hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
哺乳・離乳様式がウサギの咀嚼器官の発達に及ぼす影響の実験的研究

哺乳様式による哺乳機能の違いを調べるため,仔ウサギを出産直後から母ウサギと分離し,通常の乳房哺育を行なう乳房哺育群(N群)とゴム乳首の哺乳瓶で哺育する哺乳瓶哺育群(B群)の2群に分けて飼育した.哺乳時の両群の哺乳時の顎筋(咬筋,顎二腹筋),舌筋(茎突舌筋、オトガイ舌筋),および舌骨筋(胸骨舌骨筋,オトガイ舌骨筋)の筋電図を採取し,筋活動のパターンを調べた.また,両群の哺乳時の様相をX線テレビを用いて撮影し,舌と顎骨の運動径路を解析した.次に,哺乳様式が咀嚼および嚥下機能の発達に及ぼす影響を検証するため,両群に固形飼料を与え,飼料を摂取時の筋電図と運動パターンを調べた.1.哺乳様式による咀嚼筋活動および運動機能の違い1)筋活動:cycle lengthはB群がN群より長かった.舌筋の筋活動の積分値はB群がN群より大きかった.また,B群ではN群より顎二腹筋と咬筋,茎突舌筋とオトガイ舌筋の活動の相反性が低かった.咀嚼筋の筋活動の積分値は咬筋ではN群がB群より大きかったが,顎二腹筋では逆にN群がB群より小さかった.2)運動パターン:顎骨の上下方向の移動量はN群がB群より大きかった.舌の前後方向の移動量はB群がN群より大きかった.2.哺乳様式による咀嚼機能の違い1)筋活動:B群ではN群に比べて顎二腹筋と咬筋,茎突舌筋とオトガイ舌筋の活動の相反性が低かった.咬筋と顎二腹筋の筋活動の積分値はN群がB群より大きかった.2)運動パターン:固形飼料摂取時の捕食相の時間はN群がB群より短く,顎運動の回数も少なかった.咀嚼相の時間はN群がB群より長く,顎運動の回数も多かった.以上より、哺乳様式によって哺育筋活動や顎運動パターンが異り,哺乳瓶で哺育すると咀嚼機能の発達が遅れることが示唆された.哺乳様式による哺乳機能の違いを調べるため,仔ウサギを出産直後から母ウサギと分離し,通常の乳房哺育を行なう乳房哺育群(N群)とゴム乳首の哺乳瓶で哺育する哺乳瓶哺育群(B群)の2群に分けて飼育した.哺乳時の両群の哺乳時の顎筋(咬筋,顎二腹筋),舌筋(茎突舌筋、オトガイ舌筋),および舌骨筋(胸骨舌骨筋,オトガイ舌骨筋)の筋電図を採取し,筋活動のパターンを調べた.また,両群の哺乳時の様相をX線テレビを用いて撮影し,舌と顎骨の運動径路を解析した.次に,哺乳様式が咀嚼および嚥下機能の発達に及ぼす影響を検証するため,両群に固形飼料を与え,飼料を摂取時の筋電図と運動パターンを調べた.1.哺乳様式による咀嚼筋活動および運動機能の違い1)筋活動:cycle lengthはB群がN群より長かった.舌筋の筋活動の積分値はB群がN群より大きかった.また,B群ではN群より顎二腹筋と咬筋,茎突舌筋とオトガイ舌筋の活動の相反性が低かった.咀嚼筋の筋活動の積分値は咬筋ではN群がB群より大きかったが,顎二腹筋では逆にN群がB群より小さかった.2)運動パターン:顎骨の上下方向の移動量はN群がB群より大きかった.舌の前後方向の移動量はB群がN群より大きかった.2.哺乳様式による咀嚼機能の違い1)筋活動:B群ではN群に比べて顎二腹筋と咬筋,茎突舌筋とオトガイ舌筋の活動の相反性が低かった.咬筋と顎二腹筋の筋活動の積分値はN群がB群より大きかった.2)運動パターン:固形飼料摂取時の捕食相の時間はN群がB群より短く,顎運動の回数も少なかった.咀嚼相の時間はN群がB群より長く,顎運動の回数も多かった.以上より、哺乳様式によって哺育筋活動や顎運動パターンが異り,哺乳瓶で哺育すると咀嚼機能の発達が遅れることが示唆された.1.ウサギの飼育手技の確立妊娠ウサギにオキシトシンを静注して人工分娩させることにより,仔ウサギを出生直後から母ウサギと分離することができた.また,母乳を搾乳してゴム乳首の哺乳瓶で人工哺乳する方法を確立することができた.2.哺乳様式による哺乳機能の違いの検討哺乳様式による哺乳機能の違いを調べるため,通常の乳房哺育を行なう乳房哺育群(B群)とゴム乳首の哺乳瓶で哺育する哺乳瓶哺育群(N群)の2群に分けて飼育した.両群の哺乳時の咀嚼筋(咬筋,顎二腹筋),舌筋(茎突舌筋,オトガイ舌筋),および舌骨筋(胸骨舌骨筋、オトガイ舌骨筋)の筋電図を採取し,筋活動のパターンを調べた.また,両群の哺乳時の様相をX線テレビを用いて撮影し,舌,舌骨,および顎骨の運動径路を調べた.1)筋活動:哺乳サイクルの長さはB群がN群より長い傾向があった.

咀嚼筋の活動量は咬筋ではB群がN群より大きい傾向があったが,顎二腹筋ではN群がB群より大きい傾向があった.舌筋の活動量はN群がB群より大きい傾向があったが,舌骨筋では現時点では差が認められていない.2)運動パターン:顎骨の上下方向への移動量がB群でN群より大きい傾向があった.舌の移動量はN群がB群より大きい傾向があった.舌骨はマーカーの固定が困難であったため現時点では運動パターンの解析はできていない.現時点までに全てのデータ採取まで行えた対象の数が少ないため,今後さらに対象数を増やして両群の差の検討をしていく予定である.また,両群の離乳開始後の咀嚼機能の違いも検討する必要がある.哺乳様式による哺乳機能の違いを調べるため,仔ウサギを出生直後から母ウサギと分離し,通常の乳房哺育を行なう乳房哺育群(N群)とゴム乳首の哺乳瓶で哺育する哺乳瓶哺育群(B群)の2群に分けて飼育した.哺乳時の両群の哺乳時の咀嚼筋(咬筋,顎二腹筋),舌筋(茎突舌筋,オトガイ舌筋),および舌骨筋(胸骨舌骨筋,オトガイ舌骨筋)の筋電図を採取し,舌と顎骨の運動径路を解析した.次に,哺乳様式が咀嚼および嚥下機能の発達に及ぼす影響を検証するため,両群に固形飼料を与え,飼料を摂取時の筋電図と運動パターンを調べた.1.哺乳様式による哺乳機能の違い1)筋活動:cycle lengthはB群がN群より長かった.咀嚼筋の筋活動の積分値は咬筋ではN群がB群より大きかったが,顎二腹筋では逆にN群がB群より小さかった.舌筋の筋活動の積分値はB群がN群より大きかった.また,B群ではN群より顎二腹筋と咬筋,茎突舌筋とオトガイ舌筋の活動の相反性が低かった.2)運動パターン:顎骨の上下方向の移動量はN群がB群より大きかった.舌の前後方向の移動量はB群がN群より大きかった.舌の前後への移動量はB群はN群より大きかった.2.哺乳様式による咀嚼機能の違い1)筋活動:cycle lengthはB群がN群より長かった.咬筋の筋活動の積分値はN群がB群より大きかった.B群ではN群に比べて顎二腹筋と咬筋,茎突舌筋オトガイ舌筋の活動の相反性が低かった.2)運動パターン:固形飼料摂取時の捕食相の時間はN群がB群より短く,顎運動の回数も少なかった.咀嚼相の時間はN群がB群より長く,顎運動の回数も多かった.以上より,哺乳様式によって哺育筋活動や顎運動パターンが異り,哺乳瓶で哺育すると咀嚼機能の発達が遅れることが示唆された.
炎症性腸疾患において腸管マクロファージが腸管粘膜の損傷を修復するメカニズムの解明

