hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
新規蛍光ラベル剤を用いた多種類同時免疫測定の開発とその法医学的検査への応用

1.メタンフェタミン(MA)を測定し1pg/mlまで検出できた.この方法で尿中および毛髪約10cm中のMAを測定できた.また,このラベル剤にEuとSmを別々に結合させた標識物質を用いて,2種類の物質の同時測定を行い,MAと向精神薬(デシプラミン,クロルプロマジン)を1つの試料から同時に定量できた.さらに,癌マーカーのCEAとAFPの同時測定も可能にした.2.ヒト血清中のIgEと農薬のベンスルフロンメチルを高感度に測定できた.3. Lewis式血液型を構成する2つの抗原の出現時期やその変化の過程を正確に知るために,臍帯血,新生児血,乳幼児血,成人血の抗原量を測定した.この結果,臍帯血中にしLe(a+b-)の成人とほぼ等しいLewis^a抗原と,少量のLewis^b抗原がすでに存在するのを検出し,これは血漿中に存在すると考えられた.また,Le(a-b+)においては,生後5日から血漿中のLewis^b抗原量が上昇し始め,生後日数を経るほどその抗原量が増え,血球に吸着していくと推測された.本法によるLewis^a抗原の検出感度と抗Lewis抗体の検出感度は従来のELISAより2桁以上高感度であった.これまでは乳児期に血漿中に抗原が出現してからLewis式血液型抗原が変化するとされていたが,本研究の結果からより早い時期に抗原が出現していることが示唆され,親子鑑定などの際に役立つ有用な知見を得た.4.新規ラベル剤がイムノアッセイ以外の標識にも使えることを証明するために,DNAハイブリダイゼーションアッセイを行い,4pg/wellのDNAを検出できた.これらの分析結果はいずれも従来法よりも検出感度,簡便性,試料量などにおいてはるかに優れており,いくつかの新しい知見を得られ,法医学的検査に応用できることがわかった.1.メタンフェタミン(MA)を測定し1pg/mlまで検出できた.この方法で尿中および毛髪約10cm中のMAを測定できた.また,このラベル剤にEuとSmを別々に結合させた標識物質を用いて,2種類の物質の同時測定を行い,MAと向精神薬(デシプラミン,クロルプロマジン)を1つの試料から同時に定量できた.さらに,癌マーカーのCEAとAFPの同時測定も可能にした.2.ヒト血清中のIgEと農薬のベンスルフロンメチルを高感度に測定できた.3. Lewis式血液型を構成する2つの抗原の出現時期やその変化の過程を正確に知るために,臍帯血,新生児血,乳幼児血,成人血の抗原量を測定した.この結果,臍帯血中にしLe(a+b-)の成人とほぼ等しいLewis^a抗原と,少量のLewis^b抗原がすでに存在するのを検出し,これは血漿中に存在すると考えられた.また,Le(a-b+)においては,生後5日から血漿中のLewis^b抗原量が上昇し始め,生後日数を経るほどその抗原量が増え,血球に吸着していくと推測された.本法によるLewis^a抗原の検出感度と抗Lewis抗体の検出感度は従来のELISAより2桁以上高感度であった.これまでは乳児期に血漿中に抗原が出現してからLewis式血液型抗原が変化するとされていたが,本研究の結果からより早い時期に抗原が出現していることが示唆され,親子鑑定などの際に役立つ有用な知見を得た.4.新規ラベル剤がイムノアッセイ以外の標識にも使えることを証明するために,DNAハイブリダイゼーションアッセイを行い,4pg/wellのDNAを検出できた.これらの分析結果はいずれも従来法よりも検出感度,簡便性,試料量などにおいてはるかに優れており,いくつかの新しい知見を得られ,法医学的検査に応用できることがわかった.タンパク質を直接標識できる新規4座β-ジケトン型蛍光ラベル剤,4,4 ́-bis(1′′,1′′,1′′,2′′,2′′,3′′,3′′-heptafluoro-4′′,6′′-hexanedione-6′′-yl)-chlorosulfo-ο-terphenly(BHHCT)を開発し,このユウロピウム(Eu)錯体を蛍光ラベル剤とした時間分解蛍光イムノアッセイによって,覚醒剤のメタンフェタミン(MA)を測定した.(Eu)BHHCT標識N-アミノブチルMA-BSAとMAを競合反応させる1ステップ法と,ビオチン化N-アミノブチルMA-BSAとMAを競合反応させた後,洗浄し,さらに(Eu)BHHCT標識ストレプトアビジンを反応させる2ステップ法で測定した.1ステップ法では標準MAの検出感度は約1ng/mlで,5ng/ml10μg/mlの濃度範囲で測定できた.2ステップ法では標準MAは1pg/mlから1μg/mlまで測定可能であり,今までの方法よりも10倍から1000倍高感度に検出できた.2つの方法の測定誤差は平均CVでそれぞれ3.04%(1ステップ),5.48%(2ステップ)であった.また,34検体の覚醒剤使用者の尿を用いて,1ステップ法とガスクロマトグラフィーによる測定結果を比較したところ,相関係数は0.954で高い相関が得られた.EuやSmのようなランタノイド金属は異なる蛍光発光波長とシャープな発光ピークを持つので,たがいに重なりあわず,蛍光寿命の長さも異なるという特長をもつ.

このため,同じウエルに含まれるEu錯体とSm錯体をそれぞれ別に検出することが可能である.そこで,BHHCT-EuとBHHCT-Smの標識を用いて,2種類の物質を同時に測定することを試みた.3種の薬剤{メタンフェタミン(MA),抗うつ剤デシプラミン(DSP),抗精神病薬クロルプロマジン(CRP)}と,2種の癌マーカー{α-フェトプロテイン(AFP),癌胎児性抗原(CEA)}の測定を行った.薬剤の測定は競合法,癌マーカーの測定はサンドイッチ法を用いた時間分解蛍光イムノアッセイで行い,Euは615nm,Smは643nmにおける蛍光強度を測定した.DSP,CPZとMAの同時測定,およびAFPとCEAの同時測定を行った結果,それぞれの最小検出感度は,MA:1ng/ml,CPZ:10ng/ml,DSP:10ng/ml,AFP:0.07ng/ml,CEA:0.3ng/mlであった.また,これらの測定値は単独で測定したときと良く一致した.この方法は操作効率もよく,高い検出感度が得られるので,限られた試料に有効である.Lewis式血液型を構成するLewis^2およびLewis^bの抗原の出現時期や,その変化の過程を正確に知るために,臍帯血,新生児血,乳幼児血,成人血(血痕および血漿)の抗原量を,新規ユウロピウム蛍光ラベル剤,(BHHCT)-Eu^<3+>を用いた時間分解蛍光イムノアッセイで測定した.すなわち,血痕解離試験で解離したマウス由来抗Lewis抗体の量をビオチン化抗マウスIgMとストレプトアビジン-BSA-BHHCT-Eu^<3+>を用いた時間分解蛍光イムノアッセイによって測定し,元の血痕中のLewis式血液型抗原量を求めた.また,標準Lewis物質を(BHHCT)-Eu^<3+>で標識し,抗Lewis抗体に対する競合試験によって血漿中のLewis抗原量を求めた.さらに検体のDNAからLegenotype,Secretor genotypeを決定し,Lewis式血液型の表現型の変化を検討した.この結果,臍帯血中にLe(a+b-)の成人とほぼ等しいLewis^2抗原と,少量のLewis^b抗原がすでに存在するのを検出し,これは血漿中に存在すると考えられた.また,Le(a-b+)においては,生後5日から血漿中のLewis^b抗原量が上昇し始め,生後日数を経るほどその抗原量が増え,血球に吸着していくと推測された.本法によるLewis^2抗原の検出感度は1ng/ml,抗Lewis抗体の検出感度は1:2×10^<-6>であり,従来のELISAより2桁以上高感度であった.これまでは乳児期に血漿中に抗原が出現してからLewis式血液型抗原が変化するとされていたが,本研究の結果からより早い時期に抗原が出現していることが示唆された.次に,除草剤ベンスルフロンメチル(BSM)を測定し,農薬分析への実用性を確認した.BHHCT-Eu^<3+>標識BSM-BSAとBSMの競合法を用い,24pg/ml(0.6pg/assay)まで検出できた.HPLCなどの方法より2桁以上高感度であり,簡便であるため,環境試料中の様々な微量成分の測定への応用が期待される.さらに,このラベル剤がイムノアッセイ以外の標識にも使えることを証明するために,DNAハイブリダイゼーションアッセイを行い,4pg/wellのDNAを検出できた.
中近世から近代にかけて軍記物語・歴史認識・教訓及び教育の連関が社会に与えた影響

