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新規治療開発を目指した血液透析患者の痒み発症機序の解明－頭蓋内圧と髄液中BNP

透析患者における髄液中の高濃度BNPが、かゆみ伝達神経を刺激して特有の痒みを生じさせるという仮説を設けた。患者から髄液を採取することは、侵襲があるため不可能である。髄液中のBNPは、体液量貯留および透析用動静脈シャントによる静脈系の高圧に対し、髄液圧(=頭蓋内圧)を低下させるために反応性に上昇していると考えた。非侵襲的な頭蓋内圧測定法として、頭蓋内の音響によって、圧を推測するHeadSenceという機器を使用する予定であったが、測定値の信頼性の評価が定まっていないため使用が行えず、待機の方針であった。平成28年度はHeadSenceが使用可能になることを待ちながら、他の非侵襲的頭蓋内圧測定法として超音波断層装置による視神経鞘(ONSD)の測定を行う準備を進めていた。HeadSenceにつついては、実測値との乖離が大きいという研究が発表され、本研究期間での実行は難しいと判断した。ONSD測定は、簡便で臨床的には有用であるとの報告が多いが、術者の習熟度によって測定値がばらつくことが明らかになった。この問題を解決するため、眼科医とディスカッションを行ったところ、基本的なコンセプトは頭蓋内圧による視神経乳頭のうっ血を評価することであるとの見解であった。眼球の超音波測定も可能であるが、現在は光干渉断層計(OCT)による評価が適当であるとの助言を得た。OCTは、網膜疾患患者の眼底の断面図をミクロンレベルで繰り返し撮影することが可能な検査法である。OCTを用いて、非侵襲的に頭蓋奈圧を推定する文献が見つかり、網膜の視神経層厚が、頭蓋内圧とよく相関することが判明した。過去に当院OCTにより測定された透析患者の視神経層厚を調べたところ、正常域より大幅に上昇していた。この知見をもとに、透析患者の視神経層厚と痒みの程度の相関を検討する方針とし、院内倫理委員会の承諾が得られた。頭蓋内圧測定法が定まらなかったことが、研究の遅れをまねいた。音響による測定法は、わが国でも発売に向けて準備が進められているが、少なくとも2年以上先になると予想され、採用は困難である。超音波断層装置によるONSD測定は、文献上は実測値をよく反映するとの報告が多いが、試験的に測定してみると、同一の被験者においても、測定者によるばらつきが認められた。また、超音波断層装置によるONSD測定は、頭部外傷や頭蓋内出血などのかなり上昇した状態において有用であり、日常的に通院にて血液透析を行っている患者においては、痒みのある患者とない患者では差が明らかにならない可能性が危惧された。これら以外の方法も検索したところ、経頭蓋超音波ドプラ法(TCD)、頭部MRIないしCTによるONSD測定、脳波などの報告が認められたが、本研究の被験者にとっては、非侵襲的といえども、技術的ないし負担の大きさから採用にはいたらなかった。超音波断層装置によるONSDの問題点は測定値のばらつきだけでなく、測定限界がmm単位であることが大きい。視神経および視神経鞘はくも膜下腔と一体となっており、かつ骨に覆われていないため、頭蓋内圧の上下を反映して大きさが変化するため、ONSDを頭蓋内圧の指標として測定することには理論的な根拠が十分存在すると考えられる。研究代表者が所属する順天堂大学医学部附属静岡病院の眼科へONSD測定について意見を伺ったところ、超音波診断よりも正確で再現性の高い光断層干渉計での視神経線維層厚を測定することを勧められた。また、同時に眼球の診察を行うことで、眼疾患による測定値への影響なども評価することが可能である。眼科スタッフとの共同研究を行うこととし、研究内容の見直しを行い、倫理委員会での審査を受け、承認を受けることができた。懸案であった課題を解決するのに予想以上の時間を要してしまった。下記の計画に従い、単群、非ランダム化、オープン、無対照の臨床研究を行う。1血液透析を実施する患者に対し、透析担当医よりに従って、対象患者に研究への参加を依頼し、文書にて同意を得る。2血液透析は通常(月・水・金)ないし(火・木・土)のスケジュールで行われる。日常診療では透析が2日間行われていない月ないし火曜日に定期的な採血検査が行われる。月に2回患者の状態把握および透析条件の設定のため透析前後に後述の内容の検査を行う。定期採血検査日の透析直前にOCTによる測定を片眼2回ずつ施行する。同時に痒みの指標としてVAS(visual analogue scale)および皮膚疾患のQOL scoreとしてSkindex 21を聴取する。3通常の血液透析を行う。4透析終了時に、透析後の定期採血検査を行う(目標体重の評価のため、BNP濃度も測定される)。透析終了直後の止血中にVAS, Skindex 21を再度聴取し、帰室ないし帰宅前にOCTを行う。5患者背景を比較するため、以下の項目をカルテから抽出する。基本情報:年齢、性別、腎不全原疾患、糖尿病の有無、心血管イベントの有無、脳卒中の有無、神経疾患の有無、内服薬、バスキュラーアクセスの種類、維持血液透析の期間OCT施行時の血液検査所見:(透析前)

血算、生化学(総蛋白、アルブミン、尿素窒素、クレアチニン、ナトリウム、カリウム、カルシウム、リン、鉄、TIBC、フェリチン、A1c(糖尿病の場合)、グリコアルブミン(糖尿病の場合)、β2-ミクログロブリン(透析後)BNP、血算、生化学(尿素窒素、クレアチニン、ナトリウム、カリウム、カルシウム、リン)透析条件:目標体重、透析前体重、透析後体重、透析開始時血圧、終了時血圧、心房細動の有無その他:胸部単純写真における心胸郭比。VASに対する視神経線維層厚その他の計測値との相関を解析する。1非侵襲的頭蓋内圧測定機器の問題マウスを用いた先行研究により、髄液中のBNPにより痒み神経が刺激され、痒みが誘発されることが明らかになった。本研究は、「髄液中のB型ナトリウム利尿ペプチド(BNP)が血液透析患者では上昇するため痒みが生じる」という仮説を明らかにすることが目的である。髄液中のBNP濃度は、頭蓋内圧が上昇している際に髄液の排出を促すために上昇すると考えられる。髄液中のBNP濃度を測定するには腰椎穿刺を行う必要があるが、倫理的に行うことが難しいため、BNP濃度測定の代替法として、頭蓋内圧を測定することにした。頭蓋内圧も正式には脊髄腔内へ針を穿刺する必要があるため、非侵襲的な測定法を検討し、音響を用いた測定法のHeadSence社(HS-1000)を導入予定であった。米国での臨床試験で、HS-1000の測定値に侵襲型センサーとの乖離が指摘され、改良・再申請の方針となり、本機の使用は承認待ちの状況になった。2代替測定方法の選定HS-1000が使用できない場合の代替法を検討した。間接的な頭蓋奈圧モニタリングとして、超音波断層撮影装置による視診鞘径(optic nerve sheath diameter:ONSD)測定法がある。近年、脳外科や救急診療領域で多く行われており、観血的な頭蓋内圧モニターとの比較でも高い相関がみられている。HeadSenceモニターが使用できるまで、ONSD測定を行うこととした。3健康ボランティアに対するテスト申請者を含む研究グループ内のボランティアに対し、ONSD測定の訓練を行った。GE Healthcare社製の超音波断層撮影装置(LOGIQ eV2)を用いて検討を行ったところ、測定自体は比較的容易に再現性をもって行えることが判明し、HeadSenceモニターの代替として使用が可能であることが明らかになった。当初導入予定であったHeadSence社の非侵襲的頭蓋内圧モニターが、米国FDAの臨床試験において観血的な実測値との乖離を指摘され、再申請となったため、事態を見守る必要が生じた。非観血的頭蓋内圧測定法の代替案として、超音波断層撮影装置による視神経鞘径(ONSD)測定を行うこととした。幸い、申請者の所属する診療科において、比較的随意に使用可能な装置が導入されたこともあり、ONSD測定の訓練を研究グループ内で行った。被験者に対する侵襲度はほぼ皆無と考えられた。唯一危惧されるソノゼリー(超音波の通過円滑にするゼリー)とエコー探索子による眼の汚染対策として、探索子に滅菌されたビニールカバーをかけた状態で測定を行えるかを検討したが、特に支障はないと結論付けられた。透析患者における髄液中の高濃度BNPが、かゆみ伝達神経を刺激して特有の痒みを生じさせるという仮説を設けた。患者から髄液を採取することは、侵襲があるため不可能である。髄液中のBNPは、体液量貯留および透析用動静脈シャントによる静脈系の高圧に対し、髄液圧(=頭蓋内圧)を低下させるために反応性に上昇していると考えた。
環境DNAを用いた回遊性魚類の移動経路の回復と生息地復元に基づく流域生態系の再生

