hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
霊長類ゲノムの多様性と反復配列進化

(2)ヒトにおいてCAGトリプレットリピートによってコードされるグルタミンリピートをもち、その異常なリピート回数の拡張により脊髄小脳変性症1型を引き起こすSCA1遺伝子の産物であるAtaxin-1タンパク質の進化機能的多様性を、ヒトAtaxin-1タンパク質のグルタミンリピートを特異的に認識し結合する因子として知られているPQBP-1タンパク質との相互作用の比較から解析した。表面プラズモン共鳴法にて両者間の相互作用をin vitroで解析した結果、ヒト型PQBP-1タンパク質はヒト型Ataxin-1タンパク質のグルタミンリピートと類似した構造をもつ旧世界ザル型のAtaxin-1タンパク質は認識して結合できるものの、新世界ザル型のAtaxin-1タンパク質(モザイク型リピート構造からなる)とは結合できないことが判明した。霊長類進化とくに新世界ザル分岐後のヒト上科とオナガザル上科(旧世界ザル)の共通祖先すなわち狭鼻類が分岐する前において、Ataxin-1タンパク質の機能変異が起こったと考えられる。ヒトにおいて連続して7残基以上同一のアミノ酸が並ぶ"単一アミノ酸リピート構造"を、(a)哺乳動物全般において保存されている"単一アミノ酸リピート構造"、(b)霊長類の中では保存されている"単一アミノ酸リピート構造"、(c)霊長類の中で変異が見られる"単一アミノ酸リピート構造"、に分類し、霊長類を含む哺乳動物に関しての網羅的比較をおこなった結果、いずれにおいても、ヒトで見られた"単一アミノ酸リピート構造"の特徴である、(1)グルタミン酸、グルタミン、ロイシン、プロリン、アラニン、グリシン、セリン、それぞれのアミノ酸残基からなる単一アミノ酸リピートが多数を占めていること、(2)その多くは転写ならびに翻訳に係わっている遺伝子であること、しかし、(3)それぞれのアミノ酸残基が占める割合は各群で大きな差異が存在することを明らかにした。さらに、disorder領域を取りやすい"単一アミノ酸リピート構造"の有無を検索した結果、おおきく3つのアミノ酸残基グループに分けられた。そこで、上記(a)(c)群についてタンパク質中のdisorder領域の割合分布を調べたところ、各群間に違いが、とくに、「霊長類の中で変異が見られる"単一アミノ酸リピート構造"」である(c)群においてdisorder領域の割合分布が他の2群と大きく異なっていることが明らかとなった。次に、脳に特異的に発現しているBrain-2転写因子の単一アミノ酸反復配列のうちで哺乳動物に特徴的な複数の単一アミノ酸反復配列のみを人為的に完全欠失させたノックインマウスの作出をおこない、基本的行動指標としての自発活動量を測定したところ、単一アミノ酸リピート欠失の雌ホモ個体で明期の活動量が統計学的に有意に低くかった。そこで、エタノール誘発性睡眠時間の測定をおこなった結果、脳内のドーパミン量が低くなっていることが示された。
地域と連携したエコミュージアム化の実践的研究：オオサンショウウオの保全に向けて

1)基礎生態データの収集:広島県東広島市椋梨川上流部約4km(7区間)を調査区域とし周年にわたる2018年4月-2019年3月まで計24回の野外調査を実施した。のべ成体110頭を捕獲し、全長・体重・性別・身体的特徴を計測、マイクロチップによる個体識別を行った。2018年7月の西日本豪雨により本調査地も甚大な被害を被り、個体識別個体55個体のうち多くが流失した。緊急調査を7月20日から20回実施し、34個体を確認(6個体の新規個体を含む)し、教育委員会の許可を得て上流へ再放流を行った。流下距離の中央値1,022m(最小278m-最大4,540m,N=6)であり、長距離の流失を確認した。2)幼生(全長約65mm-430mm)の追跡(3月)と生息地探索:豪雨により3つの巣穴のうち2つが倒壊したが、幸いにも代替巣穴が2つ構築され再放流した雌の産卵を確認した。幼生の巣立ち後の3月に堰堤上で幼生85頭を確認できた。流下すべき堰堤下に50個体の放流を行った。残りの30個体については、ワイヤータグの挿入を行い放流を行う予定である。また、幼生が巣立ち後の初期(12-4月)に隠れ家や餌場として利用している水底の落葉の種類と渓畔林の植物相の関係を明らかにし学術論文として発表した。3)年齢査定と寿命の推定:昨年度は1ー11齢個体の年齢査定に成功し、学術論文として発表した。より高齢個体への応用を目指し、標本を収集中である。4)エコミュージアム化による成果の発信とその評価:東広島市教育委員会文化課、観光振興課と協力して、エコミュージアムのコア施設となる本種の一時保護施設「オオサンショウウオの宿」を整備した。新年度に試験運用を開始し、痩せ個体の保護育成、流失幼生の保護・育成、交雑種の隔離を行うとともに、展示として公開し、エコミュージアムのコア施設として機能する予定である。野外調査により、のべ110個体の成体を確認した。豪雨災害による被害は甚大であったが、豪雨により多くのオオサンショウウオが流失することを確認することができた。上流の個体群は空洞化していたため、流下個体の上流への再放流を実施しなければ繁殖への直接的な打撃となったと考えられる。本来、本種は上流に遡上して繁殖を行うが、それを制限している人工堰堤の落差解消が望まれる。豪雨災害後の野外調査の様子は、各種マスメディアに掲載されたほかNHK「ダーウィンが来た!」にも3月3日に「守れ!オオサンショウウオ豪雨からの復活大作戦!!」として取り上げられた。前倒しで整備することができたコア施設となる一時保護施設も朝日新聞デジタルにも掲載されるなど大きな反響を得た。幼生の生息環境を評価するために水底の落ち葉の種類と渓畔林を構成する植物相調査を実施しその対応関係を明らかにした結果を学術論文として発表した。3月には全長50mmの幼生の30個体を捕獲し、ワイヤータグを挿入するために育成中である。豪雨の影響は想定外で甚大であったが、個体群の影響をきちんと把握し、個体群の最低限の維持を行うことができたと考えている。引き続き野外調査を実施する。調査地を拡大して豪雨で流失した個体の捜索を引き続き実施する。また、幼生がどのくらいの範囲(距離)を生活圏として利用しているのかを解明し,本種が生活環を完結させるために最低限必要な保護ゾーンの設定を行う。エコミュージアム化による成果の発信とその評価.1.公開講演会・出前講座(4-5月):オオサンショウウオに関する公開講演会と出前講座を地域住民及び小学校を対象として実施する。2.野外観察会(9月):生息地での生態観察,解説.繁殖巣穴,堰堤などの見学.3.出前博物館(8ー11月):整備した一時保護施設にて,パネル,実物を展示し、オオサンショウウオに関心のない客層にもアプローチする。アンケート調査による評価(4月11月):参加者・来場者アンケートによるエコミュージアム体験に関する評価を実施し、ミュージアム化の課題と可能性を検討する。1)基礎生態データの収集:広島県東広島市椋梨川上流部約4kmを調査区域とし計16回の野外調査を地域住民と協働して実施した。成体53頭を捕獲し、全長・体重・性別・身体的特徴・緯度経度を計測・観察した。合わせてマイクロチップによる個体識別を行った。今後、得られた各区間の個体の移動の有無と全長組成から個体群の隔離状況を評価・推定できると考えている。2)幼生(全長約65mm-430mm)の追跡(1月-6月)と生息地探索:巣穴下流の堰堤に流下を制限されている幼生106尾を捕獲し、ワイヤータグの挿入を行い流下すべき河川に30個体の放流を行った。また、幼生が利用する餌を特定するために環境中の餌生物調査と幼生の糞分析を実施した。放流個体の再捕獲はできていないが、今回はじめて145mmの幼体を捕獲することができた。数は少ないが本河川に幼生の生息地が存在することが示せた。今後、放流個体を本確認地点周辺で確認できるのではないかと期待している。

