hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
フィブリノゲン遺伝子多型は歯周炎発症の有力なリスクファクターになり得るか?

フィブリノゲンは急性炎症時の血液凝固・止血反応において重要な機能を果たす蛋白質として知られる。高濃度フィブリノゲンは過度の血栓形成や出血傾向をもたらし、冠状動脈性心疾患や脳梗塞に対する有意な独立した危険因子となる。Bβフィブリノゲン・プロモーター領域には6つの遺伝子多型が存在するが、実際にどの多型が機能を有しているのかはわかっていない。そこで全ての組み合わせを作製し、同時に機能解析を行った。その結果、-1420G/Aと-148C/Tがサプレッサーとして、-854G/Aがエンハンサーとしての機能を有することが示唆された。フィブリノゲン(血液凝固I因子)はIL-6の誘導により肝細胞において産生される急性期蛋白質であり、血液凝固・止血反応の最終段階において重要な機能を果たしている。フィブリノゲンは炎症状態では平常時の210倍にも増加し、高/低濃度のフィブリノゲン分泌は過度の血栓形成や出血傾向をもたす。特に高濃度フィブリノゲンは炎症性サイトカインを増加させ、炎症部位に多くの白血球を引き寄せるため、冠状動脈性心疾患や脳梗塞に対する有意な独立した危険因子として知られている。また、近年、歯周病の発症・進行との関連も指摘されている。それら疾患の易罹病性や病型、発症の機序にはフィブリノゲンの遺伝子多型、とりわけBβ鎖における遺伝子多型が大きく関わっていると言われているが、そのメカニズムついては未だよくわかっていない。Bβフィブリノゲン・プロモーター領域においては、現在までに6種類の遺伝子多型(-1420G/A,-993C/T,-854G/A,-455G/A,-249C/T,-148C/T)の存在が報告されているが、機能的役割を有する遺伝子多型の特定までには未だ至っていない。更にはその内4つの遺伝子多型から成る連鎖不均衡の存在がその関係を更に複雑にしている。そこで本研究において我々はこれまでに、統計学的に存在するナチュラル・ハプロタイプ4種類と、人工的ハプロタイプ4種類、計8種類のレポータープラスミドを作製した。そして、それらを肝癌細胞にトランスフェクションし、IL-6にて刺激後、ルシフェラーゼ・アッセイにより細胞内のレポーターの発現量を測定することで、どのタイプ(どの遺伝子多型)がプロモーターとしての機能を有しているのか解析し、タイプ間における比較検討を行った。我々は既に予備実験を終え、7回分の統計解析まで進めている。その結果、いくつかの遺伝子多型が有意な生理学的機能を有する可能性が示されている。今後はさらにアッセイ数を増やし、最終的に確定させたい。Bβフィブリノゲン・プロモーター領域においては、現在までに6種類の遺伝子多型(-1420G/A, -993C/T, -854G/A, -455G/A, -249C/T, -148C/T)の存在が報告されているが、機能的役割を有する遺伝子多型の特定までには未だ至っていない。そして、それらを肝癌細胞にトランスフェクションし、IL-6にて刺激後、ルシフェラーゼ・アッセイにより細胞内のレポーターの発現量を同時に測定することで、どのタイプ(どの遺伝子多型)がプロモーターとしての機能を有しているのか解析し、タイプ間における比較検討を行った。本年度は3回分のアッセイを行い、前年度分と合わせて計10回分の統計解析を行った。
生殖細胞における性決定と雄性生殖幹細胞の増殖・分化メカニズム

X染色体上にGFP遺伝子が挿入されたマウスを用いると着床前の初期胚の段階で簡単に性の分別を行うことができる。この系を利用して作製・収集したXX型の精原細胞やXXY型精巣において過剰に発現している遺伝子群の発現状況を詳細に検討したところいずれも胎生18.5日目から急激に発現が始まっていることを認めた。またプロゲステロン投与により分娩を遅らせても同時期からの発現上昇と、XX精原細胞の消失時期に変化がないことが確かめちれた。これらは分娩という環境の変化にかかわらず遺伝子発現のカスケードによりXX型細胞の消失につながっていることを示すものであった。またXX型セルトリ細胞の能力について検討を加えたところ、XX型セルトリ細胞は移植した精原細胞を精子にまで分化させる力を持っていることが見出せたが、継続した精子形成支持能はないことが観察された。この原因を探らたところ、自己免疫疾患に似た抗体が産生されていることを発見した。精原細胞が消失してしまう原国としてセルトリ細胞が担っている免疫的なバリアの形成がXXタイプのセルトリ細胞では十分に機能せず、そのために精原細胞が非自己として免疫的に攻撃を受けている可能性が示された。一方、着床前の胚の遺伝子発現を雌雄で比べることによりRhox5遺伝子がインプリント遺伝子であることを示していたたが、今回は同様にX染色体上にあるFth117クラスター遺伝子がインプリントされている可能性が高いことを見つけた。しかしながらクラスターであるために相互に分別した発現解析が難しく、その役割を明らかにするためにノックアウトでこの領域全体を除去すべくターゲティングベクターを作製した。我々はX染色体上にGFP遺伝子を組み込み全身の細胞が緑色の蛍光を発するマウスを用いて受精後2日以内の胚で性の分別を可能にする系を確立している。その系を用いて雌雄のキメラマウスを作製すると、雌雄の生殖細胞を分別できるキメラマウスができる。このようなマウスの精細管内の雌胚に内来する精原細胞様の細胞の性状を詳しく検討した。この細胞は明らかに雄型のゲノミックインプリンティングをうけており、XXという核型にもかかわらず雄としての分化を遂げていることが分子生物学的に明らかになった。また、精巣内に現れる巨大な雌性細胞を検討したところ、卵子に特有の構造である透明帯をもつことが明らかになり、さらに精子との融合能も有していることが判明した。この細胞のゲノミックインプリンティングは不完全ながら雌型であり、同じ精巣内において、雄型および雌型のふた通りの相反するゲノミックインプリンティングがおこることを明らかにした。In vivo electropration法により精巣支持細胞に増殖因子GDNFを導入し、精巣生殖幹細胞を増殖させ、特異的なマーカーを利用し、FACSにて効率的に単離する方法を確立した。この系を利用し、生殖幹細胞を構成する2つの細胞群(Oct-3/4(+)細胞とOct-3/4(-)細胞)が、その相互転換能により同等の幹細胞を示すことを明らかにした。さらに、このOct-3/4(-)細胞が、未分化と分化の中間の状態にあり、組織再生時にGDNFにより選択的に増殖することを明らかとした。1)未分化状態の生殖細胞の性決定は必ずしも性染色体の組み合わせ通りにはいかず、周りの環境に依存していることが報告されていた。そこで、我々は遺伝子の配列に関係なく起こるエピジェネティックな現象として知られている精子と卵子で全く異なっているゲノミックインプリンティングの獲得は性染色体の組み合わせに依存するのか?それとも、周りの環境に依存しているのか?を調べようと試みた。我々はX染色体上にGFP遺伝子が導入された雄マウスを用いることで、初期胚の段階で雌雄を判別し、雌胚と雄胚を集合させて雌雄キメラマウスを作製した。この雌雄キメラでは雌由来の細胞をGFPによって標識しているために、容易に追跡することができる。雌由来生殖細胞は雌雄キメラの精巣環境において精子にまで成熟することはなかったが、Y染色体を持っていないにもかかわらず、父型のインプリンティングを獲得した精子側の細胞に分化した。一方、同じ精巣内で一部の雌由来生殖細胞は父型の刷り込みを受けた雌由来生殖細胞とは違う細胞集団として、卵子特異的な構造である透明帯を持ち、精子と融合できる卵子に分化し、不完全ではあるが母型のインプリンティングを獲得していることが分かった。これらの結果から生殖細胞は一度、性が決まるとその後の分化は環境の影響をあまり受けずに進むことが示された。2)マウス生殖幹細胞の自己保存と分化の制御に、c-kitとkit-ligandが関わることを明らかにした。c-kitは、これまで分化マーカーとされてきたが、未分化状態ですでに細胞質内に存在しており、その糖鎖修飾により未分化型と分化型があることを突き止めた。この未分化型の糖鎖修飾はES細胞でも保存されていた。この未分化型c-kitと分泌型kit-ligandが相互作用すると未分化性が維持され、膜型kit-ligandとの相互作用により分化へと進む事が示された。性染色体にGFPを発現する遺伝子を組み込むことにより、着床前の初期胚の段階で簡単に性の分別を行うことができる系を開発した。ついでこの系を用い雌性の胚と雄性の胚を集合させて「セックスキメラ胚」を作製し、こうしてできた「雄」マウスの精巣内における「雌」型精原細胞の性の分化の仕組みを探った。

