hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
異形根性に基づく水吸収輸送モデルの構築：細胞―根系間の階層的水分生理情報の統合

さらに、S型側根の表面積とこの水通導性との間にも正の相関関係が認められたことから、L型側根における通気組織形成はS型表面積の拡大に寄与し、根系全体の水通導性の増加に貢献している可能性が示唆された。浸透ポテンシャル勾配が駆動力となるときの水移動においては、根の表面積ではなく、異形根の種類が通導性を規定することをがわかった。また、25日齢の節根系においても同様の結果が得られたことから、加齢によって異形根間の水輸送能における役割分担は変化するのではなく、播種後5日目という早い生育段階でS型側根はすでに高い通導性を有していると考えられた。セルプレッシャープローブ装置の改良が、計画通りには進んでいない。装置全体はほぼ完成に近づいた。一方、測定に関わり次のような目標を設定した。(a)側根用固定具の開発、(b)キャピラリー先端を蛍光ラベリング・蛍光観察し、深層細胞へ正確にアプローチ、(c)キャピラリー先端に細胞液を充填し、深層細胞測定に必要な細胞液ーオイル間メニスカスを形成、(d)低動粘係数シリコーンオイルを導入し、オイル充填が必要なプローブ本体を小型化し、メニスカス移動の遅延を解消する。しかし、いずれの点においても、不十分な面が残っている。これ以外の点については、計画通り、あるいは計画より進んでいる面もある。A.受動的・能動的吸水における器官・組織・細胞レベルでの異形根別水通導性の測定A-1.プレッシャーチャンバー法・出液法を用いた根系の水通導性の測定これまでの研究に引き続き、プレッシャーチャンバー法で根系のLp(hydrostatic)の測定を行う。また、同時に出液法によりLp(osmotic)を測定する。さらに、画像解析ソフトウェア(WinRHIZO)を用い、各異形根の表面積を測定し、単位表面積あたりの水通導性を評価する。根系全体の表面積に占める各異形根の表面積から、水吸収に対するそれぞれの相対的貢献度を推定する。A-2.セルプレッシャープローブ法を用いた細胞膜の水通導性の測定セルプレッシャープローブ装置の改良を続ける。またそれを用いて内皮および外皮細胞の膨圧変化および細胞溶質の浸透圧を測定し、cell-to-cell経路の水移動に関わる細胞膜の水通導性を求める。加えて、根軸に沿って異なる細胞の水通導性を測定し、根齢が水通導性に及ぼす影響についても検討する。B.水分生理関連形質と水通導性との関係性解析B-1.アクアポリン発現と細胞膜の水通導性との定量的関係細胞膜および液胞膜におけるアクアポリンのmRNA発現量を解析し、水通導性との定量的関係を調べる。また、組織における局在性を免疫染色法を用いて調べる(Matsunamiら2016)。B-2.通気組織形成と水通導性との定量的関係主軸根およびL型側根における通気組織率を切片画像から面積法(Visser and Bogemann 2003)で測定し、水通導性との定量的関係を調べる。
1次元同期ポテンシャルの加わった2次元電子系の電流磁気効果

GaAs/AlGaAsヘテロ接合界面の2次元電子系を用いて、まず、電圧印加・電流測定により界面に垂直な強磁場中で対角伝導率、非対角伝導率を測定するための試料および測定用回路を作製した。これらを用い予備実験として、量子化Hall伝導率の測定を試みた。Hall伝導率のプラトーの観測はでき、測定回路が予想通り機能していることがわかった。しかし、Si-MOS FETの場合に比べると、試料の電流端子の端子抵抗を、無視できる程度に小さくすることができなかった。端子と2次元電子系とのオーミック接触は、文献に見られる最も良好な材料で行ったが、接触抵抗は20-30Ωmm程度に留まり、これは伝導率の絶対値を問題にする場合には不十分である。これらの予備実験の後、2次元電子系に1次元周期ポテンシャルの加わった試料を次のように作製した。用いたヘテロ基板の2次元電子系の4.2Kでの平均自由行程は3-10μmであり、これに対して摂動ポテンシャルの周期は可能な限り短い方がよいので、電子線描画装置を用いて安定してレジストに描画出来た最短の0.3μm周期の縞状構造を描画し、これを軽くウェット・エッチして電子系に周期的な摂動ポテンシャルを加えることを試みた。周期構造を作製した後電圧印加・電流測定用の整形プロセスを施した試料いくつかにつき、電圧印加型の電流磁気効果測定をし、目的とする共鳴による伝導度振動の観測を試みたが、これまでのところ観測に成功していない。AFMを用いて作製した周期構造を観察してみたところ、エッチングした部分にかなり凹凸が見られ、これらがランダムポテンシャルを作り、伝導度振動を観測できない一因となっていることが考えられる。これに対し電子線描画後の酸素プラズマによる試料表面の浄化やエッチャントの種類を変えるなどの改善を試みている。
新規な微生物触媒によるキナ酸からシキミ酸への高速・高効率変換法の開発

