hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
どこでも歩行者ナビ：事前データ収集を必要としない歩行者ナビゲーションの開発

本研究では,測位インフラやマップ等の事前準備なしでの屋内歩行者ナビゲーションを実現することを目指しており,人間が利用するために提供されている案内表示板等の情報を利用する.施設の出入口やエレベーター・エスカレータ付近に設置されている案内板にはフロアマップを含んでいることが多く,これをスマートフォンのカメラで撮影して解析・理解することで,ナビゲーションに必要な電子マップをその場で獲得する.また,マップ中に記載されている地下街の出入口番号や店名などの情報とシーン画像を照合することによって大まかな位置推定を行い,相対的な位置の変化を推定できる歩行者デッドレコニングと組み合わせる.フロアマップからの通路領域の解析はこれまでの準備研究である程度可能になっていたが,発見的手法を用いていたため様々なバリエーションのフロアマップに十分に対応できていなかった.さらに,地図領域の大まかな指定を手動で行う必要もあった.本年度は深層学習を用いたフロアマップ解析手法に取り組み,精度やロバスト性を向上させるとともに,地図領域の指定を不要とした.また,画像解析によって取得したマップは方位や縮尺が不明であり,従来は開始時に2か所以上の絶対位置との対応を手動で(画面をタップすることで)得ていた.これはユーザーにとって負担となるため,手動による位置の指定を不要にする手法を検討した.初期位置はフロアマップを撮影した場所であるが,マップ内には現在地が表示されていることが多く,これを認識することで自動で対応を取ることができる.深層学習を用いた手法を検討し,多くの場合に正しく認識できることを確認した.また,ここで求めたいものは初期パラメータであって高い精度が必要ないことに着目し,エレベータの大きさをヒントとして縮尺を推定する手法も検討した.当該年度は,深層学習によるセマンティックセグメンテーションベースの案内板解析手法の研究を行った.従来必要だった手動での地図領域指定が不要になり,通路領域の推定精度・ロバスト性も向上した.マップ内の現在地の検出・認識も深層学習によって高い精度で可能であることが分かった.天吊り案内板を用いた大まかな位置推定では,天吊り案内板内に複数存在する情報のまとまりの抽出や,単眼画像からのdepth推定を検討し,ある程度実現できている.以上のことから,おおむね順調に進展していると言える.本年度(平成30年度)に研究開発した天吊り案内板を用いた大まかな位置推定をさらに発展させる.複数の情報が含まれる案内板からの情報のまとまりの抽出は本年度の研究である程度実現できているが,その情報を用いて位置推定を行う手法を検討する.これまでに,単一の出入口情報のみを含んだ天吊り案内板を用いて位置推定を行うことは実現できていたが,複数の情報を含んだ天吊り案内板ではできていなかった.ピンポイントで位置を絞り込むことは理論的に難しい場合があるが,可能性の高い大まかな位置を絞り込む手法を検討する.さらに,単眼画像からの天吊り案内板までの距離推定がある程度できているので,これを利用したマップの縮尺推定を検討する.マップ画像からの情報抽出についても引き続き検討していく.本研究では,測位インフラやマップ等の事前準備なしでの屋内歩行者ナビゲーションを実現することを目指しており,人間が利用するために提供されている案内表示板等の情報を利用する.施設の出入口やエレベーター・エスカレータ付近に設置されている案内板にはフロアマップを含んでいることが多く,これをスマートフォンのカメラで撮影して解析・理解することで,ナビゲーションに必要な電子マップをその場で獲得する.また,マップ中に記載されている地下街の出入口番号や店名などの情報とシーン画像を照合することによって大まかな位置推定を行い,相対的な位置の変化を推定できる歩行者デッドレコニングと組み合わせる.フロアマップからの通路領域の解析はこれまでの準備研究である程度可能になっていたが,発見的手法を用いていたため様々なバリエーションのフロアマップに十分に対応できていなかった.さらに,地図領域の大まかな指定を手動で行う必要もあった.本年度は深層学習を用いたフロアマップ解析手法に取り組み,精度やロバスト性を向上させるとともに,地図領域の指定を不要とした.また,画像解析によって取得したマップは方位や縮尺が不明であり,従来は開始時に2か所以上の絶対位置との対応を手動で(画面をタップすることで)得ていた.これはユーザーにとって負担となるため,手動による位置の指定を不要にする手法を検討した.初期位置はフロアマップを撮影した場所であるが,マップ内には現在地が表示されていることが多く,これを認識することで自動で対応を取ることができる.深層学習を用いた手法を検討し,多くの場合に正しく認識できることを確認した.また,ここで求めたいものは初期パラメータであって高い精度が必要ないことに着目し,エレベータの大きさをヒントとして縮尺を推定する手法も検討した.当該年度は,深層学習によるセマンティックセグメンテーションベースの案内板解析手法の研究を行った.従来必要だった手動での地図領域指定が不要になり,通路領域の推定精度・ロバスト性も向上した.マップ内の現在地の検出・認識も深層学習によって高い精度で可能であることが分かった.天吊り案内板を用いた大まかな位置推定では,天吊り案内板内に複数存在する情報のまとまりの抽出や,単眼画像からのdepth推定を検討し,ある程度実現できている.以上のことから,おおむね順調に進展していると言える.本年度(平成30年度)に研究開発した天吊り案内板を用いた大まかな位置推定をさらに発展させる.複数の情報が含まれる案内板からの情報のまとまりの抽出は本年度の研究である程度実現できているが,その情報を用いて位置推定を行う手法を検討する.

これまでに,単一の出入口情報のみを含んだ天吊り案内板を用いて位置推定を行うことは実現できていたが,複数の情報を含んだ天吊り案内板ではできていなかった.ピンポイントで位置を絞り込むことは理論的に難しい場合があるが,可能性の高い大まかな位置を絞り込む手法を検討する.さらに,単眼画像からの天吊り案内板までの距離推定がある程度できているので,これを利用したマップの縮尺推定を検討する.マップ画像からの情報抽出についても引き続き検討していく.(次年度使用額が生じた理由)年度終わりごろに開発用の高性能PCを調達する予定であったが,昨今のIntel CPUの在庫不足の影響により納期が年度内に間に合わない可能性があったため,次年度の調達に変更した.なお,現有設備で開発を進めており,研究開発への影響はこれまでのところは軽微である.次年度使用額は,前述の理由により生じたもの,および,研究を効率的に推進したことに伴い発生した未使用額である.(使用計画)次年度(平成31年度)請求額と合わせ,本年度に調達予定であった開発用の高性能PCを調達して研究開発を促進するほか,次年度の研究遂行のために使用する予定である.
学校心臓検診で診断されるQT延長児のイオンチャンネル異常のマススクリーニング

