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日本中世における戦死者供養の実証的研究

本研究は、中世地域社会史研究の立場から日本中世における戦死者供養の展開と特質を検討するものである。不特定多数を対象とする大規模供養の型式としての「三界万霊供養」に注目し、政治権力レベルだけではなく地域社会への展開過程を追究した。成果として、まず、諸事例の収集により「三界万霊」文言の歴史的成立と地域社会への導入過程、「三界万霊木牌」の成立・定着過程を明らかにした。また、「三界万霊木牌」の原物調査、関連史料の調査による各事例の具体的検討を進めた。そして戦国時代に地域社会で行われた三界万霊供養を中世民衆の思想的到達点と捉えられることを論じた。調査・研究の成果は報告書にまとめ、刊行した。日本中世における戦死者供養および三界万霊供養の事例を、研究文献、自治体史をはじめとする史料集等によって探査した。その際、歴史学のみならず、仏教学、美術史学、民俗学などの研究文献も含めて対象とし、先行研究において取り上げられた個別事例を収集するとともに、研究の枠組みを構築するために諸研究における問題意識、研究状況を確認した。その成果について「三界万霊木牌の史料的意義」(奈良歴史研究会5月例会)、「三河国普門寺史料と研究の現段階」(第51回「ムラの戸籍簿」研究会例会)の口頭発表を行った。最終年度刊行の報告書に掲載するために網羅的な事例収集を継続している。16世紀以前に遡る三界万霊木牌を所蔵する普門寺(愛知県豊橋市)、円成寺(奈良県奈良市)、本興寺(静岡県湖西市)については集中的に調査を行い、現物調査および同時代史料の調査を行った。普門寺では中世後期を中心とする古文書・聖教類を調査し、中世山寺研究の中での三界万霊供養の位置づけを検討した。その成果の一部として「中近世移行期における普門寺復興と三遠国境地域」(『地方史研究』第377号)などを執筆し、「ムラの戸籍簿」研究会の三河巡見を案内して中世村落史、地域社会史研究者との意見交流を行った。円成寺では現物資料と同時代史料に関わる調査をするとともに、納骨信仰を含む大和国内近隣地域における地域社会における信仰や供養の社会史的背景を検討した。本興寺では中世後期から近世初頭の史料調査の結果、施餓鬼会に関わる文献などを見出し、寺院の地域社会への定着に際しての共同供養の意義を検討するための足掛かりを得た。関連する八幡神社所蔵資料も調査し、未紹介の16世紀の棟札を含む64点の木札資料を見出し、その成果を『湖西の文化』第44号に発表して周知を図った。研究の第一段階として重点的に行った事例収集と史料調査については、当初の計画に沿って行うことができている。史料調査の成果の一部は、史料紹介や、研究会の現地見学会にて報告することができた。また、事例収集、史料調査を基礎とする考察の深化については第2年度以降の課題だが、口頭発表によって大枠の基礎を構想することができた。昨年度に引き続き、日本中世における戦死者供養、三界万霊供養の事例を、研究文献、自治体史などによって収集した。初年度は近畿地方、中部地方を中心に事例の収集に努めたが、今年度は中国地方、関東地方など他地方などでの事例を収集を集中的に行い、各事例の検討を行った。関連の先行研究についても検討を進め、研究状況を確認し、研究の枠組みを検討した。その成果については、「『普門寺縁起』成立の歴史的背景とその影響」(今昔の会)、「中世寺院の境内と村」(第66回「ムラの戸籍簿」研究会例会)で口頭発表を行った。また、三界万霊供養と同様に地方寺社への地域諸階層の結集のうかがえる戦国時代から江戸時代初頭における地域社会の動向について、「戦国期における地域秩序の形成と地方寺社」(『中世寺社と国家・地域・史料』)、「『和州平群郡補陀洛山惣持寺縁起』の史料的性質」(『奈良県三郷町持聖院所蔵伝解脱上人貞慶五輪塔及び五輪塔地下出土蔵骨器調査報告書』)を執筆した。収集した事例のうち、特に注目される個別事例として、三河国普門寺(愛知県豊橋市)での史料調査は継続して行い、その他、鎌倉の禅宗寺院(神奈川県)、美濃国永保寺(岐阜県多治見市)などで現物調査を行った。普門寺では、暦応元年(1338)銘三界万霊木牌の位置づけを探るために、寺蔵史料の調査を継続している。日本文学、美術史学の研究者を中心とする「今昔の会」による普門寺見学会を案内し、解説を行った。中世に遡る三界万霊牌の探索、および位牌全体の歴史におけるその位置付けを探るために、鎌倉では、建長寺、円覚寺、海蔵寺で三界万霊木牌などの室町江戸初期の位牌調査を行った。美濃国永保寺でも室町期の位牌を実見した。三界万霊木牌そのものは中世に遡るものは見いだせなかったが、その源流を考えるに手がかりとなる古位牌を調査したほか、17世紀初頭の三界万霊牌が新たに見いだされた。当初の計画では、薩摩島津氏に関わる敵味方供養碑の現地調査を行う予定であったが、より三界万霊木牌の源流を明らかにするのに、禅宗寺院の調査を行う必要があると判断し、鎌倉円覚寺、建長寺、海蔵寺、美濃国永保寺などの調査を行った。