タミフル製造に重要な原料であるシキミ酸の製造法には幾多の隘路があった。研究代表者はこれを克服するために、糸状菌と酢酸菌の酵素系を利用することを目的に研究を始めた。その結果、コーヒー粕からキナ酸を大量に得て、キナ酸は新規な酢酸菌触媒によって、高速・高効率にシキミ酸へ変換される系を完成させた。クロロゲン酸加水分解酵素(Chase)の製造に好適な麹菌として、Aspergillus sojae AKU 3312を選んだ。CHaseの誘導条件の最適化を行い、インスタントコーヒー粉末または、コーヒー粕にA.sojaeを生育させた菌糸体に通常の100倍以上の効率でCHaseが誘導生成されることを発見した。A.sojaeの菌糸体からCHaseを容易に精製した。CHase反応で生成するキナ酸を酢酸菌のキナ酸脱水素酵素と共役させて、酸素電極を使用して溶存酸素の減少量で生成キナ酸量を測定する新規なCHase測定法を開発した。精製酵素の酵素化学的緒性質は文献記載のものと同等であった。精製酵素を固定化して得られた固定化CHaseは遊離の酵素の60%相当の活性を示した。キナ酸とカフェ酸を工業的に製造するために、コーヒー粕麹を製造して、当該目的に使用することを研究した。精製酵素よりも菌糸体に存在するCHaseは60度C30分の熱処理に安定であることを利用して、酵素活性を損なわないで栄養細胞と胞子の発芽を停止させたものを固定化微生物触媒とした。これを充填したカラム化触媒塔を使用してクロロゲン酸から等モルのキナ酸とカフェ酸の生成を確認するとともに、コーヒー粕はじめ芋焼酎粕など広くクロロゲン酸を含む未利用農産廃棄物から工業的規模でキナ酸とカフェ酸が得られることになったので、シキミ酸の大量製造が可能になった。ここに、研究目的に掲げたコーヒー粕からシキミ酸までの全く新規なルートが開かれた。デヒドロシキミ酸生成を触媒する膜結合型デヒドロキナ酸デヒドラターゼ(mDQD)を細胞膜から初めて可溶化・精製した。これによって、mDQDが酢酸菌細胞膜の外表層に局在し、ペリプラズム側で機能して、円滑にデヒドロシキミ酸生成が進行することを酵素化学的に証明した。酢酸菌細胞でも、その網胞膜標品を使用してもデヒドロシキミ酸が高効率に生成された。自然界からキナ酸を工業的規模で製造するために、キナ酸をクロロゲン酸として含む農産廃棄物であるコーヒー粕に着目した。クロロゲン酸加水分解酵素(CHase)を生成する糸状菌をコーヒー粕に繁殖させてコーヒー麹を作ると、菌糸体に通常の100倍以上の含量でCHaseが誘導生成された。CHaseを酢酸菌のキナ酸脱水素酵素と共役させて、酸素電極を使用して溶存酸素の減少量で生成キナ酸量を測定する新規なCHase測定法を開発した。キナ酸を工業的に製造するために、コーヒー粕麹は60度C30分の熱処理に安定であることを利用して、酵素活性を損なわないで栄養細胞と胞子の発芽を停止させたものを固定化微生物触媒とした。これを充填したカラム化触媒塔を使用してクロロゲン酸から等モルのキナ酸とカフェ酸の生成を確認するとともに、コーヒー粕はじめ芋焼酎粕など広くクロロゲン酸を含む未利用農産廃棄物から工業的規模でキナ酸とカフェ酸が得られることになった。酸化発酵系及び共役不斉還元系を固定化触媒化して、キナ酸からシキミ酸製造の高効率化を検討した。その結果、酸化発酵系はアルギン酸カルシウムで細胞膜を固定化することで、酵素として使用する細胞膜濃度を高めることができるうえ、固定化触媒その触媒能が低下することなく何度も繰り返して使用できることを明らかにした。卓上多目的反応槽を使用して高濃度キナ酸を仕込んで実験した結果、36時間反応でキナ酸はほぼ100%の転換効率でデヒドロシキミ酸へ変換された。一方、共役不斉還元系を構成するシキミ酸脱水素酵素(SKDH)とグルコース脱水素酵素(GDH)の固定化にはさまざまな方法が有効であった。親和性を応用する方法、担体への吸着力の利用、イオン結合法、格子構造中への閉じ込め法、包括法、など全てに良好な結果を与えた。なかでもBlue Dextran 2000に親和性が強いことを利用すると、容易に両酵素を固定化酵素触媒にすることができたうえ、遊離の酵素液による反応と同等の反応効率でシキミ酸が得られた。イオン交換体を担体とした場合も、60%以上100%近い反応効率を示した。二種類の脱水素酵素による共役反応系が首尾よく固定化され、円滑に機能することを示す例として、本研究成果は特筆できると確信する。