学校心臓健診でスクリーニングされるQT延長を呈する児にはQT延長症候群患児以外にも,失神の既往や家族歴のない児も多くみられる.これらのQT延長症候群の児やQT延長児でチャンネルの異常が特定されれば,その治療や管理にも大いに寄与することとなる.Cleavase fragment length polymorphism(CFLP)は1本鎖DNAの構造の差を酵素反応の切断パターンをみることで解析可能であり、変異遺伝子の存在を効率的検出可能で,2,000bpまでのサイズのPCR産物も解析できる点で特に優れている。そこで,QT延長症候群患児及びQT延長児のK, Naのチャネル遺伝子の異常についてCFLPを用いた簡便なスクリーニング法の開発を行った。QT延長症候群の1家系で検討を行ったが,HERG遺伝子は2組,KVLQT1は4組のプラィマーペアを使用し,それぞれをカバーする部分の増幅が可能だった。SCN5Aについては2対のプライマーでDIIIからDIVについてカバーできた.MinKについては1対のプライマーで検討可能だった.CFLPパターンはKVLQT1遺伝子のS4からS5の部位においてのみ差を認め,ダイレクトシークエンスで.ヘテロ接合の異常が確認された.CFLPによるヘテロの遺伝子異常を1家系でスクリーニングできたことで本方法の有用性が示された.そこで,他のQT延長症候群の2家系とQT延長児3例においてもスクリーニングを行ったが,現在のところ遺伝子異常は確認されていない。今後,症例を更に増やして検討を行ってゆく。更に,CFLPとダイレクトシークエンスを組み合わせてイオンチャネル全ての部分の解析行えるようにする予定である.学校心臓健診でスクリーニングされるQT延長を呈する児にはQT延長症候群患児以外にも,失神の既往や家族歴のない児も多くみられる.これらのQT延長症候群の児やQT延長児でチャンネルの異常が特定されれば,その治療や管理にも大いに寄与することとなる.Cleavase fragment length polymorphism(CFLP)は1本鎖DNAの構造の差を酵素反応の切断パターンをみることで解析可能であり、変異遺伝子の存在を効率的検出可能で,2,000bpまでのサイズのPCR産物も解析できる点で特に優れている。更に,CFLPとダイレクトシークエンスを組み合わせてイオンチャネル全ての部分の解析行えるようにする予定である.QT延長児のイオンチャンネル遺伝子異常は先天性QT延長症候群と同様にヘテロの異常と考えられる.Cleavase fragment length polymorphism(CFLP)により実際にヘテロの遺伝子異常がスクリーニング可能かどうかQT延長症候群の家系で異常のスクリーニングを行った.イオンチャンネルのSCN5A,HERG,KVLQT1について検討を行った.SCN5Aについては現在まで異常の報告されたDIIIからDIVについてカバーするように2対のプライマーデザインを行った.HERGについてはほぼ全遺伝子をカバーする2対のプライマーデザインを行った.KVLQT1についてはほぼ全遺伝子をカバーする3対のプライマーデザインを行った.いずれにおいても良好な遺伝子増幅が行えた.増幅された遺伝子のPCR産物を精製し,熱変性させ1本鎖DNAとし,自己Hybridizeさせた後Cleavaseを用いて自己Hybridize構造部分を特異的に切断させた.処理後のPCR産物をポリアクリルアミドゲルで電気泳動後イモビロンSメンブレンへトランスファーし,ケミルミネッセンス反応によりバンドを可視化させ,泳動パターンをQT延長症候群の母子と正常人のものと比較した.SCN5Aの2種類のPCR産物,HERGの2種類のPCR産物には差を認めなかった.KVLQT1はS2-S4,S6には差を認めなかったが,S5-porcのPCR産物に差を認めており,この部位の遺伝子異常が示唆された.3.遺伝子異常の解析QT延長児のイオンチャンネル遺伝子異常は先天性QT延長症候群と同様にヘテロの異常と考えられる。Cleavase fragmentlength polymorphism(CFLP)により実際にヘテロの遺伝子異常がスクリーニング可能かどうかQT延長症候群の家系で異常のスクリーニングを行った。1.Polymerase Chain reaction(PCR)イオンチャンネルのSCN5A,HERG,KVLQT1についてデザインした設定の調整及び検討を行い,全遺伝子の解析の条件が均一化するようにした。2・Cleavase fragment length Polymorphism(CFLP)増幅された遺伝子のPCR産物を精製し,熱変性させ1本鎖DNAとし,自己Hybridizeさせた後Cleavaseを用いて自己Hybridize構造部分を特異的に切断させた。処理後のPCR産物をポリアクリルアミドゲルで電気泳動後イモビロンSメンブレンヘトランスファーし,ケミルミネッセンス反応によりバンドを可視化させ,泳動パターンを検討した。

イモビロンSが製造中止でメンブレン変更を余儀なくされ,また,へテロの遺伝子異常であるQT延長児の異常でも検出可能とするための条件設定に難渋したが,QT延長症候群の母子における検討で,KVLQT1の遺伝子のS4部位の変異をスクリーニングすることが可能であった。この異常はシークエンスで1塩基の変異が示唆され(CCGTGG→CCATGG),CCATGGの配列を選択的に切断するN_<co>Iで母子のPCR産物のみが切断されることで確認され,1塩基のヘテロの異常の検出も可能であることが証明された。3.今後も症例数を拡大して検討を続けて行く。1.Cleavase fragmentlength polymorphism(CFLP)による遺伝子異常を1家系でスクリーニングできたが,他のQT延長児において検討を行った.現在のところは,チャネル異常は見いだされてはいない.2.MinK遺伝子の解析も条件設定を行った.3.逆転写PCRにより各チャネル遺伝子の増幅が可能となると,KVLQT1,HERG,SCN5A,minK全てが1回のPCR産物の解析で可能となり,更なる解析の簡素化が可能である.しかし,末梢血リンパ球からのこれらの対象RNAは微量で,解析が実際に可能であるかどうか検討を試みた.ボランティア健常人から得た末梢血リンパ球からtotal RNAを抽出した.oligo dTプライマー,ランダムプライマーを用いて作製したcDNAを用いてそれぞれのチャネル遺伝子のPCRでの増幅を試みたが,チャネル遺伝子のRNAが微量すぎたためか,その増幅はできなかった.そこで増幅率を改善するために,KVLQT1,HERG,SCN5A,minKそれぞれのチャネル遺伝子の逆転写反応用のプライマーをデザインし,それを用いて各チャネル遺伝子のcDNAを作製した.このcDNAからそれぞれのチャネル遺伝子のPCRでの増幅を試みたが,やはりその増幅はできなかった.4.今後,QT延長児における解析を更に進めてゆきたい.また,逆転写反応の応用もプライマーデザイン,逆転写反応の条件に改良を加えて今後も検討して行きたい.1.Cleavasefragmentlength polymorphism (CFLP)による遺伝子異常を1家系でスクリーニングできた.患児の弟は心電図異常はボーダーラインであったが,KVLQT1遺伝子のスクリーニングを行い,母・兄と同じ遺伝子異常を有することが判明した.また,他のQT延長の2家系およびQT延長児においても検討を行ったが、KVLQT1, HERGにおいては,現在のところチャネル異常は見いだされなかった.2.MinK遺伝子にても検討をおこなったが、異常は見いだされなかった.
EBウイルス蛋白質EBNA3CによるINK4a/ARF発現抑制機構

