hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
インプラント/骨界面部に生じた応力の定量的解析法の確立と治療計画最適化への応用

インプラントに負荷される力学的ストレスを術前に正確に予測すること、そしてインプラント/骨界面が耐えうる力学的ストレスの性質と強度を把握することは治療計画を立案する上で重要である。我々は、インプラント周囲骨の静的および動的な圧縮応力に対する限界応力を明らかにする目的で、骨内維持部、荷重伝達部、微小型荷重発生部と超小型圧力センサーを内部に設置可能な荷重発生部からなる装置を開発し、インプラント/骨界面部に発生させる圧縮応力を正確にコントロールするシステムを用いて周囲骨組織に生じる骨の反応を解析した。大きさの異なる静的な圧縮応力(0180MPa)を、イヌ脛骨の骨結合が確立されたインプラント/骨界面に1週間発生させ、それに対する骨の反応を組織学的に解析したところ、インプラントのシャフト先端から伝わる静的圧縮応力は、骨に伝わりシャフト直下の骨表面に新生骨添加を誘導する、骨膜反応として認められた。新生骨は、石灰化が乏しい類骨様の構造物であった。静的荷重が0の場合は骨膜反応が認められなかったが、40180MPaと荷重を強くしていくと、力の程度依存的に骨膜下の新生骨の添加が増大した。骨の微細構造の変化を解明する目的で、ハバース層板の歪みを定量的に解析したところ、荷重力とハバース層板の歪み率との間に有意な相関性は認められなかった。また、180MPaまでの静的荷重では、強い骨吸収像などの骨の実質欠損は確認されなかった。個々のハバース層板中の骨小腔は開大していないことから、静的荷重によって炎症反応が惹起されてないことが明らかとなった。今回新たに開発した、正確な荷重を発生させる装置を用いた研究成果から、静的荷重によって骨膜反応による新生骨が骨表面に添加され、その新生骨は荷重力に対応して増加することが明らかとなった。本研究で使用した正確な荷重を発生させる装置は、インプラントに想定した力を加えた際の骨反応を解析できることから、治療計画の立案などに応用されるものと考える。大きさの異なる静的な圧縮応力を、骨結合が確立されたインプラント/骨界面に1週間発生させ、それに対する骨の反応を組織学的に解析したところ、20MPa,と40MPaの静的圧縮応力に対しては、インプラント/骨界面付近の細胞や骨は経時的に殆ど変化を示さなかった。それに対して80MPaの静的荷重を加えた骨では、強い骨吸収像などの骨の実質欠損はなかったものの、シャフト先端に対応した付近の骨において、ハバース層板の走行の乱れ(ハバース層板の歪み)が観察されたことから、静的荷重に対する周囲骨の反応を確認することができた。また、ハバース層板中の骨小腔は開大していないことから、炎症反応が惹起されてないことも明らかとなった。この結果から80MPaは骨吸収を示さない限界応力の範囲内で、かつ80MPa付近に静的荷重の周囲骨に対する限界応力が存在することが示唆された。本年度は、80MPa以上の骨吸収を伴う静的な圧縮応力の検索から、インプラント周囲骨の静的な力学的ストレスの限界応力を明らかにすること、ならびにインプラントの荷重周波数に変化を与えた動的荷重の限界応力について、組織学的、分子生物学的に検討する。

今回新たに開発した、正確な荷重を発生させる装置を用いた研究成果から、静的荷重によって骨膜反応による新生骨が骨表面に添加され、その新生骨は荷重力に対応して増加することが明らかとなった。本研究で使用した正確な荷重を発生させる装置は、インプラントに想定した力を加えた際の骨反応を解析できることから、治療計画の立案などに応用されるものと考える。
骨髄系血管・免疫前駆細胞を標的とした新規肝癌治療法の開発

肝癌の発癌、治療後の再発や転移には、腫瘍血管新生が関与している。TIE2陽性単球(TEM)は、血管新生因子Angiopoietinの受容体(TIE2)を発現し、癌における血管新生への関与が報告されている。本研究では肝癌におけるTEMの臨床的意義と、肝癌によるTEMへの分化誘導機序を明らかにすることを目的とした。肝癌患者では末梢血、肝癌組織でTEMが増加しており、TEM頻度は血管新生の指標と有意に正相関した。TEMは肝硬変と肝癌の判別能に優れており、肝癌治療後の再発に伴って増加し、診断・予後マーカーとして有用である。TEMへの分化には肝癌由来のM-CSF、TNF-α、IL-1βが関与していた。TEMは肝癌における血管新生の制御を目指す治療標的となりうる。C型肝硬変からの発癌、治療後の再発や転移には、腫瘍血管の新生や免疫抑制細胞の増加が関与している。肝癌患者の予後を改善するためには、肝癌の再発予防が重要である。本研究では肝癌による血管新生と免疫抑制に関与する骨髄系前駆細胞に着目し、その血液中、組織中での動態と癌部での分化誘導過程を解明することを目的としている。前駆細胞の血液から肝臓への遊走や血管内皮、免疫抑制細胞への分化に関与する分子を同定し、それを標的とする肝癌に対する新規治療法の確立を目指す。本年度は、1)肝癌患者の血液、癌組織での血管前駆細胞の同定と頻度・機能解析、2)血管前駆細胞の分離方法の確立、3)前駆細胞の形質、遺伝子発現の網羅的解析を行った。血中には骨髄由来の血管内皮前駆細胞が存在しており、血管内皮前駆細胞(EPC)やTie-2発現単球(TEM)、VEGFR2発現単球や骨髄系幼若細胞(CD34+)などがその候補となる。その中でTEMに注目し解析した。TEMはCD14dimCD16+VEGFR2-Tie-2+の表現型であり、CD80、CD86、CCR4、CX3CR1などを強発現していた。FACS Ariaによる高速ソーティングによって、肝癌患者末梢血から高純度TEMを採取可能であった。HCV陽性慢性肝疾患患者での末梢血TEM頻度は、肝癌患者で有意に他群より高値であり、肝硬変群とも差を認めた。末梢TEM頻度は、慢性肝疾患と肝癌との判別にAFP値より感度、特異度とも優れており、ROC解析でも高いAUC値となった。またTEMは、末梢血に比較して肝癌組織で高頻度であり、肝癌組織へ集積すると考えられた。RFAや肝切除による肝癌治療によって、TEM頻度は有意に減少した。以上の結果より、肝癌によってTEMが誘導されることが明らかになった。末梢血TEM頻度は、肝癌の診断・治療におけるBiomarkerとしても有用であることが示唆された。昨年度までに、肝癌患者では末梢血中、肝癌組織中でTEMが増加していること、手術やRFAなどでTEM頻度が低下すること、末梢血TEM頻度は肝癌の診断マーカーとして有用であることを報告した。今年度は、1)TEMの肝癌組織での局在、2)TEMと肝癌組織における血管新生との関連性、3)TEM頻度と肝癌治療後の再発、予後との関連性などを明らかにすることを目的とした。免疫蛍光組織染色にてTEMは肝癌周辺部に同定され、血管壁細胞近傍に特に集積していた。また血管新生をCD34陽性細胞密度(MVD)で評価すると、末梢血TEM頻度、肝癌組織中TEM頻度は、MVDと有意に正相関を認めた。治療前のTEM頻度を中央値でカテゴリー化すると、肝癌患者のTEM高値群は低値群に比較して、治療後の無再発期間は有意に短かった。

