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マクロファ-ジのスカベンジャ-受容体の制御による動脈硬化予防

マクロファ-ジのスカベンジャ-受容体の構造、機能および制御機構の解明を通じて、マクロファ-ジへのコレステロ-ル蓄積、泡沫細胞の形成の抑制による動脈硬化の予防、治療をめざした。1)スカベンジャ-受容体の構造を人、マウス、兎で明らかにしドメイン構造を明らかにした。2)1型および2型の受容体をCOS細胞及びHEL細胞に発現し変性LDLなどのリガンド結合に関与するのがコラ-ゲン様ドメインの陽性に荷電したアミノ酸のクラスタ-であること、細胞質ドメインにエンドサイト-シスのシグナルがあること、第4ドメインにリサイクルのシグナルのあることがわかった。3)スカベンジャ-受容体の染色体遺伝子の全構造を決定し、約100kbの遺伝子は11個のエクソンよりなり、1型、2型の受容体がスプライシングによりつくられることがわかった。人及びマウスのプロモ-タ-の配列を決定し、単球からマクロファ-ジへの分化にともない発現することが明かとなった。4)ウシのスカベンジャ-受容体を発現したトランスジェニックマウスの確立に成功した。さらにヒトのスカベンジャ-受容体を発現したトランスジェニックマウスのコンストラクトを作成しマウスに導入中である。5)マウスの腹腔マクロファ-ジを用いたLDLの変性抑制剤のスクリ-ニング法を開発し、LDLの抗酸化作用を有する薬物のマクロファ-ジへのコレステロ-ル沈着を抑制する性質を検定することが可能となった。1.スカベンジャ-受容体の構造解析スカベンジャ-受容体のC端末欠失ミュ-タント13種を作成し、リガンド結合に関与するのがコラ-ゲン様ドメインのC端側の22アミノ酸の領域であることが分かった。この領域は陽性に荷電したアミノ酸が集まった部分で、スカベンジャ-受容体は、コラ-ゲンに結合する分子で陰性荷電のクラスタ-を有するものであると推定される。更にロイシンジッパ-様のコイルドコイルドメインが3量体形成に必要であることが判明した。2.スカベンジャ-受容体を介するコレステロ-ル蓄積の検討とLDL変性抑制剤の作用スカベンジャ-受容体の効率良いエンドサイト-シスはマクロファ-ジ特異的に起こることが牛スカベンジャ-受容体cDNAのヒトマクロファ-ジへの発現実験で証明された。培養cos細胞にスカベンジャ-受容体を発現させるとアセチルLDL及び酸化LDLを取り込み分解するようになる。この取り込み作用は、LDLの変性(酸化)抑制剤であるプロブコ-ルで抑制されることが証明された。牛受容体cDNAを発現した3系統のスカベンジャ-受容体過剰発現マウスが樹立された。現在病理学的検討を進めている。3.スカベンジャ-受容体遺伝子の解析ヒトスカベンジャ-受容体は、染色体8番にあり、現在まで約100Kbの部分のクロ-ニングが終了し、I型及びII型のエキソン構造(11個)の解析及びヒト、マウスのプロモ-タ-領域の解析が進められている。スカベンジャ-受容体の発現はほぼ完全にマクロファ-ジ特異的であることが分かった。1)スカベンジャ-受容体の構造を変異体をCOS細胞に発現させ各ドメインの役割を検討した。細胞質ドメインだは、11番から19番目のアミノ酸にエンドサイト-シスに重要なシグナルの存在する。コイルドコイルドメインには、リサイクルに必要な構造が存在する。2)スカベンジャ-受容体が11個のエクソンよりなり、1ー8番目のエクソンが1型2型共通のドメインで、9番目のエクソンが2型特異、10、11番目が1型特異であることがわかり、1型、2型の受容体がスプライシングによりつくられることがわかった。人及びマウスのプロモ-タ-の配列を決定し、マウスのプロモ-タ-はTATABox構造をゆうするが、ヒトのプロモ-タ-は2つのTATAlike構造をゆうすること、フォルボルエステルによる単球からマクロファ-ジの分化にともない発現するが、TPAresponsible elementは存在しないことなどが明かとなった。

3)ウシのスカベンジャ-受容体を発現したトランスジェニックマウスの確立に成功したが発現のレベルがまだ充分でなくさら強力なプロモ-タ-にヒトのスカベンジャ-受容体をつないだトランスジェニックマウスのコンストラクトを作成しマウスに導入中である。4)マウスの腹腔マクロファ-ジを用いたLDLの変性抑制剤のスクリ-ニング法を開発し、LDLの抗酸化作用を有する薬物のマクロファ-ジへのコレステロ-ル沈着を抑制する性質を検定することが可能となった。
極低酸素透過バリヤーを形成するイリジウム基金属間化合物による超耐酸化被膜の開発

W合金や炭素繊維強化炭素材料などの超高温構造材料の実用化のために、優れた耐酸化コーティングが要求されている。耐酸化性の向上のためには、基材への酸素の透過を抑制する酸素透過防止バリヤー(Oxygen Diffusion Barrier : ODB)が重要であり、ODBとして融点2720KのイリジウムIrが最適である。しかし、Ir自身の耐酸化性はあまり良くない。この点をふまえ、スマートマテリアル設計の観点から耐酸化皮膜としてIrAlおよびIr-Si合金を設計した。設計では、酸化により「ODBとなるIr連続層とそれを酸化から守るAl_2O_3またはSiO_2層を生成し,かつこれらが自己修復的機能を有する材料」になると考えられた。実験の結果、IrAlは酸化するとIrAl-Ir-Al_2O_3の3相領域に入るため(2IrAl+3O_2→2Ir+2Al_2O_3),IrAlは酸化によりIr相とAl_2O_3相を生成することがわかった。一方、Ir-Si系に関しては,Ir-2550mol%Si合金を作製し、示差熱分析を行った結果,1600-1760K程度に液相を含む反応があり,このためIr-Si2元系合金を超高温用皮膜として用いることは困難であることを明らかにした。以上より,Ir-Al合金がスマートODBとして有力であることを示し、プロセスの検討および第三元素添加による改良を試みた。プロセスとしては、素粉末からの反応ホットプレス法によるとわずかにAl_2O_3の混在したほぼB2単相の合金を作製できた。したがって、反応ホットプレス法は皮膜作製に必要となる溶射粉末やスパッタターゲット材などのIrAl単相合金の作製に有効な手法である.IrAlの改良のための添加元素としてB2安定性を高めAl_2O_3生成能を向上させると考えられるFe,Co,Niを添加し、酸化挙動を調べた結果、特にNi添加とCo添加合金で重量変化が激減し、IrAlの耐酸化性を大きく向上させることを明らかにした。しかし、これらの元素添加はODBであるIr連続層の形成能を低下させるため、数mol%程度の添加量で最も良好な耐酸化性と目的の耐酸化多層被膜構造が得られることを明らかにした。超高温構造材料の実用化にはコーティングによる耐酸化性の付与が必要であり,優れた超高温耐酸化皮膜の開発が急務である.本研究では,超高温耐酸化皮膜に要求される性質(高融点,極低酸素透過性,優れた耐酸化性,自己修復性,熱膨脹係数など)のうち,かなりの部分を満たすことのできる材料としてIrAl金属間化合物皮膜が適当と考え,アーク溶解および粉末冶金法により種々のIrAl合金を作製し,相安定性,機械的性質および耐酸化性を調べた.また,同様にIr-Si期金属間化合物を作製した.本年度明らかになった結果を列挙する.(1)組織IrAl合金では,溶解材ではIr/IrAl共晶が残存し,これを機械的に壊し焼結してもIr相が残存する.耐酸化性と靱性を劣化させる共晶Irは熱的にかなり安定であり,溶体化による除去が困難である.反応ホットプレス法ではB2単相を作製できる.(2)相安定性IrAl合金およびNi,Co添加IrAl合金は1750°Cまでの相安定性に優れる.一方,Fe添加IrAl合金およびIr-Si合金は1500°C以下の低温でも相が不安定である.(3)耐酸化性アルミとの合金化によりイリジウムの耐酸化性は極めて向上する.大気中1773Kで86.4ks酸化後の溶解材の皮膜形態をEDS/WDS分析した結果,表面から,ドメイン状のIrを含むAl_2O_3層,Al_2O_3連続層,Ir連続層,母材のIrAlとなり,設計どおり,Ir層により酸素拡散は抑制される.(4)添加元素の影響Ni,Co,Fe添加により酸化中の重量変化が減少する.特にNi,o添加はIrAlの耐酸化性向上に有効といえる.一方,Fe添加は内部まで酸化物が形成される.酸化挙動に関しては今後詳細に検討する必要がある.W合金や炭素繊維強化炭素材料などの超高温構造材料の実用化のために、優れた耐酸化コーティングが要求されている。

