hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
野生チンパンジーの遊びの多様性と環境

当初の予定では、タンザニア・マハレ山塊国立公園での野外調査で新たに得られたデータを元に分析をおこなう計画であったが、大学業務の都合により野外調査は実施せず、これまでの調査で得られたデータを用いながら、野生チンパンジーと飼育チンパンジーの比較や、ヒトの乳幼児との比較研究を進めた。平成29年度には2本の論文を執筆した。1本は、自然体験を重視する「森のようちえん」の保育活動について、その現状・課題と展望についてまとめた論文である。自然環境の様々な要素とかかわる遊びを通した学びや育ちにはヒトとチンパンジーで共通点があるが、ヒトの保育においては、子どもの経験や育ちを深めたり広げたりする大人の関わりが重要であることを指摘し、現状の「森のようちえん」の課題をいくつか示した。また、森のようちえんの保育には、国内の保育・幼児教育の問い直しにもつながり得る内容が含まれていることを指摘し、今後の展望について論じた。もう1本は、野生チンパンジーと比較しながら、ショーやテレビに出演する飼育チンパンジーの感情表出について動物福祉の観点から分析した論文である。とくに遊びにおける笑いの表出と、不安や不満を示す表情の表出に注目し、チンパンジーを動物ショーやテレビに使用することがもたらす問題点について論じた。また、飼育動物の福祉について考える際に、ストレスを示す行動指標や生理指標だけでなく、遊びや笑いにも注目することが有効であることを示した。遊びに注目してチンパンジーとヒトの比較をおこなった。環境に関心を持って主体的に働きかけることで多様な遊びと学びが見られる点は両種に共通していたが、協同遊びや遊びの支援などはヒトにのみ見られた。また、年下の遊び相手への配慮や、相手を笑わせる働きかけなど、遊びにおける利他性・共感性にも共通点があった。以上を踏まえ、遊びを通した学びや発達を保育者はどう援助すべきかを考察した。また、チンパンジーの遊び研究で得られた知見を踏まえて、自然体験を重視する「森のようちえん」の保育の課題と展望をまとめた。さらに、ショーやテレビに出演する飼育チンパンジーの遊びと笑いについて動物福祉の観点から分析した。大学業務の都合により、タンザニアでの野外調査を実施するのは困難な状況があるが、これまでに収集したデータの分析を進めることにより、本研究課題の2つの目的を達成するべく研究をおこなっていく。希少な遊びの事例の分析など、必要な場合には、マハレのチンパンジーを対象に調査をおこなっている他の研究者によるデータ提供の協力も仰ぎながら、研究を進めていく予定である。大学業務の都合により、タンザニアでの野外調査をおこなうことは困難な状況であるが、これまでに収集したデータの分析を進めることにより、本研究課題の2つの目的を達成するべく研究をおこなっていく。希少な遊びの事例の分析など、必要な場合には、マハレのチンパンジーを対象に調査をおこなっている他の研究者によるテータ提供も仰ぎながら、研究を進めていく予定である。また、得られた知見を保育実践にも役立つものとするため、保育に関する研究についても幅広く文献を集めて考察を深めていく。霊長類学、保育学
光照射によるナノ領域の光物性制御の理論解析と高密度光メモリへの応用

光ディスク内の光と熱の伝わりを同時にシミュレーションするシステムを開発した。そしてシミュレーションによって、超解像効果(光を細く絞ったときの限界値より小さい記録マークを読める現象)の仕組みを明らかにし、この超解像効果に最適な条件(入射光強度、ディスク回転速度、機能層膜厚など)を見つけた。また、超解像効果の元となる材料(InSbなど)が光照射で溶ける時の変化を計算によって調べ、材料の性質が半導体的から金属的に変化することが分かった。(1)大規模計算のための準備:光伝播ー熱伝導の連成物理シミュレーション等における大規模モデル計算を行うために本予算でワークステーション(16core, 512GBメモリ)を購入し、シミュレーションソフトウェアのインストール・設定等の準備を行った。(2)高温・熔融状態の光学誘電率の第一原理計算:第一原理計算ソフトウェアVASPを用いて、結晶状態InSbの電子状態(状態密度とエネルギーバンド図)と光学誘電率の計算を行った。通常良く用いられているGGA近似を用いた場合にはInSbのバンドギャップが再現されず、ハイブリッド関数であるHSE06やmeta-GGAのMBJを用いるとバンドギャップがほぼ実験と合うことが分かった。また、これらの近似を用いて計算した光学誘電率は実験データとよく合うことがわかった。溶融状態InSbの電子状態及び光学誘電率を求めるため、分子動力学(MD)による高温状態の再現の計算を行った。(3)光伝播ー熱伝導の連成シミュレーション:前年度開発したシミュレーション・評価技術を用い、InSbを機能層とした場合の超解像現象の再現シミュレーションを行い、超解像に最適なInSb膜厚が20nm弱であるという結果を得た。これは対応する実験とほぼ合っている。また、微小ピット構造を考慮した再生シグナルのシミュレーションを行い、超解像状態の応答関数を求めたところ、2重ピークを有する特異な形状を持つことが示された。この応答関数をフーリエ変換した空間周波数スペクトルは、超解像なしの場合より高い周波数成分を持ち、より微小な構造を識別する能力を持つことを確認した。1.高温・熔融状態の光学誘電率の第一原理計算:第一原理計算ソフトウェアVASPを用いて、第一原理分子動力学計算(ab-initio MD)を行い、溶融状態InSbをシミュレーションした。結晶状態InSbをスタートとして、1500K-6ps→900K-6ps(状態A)→900K-12ps(状態B)のシーケンスで、2つの溶融状態InSbの構造モデルを作成した。この二つのモデル構造をもとに、電子状態および光学誘電率の計算を行った。溶融状態InSbの光学誘電率の計算結果は、連携研究者によって測定されたデータと良く合うことが確認できた。また、溶融状態InSbの光学誘電率は結晶InSbと大きく異なることが分かった。InSbの電子状態は溶融により半導体から金属へ変化し、これが光学誘電率の変化を引き起こすことが計算からも確認された。波長405nmにおける光学誘電率変化がInSbと逆の傾向を示すSbTe系物質として、Sb2Te3の第一原理計算を始めた。まず結晶Sb2Te3の電子状態計算を行った。結晶構造がInSbより複雑であるためブリルアンゾーンも複雑となり、現在バンド構造の解析を行っている。2.光伝播ー熱伝導の連成シミュレーション:前年度に引き続きInSbを機能層とする超解像現象の再現シミュレーションを行い、入射光パワーやフォーカス条件を変えた超解像状態の応答関数を求めた。その結果、比較的低パワーの条件において、応答関数のダブルピークがより顕著に表れることが分かった。また、連携研究者がInSbを機能層とするROMディスクを作成し、再生シグナル波形の測定を行った。シミュレーションにより求めた応答関数から予測シグナルを計算し、測定波形データと比較した結果、比較的高い入射光パワーの条件の応答関数(ダブルピークがあまり顕著でない場合)で測定データが良く説明できることが分かった。(1)高温・溶融状態の光学誘電率の第一原理計算独自開発してきた光学応答計算コードを金属材料に適用した場合の予備計算を行った。Ni表面系に関する計算結果は、対応する実験結果(STM発光スペクトル)と良く一致し、開発した計算プログラムで光学応答の起源を解析できることを確認した。また、第一原理計算ソフトウェアであるVASPを導入し、チュートリアルにもとづく多数の予備計算を行い、VASPにおける計算パラメーター等の設定に関する習熟を図った。(2)光伝播-熱伝導の連成物理シミュレーション光ディスク内の電磁波伝播と熱伝導の連成シミュレーションを行ったところ、超解像現象(機能層のより少し下の光強度分布が回折限界より細くなる)を計算によって再現することに成功した。このシミュレーション結果は、実験データとの比較により妥当であることを確認した。超解像再生の最適条件を見つけるため、機能層材料を変えたシミュレーションを行った。