EBNA3CがINK4a/ARF発現を抑制するメカニズムを解析し、以下の点を明らかにした。(1)EBNA3CはINK4a/ARFプロモーター領域のDNAメチル化に影響を与えない。(2)EBNA3Cはp16(INK4a)領域のヒストン修飾をアクティブな状態からサイレントな状態に変化させる。(3)EBNA3CはDNA結合蛋白質RBP-Jkappaと結合して機能する。以上の結果から、EBNA3CはINK4a/ARF領域のヒストン修飾をエピジェネティックに制御していることが示唆された。EBウイルスはヒト正常Bリンパ球を形質転換して無制限に増殖可能なリンパ芽球様細胞(LCL)に変換する活性をもち、移植後リンパ増殖症の原因となる。我々はこれまで、コンディショナルにEBNA3Cの機能を制御可能なLCLを樹立し、形質転換に必須のウイルス蛋白質EBNA3Cが腫瘍抑制遺伝子INK4a/ARFの発現を抑制することを明らかにしてきた。本年度は、EBNA3CがINK4a/ARF発現を抑制するメカニズムを明らかにするために、INK4a/ARFのプロモーター領域のDNAメチル化の状態について解析をおこなった。EBNA3CオンあるいはEBNA3Cオフの状態で培養したLCLからそれぞれゲノムDNAを抽出し、メチル化特異的PCR法(MSP法)、バイサルファイトシークエンシング法を用いてp16(INK4a)のプロモーター領域のDNAメチル化を解析した。MSP法を用いた解析では、LCLのp16(INK4a)プロモーター領域はEBNA3Cオン、オフいずれにおいても低メチル化の状態であった。さらに、バイサルファイトシークエンシング法による解析を行った結果、LCLにおけるp16(INKa)プロモーターのCpG部位のメチル化の程度はEBNA3Cオン、オフいずれにおいても約10%であり、メチル化のパターンにも明らかな違いは認められなかった。以上の結果から、EBNA3CによるINK4a/ARF発現抑制にDNAメチル化は主要な役割を演じていないものと考えられた。また、一連のEBNA3C欠失変異体、点変異体を作成してそれらの機能を解析することにより、LCL増殖維持に必須のEBNA3Cのアミノ酸領域の詳細なマッピングを行った。今回のEBNA3C必須領域の同定は、EBNA3Cの作用メカニズムを明らかにしていく上で重要な情報となる。我々はこれまで、形質転換に必須のウイルス蛋白質EBNA3Cの機能をコンディショナルに制御できるLCLを樹立し、EBNA3Cが腫瘍抑制遺伝子INK4a/ARFの発現を抑制することによってLCLの増殖維持に寄与していることを明らかにしてきた。本年度は、EBNA3CがINK4a/ARF発現を抑制するメカニズムを明らかにするために、p16(INK4a)のプロモーター領域のヒストン修飾について解析をおこなった。EBNA3CオンあるいはEBNA3Cオフの状態で培養したLCLからそれぞれクロマチンを調整し、クロマチンIP法を用いてp16(INK4a)のプロモーター領域のヒストンH3のアセチル化およびメチル化を解析した。その結果、EBNA3Cをオフにすると、activeクロマチンのマークであるヒストンH3のアセチル化およびH3K4のメチル化が増加した。一方、silentクロマチンのマークであるH3K27のメチル化は減少した。すなわち、EBNA3Cオフによりp16(INK4a)のプロモーター領域のクロマチンがactiveな状態に変化することが明らかになった。したがって、EBNA3Cは何らかの方法でp16(INK4a)のプロモーター領域のクロマチンをsilentな状態に保っているものと考えられる。ウイルス蛋白質によるヒストン修飾の制御についてはこれまであまり報告がなく、ウイルスによる宿主細胞の遺伝子発現のコントロールを考える上で重要な意義をもつと考えられる。EBウイルスはヒト正常Bリンパ球を不死化して無制限に増殖可能なリンパ芽球様細胞(LCL)に変換する活性をもつ。不死化Bリンパ球は免疫機能が低下した宿主内で増殖して移植後リンパ増殖症の原因となる。我々はこれまで、ウイルスの不死化タンパク質EBNA3Cはがん抑制遺伝子INK4a/ARFの発現を抑制することによってLCLの増殖維持に寄与していることを明らかにしてきた。また、EBNA3Cは宿主細胞のDNA結合タンパク質BP-Jκと結合すること、さらに、IBP-Jκとの結合がEBNA3Cの機能発現に必須であることを明らかにしてきた。これらのことから、EBNA3Cは転写制御因子として機能しているものと考えられている。そこで本年度は、EBNA3Cにより発現誘導される宿主遺伝子、発現抑制される宿主遺伝子を同定した。さらに本年度は、EBNA3Cの兄弟タンパク質であるEBNA3Aの機能についても検討を行った。

EBNA3A遺伝子とEBNA3C遺伝子は同じ祖先遺伝子から遺伝子重複により生じたと考えられており、EBNA3Cと同様にBNA3Aも不死化に必須のウイルスタンパク質である。EBNA3Aの機能をコンディショナルに制御できるLCLを用いてEBNA3A機能を解析した。その結果、EBNA3AもEBNA3Cと同様に、がん抑制遺伝子INK4a/ARFの発現を抑制することによってLCLの増殖維持に寄与していることが明らかとなった。EBNA3AとEBNA3Cはお互いの機能を代替できないこともすでに報告しており、EBNA3AとEBNA3Cは協同で働くことによりp16(INK4a)-pRbがん抑制経路およびp14(ARF)-p53がん抑制経路を抑制していることが示唆された。本研究により、これまで不明であったEBウイルスEBNA3タンパク質群のBリンパ球不死化における働きが明らかになった。
過剰運動時に漏出するミオグロビンにより生成する脂質由来ラジカルの検出とその同定

