hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
レーザーアブレーションを利用した細胞創傷治癒機構の解明

細胞は増殖の過程で細胞膜に様々な環境ストレスを受け、傷つく。傷の周りにタンパク質が集まり、細胞質分裂とよく似た仕組みで速やかに行われる修復を「細胞創傷治癒」と呼ぶ。このしくみに欠損があるとデュシェンヌ型筋ジストロフィー症を発症するが、詳細な分子機構は解明されていない。本研究では細胞創傷治癒に関与する遺伝子を網羅的に同定し、膜損傷の修復後に細胞膜を構成する脂質の種類が変化して「細胞膜の老化」が起こり、それが細胞老化を誘導する一因となることを見出した。細胞の遺伝情報を包み込み外界のストレスから守る細胞膜の完全性を保つことは細胞の生存に必須である。細胞膜の微細な傷を修復する細胞創傷治癒機構に欠損があると、筋ジストロフィー症を始めとする様々な疾病が引き起こされるが、その分子機構には未だ謎が多く残されている。細胞創傷治癒機構を包括的に理解するため、出芽酵母の非必須遺伝子を網羅的に破壊した破壊株ライブラリー、そして必須遺伝子のmRNA量を減少させたDAmPライブラリーを用いて、細胞創傷治癒に関与する遺伝子を網羅的に探索した。その結果、108の遺伝子が細胞創傷治癒の制御因子として同定された。これらの因子は37の機能グループに分類することができ、ポジティブコントロールであるユビキチン・プロテアソーム系の因子、高等真核生物において細胞創傷治癒への関与が明らかになっているESCRT関連因子などが含まれていたことから、このスクリーニングが正しく機能していること、また細胞創傷治癒の分子機構が進化的に保存されていることが示唆された。37の機能グループについてさらに深く解析を進めたところ、細胞老化に関与することが報告されている43の機能グループと、24の項目について一致していた。このことは細胞創傷治癒と細胞老化の間に生物学的に深い繋がりがあるという予想外の事実を示唆している。また、スクリーニングヒットの中には細胞周期を制御する因子が多数含まれており、レーザーダメージ実験による詳細な解析の結果、細胞膜が傷つくことによって細胞周期の進行およびDNA合成が一時停止するというチェックポイント様の機構が新たに見出された。細胞は増殖の過程で細胞表層に様々な環境ストレスを受け、傷つく。傷の周りにアクチンや微小管、Rho型GTPaseなどが集まり、細胞質分裂とよく似た仕組みで速やかに行われる修復を「細胞創傷治癒(Cellular wound-healing)」と呼ぶ。これに欠損があるとデュシェンヌ型筋ジストロフィー症を発症するが、詳細な分子機構は解明されていない。申請者は出芽酵母の強力な遺伝学を背景に、ポストゲノム時代のツールを駆使して細胞創傷治癒に関与する遺伝子の網羅的同定を行った。その結果膜損傷の修復後に細胞膜を構成する脂質が変化することで「細胞膜の老化」が起こり、それが細胞老化を誘導する一因となることを見出した。ヒト正常培養細胞においても細胞膜の傷に起因する細胞膜構成の変化と細胞老化が認められた。これまで細胞老化はテロメア長の短縮、サーチュインの欠損、ミトコンドリアの機能欠損、Torやプロテアソームの欠損などにより誘導されることが報告されているが、細胞膜損傷も細胞老化の一因であることが明らかになった。分子生物学細胞創傷治癒に関与する遺伝子を網羅的に同定するスクリーニングの結果、細胞創傷治癒と細胞老化との関わりという重要で興味深い事実が明らかになった。さらに、細胞膜に損傷が入ることで細胞周期の進行とDNA合成が一時停止するというチェックポイント様の機構も新たに見出されており、これらは申請時には予見できなかった知見である。今後は「細胞膜が傷つくことにより細胞は老化するのか」という問題を検討すると共に、新規チェックポイントの分子機構の詳細を明らかにすることを目指す。さらに、これらの機構が高等真核生物においても保存されているかどうかを解明し、細胞創傷治癒機構が関与する筋ジストロフィー症のみならず、細胞老化の抑制につながる知見を得ることを目指す。今年度は研究室内に既存のライブラリーと既存の実験系を利用したスクリーニングを主に行ったため、次年度使用額が生じた。来年度は新たに培養細胞を用いて新たなレーザーダメージ実験系を立ち上げ、さらに出芽酵母の老化を検討する実験を新たに行うなど、研究室に既存の機器や試薬では行うことのできない研究を行うため、支出が大きくなることが予想される。
術後再発制圧のための肺癌特異的蛍光プローブの開発

