hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
酸化ストレスの病理的意義の追究とその病理診断への応用

鉄発癌モデルである鉄ニトリロ三酢酸(Fe-NTA)誘発ラット腎発癌でDifferential Displayによるスクリーニングで得られたAnnexin 2(Anx2)の役割について検討を行った。ラット腎正常近位尿細管でAnx2蛋白を検出しなかったが、Fe-NTA投与6時間より、残存尿細管で検出した。Fe-NTA反復投与後3週間ではkaryomegalic cellの胞体・核に集積を認め、腫瘍では主に細胞表面に陽性像を認めた。Anx2はSerとTyr残基においてリン酸化され、actinと共沈した。転移例の原発巣においては高発現を認めた。高発現性Fe-NTA誘発腎がん由来細胞株にanti-sense投与するとapoptosisを起した。LLC-PK1細胞に過酸化水素により酸化ストレスをかけると発現が増加し、この誘導は抗酸化剤で抑制された。Anx2はRous sarcoma virusのがん遺伝子srcの基質として発見されたが、各種kinaseの基質でもあり、さらに線溶系分子の細胞表面受容体などの役割を担う。今回の実験でAnx2がredox制御を受けることを初めて示した。Anx2は、レドックス制御・キナーゼ系・線溶系の要となり、promotion, progressionの過程で重要な役割を果たすと考えられた。更にこの結果を踏まえて、ヒト肺癌の予後の検討を行った。Anx2がひとつの予後因子となることが示された。また、PNAプローブで50年前に包埋されたパラフィン標本でmRNAを検出できることが明かにした。さらに、微量マイクロウェーブ照射装置を使用した方法で、ブロッキング後1時間以内に結果のでるウェスタンブロット法を開発した。生体肝移植に置いてもフリーラジカルによる肝傷害は重要である。今回、ABO血液型不適合輸血に置ける病理診断基準を症例解析により決定した。p15/p16がん抑制遺伝子の意義に関する研究:これまで酸化ストレス発がんの代表例と考えられる鉄キレート剤によるラット腎発がんモデルを使用して、その標的遺伝子がp15/P16がん抑制遺伝子であり、アレル欠損やプロモター領域のメチル化が主たる変化であることを見出した。今年度その変化がどの時期に起こるのかを検討し、実験開始後数週間の早期であることを見出した。この事実をヒト標本に応用するため、in situ hybridizationに関する諸条件の検討を行った。PCRで得られた数kbのプローブとTSA法を組み合わせて行ったが、まだ安定した結果は得られていない。一方、特異性は高いが高価なPNAプローブに関して、標本条件の検討をGAPDHのプローブで行ったところ、30年前のパラフィンブロックでも十分使用に耐えることが判明した。鉄トランスポーターの意義に関する研究:鉄の吸収機構に関して、5年前に初めて小腸上皮に存在する鉄トランスポーター(DMT1,NRAMP2)がクローニングされた。本研究においては、自然なかたちで吸収された過剰鉄が発がんなどのヒトの病態に関与するか調べるため、今年度トランスジェニック動物の作製を行った。まずラットDMT1(NRAMP2)をpCAGGS(Chicken beta-actin promoter)ベクターにクローニングし、トランスジェニック用ベクターを作製した。このベクターをC57B6とDBAのF1動物の卵にin jectし、同じくF1動物の子宮内に戻し、キメラ動物を作製した。ベクターの作製にあたっては、培養細胞COS7にtransient transfectionをすることにより、細胞内の鉄含有量が増加するかどうかをあらかじめ確認した。現在、キメラ動物が得られ、解析を進めている。鉄ニトリロ三酢酸(Fe-NTA)をラットに腹腔内に反復投与すると、高率に腎癌が発生する。

この発癌過程では鉄を介したフェントン反応が関与していること、癌の悪性度が高いことが特徴である。このモデルでDifferential Displayによるスクリーニングで得られたAnnexin 2(Anx2)の役割について動物モデル・試験管内の実験で詳細な検討を行い、次にヒトの癌の予後判定に役立つかどうかを手術標本を使用して検討した。ラット腎正常近位尿細管でAnx2蛋白を検出しなかったが、Fe-NTA投与6時間より、残存尿細管で高い発現を検出した。Fe-NTA反復投与後3週間ではkaryomegalic cellの胞体・核に集積を認め、腫瘍では主に細胞表面に陽性像を認めた。Anx2はSerとTyr残基がリン酸化され、リン酸化されたactinと共沈した。転移例の原発巣において高発現を認めた。高発現性Fe-NTA誘発腎がん由来細胞株にanti-sense投与するとapoptosisを起した。LLC-PK1ブタ尿細管細胞に過酸化水素により酸化ストレスをかけると発現が増加し、この誘導は抗酸化剤で抑制された。Anx2はがん遺伝子srcの基質として発見されたが、各種kinaseの基質でもあり、さらに線溶系分子の細胞表面受容体などの役割を担う。今回の実験でAnx2がレドックス制御を受けることを初めて示した。Anx2は、レドックス制御・キナーゼ系・線溶系の要となり、promotion, progressionの過程で重要な役割を果たすと考えられた。更にこの結果を踏まえて、ヒト肺癌の予後の検討を行った。Anx2の発現の高い肺癌は予後の悪いことが判明した。
重い中空原子多価イオンの静的状態と動的過程の理論

原子番号の大きい元素の多価イオンの電子状態の計算には、相対論が必須である。計算のためのコードとして、オックスフォード大学数学研究所のI.P.Grant氏等の手になるコードGRASP2(General purpose Relativistic Atomic Structure Program 2)を使用することとし、設備備品として新規に購入したワークステーションNWS-5000VIにインストールし、動作の調整を行った。現在調整は完了し、CSFの数にして2000弱の規模の計算が可能になっている。大規模な計算には、プログラムの改良が必要である。そこで本研究の代表者は上記インストールに先だち、1993年8月、約1ヶ月にわたり、オックスフォード大数学研究所に滞在し、プログラムの書換、改良についてのノウハウ、さらにGRASP2の利用法についてのノウハウを学んだ。加えて、オックスフォード大(現在、スエーデン、ゲーテブルグ)のS、Fritzche氏の開発した、Auger Programを、ゆずり受け持ち帰って、ワークステーションにインストールした。現在、動作の調整中であるが小規模の計算ならば安定に走り、合理的な結果を出すことが確認できている。
脾臓内ラット睾丸腫瘍の細胞起源と組織発生ーセルトリ細胞を中心として