その結果「雌」の細胞であっても「雄」の精原細胞として分化できることを、ゲノミックインプリンティングなどを調べることにより明らかにした。逆に、精巣のなかで一部の「雌」細胞が正常な「卵子」として分化しうることも示し、生殖細胞の性の分化の仕組みについて、どちらかの性決定がおこれば、周りの環境に影響されないで分化が進行することを明らかにした。雌雄の胚の性分化は、従来sry遺伝子の発現以降の生殖層の分化が始まりであるというのが大方の捉え方であった。しかし我々の性分別システムを用いて着床前の卵子の遺伝子発現を雌雄で比べてみると、じっに様々な違いが生じていることを明らかにした。特に、そのうちのひとつであるPem遺伝子はゲノミックインプリントを受けていることを示し、性の分化にエピジェネティックな調節が関与していることを示すことができた。生殖幹細胞はOct-3/4の発現の有無により2つのsubpopulationに分類されるが、この2つのsubpopulation間に幹細胞活性に大きな差異は認められず、幹細胞活性の維持にOct-3/4は直接関与しないことが明らかとなった。これらの幹細胞とES細胞は、新規の糖鎖修飾をもつ幹細胞型c-kitを持ち、分泌型Kit-ligandと反応することにより未分化性を維持し、膜型Kit-ligandと反応することにより分化することが示された。一方、DNA修復に関わるRad18が生殖幹細胞で強く発現することを見出し、.その品質保証に関与することが示唆された。性染色体であるX染色体上にGFP遺伝子が挿入されたマウスを用い、着床前の初期胚の段階で簡単に性の分別ができる系を確立しており、この系を応用することにより雌胚と雄胚を集合させてセックスキメラ胚を作製した。こうしてできた見た目が「雄」マウスのキメラ精巣内において、遺伝子型がXXの「雌」由来生殖細胞の性の分化の仕組みを探ったところ、大半のXX細胞に「雄」のエピジェネティックなマークが入ることを明らかにした。しかし、これらは誕生後に消滅してしまった。そこで、野生型の精原細胞との違いを探るために、遺伝子発現を比較したところ明らかに発現が異なる複数の遺伝子を見つけた。これらの遺伝子の多くはXX型の精原細胞に特異的に発現しており、野生型(XY型)ではほとんど発現していなかった。更にこれらの遺伝子群はXX型と同様の表現型を示すXXY型精巣においても過剰に発現していることを見つけた。以上の結果から、精原細胞の増殖が停止するのはY染色体の有無ではなく、X染色体上の遺伝子や同定した遺伝子群が関与しているためであることを示唆した。性分化は、従来生殖巣の分化が始まりであるというのが大方の捉え方であった。しかし我々の性分別システムを用い着床前の胚の遺伝子発現を雌雄で比べると、様々な違いが生じていることが分かった。その中でRhox5遺伝子は父親由来のX染色体のみから発現するインプリント遺伝子であることを示した。また、発現パターンを詳しく調べ、既に8細胞期という早い段階から雌雄差を示すこと、着床後は母親由来のX染色体からの発現に切り替わる非常に珍しい発現パターンを示す遺伝子であることを明らかにした。更に、Rhox5のみでなく、他にも雌で過剰に発現する新規インプリント遺伝子のクラスターをX染色体上に見つけ、性分化とエピジェネティクスの関連を示唆した。
ALS/FTLDの高次機能障害におけるadult neurogenesisの役割

