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プラズマローゲンの吸収代謝および神経保護作用に関する研究

本研究で対象とするプラズマローゲン(Pls)は、特徴的なビニルエーテル結合をsn-1位に有するリン脂質である。近年、アルツハイマー型認知症(AD)などの神経疾患患者の脳や血液でのPlsの低値が示唆され、注目されている。本研究ではADモデルラットなどを用い、Pls摂取が体内脂質や認知行動へ及ぼす影響を調査した。結果として、Pls摂取は体内のPlsレベルを増加させ、ADモデルの認知行動を改善した。認知行動と体内Pls、特にDHA型Plsレベルとは相関があり、AD予防にはPlsレベルの維持が有効であると示唆された。また、Plsレベルの増加には、Plsと比較しリゾ体の摂取が効果的であると考えられた。本研究「プラズマローゲンの吸収代謝および神経保護作用に関する研究」は、内因性機能性脂質であるプラズマローゲンに着目し、食事として摂取した時の吸収代謝と機能性およびそのメカニズムを解明することを目的としている。本研究は平成28、29年度の2年にわたり行う。初年度である平成28年度には以下のことを行った。・プラズマローゲン投与によるアルツハイマーモデルラットの認知行動改善作用について論文を作成し学術雑誌に投稿した(平成29年4月にアクセプト)。アルツハイマー型認知症患者では脳中プラズマローゲン量が低下することが報告されている。モデルラットへのプラズマローゲンの投与により脳中のプラズマローゲンの増加と行動障害の改善が観察された。・マウスにおけるプラズマローゲンの単回投与による吸収実験を行い、吸収機構と体内動態を検証した。吸収時における消化酵素の作用および体内での再合成・変換の可能性が示された。・肝炎モデルマウスにプラズマローゲンを投与し、プラズマローゲンに肝炎緩和作用があることを確認した。肝臓での炎症は肝臓でのプラズマローゲンの合成の低下、アルツハイマー型認知症の原因物質アミロイドβの合成促進および脳への蓄積と関係あるとされている。このことから、肝炎予防は間接的に神経を保護すると考えられる。・近年、内因性プラズマローゲンがコレステロール合成抑制・代謝促進および動脈硬化抑制に関わる報告が多くなされている。そこで食事性のプラズマローゲンが心血管および肝臓への脂質組成に及ぼす影響を明らかにするために、長期投与試験を計画し、そのためのプラズマローゲンの精製を行った。投与実験は次年度に行う。順番の前後はあるが、課題は順調に進んでいる。ただし、本研究により明らかになったこと、他研究者の報告をもとに若干の軌道修正を行っている。本研究「プラズマローゲンの吸収代謝および神経保護作用に関する研究」は、内因性の機能性脂質であるプラズマローゲン(Pls)に着目し、食事としてPlsを摂取した時の吸収代謝と機能性およびそのメカニズムを解明することを目的としている。本研究の期間は平成28、29年度の2年であり、最終年度である平成29年度には以下のことを行った。・前年度の試験から体内のDHAを側鎖に持つPls量がアルツハイマーと関係することが示唆されている。そこで、体内のDHA型Pls量を増やすための食材として何が有効であるかを調査するため、DHAを含む魚油摂取とPls摂取を比較した。血漿において、Plsの投与はDHA型Pls量を増加させた。一方、今回の試験では魚油の投与は血漿中のDHA型Pls量を増加させなかった。・Plsの吸収代謝解明および吸収率の向上を目的に、単回投与によるPlsの極性基の違い、脂肪酸の有無を比較した。極性基の違いにより吸収動態は異なり、またPlsを酵素処理により脂肪酸を切断したリゾPlsの使用により吸収率が増加することが示唆された。また、昨年度の成果と合わせ、以下のことが明らかとなった。・Pls投与によるアルツハイマーモデルラットの認知行動改善作用を検証し、Pls投与が脳中のDHA型Pls量を増加させ、行動障害を改善することが示唆された(Lipids, 52, 575-585, 2017)。・体内のDHA型Pls量を増やすための成分を検討し、魚油と比較し、Plsそのものの投与が血漿DHA型Plsの増加に効果的であると示唆された。さらに、Pls吸収効率の増加法を検討し、リゾPlsを使用することにより、通常のPls投与より吸収率が増加することが観察された。プラズマローゲンの単回投与による吸収について再現性を確認し、論文化を行うとともに、プラズマローゲンの長期投与が各臓器の脂質組成に及ぼす影響を検証する。また、前年度得られたプラズマローゲンの肝炎抑制効果の作用機序を明らかにすべく培養細胞実験を行う。脂質生化学
家族性大腸ポリポージスを伴う、甲状腺乳頭癌新亜型の臨床、遺伝子学的研究