当初の研究計画からは変更となったが、研究の進展に伴うものであり問題はない。三界万霊供養、敵味方供養の事例の収集については、昨年度に引き続き、進めることができている。調査、研究の成果の一部については、研究会や論文で発表することができた。最終年度である平成30年度は、初年度、第2年度にかけて行った日本中世の戦死者供養・三界万霊供養の事例収集、関連資料収集の補充調査および分析のまとめを行った。事例収集は、自治体史などの金石文史料による調査を継続した。『奈良県史金石文編』『大阪金石志』で「三界万霊」等の文言使用の事例を網羅的に収集して傾向を把握したほか、『山梨県史』で応永18年(1411)板碑銘で石造物としては「三界万霊」文言の早い例を確認するなど、事例収集に一定の成果を得た。中世の「三界万霊木牌」が所蔵される愛知県豊橋市の普門寺では、関連史料の調査を継続しているが、17世紀に遡る史料が新たに見いだされた。概要調査の結果、三界万霊供養に発する普門寺の復興事業に関わる重要史料であることが判明した。新出史料の紹介およびそれを組み込んだ論文作成のために分析を行った。現存する三界万霊木牌は、一面では中世木札資料・伝世木簡であり、史料学的に検討していく必要がある。中世木札資料の関連調査として、奈良市霊山寺所蔵の「寄進札」の原物調査を行った。霊山寺所蔵寄進札は約40年ぶりに原物が確認されたものであるが、本研究では赤外線撮影によって銘文判読を行い、改めて翻刻をし直し、内容分析を行った。その成果をもとに「鎌倉・室町期の大和国霊山寺と鳥見荘」(『元興寺文化財研究所研究報告2017』)を執筆した。3か年にわたる本研究成果の全体について、『平成2729年度科学研究費補助金〔若手研究B〕研究成果報告書日本中世における戦死者供養の実証的研究』にまとめて、刊行した。本書において、戦死者供養および三界万霊供養の系譜と展開を明らかにし、普門寺所蔵三界万霊木牌をはじめとする現存の三界万霊牌の位置づけを検討した。また、各種の三界万霊牌の原物資料調査報告や日本中世戦死者供養年表稿を収録し、今後の研究進展の基礎史料集たることを意図した。本研究は、中世地域社会史研究の立場から日本中世における戦死者供養の展開と特質を検討するものである。不特定多数を対象とする大規模供養の型式としての「三界万霊供養」に注目し、政治権力レベルだけではなく地域社会への展開過程を追究した。成果として、まず、諸事例の収集により「三界万霊」文言の歴史的成立と地域社会への導入過程、「三界万霊木牌」の成立・定着過程を明らかにした。また、「三界万霊木牌」の原物調査、関連史料の調査による各事例の具体的検討を進めた。そして戦国時代に地域社会で行われた三界万霊供養を中世民衆の思想的到達点と捉えられることを論じた。調査・研究の成果は報告書にまとめ、刊行した。事例の収集と、個別事例の考察深化とによって、最終年度の研究のまとめに向けて研究を推進していく。事例収集については、引き続き、史料集などに基づき関連資料の探査を継続する。今年度は近畿地方、中部地方を中心に検討したが、他地方を対象に網羅的収集を進める。重点的に調査してきた普門寺、円成寺、本興寺の各事例については、それぞれの三界万霊供養の背景と地域社会史の中での位置づけを、調査した同時代史料によって明確にし、論文として成果を公表していく。昨年度以来の事例収集や、個別事例の深化を踏まえて、まとめの段階に入っていく。
GPCにおける高分子の分離・溶出過程の光散乱法による研究

本研究は、具体的課題として次の二つのテーマを設定し、それぞれ成果を挙げることができた。(1)光散乱セル室、送液装置並びに光学系の設計・製作既設の動的光散乱装置は6つの散乱角度のみで測定が可能であったので、本研究のために新たに10°から150°まで5°おきの、計29個の散乱角度での測定が可能である光散乱セル室を製作した。測定において最も問題となる迷光は、径の小さな電子顕微鏡用のピンホール、光ファイバー等を新たに用いることにより解決できた。製作した送液装置・フローセルを用い予備測定を行い、10^<-2>ml/minの低流量速度から、GPC測定において実際に使用されている流量速度1ml/minまで広い範囲にわたって溶液を脈動なしに送れることを確認した。(2)本研究に関連した基礎データの集積希薄溶液、準濃厚域及び濃厚域において実験研究を行い、多くの新しい知見を得た。本研究と特に関係が深いと思われる二、三の結果について述べる。高分子からみ合い網目中での高分子の拡散は、セグメント摩擦係数ζ及びからみ合い点間分子量Meの二つのパラメーターを用いれば、同一の関数形でDのC、M依存性を記述できる。特に高からみ合い領域(M/Me》1)では、D〓(Cζ)^<-1>M^<-2.5>となった。一方低分子量高分子一溶媒中では、RouseないしはZimm型の拡散機構で高分子は拡散する。ブロック共重合体の微視的相分離形態を利用して、拡散高分子の慣性半径と同程度の球状障害物が規則的に格子上に並んだ溶液構造中での拡散は、拡散高分子が障害物の格子間隔より小さければRouse型の自由拡散であり、大きければ、からみ合い網目中より一層強く運動の制限を受けることが明らかとなった。本研究はGPCにおいて高分子の分離効率を決定する物理量の一つは,微視的空間であるゲル内部の孔の中及びゲル表面近傍での溶液の拡散係数Dであることに着目し, Dの測定法として動的光散乱並びに強制レイリー散乱法を用いる新しい研究手段の開発を第一目的としたものである.この目的の達成のため,本年度では以下の事を行った.1.GPC用坦体ゲルを充填・固定化できる光散乱フローセル並びに溶液の循環および流れの方向を一定時間毎に逆転できる送液装置の設計・製作はほぼ完了し,現在装置のテストを行っている.流れに脈動が生じないよう特別の工夫を要することが,テスト中に判明した.2.当研究室でこれまで行ってきた研究中に蓄積した知識をもとにして,新たに本研究用に光散乱室そのものの製作を行っている.この製作には多少時間を要しているが,本年3月には出き上る予定である.3.ポリスチレン・ゲルと等密度,等屈折率のチオフェノールを用いてゲルー溶媒系を調製したところ,ゲルとしてあまり巨大な粒子径のものを用いると等屈折率でもかなり強い散乱が生じることがわかった.この原因としてはゲル内部の不均質性によるものと考えている.4.自己拡散係数Dsの測定に使用する強制レイリー散乱装置は順調に稼動しており,線状高分子の濃厚溶液中及び微視的相分離構造を呈するブロック共重合体溶液中での自己拡散運動機構について有用な知見を得た.5.本研究に関連する線状ポリスチレン準濃厚溶液中でのポリメチルメタクリレートの拡散・沈降実験は完了し,準濃厚領域での高分子の拡散機構をほぼ全面的に解明することに成功した.(1).前年度の送液装置、フローセルの設計・製作に引き続き、動的光散乱測定用光散乱セル室及び光学系を新しく製作し直した。

測定においてもっとも問題となる迷光は、電子顕微鏡において用いられている真円の口径の小さな二つのピンホール、フィルム状偏光子を細い光ガイドを仲介として連結し、オプティカル・ファイバーをピンホールの手前に接続することにより除去できた。予備測定を行い、新たに作製した送液装置が、10^<-2>1.0ml/minの流量速度で脈動なしに送液できることを確認した。(2).GPCにおいて実際に使用されている、径50100μmのゲルを用いて動的光散乱測定を行ったところ、ゲルの不均質性に由来する強い散乱光のため、散乱光強度の時間相関関数から正確に拡散係数を評価するのが難しいことがわかった。現在小径のゲルで測定を行っており、解決の兆しがみえている。(3).高分子からみ合い網目中での高分子の拡散係数Dtrの分子量・濃度依存性を調べ、セグメント摩擦係数h及びからみ合い点間分子量Meの二つの量で換算することにより、Dtrの分子量・濃度依存性を統一的に一つの関数で記述できることを見いだした。(4).微視的相分離により格子上に規則的に配列したブロック共重合体の溶液体での異種高分子の拡散を調べた。拡散分子サイズが格子間隔より小さいときは、Rouseの自由拡散機構で分子はブラウン運動すること、大きいときには、レプテーション理論の予言よりさらに強い分子量・濃度依存性をDtrが示すことを見いだした。
胎仔創傷治癒機構における心臓線維芽細胞のエピジェネティクスと心筋梗塞治療への適用

