hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
川崎病の病因解明・分子感染免疫学的解析

川崎病の原因はいまだに不明である。最近、川崎病患者の末梢血において特定のT Cell Receptor(TCR)を発現しているT細胞の選択的な増加が川崎病と関係しているという報告があいついでなされている。川崎病の病態をより良く理解するために以下の研究を行った。川崎病の急性期(20例)、回復期(20例)及び、対照小児(感染症は除く18例)、健康成人(20例)より採血した新鮮抹消血を材料として、抗体を用いてT細胞に発現しているTCRのVβ2、Vβ8.1の割合の検討を行ったが、その結果これら4つのグループでは有意の差は認めなかった。さらに抹消血あるいは、病変部皮膚生検、リンパ節生検材料よりT細胞を105個クローン化した。しかしVβ2またはVβ8.1陽性細胞は認められなかった。川崎病の血管炎の成立に重要な役割をはたしているTNF-αTNF-αを刺激せずに産生しているクローンは全体の65%であった。一方、刺激を加えずにIL-2を産生しているクローンは10%、IL-6を産生しているクローンは7%であった。これらのクローン化した細胞の多くはPHAやPMAの刺激によりさらに高いレベルでTNF-α、IL-2、IL-6を産生するようになった。これらのこれらの結果からは、これまでの報告とは異なり、Vβ2またはVβ8.1陽性T細胞は川崎病の病態には関係していないと考えられた。我々の検討では、これまでの報告の方法では、抹消血単球を一度凍結融解し、その後抗CD3抗体で刺激すると、Vβ2陽性T細胞の割合が新鮮末梢血では増加していなかったものでも、増加を示してくる。これまでの報告はその実験に問題があった可能性があると考えている。またスーパー抗原の1つである、血清中のToxic Shock Syndrome Toxin-1(TSST-1)、抗TSST-1抗体について、鋭敏な方法で測定したが、TSST-1が川崎病の原因であるという結果は得られなかった。これまでの研究から、川崎病には感染が関与していることが強く示唆されており、川崎病の臨床症状やT cell receptorのレパートリーの研究等から川崎病の病態には細菌等が産生するスーパー抗原が大きく関与している可能性が考えられている。我々は川崎病におけるスーパー抗原の役割を明らかにする一環として、川崎病の急性期(n-20)あるいは回復期(n=20)の新鮮血から得られたリンパ球のT細胞に発現しているT cell receptor Vβ2とVβ8の割合を抗Vβ2抗体並びに抗Vβ8抗体を用いて検討し、川崎病の急性期と回復期において比較した結果,川崎病の急性期と回復きではVβ2とVβ8に変化がないことが明らかとなった。さらに感染症ではない対照小児(n=18)あるいは対照成人(n=20)と比較しても変化は認められなかった。以上のことはCD4陽性細胞、あるいはCD8陽性細胞についても同じ結果であった。川崎病は全身の血管炎でありこの血管炎の成立にはTNF-αの関与が考えられている。そこで我々は末梢血や皮膚からT細胞をクローン化し、なんら刺激することなくTNF-αを産生しているクローンについてVβのレパートリーを検討したが結果は同じであった。

またVβ2を発現しているT細胞を活性化し、川崎病にその臨床症状がよく似ているToxic Shock Syndromeにおいて、その病態に大きく関与しているToxic Shock Syndrome Toxin-1(TSST=1)について川崎病患者血清中のTSST-1を測定したが有意な上昇は認められなかった。また抗TSST-1抗体を急性期と回復期に測定したがこれも有意な上昇は認められなかった。川崎病の症例を増やして今年度は、急性期(20例)、回復期(20例)及び、対照小児(感染症は除く18例)、健康成人(20例)より採血した新鮮抹消血を材料として、抗体を用いてCD4陽性T細胞、又はCD8陽性T細胞に発現しているVβ2、Vβ8.1の割合の検討を行った。その結果これら4つのグループでは有意の差は認めなかった。この結果はこれまでの報告と異なるもので川崎病の原因を考える上で非常に重要な問題となる。そこでさらに詳細な検討を加えた。もしスーパー抗原が川崎病の病態に関係しているとすると、その病日で、Vβ2、又はVβ8.1陽性細胞の割合が異なる可能性があるので、上記川崎病3例について、3つ期間(i,1-5病日。ii,6-10病日。iii,11-15病日。)に分けて同様の検討を行ったが、この3つの期間で差は認められなかった。さらに抹消血あるいは、病変部皮膚生検、リンパ節生検材料よりT細胞を105個クローン化し(98クローンはCD3^+CD4^+CD8^-,7クローンはCD3^+CD4^-CD8^+)Vβ2、またはVβ8.1の発現の有無の検討を行ったが、Vβ2又はVβ8.1陽性細胞は認められなかった。川崎病は全身の血管炎症候群である。その成立にはTNF-αが重要な役割を果たしていると考えられている。今回クローン化した細胞のうち、TNF-αを刺激せずに産生しているクローンは全体の65%にも及んだ。これらの結果からは、Vβ2又はVβ8.1陽性T細胞は川崎病の病態には関係していないと考えられた。我々の検討ではこれまでの報告にあるように、抹消血単球を一度凍結融解し、その後抗CD3抗体で刺激すると、Vβ2陽性T細胞の割合が新鮮末梢血では増加していなかったものでも、増加を示してくる。これまでの報告はその実験に問題があった可能性がある。
Wistar Fattyラットの糖尿病発症機構の解明