また、環境分析と糞分析から、幼生が環境中に最も多く存在する水棲昆虫を捕食するのではなく、成体と同様に移動性の高い種群を捕食していることを明らかにし、学術論文として発表した。幼生の生息環境を探索する上で重要な結果となった。3)年齢査定と寿命の推定:生年月日と死亡年月日が確認できる標本を試料として用い1ー11齢個体の年齢査定に成功し、学術論文として発表した。今後、より高齢個体への応用が期待される。4)エコミュージアム化による成果の発信とその評価:公開講演会、野外観察会、出前講座を地域住民及び小学校を対象として地域住民と協働して実施した。また出前博物館(8月)も地域の夏祭りにて実施し、実物、レプリカ、パネル等を展示し720名の来場者を得た。本来オオサンショウウオに関心のない人々にもアプローチすることができた。豪雨等で実施できないこともあったが、概ね順調に調査を実施できた。野外調査により、53頭の成体、幼体1頭、幼生106頭を確認した。特に全長145mmの幼体の確認は本調査地では初めてのことであり、重点的な調査の成果であると言える。本確認地点をひとつのモデルとして他の幼体の生息環境の特定に近づきたいと考えている。また全長50mmの幼生の106個体のうち40個体をワイヤータグを挿入するために育成中である。今後、放流個体数の増加による再捕獲率の向上が期待される。幼生の生息環境を評価するために実施した環境中の餌生物調査、及び幼生の糞分析による食性の解析は日本オオサンショウウオの会、日本陸水学会にて成果を公表し、学術論文にも掲載された。幼生の生息環境を探索する上で重要な結果となり、幼生調査も順調に推移していると考えている。年齢査定に関する成果も論文となり、各種新聞に掲載されたほかYahooニュースや朝日新聞デジタルにも掲載されるなど大きな反響を得た。エコミュージアム化については、予定のすべての活動を実施できた。1)基礎生態データの収集:広島県東広島市椋梨川上流部約4km(7区間)を調査区域とし周年にわたる2018年4月-2019年3月まで計24回の野外調査を実施した。のべ成体110頭を捕獲し、全長・体重・性別・身体的特徴を計測、マイクロチップによる個体識別を行った。2018年7月の西日本豪雨により本調査地も甚大な被害を被り、個体識別個体55個体のうち多くが流失した。緊急調査を7月20日から20回実施し、34個体を確認(6個体の新規個体を含む)し、教育委員会の許可を得て上流へ再放流を行った。流下距離の中央値1,022m(最小278m-最大4,540m,N=6)であり、長距離の流失を確認した。2)幼生(全長約65mm-430mm)の追跡(3月)と生息地探索:豪雨により3つの巣穴のうち2つが倒壊したが、幸いにも代替巣穴が2つ構築され再放流した雌の産卵を確認した。幼生の巣立ち後の3月に堰堤上で幼生85頭を確認できた。流下すべき堰堤下に50個体の放流を行った。残りの30個体については、ワイヤータグの挿入を行い放流を行う予定である。また、幼生が巣立ち後の初期(12-4月)に隠れ家や餌場として利用している水底の落葉の種類と渓畔林の植物相の関係を明らかにし学術論文として発表した。3)年齢査定と寿命の推定:昨年度は1ー11齢個体の年齢査定に成功し、学術論文として発表した。より高齢個体への応用を目指し、標本を収集中である。4)エコミュージアム化による成果の発信とその評価:東広島市教育委員会文化課、観光振興課と協力して、エコミュージアムのコア施設となる本種の一時保護施設「オオサンショウウオの宿」を整備した。
反対称化分子動力学で探る陽子過剰核での陽子中性子相関の発現機構