我々は肺腺癌組織亜型の1つである微小乳頭癌(Micropapillary: MIP)の特性を研究し、悪性度が極めて高いこと、リンパ管侵襲・転移を起こしやすいこと報告してきた。また、MIPを含む肺腺癌(MipADC)は有意な予後不良因子であることを臨床病理学的に証明してきた。しかし、MipADCは術前・術中に診断困難であるため、術後永久標本による診断に頼らざるを得ないのが現状である。癌特異的蛍光プローブは迅速かつ簡便に診断可能であり、実用性が高いと判断し基礎研究を進めてきた。先行研究(日野ら)では蛍光プローブgGlu-HMRGを用いて肺腺癌細胞株(A549、H441)の蛍光画像から癌細胞を認識可能であることを証明した。この成果を元に本研究では手術検体(57症例)を用いて、病理学的診断により組織型を同定し、予め作成したpeptide-HMRG、peptide-2Me-SiRなど多数の蛍光プローブを用いて正常肺と腫瘍との蛍光上昇値の違いを検討した。特に肺腺癌(25症例)の蛍光上昇に着目した。ライセートスクリーニング結果をもとに選定したプローブ(7種類)の中で3種類の蛍光プローブが平均AUC:0.83 (0.815-0.84)であり、識別能力が良好であることが証明された。これらの癌特異的蛍光プローブは先行研究で用いたgGlu-HMRGよりも有用であった。しかし、組織型による各種蛍光プローブの蛍光上昇の違いに関して検討可能であったが、MipADCなどの組織亜型の蛍光局在の解明および術中検出法を確立するまでには至らなかった。今後、症例集積を含めてさらに研究を進めていく。本邦において肺癌はがん死亡原因の第1位であり、肺腺癌(ADC)は肺癌全体の約50%を占める。我々は肺腺癌組織亜型の一つである微小乳頭癌(Micropapillary: MIP)の特性を研究し、悪性度が極めて高いこと、リンパ管侵襲・転移を起こすため有意に予後不良であることを臨床病理学的に証明してきた。しかし、MIPを含む肺腺癌(MipADC)は術前・術中に診断確定が困難であるため、術後永久標本にて診断されているのが現状であり、小型肺腺癌に対して縮小手術が行われた際、局所再発(断端再発)を来すことが知られている。平成27年度は以前から行われいていた臨床病理学的検討に加えて、MipADCが画像学的に術前診断可能かどうかを検討した。【対象】外科切除された小型肺腺癌(病理病期stage I, 2cm以下)90例。1CTにて画像学的非浸潤癌とされる腫瘍に含まれるSolid成分の割合(CTR)が25%以下のものにはMipADCは存在せず、再発症例はCTRが25%以上の画像学的浸潤癌であることが分かった。2FDG-PETにおいては、MipADCとSUVmaxには相関が認めらず、FDG-PETでは術前予測は困難であった。以上の結果から、現在、術前に行われている検査では十分にMipADCを抽出は困難であることが分かった。本研究ではMipADCの予後改善および縮小手術による局所再発制圧のために、1術中迅速診断に適した癌特異的蛍光プローブ開発、2MipADCおよび断端遺残癌細胞の蛍光局在の解明のため、癌特異的蛍光プローブによる術中検出法を確立することを目的としている。平成28年度では、MIPを含む肺腺癌(MipADC)に特異的な蛍光プローブの選定し、その部位の生物学的特性を検討していく予定である。手術検体に占めるMIPを含む肺腺癌(MipADC)が占める割合が少なく、研究がやや遅れている。本邦において肺癌はがん死亡原因の第1位である、肺腺癌(ADC)は肺癌全体の約50%を占める。しかし、MipADCは術前・術中に診断困難であるため、術後永久標本にて診断されているのが現状である。平成27年度はMipADCが画像学的に術前診断可能かどうかを検討した。(病理病期stageI, 2cm以下90例)以下1, 2はその研究結果である。1CTにて画像学的浸潤癌とされる腫瘍に含まれるSolid成分の割合が25%以下の者にはMipADCは存在しない。また、MipADCの再発症例はCTRが25%以上の画像学的浸潤癌であることが分かった。2FDG-PETにてMipADCとSUVmaxには相関が認められず、MipADCの存在はFDG-PETによる術前予測は困難であった。以上の結果から、術前に行われている画像学的術前検査にてMipADCを検出するのは困難であることが分かった。平成28年度はデータベース症例を追加し(354例)、近年、再発因子の一つとして注目されているSpread Through Air Spaces (STAS)の検討を行った。小型肺腺癌に対して縮小手術が行われた際、STASが有意な再発因子であることが証明され、その結果を世界肺癌学会で報告した。

また、並行して術中迅速診断に適した癌特異的蛍光プローブ開発も進んでいる。平成29年度では、MipADCおよびSTASの蛍光局在の解明のため、癌特異的蛍光プローブの選定、術中検出法を確立することを目的とする。研究用の手術検体の採取は徐々に増加しているものの、Micropapillaryを含む肺腺癌(MipADC)やSpread Through Air Spaces (STAS)が占める割合が少ない。一方、癌特異的蛍光プローブの作成は十分あるので、現在、肺癌特異的な蛍光プローブを探索・選定している段階である。本邦において肺癌はがん死亡原因の第1位であり、肺腺癌(ADC)は肺癌全体の約50%を占める。我々は肺腺癌組織亜型の1つである微小乳頭癌(Micropapillary: MIP)の特性を研究し、悪性度が極めて高いこと、リンパ管侵襲・転移を起こしやすいこと報告してきた。また、MIPを含む肺腺癌(MipADC)は有意な予後不良因子であることを臨床病理学的に証明してきた。しかし、MipADCは術前・術中に診断困難であるため、術後永久標本にて診断されているのが現状である。そこで、基礎研究として、蛍光プローブgGlu-HMRGを用いて、肺癌細胞株に適応した結果、肺腺癌細胞株(A549、H441)、大細胞癌(H460)において、蛍光画像から癌細胞を認識することができた。しかし、小細胞癌(H82)、扁平上皮癌(H226)では蛍光を認識できなかった。また、同時に研究用の手術検体の採取し、すでに作成された多数の癌特異的蛍光プローブを用いて、肺癌組織型別のイメージングの違いを検討した。肺腺癌においてはMipADCの蛍光局在の解明および術中検出法を確立することを目的に研究を行った。平成27年度はMipADCが画像学的に術前診断可能かどうかを検討した。(病理病期stageI, 2cm以下90例)以下1、2はその研究結果である。1CTにて画像学的浸潤癌とされる腫瘍に含まれるSolid成分の割合が25%以下の者にはMipADCは存在しない。また、MipADCの再発症例はCTRが25%以上の画像学的浸潤癌であることが分かった。2FDG-PETにてMipADCとSUVmaxには相関が認められず、MipADCの存在はFDG-PETによる術前予測は困難であった。以上の結果から、術前に行われている画像学的術前検査にてMipADCを検出するのは困難であることが分かった。平成28年度はデータベース症例を追加し(354例)、近年、再発因子の一つとして注目されているSpread Through Air Spaces (STAS)の検討を行った。小型肺腺癌に対して縮小手術が行われた際、STASが有意な再発因子であることが証明され、その結果を世界肺癌学会で報告した。平成29年度では、MipADCおよびSTASの蛍光局在の解明のため、すでに作成された癌特異的蛍光プローブ(gGlu-HMRG)を選定し、術中検出法を確立することを目的に研究を行った。
ラットにおける子宮内膜増殖と内分泌異常との関係

我々はこれまで、DouryuラットはF344ラットに比べ子宮内膜腺癌の自然発生率が高く、その発生には内分泌異常が関与していることを報告してきた。ラット子宮癌の発生機序を解明する為の基礎的研究の一環として、子宮癌好発系Donryuおよび嫌発系F344ラットを用いて、子宮内膜における細胞増殖動態に及ぼす性周期及び加齢の影響を比較、検討した。その結果、Donryu及びF344ラットとも正常性周期に伴う細胞動態の変化が見られ、若齢時における性周期の各ステージでの細胞増殖には両系統間に差が見られなかったが、26週齡以降Donryuラットでは、持続発情の出現と共に内膜上皮の細胞増殖が亢進する傾向が見られた。子宮内膜細胞動態に及ぼす内分泌異常の影響をより詳細に検討するために、生後3日目のDonryuラットの皮下にテストステロンプロピオネート0.05mg/匹を注射して、無排卵ラットを作成し、子宮内膜細胞動態に対する加齢とエストロゲン投与の影響を検討した。実験はまだ進行中であるが、現在までの観察結果では、無排卵ラットの子宮内膜細胞増殖は同週齡の無処置ラットのそれに比べて高く、E2ペレットを皮下埋没することにより細胞増殖がさらに増加した。以上のことから、子宮内膜の細胞増殖能は内分泌異常、特にエストロジェンの高値と相関していることが示され、このことはDonryuラットにおける子宮癌の高率な自然発生と関連した所見と考えられた。
カンナビノイド受容体とT型Caチャネルを標的とする過敏性腸症候群の新規治療戦略

