hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
低分子量G蛋白質Rhoの情報伝達と生理的意義の研究

(7)Pull-down法を用いてRho関連蛋白質の一つCdc42の分裂時の活性化を解析し、これがmetaphaseで一過性に上昇することを見出し、変異体の発現実験でこの上昇もその後の下降のどちらも正常分裂のため必要であることを見出した。1.Rhoの情報伝達経路をすべて遮断するC3酵素とその中のROCK経路を選択的に阻害するY-27632の作用を繊維芽細胞で比較検討することにより、RhoからmDiaをへてRacを活性化する経路を発見した。2.マウス小脳顆粒細胞の初期培養系を用い、この細胞のSDF-1αによる神経突起の形成と抑制の両方にRhoの情報伝達系が働くことを見出した。前者は、mDiaを主とした経路であり、後者はROCKを主とする経路であり、この2経路の選択がRhoの活性化の程度によるらしきことを見出した。3.ROCKがcentrosome構成蛋白質として存在すること、centriole位置決定に働いているとの知見を得た。4.GFP-アクチンを用いて、培養神経細胞のアクチン細胞骨格の動態を可視化することに成功し、カルシウム動員のモードに応じて細胞内での繊維化アクチンの集積パタンが変化すること、NMDA受容体刺激に伴っては神経突起のdendriteに特異的なアクチン集積が見られることを見出した。6.ROCK-1遺伝子の欠損マウスの作成を行い、ホモ接合体が出生後48時間以内に死亡することを見出した。7.mDiaのisoformの一つ、mDia3が、CENP-AとHP-1とに結合し、間期細胞のヘテロクロマチンin領域、分裂細胞のkinetochoreに局在し、紡錘体の形成・維持に働く可能性を見出した。8.Cdc42の細胞分裂時の動態を解析し、Cdc42が分裂期紡錘体の形成や細胞質分裂の完結に働いているとの知見を得た。低分子量G蛋白質Rhoは、下流のエフェクターに働いてその作用を発揮する。我々は、これまで、主たるRhoエフェクターとしてROCK(Rhoキナーゼ)とformin蛋白質であるmDiaを発見している。そこで、これらについて以下の解析を行った。2.培養小脳顆粒細胞を用いて軸索形成におけるRhoの情報伝達を解析し、RhoがSDF1aの下流で活性化されること、この活性化の程度により軸索の伸長と退縮が起こること、Rhoは前者では主にmDiaに、後者ではROCKに働いて、反対の作用を発現することを明らかにした。3.mDiaの細胞骨格に対する機能を解析し、これが細胞内で真直ぐな長いアクチン線維の形成を触媒することを見出した。また、このアクチン重合に関わるコアドメインを結晶化し、X線結晶解析でその構造を明らかにした。4.mDiaによる徴小管安定化について解析し、そのアイソフォームの一つ、mDia3、が、分裂期紡錘体微小管のキネトコアヘの結合を安定化することにより、染色体分離に関係することを見出した。また、この上流にはCdc42(または、その近縁蛋白質)が働いていることを明らかにした。5.細胞質分裂時に働くRhoエフェクターであるcitronキナーゼのミオシンに対するリン酸化活性を検討し、これがミオシンのdiphosphorylaitonを優先的に起こすことを見出した。1.細胞分裂をモデルに時間空間特異的なRho作用を解析して以下の所見を得た。(1)細胞分裂の過程でCdc42がmDia3を活性化して、紡錘体微小管のキネトコアへの結合を安定化し、染色体の配列と分離を調節していることを明らかにした。(2)細胞分裂各期におけるGTP型Cdc42量を定量し、GTP-Cdc42がmetaphaseでピークを示すことを見出した。
SSEA-1(胎児分化抗原-1)発現の遺伝学的制御の研究

近交系マウス腎臓の糖脂質に系統差のあることを見い出し,多形を示す糖脂質(GL-X, GL-Y)を精製し,構造を決定した.GL-XはGalβ1-3Gb_4Cer, GL-YはGalβ_<1-4>(Fucα_<1-3>)GlcNAcβ_<1-6>(Galβ_<1-3>)Gb_4Cerであることが解った.GL-Yはその非還之末端にGalβ_<1-4>(Fucα_<1-3>)GlcNAβl-構造を有し,抗SSEA-1抗体と反応したことからSSEA-1決定基を持つ糖脂質であることが明らかになった.DBA/_2マウスはGL-Yの発現を欠損し, GL-XをGL-Yと同程度の量発現すること,又GL-YはGL-Xを前駆体とする構造であることから, DBAl_2マウスはGL-Xに次の糖を付加しGlcNAc-(Gal)Gb_4Cerを発現とする能力に欠損があるものと考えられた.交配実験によってGL-Yと発現は優性の形質で,戻し交配マウスが分離したことから, DBA/_2マウスは常染色体性の単一遺伝子に変異があり,上記の能力が発現出来ないことが考えられた.この遺伝子の染色体上での位置を決定するためのBXDリコンビナント・インブレッドを使った解析を行い,第19染色体上のEa-4,遺伝子座を連鎖する可能性が指摘され,交配実験で第19染色体上にあることが証明された.この遺伝子はGL-XにGlcNAcを転移する活性を支配することが考えられることから, GlcNAc転移酵素の活性測定系について検討し,ほぼ系が出来上がった.一方,新たな糖脂質発現の多形現象がガングリオシド画に見い出され, Z1, Z2の二つのガングリオシドの構造が決定された.Z1はNeuGcα2-3GL-X, Z2はNeuGcα2-8NeaGcα2-3GL-Xであった.交配実験により, Z1, Z2発現の形質は劣性であり,戻し交配で,常染色体性の単一因子を考えれば良いことが判明した.Z1, Z2ともにGL-Xを前駆体とすることから上記の第19染色体上の遺伝子の変異によってDBA/_2マウスはGL-X→GlcNAc-GL-Xを合成出来ず, GL-Xが蓄積し,その結果GL-X→Z1→Z2の経路が働き, Z_1, Z_2が検出出来るレベルになると考えることが出来る.近交系マウス腎臓の糖脂質に系統差のあることを見い出し,多形を示す糖脂質(GL-X, GL-Y)を精製し,構造を決定した.GL-XはGalβ1-3Gb_4Cer, GL-YはGalβ_<1-4>(Fucα_<1-3>)GlcNAcβ_<1-6>(Galβ_<1-3>)Gb_4Cerであることが解った.GL-Yはその非還之末端にGalβ_<1-4>(Fucα_<1-3>)GlcNAβl-構造を有し,抗SSEA-1抗体と反応したことからSSEA-1決定基を持つ糖脂質であることが明らかになった.DBA/_2マウスはGL-Yの発現を欠損し, GL-XをGL-Yと同程度の量発現すること,又GL-YはGL-Xを前駆体とする構造であることから, DBAl_2マウスはGL-Xに次の糖を付加しGlcNAc-(Gal)Gb_4Cerを発現とする能力に欠損があるものと考えられた.交配実験によってGL-Yと発現は優性の形質で,戻し交配マウスが分離したことから, DBA/_2マウスは常染色体性の単一遺伝子に変異があり,上記の能力が発現出来ないことが考えられた.この遺伝子の染色体上での位置を決定するためのBXDリコンビナント・インブレッドを使った解析を行い,第19染色体上のEa-4,遺伝子座を連鎖する可能性が指摘され,交配実験で第19染色体上にあることが証明された.この遺伝子はGL-XにGlcNAcを転移する活性を支配することが考えられることから, GlcNAc転移酵素の活性測定系について検討し,ほぼ系が出来上がった.一方,新たな糖脂質発現の多形現象がガングリオシド画に見い出され, Z1, Z2の二つのガングリオシドの構造が決定された.Z1はNeuGcα2-3GL-X, Z2はNeuGcα2-8NeaGcα2-3GL-Xであった.交配実験により, Z1, Z2発現の形質は劣性であり,戻し交配で,常染色体性の単一因子を考えれば良いことが判明した.Z1, Z2ともにGL-Xを前駆体とすることから上記の第19染色体上の遺伝子の変異によってDBA/_2マウスはGL-X→GlcNAc-GL-Xを合成出来ず, GL-Xが蓄積し,その結果GL-X→Z1→Z2の経路が働き, Z_1, Z_2が検出出来るレベルになると考えることが出来る.マウス腎よりSSEA-1活性を有する糖脂質を精製し、その構造を質量分析法、NMR、化学分析その他を用いて決定した。本糖脂質の構造はSSEA-