去勢ヌ-ドマウスの脾臓内に移植された新生仔ラットの精巣の結節性初期増殖病変に至る過程を、セルトリ細胞の動態に焦点を当てて調べた。1週齢のラットは精巣では多くのセルトリ細胞がまだ分裂を続けているが、2週齢ではS期のセルトリ細胞の数は激減し、3週齢以後はBrdUを取り込むセルトリ細胞は見当たらない。一方去勢雄ヌ-ドマウスの脾臓内に移植された新生仔ラットの精巣では、3週間後には精原細胞やライディッヒ細胞の一部にBrdUの取り込みを認めたが分裂するセルトリ細胞は認めなかった。即ち、セルトリ細胞の生理的分裂能の停止は移植により影響を受けなかった。脾内のラット精巣はマウスのゴナドトロピンに刺激されて次第に大きくなるが、精細胞の消失、ライディッヒ細胞の過形成の程度はラットの脾内におけるよりは軽い。5ケ月過ぎより白膜に接して結節病変が出現する。頻度はACI系の精巣を使用した場合は30%,BUF,ハイブリッドの場合には50%以上であったが、F344系の精巣を移植した10例では0%であった。初期病変では白膜に侵入した精細管の局所的増殖に始まる。増殖のきっかけは定かではないが、結合組織に偶々侵入した萎縮精細管内のセルトリ細胞が、peritubular myoid cellの消失を伴いつつ連続性の細胞塊として結合織内に増殖、侵入する像がしばしば見られる。出来上った結節病変の周囲および内部にも好銀繊維染色で輪郭される精細管由来の構造が見られ、BrdUを取り込む細胞が散在する。一旦分裂を停止したセルトの細胞を増殖に駆り立てる刺激が何かは推定の域をでない。精細胞、peritubular cellなどのコントロ-ルから解放されたセルトリ細胞がホルモンレセプタ-を介して感受性を増し、FSH等の刺激に反応するようになるのではと思われる。今後は、精細管のみ、あるいは培養セルトリ細胞のみの移植などの結果を通じて腫瘍化のメカニズムのより確かな理解が得られるであろう。
抗がん剤静脈内投与時における職業性曝露対策のためのエビデンスの構築

3か年の予算内での研究全体の3つの目標を設定し、中心的な研究に着手した。今年度は抗がん剤の静脈内投与手技の違いによる、投与環境および看護師の個人防護具の抗がん剤汚染の違いを明らかにし、安全で合理的な職業性曝露対策の具体策について検討することを目的に具体的な研究計画を立案し、平成29年3月2日に東京医科大学医学部看護学科倫理審査委員会に実施の承認を得た。本研究では、CPA(エンドキサン)・5FU(フルオロウラシル)を含むレジメンを投与する外来化学療法室において、「がん薬物療法における曝露対策合同ガイドライン」で推奨されるCSTD(閉鎖式薬物移送システム)を使用する群と使用しない群(一般輸液セットを使用する群)とに分け、CPA・5FUによる汚染の実態を比較する。調査対象は48施設、調査方法として、床はサンプリングシート法を、トレイ・ガウン・手袋については抽出法を、換気扇ルーバーには拭き取り法を使用し調査することとした。本研究については3月初旬よりデータ収集の協力施設の募集を始めた。また、これに平行し、基礎調査として蛍光薬を用いた投与時の汚染の可視化の計画を立案した。本研究では、蛍光薬を抗がん薬に見立て調製用CSTDを用いて輸液バッグに混注、これを一般輸液セットまたは投与用CSTDを使用して投与のプロセス(穿刺→プライミング→接続→除去)を撮影し可視化する。今年度は研究計画の検討と必要物品(各社CSTD)の入手方法について確認した。本研究は倫理審査が不要なものであるため、次年度早々に実施予定である。本研究の実施について、2016年末までに倫理審査承認を得て、2017年3月末までに5件のデータ収集を行う予定であった。実際は倫理審査承認が得られたのが2017年3月となり、それから協力施設を探し調整を始めた。そのため、3月中のデータ収集は行えなかった。研究班員全員が毎月1件の協力施設を確保するならば予定通りの進行となるため、そのようにすすめていく。これまで抗がん剤投与時に一般輸液セット使用していたが、CSTD導入または導入を検討しているという施設が増加してきている。そのため、当面は一般輸液セットを使用している施設を集中的に探し、優先的にデータ収集していく。
低次元系多体効果の数値的手法による研究

強い相互作用が本質的に重要な系の場合,単純な近似による取り扱いは正当化されないことが多く,この様な場合に数値的な手法が極めて有力な方法となる.またスピン系は,電子系がある意味で相互作用の強い極限で実現しているとも考えられる.このような視点から以下のような系について数値的な研究を行った.(I)1次元量子Ashkin-Tellerモデルはユニタリー変換によりボンド交替のあるスピン鎖に変換される.このモデルはあるパラメータの極限において,スピン1のハイゼンベルグモデルに一致することから,いわゆるハルディン相の存在が期待される.このような観点から次のような成果を得た.高次の級数展開法を用いて定量的に相図を完成した.摂動展開は17次まで行い,比熱・磁化・帯磁率に対応する量を求めた.展開された級数をPade近似により評価することで転位点における臨界指数を求めた.この結果,臨界指数が連続的に変化する臨界線の存在が新たに認められた.具体的には,低エネルギー励起をLanczos法で求め,そのconformal towerの解析から系を記述する場の種類を特定した.この数値的に求められた場の種類が,予想されたものと一致することを確認した.(II)磁場中の2次元電子系,ネットワーク系物理をトポロジカルな手法,フラクタルの視点等種々の面から研究した.(III)またメゾスコピック系で問題となっている小さなリングでの永久電流についてもこのエッジ状態を使った議論により研究を行った.(IV)ネットワーク化された計算機環境における物性物理研究という面に関してもノートブックパソコン,UNIXネットワーク,電子メールなどを十分に活用した研究を行うことができた.強い相互作用が本質的に重要な系の場合,単純な近似による取り扱いは正当化されないことが多く,この様な場合に数値的な手法が極めて有力な方法となる.またスピン系は,電子系がある意味で相互作用の強い極限で実現しているとも考えられる.このような視点から以下のような系について数値的な研究を行った.(I)1次元量子Ashkin-Tellerモデルはユニタリー変換によりボンド交替のあるスピン鎖に変換される.このモデルはあるパラメータの極限において,スピン1のハイゼンベルグモデルに一致することから,いわゆるハルディン相の存在が期待される.このような観点から次のような成果を得た.高次の級数展開法を用いて定量的に相図を完成した.摂動展開は17次まで行い,比熱・磁化・帯磁率に対応する量を求めた.展開された級数をPade近似により評価することで転位点における臨界指数を求めた.この結果,臨界指数が連続的に変化する臨界線の存在が新たに認められた.具体的には,低エネルギー励起をLanczos法で求め,そのconformal towerの解析から系を記述する場の種類を特定した.この数値的に求められた場の種類が,予想されたものと一致することを確認した.(II)磁場中の2次元電子系,ネットワーク系物理をトポロジカルな手法,フラクタルの視点等種々の面から研究した.(III)またメゾスコピック系で問題となっている小さなリングでの永久電流についてもこのエッジ状態を使った議論により研究を行った.(IV)ネットワーク化された計算機環境における物性物理研究という面に関してもノートブックパソコン,UNIXネットワーク,電子メールなどを十分に活用した研究を行うことができた.
シロイヌナズナ生態株間の二次代謝産物量をコントロールするncRNA遺伝子の役割