腸管粘膜中の腸管マクロファージと腸管上皮細胞がどのようにコミュニケーションをして、炎症によって傷害を受けた腸管粘膜を修復するのかを解明するために今年度は以下の研究を行った。渡航前に行った研究において、CD206陽性な常在性の腸管マクロファージを除去したマウスでは、大腸炎発症後の回復反応が遅延する知見を得ている。このことは、炎症によって傷害された腸管粘膜の修復に常在性の腸管マクロファージが寄与することを示唆している。2019年1月に海外渡航し、ミシガン大学のAsma Nusrat教授のラボで研究を開始した。Nusratラボでは、炎症収束因子として知られているChemerinやResolvinの受容体であるCMKLR1やFPRなどのGタンパク質共役型受容体(GPCR)が、炎症によって傷害された腸管粘膜の修復を制御する機構を明らかにする研究を開始した。CMKLR1受容体を欠損したマウスでは、大腸内視鏡生検によって傷害された腸管粘膜の修復が野生型マウスと比べて有意に抑制された。さらに、大腸上皮幹細胞から大腸上皮オルガノイドを作製し、上皮傷害の修復を評価したところ、CMKLR1欠損マウス由来大腸上皮オルガノイドでは野生型と比較して損傷修復が有意に遅延することを見出した。以上の結果は、CMKLR1が傷害された腸管粘膜の修復反応に積極的に関与することを示唆している。腸管粘膜修復におけるCMKLR1の役割を研究することは、炎症性腸疾患などの慢性炎症疾患で認められる修復機構の異常が起こるメカニズムの解明に繋がると考える。渡航前に実施したCD206陽性マクロファージを特異的に除去可能なマウスを用いた研究から、腸管粘膜に存在する常在性の腸管マクロファージが、腸管粘膜の修復に関与することを示す結果を得ることが出来た。また、予定通り2018年度内にNusratラボで研究を開始することが出来た。Nusratラボで行った研究から、GPCRであるCMKLR1が、傷害された腸管粘膜の修復への寄与を示唆する知見を得た。大腸上皮オルガノイドを用いた研究から、上皮細胞に発現するCMKLR1が、損傷修復に重要であることが考えられる。さらに、今後の研究の糧となる技術や研究人脈を幅広く得ることを心がけ行なっている。以上のことから、当初の計画通りおおむね順調に進展していると考える。CMKLR1欠損マウスにおいて認められた腸管粘膜の修復遅延についてメカニズムを解明する。具体的には、腸管上皮細胞の増殖および遊走の制御にCMKLR1が関与しているのかを明らかにする。また、修復過程におけるCMKLR1の発現および局在と上皮細胞の分化とが相関するかについて解析する。CMKLR1はマクロファージにも発現していることが知られており、常在性の腸管マクロファージが腸管粘膜修復に関与することから、炎症により傷害された腸管粘膜の損傷修復における、腸管マクロファージのCMKLR1の役割の解明を行う。また、腸管粘膜修復の制御機構における腸管上皮細胞ならびに腸管マクロファージに発現するFPRの役割についても研究を行う予定である。内定年度:2017腸管粘膜中の腸管マクロファージと腸管上皮細胞がどのようにコミュニケーションをして、炎症によって傷害を受けた腸管粘膜を修復するのかを解明するために今年度は以下の研究を行った。

さらに、今後の研究の糧となる技術や研究人脈を幅広く得ることを心がけ行なっている。以上のことから、当初の計画通りおおむね順調に進展していると考える。CMKLR1欠損マウスにおいて認められた腸管粘膜の修復遅延についてメカニズムを解明する。具体的には、腸管上皮細胞の増殖および遊走の制御にCMKLR1が関与しているのかを明らかにする。また、修復過程におけるCMKLR1の発現および局在と上皮細胞の分化とが相関するかについて解析する。CMKLR1はマクロファージにも発現していることが知られており、常在性の腸管マクロファージが腸管粘膜修復に関与することから、炎症により傷害された腸管粘膜の損傷修復における、腸管マクロファージのCMKLR1の役割の解明を行う。また、腸管粘膜修復の制御機構における腸管上皮細胞ならびに腸管マクロファージに発現するFPRの役割についても研究を行う予定である。
第一原理波動関数理論に基づく強相関電子系の近・遠距離相関の統一的記述

