hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
定量的な組織性状マッピングに基づくヒト骨格筋の可塑性評価と運動療法の基盤形成

したがって,股関節の深い屈曲位での著明な弾性増加は筋損傷に関与する大内転筋後部線維の受動張力発生を示す可能性がある.さらに,前十字靱帯再建術後症例を対象に膝蓋腱採取後の受動的な腱弾性変化を検討した結果,健側および患側の腱内外側部は,膝関節屈曲に伴い弾性率の増大がみられたが,患側の中央部は屈曲に伴う明らかな弾性変化を認めなかった.したがって腱採取部の力学特性は,術後6ヶ月では回復しない可能性がある。このような患側における膝蓋腱の弾性分布が健側と異なったことは,術後早期における腱組織の力学負荷パターンの変化を示唆し,術後合併症の病態に関する基礎的知見になると推察される.ヒト生体における骨格筋の定量的な性状評価法の確立に向けて,組織弾性を規定する要因の解明は継続した検討が必要であるものの,剪断波エラストグラフィ法を用いた臨床応用の可能性を探る検証はほぼ予定通り遂行できている為.本年度は,ヒト筋腱組織の可塑性評価および筋損傷の機序解明や運動療法の基盤形成にむけて,定量的な組織性状評価の臨床的意義確立に関わる実験をおこなった.アキレス腱縫合術後の症例を対象に,安静時の縫合腱スティフネスおよび腓腹筋の等尺性最大随意底屈時スティフネスを剪断弾性率から評価した.その結果,アキレス腱縫合術後の回復過程において,腱組織と筋組織の機械的特性の推移は異なる可能性が示された.足関節底屈トルクの低下は腓腹筋発揮張力を必ずしも反映しないこと,関節スティフネスの回復は腱の機械的特性の回復過程と対応しないことが示唆された.また,手指の巧緻動作に強く関与し,筋組織の拘縮に深く関与する手内在筋の受動的な弾性特性を評価した.その結果,手内在筋の受動張力はMP関節伸展・IP関節屈曲で増加することが示された.また,MP関節伸展に伴う弾性係数の増加率は虫様筋の方が高かったことから,筋の受動張力は骨間筋よりも虫様筋の方が高い傾向にあると推察された.さらに,他動運動における大腿直筋の弾性特性に筋内部位差が存在するかを検討した.その結果,股関節0°条件,股関節90°条件ともに膝関節の屈曲運動時において近位部が中央部,遠位部よりも有意に高値を示した.膝屈曲位に伴う受動的な弾性増加は部位間で異なるパターンを示すことから大腿直筋の受動張力には筋内部位差が存在する可能性が示唆された.サッカー選手において筋損傷に関係する長内転筋,大腿二頭筋,下腿三頭筋における筋スティフネスの特徴を検討した.その結果,長内転筋では伸長位において左が有意に高値を示し,一方で他の3筋では左右差を認めなかった.長内転筋の他筋と異なる力学的特性はサッカー選手に特徴的な股関節内転筋損傷の発生メカニズムと関連している可能性がある.骨格筋の機械的な特性を反映する性状の把握は,病態解明や理学療法プログラムの考案に有用である.本研究は最新超音波技術を用いて筋弾性を可視化・定量化し,弾性評価の妥当性や機能的な意義および臨床応用の可能性を検討することを目的とした.その結果,皮膚や筋膜の存在や筋線維の配向が弾性計測に影響を与えることが明らかになった.また,関節運動時の弾性変化を測定することで,筋張力発揮を推定できる可能性および運動療法や外科的治療による筋組織性状の可塑的な変化を評価できることが示された.骨格筋の定量的な性状評価法の確立に向けて,組織弾性における筋内の空間分布の可視化・定量化は継続した検討が必要であるものの,超音波法による筋弾性計測の妥当性や臨床応用の可能性を探る検証はほぼ予定通り遂行できている為.今後は,骨格筋の組織弾性評価に基づいた運動療法の基盤形成や運動器障害の病態解明に繋がる臨床応用の可能性を探る予定である.また,関節スティフネス・関節トルクおよび筋伸長や活動特性と羽状筋の弾性特性の関連性を分析することにより,継続的に筋性状評価の機能的意義を検討してゆく.
歯周病における生体防御反応への歯肉上皮細胞の関与

分泌型白血球蛋白分解酵素阻害物質(SLPI)とIL-1 receptor antagonist(IL-1ra)の産生を歯肉上皮細胞を中心に検討するとともに、歯周病患者歯肉溝滲出液(GCF)中におけるSLPIとIL-1raの動態について検討した。まず、培養歯肉角化細胞を用いてSLPIの産生を検討するとともに、GCF中におけるSLPIの動態について検討した。その結果、酵素抗体法により、細胞内や細胞表面にSLPIが存在することが確認された。さらに、GCF中に含まれるSLPI量、α1-protease inhibitor(α1-PI)量、好中球elastase(NE)活性を測定した。その結果、歯周病罹患部位のSLPI量、α1-PI量、NE活性は臨床的健康部位に比べて有意に上昇しており、プロービング深さと有意な正の相関があった。さらに、α1-PI量、NE活性は臨床的付着レベルと有意な正の相関があった。これらの結果から、SLPI量、α1-PI量、NE活性は歯周組織の炎症と密接に関連していることが示された。次に、培養歯肉角化細胞を用いて、培養上清および細胞1ysate中のIL-1α、IL-1βおよびIL-1ra濃度を測定した。また、IL-1α、細胞内型IL-1raのmRNAの発現を検討した。さらに、臨床的健康歯肉組織と炎症歯肉を採取し、免疫組織化学的にIL-1αとIL-1raの発現を検討した。その結果、細胞内、培養上清中にIL-1α、IL-1raの産生が認められ、TNF-αの刺激下では細胞内のIL-1αの産生が有意に上昇したが、IL-1raの産生は変化しなかった。RT-PCRの結果から、IL-1αmRNAおよび細胞内型IL-1ramRNAの発現が、TNF-α刺激下で増加した。免疫組織化学的には、臨床的健康歯肉と炎症歯肉の上皮層には強いIL-1raの発現が認められたがIL-1αの発現は認められなかった。これらの結果から、歯肉上皮細胞はL-1の作用を調節するため、IL-1raを常に産生していることが示された。臨床的に健康な歯周組織を有する被験者から下顎智歯を抜去する際に角化歯肉を採取し、Keratinocyte-SFM^<TM>で培養した3代目の歯肉角化細胞を実験に使用した。TNF-α(0、10ng/ml)添加の培地で8時間培養した細胞より培養上清および細胞1ysateを調製し、ELISA法を用いて培養上清および細胞lysate中のIL-1α、IL-1βおよびIL-1ra濃度を測定した。次に、TNF-α〔0、10ng/ml〕添加の培地で4時間、8時間培養した歯肉角化細胞から、全RNAを抽出し、RT-PCRを用いて、IL-1α、細胞内型IL-1raのmRNAの発現を検討した。さらに、臨床的に健康な歯肉組織と炎症歯肉を採取し、凍結切片を作製した後、免疫組織化学的に歯肉上皮組織中のIL-1αとIL-

