hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
石造文化財、レンガ建造物の劣化と保存対策

本年度も、多孔質中の熱水分移動に関するシミュレーション手法に関する研究を中心に行った。シミュレーションでは、倉などの土壁内の湿度分布、温度分布および、倉内の湿度変化が外気の変化による変動についての現地での測定と解析を行った。調査対象としては、埼玉県川越市の蔵および、滋賀県長浜の蔵である。埼玉県川越市の倉内で実測された一年間の相対湿度変化と、外気の温湿度変化と倉の構造をもとに計算した湿度変化は良く一致し、また、1ヶ月間(2002年6月)の倉内の湿度変化の実測値と解析値の比較において、外気の湿度が3日連続して低下した際の、倉内の湿度変化も良く再現することができた。これらの結果から、ここで開発したシミュレーション手法の有効性を確認することができた。本解析手法は、石造文化財やレンガ建造物の劣化過程を評価する上で、有効なツールであると考えられる。また、本解析を行うための土の水分特性曲線などの物性値を測定する実験も併せて行った。これらの研究成果は、ドイツドレスデン工科大学で開催された第11回建築物理に関する国際会議や文化財保存修復学会で発表した。
バウムイメージとの新たな心理臨床的関わりを探索する開発的研究

・日本心理臨床学会の自主シンポジウム(波多江洋介企画)において、これまでの研究の外観を発表した。具体的内容としては、バウムに対する2種のパースペクティブ、すなわち垂直・水平軸のパースペクティブと柄と地のパースペクティブについて、その発想のもととなったいくつかのモチーフとともに紹介し、さらに臨床例を提示した。・昨年度に根っこ描写ありなしの二枚法で収集したバウムについて、根っこ描写あるいは地平線描写と描き手のしっくり感についての連関について統計的検定を行った。結果、根っこなしの方がしっくり感があるものとして選ばれやすいという結果が得られた。地平線描写としっくり感との連関は見られなかった。また根っこを描いたバウムからより病的な様相を強く感じるということが多く、根っこ描写のもつ特性を得られたことは有意義であったが、それだけに根っこ描写をこちらから指示することの責任の重さを痛感させられる結果であった。なお、この内容については日本箱庭療法学会にてポスター形式で発表した。・再度沖縄にてバウムを収集した。根っこ描写、地平線描写について統計的処理を行った後、梅花女子大学大学院心理臨床学専攻の大学院生数名とケースカンファレンス形式で個々のバウムを検討した。その内容については心理臨床関連の学会誌に投稿発表する予定である。・京都の鞍馬寺から貴船神社にいたる山道にある通称"木の根道"を調査した。木の根道とは、根っこが地表に張り巡らされており、その昔源義経が修行の場としたともされている場所であるが、その一種異様な雰囲気は、沖縄の見事な板根をもつサキシマスオウノキを訪れた時に感じた感覚とも似ているようだった。特に根っこに関するバウムイメージを膨らませる貴重な体験だった。1、京都芦生原生林、ミュンヘン、スリランカ、沖縄などで、樹木の特に根っこに関する写真を撮影した。特にスリランカは逆さまの木のモチーフが伝統的にある地域であるが、その根拠のひとつと思われるインドボダイジュなどの気根を撮影し、まさに天から木が生えているイメージをとらえることができたのは収穫であった。また、沖縄においては、マングローブ林のヒルギやサキシマスオウの木を撮影し、支柱根や板根と呼ばれる根が、時に幹や枝以上に表情豊かに生えている様子をとらえることができた。2、樹木の生態、文化人類学、あるいは絵画(特に東山魁夷とピート・モンドリアンの樹木画)に関する資料を収集した。それらの資料を検討することによって、バウムを描く視点、あるいは見る視点の二重性、すなわち横から見る視点と上から見る視点、そしてそれらを包括するバウムのコスモロジー、また境界としてのバウム、鏡としてのバウム、バウムの余白を地・無意識・魂ととらえる視点といった、本研究の今後の骨子となるべき重要な発想を得ることができた。また、ピート・モンドリアンの樹木画はコスモロジーという見地からバウムについての豊富な見解をもたらしうるものと考えられ、またヨーロッパのモダンからポストモダンへの移行を示す格好の素材と思われるので、今後も検討を続ける予定である。3、青年期女子のバウム(梅花女子大学)、沖縄の思春期男女のバウム、沖縄の青年、老人のバウムを集団法や個人法で収集した。それらの指標化については来年度に進める予定である。・梅花女子大学にて、今回は2枚法を実施した。2枚法は、1枚目には根っこを描かないバウムを、2枚目には根っこを描くバウムを描いてもらい、さらにどちらの絵が自分にしっくりくるかを選んでもらうというものである。さらにその結果について、梅花女子大学大学院生5,6名とともに、描き手がどちらをしっくりくると選んだかをブラインドで当ててもらう合議法を実施し、さらになぜそのような結果になったのか、根っこを描く描かないによってバウムのイメージ、コスモロジーがどのように変容しているのかを、様々な視点から何度も研究会を開いて検討した。この検討結果については19年度に学会発表する予定である。根っこは一般に木のあり様と同様に大地、人間で言うと現実世界への根づきを象徴するものと考えられているが、バウムがどれだけ自分にしっくり来るかという視点は、必ずしも根づき感とは結びつかず、むしろ大地だけでなく環境、風景、紙全体の中でどれだけバウムが自然なあり方をしているかということと結びつくものと考えられた。・特徴的な樹木風土を持つ地域として、屋久杉の生息する屋久島を調査した。実際にガイドに同行し、屋久杉と屋久島についての説明を聞きながら、縄文杉をはじめとする特徴的な樹木について調査を行った。屋久島は島全体が花崗岩でできており、しかも雨量が多い島で、土壌も定着せずにすぐに流れてしまう。つまりいわゆる樹木が生息するのに快適な環境とは言えない。屋久杉の多くは岩に生えたコケに残った種子から生えてきたり、木材用に伐採された切り株の上に生えたり、あるいは倒木の上に生えているものもある。つまり、大地にしっかりと下ろしてというものの方がむしろ少ないかのような印象を持つ。また屋久島は雲霧体であり、杉にもかかわらず熱帯系の樹木のように気根や表皮から水分を吸収する。屋久杉のあり様はまさに、大地に根づくというより環境、風土に生きるというあり方を示していて、バウムのコスモロジーを考える上で非常に示唆的な調査であったと思われる。