またTEM高値群は低値群に比べて、Child B群が多く、肝予備能(血清Alb値、PT値)が有意に低かった。以上の結果より、TEMは肝癌における血管新生に関与しており、TEMの解析は治療後再発、予後の予測マーカーとしても有用であることが示唆された。C型肝硬変からの発癌、治療後の再発や転移には、腫瘍血管の新生や免疫抑制細胞の増加が関与している。肝癌患者の予後を改善するためには、肝癌の再発予防が重要である。本研究では肝癌による血管新生と免疫抑制に関与する骨髄系前駆細胞に着目し、その血液中、組織中での動態と癌部での分化誘導過程を解明することを目的としている。前駆細胞の血液から肝臓への遊走や血管内皮、免疫抑制細胞への分化に関与する分子を同定し、それを標的とする肝癌に対する新規治療法の確立を目指す。TIE2陽性単球(TEM)は、血管新生因子Angiopoietinの受容体(TIE2)を発現し、癌における血管新生への関与が報告されている。昨年度までに、肝癌患者では末梢血中、肝癌組織中でTEMが増加していること、TEMは肝癌周辺部に同定され、血管壁細胞近傍に集積すること、末梢血TEM頻度、肝癌組織中TEM頻度は、血管新生の指標(MVD)と有意に正相関すること、末梢血TEM頻度は肝癌の診断マーカーとして有用であることを報告した。今年度は、1)肝癌によるTEMの誘導機序の解明、2)TEM誘導に関与する因子と肝癌患者の予後との関連性を明らかにすることを目的とした。健康成人の末梢血からTIE2陰性単球をSortingし、種々のサイトカイン、造血因子刺激を加えて、TIE2の誘導の有無を評価した。M-CSF存在下でTNF-α、IL-1βの刺激を加えると、TIE2が有意に発現した。またヒト肝癌切除標本でM-CSF陽性と陰性の群を比較すると、M-CSF陽性肝癌患者では、陰性患者に比較して、TEM頻度が高く、MVD高値であり、術後の再発率が高かった。以上より、M-CSFと炎症刺激によって、肝癌患者ではTEMが誘導され、血管新生の亢進を介して再発率に関与することが示唆された。TEMとその誘導に関与するM-CSFは肝癌における治療標的となりうる。初年度、今年度の研究によって、1)肝癌患者では末梢血、肝癌組織においてTIE2陽性単球(TEM)が増加していること、2)TEM頻度は肝癌組織の血管新生の程度と相関していること、3)TEM頻度は、肝癌の診断、治療後再発、予後のマーカーとして有用であることを明らかにした。以上は、肝癌の病態の理解や、TEMの臨床応用へ向けて重要な知見であり、研究は当初の予定通り進行している。24年度が最終年度であるため、記入しない。今年度までの研究から、TEMの増加が肝癌の進展や再発に関与することが明らかになった。次年度は、肝癌患者においてTEMが増加する機序、TIE2が誘導される機序を解明することを目標とする。現在までに、我々は炎症性サイトカイン、造血因子が単球でのTIE2誘導効果を持つことを実験的に確認しており、今後はその分子機序の解明を目指す。それによって、TEMの制御を介した肝癌治療の実現を目指したい。
放射線応答の遺伝子制御

放射線を刺激としてえる放射線生物作用の概念は新しく、本研究はその放射線応答の遺伝子制御の機構を明らかにし放射線影響の新しい生物も鋭敏に反応し、適応応答と呼ばれる耐性を獲得するとともに、増殖刺激となって一過性の細胞増殖が誘導される。適応応答はCキナーゼとp38MAPキナーゼを介した情報伝達ループによって誘導され、長時間持続する。伝達された情報はDNA組換え機構を制御し、誤りの少ない修復が優先される(佐々木)。この過程にp53蛋白が関係していることが明らかになったが、p38MAPキナーゼとp53蛋白の関係は明らかでない。p53はHSP72などの熱ショック蛋白と会合することが分かったので(大西)、HSPを介した制御が考えられる。p53蛋白は低線量の放射線でも蓄積されるが、微小重力の下でも蓄積誘導が認められる(大西)。p53遺伝子がストレス応答のキ-遺伝子となっていることを示唆する。p53欠損マウスの細胞では低線量放射線に対する適応応答が誘導されないが(佐々木)、この細胞での突然変異は野生型マウスの細胞と紫外線誘発突然変異の型の分布が異なる(石崎)。p53蛋白がDNAの修復を制御し、突然変異の効率と型を変えていることが考えられる。DNAの酸化損傷の中で最も重要のと考えられるフォルミルウラシルの修復実験経が確立された(米井)。ショウジョウバエを使った実験で精子を照射した場合に受精後雌側のミニサテライトが変異することが分かった(丹羽)。損傷の認識が細胞全体の遺伝的不安定性を誘導することが確実なものとなった。ヒトの放射線感受性遺伝子ATMの類似遺伝子の分離には至らなかったが、アタキシテ・ラテンジエクタシア患者でATM遺伝子の新しい突然変異が明らかになった(江島)。生体は放射線に対して鋭敏に応答し、多様な生理活性を発現する。その放射線応答の遺伝子制御と生物学的意義を明らかにする目的で総合的研究を開始した。その結果、以下のことが明らかとなった。1.哺乳動物細胞は0.1Gy以下の放射線に対して適応的に応答し、その後の放射線に対する致死感受性、突然変異感受性が低下する。応答の刺激分子種は酸化ラジカルと考えられ、情報はCキナーゼ(PKC)を介して増幅され、即発応答遺伝子の発現を誘導する(佐々木)。数時間後には細胞周期制御に働くwaf-1蛋白質が増加するが、この過程は熱ショック蛋白質による安定化を介してp53蛋白質の制御を受けている(大西)。2.p53遺伝子をノックアウトした細胞では紫外線照射後のDNA複製の停止が見られず、姉妹染色分体交換(SCE)が高発する。p53がDNA損傷に対するチェック機能をしていることが明らかである(石崎)。3.活性酸素高感受性の大腸菌変異株の分離に成功した。これから新しいスーパーオキサイド誘導遺伝子(soi)3種類を単離し、一次構造を決定した。この遺伝子は細胞内の酸化還元のバランスに応答して発現が誘導されることから、刺激分子種は活性酸素そのものではないとする新しい概念が考えられる(米井)。4.ヒトの放射線高感受性遺伝病であるアタキシアテランジエクタシアの原因遺伝子の単離に取り組み、ヒトの第11染色体のq23領域の数センチモルガンの領域に限定することができた(江島)。5.放射線照射された雄マウスで交配して生まれたF1マウスではDNA反復配列の変化が高頻度で起こっていることが明らかとなった。DNAを標的とした標的理論では説明できない新しい現象であり、放射線応答が遺伝的不安定性を誘導するとと考えられ、その遺伝子制御の機構が注目される(丹羽)。