研究初年度である平成30年度は、1)現地調査による環境DNA試料の採取と分析、および2)流域ビッグデータベースの構築を中心に研究を実施した。1)環境DNA試料の採取と分析では、主に2018年9-10月、瀬戸内海流入流域の九州沿岸・中国地方の現地調査を行い、82地点においてステリベックスを用いた試料採取を実施した。対象河川は上記対象範囲におけるすべての一級河川(13流域)および、主要2級河川である。2)流域ビッグデータベースの構築では、流域基盤データ(横断構造物データ・土地利用データ・河川流路データ・水質データ等)に加え、国勢調査データ、水産統計データを入手しGISデータとして全国レベルで整備した。水産統計に関する情報としては、農林水産省(漁業センサス)・海面漁業生産統計調査・遊漁採捕量調査等を入手し、各県別・流域別にGISデータ化を行った。研究成果としては年度前半に予備解析を行い、和歌山県における「アカザ:Liobagrus reini)」、香川県における「アブラボテ:Tanakia limbata」等といった、各県レベルでの絶滅危惧淡水魚類が、既存調査データで未発見の地点から検出された。今年度の誌上発表等の成果は以下のとおりである。誌上発表;亀山哲(分担執筆),安田喜憲ほか編(2019)統計学を用いた二ホンウナギの生息適地の推定森里川海の絆の再生による自然共生社会の実現を目指して,文明の世紀,pp.131-150,株式会社インプレスPOD出版サービス,【ISBN 9784802095907】口頭発表;亀山哲,今藤夏子,松崎慎一郎(2018)ウナギを育む、豊かな森川里海の絆と幸福な人の暮らし(その3)GIS解析と環境DNA分析の統合を目指して第14回GISコミュニティフォーラム, 2018年5月,東京現在までの進捗状況の判断は「おおむね順調に進展している」である。現地調査においては調査期間全般を通して天候に恵まれ、調査スケジュールの延期や遅延等もなく、順調に各対象河川の環境DNA分析資料を収集することが出来た。次年度以降は残りの対象範囲を中心に同様の現地調査を実施する見通してある。また同時並行として進めている流域ビッグデータの構築においては、特に水産統計を含む時系列データの拡充を行う予定であり、今年2019年後半を目途に完成させる予定である。成果の発信については、研究成果の一部を他の研究成果と統合し、ニホンウナギを含む絶滅危惧種の生息地保全と資源量の回復に資する研究成果を目指す。また同時に研究成果のアウトリーチ活動として研究所外の各研究機関に出向き、講義や講演を行う予定である。本科研費研究と国立環境研究所PJ5プロジェクト「絶滅危惧種を対象とした流域圏における回遊環境の保全と再生」また外部資金課題(京都大学LAP)との整合性を高め、主に全国の主要河川(主要一級河川と瀬戸内海流入流域等)においてeDNAデータ及びGISデータを拡充するとともに、生息地評価を継続する予定である。特に現地調査(河口域および河川横断構造物前後のeDNA調査)と空間情報解析を融合化する形で生息環境の時空間的変容について要因解明と対応策の検討を計画している。更に研究を高度化し、環境DNA分析により得られるウナギを含む絶滅危惧淡水魚類の生息地情報と流域圏別の水質・分断状況・土地利用等を統合的に解析すると共に、各水系別の生息地と生態系サービス評価を行う予定である。

次年度以降は残りの対象範囲を中心に同様の現地調査を実施する見通してある。また同時並行として進めている流域ビッグデータの構築においては、特に水産統計を含む時系列データの拡充を行う予定であり、今年2019年後半を目途に完成させる予定である。成果の発信については、研究成果の一部を他の研究成果と統合し、ニホンウナギを含む絶滅危惧種の生息地保全と資源量の回復に資する研究成果を目指す。また同時に研究成果のアウトリーチ活動として研究所外の各研究機関に出向き、講義や講演を行う予定である。本科研費研究と国立環境研究所PJ5プロジェクト「絶滅危惧種を対象とした流域圏における回遊環境の保全と再生」また外部資金課題(京都大学LAP)との整合性を高め、主に全国の主要河川(主要一級河川と瀬戸内海流入流域等)においてeDNAデータ及びGISデータを拡充するとともに、生息地評価を継続する予定である。特に現地調査(河口域および河川横断構造物前後のeDNA調査)と空間情報解析を融合化する形で生息環境の時空間的変容について要因解明と対応策の検討を計画している。更に研究を高度化し、環境DNA分析により得られるウナギを含む絶滅危惧淡水魚類の生息地情報と流域圏別の水質・分断状況・土地利用等を統合的に解析すると共に、各水系別の生息地と生態系サービス評価を行う予定である。当該年度に支出を予定していた、人件費・謝金に関してはデータ入力補助および現地調査補助に対する支出を想定していたが、申請者らのエフォートに余裕が得られた時期に、自分らで現地調査準備やデータ整理等を行った為に予算的に削減が可能であった。本件に伴い繰り越した額については、次年度の人件費・謝金等に対して執行する予定である。我々は、森里川海を繋ぐ代表的指標生物としてウナギを捉え、流域圏における回遊経路や生息地環境の保全・再生を目的に研究を進めている。森里川海を繋ぎ、かつ国際的な絶滅危惧種である二ホンウナギ。しかし、森里川海の繋がりの脆弱化がウナギを絶滅の危機に追い込んでいる。本稿では二ホンウナギの生息地の時空間変動や統計学に基づく生息適地の推定、そして河川横断構造物による生息地の分断を切り口に流域環境を分析した。
細胞性免疫誘導ワクチンの感染初期の防御効果とエイズ発症阻止効果との相関の解析