胎仔創傷治癒機構(FWH)から成獣創傷治癒機構へ移行して発現が著明に低下する心臓線維芽細胞の遺伝子を網羅的に解析した。その結果Has2,Tm,Mmpの瘢痕を抑制する遺伝子,Pax,Foxo,Hoxの形態形成に関わる遺伝子が検出された。Pax遺伝子はヒストンH3のメチル化を認め,他はプロモーター領域のDNAメチル化により発現が低下した。各遺伝子を心筋壊死組織に導入すると当初Hoxのみが抗線維化を認めた。しかし最終的にはHoxを含めた全遺伝子が瘢痕を形成した。従ってFWHには更なる遺伝子がマスター遺伝子として制御する可能性,複数の遺伝子の相互作用による制御機構等が考えられた。マウスの胎仔創傷治癒機構から成獣創傷治癒機構へと転換する際に,心筋線維芽細胞で発現する遺伝子がどの様に変動するか,マイクロアレー法によって網羅的解析を行った。また各遺伝子のDNAメチル化の変化も比較解析した。その結果,胎仔創傷治癒機構から成獣創傷治癒機構へ移行する際には,約63000種の発現している全遺伝子のうち,約1300種類の遺伝子の発現が増加し,約1100種類の遺伝子の発現は低下していた。特に注目するものとしては以下の通りであった。まず,胎仔創傷治癒機構を認める組織では高分子多糖のヒアルロン酸が著明に沈着するが,このヒアルロン酸の合成酵素であるHas2の遺伝子の発現が著明に増強していた。その他,瘢痕形成を抑制するトロンボモジュリン遺伝子や老化に関わるFoxoの遺伝子発現も増強していた。一方,発現が減少数ものとしては,RegやFos遺伝子などの再生や腫瘍発生に関わる各種遺伝子であった。Has2,トロンボモジュリン,Foxoの各遺伝子のDNAメチル化を解析した結果,成獣創傷治癒機構に移行するとDNAメチル化は著明に増強しており,このことによって,各遺伝子の発現が成獣創傷治癒機構で抑制されている可能性が見出された。そこで,各遺伝子の転写調節領域であるプロモーター領域も解析し,Has2遺伝子プロモーター領域では成獣創傷治癒機構において著明にメチル化を生じる領域が同定され,転写レベルで成獣創傷治癒機構におけるHas2遺伝子の発現低下が生じている機構を明らかにした。昨度の実験における再現性に問題が本度の実験過程で見出されたので,昨年度と引き続き,マウスの胎仔創傷治癒機構から成獣創傷治癒機構へと転換する際に,心筋線維芽細胞で発現する遺伝子がどの様に変動するか,マイクロアレー法によって網羅的解析を数回繰り返した。また新たに胎仔創傷治癒機構特異的な遺伝子のエピジェネティクスの変化も解析した。胎仔創傷治癒機構を認める組織では高分子多糖のヒアルロン酸が著明に沈着するが,昨年度と同様に,このヒアルロン酸の合成酵素であるHas2の遺伝子の発現が著明に増強していることを再確認した。その一方で,ヒアルロン酸分解酵素遺伝子Hyal1は抑制していることが見出された。何れの酵素遺伝子はエピジェネテイクスな変化を受けており,前者は転写制御領域のDNAメチル化とヒストン修飾を,後者はヒストン修飾を受けていることが明らかになった。その他,注目すべきものとしては,胎仔創傷治癒機構では,ホメオボックス遺伝子に属する多数遺伝子の発現が胎仔創傷治癒機構では促進しており,この中には,この機構のみ発現するものも見出され,しかもエピジェネテイクス修飾も受けていることが明らかになり,この機構のマスター遺伝子である可能性が強く予想されるものを見出した。本年度は,このマスター遺伝子の候補を中心に,心筋梗塞モデル動物の心臓に遺伝子導入し,実際に瘢痕形成が起こらず,心筋が再生できるかの検証実験を行う。昨年度,マウスの胎仔創傷治癒機構から成獣創傷治癒機構へと転換する際に,心筋線維芽細胞で発現する全遺伝子の発現変動及びエピジェネテイクス修飾の有無の解析を行ったが,本年度の実験の過程で再現性に問題のあることが見出され,再実験を繰り返す必要が出てきたため,最終的にはヒストン修飾の解析に後れを生じた。従って,進捗状況にやや遅れを生じたと評価した。最初に,胎仔創傷治癒機構から成獣創傷治癒機構へと転換する際に心臓線維芽細胞で発現が著明に変動する遺伝子のエピジェネティクス制御機構を本年度も解析した。形態形成を司るHox,Paxの各遺伝子の結果では,Hox遺伝子は,胎仔創傷治癒機構から成獣創傷治癒機構に移行する際に,プロモーター領域のDNAメチル化を受け,抑制されていた。一方,Pax遺伝子はヒストンH3のリジン残基K9のメチル化を移行の際に認め,発現が抑制する可能性が考えられた。次に,胎仔創傷治癒機構のマスター遺伝子の候補として見出したHas,Foxo,トロンボモジュリン,Hox及びPaxの各遺伝子のどれがマスター遺伝子であるかを解析した。各遺伝子の発現ベクターを構築し,精製したリコンビナントタンパク質,naked DNA法によるベクターそのもの,或いは成獣創傷治癒機構を認める心筋線維芽細胞へとベクター導入し,この線維芽細胞を実験的に作成して器官培養した心筋壊死部に注入する,以上の3種類の方法を行い,胎仔創傷治癒機構が再現されて心筋が再生できるかを解析した。その結果,あらゆる方法によっても,壊死組織を除去できた遺伝子は無く,心筋組織の再生は認めなかった。一方,壊死部を除去後に注入したところ,Hox遺伝子で欠損部の創傷治癒促進効果が観察され,特に細胞を注入した場合に最も強い効果を認めた。