牛腎ミクロソームにスピントラップ剤4-POBN、NADPH、ADPおよびFeCl_3を添加し、37°Cで60分間反応後、高速液体クロマトグラフィー/電子常磁性共鳴/質量測定をしたところ、ペンチルラジカルおよびヒドロキシペンチルラジカルが検出・同定された。このラジカル生成反応において、ミオグロビンが過酸化脂質からのフリーラジカル生成を促進することにより腎毒性を発揮する可能性が示唆された。また、このラジカル生成反応において何らかのフリーな鉄の関与も示唆された。ラット脳ホモジネートに二価鉄およびアスコルビン酸を加えた反応溶液中に生成するラジカルの高速液体クロマトグラフィー一電子スピン共鳴(HPLC-EPR)法および高速液体クロマトグラフィー-電子スピン共鳴-質量分析(HPLC-EPR-MS)法による検出と構造決定をおこなった。反応溶液のEPRスペクトルを測定すると強いシグナルが得られたが、反応溶液からラット脳ホモジネートおよび二価鉄をそれぞれ除去すると、EPRスペクトルは殆ど得られなかった。また、反応溶液からアスコルビン酸あるいはEDTAを除去した場合、EPRスペクトルのピーク高はそれぞれ35%と54%に減少した。反応溶液のHPLC-EPR測定をおこなったところ、4つの強いピークが得られた。反応溶液からラット脳ホモジネート、二価鉄およびアスコルビン酸をそれぞれ除去すると、HPLC-EPRピークは殆ど得られなかった。また、反応溶液からEDTAを除去するとHPLC-EPRピーク高が減少した。4番目の最も強いピーク(保持時間33.7分)について、HPLC-EPR-MS測定を行ったところ、2つのイオンが得られた(m/z224およびm/z137)。このm/z224のイオンはethylラジカルとスピントラップ剤(4-POBN)との付加体に対応し、このイオンから(CH_3)_3C(O)Nが開裂した残りがm/z137のイオンに対応する。これらのことより、ラット脳ホモジネートに二価鉄およびアスコルビン酸を加えた反応溶液中においてethylラジカルが生成されたことがわかった。Mbの腎毒性のメカニズムを明らかにするために牛腎ミクロソーム/NADPH反応溶液中のフリーラジカル生成に対するミオグロビン添加の影響について検討した。牛腎ミクロソームにスピントラップ剤4-POBN、NADPH、Mbを添加し、37°Cで60分間反応後、電子常磁性共鳴スペクトル(EPR)測定した。完全反応溶液のEPRスペクトルを測定すると、トリプレット・ダブレットからなる典型的な4-POBNラジカルアダクトの顕著なEPRシグナルがみられ、反応溶液中にフリーラジカルが生成していることが明らかになった。この反応溶液より、ミクロソームあるいはNADPHを除くと、EPRシグナルがほとんど見られなかった。一方、Mbを反応溶液から除くと、EPRシグナル強度が減少した。完全反応溶液にEDTAを添加するとEPRシグナルが消失し、Mb溶液にEDTAを添加しても可視吸収スペクトルに変化がないことから、EDTAはMbのヘム鉄にキレートしないことがわかった。以上のことから、この反応にフリーな鉄イオンの関与が示唆された。過酸化脂質からのフリーラジカルの生成に対するMbの影響を検討するために、リノール酸と大豆リポキシゲナーゼとの反応により13-ヒドロペルオキシドを得た。この13-ヒドロペルオキシドとMbとの混合溶液にスピントラップ剤4-POBNを添加しEPRスペクトルを測定した。Mbを添加することにより、顕著なEPRシグナルが観測され、Mbは13-ヒドロペルオキシドからのフリーラジカルの生成を触媒することがわかった。以上のことから牛腎ミクロソーム/NADPH反応溶液中においてMbは過酸化脂質からのフリーラジカルの生成を促進することにより腎毒性を発揮する可能性が示唆された。また、この反応にはフリーな鉄イオンの関与も示唆された。なお、本研究の内容は第80回日本生化学会大会にて発表した。牛腎ミクロソーム/NADPH反応溶液中に生成するラジカル種の同定、金属イオンの影響および金属キレート剤の影響について検討した。牛腎ミクロソーム/NADPH反応溶液にADP (10mM)およびFeCl3 (0.17mM)を添加した反応溶液(牛腎ミクロソーム/NADPH/ADP/FeCl3反応溶液)をHPLC-EPR測定したところ、P1 (保持時間29.4分)、P2(保持時間32.4分)およびP3(保持時間46.6分)の3つのピークが検出された。これらの3つのピークを質量測定すると、P3については質量数266m/zが、P2およびP1については質量数282m/zが得られ、P3はペンチルラジカル、P2とP1はそれぞれヒドロキシペンチルラジカルであると同定された。牛腎ミクロソーム/NADPH反応

溶液に種々濃度の金属イオン(0、10、50、100μM)を添加し、EPR測定をおこなった。添加した金属イオンは、モール塩、塩化銅、塩化亜鉛、塩化鉄(III)、塩化カルシウムおよび塩化マグネシウムであった。モール塩ではEPRピーク強度がわずかに増加し、塩化銅および塩化亜鉛では減少した。塩化鉄(III)、塩化カルシウムおよび塩化マグネシウムでは変化が見られなかった。牛腎ミクロソーム/NADPH反応溶液に種々の金属キレート剤(100μM)を添加したときのEPRピーク高の変化を調べた。添加した金属キレート剤は、EDTA(エチレンジアミン四酢酸)、NTA(ニトリロ三酢酸)、DTPA(ジエチレントリアミン五酢酸)およびDFO(デフェロキサミン)であった。EDTA、DTPAおよびDFOにおいてはラジカル反応が消失し、NTAにおいてはEPRピーク高が35.8%増加した。
がん浸潤リンパ球の抗原受容体次世代シーケンス～がん免疫システムの包括的理解～

