hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
肺がんの複雑な遺伝子変異を利用した腫瘍浸潤リンパ球療法の開発を目指した基礎的検討

癌免疫療法の標的として癌の遺伝子変異に由来する抗原が注目されている。そこで、複雑な遺伝子変異を持つ肺がん患者に対して免疫療法を開発するために、患者個々で異なる遺伝子変異に由来する抗原を認識した腫瘍浸潤リンパ球(TIL)を使用することの有効性を調べることを目的とした。肺がん患者の手術切除組織からTILを培養する技術を確立した。また、同時にがん細胞株の樹立も試みており、今後TILの自己がん細胞に対する傷害性を確認していく。さらに次世代シーケンサー解析により遺伝子変異由来抗原の候補をあげ、TILの認識抗原を同定する。これらの解析により肺がん患者でのTILを使用した個別化細胞移入療法の開発を目指す。未治療の肺がん患者を対象とし、実験方法の確立のために40例、本解析として10例、合計50例の肺がん組織切除検体を使用する研究計画を立て、国立がん研究センター研究倫理審査委員会に申請し、研究許可を得た。次世代シーケンサーにより同定したアミノ酸置換を伴う遺伝子変異に起因する抗原ペプチドの中から、実際に腫瘍浸潤リンパ球(TIL)が認識しているペプチドを同定するためには、自己のターゲット細胞のHLA-class I分子に候補となるペプチドを提示させ、TILとの反応性を調べる必要がある。当初は、オーバーラップペプチドを作製する計画であったが、候補となる遺伝子変異一つに対して9種類のペプチドを作製する必要があるため、患者一人に100種類以上あることが予想される遺伝子変異一つ一つに対してオーバーラップペプチドを用意することは非常に困難である。そのため、変異部位を含む長鎖ペプチド、あるいは長鎖ペプチドを発現するDNAまたはmRNAを細胞に導入し、ペプチドを提示させることとした。まず自己のターゲット細胞にペプチドを提示させる方法として、抗原ペプチドを含む長鎖ペプチドをコードするmRNAをin vitro合成し、細胞に導入し発現させる方法を検討した。ポジティブコントロールの抗原として、細胞から内因性に提示されることが既に確認されているHLA-A*02:01およびA*24:02拘束性Glypican-3 (GPC3)由来長鎖ペプチドと、既に樹立しているGPC3ペプチド特異的CTLクローンを使用した。この系を用いて、現在、長鎖ペプチド、DNA、mRNAのいずれの方法が効率よくペプチドを提示させられるかを決定している段階であり、当初の計画よりやや遅れてはいるが、実際の肺がん患者切除検体を用いた解析を行う準備がほぼ整いつつある。今後多くの患者検体を用いた解析を行い、最大限の成果を報告できるよう努める。本研究では肺がん患者に対する免疫療法を開発するため、患者個々で異なる遺伝子変異に由来する抗原を認識したTILを使用することの有効性を調べることを目的とした。抗原ペプチド候補の中から実際にTILが認識しているペプチドを同定するには、自己のターゲット細胞にペプチドを提示させ、TILとの反応性を調べる必要があるが、患者一人に100種類以上ある遺伝子変異各々に対してペプチドを用意することは非常に困難である。そのため、ターゲット細胞にペプチドを提示させる方法として、変異部位を含む長鎖ペプチドをコードするmRNAをin vitro合成し、導入して発現させる方法を検討した。実験系構築のためのモデル抗原としてGlypican-3 (GPC3)を用い、CTLには我々が以前樹立したGPC3ペプチド特異的CTLクローンを使用した。GPC3全長のmRNA、およびGPC3由来長鎖ペプチドのmRNAともにターゲット細胞に導入することで、細胞内で発現しプロセスされ、ペプチドがHLA分子に結合して提示され、CTLクローンによって認識されることをIFN-γELISPOT解析で確認した。また、一過性の発現であることやタンパク発現と抗原提示の時間差を考慮しmRNA導入からCTLと反応させるまでの時間を検討すると、CTLの反応は大きく異なり、最適な時間の設定を行った。これらより次世代シーケンサー解析から選出した多数の遺伝子変異由来候補ペプチドの中からTILが認識する抗原ペプチドを効率良くハイスループットに同定するための実験系を確立した。現在、実際の肺がん患者切除検体を用いた解析も開始しており、今後、Patient-derived xenograft (PDX)の技術によるがん細胞株の樹立も試み、TILの自己がん細胞に対する傷害性を確認することで、肺がん患者でのTILを使用した個別化細胞移入療法の開発を目指す。肺がん組織切除検体を使用する研究計画を立て、国立がん研究センター研究倫理審査委員会に申請し、研究許可を得た。自己のターゲット細胞にペプチドを提示させる方法として、候補となる抗原の長鎖ペプチド、および長鎖ペプチドをコードするDNA、mRNAを合成し、細胞に導入し発現させる方法を検討した。当初の計画よりやや遅れてはいるが、実際の肺がん患者切除検体を用いた解析を行う準備がほぼ整いつつある。腫瘍免疫学今後、候補となる抗原ペプチドを提示させる方法を速やかに決定した後、実際の肺がん患者切除検体を使用した解析を行う。まず、TILを培養する方法を確立する。

また、患者個々の腫瘍細胞のcDNAライブラリーを作製することや、腫瘍細胞をターゲットとした細胞傷害性試験を行うためには、がん細胞株を樹立する必要がある。これまで肺がんでは、がん細胞株の樹立が困難であると言われているが、最近急速に進歩しているPatient-derived xenograft (PDX)の技術も駆使して免疫不全マウスに移植することや、細胞を不死化させることにより、がん細胞株の樹立を試みる。最終的には、TILの培養法を確立し、患者個々のがん細胞株を樹立する技術も向上させて、目的であるTILの認識抗原を同定することにとどまらず、患者のTILが自己のがん細胞を傷害できるかを確認できる系の確立にもチャレンジする。当該年度では、肺がん組織切除検体を使用する研究計画を立て、国立がん研究センター研究倫理審査委員会に申請し、研究許可を得て、実験条件の最適化を行った。次年度より実際の肺がん患者切除検体を用いた解析に使用する。今後、実験方法を速やかに決定した後、実際の肺がん患者切除検体を使用した解析に使用する。
グルタミン酸受容体遺伝子群の多型検索及び精神分裂病との相関解析

