hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
腸炎ビブリオエフェクターVopQによるカスパーゼ-1活性化抑制機構の解明

腸炎ビブリオのエフェクタータンパクVopQはマクロファージのインフラマソームによるカスパーゼ-1の活性化を阻害する。その機序を明らかにするために、VopQの宿主細胞内標的分子の探索およびオートファジー誘導とインフラマソーム活性化阻害との関連について検証した。結果として、VopQの宿主細胞内標的分子は細胞接着因子Afadinが候補にあがったが、マクロファージ内での相互作用は認められなかった。また、オートファジー誘導との関連について、研究期間中に十分な検証が得られなかったが、貪食細胞特異的に発現するATG5コンディショナルノックアウトマウスが出来たので、今後の研究での活用が期待できる。本研究の目的は腸炎ビブリオの3型分泌装置が分泌するエフェクタータンパクVopQによるカスパーゼ-1の活性化阻害機構、および個体レベルでの感染過程におけるその役割について明らかにすることである。本年は具体的にVopQとオートファジーの機能的関連性を明らかにするため、Cre/loxPシステムを用いたATG5欠損コンディショナルノックアウトマウスの作製に取り掛かった。また、VopQの宿主細胞内標的分子として、酵母Two-hybridスクリーニングで相互作用する分子の同定を試み、その分子が細胞膜構成成分で細胞接着に関与するAfadinであることがわかった。マウス大腸細胞CMT93やヒト大腸がん細胞Caco2、マクロファージなど各種細胞に腸炎ビブリオ野生株およびVopQ欠損株を感染させ、市販のAfadin抗体を用いて宿主細胞内におけるAfadinをウエスタンブロット法で確認した。同時にカスパーゼ-1や炎症性サイトカインの検出も行った。また免疫染色の手法により、感染時のVopQの存在の有無でAfadinがどのように影響されているかを感染後、経時的に免疫染色を行い観察した。腸炎ビブリオはヒトに対して下痢等の腸管感染症を起こすが、マウスでは経口感染モデルの感染成立が難しい。しかし、生体内でのエフェクタータンパクの機能を評価する為に動物感染モデルは重要である。マウスにストレプトマイシンを前投与し常在菌を抑えた状態で、大量の腸炎ビブリオ(ストレプトマイシン自然耐性株)をC57BL/6野生型マウスに経口投与することにより、強制的にマウスの腸管炎症を起こすモデルの構築を行った。小腸、盲腸、大腸に分けて、菌の分離を行い菌数を確認した。また、小腸、盲腸、大腸をホルマリン固定後、組織の凍結切片を作製し、菌や免疫細胞等の免疫染色を行い、組織学的、病理学的に炎症の有無を比較検討した。これまでの結果からVopQとオートファジーの関連性については、培養細胞でオートファジー関連のATG5遺伝子をノックダウンさせて、腸炎ビブリオの野生株とVopQ欠損株を感染させて比較したところ、その差は見られなかった。そこで昨年度から導入したマクロファージなど部位特異的に発現するATG5欠損コンディショナルノックアウトマウスを用いることで、VopQとオートファジーの関連性を明らかにすることを目標にした。しかし、Lyz2-Creマウスのバッククロスが十分でなかったために、実験に供することができるATG5 floxedマウスの作製に思いのほか時間がかかってしまい、本年中での結果が出せなかった。一方、VopQの宿主細胞内標的分子の一つとして、細胞膜構成成分で細胞接着に関与するAfadinがあるが、マウス骨髄細胞由来のマクロファージでAfadin抗体を用いて免疫染色をしたが、その局在は確認できなかった。マウス大腸細胞CMT93やヒト大腸がん細胞Caco2では細胞接着におけるAfadinの存在を免疫染色で確認することができた。腸炎ビブリオ野生株およびVopQ欠損株を感染させ、感染時のVopQの存在の有無でAfadinがどのように影響されているかの解析はこれからである。マウスでは腸炎ビブリオの経口感染モデルの感染成立が難しいが、生体内でのエフェクタータンパクの機能を評価するために動物感染モデルは重要である。強制的にマウスの腸管炎症を起こすモデルで感染後に小腸、盲腸、大腸に分けて、菌数を確認した。また、小腸、盲腸、大腸を採取しホルマリン固定後、組織の凍結切片を作製し、各種染色により評価した。オートファジーの解析のためのATG5欠損コンディショナルノックアウトマウスの作製に思いのほか時間がかかった。ようやく、Lyz2-CreマウスのC57BL/6野生型マウスへのバッククロスがN7世代以上になり、Lyz2-Creマウス同士の交配を始め、Lyz2-Creのホモマウスを得ることができた。さらにLyz2-CreとATG5 floxedマウスとの交配を始めたところであるが、ATG5flox/flox Lyz2-CreKI/KIおよび、リターメイトでATG5flox/+ Lyz2-CreKI/KIが得られたら、実験に供することができる。それ以外の研究は概ね予定通りに進行している。VopQがカスパーゼ-1の活性化を抑制することはこれまでの結果から明らかであるがそのメカニズムについてはわかっていない。VopQと相互作用する宿主細胞内標的分子Afadinについても、各種細胞における局在と菌との関係を解析中であるが、カスパーゼ-1活性化抑制の関係についてはこれからである。

マウス炎症モデルとして、ストレプトマイシン投与により常在菌を抑え、強制的に腸炎ビブリオを感染させたマウスの腸管内炎症を解析するための小腸、大腸、盲腸の組織切片についても組織学的、病理学的に解析するため、炎症誘導細胞や免疫細胞の各種抗体を用いた免疫染色を行ったが、詳細な解析はこれからである。腸炎ビブリオの3型分泌装置が分泌するエフェクタータンパクVopQによるカスパーゼ-1の活性化抑制機構を解明するために最終年度はオートファジーの関連性について検討した。これまでの実験で腸炎ビブリオを野生型マウス由来マクロファージに感染させると、エフェクタータンパクVopQがカスパーゼ-1活性化を阻害することが、VopQ欠損株との比較により確認された。しかし、このカスパーゼ-1活性化抑制のメカニズムはVopQがオートファジーを誘導する為に、見かけ上カスパーゼ-1の活性化が抑制されているのではないかとの疑問が残った。そこで、マクロファージなど部位特異的に発現するようにLyz2-Creを導入したATG5欠損コンディショナルノックアウトマウスを用いることでオートファジーとVopQの関連性を明らかにしようと試みた。ATG5欠損コンディショナルノックアウトマウス由来のマクロファージに、腸炎ビブリオ野生株とVopQ欠損株を感染させたところ、LC3-IからLC3ーIIへの移行は見られなかった。しかし、カスパーゼ-1の活性化の違いにおいて野生型マウス由来マクロファージと比較して明らかな差が見られなかったため、オートファジーに関してもATG5欠損だけでは説明できない複雑な経路が存在すると考えられた。また、これまでの実験ではVopQはNLRP3欠損マウス由来マクロファージでカスパーゼ-1活性化抑制がみられたので、NLRC4またはNAIP5の関与が示唆された。NLRC4とNAIP5単独欠損マウスでの検証も行ったが、NLRP3またはNLRC4のNAIP5二重欠損マウスの作成までには至らなかったため、どの経路でVopQが関与しているかの結論には至らなかった。腸炎ビブリオのエフェクタータンパクVopQはマクロファージのインフラマソームによるカスパーゼ-1の活性化を阻害する。その機序を明らかにするために、VopQの宿主細胞内標的分子の探索およびオートファジー誘導とインフラマソーム活性化阻害との関連について検証した。結果として、VopQの宿主細胞内標的分子は細胞接着因子Afadinが候補にあがったが、マクロファージ内での相互作用は認められなかった。また、オートファジー誘導との関連について、研究期間中に十分な検証が得られなかったが、貪食細胞特異的に発現するATG5コンディショナルノックアウトマウスが出来たので、今後の研究での活用が期待できる。オートファジーの解析のためのATG5欠損コンディショナルノックアウトマウスの作製では、Cre/loxPのC57BL/6野生型マウスへのバッククロスが不充分であったため、ATG5欠損の発現が一定ではなかった。そのため、バッククロスをN7世代以上にする為に繁殖交配を続けている。それ以外の研究はおおむね予定通りに進行しており、VopQと相互作用する宿主細胞内標的分子の同定を試み、Afadinであることが分かった。
高大連携のための実技系環境教育プログラムの開発とその実践的利用

