hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
癌骨転移に対する新規治療法の開発

RFPを遺伝子導入したヒト前立腺癌細胞PC-3(PC-3-RFP)を用いた.In vitro実験として,PC-3-RFP細胞をGSK-3β阻害薬(SB216763,AR-A014418)で10日間刺激し,細胞のコロニー形成を評価したところ,GSK-3β阻害薬は濃度依存的に腫瘍を抑制していた.また,in vivo実験としてヌードマウスの脛骨にPC-3-RFP細胞を注射することにより前立腺癌の骨転移モデルを作成し,GSK-3β阻害薬を腹腔内投与しところ,腫瘍の蛍光面積,腫瘍の体積,腫瘍の重量は有意に抑制されていた.BLS群とFGS群の術前の腫瘍の蛍光面積はそれぞれ24.0±2.3 mm2,24.1±2.3 mm2であった(P = 0.490).腫瘍切除後のGFPの蛍光領域は,BLS群3.0±0.7 mm2, FGS群0.2±0.1 mm2であった(P < 0.001).術後5週での蛍光面積は,BLS群200.6±43.9 mm2, 31.1±13.2 mm2であった(P < 0.001).無再発生存期間を比較したところ,術後12週での無再発生存率はBLS群で0%, FGS群で36.9%であり,FGSは有意に再発を抑制した(P < 0.001).蛍光ガイド下での腫瘍切除は遺残腫瘍,腫瘍の再発を抑制しており,蛍光イメージングは術中に腫瘍の位置,正常組織との境界を把握する手段として有用と考えた.本研究では蛍光ガイド下手術を行った群においても多くの再発を認めており,この手法の応用には腫瘍の蛍光標識の方法を改善する必要がある.予定通り結果が出ており、順調に進展している。我々はこれまでに蛍光タンパクで腫瘍を標識することにより腫瘍を可視化させて生体内で観察する技術を確立してきた.また,生体内で腫瘍を可視化させる技術を手術に応用する試みを行っており,本研究ではマウス骨転移モデルを用いて腫瘍の増大,腫瘍再発に対する蛍光ガイド下腫瘍切除術(Fluorescence-guided surgery,以下FGS)の有用性を調査した.緑色蛍光タンパク(green fluorescent protein: GFP)を発現するヒト前立腺癌細胞PC-3を作成し,25匹のヌードマウスの脛骨に注射することにより骨転移モデルを作成した.注射から1週後,癌胎児性抗原(carcinoembryonic antigen: CEA)に特異的なモノクローナル抗体をDyLight 650で標識して13匹のマウスに尾静脈注射した.12匹のマウスに対して明視野で腫瘍切除術(bright light surgery: BLS)を行い,13匹のマウスに対して蛍光ガイド下で腫瘍切除術(fluorescence-guided surgery: FGS)を行った.術後,毎週蛍光イメージングを行い,腫瘍再発を評価した.FGSは有意に遺残腫瘍を減少させ,継時的イメージングではFGS群の腫瘍再発がわずかであったのに対し,BLS群の腫瘍の急速な増大を認めた.また,FGSは有意に無再発生存率を改善した.この研究から,FGSは前立腺癌骨転移モデルにおいて,遺残腫瘍,腫瘍再発を減少させることが示された.この手法を応用することにより様々な癌腫における遺残腫瘍,腫瘍再発を減少させることができると期待される.RFPを遺伝子導入したヒト前立腺癌細胞PC-3(PC-3-RFP)を用いた.In vitro実験として,PC-3-RFP細胞をGSK-3β阻害薬(SB216763,AR-A014418)で10日間刺激し,細胞のコロニー形成を評価したところ,GSK-3β阻害薬は濃度依存的に腫瘍を抑制していた.また,in vivo実験としてヌードマウスの脛骨にPC-3-RFP細胞を注射することにより前立腺癌の骨転移モデルを作成し,GSK-3β阻害薬を腹腔内投与しところ,腫瘍の蛍光面積,腫瘍の体積,腫瘍の重量は有意に抑制されていた.新規治療法として、プラチナ製剤とビスフォスフォネートを融合させることにより骨に集積する新規プラチナ製剤、分子標的薬としてGSK-3β阻害薬の有用性についても研究しており、これらの研究を計画通りに遂行する予定である。腫瘍平成28年度に予定していた動物実験を平成29年度に実施することとしたため。次年度には動物実験を中心とした研究が中心となり、実験動物、試薬、論文掲載料など多くの費用を要すると見込まれる。
圧力誘起相転移近傍の臨界現象の研究