具体的内容としては、バウムに対する2種のパースペクティブ、すなわち垂直・水平軸のパースペクティブと柄と地のパースペクティブについて、その発想のもととなったいくつかのモチーフとともに紹介し、さらに臨床例を提示した。・昨年度に根っこ描写ありなしの二枚法で収集したバウムについて、根っこ描写あるいは地平線描写と描き手のしっくり感についての連関について統計的検定を行った。結果、根っこなしの方がしっくり感があるものとして選ばれやすいという結果が得られた。地平線描写としっくり感との連関は見られなかった。また根っこを描いたバウムからより病的な様相を強く感じるということが多く、根っこ描写のもつ特性を得られたことは有意義であったが、それだけに根っこ描写をこちらから指示することの責任の重さを痛感させられる結果であった。なお、この内容については日本箱庭療法学会にてポスター形式で発表した。・再度沖縄にてバウムを収集した。根っこ描写、地平線描写について統計的処理を行った後、梅花女子大学大学院心理臨床学専攻の大学院生数名とケースカンファレンス形式で個々のバウムを検討した。その内容については心理臨床関連の学会誌に投稿発表する予定である。・京都の鞍馬寺から貴船神社にいたる山道にある通称"木の根道"を調査した。木の根道とは、根っこが地表に張り巡らされており、その昔源義経が修行の場としたともされている場所であるが、その一種異様な雰囲気は、沖縄の見事な板根をもつサキシマスオウノキを訪れた時に感じた感覚とも似ているようだった。特に根っこに関するバウムイメージを膨らませる貴重な体験だった。
海洋生物の産生する興奮性アミノ酸およびその受容体の組織内局在性

海綿Dysidea.herbaceaおよび紅藻マクリ、Digenea simplexを材料にそれぞれに含まれる興奮性アミノ酸であるダイシハーベイン(DH)およびカイニン酸の生体内における局在性を免疫組織化学的に検討した。それぞれの低分子アミノ酸を特異的に認識するポリクローナル抗体の作成に成功したので、それらを用いて固定組織切片の染色を行った。その結果、Dysidea.herbacea直径10μm程度の球状細胞が強く染色されるという結果が得られた。一方で、海綿の組織および本海綿の共生生物として知られている藍藻Oscillatoria spongeliaeは全く染色されなかった。さらに藍藻の色素であるフコビリンの抗体を用いて同様の染色を行ったところO. spongeliaeと共に球状細胞も染色された。一方、Digenea simplexについても同様の手法で局在性を検討したところ、藻体の表層細胞が強く染色された。次にDHを固層化したアフィニティーカラムを作成し、DH結合タンパクの有無を検討したところ海綿の界面活性剤抽出物にカラムに特異的に保持される111kDのタンパクの存在が明らかとなった。また、グルタミン酸受容体の高度に保存されたアミノ酸配列をもとにプライマーを作成しD. herbaceaのRTPCRを行った。得られたcDNAについてクローニングを行いその塩基配列を調べた。その結果、いくつかのクローンにグルタミン酸受容体と相同な部分をもつアミノ酸配列が確認された。この結果は、海綿内にグルタミン酸受容体様タンパクが含まれ、何らかの生理機能を有することを示唆するものである。カイニン酸はマクリの藻体の表層および剛毛様の短条と呼ばれる部分の細胞に局在していた。細胞内では一様に染色が認められたものの、周心細胞に点在する顆粒状の構造にとくに強い染色が認められた。抗体の作製:海綿Dysidea herbaceaより得られた興奮性アミノ酸ダイシハーベイン(DH)を、水溶性カルボジイミド法を用い、コハク酸をリンカーとしてKLHと結合することで抗原を作製した。これを一部酸加水分解し、そのマウスに対する痙攣誘発作用を半定量的に測定することで、抗原のハプテン結合量は約1%と推定された。この抗原をウサギ2頭にそれぞれ68ヶ月間にわたり接種し、坑血清を得た。血清のIgG画分をアフィニティーカラムで分離後、ELISAを用いて特異性を検討した。免疫組織染色:現地で海綿を採集直後0.5%グルタルアルデヒド/2%パラホルムアルデヒドで固定した。固定サンプルは実験室に持ち帰り、エタノール脱水処理を施した後樹脂包埋し切片作製に供した。切片を上述の坑血清とインキュベート後洗浄し銀増感プロテインAゴールド染色を行った。またコントロールとしてはウサギ正常血清、ウサギ坑フコエリスリン抗血清を用いた。結果と考察:今回得られた坑血清はBSAやコハク酸を結合したBSAには反応せず、コハク酸をリンカーとしてBSAに結合させたDHに反応を示した。このことから、本坑血清は固相化されたDHを特異的に認識する抗体を含むものと考えた。そこで、この抗体を用いて固定海綿標本の切片を免疫染色後光学顕微鏡で観察した結果、坑DH坑血清による染色で、海綿組織中に数多く存在する未同定の球状細胞(10μm)に金コロイドが集中する様子が観察された。この細胞はまた坑フコエリスリン抗血清によって染色された。

本海綿に共生する藍藻Oscillatoria spongeliaeは坑フコエリスリン抗血清により強く染色されたが坑DH坑血清にはまったく染色されなかった。これらの結果はDHが海綿内の球状組織に局在することを強く示唆している。海綿Dysidea. herbaceaおよび紅藻マクリ、Digenea simplexを材料にそれぞれに含まれる興奮性アミノ酸であるダイシハーベインおよびカイニン酸の局在と受容体タンパクの存在を調べた。まず海綿内でのDHの局在を免疫組織化学的手法で調べるためにDHをハプテンとした抗原を作成しDH特異的抗体を得ることに成功した。この抗体を用いて固定海綿切片の免疫組織化学的観察を行ったところ、直系10μm程度の球状細胞が強く染色されるという結果が得られた。一方で、海綿の組織および本海綿の共生生物として知られている藍藻Oscillatoria spongeliaeは全く染色されなかった。さらに藍藻の色素であるフコビリンの抗体を用いて同様の染色を行ったところO. spongeliaeと共に球状細胞も染色されるという予想外の結果を得た。一方、Digenea simplexについても同様の手法で局在性を検討したところ、藻体の表層細胞が強く染色された。また、グルタミン酸受容体の高度に保存されたアミノ酸配列をもとにプライマーを作成しD. herbaceaのRTPCRを行った。得られたcDNAについてクローニングを行いその塩基配列を調べた。その結果、いくつかのクローンにグルタミン酸受容体と相同な部分をもつアミノ酸配列が確認された。この結果は、海綿内にグルタミン酸受容体様タンパクが含まれ、何らかの生理機能を有することを示唆するものである。
微生物工場における乳酸ベースポリマーの生合成と化学修飾