本年度はブチル酸誘起過敏性腸症候群の発症にカンナビノイドCB2受容体を多く発現するマクロファージが関与するかについて検討を行い、さらに我々のグループが新たに同定したT型カルシウムチャネル阻害薬6-prenylnaringenin (6-PNG)およびCB1受容体刺激薬ACEAが本モデルにおける結腸過敏および関連痛覚過敏を抑制するかについて明らかにした。蛍光免疫染色法により、ブチル酸投与マウスの結腸および脊髄後根神経節(DRG)におけるマクロファージ集積を確認したところ、投与開始3日後のマウスの結腸組織およびDRGにおいてコントロール群と比較してマクロファージ数の増加が認められたが、投与開始6日後では変化が見られなかった。さらに、ブチル酸誘起結腸過敏および関連痛覚過敏の発症は、マクロファージ/ミクログリア阻害薬ミノサイクリン、マクロファージ枯渇薬リポソーム化クロドロネートにより阻止された。一方、結腸痛成立後にミノサイクリンを投与しても無効であった。また、6-PNGの腹腔内投与は、ブチル酸誘起結腸過敏および関連痛覚過敏を著明に抑制した。一方、ACEAは、ブチル酸誘起結腸過敏には抑制効果を示したが、関連痛覚過敏には無効であった。以上のことからブチル酸誘起過敏性腸症候群の発症にマクロファージが関与する可能性が示唆された。さらに、ブチル酸誘起結腸過敏および関連痛覚過敏にT型カルシウムチャネル阻害薬が有効であることが明らかになった。ブチル酸誘起過敏性腸症候群の発症にマクロファージが関与することが明らかとなった。さらに、ブチル酸誘起過敏性腸症候群モデルにおける結腸過敏および関連痛が6-PNGにより抑制されることが明らかになった。ブチル酸誘起過敏性腸症候群の発症にマクロファージが関与することが明らかになったことより、マクロファージ上に発現が多くみられるCB2の刺激薬が結腸過敏および関連痛覚過敏を抑制するかについて検討を行う。また、6-PNGが結腸過敏および関連痛覚過敏を抑制したことから、6-PNGの誘導体KTt-45の効果について検討を行う。
リポソームバイオ集積センサの診断チップ化基礎技術の構築

シリコン集積バイオセンサとして各センシング原理の実証を行ってきたリポソームバイオセンサデバイス・同センシング技術を診断チップ化するために、基礎技術の具体化検討を行った。主項目として、I.バイオ分子認識ナノ分子素子としてのリポソームの物理的分子状態制御、II.アミロイドーシスセンサ応用への挑戦、III.アレイセンサ信号情報処理用電子システムの構成・作製、を進めた。特に診断チップ用ターゲット分子の代表としてアルツハイマー病バイオマーカーであるアミロイドβに注目し、ヒト血清中での同線維伸長動態を選択的に検出できた。またリポソーム脂質種の選定、低雑音電子回路技術利用により1 nMの高感度検出特性を得た。本年度の研究実施計画に基づき、I.バイオ分子認識ナノ分子素子としてのリポソームの物理的分子状態制御については、1センサ検知部での溶液中溶媒蒸散を極力抑制するため、1.検知部リポソーム分子集合安定化技術として、1)液滴封止構造の作製と同構造のリポソームカンチレバーセンサ部への適用を行った。液滴の溶媒蒸散を抑制する樹脂膜封止構造をポリジメチルシロキサン(PDMS)を用いて作製した。PDMSはゴム弾性による大きな復元力を持つためシリンジ針による液滴の導入後、導入孔が自然に塞がり液滴の蒸散を抑制できる。今回作製では1日以上経っても蒸発しない。0.1-1μLの1日オーダーでの揮発抑制を実現でき検出特性が安定化するとともに、上記カンチレバーセンサ出力の十分な経時特性の測定が可能となりその結果、同一濃度で異なるターゲット蛋白質分子にて定性的・定量的に顕著に異なるセンサ出力の経時特性を得た。またI.では2溶液の連続的な注入・排出を目指してマイクロ流路構造を作製した。センサ検知部への溶液の連続的な注入と排出を可能としてリポソームカンチレバーアレイセンサの第1段階試作を行った。これはII.2.アレイセンサチップ構成の一つと考えている。II.アミロイドーシスセンサ応用への挑戦では、特に、生体膜模擬リポソーム分子表面でのアミロイドベータ(Aβ)線維伸長の可視像検出技術の検討を開始した。生体膜模擬リポソーム分子表面でのAβ線維伸長を検出するための光学的手法について複数の候補手法を検討し、原理検証のための光学系を構築した。そこでは動画像処理手法の適用可能性も考慮して設計した。蛍光センサアレイではその出力パターンを解析するため、種々のイメージングプロトコルに対応可能なインテリジェント蛍光イメージャを新たに設計し、測定ハードウェア部は本年度物品費にて新規購入の生物用顕微鏡をベースに構築した。本年度の研究実施計画に基づき、I.バイオ分子認識ナノ分子素子としてのリポソームの物理的分子状態制御については、1センサ検知部での溶液中溶媒蒸散を極力抑制するため、1.検知部リポソーム分子集合安定化技術として、1)液滴封止構造の作製(寒川、山下)(H25-26)を継続で行い、前年度技術修正から本年度本実験で24時間測定での使用可能を確認し、検知特性結果を得た。また2)マイクロ流路構造にて検知部に検知分子リポソームをSAM共有結合インタクト固定(寒川、野田、山下)(H25-26)も、本年度試作化を進め出力検知を実測確認できた。今後アレイセンサ構造化を進める。II.アミロイドーシスセンサ応用への挑戦では、1.生体膜模擬リポソーム分子の選択と調製(野田、馬越、島内)(H25-28)は従来生体膜構成比率が最も高いDPPCリポソームに特化していたが、室温での膜流動性の異なるDSPC. POPCリポソームの調製実験を増やし同等サイズ約100nm径の調製条件を得た。さらに生体膜実状態に近いcholesterol分子封入DPPCリポソームを調製した。これら異脂質種リポソームセンサ分子を蛍光アレイに適用した。3.生体膜模擬リポソーム分子表面でのAβ線維伸長の可視像検出技術の検討、開発(福澤、野田)(H25-26)、4.リポソーム表面可視像測定システムの検討、試作(福澤、野田)は、可視光/近赤外光領域で光像直接ではなくモフォロジー情報を検出すべく、微小紛体測定実用化技術からの統計学的な測定原理の増強、光学調整自体、制御システム検討を進めた。一方で本年度研究計画項目には挙げなかったが継続進展研究として、アミロイドベータ(Aβ)線維伸長動性の明白な検出を誘電分散解析センサ、カンチレバーセンサ両技術で行い、Aβ濃度1μMでの検出性を確認した(アルツハイマー病患者生体液中Aβ線維は0.5-1μM存在)。I.バイオ分子認識ナノ分子素子としてのリポソームの物理的分子状態制御については、1.検知部リポソーム分子集合安定化デバイス構造、2)マイクロ流路構造にて検知部に検知分子リポソーム固定を継続で進め、カンチレバーアレイ化と共に、ブリッジ回路導入、ローパスフィルタ処理にて環境温度の周期的変動成分を除去し、を昨年度の1/10に雑音低減、出力安定性、再現性を十分向上した。また多チャンネルアレイ化用に溶液混合流路を試作し、任意の割合での溶液混合に成功した。2.リポソーム単一分子センサの有効性、可能性は、当研究の他の研究項目との整合性に鑑み、従来の多分子利用を優先することとした。