本研究計画は、固体の電子状態を精度よく記述するための新しい理論体系の開発と適用をおこなったものである。そこでは波動関数理論という枠組みを用いることで、従来の理論では記述の難しかった電子相関効果(電子間の避けあいの平均的記述から外れた効果)をうまく表現することを目指した。得られた研究成果として、本研究で用いた理論手法は、従来手法では精度の良い記述が困難である遷移金属酸化物の電子状態を精度よく再現できることが明らかになった。またそれを今後より広い対象に適用していくための課題も具体的な形で明らかにすることができた。第一年度の成果として、まず平面波基底によってTC法の一電子自己無撞着方程式を解く手法を確立し、それを計算コードに実装した。従来は、密度汎関数理論において求めた一電子軌道を基底として用いていたが、本研究計画における適用対象である強相関電子系においては、密度汎関数理論の一電子軌道とTC法のそれとの隔離が大きくなるために、そのような基底関数の扱いは効率的ではない。そこで固体計算において非常に汎用性の高い平面波基底を用いるような改良を行ったものである。TC法では非エルミートの対角化問題を解く必要があるため、Block Davidson法に基づいたアルゴリズムの開発を行った。またその平面波基底を用いて計算が効率化されたことを受け、擬ポテンシャルがTC法のバンド構造にもたらす誤差の解析を行った。ここで擬ポテンシャルは固体の内殻電子を近似的に取り扱う手法である。その結果、価電子の深い準位(例えば固体シリコンの3sバンド)の位置は内殻電子の露な取り扱いにより改善されることがわかった。一方でエネルギー準位の高いバンド構造は大きな変化を受けないことがわかった。これらはTC法に限らず、他の高精度波動関数理論においても重要な知見となるものである。さらに現在、このように改良されたコードを強相関電子系に適用している。適用対象は当初研究計画の通りいくつかの遷移金属酸化物であり、計算は順調に進んでいる。大きな計算を行うための並列化法の改善も準備として行った。当初の予定通り、遷移金属化合物にTC法を適用することが出来ている。またそのために必要な手法開発も合わせて行うことが出来て、他の波動関数理論にとっても重要な知見を得ることが出来た。強相関電子系への適用において、計算時間が当初想定していたよりは長く掛かっているため計算はまだ中途段階であるが、精度改善はラフな計算から既に確かめられており、総合的にみておおむね順調に進展しているといえる。第二年度の成果として、本研究計画で用いているトランスコリレイティッド(TC)法を、d電子系のひとつであるZnOに適用した。ここで、ZnOのバンド構造を正確に再現するためには、遍歴性の強い電子状態と局在性の強い電子状態との両方をequal footingで正しく記述する必要があり、それは従来の第一原理計算では難しいことが知られている。我々の研究によって、双直交形式に拡張されたTC法を用いれば、ZnOのバンド構造がより正しい精度で再現されることが明らかになった。ここで、長距離的な相関効果(電子間斥力の遮蔽効果)はジャストロウ因子の長距離部分によってある程度取り込まれているものの、近距離相関の取り扱いにはまだ課題が残っており、dバンドの位置をより正確に求めるには、(ハートリーフォック法によるバンド構造との比較から)ジャストロウ因子により多くの自由度が必要となるであろうことも明らかになった。ただし、現時点で用いているシンプルなジャストロウ因子でも、たとえば電子密度を見たときにその局在性が強まっていることから、有効的な二体相互作用を弱める働きがある(別の言い方をすれば、電子間斥力による多体波動関数の変形効果がジャストロウ因子を通してある程度表現できている)ことも同時にわかった。これらの成果は、多体波動関数によって固体の電子状態を記述する上で、重要な知見となるものである。この成果はPhys. Rev. Lett.誌にて発表された。また、スピン分極を持つd電子金属にも順次適用を進めており、適用対象は当初の研究計画通り、着実に広がっている。当初の予定通り、遷移金属化合物にTC法を適用することが出来ており、かつその成果を論文にまとめて発表することが出来た。またジャストロウ因子の長距離部分と短距離部分が、相関電子系の電子状態の記述においてそれぞれどのような役割を果たしているか、という研究計画の中心にあたる事柄に関して重要な知見を得ることができた。強相関金属への適用は中途段階にあるものの、総合的にみておおむね順調に進展しているといえる。本研究計画では、第一原理波動関数理論であるトランスコリレイティッド法の開発およびd電子系への適用をおこなった。ここで、波動関数理論とは、通常よく用いられる密度汎関数理論で考える一体問題への非自明な射影は利用せずに、多体問題あるいは多体自由度をあらわに取り扱う理論体系である。波動関数理論は系統的な精度向上の道筋が明確であることから、強い電子相関効果を記述する際に有望であるとされる。本研究計画で明らかになったこととして、特にトランスコリレイティッド法の遷移金属酸化物ZnOへの適用結果はpromisingなものであり、他の理論手法で記述の難しいバンド構造をよく再現することができた。また期待通り、クーロン斥力の短距離領域での発散が和らぐことから、電子密度が変調を受けていることを確かめた。この成果はPhysical ReviewLetters誌に発表された。また他のd電子系への適用も試みた。

その際に、第一原理量子モンテカルロ法によるジャストロウ因子(相関因子)最適化も試みたが、どのような環境で最適化を行うか次第で結果が左右されることがわかった。固体の電子状態の記述に適しているジャストロウ因子を得るために、どのような環境下でその最適化を行うのがよいかは今後の重要な問題である。d電子金属への適用も試みた。金属系の記述が可能であることは申請者のpreliminaryな計算で確かめてある。今のところは、十分に計算条件を厳しくした上でのバンド構造を得るには至っていない。このように、本研究計画を通して、研究に用いた理論手法の有用性を確かめた上で、今後の課題を具体的な形で見出すことができた。本研究計画は、固体の電子状態を精度よく記述するための新しい理論体系の開発と適用をおこなったものである。そこでは波動関数理論という枠組みを用いることで、従来の理論では記述の難しかった電子相関効果(電子間の避けあいの平均的記述から外れた効果)をうまく表現することを目指した。得られた研究成果として、本研究で用いた理論手法は、従来手法では精度の良い記述が困難である遷移金属酸化物の電子状態を精度よく再現できることが明らかになった。またそれを今後より広い対象に適用していくための課題も具体的な形で明らかにすることができた。次年度以降も強相関電子系への適用を進め、そこで得られたバンド構造の精度を分析することで計算手法の改善を試みていく。またそのために必要な手法開発もあわせて行う予定である。次年度以降も引き続き強相関電子系への適用を進める。またそこで得られた結果を分析することで、計算手法の改善および開発を進めていく。また必要に応じて、異なるジャストロウ因子を試してみることで、ジャストロウ因子が電子状態の記述に果たす役割をより明確に理解することも試みる。第一原理電子状態計算学会および研究会における研究発表の機会が当初想定よりも少なかったため。学会および研究会における研究発表の機会が当初想定よりも少なかったため。学会および研究会における研究発表のための旅費として用いる予定である。本研究計画によって得られた成果を、学会および研究会において発表するための旅費として用いる予定である。
新規cGMP経路によるNF-κBシグナル調節機構の解明

近年、自然免疫系が、病原体成分だけでなく自己成分により影響を受け、慢性炎症疾患や、ガン転移、生活習慣病などとも深い関わりがあることが明らかとなってきた。したがって、それらの疾患の理解と、それを標的とした創薬を考える際には、自己成分による自然免疫系調節機構の理解が不可欠である。NF-κB経路は自然免疫を制御する中心的なシグナル伝達系である。研究代表者は、ショウジョウバエ個体と培養細胞、並びにヒト・マウス培養細胞の系において、NF-κB経路を調節する新規cGMP経路を明らかにしている。そこで本研究では、ショウジョウバエとヒト・マウス培養細胞の系のそれぞれの利点を利用して、新規cGMP経路によるNF-κBシグナルの調節機構を明らかにすることを目的とした。加えて、ショウジョウバエにおいてcGMP経路がどのような局面で活性化され、自然免疫系を調節するのかを明らかにすることを目的とした。本年度は、ショウジョウバエにおいてcGMP経路がどのような局面で活性化され、自然免疫系を調節するのかを検討した。その結果、グラム陽性菌の感染により活性化するプロテアーゼが活性化するとcGMP経路が活性化されることが明らかとなった。この知見は、cGMP経路が、プロテアーゼの活性化により生ずる自己成分により活性化することを明確に示すと共に、cGMP経路がグラム陽性菌の感染抵抗性の発現に重要であるというこれまでの結果を支持するものであった。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。そこで本研究では、ショウジョウバエとヒト・マウス培養細胞の系のそれぞれの利点を利用して、新規cGMP経路によるNF-κBシグナルの調節機構を明らかにする。加えて、ショウジョウバエにおいてcGMP経路がどのような局面で活性化され、自然免疫系を調節するのかを明らかにする。これにより、自己成分によりどのように自然免疫系が調節されているのか、その分子機構の理解が進むことが期待できる。そのために今年度は、哺乳動物の系での先行研究で、NF-κBシグナルが活性化されると、そのシグナルを介在するIRAK1が自己リン酸化を含めてリン酸化されることが示されているため、新規cGMP経路によるNF-κBシグナルの増強におけるIRAK1の自己リン酸化の関与を検討した。そのために、自己リン酸化サイトに変異を持つIRAK1変異体を発現させ、新規cGMP経路によるNF-κBシグナルの増強が起こるかどうか調べた。その結果、IRAK1の自己リン酸化サイトのリン酸化は、新規cGMP経路によるNF-κBシグナルの増強に必要でないことが明らかとなった。自己リン酸化サイトに変異を持つIRAK1変異体を発現させ、新規cGMP経路によるNF-κBシグナルの増強が起こるかどうか調べたところ、IRAK1の自己リン酸化サイトのリン酸化が、新規cGMP経路によるNF-κBシグナルの増強に必要でないことが明らかとなったから。今年度は、新規cGMP経路に関わることが既に明らかとなっているプロテインホスファターゼ2A(PP2A)に着目して研究を進めた。まず哺乳動物の系(ヒト培養細胞)で、PP2Aの脱リン酸化活性を阻害するオカダ酸の影響を調べたところ、新規cGMP経路によるNF-κBシグナルの増強が阻害されることが分かった。この結果は、新規cGMP経路によるNF-κBシグナルの増強にPP2Aの脱リン酸化活性が必要であることを示唆している。そこで、ショウジョウバエの培養細胞系で同じくオカダ酸の影響を調べたところ、ショウジョウバエにおいても、新規cGMP経路によるNF-κBシグナルの増強にPP2Aの脱リン酸化活性が必要であることを示唆され、新規cGMP経路によるNF-κBシグナルの増強におけるPP2Aの役割が種を越えて保存されていることが示唆された。新規cGMP経路によるNF-κ