平成4年度はまずWistar Fattyラットにおいて高血糖及び高インスリン血症を生ずるにあたり肝解糖系の酵素群GK,PFK2と糖新生系の酵素であるPEPCK各遺伝子の発現異常を伴うか否かを検討した。GK,PFK2,PEPCKの活性、mRNAレベルともWistar FattyラットとそのlittermateであるWistar Leanラットとの間で有意の差は存在しなかった。また既に高血糖を来たしているWistar Fattyラットに対してインスリン感受性を上げるとされるAD-4833を投与して上記酵素の発現と血中中間体の変化を調べた。AD-4833を投与により血糖値、インスリンレベル共に低下したが上記酵素遺伝子の発現はいずれも変化しなかった。それに対して血中中間体はAD-4833投与によりグリセロールが低下、ラクテイト、パイルベイトは増加することがわかった。以上の結果より我々の調べた限りにおいてはWistar Fattyラットの高血糖を起こす機序は少なくともGK,PFK2,PEPCK等の遺伝子そのものの異常ではなさそうである。またAD-4833の作用機序もこれらの酵素活性の調節ではないと思われた。平成5年度になりAD-4833の作用点がインスリン作用カスケードの上流であることも想定して、AD-4833投与によりインスリン感受性が上がるかどうかグルコーストランスポート活性を示標に検討しているところである。また糖尿病モデル動物の発症因子だけでなくヒトのNIDDMの発症因子についても平行して主にGK遺伝子B細胞プロモーター領域の異常との関係を調べてきた。その結果日本人においてプロモーター活性の異なるバリアントが存在することがわかり、その生理的な意義について現在検討中である。またさらにプロモーターの異常とWistar Fattyラットの高血糖との関係についても今後検討する予定である。WFラットが生后8週の時点でlittermateと比して、明らかな高血糖、高インスリン血症,肥満を来すことをまず確認した。生后8週目のWFラットを2群に分け、AD-4833投与群と通常えさ(CE)投与群とした。AD投与群では2日目以降に明らかな血糖低下効果を認めた。同群ラットのインスリン血中濃度はCE群に比して50%以下に低下していたため,AD群で認められた血糖降下作用は、膵B細胞のインスリン分泌刺激によるものではなく、糖利用促進あるいは、糖産生抑制によるものであることが推察された。AD-4833のこのような効果の作用点がどこにあるのかを明らかにするため肝解糖糸の律速酵素であるグルコキナーゼ(GK)と6-フォスフォフルクト-2-Pナーゼ/フルクトース-2,6-ビスフォスファターゼ(PFK_2/F_<26>P_2)の活性が、AD投与后どのように変化するかを調べた。過去2回の実験ではGKおよびPFK_2/F_<26>P_2両酵素活性は、AD群、CE群間で違いが認められなかった。またWFラットとlittermate間でも両酵素活性に違いを認めなかった。従って現在までのところ、両酵素の発現の異常が、WFラット糖尿病発症と強くかかわっていることや、AD作用の作用点が両酵素の活性調節であることの可能性は低いと考えられた。またAD投与前后で種々の血液中の中間体(アラニン、グリセロール,3HB,ラクテート,パイルベート)を測定した。WFラットでは、littermateに比して、グリセロール、ラクテート,パイルベートが上昇していた。AD投与后、グリセロールは低下、ラクテート、パイルベートは上昇傾向を示した。このような結果はWFラットにおいてAD投与后.すみやかに体内での糖利用亢進が起こり、その結果として血糖降下が認められる可能性を強く示唆しているものと考えられた。

前年度の結果によりWistar Fattyラットではlittermateに比し肝解糖系の律速酵素であるGK,PFK2等の遺伝子の発現には有意の変化を認めないことがわかったため次に糖新生系の律速酵素であるPEPCKの発現を調べた。本酵素の活性もWistar Fattyラットとそのlittermateの間で有意差を認めなかった。インスリン作用増強剤とされるAD4833を糖尿病を発症したWistar Fattyラットに投与すると血糖、インスリン共に低下しまたそのときに測定した血中中間体ではグリセロールが低下、ラクテイトとパイルベイトが増加した。しかしAD4833は上記の酵素群の遺伝子発現には影響を及ぼしておらずAD4833の作用点は別のインスリン作用ターゲットあるいはインスリンカスケードのさらに上流に存在する可能性が示唆された。現在はグルコーストランスポートに対するインスリンの反応を検討しているところである。モデル動物の糖尿病発症メカニズムだけではなく、平成5年度にはヒトのNIDDMの発症メカニズムについても研究を進めた。日本人においてグルコキナーゼ膵B細胞プロモーターの変異を見いだし、これがプロモーター活性の異常を伴うことを報告した。現在はこの様なプロモーター変異の生理的な意義につき検討中である。またこの成果をもとにWistar FattyラットのGK遺伝子プロモーターの異常の可能性についても検討する予定である。
深海の熱水噴出域への適応機構をアミノ酸輸送体から探る

深海の熱水噴出域に生息する生物は、細胞内にヒポタウリン(HT)という物質を蓄積して環境中の硫化水素を無毒化していると考えられる。本研究では、シンカイヒバリガイ類からタウリン輸送体(TAUT)という蛋白質の遺伝子を単離し、その性質を解析した。その結果、TAUTがHTを細胞内に集める機能を担い、その遺伝子発現が環境中の硫化物濃度に応じて変化することがわかった。TAUTは細胞内のHT量を調節することにより硫化水素の無毒化を制御していると考えられる。共生細菌を持つ熱水噴出域固有生物は含硫アミノ酸であるチオタウリンを体内に多く含むことが知られており,チオタウリンは硫化物を宿主から生細菌に供給するための通通貨である可能性が高い。本研究は,チオタウリンやその前駆体を輸送するアミノ酸輸送体蛋白質の特性や分布の解析から熱水噴出域への適応や共生のメカニズムを明らかにすることを目的としており,本年度は以下の研究を行った。1.シチヨウシンカイヒバリガイBathymodio1us septemdierumタウリン輸送体(BsTAUT)cDNAを用いて,アフリカツメガエル卵においてTAUTを発現させ,その輸送特性を取り込み実験により調べた。その結果,BsTAUTがチオタウリンやその前駆物質であるヒポタウリンやタウリンを輸送することがわかった。2.比較のために,シチヨウシンカイヒバリガイと同属だがメタン酸化細菌を共生させているヘイトウシンカイヒバリガイB.platifronsのTAUT(BpTAUT)のcDNAを単離した。3.BsTAUT,BpTAUTの共通配列を用いて,両種のTAUT遺伝子のmRNA量を定量できるrealtimePCR系を確立した。また,イオウ酸化細菌の16SrDNAを定量するrealtimePCR系も確立した。4.シチヨウシンカイヒバリガイを硫化物のない環境で水槽飼育し,BsTAUT遺伝子の発現量がどのように変化するのかを調べる実験を行った。5.相模湾での深海調査に参加し,ヘイトウシンカイヒバリガイを採集して,シチヨウシンカイヒバリガイと同様の実験を試みている。共生細菌を持つ熱水噴出域固有生物が体内に大量に含む含硫アミノ酸チオタウリンは、硫化物の無毒化や硫黄酸化細菌との共生に関与している可能性が高い。本研究では、チオタウリンやその前駆体を輸送するアミノ酸輸送体の解析から、熱水域への適応や共生の仕組みの解明を試みている。本年度は、1.蛍光in situハイブリダイゼーション法を用いて、シチョウシンカイヒバリガイの鰓に共生する硫黄酸化細菌の定量を行った。硫化物濃度の異なる環境から採集した、あるいは硫化物濃度の異なる水槽で飼育した個体を比較したところ、共生菌量は環境中の硫化物量を反映していた。2.一方、タウリン輸送体(TAUT)mRNAをリアルタイムPCRにより定量したところ、有意な変化は認められず、本種は、環境中の硫化物量に応じたTAUT遺伝子の発現調節は行っていない可能性がある。3.同様の実験を、メタン酸化細菌を共生させる近縁種ヘイトウシンカイヒバリガイにおいて実施したところ、硫化物添加水槽で2カ月飼育した個体ではTAUTmRNA量が有意に増加した。硫黄酸化細菌を持たない種においてもTAUTが硫化物の無毒化に関与している可能性がある。4.チオタウリンおよびその前駆体であるヒポタウリンやタウリンを高速液体クロマトグラフィー(HPLC)により定量する系を確立した。現在、上記実験に用いた個体の分析を実施中である。5.ヘイトウシンカイヒバリガイにおいて、^<14>C標識タウリンの取り込み実験を試みた。結果のばらつきがあったため、現在方法の改良を行っている。6.ハオリムシ類のTAUTcDNAの単離を試みたが、貝類で有効なプライマーでは増幅できなかった。本研究では、チオタウリンやその前駆体を輸送するアミノ酸輸送体(タウリン輸送体;TAUT)の解析から、熱水域への適応や共生の仕組みの解明を試みている。本年度は、深海の熱水噴出域に生息し、鰓にイオウ酸化細菌を共生させているシチヨウシンカイヒバリガイをカゴに入れ、熱水噴出口から離れた場所に移植して1年間放置した個体についてTAUTmRNAをリアルタイムPCR法により定量し、移植前の個体と比較したところ、移植前より有意にmRNA量が低下していることが明らかになった。また、ヒポタウリンやタウリンを高速液体クロマトグラフィー(HPLC)により定量したところ、タウリン関連化合物の総量、チオタウリン量とも移植により低下していることがわかった。これらの結果は、シチヨウシンカイヒバリガイが、環境中の硫化物濃度によりTAUT遺伝子の発現量を調節し、それにより硫化物の無毒化に必要なタウリン関連化合物を細胞内蓄積量を調節している可能性が示唆された。(論文として発表)