放射線応答、すなわち放射線を刺激として捉える放射線生物作用の概念は新しく、本研究はその放射線応答の遺伝子制御の機構を明らかにし放射線影響の新しい生物学的基盤の確立を目指している。哺乳動物細胞は微量の放射線に対しても鋭敏に反応し、初期応答遺伝子であるjunやfos遺伝子を発現させる。刺激分子種としては、酸化ラジカルが働き、その情報はフォスフォリパーゼCからCキナーゼおよびp38キナーゼへ伝達される放射線固有の伝達系があることが分かった(佐々木)。細胞応答の初期過程を大腸菌の酸化ストレス高感受性株でその遺伝子制御の機構を解析してきたが、本年度は特にチオレドキシン変異株について解析し、過酸化水素によるヒドロペルオキシダーゼI遺伝子の発現にはOxyR遺伝子が関係していることが分かった(米井)。放射線応答の生物学意義として細胞周期制御に関わる遺伝子、特にp53及びp21遺伝子、の挙動と機能に注目してきた。p53遺伝子の発現はγ線やX線によって誘導され、蛋白質が蓄積される。これには熱ショック蛋白との分子会合が働いているが、p53蛋白p21遺伝子の発現を制御している。このp21遺伝子の発現はp53蛋白依存的でありその挙動は重荷電粒子による照射でも同じであった(大西)。p53欠損マウスの細胞に紫外線を照射し、supF遺伝子を標的として調べたところ、誘発される突然変異に質的な違いがあることが明らかとなった(石崎)。マウス精細胞のγ線照射はDNA反復配列によるミニサテライトの突然変異を高率に起こし、遺伝的不安定性を誘導する。これは核分裂中性子でも同様であり、その効果はγ線より数倍高かった(丹羽)ヒトの放射線感受性を支配する遺伝子としてアタキシア・テランギエクタシア症の原因遺伝子を追跡してきたが、最近単離されたATM遺伝子とは別の遺伝子が存在する可能性が示唆された(江島)。放射線を刺激としてえる放射線生物作用の概念は新しく、本研究はその放射線応答の遺伝子制御の機構を明らかにし放射線影響の新しい生物学的基盤の確立を目指してきた。哺乳動物細胞は微量の放射線に対しても鋭敏に反応し、適応応答と呼ばれる耐性を獲得するとともに、増殖刺激となって一過性の細胞増殖が誘導される。適応応答はCキナーゼとp38MAPキナーゼを介した情報伝達ループによって誘導され、長時間持続する。伝達された情報はDNA組換え機構を制御し、誤りの少ない修復が優先される(佐々木)。この過程にp53蛋白が関係していることが明らかになったが、p38MAPキナーゼとp53蛋白の関係は明らかでない。p53はHSP72などの熱ショック蛋白と会合することが分かったので(大西)、HSPを介した制御が考えられる。p53蛋白は低線量の放射線でも蓄積されるが、微小重力の下でも蓄積誘導が認められる(大西)。p53遺伝子がストレス応答のキ-遺伝子となっていることを示唆する。p53欠損マウスの細胞では低線量放射線に対する適応応答が誘導されないが(佐々木)、この細胞での突然変異は野生型マウスの細胞と紫外線誘発突然変異の型の分布が異なる(石崎)。p53蛋白がDNAの修復を制御し、突然変異の効率と型を変えていることが考えられる。DNAの酸化損傷の中で最も重要と考えられるフォルミルウラシルの修復実験経が確立された(米井)。
膠原病におけるB細胞を表面分子をターゲットとした免疫治療法の研究

免疫系が破綻することにより生じる膠原病は長期にQOLを損ない生命を脅かす難治性疾患の代表的なものであり,発症機序の解明とその理解に立脚した新たな分子療法の開発が望まれている。その病態形成にT細胞をはじめとするリンパ球が重要な役割をしていることはよく知られているが、近年、膠原病の病態形成にB細胞の重要性が注目されており、実際、B細胞をターゲットしたさまざまな治療法が検討されてきている。そこで我々はB細胞の表面分子をターゲットとした治療法の可能性をまずSLEモデルマウス(NZB/W)を用いて検討した。ターゲット分子はB細胞の表面分子であるCD20で、モデルマウスにハイブリドーマにより作成したモノクローナルマウス抗マウスCD20抗体を投与したところ、末梢でのB細胞の除去がみられた。腎障害の出現頻度には有意差はみられなかったが、興味深いことに、抗CD20抗体投与群では、コントロール抗体投与群と比較して抗核抗体の出現が遅れた。またマウス抗マウスCD19抗体を作成するために、CD19ノックアウトマウスにCD19陽性マウス細胞を免疫して抗CD19抗体作製を行っている。またヒトCD19トランスジェニックマウスにマウス抗ヒトCD19抗体を投与したところ、末梢でのB細胞の除去がみられ、血清中免疫グロブリンの低下もみられた。ヒトCD19トランスジェニックマウスは、自己抗体の出現がみられるが、抗ヒトCD19抗体投与群では、その出現が抑制された。さまざまな自己抗体が病態形成と関与していることが知られており、さらなる検討が必要と考えられた。
パネル法による大学卒業生の成人前期の人生移行に関する研究

われわれは今回の研究助成を受ける以前より、首都圏の私立大学を1991年1993年に卒業した者たちの対象にして、学部在学中(4年生の12月)、卒業直後の6月、卒業2年目の6月という3時点の追跡調査(第一波調査)を、さらに1998年11月には「30代への移行調査1」(第二波調査初回)を実施してきた。そして今回、研究助成を得て、2002年11月に「30代への移行調査2」(第二波調査2回目)を実施した。「30代への移行調査2」は、「30代への移行調査1」の回答者のうち住所不明のケースを除く519名に対して実施し、379名の有効回答が得られた(回収率73%)。ただし、第一波の初回調査(学部在学中)の対象者は1570名に対する最終時点での追跡率は24%にとどまる。379名の性別は男性183名(43%)、女性196名(52%)。年齢は31歳から37歳まで広がっているが、9割が32歳から35歳の間にある。調査時点における対象者の職業と家族を中心とした生活状況については、『発達レポート』13号(早稲田大学人間総合研究センター、2003年)を参照されたい。また、379名のうちの98名(男性46名、女性52名)に対して、2003年7月から11月にかけて、面接法によるライフストーリー調査を実施したが、この結果については、『そして彼らは30代の半ばになった-バブル崩壊の前後に大学を卒業した若者たちのライフストーリー』(早稲田大学第一文学部社会学専修、2004年)を参照されたい。今後、われわれは全5時点の調査データを連結したパネルデータを構築し、大学卒業から30代の半ばに至るまでのライフコースの持続と変容に関する分析を進めていく。われわれは今回の研究助成を受ける以前より、首都圏の私立大学を1991年1993年に卒業した者たちを対象にして、在学中、卒業直後の6月、卒業2年目の6月という3時点の追跡調査(第一波調査)を、さらに1998年11月には「30代への移行調査」(第二波調査)をすでに実施してきた。そして今回の研究助成を受けて、2002年11月に第二波調査の二回目を実施する予定である。今年度はそれに向けての準備作業を行なった。第一に、第一波調査の縦断データセットの構築を行なった。この作業には莫大な時間を要したが、コードブックも完成し、パネル項目(反復質問項目)の個人水準での推移について単純集計結果を出した。この縦断データセットに来年度実施する調査のデータを連結すれば、大学卒業後の約10年間にわたる成人前期の移行過程を詳細に分析することが可能になる。第二に、定期的な研究会を開いて、パネルデータを用いた縦断分析の方法論の検討を行ない、その成果を日本社会学会大会や(財)家計経済研究所が主催のパネル調査カンファレンスで報告した。また、これまでの研究成果の一部をまとめて『変容する人生』(大久保孝治編著、コロナ社)を刊行した。第三に、2002年11月に実施予定の調査の対象者たちに継続して調査への協力をお願いするべく(同時に住所データベースの管理のために)、ニューズレター『ディベロプメント』の12号(2001年8月)と13号(2002年1月)を発行し、対象者に発送した。われわれは、5年前の1998年11月に、東京近郊の某4年制

