hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
病原細菌のゲノム進化における逆転写酵素とレトロエレメントの役割

細菌逆転写酵素は,細胞内でcDNA産物であるmulticopy single-stranded DNA(msDNA)と呼ばれるRNA-DNA複合体の合成に必須の酵素である。細菌逆転写酵素遺伝子(ret)は,ゲノム上でmsDNAの配列をコードする領域とともにレトロンと呼ばれるオペロンを形成しており,一種のレトロエレメントであると考えられている。本研究では,転移性遺伝因子の一種と考えられるレトロンが細菌のゲノム進化にどのように寄与しているのか,また他の転移性因子との関連性などについて明らかにすることを目的としている。これまでの解析で,新たにSalmonella enterica serovar Typhimurium由来のレトロンの詳細な解析を行い,msDNA-St85の構造解析を行った。このレトロンは,S.Typhimuriumの多剤耐性株であるDT104株にも見つかっており,この株では複数の薬剤耐性遺伝子を含むpathogenicity islandとレトロンが隣接して存在している。薬剤耐性遺伝子の転移に関与しているインテグロンの場合,転移遺伝子カセットの形成に逆転写酵素が関与しているという説があることからインテグロンの解析も同時に行っている。これまでにVibriofluvialis, salmonella,毒素源性大腸菌(ETEC),腸管侵入性大腸菌(EIEC)などから新たなインテグロンを単離・解析している。
海馬回路網からの刺激に依存した成体神経幹細胞の運命決定機構の解明

成体海馬における新生ニューロンの数は、特定の生活習慣(運動や学習)や病態時(脳梗塞や癲癇)に増加することが知られていた。そこで、これまでに、脳梗塞の動物モデル(サル、ラット、マウス)を用いて、どのような仕組みにより、新生ニューロンの数が増加するかについて、検討を進めてきた。サルの中大脳動脈閉塞モデルを用いて、研究を行ったところ、梗塞を誘導した側の海馬では、新生ニューロンの数が、健常時に比較して4倍以上になっていることがわかった。新生ニューロンは、成体海馬において、成体神経幹細胞(タイプ1細胞)から、ニューロン前駆細胞(タイプ2細胞)を経て、分化することが知られている。そこで、本年度は、マウスの自発運動モデルを導入し、どの細胞が応答しているかについて解析を進めた。すると、運動後に、成体神経幹細胞の増殖が顕著に増していることがわかってきた。そこで、さらにこの機構の分子メカニズムを明らかにするために、脳スライスを用いた研究を実施した。これまでに行った予備研究により、海馬回路(貫通線維)を電気刺激することにより、神経幹細胞に、カルシウム応答が誘起されることが示唆されていた。この反応が、カルシウムオシレーション様のパターンであったことから、イノシトール3リン酸(IP3)に関連したカルシウム応答であることが推定された。さらに、成体神経幹細胞の突起は、貫通線維(グルタミン酸神経)部位に到達していることがわかった。この突起部分にグルタミン酸を投与したところ、細胞体の部分にカルシウム応答が見られることがわかった。阻害薬などを用いた実験から、神経幹細胞はmGluR5分子を利用して神経刺激を受け取っていることが示唆された。我々はこれまでに、成体海馬において神経幹細胞から新生ニューロンが生み出されるニューロン新生の細胞分化過程を解き明かすために、『蛍光ガイド神経幹細胞パッチクランプ法』を開発し、分化段階の異なる2種類の神経幹細胞(Type-1細胞とType-2細胞)を同定した。そして、後期神経幹細胞であるType-2細胞は、海馬のGABA神経より興奮性の神経入力を受け、海馬回路の活動に依存してニューロン分化が促されていることを見出した。本研究においては、カニクイザルの中大脳動脈閉塞モデルを用いて、霊長類においても脳梗塞後に海馬新生ニューロンの数が顕著に増加することを見出した。そして、脳梗塞後に新生ニューロンが増加する機構を解明するために、げっ歯類中大脳動脈閉塞モデルを用いて研究を行った。すると、驚くことに、中大脳動脈の閉塞後2日目から海馬回路の活動性が顕著に増大することが、この動物の海馬に挿入した慢性電極からの記録により明らかとなった。つまり、脳梗塞後のニューロン新生の増加においても、海馬回路の活動上昇が寄与していることが推測された。この活動上昇に応じて、Type-1細胞が活性化され、この細胞の増殖が誘導されることが明らかとなった。そして、Type-2細胞の増加を経て、新生ニューロン数が増加することが判明した。海馬回路の活動によりどのような仕組みでType-1細胞が活性化されるかを明らかにするために、海馬スライスを用い嗅内皮質から海馬への投射線維である貫通線維を高頻度(テタヌス刺激、シータバースト刺激等)で電気刺激し、Type-1細胞に誘起されるカルシウム応答を評価した。その結果、貫通線維を40μAの強さでシータバースト刺激することで、Type-1細胞に強いカルシウム応答が誘導されることが示された。この応答が引き金となって、Type-1細胞の増殖が誘導されていることが推定された。
アポトーシス抑制遺伝子bcl-2トランスジェニックマウスを利用した発がん機構の解析

種々の刺激で惹起されるアポートシスのシグナルは、最終的に共通経路に集約される。Bcl-2およびBcl-xLは、ほとんと全ての刺激で誘導されるアポトーシスを抑制しうることから、Bcl-2,Bcl-xLはアポトーシスの共通経路のクリティカルなステップを抑制制御しているものと考えられている。しかし、その生化学的機能は不明であり、本年度はその解明を主目的とし、特にネクローシス系の利点を利用した解析を行なった。1.アポトーシスを抑制するBcl-2やその類似遺伝子産物Bcl-xL、およびICEファミリーシステインプロテアーゼ(アポトーシス実行因子)の阻害剤が、ミトコンドリア呼吸鎖の阻害剤で誘導されるネクローシスを抑制することを示した。このことは、少なくとも一部のネクローシスとアポトーシスのシグナルが共通ステップを通過することを示している。2.呼吸鎖の阻害剤で誘導されるネクローシスは、その細胞死に至る過程、特にミトコンドリアにおける変化がよく解析されているのでミトコンドリアを細胞局在場所に持つBcl-2やBcl-xLの機能解析に有用と判断し解析を行った結果、Bcl-2,Bcl-xLは、細胞死の時にみられるミトコンドリアの膜電位の低下を抑制しうることが明らかなった。3.ネクローシスに限らず、Bcl-2,Bcl-xLはアポトーシス時に起こるミトコンドリアの膜電位低下も抑制した。5.ICE阻害剤は、細胞死を抑制するが、ミトコンドリア膜電位の低下は抑制できなかった。これらの結果は、ミトコンドリアの膜電位低下が細胞死(アポトーシスおよびネクローシス)の重要な引金になっていることを示唆しており、Bcl-2,Bcl-xLはその電位低下を抑えることにより細胞死を抑制していると考えられる。一方、ICE様プロテアーゼはミトコンドリアの膜電位低下より下流で機能していると考えられる。ヒトリンパ腫に見られる染色体転座t(14;18)の解析から同定したbcl-2がん遺伝子は細胞増殖には顕著な関与を示さず細胞死を抑制するというユニークな機能を有する。このがん遺伝子の発見は、細胞死の抑制が発がん過程において重要なステップであるという新しい概念をがん研究の分野に提示した。その後複数のがん関連遺伝子が細胞死と係わる機能を持つことが示され、細胞死はがん研究においても重要なテーマとなった。本研究は発がんに係わる細胞死抑制の分子機構を解明すると同時に、bcl-2活性化を伴うリンパ腫の発生とより高い悪性度の獲得の分子機構を明らかにすることを目的としている。リンパ腫発生に係わる遺伝子群の解析のために、BまたはT細胞でbcl-2を過剰発現するトランスジェニックマウスを用い、新生児にモロニ-白血病ウイルスを染色させ悪性リンパ腫発生に必要な遺伝子群に分子タグを付ける実験系を利用した。ウイルス感染により悪性リンパ腫発生が促進されB/bcl-2マウスではB,Tリンパ腫が、またT/bcl-2マウスでは未熟なT細胞リンパ腫が発生した。複数のリンパ腫においてc-myc遺伝子の関与が確認され、ヒトの瀘胞性リンパ腫の高悪性度獲得プロセス解析の実験モデル系に成りうることを示した。細胞死抑制の分子機構の解明に向け、bcl-2の生化学的機能の割り出しと細胞死実行遺伝子群の解析を行なってきた。bcl-2の生化学的機能としては、抗酸化経路での機能が最も有力なモデルであるが、無酸素下で誘導される細胞死をbcl-2が効率よく抑制することとその系に活性酸素が関与しないことを実証することでbcl-2/抗酸化経路での機能のモデルを否定することが出来た。また細胞死実行遺伝子としてced3/ICE遺伝子が最近注目されているが、ICE類似遺伝子を複数単離することに成功した。