背景:1992年、4例の特徴ある甲状腺乳頭癌が報告された。(Yamashita ct al.,Cancer 70:2923,1992)これは臨床的、摘出標本の肉眼的所見、組織学的所見、電顕所見いずれも通常の甲状腺乳頭癌とは異なる特徴的な所見を備えており、乳頭癌の新しい1亜型もしくは全く新しい型の甲状腺癌であることが示唆されている。以前より家族性大腸ポリポージスと甲状腺癌の合併の報告は散見されていたが、1994年、Harachの報告した4例の症例の組織像はこの報告症例と酷似している。(Harch et at., Histopathology,25:549,1994)。基礎的には、家族性質大腸ポリポージスの原因遺伝子であるAPC遺伝子は、ラット等の動物実験で、膵臓癌、および甲状腺癌の発生に関与することが示唆されている。これらの特殊なタイプの甲状腺乳頭癌の臨床的追跡、遺伝子的検索により、1.甲状腺乳頭癌の新しい1亜型もしくは全く新たなタイプの甲状腺癌組織方の確立、2.家族性大腸ポリポージスを中心とした、多臓器に異常をきたす新たな遺伝子疾患の発見、3.重複癌を含め、大腸癌、甲状腺癌、膵臓癌、乳癌と広く腺癌発生の追及への発展が期待できるものである。臨床的研究:1.現在まで確認した9例の特殊型の甲状腺癌患者のうちすでに大腸手術の施行された1名を除く8名に対し、大腸の検索、特に内視鏡による生検を奨める。同時に各々の患者に対して綿密な家族調査を行い、必要に応じて家族にも甲状腺、大腸の検索を奨める。2.他施設に協力を仰ぎ、甲状腺癌患者と家族性大腸ポリポージスの合併例に対し、甲状腺癌組織標本を収集、組織肩を再検討しおこの特徴型に相当するかを確認、1.と同様必要に応じて家族の調査を行う。基礎的研究:患者末梢血よりm-RNA,DNAを抽出しAPC遺伝子上の既知のhot pointに対してgemline mutationの有無を検索する。同時に他の遺伝子異常も検索を行う。結果:全9例中7症例追跡可能であった。すでに大腸ポリポージスの手術を受けた1例を除く6例のうち明らかな家族歴を持つ患者はいなかった。大腸疾患の既往や、今までに注腸検査や大腸鏡を受けた患者もいなかった。この6症例について、大腸鏡を施行したところ、1例に数個のポリープを認め、2例に2個のポリープを認めた。残りの2例は粘膜の過形成もなく全く正常であった。ポリープの3例の生検結果はいずれもhyperplastic polypであった。6例に同意を得て末梢血を採取した。抽出したm-RNAは保存の問題よりqualityが悪くRT-PCR不可であった。抽出したDNAより現在まで発表されているprimerでPCRを試みたが不可であった。いままでに使用していたras,gsp,gi2遺伝子はいずれもmutationをみなかった。再度の新鮮な検体の採取を依頼するも、遺伝性疾患の関連で同意を得ることができなかった。背景: 1992年、4例の特徴ある甲状腺乳頭癌が報告された。(Yamashita et al.,Cancer 70 : 2923,1992)これは臨床的、摘出標本の肉眼的所見、組織学的所見、電顕所見いずれも通常の甲状腺乳頭癌とは異なる特徴的な所見を備えており、乳頭癌の新しい1亜型もしくは全く新しい型の甲状腺癌であることが示唆されている。以前より家族性大腸ポリポ-ジスと甲状腺癌の合併の報告は散見されていたが、1994年、Harachの報告した4例の症例の組織像はこの報告症例と酷似している。(Harach et al.,Histopathology,25 : 549,1994)。基礎的には、家族性大腸ポリポ-ジスの原因遺伝子であるAPC遺伝子は、ラット等の動物実験で、膵臓癌、および甲状腺癌の発生に関与することが示唆されている。これらの特殊なタイプの甲状腺乳頭癌の臨床的追跡、遺伝子的検索により、1.甲状腺乳頭癌の新しい1亜型もしくは全く新たなタイプの甲状腺癌組織型の確立、2.家族性大腸ポリポ-ジスを中心とした、多臓器に異常をきたす新たな遺伝子疾患の発見、3.重複癌を含め、大腸癌、甲状腺癌、膵臓癌、乳癌と広く腺癌発生の追求への発展が期待できるものである。臨床的研究: 1.現在まで確認した9例の特殊型の甲状腺癌患者のうちすでに大腸手術の施行された1名を除く8名に対し、大腸の検索、特に内視鏡による生検を奨める。2.他施設に協力を仰ぎ、甲状腺癌患者と家族性大腸ポリポ-ジスの合併例に対し、甲状腺癌組織標本を収集、組織型を再検討しこの特殊型に相当するかを確認、1.と同様必要に応じて家族の調査を行う。結果:全9症例中7症例追跡可能であった。すでに大腸ポリポ-ジスの手術を受けた1例を除く6例のうち明らかな家族歴を持つ患者はいなかった。3症例について、大腸鏡を施行したところ、1例に複数のポリ-プを認めた。

残りの2例は粘膜の過形成もなく全く正常であった。現在APC遺伝子を中心としたgermline mutationの検索の準備中であり、すでに6例の患者自身の同意を得て、末梢血を採取、のこりの2例の調査をすすめるとともに、すでに大腸の手術をうけた患者とポリ-プの見つかった患者の家族の検索の同意を得るべく準備中である。背景:1992年、4例の特徴ある甲状腺乳頭癌が報告された。(Yamashita ct al.,Cancer 70:2923,1992)これは臨床的、摘出標本の肉眼的所見、組織学的所見、電顕所見いずれも通常の甲状腺乳頭癌とは異なる特徴的な所見を備えており、乳頭癌の新しい1亜型もしくは全く新しい型の甲状腺癌であることが示唆されている。以前より家族性大腸ポリポージスと甲状腺癌の合併の報告は散見されていたが、1994年、Harachの報告した4例の症例の組織像はこの報告症例と酷似している。(Harch et at., Histopathology,25:549,1994)。基礎的には、家族性質大腸ポリポージスの原因遺伝子であるAPC遺伝子は、ラット等の動物実験で、膵臓癌、および甲状腺癌の発生に関与することが示唆されている。これらの特殊なタイプの甲状腺乳頭癌の臨床的追跡、遺伝子的検索により、1.甲状腺乳頭癌の新しい1亜型もしくは全く新たなタイプの甲状腺癌組織方の確立、2.家族性大腸ポリポージスを中心とした、多臓器に異常をきたす新たな遺伝子疾患の発見、3.重複癌を含め、大腸癌、甲状腺癌、膵臓癌、乳癌と広く腺癌発生の追及への発展が期待できるものである。臨床的研究:1.現在まで確認した9例の特殊型の甲状腺癌患者のうちすでに大腸手術の施行された1名を除く8名に対し、大腸の検索、特に内視鏡による生検を奨める。同時に各々の患者に対して綿密な家族調査を行い、必要に応じて家族にも甲状腺、大腸の検索を奨める。2.他施設に協力を仰ぎ、甲状腺癌患者と家族性大腸ポリポージスの合併例に対し、甲状腺癌組織標本を収集、組織肩を再検討しおこの特徴型に相当するかを確認、1.と同様必要に応じて家族の調査を行う。基礎的研究:患者末梢血よりm-RNA,DNAを抽出しAPC遺伝子上の既知のhot pointに対してgemline mutationの有無を検索する。同時に他の遺伝子異常も検索を行う。結果:全9例中7症例追跡可能であった。すでに大腸ポリポージスの手術を受けた1例を除く6例のうち明らかな家族歴を持つ患者はいなかった。大腸疾患の既往や、今までに注腸検査や大腸鏡を受けた患者もいなかった。この6症例について、大腸鏡を施行したところ、1例に数個のポリープを認め、2例に2個のポリープを認めた。ポリープの3例の生検結果はいずれもhyperplastic polypであった。6例に同意を得て末梢血を採取した。抽出したm-RNAは保存の問題よりqualityが悪くRT-PCR不可であった。抽出したDNAより現在まで発表されているprimerでPCRを試みたが不可であった。いままでに使用していたras,gsp,gi2遺伝子はいずれもmutationをみなかった。再度の新鮮な検体の採取を依頼するも、遺伝性疾患の関連で同意を得ることができなかった。
両親媒性高分子不斉触媒の創製