比較ゲノム解析によって、系統特異的に最近に重複した遺伝子は、二次代謝産物に関係する傾向が高いという結果を得ている。しかし、一方で、比較的最近に重複した二次代謝産物の生成に関係する遺伝子は、冗長した機能を保つことも明らかになっている。このように、重複遺伝子が持つ多様性と冗長性が、各代謝産物に関係する遺伝子を同定するための大きな壁になっている。そこで、トランスクリプトームを取り入れたゲノム関連解析によって、各代謝産物に関係する遺伝子を網羅的に同定する方法を構築した。その結果、重複遺伝子も、二次代謝産物の多様性に大きく影響するが、ncRNA遺伝子も大きく影響していることを明らかにした。二次代謝産物が同種内の局所適応で必須であるならば、幅広い環境条件で生き残っているシロイヌナズナの生態株間では二次代謝産物の多様性があることが期待される。そこで、SNPで既に同定されている世界中の76ヵ所で自生しているシロイヌナズナの生態株に着目し、50種類の既知二次代謝産物と1000種類の未知の二次代謝産物の定量を行った。その結果、同種間でも生態株間で二次代謝産物のに多様性があることが明らかとした。その後、各二次代謝産物の多様性の原因となる遺伝子を同定するために、ゲノム関連解析を用いて各代謝産物の蓄積量に相関するSNPを同定した。しかし、相関するSNPの近辺には多数遺伝子が存在しており、各代謝産物の蓄積量に真に関係する遺伝子を同定することは困難であった。そこで、75個の生態株の全遺伝子の発現プロファイルをマイクロアレイによって同定し、各代謝産物の蓄積量と相関する遺伝子発現を示す遺伝子も同定した。次に、代謝産物の蓄積量に強い相関を示すSNPが近縁にあり、その遺伝子発現自身も代謝産物の蓄積量に強い相関を示す遺伝子群を各代謝産物の生合成に関係するものと定義した。しかし、各代謝産物の生合成に関連している遺伝子が、重複遺伝子である傾向は見られなかった。これは、二次代謝産物の多様性を生み出す主要因が、重複遺伝子であることを否定していた。一方で、想定外のことであったが、各代謝産物の生合性に関係する遺伝子の多くに、PolyAを持つ機能未知のnon-coding RNA(ncRNA)遺伝子が同定された。そこで、様々な代謝産物の生成に関わると考えられる13個の機能未知のncRNA遺伝子に焦点を絞り、Reference株であるCol-0において、それらの遺伝子の変異体(過剰発現体およびノックアウト体)が二次代謝産物を変動させているかを検討した。その結果、いくつかのncRNA遺伝子で、目的の二次代謝産物を変動させていることを明らかとしている。代謝産物の生合成に関与するncRNA遺伝子の同定Reference株を用いた逆遺伝学手法によって、明瞭に代謝産物の生合成に関与するncRNA遺伝子を同定する。その後、代謝産物の生合成に関与するncRNA遺伝子の発現多型生態株間のncRNA遺伝子のプロモーター部分も合わせたDNA多型およびメチル化の違いを調べ、ncRNA遺伝子の発現が生態株間で異なる原因因子を推定する。さらに、ncRA遺伝子の変異体解析ncRNA遺伝子の過剰発現体およびノックアウト体で、トランスクリプトーム解析およびヒストンを中心としたエピジェネティクス解析を行い、ncRNA遺伝子の下流因子を同定する。最後に、ncRNA遺伝子の下流に存在する生合成酵素の同定ncRNA遺伝子の下流因子に存在すると考えられる対象代謝産物の生合成遺伝子を逆遺伝学的方法によって同定する。

しかし、一方で、比較的最近に重複した二次代謝産物の生成に関係する遺伝子は、冗長した機能を保つことも明らかになっている。このように、重複遺伝子が持つ多様性と冗長性が、各代謝産物に関係する遺伝子を同定するための大きな壁になっている。そこで、トランスクリプトームを取り入れたゲノム関連解析によって、各代謝産物に関係する遺伝子を網羅的に同定する方法を構築した。その結果、重複遺伝子も、二次代謝産物の多様性に大きく影響するが、ncRNA遺伝子も大きく影響していることを明らかにした。本研究では、ncRNA遺伝子、エピジェネティクス制御、生合成遺伝子発現の変化、二次代謝産物の生成という分子メカニズムの過程を明らかにすること目指している。現在までで、エピジェネティクス制御によって生合成遺伝子発現の変化することを強く示唆する結果を得ているため、おおむね順調に進展しているといえる。27年度が最終年度であるため、記入しない。比較ゲノムncRNA遺伝子発現が高い生態株と低い生態株で、バイサルファイトシークエンス方法によってメチル化状態を調べ、ncRNA遺伝子の発現の原因を推定する。ncRNA遺伝子の発現の原因となりえるDNA変異あるいはメチル化の変異を見出した際は、その変異を示すncRNA遺伝子領域をncRNA遺伝子発現が高い生態株と低い生態株間の掛け合わせで導入し、その変異を含んだ掛けあわせ体で期待通りの遺伝子発現を示すかを確認する。期待通りの発現を確認できたならば、遺伝子発現にトランスの影響はほとんどなく、同定された変異によって遺伝子発現が変動することを意味する。ncRNA遺伝子の過剰発現体とノックアウト体の変異体で遺伝子発現が反対になっている酵素遺伝子は、目的の代謝産物の生合成酵素である可能性が高い。そこで、その生合成酵素の候補遺伝子の変異体と野生株間で、目的の代謝産物に変動があるかを確認する。学術研究助成基金助成金500万円は、25年・26年度では、主に消耗品として、160万円使用した。次年度使用額が生じた理由として、ポスドク研究員を雇用する代わりに、技術員を雇用したこと、次世代シークエンスに使用する予定だった物品費は様々なゲノム支援の研究費に通ったため使う必要がなくなったためである。ncRNA遺伝子発現が高い生態株と低い生態株で、バイサルファイトシークエンス方法によってメチル化状態を調べ、ncRNA遺伝子の発現の原因を推定する。
ラジカル反応による多元素環構築のための新方法論