HIV-1、C型肝炎ウイルスなどの持続感染による慢性感染症については、その抑制における宿主細胞性免疫の重要性が指摘されている。近年、われわれを含めた数グループが、各々優れた細胞性免疫誘導型プライムブーストワクチンを開発し、サル急性エイズモデルにおける発症防御に初めて成功した。これらの手法はエイズワクチンとして非常に有望であるが、この感染初期の防御効果がヒトにおけるエイズ発症阻止効果をどの程度反映しているかについては未知数である。そこで本研究では、細胞性免疫誘導型ワクチンによる感染初期の防御効果が、慢性感染症としてのエイズ発症阻止にどの程度つながるかを知ることを目的とし、サル免疫不全ウイルス(SIV)感染慢性エイズ発症モデルにおいて、DNAワクチン接種サルの特異的細胞性免疫を長期的に観察した。対照群の2頭がエイズ症状を呈して各々第17週、第45週に死亡したのに対し、DNAワクチン接種群の3頭は1年以上健在であった。しかし、その後、2頭がエイズ症状を呈して各々第81週、第136週に死亡した。残りの1頭は現在約3年になるが健在である。DNAワクチンを接種した3頭は、チャレンジ後約3ヶ月までは、特異的CD4Tリンパ球および特異的CD8Tリンパ球を維持していた。しかし、その3頭のうち最終的にエイズを発症した2頭については、その後1年までの間に、特異的CD4Tリンパ球レベルが低下し、血漿中のSIV量が増加に転じた。特異的CD8Tリンパ球レベルは末期まで維持された。一方、未発症の1頭では、現時点まで特異的CD4Tリンパ球および特異的CD8Tリンパ球ともに維持され、血漿中のSIV量も検出限界レベル以下にコントロールされた状態が維持された。以上の結果は、慢性期におけるSIV複製のコントロールと特異的CD4Tリンパ球レベルとの相関を示唆している。
アーチェリーにおける肩甲骨を含む肩関節の運動解析

アーチェリーのシューティング動作における肩甲骨運動の無侵襲測定は,皮膚の動揺による誤差が大きく,その手法は未だ確立されていない.そこで,本研究は,モーションキャプチャ・システムを用いた肩甲骨運動の無侵襲測定法の開発を目的とした.反射マーカを肩甲骨周辺の体表面に100個貼付することで体表面形状を測定し,その形状変化から肩甲骨運動を推定した.結果から肩甲骨運動を推定できることを示した.また,アーチェリーのシューティング動作における肩甲骨運動を計測した結果から,アーチェリーのシューティング動作にともなう肩甲骨運動を測定できることを明らかにした.アーチェリーのシューティング動作において,肩甲骨の使い方は非常に重要である.しかし,シューティング動作時の肩甲骨運動は十分には評価されていない.そこで本申請は,アーチェリーのシューティング動作における肩甲骨の位置と姿勢を含む肩関節の運動を無侵襲に計測することを目的とする.平成25年度は,モーションキャプチャ・システム(Mac3D, Motion Analysis)を用いて,10名の健康な体育会アーチェリー部に所属する男子大学生のシューティング動作を計測した.この10名は,70mラウンド平均600点以下及び70mラウンド未経験者の初心者5名と,70mラウンド平均600点以上の上級者5名に分類できた.被験者の背側左右の体表には,肩甲骨の肩甲棘と内側縁,肩峰の形状を記録できるように,格子状に4行5列の合計20個の反射マーカをそれぞれ貼付した.加えて,上肢の運動を計測するために,上肢に8個の反射マーカを貼付した.結果からアンカーからリリースにおける両肩の地面に対する傾斜角度は,上級者群と初心者群において有意差が認められなかった.上級者はエイミング時に肩の傾斜を減少させながらリリース動作に移行している傾向が見られた.上級者は,アンカー・リリース間を通して個人差はあるが一定の角度で安定し,またアンカーからリリースにかけて肩の傾斜角度を減少させる特徴が見られた.以上から,体表から肩甲骨の姿勢を完全には推定するところまで至っていないが,アーチェリー動作における上級者と初心者のフォームの特徴を明らかにした.この成果は,無侵襲にて肩甲骨を含む肩関節の動作を推定するための基礎として意義があるものと考える.アーチェリーのシューティング動作における肩甲骨運動の無侵襲測定は,皮膚の動揺による誤差が大きく,その手法は未だ確立されていない.そこで,本研究は,モーションキャプチャ・システムを用いた肩甲骨運動の無侵襲測定法の開発を目的とした.反射マーカを肩甲骨周辺の体表面に100個貼付することで体表面形状を測定し,その形状変化から肩甲骨運動を推定した.結果から肩甲骨運動を推定できることを示した.また,アーチェリーのシューティング動作における肩甲骨運動を計測した結果から,アーチェリーのシューティング動作にともなう肩甲骨運動を測定できることを明らかにした.アーチェリーのシューティング動作において,肩甲骨の使い方は非常に重要である.しかしながら,肩甲骨の運動計測が非常に困難なことから,シューティング動作時の肩甲骨運動は評価されていない.そこで本申請は,アーチェリーのシューティング技術のより正確な評価を目的として,シューティング動作における肩甲骨の位置と姿勢を含む肩関節の運動を無侵襲に計測することを目的とする.平成24年度は,モーションキャプチャ・システム(Mac3D, Motion Analysis)を用いて,体育会に所属する6名の健康な男子大学生の肩関節運動を計測した.被検者の背側左側の体表には,左肩甲骨の肩甲棘と内側縁,肩峰の形状を記録できるように,格子状に4行5列の合計20個の反射マーカを貼付した.同時に,骨特徴点を触診し,最も骨特徴点に近いマーカ番号を記録した.加えて,上肢の運動を計測するために,上肢に8個の反射マーカを貼付した.計測した動作は,解剖学的に基準となる関節動作とし,肩関節の屈曲・伸展,内転・外転,内旋・外旋,肩甲骨の内転・外転とした.被検者群は,上肢の筋トレーニングを積んだ男子であったため,肩周辺筋群(棘下筋と棘上筋,僧帽筋)が大きく発達していた.そのため測定結果は,被検者の肩関節の運動にともない筋が大きく隆起するため,肩甲骨と大きく隆起した筋を含む形状となった.そのため,肩甲骨の骨形状モデルとの重ね合わせだけでは,精度が不十分であった.平成25年度には,骨モデルに加え筋もモデルに含める計画である.以上から,体表から肩甲骨の姿勢を推定するところまでは至っていないが,被検者の体型を分類し,筋も含めたモデルを開発していく必要があることが明らかとなった.この成果は,無侵襲にて肩甲骨を含む肩関節の動作を推定するための基礎として意義があると考える.肩甲骨の動作は,アーチェリーのシューティング動作において非常に重要である.しかしながら肩甲骨は体表下で滑るように動く.

