hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ラマン分光岩石学:含マイクロ・ダイヤモンド捕獲岩に記録されたプルーム活動の解読

(1)短時間で岩石・鉱物試料のラマンスペクトル・2次元画像を撮影するためのイメージングラマン分光装置を研究開発した.(2)西南日本に分布する,アルカリ火山岩とそれらに包有されているマントル捕獲岩の鉱物学的地球化学的特徴と成因について論じた.(1)短時間で岩石・鉱物試料のラマンスペクトル・2次元画像を撮影するためのイメージングラマン分光装置を研究開発した.(2)西南日本に分布する,アルカリ火山岩とそれらに包有されているマントル捕獲岩の鉱物学的地球化学的特徴と成因について論じた.試験的に,ダイヤモンド・ウェファーとざくろ石中に包有される石英粒の2次元画像の撮影を行った.その結果,画像は得られたものの,薄片を試料とした場合,それを製作する際に用いた(1)樹脂からの蛍光が予想以上に強く,SN値が極めて小さくなることおよび,(2)励起光の強度が試料面上で均一でないなどの問題点が明らかとなった.このうち,問題点の(1)に関しては,薄片試料を作成するために必要な接着強度を有し,実際に使用されている製品9種類について蛍光強度を測定し,ほぼ使用目的にあった樹脂を選択することができ,解決できる見通しが立った.また,(2)の影響は,蛍光板上で蛍光強度を測定し,それから励起光の相対強度比を求め,この値を用いて画像プロクラム処理することによって軽減化することを目指している.前年度試作した,イメージング・ラマン分光装置の概要を,「音響光学的可変フィルター(AOTF)を利用したイメージング・ラマン分析装置の開発」と題して,日本地球惑星科学連合2010年大会(千葉・幕張メッセ)でポスター発表をした.そして,実用化する際の問題点として,(1)試料を作成する際に用いる樹脂からの傾向が予想以上に強く,SN値が極めて小さくなることおよび,(2)励起光の強度が試料面上で均一でない点などを説明して,参加者と解決方法を議論した.このうち(1)に関しては,用いる樹脂の種類だけではなく,固化させる際の温度や固化速度も蛍光の強弱に大きく影響することが明らかとなり,使用目的に合った樹脂選択のみならず,試料の最適な調整条件をほぼ決めることができた.(2)の問題点については,当初対物レンズの選定など本体の設計を一部変更することで改善を試みたが,最終的には対応できないことが明らかとなった.そこで,最終的には画像処理によって解決することとして,処理プログラムの作成を行うこととした.このプログラムは主に次の2点からなっている:(1)均一な蛍光板上で蛍光強度を測定し,その際観測された蛍光の不均一が励起光強度の関数であると見なして補正を行う,(2)樹脂の選択や固化条件の調整によっても取り除けない蛍光(バックグラウンド)を,任意のスペクトルのピーク位置と任意の波数だけずらした位置で測定したバックグラウンド,それぞれの強度から補正する.このうち,(1)に関するプログラムはほぼ完成しており,(2)について研究を進めている.イメージング・ラマン分光装置の概要および画像処理の概要を,(1)均一な蛍光板上で蛍光強度を測定し,その際観測された蛍光の不均一が励起光強度の関数であると見なして補正を行う,および(2)樹脂の選択や固化条件の調整によっても取り除けない蛍光(バックグラウンド)を任意のスペクトルのピーク位置と任意の波数だけずらし準位置で測定したラマンそれぞれの強度から補正するプログラムの内容を中心に,日本鉱物科学会2011年度年会(茨城大学)でポスター発表をした.含マイクロ・ダイヤモンド捕獲岩とともに産するスピネルかんらん岩,斜長石かんらん岩,斑れい岩の岩石学的・鉱物学的特徴と三者相互の関係を,日本地質学会第118年学術大会(茨城大学)で発表した.主な内容は,各岩種の平衡温度,形成圧力,単斜輝石などに包有されているCO_2流体包有物の密度,および希土類元素を含む微量元素組成の特徴である.そして,これらの情報を元にして,中新世の北部四国下には,斑れい岩質の地殻,かんらん石集積岩の下位に高枯渇度のマントルが位置するリソスフェア層構造が存在し,その中位に斑れい岩-ノーライト質のマグマが貫入したことを論じた.そして,このマグマを熱源として地下30kmが1000°C近くに達する高い地温勾配か・形成された可能性を論じた.また,画像処理ソフトのさらなる改良を行うとともに,二次元画像の重ね合わせによって,三次元イメージを得る画像ソフトの開発を行っている.(1)イメージング・ラマン分光装置の弱点であった,照射されるレーザー強度が資料面上で不均一であるためにスペクトルの強度が不均一になること,および対象とする試料によっては,蛍光励起が強くバックグラウンドが高くなるためS/N値が悪くなる点に対応した.これらに対する対応はすでに2011年から始めて一部の成果は公表していたが,最終的に均一な蛍光板上で蛍光強度を測定し,その際観測された蛍光の不均一が励起光強度の関数であると見なして補正を行う,および任意のスペクトルのピーク位置と任意の波数だけずらした位置で測定したラマンそれぞれの強度から補正するプログラムを完成させた.(2)マイクロダイヤモンドを含む捕獲岩が産する愛媛県新宮地域を中心として,アルカリ玄武岩岩脈に捕獲されているマントルゼノリスの鉱物学的・岩石学的記載を中心とした研究を続けた.新宮地域の斑れい岩質ゼノリスに注目すると,含角閃岩斑れい岩,含斜方輝石斑れい岩ー輝岩と斑れい岩ノーライトに区分される.

このうち,斑れい岩は新宮直下の下部地殻に由来し,斑れい岩ー輝岩は母岩であるアルカリ玄武岩マグマからの集積岩,斑れい岩ノーライトはアルカリ玄武岩マグマによる交代作用を被った斑れい岩質岩であると考えられる.斑れい岩ノーライトは, Cr2O3に富むにもか変わらずアルカリ元素に富むという特徴を持つ.これは,アルカリ玄武岩質マグマの上昇によるリソスフェアマントル中の斜方輝石の同化作用を示している可能性がある.また,著しくHFS元素に富む特徴は,マグマ進化の過程でカーボナタイトメルトの分離があったことを示唆する.アルカリマグマ活動の初期に低い部分融解度によって形成されたアルカリマグマが,大陸リソスフェアを改変した可能性がある.予定通り,AOTFを利用したイメージング・ラマン分析装置本体は完成したが,当初の予想以上に分析用試料作成時に用いる樹脂の蛍光励起による妨害が強いことと,照射するレーザー強度が不均一であることが問題点として顕在化し,それらに対する対応が必要となったため.また,レーザー光源とレーリー散乱用フィルターに不具合が生じ,高原の修理およびフィルターの交換に時間を要したため.24年度が最終年度であるため、記入しない。当初は,イメージング・ラマン分析装置本体の改良や対物レンズの交換などにより,顕在化した問題点に対応しようと試みたが,完全には問題を解決することができなかった.そこで,得られた画像をコンピュータ処理することで,ほぼ解決できる見通しとなった.今後は,画像処理ソフトのさらなる改良を目指す.これと平行して,を含マイクロ・ダイヤモンド捕獲岩の検討を開始して,その研究は,計画年度終了後も継続して行い,申請時の目標を達成する予定である.24年度が最終年度であるため、記入しない。
腫瘍選択的融解アデノウイルス製剤と免疫チェックポイント阻害剤との併用効果の検討

