機構

X染色体にコードされるプロテインキナーゼNrkの生理的意義を解明するため,Nrk遺伝子欠損マウスを作製し解析した結果,遺伝子を欠くメス妊娠個体で胎盤過形成が生じ分娩不全に陥ることから,Nrkは哺乳動物妊娠過程に重要であり分娩誘発に必須であることを突き止めた。本研究ではNrkの分娩発来における働きを明らかにするため,Nrk遺伝子欠損マウスの分子生理学的解析ならびにNrkと相互作用する因子の探索を行った。これまでNrk遺伝子欠損メスマウスにおいて周産期分娩不全の原因遺伝子は特定できていないが,Nrkの細胞機能に関与しうる遺伝子産物を複数同定しており,現在これらの候補となる因子の解析を進行中である。応募者はX染色体にコードされる新規プロテインキナーゼNrk(Nik-related kinase)ノックアウトマウスの解析を行い,胎児におけるNrk欠損によって胎盤の過形成が生じることならびにその母体に分娩不全を引き起こすことを見出した(Denda et al.)。これは胎児から母体に向けて何らかの分娩誘発シグナルが発信されること,その際にNrkがこのシグナの発信に不可欠な役割を担っていることを意味し,さらにNrk欠損により胎児と母体を結ぶ胎盤に形態異常が見られたことから,このシグナルが胎盤から出されていることが示唆されるものである。本研究では胎児(胎盤)による分娩誘発の分子機構を知る有力な手掛かりを得るため,まずNrkと相互作用するタンパク質の同定を行った。これまでタンパク質分子間相互作用によって細胞増殖制御に関わることが報告されているシグナル伝達分子を含め複数の候補分子が得られてきており,現在これら結合因子であるタンパク質分子に関し哺乳動物細胞内でNrkと結合するか,Nrkによってリン酸化されるか否かの解析を進め,Nrkの生理的役割を明らかにしようとしている。また,Nrkの遺伝子ノックアウトによって遺伝子産物量が変動するタンパク質の検索を行い,これまでのところ胎盤全組織由来のリン酸化基質の可能性が期待される十数個の検出スポットを取得した。これら検体の質量分析を行い発現タンパク質を解析し,Nrkと相互作用する細胞内分子の同定を開始したところである。分娩は妊娠維持ホルモンであるプロゲステロンの母体血中レベルの低下により誘発される。そこでNrkによる分娩誘発とプロゲステロン(P4)との関係を調べた。これまでのところ,マウス妊娠後期におけるWTとKOに有意な差は認められず,既知のP4制御による分娩誘発に直接Nrkが関与していないことが示唆された。X染色体にコードされる新規なプロテインキナーゼNrk(Nik-related kinase)の遺伝子欠損マウスを作製しその解析を行った結果,胎児のNrk欠損によって胎盤の胎児由来組織に過増殖が生じ,さらにその母体に分娩不全を引き起こすことが見出された(Denda et al.)。これは胎児から母体に向けて折りよく発信されると考えられる未知の分娩誘発シグナルの誘発に,Nrkが重要な役割を担っていることを意味する。他方,Nrk欠損により胎児と母体を結ぶ胎盤に形態異常が見られたことから,このシグナルは胎盤から出されることが示唆される。本研究では,胎児(胎盤)が発信する分娩誘発の分子機構を知る有力な手掛かりを得るため,まずNrkと相互作用するタンパク質の同定を行った。これまでタンパク質分子間相互作用によって細胞増殖制御に関わることが知られるシグナル伝達分子を含め,若干の結合分子が得られてきており,現在,これら候補因子について哺乳動物細胞内でNrkと結合するか,Nrkによってリン酸化されるか否かの解析を進めている。また,Nrkの遺伝子ノックアウトによって遺伝子産物量が変動するプロテオミクス解析を行い,これまでのところ胎盤全組織由来のリン酸化基質の可能性が期待される十数個の検出スポットを取得した。これら検体の質量分析を行い発現タンパク質を解析し,Nrkと相互作用する細胞内分子の同定を行っている。