熔融により光吸収が増大するInSbを機能層とした場合には、光遮蔽領域の横移動による漏れ光の効果が超解像の発現機構であることが分かった。また、熔融より光吸収が減少するSb2Te3を機能層とした場合には、光透過領域の横移動による実効窓幅の減少が超解像の発現に寄与していることが分かった。超解像現象を実際の光ディスクとして応用する場合、記録ピットからの反射光シグナルを評価する必要があり、「光ディスク内の電磁波伝播シミュレーション」と「集光レンズ系の波動光学計算」を組み合わせた新しい評価方法を開発した。<最終年度の研究実績>1.結晶Sb2Te3の電子状態および光学応答の第一原理計算を行った。Sb2Te3の特徴は、バンド間遷移による光学吸収が光子エネルギーhω=1-3eV付近で大きく、InSbより約1eV低エネルギー側にシフトしていることが分かった。この違いが、融解による光吸収変化の振る舞いに違いを生じさせると考えられる。Sb2Te3の液体状態に関しては、MD計算がほぼ終了した。2.Sb2Te3を機能層とする光伝播ー熱伝導の連成物理シミュレーションを詳細に行った。その結果、融解領域(光透過領域)のサイズが従来予想されていた値よりずっと大きいことが分かった。また、超解像のための微小光学窓として機能するためには、光ディスクの回転による熱移動によって融解領域がシフトすることが本質的に重要であることを明らかにした。<研究期間全体の研究実績>光伝播ー熱伝導の連成物理シミュレーションシステムの開発を行い、InSb及びSb2Te3を機能層とする超解像現象をシミュレーション上で再現することに成功した。融解によって光吸収が増大するInSbと光吸収が減少するSb2Te3のそれぞれの超解像発生メカニズムを明らかにし、様々なパラメーター(入射光パワー、機能層膜厚、ディスク回転速度等)に関して超解像の最適条件を見つけた。InSbに関しては、微小ピット構造のシミュレーションから超解像状態の応答関数を求め、超解像状態では特異なダブルピーク構造になることを明らかにした。機能層材料として重要なInSbとSb2Te3の融解による光学応答の変化の起源を調べるため、第一原理計算ソフトウェアVASPを用いて電子状態及び光学誘電率計算を行った。InSbの電子状態は融解によって半導体から金属へ変化し、これが光学誘電率変化を引き起こすことを確認した。また、InSbとSb2Te3の融解による光学誘電率変化の違いは、結晶状態のバンド間遷移の違いによると考えられる。光物性第一原理計算ソフトウェアVASPの使用方法の習熟と適切な計算パラメーターの設定を見つけるために非常に多くの時間を費やすことになった。また、溶融状態の計算では原子数の多い大規模なモデルを用いるため計算時間が大幅に増えた。これらのことにより、高温・熔融状態の光学誘電率の第一原理計算に関しては、当初の計画より遅れている。一方、光伝播ー熱伝導の連成物理シミュレーションに関しては、当初の計画より進んでいる。
広温度領域にわたる磁場中高周波インピーダンス精密測定法の開発

本研究では、強相関電子系や磁束ダイナミクスの研究にとって重要な情報である高周波インピーダンスを磁場中で高精度に測定するための手法として、ボロメータ法による表面抵抗測定装置の開発、および空洞共振器摂動法による表面インピーダンス測定装置の開発を行った。ボロメータ法の装置は、試料に対する電磁場の方向を指定するために試料を空洞内に設置し、また、測定周波数を変えるために複数の空洞が容易に交換可能な構造となっている。従来ボロメータ法はボロメータの感度の低下によって高温での測定は困難であったが、測定条件の最適化によって80K以上での測定が可能になった。また、これまでのボロメータ法の実験はすべて温度を一定に保ち、磁場を掃引することによって行われていたが、本研究では温度掃引測定に初めて成功した。これは超伝導体への応用を考える際に磁束ピン止めの影響を排除できる点で極めて重要である。この装置を利用し、高温超伝導体のジョセフソンプラズマ共鳴の観測を行った。空洞共振器摂動法の装置では、最高98GHzの共振周波数をもつ温度可変なTE_<011>円筒空洞を製作した。共振周波数と共振線幅の同時測定から表面インピーダンスの実部、虚部が温度、磁場の関数として測定可能になっている。結合度の調整を注意深く行うことにより、共振のQ値として10^4程度の高い値を達成できた。現在、零磁場での試験測定を行っているが、周波数の再現性として約10^<-6>、Q値の再現性として約10^<-3>が得られており、ボロメータ法では困難な磁場中での表面インピーダンスの絶対値測定に有効であると考えている。将来はボロメータ法とこの空洞的共振摂動法を相補的に利用し、様々な物質の磁場中での表面インピーダンス測定を行う予定である。本年度は以下の成果から得られた。1)ボロメトリックな手法を用いて磁場中で表面抵抗を測定する測定システムを、作成した。2)高温超伝導体微少単結晶を用いて、混合状態での表面抵抗の磁場依存性を測定した。より具体的には、(i)Bi-2212系単結晶で最近報告されたようなジョセフソンプラズマ共鳴吸収を定量的にも定性的にも確認した。(ii)Bi-2212系とブロック層のみが異なるTl-2212系でもマイクロ波吸収の磁場依存性の測定を行なったが、マイクロ波領域にジョセフソンプラズマ共鳴は観測されなかった。これは。この物質の異方性が非常に小さい為と考えられる。(iii)ブロック層は同一で、CuO2層の重なりが異なるBi-2201系についてマイクロ波吸収の磁場依存性の測定を行なったところ、ジョセフソンプラズマ共鳴が観測された。しかし、Bi-2212系のそれと比較した場合、共鳴磁場が1/100程度である、共鳴ピークが非対称である、共鳴磁場の温度依存性が非常に複雑であり、特に低温極限で共鳴磁場は増大する等の点で非常に異なっている。これらの差異の多くは、Bi-2201系の異方性が極めて強いために磁束渦糸が三次元的であることによると考えると定性的に理解できることを示した。平成8年度は、主にボロメータ用単結晶の育成とカーボン抵抗を用いたボロメータ法による表面抵抗測定システムの運用を行った。単結晶育成はBi_2Sr_2CaCu_2O_yを中心に、光加熱帯域溶融法で行った。成長させた結晶は様々な条件でアニールし、電気抵抗を磁場中で測定した。