本研究成果として述べた上記の方法によって、シキミ酸は容易にキログラムレベルの収量を実験室でも達成することができたことは、シキミ酸製造法が隙路となっていたタミフル合成に大きく貢献する技術として、世界中で利用されるようになることが望まれる。これまでの研究成果と合わせることで、コーヒー粕のような農産廃棄物から容易に高付加価値のある有用物質が生産できることが本研究によって示すことができた。このような次第で、過去3年にわたって行ってきた研究はここに目的通りに完成された。
悪性グリオーマに対する腫瘍溶解性ウイルスと抗血管新生薬との併用療法についての検討

腫瘍微小環境をターゲットとした抗血管新生治療薬と腫瘍溶解ウイルス(OV)との併用による治療効果について実験した。次に抗血管新生治療薬とOV治療との併用療法による相乗効果についてのメカニズムを調べた。オンコリティックウイルスと抗血管新生治療薬との併用療法は、脳腫瘍治療の新たな展開に必要であると考える。我々はオンコリティックウイルス(OV)をより効果的な治療戦略とするため悪性グリオーマに対するオンコリティックヘルペスウイルスを用いた宿主の間葉系システムにおける反応、腫瘍のマイクロエンバイロメント、さらには、腫瘍血管の変化について研究を行ってきた。我々は抗血管新生治療薬と併用によりOV治療の効果を増強することができたが、この結果は薬剤の局所投与、1種類のウイルスと1種類の抗血管新生治療薬の結果であった。この結果を発展させるために他のOVや他の抗血管新生治療薬の使用について検討した。1) cRGDペプタイド(Cilengitide)の投与法を全身性投与法に変えたところ、同様な相乗効果が得られた。2)他の抗血管新生薬であるベバシツマブも今回の実験に使用したが、現段階では、はず、脳腫瘍モデルに対する薬剤単独の効果を検討していることであり、OVとの併用の元データをとっているところである。3)他のHSV-1ウイルスrQNestin34.5,(腫瘍特異的なネスチンプロモーターのコントロール下でIGP34.5遺伝子がドライブされる)を使用したところ、同様な相乗効果が得られた。4)オンコリティックアデノウイルス(AdexElAdB)を使用したが、AdexElAdB単独群と比べ、U87dEGFRなどのヒト脳腫瘍細胞系列のモデルを用いたところ、生存期間の延長傾向が認められたが、まだ、有意な結果ではないため、今後、cRGDペプタイド(Gilengitide)投与量の検討、ウイルス量の検討をする予定である。以上の結果をさらに発展させ、22年度の計画である「抗血管新生治療薬によりOVの腫瘍溶解を増強するメカニズムの検討」を始めていく予定である。我々は、悪性グリオーマに対する新規治療として腫瘍溶解ウイルス(OV)をより効果的な治療戦略とするため、腫瘍溶解ヘルペスウイルスを用いた腫瘍微小環境、さらには、腫瘍血管の変化についての研究を行ってきた。そこで、抗血管新生治療薬cilengitideとの併用によりOVの効果が増強されることが新知見としてえられたが、この結果は薬剤の局所投与、1種類のウイルスと1種類の抗血管新生治療薬の結果であった。今回のプロジェクトでは、この結果を発展させるために他のOVや他の抗血管新生治療薬の使用について検討し、抗血管新生治療薬によりOVの腫瘍溶解を増強するメカニズムをさらに調べた。1)血管新生を抑制しているか否かを確認するため、微小血管密度を調べたところ、cilengitide投与群において血管密度が低下しており、今回はさらに、血管径が縮小していることもわかった。2)CD45などの免疫染色で、cilengitide投与群では宿主の炎症細胞浸潤の低下を認めた。さらには、併用群においても炎症反応の発現低下が認められた。3)cilengitide単独群においてQuantitative PCRにて、IL-1,IP-10,Mig,IL-8などの炎症反応に関連する遺伝子の発現が低下していた。さらには、併用群においても炎症反応の発現低下が認められ、OVを増強させる、相乗効果の一つの機序として考えられた。4)他の抗血管新生薬であるベバシツマブも今回の実験に使用したところ、非投与群とくらべ、ベバシズマブ投与群において、血管密度が低下していたが、血管径の縮小化はなく、各々の抗血管新生治療薬による血管新生阻害の形態学的な違いが認められた。ベバシズマブとの併用についても検討していく予定である。以上の結果をさらに発展させ、今後、腫瘍微小環境をターゲットとした分子標的薬と新規腫瘍溶解ウイルス(OV)との併用による治療効果についての実験を始めていく予定である。
胚性腫瘍と胚幹細胞の成立と分化の機構