一方でリポソーム分子自体については、II.1.生体膜模擬リポソーム分子の選択と調製(H25-28)が順調で感度向上のための脂質種検討が進んだ。II.アミロイドーシスセンサ応用への挑戦では、バイオ工学である上記II.1の進展があるが、電子情報技術を主に進めた。3.生体膜模擬リポソーム分子表面でのAβ線維伸長の可視像検出技術の検討、開発、4.リポソーム表面可視像測定システムの検討、試作では、繊維伸張ラフト形状の散乱スペクトルに着目した光学的検出技術の検討、検証のための光学系の構築を進めた。線維伸長モードを模したモルフォロジーと散乱スペクトルの関係を調べる機能を実装した。構築は、蛍光センサアレイをターゲットとした蛍光顕微鏡イメージャシステムとした。III.アレイセンサ信号情報処理用電子システムの構成・作製では、1.蛍光センサアレイ出力パターン統計的識別手法の検討(H26-28)、2.各アレイ出力からの相互作用情報の抽出処理方法の検討として、ソフトウェアプラットフォームを構築し、複数ハードウェアに対応すると共に、信号処理・統計的識別フェーズを共通モジュールとして開発できるようにし、信号処理モジュールも開発できた。研究調書での研究計画に記載したH27年度での研究項目は全て考察検討しているが、特に電子情報技術で後半年度の対象項目にまだ十分着手できていない内容がある。しかし一方で、本年度実施計画には明文化しなかったが従前でほぼ達成できた研究項目の一層の進展が期待できる内容が非常に顕在化しており(特にアミロイドーシス応用上でのターゲット濃度検出実現の観点で、現在アミロイドベータ50 nMを検知可能:患者血中濃度より十分低)、本基盤A研究の最終成果レベルをさらに向上する点も進めたいため、現実には双方とも行ってきた。II.アミロイドーシスセンサ応用への挑戦での3.生体膜模擬リポソーム分子表面でのAβ線維伸長の可視像検出技術の検討、開発(福澤、野田)、4.リポソーム表面可視像測定システムの検討、試作(福澤、野田)では、繊維伸張ラフト形状凝集物のリポソーム表面可視像測定システムの機能実装ができたので、今後機能性能実証へ進める。III.アレイセンサ信号情報処理用電子システムについては、ハードウェアの開発はほぼ終了した。ソフトウェアについては、プラットホーム化が完了したため、解析機能が極めて容易に開発できるようになった。信号処理モジュールは開発済みであり、統計識別モジュールの構築を残すのみとなった。線維伸長ラフト形状検出については、実験系の構築がほぼ終了し、散乱特性のモルフォロジー依存性を調べる準備が整った。申請計画全般にわたり進めてきた1.バイオ分子認識分子素子としてのリポソームの物理的分子状態制御、2.アミロイドーシスセンサ応用への挑戦、3.アレイセンサ信号情報処理用電子システム構成・作製のうち特に2、3の後半実体をまとめた。最終的に主要な観点で本科研研究が目指したリポソームバイオ集積センサの診断チップ化基礎技術の構築を進展できた。2.では、1)生体膜模擬リポソーム分子種の検討・選択、として、脂質6種、それら各脂質種へコレステロール添加した混合物(より生体膜を模擬)、を各アミロイドーシスセンサに適用した。重要マーカー分子Aβでは近年モノマーよりオリゴマーが毒性発現原因物質と認識されているがDMPC/コレステロールではモノマー検出が抑制されオリゴマー検出が強くなる結果を得た。
血管内皮-単球の相互作用の制御による新規抗動脈硬化療法の検討

動脈硬化発症における血管内皮特異的接着因子(ESAM)の役割を検証した。ESAM/apoE double KO(DKO)マウスを作成し、対照群であるapoE KOマウスと動脈硬化進展の比較検討を行い、細胞実験にて、ESAM発現抑制による炎症細胞の浸潤を検討した。DKOマウスにて有意に動脈硬化病変は減少し、ESAMの発現低下により炎症細胞の侵入の低下を認めた。我々はESAM抑制療法が、新規の抗動脈硬化療法になりうることを動物モデルにおいて証明した。血管内皮特異的接着分子(Endothelial cell-selective adhesion molecule : ESAM)は免疫グロブリンスーパーファミリーに属する接着分子で血管内皮細胞に特異的に発現している。ESAMはhomophilicな結合を介して血管内皮細胞の接着及び血管新生に関与するが、動脈硬化における役割は不明である。今回、動脈硬化モデルであるApoE KOマウスを用いて、動脈硬化形成におけるESAMの役割の解明を試みた。ESIW/ApoE double knockout(DKO)マウスを作成し、動脈硬化病変の面積・マクロファージ含有量・接着分子の発現などを比較したところ、DKOマウスでは対照群のApoE KOマウスと比べて、動脈硬化病巣の進展が有意に抑制されていた。また、DKOマウスの動脈硬化病巣ではマクロファージ含有量が有意に減少していた。動脈硬化病変における既知の接着分子の発現は両群間で差を認めなかった。また、ESAMの炎症細胞浸潤における役割を明らかにするため、炎症刺激後の腹腔マクロファージ浸潤量を評価し、さらに、培養血管内皮細胞においてESAMをsiRNAを用いてknock-downし、培養単球細胞とのadhesion assay及びtransmigration assayを行った。ESAM KOマウスでは炎症刺激後の腹腔マクロファージ浸潤が減少し、ESAMをknock-downした内皮細胞は単球細胞との接着・遊走が減少していた。以上より、ESAMは血管内皮同士の接着のみならず、単球/マクロファージの接着・遊走を制御している。ESAMの阻害によりマクロファージの浸潤と動脈硬化の進展が抑制されることが明らかとなった。ESAMはhomophilicな結合を介して血管内皮細胞の接着及び血管新生に関与することは知られているが、動脈硬化における役割は不明である。我々は、動脈硬化モデルApoE KOマウスを用いて、動脈硬化発症におけるESAMの役割を検証した。ESAM/ApoE double knockout (DKO)マウスを作成し、動脈硬化病巣面積・病変における炎症細胞の割合・接着分子の発現を比較した。DKOマウスでは、対照群のApoE KOマウスと比べて、血漿コレステロール値が高値にも関わらず、動脈硬化病巣の進展が有意に抑制されていた。さらに、DKOマウスの動脈硬化病巣ではマクロファージ含有量が有意に減少していた。また、動脈硬化病変における既知の接着分子の発現は両群間で差を認めなかった。次に、ESAMの炎症細胞浸潤における役割を検証するため、炎症刺激後の腹腔マクロファージ浸潤量を測定した。さらに、培養血管内皮細胞にてESAMをsiRNAの手法を用いて発現抑制し、培養単球細胞の接着及び遊走を対照群であるESAM正常発現内皮細胞と比較した。ESAM KOマウスでは炎症刺激後の腹腔マクロファージ浸潤が減少し、ESAMを発現抑制した内皮細胞は単球細胞との接着・遊走が減少していた。これらの結果から、ESAMは血管内皮同士の接着のみならず、単球/マクロファージの接着・遊走を制御していることが明らかになった。我々はESAMの発現低下により炎症細胞の侵入、さらにESAM欠損により動脈硬化の進展が抑制されることを発見した。
視床下部・下垂体・卵巣機能調節における甲状腺と副腎の役割