Hox遺伝子の導入した心臓線維芽細胞の培養系での増殖能,接着・遊走能の解析でも促進しており,結果を反映していた。しかし創傷治癒促進部の心筋組織は最終的には瘢痕組織へ変化してしまい,Hox遺伝子でも胎仔創傷治癒機構が再現されなかった。理由としては,解析が器官培養系であり,生体内の環境を反映していない可能性,一種類のマスター遺伝子が胎仔創傷治癒機構を制御しているのではなく,複数の遺伝子の相互作用によって制御している可能性等が考えられた。胎仔創傷治癒機構(FWH)から成獣創傷治癒機構へ移行して発現が著明に低下する心臓線維芽細胞の遺伝子を網羅的に解析した。その結果Has2,Tm,Mmpの瘢痕を抑制する遺伝子,Pax,Foxo,Hoxの形態形成に関わる遺伝子が検出された。Pax遺伝子はヒストンH3のメチル化を認め,他はプロモーター領域のDNAメチル化により発現が低下した。各遺伝子を心筋壊死組織に導入すると当初Hoxのみが抗線維化を認めた。しかし最終的にはHoxを含めた全遺伝子が瘢痕を形成した。従ってFWHには更なる遺伝子がマスター遺伝子として制御する可能性,複数の遺伝子の相互作用による制御機構等が考えられた。マウスの胎仔創傷治癒機構から成獣創傷治癒機構へと転換する際に,心筋線維芽細胞で発現する全遺伝子の発現変動及びメチル化の有無の解析まで施行できたので,順調に進展していると評価した。最終年度の来年度は,胎仔創傷治癒機構から成獣創傷治癒機構へと移行する際に,発現変動する遺伝子のヒストン修飾機構の解析を急ぐとともに,平成27年度でマスター遺伝子の候補として見出している幾つかの遺伝子を心筋梗塞モデルマウスに投与して,その治療効果を解析する。アンチエイジング医学今後は発現変動する遺伝子のヒストン修飾機構を解析し,この結果と,平成26年度の結果を基にして胎仔創傷治癒機構のマスター遺伝子を絞り込む。そしてこの遺伝子を心筋梗塞モデルマウスに投与して,その治療効果を解析する。
パーソナル・コンピュータによる『カンタベリー物語』諸刊本の計量的比較

G.チョーサーの『カンタベリー物語』諸刊本の中で、今日まで一般的に受け入れられてきたF.N.Robinson(ed.)The Works of Geoffrey Chaucer(Boston:Houghton Mifflin,1957,1961)(以下Robinson版と略す)その改定版L.D.Benson(ed.)The Riverside Chaucer(Boston:Houghton Mifflin,1987)(以下Benson版と略す)N.F.Blake(ed.)The Canterbury Tales(London:Edward Arnold,1980)(以下Blake版と略す)のテキストをパーソナル・コンピュータ(以下パソコンと略す)を利用して計量的比較をするにあたって、Robinson版とBenson版は共にEllesmere写本に基づいて編集されたものであり、Benson版はRobinson版の改定版にあたるので、Robinson版を第一テキストに選んだ。このテキストをチョーサーの写本の中で最古のものと推定されるHengwrt写本に基づいて編集されたBlake版と比較することにした。両テキストの顕著な特徴をパソコンによって包括的に把握することを可能にするために、まず各行が対応しているテキストを作成した。そこで、Hengwrt写本に欠落した箇所は本研究のテキストからは削除することとし、Blake版と、Robinson版の本文の共通部分のみを比較した。その際、用いた手順は実績報告書の序文(英文)に述べたとおりである。
放射光を用いた多糖類複合ゲルの構造解析

多糖類複合ゲルは食品等に広く用いられており、その構造と物性の相関を解明することは重要である。本研究では、放射光を用いた分光法(放射光真空紫外円二色性)と散乱法(放射光X線小角散乱)を多糖類複合ゲルの研究に適用し、混合前後での分子形態変化と架橋領域の構造変化を調べることによって、典型的な多糖類複合ゲルの網目構造を明らかにした。また、放射光真空紫外円二色性は、複合ゲル内部での微視的な分子レオロジー測定に適用可能であることを見出した。多糖類複合ゲルのモデル系としてκ-カラギーナン(CAR)+ガラクトマンナン(GM)を用い、レオロジー測定により確認された多糖類複合ゲルの相乗効果を解明するため、放射光VUVCD実験を行い、複合ゲル中におけるCARとGMのコンフォメーションを調べた。(CAR+GM)複合ゲルのVUVCDスペクトルは、CARゲル及びGM溶液のスペクトルを用いて、単純な混合則によって説明可能だった。これにより、GMとCARの相互作用によってGMのコンフォメーションが特別な変化を起こさないことを、初めて明確に示した。この結果は、(CAR+GM)複合ゲルは、GM鎖がCAR網目に取り込まれるモデル、又は相分離網目モデルのいずれかで表現されることを意味している。どちらのモデルが妥当であるか検討するためには、散乱実験が有効であると考えられた。そこで、(CAR+GM)複合ゲルの放射光SAXS測定を行った。今後、SLS, SALS測定を行い、ゲルの階層構造を考察することにより、(CAR+GM)複合ゲルの構造を明らかにする予定である。相分離網目モデルに従う複合ゲルの散乱データ解析法の確立のため、既知の相分離網目ゲルである(寒天+ゼラチン)複合ゲルを用いて、SAXS測定を行った。また、(寒天+ゼラチン)複合ゲルの放射光VUVCD測定を行い、ゾル-ゲル転移過程におけるゼラチン分子のコンフォメーション変化を調べた。ゼラチンに添加する寒天の量の僅かな違いで、ゼラチンのゲル化速度が転移的に変化する新奇な現象を見出した。このような、VUVCDを用いたゼラチンのゲル化過程の測定では、複合ゲル中における微視的なゲル構造が反映されていると考えられる。すなわち、放射光VUVCD測定を用いて、ゲル化過程の微視的レオロジー計測が可能であることを見出した。放射光VUVCDと放射光SAXS測定により、相乗効果を示す多糖類複合ゲルであるκ-カラギーナン(CAR)+ガラクトマンナン(GM)系およびキサンタンガム(XAN)+GM系の複合ゲル構造を調べた。CAR+GM複合ゲルの放射光SAXSでは、CAR網目の架橋領域に対応するq領域の散乱関数の形はGMの混合により影響を受けず、より小角ではGMの混合により散乱強度が減少することから、混合により架橋構造やコンフォメーションには変化がないが、架橋領域の分布はより均一になることがわかった。この結果はGM鎖がCAR網目に取り込まれる複合ゲル構造モデルに対応し、放射光VUVCDスペクトルで単純な混合則が成立する観察結果とも合致する。相乗効果とゲル構造の均一化との相関については今後の課題である。一方、XAN+GM複合ゲルでは、粘弾性と旋光度に対する塩強度依存性の測定から、混合と熱処理によるコンフォメーション変化が相乗効果と関連すると考えられた。放射光VUVCDではコンフォメーション変化が示唆されたが、放射光SAXSでは架橋構造に顕著な変化が観察されず、これについてはさらに検討を要する。相分離網目ゲルである寒天(AG)+ゼラチン(GT)複合ゲルについて、pHやGTの種類に依存して弾性率の相殺効果または相乗効果が生じる現象を発見した。放射光SAXSでは混合による構造変化は観察されず、顕微鏡観察による相分離ドメイン構造の違いによって相殺効果と相乗効果を説明することを試みた。また、AG+GT系のゲル化過程について、放射光VUVCDを用いた微視的レオロジー計測を行い、AGドメイン存在下でのGT分子のコンフォメーション変化を観察した。定量的な解析から、AGドメインの存在により架橋構造を形成しないGT分子が増加することがわかり、これはAGドメイン内に存在するGT分子に対応すると考えられた。高分子溶液・ゲル平成25年度は、主として多糖類ゲル(単一成分系及び複合ゲル)中の分子コンフォメーションの測定・解析を中心に取り組んだ。自動旋光計の導入による実験設備の整備と、放射光VUVCD実験における測定・解析の方法論の確立を達成した。さらに、これらの測定・解析の方法論を、(CAR+GM)複合ゲルに対して実際に適用し、CARおよびGMのコンフォメーション変化についての新たな知見を得た。これ以外の複合ゲルのモデル系(CAR+コンニャクグルコマンナン(KGM)、キサンタンガム+KGM、アガロース+ジェラン)については、旋光度およびVUVCD実験における試料調製法の予備的検討が進行中である。