本研究では、強相関系物質等における多重極限環境(高圧・低温・高磁場)下での基礎物性研究を行う事を目的とし研究を行った。本年はCrAsにおいて圧力誘起超伝導現象を発見すると共に高圧装置の最適化を行い15GPa程度までの精密物性測定を可能とした。また、その他物質の研究を行った。反強磁性CrAsの圧力誘起超伝導現象の発見:CrAsは、斜方晶MnP型の結晶構造を有する、反強磁性体(TN=265K)である。実験には、自己フラックス法により作製した良質単結晶試料を用い、電気抵抗、磁化、中性子回折等の諸物性の高圧下測定を極低温まで行った。圧力は、ピストンシリンダー型圧力装置およびキュービック型圧力装置を用いて発生し、その結果、反強磁性秩序は、僅か9 kbar以上で消失しすると共に、低温ではフィラメンタリーな大きい超伝導が観測された。9 kbar以上では、転移幅0.1 K以下のバルク超伝導が観測された。さらに圧力を加えると、4 GPa以上の高圧力下で超伝導は消失する事を発見した。この結果はNature Communication(2014)で発表された。パームキュービック圧力発生装置における発生圧力の拡張の研究:パームキュービックアンビル圧力装置は、ほとんどの液体圧力媒体が固化する3GPa以上の圧力範囲においても、良好な静水圧を発生出来る優れた小型の装置である。この装置の発生圧力を拡張するため、アンビルトップの大きさを、4 x 4 mm2から2.5 x 2.5 mm2に変更し、最大発生圧力をこれまでの約2倍である16 GPa程度にすることに成功した。この結果は、Review of Scientific Instruments(2014)で発表された。その他、反強磁性絶縁体PbCrO3の圧力効果の研究やアンチポストペロブスカイト化合物V3PnNx(Pn=P、As)の圧力効果の研究を行った。26年度が最終年度であるため、記入しない。Chang氏は、着任後、強相関系物質等における多重極限環境(高圧・低温・高磁場)下での基礎物性研究行うための、予備実験を開始し、装置稼働のための技術習得を行った。具体的には、研究室に設置されている。キュービックアンビル圧力装置およびピストンシリンダー型圧力発生装置を用い、電気抵抗、ac磁化およびac比熱の測定方について習得した。また、圧力範囲を広げるため、新しいアンビルを用いた装置開発も平行して行った。まず、高圧合成で作成されたPbCrO3多結晶試料の電気抵抗温度依存の測定を各圧力下で行った。常圧下では、電気的には半導体(絶縁体)的振る舞いを示すと共にTN鯉245K以下で反強磁性体にオーダーしさらに、低温の185Kおよび62Kで磁気構造の再配列が起こる物質として報告されている。また、高圧下x線測定により、PV1.6GPa付近で結晶構造を変えずに体積が減少する一次相転移が存在するとして伝導、磁性、構造の点から興味を持たれている物質である。この物質の高圧下での物性を明らかにする目的で高圧下での電気抵抗の温度依存性の測定を行った。その結果、電気抵抗の温度依存性は、PVの前後の圧力でその値が全温度範囲で急激に小さくなった。しかしながら、半導体的振る舞いは、8GPaという高圧下においても観測された。電気抵抗測定からは、磁気秩序の圧力依存性があまりはっきりしなかったので、磁気的な振る舞いが高圧下でどの様に変化するかを明らかにする必要がある。現在、結果を論文にまとめている最中である。本年度は、強相関系物質等における多重極限環境(高圧・低温・高磁場)下での基礎物性研究を行った。具体的には、10GPa級での圧力下における物性研究を行い、圧力誘起超伝導や、数奇物性現象の発見およびその機構解明を目的とした。さらにより広い圧力範囲での物性測定を可能とする装置開発も行った。より具体的な研究成果を以下に述べる。(1)量子臨界現象点近傍の研究:常圧で超伝導秩序を示す圧力充填ダイト化合物YFe_4P_<12>の圧力依存性を調べ、超伝導転移温度が正の圧力依存性を示す原因について、それぞれ物質においてバンド構造を計算し比較検討する事により明らかにした。また、CaCu_3Ir_4O_12について高圧合成を行い、純良試料を作製した。測定により、この物質が報告例の少ない、d電子に起因する近藤物質であることを明らかにした。(2)圧力誘起金属ー非金属転移現象の研究:ペロブスカイトPbCrO_3は臨界圧力(1.6GPa)近傍で体積が10%程度減少する。この臨界圧力で起こる体積変化がCrの価数変化に起因することを明らかにした。同様な物質であるペロブスカイトBaIrO_3の試料を25GPaの超高圧下で合成する事に成功し、一連の113化合物について統一的に理解できることを明らかにした。(3)圧力装置の開発:測定圧力範囲を10GPa以上にすべく、アンビルトップの大きさを、4x4mm^2から2.5x2.5mm^2に変更した開発を行った。

その結果は、ガスケットを工夫することにより、最大発生圧力をこれまでの約2倍である16GPa (T=4.2K付近)にすることに成功したと同時に、試料セットの成功率が大幅に上昇させると共に、ほとんど失敗の無い試料セット方法として確立することに成功した。本研究では、強相関系物質等における多重極限環境(高圧・低温・高磁場)下での基礎物性研究を行う事を目的とし研究を行った。本年はCrAsにおいて圧力誘起超伝導現象を発見すると共に高圧装置の最適化を行い15GPa程度までの精密物性測定を可能とした。また、その他物質の研究を行った。反強磁性CrAsの圧力誘起超伝導現象の発見:CrAsは、斜方晶MnP型の結晶構造を有する、反強磁性体(TN=265K)である。実験には、自己フラックス法により作製した良質単結晶試料を用い、電気抵抗、磁化、中性子回折等の諸物性の高圧下測定を極低温まで行った。圧力は、ピストンシリンダー型圧力装置およびキュービック型圧力装置を用いて発生し、その結果、反強磁性秩序は、僅か9 kbar以上で消失しすると共に、低温ではフィラメンタリーな大きい超伝導が観測された。9 kbar以上では、転移幅0.1 K以下のバルク超伝導が観測された。さらに圧力を加えると、4 GPa以上の高圧力下で超伝導は消失する事を発見した。この結果はNature Communication(2014)で発表された。パームキュービック圧力発生装置における発生圧力の拡張の研究:パームキュービックアンビル圧力装置は、ほとんどの液体圧力媒体が固化する3GPa以上の圧力範囲においても、良好な静水圧を発生出来る優れた小型の装置である。この装置の発生圧力を拡張するため、アンビルトップの大きさを、4 x 4 mm2から2.5 x 2.5 mm2に変更し、最大発生圧力をこれまでの約2倍である16 GPa程度にすることに成功した。この結果は、Review of Scientific Instruments(2014)で発表された。その他、反強磁性絶縁体PbCrO3の圧力効果の研究やアンチポストペロブスカイト化合物V3PnNx(Pn=P、As)の圧力効果の研究を行った。26年度が最終年度であるため、記入しない。来日以来、多くの試料を測定し、と同時に論文執筆を行い、その結果の一部は既に雑誌に投稿している。また、学会での発表も積極的に行っている。計画した実験はそのすべてを行い。論文として発表している。その一遍は著名な学術誌で有り、研究内容が優れていることを示している。昨年と同様に、当初の計画に従って、高圧合成やフラックス法などを駆使して作成した多結晶試料や単結晶試料の電気抵抗測定を高圧下で行い、物性探索を進めて行く。基本的には、当初の研究計画通り進めていく。装置開発により、研究圧力範囲が広がったので、より多くの試料が研究対象となることが期待される。
高発癌性遺伝病の修復欠損要因と修復遺伝子の解析

ヒト高発癌性遺伝病である色素性乾皮症(XP)は発癌基本機構に関わるDNA除去修復の欠損を示すもので、日本で頻度の高いA群XPの修復遺伝子、XP蛋白因子、群別修復欠損の特長、日本人XP患者の相補群決定と分布および修復欠損と発癌実態の研究を行った。A群XPの修復は欠損を相補する遺伝子がマウスゲノム遺伝子およびヒトcDNA遺伝子としてクローニングでき、完全長cDNAはマウス1kbとヒトの1kbおよび1.3kbであり、マウス細胞では1kbmRNAとして、ヒト正常細胞では1kdおよび1.3kdmRNAとして発現し、多数のA群XP患者細胞でmRNA発現の欠損がみられた。このcDNA長に一致して、精製されたA群蛋白因子の基本分子量は42kDであり、85kD複合体としてA群細胞のみに修復活性を与えた。C群因子はゲル濾過分子量で600kDと大きくI群因子と共存した。さらにヒト細胞でのcDrAクローニング、一次薬剤耐性選択、hMTIIプロモーターによる誘導発現の3者のできるクローニング・ヒト細胞発現ベクターも開発でき、A群以外のXP遺伝子研究が可能となった。日本人Aバリアント(Va)XP患者細胞の修復欠損を四環ダイマーと(6-4)産物の酵素プローブによる生化学的検出と新しく樹立した特異モノクローナル抗体によるELISA検出法によって群別に明らかにした。即ちA、C、D群の両者の完全欠損とVa群の(6-4)産物のみの部分修復欠損を明らかにした。シャトルベクターを用いたUV突然変異解析からTC、CC配列でのCの選択的変異とXP細胞での(6-4)産物の高い突然変異性が示唆された。300例以上の日本人XP患者の調査と上記の研究から、XPの発癌頻度と平均発癌年令は修復欠損度の高い程高く早い(A、C、D群)が、中間修復をするE、F、Va群では頻度が低くかつ中高齢で発癌することが明らかとなった。相補群分布から、日本ではA、E、F、Va群の発生頻度が高い。
複素五員環を連結させた分子コイルの創製