1raの発現を検討した。その結果、細胞内、培養上清中ではIL-1βよりIL-1αが量的に多く産生された。さらに、細胞内、培養上清中にIL-1α、IL-1raの産生が認められ、TNF-αの刺激下では細胞内のIL-1α、IL-1βの産生が有意に上昇したが、IL-1raの産生は変化しなかった。RT-PCRの結果から、IL-1αmRNAおよび細胞内型IL-1ra mRNAの発現が、無刺激の状態と比べ、TNF-αの4時間、8時間の刺激下で増加した。免疫組織化学的には、臨床的に健康な歯肉と炎症歯肉の上皮層には強いIL-1raの発現が認められがIL-1αの発現が認められなかった。以上のことから、歯肉上皮細胞はIL-1の作用を調節するため、IL-1raを常に産生していることが考えられる。培養歯肉上皮細胞を用いて分泌型白血球蛋白分解酵素阻害物質(SLPI)の産生を検討するとともに、歯周病患者歯肉溝滲出液(GCF)中におけるSLPIの動態について検討した。まず、採取した臨床的健康歯肉から歯肉上皮細胞の分離、培養を行った。酵素抗体法により、培養上皮細胞内や細胞表面にSLPIが存在することが確認された。次に、成人性歯周炎患者15名(男性7名、女性8名、平均年齢50.9歳)を対象として、被検部位30部位に対して臨床的診査ならびにDNAprobeによる細菌検査を行い、歯周病罹患部位と臨床的健康部位を各々15部位ずつ選択した。被験部位から採取したGCFの量をペリオトロンにて計測したのち、GCF中に含まれるSLPI量、α1-protease inhibitor(α1-PI)量をsandwich ELISA法で測定し、好中球エラスターゼ(NE)活性をS-2484試薬を基質として測定した。その結果、SLPI量、α1-PI量、NE活性は歯周病罹患部位が臨床的健康部位に比べて有意に上昇しており、プロービング深さと有意な正の相関があった。さらに、α1-PI量、NE活性は臨床的付着レベルと有意な正の相関があった。以上のことからSLPI量、α1-PI量、NE活性は歯周組織の炎症と密接に関連していると考えられるが局所から産生されるSLPIについては明確な結果が得られなかった。また、歯周病罹患部位では阻害物質が多量に検出されているにも関わらず、NE活性を制御することが出来ないことが示された。今後、阻害物質を不活性化する要因について検討する必要がある。
植物における亜鉛とオーキシン

まず、不安定かつ微量なインドール酢酸(IAA)を低い損失率で、しかも出来るだけ他の成分を含まない状態で集め、定性・定量することについて、種々検討を重ねた結果以下の方法が有効なことが判明した。ついで、本法により、ハツカダイコン幼植物中の結合型IAA(1M-MaOH、室温、1時間加水分解)含量の化学的定量を行った。その結果、亜鉛欠乏区の結合型IAA含量は遊離IAA含量と同様、対照区のそれらと大差が無いことが判明した。一方、水稲を供試し、種々な亜鉛栄養下でオーキシンによるカルスの誘導形成について調べ興味深い結果が得られた。すなわち、高濃度オーキシン下で、誘導形成されるカルスの量は、亜鉛量とほぼ正比例関係があることが認められた。さらにこれらの結果を総合し、"植物における亜鉛は、オーキシンの生理活性発現に密接な関係がある"との仮説を考えるに至った。細菌、オーキシン結合蛋白質やジンクフインガー蛋白質の存在が報告され、注目を集めている。これらの蛋白質の発見と我々の作業仮説を関連ずけて考えるとき、亜鉛の生理機能解明に、ますます興味がわく。まず、不安定かつ微量なオーキシン(IAA)を低い損失率で、しかも出来るだけ他の成分を含まない状態で集めることについて、種々検討を重ねた結果以下の方法が有効なことが判明した。ついで、本法により、ハツカダイコン幼植物中の結合型IAA(1N-NaOH、室温、1時間加水分解)含量の化学的定量を行った。これらの結果を総合し、"植物における亜鉛は、オーキシンの生理活性発現に密接な関係がある"との仮説を考えるに至った。最近、オーキシン結合蛋白質やジンクフインガー蛋白質の存在が報告され、注目を集めている。ついで、本法により、ハツカダイコン幼植物中の結合型IAA(1M-NaOH、室温、1時間加水分解)含量の化学的定量を行った。
ウイルス粒子中の宿主蛋白質

ウイルスの病原性を考える上で、ウイルスと宿主細胞との相互作用を分子レベルで明らかにすることが重要である。ウイルスの病原性に関わる宿主因子(蛋白質)をどのように探し出すかが大きな問題であるが、本研究ではウイルス粒子に取り込まれる宿主蛋白質に着目した。ウイルスの粒子形成過程で偶然(意味なく)取り込まれる宿主蛋白質以外に、ウイルス成分との特異的な相互作用の結果取り込まれる宿主蛋白質があるのではないかと発想した。狂犬病ウイルスをモデルとして、そのウイルス粒子に取り込まれる宿主蛋白質を同定し、ウイルス成分との相互作用の有無を調べた。この結果、(1)常在性の熱ショック蛋白質70(HSC70)、(2)膜裏打ち骨格成分の重要成分のひとつであるERM、(3)免疫や細胞接着で重要な働きをしていると考えられているCD99のホモログがウイルスに取り込まれることが明らかとなった。ウイルス成分との関係解析から;(4)ERMはウイルスエンベロープ蛋白質と結合している。(5)CD99のホモログはウイルス膜蛋白質と同程度の効率ウイルス粒子に濃縮される。(6)同定したいづれの宿主蛋白質もウイルス感染にともない異常な分布を示すようになり、その分布はウイルスエンベロープ蛋白質と密接な関係にある。今後、ウイルスの病原性との関わりを調べる必要があるが、ウイルス粒子に取り込まれる宿主蛋白質を研究することはウイルス成分と相互作用(結合)する宿主因子を見つけ出すひとつの$有効な方法であると考えられる。1)狂犬病ウイルスの膜骨格撹乱作用とウイルス粒子形成狂犬病ウイルスの膜蛋白質はERM(エズリン、ラディキシン、モエシン)と結合している。ERMとアクチン線維は協同して細胞膜の突起(マイクロビライなど)形成など、膜骨格成分として重要な働きをしている。狂犬病ウイルス感染培養細胞ではマイクロビライが消失し、代わって小胞構造が細胞表面に現われた。この現象はERMとアクチン繊維を中心とする膜骨格を乱す作用がウイルスに備わっていることを示す。では何故、宿主細胞の膜骨格を乱す必要があるのか。この意味を考えるために人為的にアクチン線維を壊してみた(サイトカラシンBを用いた)。すると、ウイルス形成は抑制されず、かえって促進されることが明かとなった。膜表面分子のあるものは膜直下の骨格成分により自由な動きを制限されているが、ウイルス膜蛋白質と雖この原理から逃れるものではない。そこで細胞膜上でのウイルス粒子集合過程の制限因子たる膜骨格構造を壊す必要性が考えられる。2)狂犬病ウイルスに効率よく取り込まれる宿主(ハムスター細胞BHK)蛋白質の同定ウイルスに効率よく取り込まれる2つの宿主蛋白質を解明した。興味あることに、いずれの蛋白質も感染にともない細胞表面での分布が大きく変化する。この観察はこれらの宿主蛋白質とウイルスの病原性との関係を考えるとき重要である。そのうちの一つは人間のCD99(MIC2遺伝子産物)と構造的によく似たハムスターの膜蛋白質であった。齧歯類ではCD99の存在は現在まで不明であった。CD99と宿主の感染防御機能との関わりを研究するうえでこの発見は重要である。もう一つは新規のものであった。

