hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
アブラナ科自家不和合性花粉側S遺伝子産物の形質転換と多型性に基づく単離

アブフナ科植物Brassica campestrisの自家不和合性は、1遺伝子座S複対立遺伝子系によって説明されている。柱頭側の認識物質としては、SRKが、その補助因子がSLGであることがわれわれの研究から明らかになっている。しかしながら、花粉側因子については、明らかになっていない。そこで、SLG9,SRK9を含む76kbの連続したゲノム断片上の12の遺伝子から、花粉特異的なものとして、2つの遺伝子(SAE1,AP11)を同定した。そこで、この2遺伝子と30のS遺伝子ホモ系統、遺伝子導入技術を組み合わせ、花粉側S遺伝子の単離を目標とした。SP11に着目し、S52系統から類似のクローンを単離し、奈良先端大との共同研究から、S8,S12系統でも同様のcloneを単離できた。これらのクローンは、システインに富んだ新規のPCP(Pollen Coat Protein)をコードし、いずれもSLG, SRKに近接しており、S対立遺伝子間で高い多型性が見られた。さらに、この遺伝子は、葯のタペート細胞で発現しており、胞子体型の自家不和合性を説明することが可能な発現パターンであった。以上の状況証拠から、SP11が花粉側S因子として、最も期待できるものと判断し、遺伝子導入を行ったところ、SP11を導入した個体では、花粉のみの表現型に変化が見られたことから、このSP11が花粉がS遺伝子であることを証明できた。さらに、RT-PCRとCHEFを組み合わせることによって、16の新規のSP11遺伝子を単離し、これらはいずれもS3遺伝子座上の60-104kbの範囲に存在していた。単離できたSP11対立遺伝子から推測されるアミノ酸配列を並べたところ、8つの特徴的なシステイン残基のうち、6ヶ所すべての系統で保存されており、これらのシステイン残基は、SP11の高次構造を形成する上で重要であると考えられた。雌しべ側の3遺伝子であるSLG, SRKとSP11ついて、分子系統樹を作製したところ、これら3者は共進化をしており、それによって、新しい対立遺伝子が生まれていることが推測された。また、劣性のclass II SP11についても単離し、同様な結果を得た。今までの研究から、SLG9/SRK9に近接した領域に2つの葯特異的遺伝子(SAE1,SP11)を同定していた。SAE1については、Southern解析で、他のS遺伝子系統で多型性が見られるものがなかったことから、今年度はSP11を中心に解析した。昨年度までの研究から、SP11の対立遺伝子となる可能性のあるcloneがS52系統から単離できていた。また、同様の構造をした遺伝子が共同研究を行っている奈良先端大・磯貝教授のグループによって、S8,S12系統から単離されていた。これら4つの遺伝子は、システインに富んだ新規のPCP(Pollen Coat Protein)をコードしていた。特徴として、シグナルペプチド領域が高く保存されていたので、この4つの遺伝子の塩基配列からプライマーを設計し、RT-PCRにより、B.Campestrisの22 Sホモ系統からのSP11遺伝子の増幅を試みた。

まず、4系統の葯cDNAを鋳型とした場合に、SP11のみが増幅されることを確認したので、クローニングし、それぞれの系統に関して3つ以上の独立したクローンの塩基配列を決定したところ、既存のSP11 cDNAの塩基配列とプライマーの塩基配列と3' UTRの長さを除いて、完全に一致が見られたことから、この手法によりSP11の対立遺伝子をクローニングできることを確認した。この手法を他のS遺伝子ホモ系統に応用したところ、実験に用いた18 S遺伝子ホモ系統のうち、花粉側で劣性を示す系統を除いて、いずれの系統でも増幅が確認された。この増幅された系統から、クローニング・シークエンスを行ったところ、いずれの系統でも1種類のクローンの増幅を確認した。さらに、雌しべ側のS遺伝子の侯補であるSLG,SRKとどのように進化しているかという点について、現時点でSP11/SLG/SRKのすべての遺伝子がそろっている5系統について、アミノ酸レベルで、分子系統樹を作製した。その結果、これら3つの遺伝子は共進化していると考えられた。SLG29,SRK29のflanking regionについて、RNA gel blotによる発現解析を行ったが、SP11の転写産物に対応する大きさのものは検出されなかった。さらにS29ゲノムライブラリーから、S遺伝子座に強く連鎖しているSP2,SP4,SP7をprobeにしてゲノムクローンを単離した。今後は、SLG,SRKのflanking regionをprobeとしてchromosome walkingするとともに、得られたgenome cloneを用いた発現解析から、SP11遺伝子の単離を行うことを計画している。SLG9/SRK9/SP11-9導入シロイヌナズナの系統を交配し、SLG9/SRK9の両方を持ついくつかの系統を作出した。この系統を雌しべ側とし、SP11導入系統の花粉を交配した場合に、特定の個体において、花粉管の侵入が抑制される交配組合せが見られた。現在、この現象がこの交配組合せにおいて、確実に起こるか確認するとともに、次世代における遺伝性の実験も行っている。SP11-9のC末にHis-tagをつけたconstructをCaMV-35S promoterで制御したものを、シロイヌナズナに遺伝子導入したが、RT-PCRにより発現は確認されるものの、Histag抗体によりタンパク質の発現は確認されなかった。SP11を柱頭でSLG/SRKと共発現させると、恒常的に自家不和合性反応が起きるのではないかと考え、SP11-52遺伝子をSLGのプロモーターで制御したconstructをS52系統に導入する実験を開始した。現在、シュート再生を行っており、次年度秋にはその表現型の確認を計画している。花粉側で劣性を示すSハプロタイプからの花粉側S因子SP11の単離を目的とし、共同研究を実施している奈良先端大でのS^<60>ゲノムクローンの解析から得られたSP11類似クローンが、他のS遺伝子系統にも発現しているかを確認した。その結果、劣性のS^<29>,S^<40>,S^<44>でも類似のクローンが単離でき、優性のSP11と同様にcysteine-rich proteinをコードしていた。これらのクローン間の相同性は、優性のSP11における対立遺伝子間の相同性よりも高かった。
蛍光標識化によるO^ー配糖体糖鎖の高感度な構造解析法の開発