また、シチヨウシンカイヒバリガイは、熱水噴出域固有生物としては例外的に、実験室内で飼育することが可能である。硫化物濃度の異なる水槽においてシチヨウシンカイヒバリガイを飼育し、上記の実験結果の再現を試みたが、平成22年の航海で得た個体は極めて活性が低く、有意な結果が得られなかった。繰り越し中請を行って平成23年に新たな個体を採集して飼育実験を行い、TAUT遺伝子の遺伝子発現を解析した。結果は近日中に報告する予定である。
前3千年紀におけるインダス文明とアラビア半島の交流関係に関する考古学的研究

本研究は、前3千年紀におけるインダス文明地域とアラビア半島の交流関係について考古資料をもとに検討するものです。モノの移動によって把握される「交易関係」という視点だけでなく、その背後にある人・情報の移動、それが各地の地域社会に与える影響といった「交流関係」というより高次の視点から両地域間の関係について考察します。この2つの地域間の交流関係は、メソポタミアやイラン高原の社会とも深く関わっており、前3千年紀に展開した「西南アジア文明世界」の一端をなすものです。文明世界を支える各地の都市社会が交易・交流関係によってどのようにつながり、どのように展開したのか理解するための基礎の構築をめざします。
疲労骨折発症メカニズムの検証-長距離選手におけるトレーニングの質と量に着目して-

疲労骨折の発症率が高い長距離選手は、遅い走速度で長距離を走る「量」の多いトレーニングや、速い走速度で短い距離を走る「質」の高いトレーニングを実施しており、どちらのトレーニングが疲労骨折の要因なのか不明であった。そこで、長距離選手のトレーニングにおける質と量のどちらが疲労骨折を発症させているのかを、尿から骨の状態を把握することで明らかにする。トレーニングの質は走行速度、量は走行距離とする。これらの測定は、GPS搭載のスマートウォッチを用いることで正確に把握する。本研究で得られる結果は、疲労骨折なしでトレーニングを継続させるためのトレーニング計画を立案する一助になると考える。
グルタチオンS-トランスフェラーゼによる血管弛緩因子、一酸化窒素の代謝

1.グアニル酸シクラーゼを活性化するヘマトポルフィリン、ニトロプルシドや過酸化水素などにより、ヒト血管の主要なグルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)分子種であるGST-πは不活性化された。2.ヒトGST-πおよびラットの対応する分子種GST-Pは過酸化水素処理によりサブユニット内やサブユニット間のシスティン残基間でS-S結合を形成した。さらに、部位特異的突然変異法を用いて、S-S結合と不活性化に係わるシスティン残基を同定した。3.GST-Pを発現させた大腸菌ではカタラーゼなど数種類のタンパク質が減少し、低濃度の過酸化水素で増殖が抑制された。大腸菌で発現させたGST-Pはサブユニット1モル当り0.51モルのヘムを結合していると考えられた。4.クロフィブレートなどのペルオキシソーム増殖剤投与や紫外線・放射線照射などにより酸化的ストレスに置かれた場合、ラットやヒト組織でのGST-P、GST-πの発現は抑制された。紫外線によるラット表皮細胞でのGST-P mRNA量の低下には、GST-P遺伝子上流のサイレンサー領域が関与することが示唆された。5.ヒト血管のmuクラスのGST分子種はニトログリセリンから亜硝酸を放出する。一酸化窒素(NO)を放出することが知られているニトロプルシドと亜硝酸(NO_2)はGST-μの活性を抑制し、活性の50%を抑制する濃度(IC_<50>)はそれぞれ、0.05mMと0.39mMであった。MuクラスのGST分子種のニトログリセリンに対するKm値は1.12.5mMであることから、ニトログリセリンから産生される低濃度の亜硝酸によって活性が抑制されることが示唆された。本年度の主要な成果と進行状況を研究計画・方法に従って報告する。1.ヒト血管の主要なグルタチオンSートランスフェラ-ゼ(GST)分子種は胎盤型(GSTーπ)、GSTーM_1M_2とGSTーM_2N_1であるが、GSTーμも少量存在する。さらにヒト心臓から新しい分子種を見い出した。同分子種のサブユニットはSDS電気泳動の結果から、分子量約30,000と推定され、既知のサブユニット(28,00026,000)に比べ大きいが、GSTーμと免疫学的交叉性を有し、Muクラスに属すると考えられた。2.グアニル酸シクラ-ゼ活性の測定法が確立できていないため、ニトログリセリンによるグアニル酸シクラ-ゼ活性化へのGST分子種の関与については、検討できなかった。早急に測定法を確立し、検討を進めたい。3.グアニル酸シクラ-ゼを活性化するヘマトポルフィリン、ニトロプルシドや活性酸素(過酸化水素)などにより、GSTーπは不活性化され、GSTーM_1M_2と類似したGSTーμもヘマトポルフィリンやニトロプルシドにより不活性化されることを明らかにした。ヒトGSTーπおよびラットの対応する分子種GSTーPは過酸化水素処理によりサブユニット内やサブユニット間のシスティン残基内でSーS結合を形成することから、GSTーπはグアニル酸シクラ-ゼの活性化因子を結合・除去することが示唆された。さらに、siteーdirected mutagenesisによりGSTーPの変異体を作製しSーS結合に係わるシスティン残基を同定した。本研究は当初の計画にそって着実に成果を挙げつつあり、本年度中にできなかった一部の計画について、次年度以降引き続き検討し明らかにする予定である。