チオフェン環のβ位に分子間相互作用を抑制するフェニル基を導入したベンゾジチオフェンユニットを合成し、さらにその両端にラジカルカチオン種を安定化させ高いπダイマー形成能を示すチオフェン環のβ位にCH3O-基を導入したジチエニルピロールユニットをクロスカップリングさせた分子を合成した。さらにそのジカチオン種が、中央のベンゼン環の芳香族性に由来し、高いジラジカル性を発現することを理論計算および吸収スペクトルの波形から確認した。そのカチオン状態でのキノイド構造への変化において、ピロールのN-CH3基とチオフェンのβ位の置換基間の立体反発から、通常の安定配座であるtrans体が不利となり、cis-cis体の方が安定化すると期待され、らせん構造を有するオリゴマーの超分子構造体の構築に向けた新たな知見を得ることができた。一方、本研究課題に関連して、部分被覆構造をもつオリゴチオフェンで取り囲まれた金微粒子のキャスト膜が、ヨウ素ドープにより伝導度の高いスイッチング機能を有することを示し、理論計算の結果とTEMの観測結果を合わせて、部分被覆により金微粒子間の距離が引き離されることにより中性状態で絶縁性を示す一方、カチオン状態で期待されるπダイマー形成により伝導度が高まることが起因しているという結論を導いた。26年度が最終年度であるため、記入しない。チオフェン環のβ位にCH3-, CH3O-, CH3S-基を導入したジチエニルピロールを合成し、ラジカルカチオン種の安定性及びπダイマー形成能に対する置換基の効果を検討した。吸収スペクトルの経時変化及び温度変化の結果から、CH3O-基を導入した誘導体が最も安定であり、高いπダイマー形成能をもつことがわかった。また一電子酸化に伴うこの交互三量体のキノイド構造への変化において、ピロールのN-CH3基とチオフェンのβ位の置換基間の立体反発から、通常の安定配座であるtrans体が不利となり、cis-cis体の方が安定化すると考えられるが、実際理論計算と実測のスペクトルとの比較から、このチオフェンのβ位に置換基を導入したラジカルカチオンおよびそのπダイマーが、シス体になるということを確認することに成功した。一方、チオフェンユニットのβ位にアルキルチオ基をもつベンゾジチオフェンの新規合成経路を開拓し、先のチオフェンのβ位にアルキルチオ基を導入したジチエニルピロールをこのベンゾジチオフェンユニットの両サイドに導入したオリゴマー分子を合成した。さらにそのジカチオン種が、中央のベンゼン環の芳香族性に由来し、高いジラジカル性が発現することを明らかにした。これらの結果から、シス型が安定配座であり、カチオン種でも高い安定性を示すジラジカル種に関する知見が得られ、今後らせん構造を有するオリゴマー分子の構築に向け、基礎的な知見を得ることができた。今年度は、チオフェン環のβ位にメトキシ基を導入したジチエニルピロールのラジカルカチオン種が、室温溶液中で長時間安定に存在できることを明らかにし、さらにシス型のπダイマーを形成することを見出した。また、オリゴチオフェンにベンゾジチオフェンを挿入することにより、ジカチオン種のジラジカル性が高まるという結果も得ており、今後の進展の鍵となる知見を得ることができた。今年度に得られた知見を基に、アルコキシ基をチオフェンのβ位に導入したジチエニルピロールおよびベンゾジチオフェンを基本骨格とし、これらを組み合わせることにより、酸化状態でらせん構造が誘起される高分子およびジカチオンジラジカルのπダイマーの積層による超分子構造体の構築を目指す。
食物依存性運動誘発アナフィラキシーにおける原因蛋白小麦グルテニンのエピトープ解析

小麦製品摂取後の運動時にアナフィラキシー症状を呈した患者について,小麦製品の摂取と運動負荷,アスピリンの摂取を組み合わせた誘発試験を行い,小麦による運動誘発アナフィラキシーと確定診断した患者血清を収集した。これらの患者血清について精製小麦グルテン構成蛋白質(α-グリアジン,β-グリアジン,γ-グリアジン,ω-5グリアジン,ω-1,2グリアジン,高分子量グルテニンと低分子量グルテニン)に対するIgE抗体の反応性をドットブロット解析により検討した結果,小麦依存性運動誘発アナフィラキシー患者にはω-5グリアジンに最も強く反応するグループと,高分子量グルテニンに反応する2つのグループがあることを見いだした。まず、高分子量グルテニンのIgE結合エピトープを決定するために、SPOTsメンブレン(SIGMA-Genosys社)上に高分子量グルテニンのアミノ酸配列を基にデザインしたオーバーラップペプチド(14アミノ酸長、オフセット7アミノ酸)を合成しペプチドアレイを作製した。ドットブロット解析で高分子量グルテニンに対する特異的IgE抗体価が高かった患者6名の血清IgEについて、作製したペプチドアレイに対する反応性を調べた。その結果、血清IgEはいくつかのペプチドに結合する事が明らかとなった。さらに、IgEが反応したペプチドには共通して、QQPGQ, QQPGQGQQ, QQSGQGQ配列が含まれており、これらの3種の配列がIgE結合エピトープであると予想された。
百年，千年後の影響を見据えた文化財にやさしい陽子線励起単色X線による蛍光X線分析

