hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
作物体に共生する脱窒菌からの好気的N2O発生メカニズムの解明

温室効果ガス一酸化二窒素(N2O)は葉菜類の作物体やその残さからも発生するが、そのメカニズムは不明である。そこで作物体に存在する脱窒菌群集からのN2O発生メカニズムを解明することを目的とした。圃場からN2Oが多量に発生している試料を回収し、そこから脱窒菌を分離して解析した。その結果、分離した脱窒菌は植物と関わりのある分類群に属していること、微好気条件で脱窒を行いN2Oを最終生産物とすることなどが明らかになった。地球温暖化ガスの1つである一酸化二窒素(N2O)は施肥や降雨時に土壌から発生するだけでなく葉菜類の作物体やその残さからも発生することがある。しかし申請者らはN2Oが土壌でなく作物体(キャベツ)が腐敗するのに伴い葉から直接発生することを突き止め、そこから好気環境で脱窒を行う細菌を分離した。本課題では葉でのN2O発生がどういった脱窒経路に起因しているのか解明し、窒素循環における葉面微生物の寄与を示すことを目的として研究を開始した。作物体から脱窒菌を約60株分離した。それらを16S rRNA遺伝子配列に基づき分類したところ、5属に分かれた。分離株の中から8株を用いて脱窒の特徴を調べた。まず分離株の脱窒能と最終生産物(N2OまたはN2)を調べるため、アセチレンブロック法を用いて脱窒活性を測定した。脱窒菌を好気環境で(気相を窒素などの無機ガスで置換せずに)培養したところ、用いた8株は数倍程度の範囲で異なる脱窒活性を示したが、いずれも最終生産物としてN2Oを発生した。また脱窒に関する酸素の影響を調べるため、培養液を異なる速度で撹拌・通気しながらアセチレンブロック法で脱窒活性を測定した。その結果、通気を激しくすると脱窒活性が低下した。次に培養液中の酸素濃度を測定するために、マイクロセンサーを用いた酸素濃度の測定法を確立した。深さ4mmの培養液中で分離株を培養し、脱窒能と酸素濃度を測定した。その結果、静置培養しN2O発生量が多かった培養液では深さ23mmで急激に酸素濃度が低下した。一方、撹拌によりN2O発生が認められなかった培養液では培養液の底面でも酸素が培養液中に含まれていることが分かった。以上から酸素濃度がN2O発生に大きく影響することが分かった。また分離した脱窒菌は好気的に脱窒をすると思われたが、実際には低酸素濃度下で脱窒を行っていることが考えられた。温室効果ガス一酸化二窒素(N2O)の主な発生源は、土壌に存在する脱窒菌等の窒素循環に関わる微生物であるといわれている。しかし葉菜類の作物体やその残さからも発生する。我々は既に圃場で発生するN2Oが土壌からではなく作物体から直接発生していることを突き止めた。作物体の成分などから、このN2O発生は作物体に存在する脱窒菌によるものであると考え、作物体に存在する脱窒菌のN2O発生メカニズムを明らかにすることを目的とした。前年度までに約60株の脱窒菌を分離した。それらの持つ16S rRNA遺伝子の塩基配列を用いて分離株を簡易的に分類した。さらに活性の安定している菌株を選抜してそれを用いてN2O発生における酸素濃度の影響を調べた。本年度はこの代表菌株のゲノムを明らかにした。その結果、この菌株は植物と関わりの深い微生物群に属していた。分離株に最も近縁なものは全ゲノムが明らかになっている既知の脱窒菌であり、その代謝経路は明らかにされている。そこでその既知脱窒菌と代表菌株との脱窒遺伝子を比較したところ、両者は類似しており、ともにN2Oを脱窒の最終生産物とすると推定された。この結果に基づき、脱窒の最終生産物を安定同位体を用いたGC-MS分析により調べたところ、やはり脱窒の最終生産物はN2Oであった。現在、メタボローム解析とトランスクリプトーム解析を進めており、それらの解析結果を統合することで作物体における脱窒とN2O発生のメカニズムが明らかになると考えている。土壌での脱窒は嫌気環境で脱窒が起こると考えられている。一方で、作物体の葉という酸素に触れる環境での脱窒については不明であった。本年度の研究の結果、脱窒が盛んに行われている培養液では、わずか数mmの深さで嫌気環境が構築され、そこで脱窒が行われていたことが明らかとなった。このことから、葉での脱窒は作物体に存在する微小な嫌気環境内で起こっていると考えられた。また分離株の脱窒能は既存の土壌由来の脱窒菌よりも高かった。これは作物体に豊富に含まれる基質によるものと考えられた。

以上から、作物体からのN2O発生は土壌で起こる場合とは特徴が異なることが示唆された。一方、本年度の計画では上記の生化学的な実験のほか、作物体のメタボローム解析等も行う予定であった。しかし脱窒菌の分離培養実験を開始した直後は、1つの菌株でも日によって脱窒活性が異なるなど、脱窒活性を正確に把握できなかった。そのため、このようなばらつきをなくすための新たな脱窒活性測定法を確立する必要が生じた。この検討に時間を要したため、メタボローム解析等まで研究を進めることが出来ず、計画は「やや遅れている」と判断した。環境微生物学本年度は分離した脱窒菌の生化学的な特徴を明らかにした。来年度は葉での脱窒に必要な基質を特定するためにメタボローム解析を行う。またメタゲノム解析で分離株が有する脱窒関連遺伝子群を特定する。さらに分離株が脱窒しているときに発現している遺伝子を特定するため、mRNAを抽出し、トランスクリプトーム解析に供する。こうして窒素代謝が起こっているときの遺伝子の発現状況を把握し、葉での脱窒とN2O発生がどういった窒素代謝に起因しているのか提示する。一方で、本年度までに分離した脱窒菌は複数の属に分類された。従って葉では複数種の脱窒菌が作物体由来の脱窒基質に対して競合あるいは協調しながら脱窒が起こっていると考えられる。そこで脱窒菌を混合培養して、培養液をメタボローム解析やトランスクリプトーム解析に供する。これにより微生物間の相互作用と機能(脱窒)に関する知見を得る。これまで作物体から脱窒菌が分離されたという知見はなかったため、本年度は作物体由来の脱窒菌の培養方法や脱窒活性測定法を確立することから検討することとなった。そのため培養実験に重点をおくこととなり、高額な試薬を用いるDNA・RNAの抽出やメタゲノム解析およびメタボローム解析等を行うことが出来なかった。これにより次年度使用額が生じた。分子生物学的手法やゲノム解析あるいはメタボローム解析等、申請時には26年度中に行う予定であった計画を27年度に移行して遂行する。
NK4産生細胞封入マイクロカプセルを用いた膵癌の新規治療法の開発