これに加えて、ゲル階層構造の解析法構築のため、既知の相分離網目ゲルとして(ゼラチン+寒天)複合ゲルの散乱実験を行うことにし、放射光SAXS実験については既に完了した。これに対し、光散乱測定装置の整備と測定は平成25年度には完了しなかった。最初の計画では、平成25年度に単一成分ゲル、平成26年度に複合ゲルの実験を行うことになっていたが、実際には、放射光VUVCDと放射光SAXSについては、複合ゲルの実験も平成25年度中に先取りして実施することができた。このため、当初の予定と順番の前後はあったものの、おおむね順調に研究の遂行することができたと考える。平成25年度では、(CAR+GM)複合ゲルの放射光VUVCD実験および放射光SAXS実験を完了したので、平成26年度では引き続き、複合ゲルのモデル系として、CAR+コンニャクグルコマンナン(KGM)、キサンタンガム+KGM、アガロース+ジェランの各複合ゲルについて、放射光VUVCD実験による糖鎖コンフォメーションの研究と、放射光SAXSによる架橋構造の構造解析の研究を実施する予定である。また、ゲルの階層構造の解析法を確立するため、まず光散乱装置(小角光散乱、マルチスペックル動的光散乱)の整備・構築を行う。次に、複合ゲルのモデル系に対する光散乱実験を行い、放射光SAXSの実験結果と合わせて、複合ゲルの階層構造を表現するモデルを検討する。この際、既知の相分離網目ゲルのモデルとして(ゼラチン+寒天)複合ゲルの実験から得られる知見を利用する。さらに、可能であれば、SPring-8のビームラインBL-19B2等において放射光USAXS測定を実施し、光散乱と放射光SAXSから考えられたモデルの妥当性を検討する。最終的に、放射光VUVCDと光散乱・放射光SAXSの結果を総合して、CAR+GM、CAR+KGM、キサンタンガム+KGM、アガロース+ジェランの各複合ゲルの構造を明らかにする予定である。
シロイヌナズナの花の器官形成に関与するホメオティック遺伝子群の分子遺伝学的研究

1.シロイヌナズナの突然変異体の中から、花器の発生及び形態形成過程に種々の異常を示すものを多数分離して、変異過程の解析と遺伝解析をおこなった。これまでに、(1)花茎の先端に花芽が形成されないもの、(2)花のかわりに葉状の構造が生じるもの、(3)花の器官(がく片、花弁、おしべ、めしべ)の数が異常になるもの、(4)花の器官の形態が異常になるもの、(5)ある器官が、他の器官の形態を持つようになるもの、などが得られている。このうち、(5)のグループは、1つの器官が、他の器官に転換したもので、ホメオティック突然変異体と呼ばれる。上記の突然変異体は、遺伝解析の結果から、いずれも一個の劣性突然変異をもっていることがあきらかになった。これらの突然変異は、花器の器官発生過程の各段階に作用する遺伝子に生じたものと考えられる。ホメオティック突然変異を生じる遺伝子(ホメオティック遺伝子)は、5個同定された。これらの突然変異体のいくつかについては、論文にまとめ発表した。2.突然変異を生じた遺伝子を単離し、その構造と発現機構を解析して分子レベにおける機能を調べるために、Tiプラスミドベクターを用いた遺伝子導入系の開発をおこなった。まず、このベクターを用いたシロイヌナズナ野生型のジェノミックライブラリー(1.2×10^5個の独立なクローンからなる。挿入断片のサイズは平均35キロ塩基対)を作製した。ついで、このライブラリーをアグロバクテリアに移し、シロイヌナズナの葉、茎、根または種子に感染させた。これまでに、ライブラリーDNAのマーカー遺伝子が発現した(形質導入された)カルス及び幼植物を数株得た。現在、遺伝子導入過程と、トランスジェニック植物体の再生過程の効率を上げるための実験条件を検索している。
認知症患者の行動・心理症状の改善を目的とした治療薬の薬物動態・薬効解析