文化財としての絵画に使用される絵具の基材となる膠を模擬したゼラチンの水溶液中にコバルト系青色顔料を模擬した塩化コバルトを混合してスライドグラスに滴下,乾燥し,厚さ数十ミクロンの薄膜試料を作製した.並行して,微量元素のXRF分析に必要な高強度の一次X線を発生するため,既存の静電加速器システムに専用のビームラインを構築した.コバルトのX線吸収端(7.71 keV)に近いエネルギーの特性X線を発生する金属元素標的として銅(KX線エネルギー= 8.04 keV)板を用意した.銅板は陽子線の飛程よりもわずかに厚くし,陽子線が試料に直接当たらず,かつX線の裏面への透過率が最大になるように調整した.これを静電イオン加速器からの2.5 MeVの陽子線で照射し,発生した特性X線のエネルギースペクトルを測定したところ,主成分は銅のKX線であり,十分な単色性を有することが確認できた.さらに銅標的裏面にポリキャピラリーX線レンズを置いてX線を集束させ,そのスポット径を測定したところ1 mm以下であることが分った.一方,作製したゼラチン試料にX線管を用いて1 MGy程度までの照射を行い,照射後試料をフーリエ変換赤外分光分析した.いくつかの官能基による吸収ピークが見られ,未照射試料と比較したところ吸収スペクトルに差が見られたが,多数の試料に対する系統的な違いは確認できなかった.さらにコバルトを含むゼラチン試料を作製し,陽子線を照射してPIXE分析を行った.並行して銅板からの陽子線励起X線を同じ試料に照射してXRF分析を行い,これらの測定方法に対するそれぞれのコバルトの検出下限を評価した.それぞれ陽子及びX線により試料が受ける吸収線量を計算し,同じ検出下限が得られる場合の試料の吸収線量を求めた.その結果,PIXE分析に比べ,陽子線励起X線を用いたXRF分析では線量を数桁低く抑えられることが分った.ゼラチンとコバルト化合物を用いて,膠を基材とする鉱物系顔料を含む絵具の分析を想定した模擬文化財試料を予定通り作製することができた.また,金属標的を陽子線で照射することにより発生した特性X線のエネルギースペクトルを測定してその単色性を評価した後,ポリキャピラリーX線レンズで試料上に集束させ,そのスポットサイズを測定することも予定通り達成できた.また,明確な差異は確認できなかったが,フーリエ変換赤外分光分析による放射線損傷評価の予備実験を前倒しで実施できた.また最終目的とするXRF分析法ではないが,PIXE分析法により試料に付与される線量との違いを定量的に評価する計算手法を確立できた.一方で,微量元素分析に必要な高強度の一次X線を発生するため,既存の静電加速器システムに専用のビームラインを構築して一次陽子線強度の増強を試みたが,加速器のイオン源の不調等のため目標の強度を実現できなかった.今後も予定通りイオン源から加速器本体,ビーム輸送系・集束系に至る加速器システム全体の運転条件を最適化し,金属標的上でビーム電流がマイクロアンペア級の高強度陽子ビームを得ることを目指す.あわせて大電流ビーム照射に伴う金属標的の発熱に備え,標的を強制的に冷却する機構の設計・試作も行う.一方,専用の小型フーリエ変換赤外分光測定装置を導入して加速器のビームラインの近くに設置して最適化調整を行い,照射後試料を直ちに測定できる環境を整備する.この装置系を用い,従来のX線管からの連続X線を用いたXRF分析を比較対象として,検出下限が同じになる場合に試料に与えられるミクロな損傷の違いを精密に調べる.これにより,本研究課題で提案する陽子線励起X線を用いた蛍光X線分析の文化財分析における優位性を検証する.文化財としての絵画に使用される絵具の基材となる膠を模擬したゼラチンの水溶液中にコバルト系青色顔料を模擬した塩化コバルトを混合してスライドグラスに滴下,乾燥し,厚さ数十ミクロンの薄膜試料を作製した.並行して,微量元素のXRF分析に必要な高強度の一次X線を発生するため,既存の静電加速器システムに専用のビームラインを構築した.コバルトのX線吸収端(7.71 keV)に近いエネルギーの特性X線を発生する金属元素標的として銅(KX線エネルギー= 8.04 keV)板を用意した.銅板は陽子線の飛程よりもわずかに厚くし,陽子線が試料に直接当たらず,かつX線の裏面への透過率が最大になるように調整した.これを静電イオン加速器からの2.5 MeVの陽子線で照射し,発生した特性X線のエネルギースペクトルを測定したところ,主成分は銅のKX線であり,十分な単色性を有することが確認できた.さらに銅標的裏面にポリキャピラリーX線レンズを置いてX線を集束させ,そのスポット径を測定したところ1 mm以下であることが分った.一方,作製したゼラチン試料にX線管を用いて1 MGy程度までの照射を行い,照射後試料をフーリエ変換赤外分光分析した.いくつかの官能基による吸収ピークが見られ,未照射試料と比較したところ吸収スペクトルに差が見られたが,多数の試料に対する系統的な違いは確認できなかった.さらにコバルトを含むゼラチン試料を作製し,陽子線を照射してPIXE分析を行った.並行して銅板からの陽子線励起X線を同じ試料に照射してXRF分析を行い,これらの測定方法に対するそれぞれのコバルトの検出下限を評価した.それぞれ陽子及びX線により試料が受ける吸収線量を計算し,同じ検出下限が得られる場合の試料の吸収線量を求めた.

その結果,PIXE分析に比べ,陽子線励起X線を用いたXRF分析では線量を数桁低く抑えられることが分った.ゼラチンとコバルト化合物を用いて,膠を基材とする鉱物系顔料を含む絵具の分析を想定した模擬文化財試料を予定通り作製することができた.また,金属標的を陽子線で照射することにより発生した特性X線のエネルギースペクトルを測定してその単色性を評価した後,ポリキャピラリーX線レンズで試料上に集束させ,そのスポットサイズを測定することも予定通り達成できた.また,明確な差異は確認できなかったが,フーリエ変換赤外分光分析による放射線損傷評価の予備実験を前倒しで実施できた.また最終目的とするXRF分析法ではないが,PIXE分析法により試料に付与される線量との違いを定量的に評価する計算手法を確立できた.一方で,微量元素分析に必要な高強度の一次X線を発生するため,既存の静電加速器システムに専用のビームラインを構築して一次陽子線強度の増強を試みたが,加速器のイオン源の不調等のため目標の強度を実現できなかった.今後も予定通りイオン源から加速器本体,ビーム輸送系・集束系に至る加速器システム全体の運転条件を最適化し,金属標的上でビーム電流がマイクロアンペア級の高強度陽子ビームを得ることを目指す.あわせて大電流ビーム照射に伴う金属標的の発熱に備え,標的を強制的に冷却する機構の設計・試作も行う.一方,専用の小型フーリエ変換赤外分光測定装置を導入して加速器のビームラインの近くに設置して最適化調整を行い,照射後試料を直ちに測定できる環境を整備する.この装置系を用い,従来のX線管からの連続X線を用いたXRF分析を比較対象として,検出下限が同じになる場合に試料に与えられるミクロな損傷の違いを精密に調べる.これにより,本研究課題で提案する陽子線励起X線を用いた蛍光X線分析の文化財分析における優位性を検証する.
結核感染症に対する樹状細胞を用いた次世代ワクチンの開発に関する研究