ALS/FTLDの原因遺伝子であるFUSの発現抑制がタウisoformの発現変化を通じて、抑制後6週間で海馬のadult neurogenesisを低下させ、FTLD様の情動異常を呈し、18ヶ月以上の長期観察によって、リン酸化タウの蓄積、神経脱落を呈する。ヒト野生型FUS発現によってこれらのフェノタイプは回復したが、ALS/FTLDに認められる変異R521Gを有するヒトFUSの発現では回復しなかった。以上のことからタウisoformを介したadult neurogenesisはFTLDにおいて神経脱落を呈する前の神経機能の異常を反映しているものと考えた。ALS/FTLDの高次機能障害における成体神経新生(adult neurogenesis)の役割の解明をマウスモデルとALS/FTLD剖検脳における検討から行った。ALS/FTLDの原因遺伝子であるFUSをAAVにshRNAを発現させることで全海馬において抑制したマウスモデルではFTLD様の情動異常を来たすが、同時にタウisoformの発現変化を介して海馬歯状回におけるadult neurogenesisを抑制する。このFUS抑制マウスに対してヒト野生型FUSを海馬特異的に発現させる実験(FUS発現回復実験)を行った。AAVの濃度を振って内在性のマウスFUSとほぼ等量にヒトFUSを発現する量を同定し、そのマウスを解析した。その結果ヒト野生型FUSをFUS抑制マウスの海馬に発現させることで、FUS抑制によって生じたタウisoformの発現変化(4R-tauの増加と3R-tauの低下)を回復することができた。しかし、ALS/FTLD関連変異であるR521G変異を有するヒトFUSをFUS抑制マウスの海馬に発現させる実験では、FUS抑制によって生じたタウisoformの発現変化は回復しなかった。同様に、ヒト野生型FUSの発現はFUSに抑制によって生じた情動異常(多動、不安の欠如、社会性の低下など)を改善させたが、R521G変異を有するヒトFUSの発現では回復できなかった。さらにBrdU取り込みassayなどにより評価を行った結果adult neurogenesisについても、ヒト野生型FUSの発現によってFUS抑制に伴うadult neurogenesisの低下が改善することを見出した。一方でR521G変異を有するヒトFUSの発現ではFUS抑制によって生じたadult neurogenesisの低下の改善は認められなかった。ALS/FTLDの高次機能障害における成体神経新生(adult neurogenesis)の役割の解明をマウスモデルの検討を中心に行った。FUS抑制マウスに対してヒト野生型FUSを海馬特異的に発現させる実験(FUS発現回復実験)はほぼ完了した。ヒト野生型FUSではレスキュー効果を明らかに認めることができたが、ALS/FTLD変異(R521G)を有するFUSではレスキュー効果が認められなかった。このことはALS/FTLDの高次機能障害におけるadult neurogenesisの役割を強く示唆するものであり、またヒト野生型FUSのレスキュー効果としてタウisoformの発現の正常化が認められたことより、タウの病態への関与についても強く示唆された。一方で、通常は核に強い局在を示すRNA結合タンパク質であるFUSが神経細胞の核内で高分子複合体を形成し、主要な結合分子が別のRNA結合タンパク質であるSFPQであることを見出した。またFUSの疾患変異体はSFPQとの結合性が低下し、核内における高分子複合体も形成しづらくなることを明らかにした。FUSとSFPQはどちらも選択的スプライシングを通じてTau isoform(3R/4R)のバランス変化を制御し、SFPQの機能喪失マウスモデルは、タウisoformのバランスが4-repeatタウ優位に傾き、FUS抑制マウスと同様の情動の異常を中心とするFTLD様の高次機能障害を呈し、海馬歯状回における成体神経新生が抑制されることを見出した。さらに、これらの異常は4-repeatタウを特異的に抑制する実験によって改善した。以上の知見についてまとめた上で論文化を行った。FUS抑制マウスに対してヒト野生型FUSを海馬特異的に発現させる実験(FUS発現回復実験)は完了した。

またFUSの疾患変異体はSFPQとの結合性が低下し、高分子複合体も形成しづらくなることを明らかにした。FUSとSFPQはどちらも選択的スプライシングを通じてTau isoform(3R/4R)のバランス変化を制御し、SFPQの機能喪失マウスモデルはFUS抑制マウスと同様の情動の異常を中心とするFTLD様の高次機能障害を呈し、海馬歯状回における成体神経新生を抑制することを見出した。以上について論文化を行った。ALS/FTLDの原因遺伝子であるFUSをAAVにshRNAを発現させることで全海馬において抑制したマウスモデルではFTLD様の情動異常を来たすが、同時にタウisoformの発現変化を介して海馬歯状回におけるadult neurogenesisを抑制した。このFUS抑制マウスに対してヒト野生型FUSを海馬特異的に発現させる実験(FUS発現回復実験)によりFUS抑制によって生じたタウisoformの発現変化(4R-tauの増加と3R-tauの低下)を回復することができた。しかし、ALS/FTLD関連変異であるR521G変異を有するヒトFUSを発現させる実験では、FUS抑制によって生じたタウisoformの発現変化は回復しなかった。同様に、ヒト野生型FUSの発現はFUSに抑制によって生じた情動異常を改善させたが、R521G変異を有するヒトFUSの発現では回復できなかった。さらにBrdU取り込みassayなどにより評価を行った結果adult neurogenesisについても、ヒト野生型FUSの発現によってFUS抑制に伴うadult neurogenesisの低下が改善することを見出した。一方でR521G変異を有するヒトFUSの発現ではFUS抑制によって生じたadult neurogenesisの低下の改善は認められなかった。さらに、FUSと核内で結合しタウisoformの発現変化を制御するSFPQについても同様の海馬特異的抑制モデルを作成し、FUS抑制マウスと近似した情動異常、adult neurogenesisの低下を認めた。FUS抑制マウスは長期観察によって、12ヶ月齢でME-MRIによって海馬における過興奮を呈することを見出した。このことはヒトの認知症に類似する所見であり、神経脱落を呈する前の神経機能の異常を反映しているものと考えた。また18ヶ月齢でリン酸化タウの蓄積と海馬の神経細胞脱落を認めた。これに対してSFPQ抑制マウスではinjection後6ヶ月の9ヶ月齢で海馬の神経細胞脱落を高度に認めた。このことはタウ以外のFUSとSFPQの下流因子が病態に影響していることを示唆すると考えられた。ALS/FTLDの原因遺伝子であるFUSの発現抑制がタウisoformの発現変化を通じて、抑制後
階層付きモチーフ・パターン分析によるネットワークの類型化

