hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ベータ酸化系を制御するシグナル系の解析

肺線維症患者肺組織より独自に樹立した初代培養細胞(肺線維症細胞)では、ミトコンドリアでβ酸化を担うVLCAD1のリン酸化レベルが有意に減少していた。VLCAD1のリン酸化部位はセリン586でPKAによりリン酸化されること、変異体の解析から、リン酸化の低下が活性酸素生成の促進につながることを明らかにした。β酸化系がPKAなどのミトコンドリア内シグナル伝達分子により調節されていて、その異常が活性酸素生成につながる可能性を示した。β酸化は生体のエネルギー供給において中心的な役割を担う代謝系であり、主にミトコンドリア内膜に存在する脂肪酸代謝酵素を含む複雑な分子複合システムである。β酸化の最初の反応ステップがアシルCoA-デヒドロゲナーゼ(ACAD)によるαβ位の脱水素反応(α,β-dehydrogenation)で、システム全体の律速となっている。このACADによる脱水素反応で生成する電子がフラビン分子を介して呼吸鎖へ供給されるが、同時に、活性酸素の発生とも密接に関連することから正常細胞のミトコンドリア内ではシステム全体が厳密に制御されている。β酸化の制御機構についての報告はほとんどないことから、本研究ではβ酸化を調節するシグナルの解明を目的とした。独自に肺線維症患者肺組織より樹立した初代培養細胞(肺線維症細胞)を用いた解析より次のことを明らかにした。1、肺線維症細胞では活性酸素や過酸化脂質の産生量が有意に高く、その代償として抗酸化ストレスタンパク質の発現が極めて高かった。2、ミトコンドリアタンパク質のプロテオミック解析を行い、肺線維症細胞に特有な変化を検出しタンパク質を同定した。3、その一つがACADファミリーに属するVLCAD1であった。正常細胞ではACADファミリーに属するVLCAD1がPKAにより恒常的にリン酸化されているのに対し、肺線維症細胞では有意に減少していた。4、PKAによるVLCAD1のリン酸化部位はセリン586であった。5、このリン酸化部位の変異体を用いた解析から、リン酸化と過酸化脂質の生成とが密接に関連することが判明した。以上のことから、β酸化システムがリン酸化などのシグナルにより調節されていること、過酸化脂質の生成にβ酸化システムが関与する可能性が示唆された。昨年度、β酸化の最初の反応ステップを司るアシルCoA-デヒドロゲナーゼ(ACAD)ファミリーに属するVLCAD1がPKAにより恒常的にリン酸化されていることを見出し、さらに、このリン酸化がVLCAD1酵素活性に必須であること、このリン酸化を抑制すると活性酸素や過酸化脂質の産生量が増加することを明らかにした。これらの結果は、β酸化系を含むエネルギー代謝系のコンポーネントがリン酸化などのシグナルにより調節されていることを示唆した。そこで本年度は、ミトコンドリアタンパク質のプロテオーム解析を行い、リン酸化ペプチドの解析およびリン酸化の意義の解明に取り組んだ。これまでに以下の結果を得た。1、β酸化系を含むエネルギー代謝系のコンポーネント数種をチロシンリン酸化タンパク質として同定した。2、ミトコンドリアには代表的なチロシンキナーゼの一つc-Srcが比較的高く発現していた。3、チロシンキナーゼ阻害剤であるPP2で細胞を処理するとミトコンドリアの酸書消費が著しく阻害され、同時にATP産生も抑制された。4、同様の変化がCskをミトコンドリア内に発現した場合にも観察された。5、c-Srcのターゲットとしてβ酸化系に含まれる1分子、TCA回路に含まれる1分子、電子伝達系に含まれる2分子のリン酸化部位を特定した。6、リン酸化部位のチロシン残基をアラニンに置換した変異体をミトコンドリア内に発現させると細胞死や活性酸素の上昇が観察された。以上のことから、c-Srcがβ酸化系の調節や過酸化脂質の生成に関与し、直接エネルギー代謝系を制御する可能性が示唆された。精製ミトコンドリア標品より既報に従いβ酸化系酵素複合体や電子伝達系複合体などを調製し、複合体タンパク質のプロテオーム解析を行なった。その結果、β酸化系を含むエネルギー代謝系の多くのコンポーネントがリン酸化やアセチル化などの翻訳後修飾を受けていることが明らかになった。これらの翻訳後修飾の生物学的意義を明らかにするために、HEK細胞に修飾を受けるアミノ酸を置換した変異体を強制発現させ細胞機能の変化を観察した。

その第一段階として、ミトコンドリアに比較的高く発現している代表的なチロシンキナーゼc-Srcについて検討した。今回、c-Srcのターゲットとしてβ酸化系に含まれる1分子、TCA回路に含まれる1分子、電子伝達系に含まれる2分子のリン酸化部位を特定したが、変異体の発現により、(1)ATP産生を抑制する、(2)活性酸素産生を有意に促進する、(3)明らかな変化が検出できない、などに分類できることが判明した。また、多くの変異体がアポトーシスを誘導したが、(1)または(2)の現象が同時に観察された。一方、活性酸素を恒常的に産生する変異体発現細胞株の遺伝子発現解析から、これらの細胞ではセレン含有タンパク質やチオレドキシンなどの抗酸化タンパク質や、エネルギー代謝経路の変換を担うタンパク質の発現が高くなる傾向を示した。以上のことから、シグナル系が直接β酸化系の調節や過酸化脂質の生成に関与することが示唆された。
BDNFは小脳外顆粒層由来顆粒細胞のアポトーシスを誘導するか?