そのため,モーションキャプチャ・システムを用いて体表上の骨特徴点に貼付した反射マーカ位置を計測する従来の手法では,皮膚の動揺により肩甲骨動作の計測が困難である.過去の研究においては,肩甲骨動作を計測するための装具を体表に装着する,または,X線を用いて肩甲骨動作を計測する方法が用いられてきた.しかし,これらの方法は,装具を用いるため被験者の動作を制限する,または侵襲性があるためスポーツ動作の計測には適さないと考えられる.そこで本研究は,モーションキャプチャ・システムを用いた肩甲骨運動の無侵襲測定法の開発を目的とした.研究期間全体を通じて,反射マーカを肩甲骨周辺の体表面に大量に貼付することで体表形状を測定し,体表面の形状変化からスポーツ動作中の肩甲骨運動を無侵襲に推定する方法を開発した.肩甲骨の推定誤差は,静止位において,触診により測定した肩甲骨姿勢と,本研究で提案する推定法を用いて推定した肩甲骨姿勢との差で評価した.その結果,従来の装具を体表に装着する肩甲骨動作の計測方法と同等の精度を得たことから,体表の形状変化から肩甲骨の動作を推定できる可能性を示した.最終年度には,アーチェリーのシューティング動作における肩甲骨運動を計測した.推定の結果,被験者の肩甲骨は,ドローイング開始時からフルドロー到達時までに下方回旋していた.またリリース直前からフォロースルー終了時までに下方回旋する傾向が見られた.従来計測が困難であったスポーツ動作中の肩甲骨動作を推定できる可能性を示した.今後は,さまざまなスポーツ動作に対応できるように,本論文で提案する推定法を改良することで汎用性を高めることができると考える.スポーツ・バイオメカニクス申請時には,平成25年度の被検者は15名を計画していた.しかし,平成25年度は10名の計測に留まった.しかしながら,その結果から,アーチェリー動作における上級者と初心者のフォームの特徴を明らかにした.前述の結果に加えて,上級者と初心者の腰部運動を比較した結果,初心者群は比較的早い段階からリリース直前と同様のねじりに至る傾向に対し,上級者群ではそのような傾向が見られなかった.初心者はリリース時のねじれに至ってから実際にリリースするまでに時間を掛けていたといえる.これは,初心者がアンカーの後,先に的を狙う動作を終えてから,一度静止し,クリッカーを落とす動作に移り,その後にリリースしたと考えられる.これは,シューティング動作において,引き手側の動作に影響を与えると考えられる.このことから,今後は,引き手側の肩甲骨の動作をより詳細に計測する.次に,上級者の上位2名は,MRIを用いて肩関節を計測した.ただし,肩甲骨と共に周辺筋群の形状も計測するため,造影剤を入れた反射マーカは体表面に貼付しなかった.また,被験者にできるだけ時間的な負担を与えず肩甲骨の全体像を撮影したため,撮像スライスを10mmに設定した.肩甲骨周辺の軟組織も計測するため伏臥位としたが,利用したコイルの制約から画像が粗くなっていた.以上から,計画に必要な基礎データを得ることは出来たが,より分解能の高い撮像画像を必要とすることが明らかとなったため上記の自己評価とした.当初の研究計計画では,被検者の性別を指定していなかった.そのため,被検者として,男性と女性の区別無く被検者を募った.しかしながら,肩甲骨周辺の背部形状を計測するため,プライバシーの観点から女性の被検者から一部の計測に同意が得られなかった.そのため当初予定していた被験者数10名に至らなかった.しかしながら,6名の男子学生の計測データから,十分な基礎データを得ることができた.つぎに,当初の計画では,アーチェリーのシューティング動作を計測対象としていたが,計測動作を解剖学的な基準姿勢となる肩関節の屈曲・伸展,内転・回転,内旋・外旋,肩甲骨の内転・外転とした.このことから,さまざまな肩関節の運動に対応する計測データが得られた.以上から,被検者数が当初の予定よりやや少ないが,計画を遂行するために必要なデータを得ることが出来たことから,上記の自己評価とした.平成25年度は,アーチェリーの動作を計測するため,左右の肩甲骨にマーカを貼付した.
RNAi法を応用した優性遺伝性の先天性表皮水疱症の治療法の模索

単純型表皮水疱症や優性栄養障害型表皮水疱症など常染色体性優性に遺伝する皮膚疾患の多くは、優性ネガティブ変異と呼ばれ、1方の対立遺伝子は正常な蛋白を充分に合成しながら、もう一方の変異遺伝子に由来する変異タンパク質が、正常なタンパク質の機能を阻害されることで発症する。本研究においては、特定の遺伝子の発現を阻害するために用いられるRNAi(RNA interference)の手法を応用することで、変異対立遺伝子のみを特異的に抑制する可能性を検討した。ケラチン遺伝子はタイプI型とタイプII型がヘテロダイマーを形成し働き、また培養表皮角化細胞には、恒常的にケラチン線維を発現することから、同じ中間型繊維であり、デスモゾームへ付着することの知られている筋肉型のデスミン蛋白の変異体を用い解析を進めた。表皮角化細胞株に変異デスミン遺伝子を恒常的に発現する遺伝子ベクターを導入し、形質変換した細胞を選択し実験に供している。デスミンの遺伝子変異は、実際の筋萎縮症患者の点変異の領域に合致するように、ロッド領域のアミノ酸を置換する形の遺伝子変異を準備した。このデスミン変異遺伝子を発現する培養角化細胞は、抗デスミン抗体を用いた免疫染色によりドット状の染色像を取ることより、容易に選択可能である。この際発現量の異なる数種類の細胞クローンを準備した。変異デスミン遺伝子を安定的に導入したこれらの細胞に、変異遺伝子の塩基に相当する部分を中央部・5'側・3'側など多様な部位に含む形で合成した数種類の2重鎖RNAを、短鎖核酸用のリポソームやエレクトロポレーションを利用し細胞内へ導入する準備をしたが、必ずしも安定した遺伝子発現の抑制を得ることはできなかった。そのためどの2重鎖RNAの配列がこの治療法に適切なのかを判断するには至らなかった。本研究においては、特定の遺伝子の発現を阻害するために用いられるRNAi(RNA interference)の手法を応用することで、変異対立遺伝子のみを特異的に抑制する可能性を検討している。この際発現量の異なる数種類の細胞クローンを準備している。現在、変異デスミン遺伝子を安定的に導入したこれらの細胞に、変異遺伝子の塩基に相当する部分を中央部・51側・31側など多様な部位に含む形で合成した数種類の2重鎖RNAを、短鎖核酸用のリポソームやエレクトロポレーションを利用し細胞内へ導入する準備をしている。
現代の後期高齢者における循環器疾患リスク要因の検証