これまでHepatocyte Growth Factor (HGF)とその受容体であるc-Metの関係をブロックする治療物質としてNK4を用いてきたがこれは癌細胞の増殖を抑制する静細胞的な効果物質である。更なる治療効果を上げるために積極的に細胞を殺す殺細胞効果のある物質の開発を考案した。c-Metとの結合部位であるNK4のN端配列の一部(NK1)と緑膿菌外毒素(PE)の一部を結合させた融合タンパク(NK1-PE)の作製を行った。NK4プラスミドのNK1配列とIL13-PEプラスミドのIL13配列を組み替える事によりNK1-PEのコンストラクトを作製した。タンパク発現をlmM IPTG、37°Cで3時間誘導を行い、不溶性に発現したタンパクを回収した後リフォールディング、FPLCによる精製を行ったが収量を増やす事は困難であった。次に収量を増やす為に上記で作製したコンストラクトのNK1-PE部分をpGEX-2Tベクターに組み込む事によりGSTタグを融合させたタンパクの作製を試みた。また宿主の菌はOrigami株を用いた。タンパク発現を0.lmM IPTG、24°Cで一晩誘導する事により可溶性に発現する事ができた。このタンパクをグルタチオンセファロースに結合後、トロンビンによりGSTを切断して回収する事で問題を改善する事ができた。in vitroにて膵癌細胞にNK1-PEを添加し(0.1ng/ml100μg/ml)、72時間後に生死細胞の評価を行った。c-Metが高発現しているSUIT-2、AsPc-1での殺細胞効果は決して高くなく、低発現のしているBxPc-3やMiaPaca-2である程度の殺細胞効果が認められた。これは作製したNK1-PEがこれまで報告されているNK4が血管新生を抑制する経路上のc-Met以外の細胞表面上に発現している受容体に結合しPEの作用により死滅した可能性が示唆された。今までに既存の二重ノズル法によりNK4産生細胞封入マイクロカプセル(NK4-MC)作製を行ってきた。従来の方法で作製できるカプセルの大きさは0.31mmであるが、封入した細胞の生存率やNK4の分泌効率、またがん治療を考える上で実際にがん細胞が転移巣を形成しやすい腹膜上の乳斑や抹消門脈などに留置させるにはできるだけ小さいカプセルが適切であることを確認した。そこでシリコンの微細加工技術を応用し直径200μm以下のカプセルを作製することを考案した。シリコン基盤に直径60μmのアルギン酸通過孔を開け、その両側に空気通過孔を開けたマイクロ二重ノズルを作製した。アルギン酸のみを用いた場合、200μm以下のカプセル作製は可能であったが、細胞を1×10^7 cells/mlで混合した場合には粘稠度にむらが出来たり、細胞が目詰まりする問題が生じ微小なカプセルを作製する事は困難であった。アルギン酸の液滴の遊離を良くする為、アルギン酸が通過する内筒部分を80μm突出させた基盤を作製した。この装置では直径150μmの細胞封入マイクロカプセルを作製する事に成功した。しかしながら生産性や安定性の解決には至っていない。既存の二重ノズル装置で作製した300μmのNK4-MCを用いて延命治療効果を検討した。ヌードマウス(オス、6週齢)の膵臓に膵がん細胞(2×10^5 cells)を移植し、腹腔内にNK4-MCを70000個投与し延命効果を検討した。コントロール群の平均生存日数は21.4日であったのに対し、NK4-MC投与群では45.9日であり、有意に生存期間を延長させた。この事はマイクロカプセルの改良を進めることでより治療効果を向上させることができると期待される。我々はこれまでマウスの膵臓がん同所移植モデルにおいてNK4産生細胞封入マイクロカプセル(NK4-MC)の腹腔内投与により延命効果を示した。これまで細胞封入マイクロカプセルの作製は既存のカテーテル(サーフロー)と針を組み合わせて行っており、安定していなかった。そこで先端が平坦な内径150μmの針を用いた二重ノズルを設計し、300μmの細胞封入マイクロカプセルを安定して作製することが可能となった。この装置を用いて約300μmの大きさのNK4-MCを作製し、我々が独自に確立した膵臓がん肝転移モデルを用いて腫瘍抑制効果を検討した。ヌードラット(オス、5週齢)にNK4分泌細胞封入マイクロカプセル5000個を経門脈的に肝臓に投与し、その後、膵臓がん細胞(SUIT-2)封入マイクロカプセル1000個を投与し、4週間後に腫瘍の抑制効果を観察した。肝臓全体に占める腫瘍体積の割合はコントロール群に比べNK4-MC投与群で有意に腫瘍抑制効果を得ることはできなかった。一方、HGFとその受容体であるc-Metの関係をブロックする治療物質としてNK4を用いてきたが、その効果は腫瘍細胞の増殖を抑制する静細胞的なものである。そこで更なる治療効果を上げるために殺細胞効果のある物質の開発を考慮に入れている。具体的にはc-Metとの結合部位であるNK4のN端配列の一部(NK1)と緑膿菌外毒素の一部を結合させた融合タンパクの作製を現在行っている。

これまでHepatocyte Growth Factor (HGF)とその受容体であるc-Metの関係をブロックする治療物質としてNK4を用いてきたがこれは癌細胞の増殖を抑制する静細胞的な効果物質である。更なる治療効果を上げるために積極的に細胞を殺す殺細胞効果のある物質の開発を考案した。c-Metとの結合部位であるNK4のN端配列の一部(NK1)と緑膿菌外毒素(PE)の一部を結合させた融合タンパク(NK1-PE)の作製を行った。NK4プラスミドのNK1配列とIL13-PEプラスミドのIL13配列を組み替える事によりNK1-PEのコンストラクトを作製した。タンパク発現をlmM IPTG、37°Cで3時間誘導を行い、不溶性に発現したタンパクを回収した後リフォールディング、FPLCによる精製を行ったが収量を増やす事は困難であった。次に収量を増やす為に上記で作製したコンストラクトのNK1-PE部分をpGEX-2Tベクターに組み込む事によりGSTタグを融合させたタンパクの作製を試みた。また宿主の菌はOrigami株を用いた。タンパク発現を0.lmM IPTG、24°Cで一晩誘導する事により可溶性に発現する事ができた。このタンパクをグルタチオンセファロースに結合後、トロンビンによりGSTを切断して回収する事で問題を改善する事ができた。in vitroにて膵癌細胞にNK1-PEを添加し(0.1ng/ml100μg/ml)、72時間後に生死細胞の評価を行った。c-Metが高発現しているSUIT-2、AsPc-1での殺細胞効果は決して高くなく、低発現のしているBxPc-3やMiaPaca-2である程度の殺細胞効果が認められた。これは作製したNK1-PEがこれまで報告されているNK4が血管新生を抑制する経路上のc-Met以外の細胞表面上に発現している受容体に結合しPEの作用により死滅した可能性が示唆された。
成熟期エナメル芽細胞の自己組織化による空間パターン形成とその制御機の実験的解明