本研究の目的は大規模ネットワークの特徴抽出技術の構築である。具体的には、1)現実のネットワークデータの収集、基本統計量の分析、ならびに適切なネットワーク生成モデルの構築。2)階層付きモチーフ・パターンによるネットワーク類型化法の確立、ならびに人工ネットワークと現実ネットワークに対する計算機実験による評価。3)時系列データに対する変化点の検出、および主要変化点の編纂に関する各種方法論の確立、を行った。本研究の目標は、1)現実のネットワークデータの収集、ネットワークの階層を考慮した基本統計量の分析、ならびに適切なネットワーク生成モデルの構築。3)時系列データに対する変化点の検出、および主要変化点の編纂に関する各種方法論の確立である。このうち、平成24年度は主に3を中心として実施した。そして、ブログやTwitter、レビューサイトの構造の比較を行った。1)については、2011年3月8日から20日までのtwitterデータで欠けていた部分のデータを追加入手し、そこからFollow, Mention, Facoritesという異なる繋がり方に着目したネットワークを生成し、分析ならびに比較を行った。加えて、本等に対する複数のレビューサイトデータと株価推移データを入手した。2)については、twitterデータに関して、ツイートのタイミングやユーザ集合を特徴量としてキーワードを類型化する手法を提案した。また、レビューサイトデータに対し、ユーザー間の類似度を定式化すると共に、どのように変化していくかについて、統計的な分析を行った。3)については、時系列の変化点を検出する方法を複数提案するとともに、株価データやレビューサイトに対して適用することにより、妥当性の検討を行った。加えて、ユーザーがWレビューサイトにデータを投稿する行動のモデルを提案した。また、データが時間と共に拡散していく様子を効率的に可視化する方法を提案した。このうち、平成25年度は主に3を実施した。1)については、引き続き最新のネットワークを対象にした解析を行うべく、twitterデータならびに@COSMEのデータの収集を行った。くわえて、基本統計量を解析するとともに、新しい有向ネットワークを生成する、成長モデルを提案した。2)については、ネットワークモチーフ(トライアド)を用いたネットワークの時系列分析方法を提案するとともに、twitterのrepleyとRTによって作られる2つのネットワークに対して適用し、その有効性を示した。また、レビューサイトや株価データを対象として類似度分析を行った。3)については、twitterデータを対象とした解析等を行い、つぶやきを類型化し可視化する手法を提案した、本研究の目的は大規模ネットワークの特徴抽出技術の構築である。このうち、平成23年度は主に1と2を実施した。1)については、ネットワークデータの拡充をするため、国立国会図書館から国立大学のWebサイトデータを各大学35年分、あわせて350件ほど入手した。そして、それらのWebサイトデータからネットワークデータへの変換を行った。また、2011年3月8日から20日のあいだのtwitterデータも入手した。これらのデータに対して、ネットワークモチーフ数や連結成分数、次数分布等を評価することにより、ネットワーク構成を特徴付けるいくつかの重要な基本統計量を明らかとした。さらに、これらのネットワークが時間と共にどのように成長したのか、Gini係数を評価することにより解析した。これらの結果により、ネットワーク生成モデル構築に必要となる、ネットワーク構造ならびに成長過程の特徴が明らかとななりつつある。2)については、入手した各種ネットワークデータに対して、妥当な階層付け方法の検討を行った。また、3)について年度を繰り上げて実施した。まず、尤度比検定を用いた新しい変化点抽出手法を提案した。そして、価格.comならびに@COSMEの各オンラインレビューサイトの時系列データに対して提案手法を適用することで、その妥当性を検討した。その結果、明らかに異常な評点行動をとっているユーザーや、時事的な原因による商品の評価変動、及び評価の変化点を検出することに成功した。このうち、平成25年度は主に2,3を実施した。1)については、引き続き最新のネットワークを対象にした解析を行うべく、twitterデータ等のデータ収集を行った。

2)については、昨年度までは主にネットワーク全体を対象としてモチーフパターンを用いた解析を行っていたが、今年度は各ノードに注目し、新しい解析手法を提案した。具体的には、あるユーザーとその周辺のみからなる部分グラフをモチーフパターン分析することにより、あるユーザーがネットワーク上においてどのように活動しているかを特徴付ける手法を提案した。提案手法をTwitterデータに適用することにより、どのような行動を行うユーザーがいるかの分析・類型化をおこなった。3)については、twitterデータを対象とした解析等を行うとともに、つぶやきを類型化し可視化する手法についての検討を行った。特に、共通の話題毎に類型化し、各集合に適切な注釈単語をつける手法を提案するとともに、実際にTwitterデータに適用することにより、その有効性を示した。情報セキュリティ、量子計算、行動の類型化、ゲーム情報学目的1)については、平成23年度入手のデータに加えて、各種レビューサイト等のネットワークデータを追加で入手済みである。そして、これらのデータからより詳細な統計データを明らかにしている。今後、時系列データを元にしたネットワークモデルを構築する予定である。このことより、おおむね順調に進展していると考える。目的2)については、ネットワークデータに対して、時系列データやユーザー集合を元にしたユーザーの類型化方法を提案している。今後、モチーフ等のさらなる特徴量を検討することにより、より妥当な類型化手法を提案する予定である。目的3)については、時系列データの変化点を抽出する方法を複数提案するとともに、これらの手法をさまざまなデータに適用することにより妥当性を検討している。加えて、時系列に対するユーザーの行動モデルも提案している。今後、さらなる特徴量を検討することより妥当な変化点抽出手法を提案する予定である。以上のことを総合的に判断し、おおむね順調に進展していると考える。目的1)については、引き続き最新の各種ネットワークデータを取得するとともに、基本統計量の分析を行っている。また、新しい有向ネットワーク生成モデルを提案している。
新規癌胎児抗原glypican3の小児固形腫瘍における組織発現と血中動態の解析

小児悪性腫瘍におけるglypican3の発現を組織学的に検討した。小児悪性固形腫瘍83例について検討した結果、神経芽腫27例には発現は見られなかった。腎芽腫8例ではすべて発現がみられた。横紋筋肉腫9例では1例のみ発現が認められた。胚細胞性腫瘍40例では、卵黄嚢腫瘍と未熟奇形腫8例で発現が認められた。この結果から、腎芽腫と卵黄嚢腫瘍ではglypican3が腫瘍マーカーとして有用である可能性が示された。血中glypican3の濃度につては測定系が確立できずに今後の課題とした。今年度はまず、これまでに当科で経験した小児固形腫瘍についてGPC3の組織発現を免疫組織化学法によって検討した。検討した腫瘍の内訳は、神経芽腫27例、神経節芽腫7例、副腎腫瘍3例、腎芽腫6例、横紋筋肉腫9例、胚細胞性腫瘍40例、である。神経芽腫、神経節芽腫、副腎腫瘍ではGPC3陽性のものは見られなかった。また、横紋筋肉腫では1例の陽性例があったが古い症例で、診断の面で検討が必要であると結論した。腎腫瘍では、6例全例で、未熟な線管構造や腎芽細胞にGPC3が陽性であった。胚細胞性腫瘍では、卵黄嚢腫瘍5例では全例GPC3が陽性であった。また未熟奇形腫と診断された3例でも、部分的にGPC3が陽性であった。胚細胞性腫瘍に関しては、卵黄嚢腫瘍で全例GPC3陽性、一部の未熟奇形腫で陽性、との結果で、これまでに報告されている精巣腫瘍や卵巣腫瘍の結果を裏付ける結果であった。腎腫瘍に関して、組織発現が当科症例6例全例でGPC3陽性であったことは特筆すべき新知見であると考える。腎芽腫ではこれまで良い腫瘍マーカーが見つかっておらず、本結果を考慮すると、GPC3が腎腫瘍の良い腫痩マーカーになる可能性が示唆された。今後腎芽腫における血清中のGPC3測定を、これまでに保存した腎芽腫患児血清と新規に経験した腎芽腫症例とで、おこなって検証していく予定である。また腎芽腫組織でのGPC3発現をウエスタンブロット法で検証することも予定している。今年度は、これまでに当科で経験した小児固形腫瘍について昨年度に検索した腫瘍に加えて、新たに経験した腎芽腫2例とこれまでに経験した肝芽腫8例を追加でGPC3の組織発現を免疫組織化学法によって検討した。この結果最終的には検討した腫瘍の内訳は、神経芽腫27例、腎芽腫8例、肝芽腫8例、横紋筋肉腫9例、胚細胞性腫瘍45例、となった。神経芽腫ではGPC3陽性のものは見られなかった。また、横紋筋肉腫では1例で陽性であったがこの症例は検討の結果PNET腫瘍ではないかと結論されて除外した。また肝芽腫はこれまで報告されている結果と同様に全例でGPC3陽性であった。腎腫瘍では、8例全例で、未熟な線管構造や腎芽細胞の一部にGPC3が陽性であったが、その陽性成分は腫瘍によって異なっていた。胚細胞性腫瘍では、卵黄嚢腫瘍4例では全例GPC3が陽性であった。また未熟奇形腫と診断された6例でも、部分的にGPC3が陽性であった。胚細胞性腫瘍に関しては、卵黄嚢腫瘍で全例GPC3陽性、一部の未熟奇形腫で陽性、との結果で、これまでに報告されている内容と一致した。しかし、腎芽腫に関しては、組織発現が当科症例8例全例でGPC3陽性であった。腎芽腫ではこれまで良い腫瘍マーカーが見つかっておらず、本結果を考慮すると、GPC3が腎芽腫の良い腫瘍マーカーになる可能性が示唆された。これらの組織発現を踏まえて腎芽腫、肝芽腫、卵黄嚢腫瘍における血清中のGPC3測定を行ったが、市販されているELISAキットが、検討途中で仕様変更があり、結果に再現性が得られないという問題が発生し、現在ロットの変わらない古いキットを発売業者から取り寄せて検討する予定としている。これまでに小児固形腫瘍92例についてglypican3の組織発現を検討してきたが、肝芽腫、卵黄嚢腫瘍、未熟奇形腫の一部に発現が認められることが明らかになったが、これは成人腫瘍の知見とも合致するものであった。しかし、腎臓腫瘍における発現では、8例すべてにglypican 3が発現することが明らかとなり新知見と考える。腎腫瘍としては、Wilms腫瘍では、その組織型にかかわらず発現がみられ、腎芽細胞や上皮系細胞に発現が集中していた。また発現頻度は腫瘍によって様々で、その特徴を明らかにすることはいまだできていない。