本研究は、軍記物語と教訓書の関わりから見える、16世紀の社会がもたらした理想や教訓を基軸に、それらが以降の中近世近代の社会に対してどのように影響を与え続け、利用され、あるいは変化・展開していったのかを解明することを目的とする研究である。すなわち軍記物語・歴史認識・教訓及び教育という三要素を意識した複合的研究を行うことで、〈戦争を書く文学〉と社会の関わりを明らかにしていくことを目指す。
質感認知に伴う情動惹起の神経機構

視覚に基づく価値判断のメカニズム解明のため、報酬量課題遂行中のサルの吻内側尾状核と腹側淡蒼球から神経活動記録を行い、いずれも予測される報酬量に直線的に神経活動を増やす、あるいは減らす価値表現を示すニューロンが見出された。感性的質感認知の神経回路基盤の解明に向け、価値判断・情動に関与が示唆されている前頭眼窩野(OFC)に着目し、化学遺伝学操作によりマカクザルのOFCを不活化したところ、顕著性の高い音声(叫び声)に対する選択的な自律神経性の情動反応が減弱するとともに、OFCをはじめとする複数の領域における賦活が減弱することをfMRI計測により見出した。この結果は、聴覚による情動惹起において、OFCが必須であることを示唆する。また、視覚による情動惹起の神経機構を調べるため、ECoG電極を用いた情動性視覚刺激を提示した際の脳活動計測を開始した。また、感性的質感認知と環境情報の<エンリッチメント>の関連について、音響環境が短期的な音声呈示がオスマウスの行動量や情動行動、社会行動に及ぼす影響を調べるため、複数の行動テストを異なる音響環境下で実施し、豊かな音響環境は短期的であってもマウスの行動量を増大させる可能性がある知見を得た。さらに、取り巻く環境の明るさが及ぼす情動的作用の神経基盤の解明を目指し、明るさ感の神経基盤に関する研究と、白色境界線がもたらす色対比の増強現象、ならびに透明物体の厚みが潰れて誤認識される現象について調べるとともに、神経活動記録に用いる微小金属電極の記録位置を高精度にマーキングする手法を開発した。視覚に基づく価値判断の神経回路の特定と神経表現の解析が順調に進んでいる。また、サル情動評価系の構築や脳計測の準備も並行して進めており、情動惹起の神経回路の探索も着手できた。加えて、情動反応形成に重要な質感刺激属性の特定については、聴覚における環境情報の複雑性と実験動物の寿命などとの関連を見出すとともに、視覚における明るさの選好性の脳メカニズムを示唆する、明暗の非対称な情報処理の一端が明らかとなった。(1)感性的質感認知における情動・感性系の神経回路の特定と操作強い情動反応を惹起する視覚・聴覚刺激に対するサルの情動性反応を計測するとともに、fMRIやECoG法による脳活動計測を進める。脳活動-情動反応がOFCなど情動・価値判断に重要な領域の神経活動を化学遺伝学手法より操作することで、どのような影響が生じるかを特定することで、感性的質感認知における情動・感性系の神経回路とその仕組みの理解につなげる。(2)特定情動反応に影響を与える質感属性の同定と、その神経系への作用機序上記で用いる具体的な感性的質感情報として超高周波によって音の質感が向上する〈ハイパーソニック・エフェクト〉に着目する。様々な音響信号(自然環境音、超音波発声、ホワイトノイズなど)をマウスに呈示して各種行動バッテリーを実施し、音響環境情報が行動に及ぼす影響を明らかにする。またH31年度には、特定の神経系の活動を低下させたモデルマウスを用いて、音響環境情報と行動との関係がどのように変容するかを観察し、質感情報が行動に結びつく脳内メカニズムを明らかにする予定であるが、それに向けた準備とパイロット実験を実施する。(3)画像の視覚的注意と情動・感性へ寄与する要因の特定サルとヒトで共通の選好性を示す視覚刺激として、高輝度・高コントラスト刺激に着目する。画像を呈示した際の選好性判断とともに、瞳孔系の変化を測定することで不随意応答を測定する。瞳孔経には光に対する対光反射と、観察者の関心度が足し合わされている。対光反射の神経核である被蓋前域、さらに視交叉上核、外側膝状体、上丘からニューロン活動記録を行い、自立応答特性と認知に基づく効果を切り分ける。ニューロン活動計測の際には新規開発した精密な電極位置マーキング手法を導入し、小さな神経核からの計測を確認するとともに手法を洗練させる。価値判断の神経回路を特定するため、価値判断課題を訓練したサルを対象に局所脳部位の神経細胞に人工受容体(DREADD)を導入することで、その活動を薬物(CNO)で一過性に抑制させることのできる化学遺伝学的手法(DREADD-CNO法)を用い、内側側頭葉の嗅周野と前頭眼窩皮質との神経連絡が価値判断評価に必須であることを明らかにした(Eldridgeら, 2016)。このDREADD-CNO法を中心とした手法を用い両側の前頭眼窩皮質の抑制を含む、複数の神経核や神経回路を抑制した際の価値判断に対する影響とその特異性を評価している。加えて、価値判断以外の情動反応への影響を特定するために、行動評価系の開発を開始した。またこれらと並行して、DREADD-CNO法による特定神経活動操作に伴うターゲット脳部位ならびに下流の神経活動・神経情報表現の変化をfMRIや電気生理学的手法を用いて抽出する試みを開始した。一方、特定情動反応に影響を与える質感属性を特定し、神経系への作用機序を明らかにするために、人間の可聴域上限をこえる超高周波によって、ヒトの音の感性的質感認知が顕著に向上する現象〈ハイパーソニック・エフェクト〉について、より強い効果をもたらす刺激属性を抽出し、ラットを用いた実験でその効果の検証を行なう。不快時には20kHz付近の帯域、快時には50kHz以上の帯域の鳴き声を発する齧歯類のUltrasonic Vocalization (USV)との共通性が注目される。