これらの結果は、ミトコンドリアの膜電位低下が細胞死(アポトーシスおよびネクローシス)の重要な引金になっていることを示唆しており、Bcl-2,Bcl-xLはその電位低下を抑えることにより細胞死を抑制していると考えられる。一方、ICE様プロテアーゼはミトコンドリアの膜電位低下より下流で機能していると考えられる。
遺伝子工学的手法を用いた肺動脈の低酸素応答の分子生物学的解析と制御の研究

低酸素性肺高血圧の進展には、筋性肺動脈の収縮と中膜の肥厚、非筋性肺動脈への平滑筋増殖が認められる。このような病理学的所見から肺動脈の位置によって低酸素応答の相違が存在するのか、また、肺動脈の低酸素応答の特性を分子レベルであきらかにし、その結果を基に低酸素性肺高血圧の進展の制御の可能性を探ることを目的として本研究を行った。研究実績の概要は以下の通りである。2. HIFlαcDNAの一部をプローブにしてヒト肝臓癌細胞株(Hep3B),ヒト肺胞上皮細胞株(A549),ヒト肺動脈内皮細胞の低酸素環境下におけるHIFlαの発現をmRNAレベルで評価した。HIFlαの発現は低酸素暴露48時間までHep3B,肺動脈内皮細胞において漸増傾向を示したが、一方、A549ではHep3Bや肺動脈内皮細胞に比較してHIFlαの発現は低い漸増傾向は示さなかった。3. HIF-1の認識塩基配列5'-RCGTG-3'をレポーター遺伝子と組み合わせ各種血管内皮細胞へ遺伝子導入することで各種血管内皮細胞の低酸素応答を評価するシステムを構築し、内皮細胞の低酸素応答解析を行った。HIFが認識する低酸素応答塩基配列(HRE)を含むリポーター(Re)遺伝子発現アデノウイルスベクター(Adv)AdvHREとHREを含まないRe遺伝子発現Adv(control)を相同遺伝子組換えにより作成した。肺末梢血管内皮細胞は近位肺動脈血管内皮細胞、大動脈内皮細胞に比較して早期に高いHIFを介する低酸素応答を示した。これは、肺末梢血管内皮細胞が、低酸素へ早期の適応と肺血管リモデリングに重要な役割を果たしていることが示唆された。またHIFが認識する低酸素応答塩基配列(HRE)を細胞内へ導入し、過剰な低酸素応答を抑制する実験はまだ完遂していないがVEGFの発現を指標とした場合、抑制傾向が認められた。これは、過剰な低酸素応答で起こりうる病的状態を防ぐ手段となりえることが期待された。このような病理学的所見から肺動脈の解剖学的位置によっても低酸素応答の相違が存在するのか、また肺動脈の低酸素応答の特性を分子レベルで明らかにし、さらに、その結果を基に低酸素性肺高血圧進展の制御の可能性を探ることを最終的な目的として本研究を行う。平成9年度に行った研究は以下の通りである。2.HIF1αcDNAの一部をプローブにして低酸素培養下Hep3B細胞株、ヒト肺胞上皮細胞株(A549)、ヒト肺動脈内皮細胞のHIF1αの発現を経時的に調べた結果、Hep3B細胞株、肺動脈内皮細胞では、低酸素曝露前でもわずかに発現を認め、以後48時間まで発現の程度は高まる傾向を示した。特にHep3B細胞株では低酸素曝露12時間で肺動脈内皮細胞以上のHIF1αの高い発現を示した。A549細胞株ではHIF1α発現はHep3細胞株、肺動脈内皮細胞に比し著しく低い傾向を示した。

血管内皮細胞の血管増殖因子(VEGF)、エンドセリンの発現は低酸素により増加した、また低酸素刺激によるエンドセリン-1の発現は大動脈内皮細胞より肺動脈内皮細胞でより高い傾向を示した。低酸素培養下肺動脈内皮細胞でHIF1αの発現が高まることやエンドセリン-1の発現が大動脈より高いことは、肺動脈が低酸素性血管収縮を示すことや、低酸素性肺高血圧の進展との強い関わり合いが示唆された。次年度は、低酸素応答を詳細に評価するために低酸素応答性の定量化を試みる。その手段として遺伝子工学的方法を用いてHIF1αの認識する塩基配列を組み込んだレポーター遺伝子発現ベクターを作成する。そして、そのベクターを用いて肺動脈を含む各種血管内皮細胞の低酸素応答を評価する。低酸素による肺血管リモデリングの機序を低酸素誘導転写因子(HIF)に焦点をあて血管内皮細胞の低酸素応答から明らかにすることを目的として本研究を行った。平成10年度は、HIF-1の認識塩基配列5′-RCGTG-3′をレポーター遺伝子と組み合わせ各種血管内皮細胞へ遺伝子導入することで各種血管内皮細胞の低酸素応答を評価するシステムを構築し、内皮細胞の低酸素応答解析を行った。HIFが認識する低酸素応答塩基配列(HRE)を含むリポーター(Re)遺伝子発現アデノウイルスベクター(Adv)AdvHREとHREを含まないRe遺伝子発現Adv(control)を相同遺伝子組換えにより作成し、まず、これらのAdvが機能することを低酸素応答がはっきりしているヒト肝臓癌細胞株Hep3B細胞で確認した。目的のヒト血管内皮細胞は、中枢側肺動脈内皮細胞、末梢肺動脈内皮細胞、大動脈内皮細胞を用いた。低酸素刺激は、細胞培養液へ塩化コバルト(Co2+)を添加することで行った。各種ヒト血管内皮細胞へAdvHRE,Adv感染後、Co2+の添加の有無で培養し、経時的に培養上清を回収し、Re遺伝子由来蛋白を定量化し、Co2+有無におけるRe遺伝子由来蛋白の比で低酸素応答を数量化した。Adv感染においてはCo2+有無でReの産生量に変化はなくその比は1であった。AdvHRE感染では、Co2+添加24時間から48時間まで末梢肺動脈内皮細胞がCo2+無添加のものに比較して8倍の高いRe発現量を示した。中枢肺動脈内皮細胞、大動脈内皮細胞では4倍の発現量を示した。肺末梢血管内皮細胞は近位肺動脈血管内皮細胞、大動脈内皮細胞に比較して早期に高いHIFを介する低酸素応答を示したことは、肺末梢血管内皮細胞が、低酸素へ早期の適応と肺血管リモデリングに重要な役割を果たしていることが示唆された。またHIFが認識する低酸素応答塩基配列(HRE)を細胞内へ導入し、過剰な低酸素応答を抑制する実験は完遂していないがVEGFの発現を指標とした場合、抑制効果が認められた。これは、過剰な低酸素応答で起こりうる病的状態を防ぐ手段となりえることが期待された。
高校生物の新学習指導要領に対応した指導力向上の取組み～遺伝子を扱う技術について～