本研究は高大連携教育の中で利用可能な実技系環境教育プログラムを開発することを目的とする。生徒がチーム活動を通して持続可能な社会を実現するためのモノ作りの設計思想や環境問題への配慮などを学習する教育プログラムを検討する。本研究の成果の以下にまとめる。1)モノ作りを主体とした高大連携プログラムの構築と実践高校生約40名を4人単位でチームを組ませ、バルサ材による模型橋の製作とその強度調査に関するプロジェクト活動を実施した。プログラムは2日間コースで、高校生は物理の知識と創造力を発揮し模型橋を製作した。講義においては、地域の住環境における橋の役割について説明することでモノ作り学習と地域環境学習が融合されたものになった。2)Web上の掲示板を利用したチーム活動の実践とのその有効性の確認チーム活動には同期した活動と非同期の活動がある。前者はチームミーティングによる活動であり、後者はWebの掲示版を利用した活動である。放課後に自由になる時間は個人よって異なるので、同期した活動が難しい場合がある。ここではチーム活動に掲示板を活用することでこの問題が解決されることを確認した。3)河川環境の計測とWebサイトの構築金沢市内の河川における水質調査を実施し、その結果をWeb上に掲載した。生徒が自分から問題点を見出し、解決していくことが環境教育にとって必要であることをこの実践を通して確認した。4)金沢市内温度・湿度観測の実施と環境教育データの製作兼六園を中心に半径4キロメートル内の小学校の百葉箱に温湿度データロガーを設置し、気温と湿度を10分間隔で観測した。これらのデータを環境教育用教材として活用できるように集計・編集した。生徒が自作した測定装置で環境計測をしたり、市販の計測機器を用いて測定する。その測定を通して持続可能な社会を実現するモノ作りの設計思想・環境問題への配慮・国民の責務などを学習する教育プログラムを検討し、高専1年生から3年生と対象に教育実践する。その結果を踏まえ高大連携教育プログラムを検討する。本年度は、1)計測装置設計の教育プログラム検討の検討、2)計測装置の工作プログラム、3)河川環境計測についてのWebサイトを構築した。1)計測装置設計の教育プログラム検討GPS機能付き水質評価測定器として堀場製作所のU-23型計測器を用いた環境計測教育プログラムを作成した。内容は高専生による環境計測演習から得られた知見に基づき、環境計測機器の取り扱い方から測定項目の選定にまで及んでいる。2)計測装置設計の工作プログラム検討学習者の知識および技術レベルを考慮し、製作可能な計測装置として河川水の抵抗値測定装置を検討した。河川水を入れたプラスチックの容器に電極棒を2本設け、電極棒間の抵抗値をテスターで測定するものである。3)河川環境計測についてのWebサイトの構築金沢市内の河川における水質調査を実施し、その結果をWeb上に掲載した。GPSにより観測点の位置座標を同定しており、これにより衛星リモートセンシング画像データとの検証ができるようになっている。その測定を通して持続可能な社会を実現するモノ作りの設計思想・環境問題への配慮・国民の責務などを学習する教育プログラムを検討し、初等・中等教育を対象に教育実践する。本年度は以下の通り実践した。1)気温・湿度の金沢市内同期観測の教育プログラムの検討、金沢市内中心部に33カ所に気温・湿度データロガーを設置し、夏季の地方都市のヒートアイランド現象の状況を調査した。体感しているものを具体的な数値で表すことの重要性を、学習者の興味を持続しながら学習する教育プログラムを検討した。2)上記の結果をCDに納め、初等・中等教育で活用可能な形式に変換し、配布用資料としてまとめた。

また、人工衛星から得られた画像と上記観測結果を用いて、初等教育の場において出張講義を行った。3)大気観測の教育プログラムの検討大気エアロゾルの光学的厚さの日々の変化をスカイラジオメータを用いて観測した。地球温暖化解明の科学的調査の意義を実際の観測データを用いて理解する教育プログラムを検討した。また、その教育プログラムへの衛星リモートセンシングデータへの活用も併せて検討した。本研究は高大連携教育の中で利用可能な実技系環境教育プログラムを開発することを目的とする。生徒が自作した測定装置で環境計測をしたり、市販の計測機器を用いて測定する。その測定を通して環境問題への配慮・国民の責務などを学習する教育プログラムを検討し、初等・中等教育を対象に教育実践する。本年度は以下の通り実践した。1)気温・湿度の金沢市内同期観測の教育プログラムの検討、昨年度に引き続き金沢市内中心部に33カ所に気温・湿度データロガーを設置し、夏季の地方都市のヒートアイランド現象の状況を調査した。体感しているものを具体的な数値で表すことの重要性を、学習者の興味を持続しながら学習する教育プログラムを検討した。2)昨年度に引き続き上記の結果をCDに納め、初等・中等教育で活用可能な形式に変換し、配布用資料としてまとめた。また、人工衛星から得られた画像と上記観測結果を用いて、高等学校において出張講義を行った。さらにその高等学校に対してこれらのデータを課題研究の材料として活用できるようにし、課題研究への取り組みを通した環境教育の実践を行った。3)大気観測の教育プログラムの検討昨年度に引き続き大気エアロゾルの光学的厚さの日々の変化をスカイラジオメータを用いて観測した。4)グループ学習におけるe-Learningシステム利用に関する検討グループ学習においてWeb上にある掲示板を利用することでチーム活動が促進できないかを調査し、本学の学生に対する試行を通してその有効性を示した。
希土類元素のう蝕抑制高価とそのメカニズム