更なる同腫瘍の解析が必要と考える。また、腎腫瘍では有効な腫瘍マーカーが存在しないため治療効果判定などの患児の治療上不利な面があったが、今回明らかになったglypican3の発現は、腫瘍マーカーとしての可能性を示唆するものと考えた。そこで、これらの腎腫瘍における患児の血中濃度測定を行うことが重要と考えて検討したが、市販のELISA測定キットではロットによって測定値が大きく変動することが明らかとなり、現在有用な測定系が使用できない状況である。今後国内共同研究者の協力を得て測定を進めていくことにしている。
日本人に適したマルチプレックスＩＮＤＥＬ多型検出システムの構築とその法医学的応用

市販のINDEL多型検出キットを用い,キットに含まれる30種類のINDELマーカーの日本人集団における多型性を調査するとともに,その結果を他の人種集団のデータと統計学的に比較し,本キットの総合識別能は日本人集団では白人集団に比べ低いことを明らかにした。次いで,常染色体から日本人集団において高い多型性を示す12種類のINDELマーカーを選び出し,これらのマーカーを用いたマルチプレックスINDEL多型検出法について検討した。また,INDELマーカーを選択する過程で見出したINDEL-STRについて,STRにおける可変反復ブロックの反復数とINDEL多型との間に強い関連があることを明らかにした。INDEL多型とは数bpから十数bp程度の短い塩基配列の挿入もしくは欠失により生ずるDNA多型のことであり、新しいDNAマーカーとして様々な領域でその利用が期待されている。本研究の目的は、日本人に最適化された、識別能の高いマルチプレックスINDEL多型検出システムを開発し、法医鑑定実務に応用することである。本年度は、インターネット上のデータベースサイトおよび既報のデータをもとに、まず常染色体の非遺伝子領域にある4種類のINDEL多型マーカー(rs2308137、rs2308189、rs2308020、rs3051300)を選択し、これらのPCR増幅条件ならびに日本人集団における多型性について検討した。すでに日本人集団において高い多型性を有することを確認している3種類のINDELマーカー(rs1160956、rs35769550、rs33917182)を含め、PCR増幅産物のサイズはいずれも60 bpから150 bpほどと小さく、法医学的個人識別に有効と考えられた。しかしながら、rs2308189およびrs3051300では一方のアレルの出現頻度は0.3以下であり、多型性は若干低かった。これらのINDELマーカーについては、識別能の高いマルチプレックスINDEL多型検出システムを構築するために、より多型性の高いINDELマーカーと置き換える必要があろう。なお、STRの反復領域の近傍にINDEL多型領域が存在することがあるが、本研究においてINDEL多型マーカーを検索する過程で、DXS10146およびDXS10147の3'側のフランキング領域内に、DXS10146では3箇所、DXS10147では1箇所のINDEL多型領域を認めた。これらのINDEL多型における各塩基の欠失は、いずれもそれぞれのSTRの反復領域に存在する特定の反復ブロックの反復数と強い関連があることがわかった。本年度は、昨年度に引き続き、インターネット上のデータベースサイトならびに既報のデータをもとに、常染色体の非遺伝子領域にある7種類のINDEL多型マーカー(rs3047269、rs2307708、rs1160963、rs2307978、rs1160886、rs10688868、rs35605984)を新たに選択し、PCR増幅条件ならびに日本人集団における多型性について検討した。その結果、これらのPCR増幅産物のサイズは75 bpから160 bpと小さく、いずれも一方のアレルの出現頻度は0.5から0.6を示した。すでに日本人集団において高い多型性を有することを確認している5種類のINDELマーカー(rs1160956、rs2308137、rs35769550、rs2308020、rs33917182)とともに、これらのINDELマーカーも法医学的個人識別に有効と考えられた。なお、昨年度の本研究においてINDEL多型マーカーを検索する過程で、DXS10146の3'側のフランキング領域内に3箇所のINDEL多型領域を認めたが、本年度は市販のX-STR解析キットに含まれるDXS10146のPCR増幅に及ぼすそれらINDEL多型領域の影響について検討した。その結果、3箇所のINDEL多型領域のうち、(TCTT/-)において欠失のみられる試料ではDXS10146が十分に増幅されないことが明らかとなった。これはプライマー結合領域内にこのINDEL多型領域が存在するためと考えられた。これまでに、インターネット上のデータベースサイトならびに既報のデータをもとに常染色体の非遺伝子領域にある12種類のINDEL多型マーカー(rs1160956、rs2308137、rs35769550、rs2308020、rs33917182、rs3047269、rs2307708、rs1160963、rs2307978、rs1160886、