高分子固定化型触媒は、反応後の分離回収の容易さ、再使用の可能性、連続的なフローシステムの構築などの点から、効率的な有機合成プロセスのために重要な役割を果たしている。特に、貴重な遷移金属や、光学活性配位子などを利用する不斉反応では、容易にリサイクルが可能固定化触媒の使用が望まれる。一方で、環境負荷の軽減のため、有機溶媒の使用量を極力抑制し、水を媒体とした反応の開発はその重要性がさらに増している。不斉反応に関しても上記の要請に対して、不斉触媒の高分子固定化及び、水系での不斉反応の開発が必要とされている。しかしながら高分子固定化型不斉触媒を用いる水系での不斉反応についての成功例は少なく、重要な課題のひとつとなっている。そのために水系での有機反応に適切な反応場を提供できる両親媒性高分子の開発が必要である。本研究では高分子固定化と水系不斉反応の両者の組み合わせを目指して、両親媒性高分子およびそれを用いた高分子不斉触媒の開発に取り組んだ。特に第四級アンモニウム塩は、その合成の容易さ、幅広い構造の可能性、塩交換の容易さ、親水性-疎水性の程度を広範かつ詳細に制御できることなど優れた特徴を有していることから、この構造を取り入れた高分子固定化を検討した。具体的には、スルホン酸塩型高分子の合成と水系不斉反応、キラル第四級アンモニウム塩の合成と高分子固定化とそれを用いる不斉アルキル化反応を検討した。高分子不斉触媒を用いることかより、非常に高い光学純度の生成物を容易に得ることに成功し、高分子触媒は簡単に回収でき、再使用することができた。触媒分子の高分子固定化は、反応後の分離回収の容易さ、再使用の可能性、連続的なフローシステムの構築などの点から、効率的な有機合成プロセスのために重要な役割を果たしている。特に、貴重な遷移金属や、光学活性配位子などを利用する不斉反応では、固定化触媒の使用が重要であり、容易にリサイクルが可能な触媒が望まれる。一方で、有機溶媒の使用量や廃液を極力制限する有機合成プロセスが環境調和型プロセスとして強く求められており、水系での反応の開発はその重要性がさらに増している。不斉合成反応に関しても上記の要請に対して、不斉触媒や不斉反応剤の高分子固定化及び、水系での不斉反応の開発はそれぞれ進んでいる。しかしながらこれらの組み合わせ、すなわち高分子固定化型不斉触媒を用いる水系での不斉反応については、これまでにあまり研究が進んでいない。ポリエチレングリコール鎖を有する高分子を両親媒性の高分子サポートとして用いた系がいくつか報告されているが、高分子鎖の末端にしか官能基を導入できないなど不利な点も多い。水系での有機反応に適切な反応場を提供できる両親媒性高分子そのそのものが充分に検討されていないのが現状である。
犬の播種性血管内凝固症候群におけるトロンボモジュリンの動態ならびに治療薬への応用

平成17年度は、まず腫瘍罹患犬の凝固亢進状態を明らかにするため、トロンビン-アンチトロンビンIII複合体(TAT)を評価した。その結果、悪性腫瘍症例では健常群、良性腫瘍群に比較して極めて高値を示し、悪性腫瘍症例は常に凝固亢進状態であることが示唆された。次に悪性腫瘍を上皮系、間葉系、血管肉腫および造血器系に再分類しTAT濃度を再検討した。この結果血管肉腫の全例および造血器系腫瘍の全例でTATの高値を認め、これら腫瘍における凝固亢進状態が明らかになった。また上皮系腫瘍および間葉系腫瘍症例においてもTATの高値を示す例が多く存在していた。さらにDIC発症群と非発症群におけるTAT濃度の評価を行ったところDIC発症群では全例でTATの高値を認めたのに対し非発症群においても極めて高いTAT濃度を示した個体がいることから、これら症例は今後DICへと移行する可能性があるものと考えられた。このように悪性腫瘍罹患犬では凝固亢進状況にあることが示され、これが多数の凝固異常の原因となっていることが示唆された。次に昨年度クローニングした犬トロンボモジュリン(TM)の遺伝子配列をもとにプライマーを設定し凝固亢進状態にある腫瘍症例8例の末梢血白血球についてTMおよび組織因子(TF)の発現状況をRealTimePCR法にてmRNAの発現量を解析した。この結果、腫瘍症例におけるTM遺伝子の発現が低下していることが明らかとなった。いっぽうTF遺伝子に関しては対照群と比較して若干の低下を認めた。内部標準遺伝子であるGAPDHの発現が腫瘍症例でやや低下したことからTMとTFの比を求めたところ、TF/TMは腫瘍症例で対照群に比較して高値を示したことから腫瘍症例ではTMとTFの発現不均衡があり、このため凝固亢進状況にあることが示された。このため播種性血管内凝固症候群発症時の治療薬としてTMがなりうることが考えられた。平成16年度はまず日本大学付属動物病院に来院し播種性血管内凝固症候群と診断した腫瘍症例について検討した。その結果、全腫瘍症例208例のうちDICを発症した症例は20例であり全体の9.6%を占めていた。このうち血管肉腫が7例、乳腺腫瘍が4例と悪性腫瘍でDICの発症が多いことが示された。次に悪性腫瘍罹患犬におけるトロンビン-アンチトロンビンIII複合体(TAT)を評価し、悪性腫瘍症例における凝固亢進状態の把握を行った。この結果悪性腫瘍群では健常群、良性腫瘍群に比較して極めて高値を示し、悪性腫瘍症例は常に凝固亢進状態であることが示唆された。また悪性腫瘍の中でも血管肉腫や造血器系腫瘍ではTATが著しく高値を示しており全例で凝固亢進状態にあることが示された。次に組織因子(TF)のクローニングを行った。健常犬の肺からTotal RNAを抽出しcDNAを合成した後、PCR法にてTF遺伝子を増幅した。得られた断片をもとに塩基配列を解析し犬TFの塩基配列を確認した。犬TF cDNAは1813bpで292残基のアミノ酸をコードし、推測されたアミノ酸配列は他種と約56%から75%の相同性を示すことが明らかとなった。さらに悪性腫瘍症例6例について末梢血白血球からTotal RNAを抽出cDNA合成後、リアルタイムPCR法にてmRNAの発現量を解析したところ健常群に比較して有意に高値を示していた。この結果悪性腫瘍症例における凝固亢進の原因として白血球のTFの発現量の増加がその一つであることが示唆された。いっぽう、犬のcDNAを用いてトロンボモジュリン(TM)遺伝子のクローニングを行った。その結果犬TM cDNAは1878bpで、578残基のアミノ酸をコードしており抗凝固作用に重要なEGF様ドメインは他種のそれと類似していた。また健常犬の各臓器におけるTM遺伝子の発現を検討したところ肺、肝臓、脾臓、腎臓、膵臓およびリンパ節など毛細血管に富む臓器で多く発現が認められた。この遺伝子配列の決定により犬組み替え型TMの作成のための貴重な情報が得られた。次に昨年度

クローニングした犬トロンボモジュリン(TM)の遺伝子配列をもとにプライマーを設定し凝固亢進状態にある腫瘍症例8例の末梢血白血球についてTMおよび組織因子(TF)の発現状況をRealTimePCR法にてmRNAの発現量を解析した。この結果、腫瘍症例におけるTM遺伝子の発現が低下していることが明らかとなった。いっぽうTF遺伝子に関しては対照群と比較して若干の低下を認めた。内部標準遺伝子であるGAPDHの発現が腫瘍症例でやや低下したことからTMとTFの比を求めたところ、TF/TMは腫瘍症例で対照群に比較して高値を示したことから腫瘍症例ではTMとTFの発現不均衡があり、このため凝固亢進状況にあることが示された。このため播種性血管内凝固症候群発症時の治療薬としてTMがなりうることが考えられた。
地域における三次予防の技術開発に向けた後天性脊髄性運動麻痺の疫学研究