発生過程において小脳顆粒細胞は、外顆粒層で増殖分化し、グリア細胞を介して移動、内顆粒層にたどり着きシナプス結合を行うと考えられ、それぞれの層でアポトーシスを行うことが知られている。生後一週間のラット小脳全体より単離した小脳顆粒細胞を通常のK+濃度(5.4mM)下で培養すると、細胞は突起伸長・細胞肥大等の分化の後、変性を始め、死滅する。この細胞死は脱分極剤、BDNFなどにより抑制され、アポトーシスの特徴をもつことが明らかになった)。この過程で起こる遺伝子発現をノーザンブロット法により調べると、c-junは細胞死に伴い弱く誘導された。これに対して。cyclin D1(3.7kbp)は顕著に誘導された。抗cyclin D1抗体によるウェスタンブロットによっても増加が確認された。免疫組織化学では顆粒細胞の核のみならず、細胞死に先行して細胞質も染色されることが見出された。更に、この細胞死はミノシンなどの細胞周期阻害剤によって抑制された。この未熟な顆粒細胞で見出された。cyclin D1の顕著な誘導は成熟した顆粒細胞では起こらなかった。この結果はin vivoにおけると免疫組織化学的実験と符合すると考えられる。更に、外顆粒層のみを単離培養して、神経栄養因子などの効果を調べた。その結果、小脳全体を分散培養した場合と異なって、BDNFは細胞死を抑制しなかった。このため、BDNFの作用に関して、分化した顆粒細胞に対してはBDNFは細胞生存を促進するが、細胞増殖系の神経前駆細胞に対しては異なる作用を持つと考えられた。神経細胞は発生過程で大量の細胞死を起こすことが知られ、これがシナプス形成の確立に重要な役割を果たしている。小脳顆粒細胞系ではin vitroで大量の神経細胞死が起こり、且つBDNFで抑制されることから中枢神経プログラム細胞死モデルとみなされる(Suzuki&Koike,1997;Tanaka et al.,1998など)。生後一週間のラット小脳全体より単離した小脳顆粒細胞を通常のK+濃度(5.4mM)下で培養すると、細胞は突起伸長・分化の後(2-4DIV)、変性を始め、5-6DIVには約半数の細胞が死滅する。この細胞死はタンパク合成及びRNA合成阻害剤などにより抑制される。既知の遺伝子の発現に関してノーザンブロット法により調べた。対照としてはG3PDH(1.3kbp)の発現を調べた。c-fosは全く検出されなかった。c-jun(3.2kbp)は3DIVでもわずかに検出され、5DIVで弱く誘導された。これに対して、cyclinD1(3.7kbp)は3DIVでは検出されず、4一5DIVで顕著に誘導された。抗cyclin D1抗体による免疫組織化学では顆粒細胞とミクログリアに染色性を認めた。アフィデイコリン処理で顆粒細胞に特異的な発現を認めた。cyclinD1(3.7kbp)の顕著な誘導は本培養条件下での小脳顆粒細胞死に対して重要な役割を持つものと考えられ、この結果はin vivoにおけると免疫組織化学的実験と符合すると考えられる(Sakai et al.,投稿中)。更に、外顆粒層のみを単離培養して、栄養因子などの効果を調べた。その結果、小脳全体を分散培養した場合と異なって、BDNFは細胞死を誘導した。現在この効果の分子機構を詳細に検討している。これに対して。
カナダ北極海諸島における第三紀樹木遺体の発堀

現在の北極域は雪氷に閉ざされた寒冷な気候下にあるが,中世代新生代第三紀には温暖湿潤で,陸上には森林が繁茂していたことが,北極海諸島に出土する樹木の化石などから知られている。通常,これらの化石は根の浮いた樹木の破片として出土するので,かって樹木が生育していたことの証明にはなるが,その生育環境についてさしたる情報を提供するものではない。これに対し,共同研究者J.F.バシンジャーが1986年アクセルハイベルグ島(ア島)で,また我々が予備調査において昨年エルズミュア島(エ島)で発見した第三紀の化石林は,往時の森林が生育時の状態で根を張ったまま埋没したもので,樹種構成はもとより林木相互の位置や競合関係に至るまで,森林としての構造が保存されており,往時の生育状況や,極地方において森林の成立を可能にした地球環境について,単なる樹木化石とは較べものにならないほどの情報を与えるものである。本年度は,森林とその生育環境の復元を目的に,ア島の『化石林の丘』およびエ島の『ミュージアムサイト』と『ニューサイト』で化石林の発掘と復元を行った。これら三箇所の調査地いずれにおいても,数十層の地層が露出しており,各層に化石林が含まれている。このうち『化石林の丘』の特徴は,その地層が水平に保たれているとともに,生育時の状態で出土する根株,丸太,落枝落葉が化石とは言うもののミイラ化した木材で未だ珪化していない点である。これに対しエ島の化石林は二箇所とも地層が傾斜し,出土物はすべて珪化している。珪化していない樹木の遺体からはより多くの情報が得られるので,調査の主眼はア島の化石林の丘においた。ただし,これが第三紀始新世(3700-5800万年前)のものであるのに対し,エ島の化石林は同,暁新世(5800-6600万年前),とりわけニューサイトの化石林は中世代白亜期の可能性もあり,これら三つのサイトを繋ぐことにより,地球が地球寒冷化したK-Tバウンダリーから第三紀前半を被うことができるので,この点にも留意して調査を行った。以下に各サイトの概要を記す。化石林の丘:水平に堆積した地層と山腹斜面が成す等高線に沿って線状に化石林が出土するのが一般的だが,うちN層は稜線上にあって水平に風食されているため,面積0.4ヘクタールにわたり化石林が面状に露出している。N層の表土を剥いで,この中に存在するすべての根株を同定した後,その位置を測量し,直径,高さ,テーパー,根の形態,根圏の深さ等につき毎木調査を行い,森林の復元に必要な定性的・定量的なデータを収集した。また室内での分析に供するため,根株,樹皮,落枝落葉層,古土壌などを採取し持ち帰った。N層以外の化石林については,化石林の丘全体の地形測量に併せて地層の柱状図を作成し,各層から線状に出土する化石林と地質の対比から堆積環境の変化を復元するためのデータを収集した。ミュージアムサイト:地層が傾斜しているため,地表面には各層に含まれる森林が線状に露出している。地形測量を行ったうえ,化石林の丘の場合と同様,露出した根株の位置測量に併せてその直径,高さ,テーパー,根の形態,根圏の深さなどを測定した。この方法は,現生の森林調査に例えるならばラインサンプリングに相当し,これと同水準の森林復元が可能である。ニューサイト:ミュージアムサイトと同様,地層が傾斜しており,ラインサンプリングの手法で森林復元を行った。ただしミュージアムサイトより保存が悪い。最終的な結果は今後の解析を待たねばならないが,少なくとも現地の調査より,第三紀の北極圏には現在の温帯林暖帯林に相当する現存量と一次生産を持つ森林が存在したことが明らかになった。本研究とは別に,地球化学的な炭素循環の研究から,第三紀の大気には現在の35倍の二酸化炭素があったとされているが,基本的にはこれが往時の北極地方で森林の存在を可能にした最大の要因であろう。また現在懸念されている二酸化炭素の倍増にともなう気候の変化について,大気大循環モデルの予測から特に極地方での気温上昇が著しいと言われているが,本研究は,こうした数値モデルによる地球温暖化の予測に,具体的なナチュラルアナログを提供するものである。