う蝕原因菌(S.sobrinus)をTTY培地約30lに摂取・培養(37°C,48h)後遠心分離し、菌体の一部はPBSに懸濁し生菌材料とした。一部は凍結乾燥後加熱処理(100°C,10min)した。これら菌体を付着実験に用いた。遠心上清の硫安分画(40%)後の沈殿を付着実験用GTaseとし、更にDEAEセルロース分画後の標品を活性阻害実験に用いた。ガラス製試験管壁への付着実験では、グルコースの代わりにスクロースを添加したTTY培地、Lnの硝酸塩溶液(2.3×10^<-3>M)および生菌を加え37°Cで18h培養後、未着菌体を除去し、付着菌体を超音波処理で遊離させその濁度を測定(530nm)した。ポリスチレン製試験管壁への付着実験では、加熱処理菌体とLn硝酸塩溶液を37°C,1h反応後、菌体を分離し、スクロース、粗精製GTase,KPBを加え37°C,18h反応させ、全菌体濁度に対する付着菌体濁度比を測定した。GTaseの阻害活性は^<14>C-スクロースを基質とするRI方とアントロンを用いた比色定量法で測定した。また、Lnによる細菌細胞の増殖阻害を検討した。最小発育濃度の決定は日本細菌学会の定める方法(三橋ら、Chemotherapy,29、76-79,1981)で行った。<結果と結論>1)Lnにはう蝕菌のガラスおよびプラスチック試験管壁への付着を抑制する効果がある。生菌では特にCe,Prに高い付着阻害がみられた。40μg/ml濃度のLnでは殆どのものに50%前後の付着阻害があった。死菌に対しては同濃度で、La,Ho,Er,Ybに70%前後の阻害がみられた。2)Lnによる細菌の付着阻害は細菌の増殖阻害が主因ではない。Pr,Nd,Hoの3.47M濃度でs.sobrinusの発育阻止はみられたがこの濃度は抗生物質などに比して高濃度であった、また他のLnには発育阻害は認められなかった。3)GTase活性を阻害して細菌付着を阻止するLnがある。特に重希土類(Sm,Ho,Er)に活性阻害が認められた。以上より、Lnにはう蝕細菌の管表面への付着を阻害する効果のあることが判明した。
両親媒性高分子電解質ユニマーミセルの研究

両親媒性高分子電解質は、水溶液中において疎水性相互作用によるミクロ相分離によって、自己組織化し、ナノ組織体を形成する。ナノ組織体の形態、構造、および性質は疎水基会合が分子内か分子間かによって大きく異なり、それは溶媒組成、濃度、温度などの外的条件によっても影響されるが、基本的には高分子の化学構造によって決定される。これまでわれわれは、高分子の化学構造と自己組織化との相関についての基礎的知見を集積し、両親媒性高分子電解質の自己組織化を支配する化学構造的要因として、親水性連鎖と疎水性連鎖の配列分布が重要であることを見いだしてきた。両親媒性高分子電解質のデザインにより、形態・構造・物性の制御された高分子ナノ組織体の構築を目的として本研究を開始した。本年度は蛍光ラベルとしてピレニル基やナフチル基を少量導入したアクリルアミド-2-メチルプロパンスルホン酸ナトリウムとドデシルメタクリルアミドからなる両親媒性高分子電解質を合成し、蛍光法、蛍光消光法、静的および動的光散乱法、NMR、キャピラリー電気泳動法、GPC法などのさまざまな手法を用いて、その両親媒性高分子電解質をキャラクタライズした。その結果、ドデシル基コンテントが3050mol%付近で高次に折り畳まれたナノ組織体(ユニマーミセル)を形成することを明らかにした。また、ユニマーミセルへ機能を付加することを目指し、光架橋性基を導入した両親媒性高分子電解質の合成と光応答性の評価実験を開始した。
表在性膀胱癌におけるBCGの分子遺伝学的作用機序の解析及び臨床応用

動物実験では、肉眼的に生理食塩水の膀胱内注入はいずれの時期においても膀胱腫瘍、前癌病変に対してプロモーション作用を示した。病理組織学的にはBCG早期(予防的)投与群において膀胱癌の発生率、個数ともに生理食塩水早期投与群よりも低値を示した。以上より、BCG膀胱内注入療法はラットでは予防的な目的では有効であると思われた。一方生理食塩水の膀胱内注入は膀胱発癌をプロモートする事が再確認され、BCGの溶解液として一般に使用されている生理食塩水の妥当性について検討の余地がある事が示唆された。臨床的には、BCG膀胱内注入療法を施行した表在性膀胱癌患者14名につき、ras,pb3の突然変異をチェック、さらに、可能な限りLOHの検索を行った。その結果1例にp53の突然変異が認められた。また、p53でLOHの検索が可能であった7例中2例、RBで5例中1例にLOHを認めた。その後3例再発したが、1例のみにRBのLOHが認められ、特に臨床経過、病理組織像との関連は認められなかった。さらに表在性膀胱癌患者23名のp16遺伝子の突然変異の有無、発現を検索した。その結果、いずれの膀胱癌患者においてもp16に突然変異は認められなかった。しかし、7例で明らかな発現低下が認められ、転写レベルでの発現抑制が膀胱癌に関与していることが示唆された。また、BCG膀胱内注入療法例中再発した19例に、p53,PCNA,bc1-2の抗体を用いて免疫組織化学染色を行い、非再発例と比較検討を行った。その結果、p53陽性例は再発例、非再発例ともに同様の傾向であり、PCNA,bc1-2陽性例は両者共に再発例に陽性例が少ない傾向であった。またこれら再発例の治療前後での共通陽性例はp53で6例存在したが、PCNA,bc1-2が各々2例ずつのみであった。以上より、BCG感受性腫瘍と抵抗性腫瘍との間にPCNA,bc1-2発現レベルに違いがある事が示唆された。平成6年度中に終了予定であった最初の動物実験が、BCGを使用するため感染の危険性が有り、動物舎の許可が大幅に遅れた。現在、10週間のBBNの投与が終了し、BCGの膀胱内注入を週1回施行中である。当初予定した実験期間を24週から30週に変更し、本年7月に実験終了予定である。臨床的には、表在性膀胱癌患者でBCG膀胱内注入療法を施行した患者14名につきその施行前の生検材料を採取し、PCR-SSCP、RT-SSCP解析及びseqencingを行い、ras、p53のmutationをチェック、さらにこれらの患者より血液を採取し、可能な限りp53とRBについてのLOHの検索を行った。その結果一例にp53のmutationが認められた。また、p53でLOHの検索が可能であった7例中2例、RでBで5例中1例にLOHが認められた。その後3例に再発を認めたが、3例中1例のみにRBのLOHが認められ、特に臨床経過、病理組織像との関連は認められなかった。現在、さらに症例を重ねつつ、p16についても検索中である。また、当科でこれまでに施行した表在性膀胱癌患者に対するBCG膀胱内注入療法例79例中、BCG無効例が18例存在した。