本研究においては、現在臨床試験段階にあるテロメラーゼ特異的腫瘍融解アデノウイルス製剤(OBP-301、テロメライシン)を基本骨格として、マウス癌細胞株に感染性の高いペプチド改変ファイバーを搭載した腫瘍融解アデノウイルス(BP-502)を用いた。細胞株は、CT26(BALB/cマウス由来大腸癌細胞株)とPan02(C57BL/6マウス由来膵癌細胞株)を用いた。当初の研究実施計画に基づき、その進捗状況を概説する。V.転移を有するマウス同所性移植腫瘍モデルにおける治療効果とがん微小環境への影響---ルシフェラーゼを遺伝子導入したCT26細胞株(CT26-Luc)を、BALB/cマウスの直腸粘膜下に移植し、またその2日目にCT26-Lucを門脈内投与し、肝転移を有する直腸癌同所性モデルを作成した。マウスを4群(PBS, OBP-502腫瘍内投与,抗PD-1全身投与,併用)に分け、1週間に1回ずつを計3回ずつ治療を行い、経時的に直腸癌と肝転移の腫瘍量をIVISにて測定したところ、他群と比較して併用群において有意に腫瘍量が少なく、また生存率も有意に改善した。VI.ヒトがん細胞株とヒト末梢血単核細胞との共培養条件下における治療効果の検討---実施することができなかった。VII.テロメライシンと抗PD-1抗体の併用効果のメカニズム解明---in vitroにおいて、CT26およびPAN02をOBP-502で治療したところ、Western blotおよびFACSにてPD-L1発現が増強していることが確認され、このことが抗PD-1抗体との併用効果のメカニズムの一つと考えられた。研究期間全体を通して、テロメラーゼ特異的腫瘍融解アデノウイルス製剤は宿主の抗腫瘍免疫を活性化し、抗PD-1抗体との併用において有意な抗腫瘍効果を発揮することを証明した。当初計画していた平成28年度の研究実施計画は以下の2点であり、それぞれの研究成果について概説する。I.ヒト食道癌・胃癌組織(手術標本)におけるPD-L1発現と臨床病理学的特徴の検討255例の胃癌手術標本においてPD-L1発現を免疫組織化学染色にて評価したところ、陽性は37例(15%)であった。臨床病理学的因子との検討において、PD-L1陽性は進行度が高くまた浸潤傾向の強い症例に有意に多く認められ、組織型では分化型癌に多く認められる傾向にあった。生存分析では、PD-L1陽性群は陰性群と比較し有意に予後不良で、多変量解析においても、PD-L1陽性は独立した予後不良因子であった。また、再発形式に関する検討において、PD-L1陽性群では腹膜播種再発が有意に少なく、血行性転移再発が多い傾向にあった。腹膜播種再発を来した25例のうち3例において再発時の播種結節の組織学的検討が可能であったが、この3例ではいずれも初回手術の原発巣と再発時の腹膜播種巣ともにPD-L1陰性であった。多変量解析では、PD-L1発現が腹膜播種再発の独立した予測因子であることが示された。II.ヒト食道癌組織におけるテロメライシン投与のがん微小環境に及ぼす影響の検討岡山大学で現在進行中の臨床研究(テロメライシンと放射線との併用)において、治療前後に採取された生検組織におけるCD8リンパ球の発現を免疫組織化学染色にて確認したが、治療前後で大きな差異を認めなかった。2症例のみの検討であることや採取部位が治療前後で異なることなどから、結論を得るためには更なる検討が必要と考えられた。当初の研究実施計画に沿って順調に研究を進めることができており、また次年度に予定している研究の準備にも取りかかることができているため。III.マウスがん細胞株におけるPD-L1発現レベルの検討ーCT26とPan02におけるPD-L1発現をFACSにて検討し、両細胞株ともにPD-L1陽性であることを確認した。IV.マウスがん細胞株を用いた皮下移植腫瘍モデルにおける治療効果とがん微小環境への影響ーCT26とPan02のマウス背部皮下腫瘍モデルにおいて、OBP-502の腫瘍内投与は腫瘍組織へのCD8陽性リンパ球の浸潤を促し、抗PD-1抗体との併用においてはコントロール治療群に比し有意な抗腫瘍効果を発揮し、33%(4/12)のマウスにおいて腫瘍消失を認めた。腫瘍消失を認めた4匹のマウスに再度腫瘍の皮下投与を試みたが、50%(2/4)のマウスには生着せず獲得免疫による抗腫瘍効果の持続が確認された。また、CT26の両側背部皮下腫瘍モデルを作成し、OBP-502を片側の腫瘍にのみ投与を行ったところ、治療側のみならず非治療側の腫瘍の増殖も有意に抑制され、アブスコパル効果が確認された。

このアブスコパル効果はヌードマウスでは消失しており、OBP-502の局所投与が宿主の腫瘍免疫の増強につながっていることが確認された。当初の研究実施計画に沿って順調に研究を進めることができており、また次年度に予定している研究の準備にも取り掛かることができているため。本研究においては、現在臨床試験段階にあるテロメラーゼ特異的腫瘍融解アデノウイルス製剤(OBP-301、テロメライシン)を基本骨格として、マウス癌細胞株に感染性の高いペプチド改変ファイバーを搭載した腫瘍融解アデノウイルス(BP-502)を用いた。細胞株は、CT26(BALB/cマウス由来大腸癌細胞株)とPan02(C57BL/6マウス由来膵癌細胞株)を用いた。当初の研究実施計画に基づき、その進捗状況を概説する。V.転移を有するマウス同所性移植腫瘍モデルにおける治療効果とがん微小環境への影響---ルシフェラーゼを遺伝子導入したCT26細胞株(CT26-Luc)を、BALB/cマウスの直腸粘膜下に移植し、またその2日目にCT26-Lucを門脈内投与し、肝転移を有する直腸癌同所性モデルを作成した。マウスを4群(PBS, OBP-502腫瘍内投与,抗PD-1全身投与,併用)に分け、1週間に1回ずつを計3回ずつ治療を行い、経時的に直腸癌と肝転移の腫瘍量をIVISにて測定したところ、他群と比較して併用群において有意に腫瘍量が少なく、また生存率も有意に改善した。VI.ヒトがん細胞株とヒト末梢血単核細胞との共培養条件下における治療効果の検討---実施することができなかった。VII.テロメライシンと抗PD-1抗体の併用効果のメカニズム解明---in vitroにおいて、CT26およびPAN02をOBP-502で治療したところ、Western blotおよびFACSにてPD-L1発現が増強していることが確認され、このことが抗PD-1抗体との併用効果のメカニズムの一つと考えられた。研究期間全体を通して、テロメラーゼ特異的腫瘍融解アデノウイルス製剤は宿主の抗腫瘍免疫を活性化し、抗PD-1抗体との併用において有意な抗腫瘍効果を発揮することを証明した。当初の研究実施計画(下記)通りに、腫瘍融解アデノウイルス製剤と抗PD-1抗体との併用効果に関して、in vitroやin vivoでの検討を開始する予定である。III.マウスがん細胞株におけるPD-L1発現レベルの検討IV.マウスがん細胞株を用いた皮下移植腫瘍モデルにおける治療効果とがん微小環境への影響V.転移を有するマウス同所性移植腫瘍モデルにおける治療効果とがん微小環境への影響当初の研究実施計画に基づき、腫瘍融解アデノウイルス製剤と抗PD-1抗体との併用効果に関して、in vitroやin vivoでの検討を行う予定である。V.転移を有するマウス同所性移植腫瘍モデルにおける治療効果とがん微小環境への影響VI.ヒトがん細胞株とヒト末梢血単核細胞との共培養条件下における治療効果の検討VII.テロメライシンと抗PD-1抗体の併用効果のメカニズム解明実験消耗品の購入が当初の予定より安く済んだため。(理由)実験消耗品の購入が当初の予定より安くすんだため(使用計画)繰り越しとなった金額は主に次年度の実験消耗品に用いる予定である。繰り越しとなった金額は主に次年度の実験消耗品に用いる予定である。
幼少期社会的経験が形づくる前頭前野-視床回路の同定