これら三箇所の調査地いずれにおいても,数十層の地層が露出しており,各層に化石林が含まれている。このうち『化石林の丘』の特徴は,その地層が水平に保たれているとともに,生育時の状態で出土する根株,丸太,落枝落葉が化石とは言うもののミイラ化した木材で未だ珪化していない点である。これに対しエ島の化石林は二箇所とも地層が傾斜し,出土物はすべて珪化している。珪化していない樹木の遺体からはより多くの情報が得られるので,調査の主眼はア島の化石林の丘においた。ただし,これが第三紀始新世(3700-5800万年前)のものであるのに対し,エ島の化石林は同,暁新世(5800-6600万年前),とりわけニューサイトの化石林は中世代白亜期の可能性もあり,これら三つのサイトを繋ぐことにより,地球が地球寒冷化したK-Tバウンダリーから第三紀前半を被うことができるので,この点にも留意して調査を行った。以下に各サイトの概要を記す。化石林の丘:水平に堆積した地層と山腹斜面が成す等高線に沿って線状に化石林が出土するのが一般的だが,うちN層は稜線上にあって水平に風食されているため,面積0.4ヘクタールにわたり化石林が面状に露出している。N層の表土を剥いで,この中に存在するすべての根株を同定した後,その位置を測量し,直径,高さ,テーパー,根の形態,根圏の深さ等につき毎木調査を行い,森林の復元に必要な定性的・定量的なデータを収集した。また室内での分析に供するため,根株,樹皮,落枝落葉層,古土壌などを採取し持ち帰った。N層以外の化石林については,化石林の丘全体の地形測量に併せて地層の柱状図を作成し,各層から線状に出土する化石林と地質の対比から堆積環境の変化を復元するためのデータを収集した。ミュージアムサイト:地層が傾斜しているため,地表面には各層に含まれる森林が線状に露出している。地形測量を行ったうえ,化石林の丘の場合と同様,露出した根株の位置測量に併せてその直径,高さ,テーパー,根の形態,根圏の深さなどを測定した。この方法は,現生の森林調査に例えるならばラインサンプリングに相当し,これと同水準の森林復元が可能である。ニューサイト:ミュージアムサイトと同様,地層が傾斜しており,ラインサンプリングの手法で森林復元を行った。ただしミュージアムサイトより保存が悪い。最終的な結果は今後の解析を待たねばならないが,少なくとも現地の調査より,第三紀の北極圏には現在の温帯林暖帯林に相当する現存量と一次生産を持つ森林が存在したことが明らかになった。本研究とは別に,地球化学的な炭素循環の研究から,第三紀の大気には現在の35倍の二酸化炭素があったとされているが,基本的にはこれが往時の北極地方で森林の存在を可能にした最大の要因であろう。また現在懸念されている二酸化炭素の倍増にともなう気候の変化について,大気大循環モデルの予測から特に極地方での気温上昇が著しいと言われているが,本研究は,こうした数値モデルによる地球温暖化の予測に,具体的なナチュラルアナログを提供するものである。本研究の目的は、カナダ北極海諸島において第三紀の化石林を発掘し、その復元を通じて、樹木の生育が可能なほど温暖だった往時の北極圏の環境を復元することにある。ここで言う化石林とは、森林が生育時の姿を保ったまま埋没保存されたもので、森林を構成するすべての林木だけでなくこれら林木相互の位置関係が保存されているという点で、単なる樹木の化石とは大きく異なり、樹種構成、成長量、バイオマスなど単に当該林分の特性だけでなく、それを取り巻く北極圏全体の環境の復元も可能とするものである。
プニクトゲンを含む三元系希土類化合物が示す新奇な物性変化の系統的研究

結晶構造に就いて先ず述べる.CePtSbはLiGaGe型,CePtAs,CePtPはYPtAs型である事が判明した.CePtNは数種の方法で作成を試みたが現在までのところ結晶の合成までには至っていない.CePdX系では,CePdAsはLidaGe型,CePdPはBeZrSi型結晶構造をとる.CePdNはCePtNと同様結晶構造の決定までには至っていない.LiGaGe型,YPtAs型,BeZrSi型は共に六方晶であり,格子内での原子の配列は略等しく,物性のX依存性を調べるのに好都合な物質群であった.次に成果を述べる.CePtAs,CePtPは電気抵抗に強い異方性を示し,Fermi面を決定すべくdHvA効果の実験を行った.予想通り二次元的な円筒状のFermi面の観測に成功した.CePdAsでもdHvA効果の観測できる良質な結晶の育成に成功し,回転楕円体状のFermi面の観測に成功した.一方,バンド計算も行い実験との良い一致を見た.CePdPの純良化を引き続き続行中である.CePtX系に於いて,XがSb,As,Pと変化するに従い磁化容易軸がC軸方向からC面内に連続的に変化することを明らかにした.EuPdSbはTiNiSi型である.EuPdSbの単結晶の作成にも成功し,dHvA効果の実験も行われた.更には,磁場中比熱及び強磁場磁化過程の測定から磁気相図を決定した.EuPdSbでのdHvA効果の観測の成功は,TiNiSi型結晶構造で初めてであり,学会に大きなインパクトを与えた.PrPtBiでは単結晶の作成までには至らなかったが純良化か行われ,電気抵抗,ホール係数ともに明らかに半導体的になった.以上の如く多くの成果を得て本研究を完了した.結晶構造に就いて先ず述べる.CePtSbはLiGaGe型,CePtAs,CePtPはYPtAs型である事が判明した.CePtNは数種の方法で作成を試みたが現在までのところ結晶の合成までには至っていない.CePdX系では,CePdAsはLidaGe型,CePdPはBeZrSi型結晶構造をとる.CePdNはCePtNと同様結晶構造の決定までには至っていない.LiGaGe型,YPtAs型,BeZrSi型は共に六方晶であり,格子内での原子の配列は略等しく,物性のX依存性を調べるのに好都合な物質群であった.次に成果を述べる.CePtAs,CePtPは電気抵抗に強い異方性を示し,Fermi面を決定すべくdHvA効果の実験を行った.予想通り二次元的な円筒状のFermi面の観測に成功した.CePdAsでもdHvA効果の観測できる良質な結晶の育成に成功し,回転楕円体状のFermi面の観測に成功した.一方,バンド計算も行い実験との良い一致を見た.CePdPの純良化を引き続き続行中である.CePtX系に於いて,XがSb,As,Pと変化するに従い磁化容易軸がC軸方向からC面内に連続的に変化することを明らかにした.EuPdSbはTiNiSi型である.EuPdSbの単結晶の作成にも成功し,dHvA効果の実験も行われた.更には,磁場中比熱及び強磁場磁化過程の測定から磁気相図を決定した.EuPdSbでのdHvA効果の観測の成功は,TiNiSi型結晶構造で初めてであり,学会に大きなインパクトを与えた.PrPtBiでは単結晶の作成までには至らなかったが純良化か行われ,電気抵抗,ホール係数ともに明らかに半導体的になった.以上の如く多くの成果を得て本研究を完了した.平成10年度の最大目標は,CePtAs,CePtPの単結晶の育成であった.われ心れはW(タングステン)坩堝を用いてブリッジマン法で作成を試みた.今回開発した手法を先ず述べる.最初にCeとPtを重量比で1:1に秤量し,トリアーク炉で溶解してCePtのボタンを作る.次にこのボタンを乳鉢で粉砕し,1mm程度の大きさの粒子まで細かくする(粉末にしないのは,酸化を防ぐためである).得られたCePtの粒子と10%増しのAs又はPを石英管に真空封入,横炉に入れて過熱して反応させる.反応は,Pの場合で言えば,未反応の赤色のPが無くなる事をもって終了とする.次に,反応物をペレット状にプレスし,Wルツボ内に再度真空封入して高周波炉を用いてブリッジマン法で単結晶作成を試みた.結果はCePtAs,CePtP共に金属光沢のある奇麗な単結晶をうることが出来た.結晶構造は六方晶YPtAs型である.以下に得られた結果の概要を書く.CePtAs:室温でのa-軸方向とc-軸方向の抵抗比は1:10でc-軸方向に電流が流れにくく異方性が大である.1Kにネール点をもつ反強磁性体で磁場中ではメタ磁性を示す.磁気異方性は弱い.比熱では3.1Kと1Kに異常があり,3.1Kで強磁性になり,1K以下で反強磁性へと転移する.