認知症では中核症状の認知障害に加えて、周辺症状の行動・心理症状(BPSD)が問題化している。本研究では、BPSDの発現とdonepezilの薬物動態との関係を検討した。まず、ドネペジルおよび主代謝物の血漿中濃度を0.1 ng/mLの高感度で測定できるLC-MS/MS法を開発した。この測定法を用いて検討したところ、donepezilの血漿中濃度とBPSDの発現に関連が認められ、donepezilの血漿中濃度が治療域を超える患者ではBPSDの発現がむしろ抑えられていた。この結果は、BPSDの発現を抑えながら認知症治療を行う上で、臨床上の重要な知見と考えられる。本研究では、ドネペジルを始めとする認知症治療薬やそれらの代謝物の薬物体内動態に着目して、認知症で患者および介護者のQOLを著しく損ねている周辺症状の行動・心理症状(BPSD)の発現状況との関連性を詳細に評価し、BPSDの発現を最小限に抑える認知症の薬物投与法を探索することにある。平成26年度の研究成果は以下の通りである。国立病院機構静岡てんかん・神経医療センターの研究倫理委員会の研究倫理委員会の承認を得て、静岡てんかん・神経医療センターにて加療中のドネペジル投与患者50名以上から研究参加の同意を取得し、ドネペジルおよびその活性代謝物である6-O-desmethyl体の血漿中濃度を、新規に開発した高速液体クロマトグラフ質量分析計(LC-MS/MS)による高感度測定法を用いて測定した。このドネペジルおよび6-O-desmethyl体の血漿中濃度のLC-MS/MS測定法は、0.1 ng/mLから100 ng/mLまでの血漿中濃度を高い再現性で測定できるものであり、2015年3月の日本薬学会第135年会(神戸)において成果を発表した(演題名:有害事象解析を志向したドネペジルおよび代謝物の血中濃度同時測定法の開発)。また、患者のカルテから患者の容態、薬物動態・治療効果に影響する可能性がある臨床検査値、併用薬情報を入手した。認知症治療薬の治療効果とBPSDを含む有害事象の発現状況をMini-Mental State Examination (MMSE)およびNeuropsychiatric Inventory (NPI)スコアを用いて測定した。現在、症例をさらに集積して、BPSDとドネペジルの薬物動態について、統計学的手法を用いて解析する予定である。認知症の治療のためDNPを服用している患者を対象とした。血漿中DNP及び代謝物の6-ODDは固相抽出処理後LC-MS/MSシステムを用いて測定した。これまでに開発した測定法は、0.1から100 ng/mLで良好な直線性が得られおり、DNPおよび6-ODDの高感度同時血漿中濃度測定が可能である。BPSDの評価はNeuropsychiatric Inventory(NPI)スコアを用いた。本研究は国立病院機構静岡てんかん・神経医療センターの倫理委員会の承認を得て実施した。DNPの血漿中濃度は個体間変動が大きく、治療域とされる3075 ng/mLにDNP濃度が分布する患者は全患者の48.6%であった。6-ODDの血漿中濃度にも大きな個体間変動がみられた。また、6-ODD血漿中濃度の平均はDNP血漿中濃度の平均の約130分の1であった。血漿中DNP濃度及び6-ODD濃度とNPIスコアに相関はみられなかったが、血漿中DNP濃度が75 ng/mL以上の患者では、それ未満の患者に比べNPIスコアが低い傾向を示した。ドネペジルおよび代謝物の高感度薬物血漿中濃度測定法を開発することに成功している。本研究に参加している認知症患者は50例以上に達しており、順調に被験者のリクルートが進んでいる。研究参加患者の薬物血漿中濃度を測定するとともに、BPSDの指標であるNPIスコアおよび認知症のMMSEスコアも順調に取得している。臨床薬剤学ドネペジル以外の認知症治療薬の中で、作用機序の異なるメマンチンに注目し、その血漿中濃度測定法を現在、LC-MS/MSで開発中である。メマンチン服用患者を対象にするため、研究倫理委員会の申請を行い、認知症の病態やBPSDとメマンチン血漿中濃度の関係を解明する研究をドネペジルの研究と平行して進めているところである。(2) Donepezilの主要代謝酵素であるCYP2D6の遺伝子多型検出をLightcyclerを用いて確立することができた。(3)臨床研究の研究倫理委員会の承認を得ることができ、患者リクルートが4月より開始可能になった。以上のことから、研究計画はおおむね順調に進呈していると判断した。研究用試薬の購入が予定より少なかったため。

静岡てんかん・神経医療センターにおいて、主治医などの協力を得ながら、患者リクルートを推進し、予定される必要症例を確保する。臨床試験の協力患者に対して、認知症治療薬の周辺症状の行動・心理症状(BPSD)をNPI(Neuropsychiatric Inventory)で実際に評価する。患者血液を用いてdonepezilの主要代謝酵素であるCYP2D6の遺伝子多型検出をLightcyclerで実施する。Donepezilの血漿中濃度測定法に加えて、高速液体クロマトグラフ質量分析計(LC-MS/MS)を用いる遊離形濃度測定法を早期に確立する。CYP3A4に関しては、Phenotype解析を考慮し、患者の尿中6β-ヒドロキシコルチゾールを指標とした酵素活性の測定も検討する。患者のNPIスコア、臨床症状の改善状況、薬物血漿中濃度、遊離形濃度を10名程度の小数例でパイロット評価し、今後の研究方針を調整する。繰り越し分を含めて、研究費を有効に活用していく。本研究計画は、3年間の継続によるものであり、次年度は2年目にあたる。次年度の研究費は、患者検体を用いた薬物血中濃度測定や遺伝子多型検出に充てる。当該研究費は、患者検体の薬物血中濃度を測定用するための各種試薬、遺伝子多型解析用の各種試薬および研究成果発表時の旅費に用いる。
口腔癌の悪性度に関与するG1期制御因子の解明と分子診断法への応用