セリン又はトレオニンに結合している糖鎖(Oー配糖体)はムチン、プロテオグリカン、免疫グロブリン、ホルモン等広く存在しているものである。従来よりOー配糖体糖鎖の構造研究にはアルカリーボロヒドリドによる切り出しや酵素を用いている。一方我々は糖鎖の還元末端を蛍光標識して高感度に分析する蛍光標識法を開発しNー配糖体糖鎖に応用して来た。この方法をOー配糖体糖鎖にも応用することを本研究で試みた。アルカリーボロヒドリド法では切り出した糖鎖の還元末端が糖アルコ-ルとなり蛍光標識されない。このため新しい切り出し方法の開発が必要となる。このため糖蛋白質よりOー配糖体糖鎖を含む糖ペプチドと蛍光標識したOー配糖体糖鎖を調製し、それらの構造をGCーMS等で同定した。これらの標準試料を用いてOー配糖体糖鎖の切り出し方法を検討した。糖ペプチドより切り出した糖鎖は蛍光標識後HPLCにより分離定量した。種々の切り出し試薬を検討した結果、無水ヒドラジンが最も良い結果を与えた。無水ヒドラジンを用い糖ペプチドより糖鎖を切り出し、Nーアセチル化、蛍光標識化をして、HPLCで定量をし、切り出しの条件を検討したところ、糖ペプチドから蛍光標識糖鎖までの収率は最良で50%であった。コントロ-ル実険の結果、Nーアセチル化の反応や蛍光標識等での収率を補正すると、Oー配糖体糖鎖の収率は約80%であった。この方法を天然のOー配糖体を持つ糖蛋白質に応用したところ、期待した通りのOー配糖体糖鎖の蛍光標識物が得られた。セリンまたはトレオニンに結合している糖鎖(Oー配糖体)はムチンやプロテオグリカン以外にも血液凝固因子、免疫グロブリン、ホルモン等やグリコホリンの様な膜蛋白質中に見出され、組織中に広く存在することが明らかとなった。又Oー配糖体糖鎖はその非還元末端が癌関連抗原、血液等生理活性糖鎖残基となっている。従ってOー配糖体糖鎖を高感度に切りだし、分離し、構造解析することは生理活性の研究や臨床検査において重要である。本研究はピリジルアミノ化法をOー配糖体にも応用し、高感度で検出や分離が出来るだけでなく、二次元マップの作成も含めた糖鎖構造解析法の開発を目的とした。このため、糖蛋白質よりヒドラジン分解を用いOー配糖体糖鎖を切りだし、得られた還元末端をピリジルアミノ化する方法をとった。この反応での収率を向上させる条件を検討するため次の実験を行なった。1)予備実験としてOー配糖体糖鎖をもつフェツインを選び、上記方法でピリジルアミノ化Oー配糖体糖鎖を得ることが出来たので、この方法でピリジルアミノ化Oー配糖体糖鎖を調製出来ることが判明した。2)フェツインをプロナ-ゼ消化することよりOー配糖体糖鎖を含む糖ペプチドを大量に調製した。3)フェツインよりヒドラジン分解を用いてOー配糖体糖鎖を調製し、その還元末端をピリジルアミノ化した化合物を調製した。その構造をメチル化分析等を行ない、ガスクロマトグラフー質量分析計で決定した。4)ピリジルアミノ化Oー配糖体糖鎖のHPLCでの溶出位置を求めた。これらの量の分かっているOー配糖体糖ペプチドとピリジルアミノ化Oー配糖体糖鎖を用いてヒドラジンの分解による糖鎖の切り出しの条件を検討し、求めた最良の条件下で種々のピリジルアミノ化Oー配糖体糖鎖を調製する予定である。

セリン又はトレオニンに結合している糖鎖(Oー配糖体)はムチン、プロテオグリカン、免疫グロブリン、ホルモン等広く存在しているものである。従来よりOー配糖体糖鎖の構造研究にはアルカリーボロヒドリドによる切り出しや酵素を用いている。一方我々は糖鎖の還元末端を蛍光標識して高感度に分析する蛍光標識法を開発しNー配糖体糖鎖に応用して来た。この方法をOー配糖体糖鎖にも応用することを本研究で試みた。アルカリーボロヒドリド法では切り出した糖鎖の還元末端が糖アルコ-ルとなり蛍光標識されない。このため新しい切り出し方法の開発が必要となる。このため前年度で調製した糖ペプチド、蛍光標識Oー配糖体、そのHPLCでの溶出条件等を用いてOー配糖体糖鎖の切り出し方法を検討した。種々の切り出し試薬を検討した所、無水ヒドラジンが最も良い結果を与えた。無水ヒドラジンを用い糖ペプチドより糖鎖を切り出し、Nーアセチル化し、蛍光標識して、HPLCで定量して、切り出しの条件を検討したところ、糖ペプチドから蛍光標識糖鎖までの収率は最良で50%であった。コントロ-ル実験の結果、Nーアセチル化の反応や蛍光標識での収率を補正すると、Oー配糖体糖鎖の収率は80%であった。この方法を天然のOー配糖体を持つ糖蛋白質に応用したところ、期待した結果が得られた。
新しいサイトカイニン活性物質の分子設計

サイトカイニンの植物ホルモン作用の理解に役立てるために、活性に必須な基本構造に関する仮説に基づいて、新規な炭素置換基サイトカイニンの合理的な分子設計による開発を行ない、強力な活性をもつ4-スチリルビリミジン誘導体と新たなサイトカイニンのリード化合物として4-スチリルピリジンを発見した。1.合成構造最適化のために2位、5位、6位およびβ位に電子的、立体的効果の異なる置換基をもつ様々な4-スチリルピリミジン誘導体を以下の方法で合成した。相当する4-ハロゲン置換ピリミジン誘導体を出発物質とし、パラジウム触媒によるカップリング反応により4-アルキニル体を得、これにハロゲン化水素、アルコール、メルカプタン等を付加させ、(Z)-および(E)-スチリル誘導体を合成した。また、これらの幾何異性体の合成には一定波長の光を照射し、立体選択的な光異性化を行なった。ここで確立した簡便かつ高収率な合成法を用いて、同様に幾つかの4-スチリルピリジン誘導体を合成した。2.サイトカイニン活性ヒモゲイトウ色素形成テストおよびタバコカルステストで生物活性を評価した結果、β位置換基としてエトキシ基、臭素が最も適当であり、一定のかさ高さの置換基の存在が活性発現に重要と考えられた。2位置換基には電子吸引性基は不適であり、電子供与性のアミノ基が最も適していた。電子吸引性基および電子供与性の5位置換基はいづれも活性を著しく減少させた。また、6位置換基は、2位置換基に比べて、活性を増加させなかった。最終的に(Z)-2-アミノ-β-エトキシ置換体がベンジルアデニンの約5倍の活性を示した。(Z)-4-(β-エトキシスチリルピリジンはベンジルアデニンより約10倍弱い活性を示した。
測度集中の幾何と曲率