原子核構造におけるSU(4)対称性は、フェルミ型のベータ遷移の終状態の近傍にガモフ・テラー型のベータ遷移の終状態が存在するという対称性である。近年、42Ca→42Scにおける荷電交換反応の実験結果から低励起状態にSU(4)対称性が見出された。このSU(4)対称性は、N=Z奇奇核におけるアイソスカラー型の陽子中性子対相関によって実現されることがHFB+QRPA理論によって理解されている。また、変形とスピン軌道力によるSU(4)対称性の破れが、46Ti→46V, 50Cr→50Mnの反応において実験や殻模型の理論計算によって理解されている。しかし、これらの系統的な議論はpf殻やそれよりも重い原子核に限定されており、軽いN=Z奇奇核近傍のSU(4)対称性についての理解は十分ではない。本研究では軽い原子核において、陽子中性子相関とSU(4)対称性を議論した。本年度はアイソスピン射影反対称化分子動力学(AMD)法を用いて、22Naの近傍でのガモフ・テラー遷移強度を研究した。22Ne→22Naの基底状態0+1からのガモフ・テラー遷移強度は異なる2つの1+0状態にフラグメントするという結果を得た。このフラグメントは、基底状態でK=0を持っていた状態がK=0,1を持つ状態に、スピン保存型とスピンフリップ型のガモフ・テラー演算子で遷移するために引き起こされる。つまり、変形とスピン軌道力がSU(4)対称性の破れを引き起こすということが明らかになった。この内容がPhysical Review Cに掲載された。この結果は近年46Ti→46V, 50Cr→50Mnなどの遷移で殻模型によって議論されている変形とスピン軌道力によるSU(4)対称性の破れに対応し、sd殻核においても普遍的に生じる現象であることが明らかとなった。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。今年度はN=Z=odd核における陽子中性子間(pn)相関を取り扱う際の新手法の開発(下記1)と同手法の軽い原子核への適用(下記2)を行った.その結果,本研究課題の基礎となる手法とその有効性が確立された.(1)アイソスピン射影とβγ拘束を同時に課した反対称化分子動力学(AMD)法を開発し, 10Bに適用することでN=Z=odd核におけるpn相関を取り扱う上での有用性を確かめた.この手法はアイソスピンT=0,1状態それぞれに対して四重極変形度を定義し,それを良い生成座標として用いることで, pn対のコア核に対する空間的な発達を記述できるようにした手法である.この手法をTβγ-AMD+GCM法と名付け,内容をまとめた論文がPTEPに掲載された.Tβγ-AMD+GCM法はpn対の形成と運動を取り扱える手法でありながらpn対の形成を仮定しない自己無撞着な枠組みであり,あらゆる質量領域で適用可能な方法になると期待できる.また,本手法の計算コードは並列計算に最適化されており,十分な資源が与えられれば質量数の依存性はほとんど問題にならない.(2)p殻核において系統的なGamow-Teller(GT)遷移確率の計算を行った.その結果,全てのp殻核のGT遷移において,中性子過剰な親核(6He, 10Be, 14C)の基底0+1状態から娘核(6Li, 10B, 14N)の1つの1+0状態に対して強度が集中するという計算結果が得られた.この結果は,親核と娘核のそれぞれに対して中性子(nn)対とpn対が形成されており,それらの間でスピンとアイソスピンが同時にflipするという描像がよく成り立っていることを示している.この現象は必ずしもp殻に限定されたものでないと考えられるため,より重い原子核においてもpn対の形成を議論する上で有用であると期待される.研究実施計画では,スピン・アイソスピン拘束が行えるようにAMDを拡張し,高速回転に伴うpn相関の発現とspin-flip M1遷移によるpn対の検出可能性を明らかにする予定であった.これらの課題については、おおむね順調に進展している.前者については計画通りに研究を進めた.特に,手法の開発だけなく10Bへの適用によって有効性を示せた点については当初の計画以上に進展したといえる.また,この内容について複数の学会,国際会議等で発表しただけでなく原著論文としてまとめられたことは大きな成果である.一方,後者については一部計画を変更し,研究を進めた.当初考えていたspin-flip M1遷移はg因子や軌道成分の遷移による影響を受けるため, pn相関との関係を議論することが容易ではない.そこで,これらの影響の無いGT遷移とpn相関の関連について詳しく研究した.この内容はより重い原子核でも同様の議論ができる可能性があり,次年度でのさらなる展開が期待される.この内容についても複数の学会,国際会議等で発表し,現在論文として投稿中である.(1)低励起状態でのGamow-Teller(GT)遷移確率の上昇と陽子中性子間相関の関係について議論した。具体的には, p殻N=Z=odd核である6Li,10B,14Nを対象にして、アイソスピン射影されたAMDを用いて系統的にGT遷移を計算した。

中性子過剰なN=Z+2核のJπT=0+1状態からN=Z=odd核の1+0状態へのGT遷移強度を計算し,基底状態や励起状態からの遷移の中にGT和則の50%以上を尽くすものを見出した.これらの遷移強度の集中は, nn(ST=01)状態からpn(ST=10)状態へのスピン・アイソスピンフリップ遷移という見方でおよそ説明がつくことを示した。この内容についての論文がPhysical Review Cに掲載された。(2)スピン・アイソスピンフリップ遷移の考え方をより重い原子核に適用するために, 22Neから22NaへのGT遷移強度を計算した。これらの原子核は(1)で詳しく調べられた10Beや10Bと同様にプロレートに変形した原子核であるが、低励起状態へのGT遷移の振る舞いは異なる様相を見せる。本研究では基底状態からのGT遷移強度が異なる二つの1+0状態へ分裂する現象に注目して、陽子中性子対の形成とそのSz固有状態への崩れの観点から議論した。終状態の1,2番目の1+0状態はそれぞれK=0,1状態に対応し、これは陽子中性子対がそれぞれSz=0,1の状態に崩れたことに対応する。これらの状態は始状態にGT演算子のうちスピンを変えないものを作用させた場合とスピンを変えるものを作用させた場合に対応する。このようなGT強度のフラグメントは、pf殻核などで実験的に観測されているフラグメントの最も単純なケースとして捉えることができる。研究実施計画では「N=Z=odd核を扱う新しい手法Tβγ-AMD+GCM法の開発と超許容Gamow-Teller遷移の解析への適用をsd殻領域に拡張する」予定であった。この課題については、おおむね順調に進展している。sd殻のうち典型的なプロレート変形核である22Neや22Naについて、すで実験で測られているエネルギー準位を再現するとともにGT遷移強度を計算できた。これは変形度拘束や生成座標法による量子ゆらぎの取り込みがうまくはたらいたためと考えられる。この成果については、p殻との違いに注目して論文としてまとめており投稿する予定である。一方で、その他のsd殻核については基底状態が高い角運動量を持つ場合の取り扱いの工夫や質量の増加に伴う相互作用の改善が必要なため、系統的に計算を進めることが難しいことが分かった。原子核構造におけるSU(4)対称性は、フェルミ型のベータ遷移の終状態の近傍にガモフ・テラー型のベータ遷移の終状態が存在するという対称性である。近年、42Ca→42Scにおける荷電交換反応の実験結果から低励起状態にSU(4)対称性が見出された。このSU(4)対称性は、N=Z奇奇核におけるアイソスカラー型の陽子中性子対相関によって実現されることがHFB+QRPA理論によって理解されている。また、変形とスピン軌道力によるSU(4)対称性の破れが、46Ti→46V, 50Cr→50Mnの反応において実験や殻模型の理論計算によって理解されている。しかし、これらの系統的な議論はpf殻やそれよりも重い原子核に限定されており、軽いN=Z奇奇核近傍のSU(4)対称性についての理解は十分ではない。本研究では軽い原子核において、陽子中性子相関とSU(4)対称性を議論した。本年度はアイソスピン射影反対称化分子動力学(AMD)法を用いて、22Naの近傍でのガモフ・テラー遷移強度を研究した。22Ne→22Naの基底状態0+1からのガモフ・テラー遷移強度は異なる2つの1+0状態にフラグメントするという結果を得た。
欠損指再建のための生体骨模倣人工指骨の開発

