hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
微小流れ場における３次元温度速度同時計測手法の開発

本年度は,温度速度計測法開発の前段階としてアルミニウム製のT字微小流路にペルチェ素子で温調を行った流れ場について,2次元的な速度場と温度場をPIVとLIFを用いて計測したところ,報告例のない現象が見られたため,そのメカニズム解明を進めた.PIV,LIF等の光学計測では,光源の選定が重要となるため,光学計測倒立顕微鏡における落射照明が可能な光源について、LED,水銀灯等を試した.結果として,高輝度、光源の安定性、照明範囲の広さの観点から水銀灯を用いて実験を進めた.微小スケールでは局所的な温度勾配が付きにくいが,T字の金属流路では,流路裏側に配置したペルチェ素子に電圧を印加することで,1mmあたり34°Cの温度勾配を生じさせることができた.速度場は対物レンズの焦点位置を移動させることで,垂直方向に3断面を観察した.ペルチェ素子を印加する瞬間に流速が一時的に遅くなり,反対にペルチェ素子の電圧を切る場合は,流速が一時的に早くなる現象が見られた.この速度変動量は,電力に依存していることがわかった.一方、流動が変化している瞬間では温度場に有意な変化はみられず,この速度変動は温度が原因ではないと考えている.ペルチェ素子を印加した後,流路垂直方向上部断面を観察したところ,温度が高い側の流動が速くなり,かつ支配的になった.反対に,下部の断面を観察した際には,温度が低い側の流動が速くなり,かつ支配的になった.また,下流部では流れが旋回することを確認した.一般的に微小スケールでは密度による成層について現象は報告例がない.ペルチェ素子による流動制御が可能になれば,非接触で着脱可能なマイクロミキー等への応用が期待できるため,温度場からメカニズム解明と数値モデル化を進めている.27年度が最終年度であるため、記入しない。27年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では,微小スケール流れの速度場や温度場を定量的に可視化計測する手法を開発し,吸収式ヒートポンプの吸収器内における液膜流れなど,微小スケール流れをもつエネルギー機器の高効率化に繋げることを目的としている.このため,3次元の温度速度同時計測を達成することを目標とし,二色蛍光法(LIF)とPIV・PTVを融合した計測手法の開発を試みる.微小流れ場では,流れの代表長さが小さく,代表速さが遅いことから,トレーサ粒子の密度制御が重要である.本研究では,中空のマイクロカプセルへ蛍光色素を封入することで,トレーサ粒子の作成を行う. 25年度は,温度応答性を持つ色素の調査を行った.二色蛍光法や粒子画像による流れ場計測は,多岐の分野で行われているが,技術の根幹は類似しているものの,独自の色素が用いられ,それぞれの計測方法が発展しており,情報が体系化されていない.また,二色蛍光法では,高いシグナルを得るために,二色素の発光スペクトルが離れており,かつ,発光スペクトルがもう一方の色素の吸収スペクトルとオーバーラップしないことが求められる.このため,色素と励起の組み合わせを検討することが非常に重要である.本年度は,すべての領域について詳細な文献調査を行い,従来行われている計測法や使用蛍光色素の組み合わせ,発光波長,吸収波長,励起可能なハードウェア等を調査することで,本研究への指針を得ると同時に,先行研究との位置づけを明確に出来るようにした.次に,実際に粒子を流路に流したと想定し,画像処理プログラムを作成した. PTV計測では粒子を個々に識別し,その移動をサブピクセルオーダーで計測することが求められる.このため,輝度値の局所的なピークから個々の粒子を識別するラベリング処理を行い,この後それぞれの局所的な輝度値パターンヘガウシアンフィッティングを行うことで,粒子位置特定を行うアルゴリズムを作成した.μTASやμ熱交換器など,微細細管流れを持つエネルギー機器が増加している.これらの小型高効率化のためには温度と流れを計測することが重要となる.微小空間内の熱流動計測のうち,温度場計測については未だ確立されていない.本研究は新たな微小領域の温度計測法を開発し,温度速度同時計測を行うことを目的とする.本研究は,色素を溶解させるLIFに対して,LIF的な感温性を持たせたカプセルを用いることで温度速度計測を行う.今年度前半期では,二色蛍光カプセルを作成した.中空μカプセルのシェル剤に,感温性を持つ蛍光色素と,感温性を持たない蛍光色素を同時にドープさせた.粒子一つ一つの二色比を算出することによって各粒子位置における温度計測を試みた.二色のシグナルを分光して二台のカメラで撮影した.温度一様場における二色蛍光比を粒子ごとに算出したところ,標準偏差が大きい結果になった.この偏差はピンボケによる画像上の粒径変化の影響とは無関係であった.現時点では温度計測に使用できないが,今後カプセルの改善を試みる.

後半期では,単色のμカプセルを用いて,実際に温度勾配のついた微小流れを計測した.光源の顕微鏡への組み込みなど,実験系のセットアップを完了した.T字の金属流路を作成し,ペルチェ素子を用いる事で,温度差を持つ合流流れを作る装置を作成した.T字の左右両端から粒子を分散させた水を流入させ,対向流に温度差を持たせ,合流部の混合の様子をPIV,LIFを用いて観察した.結果,温度勾配によって速度場が変化する場を観測した.本年度は,温度速度計測法開発の前段階としてアルミニウム製のT字微小流路にペルチェ素子で温調を行った流れ場について,2次元的な速度場と温度場をPIVとLIFを用いて計測したところ,報告例のない現象が見られたため,そのメカニズム解明を進めた.PIV,LIF等の光学計測では,光源の選定が重要となるため,光学計測倒立顕微鏡における落射照明が可能な光源について、LED,水銀灯等を試した.結果として,高輝度、光源の安定性、照明範囲の広さの観点から水銀灯を用いて実験を進めた.微小スケールでは局所的な温度勾配が付きにくいが,T字の金属流路では,流路裏側に配置したペルチェ素子に電圧を印加することで,1mmあたり34°Cの温度勾配を生じさせることができた.速度場は対物レンズの焦点位置を移動させることで,垂直方向に3断面を観察した.ペルチェ素子を印加する瞬間に流速が一時的に遅くなり,反対にペルチェ素子の電圧を切る場合は,流速が一時的に早くなる現象が見られた.この速度変動量は,電力に依存していることがわかった.一方、流動が変化している瞬間では温度場に有意な変化はみられず,この速度変動は温度が原因ではないと考えている.ペルチェ素子を印加した後,流路垂直方向上部断面を観察したところ,温度が高い側の流動が速くなり,かつ支配的になった.反対に,下部の断面を観察した際には,温度が低い側の流動が速くなり,かつ支配的になった.また,下流部では流れが旋回することを確認した.一般的に微小スケールでは密度による成層について現象は報告例がない.ペルチェ素子による流動制御が可能になれば,非接触で着脱可能なマイクロミキー等への応用が期待できるため,温度場からメカニズム解明と数値モデル化を進めている.高輝度で温度応答性が高く,追従性が良好なマイクロカプセルを作成した.温度差をもった流れの合流の様子が観察可能な実験系のセットアップ,流路の作成が完了した.温度速度同時計測の前段階のテストとして,PIVとLIFによる速度と温度場の計測を行ったところ,強制対流において温度が速度場に影響を与える3次元的な流れ場を観察した.これまで微小領域での温度勾配による流れ場を計測した例は多くないことから,本手法を用いてメカニズムの詳細を観測することで,報告例のない知見を得られる可能性がある.27年度が最終年度であるため、記入しない。昨年度は機能性μカプセルを用いて,実際に温度勾配のついた微小流れを計測した.倒立顕微鏡における高輝度な落射照明が可能な光源の組み込みなど,実験系のセットアップを完了した.T字の金属流路を作成し,流路裏側に配置したペルチェ素子に電圧を印加することで,微小領域においても温度差を持った合流流れを作る装置を作成した.対向流に温度差を持たせ,合流部の混合の様子をPIV,LIFを用いて観察した結果,ペルチェ素子を印加する際には流速が一時的に遅くなった.反対にペルチェ素子の電圧を切る場合は,流速が一時的に早くなる現象がみられた.また,ペルチェ素子を印加した後,流路垂直軸に対して上部断面を観察したところ,温度が高い側の流動が速くなり,かつ支配的になった.反対に,下部の断面を観察した際には,温度が低い側の流動が速くなり,かつ支配的になった.この流速の差はペルチェを印加してからの時間に対して,徐々に減少していく傾向が見られた.温度勾配によって流れの潜り込みが生じており,強制対流において,温度が速度場に影響を与える場を観測したと言える.
統合失調症・気分障害患者における突然死の素因探索と予防法の立案