私立大学の文理系の学部を1991年から1993年の3年間に卒業した男女1,110名を対象にして、郵送法による「30代への移行」調査を行い、555名(50.0%)の有効回答を得た。その基礎集計の結果は、早稲田大学人間総合センター発行の『発達レポート』12号(1999年11月)に発表した。今回、2002年11月に行った第2回「30代への移行」調査は、第1回の有効回答者555名のうち、その後の住所が不明の14名を除いた536名に対する追跡調査である。第1回の調査のときに第2回の調査の予告と、それへの協力をあらかじめお願いしておいた結果、378名(70.5%)から有効回答を得ることができた。第1回の調査のときに30歳前後であった対象者たちは、今回の調査では、30代の半ばにさしかかろうとしていた。現代社会の延長された青年期の最後の段階である30代の前半という人生の時期を、彼らはどのように送ったのか。2回の調査のデータをつなぎあわせることによって、「30代への移行」における変化と持続が明らかになるだろう。現在(2003年3月)、作業はデータの入力とクリーニングの段階にある。第2回調査の基礎集計は2003年度前半に『発達レポート』13号として発表予定であり、第1回と第2回のデータをつなげたパネル・データの分析結果は2003年度末までに報告書として刊行の予定である。
Th2非依存的なN.brasiliensis感染排除機構の解析

Th2非依存的N.brasiliensis(NB)排除機構の解析において本年度は以下の点を明らかにした。1)IRF4 KOにNBを感染させると、小腸への激しい好酸球の浸潤を認めた。腹腔内IL5の値は野生型に比べ高値で、このIL5が好酸球の浸潤を引き起こしていると考えられた。2)IL5の供給源として腸管に存在するナチュラルヘルパー(NH)細胞を想定した。未感染マウスのNH細胞からのTh2サイトカイン産生を比較したところ、IRF4 KO由来のもので高値を示した。IRF4がNH細胞におけるTh2サイトカイン産生を負に制御している可能性が示唆された。3)そこで、NH細胞内のIRF4発現を確認したところ、刺激に伴いIRF4の発現が認められた。siRNAによりIRF4をsilencingしたところ、Th2サイトカイン産生は著明に亢進した。4)抗IL5抗体によりIL5を中和したところ、IRF4 KOでは小腸への好酸球の浸潤が抑制されただけでなく、杯細胞の過形成も認められなくなり、その結果、排虫の著しい遅延を認めた。5)杯細胞の過形成がIL5の中和によって抑制されたことから、NH細胞からのIL13産生が直接杯細胞の過形成を引き起こしているというより、浸潤した好酸球からIL13が産生している可能性が考えられた。そこで、感染マウスの小腸LPの好酸球のサイトカイン産生を調べたところ野生型、IRF4KOとも産生が確認された。好酸球にはIRF4の発現を認めなかった。以上のことから、IRF4 KOにおけるTh2非依存的NB排除機構は、NH細胞から野生型よりも多量のIL5が産生され、このIL5によって好酸球が浸潤、浸潤好酸球からのIL13が最終的に杯細胞の過形成を引き起こすため排虫がおきることが明らかとなった。N.brasiliensis(NB)感染は、NB特異的Th2が誘導されると小腸の杯細胞にIL-13が作用し、粘液を産生することによりNBが排除されると考えられてきた。実際、Th2分化が起きないSTAT6 KOではNB排除は起こらない。転写因子IRF4はTh2分化に必須の転写因子で、IRF4 KOマウスはTh2分化が起きないことを我々は報告した。そこで、このマウスにNBを感染させたところ、野生型より1-2週遅れるもののNBは完全に排除され、Th2非依存的NB排除機構の存在が示唆された。◆野生型、IRF4 KOにNBを感染させ、経時的に成虫数、脾臓(全身免疫系)、腸間膜リンパ節細胞(所属リンパ節)、パイエル板細胞(感染局所)をNB粗抗原で刺激し、IL4、IL13産生を測定した。野生型は感染2週で排虫が完了、IRF4 KOは3週で排虫が完了した。野生型では排虫の時期に一致して抗原特異的IL4、IL13産生が認められたが、全経過を通じてIRF4 KOではこれら抗原特異的サイトカイン産生は認めなかった(パイエル板においてもTh2分化はなかった)。◆しかし、小腸の組織をPAS染色すると排虫の時期に一致して、野生型同様IRF4 KOでも杯細胞の過形成は認められ、Th2が誘導されなくとも、杯細胞の過形成は起こりその結果、排虫されるものと考えられた。◆しかし、小腸組織をHE染色したところ、野生型では様々な種類の細胞が浸潤しているのに対して、IRF4 KOでは著しい好酸球浸潤が認められた。◆この浸潤した好酸球のTh2非依存的NB排除への関与を確かめるために、抗IL5抗体(TRFK5)を投与し好酸球浸潤を阻止したところ、コントロール抗体に比べ排虫が著明に遅延した(現在実験継続中で最終的な排虫の有無については結論は出ていない)。これらの結果から、Th2非依存的NB排除のメカニズムの一つは好酸球によるものであることが判明した。現在、NBによる好酸球浸潤の機序を解析中である。

そこで、感染マウスの小腸LPの好酸球のサイトカイン産生を調べたところ野生型、IRF4KOとも産生が確認された。好酸球にはIRF4の発現を認めなかった。以上のことから、IRF4 KOにおけるTh2非依存的NB排除機構は、NH細胞から野生型よりも多量のIL5が産生され、このIL5によって好酸球が浸潤、浸潤好酸球からのIL13が最終的に杯細胞の過形成を引き起こすため排虫がおきることが明らかとなった。
イネの窒素利用効率の向上に向けて-秋田63号の高い窒素利用効率の要因解析-