抵抗の温度依存性が大きくボロメータとしての利用が可能な高温域では、抵抗は磁場、温度サイクルに対し可逆であり、再現性もある。しかし、半年間デシケータに保管したものを再度測定すると、若干の特性劣化が見られた。長期間の安定性の確保が実際の応用には重要であると考えられる。ボロメータ法による表面抵抗測定では、測定条件の最適化を行った。入射するマイクロ波のパワーと、ボロメータの励起電流を制御することによって、単一のカーボン抵抗ボロメータで1Kから80K程度までの広温度領域をカバーした測定が可能になった。また、これまでのボロメータ法の測定は、温度一定の条件で磁場を掃引して行われてきたが、本研究ではボロメータ法を初めて温度掃引実験に応用した。これは超伝導体への応用を考える場合、ピン止めの影響を排除出来る点で、極めて重要である。我々は、本研究で作製したシステムを用いて、高温超伝導体特有の素励起であり、磁束状態の新しいプローブとしても注目されているJosephsonプラズマ共鳴を、温度掃引によって検知することに初めて成功した。その他、空洞共振器摂動法のシステムも現在構築の最終段階にあり、近い内に最高100GHzの周波数域で表面インピーダンスの磁場中測定を行う予定である。今後、ボロメータ法と空洞共振器摂動法を相補的に利用して、さらに測定範囲を広げる努力をしたい。
シクロスポリンによるSTAT3シグナルを介した腸上皮細胞アポトーシス制御

DSS誘発大腸炎モデルにおけるシクロスポリンによる粘膜障害抑制効果は、腸管上皮細胞IL-22受容体の発現増強とSTAT3の活性化による粘膜障害抑制機序が関与していることが明らかとなった。腸上皮細胞株Caco2を用いた解析では、リコンビナントTGF-beta単独またはシクロスポリン単独刺激による腸上皮細胞IL-22受容体発現増強効果は認めず、両者の刺激よりIL-22受容体の発現増強は認めた。シクロスポリンによる腸上皮細胞のIL-22受容体発現増強及びSTAT3活性化を介した粘膜障害抑制効果は、TGF-betaからのシグナルと同時にシクロスポリンが加わることで誘導されることが示唆された。初年度の予定に従い、マウス(C57BL/6)DSS誘発腸炎モデルにおいてシクロスポリン投与による腸管局所のIL-22、分離した腸上皮のIL-22受容体・活性化STAT3発現についての解析を行った。次に抗IL-22抗体、STAT3阻害剤投与によるシクロスポリン治療効果の抑制の有無を検証も行った。コントロール群に比しシクロスポリン投与群でELISA法及び免疫染色による検討で腸管局所のIL-22の発現増加を認めた。IL-22受容体の発現は、免疫染色による解析では、腸上皮細胞に一致して認め、コントロール群に比しシクロスポリン投与群で発現増加を認めた。またEDTA環流により分離した腸上皮細胞のウェスタンブロット解析の結果でも同様の結果を認めた。IL-22の下流シグナルのSTAT3の発現についても、免疫染色と分離した腸上皮細胞のウェスタンブロット解析の結果、コントロール群に比しシクロスポリン投与群でリン酸化STAT3の発現増加を認めた。抗IL-22抗体、STAT3阻害剤投与による効果は、コントロール群に比しシクロスポリン投与群で、体重減少、病理組織学的腸炎スコア及び腸上皮細胞アポトーシスが有意に抑制されるが、抗IL-22抗体、STAT3阻害剤投与のいずれにおいても、シクロスポリンによる腸上皮細胞アポトーシスを介した粘膜障害抑制効果が相殺された。シクロスポリンによる粘膜障害抑制効果には、腸管局所のIL-22発現増強と腸管上皮細胞IL-22受容体の発現増強による粘膜障害抑制機序が関与している可能性が示唆された。追加解析で腸上皮細胞株Caco2を用いてシクロスポリンの処理による腸上皮細胞IL-22 receptor mRNAの発現について解析を行った。シクロスポリンの処理によってもIL-22 receptor mRNAの発現増強は認めなかった。このことから、シクロスポリンによる腸上皮細胞IL-22受容体発現増強効果は直接的な効果ではない可能性が考えられた。初年度の解析結果で、シクロスポリンによる粘膜障害抑制効果は、腸管上皮細胞IL-22受容体の発現増強とSTAT3の活性化による粘膜障害抑制機序が関与していることが明らかとなった。また、追加解析で腸上皮細胞株Caco2を用いてシクロスポリンの処理による腸上皮細胞IL-22 receptor mRNAの発現調節について解析を行った結果、シクロスポリンによる腸上皮細胞IL-22受容体発現増強効果は直接効果ではない可能性が考えられた。本年度はまず腸上皮細胞株Caco2を用いたシクロスポリンによる腸上皮細胞IL-22受容体発現調節の機序の解析を行った。その結果、シクロスポリンと同時にリコンビナントTGF-βを加えるとIL-22 receptor mRNAの発現増強は認めた、しかし、シクロスポリン単独あるいはリコンビナントTGF-β単独の刺激では、IL-22 receptor mRNAの発現増強は認めなかった。従って、シクロスポリンによる腸上皮細胞のIL-22受容体発現増強及びSTAT3活性化を介した粘膜障害抑制効果は、TGF-βからのシグナルと同時にシクロスポリンが加わることで誘導されることが示唆された。次に、マウス腸炎モデルにおいてもシクロスポリンによる腸上皮細胞のIL-22受容体発現増強及びSTAT3活性化を介した粘膜障害抑制効果におけるTGF-βからのシグナルの関与について解析を行った。抗TGF-β抗体投与下では、シクロスポリン投与による腸上皮細胞のIL-22受容体発現増強・STAT3活性化誘導の効果がキャンセルされた。初年度の解析結果で、シクロスポリンによる粘膜障害抑制効果は、腸管上皮細胞IL-22受容体の発現増強とSTAT3の活性化による粘膜障害抑制機序が関与していることを証明できた。本年の目標であった腸管上皮細胞IL-22受容体の発現調節因子についても、シクロスポリンとTGF-βシグナルを介していることを明らかにすることができた。初年度の解析によりシクロスポリンによる粘膜障害抑制効果は、腸管上皮細胞IL-22受容体の発現増強とSTAT3の活性化による粘膜障害抑制機序が関与していることが明らかとなった。また、腸上皮細胞株Caco2を用いてシクロスポリンの処理による腸上皮細胞IL-22 receptor mRNAの発現調節について解析を行った結果、シクロスポリンによる腸上皮細胞IL-22受容体発現増強効果は直接効果でないことが明らかとなった。昨年度の解析では、腸上皮細胞株Caco2を用いたシクロスポリンによる腸上皮細胞IL-22受容体発現調節の機序の蛋白レベルでの解析を行い、シクロスポリンによる腸上皮細胞のIL-22受容体発現増強及びSTAT3活性化を介した粘膜障害抑制効果は、TGF-betaからのシグナルと同時にシクロスポリンが加わることで誘導されることが明らかとなった。