この結果、(1)常在性の熱ショック蛋白質70(HSC70)、(2)膜裏打ち骨格成分の重要成分のひとつであるERM、(3)免疫や細胞接着で重要な働きをしていると考えられているCD99のホモログがウイルスに取り込まれることが明らかとなった。ウイルス成分との関係解析から;(4)ERMはウイルスエンベロープ蛋白質と結合している。(5)CD99のホモログはウイルス膜蛋白質と同程度の効率ウイルス粒子に濃縮される。(6)同定したいづれの宿主蛋白質もウイルス感染にともない異常な分布を示すようになり、その分布はウイルスエンベロープ蛋白質と密接な関係にある。今後、ウイルスの病原性との関わりを調べる必要があるが、ウイルス粒子に取り込まれる宿主蛋白質を研究することはウイルス成分と相互作用(結合)する宿主因子を見つけ出すひとつの$有効な方法であると考えられる。
有毛細胞の音受容に関与するアクチン関連蛋白と遺伝性難聴DFNA20/26の研究

モルモット蝸牛試料を界面活性剤で脱膜処理後に細胞質可溶性成分を除外して電界放射型走査電子顕微鏡により観察し、従来に無い広い範囲での不動毛細胞骨格の超微細構造の観察を可能にした。音受容に関係する有毛細胞不動毛のアクチンおよび関連蛋白分子の三次元的配列を明らかにした。加えて細胞外カルシウム濃度によるそれらの構造の変化を明らかにした。(1)細胞の剛性、細胞間の接着に関与する細胞骨格蛋白・アクチンに結合するアクチン関連蛋白のうち、Focal adhesion kinaseの蝸牛での局在を免疫組織化学法により初めて得た。加えて、アクチンを裏打ちとして細胞-細胞外基質を係留する膜貫通蛋白であるβ1-lntegrinが内耳蝸牛の血管条に発現することを明らかにした。これらの蛋白が有毛細胞を含む蝸牛の形態形成と保持に重要な役割を担っていることが示唆された。(2)研究計画に従い英国キール大学のFurness博士のグループと連携し、蝸牛試料を界面活性剤で脱膜処理後に細胞質可溶性成分を除外して凍結割断する簡便な方法を考案し、従来に無い広い範囲での超微細構造の観察を可能とした。この方法により、モルモット内耳のアクチン分子の三次元的配列を、有毛細胞を含む広い範囲で電界放射型走査電子顕微鏡により観察し得た。この試料の中でさらに、聴覚に重要な有毛細胞の機械電気変換(mechanoelectrical transduction)に関与する不動毛間架橋構造を同定し得た。この観察手法は次の段階でFocal adhesion kinaseおよびβ1-Integrinの局在を電子顕微鏡レベルの免疫組織化学で詳細に検討するために重要な基礎となると考えられる。界面活性剤で脱膜化した内耳有毛細胞不動毛の微細構造を電界放射型走査電子顕微鏡により高倍率・高解像観察することにより、有毛細胞の機械電気変換機能との関与が示唆されている不動毛間架橋構造(tip-link)と細胞膜裏打ち構造との構造的関係を明らかにした。Tip-linkの両端、すなわち短い不動毛の頂上と隣の長い不動毛の側面には脱膜処理でも失われることのない径約50ナノメートルの円盤型構造があり、不動毛の細胞骨格であるアクチン細糸と連絡していた。頂上側の構造は、先駆研究によって明らかにされているキャッピング蛋白であることが類推され、また側面側の構造はアクチン細糸上を動くミオシン分子ないしはカドヘリンの係留蛋白を含むことが示唆された。これらの構造が今後免疫組織化学的に証明されるならば、今回の観察結果は有毛細胞レベルでの音受容機構の解明とアクチン分子に関係する遺伝性難聴の病因解明の足がかりになると期待される。内耳有毛細胞の機械電気変換機能は細胞外カルシウム濃度に依存し、単離された有毛細胞はカルシウムフリー緩衝液中では機械電気変換機能を失うことが報告されているが、今回、固定前にカルシウム濃度を変えた状態の組織を観察し、tip-linkの長さが変化すること、ないし消失する所見を明らかにした。このことは内耳有毛細胞のtip-linkが内耳の音受容に重要な役割を果たしていることを示唆した。研究成果は英国キール大学のFurness博士と共著で神経科学領域の国際誌Neuroscienceに発表した。
化学的刺激により誘発される実験的歯髄炎に伴う抹消並びに中枢神経系の応答性の変化

本研究で明らかになった研究実績の概要は以下の通りである。ネコ下歯槽神経の電気刺激に対してスパイク応答する頸髄ニューロンは,同側下顎犬歯歯髄へのmustard oil適用による侵害性化学的条件刺激により修飾を受け,化学物質歯髄適用1020分後に最大興奮性を示すこと,およびこの一過性興奮が消退した後のnaloxoneの静脈内投与によりこのニューロンは再び興奮性を増大することが確認された。同ニューロンの皮膚受容野については,その応答特性並びに受容野の面積が変化した。この事実は,mustard oilによる歯髄の侵害性化学的条件刺激により,中枢神経系においては神経可塑的変化および内因性opioidを介する下向性抑制が生じていることを示唆している。週齢を異にするラットの上顎第一臼歯歯髄にmustard oilを適用し,その際に誘発される咀嚼筋筋電図上の筋活動を計測してみると,若い週齢のラット程誘発される筋活動の絶対値が大きいこと,誘発筋活動第2相の発現時刻(潜時)が週齢の増加とともに遅延すること,さらにこれらの筋活動の消退後にnaloxoneを静脈内に投与すると再び増大した筋活動が観察されることが確認された。この事実は,歯髄侵害性化学刺激により誘発される反射性咀嚼筋活動の発現には加齢的要素が関与していること,並びに内因性opioidを介する下向性抑制系が関与していることを示唆している。ネコ第2前臼歯に対する電気刺激あるいはmustard oilによる化学的刺激は,レーザードップラー血流計による同側同顎犬歯のは歯髄血流量の増大並びに象牙質電極から記録される歯髄内神経の活動性を増大させた。この事実は,複数歯の歯髄に分岐して分布する神経線維の存在と,それらを介した軸索反射が関与する歯髄内神経原性炎症の発症の可能性を示唆している。
神経細胞分化における転写動態の１分子イメージング解析