平成26年度においては、「ポリマーの化学修飾と物性解析」を中心に実験を行った。化学反応性が高い不飽和結合に化学修飾を行うことにより、高機能性を有するポリマーの創出が可能であることが一般的に知られている。具体的には、1.架橋反応を起こすため、thiol化合物として1,2-ethanedithiolを用いた。1,2-ethanedithiolは両末端にthiol基を有し、ポリマー内の不飽和結合と両末端のthiolがUV照射することで反応し、ポリマー鎖同士にネットワークが形成され、分子量の上昇やゲル化による物性の変化が見られた。2.carboxyl基の導入実験において、酸化剤であるKMnO4、相間移動触媒であるcrown etherを用い、不飽和結合にcarboxyl基化を起こし、chloroformに可溶であったポリマーが不溶化された。この現象から、carboxyl基の付加により、ポリマーの疎水性が弱まったことが分かった。3.分解性の変化を評価するため、修飾前の乳酸ベースポリマーに対し、異なる分解活性を持つ酵素をライブラリ化した。まず、修飾前の乳酸ベースポリマーを用い、土壌サンプルをスクリーニングし、分解菌の単離を行った。単離した分解菌から分解酵素を精製し、活性によるライブラリ化した。平成26年度の研究では不飽和ユニットに対し、架橋化や官能基の付加を行うことにより、乳酸ベースポリマーの化学修飾に成功した。化学修飾により、新たな物理的性質が現れた。今後、様々な不飽和ユニット分率を有する乳酸ベースポリマーに対し、化学修飾の反応分率を調節し、更なる物理性質の制御が可能になった。また、分解酵素をライブラリ化したことにより、多種多様な化学修飾された乳酸ベースポリマーに対し、網羅的に分解性の変化を分析することができると考えている。26年度が最終年度であるため、記入しない。申請者は平成24年度で、化学修飾が可能である不飽和ユニットを有する乳酸ベースポリマーを生合成するため、「不飽和ユニットを有する乳酸ポリエステル生産経路の構築」と「ポリマーの生合成実験」を中心に研究を行った。当研究室での大腸菌における「オールバイオプロセス」での乳酸ポリエステルの生合成は、有害な重金属触媒を用いないため、高い安全性が求められる医療用材料への応用が可能となる。さらに、乳酸とPHAの共重合体は透明性が高く、より優れた延性を持つ。しかし、現在まで生合成可能な乳酸ポリエステルは疎水性であり、分解性と生体適合性が低いということが問題であった。そこで、化学反応性が高い不飽和結合側鎖を有する乳酸ベースポリマーを合成し、化学修飾によって水酸基の付加をすることで、分解陸と生体適合性が高い親水性乳酸ベースポリマーを創出できると考えた。不飽和ユニットを有する乳酸ベースポリマーを生合成するため、乳酸ベースポリマーの重合の鍵となる乳酸重合酵素PhaClSTQK、及び各種モノマー供給酵素の遺伝子を含むプラスミドベクターを構築し、大腸菌に導入した。そして、不飽和ユニット3-ヒドロキシ-4-ペンテン酸の前駆体である短鎖不飽和脂肪酸4-ペンテン酸を培地中に添加し、ポリマー生合成を試した結果、不飽和乳酸ポリエステルの創出ができた。しかし、共重合体中の不飽和ユニットの分率が低いという問題があった。そこで、乳酸と共通の主鎖構造を有する2-ヒトロキシブテン酸を用い、より不飽和ユニット分率が高い乳酸ベースポリマーの生合成に成功した。申請者は平成25年度において、化学修飾が可能である不飽和ユニットを有する乳酸ベースポリマーを生合成するため、「ポリマー中の不飽和ユニット分率の制御」と「不飽和ユニットを有するベースポリマーの大量生産」を中心に研究を行った。本研究では化学反応性が高い不飽和結合側鎖を有する乳酸ベースポリマーを合成し、化学修飾によって水酸基の付加をすることで、分解性と生体適合性が高い親水性乳酸ベースポリマーの創出を目指している。以前の研究で、2-ヒトロキシブテン酸を用い、大腸菌における不飽和結合を有する乳酸ベースポリマーを生合成する経路を構築し、不飽和ユニットと共重合した乳酸ポリマーを生合成することができた。しかし、ポリマーの化学修飾とその物理的性質の分析をするため、ポリマー中の不飽和ユニット分率の制御と不飽和結合を有する乳酸ベースポリマーの大量合成が必要であった。そのため、1ポリマー生産性の高い大腸菌株の検討、2乳酸ベースポリマーの重合の鍵となる乳酸重合酵素PhaClSTQKから重合能力の高いPhaClSTQKFSへの変更、3培地中に添加する2-ヒトロキシブテン酸の濃度の検討、4培養中の炭素源をglucoseからポリマー合成に有利なxyloseへの変更、の4つの研究内容を行った。その結果、GCとNMRの分析によって、2-ヒトロキシブテン酸の分率が013 mo1%の不飽和ユニットを有するポリマーが生合成されたことが分かった。また、不飽和ユニットを有するポリマーの生産量を従来の0.08g/Lから0.7g/Lに上げることができた。

1,2-ethanedithiolは両末端にthiol基を有し、ポリマー内の不飽和結合と両末端のthiolがUV照射することで反応し、ポリマー鎖同士にネットワークが形成され、分子量の上昇やゲル化による物性の変化が見られた。2.carboxyl基の導入実験において、酸化剤であるKMnO4、相間移動触媒であるcrown etherを用い、不飽和結合にcarboxyl基化を起こし、chloroformに可溶であったポリマーが不溶化された。この現象から、carboxyl基の付加により、ポリマーの疎水性が弱まったことが分かった。3.分解性の変化を評価するため、修飾前の乳酸ベースポリマーに対し、異なる分解活性を持つ酵素をライブラリ化した。まず、修飾前の乳酸ベースポリマーを用い、土壌サンプルをスクリーニングし、分解菌の単離を行った。単離した分解菌から分解酵素を精製し、活性によるライブラリ化した。平成26年度の研究では不飽和ユニットに対し、架橋化や官能基の付加を行うことにより、乳酸ベースポリマーの化学修飾に成功した。化学修飾により、新たな物理的性質が現れた。今後、様々な不飽和ユニット分率を有する乳酸ベースポリマーに対し、化学修飾の反応分率を調節し、更なる物理性質の制御が可能になった。また、分解酵素をライブラリ化したことにより、多種多様な化学修飾された乳酸ベースポリマーに対し、網羅的に分解性の変化を分析することができると考えている。26年度が最終年度であるため、記入しない。大腸菌における不飽和結合を有する乳酸ベースポリマーを生合成する経路を構築し、不飽和ユニットと共重合した乳酸ポリマーを生合成することができた。さらに、2-ヒトロキシブテン酸を用い、不飽和ユニットの分率が高い乳酸ベースポリマーの創出によって、様々な割合で親水基を導入することが可能となった。大腸菌によるポリマー生合成の条件検討によって、2-ヒトロキシブテン酸を前駆体として用いた不飽和ユニットを有するポリマーの不飽和分率の制御と大量合成が可能になった。そのため、不飽和ユニットを有するポリマーに様々な割合で官能基を導入することが可能となった。さらに、化学修飾によるポリマーの物理性質と分解性の変化を調べられるようになった。不飽和ユニットの分率が高い乳酸ベースポリマーの創出がてきたが、生産された乳酸ベースポリマーの透明性や延性を調節するために、乳酸分率の制御が必要である。しかしながら、現在の系ではポリマー中の乳酸分率には上限がある。今後、効率良く乳酸を供給することの出来る経路を構築し、乳酸分率の向上を図る。また、ポリマーの親水性化学修飾と熱的、機械的性質の分析をするため、培養条件を検討し、不飽和結合を有する乳酸ベースポリマーの大量生産を試みる。今年度の研究では不飽和分率の制御可能な不飽和ユニットを有するポリマーの大量合成が成功したため、平成26年度において、「ポリマーの親水性化学修飾と物性解析」を中心に実験を行う。具体的に、1不飽和ユニットを有するポリマーに対する親水基の導入実験の条件を検討し、ポリマー化学修飾を行う。さらに化学修飾前後の2ポリマーの親水性変化の分析3ポリマーのフィルムを作り、物性の解析4ポリマー分解性と生体適合性の解析を行う。
インスリン糖代謝・動脈硬化因子と認知症リスクの解析