近年、児童虐待は深刻な社会問題となっている。児童虐待などの劣悪な幼少期社会的経験は長期にわたり心身に障害をもたらすが、その詳細な機序は不明な点が多い。ヒトのニューロイメージング研究により、劣悪な小児期体験は前頭前野と視床を結ぶ回路を障害させることが明らかになっており、本研究課題ではマウスを用い、幼少期社会的経験によって形成される前頭前野-視床回路の機能を調べていく。
硫酸化グリコサミノグリカン糖鎖の普遍的シークエンシング法の開発

多くの細胞増殖因子や分化因子の作用発現は、細胞表面の高親和性レセプターとの結合を介して行われる。そのためには、これらの因子が細胞表面上のヘパラン硫酸などの硫酸化グリコサミノグリカン(GAG)鎖と結合することが必要である。しかし、硫酸化GAG鎖は構造が複雑なため、構造解析は困難を極めている。本研究では、硫酸化GAG鎖の簡便で普遍的なシークエンシング法の確立を目指し、以下の一連の研究成果をあげた。(1)イカ軟骨の多硫酸化コンドロイチン硫酸から5種類の新規の四糖構造を単離し、構造決定した。(2)ブタ小腸ヘパリンから新規の硫酸化四糖1種、五糖1種、六糖構造8種、3種の八糖、4種の八糖セリンを単離し、構造決定した。また、微量成分として含まれている高硫酸化デルマタン硫酸由来の硫酸化四糖と六糖を単離精製し、構造決定した。(3)ヌタウナギ脊索の多硫酸化コンドロイチン硫酸Hから新規の8種類の四糖と5種類の六糖を単離し、構造決定した。(6)蛍光試薬である2-aminobenzamideで糖鎖の還元末端を標識することによって、硫酸化GAGの微量分析を開発するとともに、この標識法と糖鎖分解酵素による消化を組み合わせ、高感度な糖鎖シークエンシング法を開発した。(7)上記の微量分析法を用いて、線虫C. elegansに硫酸化されていないコンドロイチンと高度に硫酸化されたヘパラン硫酸が存在することを世界に先駆けて明らかにした。(1)エキソシークエンシング法の開発に必要な構造の確定された硫酸化オリゴ糖(四糖)をイカ軟骨由来のコンドロイチン硫酸Eから単離、精製し、構造決定することに成功した。明らかになった構造には従来知られていなかった新規の構造が含まれていた(論文)。(2)エキソシークエンシング法の開発に必要な構造の確定された硫酸化オリゴ糖(六糖)をブタ小腸由来のヘパリンから単離、精製し、構造決定することに成功した。(3)ヘパリンやヘパラン硫酸の構造解析に必要なヘパリナーゼを精製し、その性質を明らかにすることに成功した(論文)。(4)ヘパリンやヘパラン硫酸からこれまで我々をはじめとする世界中の研究者が単離精製し、構造解析してきた硫酸化オリゴ糖をまとめ、総説を書き、国際的な雑誌に掲載した(論文)。(5)糖タンパク質や糖脂質由来のオリゴ糖鎖の標識のために開発された蛍光試薬2-aminobenzamideを、硫酸化GAG鎖由来の数種のモデル化合物の蛍光標識に適用し、数ピコモルでのアイソトープラベルに匹敵する高感度分析が実現可能であることを示した。さらに、すでに単離・構造決定したオリゴ糖プローブを用いてエキソシークエンシング法のモデル実験を行い、構造の複雑さが比較的緩やかなコンドロイチン硫酸とデルマタン硫酸由来のオリゴ塘プローブに適用することに成功した(論文作成中)。(1)ヘパリンをバクテリアのエリミナーゼで分解して得た不飽和二糖が、アルカリ性水溶液中で、非酵素的にのC2-エピメリゼーションによってマンノサミンに変化することを見い出した。(2)ブタ小腸由来のヘパリンオリゴ糖標品中にデルマタン硫酸由来の硫酸化四糖と六糖を見い出し、-3GalNAc(4,6-disulfated)βl-4IdoAα1-という珍しい二糖単位を含む、新規の配列を見い出した。(3)ブタ小腸由来のヘパリンをヘパリナーゼで消化して断片化して得た硫酸化八糖の構造をプロトンNMRで解析することによって決定した。

その結果、硫酸化パターンとプロトンのケミカルシフト値の間に密接な関係があることを見い出した。(4)バクテリア由来のコンドロイチナーゼCはコンドロイチン硫酸やデルマタン硫酸の構造解析の重要なツールとなることが期待される。バクテリア由来のコンドロイチナーゼCを、当研究室でプロテオグリカンも糖とタンパク質との結合領域から単離した様々な硫酸化Glycoserineに作用させることによって、結合領域に対する基質特異性を明らかにした。(5)すでに当研究室で構造を決定した標識硫酸化オリゴ糖をモデル化合物として2-aminobenzamideで蛍光標識し、標識誘導体をまずバクテリア由来のコンドロイチンナーゼ、ヘパリチナーゼ、スルファターゼなどを用いて消化し、消化物のHPLC分析、ゲル電気泳動分析によりシークエンシングを実施し、酵素消化、HPLC、電気泳動の至適条件を決定することが出来た。動物組織のみに見い出され、高等な細胞での様々な機能が証明されてきている硫酸化グリコサミノグリカン糖鎖について、以下のような研究成果をえた。(1)ヌタウナギ脊索の多硫酸化コンドロイチン硫酸H(多硫酸化デルマタン硫酸E)から新規の8種類の四糖と5種類の六糖を単離し、構造決定した。また、これらのオリゴ糖鎖のプロトンNMRスペクトルのデータを得た。(2)構造解析に必須のToolとしてのバクテリア(Prevotella heparinolytica)由来のへパリン/ヘパラン硫酸の分解酵素であるへパリナーゼおよび同じくバクテリア(Flavobacterium)由来のコンドロイチン硫酸/デルマタン硫酸に作用するchondroitinase Cの基質特異性をそれぞれ明らかにした。(3)蛍光試薬である2-aminobenzamideで糖鎖の還元末端を標識することによって、硫酸化グリコサミノグリカンの微量組成分析法を開発するとともに、この標識法とコンドロイチナーゼやハパリチナーゼなどの糖鎖分解酵素による消化を組み合わせることによって、高感度な糖鎖シークエンシング法を開発した。(4)上記の新しく開発した微量分析法を用いて、線虫C.elegansに硫酸化されていないコンドロイチンと高度に硫酸化されたヘパラン硫酸が存在することを世界に先駆けて明らかにした。非常に下等な動物種にもこれらのグリコサミノグリカンが存在することから、それらの糖鎖の重要性が示唆された。
ラット培養腎メサンギウム細胞におけるアドレノメジュリン受容体の特性