我々の研究グループが先駆けて構築した神経細胞における核内1分子イメージング解析の手法によって、神経活動依存的な転写因子動態を明らかにしてきたが、動態と生理的意義には不明な点が多く残されている。本研究ではこれまでの手法を発展させ、マウス及びヒト神経細胞において転写因子と特異的遺伝子座の相互作用、そこから産生される転写産物の量を1分子蛍光イメージングで同時に定量計測する。さらに、神経細胞分化におけるDNA脱メチル化を介した転写制御の動態解析をDNAポリメラーゼβに着目して進める。以上によって、核内分子動態から神経細胞分化・可塑性の原理・法則性を理解することを目指す。本年度は、(1)ヒト神経細胞での核内1分子イメージング解析を確立するために、ヒトiPS細胞から神経細胞を分化誘導する実験系を確立した。特に、大脳皮質神経細胞と同様の性質を持った細胞を得るために大脳オルガノイドの作製を試み、分子マーカーの時空間的発現が類似する神経細胞を確認することができた。(2)神経細胞分化過程でのDNA脱メチル化制御の動態を明らかにするために、その制御を受ける遺伝子群を特定することを試みた。DNAポリメラーゼβ欠損神経細胞を用いて次世代シーケンサーにより網羅的発現解析(RNAseq)を行い、候補遺伝子群を明らかにすることができた。さらに、定量RT-PCR法によってその中でもある遺伝子群においては、神経細胞が成熟しても継続して発現変化が観察されることから、DNA脱メチル化制御を受けている可能性が高いことが示された。(3)神経細胞分化におけるDNA脱メチル化制御においてDNAポリメラーゼβはゲノム安定性に不可欠であり、それが神経回路形成さらには学習・記憶といった脳機能の構築に繋がることを明らかにした。本研究成果に関して学会発表を行なった。当初の予定通り、実験はおおむね順調に進んでいる。その一方で、神経活動依存的転写産物の定量には至っていない。今後の研究の推進方策として、継続してmRNAを可視化できるマウス及びヒト細胞株を用いて神経活動依存的転写転写動態のイメージングを目指す。さらに、神経細胞分化におけるDNA脱メチル化機構を介したDNAポリメラーゼβの役割の解析を足がかりにエピジェネティック制御を含めた転写動態解析を進める。これまでの我々の研究グループが先駆けて構築した神経細胞における核内分子の1分子イメージング解析手法によって、神経活動依存的な転写因子動態を明らかにしてきたが、動態と生理的意義に不明な点が多く残されている。さらに、神経細胞分化におけるDNA脱メチル化を介した転写制御の動態解析を進める。以上によって、核内分子動態から繋がる神経細胞分化・可塑性の原理・法則性を明らかにすることを目指す。本年度は、(1)神経活動依存的遺伝子発現の動態を定量的に解析するため、最初期遺伝子Fosの遺伝子座にmRNAの可視化を可能にするMS2配列を3'非翻訳領域にCRISPR/Cas9法を利用したノックイン法でゲノムに挿入するためのベクターを構築した。(2)神経細胞分化過程でのDNA脱メチル化制御の動態を明らかにするために、DNA修復酵素DNAポリメラーゼβとタグタンパク質との融合タンパク質の発現ベクターを初代培養細胞に遺伝子導入した後にタグに特異的に結合する蛍光色素で標識し、斜光レーザー顕微鏡による観察を行った。核内に多数の動的な輝点を観察することに成功し、変異原物質によるDNA損傷や神経活動に対する応答性を調べた。(3)CRISPR/Cas9法によるマウス初代培養神経細胞での遺伝子破壊に関する研究論文を発表した。さらに、マウス神経前駆細胞におけるDNA脱メチル化機構にDNAポリメラーゼβが必要であることを明らかにした研究成果を研究論文として発表すると共に国内外の学会で発表を行った。その一方で、神経活動依存的遺伝子発現の動態解析を可能にするmRNA可視化細胞樹立のためのベクター構築は行ったものの、細胞株を得るには至っていない。また、予定していた神経活動依存なクロマチン構造変化が転写因子動態に及ぼす影響を調べる必要がある。

さらに、定量RT-PCR法によってその中でもある遺伝子群においては、神経細胞が成熟しても継続して発現変化が観察されることから、DNA脱メチル化制御を受けている可能性が高いことが示された。(3)神経細胞分化におけるDNA脱メチル化制御においてDNAポリメラーゼβはゲノム安定性に不可欠であり、それが神経回路形成さらには学習・記憶といった脳機能の構築に繋がることを明らかにした。本研究成果に関して学会発表を行なった。当初の予定通り、実験はおおむね順調に進んでいる。その一方で、神経活動依存的転写産物の定量には至っていない。今後の研究の推進方策として、mRNAを可視化できるマウス及びヒト細胞株の樹立を目指すと共に、これまでに解析を行ってきた転写因子CREBに加えて作製したDNA修復酵素DNAポリメラーゼβの動態解析をさらに進める。今後の研究の推進方策として、継続してmRNAを可視化できるマウス及びヒト細胞株を用いて神経活動依存的転写転写動態のイメージングを目指す。さらに、神経細胞分化におけるDNA脱メチル化機構を介したDNAポリメラーゼβの役割の解析を足がかりにエピジェネティック制御を含めた転写動態解析を進める。(理由)培養神経細胞に遺伝子導入を行い細胞株を樹立する実験を進める予定であったが、その実験が当初の予定よりもやや遅れていることから、それに予定していた費用を次年度で使用することとなった。(使用計画)実験を継続して行い、その経費・研究発表の旅費・研究成果の発表に充てる予定である。イメージング解析の実験を進める予定であったが、その実験が当初の予定よりも遅れていることから、それに予定していた費用を次年度で使用することとなった。実験を継続して行い、その経費・研究発表の旅費・研究成果の発表に充てる予定である。
新しい血管新性療法の応用による低侵襲軟部組織再健システムの開発