本研究では、2002年より開始された全国33コホートの大規模研究「日本動脈硬化縦断研究(JALS)」で長期追跡されている高齢者、特に75歳以上の後期高齢者13,475名を対象に、高齢者のリスクファクターの特徴と循環器疾患発症・死亡への寄与を定量的に評価することを目的としている。平成28年度に、20022004年にベースライン調査を実施したJALS各コホート集団から提出された死亡、発症例について、2010年末までの死因・発症・病型等を確定し、死亡・発症データベースを構築した。それに基づき、平成29年度に、ベースライン調査で測定した各種危険因子(身体測定項目、血圧値、脈拍、糖脂質代謝指標等)および問診項目(既往、服薬状況、食事調査、身体活動調査(家事、運動以外の余暇活動など低強度活動を含む)、睡眠時間、飲酒、喫煙)と総死亡、循環器疾患発症・死亡(脳卒中、心筋梗塞)との関連を性・年代別(中高年(65歳未満)、前期高齢者、後期高齢者)に検討した。これらをもとに発症・死亡の予測に有用な測定項目・問診項目を明らかにし、平成30年度にリスクスコア算出のためのモデル化を行った。加えて、高齢者における心房細動について詳細な分析を行い、心房細動の存在は脳梗塞のみならず脳出血発症リスクの有意な増大と関連していることを明らかにした。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。平成28年度は、20022004年にベースライン調査を実施したJALS各コホート集団から提出された死亡、発症例について、2010年末までの死因・発症・病型等を確定し、死亡・発症データベースを構築した。また、ベースライン調査で測定した各種危険因子(身体測定項目、血圧値、脈拍、糖脂質代謝指標等)および問診項目(既往、服薬状況、食事調査、身体活動調査(家事、運動以外の余暇活動など低強度活動を含む)、睡眠時間、飲酒、喫煙)と総死亡、循環器疾患発症・死亡(脳卒中、心筋梗塞)との関連を性・年代別(中高年(65歳未満)、前期高齢者、後期高齢者)に検討した。加えて、ベースライン調査で測定した血圧値について性・年代別に詳細な分析を行った。死亡例データベース構築(2010年末で5,935例):生死、転居日、死亡日の情報は、JALS各コホートからJALS中央事務局に提出されている。その情報をもとに、人口動態統計の二次利用使用申請を行い、市町村、性別、生年月日、死亡日をキー変数として照合し、死因を確定した。発症例データベース構築(2010年末で脳卒中2,437例、急性心筋梗塞444例、疑い例を含む): JALS参加コホートでは、標準化した発症定義、発症登録項目を用いて、発症登録が実施されている。初発例に限らず、再発例も登録している。脳卒中については、病型だけでなく詳細な梗塞・出血の発症部位についても登録している。これらをもとに、循環器疾患発症の判定を行い、発症・病型等を確定した。特に、脳卒中の病型について詳細に分析を行い報告した。ベースライン調査で測定した各種危険因子および問診項目と総死亡、循環器疾患発症・死亡(脳卒中、心筋梗塞)との関連:性・年代別(中高年(65歳未満)、前期高齢者、後期高齢者)に検討した。特に、イベント数が多い脳卒中について病型別に詳細な検討を行い、高血圧・糖尿病・喫煙・心房細動は、前期高齢者・後期高齢者のいずれにおいても脳梗塞の有意なリスクとなるものの、慢性腎臓病は前期高齢者においてのみ脳梗塞の有意なリスクとなる(交互作用のp<0.01)こと、高脂血症の存在は前期高齢者・後期高齢者のいずれにおいても脳出血の有意なリスクとなること、やせた体格は後期高齢者においてのみ脳出血の有意なリスクとなる(交互作用のp=0.02)こと、等の知見を得た。ベースライン調査で測定した血圧値:性・年代別に詳細な分析を行った。

これらをもとに発症・死亡の予測に有用な測定項目・問診項目を明らかにし、リスクスコア算出のためのモデル化を行った。加えて、ベースライン調査で測定した血圧値について性・年代別に詳細な分析を行った。死亡例データベース構築(2010年末で5,935例):生死、転居日、死亡日の情報は、JALS各コホートからJALS中央事務局に提出されている。その情報をもとに、人口動態統計の二次利用使用申請を行い、市町村、性別、生年月日、死亡日をキー変数として照合し、死因を確定した。発症例データベース構築(2010年末で脳卒中2,437例、急性心筋梗塞444例、疑い例を含む): JALS参加コホートでは、標準化した発症定義、発症登録項目を用いて、発症登録が実施されている。脳卒中については、病型だけでなく詳細な梗塞・出血の発症部位についても登録している。これらをもとに、循環器疾患発症の判定を行い、発症・病型等を確定した。特に、脳卒中の病型について詳細に分析を行い報告した。ベースライン調査で測定した各種危険因子および問診項目と総死亡、循環器疾患発症・死亡(脳卒中、心筋梗塞)との関連:性・年代別(中高年(65歳未満)、前期高齢者、後期高齢者)に検討した。特に、イベント数が多い脳卒中について病型別に詳細な検討を行い、高血圧・糖尿病・喫煙・心房細動は、前期高齢者・後期高齢者のいずれにおいても脳梗塞の有意なリスクとなるものの、慢性腎臓病は前期高齢者においてのみ脳梗塞の有意なリスクとなる(交互作用のp<0.01)こと、高脂血症の存在は前期高齢者・後期高齢者のいずれにおいても脳出血の有意なリスクとなること、やせた体格は後期高齢者においてのみ脳出血の有意なリスクとなる(交互作用のp=0.02)こと、等の知見を得た。また、65歳未満を含めたJALSコホート全体を対象に、発症・死亡の予測に有用な測定項目・問診項目を明らかにし、リスクスコア算出のためのモデル化を行った。また、ベースライン調査で測定した血圧値をもとに高血圧の有病率・治療率・管理率について性・年代別に詳細な分析を行った。本研究では、2002年より開始された全国33コホートの大規模研究「日本動脈硬化縦断研究(JALS)」で長期追跡されている高齢者、特に75歳以上の後期高齢者13,475名を対象に、高齢者のリスクファクターの特徴と循環器疾患発症・死亡への寄与を定量的に評価することを目的としている。平成28年度に、20022004年にベースライン調査を実施したJALS各コホート集団から提出された死亡、発症例について、2010年末までの死因・発症・病型等を確定し、死亡・発症データベースを構築した。それに基づき、平成29年度に、ベースライン調査で測定した各種危険因子(身体測定項目、血圧値、脈拍、糖脂質代謝指標等)および問診項目(既往、服薬状況、食事調査、身体活動調査(家事、運動以外の余暇活動など低強度活動を含む)、睡眠時間、飲酒、喫煙)と総死亡、循環器疾患発症・死亡(脳卒中、心筋梗塞)との関連を性・年代別(中高年(65歳未満)、前期高齢者、後期高齢者)に検討した。これらをもとに発症・死亡の予測に有用な測定項目・問診項目を明らかにし、平成30年度にリスクスコア算出のためのモデル化を行った。加えて、高齢者における心房細動について詳細な分析を行い、心房細動の存在は脳梗塞のみならず脳出血発症リスクの有意な増大と関連していることを明らかにした。平成28年度に構築したデータベースをもとに、性別・年代別・疾患別に、予測に有用な測定項目・問診項目を明らかにする。それに基づき、後期高齢者に有用な測定・問診項目を提案する。
酵母ゲノム染色体におけるクロマチンの機能構造と転写調節機構