本年度はさらに、マウス腸炎モデルにおいて、シクロスポリンによる腸上皮細胞のIL-22受容体発現増強及びSTAT3活性化を介した粘膜障害抑制効果におけるTGF-betaからのシグナルの関与について解析を行った。抗TGF-beta抗体投与下では、シクロスポリン投与による腸上皮細胞のIL-22受容体発現増強・STAT3活性化誘導の効果がキャンセルされた。また、マウス腸炎モデルにおいて抗IL-22抗体投与及びSTAT3インヒビター投与下では、シクロスポリンによる腸上皮細胞アポトーシス増加を介した粘膜障害抑制効果がキャンセルされた。腸上皮細胞株Caco2を用いたシクロスポリンによる腸上皮細胞IL-22受容体発現調節の機序の解析について、シクロスポリンによる腸上皮細胞のIL-22受容体発現増強及びSTAT3活性化を介した粘膜障害抑制効果が、TGF-betaからのシグナルと同時にシクロスポリンが加わることで誘導されることの再現性の確認が必要であったため。初年度の解析によりシクロスポリンによる粘膜障害抑制効果は、腸管上皮細胞IL-22受容体の発現増強とSTAT3の活性化による粘膜障害抑制機序が関与していることが明らかとなった。また、腸上皮細胞株Caco2を用いてシクロスポリンの処理による腸上皮細胞IL-22 receptor mRNAの発現調節について解析を行った結果、シクロスポリンによる腸上皮細胞IL-22受容体発現増強効果は直接効果でないことが明らかとなった。2年目の解析では、腸上皮細胞株Caco2を用いたシクロスポリンによる腸上皮細胞IL-22受容体発現調節の機序の解析を行い、シクロスポリンによる腸上皮細胞のIL-22受容体発現増強及びSTAT3活性化を介した粘膜障害抑制効果は、TGF-betaからのシグナルと同時にシクロスポリンが加わることで誘導されることが明らかとなった。昨年度はさらに、マウス腸炎モデルにおいて、シクロスポリンによる腸上皮細胞のIL-22受容体発現増強及びSTAT3活性化を介した粘膜障害抑制効果におけるTGF-betaからのシグナルの関与について解析を行った。また、マウス腸炎モデルにおいて抗IL-22抗体投与により、シクロスポリンによる腸上皮細胞アポトーシス増加を介した粘膜障害抑制効果がキャンセルされた。本年度においてCaco2細胞のIL-22受容体の発現増強効果の再現性が確認され、in vitroの結果も合わせて論文作成中である。DSS誘発大腸炎モデルにおけるシクロスポリンによる粘膜障害抑制効果は、腸管上皮細胞IL-22受容体の発現増強とSTAT3の活性化による粘膜障害抑制機序が関与していることが明らかとなった。腸上皮細胞株Caco2を用いた解析では、リコンビナントTGF-beta単独またはシクロスポリン単独刺激による腸上皮細胞IL-22受容体発現増強効果は認めず、両者の刺激よりIL-22受容体の発現増強は認めた。シクロスポリンによる腸上皮細胞のIL-22受容体発現増強及びSTAT
L型DNA固定化DNAマイクロアレイの開発とCAGリピート結合分子の開発

生体内で遺伝子発現を抑制する方法としてRNAi法やアンチセンス法がある。これらの方法ではmRNAに対して相補的な配列を持つ一本鎖RNAあるいはDNA(アンチセンスオリゴ)が機能の中核を担っている。アンチセンス法ではアンチセンスオリゴがmRNAと相補鎖を形成した後、RNase HによってmRNAの切断が起こる経路、または、相補鎖形成が翻訳開始複合体の形成を阻害する経路のどちらかでタンパク質の翻訳を抑制する。このように、遺伝子発現を翻訳段階で抑制する方法論は確立されてきているが、逆に、遺伝子発現を促進させる方法論はまだほとんどない。今回我々は、RNase Hが存在しない無細胞翻訳系で、GFPメッセンジャーRNAの翻訳領域に相補的なアンチセンスオリゴが、翻訳反応を促進させることを見出した。我々は、再構成系の無細胞翻訳系であるPURESYSTEMを用いて、GFPの翻訳反応を行った。この反応系中に、GFPのmRNAに対するアンチセンスオリゴを加えると、リボソーム結合サイトや開始コドン付近にハイブリダイズするものは、翻訳されるGFPタンパク量の低下を示したのに対し、より下流にハイブリダイズするアンチセンスオリゴのいくつかは、1.52倍程度の翻訳量の上昇を促す事が確認された。これは、アンチセンスオリゴのmRNAの複合体形成が、より翻訳開始複合体の形成に有利なmRNA構造を誘起したためだと考えている。これからより詳細に調査して行きたい。L-DNAは天然に存在するDNA(D-DNA)の鏡像体であり、ユニークな性質を持っている。一つは、D-DNAがその相補鎖と2重鎖を形成するのと同様に相補的な配列を持つL-DNAとハイブリダイズし、安定なB型左巻きの2重鎖構造を形成するということである。ただ、互いに相補的な配列を持つL-DNAとD-DNAはその糖骨格のキラリティーのため安定構造をとることはない。そのキラリティーはタンパク質の相互作用にも効いており、D-DNAを認識するタンパク質がL-DNAは認識できない、という報告がなされている。我々はこのようなL-DNAの特徴ある性質を用いて、PCR産物をラベル化することに成功した。まず、L-DNAのホスホロアミダイト4種類を化学合成し、続いてDNA合成機による固層合成でL-DNAとD-DNAからなるキメラオリゴマーを得た。このキメラDNAのD-DNA部分はPCRのプライマー配列となるように設計し、L-DNA部分の配列はPCR産物をコードする特異的な配列に設計した。このキメラDNAをプライマーとしてPCRを行うと伸長反応はL-DNAとD-DNAの間で止まり、L-DNAタグでラベル化されたPCR産物を得た。このラベル化されたPCR産物はタグ配列に相補的な配列を持つL-DNAを固定化したSPRアレイ上に流すとアレイ上でのハイブリダイズをSPRイメージングによって観察された。さらにアレル特異的PCRをこのプライマーを用いて行うことでSPRアレイ上での迅速なSNP検出を実現した。このように、既存のバイオテクノロジーの技術とL-DNAの科学を融合させる事によってより洗練された技術の開発が行えると考えられる。リボスイッチの発見により生体内での小分子リガンドとRNAの相互作用の重要性がよりいっそう高まってきている。リガンドがmRNAに結合することによって、RNAの高次構造が変化し、転写または翻訳が制御される。現在、in vitroセレクション法によって多くの研究グループが有機小分子に対するRNAアプタマーを得ているが、RNAと有機小分子の結合を人為的に制御するには、有機小分子に何らかの細工を施す必要がある。そこで我々は光異性可能を持つアゾベンゼン誘導体を含む分子を用いてin vitroセレクションを行うことで、トランス体にしか結合しないRNAアプタマーを取得し、有機小分子であるペプチドとRNAの結合を光制御する事に成功した。我々の設計した分子はペプチドの主鎖にアゾベンゼン誘導体をもち、その両側に塩基性アミノ酸であるアルギニンを持っている。この分子を合成し、in vitroセレクションを行った。得られたRNAアプタマーを、アゾベンゼン含有ペプチドを固定化したセンサーチップを用いてSPR測定したところ、数種類のアプタマーはトランス体ペプチドと強い相互作用を示した。センサーチップに360nmの光を当てて、シス体ペプチドとした後RNAアプタマーを分析するとほとんど相互作用しなかった。再び430nmの光をあててから分析するとシグナルは回復した。また、ペプチドとアプタマーの複合体に直接光を当てると、複合体の解離が観察された。

