hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
高度な環境調和型物質変換プロセスを指向した新世代型ハイブリッド触媒の開発

また、本固定化Pdナノクラスター触媒は、1気圧の水素存在下で、環境汚染物質である含ハロゲン化合物から極めて効率的にハロゲンを除去することができた。3)モンモリロナイトの層間に固定化したScやCuの単核カチオン種は、水中あるいは無溶媒条件下で効率的にマイケル付加反応を進行させた。特に、Cuイオン交換モンモリロナイト触媒は、Sakurai-Hosomi反応、Diels-Alder反応等の有効な炭素-炭素結合形成反応にも適用が可能であった。本研究で開発した不均一系触媒は、分離・回収が容易で再使用が可能であるというだけでなく、均一触媒系に比較し、高い活性と選択性を示す特徴がある。本研究では、高度な環境調和型物質変換プロセスを指向し、無機結晶化合物の特性を利用し新しいタイプのハイブリッド触媒の開発を行った。以下に代表的な成果を述べる。(1)PdCl_2錯体をアミド系溶媒中にて用い、分子状酸素のみをPd(0)種の再酸化剤とした極めて効率的なWacker酸化反応系を開発した。本反応系は、銅や塩酸を全く必要とせず、80度という温和な条件下で、従来のWacker反応系よりも高い活性・選択性・基質適用性を示す。本触媒系は、求核剤を選択することで、末端オレフィンの酸化的官能基化反応における位置選択性の完全スイッチが達成できる特徴ももちあわせており、例えば、H_2Oの代わりに酢酸を求核剤に用いると、1級炭素のみが選択的にアセトキシル化される。(2)均一系では酸と塩基を混合すると中和反応により、お互いを不活性化してしまうため、反応系内に共存することができない。金属カチオン交換モンモリロナイト(M^<n+>-mont)は、固体酸触媒として機能することを見出しているが、その酸点は数Åのmont層間の金属カチオン種に起因する。また、約40μmの粒子であるハイドロタルサイト(HT)は、表面塩基点をもっている。この2つの固体触媒を混合しても、mont層間の酸点とHT表面の塩基点は接触することなくお互いの機能を発揮でき、複数の酸・塩基触媒反応を連続的に進行させるone-pot反応を可能とする。(3)ハイドロキシアパタイト表面に固定化した単核Laカチオン種は、不斉マイケル反応を進行させる固体触媒となることを見出した。本研究で開発した触媒は、分離・回収が容易で再使用が可能であるというだけでなく、均一触媒系に比較し、優れた化学選択性を示す特徴があり、目的物質をシンプルに作る新しい合成ストラテジーを提供し、自然共生型のモノづくりを可能とすると考えている。
チオフェノール基で架橋した新規三核ルテニウム錯体の合成とその金属間相互作用

チオフェノール基を修飾したトリアザシクロノナンの六座配位子を用いて3個の金属イオンをチオフェノールで架橋した様々な種類のFace-sharing直線型三核錯体を合成し、これらの電子状態や磁気的な性質を解明することを目的として研究を行なった。平成7年度は、両端にルテニウムイオンを、中心に他の金属イオンを含む新しいタイプの直線型異核三核ルテニウム錯体の合成法を確立した。この方法は、始めに単核のルテニウム錯体を合成し、これに更に金属イオンを反応させるものである。実際に、Ru(III)Ni-(II)Ru(III)およびRu(III)Co(II)Ru(III)錯体を合成した。Ru(III)Co(II)Ru(III)錯体の場合には、さらに1電子酸化を行い、Ru(III)Co(III)Ru(III)錯体を合成し、3個の金属イオン間の相互作用を明らかにするために磁性測定をおこなった。この結果、Ru(III)Co(III)Ru(III)錯体は常温付近でμ_<eff>=3.0(S_t=1)、すなわち不対電子2個分に相当する磁性を示した。つまり、この錯体は4d^5(low-spin)-3d^6(low-spin)-4d^5(low-spin)の電子状態にあり、しかも金属間結合の存在は考えられないため、両端のRu(III)の不対電子は相互作用していないと考えられる。得られた結果は、4d^5(low-spin)-4d^6(low-spin)-4d^5(low-spin)の等電子構造である三核Ru(III)Ru(II)Ru(III)錯体が反磁性で、金属結合により2個の不対電子が強く相互作用していることと全く対照的であり、非常に興味深い。上記の成果は、平成7年10月福岡で開催された錯体化学若手の会(錯体化学討論会)に講師として招聘された際に報告した。現在、ルテニウムイオン間相互作用を解明すべくRu(III)Ru(III)Ru(III)錯体を合成し、その構造と電子状態を研究中である。
核リプログラミング誘導因子を利用した新規体細胞核移植技術の開発

体細胞核移植における核リプログラミング能力を強化するために、iPS細胞の誘導に必要な核リプログラミング関連因子(Oct3/4,sox2,klf4,c-Myc,Nanog,Gadd45a)を強発現させたブタ未受精卵を作出してレシピエント卵細胞として用いたが、核移植卵の体外発生能を向上させることはできなかった。体細胞核移植によるクローン動物の作出は、未受精卵子には体細胞をリプログラミングを誘導する因子が存在していることを証明した。近年、ES細胞特異的な転写因子を体細胞に導入することにより直接多分化能を持つES細胞と同等な性質を持っiPS細胞を誘導できるようになったことから、核リプログラミングを詳細に解析することが可能となった。しかしながら、どちらの手法を用いてもその効率は極めて低く、その効率を向上させることが機能的な解析には必要となる。特に哺乳動物の未受精卵を用いた解析には、多数の未受精卵が必要となるため、比較的に多数の未受精卵を採取しやすいブタを用いることが有効である。そこで今年度は、マウスやウシよりも発生率が低いブタ体細胞核移植の効率的な技術の確立を行った。最初に、体細胞核移植だけではなくiPS細胞の作出においてもヒストン脱アセチル化酵素阻害剤の有効性が示されていることから、阻害剤のスクリーニングを行った。その結果、活性化処理後の体細胞核移植卵を40nMのトリコスタチンAおよび1mMのバブプロ酸で48時間処理することにより無添加区と比較して胚盤胞への体外発生率が約2および3倍に向上し、得られた胚盤胞の細胞数も増加した。しかしながら、体細胞に同様な処理をしてもその効果はなかった。このことから、核移植卵を1mMのバブプロ酸で処理することにより効率的なブタ体細胞核移植の実験系を構築することができた。第二減数分裂中期の未受精卵をレシピエント卵細胞として用いてクローン胚を作製しても、核リプログラミングの効率が極めて低く、体細胞ゲノムの脱メチル化などのエピジェネティックな変化が起こらないことがその原因の一つとして考えられている。そこで予め未受精卵にiPS細胞及びES細胞との融合によるリプログラミングに必要な既知の誘導因子を強制発現することでその効率の向上を目的とした。すなわち、iPS細胞樹立のための核リプログラミング誘導因子(oct3/4、sox2、klf4、c-myc)やES細胞との融合法で効果的なnanog、核リプログラミングの中心因子であるOct3/4の脱メチル化に関与するGadd45a遺伝子をマウスES細胞からクローニングし体外でmRNAを合成した後、体細胞核移植前2-3時間のブタ未受精卵に注入することで核リプログラミング誘導因子過剰発現卵を作製した。得られた強制発現未受精卵は、その発現レベル、初期胚の発生に影響を与えない発現レベルを確認した。至適化した核リプログラミング強制発現ブタ未受精卵を用いて体細胞核移植を行った。しかしながら、GFP mRNAを注入した対照区と比較してクローン胚の発生率を向上させることができなかった。また核移植された体細胞核のエピジェネティックな状態をHistoneH3-K9のメチル化を指標にして免疫染色して確認したが、高メチル化状態であったことから核リプログラミング強制発現卵は核リプログラミングを促進することはできなかった。
共生栄養供給能の利用に向けた共生促進剤の探索と解析