Gromovによる測度距離空間の幾何学的理論を解明し,本を執筆した.オブザーバブル距離に関して,測度距離空間の列が測度距離空間へ収束するとき,この曲率次元条件が保たれることを証明した.これを応用して,リッチ曲率が非負の閉リーマン多様体に対して,第k固有値と第1固有値の比がkのみによる定数で評価できることを示した.Gromovはオブザーバブル距離を備えた測度距離空間全体の空間の自然なコンパクト化を定義した.これについて詳しく考察し,自然な距離構造を導入した.これを応用して,ユークリッド空間の半径がnの平方根のn次元球面の極限が,無限次元ガウス空間へ収束することを証明した.昨年度,証明に成功した曲率次元条件の安定性定理と固有値の不等式を論文にまとめて,Geometric and Functional Analysisに投稿し,掲載が決定した.今年度の研究として,Gromovの測度集中に基づいた測度距離空間の理論の解明を進め,予定していたほぼ全ての部分について満足のいく理解に到達した.現在,本を執筆中で,出版社とも連絡をとっている.さらにこれに付随した新しい研究として,球面の半径と次元が動くときの極限空間について調べ,以下を証明した.半径が次元のルートより小さいオーダーのときは,レビ族となること.半径が次元のルートより大きいオーダーのときは,無限消散すること.半径が次元のルートと同じオーダーのとき,ガウス測度をもつ無限次元l_2空間に収束すること.これらの結果は楕円にも拡張されると思われ,それについても調べている.さらに複素射影空間の場合にも新しいアイディアを得たので,それらが解明できた時点で論文としてまとめる予定である.これとは別に,院生の小澤龍ノ介氏との共同研究を開始した.ピラミッドの不変量について考察している.測度距離空間の重要かつ基本的な不変量として,オブザーバブル直径とセパレーション距離があるが,これらを測度距離空間全体の空間の完備化の元や,さらにコンパクト化の元,つまりピラミッドに対して定式化することを考察中である.これがうまく行けば,昨年度に証明したk-レビ族の極限についての定理の証明を大幅に簡略化することが可能であろうと思われる.本研究ではGromovによる測度距離空間の集中と収束に関する理論のほぼ完全な解明をして,さらにそれを展開・応用した.これは次元が無限大へ発散する空間を研究するのに役立つ理論である.Gromovは測度距離空間の間の自然な距離を,測度の集中現象のアイディアに基づいて導入し,この距離が付随した測度距離空間全体の空間の自然なコンパクト化を構成した.この理論はGromovの有名な本:「Metric structures for Riemannian and non-Riemannian spaces」に書かれているが,その詳細は大幅に省かれており,その重要性は広く認められながらも,理解出来る専門家は皆無であった.本研究において,その詳細をほぼ完全に解明・改良し,本を執筆した.この本「Metric measure geometry」は現在EMSにおいて出版を審査中である.中間審査は既に通って,現在詳細が正しいかどうかを検証中である.また,このGromovの距離で測度距離空間の列が測度距離空間に収束したとき,曲率次元条件(リッチ曲率の下限条件の一般化)が保たれることを証明し,それを用いて,非負曲率をもつ閉リーマン多様体の正の第k固有値と第1固有値の比がkのみによる定数で評価されることを証明した(船野氏と共同).今まで,次元による定数での評価は知られていたが,次元によらない定数での評価は従来の方法では証明不可能であった.さらに,次元でパラメーター付けされたユークリッド空間の球面(または複素射影空間)の列に対して,相転移現象の類似の現象が成り立つことを証明した.丁度,臨界の極限において,無限次元のガウス測度が得られることを証明した.Gromovによる測度距離空間の幾何学的理論を解明し,本を執筆した.オブザーバブル距離に関して,測度距離空間の列が測度距離空間へ収束するとき,この曲率次元条件が保たれることを証明した.これを応用して,リッチ曲率が非負の閉リーマン多様体に対して,第k固有値と第1固有値の比がkのみによる定数で評価できることを示した.Gromovはオブザーバブル距離を備えた測度距離空間全体の空間の自然なコンパクト化を定義した.これについて詳しく考察し,自然な距離構造を導入した.これを応用して,ユークリッド空間の半径がnの平方根のn次元球面の極限が,無限次元ガウス空間へ収束することを証明した.当該年度の成果として、曲率次元条件(リッチ曲率の下限条件を測度距離空間へ一般化したもの)がオブザーバブル距離に関する収束で安定であることを証明した。この成果は測度集中の幾何学的研究においての中心的な定理として重要である。この定理の系として、非負リッチ曲率をもつ閉リーマン多様体の列について、そのラプラシアンの第k固有値が無限大へ発散することと、その列がレビ族であることが同値であることが分かった。さらに、任意のkに対してある定数C(k)が存在して、任意の非負リッチ曲率をもつ閉リーマン多様体のラプラシアンの第k固有値が第1固有値のC(k)倍以下であることが従う。これらの結果は当初の研究計画を大きく越える成果である。さらに、アレクサンドロフ曲率の非負性がオブザーバブル距離に関する収束で安定であることを証明した。この系として、非負曲率をもつアレクサンドロフ空間の列について、そのラプラシアンの第k固有値が無限大へ発散するならば、その列がレビ族であることを証明した。

これらの成果を国内外のいくつかの研究会などで発表し、非常に好意的なコメントを多数いただいた。Gromovの測度集中の幾何学的理論の解明について、少し進展があった。測度距離空間全体の空間をピラミッドの空間へ埋め込めること、およびその埋め込み写像が測度距離空間全体の空間のオブザーバブル距離に関する完備化へと延びることについて考察し、証明の目処をつけた。曲率次元条件の安定性定理は,当初その証明は困難を極めたが,なんとか証明できた.これは予想外によい研究成果であった.応用として得られた固有値の不等式も,測度集中の分野においてインパクトのある結果であり,Geometric and Functional Analysisという一流誌に掲載が決定した.Gromovの理論の解明については順調に進んでいる.さらに,ここから,球面の極限についての結果や,ピラミッドの不変量についての研究など新しい結果を得つつあり,今後の研究の展開が楽しみである.研究実績の概要で説明したように、当初、難問と考えられていた曲率次元条件の安定性の証明に成功した。これに付随して、ラプラシアンの固有値についての予想をすべて肯定的に解決することができた。これは予定していた研究計画を大きく越える成果である。今後は,楕円や複素射影空間の極限について研究する.楕円の極限は球面の極限とほぼ同じ方法で得られると予想している.この場合も極限は無限次元ガウス測度をもつl_2空間となる.これは一般には測度距離空間となならないが,ピラミッドとしてのバーチャルな空間として実現される.ただし,極限が普通の測度距離空間となる場合もあり,より豊富な例を提供できるだろうと予想している.複素射影空間の極限は,ガウス測度をもつ無限次元l_2空間のホップ作用による商空間として得られるだろうと予想している.これらの証明のキーとなるのは,ピラミッドの間の自然な距離の導入であり,これについては既にまとめてある.もう一つの研究として,ピラミッドの不変量の研究がある.ここでは,オブザーバブル直径やセパレーション距離とオブザーバブル距離との関係を調べることが最初の重要なステップであると考えている.今後の研究として、Gromovの測度集中の幾何学的理論の解明を進める。具体的には、測度距離空間全体の空間をピラミッドの空間へ埋め込めること、およびその埋め込み写像が測度距離空間全体の空間のオブザーバブル距離に関する完備化へと延びることの詳細な証明をつける。さらに、閉リーマン多様体の列について、ラプラシアンのスペクトルの条件から、その列がオブザーバブル距離についてのコーシー列となることを証明する。また消散現象についても研究する。研究計画にある測度距離空間のリッチ曲率についてだが、共同研究者のJianguo Cao教授が肝臓癌で亡くなったため、計画の変更が必要となった。現在、私の指導する大学院生と共にサブ・リーマン多様体の分割定理を測度距離空間へ拡張できないかを考察している。そこでは、測度距離空間のリッチ曲率が鍵となる。
随意運動介助型電気刺激を用いた摂食・嚥下障害患者の嚥下動作再建法