この反応系中に、GFPのmRNAに対するアンチセンスオリゴを加えると、リボソーム結合サイトや開始コドン付近にハイブリダイズするものは、翻訳されるGFPタンパク量の低下を示したのに対し、より下流にハイブリダイズするアンチセンスオリゴのいくつかは、1.52倍程度の翻訳量の上昇を促す事が確認された。これは、アンチセンスオリゴのmRNAの複合体形成が、より翻訳開始複合体の形成に有利なmRNA構造を誘起したためだと考えている。これからより詳細に調査して行きたい。
HCV特異MHC拘束性CTLクローンのHCV組換えワクチニアウィルスによる確立

C型肝炎ウィルス(HCV)の遺伝子(HCV RNA)がクローニングされているが、なおHCV粒子の分離同定はなされておらず、ヒト、チンパンジー以外の感染系は明らかにされていない。HCVの構造遺伝子(coreおよびenv)のcDNAを組込んだ組換えワクチニアウィルス(Vac-HCV/core-env)を作製して、HCVcoreおよびenv蛋白を発現させ、標的抗原として、HCV特異MHC拘束性CTLクローンを作製する。1組換えワクチニアウィルス(Vac-HCV/core-env)の作製: HCVcDNAと弱毒株ワクチニアウィルスとの相同組換えによりVac-HCV/core-envを作製した。3エフクター細胞(CTL)の作製:C型慢性肝炎患者の末梢血リンパ球を合成HCVcoreおよびenvペプチドで刺激(誘発)し、^3Hチミヂンの取り込みにより、誘発されたリンパ球を選択し、HCV蛋白を認識しているT細胞のクローニングを実施している。4対象患者のHLAの同定:CTLの標的抗原はMHCと結合(MHC拘束性)して標的細胞に表出される。対象患者のHLAを同定する。
光波長応答型殺菌性分子を応用した細胞・組織加工製品の無菌化技術の開発

光反応型化合物として天然物であるフェルラ酸(FA)を用い、紫外線ーA(UVーA)との併用殺菌機構を調べた。UVーA照射下においてFAは、グラム陰性・陽性菌に対して高い殺菌力を示した。同条件で脂質過酸化レベルは有意に上昇し、細胞損傷を表すPI蛍光レベルも上昇した。CTC反応による呼吸活性は、FAと接触させることにより無処理の細胞と比較して減少した。従って、FAは細胞表面に吸着後、UVーA照射下で酸化的破壊を引き起こすことが示唆された。ポリヒドロキシメチルメタクリレートを主鎖とするFA分岐ポリマーを合成した。その分子量を約15000とする化合物10は、遊離FAに匹敵する抗微生物活性を示した。平成27年度の実施計画では、365nmおよび465nmの併用によるウイルス不活化試験を行い、光応答性の高い殺菌性分子を絞り込むことであった。平成26年度までの成果により、光反応性の高い分子としてフェルラ酸とチロシンの縮合体が得られていた。そこで平成27年度は、光応答性を高めるためにチロシンをトリプトファンに変え、合成反応では適宜、官能基を保護し新規化合物を合成することを進めた。また、フェルラ酸の類縁化合物であるクマル酸を用い、フェルラ酸との縮合化合物の合成も進めた。しかし、トリプトファン縮合化合物の前々駆体の合成収率は36%であり、その後の反応収率を含めた最終目的化合物の収量を考慮すると活性評価試験を進めることは困難と考え中止した。一方、フェルラ酸とクマル酸の縮合体は最終化合物として18%収率で精製できた。精製化合物は、NMRによる構造確認、質量分析により目的物であると結論付けた。ウイルス不活試験の前実験として、大腸菌を使用した365nmの光照射下における殺菌力評価試験を行った。大腸菌を滅菌水に2×10^6 cells/mlに調製し、350ー385nmの光(ピーク365nm、5.55mW/cm^2)を7.4J/cm^2の光量で照射した。化合物の濃度は100マイクロMとした。無照射条件での化合物の殺菌力は、0.3ーlogの生菌数減少を示し、光照射下においては2.5ーlog減少を示した。この結果より、光を併用したことによる相乗殺菌性が明らかとなったが、その殺菌力は高くないことが分かった。その一方で、比較試験で使用したフェルラ酸の光相乗殺菌力は、縮合化合物よりも極めて高く(>5.0ーlog減少)、フェルラ酸ーチロシン縮合体と同程度であることが分かった。近紫外線反応性を高めるために、フェルラ酸にチロシンおよびトリプトファンを結合させた化合物の合成と、フェルラ酸の類縁体であるクマル酸をフェルラ酸に縮合させた二量化化合物の合成を検討に時間を要し、抗ウイルス活性評価試験を実施することができなかった。しかしながら、大腸菌を使用した光照射試験により、フェルラ酸を単独で用いることが有効であることが分かった。フェルラ酸を光応答部とした水溶性ポリマーの合成を検討した。モノマーは、β-メタリルアルコール、メタクリル酸メチルエステル、2ーメチルー2ープロペニルアセテート、重合反応はAIBNによるラジカル重合とした。しかし、高分子量ポリマーの収量は極めて低かった。そこで、2ーヒドロキシエチルメタクリレートをモノマーとしてAIBNラジカル重合を検討した結果、収量高くポリマーを合成できた。そして、AIBNのmol%を0.2から2.0と条件を変えてポリマーを合成した結果、1mol%反応で分子量26000程度のポリマーが合成できた。次にカルボジイミドを用いたエステル縮合反応により、ポリマー分岐鎖末端のヒドロキシル基にフェルラ酸を導入した。そして、ポリマーの水溶性向上を目的として、グルタリル酸無水物またはコハク酸無水物により、ヒドロキシル基残基をカルボキシル基末端とした。しかし、水溶性の向上は認められなかった。ポリマー合成と並行して、フェルラ酸の殺菌機構の解明を進めた。フェルラ酸のUVーA照射下における殺菌は、活性酸素種が関与することがこれまでの実験により示唆されている。そこで、細胞膜の過酸化状態をTBARSアッセイにより調べ、殺菌効果の認められない積算照射量2.0J/cm^2で有意に過酸化脂質を生成していることが分かった。そして、DAPI/PI染色により、高い殺菌力が得られる8.0J/cm^2において、PI蛍光量が著しく上昇することがフローサイトメトリー解析により明らかとなった。一方で、大腸菌に形質転換したプラスミドは、殺菌条件においてもスーパーコイル構造を維持していることが分かった。以上の結果、フェルラ酸は、細胞膜に吸着後、細胞膜に局在し、UVーA照射下において酸化的膜破壊を生じ、細胞死に至らしめることが示唆された。フェルラ酸を分岐させるポリマーの合成において、適切なモノマーを選定することに時間を要し、さらに、酸無水物による水溶性の向上が達成できなかった。しかしながら、フェルラ酸の細胞膜局在による酸化反応が細胞損傷に寄与することが分かったため、ポリマー分子設計において、細胞への効率的な取り込みを実現できる水溶性ポリマー構造が必要であることが考えられた。フェルラ酸を光応答部とした水溶性ポリマーを合成した。モノマーは、2ーヒドロキシエチルメタクリレートとし、重合反応はAIBNによるラジカル重合とした。