口腔癌細胞でのG1期制御因子について,サイクリンE1(以下E1)の発現及びCdk2活性が低下している細胞(HSC-2)を見いだした.さらにE1のアンチセンスを導入しても増殖抑制はみられなかった.よってHSC-2ではE1の標的に異常を起こしている可能性がある.次に,Rb経路をみると,D1の発現は高く,p16により増殖が抑制されることから,サイクリンDはこの細胞の増殖に必須であると考えられた.E/Cdk2の標的として多くの分子があるが,Brm, NPATの異常は認めなかった.しかし,多くの癌でE/Cdk2の標的の一つである中心体の異常が報告されており今後も検索が必要と考えられる.また,E1/Cdk2活性は足場依存的増殖と相関し,E1の発現に伴い基質との接着が亢進する.HSC-2は頸部リンパ節転移巣から株化された細胞であり,基質との接着に異常があると推定され,今後インテグリンなどとの関連を検索したいと考えている.Rbと類似するp130はE/Cdk2の基質の一つであり,癌抑制遺伝子の可能性が示唆されている.口腔扁平上皮癌患者122名の検体において,p130の発現と臨床病期,頸部リンパ節転移,分化度との間に有意な相関が認められ,p130の高発現グループは一般に予後が良好であることがわかった.即ち,p130は口腔癌の予後因子である可能性が示唆された.またHAT活性を有し,転写活性化因子であるp300について,HOC313細胞で2つの変異を見いだした.この細胞ではTGF-βの増殖抑制能が失われているが,野性型p300を導入したところこの抑制能が回復した.即ち,p300は癌抑制遺伝子として機能することが明らかになった.以上,G1期制御因子の発現,基質のリン酸化が個々の口腔癌細胞によって異なることが明らかになり,このことが癌細胞の悪性度の差に反映している可能性がある.上記の成果は口腔癌治療に対する特異的分子標的薬の開発に寄与する可能性を示唆していると考えられる.口腔癌細胞でのG1期制御因子について,サイクリンE1(以下E1)の発現及びCdk2活性が低下している細胞(HSC-2)を見いだした.さらにE1のアンチセンスを導入しても増殖抑制はみられなかった.よってHSC-2ではE1の標的に異常を起こしている可能性がある.次に,Rb経路をみると,D1の発現は高く,p16により増殖が抑制されることから,サイクリンDはこの細胞の増殖に必須であると考えられた.E/Cdk2の標的として多くの分子があるが,Brm, NPATの異常は認めなかった.しかし,多くの癌でE/Cdk2の標的の一つである中心体の異常が報告されており今後も検索が必要と考えられる.また,E1/Cdk2活性は足場依存的増殖と相関し,E1の発現に伴い基質との接着が亢進する.HSC-2は頸部リンパ節転移巣から株化された細胞であり,基質との接着に異常があると推定され,今後インテグリンなどとの関連を検索したいと考えている.Rbと類似するp130はE/Cdk2の基質の一つであり,癌抑制遺伝子の可能性が示唆されている.口腔扁平上皮癌患者122名の検体において,p130の発現と臨床病期,頸部リンパ節転移,分化度との間に有意な相関が認められ,p130の高発現グループは一般に予後が良好であることがわかった.即ち,p130は口腔癌の予後因子である可能性が示唆された.またHAT活性を有し,転写活性化因子であるp300について,HOC313細胞で2つの変異を見いだした.この細胞ではTGF-βの増殖抑制能が失われているが,野性型p300を導入したところこの抑制能が回復した.即ち,p300は癌抑制遺伝子として機能することが明らかになった.以上,G1期制御因子の発現,基質のリン酸化が個々の口腔癌細胞によって異なることが明らかになり,このことが癌細胞の悪性度の差に反映している可能性がある.上記の成果は口腔癌治療に対する特異的分子標的薬の開発に寄与する可能性を示唆していると考えられる.サイクリンD1は頭頚部の扁平上皮癌を含む多くの悪性腫瘍で遺伝子増幅,過剰発現が報告されているが,当科で樹立した7つの口腔扁平上皮癌細胞株を調べたところ,3株ではD1の高発現がみられたが,そのホモログであるD2の発現は低下していた.そしてこれらの株ではRbおよびそのファミリーの1つであるp107が高度にリン酸化されていた.ところが,残りの4株においてはD1の発現は逆に低下しており,代わりにD2の高発現がみられ,さらにp107の高リン酸化バンドは認められなかった.このことより,サイクリンD1の発現レベルとRb,p107のリン酸化に相関がみられ,2つの細胞群でG1期の増殖制御に差が認められることが明らかになった.一方,サイクリンEについて,最近そのホモログであるE2がクローニングされ,従来のものはE1と呼ばれている.E2もE1と同様にCdk2を活性化し,その発現,活性化はG1/S期にピークを迎える.そこで上記の口腔癌細胞株を調べたところ,いずれの細胞株でもE2は高度に発現が認められたが,E1の発現は2株の細胞(HSC-2,HSC-3)で極めて低かった.

そこでサイクリンE1,E2のN端cDANの約1KbをPCRによりクローニングし,哺乳類細胞で高発現可能なベクターにアンチセンス方向に組み込んだ.これらをHOC313,HSC-2にtransfectionしてcolony formation assayを行い,それぞれのアンチセンスの増殖抑制効果を調べた.その結果,サイクリンE1に関しては予想どうりその発現に依存した増殖抑制効果がみられた.ところがサイクリンE2に関しては予想に反しどちらの細胞株においてもアンチセンスによる増殖抑制がみられなかった.現在,アンチセンスが確かにサイクリンE2の発現を抑制したにもかかわらず,増殖抑制効果を示さなかったのか,またE2のアンチセンスによりE1が相補的に発現した可能性がないかどうか検討中である.昨年までに口腔扁平上皮癌細胞株においてサイクリンEの発現が極度に低下している細胞(HSC-2)が存在することがわかった.そこで,サイクリンEのアンチセンスベクターをHSC-2にtransfectionし,colony formation assayによる増殖抑制効果を調べた.その結果,発現の高いHOC313では増殖抑制がみられたが,HSC-2では認められなかった.さらにH1 kinase assayにおいて,HSC-2ではCdk2活性そのものの低下がみられた.サイクリンE/Cdk2はG1/Sの移行に必須だと考えられているが,以上のことからHSC-2ではこの活性を相補する因子があるのか,下流のターゲットがサイクリンE非依存性に活性化している可能性などが考えられる.最近,サイクリンEのホモログであるE2がクローニングされたが,サイクリンE2の発現をみるとHSC-2を含めていずれの細胞でも高度の発現がみられた.ところがHSC-2にこのアンチセンスを導入しても増殖抑制はみられず,E2がEの機能を相補しているという証拠は得られなかった.次に,後者の可能性について,Cdk inhibitorであるp16,p21のアデノウイルスベクターを上記細胞に感染させ,増殖効果,さらにサイクリンEの基質蛋白の発現を調べた.その結果,HSC-2ではp16,p21により増殖抑制され,Rb,p130が低リン酸化されることがわかった.このことから,HSC-2ではサイクリンE低下によるRb pathwayへの影響は関与していないと推論された.最近,サイクリンE/Cdk2のターゲットの候補として,Rbだけでなく,p27,E2F-5,中心体複製,DNA複製因子,chromatin remodeling complexを形成するSWI/SWFfamily,ヒストン合成に関与するNPATなどの報告がされ,G1/S期で多彩な作用をしている可能性が指摘されている.そこで現在,HSC-2をはじめ口腔癌細胞株においてこれら下流分子の異常が起こっていないかどうか,解析中である.平成11年度から増殖制御のkeyとなるG1期制御因子,サイクリンD(D1, D2, D3)及びサイクリンE(E1, E2)を中心に口腔扁平上皮癌細胞株での増殖異常への関与について解析を進めてきた.サイクリンDの発現を調べたところ,3株でD1の高発現,D2の発現低下がみられ,さらにRb, p107が高度にリン酸化されていた.一方,他の4株ではD1の発現は逆に低下し,D2の高発現がみられ,p107の高リン酸化バンドはみられなかった.即ち,D1の発現レベルとRb, p107のリン酸化に相関がみられた.一方,サイクリンEについては,いずれもE2は高度に発現がみられたが,E1の発現はHSC-2において極めて低下していた.そこでE1のアンチセンスベクターを作製し,HSC-2に導入してcolony formation assayによる増殖抑制効果を調べたところ,増殖抑制はみられなかった.
癌の分子標的治療をめざした効率的アンチセンスオリゴヌクレオチドのデザイン