現在、日本では食料自給率の改善が急務とされ、また世界的な植物バイオマスの利用価値への注目から農業生産性の向上が望まれている。現代農法では過剰な化成肥料・農薬の添加によりその生産性を維持しているが、持続的な農業の発展のためには化成肥料・農薬の使用量の低減が可能となる環境低負荷型の農業スタイルの確立が不可欠となる。植物と菌根菌・根粒菌との菌根共生・根粒共生はリンや窒素などの栄養を供給することで宿主植物の生育の大きな恩恵をもたらす。この共生の成立過程は宿主植物、共生菌の共生因子により制御されているが、外部の温度・湿度・栄養状態などの環境因子によっても大きく影響を受けるため、宿主への生育促進効果も不安定なものとなってしまう。本研究では共生菌の感染能と生育促進効果をもつ物質の探索と解析を行い、それらの物質を添加することによって共生能の向上と安定制御を行うことを目的とした。このアプローチとして、根粒菌・菌根菌と共生状態にある植物での共生の場となる根部、生育促進効果がみられる地上部でのトランスクリプトーム解析や、共生シグナル分子を添加した際のトランスクリプトーム解析を行い、共生時に変動する遺伝子・物質の探索を行っている。また、同定した物質の共生促進効果の評価を行うため、共生菌の感染効率や栄養供給能などを測定する技術開発を行った。この共生の成立を外部から調整しうる「共生促進剤」を開発することで、共生栄養供給能を用いた微生物肥料としての共生菌の利用を促進し、低肥料・低環境負荷型農業とバイオマス増産という相反する課題を解決に貢献する。根粒菌・菌根菌と共生させたマメ科植物ミヤコグサでのトランスクリプトームデータ、共生シグナル分子を添加したデータ、および共生変異体のデータ取得を行った。共生シグナル分子としては、根粒共生時に根粒菌から分泌されるNod factor、菌根共生時に菌根菌から分泌されるキチンオリゴマーを添加した植物体での発現プロファイルを取得した。共生変異体としては、根粒の過剰着生、菌根菌の過剰感染が確認されている変異体har1およびtmlのトランスクリプトーム解析を行った。これらの共生変異体では非感染状態での植物状態が共生菌の感染や共生器官の形成を促進していると考えられたことから、非感染状態での根および地上部の発現プロファイルの取得を行った。トランスクリプトーム解析の手法としては、次世代シーケンサーを用いたRNA-seqを用いた。上記のサンプルより抽出したRNAから次世代シーケンス用ライブラリを作製し、Illumina Hiseq2000を用いて数M数十M readsのショートリード情報を取得した。現在、これらのデータの解析を行っている。このような解析によって得られた共生促進効果を持つ物質については、菌根菌、根粒菌の感染率の測定法や、共生栄養供給能の評価、生育促進効果を統一した基準で、栽培室レベルで評価をおこなう。そのための評価法として、根粒菌に関しては根粒菌の感染経路である感染糸形成数と共生器官である根粒の計測条件の確定を行った。また、その根粒における窒素固定能の測定技術として、ガスクロマトグラフィーを用いたアセチレン還元活性測定の測定法を導入した。菌根共生においては、接種胞子数に応じた感染率の変化を測定することで宿主植物における感染能の変動と生育促進効果を評価する手法を確立した。とくに応用対象として想定しているネギを用いた測定では、安定した感染と生育促進効果を計測できるようになっている。平成27度の解析で得られたRNA-seqデータをインフォマティクスによる解析を行い、これらの遺伝子発現プロファイルから共生促進物質の候補となる物質とその合成遺伝子・経路の情報を得る。ここでは、関連する生合成遺伝子に変動が見られれば、遺伝子発現の大きな変動が無い遺伝子であっても、コアとなる律速酵素遺伝子やその制御系に働く遺伝子についての解析も行い、その代謝経路全体に注目して研究を進めていく。これらの研究によって同定した候補物質は、その共生促進効果の大きさとともに、現時点でその物質が大量に入手可能であるか、効果に対してコスト面で見合うものであるかなども考慮して優先順位をつけ、詳細な機能解析を行っていく。この共生効果の観測や遺伝子機能解析では、宿主植物だけでなく、共生菌における増殖や感染形態の変化、共生菌側の共生遺伝子発現などへの影響も解析していくことで、それらの物質が効果を発揮する機構について解明していく。現在、共生の評価法としては、基礎的な研究に用いるミヤコグサのほかに、作物種としてネギを有効に使用できることが明らかとなっている。そのため、本研究により同定した共生促進因子が、広い植物種おいて普遍的に存在する共生システムで機能する物質であることを証明するとともに、実用に向けた作物への知見の適用も行うことができる。平成27年度、適任者がいなかった研究支援を行う人員を平成28年度に雇用した。また、研究推進のため、次世代シーケンスの拡張を行うことを計画しておりその費用に充てる予定である。