そこで、まず鳴き声の50kHz以上の成分を抽出したものと、鳴き声の信号構造を持たない人工的に合成した様々な帯域の音響信号をラットに呈示して、側坐核のドーパミン遊離量を計測し比較することにより、信号構造と情動神経系活動との関係を明らかにするための実験を開始した。情動・価値判断の神経回路を特定するための化学遺伝学的手法が霊長類で適用可能であることを示し、この手法を用い前頭眼窩野と嗅周野との神経連絡が価値判断に必須であることを国際誌に発表した。また、特定情動反応に影響を与える質感属性を特定するための齧歯類をもちいた研究系を立ち上げ、ハイパーソニック・エフェクトとドーパミンとの関係を調べる実験が開始できた。感性的質感認知における脳の基本的作動原理の一つとして、視覚に基づく価値判断の神経回路の特定を進めている。28年度は、OFCの神経投射を強く受ける吻内側尾状核(rmCD)に着目し、価値判断課題を訓練したサルを対象に化学遺伝学的手法を用い神経活動を一過性に抑制させることで価値判断に障害を引き起こすことを明らかにした(Nagaiら2016)。H27年度の結果とあわせ、視覚に基づく価値判断には高次視覚野→Rh→OFC→rmCDという神経連絡が必須の役割を果たすことが示唆された。さらに、抑制性DREADDを両側のOFCに導入したサルを作出し、活動抑制によって情動に関連する神経ネットワーク活動がどのように変化するかをfMRIにより調べる実験系を構築した。また情動性の異なる音声を呈示した際などにみられるサル情動反応の評価系の開発を開始した。一方、聴覚における環境情報の複雑性が、実験動物の寿命や自発活動に与える影響を特定するため、マウスを聴覚環境エンリッチメント条件と、通常騒音下で飼育する対照条件に分けて長期飼育した。その結果、聴覚環境エンリッチ条件のマウスで寿命が有意に延長し、自発活動量の増加が認められた。これらは聴覚的に多様な刺激を加えるという聴覚環境エンリッチメントが、生物の生存にポジティブな効果をもたらす可能性を示唆する。視覚においては一般的に明るく・輝きのある環境や刺激が好まれる。この神経基盤を明らかにするため、サイン波グレーティングの明・暗を変調した画像の検出感度を測定するヒト心理物理実験を行い、明・暗で異なる特性が観察された。次に、シーンの明るさへの生体応答として、赤、青の全画面刺激に対する瞳孔径の応答特性として計測し、自律神経系へ寄与を見積もることができた。以上の結果はON/OFF非対称の視覚現象の存在を示唆し、明るさ・輝きの選好性の背景となっている可能性がある。化学遺伝学的操作法とPETイメージングの融合による新技術を開発し、サルにおける神経活動操作を再現性よく実施できることを示すとともに、この技術を利用して吻内側尾状核が価値判断に必須であることを明らかにした(Nat Commun誌に発表)。H27年度の成果と合わせ、視覚に基づく価値判断の神経回路の特定が順調に進んでいる。また、サル情動評価系の構築や脳計測の準備も並行して進めており、情動惹起の神経回路の探索も着手できた。加えて、情動反応形成に重要な質感刺激属性の特定については、聴覚における環境情報の複雑性と実験動物の寿命などとの関連を見出すとともに、視覚における明るさの選好性の脳メカニズムを示唆する、明暗の非対称な情報処理の一端が明らかとなった。
溶液内超高速反応過程の解明とエキサイプレックスピコ秒ダイナミックスの確立

(1)極性溶媒中におけるエキサイプレックス系や弱い電荷移動錯体系の励起状態の挙動をピコ、+1秒レーザーホトリシスによる時間分割発光、過渡吸収及び光電導測定によって調べ、その機構を明らかにした。(2)以上のような光誘起電子移動により生成するイオンラジカル対に関連してTMPDのような低イオン化電圧ジアミンの極性溶媒中の光イオン化についてピコ秒レーザーによる詳細な測定を行い、アミンの蛍光状態から溶媒クラスターへの電子移動による新しい機構を確立した。また、ピコ秒紫外多光子励起により無極性溶媒中のピレンのRydberg状態からビフェニルへの電子移動による極短寿命イオン対をはじめて検出した。(3)極性溶媒中におけるポルフィリン-キノン光合成モデル系や強い電荷移動錯体系の励起-重項電子移動状態からの超高速失活についてピコ秒分光による詳細な測定を行いその機構を明らかにし、またポルフィリンとキノンをメチレン鎖でつないだモデル系についての研究で二段階電子移動の重要性を明らかにした。また、電子移動状態を経る高速失活の機構をπ電子系水素結合体の場合に解明した。(4)ピコ秒紫外多光子レーザーホトリシスを純液体、ポリマーフィルム等の分子集合体に適用しその励起状態、イオン化状態のダイナミックスを調べる方法を確立し、アルコール,アルキルベンゼン,アルカン等について興味ある結果を得た。(5)光誘起電子移動状態を経る光化学反応としてA-CH=CH-D型分子の光異性化について調べ、電荷移動の増大とともに異性化速度が増大することを明らかにした。(6)以上のような研究結果に基き、溶液中における光誘起電荷分離及び生成したラジカル対の再結合過程のエネルギーギャップ依存性につき、溶質の周囲の溶媒フォノンの振動数が溶質の荷電状態と中性状態でかなり大きく異ることを考慮した新しい理論を提出し、実験事実をよく説明できることを示した。
マウスc‐kit遺伝子異常と症状との相関性