(研究目的)PCR(ポリメーラーゼ連鎖反応)法と呼ばれるDNA増幅技術は,現代分子生物学において必須の実験手法である。また,高等学校学習指導要領「生物」には「遺伝子増幅技術に触れる」と記述されており, PCR法の原理や実社会での遺伝子判定への応用について高校生に深く考えさせるためにも,高等学校生物の授業に導入したい実験である。そこで,次の3点の実施を試みることを目的とした。1遺伝子組換え青いバラや青いカーネーションを用いて, PCR法による遺伝子判定実験を高等学校生物の授業に適した形で教材開発する。2広島県高等学校の生物教員で組織している自主研究会で,開発した教材を紹介する。3開発した教材を用いて,高等学校において授業実践を行う。(研究方法)パンジーやペチュニアの青色遺伝子(フラボノイド3', 5'水酸化酵素遺伝子)を導入し作出された遺伝子組換え青いバラや青いカーネーションを実験材料として用いて,パンジーとペチュニアのどちらの青色遺伝子を持っているのかを, PCR法と電気泳動法によって判定する教材の開発を試みた。また,開発した教材を生物教員の自主研修会で紹介するとともに,高等学校において授業実践することを試みた。(研究成果)12セットのプライマーを同時に使用しPCR装置や電気泳動装置を用いて遺伝子判定実験を行うことにより,青いバラや青いカーネーションに含まれている青色遺伝子を判定する実験教材を開発することができた。2自主研究会において, 25名の高等学校生物教員に対して本教材を紹介することができた。また,本教材を用いた授業展開について検討することができた。3本教材を用いて2校の高等学校生物の授業において授業実践を行うことができたことから,本教材は高等学校生物の授業で実施することが可能であることが分かった。また授業実践の結果, PCR法や電気泳動法の原理についての理解を深めることや,それらの技術の素晴らしさを実感させることができた。また,科学的思考力を育成することにもつながると考えられた。
ウエルナー症候群患者の生体内のテロメア代謝の解析

研究計画調書の研究計画・方法の記載の順に記載する。(1)組織の収集、保存:ウエルナー症候群(WS)愚者からの組織検体の収集は7例9検体となり、時期の異なる検体を2例から得ることができた。非WS患者からの検体は、表皮・真皮221検体、骨髄51検体、骨格筋20検体を収集した。(2)組織の検定:組織学的に組織を検定した結果は、切断部位の近くでは変性、壊死や炎症が乏しく研究に使用可能であった。(3)DNAの抽出、検定、テロメア長測定:(1)で得られた組織から、キットを用いずにDNAを得て(キットでは50kbp程度の短いDNAが得られる)、ジェノフィールド電気泳動法で200kbp以上であることを確認した。新生児表皮のテロメア長は13.3kbp(8例)、年間短縮率は36bpであり、WS患者の3761歳の短縮率は161bpであり、明らかな短縮の加速(3倍)があった。骨格筋のテロメア長7.012.8kbp(3961)、骨髄8.5kbp(61歳)、軟骨10.8kbp(61歳)、肘潰瘍部5.6kbp(61歳)、線維芽細胞11.5kbp(41歳)であった。(4)テロメレース活性の検出:非WS患者のTRAP法による陽性率は8%であり、WS患者の陽性率は6%であり、有意差はなかった。(5)hTERT mRNAの検出:我々の考案したプローブを用いたISHの結果は、患者、非患者において、基底細胞とリンパ球がシグナル陽性を示した。酵素抗体法によるテロメレース蛋白の検出は、基底、傍基底細胞と浸潤するリンパ球が陽性を示した。(6)研究論文の進行過程:日本語総説は出版となっているが、英語論文は投稿中。(7)培養細胞株の樹立:2人のWS患者から表皮と線維芽細胞の培養系を確立した。(8)特許:本研究の進行過程で、サザンブロット法よりも正確なPNAプローブを用いたテロメア長測定法(Q-FISH法)に関連する特許を申請した。平成15年度研究計画調書(新規)の研究計画・方法の記載順に基づき、倫理面への配慮と研究論文の進行過程を加えて記載します。(1)組織の収集、保存:ウエルナー症候群(WS)患者からの組織は、4例に加えて、3例を収集し(合計7例)、時期の異なる同一症例からの検体を含めると7例8検体を集めることができました。非WS症候群患者からの検体を、表皮、真皮に関しては123検体以上、骨髄に関しては41検体を収集し、冷凍保存しました。(2)組織の検定:病理組織学的に収集した組織を検定した結果、切断されて四肢の切断部位の近くでは、表皮、真皮に関しては、変性や炎症がなく、使用が可能であることがわかりました。(3)DNAの抽出と検定:(1)で得られた組織からDNAを用手法で抽出し(キットによる抽出では50kbp程度の短いDNAしか得られません)、電気泳動法で200kbp以上あることを確認し、特に、WS患者からのDNAは全てテロメア長測定に使用できることがわかりました。