1活性決定基がラクト骨格ではなく、グロボ骨格構造に結合してしていたこと、又、SSEA-3構造とされるGal-GlobotetraoseにSSEA-1構造が結合し、SSEA-1,SSEA-3両抗原決定基を一分子中に持っていたという点で全く新しい構造であった。この糖脂質の腎での発現には近交系マウス間に多型現象が見出され、この糖脂質発現を欠くマウス(DBA/2)と発現マウス(BALB/C)との間で交配実験を行うことによって、この糖脂質発現を欠くDBA/2マウスは常染色体性の単一遺伝子に何らかの欠損のあることが明らかになった。一方、この糖脂質発現を欠くDBA/2マウスは発現マウスとは異なる糖脂質パターンを示した。このDBA/2マウス特有と思われる糖脂質を精製し、構造を決定した所、Gal-GlobOtetraosylceramideであることが明らかとなった。この糖脂質は上記の新しい構造の糖脂質と比較する時、骨格構造となっていることが明らかであり、以上の結果を総合するとDBA/2マウスはGal-Globotetraose骨格にβ1-6結合でGlcNAcを付加する能力に欠けるため、さらに糖鎖を伸長させてGal(β1-4)[Fue(α1-3)]GlcNAc(β1-6)-を非還元末端に持つ糖脂質を造り出せない近交系であることが結論される。このDBA/2マウスが持つ欠損遺伝子がどの様な分子をコードするものが、今後の重要な課題である。この欠損遺伝子を目印として、遺伝子座の決定を試みた。DBA/2マウスとc57BL/6マウス間で作製されたBXD/Tyリコンビナント、インブレッド・マウスをJackson研究所より購入して解析した所、連鎖する染色体マーカーは見い出されなかった。その後Taylor博士からの私信で、我々の解析している遺伝子は第19染色体のEa-4抗原をコードする遺伝子座と連鎖する可能性が示唆され、現在、この連鎖の証明を交配実験により行おうとしている。
広汎性発達障害における高次連合野の刺激応答特性と神経可塑性

TMS(経頭蓋磁気刺激法)と脳波を組み合わせた実験の方法論を確立し、定型発達者29名、自閉症スペクトラム障害者20名のデータを取得した。前頭前野へのシータバースト刺激(TBS)前後で経時的にTMS誘発電位と認知機能を測定した。定型発達者において、TBS群はシャム刺激群と比較して、TBS実施後10分50分においてN45成分の振幅が増幅効果を示し、20分40分において作動記憶の一時的な増強効果を示すことが確認された。その一方で、発達障害者においては、N45成分や作動記憶の増強効果を認めなかった。前頭前野の神経可塑性様変化において、定型発達者と発達障害者の間で顕著な違いを見出すことができた。平成25年4月以降は、TMS(経頭蓋磁気刺激法)と脳波を組み合わせた実験(TMS-EEG実験)を継続し、健常被験者の実験を実施した。シータバースト刺激(TBS)の前後でTMS誘発電位を測定したところ、N100、P180などの成分の振幅の経時的変化をとらえることができた。この予備的結果は「TMS誘発電位」が前頭連合野の興奮特性や可塑性を反映するバイオマーカーとしての可能性を示唆した。その一方で方法論上の課題も明らかとなり、種々のTMS関連アーティファクトの除去が不十分であることと、被験者負担が大きいことなどが重要課題であった。平成25年9月以降は、TMS-EEG実験に特化した実験環境を追求し、ANT社製のDC脳波アンプ(ASA-lab)と64ch脳波キャップ(Waveguard)を用いた予備実験を重ねた。新しい実験システムと研究プロトコールによって、TMSアーティファクトの混入が劇的に低減され、TMS誘発電位の超早期成分(N45など)の解析が可能となった。これまでは5時間以上かかっていた実験時間も3時間以内に短縮した。新規プロトコールを用いて、本報告書作成時点までに健常被験者計17名のデータを取得した。データの予備的解析を行い、次の2点が明らかとなった。1)TBS前後でTMS誘発電位を経時的に測定したところ、TBS群はベースラインとの郡内比較でも、シャム群との群間比較においても、N45成分の振幅においてTBSによる増幅効果が40分程度確認された。2)TBS前後で認知機能課題を経時的に測定したところ、TBS群はベースラインとの郡内比較でも、シャム群との群間比較においても、TBSによる作動記憶課題の増強効果が40分程度確認された。平成25年4月以降は、TMS(経頭蓋磁気刺激法)と脳波を組み合わせたTMS-EEG実験を健常被験者に対して、実施した。この予備的結果はTMS誘発電位が前頭連合野の興奮特性や可塑性を反映するバイオマーカーとしての可能性を示唆した。平成25年9月以降は、被験者負担が少なくTMS-EEG実験に特化した実験環境を追求した。新規プロトコールを用いて、健常成人被験者計13名のデータを取得して、予備的解析を行い以下の2点を明らかにした。平成26年4月以降は、成人の自閉症スペクトラム障害の当事者を対象としたデータ取得を開始した。3時間に及ぶ実験であるが、概ね問題なく実験を実施できることが明らかとなった。本報告書作成時点において、健常被験者は27名で自閉症スペクトラム障害の当事者は8名のデータ取得が完了している。平成25年4月以降は、TMS(経頭蓋磁気刺激法)と脳波を組み合わせたTMS-EEG実験を健常被験者(定型発達者)に対して実施した。シーバースト刺激(TBS)の前後でTMS誘発電位を測定したところ、N100、P180といった成分の振幅の経時的変化を捉えることができた。この予備的結果は、TMS誘発電位が前頭連合野の興奮特性や可塑性を反映するバイオマーカーとしての可能性を示唆した。平成25年9月以降は、被験者負担が少なく、TMS-EEG実験に特化した実験環境を確立した。新規プロトコールを用いて、TMS-EEG実験を繰り返し平成28年2月までに、定型発達者29名、発達障害者(自閉症スペクトラム障害)20名のデータを取得した。初期の解析を既に終えており、以下の3点を明らかにした。