rs10688868、rs35605984)を選択し、PCR増幅条件ならびに日本人集団における多型性について検討した。その結果、これらのPCR増幅産物のサイズは75 bpから160 bpと小さく、いずれも一方のアレルの出現頻度は0.5から0.6を示すことから、選択した12種類のINDELマーカーは日本人集団において高い多型性を有し、法医学的個人識別に有効と考えられた。最終年度にあたるH27年度は、H26年度までと同様に常染色体の非遺伝子領域にあるINDEL多型マーカーを新たに選択するとともに、選択したINDEL多型マーカーによるマルチプレックス検出の検討ならびに陳旧法医学的試料を用いたマルチプレックスINDEL多型検出システムの有用性について評価する予定であった。しかしながら、病気により研究を進めることがほとんどできなかったので、研究を完遂するために1年度の補助事業期間の延長を申請し、承認された。マルチプレックスINDEL多型検出システムの構築に向けて、日本人に適した12種類のINDEL多型マーカーを選び出すことができたが、H27年度中に開始する予定であったINDEL多型マーカーによるマルチプレックス検出条件の検討を行うことができなかった。INDEL多型とは数bpから十数bp程度の短い塩基配列の挿入もしくは欠失により生ずるDNA多型のことであり、新しいDNAマーカーとして様々な領域でその利用が期待されている。本研究の目的は、日本人に最適化された、識別能の高いマルチプレックスINDEL多型検出システムを開発し、法医鑑定実務に応用することである。これまでに、インターネット上のデータベースサイトならびに既報のデータをもとに常染色体の非遺伝子領域にある12種類のINDEL多型マーカー(rs1160956、rs2308137、rs35769550、rs2308020、rs33917182、rs3047269、rs2307708、rs1160963、rs2307978、rs1160886、rs10688868、rs35605984)を選択し、PCR条件ならびに日本人集団における多型性について検討した。その結果、これらのPCR産物のサイズは75 bpから160 bpと小さく、いずれも一方のアレルの出現頻度は0.5から0.6を示すことから、選択した12種類のINDELマーカーは日本人集団において高い多型性を有し、法医学的個人識別に有効と考えられた。本年度は、選択したINDEL多型マーカーを用いたマルチプレックス検出法の確立を目指し、マルチプレックスPCRを行うための最適な条件を検討したが、有効な検出法を確立するに至らなかった。そこで、新たなINDEL多型マーカーの組み合わせも視野に入れ、本研究の対照となる市販の30種のINDELマーカーの多型性に関する基礎的データを得ることを目的として、日本人非血縁者225人について30種のINDEL多型を解析するとともに、得られたデータを他の複数の人種集団と統計学的に比較した。研究期間内に目的とした成果が得られなかったので、今後は他の研究者の協力も仰ぎながら、本研究を完遂する所存である。市販のINDEL多型検出キットを用い,キットに含まれる30種類のINDELマーカーの日本人集団における多型性を調査するとともに,その結果を他の人種集団のデータと統計学的に比較し,本キットの総合識別能は日本人集団では白人集団に比べ低いことを明らかにした。
エコロジーを考慮したAl-Al_3Fe傾斜機能材料の開発

継続的に改良を加えてきた自製の遠心鋳造装置でのノウハウを基礎にして、真空容器中で遠心鋳造できる傾斜機能材料作製システムを設計・製作した。このシステムを用いて、市販のAl-50mass%Fe合金をベースに別途作製したAl-Fe母合金により、長さ90mm,外径90mm,肉厚12mmのAl-Al_3Fe傾斜機能材料厚肉円筒の作成プロセスを確立することができた。作成したAl-Al_3Fe傾斜機能材料厚肉円筒を素材として、1)Al_3Fe粒子形状・寸法は、厚肉円筒管内の半径方向の位置によって変化し、外周側は最大数百μmのやや長手の太い棒状組織であるのに対し、内周側では幅百μm程度の針状組織となる。3)Al-Al_3Fe傾斜機能材料の組成傾斜は、Al_3Feが040vol%の範囲で増加し、この組成傾斜分布に対応して、アルミニウムマトリックスのマイクロビッカース硬さは、Hv=3946程度の範囲で増加する。4)Al_3Feの040vol%の範囲で増加に対応して、ヤング率はE=7199.5GPaの範囲で増加するが、線膨張係数はα=25.5×10^<-6>21.3×10^<-6>K^<-1>の範囲で減少し、平均化剛性E/ρ=2.9×10^6m^2s^<-2>である。5)均質とみなす平均約28vol%Al_3FeのAl-Al_3Feの引張り試験片において、最大引っ張り応力86MPa、破断ひずみ0.44%であり、ヤング率E=90GPaという値となる。ということを実験的に明らかにし、本研究で完成させた真空遠心力法のシステムを用いて作製したAl-Al_3Fe傾斜機能材料はエコ傾斜機能材料と考えられ、要素・構造用材料として極めて良好な可能性を持つ素晴しい材料と認められることを示している。現有の遠心鋳造装置を基礎にして、真空あるいは低圧容器中で遠心鋳造できるような圧力容器を含む鋳造システム設計・製作した。溶解・鋳造装置を収納する容器を出来る限りコンパクトに設計したにもかかわらず約200lの大きさとなった。らさに、母合金溶解炉、金型予熱炉、金型回転用モーターなどの電気配線・熱電対の取り回し、真空中での金型への溶湯投入の機構に関する解決すべき困難な問題点があった。多々の改善点が未だ有ると認められるが、最終的に1時間の排気にて-740mmHg程度の真空中で材料作製可能なシステムを完成した。問題点は、今後逐次改善する。市販のAl-Fe合金インゴットはAl-50Fe合金のみであり、必要とするAl-Al_3Fe合金の入手は当初の予定と異なり困難であったため、ルツボ炉を用いて10%強Feを含むAl-Feの母合金を別途作製した。この母合金・今回作製したシステムを用いて、試行錯誤の末に長さ90mm、外径90mm、肉厚15mmのAl-Al_3Fe傾斜機能材料厚肉円筒を作成した。作成した厚肉円筒中のAl_3Feの析出状態・形状を、主として半径・長手・円周方向からの顕微鏡観察を行った。Al_3Feは針状であり、最大40vol%程度のAl_3Feの傾斜分布と、Hv=45-55程度のアルミニウムマトリックスの硬さ分布を得た。

また、Al_3Feのヤング率は200GPa以上と推定できるし、真空中で作製した材料は極めて良好な材料と思われる。継続的に改良を加えてきた自製の遠心鋳造装置でのノウハウを基礎にして、真空容器中で遠心鋳造できる傾斜機能材料作製システムを設計。製作した。このシステムを用いて市販のAl-50mass%Fe合金をベースに別途作製したAl-Fe母合金により、長さ90mm、外径90mm、肉厚12mmのAl-Al_3Fe傾斜機能材料厚肉円筒の作成プロセスを確立することができた。作成したAl-Al_3Fe傾斜機能材料厚肉円筒を素材として、1)Al_3Fe粒子形状・寸法は、厚肉円筒管内の半径方向の位置によって変化し、外周側は最大数百μmのやや長手の太い棒状組織であるのに対し、内周側では幅百μm程度の針状組織となる。3)Al-Al_3Fe傾斜機能材料の組成傾斜は、Al_3Feが040vol%の範囲で増加し、この組成傾斜分布に対応して、アルミニウムマトリックスのマイクロビッカース硬さは、Hv=3946程度の範囲で増加するAl_3Feの040vol%の範囲で増加に対応して、ヤング率はE=7199.5GPaの範囲で増加するが、線膨張係数はα=25.5×10^<-6>21.3×10^<-6>K^<-1>の範囲で減少し、平均比剛性E/ρ=2.9×10^6m^2s^<-2>である。5)均質とみなす平均約28vol%Al_3FeのAl-Al-_3Fe引張り試験片において、最大引っ張り応力86MPa、破断ひずみ0.44%であり、ヤング率E=90GPaという値となる。ということを明らかにし、本研究で完成させた真空遠心力法のためのシステムを用いて作製したAl-Al_3Fe傾斜機能材料が、要素・構造用材料として極めて良好な可能性を持つ素晴しい材料と考えられることを示している。
尿路病原性大腸菌の薬剤排出ポンプ機能の阻害によりキノロン耐性誘導を阻止する