マウスのW遺伝子座はc-kitセレプター・チロシンキナーゼ(KIT)をコードとしており、この遺伝子座に2個の突然変異を持つ多くのマウスでは貧血がみられメラノサイト・マスト細胞及び生殖細胞が欠損する。本研究では日本で発見された突然変異(W^<Jic>,W^n)とホモになっても生殖力を持つ突然変異(W^f,W^<sh>)のc-kit遺伝子異常を明らかにし、ミュータントマウスの症状、特に皮膚におけるマスト細胞数との相関性を示した。1.KITはc-kit蛋白が二量体を形成することにより機能しこの二量体形成には正常に発現したc-kit蛋白の細胞外領域を必要とする。W^<Jic>/+マウスでは皮膚のマスト細胞数が有意に減少しており"dominant negative"表現型を示した。これはW^<Jic>突然変異がキナーゼドメインのATP結合領域の点突然変異であるため、W^<Jic>/+マウスではキナーゼ活性がないc-kit蛋白が参画した機能のないKITが作られるからであった。2.W^n/W^nマウスは強い貧血のため生後5日以内に死亡するが、W^n/+マウスでは皮膚のマスト細胞数は減少しなかった。W^n突然変異はキナーゼドメインの点突然変異であったが、そのc-kit蛋白はサイズが小さく細胞外に発現していないため異常なc-kit蛋白が参画したKITは作られない。このためW^n/+マウスは症状を示さない"null"表現型をとると考えられた。3.W^f/W^fマウスが雌雄とも生殖能力を有し貧血や皮膚のマスト細胞数の減少が軽度であるのは、W^f突然変異がキナーゼ領域の点突然変異であるにも拘らずキナーゼ活性がかなりの程度保たれるからであった。4.W^<sh>/W^<sh>マウスではマスト細胞とメラノサイトを欠損するが貧血がみられず生殖力もあるのは、W^<sh>突然変異はc-kit遺伝子の構造領域の突然変異ではなくマスト細胞においてc-kit遺伝子の発現がみられないからであった。W^<sh>突然変異はマスト細胞とメラノサイトにおいてc-kit遺伝子の転写を促す制御領域の異常と思われた。
エルビウム添加酸化亜鉛薄膜を用いた注入型赤外発光素子に関する研究

レーザーアブレーション法により、Er添加酸化亜鉛(ZnO : Er)薄膜を作成し、光学的および電気的特性を評価することにより、ZnO : Er薄膜の赤外発光素子応用への可能性を追求した。ZnO : Er薄膜を作成し、Erの発光センターを活性化するために、酸素雰囲気中で熱処理を施し、XRD測定により薄膜の結晶性を評価した。その結果、強いc-軸配向性を示しており、典型的なZnOバルク結晶と比較してみると、薄膜ではEr添加によりc-軸長が約0.9%伸張していることを明らかにした。ZnO : Er薄膜の抵抗率を四端子法により求めた。熱処理により抵抗率は6.3×10^<-3>Ωcmから100Ωcmへと約4桁の増加を示した。アニール前では良好なn型伝導を示したが、アニールにより酸素欠損が回復した結果、導伝性の低下を生じたと考えられる。1.54μm発光機構を理解するために励起スペクトル(PLE)の測定を行った。PLE信号は、それぞれ基底状態から^4F_<9/2>、^4S_<3/2>、^2H_<11/2>、^4F_<7/2>の各励起準位への吸収遷移であることを明らかにした。これらのEr^<3+>イオンの励起準位を直接励起した場合とZnO母材を励起しEr^<3+>イオンを間接励起した場合の1.54μm発光スベクトルを測定した。直接励起では、^4F_<9/2>→^4I_<15/2>、^4S_<3/2>→^4I_<13/2>、^4I_<11/2>→^4I_<15/>のEr^<3+>イオンの発光遷移を観測した。間接励起の場合には、これらの発光ピークは全く観測されない。直接励起の場合にはEr^<3+>イオンの励起準位間をカスケードに緩和し、最終的に第一励起準位から基底準位への1.54μm発光が生じる。しかし、間接励起ではカスケード的なEr^<3+>イオンの緩和は行われずに、ZnO母材に光励起により生じた電子・正孔対の消滅エネルギーが直接にEr^<3+>イオンの第一励起準位を励起し、1.54μmの緩和発光を生じさせていると結論されるレーザーアブレーション法により、Er添加酸化亜鉛(ZnO : Er)薄膜を作成し、光学的および電気的特性を評価することにより、ZnO : Er薄膜の赤外発光素子応用への可能性を追求した。しかし、間接励起ではカスケード的なEr^<3+>イオンの緩和は行われずに、ZnO母材に光励起により生じた電子・正孔対の消滅エネルギーが直接にEr^<3+>イオンの第一励起準位を励起し、1.54μmの緩和発光を生じさせていると結論される今年度の研究実績は次のようにまとめられる。1)酸化亜鉛に酸化エルビウムを添加したZnO:Er_2O_3(Er添加量:9×10^<19>cm^<-3>)ターゲットを、1×10^<-2>Torrの酸素雰囲気中でKrFエキシマレーザーを用いたアブレーションを行い、Si基板あるいは石英基板上にZnO:Er薄膜を形成した。

このアブレーション中に発生するレーザープルームを分光分析し薄膜形成におよぼすレーザー生成プラズマの活性種を測定した。その結果、Znは1価イオン(Zn^+)が観測されるものの、主に原子ラジカル(Zn*、Er*、O*)による発光線が支配的に観測された。このことから、ZnO:Er薄膜は原子ラジカルによって形成されていることを明らかにした。2)ZnO:Er薄膜中に添加されたEr量を定量分析するために、蛍光X線分析を行った。蛍光X線の輝線強度比(ZnKβ/ErLα)は、ターゲットと作成された薄膜とにおいてほぼ一致することから、ターゲット中のEr(9×10^<19>cm^<-3>)が、原子ラジカルのEr*として基板に到達しZnO薄膜中に添加されていることを確認した。3)ZnO:Er薄膜の化学結合状態を知るためにX線光電子分光測定を行った。その結果、Zn_<2p3/2>とO_<1s>のスペクトルの化学シフト量から評価した結果、Zn-O結合が確認された。また、Er_<4f>スペクトルよりEr-O結合の存在を確認した。このことは、Erは酸素と六配位で結合していることを示唆していると思われる。4)Erの発光センターを活性化するために、ZnO:Er薄膜を大気圧の酸素雰囲気中で700°C、3分間の熱処理を施し、X線回折測定によりZnO:Er薄膜の結晶性を評価した。その結果、強いc-軸配向性を有し、Erの添加によりc-軸長が約0.8%伸張していることが明らかになった。これは、原子半径の大きなErの添加に起因すると思われる。5)母材であるZnO(E_g=3.2eV)を励起するために、He-Cdレーザー(波長325nm)励起下における発光測定を行った。ZnOのバンド間発光が378.8nmに観測された。また、Erの赤外発光が、1.5377μmに観測された。Erの発光はEr^<3+>イオンの直接励起ではなく、間接励起によることが明らかになった。今年度の研究実績は次のようにまとめられる。1.Erの発光センターを活性化するために、ZnO:Er薄膜を大気圧酸素雰囲気中で700°C、3分間の熱処理を施し、XRD測定により薄膜の結晶性を評価した。その結果、強いc-軸配向性を示しており、典型的なZnOバルク結晶と比較してみると、薄膜ではEr添加によりc-軸長が約0.9%伸張していることが明らかになった。2.ZnO:Er薄膜の抵抗率を四端子法により求めた。大気圧酸素雰囲気中で700°C、3分間の熱処理により抵抗率は6.3×10^<-3>Ωcmから100Ωcmへと約4桁の増加を観測した。アニール前では良好なn型の導伝性を示したが、アニールにより酸素欠損が回復した結果、導伝性の低下を生じたと考えられる。3.Er^<3+>イオンの1.54μm発光機構を理解するために励起スペクトル(PLE)の測定を行った。観測されたPLE信号のピークは、それぞれ基底状態から^4F_<9/2>、^4S_<3/2>、^2H_<11/2>、^4F_<7/2>の各励起準位への吸収遷移であることを実験的に明らかにした。4.Er^<3+>イオンの励起準位を直接励起した場合、あるいはZnO母材を励起しEr^<3+>イオンを間接励起した場合の1.54μm発光スペクトルを測定した。直接励起では、^4F_<9/2>→^4I_<15/2>、^4S_<3/2>→^4I_<13/2>、^4I_<11/2>→^4I_<15/2>準位のEr^<3+>イオンの発光遷移を観測した。間接励起の場合には、これらの発光ピークは全く観測されなかった。直接励起の場合にはEr^<3+>イオンの励起準位間をカスケードに緩和し、最終的に第一励起準位から基底準位への1.54μm発光が生じる。
ｍＴＯＲ複合体１による白血病幹細胞自己複製維持メカニズムの解明