研究1:脊髄損傷者とポリオ患者を対象に、国際障害分類(現.国際生活機能分類)に従ってその障害を把握する研究の中で、身体状態、活動状況、社会参加状況、社会参加満足度、生活満足度の時間的経過を把握するため、調査項目の1つに経時的視覚アナログ尺度を採用した。ポリオ患者976人、脊髄損傷者1,181人を対象に自記式調査票を配布・回収、それぞれ583票、519票の回答を得た。ポリオ患者では、身体状態、活動状況、社会参加状況は、発症後の低下から速やかに上昇した。発症後25年前後でピークを迎え、その後は下降した。社会参加満足度と生活満足度は、緩やかに上昇し、発症後35年前後で安定した。脊髄損傷者では、身体状態および活動状況は、受傷後の低下から速やかに上昇し、受傷後30年前後まで横這いの期間が続き、その後下降に転じた。社会参加状況、社会参加満足度、生活満足度は揃って上昇し、30年前後で下降に転じた。研究2:同障害者の生活満足度改善に関する質的研究を実施した。文献レビューおよび研究者のディスカッションによりインタビューガイドを作成した。対象者の選択は目的指向的に行ったポリオ患者では発症後30年以上が経過し、かつ生活満足度VASTが改善型であった者、脊髄損傷者では受傷後15年以上が経過し、かつ生活満足度VASTが改善型であった者から、各疾患10人ずつを抽出し、インタビューを行った。インタビューの内容については量的な分析を行うと同時に、質的研究の手法であるEditing Approach(Constant Comparative Method)を用いた分析を行った。生活満足度の上昇にかかわる要件には、障害に固有のもの、障害の種類にかかわらず障害者に固有のもの、障害の有無にかかわらず人間として共通のものの3種があることが考察された。研究1:これまで行った研究で、脊髄損傷とポリオ患者を対象に質問紙調査を実施し、社会参加と障害の二次的悪化をWHOのICIDH-2(B-2版)の分類に従って把握し、経時的視覚アナログ尺度(VAST)を用いて時間的経過に沿って記述した。脊髄損傷者1,181人、ポリオ患者976人を対象に、無記名自記式の調査票を郵送により配布・回収した。調査項目は両者に共通で、回答者属性、身体状況、活動性、社会参加、健康サービス、生活満足度について回答を求めたところ、脊髄損傷患者519票、ポリオ患者583票の回答を得た。今年度はVASTについて分析を行った。脊髄損傷者では受傷直後から二次的障害が発生し、生活満足度も早期から低下した。ポリオ患者では約30年の安定期の後に二次的障害の発生頻度が急速に増加したが、生活満足度は後年までよく保たれていた。研究2:同障害者の生活満足度改善に関する質的研究を実施し、(a)障害者が自分の障害をどのように認知し、対処し、他の障害者に伝達するかを、当事者間情報伝達のインターフェースとして明らかにすること(b)同障害者のための情報集を作成すること(c)同障害者以外で交換される情報の実態把握・情報交換のための方法論の確立を目指すことを目的とした。データ収集にはLong Interviewを、分析にはEditing Approach(Constant Comparative Method)を用いる。Long Interviewの手法に従い、今年度はテーマを同定するためのレビューを行い、面接で台本として用いるインタビューガイドを作成した。研究1の回答者の中から、障害後10年以上が経過し、かつ生活満足度が上昇した者を抽出したところ、脊髄損傷者115人、ポリオ患者101人となった。

協力に同意が得られた者の中から目的指向的に対象者を選択する作業が、現在進行中である。前年度後半より開始した、生活満足度改善に関する質的研究(研究2のインタビュー調査)をさらに進めた。手法としては、Long Interview法を用いた。研究では、まず、対象者の基準をさらに詳細に決定し、目的指向的に対象者の選択を行った。研究1の結果から、ポリオ患者では発症後30年以上が経過し、かつ生活満足度VASTが改善型であった者、脊髄損傷者では受傷後15年以上が経過し、かつ生活満足度VASTが改善型であった者を選択した。該当するポリオ患者は51人、脊髄損傷者47人となった。そのなかから、その他の質問項目の傾向や、地理的・日程的条件の合致する者を抽出し、結果として、ポリオ患者・脊髄損傷者各10人、計20人がインタビューの対象となった。前年度に作成したインタビューガイドに従って、4月末から5月初旬には各疾患1人ずつにプレ・インタビューを行った。7月から8月にかけて各疾患9人ずつにインタビューを行った。インタビュー場所は、対象者の希望を優先し、対象者の自宅や入所施設、職場、自宅近隣の公共施設、障害者施設、インタビュアーの所属機関等、多岐にわたった。インタビュー終了後、録音したインタビューの内容を書き起こして、それを基にインタビューの分析を行った。行った分析は大別して2種類であった。1つめはGrand Tour QuestionsやFinal Questions, Additional Questionsへの回答を量的に分析したものであり、2つめは質的研究の手法であるEditing Approach(ConstantComparative Met hod)を用いた分析であった。生活満足度の上昇にかかわる要件には、障害に固有のもの、障害の種類にかかわらず障害者に固有のもの、障害の有無にかかわらず人間として共通のものの3種があることが考察された。
イネ科植物における二遺伝子座型自家不和合性の分子遺伝学的解析