向精神薬治療中の患者に致死性不整脈の割合が高い。QT間隔より突然死予測の優れている指標を用いてその危険性を評価した。気分障害患者で三環系抗うつ薬が用量依存性にQT dispersion延長と関連があり、健常者との間でQT dispersionに有意差があることを確認した。統合失調症患者は突然死の割合が高いため、統合失調症と心臓突然死の両方に関連が指摘されている遺伝子のmRNA発現量を健常者と比較し、発現量とQT間隔との相関を検討した。AKAP9977、KCNH2の発現量は、統合失調症患者で有意に低く、NRG1では、有意に高いことを見出したが、QT間隔と各種mRNAと相関は認められなかった。平成27年度においては、向精神薬の使用と心臓突然死の危険性についての関連を評価するために、統合失調症患者151名と気分障害患者378名を対象にそれぞれ抗精神病薬や抗うつ薬などの服用している薬剤データを収集し、同時に心電図測定を行い、QT間隔、QT dispersion、Tpeak-endを測定した。内服薬の種類やその用量などの臨床データと心電図より得られた情報との関連を重回帰分析を用いて解析した。統合失調症患者においては、抗精神病薬の使用は、QT dispersion、Tpeak-endともに関連性を認めなかったが、炭酸リチウムの使用が用量依存性にQT dispersionと、Tpeak-endの延長と関連があることを確認した。気分障害患者においては、三環系抗うつ薬の使用が用量依存性にQT dispersionの延長と関連があることを確認したが、Tpeak-endでは、どの薬剤も関連性は指摘されなかった。また、薬物治療を受けている気分障害患者215名と健常者165名との間で、心電図データを一般線形モデルを用いて比較し、QT dispersionにおいて有意差があることを確認したが、Tpeak-endでは、有意差を確認できなかった。上記内容の一部を第25回日本臨床精神神経薬理学会(2015年10月30日)で発表した。現在、上記結果を、英語論文としてまとめている。平成27年度の計画通り、統合失調症患者、気分障害患者を対象に内服薬と心電図上のQT dispersion及びTpeak-endとの関連を検討することができた。また、統合失調症と心臓突然死の両方に関連が指摘されている遺伝子の解析に関しても、現在、100人程度検体の収集が進んでいる。抗うつ薬と心臓突然死との危険性についての関連を評価するために、気分障害患者378名を対象に服用している抗うつ薬の種類やその用量などの臨床データを収集し、同時に心電図測定を行い、QT間隔、QT dispertion、Tpeak-endを測定し、得られた情報との関連を重回帰分析を用いて解析した。その結果、三環形抗うつ薬の使用が用量依存性にQT間隔とQT dispertionの延長に関連があることを確認したが、Tpeak-endとの関連性はどの薬剤も関連性は指摘されなかった。上記のことを英語論文としてまとめ、現在専門誌への投稿準備を進めている。平成28年度の計画通り、統合失調症と心臓突然死の両方に関連が指摘されている遺伝子の解析を行うことができ、また、気分障害患者における内服薬と心電図以上に関する論文の作成も順調に進行している。抗うつ薬と心臓突然死との危険性についての関連を評価するために、気分障害患者378名を対象に服用している抗うつ薬の種類やその用量などの臨床データを収集し、同時に心電図測定を行い、QT間隔、QT dispersion、Tpeak-endを測定し、得られた情報との関連を重回帰分析を用いて解析した。その結果、三環形抗うつ薬の使用が用量依存性にQT間隔とQT dispersionの延長に関連があることを確認したが、Tpeak-endとの関連性は指摘されなかった。上記のことを英語論文としてまとめ、現在専門誌への投稿中である。また、104名の統合失調症患者を対象として、KCNH2エクソン部分をリシークエンスし、データベース上の遺伝子配列と比較した。また、65名の統合失調症患者のKCNH2の血液中mRNA発現量をGAPDHのmRNA発現量で標準化して40名の健常者と比較することで、統合失調症患者のKCNH2 mRNA発現パターンを調べ、更にQT間隔との関連を検討した。KCNH2のリシークエンスにていくつかの変異が見出され、一部は病的意義があると既に報告されているものであったが、QT間隔が延長している症例では既知の問題点は見出されなかった。KCNH2のmRNA発現量は患者群で有意に発現量が多かった(p<0.01)。しかし、KCNH2末梢血中mRNA発現量とQT間隔の間に統計学的に有意な関連は見られなかった。今後は症例数を増やすとともに、KCNH2のmRNA発現量に変化を及ぼす可能性のある生物学的な現象について検討する予定である。

AKAP9977、KCNH2の発現量は、統合失調症患者で有意に低く、NRG1では、有意に高いことを見出したが、QT間隔と各種mRNAと相関は認められなかった。統合失調症と心臓突然死の両方に関連が指摘されている遺伝子(KCNH2、AKAP、NRG1)のmRNAを全血中から抽出し、定量的PCR法を行い、各mRNA発現量を求め、統合失調症患者と健常者との比較をする。また、mRNA発現量とQT間隔との相関を検討する。引き続き、統合失調症と心臓突然死の両方に関連が指摘されている遺伝子(KCNH2、AKAP、NRG1)のmRNAを全血中から抽出し、定量的PCRT法を行い、各mRNA発現量を求め、統合失調症患者と健常者との比較をする。現在までに抗精神病薬を服用し、脈拍で補正したQT間隔が440msec以上を示した患者約20人のDNAを採取している。これら患者のKCNH2、AKAP9977、AKAP9978、NRG1の各遺伝子のエクソン部分をリシークエンスし、問題が見られるかどうかを検索する予定としている。また、統合失調症患者の内服薬と心電図異常に関する結果を論文としてまとめる。精神神経薬理学予定していた金額より、購入金額が安かったため。予定していた金額より、購入金額が少なかったため。次年度の研究で引き続き、併せて研究に必要な物品の購入に用いる。
抗Aレセプター抗体を用いた周産期脳障害の治療法開発