(1)これまで、ヒトグルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)-πは血管の主要なGST分子種であり、活性酸素やヘマトポルフィリンなどのグアニル酸シクラーゼの活性化因子により不活性化されることをin vitroの実験から明らかにしたので、ヒトGST-πと類似したラットGST-Pを大腸菌に発現させ、このモデル系でGST-Pがヘムを結合するか検討した。発現したGST-Pの約20%はhemeを結合していると考えられ、in vivoでもhemeを結合することが明らかとなった。さらに、GST-Pを発現させた大腸菌ではカタラーゼなど数種類のタンパクの低下が観察され、GST-Pを発現していないコントロール大腸菌に比べ、低濃度の過酸化水素で増殖が抑制される傾向を示した。GST-P発現大腸菌では過酸化水素処理に伴い、GST-Pのシステイン残基間でS-S結合が形成されることから、発現したGST-Pが過酸化水素をトラップし、大腸菌本来の過酸化水素に対する消去系(転写因子、Oxy Rを介するカタラーゼなどの誘導)を抑制することが示唆される。従って、GST-Pは過酸化水素を含む活性酸素とin vivoでも作用していると考えられる。(2)GST分子種によるニトログリセリンの代謝産物について、1,2-ジニトログリセリン(GDN)と1,3-GDNの分離条件を検討中であり、GST分子種により1,2-GDNと1,3-GDNの産生に差があるが結論が得られなかった。一酸化窒素とグルタチオンからニトロソグルタチオン(GS-NO)が産生される反応は非酵素的と進む考えられたが、一酸化窒素が低濃度の場合、GSTが関与していないか検討の予定である。(3)グアニル酸シクラーゼ活性の測定法が確立できていないため、ニトログリセリンによるグアニル酸シクラーゼ活性化へのGST分子種の関与については、まだ検討できていない。早急に測定法を確立し、検討の予定である。1.大腸菌に発現させたラットグルタチオンS-トランスフェラーゼP(GST-P)は、DEAE-セルロースカラムにより2つの活性ピークに分離された。一方のピークではGST-Pの活性に一致してヘムも検出され、抗GST-P抗体によりヘムも共沈したことから、GST-Pがヘムを結合していると考えられた。ヘム定量の結果から、GST-Pサブユニット1モル当たり0.51モルのヘムを結合すると計算された。2.ラット肝前癌病変のGST-P量とそのmRNA量は過酸化水素の産生を促すクロフィブレートの投与により減少した。また、ラット表皮細胞のGST-P mRNA量は紫外線照射によっても減少した。さらにヒト頭頚部癌のGST-πは1070GrayのX線照射後陰性化することが明らかとなった。X線照射は活性酸素などのラジカルを産生することから、in vivoで酸化的ストレスに置かれた場合、ラットやGST-PやヒトGST-πの発現は抑制されると考えられた。現在、その発現抑制の機構を解析中であるが、紫外線の場合は、GST-P遺伝子上流のサイレンサー領域を介することが示唆される。3.一酸化窒素(NO)を放出することが知られている、ニトロプルシドはヒトGST-α、GST-μとGST-πの3者の活性を抑制し、活性の50%を抑制する濃度(IC_<50>)はそれぞれ、0.04mM、0.05mMと0.14mMであった。一方、亜硝酸(NO_2)はGST-μの活性のみを抑制し、そのIC_<50>は0.39mMであった。MuクラスのGST分子種のニトログリセリンに対するKm値は1.12.5mMであることから、ニトログリセリンから産生される低濃度の亜硝酸によって活性が抑制される可能性が示唆された。
冷戦初期アメリカにおけるヨーロッパ統合研究の誕生と発展

研究の初年度にあたる平成30年度においては、今後の研究活動の基礎固めを行う準備段階という位置づけとして、(1)基礎資料および文献の収集と(2)2年目以降の研究遂行に不可欠な位置維持資料の特定とリストアップの作業を行った。(1)(2)の作業を行う中で、第二次世界大戦後から1950年代のアメリカにおけるヨーロッパ統合研究の誕生の背景として、「欧州統合思想」の父として知られるクーデンホーフ=カレルギ伯爵が第二次世界大戦中にアメリカに亡命し、ニューヨークを拠点に展開したヨーロッパ統合推進運動と学術研究が重要であったとの知見を得た。これに関して、当時のクーデンホーフ=カレルギ伯爵の活動を支えたアメリカの大学人・財界人のリストを作成し、各人のヨーロッパ統合に関する著作の収集も行ったところである。第二次世界大戦中のこのような米欧の人的ネットワークは、戦後のヨーロッパ統合研究を主導したそれと重なる部分が多いため、今後はその連続性・非連続性についてさらに詳細に検討することを予定している。また、戦後はアメリカ政府の冷戦戦略の一環として、政府の外交関係者と深いつながりをもっていたハーヴァード大学のC.J.フリードリヒ教授やR.ボウイ教授のもとでヨーロッパ統合研究が組織化していくことになる。そのため、両名が戦時中・戦後に発表した著作についても収集を一通り行い、そのヨーロッパ統合論や冷戦戦略についても分析を終えたところである。基本資料・文献の作業において本研究に直接的に関連する新たな文献が欧米にて発表されたため、今後の研究計画の微調整を行う必要があったことから、やや研究が遅れている。ただし、2年目以降に必要な資料の収集や一次史料の特定は完了させており、また現在1年目で得られた知見をもとに論文を執筆中であるため、2年目以降の研究計画はスムーズに進むものと予想される。研究の2年目にあたる平成31年度は、1年目に収集を行った基礎資料・文献の確認と分析を続けながらも、研究遂行のためにリストアップをした一次史料の収集・分析を行うことをメインとする。ヨーロッパ統合は戦後、西ヨーロッパ6ヵ国を中心として具現化・制度化されたものであり、多くの同時代研究が登場したが、その中心的な担い手はアメリカの学者であった。アメリカ政府の対ヨーロッパ戦略・冷戦戦略を下支えするシンクタンク的な役割を果たしたこのようなアメリカの学者たちはヨーロッパ統合を直接的に推進する西ヨーロッパの政治家や官僚と親密な人的ネットワークを構築していたため、まずは一次史料をもとにその内実を明らかにすることに務めたい。また、1年目に行った基礎・予備調査をもとに、このような米欧間の人的ネットワークがヨーロッパ統合の生成期にいかなる影響を及ぼしたのかを、主に法的な観点から分析することも2年目の課題としたい。