1)定型発達者において、TBS前後でTMS誘発電位を経時的に測定したところ、TBS群はシャム刺激群と比較して、TBS実施後10分50分においてN45成分の振幅が増幅効果(長期増強様効果)を示すことが確認された。2)定型発達者において認知機能課題を経時的に測定したところ、TBS実施後20分40分において作動記憶を中心とした認知機能の一時的な増強効果(機能的可塑性)が確認された。3)発達障害者においては、上記の1)も2)も認められなかった。このように前頭前野の神経可塑性様特性において、定型発達者と発達障害者の間で顕著な違いを見出すことができた。これらの結果は今後の治療的介入法開発の基礎データとして重要である。TMS(経頭蓋磁気刺激法)と脳波を組み合わせた実験の方法論を確立し、定型発達者29名、自閉症スペクトラム障害者20名のデータを取得した。前頭前野へのシータバースト刺激(TBS)前後で経時的にTMS誘発電位と認知機能を測定した。定型発達者において、TBS群はシャム刺激群と比較して、TBS実施後10分50分においてN45成分の振幅が増幅効果を示し、20分40分において作動記憶の一時的な増強効果を示すことが確認された。その一方で、発達障害者においては、N45成分や作動記憶の増強効果を認めなかった。前頭前野の神経可塑性様変化において、定型発達者と発達障害者の間で顕著な違いを見出すことができた。技術的に困難であるとされるTMS-EEG実験とその解析技法を概ね確立できたことの意義は大きい。そして、平成26年度前半からは自閉症スペクトラム障害の当事者の方々のデータ取得が開始できたことは順調な進展を裏付けている。医歯薬学・内科系臨床医学・精神神経科学・自閉症スペクトラム障害の当事者のデータ取得を推進する(患者群のサンプル数の目標は20名程度)。・健常者データの解析をさらに発展させて、論文化する。・健常者と自閉症スペクトラム障害の違いを明らかにして論文化する。技術的に困難であるとされるTMS-EEG実験と解析技法を概ね確立できたことの意義は大きい。また、健常被験者のデータを予備的に解析することによって、TMS誘発電位が神経可塑性を反映するバイオマーカーとして有用である可能性が示唆され、研究仮説を裏付けることができた。・平成26年度中にTMSーfMRI実験のプロトコールと解析手法を確立する(研究目的2)。昭和大学附属烏山病院では、平成26年5月に研究用3テスラMRI装置が新規に設置され、TMS専用のヘッドコイルも導入されることになっている。・平成26年度前半において、広汎性発達障害患者のリクルート体制構築を実施する。主に昭和大学の発達障害医療研究センターの発達障害専門外来からの被験者が中心となり、TMS-EEG実験のデータを蓄積する(研究目的4)。平成25年度には、経頭蓋直流電流刺激(tDCS)装置(約210万円)を購入予定であった。しかし、当該研究費の単年度額を超えていたことと、同装置は申請者が所属する他機関から借用できたことで、購入しないこととなり次年度使用額が生じることとなった。
沖縄における録音・レコード音楽の黎明期研究─田辺尚雄の沖縄現地調査を起点として

本研究の目的は、日本における民族音楽研究のパイオニア・田辺尚雄が1922年に実施した「沖縄・八重山諸島音楽現地調査」について、沖縄で準備に奔走した人々や田辺が残した記録を分析し、調査の全体像を明らかにすることにある。沖縄県立芸術大学附属図書館「田辺文庫」には、沖縄調査に関する文献、楽譜、レコード等が所蔵されている。田辺の著書『南洋・台湾・沖縄音楽紀行』と田辺文庫の資料を照合し、受け入れ側と調査する側、双方の意図と成果を読み解いた。その結果、調査は田辺の研究者としての責務と、日本本土、つまり〈外向き〉に音楽を発信する機会を得た沖縄の研究者の目論みが複雑に絡み合いながら実施されていた。本研究の目的は、田辺尚雄が1922年に実施した「沖縄・八重山諸島音楽現地調査」を起点として、近代沖縄における録音・レコード音楽の成立を明らかにすることである。26年度は以下の調査を実施した。(1)1922年沖縄調査の全容を把握するために、沖縄県立芸術大学附属図書館「田辺文庫」で資料収集を行った。特に、歌詞・楽譜資料、フィールドノート、楽器の写真、書簡を中心に撮影した。さらに、琉球古典音楽、沖縄民謡のSPレコード(40枚)とLPレコード(17枚)を対象に、レーベルと歌詞カードの撮影を行った。レコード会社別のディスコグラフィーを作成した結果、沖縄音楽初の商業録音SP(制作:大阪蓄音器株式会社)が5枚所蔵されていた。高橋2011『高知大学教育学部研究報告』71号でこのSPについて論じた時には実物が発見されていなかったが、調査により確かに販売されていたことが判明した。その他、日本コロムビア、沖縄音楽専門レーベル・トモエレコード(那覇市)のSPが所蔵されており、40枚の中には1922年調査の際、購入したものも含まれている。(2)田辺が日本・アジアの音楽研究をふまえ、沖縄の音楽をどのように位置づけていたのかを解明するため、国立劇場所蔵「田辺尚雄・秀雄寄贈資料」の資料収集を行った。田辺自筆記録『音楽見聞録』(53冊)、スクラップブック(38冊)を調査した結果、様々な交友関係を通じて沖縄音楽の知識や情報を入手していたことが明らかになった。(3)沖縄県金武町教育委員会には海外に移民した沖縄出身者が寄贈したレコードが所蔵されている。近代沖縄のレコード産業の成立を明らかにするためには、音源の複製デジタル化が不可欠と考え、教育委員会の協力のもと実施した。その結果、沖縄音楽のレコードが沖縄からブラジルへ送られ、それを原盤として制作された海賊盤LPが沖縄系コミュニティで販売されていた実態を確認できた。平成27年度は(1)(2)を実施した。(1)平成26年度に実施した沖縄県立芸術大学附属図書館「田辺文庫」調査に基づき、平成27年11月に東洋音楽学会で口頭発表を行った。本発表では沖縄調査に関する記録を時系列に整理するのみならず、田辺文庫の資料と照合させ、受け入れ側と調査する側、双方の意図と成果も読み解いた。結論として、以下2点が明らかになった。第1に、沖縄側で準備に携わった人々が企画した演奏会、歓迎会をそのまま受け入れる形で調査は進められた。田辺の研究者としての責務と、〈外向き〉に音楽を発信する機会を得た沖縄の研究者の目論みが複雑に絡み合いながら調査が実施された。結果的に、東京という中央に音楽を発信する新たな志向が沖縄社会に導入され、田辺の沖縄調査は〈外向き〉発信スタイルの起点として位置づけられる。第2に、田辺は調査の目的であった八重山民謡を聴き、録音、採譜し、講演会で音源を披露した。1926年日東蓄音器からプライベート盤として制作された八重山民謡レコード23枚が田辺における八重山民謡研究の完成版だと位置づけられる。(2)京都市立芸術大学日本伝統音楽研究センター「田邊氏寄贈コレクション」を調査した。田辺が沖縄調査で入手した楽器、レコード、文献、使用した蓄音器が所蔵されており、諸資料の写真撮影を実施した。(1)の研究成果と照合することにより、調査の全体像がより明確になると考えている。なお、「田辺文庫」レコード音源のデジタル化は沖縄県立芸術大学の企画で実施されたため、今後本研究に活用する。また、石垣市立八重山博物館「喜舎場永珣コレクション」は公開のための資料整理が完了しておらず、調査は実現できなかった。本研究に関わる2つの調査は順調に進んでおり、田辺の著書『南洋・台湾・沖縄音楽紀行』による沖縄調査の記述と収集した資料との照合作業も実施した。