本研究の目的は、次世代シーケンスによってがん浸潤リンパ球の抗原受容体レパートリを網羅的に解読し、ゲノミクス的観点から腫瘍免疫の全体像を解明することであった。さらに、がん組織特異的に存在する抗原受容体配列を基盤として、新規抗がん抗体の開発を試みるなど、新しいがん治療戦略の基盤を作ることをも目的とした。以下の成果が得られた。(1)臨床がん症例の抗原受容体次世代シーケンス・プロトコールが樹立された。(2)がん組織中にドミナントに存在するT細胞受容体や免疫グロブリンを多数同定できた。(3)人工発現系を用いて再構築したがん特異的免疫グロブリン分子について機能的スクリーニングを進めることができた。平成26年度は、研究計画に従いながら以下3点について研究を進めた。1.ヒト抗原受容体遺伝子(TCRα鎖β鎖およびBCR重鎖軽鎖)の増幅プライマーに関して検討を進め、凍結病理標本などから抽出したtotal RNAを鋳型としたシーケンス解析を行うことができるように、各種実験段階における条件検討を進めた。その結果、凍結病理標本を用いた抗原受容体の次世代シーケンス解析に関する実験プロトコールが完成した。2.胃がんを中心として肺がんや肝がんなどを含むさまざまなヒトがん症例などを対象として、抗原受容体シーケンスを行うためのサンプル採取を遂行した。その結果、総数約300シーケンス・アッセイ以上の症例数を集めることができた。3.新鮮組織標本からTh, Treg, NKTあるいはPlasmacyteなどといった特異的免疫関連細胞のみを単離する実験系を整備するために、1細胞単離装置を用いながら蛍光標識された特定の細胞を単離することができるような実験プロトコールを検討し決定した。4.蒐集されたサンプルの一部を用いて、抗原受容体遺伝子の次世代シーケンス解読を順次進めた。また同時に、抗原受容体遺伝子配列におけるCDR1ないしCDR3領域の特定アルゴリズムあるいはV-(D)-J再構成部位の特定アルゴリズムに関して、バイオインフォマティクス解析パイプラインの検討を進めた。平成26年度の研究実績によって、腫瘍病理組織中における浸潤リンパ球の抗原受容体次世代シーケンス解析のプロトコールが完成された。また同時にサンプル蒐集も順調に進められている。平成27年度は、平成26年度に収集されたさまざまな臨床がん試料に対して、平成26年度に設計された抗原受容体遺伝子(TCR遺伝子/免疫グロブリン重鎖/軽鎖遺伝子)を標的とするマルチプレックス・プライマー・セットを用いた抗原受容体配列次世代シーケンスを行った。目標としていた症例数の次世代シーケンス解析を完了させた。シーケンス解読と並行しながら、以下3点を進めた。(I)収集した臨床がん試料におけるがん浸潤リンパ球のT細胞抗原受容体・免疫グロブリン遺伝子のシーケンス配列を網羅的にデータ化し、腫瘍免疫ゲノム解析に関する基盤的データベースの構築を完遂させた。(II)臨床がん試料に関する臨床病理学的所見と、次世代シーケンスによって明らかになった網羅的抗原受容体シーケンス配列の相関等について解析し、「抗原受容体レパートリーから見た腫瘍免疫」を検討することが出来るようなデータ解析手法を樹立し、実際に解析を開始した。(III)各々の症例におけるT細胞あるいはB細胞といった細胞種ごとの抗原受容体配列プロファイルを相互的に比較し、異なる免疫細胞間における抗原受容体レパートリー構成を比較することが出来るようなデータ解析手法を樹立し、実際に解析を開始した。これらの成果によって、がん浸潤リンパ球のクローナリティの程度の解析、抗原受容体遺伝子配列のmaturationの過程に関する解析、がん部特異的抗原受容体構造の探索等が可能になった。研究計画に沿った研究が遂行されているため。本研究の目的は、次世代シーケンス技術によってがん浸潤リンパ球の複雑多彩な抗原受容体遺伝子レパートリを網羅的に解読し、ゲノミクス観点からがん免疫システムの全体像を解明することである。さらに、そのような抗原受容体シーケンスデータの解析から新規抗がん抗体の開発を試みるなど、新しいがん治療戦略の開発基盤を作ることをも目的とする。平成28年度においては、多様な臨床がん試料におけるがん浸潤リンパ球の抗原受容体次世代シーケンス解析を進め、さらにこれまでに得られた成果を統合的に解析することで以下の研究を進めた。(1)抗原受容体次世代シーケンスの解析から、腫瘍組織中に特異的かつドミナントに存在する免疫グロブリンを探索し、そのような免疫グロブリン分子を症例ごとに複数同定することができた。(2)抗原受容体シーケンス情報をもとに、それらの免疫グロブリン分子を人工発現系によって再構築・再発現することが可能なシステムを樹立した。(3) (1)によって同定され(2)によって再構築・精製されたがん組織特異的免疫グロブリン分子について、以下の研究項目を進めた。(3-A)免疫沈降及び質量分析その他の方法を用いて抗原同定を進めた。その結果、がん組織特異的に存在する複数の免疫グロブリン分子について、その抗原分子を同定することができた。それらの抗原物質は、新しいがん抗原として重要な意義を持つことが期待される。(3-B)がん細胞増殖抑制活性などの抗がん活性を有する免疫グロブリン分子のスクリーニングを進めた。その結果、明瞭な細胞増殖抑制効果を呈する複数の免疫ブログリン分子を同定することができた。

本研究の目的は、次世代シーケンスによってがん浸潤リンパ球の抗原受容体レパートリを網羅的に解読し、ゲノミクス的観点から腫瘍免疫の全体像を解明することであった。さらに、がん組織特異的に存在する抗原受容体配列を基盤として、新規抗がん抗体の開発を試みるなど、新しいがん治療戦略の基盤を作ることをも目的とした。以下の成果が得られた。(1)臨床がん症例の抗原受容体次世代シーケンス・プロトコールが樹立された。(2)がん組織中にドミナントに存在するT細胞受容体や免疫グロブリンを多数同定できた。(3)人工発現系を用いて再構築したがん特異的免疫グロブリン分子について機能的スクリーニングを進めることができた。概ね研究計画に記載した通りに研究が遂行されており、順調な進展と考えられる。平成28年では、引き続き臨床がん試料における臨床病理学的因子と抗原受容体シーケンスとの相関等を解析し、がん組織における腫瘍免疫システムの全体像を、抗原受容体シーケンス構成という観点から定義付ける。総合的に得られた成果を基盤として、以下2点の研究を進める。(I)免疫グロブリンの全体構造をCHO細胞等の人工的発現系によって再構築・発現することが可能なシステムを作ること。(II) (I)によって免疫グロブリンの全体構造が再現可能となったのちに、以下2項目を進める。(II-A)抗原受容体がいかなる「がん抗原」を認識しているか探索する。mass spectrometry等によってタンパク/糖鎖/代謝物などを網羅的に検索し、新規がん抗原を同定することを予定している。(II-B)がん環境に存在するがん特異的免疫グロブリンは、それ自体が治療コンテンツとなりうる情報であり、それらの人工的再構成・強制発現系によって、がん免疫療法に応用可能な抗がん抗体を同定することを予定している。本研究によりがん浸潤リンパ球の抗原受容体構成が網羅的に解明されれば、これまで未開であった「がん免疫システムの全体像」が明らかになると考えられる。さらに、がん抗原および抗がん抗体が新たに同定されることで、新規抗がん療法の開発に繋がる基盤的成果になることが期待される。28年度が最終年度であるため、記入しない。ゲノム病理学当初の研究計画に従いながら、平成27年度以降は以下の研究を遂行する予定である。1.多くの臨床がんサンプルにおけるがん浸潤リンパ球の抗原受容体・免疫グロブリン遺伝子配列レパートリを網羅的にデータ化し、免疫ゲノム解析に関する基盤的データベースを作成する。2.各々の症例における病理所見や臨床経過と、網羅的抗原受容体配列の相関などについて検討し、「抗原受容体構成から見た腫瘍免疫システム」を解析することができるようなデータ解析手法を確立する。3.シーケンス解読された抗原受容体・免疫グロブリンの塩基配列情報をもとにして、それらの全体構造を人工的発現系によって再構築・発現させることが可能なシステムを作製する。4.上記の抗原受容体・免疫グロブリンの再構築・発現系を用いながら、以下の項目について検討を進める。4-
ネットワークシステムのロバスト安定化を誘発する相互作用の解析と設計