近年、有機合成化学においてラジカル反応の化学の重要性が再認識されると共に、その未開拓な潜在力が注目されている。本研究では、多元素環構築のための新方法論の開発を、一酸化炭素の取り込みを伴うタンデム型ラジカル反応に依拠して達成するものとした。特に炭素ラジカル種の一酸化炭素への付加と、つづくアシルラジカル種の分子内SH2型反応による含カルボニルヘテロ環構築法の開発を検討した。その結果、以下にしめすような3つの型の反応を達成した。オレフィンへのシリルカルボニル化に基づく方法を検討した結果、アシルラジカル種は分子内の硫黄への攻撃を行い、tert-ブチルラジカルの脱離と共に五員環のチオラクトンが生成した。また同様なセレノエーテルとの反応では五員環のセレノラクトンが生成した。一方、ケイ素上でのアシルラジカルによる分子内SH2型反応について検討しシラシクロペンタノンへの変換を期待した。その結果、アルキル基やトリメチルシリル基を脱離基として用いた場合には分子内SH2型反応は生起しなかったが、トリメチルスズ基を脱離基として用いた場合に反応が進行し、期待したシラシクロペンタノンが生成した。シラシクロペンタノンは基本的環骨格を有するヘテロ環化合物であるにもかかわらず、これまでほとんど知られていない。本反応はアシルラジカルによるケイ素上でのSH2型反応の最初の例であり、一酸化炭素の組込みによる新手法となる。
ヒト歯髄幹細胞による肝不全に対する新規再生医療の開発

四塩化炭素誘導肝不全モデルマウスに未分化乳歯幹細胞1.0x10^6を脾臓内に注入した。病理学的解析により、肝組織における線維化の軽減化ならびに肝細胞壊死像の減少が認められた。治療効果の機序として、星細胞の活性化抑制による線維化の軽減および免疫担当細胞(クッパー細胞、Tリンパ球)の抑制効果による抗炎症効果が示唆された。in vitroにて乳歯幹細胞より肝細胞への分化誘導に成功し、上記実験方法にて肝障害モデルマウスにこの分化誘導肝細胞を移植したところ治療効果が確認されるに至った。さらに臨床応用を視野にXeno-Freeの細胞培養培地で乳歯幹細胞の増殖および肝細胞へ分化誘導させることに成功した。8週齢C57BL/6マウスに、四塩化炭素CCl4(0.5ml/kg)を週2回、計8週間腹腔内投与し、肝障害モデルマウスを作製した。病理学的解析により、肝組織における線維化および肝細胞壊死像が認められた。次に四塩化炭素CCl4を週2回、計4週間腹腔内投与後、未分化乳歯幹細胞1.0x10^6を脾臓内に注入した。さらに4週間CCl4投与を継続し、解析を行ったところ。また、レシピエントマウス肝組織において、ドナー未分化乳歯幹細胞が生着し機能的肝細胞へ分化している事が確認された。この生体内で分化した乳歯幹細胞由来肝細胞を一度単離して取り出し、再度同様の実験にて肝障害モデルマウスに移植した場合でも抗線維化、抗炎症効果がみられた。また、in vitroにて乳歯幹細胞より肝細胞への分化誘導に成功し、上記実験方法にて肝障害モデルマウスにこの分化誘導肝細胞を移植したところ治療効果が確認されるに至った。当初の計画通り薬剤性の肝不全モデルマウスの作製に成功し、乳歯幹細胞および乳歯幹細胞由来肝細胞の移植実験を行った。その結果乳歯幹細胞および乳歯幹細胞由来肝細胞の薬剤性肝障害に対する治療効果を確認するに至った。さらに臨床応用を視野にXeno-Freeの細胞培養培地で乳歯幹細胞の増殖および肝細胞へ分化誘導させることに成功し、現在モデルマウスに対する治療効果の解析を進めている。さらに、臨床応用も視野にXeno-Free培養にも着手できている。8週齢C57BL/6マウスに、四塩化炭素CCl 4(0. 5m /kg)を週2回、計8週間腹腔内投与し、肝障害モデルマウスを作製した。次に四塩化炭素CCl 4を週2回、計4週間腹腔内投与後、未分化乳歯幹細胞1. 0x10^6を脾臓内に注入した。さらに4週間CCl 4投与を継続し、解析を行ったところ。また、i n vi troにて乳歯幹細胞より段階的にサイトカインを培地に加えることで肝細胞への分化誘導に成功し、上記実験方法にて肝障害モデルマウスにこの分化誘導肝細胞を移植したところ治療効果が確認されるに至った。

さらに臨床応用を視野にXeno-Freeの細胞培養培地で乳歯幹細胞の増殖および肝細胞へ分化誘導させることに成功したが、ドナーによる分化効率や獲得機能の差があることがわかり、その差異についてさらなる解析を進めている。四塩化炭素誘導肝不全モデルマウスに未分化乳歯幹細胞1.0x10^6を脾臓内に注入した。病理学的解析により、肝組織における線維化の軽減化ならびに肝細胞壊死像の減少が認められた。治療効果の機序として、星細胞の活性化抑制による線維化の軽減および免疫担当細胞(クッパー細胞、Tリンパ球)の抑制効果による抗炎症効果が示唆された。in vitroにて乳歯幹細胞より肝細胞への分化誘導に成功し、上記実験方法にて肝障害モデルマウスにこの分化誘導肝細胞を移植したところ治療効果が確認されるに至った。さらに臨床応用を視野にXeno-Freeの細胞培養培地で乳歯幹細胞の増殖および肝細胞へ分化誘導させることに成功した。乳歯幹細胞および乳歯幹細胞由来肝細胞の薬剤性肝障害に対する治療効果について、その作用機序や長期成績について解析を進めていく。今後は他の肝不全モデルについても治療効果の検証を行う予定である。臨床応用に有用な乳歯幹細胞の品質評価法や条件を検討していく。また、今後は他の肝不全モデルについても治療効果の検証を行う予定である。小児外科乳歯幹細胞および乳歯幹細胞由来肝細胞の薬剤性肝障害に対する治療効果についての作用機序や長期成績解析が継続中であるため。臨床応用を視野にXeno-Free培養に着手し、次年度に継続するため。また、他の肝不全モデルについても治療効果の検証を行う予定である。臨床応用に有用な乳歯幹細胞を培養し、品質評価法や条件を検討していく。
かゆみ受容体の同定