周産期低酸素性虚血性脳症に対する新規治療法の開発は急務である。本研究では、炎症性サイトカインであるAのレセプター抗体が、周産期脳障害の改善に対しても有効であるかを検討した。周産期脳障害モデルマウスに抗Aレセプター抗体を投与すると、有意にアポトーシスを抑制し、梗塞体積を減少させた。また、抗体は、脳内に移行し、サイトカインAの血中濃度は抗体投与により有意に上昇することがわかった。本研究課題の最終目標は、ある種の炎症性サイトカインの受容体に対する抗体である抗Aレセプター抗体を用い周産期HIEに対する新規治療法を開発することである。今年度は、研究環境、設備が変わったため、マウスモデル作製の確認、および、抗Aレセプター抗体投与による梗塞軽減効果の確認を行った。7日齢(P7)の新生仔マウス(C57BL/6)の左総頸動脈を2重結紮、切離し、その後低酸素インキュベーターを用い、8%酸素負荷を行った。様々な低酸素負荷時間で確認したところ、40分間負荷をかけることにより片側に適度な受傷が起こることを確認した。抗体投与群では抗体100μg/体重(g)を、対照群では同量のrat IgGを、低酸素負荷の直前に腹腔内投与した。負荷から48時間後に各群同部位の脳切片6枚の2,3,5triphenyltetrazolium chloreide(TTC)染色を行い、平均虚血面積を比較したところ、抗体投与群で有意に小さかった。また、同様に実験を繰り返したところ、低酸素負荷のかかり具合により、抗体投与による虚血面積減少効果が異なる可能性が見出された。対照群での平均虚血面積=Aとした時、各施行回を1A≦5%、25<A≦10%、3A>10%の3群に分け、両群の虚血面積を比較したところ、3群でのみ、平均虚血面積が有意に小さかった。すなわち、ある程度の負荷が加わった場合(中等症から重症)のみ抗体投与の効果があると考えられた。今年度は、抗Aレセプター抗体投与後の血中A濃度の推移、投与後の脳内の抗体分布、また、投与24時間後の急性期評価を行った。抗Aレセプター抗体投与後の血中A濃度の推移では、抗体投与後0, 2, 4, 24時間の時点で両群のマウス心臓より採血し、血清を分離した。Mouse A ELISAkit (Endogen co. Ltd,にて血清中A濃度を測定した。従来の報告どおりA濃度のピークは負荷後(≒投与後)数時間のところにあり、24時間後には基礎値に近くなった。抗体投与群ではAレセプターがブロックされているため、positive feedbackが生じて血清中のA濃度が非常に高値となると考えられた。また、腹腔内投与された抗体は、確かに(全身の)血液中で作用していることを確認できた。抗Aレセプター抗体投与後の脳内分布では、抗体投与群、対照群1(rat IgG投与)、対照群2(溶媒投与)の3群より抗体投与後(負荷後)3時間で脳を摘出した。パラフィン切片を作製し、抗rat IgG抗体による免疫染色を行った。抗体投与群では抗体の脳局在が確認された。腹腔内投与された抗体は、確かに脳にも分布していることがわかった。投与後24時間後の急性期評価では、負荷後24時間後に脳を摘出し、パラフィン切片を作製し、免疫組織学的に海馬の歯状回のactive-caspase-3陽性細胞数を評価した。抗体投与群では、コントロール群に比べ42%陽性細胞が減少し、アポトーシス抑制効果があることがわかった。今年度は、受傷後の急性期評価をより詳細に行った。また、受傷24時間後にタンパクを抽出し、ウエスタンブロット法でStat-3、Akt、MapKのリン酸化に関して調べた。受傷24時間後に脳を摘出し、5μmのパラフィン切片を250μm毎に作製した。抗Actuive-caspase-3抗体を用い免疫組織染色を行い、Caspase-3陽性細胞(アポトーシス細胞)を評価した。陽性細胞は海馬に限局していたため、海馬全体のCaspase-3陽性細胞をカウントした。Caspase-3陽性細胞数は、PBS投与群で563±103個/海馬に対し、抗Aレセプター抗体投与群では、315±45個/海馬であり、抗Aレセプター抗体を投与することにより陽性細胞を44%減少させた(p<0.05)。現在、酸化ストレスマーカーである4HNEの陽性細胞数を同様な方法で評価している。ウエスタンブロット法による評価では、Stat-3、Akt、MapK、またそれぞれのリン酸化されたタンパク(p-Stat-3、p-Akt、p-MapK)を評価した。PBSを投与した群と抗Aレセプター抗体群でそれぞれのバンドを比較したが、両群間で差を認めず、抗Aレセプター抗体投与はこれらのシグナル伝達には影響しないことが示された。

周産期低酸素性虚血性脳症に対する新規治療法の開発は急務である。本研究では、炎症性サイトカインであるAのレセプター抗体が、周産期脳障害の改善に対しても有効であるかを検討した。周産期脳障害モデルマウスに抗Aレセプター抗体を投与すると、有意にアポトーシスを抑制し、梗塞体積を減少させた。また、抗体は、脳内に移行し、サイトカインAの血中濃度は抗体投与により有意に上昇することがわかった。効果の確認等順調である。新生児学効果の機序の確認、行動評価等を予定している。本研究では、予備実験の際に、モデルの確立、および簡易的な評価による効果の確認をすでに行っていたが、研究施行施設の変更により低酸素負荷をかける装置が違うものとなったため、再度モデル作製の条件設定が必要であった。至適条件を決めることに当初の予定より時間がかかってしまい、研究計画の遅れにつながってしまった。26年度に予定していた免疫組織染色の一部を27年度にしたため、抗体等の購入に充てていた予算が残った。免疫組織学的手法、生化学的手法を用いて、以下の観点から抗体投与の効果の機序を解明する。行動実験による評価学習障害や運動障害の軽減効果を確認する。学習能力については、novel object recognitiontest、受動的回避反応、水迷路試験を施行する。運動能力については、CatWalk XT 9を用い歩行障害に関して詳細に評価する。その他、cylinder試験、回転棒試験、傾斜板試験(受傷後早期)による評価を行う。また、open field試験により基本行動解析を行う。抗体等の購入に使用する。モデルの確立に時間がかかり、モデルを使っての検討が遅れている。当初予定していた抗体の購入も次年度とした。当初の予定の通り、実験動物、抗体などの免疫関連試薬、細胞培養に使用する薬品などに用いる。
無機錯体を内包するナノ球体リポソームを用いるウイルスの高感度電気化学検出