計画初年度の「ミニ浸透圧ポンプによるGap Junction Blockerの局所投与実験」では、下顎切歯エナメル質成熟部への塩酸チオリダジン(10mM)持続投与によって、エナメル芽細胞の形態変化周期の遅延を示唆する結果が得られたと報告した。今回、生後6週齢の雄性Wistarラット40匹を用いて、異なる濃度の2種類のギャップ結合阻害薬がエナメル芽細胞の形態変化の周期とパターンに与える影響を改めて検討したところ、薬剤投与群と無処置コントロール群間に有意な差を認めることはできなかった。多数歯を観察してみると、切歯エナメル質上のSAの縞状パターンは左右対象ではあるものの、正常でも左右で前後方向にずれていることが多く、初年度の所見は特に薬剤の影響とはいえないと判断された。微小管阻害剤であるビンブラスチンをラットに投与すると、812時間でエナメル芽細胞の波状縁が消失し、成熟期エナメル芽細胞がすべてSA様を呈することが知られている。今回、6週齢ラット60匹を用いてビンブラスチンがラット成熟期エナメル芽細胞に与える変化をエナメル質のGBHA染色法によって長期観察したところ、投与後2448時間以降、成熟期エナメル質上に左右非対処の動的な渦巻き模様が出現し、経時的にその形態と位置を変化させることが確認された。渦巻き模様は注射後一週間を経ても持続しており本来の左右対称の線状構造に復帰することはなかった。更にラット20匹を対象に歯科用バーでエナメル器の部分破壊実験を行なったところ、特定部位を破壊するとSAの線状パターンが渦巻状に変化し、それ以外の部位では変化が生じないことも確認された。本研究で確認されたこれらの事実は、成熟期エナメル芽細胞の周期的形態変化が、反応拡散系に基づく自発的形態形成現象であることを初めて実験的に示したものである。生体の細胞・組織における動的空間パターンの発現の仕組みとその制御機講を究明する上で、ラット切歯成熟期エナメル芽細胞層は優れた実験モデルである。ラットの成熟期エナメル芽細胞層に発現する動的な周期パターンが、反応拡散系に基づく自己組織化によるものか否かを検証するために、以下の実験を行なった。1.ラット切歯のエナメル器構成細胞におけるギャップ結合のマッピング細胞の興奮による電気的進行波の伝達の場であるギャップ結合を免疫組織化学的に染め出し、その配列に何らかの方向性(極性)があるか否かを検証し、ギャップ結合の発達とエナメル芽細胞の周期的形態変化の間の相関の有無を検討した。実験には通法に従って固定、脱灰したラットの下顎から切歯のエナメル質成熟期に相当するエナメル器をシート状に摘出し、そのまま、あるいは凍結切片にして抗コネクシン43抗体で免疫染色した。エナメル芽細胞層にはパッチ状を呈するギャップ結合が多数染め出されたが、シート状のエナメル器の全載標本の免疫染色では染色ムラがおおきく、正確な空間配置を確認するには至らなかった。二年次の課題である。2.ミニ浸透圧ポンプによるGap Junction Blockerの局所投与実験ラット下顎骨に作製した開窓部に微細なカテーテルを挿入し、背部皮下に埋入したミニ浸透圧ポンプ(Alzet)により下顎切歯エナメル器の成熟期初期に向けて塩酸チオリダジンの10mM溶液を持続投与(1.0μ1/hr)を行なった。この方法はin vivoの実験系でありながら投与薬剤の効果を局所に留めることが可能で、反対側の下顎切歯を対象群として評価できる利点がある。投与開始44時間後、Gap junction blocker投与側で、エナメル芽細胞の形態変化の周期の遅延を示唆すする結果が得られた。今後、投与薬剤の種類と濃度を変えて実験を継続する。
ペプチド核酸(PNA)を用いた遺伝子診断法の開発

I.PNAのプローブとしての特性の解析・・・・・・まず、PNA(ペプチド核酸)プローブのもつ物理化学的、生物学的特性を、MRSA(メチシリン耐性黄色ブトウ球菌)と結核菌を対象として検討した。これにより、PNAプローブのもつ特性(高い細胞膜透過性と配列特異性、強いDNA結合能)を確認したが、同時に、感度が臨床応用には不十分で、シグナル増幅の必要がある、という重大な問題点を見出した。II.PNA-CSA法の開発・・・・・・Iで明らかとなった感度の問題を解決するため、PNAプローブに、チラミンの酸化(ラジカル化)を応用したCSA(Catalyzed Signal Amplification)法を組み合わせた方法の開発を進めた。この新しい方法(PNA-CSA法)をMRSAのmecA遺伝子に適用した結果、MRSAを数コピーまで特異的に検出できることが明らかとなった。これは、DNAやPNAプローブによる従来法に比較すると、大幅な感度向上である。III.高感度IM-PCR法の開発・・・・・・PNA-CSA法と平行して、IM-PCR(インターカレーション・モニタリングPCR)法の開発をおこなった。すなわち、PCRによって増幅する2本鎖DNAにインターカレートする色素の蛍光をリアルタイムに測定する方法で、これにより数十コピーのHCVの検出が可能となった。IV.in situ PCR法の改良・・・・・・肺癌患者の肺組織中の変異K-ras遺伝子を指標に、反応条件の詳細な検討をおこなった。その結果、病理標本上で単一コピーの点突然変異を検出できる目途が立った。V.Ampdirect^<TM>による生体試料からの直接PCR法の開発・・・・・・Ampdirect^<TM>を糞便および血液に適用し直接PCR法をおこなった結果、従来のPCRバッファーに比較して、圧倒的に良好な増幅が得られることが明らかとなった。まずPNAプローブを使って特定遺伝子を検出する系の開発を目指して研究を開始した。対象遺伝子としてMRSAの原因となる黄色ブドウ球菌のmecA遺伝子を取り上げ、PNAプローブが遺伝子配列特異的に結合することを確認した。PNAプローブは濃度依存的に対象遺伝子と結合し、この結合は溶液のpHや塩濃度の影響を受けないことが明らかとなった。次いでPNAプローブを用いてmecA遺伝子のELISA類似系での検出を試みた。方法としては、まずFITCおよびビオチンで標識したPNAプローブと、菌から抽出したDNA(またはそのPCR産物)を94°Cで反応させた後、室温に戻した。ここで形成されたDNA-PNA複合体を抗FITC抗体の同定化プレートで回収し、発色をダコ・エンビジョン法にておこなった。この際、標的遺伝子の低回収率および遺伝子の非特異的な付着による高バックグランドが問題となった。そこで標的部位をPNAで挟み込んでDNase処理を行ったところ、その標的部位だけを残して大部分のDNAを消化することができた。この結果、目的とする遺伝子部位の回収率が顕著に向上し、さらにバックグランドの低下が観測された。この方法による検出限界は10_6コピーであった。この方法はPCR法と比較して感度的には劣るものの、簡便さ、迅速性、自動化等において優れている。さらに、この方法をin situ PCR法とドッキングさせ、病理組織標本上でK-rasやp53などの変異遺伝子検出へ応用していくのが次年度の課題である。まず、初年度にひき続き、PNAプローブのもつ特性について検討を加えた。試料として、分離・培養し、スライドガラスに塗布したMRSA(メチシリン耐性黄色ブトウ球菌)と、患者の喀痰塗沫標本中の結核菌を用いた。