AIBNの添加量は、1、4、8mol%と条件を変えてポリマー(polyーHEMA)を合成した結果、分子量ピークを15000、7300、5800とする3種類のポリマーを得ることができた。次に、最終化合物(polyーHEMAーFA)は、カルボジイミドを用いたフェルラ酸のエステル縮合反応により得た。そのFA含有量は、ポリマーからのFAの脱離反応を経て分光工学的手法で測定され、ポリマー重量に対して5.0から9.8wt%であることが分かった。次に、polyーHEMAーFAの大腸菌に対するUVーA併用殺菌力を評価した。365nmの照度を10.5mW/cm^2に調整した。polyーHEMAーFA(分子量ピーク5800)は、照射エネルギー量に依存して生菌数が減少することを確認したが、その減少の程度はUVーA照射だけの処理と差はなかった。その他の分子量ピークを持つポリマーにおいても、UVーAとの併用による相乗殺菌効果は認められなかった。その一方で、殺菌試験に使用したポリマーと同濃度の遊離フェルラ酸は、UVーA照射条件で高い殺菌力を示した。そこで、UVーA照射時間毎のpolyーHEMAーFAのUV吸収スペクトルを測定した。その結果、照射時間に依存して吸収スペクトル全体が減少する傾向を示した。一方遊離フェルラ酸は、等吸収点を有したスペクトル変化を示し、トランス体からシス体への異性化と異性化反応の平衡化を示した。フェルラ酸の異性化は、UVーA照射によるフェノキシラジカルの生成に寄与する反応であることから、等吸収点を示さなかったpolyーHEMAーFAは、フェノキシラジカルを生成していないと考えられ、そのことが低殺菌力の原因と推察した。光反応型化合物として天然物であるフェルラ酸(FA)を用い、紫外線ーA(UVーA)との併用殺菌機構を調べた。UVーA照射下においてFAは、グラム陰性・陽性菌に対して高い殺菌力を示した。同条件で脂質過酸化レベルは有意に上昇し、細胞損傷を表すPI蛍光レベルも上昇した。CTC反応による呼吸活性は、FAと接触させることにより無処理の細胞と比較して減少した。従って、FAは細胞表面に吸着後、UVーA照射下で酸化的破壊を引き起こすことが示唆された。ポリヒドロキシメチルメタクリレートを主鎖とするFA分岐ポリマーを合成した。その分子量を約15000とする化合物10は、遊離FAに匹敵する抗微生物活性を示した。平成27年度の成果より、フェルラ酸が光応答部位そして殺菌性分子として適切な化合物であると判断し、フェルラ酸を分岐側鎖とする水溶性ポリマーを合成し、その光照射条件における抗ウイルス活性評価および細胞毒性評価を実施する。水溶性ポリマーは、ポリメタクリル酸メチルエステルを出発原料とし、エステル還元によりヒドロキシル基に置換後、フェルラ酸との縮合反応を行う。そして、未反応の置換基は、環状酸無水物(例:グルタリル酸無水物)により末端をカルボキシル基とする側鎖を導入し、水溶性特性を付与する。ポリマーに水溶性を付与できる分子設計が必要である。グルタリル酸無水物またはコハク酸無水物の反応による側鎖末端のカルボキシル基への変換は効果がなかった。そこで、N-メタクリロイルグリシンのカルボキシル基をt-ブチルカルバゼートを反応させることにより、末端に反応性置換基としてヒドラジンを導入する。
心内辞書表示における音韻単位の発達の研究

本研究は、日本語を母語とする幼児の心内辞書表示における音韻単位(音節とモーラ)及び音韻単位と文字の獲得の関係を明らかにする実証的研究を行い、心内辞書表示の音韻単位に関する普遍性と個別性を論じた。本研究では日本語話者の幼児が心内辞書の語彙表示をする際に音節とモーラのいずれの単位によっているかを明らかにする実験を行った。文字の獲得が行われていない幼児に焦点を当て、従来の研究では明らかにされなかったモーラと文字の関係を論じた。実験の言語材料は、撥音、促音、長音の3つの特殊拍を含み、幼児にとり既知と未知の日本語の単語を用いた。実験方法は、タッピング。40語からなる単語のリストを一語ずつ読み上げ、幼児がタッピングをする様子をビデオカメラで撮影した。被験者は保育園園児38名。年齢は4.8才から6.3才。平均5.3才。国立国語研究所の文字読み取り調査票を用いて幼児の文字読み取り能カの調査を実施した。実験者が40語の単語を一語ずつ読み上げ、各単語に対してタッピングをさせた。撥音、促音、長音を含む音節を1つとして叩いた場合を音節、2つとして叩いた場合をモーラとした。幼児は撥音の文字が読めてちモーラを選択するとは限らず、全体としては音節を選択する可能性が高く、促音と長音は、文字の読み取り能力とは無関係に音節を選択する可能性が高いことが明らかになった。既知語、未知語に無関係に同一の結果が得られた。この結果は、2つことを示唆していると思われる。1つ目は、個々のかな文字が読めてもモーラの選択が行われるわけではない。かな文字の獲得は個々の文字ではなく、文レベルの認識が重要と思われる。2つ目は、かな文字が読めない幼児は、モーラではなく、音節の音韻単位を選択する可能性が高い。しかし、この結果は心内辞書におけるモーラ表示の可能性を否定するものではなく、この点は今後の研究で明らかにする。平均5.3才。
空間構造の形態解析と創生に関する研究