精神分裂病感受性遺伝子の候補として、以下の6つのグルタミン酸受容体遺伝子座を選び、精神分裂病罹患群約200検体およびそれに対応する健常群約250検体を用いて関連解析を行った。GRM2:デノミッククローニングと5'-RACEによって、転写開始点および6つのエクソン(うちひとつは非翻訳)を決定した。多型検索の結果翻訳領域から13個のSNP(うち10個は非同義置換)、またプロモーター領域から1個の挿入、2個の欠失を含む4個の多型を見い出した。いずれの多型も頻度が低く、精神裂病との有意な関連は見られなかった(Joo et al. 2001)。GRIKI:全エクソンの多型検索を行い、6個のSNPを同定した.そのうち3個は新規のSNPであったがいずれも頻度は低かった。既知の3個のSNPの頻度測定の結果、遺伝子頻度ハブロタイプ頻度ともに、精分裂病との有意な関連は見られなかった(Shibata et al. 2001)。GRM3:公共のSNPデータベースであるdbSNPから遺伝子全領域にわたって約50kbごとに合計6つのSNPを選択し、関連解析および連鎖不平衡解析をおこなった。そのうちひとつのSNPは精神分裂病と強い関連を示した(p=0.0032)。またこのSNPをふくむハプロタイプ解析でも極めて強い関連(p=0.00004)が知示された(論文投稿中)。GRIA4:RM3と同様に遺伝子全領域にわたって6つのSNPを選択し、関連解析および連鎖不平衡解析おこなった。いずれのSNPも単独では精神分裂病との有意な関連は示さなかった。しかし2つのSNPによるハプロタイプ解析で精神分裂病との強い関連が示された(p=0.0057)(論文投稿中)。GRIK2:同様に遺伝子全領域にわたって15個のSNPを選択し、関連解析および連鎖不平衡解析をおこった。また2つのSNPによるハプロタイプ解析を行ったが、有意な関連は見い出されなかった。(論文準備中)以上の結果から、6つのグルタミン酸受容体遺伝子群のうち2つ、GRM3及びGRIA4は日本人集団において精神分裂病発症に関与していると結論した。九州大学大学病院精神科と共同で収集した、精神分裂病罹患群約200検体およびそれに対応する健常群約250検体に対して、以下のグルタミン酸受容体遺伝子座の多型(主にSNP)解析を行い精神分裂病発症との関連を解析した。SNPの検索はSSCPにより分裂病群36検体(72アレル)で行い、その際5%以上の頻度で観察されたSNPについてのみ、残り全部の検体についてゲノタイピングを行い、各アレルの頻度を推定した。ゲノタイピングはSSCP、ダイレクトシーケンシングまたはRFLPによって行った。NMDAR1:完全なプロモーター活性が報告されている約300bpを含む5'上流領域1kbを3つのPCR断片として多型検索し、15個のSNPを同定したがいずれも頻度が低く(5%以下)、分裂病患者群と正常群の間に有意な頻度の差は見られなかった(現在投稿準備中)。mGluR2:cDNA配列のみが知られていたため、ゲノミッククローニングと5'-RACEによって、転写開始点および6つのエクソン(うちひとつは非翻訳)を決定した。その全翻訳領域を11のPCR断片に分割して多型検索を行い、13個のSNPを同定した。そのうち10個はアミノ酸置換を伴っていた。またプロモーター領域として、転写開始点から上流1kbを3つの断片に分割して多型検索を行ない1個の挿入、2個の欠失を含む4個の多型を見い出した。いずれの多型も頻度が低く、患者群と正常群の間で有意な頻度の差は見られなかった(Joo et al.印刷中)。GRIK1:既に報告されていた全エクソンを18個のPCR断片としてSSCPによる多型検索を行い、6個のSNPを同定した。そのうち3個は新規のSNPであったが頻度は低かった。既知の3個のSNPの頻度測定の結果、分裂病患者群と正常群の間に有意な頻度の差は見られなかった。(現在投稿準備中)。以上3つのグルタミン酸受容体遺伝子は日本人集団の分裂病発症には大きな効果はもたないことがわかった。現在ひきつづき別のグルタミン酸受容体GRIA4、mGluR3の多型検索が進行中である。またNMDAR1とmGluR2のプロモーター領域にみつかった多型については、機能解析の準備中である。GRIKI:全エクソンの多型検索を行い、6個のSNPを同定した.

そのうち3個は新規のSNPであったがいずれも頻度は低かった。既知の3個のSNPの頻度測定の結果、遺伝子頻度ハブロタイプ頻度ともに、精分裂病との有意な関連は見られなかった(Shibata et al. 2001)。GRM3:公共のSNPデータベースであるdbSNPから遺伝子全領域にわたって約50kbごとに合計6つのSNPを選択し、関連解析および連鎖不平衡解析をおこなった。そのうちひとつのSNPは精神分裂病と強い関連を示した(p=0.0032)。またこのSNPをふくむハプロタイプ解析でも極めて強い関連(p=0.00004)が知示された(論文投稿中)。GRIA4:RM3と同様に遺伝子全領域にわたって6つのSNPを選択し、関連解析および連鎖不平衡解析おこなった。いずれのSNPも単独では精神分裂病との有意な関連は示さなかった。しかし2つのSNPによるハプロタイプ解析で精神分裂病との強い関連が示された(p=0.0057)(論文投稿中)。GRIK2:同様に遺伝子全領域にわたって15個のSNPを選択し、関連解析および連鎖不平衡解析をおこった。また2つのSNPによるハプロタイプ解析を行ったが、有意な関連は見い出されなかった。(論文準備中)以上の結果から、6つのグルタミン酸受容体遺伝子群のうち2つ、GRM3及びGRIA4は日本人集団において精神分裂病発症に関与していると結論した。
雲解析による海象把握システムの構築