本研究では平成18年3月からの愛媛大学附属病院抗加齢・予防医療センターにおける、抗加齢ドック受診者のデータの収集及び解析を行っている。研究の初年度(平成28年度)は平成26年11月までの初回受診者のみの解析(横断研究)にとどまったが、平成29年度は平成29年10月末まで期間を延長し、同ドック受診者のうち複数回受診し、経時的に認知機能検査を行った方で、特に糖尿病治療歴のない288名(男性188名、平均年齢67.0±8.9歳、平均受診間隔3.0±2.0年)のデータを集積し、解析を進めた。認知度チェックテスト(MCI Screen)で軽度認知障害(MCI)を診断し、血液検査にて空腹時血糖、HbA1c、空腹時インスリン値、末梢インスリン抵抗性(HOMA-IR)、インスリン分泌能(HOMA-β)、動脈硬化の指標として上腕足首間脈波伝搬速度(baPWV)及び頸動脈エコーで総頸動脈内膜中膜厚(IMT)を評価した。その結果、末梢性インスリン抵抗性が高い場合、インスリン分泌能がMCI発症や認知機能の経時的悪化に独立して影響する可能性が示唆された。研究成果については次年度(平成30年度)に日本老年医学会や日本認知症学会、日本神経学会などの関連学会にて発表予定であり、論文化も進めている。また、同時に、同ドック受診者におけるフレイルとMCIとの関連についても解析を進め、論文化し公表した。初年度の研究成果を踏まえ、さらに経時的な変化についての解析を進めることができた。成果についても随時、学会等で発表予定であり、ほぼ計画通りに研究を進めることができている。研究成果を学会で発表するとともに論文化し、公表していく。平成18年3月26年11月までの愛媛大学附属病院の抗加齢・予防医療センターにおいて、抗加齢ドック初回受診者1,891名のうち、コリンエステラーゼ阻害薬などの認知症治療薬使用者を除く1,877名(男性743名、女性1,134名、平均年齢65.4±9.5歳)を対象として横断研究を行った。認知機能はタッチパネル式認知症検査、認知度チェックテスト(MCI Screen)で評価し、末梢の糖・インスリン代謝の指標として空腹時血糖(FBS)、HbA1c(NGSP値)、空腹時インスリン値(IRI)、末梢インスリン抵抗性(HOMA-IR=IRI×FBS÷405)、インスリン分泌能(HOMA-β=IRI×360÷[FBS-63])を測定し、その関連を解析した。その結果、糖・インスリン代謝異常が軽度認知障害(MCI)を促進し、特に比較的若年層ではその影響が大きい可能性が示唆された。早期の糖・インスリン代謝異常に対する介入が必要と考え、研究成果を日本神経学会、日本老年医学会、日本認知症学会などの関連学会にて発表した。また、MCIやアルツハイマー型認知症(AD)には根本的な治療がないことから、近年、糖尿病治療薬による認知症改善・進行予防効果が期待されており、特にチアゾリジン系誘導体は高インスリン血症やインスリン抵抗性の改善に加え神経保護的効果も報告されている。インスリンや経口糖尿病薬について使用期間や種類、容量などの情報収集を行い、追加解析を行った。ほぼ計画通りの内容で解析を進めることができており、成果についても随時、発表できているため。抗加齢ドックの初回受診時に認知機能異常や糖・インスリン代謝異常があった者について再受診した際のデータ収集を行い、糖・インスリン代謝異常がMCIや認知症を進展させたかどうかを追跡調査する。物品購入を次年度に持ち越したため。(理由)物品購入費、学会での成果発表にかかる旅費、論文化に関係する諸経費を次年度に持ち越したため。(使用計画)
シグマ受容体シャペロンによる細胞保護作用およびμ-受容体機能調節の機序解明