mTORは、二つの複合体(mTORC1とmTORC2)を形成して機能するキナーゼである。これまでの成果から、mTORC1欠損下で分化AML細胞の産出と白血病発症は抑制されるが、AML幹細胞は自己複製し、生体内で維持されることを明らかにしていた。本研究では、mTORC1欠損AML細胞を用いて、自己複製を司る分子の同定を主題として研究を展開し、新規のmTORC1下流候補分子やAML幹細胞関連分子を同定した。また、mTORC2-FOXO経路の生体内AML幹細胞における役割を解明する研究基盤を構築した。今後の研究によって白血病幹細胞の新たな治療標的となることが期待される。本研究ではmTORC1欠損AML幹細胞集団において機能する、自己複製維持メカニズムの同定を目的としており、幹細胞維持におけるmTORC1抑制の役割の解明を目指している。前年度に行ったリン酸化プロテオームによる解析に加え、mTORC1欠損AML細胞の特徴を同定することを目的とし、BD Lyoplateを用いた網羅的な表面抗原の解析を行った。その結果、mTORC1欠損AML幹細胞集団では正常造血幹細胞の幹細胞マーカーとして知られているSca-1の発現が増加していることが明らかとなった。またCML幹細胞での発現が報告されているCD27の著しい誘導が認められ、幹細胞の維持に必要なシグナルが増強されていることが示唆された。In vivoのmTORC1欠損AML細胞では、他にも接着分子や、免疫抑制分子などの発現の増加が観察され、これらの分子が協調的にmTORC1抑制下での自己複製を促進していることが示唆された。またmTORC1欠損時にはmTORC2が機能していることが示唆されたことから、MLL-AF9 AMLモデルにおけるmTORC2の機能解析を試みた。in vitro, in vivoでRictorを欠損させて増殖・生存に対する影響を観察したが、Rictor単独での明らかな影響は観察されなかった。さらにmTORC1とmTORC2を同時に欠損するマウスを樹立した。またmTORC2の下流分子として知られるFOXOのin vivoでの長期的な抑制を実現するため、FOXO1/3/4ノックアウトマウスを導入し、解析を進行させた。詳細な結果はまだ得られていないため、今後の研究進展が必要である。本年度はmTORC1欠損AML細胞のリン酸化プロテオーム解析から得られたデータを基に、急性骨髄性白血病(AML)細胞においてmTORC1依存的にリン酸化変動するmTORC1下流候補分子の機能スクリーニングを行った。リン酸化変動の認められた分子について、shRNAを用いたノックダウン実験を行い、in vitroとin vivoの両者でAML細胞の増殖に必須な分子にリン酸化変動が生じていることを見出した。また、mTORC1欠損によって幹細胞維持に関わるFOXOが活性化しているかどうかを検討するため、mTORC1欠損AML細胞におけるFOXOの細胞内局在を解析し、mTORC1欠損細胞においてFOXOが活性化していることを示すデータを得た。この細胞内局在変化は幹細胞様の表現型を示す生体内の細胞で顕著であったことから、mTORC1の抑制に伴い、生体内の微小環境によってFOXOが活性化されることが細胞の生存に重要であることが示唆された。また、shRNAを用いたFOXO3aの発現抑制はAML細胞の分化を誘導し、mTORC1欠損と組み合わせることで相乗的にAML細胞の増殖を抑制した。以上の結果から、mTORC1欠損時のAML細胞の生存に、FOXO3aの活性化が関与することが強く示唆された。またこれに伴い、In vivoでのmTORC1欠損時におけるFOXOの機能を評価するモデルの樹立を試みており、今後このモデルを用いてin vivoでの機能を明らかにすることにより、白血病幹細胞の生存メカニズムの解明が進展することが期待される。当初計画していた、1mTORC1欠損AML細胞を用いたリン酸化プロテオーム解析の結果を基に、リン酸化変動分子の機能スクリーニング、2mTORC1欠損時における転写因子FOXOの役割とmTORC1を介した制御機構の解明、3mTORC1欠損時のmTORC2の役割の解明のそれぞれの課題において、研究を進展させることが出来た。1リン酸化プロテオームにおいて変動の認められた分子を候補分子とし、shRNAを用いた機能スクリーニングを行い、in vitroのAML細胞の増殖に影響する分子の絞り込みを行った。一部ではin vivoでのAML発症に対する役割も評価し、AMLの増殖・生存に機能する分子を見出した。2mTORC1欠損時にFOXO3aの核局在を解析すると共に、shRNAによるFOXO3aのノックダウンから、mTORC1欠損時のFOXO3aの機能について解析を行った。

In vitroでの評価では、既に報告されているようにFOXO3aのノックダウンによるAML細胞の分化誘導効果が認められ、mTORC1欠損と組み合わせることで、有意にAML細胞の増殖を抑制することが出来た。一方で、in vivoではこのshRNAを用いて、長期的に効率よくFOXO3aの発現抑制を行うことが出来なかったため、今後は別のモデルを用いてFOXO3aの機能解析を行う予定である。3FOXO3aと同様にshRNAを用いたin vivoでの評価が困難であったため、Rictorノックアウトマウスを供与して頂き、Rictorの欠損可能なAMLモデルの樹立を行った。リン酸化プロテオームの解析結果から、既に候補分子のリン酸化変動部位は同定されている。mTORC1下流候補分子のリン酸化部位変異蛋白を作製し、リン酸化による細胞内局在、細胞内機能、白血病細胞自己複製に対する役割を明らかにする。FOXOに関しては、mTORC1欠損細胞におけるin vivoでの機能解析を中心に研究を進める。まず、in vivoでのFOXOの機能を解析するために必要な遺伝子改変マウスは導入済であることから、Raptot欠損マウスと交配を進め、mTORC1欠損下でFOXOの機能を解析するためのマウスモデルの樹立を行う。また既に樹立してあるmTORC1欠損AML細胞にdominant-negative formのFOXO3aを導入し、mTORC1抑制下におけるFOXO3aの役割を明らかにする。mTORC2の機能解析については、コンディショナルにRictorを欠損できるAML細胞をレシピエントマウスに移植し、in vivoにてRictorを欠損させることにより、mTORC2の機能解析を行う。またmTORC1とmTORC2を共に欠損できるAMLモデルを樹立し、各単独欠損モデルと比較して、AMLの治療において、両者を同時に抑制することの意義を明らかにする。研究期間を通じて、実験動物維持に関わる消耗品費用が必要となる。造血幹細胞・白血病幹細胞の取得には、抗体、試薬、プラスチック類の消耗品費用が必要であり、その費用を申請する。またシグナル伝達経路の解析にも、抗体や試薬、消耗品の費用が必要となるため、申請する。本研究分野は日進月歩の分野であり、国内外の研究の動向を把握することが必須である。そこで、初年度と二年目に国内旅費を申請する。二年目には情報収集と成果発表を兼ねて、外国旅費を申請する。また研究成果の論文発表に必要な外国語論文の校正並びに投稿料を申請する。
アレー型ボアホールレーダによる断層、き裂や鉱脈の３次元位置形状計測と分類法の確立