前者についてはmecA遺伝子のAとTのみを含む領域、後者についてはM.tuberculosis complex(MTC)とNontuberculous Mycobacterum species(MOTT)に特異的な16SrRNA領域に対して、それぞれ相補的なFITC標識PNAプローブを調製し、標本と反応(ハイブリダイゼーション)の後、蛍光顕微鏡下に観察した。この検討により、PNAプローブのもつ(1)疎水性が強く、容易に細胞膜を透過して標的核酸に到達・結合できる、(2)高い配列選択性をもち、1塩基のミスマッチによるTm値の差がDNAの場合よりも大きい、(3)PNA/DNAの結合が非常に強く、ほとんど瞬時に形成されるため、ハイブリダイゼーションに要する時間は30分で十分である、などの特性を確認した。一方、(4)感度が不十分で、シグナル増幅の必要がある、という重大な問題点を見出した。そこで、PNAプローブを最近ダコ社の開発したCSA(Catalyzed Signal Amplification)法と組み合わせ、高感度化することを試みた。CSAは、ビオチン標識したチラミンを基質にペルオキシダーゼ反応を行い、これによって生じるラジカルの沈着およびABC(アビジン-ビオチンコンプレックス)法を組み合わせた検出系で、この検出系の採用により期待通りの大幅な感度向上が得られた。これとは別に、PNAのもつ高い配列選別能力を利用して、肺癌組織切片中のK-ras遺伝子の点突然変異をin s i tu PCRで検出する試みを開始した。これはまだPNAの非特異的沈着が強くて成功していないが、液相中ではPNAの特異的結合を確認しており、改良可能と思われる。前年度に引き続き、PNAプローブにCSA(Catalyzed Signal Amplification)法を組み合わせた高感度遺伝子検出法の開発を進めた。CSA法はビオチン化したPNAプローブを標的核酸とハイブリダイズさせた後、これにペルオキシダーゼ標識したストレプトアビジンを反応させてペルオキシダーゼを局在化させ、過酸化水素の存在下、ビオチン化したチラミンを酸化(ラジカル化)させ、沈着したチラミンをABC法で検出する方法である。この方法により、PNAプローブのもつ種々の利点(容易な細胞膜透過性や高い配列特異性、強いPNA/DNA結合能)を高感度検出法として活用することが可能となった。まず、この検出法をMRSA(メチシリン耐性黄色ブドウ球菌)のmecA遺伝子に適用し、MSSA(メチシリン感受性黄色ブドウ球菌)との比較により、MRSAを数コピーで特異的に検出できることを確認した。これは、PNAプローブによる従来の検出法に比較すると、大幅な感度向上である。さらに、PNAのもつ高い配列特異性を生かして、変異特異的プライマーと組み合わせることにより、癌細胞の点変異の検出に応用を試みている。対象としているのは肺癌細胞におけるK-ras点変異の検出で、既にわれわれは、変異特異的プライマーを用いたin situ PCR法により、点変異の検出に成功している。さらに、HCVウイルス等の感染細胞にこの方法を適用し、単一コピーのウイルスゲノムを検出できる技術の開発を目指している。
肺胞水分再吸収機序の研究

肺胞水分再吸収機序を研究した.1.β-交感神経刺激薬による肺胞水分クリアランス亢進:β1-交感神経刺激薬は肺胞II型上皮細胞のcAMPを上昇させ,肺胞水分再吸収およびナトリウムイオン輸送を亢進させた.高濃度β2-交感神経刺激薬はβ1-受容体を介してβ2-効果を減弱させた.2.虚血再潅流肺傷害:ラットで肺胞水分クリアランスを測定する実験モデルを作成した.ラットの虚血再潅流傷害肺では再潅流後1,3日で上昇し,7日後に水分クリアランスは回復した.虚血再潅流傷害肺における肺胞水分クリアランスの上昇はプロプラノロールで抑制されることにより内因性カテコールアミンによると考えられた.肺組織と培養肺胞II上皮細胞のαrENaCのmRNA(RT-PCR法)のには有意差がなく,肺胞水分クリアランスの亢進にはαrENaCのmRNAの関与は少ない.肺虚脱によるナトリウムイオン輸送と肺胞水分再吸収能力は減少し,その減少には活性酸素が関与した.3.高低濃度酸素肺傷害:高濃度酸素肺傷害ではβ1-交感神経刺激薬はβ2-交感神経刺激薬と同じく肺胞水分クリアランスを亢進させた.低濃度酸素暴露では,内因性ノルアドレナリンが分泌され,肺胞水分クリアランスは亢進した.この状態でβ受容体機能は温存された.4.肺手術侵襲が肺胞水分クリアランス機能に及ぼす影響:手術侵襲後2週間は肺胞水分クリアランスは不変であるが,2,4週間目には肺胞水分クリアランスは九進した.αrENaCの発現が亢進していること,ナトリウムチャンネルの機能亢進が阻害薬使用の結果確認されたことより,ナトリウムチャンネルを介する肺胞水分クリァランスが亢進した.また,ヒト手術後残存肺では肺胞II型上皮細胞が過形成され,その結果肺胞水分クリアランスが亢進したことが示唆された.肺胞水分再吸収機序の研究は多くの肺傷害において重要である.肺胞水分再吸収機序を研究した.1.β-交感神経刺激薬による肺胞水分クリアランス亢進:β1-交感神経刺激薬は肺胞II型上皮細胞のcAMPを上昇させ,肺胞水分再吸収およびナトリウムイオン輸送を亢進させた.高濃度β2-交感神経刺激薬はβ1-受容体を介してβ2-効果を減弱させた.2.虚血再潅流肺傷害:ラットで肺胞水分クリアランスを測定する実験モデルを作成した.ラットの虚血再潅流傷害肺では再潅流後1,3日で上昇し,7日後に水分クリアランスは回復した.虚血再潅流傷害肺における肺胞水分クリアランスの上昇はプロプラノロールで抑制されることにより内因性カテコールアミンによると考えられた.肺組織と培養肺胞II上皮細胞のαrENaCのmRNA(RT-PCR法)のには有意差がなく,肺胞水分クリアランスの亢進にはαrENaCのmRNAの関与は少ない.肺虚脱によるナトリウムイオン輸送と肺胞水分再吸収能力は減少し,その減少には活性酸素が関与した.3.高低濃度酸素肺傷害:高濃度酸素肺傷害ではβ1-交感神経刺激薬はβ2-交感神経刺激薬と同じく肺胞水分クリアランスを亢進させた.低濃度酸素暴露では,内因性ノルアドレナリンが分泌され,肺胞水分クリアランスは亢進した.この状態でβ受容体機能は温存された.4.肺手術侵襲が肺胞水分クリアランス機能に及ぼす影響:手術侵襲後2週間は肺胞水分クリアランスは不変であるが,2,4週間目には肺胞水分クリアランスは九進した.αrENaCの発現が亢進していること,ナトリウムチャンネルの機能亢進が阻害薬使用の結果確認されたことより,ナトリウムチャンネルを介する肺胞水分クリァランスが亢進した.また,ヒト手術後残存肺では肺胞II型上皮細胞が過形成され,その結果肺胞水分クリアランスが亢進したことが示唆された.肺胞水分再吸収機序の研究は多くの肺傷害において重要である.達成された研究:1.実験モデルの作成.1)ラット摘出肺での実験:SDラットの摘出肺でエンスブルーと蛋白濃度変化より肺胞水分クリアランスを測定し,実験モデルを作成した.2)ラットの虚血再潅流傷害肺では再潅流後1日及び3日で上昇し,7日後に水分クリアランスは回復する.2.ナトリウムチャンネルおよびNa-K-ATPase機能.1)虚血再潅流傷害肺における肺胞水分クリアランスの上昇はプロプラノロールで抑制されることにより内因性カテコールアミンによると考えられる.またそれはナトリウムチャンネルを介する.2)肺組織と培養肺胞II上皮細胞のαrEN_aCのmRNA(RT-PCR法)の発現を検討した.発現には有意差がなく,肺胞水分クリアランスの亢進にはαrEN_aCのmRNAの関与は少ない.3.低酸素暴露による肺胞水分クリアランス.虚血再潅流肺傷害では低酸素に暴露されるため,低酸素暴露実験を施行した.