〈目的〉ヒト褐色細胞腫より発見されたadrenomedullin(AM)は、血小板cAMP及び血管平滑筋cAMPの上昇を介して降圧効果を発揮する新しいペプチドであり、構造上強力な血管拡張作用を持つcalcitonin gene-related peptide(CGRP)及びamylinとホモロジーを有することが知られている。近年、AMのmRNAは腎臓にも存在し、AMにはCGRPと同様に糸球体濾過量の増加およびNa利尿作用のあることが報告されている。申請者は、すでにラット腎尿細管基底膜側細胞膜にてAMがcAMPを強力に上昇させたことより、腎尿細管におけるAM受容体の存在優位性を示唆した(Osajima et al.,LifeSci.57,457,1995)。今回、ラット培養腎メサンギウム細胞(MC)においてAM受容体のcharacterizationを行い、さらに免疫組織染色法によるAMの局在性についても検討した。〈方法〉MCを用いて以下の実験を行った。(1)cAMP産生に及ぼす三者ペプチド(AM,CGRP,amylin)の比較(2)(1)に対するAM受容体拮抗剤,AM[22-52]-NH_2及びCGRP受容体拮抗剤,CGRP[8-37]の抑制効果(3)AMとCGRPの相加的効果の有無(4)免疫組織染色法によるAM局在の有無〈結果〉(1)AM及びCGRPは10分の反応で濃度依存性にcAMP産生を各々7倍、2倍まで増加させた。EC_<50>濃度はそれぞれ3×10^<-9>M,10^<-7>Mであった。amylinにはcAMP増加作用は認めなかった。(2)AM刺激下cAMP及びCGRP刺激下cAMPに対するAM[22-52]-NH_2のIC_<50>濃度は,それぞれ7×10^<-8>M,5×10^<-8>Mであった。AM刺激下cAMP及びCGRP刺激下cAMPに対するCGRP[8-37]のIC_<50>濃度はともに10^<-6>Mであった。(3)AMとCGRPに相加的効果は認めなかった。(4)MCにおいてAM及CGRPの免疫活性は認めなかった。〈考察〉培養メサンギウム細胞において、AMはパラクリン的に作用しcAMPを介する機序により腎機能を調節している可能性が示唆された。
マルチモーダルサイレント音声認識技術に関する研究

1.実施計画に基づき、本研究グループが企画・運営するワークショップ(第5回サイレント音声認識ワークショップ)を2018年9月29日(土)30日(日)に東京理科大学野田キャンパスで開催した。ワークショップでは特別講演1件、チュートリアル講演1件を含め16件の発表があった。特別講演に関してはサイレント音声の一つのアプローチである手話に関して、チュートリアル講演に関しては、本研究グループの研究者が近年注目を集めている機械学習と深層学習による時系列モデルについて講演された。また実施計画通りに表彰制度において学生奨励賞1名を表彰した。2.実施計画に基づき、カラー画像を用いた音声認識技術である読唇技術において、研究代表者が構築したスマートデバイスを用いた発話シーンデータベース(SSSD)を公開し、さらにSSSDを用いたコンペティション「機械読唇チャレンジ」を国内初開催した。初の試みであったため参加は3グループと少なかったが、関係者からは好評であり、第2回の開催要望があった。3.本研究グループ6名の研究者は、各モダリティにおける研究を進め、国際学会発表5件、国内学会発表15件の研究成果を挙げた。また研究代表者は、ひらめき☆ときめきサイエンスなどにおいても本研究テーマについて高校生向けに紹介した。4.読唇向けの公開データベースSSSDを用いて、読唇技術を体験できるWebアプリを開発し、一般に公開した。さらに新聞やラジオ等で取り上げられ、本研究成果を社会に発信した。ワークショップの開催に関しては、研究成果発表だけでなく特別講演およびチュートリアル講演を企画して魅力あるワークショップを開催した。サイレント音声認識技術の一つである読唇技術における公開データベースSSSDを用いた国内初の読唇技術のコンペティション「機械読唇チャレンジ」の実施や読唇技術を体験できるWebアプリを開発・公開することで研究成果を社会に発信することができた。本研究グループ6名の研究者は、各テーマにおける研究を進め、国内外でそれぞれ研究成果を発表した。ワークショップについては継続して開催する。2019年度は九州地方での開催を計画している。これまで同様に学生奨励賞を設ける。2018年度に続き、読唇技術向けのコンペティション「第2回機械読唇チャレンジ」をワークショップ内で開催する予定である。1.実施計画に基づき、本研究グループが企画・運営するワークショップ(第3回サイレント音声認識ワークショップ)を2016年10月14日(金)15日(土)に福岡朝日ビル貸会議室(福岡県福岡市)で開催した。発表件数は17件(特別講演1件を含む)、参加者数は45人であり、本研究グループの研究者も参加・発表した。また実施計画通りに表彰制度を設けて、学生奨励賞1名を表彰した。ワークショップの最後に、ビジネスミーティングを実施して、今後の研究の方向性について検討した。3.本研究グループ6名の研究者は、カラー画像、音声、距離画像、表面筋電信号、脳波などの各モダリティ、あるいはバイモーダルなどの各テーマで研究を進め、雑誌論文2編、国際会議発表11件、国内学会発表19件の研究成果を挙げた。4.マルチモーダルコーパスの構築については、研究代表者が準備を進めている。ワークショップ開催に関して、実施計画では国内のみであったが、国際ワークショップにも本研究グループが関連した。国内ワークショップでは聴覚障害者、国際ワークショップでは研究者を招聘して特別講演を実施した。本研究グループ6名の研究者は、各テーマにおける研究を進め、国内外で成果を発表した。1.実施計画に基づき、本研究グループが企画・運営するワークショップ(第4回サイレント音声認識ワークショップ)を2017年9月3日(日)4日(月)に岐阜大学JR岐阜駅前サテライトキャンパスで開催した。今回は新しい試みとして、計測自動制御学会ライフエンジニアリング部門シンポジウム(LE2017)と併催し、ワークショップの2日目のセッションは、LE2017のオーガナイズドセッション「サイレント音声認識の現状と今後」として、5件の発表のうち、本研究グループメンバー4名が招待講演として各研究について発表した。ワークショップの発表件数は18件であった。2.本研究グループメンバーは、前述のLE2017のオーガナイズドセッションにおける招待講演の他に、国内学会で招待講演2件を行い、本研究テーマについてアピールした。3.本研究グループ6名の研究者は、各モダリティ、あるいはバイモーダルなどの各テーマで研究を進め、雑誌論文1編、国際学会発表11件、国内学会発表18件の研究成果を挙げた。4.カラー画像を用いた音声認識技術である読唇技術において、研究代表者がスマートデバイスを用いた発話シーンデータベース(SSSD)を構築し、国内学会で発表した。このデータベースは2018年4月に研究者向けに無償で公開しており、読唇技術の活性化に貢献した。ワークショップの開催に関しては、LE2017と併催することでより多くの研究者に本研究テーマについて紹介した。さらにその他の招待講演なども実施した。サイレント音声認識技術の一つである読唇技術における公開データベースを構築した。