Bシグナルの増強におけるPP2Aの役割が種を越えて保存されていることが示唆されたから。近年、自然免疫系が、病原体成分だけでなく自己成分により影響を受け、慢性炎症疾患や、ガン転移、生活習慣病などとも深い関わりがあることが明らかとなってきた。したがって、それらの疾患の理解と、それを標的とした創薬を考える際には、自己成分による自然免疫系調節機構の理解が不可欠である。NF-κB経路は自然免疫を制御する中心的なシグナル伝達系である。研究代表者は、ショウジョウバエ個体と培養細胞、並びにヒト・マウス培養細胞の系において、NF-κB経路を調節する新規cGMP経路を明らかにしている。そこで本研究では、ショウジョウバエとヒト・マウス培養細胞の系のそれぞれの利点を利用して、新規cGMP経路によるNF-κBシグナルの調節機構を明らかにすることを目的とした。加えて、ショウジョウバエにおいてcGMP経路がどのような局面で活性化され、自然免疫系を調節するのかを明らかにすることを目的とした。本年度は、ショウジョウバエにおいてcGMP経路がどのような局面で活性化され、自然免疫系を調節するのかを検討した。その結果、グラム陽性菌の感染により活性化するプロテアーゼが活性化するとcGMP経路が活性化されることが明らかとなった。この知見は、cGMP経路が、プロテアーゼの活性化により生ずる自己成分により活性化することを明確に示すと共に、cGMP経路がグラム陽性菌の感染抵抗性の発現に重要であるというこれまでの結果を支持するものであった。当初の研修計画に従って研究を推進する。当初の研究計画に従って研究を推進する。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
シグナル経路選択的活性化のための光応答性分子の開発と応用

本研究では、シナプス可塑性に必須なシグナル経路を選択的に光応答性分子で動作させ、それによって活性化する分子と細胞機能を観察する単一経路時空間活性イメージング法を確立する。これまでのシグナル伝達研究は、グルタミン酸等のリガンドで細胞を刺激し、細胞内の分子動態や活性を見るというものであった。しかしながらこの方法では、様々なシグナル経路を活性化してしまうため、本質的に重要なシグナル経路の時空間分布は明らかにすることは困難であった。そこで本研究では新規光応答性分子と新規蛍光タンパク質を開発し、これらを用いて、シナプス可塑性に必要な経路のみを選択的に光活性化させ、各種分子の分子活性を蛍光寿命イメージング法により可視化する。シグナル伝達をシンプルに動作させ、その出力を可視化することが可能になるため、複雑なネットワーク内でのクロストークによってかき消されていた時空間情報が次々と明らかになると考えられる。現在までに光応答性キナーゼ分子の開発に成功しつつあり、神経細胞において光照射によりスパイン体積の増大を惹起することに成功している。しかしながら、生化学的なアッセイにより、我々が開発した光応答性キナーゼは内在性のものと比較して、光非存在下でのベース活性が3倍程度高く、細胞内のシグナル伝達系を乱してしまうことが分かってきた。そこで本研究では、paCaMKIIのキナーゼドメインのリンカーの長さや変異導入によるダイナミックレンジの最適化(ベース活性を抑える)を進め、いくつかの変異体を得ることに成功した。今後は、光応答性キナーゼをシナプス内で活性化させたときの下流分子の活性化の可視化を2光子蛍光寿命イメージング顕微鏡を用いて試みる予定である。
メチレンシラシクロブタンを用いる新しい有機合成反応の開拓

1.アリルトリメチルシランによるカルボニル化合物のアリル化反応では四塩化スズや四塩化チタンなどのルイス酸を必要とする。これに対してアリルシラシクロブタンを用いた場合にはケイ素自身のもつルイス酸性によりアルデヒド類と加熱するだけで目的とするアリル化が進行する。本研究においては4員環上にアリルシラン官能基を組み込んだ3-メチレンシラシクロブタンを合成した。さらにこのものを用いると無触媒でアルデヒドのアリル化が進行することを見いだした。生成した2-オキサシラシクロヘキサンはアリルシラン部分をもっている。したがってもう一分子のカルボニル化合物と反応させ、3-メチレン-1,5-ジオールを収率よく得ることができる。また3-メチレンシラシクロブタンに三フッ化ホウ素共存下4-ケトアルデヒドを反応させると3-メチレン-8-オキサビシクロ[3.2.1]オクタンを一挙に得ることができた。2. 3-メチレンシラシクメブタンにジブロモメチルリチウムあるいはジヨードメチルリチウムを作用させるとシラシクロブタンからシラシクロペンタン環への環拡大反応が進行することを見いだした。また3-メチレンシラシクロブタンをアルデヒドの共存下に触媒量のカリウム第三級ブトキシドで処理すると5-メチレン-2-オキサ-1-シラシクロヘキサンが収率よく得られることも明らかとなった。3.シラシクロブタンのシラシクロペンタンへの環拡大反応を二つ開発した。ひとつは、1-(1-ヨードアルキル)シラシクロブタンをカリウム第三級ブトキシドあるいは酢酸銀で処理する方法である。いまひとつは、エポキシ基をケイ素上にもつシラシクロブタンにリチウムイソプロポキシドを作用させる方法である。生成物はそれぞれ1,4-ジオールあるいは4-アルケン-1-オールに変換することができる。
ポリシロキサン超薄膜のナノトライボロジー