胚性腫瘍、胚幹細胞で発現が著しい制御遺伝子を対象とした多彩な研究がなされた。胚性腫瘍・胚幹細胞の分化において発現が大きく変動する転写制御因子・細胞増殖因子の代表的なものが発見・同定されたが、それらは、実際の胚発生の制御において中心的な役割を果たしているとともに、悪性腫瘍の発生にも深く関わるものであることが示された。N-myc遺伝子については、胚幹細胞における相同組換えを利用して、N-myc突然変異マウスが作り出され、その突然変異体の表現型の解析から、N-mycは転写制御因子として、器官形成に積極的に関与する遺伝子を制御していると結論された。胚性腫瘍・胚幹細胞の未分化状態で活性を持つ転写因子Oct3の遺伝子の発現制御の機構が明らかにされた。未分化状態におけるレトロウイルスの抑制因子ELPがステロイド受容体遺伝子群の一員であり、とくにP450遺伝子の転写活性化因子と同じ遺伝子であることが明らかになった。ポリオーマウイルス・エンハンサーの分化状態における活性化因子として同定されたPEBP2αがショウジョウバエのrunt遺伝子産物のホモログであることが明らかになった。また、分化状態に対応した活性化因子としてG19-Znフィンガータンパク質、Etsプロトがん遺伝子産物が同定された。胚性腫瘍・胚幹細胞の分化にともなって発現される増殖因子Midkineが、胎児の脳の内在性神経成長因子であること、また、ヒト癌の多数で発現される成長因子でもあることが明らかになった。また、このような因子を検定するための無血清培養系が確立された。このように、本研究から、これまで未知であった重要な制御因子が続々と単離され、また、それらの正常な個体発生・細胞分化と腫瘍発生における役割が明らかにされつつある。
老化繊維芽細胞のアレルギー性気道炎症での役割