基礎資料・文献の収集・分析作業において本研究に直接的に関連する新たな文献が欧米にて発表されたため、今後の研究計画の微調整を行う必要があったことから、渡航による一次史料収集を2年目に延期し、2年目の史料収集がより円滑に進むよう網羅的な史料の特定・リストアップを行ったため。
アブラナ科植物のモンシロチョウ誘引成分の同定との生物間相互作用の解明

アブラナ科植物の重要害虫であるモンシロチョウの誘引トラップの開発を目指し、モンシロチョウメス成虫の誘引成分を特定すること、ならびにその生物間相互作用を解明することを目的とした。メス成虫は5種のアブラナ科植物中キャベツを最も好むことが判明し、そのキャベツ抽出液に含まれる4誘引成分を推定した。また、1日のキャベツ揮発性成分放出時間およびメス成虫最大飛来時間はほぼ同時間帯であることを明らかにした。環境や人体に配慮した生物農薬の開発を目的とし、これまでに、アブラナ科植物キャベツの揮発性抽出液がモンシロチョウメス成虫に対し誘引性が認められたことから、モンシロチョウメス成虫を誘引するキャベツの揮発性成分を同定し、その誘引選好強度を評価した。また、誘引成分の標準品を用いて、誘引性の検討を行った。アブラナ科植物の揮発性成分をジエチルエーテル抽出法により抽出し、分取ガスクロマトグラフィーで32画分に分画した。各分取ガスクロマトグラフィー回収分画溶液において、モンシロチョウメス成虫の誘引選好実験を行い、誘引強度の高い4分画を特定した。その4画分に含まれる揮発性成分をGC-MSを用いて、キャベツ特有揮発性成分を8成分[4, 4-dimethyl-3-oxo-pentanenitrile, 4-methyl-pentanenitrile, methyl thiocyanate, allylisothiocyanate, dimethyl trisulfide, 3-methoxy-3-methylbutanol, 3-butenyl isothiocyanate, (E,E)-2,4-heptadienal]を同定した。さらに、この分画を様々に組み合わせたもの、さらに、同定された8成分の標準品についてモンシロチョウに対する誘引選好実験を行い、誘引成分を特定した。モンシロチョウメス成虫に対する重要揮発性誘引成分は、8成分のうち4成分であることが推定された。これらの結果から、モンシロチョウに対する生物農薬の開発の糸口となることが示唆された。環境や人体に配慮した生物農薬の開発を目的とし、その中で、モンシロチョウ雌成虫が寄主植物であるアブラナ科植物を特異的に探索・産卵する要因が揮発性成分であることから、アブラナ科植物放出揮発性成分とモンシロチョウのコミュニケーションシステムを解明するために、キャベツが生育期間中に放出する揮発性成分の組成と放出量の変動とモンシロチョウ雌成虫の飛来選好性を調査した。アブラナ科植物の放出する揮発性成分の回収にあたり樹脂等の検討では、10mlのPorapak Qカラムが成分数および成分量ともに最適であることが判断された。この樹脂を使用し、収穫期キャベツの1日の放出揮発性成分の変動を調査したところ、各成分によって最大放出時間は異なったが、総放出揮発性成分量は8時30分で約23ppmと最大となり、この時間以降夜間まで徐々に減少傾向を示した。この1日の放出揮発性成分量の変動に対するモンシロチョウ雌成虫の飛来数および産卵数は、それぞれ12時13時で最大となることが判明した。また、各時間における放出揮発性回収液に対するモンシロチョウ雌成虫の選好性は、10時30分の回収液で約70%と最大となり、6時30分14時30分までの放出揮発性回収液に対して有意に選好することが明らかとなった。このことから、アブラナ科キャベツの揮発性成分の最大放出時間とモンシロチョウ雌成虫の最大飛来時間には若干のずれはあるがほぼ一致しており、モンシロチョウ雌成虫は、キャベツの放出する揮発性成分を認識して飛来していることが判明し、植物の放出する揮発性成分が昆虫のコミュニケーションの媒介役を担っていることが示唆された。将来的に環境や人体に配慮した生物農薬の開発を目的とし、その中で、モンシロチョウが寄主植物であるアブラナ科植物を特異的に探索・産卵する要因が揮発性成分であることから、モンシロチョウの寄主選好強度は、種類(品目)によって差があることが考えられる。また、この寄主選好の差は、各品目の放出する揮発性成分の組成や放出量の違いによるもの考えられ、ここでは5品目(キャベツ、ダイコン、ハクサイ、ブロッコリー、カラシナ)のアブラナ科野菜の揮発性成分を分析するとともに、各品目へのモンシロチョウの飛来選好強度を計測するとともに、アブラナ科植物共通のモンシロチョウメス成虫誘引成分を推定した。供試植物5種に対するモンシロチョウメス成虫選好性において、キャベツを対照植物として選好実験を行ったところ、メス成虫は、他の4種アブラナ科植物よりもキャベツを有意に選好し、同様の組み合わせ選好実験を行い、モンシロチョウメス成虫の選好性は、キャベツ>カラシナ>ハクサイ>ダイコン>ブロッコリーの順となることが判明した。

次に、供試植物5種の共通揮発性成分は、11成分検出され、isopropyl alcohol、Z-3-hexenyl acetate、o-menthan-8-olの3成分が最も高く選好したキャベツに多く含まれている成分であり、誘引成分の候補となると推定された。また、5種のアブラナ科植物の特有揮発性成分総濃度に大きな差は認められなかったものの、特有成分数および濃度はキャベツでもっとも多くなった。キャベツ、カラシナ、ハクサイ、ダイコンおよびブロッコリーの特有揮発性成分濃度は、それぞれ16成分、9成分、5成分、15成分および9成分であり、これら化合物が揮発性誘引成分である可能性が示唆された。
係留ADCPアーカイブデータを用いた10年規模動物プランクトン変動の復元