IME1(Inducer of Meiosis)は,S.cerevisiaeの減数分裂の開始を制御するマスター遺伝子であり,Rmelp(Repressor of Meiosis)は,一倍体細胞においてIME1の転写を抑えることによって減数分裂開始を阻害している.Rmelpによる転写抑制機構を明らかにするために,IME1,RME1の変異株を用いて,酵母ゲノムIME1遺伝子上流をin vivofootprint法によって解析した.その結果,1)ゲノムのIME1上流における-2030と-1950の2つのRmelpの結合部位は,IME1の転写抑制,胞子形成阻害に必要である,2)ヌクレオソームがポジショニングすることによって2つのRmelpの結合部位が空間的に近くに配置される,3)CYC1プロモーターにおいて,Rmelpは約300400bp離れた部位からactivatorsの結合を阻害する,4)Rmelpによるactivatorsの結合阻害及び転写抑制には,グローバルな転写因子Rgr1pとSin4pが必要である,などを明らかにした.以上のことから,Rme1pはRgr1p,Sin4pと協同して,転写不活性なクロマチンドメインを構築する,というモデルを提唱した.2.クロマチンの構築におけるDNAの高次構造の役割ヌクレオソームの形成・排除におけるDNAの高次構造の役割を明らかにするために,ヌクレオソームの中央またはリンカー部位に様々なnon-B型DNA配列を挿入し,in vivoでのヌクレオソーム形成に及ぼす影響について解析した.その結果,d(A)n・d(T)n,d(G)n,d(C)n,d(CG)n配列はヌクレオソームを破壊すること,またd(GA)n,d(AT)n配列はヌクレオソームのポジショニングに大きな影響を及ぼすことを明らかにした.IME1(Inducer of Meiosis)は,S.cerevisiaeの減数分裂の開始を制御するマスター遺伝子であり,Rmelp(Repressor of Meiosis)は,一倍体細胞においてIME1の転写を抑えることによって減数分裂開始を阻害している.Rmelpによる転写抑制機構を明らかにするために,IME1,RME1の変異株を用いて,酵母ゲノムIME1遺伝子上流をin vivofootprint法によって解析した.その結果,1)ゲノムのIME1上流における-2030と-1950の2つのRmelpの結合部位は,IME1の転写抑制,胞子形成阻害に必要である,2)ヌクレオソームがポジショニングすることによって2つのRmelpの結合部位が空間的に近くに配置される,3)CYC1プロモーターにおいて,Rmelpは約300400bp離れた部位からactivatorsの結合を阻害する,4)Rmelpによるactivatorsの結合阻害及び転写抑制には,グローバルな転写因子Rgr1pとSin4pが必要である,などを明らかにした.以上のことから,Rme1pはRgr1p,Sin4pと協同して,転写不活性なクロマチンドメインを構築する,というモデルを提唱した.2.クロマチンの構築におけるDNAの高次構造の役割ヌクレオソームの形成・排除におけるDNAの高次構造の役割を明らかにするために,ヌクレオソームの中央またはリンカー部位に様々なnon-B型DNA配列を挿入し,in vivoでのヌクレオソーム形成に及ぼす影響について解析した.その結果,d(A)n・d(T)n,d(G)n,d(C)n,d(CG)n配列はヌクレオソームを破壊すること,またd(GA)n,d(AT)n配列はヌクレオソームのポジショニングに大きな影響を及ぼすことを明らかにした.
生理活性ペプチドの特異性を生かした新しい腎疾患治療開発に向けた基盤的研究

腎間質の線維化は腎予後の独立規程因子であることが知られている。我々は腎間質線維化を促進させるアンギオテンシンII(Ang II)をナトリウム利尿ペプチド(ANPおよびBNP)の生理活性受容体であるguanylyl cyclase A (GC-A)欠損マウス(GC-A-KO)および内皮特異的GC-A強発現マウスに持続投与した。内因性ナトリウム利尿ペプチドはAng IIによる尿細管細胞萎縮、間質線維化、尿細管細胞と線維芽細胞の形質転換を抑制する作用を有する可能性が示唆され、その機序のひとつとして腎組織の血流維持に果たす役割が関与している可能性が示唆された。WinROOFsoftware (Mitani, Fukui, Japan)を用いて腎組織における光学顕微鏡上200倍の視野における組織学的変化についての定量化を改めて行った。線維化に関しては、1腎臓毎に20カ所をランダムに選択し、1視野当たりの線維化面積の割合をIndexとして算出した。尿細管の萎縮に関しては、1腎臓毎に10カ所をランダムに選択し、1視野当たりの萎縮尿細管数の全尿細管数に対する割合をIndexとして算出した。この結果、線維化IndexはWild-Saline、Wild-Ang II、GC-A-KO-Salineが2%4%台であるのに対して、GC-A-KO-Ang IIでは10%以上に及び、この線維化亢進はヒドララジン投与による血圧コントロールで抑制されなかった。尿細管萎縮IndexはWild-Saline、Wild-Ang II、GC-A-KO-Salineが各々02%台であるのに対して、GC-A-KO-Ang IIでは10%以上に及び、この尿細管萎縮の亢進はヒドララジン投与による血圧コントロールで抑制されなかった。また、マイクロスフェア法を用いて腎血流量の定量評価を行った。GC-A-KO miceにおいてWild miceと比較して腎血流量は有意に低下していた。昨年度までの分子生物学的検討結果も合わせて、内因性Na利尿ペプチドは、Ang II投与による腎臓の尿細管萎縮や線維化および尿細管細胞や線維芽細胞の形質変換を抑制するが、その機序のひとつとして腎組織の血流維持に果たす役割が関与している可能性が示唆された。さらに、FITC-Dextranを尾静脈より注入し、共焦点レーザー顕微鏡にて腎臓表面直下の腎微小血管数と血管径を定量評価し、内因性Na利尿ペプチドの腎微小循環維持への役割について解析を検討中である。一部組織学的検討や分子生物学的検討の結論が得られていないため。24年度が最終年度であるため、記入しない。これまでどおり、研究実施計画に基づいた検討を行い、データを論文化する。
明治初年における神道国教化政策の展開過程-大山崎離宮八幡宮を中心に-

1研究の目的中世に大山崎油神人の拠り所として創建され、近世においては幕府より950石の神領を与えられて「当職」と呼ばれる6人の社家によって独特の神領支配が行われていた大山崎離宮八幡宮が、明治維新期の廃仏毀釈を経て神社の近代的再編の中でどのような変容を被ったのかということをあきらかにすることにあった。2研究の実施過程在地(京都府大山崎町、大阪府島本町)の神社や旧社家宅に所蔵されている文書、及び京都府総合資料館などに所蔵されている厖大な文書の収集を三度にわたって行い、そこで得られた資料の筆写・整理を行い、今後の研究の基礎的データを作成した。3新たな知見今後の総合的研究のほんの一部分であるが、とくに新たに得られた知見は、旧神領時代においては離宮八幡宮に隷属し、同社の祭典にも奉仕していた天台宗西観音寺の廃仏毀釈、椎尾社への転換について(1)西観音寺の僧侶の動向(2)西観音寺檀家農民の廃寺に対する抵抗の二点についてかなり具体的に明らかにすることができた。
「新たな調査票」の開発による「いじめ追跡調査」の継承と発展