イネ科植物(Poaceae)には,独立二遺伝子座(SおよびZ)支配の配偶体型自家不和合性が認められる.本研究は,オオムギ近縁野生種Hordeum bulbosum (2x)を主実験材料に用い,二遺伝子座型自家不和合性の遺伝解析ならびに自家不和合性遺伝子の単離を目的とした分子的解析を行った.まず,H.bulbosumにおいて,実験系統の交配試験,自家不和合性遺伝子型の決定,大規模連鎖分析用分離集団の作出,自家不和合性遺伝子座に密接に連鎖するDNAマーカーの同定など,自家不和合性の分子的解析を進める上で基盤となる遺伝解析を行った.つぎに,H.bulbosumの自家不和合性遺伝子の単離には,開花期の雌ずいまたは葯で発現している遺伝子の中から自家不和合性遺伝子型間で多型を示すものをスクリーニングするのが有効と考えた.この考えに基づき,AMF (AFLP-based mRNA fingerprinting)法を用いて,開花期の雌ずいおよび葯におけるS遺伝子特異的転写産物の探索を行った.AMF分析の結果,雌ずいと葯を合わせ,数十種類のS遺伝子特異的DNA断片が得られた.これらの特異的断片をクローン化し,順次RFLP分析を行った結果,S遺伝子座に連鎖する種々のクローンが得られた.S遺伝子座連鎖クローン数種類について,さらに詳細な連鎖分析を行い,S遺伝子座周辺のDNAマーカー地図を作成した.これらのDNAマーカーのなかには.S遺伝子座と組換えが認められないクローン,すなわちS遺伝子候補となるクローンも含まれていた.今後,これらの発現特異性や塩基配列の多型性を詳しく調査し,S候補クローンを絞り込むことが必要である.さらに,絞り込まれた候補クローンが自家不和合性決定因子であるかどうかを証明するためには,当該クローンを導入した形質転換植物の作出・評価が必須となる.一方H.bulbosumの形質転換にはまだ成功例がなく,形質転換系の開発・確立も今後の重要な課題である.イネ科植物(Poaceae)には,独立二遺伝子座(SおよびZ)支配の配偶体型自家不和合性が認められる.本研究は,オオムギ近縁野生種Hordeum bulbosum (2x)を主実験材料に用い,二遺伝子座型自家不和合性の遺伝解析ならびに自家不和合性遺伝子の単離を目的とした分子的解析を行った.まず,H.bulbosumにおいて,実験系統の交配試験,自家不和合性遺伝子型の決定,大規模連鎖分析用分離集団の作出,自家不和合性遺伝子座に密接に連鎖するDNAマーカーの同定など,自家不和合性の分子的解析を進める上で基盤となる遺伝解析を行った.つぎに,H.bulbosumの自家不和合性遺伝子の単離には,開花期の雌ずいまたは葯で発現している遺伝子の中から自家不和合性遺伝子型間で多型を示すものをスクリーニングするのが有効と考えた.この考えに基づき,AMF (AFLP-based mRNA fingerprinting)法を用いて,開花期の雌ずいおよび葯におけるS遺伝子特異的転写産物の探索を行った.AMF分析の結果,雌ずいと葯を合わせ,数十種類のS遺伝子特異的DNA断片が得られた.これらの特異的断片をクローン化し,順次RFLP分析を行った結果,S遺伝子座に連鎖する種々のクローンが得られた.S遺伝子座連鎖クローン数種類について,さらに詳細な連鎖分析を行い,S遺伝子座周辺のDNAマーカー地図を作成した.これらのDNAマーカーのなかには.S遺伝子座と組換えが認められないクローン,すなわちS遺伝子候補となるクローンも含まれていた.今後,これらの発現特異性や塩基配列の多型性を詳しく調査し,S候補クローンを絞り込むことが必要である.さらに,絞り込まれた候補クローンが自家不和合性決定因子であるかどうかを証明するためには,当該クローンを導入した形質転換植物の作出・評価が必須となる.一方H.bulbosumの形質転換にはまだ成功例がなく,形質転換系の開発・確立も今後の重要な課題である.1)オオムギ野生種Hordeum bulbosumの自家不和合性遺伝子(SおよびZ遺伝子)に特異的なcDNA断片の検出:3種類のS遺伝子型(S_<1.2>、S_<1.3>、S_<2.3>)とZ遺伝子型(Z_<1.2>、Z_<1.3>、Z_<2.3>)について、それぞれ数個体の葯から抽出したmRNAを用いて、AMF(AFLP-based mRNA fingerprinting)法により各遺伝子型に特異的な転写産物の探索を行った。その結果、総数7024本のPCR断片のうち、いずれかの遺伝子型に特異的と考えられる断片が68本検出された。現在これらのPCR断片をクローン化し、RFLP分析によるSまたはZ遺伝子座との連鎖分析を行っている。2)H.bulbosum自家和合性突然変異体の誘発:減数分裂期から小胞子期の葯をもつ個体に820Gyのγ線を照射した後、照射個体の成熟花粉を、クローン増殖した非照射の同一個体に授粉した。約900花の交配から4粒の種子が得られた。これらが自家和合性突然変異を有するかどうか受粉試験により検定する予定である。3)H.bulbosumにおける形質転換系の確立:開花後約2週間の未熟胚より誘導した胚発生カルスからの植物体再生には、BAPを含む再分化培地が有効であることが明らかとなった。

一方、未熟胚にアグロバクテリウムを感染させた場合には、選択培地上である程度増殖するカルスが得られたが、植物体の再分化には至らなかった。アグロバクテリウムの感染時期・方法について再検討する必要があると考えられた。1.オオムギ野生種Hordeum bulbosumの自家不和合性遺伝子(SおよびZ遺伝子)転写産物の探索3種類のS遺伝子型(S_<1.2>、S_<1.3>、S_<2.3>)とZ遺伝子型(Z_<1.2>、Z_<1.3>、Z_<2.3>)について、それぞれ数個体の葯および雌ずいから調製したmRNAを用いてAMF(AFLP-based mRNA fingerprinting)分析を行った。各遺伝子型に特異的に検出されたDNA断片のRFLP分析の結果、SおよびZ遺伝子座に密接に連鎖しているクローンがそれぞれ7種類および1種類得られた。現在これらのクローンについて、SまたはZ遺伝子座との詳細な位置関係、ならびに塩基配列の多型性および発現特異性について調査を進めている。2.チオレドキシン様(HTL)遺伝子の塩基配列を用いたHordeum属植物の分子系統学的解析H.bulbosumのS遺伝子座に密接に連鎖しているHTL遺伝子の塩基配列を用いて、Hordeum属植物11種の系統解析を行ったところ、4つの基本ゲノムの明らかな分化が認められること、XゲノムとIゲノムは姉妹群を形成すること、YゲノムはX/Iゲノム群と比べるとHゲノムにより近縁であることが明らかとなった。γ線照射花粉の受粉によって得られた自殖種子(4粒)から個体を育成し、受粉試験を行った。いずれの個体も生殖器官の異常は認められなかったが、自家不和合性であったことから、自家不和合性関連遺伝子には突然変異は生じていないと考えられた。栽培オオムギで報告されている未熟胚へのアグロバクテリウム感染処理による形質転換法をもとに、H.bulbosumにおいて種々の培養条件を検討したが、抗生物質耐性カルスからの形質転換植物の再分化は認められなかった。形質転換の成否に関わる要因を再検討した結果、未熟胚を摘出する植物体の生育条件(人工気象室内で比較的低温条件で開花させる)、ならびにアグロバクテリウムの菌株を変更する必要があると考えられた。1.オオムギ野生種Hordeum bulbosumにおけるS遺伝子座周辺DNAマーカーの単離とマッピングS遺伝子転写産物の単離を目的として、昨年度行ったAMF(AFLP-based mRNA fingerprinting)分析において検出されたS遺伝子型特異的クローンの単離を続行するとともに、それらのクローンの詳細なマッピングを行った。S遺伝子型特異的断片(18本)をクローン化し、シークエンス解析を行った後、RFLP分析によりS遺伝子座との連鎖関係を調査した。その結果、S遺伝子座との連鎖が確定したクローンが2種類、連鎖の可能性が高いクローンが3種類単離された。つぎに従来単離されたS遺伝子座連鎖クローンを含め、更に大規模なRFLP分析を行い、これらDNAマーカーのS遺伝子座周辺における詳細な位置関係を調査した。3種類のマッピング用分離集団、それぞれ324個体、94個体および62個体を用いて連鎖分析を行った結果、HAS5、HAS67、HAS79およびHAS122の4クローンについては、互いに密接に連鎖し、S遺伝子座から0.62cM離れた距離に位置すること、またHTL、HAS31、HPS10およびHPS72の4クローンについてはいずれもS遺伝子座との組換えが認められず、S遺伝子座ときわめて密接に連鎖していることが明らかとなった。
自己免疫疾患と生活習慣病を結ぶリスクファクター遺伝子の生理機能と病態