ASIClaとASIC3のダブルノックアウトマウスを作製した。このマウスを使ってヒスタミン皮内注射による掻爬実験を行った。ヒスタミン100nmolを剃毛したマウスの背側頸部に皮内注射し、20分間で何回掻爬行動を起こすか計測したところ、野生型マウスで平均数回、ダブルノックアウトマウスでもおよそ7,8回程度であり、有意差は得られなかった。これとは別に、いくつかのプロテアーゼインヒビターのASICチャネルに対する効果を検討した。急性膵炎の治療に使われているnafamostatmesilate(NM)は、高濃度(mMオーダー)で肥満細胞からのヒスタミンの放出を抑制するのであるが、これを全身投与された患者は、しばしばかゆみの消失を訴えていた。全身投与時の血中濃度は高くてもμMのオーダーであり、このかゆみ抑制効果が肥満細胞の活性抑制を介しているとは考えにくい。そこで、この薬物自身がASICチャネルをブロックするのではないかと考え、アフリカツメガエル卵母細胞にヒトASIC1a、ASIC2、ASIC3を強制発現させ、NMの効果を電気生理学的に調べたところ、μMオーダーのNMの存在下で、内向き電流がほぼ完全に抑制されることがわかった。このことは、感覚神経に発現するASICチャネル分子がかゆみ受容体として機能している可能性を示唆している。現在、種々の方法を用いて研究を継続している。現在、C線維(痛み・痒みを伝達する感覚神経)に発現する二つの陽イオンチャネル(orチャネルファミリー)-カプサイシンレセプターTRPV1(transient receptor potential-V1)と酸感受性イオンチャネルASIC(acid-sensing ion channel)-が、かゆみの惹起にどのように関与しているのか別々に検討している。掻痒物質の代表であるヒスタミンはC線維においてphospholipase A_2(PLA_2)とlipoxygenase(LO)の経路を活性化し、このpathwayで生成される代謝産物(12-HETEなど)がTRPV1を活性化することで、C線維に内向きカルシウム電流を引き起こすことが推測されている。このことは、ヒスタミンが引き起こす痒みにヒスタミンにより間接的に活性化されたTRPV1が関与している可能性を示唆している。我々は、TRPV1ノックアウトマウスを用いて痒み誘発試験を行い、野生型マウスとの比較を行った。ヒスタミン100nmolを毛を剃ったマウスの背側頸部に皮内注射し、20分間で何回掻爬行動を起こすか計測したところ、野生型マウスで平均数回程度、ノックアウトマウスでおよそ30回程度であった。この結果は、TRPV1ノックアウトマウスは痒みに鈍感になって掻爬回数が増えるであろうという我々の予測とは全く逆の結果であった。TRPV1は痛みの受容体として確立しているので、ノックアウトマウスでは痛みに鈍くなった分、痒みに対して感度が上がったと考えられ、痛覚と掻痒感との関連を示唆するもので大変興味深い。一方、同様の痒み誘発試験をASIC1aとASIC3ノックアウトマウスに対して行ったところ、どちらのマウスも野生型に比べて掻爬回数がわずかに上昇しているように見えた。ただ、有意差が得られず、ASIC1aとASIC3のダブルノックアウトマウスを用いて実験を行うことにした。現在、matingにてマウスを作製しているところであり、結果は来年度に報告したい。
ＬＲＲＫ１によるＥＧＦＲリソソーム分解経路選別機構の解析

ROCOファミリーキナーゼLRRK1はRasに似たGTPaseドメインとMAPKKKに似たキナーゼドメインを持つユニークな分子である。これまで我々は、LRRK1がキナーゼ活性依存的に、EGFRの細胞内トラフィックを制御することを明らかにしてきた。LRRK1はEGF刺激依存的にEGFRと複合体を形成し、EGFRの早期エンドソームから後期エンドソームへの移行を制御する。生細胞を用いたタイムラプス観察から、LRRK1によるEGFRの輸送制御は微小管上をDyneinモータータンパク質依存的に行われることを明らかにした。この輸送制御にはLRRK1のキナーゼ活性が重要な働きをしており、恒常的に活性化させたLRRK1を発現させると、EGFRの輸送が過剰に促進されることを見いだした。その結果、EGFRを含むエンドソームでは早期エンドソームから後期エンドソームへの成熟が異常となり、核付近に肥大化した未成熟でミックスされた小胞を形成する。さらに我々はLRRK1の基質として、微小管プラス端結合因子CLIP-170を同定した。質量分析によりLRRK1がリン酸化する部位を同定したところ、LRRK1はCLIP170のC末のアミノ酸を複数リン酸化し、CLIP-170とp150Gluedとの結合を制御していることが明らかとなった。LRRK1によるCLIP-170のリン酸化は、EGFRを含む早期エンドソームの微小管上輸送の開始に重要である可能性が考えられ、今後その分子メカニズムを解析していく予定である。24年度が最終年度であるため、記入しない。これまで我々は、LRRK1がEGFRの細胞内トラフィックを制御することを明らかにしてきた。電子顕微鏡観察から、これらの小胞では内部小胞の形成が阻害されていることを明らかにした。またLRRK1のキナーゼ活性は、複合体に含まれるEGFRによってリン酸化され抑制されていることも明らかにした。EGFRキナーゼの活性はエンドサイトーシスに重要であることが知られているが、本研究から、EGFRキナーゼはLRRK1を負に制御することで自身の細胞内トラフィックを適切に制御していることが明らかとなった。LRRK1によるEGFR細胞内トラフィックの制御機構に関し、現在のところ順調に成果を出し論文としても発表できている。現在までに得られた知見をもとに研究計画に沿って研究を遂行する。これまでのところ特に大きな問題はなく、本年度中に論文として発表できるよう研究を進める予定である。
１７～１９世紀アジア認識の転換過程の日韓比較分析―「漂流記」言説を中心に