これら再発例は、他の抗癌剤膀胱内注入の既往例および全身化学療法施行例が半数を占めていた。これらの症例のホルマリンブロックを用いて、p53およびRBの免疫組織染色を予定している。動物実験においては、当初100匹でスターとした実験が麻酔の影響で最終的に84匹となった。肉眼的には生理食塩水の膀胱内注入はいずれの時期においても膀胱腫瘍、前癌病変に対してプロモーション作用を示した。病理組織学的にはBCGを早期(予防的)に投与した群において膀胱癌の発生率、個数ともに生理食塩水を早期に投与した群よりも低値を示した。以上より、BCG膀胱内注入療法はラットにおいては予防的な目的では効果があると思われた。一方、生理食塩水の膀胱内注入はラットにおいて膀胱発癌をプロモートする事が再確認され、BCGの溶解液として一般に使用されている生理食塩水の妥当性について検討の余地がある事が示唆された。臨床的には、表在性膀胱癌患者でBCG膀胱内注入療法を施行した患者23名につきその施行前の生検材料を採取し、p16/MTS1遺伝子の突然変異の有無をexon1,2,3についてPCR-SSCP法で、その発現をRT-PCR法で検索した。その結果、いずれの膀胱癌患者においてもp16に突然変異は認められなかった。しかし、7例で明らかな発現低下が認められ、転写レベルでの発現抑制が膀胱癌に関与していることが示唆された。また、当科でこれまでに施行した表在性膀胱癌患者に対するBCG膀胱内注入療法例79例中、再発した19例に対して、ホルマリンブロックを用いて、p53、PCNA、bc1-2の抗体を用いて免疫組織化学染色を行い、BCG非再発例と比較検討を行った。その結果、p53陽性例は再発例:非再発例=11/19:10/19とほぼ同様の傾向であり、PCNA陽性例は再発例:非再発例=4/19:7/19、bc1-2陽性例は再発例:非再発例=8/19:14/19と両者共に再発例に陽性例が少ない傾向であった。
ＤＮＡ配列設計によりアメーバ運動を自律的に制御する細胞サイズ分子ロボット

本年度は,細胞サイズ分子ロボット界面における分子デバイスの集積化および運動の自律制御のための信号分子増幅回路の実装に向けた研究を行った.分子デバイスの集積化技術の開発に向けて,前年度に開発したアメーバ型分子ロボットの筐体が相分離リポソームであることを踏まえ,相分離脂質膜上におけるDNAオリガミ構造の自己集合特性について調査した.成果として,相分離膜上のDNAオリガミは脂質の相およびイオン強度に依存した自己集合特性を示すことが明らかとなった.この知見は,外部環境に応答して膜面上で自己組織化する分子デバイス開発のための要素技術として応用でき,分子ロボットの自律的な動作決定や膜面上の分子配置の制御を実現する上で重要な成果である.この成果について学術論文として報告した.また,信号増幅回路の実装においても成果があった.従来のリポソーム内部でのDNA増幅反応は高温域での人為的な温度サイクルを必要とするものであり,分子ロボットの構成要素への熱損傷や反応が自律的に進まないなどの課題があった.本年度の成果として,生理学的等温条件で特定のDNA分子を増幅する機構を細胞サイズリポソームに実装することに成功した.さらに,その増幅挙動が試験管内とリポソーム内との間で大きく異なることを明らかとした.これは,分子ロボットの自律制御を実現する上で有用な知見であり,この成果について,発表賞を受賞するとともに,現在学術論文として投稿するための準備を行っている.運動方向の規定については,計画時にはマイクロビーズを用いることを想定していたが,ビーズの封入率の個体差が大きく,困難であることが明らかとなった.一方,本年度に開発したDNAナノ構造の集積化技術は,人工機能性膜ドメインの構築へも応用できる成果である.今後,この成果をもとに分子ロボットの局所的な変形・方向性を持った運動へと発展させたいと考えている.29年度が最終年度であるため、記入しない。29年度が最終年度であるため、記入しない。本研究は,細胞サイズ分子ロボットが自律的に運動を制御するための基盤技術を創出することを目的とする.分子ロボットとは,人間が設計した機能性分子機械を組み合わせて構築される極微小なロボットのことを指す.従来の分子ロボットの運動は,熱揺らぎに依存したランダムなものであり,運動の制御は実現できていなかった.我々は,DNAの配列設計技術を応用し分子ロボットの運動を可制御なものへと発展させることを提案している.本年度は,細胞サイズ分子ロボットが短鎖DNA分子信号に応じてアメーバ様の変形挙動の制御機構の開発に努めた.具体的には,キネシンと微小管から構成される「分子アクチュエータ」とDNAから構成される「分子クラッチ」を,その他20種類以上の分子種とともにリポソーム内に統合した.分子ロボットへの信号分子の入力は,ロボット内部に光応答性のDNA信号分子(UV光により特定の塩基配列が現れるDNA)を内包する手法を採用した.本年度の成果として,分子ロボットの構成要素を適切に調整することで,連続的な変形挙動を示すアメーバ型分子ロボットを開発することに成功した.また,実験により,分子ロボットが信号分子に応じた変形/静止状態を制御可能であることを示した.本成果は,信号を認識してアクチュエータを制御する,というロボットシステムを分子機械で実現した初の成果である.これらの成果は研究計画における「分子デバイス群の統合によるアメーバ運動の制御」にあたるものであり,国内外の会議で発表を行うとともにアメリカ科学技術振興協会(AAAS)刊行のScience Robotics誌より学術論文として掲載された.さらに,国内外のメディアにも紹介されるなど,高い注目を集めるものであった.分子ロボティクス分野の課題であった分子機械の統合を実現し,信号分子の入力に応じて変形と停止を制御する分子ロボットの開発に成功した.本成果は,分子ロボットが自律的に運動を制御するための基盤技術となりうるものと考えられる.さらに,我々が開発した分子ロボットは,凍結・融解に耐えうることを発見した.凍結状態で他の研究室へと郵送された分子ロボットは,解凍後も変形機能を維持することが可能であった.これは,当初の想定を上回る成果であり,本研究成果を分子ロボット開発の標準プラットフォームとして活用することが期待出来る.ビーズを利用したリポソーム膜面上の分子配置制御技術の開発については,複数のポリスチレンビーズを高密度でリポソーム内に封入することに成功した.膜面上の分子配置の制御の確認・評価はまだできていないが,研究課題全体としてはおおむね順調に進展していると言える.本年度は,細胞サイズ分子ロボット界面における分子デバイスの集積化および運動の自律制御のための信号分子増幅回路の実装に向けた研究を行った.分子デバイスの集積化技術の開発に向けて,前年度に開発したアメーバ型分子ロボットの筐体が相分離リポソームであることを踏まえ,相分離脂質膜上におけるDNAオリガミ構造の自己集合特性について調査した.成果として,相分離膜上のDNAオリガミは脂質の相およびイオン強度に依存した自己集合特性を示すことが明らかとなった.この知見は,外部環境に応答して膜面上で自己組織化する分子デバイス開発のための要素技術として応用でき,分子ロボットの自律的な動作決定や膜面上の分子配置の制御を実現する上で重要な成果である.この成果について学術論文として報告した.また,信号増幅回路の実装においても成果があった.従来のリポソーム内部でのDNA増幅反応は高温域での人為的な温度サイクルを必要とするものであり,分子ロボットの構成要素への熱損傷や反応が自律的に進まないなどの課題があった.本年度の成果として,生理学的等温条件で特定のDNA分子を増幅する機構を細胞サイズリポソームに実装することに成功した.