事故により指を切断するなどした患者に対して、本来の指骨に限りなく近い人工指骨構造体を適用できれば、彼らのクオリティーオブライフ向上のために有益であることは間違いない。また、このような指骨構造体を作製可能な技術を確立すれば、それを基盤として指骨以外の臓器の構築も可能となる可能性を有している。本研究では、ヒドロゲルの内部に血管構造体の鋳型となる血管構成細胞からなる構造体を作製した後に、エレクトロスピニング法を利用して、その周囲をシリカおよびコラーゲンのファイバーで覆うことで人工指骨の構築を目指している。平成21年度はファイバーを巻き付ける基材として、前年度に開発に成功した細胞に穏和な酵素反応で架橋し、体温下でも溶解しないゼラチン誘導体を、実際にヒトに利用することを想定した検討を行い、機能性向上のための多糖との複合化を試みた。多糖にも酵素によって認識され、架橋される官能基を導入し、ゼラチン誘導体との混合溶液に対して酵素反応を行ったところ、動物細胞の生存を損なうことなく、ゼラチン誘導体と多糖誘導体が結合したハイブリッド材料を得ることができた。この基材に巻き付けるシリカファイバーの高機能化に関しては、シリカ表面の疎水性をシランカップリング剤により制御することによって、タンパク質の吸着を向上させることに成功し、この技術を利用すれば生体への移植後の周囲組織との親和性をコントロールできることが分かった。ゼラチン誘導体ゲルをターゲットとしてシリカファイバーをエレクトロスピニング法により形成させることにより、そのゲルの表面にファイバーを堆積させることが可能であった。平成19年度は、要素技術の確立を目指し、(1)ハイドロゲル内への自発的な血管網構築手法の開発、(2)シリカファイバーに対する骨芽細胞の親和性に関ずる検討を中心に行い、それぞれに関して以下の知見を得た。(1)本研究の最終段階では、骨形成細胞を組み込んだ構造体の作製を目指している。このため、これらの細胞のライフラインとなる血管様ネットワークをコラーゲンなどの細胞外マトリックス中に効率的に形成させ得る手法の確立が不可欠である。これを実現するために、ゼラチンとアルギン酸から作製されるゲルファイバーの中に血管内皮細胞を包括し、そのファイバー表面を平滑筋細胞で被覆した後に、コラーゲンゲル内に埋入した。その後、このファイバーを分解することで、生体の血管と同様に平滑筋と血管内皮細胞から構成される構造体を作製することを試みた。その結果、上記の2種類の血管構成細胞の二層構造からなる血管様構造体を作製することに成功した。しかしながら、この構造体から周囲のコラーゲンゲル内への毛細血管様構造体の自発的な形成は確認されず、次年度にはこれを解決することを目指した検討を新たに行う必要があることが明らかになった。(2)本研究では骨主成分であるアパタイト形成誘導能を有するシリカからなるファイバーを利用することにより、より骨に類似した構造体を作製できるものと考えている。そこで、これまでは接着および増殖性のみしか評価していなかったシリカファイバーと骨細胞との親和性を、骨芽細胞から骨細胞への分化を観察することで評価した。その結果、エレクトロスピニングシリカファイバー上で培養されたヒト骨芽細胞(MG-63)は培養約1週間で骨細胞への分化のマーカーとして知られるアルカリフォスファターゼ活性を強く発現し、シリカファイバーが骨細胞に分化する骨芽細胞に対して高い親和性を有していることが明らかとなった。事故などにより指を切断するなどした患者に対して、本来の指骨に限りなく近い人工指骨構造体を適用できれば、彼らのクオリティーオブライフ向上のために有益であることは間違いない。平成20年度には、前年度にヒドロゲル内で自発的な毛細血管網の構築が起こらなかったことから、それを可能とするための新たなヒドロゲル材料の開発と、シリカファイバーの生体親和性の向上に関する検討を行った。前者に関して具体的には、細胞親不口性が非常に高いことが知られているゼラチンを新たなヒドロゲル材料として利用するために、細胞に穏和な酵素反応で架橋し、さらに体温下でも溶解することのない架橋構造を導入した。この新たなゼラチン誘導体は、未修飾のゼラチンと同様の高い細胞親和性を保持しており、さらに、架橋形成のための酵素反応を適用することによって、10秒程度でゲルを形成できることを見出した。後者のシリカファイバーの高機能化に関しては、細胞接着性ペプチドでコートすることによって、細胞の接着性を20%程度向上させることができた。また、骨の主成分であるアパタイトに関して、シリカファイバーの熱処理の有無によって骨親和性をコントロールできることを見出した。

平成21年度はファイバーを巻き付ける基材として、前年度に開発に成功した細胞に穏和な酵素反応で架橋し、体温下でも溶解しないゼラチン誘導体を、実際にヒトに利用することを想定した検討を行い、機能性向上のための多糖との複合化を試みた。多糖にも酵素によって認識され、架橋される官能基を導入し、ゼラチン誘導体との混合溶液に対して酵素反応を行ったところ、動物細胞の生存を損なうことなく、ゼラチン誘導体と多糖誘導体が結合したハイブリッド材料を得ることができた。この基材に巻き付けるシリカファイバーの高機能化に関しては、シリカ表面の疎水性をシランカップリング剤により制御することによって、タンパク質の吸着を向上させることに成功し、この技術を利用すれば生体への移植後の周囲組織との親和性をコントロールできることが分かった。ゼラチン誘導体ゲルをターゲットとしてシリカファイバーをエレクトロスピニング法により形成させることにより、そのゲルの表面にファイバーを堆積させることが可能であった。
肺動脈性肺高血圧症での新規アポトーシス誘導物質の病態への関連性と新規治療法の開発

肺動脈性肺高血圧症(PAH)は予後不良の病態であるが、近年、薬物療法の進歩により予後は改善してきている。しかし、その効果は十分とはいえず、新しい機序の治療薬の開発が喫緊の課題である。低酸素負荷後再酸素化刺激された心筋細胞から分泌されアポトーシスを誘導する分泌型タンパク質として、2015年にはじめて同定された物質があり、このタンパク質は酸化ストレス性疾患のバイオマーカーとしてだけでなく、その中和抗体は新しい機序の治療薬として注目されている。本研究では、このタンパク質がPAHのバイオマーカーとしての有用性を探究し、PAHの病態への関与を解明、新しい機序の治療法の開発へとつながる研究を行う。
東アジアで放散的種分化を起こしている植物の系統解析