21年間(19982018年)の実績と蓄積のある「いじめ追跡調査」について,これからの10年、20年の社会状況の変化に対応できるように見直しと充実を図った上で,従来のデータとの比較可能性を担保できるように配慮して3年間の追跡調査を実施し,調査票の最終版を開発する。これにより,文部科学省の「問題行動等調査」との完全な対応をとるとともに,学術的ないじめ質問紙調査の基準となる調査票と,併せて,海外のbullying researchのstandardとなる調査票(日本語版・英語版・スウェーデン語版)を完成させる。
サル近視モデルを用いたオルソケラトロジーの近視進行抑制効果の検討

当該研究の目的は近視モデルを4群(オルソケラトロジー群、単焦点コンタクトレンズ群、単焦点眼鏡群、無装用群)に振り分け、各群の屈折、眼軸長、波面収差、角膜形状を経時的に評価することにより、各矯正法が屈折や眼軸の発達に及ぼす影響を明らかにすることであり、特にオルソケラトロジーによる近視・眼軸長進行抑制効果を明確にすることである。さらにこの近視進行抑制効果のメカニズムを明らかにすることであり、なかでも高次収差との関連について検討することに焦点を絞っている。計3年間の研究を成功させるうえで最も重要なのが近視モデルの作成であり、適切なモデルができないことにはその後の実験が成立しない。したがって本年度はこの作業に多くの時間と労力を費やした。まず、ディフューザーレンズを上手く装用させることに難渋したが、試行錯誤の末に装用継続が可能となり、現在近視モデルの作成を進行中である。また、今後の群分けに必要なオルソケラトロジーレンズの作成や単焦点コンタクトレンズ、単焦点眼鏡の調達を行い、次のステップに備え万全の準備を整えている。各群に振り分ける前のベースラインデータも詳細に測定しており、これらのデータは今後の各矯正法によるさまざまなパラメーターの変化を評価するうえで必須の基礎データとなる。以上に記したように、本年度に行った実験は3年間のプロスペクティブ研究を遂行するための大元となる不可欠な作業であり、その意義や重要性は極めて大きい。来年度以降もこの基礎データをもとに実験を進めていく予定である。オルソケラトロジー治療群とコントロール群に群分けし,屈折、眼軸長、波面収差、角膜形状について経時的な評価を開始した.現在まで約半年のfollow upが終了したが,眼軸長に関しては,すでに両群間の有意差が認められており,オルソケラトロジー治療群において有意に眼軸の伸長が抑制されているという結果が得られている.今後1年間まで治療を継続することにより,この差がどのように変化するのか,つまりさらに差が広がるのか,一定の差で安定するのか,もしくは差が縮まってしまうのかを注意深く見守りたい。これらの眼軸伸長抑制にどのファクターが関わっているのかという点については最も興味深い点ではあるが,現在までに波面収差や角膜形状との有意な相関関係は得られていない.今後1年間のfollow upが終了した時点で再検討を行う予定である.また1年が経過した時点で,両群ともに片眼のみ矯正を中止する予定である.つまり,それぞれの矯正法を同一個体の片眼のみで継続する.この片眼矯正を半年継続することにより,同一個体の左右眼でどのような相違が生じるかという点についても検討を行う予定である.そして治療を中止すると近視進行抑制効果が消失してしまうのか,もしくは維持されるのかという点についても明らかにしたい,これまでに得られた結果は下記に示したように,複数の学会や論文,著書にまとめて報告している.今回得られた結果は,オルソケラトロジーが小児の近視進行抑制効果を有するという点について明らかなエビデンスを持って証明したという点において,極めて重要な発見であり,現在の高い近視の有病率や近視に伴う様々な眼合併症の発生を考えると,その社会的意義は非常に大きいと言える.来年度もさらにデータを蓄積し,詳細な検討を進める予定である.オルソケラトロジー治療群とコントロール群に群分けし,屈折、眼軸長、波面収差、角膜形状について経時的な評価を開始した.昨年度までに約半年のfollow upが終了し,オルソケラトロジー治療群において有意に眼軸の伸長が抑制されているという結果が得られたが,本年度は震災の影響により実験を中断せざるを得ず.この後のデータの収集ができていない.したがって,これまでに得られたデータからできるかぎりの解析を行う予定である.また基礎研究と併せて行ってきた臨床研究についてはデータの解析が終わり,論文の作成も終了した.現在,Investigative Ophthalmology Visual Science誌に論文投稿中であるが,すでに4度のリバイスを行っており,間もなくアクセプトとなる予定である.この一連の研究により得られた結果では,眼鏡矯正群(コントロール群)と比較してオルソケラトロジー群では有意に近視進行抑制効果が認められ,本治療法の小児近視進行抑制効果を明らかなエビデンスを持って証明するという点において,極めて重要な研究であり,現在の高い近視の有病率や近視に伴う様々な眼合併症の発生を考えると,その社会的意義は非常に大きい研究であったと言える.また,治療開始年齢が低いほど効果が大きいことも判明し,これまで曖昧だった開始年齢についても一定の見解を示すことができたと考えている.研究で明らかとなった近視進行抑制治療効果は眼科学や一般社会に還元できるところが大きく,公的研究資金を得た責任は十二分に果たせたと自負している.
培養ヒト食道上皮細胞、線維芽細胞を用いた組織再構築型人工食道の開発