以上より,Ir-Al合金がスマートODBとして有力であることを示し、プロセスの検討および第三元素添加による改良を試みた。プロセスとしては、素粉末からの反応ホットプレス法によるとわずかにAl_2O_3の混在したほぼB2単相の合金を作製できた。したがって、反応ホットプレス法は皮膜作製に必要となる溶射粉末やスパッタターゲット材などのIrAl単相合金の作製に有効な手法である.IrAlの改良のための添加元素としてB2安定性を高めAl_2O_3生成能を向上させると考えられるFe,Co,Niを添加し、酸化挙動を調べた結果、特にNi添加とCo添加合金で重量変化が激減し、IrAlの耐酸化性を大きく向上させることを明らかにした。しかし、これらの元素添加はODBであるIr連続層の形成能を低下させるため、数mol%程度の添加量で最も良好な耐酸化性と目的の耐酸化多層被膜構造が得られることを明らかにした。
官能基化された高歪み環状化合物の反応を軸とした新規反応活性種の創製

研究目的・歪み化合物に内在する化学エネルギ-を金属化合物などとの相互作用を通じて利用し新しい活性種を創製することを目的とし、単環性化合物中最も歪みの大きいシクロプロペノンおよびメチレンシクロプロパンに注目して新規反応活性種,新反応を開発する.研究成果.(1)新規【3+2】付加環化反応の開発.メチレンシクロプロパノン誘導体の環開裂をともなう,【3+2】型の5員環合成法を開発することができた.即ち2-メチレンシクロプロパノンアセタ-ルを電子不足オレフィンと加熱することによりシクロペンタン誘導体を得ることができた.一方カルボニル化合物との反応も同様に進行しαーメンチレンーγーブチロラクトンのアセタ-ルが得られた.また本熱分解反応で反応活性種を,加溶媒分解と熱異性化の反応速度論目研究および理論計算を用いて明かにした.(2)カルボメタル化反応の選択性.シクロプロペノンアセタ-ルに対する有機金属化合物の付加反応によって、官能基化されたシクロプロピル有機金属活性種を合成し,この反応の関する種々の選択性の詳細を検討した.さらにこれらの反応を応用し,光学活性アセタ-ルを出発物質として新しい不斉合成の手法に展開した.(3)ジカルボニル化合物合成法の開発.一酸化炭素およびアリ-ルトリフルオロメタンスルホナ-トを利用した,パラジウム触媒下でのシクロプロパノンアセタ-ルの開環反応を利用することで,パラジウムホモエノラ-トを中間活性種とする1,4-ジカルボニル化合物の合成反応を開発し,またその反応機構を検討した.研究目的・歪み化合物に内在する化学エネルギ-を金属化合物などとの相互作用を通じて利用し新しい活性種を創製することを目的とし、単環性化合物中最も歪みの大きいシクロプロペノンおよびメチレンシクロプロパンに注目して新規反応活性種,新反応を開発する.研究成果.(1)新規【3+2】付加環化反応の開発.メチレンシクロプロパノン誘導体の環開裂をともなう,【3+2】型の5員環合成法を開発することができた.即ち2-メチレンシクロプロパノンアセタ-ルを電子不足オレフィンと加熱することによりシクロペンタン誘導体を得ることができた.一方カルボニル化合物との反応も同様に進行しαーメンチレンーγーブチロラクトンのアセタ-ルが得られた.また本熱分解反応で反応活性種を,加溶媒分解と熱異性化の反応速度論目研究および理論計算を用いて明かにした.(2)カルボメタル化反応の選択性.シクロプロペノンアセタ-ルに対する有機金属化合物の付加反応によって、官能基化されたシクロプロピル有機金属活性種を合成し,この反応の関する種々の選択性の詳細を検討した.さらにこれらの反応を応用し,光学活性アセタ-ルを出発物質として新しい不斉合成の手法に展開した.(3)ジカルボニル化合物合成法の開発.一酸化炭素およびアリ-ルトリフルオロメタンスルホナ-トを利用した,パラジウム触媒下でのシクロプロパノンアセタ-ルの開環反応を利用することで,パラジウムホモエノラ-トを中間活性種とする1,4-ジカルボニル化合物の合成反応を開発し,またその反応機構を検討した.本研究は歪み化合物に内在する化学エネルギ-を利用してこれまでにない反応活性種を創製することを目的として行ない、本年度はとくにシクロプロペン、メチレンシクロプロペノン誘導体の反応を中心に新規反応活性種、新反応を開発した。今年度発表したシクロプロペン、シクロプロペノン誘導体の新規合成法に基づき合成した種々の基質に対し有機銅、有機亜鉛試薬、またラジカル活性種などを付加させることによりシクロプロパン、シクロプロパノン類を合成するという新規合成手法を開発した。また以上の方法を応用することにより初めて合成可能となったメチレンシクロプロパノン誘導体の環開裂をともなう、〔3+2〕型の5員環合成法を開発することができた。即ち2-メチルシクロプロペノンケタ-ルの塩基処理にて容易に得られる2-メチレンシクロプロパノンケタ-ルを不飽和エステルなどの電子不足オレフィンと80度程度に加熱することによりシクロペンタン誘導体を一挙に、かつほぼ定量的な収率で得ることができた。また一方アルデヒド、ケトンなどカルボニル化合物との反応も同様に進行しα-メチレン-Υ-ブチロラクトンのアセタ-ルがほぼ定量的な収率で得られた。本反応は中間にトリメチレンメタン活性種を経て進行していると考えられる全く新しい形の付加環化反応であり、6員環合成でのDiels-Alder反応に対応する、熱反応による5員環合成法として有効であると期待される。またここでは本研究費で購入した超高圧装置の使用が反応収率の向上に極めて有効であった。研究目的.歪み化合物に内在する化学エネルギ-を金属化合物などとの相互作用を通じて利用して新しい活性種を創製することを本研究の目的とする.本研究では単環性化合物中最も歪みの大きいシクロプロペノンおよびメチレンシクロプロパンに注目し新規反応活性種,新反応を開発した.研究成果.昨年度開発したシクロプロパノン誘導体,メチレンシクロプロパノン誘導体の新規反応に基づき,次の3つの反応を開発した.(1)新規[3+2]付加環化反応の開発