中国のシロヨメナ群は1種11変種に分類されているが,本研究およびこれまでの知見により約3分類群にまとめられることになった.一方,日本のシロヨメナ群には6種4変種が認められ,放散的種分化はむしろ日本で顕著に起こったとみなすことができる.これは大陸では地形が連続的なので遺伝的交流が妨げられない広分布種が存在するのに対し,日本の地形の複雑さが遺伝的交流を妨げて種分化を促進した結果であると考えられる.これらシロヨメナ群の分子系統解析は難航しているが,その理由は各分類群間の遺伝的差異が小さいためであり,そのこと自体が,シロヨメナ群が比較的最近,急速な放散的種分化を遂げた証拠とみなすことができる.中国のシロヨメナ群は1種11変種に分類されているが,本研究およびこれまでの知見により約3分類群にまとめられることになった.一方,日本のシロヨメナ群には6種4変種が認められ,放散的種分化はむしろ日本で顕著に起こったとみなすことができる.これは大陸では地形が連続的なので遺伝的交流が妨げられない広分布種が存在するのに対し,日本の地形の複雑さが遺伝的交流を妨げて種分化を促進した結果であると考えられる.これらシロヨメナ群の分子系統解析は難航しているが,その理由は各分類群間の遺伝的差異が小さいためであり,そのこと自体が,シロヨメナ群が比較的最近,急速な放散的種分化を遂げた証拠とみなすことができる.中国に分布するキク科植物のシロヨメナ類について,22年度前半は可能な限りの文献調査と,国内標本庫の標本調査を行った.その結果,中国におけるシロヨメナ類の分布の中心のひとつである河北平野の北部北西部で野外採集を行う計画をたてた10月11月にかけて,共同研究者と二人で訪中し,河北平野の北部にあたる北京周辺の山地と,北西部にあたる陜西省南部から湖北省西北部の山地において,現地の研究者の協力を得て,車を使った移動と採集を行ったこの野外採集により,目的とするシロヨメナ類植物の32集団薬150個体を採集することができた.現地での観察で,今回採集を行った地域にはおそらく3種類のシロヨメナ類が生育することや,形態だけでなく花期のずれという分化が起きているらしいことが明らかになった.採集した植物体は,押し葉標本およびDNA用サンプルを確保した後,生きたままの根を持ち帰り,圃場で鉢植えとした.持ち帰ったDNA用サンプルからのDNA抽出はすでにすみ,系統解析に必要な分子データを得る準備が進んでいる.また,持ち帰った生植物はほとんどの個体が活着して冬を越したので,今後これらの材料を用いて細胞学的な観察を行う予定である一方,中国で野外採集を行う前後に,中国科学院の植物標本庫で標本調査を行い,中国全域におけるシロヨメナ類植物の分布と形態的変異についての知見を得ることができた.この結果から23年度の具体的な採集計画を効率よく立てられることが期待できる中国に分布するキク科植物のシロヨメナ類について,平成22年度に文献調査と国内標本庫の標本調査を行い,22年度は河北平野の北部北西部,23年度は中国南部の広東省および広西省で野外調査採集を行う計画をたてた.平成23年11月上旬に共同研究者と二人で訪中し,広東省北東部の山地と広西省西北部の山地において,車を使った移動と採集を行った.現地では北京大学の共同研究者の学生が助手としてガイドと通訳を担当してくれたほか,中国科学院の華南植物研究所,南西植物研究所の研究者らの協力を得ることで,中国の農山村部での活動を円滑に行うことができた.この野外採集により,目的とするシロヨメナ類植物の20集団約150個体を採集することができた.現地での観察で,今回採集を行った地域にはおそらく2種類のシロヨメナ類が生育すること,それらは標高ですみ分けているらしいことが明らかになった.採集した植物体は,押し葉標本およびDNA用サンプルを確保した後,生きたままの根を持ち帰り,圃場で鉢植えとした.生植物の持ち出しについては,北京大学の共同研究者Rao教授の協力により許可を得た.持ち帰ったDNA用サンプルからのDNA抽出はすでにすみ,系統解析に必要な分子データを得る準備が進んでいる.また,持ち帰った生槙物はほとんどの個体が活着して冬を越したので,今後これらの材料を用いて細胞学的な観察を行う予定である.また,22年度に得られたサンプルについては,染色体数の観察がほぼ終了し,分子系統解析のデータも順調に得られている.中国に広く分布するシロヨメナ群の形態や染色体数の変異を把握する為に,北京周辺,陜西省南部,広東省西部,および広西省東部において現地調査を行った.観察の結果,日本に分布するシロヨメナと同種とみなすことができるものがこれら全ての地域に広く分布すること,その中に2倍体,4倍体があり,地域によってはモザイク状に入り交じって生育している事がわかった.このシロヨメナは形態変異幅が大きく多様性が高いが,その変異は連続的であり,複数の分類群に分ける必要は認められない.分布域が広く形態的に多様なので,これまで中国植物誌などで複数の分類群と認識されていたようである.また,広東・広西省南部には植物体全体に密毛をもつものが分布しており,シロヨメナとは別種とみなすことができる.これにも2倍体と4倍体が出現するが,4倍体の方がやや標高の高い土地に出現する傾向がみられた.

これはAster lasiocladusと同定される.中国植物誌によると,中国のシロヨメナ群は1種11変種に分類されている.しかし,本研究およびこれまでの知見を合わせて考えると,約3分類群にまとめることができる見込みである.この数の違いはこれまで広分布種の分布と形態変異の連続性が正確に認識されてなかったためと考えられる.一方,日本のシロヨメナ群には6種4変種が認められており,放散的種分化はむしろ日本で顕著に起こったとみなすことができる.これは大陸の地形が連続的であるため,遺伝的交流が妨げられない広分布種が存在するのに対し,日本の地形の複雑さが遺伝的交流を妨げて種分化を促進した結果である可能性が考えられる.これらシロヨメナ群の分子系統解析では,系統関係を推測するために必要な変異がほとんどみつからず,解析が難航している.しかしこのことこそが,これらの分類群が比較的最近,急速に種分化した証拠ともみなす事が可能である.野外採集,染色体観察,分子系統解析のいずれも当初計画の通り進んでおり,中国南部におけるシロヨメナ類の分布様式が明らかになった.25年度が最終年度であるため、記入しない。引き続き,染色体観察と分子系統解析を行う.得られたデータと採集標本に基づく形態観察により,細胞地理学的考察および分類学的考察を行い,分類学的な混乱がみられた中国のシロヨメナ類についての再検討を行う.分類学的な検討を行う上で必要が生じれば,中国の標本庫を訪問して標本調査を行うことにする.25年度が最終年度であるため、記入しない。
強相関電子系ナノワイヤー金属錯体における新奇非線形現象の創出