我々は先に、イネ大粒品種・秋田63号が9.8t/haの超多収性を示すことを圃場試験で実証すると共にその超多収要因の解析を行い、秋田63号が、(1)単位吸収窒素量当たりのシンク容量が従来品種に比べ格段と大きいこと、(2)光合成産物の籾への転流効率に優れていること、(3)単位吸収窒素量当たりの玄米生産効率に優れること等を明らかにしてきた。今年度は、秋田63号の単位吸収窒素量当たりの収穫物容量が大きいことおよび乾物の籾への転流効率に優れているとの品種特性が、将来に予想される高CO環境条件下では収量増に対し優位に働き、更なる高収量が期待されると想定し、それを実証することを目的とした。栽培は、岩手県・雫石のFACE実験圃場で行なった。対照品種にあきたこまちを選び、施肥水準は標準施肥区と無窒素区の2区を設け、それぞれ3連で行なった。その結果、秋田63号の収量は、あきたこまちに対し普通大気条件では、施肥区で1,19倍、無窒素区で1.25倍の収量を示した。高CO2条件下での秋田63号の収量は、あきたこまちに対しさらに高くなり、施肥区で1,25倍、無施肥区で1.37倍の収量となった。以上より、秋田63号の収量は、あきたこまちに較べふつう大気CO2条件、高CO2条件のいずれの条件下においても、窒素栄養レベルによらず多収性が発揮され、高CO2条件下では普通CO2条件下よりさらに増収となることが示された。これらの結果は、「単位吸収窒素量当たりのシンク容量の拡大は、高CO2環境下でのイネの収量性の増大に大きく寄与する」ことを示すものである。秋田63号が、従来からの日本記録に迫る9t/haの収量を少ない施肥窒素量の下で2年続けて記録した。そしてその要因は、(1)単位吸収窒素量当たりのシンク容量が従来品種に較べ格段と大きいこと、そして、(2)乾物の穂への分配率が高く、収穫物指数が大きいことにあることを明らかにした。本研究では、高い収穫物指数を示した要因を探ることとした。その一因として、秋田63号の籾(種子)のシンク能が一般品種よりも高いということが考えられるため、これを評価することとした。指標は、炭素の主要な転流形態であるショ糖の輸送を担うショ糖トランスポーター(SUT)およびデンプン合成の鍵酵素であるAGPグルコースピロボスホリラーゼ(AGPase)の種子におけるmRNA量とし、これを登熟初期から完熟後期まで経時的に測定した。対照品種として、トヨニシキを用いた。秋田63号の種子におけるSUT mRNAの単位新鮮重当たりの量は、登熟前期に最大となり、以降登熟後期に最大時の117となるまで徐々に低下した。SUTのmRNA量には、単位新鮮重当たりでは秋田63号とトヨニシキとの問で著しい違いは認められなかった。秋田63号の種子におけるAGPase mRNAの単位新鮮重当たりの量は、登熟初期には極めて低かったが、その直後に急激に増加し最大となり、以降完熟期に最大時の1/2となるまで徐々に低下した。AGPaseのmRNA量には、単位新鮮重当たりでは秋田63号とトヨニシキとの間で著しい違いは認められなかった。以上のことから、秋田63号の種子のシンク能は単位新鮮重当たりでは対照品種と同程度であるが、その種子が大粒であるため、一粒当たりで見た場合には一般品種よりも高くなるということが示唆された。
リラクサの高誘電率発生の機構解明

リラクサ強誘電体固溶体(1-x)Pb(Mg_<1/3>Nb_<2/3>)O_3(PMN)-xPbTiO_3(PT)のあるPT組成範囲(0.1<x<0.2)に於いてrhombohedral(001)板に直流電界が印加されると、誘電率及びドメイン構造の電界依存性から、最初電界増加に伴い高誘電率領域から低誘電率領域へと電界誘起転移が生じ、同時に暗視野(光遮断)状態から明視野(光通過)状態へとドメイン構造も変化する。最初の暗視野状態は偏光顕微鏡のステイジの回転に対しても暗視野のままである。一旦電界により、低誘電率領域で光通過領域のメモリ状態へ移ると、誘電率、ドメイン構造はメモリされたままになる。ドメイン構造には<001>あるいは<010>方向に沿ったドメインウオールが見られ、電界極性反転による分極反転に伴い坑電界に対応して<001>あるいは<010>方向に沿ったドメインウオールが出現し、この時小さな誘電率異常が見られる。一旦分極が揃うとエンジニアードドメイン配置であるので安定なドメイン構造になり誘電率変化も少ない。この試料をキュリー温度まで上げて室温まで戻した状態の誘電率は高誘電率領域に戻り、偏光顕微鏡下での暗視野像はステイジの回転に対して暗視野像のままでas-grownの状態に戻っている。偏光顕微鏡のハロゲンランプは540nmのグリーンの波長を中心に400nmから600nmの範囲の光に対して暗視野になっておりリラクサーのドメインサイズはこれ以下であると考えられ、電顕によるドメインサイズ200nm以下の報告もある。このことからリラクサー強誘電体固溶体には光バルブ誘電率制御素子として使用可能であることが分かる。この事実を特許として出願した。更に、リラクサ強誘電体混晶Pb(Zn_<1/3>Nb_<2/3>)O_3-PbTiO_3のうち、正方晶相を示すPZN-20%PTと、室温で菱面体晶相を示し濃度相境界に近いPZN-8%PTのエッチング処理表面のAFM観察を行った。PZN-20%PTでは、90°および180°ドメインウォール構造が観察できた。PZN-8%PTでは、(001),(110),(111)に垂直な表面の観察から、180°,109°,71°のドメインウォール構造が観察できた。これらのドメインウォール構造の解析では、弾性的な条件であるSaprielの理論と、ドメインウォール表面で分極電荷が存在しないという電気的な条件の両方を満たしていることが確認できた。PZN-8%PTにおいてチャージドウォールは存在しない。PZN-8%PTの濃度相境界における正方晶相と菱面体晶相の相転移は、散漫な相転移であることが指摘されているが、局所的にはシャープな相転移をし、転移温度が場所に依存して分布していることがわかった。また、室温でのドメイン-ウォール構造は、通常の強誘電体と同様に古典論によって理解できることを実験的に示した。大きな誘電率薄膜はDRAMにおける蓄積キャパシタだけでなく、次世代ULSIのFETゲート絶縁膜として注目されている。室温で比誘電率が20000程度のリラクサ強誘電体Pb(Mg_<1/3>Nb_<2/3>)O_3(PMN)と強誘電体PbTiO_3(PT)の強誘電体固溶体単結晶等を選定し、比誘電率の厚さ依存性を現在調査している。この様な高誘電率発生機構として微細ドメイン構造との関連を明らかにするため、光学顕微鏡、操作プローブ顕微鏡(本科研費により購入)、電気力顕微鏡(次年度購入)や電子顕微鏡を用いて、強誘電体ドメインやそれに伴う強弾性ドメインあるいはそれらの起源である極性微小領域等、様々な種類及びサイズのドメイン像を調査している。ペロブスカイト強誘電体固溶体の濃度相境界近傍の分極反転についてランダウ型熱力学的ポテンシャルを用いて濃度相境界近傍での誘電率、圧電定数、弾性定数の増大を自発分極にたいする垂直方向の不安定性から生じていることを解明した。更に、その理論を用いた分極反転のダイナミックスからメモリデバイスにおける強誘電体薄膜分極反転機構の解明にも重要な貢献を行った。FeRAM材料に関連して、特にリラクサ強誘電体-PT固溶体単結晶の濃度相境界付近のrhombohedral側での方位依存性は(100)方位で分極反転にたいする残留分極の劣化現象やimprintに関して分極方位(111)より優位であるというドメインエンジニアリングを利用した立場での材料提案を現在行っている。例えば現在電気炉(購入)を用いて育成しているPb(In_<1/2>Nb_<1/2>)O_3(PIN)-PTは高キュリー温度(280°C)を有し、PMN-PTと同様、合致溶融化合物にちかくrhombohedral側でペロブスカイト相が作りやすい、また高いキュリー温度(400°C)を有するPb(Yb_<1/2>Nb_<1/2>)O_3(PYN)-PTについても小さいながらも単結晶育成をしている。これらのことから、FeRAMとしての材料設計指針の提案を行っていきたい。リラクサ強誘電体及びそのPbTiO_3(PT)固溶体は、メモリーFERAMあるいはDRAMキャパシタ高誘電率薄膜等への応用が期待されている。