この研究では、ダイポールアレーとループアンテナ(DALAB)とそれに適用可能な信号処理法を提案している。これを用いると、坑井内で波の到来方向と偏波状態が推定可能になる。この信号処理では、ダイポール信号とループ信号の両方を時間領域で抽出し、2つの信号の比を計算する。この比と理論計算と比較することで、波の偏波状態を推定する。この研究では、実験データへ、提案した方法を適用した。実験場は垂直導体円柱と地層境界面が存在している。DALABで反射点の3次元位置と偏波状態を推定したところ、導体円柱からの反射波は垂直偏波に近く、地層境界面からの反射波は水平偏波成分を含むことがわかった。本年度の研究実績は以下の通りである。1、アレー型ボアホールレーダへのパルスレーダシステムの導入:アレー型ボアホールレーダはステップ周波数方式が採用されていた。測定対象が坑井から離れている場合にはパルスレーダ方式が有利になる.本年度はこのパルスレーダ用パルス発生器を試作した。トリガー信号は地表で周期50msで発生させ、シングルモード光ファイバで地中の高周波パルス発生器へ伝送する。この発生器、2次電池及び光/電気変換回路は円柱形状のシャーシ(φ41.3mm×770mm)に内蔵される。発生パルスのパルス幅は約5nsであり、最大電圧は100Vである。このパルスはボアホールレーダの測定周波数帯域を十分にカバーする。2、波の到来方向及び偏波状態の同時推定用アンテナの開発:斜め形状をしたダイポールアンテナを素子とするアレーアンテナを開発対象とした。FDTD法によって、このようなアンテナへ直交する2つの偏波を入射した場合の給電点での電圧を計算した。その結果、アレー信号から入射した波の到来方向だけでなく、偏波状態も推定できる可能性があることがわかった。この数値計算で用いたアンテナモデルを実際に試作し、坑井内に挿入し、坑井の外から電磁波を入射したところ、数値計算と同様な結果が得られた。3、アレー型ボアホールレーダによる神岡鉱山(岐阜県)での断層計測:比較的均質な媒質中に3次元位置形状が既知である断層が存在する本実験場内にある水平坑井で計測を行った。断層付近でダイポールアレーアンテナを走査したところ、断層から明確な反射波を受信した。受信したアレー信号を解析することで、断層の3次元位置と形状を推定することができた。この結果より、断層の3次元計測にダイポールアレーアンテナの使用が有効であることが確認できた。本年度の研究成果を以下に列挙する。斜めダイポールアレーアンテナの開発斜めに配置したダイポールアンテナをアレー配置することで、任意の偏波状態を受信することが可能か検討した。このためには、流通するアンプで受信電圧に対する感度を十分得られるように、坑井内の中心導体円柱(アンプや電池内蔵)からの同軸給電を行うことが必要である。この場合、導体円柱とアンテナ間の干渉が問題となる。垂直ダイポールアレーの場合で、導体円柱とアンテナ素子間の干渉の大きさを理論的に表現した干渉度を提案し、設計法を確立しており、これと同様な手法でアンテナ設計法を提案した。ダイポールループアンテナの開発ループ面を水平にしたループアンテナと垂直ダイポールアレーアンテナを組み合わせることで、到来する波の偏波状態が推定可能か検討した。これらのアンテナ素子は同軸給電されており、モーメント法で平面波入射に対する応答をシミュレーションした。その結果、アレー信号を適切に合成することで、偏波の推定が可能であることが判明した。坑井におけるモード変換:ボアホール効果により水平偏波が斜め入射した場合には電界の垂直成分(=主に垂直ダイポールが受信する成分)が発生することを定量的に表現できることをフィールド実験で示すことができた。四条畷実験場(大阪府)におけるフィールド計測:斜めダイポールアレーアンテナ及びダイポールループアンテナを土中に掘削した坑井に挿入し、坑井の外部から任意の直線偏波を入射させる実験を行った。斜めダイポールアレーアンテナに関しては、シミュレーションで見られた偏波に対する特有な応答があることを確認した。これは同アンテナで偏波状態の推定が可能であることを示している。また、ダイポールループアンテナでは、受信データへモーメント法を用いた偏波状態推定法を適用したところ良好に偏波推定ができた。2013年度までに、ポラリメトリック指向性アンテナの提案・その妥当性の検討と指向性ボアホールレーダにおけるパルスレーダ方式の検討を行った。最終年度である今年度は最終目標を達成するべく、以下の項目に関して研究を行った。ポラリメトリック指向性アンテナの性能評価:試作したアンテナが、到来する電磁波の偏波、到達時刻と到来方向の同時推定が可能であることをフィールド実験によって示した。

実験環境は大気中、土壌中で坑井内にアンテナを設置した場合であった。対象とするアンテナはダイポールループアレーアンテナであった。パルス方式の導入:昨年度に整備したパルス発生器をレーダゾンデに導入することで、パルス方式のダイポールアレー型指向性ボアホールレーダを試作した。フィールド実験を行い、3次元ボアホールレーダシステムでのパルス方式の有効性を示した。ポラリメトリック指向性アンテナ用信号処理法の完成:FDTD法やモーメント法を用いてアンテナへ任意の偏波状態をもつ波が入射したときの受信信号をシミュレーションし、これらの信号を合成することで波の到来方向と偏波状態を推定できることを示した。ポラリメトリック指向性アンテナを用いた3次元位置形状計測と分類法:上記で導入したアンテナ、レーダゾンデやレーダ信号処理法を用いて、実際に不均質や導体円柱等が存在する実験場にて計測を行った。実施した実験場は、四条畷実験場(大阪府)、寝屋川実験場(大阪府)、中竜鉱山実験場(福井県)であり、計測対象はき裂、断層、鉱脈や人工物体であった。これらからの反射波を受信し、物体ごとに3次元位置推定した上で偏波状態を推定した。26年度が最終年度であるため、記入しない。地下電磁波計測工学26年度が最終年度であるため、記入しない。実施計画で掲げていたレーダシステムの試作、大学構内における試験及び神岡鉱山におけるフィールド実験をおおむね実施することができたため。アンテナの開発については概ね順調に行うことができた。最終年度で実施するフィールド実験におけるデータの質等にも依存するが、概ね目標には到達できると考えている。レーダシステム試作、数値計算による検証及びフィールド実験による実証までを行うことが本研究の特色であることを踏まえた上で研究を推進する。次年度が最終年度であるため、研究の総括を行う。特にフィールド実験での試作したアンテナ及びレーダシステムの評価が重要になる。旅費・人件費については予定通り研究を遂行しながらも節約することができたため、全体として10%程度の残金がでた。一方、次年度はレーダシステムのパルス方式化のための物品が必要となるため、物品費が不足する可能性がある。来年度は今年度の残金を活用していくことができると考えている。フルポラリメトリック計測のため送信アンテナシステムのアレー化を行う必要があり、送信アンテナシステムの地中部に高周波スイッチを導入することにしていた。この試作には200万円程度の予算が必要であり、2013年度までの予算では足らず、開発が難しくなっていた。このため、2013年度の残金を2014年度予算へ繰り越す形にすることで、2014年度に送信アンテナシステムの試作を行うことを可能にする。「直接経費次年度使用額」と2014年度の直接経費と併せて、送信アンテナシステムの試作、野外計測を実施する。
酸素および一酸化窒素のヘムによる活性化に及ぼすチオレート軸配位子効果