また実施計画通りに表彰制度において学生奨励賞1名を表彰した。2.実施計画に基づき、カラー画像を用いた音声認識技術である読唇技術において、研究代表者が構築したスマートデバイスを用いた発話シーンデータベース(SSSD)を公開し、さらにSSSDを用いたコンペティション「機械読唇チャレンジ」を国内初開催した。初の試みであったため参加は3グループと少なかったが、関係者からは好評であり、第2回の開催要望があった。3.本研究グループ6名の研究者は、各モダリティにおける研究を進め、国際学会発表5件、国内学会発表15件の研究成果を挙げた。また研究代表者は、ひらめき☆ときめきサイエンスなどにおいても本研究テーマについて高校生向けに紹介した。4.読唇向けの公開データベースSSSDを用いて、読唇技術を体験できるWebアプリを開発し、一般に公開した。さらに新聞やラジオ等で取り上げられ、本研究成果を社会に発信した。ワークショップの開催に関しては、研究成果発表だけでなく特別講演およびチュートリアル講演を企画して魅力あるワークショップを開催した。サイレント音声認識技術の一つである読唇技術における公開データベースSSSDを用いた国内初の読唇技術のコンペティション「機械読唇チャレンジ」の実施や読唇技術を体験できるWebアプリを開発・公開することで研究成果を社会に発信することができた。本研究グループ6名の研究者は、各テーマにおける研究を進め、国内外でそれぞれ研究成果を発表した。ワークショップについては継続して開催する。2017年度は岐阜で開催する予定で計画を進めている。2016年度同様に特別講演の実施や学生奨励賞を設ける。マルチモーダルコーパスの構築を進める。2018年度は東京理科大学野田キャンパスで開催する予定である。これまで同様に学生奨励賞を設ける。さらに新しい企画として、公開データベースSSSDを用いたコンペティションをワークショップ内で開催する予定である。2019年度は九州地方での開催を計画している。2018年度に続き、読唇技術向けのコンペティション「第2回機械読唇チャレンジ」をワークショップ内で開催する予定である。
μオピオイドによる痒みの機序解明とガバペンチンの鎮痒効果

マウスの脊髄くも膜下腔にμオピオイドレセプター(MOR)アゴニストであるDAMGOを投与したところ、総引っ掻き回数はPLCβ3欠損マウスでは野生型に比べ減少したため、MORアゴニストによる痒みにPLCβ3が重要な役割を果たすことが明らかとなった。DAMGO単独の脊髄くも膜下投与に比べ、DAMGOとガバペンチン(GBP)の混合投与によりマウスの引っ掻き行動が抑制されたため、GBPがMORによる痒みを抑制することがわかった。ラット術後痛モデルでの脊髄くも膜下腔ガバペンチンの鎮痛効果を検討したところ、GBPは二次性痛覚過敏を抑制し、術後痛を軽減するのに重要な役割があることを解明した。μオピオイド受容体(MOR)アゴニストの合併症の一つとして痒みが知られている。マウスの脊髄くも膜下腔にMORアゴニストを投与すると痒み行動とされる引っ掻き行動が観察される。臨床上、MORアゴニストによる痒みはナロキソンにより拮抗されるが、同時に鎮痛効果も拮抗されるため有用ではない。【研究の目的】ガバペンチン(GBP)の脊髄くも膜下腔投与がMORアゴニストによる引っ掻き行動と鎮痛効果に及ぼす影響を検討した。【対象】C57BL/6系雄マウス【方法】(実験1)脊髄くも膜下腔にMORアゴニストである[D-Ala2,N-MePhe4, Gly-ol]-enkephalin (DAMGO)3、10pmol、GBP 0.23μmol、DAMGO10pmol+GBP0.23μmol、または、生理食塩液5μlを投与後30分間、引っ掻き行動をビデオ撮影し、総引っ掻き回数を解析した。(実験2)脊髄くも膜下腔にDAMGO10pmol、GBP 0.23μmol、DAMGO10pmol+GBP 0.23μmol、または、生理食塩液5μlを投与後60分間、マウスの尾を48°Cの温水につけて反応するまでの潜時を測定した。また、DAMGO 10pmol投与15分前に腹腔内にナロキソン25μgを投与し、同様の測定を行った。結果は時間曲線下面積(AUC)で算出した。【結果】(実験1)DAMGO単独は生理食塩液に比べ、有意に引っ掻き行動が増加した。DAMGO単独と比べ、DAMGOとGBPの混合液は、引っ掻き行動が抑制された。(実験2)DAMGO単独とDAMGOとGBPの混合液は、AUC値に差はなかった。ナロキソン前処置はDAMGOのAUC値を減少させた。【結語】GBPの脊髄くも膜下腔投与はMORアゴニストによる鎮痛効果を減ずることなく引っ掻き行動を抑制したため、鎮痒薬として有用であることが示唆された。モルヒネは強力な鎮痛効果があるものの、副作用として過鎮静、呼吸抑制、悪心、嘔吐、痒みなどの副作用が問題となっている。米国では区域麻酔としてオピオイドを用いたときのガイドラインが存在するが、本邦ではなく、安全な区域麻酔時のオピオイド使用が求められる。今回、マウスの脊髄くも膜下腔にモルヒネを投与し、熱刺激による抗侵害受容効果と副作用である鎮静と痒みを検討した。【対象】C57BL/6系雄マウス各群5-6匹【方法】(実験1)脊髄くも膜下腔にモルヒネ0.1、0.3、1.0nmol、または生理食塩液5μlを投与前、投与後150分間、マウスの尾を48°Cの温水につけて反応までの潜時を測定した。(実験2)脊髄くも膜下腔にモルヒネ0.1、0.3、1.0nmol、または生理食塩液5μlを投与後60分間ビデオ撮影し、鎮静レベルを3段階に分け経時的な鎮静スコアを解析した。実験2と同様の方法で痒み行動とされる引っ掻き回数の経時的変化と総引っ掻き回数を解析した。【結果】(実験1)生理食塩液群に比べモルヒネ0.1nmol群は5分後のみ、0.3nmol群は5-90分後まで、1.0nmolは5-150分後まで有意に潜時が長かった。(実験2)モルヒネ0.3nmolと1.0nmol群は生理食塩液群に比べ濃度依存性に強く鎮静された。また、モルヒネ0.3nmolと1.0nmol群は生理食塩液群に比べ有意に引っ掻き行動が増加した。【結語】モルヒネの脊髄くも膜下腔投与は少量でも熱性抗侵害受容効果を示すが、同時に痒みのみならず過度の鎮静状態を引き起こした。ラット術後痛モデルでの脊髄