1、高月観音の里歴史民俗資料館にて対馬藩に関する史料を入手した。韓国での史料調査(大韓民国国史編纂委員会、ソウル大学校奎章閣、大韓民国中央図書館、高麗大学校)において、対馬藩、朝鮮通信使などに関する史料を入手した。特に国史編纂委員会で300冊・20000枚にわたる「宗家文書」史料を収集することができ、これらの史料は今後も長期的に活用できるという点においても意義深い。2、1811年度の通信使と日本知識人との接触を中心としてみる徳川後期の朝鮮認識について、論文「近世後期日本人の朝鮮認識ー文化度通信使との接触を中心として」としてまとめて学会誌に投稿し、現在審査中である。19世紀初期の朝鮮認識について、「異学の禁」を経て朱子学に対する関心が高まるという背景、そして易地聘礼という新たな形での日朝関係の展開の現実化という背景をもとに、礼的秩序における日朝関係の位置づけに対する再解釈が要請され、そうしたなか朝鮮との「対等」関係をいかにすれば実現できるのかということを模索する過程にあったことを示した。3、対馬藩知識人の朝鮮認識について、論文「対馬藩儒満山雷夏の自他認識ー「藩屏」論と「礼」論より」にまとめ学術誌に掲載された。18世紀後期の対馬の知識人たちは、対馬を徳川幕藩体制下に積極的に位置づけるため、対馬の不確かな位置づけについて礼的秩序に基づいて前近代の王権同士での整合性を合わせようとする方向性と、もっぱらその軍事的役割を強調する方向性が存在しており、「文」を志向するのか「武」を志向するのかという複数の方向性が存在していたということを示した。今後、上記2、3の論文を中軸に据えて博士論文としてまとめていく計画である。また漂流民に関する史料については概ね収集できているので、今後成果物としてまとめていく計画である。29年度が最終年度であるため、記入しない。本年度は、今後の研究の中核をなす基本資料の収集・調査を行い、研究史・論点の整理を行うなど、基礎的な作業に重点を置いて研究に取り組んできた。1.史料の収集・調査では、まず活字化されている基本史料の収集(例えば石井研堂『江戸漂流記総集』、荒川秀俊『異国漂流記集』、関西大学東西学術研究所『江戸時代唐船漂着資料集』など)を行った。また各地での史料調査(北海道大学北方資料館、道立文書館、名古屋市蓬左文庫、東京都立中央図書館、国立公文書館、国立国会図書館など)を行った。2.研究状況は次の通りである。武士階層の朝鮮認識を検討するため、1819年に朝鮮へ漂着した薩摩藩士の記録(『朝鮮漂流日記』)を分析した。ここで徳川日本の武士階層と朝鮮の文人は共通する漢字文化を基盤とした相互認識を有していたことを指摘した。また庶民階層の朝鮮認識を考察するため、日本から朝鮮に漂着した事例の網羅的検討を行った。ここから朝鮮認識には階層的差異が見出されることを指摘した。これらをより広い動向に位置づけるため知識人層の朝鮮認識一般の検討を行った。また並行して行った夫馬進『朝鮮燕行使と朝鮮通信使』の書評執筆を契機に、朝鮮通信使も踏まえて検討することが議論を活かすのに有用であることを見出した。すなわち1819年に朝鮮へ漂着した薩摩藩士の記録にある朝鮮文人との筆談をより広い文脈でとらえるためには、1811年の通信使と日本側文人との接触についても検討することには意義があり、漂流記執筆者の対外観(今後検討予定)とを有機的に連関させることができる見通しが立った。日本国内での資料収集・調査には当初の計画よりも時間を要することとなった。また、対象を朝鮮漂着漂流民に限定して行ったため、他地域への漂流民、漂流記執筆者にまで検討は及ばなかった。しかしながら、朝鮮通信使に着目することに大きな意義を見出したことは、今後の研究の方向性を左右すると言え、当初の想定を超えた大きな進展であると見なせる。以上の理由によりおおむね順調に進展していると評価する。1.史料の収集・調査では各地での史料調査(国立国会図書館、国立公文書館、福岡県立図書館、山口県立文書館、長崎県立対馬歴史民俗資料館、高月観音の里歴史民俗資料館など)を行った。とりわけ長崎県立対馬歴史民俗資料館での調査においては200冊・40000枚にわたる「宗家文書」史料を収集することができ、これは長期的に見ても意義深い調査となった。(1)昨年度新たに発見した論点である朝鮮通信使との関連について深化させることができた。1811年度の通信使と日本知識人との接触を中心として、徳川後期の朝鮮認識について検討した。これを韓国の学会にて報告(「19世紀初期朝日相互認識の一側面ー日本知識人と1811年辛未通信使との接触を中心に」)したうえで、論文(「徳川後期知識人の朝鮮認識と文化度通信使」)として完成させ学会誌に投稿した(審査中)。(2)対馬での調査を契機として、新たに「対馬藩知識人の朝鮮認識」という論点に着目することが有用であることを見出した。そこで国内外の学会で報告(「近世後期対馬における朝鮮認識ー小田幾五郎を中心としてー」、「18世紀對馬島知識人の自他認識構造」)し、現在論文にする準備をしているところである。

韓国での史料調査(大韓民国国史編纂委員会、ソウル大学校奎章閣、大韓民国中央図書館、高麗大学校)において、対馬藩、朝鮮通信使などに関する史料を入手した。特に国史編纂委員会で300冊・20000枚にわたる「宗家文書」史料を収集することができ、これらの史料は今後も長期的に活用できるという点においても意義深い。2、1811年度の通信使と日本知識人との接触を中心としてみる徳川後期の朝鮮認識について、論文「近世後期日本人の朝鮮認識ー文化度通信使との接触を中心として」としてまとめて学会誌に投稿し、現在審査中である。19世紀初期の朝鮮認識について、「異学の禁」を経て朱子学に対する関心が高まるという背景、そして易地聘礼という新たな形での日朝関係の展開の現実化という背景をもとに、礼的秩序における日朝関係の位置づけに対する再解釈が要請され、そうしたなか朝鮮との「対等」関係をいかにすれば実現できるのかということを模索する過程にあったことを示した。3、対馬藩知識人の朝鮮認識について、論文「対馬藩儒満山雷夏の自他認識ー「藩屏」論と「礼」論より」にまとめ学術誌に掲載された。18世紀後期の対馬の知識人たちは、対馬を徳川幕藩体制下に積極的に位置づけるため、対馬の不確かな位置づけについて礼的秩序に基づいて前近代の王権同士での整合性を合わせようとする方向性と、もっぱらその軍事的役割を強調する方向性が存在しており、「文」を志向するのか「武」を志向するのかという複数の方向性が存在していたということを示した。今後、上記2、3の論文を中軸に据えて博士論文としてまとめていく計画である。また漂流民に関する史料については概ね収集できているので、今後成果物としてまとめていく計画である。1.史料の収集・調査次年度も引き続き日本国内とりわけ西日本での資料収集・調査を中心に行う。韓国での調査も可能な限り行う。2.研究対象の拡張次年度は他地域への漂流民にも対象を広げ、中国認識などについても検討していくようにしたい。また、本年度新たに発見した論点である朝鮮通信使との関連についても深化させて検討していくようにしたい。なお本年度は日本側の視点が中心だったのに対し、次年度は朝鮮側の視点にも目配せすることを念頭において研究を進めたい。3.漂流記執筆者への着目本年度は漂流記テクスト内部の分析に集中したため、漂流記執筆者については先送りにしてきた。次年度は漂流記執筆・編集者の対外観、それと漂流記言説の広がりについても検討を行うようにしたい。その際に、知識人層の朝鮮認識をめぐる論点と接続することで、より有機的に検討することができる見通しである。1.史料の収集・調査。次年度も引き続き日本国内での資料収集・調査を行い、韓国での調査にも力を入れたい。2.研究対象の拡張。昨年度見出した、朝鮮通信使と接触した知識人の朝鮮認識という論点をさらに深化させるようにしたい。昨年度後半より対馬藩知識人の朝鮮認識という論点を見出し、その検討を始めており、これについて論文として完成させることを目標の一つとしたい。3.当初の計画の修正。研究遂行中に新たに見出した論点の検討を優先させたことにより、当初の計画そのものについては先送りになっている状況ではある。さりながらこれらの論点(通信使との接触者の朝鮮観、対馬藩知識人の朝鮮観)と漂流記執筆・編集者の対外観という論点とを接合させることで、当初の想定以上に論点を深化させることができる見通しである。
単純かつ安価で広範囲において使用可能なチップレスＲＦＩＤの開発