【研究目的】DCを用いた新しい抗結核vaccineを開発するために,まず,同じ細胞内寄生菌であるリステリア菌感染モデルにおいて菌由来のpeptideを遺伝子導入したDCのvaccineとしての有用性を検討する.さらに,リステリア菌のdominant CTL epitopeであるLLO91-99を遺伝子導入したDCのvaccineとしての有効性を,同じepitopeを組み込んだDNA vaccineと比較検討する.【研究の特色と意義】本研究の特色は,生体で最も強力な抗原提示細胞であるDCを利用して,結核菌などの細胞内寄生菌感染症に対して有用なvaccineの開発を試みることである.未だ完全なvaccineがないヒトの結核感染症において,本研究の成果によって,DCを用いた優れた次世代vaccineが開発できる可能性があり,臨床応用の点からみても大変意義のある研究と考えられる.【結果】1.Retrovirusを用いてリステリア菌のdominant CTL epitopeであるLLO91-99の遺伝子をマウス骨髄由来のDCに効率よく導入することに成功した.2.この遺伝子導入DCをマウスに接種することによって,LLO91-99特異的なCTL活性とIFN-gamma産生を誘導することが可能であった.さらに,遺伝子導入DC vaccineは生菌免疫に匹敵するほどのリステリア感染症に対する強力なprotective immunityを誘導した.3.遺伝子銃を用いたDNA vaccineと遺伝子導入DC vaccineの有効性を比較したところ,後者が前者に比しはるかに強いprotective immunityを誘導した.【結論】細胞内寄生菌感染症に対して,retrovirusを用いて細菌由来のCTL epitopeを遺伝子導入したDCは極めて強力なvaccine効果を発揮することを明らかにした.遺伝子導入DCは,従来のDNA vaccineと比較してもはるかに強い感染防御能を誘導することが証明され,今後,結核菌などの細胞内寄生菌感染症に対する次世代のvaccineとして有望である可能性が示唆された.【研究目的】DCを用いた新しい抗結核vaccineを開発するために,まず,同じ細胞内寄生菌であるリステリア菌感染モデルにおいて菌由来のpeptideを遺伝子導入したDCのvaccineとしての有用性を検討する.さらに,リステリア菌のdominant CTL epitopeであるLLO91-99を遺伝子導入したDCのvaccineとしての有効性を,同じepitopeを組み込んだDNA vaccineと比較検討する.【研究の特色と意義】本研究の特色は,生体で最も強力な抗原提示細胞であるDCを利用して,結核菌などの細胞内寄生菌感染症に対して有用なvaccineの開発を試みることである.未だ完全なvaccineがないヒトの結核感染症において,本研究の成果によって,DCを用いた優れた次世代vaccineが開発できる可能性があり,臨床応用の点からみても大変意義のある研究と考えられる.【結果】1.Retrovirusを用いてリステリア菌のdominant CTL epitopeであるLLO91-99の遺伝子をマウス骨髄由来のDCに効率よく導入することに成功した.2.この遺伝子導入DCをマウスに接種することによって,LLO91-99特異的なCTL活性とIFN-gamma産生を誘導することが可能であった.さらに,遺伝子導入DC vaccineは生菌免疫に匹敵するほどのリステリア感染症に対する強力なprotective immunityを誘導した.3.遺伝子銃を用いたDNA vaccineと遺伝子導入DC vaccineの有効性を比較したところ,後者が前者に比しはるかに強いprotective immunityを誘導した.【結論】細胞内寄生菌感染症に対して,retrovirusを用いて細菌由来のCTL epitopeを遺伝子導入したDCは極めて強力なvaccine効果を発揮することを明らかにした.遺伝子導入DCは,従来のDNA vaccineと比較してもはるかに強い感染防御能を誘導することが証明され,今後,結核菌などの細胞内寄生菌感染症に対する次世代のvaccineとして有望である可能性が示唆された.■マウス結核感染症に対するDCを用いたvaccineの有効性を検討するために,以下の抗結核vaccineを作製した.2)結核菌由来の抗原ペプチド(Ag85A,Ag85B)を遺伝子導入したDC各種vaccineによるマウスの免疫は,DNA vaccineは金粒子に付着させて,遺伝子銃で皮内に接種,遺伝子導入したDCは静注,DC exosomeは皮内に接種して行った.■マウス結核感染症に対するDCを用いたvaccineの有効性を検討するために,以下の抗結核vaccineを作製した.2)結核菌由来の抗原ペプチド(Ag85A,Ag85B)を遺伝子導入したDC■マウス結核感染モデルにおいて,上記の1),2),3)をvaccineとして接種し,誘導されるprotective immunityの強さを,BCG生菌vaccineと比較した.2.各種vaccineによるマウスの免疫は,DNA vaccineは金粒子に付着させて,遺伝子銃で皮内に接種,遺伝子導入したDCは静注,DC exosomeは皮内に接種して行った.3.各種vaccine接種4週間後に,免疫マウスに10^6CFUの結核菌を静注し,経時的に脾,肺内の結核菌の菌量を測定する.また,経気道的にも同量の結核菌を吸入させて経時的に肺内菌量を測定する.vaccineによって誘導されるprotective immunityの強さは臓器内菌量で評価し,無免疫マウスとBCG生菌を接種したマウスと比較した.
三次元トラッキング顕微鏡を用いた鞭毛運動の定量解析