(4)テロメア長の測定と検定:WS症候群のテロメア長は、表皮では11.5、14.8、7.7、12.8kbpであり、非WS症候群41例のテロメア長の年間短縮率は36bpでした。WSの骨格筋のテロメア長は、14.2、16.6、8.7kbpでした。(5)テロメレースの検出:非WS症候群患者のTRAP法によるテロメレース活性は8%で陽性でした。(6)hTERT mRNAの検出:我々考案したプローブを使用したインサイチュウハイブリダイゼーションでは、非WS患者の表皮の基底膜上の表皮細胞と浸潤リンパ球で高度なシグナルが得られました。(7)倫理的配慮:東京都老人総合研究所倫理委員会に本研究に関する研究計画書を提出し、承認を得ました。(8)研究論文の進行過程:WS患者と非WS患者の表皮のテロメア長に関する論文を執筆中です。研究計画調書の研究計画・方法の記載の順に記載する。(1)組織の収集、保存:ウエルナー症候群(WS)患者からの組織検体の収集は7例9検体となり、時期の異なる検体を2例から得ることができた。非WS患者からの検体は、表皮・真皮221検体、骨髄51検体、骨格筋20検体を収集した。(2)組織の検定:組織学的に組織を検定した結果は、切断部位の近くでは変性、壊死や炎症が乏しく研究に使用可能であった。(3)DNAの抽出、検定、テロメア長測定:(1)で得られた組織から、キットを用いずにDNAを得て(キットでは50kbp程度の短いDNAが得られる)、ジェノフィールド電気泳動法で200kbp以上であることを確認した。新生児表皮のテロメア長は13.3kbp(8例)、年間短縮率は36bpであり、WS患者の3761歳の短縮率は161bpであり、明らかな短縮の加速(3倍)があった。骨格筋のテロメア長7.012.8kbp(3961)、骨髄8.5kbp(61歳)、軟骨10.8kbp(61歳)、肘潰瘍部5.6kbp(61歳)、線維芽細胞11.5kbp(41歳)であった。(4)テロメレース活性の検出:非WS患者のTRAP法による陽性率は8%であり、WS患者の陽性率は6%であり、有意差はなかった。(5)hTERT mRNAの検出:我々の考案したプローブを用いたISHの結果は、患者、非患者において、基底細胞とリンパ球がシグナル陽性を示した。酵素抗体法によるテロメレース蛋白の検出は、基底、傍基底細胞と浸潤するリンパ球が陽性を示した。(6)研究論文の進行過程:日本語総説は出版となっているが、英語論文は投稿中。(7)培養細胞株の樹立:2人のWS患者から表皮と線維芽細胞の培養系を確立した。(8)特許:本研究の進行過程で、サザンブロット法よりも正確なPNAプローブを用いたテロメア長測定法(Q-FISH法)に関連する特許を申請した。
放射性廃棄物核種を包含するガラスナノボイドの構造および安定性の解明

本研究では、陽電子と電子の束縛状態であるポジトロニウムが、ガラス中の構造的なサブナノ空隙中で消滅し、そのサブナノ空隙のサイズに関する情報を与えてくれることに注目した。このことを利用して、放射性廃棄物ガラス固化体中に含まれる放射性核種からの放射線によって生ずる照射欠陥形成に伴う、核種含有サイトである構造サブナノ空隙の変化の解明やそれらが長期保管に与える影響について調べようとする。放射性廃棄物ガラス固化体を理解するには、その基本要素から構成される2成分系モデルガラスについての理解が必要不可欠であり、先ずこれらのガラスについて、サブナノ空隙の化学組成や照射による変化、照射欠陥の形成過程について調べた。廃棄物ガラスの主成分であるSiO_2に網目形成酸化物であるB_2O_3や網目修飾酸化物Na_2Oを加えた2成分系モデルガラスについて組成比を変化させて試料を作製し、陽電子消滅法を用いてサブナノ空隙のサイズの化学組成依存性について系統的に調べた。その結果、大部分の放射性廃棄物核種が属する網目修飾酸化物の陽イオンは、サイズの大きなサブナノ空隙から選択的に入り込むことがわかった。また、この試料に、電子線(エネルギー3MeV、照射量1×10^<18>e/cm^2)やプロトン(エネルギー1MeV、照射量1×10^<16>H^+/cm^2)を照射し、照射欠陥形成に伴うサブナノボイドのサイズ変化を系統的に調べた。照射によるサブナノ空隙のサイズ変化は本研究の照射条件では起こらないことがわかった。電子スピン共鳴法を用いて、粒子線照射に伴うボンド切断や照射欠陥形成について系統的に調べた。SiO_2・B_2O_3系モデルガラスではB_2O_3の含有率が増えるほど、常磁性照射欠陥の回復温度は低くなること、Na_2Oを含有するSiO_2・Na_2O系モデルガラスではNa_2Oの含有率が増えるほど、常磁性照射欠陥の生成量が減少することがわかった。高レベル放射性廃棄物ガラス固化体は、約1000年の長期間、含有する放射性核種を安全に閉じ込めておかなければならない。ガラス固化体中の放射性核種は、ガラス構造のゆらぎで生じる構造空隙に閉じ込められていると考えられる。この構造空隙の大きさが、放射性核種閉じ込めに影響を及ぼすと考えられるが、それを評価できる実験手法がほとんどないため、構造空隙に関することは未だよくわかっていない。陽電子がガラス中に入射するとポジトロニウム(Ps)が生成する。Psは構造空隙で消滅するため、その構造空隙の寸法を見積もることができるユニークなプローブである。放射性廃棄物ガラス固化体の模擬ガラスは非常に多くの酸化物成分を含有し複雑な構造である。そのため、本研究では放射性廃棄物ガラス固化体に多く含まれている成分に着目し、SiO_2を主成分とする各種2成分系モデルガラスを製作しPsをプローブとして構造空隙の寸法について系統的に調べた。即ち、オルソPs(o-Ps)のピックオフ消滅寿命(τ_3)から、高分子中の自由体積解析に使われているTao-Eldrup-Nakanishi-Jean模型を用いて、各種ガラス中の空隙の平均半径の化学組成依存性を求めた。ガラス網目形成体であるB_2O_3、GeO_2を添加したガラス中の空隙平均半径は2成分ガラスのモル濃度比に比例して変化する。一方、網目修飾体であるLi_2O、Na_2O、K_2Oを添加したR_2O-SiO_2ガラス(R=Li, Na, K)では、R_2Oモル濃度が増加すると、平均半径が急激に減少する。これは、これらのガラスではSiO_4四面体が作るガラス網目の構造空隙にRイオンが入り込むためである。このことは、Zachariasen-Warrenガラス構造模型から期待される空隙を直接かつ系統的に観測した結果である。以上のような構造空隙に関する知見は、ガラス固化体中での放射性核種イオンが空隙に安定に存在することを評価する上で重要なものではないかと考えられる。

また、この試料に、電子線(エネルギー3MeV、照射量1×10^<18>e/cm^2)やプロトン(エネルギー1MeV、照射量1×10^<16>H^+/cm^2)を照射し、照射欠陥形成に伴うサブナノボイドのサイズ変化を系統的に調べた。照射によるサブナノ空隙のサイズ変化は本研究の照射条件では起こらないことがわかった。電子スピン共鳴法を用いて、粒子線照射に伴うボンド切断や照射欠陥形成について系統的に調べた。SiO_2・B_2O_3系モデルガラスではB_2O_3の含有率が増えるほど、常磁性照射欠陥の回復温度は低くなること、Na_2Oを含有するSiO_2・Na_2O系モデルガラスではNa_2Oの含有率が増えるほど、常磁性照射欠陥の生成量が減少することがわかった。
卵成熟における蛋白質翻訳開始の分子機構