本研究では,サブシステムの相互作用によって構成されるネットワークシステムに発生する現象の検討を行った.具体的には,複雑系科学分野とシステム制御工学を知見を活かした学際的なプローチにより,様々な状況のネットワークシステムに生じる振動停止現象がロバストに誘発される相互作用の設計を行った.特に,サブシステム間の相互作用に伝送遅延が伴う場合の振動停止現象については,多くの知見を得ることができた.複数の要素が相互作用を受ける複雑なネットワークシステムのダイナミクスの解析は,様々な応用研究の基盤的な知見を担う重要な基礎研究である.従来の研究では,非常に単純な相互作用のみが想定されていた.協調型移動ロボットなどの実システムでは,各要素の相互作用の構造が未知であったり,時々刻々と変化する.また,センサーネットワークなどでは,各要素はWWW,無線通信,物理的な相互影響により,伝達情報の遅延やパケット化は無視できない.これら2つの要因がネットワークのダイナミクスに与える影響は,未解決のままである.本年度は,以下のような成果を得ることができた:(1)伝送遅延が時間共に変化する2つの結合発振回路に生じる振動停止現象の実験的検証,(2)遅延を伴うパケット化された情報によって相互作用を受ける結合発振器に生じる振動停止現象の理論的解析,(3)非対称な伝送遅延が時間共に変化する結合系に生じる振動停止現象の理論的解析と回路実験による検証,(4)伝送遅延が時間と共に変化する大規模ネットワークに生じる安定化現象の理論的解析,(5)動的結合ネットワークに生じる振動停止現象を誘発する結合パラメータの設計,(6)トポロジーが時間と共に変化するネットワークに生じる振動停止現象の理論的解析,(7)複数遅延結合によって相互作用を受ける遅延発振器に誘発される振動停止現象の設計.本研究の大きな目的は,相互に影響を与える複数の要素から構成されるネットワークシステムのダイナミクスを解析し,複雑系科学分野だけでなくシステム制御理論の視点から考察することである.特に,工学的な応用研究への発展を意識しつつ,新たな展開も考慮している.最終年度は,以下のような成果を得ることができた:(1)複数の遅延発振器を遅延結合したネットワークシステムに振動停止現象を誘発させる結合方式の設計;(2)複数の負荷や電源から構成されるDCマイクログリッドシステムの基本回路の解析と制御方法を提案;(3)時変遅延を伴う結合が空間的に非一様なネットワークシステムに生じる振動停止現象の解析; (4)結合遅延に依存しないカオス同期ネットワークシステムの設計;(5)結合ネットワークの同期現象を活用した小型ロボットの分散制御;(6)高次元発振器から構成されるネットワークシステムに振動停止現象を誘発させる結合方式の設計.本研究では,研究期間全体を通じて,当初の目的であった振動停止現象の調査・研究に,ロバスト制御理論の各種ツールを活用し,多くの成果を得ることができた.また,この成果を核としたサブ研究テーマが次々と生まれ,工学的な応用を視野に入れて大きく展開されつつある.本研究では,サブシステムの相互作用によって構成されるネットワークシステムに発生する現象の検討を行った.具体的には,複雑系科学分野とシステム制御工学を知見を活かした学際的なプローチにより,様々な状況のネットワークシステムに生じる振動停止現象がロバストに誘発される相互作用の設計を行った.特に,サブシステム間の相互作用に伝送遅延が伴う場合の振動停止現象については,多くの知見を得ることができた.自然界のシステム,人工的なシステムなどでは,システム内部で多くの信号が伝達・処理され,システム固有の機能が維持されている.多数の要素が相互に影響を与える複雑なネットワークシステムのダイナミクスの解析は,様々な応用研究の基盤的知見を担う重要な基礎研究である.物理学における先行研究では,問題を簡単化するため,非常に単純な相互作用のみが想定されていた.自律分散型移動ロボットなどの実システムでは,各要素の相互作用の構造が未知であったり,時々刻々と変化したりする場合も多い.一方,センサーネットワークなどでは,各要素はWWW,無線通信,物理的な拡散結合などで相互に影響を与えあうことも多いため,伝達情報の遅延やパケット化は無視できない.これら2つの要因(相互作用を担う伝達情報の遅延やパケット化,相互作用の構造(トポロジ)の変化)がネットワークシステム全体のダイナミクスに与える影響は,その解法が困難なことを理由に未解決課題として残されている.本年度は,以下のような成果を得ることができた:(1)非常に弱い拡散結合に伴うカオス発振器の安定周期軌道への収束メカニズムと実験による検証,(2)伝送遅延が時間共に変化する結合系に生じる安定化現象の実験による検証,(3)オンオフ遅延フィードバック制御系の実験による検証,(4)遅延発振器の安定化を誘発する遅延結合の系統的設計手順の導出.これらの研究は,本研究の目的に向けて,予備研究の拡張ならびに実験的検証を実施したものである.制御工学本年度は,相互作用に要する遅延時間が時間と共に変化する2つの発振器に生じる振動停止現象の実験的検証結果をまとめ上げ,国際学術論文誌で発表することができた.また,遅延を伴うパケット化された情報によって誘発される振動停止現象の存在を指摘した結果も,同様に国際学術論文誌に採択された.このように,質の高い成果が順調に得られており,本研究の進捗状況は極めて良好である.さらに,遅延発振器に関する最新の成果も,米国物理学会の採択が決まっている.また,本年度は、国内学会・国際会議で多くの成果を精力的に発表することができた.次年度は,これらをまとめ上げた成果が,国際学術論文誌に数多く投稿できるものと思われる。