この共生の成立過程は宿主植物、共生菌の共生因子により制御されているが、外部の温度・湿度・栄養状態などの環境因子によっても大きく影響を受けるため、宿主への生育促進効果も不安定なものとなってしまう。本研究では共生菌の感染能と生育促進効果をもつ物質の探索と解析を行い、それらの物質を添加することによって共生能の向上と安定制御を行うことを目的とした。このアプローチとして、根粒菌・菌根菌と共生状態にある植物での共生の場となる根部、生育促進効果がみられる地上部でのトランスクリプトーム解析や、共生シグナル分子を添加した際のトランスクリプトーム解析を行い、共生時に変動する遺伝子・物質の探索を行っている。また、同定した物質の共生促進効果の評価を行うため、共生菌の感染効率や栄養供給能などを測定する技術開発を行った。この共生の成立を外部から調整しうる「共生促進剤」を開発することで、共生栄養供給能を用いた微生物肥料としての共生菌の利用を促進し、低肥料・低環境負荷型農業とバイオマス増産という相反する課題を解決に貢献する。根粒菌・菌根菌と共生させたマメ科植物ミヤコグサでのトランスクリプトームデータ、共生シグナル分子を添加したデータ、および共生変異体のデータ取得を行った。共生シグナル分子としては、根粒共生時に根粒菌から分泌されるNod factor、菌根共生時に菌根菌から分泌されるキチンオリゴマーを添加した植物体での発現プロファイルを取得した。共生変異体としては、根粒の過剰着生、菌根菌の過剰感染が確認されている変異体har1およびtmlのトランスクリプトーム解析を行った。これらの共生変異体では非感染状態での植物状態が共生菌の感染や共生器官の形成を促進していると考えられたことから、非感染状態での根および地上部の発現プロファイルの取得を行った。トランスクリプトーム解析の手法としては、次世代シーケンサーを用いたRNA-seqを用いた。上記のサンプルより抽出したRNAから次世代シーケンス用ライブラリを作製し、Illumina Hiseq2000を用いて数M数十M readsのショートリード情報を取得した。現在、これらのデータの解析を行っている。このような解析によって得られた共生促進効果を持つ物質については、菌根菌、根粒菌の感染率の測定法や、共生栄養供給能の評価、生育促進効果を統一した基準で、栽培室レベルで評価をおこなう。そのための評価法として、根粒菌に関しては根粒菌の感染経路である感染糸形成数と共生器官である根粒の計測条件の確定を行った。また、その根粒における窒素固定能の測定技術として、ガスクロマトグラフィーを用いたアセチレン還元活性測定の測定法を導入した。菌根共生においては、接種胞子数に応じた感染率の変化を測定することで宿主植物における感染能の変動と生育促進効果を評価する手法を確立した。とくに応用対象として想定しているネギを用いた測定では、安定した感染と生育促進効果を計測できるようになっている。平成27度の解析で得られたRNA-seqデータをインフォマティクスによる解析を行い、これらの遺伝子発現プロファイルから共生促進物質の候補となる物質とその合成遺伝子・経路の情報を得る。
液中原子間力顕微鏡による固液界面現象の局所動的解析に関する研究

本研究では、電気化学原子間力顕微鏡(AFM)の開発による電極反応過程における電極表面のキャラクタリゼーションについて基礎検討を行った。3電極方式により、電位規制あるいは電流規制電解中の電極表面をAFM測定した。作用電極には、構造規制グラファイト(HOPG)、鏡面研磨白金、鏡面研磨グラッシーカーボンおよび光透過性ITO電極等を用いた。まず、HOPG電極表面を10mM-KCl及び-KNO_3水溶液中で酸化、還元処理を行って、電極表面構造に与える影響を詳細に観察した。その結果、KCl溶液中では電解処理による表面構造の変化は観られなかったが、KNO_3水溶液中で酸化処理すると、表面構造が大きく乱れて電極炭素の部分的酸化、及びインタカレーションによる層間での気体発生などが観察された。これらについては電気化学STM測定においても同様の結果が得られた。次に、各種電極上への微量水銀、銀、鉛などの電析による薄膜形成過程について詳細な観察を行った。例えば、水銀は白金上には微小球に分布析出するのに対して、銀は一様な薄膜を形成、鉛析出膜では粒界が観察された。電極反応初期過程をin situで、かつ原子レベルの分解能で観察することが大目標であったが、光てこ方式AFMは液面の影響が大きく液中原子レベルでの測定が困難であった。そこで新しく光干渉型観測ヘッドへの改良について検討を重ねてきた。カンチレバ-の励振方法や共振回路、安定で高感度な周波数検波回路等の開発要素が多くあり、それらを克服していくのに大変手間取ったがようやく完成の見通しが得らた。また、研究代表者が本研究期間中に配置換えになったことも加わり、本研究報告書の提出が遅れたが、本研究は大きく進展してきている。本年度は,まず,電極反応過程における電極表面のin situ動的観測を可能にし,複雑な固液界面現象を原子,分子レベルで解析することを目的として,雰囲気制御型液中原子間力顕微鏡(AFM)を開発,導入した。本原子間力顕微鏡は,ステンレス製の真空チャンバー内に設置されているため,10^<-8>Torrの高真空中での観測が可能となった。また,アルゴンガスを導入して,不活性ガス雰囲気下での液中測定ができるため,無酸素下における電極反応過程の観測が可能となり,金属の電解析出初期過程や腐食初期過程の観測が可能になった。本顕微鏡は,XY方向分解能が1nm,Z方向分解能が0.1nmと非常に高分解能でありながら,XY走査範囲は最大10μmと広域測定も可能であるなど,特に電極反応過程の原子,分子レベルでの観測を目的として設計されたものである。次に,AFM観測用の金,白金,及びパラジウム電極を製作し,まず,これらの電極を用いて塩化カリウム及び塩酸支持電解質中でサイクリックボルタンメトリー測定を行って,各々の電極の電気化学的挙動の解析を行った。さらに,本装置を用いて,酸化及び還元雰囲気下での各種電極表面のキャラクタリゼーションを行った結果,特に,パラジウム電極では,電極表面のパラジウム粒子の配列が酸化還元により特異的な挙動を可逆的に示すことを見いだした。現在,これら電極上への各種金属の電解析出初期過程の動的観察を行っている。さらに,ITO光透過性電極上に電解重合させたポリピロール薄膜の観測を行った。無置換及び長鎖アルキル基置換ピロールポリマーの表面観察結果から,極性の高いITOガラス表面に対してピロールの-NII部分が結合し,長鎖アルキル基が比較的規則的に配列している様子を観測した。

電極反応過程における電極表面のin situ動的観測を可能にし、複雑な固液界面現象を原子、分子レベルで解析することを目的として、超高真空原子間力顕微鏡(UHV-AFM)を開発、導入した。まず、UHV-AFM装置に適したカンチレバ-の高感度変位検出方式について光検出方式とトンネル電流検出方式の両法について詳細に比較検討した結果、近接場走査光学顕微鏡における光学探針のAFM制御への応用をも考慮して、トンネル電流検出方式を採用した。本UHV-AFMは、原子レベルの高分解能を有しながら、X-Y走査範囲は最大1.0μmと広域測定にも適用でき、また、アルゴンガスなどの不活性ガス雰囲気下での液中測定に適しているという大きな特色を有している。本装置による電極反応過程の原子、分子レベルでの表面観測により、金属の電析や腐食初期過程、及び導電性有機薄膜形成過程の観測が可能になった。次に、AFM観測用の金、白金及びパラジウム電極をスパッタリング法により製作し、これらの電極を用いて塩化カリウム及び塩酸支持電解質中における電気化学的挙動をサイクリックボルタンメトリーにより解析するとともに、UHV-AFMにより、酸化及び還元雰囲気下での電極表面のキャラクタリゼーションを行った。その結果、特にパラジウム電極表面は他の電極とは著しく異なりPdが多孔質粒子を形成していることがわかった。また、酸化及び還元により、Pd粒子の配列が特異的な挙動を可逆的に示すことを見いだした。さらに、ITO光透過性電極上に電解重合させたポリピロール薄膜の観測を行った。無置換及び長鎖アルキル基置換ピロールポリマーの表面観測結果から、極性の高いITOガラス表面に対してピロールの-NH部分が結合し、長鎖アルキル基が比較的規則的に配列している様子を観測した。現在、種々の電極上への各種金属の電解析出及び有機薄膜形成の初期過程の動的観察を中心に研究を進展させている。
地球化学プロセスによる地盤中有害重金属の溶出性制御