さらに,その増幅挙動が試験管内とリポソーム内との間で大きく異なることを明らかとした.これは,分子ロボットの自律制御を実現する上で有用な知見であり,この成果について,発表賞を受賞するとともに,現在学術論文として投稿するための準備を行っている.運動方向の規定については,計画時にはマイクロビーズを用いることを想定していたが,ビーズの封入率の個体差が大きく,困難であることが明らかとなった.一方,本年度に開発したDNAナノ構造の集積化技術は,人工機能性膜ドメインの構築へも応用できる成果である.今後,この成果をもとに分子ロボットの局所的な変形・方向性を持った運動へと発展させたいと考えている.ビーズを利用したリポソーム膜面上の分子配置制御技術の開発については,引き続き評価実験を行う予定である.一方で,本年度の成果が分子ロボット開発のプラットフォームとして活用できる可能性が示されたことから,当初の計画に加えて,他の研究室で開発された分子デバイスとの組み合わせを共同研究として推進することを予定している.29年度が最終年度であるため、記入しない。本年度の研究成果に関して,大学の広報部を通じ研究成果のプレスリリース(日・英)を発表し,国内外のメディアを通じて研究成果が紹介された.(参考: https://www.altmetric.com/details/16903992)29年度が最終年度であるため、記入しない。
動物発生における形成中心の分子的機能に関する比較発生学的総合研究

本研究の目的は、動物の胚発生において体軸の決定や大きな体制の構築に必須である形成中心の分子的機構を、主として後口動物について比較発生学的見地から解明することである.形成中心は、各動物群(棘皮動物、原索動物、脊椎動物)に固有の分子的作用を持つが、一方で進化的制約の元にあり、従って機能的にも構造的にも相同の部分があることが明らかになった.3年間の主要な成果は以下の通りである.1ヒトデの形成中心について、植物極に局在する原腸決定因子をもつ細胞とその細胞質の検出法方が確立された。これは、ホヤやツメガエルではすでに確立されているが、棘皮動物でも同様のことが可能であることが示されたことによって、棘皮動物形成中心の分子的基盤の研究は飛躍的に進歩すると思われる.棘皮動物についてはさらに、原腸形成の機構に関わる外腸胚形成ペプチド結合蛋白質の遺伝子的解析が一気に進展した。また、ウニ胚の形成中心というべき小割球に特異的に発現する遺伝子としてホメオボックスもつものが単離され、他の動物群の形成中心で発現するホメオボックス遺伝子との比較がなされた。2ホヤに関しては、中胚葉のパターニングの全貌がほぼ解明された.すなわち、分化した間充織細胞を特異的に認識する抗体などの作成により、間充織細胞の分化の自律性の検討と決定因子の同定がなされ、初期胚後方の中胚葉組織である間充織は決定因子と細胞間相互作用によって分化することが明瞭に示された.このことは、モザイク的発生をするホヤにも形成中心的領域が存在することを明らかにするものである.3従来魚類と両生類では、形成中心の考え方にかなりの差違があったが、本研究班の研究から、多くの点で共通の遺伝子が働いていることが示された.とくに魚類では形成中心を誘導する領域として卵黄のシンシチウム細胞の重要性が巧みな実験発生学的研究によって明らかにされ、同時にこの領域からの作用で形成中心が働く遺伝子カスケードも相当解析された.4鳥類と哺乳類では従来からノードの形成中心としての作用が注目されていたが、ニワトリについてはこの領域からの胚葉形成後の領域化の機構が主として内胚葉に関して解析された.また哺乳類の脊索の機能・形成の制御機構が、主としてT/t complex突然変異体を用いて研究された.これら高等脊椎動物の形成中心と、これまでに述べた動物群のそれとの比較発生学的研究の基礎が築かれた.本研究の目的は、動物の胚発生において体軸の決定や大きな体制の構築に必須である形成中心の分子的機構を、主として後口動物について比較発生学的見地から解明することである.形成中心は、各動物群(棘皮動物、原索動物、脊椎動物)に固有の分子的作用を持つが、一方で進化的制約の元にあり、従って機能的にも構造的にも相同の部分があることが明らかになった.3年間の主要な成果は以下の通りである.1ヒトデの形成中心について、植物極に局在する原腸決定因子をもつ細胞とその細胞質の検出法方が確立された。2ホヤに関しては、中胚葉のパターニングの全貌がほぼ解明された.すなわち、分化した間充織細胞を特異的に認識する抗体などの作成により、間充織細胞の分化の自律性の検討と決定因子の同定がなされ、初期胚後方の中胚葉組織である間充織は決定因子と細胞間相互作用によって分化することが明瞭に示された.このことは、モザイク的発生をするホヤにも形成中心的領域が存在することを明らかにするものである.3従来魚類と両生類では、形成中心の考え方にかなりの差違があったが、本研究班の研究から、多くの点で共通の遺伝子が働いていることが示された.とくに魚類では形成中心を誘導する領域として卵黄のシンシチウム細胞の重要性が巧みな実験発生学的研究によって明らかにされ、同時にこの領域からの作用で形成中心が働く遺伝子カスケードも相当解析された.4鳥類と哺乳類では従来からノードの形成中心としての作用が注目されていたが、ニワトリについてはこの領域からの胚葉形成後の領域化の機構が主として内胚葉に関して解析された.また哺乳類の脊索の機能・形成の制御機構が、主としてT/t complex突然変異体を用いて研究された.これら高等脊椎動物の形成中心と、これまでに述べた動物群のそれとの比較発生学的研究の基礎が築かれた.本研究の目的は、種々の動物における形成中心(両生類のオ-ガナイザー相当)の出現の原理と、それ以後の胚発生、とりわけ三胚葉体制の確立における作用という、二〇世紀における生物学上の最大の問題を分子生物学的に、また、比較発生学的視点から開明することを目的とした。この研究はまた、地球上における生命の存在形態や発生様式の多様性が、系統発生と深く関わっていることを、形成中心の分子的機構という具体的なデータに基づき総合的に理解することを目指した。