舌骨上筋上に表面電極を装着し,嚥下反射が生じたときに舌骨上筋に発生する筋電量に比例した電気刺激を発生させる随意運動介助型電気刺激を行った.随意運動介助型電気刺激を用いることで嚥下反射が起こったときのみ電気刺激を与えることが可能になり,液体,並びにクッキー咀嚼時の喉頭挙上距離を大きくすることができた.実際に重度の摂食・嚥下障害患者に適用し,摂食・嚥下障害患者に対する新たな治療法の選択枝を示した.舌骨上筋上に表面電極を装着し,嚥下反射が生じたときに舌骨上筋に発生する筋電量に比例した電気刺激を発生させる随意運動介助型電気刺激を行った.随意運動介助型電気刺激を用いることで嚥下反射が起こったときのみ電気刺激を与えることが可能になり,液体,並びにクッキー咀嚼時の喉頭挙上距離を大きくすることができた.実際に重度の摂食・嚥下障害患者に適用し,摂食・嚥下障害患者に対する新たな治療法の選択枝を示した.随意運動介助型電気刺激装置(オージー技研)の刺激電圧を検出するシステムを作製した.刺激電圧を検出することで,実際に刺激装置が嚥下の随意運動をとらえ,運動を介助しているかどうかを知ることができる.さらに,検出した電圧を動作解析装置と同期させることで,嚥下運動と電気刺激のタイミングを検出可能になった.次に健常成人に液体3ml,液体10mlを嚥下させ,電気刺激を加えたときと加えない時の舌骨・喉頭の動きを三次元動作解析装置KinemaTracer(キッセイコムテック社)を用いてサンプリング周波数60Hzで計測した.カラーマーカは額,鼻尖,下顎,舌骨,喉頭隆起に装着し,CCDカメラ2台で撮影した.電気刺激は銀・塩化銀表面電極(Vitrode F-150M)を用いて,舌骨・喉頭挙上筋に対して行った。刺激波形はパルス幅50μs×6回,刺激周波数20Hzの振幅変調方式である。刺激電圧はサンプリング周波数20Hzでモニターし,その時間的変化をKinemaTracerと同期させた.電気刺激なしに比して,随意運動介助型電気刺激を与えた場合に喉頭の挙上量が有意に大きくなった.また刺激電圧は喉頭隆起の動きに同調して上昇,下降がみられ,喉頭の動きと電気刺激電圧が同期していることが明らかになった.随意運動介助型電気刺激が嚥下動作に対して有効であることが示唆され,摂食・嚥下障害患者への応用の道が開けたことは重要と考えられる.健常成人12名(平均年齢32歳,平均身長167cm,平均体重62kg)に対して液体3ml,10mlをシリンジで口腔底に注ぎ,命令嚥下させた.次にクッキーの咀嚼嚥下も行わせた.被験者の舌骨上筋上に表面電極(Vitrode F-150M)を装着し,PASシステム^<[○!R]>(オージー技研)を用いた随意運動介助型電気刺激の有無による喉頭の動きを三次元動作解析装置KinemaTracer^<[○!R]>(キッセイコムテック社)を用いて計測した.カラーマーカは喉頭隆起に装着し,CCDカメラ2台で撮影した.刺激波形はパルス幅50μs×6回,刺激周波数20Hzの振幅変調方式とした.刺激電圧はサンプリング周波数20Hzでモニターし,その時間的変化をKinemaTracer^<[○!R]>と同期させた.喉頭挙上距離は液体3ml刺激なし,液体3ml刺激あり,液体10ml刺激なし,液体10ml刺激ありの順に6.7±3.0mm,8.8±5.1mm,6.7±3.3mm,10.0±4.1mm(平均値±標準偏差)であり,repeated measureANOVAにより有意差がみられ,Tukey HSD法による多重比較では液体10ml刺激ありが液体3ml刺激なし,液体10ml刺激なし群よりも喉頭挙上距離が大きかった.クッキーの咀嚼嚥下においても,喉頭挙上距離は刺激なし14.3±5.3mm,刺激あり21.3±9.6mmと有意に刺激ありで大きくなった.以上から,随意運動介助型電気刺激の使用により嚥下動作時の喉頭挙上を大きくできることがわかった.これまでの健常人を用いた研究から,随意運動介助型電気刺激の使用により嚥下動作時の喉頭挙上をより大きくできることがわかった.そこで,実際に摂食・嚥下障害患者に応用を試みた.摂食・嚥下障害を持ちリハビリテーション科に入院している患者のうち,書面で同意を得た場合に,まず随意運動介助型電気刺激装置PASシステム(オージー技研)を用いた治療的電気刺激を行った.刺激波形はパルス幅50μs×6回,刺激周波数20Hzの振幅変調方式である.言語聴覚療法士が行う間接訓練時に,舌骨上筋上に表面電極(Vitrode F-150M)を装着した.随意運動介助型電気刺激を用いることで,舌骨上筋の筋収縮がみられたときに,収縮に伴う筋電波形に比例して,電気刺激は強くなる.間接訓練時に,嚥下反射が惹起され舌骨上筋の筋収縮が生じると同時に電気刺激が入り,舌骨挙上をアシストした.

嚥下反射が生じないときには電気刺激が入らないため,20分程度の訓練中に筋疲労の訴えなどはみられなかった.定期的に行われる嚥下造影検査の時に,電気刺激の有無による舌骨挙上距離を比較した.摂食・嚥下障害患者においても,電気刺激を行うことにより嚥下動作時の喉頭挙上をより大きくできることがわかった.液体を嚥下する場合には嚥下時のみに電気刺激を加えることが可能であったが,固形物で咀嚼を伴う場合は,咀嚼運動時に舌骨上筋の筋収縮が生じるため,咀嚼と嚥下を区別する必要があった.今後は咀嚼と嚥下を区別することによって,咀嚼嚥下に対しても随意運動介助型電気刺激を用いた動作再建を行っていく予定である.随意運動介助型電気刺激を用いることで,喉頭挙上が増強することが明らかとなった.液体だけでなく,当初の予定になかった固形物の咀嚼においても随意運動介助型電気刺激が有効であることも明らかとなったので,研究の達成度は概ね順調と考えられる.24年度が最終年度であるため、記入しない。今後は摂食・嚥下障害患者に対して随意運動介助型電気刺激を用いた嚥下動作の再建を行う.最初に通常行われる評価である嚥下造影検査または嚥下内視鏡検査により摂食・嚥下機能を評価する.次に空嚥下時に随意運動介助型電気刺激を行い,舌骨挙上筋の強化訓練を行う.そして,嚥下造影検査または嚥下内視鏡検査で確認しながらとろみ,液体,咀嚼物を用いた食事の訓練を行う予定である.24年度が最終年度であるため、記入しない。
朝鮮美術展覧会の工芸部新設と郷土性議論