ラットを5日間低酸素に暴露することにより,内因性ノルアドレナリンが分泌され,肺胞水分クリアランスほ亢進する.この状態でβ1及びβ2交換刺激薬は肺胞水分クリアランスをさらに亢進させるため,β受容体機能は温存される.未達成の研究:1.Na-K-ATPase機能.1)虚血再潅流傷害肺における肺胞水分クリアランスとナトリウムポンプの関与を明らかにする.2)肺組織と培養肺胞II上皮細胞のα1Na+-K+-ATPaseのmRNA(RT-PCR法あるいはノーザンブロット法)と蛋白レベル(ウェスタンブロット法)の発現を調べる.達成された研究:1.肺胞II型上皮細胞の分離培養方法の確立.ラットにおける肺胞II型上皮細胞の分離培養し,それを用いてβ1-交感神経刺激薬が肺胞II型上皮細胞のcAMPを上昇させ,肺胞水分再吸収およびナトリウムイオン輸送を亢進させることを報告した(J Appl Physiol 2000).2.β1-受容体の機能の研究.過去に報告のなかった肺胞II型上皮細胞におけるβ1-受容体の機能を研究し報告した(J Appl Physiol 2001).またβ1-受容体とβ2-受容体の相互作用を研究し報告した(Exp Lung Res 2001,in press).この研究では高濃度β2-交感神経刺激薬は効果を消失するが,それはβ1-受容体を介することが判明した.すなわち,β1-受容体とβ2-受容体には相互作用が存在すると考えられる.3.肺傷害モデルの作成.高濃度酸素暴露による肺傷害モデルを作成し,そのモデルにおけるβ1-受容体の機能を研究し報告した(Jpn J Pharmacol 2001).この研究によりβ1-交感神経刺激薬はβ2-交感神経刺激薬と同じく肺胞水分再吸収に有効な薬剤であると考えられる.4.肺移植モデルの作成.肺移植におけるドナー肺保存実験モデルを作成し報告した(Transplantation 2000).肺虚脱によるナトリウムイオン輸送と肺胞水分再吸収能力は減少し,その減少には活性酸素が関与する.未達成の研究:1.肺胞水分再吸収機序におけるサイトカインと成長因子の影響.2.ナトリウムチャンネル及びナトリウムポンプの機能.3.In vivo移植肺モデルの作成.なおナトリウムチャンネルmRNAの発現をRT-PCRにて研究した.しかし,Quantitative Competitive PCRが必要であり実験中である.肺移植と肺傷害における肺胞水分再吸収機序を研究した.まず,肺に対する手術侵襲が肺胞水分クリアランス機能とRT-PCR法で測定したαrENaCの発現への影響を検討した.その結果,手術侵襲後2週間は肺胞水分クリアランスは不変であるが,2,4週間目には肺胞水分クリアランスは亢進する.その機序を検討し,αrENaCの発現が亢進していること,ナトリウムチャンネルの機能亢進が阻害薬使用の結果確認されたことより,ナトリウムチャンネルを介する肺胞水分クリアランスの亢進が示唆された.また,分離採取された肺胞II型上皮細胞数が増加したことより,手術後残存肺では肺胞II型上皮細胞が過形成され,その結果肺胞水分クリアランスが亢進した可能性も示唆された.またこのモデルでのカテコールアミンの関与は否定された.以上の結果をJ Thorac Cardiovasc Surgに投稿し,平成14年に掲載される.肺移植及び肺手術後肺傷害時には低酸素血症が発症するが,低酸素暴露により内因性カテコールアミンが分泌され,肺胞水分クリアランスを亢進させる機序を研究し,その結果を論文報告した(J Appl Physiol 2001).カテコールアミンのうちノルエピネフリンの関与が示唆され,これはヒトでの高地暴露における反応と一致するものであった.
アラキドン酸酸素添加酵素の触媒活性と遺伝子発現の阻害剤の研究

アラキドン酸由来の種々の脂質メデイエーターの生合成の始まりは、シクロオキシゲナーゼやリポキシゲナーゼのような酸素添加酵素の反応である。このような酵素の触媒活性と遺伝子発現の阻害剤を探索するのが本研究計画の目的である。1)シクロオキシゲナーゼ転写阻害剤の生物活性:ビールホップのフムロンがシクロオキシゲナーゼ-2遺伝子の転写を阻害するという私達の以前の知見を基に、この酵素が血管新生に関与することに着目し、ニワトリ胎児絨毛尿膜の血管新生が、フムロンによって顕著に抑制されることを見出した。2)12-リポキシゲナーゼ活性阻害剤の開発:12-リポキシゲナーゼには血小板型・白血球型・皮膚型の3つのアイソザイムがある。以前に申請者らは、トロポロン化台物ノヒノキチオールが血小板型の酵素を特異的に阻害することを見出しているが、トロポロン誘導体を検討して、ヒノキチオールと桂皮アルコーがエーテル結合したものが、血小板型に特異性が高いことを見出した。また、その抗酸化作用に着目して、茶葉カテキン類を検討したところ、いずれも血小板型12-リポキシナーゼを相対的に強く阻害し、特に(-)-ガロカテキンガレートが0.1μMというIC50で酵素阻害能を示した。さらに、ヒノキチオールが10μM程度で、種々のメラノーマ細胞腺癌細胞の増殖を抑制することを見出し、検討を続けている。3)プロスタグランジンE2酵素免疫測定法:シクロオキシゲナーゼの作るアラキドン酸代謝物で、最も多彩な生物活性を示すのがプロスタグランジンE2で、病態におけるシクロオキシゲナーゼ発現の動態を追跡するのに、測定の対象となることが多い。その簡便で高感度の測定法として、種々の酵素を標識とする免疫測定法を検討した結果、アセチルコリンエステラーゼを標識酵素として使った酵素免疫測定法で、IC50が4.5pg/50μl試料という検量線を得た。1)12-リポキシゲナーゼ阻害剤:12-リポキシゲナーゼの2つのアイソザイムのうち血小板型が、トロポロン化合物のヒノキチオールによって強力に阻害されるという既報の知見を基に、種々のトロポロン化合物を検討した。白血球型には影響せず血小板型に特異的であるという点で、ヒノキチオールのベンジルエーテルが見出され、その構造活性相関を検討した。2つのアイソザイムの識別に要する構造として、ベンゼン環は必要で、さらに、ベンゼン環とヒノキチオールの間のアルキル鎖の長さを変えたり不飽和化したりした結果、桂皮アルコールがヒノキチオールとエーテル結合したものが、血小板型12-リポキシゲナーゼを20μM程度のIC_<50>で阻害し、白血球型の酵素ではもっと弱い阻害しか示さなかった。より特異的で強い阻害剤を求めて、構造活性相関の検討を続けている。2)シクロオキシゲナーゼ-2の転写阻害剤:血管新生にシクロオキシゲナーゼ-2が関与することが報告されている。ビールホップから抽出されたフムロンが、シクロオキシゲナーゼ-2の転写を阻害するという以前の知見の上に、この化合物が血管新生を抑制する可能性に注目した。