平成8年度においては、各班員が十分な議論をし、さらに研究の情報を交換するために班会議を開催した。この班会議は、「形成中心フォーラム」として開催され班員以外の研究者も多数参加した。この会議で報告された研究は以下のように要約できる。(1)ウニやヒトデのような無脊椎動物では形成中心という概念そのものの意味付けが問われた。これらの動物では原腸形成が植物極の因子によることが推定されてはいるが、その本質は明らかではない。ただ外腸胚形成ペプチドが表皮成長因子のホモログであることなど、その分子的性質の解明が端緒についてことが報告された。(2)原索動物では、いわゆるオ-ガナイザー相当領域で発現する遺伝子が明らかにされ、脊椎動物との相同性が論じられるようになった。しかし遺伝子の相同性のみで形成中心を定義することに対する疑問も指摘された。このような研究は脊椎動物の形成中心の起源を明らかにする上で極めて重要である。(3)魚類や両生類では形成中心、いわゆるオ-ガナイザーが明瞭である。ここではすでに形成中心の機能に関わる遺伝子が相次いで確認され、その分子的作用に関する研究にと進みつつある。一方で、従来から行われてきた実験発生学的な解析も特に鳥類を中心に進められ、胚葉の分化に関わる遺伝子レベルの研究の進展が報告された。以上のように、本研究班の平成8年度の研究は、それぞれの動物群の形成中心のもつ意義とその分子的作用の解析の点で、多くの成果を上げることができた。本研究の目的は、多くの動物、特に新口動物幹に属する動物の発生において中心的役割を担っている形成中心の分子的機能を種々の動物群について明らかにしようとするものである。平成9年度には、平成8年度の成果をふまえて、より先端的に研究を進めることを心がけた。班員は常に密接な連絡を取りながら研究を進め、さらに12月に一泊の班会議を行い、各班員の研究について討論を行った。無脊椎動物のウニについては、内胚葉誘導シグナルを出す小割球に特異的に発現する遺伝子の探索が続けられた。脊椎動物では、魚類特にゼブラフィッシュの背腹軸を決定する多くの遺伝子が同定された。一方アフリカツメガエルにおける背腹軸の決定に関しては従来からも多くの知見が集積しているが、両生類の形成体の成立と背腹軸の決定に関わる因子が実験発生学的にも、また分子的にもより一層明確になってきた。これらの研究により、少なくとも脊椎動物の諸綱の中では、形成中心というものの相同性を分子レベルで理解する事ができるようになった。この点は本年度の大きな進展である。さらに鳥類や哺乳類のような高等脊椎動物での初期発生に関わる遺伝子の研究も活発に行われ、脊索の形成や内胚葉の領域決定に関わる遺伝子が同定されつつある。このように、研究は着実に進展しており、来年度は最終年度として、各動物グループ間の形成中心の相同性に関して、分子的立場から統一的な仮説を提出できるだけのデータを得たいと考えている。本研究は後口動物の発生においてその体制の構築に中心的役割を果たす形成中心の機能を分子的および進化的側面から解明することを目的としている。本年度は研究の最終年度に当たるため、各研究分担者の研究を収束させ全体としてまとめるために、合宿形式の班会議を開催した。本年度に得られた主要な成果は以下の通りである。(1)ヒトデ卵の原腸形成因子を受け継いだD細胞の細胞表面に誘導物質が存在することを確認した。(2)ホヤ神経索の形成と誘導の関係を明らかにした。(3)ウニ外腸胚形成ペプチド結合蛋白質の機能解析が進んだ。
麻酔・集中治療領域における交感神経活動定量システムの開発

手術室や集中治療室においてマイクロニューログラムの記録を可能とするため、交感神経活動の定量化システムを構築した。このシステムは電磁シールド、差動絶縁増幅、デジタル処理による活動電位バーストの検波、ノイズ弁別等の手法を使用した。このシステムにより、麻酔・集中治療領域における筋交感神経活動の新たな知見:1)星状神経節ブロックの脛骨神経筋交感神経活動(MSNA)に対する効果ならびに、2)陰圧・陽圧呼吸時の筋交感神経活動を得た。左側星状神経節ブロックは心拍数、血圧を増加させるが、そのメカニズムとして大動脈弓における圧受容器からの求心性の迷走神経がブロックされることによると推測されるが、遠心性の筋交感神経活動は動脈圧受容器に影響されるので、左側星状神経節ブロックは脛骨神経における遠心性MSNAを促進すると考えられた。つぎに、陰圧・陽圧呼吸時の筋交感神経活動を検討した。陰圧呼吸時、血圧は低下、心拍数は上昇したが筋交感神経活動は変化しなかった。陽圧呼吸時、血圧、心拍数は有意に変化しなかったが筋交感神経活動は増加した。結論として、陰圧呼吸時には血圧低下による動脈圧受容器の負荷減弱と静脈還流量増加による心肺圧受容器の負荷が筋交感神経活動に対し拮抗的に働いたと考えられた。陽圧呼吸時は静脈還流量低下による心肺圧受容器の負荷減弱の他に肺伸張受容器の刺激も筋交感神経活動の促進に働いたと推測された。ヒトにおける交感神経活動の評価はこれまで血圧、心搏数、皮膚血流量など交感神経効果器の反応や血漿カテコラミン値で間接的に行われてきた。これに対し近年マイクロニューログラフィーが開発されヒトにおいて交感神経節後遠心線維の活動を直接記録することが可能となった。一方、麻酔・集中治療領域において患者の交感神経活動を記録することは麻酔深度や患者のストレスの評価に極めて重要であるが、手術室、集中治療室における電磁波や交流雑音が障害となりそれを記録することは困難が予想される。そこで、手術室、集中治療室において交感神経活動を記録することを本年度の目的とした。健康成人男性ボランティアを対象として、手術室、集中治療室において実験を行った。タングステン微小電極を被験者の腓骨神経に挿入し骨格筋の血管を支配する筋交感神経活動の電位を記録した。得られた電位はタングステン微小電極のすぐ近傍に備えられたプリアンプにおいてまず増幅され、メインアンプにおいて再び増幅された。その後、500Hzから5,000Hzのバンドパスフィルタ、ノイズディスクリミネータを通し、時定数0.1秒にて全波整流積分しLabVIEW(平成7年度設備費)にて記録した。手術室、集中治療室におけるボランティアを対象とした本研究では筋交感神経活動を記録することが可能であった。しかしながら、その記録には多くの雑音を伴い、1分間あたりのバースト数として筋交感神経活動を定量的に評価することは困難であった。電気メスを作動させた状態では筋交感神経活動を記録することは不可能であった。本研究より手術室、集中治療室においても交感神経活動を記録することは可能であることがわかった。その定量的評価にはプリアンプ、メインアンプ、バンドパスフィルタ、ノイズディスクリミネータなどの設定の改良や絶縁の方法など雑音の軽減が必要であると考えられた。