当初は沖縄県立芸術大学附属図書館「田辺文庫」所蔵のレコードを複製デジタル化する予定であったが、沖縄県金武町教育委員会所蔵レコードのデジタル化を先に実施し、その研究成果を論文としてまとめることができた。音楽学1. 26年度に実施できなかった沖縄県立芸術大学附属図書館「田辺文庫」所蔵のレコード音源を複製デジタル化する。2.八重山出身の民俗学者・喜舎場永珣と田辺との学術交流の実態を把握するため、石垣市立八重山博物館所蔵「喜舎場永珣コレクション」の資料収集を行う。3.沖縄調査に関する田辺の紀行文を時系列に整理するだけに留まらず、田辺文庫所蔵の録音・文献資料と照合させることにより、沖縄音楽の共時的な様相・実態と、沖縄音楽界及びレコード産業の通時的な変容を明らかにする。当初、600枚程度の写真現像をする予定であったが、実際は478枚の現像で納まったため、1091円の残額が生じた。1.東京での資料収集と沖縄・八重山諸島調査のための国内旅費に使用する。2.沖縄・八重山諸島の音楽・芸能関連書籍とレコード・録音・複製技術関連書籍に使用する。3.沖縄県立芸術大学附属図書館「田辺文庫」所蔵レコード音源の複製デジタル化に使用する。
離散凸構造に着目した最適化法とその次世代型CRMへの適用

離散最適化問題は様々な応用分野で現れるが,最適解を効率的に求めることは多くの場合に困難であることが知られている.本研究では,市場の成熟化・ニーズの多様化により重要視されているマーケティング戦略のCRM(顧客関係管理)に適用すべく,離散凸構造をより精緻に解明した.離散凸最小化に対して,実用上高率的な連続緩和解法の実装と,その効率のよさを理論的に保証する近接定理の導出にも成功した.離散最適化問題は様々な応用分野で現れるが,最適解を効率的に求めることは多くの場合に困難であることが知られている.本研究では,市場の成熟化・ニーズの多様化により重要視されているマーケティング戦略のCRM(顧客関係管理)に適用すべく,離散凸構造をより精緻に解明した.離散凸最小化に対して,実用上高率的な連続緩和解法の実装と,その効率のよさを理論的に保証する近接定理の導出にも成功した.離散最適化問題は,生産計画,ロジスティクス,システム設計,ファイナンスなどの様々な応用分野で現れるが,最適解を効率的に求めることは多くの場合に困難であることが知られている.本研究では,離散最適化問題に対する効率的なアルゴリズムを構築する鍵となる離散凸構造を究明していく.そしてその結果を,顧客情報を管理し,顧客の維持や関係強化を行い,派生需要・潜在需要を創出するマーケティング戦略で,市場の熟成化・ニーズの多様化により重要視されているCRM(顧客関係管理)に適用していく.計画の初年度にあたる本年度では,現状のCRMにおいて顕在する課題・新しい要求の調査を行い,これらを解決する次世代型CRMを達成するために必要な数理的手法・離散凸アルゴリズムの研究を行った.扱うデータの種類が膨大で,離散変数で表されるものと連続変数で表されるものが混在するため,混合整理計画問題を効率的に解く必要がある.そこで,連続/離散ハイブリッ凸関数に対する詳細な考察を行った.まず,離散凸解析において提案されているM凸性に基づき,ハイブリッドM凸性を導入し,整多面体的ハイブリッドM凸関数に対する最小性基準を与えた.さらに,L凸関数に比べて,M凸関数におけるハイブリッド凸性には数学的により精細な議論を必要とし,理論的扱いが困難な状況にあることを指摘した.実用上に,導出した最小性基準を用い,明らかになった困難さを回避することで,特定のクラスについて,効率的なアルゴリズムが構築できると考えられる.離散最適化問題は、生産計画,ロジスティクス,システム設計,ファイナンスなどの様々な応用分野で現れるが、最適解を効率的に求めることは多くの場合に困難であることが知られている.本研究では、離散最適化問題に対する効率的なアルゴリズムを構築する鍵となる離散凸構造を究明していく.明らかになった構造を基礎として,効率的な離散最適化アルゴリズムを開発していく,そしてその結果を,顧客情報を管理し,顧客の維持や関係強化を行い,派生需要・潜在需要を創出するマーケティング戦略で,市場の成熟化・ニーズの多様化により重要視されているCRM(顧客関係管理)に適用していくことを目的とする.本年度では、離散凸関数を実用的に高速に最小化することを実現するために、連続関数を用いて離散関数が定義されているという実用上一般的なケースに対して,連続緩和を利用した最小化法を導入した.さらに,連続緩和を利用した最小化法が効率的であることを理論的に保証する,連続緩和解と離散最小解に対する近接定理を証明した.そして,提案した手法を実装し、提案した手法が既存のアルゴリズムよりも高速に最小解を求めることを数値実験により示した.プログラムの実装に際しては,今後の応用・ソフトウェアの公開を想定して,汎用性並びにユーザビリティにも気を配った開発も行っている.また,この連続緩和に関する離散凸関数における結果を,より一般的なクラスである離散準凸関数に拡張することにも取り組んだ.本研究では,離散最適化問題に対する効率的なアルゴリズムを構築する鍵となる離散凸構造を究明していくことを目的とした.離散最適化問題は,生産計画,ロジスティクス,システム設計,ファイナンスなどの様々な応用分野で現れるが,最適解を効率的に求めることは多くの場合に困難であることが知られている.離散凸構造を基礎として,効率的な離散最適化アルゴリズムを開発した.そしてその結果を,顧客情報を管理し,顧客の維持や関係強化を行い,派生需要・潜在需要を創出するマーケティング戦略で,市場の成熟化・ニーズの多様化により重要視されているCRM(顧客関係管理)に適用していくことを目的とした.応用においては,理論的な計算量による評価だけでなく,実装時の実際の速さ,使いやすさが要求される.そこで本研究では,離散凸関数を実用的に高速に最小化することを主眼においた連続緩和アルゴリズムを開発した.離散L凸関数,離散M凸関数,離散準L凸関数に対して,開発したアルゴリズムの効率の良さを保証する近接的理を導くことができた.実装実験で,既存研究により提案されたスケーリング法などに比べて,実用的に高速に最小化できることが示せた.さらに,今後の応用を想定して,開発したアルゴリズムを広く一般に利用してもらえるよう.離散凸最小化ソルバーとしてソフトウェアの公開・配布も行った.前年度の研究に基づき,離散最適化問題に対するアルゴリズムの枠組みを提案するとともに,これまでの研究結果を論文誌や学会にて発表した.
昼光照明が視的快適性に及ぼす影響に関する基礎的研究