くも膜下腔ガバペンチンの鎮痛効果を検討したところ、GBPは二次性痛覚過敏を抑制し、術後痛を軽減するのに重要な役割があることを解明した。ガバペンチンの鎮痛効果について、ラット術後痛モデルにおいて脊髄レベルでの経時的変化を明らかにするために、今年度はガバペンチンとNSAIDsであるジクロフェナックを用いて、薬剤投与後から7日間までの二次性痛覚過敏の抑制効果の検討をおこなった。薬剤投与3日前に全身麻酔下にラットの脊髄くも膜下腔にカテーテルを挿入した。ガバペンチン、ジクロフェナック、おのおのの混合液、対照群として生理食塩液、または、6%ブドウ糖液20μlを投与後、ラット術後痛モデルを作成した。鎮痛効果検討するための行動学的検討として、Von Frey filamentsを用いて機械的閾値を測定した。測定は薬剤投与前、術後2時間、1、3、5、7日目に行った。ラット術後痛モデルは全例、二次性痛覚過敏を生じた。低、中濃度ガバペンチン、ジクロフェナックは、対照群と比べ二次性痛覚過敏を抑制しなかった。高濃度ガバペンチンは、全測定期間、高濃度ジクロフェナックは、術後2時間、1、3日目で有意にこの痛覚過敏を抑制した。低濃度混合液は、術後2時間で、中濃度混合液は、術後2時間、1日目で有意に二次性痛覚過敏を抑制した。ラット術後痛モデルにおいて、おのおの単独では効果のないガバペンチン、ジクロフェナックの脊髄くも膜下腔への混合投与が二次性痛覚過敏を抑制することが明らかとなった。これらの結果からガバペンチンとジクロフェナックは脊髄レベルにおいて術後痛を軽減するのに重要な役割があること、また、ガバペンチンは脊髄レベルでジクロフェナックの二次性痛覚過敏抑制効果を増強することが示唆された。モルヒネの脊髄くも膜下腔投与は、少量でも強力な鎮痛効果が得られるが、合併症として痒みを引き起こすことがある。ガバペンチンと同様な機序で鎮痛作用が得られるプレガバリンの全身投与によりμオピオイド受容体(MOR)作動薬よる痒みが抑制されることが明らかとなってきた。しかし、臨床上、プレガバリンの全身投与によりふらつきなどの副作用が問題となることがある。今回、少量の選択的MOR作動薬とプレガバリンの混合液を脊髄くも膜下腔投与し、プレガバリンが選択的MOR作動薬[D-Ala2, N-MePhe4, Gly-ol]-enkephalin (DAMGO)による痒みと鎮痛効果に及ぼす影響を検討した。C57BL/6系雄マウスを各群46匹を用いて以下の実験を行った。実験1:DAMGO 3, 10 pmol、プレガバリン0.016 μmol、DAMGO 10pmol +プレガバリン0.016μmol、または、生理食塩液5μlをi.t.投与後30分間ビデオ撮影し、総引っ掻回数を解析した。実験2: DAMGO10pmol、プレガバリン0.016 μmol、DAMGO10pmol+プレガバリン0.016μmol、生理食塩液5μlを脊髄くも膜下腔投与前、投与後60分間、マウスの尾を48°Cの温水につけ反応までの潜時を測定した。(実験1)生理食塩液群と比較してDAMGO群は用量依存性に有意に引っ掻き回数が増加したが、DAMGO+プレガバリン群では引っ掻き回数は増加しなかった。プレガバリン群は引っ掻き行動を誘発しなかった。(実験2)生理食塩液群と比較し、DAMGO単独群では潜時が有意に延長した。また、混合群では生理食塩液群、DAMGO単独群と比較し、潜時が有意に延長した。プレガバリン群は潜時が延長しなかった。
脱細胞化骨格を用いた霊長類子宮の再生とその機能解析

平成30年度は,脱細胞化骨格を用いた子宮再生・再建の基盤データ・技術をヒトおよびカニクイザルに応用すべく,滋賀医科大学動物生命科学研究センターを霊長類実験の実施場所として選定・決定し,施設基準を満たし且つ実験実施に必要な実験体制と実験チームを整えた.その基盤となる知見とデータをさらに確固にするため,前年度より引き続いて,ラットを用いて子宮内膜を子宮内膜脱細胞化骨格(DES)で全置換する方法の技術的検討を行った.その検討のなかで,DESの構造極性が再生される子宮組織の構造に反映されることが判明した.すなわち,正しいオリエンテーションでDESを用いないと,再生・再建される子宮が高率に異常構造を呈した(Miki, et al., 2019).一方, DESによる再生子宮の内膜癒着を防止するためシリコンチューブや癒着防止剤などを用いて様々な検討を行った結果,内膜癒着を来さない処理ラットも得られるようになったが,高い率で再現できるまでには至っていない(三木,他,2017).その理由として,DESのみでは周囲の組織からの再細胞化が不十分であることが考えられたため,DESに子宮構成細胞に分化し得る細胞を予め搭載して再細胞化を効率良く行う戦略を考案した.将来のヒトへの臨床応用を鑑み,その候補としてヒトiPS細胞を用いて検討した結果,胚様体形成とWNT/CTNNB1経路の活性化を通じてヒトiPS細胞をプロゲステロン応答性の子宮内膜間質細胞へ分化誘導する方法を共同研究により世界に先駆けて確立した(Miyazaki, et al., 2018).ヒトおよびカニクイザルの子宮からの脱細胞子宮骨格の作成とその機能解析の基盤となる知見とデータを得るため、平成29年度は、主にラット子宮を用いて実験を行った。その理由として、霊長類において子宮頸部と子宮内膜全体の再生を主な目的とする当プロジェクトにおいて、子宮内膜全体の脱細胞化および再細胞化の技術的基盤と知見が未だ十分に得られていないことが実験を進めていくなかで判明したためである。そこで、ラットの子宮内膜を全置換する方法の技術的検討を行った結果、まず、子宮を長軸方向に縦切開した後に物理的に子宮内膜全層を全周性に摘出できることが可能になった。さらに、この摘出内膜組織を界面活性剤を含む溶液で脱細胞化させた後に、その脱細胞化骨格を、同様の方法で子宮内膜全層を全周性に摘出した別のラットの内膜欠損部に留置し縫合により固定化させたところ、in vivoで同部位が再細胞化された。再細胞化組織には腺管構造も含め内膜様組織が再構築された。しかし、主に管腔内で癒着が生じることにより管腔構造が十分出来なかった。そこで、細いシリコンチューブ等を管腔部分に挿入・留置することによる癒着防止等を通じて、強制的に管腔スペースを確保する方法を用いたが、十分な管腔構造を有する内膜は構築されなかった。現在、より侵襲の少ない新しい置換方法とともに、新しい癒着防止策と管腔形成方法を行っている。一方、ラット子宮特有の問題があるので、いつまでもラット実験を行うのではなく早い段階で霊長類実験に移行するべく、29年度後半から霊長類実験が可能な施設の選定作業と作業チームの構築を開始した結果、現在候補施設が絞られてきており、作業チームの最終的な構築と調整作業の初期段階を終了した。霊長類実験の施行場所の選定と作業チームの構築に時間を要したため、現時点ではこれらが最終決定されておらず、霊長類子宮を用いた本格的な実験には達していない点で「遅れている」とした。平成30年度は,脱細胞化骨格を用いた子宮再生・再建の基盤データ・技術をヒトおよびカニクイザルに応用すべく,滋賀医科大学動物生命科学研究センターを霊長類実験の実施場所として選定・決定し,施設基準を満たし且つ実験実施に必要な実験体制と実験チームを整えた.その基盤となる知見とデータをさらに確固にするため,前年度より引き続いて,ラットを用いて子宮内膜を子宮内膜脱細胞化骨格(DES)で全置換する方法の技術的検討を行った.その検討のなかで,DESの構造極性が再生される子宮組織の構造に反映されることが判明した.すなわち,正しいオリエンテーションでDESを用いないと,再生・再建される子宮が高率に異常構造を呈した(Miki, et al., 2019).一方, DESによる再生子宮の内膜癒着を防止するためシリコンチューブや癒着防止剤などを用いて様々な検討を行った結果,内膜癒着を来さない処理ラットも得られるようになったが,高い率で再現できるまでには至っていない(三木,他,2017).