本プロジェクトにおいて,我々は,低コストで,かつ,広範囲での使用が可能なチップレスRFIDを提案した.提案したRFIDは,実用的に十分な広さをカバーできる一方で,保持できる情報量が少ない.しかしながら,多数の金属パッチや異なる周波数帯の掃引信号を使用することにより,保持できる情報量は増やすことが可能である.我々が行ったすべての実験においては,2,3層から成るシングルパッチRFIDが用いられた.実験は,無響環境下,および,金属枠で囲まれた研究室にて行われた.提案したノイズ緩和アルゴリズムにより,1[%]以内のエラー率が得られた.本研究の目的の1つは,チップレスRFIDの周囲に存在する金属物によるノイズの影響を見積もることである.これを確認するため,2012年度において,我々は,電波の影響がない無響環境を構築した.この無響環境下で実験を行うことにより,ノイズに影響を受けない状態での金属片アンテナの振る舞いを確認した.このような環境下で多くの実験を行い,受け取った信号を確認することにより,我々は,共鳴周波数を算出する新しい手法を提案した.本プロジェクトにおいて,我々は,低コストで,かつ,広範囲での使用が可能なチップレスRFIDを提案した.提案したRFIDは,実用的に十分な広さをカバーできる一方で,保持できる情報量が少ない.しかしながら,多数の金属パッチや異なる周波数帯の掃引信号を使用することにより,保持できる情報量は増やすことが可能である.我々が行ったすべての実験においては,2,3層から成るシングルパッチRFIDが用いられた.実験は,無響環境下,および,金属枠で囲まれた研究室にて行われた.提案したノイズ緩和アルゴリズムにより,1[%]以内のエラー率が得られた.2011年度において,我々は実験環境の設定を行った.具体的には,Vector Network Analyzer (VNA)のような機材や広範囲の周波数領域における信号の送受信のためのアンテナなどを購入した.実験においては,面積の異なる金属片アンテナを複数用意した.2つの異なるノイズ環境下において多くの実験を行い,データを収集した.これらのデータを解析し,精度向上のため,提案手法のアルゴリズムを見直した.これらの初期実験において,アンテナの向きに対する頑健さを保持するようなアンテナ設計に関する知見を得た.また,ノイズの発生源とその特性についての知見を得た.工学これまでに行った無響環境下での実験結果から,我々は,共鳴周波数を算出するよりよい方法や金属片アンテナに格納可能な情報量を算出する方法を発見した.これらの成果は,国内外の学会において,すでに発表済みである.その他,13件の招待講演,キーノートスピーチにおいても,公表済みである.我々が提案する金属片アンテナを用いたチップレスRFIDを用いた実験を行い,データを収集した.実験は,窓ガラスやイスにおける金属フレーム,その他小さな物体など,さまざまなノイズを含む環境で行われた.金属片からの拡散信号を受信し,オフラインでの解析のために保存した.アンテナの面積を変更することにより,これと共鳴周波数との関係を示すことができる.これにより,実際の実験結果が理論上のものに比べて,どれくらい異なるかを確認することができる.さらに実験が必要ではあるが,いくつかの実験から,今回の結果における分解能を評価した.また,入力と拡散信号に関して,金属片のずれの影響を評価した.これにより,角度に対して頑健さを高めるために,円形の金属片を利用するとの着想を得た.現在,我々は,円形の金属片を用いた実験を行っている.これまでは,正方形あるいは長方形の金属片を用いてきた.しかしながら,この場合,アンテナと金属片RFIDの間における角度の変化が,金属片の長さの計算に大きく影響することが問題となっていた.円形の金属片を用いることにより,このような問題を回避することが可能である.工場等での実使用においては,電波の入射角度と反射角度は,必ずしも一定ではなく,このような不完全な状況が結果にわずかな影響を及ぼす.我々は,この変化が共鳴周波数の算出に及ぼす影響を評価する実験を行う.最終的には,金属片からアンテナまでの距離を変化させることにより,我々が使用可能な設備において運用可能な最大の距離を導き出す予定である.我々の研究において次の段階では,理想的な環境下での実験を行う.すべての意図しない拡散信号を排除するため,無響環境を構築する必要がある.この理想的な環境下で行われる実験の結果から,ノイズの影響をよく知ることができる.これにより,より効果的なアルゴリズムを提案することができ,よりよい結果を得ることができるものと考えられる.また,我々は,共鳴周波数が向きに影響を受けないような安定した形状を調査するため,違った形の金属片での実験を行う.加えて,この分野の研究に特化した国際会議での発表を予定している.当初の変更なく、使用する計画である。提案方式によるRFIDの動作レンジに関する最終成果が成果発表されていない。さらに現在、RFIDの実利用に重要なパラメータとなる情報密度(ユニットあたりの情報量)に関する実験を実施中である。未使用額は、最新成果の次年度での発表費用として使用する。ここ68ヶ月の最新の研究成果の成果発表が完了しておらず、次年度に国際会議での発表とジャーナルへの投稿を予定している。未使用額は、国際会議の登録費用および旅費、ジャーナルの別刷りの費用として使用を予定する。2012年度における研究費の主な使用用途は,無響環境の構築である.いくつかの材料はすでに購入済みであるが,安定した環境を構築するために,さらに材料の購入が必要である.

この一部に本研究費を充てる.現在,我々は,2011年度に得られた結果をまとめており,これを国内,および国外の学会において発表する予定である.よって,本研究費の一部は,この登録費や参加費に充てる.
染色体分配の正常化による加齢マウス卵子の品質改善の試み