室内光環境の質を損なうことなく、窓を透過した昼光を室内の照明に利用できるようにするためには、窓面から得られる昼光がグレア感(まぶしさ感)や明るさ感にどのような影響を及ぼすかを明らかにしておく必要がある。本研究では、前年度に窓面を透過した昼光による在室者のグレア感を取り上げ、あるグレア感に対してそれを不満とする在室者の割合はどれほどか、また、グレア感が各種光学的物理量とどのような関係にあるかについて実験を中心に検討を行なった。本年度は、前年度の実験結果と若干の追加実験の結果から、グレア感の実験式を求めることを試みた。それによると、グレア感(0がまぶしさを感じ始める、3がひどすぎると感じ始めるに対応する)は、グレア光源の輝度の対数に比例し、グレア光源の大きさには反比例する。また、グレア感は背景輝度の対数とは比例もしくは反比例の関係にある。グレア感が背景輝度の対数に対して比例となるか、反比例となるかは、グレア光源の大きさが影響することが示された。この実験式のグレア感シミュレーションへの適用性を検討するために、間口8m、奥行き8m、天井高2.6mの一般的事務室で、窓が一つの場合、二つの場合などを対象にグレア感の数値計算を試みた。その結果、サンスクリーンはベネシャンブラインドに比べてグレア感を起こさせ易いこと、太陽高度の低い冬季にグレア感が大きくなる傾向にあること等が定量的に表わせることが示された。また、日除けがない場合には、床に入射した直射日光がグレア光源となる可能性があるので、そのグレア感シミュレーションにおける考慮方法について検討を行い、その可能性が示された。本研究は、窓面を透過した昼光による在室者のグレア感を取り上げ、あるグレア感に対してそれを不満とする在室者の割合はどれほどか、また、グレア感が各種光学的物理量とどのような関係にあるかについて検討を行なったものである。輝度可変の模擬窓を有する光環境実験室において、窓面輝度5種類、窓の大きさ5種類、壁面の反射率2種類、被験者の着席位置2種類の合計100条件のそれぞれに対して、被験者10人ずつ(延べ被験者数1000人)を用いて実験を行なった。その結果、グレア感スケ-ルと不満足者率はロジットモデルでよく近似でき、グレア感スケ-ル2(グレアを不快と感じ始める)に対して不満足者率60%、グレア感スケ-ル1(グレアが気になり始める)に対して不満足者率25%であることがわかった。グレア感は、一般に、光源の輝度、光源の立体角の対数に比例し、背景輝度の対数に対しては反比例すると言われてきたが、本研究における実験結果の、グレア感と光学物理量との関係を表わす一般式への当て嵌めを試みたところ、背景輝度の対数に係わる係数が窓面立体角の関数となり、窓面立体角が大きくなると背景輝度の影響は小さくなることがわかった。これは、窓のような大きな光源の場合、光源がある大きさを越えると、光源から目に入る光の総量が問題となることを示唆していると考える。

本研究では、前年度に窓面を透過した昼光による在室者のグレア感を取り上げ、あるグレア感に対してそれを不満とする在室者の割合はどれほどか、また、グレア感が各種光学的物理量とどのような関係にあるかについて実験を中心に検討を行なった。本年度は、前年度の実験結果と若干の追加実験の結果から、グレア感の実験式を求めることを試みた。それによると、グレア感(0がまぶしさを感じ始める、3がひどすぎると感じ始めるに対応する)は、グレア光源の輝度の対数に比例し、グレア光源の大きさには反比例する。また、グレア感は背景輝度の対数とは比例もしくは反比例の関係にある。グレア感が背景輝度の対数に対して比例となるか、反比例となるかは、グレア光源の大きさが影響することが示された。この実験式のグレア感シミュレーションへの適用性を検討するために、間口8m、奥行き8m、天井高2.6mの一般的事務室で、窓が一つの場合、二つの場合などを対象にグレア感の数値計算を試みた。その結果、サンスクリーンはベネシャンブラインドに比べてグレア感を起こさせ易いこと、太陽高度の低い冬季にグレア感が大きくなる傾向にあること等が定量的に表わせることが示された。また、日除けがない場合には、床に入射した直射日光がグレア光源となる可能性があるので、そのグレア感シミュレーションにおける考慮方法について検討を行い、その可能性が示された。
ブタ子宮に存在するプロスタノイド受容体とその機能に関する研究

ブタ子宮に存在するprostanoid受容体種及び合成酵素(cyclooxygenase, COX)について薬理学的、生化学的手法を用いて解析し以下の結果を得た。(1)未経産、発情前期ブタ子宮筋(角部)には収縮性EP1,EP3,FP, TP受容体及び弛緩性EP2,DP, IP受容体が筋層依存性に分布していた(収縮性受容体は縦走筋、弛緩性受容体は輪走筋に高密度に分布)。FP, DP, EP3受容体mRNAの筋層依存性分布もPCRにより確認された。これらブタ子宮に存在する受容体サブタイプは、ヒト子宮で報告されているものと一致していた。(2)DP、FP、TP、EP3受容体作動薬の反応性は、子宮の部位(角部、体部、頸管部)で異なっていた(特に縦走筋、輪走筋では部位差は認められない)。即ち、縦走筋において収縮性prostanoidの反応性は、角部>>体部=頚管部、弛緩性prostanoidの反応性は、頸管部=体部>>角部であり、反応性勾配は収縮性、弛緩性prostanoidでは逆になっていた。この成績から、ブタ子宮では角部の収縮活性が頸管部よりも高くなり、角部から頸管部に向い減少していく内圧勾配が形成されると考えられた。(3)非妊娠子宮ではCOX-1のみが筋層依存性(縦走筋>輪走筋)に発現し、角部から頸管部に向かい減少する勾配を示した。COX-2の発現は非妊娠子宮では認められず妊娠子宮でのみ観察された。また妊娠子宮では、FP受容体を介する収縮反応の増大が認められた。このことは、妊嫁期、prostanoid受容体がup regulationされると共に合成酵素が誘導されprostanoidが大量に産生され子宮運動調節に重要な役割を果たしている可能性を示唆した。(4)COX及びthromboxane合成酵素阻害薬は、子宮縦走筋の自発性収縮高を著明に抑制した。このことより子宮自発性収縮の発現には、内因性prostanoidが関与している可能性が窺われた。本研究から、ブタ子宮はヒト子宮に対するprostanoid受容体作動薬の作用を推定するための有用なモデルになりうること、prostanoid受容体、合成酵素の部位依存性分布によりブタ子宮では角部から頸管部に向かい減少する内圧の勾配が構成されており、自発収縮の発現、内容物の輸送に関与していることが明らかになった。Prostanoid受容体、合成酵素の発現は妊娠期では変化しており、このことはprogesterone, estradiol-17B等が発現調節に関与していることを示唆している。