自己免疫疾患、生活習慣病に共通した疾患関連遺伝子として注目される細胞内アダプター蛋白質Lnk/Sh2b3について、機能異常の標的となる細胞や細胞間相互作用の解明を目指した。Lnk/Sh2b3発現をモニターできるレポーターマウスを樹立し、成熟T細胞や樹状細胞においても発現することを確認した。Lnk欠損マウスではCD44+ CD8+T細胞が増加すること、この増加はIL-15への反応性亢進に因ること、小腸で自然発症する絨毛萎縮の責任細胞となることを見出した。Lnk機能障害が自己免疫性組織障害の病態形成に繋がる可能性を初めて明らかにした。I型糖尿病やセリアック腸炎等の自己免疫疾患、心筋梗塞、血圧異常に共通した疾患関連遺伝子としてその多型が報告され注目を集めている細胞内アダプター蛋白質Sh2b3/Lnkについて、作用標的となる細胞や細胞間相互作用を明らかにし、自己免疫疾患や心血管障害の克服へ向けての基盤を確立する。免疫寛容や慢性炎症に関わる未知の制御機構を明らかにして、病態形成過程の理解と新たな治療標的の創出に資する。Sh2b3/Lnkの発現低下は造血系及び免疫系細胞の産生に大きな影響を及ぼす。各種刺激や環境による発現の変化、組織内での発現細胞の分布について解析するため、Sh2b3/Lnk遺伝子座にGFPをノックインしたマウスを作成し、一次、二次リンパ器官や腸管粘膜組織におけるSh2b3/Lnk発現細胞の組織内分布、Sh2b3/Lnk発現量の変化を検討した。B細胞、樹状細胞で発現が高いこと、B細胞系では骨髄B前駆細胞で一旦低下し分化成熟に伴って発現が回復することを確認した。胸腺細胞では発現はみられないが、成熟T細胞でもB細胞には及ばないものの発現の回復がみられた。腸管関連組織のT細胞では脾臓や末梢血のT細胞に比べ発現が低下することがわかった。I型糖尿病やセリアック病の危険因子としてSh2b3/Lnkが同定されていることを鑑み、これまで解析が進められていない腸管粘膜免疫応答への関与について解析した。Lnk欠損マウスの小腸遠位部では絨毛萎縮が自然発症することがわかった。この絨毛萎縮の性状について、IEL及びLPLの細胞分画の変化、サイトカイン産生能、反応性を検討した。Lnk欠損脾臓細胞の養子リンパ球移入実験等により絨毛萎縮が生じること、成熟T細胞の内因性異常が主因であることを明らかにした。自己免疫疾患、心血管障害に共通した疾患関連遺伝子としてその多型が報告され注目を集めている細胞内アダプター蛋白質Sh2b3/Lnkについて、作用標的となる細胞や細胞間相互作用を明らかにし、免疫異常の修復や疾患克服に向けての基盤を確立する。Sh2b3/Lnk遺伝子にGFPをノックインしたマウスを作成し、Sh2b3/Lnk発現は胸腺細胞で一旦消失するものの成熟に伴い末梢T細胞で回復することを確認した。T細胞分画を詳細に解析し、Sh2b3/Lnk欠損によりCD44を高発現するメモリー型CD8+T細胞が有意に増加することがわかった。この増加はIL-15及びIL-21への反応性がSh2b3/Lnk欠損により亢進するためであることを明らかにした。Sh2b3/Lnk遺伝子の一塩基多型がI型糖尿病やセリアック病の危険因子として同定されていることを鑑み、これまで解析が進んでいない腸管粘膜免疫系への関与について解析した。Sh2b3/Lnk欠損マウスの腸管では高頻度に回腸遠位部の絨毛萎縮が起こっていた。養子リンパ球移入実験を行い、CD8+T細胞の移入により腸管絨毛萎縮が再現できることを明らかにした。また、Sh2b3/Lnk欠損マウスでは樹状細胞数が増加しており、前駆細胞の分化過程や分化後の増殖に関与するGM-CSFやFlt-3L等への反応性亢進が原因となることが判明した。さらにSh2b3/Lnk欠損樹状細胞は、IL-15に対しても感受性が亢進することがわかり、炎症応答への影響を検討している。一方、同じSh2bアダプターファミリーに属するAPS/Sh2b2のの欠損マウスでは、Igeサブクラス抗体の選択的な産生障害がみられることを明らかにした。自己免疫疾患、生活習慣病に共通した疾患関連遺伝子として注目される細胞内アダプター蛋白質Sh2b3/Lnkについて、機能異常の標的となる細胞や細胞間相互作用の解明を目指した。改良型GFPであるVenusをLnk/Sh2b3遺伝子座にノックインし、Lnk/Sh2b3発現をモニターできるレポーターマウスを樹立した。成熟T細胞や樹状細胞においてもLnk/Sh2b3発現が確認された。Lnk欠損マウスではCD44+CD8+T細胞が増加すること、この増加がCD8+T細胞のIL-