本研究は,雲の盛衰・挙動と気象の関係,海上気象と海洋波浪との関連に着目し,気象衛星「ひまわり」の可視・赤外画像情報と地上天気図,海洋波浪実況図を用いて,雲-海上気象-海象の間の時・空間相関関係を工学的手法を用いて明らかに,雲の盛衰・挙動から海象の把握を間接的に行うための手法を開発することを目的として,1.静止気象衛星「ひまわり」をプラットフォームとするリモートセンシングデータ(可視・赤外画像)を工学的手法を用いて解析し,雲の判別モデルを構築した.可視・赤外画像を組み合わせて雲系の領域を抽出し,雲頂高度,雲系の厚さ,雲系縁部の傾きおよび雲系外縁の複雑さを雲系の特徴表現パラメータとしてファジイ積分を適用することによって雲種判別が可能であることを示した.2.雲種判別結果と天気図情報より,低気圧および積雲系の雲の動態を関連づける方法を提案した.積雲の領域とその雲厚は低気圧の勢力範囲および勢力と関係が強いことを見出し,これらの関係を用いて,低気圧の動態を雲画像から把握できることを示した.特に,タイ風の発生,成長,減衰過程を積雲系の雲の動態に注目すれば類型化が可能であることを示した.3.印刷天気図と海洋波浪実況図を用いて,両情報の時・空間相関解析を行い,低気圧の勢力が強い場合には,高波高域の現況は約半日前の低気圧および気圧配置と関連が強いことが明らかとなった.更に,時・空間領域で天気図をシフトさせ,そのシフト量から海像の動態を把握することが可能であることを示した.本研究は,雲の盛衰・挙動と気象の関係,海上気象と海洋波浪との関連に着目し,気象衛星「ひまわり」の可視・赤外画像情報と地上天気図,海洋波浪実況図を用いて,雲-海上気象-海象の間の時・空間相関関係を工学的手法を用いて明らかに,雲の盛衰・挙動から海象の把握を間接的に行うための手法を開発することを目的として,1.静止気象衛星「ひまわり」をプラットフォームとするリモートセンシングデータ(可視・赤外画像)を工学的手法を用いて解析し,雲の判別モデルを構築した.可視・赤外画像を組み合わせて雲系の領域を抽出し,雲頂高度,雲系の厚さ,雲系縁部の傾きおよび雲系外縁の複雑さを雲系の特徴表現パラメータとしてファジイ積分を適用することによって雲種判別が可能であることを示した.2.雲種判別結果と天気図情報より,低気圧および積雲系の雲の動態を関連づける方法を提案した.積雲の領域とその雲厚は低気圧の勢力範囲および勢力と関係が強いことを見出し,これらの関係を用いて,低気圧の動態を雲画像から把握できることを示した.特に,タイ風の発生,成長,減衰過程を積雲系の雲の動態に注目すれば類型化が可能であることを示した.3.印刷天気図と海洋波浪実況図を用いて,両情報の時・空間相関解析を行い,低気圧の勢力が強い場合には,高波高域の現況は約半日前の低気圧および気圧配置と関連が強いことが明らかとなった.更に,時・空間領域で天気図をシフトさせ,そのシフト量から海像の動態を把握することが可能であることを示した.平成9年度の研究実績を以下に述べる。1.ひまわりS-VISSR画像データの取り込みひまわり高解像度画像データ(S-VISSR)を入手し,入手した画像データを取り扱うための周辺整備(パーソナルコンピュータをプラットフォームとするハードウェアおよび,基本的な画像処理ソフトウェアの開発整備)を行った.2.雲系の抽出アルゴリズムの開発雲解析図と可視画像を用いた雲系の領域設定,その結果を用いた赤外画像上での閾値決定及び,画像処理手法を用いた雲の輪郭の抽出アルゴリズムを開発した.3.雲系の特徴量の検討と抽出雲頂高度,雲系の厚さ,雲系周辺部の傾き,フラクタル次元による雲系輪郭線形状の複雑度等の雲系の特徴量の抽出法を示した。次に各特徴量について雲種別に分布を調べ,箇々の特徴量と雲種の関係を示した.4.特徴量を用いた雲種判別多数の雲系に対して3.で得られた特徴量と雲解析図に示された雲種をファジイ理論を用いて関連づけ,雲解析モデルを構築し,雲種の評価結果を積雲度,層雲度といった量的指標で表現可能とした.5.雲画像-天気(気圧配置)図-波浪概況図の関連について調査するため,同時期の天気図及び波浪概況図を入手した.次に,印刷されている天気図,波浪概況図の時空間的相関をとるために必要となる図面の数値的表現法と時空間相関解析方法について検討を開始した.今年度の研究成果の一部は平成10年日本造船学会春期講演会(5月)にて講演する予定である.平成10年度研究実績1.画像解析の自動化S-VISSR画像からの雲系抽出,雲形状認識および雲種判別の自動化を行うために必要となる,(1)雲系抽出ルール(可視画像を用いた雲域の特定方法)(2)雲系形状特徴量抽出アルゴリズム(赤外画像上を用いた雲系の雲頂高度,雲系周辺部の厚さ,傾きの抽出)(3)雲種判別ルール(メンバーシップ関数の設定,ファジイ積分を用いた各特徴量の寄与関係の解析,特徴量をとメンバーシップ関数を用いた簡易手法による雲種判別方法)などについて考察,ソフトウェアの開発,試行および検討を行った.

2.天気図-波浪図の時・空間相関解析雲解析から間接的に得られる気象(下層天気)と海象を結びつけるために必要となる,気象と海象の時間的・空間的相関関係を得るため,(1)天気図のデジタル化(気圧のベクトルデータのデータ変換)(2)波浪図のデジタル化(印刷波浪図のデジタイズ)(3)天気図-波浪図間の時・空間相関解析手法およびソフトウェアの開発を行い,天気図-波浪図間の時・空間相関解析を行った.平成11年度研究実績(1)ひまわり画像の解析(2)雲画像-天気図の時空間相関解析雲解析結果と気象(下層天気)を結びつけるため,本研究で構築した雲解析手法を用いて雲画像から得られる雲種・雲量の分布と同時刻の地上天気図との相関解析を行った。また,雲域と低気圧との相関を解析するため,雲画像上および天気図上での低気圧の勢力および勢力範囲の定義を行い,低気圧の位置,勢力の時空間相関解析を行った結果,雲画像情報から低気圧の盛衰を計測,推定することが可能であることを示した。
堆積岩岩石学データベースの構築に関する基礎的研究