本年度実施した研究では,予備研究での問題点を,実験レベルの視点で洗い出すことができ,今後のより具体的な研究の方向性を定める上で参考となる貴重な成果を得ることができた.例えば,予備研究で得られた理論的な知見では,相互作用が断続的にオンオフするネットワークシステムの安定性は,連続的な相互作用の場合より,条件によっては優れていることが見込まれたが,成果(3)により,実験レベルではその安定性の確保が難しく,優れた安定性の確保が目的の場合,断続的な相互作用は使用しない方がよいとの結論を得た.このように,本年度に得られた研究成果(1)-(4)は,今後の研究の礎を担い,次年度以降の研究は順調に進むと思われる.さらに,未発表ではあるが,ロバスト制御理論を予備研究の成果に導入する試みは順調であり,当初の予想よりも広いクラスのネットワークシステムで有用であることが明らかになりつつある.次年度以降は以下の項目を中心に実施する.(1)非常に弱い拡散結合に伴うカオス発振器の安定周期軌道への収束現象の実験による検証結果をまとめ上げ,学術論文として発表する.(2)伝送遅延が時間と共に変化するネットワークに生じる安定化現象とネットワークトポロジーの関係の調査結果をまとめ上げ,学術論文として発表する.(3)ネットワークトポロジーが時間と共に変化するネットワークに生じる振動停止現象の調査結果をまとめ上げ,学術論文として発表する.(4)本研究で得られた知見をカオス同期現象の安定性解析に応用する.次年度以降は以下のサブテーマを推進させる.(1)非常に弱い拡散結合に伴うカオス発振器の安定周期軌道への収束現象とネットワークトポロジーの関係を明らかにし,実験による検証を行う.(2)伝送遅延が時間と共に変化するネットワークに生じる安定化現象とネットワークトポロジーの関係を解析的に明らかにする.この知見に基づき,安定化現象を確実に発生させる結合パラメータの設計手順を,ロバスト制御理論の活用によって導出する.さらに,これらの解析結果を実験的に検証する.(3)遅延発振器の安定化を誘発する遅延結合の設計手法が,ネットワークの安定化に拡張できることを示す.さらに,これらの結果を実験的に検証する.(4)動的な相互作用によるネットワークの安定化現象を確実に誘発するため,相互作用の設計手法を解析的に導出する.(5)情報がパケット化された相互作用によってネットワークが安定化されることを示し,安定化現象の発生が保証された相互作用の設計手法をロバスト制御理論の活用により導出する.さらに,これらの解析的な結果を実験的に検証する.一昨年度は学内で責任のある役職に就いており,研究実施にあてる時間が当初の計画よりも少なく,研究費は当初の予定より少ないものとなった.しかし,今年度は,責任のある役職に就いていなかったため,予定通りの研究を遂行し,ほぼ当初の計画通りの研究費を使用した.次年度も,今年度とほぼ同じ状況であるため,より積極的に研究を発展させ,研究成果の発表も活発に行いたいと考えている.特に,研究成果を着実に学術論文誌へ発表していく.
遺伝マーカーおよび蛍光標識法を用いた沿岸性腹足類幼生の生態解明

沿岸性無脊椎動物の多くは,浮遊幼生期を持ち,広い分布域をもつ.アマオブネ科巻貝類は海産・陸水種を含み,河川種の多くは両側回遊をおこない,幼生期に海流によって分散する.マイクロサテライト解析の結果,小笠原群島・南西諸島集団を含めた回遊種の日本産集団内に明瞭な遺伝的構造は確認されず,同科海産種と同様に分散能力が高いことが示唆された.また,アマオブネ類幼生への蛍光標識付着をおこない,野外における幼生実験への基盤を確立した.沿岸性海洋生物の多くは浮遊幼生期を持ち,その個体群動態・生物地理を理解するためには,幼生の分散および生態の把握が必須である.その一方で,微少な幼生を追跡することは難しく,一つの個体がその初期生活史中にどのような挙動をとるかは多くの種でほとんどわかっていない.そこで,本研究では,短期から長期のプランクトン幼生期をもつ沿岸性の有殻腹足類を用い,各種の遺伝子マーカーおよび幼生蛍光標識法を開発,各地域・ハビタット間のコネクティビティの検証をおこなう.本年度は,まず小笠原父島の河川・岩礁域において,遺伝的集団構造の解析に使用する腹足類サンプル(イシマキ等)を採集した.その後,研究室に持ち帰ったアマオブネ類からDNAを抽出し,大気海洋研究所所蔵の次世代シーケンサー(Roche, 454 GS junior+ system)により,マイクロサテライト(SSR)の探索をおこない,複数の種についてSSRマーカーを開発した.開発したマーカーについては,マルチプレックスPCR系の構築を行った.その後,河川性・海産種を対象に,日本各地の約10地点から約20個体ずつを選び出し,ミトコンドリアCOI・核SSRマーカーを用い,遺伝的集団構造解析をおこなった.その結果,両側回遊性の種については,小笠原群島集団を含めた日本産の集団に遺伝的構造は見られず,海産の近縁種と同様,幼生分散能力が高いことが示唆された.また,幼生殻蛍光色素付着実験のために野外から持ち帰ったアマオブネ科腹足類の卵のうを飼育したところ,幼生を孵化・成長させることに成功した.今回飼育したアマオブネ類の幼生は数ヶ月程度の浮遊期間を持つことが判明し,大量の幼生を飼育する基盤が整った.初年度は,遺伝マーカーの開発および蛍光物質を用いた幼生標識法を確立するために大量の幼生を飼育する基盤を整えた.マイクロサテライトマーカーについては,予定していたほぼ全ての種で開発を終え,またマルチプレックスPCR系を構築し,実際に集団遺伝学的解析に用いた.また,ミトコンドリアDNA COI遺伝子の相同塩基配列を増幅,塩基配列を決定し,得られた配列から系統樹およびハプロタイプネットワークを形成,解析ソフトを用いて各集団間の遺伝的交流の有無を検証した.幼生標識法については,次年度以降,孵化後および卵嚢内の幼生について蛍光染色実験をおこなう予定である.論文発表作業が進んでいないため,十分な成果が得られた研究から順次研究発表を行い,論文を投稿する.沿岸性海洋生物の多くは浮遊幼生期を持ち,その個体群動態・生物地理を理解するためには,幼生の分散および生態の把握が必須である.その一方で,微少な幼生を追跡することは難しく,一つの個体がその初期生活史中にどのような挙動をとるかは多くの種でほとんどわかっていない.そこで,本研究では,短期から長期のプランクトン幼生期をもつ沿岸性の有殻腹足類数種を用い,各種の遺伝子マーカーおよび幼生蛍光標識法を開発,各地域・ハビタット間のコネクティビティの検証をおこなう.本年度は,分子実験・集団遺伝解析を中心に研究を進めた.具体的には,次世代シーケンサーにより,新たに2種について,マイクロサテライト(SSR)の探索をおこない,SSRマーカーを開発した.開発したマーカーについては,マルチプレックスPCR系の構築をおこない,SSRマーカーを同時に増幅できるマルチプレックスパネルを作成した.続いて,これまでに採集した腹足類サンプル約1,000個体より,遺伝的集団構造の解析に使用する個体を選別し,DNAを抽出後,ミトコンドリアCOI遺伝子配列の取得および新規に開発したマイクロサテライト(SSR)マーカーを用いた解析をおこなった.その結果,海産・両側回遊性の種の両方について,小笠原群島・沖縄離島集団を含めた日本産集団に明瞭な遺伝的構造は確認されなかった.これは各種の幼生分散能力が高いことを示し,各地の集団維持には自己再生産だけでなく他地域集団からの幼生加入が重要であることを示唆する結果となった.続いて,幼生殻蛍光色素付着実験のため,野外から持ち帰った回遊性腹足類を飼育下で産卵させ,その卵のうより孵化した幼生を約2ヶ月間飼育することに成功した.この予備的実験により,次年度の幼生飼育基盤が整った.今年度は,集団遺伝解析および幼生飼育法の確立をおこなった.各種のマイクロサテライトマーカーおよびマルチプレックスPCR系を構築し,実際に解析に用いた.また,前年度に引き続き,ミトコンドリアDNA COI遺伝子の相同塩基配列を増幅し,得られた配列から系統樹およびハプロタイプネットワークを作成した.SSRデータについては,解析ソフトSTRUCTUREなどを用いて各集団間の遺伝的交流の有無を検証した.幼生標識法については,最終年度である次年度,海産・回遊性種の孵化後および卵嚢内の幼生について蛍光染色実験をおこない,実践研究をする予定である.本年度はSSRマーカー作成に伴う次世代シーケンサー