シリカとマグネシアの反応によって生成する3八面体型層状ケイ酸塩鉱物の構造水酸基を置換する形でフッ化物イオンを取り込ませ固定化することを試みた.フッ化物イオンは層状ケイ酸塩の生成を促進し,長期的には溶出制御につながると考えられたが,反応が遅く,処理技術としては他の補助的な方法と組み合わせる必要があった.また,同じ反応によって生成する3八面体型層状ケイ酸塩鉱物の八面体層に,マグネシウムを置換する形で,ニッケルイオン,銅イオンを取り込ませて溶出を抑制することを試みた.粉末X線回折と赤外スペクトル測定から,非常に発達の程度は弱いものの層状ケイ酸塩が生成し,少なくとも一部の金属イオンは八面体層に取り込まれていることが示唆された.この反応と同時に起こる表面錯形成反応のため,シリカ-マグネシア混合物に固-液比1kg:2Lで8000mg/Lの銅およびニッケル塩溶液を添加した場合,30日以内に溶液濃度は0.01mg/Lまで低下した.数千mg/kgの銅,およびニッケル汚染土に土の10%程度のシリカ-マグネシア混合物を添加した場合でも,30日以内に1:10水抽出液への金属イオンの溶出濃度は0.01mg/L以下となった.生成速度は研究計画段階で予想したよりも遅く,研究は現在も継続中である.ただ,シリカ-マグネシア混合物を土に添加すると表面錯形成反応を促進することから,短期的には表面錯形成反応により,長期的には新生鉱物への取り込みによって銅,ニッケルなどの溶出制御が可能であり,高レベル汚染土を受け入れる処分場における処理技術として有望であると考えている.この他,有害重金属の溶出機構のモデル化のため,イオン交換,表面錯形成反応を組み込んだ物質輸送コードの開発も行った.さらに,モデルパラメータを得るため,土の鉱物や腐植物質による重金属イオンの吸着反応についても研究を行った.シリカとマグネシアの反応によって生成する3八面体型層状ケイ酸塩鉱物の構造水酸基を置換する形でフッ化物イオンを取り込ませ固定化することを試みた.フッ化物イオンは層状ケイ酸塩の生成を促進し,長期的には溶出制御につながると考えられたが,反応が遅く,処理技術としては他の補助的な方法と組み合わせる必要があった.また,同じ反応によって生成する3八面体型層状ケイ酸塩鉱物の八面体層に,マグネシウムを置換する形で,ニッケルイオン,銅イオンを取り込ませて溶出を抑制することを試みた.粉末X線回折と赤外スペクトル測定から,非常に発達の程度は弱いものの層状ケイ酸塩が生成し,少なくとも一部の金属イオンは八面体層に取り込まれていることが示唆された.この反応と同時に起こる表面錯形成反応のため,シリカ-マグネシア混合物に固-液比1kg:2Lで8000mg/Lの銅およびニッケル塩溶液を添加した場合,30日以内に溶液濃度は0.01mg/Lまで低下した.数千mg/kgの銅,およびニッケル汚染土に土の10%程度のシリカ-マグネシア混合物を添加した場合でも,30日以内に1:10水抽出液への金属イオンの溶出濃度は0.01mg/L以下となった.生成速度は研究計画段階で予想したよりも遅く,研究は現在も継続中である.ただ,シリカ-マグネシア混合物を土に添加すると表面錯形成反応を促進することから,短期的には表面錯形成反応により,長期的には新生鉱物への取り込みによって銅,ニッケルなどの溶出制御が可能であり,高レベル汚染土を受け入れる処分場における処理技術として有望であると考えている.この他,有害重金属の溶出機構のモデル化のため,イオン交換,表面錯形成反応を組み込んだ物質輸送コードの開発も行った.さらに,モデルパラメータを得るため,土の鉱物や腐植物質による重金属イオンの吸着反応についても研究を行った.今年度は,溶出性制御のため地盤中で生成させようとする鉱物の生成速度の実験室における測定を行なった.またそれに加えて関連鉱物による重金属イオン吸着の測定も行った.まず,3八面体型層状ケイ酸塩の生成速度を推定するため,シリカとマグネシアを混合して水分調節し,多数の密閉容器に封入して25°Cで反応させた.鉱物は数日で生成し始め時間の経過とともに生成量は増加した.ただXRDによる定量は困難であったので,支出計画を変更してFTIRを購入し,FTIRスペクトルとXRDの併用によって定量のためのデータを得た.重金属共存系における実験でも,ほぼ同様に鉱物は生成したが,重金属類の取り込み部位を正確に決定するには至らなかった.これは来年度分光学的な方法を適用して再測定する予定である.層状ケイ酸塩の他,地盤中で重金属取り込みのため生成させる鉱物として,アカガネアイトも検討することにした.この鉱物の生成は早いものの,不安定であり,しだいに反応性の低いゲータイトに転換することから,土環境中におけるアカガネアイトからゲータイトへの転換速度の測定も行った.その結果土環境下での速度は非常に遅く定量的な結果を得ることができなかったので,高アルカリ,高温条件での加速試験を行った.現在,両鉱物に関する反応速度の解析中である.さらに,鉱物骨格への重金属類の取り込みの効果を評価するためには,それと表面への吸着を区別して評価する必要がある.そのためには土の構成鉱物による重金属類の吸着量を間隙水組成の関数として推定することが必要になる.その際に用いる吸着モデルのパラメータの測定値が十分でないことから,今年度はシリカ,ギブサイト,ハロイサイトによる2価鉄,2価マンガンおよび銅の吸着をpHの関数として測定した.