キノロン感受性尿路病原性大腸菌株からキノロン高度耐性を得た。耐性株においては元株にはなかったQRDRのgyrA,、parC、parEなどに遺伝子変異がみられた。薬剤排出ポンプ関連蛋白のmRNA発現レベルを比較したところ、marAにおいては1001000倍と顕著な増加を示した。さらに大腸菌にキノロン耐性を誘導すると、832倍のセフェム系抗菌薬に対する耐性も同時に誘導されていることが確認された。セフェム系抗菌薬に対する耐性誘導のメカニズム解明のため、元株および対象菌株のホールゲノムシークエンスを行い、キノロン系およびセフェム系耐性の誘導に関与する遺伝子の同定を進めている。1.基盤研究C:課題番号22591803の追加実験:キノロン感受性尿路病原性大腸菌株89株をLVFX0.58μg/ml、464μg/ml、3228μg/ml含有アガー培地で継代培養し、そのうち5株から中等度耐(432μg/ml)さらに2株の高度耐性(128μg/ml)を得た。薬剤排出ポンプ関連蛋白およびquorum sensing調整蛋白のmRNA発現レベルを比較したところ、marAにおいては1001000倍と顕著な増加を示した。128μg/ml耐性株においては元株にはなかったQRDRの3カ所に遺伝子変異がみられた。この結果をYamazaki etal: J Infect Chemother 21: 105-109, 2015に報告した。2.抗菌薬併用による抗菌活性の評価BCプレート(栄研)を用いて、上記で得られたキノロン感受性高度耐性大腸菌株に対して、さまざまな併用抗菌薬の組み合わせによる抗菌活性を評価した。RFP4μg/ml・CPFX 1μg/mlそれぞれ単独では耐性を示した菌株(Uec314・R2)がRFP2μg/ml・CPFX 1μg/ml併用で感受性を示した。同様にRFP4μg/ml・CPFX 2μg/mlそれぞれ単独では耐性を示した菌株(Uec314・R8)がRFP4μg/ml・CPFX 2μg/ml併用で感受性を示した。その他の抗菌薬では、明らかなキノロン製剤との併用による抗菌活性の増幅効果は見られなかった。1.キノロン感受性尿路病原性大腸菌株89株をLVFX0.58μg/ml、464μg/ml、3228μg/ml含有アガー培地で継代培養し、そのうち5株から中等度耐(432μg/ml)さらに2株の高度耐性(128μg/ml)を得た。現在までの研究の成果からは、当初の目的であったさまざまな併用抗菌薬の組み合わせによる抗菌活性により、有効に薬剤排出ポンプを抑制する物質を同定するには至ってはいない。この点については今後さらなる検索が必要であると考える。一方、次の「今後の研究推進方策」にも触れているが、いままでの研究成果から大腸菌にキノロン耐性を誘導すると、セフェム系抗菌薬に対する耐性も同時に誘導されていることが確認されている。2015年度は、元株およびキノロン耐性が誘導された株を対象に、17株すべてに対してパルフィールドを施行することにより、元株とキノロン耐性誘導株が間違いなく同じクローンであることを検証し、さらに30種類以上の抗菌薬に対する感受性を網羅的に調べた。その結果、キノロン耐性誘導と同時に誘導される抗菌薬耐性は主にペニシリン系、第13セフェム系、ST合剤、テトラサイクリン系、に観察されるものの、アミノグリコシド系、カルバペネム系では観察されなかった。キノロン感受性尿路病原性大腸菌株89株をLVFX0.58μg/ml、464μg/ml、3228μg/ml含有アガー培地で継代培養し、そのうち5株から中等度耐(432μg/ml)さらに2株の高度耐性(128μg/ml)を得た。さらに大腸菌にキノロン耐性を誘導すると、セフェム系抗菌薬に対する耐性も同時に誘導されていることが確認されている。

2015年度は、元株およびキノロン耐性が誘導された株を対象に、17株すべてに対してパルフィールドを施行することにより、元株とキノロン耐性誘導株が間違いなく同じクローンであることを検証し、さらに30種類以上の抗菌薬に対する感受性を網羅的に調べた。その結果、キノロン耐性が誘導された大腸菌株にセフェム系をはじめ様々な抗菌薬に対する耐性も同時に誘導されていることが確認されている。多くの株はペニシリン系、第13セフェム系に対して48倍の耐性を示す程度であるが、CMZにいたっては元株の1632倍の耐性をしめす株も採取されている。2016年度はペニシリン系およびセフェム系抗菌薬に対する耐性誘導のメカニズム解明のため、元株および対象菌株のホールゲノムシークエンスを行い、キノロン系およびセフェム系耐性の誘導に関与する遺伝子の同定を進めている。現在ホールゲノムシークエンス対象株17株のうち、8株においてはシークエンスが終了しており、変異遺伝子の同定を解析中、残る9株についてはホールゲノムシークエンスの準備中である。キノロン感受性尿路病原性大腸菌株からキノロン高度耐性を得た。耐性株においては元株にはなかったQRDRのgyrA,、parC、parEなどに遺伝子変異がみられた。薬剤排出ポンプ関連蛋白のmRNA発現レベルを比較したところ、marAにおいては1001000倍と顕著な増加を示した。さらに大腸菌にキノロン耐性を誘導すると、832倍のセフェム系抗菌薬に対する耐性も同時に誘導されていることが確認された。セフェム系抗菌薬に対する耐性誘導のメカニズム解明のため、元株および対象菌株のホールゲノムシークエンスを行い、キノロン系およびセフェム系耐性の誘導に関与する遺伝子の同定を進めている。2014年度の前半においては、基盤研究C:課題番号22591803(H2224)の研究を終了させ論文投稿するために追加実験が必要であったため、やや本研究の着手が遅れた。しかし、前研究の完了によりさらに新たな知見(後述)が得られたこと、またキノロン系抗菌薬の抗菌活性を増幅させる可能性のある併用抗菌薬の候補が確認されたことは、今後の研究の発展に大変有望な成果と考える。大腸菌キノロン耐性誘導に付随するセフェム系抗菌薬耐性誘導機序の解明上述のように、キノロン耐性が誘導された大腸菌株にセフェム系をはじめ様々な抗菌薬に対する耐性も同時に誘導されていることが確認されている。これらのキノロン耐性誘導の機序は薬剤排出ポンプの高発現やQRDR(キノロン耐性決定遺伝子領域)変異で説明可能であるが、ペニシリン系およびセフェム系抗菌薬に対する耐性誘導は説明ができないため、元株および対象菌株のホールゲノムシークエンスを行い、キノロン系およびセフェム系耐性の誘導に関与する遺伝子を同定する。2015年末より本格的なシークエンス作業にはいっている。2016年末にはフルシークンスを終えて解析作業に入る予定である。尿路感染症1. RFP・CPFX(またはLVFX)併用による抗菌活性増幅効果のメカニズム解析RFP・CPFX(またはLVFX)の様々な濃度における抗菌薬併用による抗菌活性増幅効果を検証する。さらに、RFP単独、CPFX(またはLVFX)単独、両者併用時における薬剤排出ポンプ関連蛋白およびquorum sensing調整蛋白のmRNA発現レベルを解析する。
ヘルペスウイルスベクターによるグルタミン酸受容体の遺伝子発現とその制御機構の解析