シグマ1受容体シャペロンとBcl-2は、細胞に対するストレスに対し、ミトコンドリアにおいて作用を惹起すると信じられて来たが、小胞体においてそれぞれカスパーゼならびにGSK-3βを介して細胞保護作用を示すことが明らかとなった。一方、長期間の受容体刺激に対して、シグマ1受容体シャペロンは細胞内増加し、細胞保護作用を示すことも明らかに出来た。さらに、この状況で急激に刺激がなくなった場合、シグマ1受容体シャペロンが核膜周辺に細胞内移行し、離脱症状が発現し、これらの効果は拮抗薬の処置で完全に抑制された。この様に、シグマ受容体シャペロンは細胞保護作用に重要であり、その機序を明らかにすることが出来た。抗がん剤は、がん治療において必要不可欠であるが、痛みの原因となるがんを抑制させる抗がん剤自身が、神経を障害することにより、疼痛を引き起こすことが臨床現場で問題となっている。一方、シグマ1受容体シャペロンは痛みと密接に関わっていることも知られている。そこで本研究では、抗がん剤誘発神経障害性疼痛下におけるシグマ1受容体シャペロンの関与ついて検討した。まず、抗がん剤誘発神経障害性疼痛下における脊髄の小胞体シャペロンタンパクシグマ1受容体シャペロンおよびBiPの変化を確認したところ、シグマ1受容体シャペロンのdownregulationが認められたが、BiPでは変化が認められなかった。さらに、paclitaxel誘発シグマ1受容体シャペロン細胞内分布の変化をシグマ1受容体シャペロン-EYFP安定発現CHO細胞を用いて検討を行ったところ、paclitaxel処置後にCHO細胞内のシグマ1受容体シャペロンの分布が小胞体から核膜付近に移動していた。これらの結果は、paclitaxelがシグマ1受容体シャペロンの細胞内分布を変化させ、且つ、downregulationを引き起こすことにより、シグマ1受容体シャペロンとしての作用を抑制している可能性が考えられた。最後に、シグマ1受容体シャペロン作用薬の鎮痛効果についても検討を行った。抗がん剤誘発神経障害性疼痛モデルに対し、シグマ1受容体シャペロン作動薬であるSA4503の投与により鎮痛効果が認められたが、その鎮痛効果はシグマ1受容体シャペロン拮抗薬であるNE100によって抑制された。以上の結果より、SA4503には抗がん剤誘発神経障害性疼痛に対して鎮痛作用があり、この鎮痛作用はシグマ1受容体シャペロンを介していることが示唆された。本年度に予定していた研究と来年度に予定していた研究を併行しておこなっており、当初予定していたGSK-3βに関する研究も進んでいる。Sigma-1受容体chaperone (Sig-1R)およびのBcl-2のCHO細胞へ過剰発現する事により、GSK-3βの脱リン酸化およびNF-κBの抑制が認められた。また、Sig-1RのsiRNAによるノックダウンでは、staurosporineにより誘発されるcaspase-3の活性化は増強された。一方、Bcl-2のsiRNAによるノックダウンによりstaurosporineにより誘発されるcaspase-3の活性化は抑制された。逆に、Sig-1Rの過剰発現では、staurosporineにより誘発されるcaspase-3の活性化を抑制しなかったが、Bcl-2の過剰発現はにcaspase-3の活性化に対して全く抑制を示さなかった。よって、Bcl-2は、Sig-1Rとは異なり、staurosporineによるcaspase-3の活性化に対して抑制作用を示さない可能性が示唆された。一方、staurosporineによりGSK-3βの著明な活性化が観察されたが、この活性化はBcl-2の過剰発現で抑制された。逆に、staurosporineによるGSK-3βの活性化はSig-1Rにより全く抑制されなかったことより、staurosporine処置下においてSig-1RとBcl-2によるGSK-3βに対する活性化調節作用は明らかに異なる事が示された。これまでの報告で、Sig-1Rは酸化ストレスに対してNF-κB/Bcl-2経路を介して細胞保護作用を示すことが明らかとされてきているが、本研究により、Bcl-2は、GSK-3βの活性化を著明に抑制することを初めて見出し、ミトコンドリアにおいてSig-1RとBcl-2はそれぞれcaspase-3およびGSK-3βを調節する事により細胞保護作用を惹起する事が示唆された。本年度、ミトコンドリアにおけるSigma-1 receptorとBcl-2の細胞保護作用の違いを明らかにすることができ、ほぼ予定通り研究が遂行されている。昨年度、sigma-1受容体シャペロン(Sig-1R)とBcl-2はそれぞれcaspase-3およびGSK-3βを調節する事により細胞保護作用を発現していることを見出した。さらに機序を解析した結果、Bcl-2は主に小胞体に存在し、Sig-1Rは小胞体とミトコンドリアの結合部に存在していた。薬物によるストレス初期にはSig-1Rは小胞体へ細胞内移行し、一方で、Bcl-2はストレス後期にミトコンドリアに細胞内移行し細胞保護作用を示していた。ストレス後期では、Sig-1Rはもはや細胞保護作用を惹起していないのに対し、ストレス初期にGSK-3βを介して細胞保護作用発現していたBcl-2はストレス後期においてミトコンドリア移行し、caspase-3依存的に細胞保護作用を示した。このようにBcl-2およびSig-1Rはそれぞれ時間依存的に、あるいはオルガネラ依存的に異なるアポトーシス関連タンパク質を調節して細胞保護作用を惹起していることを見出した。

さらに、モルヒネの長期処置に対するSig-1Rの細胞保護作用について検討を行った。Sig-1Rは、小胞体において細胞内増加することにより、細胞保護作用を示すとこが明らかとなった。一方、モルヒネの長期処置後に急激な休薬を行うと、細胞内増加したSig-1Rは、短時間に小胞体から核膜に細胞内移行し、この細胞内移行はSig-1R拮抗薬により完全に抑制された。動物において、同様な検討を行った所、モルヒネ休薬時に様々な退薬症候が認められ、これらの症候はSig-1R拮抗薬の前処置により完全に抑制され、Sig-1Rが退薬症候に重要な役割を果たしていることが明らかとなった。このようにSig-1Rは様々なストレスに対して、細胞内移動ならびに細胞内増加することにより適応し、細胞および体内のホメオスタシスに重要な役割をしていることが明らかとなった。シグマ1受容体シャペロンとBcl-2は、細胞に対するストレスに対し、ミトコンドリアにおいて作用を惹起すると信じられて来たが、小胞体においてそれぞれカスパーゼならびにGSK-3βを介して細胞保護作用を示すことが明らかとなった。一方、長期間の受容体刺激に対して、シグマ1受容体シャペロンは細胞内増加し、細胞保護作用を示すことも明らかに出来た。さらに、この状況で急激に刺激がなくなった場合、シグマ1受容体シャペロンが核膜周辺に細胞内移行し、離脱症状が発現し、これらの効果は拮抗薬の処置で完全に抑制された。この様に、シグマ受容体シャペロンは細胞保護作用に重要であり、その機序を明らかにすることが出来た。作用機序的にも明らかになりつつあり、今後はより細胞を用いた生化学的な研究にシフトしていく。特に、昨年度の予備的な結果として、シグマ1受容体シャペロンは、GSK-3βに直接作用する事により細胞保護作用に働いている可能性が低くなったため、Bcl-2とシグマ1受容体シャペロン相互作用に着目し、カスパーゼの活性化を伴ったapoptosisに至るシグマ1受容体シャペロンのミトコンドリアにおける細胞保護作用の機序についてtunnelおよびannexin VおよびWB法によりCHO細胞等を用いて明らかにする。特に、シグマ1受容体シャペロンのBcl-2に対する作用がミトコンドリアもしくは小胞体のどちらに存在するBcl-2に影響して細胞保護作用を示すのかを明確にしていく。併行して、モルヒネの退薬症候におけるシグマ1受容体シャペロンの関与を生化学的ならびに行動薬理学的に明らかにする。今後は、オピオイド鎮痛薬により身体依存におけるsigma-1 receptorの重要性について動物および培養細胞を用いて検討していく。行動薬理
光化学系I反応中心複合体内部のクロロフィル, キノンの存在状態と機能の関係