高濃度(0.4M)のフェロシアン化カリウムを内包するイムノリポソームと電気化学検出を組合わせた、インフルエンザウイルスの新規高感度検出を創案した。先ず高濃度のリポソーム作成条件検討し、高濃度のフェロシアン化カリウムを一か月以上安定に内包することを認めた。続いて、このリポソームを用いてイムノリポソームを調製し、マイクロプレート上で牛血清アルブミンの検出操作を実施し、ブロッキング過程を省いても検出できることを見出した。インフルエンザウイルスについては、全検出操作時間20分以内で1x104PFU/mLの定量が可能であることを明らかにした。今後、本法の実用化が期待される。本手法は、高感度な検出装置の小型化および低コスト化に繋がるものである。開発には、最適な電気化学活性種の探索及び電気化学活性種のリポソームへの内包手法を確立する必要がある。本年度の成果は以下のとおりである。1.最適な電気化学活性種の探索:数種の金属錯体についてリポソームに内包させて内包濃度および内包率を調べた。リポソームの調製はエクストルーダを使用した。その結果、Fc(COONa)2(Fcはフェロセニルを示す)が0.2M濃度で1%程度内包できた。Ni(NH3)6Cl2は1M濃度でも内包できたが、還元電流で測定するので不適であった。Ru(NH3)6Cl3も0.4Mで1%程度内包できた。K4Fe(CN)6は内包濃度が低かったが、調製中に不溶物がみられたの次年度検討する。従って、良好な酸化還元を示すFc(COONa)2を使用することにした。2.リポソームの破壊方法:界面活性剤および有機溶媒による破壊を試みた。その結果、Fc(COONa)2の酸化還元波への影響がすくない100ppmTritonX-100が最適であった。3.フローインジェクション法による検量線:内包されたFc(COONa)2を定量するためTriotoX-100共存下で電気化学検出器を使用し、Fc(COONa)2の検量線の作成を試みた。それより1x10-7Mまで測定可能であった。4.2成分SAMの調製:測定のバックグランド信号を低減させるために電極のSAM欠陥の少ない2成分SAM調製を検討した。その結果、ジチチオジプロピオン酸およびヘキサンチオールの溶液比100:1程度で調製したSAMの欠陥が小さいことを見出した。本検出法は、ウイルスの迅速判定に役立つ、低コストな手法を開発することを目指す。今年度は以下の結果を得た。1.内包電気化学活性種の最適化:前年度は内包電気化学活性種としてフェロセンジカルボン酸2ナトリウム塩を使用したリポソームを用いて検討したが、溶解性が幾分低い欠点があった。そこで1.0 M濃度の内包が可能なフェリシアン化カリウムを用いてリポソームを調製し、内包安定性について調べた。0.20 - 0.40Mの濃度では、40日程度でも低い漏出であり、最も強い電気化学応答を示した。2.イムノリポソームの調製:これまでと同様な方法でBSA抗体を用いてイムノリポソームを調製した。幾つかの非イオン性界面活性剤によるリポソームの破壊条件を調べると200ppmTritonX-100が最適であった。漏出フェリシン化カリウムは、購入した電気化学検出(+0.50 V vs. Ag/AgCl)を用いるフローインジェクション法で定量した。3.マイクロプレート上でのBSAの検出:代表的なタンパクであるBSAタンパクをマイクロプレートにBSAを固定化した後、検体である、様々な濃度のBSAと一定量のイムノリポソームを添加し、抗原抗体反応した。PB溶液で洗浄後、TritonX-100を含むPB溶液でリポソームを破壊した。得られた検量線は0.01 - 1μg/mLの範囲で良好なシグモイド曲線を示した。抗原抗体反応15分間でも十分な応答が得られ、さらにマイクロプレートの調製でも簡略できる特性があることを見出した。この結果は、本手法が通常の迅速判定に使用できる可能性を示している。0.40Mの高濃度の電気化学活性種を安定に内包するイムノリポソームを調製することができた。さらに、このイムノリポソームを用い、マイクロプレード上短時間(15分間)の抗原抗体反応時間でBSAの検量線を作成することができた。高濃度の電気化学活性種を内包したイムノリポソームを利用し、30分程度で数千PFU程度(PFU:プラーク形成単位であり、ウイルスの粒子数に相当する)のウイルスの迅速検出法を開発することを目的とする。前年度までに明らかにしたリポソームの調製条件として、電気化学活性種の中でフィリシアン化カリウムが最も高い内包濃度と安定性を示す0.4M濃度を使用することにした。また、200ppm TritonX-100を使用するとリポソームが最も破壊できた。抗体を表面に固定したリポソーム(イムノリポソーム)を使用し、マイクロプレート上で抗原抗体反応するとBSAタンパクを0.01-1μg/mLの濃度範囲で定量できることを確認した。

最終年度では、これまで明らかにした条件で調製したイムノリポソームと抗原ペプチド(19mer)を固定したマイクロプレートを使用して実際にインフルエンザウイルス(H1N1)の電気化学検出を実施し、最終年度では以下の成果を得た。1.本法を用いると競合時間10分、全体の測定は15分で104PFU/mLの検出が可能である。これは現在の迅速測定(イムノクロマト法)に匹敵する。本法は、抗原ペプチドを固定したマイクロプレート上で抗原抗体反応し、上澄み液を電気化学検出器で測定する2段階である。特徴として、0.4Mの高濃度の電気化学活性種フェリシアン化カリウムを内包したイムノリポソームを使用し、感度増幅していることにある。このように高濃度の塩でもリポソームからの漏出は無視でき、一か月程度であれば安定に内包できる。高濃度(0.4M)のフェロシアン化カリウムを内包するイムノリポソームと電気化学検出を組合わせた、インフルエンザウイルスの新規高感度検出を創案した。先ず高濃度のリポソーム作成条件検討し、高濃度のフェロシアン化カリウムを一か月以上安定に内包することを認めた。続いて、このリポソームを用いてイムノリポソームを調製し、マイクロプレート上で牛血清アルブミンの検出操作を実施し、ブロッキング過程を省いても検出できることを見出した。インフルエンザウイルスについては、全検出操作時間20分以内で1x104PFU/mLの定量が可能であることを明らかにした。今後、本法の実用化が期待される。今年度の主たる目標は高濃度(0.1M以上)の電気化学活性種を内包したリポソームを調製することである。比較的順調に幾つかの候補となる金属錯体の探索し、漏出の少ないリポソームを調製できた。1.抗原抗体反応時間および測定操作全体のさらなる短時間化が可能か検討する。2.他のタンパクの検出へ応用する。3.得られた最適条件で最終目的であるインフルエンザウイルスについて検量線作成を試みる。工学1.イムノリポソームの調製:代表的なタンパクBSAの抗体を使用してイムノリポソームを調製する。この手法についてはすでに研究室で確立している手法を使用するので短時間に確立できる予定である。2.BSAタンパクの検量線:金電極上かマイクロプレート上で抗原抗体反応し、固定化されたイムノリポソームを破壊し、フーロインジェクション法で定量する。ここでは、最も問題となるバックグランドの信号低減を中心に検討する。物品費の納入金額が見込みと異なったため。物品費の納入金額の見込みが異なり、余ってしまったため。繰り越し分は、次年度の物品費として使用する。繰り越し分は、次年度の物品費として使用する予定である。
高度分子変換反応に有効な環境調和型新規不均一系ルテニウム触媒の創成