また,酸性での溶出評価において重要なAlの関与するイオン交換平衡パラメータの測定も行った.昨年度に引き続き,フッ化物イオンを三八面体型スメクタイトの骨格に取り込んで不溶化する反応のモニタリングを継続した.つまりマグネシアとシリカの混合物にフッ化ナトリウムを添加し,生成物と,フッ化物イオン濃度を継続してモニタリングした.フッ化物イオンが存在したほうがスメクタイト生成反応が早く進行し,通常1ヶ月程度では観察できない001反射を与えるものが生成した.ただ,共存溶液のフッ化物イオン濃度は環境基準を下回るまでは短時間では低下せず,単独で適用できる不溶化技術としては問題あることがわかった.他の,短時間で効果のある方法と組み合わせることが必要と思われた.今年度は,フッ化物イオンの不溶化だけでなく,鉛などの重金属イオンの不溶化も対象とした.方法としては,ゼオライト,炭酸塩,アロフェン質土などを添加し,これらと鉛イオンの反応を利用した不溶化技術における基礎反応と,それぞれの鉱物の寄与を判定することを目的とした.人工鉛汚染土にこれらの資材を単独あるいは複合して添加し,時間をおって鉛の形態変化,酸性化に対する溶出抵抗性を測定した.炭酸塩は,土のpHを上昇させることにより,ゼオライトは陽イオン交換基への吸着により重金属イオンの溶出を抑制した.そしてこれらを混合施用すると,酸性化に抵抗力のある溶出抑制技術となることがわかった.ただし,添加された炭酸塩を消費し尽くすほど高濃度の酸が大量に添加された場合には,むしろ未処理土よりも大量の鉛イオンを溶出させた.このようなことはありにくいことではあるが,適用には注意が必要であると考えられた.昨年度後半からの継続として,シリカとマグネシアの反応によって生成する3八面体型層状ケイ酸塩鉱物の八面体層に,マグネシウムを置換する形で,ニッケルイオン,銅イオンを取り込ませて溶出を抑制することを試みた.粉末X線回折と赤外スペクトル測定から,非常に発達の程度は弱いものの層状ケイ酸塩が生成し,少なくとも一部の金属イオンは八面体層に取り込まれていることが示唆された.この反応と,同時に起こる表面錯形成反応のため,シリカ・マグネシア混合物に固・液比1kg:2Lで8000mg/Lの銅およびニッケル塩溶液を添加した場合,30日以内に溶液濃度は0.01mg/Lまで低下した.数千mg/kgの銅,およびニッケル汚染土に土の10%程度のシリカ・マグネシア混合物を添加した場合でも,30日以内に1:10水抽出液への金属イオンの溶出濃度は0.01mg/L以下となった.室温における層状ケイ酸塩鉱物の生成速度は研究計画段階で予想したよりも遅く,研究は現在も継続中である.ただ,シリカ・マグネシア混合物を土に添加すると表面錯形成反応を促進することから,短期的には表面錯形成反応により,長期的には新生鉱物への取り込みによって銅,ニッケルなどの溶出制御が可能であり,高レベル汚染土を受け入れる処分場における処理技術として有望であると考えている.今年度はこの他に,土の酸性化による有害重金属の溶出機構のモデル化のため,イオン交換,表面錯形成反応を組み込んだ物質輸送コードの開発も行った.さらに,モデルにおける吸着パラメータを得るため,土の鉱物や腐植物質による重金属イオンの吸着反応についても研究を行った.
微小管阻害剤に反応する分裂期チェックポイント遺伝子CHFRの機能解析

CHFRは微小管阻害剤に反応して分裂期の染色体凝集を遅延させる重要なユビキチンリガーゼであり、我々はCHFRが癌で高率に異常なメチル化を受け発現が低下していることを明らかにしてきた。本研究ではCHFR結合分子の同定を試み、微小管ストレスに対する応答のメカニズムを明らかにすることを目的とした。全長ならびにFHAドメインを欠損させたCHFRをbaitとして用いた酵母two-hybrid法によって、CHFR結合分子候補としてE2酵素群および他の分子が同定された。単離された分子のうち、clone #319はCHFRのFHAドメインに結合を示すことがtwo-hybrid法および免疫沈降法による解析で確認され、CHFRの補助因子として機能する可能性が示唆された。一方単離されたE2酵素のうちUbc13はCHFRを介したユビキチン化に関与するため、CHFRによる非分解系のポリユビキチン化の重要性が示唆された。本年度は他のCHFR結合候補分子として単離され、ポリユビキチン鎖に親和性を示すシグナル調整分子として報告されているclone #5515の解析も行った。two-hybrid法によって単離されたのはこの分子のC末断片であることが判明した。two-hybrid法による結合解析では、この分子はCHFRのFHAドメインには結合せず、ΔFHA型CHFRと結合することが確認された。Cos7細胞を用いて免疫沈降法で解析を行ったところ、clone #5515のC末端側がCHFRと強い結合を示すことが確認された。HAタグを付した全長clone #5515の免疫染色による細胞内局在の解析の結果、この分子は核膜周囲に局在すると考えられた。GFP-clone #5515は細胞質にドット状の局在を示した。現在、微小管ストレス存在下でのこの分子を介したシグナル伝達経路にCHFRが与える影響について解析を進めている.CHFRは微小管阻害剤に反応して分裂期の染色体凝集を遅延させる重要なユビキチンリガーゼであり、我々はCHFRが癌で高率に異常なメチル化を受け発現が低下していることを明らかにしてきた。全長ならびにFHAドメインをケ存させたCHFRをbaitとして用いた酵母two-hybrid法によって、CHFR結合分子候補として、E2酵素群および他の分子が同定した。一方分裂期制御キナーゼであるPlk1の蛋白安定性はCHFRの発現によっても影響を受けなかった。GFP-CHFRを安定発現するHela細胞を樹立しその細胞内局在を解析した所、GFP-CHFRは間期は核内に存在し、分裂期の核膜崩壊後は細胞全体に拡散、細胞質分裂後は再び核内に集積することが明らかとなった。またGFP-CHFRの細胞内局在は微小管阻害剤処理後も処理前と同様のパターンを示した。GFP-CHFRを用いたCHFRの蛋白安定性の解析では、CHFR自身は微小管ストレス下や分裂期においても安定であることが示された。今回のスクリーニングで得られた分子がCHFRの機能に与える影響を引き続き詳細に解析したいと考える。
味覚嫌悪学習の文脈依存性を規定する要因の検討