本研究の目的は、血管新生療法を応用した新しい低侵襲軟部組織再建法を開発することであり、以下のことがらについての研究成果を得た。(1)bFGF遺伝子を組み込んだ発現プラスミドDNAのIn vivo electroporation法によるskin flap直下の筋組織に対する遺伝子導入法の開発:ラット背部皮膚のaxial flapモデルを使用した。皮弁作成2日前にbFGF遺伝子を組み込んだ発現プラスミドをrecipient bedとなる筋組織内へ筋注し続いて電気刺激を加えた。7日後にbFGF遺伝子導入群において、対照群と比較して有意に皮弁への血流が改善し壊死の進行も抑えられた。(2)酸性ゼラチンハイドロゲル・マイクロスフィアー(AGHM)によるbFGFタンパク徐放システムを用いた方法の開発:上記と同じモデルを用いて、AGHMによりrecipient bed内へbFGFタンパクをデリバリーした。7日後の評価では、AGHMを用いた群が、直接bFGFを注射した群と比較して有意な皮弁の生着とrecipient bed内の血管新生の亢進を認めた。またその程度は、投与したbFGFの量が多い方がまさっていた。(3)高分子ミセル型ナノ・パーティクルによるラット背筋への遺伝子導入の試み:高分子ミセル型ナノ・パーティクルによる筋組織への遺伝子導入に関して検討した。ルシフェラーゼ遺伝子組み込んだ発現プラスミドをナノミセルに入れてラット背筋へ筋注したが、対照と比較して有意な遺伝子導入効率の増加が認められなかった。ミセル表面に筋組織を指向したリガンドペプチドを付加して同様の検討を行ったが、in vitroでは高い導入効率を示すことができたものの、in vivoでは実用化可能なレベルの導入効率を得ることができなかった。1.bFGF遺伝子を組み込んだ発現プラスミドDNAのIn vivo electroporation法によるskin flap直下の筋組織に対する遺伝子導入本研究開始にあたって確立したラット背部皮膚によるaxial flapモデルを使用した。Skin flap作成2日前にシグナル配列付bFGF遺伝子を組み込んだ発現プラスミドベクターをflap作成予定部直下の筋組織内へ筋注し、続いて同部に二本の電極を刺入して30V、50msecの電気刺激を計6回加えた。この操作による導入遺伝子の筋組織内発現は、LacZ遺伝子を同じプラスミドベクターに組み込んだものを用いてあらかじめ検証しており良好な発現が約1週間にわたり認められた。Skin flap作成後、7日目にflapの壊死部のサイズ測定、flapの血管造影、組織学的検討を行い、bFGF遺伝子を導入した群が、対照群(LacZ遺伝子導入群)と比較して有意にflapへの血流が改善し、壊死の進行も遅くなっていることが明らかになった。この実験結果は現在、投稿中である。2.高分子ミセル型ナノ・パーティクルによるラット背筋への遺伝子導入の試み上記の実験システムを用いて、高分子ミセル型ナノ・パーティクルによる筋組織への遺伝子導入に関して検討した。マーカー遺伝子としてLacZ遺伝子またはルシフェラーゼ遺伝子組み込み発現プラスミドベクターをナノ・パーティクルに入れてラット背筋へ筋注した。しかし、対照として同時施行したプラスミドベクターのみの筋注と比較して、有意な遺伝子導入効率の増加が認められず、この遺伝子導入法は筋肉注射には不向きであることが明らかになった。現在、ミセル型ナノ・パーティクルの導入効率を改善させるための改良を施行中である。本研究の目的は、血管新生療法を応用した新しい低侵襲軟部組織再建法を開発することであり、本年度の達成目標は、(1)酸性ゼラチンハイドロゲル・マイクロスフィアー(AGHM)によるbFGFタンパク徐放システムを用いた方法の開発と、(2)高分子ナノミセル構造体(ナノミセル)によるデリバリーシステムを用いた方法の開発の2点であった。

AGHMを用いた検討では、ラット背部axial skin flapモデルにおいて、虚血皮弁に接する背部の筋組織(recipient bed)にbFGFタンパクをデリバリーした。1.5ミリグラムのAGHM(徐放期間は2週間)にbFGFを含有させたものを筋組織内に注射して7日後に皮弁の生着の程度や、recipient bed内の血管新生の程度を血管造影と組織学的検索で測定した。含有させたbFGFの量によって50μg、100μg、150μgの3群を設けた。また、bFGFタンパクの直接の筋肉注射のみによる効果をみるため、50μg、100μg、150μgのbFGFを筋注する3群も作成した。結果は、AGHMを用いた3群が直接注射の3群と比較して有意な皮弁の生着とrecipient bed内の血管新生の亢進を認め、またその程度は、投与したbFGFの量が多い方がまさっていた。現在、残りの研究期間を使って、投与した筋組織内における各種の遺伝子発現に関して検討中である。一方、ナノミセルを用いた検討では、筋組織(recipient bed)への遺伝子導入により血管新生を誘導する方針とし、まず筋組織を標的として特化した機能化ナノミセルを創製した。しかし、in vitroでは高い導入効率を示すことができたにもかかわらず、in vivoでは期待していたほど(実用化可能なレベルの)の導入効率を得ることができなかった。
ニッケル/チタニアサ-メットのジルコニア燃料電池燃料極への応用

まず,Ni/TiO_2サ-メット電極を固相置換反応法で作製する際の技術,特に気孔率の制御法を確立し,熱膨張係数,強度,導電率,ガス透過率を調べた.その結果,(1)反応後の組織はNiとTiO_2のみから成り,焼成温度が高くなるにつれて粗い組織になる,(2)成形圧力が高いほど気孔率は低くなる,(3)焼成温度が高くなるほど気孔率は低くなる,(4)強度は気孔率のみに関係し,気孔率が高いと強度は低くなり,気孔率30%の時の強度は約100MPaと高いことがわかった.気孔率36.8%の試料の電気伝導率は1000°Cで約1000Scm^<-1>と非常に高く,ガス透過係数は,気孔率3040%の試料では10^<-2>10^<-3>cm^4g^<-1>s^<-1>(室温N_2)の範囲にあり,非常に良好であった.以上の結果に基づいて作製した気孔率33.6%Ni/TiO_2サ-メット電極にSOFCの電解質として最も有望だとされているZrO_2-8mol%Y_2O_3(YSZ)をプラズマ溶射法で取り付け,水蒸気を含む水素雰囲気中で,電極抵抗の測定およびジルコニアとの反応性の評価をおこなった.電極導電率は,30°Cの飽和水蒸気を含む水素雰囲気中では,温度が高くなるに従って増大し,1000°Cで150S・cm^2と非常に高い値であった.この導電率は他のSOFCの燃料極と比較して十分な値であると考えられた.さらに,1000°Cでの電極導電率の水蒸気分圧依存性を測定すると,導電率は水蒸気分圧が高くなるほど増加し,この挙動を解析した結果,酸素原子のニッケル上での移動過程がアノード反応が律速段階であると考えられた.最後に,YSZとの反応性のテストを行った。その結果、1000°Cの焼き付けでは反応による劣化は生ぜず,この電極はSOFCの燃料極として有望であることが分かった.まず,Ni/TiO_2サ-メット電極を固相置換反応法で作製する際の技術,特に気孔率の制御法を確立し,熱膨張係数,強度,導電率,ガス透過率を調べた.その結果,(1)反応後の組織はNiとTiO_2のみから成り,焼成温度が高くなるにつれて粗い組織になる,(2)成形圧力が高いほど気孔率は低くなる,(3)焼成温度が高くなるほど気孔率は低くなる,(4)強度は気孔率のみに関係し,気孔率が高いと強度は低くなり,気孔率30%の時の強度は約100MPaと高いことがわかった.気孔率36.8%の試料の電気伝導率は1000°Cで約1000Scm^<-1>と非常に高く,ガス透過係数は,気孔率3040%の試料では10^<-2>10^<-3>cm^4g^<-1>s^<-1>(室温N_2)の範囲にあり,非常に良好であった.以上の結果に基づいて作製した気孔率33.6%Ni/TiO_2サ-メット電極にSOFCの電解質として最も有望だとされているZrO_2-8mol%Y_2O_3(YSZ)をプラズマ溶射法で取り付け,水蒸気を含む水素雰囲気中で,電極抵抗の測定およびジルコニアとの反応性の評価をおこなった.電極導電率は,30°Cの飽和水蒸気を含む水素雰囲気中では,温度が高くなるに従って増大し,1000°Cで150S・cm^2と非常に高い値であった.この導電率は他のSOFCの燃料極と比較して十分な値であると考えられた.さらに,1000°Cでの電極導電率の水蒸気分圧依存性を測定すると,導電率は水蒸気分圧が高くなるほど増加し,この挙動を解析した結果,酸素原子のニッケル上での移動過程がアノード反応が律速段階であると考えられた.最後に,YSZとの反応性のテストを行った。その結果、1000°Cの焼き付けでは反応による劣化は生ぜず,この電極はSOFCの燃料極として有望であることが分かった.Ni/TiO_2サ-メット電極を固相置換反応法で作製する際の技術,特に気孔率の制御法を確立し,熱膨張係数,強度,導電率,ガス透過率を調べた.まず,固相置換反応,2NiO+Ti→2Ni+TiO_2で,一定の気孔率を有する多孔質のNi/TiO_2サ-メットを作製するための条件を探索した.すなわち,SOFCの燃料極はガスの流通をよくするために30%程度の気孔率が必要といわれているので,30%付近の気孔率の材料を作るための条件を調べた.このため,NiOとTi粉末の粒度,成形圧力,焼成温度(9001400°C)を変えて種々の試料を作成し,それらの組織観察を行い,気孔率および4点曲げ強度の測定を行った.その結果,(1)反応後の組織はNiとTiO_2のみから成り,焼成温度が高くなるにつれて粗い組織になる,(2)粉末の粒径が大きいと組織が不均一になるが,粒径は気孔率には関係しない,(3)成形圧力が高いほど気孔率は低くなる,(4)焼成温度が高くなるほど気孔率は低くなる.