1)朝鮮人は日本の朝鮮美術展覧会創設の目的が、植民地統治政策であることを知りながらも、展覧会・展示の自己アピールの舞台を芸術創作活動における近代化表象の空間として受け入れたことを明らかにした。2)工芸部新設と郷土性議論の背景には、在朝鮮日本人浅川伯教と白樺派柳宗悦の活動による「工芸ブーム」が影響を与え、自然等の朝鮮の固有性の表現として「郷土」概念が定着していったことを明らかにした。3)「郷土」概念は日本の文壇を経て、日本留学経験の朝鮮の若者らによって朝鮮に伝わり、さらに彼らが朝鮮美術展覧会活動を通して、社会と民衆に対して朝鮮の「個性」と「固有性」への尊重のメッセージを広めたことを明らかにした。本研究の大きなテーマである「朝鮮美術展覧会」の創設背景とその影響について考察していくなか、西洋の概念としての「美術」が日本による植民統治時代の朝鮮社会と美術界にどのような影響を与えてきたのかを分析する作業が進んだ。具体的には『朝鮮美術展覧会図録』を丁寧に分析しながら、朝鮮美術展覧会の出品作家であり、審査の参与でもあった在朝鮮日本人浅川伯教と白樺派柳宗悦の活動を通して、在朝鮮生活者・日本人の「朝鮮観・朝鮮美術観」と旅行者・日本人の「朝鮮観・朝鮮美術観」を考察することができた。特に二人は1920年代に「朝鮮民族美術館」を設立し、当時の日本と朝鮮に「工芸ブーム」を巻き起こしていた。このように朝鮮美術展覧会の関係者の活動に注目し、分析することによって、「工芸部」新設と「郷土性」議論の背景と原因を今後の研究において幅広く考察することができる。2014年度の研究実績として本研究の大きなテーマである「朝鮮美術展覧会」の創設背景とその影響について考察し、西洋の概念としての「美術」が日本による植民統治期の朝鮮社会と美術界にどのような影響を与えてきたのかを分析する作業が進んだ。そして、2015年度には前年度の研究実績を踏まえて、朝鮮美術展覧会における「郷土性」とその議論に関する分析を進めることができた。1910年代に朝鮮で暮らし始めた浅川伯教・巧兄弟と白樺派として活動していた柳宗悦との出会いによって朝鮮美術・工芸を研究対象とする活動が活発になり、1920年代からは日本と朝鮮に「工芸ブーム」が巻き起こった。彼らの活動は朝鮮美術展覧会の作風と審査員の審査基準に影響を与え、美術における「郷土性」表現が強く意識されるようになった。近代化の中に固執されている伝統文化・習慣の表現であるのか、近代化を受け入れたありのままの現状の表現であるのか、その議論は朝鮮人作家、日本人作家、日本人審査員によって対立しているようにみえるが、伝統の「継承」を表象として確立していこうとする意志は共通している。このように朝鮮人作家、日本人作家、日本人審査員の言説を分析することによって、「郷土性」表現の真相とその意義を今後の研究において幅広く考察することができる。朝鮮美術展覧会の朝鮮人作家と日本人作家の作風を分析しながら、その表現における「郷土性」が過去・後進性を表す前近代的なものであるのか、あるいは現在・先進性を表す近代的なものであるのかについて考察することができた。それは、明確に分かれるものではなく「継承」というキーワードで過去と現在をつなぐものであった。今年度に特別企画展覧会「日韓近代美術家のまなざしー『朝鮮』で描く」が全国6ヶ所巡回展(神奈川県立近代美術館等)をし、多くの朝鮮美術展覧会の出品作品を公開したので、その作品を観覧し、配色などにも注目し、作風を分析することができた。さらに各担当学芸員のインタービュから得た情報を通して、当時の朝鮮美術展覧会の様子をより明確に考察することができた。このような分析内容を学会で発表しながら、より客観的な考察ができるようにしている。2016年度の研究実績は、本研究テーマの「朝鮮美術展覧会と郷土性」の関連性について1920年代を中心に一次資料の分析を進めたことである。「郷土」概念は、19世紀末のドイツに由来する概念で、1900年代の日本の文壇を経て、日本留学で近代西洋文化を学び、帰国した朝鮮の若者らによって朝鮮に伝えられた。そして、彼らは、1920年代の文学・美術活動を通して社会と民衆に対して朝鮮の「個性」と「固有性」を意識・尊重するメッセージを広めていった。それは、彼らが西洋文化に触れることによって新しい情報や作風に影響を受け、自国「朝鮮」について、制作者として自己の表現方法の確立を図っていたから実現できたことである。その中、1922年に朝鮮美展が開催されることによって、近代文化の領域に美術が明確に位置づけられることとなった。例えば、羅蕙錫、金周経、洪得順らの活動によって、伝統的画題としての「郷土」から他者に影響されずに変わらない・変えられない「生の主体」=固有性・主体性が美術として確立されて行った。1920年代は朝鮮美展の作品において、抽象的表現ではなく、自然や風景を具体的に描写するリアリズムによって「郷土」概念が表現され、西洋画受容の混乱期を乗り越えて純粋な芸術領域の美術論として定着した時代であり、朝鮮の郷土に固有の美術文化・美術様式を創り上げた時代であった。そして、1932年に「工芸部」が新設され、郷土=地方・前近代性という概念によって薄色されるまで、朝鮮美展の初期は「郷土」=朝鮮の個性・固有性の概念が認められ、朝鮮における純粋美術が発展していく可能性が潜在していたと言える。

1)朝鮮人は日本の朝鮮美術展覧会創設の目的が、植民地統治政策であることを知りながらも、展覧会・展示の自己アピールの舞台を芸術創作活動における近代化表象の空間として受け入れたことを明らかにした。2)工芸部新設と郷土性議論の背景には、在朝鮮日本人浅川伯教と白樺派柳宗悦の活動による「工芸ブーム」が影響を与え、自然等の朝鮮の固有性の表現として「郷土」概念が定着していったことを明らかにした。3)「郷土」概念は日本の文壇を経て、日本留学経験の朝鮮の若者らによって朝鮮に伝わり、さらに彼らが朝鮮美術展覧会活動を通して、社会と民衆に対して朝鮮の「個性」と「固有性」への尊重のメッセージを広めたことを明らかにした。まず、朝鮮美術展覧会の関係者に注目し、展覧会への関係性、その影響、作品制作活動を分析しながら、朝鮮美術展覧会の朝鮮における役割について考察することができた。「工芸部」新設と郷土性議論は朝鮮美術展覧会の内部からの発生ではなく、朝鮮と日本の美術界における大きな変化であり、芸術性のみならず民族の固有性の認識へと拡大していったと考えられる。その分析の結果を今後の学会で発表する予定である。『朝鮮美術展覧会図録』と展覧会関連の論説・新聞記事などの一次資料の分析をより精密に進めながら、審査員や作家の個々の経歴に注目し、それが朝鮮美術展覧会と「工芸部」新設と「郷土色」議論にどのように影響を与えたのかについて考察していく。人文学『朝鮮美術展覧会図録』と展覧会関連の論説・新聞記事などの一次資料の分析をより精密に進めながら、審査員や作家の個々の経歴に注目し、それが朝鮮美術展覧会と「工芸部」新設と「郷土性」議論にどのように影響を与えたのかについて考察していく。まず、これまでの分析結果を学会で口頭研究発表を行い、加筆しながら学会誌に投稿する。そして、今年は特別企画展覧会「日韓近代美術家のまなざしー『朝鮮』で描く」が全国6ヶ所巡回展(神奈川県立近代美術館、)をするので、巡回展を観覧し、さらに各担当学芸員のインタービュを通して、作品からみる朝鮮美術展覧会の「郷土性」についてより深く考察していく。『朝鮮美術展覧会図録』と展覧会関連の論説・新聞記事などの一次資料の分析をより精密に進めながら、審査員や作家の個々の経歴に注目し、それが朝鮮美術展覧会と「工芸部」新設と「郷土性」議論にどのように影響を与えたのかについて考察していく。
戦前から戦後の日本の教養教育　ー高等普通教育による一般教育への影響ー