申請者らは、これまでに例のない400K以上で平均原子価状態をとるBr架橋Pd錯体の合成に成功した。また、擬一次元ハロゲン架橋金属錯体と呼ばれる物質系を中心にその熱電特性の評価を行った。擬一次元ハロゲン架橋金属錯体はNi, Pd, Ptを中心金属とした一次元電子系物質であるが、CoやCuなどをドープすることでその電子状態を連続的に制御できることが知られている。我々はNi錯体とPd錯体に対してCoをドープすることでどのように熱電特性が変化するかを明らかにした。申請者は、本研究課題にいおいて、擬一次元ハロゲン架橋金属錯体というナノワイヤー金属錯体において、新奇な非線形現象を創出するという目的で研究を行っている。その中で、申請者は今回、Pd(II)-Pd(IV)の混合原子価状態とPd(III)の平均原子価状態との間で相転移を示す錯体[Pd(cptn)2Br]Br2 (cptn=1R,2R-cyclopentanediamine)を新規に開発することに成功した。この錯体は50K-150K程度の比較的幅広い温度領域で両電子状態がそう分離することで共存していることが明らかとなった。この現象をX線結晶構造解析、ESRスペクトル、光学伝導度スペクトル、Ramanスペクトル、光学顕微鏡観察などにより明らかにした。さらには、温度可変走査トンネル顕微鏡(STM)を測定することで、温度によって電子状態が変化する現象を実空間で観測することに初めて成功した。また、新しい配位子dabdor(=1,4-dihydro-2R,3R-diaminobutaneを開発し、この配位子を用いた新規臭素架橋Pd錯体において、室温でPd(III)の平均原子価状態をとることを明らかにした。この電子状態をX線結晶構造解析、Ramanスペクトル、STM測定などにより明らかにした。また、さらにはナノワイヤー金属錯体のデバイス応用を視野に入れ、本錯体のナノ粒子化、単一分子層薄膜の作成などの試みも行っている。論文未発表であるが、ナノ粒子化による吸収極大波長のシフトなども観測されている。申請者は、本研究課題において、擬一次元ハロゲン架橋金属錯体を中心とした低次元電子系物質において、新奇な非線形現象を創出するという目的で研究を行っている。その中で申請者は従来はPd(II)-Pd(IV)の混合原子価状態をとると考えられてきたPd錯体でPd(III)の平均原子価状態をとる物質の開発に成功した。また、この錯体が比較的幅広い温度領域で相分離現象を示すことを明らかにした。この錯体の混合原子価相における価数配列を3DーΔPDF法という手法を用いて明らかにした。また、Au(I)-Au(III)混合原子価錯体においてもメチルアンモニウムイオンを有する新規ペロブスカイト型金属錯体の開発に成功し、この錯体中のメチルアンモニウムイオンの運動状態が温度によって変化することを明らかにした。これまでに得た成果としては、1.混合原子価ー平均原子価相転移を示す新規臭素架橋パラジウム錯体の開発、2.室温で平均原子価状態を示す新規臭素架橋パラジウム錯体の開発、3.電気二重層トランジスタ(EDLT)を利用したNi錯体へのキャリア注入、4.新規Au(I)-Au(III)混合原子価ペロブスカイト型金属錯体の開発などがあげられる。これらの錯体のデバイス化に向けて、物質開発のみならず、薄膜化なども同時に進めており、新奇非線形現象の創出に向けて着実に進展している。MX錯体の一次元鎖構造は、金属イオンの面内配位子のアミノ基と対アニオン間の水素結合によって安定化されている。従って、この水素結合部分をうまく利用することで、一次元鎖から遠く離れた場所で働くアルキル鎖間の引力的相互作用よりも、より効果的に一次元鎖方向の圧縮を行うことができると考えられる。そこで、水素結合距離はどのようなMX錯体でもほぼ不変であることに着目し、対アニオンを一次元鎖から遠ざけることで、一次元鎖の圧縮を試みた。安価なキラル試薬であるL-酒石酸を原料として、Pd(II)錯体[PdII(dabdOH)2]Br2を合成し、臭素酸化によって一次元臭素架橋Pd錯体[Pd(dabdOH)2Br]Br2 (PdBr1)を合成した。PdBr1では、ヒドロキシ基と対アニオンとの間にもう一つ水素結合が追加され、対アニオンをMX鎖から離す効果があることが確かめられた。これにより、Pd-Pd間距離は5.18Aとこれまでに知られているPdBr錯体では最も短くなり、室温でも平均原子価(AV)相であった。種々の測定から、PdBr1では、分解が始まる443 Kという高温までAV相が安定化されていることが明らかとなった。これは、これまでに報告されているM = PdのMX錯体の最高記録を133 Kも上回る値であり、水素結合を導入するというアプローチの有効性を示している。さらに、電気伝導率を測定したところ、室温で38 S cm-1にも達し、既存のPdBr錯体の記録の1万倍という極めて高い値を示した。この記録は既存のMX錯体中で最も電気伝導率の高い物質であった。このように、配位子と対アニオン間に水素結合という新たな相互作用を導入するというアプローチは、一次元鎖を圧縮する極めて有効な手法であることが確かめられた。

臭素架橋Pdにおける平均原子価の実現や塩素架橋Pd錯体における平均原子価状態の実現など、新電子相の創出、さらには同錯体においてMX錯体中最高の電気伝導率を実現するなど、ナノワイヤー金属錯体における多くのブレークスルーを果たした。さらには、様々なナノワイヤー金属錯体の熱電特性を評価し、中には500μV/Kという比較的高いSeebeck係数を見いだした。平均原子価状態にあるPdBr錯体を得たため、この錯体の詳細を明らかにするために種々の測定を行った。その結果、この錯体の電気伝導率は40 Scm^-1と非常に高く、PdBr錯体としてのこれまでの最高記録から100万倍も向上していることが明らかとなった。また、試料を加熱しても平均原子価状態から混合原子価状態への相転移が現れることはなく、443 Kで分解が起こった。このような高温まで平均原子価状態を維持しているPdBr錯体は初めてである。これは、面内配位子のヒドロキシ基が対アニオンであるBr-イオンを遠ざけることで、一次元鎖間が離れ、代わりに一次元鎖方向への圧縮が起こったことで、平均原子価状態が安定化されたものと考えられる。申請者らは、これまでに例のない400K以上で平均原子価状態をとるBr架橋Pd錯体の合成に成功した。また、擬一次元ハロゲン架橋金属錯体と呼ばれる物質系を中心にその熱電特性の評価を行った。擬一次元ハロゲン架橋金属錯体はNi, Pd, Ptを中心金属とした一次元電子系物質であるが、CoやCuなどをドープすることでその電子状態を連続的に制御できることが知られている。我々はNi錯体とPd錯体に対してCoをドープすることでどのように熱電特性が変化するかを明らかにした。これまでに得た主な成果は、1.混合原子価ー平均原子価相転移を示す新規臭素架橋パラジウム錯体の開発、2.室温で平均原子価状態を示す新規新規臭素架橋パラジウム錯体の開発である。今後、これらの化合物を用いて様々な物理的測定を通して新奇現象を明らかにしていく予定であるが、そのベースには必ず新物質の作成が必要であり、1年目でここに示した新物質を開発できたことから、今後の研究につながると考えている。また、本錯体のデバイス化を視野に入れ、ナノ粒子化、単一分子層薄膜の作成などの試みも行っており、これまでにナノ粒子化による吸収極大波長のシフトなども観測されるなど、バルク結晶とは異なる物性を示しており、ナノ粒子化による効果を得ている。このように、新物質探索とナノファブリケーションを並行しておこなっており、次年度以降のデバイス化にむけて着実に下地を整えている。平成28年度は、これまでの研究をさらに進め、1新物質の開発、2電気二重層トランジスタを利用したキャリアドーピング、3低次元電子系特有の物性(熱電特性など)の開拓を行っていく予定である。1に関しては、これまでに一例も報告例がないPt錯体での平均原子価状態を実現したい。これまでの研究でPd錯体でも面内配位子を適切に選択すれば、比較的容易にPd(III)の平均原子価状態を実現できることがわかってきており、同様の配位子をPt錯体に適用することでPt錯体で平均原子価状態を実現できる可能性は十分にあると考えられる。また、Au錯体では、メチルアンモニウムイオンを用いたAu錯体の合成に成功したが、アルキルアンモニウムイオンは多岐にわたるため、これらの導入を網羅的に試みていく予定である。2に関しては、名古屋大学の竹延教授と共同で研究を推進していく予定であり、同教授の同意をすでに得ている。
ヒスタミンの分解と再取込み系に関する新規作成KOマウスによる機能研究