植物光化学系I(PSI)反応中心は,強力な還元力を作りだしNADPを還元する点で紅色光合成細菌あるいは光化学系II反応中心とは異なり,その内部構造も異なると推定されてきたが,その構成電子伝達成分が完全に明らかになっておらず,研究が遅れていた.特にその内部に存在するphylloquinone(ビタミンK1=VK1)の役割が不明であった.本研究ではVK1の役割を,ナノ秒分光,蛍光法,及び極低温ESR測定法による電子伝達反応の解析から明らかにした.この結果,光照射により反応中心クロロフィルa(P700)と電子受容体クロロフィルa(AO=CHL a 687)間で電荷分離がまず生じ,電子は更に電子受容体(A1=VK1), FeSセンター(FX, FA, FB)へと流れると推定された.VK1は,そのセミキノンが非常に低い酸化還元電位となり(Em<-700mV), Hの関与なしに電子伝達を行えるような反応環境にあると結論された.また,これまでPSIの遅延蛍光は観測されていなかったが, VK1抽出後のPSI粒子は新たに279Kで694nm, 77Kで701nmに発光極大を示す蛍光をしめす.時間分解蛍光スペクトル測定を行った結果,この蛍光の大部分はPSIでの電荷再結合により再励起された反応クロロフィル(P700)が基底状態に落ちる際に生じる事が明きらかになった.以上のような測定結果からVK1の反応様式,速度が推定された.この様な電子移動の様式は, PSII及び紅色光合成細菌の反応中心内部での電子移動と似ており,構成ポリペプチドのかなり大きな違いにも関わらず,反応中心内部構造は似ている事が明きらかになった.植物光化学系I(PSI)反応中心は,強力な還元力を作りだしNADPを還元する点で紅色光合成細菌あるいは光化学系II反応中心とは異なり,その内部構造も異なると推定されてきたが,その構成電子伝達成分が完全に明らかになっておらず,研究が遅れていた.特にその内部に存在するphylloquinone(ビタミンK1=VK1)の役割が不明であった.本研究ではVK1の役割を,ナノ秒分光,蛍光法,及び極低温ESR測定法による電子伝達反応の解析から明らかにした.この結果,光照射により反応中心クロロフィルa(P700)と電子受容体クロロフィルa(AO=CHL a 687)間で電荷分離がまず生じ,電子は更に電子受容体(A1=VK1), FeSセンター(FX, FA, FB)へと流れると推定された.VK1は,そのセミキノンが非常に低い酸化還元電位となり(Em<-700mV), Hの関与なしに電子伝達を行えるような反応環境にあると結論された.また,これまでPSIの遅延蛍光は観測されていなかったが, VK1抽出後のPSI粒子は新たに279Kで694nm, 77Kで701nmに発光極大を示す蛍光をしめす.時間分解蛍光スペクトル測定を行った結果,この蛍光の大部分はPSIでの電荷再結合により再励起された反応クロロフィル(P700)が基底状態に落ちる際に生じる事が明きらかになった.以上のような測定結果からVK1の反応様式,速度が推定された.この様な電子移動の様式は, PSII及び紅色光合成細菌の反応中心内部での電子移動と似ており,構成ポリペプチドのかなり大きな違いにも関わらず,反応中心内部構造は似ている事が明きらかになった.
病原性細菌の鉄取り込みに関与するタンパク質の構造・機能に関する研究と創薬への応用

本研究は病原菌の一つであるコレラ菌が増殖に必要とする鉄を獲得する機構を明らかにすることを目的とした研究である。主要な鉄源は血液中のヘモグロビンに存在するヘムがであることから、ヘモグロビンからのヘムを獲得とそれを分解し、鉄を取り出す一連のタンパク質を網羅的に解析した。その結果、VCA0907がヘム分解酵素であり、その酵素活性は活性中心に存在する水素結合の強度により、制御されることがわかった。また、基質であるヘムはVCA0908から受け取ることがわかった。ヘムを分解し、鉄を取り出す過程は病原菌の増殖に必須の過程であることから、新たな病原菌増殖剤の開発につながら可能性を見いだすことができた。本研究は病原性細菌の一つであるコレラ菌が自身の増殖に必要とする鉄原子を獲得する機構を蛋白質レベルで明らかにすることを目的とした研究である。コレラ菌のゲノム配列を遺伝子解析し、HutZと呼ばれる蛋白質がヘムの分解酵素である可能性を見出したので、大腸菌での発現系を構築し、精製蛋白質の反応解析を行った。これまでの研究からヘム分解酵素はヒト型、黄色ブドウ球菌型、ピロリ菌型の三種類に分けられ、それぞれ立体構造が異なることが知られる。HutZはピロリ菌型の酵素であるが、ヒト型の酵素がヘムを分解する時に観測される中間体と同じ中間体を経由してヘムを分解することが示され、立体構造に相同性はないが、ヒト型酵素と同じ反応機構でヘムを分解することを明らかにした。しかし、中性付近での反応性が著しく低いという特徴があった。活性部位近傍の構造を分光学的手法を用い検討した結果、ヘムと結合するヒスチジンが周囲のアミノ酸残基と水素結合を形成し、それによりヒスチジンが分極し、酸化型のヘムを安定化させるためであり、逆にこの水素結合の強度を弱めると還元反応が進むことがわかった。ヒト型のヘム分解酵素の場合、電子の供給が還元酵素か還元剤かに関わらず反応が進むのに対し、HutZでは還元剤からは電子を受け取れない構造をしているため、還元酵素の存在が反応に必須であると考えられる。これは、人の体内では恒常的にヘムを分解しているのに対し、コレラ菌では、水辺など増殖に適していない環境に存在する場合、酵素活性を抑制し、エネルギーを無駄に消費しない状態で存在しており、一旦、ヒトの体内に侵入し、栄養が豊富で、増殖が可能な状況にると酵素を活性化させ、急激に増殖する、というように生存している環境に応じ、酵素活性を制御する必要があり、菌の生存に合致するような反応機構を有するという新たな概念を提案することができた。本研究は病原菌の一つであるコレラ菌が増殖に必要とする鉄原子を獲得する機構を明らかにすることを目的とした研究である。

遺伝子解析からHutZがヘム分解酵素であることを予想されたので、大腸菌での発現系を構築し、そのヘム分解活性を調べた。その結果、HutZはヒトのヘム分解酵素とアミノ酸配列に相同性がないが、同じ反応機構でヘムを分解することがわかった。しかし、この分解活性はpH 6以下で発現するが、pH 8以上ででは発現しないというpH依存性があることがわかった。ラマン分光法など分光学的手法を用いた構造解析から、基質であるヘムと結合するHis170が隣接するAsp132と水素結合を形成し、この水素結合の強度の変化と酵素活性が関連していることがわかった。これは、この水素結合により、His170からヘムへの電子供与性が変化し、ヘムの還元速度、自動酸化速度が変化することで、酵素活性が制御されるという新規なヘム分解活性制御機構を明らかにすることができた。続いて、HutZとオペロンを形成しているHutX, HutWに注目した。遺伝子解析から、HutXはヘム結合蛋白質と予想されたことからHutZに基質であるヘムを輸送する蛋白質、HutWは鉄-硫黄クラスターの結合モチーフが存在することから、ヘム分解反応に必要な電子供与体である可能性が考えられた。そこで、これらの蛋白質のヘム取り込みにおける役割を検討するため、大腸菌での発現系を構築し、機能・構造解析を行った。HutXは2当量のヘムと結合し、その親和性はHutZより高かった。しかし、ヘムと結合させたHutXとヘムと結合していないHutZを混合すると数秒以内にヘム移動が観測された。親和性が高いのにも関わらず、ヘムを含まないHutXを10倍当量追加しても、逆移動が起こらなかったことから、HutXからHutZへのヘムの輸送は不可逆的であることがわかった。このことからコレラ菌内でヘム分解酵素にヘムを輸送する蛋白質として、HutXを世界で初めて見出した。生物無機化学初年度はコレラ菌のヘム分解酵素の詳細な反応機構を明らかにすることができた。ビフィズス菌などのヒトの常在性細菌の多くはヘムの分解酵素を持たないのに対し、結核菌や黄色ブドウ球菌などヒトに有害な細菌の多くはヘムの分解酵素をもつことを遺伝子解析により明らかにし、コレラ菌もその例外でないことがわかった。さらに、これまで知られているヘム分解酵素と異なり、活性部位近傍に水素結合のネットワークが形成されており、これにより酵素活性が抑制されているが、蛋白質-蛋白質相互作用などにより、水素結合の強度が変化すると容易に活性が上昇することがわかった。ペプチド鎖の一部を切断することにより、酵素活性を上昇させる例は知られるが、水素結合の強度変化による活性の制御はこれまでほとんど例がなく、ペプチド鎖の切断が非可逆的なのに対し、水素結合の強度変化は可逆的なので、周囲の環境に応じ、柔軟に酵素活性を制御可能であるという特徴をもつ。これは、酵素科学の分野における新たな発見であると共に病原性細菌に対する治療薬の開発などにつながる貴重な発見であり、当初の予定通り、順調に成果が得られていると言える。初年度はコレラ菌のヘム分解酵素の詳細な反応機構を明らかにすることができた。
校旗の象徴機能に関する基礎研究