1.データの所在調査により国内における堆積岩岩石学データの概要が明らかになり,その一部については実際のデータを収集・入力して国際プロジェクトIGCP269に供給した.2.IGCP269によって提案されたデータ構造およびデータシートの原案を検討した結果,記載項目,標記方法などについて問題点が明らかにされたので,これをIGCP269に送って検討・修正してもらった.3.IGCP269に協力してIBM/PC用の市販ソフトParadoxおよびFoxbaseによるデータベースシステムの設計およびデータ入力に協力し,テスト版(原型)データベース(データ約300件,データ量1.4MB)をランタイム版ソフトと共に公開・配布した.4.日本語対応版の技術的な障害については,プログラム上の障害とソフト(PARADOX)側の規格の違いがあることが分かった.前者についてはほぼ解決したが,後者については解決に今暫く時間がかかりそうである.5.テスト版については,そのデータ構造,データの入力法,検索機能などについて総研としての検討結果をIGCP269に送ると共に,ICS,IGC,CODATAなどの学会での研究発表とデモンストレーション,および独自の講習会を実施し,普及に努めた.6.以上の結果,テスト版の改良・拡張・普及を継続して実用版データベースを構築する必要性が明らかにされ,そのための新プロジェクトをIGCP269の最終会合(平成5年6月,Ankara)に提案することとなった.1.データの所在調査により国内における堆積岩岩石学データの概要が明らかになり,その一部については実際のデータを収集・入力して国際プロジェクトIGCP269に供給した.2.IGCP269によって提案されたデータ構造およびデータシートの原案を検討した結果,記載項目,標記方法などについて問題点が明らかにされたので,これをIGCP269に送って検討・修正してもらった.3.IGCP269に協力してIBM/PC用の市販ソフトParadoxおよびFoxbaseによるデータベースシステムの設計およびデータ入力に協力し,テスト版(原型)データベース(データ約300件,データ量1.4MB)をランタイム版ソフトと共に公開・配布した.4.日本語対応版の技術的な障害については,プログラム上の障害とソフト(PARADOX)側の規格の違いがあることが分かった.前者についてはほぼ解決したが,後者については解決に今暫く時間がかかりそうである.5.テスト版については,そのデータ構造,データの入力法,検索機能などについて総研としての検討結果をIGCP269に送ると共に,ICS,IGC,CODATAなどの学会での研究発表とデモンストレーション,および独自の講習会を実施し,普及に努めた.6.以上の結果,テスト版の改良・拡張・普及を継続して実用版データベースを構築する必要性が明らかにされ,そのための新プロジェクトをIGCP269の最終会合(平成5年6月,Ankara)に提案することとなった.本総研に先行して活動を始めている国際プロジェクトIGCP269は第3回国際研究集会(5月、中国)および作業委員会(10月、フランス)を行い、デ-タシ-トや入力説明書の作成を進めている。これに遅れないようにするため、および本年度は本総研の初年度であることから、本年は二回の研究打ち合せ回を行った(10月、2月)。本総研の第一回研究打ち合せ会では、研究体制の整備と共に、今後この国際プロジェクトの活動とどの様に調整して行くかを検討した。デ-タの所在調査については、第一回研究打ち合せ会で決定された書式を分担者各位に配布して調査を行ってもらい、第二回研究打ち合せ会でその集約を行った。デ-タの具体的内容については分担者各位が文献の収集を続けて、次回(6月予定)の研究集会までにそれぞれ数十件のデ-タをIGCP269のデ-タシ-トに記入してみることとなった。一方、デ-タベ-ス管理システムについては、現在想定されている数種類のデ-タベ-ス用ソフトを購入し、本総研において購入したデスクトップ型およびラップトップ型のパソコンに実装し、IGCP269のデ-タを参考にしながら、その機能についての検討を始めた。デ-タそのものについてはメディア交換さえすれば国内・海外共通に使えるが、デ-タベ-ス管理システムそのものは海外と国内で共通に使えないことが多いため、デスクトップ型は主に国内用に、ラップトップ型は海外用にインスト-ルした。国際プロジェクトの研究集会には研究代表者と研究分担者一名(岡田)とが参加し、作業委員会には研究代表者が参加したが、今後は本総研の関係者全員が国際プロジェクトのメンバ-となり、緊密に協力していくこととなった。1.昨年度から継続のデ-タの所在確認と収集およびデ-タの標準化については,各々の分担者および協力者がアルバイタ-の協力を得ながら進めており,国内のデ-タの概要が明らかになりつつある.2.デ-タ構造およびデ-タシ-トについては,堆積岩の区分毎に検討して全体会議(本年度は6月と12月の二回)に報告してもらい,デ-タベ-ス全体の構造を決めていくこととしている.昨年度までに出された原案について,炭酸塩岩のデ-タ構造や化学分析値の記載方法などに問題のあることが明らかになり,今後のデ-タベ-スの設計およびデ-タシ-トの印刷の段階で修正していくこととなった.3.市販のソフトParadoxおよびFoxbaseをによるデ-タベ-スシステムを開発し,デ-タ入力を開始したが,このシステムはIBMーPCおよびその互換機上でしか使えないので,日本国内でより普及しているPCー9801およびその互換機で使えるようコンバ-トすることとなった.

4.原型デ-タベ-スの構築とそのテストについては,前述のIBMーPC版のシステムで作成した初版について全体会議の機会にデモンストレ-ションと併せて行った.現在,約200件のデ-タで,その容量は1.4MBである.最終的には相当の容量になるので,そのような大型のデ-タベ-スを旨く動かせるようなシステムの検討が必要である.5.本総研は国際プロジェクトIGCP269と密接な関係にあり,そこでの堆積岩デ-タベ-スのシステム設計,デ-タ収集と入力,テスト版の構築と配布などの作業,および,第4回国際研究集会(4月、Cairo)および作業委員会(11月、Rennes)には,本総研の関係者全員がのメンバ-として全面的に協力している.本年度は本総合研究の最終年度であると共に,本研究の国際的母体である国際層序対比計画(IGCP)No.269の最終年度でもあるので,当初の目的である堆積岩岩石学データベースに関する基礎的問題のとりまとめと,今後の検討のためのたたき台としてのテスト版(原型)データベーテ構築の作業,および,将来における実用版データベース開発に向けた普及活動を行った。1.これまでに所在が確認された国内のデータの中から,データシートへの記入(約400件)およびパソコンからの入力(約300件)を行い,このうちデータクリーニングを終えた約200件をIGCP269に送った。2.咋年度までに開発されたテスト版について,データ構造,データの入力法,検索機能などについての問題店を検討し,IGCP269の第5回研究集会(4月,Rennes)および万国地質学会での会合(8月,京都)などに持ち寄り,テスト版改良に役立てた。3.テスト版データベーすは8月にリリースされ,ランタイム版のソフト付きで希望者に無料配布されている。4.日本語対応版の技術的な障害については,プログラム上の障害とソフト(PARADOX)側の規格の違いがあることが分かった。前者についてははぼ解決したが,後者については解決に今暫く時間がかかりそうである。5.本年度は総研としての研究集会(6月,11月)のほか,普及活動として,第29回万国地質学会でのショートコース(共催,1日)と,若手研究者の為の講習会(3日)を実施した。また,テスト版についての第1回国際講習会(12月,Nancy)には研究代表者が主催者・講師として参加した。さらに,第29回万国地質学会および第13回国際コデータ会港(10月,北京)で,研究発表(口頭)とデモンストレーションを行った。6.以上の結果,テスト版の改良・拡張・栽及を継続して実用版データベースを構築する必要性が明らかにされ,そのための新プロジェクトをIGCP269の最終会合(平成5年6月,Ankara)に提案することとなった。
国際理解教育の理論的、実践的指針の構築に関する総合的研究