その理由として,DESのみでは周囲の組織からの再細胞化が不十分であることが考えられたため,DESに子宮構成細胞に分化し得る細胞を予め搭載して再細胞化を効率良く行う戦略を考案した.将来のヒトへの臨床応用を鑑み,その候補としてヒトiPS細胞を用いて検討した結果,胚様体形成とWNT/CTNNB1経路の活性化を通じてヒトiPS細胞をプロゲステロン応答性の子宮内膜間質細胞へ分化誘導する方法を共同研究により世界に先駆けて確立した(Miyazaki, et al., 2018).平成30年度は霊長類実験の施行場所の決定と作業チームの構築を行ったうえで、ラットで得られた内膜全置換法、全子宮内膜の脱細胞化法、およびin vivo再細胞化法などの基盤技術を元に、ヒトあるいはカニクイザル(ニホンザルも考慮)の子宮の再生、特に内膜の再生の基盤となる技術の確立と知見を得る。子宮頸部については、ラットでは明確な子宮頸部が無いため霊長類でしか実験ができないので、内膜再生の進捗状況に併せて、子宮頸部欠損サルの外科的作成と脱細胞化サル子宮頸部骨格の移植を行う。また脱細胞化子宮内膜骨格をin vitroで再細胞化する場合は、これまで共同研究で行って得られたヒトiPS細胞由来の子宮内膜細胞を用いることも予定している。平成29年度はラットでの実験が主体となったため、霊長類動物や手術器具の購入費およびそれに関わる人件費などを次年度使用額分として確保した。さらに、未使用額の発生は効率的な物品調達を行った結果でもある。次年度は、適宜必要な消耗品および実験動物、人件費等に充てていく。
緑内障性軸索流障害の原因究明とその治療法の研究

成果1)臨床的に重要な正常眼圧緑内障モデルマウスを開発した。成果2)緑内障研究をin vitroで行うための装置の開発を進め特許を取得した。成果3)緑内障における視神経アストロサイトの機能としてRGCの生存率と神経突起の形成に影響を与えることを確認した。成果4)神経生存に関与するグルタミン酸トランスポーター(GLT)の発現が虚血、緑内障、NMDA負荷などの負荷によってサブタイプ毎に異なり各条件における関与が異なることを明らかにした。成果1)正常眼圧緑内障モデルの作成これまで、作成が困難と考えられていた正常眼圧緑内障のモデルマウスの作成を進めた。本マウスは加齢性に網膜神経節細胞(RGC)が脱落することが形態的、RGCの特異mRNAの定量から観察されており、また眼圧は正常域であることも確認されている。有力なモデルマウスになる可能性があり、さらに詳細な検討を進めているところである。緑内障研究をin vitroで行うための装置の開発を進め特許を取得した。これまで、in vitroでの緑内障研究は良好な実験装置がなかったが、本装置によってより生体に近い緑内障in vitro実験が可能となった。成果3)視神経アストロサイトのRGC生存への影響緑内障は視神経部分において神経軸索障害を受けるが、視神経アストロサイトはその際、重要な役割を果たしていると考えられている。しかし、その機能に関しては不明であった。今回in vitroの緑内障実験系を用い、視神経アストロサイトがRGCの生存に影響を及ぼすことが判明した。成果4)各種負荷によるミュラー細胞のグルタミン酸トランスポーターの発現の差異とRGC生存への影響グルタミン酸トランスポーター(GLT)は5種類のサブタイプが存在し、細胞外のグルタミン酸量を調整することで神経生存に関与すると考えられるが、その発現機序は十分には解明されていない。今回虚血、緑内障、NMDA負荷など負荷の差によってGLTのサブタイプの発現パターンが異なることを発見し、RGCへのGLTの作用も負荷条件によって異なることを発見した。今後の治療法の開発にとって重要な発見である。成果1)眼グリア細胞の役割の検討網膜の主なグリア細胞であるミュラー細胞と視神経の主なグリア細胞であるアストロサイトの網膜神経節細胞(RGC)への影響を比較検討した。その結果、両細胞ともRGCの保護効果があることが確認されたが、アストロサイトはRGCの神経突起の伸長により効果的あった。これらの2つのグリア細胞におけるmRNAの発現を網羅的に解析したところ、非常に異なることが判明し同じ眼内のグリア細胞でもその機能に大きな差異を持つことが判明した。成果2)グルタミン酸トランスポーターの発現制御とRGC障害グリア細胞はグルタミン酸調整にグルタミン酸トランスポーター(GLT)を介して重要な役割を果たしているがRGC障害とGLTの関係につき検討した。主要なGLTであるGLAST, GLT-1はin vitroにおいて負荷の種類によって異なる反応を示し、これらを阻害するとRGCの生存率が変化することを明らかにした。さらにin vivo実験の結果、同様にGLTの阻害剤はRGCを主体とした網膜障害に関与する可能性を明らかにした。成果3) NMDAは主要なグルタミン酸受容体でその阻害は網膜に対し障害を来すことが報告されているが障害の詳細は不明であった。組織学的検討からNMDAの阻害は、主にRGCの大型細胞を障害し小型細胞には影響が少ないことが判明した。このような細胞選択制の高い障害は細胞保護治療の観点から重要な知見であると考えられる。
バングラデシュにおけるポスト・カラ・アザール皮膚リーシュマニア症の発症機序の解明