ニワトリ胎児絨毛尿膜にフムロンを添加すると、その血管新生を顕著に抑制し、また、培養血管内皮細胞のVEGF(血管内皮成長因子)の生成を阻害することを見出した。3)プロスタグランジンE_2(PGE_2)の酵素免疫測定法の開発:シクロオキシゲナーゼ系の代謝産物で、最も多彩な生理活性を示すのはPGE_2である。シクロオキシゲナーゼの病態生理的機能の解析の一つの手段として、PGE_2の酵素免疫測定法の開発を検討している。何故この時点でPGE_2の酵素免疫測定法かというと、一般に市販されているキットでは、不安定なβ-ケトール構造をもつPGE_2そのものに標識酵素を結合しており、保存しているうちにPGE_2が分解してPGB_2に変換して、それが抗体に認識されなくなる。そこで、PGB_2の安定な誘導体で抗体が確認するものを検索して、いくつかの誘導体が抗体に高い親和性をもつことを見出している。それらをリガンドとして酵素標識したものを使って、安定で感度のよい酵素免疫測定法の開発を進めている。1.リポキシゲナーゼ阻害剤:健康食品として茶葉のカテキン類の抗酸化作用が注目されている。種々の抗酸化性カテコールがリポキシゲナーゼを阻害することが知られているので、栄養学的ならびに酵素学的視点から、茶葉から抽出された種々のカテキンを種々のリポキシゲナーゼとアラキドン酸との反応系に添加して、その酵素阻害活性を検討した。trans型のカテキン類がヒト血小板の12-リポキシゲナーゼを、cis型のカテキン類がウサギ網状赤血球の15-リポキシゲナーゼを、比較的特異性をもって強く阻害することがわかった。また、没食子酸がエステル結合したものが強い阻害活性を示したので、さらに検討したところ、没食子酸とその類縁体が種々のリポキシゲナーゼを強く阻害した。さらに詳細な阻害機構とその他のリポキシゲナーゼへの効果の検討を続けている。2.シクロオキシゲナーゼ-2の転写阻害剤:特に研究の進展はなかった。3.プロスタグランジンE_2(PGE_2)の酵素免疫測定法:種々のプロスタノイドのうちPGE_2は最も多彩な生理活性を示し、炎症・胃傷害・発癌などの病態との関連が研究課題となっている。そのPGE_2の測定法として一般的な酵素免疫測定法の市販のキットでは、PGE_2自体を酵素標識しているが、不安定なβ-ケトール構造をもつPGE_2に代わるリガンドを探索した結果、9-デオキシ-9β-クロロ-PGFが抗体に高い親和性をもつことがわかった。その類縁体を標識酵素としての仔ウシ小腸アルカリホスファターゼに結合させ、二抗体法の酵素免疫測定法を設定して、30pg/50-μl試料というIC_<50>値を得た。現在さらに高い感度を目指して改良を試みている。アラキドン酸カスケードと呼ばれる代謝系では、種々の脂質メデイエーターがアラキドン酸を前駆物質として生合成されその始まりはシクロオキシゲナーゼやリポキシゲナーゼのような酸素添加酵素の反応である。このような酵素の触媒活性と遺伝子発現の阻害剤を探索する本研究計画の一環として、最終年度は次の2点について研究を進めた。1)12-リポキシゲナーゼ阻害剤の探索:この酵素の生理的役割は未だ確定していない。その抗酸化作用故に健康食品として注目される茶葉のカテキン類を検討して来たが、(-)-ガロカテキンガレートが、ヒト血小板の12-リポキシゲナーゼを特異的に阻害することを見出した。そのIC_<50>値はおよそ1μMであった。他のリポキシゲナーゼやシクロオキシゲナーゼのアイソザイムは10μMでは顕著な阻害が認められなかった。2)プロスタグランジンE_2の酵素免疫測定法の開発:シクロオキシゲナーゼ産物で最も多彩な生理活性をもつプロスタグランジンE_2の動態を追うことによって、シクロオキシゲナーゼの動態を調べることが出来る。
機能性タンパク質結晶の細胞内合成

本研究では、新たなタンパク質機能材料として注目されているタンパク質結晶に着目し、機能化タンパク質結晶の細胞内合成に向けた合理的設計法の確立を目指す。具体的には、細胞内結晶性タンパク質である「多角体」の結晶に着目し、(1)細胞内多角体結晶化メカニズムの解明、(2)多角体結晶のエンジニアリングから、(3)合理的機能設計へ向けた計算化学と構造解析手法の確立を達成する。細胞を反応容器とした目的タンパク質の自在な結晶化手法を確立することができれば、有用タンパク質材料の機能化・合成・構造決定を細胞内のみで一貫して達成することが可能となり、バイオ分野に大きな波及効果を及ぼす技術につながる。
ｐ５７ＫＩＰ２による脂溶性ビタミンの生理活性制御機構の解明と応用研究