左側星状神経節ブロックは心拍数、血圧を増加させるが、そのメカニズムとして大動脈弓における圧受容器からの求心性の迷走神経がブロックされることによると推測されるが、遠心性の筋交感神経活動は動脈圧受容器に影響されるので、左側星状神経節ブロックは脛骨神経における遠心性MSNAを促進すると考えられた。つぎに、陰圧・陽圧呼吸時の筋交感神経活動を検討した。陰圧呼吸時、血圧は低下、心拍数は上昇したが筋交感神経活動は変化しなかった。陽圧呼吸時、血圧、心拍数は有意に変化しなかったが筋交感神経活動は増加した。結論として、陰圧呼吸時には血圧低下による動脈圧受容器の負荷減弱と静脈還流量増加による心肺圧受容器の負荷が筋交感神経活動に対し拮抗的に働いたと考えられた。陽圧呼吸時は静脈還流量低下による心肺圧受容器の負荷減弱の他に肺伸張受容器の刺激も筋交感神経活動の促進に働いたと推測された。
島嶼における北限ブナ林の植生および遺伝変異の地理的構造と地史的な成立過程

北海道のブナは日本海側と太平洋側で異なるハプロタイプ(葉緑体DNA変異)を示す。太平洋側ブナは下北半島や北上山地のブナと同じハプロタイプをもち,日本海側ブナは津軽半島と同じハプロタイプを持つ。このことは,北海道のブナに2つの起源があり,現在北限に達しているのは日本海側のブナであることを示している。本研究では,奥尻島は日本海側にあるにも関わらず,太平洋側と同じハプロタイプを持つブナが多いことを示した。また,ブナ林の種組成も,東北地方北部(下北半島と北上山地)のブナ林と共通な複数の種で特徴づけられることを示した。これらの結果から,氷期,奥尻島は太平洋側ブナの逃避地の一つであったと推察される。日本海側の島嶼におけるブナの北限である奥尻島と対岸の渡島半島において,ブナ林分あるいは個体群を対象に,種組成あるいは葉緑体ハプロタイプを明らかにすることを目的に,以下の調査および試料の採取・分析を行った。1)奥尻島および渡島半島で,それぞれ17および6林分を対象に,植物社会学的な種組成の調査を行った。2)植物社会学的な調査から得られたデータをデータベース化するとともに,渡島半島における文献資料をデータベース化し,奥尻島ブナ林の種組成から見た特徴を検討した。3)葉緑体DNAのハプロタイプを同定するために、植物社会学的な調査を行った林分周辺のブナ個体群(26個体群)を対象に,葉の採取とハプロタイプの同定を行った。上に示した1)および2)の結果,奥尻島ブナ林は,ツルアリドウシ,ヒメカンスゲ,アカイタヤなどの出現によって,渡島半島のブナ林と区別された。また、奥尻島ブナ林の一部は,岩手県の北上山地にみられる植生単位(ブナーチシマザサ群集のツクバナンブスズ亜群集)を特徴づけている種群(標徴種)であるクルマバソウ,ズダヤクシュ,エゾイボタなどの出現によって特徴づけられた。一方,上に示した3)の結果,奥尻島および渡島半島でハプロタイプAとBの二つのタイプが見られたが,奥尻島ではハプロタイプBが優勢,渡島半島ではハプロタイプAが優勢であった。奥尻島で優勢なハプロタイプBの本州での分布をみると,鳥取県の大山から群馬県の鳩待峠まで連続的に分布し,これと少し距離を隔てて岩手県の北上山地の一部に分布していた。また,奥尻島のハプロタイプBからなる林分の多くは,北上山地の植生単位を特徴づける種群を持つ林分であった。これらの事実は,林分の種組成および葉緑体ハプロタイプから見た場合,奥尻島のブナ林分および個体群は,岩手県の北上山地のブナ林分および個体群と何らかの関連性があることを示唆している。昨年度行った植物社会学的な種組成調査の結果,奥尻島ブナ林の一部は,岩手県の北上山地にみられる既存の植生単位(ブナーチシマザサ群集ツクバナンブスズ亜群集)との関連が認められた。このことを受け,本年度は北上山地を中心とする東北地方北部(以後,東北地方と記述)および佐渡島において,以下のような植生調査と得られた資料の解析及び分子遺伝学的な変異の解析に必要な試料の採取と分析を行った。1)東北地方および佐渡島の13林分を対象に,植物社会学的な種組成の調査を行った。2)植物社会学的な調査から得られたデータをデータベース化し,昨年度行った奥尻島および道南での植生資料(23林分)と併せ,奥尻島ブナ林の種組成から見た特徴を検討した。3)葉緑体DNAのハプロタイプの同定と核マイクロサテライトの変異を明かにするために,植物社会学的な調査を行った林分周辺のブナ個体群(13個体群)を対象に,葉あるいは冬芽の採取を行った。4)葉緑体DNAのハプロタイプの同定と核マイクロサテライトの変異を解析した。上に示した1)および2)の結果,奥尻島と佐渡島のブナ林の種組成の間に明瞭な関連は認められなかった。一方,奥尻島のブナ林は種組成から2つのタイプに分けられ,東北地方の相対的に標高の低い場所に位置するブナ林あるいは渡島半島および東北地方の相対的に標高の高い場所に位置するブナ林と,それぞれ共通の種群によって特徴づけられた。3)および4)の結果,調査した合計36個体群のハプロタイプは,奥尻島(4個体群)および渡島半島(5個体群)を除き全てハプロタイプBであった。また,核マイクロサテライトの変異の分析については未だ不十分であるが,下北半島の個体群(浅虫と大間)と渡島半島および奥尻の個体群の間に類似性が認められた。昨年度までに得た植生資料に,本年度渡島半島で行った4箇所の調査地の植生資料を加えた。これらに文献から得た東北地方日本海側の低地の植生資料14箇所を加え,植物社会学的な表操作を行った。その結果,奥尻島,渡島半島,東北地方北東部のブナ林は共通の種群でまとめられ,東北地方日本海側のブナ林とは組成的に異なることが明らかになった。奥尻島に限ると,島の北西側に位置するブナ林は寡雪環境を指標する種群を持ち,島の東側中部に位置するブナ林とは異なる種組成を示した。