本研究では、北極海における動物プランクトン群集は、2000年代初頭から2010年代初頭にかけて現存量が1.6倍増加していることを明らかにした。現存量増加の要因として、夏季の水温上昇による成長速度の上昇、開氷期間が長くなったことに伴う基礎生産力の増大(餌環境の好転)、餌環境の好転により動物プランクトン体内の油球蓄積量が増大して越冬成功率を上昇させた可能性などが考えられる。この動物プランクトン現存量の増加が海洋生態系に与えるインパクトを評価するために、群集の摂餌圧変化を見積もったところ、水温上昇と個体数増加の影響により摂餌圧も増加していた。さらに、衛星観測により見積もられる基礎生産速度から摂餌速度を引いた値を沈降フラックスと仮定すると、開氷期の総沈降フラックスは2000年代初頭から2010年代初頭にかけて減少していた。この結果は、温暖化による動物プランクトン群集の変化が海洋の物質循環に影響を与えていることを示唆している。本結果について論文執筆を行い投稿した。本研究による亜熱帯域データの解析では、中層性の有標魚類に由来する音響散乱が動物プランクトンによる音響散乱を覆い隠してしまう可能性が示唆された。係留ADCPデータから動物プランクトンの現存量変動を復元するためには、ノイズ的な効果を与えてしまう魚類群集の知見が必要である。そこで亜寒帯の係留ADCP観測点・K2における魚類群集について、種組成・鉛直分布・日周鉛直移動などの情報を採取した。春夏秋冬の全季節から得られた魚類標本を精査し、計27種を同定するとともに鉛直分布と日周鉛直移動の有無を明らかにした。亜熱帯海域の中層において高い音響散乱層を形成すると判断された有標魚類・オニハダカ類は、測点K2においては個体数密度が低いと示唆された。これらの結果については、現在論文執筆中である。本研究は、様々な時間スケールの環境変動に対する動物プランクトンの応答を明らかにするために、音響式流向流速計(ADCP)アーカイブデータから動物プランクトンの時系列変動を復元する。研究対象海域として、西部北太平洋亜熱帯域、北極海、西部太平洋熱帯域を設定する。平成26年度は、西部北太平洋亜熱帯の時系列観測点S1(30°N, 145°E)において2010年2月から2013年7月まで測定された(2010年6月10月は欠測)ADCPデータを用いて解析を行った。75kHzのADCPデータから算出された音響散乱強度は、プランクトンネットを用いて得られた300m以浅のバルク動物プランクトンバイオマスと良い相関があった。一方で、300m以深においては昼夜を通して高い音響散乱があり、音響と動物プランクトンバイオマスの間に良い関係は認められない。ネットサンプルの観察から、300m以深にはオニハダカ属魚類が卓越していたが、本属の多くは浮き袋を有する。これらの結果から、得られた音響散乱は、300m以浅では動物プランクトンバイオマスを反映し、300m以深では動物プランクトンと中層魚類に由来すると考えられた。音響散乱の時系列変動からは、当海域においては周年にわたって動物プランクトンの日周鉛直移動が認められ、表層滞在時間は日出没タイミングに同調して季節変動すること、満月時は新月時に比べて夜間の分布深度層が深くなること等を明らかにした。また、中規模渦の通過に伴い、動物プランクトンの鉛直分布様式も変化した。これらの結果を論文草稿にとりまとめ、平成27年4月にJournal of Geophysical Research: Oceansに投稿した。北極海のADCPデータを用いて、少氷年と多氷年では動物プランクトンバイオマスが異なることを明らかにし、2015年3月に行われた日本海洋学会において報告した。平成27年度は、前年度に解析を行った西部北太平洋亜熱帯域の時系列観測点S1 (30N, 145E)における2010年2月から2013年7月(2010年6月10月は欠測)までの結果について論文投稿を行い、Journal of Geophysical Research: Oceansに受理された。当該海域における動物プランクトンの鉛直分布には季節変化があり、夜間表層の高バイオマス層は冬季に深く(>100m)その他の時期に浅かった。また、日周鉛直移動のタイミングは日出没時間の季節変化に応答して変化していた。月齢も夜間の動物プランクトンの鉛直分布層に影響を与え、満月期は新月期に比べて分布深度が深かった。また、冬季の満月期には、中層から浮上してきた日周鉛直移動性の動物プランクトンの一部が真夜中前に100m付近まで潜り、最表層における滞在時間は新月期に比べて短かった。これはおそらく被食のリスクを低減させるためであろう。混合層が深くなること、再成層化、中規模渦の通過といった物理環境の変化も動物プランクトンの鉛直分布に影響を与えていたが、これらはおそらく、物理的な環境変化が表層の餌環境に変化をもたらし、それに応答して動物プランクトンの分布に変化が現れたものと考えられた。