本研究は、東京大学生産技術研究所故半谷裕彦教授を研究代表者として開始されたが、無念にも平成10年8月9田に半谷先生は急逝されてしまった。その後、研究分担者であった東京大学生産技術分究所川口健一助教授が引き継ぐことにより研究を継続した。その時点で既に研究は最後の仕上げの段階に入っており、川口は最後のとりまとめのみを行なった。本報告書の内容は本研究課題に対して半谷教授を中心としてまとめられた研究成果の集成となっている。本報告書は本研究課題における研究成果を主に3つの部分に分け,それに対応した形の3つの部分からなる。第1部は逆変分原理を中心とする形態解析手法の提案であり、不安定構造や自己釣り合い応力決定法の形態解析に関する研究成果をまとめたものである。既往の文献の解析結果などと本解析手法の結果を比較している。第2部は形態解析によって得られた任意形態構造物のための載荷実験装置の開発であり、主に離散型骨組みモデルに対する載荷実験装置の開発について報告している。第3部は本研究課題遂行に到るまでの半谷教授等による発表論文等を集めたものである。主要と思われるもののみを収録した。半谷教授は、構造物の形態を解析により創生する「形態解析」という新しい構造解析の分野の確立を提唱されていた。形態解析は、解析によって得られる構造形態の「美しさ」「面白さ」或いは「意外さ」といった幅をもった人間的感性の価値基準を積極的に受け入れる点を特徴としている。厳密な最適性を追求する、いわゆる最適設計とはその点で異なる。半谷教授の人柄と研究に対する情熱、柔軟な,研究姿勢が生んだ魅力的な研究分野である。本研究も半谷教授のそのような形態解析への挑戦過程における研究テーマと位置付けられよう。構造力学は,主に,設計された構造物の形態を基点に,そこからの変位や応答など,設計された構造物の性質を把握するために用いられている。しかし,最近,工学や理学等の分野で形態に関する研究が盛んに行われ,形態を創生するための力学が芽生えつつある。本研究では,構造力学の基礎方程式に立脚する形態解析として,(a)不安定構造の形態解析,(b)自己応力と自己応力の導入方法,(c)変位指定の形態解析,(d)地震動の作用する塔状構造物の最適形態解析,を取り上げ,その力学的背景と創生される形態の性質を調査している。本年度実施した研究を列挙する。(1)ケーブルと剛体構造による複合構造に対して,適合方程式と釣合方程式の理論構成,安定・不安定の判別法,応力・変形解析,振動解析,風応答解析,実験的研究,を行った。(2)遺伝的アルゴリズムを応用し,エルセントロ地震,八戸地震等に対して応答の最小となる最適形態を求める方法を確立した。(3)上下加振の作用する偏平アーチの動的座屈に対する最適形状を求める解析を行い,座屈荷重の形状に対する感度を検討した。(4)変位指定の形態解析(ホモロジー設計)に対して,連続法を応用する手法を試みた。形態解析には目標が必要である。目標には力学的目標,形状目標,機能目標等があり,創生される形態を持つ構造は指定した目標を満足する。そのため,形態解析を通して得られる形態と経験によって設計される形態の差がどの程度目標の変動を生じるかの検討が必要となる。次年度以降,本研究において,指定した機能を持つ構造の価値を評価する価値工学を確立する予定である。

しかし,最近,工学や理学等の分野で形態に関する研究が盛んに行われ形態を創生するための力学が芽生えつつある。構造物の形態を設計する過程(形態設計過程)と設計された形態が外乱等によって変化していく過程(形態変化過程)を考える場合,本研究は形態設計過程における理論と解析における研究として位置付けることができる。スペースフレーム,膜構造,展開構造等は空間構造に属し,形態と抵抗能力が密接に関連しており,形態抵抗型構造に含まれる。そのため,設計段階における構造形態の創生と創生技術としての形態解析法の研究は重要な課題である。本研究では構造解析の基礎方程式:適合方程式,釣り合い方程式,荷重-変位式を基礎とする形態解析を取り上げ,個々の形態解析の性質を明らかにし,その性質に基づく理論構成を行う。次いで,解析法を提案し,数値解析を行い,提案した方法の有用性を評価する。本年度は,次の項目の研究を実施している。(1)アクチュエータ制御による形態制御構造:形態制御構造の課題として、ホモロガス変形を満足するための制御力の評価法と最適アクチュエータの配置理論の構築,(2)地震外乱に対して最小変位を生じる塔状構造物の形態解析:GA(遺伝的アルゴリズム)を利用して,エルセントロ,八戸,神戸,タフト地震波に対する最適形態を決定する数値解析法を開発,(3)骨組み構造の畳み込み解析:一般的な骨組み構造を目的の形状に畳み込むという問題に対し,構造物の幾何学的形状に基づいて動きに最も無駄の少ない畳み込み経路を求める解析手法を提案。本研究では,構造解析の基礎方程式,釣り合い方程式,荷重-変位式を基礎とする形態解析を取り上げ,ここの形態解析の性質を明らかにし,その性質に基づく理論構成を行なうことを目的としている。平成8年8月9日に研究代表者であった,半谷裕彦東京大学教授が急逝され,研究分担者であった川口健一東京大学助教授が,研究代表者となることで研究を続行した。平成10年度は,平成8年,9年と行なって来た今までの研究実績のまとめとして,逆変分原理に焦点をあて,不安定構造や自己釣り合い応力決定法の形態解析に関する理論の開発,特に,非線形領域における逆変分原理を定式化し,数値解析を実行した。本解析手法は、ケーブル構造などの構造形態と力の流れが密接に関わった構造物の最適化手法として優れており,特に,ケーブル構造などの自己釣り合い応力によって初期剛性が付与される,不安定構造物の自己応力の最適化に力を発揮する。本研究における数値解析においても,5つの自己釣り合いモードを持った平面ケーブル構造を解析モデルとして選定し,その最適自己釣り合いモードの割合を決定した。また、その結果を既往の文献の数値解析結果と比較し,考察を行なった。さらに,モデル実験として,形態解析によって得られた任意形態構造物のための載荷実験装置の開発を行なった。本装置は,任意形状の離散型骨組みモデルに対する載荷実験を行なうための装置であり,数トンの載荷能力がある。試験体として,異なるライズスパン比をもつ扁平単層スペースフレームモデル,さらに球面分割パターンの異なる扁平単層スペースフレームモデルを作成し,これに対する載荷実験のための装置の開発を行なった。
情動記憶の消去における扁桃体神経回路制御機構の解明