本研究は、戦後の新制大学において、米国の教育をモデルとして新しく導入されたと考えられてきた一般教育が、戦前の旧制高等学校や大学予科における高等普通教育の影響を受けていた事実を明らかにすることを目的とする。申請者がこれまで検討してきた戦前の高等普通教育と戦後の新制大学における一般教育とを比較・分析し、運営組織や教育内容等における関連性を明らかにすることにより、現代においても懸案とされる教養教育の課題解決の一助となることを目指す。
超低周波磁場のヒト精子染色体に及ぼす影響に関する研究

【対象および方法】健常男性3名から得られた精液にBMまたはMNNGを添加し30分後に、培養液で洗い、それを二分し、一方を37°C,5%CO2の条件下で超低周波磁場曝露細胞培養装置中で50Hz,20mTの低周波磁場に2時間曝露させ、他方は非曝露対照群として前記装置と同室にある通常の炭酸ガス培養器中に同時間置いた。曝露終了後それぞれを精子凍結保存用TYB液で希釈後、液体窒素中に保存した。凍結精液を解凍後、運動能の高い精子を回収し、それらに受精能獲得処理を施し、凍結解凍ハムスター卵と体外受精させた。受精後2021時間目に染色体標本を作製し、おのおの100精子当たりの染色体異常頻度を算出した。【結果および考察】曝露群および非曝露対照群における構造的染色体異常を持つ精子の出現率では、曝露群における異常率の増加は見られなかった。染色体異常のタイプと頻度で観察しても染色体型、染色分体型ともに切断型異常、交換型異常で差は認められなかった。これらの結果はこの実験条件下では複合影響が認められなかったことを示しているが、さらに実験条件(磁場強度、化学物質の種類・濃度など)を変えた検討も必要と思われた。(1)超低周波磁場の精子染色体に及ぼす影響:健常男性から得られた精液を二分し、一方を37°C,5%CO2の条件下で超低周波磁場曝露細胞培養装置中で50Hz,20mTの低周波磁場に2時間曝露させ、他方は非曝露対照群として前記装置と同室にある通常の炭酸ガス培養器中に同時間置いた。曝露群および非曝露対照群における構造的染色体異常を持つ精子の出現率はそれぞれ17.1%(35/206精子)、20.8%(55/264精子)で、曝露群における異常率の増加は見られなかった。(2)化学物質の精子染色体に及ぼす影響:前記(1)で超低周波磁場の替わりに化学物質(nitrobenzene(NB),bleomycin(BM),urethane(UT),N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidine(MNNG))を曝露し、同様の方法で精子染色体に及ぼす影響を検討した。NB,UTでは染色体異常誘発性は認められなかった。BMでは、染色体異常を有する精子の頻度は対照群と差は見られなかったが、精子当たりの染色体異常の数は有意に高くなっていた。BMによる染色体異常の種類は、切断、断片、交換型異常であり、染色体型、染色分体型の両者が見られた。MNNGも精子染色体異常を誘発したが、異常の種類は主として染色体型の切断と断片であった。次年度には超低周波磁場と化学物質の精子染色体に及ぼす複合影響について検討する予定である。
全身性慢性炎症・早老症の新規モデルマウスの確立とその病態解析

通常飼育においてProgranulin(PGRN)・ApoE double KOマウス(DKO)は手足の関節腫脹や皮膚炎はApoE KOマウスに比して早期から有意に発生率が高く、寿命も有意に短いことから、DKOマウスが全身性慢性炎症・早老症の新規モデルマウスになりうる可能性が考えられた。またPGRNの抗炎症作用の機序としてこれまでにTNF受容体(TNFR)のアンタゴニストとしての役割が報告されているが、TNFR KOマウスの検討によりTNFR以外の作用機序がある可能性を示した。マクロファージから分泌されるPGRNの持つ抗動脈硬化作用やPGRN結合HDLの抗酸化作用なども明らかにした。Progranulin(PGRN)/ApoE double KOマウス(DKO)が1全身性慢性炎症・早老症モデルになりうるのかおよび2その病態の解明を目的にしている。1:この1年で、通常飼育にてDKOおよびApoE KOにおいて目視できる表現型である(i)手足の関節腫脹(関節炎?)(ii)皮膚炎の発生率に関して検討を行った。(i)手足の腫脹はDKOのみ(♂♀とも)に認められた。40週齢以降では半数以上に認めた。(ii)皮膚炎に関してもDKOの発生率は有意に多く、♂は20週齢以降8割以上・♀でも20週以降で緩やかに上昇し、60週齢には♂同様の割合になった。ApoE KO♂はDKO♀と同様の経過、ApoE KO♀はさらに高齢になってから発生を認めた。以上よりDKOはApoE KOマウスに比して有意に炎症が起こりやすいと考えられる。2:病態の解明a)TNFRアゴニスト以外のPGRNの機序の検討:TNFR1/TNFR2 KOマウスの腹腔マクロファージを採取培養し、rPGRNを添加しAktシグナルを検討した。PGRNよってAktのシグナルが入ることはすでに報告がされているが、今回の検討によってもrPGRN添加濃度依存的にAktのリン酸化が増えており、TNFRを介さないPGRN作用経路があることが明らかになった。b)マクロファージから分泌されるPGRNの役割の検討:骨髄移植実験を行っており、放射線を当てたApoE KOにDKOの骨髄移植した群がApoE KOの骨髄移植をした群に比して有意に動脈硬化が増悪していた。マクロファージから分泌されるPGRNが抗動脈硬化作用に重要であることが示された。c)PGRNがHDLと結合している意味の検討:コレステロール引き抜き能の検討では、PGRNが結合していないHDLは、PGRNが結合しているHDLに比して、引き抜き能が有意に低下していた。1Progranulin(PGRN)・ApoE double KOマウス(DKO)が全身性慢性炎症・早老症モデルになりうるかを検討した。通常飼育にて(1)手足の関節腫脹(関節炎)(2)皮膚炎の発生率に関して検討を行った。(1)関節腫脹はDKOにのみ認め40週で50%、60週齢以上では80%以上で認めた。(2)皮膚炎もDKOは早期から発生率が高く、40週齢以降では80%以上で認めた。野生型では変化無く、PGRN KO・ApoE KOでは60週齢以降で50%程度であった。DKOは有意に寿命も短く、全身の慢性炎症が起こりやすい老化モデルマウスとなる可能性が考えられた。形態学的にDKOは関節周囲や皮下に炎症だけではなく通常蓄積しない何らかの物質が大量に蓄積していた。2PGRNの抗炎症作用はTNFRアゴニストとしての機序の報告があるが、それ以外の機序の検討を行った。PGRN添加によりAktのシグナルが入ることは既知であるが、TNFR1/TNFR2 KOマウスの腹腔マクロファージにrPGRN添加実験を行ったところ添加濃度依存的にAktのリン酸化が増えることがわかり、TNFRを介さない作用経路の存在が示唆された。3マクロファージのPGRNの役割の検討として骨髄移植実験を行った。ApoE KOに放射線照射し、ApoE KOないしはDKOの骨髄を移植した群に高脂肪食負荷をかけ動脈硬化を評価すると、DKOの骨髄を移植した群で有意に動脈硬化が増悪していた(4.3%,9.3%:p<0.05,n=9)。マクロファージのみPGRNを欠損させても増悪することよりマクロファージのPGRNに抗動脈硬化作用があることが示唆された。4PGRNがHDLと結合している意味の検討として、コレステロール引き抜き能・抗酸化能の検討を行った。PGRN KOのHDLは野生型のHDLに比して引き抜き能が有意に低下していた。ApoE KOとDKOのHDLでは、コレステロール引き抜き能に有意な差はなかったが、抗酸化能はDKOのHDLでは有意に低下していた。