平成8年度は、Push-Pullカニューレを用いて視床下部からのCRHおよびAVP分泌量を直接測定し、甲状腺機能低下ラットにおける視床下部・下垂体機能を神経内分泌学的に検討した。実験では、成熟雄ラットに4-メチル-2-チオウラシル(チオウラシル)を飲水投与することにより甲状腺機能低下ラットを作出した。1.CRH及びAVPに対する下垂体のACTH分泌反応性の変化甲状腺機能低下ラット下垂体のACTH分泌反応性を調べる目的でCRH(1μgと10μg)とAVP(0.1μgと1μg)を静脈内投与し、その後の血中ACTH濃度の変化を調べた。その結果、甲状腺機能低下ラットでは、CRHとAVPのいずれを投与した場合にも対照群に比較して下垂体のACTH分泌反応性が上昇している事実が判明した。2.視床下部からのCRHおよびAVP分泌量の変化視床下部からのCRHとAVPの分泌量の変化を調べる目的で、正中隆起部にPull-Pullカニューレを装着し、18:3021:30hの間1分間に15μlの流速で人工脊椎液を還流し、20分こどに還流液を採集し、CRHとAVP濃度を測定した。その結果、甲状腺機能低下ラットでは、CRH、AVP共に分泌量が対照群に比べて多く、視床下部からのCRHとAVP分泌が亢進している事実を初めて明らかにした。以上の結果から、甲状腺機能低下時における卵巣機能の低下には、「視床下部からのCRH分泌低下→LHRH分泌低下→下垂体からのLHとFSH分泌低下、その結果として卵巣機能が抑制される」とする当初の仮説が実証された。また、AVPの分泌も亢進する事実が判明したが卵巣機能抑制との関連性は現在のところ不明である。本年度は、正常に発情周期を回帰する成熟雌ラットを用いて、甲状腺機能低下状態下における卵巣機能と副腎皮質機能について検討した。1.甲状腺低下状態下における発情周期及び排卵正確に4日周期を回帰する成熟メスラットに、4-メチル-2-チオウラシル(MTU)を飲水投与することにより甲状腺機能低下状態を作出した結果、(1)MTU投与後7周期目から発情周期の乱れる個体が出現し、8周期目以降は、ほとんどの動物で発情周期に乱れを生ずる事実が明らかとなった。この様な、低甲状腺機能状態のラットの排卵数を調べた結果、(2)MTU投与後6周期目までは、対照群と比較して差の無い値を示した。MTU投与開始後、2周期ごとの発情期11時に断頭採血して、血中LH、FSH、プロラクチン、インヒビン濃度を測定した結果、(3)MTU群では、4周期目から血中プロラクチン濃度の増加が認められた。臓器重量を調べた結果、(4)副腎、脾臓及び子宮重量の低下が認められた。2.偽妊娠誘発実験甲状腺機能低下状態下のラットでは、プロラクチン分泌に変調をきたす可能性が示されたことから、精管を結さつした雄ラットを用いて偽妊娠誘発実験を行った。その結果、甲状腺機能低下ラットでは、正常ラットに比べて明らかに偽妊娠誘発率が高い事実が判明した。これらの結果から、低甲状腺状態下の成熟雌ラットでは、明らかな内分泌学的変化が起こり卵巣機能に変調が誘起されるものと推察された。現在その機構を解析する目的で、MTU投与後45周期における内分泌学的検索を続けている。また、この様な卵巣機能の低下には、プロラクチン分泌が関与する可能性が示唆された。本年度は、平成6年度に引き続き、正常に発情周期を回帰する成熟雌ラットを用いて、甲状腺機能低下状態下における卵巣機能と副腎皮質機能について検討した。

実験に際しては、正確に4日周期を示す成熟雌ラットに、4メチル2チオウラシル(MTU)を飲水投与して甲状腺機能低下ラットを作出した。1.発情周期及び排卵:MTU投与後4周期目までは、発情周期に変化は認められなかったが、5周期目から次第に発情周期が乱れる個体が出現した。しかし、卵巣数には、変化が認められなかった。2.臓器重量:MTU投与16日後に検査した結果排卵、子宮、副腎及び脾臓重量が有意に低下した。3.血中ホルモン濃度:発情周期が乱れる直前の4周期目の血中ホルモン濃度を6時間間隔で4日間測定した結果、MTU群では、発情休止期第2日から発情前期のかけて血中LH、エストラジオール及びテストステロン濃度が低く、プロジェステロン濃度は高い値を示した。また、血中プロラクチンは、発情前期から発情期にかけて高い値を示した。血中FSH及びインヒビン濃度には、対照群との間に差は認められなかった。血中ACTH濃度は、対照群との間に差は認められなかったが、血中コルチコステロン濃度は、対照群に比べて著しい低値を示した。4.卵胞発育:ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン投与による排卵試験法により、卵胞発育を調べた結果、MTU投与群では、発情休止期第2日に発育卵胞数が対照群に比べて低下した。5.ストレス負荷実験:副腎皮質機能を調べる目的で、発情休止期第2日の10時15時の間に拘束ストレス実験を行い経時的に血中ACTHとコルチコステロン濃度を測定した。その結果、MTU投与群では、対照群に比べて、ストレス負荷時における血中ACTH濃度が高く、逆に血中コルチコステロン濃度は、低い値を示した。平成8年度は、Push-Pullカニューレを用いて視床下部からのCRHおよびAVP分泌量を直接測定し、甲状腺機能低下ラットにおける視床下部・下垂体機能を神経内分泌学的に検討した。実験では、成熟雄ラットに4-メチル-2-チオウラシル(チオウラシル)を飲水投与することにより甲状腺機能低下ラットを作出した。1.CRH及びAVPに対する下垂体のACTH分泌反応性の変化甲状腺機能低下ラット下垂体のACTH分泌反応性を調べる目的でCRH(1μgと10μg)とAVP(0.1μgと1μg)を静脈内投与し、その後の血中ACTH濃度の変化を調べた。その結果、甲状腺機能低下ラットでは、CRHとAVPのいずれを投与した場合にも対照群に比較して下垂体のACTH分泌反応性が上昇している事実が判明した。2.視床下部からのCRHおよびAVP分泌量の変化視床下部からのCRHとAVPの分泌量の変化を調べる目的で、正中隆起部にPull-Pullカニューレを装着し、18:3021:30hの間1分間に15μlの流速で人工脊椎液を環流し、20分ごとに環流液を採集し、CRHとAVP濃度を測定した。その結果、甲状腺機能低下ラットでは、CRH、AVP共に分泌量が対照群に比べて多く、視床下部からのCRHとAVP分泌が亢進している事実を初めて明らかにした。以上の結果から、甲状腺機能低下時における卵巣機能の低下には、「視床下部からのCRH分泌低下→LHRH分泌低下→下垂体からのLHとFSH分泌低下、その結果として卵巣機能が抑制される」とする当初の仮説が実証された。また、AVPの分泌も亢進する事実が判明したが卵巣機能抑制との関連性は現在のところ不明である。
肥満に伴う炎症性肝疾患に対する没食子酸の新規改善メカニズムの解明