三次元トラッキング顕微鏡の開発により、緑藻クラミドモナスを三次元空間で追尾しながら、同時に鞭毛の動きを安定に観察することが可能となった。クラミドモナスの位置(x,y,z)情報と画像に対して、1回の鞭毛打で進む距離、x,y,z方向への瞬間的な速度、曲率、クラミドモナスの回転とその周期、三次元空間における泳動軌跡を容易に計算できるシステムを構築した。これを用いて、異なる光条件下における野生株、既存のダイニン変異株の鞭毛運動の定量的なデータを得る系を構築した。クラミドモナスを三次元空間で追尾しながら、同時に鞭毛の動きを安定に観察することを可能としたトラッキング顕微鏡の開発を続けた。トラッキング顕微鏡の評価のために、高速ビジョンにより計測された顕微鏡画像から画像処理によって得られる細胞位置の計測精度を評価したところ、最大0.54マイクロメートル、最小-0.52マイクロメートルの誤差が確認された。また対象をトラッキングしている際の誤差を計測したところ、面内方向については最大で±1マイクロメートルの誤差、奥行き方向についてはー155マイクロメートルの誤差があることが分かった。上記の評価と並行して、鞭毛運動を担う遺伝子の分子遺伝学的解析を迅速に進めるためのクラミドモナス形質転換系を構築した。前年度に構築した矩形波パルスを用いたエレクトポレーションによる形質転換系をさらに発展させ、電気パルスの条件検討に使用した雄株C-9の他に、雄株CC-124、雌株CC-1690、雌株CC-125についても同様の効率で形質転換できることを確認した。これによってクラミドモナス両性の野生株を高効率で形質転換することが可能となり、交配による育種を行う基盤が確立された。以上の研究結果を論文に投稿した(Yamano et al. J. Biosci. Bioeng. in press)。クラミドモナスを三次元空間で追尾しながら、同時に鞭毛の動きを安定に観察することが可能となった。一次データとして得られる1/1,000秒ごとのクラミドモナスの位置(x,y,z)情報と画像に対して、統計処理ソフトウェアR及びMatlabを利用した数値・画像解析により、1回の鞭毛打で進む距離、x,y,z方向への瞬間的な速度、曲率、クラミドモナスの回転とその周期、三次元空間における泳動軌跡を容易に計算できるシステムを作成した。これを用いて、野生株、既存のダイニン変異株の鞭毛運動の数量データを得た。Molnar et al. 2007によって報告された人工マイクロRNA法(amiRNA法)が、クラミドモナス鞭毛構成遺伝子についても適用できるかを検討した。ダイニン軽鎖遺伝子をamiRNA法によってノックダウンした株を作成し、トラッキング顕微鏡にて鞭毛運動を観察したところ、既知の報告と同様な表現型が観察された。また機能未知の鞭毛遺伝子についてamiRNAによるノックダウンを行ったところ、2本の鞭毛運動の協調が損なわれた表現型を持つ株が単離できた。このことから、amiRNA法は鞭毛遺伝子のノックダウンとその機能解析に有効であることが示唆された。また、クラミドモナスの細胞壁の有無は鞭毛運動に影響を与えるため、細胞壁を持つ株を研究に利用することが必要である。しかしこれまでは、細胞壁があるクラミドモナス株を形質転換するためには、ガメトライシンを用いて細胞壁を融解させる必要があるため、時間と手間がかかっていた。そこで細胞壁を有する株を簡便に形質転換するために、NEPAGENE社のエレクトロポレーターの条件を検討し、細胞壁がある株に直接エレクトロポレーションする場合でも、形質転換効率0.025%で薬剤耐性株が得られる系を確立した。三次元トラッキング顕微鏡の一次データとして得られる1/1,000秒ごとのクラミドモナスの位置(x,y,z)情報と画像に対して、定量的に解析できるプラットフォームを作成できたため。細胞壁を持つクラミドモナスに関してエレクトロポレーションにより簡便に形質転換できる系を確立し、また鞭毛遺伝子のノックダウン解析とトラッキング顕微鏡の観察を組み合わせた方法が、鞭毛運動の協調が損なわれた新奇な変異株の単離に有効であることが示されたため。遺伝子タギングにより順遺伝学的に変異株を作出し、鞭毛運動の定量解析を行う。Tail PCR法及びinverse PCR法により、それらの変異株の原因遺伝子を同定する。また20種類程度の鞭毛関連遺伝子について、引き続きamiRNAによる変異株の作出を行い、トラッキング顕微鏡を用いた鞭毛運動の定量化を行う。細胞壁を持つクラミドモナスの形質転換系をさらに改良し、0.1%の形質転換効率を持つ系を確立する。24年度の研究費で、顕微鏡観察に必要なハード・ソフトウェアが準備できたため、25年度では主にクラミドモナスを用いた遺伝子操作に必要な経費を使用する予定である。
対面する複数モバイルユーザ間の直感的かつ効率的データ交換手法

カメラ付きモバイル機器を用いて撮影した写真データを,その場で効率的に周囲の複数のモバイル機器に送信するために,送信側のモバイル機器のカメラの撮影範囲に受信側のモバイル機器のディスプレイを収め,送信側がシャッタボタンを押すことで,データを送信する手法を提案した.なお,受信側のディスプレイには各機器固有の2次元画像パターンを提示し,送信側が受信側機器を特定できるようにした.評価実験の結果,提案手法は従来手法に比べて,複数の受信側モバイル機器をより効率的に選択でき,その操作方法の学習も容易であることがわかった.カメラ付きモバイル機器を用いて撮影した写真データを,その場で効率的に周囲の複数のモバイル機器に送信するために,送信側のモバイル機器のカメラの撮影範囲に受信側のモバイル機器のディスプレイを収め,送信側がシャッタボタンを押すことで,データを送信する手法を提案した.なお,受信側のディスプレイには各機器固有の2次元画像パターンを提示し,送信側が受信側機器を特定できるようにした.評価実験の結果,提案手法は従来手法に比べて,複数の受信側モバイル機器をより効率的に選択でき,その操作方法の学習も容易であることがわかった.提案手法を実装するための詳細仕様を決定し,試作システムを作成した.試作システムの主要部分は通信部と認識部の2つに大別できる.通信部は他のモバイル機器との通信を処理する部分であり,UDPによるブロードキャストとTCP/IPによるサーバ-クライアントモデルを使用した.一方,認識部はデータ受信側からデータ送信側に固有のパターンを提示することによって受信モバイル機器の識別を行う部分である.この受信側から送信側に提示するパターンとして赤外線LEDの点滅とディスプレイに提示する2次元画像パターンとの2種類を検討した.これらはいずれも現行のモバイル機器に備わっているデバイスによって実現可能な方法である.赤外線LED点滅パターンによる認識は,屋内での利用は可能であったが,日中の屋外において,太陽光と赤外線LEDの発光とが区別できず,機器の識別が困難であった.本研究では,受信側のディスプレイに2次元の画像パターンを表示し,送信側のカメラがとらえた画像中からこの画像パターンを検出することによって受信する機器を認識する手法を採用した.また,送信側で画像パターンを検出すると,送信側のディスプレイ上の検出した位置に色の付いた立方体を重ねて表示し,現在どの機器が認識されているかを明示した.システム試作には,ARToolKitが持つ画像認識を用いた.システムの評価には解像度が1024×600[pixel]であるVAIO Uを用いた.表示したパターンの大きさは1辺5.8[cm]の正方形であった。実用化を想定し,試作システムを屋外で使用したところ,ディスプレイに太陽光が差し込み,画像パターンを認識することができないことがあった.しかし,受信側のディスプレイに光が入りこまないようにすると,約3[m]の距離で認識することができた.さらに,屋内での使用を試した結果,同様の距離で複数台の認識も可能であった.1.片手による効率的なメモ入力が可能な手法として人差し指の一筆書き動作を用いた文字入力手法を提案し,その有用性を実験により評価した。実験の結果,提案手法で取ったメモはある程度読むことができ,携帯電話のメモ機能より速く入力できることがわかった.ただし,入力のしやすさでは,提案手法,手書きのメモ帳,携帯電話のメモ機能の間で有意な差は見られなかった,また,筆跡再生機能やメモを取った状況を提示することにより,メモの判読率が向上する可能性があることがわかった.さらに,提案手法は練習を積むことにより,メモを正しく読むことができるようになる可能性が見られた2.携帯端末によるWebページ閲覧時において,利用者が把持する携帯端末の動きを入力に利用することにより,Webページの閲覧を効率的に行う手法を提案した.提案手法では,携帯端末の画面をカメラのファインダーに,またWebページを被写体に見立て,携帯端末を上下左右方向,また奥もしくは手前方向に移動させることにより,画面に表示されるWebページの位置の調整すなわちズームとスクロールを行う.このように,提案手法では,ズームとスクロールの並行実行を可能にすることにより,Webページの閲覧を効率的に行うことが期待される.従来手法であるGUI手法とD&P手法との比較実験を行った結果,タスク達成時間や主観評価の結果は従来手法と変わらないものの,従来手法よりも少ない操作数で操作を行えることが示唆された.ただし,並行実行が十分に行われていない可能性が示された携帯電話やPDAなどのカメラ付きモバイル機器を用いて撮影した写真のデータをその場で他のモバイル機器に送信する場合,現状では赤外線通信あるいは電子メールを利用することが考えられるが,モバイル機器の数だけ送信を繰り返したり,複数のモバイル機器を選択したりするのに手間がかかる.本研究では,撮影したその場で効率的に周囲の複数のモバイル機器に写真データを送信するために,送信側のモバイル機器のカメラの撮影範囲に受信側のモバイル機器を収め,送信側がシャッタボタンを押すことで,受信側のモバイル機器にデータを送信するという手法を提案する.なお,受信側のディスプレイに各受信側機器固有の2次元画像パターンを提示し,これを送信側のモバイル機器のカメラでとらえることにより送信側が受信側機器を特定できるようにした.評価実験の結果,提案手法は従来手法に比べて,複数の受信側モバイル機器をより効率的に選択でき,その操作方法の学習も容易であることがわかった.また,さらに以下の研究成果も得られた.1.モバイル機器を用いてテキストと図表が混在した電子書籍を効率的に閲覧するために,各図表とテキストを独立して拡大あるいは縮小する手法を提案した従来手法との比較評価実験の結果,操作時間は低減されなかったが,操作数は低減されることが分かった.