原子効率に優れ、有害廃棄物を排出せず、かつ経済的な有機合成プロセスを可能にする固体触媒の開発が望まれる。本研究では、芳香族炭素-水素結合の直接アリール化・直接アルキル化反応、炭素-炭素結合の切断と再配列を伴うアリル基移動反応、アルキンへのカルボン酸の位置および立体選択的付加反応、アルキンあるいはアルケン等のホモおよびクロスカップリング反応、アミノアルコール類の脱水素環化によるインドール合成反応に対して、優れた活性を示すセリアおよびジルコニア担持ルテニウム触媒を開発した。これらの触媒からのルテニウムの溶出はほとんど無く、活性の低下を伴うことなく再生利用可能であった。また、EXAFSやFTIR等の分光学的手段によってセリア表面上に歪んだ構造を有するRu=O種が形成され、反応系中で低原子価活性Ru種に変換されると推察された。原子効率に優れ、有害廃棄物を排出せず、かつ経済的な有機合成プロセスを可能にする環境対応型触媒の開発は重要である。特に不活性炭素一水素結合活性化を伴う分子変換反応は、最重要課題の一つであるが、これまでは均一系ルテニウム錯体触媒の使用が不可欠と考えられており、有効な固体酸化物触媒は見出されていなかった。そこで本研究では、不活性な炭素一水素結合や炭素一炭素結合の活性化を経る反応をはじめとする、多様な高度分子変換反応に有効な、環境調和型の不均一系ルテニウム触媒を開発する。本年度の検討の結果、クロロアレーンによる芳香族炭素一水素結合の直接アリール化反応に対して、優れた活性を示すセリアおよびジルコニア担持ルテニウム触媒を開発した。特にリン添加剤存在下、適切な条件で還元前処理を触媒に施すことによって飛躍的に触媒活性が向上した。本反応には、セリアあるいはジルコニア担持触媒が特異的に有効であり、MgO、siO_2、TiO_2、Al_2O_3担持触媒では全く反応は進行しなかった。固体触媒からのルテニウムの溶出はほとんど無く、触媒の熱時ろ過試験によって本反応は固体触媒表面上で進行していることが示された。また、活性の低下を伴うことなく、少なくとも3回触媒の再使用が可能であり、高い環境対応型触媒機能を示した。また、セリア担持ルテニウム触媒による、炭素一炭素結合の切断と再配列を伴うアリル基移動反応を初めて見出した。既に報告されている均一系触媒反応においては、ホスフィンや塩基等の大量の添加剤が必須であったが、本固体触媒の場合には添加剤は一切不要である点が特徴的である。やはりセリアあるいはジルコニア担持触媒が有効であり、MgO、SiO_2、TiO_2、Al_2O_3等を担体とした場合には本反応が全く進行しなかった。なお、触媒の再焼成によって、活性低下を伴うことなく再使用が可能であった。特に不活性炭素-水素結合活性化を伴う分子変換反応は、最重要課題の一つであるが、これまでは均一系ルテニウム錯体触媒の使用が不可欠と考えられており、有効な固体酸化物触媒は見出されていなかった。そこで本研究では、不活性な炭素-水素結合や炭素-炭素結合の活性化を経る反応をはじめとする、多様な高度分子変換反応に有効な、環境調和型の不均一系ルテニウム触媒を開発する。本年度の検討の結果、アルキンとアクリル酸誘導体のカップリング反応に対し、Ru/CeO_2およびRu/ZrO_2触媒が優れた活性を示すことを見出した。反応はギ酸ナトリウム共存下で効率的に進行し、内部および末端アルキンから対応する置換ジエン化合物が高収率で得られた。一方、カルボン酸のアルキンへの付加反応は、化学工業において重要な原料であるエノールエステルの最も原子効率の高い合成法の一つであるが、本反応に対してセリアおよびジルコニア担持ルテニウム触媒が均一系触媒に匹敵する高い活性を有することを見出した。本触媒系には多様なカルボン酸および末端アルキンが適用可能であり、anti-Markovnikov付加したE-異性体が収率よく得られた。担体としてはセリアあるいはジルコニアのみが有効であり、MgO、SiO_2、TiO_2、Al_2O_3等を担体とした場合には反応が全く進行しなかった。なお、本触媒は再焼成によって活性低下を伴うことなく再使用が可能であった。さらに、酸化セリウム担持Ru触媒が、2-(2-アミノフェニル)エタノールからのインドール合成反応に対して優れた活性を示すことを見出した。

本触媒は活性の低下を伴うことなく複数回再生利用可能であり、熱時ろ過試験の結果から本反応は固体触媒表面で進行することが示された。原子効率に優れ、有害廃棄物を排出せず、かつ経済的な有機合成プロセスを可能にする環境対応型触媒の開発は重要である。そこで本研究では、多様な高度分子変換反応に有効な、環境調和型の不均一系ルテニウム触媒を開発した。本年度の検討の結果、芳香族C-H結合の活性化を伴うアルキル化反応について、より多様な基質が適用可能な新しい触媒系を見出した。代表者らが以前に見出した酸化セリウム担持Ru触媒の場合、適用できるアルケンはアルコキシビニルシラン類に限られていたが、触媒をトリフェニルホスフィンおよびホルマリン処理することにより、スチレン等の多様なアルケンが適用可能であり、活性の低下を伴うことなく触媒の再生利用が可能であることを見出した。カルボン酸の末端アルキンへの直接付加反応によるエノールエステル類の合成反応に対して、種々のホスフィンで修飾した酸化セリウム担持Ru触媒を用いることで、反応の位置および立体選択性が自在に制御可能であることを見出した。例えば、酸化セリウム担持Ru触媒を1,4-(ジフェニルフォスフィノ)ブタンによる修飾処理を施した酸化セリウム担持Ru触媒を用いたところ、アンチ-マルコフニコフ付加したZ・異性体が選択的に得られた。一方、トリ-n-オクチルホスフィンで修飾した触媒を用いたところ、マルコフニコフ付加体が選択的に得られた。さらに、顕著な担体効果の原因を明らかにするため触媒表面のRu種の状態を解析した。酸化セリウム担持Ru触媒のmmESスペクトルには22110 eV付近に顕著なpre-edgeピークが認められ、FTIRスペクトルにはRu=Oに帰属されるピークが認められた。このピークは反応後に消失し、触媒を再焼成すると再び現れたことから、セリア表面上にRu=O種が形成され、反応系中で活性種に変換されて触媒として機能し、再度焼成するとRu=O種が再生すると推察される。
糖尿病足病変ハイリスク患者の自己管理の実態－靴・靴下への認識－