シトクロムP450およびNO合成酵素(NOS)の活性中心のヘムの軸配位子が共通してシステインのチオレート(S)であることはヘム酵素として特異であるが酵素化学的にはこれらヘムーチオレート酵素の強力な反応性とその構造的特徴との関連は未解明であった。また近年P450およびNOSにおけるS原子へのNHの水素結合の存在が明らかになったがこの水素結合が反応性に及ぼす影響は未解明なためNH-S水素結合を有し且つ反応性の検討可能なアルカンチオレート配位モデルの構築を行い検討を加えた。SR錯体の構造にS原子に水素結合を形成し得る位置にアミドのNHをリンカー部分に導入した錯体(SR-HB)を設計し合成を行った。SR-HB錯体ではソーレ帯吸収が他より短波長シフトしていた。SR-HB錯体のX線結晶構造解析を試みたところ解析に成功した。構造はほぼ予想通りでありFe-S結合距離は2.18Åと合成錯体としてはP450自身に最も近かった。また、NH...S間距離は2.7Åであり水素結合の存在を示唆した。次にFe-S結合次数の比較を共鳴ラマン分光を用いて行った。その結果合成ヘムチオレート錯体として初めてvFe-S modeを観測し、SR-HBがSRより28cm^<-1>高波数であったことから、水素結合によりFe-S結合の結合次数が高まったと考えられた。SR-HB錯体の触媒的酸素活性化能をSR錯体等と比較検討するために、活性種の反応性を鋭敏に反映するアルカンーオレフィン競争反応をmCPBAを酸化剤として行った。その結果、SR錯体はイミダゾール配位やクロル配位ヘムに比較し10倍アルカン酸化を優先したがSR-HBではややアルカン酸化比率が低下し、活性種が求電子性がSRに比べて高まっていることがわかった。以上精密なモデル錯体の合成に成功し、酵素機能解明に寄与する生物無機化学的研究を行い得た。
自己細胞移植による次世代型血友病A治療の創出

遺伝子、細胞治療においてウイルスベクターの全身投与は免疫学的副反応や細胞毒性をきたす危険性がある。我々はpiggyBackトランスポゾンベクターを用いたハイドロダイナミック法(HGD)による非ウイルス性遺伝子伝播法を確立した。血友病Aマウスモデルに本ベクターを用いて全長第VIII因子遺伝子の導入に成功した。その結果、免疫反応なしに第VIII因子が300日にわたって発現することを確認した。次に、血友病AイヌにおいてGFPあるいはFVIII発現piggy Backベクターを用いて肝標的HGDを行ったところ、肝4葉の70-80%の肝細胞が120日後も陽性であった。血友病Aは血液凝固第VIII因子(FVIII)の量的・質的異常による先天性出血性疾患である。出血部位は主として関節内が多く、反復すると非可逆的な血友病性関節症を発症するため患者QOLは著しく障害される。そればかりでなく、筋肉や頭蓋内出血などの重篤な出血もしばしば認めることがある。現在我が国では、血漿由来あるいは遺伝子組換えFVIII製剤の定期補充療法が行われており、患者QOLは格段に改善された。しかし確実に出血を防ぐためには最低週3回FVIII製剤を経静脈投与することが必要で、いまだに患者や家族の身体的・心理的負担には絶大なものがある。また平成22年度月額高額医療費の上位10件中9件(2000万円以上)が血友病で占められていることからわかるように、製剤は高価であり、我が国の医療財政を圧迫している。さらに、過去に血液製剤に起因する肝炎ウイルスやHIV感染症が大きな社会問題となった我が国の歴史的背景からもより安全かつ有効な新規治療法の確立が求められている。本研究は血友病A患者とその家族の身体的・心理的負担をなくし、QOLを改善することが可能となる新規細胞治療法を血友病Aイヌモデルで確立し、臨床展開に直結させることを目的とする。現在、血友病A患者の出血に対する予防的定期補充療法は、FVIII製剤を最低週3回静注するプロトコールが一般的である。しかし、我々の提案する自己細胞を用いた新規治療法で、目標であるFVIII発現活性を最低6か月持続することができれば、患者自身の負担の軽減とともに、国の医療費負担も著しく削減される。したがって我々の新規細胞治療は、現在の補充療法より効果的かつ経済的な治療法となる可能性があり、血友病A患者の治療の進展に大きく寄与するものと確信している。最近、血友病B患者に対し、アデノ随伴ウイルスベクター(AAV)を用いた遺伝子治療の臨床試験が欧米で実施された。その結果、一定期間凝固第IX因子(FIX)の発現は確認されたものの、ベクターや発現蛋白に対する免疫応答が発生し、肝臓などに機能障害が認められるなど安全性は確立されていない。血友病Aに対するウイルスベクターを用いた遺伝子治療は、導入する遺伝子であるFVIIIcDNAが7kbとFIXと比べ非常に大きいために臨床応用をめざした研究の進展には至っておらず、新たな戦略が必要である。次世代の血友病A治療の必要条件として1)患者に対する侵襲が軽微である。2)免疫応答を回避でき、仮に不側の事態には治療が中断できる。3)長期間治療効果が持続する。の3つが挙げられる。我々は、これらすべて満たす治療法のひとつとして、自己細胞にex vivoでFVIII遺伝子を導入する細胞治療が有効と考え研究を開始している。前年度までの研究にて我々は非ウイルス性ベクターであるpiggyBackトランスポゾンベクターを用いて血友病Aマウスモデルに第FVIII因子遺伝子を導入し300日にわたって第VIII因子を発現することに成功した(Matsui H, et.al. PLos One 9(8) e104597, 2014)。しかしながら、ヒトへの臨床応用を考える場合、さらに、大きな動物での検討が必須であった。平成27年度では、ハイドロダイナミック法(hydrodynamic:gene delivery:HGD)を用いて奈良医大で所有する血友病Aイヌモデルに遺伝子を導入する実験を行った。10ー12kgの血友病イヌビーグル犬に全身麻酔下に大伏在静脈に18Gの末梢カテーテルを挿入し、ガイドワイアーを用いて注入用のバルーンカテーテルを挿入した。IVR技術によりバルーンカテーテルは肝静脈分岐下に設置した。肝標的HGDはpiggyBackトランスポゾンベクターを用いて右側、右中葉、左中葉左側の、4つの肝葉で実施した。組織損傷の評価のために血液サンプルを採取した。GFP発現の評価のためにベクター投与5および120日目にエコーガイド下に肝生検を実施した。ASTおよびALTの一過性の上昇がみられたが、循環、呼吸、心機能に影響は見られなかった。組織学的検査により、全4肝葉の70ー80%の肝細胞でGFPが投与5および120日とも陽性であった。