一方、深度500mに係留したADCPデータからは、海面反射の影響を含んでしまうため50m以浅の動物プランクトン情報を復元することは出来なかった。これは、今後の係留系設計やアーカイブデータの解析を行う際に有用な情報となる。27年度は西部北太平洋亜熱帯域におけるデータ解析論文の出版が最大の目標であり、これが受理されたため。また、他海域におけるデータ解析を進めるうえでの留意点として、以下が抽出されたため。・係留深度によって表層のデータ欠損深度が変わること・アーカイブADCPデータを用いた動物プランクトン情報の復元に際して、欠損深度が広い場合は、表層域ではなく中層の生物過程に注目した解析を行うべきであること・浮き袋を有する魚類の出現有無がデータに影響すること平成28年度は北極海のデータ解析を行った。北極海は、温暖化の進行に伴って、夏季の海氷域縮小や表層水温の上昇など著しい環境変化が報告されている。このような変動に影響されて、基礎生産力の上昇や魚類分布域の北上など、生態系にも変化が現れているが知見は少ない。これまで、北極海生態系の特徴として、強固なPelagic-benthic coupling(動物プランクトンなど水柱中の動物バイオマスが少ないことに由来して、基礎生産産物のほとんどが沈降してベントス群集を支える)があげられてきた。そこで本研究では、Pelagic-benthic couplingの鍵を握る動物プランクトンについて、気候変動に応答したバイオマス変動があるか否か明らかにすることを目的とした。解析に用いたデータは、チャクチ海(太平洋側北極海)の北部に位置するバロー海底谷において、2000ー2003年と2010ー2013年それぞれに採取されたアーカイブADCPデータである。海氷状況から、2000ー2003年を多氷期、2010ー2013年を少氷期と捉えることが可能である。解析の結果、2000ー2003年に比べて2010ー2013年は、動物プランクトンの季節的消長パターンは変わらないものの(1)海氷融解期(6ー7月)のバイオマス増加速度が上昇、(2)夏季のバイオマスが2倍程度増加、(3)冬季のバイオマスも増加しており、これは越冬成功率の上昇を示唆、(4)年平均バイオマスは1.6倍増加、が明らかにされた。近年、季節海氷が薄くなった影響で融解前にも海氷下で植物プランクトン増殖が活発化されること、融解後の基礎生産力が上昇していることが報告されている。これら餌環境の好転と表層水温の上昇が(1)および(2)をもたらし、さらには油球の蓄積を増加させて(3)に関わると考えられた。北極海において観測されたアーカイブADCPデータを使って、動物プランクトンバイオマスの10年規模変動を定量的に復元することができた。また、衛星観測データより得られた表層水温・海氷密接度・基礎生産力など環境パラメータに関する情報をとりまとめ、動物プランクトンバイオマスの変動と比較した。これらの結果、当初立てられた仮説のように10年間で動物プランクトンバイオマスが増加していることが明らかとなり、その要因(海氷減少による基礎生産力の増加と表面水温の上昇)についても考察することが出来た。研究立案時には、この北極海研究も平成28年度内に論文投稿することを目指した。しかし、バイオマス増加という現象の記載にとどまらず、その増加が持つインパクトを評価したうえで投稿することにしたため、論文投稿タイミングが遅れた。ただし、平成29年度の早い段階で投稿出来る見込みである。
磁気圏内衛星の海洋光学探査のためのパルス電子線照射による色中心導入と回復挙動

1)低温照射・吸光度測定装置開発低温吸光度測定装置を作製し、試用した。ETIGO-IIIで室温照射したNaCl単結晶の吸光度を測定したことろ、NaCl中のF中心の460nm、F2中心の720nmのピークが検出可能であることが判明した。また、ステンレス二重容器の低温照射装置を作製し、試用した。事前のCASINOによる計算結果から、70%の電子が容器を透過すると予想した。ETIGO-IIIで2MeVの電子線照射を行ったところ、NaCl単結晶に色中心が生成した。この結果、低温でのNaClの照射が可能であることが分かった。一方、フィルム線量計での測定結果から、照射装置内部では外部の1/10以下の線量に低下した。2)ドープしたNaClの電子線照射実験ドープしたNaClの電子線照射実験の前段階として、無ドープNaCl単結晶の電子線照射実験を行った。量研機構の1号加速器にて、2MeVの電子ビームをNaCl単結晶に照射した。この結果、F2とF中心の平衡定数は、ETIGO-IIIで照射した試料とほぼ同じであるが、文献に記載の加速器によるデータより高い値となった。よって、試料中の微量な不純物が色中心の生成に影響していることが分かった。状態図上にNaClへの固溶域はないCsを使って、結晶成長を試みた。溶融法と水溶媒法でCsClを混合したNaCl粉末を原料として、単結晶成長を試みた。作製した結晶を走査型電子顕微鏡とエネルギー分散型X線分析装置で分析した。この結果、Cs量は検出限界(1原子%)以下であり、第二相が存在しうる粒界がない単結晶を成長させることが出来た。1)低温照射・吸光度測定装置開発低温吸光度測定装置開発では、ETIGO-IIIでの室温照射でNaClに導入したF中心とF2中心を検出することが出来た。これは申請の予定通りである。低温照射装置開発では、ETIGO-IIIで2MeVの電子によりNaCl単結晶に色中心が生成した。これは申請の予想通りである。2)ドープしたNaClの電子線照射実験量研機構の1号加速器で無ドープNaCl単結晶の電子線照射実験を行い、色中心濃度が文献のそれと異なり、不純物濃度の重要性が判明した。つぎに、2つの方法を用い、双方で吸光度測定が可能な最大5mmの結晶成長に成功した。また、状態図上で固溶域のないCsは結晶成長で排除された。この結果、状態図上で全率固溶しているKはドープした結晶成長が可能であると考えられた。1)低温照射・吸光度測定装置開発平成30年度の結果から、低温照射装置ではNaClに色中心を導入できるものの、照射装置内部の線量が低いことが分かった。これは、ETIGO-IIIで生成した電子ビームには、その電圧波形の広がりから、最高エネルギーの2MeVより低いエネルギーの電子も含まれていることが示唆された。このため、令和元年度には、より電子透過能の高く、かつ熱の遮蔽に寄与する発泡スチロール製の容器も利用することとなった。2)ドープしたNaClの電子線照射実験令和元年度には、状態図で固溶域全率固溶することが分かっているK、固溶域がないMgをドープしたNaClの結晶成長を試みる。KCl、Mg2Clを混合したNaCl粉末を原料として、溶融法と水溶媒法で単結晶成長を試みる。以上の結晶を用いて、ETIGO-IIIで低温での色中心生成、熱処理による回復挙動を測定する。

1)低温照射・吸光度測定装置開発低温吸光度測定装置開発では、ETIGO-IIIでの室温照射でNaClに導入したF中心とF2中心を検出することが出来た。これは申請の予定通りである。低温照射装置開発では、ETIGO-IIIで2MeVの電子によりNaCl単結晶に色中心が生成した。これは申請の予想通りである。2)ドープしたNaClの電子線照射実験量研機構の1号加速器で無ドープNaCl単結晶の電子線照射実験を行い、色中心濃度が文献のそれと異なり、不純物濃度の重要性が判明した。つぎに、2つの方法を用い、双方で吸光度測定が可能な最大5mmの結晶成長に成功した。また、状態図上で固溶域のないCsは結晶成長で排除された。この結果、状態図上で全率固溶しているKはドープした結晶成長が可能であると考えられた。1)低温照射・吸光度測定装置開発平成30年度の結果から、低温照射装置ではNaClに色中心を導入できるものの、照射装置内部の線量が低いことが分かった。これは、ETIGO-IIIで生成した電子ビームには、その電圧波形の広がりから、最高エネルギーの2MeVより低いエネルギーの電子も含まれていることが示唆された。このため、令和元年度には、より電子透過能の高く、かつ熱の遮蔽に寄与する発泡スチロール製の容器も利用することとなった。2)ドープしたNaClの電子線照射実験令和元年度には、状態図で固溶域全率固溶することが分かっているK、固溶域がないMgをドープしたNaClの結晶成長を試みる。KCl、Mg2Clを混合したNaCl粉末を原料として、溶融法と水溶媒法で単結晶成長を試みる。以上の結晶を用いて、ETIGO-IIIで低温での色中心生成、熱処理による回復挙動を測定する。
アミノ酸置換の導入による耐熱性酵素の高度熱安定化