マクロファージから分泌されるPGRNの持つ抗動脈硬化作用やPGRN結合HDLの抗酸化作用なども明らかにした。1に関しては、手足の関節腫脹や皮膚炎といった表現型の発生率の概要はわかってきたが、さらにnを増やして検討していく必要がある状態である。さらに、詳細な形態学的検討によって、実際に炎症がどのように起こっているのかを検討していく。現在、血液サンプルからqPCRを用いてテロメア長の長短の検討ができる準備も整ってきているので、テロメアの検討を行うことで老化が早期に起こっているのかという検討もできると考えている。a)これまでの検討でPGRNの作用機序としてTNFR以外の存在は示すことができたと考えている。b)これまでの骨髄移植の実験でマクロファージから分泌されるPGRNがPGRNの抗動脈硬化作用のなかで重要であることを見出しているが、現在今までの検討に加えて、放射線を当てたDKOに、ApoE KOもしくはDKOマウスの骨髄を移植するという実験も施行しているところであり、この検討でさらにマクロファージから分泌されるPGRNの意義を見出せると考えている。c)これまでの検討で、HDLに結合しているPGRNが欠損するとコレステロール引き抜き能が有意に低下することがわかってきた。これからは、抗酸化能や抗炎症能に関しても検討を行っていく。動脈硬化1現在飼育しているマウスの表現型を検討することで、nを増やしていく。形態学的・病理学的な検討も同時に行っていく。実際に手・足の関節の腫脹が起こっているところ・皮膚炎などが起こっているところがどのような形態学的変化を起こしているのかを検討し、PGRNが欠損することに伴う変化の意義を見出す。形態学的検討では老化性色素と呼ばれるリポフスチンの沈着に関しても併せて検討する予定である。大阪大学整形外科の協力も得て、手足の関節のレントゲン写真やmicro CTなどの撮影も予定している。またqPCRでテロメア長の検討をおこなうことで、実際に老化とどのような連関があるかを見出していく。最終的には、全てのマウスを含めた生存曲線を作成する予定である。2b)現在施行している骨髄移植実験であるが、動脈硬化病変の検討に加えて、そのマウスから採取したサンプルを用いて老化や炎症に関連する因子の検討を行っていく。放射線を当てたDKOマウスに対してApoE KOの骨髄もしくはDKOの骨髄を移植する検討も始めており、その結果もあわせて報告できる予定である。c) HDLのコレステロール引き抜き能に加えて、PGRN(+)-HDLとPGRN(-)-HDLを用いてPON-1活性の測定をおこない抗酸化能の検討を行う。また、抗炎症能に関してはPGRN(+)-HDLもしくはPGRN(-)-HDLを添加することで炎症性サイトカインの発現に影響があるのかを検討する予定である。
高次構造制御に基づく有機無機ハイブリッド放射線検出材料の創成

今年度は、シンチレータの開発を進めた。材料の合成について、無機ナノ粒子を添加したプラスチックシンチレータの系では、主に酸化物ナノ粒子を溶液中で合成し、その後に(あるいは合成中に)ナノ粒子表面に有機分子を修飾した。最終的にはポリマーに分散させて材料を合成した。あるいは、ゾルゲル法という溶液法を用いた合成を進めた。この手法では、酸化物ナノ粒子を形成する塩化物や塩化酸化物と、その脱水縮重合反応を進める触媒としての酸、プラスチックを形成するポリマーと有機蛍光体とを全て溶液中で混合し、反応と溶媒蒸発とを同時に進めることにより構造を形成した。開発した材料について、基礎的な構造解析を進めた。粉末X線回折により結晶構造の同定を行うとともに、透過型、あるいは走査型電子顕微鏡観察による構造解析も進めた。開発した材料のシンチレーション特性については、基礎的な物性として、シンチレーションの波長(スペクトル)および減衰挙動とを調査した。その上で、高エネルギー加速器研究機構の放射光施設(フォトンファクトリー)における高エネルギーX線検出特性についても調査を進めた。これらの結果、まず、ナノ粒子を合成後にプラスチックへと添加した系については、蛍光体濃度の最適化により、市販の高エネルギーX線検出用プラスチックシンチレータであるEJ256を凌駕する性能を達成した。一方、ゾルゲル法により開発した材料では、EJ256の特性を大幅に上回る検出効率およびシンチレーション収率を達成した。初年度として、有機無機ハイブリッドシンチレータにおいて、二つの手法での開発手段を確立した上、既に同様の用途を想定した市販品を大幅に上回る特性を達成したため。今年度には、電子や正孔の捕獲過程を中心的課題として捉える。その上で、捕獲サイト周辺の構造と捕獲能との関連を定量的に解析する。本研究では高次構造の解析が重要となる。粉末X線回折や単結晶X線回折測定により結晶構造の同定を行うとともに、TEMを用いた構造解析も進める。試料によっては小角X線散乱測定も行う。さらに、電子スピン共鳴測定を用い、電子や正孔の捕獲サイトを同定する。さらに、X線吸収分光により、捕獲サイトでの価数変化をとらえ、また捕獲サイト周辺の局所構造を解析する。
上皮細胞系の統合的理解を目指した細胞接着・細胞骨格研究の新展開