15反応性亢進に因ることを見出した。野生型マウスにCD8+T細胞を移入しても恒常性維持増殖が誘導されない環境のため増殖しないが、Lnk欠損CD8+T細胞を移入すると数週のうちに増殖した。IL-15欠損マウスに移入した場合この増殖はみられずIL-15依存性であった。一方、Lnk欠損マウスの回腸で絨毛萎縮が自然発症することを見出した。絨毛萎縮はLnk欠損CD44+CD8+T細胞を野生型CD4+T細胞とともにリンパ球欠損マウスに移入することで再現され、CD8+T細胞におけるLnk欠損が主な要因となることがわかった。Lnk機能障害が、CD44+CD8+T細胞のIL-15反応性亢進による増幅から腸管障害を起こすこと、セリアック病の病態形成に繋がる可能性を初めて明らかにした。Lnk欠損では樹状細胞も増加し、前駆細胞のGM-CSFやFlt-3Lへの反応性亢進が原因であることがわかった。成熟樹状細胞のIL-15感受性も亢進しており、炎症応答への影響が考えられた。骨髄増殖性疾患でもLNK/SH2B3遺伝子の欠損や変異例が見つかっている。Lnk欠損造血幹細胞ではTPO反応性亢進によりBcl-xL発現が亢進すること、放射線等アポトーシス誘導刺激に対し抵抗性が増大することを明らかにした。セカンドヒットによる遺伝子異常の蓄積確率を上昇させる発症機構が考えられる。ほぼ計画に従った解析によって、リスクファクター遺伝子Sh2b3/Lnkの新しい標的細胞として成熟T細胞や樹状細胞を同定し、生理作用を明らかにしつつある。Sh2b3/Lnkの機能消失により自己免疫様の腸管組織障害が生じること、その責任細胞がCD8陽性T細胞であることを明らかにした。順調に成果が得られている。生理作用から分子機構の解明を進めるとともに新たに作製したSh2b3/Lnk遺伝子座にGFPをノックインしたマウスを用い発現制御機構についても知見収集を目指す。
魚類黒色素胞刺激ホルモンの新規機能

1、マツカワメラノコルチン3型受容体(MC3R)のクローニングメラノコルチン受容体(MCR)には、一般的に5種類のサブタイプ(MC15R)が存在する。これまでに、マツカワからMC3Rを除く4種類のMCRサブタイプをクローン化した。そこで、未同定であるマツカワMC3Rのクローン化を試みた。しかしながら、現在までにMC3Rをクローン化するまでには至っていない。マツカワと同じ異体類であるヒラメにおいてもMC3Rのクローン化が報告されていないこと、およびマツカワと系統的に近縁であるフグのゲノムデータベースにもMC3Rが登録されていないことを考慮すると、魚類における進化の過程でMC3Rが失われた可能性がある。2、マツカワ4種のMCR遺伝子の逆転写定量PCR法の測定系これまでにマツカワからクローン化した4種のMCR遺伝子(MC1R、2R、4R、5R)の組み換え体を鋳型に、スタンダードRNAをin vitro転写により合成した。これにより、絶対定量RT-リアルタイムPCR法を用いて、マツカワ各MCR遺伝子の発現量の精査が可能となった。3、マツカワ頭腎におけるMCR遺伝子の発現量の精査マツカワ7個体から採取した頭腎から全RNAを抽出した。これらを鋳型として、各MCR遺伝子の発現量を絶対定量RT-リアルタイムPCR法により精査した。その結果、マツカワの頭腎においては、MC2RとMC5Rが主要なMCR受容体であることを明らかにした(MC1RとMC4Rは検出限界以下)。また、これまでに、我々はマツカワにおいて副腎皮質刺激ホルモン(ACTH)のみならず黒色素胞刺激ホルモン(MSH)が頭腎からのコルチゾル分泌を促進するという興味深い現象を報告した。本研究の結果を考慮すると、マツカワの頭腎ではMC5Rを介してMSHがコルチゾル分泌に関与すると推測される。1、メラノコルチン(MC)受容体のクローニング:MC2型と5型受容体の全構造をクローニングにより決定した。これによりマツカワにおいて黒色素胞刺激ホルモン(MSH)の新規機能を明らかにするための遺伝子情報がほぼ出揃った。2、背景色とMSH遺伝子の関連:脳下垂体で発現する3種(A,B,C)のMSH遺伝子と背景色(白と黒)の関係を調べた。その結果、MSH遺伝子が背景色と対応して変動した例は少なかった。即ち、MSH遺伝子の発現は背景色変化以外の様々な要因に関連する神経内分泌系により制御されていると推測される。3、皮膚におけるMSHペプチドの同定とその作用:皮膚抽出物から、皮膚で発現するMSH遺伝子-Cに由来するMSH-Cの存在を確認した。さらに皮膚片をMSH-Cを用いて培養したところ、黒および黄色素ともに濃度依存的に拡散した。またアセチル化修飾を受けていないMSHの方が拡散能は高かった。この結果は両生類とは逆であり、当該遺伝子および受容体の機能分化の考察に重要な知見を与える。4、皮膚におけるMSH遺伝子とMC受容体発現細胞の同定:皮膚では色素胞以外の細胞でMSH-C遺伝子が発現しており、黒色素胞ではMC1型および5型受容体が、黄色素胞ではMC5型受容体が発現することを、単離した細胞由来のcDNAを鋳型としたPCR法により明らかにした。即ち、皮膚で産生されるMSHは色素胞に傍分泌的に作用すると考えられる。5、皮膚におけるMSHシステムの考察:皮膚におけるMSH遺伝子発現量は脳下垂体におけるMSH遺伝子発現量に匹敵する。このことから、皮膚は脳下垂体と共に主要なMSH関連ペプチドの産生器官であると考えられる。即ち、マツカワでは脳下垂体を起点とする内分泌系と皮膚内で完結する傍分泌系により、体色は制御されていると考えられる。1.マツカワ頭腎におけるメラノコルチン受容体(MCR)の発現:コルチゾルは、副腎皮質(魚類では頭腎に相当)に局在するACTH特異的受容体であるMC2Rと、副腎皮質刺激ホルモン(ACTH)が結合することにより分泌が促進される。我々はRT-PCR法により、マツカワの頭腎においてMC2Rのみならず黒色素胞刺激ホルモン(MSH)と親和性を有するMC5Rも発現していることを認めた。即ち、マツカワにおいてMSHがMC5Rを介してコルチゾル分泌に関与する可能性を示した。2、マツカワ頭腎におけるMCR発現細胞の同定:頭腎の切片を作成し、細胞の形態およびステロイド産生に関与する11βヒドロキシラーゼの抗体を用いた免疫組織染色により、コルチゾルを産生す粘る間腎腺細胞を同定した。続いて、頭腎切片に対するin situ hybridization法によりMC2RおよびMC5Rともに間腎腺細胞で発現していることを認めた。また、MC5Rは間腎腺細胞以外の細胞でも発現が認められた。この結果は、MSHがコルチゾル分泌に関与するという仮説を強く支持する。3、マツカワ頭腎におけるMCのコルチゾル分泌能:細切したマツカワの頭腎をACTHおよびDi-Ac-α-MSH、α-HSH、Des-Ac-α-MSH(1nM100nM)を用いて培養し、培養液中のコルチゾル濃度を時間分解蛍光免疫測定法により測定した。その結果、α-MSH以外のホルモンは25nMで頭腎からのコルチゾル分泌を促進した。この際の分泌能の強さは、ACTH>diacetyl-α-MSH>desacetyl-α-MSHであった。また、α-HSHとdiacetyl-