卵成熟誘起の主要調節因子(MPF)の形成・活性化に直結するサイクリンBmRNA翻訳開始の分子機構を探る目的で、次の3点について研究した。1)卵成熟誘起におけるサイクリンB翻訳開始重要性の一般性検討キンギョで初めて明らかにされたサイクリンB翻訳開始機能の卵成熟誘起への必要性を、他の動物種で検討した結果、アカガエルやイモリでも同様な結論が得られ、下等脊椎動物における一般的機構と結論された。2)サイクリンBmRNA結合蛋白質の分子同定と翻訳抑制機能の検討ビオチン標識mRNAアフィニティー精製で単離したキンギョサイクリンBmRNA結合蛋白質の分子同定を試みたが、試料不足のため成功には至らなかった。ホルモン刺激のmRNA翻訳への影響を調べる目的で、ホルモン刺激したゼブラフィッシュ未成熟卵にサイクリンBmRNAを注射する実験を行った。その結果、サイクリンBmRNAの注射に対して、ホルモン刺激を受けた卵母細胞の方が未刺激のものより早く成熟することがわかった。このことはホルモン刺激によりサイクリンBmRNAの翻訳効率が高まることを示唆する。3)サイクリンBmRNA翻訳開始における既知蛋白質の機能他の生物種や実験系でmRNA翻訳調節に関与すると予想されている蛋白質のキンギョ及びアフリカツメガエルホモログcDNAを単離し、組換え蛋白質に対する単クローン抗体を作製した。具体的には細胞質ポリアデニル化エレメント結合蛋白質(CPEB)、Nanos、Pumilio、ポリAポリメラーゼ、ポリA結合蛋白質、Yボックス蛋白質が挙げられる。これらのうち、PumilioとYボックス蛋白質についてはサイクリンBmRNAに結合することを確認し、翻訳抑制の強力な候補であることがわかった。その他の蛋白質についても、抗体を用いて卵母細胞内での局在、卵成熟過程での挙動及び機能の解析を進めている。卵成熟誘起において重要な意味を持つサイクリンBmRNA翻訳開始の分子機構を明らかにすることを目的に、以下の2点について調べた。1)サイクリンBmRNA結合蛋白質の分子同定と翻訳抑制機能の検討ビオチン標識mRNAアフィニティー精製で単離したキンギョサイクリンBmRNA結合蛋白質を蛋白質分解酵素で限定分解し、得られたペプチド断片のアミノ酸配列の決定を試みたが、十分量の試料が得られず、成功には至らなかった。現在、蛋白質精製のスケールアップを試みている。また、また、ホルモン刺激のmRNA翻訳への影響を調べる目的で、ホルモン刺激したゼブラフィッシュ未成熟卵にサイクリンBmRNAを注射する実験を行った。2)サイクリンBmRNA翻訳開始における細胞質ポリアデニル化エレメント結合蛋白質(CPEB)とNanosの機能キンギョCPEBとツメガエルNanosホモログのcDNAクローニングに成功し、リコンビナント蛋白質に対する単クローン抗体を作製した。さらに、mRNAの翻訳に関わると予想されるポリAポリメラーゼ、ポリA結合蛋白質、Yボックス蛋白質、PumilioのキンギョホモログcDNAを単離し、抗体を作製した。現在これらの抗体を用い、各蛋白質の卵母細胞内での局在、卵成熟過程での挙動及び機能の解析を進めている。動物卵成熟誘起において重要な意味を持つサイクリンBmRNA翻訳開始の分子機構を明らかにすることを目的に本研究は遂行され、本年度は特に、Pumilio蛋白質に関する研究で成果を得た。Pumilioはショウジョウバエの形態形成に関わる重要な蛋白質の一つで、mRNAに結合し、その翻訳を抑制する機能を持つと推測されている。

キンギョやアフリカツメガエルサイクリンB1mRNAの3'非翻訳領域(UTR)にはPumilioが結合する配列に似た配列が存在することから、サイクリンBmRNA翻訳調節にこの蛋白質が関与する可能性がある。本研究ではキンギョとアフリカツメガエルPumilioホモログcDNAをクローニングし、モノクローナル抗体を作製した。まず、得られた抗体によるウエスタンブロッティングにより、キンギョ・ツメガエル未成熟卵及び成熟卵、両方にこの蛋白質が存在することを確認した。続いて、poly(U)Sepharoseとoligo(dT)celluloseにより精製したmRNA結合蛋白質中に、Pumilio蛋白質が存在することを確認した。さらに、RNAアフィニティークロマトグラフィーとノースウエスタンブロッティングにより、Pumilio蛋白質がサイクリンBmRNA、特にその認識配列に類似の配列が存在する3'UTR部に、特異的に結合することを確認した。以上の結果はPumilio蛋白質がサイクリンBmRNA結合蛋白質であることを証明し、サイクリンBmRNA翻訳調節機能を果たしている可能性を強く示唆する。今後、PumilioによるサイクリンBmRNA翻訳抑制とホルモン刺激によるその解除の分子実体に切り込む予定である。
脊髄内痛覚伝導回路に関与する抑制性アミノ酸受容体の役割

グリシン受容体・Cl^-チャネルは哺乳動物脊髄ニューロンにおいて、一次知覚ニューロンから伝えられるシグナルを抑制的に調節する役割を果している。グリシン受容体と同様にCl^-チャネルを形成するGABA_A受容体に対しては、ベンゾジアゼピンやバルビタールなど中枢疾患治療薬として汎用される薬物が作用することが知られているが、グリシン受容体の機能を修飾する薬物の存在はこれまでのところ知られていない。本研究において、グリシン受容体チャネルの機能を修飾する薬物のスクリーニングを行っている過程で、亜鉛イオン(Zn^<2+>)が受容体の活性を増強させることを見出した。グリシン受容体α1サブユニットのhomo-oligomericチャネルを発現している卵母細胞に低濃度Zn^<2+>(0.1-10μM)を適用したところ、グリシン電流は著しく増強された。1μMのZn^<2+>存在下で電流の振幅は平均で3.2倍に増大した。他の2価陽イオン(Co^<2+>,Mn^<2+>,Ni^<2+>,Cd^<2+>及びMg^<2+>)には同様の作用は認められなかった。Zn^<2+>はグリシンの濃度反応曲線を低濃度側に平行移動させた。グリシンとZn^<2+>の同時適用すると膜電流は直ちに増大することから、Zn^<2+>はα1サブユニットの細胞外領域に結合し、グリシンの受容体結合親和性を増大させることによりチャネル活性を増強するものと考えられる。中枢神経系組織において、グリシン作動性シナプス伝達の修飾にZn^<2+>が関与するか否かを確かめることが今後の課題である。
強い近赤外蛍光を発する樹脂を材料とする術中ナビゲーション用標識具の開発