近年、脂質蓄積した肝臓における慢性炎症状態は、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)をはじめとする炎症性肝疾患の発症に関与すると考えられている。本研究では、日本人の摂取量が多いポリフェノールである没食子酸が、肥満に伴う肝臓の慢性炎症に及ぼす影響とその詳細な分子メカニズムを解明することを目的とした。本年度は培養細胞を用いた実験を行い、以下の成果を得た。1.肝臓の慢性炎症の成因である肝細胞の脂質蓄積に対する没食子酸の影響を検討した。パルミチン酸で刺激したHepG2に没食子酸を作用させた結果、脂質蓄積量が減少し、脂肪酸取込及び合成に関与するCD36、FATP2、ACCαの発現が減少することを確認した。そのメカニズムとして、脂質代謝の重要な転写因子であるSREBP-1c、LXRαの発現を没食子酸が抑制する可能性を見出した。またHepG2をパルミチン酸及び過酸化水素で刺激し、肝細胞のアポトーシスに対する影響を検討した結果、没食子酸による細胞生存率の回復、Bax/Bcl-2発現比及び転写因子ATF3の発現抑制を確認した。さらに没食子酸はMAPK/NF-κB経路を介して、慢性炎症進展に重要な役割を果たすマクロファージの炎症を抑制することを明らかにした。2.生体内における肝臓の慢性炎症再現モデルとして、肝細胞とマクロファージの共培養系の確立を試みた。肝細胞に脂肪酸を負荷して脂質蓄積させた後、マクロファージを播種することで共培養を行った。その結果、共培養によって炎症関連遺伝子の発現が増加すること、脂質蓄積によってより強い炎症が惹起されることを明らかにした。また没食子酸はこの共培養系において炎症及び酸化ストレスを抑制した。本研究により、没食子酸は肝細胞の脂質蓄積及びアポトーシス、肝細胞とマクロファージの相互作用による炎症反応を抑制することで、肝臓における慢性炎症を改善する可能性が示唆された。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。
消化器癌に発現する抗癌剤耐性ＡＢＣトランスポーターのスプライシングの機能解析

RNA-seqによる解析結果から、Ensemblに登録されている48種類のABCトランスポーター全502種類のスプライスバリアントについて、正常組織と癌組織・大腸癌細胞株の発現量を比較したところ、大腸癌特異的なバリアントの候補として71種類が抽出された。これらの中で、ABCA12のスプライスバリアントであるENST00000513511はRNA-seqの結果をRT-qPCRで再現することができた。このことからENST00000513511は大腸癌特異的なスプライスバリアントの可能性が高いと考えられた。【背景・目的】本研究では、大腸癌組織における各ABCトランスポーター遺伝子、およびそのスプライスバリアントの発現プロファイルを次世代シーケンサーを用いて明らかにし、そして同定されたスプライスバリアントを機能解析し、スプライスバリアントによる抗癌剤耐性メカニズムを明らかにすることを目的としている。【方法】当院で手術を施行した抗癌剤投与前大腸組癌患者3例の手術検体から、正常組織と癌組織をそれぞれ回収した。また、5種類のヒト大腸癌由来細胞株を培養した。これらからtotal RNAを抽出し、次世代シーケンサーを用いた網羅的な遺伝子発現量解析(RNA-seq)を行った。本研究では、特にEnsemblデータベースに登録されている48種のABCトランスポーター遺伝子ならびにそのスプライスバリアントの発現量を詳細に調べた。【結果】1.遺伝子レベルでの発現量の解析:RNA-seqによる解析の結果、多剤耐性に関わる代表的なABCトランスポーターであるABCC1、ABCC2の発現量は正常組織に比べ癌組織で2倍以上に増加していた。一方でABCB1、ABCC3、ABCG2の発現量は正常組織に比べ癌組織で半分以下に低下していた。これらの結果は、過去の報告、およびマイクロアレイのデータと同様の発現傾向を示していた。また、次世代シーケンサーでのこれらの結果はRT-qPCRによって再現できることが確認された。2.スプライスバリアントの発現量の解析:RNA-seqによる解析の結果から、Ensemblに登録されている48種類のABCトランスポーター全505種類のスプライスバリアントについて、正常組織と癌組織・大腸癌細胞株の発現量を比較したところ、大腸癌特異的なスプライスバリアントの候補として41種類が挙げられた。これらの中で、その配列特異性からプライマーを設計することができた9種類について、RT-qPCRによってvalidation実験を行ったところ、2種類については再現性があったが、7種類については再現性を示すことができなかった。1胃癌・大腸癌切除標本(癌部/正常部)を用い、ABCトランスポーターのスプライスバリアントの発現解析を行うため、1)当科で保存する胃癌・大腸癌凍結標本をリスト化を行った。2)また、新たに切除標本からサンプルを採取した。3)組織以外に癌細胞株も解析対象とするため、癌細胞株の収集、整理を行った。2抗癌剤耐性ABCトランスポーターのひとつであるABCB1の抑制剤についての解析(ATPase assay, FACS assay, IAAP binding assay)を行った結果を、2012年日本癌学会総会で発表を行った。個々のABCトランスポーターのスプライシングの発現解析は、今後順次開始する予定である。解析方法としては、まず癌細胞株からDNA, total-RNAを抽出し、PCR, RT-PCRを行い、その後PCR産物のsequencingを行う予定である。また、同時に次世代シークエンサーも使用し、スプライシングバリアントの発現解析を網羅的に行う予定である。3研究代表者のグループでは5-FUの代謝酵素であるDPDに注目し、DPDをコードする遺伝子DPYDのスプライシングバリアントを解析した。スプライシングバリアントの解析手法として上記2に述べたが、DPYDスプライシングバリアントを実際に患者検体から同定することができており、ABCトランスポーターのスプライシングバリアント解析においても、同手法を適応できるものと考えている。大腸癌に発現する抗癌剤耐性ABCトランスポーターのスプライスバリアント解析を行った。大腸癌患者3例の手術検体(正常組織と癌組織)、また、5種類のヒト大腸癌由来細胞株からRNAを抽出し、次世代シーケンサーによる網羅的なトランスクリプトーム解析(RNA-Seq)を行った。結果、Ensemblに登録されている48種類のABCトランスポーター全505種類のスプライスバリアントについて、正常組織と癌組織・大腸癌細胞株の発現量を比較したところ、大腸癌特異的なスプライスバリアントの候補として41種類が挙げられた。RT-qPCRによってvalidation実験を行ったところ、2種類について再現性を示すことができた。将来的にこのバリアントの臨床病理像と相関解析し、さらには機能解析を行う。また、RNA-Seqによる解析の結果、多剤耐性ABCトランスポーターであるABCC3の発現量が正常組織に比べ癌組織で半分以下に低下していた。