磁気異方性も強く,磁気モーメントはc-軸方向にある.なお,両物質ともに,dHvAの実験が阪大大貫氏との共同研究で行われ,シグナルが観測された.従って両物質共,純度の高い試料であり,初期の目的は略達成された.dHvAから得られたフェルミ面はほぼ円筒状でありこぼぇ実験から得られた伝導の二次元性を良く再現している.バンド計算との比較は今後の課題である.まず結晶構造はCePtSbはLiGaGE型,CePtAsはYPtAs型である事が判明した.CePdXは数種の方法で合成を試みたが現在までのところ結晶構造を決めるまでには至っていない.CePdX系では,CdPdAsはLiGaGe型,CePdPはBeZrSi型結晶構造をとる.CePdNはCePtNと同様結晶構造の決定までには至っていない.EuPdSbはTiNiSi型である.LiGaGe型,YPtAs型,BeZrSi型,TiNiSi型共に,六方晶であり,格子内での原子の配列はほぼ等しく,物性のX依存性を調べるのに好都合な物質群であった.次に成果を述べる.CePtAs,CePtPは電気抵抗に強い異方性を示し,Fermi面を決定すべくdHvA効果の実験を行った.予想通り二次元的な円筒状のFermi面の観測に成功した.CePdAsでもdHvA効果の観測できる良質な結晶の育成に成功し,回転楕円体状のFermi面述べる観測に成功した.一方,バンド計算も行い実験との良い一致を見た.CePdPの純良化を引き続き続行中である.EuPdSbの単結晶の作成にも成功し,dHvA効果の実験も行われた.更には,磁場中比熱及ぴ強磁場磁化過程の測定から磁気相図を決定した.以上の如く多くの成果を得て完了した.
耕地から河川へのNO3流出のモデル化

本研究の調査地である標津川集水域では、農耕地における純窒素投入量の約25%は土壌中の硝化作用により土壌に保持をうけない硝酸態窒素に変換され、脱窒や植物による吸収を受けずに河川に流出する。この硝酸態窒素は河川や沿岸域の富栄養化を引き起こし、環境の悪化と時には水産業への悪影響をもたらす。そこで農地では、硝酸態窒素の流出を最小限に抑えるための窒素管理が必要となる。農地での窒素管理において重要な事に、河川に流れ出しにくい場所に廃棄窒素を保管すること、土壌の脱窒反応による浄化を最大限に利用することが考えられる。このためには、どの位置に置かれた窒素が最大限の浄化を受けるかを定量的に評価する必要がある。しかし、実測による評価は不可能であるため、モデルによる推定が必要となる。本研究では、脱窒による浄化能を地図上で表現する事を最終目標にしたモデルの開発である。このモデルでは、地下水層を移動する硝酸態窒素が一次反応式(C_t=C_0exp[-kt])に従って脱窒を受けると仮定し、移動速度は始点から最大勾配に沿った河川への距離(distance)と、その勾配(slope)から計算したdistance/slopeに比例すると仮定した。また、現地踏査から河川勾配と硝酸態窒素の負の関係を見出し、硝酸態窒素の流出率が河川勾配の逆数に比例して上昇すると仮定した。このモデルは河川の硝酸態窒素の実測値との適合が極めてよい事が分かった。モデルはNO3濃度の変動の94%を説明した。その結果、調査地の標津川集水域において、純窒素投入量の数%から最大50%近くの硝酸態窒素が河川に流出する前に脱窒によって除去されるという推定結果を得た。しかし、モデル自体の欠点も明らかになってきた。土台にしたモデルは半経験的な理論を土台にしている。そこでこの欠点を克服するために、河川勾配の項に対する理論付けを試みた。具体的には、水理学や河川地理学の公式(マニングの式やLeopoldの経験則)から流出率が河川勾配の逆数に比例する関係を得ることを試みたが、河川勾配の平方根を説明するにとどまった。今後、残りの平方根を説明する理論的作業が必要である。通常、耕地では作物生産の2倍以上の窒素肥料および堆肥が投入され、養分吸収を受けなかった窒素成分(余剰窒素)は、温室効果ガスである亜酸化窒素(N2O)や水圏の富栄養化を担う硝酸イオン(NO3)として環境中に放出される。そこで、生産性を損なわない程度に余剰窒素量を低下させる事、および、集水域内の余剰窒素の浄化機能(脱窒による)を最大限に維持する事が、持続的農業活動の最重要課題の一つとなっている。本研究は、集水域内の脱窒反応をモデル化し、平水時の河川のNO3濃度の実測値から脱窒反応の定量的評価を行う事を最終的な目標としている。本モデルは2つの要素から構成される。1つは、耕地のを辿った河川への距離と標高差をもとに、最大勾配ルートに沿った地下水層中での脱窒反応の進行を計算するサブモデルである。これはHYDROLOGY MODELING機能を用いることで計算可能となるが、今年度はこの計算の自動化が大きな課題であった。

現在、ArcObjectを用いたプログラミングの設計が進行途中の段階にある。もう一つのサブプログラムは、定常的に耕地から河川に供給される、分配の効率を計算する部分で、これは流速に比例すると仮定している。NO3の実測値の解析から、耕地から河川へのNO3の輸送効率を河川の平均勾配の逆数に比例する事が判明した。しかし現在、この理論的根拠を欠いたままでいるのが最大の課題で、次年度の最大の目標となっている。解放水路の平均流速に関する水理学の最も基本的なマニングの式によると、この部分が河床の形態に依存する粗度係数と河川勾配の平方根の逆数に比例する。しかし解析結果からは河川勾配の1乗の逆数に比例する結果が得られ、この矛盾の解明が早急に必要である。農耕地における余剰窒素は、その数十%が土壌中の硝化作用により土壌に保持をうけない硝酸態窒素に変換され、河川に流出する。この硝酸態窒素は河川や沿岸域の富栄養化を引き起こし、環境の悪化と時には水産業への悪影響をもたらす。そこで農地では、硝酸態窒素の流出を最小限に抑えるための窒素管理が必要となる。農地での窒素管理において重要な事に、河川に流れ出しにくい場所に廃棄窒素を保管すること、土壌の脱窒反応による浄化を最大限に利用することが考えられる。このためには、どの位置に置かれた窒素が最大限の浄化を受けるかを定量的に評価する必要がある。しかし、実測による評価は不可能であるため、モデルによる推定が必要となる。本研究では、脱窒による浄化能を地図上で表現する事を最終目標にしたモデルの開発である。このモデルでは、地下水層を移動する硝酸態窒素が一次反応式に従って脱窒を受けると仮定し、移動速度は始点から最大勾配に沿った河川への距離と、その標高差から推定した。また、現地踏査から河川勾配と硝酸態窒素の負の関係を見出し、硝酸態窒素の流出率が河川勾配の逆数に比例して上昇すると仮定した。このモデルは河川の硝酸態窒素の実測値との適合が極めてよい事が分かった。その結果、調査地の北海道道北地帯の中規模河川において、余剰窒素の数%から最大50%近くの硝酸態窒素が河川に流出する前に脱窒によって除去されるという推定結果を得た。しかし、モデル自体の欠点も明らかになってきた。土台にしたモデルは半経験的な理論を土台にしている。そこでこの欠点を克服するために、河川勾配の項に対する理論付けを試みた。具体的には、水理学や河川地理学の公式(マニングの式やLeopoldの経験則)から流出率が河川勾配の逆数に比例する関係を得ることを試みたが、河川勾配の平方根を説明するにとどまった。今後、残りの平方根を説明する理論的作業が必要である。
マイクロNMRセンサによる燃料電池用固体高分子膜内の電極近傍水分量計測と湿潤制御