細胞周期制御分子として見出されたp57Kip2は、その欠損動物が胎生期の骨形成の未発達を呈したことから、個体形成時の骨器官に作用する生理活性物質の活性を支える分子である事が示唆されてきた。今回申請者は、p57Kip2が骨形成に必須のビタミンD3の作用点であるビタミンD受容体(VDR)に結合することでVDRの転写因子活性能を支持する事を見出した。またp57遺伝子欠損マウスは胎盤細胞の過増殖を示したことから、p57の胎盤機能維持への機能を考えた。今回の研究から、申請者はp57が胎盤形成時にみられる胎盤細胞同士の融合に関わる膜性糖タンパク質ASCT2の発現量や細胞内挙動に影響する事を見出した。p57遺伝子欠損マウスは骨形成と胎盤形成の異常を顕著に示す。まず骨の形成に着目してマウスの新生児から調製した骨芽細胞におけるp57とビタミンD受容体との関係を調べた。ビタミンD受容体の抗体を用いた免疫沈降法を行なったところ、沈降物にp57の検出を認めたことから、骨芽細胞ではp57はビタミンD受容体と複合体を形成していることが示唆された。p57欠損による骨形成の異常は、骨芽細胞におけるp57-ビタミンD受容体(VDR)形成の破綻によるVDRの機能不全が原因になる事が考えられた。p57欠損動物で異常を示す器官(骨、胎盤)の形成では、細胞融合による多核化細胞の出現が必要であることから、細胞融合化に関わる分子のうち細胞膜局在分子ASCT2の発現レベルを検討した。胎盤分化モデル細胞で用いるヒト胎盤絨毛癌細胞株BeWo細胞におけるASCT2の発現レベルが、p57発現により有意に減少する事を見出した。p57は核内及び細胞質にも検出される事から、p57はASCT2の発現調節を転写因子の活性制御を通して抑制する可能性と、ASCT2の細胞内の挙動(安定性と移動)に関与する可能性が示唆された。細胞周期制御因子としてのp57は、p53の機能制御にも関わる事を示唆する報告があることから、申請者はp53の安定性に関わるタンパク質の立体異性化酵素Pin1がp57に関与する事を想定し検討を進めている。現在、Pin1とp57との関連についての研究を培養細胞とマウスを用いた検討の両面から進めている。p57の役割を核内外の両面から迫る事が、p57の脂溶性ビタミン応答に対する機能制御機構の解明繋がる事が期待された。申請者らは、細胞周期制御蛋白質であるp57Kip2は、遺伝子欠損により個体発生時の骨形成と胎盤形成に異常を呈したことから、p57Kip2はビタミンDや長鎖不飽和脂肪酸などの脂溶性生理活性物質の受容体である各種核内受容体タンパク質の機能制御にも関与することを仮定し本研究計画を立案した。特に胎児期の骨の形成に顕著に影響していたことから、脂溶性ビタミンであるビタミンD3の受容体VDRへの関与に着目し検討を進めてきた。p57Kip2はVDRとの結合能を示し、ビタミンDによるVDRの転写因子としての作用を更に活性化する事が示された。p57欠損マウスで認められた表現型のうち骨形成に関する異常を、p57-VDRの相互作用の存在から説明できる様になった。更に、脂溶性ビタミンのうちビタミンAにも着目し、その生理活性体であるレチノイン酸と特異的核内受容体RARへの関与についても検討を試みたが、VDRとは異なり複合体形成は認められなかった。レチノイン酸処理によるプロテインキナーゼA(PKA)の活性化をp57Kip2が制御することが示唆され、レチノイン酸の作用に対するp57Kip2の関与も考えられた。また正常の胎盤形成では胎盤細胞同士の融合による多核化の進行が認められる。この細胞融合は、細胞表面タンパク質のうちシンシチンとその受容体分子であるASCT2との結合による。細胞膜糖タンパク質であるACST2は、今回の申請者らの検討からp57による細胞内レベル及び細胞内挙動の制御を受ける事が示唆された。今後、p57Kip2によるASCT2の機能制御の機序に焦点をあてて解析を進めていく。p57Kip2の核内受容体タンパク質への作用を解明するため、p57Kip2の欠損細胞株であるBeWo細胞を用いて、これにp57Kip2発現誘導を行った。各種核内受容体タンパク質の検出をイムノブロット法で行ったところ、BeWo細胞ではp57発現によりVDR、RXRの発現量が有意に増加した。

免疫沈降法から、各種核内受容体のうちVDR、RXRとp57との複合体形成が認められた。BeWo細胞はcAMP賦活剤やレチノイン酸・ビタミンD3の刺激により胞合化による分化誘導を示す。p57発現はBeWo細胞の胞合化を促し、更に脂溶性ビタミン(レチノイン酸、ビタミンD3)による分化誘導を亢進した。p57発現誘導したBeWo細胞では、cAMP賦活剤ホルスコリン刺激で分化誘導に加えて、p57の安定化、p57とRXRとの複合体形成の亢進が認められた。ホルスコリンによるcAMPの増加は、細胞内でcAMP依存性リン酸化酵素(Protein Kinase A (PKA))の活性化を促すことから、p57発現がPKAに及ぼす影響を検討した。PKAを構成する制御サブユニット、触媒サブユニットそれぞれの量的変化は認められず、細胞内局在性にも影響しない事が示された。レチノイン酸刺激では、p57とVDR、RXRとVDRとの解離が認められた。p57遺伝子欠損マウスが骨形成不全を示すことから野生型とp57-/-由来の初代培養骨芽細胞を調整し、各種核内受容体の発現レベルやp57との相互作用を検討した。興味深い知見としてVDRの発現量がp57欠損で現象すること、また骨芽細胞でVDRとp57との複合体形成を示す事、更にビタミンD3に依存するVDRの転写活性をp57は支える事が認められた。骨形成におけるp57の役割の一つに、ビタミンD3によるVDRの活性化の支持がある事が示唆された。前年度から引き続き、所属教室の方針から学生・院生の協力を仰ぐ事が叶わず、別の研究課題の指導で研究時間の大半を使った。また二度の入院を余儀なくされ、その間の本研究計画は実験者不在のため停止せざるを得なかった。上記の状況を考慮すれば、計画書の目的のうち脂溶性ビタミンのうちVDRとp57Kip2との関係の検討を進める事ができ、また新たにグルタミン輸送体との関係にも迫る事ができたのは、大きな成果であった。また、学外との共同研究体制の強化を計ったので、次年度への準備は充分できたものを自負している。大学での教育業務と並行する中で、実験動物の維持、培養細胞の維持など全ての研究作業を代表者が一人で進めている現状を考慮すれば、研究遂行はこれまで滞りなく進めていると自負している。本研究の更なる発展を実現するにあたり、申請時の研究体制を具体化出来る様に努めると共に旧知の研究者とのコミュニケーションを密にとり、本交付金の成果を研究業績としてまとめることで医療現場への還元を目指して、臨床医とのコミュニケーションを図っていく所存である。教室の方針から院生・学生の協力は仰げないため、申請者自身の体調管理を最優先にすることで、日々の計画を遂行を実現していく。申請者の旧知の研究者との共同研究の体制を早々に再構築し、昨年度の遅れを取り戻すことで本計画の達成度の向上を図りたい。本年度の研究で用いたBeWo細胞についてp57発現によるRAR、VDRの転写活性を各々の応答配列をもつレポータープラスミドで定量的測定する予定である。本細胞では更にPPARとp57との関係を検討していきたい。脂溶性ビタミンや脂溶性生理活性物質(長鎖不飽和脂肪酸やその代謝物(プロスタグランディンなど)の処理による影響も同時に検討する。申請時の計画に沿って、p57遺伝子欠損マウスと野生型マウスの臓器(特に胎盤、脳、肝臓)を用いて各種転写因子(RAR、VDR、PPAR、RXRなど)の発現量やp57との相互作用の有無を検討する。初代培養細胞の脂溶性ビタミン添加によってうける形体的、内分泌学的あるいは生化学的変化を解析する。
介護モデルの構築に関する研究-介護保険制度に向けて-