.ジアルコキシメチレンシクロプロパンとカルボニル化合物間の[3+2]付加環化反応を検討し,この反応がαーメチレンーγーブチロラクトンのアセタ-ルを高選択的かつ高収率で与えることを見いだした.さらにこの生成物の誘導により,各種テトラヒドロフラン誘導体の合成法を開発した.また本熱分解反応で生じる反応活性種を,加溶媒分解と熱異性化の反応速度論的研究および活性種と考えられるトリメチレンタンの理論計算を用いて明かにした.(2)ジカルボニル化合物合成法の開発.1酸化炭素およびアリ-ルトリフルオロメタンスルホナ-トを利用した,パラジウム触媒下でのシクロプロパノンアセ-ルの開環反応を利用することで1,4ージカルボニル化合物の合成反応を開発し,またその反応機構を検討した.(3)カルボメタル化反応の選択性.昨年度までに開発したシクロプロポノンアセタ-ルに対する有機銅,有機亜鉛化合物の付加反応に関する種々の選択性の詳細するとともに,光学活性アセタ-ルを合成しそのジアステレオ選択性を検討した.
疾患研究応用に向けたヒトiPS細胞からの高効率B細胞誘導法の開発

本年度は以下の3つの研究を行った。1当研究室にて樹立したヒトiPS細胞をMEF細胞上より剥離し、胚様体形成を行った。分化誘導後16-40日目にて胚様体を回収し、CD34陽性細胞を分離してMS-5細胞上に播種し、B細胞系への分化誘導を行った。MS-5細胞上への播種後4週間目にてB細胞マーカーであるCD19陽性細胞が極めて低効率(CD45陽性細胞中の1%以下)で検出された。この結果は予想した通り、遺伝子導入なしにヒトiPS細胞からB細胞系譜への分化誘導が困難であることを示すと考える。2申請書に示した候補遺伝子のうち、すでにクローニングできている遺伝子について臍帯血由来造血幹細胞に遺伝子導入を行い、リンパ球系細胞の分化能について確認を行った。まずEF1aプロモーターにて候補遺伝子が発現するレンチウイルスベクターを開発し、造血幹細胞に強制発現させたところ、リンパ球系細胞へ分化した細胞は確認できなかった。次に上記の候補遺伝子をドキシサイクリン濃度依存的に発現させるレンチウイルスベクターを構築した。候補遺伝子の代わりに緑色蛍光タンパク質を発現誘導できるベクターをヒト臍帯静脈内皮細胞に導入してベクターの品質評価試験を行ったところ、ドキシサイクリン濃度依存的にGFPを発現誘導できることが確認された。現在は、臍帯血由来造血細胞やiPS細胞への導入条件の最適化を行っている。3我々は同時に造血幹細胞を含む血球系細胞への複数遺伝子を可能に高効率にする導入するベクターの開発を行った。我々は当研究室で新規開発した麻疹ウイルスベクターを用いて、これら血球系細胞への遺伝子導入を行った。5遺伝子搭載麻疹ウイルスベクターは造血幹・前駆細胞、B細胞系細胞へ8割以上の導入効率を示し、また安定的に5遺伝子の高い発現が確認できた。
次世代ペリオスチン測定キットの開発

ペリオスチンは多くの疾患におけるバイオマーカーとして有用だが,疾患特異性に問題が存在する。本研究では,疾患特異的なペリオスチン測定キットの構築を目的とした。我々は,まず血清ペリオスチンは多量体と単量体とで存在し, SS19DとSS19Aの二つの抗ペリオスチンモノクローナル抗体が単量体ペリオスチンのみを認識することを見出した。さらに,単量体ペリオスチンは,特発性肺線維症(IPF)の診断能力や呼吸機能悪化の予後予測能力において,従来のバイオマーカーに比べて優れていることを明らかにした。以上より,単量体ペリオスチンの測定は, IPF患者の診断・管理において有用であると考えられた。ペリオスチンは細胞外マトリックスタンパク質の一つである。我々は,ペリオスチンが喘息における肥厚した基底膜の構成成分となっていることを明らかにした。その後,ペリオスチンは2型炎症反応のバイオマーカーとなるとともに, 2型炎症反応阻害薬の効果予測に有用であることが示されている。我々も,独自でペリオスチン検出キットを構築し,喘息のクラスター分類,あるいは治療薬の選択において有用なバイオマーカーとなることを明らかにした。しかし,アトピー性皮膚炎,間質性肺炎,強皮症など数多くの炎症疾患において血中ペリオスチン濃度が上昇することから,現在のペリオスチン検出キットには疾患特異性に問題が存在する。本研究では,疾患特異的なペリオスチンを同定し,そのタイプに特異的な抗体を作製することを目的としている。我々は,まず血清ペリオスチンは多量体と単量体とで存在することを明らかにし,この両者を区別することのできる抗体を探索した。その結果, SS19DとSS19Aの二つの抗ペリオスチンモノクローナル抗体が単量体ペリオスチンのみを認識することを見出した。この両者を組み合わせてELISAシステムを構築して60名の特発性肺線維症(IPF)患者を対象として解析を行った結果,(1)単量体ペリオスチンはKL-6, SP-D, LDH,総ペリオスチン(多量体ペリオスチン+単量体ペリオスチン)に比べてIPFの診断能力が優れている,(2)単量体ペリオスチンと総ペリオスチンはKL-6, SP-D, LDHに比べて呼吸機能悪化の予後予測能力において優れている,(3)単量体ペリオスチン/総ペリオスチン比はIPFにおいて喘息,アトピー性皮膚炎,強皮症に比べて高いことを明らかにした。血清ペリオスチンには多量体と単量体が存在することは,我々も含めて複数のグループによりすでに確認されていた。しかし,単量体を特異的に認識する抗体の作製に成功したのは本研究が始めてである。しかも単量体ペリオスチンの測定が,従来の総ペリオスチン(多量体ペリオスチン+単量体ペリオスチン)の測定に比較して, IPFの診断や,他のペリオスチン高値を示す疾患の鑑別において有用であることを明らかにした。このことは,単にペリオスチンタンパク質の生物学的意義の発展に留まらず, IPFの診断・管理に大きく貢献すると期待され,大きな基礎的・臨床的意義を持つ研究成果であると言える。ただ,今回の成果はIPFに特異的な現象であり,喘息,アトピー性皮膚炎,強皮症など他のペリオスチン高値を示す疾患での特異的タイプの同定には至っておらず,今後の課題となっている。涙液ペリオスチンを測定するための迅速測定システムの構築を検討した。その結果、まず涙液を試験紙で収集し、それを測定溶液に溶解して検体として測定に用いるようにした。この方法だと、涙液の容量は5 mLで充分であった。Immunotrap法と磁気ビーズを組み合わせてペリオスチン検出システムを構築した。これにより、涙液ペリオスチンの検出は1分で可能となった。カットオフ値は10 ng/mLに設定し、その結果、健常人とアレルギー性結膜炎患者との鑑別における感度、特異度はともにほぼ1.0であった。以上より、涙液ペリオスチンを測定するための迅速測定システムの構築に成功した。現在、アレルギー性結膜炎患者の涙液を用いた臨床性能試験の実施を計画している。これにおいて満足した結果を得ることができれば、PMDAに提出して体外診断薬システムとしての認可を獲得する予定である。今年度涙液ペリオスチンを測定するための迅速測定システムの構築に成功した。これによりアレルギー性結膜炎患者に対する体外診断薬の開発に道筋を作ることができ、当該疾患の診療に非常に有用となると期待される。ペリオスチントランスジェニック(TG)マウスを作製して、ペリオスチンの生理的・病的役割について解析するとともに、マウスにおける血清ペリオスチン測定システムの構築を目指した。CAGプロモーター・エンハンサー遺伝子の下流にペリオスチン遺伝子を挿入してマウスに発現させた。その結果、三つのラインにおいて生殖細胞を経由するペリオスチン遺伝子の発現を認めた。また、我々が作製した抗ペリオスチン抗体の中で、SS19CとSS19Dを組み合わせたELISAキットを用いると、マウス血清においてペリオスチン測定が可能となることが判明した。このキットを用いてTGマウスでの血清ペリオスチンを測定したところ、ライン7のTGマウスにおいて、他のラインに比べて7-10倍の値を示した。そのため、その後の解析にはライン7を用いた。ライン7のTGマウスでは、皮膚、肺、心臓において恒常的なペリオスチン発現が認められた。