Prostaglandin(PG)製剤は、獣医臨床領域で分娩誘起、発情同期化などに用いられているがPGの作用部位であるprostanoid受容体の存在、分布を家畜の生殖器系で検討した報告は見当たらない。そこで本研究ではブタ子宮(発情前期)に存在する機能的prostanoid受容体種、その縦走筋(LM)及び輪走筋間(CM)での分布を収縮実験から解析し以下の成績を得た。(1)LMにおいてPGF_<2α>,PGE_2,PGD_2,PGI_2はこの順序で収縮活性を増加した。しかし、高濃度のPGE_2(1μM以上)では収縮抑制が起き濃度反応曲線はベル型になった。(2)CMにおいてPGD_2は、自発収縮の高さ及び頻度を濃度依存性に抑制した。この抑制にはcAMPが関与していた。一方、PGE_2,PGF_2,PGI_2の自発収縮抑制作用は極めて弱かった。(3)Cloprostenol(FP受容体agonist)及びBW-245C(DP受容体agonist)を用いた解析から、ブタ子宮にFP受容体(LM>CM)及びDP受容体(CM>LM)が筋層依存性に存在していることが示された。(4)各種EP受容体のagonist, antagonistを用いた検討から、収縮性受容体としてEP1,EP3が抑制性受容体としてEP2が存在すること、PGE_2による収縮にはEP3が抑制にはEP2が関与していることが明らかになった。(5)Cicaprost(IP/EP3受容体agonist)は、LMの自発収縮を増大させたが、CMの自発収縮は抑制した。このことは、cicaprostがLMではEP3受容体にCMではIP受容体に主に作用することを示し、IP受容体の存在とその分布が筋層により異なることを(CM>LM)示唆した。(6)Indomethacinは、K^+収縮には影響を与えずLMの自発収縮頻度を減弱させた。一方、CMの自発収縮は全く影響を受けなかった。以上の成績から、ブタ子宮には,収縮性(FP,EP1,EP3)及び抑制性(DP,EP4,IP)prostanoid受容体が存在し、その分布には筋層差(IP,DP,CM>LM;EP1,EP3,FP,LM>CM)が認められることが明らかになった。また、indomethacinが自発収縮を減弱させたことから、内因性PGはLMで自発収縮の発生に関与するものと考えられた。ThromboxaneA2(TXA2)はアラキドン酸から合成されるprostanoidの一つであり、子宮平滑筋上のTP受容体に作用し、PGF_<2α>、PGE_2と共に妊娠維持、分娩誘起に重要な役割を果たしている。今回、TP受容体分布がブタ子宮筋層により異なるか否かを収縮実験、器官培養法及び放射性ligand結合実験から検討した。【方法】発情前期ブタ子宮から作製した縦走筋(LM)と輪走筋(CM)標本を37°CKrebs液又は28°CKumagai液中に懸垂し、薬物による機械的反応を波形下面積と収縮高で解析した。LM、CM膜標本に存在するTP受容体の特徴は[^3H]SQ29548結合実験から明らかにした。【結果】1.Krebs液中でU46619は両筋層にTTX非感受性の収縮を誘起した。自発収縮の面積を100%とした時、最大反応はLMで390%、CMで197%、pEC_<50>はLMで6.7、CMで7.3であった。U46619誘発性収縮はTP受容体遮断薬、ICI-192605(PK_B,8.5)、SQ29548(8.0)により競合的に抑制された。2.U46619は、Kumagai液中でも子宮筋収縮を誘起した。50mMK
在宅療養支援診療所における高齢糖尿病患者のフットケアシステム構築のための研究

本研究は、在宅療養支援診療所における高齢糖尿病患者のフットケア(ニーズを満たす)システム構築のための研究である。国内文献検討の結果から、高齢者糖尿病患者におけるフットケア実践は、有床病院における実態研究は進んでいるが、診療所における実態研究は進んでいないことが明らかになった。2018年度は、在宅療養支援診療所のフットケア支援システム構築のための予備調査として、調査協力が得られた糖尿病認定専門医が開業している診療所におけるフットケア介入の実態を検討した。協力施設は、5年以上継続的なフットケア介入が実践されている診療所を選択した。調査は、5年以上、直接的にフットケアの介入をおこなっている5名の看護師(糖尿病療養指導士)へのヒアリングをおこなった。結果、診療所独自のアセスメントシートの活用、デジタルカメラで撮影した足画像の情報共有、非潰瘍性病変の乾燥、亀裂、不適切に切られた爪等の教育・指導という予防的フットケアが展開されていた。課題として、限られた診療時間(予約枠)の中で、医師が指示する糖尿病治療計画の患者の理解度や薬物、食事、運動療法等の多岐にわたる療養指導内容が求められるため、時間不足、人手不足から毎回、外来でフットケア指導をおこなうことは、現実的に難しい状況が明かになった。また、家族支援が得られない高齢者糖尿病患者からの爪切りニーズは増えているものの、多忙さから快く対応しきれない看護師の心のジレンマも聞かれた。2019年度は、糖尿病足病変の病態に応じた支援をおこなうためにリスク要因をチェックするシステムをルチン化する等の方策はフットケアシステム構築のためには必須と考えている。診療所の看護師が無理なく継続的に実施できるフットケア展開および評価のためのフレームワーク作りを進めている。在宅療養視線診療所の高齢者糖尿病患者のフットケア実態把握のため対象数を確保するため、研究協力施設を拡充することに多くの時間を要した。しかし、糖尿病専門医がいる在宅療養支援診療所での事前調査の承諾が得られず研究の進捗が遅れた。高齢者糖尿病患者のフットケア効果測定では、協力が得られた糖尿病専門医が開業している診療所に足底圧分析測定器導入による足の機能評価による計測を予定していたが、診療体制の変更と外来患者数の増加、マンパワー不足により測定器の導入まで至らなかった。また、測定器の設置場所として外来診療の妨げにならない設置場所の検討も必要となり計画に遅れが生じている。以上の段階までの研究に充てる予定であった時間の確保困難と教育等の役割時間の調整が難しく体調を崩しできなかった点も進捗が遅れた理由である現在、在宅医療を担う診療所数をみると、在宅療養支援診療所ではない診療所が相当数あり、高齢者糖尿病患者のフットケアに取り組んでいるのは、糖尿病専門医がいる診療所のシェアが大きいと推測される。実効的な診療所における高齢者糖尿病患者のフットケア実践の基礎データの抽出は、全国の糖尿病専門医がいる診療所調査から在宅療養支援診療所においても共有した方向性を踏まえた実態が明らかになると考えた。倫理委員会承認後、日本糖尿病学会専門医に登録されている診療所の全国調査をおこなう。高齢糖尿病患者のフットケア継続の効果測定については、昨年度と同様に承諾を得ている診療所の外来看護師との連携を図りデータを収集していく。今後、遅れた事項の研究を取り戻す対策として、最終年度は調査のための事務的な課題はアルバイトの活用により効果的に進める計画である。データ収集や研究分担に関しては実施できる体制を再検討する。高齢糖尿病患者の足は、糖尿病罹患歴の長期化による合併症の進行を背景に自覚症状が乏しい上、早期発見や治療が遅れると重症化を招きやすい。この問題が深刻化する前に、かかりつけ医である地域診療所が地域包括ケアシステムに対応した早期発見と早期対応を目的としたフットケア支援を行うことにより、足病変の発見、重症化予防の効果が高くなると考える。平成29年度は、外来における高齢糖尿病患者のフットケアに関する実態調査の動向について国内文献を検討した。文献検討の結果、調査研究対象が病院外来におけるものが9割をしめており、診療所における調査研究の報告はほとんど見られなかった。病院外来におけるフットケアは、患者への一定基準のアセスメント、介入、評価のプロセスがとられ、フットケアを提供すると同時にセルフケア状況の評価、指導用パンフレットを用いた実践報告、その実態に即した予防的フットケアとセルフケア教育支援が実践されていた。課題として非ハイリスク患者への早期介入と予防教育が示唆され、その支援システムの構築課題が示唆されていたが、局部的なケア介入による事例研究が多く実態を把握するのが難しい状況であった。また、本研究の対象施設である診療所(在宅療養支援診療所)のフットケア研究が少なく現状把握の調査の必要性が明らかになった。今年度から来年度にかけて、量的な調査によるアンケート調査を糖尿病認定医がいる診療所のフットケア実践体制についてアンケート調査を実施および質的な調査によるヒアリングを実施する計画を進めている。これらの調査を基盤に在宅療養支援診療所のフットケア支援体制の実態を明らかにし、医師、看護職が対応可能なフットケア支援システムについて検討することが地域医療支援システムにつながると考えた。研究協力施設における調査を計画していたが、体制変更により難しい状況となったため、研究協力施設の拡充をはかるために多くの時間を要した。