このことから、多段階的に大腸を癌化させるadenoma-carcinoma sequenceが、ABCC3の発現を制御していることが考えられた。そこでWntシグナルに着目、大腸癌細胞株でWntシグナル下流で様々な遺伝子の発現を制御しているβ-cateninとTCF7L2をノックダウンしたところ、ABCC3のmRNA発現量が概ね2倍以上に増加した。次に、Wntシグナル経路においてβ-cateninの分解を促進しているGSK-3βの阻害剤(AR-A014418, LiCl)を投与しWntシグナルを活性化させたところ、大腸癌細胞株においてABCC3の発現が濃度依存的に低下した。このことから、ABCC3は、Wntシグナル経路にあるβ-catenin/TCF7L2によって、その発現が抑制されていることが示唆された。大腸癌の集学的治療・分子生物学次世代シーケンサーによる実験により、大腸癌組織、大腸がん細胞株に発現するABCトランスポーターの全容が明らかにすることができた。しかし、ABCトランスポーターのスプライシングバリアントについては、発現は確認されたもののその発現パターン、頻度については更なるin silico解析が必要である。現在解析中であり、2014年5月までに結果が明らかになる予定である。機能解析をこれから行うところであり、研究に「若干の遅れがある」とした。ABCトランスポーターのスプライスバリアントの発現解析を行うための実験の下準備が整い、さらに実験をすすめて行きたい。1.遺伝子レベルでの発現量の解析:今回の実験で、大腸正常組織が癌化することで、抗癌剤耐性に関わる5種類の代表的なABCトランスポーターの発現量に特徴的な変化がみられることが明らかとなった。このことから、癌化に関連する何らかのシグナルがABCトランスポーターの発現を制御しているのではないかと考え、正常組織に比べて癌組織で発現量が2倍以上に増加した遺伝子3560個を抽出しPathway解析を行った。その結果、大腸癌に関わるPathwayの中でWntシグナルの亢進がみられ、特に下流の転写因子TCF/LEFファミリーのシグナルが亢進していた。そこで、WntシグナルとTCF/LEFファミリーがABCトランスポーター遺伝子の発現に与える影響を調べるために、今後shRNAを用いてβ-cateninとTCF/LEFをノックダウンし、ABCトランスポーターの発現変化を解析する実験を行っていく予定である。2.スプライスバリアントの発現量の解析:大腸癌特異的なスプライスバリアントとして候補に挙がったもののうち、再現性を示すことが出来た2種類は発現量が大きく、また同一遺伝子由来のスプライスバリアントが少ないという特徴があり、一方で再現性を示すことができなかった7種類は発現量が小さく、同一遺伝子由来のスプライスバリアントが多いという特徴があった。
直流及び交流磁場を併用した原子力発電プラント内の鋼管減肉モニタリング検査

原子力発電所では、炉心内の1次冷却系配管や、炉心付近の構造物に関して入念な検査が実施されている。しかし炉心から離れた2次系の鋼管は、放射線が含まれない部分であるため、長期間に渡る詳細検査の頻度は必ずしも多くはない。そこで運転を止めず、安価で常時検査が可能となる状態監視検査技術の構築が望まれる。本研究では、直流磁場と微小交流磁場を併用することにより、短時間で鋼管の裏面減肉検査が実施できる電磁気検査法の研究開発を行った。検査鋼管のヒステリシス磁気特性・導電率の測定検査対象とした鋼管材料のヒステリシス磁気特性および導電率の測定を行った。ヒステリシス磁気特性に関しては、最大で1.3Tまでの磁束密度の測定が行え、この最大磁束密度までの間の20パターンにおけるヒステリシス曲線の測定を行った。また、導電率に関しては、ダブルブリッジ低抵抗測定回路を使用し、試験鋼管と同じ材料で9φ×2mの冷間圧延鋼材の平均的な導電率の測定を行った。マイナーループを考慮した三次元磁界解析法の開発ここでは、六面体辺要素の有限要素法を使用した三次元交流非線形渦電流解析プログラムをベースとし、実測で求めた鋼管のヒステリシス曲線(メジャーループ)を用いてマイナーループを求める非線形磁界解析法の開発を行った。本研究では、マイナーループの上側曲線を点対称で折り返してマイナーループの下側曲線を導き出す手法を採用した。この結果、有限要素法のメッシュ分割数が40000要素程度のモデルの場合、メモリ使用量が1.5GB程度を必要とすることが分かった。検証実験モデルの作成と基礎的実験本開発プログラムが実測値に合うのかについて検討を行うための検証用実験装置の作製を行った。また、基礎実験として、厚み3mm鋼板の裏面に深さ1mm、幅0.5mmのスリット状の溝を掘り、その溝を表面から直流磁界と交流磁界を併用して検出が行えるかの基礎的実験を行った。その結果、直流励磁電流3A、交流励磁1kHz、0.5A(rms)の磁化条件で、検出が可能であることを確かめた。次年度は、本開発プログラムと検証実験による比較検討を行い、開発プログラムの有用性を確認した上で、本検査手法の現象解明を詳細に検討する予定である。本提案検査手法の検査原理・現象解明と、検査に最適なセンサの形状や磁化条件の検討を行った。検査原理の解明六面体辺要素の有限要素法を使用した三次元交流非線形渦電流解析プログラムをベースとし、実測で求めた鋼管のヒステリシス曲線を用いてマイナーループを求める非線形磁界解析法を開発し、本提案検査手法の検査原理の解明を行った。厚み3mm鋼板の裏面の深さ1mm、幅0,5mmスリット状溝を検査した場合、鋼板内部の直流および交流磁界の振る舞いについて詳細に検討を行った。まず、直流励磁電流3Aの磁化条件で静磁界のみを加えた場合、裏面欠陥モデルが無いときは、鋼板内の直流磁界は一様に分布しており、鋼板表層の磁束密度は1.26T程度であった。しかし、裏面欠陥モデルが存在する場合、直流磁界は欠陥を迂回して分布しており、鋼板表層の直流磁束は1.6T程度まで増加していることが分かった。次に、直流磁界を加えている上から交流励磁1kHz、0.5A(rms)を重ねて加えた場合、欠陥付近には交流磁界はほとんど発生していない事が分かった。これは、欠陥周辺では直流磁界が集中して分布しているため、磁気飽和領域に近づいた結果である。そのため、検査器を移動した場合、欠陥に検査器が近づくに連れて交流磁界の検出コイル信号が低下する結果が得られた。実験と解析探傷比較ここでは、実験と解析による比較を行った。比較は、交流磁化ヨークに巻いている検出コイル内に得られる磁束密度で行った。その結果、0,3%の誤差範囲内で両者ともよく一致する結果が得られた。次年度は最適な検査条件の検討や実際の検査環境下における影響等を検討する予定としている。本検査手法は、原子力発電所の2次系鋼管の裏面欠陥を鋼管表面から電磁気現象で検査する新しい技術の開発である。鋼管表面より非接触で直流磁界を加え、さらに交流磁界を印加し、鋼管肉厚部における微分透磁率の変化を検出コイルの誘導電圧で検出する。本年度は、本提案検査手法の現象解明と、実用的な検査における最適な条件の検討を行った。1.裏面欠陥深さが検出信号に与える影響裏面欠陥の幅と長さは一定に保ったまま、深さのみを変化させた場合、検出コイルに鎖交する磁束密度の変化について解析を行なった。その結果、裏面欠陥の深さが深くなるにつれて磁束密度の振幅がほぼ直線的に低下することが分かった。