神経親和性である単純ヘルペスウイルス1型(Herpes simplex virus 1;ここではHSVと略す)に由来する欠損型非増殖性HSVベクター発現系の一般的な検討を行い、方法論的に改良、発展させることを進め、本系のプロトコールを成書にまとめた(シュプリンガー・フェアラーク東京)。NMDA型グルタミン酸受容体(GluR)チャネルは、2種(ε,ζ)のサブユニットファミリーにより構成され、εサブユニットの分子的多様性がその機能的多様性の基盤を担っている。εサブユニット発現HSVクローンの研究を昨年度に続いて更に進めつつ、新たに、ζ1サブユニットのHSVクローン(HSV/GluRζ1)を構築・解析した。すなわり、HSV/GluRζ1を感染させたRabbit skin cellについて、RT-PCR、ドットブロット及びウェスタンブロット解析により、その高い発現が確認でき、発現したζ1サブユニットタンパクを分子的、機能的に解析するとともに、εサブユニットと組み合わせてin vivoでの感染実験を計画している。また、ζ1サブユニットタンパク分子の種々の部位の欠損変異体や、AMPA型GluRα1サブユニットの部位特異的変異体を発現するバキュロウイルスクローンを構築して、各リガンドの結合領域の解析を進めた。また、ラット胎仔大脳皮質初代培養神経細胞の細胞死に阻害的に機能している未知遺伝子のHSVベクターを構築し、その未知因子の機能解析を進め、本遺伝子産物がBcl-2、BDNFの発現を調節して細胞死に阻害的に働く機能を持つ因子であることが示唆された。また、悪性グリオーマに対する遺伝子治療用ベクターの可能性も考え、インターフェロンγやインターロイキン2を発現するHSVクローンを構築し、グリオーマ細胞、ヌードマウスを用いてin vitro、in vivoで基礎的検討を進めている。
IDH変異陽性グリオーマに対するグルタミン代謝を標的とした治療法の開発

腫瘍組織標本を用いた遺伝子解析やメタボローム解析によって、IDH1変異を有するグリオーマでは2-hydroxyglutarate(2HG)濃度の高値、およびGDH1/2とBCAT1が関連するグルタミン酸代謝の変動が示唆された。さらに、ヒトグリオーマ継代培養細胞(U87 MG)にIDH1変異遺伝子を導入した細胞モデルでも、IDH1変異型U87MG細胞では2HG濃度の増加とともにグルタミン酸濃度の低下を認めた。IDH変異グリオーマ細胞に対するグルタミン酸代謝の影響を調べるため、グルタミナーゼ(GLS)阻害剤やグルタミン酸デヒドロゲナーゼ(GDH)阻害剤を用いた実験を行った。それぞれの阻害剤でαケトグルタル酸(αKG)や2HGの低下を認め、dimethyl α-ketoglutarate(dm-KG)の投与で野生型と比べ有意な上昇を認めた。以上より、IDH変異グリオーマの細胞内代謝においてグルタミン酸代謝が関係することが示唆された。しかし、これらの阻害剤による細胞増殖能や細胞死誘導に著明な変化を認めなかった。したがって、今後はIDH変異グリオーマの発生やエピゲネティックな変化(メチル化など)に焦点をあてて、2HGやグルタミン代謝が関連する因子について検討する予定である。ヒトグリオーマ継代培養細胞(U87 MG)にIDH1変異遺伝子を導入した細胞モデルを作成して研究を進めているが、安定発現細胞株の作成が困難である。また、IDH変異を有するグリオーマ組織から直接培養継代した細胞株の作成も試みているが、安定した継代が得られていないため、組織を直接ヌードマウスの脳内あるいは皮下移植してin vivo実験の確立を目指している。IDH変異グリオーマの発生やエピゲネティックな変化(メチル化など)に焦点をあてて、2HGやグルタミン代謝が関連する因子について検討する予定である。また、同時に低酸素状態やグルタミン飢餓状態が及ぼす影響についても検討を行っており、他のアミノ酸の変動などに注目して解析を行う予定としている。腫瘍組織標本のメタボローム解析では、IDH1変異を有するグリオーマで2-hydroxyglutarate(2HG)濃度の高値とグルタミン酸濃度の低値を示した。さらにリアルタイムPCR法を用いてグルタミン酸代謝に関連する代謝遺伝子のmRNA発現を調べると、glutamate dehydrogenase 1 and 2 (GDH1/2)の発現がIDH1変異を有するグリオーマ組織で有意に高く、branched chain amino-acid transaminase1 (BCAT1)の発現が有意に低下していた。同様にウエスタンブロット法によるタンパク発現の解析においてもIDH1変異を有するグリオーマ組織でGDH1/2の発現が亢進しBCAT1の発現は低下していた。また腫瘍標本を用いた免疫組織化学染色法によるGDH1/2陽性細胞の測定では、IDH1変異型腫瘍組織でGDH1/2の陽性細胞比率が有意に高かった。これらのことからIDH1変異型腫瘍ではGDH1/2とBCAT1が関連するグルタミン酸代謝の変動が示唆された。次にヒトグリオーマ継代培養細胞(U87 MG)にIDH1変異遺伝子を導入し代謝変動を解析した。IDH1変異型U87MG細胞では2HG濃度の増加とともにグルタミン酸濃度の低下を認め、多変量解析を行うと、2HGとともにグルタミン酸が代謝変化に最も寄与する代謝物であった。今後はこの細胞モデルを使用して研究を進める予定とした。また、IDH変異を有するグリオーマ組織から直接培養継代した細胞株の作成も試みているが、安定した継代が得られていない。