2.図表を含むドキュメントをモバイル機器上で効率的に閲覧するために,参照される図表を参照元の文章の近くに重畳して表示する図表表示用ウインドウ内に表示することによって,交互参照を効率的に行う手法を提案した.実験により,提案手法の操作は効率的であり,ユーザによる主観評価においても高い評価を得ることが出来た.
COX-2阻害剤による肝細胞癌のアポトーシス誘導と血管新生抑制

平成11年度は、肝癌細胞においてCOX-2阻害剤(NS398)によるアポトーシスおよびVEGF産生抑制効果を検討したが、有意な結果が得られなかった。しかしながら、NS398は肝癌細胞の増殖を有意に抑制することが明らかになった。さらに本研究遂行中、NS398が核内リセプターPPARγのリガンドになりうることが示されたため(J Biol Chem,1999)、PPARγリガンド(troglitazone)による肝癌細胞の増殖抑制機構に焦点を当て、研究を継続した。平成12年度は、まずPPARγの活性化によって、肝癌細胞はG1期で停止(G1 arrest)することをFlow Cytometryにより明らかにした。G1arrestが誘導された細胞株では、種々の細胞周期制御蛋白のうち、p21の発現増強を認めた。p21はmRNAレベルでも発現が増強していた。さらにp21発現増強に引き続くCDK2の活性低下とpRbの低リン酸化も認めた。しかし、pRb-deficient細胞でもG1 arrestを認めたことから、troglitazoneによるG1 arrestは必ずしもpRbの低リン酸化を介さないことが示唆された。また、興味深いことにpRb-deficient細胞ではp27の細胞内蓄積を認めた。troglitazone処理された肝癌細胞の超微形態学的検討では、ミトコンドリア内にelectron dense bodyを認めたが、明らかなアポトーシスの所見は見られなかった。血管新生因子VEGFの産生についても検討したが、mRNAレベルでは減少していたものの(DNA microarrayによる検討)、培養上清中のVEGF濃度は上昇しており(高感度ELISA;東亜合成)、VEGFの分解抑制による上昇が考えられた。平成11年度は、種々の肝癌細胞株について以下の検討をおこなった。1)COX-2蛋白およびmRNA発現の検討、2)NS398(選択的COX-2 inhibitor)による増殖抑制、3)培養上清中のPGE2測定、4)NS398によるアポトーシス誘導、5)培養上清中のVEGF量の評価と、NS398によるVEGF産生量の変化。その結果、RT-PCRではCOX-2mRNAの発現を認めたが、Western blotではCOX-2蛋白の発現は認められなかった。しかし、間接蛍光抗体法(共焦点レーザー顕微鏡で観察)により、主として粗面小胞体に局在するCOX-2蛋白を検出した。NS398による肝癌細胞の増殖抑制を濃度依存性に認めたが、培養上清中のPGE2は変化しなかった。従って、NS398にはCOX-2活性に依存しない増殖抑制のメカニズムがあると考えられた。ごく最近、NSAIDは核内レセプターの一種であるPPARのリガンドになりうるとの報告がなされた。NS398が示した増殖抑制効果は、PPAR経由ではないかと考えられる。また、アポトーシスに関しては、NS398の添加により、核内DNAの断片化およびcaspase3の活性化は認められず、アポトーシス誘導はおこらなかったと結論した。一方、肝癌細胞が分泌するVEGFは、NS398により有意な産生の抑制を受けなかった。低酸素状態にしVEGFの産生を刺激した状態でNS398を添加しても、VEGFの産生量には変化を認めなかった。その理由として、1)肝癌細胞ではCOX-2の発現量がもともと少ないため、COX-2活性をNS398で抑制してもVEGFの変化に有意な差が出ない、2)大腸癌などと異なり肝癌では、VEGFの産生はCOX-2によりregulateされていないことが考えられた。平成12年度の研究においては、主としてPPARγリガンドによる肝癌細胞の増殖抑制機序の解明をおこなった。

その理由として平成11年度の報告書で述べたように、肝癌細胞ではCOX-2阻害剤(NS398)による有意なアポトーシスおよびVEGF産生抑制効果を認めなかったためである。しかしながら、NS398は肝癌細胞の増殖を有意に抑制した。さらに本研究遂行中、NS398が核内リセプターPPARγのリガンドになりうることが示されたため(J Biol Chem,1999)、PPARγリガンド(troglitazone)による肝癌細胞の増殖抑制に焦点を当て、研究を継続した。まずFlow Cytometryにより、troglitazoneは肝癌細胞にG1 arrestを誘導することを明らかにした。G1arrestが誘導された細胞株では、種々の細胞周期制御蛋白のうち、p21の発現増強を認めた。p21はmRNAレベルでも発現が増強していた。さらにp21発現増強に引き続くCDK2の活性低下とpRbの低リン酸化も認めた。しかし、pRb-deficient細胞でもG1 arrestを認めたことから、troglitazoneによるG1 arrestは必ずしもpRbの低リン酸化を介さないことが示唆された。また、興味深いことにpRb-deficient細胞ではp27の細胞内蓄積を認めた。troglitazone処理された肝癌細胞の超微形態学的検討では、ミトコンドリア内にelectron dense bodyを認めたが、明らかなアポトーシスの所見は見られなかった。血管新生因子VEGFの産生についても検討したが、mRNAレベルでは減少していたものの(DNA microarrayによる検討)、培養上清中のVEGF濃度は上昇しており(高感度ELISA;東亜合成)、VEGFの分解抑制による上昇が考えられた。
プラスミドR64の接合伝達遺伝子群の解析