サーモライシンより耐熱性,比活性共に高い耐熱性中性プロテアーゼの構造遺伝子(nprM)をB stearothermophilus MK232よりクローン化し,塩基配列を決定した.その結果,サーモライシンとは2箇所アミノ酸置換しただけの酵素であることが判明した.これらの変異(Asp37→Asn37, Glu119→Gln119)はいずれもアミノ酸が付加されたものであり,静電気的相互作用か水素結合の強化が耐熱性の理由ではないかと考えている.この点を明らかにするため,本酵素(NprM)とサーモライシン(TLN)をそれぞれ結晶化し,その三次構造を精密に検討した.精密化の結果得られたNprMの主鎖の構造をTLNと比べたところ,両者にほとんど差のないことが明らかとなった. NprMとTLNで異なる2つの側鎖のうち, Asn37は分子の外側に突き出しており,両酵素の物性の違いに寄与するとは考えがたい.一方, Gln119は分子内部のβ-ターン部分に位置し,近傍の側鎖との水素結合ネットワークに関与する.Gln119のまわりの重要と思われる水素結合の距離の比較から, NprMにおいてはTLNにおけるより強固な水素結合ネットワークが形成されていることが解った.蛋白質では一般に活性状態と変成状態の間の自由エネルギーの差が510kcal/mol程度であると言われている.従って, NprMにおけるGln119近傍の水素結合ネットワークのわずかな変化に起因する自由エネルギー差が,耐熱性向上の一因ではないかと考えられる.サーモライシンより耐熱性,比活性共に高い耐熱性中性プロテアーゼの構造遺伝子(nprM)をB stearothermophilus MK232よりクローン化し,塩基配列を決定した.その結果,サーモライシンとは2箇所アミノ酸置換しただけの酵素であることが判明した.これらの変異(Asp37→Asn37, Glu119→Gln119)はいずれもアミノ酸が付加されたものであり,静電気的相互作用か水素結合の強化が耐熱性の理由ではないかと考えている.この点を明らかにするため,本酵素(NprM)とサーモライシン(TLN)をそれぞれ結晶化し,その三次構造を精密に検討した.精密化の結果得られたNprMの主鎖の構造をTLNと比べたところ,両者にほとんど差のないことが明らかとなった. NprMとTLNで異なる2つの側鎖のうち, Asn37は分子の外側に突き出しており,両酵素の物性の違いに寄与するとは考えがたい.一方, Gln119は分子内部のβ-ターン部分に位置し,近傍の側鎖との水素結合ネットワークに関与する.Gln119のまわりの重要と思われる水素結合の距離の比較から, NprMにおいてはTLNにおけるより強固な水素結合ネットワークが形成されていることが解った.蛋白質では一般に活性状態と変成状態の間の自由エネルギーの差が510kcal/mol程度であると言われている.従って, NprMにおけるGln119近傍の水素結合ネットワークのわずかな変化に起因する自由エネルギー差が,耐熱性向上の一因ではないかと考えられる.
肝発癌を促進する微小環境制御による革新的な癌治療法の開発・研究

今回肝癌切除後の臨床データから、肝切除後に脾臓容量が大きいと再発が多く、脾摘症例では再発が少ないことを報告した。そこで脾臓由来のマクロファージと線維芽細胞、抗腫瘍免疫で特に重要なNK細胞に注目した。肝癌症例の脾臓から線維芽細胞と単球を分離し、さらにNK細胞とマクロファージを単離した。これらと肝癌細胞株を共培養したところ、マクロファージを除くと肝癌増殖能が抑制され、線維芽細胞を除くと増殖能が増加することがわかった。このことから脾臓由来マクロファージは抗腫瘍免疫に関わるが、線維芽細胞は腫瘍増殖に関与することが考えられた。そこで前述のCAF及びNF由来エクソソーム内のmiRNAをマイクロアレイにかけたところmiRNA150-3pの発現がCAFで有意に低下しており、miRNA150-3pを強制発現、または強制発現させたCAFと共培養させた肝癌細胞株は有意に浸潤能が高くなった。miRNA150-3pの負の標的遺伝子をデータベースからCDH2と特定し、CDHをノックダウンした肝癌細胞株では有意に浸潤能が低下した。実際の肝癌切除症例のパラフィン包埋ブロックで免疫組織染色を行うと、CDH高発現群で無再発生存率、全生存率ともに有意に予後不良であった。これまで生体肝移植症例において、摘出した肝臓及び脾臓をコラーゲン・プロナーゼでdigestしたのち、optiprepを用いた比重遠心法で単球を単離し、磁力細胞単離法(MACS)にてマクロファージと肝星細胞を単離し、細胞のpurityを、F4/80(マクロファージ), αSMA(肝星細胞・筋線維芽細胞)で評価済みである。また担癌肝組織の癌部・非癌部からも各々線維芽細胞を採取し、cancer-associated fibroblast(CAF)とnormal fibroblast(NF)でαSMAやvimentin、FAPの発現が有意にCAFで高いことをウエスタンブロット法や蛍光免疫染色法で確認できている。またCAFのエクソソームにも注目し、遠心法にてエクソソームを抽出し、肝癌細胞株であるHuh7と共培養してmigration assayで浸潤能をみたところ、CAF由来エクソソームで有意に浸潤能が高かった。細胞増殖に関してはPBSに比し線維芽細胞由来のエクソソームとの共培養で有意に増殖していたが、NFとCAFで差はなかった。肝組織から肝細胞、単球、線維芽細胞の単離と培養まではすでにできており、残るマクロファージの培養及び共培養によるphenotypeやサイトカイン産生の変化を今後見ていくことで課題の目的を達成できるため。一方で最近注目されているエクソソーム研究にも着手しており、線維芽細胞由来のエクソソーム内miRNA分析も進んでおり、今後の進捗次第では新たな知見及び研究課題も見えて来る可能性が高い。NF及びCAF、また肝由来と脾臓由来の線維芽細胞とでマクロファージとの共培養を行い、マクロファージの形質転換があるか検討していく。前述の通りCAF及びCAF由来のエクソソームが癌の進展に大きく関わっている可能性が高いが、これまで癌との関連で報告があった腫瘍関連マクロファージ(tumor-associated macrophage:TAM)が、実はCAFを介した作用であるとすれば全く新しい知見で今後の癌研究の発展に癌腫を超えて寄与することも考えられる。