また、本研究の調査対象の基盤となる在宅療養支援診療所は、相当数の診療所が在宅医療を実施しているにも関わらず届け出をしていない現状も明らかとなり、平成29年度は研究実施計画の一部変更を必要としたため研究の進捗が遅れた。高齢糖尿病患者のフットケアの効果測定については、10年フットケアを継続している高齢糖尿病患者の評価を行う予定であったが、病状の変化や生活環境の変化に伴う転院等の理由から予定数よりデータ収集人数が減少したこともあり、新たに対象者を追加選定する必要が生じた。本研究は、在宅療養支援診療所における高齢糖尿病患者のフットケア(ニーズを満たす)システム構築のための研究である。国内文献検討の結果から、高齢者糖尿病患者におけるフットケア実践は、有床病院における実態研究は進んでいるが、診療所における実態研究は進んでいないことが明らかになった。2018年度は、在宅療養支援診療所のフットケア支援システム構築のための予備調査として、調査協力が得られた糖尿病認定専門医が開業している診療所におけるフットケア介入の実態を検討した。協力施設は、5年以上継続的なフットケア介入が実践されている診療所を選択した。調査は、5年以上、直接的にフットケアの介入をおこなっている5名の看護師(糖尿病療養指導士)へのヒアリングをおこなった。結果、診療所独自のアセスメントシートの活用、デジタルカメラで撮影した足画像の情報共有、非潰瘍性病変の乾燥、亀裂、不適切に切られた爪等の教育・指導という予防的フットケアが展開されていた。課題として、限られた診療時間(予約枠)の中で、医師が指示する糖尿病治療計画の患者の理解度や薬物、食事、運動療法等の多岐にわたる療養指導内容が求められるため、時間不足、人手不足から毎回、外来でフットケア指導をおこなうことは、現実的に難しい状況が明かになった。また、家族支援が得られない高齢者糖尿病患者からの爪切りニーズは増えているものの、多忙さから快く対応しきれない看護師の心のジレンマも聞かれた。2019年度は、糖尿病足病変の病態に応じた支援をおこなうためにリスク要因をチェックするシステムをルチン化する等の方策はフットケアシステム構築のためには必須と考えている。診療所の看護師が無理なく継続的に実施できるフットケア展開および評価のためのフレームワーク作りを進めている。在宅療養視線診療所の高齢者糖尿病患者のフットケア実態把握のため対象数を確保するため、研究協力施設を拡充することに多くの時間を要した。しかし、糖尿病専門医がいる在宅療養支援診療所での事前調査の承諾が得られず研究の進捗が遅れた。高齢者糖尿病患者のフットケア効果測定では、協力が得られた糖尿病専門医が開業している診療所に足底圧分析測定器導入による足の機能評価による計測を予定していたが、診療体制の変更と外来患者数の増加、マンパワー不足により測定器の導入まで至らなかった。また、測定器の設置場所として外来診療の妨げにならない設置場所の検討も必要となり計画に遅れが生じている。以上の段階までの研究に充てる予定であった時間の確保
ヌクレオソームーエンハンソソーム変換の機構の解明