接合伝達は、細菌細胞種内、種間の遺伝物質の移行に関与しており、細菌における遺伝物質の交換ひいては進化を考察する上で重要な過程である。R64の接合伝達領域(54kb)には49個の遺伝子の存在する。各遺伝子の機能を調べるため、全遺伝子に挿入または欠失変異を導入して接合伝達に対する影響を調べた。表面接合伝達には24個の遺伝子が必須であり、液内接合伝達にはさらに12個の遺伝子が要求されることが明らかになった。pnd遺伝子はプラスミドの安定保持に関与する。多数の遺伝子産物がマキシセル法等で検出された。液内接合伝達にのみ要求される12遺伝子はR64細線毛の産生に必要である。細線毛を精製して調べた結果、R64細線毛はpilS,pilV遺伝子産物から構成されていることが明らかになり、R64細線毛がIV型線毛に属することが推定された。pilS産物は22kDタンパクとして合成され、pilU産物の機能により、19kDピリンにプロセスされる。多数のpilS突然変異を分離しpilS遺伝子産物の構造と機能の関係を調べた。R64シャフロンのDNA再編成はpilV遺伝子のC-末端部を変換させ、液内接合伝達における受容菌の特異性を決定する。大腸菌K-12、サルモネラ菌rfa変異株を受容菌とした実験や、大腸菌B株にK-12株由来のrfa遺伝子を導入して受容菌とした実験から、pilVタンパクに対する受容体は細菌のリポ多糖コアであると推定された。シャフロンの組換え酵素rci遺伝子を大量発現させ、その産物を精製し、Rciタンパクを用いた試験管内DNA組換え反応に成功した。2個のR64 oriT配列を直列に持つプラスミドを作成した。プラスミドの伝達によるoriT配列間を欠失する組換え現象が発見された。また供与菌中でのrecA非依存でnikAB依存の、伝達によらない欠失も認められた。我々はすでに、R64の接合伝達領域(54kb)の全塩基配列を決定し、49個のORFの存在を確認している。各遺伝子の機能を解明するため、49個の全遺伝子に挿入または欠失変異を導入して接合伝達に対する影響を調べた。その結果、表面接合伝達には23個の遺伝子が必須であり、液内接合伝達にはさらに12個の遺伝子が要求されることが明らかになった。液内接合伝達にのみ要求される12遺伝子はR64の細線毛をコードしていたので、R64誘導プラスミドを持つ大腸菌から細線毛を精製した。精製細線毛には48,21kDaの2種のタンパクが検出された。48kDaタンパクは、抗PilV抗体と反応し、pilV遺伝子の産物であると推定された。21kDaのタンパクはpilS遺伝子の産物で、細線毛の主成分-ピリン-である。以上の結果、シャフロンのDNA再編成は、細線毛の構成成分をコードするpilV遺伝子のC-末端部を変換させることにより、液内接合伝達における受容菌の特異性を決定すると結論した。また、pilS遺伝子産物は23kDaタンパクとして合成され、pilU遺伝子産物の作用により21kDaタンパクにプロセスされると推定した。

oriTオペロンに関してはnikA遺伝子の各種変異株を作成して、oriTとの相互作用を解析した結果、nikA遺伝子内のDNA総合ドメインを推定した。また、oriT配列に各種変異を導入し、oriT活性とNikAタンパク結合とに及ぼす影響を調べた。rci遺伝子に関しては、多数の変異株を作成して構造と機能の関係を調べるとともに、T7プロモーター系を用いた大量発現系の作成に成功した。なお、備品として購入したローターは細線毛の精製に使用した。接合伝達は、細菌細胞種内、種間の遺伝物質の移行に関与しており、細菌における遺伝物質の交換ひいては進化を考察する上で重要な過程である。R64の接合伝達領域(54kb)には49個の遺伝子の存在するが、その機能を解明するため、全遺伝子に挿入または欠失変異を導入して接合伝達に対する影響を調べた。その結果、表面接合伝達には24個の遺伝子が必須であり、液内接合伝達にはさらに12個の遺伝子が要求されることが明らかになった。液内接合伝達にのみ要求される12遺伝子はR64細線毛の産生に関与している。細線毛のタンパク成分を電気泳動で調べた結果、細線毛はpilS,PilV遺伝子産物から構成されていることが明らかになり、pilS,pilVの構造から、R64細線毛がIV型線毛に属することが推定された。PCR法で多数のpilS突然変異を分離しpilS遺伝子産物の構造と機能の関係を調べた。またpilQ遺伝子を大量に発現させ、その産物を精製した。現在その抗体を作成中である。R64では、シャフロンのDNA再編成でpilV遺伝子のC-末端部を変換させ、液内接合伝達における受容菌の特異性を決定する。受容菌にはpilVタンパクに対する受容体が想定される。大腸菌K-12株rfa変異株を受容菌とした実験や、大腸菌B株にK-12株由来のrfa遺伝子を導入して受容菌とした実験から、pilV受容体は細菌のリポ多糖であると推定された。シャフロンの組換え酵素をコードするrci遺伝子を大量発現させ、その産物を精製した。シャフロン部位を持つプラスミドDNAを基質とし、精製Rciタンパクを用いて、試験管内でのDNA組換え反応に成功した。2個のoriT配列を直列に持つプラスミドを作成し、可動化実験を行ったところ、プラスミドの伝達によるoriT配列間を欠失する組換え現象が発見された。さらに供与菌中でのnikeAB遺伝子に依存した、伝達によらない欠失も認められた。R64の接合伝達領域(54kb)には49個の遺伝子の存在する。全遺伝子に挿入または欠失変異を導入して接合伝達に対する影響を調べ、表面接合伝達には24個の遺伝子が必須であり、液内接合伝達にはさらに12個の遺伝子が要求されることが明らかになった。細線毛を精製して調べた結果、R64細線毛はpiIS,piIV遺伝子産物から構成されていることが明らかになり、R64細線毛がIV型線毛に属することが推定された。多数のpiIS突然変異を分離しpiIS遺伝子産物の構造と機能の関係を調べた。シグナル配列の切断に欠損を持つpiIS変異や、伝達活性の低下したpiIS変異が分離された。R64