燃料電池用固体高分子膜内の水素極・酸素極での水分濃度にイオン伝導度は強く依存し、発電性能が影響を受ける。この高分子膜内の水分量計測を高空間・時間分解で計測するためにマイクロRFコイルを用いて局所計測を行えば、膜内水分濃度が短時間で計測できる。PEM内含水量のリアルタイムモニタリングを開発目標として、小型表面コイルにより核磁気共鳴(NMR)信号を受信し、PEM内の局所含水量を短時間で計測できる手法を開発した。燃料電池の始動時や負荷変動時にはPEM内の輸送現象が過渡的に変動する。その現象の時定数は110秒のオーダと推測されている。PEM内輸送現象を時間応答性まで含めて把握するには、過渡変動時のPEM内含水量を計測する必要がある。さらに、複数センサーを用いれば、燃料電池内の含水量分布計測が可能となる。そこで、MEA(Membrane Electrode Assembly)のアノード側とカソード側に二つずつのセンサーを配置して、MEAに直流電圧を印加して水電解運転させた。この場合のNMR信号強度の過渡変動を小型NMRセンサーで捉える試行実験を行った。計測システムは、8系統の独立した送受信系を持っており、8個の表面コイルに励起パルスを同時に送信して、8つのNMR信号を同時に受信・検波できるという特徴がある。8個の表面コイルをMEAに貼り付け、含水量を8点同時に計測できるマルチNMRセンサー計測システムを製作した。MEAに直流電圧を印加して、アノード側とカソード側で取得されたエコー信号強度の時間経過を取得した。エコー信号強度と含水量が正の関係にあるとし、エコー信号の挙動を調べた。その結果、アノード側では電気分解と電気浸透流によってPEM内の含水量が早く減少し、カソード側では電気浸透流によって一旦は含水量が増加するが、その後は徐々に減少していく様子が本計測システムで捉えられた。このセンサーの開発により燃料電池内のリアルタイム計測と制御へと展開できる基礎を築いた。この「マイクロNMRセンサ」による水分量モニタリングに基づいて水蒸気供給量の制御を行えば、膜の最適な湿潤状態の維持が可能となる。本研究では「マイクロNMRセンサ」の開発と高分子膜両電極近傍の水分濃度計測を行い、膜の湿潤制御への適用を試みる。本年度は、小型MRIシステムを用い、マイクロRFコイルシステムの構築と水分量計測法の確立、さらには高分子膜への適用試験を以下のように行った。(1)マイクロRFコイルと小型LC共振回路を製作し、共振回路特性を計測し、低ノイズ化と高感度化を行った。共振回路特性としてQ値、さらに感度特性として信号雑音比を評価した。(2)マイクロNMRセンサによる水分量計測の定量化手法の確立を目指し、標準試料によるT1,T2緩和時定数をInversion recovery法とCPMG法により計測した。この手法を基本シーケンスとし、パルス間隔を変えて水分量計測でのシーケンスの最適化を行い、定量計測法の基盤を確立した。(3)固体高分子膜に電磁波の透過が可能な5mm厚の電極・触媒層を無電解メッキ法により高分子膜表面に析出させ、マイクロRFコイルを設置して、マイクロNMRセンサによるNMR信号取得を行った。この信号を基にして固体高分子膜内の水分量計測法の検証を行った。そこで、PEM内含水量の過渡変動を小型NMRセンサーで捉える試行実験として、PEMを水電解モードで運転した際の含水量変化を計測した。MEAの含水量は約12[H_2O/SO_3^-H^+]、MEAの両電極間に印加した電圧は2.83.4V、電流密度は0.060.08A/cm^2であった。電解中のMEAには水を供給していない。このような場合、アノード側のPEM内の水が時間と共に電気分解と電気浸透流によって減少すると推測される。4.8秒間隔で水電解運転時の信号強度の変化を計測し、信号強度が低下していく様子を捉えることができた。また、RFコイルはPEM内のどの領域からNMR信号を主として受信しているのかが計測領域を特定する上で重要となる。

そこで、円形コイルが空間に作る励起磁場分布をビオ・サバールの法則を用いて算出し、実測値から求めた励起磁場強度と磁化ベクトルの励起角度の関係、励起角度と複数回励起によるエコー信号強度の関係と、さらにコイルの受信感度分布を考慮して相対的なエコー信号受信強度分布を求めた。励起磁場解析から小型表面コイルでの計測領域は深さ方向が直径の5分の1程度までの円盤状領域であることが明らかとなった。燃料電池用固体高分子膜内の水素極・酸素極での水分濃度にイオン伝導度は強く依存し、発電性能が影響を受ける。この高分子膜内の水分量計測を高空間・時間分解で計測するためにマイクロRFコイルを用いて局所計測を行えば、膜内水分濃度が短時間で計測できる。PEM内含水量のリアルタイムモニタリングを開発目標として、小型表面コイルにより核磁気共鳴(NMR)信号を受信し、PEM内の局所含水量を短時間で計測できる手法を開発した。燃料電池の始動時や負荷変動時にはPEM内の輸送現象が過渡的に変動する。その現象の時定数は110秒のオーダと推測されている。PEM内輸送現象を時間応答性まで含めて把握するには、過渡変動時のPEM内含水量を計測する必要がある。さらに、複数センサーを用いれば、燃料電池内の含水量分布計測が可能となる。そこで、MEA(Membrane Electrode Assembly)のアノード側とカソード側に二つずつのセンサーを配置して、MEAに直流電圧を印加して水電解運転させた。この場合のNMR信号強度の過渡変動を小型NMRセンサーで捉える試行実験を行った。計測システムは、8系統の独立した送受信系を持っており、8個の表面コイルに励起パルスを同時に送信して、8つのNMR信号を同時に受信・検波できるという特徴がある。8個の表面コイルをMEAに貼り付け、含水量を8点同時に計測できるマルチNMRセンサー計測システムを製作した。MEAに直流電圧を印加して、アノード側とカソード側で取得されたエコー信号強度の時間経過を取得した。エコー信号強度と含水量が正の関係にあるとし、エコー信号の挙動を調べた。その結果、アノード側では電気分解と電気浸透流によってPEM内の含水量が早く減少し、カソード側では電気浸透流によって一旦は含水量が増加するが、その後は徐々に減少していく様子が本計測システムで捉えられた。このセンサーの開発により燃料電池内のリアルタイム計測と制御へと展開できる基礎を築いた。
国際教育協力学の構築に関する基礎的研究