本研究では文脈依存的な味覚嫌悪反応の形成、すなわち文脈間の弁別学習の手続きによって、条件づけが行われた文脈においてのみ味覚に対する嫌悪反応が示されるようになる現象における文脈の役割について実験的な検討をいった。この問題に関しては、文脈自体が味覚刺激と同様に嫌悪と直接に連合するという説明と、文脈は嫌悪とは直接に連合せず、味覚-嫌悪連合の有効性を規定する機会設定子としての機能を獲得するという説明の2つがある。これらの説明の妥当性を検討するために、ラットを被験体とし、味覚溶液を条件刺激、塩化リチウムの投与を無条件刺激として、文脈依存的な味覚嫌悪反応の形成の可否、およびその後のテストでそれが他の味覚に対しても転移するかどうかを規定する要因を実験的に検討した。その結果、文脈依存的嫌悪は味覚が被験体にとって新奇か既知かに関わらず形成され、またそれは第2の味覚に対しても転移する、つまり条件づけを受けた文脈内での摂取がもう一方の中性文脈内よりも抑制されることが示された。しかし、文脈間弁別の訓練時にホームケージ内でも同じ味覚を経験させると、文脈間弁別の習得が遅延すると同時に、形成された文脈依存的嫌悪は第2の味覚には転移しないことが明らかとなった。また、このようなある味覚に特殊な文脈間弁別の形成後に、さらに延長訓練を実施すると文脈依存的嫌悪の味覚特殊性は消失した。さらに、文脈間弁別の訓練の1サイクルにおける中性文脈の呈示回数が1回の場合には、形成された文脈依存的嫌悪は他の味覚に対して転移するが、2回の中性文脈呈示を各サイクルで行うと、訓練時に呈示された味覚に特殊な文脈依存的嫌悪の形成が示唆された。これらの事実は、文脈依存的な味覚嫌悪反応は文脈が機会設定子としての機能を獲得した結果ではなく、むしろ文脈が味覚と同様に嫌悪と直接的に連合し、両者の連合強度の加算効果であることを示唆している。本年度は、ラットを用いてある文脈では液体と中毒症状を引き起こす物質(塩化リチウム)とを対呈示し、他の文脈では液体を単独で呈示するという文脈間弁別の手続きによって習得される文脈依存的な味覚嫌悪の成立と、そこで文脈が獲得する機能を規定する可能性のあるいくつかの要因について実験的検討を行ない、以下のような知見を得た。1.条件づけにおいて明瞭度が比較的低い液体が与えられる場合には、それが新奇(サッカリン)であっても既知(水)であっても文脈依存的な嫌悪は成立し、かつそれは第2の液体(食塩水)にも般化した。2.同じく液体の明瞭度が小さい水を用いた場合に、ホームケージでも同じ水を与えると文脈依存的な嫌悪の形成は遅延し、またそれは他の液体には般化しなかったが、ホームケージで食塩水を与えた場合に形成された文脈依存的な嫌悪は他の液体(サッカリン)に対しても認められた。3.液体(蔗糖溶液)の明瞭度(濃度)あるいは文脈間の弁別訓練の各サイクルにおける中性(安全)文脈内での液体呈示の回数に関わらず、文脈依存的な嫌悪は同程度の速度で成立した。だが、第2の液体(食塩水)に対しては、2回のテストの初回のみで文脈依存的な嫌悪が認められ、2回目のテストではいずれの文脈内でも嫌悪は示されなかった。これらの結果から、文脈依存的な嫌悪は液体および文脈の各々が無条件刺激と直接的に連合し、それらが加算的な効果を示した結果として説明できることが示唆された。

この問題に関しては、文脈自体が味覚刺激と同様に嫌悪と直接に連合するという説明と、文脈は嫌悪とは直接に連合せず、味覚-嫌悪連合の有効性を規定する機会設定子としての機能を獲得するという説明の2つがある。これらの説明の妥当性を検討するために、ラットを被験体とし、味覚溶液を条件刺激、塩化リチウムの投与を無条件刺激として、文脈依存的な味覚嫌悪反応の形成の可否、およびその後のテストでそれが他の味覚に対しても転移するかどうかを規定する要因を実験的に検討した。その結果、文脈依存的嫌悪は味覚が被験体にとって新奇か既知かに関わらず形成され、またそれは第2の味覚に対しても転移する、つまり条件づけを受けた文脈内での摂取がもう一方の中性文脈内よりも抑制されることが示された。しかし、文脈間弁別の訓練時にホームケージ内でも同じ味覚を経験させると、文脈間弁別の習得が遅延すると同時に、形成された文脈依存的嫌悪は第2の味覚には転移しないことが明らかとなった。また、このようなある味覚に特殊な文脈間弁別の形成後に、さらに延長訓練を実施すると文脈依存的嫌悪の味覚特殊性は消失した。さらに、文脈間弁別の訓練の1サイクルにおける中性文脈の呈示回数が1回の場合には、形成された文脈依存的嫌悪は他の味覚に対して転移するが、2回の中性文脈呈示を各サイクルで行うと、訓練時に呈示された味覚に特殊な文脈依存的嫌悪の形成が示唆された。これらの事実は、文脈依存的な味覚嫌悪反応は文脈が機会設定子としての機能を獲得した結果ではなく、むしろ文脈が味覚と同様に嫌悪と直接的に連合し、両者の連合強度の加算効果であることを示唆している。
HO-1を用いた細胞ストレス耐性の増強による特発性大腿骨頭壊死症予防法の開発

ステロイドと低酸素によって,骨細胞のアポトーシスおよびネクローシスが誘導されることが知られており,ステロイド関連大腿骨頭壊死症の病態に関与している可能性がある.heminによって誘導されるHO-1 (heme oxygenase-1)は,抗酸化および抗炎症作用を持ち,細胞保護効果を有する.本研究の目的は,ステロイド投与・低酸素環境における,HO-1の骨細胞に対する細胞保護効果を評価することである.定常酸素(20%)でマウス骨細胞を培養した対照群と,hemin 10μMを投与し同環境で培養したhemin群,HO-1阻害剤を加えたhemin-PP群を作成した.HO-1の遺伝子と蛋白発現をreal time PCRとWestern blot法を用いて3群間で比較した.次に,control群:定常酸素,DH群:デキサメサゾン(Dex)1μMと1%酸素で24時間培養,DH-h群:hemin添加後,Dexと1%酸素で培養,DH-h-PP群: heminおよびHO-1阻害剤添加後にDexと1%酸素で培養,の4群を作成した.各条件で培養後,細胞死の割合をフローサイトメトリーで測定し4群間で比較した.hemin群では,対象群よりHO-1の遺伝子発現が有意に増加し,HO-1の蛋白発現量が増加した. hemin-PP群では,HO-1遺伝子の発現が抑制された.細胞死の割合は,control群と比べ,DH群では有意に増加した.DH-h群ではhemin投与によって細胞死がDH群と比べて有意に減少した. DH-h-PP群では,細胞死抑制効果が減弱しDH群と有意差が無くなった.本研究ではHO-1誘導剤であるhemin投与により,ステロイドと低酸素による骨細胞死の割合が減少した.HO-1阻害剤によって,その効果は減弱し細胞死が増加した.HO-1の細胞保護効果によって骨細胞死を抑制したと考えられる.HO-1誘導は,骨壊死予防に有効な可能性がある.特発性大腿骨頭壊死症(idiopathic osteonecrosis of the femoral head; ION)の発生には,ステロイド投与後に骨内に生じる酸化ストレスやアポトーシスなどが複合的に関わっていると考えられている.低酸素状態や血流障害により生じる骨細胞や血管内皮細胞へのストレスを軽減することでIONの発生を予防することができると考えられる.HO-1(heme oxygenase-1)はストレス反応性タンパクである.HO-1は抗酸化,炎症作用を持ち細胞保護に働くさまざまな生理活性を有している.HO-1は各種のストレスにより誘導される.HO-1はヘムを一酸化炭素,ビリベルジンおよびFe2+に分解しそれぞれの産物が多様な生理作用を有する.HO-1は脳梗塞や心筋梗塞などの虚血性疾患での発現増強が報告されている.さらにHO-1の誘導による腎臓虚血再灌流障害の改善や心筋梗塞の軽減が報告されている.したがって阻血性疾患であるIONの予防にも応用可能であると考えた.本年度はIONへのストレス反応タンパクの関与を明らかにし,生体のストレス応答機構を高めることで骨壊死の予防をはかることを目標として研究を開始した.in vitroで骨細胞に対して低酸素状態やステロイド投与を行い,HO-1の発現に及ぼす影響について検討した.また,骨細胞のアポトーシスおよびネクローシスに対する影響について検討した.プロトコールを作成し,実験を開始する準備は整っており,現在研究を進行させている最中である.具体的にはセルラインを選定し,HO-1の遺伝子発現量や細胞死の有無を検討している,骨細胞におけるHO-1の発現,役割を検討する.低酸素・ステロイド投与環境下で骨細胞の細胞死が促進されることが報告されている.更に,低酸素・ステロイド投与環境下での細胞のHO-1の発現が促進されることが報告されている.しかし,ヒトの骨に最も多く含まれる骨細胞においてHO-1の細胞死の予防効果は検討されていない.はじめに,骨細胞にHO-1誘導剤であるheminを投与し,HO-1発現の有無を検討する.次に低酸素・ステロイド投与環境下で細胞死に至る骨細胞におけるHO-1の発現を確認する.さらに,骨細胞にheminを投与し細胞死に対する効果を検討する.骨細胞にHO-1誘導剤であるheminを投与し,HO-1発現の有無を検討する.次に低酸素・ステロイド投与環境下で細胞死に至る骨細胞におけるHO-1の発現を確認する.さらに,骨細胞にheminを投与し細胞死の比較検討を行う.【研究の目的】ステロイド関連の特発性大腿骨頭壊死症(ION)の発生には,ステロイド投与後に骨内に生じる酸化ストレスやアポトーシスが関わっている.従って,低酸素状態や血流障害による骨細胞や血管内皮細胞へのストレスを軽減しIONの発生を予防できると考えられる.本研究の目的は,抗酸化・抗炎症作用を持つheme oxigenase-1(HO-1)の誘導を用いたION予防法開発につながる基礎研究を行うことである.【研究実施計画】ステロイド投与・低酸素環境下では,骨細胞のアポトーシスおよびネクローシスが誘導されることが知られており,ステロイド関連のIONに関与している可能性がある.heminは心筋梗塞や腎虚血に伴う細胞死抑制作用が報告されている.本研究では,ステロイド投与・低酸素環境において,heminによって誘導されるHO-1のもつ骨細胞死の抑制効果を評価した.【対象と方法】マウス骨細胞を低酸素(1%)環境で培養し,メチルプレドニゾロン(1μM)を添加し骨細胞死を誘導した.