本研究は当初から4つの班に分かれて調査研究及びその分析作業を行ってきた。その第1はユネスコ資料収集班である。我が国の国際理解教育の発端はユネスコのめざす国際理解教育にあることは周知のことである。しかしながらユネスコの動きについては、一般に一部の研究者と実践者のみしか知るところでなかった。この班は膨大なユネスコから公刊された報告書を収集、分析した上で歴史的な流れを追及した。そして来たるべき21世紀への展望を解読した。第2のものはユネスコ協同学校の資料収集班である。ユネスコ協同学校は1952年の総会で発足が決議され、54年から実験学校として発足し現在も継続されている。我が国は当初から協同学校計画に参加しているが、歴史の流れとともに資料の散逸は免れない事実であるので、その資料を収集した。そして、ユネスコ協同学校事業の全体の変遷、日本のこの事業に対する取り組みの実態と変遷の解析を試みた。第3は日本の国際理解教育に関する理論分析班である。ここでは、文献を通しての国際理解教育の概念の検討と問題提起を、次の3点にしぼって考察した。第1は「グローバル」という概念をめぐって、第2は日本の特殊性と普遍的価値を巡る問題、第3は教育実践における国際理解教育論を巡るものである。これらの論は1950年代に遡るが、(1)ユネスコの国際理解教育を踏襲するもの、(2)1980年代以降の新しい国際理解教育の流れ、(3)国際化に対応した教育を視野にいれた流れに大別される。第4は実践資料分析班である。学校教育における国際理解教育の実践の経緯をまとめた。これを解明するために、可能な限り多くの学校からの報告書を収集し、研究主題名、研究開始の契機、研究の目的・ねらい、研究の実践の4つの視点から分析を試みた。この結果、学校における国際理解教育は社会的背景、教育施策が大きく反映していること、海外帰国子女教育を始点として展開されていること、国際化の進展とともに児童・生徒に国際的資質を求める教育へと展開されていることが明らかになった。A.聞き取り調査.国内で国際理解教育を研究したり実践したりしてきた数名の研究者、実践者より聞き取り調査を行い、全体像の把握に努めた。(1)天城勲氏よりはユネスコの研究フォーラムの報告に関する話しを聞き、ユネスコの現在の方向性についての理解を深めた。(2)川端末人氏は、関西における国際理解教育の実態を把握しているので、神戸を中心として小・中学校での国際理解教育の実態について質疑応答した。(3)米田伸次氏よりは、氏の所属している帝塚山学院大学国際理解研究所の活動を中心にその成果について話しを聞き、併せて同研究所が毎年刊行している『国際理解』から理論面と実践面における動向の講義を受けた。(4)宇土泰寛氏から東京都における国際理解教育の小学校における実践状況の話しを聞いた。(5)多田孝志氏からは、全国海外子女教育研究協議会の研究の実態について話しを聞いた。(6)渡部淳氏よりは氏の属する帰国子女受入校である国際基督大学高等学校における国際理解教育の実践の状況を話しを聞いた。(7)永井滋郎氏よりは、日本ユネスコ協同学校の戦後の流れと課題について講義を受けた。B.調査研究の大枠設定以上の報告より、この研究課題を推進するためにはいくつかのグループを設定して研究を推進する必要があることが確認され、次年度の研究に向けての方向付けを行った。(1)国連、ユネスコ資料収集・分析-千葉、天野、渡部の3名が国連の相良憲昭氏と連携をとりながら進める。(2)ユネスコ協同学校資料収集・分析-金谷、嶺井、米田の3名が関係機関より収集する。(3)理論・理念に関する資料収集・分析-佐藤、新井が1970年代後半を中心に収集する。(4)実践資料の収集・分析-中西、多田、宇土が収集する。(5)キーワード作成-国際理解教育のキーワードを川端、天城、島、佐藤、新井、多田でまとめる。(1)国連、ユネスコの資料収集と分析1946年の第1回総会から96年までの国連及びユネスコ関係の会議及び動きの歴史的流れを分析し、ユネスコの国際理解教育の概念の変遷をまとめた。初期の展開、新独立国と発展途上国の問題、74年勧告から現在に至るまでの展開、96年の21世紀教育国際委員会報告書『学習:秘められた宝』からユネスコの理念と21世紀に向けた新しい展開を論じた。(2)ユネスコ協同学校関係の資料の収集と分析1953年より80年代にいたる日本ユネスコ国内委員会刊行の報告書や資料を分析し、日本のユネスコ協同学校事業の概要をまとめ、かつ日本ユネスコ国内委員会の協同学校事業に対する取組姿勢の変遷を論述した。また、国際社会におけるユネスコ協同学校事業検討の移り変わりについても分析した。(3)理論・理念に関する文献資料の収集と分析摘出したキーワードを基にして国際理解教育論の理論・理念の推移とその展開を分析し、文献の解題から歴史的推移を展望した。また、国際理解教育の概念を巡ってそれに関わる問題点を解明し論述した。(4)学校における国際理解教育実践資料の収集と分析日本の学校教育における国際理解教育の実践とその成果を、学校からの報告書を年代毎に別けて分析してた。それは研究主題名からみた変遷、研究の契機または動機、実践されている教科・領域や実践内容の分析からなる。(5)国際理解教育国際協同研究に関するまとめ

いわゆるカルコン(CULCON)と称せられる1962年からの国際理解教育日米共同研究、および1977年に創立をみた環太平洋組織と活動の成果をまとめた。本研究は当初から4つの班に分かれて調査研究及びその分析作業を行ってきた。その第1はユネスコ資料収集班である。我が国の国際理解教育の発端はユネスコのめざす国際理解教育にあることは周知のことである。しかしながらユネスコの動きについては、一般に一部の研究者と実践者のみしか知るところでなかった。この班は膨大なユネスコから公刊された報告書を収集、分析した上で歴史的な流れを追及した。そして来たるべき21世紀への展望を解読した。第2のものはユネスコ協同学校の資料収集班である。ユネスコ協同学校は1952年の総会で発足が決議され、54年から実験学校として発足し現在も継続されている。我が国は当初から協同学校計画に参加しているが、歴史の流れとともに資料の散逸は免れない事実であるので、その資料を収集した。そして、ユネスコ協同学校事業の全体の変遷、日本のこの事業に対する取り組みの実態と変遷の解析を試みた。第3は日本の国際理解教育に関する理論分析班である。ここでは、文献を通しての国際理解教育の概念の検討と問題提起を、次の3点にしぼって考察した。第1は「グローバル」という概念をめぐって、第2は日本の特殊性と普遍的価値を巡る問題、第3は教育実践における国際理解教育論を巡るものである。これらの論は1950年代に遡るが、(1)ユネスコの国際理解教育を踏襲するもの、(2)1980年代以降の新しい国際理解教育の流れ、(3)国際化に対応した教育を視野にいれた流れに大別される。第4は実践資料分析班である。学校教育における国際理解教育の実践の経緯をまとめた。これを解明するために、可能な限り多くの学校からの報告書を収集し、研究主題名、研究開始の契機、研究の目的・ねらい、研究の実践の4つの視点から分析を試みた。この結果、学校における国際理解教育は社会的背景、教育施策が大きく反映していること、海外帰国子女教育を始点として展開されていること、国際化の進展とともに児童・生徒に国際的資質を求める教育へと展開されていることが明らかになった。
オニウムアミドを用いる有機触媒脱プロトン化反応