研究成果の概要(実証的分析結果について)1:研究方法の概要:(1)学校総覧から、小学校・中学校・高等学校をランダムに選択し、質問紙法によるメールサーヴェイを行った。約800の有効標本を得た。然し、校旗を撮影する際に必ずしも自然光のもとで撮影されているとは限らず、色彩のシンボル効果を吟味するために最良の標本が得られたことにはならなかった。(2)校旗を制定する過程は、学校の設置者と校旗を制定する契機によって異なり多様である。然し、学校を訪問しても、十分な記録が残されている場合は少ない。2:校旗の種類と活用場面:活用場面は(1)日常の教育活動に一環として、校旗が構内に掲揚されている場合と(2)特別教育活動・学校行事の場面。それぞれに応じて校旗があり、それらの形態・デッサン・材質に相違がある。3:校旗のデザインや色彩には傾向がある。共通性の多い校旗構成は中心部分に校章を印するもの、またはその図案化したデザインをおくものである。校旗の地色や校章のデザインには、学校がおかれる地域の文化的な背景を反映するものが少なくなく、校旗を制定した時代の趨勢をも相当程度反映する。この観点から校旗の文化批判が可能である。4:校旗は、一定の教育理想を形式的に代表する。しかし校旗の形・色・デザインがどのような教育的象徴機能を実際の教育過程でもちうるかを解析するためには、校旗を受け入れる生徒の立場と監護者たちの立場を教育的象徴との関連において分析する作業を含めてそれが行われる必要がある。研究計画に即し、以下の活動を行った。1)校旗に関する第一期第一次調査アンケート方式により、北海道・東北地区所在の小・中・高等学校(公私立)を対象とする。(A)校旗の形状と(B)校旗の制定過程に関する実態調査を行った。ランダムサンプリングによる道県別抽出標本数小・中・高等学校各300校、回収率平均47.62%(1996年12月31日現在)である。2)第一期第一次調査集計校種別毎の有効回答について、その整理を行いつつある。3)第二期第一次調査の準備アンケート方式により、関東甲信越及び関西地区所在の小・中・高等学校(公私立)を対象とする調査(内容・形式は1996年度と同一)を行うため、準備作業を行った。4)第二期第二次調査の準備第一期第一次調査を行った地域について、有意抽出による各校種平均30例(合計100校程度)について、デプススダディーとしての第二次調を実施するため、その準備を行った。1)校旗に関する第二期第一次調査アンケート方式により、関東甲信越及び関西地区所在の小・中・高等学校(公私立)を対象とする(A)校旗の形状と(B)校旗の制定過程に関する実態調査を行った。ランダムサンプリングによる都府県抽出標本数小・中・高各300校、回収率は1997年12月31日現在で45.1%であった。2)第一期第一次調査結果と併わせて、有効回答につき整理を行っている。3)第三期第一次調査の準備アンケート方式による中四国・九州地方所在の小・中・高等学校(公私立)を対象とする調査を行うため、準備作業を行った。なお、アンケートの設計について部分的な手直しを行った。4)第二期第二次調査の準備第二期第一次被調査地域について、有意抽出による各校種別標本30(計100)について、デプ-ススタディーとしての第二次調査を実施するため、その準備を行った。
歯周病細菌特異的なナイーブT細胞の抗原認識

目的歯周炎局所でのT細胞の挙動を試験管内で再現する実験培養系を用いると,P.gingivalis菌体とともに培養した末梢血T細胞は,ナイーブタイプのものからメモリータイプのものへと表現形質をかえる。この応答は,抗HLA-DR抗体で抑制されるので,P.gingivalis菌体成分の抗原認識によってT細胞の活性化が起こっていることを示している。そこで,この抗原が何かであるかについての検索を行うことを本研究の目的である。方法P.gingivalis FDC381菌体を,SDS-PAGE力ラムによって分子量で分画した画分を用い,HLA遺伝子型のあきらかな健常者由来の末梢血単核球を活性化し,その増殖応答をBrdU取り込み量によって測定した。本年度は,分画成分に混入した細菌ゲノムDNAの影響を評価するため,P.gingivalis菌体からphenol-chloroform抽出を行って得た精製ゲノムDNAに対する末梢血単核球の増殖活性を検討し,あわせてその際のTNF-alphaおよびIL-6産生量を測定した。結果および考察末梢血単核球は,精製ゲノムDNAに対しては,弱い増殖活性しか示さなかった。また,調べた限りのサイトカイン誘導能も弱かった。このことから,T細胞活性化に関わるP.gingivalis菌体成分は,タンパク由来のもの,およびゲノムDNA以外の非タンパク成分であると考察された。目的:歯周病関連細菌に対する免疫応答,とりわけナイーブT細胞の認識する抗原を同定することを目的とした。材料・方法:歯周病関連細菌:P.gingivalis FDC381株;菌体成分の分画:連続分取型SDS-ポリアクリルアミド電気泳動装置を用い,SDSならびにβ-メルカプトエタノールで変性させた菌体成分を分子量で分画し,分取した;分取した菌体成分に対するT細胞の抗原認識:分取成分とともに培養した健常者末梢血単核球のbromo deoxyuridine(BrdU)取り込み能によって調べた。結果・考察1)P.gingivalis菌体成分を,10kDaから40kDaの範囲に50画分に分画した。2)末梢血単核球の分取菌体成分に対する抗原認識は,被験者によって異なった。約2/3の被験者は,ほとんどすべての画分を認識したが,約1/3は,限られた画分のみを抗原認識した。3)P.gingivalis全菌体で刺激したときに末梢血単核球のBrdU取り込み能の低い被験者が認識する抗原が限られた画分に集中することが明らかになった。このことは,これらの抗原が免疫応答を抑制するT細胞クローンを誘導する可能性を示唆するものと考えられた。これらのことから,P.gingivalisの感作を受けていないと考えられる個体にもP.gingivalisの分画成分を認識するT細胞が存在し,その認識の様態には個体差があること,また抑制性のT細胞のみを誘導する個体ではP.gingivalis菌体すべてに対する免疫応答が抑制される可能性が示唆された。方法P.gingivalis FDC381菌体を,SDS-PAGEカラムによって分子量で分画した画分を用い,HLA遺伝子型のあきらかな健常者由来の末梢血単核球を活性化し,その増殖応答をBrdU取り込み量によって測定した。