糖尿病はインスリン作用不足による慢性高血糖を主徴とし、様々な合併症を引き起こす。糖尿病足病変は、多くの糖尿病合併症と関連しており、患者の生活・セルフケア状況の様々な要因が複合して発症する。糖尿病足病変の足潰瘍は最終的に切断に至る確率が高いのみならず、再発・再切断率も高く、歩行機能が失われた患者のQOLは著しく低下するため、早急に対応しなければならない。本研究は、糖尿病足病変ハイリスク患者を対象に日常的な自己管理の実態と靴・靴下への認識を明らかにし、自己管理が困難な理由および医療者に求めることを見出し、個別性を配慮した患者教育へとつなげることを目的としている。
アルツハイマー病：食物由来のアミロイド-β蛋白抑制物質の併用療法と環境療法の探索

アルツハイマー病のモデルマウス(PSAPPマウス)に、食物由来フェノール化合物(Aβ蛋白産生系の抑制化合物と非Aβ蛋白産生系の亢進化合物)の併用投与を行った。併用投与が、行動学的障害(新規物体認識障害、探索行動における過活動、空間作業記憶障害、短期記憶障害)と脳アミロイド症の病態軽減に加算効果がある重要なデータが得られた。これらの効果は、アミロイド前駆体蛋白の段階的酵素切断への加算的な干渉に関連していた。さらに、病態改善には、併用投与による抗炎症効果、抗酸化効果、シナプス関連蛋白の改善効果も重要な役割を果たしていた。以上、併用投与が、アルツハイマー病の有望な治療法となる前臨床データを提示した。これまでに有効性を明らかにしてきた食物由来フェノール化合物のコンビネーション投与による認知機能障害の改善・軽減効果への相乗効果の研究を行った。即ち、1)Aβ蛋白産生系を抑制する化合物であるferulic acid(β-secretase modulator)そして2)非Aβ蛋白産生系を亢進する化合物octyl gallate(α-secretase modulator)を組み合わせた併用投与を行った。PSAPPマウスに、12ヵ月齢から3ヵ月間(15ヵ月齢まで)、胃ゾンデを用いて0.2 mL(総投与量)/mouse(20-30 mg/kg)を24時間毎に経口投与して、その効果を単独投与群そして対照群と比較検討した。また、wild-type littermateマウスにも同様の投与を行い比較検討した。その結果、これらの化合物を併用投与すると、病態モデルマウスであるPSAPPマウスで観察される過活動、物体認識障害、空間認知機能障害などの行動学的障害が単独投与群よりも有意に改善し、相乗効果が得られた。また、単独投与群でも対照投与群と比較してこれらの行動学的障害が有意に改善し、同様の投与を行ったwild-type littermateマウス群と有意差がないレベルに改善した。これら化合物の投与は、正常マウスの認知機能亢進には影響しなかった。即ち、アルツハイマー病の治療にさらに有効となり得る研究データを集積できた。アルツハイマー病の病態モデルマウス(PSAPPマウス)に、12ヵ月齢から3ヵ月間(15ヵ月齢まで)、胃ゾンデを用いて0.2 mL(総投与量)/mouse(20-30 mg/kg)を24時間毎に経口投与して、その効果を単独投与群そして対照群と比較検討した。その結果、これらの化合物を併用投与すると、PSAPPマウスで観察される新規物体認識障害、探索行動における過活動、空間作業記憶障害、短期記憶障害などの行動学的障害が単独投与群よりも有意に改善し、相乗効果が得られた。併用投与したマウスの改善効果は、同様の投与を行ったwild-type littermateマウス群と有意差がないレベルにまで改善した。また、単独投与群でも対照投与群と比較してこれらの行動学的障害が有意に改善した。何れの化合物の投与も、正常マウスの認知機能亢進には影響しなかった。さらに、両薬剤を併用投与したPSAPPマウスは、単独投与と比較して、脳実質のAβ沈着及び脳内Aβレベルも有意に減少させた。これらの効果は、両薬剤のアミロイド前駆体蛋白の段階的酵素切断への相乗的な干渉に関連していた。以上の結果は、ferulic acid及びoctyl gallateの併用投与が、アルツハイマー病の病態で最も重要視される行動学的障害及び脳アミロイド症の病態軽減に相乗効果があることを示している。平成26年度に実施した継続研究として、平成27年度はPSAPPマウスそしてwild-type littermateへの12ヵ月齢から3ヵ月間(15ヵ月齢まで)の胃ゾンデを用いた24時間毎の各群マウスへの経口投与を完了した各群マウスから摘出された脳を用いて、病理組織学的そして生化学的解析を実施した。両薬剤を併用投与したPSAPPマウスは、単独投与と比較して、脳実質のAβ沈着及び脳内Aβレベルも有意に減少させた。26-27年度に予定していた各投与群のマウスにおける行動学的解析、病理組織学的解析、生化学的解析が完了できた。継続的に得られたデータから、1)Aβ蛋白産生系を抑制する化合物であるferulic acid(β-secretase modulator)そして2)非Aβ蛋白産生系を亢進する化合物octyl gallate(α-secretase modulator)を組み合わせたセクレターゼ標的薬剤の併用投与が、アルツハイマー病の病態改善にさらに有効であることが示された。食物由来フェノール化合物:1)ferulic acid(Aβ蛋白産生系を抑制する化合物)、2)octyl gallate(非Aβ蛋白産生系を亢進する化合物)の併用投与を行った。

アルツハイマー病の脳アミロイド症のモデルマウス(PSAPPマウス)に、12ヵ月齢から3ヵ月間、0.2 mL(総投与量)/mouse(30 mg/kg)を24時間毎に経口投与して、その効果を単独投与群そして対照群(Wild-typeマウス群)と比較検討した。併用投与すると、PSAPPマウスで観察される新規物体認識障害、探索行動における過活動、空間作業記憶障害、短期記憶障害などの行動学的障害が単独投与群より有意に改善し、加算効果を示した。単独投与群でも対照投与群と比較して、行動学的障害が有意に改善した。両薬剤を併用投与したPSAPPマウスは、単独投与と比較して、脳実質のAβ沈着及び脳内Aβレベルが有意に減少した。これらの効果は、アミロイド前駆体蛋白の段階的酵素切断への加算的な干渉に関連していた。さらなる重要な有効性として、これらの薬剤の併用投与は一剤投与よりも、β-アミロイド斑周囲のgliosisを有意に抑制、pro-inflammatory cytokines(TNF-α・IL-1β)のmRNAレベルも有意に沈静化した。抗酸化酵素(SOD1・GPx1)のmRNAレベルを低下した。神経線維末端のシナプス関連蛋白であるsynaptophysinの免疫染色性が海馬のCA1領域、皮質のentorhinal cortex領域で有意に改善した。以上の結果は、併用投与が、行動学的障害及び脳アミロイド症の病態軽減に加算効果がある重要なデータが得られたことを示していることに加えて、これらの病態改善にプラスに影響した抗炎症効果、抗酸化効果、シナプス関連蛋白の改善の加算効果も重要な役割を果たしているものと考えられた。平成26-27年度に実施した継続研究として、平成28年度はPSAPPマウスそしてwild-type littermateへの12ヵ月齢から3ヵ月間(15ヵ月齢まで)の胃ゾンデを用いた24時間毎の各群マウスへの経口投与を完了した各群マウスから摘出された脳を用いて、抗炎症効果、抗酸化効果、神経末端のシナプス関連蛋白に関して、病理組織学的そして生化学的解析を実施した。両化合物を併用投与したPSAPPマウスは、単独投与と比較して、gliosis(astrogliosis・microgliosis)を有意に抑制、pro-inflammatory cytokines(TNF-α・IL-1β)のmRNAレベルも有意に沈静化した。抗酸化酵素(SOD1・GPx1)のmRNAレベルも低下した。神経線維末端のシナプスの変化を免疫組織化学的に解析し、シナプス関連蛋白であるsynaptophysinの免疫染色性(immunoreactivity)が海馬のCA1領域、皮質のentorhinal cortex領域で有意に改善した。即ち、抗炎症効果、抗酸化効果、神経末端のシナプス関連蛋白の改善に関しても加算効果があることが明らかになった。以上の得られたデータから、1)ferulic acid(Aβ蛋白産生系を抑制する化合物)2)octyl gallate(非Aβ蛋白
ヒト肝および腎フラビン含有酸素添加酵素の薬物相互作用を考慮した医薬品体内動態予測