有機触媒プロセスはキラルな有機分子を触媒として不斉反応を中心に研究され、大きな成果が得られている。しかし、芳香環あるいは芳香複素環の直接修飾反応に有機触媒を用いる例は限られており、特に脱プロトン化を経る有機触媒反応はこれまで未開拓と考えられる。芳香環の選択的修飾反応の自由度を拡大するために有用な有機触媒プロセスの開発を行った。オニウムアミドを塩基として用いる触媒プロセスを開発し、比較的酸性度の高いsp3炭素のプロトンや末端アルキンのsp炭素プロトンから芳香族のsp2炭素プロトンまで幅広く触媒的に脱プロトン化-修飾を行うことができた。種々のジアルキルアミノケイ素化体に対して種々のフッ化物イオンを作用させてアミドアニオンの発生を検討した。その構造についての研究はこれまでほとんど行われていないので、この構造化学研究を各種スペクトルを用いて解析した。また反応開発においてもアミドアニオンの生成については各核種NMRスペクトルでモニターを試みるとともに、末端アルキンの脱プロトン化修飾反応を用いて生成するアミドアニオンの脱プロトン化剤としての評価を行った。当量反応で評価を行った後、活性化剤であるフッ化物の量を触媒量として脱プロトン化ー修飾反応を検討しその触媒効率の向上をはかった。フェニルアセチレンの場合にはフッ化物の当量が1mol%でも反応が円滑に進行することを確認し、さらにこの触媒反応を芳香族化合物の環プロトンの脱プロトン化ー修飾反応への適用を検討した。芳香環上の環プロトンのpKaの値からこのオニウムアミドを用いる脱プロトン化の適用は、アゾール類などの芳香複素環や電子求引性の置換基を有する芳香族化合物について幅広く可能であることを示した。さらに開発した反応の応用として不斉変換反応を試みた。キラルなオニウムアミドについては既知のキラルオニウム塩から容易に発生させることができると考えられる。丸岡らのビナフチル型キラルアンモニウム塩あるいはDollingにより開発されたシンコナアルカロイド誘導体型キラルアンモニウム塩から調製を検討した。またさらに独自にキラルなホスファゼニウム塩を設計、開発を試みた。このようなキラルなオニウムアミド試薬を用いて脱プロトン化ー修飾の不斉触媒反応を行い、エナンチオ選択的な変換が可能と考えられるが現時点ではまだ不斉変換には成功していない。アミドアニオンで脱プロトン化を行うため、従来の有機触媒では困難と考えられた芳香環炭素上での直接的な不斉変換が可能と考えられさらに検討を続ける。平成23年度はオニウムアミドを用いる脱プロトン化反応について基礎的な素反応開拓を行った。まず種々のジアルキルアミノケイ素化体に対して種々のフッ化物イオンを作用させてアミドアニオンの発生を検討した。フッ化物イオンとしてアンモニウムあるいはホスホニウムを用いることにより、これまであまり知られていなかったオニウムアミド誘導体の調製が可能となった。その構造についての研究はこれまでほとんど行われていないので、この構造化学研究を各種スペクトルを用いて解析し新たな反応種の発生を確認した。また反応開発においてもアミドアニオンの生成については各核種NMRスペクトルでモニターを試みた。末端アルキンの脱プロトン化修飾反応を用いて生成するアミドアニオンの脱プロトン化剤としての評価を行いその実用性を明らかにした。当量反応で評価を行った後、活性化剤であるフッ化物の量を触媒量として脱プロトン化ー修飾反応を検討し、さらにその触媒効率の向上を図ることができた。フェニルアセチレンの場合にはフッ化物の当量が1mol%でも反応が円滑に進行することを予試験的に明らかにしていたが、この反応の一般性を様々な置換アルキン類を用いて明らかにした。さらにこの触媒反応を芳香族化合物の環プロトンの脱プロトン化ー修飾反応への適用を検討し、アゾール類などの芳香複素環や電子求引性の置換基を有する芳香族化合物について幅広く適用可能であることを見出した。環内窒素あるいは官能基に配位する金属カチオンを含まないので反応は環上の最も酸性度の高い部位において進行することも明らかにした。交付申請時の研究計画に従い実験を進めおおむね予定通りに進展していると考えられる。これまで有機合成に用いられていなかったオニウムアミドを利用することが可能であることを明らかにし、また脱プロトン化剤として優れており、従来の金属性試薬と相補的に用いることができることを示した。触媒反応の開発を行うための基礎を確立できたと考えられる。平成23年度に行った基礎的な検討をもとに、新しい芳香族脱プロトン化反応を用いる触媒反応の開発を行う。反応の部位選択性については従来の有機金属試薬と大きく異なることが期待され、また官能基共存についても幅広く許容されることが期待される。芳香環の脱プロトン化のみならず、ある程度の酸性度を有する脂肪族の脱

プロトン修飾反応の開発を行い、特に医薬品開発において重要である芳香族複素環化合物の修飾について自由度の拡大をはかる。次年度使用額は、今年度の研究を効率的に推進したことに伴い発生した未使用額であり、平成24年度請求額とあわせ、次年度に計画している研究の遂行に使用する予定である。平成23年度とほぼ同様に主たる研究史は、物品費、旅費等であり、とくに備品の購入は計画しておらず物品費は有機試薬、無機試薬、ガラス器具、有機溶媒などの消耗品である。
好中球のRhoキナーゼ活性で冠動脈病変の進行と病態を予測する事ができるか？