由来のデータを元に2編の論文を発表したが,論文発表作業が予定より遅れているため,今後は,遺伝的集団解析の論文を含め,十分な成果が得られた研究内容から順次研究発表をおこなう.沿岸性海洋生物の多くは浮遊幼生期を持ち,その個体群動態・生物地理を理解するためには,幼生の分散および生態の把握が必須である.その一方で,微少な幼生を追跡することは難しく,一つの個体がその初期生活史中にどのような挙動をとるかは多くの種でほとんどわかっていない.そこで,本研究では,短期から長期のプランクトン幼生期をもつ沿岸性の有殻腹足類数種を用い,各種の遺伝子マーカーおよび幼生蛍光標識法を開発,各地域・ハビタット間のコネクティビティの検証をおこなった.本年度は,分子実験・集団遺伝解析を中心に研究を進め,沖縄本島・石垣島・ニューカレドニア等の河川・岩礁域において,遺伝的集団構造の解析に使用する腹足類サンプルを採集した.その後,研究室に持ち帰ったアマオブネ科腹足類からDNAを抽出し,ミトコンドリア(mt)・核遺伝子マーカーによる解析をおこなった.前年度に引き続き,mtDNA COI遺伝子の相同塩基配列を増幅し,得られた配列から系統樹・ハプロタイプネットワークを作成した結果,両側回遊性の種については,種内における遺伝的差異が極めて小さく,数千km離れた地域間でも同一のCOI遺伝子型の共有が見いだされた.さらに,各種のマイクロサテライト解析により,日本産の各集団間における遺伝的交流の有無を検証した.STRUCTUREによる遺伝構造解析では,両側回遊性種において,小笠原諸島集団を含めた日本産集団に明瞭な遺伝的構造は確認されなかった.また,幼生殻蛍光色素付着実験のため,沖縄・宮崎で採集したアマオブネ類卵のうから幼生を孵化・成長させ,カルセイン溶液での殻体染色をおこなった.今回飼育したアマオブネ類の幼生は数ヶ月程度の浮遊期間を持つことが判明し,幼生分散能力が高いことが示唆された.沿岸性無脊椎動物の多くは,浮遊幼生期を持ち,広い分布域をもつ.アマオブネ科巻貝類は海産・陸水種を含み,河川種の多くは両側回遊をおこない,幼生期に海流によって分散する.マイクロサテライト解析の結果,小笠原群島・南西諸島集団を含めた回遊種の日本産集団内に明瞭な遺伝的構造は確認されず,同科海産種と同様に分散能力が高いことが示唆された.また,アマオブネ類幼生への蛍光標識付着をおこない,野外における幼生実験への基盤を確立した.平成28年度は,前年度に得られた結果を基にして,マイクロサテライトマーカーによる遺伝的集団構造解析および幼生標識実験をおこなう.遺伝的集団構造解析には,COI遺伝子配列および前年度に開発したマイクロサテライトマーカーを用いる.その後,両マーカー間の結果を比較し,沿岸性腹足類の幼生分散について検討する.幼生蛍光色素付着実験については,これまで腹足類において,幼生時にカルセインやテトラサイクリン溶液に浸透させ,殻体に蛍光物質を取り込ませる方法が開発されている.対象種の繁殖期は夏期で,一つの個体が数十個の卵のうを基質に産みつけるため,飼育実験用の卵の採集は,6月から8月に行う.上記で採集した卵のうを複数の濃度に分けた蛍光物質溶液に72時間浸透させ,その後,室内において孵化した幼生が蛍光物質を取り込んでいるのかを蛍光顕微鏡により確認する.また,孵化した幼生の成長率や生存率を検討し,最適の濃度を選出する.幼生蛍光標識の開発がうまく進まない場合は,以下の2つの対策を試みる:1)系統の異なる他の貝類幼生で実験,
ヒト肥満細胞表面FcγRIによって惹起される生物学的機能の検討

ヒトマスト細胞が、IFN-γによって高親和性のIgG受容体を発現し(J Immunol,2000,164:4332)、その架橋によって、即時型のメディエーターのみならず、各種のサイトカイン、特にTNF-α,IL-1β,IL-6といったproinflammatory cytokineを多量に産生すること(J Immunol,2001,166:4705,Eur J Immunol,2001,31:3298)などを報告してきた。さらにFcγRIの架橋による、ヒトマスト細胞内情報伝達機構をFcεRIの架橋によるものと比較検討し、共通の系と異なる系を見いだした(Okayama Y, et al. Eur J Immunol,2003,33,1450)。顕著な差異はPI3 kinaseの活性化がFcγRIの架橋による脱顆粒には要求されるが、FcεRIの架橋による脱顆粒には要求されなかった。さらにNF-κB系のマスト細胞内情報伝達機構について検討した(J Immunol,2002,169:5287)。マスト細胞に発現するFcγRIの免疫系における役割を考察する目的にて、FcγRIあるいはFcεRIの架橋によってマスト細胞において発現の変動する遺伝子群を網羅的にDNAチップを用いて解析を行った。両者の遺伝子発現パターンは非常に似かよっていたが、異なる遺伝子群も同定された(Okayama Y, et al.投稿準備中)。また、Toll様受容体4(TLR4)がヒトマスト細胞に発現し、FcγRIと同様IFN-γによって発現と機能が増強することを報告した(Okumura S, et al. Blood,2003,102:2547)。以上より、ヒトマスト細胞に発現するFcγRIがTh1環境においてFcεRIとは異なった生理的、病理的役割を果たしていることが示唆された。さらにFcγRIの架橋による、ヒトマスト細胞内情報伝達機構をFcεRIの架橋によるものと比較検討し、共通の系と異なる系を見いだした(Okayama Y, et al.Eur J Immunol,2003,33,1450)。両者の遺伝子発現パターンは非常に似かよっていたが、異なる遺伝子群も同定された。また、Toll様受容体4(TLR4)がヒトマスト細胞に発現し、FcγRIと同様IFN-γによって発現と機能が増強することを報告した(Okumura S, et al.Blood,2003,102:2547)。