気管支喘息基底膜の肥厚が喘息の病態に関わることが報告され、肺線維芽細胞の過剰反応の関与が示唆されている。老化がリモデリングにはたす役割の変化を明らかにするために、若年細胞としてはWI-38細胞のPDL (population doubling level) 23-27を、老化細胞としてPDL39-45を使用した。気管支喘息におけるエフェクター細胞の一つである肥満細胞から産生され、喘息の病態形成に重要とされるヒスタミンやPGD2の老化細胞に対する効果の変化を検討した。前年度はBoyden blind well chamberやGel Contraction法で老化細胞の遊走能、収縮能を検討したが、今年度は蛋白産生能について検討した。組織の細胞自身が産生するサイトカインに引き寄せられる、好中球、好酸球などの炎症細胞による末梢組織に対する効果はリモデリングを検討するうえで重要であることから、今回は老化線維芽細胞からのIL-8の産生能の違いについて若および老化細胞で比較検討した。老化細胞は若年細胞よりIL-8の産生能は低かった。しかしアレルギー炎症に関与するヒスタミンやPGD_2に対する反応には大きな差を認めなかった。これらのことから老化肺では線維化過程自体が減弱していることが示された。この研究から気管支喘息を含めリモデリングが病態形成に関わる疾患は老化に伴いその病勢は低下する可能性が示唆された。近年気管支喘息基底膜の肥厚が喘息の病態に関わることが報告されてきた。肺線維芽細胞の過剰反応の関与が示唆されている。老化がリモデリングにはたす役割の変化を明らかにするために、若年細胞としてはWI-38細胞のPDL(population doubling level)23-27を、老化細胞としてPDL39-45を使用した。Boydenblind well chamber法で遊走能を、Gel Contraction法で収縮能についての比較検討を行った。さらに気管支喘息におけるエフェクター細胞の一つである肥満細胞から産生され、病態形成に重要とされるヒスタミンやPGD2の老化細胞に対する効果の変化も検討した。Boydenblind well chamberの上部wellsにWI-38を添加した。ヒスタミンもしくはPGD_2も上部wellsに添加した。8μm孔のmembraneで隔てた下部wellにはchemoattractantとしてfibronectin 20μg/mlを入れ6時間incubateし遊走細胞をカウントしデータとした。Gel Contraction法ではRat tailより抽出したType I collagenn内に3X10^5 cells/ml濃度でWI-38を加えゲル化させ3次元的に培養した。ゲル化した線維芽細胞含有ゲルを各コンディションの培養液に浮遊させ、そのサイズの変化を収縮能とし若および老化細胞で比較検討した。老化細胞は若年細胞より遊走能、収縮能は低かった。しかしアレルギー炎症に関与するヒスタミンやPGD_2に対する反応には差を認めなかった。次年度は蛋白産生能について検討する。

老化細胞は若年細胞よりIL-8の産生能は低かった。しかしアレルギー炎症に関与するヒスタミンやPGD_2に対する反応には大きな差を認めなかった。これらのことから老化肺では線維化過程自体が減弱していることが示された。この研究から気管支喘息を含めリモデリングが病態形成に関わる疾患は老化に伴いその病勢は低下する可能性が示唆された。
房室結節・洞結節に対する”クライオマッピング”の有用性に関する検証

本研究は房室結節回帰性頻拍の治療で用いられている"クライオマッピング"という手法を用いて、正常な房室結節、洞結節の一時的な機能停止が得られるかどうかを検証し、難治性心房細動に対する房室結節アブレーション、不適切洞頻脈を含めた洞結節近傍へのアブレーションの臨床応用への可能性を探求することである。
ホメオボックス遺伝子のfail-safe機構と細胞の機能分化

BarH1,BarH2間80kbを含め、両遺伝子を含むクローン化された、全長200kbの領域を各種の制限酵素で平均10kb程度に分割し、それぞれにlacZ遺伝子を結合させ、P因子発現ベクターに挿入し、複眼色遺伝子を選択マーカーとし、トランスジェニックハエを複数ラインづつ作成した。X-gal染色、抗lacZ抗体により組織染色を、embryo,larvaeおよびpupaeについて行い、BarH1、BarH2の組織特異的エンハンサー分布の物理地図を作成した。得られた結果は、抗BarH1/BarH2抗体と逆位変異体を用いて得られた粗い物理と矛盾しなかった。現在までに確認されたエンハンサーとしては、肢の一節での円環状発現を決め、肢の二次元平面からの伸長を支配しているエンハンサー、複眼の光受容細胞R1,R6およびfurrowでの発現を制御するエンハンサー等、存在が予想された多くのエンハンサーが単離された。現在これらのエンハンサー含有断片を更に小さく切断し、再度トランスジェニックハエを作り、最終的にエンハンサー領域を200bp程度までに絞るための実験をしている。また、BarH1,BarH2欠損による行動異常の原因エンハンサーも同定され、その発現中枢神経細胞の特定を急いでいるところである。
常染色体およびX染色体上に位置するSTRローカスの繰り返し塩基配列の構造解析