介護モデルは、介護度に応じて、ケアプラン・ケアマネジメントを策定して介護を実践していく過程であります。介護モデルの実践は継続的な介護過程である線であり、ケアマネジメントは介護モデルの実践の線を繋ぐ点であり、ケアプランは介護モデルの点と線の方向性であります。それらが介護モデルの理論による実践で、その介護モデルの点と線が、しだいに共同連帯することでより実線になっていくのです。介護モデルの構築には、介護を必要とする人々への介護学からの研究アプローチが必要であります。介護を必要とする人々へ実践的アプローチをすることで、「尊厳のある生活(ROL:Respect of Life)」を護り介(たす)ける介護モデルを確立することが可能となるのです。介護モデルは、要介護者と介護者の個別性を重んじその多様性を認めて、個人に合った介護支援業務により構成される必要があります。まず介護モデルを構成するための基本的な介護業務を、(1)生命(Life Care)(2)生活(Living Care)(3)ケアマネジメント(Care Management)(4)医療(Medical Care)(5)末期(Terminal Care)(6)在宅(Home Care)(7)家族(Family Care)の7介護要因によって大別しました。それぞれの介護支援業務を、I関わり度(Involvement)II困難度(difficulty)III必要度(Necessity)の評価によって、介護モデルの指標である「介護度(Kaigo Index)」によって介護状態を評価していきます。つまりその7つの介護要因に属する介護業務が、要介護者に対して、1)どのように関わっているのか。2)どのように困難があるのか。3)どのように必要であるのか。という3つの視点にたって介護評価していきます。その関わり度・困難度・必要度から数量化した介護度による介護評価に基づいて、ケアプラン・ケアマネジメントを通じて介護する過程が介護モデルなのです。その介護評価の相互関係から、介護度=困難度X平均(関わり度+必要度)として数量化できました(参考文献:住居広士著『-介護保険総合研究-介護モデルの理論と実践』大学教育出版、1998)。介護を必要としている要介護者が本来求めているのは、従来の保健医療福祉のモデルだけではなく、「尊厳のある生活(ROL)」を護り介ける介護モデルを強く望んでいるのです。障害モデルである要介護度(要介護状態区分等)や医学モデルであるかかりつけ医意見書(要介護度総合分類)に基づいた支援だけではなく、介護モデルによる介護度に基づいて介護状態に応じた支援が求められているのです。要介護者が、いかに高齢であろうと障害があろうと、どのような生活状態であろうと「尊厳のある生活」を護り介ける介護モデルによる支援が求められているのです。要介護者が人間として尊厳のある生活を保ち、介護者との共同連帯により主体的に生活することへの支援が、介護モデルの理念であります。いままでは、医学モデルを中心とした診断し治療して生命の延長(LOL)をはかりました。そして障害モデルを中心とした生活の質(QOL)の向上がいままで介護の理念でありました。しかし21世紀の介護保障時には、要介護状態でもいかに「尊厳のある生活(ROL)」にしていくかという考え方への転換をはかる介護モデルの理論と実践を確立する必要がある。

介護を必要としている要介護者が本来求めているのは、従来の保健医療福祉のモデルだけではなく、「尊厳のある生活(ROL)」を護り介ける介護モデルを強く望んでいるのです。障害モデルである要介護度(要介護状態区分等)や医学モデルであるかかりつけ医意見書(要介護度総合分類)に基づいた支援だけではなく、介護モデルによる介護度に基づいて介護状態に応じた支援が求められているのです。要介護者が、いかに高齢であろうと障害があろうと、どのような生活状態であろうと「尊厳のある生活」を護り介ける介護モデルによる支援が求められているのです。要介護者が人間として尊厳のある生活を保ち、介護者との共同連帯により主体的に生活することへの支援が、介護モデルの理念であります。いままでは、医学モデルを中心とした診断し治療して生命の延長(LOL)をはかりました。そして障害モデルを中心とした生活の質(QOL)の向上がいままで介護の理念でありました。しかし21世紀の介護保障時には、要介護状態でもいかに「尊厳のある生活(ROL)」にしていくかという考え方への転換をはかる介護モデルの理論と実践を確立する必要がある。介護モデルの構築に関する研究-介護保険制度に向けて-介護度を、介護支援状態の指標として数量化し、家族介護評価表を家族介護要因から設定し比較検討した。介護度を介護モデルから、介護度=困難度×(関わり度+必要度)と設定した。対象は、ホームヘルパー170事例、看護職201事例の総対象371事例で介護度で分析した。家族介護評価は、(1)知識技術(2)介護意欲(3)家族関係(4)介護者の体力(5)時間的余裕の5要因で設定した。1年6ケ月間に訪問リハビリの完了できた10事例と継続中の16事例等の家族介護評価した。80項目の介護業務を6種類(生命、生活、ケアマネジメント、医療、末期、在宅)にまとめ、関わり度・困難度・必要度は6段階評価した。主観的QOLに関する面接調査を、保健福祉施設入所者100名の内、質問に応答可能な男性10人、女性54人の計64人を対象とした。これらの対象者に対して、施設入所者の主観的QOLへの影響を、改訂販PGCモラールスケール(17項目)を用いて分析した。ホームヘルパーは、訪問看護と相関係数が0.659と中等度の正の相関を示した。すべての介護支援業務の介護度は低値であった。ホームヘルパーはケアマネジメント、生命が主体で、訪問看護はケアマネジメント、医療が主体であった。ホームヘルパーは、在宅とケアマネジメントにおいて訪問看護に比較し有意に高値であった。ホームヘルパー・訪問看護は共に、生命・生活・医療において、特養寮母に比し有意(p<0.01)に低値であった。在宅ケアのチームケアや職種間の連携評価のためにも、介護モデルによる要介護者への介護支援の指標でもある介護度の創設が必要である。家族介護評価による訪問リハビリの完了の有無との関係は、介護の知識技術は、有意差(p<0.01)を認めた。
大規模国際調査の授業ビデオを用いた授業実践の質的変容の分析と授業改善に関する研究

本研究では、前期中等教育段階の科学教育の領域(理科及び数学)の授業実践について、授業ビデオ分析の手法を用いて、経時的な比較・分析を行い、主体的・協働的で深い学びの観点から、これまでの授業改善の成果と課題を明らかにすることを目的とする。授業分析の国際的な枠組みを基にしながら、我が国で求められる観点を含めた分析手法を開発し、これを用いた教員研修のプログラムを開発・試行することとする。