加齢による卵子の質の低下とそれに伴う不妊や流産、新生児疾患等が社会的問題となっている。本研究ではマウスをモデルとして、加齢による卵子の質を非侵襲的方法にて改善を図ることを目標とした。若齢マウスGV卵にRNA干渉により脱アセチル化酵素HDAC活性を減少させたところ、MII後のヒストンアセチル化の異常(高アセチル化)が確認、さらに染色体数が正常より多い、あるいは少ないサンプルが認められ、老齢マウス卵子を再現することが出来た。また、老齢マウスの排卵誘起時に、内因性FSHを利用した抗インヒビン血清を使用することで通常の外因性FSHを利用したeCGの場合と比較して排卵数の増加、異常卵の減少が認められた。近年、加齢による卵子の質の低下とそれにともなう不妊や流産、新生児の疾患が社会的に問題になっている。卵子の質の低下には、細胞質の劣化および染色体の異常の2種類が原因と考えられている。本研究ではマウスをモデルとして、加齢による卵子の質を、顕微操作等によらない、非侵襲的方法にて染色体の改善を図ることで向上させることを目標とした。まず最初に加齢卵子の質を確認するため、老齢(8ー15ヶ月齢)マウスより採取したMII期卵のホールマウント標本を作製したところ、MII紡錘体の赤道面から離脱した姉妹染色分体が多くの卵子で確認された。また、老齢マウス卵子のGV期からMII期への発生をライブイメージングにおいて観察したところ、ヒストンアセチル化の異常(高アセチル化)が確認された。次に2-3ヶ月齢マウスGV期卵に、RNA干渉により脱アセチル化酵素HDAC活性を減少させたところ、HDAC8を減少させた卵子ではMIIへの発生後、ヒストン高アセチル化が確認された。さらにそれら卵子のホールマウント標本を作製し染色体本数を確認したところ、正常の2n=20より多い、あるいは少ないサンプルが確認された。以上の結果より、卵子GV期におけるヒストンアセチル化の異常によって姉妹染色分体の緩みが生じ、結果的に染色分配の異常に繋がる可能性が示唆された。また同様の現象が老齢マウスの卵子でも生じていることにより、受精がうまく行かない可能性が示唆された。卵子の質の低下には、卵子細胞質の劣化および卵子染色体の異常の2種類が主な原因と考えられている。本研究ではマウスをモデルとして、加齢による卵子の質を、顕微操作によらない、非侵襲的方法にて染色体の改善を図ることで向上させることを目標とした。前年度において、卵子を回収するために通常の排卵誘起法(PMSG)を行った際、老齢マウス(8-15ヶ月齢)において排卵する確率が若齢マウス(7ー12週齢)のそれより低率で、排卵誘起の効果に個体差が認められた。さらに排卵が確認された個体において、1匹あたりの排卵数が非常に少なく、その多くが実験に用いることの出来ない異常分裂や発生をした『外見上、異常と認められる卵子』であった。今年度、抗インヒビン血清(AIS; Anti inhibin serum)による内因性FSHを利用した排卵誘起を試みたところ、排卵効率および1匹あたりの排卵数の上昇が確認された。また、排卵卵子に占める異常卵の大幅な減少が認められた。この結果は、外因性FSHを利用した通常の排卵誘起法では老齢マウスには過剰刺激となり、異常卵への発生を誘起している可能性が考えられた。内因性FSHを利用した方法ではより自然な排卵が促され、『外見上、正常と判断できる卵子』の排卵が増加したと考えられる。排卵数が少なく、しかも染色体異常出現率が高率である老齢マウスにとっては、実験に使用可能な正常卵子を少しでも多く回収できるという意味で非常に有益な排卵誘起法であることが明らかになった。実験を行う上で大きな問題であった、老齢マウスからの卵子の回収率の改善に成功した。このことにより、より多くの卵子を実験に用いることが可能となった。前年度、2-3ヶ月齢マウスGV卵にRNA干渉により、脱アセチル化酵素HDAC活性を減少させたところ、HDAC8減少卵ではMIIへの発生後、ヒストン高アセチル化が確認された。老齢マウス卵子においても同じ現象が生じているのか、解析可能な程度にまでGV期およびMII期卵子の回収保存ができたので、本年度は本格的に解析を行う計画である。近年、加齢による卵子の質の低下とそれに伴う不妊や流産、新生児の疾患が社会的に問題になっている。まず最初に加齢卵子の質を確認するため、老齢(8-15ヶ月齢)マウスより採取したMII期卵子をホールマウント標本作製後、アセトオルセイン染色した結果、MII紡錘体の赤道面より離脱した姉妹染色分体が多くの卵子で確認された。また、老齢マウス卵子のGV期からMII期への発生をライブイメージングにて観察したところ、ヒストンアセチル化の異常(高アセチル化)が確認された。次に幼若(2-3ヶ月齢)

マウスのGV期卵子にRNA干渉により脱アセチル化酵素であるHDAC活性を減少させたところ、MIIへの発生後、ヒストン高アセチル化が確認された。さらに卵子の染色体数について確認したところ、正常の2n=20より多い、あるいは少ないサンプルが認められた。また、老齢マウスでは排卵誘起の効果が若齢マウスに比較して低率で、反応性の個体差も確認された。さらに排卵された卵子の多くが異常分裂や異常発生した卵子であった。抗インヒビン血清による内因性FSHを利用した排卵誘起を試みたところ、排卵効率および1匹あたりの排卵数の上昇、異常卵の大幅な減少が認められた。この結果は外因性FSHを利用した通常の排卵誘起法では老齢マウスには過剰刺激となり、異常卵発生の一因と考えられた。排卵数が少なく、染色体異常率が高い高齢マウスには、本法が非常に有益な排卵誘起法であることが明らかになった。また、異常卵率が高いマウス系統においても本法により改善が認められたことより、加齢卵子モデルとして利用できる可能性が考えられた。加齢による卵子の質の低下とそれに伴う不妊や流産、新生児疾患等が社会的問題となっている。本研究ではマウスをモデルとして、加齢による卵子の質を非侵襲的方法にて改善を図ることを目標とした。若齢マウスGV卵にRNA干渉により脱アセチル化酵素HDAC活性を減少させたところ、MII後のヒストンアセチル化の異常(高アセチル化)が確認、さらに染色体数が正常より多い、あるいは少ないサンプルが認められ、老齢マウス卵子を再現することが出来た。また、老齢マウスの排卵誘起時に、内因性FSHを利用した抗インヒビン血清を使用することで通常の外因性FSHを利用したeCGの場合と比較して排卵数の増加、異常卵の減少が認められた。マウスGV卵を用いたHDACのRNA干渉により、GV期に起きたヒストンアセチル化の異常がMII期における染色体分配の異常に繋がる可能性が示された。この現象は老齢マウス卵の異常を実験的に再現した結果となった。本年度で得られた結果をもとに、次年度以降メカニズムの解明および改善を試みる予定である。本年度は老齢マウス由来卵子のHDAC活性の定量および卵子内での発現状態を定量PCRおよび免疫染色で解析を行う。さらに、姉妹染色分体の結合分子である、コヒーシンの結合距離の解析を行い、染色分体の緩みについて調べる。発生工学本年度の研究により、卵子のGV期におけるヒストンアセチル化の異常がMII期の染色体分配の異常に関与していることがGV卵を用いたHDACのRNA干渉法により示唆された。次年度はHDAC抗体を用いた免疫染色法にて卵子内のHDAC発現量についての解析を行う。さらに、MII期において染色体分配異常がみられる場合はその1ステージ前のMI前期において姉妹染色分体の緩みが生じていると予想される。姉妹染色分体の結合をつかさどるコヒーシンの解析も行う。排卵誘起方法を変更したことで、マウスの使用が予定より少なく済んだため。研究が順調に進み、マウスや消耗品の使用が済むなく済んだ為。本研究ではマイクロマニピュレーター装着倒立顕微鏡等は既に申請者が所属する研究室で所有しているもの、もしくは導入予定のものを使用する。・マウス購入・維持費:卵子採卵用ICR・C57BL/6・B6D2F1@1,000-1,500円x250匹+マウス用餌+床敷き・消耗品:卵子培養用消耗品(プラスチック消耗品、試薬など。約2,000円/回x50回/年)