α-MSHを同時に添加し培養したところ、diacetyl-α-MSH単独培養時とコルチゾル分泌能に差異はなかった。このことから、MSHのアセチル基の有無によるコルチゾル分泌能の違いは、受容体との親和性の違いに起因すると考えられる。1、マツカワメラノコルチン3型受容体(MC3R)のクローニングメラノコルチン受容体(MCR)には、一般的に5種類のサブタイプ(MC15R)が存在する。これまでに、マツカワからMC3Rを除く4種類のMCRサブタイプをクローン化した。そこで、未同定であるマツカワMC3Rのクローン化を試みた。しかしながら、現在までにMC3Rをクローン化するまでには至っていない。マツカワと同じ異体類であるヒラメにおいてもMC3Rのクローン化が報告されていないこと、およびマツカワと系統的に近縁であるフグのゲノムデータベースにもMC3Rが登録されていないことを考慮すると、魚類における進化の過程でMC3Rが失われた可能性がある。2、マツカワ4種のMCR遺伝子の逆転写定量PCR法の測定系これまでにマツカワからクローン化した4種のMCR遺伝子(MC1R、2R、4R、5R)の組み換え体を鋳型に、スタンダードRNAをin vitro転写により合成した。これにより、絶対定量RT-リアルタイムPCR法を用いて、マツカワ各MCR遺伝子の発現量の精査が可能となった。3、マツカワ頭腎におけるMCR遺伝子の発現量の精査マツカワ7個体から採取した頭腎から全RNAを抽出した。これらを鋳型として、各MCR遺伝子の発現量を絶対定量RT-リアルタイムPCR法により精査した。その結果、マツカワの頭腎においては、MC2RとMC5Rが主要なMCR受容体であることを明らかにした(MC1RとMC4Rは検出限界以下)。また、これまでに、我々はマツカワにおいて副腎皮質刺激ホルモン(ACTH)のみならず黒色素胞刺激ホルモン(MSH)が頭腎からのコルチゾル分泌を促進するという興味深い現象を報告した。本研究の結果を考慮すると、マツカワの頭腎ではMC5Rを介してMSHがコルチゾル分泌に関与すると推測される。
三次元形態構築に必要な表皮細胞の力学的特性とその分子機構の解明

昨年度までに、神経管の閉鎖過程において神経と表皮の境界では、幹細胞マーカーを発現する未分化な前駆細胞が存在すること、神経管が閉鎖するタイミングで、カノニカルWntシグナルと下流エフェクター分子であるGrainyhead-like 3(Grhl3)によって前駆細胞は、表皮外胚葉へ分化すること、また、ES細胞から表皮細胞への分化系においては、Grhl3は、F-actin豊富な大型の表皮細胞を誘導すること、大型の表皮細胞の誘導には、カノニカルWntに加えて、ノンカノニカルWntが関与していることを明らかにしている。本年度は、分化した表皮細胞が、どのように神経管閉鎖運動を進行させるのか、主にマウス胚の個体レベルで解析を進めた。まず、ノンカノニカルWntとGrhl3が実際に相互作用しているかどうか検討するため、Grhl3変異マウス胚を解析した。結果、Grhl3欠損胚では、Vangl2タンパク(ノンカノニカルWnt経路のコア分子)及び標的であるリン酸化ミオシンの発現が低下したこと、Vangl2とGrhl3遺伝子の二重変異マウスでは、神経管閉鎖異常が重篤化したことから、Grhl3とノンカノニカルWnt経路が相互作用していることが分かった。分子機構としては、Grhl3タンパクの細胞内局在を解析すると、表皮分化後に核内から細胞質へと移動しノンカノニカルWnt経路を活性化することが示唆された。更に、より細胞質内又はより核内で局在させるようなGrhl3タンパク質を発現させて、表現型を解析したところ、表皮細胞の誘導や神経管閉鎖の進行には細胞質内でGrhl3が分布することが必要であることが分かった。以上の結果から、Grhl3遺伝子は、核内で転写因子として表皮細胞分化を誘導するだけでなく、細胞質内でノンカノニカルWnt経路を活性化することで神経管閉鎖運動に働いている可能性が強く示唆された。29年度が最終年度であるため、記入しない。神経管形成過程では、表皮と神経の境界部分で一層の二次元の細胞シートが折れ曲がり、向かい合う表皮同士が癒合し、表皮が神経管を包み込むことで三次元管構造が構築される。本課題では、神経管閉鎖時において癒合境界線(背側正中線上)周辺に存在する表皮細胞が特有な力学的な特性を持ちジッパー様に働くことで、三次元管構造が構築できるのではないかという仮説を立てている。そこで、神経管の閉鎖過程における表皮の弾性率など物理的特性を計測すること、更にはin vitro細胞実験を通じて特異な表皮細胞を生み出せる分子経路を特定することを目的に実験を行い、下記の知見を得た。現在までに、未分化な外胚葉細胞から表皮細胞への分化には、カノニカルWntシグナルに依存していることを明らかにしていた。本年度は、ES細胞からの表皮細胞へのin vitro分化系を用いることで、ノンカノニカルWntシグナルであるPCP経路が同時に活性化されることでGrhl3陽性の特有な表皮細胞が誘導されえることを明らかにした。Grhl3陽性の表皮細胞の物理的特性を計測するため、Grhl3陽性の表皮細胞と陰性の表皮細胞について原子間力顕微鏡でヤング率を計測した。その結果、Grhl3陽性の表皮細胞の方が陰性のそれと比べて高いことが分かった。神経管閉鎖過程の表皮組織において、Grhl3を欠損胚と野生型胚との間でどのような違いがあるか計測するため、ガラスピペットを用いて組織端を牽引又は吸引する実験を行った。Grhl3欠損表皮細胞を牽引すると、野生型表皮細胞に比べより変形することが分かった。また、Grhl3欠損表皮組織を吸引すると野生型表皮組織に比べてより小さい圧力で変形できることが分かった。これらの結果から、Grhl3は、PCP経路などを介してより強固な表皮細胞を誘導することで神経管閉鎖に必要な力学的機能を担っていると示唆される。表皮細胞の誘導にはカノニカルWntシグナルだけでなく、ノンカノニカルWntシグナルが関与していることを見いだした。更に、原子間力顕微鏡を用いた解析及びピペット牽引実験によりGrhl3によって誘導された表皮細胞表面の物理的な特性を計測することに成功した。以上の知見から、当初の計画以上に進展していると考えられる。

更に、より細胞質内又はより核内で局在させるようなGrhl3タンパク質を発現させて、表現型を解析したところ、表皮細胞の誘導や神経管閉鎖の進行には細胞質内でGrhl3が分布することが必要であることが分かった。以上の結果から、Grhl3遺伝子は、核内で転写因子として表皮細胞分化を誘導するだけでなく、細胞質内でノンカノニカルWnt経路を活性化することで神経管閉鎖運動に働いている可能性が強く示唆された。Grhl3遺伝子がどのようにノンカノニカルWntシグナル(PCP経路)に関与しているのか、in vitro細胞培養系での生化学的解析やマウス個体を用いた遺伝学的解析を進める。29年度が最終年度であるため、記入しない。