しかし、これらの臓器の機能においては明らかな異常は認められなかった。一方で、これらのマウスを用いて創傷治癒機能について解析したところ、TGマウスでは野生型マウスに比べて治癒が遅延することが明らかとなった。これは時間的・空間的に異常なペリオスチンの発現は、正常なペリオスチンの機能とは異なり、創傷治癒過程に影響を与えていると考えられた。以上より、ペリオスチンTGマウスはペリオスチンの生理的・病的役割を解析する上での有用な手段となるとともに、SS19CとSS19Dを組み合わせたELISAキットによるマウス血清ペリオスチンの測定により、生体内でのペリオスチン産生・代謝の動向を検討することが可能となることが明らかとなった。ペリオスチンは多くの疾患におけるバイオマーカーとして有用だが,疾患特異性に問題が存在する。本研究では,疾患特異的なペリオスチン測定キットの構築を目的とした。我々は,まず血清ペリオスチンは多量体と単量体とで存在し, SS19DとSS19Aの二つの抗ペリオスチンモノクローナル抗体が単量体ペリオスチンのみを認識することを見出した。さらに,単量体ペリオスチンは,特発性肺線維症(IPF)の診断能力や呼吸機能悪化の予後予測能力において,従来のバイオマーカーに比べて優れていることを明らかにした。以上より,単量体ペリオスチンの測定は, IPF患者の診断・管理において有用であると考えられた。血清においてどうして多量体ペリオスチンと単量体ペリオスチンが存在し, IPF患者において単量体ペリオスチンが相対的に多量体ペリオスチンに比べて増加するのかを明らかにする。そのために,多量体ペリオスチンの構成様式について解析を行う。具体的には, (1)ペリオスチン会合タンパク質の同定, (2)会合に関与しているジスルフィド結合の同定とその結合様式の解析を進める。さらに,喘息,アトピー性皮膚炎,強皮症など他のペリオスチン高値を示す疾患での特異的タイプの同定を進める。具体的には, (1)種々のペリオスチンアイソフォームに対する抗体の作製と疾患における発現の解析, (2)患者血清からのペリオスチン精製とそれによる患者特異的アイソフォームの同定により進める。当初の目標通り、涙液ペリオスチンを測定するための迅速測定システムの構築に成功した。今後、ペリオスチンの体液、あるいは血清内での性状について解析を進め、新たなペリオスチン測定キットの開発につなげる。アレルギー学
複数遺伝子の同時・並列転写制御によるヒト細胞内での遺伝子発現ネットワークの構築