国際協力、あるいは、国際教育協会の分野においては、これまでも、さまざまな援助や協力が行われてきた。しかし、従来は、援助や協力の実態が先行し、これらに関する体系的な研究は、きわめて不十分な状況にあったといわざるをえない。国際教育協力の分野では、ユネスコの教育白書(1993年版)が指摘するように、資金を支出する主体が、二国間から他国間機関、とくに銀行や基金へと移ってきている。その中でも、世界銀行が教育協力の分野で主要なプレーヤーとして登場してきたことに注目する必要がある。そして、問題の本質は、世界銀行などの教育プロジェクトにおいて、経済的な視点だけが考慮された改革案でありながら、その対象が当該国の教育内容や制度の全般に及んでおり、しかも、物質的インフラに対する援助を梃子として、その実施が途上国に対して強制されていることである。世界銀行の教育事業に対する融資案件で問題となった事例は、その多くが、世界銀行側において、途上国における教育事業のあるべき姿を描き、それを借り手側である途上国に押し付け、借り手側が本来持っていたはずのニーズに考慮を払わなかったというものである。こういう教育援助・協力の実態を是正していくためには、教育協力の体系的研究、すなわち、国際教育協力学の構築が必要であるといわなければならない。本研究では、国際教育協力学の構築の必要性を示すとともに、その方法論として、脱西欧的アプローチ、内発的アプローチ、総合的アプローチおよび協力的アプローチの4つを導き出し、これら4つを統合することにより客観的な認識に到達することが可能となり、それを通じて、国際教育協力学の構築も可能になることを明らかにした。また、途上国の教育開発と教育協力に関する諸外国の研究者、行政官、教員等に対するアンケート調査から、国際教育協力学の可能性とその方向を示した。
終末糖化産物の構造を識別する機能性一本鎖抗体を用いた高感度画像解析法の開発

終末糖化産物(AGE)を認識する一本鎖抗体(scFv)融合タンパク質を作製し、生体内に局在するAGEをin vivoイメージングする方法の開発研究を行った。ファージディスプレイ法によって、抗原結合性ならびに熱安定性の高いscFv抗体を作製した。次にscFvの血中滞留性を改善するために、Sortase Aを用いてヒト血清アルブミンとの融合分子を作製し、血中滞留性の向上が確認できた。scFv抗体にランタノイド蛍光ペプチド配列を結合させ、時間分解蛍光測定が可能なランタノイドイオンの導入を試みたが、蛍光は観測されなかった。現在、クリック反応を用いて蛍光プローブの導入を進めている。本研究では、生体内に局在する終末糖化産物(AGEs)修飾タンパク質を高感度でin vivoイメージングできる新規機能性抗AGEscFv分子の創製し、糖尿病血管合併症の発症・進展メカニズムの解明と新たな治療戦略の開発を目的としている。生体内で生じる糖化修飾体としてGA-pyridineを標的とし、既に作製されているGA-pyridineを特異的に認識する一本鎖抗体(AGE73scFv)をもとに、ファージディスプレイ法によって、抗原親和性ならびに熱安定性を向上させたscFv分子(73MuL/V94A)の作製に成功した。scFv分子の抗原親和性ならびに熱安定性は、SPR、ITC、DSC、DSF等の物理化学的測定法により評価した。今後、より優れたscFv分子の作製を目指して、同様の実験を続けている。また、scFvに血中滞留性を保持させるために、ペプチド鎖転移酵素Sortase Aを用いた酵素的連結法により、scFv分子のC末端側にヒト血清アルブミン(HSA)を融合させた機能性scFv分子、73MuL/V94AscFvーHSAの作製を行った。ICRマウスを用いた実験において、このHSA融合scFv抗体は、intactのHSAと同程度の血中滞留性を示した。一方で、scFvのVLとVH領域をつなぐリンカー部分にトリプトファンを受光部とするランタノイド金属を配位するペプチド配列(LBP)、すなわち、ランタノイド蛍光プローブを導入したscFv分子(VL-LBP-VH)を作製した。この分子の抗原結合活性を測定したところ、十分な抗原結合活性は保持していたが、テルビウムによるランタノイド蛍光は観察されなかった。今後、リンカー配列の最適化、あるいは、ランタノイド蛍光プローブの導入部位の選択が必要であることが示された。error-prone PCRによるVH、VL遺伝子へ変異の導入とバイオパニングによるスクリーニング条件の検討により、比較的高性能なGA-pyridine特異的scFv抗体を獲得することに成功した。今後は、生体内温度でもより高い抗原結合活性有するscFv分子の獲得を目指して、さらに同様の実験を継続する。scFv分子の抗原親和性ならびに熱安定性の評価は、現在行っているSPR、ITC、DSC、DSF等の物理化学的測定法が適していることが示された。HSAは、宿主としてメタノール資化酵母を用い、既に報告された方法によって調製している。調製にやや時間を要するが、純度の高いタンパク質が得られることから継続して本方法を採用する。配列特異的にペプチド転移反応を触媒するStaphylococcus aureus由来のSortase Aは、比較的効率よく、scFvとHSAを連結できたことから、今後もこの方法を用いることにした。scFvのVLとVHをつなぐリンカー領域にLBPを導入した分子は、高い抗原結合性を示したものの、ランタノイド蛍光の観測は認められなかった。scFvのリンカー領域は、ランタノイド蛍光プローブの導入部位として適していない可能性が示唆されたので、今後はscFvとHSAの結合領域、または、HSAのC末端側領域に数種類の代表的なLBP配列の導入を試みる。平成28年度に作製することができた73MuL/V94AscFvーHSA融合分子について、本年度は、これまでに報告されている様々なLBP配列をscFvとHSAの連結している領域、ならびに、HSAのC末端側領域に導入する。また、HSAのN末領域に存在するカルシウムイオン結合部位(Helix-Loop-Helix領域])に変異を導入し、ランタノイドイオン結合部位への改変を試みる。さらには、LBP配列をタンデムにつなげると発光強度が約3倍上昇することが報告されていることから、HSAのC末端側領域にタンデムLBPを導入した融合分子も同様に構築する。ランタノイドイオンとして、テルビウムの他にユーロピウムの導入も試みる。さらに、より優れたscFv分子の作製を目指して、scFv分子のスクリーニング実験を続ける。ランタノイド蛍光を観測することができた分子を用いて、糖尿病モデルマウスに静脈注射により投与し、in vivoイメージング解析を行う。

IVIS Imaging Systemを利用して、血管、臓器(腎臓、肺、膀胱)等の観察を進め、機能性抗AGEscFv-HSA融合分子の体内動態ならびにAGEsの局在と疾患の関連性について考察する。タンパク質工学金額が小さいので適切な物品購入を行うことが困難であったことから、次年度分の助成金と合せて使用することにした。物品費(試薬類、プラスチック器具類)として使用する。
褐炭由来の有機酸を原料とする生分解性プラスチックの新規製造法の開発