組織再構築型人工食道の開発の為,正常ヒト食道上皮細胞,正常ヒト線維芽細胞を用い以下の実験を行つた.(方法)30mmのdish上で,PGA meshとヒト食道粘膜固有層由来の線維芽細胞8×10^5個/mlを包埋した豚腱由来TypeIaコラーゲンゲル2mlをゲル化させ,その上面に食道新鮮切除標本の正常食道粘膜を酵素処理して得られた食道上皮細胞2×10^5個/cm^2を播種した.Keratinocyte growthmediumと10%FCS添加Dulbecco MEMにより,上皮細胞がconfluentになったところで,dishより剥離し,2cm平方にトリミングしたものの両端を縫合し管腔を作製した.この管腔をヌードラット腹直筋弁に移植した.(結果)移植後7日目にヌードラットより,腹直筋弁に被覆されたPGAメッシュチューブを摘出したところ,長径2cm,内径6mmの管腔が作製されていた.組織像では,内腔は全周性に重層化したヒト食道上皮細胞で被覆され,管腔の狭窄はみられなかった.外側より筋層,PGAメッシューコラーゲン複合体,線維芽細胞包埋コラーゲン層,培養ヒト食道上皮細胞が層構造となり正常の食道組織に類似した構造が再構築された.強拡大像においては,線維芽細胞包埋コラーゲン層の上方に,食道上皮細胞が8層以上に重層化して,細胞の形態も分化傾向を示した.移植後14日目に摘出した管腔の組織像では,内腔は全周性に約20層に重層化したヒト食道上皮細胞で被覆され,間質への慢性炎症性細胞の浸潤は軽度で,新生血管の増生を認めた.移植後23日目においても管腔は維持された.組織再構築型人工食道の開発の為,正常ヒト食道上皮細胞,正常ヒト線維芽細胞を用い以下の実験を行つた.(方法)30mmのdish上で,PGA meshとヒト食道粘膜固有層由来の線維芽細胞8×10^5個/mlを包埋した豚腱由来TypeIaコラーゲンゲル2mlをゲル化させ,その上面に食道新鮮切除標本の正常食道粘膜を酵素処理して得られた食道上皮細胞2×10^5個/cm^2を播種した.Keratinocyte growthmediumと10%FCS添加Dulbecco MEMにより,上皮細胞がconfluentになったところで,dishより剥離し,2cm平方にトリミングしたものの両端を縫合し管腔を作製した.この管腔をヌードラット腹直筋弁に移植した.(結果)移植後7日目にヌードラットより,腹直筋弁に被覆されたPGAメッシュチューブを摘出したところ,長径2cm,内径6mmの管腔が作製されていた.組織像では,内腔は全周性に重層化したヒト食道上皮細胞で被覆され,管腔の狭窄はみられなかった.外側より筋層,PGAメッシューコラーゲン複合体,線維芽細胞包埋コラーゲン層,培養ヒト食道上皮細胞が層構造となり正常の食道組織に類似した構造が再構築された.強拡大像においては,線維芽細胞包埋コラーゲン層の上方に,食道上皮細胞が8層以上に重層化して,細胞の形態も分化傾向を示した.移植後14日目に摘出した管腔の組織像では,内腔は全周性に約20層に重層化したヒト食道上皮細胞で被覆され,間質への慢性炎症性細胞の浸潤は軽度で,新生血管の増生を認めた.移植後23日目においても管腔は維持された.
高速原子線を用いたナノ・ファブリケーション・センタの開発

本研究の目的は、高速原子線による除去・成膜・改質を、被加工物の表面に集中して行う加工機、すなわち、ナノ・ファブリケーション・センタを開発することである。これを用いると、直径10μm程度の場所に深さ0.1μm以下の凹凸を有する微細局部構造を3次元全体構造の任意の表面に作り込むことができる。なお、高速原子線は、直進性が優れる高速中性原子ビームである。まず、ナノ・ファブリケーション・センタを設計・製作した。これは、真空度が10^<-7>Torrで一辺約400mmの立方形の真空容器内に、ペンシル形高速原子線源、マスク微動装置、小形集動マニピュレータ、などを配した装置である。ペンシル形高速原子線源は直径10mm、長さ80mmのガラス管から成り、両端と中心に輪状の電極が接着されている。ガスの流入端側の電極と中心の電極とには約30Wの高周波交流電圧が印加され、ガス管内にプラズマが発生する。また、流出端側と流入端側の電極には、約3kVの直流電圧が印加され、プラズマ内のイオンが加速される。流入端側には、接地されている孔のあいたカーボン電極が付いており、ここでイオンは中性になる。たとえば、ガスをアルゴンにして高速原子線を流入端出口においた銅箔のターゲットに当てて、スパッタリングさせたところ、10nm/minの速度で銅が成膜できた。また、直径50μmのマスクをターゲットと被加工物との間において、幅100μmの微小力センサの側面に配線を描くことができた。マスク微動装置や小形集動マニピュレータはそれぞれ並進3自由度、回転1自由度を有するものであり、各モータを真空装置外から操作できる。さらにここでは蒸着用の発熱体をガラス管に入れて亜鉛箔を蒸発させ、亜鉛ガスをアルゴンの高速原子線で押し出し、、直径0.1μmのクラスタが堆積したような亜鉛膜を被加工物上に成膜できた。またペンシル形の出力1.6Wの半導体レーザを用いて、直径100μmの錫・銀半田ボールを1Torr以上の真空中で溶かして、ステンレスや金の微細構造物の半田付けを行ったが、この半導体レーザを用いて成膜した亜鉛膜の再溶融を試みた。これらの試みから、微細な被加工物を中心にペンシル形の工具を配して、さらに超微細な形状を除去・成膜・改質できることがわかった。本研究の目的は、高速原子線による除去・成膜・改質を、被加工物の任意の表面に集中して行う加工機、すなわち、ナノ・ファブリケーション・センタを開発することである。これを用いると、直径10μm程度の場所に深さ0.1μm以下の凹凸を有する微細局部構造を、3次元全体構造の任意の表面に作り込むことができる。平成8年度では、ナノ・ファブリケーション・センタを設計・製作した。

これは、真空度が10^<-7>Torrで一辺約400mmの立方形の真空容器中に、ペンシル形高速原子線源、マスク微動装置、小形集動マニピュレータ、などを配した装置である。ペンシル形高速原子線源は直径10mm、長さ80mmのガラス管から成り、両端と中心に輪状の電極が接着されている。ガスの流入端側の電極と中心の電極とには約30Wの高周波交流電圧が印加され、ガラス管内にプラズマが発生する。また、流出端側と流入端側の電極には、約3kVの直流電圧が印加され、プラズマ内のイオンが加速される。流入端側には、接地されている孔の明いたカーボン電極が付いており、ここでイオンは中性になる。たとえば、ガスをアルゴンにして高速原子線を流入端出口においた銅箔のターゲットに当てて、スパッタリングさせたところ、10nm/minの速度で銅が成膜できた。また、直径50μmのマスクをターゲットと被加工物との間において、幅100μmの微小力センサの側面に配線を描くことができた。マスク微動装置や小形集動マニピュレータはそれぞれ並進3自由度、回転1自由度を有するものであり、各モータを真空装置外から操作できる。さらに次年度では、微細線を加熱して蒸発させ、成膜速度を1μm/minと大きくしたペンシル形高速原子線源や、ラジカルを微細な拡散接合予定面だけに当てるラジカル源、などを設計・試作する。本研究は、ペンシル形の高速原子線ソースや半導体レーザを被加工物のまわりに配して、ナノメータオーダの成膜・除去・改質を3次元的に行うシステムの構築を目的とする。ペンシル形の高速原子線ソースとして、直径10mm長60mmのガラス管を用いて、管外に電極を配したものを用いた。陰極には直径50μmの穴をあけて、被加工物に直径50μmだけ加工できるようにした。ここでは蒸着用の発熱体をガラス管に入れて亜鉛箔を蒸発させ、亜鉛ガスをアルゴンの高速原子線で押し出し、直径0.1μmのクラスタが堆積したような亜鉛膜を被加工物上に成膜できた。また、ペンシル形の出力1.6Wの半導体レーザを用いて、直径100μmの錫・銀半田ボールを1Torr以上の真空中で溶かして、ステンレスや金の微細構造物の半田付けができた。