これまでに開発した近赤外蛍光樹脂材料を用いて,生体深部の患部および損傷を回避すべき臓器を“ひかりナビゲーション"するための標識具を試作開発し,動物実験でその有用性を検証する。到達目標:1軟性消化管内視鏡で留置できる近赤外蛍光樹脂製粘膜クリップの試作:狙い;消化管患部を漿膜面から鏡視下で位置特定するための標識技術の実現。2気管支鏡で区域気管支に留置できる近赤外蛍光樹脂製有棘チューブの試作:狙い;肺癌の鏡視下区域切除のための患部標識技術の実現。3近赤外蛍光樹脂製の尿管カテーテル・胆管カテーテルの試作:狙い;鏡視下手術における損傷リスクを回避するための臓器標識技術の実現これまでに開発した近赤外蛍光樹脂材料を用いて,生体深部の患部および損傷を回避すべき臓器を“ひかりナビゲーション"するための標識具を試作開発し,動物実験でその有用性を検証する。3近赤外蛍光樹脂製の尿管カテーテル・胆管カテーテルの試作:狙い;鏡視下手術における損傷リスクを回避するための臓器標識技術の実現
中東欧銀行市場における外国銀行のチェリー・ピッキング行動の検証

平成19年度の研究は、主に中東欧リテール金融市場の現地調査が中心であった。期間は平成19年8月21日から9月7日の約3週間にわたり、オーストリア、スロベニア、ハンガリー、スロバキア、チェコ、ポーランドの6ヵ国を調査した。現地では、野村證券、東京三菱UFJ銀行、日本貿易振興機構(JETRO)、現地銀行等の各機関の協力を得て、中小企業・個人向け金融サービスの状況を調査した。その結果、得られた情報は以下の通りである。第1に、現地個人顧客に提供されている金融サービスは、西欧諸国で提供されているものと全く遜色ないものであること。第2に、金融サービスのディストリビューション・チャネルは多種多様であり、モバイルバンキング等の先進的チャネルの浸透は日本以上であること。第3に、国民所得の増大(特にポーランド)に伴って消費者金融業務の拡大が著しく、現地銀行、外国銀行とも主要な収益源となっていること。第4に、日系企業(特に自動車や家電といった製造業)の当該地域への進出が増加しているが、現地日系企業の取引先金融機関は、日系金融機関にほぼ限定されていること(現地銀行や西欧金融機関は取引を拒否する場合が多い)。第5に、本研究の主要な研究テーマである外国銀行による中小企業や個人への金融サービス提供拒否(いわゆるチェリー・ピッキング行動)の存在は、現地企業や銀行の双方へのヒヤリングの結果では確認できなかった。外国銀行にとって、競争の激しいホールセール金融分野よりも、市場の拡大が著しいリテール金融分野は主要な収益源となっており、「顧客を選別する余裕はない」というのが各銀行の共通した意見であった。今後は、ECBによる金融政策の波及の観点から、リテール金融サービスが、適正な価格づけのもとで提供されているか(特に貸出金利)を調査・研究する必要があると考えられる。本研究は、チェコ、ポーランドを対象に、外国銀行の現地子会社の財務データを用いた定量分析と外国銀行と現地企業に対するアンケート・ヒヤリング調査の定性分析を行うことで、中東欧銀行市場における外国銀行のチェリー・ピッキング行動の有無を包括的に検証するものである。平成18年度は、(1)中東欧地域の金融市場に関する最近5年間の情報整理、(2)計量分析に用いるデータセットの構築、(3)現地企業に対するアンケート調査を実施した。(1)に関しては、研究対象国金融当局が公表している市場データ、IMF、世界銀行、OECD等から出された調査資料、研究対象国に関して書かれた学術論文、日本の国内外の新聞・雑誌等を収集し、整理・分析を行った。(2)に関しては、各銀行のウェブサイトにてダウンロード可能な2002年以降の四半期財務レポートや年次報告書の収集を行った。その上で、各銀行の中小企業・個人向け貸出のそれぞれの貸出残高及び伸び率、経営健全性指標(自己資本比率、経費率等)の数値を整理し、データセットの構築を行った。(3)に関しては、チェコ・ポーランドの現地企業100社に対して、(1)主な取引先銀行(外国銀行か現地銀行か、銀行名までは問わない)、(2)調査企業の業況(『悪い』から『良い』まで3段階評価)、(3)最近の取引先銀行の貸出態度(『緩やか』から『厳しい』まで3段階評価)、(4)取引先銀行の金融サービス全般に対する満足度(『低い』から『高い』まで3段階評価)の4点に関してアンケート調査を実施した。アンケートはメールにて送付し、現在(平成19年3月末時点)のところ16社より回答が得られた。
インフルエンザ肺炎の重症化メカニズムの解明～その治療を目指して～

高病原性鳥インフルエンザウイルスなどの新型インフルエンザでは重症肺炎(急性呼吸促迫症候群(ARDS))を起こして死亡するが、治療法は確立していない。研究代表者らは、これまでに、1インフルエンザ感染マウスが、ヒトと同様にARDSで死亡すること、2肺サーファクタント(肺胞腔内に分泌される宿主因子)を人工的に投与すると死亡率が低下すること、を明らかにしてきた。本研究では、このメカニズムの解明と、全く新しい人工調製肺サーファクタントを検討した。その結果、研究期間内に新規人工調製肺サーファクタントの有効性を示すことは出来なかったが、その調整方法に改善の余地があると考えられた。本研究では、「インフルエンザウイルス感染による肺炎の重症化メカニズムを明らかにし、ヒトへの治療応用を目指すこと」を目的としている。高病原性鳥インフルエンザウイルス(H5N1)の他、2013年中国で流行したH7N9インフルエンザウイルスなど、新興インフルエンザウイルスの感染では致死率が高い。これらウイルスによる死亡者の全てで重症肺炎を起こしていることが判っているが、治療法は確立していない。本研究では新しい治療法開発が最終ゴールであり、昨年度は以下の点について進展した。1マウスを用いたインフルエンザウイルス感染によるヒト重症肺炎モデルを確立。研究代表者は平成24年度より現所属の広島大学に異動した。このため、本科研費の初年度にあたる平成25年度は、マウス感染実験系を確立する段階からスタートした。その結果、インフルエンザウイルス感染マウス実験系を無事立ち上げることができ、病理組織学的にも、ヒト重症肺炎を再現できることを確認した。2新規人工調製肺サーファクタント投与の検討。研究代表者はこれまでに、上記マウス感染モデルを用いて、抗インフルエンザ薬と既存の人工肺サーファクタントの併用投与により、マウス致死率を最大50%改善することを報告している(Fukushi et al., PLoS ONE 2012)。この人工肺サーファクタントは牛由来生物製剤であり極めて高価なことから、当初、肺サーファクタント構成成分を個別あるいは複数混ぜて投与することを計画していた。しかし、関連文献の詳細な検討により、完全な人工調製の肺サーファクタントを新規開発している研究グループがいる事を知った。現在この研究グループとの共同研究で、新規人工調製肺サーファクタントを提供してもらい、インフルエンザ感染マウスへの投与などの実験を進行中である。本研究では、「インフルエンザウイルス感染による肺炎の重症化メカニズムを明らかにし、ヒトへの治療応用を目指すこと」と目的としている。高病原性鳥インフルエンザウイルス(H5N1)のほか、2013年中国で流行したH7N9インフルエンザウイルスなど、新興インフルエンザウイルスの感染では致死率が高い。これらウイルスによる死亡者のすべてで重症肺炎を起こしていることが判っているが、治療法は確立していない。本研究では新しい治療方法開発が最終ゴールであり、昨年とは以下の点について進展した。1マウスを用いたインフルエンザウイルス感染によるヒト重要肺炎モデルを用い、既存の人工肺サーファクタント投与が効果を示すか否かを検討した。2前述のマウスによる重症肺炎モデルを用い、既存の人工肺サーファクタントとは異なる新規の人工調整肺サーファクタントの有効性を検討した。高病原性鳥インフルエンザウイルス(H5N1)をはじめ、2013年中国で流行したH7N9インフルエンザウイルスなど、新興インフルエンザウイルスの感染では致死率が高い。2009年に世界的に流行したインフルエンザA(H1N1)pdm09感染でも多くの人が亡くなった。これらのインフルエンザウイルスによる死亡者の全てが重症肺炎を起こしていることが判っているが、いまだ治療法は確立していない。このため本研究では「インフルエンザウイルス感染による肺炎の重症化メカニズムを明らかにし、ヒトへの治療応用を目指すこと」を最終的なゴールとしている。研究代表者らは、インフルエンザ肺炎の重症化に肺サーファクタント(肺胞腔内に存在する肺特異的因子)の欠乏が関わっていることを明らかにした(PLoS ONE 2012, PLoS ONE 2011)。この成果を発展させ、本研究課題では以下の点について検討を行い、重症肺炎メカニズム解明とヒトへの治療応用を目指した。特に最終年度には、3の新規人工調整肺サーファクタントを用いて検討を行った。1マウスを用いたインフルエンザウイルス感染によるヒト重症肺炎モデルを用い、既存の人工肺サーファクタント投与が効果を示すか否かを検討した。2肺サーファクタント構成成分のうち、どの成分が重症肺炎の緩和に影響があるのかを明らかにする。3インフルエンザ重症肺炎マウスモデルを用い、既存の人工肺サーファクタントとは異なる新規の人工調整肺サーファクタントの有効性を検討した。実験の結果、残念ながら新規人工調整肺サーファクタントが既存人工肺サーファクタントより有効であることを示すことはできなかった。その理由の一つとして、投与前の段階の新規人工肺サーファクタントの調整方法に問題がある可能性が浮上した。この点を改善することにより有効性が発揮される可能性があると考えている。