癌の分子標的治療を行なううえで,生体内で効果的に機能するアンチセンスオリゴヌクレオチド(ASODN)をデザインすることを目的として,生体内RNA・DNAハイブリッドの特性や内在性のRNase Hとの関連,およびDNAハイブリッド形成部位について検討した。(1)生体内RNA・DNAハイブリッドの特性...大腸菌RNase HによるRNA分解は当初精巣特異的であると思われたが,酵素量の増加あるいは反応時間を延長することにより,調べる限りすべての組織のRNAが感受性を示すことが明らかとなった。また,分解産物はノーザンブロット上で複数の明確なハンドとして検出されることや,RNase Hに対する感受性はmRNAにより異なることなどから,DNAはmRNA上の特定部位にハイブリダイズしていることが示唆された。さらに,プライマーを外部から加えなくても逆転写酵素によりcDNA合成が可能であったことから,RNA・DNAハイブリッドの存在がより明確となった。(2)哺乳動物RNase Hの局在解析...哺乳動物細胞で報告されている2つのRNase Hについて,それぞれに特異的な抗体を作製し解析した結果,RNase H1がおもに核とミトコンドリア画分に存在するのに対し,RNase H2は細胞質に局在していた。RNase H2の細胞質でのRNA・DNAハイブリッド分解への関与を明らかにすることを目的として,遺伝子欠損マウスの作製を試みた。2ラインの変異ES細胞に由来するヘテロ変異マウスが得られ,それぞれのヘテロ変異マウス間で交配を行なったがホモ変異産仔は得られなかった。したがって,胎生致死であると考えられ,RNase H2がRNA・DNAハイブリッド分解を介して,個体発生あるいは細胞の機能に必須な役割を果たしていることが示唆された。(3)ハイブリッド形成部位の同定...アクチンmRNAについて,reverse ligation-mediated PCRにより切断産物のcDNAを増幅した。それらの末端塩基配列を決定した結果,ハイブリッド形成部位にはある程度の傾向性が存在することが示された。今後は癌関連遺伝子mRNAについて解析を行い,切断部位の配列情報にもとづいて合成したAS ODNの標的遺伝子に対する発現抑制効果を解析することにより,このアプローチのAS ODNのデザインに対する有効性を検証する予定である。
人工膜による分子認識-自励発振現象の応用

本研究は、生体の分子認識機構を学ぶ立場から、膜の興奮性に注目し、興奮性人工膜により分子認識を行うことをめざしている。昨年度は、各種の興奮性人工膜を用いて、研究をすすめた結果、これらの人工膜は、種々の化学物質を、電位振動の振動数・振巾・周波数変調度ならびに波形の情報に基づいて、認識できることを明らかにした。本年度も、このような研究を発展させたが、なかでも、興奮性薄膜の作製において、注目すべき成果が得られた。以下、その概略を記す。生体系においては、神経興奮が膜内外のNa,Kイオン濃度差によって駆動されている。このような機能をもつ生体膜は、リン脂質の二分子層よりなる厚さ、百Å以下の薄膜である。そこで、私達は、3つの異なる方法で、リン脂質薄膜を製作した。すなわち、面積1m【m^2】程度の黒膜(BLM)、径数μmのピペットの先に固定化した二分子膜(ピペット・クランプ法)、およびLangmuir-Blodgett法によりミリポア膜上に移し取ったリン脂質薄膜(LB膜)の人工膜系を用いた。いずれの場合も、自発的な電位振動や、電気的ゆらぎが見い出された。さらに、これらの膜は、スイッチング・負性抵抗や記憶効果(ヒステリシス)などの機能をもつことも明らかになった。從来、生化学や生理学の分野では、膜の興奮には、チャネルタンパク質の存在が不可欠であると信じられてきた。今回の実験結果は、タンパク質が存在しなくても、リン脂質だけでも、興奮現象や、イオンチャネルの開閉が可能であることを意味しており、生命現象との関連においても興味深いと思われる。上述した以外にも、合成高分子膜において、自発的な電位振動をおこすことができることを示した。これらの研究成果に立脚して、膜の興奮性を利用した、全く新しい型の、情報変換・認知システムを提案した。
包括的1細胞オミックス解析を用いた創傷治癒関連細胞の多様性獲得機構の解明

本年度は皮膚創傷治癒研究に資するシングルセル解析機器及び基本的実験方法の確立に注力した。そして、(1)1細胞ピッキング装置を用いた皮膚創部における目的細胞の採取法の確立、(2)皮膚全層のシングルセル化及び磁気ビーズ抗体を用いた目的細胞の抽出、(3)セルソーターを用いた目的細胞の抽出、(4)遺伝子発現解析可能なシングルセル固定法の確立及び固定細胞を用いた目的細胞採取法の試み、(5)シングルセル化細胞の培養系及び遺伝子発現解析系の確立に成功した。一方、皮膚創傷治癒研究で見出した炎症関連miRNAは、miRNAノックアウトマウスを用いた解析により、他臓器における炎症性疾患及び加齢に伴う炎症反応変化に関与することが明らかとなり、他領域への波及効果を示すことができた。既に報告しているmiR-142及びmiR-223以外の炎症・瘢痕関連microRNAの遺伝子発現動態解析に着手し、数種類の候補遺伝子を見出した。全身性miRNAノックアウトマウス、コンディショナルmiRNAノックアウトマウス群の確立に成功した。シングルセル解析に必要な機器類の整備および解析系プラットフォームの確立を、本年度の重要課題として研究を行った。上記研究実績の概要に述べたように、その目的をほぼ達成することができた。シングルセル化した細胞のコンディションは、生存率70%ー80%を保つなど、その後のダウンストリーム解析にも十分使用できた。さらに、解析系プラットフォームを他領域へ応用するため、他臓器における応用の検討を行った。その結果、良好な結果を得ることができ、様々な分野へ応用可能であることが示唆された。他領域への応用は、本研究課題の重要事項の一つと考えているため、引き続き促進する予定である。シングルセル化した細胞群を、シングルセル解析装置を用いて、個々の細胞における遺伝子発現状態を探索する。本研究成果により、同一細胞においても様々な遺伝子発現状態を呈し、その変化が次のフェーズへと移行する鍵となると考えている。その点を中心に、解析する予定である。本研究で着目している遺伝子群は、皮膚創傷治癒のみならず、他の病態にも関与することが明らかとなった。引き続き、本研究成果の他領域への応用を推進する。