これらの物質は、相転移温度近傍における誘電率のピークがブロードで温度係数が小さいこと、誘電率が著しく大きいこと、またそのモルフォトロピック相境界(MPB)で自発分極に垂直方向の不安定性のためメモリー等の特性が優れていることが理論的に石橋教授(1班)を含む本研究班により明らかにされて来ており、高いキュリ温度を有する単結晶材料のrhombohedral(100)板がFERAMに有用であることを指摘している。本研究班の目的は強誘電体薄膜素子に用いられる高誘電率物質リラクサ強誘電体における物性の解明や疲労効果の無いFERAMのデザインの提案である。本研究では、リラクサ強誘電体固溶体Pb(Zn_<1/3>Nb_<2/3>)O_3-PbTiO_3(PZN-PT)-Pb(Mg_<1/3>Nb_<2/3>O_3(PMN)Pb(In_<1/3>Nb_<2/3>)O_3-PbTiO_3(PIN-PT)を用いて、ラマン散乱、電子線回折、電気光学、ドメイン構造の変化の観測を行った。ラマン散乱と電子線回折の結果、PZNにおいて観測されるラマン活性モードの起源を明らかにし、また、PZN-PT混晶系の低周波数モードはPTにおけるソフトモードと同一の起源のモードであることが結論できた。電気光学応答測定の結果、リラクサ中には、不均一な歪場と誘電異方性があることが実験的に見出された。偏光顕微鏡を用いたドメインの構造変化を分極反転機構との関連に於いて調べ、分極反転ルートがrhombohedral(100)板の方がtetragonal(100)板に比べて、多肢に亘ることを実験的に明らかにし、分極が電極に垂直な角度からある角度ずれている方位の方がFERAMの疲労効果の少ないデザインであることを提案した。更に、自発分極に垂直方向の不安定性からリラクサの高誘電率発生のメカニズムについて議論した。応用上重要なエンジニアドドメイン配置でモルフォトロッピク相境界近傍のリラクサ強誘電体Pb(In_<1/2>Nb_<1/2>)O_3-PbTiO_3(PIN-PT)において電界によるrhombohedral相からtetragonal相への相転移が(110)面に沿って進展して行く様子を捉え、rhombohedral相とtetragonal相が共存するモザイク状結晶で、pseudo-cubic(110)面がこの相転移に重要な役割をになうことを明らかにした。電界変化に伴う誘電率や分極とドメイン構造の変化の同時測定から、rhombobedral(001)板及び(110)板を用いて、石橋理論の分極垂直方向の不安定性による高誘電率の発生や、分極のドメイン構造の変化との関連を明らかにした。また、リラクサ強誘電体Pb(Zn_<1/3>Nb_<2/3>)O_3-PbTiO_3(PZN-PT),のPZN-8%PTに於いてドメインの不均一構造を見出し、この不均一構造はリラクサPZNのBサイトイオンの組成の偏りによって発生し、相転移と誘電特性に大きく影響を与えることを明らかにした。PZN-PTのエッチング処理表面のAFM観察からPZN-20%PTではSapriel理論で説明できるドメインウオールが観測されるが、PZNの組成が増加するに従い、光学顕微鏡では観測できない微小な強誘電体ドメインが観測され、ドメインウオール構造が複雑になって行くことを明かにした。また薄膜でのインプリント効果に関連して、MgO基板上のPT薄膜を用いて、出現しているインプリント効果を、膜と基板との間に発生する応力効果を、静水圧力を導入して緩和させ、インプリント効果を消失させることに成功し、酸素vacancyからインプリント効果が出現しているのではないことを証明した。インプリント効果の起源を検討している。リラクサ強誘電体固溶体(1-x)
急性肺損傷発生における好中球,マクロファージ,好中球エラスターゼの関与

急性肺損傷の発生機序における蛋白分解酵素,特に好中球エラスターゼの関与について,覚醒時緬羊を用い,以下の実験的研究をおこなった。(1)エンドトキシン肺損傷における特異的好中球エラスターゼ阻害剤,ONO-5046の効果(i)前投与の効果E.coliエンドトキシン(ETX)1μg/kg投与前,1時間から,本剤,10mg/kg/hr,を経静脈的に投与しておくと,ETXにより若起される早期の肺高血圧,末梢血好中球減少および後期の肺血管透過性亢進は明らかに抑制された。肺高血圧に一致して認められる血中および肺リンパ液中のトロンボキサンB_2および6-heto PGFidの上昇も本剤により抑制された。また,肺への好中球の集積も抑制された。ONO-5046,1mg/kg/hr,を(i)と同様に投与すると,上記の肺高血圧,末梢血好中球減少,後期の肺血管透過性亢進は,およそ50%に抑制された。(iii)後投与の効果(2)肺微小空気塞栓による肺損傷におけるONO-5046の効果肺微小空気塞栓による肺高血圧,肺血管透過性亢進にはONO-5046は変化を与えなかった。以上より,覚醒時緬羊では,エンドトキシン肺損傷の発生には好中球エラスターゼの関与が推定されるが,肺空気塞栓による肺損傷にはその関与が少ないものと推定された。〓羊のエンドトキシン血症による肺損傷は、人のARDS(呼吸窮迫症候群)の有用なモデルである。著者らはこのモデルを用い急性肺損傷の発生機序につき検討を加えてきた。今回はこの肺損傷に対する好中球エラスターゼの関与につき検討した。特異的好中球エラスターゼ阻害剤(ONO-5046)を用い、エンドトキシン(ug/kg投与により〓起される種このlung dipfuctionについて、ONO-5046の効果を検討した。ONO-5046 10mg/kg/hrの前および持続静脈内投与はエンドトキシンによる肺高血圧、肺血管透過性亢迫による肺水腫、血中球(特に好中球)の減少、低酸素血症などを有意に抑制した(ARRD143;A580,1991)。次に、ONO-5046 1mg/kg/hrを投与し、dose-responseの効果につき検討した。左記に示すようにdose-respouseにlung dysfunctionを抑制した。ONO-5046は人のARDSの治療に有用と思われる。平成5年度に,慢性肺リンパ瘻を作製した覚醒時緬羊を用い,以下の2点につき検討した。1.E.coli 1μg/kg投与によるエンドトキシン肺損傷における特異的好中球エラスターゼ阻害剤(ONO-5046)の濃度依存的効果:ONO-5046,1mg/kg/hrにより処置すると,前年度報告した10mg/kg/hrの効果に比し,エンドトキシン投与による肺高血圧,肺血管透過性亢進,末梢血好中球数の減少は各々,およそ50%の抑制効果がみられた。ONO-5046の投与はエンドトキシン注入,1時間前であり,肺高血圧の発生におけるエラスターゼの関与を検討するために,エンドトキシン注入後,早期に本剤を投与する実験が必要であろう。2.ONO-5046の肺微小空気塞栓時の急性肺損傷におよぼす効果:肺動脈内への径0.3mmのシリコンチューブを介しての空気1.2ml/min,2時間の肺空気塞栓前よりONO-5046 10mg/kg/hrを投与しても,空気塞栓より惹起される,肺高血圧,肺血管透過性亢進は抑制されなかった。肺空気塞栓による急性肺損傷には好中球エラスターゼの関与は少ないものと考えられた。今後,肺の組織的な検討も必要と思われる。
大気蛍光望遠鏡による宇宙線空気シャワー観測のための雲距離測定