その結果、研究期間内に新規人工調製肺サーファクタントの有効性を示すことは出来なかったが、その調整方法に改善の余地があると考えられた。1マウスによる重症肺炎モデルは確立出来た。2上記マウス感染モデルへ、既存の人工肺サーファクタント投与により、マウスが死に始める時期を13日程度遅らせることに成功した。しかし、現時点で、最終的な致死率の改善には至っていない。致死率の改善が見られない点については、予想外であり、現在改善・検討中である。3上記マウス感染モデルへ、新規の人工調整肺サーファクタント投与を行った。この新規サーファクタントの構成成分は、既存のサーファクタントを参考にして作製している。しかし、生体にそのまま投与するには、粘度の問題などいくつかの改善点が必要と考え、現在検討中である。ウイルス学現在の問題点を改善するため、以下の点について検討する。1感染マウスの最終的な致死率が改善されない点については、細菌の2次感染などが疑われるため、抗菌剤の投与などを検討する。また、既存肺サーファクタント投与量および濃度の検討を行う予定である。2新規人工調整肺サーファクタントは、現在の調整方法では粘度が高くマウスへの投与は難しいことは判った。このため、粘度を低下させるために、濃度を下げるなどの検討を行う予定である。1マウス感染実験系を立ち上げることができたこと。2ヒト肺サーファクタントの構成成分のうち、最も割合の多いジパルミトイルトスファチジルコリン(DPPC)を単独で感染マウスに投与することが当初の計画であった。しかし、物理化学的にDPPC単独では肺サーファクタントの特性は得られないことを文献的に知った。しかし、この過程で、新規人工調製肺サーファクタントを研究しているグループと知り合い、共同研究を進めることになった。この点で大きな進展があったと考えている。1初年度に実施する予定であったマウス感染モデルの立ち上げが、遅れたため。その理由は、使用する抗インフルエンザ薬の原末を製薬企業から入手する必要があったが、手続き上遅れがあった。2新規人工調整肺サーファクタントは共同研究先から分与してもらうことになった。しかし実際にマウスに投与してみると、性状に問題があり、改善のための検討を行った。その結果、当初予定していたよりも、マウス感染実験を行う回数が少なかった。このため、本年度の使用額が見込みより少額となり、次年度へ回すことになった。共同研究先から提供される新規人工調製肺サーファクタントを用いて、以下の点を検討する予定である。1新規人工調製肺サーファクタントと抗インフルエンザ薬との併用投与が、感染マウスの致死率を低下させるかどうかを検討する。2新規人工調製肺サーファクタントの単独投与での、感染マウスの致死率を検討する。3新規人工調製肺サーファクタントの量的検討、また、投与開始時期の検討などを行う。
農夫肺症における遺伝的要因および発症予防に関する研究

農夫肺症の発症予防対策を目的に、遺伝的体質要因としてHLA抗原を、実際的予防対策として防じんマスク着用の有効性を検討した。また特異的血清IgA抗体の診断的有用性についても検討を加えた。その結果、次の結論を得た。1)農夫肺症発症、原因抗原に対する抗体産生と特に関連すると思われるHLA抗原は、今回の検討では認められなかった。2)最近開発された軽量・小型・低呼吸抵抗の防じんマスクは十分実用性があり、また本症発症の予防に有効であることが確認された。3)真菌に対する特異的血清IgA抗体の測定は感度に優れ、特に無症状患者と無症状農夫との鑑別に有用であった。以上の結果は、本症の今後の対策に極めて有用であると思われた。平成3年2月26日から3月1日にかけて北北海道酪農地帯において第14回の農夫肺検診をおこなった。検診においては胸部単純写真、Immunoーcounter Electrophoresisによる沈降抗体の測定(2種類のかびMicropolyspora faeniとThermoactinomysis vulagarisに対し測定)、農夫肺症を既往にもつものに対してはDLcoも含めた呼吸機能検査を行なった。総受診者数は247名であった。そのうちMicropolyspora faeniにたいして抗体陽性者は22名(8.9%)で、Thermoactinomysis vulagarisにたいして抗体陽性者は4名(1.6%)であった。毎年農夫肺症の発症機序やマスクの普及に努めているためここ数年新発症者が見られなかったが、新発症者が1名あった。この患者は当科を受診し、ステロイド治療によって軽快している。受診者中農夫肺症を既往にもつ10名にたいして採血を行ない、DQ・DRまで含めてHLA抗体の検査を行なっている。今後平成4年度の農夫肺検診にて農夫肺症の既往者にたいして採血を行ない数を増やす予定である。また、沈降抗体が強陽性でありながら今まで農夫肺症を発症していない人もいるためこれらの人に対して、臨床的にどのような因子が関与しているかを調べるとともに、採血も行なってHLA検査を行ないその違いを検討していく予定である。平成4年度の結果を今までの分析結果と合わせて、正常コントロ-ルと比較検討する予定である。農夫肺症の発症予防対策を目的に,遺伝的体質要因としてHLA抗原を,実際的予防対策として防じんマスク着用の有効性を検討した。1)農夫肺症発症,原因抗原に対する抗体産生と特に関連すると思われるHLA抗原は,今回の検討では認められなかった。2)最近開発された軽量・小型・低呼吸抵抗の防じんマスクは十分実用性があり、また本症発症の予防に有効であるとが確認された。3)真菌に対する特異的血清IgA抗体の測定は感度に優れ,特に無症状患者と無症状農夫との鑑別に有用であった。
細胞増殖の調節と2次メッセンジャー