単分子膜の表面力学物性は、膜の安定性、撥水性、耐摩耗性などと密接に関連している。有機シラン化合物を水面上に展開後重合し、基板上にポリアルキルシロキサン超薄膜を固定した。表面力学特性を評価するため、水平力顕微鏡(LFM)測定を行った。ポリアルキルシロキサン単分子膜の水平力のアルキル鎖長およびフルオロアルキル鎖長依存性を評価した。アルキル鎖長の長鎖化に伴い水平力は増大することが明らかとなった。これは、アルキル鎖長の長鎖化により分子間の凝集力が増大し、それに伴い剪断強度が増大したことに起因すると考えられる。一方、フルオロアルキルシラン単分子膜の場合、フルオロアルキル鎖は螺旋構造を有するため、分子自体は非常に剛直であり、剪断強度は高く、高い水平力を示した。またバルキーで極性が高いフルオロメチル基の存在も水平力に寄与する因子の一つである。種々の温度で、オクタデシルトリクロロシラン(OTS)単分子膜の分子凝集状態を赤外吸収分光(IR)測定に基づき、また、分子運動特性を種々の温度でのLFM測定に基づき評価した。va(CH2)のピーク波数の温度依存性は、240Kおよび330Kを境に急激に変化した。IRの結果は、OTS単分子膜が240Kおよび330K付近で、それぞれ長方晶から六方晶へと、また、六方晶から非晶状態へ転移することに対応している。一方、水平力は温度の上昇に伴い、240Kおよび330K付近において著しく減少した。これらの温度域は、IR測定より得られた分子凝集状態が変化する温度域とよく一致した。長方晶の場合と比較して、六方晶の単位面積当たりの分子鎖数が少なく、分子運動性が活性化されたため、水平力が低下したと考えられる。さらに、非晶状態では、六方晶と比較してアルキル鎖の分子運動が著しく活性化されているため、カンチレバー探針-試料表面間の剪断強度が低下し、水平力は低い値となったと考えられる。1)単分子膜形成能を有する有機クロロシラン化合物の合成疎水性の長鎖フルオロアルキルあるいはアルキル基を有する有機トリクロロシラン化合物及びアルキル末端に化学修飾のために反応性の官能基を導入した単分子膜形成能を有する新規有機シラン化合物を水面上に展開し縮合重合することにより水面上にポリシロキサン単分子膜を調製した。水面上での単分子膜の凝集構造を外部反射赤外分光法で直接評価し、長鎖アルキル基を有する有機シラン化合物は水面上で単分子膜を形成し、結晶化することを見いだした。ビニル基を疎水基末端に有する有機シラン化合物を酸化することにより分子鎖末端にカルボキシル基を導入した。水酸基の導入をX線光電子分光(XPS)測定に基づき確認した。また単分子膜の凝集状態を電子線回折測定に基づき評価し、長鎖アルキル基の場合、アルキル基が結晶化することを見いだした。2)ポリシロキサン表面のナノトライボロジー種々のアルキルポリシロキサンおよびフルオロアルキルシロキサン単分子膜について分子レベルでの摩擦挙動を摩擦力顕微鏡(FFM)を用いて評価した。アルキル鎖長の増大とともに摩擦力の増加が観測された。

フルオロアルキルシラン単分子膜はまた同じ鎖長のアルキルシラン単分子膜に比べて高い摩擦力を示した。末端の二重結合の酸化は、空気中での摩擦力の著しい増大をもたらした。。種々の温度で、オクタデシルトリクロロシラン(OTS)単分子膜の分子凝集状態を赤外吸収分光(IR)測定に基づき、また、分子運動特性を種々の温度でのLFM測定に基づき評価した。υa(CH2)のピーク波数の温度依存性は、240Kおよび330Kを境に急激に変化した。IRの結果は、OTS単分子膜が240Kおよび330K付近で、それぞれ長方晶から六方晶へと、また、六方晶から非晶状態へ転移することに対応している。一方、水平力は温度の上昇に伴い、240Kおよび330K付近において著しく減少した。これらの温度域は、IR測定より得られた分子凝集状態が変化する温度域とよく一致した。長方晶の場合と比較して、六方晶の単位面積当たりの分子鎖数が少なく、分子運動性が活性化されたため、水平力が低下したと考えられる。さらに、非晶状態では、六方晶と比較してアルキル鎖の分子運動が著しく活性化されているため、カンチレバー短針-試料表面間の剪断強度が低下し、水平力は低い値となったと考えられる。
機能維持性を高める建物・複数機器の協調制御

制振装置を持つ機器が導入された建物の機能維持のため,制御手法と設計法を開発した。1建物・機器協調制御手法を構築し,データセンターを事例に数値解析と震動台実験で有効性を実証した。2機能停止確率を最小化する制御系設計法を定式化し,地震ハザード曲線と建物フラジリティ曲線を用いて少ない計算負荷で設計できることを確認した。3センサの信頼度パラメータとLQG制御理論に基づく故障補償制御法を構築し,数値解析と震動台実験で有効性を確認した。4過減衰モードを考慮できる拡張応答スペクトル法で絶対加速度応答と最大制御力の推定手法を構築した。5セミアクティブダンパーの減衰特性を考慮した最適制御系設計の理論を構築した。本研究は,建物の制振装置と建物内の機器の制振装置を協調的に動作させる効果的な手法の提案を目的としている。建物の制振装置は建物の応答抑制と同時に機器の損傷を防ぐ制御を行うことが可能であり,また,機器の制振装置も建物の制振装置の制御に関する情報を踏まえて制御することで制御性能を飛躍的に向上させることが期待できる。平成24年度では、建物内に制振装置を持つ複数の機器が導入されたときの機能維持のための合理的な制御方法について、基礎的な検討を行った。まず、制御パラメータの設計に関して、データセンターを事例に地震リスク評価を行い、被害発生確率が最も小さくなるようパラメータの値を選択する手法を構築した。LQR制御とスライディングモード制御に適用し、その有効性を検証した。また、制御機器の優先順位決定理論に関連し、過減衰モードを考慮できるよう応答スペクトル法を拡張し、絶対加速度応答と最大制御力を推定する手法を構築した。次に、協調制御の研究担当者と連携して、LQG制御を用いた複数の制振装置に対する協調制御手法の構築を行い、制御性能の比較検討を行い、制御機器の優先順位決定のための基礎的なデータを得た。また、完全分散制御のひとつの方法として建物の制振装置の制御に関する情報を外乱包含制御を用いて考慮する方法を提案し、制御性能について検証した。また、通信システムの研究担当者と連携して、センサネットワークが故障した場合のロバストな制御方法の構築を行った。そして、提案手法の有効性を震動台実験により検証を行い、改良のための実験データの収集を行った。2013年度では,建物内に制振装置を持つ複数の機器が導入されたときの機能維持のための合理的な制御方法に関して,構造系・制御系の設計法の理論の構築を行った。まず,地震ハザード曲線と建物フラジリティ曲線を用いて評価した地震時の機能停止確率(機能停止事象の発生確率)をもとに,制御系の設計を行う手法を定式化した。複数階の免震床上に設置されたコンピュータサーバーを有するデータセンターを事例に数値解析を行い,構築した設計法を用いることで機能停止確率が低い制御系のパラメータを少ない計算負荷で求めることができるのを確認した。次に,メタ制御理論に関して,協調制御の研究担当者と連携して,既往のゲインスケジューリングとは異なる,センサの信頼度パラメータとLQG制御理論に基づく新たな故障補償制御法の定式化を行った。そして,シミュレーション解析により提案手法の有効性を確認した。また,通信システムの研究担当者と連携して,センサネットワークが故障した場合の提案手法の有効性を震動台実験により確認するため,通信故障のモデルを実験に実装する方法について検討を行った。本研究は、建物と制振装置と建物内の機器の制振装置を協調的に動作させる効果的な手法の提案を目的としている。建物の制振装置は建物の応答抑制と同時に機器の損傷を防ぐ制御を行うことが可能であり、また、機器の制振装置も建物の制振装置の制御に関する情報を踏まえて制御することで制御性能を飛躍的に向上させることが期待できる。2014年度では、まず理論の実証に関して、次のような研究成果があった。(1) 2013年度に開発したセンサの信頼度パラメータに基づき連続的にオブザーバの観測行列を変動させた耐故障制御を実現する理論について、震動台実験による有効性の検証を行った。(2)複数の制振装置に対する協調制御手法の実証実験を震動台を用いて行い、その有効性を確認した。次に理論の構築に関するものとして、次のような研究成果があった。(3) 2013年度に開発した被害確率を最小化する設計手法をスライディングモード制御に応用する検討を行った。(4)高次モードで過減衰を生じる多自由度系の最大応答を予測する理論を構築した。(5)セミアクティブダンパの減衰特性を考慮した最適制御系設計の理論を構築した。そして、通信システムの研究に関するものとして、(6)災害に関するデータの扱いの標準化案を作成し、国際電気通信連合の部門の一つで通信分野の標準策定を担当する「電気通信標準化部門」ITU-Tのスマート・サステナブル・シティのフォーカスグループFG-SSCに提出した。