(5)強度は気孔率のみに関係し,気孔率が高いと強度は低くなり,気孔率30%の時の強度は約100MPaと高いことが分かった.ついで,電気伝導度と気孔率を測定した.電気伝導度は直流四端子法で測定した結果,1000°Cで約1000 S cm^<-1>と非常に高かった.また,電気は金属ニッケル相を通って流れているが,水素分圧が高くなると(酸素分圧が非常に低くなると),少しではあるがチタニア相も導電に寄与することが分かった.ガス透過係数は一定差圧下で窒素ガスを流したときの流量から測定した.その結果,気孔率3040%の試料では10^<-2>10^<-3>cm^4g^<-1>s^<-1>(室温)の範囲にあり,非常に良好であった.本年度では,7年度で確立した固相置換反応法に基づく製造法で作製したNi/TiO_2サ-メット電極にSOFCの電解質として最も有望だとされているZrO_2-8mol%Y_2O_3(YSZ)をプラズマ溶射法で取り付け,水蒸気を含む水素雰囲気中で,電極抵抗の測定およびジルコニアとの反応性の評価をおこなった.電極導電率の測定には複素インピーダンス法と直流分極法を用い,反応性の評価は,反応後の試料を樹脂で固定後,切断し,その接合部をEPMAで分析して元素の拡散状況を調べておこなった.電極導電率は,30°Cの飽和水蒸気を含む水素雰囲気中では,温度が高くなるに従って増大し,1000°Cで約1000S・cm^2と非常に高い値であった.この導電率は他のSOFCの燃料極と比較して十分な値であると考えられた.さらに,1000°Cでの電極導電率の水蒸気分圧依存性を測定すると,導電率は水蒸気分圧が高くなるほど増加し,導電率の対数をP_H_2^O/P_H_2の対数で整理すると,その傾きは1/2となった.この挙動を解析した結果,酸素原子のニッケル上での移動過程がアノード反応の律速段階であることが分かった.反応性のテストは1000°C,1100°C,1200°Cで行った.1200度で反応させた試料の界面には,YSZとTiO_2が反応した層が観察されたり、1000°C,1100°Cでは反応層は観察されなかった.したがって,1100°C以下の温度で電極を取り付ければ,反応による劣化は生じないことが分かった.
低温プラズマ止血医療の確立を目的としたトランスレーショナル分子イメージング研究

本研究では、低温プラズマ止血を医療行為として確立することを目的として、低温プラズマ照射装置の止血能力評価と中動物を用いたトランスレーショナル分子イメージング研究を行った。前者の研究については、名古屋大学および産業技術総合研究所それぞれによって開発された装置を用いて、抗血液凝固薬であるワルファリンを投与したマウスでの止血能力を比較した。ワルファリンを溶かした水を自由飲水により摂取させたところ、マウスの血液凝固能は顕著に低下(INR値が顕著に増大)した。しかしながら、大腿静脈に針を刺した出血部位に低温プラズマを照射したところ、いずれの装置を用いても止血は可能であり、止血までに要する時間はワルファリン投与の有無で差を認めなかった。このことから、いずれのプラズマ照射装置も内因性の血液凝固系が阻害された状態でも止血が可能であることが明らかとなった。後者の研究については、ミニブタの胃壁からの出血を低温プラズマ照射により止血し、その後の炎症からの回復過程を、炎症イメージングプローブである18F-FDGを用いる非侵襲的PETイメージングにより評価した。詳細な組織学的検討が必要であるものの、胃壁への18F-FDGを認め、小動物(マウス)で確立したPETイメージングによる炎症の非侵襲的追跡を中動物(ミニブタ)へと応用することに成功し、ヒトへの橋渡しに資する知見を得た。28年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では、低温プラズマ止血を医療行為として確立することを目的として、止血に有効なプラズマ活性種の同定と中動物を用いたトランスレーショナル分子イメージング研究を行う。以前の公募研究で、現在臨床で用いられている高温熱凝固止血に比べて低温プラズマ止血では、止血後の炎症反応が早期に終了することを明らかとし、その炎症反応の差を、炎症部位に集積する放射性プローブ18F-FDGを用いたオートラジオグラフィにより定量評価することにも成功した。そこで今年度の検討では、個体を屠殺して評価するオートラジオグラフィではなく、非侵襲的に評価が可能なPETイメージングを実施した。肝臓切開・止血モデルマウスを作製し、止血15日後に尾静脈から18F-FDGを投与し、2時間後にPET撮像を行ったところ、高温熱凝固装置で止血した群に比べ、低温プラズマ照射装置で止血した群では、肝臓への放射能集積が約4割低く、炎症が収まっていることを非侵襲的に明らかとした。さらに、新学術領域内で開発されたヘリウムを作動ガスとする2種類のプラズマ照射装置を用いて、マウスの肝臓切開・止血を行ったところ、プラズマ強度の違いで止血能力に差が出ることも見出した。18F-FDG-PETによる止血後炎症の非侵襲的解析を達成することができ、それをミニブタで評価するための環境整備を連携研究者とともに行うことができた。また、2種類の低温プラズマ照射装置の止血能力の差も同定することができた。以上の結果から、本研究は計画通りにおおむね順調に進展していると判断した。2種類の低温プラズマ照射装置の止血能力の差を、計画班によって行われるプラズマ中の粒子パラメータの計測結果と比較することで、迅速・低侵襲止血を達成するために必要な活性種の同定を行う。また、これまで小動物(マウス)で行ってきた止血後の炎症反応のイメージング解析を中動物(ミニブタ)に応用することで、ヒトへの橋渡し研究へと繋げる。
上下気道粘膜免疫における経年的免疫応答動態の解析