ステロイド投与・低酸素環境で骨細胞を培養した対照群と,hemin 10μMを投与し同環境で骨細胞を培養したhemin群に分けた.HO-1の遺伝子と蛋白の発現をreal time PCRとWestern blot法を用いて2群間で比較した.さらに,フローサイトメトリーを用い,骨細胞のアポトーシスとネクローシスの割合を2群間で比較した.【結果】hemin群ではHO-1の遺伝子発現および蛋白量が対照群と比べ有意に増加した.hemin群のネクローシスの割合(4.6%)は対照群(5.2%)と比べ有意な変化はなかった(p=0.505). hemin群のアポトーシスの割合(8.6%)は対照群(12.0%)に比べて有意に低下した(p=0.038).HO-1の細胞保護効果によって骨細胞のアポトーシスを抑制することが示唆された.本研究ではHO-1誘導剤であるhemin投与により,ステロイド投与および低酸素環境での骨細胞のアポトーシスの割合が減少した. HO-1の細胞保護効果によって骨細胞のアポトーシスを抑制したと考えられる.heminは骨細胞のアポトーシスを減少させることで,骨壊死の予防に応用できる可能性がある.本研究は,heme oxigenase-1(HO-1)の誘導を用いたION予防法開発につながる基礎研究である.HO-1による骨細胞の細胞死抑制の段階までは結果が出ていると考える.本研究の結果内容を今年度の学会で発表し,同時に論文作成を進めていく予定である.ステロイド投与および低酸素環境において誘導される骨細胞のアポトーシスおよびネクローシスに対するHeme Oxygenase-1の抑制効果を検討した。【目的】ステロイド投与・低酸素環境では,骨細胞のアポトーシスおよびネクローシスが誘導されることが知られており,ステロイド関連の特発性大腿骨頭壊死症に関与している可能性がある.heminは心筋梗塞や腎虚血に伴う細胞死を減少させる作用が報告されている.heminによって誘導されるHO-1 (heme oxigenase-1)は,抗酸化および抗炎症作用を持ち,細胞保護効果を有する.本研究の目的は,ステロイド投与・低酸素環境において,heminのもつ骨細胞の細胞死の抑制効果を評価することである.【対象と方法】マウス骨細胞を低酸素環境で培養し,メチルプレドニゾロンを添加し骨細胞死を誘導した.ステロイド投与・低酸素環境で骨細胞を培養した対照群と,heminを投与し同環境で骨細胞を培養したhemin群に分けた.HO-1の遺伝子および蛋白の発現をreal time PCRおよびWestern blot法を用いて2群間で比較した.さらに,フローサイトメトリーを用いて,骨細胞のアポトーシスおよびネクローシスの割合を2群間で比較した.【結果】hemin群ではHO-1の遺伝子発現および蛋白量が対照群と比べ有意に増加した.hemin群のネクローシスの割合は対照群と比べ有意な変化は認めなかった. hemin群のアポトーシスの割合は対照群に比べて有意に低下した.【考察】本研究ではHO-1誘導剤であるhemin投与により,ステロイド投与・低酸素環境での骨細胞のアポトーシスの割合が減少した.HO-1の細胞保護効果によって骨細胞のアポトーシスを抑制したと考えられる.heminは骨細胞のアポトーシスを減少させることで,骨壊死予防に有効な可能性がある.
算数・数学教育におけるジグソー学習法の授業デザインに関する研究