褐炭を過酸化水素水中で効率的に有機酸に変換し、それから微生物を用いて、生分解性プラスチックを生産する新規製造法の開発を目的に、(1)褐炭の液相酸化分解による有機酸の製造、(2)有機酸の微生物反応による生分解性プラスチックの生産、(3)水素細菌を利用して有機酸をPHBに変換させるための代謝システム解析とバイオリアクターによるPHBの効率的生産について種々の検討を実施した。その結果、まず褐炭を60°C程度でH_2O_2中温和に酸化する方法を提案した。提案した方法に基づきND炭を30%H_2O_2中、60°C,24h酸化した結果、ギ酸,酢酸,グリコール酸,マロン酸、蓚酸などの低級脂肪酸を計20wt%以上回収することに成功した。これらの生成物は、主として褐炭構造中の側鎖部分の分解から得られることが明らかになった。また、H_2O_2酸化分解法は、セルロースあるいは褐炭-セルロース混合物にも有効な方法であることが示された。次に、このように得られた有機酸を原料に水素細菌(Aldaligenes eutrophas)により生分解性プラスチックであるポリヒドロキシ酪酸(PHB)を生産することを試みた結果、培養槽内の総有機酸濃度は5g/l以下に保つ必要があることがわかった。一方、半回分培養の結果、酢酸を基質にした場合、PHB含量は70%に達することがわかった。また、マロン酸は不活性で褐炭由来の有機酸からPHBを生産しつつ、マロン酸の分離を可能にする分離を伴うバイオリアクターの開発が可能であることが示唆された。さらに、有機酸からPHBに効率良く変換させるための培養工学的検討、および代謝システム解析を行った結果、TCA(トリカルボン酸)回路のイソクエン酸から生成されるNADPHが反応の調節制御に重要な役割を果たしていることがわかった。このように、提案した酸化分解-バイオプラスチック製造法は未利用の含水低品位資源混合物を高品位な資源に変換できる有用な方法であることが示された。廉価、大量に存在する褐炭を効率的に有機酸に変換したのち、微生物を用いて生分解性プラチックを生産する新規製造法の開発・実証を目的に、(1)褐炭の液相酸化分解による有機酸の製造・精製、(2)有機酸の微生物反応による生分解性プラスチックの製造について検討した。1.褐炭の液相酸化分解による有機酸の製造・精製2.有機酸の微生物反応による生分解性プラチックの製造褐炭から生成される主低級脂肪酸の模擬混合さんを調製し水素細菌(Alcaligenes eutrophas)を用いて生分解性プラスチク(ポリヒドロキシ酪酸、PHA)の生産を試みた。この結果、酢酸が菌体の増殖、PHA合成の原動力で、グリコール酸は菌体の増殖に寄与することがわかった。また、マロン酸の蓄積を防止する半回分灌流培養を提案し、PHAの生産とマロン酸の分離を同時に実施できることを示した。一方、有機酸濃度を制御したバイオリアクター実験から菌体の増殖、PHAの合成には、ある一定レベル以下の濃度に保つ必要性があることがわかった。今後、以上の成果に基づき、1)Fenton試薬を用いた褐炭の酸化分解による選択率、収率の向上、2)提案した半回分灌流培養による生分解性プラスチックの高効率製造とその制御について検討を進めていく予定である。

褐炭を過酸化水素水中で効率的に有機酸に変換し、それから微生物を用いて、生分解性プラスチックを生産する新規製造法の開発を目的に、(1)褐炭の液相酸化分解による有機酸の製造、(2)有機酸の微生物反応による生分解性プラスチックの生産、(3)水素細菌を利用して有機酸をPHBに変換させるための代謝システム解析とバイオリアクターによるPHBの効率的生産について種々の検討を実施した。その結果、まず褐炭を60°C程度でH_2O_2中温和に酸化する方法を提案した。提案した方法に基づきND炭を30%H_2O_2中、60°C,24h酸化した結果、ギ酸,酢酸,グリコール酸,マロン酸,蓚酸などの低級脂肪酸を計20wt%以上回収することに成功した。これらの生成物は、主としてて褐炭構造中の側鎖部分の分解から得られることが明らかになった。また、H_2O_2酸化分解法は、セルロースあるいは褐炭-セルロース混合物にも有効な方法であることが示された。次に、このように得られた有機酸を原料に水素細菌(Aldaligenes eutrophas)により生成解性プラスチックであるポリヒドロキシ酪酸(PHB)を生産することを試みた結果、培養槽内の総有機酸濃度は5g/1以下に保つ必要があることがわかった。一方、半回分培養の結果、酢酸を基質にした場合、PHB含量は70%に達することがわかった。また、マロン酸は不活性で褐炭由来の有機酸からPHBを生産しつつ、マロン酸の分離を可能にする分離を伴うバイオリアクターの開発が可能であることが示唆された。さらに、有機酸からPHBに効率良く変換させるための培養工学的検討、および代謝システム解析を行った結果、TCA(トリカルボン酸)回路のイソクエン酸から生成されるNADPHが反応の調節制御に重要な役割を果たしていることがわかった。このように、提案した酸化分解-バイオプラスチック製造法は未利用の含水低品位資源混合物を高品位な資源に変換できる有用な方法であることが示された。
ボロン酸を利用した新規イオンシーケンシング法の開発