本研究課題では、RNAの構造変化の前後における熱安定性変化を考慮することで、標的の化合物に応答してTatタンパク質由来のペプチド(Tatペプチド)との結合親和性を向上させるRNAを合理的に設計することに成功した。この成果は、転写活性化因子であるTatタンパク質の相互作用を利用した細胞内での転写反応制御システムに活用できると期待される。さらに本研究課題では、転写反応の制御と併用するために、RNAの構造変化を利用した翻訳反応の制御システムの構築を検討した。mRNA上での二次構造と四重鎖構造との競合的な平衡が遺伝子の発現に影響することを見出し、翻訳反応の制御システムへの研究展開の可能性を示した。本研究課題では、ヒト細胞内において複数遺伝子の転写活性化を、同時かつ並列に制御できる人工システムを構築することを目的としている。そのために、特定の低分子化合物を用いて、ウイルス由来の転写トランス活性化因子(Tat)とその標的RNAであるTAR-RNAとの相互作用をアロステリックに制御し、転写反応レベルでの遺伝子発現制御を行う。当該研究年度では、TAR-RNAのループ領域に、1.テオフィリン、2.テトラサイクリン、3.ネオマイシン、4.アデニン、5.グアニン、6.S-アデノシルメチオニン、7.チアミンピロリン酸と特異的に結合するRNAアプタマーを挿入したRNAを7種類設計した。各RNAは、標的化合物の存在下で、Tat由来のペプチド(Tatペプチド)との親和性が低下した(ChemMedChem, 9,2045-2048 (2014))。これらのRNAを用いることで、各化合物に応答した転写反応のOFFスイッチを構築できると期待される。また、天然に存在するフラビンモノヌクレオチド(FMN)に結合するRNAアプタマーに関して、RNA高次構造中に存在する二次構造領域の熱安定性および一本鎖領域間の相互作用が、FMNとの結合親和性および結合反応速度に及ぼす影響を解析した(Bull. Chem. Soc. Jpn. (2015), in press、Angew. Chem. Int. Ed., 54, 905 (2015))。これらの研究成果は、制御分子となる分子に対する遺伝子発現制御システムの応答性を合理的に調節できる可能性を示したといえる。細胞内での遺伝子発現制御を行うために、Tatを定常的に発現する細胞株を用いての検討を行った。In vitroで得られた、テオフィリンに応じてTatペプチドとの親和性を向上させるRNA配列を用いることで、細胞内で転写反応のONスイッチとして機能し得ることが確認された(論文未発表)。これにより、本システムがOFFスイッチとONスイッチの両方に適用できる可能性を示すことができた。本研究課題では、インプットシグナルとなる特定の化合物に応答したRNAの構造変化に基づき、複数遺伝子の発現を制御できるシステムを構築することを目的としている。初年度において、ネオマイシンを標的としたRNAのセレクションにより、ネオマイシンに応答して転写活性化因子であるTat由来のペプチド(Tatペプチド)との結合親和性が向上するRNAが得られている。当該研究年度では、得られたRNA配列が示す構造変化の前後における熱安定性の変化を考慮することで、ネオマイシン以外の化合物に応答してTatペプチドとの結合親和性を向上させるRNAの配列設計に成功した(Anal. Chem., 87, 7628 (2015))。この研究成果は、既存の分子認識RNA(アプタマー)を利用することで、様々な化合物を対象に、構造変化を示すRNAの配列を合理的に設計できることを示しており、細胞内での遺伝子発現制御や特定の化合物のセンサーに活用可能であると考えられる。当該研究年度では、新生RNAの構造変化を利用した翻訳制御システムについてもその可能性を検討した。四重鎖構造を形成し得るRNA配列の前後に、安定な二次構造を形成する配列を挿入し、転写反応の途中で四重鎖構造が形成されるか否かを検討した。その結果、四重鎖構造を形成するRNAの5'側に二次構造の形成配列が存在していた場合、転写反応中の四重鎖構造の形成が抑制されることが示された(Anal. Chem., 88, 1984 (2016))。研究代表者らは、RNAの四重鎖構造が翻訳反応を抑制することを既に示している。そのため、四重鎖構造を形成するRNAの5'側にアプタマーの配列を導入することで、標的化合物に応答した翻訳反応の制御システムを構築できる可能性が考えられる。当該研究年度では、四重鎖構造を形成する配列をmRNA中のどの位置に導入すれば、効率良く翻訳反応を抑制できるのかについての知見も得た(Sci. Rep., 6, 22719 (2016))。本研究課題では、転写反応の制御を中心とした遺伝子発現の制御システムを構築することを主目的としている。これまでの研究の遂行により、様々な化合物(ネオマイシン、アデニン、S-アデノシルメチオニン、チアミンピロリン酸など)に応答し、転写活性化因子であるTat由来のペプチド(Tatペプチド)との親和性を変化させるRNAの合理的な設計に成功した。当該研究年度における研究成果は、平成26年度での研究の進捗状況を受けて設定した【今後の研究の推進方策】に沿った研究成果である。一方で、合理的に設計したRNA配列を用いて、特定の化合物による細胞内での遺伝子発現制御を試みたところ、RNAの構造変化特性を反映して遺伝子の発現量変化が起こるものの、当初想定していたほどの大きな変化が現れないことも見出されつつある。

そこで当該研究年度では、転写反応に引き続く翻訳反応段階にも制御点を設け、転写と翻訳の2段階の発現制御を組み込むことで、OFF状態とON状態での遺伝子発現量の差が大きなシステムを構築するための検討を始めた。翻訳反応を抑制するRNA四重鎖構造を形成する配列の近傍に、安定な二次構造を形成するRNA配列を導入することで、四重鎖構造の形成が抑制されることを示すことができた。また、翻訳反応を効率良く抑制するための四重鎖構造の最適な導入位置についても知見を得た。これらの研究成果は、当初の研究計画にはなかったものであるが、特定の標的化合物とRNAアプタマーとの結合によるRNA構造の安定化を利用した、新たな遺伝子発現制御システムへの応用展開が期待される成果である。以上の研究成果により、当該研究課題は、研究目的の達成に向けておおむね順調に進展していると判断できる。本研究課題では、特定の分子に応答したRNAの構造変化に基づき遺伝子の発現を制御できるシステムを構築する。これまでに、構造変化の前後におけるRNAの熱安定性変化を考慮することで、標的の化合物に応答してTatタンパク質由来のペプチド(Tatペプチド)との結合親和性を向上させるRNAを合理的に設計することに成功した。この研究成果は、転写活性化因子であるTatタンパク質の相互作用を利用した細胞内での転写反応制御システムに活用できると期待される。また本研究課題では、新生RNAの構造変化を利用した翻訳制御システムについてもその可能性を検討してきた。これまでに、四重鎖構造を形成するRNA配列に重複して、5'側に安定な二次構造を形成する配列が存在していた場合、転写反応直後には準安定な二次構造が優先的に形成されることを明らかにした。本年度は、いくつかの癌遺伝子のmRNAにおいて、このような塩基配列を見出した。さらに癌細胞内での発現量が上昇するtRNAが存在すると、四重鎖構造よりも二次構造の方が安定になり、タンパク質の発現量に影響することを示した(Angew. Chem. Int. Ed., 55, 14315 (2016))。この成果は、準安定な二次構造に相互作用する分子を用いて、四重鎖構造の機能を制御可能であることを示している。そこで、RNAの二次構造に特異的に結合するペプチド核酸(PNA)を利用した遺伝子発現制御システムの構築を念頭に、RNA二次構造とPNAとの結合反応を詳細に解析した。その成果として、pHが低い環境で結合速度定数が上昇することでRNAとPNAとの結合親和性が増大することを明らかにした(Phys. Chem. Chem. Phys., 18, 32002 (2016))。また、これらの研究成果を総説としてまとめた(The Chem. Rec., in press)。本研究課題では、RNAの構造変化の前後における熱安定性変化を考慮することで、標的の化合物に応答してTatタンパク質由来のペプチド(Tatペプチド)との結合親和性を向上させるRNAを合理的に設計することに成功した。この成果は、転写活性化因子であるTatタンパク質の相互作用を利用した細胞内での転写反応制御システムに活用できると期待される。さらに本研究課題では、転写反応の制御と併用するために、RNAの構造変化を利用した翻訳反応の制御システムの構築を検討した。
インフルエンザ菌感染症に及ぼすＩ型インターフェロンの役割