無莢膜型インフルエンザ菌は急性および慢性気道感染を来す主要起炎菌として挙げられ、小児においては急性中耳炎、成人においては慢性閉塞性肺疾患(COPD)における持続感染菌として臨床的に重要である。下気道感染の発症にはone way one diseaseといった上気道感染が契機となる症例も少なくなく、気道粘膜疾患制御は、小児のみならず成人においても重要な意義を持つものと思われる。今回、インフルエンザ菌由来のワクチン抗原による上下気道粘膜免疫賦活化誘導と加齢に伴う粘膜免疫免疫応答の変化の解析を行い、ヒト上下気道感染の感染防御に関する新療法を模索する。
グローバル空間において多極的な法のネットワークが構成する公共調達の法

本科研は、「公共調達契約がグローバル化および公共調達に関わる主体の多極化に直面する現在にあって、この公共調達契約をどのような法がどのように規律しうるか」を探究するものであった。本科研の成果として、グローバル化や行政の私化に対応した新しい行政法理論を構築するための基本となる法概念を析出することができた。すなわち、国家法(法令)ではない「公共的主体の内部法・自主法」、情報の共有・加工を可能にする「異種混成手続」(各公共的主体がそれぞれに装備している基準適合性審査手続を接合させた手続)、物理的に不正を排除する「アーキテクチャルな規制」等である。今日の公共調達契約は、既存の研究が前提にした公私の区別の相対化、手段の多様化といった現代行政法現象だけではなく、新たに国境を超えた空間に展開するグローバル行政法現象、そして、公私を超える多様な主体が契約関係に登場する多極的行政法現象のなかにある。本研究は、公共調達契約について、このグローバル行政法および多極的行政法のなかに定位するものとして新たな位置づけを与え、新しい行政法理論を構築することを目的とする。研究初年度である平成27年度は、公共調達契約が展開する空間として、まず日本国内に主たる焦点をあて、そこに登場する主体やルールの調査および整理、分析をおこなった。これにより、行政法理論上の課題を抽出し、従来の課題と新たな課題とを切り分け、今後の理論構築のための鍵概念と問題の核心を見出した。すなわち、情報の共有・加工と、それを可能にする異種混成手続(各公共的主体がそれぞれに装備している基準適合性審査手続を接合させた手続)である。本研究の成果の一部は、論文として公表された。また、インドネシア・ガジャマダ大学が主催した国際シンポジウム、および、名古屋大学が主催した国際シンポジウムにおいて、本研究の成果の一部を報告し、国内外の研究者、実務家等との意見交換を重ねた。意見交換の結果、本研究が目的とする理論構築の試みは国内外において類例が少なく、グローバル化、行政の主体の多元化、および、情報のネットワーク化に伴う法問題を析出する研究として意義が大きいことが確認された。当初の計画では、初年度の目標は、国内外の公共調達契約における規制および運用例の調査および分析であった。この計画を、国内の公共調達契約に限定することによって、行政法上の理論的課題をよりクリアに析出することができた。具体的には以下のとおりである。モンゴルにおいて、モンゴル法律家協会が主催する行政法のワークショップに参加し、ウランバートル市控訴行政裁判所判事や国会議員、行政法研究者らとの情報交換および資料収集を行うことで、上記目標を達成した。また、モンゴルの法律家等とのネットワークが確立したことから、今後も継続的に実質的な意見交換が可能となるという成果を得た。インドネシアにおいては、汚職取締委員会のdirectorやvice chairman等との面談、当委員会で開催されたワークショップへの参加、ガジャマダ大学主催の国際シンポジウムにおける研究報告を通して、インドネシア、オーストラリア、タイ等の法律家等との意見交換および資料収集を行うことで、今年度の目標を達成した。さらに、名古屋大学主催の国際シンポジウムにおいても研究報告を行い、既述の国々の法律家の他、日本の法律家等はもとより、アメリカ、中国、台湾やアセアン事務局等々の法律家らとの意見交換を行ことで、今年度の目標を達成した。上記活動を通して、人的ネットワークが形成されるという成果を得た。今後は、これらのネットワークを生かした比較法研究を行う予定である。本研究は、公共調達契約について、これをグローバル行政法および多極的行政法のなかに定位するものとして新たな位置付けを与え、新しい行政法理論の構築をめざすものである。研究の第二年度にあたる28年度は、第一に、日本国内の公共調達契約について、とくに、政府出資株式会社の「公共」調達契約を検討対象として、調査・分析を行った。公共調達契約の主体は、典型的には政府(省庁、地方公共団体)であるが、本研究は、存在形式としては私法人であり、しかし出資は政府が行っているという、政府出資株式会社を検討対象とすることで、行政法と民事法(特に会社法)とが交錯する領域における「公共」調達契約の法的コントロールを考察した。日本の政府出資株式会社は、かつての国営企業が民営化された結果、株式会社となったものである(日本道路公団→NEXCO中日本等)。政府出資株式会社による資材調達は、現在は私企業であるにもかかわらず、国・地方の公共調達の仕組みを参照しそれを自ら取り込んでおり、その結果、国・地方の公共調達と政府出資株式会社の資材調達は、そのルールおよび運用が共に接合していることが明らかとなった。また、28年度は、第二に、諸外国における公共調達契約の調査・検討を行った。とくに、中国、ベトナム、ロシアがその対象である。研究初年度末には、中国およびベトナムのみを調査する計画であったが、研究をすすめるなかで、市場経済移行国であり、かつ、社会主義法の母国であるロシア研究の必要性を認識することとなった。グローバル行政法、多極的行政法を考察するとき、フランスで生成し、ドイツから日本へと継受された大陸法系の行政法、そして、イギリスとアメリカで生成した英米法系の行政法という二つの行政法だけでなく、ドイツからソビエトへ継受され、中国、ベトナム、モンゴル等へ継受されたソビエト(ロシア)行政法の意義は大きいことが確認された。28年度は、当初の計画通り、諸外国(とくに、ベトナム、中国)を対象として、それらの国における公共調達契約の仕組み、国際取決めの国内実施、公共調達契約における不正・汚職の実態とその法的対応の調査・検討を行った。