建物の制振装置は建物の応答抑制と同時に機器の損傷を防ぐ制御を行うことが可能であり,また,機器の制振装置も建物の制振装置の制御に関する情報を踏まえて制御することで,制御性能を飛躍的に向上させることが期待できる。2015年度では,建物内の設備機器の制御装置に関して,2014年度とは異なる制御装置に注目し,本研究プロジェクトで構築した協調制御理論を適用し,有効性の検証を行った。具体的には,15階建てデータセンター建物を想定し,建物の最上階に設置された建物応答を制御するアクティブマスダンパーと,建物内に存在する免震床上のコンピューターサーバーの応答を制御する免震床免震層内に設置されたセミアクティブダンパーの協調制御について,検討を行った。上記のように想定した建物・設備連成系の縮小試験体(層数3,固有周期の相似比1/3)を製作し,震動台実験を行った。入力波として絶対加速度を5倍に,継続時間を1/5倍にスケーリングしたTaft波とEl Centro波を用い加振実験を行い,非制御時や非協調制御時と協調制御時の比較を行った。その結果,協調制御において,建物(メインシステム)試験体と設備(サブシステム)試験体の絶対加速度を低減しつつ,サブシステム試験体の免震床層間変位を低減する効果があることを確認した。また,2014年度に基礎的検討を行ったスライディングモード制御を用いた制震建物について,被害確率を最小化する設計理論を完成し,セミアクティブ免震建物を対象として検証解析を行った。研究成果は査読付き論文にて発表済みである。制振装置を持つ機器が導入された建物の機能維持のため,制御手法と設計法を開発した。1建物・機器協調制御手法を構築し,データセンターを事例に数値解析と震動台実験で有効性を実証した。2機能停止確率を最小化する制御系設計法を定式化し,地震ハザード曲線と建物フラジリティ曲線を用いて少ない計算負荷で設計できることを確認した。3センサの信頼度パラメータとLQG制御理論に基づく故障補償制御法を構築し,数値解析と震動台実験で有効性を確認した。4過減衰モードを考慮できる拡張応答スペクトル法で絶対加速度応答と最大制御力の推定手法を構築した。5セミアクティブダンパーの減衰特性を考慮した最適制御系設計の理論を構築した。通信の遮断や遅延があった場合の協調制御のロバスト性に関する実証実験が遅れているが、高次モードに過減衰がある多自由度系の最大応答の推定理論や被害確率を最小化する制御系設計法のスライディングモード制御への応用などで計画以上の研究の進捗が見られた。全体としては、おおむね順調に進展していると考えられる。27年度が最終年度であるため、記入しない。地震工学研究計画どおり、実験・解析の両面の研究を研究協力者と連携して実施する。地震リスク評価に基づく制御パラメータ設計法、過減衰モードの考慮が可能な応答スペクトル法を用いた最大応答値・最大制御力予測手法や、完全分散制御のひとつの方法として建物の制振装置の制御に関する情報を外乱包含制御を用いて考慮する方法を新たに構築した。また、震動台を用いた実証実験に向けて、試験体の製作や予備的な制御実験の実施を行った。通信障害時の協調制御に関する震動台実験の実施については遅れているが、構造系・制御系の設計法の理論構築については計画以上の研究の進捗が見られ、全体としては順調に進展していると考えられる。
腎疾患特異的マクロファージの同定と機能解析および制御法の確立

本研究は慢性腎疾患の組織病変の進展にマクロファージ(MQ)が関与すること、特に尿細管間質の線維化や糸球体のメサンギウム基質の増生、糸球体硬化といった慢性病変の形成に慢性腎病変形成に関わる疾患特異的MQが存在することを明らかにし、その機能の解析ならびに制御法を確立することを目的としたものである。これまでにヒト腎生検組織を用いた検討から、炎症性、非炎症性を問わず、またステロイドや免疫抑制薬などによる治療下の有無に関わらず、慢性腎疾患の代表的な終末像にあたる尿細管間質の進展にCD163陽性のM2型活性化MQが普遍的に関わることを明らかにした。末梢血単球を用いて誘導した正常ヒトMQに、酸化LDL、ステロイドを添加し誘導したCD163陽性MQのサイトカイン発現を網羅的に解析し、慢性病変の進展機序として線維化促進因子(FGF1, FGF2など)を見出し、腎組織中での発現も確認した。最終年においては、各種慢性糸球体腎炎やネフローゼ症候群の治療、あるいは腎移植の際に用いられているいくつかの免疫抑制薬を用い、同様の培養系においてCD163陽性MQのサイトカインを含む各種分子の発現を網羅的に解析することにより、免疫抑制薬の作用機序およびCD163陽性MQの制御法の検討を行った。その結果、シクロスポリンやタクロリムスなどカルシニューリン阻害薬はCD163陽性MQ活性化に影響せず、一方ミゾリビンやミコフェノール酸モフェチルなどの代謝拮抗薬による活性化制御が可能であることを見出した。小児慢性糸球体腎炎の治療に汎用されるミゾリビンは、MQの生存に関わるCD300e分子の発現制御に関わる可能性を見出した。これらの結果はいずれも国内外の学会にて報告しており、引き続き論文化に努めている。研究目的は、全ての慢性腎疾患の進展過程における普遍的な現象であるマクロファージ(Mφ)浸潤と終末病変である尿細管間質の線維化に、疾患の種類や治療の有無を問わず、常にCD163陽性M2型活性化Mφが関与していることに着目し、腎疾患の進展に特異的に関与するMφ群(腎疾患特異的Mφ)を同定し、その機能解析および制御法を開発である。申請者は2016年4月に所属機関を異動したため、新所属機関における研究再開に向けて体制整備を行いほぼ完了した。また、研究の一環として行なうヒト腎疾患の生検標本の解析を行う上で、前所属機関である新潟大学との共同研究体制の整備と同機関の臨床検体を利用するための倫理委員会申請など行いほぼ準備が完了した。さらに、新所属機関である藤田保健衛生大学においては、腎疾患特異的Mφの腎組織集積機序を解明する目的で、ステロイド感受性および抵抗性ネフローゼ症候群患児の尿検体を用いたサイトカイン解析を行い、Mφ遊走因子であるMCP-1の尿中ステロイド抵抗群で有意に高いことを明らかにし、2016年米国腎臓学会にて報告した。また、腎疾患特異的Mφの有力な候補と考えているCD163陽性Mφがループス腎炎の慢性病変の形成に関与していることを見出し、同学会にて報告した。申請者の勤務地異動につき実験体制の準備に若干時間を要したため。ただし、異動については本研究課題申請時にはすでに認識しており、速やかに準備は完了している。マクロファージ(MQ)による慢性腎疾患の難治化機序解明のため、末梢血単球を用いて誘導した正常ヒトMQに難治性ネフローゼ症候群または慢性糸球体腎炎における糸球体環境(高酸化LDL、ステロイド治療下)と同様の薬物、サイトカイン刺激を行った際のMQによるサイトカイン発現を網羅的に解析した。発現量の多かったいくつかの線維化促進因子(FGF1, FGF2など)について、ヒト腎生検組織中または尿中での発現を解析し、腎疾患難治化機序の解明ならびに難治化を予測するバイオマーカーとしての応用を検討中である。現在、上記解析を遂行するための腎生検検体ならびに尿検体の収集を同時に遂行している。難治性腎疾患の定義を満たす症例と検体の収集に時間を要している。