ヒスタミンは脳内で神経伝達物質として機能しており、睡眠やストレス応答などにおいて重要な役割を担っている。我々は神経細胞から放出されたヒスタミンがどのように除去されるかというヒスタミンクリアランス機構について研究を行った。その結果、ヒスタミンを不活化するhistamine N-methyltransferase分子がヒスタミンクリアランスに重要であることを明らかにした。ヒスタミンは、必須アミノ酸であるL-ヒスチジンからヒスチジン脱炭酸酵素(histidine decarboxylase, HDC)によって合成される。主な産生細胞は、視床下部、結節乳頭核に細胞体を持つヒスタミン神経、胃ECL細胞、マスト細胞、好塩基球などで、4種類のGPCR受容体により機能が発揮される。H1受容体の機能研究は最近H1受容体のX線解析が報告されたように多くの研究がなされている。またノックアウト(KO)マウスも我々の研究を中心にH1H4受容体、HDCで作成されて多くの研究が発表されているが、分解系のヒスタミンN-メチルトランスフェラーゼ(HNMT)遺伝子KOマウス作成に関してまだ報告されていない。脳におけるヒスタミン分解系であるHNMTの機能について、KOマウスを用いて明らかにすることは学術的に重要であり、またHNMT阻害薬などの新しいヒスタミン系の創薬に発展できる可能性がある。脳における神経伝達物質ヒスタミンの増加は、アルツハイマー病になりにくい、抗ストレス・抗不安、抗疲労作用がある、ミクログリアの機能を健全に保ち神経保護作用がある、認知機能を高める、抗肥満作用があるなど改善効果が期待される。ヒスタミンには特異的トランスポーターは存在しないために、マスト細胞における取り込みに非特異的トランスポーターOCT3が関係していると考えられていたが、我々は最近、グリアに発現している非特異的トランスポーターPMAT(plasma membrane monoamine transporter)がヒスタミンの取込に重要な分子であることを明らかにしている(Yoshikawa T, Yanai K, et al.Glia 2013, 61, 905-916)。本研究によりHNMT-KOマウスとPMAT-KOマウスを初めて作成することができた。現在、表現型を解析している。ヒスタミン研究
液相反応法を利用した可視光応答水分解光触媒電極の作製

可視光を利用できる水分解光触媒のひとつであるLaTiO2Nを研究対象とし、エネルギー変換効率の高い電極の作製を目的とした。理想的な電極作製法は、光触媒膜を金属基板上へ直接作製することであると考え、LaTiO2N膜を金属基板上へ直接作製することを試みた。LaTiO2Nは酸化物前駆体La2Ti2O7膜を窒化して合成されるので、酸化物前駆体を金属基板上へ直接作製することを目指した。従来法では作製が困難であったLa2Ti2O7膜を、水熱法を利用することで作製できることを明らかにした。さらに、La2Ti2O7膜を窒化することでLaTiO2N膜を作製することに成功した。作製したLaTiO2N膜について光電気化学測定を行った結果、LaTiO2N膜が可視光照射下においてn型半導体として光触媒能を有することが明らかとなった。さらに、作製したLaTiO2N膜の活性向上を目指し、光電気化学反応に用いる電解質溶液が光電流密度に与える影響を検討した。窒化過程での高温加熱による窒素欠陥の生成を抑制するため、窒化過程を経ない酸窒化物膜の直接作製を目指した。その方法として、低温条件下で結晶性の窒化物膜の直接作製が可能である溶融塩電解法を選択した。溶融塩電解を行うための装置を立ち上げ、タンタル基板上へ窒化タンタル膜の作製を試みた。LiCl-KCl-Li3N溶融塩中でタンタル基板をアノード分極し、3 h反応させた。得られた生成膜について元素分析した結果、タンタルと酸素が検出され、窒素は検出されなかった。反応系内に水分などの酸素源が混入していると考えられるので、今後装置の改良が求められる。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。
脳脊髄液中のマイクロRNAを用いた精神疾患バイオマーカーの開発