致命的な内臓型リーシュマニア症(VL)の制圧には、治療による全身症状寛解後に発症する皮膚病変(PKDL)の発症機序を理解し、PKDLを的確に診断・治療することが不可欠である。PKDLのリスクファクターを解明するため、バングラデシュのPKDL患者の調査を行い、VL治療薬別PKDL発症率を解析したが治療薬と発症率に因果関係は認められなかった。しかし、リーシュマニア原虫のReal-Time PCRによる定量的検出に成功し、ミルテフォシンがPKDL皮膚病変内リーシュマニア原虫排除に機能することを経時的、定量的に示した。更に、原虫を高感度で検出する乾燥LAMPの試作に成功し現地での実用性も検証された。全世界で毎年50万人が致命的な内臓型リーシュマニア症(Visceral Leishmaniasis: VL、別名カラアザール)に罹患している。インド亜大陸におけるVLはLeishmania donovaniに起因し、治療による全身症状寛解から24年の後に510%の患者がポスト・カラ・アザール皮膚リーシュマニア症(PKDL)を発症する。PKDL患者の皮膚病巣にはL. donovaniが寄生しており、感染伝搬の感染源となっている。したがってVLの制圧には、PKDLの発症機序を理解し、的確に診断・治療することが不可欠である。本研究の目的は、PKDLの発症機序とリスクファクターを解明し、世界におけるリーシュマニア症のコントロールに貢献することである。そこで本年度はまずバングラデシュにおいてVL患者の治療薬別のPKDL発症率を調査し、その過程で65名のPKDL疑い例を同定した。PKDL疑い例は、被験者の同意の上で県立病院に搬送され、バングラデシュ政府ガイドラインに沿って検査・診断が行われた。次いでPKDL確診例の中で研究の趣旨に同意を示した40名、ならびに年齢・性別がマッチし研究の趣旨に同意を示した40名のPKDL非発症コントロールに関しては、県立病院に紹介され、倫理委員会で承認された研究計画に基づき、治療前の臨床サンプル(血液・尿およびPKDL確診例患者においては皮膚病変部)が採取され、政府ガイドラインに沿った治療が始められた。本年度採取した治療前サンプルに関しては、寄生虫学的、血清学的解析を進めているところである。インド亜大陸におけるVLはLeishmania donovaniに起因し、治療による全身症状寛解から24年の後に5 10%の患者がポスト・カラ・アザール皮膚リーシュマニア症(PKDL)を発症する。我々はまずバングラデシュにおいてVL患者の治療薬別のPKDL発症率を調査し、その過程で65名のPKDL疑い例を同定した。PKDL確診例の中で研究の趣旨に同意を示した40名、ならびに年齢・性別がマッチし研究の趣旨に同意を示した40名のPKDL非発症コントロールに関しては、県立病院に紹介され、倫理委員会で承認された研究計画に基づき、治療前の臨床サンプル(血液・尿およびPKDL確診例患者においては皮膚病変部)が採取され、政府ガイドラインに沿った治療が始められた。PKDL群では治療後定期的に臨床病態をモニタすると共に、血液・尿・皮膚病変部の臨床サンプルが採取され、病態の解析を進められた。これまで、我々はバングラデシュにおけるVL患者の治療薬別のPKDL発症率を調査し、その過程でPKDL疑い例を同定した。さらに、PKDL確診例は、県立病院に入院の上、政府ガイドラインに沿った治療が行われた。また皮膚パンチ生検中におけるリーシュマニア原虫のRealTime-PCRによる定量的検出に成功した。経口抗リーシュマニア薬であるミルテフォシンを用いた3ヶ月におよぶ治療は無事に完了した。既にインドで報告されているように、ほとんどの症例で治療後に病態が改善し、また皮膚生検組織内原虫数が減少することが確認された。さらに、L. donovaniを高感度で検出するための乾燥Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP)法の試作に成功した。テロや交通機関を含めたストの頻発など世界的に社会情勢が不安定な中、これだけのことが出来たのは、ひとえにバングラデシュの研究協力者たちのおかげであり、研究はおおむね順調に進展している。全世界で毎年50万人が致命的な内臓型リーシュマニア症(visceral leishmaniasis: VL、別名カラ・アザール)に罹患している。インド亜大陸におけるVLはLeishmania donovaniに起因し、全身症状寛解から24年後に510%の患者がポスト・カラアザール皮膚リーシュマニア症(PKDL)を発症する。PKDL患者の皮膚病巣にはL. donovaniが寄生しており、感染伝搬の温床となっている。したがってVLの制圧には、PKDLの発症機序の理解と的確な診断・治療が不可欠である。

Mymensingh県Muktagacha郡保健センターで20002011年に加療されたVL患者1467人のうち40人のPKDL患者から研究協力の同意を得た。PKDLの診断法は皮膚切開標本中の虫体の証明であるが、感度が低いため、今日ではPCRによる虫体DNAの検出が頻用される。PKDLの標準的治療はミルテフォシンの内服であるが、皮膚症状の経過と皮内原虫数の相関は十分には理解されていない。そこで本年度われわれはバングラデシュのPKDL患者40名に関して、治療前、ミルテフォシン投与終了直後、および投与終了12ヶ月後に、皮疹の広がりを測定し、皮膚検体中の虫体DNAの定量的PCR解析を行った。皮疹の広がりは、治療の経過に相関して有意に減少した。皮疹の完全消失は、投薬終了直後で3人、12ヶ月後で31人に認められた。一方、皮膚検体中の虫体DNA量を定量したところ、治療前で15人、治療直後で33人、12ヶ月後で37人がPCR陰性であり、虫体の消失に続き皮疹が消失するという経過をたどることが示された。実際に、12ヶ月後に皮疹が残存していた7人は全てPCR陰性であり、皮膚のターンオーバーに時間がかかることが推測された。一方、1人の患者は12ヶ月後に皮疹は消失していたがPCR陽性であり、皮疹の広がりと虫体DNA量の変化に齟齬を来たす症例も見出された。致命的な内臓型リーシュマニア症(VL)の制圧には、治療による全身症状寛解後に発症する皮膚病変(PKDL)の発症機序を理解し、PKDLを的確に診断・治療することが不可欠である。PKDLのリスクファクターを解明するため、バングラデシュのPKDL患者の調査を行い、VL治療薬別PKDL発症率を解析したが治療薬と発症率に因果関係は認められなかった。しかし、リーシュマニア原虫のReal-Time PCRによる定量的検出に成功し、ミルテフォシンがPKDL皮膚病変内リーシュマニア原虫排除に機能することを経時的、定量的に示した。更に、原虫を高感度で検出する乾燥LAMPの試作に成功し現地での実用性も検証された。過去にVLの治療を受けた患者(計1463人、男974人、女489人)がいる家屋(家族)を調査の対象とした。1179家屋、計6079人(男3180人、女2899人)を調査の対象として、スクリーニングを行うことが出来た。本スクリーニングを通して、VL患者の治療薬別のPKDL発症率が明らかとなった。その結果、PKDL疑い例として組み入れ基準を満たし除外基準に該当しない65名がPKDL疑い例として同定できた。その中から40名のPKDL患者が研究の趣旨に同意を示し、さらに年齢・性別がマッチし研究の趣旨に同意を示した40名のPKDL非発症コントロールを研究に組み入れることが出来た。治療前サンプルの寄生虫学的解析に想定以上に時間を費やしているが、交通機関を含めたストの頻発など社会情勢が比較的不安定な中、これだけのことが出来たのは、ひとえにバングラデシュの研究協力者たちのおかげであり、研究はおおむね順調に進展している。今年度は末梢血白血球および皮膚パンチ生検中の宿主免疫