その結果、シクロスポリンやタクロリムスなどカルシニューリン阻害薬はCD163陽性MQ活性化に影響せず、一方ミゾリビンやミコフェノール酸モフェチルなどの代謝拮抗薬による活性化制御が可能であることを見出した。小児慢性糸球体腎炎の治療に汎用されるミゾリビンは、MQの生存に関わるCD300e分子の発現制御に関わる可能性を見出した。これらの結果はいずれも国内外の学会にて報告しており、引き続き論文化に努めている。ヒト腎疾患患者検体(腎生検組織、尿、血清)を用いた解析をさらに進めるとともに、動物モデル、in vitro実験系の確立と解析を進めていく予定である。特にin vitroの実験系の確立に必要な資材はすでに準備が完了しており、また解析に必要な設備品が本学に揃っていることを確認済である。現在新潟大学ほ本学関連施設との共同による症例ならびにデータの蓄積のため倫理委員会への申請準備である。患者検体の収集とともにすでに抽出済の候補サイトカイン類の発現について尿中、血清中発現を解析する予定であり、そのために必要な解析キットはすでに入手済である。申請者(研究代表者)の異動に伴い、研究の再開にあたり準備に時間を要し、研究の遂行にあたり若干の遅れを生じたため。測定予定の検体収集に時間を要しているため、測定に必要なキット(消耗品)の購入のための使用額が少なかった。本年度は検体数が増加し、キットの使用数(購入数)が増える予定である。新所属機関における研究体制の整備がほぼ完了し、前年度に実施できなかった実験も本年度計画と併せて遂行する予定である。繰越し分の助成金の用途もすでに決定しており、今年度研究計画分と合わせて全て使用予定である。
時計遺伝子発現変動と糖尿病性血管障害との相互関係の解明

体内時計を制御する時計遺伝子発現を低下させると、血管内皮細胞の拡張機能や血管新生能は低下すると報告されているが、時計遺伝子発現と高血糖等のストレスに対する血管の抵抗性との関連は不明である。本研究では糖尿病性血管障害発生に時計遺伝子発現が関与するか明らかにする。まず2型糖尿病モデルTSODマウスが11週齢で糖尿病病態を呈することを示した。正常マウスと比較して、このマウスの活動量は著しく低下し、活動位相は前進傾向であった。さらにTSODマウスの大動脈における時計遺伝子Per2およびBmal1発現量は減少傾向であった。以上の結果、糖尿病発症後の血管では時計遺伝子発現が低下することが明らかとなった。本研究では糖尿病性血管障害の発生と体内時計の異常との相互関係の解明するために、動物個体で糖尿病発症とそれに伴う血管障害および時計遺伝子発現や行動パターンの異常を確認する必要がある。そこで本年度は2型糖尿病モデルマウスを用いて、当該分野で既に汎用されている糖尿病病態解析法および行動リズム解析法の確立を行った。当初はC57BL/6マウスへの高脂肪食負荷により2型糖尿病モデルの作製を予定していたが、高脂肪食のような人為的処置を施すよりも安定した病態を呈すると予想された自然発症型2型糖尿病モデルであるTSODマウスを利用した。対照であるTSNOマウスと比較した結果、5週齢から体重、精巣上体脂肪量、血漿トリグリセリド量、血漿コレステロール量が増加しており、若齢より高度に肥満を呈することが示された。糖尿病発症の有無を判定するために、HbA1cおよび随時血糖を測定したところ、HbA1cは5週齢から増加、随時血糖は6週齢以降徐々に増加し、13週齢で高度に増加した。さらに、5週齢から同一個体で経時的に糖負荷試験を行ったところ、耐糖能異常は11週齢で観察されたことから、TSODマウスはおよそ11週齢で明らかな糖尿病様フェノタイプを呈することが示された。マウスは約24時間周期の行動リズムをもち、明期にはほとんど活動しない。しかし、高脂肪食負荷マウスは明期に摂食する割合が増加し、摂食パターンの減り張りがなくなる。そこで、TSODマウスの行動リズムを解析するために、摂食パターンと相関する飲水パターンを3時間間隔で測定した。その結果、3および6ヶ月齢のTSODマウスの明期中飲水量の割合はTSNOマウスと同程度であったが、ZT 9-12 h、つまり暗期直前に飲水する割合は対照の約2.5倍となり、TSODマウスの行動パターンはTSNOマウスとは異なる可能性を初めて見出した。本研究では糖尿病性血管障害の発生と体内時計の異常との相互関係の解明するために、動物個体で糖尿病発症と血管における時計遺伝子発現、行動パターン異常について検証した。昨年度は、2型糖尿病モデルTSODマウスの糖尿病発症が11週齢であること、さらにTSODマウスは対照マウスと比較して行動パターンに違いがあることを明らかにした。今年度は臓器レベルの時計遺伝子発現および糖尿病マウス血漿の時計遺伝子発現に及ぼす影響解析を行なった。時計遺伝子は24時間周期で発現変動するため、明期開始時刻をzeitgeber time (ZT) 0とし、ZT2およびZT14の時点における時計遺伝子Per2およびBmal1発現量をreal-time PCRにて解析した。TSNOマウスにおける発現量と比較した結果、TSODマウスの肝臓におけるPer2発現量は増加し、Bmal1発現量は減少傾向であった。一方、大動脈ではPer2およびBmal1ともに減少傾向であり、肝臓と血管では傾向が異なることが明らかとなった。続いて、Per2-SLG(緑色ルシフェラーゼ)およびBmal1-SLR(赤色ルシフェラーゼ)を導入したマウス繊維芽細胞に糖尿病発症前後のTSODマウスの血漿を添加し、時計遺伝子発現に対する影響を解析した。その結果、TSNOマウスの血漿を添加しても、Per2及びBmal1の周期、位相、振幅、減衰率には影響はなく、糖尿病発症前の5週齢TSODマウス血漿でも同様の結果となった。しかし、興味深いことに、糖尿病フェノタイプを呈する11週齢TSODマウス血漿では、周期及び位相は変化しないものの、Per2の振幅低下、Bmal1の減衰促進が観察され、糖尿病マウスの血中成分が時計遺伝子発現を低下させることが示された。以上の結果、糖尿病モデルマウスの血管における時計遺伝子発現は低下し、糖尿病発症に関わる血中成分がその原因である可能性が示唆された。