本研究では、うつ病など精神疾患の脳脊髄液中マイクロRNAバイオマーカーの開発を目指した。収集済みの精神疾患脳脊髄液と、うつ病、統合失調症、双極性障害、健常対照合計106例のマイクロアレイ測定結果から候補分子を選択し定量PCRによる検証を試みた。アレイの結果から延べ193分子を選択したが、定量PCRによる解析により定量性の確保できる分子は限られることが明らかとなり、実用性の観点等から40分子に絞り込んだ。その中には、うつ病の一部で顕著に亢進しているmiR-3620-5pや重症度と相関するmiR-1908などが含まれていた。今後、亜型分類マーカーを中心とした実用化を目指したい。本研究は、統合失調症、うつ病など精神疾患の脳脊髄液(CSF)中miRNAマーカーを開発することが目的である。候補分子(申請時39分子)は既にマイクロアレイの解析で得られており、その検証のため、本年度はまず、定量PCRによるmiRNA測定系の構築を行うことを目標にしていた。結論としては、リアルタイムPCRを用いた場合、miRNAの検出自体は多くの分子で可能であるが、候補マーカーの検証に必要な定量性を確保することが困難であることが判明した。CSFからのRNA抽出はマイクロアレイと同じ方法(Qiagen社のキット)で行い、当研究部の保有するリアルタイムPCR解析装置(Applied Biosystems社)にて、内在性コントロール(RNU44, 28)や比較的高発現が見込まれる候補(mir-24)、低発現が見込まれる候補(mir-4513)を中心に、TaqMan microRNA assay(Applied Biosystems社)にて解析を行った。通常のプロトコールでは比較的高発現と見込まれるRNU44やmir-24であってもCT値35以上であった。mRNAの測定ではCT値25-30以下でないと、必要な定量性(CV 20%以下)は確保できないことが分かったため、逆転写反応やPCR反応系の改善などを中心に測定を行ったが、高発現分子でもCT値32を割ることはできなかった。申請時点でマーカー候補分子として39個のmiRNAを選択していたが、特許を出願するため、更に詳細な統計的解析を行った。具体的には、平均値の差、正常値からの逸脱症例数、症状との相関などを再選択、グラフを作成して確認を行い、最終的に統合失調症45分子、うつ病97分子を含む合計193分子を選択し、特許を申請した(「miRNAを用した精神疾患判定マーカー」、特願2015-008710)。前年度はCSFマイクロアレイデータの統計解析により193分子を選択し特許申請した。それらのマーカー候補を定量PCRにより検証することを目指していたが、CSF中のmiRNA濃度が極めて低いため既存のリアルタイムPCRでは十分な感度・定量性が確保できなかった。本年度は、施設に新たに導入されたデジタルPCRによる検証を目指していた。デジタルPCRはメーカーのトレーニングと技術指導を受けつつ実施した。7つのプローブ(RNU44, 48, miR-24, 659, 4484, 4515, 4749)について条件検討を行い、少なくとも4プローブについて測定可能となったが、1000 copy以下では定量性が不十分であることも判明した。また、10種のプローブの解析により、リアルタイムPCRのCT値と、マイクロアレイの蛍光強度との間には関連が認められ、デジタルPCRの1000copyはアレイの約400RFUに相当することが判明した。そこで、昨年度のアレイの解析結果より平均蛍光強度が400RFU以上の分子40を、再現確認可能性の高いマーカーとして再選択した。また、感度の向上と背反するが、マーカーの機能的な意義を考えるうえでは近年、ガンやアルツハイマー病で最近研究が進んでいるextracellular vesicles (EVs)に含まれるmiRNAを測定することも重要であると考え、CSFにおけるEVs由来のmiRNAを測定する系の開発も試みた。主要三社(Q社、I社、S社)のキットを用いたところいずれも類似した結果(3種のプローブで測定)を得られたが、Q社が優れていいた。また全miRNAのうちEVs由来が10-30%以上と高率を占めていることも予備的に判明した。本年度、第一の目標であったデジタルPCRによるCSF中miRNAの測定系は構築できた。飛躍的な感度・定量性は得られなかったが、これはガン等と比べ精神疾患の特性上マーカーの統計的な効果量が小さく求められる定量性が高い(概ねCV<20%)であることも影響している。第二の目標であった候補マーカーの検証は次年度に持ち越されることになった。一方、本年度までの結果をもとに、候補分子自体を発現量(検証可能性)の高さで絞りこむことができた。また、機能的意義の高いEVs由来のCSF中miRNAを測定することにも成功した。本研究は、統合失調症、うつ病など精神疾患の脳脊髄液中miRNAバイオマーカーを開発することが目的である。これまでに統合失調症30例、うつ病30例、双極性障害16例、健常対照30例のCSFマイクロアレイデータ解析(約2000分子)により193分子を選択しており、それらのマーカー候補を定量PCRにより検証することを目指していた。

前年度までに、CSF中のmiRNA濃度が極めて低く、リアルタイムPCR法のブラッシュアップや高感度なデジタルPCR法を用いても1000copy以下では十分な定量性が確保できないことが明らかとなっていた。一方、マイクロアレイの400RFUが1000copyに相当することも判明したため、統計的に有意かつ400RFU以上の分子40個を再選択した。これらのうち、特に発現量が高くかつ有力なマーカー候補分子および内部標準として使用できる可能性の高い分子(miRNA全部の量を反映していると考えられ、検体間での変動が小さい)、合計8分子を選択し定量性の検証を行った。定量測定にあたっては、より少ない試料量で充分な定量性が確保できるよう解析系を最適化した。そのうえでマーカー候補3分子、内部標準候補1分子について各々32検体(マイクロアレイ測定に用いた検体のサブサンプル)の定量解析を実施し成功した。しかし、いずれの分子についてもリアルタイムPCRの測定値とマイクロアレイの測定値との間に有意な相関はみられなかった。相関がみられない原因としては発現量が低いこと以外にmiRNAの構造上の要因(極めて短い)に由来する可能性があると考えられた。miRNAのマイクロアレイ同士の解析では比較的再現性が高いことも報告されている。そこで、今回はマイクロアレイ解析の結果を中心にPCRの解析結果も基礎的なデータとして加えて公表することにした。本研究では、うつ病など精神疾患の脳脊髄液中マイクロRNAバイオマーカーの開発を目指した。収集済みの精神疾患脳脊髄液と、うつ病、統合失調症、双極性障害、健常対照合計106例のマイクロアレイ測定結果から候補分子を選択し定量PCRによる検証を試みた。アレイの結果から延べ193分子を選択したが、定量PCRによる解析により定量性の確保できる分子は限られることが明らかとなり、実用性の観点等から40分子に絞り込んだ。その中には、うつ病の一部で顕著に亢進しているmiR-3620-5pや重症度と相関するmiR-1908などが含まれていた。今後、亜型分類マーカーを中心とした実用化を目指したい。本年度中にCSF中miRNAのリアルタイムPCRによる定量系を確立するという目標は果たすことができなかった。CSF中のmiRNAの量が非常に低いことが、その原因であった。マイクロアレイでは十分に検出できていたため、より高感度と思われていたリアルタイムPCRで、十分な測定ができなかったことは予想外であった。後述するように、その対応としてデジタルPCRを利用できることが判明したため、導入されるまで、本研究で他にやるべきことに注力した。すなわち、既存のデータの再解析をおこない、有望なマーカー候補を、より多く得て特許の出願を行った。次年度は定量可能であったトップ候補分子について検証を試みる。発現量が高い分子についてはコストの低いリアルタイムPCRを用い、統計上は有望であるが発現量が低めの分子についてはデジタルPCRを用いる。また、発現量が高い分子について、より機能的意義の高いEVsにおける発現も検討する。分子精神医学最近、当研究所の共通機器としてデジタルPCR(Lifetechnology社QuantStudio 3D)が導入された。