インフルエンザ菌による慢性下気道感染症の成立機序について、インフルエンザ菌が気道上皮細胞内侵入性を有することに着目して解析を行った。肺気腫患者の下気道に定着したインフルエンザ菌21株について気道上皮細胞内侵入性について比較したところ、菌株によって侵入能力に差が認められた。さらに気道上皮細胞内へ高頻度に侵入したインフルエンザ菌では、I型インターフェロン(IFN)の産生が有意に増加していた。通常、I型(IFN)は抗ウイルス作用を発揮するが、インフルエンザ菌感染症においては気道感染を発症しやすくする増悪因子として作用することが明らかとなった。非莢膜型インフルエンザ菌(nontypeable Hamophilus influenzae; NTHi)は市中肺炎や慢性下気道感染症の重要な原因菌の一つである。一旦、下気道に定着すると完全に除去することは困難であり、繰り返す気道感染によって気管支拡張像が進行し、患者のQOLを著しく障害する。今回我々はインフルエンザ菌が持つもう一つの特徴である細胞内寄生性に着目し、細胞内寄生後に気道上皮細胞から産生されるI型インターフェロンがNTHiの細胞内寄生性を促進し、好中球などの宿主自然免疫からの回避機構を獲得しているのではないかと仮説を立て、研究を行った。NTHiの気道上皮細胞侵入性を確認するため、H292細胞をNTHi培養液で共培養し、電子顕微鏡で細胞内NTHiを確認したところ、細胞表面から細胞内に侵入するNTHiを確認することができた。またCOPD患者の下気道に慢性的に定着したNTHi臨床分離株をH292細胞と共培養した後に破砕し、細胞内NTHi数を測定したところ、菌株によって細胞内侵入性に有意差があることが確認できた。さらに気道上皮細胞をrecombinant IFN-βで前処理した後にNTHiと共培養したところ、IFN-βの用量依存的に細胞内NTHi菌数が増加することも確認できた。さらにインフルエンザ菌をマクロファージ(voluntterより採取した血液より分離)、およびH292細胞と共培養し、細胞上清中のIFN-β、IFNN-βmRNA発現をそれぞれELISA, RT-PCRで測定したところ、有意に増加していることが明らかとなった。以上のことより、NTHiが感染することで宿主気道上皮細胞およびマクロファージよりIFN-βが産生され、INF-βによってNTHiの気道上皮細胞内侵入性が促進し宿主自然免疫系を回避し、慢性下気道感染症が成立するものと考えられた。本研究は市中肺炎および慢性気道感染症の主な病原細菌であるインフルエンザ菌の新規自然免疫耐性機序を宿主免疫との相関に着目し解明するものである。細胞外寄生体と考えられていたインフルエンザ菌が近年、細胞内へ侵入し宿主免疫を回避することが知られるようになった。我々は、細胞内へ侵入した際に宿主細胞から産生されるI型IFNが細菌感染症の進展に影響を及ぼしていることが報告されていることに注目した。インフルエンザ菌はインフルエンザ菌が気道上皮細胞内へ侵入することを確認するため、インフルエンザ菌臨床分離株を用いてinvasion assayを行った。インフルエンザ菌感染後の気道上皮細胞(H292)を電子顕微鏡で観察したところ、細胞内に侵入するインフルエンザ菌の菌体を確認できた。インフルエンザ菌感染時に宿主細胞よりI型IFN産生が誘導されることを再確認するため、インフルエンザ菌感染後の気道上皮細胞によるIFN-βmRNA発現をRT-PCRで解析したところ、有意にIFN-βmRNA発現が亢進していた。さらに野生型マウス腹腔内マクロファージを抽出し、インフルエンザ菌で刺激したところ、IFN-βmRNA発現の亢進が認められた。またマクロファージによるインフルエンザ菌の貪食過程がIFN産生に重要であることを確認するため、サイトカラシンDで前処理した腹腔内マクロファージをインフルエンザ菌で刺激したところ、RT-PCRによるIFN-βmRNA発現が低下した。現在、I型IFN産生に必要なインフルエンザ菌の構成成分を明らかにするため、インフルエンザ菌菌体よりDNA、菌外膜、リポオリゴサッカライドの抽出し、腹腔内マクロファージを刺激しIFN-βmRNA発現量について比較検討を行っている。インフルエンザ菌の組織内侵入性およびI型IFN産生が誘導される点については明らかにできている。しかしながらインフルエンザ菌組織内侵入の明確な機序の解明についてはやや研究の進行が遅れている。今後は、インフルエンザ菌の菌体成分のうち、どの部分が特にI型IFN産生に重要であるのか、菌体成分のそれぞれを抽出し確認する。またin vivoにおけるI型IFNのインフルエンザ菌感染症の経過に及ぼす影響を明らかにし、IFNAR KOマウスを用いた確認実験も同時に行う。またインフルエンザ菌組織内侵入性の機序解明について、インフルエンザ菌感染前後の気道上皮細胞をマイクロアレイで解析し、I型IFN関連遺伝子など組織侵入性に関連する遺伝子群を網羅的に解析する。

IFNAR KOマウスの購入費や維持費、野生型マウスの購入費、マイクロアレイ解析費、消耗品(RTーPCR、ELISA、Westernblot、細胞培養、細菌培養など)、学会出張費、論文投稿費など。
腫瘍リンパ節標的型クラスターナノDDSによる複合がん免疫療法

本申請研究では、腫瘍リンパ節内の抑制性樹状細胞の抑制解除と免疫活性化を担うナノ粒子と制御性T細胞(Treg)の機能抑制を担うナノ粒子をクラスター化したクラスターナノ粒子を開発することで、腫瘍所属リンパ節(Tumor-Draining Lymph Node: TDLN)内での免疫システムの抑制解除と自発的がん免疫誘導を実現し、ナノテクに基づいた新しいがん免疫療法を確立する。本年度は昨年度に構築した粒子径30 nmのTDLN標的型脂質ナノ粒子(Lipid Nano Particle: LNP)にアジュバントとして細胞内DNAセンサーであるstimulator of interferon genes(STING)経路を活性化する短鎖DNAを搭載し、がん免疫応答の評価を行った。その結果、リンパ節内での樹状細胞の活性化や抗原特異的T細胞の活性化において、30 nmのLNPは100 nmや200 nmのLNPと比較して有意に優れていることが示されたが、全身のがん免疫応答評価では有意な違いは認められなかった。この結果を受けて、リンパ節局所から全身のがん免疫応答への過程の見直しを行い、原因となる因子の特定に成功した。また、免疫細胞にsiRNAを導入するためのLNPの毒性軽減に成功した。免疫細胞へのsiRNA導入は抑制性樹状細胞やTregの機能を遺伝子レベルで制御するために必須の技術である。免疫細胞へと効率的にsiRNAを導入するためにはカチオン性脂質が重要であるが、siRNAと静電的に相互作用してLNPを形成するためにカチオン性脂質が使用され、毒性発現の原因となっていると考えられた。そこで、カチオン性脂質の代わりにポリカチオンであるプロタミンを用いてsiRNAをコア化し、LNPへと封入することでカチオン性脂質の量を減らすことに成功した。その結果、免疫細胞への細胞毒性は有意に軽減され、遺伝子発現抑制活性は同レベルに維持されていた。リンパ節標的化ナノ粒子によるがん免疫応答の誘導が予想に反して十分ではなく、解決策を見出すために時間を要したために、当初の計画よりも若干遅れている。リンパ節標的型ナノ粒子のがん免疫応答が予想に反して十分でなかった原因をさらに詳細に調べ、その要因を解決するための戦略を組み合わせることにより、本申請研究のコンセプトの検証を行う予定である。本研究では、腫瘍所属リンパ節内の抑制性樹状細胞の抑制解除と免疫活性化を担うナノDDSと制御性T細胞の機能抑制を担うナノDDS(ナノテクノロジーを駆使したDrug Delivery System)をクラスター化したクラスターナノDDSを開発することで、腫瘍所属リンパ内での免疫システムの抑制解除と自発的がん免疫誘導を実現し、ナノテクに基づいた新しいがん免疫療法を確立することを目的としている。平成29年度では、所属リンパ節内の樹状細胞を標的可能なナノDDSの開発および機能評価を行った。皮下投与後にリンパ管輸送を介して所属リンパ節へと到達するために、50 nm以下の微小脂質ナノ粒子を調製した。まずは顕微鏡およびフローサイトメトリーを用いて、構築した微小脂質ナノ粒子の所属リンパ節への移行性とリンパ節内分布を調べた。その結果、微小脂質ナノ粒子は、200 nmや100 nmの脂質ナノ粒子と比較して非常に効率的に所属リンパ節に集積することが明らかになった。さらに、所属リンパ節へと移行した微小脂質ナノ粒子は所属リンパ節内に存在する樹状細胞の70%以上に取り込まれていた。続いて、短鎖DNAをアジュバントとして搭載した微小脂質ナノ粒子を構築し、所属リンパ節内の樹状細胞の活性化を介した抗原特異的な免疫応答をフローサイトメトリーにより評価した。その結果、100 nmや200 nmの脂質ナノ粒子を比較して、微小脂質ナノ粒子を投与後の所属リンパ節内の抗原特異的キラーT細胞の割合が有意に増加していた。以上のことから、所属リンパ節内の樹状細胞を効率的に標的可能なナノDDSの構築に成功した。当初の予定通り、所属リンパ節内の樹状細胞を標的可能なナノDDSを構築し、がん免疫を活性化させる十分な機能を有していることを確認した。以上のことから、おおむね順調に進展していると考えている。