薬理学本年度は糖尿病病態の解析に時間を要したが、使用した2型糖尿病モデルマウスの病態は、環境要因にも依存するため他施設で得られている実験手法を踏襲し、結果の再現性を得る必要があり、それらについては良好な結果が得られている。さらに、糖尿病発症に関わるフェノタイプが現れる週齢を把握することができ、糖尿病発症と血管障害の因果関係を説明する上で必要な知見を得ることができたため、概ね順調と考えている。高齢TSODマウスの腹部大動脈の時計遺伝子発現およびeNOS、ET-1発現をリアルタイムPCR法で解析し、時計遺伝子発現変化の有無と血管障害度合いを評価する。さらに、糖尿病病態と密接に関わる臓器(脂肪、肝臓、腎臓、膵臓)の血管を磁気ビーズで採取する方法を検討し、同様の方法で遺伝子発現解析を行う予定である。次年度、糖尿病モデルマウスの血管における時計遺伝子発現およびeNOS、ET-1発現をリアルタイムPCR法で解析し、時計遺伝子発現変化の有無と血管障害度合いの評価を実施する必要があるため。さらに、同様のマウスから臓器(脂肪、肝臓、腎臓、膵臓)の血管を磁気ビーズで採取する方法を確立し、得られた血管の遺伝子発現や培養方法の予備実験を行う。大型備品購入の予定はなく、実験動物、遺伝子発現解析試薬、細胞単析・解析試薬等の消耗品を中心に使用する事を予定している。尚、研究成果が纏まり次第、論文作成の為の英文校正費や学会発表時の旅費に充てる予定である。
ヒト心筋形成物質(因子)の同定-ヒト心筋の再生誘導-

ヒト由来間葉系幹細胞に着目し、培養方法の標準化を行った。培養方法については完全ヒト型培養法の確立を目指すとともに、分化誘導培養法の標準化も検討した。これらの培養で維持された細胞について、効率よく心筋細胞に分化させる因子を質量分析などにより網羅的に分析し、複数精製した。さらに、高い心筋分化効率を有する間葉系幹細胞株にのみ強発現している遺伝子を同定した。さまざまな臓器由来の間葉系幹細胞を単離し、限界稀釈法によりサブクローニング後、得られた各種間葉系幹細胞に細胞寿命の延長に関わる遺伝子を導入、高発現させ、それに伴う細胞の増殖能の増加、寿命の延長を検討した。培養上清中の物質を、心筋細胞への分化誘導能を指標に精製し、質量分析により同定した。UBET細胞より分泌される分子を同定し、P19CL6の心筋細胞分化誘導能を指標に、分子を絞り込んだ。UBET細胞と心筋細胞分化誘導能のない間葉系細胞のDNAchip解析またはサブストラクションを行い、心筋細胞分化誘導因子を特定した。ヒト間葉系細胞を、マウス胎児初代心筋培養細胞と共培養すると、自己拍動し心筋特有の活動電位を有する心筋細胞に分化する。再生心筋細胞の細胞源の一つとして骨髄は有名であるが、骨髄に比し本研究で重要な細胞ソースとして考えている子宮内膜・月経血は、若年者から得られ、大量の細胞が得られる点が利点で、心機能を改善できるだけの十分な細胞量を確保できる。また、臍帯血・胎盤は、あらゆるHLAをカバーできる細胞バンクを形成できる可能性がある。しかし心筋への分化誘導率の低い大量の細胞を保存することはコストパフォーマンス的に困難であり心筋誘導率の高い細胞を簡単に選定し濃縮する技術が必須となる。本研究は(1)様々な臓器由来のヒト間葉系幹細胞株から効率よく多量の分化心筋細胞を獲得する方法の確立、骨髄間葉系細胞を心筋細胞に分化誘導する分泌分子の単離精製と臨床応用を目指したin vivoでの効果の検討、(2)心臓幹細胞である心臓SP細胞の心筋細胞への分化誘導、(3)移植組織の血管新生の機序と促進因子の同定を目的とし、研究を遂行する。本研究は、心筋細胞分化および血管新生誘導因子という安全かつ効率のよい細胞移植治療確立のために欠くことのできない要素の集約的研究である。心筋形成因子としてBMPアンタゴニストであげられ、発生時の四肢形成にSonic hedgehogやBMP、FGFらと相互作用している事が報告されており(Nat Genet. 2003,34:303)、骨格筋の分化にも関与している事も報告されている。今回、我々はGene chipの解析を行う事で心筋分化にBMPアンタゴニストが関与している可能性を示唆する事ができた。そこでBMPアンタゴニストを用いた心筋分化誘導実験を胎児性癌細胞(mEC)細胞であるP19CL6を用いてその検討を行った。DMSOと一緒にBMPアンタゴニストを添加することでDMSO単独の添加よりも高い心筋分化誘導に成功した。BMPアンタゴニストが心筋形成(促進)因子であることを明らかにした。また、我々は生体内のさまざまな臓器由来の間葉系細胞株を確立し、細胞寿命の延長に関わる遺伝子を導入して細胞の増殖能の増加、寿命の延長を検討した。間葉系幹細胞を効率よく心筋細胞に分化させる因子を質量分析し、複製精製した。さらに、高い心筋分化効率を有する間葉系細胞株にのみ強発現している遺伝子をMicroArray法により同定し、間葉系幹細胞から心筋細胞に分化しやすい細胞を選択する方法を確立した。前年度に引き続き下記の検討を継続し、データの蓄積に努めている。(1).ヒト間葉系幹細胞の培養・心筋への分化誘導法の確立に関する研究完全ヒト型培養法の確立をめざすとともに、未分化状態での維持法ならびに分化誘導培養法の標準化に向けて、データを蓄積している。(2)バイオインフォマティクスを用いた心筋分化因子の探索心不全・心筋梗塞の新しい治療法として再生治療が注日されている。現在、骨格筋芽細胞、骨髄細胞、内皮前駆細胞による細胞移植が臨床試験中であるが、臨床的に十分な数の心筋細胞と血管の両者を再生する方法は確立されていない、細胞移植治療の際の移植細胞のうち、ES細胞〓