転写因子は遺伝子の転写制御において中心的な役割を果たすが、転写因子のエンハンサーへの作用機序については未だに不明な点が多く残されている。例えば、ゲノムDNAは単なるDNAとしてではなく、転写因子のDNA結合を阻害するヌクレオソームとして存在するが、ヌクレオソームに対して、転写因子群がどのようにして特異的な結合サイトを探し当て、結合し、転写を制御するのか、その素過程は不明なままである。これまでの解析から、転写因子群のヌクレオソームへの結合には、ヒストン修飾酵素、クロマチンリモデリング因子、ヒストンシャペロン等のタンパク質群や、それらによって引き起こされるヒストン修飾が必要であることが想定されている。本研究では、これらの因子がどのように協調してヌクレオソーム状態のエンハンサーDNAに作用して転写を活性化するのか、その詳細な過程を生化学的な再構成実験により明らかにすることを目的とする。実験内容として、まず蛍光標識した180 bpからなるT細胞抗原受容体(TCRα)のエンハンサーDNAを含むヌクレオソームを調製して、個別に精製したRunx1やEts1等のTCRαエンハンサーを標的とする転写因子群と相互作用するか検証した。その結果、これら転写因子は、ヌクレオソームDNA上の標的配列が末端側に配置されたヌクレオソームに対して結合活性を示したものの、標的配列に変異導入したヌクレオソームに対しても同程度結合したことから非特異的なヌクレオソーム結合であることが示唆された。これらの結果よりヌクレオソームからエンハンソソームへの変換は、転写因子のみでは進展せず、別の因子の関与が示唆された。今後、ヒストン修飾酵素、クロマチンリモデリング因子、及びヒストンシャペロン等の共存下で、転写因子群とヌクレオソームの結合条件の解析を行い、ヌクレオソームDNA上にエンハンソソームが形成される過程を検証する。実験試料の準備として、転写因子群(Runx1, Ets1, LEF1,及びCREB)のDNA結合ドメイン、ヒストンアセチル化酵素p300、ヒストンメチル化酵素NSD1の機能ドメイン、ヒストンシャペロンNap1、クロマチンリモデリング因子ACFの精製を高純度で行った。発現系としては、大腸菌やバキュロウイルスを用いた昆虫細胞を使用した。さらに、転写因子により認識される標的配列クラスターを有するTCRαエンハンサーDNA(180 bp)を蛍光標識し、それを含むヌクレオソームを塩透析法により調製した。また、実験の陽性コントロールとしてiPS細胞を生み出す転写因子Oct3/4及びSox2の標的遺伝子の一つであるLIN28BエンハンサーDNA(162 bp)を含むヌクレオソームも同様に調製した。機能解析として、TCRαエンハンサーDNAを含むヌクレオソームに対して転写因子Runx1, Ets1, CBFβ, LEF1,及びCREBを様々な濃度で加えることで、転写因子群によるヌクレオソームへの特異的な結合をゲルシフトアッセイにより検証した。その結果、これら転写因子は、ヌクレオソームDNA上の標的配列が末端側に配置されたヌクレオソームに対して結合活性を示したものの、標的配列に変異導入したヌクレオソームに対しても野生型と同程度の結合活性を示したことから、両者の結合は非特異的相互作用によるものと考えられた。同様に、陽性コントロールとして準備したLin28BエンハンサーDNAを含むヌクレオソーム対しても、過去の報告に反して転写因子Oct1やSox2による特異的な結合は検出されなかった。これらの解析から、ヌクレオソームからエンハンソソームへの変換は、転写因子のみでは進展せず、別の因子の関与が強く示唆された。今後、ヒストン修飾酵素、ヒストンリモデリング因子、ヒストンシャペロン等を測定に加え、ヌクレオソームと転写因子群の結合条件の解析を行う。1)転写因子には、DNA結合ドメインに加えて転写活性化領域等の転写制御に欠かせない機能性領域が存在するため、本研究では、転写因子の全長を用いて解析することを予定している。転写因子の全長タンパク質の準備状況として、Ets1やLEF1は精製を完了させたが、残り複数の転写因子では発現系の構築段階にある。これらの調製を早期に完了させて解析の系に加える。2)これまでに転写因子群とヌクレオソームとの結合の解離定数をMicroScale Thermophoresis装置(NanoTemper Monolith)により定量解析したが、試料によってはシグナルの不安定化により測定が困難であった。実験方法を改善して、様々な組み合わせの転写因子とヌクレオソーム間の解離定数を解析する。3)TCRα、及びLIN28BのエンハンサーDNAを含むヌクレオソームを再構築し、個別に精製した転写因子群、ヒストンメチル化酵素p300、クロマチンリモデリング因子ACF、ヒストンシャペロンNap1等を様々な組み合わせで作用させ、ヌクレオソームへの転写因子群の結合状態やヒストン修飾状態を解析する。さらに、予め酵素的にアセチル化やメチル化したヌクレオソームを調製し、転写因子群に対する反応の違いを検証する。これらの解析から、ヌクレオソームDNA上に複数の転写因子群からなるエンハンソソームが形成される過程、あるいは、ヌクレオソームからヒストンを競合的に追い出すために必要な因子は何か明らかにする。

例えば、ゲノムDNAは単なるDNAとしてではなく、転写因子のDNA結合を阻害するヌクレオソームとして存在するが、ヌクレオソームに対して、転写因子群がどのようにして特異的な結合サイトを探し当て、結合し、転写を制御するのか、その素過程は不明なままである。これまでの解析から、転写因子群のヌクレオソームへの結合には、ヒストン修飾酵素、クロマチンリモデリング因子、ヒストンシャペロン等のタンパク質群や、それらによって引き起こされるヒストン修飾が必要であることが想定されている。本研究では、これらの因子がどのように協調してヌクレオソーム状態のエンハンサーDNAに作用して転写を活性化するのか、その詳細な過程を生化学的な再構成実験により明らかにすることを目的とする。実験内容として、まず蛍光標識した180 bpからなるT細胞抗原受容体(TCRα)のエンハンサーDNAを含むヌクレオソームを調製して、個別に精製したRunx1やEts1等のTCRαエンハンサーを標的とする転写因子群と相互作用するか検証した。その結果、これら転写因子は、ヌクレオソームDNA上の標的配列が末端側に配置されたヌクレオソームに対して結合活性を示したものの、標的配列に変異導入したヌクレオソームに対しても同程度結合したことから非特異的なヌクレオソーム結合であることが示唆された。これらの結果よりヌクレオソームからエンハンソソームへの変換は、転写因子のみでは進展せず、別の因子の関与が示唆された。今後、ヒストン修飾酵素、クロマチンリモデリング因子、及びヒストンシャペロン等の共存下で、転写因子群とヌクレオソームの結合条件の解析を行い、ヌクレオソームDNA上にエンハンソソームが形成される過程を検証する。実験試料の準備として、転写因子群(Runx1, Ets1, LEF1,及びCREB)のDNA結合ドメイン、ヒストンアセチル化酵素p300、ヒストンメチル化酵素NSD1の機能ドメイン、ヒストンシャペロンNap1、クロマチンリモデリング因子ACFの精製を高純度で行った。発現系としては、大腸菌やバキュロウイルスを用いた昆虫細胞を使用した。さらに、転写因子により認識される標的配列クラスターを有するTCRαエンハンサーDNA(180 bp)を蛍光標識し、それを含むヌクレオソームを塩透析法により調製した。また、実験の陽性コントロールとしてiPS細胞を生み出す転写因子Oct3/4及びSox2の標的遺伝子の一つであるLIN28BエンハンサーDNA(162 bp)を含むヌクレオソームも同様に調製した。機能解析として、TCRαエンハンサーDNAを含むヌクレオソームに対して転写因子Runx1, Ets1, CBFβ, LEF1,及びCREBを様々な濃度で加えることで、転写因子群によるヌクレオソームへの特異的な結合をゲルシフトアッセイにより検証した。その結果、これら転写因子は、ヌクレオソームDNA上の標的配列が末端側に配置されたヌクレオソームに対して結合活性を示したものの、標的配列に変異導入したヌクレオソームに対しても野生型と同程度の結合活性を示したことから、両者の結合は非特異的相互作用によるものと考えられた。同様に、陽性コントロールとして準備したLin28BエンハンサーDNAを含むヌクレオソーム対しても、過去の報告に反して転写因子Oct1やSox2による特異的な結合は検出されなかった。