奥尻島での種組成の違いが積雪深と関連することが予想されたことから,3月上旬に積雪深の実測を行った。その結果,奥尻島の積雪深は全体として少ないものの,島の東側中部(約50 cm)に比べ北西側では半分以下(約20 cm)で,種組成と積雪深との間に密接な関係のあることが明らかになった。奥尻島のブナの葉緑体DNAハプロタイプをみると,積雪深の小さい北西側にハプロタイプBが,積雪深の大きい東側中部にハプロタイプAがみられた。また,渡島半島の東側(亀田半島)においても積雪深とハプロタイプの間に同様の関係が見られた。ハプロタイプBは東北地方北東部にも分布し,津軽海峡を挟みその北の亀田半島へと連なって分布し,さらに距離をおいて奥尻島西側に隔離的に分布していた。一方,相対的に多雪な地域に分布するハプロタイプAは,東北地方日本海側から津軽海峡を挟み渡島半島の西側(松前半島)に分布し,奥尻海峡を挟んで対岸(奥尻島東側中央部)に分布していた。奥尻島におけるハプロタイプBの存在は,奥尻海峡の幅(約18 km)とハプロタイプBの地理的分布および積雪深との関係から考えると、奥尻島がこの寡雪に適応したタイプのブナの逃避地であったことを示唆している。一方,多雪地に分布の中心を持つハプロタイプAが最終氷期に奥尻島に存在していた可能性は低く,氷期以降に分布拡大したと推察される。北海道のブナは日本海側と太平洋側で異なるハプロタイプ(葉緑体DNA変異)を示す。太平洋側ブナは下北半島や北上山地のブナと同じハプロタイプをもち,日本海側ブナは津軽半島と同じハプロタイプを持つ。このことは,北海道のブナに2つの起源があり,現在北限に達しているのは日本海側のブナであることを示している。本研究では,奥尻島は日本海側にあるにも関わらず,太平洋側と同じハプロタイプを持つブナが多いことを示した。また,ブナ林の種組成も,東北地方北部(下北半島と北上山地)のブナ林と共通な複数の種で特徴づけられることを示した。これらの結果から,氷期,奥尻島は太平洋側ブナの逃避地の一つであったと推察される。奥尻島のブナ林の種組成は,当初予想していた同じ日本海に浮かぶ島嶼である佐渡島のブナ林との類似性を示さなかった。一方,奥尻島のブナ林には,種組成から見て2つのタイプのブナ林があり,それぞれ渡島半島および東北地方の相対的に標高の高い場所に位置するブナ林(地理的には,早池峰山周辺,岩手県北部の内陸側,八甲田山の南西部)及び東北地方の相対的に標高の低い場所に位置するブナ林(地理的には,宮古市周辺と下北半島の浅虫および大間)と共通する種群を持つことが明らかになった。このような種組成の違いは,当初予想していたように温度要因や積雪量(日本海指数)と対応していることが明らかになったが,標高とも対応していることは予想外であった。今後は,文献資料も併せて解析するとともに,種組成だけでなく,出現した種の地理的分布や生態にも着目し,奥尻島のブナ林の種組成についての詳細な解析が必要であることが判明した。一方,核マイクロサテライトの変異について解析した結果,下北半島,渡島半島,奥尻島の間に変異の類似性が認められた。このことは,未だ予備的な解析の段階だが,後氷期のブナの北進ルートに関し,下北半島経由でのルートが存在することを示唆している。このことは,本研究の目的である「奥尻島のブナが,どこから,どのようにしてやって来たのか」という課題に対し,「どこから」という点に大きな示唆を提供する結果である。森林生態学今年度は,植生に関わる研究及び分子遺伝学的な変異に関わる研究,何れについてもこの2年間のデータに参照可能なデータを加え,最終的なまとめを行う予定である。植生に関わる研究については,これまで蓄積した植生資料に文献資料を加え,奥尻島ブナ林の種組成の特徴を,構成種の地理的分布とその生態にも着目して明らかにし論文としてまとめる予定である。
独自手法でES細胞から誘導された肝細胞を用いた慢性肝不全治療用人工肝臓の開発

本研究課題の研究成果概要を下記に示す。オルガノイド培養によるES細胞から肝細胞への分化誘導技術の開発として,遠心力を利用して中空糸内部にてオルガノイドを形成させる中空糸/オルガノイド培養を用いて検討を行った。まず齧歯類であるマウスES細胞を用いて検討を行った結果,中空糸内部に充填されたマウスES細胞は活発な増殖能を示し,高密度培養を達成するとともにオルガノイドを形成した。さらにES細胞から肝細胞への分化誘導効果が報告されている種々の分化誘導因子を添加することによりmRNAレベルでの種々の肝特異的マーカーの発現とともに,アルブミン分泌能,アンモニア除去能の発現が認められた。高密度培養を達成した結果,培養空間体積あたりでは初代マウス肝細胞と比較して1/2同等程度のアルブミン分泌能,アンモニア除去能を発現することが示された。次に霊長類ES細胞であるカニクイサルES細胞を用いた検討を行った結果,同様に旺盛な増殖能を示し高密度培養を達成した。一方肝機能評価としてアンモニア除去能を評価した結果、特別な分化誘導因子を添加することなく機能の発現が認められた。サルES細胞を用いたオルガノイド培養法における肝機能発現レベルを初代ブタ肝細胞、初代ヒト肝細胞およびヒト肝芽腫由来細胞株であるHepG2、C3Aと比較した。その結果、培養空間体積あたりでの機能発現レベルは初代肝細胞の約1/3、ヒト肝由来細胞株と同等の値を示した。分化誘導条件の最適化によりさらなる機能向上も見込め,本結果は将来的に同じ霊長類であるヒトES細胞に適用することにより,臨床用人工肝臓開発における細胞源確保の課題を解決する有望な手段であることが示された。本年度研究成果概要を下記に示す。1.オルガノイド培養によるES細胞から肝細胞への分化誘導技術の開発として,遠心力を利用して中空糸内部にてオルガノイドを形成させる中空糸/オルガノイド培養を用いて検討を行った。中空糸内部に充填されたマウスES細胞は活発な増殖性を示し,初代マウス肝細胞と比較すると約10倍に相当する1×10^9cells/cm^3-lumen volumeの高密度培養を達成した。ES細胞は中空糸内部において円柱状のオルガノイドを形成することが示された。さらに細胞増殖,オルガノイド形成能に与える中空糸膜表面特性の影響を検討するために,表面ぬれ特性の異なる2種類の中空糸を用いてマウスES細胞のオルガノイド培養を行った。その結果,疎水的表面を有する中空糸を用いた場合に高い増殖速度が示された。中空糸膜の表面特性とマウスES細胞の増殖性については現在詳細を検討中である。2.中空糸/オルガノイド培養を行ったマウスES細胞の肝細胞への分化について検討を行った結果,オルガノイドを形成させることによりアルブミンを分泌する細胞が認められた。ES細胞から肝細胞への分化誘導効率については現在検討中であるが,高密度培養を達成した結果,中空糸単位体積あたりでは初代マウス肝細胞と比較して1/2同等程度のアルブミン分泌能,アンモニア除去能を発現することが示された。以上の結果,ES細胞への中空糸/オルガノイド培養の適用は肝細胞への分化誘導手法として有望であることが示された。現在分化誘導のための最適条件を検討するとともに,ES細胞から肝細胞への分化誘導効率の定量的評価について検討を行っている。1.前年度の検討において確立した中空糸/