冠動脈病変の進行を予測し、早期に治療介入することは循環器病学の重要課題の一つである。本研究の研究項目は、冠動脈病変の進行予測のバイオマーカーとして着目した好中球のRhoキナーゼ活性である。初年度(平成27年度)でRhoキナーゼ活性と冠動脈硬化病変の重症度との関連性を検証するために末梢好中球のRhoキナーゼ活性を測定し、冠動脈造影上の冠動脈病変の重症度との関連性を調査した。平成28年度からは、対象患者75例の血液サンプルを用いて、引き続き基礎的な検証を進めた。平成28年4月から平成30年3月までは、厚生労働省へ出向することとなり、出向先業務の増大により研究計画の実施が困難となった。補助事業期間延長申請を提出し受理された平成30年度は、Rhoキナーゼ活性の測定系が不安定であり、正確な測定を行うことが難しいと判断し、冠動脈病変の進行を予測するためのバイオマーカーとしてRhoキナーゼ活性を利用することは断念した。一方で、本研究費の助成の下で継続して冠動脈病変の進行を予測するための研究を継続した。特に、心臓移植後の冠動脈病変の進行を予測するための低侵襲的な手段として、心筋生検病理に着目し、心筋生検による微小血管の変化、及び移植心筋組織内の冠動脈血管壁へのレシピエント細胞の迷入の程度と心臓移植後の冠動脈病変の進行の程度との関連性を評価するための研究計画を発案した(平成31年度日本学術振興会科学研究費助成事業基盤研究C採択された。)また、本研究費の助成の下で得られたこれまでの論文、学会発表の成果平成30年度は、新規の免疫抑制薬であるバシリキシマブを用いた心臓移植導入療法が、心臓移植後患者に与える影響について研究成果をまとめ、国際移植学会のアジア会議(Transplantation Science Symposium)において2018年度のTravel grandを取得した。様々な冠動脈病変の進行を予測し、早期に治療介入する事は循環器病学の重要課題の一つである。本研究の研究項目は、冠動脈病変の進行予測のバイオマーカーとして着目した好中球Rhoキナーゼ活性と1動脈硬化病変の重症度、組織性状、2心臓移植後の冠動脈病変の進行、そして3これらの病態における長期的な心血管イベントとの関連性について検討する事である。Rhoキナーゼの活性と冠動脈硬化病変の重症度(狭窄度や病変数、病変組織性状)との関連性を検証した。冠動脈硬化症を疑われ、冠動脈造影検査を施行する患者を対象とし、末梢血好中球のRhoキナーゼ活性を計測し、冠動脈造影上の冠動脈硬化病変の重症度との関連性を検証した。対象患者75例の血液サンプルを採取して、検証を行っている。また、心臓移植後の冠動脈病変の進行に関与する因子の検証を進めるために、心臓移植後患者の冠動脈を三次元血管内血管内超音波によって解析し、発表を行った。論文、学会発表の成果として、ドナー心由来の持ち込み病変の存在が、移植後1年目から3年目までの病変の進行を予測する事を報告した(Transplantation 2016 in press)。また、心臓移植後患者の新規の免疫抑制薬であるエベロリムスへの変更が病変の進行を抑制し、その抑制効果は血管内膜増殖の抑制だけでなく、血管外膜の縮小変化の抑制によってももたらされることを報告した(International Journal of Cardiology 203 (2016) 307-314)。更に、レシピエントの上腕動脈の血流依存性血管拡張反応により評価される、末梢血管の内皮機能の低下が、冠動脈病変の重症度と関連する事を報告(日本血管生物医学会2016、Young Investigator Award優秀賞)し、心臓移植後の冠動脈病変進行の予測に用いる事が出来る可能性を見出した。好中球のRhoキナーゼの活性と冠動脈病変の重症度との関連性の検証において、好中球Rhoキナーゼ活性の計測が思う様に進んでいない。これまでに冠動脈形成術を行っておらず、新規に冠動脈硬化症が疑われ、冠動脈造影が行われる患者が対象となるために予定よりも患者の組み入れに時間を要していることが一因と考えている。様々な冠動脈病変の進行を予測し、早期に治療介入をすることは循環器病学の重要課題の一つである。本研究の研究項目は、冠動脈病変の進行予測のバイオマーカーとして着目した好中球Rhoキナーゼ活性と1動脈硬化病変の重症度、組織性状、2心臓移植後の冠動脈病変の進行、そして3これらの病態における長期的な心血管イベントとの関連性について検討することである。初年度(平成27年度)で、Rhoキナーゼの活性と冠動脈硬化病変の重症度(狭窄度や病変数、病変組織性状)との関連性を検証するために、冠動脈硬化症を疑われ。冠動脈造影検査を施行する患者を対象とし、末梢血好中球のRhoキナーゼ活性を測定し、冠動脈造影上の冠動脈相可病変の重症度との関連性を収集した。本年度(平成28年度)は、対象患者75例の血液サンプルを用いて、引き続き基礎的な検証を進めている。また、心臓移植後の冠動脈病変の進行に関与する因子の検証を進めるために、心臓移植後患者の冠動脈に対して三次元血管内超音波検査解析を行っている。これまでの論文、学会発表の成果(Transplantation 2016

acccepted、International journal of cardiology 203(2016) 307-314)に加え、心臓移植後患者の新規の免疫抑制薬であるエベロリムスへの変更が病変の進行を抑制することを示した論文は、第7回臨床医学研究塾で、研究奨励賞を受賞した。レシピエントの上腕動脈の血流依存性血管拡張反応により評価される末梢血管の内皮機能の低下が、冠動脈病変の重症度と関連することを報告(日本血管生物医学会2016 YIA受賞)した。その中で、レシピエントの末梢結果の内皮機能が、心臓移植前の喫煙と移植後からの経過年に影響を受けていることを報告した(国際心肺移植学会2016、国際移植学会)。好中球のRhoキナーゼ活性と冠動脈病変の重症度との関連性において、好中球Rhoキナーゼ活性の解析が進んでいない。様々な冠動脈病変の進行を予測し、早期に治療介入をすることは循環器病学の重要課題の一つである。本研究の研究項目は、冠動脈病変の進行予測のバイオマーカーとして着目した好中球Rhoキナーゼ活性と1動脈硬化病変の重症度、組織性状、2心臓移植後の冠動脈病変の進行、そして3これらの病態における長期的な心血管イベントとの関連性について検討することである。初年度(平成27年度)で、Rhoキナーゼの活性と冠動脈硬化病変の重症度(狭窄度や病変数、病変組織性状)との関連性を検証するために、冠動脈硬化症を疑われ。冠動脈造影検査を施行する患者を対象とし、末梢血好中球のRhoキナーゼ活性を測定し、冠動脈造影上の冠動脈相可病変の重症度との関連性を調査した。平成28年度は、対象患者75例の血液サンプルを用いて、引き続き基礎的な検証を進めた。研究代表者は、平成28年4月から平成30年3月まで国立循環器病研究センターから厚生労働省へ出向していた。平成29年度に入り、出向先業務の増大により、研究計画の実行が困難であった。平成30年度は国立循環器病研究センターの移植医療部に常勤医師として復帰するために、補助事業期間延長承認申請を提出し受理されている。また、心臓移植後の冠動脈病変の進行に関与する因子の検証について、これまでの論文、学会発表の成果(Transplantation.2017;101(6):1310-1319, International journal of cardiology. 2016;15:307-314,第7回臨床医学研究塾研究奨励賞、日本血管生物医学会2016YIA受賞)に加え、ドナー心からの持ち込み病変が心臓移植後の冠動脈病変の進行に影響をあたえることを示した論文は、第8回臨床医学研究塾(平成29年度)で研究奨励賞を受賞した。既に学会発表している研究成果の論文発表を進めている。また、研究代表者が別部署に出向となっており、研究の実施が困難な状況であった。平成30年度からは研究の実施は可能である。冠動脈病変の進行を予測し、早期に治療介入することは循環器病学の重要課題の一つである。本研究の研究項目は、冠動脈病変の進行予測のバイオマーカーとして着目した好中球のRhoキナーゼ活性である。初年度(平成27年度)でRhoキナーゼ活性と冠動脈硬化病変の重症度との関連性を検証するために末梢好中球のRhoキナーゼ活性を測定し、冠動脈造影上の冠動脈病変の重症度との関連性を調査した。平成28年度からは、対象患者75例の血液サンプルを用いて、引き続き基礎的な検証を進めた。
真核生物型翻訳開始因子マルチ複合体の構造機能解析による翻訳開始機構の解明