GABA作動性ニューロンを蛍光タンパク質Venusで標識したトランスジェニックマウス(VGAT-Venusマウス)を用いて、扁桃体GABA作動性ニューロンの化学マーカー(特に神経ペプチド)による免疫組織化学的解析を行った。その結果、ソマトスタチン(SST)陽性および血管作動性小腸ペプチド(VIP)陽性神経終末様シグナルが扁桃体中心核に特に観察された。扁桃体中心核は扁桃体からの出力であり、SST、VIPは各GPCRを介して抑制性・興奮性シグナルを行うことが知られていることから、神経ペプチドにより恐怖記憶の消去機構に独自の調節を行っている可能性が示唆された。扁桃体は恐怖など情動の中枢であり、扁桃体でのGABAを介した抑制性神経伝達は情動の発現・記憶、さらには不安障害や心的外傷後ストレス障害(PTSD)など精神疾患の病因との強い関連が考えられている。これらの精神疾患では、恐怖体験の記憶を「無害」であると新たに学習していく「消去」過程の異常が考えられているが、その分子・細胞レベルでのメカニズムは不明な点が多い。本研究では、GABA作動性ニューロンを黄色蛍光タンパク質分子Venusで標識したVGAT-Venusトランスジェニックマウス(VGAT:小胞型GABAトランスポーター)を用いて、恐怖記憶の生成過程および消去過程に関わる扁桃体GABA作動性ニューロンの同定とその特性を明らかにすることで、扁桃体局所回路の制御機構を解明することを目標とする。本年度は恐怖記憶の消去過程に関わると想定される扁桃体GABA作動性ニューロンのサブクラスを同定するために、昨年度に引き続き、免疫組織化学的解析を行った。VGAT-Veunusマウスを灌流固定後、凍結切片を作製し、コレシストキニン(CCK)、血管作動性腸ペプチド(VIP)、ニューロペプチドY(NPY)、コルチコトロピン放出因子(CRF)、コリンアセチルトラスフェラーゼ(ChaT)の分布を解析した。その結果、ChaTは扁桃体基底外側核(BLA)に免疫陽性シグナルが検出されたことから、コリン性神経入力による扁桃体回路制御が行われていることが示唆された。扁桃体は、恐怖など情動の中枢であり、扁桃体でのGABAを介した神経伝逹は、情動の発現と記憶、さらに不安障害など精神疾患の病因との強い関連性が考えられている。特に扁桃体を囲むようにクラスター状に分布しており、扁桃体への入力を調節していると考えられている扁桃体介在核はGABA作動性ニューロンであり、恐怖記憶の消去過程に重要な役割を担っていると考えられているが、そのニューロンの特性(発現化学マーカー、発火パターン、入出力関係)は不明な点が多い。本研究では、1.GABA作動性ニューロンを黄色蛍光タンパク質分子Venusで標識したVGAT-Venusトランスジェニックマウス(VGAT:小胞型GABAトランスポーター)な用いて、不安、恐怖の生成過程および恐怖消去過程に関わる扁桃体GABA作動性ニューロンの特性を明らかにすることで、扁桃体神経回路の制御機構を解明することを目標とする。本年度は、恐怖記憶の消去過程に関わると想定される扁桃体GABA作動性ニューロンのサブタイプを検討するために、特に神経ペプチドに着目し、組織学的解析を行った。まず、VGAT-Venusマウスを灌流固定後、凍結切片を作製し、ソマトスタチン、血管作動性腸ペプチド(VIP)陽性シグナルの分布を免疫組織化学的解析により行った。その結果、ソマトスタチン陽性およびVIP陽性神経終末様シグナルが扁桃体中心核に特に観察された。以上の結果から、異なる特性をもつGABA作動性ニューロンが扁桃体の出力である中心核に局在し、神経伝達物質GABAに加えて各種ペプチドを標的細胞に放出することで、扁桃体による情動磯能の独自の調節を行っていることが示唆された。本年度は、恐怖記憶の消去過程に関わると想定される扁桃体GABA

作動性ニューロンのサブタイプを検討するために、特にペプチド、オピオイドに着目し、組織学的解析を行った。まず、VGAT-Venusマウスを灌流固定後、凍結切片を作製し、GABA、コレシストキニン、オピオイド、ニューロペプチドY、アクチニン、ソマトスタチン、血管作動性腸ペプチド(VIP)陽性細胞の分布を免疫組織化学的解析により行った。その結果、1.アクチニン陽性細胞は扁桃体に認められなかった。2. VIP陽性シグナルが扁桃体中心核に認めれた。以上の結果から、異なる特性をもつGABA作動性ニューロンが扁桃体の各亜核に局在し各種ペプチド、オピオイドを標的細胞に放出することで、扁桃体による情動磯能の独自の調節を行っていることが示唆されたGABA作動性ニューロンの化学マーカーによる分類のめどがたったので、今後恐怖記憶の各過程(獲得・再固定・消去)においてどのGABA作動性ニューロンのサブクラスが特に活動して扁桃体神経回路を制御しているかの解析に進む予定である。本研究計画ではGABA作動性ニューロンをラベルするためにBACトランスジェニックマウスであるVGAT-Venusマウスを利用している。そこでVenus陽性細胞がGABA陽性細胞かを確認するために、GABA抗体を用いて免疫組織化学による検証を行った。しかしながら、GABA陽性シグナルは組織の表面にしか確認できず、抗体の浸透度など問題が生じた。この問題を解決するために、脳組織の固定、固定方法、抗体の種類、抗体の希釈濃度などさまざまな条件検討を行ったために、研究計画の遅れを生じたが、上記の問題も解決でき、現在引き続き計画通り研究を進めている。扁桃体神経回路を制御する脳部位を特定するために、まず逆行性トレーサーを扁桃体に注入し同定を行う。そして同定した脳部位に順行性トレーサーを注入し、扁桃体GABA作動性ニューロンのどのサブクラスに投射しているのかを解析する。現在までの結果をもとに論文としてまとめる時間を確保するため、トレーサー購入分の研究費を次年度に使用することに変更する。これまでで扁桃体GABA作動性ニューロンの発現化学マーカーによる分類ができた。今後は、これらの各GABA作動性ニューロンの発火特性を電気生理的手法により解析する。さらに、本計画の中心的課題である、内側前頭前野から扁桃体への入力を検討するため、各種トレーサーをin vivoで脳内に注入し、分類したGABA作動性ニューロンのうち、どのサブクラスにシナプス入力があるのかを検討する。前年度から繰り越した研究費をトレーサーなど各種消耗品の購入に使用する。また学会などの成果報告あるいは研究技術の習得のための共同研究など国内旅費に使用する。電気生理学解析を行う予定であり、前年度に繰り越した研究費も合わせ、電気生理学用設備充実のため、除振台などを購入予定である。抗体、試薬など各種消耗品に使用する。研究成果報告のため、学会参加旅費等に使用する。