生体内の上皮細胞シートの特異性と多様性という視点から、上皮細胞系の統合的理解を目指した。既知の細胞接着装置・細胞骨格複合体構成因子に加え、新たに同定した因子の解析を行い、上皮細胞シートシステムの解析を進めた。その結果、1)タイトジャンクションの透過性制御と微小環境を介した生体機能(Cldn2/15-カチオン透過-Naイオンホメオスタシス-栄養吸収、Cldn18st-プロトンバリア-障害で炎症惹起、等)、2)上皮機能における、細胞間接着装置から発するシグナルと細胞骨格の役割(AJ-IQGAP3-上皮細胞増殖、接着分子転写制御、等)、3)アピカル構築と細胞間接着装置との機能連動(繊毛異常-アピカル微小管走行異常、等)、など、上皮細胞シトシステムの統合的な理解を深めた。生体内の上皮細胞シートの多様性という視点からの上皮細胞系の統合的理解を目指し、新規細胞接着装置・細胞骨格複合体構成因子に注目して、上皮細胞のシステム解析を新しい切り口から進めている。独自の方法により単離した細胞間接着装置画分より同定された新規構成因子が中心になっている。1)先進的プロテオミクスにより同定した新規細胞間接着装置構成蛋白質を含む多様な分子群による上皮細胞シートの形成とシートの特性の制御機構の解析、2)上皮細胞間バリアーによる上皮細胞シートの物質透過性および物性の制御機構の解析、3)細胞間接着装置・アピカル膜を裏打ちする細胞骨格との関連からの、上皮細胞シートの特性の制御機構の解析、4)上皮細胞アピカル膜の繊毛による上皮細胞の特性の制御機構の解析、を行う。上皮組織を構成する上皮細胞は、多細胞生物において、体表面をおおうシート構造を形成して、体内のコンパートメントを形成し、ホメオスターシスを保つという本質的な役割を担う。「多様な上皮細胞の機能」についての分子的基盤の研究は充分というにはほど遠いのが現状であり、当該研究分野の問題点であり、本研究においてはその解析を行なっている。本年度の実績の概要は以下のようである。先進的プロテオミクスにより同定した新規細胞間接着装置構成蛋白質を含む多様な分子群による上皮細胞シートの形成とシートの特性の制御機構私達の確立した方法により肝臓毛細胆管画分から単離精製した細胞間接着装置画分について、優れた細胞分画法の開発と質量分析を組み合わせて、この画分を構成する遺伝子を総括的に把握することができ、そのなかの新規膜蛋白質について、解析を手がけた。本研究で対象とする新規蛋白質は4種類であるが、その抗体の作製は極度に難しいという状況で、ようやくそのなかの1種類のものについてモノクローナル抗体を得ることができた。その他のものの抗体作製は困難をきわめており、現在、ノックアウトマウスの作製を行なっている。うち、2種類のものについて、ヘテロのマウスが得られている。さらにかけあわせにを重ねることにより、将来的にノックアウトマウスを得ることができると思われる。また、細胞間接着装置を構成する新規細胞骨格成分については、2種類のものの抗体を得ることができ、それらについて、RNAiを用いて、細胞レベルでの機能解析を進めている。上皮細胞間バリアーによる上皮細胞シートの物質透過性及び物性の制御機構クローディンを中心として、細胞間の物質透過性の制御機構を、細胞レベルと個体レベルの両面から解析している。細胞レベルでは、細胞間の構成蛋白質の制御システムを開発し、その細胞の生理学的測定をすすめている。また、個体レベルでは、クローディンのノックアウトマウスの作製を推進して、細胞間バリアーの測定を行なった結果、細胞間バリアーの制御機構の一端が分子レベルで明らかになった。その他、アピカル膜の機能解析など進めることができた。本学術創成研究では、体内の各部分を区画化することで、電解質や水・浸透圧のホメオスタシスの形成・維持の要となるとともに、不必要なものや毒物透過の隔壁となる上皮細胞シートの、選択的な物質透過性制御機構の「分子的基盤の新展開」について、生物物理学的および生理学的な手法を取り入れながら解明していくことが目的である。平成20年度では、以下の3点を目的に解析を行った。1、先進的プロテオミクスにより同定した新規細胞間接着構成タンパク質による上皮細胞シートの形成とシートとしての特性の制御機構の解明我々が幾重にも改良を重ねてきた肝臓高純度毛細胆管画分に対する、2次元電気泳動細胞間接着装置複合体濃縮スポットの解析から、複数の新規細胞間接着装置複合体構成蛋白質が同定された。

これらのうち膜貫通蛋白質AI, Cats(仮称)については、ノックアウト(KO)マウスの作製がすみ、順次解析を行っている。AIはタイトジャンクションに、Catsはアドヘレンスジャンクションに局在する蛋白質であり、電気生理学的な測定からバリアー機能にも影響する可能性が示唆されている。細胞質側から細胞間接着装置にリンクする可溶性蛋白質であるX, Yについては培養細胞レベルでの実験から、これらが細胞や組織の形態形成に重要な働きを担うことを示唆する結果を得ている。Xについては、生体での機能解析を目指して、KOマウスの作製を開始している。2、上皮細胞間バリアーによる上皮細胞シートの透過性や強度などの特性の制御機構の解明細胞間バリアーの再構築については、ビオチンなど一般的な透過試験試薬での解析を進め、バリアー機能の機能的再構築系の困難に挑戦している。3、上皮細胞アピカル膜からの上皮細胞の特性の制御機構の解明中心体関連蛋白質Odf2のKOマウスの解析を進めている。またアクチンフィラメント系との観点から、細胞接着やアクチンの接着に関係するIQGAP3のKOマウスの解析を進めている。以下のように本研究課題において、主に三つの側面から目的とする進展が得られた。1、先進的プロテオミクスにより同定された新規アドヘレンスジャンクション局在たんぱく質の解析複数の新規アドヘレンスジャンクション(AJ)局在たんぱく質について解析を進めているが、その中で、AJに局在するGEFの制御因子TRIOBPについての解析を進めることができた。TRIOBPは、上皮細胞のシート構築において中心的な役割を担うE-カドヘリンの転写を制御する新規のシグナル伝達経路を統御することを示すことができた。このシグナル伝達経路は、発生やがん化などを制御するために重要であることから、さらなる解析を進めている。この他に、複数のAJ関連因子について、上皮細胞シート構築に関わる機能解析を行なっている。2、上皮細胞間バリアーによる上皮細胞シートの透過性や強度などの特性の制御機構解明本研究において、新しく構築した上皮細胞間バリアーの再構築系を用い、タイトジャンクション(TJ)上のクローディンの時空間的ダイナミクスを調べるため、FRAP解析、一分子解析を行った。これにより、TJは、予想以上に動的な構造であることがわかってきた。今後、TJのクローディンの種類による特性の違いを理解することをさらに目指す。3、上皮細胞アピカル膜、細胞間接着部位の細胞膜を裏打ちするタンパク質による上皮細胞特性の制御機構解明細胞間接着因子IQGAP3が時空間的に増殖制御因子Rasの活性を制御していることを報告したが、生体内において、IQGAP3がどのように時空間的制御を受けているかはほとんどわかっていなかった。我々は、再生肝モデルを用いて肝細胞増殖におけるIQGAP3の時空間的発現制御を調べ、IQGAP3が増殖と相関して厳密な発現制御を受けていることを明らかにし、論文に発表した。さらにプライマリーシリアの構築に関わる細胞骨格性タンパク質Odf2とともにIQGAP3のコンディショナルノックアウトマウスのヘテロを得ることに成功したため、個体解析を進めていく予定である。