翻訳開始段階は翻訳終結やmRNA品質管理装置などと連携して,mRNAの代謝に深く関与する一方で,飢餓,ウイルス感染,酸化ショックや熱ショックなどのストレス,あるいは発生・分化やガン化などに応じて,細胞全体の翻訳量を制御することで細胞の活動度,ひいては生死をコントロールしている非常に重要なステップである.開始段階では12種類の開始因子が必須な役割を果たすことが知られているが,その中でもeIF1,eIF2-GTP-Met-tRNA_i,eIF3,eIF5はリボソームに結合する前段階でMulti-Factor Complex(MFC)を形成することが示されている.本研究はMFC全体あるいは部分複合体のX線結晶構造解析を行うことでMFC内部における開始因子間の相互作用やそれに伴う構造変化を解明し,開始因子の構造機能相関,開始因子間の機能的連携,そしてMFC形成の機能的意義を明らかにすることを目的としている.翻訳の開始段階は翻訳調節やmRNAの代謝と密接に関連しており,特に真核生物において重要な役割を果たしている複雑な過程である.開始段階にはmRNA,リボソーム,Met-tRNA_iの他に,30余りの開始因子と呼ばれるタンパク質群が必須であり,これらが密接に関連し合うことで各ステップが厳密に制御されている.本研究課題では,これらの開始因子の複合体のX線構造解析を行い,各因子間の相互作用や構造変化を明らかにすることで,開始段階の分子メカニズムを包括的に理解することを目的としている.本年度は以下のような成果が得られた.真核生物翻訳開始因子のホモログである古細菌由来aIF2α-CTD, aIF2β, aIF2γの個別大量発現および精製に成功した.また各サブユニット間の結合をNative-PAGEおよびゲルろ過分析により確認し,aIF2α-CTD-βγ複合体の大量調製・結晶化を行った.結果,これまでにGTP加水分解中間体アナログであるGDP-AlF_4-Mg^<2+>存在下において初期結晶を得ることに成功している.この結晶を用いてX線回折実験を行ったところ約10Åの反射を得ることに成功した.現在,結晶化条件の最適化を行っている.同様に古細菌由来aIF5B-aIF1A複合体に関しても,発現・精製・結晶化を行い,初期結晶を得ることに成功している.翻訳開始段階は翻訳終結やmRNA品質管理装置などと連携して,mRNAの代謝に深く関与する一方で,飢餓,ウイルス感染,酸化ショックや熱ショックなどのストレス,あるいは発生・分化やガン化などに応じて,細胞全体の翻訳量を制御することで細胞の活動度,ひいては生死をコントロールしている非常に重要なステップである.開始段階では12種類の開始因子が必須な役割を果たすことが知られているが,その中でもeIF1,eIF2-GTP-Met-tRNA_i,eIF3,eIF5はリボソームに結合する前段階でMulti-Factor Complex(MFC)を形成することが示されている.本研究はMFC全体あるいは部分複合体のX線結晶構造解析を行うことでMFC内部における開始因子間の相互作用やそれに伴う構造変化を解明し,開始因子の構造機能相関,開始因子間の機能的連携,そしてMFC形成の機能的意義を明らかにすることを目的としている.
MAPK経路制御因子Sproutyによるエナメル上皮腫増殖・分化抑制機構の解明

エナメル上皮腫細胞株AM-1にSprouty2を強制発現させMAPKのリン酸化を調べたところ、FGF刺激によるMAPKのリン酸化は抑制するものの、EGF刺激ではむしろMAPKのリン酸化を増強した。またAktのリン酸化やBCL-xLの発現はEGF刺激で増強し、FGF刺激では逆に抑制する結果を得た。このようにSprouty2はFGF刺激により細胞増殖を抑制する一方でEGF刺激では抗アポトーシスに作用する。以上より、エナメル上皮由来のエナメル上皮種の増殖・分化にEGF刺激が深く関与しており、Sprouty2により増強されていることが示唆された。AM-1におけるSprouty2とSprouty4のmRNAレベルでの発現を調べるため、AM-1をEGFとFGFで刺激を行い、Sproutyファミリーの発現量を比較した。その結果、Sprouty2, Sprouty4ともにFGF刺激で強く誘導されていることが分かった。そこで次にAM-1におけるSprouty2とSprouty4の機能について解析するため、human Sprouty2(Full length)とhuman Sprouty4(Full length)ならびに各々のドミナントネガティブ変異体を作成し、これらをAM-1に強制発現させることでEGFおよびFGF刺激時のMAPKのリン酸化を調べた。その結果、Sprouty2を強制発現させたAM-1のMAPKのリン酸化はEGF刺激時に増強し、FGF刺激では逆に減弱した。Sprouty4に関してはEGF/FGF両刺激共にMAPKのリン酸化に大きな影響はなかった。一方、AM-1におけるSproutyの機能をアポトーシスシグナルで調べるため、同様にAktのリン酸化およびBCL-xLの発現量を各々の刺激下で比較した。その結果、FGF刺激下でSprouty2がAktのリン酸化を増強し、またBCL-xLの発現も増強させることが分かった。以上の結果から、Sprouty2がEGF刺激ではMAPKのリン酸化を促すことで増殖・分化を促進し、同時にFGF刺激では抗アポトーシスなシグナルを活性化することで増殖・分化を制御していることが示唆された。本年度は、エナメル上皮腫細胞株AM-1にSprouty2を強制発現させることで、FGF刺激によるERK1/2の活性化を抑制するものの、EGF刺激による活性化は増強させることをウエスタンブロット法により示し、それに伴う骨芽細胞・破骨細胞の分化誘導を誘導する各種サイトカインの産生を制御していることを示した。また、PI3-K-Akt経路においては、FGF刺激によりSprouty2がAktのリン酸化を抑制し、抗アポトーシス効果を示すことが分かった。以上の結果は学会にて発表した。また、Sprouty2遺伝子欠損マウスにおいては、エナメル上皮腫が発症することのある上顎骨部分-口蓋に裂を形成することを発見した。そのメカニズムとしてFGF刺激が増強されることで、口蓋突起のエレベーションが阻害されるのではないかという仮説に基づき、実験を行った。まず口蓋における癒合不全が上皮によるものなのか、それとも間葉によるものなのかを調べるため、マウスの口蓋の器官培養を行い、舌の非存在下ではsiRNAを用いてSprouty2をknock downしても癒合することが分かった。このことから間葉における異常が口蓋裂発症に関与していることが示唆されたため、Sprouty2遺伝子欠損マウスの口蓋における、間葉系細胞の増殖活性をKi-67の免疫染色にて調べた。その結果、Sprouty2遺伝子欠損マウスの口蓋間葉細胞は野生型のものと比較して、有意に増殖活性が高かった。以上の結果は学会発表のみならず論文雑誌にも掲載することができた。これらの結果は、Sprouty2がFGFシグナルのアンタゴニストとして頭頸部領域の疾患に深く関わっている一方、EGFシグナルに関しては増強因子として作用し、腫瘍の増殖にEGF刺激が深く関与していることを示唆することにつながった。