中国については、全国人民代表大会法制工作委員会が開催した共同ワークショップ(北京と京都にて二回開催した)において、報告と意見交換を行うことにより、上記の作業を行うことができた。ベトナムについては、ハノイ法科大学行政法教授らや国会議員とともに開催した共同ワークショップにおいて、議論および意見交換を行った。これらの成果の一部は、論文として公表した。また、28年度は、(当初の計画にはなかったが)新たに、ロシア・モスクワ大学のビジネス法講座とのネットワークを構築することができた。その結果、ロシア・モスクワ大学での国際シンポジウムでの報告およびそれに伴う意見交換の機会を得た。その成果の一部は、論文として公表した。上述のような、既に確立された人的ネットワークを通して、情報収集や意見交換を今後も継続的に行っていく。本研究は本研究は、公共調達契約について、これをグローバル行政法および多極的行政法のなかに定位するものとして新たな位置付けを与え、新しい行政法理論の構築をめざすものである。研究の最終年度にあたる平成29年度は、第一に、これまで調査・分析を行ってきた政府出資株式会社の資材調達契約について、これを取りまとめ、論文として公表した。本稿の最も独創的な点は、従来、行政法学も会社法学も検討してこなかった政府資株式会社の「内部法」に着目して法構造を分析した点にある。また、これと並行して、組織上、純粋に私的主体である医療職集団の内部法・自主法(以下「『法』」という。)にも着目して、これらの「法」が私的主体の活動をどのように規律しているかの分析を行い、論文として公表した。これら作業は、従来の行政法理論の限界と発展可能性を検討するためのものである。また、平成29年度は、第二に、前年度に引き続き、諸外国における公共調達契約の調査・検討を行った。平成29年度は、とくに、ロシア、中央アジア(ウズベキスタン等)を検討対象とした。研究の第二年度にあたる平成28年度末に、市場経済移行国であり、かつ、社会主義法の母国であるロシア研究の必要性を認識することとなったたことから、ロシア、およびかつてソビエト体制にあった中央アジアの公共調達契約を調査・検討する意義は大ききと認識したことに因る。本年度の調査・分析を通して、フランスで生成し、ドイツから日本へと継受された大陸法系の行政法、そして、イギリスとアメリカで生成した英米法系の行政法という二つの行政法だけでなく、ドイツからソビエトへ継受された社会主義行政法が、中国、ベトナム、中央アジアへと継受されていく行政法の姿を把握することができた。これに加えて、政府出資株式会社の内部法を視野に入れることで、グローバル行政法、多極的行政法を考察する道筋を描くことができた。本科研は、「公共調達契約がグローバル化および公共調達に関わる主体の多極化に直面する現在にあって、この公共調達契約をどのような法がどのように規律しうるか」を探究するものであった。本科研の成果として、グローバル化や行政の私化に対応した新しい行政法理論を構築するための基本となる法概念を析出することができた。
入力系の再構成によるオーファン受容体の出力の解析

Gタンパク質共役型受容体(GPCR)は、様々な刺激の受容体として細胞間相互作用の重要な役割を担う分子であり、生命機能の解明という基礎研究分野のみならず、創薬のターゲットとしても非常に注目され続けてきた。しかしながら、未だリガンドや生理機能との関連が不明なオーファンGPCRが多数存在し、GPCRが支える多様な生理機能の全容解明には程遠い。この理由の一つは、従来のGPCR研究がリガンド同定を中心に進められ、したがってリガンドが同定されなければ解析が進まないという点にある。そこで本研究では、私たちが見出した多様なロドプシン(光感受性GPCR)を光スイッチとして用いることで、GPCRのリガンドを決めることなく光刺激を使ってGPCRが関与する生理機能を解析するという新しいアプローチを試みる。具体的には、光透過性の高いゼブラフィッシュを実験動物として主に用い、1光感受性GPCRツールの開発と評価、2遺伝子導入コンストラクトの作製と遺伝子改変動物の作製、3遺伝子改変動物の表現型解析、という流れで研究を進めており、平成30年度は以下の研究成果を得た。・昨年度に取得したオーファンGPCRのプロモーター配列を用いて、光スイッチの標的細胞特異的発現に成功した。・一種類の光スイッチを用いて、GPCRシグナル伝達の波長依存的な光操作(色操作)に、培養細胞および個体レベルで成功した。・複数の光スイッチについて、Cre/loxPシステムを用いた遺伝子導入マウスを作製した。本研究の基盤となる光スイッチの開発については十分な成果を得ており、また、光スイッチを導入した遺伝子改変動物も随時作出できており、研究はおおむね順調に進んでいる。研究計画通りに、開発した光スイッチの遺伝子導入を継続するとともに、作出した遺伝子改変動物の表現型解析を進める。表現型がわかっているGPCRを標的とした解析によって本アプローチの有用性を示しつつ、オーファンGPCRを標的にした解析によって、オーファンGPCRが関わる表現型を明らかにする。Gタンパク質共役型受容体(GPCR)は、様々な刺激の受容体として細胞間相互作用の重要な役割を担う分子であるり、そのため生命機能の解明という基礎研究分野のみならず、創薬のターゲットとしても非常に注目され続けてきた。この手法によって、新規「GPCRー生理機能相関」が多数見出されると期待される。平成28年度は、以下の研究成果を得た。・本研究で主に用いる異なる性質をもつ3タイプの光感受性GPCRそれぞれについて、活性化するGタンパク質の選択性を変えたキメラ変異タンパク質を作製し、in vitroの解析系を用いてそれらの機能性の評価を行った。その結果、3タイプの光感受性GPCRについて、異なるGタンパク質を効率的に活性化できる改変型光スイッチの作製に成功した。・オーファンGPCRの網羅的な解析と並行して、代表的なオーファンGPCRに狙いを絞り、光スイッチ導入のためのプロモーター配列の取得を行った。本研究の基盤となる光スイッチの開発については十分な成果を得ている。また、現在、遺伝子ノックインの系は構築中であるが、その間に並行して行っている、通常の遺伝子導入については順調に進んでいる。具体的には、光透過性の高いゼブラフィッシュを実験動物として主に用い、1光感受性GPCRツールの開発と評価、2遺伝子導入コンストラクトの作製と遺伝子改変動物の作製、3遺伝子改変動物の表現型解析、という流れで研究を進めており、平成29年度は以下の研究成果を得た。・標的とする複数のGPCRについてプロモーター配列を取得した。それぞれのプロモーター配列を利用して、昨年度作製した光感受性GPCRツールの遺伝子導入コンストラクトの作製およびゼブラフィッシュへの遺伝子導入を行った。ジェノタイピングの結果、いくつかの標的GPCRについて、遺伝子導入系統の樹立に成功した。・現在作製中の光感受性GPCRツール導入ゼブラフィッシュの表現型解析のために、赤外光下での行動解析システムを構築した。・従来にはなかった、光照射によって不活性化できる光感受性GPCRツールの開発に成功した。本研究の基盤となる光スイッチの開発については十分な成果を得ており、さらに新規ツールの開発にも成功しつつある。遺伝子ノックインの系は構築の途中段階であるが、通常の遺伝子導入の系を用いることで研究は順調に進んでいる。