最高エネルギー領域の宇宙放射線の観測は、宇宙放射線が地球大気との相互作用で引き起こす空気シャワーと呼ばれる現象を観測することで行われている。その観測方法の一つに、空気シャワーが引き起こす大気からの蛍光を望遠鏡を用いて観測する方法がある。通常の光学天文台による宇宙観測と異なり、大気傾向望遠鏡による観測は宇宙からの光ではなく大気からの光を観測してるため、雲の方向だけでなく距離が問題となる。この研究は大気蛍光観測に影響を与えず、雲の方向と距離を観測する方法を試験し、宇宙線観測に反映するための研究である。
手術用顕微鏡(キセノン光源)による神経細胞障害の危険性

近年、脳神経外科領域では良好な手術視野を得るため、高輝度・高倍率の手術用顕微鏡を使用するようになった。以前はハロゲンランプを光源に用いていたが、最近の手術用顕微鏡はキセノンランプを使用している。キセノンランプは紫外領域に強いスペクトルを持ち、神経細胞障害を起こす可能性がある。そこで、ロジスティック回帰分析により、神経細胞障害を引き起こす紫外線強度をラットを用いて求めた。30%の神経細胞障害を引き起こす紫外線強度は3.7mwatts/cm250%の神経細胞障害を引き起こす紫外線強度は5.4mwatts/cm270%の神経細胞障害を引き起こす紫外線強度は7.1mwatts/cm2であった。現在、臨床で使用されている手術用顕微鏡の紫外線照射強度を測定したところ、最も多いもので0.320mwatts/cm2であり、急性の組織障害を生じる可能性は低いと考えられた。次に、脳表に散布した生理食塩水の紫外線照射に対する神経細胞保護効果を検討した。生理食塩水の層0.5mm,1.0mm,2.0mmに対する24時間後の細胞障害度はそれぞれ42 23%、21 18%、10 8%で、生理食塩水による明らかな保護効果がみとめられた。生理食塩水による紫外線の吸収率を測定したところ、ほとんど吸収されていなかった。このことより、生理食塩水による直接の保護効果が存在するか、もしくは生理食塩水により紫外線がscatteringし脳表に対する紫外線刺入角度が減少したことが関与していると考えられた。キセノンランプはその光特性として365nmの紫外領域に強いピークを持ち、神経細胞障害を起こす可能性がある。そこで、ラットの左頭頂骨に2mm×2mmのcranial windowを開け、365nmの紫外線フィルターを装着した200wキセノンランプを用い、紫外線(365nm)を照射した。0,0.3,1.3,4.4,9.6mwatts/cm2のニネルギーレベルで30分間の照射により0 0%,0 0%.9 6%,42 23%,90 4%の経細胞が照射24時間後に組織学的障害が認められた。ロジスティック回帰分析により、神経細胞障害を引き起こす、紫外線強度は以下のように算出された。30%の神経細胞障害を引き起こす紫外線強度は3.7mwatts/cm250%の神経細胞障害を引き起こす紫外線強度は5.4mwatts/cm270%の神経細胞障害を引き起こす紫外線強度は7.1mwatts/cm2現在、臨床で使用されている手術用顕微鏡の紫外線照射強度を測定したところ、最も多いもので0.320mwatts/cm2であった。神経細胞障害を引き起こす域値の10%以下であり、急性の組織障害を生じる可能性は低いと考えられた。紫外線は水に吸収されることが知られており、脳表面の水分は神経細胞保護効果を示す可能性がある。臨床上は、脳表に生理食塩水を滴下し脳の乾燥を防ぐ事が多く、神経細胞保護効果が期待できる。そこで、本年度は生理食塩水の紫外線照射に対する神経細胞保護効果を検討した。脳表に生理食塩水の層(0.5mm,1.0mm,2.0mm)を形成し、cranial window内に4.4m watts/cm2の紫外線を照射した。照射24時間後に潅流固定を施行し、ヘマトキシリンエオジン染色によりcranial window部位の障害神経細胞数をカウントした。

生理食塩水の層0.5mm,1.0mm,2.0mmに対する24時間後の細胞障害度はそれぞれ42 23%、21 18%、10 8%で、生理食塩水による明らかな保護効果がみとめられた。生理食塩水による紫外線の吸収率を測定したところ、ほとんど吸収されていなかった。このことより、生理食塩水による直接の保護効果が存在するか、もしくは生理食塩水により紫外線がscatteringし脳表に対する紫外線刺入角度が減少したことが関与していると考えられた。
エピゲノム修飾因子を標的とした悪性脳腫瘍の異常エピゲノムの修復