いくつかのピリジル系ヘテロ環含有ボロン酸誘導体が、ピロリン酸とその一部の誘導体と特異的かつ可逆的、pH依存的に結合することを定量的に明らかにした。この知見を元に、電極修飾材料を開発し、ピロリン酸を30μM以上の感度で電位検出することに成功した。さらに、ピロリン酸に応答して溶解性転移を呈する材料を新たに創成し、溶液条件等を最適化することにより、核酸増幅反応におけるサーマルサイクルとの組み合わせにより、より高感度かつ簡便な電気的計測を可能とする方法論を開発した。今年度、我々は、11Bおよび31P NMRによる評価から、比較的酸性度の高いタイプ(pKaが7以下)のボロン酸が、PPiとその一部の誘導体と特異的かつ可逆的(結合定数103 M-1)に結合することを見いだした。その結合の強さと選択性はpH依存的であり、いずれも弱酸性領域(pH5-6)で最大化する。興味深いことに、一リン酸や三リン酸とは全く結合せず、塩濃度依存性も(500 mM NaClまで)観測されなかった。いくつかの重要な有機リン酸化合物(ATP, dATP, ADP, dADP)との結合性を調べたところ、リボースを持つATP、ADPとのみ結合し、二リン酸-ボロン酸間の特異的な結合は観測されなかった(dATPと結合しないことはパイロシークエンシング等の応用には朗報である)。一方、ヌクレオシド類似体(代謝拮抗剤)の一種であるゲムシタビンの二リン酸付加体(すなわち活性体)においては、二リン酸-ボロン酸間の結合が確認された。これらの比較から、当該分子認識においては、分子同士の立体効果が重要な決定因子として提案される。さらに、二リン酸との特異的結合性が見いだされたボロン酸誘導体を頭部構造とする自己組織化単分子膜を合成し、これを金表面に導入することによる「ピロリン酸検出電極」を作製し、これによるピロリン酸選択的な電位測定にも既に成功している。前年度までに11B-NMRおよび31P-NMR測定による検討から明らかとなった「ピリジル骨格を有するボロン酸誘導体とピロリン酸との特異的な結合」に関する知見を元に、これをアルカンチオール構造と組み合わせることで、新たな金電極修飾分子を合成した。この電極を用いて、弱酸性環境下で、検出感度30μMでのピロリン酸の電位検出に成功した。さらに、当該構造をアクリルアミド誘導体化し、これをモノマーとして、感温性材料として知られるpoly(N-isopropylacrylamide)(PNIPAAm)との共重合体とすることで、ピロリン酸に応答して溶解性転移を呈する材料を新たに創成した。以前の研究から、電極表面で生起する溶解性転移(水和・脱水和)に伴う著しい誘電率変化が、電位測定時の効果的なシグナル増幅モードとして機能することが明らかになっている。さらなる付加価値として、その転移温度を適度に設定することで、PCR(ポリメラーゼ連鎖反応)法におけるサーマルサイクルとの組み合わせにより、より高感度かつ簡便な(PCR時に生成するピロリン酸検出による)電気的手法の創出が期待される。27年度までに、その材料設計と基礎的なキャラクタリゼーションを行った。ボロン酸ーピロリン酸間の結合は弱酸性化で最大化するが、そのような条件下でのポリメラーゼ活性の低下が課題として顕在化した。反応と測定を分離して行うプロトコールを検討する一方、至適pHを弱酸性領域に有するポリメラーゼの探索も進めており、入手の目処も立っている。また、溶解性転移を呈し、電位計測時のシグナルーノイズ比を格段に向上させる新たな電極修飾材料に関する新規技術等、当初予定しなかった追加的な成果も創出しており、概ね順調に進展しているものと判断される。H28年度は、これまで11B-NMRや31P-NMR測定より明らかにしてきた代表的なピリジル系ヘテロ環含有ボロン酸誘導体とリン酸関連物質について、蛍光色素(アリザリンレッドS)を利用した競合アッセイ法によりそれらの結合強度と特異性の定量化を進めるとともに、前年度に引き続き、高分子複合化による電極材料の設計と評価を実施した。当該「pH依存的かつ二リン酸特異的」な結合特性について、これまでの発見を支持するとともに、比較的軽微な一および三リン酸化合物との結合強度についても初めて精密に定量できた。高分子材料との複合化については、温度応答性材料との組み合わせにより電極表面で生起する誘電率変化を変換モードとしてシグナル増幅を図る目的とともに、PCR(ポリメラーゼ連鎖反応)法におけるサーマルサイクルとの組み合わせによる簡便計測法を確立するための最適化を実施した。温度応答性高分子であるN-isopropylacrylamide(NIPAAm)と、上記ボロン酸構造を有するアクリルアミド誘導体(モノマー)を合成し、これらを原子移動ラジカル重合法により共重合させた。

種々の分子量、組成について検討した結果、50ー70°Cの範囲で、二リン酸濃度依存的な溶解性転移を呈する材料の創出に成功した。二リン酸との特異的結合性が見いだされたボロン酸誘導体を頭部構造とする自己組織化単分子膜を合成し、これを金表面に導入することによる「ピロリン酸検出電極」を作製し、これによるピロリン酸選択的な電位測定まで成功しており、当初の計画通りに進んでいる。これまでに開発した電極修飾材料を元に、拡散増幅反応の産物ピロリン酸を検出技術を確立する。使用するDNAポリメラーゼに関しては、現在、様々な至適pH・温度を有するものが市販または研究レベルで報告されている。これまでに見いだした「ピリジルボロン酸ーピロリン酸の結合」の強度ならびに選択性は弱酸性条件(pH5-6)で最大化するため、これに留意して最適なものを採用する。また、従来のプロトン検出方式のプラットフォームと同様の条件下で系統的に比較することで、その優位性を検証する。生体計測、ドラッグデリバリーシステム28年度が最終年度であるため、記入しない。まず、核酸増幅反応(PCR)の産物ピロリン酸の検出を検討する。この際、PCR反応の溶液条件の検討、反応ー検出操作分離の必要性などを併せて検討する。ついで、プローブDNAを修飾した磁性微粒子補足のためのウェル構造を備えた多チャンネル電極アレイを外部発注により作製し、これを流体制御デバイスと組み合わせ、DNAポリメラーゼの作用により生じるピロリン酸検出の評価を開始する。流体制御システムや多チャンネルかつリアルタイムの電位計測系は、研究室内に保有する設備を活用して行なう。磁性微粒子に対するプローブの固定化は既報の方法を参考にして行なう。測定結果の信頼性向上のため、一種類のプローブ固定化微粒子を最大10箇所程度のウェルに配し、集積化のメリットを最大化するための統計的処理法についても検討を行う。当初、多チャンネル電極アレイや流体制御システムの外部発注を予定していたが、研究進展の方向性から、電極材料の創成とキャラクタリゼーションに注力した。変更分を、研究推進の効率化を図るための人件費や成果発表を目的とした会議出席旅費などに充てたため、その差額として繰り越しが発生した。28年度が最終年度であるため、記入しない。当初、サブミクロンサイズの微粒子やそれと同程度のピッチを有する電極アレイを液中で効率的に観察・評価する手段として、液中での観測が可能な(比較的高額である)原子間力顕微鏡装置の導入を予定していたが、採択時の減額配分に留意して、予算計画を変更し、これを取りやめた。変更分を、研究推進の効率化を図るため人件費等に当てて対応したが、その差額として繰越が発生した。引き続き、必要かつ十分な人件費、物品費に充てることにより、さらなる研究推進を図る。引き続き、必要かつ十分な人件費ならびに物品費に充てることにより、さらなる研究推進の効率化を図る。
近位尿細管細胞と集合管細胞の増殖分化誘導因子に関する研究

1.近位尿細管細胞と集合管細胞の増殖,分化誘導因子に関する研究ウサギ腎臓より近位尿細管,皮膚集合管細胞を単離培養し、SV40を用いて各々のcell lineを作製した。各々の細胞にEGF.TGFbeta_1.IGF-I.ビタミンAを添加培養し、細胞数、チシジンの取込みを経時的に測定したが有意な変化は認められなかった。2.急性腎不全モデルにおける癌抑制遺伝子の変化SDラットの阻血性急性腎不全モデルを作製し、1時間後より30日後まで経時的に腎臓を摘出、mRNAとタンパクを抽出、癌抑制遺伝子p53.WTIのmRNAの経時変化を1ザンブロッティングに検出中である。3.膜性腎症兄弟発症例におけるHLADR2変異の検出我々が経験した膜性腎症兄弟発症例が同じHLAタイピングを示したことより家系内のDNAを解析した。腎症発症例ではDR2の遺伝子変異が認められた。