HGDおよびIVRを併用することにより大動物モデルにおいても低侵襲的に安全かつ有効に遺伝子を導入することが確認された。次に、血友病Aイヌモデルを用いて第VIII因子遺伝子をHGD法およびIVR法にて導入を試みる。さらに本年度は第VIII因子インヒビターが発生した軽症血友病A患者の抗原構造を明らかにした。遺伝子、細胞治療においてウイルスベクターの全身投与は免疫学的副反応や細胞毒性をきたす危険性がある。我々はpiggyBackトランスポゾンベクターを用いたハイドロダイナミック法(HGD)による非ウイルス性遺伝子伝播法を確立した。血友病Aマウスモデルに本ベクターを用いて全長第VIII因子遺伝子の導入に成功した。その結果、免疫反応なしに第VIII因子が300日にわたって発現することを確認した。次に、血友病AイヌにおいてGFPあるいはFVIII発現piggy Backベクターを用いて肝標的HGDを行ったところ、肝4葉の70-80%の肝細胞が120日後も陽性であった。血友病Aイヌへの適性試験として正常犬における細胞シートの生着状況を確認した。単離培養したイヌBOECsをex vivoでGFP発現レンチウイルスベクターで遺伝子導入後、温度応答性培養皿で培養後、イヌBOECsシートを作成した。全身麻酔下で開腹後、胃大網を露出させ、GFP発現BOECsシートを胃大網へ移植した。その結果移植30日後生検を行った。胃大網は肉眼上、細胞シート移植部位に一致してGFP蛍光を発色しており、また同部位の組織学的検索では、脂肪組織層内にGFPを発現する血管内腔構造形成を多数確認した。移植されたBOECsシートが拒絶反応なしに生着し、血管内皮へ分化したことが示唆された。27年度が最終年度であるため、記入しない。小児血液学イヌ自己末梢血からBOECsを単離しex vivoでFVIII遺伝子を導入後胃大網へ移植する自己細胞治療を血友病Aイヌモデルで検討を開始する予定である。既知の方法で単離培養したイヌBOECsに、イヌFVIII発現レンチウイルスベクターでイヌFVIII遺伝子をex vivoで導入した。イヌFVIII遺伝子を導入したイヌBOECsは、十分なFVIII活性を発現していることをin vitro assayで確認している。移植方法はフィブリン糊による移植と細胞シート移植の両方を検討する予定である。次世代の血友病A治療の必要条件として1)患者に対する侵襲が軽微である。2)免疫応答を回避でき、仮に不測の事態には治療が中断できる。3)長期間治療効果が持続する。の3つが挙げられる。我々は、これらすべて満たす治療法のひとつとして、自己細胞にex vivoでFVIII遺伝子を導入する細胞治療が有効と考え研究を進めている。全長FVIIIcDNAが導入可能な新しいベクターシステムの確立する。現行のAAVベクターやレンチウイルスベクターでは全長FVIIIcDNAを搭載することが不可能である。
半導体量子井戸におけるサブバンド間共鳴光によるバンド間共鳴光の超高速変調の研究

サブバンド間遷移は、その遷移の行列要素が大きく、緩和時間がピコ秒程度と非常に速いことから、超高速デバイスへの応用が期待されている。本研究では、このような優れた特長をもつサブバンド間遷移と通常のバンド間遷移を同時に用いた独自の超高速光制御光変調デバイスを作製し、その超高速動作を実証することに成功した。このような超高速の光-光デバイスは、将来の時分割多重光通信システムにおけるデマルチプレックサ-等への応用が期待される。光-光変調の原理は以下の通りである。n型量子井戸では、伝導帯第1サブバンドに電子が存在するため、バンド間遷移による吸収が抑制されている。ここで、サブバンド間光が照射されると、その吸収にともなって伝導帯第1サブバンドの電子が第2サブバンドに実励起される。このため、第一サブバンドに空準位が生じ、バンド間遷移の抑制が解除されバンド間光の吸収が増加しバンド間光が変調される。つぎに、サブバンド間光の照射を停止した場合には、サブバンド間の実励起緩和時間(ピコ秒)程度で第1サブバンドの電子密度が回復しバンド間吸収が抑制された状態に復帰する。よって、速度としてはピコ秒程度の超高速変調が期待できる。本研究では試料をMBEで実際に作製し、光導波路構造に加工した試料を用いて行った。ただし、n型不純物添加は、その相互作用の増大を狙って障壁層への選択添加を行った。変調特性の測定においてサブバンド間光源としては自由電子レーザ(FEL)システムを用いた。FELは大きな波長可変性や非常に短いパルス幅等の優れた特徴を持ち、本変調方式の実験的検討に大きな威力を発揮した。ここで用いたFELは幅5ps程度の極短光パルスを45nsの間隔で約300-400個含むパルス列からなるマクロパルス(幅15μs)を10Hzの繰り返しで発生するシステムである。バンド間光源としては通常の半導体レーザを用い、対物レンズで集光して光導波路に導入した。その結果、制御光の鋭いパルス波形に追従したピコ秒台の超高速の光-光変調が観測され、初めて超高速変調が実証された。光通信、光情報処理の分野においては光パルス列を時間軸上にいかに高密度に発生させるか、またその光パルス列をいかに高速に変調するかが重要な課題となっている。申請者はこのような観点から、光による光の超高速変調を目指し、量子井戸におけるサブバンド間共鳴光によるバンド間共鳴光の変調という独自の光制御光変調方式を提案し、その可能性を示してきた。ただし実験的には、量子井戸材料としてAlGaAs/GaAs系を用いていたため、サブバンド間共鳴光として用いることができる光源がCO_2レーザに限られていた。その結果、サブバンド間共鳴光波長が10.6μmと長く、そのパルス幅も100ns程度と幅広くなり、現実の光通信との整合性に問題があった。本研究ではこの問題点を念頭におき、量子井戸を構成する材料およびその構造の最適化を行い、サブバンド間遷移波長を10.6μmから、光通信において重要な2μm程度以下へと大幅な短波長化を図るとともに、こうして得られた量子井戸を用いて、ピコ秒さらにはフェムト秒領域での超高速光制御光変調を実証することを目的として研究を行っている。