脳腫瘍を自然発生するMADMマウスモデルを用いて、平成28年度は阻害剤による細胞増殖抑制効果の確認と、動物実験にてMADMマウスに対してEZH2の阻害剤投与を開始した。平成29年度は阻害剤投与実験を複数個体に行うことで再現性を確認する実験を続けた。また、阻害剤投与後のMADMマウスの腫瘍細胞から回収したRNAを用いたマイクロアレイ法にて遺伝子発現変化の解析を進め、また動物実験の裏付け実験としてMADM細胞株のEZH2をノックダウンした細胞株を用いた実験を進めた。細胞株の樹立等に時間を要したため、平成30年度は同様に以下の実験を進めた。(1)阻害剤投与後の脳腫瘍のRNAを用いたマイクロアレイによる遺伝子発現解析これまでに研究代表者は脳組織の凍結切片を作成し、腫瘍部位からDNA, RNAを回収し解析する方法を確立している。本研究では治療後のMRIを施行したマウスをサクリファイスし、凍結切片からRNAを回収した。複数個体から解析に用いることができるクオリティーを有したRNAを回収して、マイクロアレイの準備中である。予備実験として、EZH2をノックアウトしたMADMマウスを樹立し、腫瘍抑制効果を確認することができ、腫瘍細胞から回収したRNAを用いたマイクロアレイ解析を行った。エピゲノム異常を同定していた遺伝子群の遺伝子発現変化を確認することができた。(2)MADM腫瘍細胞株のEZH2ノックダウンによる細胞増殖抑制効果と遺伝子発現の解析ノックダウンに用いるshRNAのトランスフェクションを複数の細胞株に対して行い、ノックダウン効果、細胞増殖抑制効果を確認した。shRNAの安定発現細胞株を樹立することができ、その解析準備中である。平成28年度は腫瘍細胞株を用いて、in vitro研究にて阻害剤による細胞増殖抑制効果、遺伝子発現変化の解析を予定した。動物実験ではこれまでに樹立しているMADMマウスに対してEZH2の阻害剤投与を開始した。当初の予定は(1)腫瘍細胞株への阻害剤投与実験による、細胞増殖抑制効果の評価と遺伝子発現解析、(2)MADMマウスに対するEZH2阻害剤投与による腫瘍抑制効果の評価、(3)MADM腫瘍細胞株におけるEZH2ノックダウンのためのshRNAベクターの作成であった。それぞれの進捗状況を記載する。これまでに樹立していた腫瘍細胞株(3細胞株)を用いてMTTアッセイを行い腫瘍抑制効果を認めることを証明した。阻害剤を数日間投与した細胞株からRNA、タンパク質を回収し、遺伝子発現等を解析し、発現変化を示す遺伝子群を同定した。またEZH2はヒストン修飾の中でも、ヒストンH3リシン27トリメチル化(H3K27me3)修飾を行うことが知られている。阻害剤使用後のタンパク質に対して抗H3K27m3抗体を用いたウエスタンブロッティング法を行い、H3K27me3修飾の低下を確認した。これまでにMADMマウスの腫瘍形成過程を、動物用脳MRIにて評価する方法を確立した。本研究では腫瘍形成期にMRIを施行後、阻害剤を経口投与し、治療終了後にMRIにて評価し腫瘍増殖抑制効果を証明した。EZH2ノックダウンのためのshRNAベクターの作成については、現在shRNAベクターを作成途中である。当初予定していた実験内容の中でいくつか遅れている点もあるが、動物を用いた実験が多いことが原因と考えられ、技術的な問題や論理の相違等が原因となっているわけではなく、進めることができている。脳腫瘍を自然発生するMADMマウスモデルを用いて、平成28年度は阻害剤による細胞増殖抑制効果を確認した。これらの結果を受けて、平成29年度は阻害剤投与実験を複数個体に行うことで再現性を確認する実験を続けている。また、阻害剤投与後のMADMマウスの腫瘍細胞から回収したRNAを用いたマイクロアレイ法にて遺伝子発現変化の解析を進めた。また動物実験の裏付け実験としてMADM細胞株のEZH2をノックダウンした細胞株を用いた実験を進めた。(1)阻害剤投与後の脳腫瘍のRNAを用いたマイクロアレイによる遺伝子発現解析これまでに申請者は脳組織の凍結切片を作成し、腫瘍部位からDNA, RNAを回収し解析する方法を確立している。現在複数個体から解析に用いることができるクオリティーを有したRNAを回収しており、マイクロアレイによる網羅的遺伝子発現解析を準備中である。また投薬実験も繰り返しており、解析に用いる個体数も増やしているところである。現在はそのshRNAの安定発現細胞株の樹立を行っているところである。本研究で用いるMADMマウスモデルは脳腫瘍を自然発生するモデルであり、腫瘍を形成するまでの期間が長いこと(生後約100日で腫瘍形成)、腫瘍細胞株を樹立できる可能性は高いものではなく、複数の細胞株を樹立するためには多くの個体数を要することから遅れが出ているものと考えられる。また、阻害剤投与中に予期せず死亡する個体も多いため、安定した結果を得るためには多くの個体を要するため、概ね個体の準備に予想よりも多くの時間を要していると考えられる。論理に矛盾しない結果が得られているため、再現性の担保のために時間を要しているものと考えられる。脳腫瘍を自然発生するMADM

マウスモデルを用いて、平成28年度は阻害剤による細胞増殖抑制効果の確認と、動物実験にてMADMマウスに対してEZH2の阻害剤投与を開始した。平成29年度は阻害剤投与実験を複数個体に行うことで再現性を確認する実験を続けた。また、阻害剤投与後のMADMマウスの腫瘍細胞から回収したRNAを用いたマイクロアレイ法にて遺伝子発現変化の解析を進め、また動物実験の裏付け実験としてMADM細胞株のEZH2をノックダウンした細胞株を用いた実験を進めた。細胞株の樹立等に時間を要したため、平成30年度は同様に以下の実験を進めた。(1)阻害剤投与後の脳腫瘍のRNAを用いたマイクロアレイによる遺伝子発現解析これまでに研究代表者は脳組織の凍結切片を作成し、腫瘍部位からDNA, RNAを回収し解析する方法を確立している。本研究では治療後のMRIを施行したマウスをサクリファイスし、凍結切片からRNAを回収した。複数個体から解析に用いることができるクオリティーを有したRNAを回収して、マイクロアレイの準備中である。予備実験として、EZH2をノックアウトしたMADMマウスを樹立し、腫瘍抑制効果を確認することができ、腫瘍細胞から回収したRNAを用いたマイクロアレイ解析を行った。エピゲノム異常を同定していた遺伝子群の遺伝子発現変化を確認することができた。(2)MADM腫瘍細胞株のEZH2ノックダウンによる細胞増殖抑制効果と遺伝子発現の解析ノックダウンに用いるshRNAのトランスフェクションを複数の細胞株に対して行い、ノックダウン効果、細胞増殖抑制効果を確認した。shRNAの安定発現細胞株を樹立することができ、その解析準備中である。実験系とマウスモデルの確立はできており、今後は同様の手法を用いて進めていく予定である。細胞実験、動物実験共に手法は確保しており、マウス個体を確保する技術も確保できているものと考える。今後はこれまでの結果について、統計的に証明することを目的として複数の実験を重ねていく予定である。今年度は実験系の確立とマウスモデルの確立が主であったため。今年度は実験手技、試薬を増やすことはなく、個体数を増やして安定した結果をえるための実験が主であったためと考える。次年度はデータ解析を進め、論文投稿を目標とする。次年度は確立した実験系を頻回に行い、かつ個体数を増やして統計的に意義のあるデータを作るために費用を費やす予定である。