免疫細胞へと効率的にsiRNAを導入するためにはカチオン性脂質が重要であるが、siRNAと静電的に相互作用してLNPを形成するためにカチオン性脂質が使用され、毒性発現の原因となっていると考えられた。そこで、カチオン性脂質の代わりにポリカチオンであるプロタミンを用いてsiRNAをコア化し、LNPへと封入することでカチオン性脂質の量を減らすことに成功した。その結果、免疫細胞への細胞毒性は有意に軽減され、遺伝子発現抑制活性は同レベルに維持されていた。リンパ節標的化ナノ粒子によるがん免疫応答の誘導が予想に反して十分ではなく、解決策を見出すために時間を要したために、当初の計画よりも若干遅れている。今後は、本年度に構築した所属リンパ節内の樹状細胞を標的可能なナノDDSの抗腫瘍活性を評価する。また、所属リンパ節内の制御性T細胞を標的化可能なナノDDSの開発し、その機能制御の評価を行う予定である。リンパ節標的型ナノ粒子のがん免疫応答が予想に反して十分でなかった原因をさらに詳細に調べ、その要因を解決するための戦略を組み合わせることにより、本申請研究のコンセプトの検証を行う予定である。
非周期構造無機固体の塑性変形機構に関する研究

結晶と同様にすべり過程で塑性変形することが知られている非周期構造無機固体の準結晶と金属ガラスについて、塑性変形の微視的過程を広範な条件下での実験および計算機シミュレーションによって解明することを目的とした。(1)さまざまな準結晶について高温塑性変形実験を行い、準結晶が普遍的に(a)0.75Tm(Tm:融点)以上の高温で塑性変形が可能で降伏応力は温度上昇と共に急激に減少すること、(b)大きな加工軟化を示すことを明らかにし、(c)熱活性化解析の結果、軟化が活性化エンタルピーの減少に起因することを示した。準周期格子中の転位に関するシミュレーションの結果、転位の移動にはフェイゾン形成に伴う抵抗と準周期パイエルス・ポテンシャルによる抵抗が重塁し、高温ではキンク対形成エネルギーが転位速度を律速すると結論した。フェイゾンを含まない準結晶では大きなパイエルス・ポテンシャルでのキンク対形成が転位速度を律速し、塑性変形によってフェイゾン歪みが増加すると小さなパイエルス・ポテンシャルでのキンク対形成が律速するという変形モデルによって実験結果が説明できることを明らかにした。(2)バルク金属ガラスを広い温度範囲で圧縮変形し、準結晶と異なりその降伏応力は極低温まで殆ど温度に依存しないことを示した。金属ガラス中でどのような転位がすべり過程に寄与しているのかを明らかにする目的で計算機シミュレーションを行った。逆モンテカルロ法によりNi-Nb2元素金属ガラスのモデルを作成し、原子間ポテンシャルで緩和した。このモデルに転位を導入して緩和すると、バーガース・ベクトルが約3Å以上のときに転位が安定に存在しうることが示された。この最小バーガース・ベクトルの転位によるすべり過程のモデルが想定されるが、転位のすべり過程のシミュレーションは未完成であり、変形機構の確定までには至らなかった。1.塑性実験(1)金属ガラス:3種類のバルク金属ガラスいついて極低温まで圧縮変形を行い、変形開始応力は低温側にも高温側にもわずかに減少する傾向を示したが、いずれの合金も極低温からガラス転移温度までの変形応力はヤング率のほぼ2%であることが明らかになった。(2)準結晶:Al-Pd-Mn正20面体単準結晶に関する高温圧縮実験から、真歪量0.30.5まで加工軟化し、変形応力が最大変形応力の約半分まで減少した後、緩やかな硬化に転じることが明らかになった。変形応力の温度依存性と応力緩和実験から求めた活性化体積の応力依存性をもとに熱活性化解析を行った結果、顕著な加工軟化現象は歪の増加に伴う活性化エンタルピーの減少に起因することが明らかになった。これらの結果を準周期構造中の転位のパイエルス機構で解釈した。2.計算機シミュレーション(1)準結晶:1次元準周期構造中の刃状転位に関するシミュレーションを行い、運動抵抗はフェシゾン生成応力成分とパイエルス応力成分からなり前者はフィボナッチ数の転位の集団的連携運動によって無視できる大きさになることを示した。次いで、2次元準周期構造の正10角形準結晶モデル中の転位についてもシミュレーションを行い、(1)フェイゾン生成応力成分は2本の転位の対運動によって無視できるほど小さくなること、(2)パイエルス応力成分は転位線の方向に強く依存すること、(3)パイエルスポテンシャルの大きな方向のパイエルス応力成分の大きさは0.1G(G:剛性率)程度であることなどが明らかになった。(2)アモルファス金属:アモルファス金属中で生じるすべりの素過程を理解するため、準結晶モデル作成に用いられる高次元射影法を援用して転位を含むアモルファス構造の作成法を検討した。1.変形実験