これは欠陥深さが深くなると、鋼材表面から裏面欠陥までの間を通る直流磁束が密になり、磁気飽和に近づき、交流磁化器からの交流磁束の浸入量が減るためだと考えられる。一方、裏面欠陥の深さが増しても、励磁電流波形に対する検出された磁束密度波形との位相差は、あまり変化しない事が分かった。これは本手法の場合、交流磁化器から発生する交流磁束や、それによって生じる渦電流は裏面欠陥に到達する訳では無いため、大きな位相差は生じない事が理解できる。2.実用的な検査手法の検討ここでは実際の原子力発電所で本提案検査手法が適用できるかについての検討を行った、具体的には、長時間、本提案プローブで検査を行った場合、コイルの発熱が検査制度の及ぼす影響等の検討を行った。その結果、検査時間による検出誤差はわずかに数%程度であった。本手法は直流励磁を使用するため、鋼管の外面に配置するだけで電磁力の吸引力が働き、位置固定も容易な事から、状態監視検査センサとして十分使用可能であると考えられる。
ナノレベルで表面構造制御された可視光応答型機能集積金属酸化物光触媒の開発

二酸化チタンナノ粒子を逆相ミセル法、エマルション法を駆使して、触媒表面上の反応活性点の構造をナノレベルで制御し、反応に最適化された表面構造をもつ二酸化チタン光触媒の開発に成功した。また、モレキュラーインプリント法を駆使して調製することで反応分子の3次元構造を認識し、光触媒反応に関して高度な選択性を発現する3次元反応場を有する二酸化チタンナノ光触媒の開発にも世界に先駆けて成功した。また、分子認識能の発現には、表面修飾法も開発し、対象物質の疎水性、カチオン性、アニオン性などの認識を可能にした光触媒も開発に成功した。具体的には分子認識能を発現すると考えられる炭化水素鎖、炭化フッ素鎖、芳香族誘導体を表面構造制御された二酸化チタン粒子上に特異的に固定化した複合型高効率光触媒反応システムの開発に成功した。これら開発した表面修飾型二酸化チタンは、表面に導入された官能基の特性に従って、反応分子の性質を認識すると共に、触媒表面に濃縮する能力を発現することが明らかになった。その結果、表面修飾前の光触媒粒子と比較して、その反応分子認識能力、触媒活性いずれも、10倍程度の極めて高い性能を発揮する表面修飾型光触媒粒子であることを明らかにしている。また、光吸収を行う反応場としての二酸化チタンナノ粒子についても、通常は紫外光照射でしか電子とホールを生成することが出来ないが、硫黄、炭素、窒素などを二酸化チタン結晶格子内に新規な元素ドープ法の開発に成功し、可視光照射によってもでも活性を発現する触媒の調製法を確立した。さらに、可視光化でより高い光触媒の向上のため、開発した可視光応答型二酸化チタン光触媒を電子アクセプターである鉄3価イオンで表面処理することで、電荷分離効率を向上させた結果、市販を含め現在存在する二酸化チタン光触媒中、最高の触媒活性を発現する可視光応答型二酸化チタンナノ粒子の開発に成功した。二酸化チタン光触媒は、同じ粒子上で全く逆の反応(酸化反応と還元反応)が同時に進行するため、触媒活性を大きく向上させるためには、酸化反応と還元反応が粒子上の別の場所で進行する必要があります。二酸化チタン光触媒の触媒粒子がゆっくりと成長する条件で製造したところ、極めて結晶性のよい二酸化チタン粒子(アナタース型ルチル型)が得られました。この様にして製造した二酸化チタン粒子は、低指数の結晶面が露出していることが明らかになったので、それぞれの結晶面の反応性(酸化反応、還元反応)について調べました。還元反応は白金イオン(四価)が還元されて白金粒子が析出する反応を使って調べました。また、酸化反応が進行する結晶面について調べるために、鉛イオンを酸化して、酸化鉛を析出する反応を行いました。その反応後の二酸化チタン粒子を走査電子顕微鏡で観察したところ、酸化反応により生成した酸化鉛は柱状の二酸化チタン粒子の頂点の部分に、還元反応により生成する白金粒子は側面部分に選択的に析出していることが明らかになりました。この様に、非常に結晶性のよい二酸化チタン粒子を開発することで、酸化反応と還元反応が進行する反応点を分離することに世界で初めて成功しました。すでに、窒素原子を二酸化チタンにドープすることにより可視光照射下で活性を発現することが報告されているが、可視部の吸光係数は極めて小さく、十分に活性が高いとは言い難い。一方、計算化学的には硫黄原子の導入により、二酸化チタンが可視光応答性を発現する可能性が示唆されているが、硫黄原子はアニオン状態ではイオン半径が大きいために、二酸化チタンの酸素原子と置換することは極めて困難であることも指摘されている。