フラビン含有酸素添加酵素(FMO)は化学物質、食品由来成分および医薬品などの窒素および硫黄原子の酸化反応を触媒する。ヒトFMOの分子種は成人肝に多く発現するFMO3と胎児肝または成人腎に発現するFMO1が存在する。近年、FMO3が代謝消失にかかわる医薬品が報告および上市されている。これら分子種の発現には年齢差、臓器差さらに動物種差が存在する。ヒト肝FMO3に関する薬物代謝消失や薬物相互作用の情報は増えつつあるが、FMOが医薬品の全身における消失に影響するか否かの情報は十分ではない。そこで本研究では、ヒトおよび動物の生体内薬物酸化におけるFMO1およびFMO3の寄与を検討するため、サルの腎FMO1含量の定量およびFMO基質であるベンジダミンN-酸化酵素活性測定を行った。その結果、サルの腎FMO1含量および酵素活性に性差は認められなかった。サル腎のFMO3タンパク質含量は検出限界以下であった。ヒト腎にはFMO3がほとんど発現していないことから、サルはヒトのモデルとして有用であると推察された。ヒトのFMO3には遺伝子多型が存在し、それらの変異をホモで有するヒトは表現型としてトリメチルアミン尿症を呈する場合がある。体臭を訴えるボランティアから新規FMO3遺伝子変異5種および新規ハプロタイプ2種を見出した。大腸菌発現系を用いてこれらの変異タンパクの機能低下を明らかにした。一方、実験動物のFMO3遺伝子多型に関する情報は少ない。そこで、サルのFMO3遺伝子配列を検索し、18種の遺伝子変異を見出した。これらの変異の頻度はサルの産地によって一部、差があった。サル変異FMO3のベンジダミンN-酸化酵素活性を測定した結果、一部は野生型に比較して低値を示した。これらの結果は動物およびヒトにおけるFMO基質の体内動態および薬物相互作用の予測を行ううえで、基盤となる情報になると推察された。フラビン含有酸素添加酵素(FMO)は化学物質、食品由来成分および幅広い医薬品のN-およびS-酸化反応を触媒する。近年、成人ヒト肝に発現するFMO3が代謝消失にかかわる医薬品が報告あるいは上市されている。ヒト胎児肝に発現するFMO1が成人腎にも発現するように、これら分子種の発現には年齢差、臓器差さらに動物種差が存在する。ヒト肝FMO3に関する薬物代謝消失や薬物相互作用の情報は増えつつあるが、FMO1が医薬品の全身における消失に影響するか否かの情報は十分ではない。そこで本研究では、ヒトおよび動物の生体内薬物酸化におけるFMO1とFMO3の寄与を検討するため、ヒト肝移植および非移植マウスにベンジダミンを経口投与し、基質と2つの酸化的代謝物の血中濃度を測定し、in vivoプローブとしてのベンジダミンの有用性を評価した。マウスおよびヒトの肝および腎ミクロゾームによるベンジダミンの酸化的代謝物を測定した。動物データを元に簡素な生理学的薬物動態(PBPK)モデル手法でベンジダミンのヒト血中濃度推移の予測を試みた。ヒト肝移植マウスでの本薬血中動態特性から、簡素PBPKモデル手法によりヒト仮想経口投与血中濃度推移を得るには、移植したヒト肝以外のマウスとヒトの代謝消失の種差を考慮する必要があった。マウス腎の高FMO活性に依存しうる乖離を定量的に解決する一法として、ヒト肝細胞移植前のマウス由来肝細胞を不活化したTK-NOGマウスでのベンジダミン動態実測値を得て、ヒト肝移植マウスからヒトへ本薬血中動態予測を補正する方法が考えられた。In vivoでの薬物相互作用の検討を行う条件整備のためにヒト肝移植マウスにおけるFMO基質の血中濃度推移、および簡素PBPKモデル手法による薬物動態パラメータが得られた。さらにin vitroのデータと合わせ、FMO1とFMO3の統合的な検討を行うための準備が整ったと考えられる。そこで本研究では、ヒトおよび動物の生体内薬物酸化におけるFMO3の寄与を検討するため、ヒト肝移植および非移植マウスにトリメチルアミンd9体を経口投与し、基質とトリメチルアミンN-酸化体の血中濃度を測定し、簡素な生理学的薬物動態(PBPK)モデル手法でトリメチルアミンのヒト血中濃度推移の予測を試みた。さらに、ラット血中トリメチルアミン動態から簡易PBPKモデル手法よりヒト血中濃度推移の予測も試みた。比較すると、ラットはトリメチルアミンの代謝が低く、ヒトとの乖離があった。ヒト肝移植マウスにおけるトリメチルアミンd9体のN-酸化体血中動態特性から、コントロールマウスに比較してヒト肝移植マウスは高いN-酸化体生成が認められた。近年、生体内のトリメチルアミンN-酸化体が動脈硬化症の進展に関係するとした報告があることから、これらのPBPKモデルは日常化におけるトリメチルアミン摂取と血中トリメチルアミンN-酸化体濃度との関係を予測するのに有用であると推察された。ラット血中トリメチルアミン動態から簡易PBPKモデル手法を用いてヒト血中濃度推移の予測を行った。