算数・数学教育におけるジグソー学習法の授業実践を長期的に行った。その際,デザイン研究の手法を用いて,算数・数学教育におけるジグソー学習法の教材の構成原理,授業実践の構成原理を抽出を試みた。デザイン原則は授業において必ず実現したい子どもの姿を指しており, 2種の構成原理は必ず適用しなければならない条件ではなく,デザイン検討の際の規範的指針であり,教材内容や子どもの実態に応じて柔軟に活用していくべきものとした。そのためこれらの構成原理は,デザイン研究の進展にともなって常に修正される特性をもつものである。デザイン原則は,「数学的な問題について,他者と対話しながら,それぞれ独自の考え方を話し手になったり聞き手になったりして深める学習活動を繰り返し,数学的な概念を統合的,発展的に深める姿」としてデザイン研究を進めた。教材の構成原理は,「現実の事象から数学化する過程を盛り込むこと」,「ジグソーグループでの対話において統合的な対話の視点を設定すること」,「単元末に,単元で学んだ知識を活用する活動を設定すること」,「解決方法が多様なエキスパート課題を設定すること」の4種を抽出した。授業実践の構成原理は,「エキスパートグループでの活動を保証するためのゆとりのある時間を設定すること」,「他者の考えを参考にしてよかったと感じられる経験を積むこと」,「異なった表現様式の考えの子ども同士でジグソーグループを構成すること」の3種を抽出した。算数・数学教育における数学学習と言語の関係についての認識論的考察においては, Ernest, P. (1998)とSfard, A. (2008)の理論的基盤の共通性から, Wittgensteinの言語ゲームの理論, Vygotskyの外化と内化の理論の重要性を指摘した。Wittgensteinの言語ゲームの理論の立場に立てば,知識は使用することによってその用法や内包と外延を明確にすると考えられ, Vygotskyの外化と内化の理論の立場に立てば,知識の外化によってその適用が修正されて内化され,知識を自覚的に随意的に再び外化できるようになると解釈できる。したがってジグソー学習法の本質である「すべての学習者の対話の保障」は,学習者の理解を深めるための1つの要素となると認識論的に述べられることを指摘した。
細胞間マトリックス成分によるマウス胎仔唾液腺上皮の形態形成の制御

本研究の主要テ-マは、マウス胎仔発生時における唾液腺上皮のクレフト形成、いわゆる分枝形成に必須な細胞間マトリックス成分の同定と、それによる形態形成の制御のメカニズムを明らかにすることであった。これに関して今年度中に得られた結果について以下に報告する。1.細胞間マトリックス成分として近年興味の中心であるヘパラン硫酸プロテオグリカンの役割を明確にするために、単一蛋白にまで精製されたヘパリチナ-ゼで培養中の唾液腺原基を処理したところ、増殖阻害と共に完全な分枝行動阻害を引は起こし、上皮の棒状への変形をももたらした。単純な増殖阻害は上皮の棒状への変形を起こさず、むしろ正常に近い分枝を行うことをすでに明らかにしているので、ヘパリチン-ゼの影響はヘパラン硫酸の独自の機能の反映であることを明らかにした。2.上に述べたヘパラン硫酸プロテオグリンカンを含む細胞間マトリックス分子が上皮の形態形成を制御していることは明かであり、またコラ-ゲンが必須の分子であることも既に明らかにしている。しかし、マトリックスには多彩な分子種が存在していることも予想されている。このような分子種を明らかにする方法の一つとしてモノクロ-ン坑体の作製を行ってきた。この目的のため、マウス胎仔から得た唾液腺、肺臓、腎臓を生きたままラット腹腔に注射して免疫し、マウスのミエロ-マ細胞と融合してハイブリド-マを得た。現在までに約60個のマトリックスを認識するハイブリド-マを得た。今後これらの坑原を明らかにすることが必要である。また、マトリックス成分で最もよく知られているフィブロネクチンも形態形成に関与していることが予想されるため、これに対するモノクロ-ン坑体の作製も行った。3種のハイブリド-マを得ており、確かにフィブロネクチンを坑原とすることも明らかにした。これを用いて形態形成を撹乱できるかどうかの実験を計画中である。本研究の主要テ-マは、マウス胎仔の発生時における唾液腺上皮のクレフト形成、いわゆる小葉形成に必須な細胞外物質の同定とそれの上皮-間充織相互作用への関与を明確にすることである。これらについて今年度新たに得られた成果について以上報告する。1.すでにIII型コラ-ゲンがクレフト形成に必須である可能性について指摘してきたが、今回上皮-間充織界面におけるIII型コラ-ゲンの存在様式について、その三次元像の再構築をパ-ソナルコンピュ-タ-を用いて行い、成功した。それによればIII型コラ-ゲンはクレフトに沿ってほぼ連続的な繊維束として存在しており、コラ-ゲン繊維を介しての間充織の物理的力が働き易い存在状態にあることが明らかにとなった。2.ヘパリン、ヘパラン硫酸を分解するヘパリチナ-ゼはクレフト形成を阻害することをすでに明らかにしてきたが、^<35>S-無機硫酸を用いる標織実験によって、ヘパリチナ-ゼの存在下では組織中のヘパラン硫酸鎖は完全に分解除去されているとが判明し、ヘパラン硫酸プロテオグリカンが上皮の形態形成に重要な鍵を握っている可能性を示した。3.上記コラ-ゲンやヘパラン硫酸プロテオクリカンは、組織中では細胞間マトリックス成分と相互作用をしていると考えらえっる。これらの未同定の物質を検索するひとつの有力な方法としてモノクロ-ン抗体を利用することを試みた。

1個が1mm以下の唾液腺原基100個程度でラットを免疫して、原基の細胞間マトリックス成分と反応する抗体を産生するハイブリド-マを選択しているが、すでに20個以上のクロ-ンを得た。その内いくつかは唾液腺原基と特異的に反応しており、現在抗原を探索中である。この方法は、発生途上のきわめて小さな器官原基の生物学と生化学を推進するための有力な方法であることが示唆された。本研究の主要テ-マは、マウス胎仔発生時における唾液腺上皮のクレフト形成、いわゆる分枝形成に必須な細胞間マトリックス成分の同定と、それによる形態形成の制御のメカニズムを明らかにすることであった。これに関して今年度中に得られた結果について以下の報告する。1.細胞間マトリックス成分のして近年興味の中心であるヘパラン硫酸プロテオグリカンの役割を明確にするために、単一蛋白にまで精製されたヘパリチナ-ゼで培養中の唾液腺原基を処理したところ、増殖阻害と共に完全な分枝行動阻害を引き起こし、上皮の棒状への変形をももたらした。単純な増殖阻害は上皮の棒状への変形を起こさず、むしろ正常に近い分枝を行うことをすでに明らかにしているので、ヘパリチナ-ゼの影響はヘパラン硫酸の独自の機能の反映であることを明らかにした。2.上に述べたヘパラン硫酸プロテオグリカンを含む細胞間マトリックス分子が上皮の形態形成を制御していることは明かであり、またコラ-ゲンが必須の分子であることも既に明らかにしている。しかし、マトリックスには多彩な分子種が存在していることも予想されている。このような分子種を明らかにする方法の一つとしてモノクロ-ン坑体の作製を行ってきた。この目的のため、マウス胎仔から得た唾液腺、肺臓、腎臓を生きたままラット腹腔に注射して免疫し、マウスのミエロ-マ細胞と融合してハイブリド-マを得た。現在までに約60個のマトリックスを認識するハイブリド-マを得た。今後これらの坑体の抗原を明らかにすることが必要である。また、マトリックス成分で最もよく知られているフィブロネクチンも形態形成に関与していることが予想されるため、これに対するモノクロ-ン坑体の作製も行った。3種のアイブリド-マを得ており、確かにフィブロネクチンを坑原とすることも明らかにした。これを用いて形態形成を撹乱できるかどうかの実験を計画中である。