(1)準結晶については、2000年の暮れに新たに発見された2元系準結晶のCdYb合金正20面体相準結晶について、バルクの多結晶試料を作成し、高温で圧縮塑性変形実験を行った。その結果、これまでの3元系正20面体準結晶と同様に、(1)400°C°C以下では降伏以前に破壊しそれより高温では降伏応力が温度と共に急激に低下すること、(2)降伏後は低温ほど加工軟化が顕著で、真応力は真歪が0.5程度で降伏応力の実に1/10になること、(3)変形の活性化体積は高応力で0.1nm^3程度の小さな値を持つことが明らかになった。さらに、(4)真歪量が0.5以上の高歪では変形応力の温度依存性が、従来の3元系準結晶の場合と異なり非常に小さいという新しい結果が得られた。これらの挙動について解釈を試みている。(2)バルク金属ガラスについて、ガラス転移温度から結晶化温度の間で生じるの粘性変形挙動の機構を解明するためさまざまなバルク金属ガラスについて高温の内部摩擦測定を行い、その解析を進めている。(3)高圧化の塑性変形実験は、実験温度が低く試料が脆性破壊するため、より高温での実験を計画中である。2.計算機シミュレーション(1)準結晶:2次元準結晶中の転位の運動抵抗に関するシミュレーションを進め、パイエルスポテンシャル成分は転位線の方向に強く依存することをしめし、パイエルスポテンシャルは基本的に結晶転位と同じであることが明らかになった。(2)アモルファス金属のモデル作成は結局NbNi合金をモデルとして逆モンテカルロ法を用い構造モデルを作成した。文献で得られている原子間ポテンシャルを用いて構造緩和及び塑性変形のシミュレーションを行い変形機構の解明を進めている。本年度は、準結晶及び近似結晶に関する塑性実験、アモルファス金属のモデルに関する計算機シミュレーションを行ない、変形機構について考察した。1.2元系準結晶および近似結晶の塑性実験:近年発見された2元系の正20面体準結晶のCd_<84.6>Yb_<15.4>合金および組成の近いCd_6Yb1/1近似結晶の多結晶について世界で始めて塑性実験を行った。2元系準結晶の塑性挙動は基本的に3元系準結晶に類似したもので、(1)融点の3/4以上の高温で塑性変形し、(2)降伏応力の温度依存性が大きく、(3)著しい加工軟化を示し、高歪での変形応力は降伏応力の20%以下になる。1/1近似結晶も準結晶と類似の挙動を示し、準結晶、近似結晶ともに転位の運動を支配する熱活性化エンタルピーが塑性変形の増大とともに減少することが明らかになった。2.準結晶の塑性変形機構:これまでの実験および計算機シミュレーションを基に、(1)準結晶(および近似結晶)の塑性変形はキンク形成エネルギーの分布するパイエルス機構で支配され、(2)塑性変形によるフェイゾン欠陥の導入とともに転位運動は次第に低い活性化エネルギーのキンク対形成が支配するようになる、と結論される。3.アモルファス金属中の転位:逆モンテカルロ法を用いてNi-Nbアモルファス合金の構造モデルを作成し原子間ポテンシャルで緩和した。
強勢と語順の変化に関する理論的・実証的研究

英語の語順が目的語-動詞から動詞-目的語に歴史的に変化したことについて、従来は、格語尾が消失したことにより、語順が固定したという説明が成されてきた。本研究は、古フランス語からの語彙の借用によって、語強勢の位置が、ゲルマン的な語頭から、語末方向へ変化したことが、語順変化の原因であるという仮説を立て、古い英語(中英語)のコーパス(テキストのデジタルデータ)を調査した。古フランス語(もしくはアングロ・ノルマン語)からの借入語が目的語として現れる場合、本動詞・目的語(VO)語順の頻度が高く、目的語・本動詞(OV)語順の頻度が低いことを示した。研究の目的は、英語における目的語ー動詞(OV)から動詞ー目的語(VO)への語順変化は、音韻の歴史変化が原因であるとする、新しい仮説を提案し、これを英語歴史コーパスの方言分析と言語類型論によって実証することである。英語の語強勢の位置は、ゲルマン的な語頭から語末方向に向かって移動したが、その原因として、語末付近に強勢を持つフランス語などからの借入語の増加が考えられる。コーパスのテキストごとに、借入語の数とVO語順の動詞句の数を調査し、年代および方言別に比較して数値に相関があるかを統計的に検討する。この相関を音韻と統語のインタフェース理論によって説明する。研究実施計画では、初年度は、分析しやすいコーパスを選定し、試験的な分析を行い、今後の基礎を作ることとしていた。この目的と計画に基づき、今年度は、13世紀初期に書かれた文献であるAncrene Wisseを分析対象として選定し、本動詞(V)と目的語(O)の相対的語順とフランス語借入語の相関を分析した。暫定的な結論としては、この分析結果はTokizaki (2011, 2013)などでの展開している、語強勢の位置が語順を決定するという主張を支持するものと考える。最初のテキストについて、分析を行い、当初の予想におおむね沿った結果を得ている。また、この内容を2016年秋の国内学会で発表する計画である。平成28年度は、日本英語学会第34回大会で、研究発表「Ancrene Wisseにおける本動詞と目的語の相対的語順と借入語」を行った。その内容をJELS 34に論文「Ancrene Wisseにおける本動詞と目的語の相対的語順と借入語」として発表した。ミニマリスト・プログラムでは、形態統語部門は線形順序(語順)に関与せず、音韻部門がこれを決定するとされている。これを受けて、Tokizaki (2011,2013, 2016)は、通言語的事実に基づいて、ある言語における主要部(H)と補部(C)の相対的語順は韻律上の要因によって決定されるという理論を提案している。今年度は、この理論を支持する証拠を、通時的観点から提示した。初期中英語の文献であるAncrene Wisse (AW)では、古フランス語(OF) (もしくはアングロ・ノルマン語(AN))からの借入語が目的語として現れる場合、本動詞・目的語(VO)語順の頻度が高く、目的語・本動詞(OV)語順の頻度が低いことを示した。これは、次のようにまとめられる。MEの強勢体系は、OFからの借入語によって、純粋なゲルマン語型のものではなくなった。そのような状況のもとで、主に語彙のレベルでOFの影響を受けたAWにおけるVとOF借入語を含むOの相対的語順を調査した結果、OF借入語を目的語として含むOV語順よりも、OF借入語を目的語として含むVO語順の方が割合が高く、OF借入語をOとして含むOV語順の例は、実際には例外として扱うことができることが分かった。したがって、英語史において、OEで基本語順であったOV語順からMEで急激に発達したVO語順への推移は、OFからの借入語を介した語強勢の体系の変化によって引き起こされたと結論づけることができる。研究の目的は、英語における目的語-動詞(OV)から動詞-目的語(VO)への語順変化は、音韻の歴史変化が原因であるとする、新しい仮説を提案し、これを英語歴史コーパスの方言分析と言語類型論によって実証することであった。平成29年度の研究実施計画では、1分析結果の集計、2追加テキストの分析、3理論の精密化、4研究発表と研究論文の執筆を予定していた。研究内容としては、古フランス語からの借用語が用いられている動詞句では、動詞-目的語の語順が多く現れることが実証された。意義重要性英語の語順が目的語-動詞から動詞-目的語に歴史的に変化したことについて、従来は、格語尾が消失したことにより、語順が固定したという説明が成されてきた。