増殖因子や分化因子による種々の細胞応答のメカニズムについて2次メッセンジャーの生成という視点で研究を進めた。特に、増殖因子や分化因子刺激に応じて速やかに活性化されるホスファチジルイノシトール3キナーゼ(PI3K)に注目し、その活性化機構、生理的役割について検討した。まず、P13Kの各部位の役割を明らかにするために、各部位を認識するモノクローナル抗体を作製した。85KDサブユニットのうちαタイプのアミノ酸末端側約2/3の各部位に対するものは前年からの研究で得ていたが、カルボキシル末端側のものはなかった。そこがカルボキシル末端側のペプチドを用いて免疫することでこの部位に対するモノクローナル抗体を得た。得られたモノクローナル抗体パネルを用いて、各種癌細胞株におけるαタイプ85KDサブユニットの発現を調べた。その結果、1つの細胞株HCC2998において野性型のものが存在せず、カルボキシル末端が欠欠落した変異型を発見していることがわかった。この変異と細胞の癌化に関連については検討中である。もう一方の110KDサブユニットに関してもモノクローナル抗体の作製を試みているが今のところ成功していない。また、破骨細胞におけるPI3Kの生理的役割について検討した。PI3Kの阻害剤Wrotmauninを作用させたところ、骨吸収を抑制した。これは、ラッフルドボーターが形成されないためであることがわかった。また、同時に破骨細胞内に形成されるF-アクテンの構造体ポソドームも消失した。このとき、繊維芽細胞内に見られるストレスファイバーは影響を受けなかった。これらのことより、アクチンの重合には精巧な調節機構があり、PI3Kはポソドームの形成のために必要であることがわかった。ラッフルドボーダーとポソドームの形成の関係については現在検討中である。ホスファチジルイノシトール(PI)-3キナーゼは85KDサブユニット、110KDサブユニットからなる。細胞増殖の調節と深い関係があると思われるがその生理的役割はまだはっきりしない。この点を解明するために本酵素の精製標品が必要であるが、通常の方法では長い過程を必要とし、収率もよくない。そこで、モノクローナル抗体を用いた簡便な精製を試みた。ヒトPI-3キナーゼ85KDサブユニットcDNAを大腸菌で発現させ、マウスに免疫し、多種の抗85KDサブユニットモノクローナル抗体を分離した。それらのエピトープをマップしたところ、85KDサブユニット分子に広く分布していることがわかった。反応性を調べたところ、85KDサブユニット分子のアミノ末端、カルボキシル末端領域にエピトープをもつものは85KD、110KDサブユニットのヘテロダイマーを免疫沈降できたが、分子中央部をエピトープとするものでは免疫沈降できなかった。85KDサブユニット単独のものは免疫沈降できるので、110KDサブユニットと結合することによって、85KDサブユニットの中央部は覆われてしまうと思われる。次に、モノクローナル抗体を用いての酵素精製を試みた。数種調べた中で、一種の抗体(AB7)が効率よく、本酵素と結合し、高pH条件下で遊離することがわかった。しかし、本酵素は高pH条件下では比較的不安定なことが判明したので、合成ペプチドによる溶出を試みた。AB7のエピトープを含むペプチドを大腸菌で合成させ、精製し、競合剤として用いた。約1000倍の合成ペプチドを投入することで、酵素活性を保持したままで溶出できた。比較的簡便に精製標品を得ることが可能になったので、PI-3キナーゼの酵素化学的解析が容易になった。

1.ホスファチジルイノシトール3キナーゼ(PI3K)は85kDサブユニット(p85)と110kDサブユニット(p110)のヘテロダイマー構造をとっていて、p85が触媒サブユニットのp110の活性をコントロールしていると考えられている。PI3Kの活性調節の機構と活性調節の異常になった変異株構築に対する情報を得るために両者の結合領域を決定した。p110のアミノ末端にヒスチジン数個をつけ、ニッケル樹脂で精製できるようにした。1)ヒスチジン-p110とp85の変異株をcos7細胞に発現させる。2)p85とヒスチジンのついたp110の変異株をcos7細胞に発現させる。の方法で、p85とp110の複合体を形成させ、ニッケル樹脂で精製した。p110と結合したp85をウエスタンブロッティングで検出した。その結果、p85では結合に必要な領域をp85の2つのSH2領域(増殖因子受容体などと結合する領域)の中央部約80アミノ酸に限定した。またp110ではアミノ末端側約100アミノ酸に限定した。この部分はPI3K活性に必要のない可能性が高く、p85と結合しない変異株のできる可能性を示唆している。2.PI3Kはホスファチジルイノシトール3リン酸(PIP_3)を生じることが知られている。PIP_3を分解する酵素活性を検索した結果、5位のリン酸を特異的にはずす活性のあることを確かめた。現在、精製を続行中であるが、今までのところ、マグネシウムイオンを要求し、カルシウムイオンで阻害されることを見いだしている。増殖因子や分化因子による種々の細胞応答のメカニズムについて2次メッセンジャーの生成と言う観点で研究を進めた。特に、増殖因子や分化因子刺激に応じて速やかに活性化されるホスファチジルイノシトール3キナーゼ(P13K)に注目し、その活性化機構、生理的役割について検討した。まず、P13Kの各部位の役割を明らかにするために、各部位を認識するモノクローナル抗体を作製した。85kDサブユニットのうちαタイプのアミノ末端側約2/3の各部位に対するものは前年からの研究で得ていたが、カルボキシル末端側のものはなかった。そこで、カルボキシル末端側のペプチドを用いて免役することでこの部位に対するモノクローナル抗体を得た。得られたモノクローナル抗体パネルを用いて、各種癌細胞株におけるαタイプ85kDサブユニットの発現を調べた。その結果、1つの細胞株HCC2998において野性型のものが存在せず、カルボキシル末端が欠落している変異型を発現していることがわかった。この変異と細胞の癌化の関連については検討中である。もう一方の110kDサブユニットに関してもモノクローナル抗体の作製を試みているがいまのところ成功していない。また、破骨細胞におけるP13Kの生理的役割について検討した。P13Kの阻害剤wortmanninをいろいろな場合に作用させてみたところ、骨吸収を抑制した。これは骨吸収をするruffled borderが形成されないためにおこることがわかった。同時に破骨細胞内に形成されるF-アクチンの構造体(ポドソーム)も消失した。