一般に分娩は妊娠維持ホルモンであるプロゲステロン(P4)ならびにエストラジオール(E2)の母体血中濃度の低下により誘発されることが知られることからNrkによる分娩誘発とこれらホルモンとの関連性を調べた。これまでのところ,マウス妊娠後期におけるWTとKOに有意な差は認められなかった。従って,Nrkが齎すと考えられる分娩誘発メカニズムに,直接既知のP4制御が関与していないことが示唆される。応募者はX染色体にコードされる新規プロテインキナーゼNrk(Nik-related kinase)のノックアウトマウスの解析を行い,胎児におけるNrk欠損によって胎盤の過形成が生じることならびにその母体に分娩不全を引き起こすことを見出した(Denda et al.)。

これは胎児から母体に向けて何らかの分娩誘発シグナルが発信されること,その際にNrkがこのシグナルの発信に不可欠な役割を担っていることを意味し,さらにNrk欠損により胎児と母体を結ぶ胎盤に形態異常が見られたことから,このシグナルが胎盤から出されていることが示唆されるものである。本研究では胎児(胎盤)による分娩誘発の分子機構を知る有力な手掛かりを得るため,まずNrkと相互作用するタンパク質の同定を行った。これまでタンパク質分子間相互作用によって細胞増殖制御に関わることが報告されているシグナル伝達分子を含め複数の候補分子が得られてきており,現在これら結合因子であるタンパク因子に関し哺乳動物細胞内でNrkと結合するか,Nrkによってリン酸化されるか否かの解析を進め,Nrkの生理的役割を明らかにしようとしている。また,Nrkの遺伝子ノックアウトによって遺伝子産物量が変動するタンパク質の探索を行い,これまでのところ胎盤全組織由来のリン酸化基質の可能性が期待される十数個の検出スポットを取得した。これら検体の質量分析を行い発現タンパク質を解析し,Nrkと相互作用する細胞内分子の同定を開始したところである。分娩は妊娠維持ホルモンであるプロゲステロン(P4)の母体血中レベルの低下により誘発される。そこでNrkによる分娩誘発とP4との関連性を調べた。これまでのところ,マウス妊娠後期におけるWTとKOに有意な差は認められなかった。従って,Nrkが齎すと考えられる分娩誘発メカニズムに,直接既知のP4制御が関与していないことが示唆された。本研究では胎児胎盤による分娩誘発の分子機構を知る有力な手掛かりを得るため,Nrkと相互作用するタンパク因子のスクリーニングを進めてきた。その結果,酵母ツーハイブリド法により取得した複数の候補分子は,細胞周期を介する細胞増殖調節因子であることが報告されているものや直接タンパク合成に与る分子等が含まれていた。他方,タンパク質分子間相互作用の別法としてGST-プルダウン法も並行して実施した結果,シグナル伝達に関与する複数の候補分子が得られている。現在これらNrkと相互作用するタンパク質分子に関し哺乳動物細胞内でNrkと結合するか,Nrkによってリン酸化されるか否かを知るためまず免疫沈降法による解析を進めている。さらにNrkがリン酸化する基質タンパク質についても胎盤の全組織に対して行い,リン酸化基質の可能性が期待される十数個の検出スポットを取得した。これら検体の質量分析を行うことで発現タンパク質を解析し,Nrkと相互作用する細胞内分子の同定を進めており,本研究の進展によりNrkと結合するタンパク因子によって未知の細胞内シグナル伝達機構が明らかにされることが期待できるものと考えられる。第二にNrk欠損の胎児(胎盤)をもつ妊娠マウスにおいて,P4に関連する母体由来の既知の分娩誘発機構に異常が認められるか解析したところ,Nrkの関与する分娩誘発機構が既知の機構と独立したメカニズムであることを肯定する結果が得られた。従って胎盤においてNrkによるシグナル伝達の下流で誘導される標的遺伝子の同定に力点を置き,分娩の誘発に至るNrkのシグナル伝達経路を解明していくことが重要である。以上より,現在までのところ研究計画はおおむね予定に沿って漸進していると思われる。