さらにin vivoでの薬物相互作用の検討を行う条件整備のためにヒト肝移植マウスにおけるFMO3基質の血中濃度推移、および簡易PBPKモデル手法による薬物動態パラメータが得られた。さらにin vitroのデータと合わせ、FMO1とFMO3の統合的な検討を行うための準備が整ったと考えられる。フラビン含有酸素添加酵素(FMO)は化学物質、食品由来成分および医薬品などの窒素および硫黄原子の酸化反応を触媒する。ヒトFMOの分子種は成人肝に多く発現するFMO3と胎児肝または成人腎に発現するFMO1が存在する。近年、FMO3が代謝消失にかかわる医薬品が報告および上市されている。これら分子種の発現には年齢差、臓器差さらに動物種差が存在する。ヒト肝FMO3に関する薬物代謝消失や薬物相互作用の情報は増えつつあるが、FMOが医薬品の全身における消失に影響するか否かの情報は十分ではない。そこで本研究では、ヒトおよび動物の生体内薬物酸化におけるFMO1およびFMO3の寄与を検討するため、サルの腎FMO1含量の定量およびFMO基質であるベンジダミンN-酸化酵素活性測定を行った。その結果、サルの腎FMO1含量および酵素活性に性差は認められなかった。サル腎のFMO3タンパク質含量は検出限界以下であった。ヒト腎にはFMO3がほとんど発現していないことから、サルはヒトのモデルとして有用であると推察された。ヒトのFMO3には遺伝子多型が存在し、それらの変異をホモで有するヒトは表現型としてトリメチルアミン尿症を呈する場合がある。体臭を訴えるボランティアから新規FMO3遺伝子変異5種および新規ハプロタイプ2種を見出した。大腸菌発現系を用いてこれらの変異タンパクの機能低下を明らかにした。一方、実験動物のFMO3遺伝子多型に関する情報は少ない。そこで、サルのFMO3遺伝子配列を検索し、18種の遺伝子変異を見出した。これらの変異の頻度はサルの産地によって一部、差があった。サル変異FMO3のベンジダミンN-酸化酵素活性を測定した結果、一部は野生型に比較して低値を示した。これらの結果は動物およびヒトにおけるFMO基質の体内動態および薬物相互作用の予測を行ううえで、基盤となる情報になると推察された。ヒトFMOの基質として化学物質、食品由来成分および幅広い医薬品が知られている。ヒトFMO1およびFMO3分子種の発現には年齢差、臓器差さらに動物種差が存在する。さらに、ヒトおよび動物の生体内薬物酸化におけるFMO1とFMO3の寄与ならびにヒトFMO1およびFMO3の薬物相互作用の検討をin vivoで行うためにヒト肝移植マウスにFMO基質であるベンジダミンおよびメチマゾール、スリンダクスルフィド、トリメチルアミンなどのFMO3基質を投与し血中濃度推移を測定することを試みる。これらのデータから、FMO基質のヒト血中濃度シミュレーションが可能か、検討を行う。これらの基質整備ののち、FMO1およびFMO3の相互作用について、in vitro系を用いて検討を行う。
ゴンドワナ分布裸子植物Dacrydium(マキ科)における系統進化学的研究

マキ科Dacrydium属の範疇と系統関係を解析するために、広義のDacrydium属15種をマキ科の全ての属(16属)、マキ科に最も近縁であると見なされているPyllocladaceae,並びにこれらの外群としてAraucariaceae,Cupressaceae,Taxodiaceaeと共に分子系統解析を行った。解析に用いたのは葉緑体DNA上のmatK遺伝子とrbcL遺伝子の合計約2600bpである。その結果以下のことが明らかになった。3.上記1以外のDacrydium属構成種は狭義のDacrydium属として認識される。このうちニューカレドニア固有の全4固有種は単系統であり、種間の塩基置換がほとんど認められなかった。これは共通祖先由来の急速な適応放散を示唆しており、AraucariaやAgathis,Nothofagusなどのほかのニューカレドニア固有種にも共通して認められる現象である。
中国近代外交史の基礎的研究―19世紀後半期における出使日記の精査を中心として―

中国外交における歴史研究と現状研究がなお断絶している現状は、主として歴史学方面における研究の薄さに由来しており、その打開のためには、とりわけ19世紀から20世紀初頭の中国近代外交史の研究蓄積を増大させる必要がある。そこで本研究は、出使日記の網羅的な収集と検討を行って、とりわけ研究の手薄な清末の在外公館を中心に、中国近代外交史研究の足がかりを形成することを目標とした。2005年から3年間にわたって、国内外での研究会に参加し、著書・論文を個別に発表するとともに、出使日記の集積と解析をすすめた。その成果が別に提出する研究成果報告書であり、以下その内容を簡単に述べる。第1章「清末の在外公館と出使日記」は、出使日記と総称する史料群のありようを清末外政機構の歴史に位置づけ、第2章「清末出使日記解題」は、その出使日記の内容・体裁を解説する。第3章「清末出使日記リスト」は、出使日記および関連の文献を網羅的に収載したものであり、第4章「清末公使館員表」は、出使日記を生み出した母胎である在外公館の構成をみわたせる一覧である。以上によって中国近代外交史、とりわけ外政機構を研究するさいの足がかりを提供できたと考える。しかし出使日記という史料のありようが予想以上に複雑多端なこともあって、当初に目標としていた訳注刊行やデータベースの完成はかなわなかった。今後その完遂をめざして、さらに研究をすすめていきたい。本年度はまず、1870年代末より各国の在外公館に赴任した中国外交官が残した、執務日誌・日記体報告書である出使日記と総称する史料の調査に意を注いだ。現存する出使日記の、異本もふくめた網羅的な収集をめざし、同時に、在外使節と出使日記の対応関係のリストアップ、関連史料の調査収集、それぞれの分析をも並行して行った。国内および台湾・アメリカでの調査を経て、駐英公使の郭嵩〓や曾紀澤、駐米公使の張蔭桓など、いくつかのものについて具体的な校合・解析・入力の作業をすすめつつ、清末時期の出使日記にかかわる全体的な見通しを得ることができた。その成果の一端は、「清末の在外公館と出使日記」と題して、国際政治学会(2005年度研究大会)で報告を行った。ただし全体としては、なお作業の途上にあって、データベースの構築も着手したばかりである。その一方で、研究代表者が従来からとりくんできた外交史プロパーの研究との接続をはかった。各種研究会に参加し、また川島真と共同で組織する中国近代外交史研究会を開催して、本研究の活動を公開しつつ、ひろく明清史・近代史・外交史研究と関連づける活動を行った。書評・論文などで外交史に関わる問題をあっかったほか、日清戦争後の清韓関係を中心に国際政治を考察した、「独立と自主のあいだ」と題する研究成果を東方学会(第55回会員総会シンポジウム)で報告し、また19世紀後半期の中国・日本で領事と公使をつとめたオルコックを考察する「イギリス帝国と東アジア」を洛北史学会定例大会で報告し、比較史的な検討もすすめた。本年度は昨年度にひきつづき、1870年代末より各国の在外公館に赴任した中国外交官が残した、執務日誌・日記体報告書である出使日記と総称する史料の調査に意を注いだ。欧米の常駐公使の日記を調査・蒐集した昨年度の成果をふまえ、本年度はさらに範囲をひろげて、公使の日記のみならず、そのほかの文書・書簡、あるいは随行員などが残した日記・記録にも対象を拡大し、国内および中国での調査を経て、リストアップ作業をすすめた。