結果および考察末梢血単核球は,精製ゲノムDNAに対しては,弱い増殖活性しか示さなかった。また,調べた限りのサイトカイン誘導能も弱かった。このことから,T細胞活性化に関わるP.gingivalis菌体成分は,タンパク由来のもの,およびゲノムDNA以外の非タンパク成分であると考察された。
ヒト神経膠腫の悪性化因子に関する研究-特に浸潤のメカニズム解明について-

悪性神経膠腫に代表される悪性脳腫瘍の治療を困難なものにしている最大の原因は、その著名な浸潤性にある。ヒト神経膠腫において腫瘍の悪性化に関するkey factorと考えられた、癌原遺伝子産物であるc-Met蛋白に注目し、その活性化機構、細胞内シグナル伝達を解明し、c-met蛋白が、培養アストロサイトにおいて発現する事を明らかにし、脳障害の際に供給される各種サイトカインが、アストロサイトによるnerve growthfactor(NGF)をはじめとする様々な神経栄養因子の産生もしくは分泌を増強することを明らかにした。さらに臨床的に低悪性群の神経膠腫において、c-Met蛋白陽性率と再発との間に相関が見られ、c-Met蛋白は神経膠腫のすべてのグループにおいて発現しており、神経膠腫においてはその悪性化のメカニズムではなく、浸潤にかかわる可能性を明らかにした。また、アストロサイトに発現するneural cell adhesion molecule(NCAM)も、神経細胞の移動、神経突起の誘導・伸長などに関与しており、悪性脳腫瘍の浸潤発育におけるその役割は重要であり、神経膠腫においても悪性化機構に深くかかわっているものと考えられ、その悪性化に伴ってNCAMのそれぞれのisoformの発現は抑制されることを明らかとした。また、多分化能を有する神経幹細胞、神経前駆細胞等において、その分化調節に深くかかわるとされているneuronspecific RNA binding protein遺伝子群であるMusashiは、神経組織の成熟過程で発現し重要な役割を担っていることが報告されている。中枢神経系より発生する腫瘍の細胞起源はいまだ不明であり、その候補となるMusashiの発現を神経膠腫において検討し、遺伝子、蛋白レベルいずれでもMusashi1の発現が見られ、なおかつ、悪性度と相関が見られることを明らかにした。悪性神経膠腫の治療を困難なものとしている最大の理由は、その著明な浸潤能にある。そして浸潤の基本的メカニズムとしては、(1)個々の腫瘍細胞の腫瘍本体からの離脱、(2)腫瘍細胞の宿主組織への接着、(3)腫瘍細胞が産生するプロテアーゼによる宿主細胞外マトリックスの分解、の3つのプロセスが重要である。神経膠腫において(1)のプロセスへの関与の可能性が報告されている分子は現在のところわずかにDCC(The deleted in colorectal cancer)のみであり、本来脳組織における発現量の多い接着分子であるN-cadherin,NCAM(neural cell adhesion molecule)のうちN-cadherinは文献上(1)のプロセスへの関与は否定されている。このような背景に基ずき、我々はまずNCAMの神経膠腫の浸潤能への関与を検討した。我々は既にWestern blottingによるpilot studyにて神経膠腫におけるNCAMの発現が腫瘍の悪性化に伴いdown-regulateされている可能性を指摘していたが、今年度我々はquantitative Western blot analysisおよびcryostat sectionにおけるimmunohistochemistryにより、ヒト神経膠腫におけるNCAMの発現は腫瘍の組織学的悪性度および生物学的悪性度に対し逆相関を示すことを確認することができた(Cancer,in press)。現在はrat NCAM 140kD isoformをヒトグリオーマ細胞T98Gに強制発現させることによる浸潤能、増殖能の変化を解析することにより、接着分子NCAMの腫瘍の生物学的悪性度への関与メカニズムについて検討中である。ヒト神経膠腫の悪性化に関わる因子として、細胞接着因子であり、浸潤能との関わりが予想される神経細胞接着因子(NCAM)とhepatocyte growthfactorのreceptorであり、Proto-oncogeneのproductであるc-Met蛋白に注目し、それらのヒト神経膠腫における発現と意義を検討した。まず、astrocytic tumorのおけるNCAMの3つのisoformの発現を検討した。その結果、low grade astrocytomaでは、NCAMの3つのisoformの発現が認められたが、grade4astrocytomaでは、NCAMの発現は著明に減弱していた。

NCAMの発現量の半定量を行ったところ、増殖能の指標であるMIB-lindexとは逆相関を示した。また、画像上浸潤性に発育する腫瘍は、NCAMの発現はほとんど認められなかった。一方、c-Met蛋白の検討では、high grade astrocytomaにおいて、有意にその発現が認められ、MIB-1、epidermal growthractor receptorとは発現様式が異なり、c-Met蛋白発現例では生存期間が短い蛍光にあり、悪性度のひとつの指標ととなることが判明した。以上の研究結果から、NCAMの発現の低下が浸潤能の獲得に関与し、悪性度の指標になりうること、c-Met蛋白の発現も組織学的悪性度のみならず、臨床的悪性度を反映していることが明らかとなった。当教室では、サイトカインにより活性化されたアストロサイトが、脳損傷時の神経機能維持、再生に重要な役割を果たしていると想定し、fibroblast growth facter(FGF)、interleukin-1β(IL-1β)、tumor necroting facter-α(TNF-α)、epidermal growth facter(EGF)、transforming growth facter-β1(TGF-β1)等の、脳障害の際に供給される各種サイトカインが、アストロサイトによるnerve growth facter(NGF)をはじめとする様々な神経栄養因子の産生もしくは分泌を増強することを明らかにしてきた。本研究期間中は、各種細胞の増殖能、遊走能、形態形成及び分散に関与することが報告されているhepatocyte growthfacter(HGF)の膜受容体であるc-met蛋白が、培養アストロサイトにおいて発現する事を明らかにしてきた結果を踏まえ、western blottingを用いた蛋白レベルでの解析を行い、各種サイトカインの刺激によりc-met蛋白発現量が増加する傾向を確認した。各種サイトカインのなかで特にacidic FGF、basic FGFによる刺激にてc-met蛋白が優位に増加することが明らかとなった。現在はさらにc-met蛋白mRNAの経時的な発現量の変化を知るために、FGFにて培養アストロサイトを刺激し、competitive PCRによりc-met蛋白mRNAの定量を行っており、その発現量にdynamicな変化のあらわれることをすでに確認している。悪性神経膠腫に代表される悪性脳腫瘍の治療を困難なものにしている最大の原因は、その著名な浸潤性にある。