白骨化したあるいは高度に腐乱した死体の個人識別を目的に、歯髄DNAを試料とし,vWAローカス(12p12-12pter)およびDXS986ローカスの塩基配列の構造多型について検討した。vWAローカスは,歯髄DNA142例を試料とし,イントロン40の約670bpに及ぶ塩基配列のうち,上流に位置するKimptonらが報告した遺伝子領域(vWA-Kローカス)と,そこから約600bp下流に位置するPloos van Amstelらが報告した遺伝子領域(vWA-Pローカス)について検討した。vWA-Kローカスにおいて,アリール14の塩基配列は5'-(tcta)1(tctg)1(tcta)1(tctg)4(tcta)3(tcca)1(tcta)3(tcca)(tcca)-3'であり,アリールNo.はtctaの繰り返しの数1+1+1+4+3+1+3=14で表された。ただし,3'側の(tcta)3からさらに下流へ向かって7塩基目のtがcに置換していた.一方,アリール15-20は5'-(tcta)1(tctg)4(tcta)m(tcca)(tcta)-3'であり,アリールNo.は1+4+m(m=10-15)で示された。つぎに,vWA-Pローカスのアリールは(tgta)p(tcta)q(tcta)rで示され,アリールNo.はp+q+r(p=5-8,q=2-4,r=8-15)で表された。従って,同鎖長異型が各アリールで認められた。アリール21-23ではp=7の場合(アリール23ではp=8の場合も)にはq=4であり,かつ,3'側の(tcta)rから下流へ向かって8塩基目のcがtに置換していた。また,歯髄DNA68例を試料とし,DXS986ローカスの構造多型について検討したところ,アリール26-37と42の計13アリールが検出された。アリールNo.はcaとtaの反復配列の総和(ta)p(ca)q〔p+q : p=11-20と26,q=13-21〕で示された。同鎖長異型はアリール27,29-31,33-35および37に確認された。以上のことから,vWAおよびDXS986ローカスの塩基配列には同鎖長異型が存在し,より精度の高い個人識別が可能であることを明らかにした。

当教室保存の131歯から採取・抽出した歯髄DNAを試料とし、常染色体STRローカスの中からvWAローカスを選択し、Ploos van Amstelらが報告した塩基配列(nt22152380)について詳細に検討した。Ploos van Amstelらに従って合成したプライマーを用い、増幅したPCR産物を電気泳動し、アリールを判定した。その結果、アリール数は7アリール〔アリール1723(154178bp)〕検出され、アリール19(30.9%)、アリール20(28.6%)、アリール22(16.8%)の順に出現した。遺伝子型は23パターンに分類され、19-20型(23.7%)、19-22型(11.5%)、20-22型(10.0%)の順であった。ヘテロ接合度は0.774、PICは0.740、PDは0.895であった。つぎに、各アリールのDNAバンドを切り出して精製し、ダイレクトシークエンスを行い、塩基配列を解析した。その結果、vWAローカスのリピート構造は、(tgta)p(tcta)q(tcta)rであり、アリールNo.はそれらの繰り返し数の総和(p+q+r)で示されることが判明した。全試料について検討した結果、それぞれのアリールにおけるp、q、rは同値ではなく、同鎖長異型が認められた。すなわち、p=58、q=24およびr=815であった。また、アリール18、21、22、23は2あるいは3分類され、アリール19と20では出現頻度は高いにも係わらず、同鎖長異型は認められなかった。検出された7アリールは、同鎖長異型により13パターンに分類された。アリール2123ではp=7の場合(アリール23ではp=8の場合でも)にはq=4であり、かつ、(tcta)rの3'側から8番目の塩基がc→tに置換していることが判明した。さらに、遺伝子型を同鎖長異型で分類した結果、18-20型、19-21型、19-22型、19-23型、20-21型、20-23型および21-22型にはその存在が確認され、リピート構造解析による分類は32パターンになり、ヘテロ接合度は0.784、PICは0.763、PDは0.904に向上した。X染色体STRローカスの中からDXS986ローカスを選択し、その塩基配列の構造を解析して法医鑑識領域への有効性について検討した。試料DNAは、当教室で保存されていた歯から採取した、男性歯髄54例および女性歯髄14例から抽出した。PCRプライマーはforward:5'-cacacacaggtttctagc-3'およびreverse:5'-catttttatggccatggtat-3'を新たに設定し、PCR反応液は30μl系で行った。PCRサイクルは95°C・30秒、54°C・30秒、72°C・40秒を30回行った。PCR産物を電気泳動し、銀染色法でDNAバンドを検出した。その後、DNAバンドを精製し、ダイレクトシークエンスを行って塩基配列の構造解析とDNA型を判定した。その結果、試料68例のDNA鎖長は171203bpであり、アリール2637(171193bp)と42(203bp)の計13アリールが検出された。なお、アリールNo.はシークエンシングにより得られたCAおよびTAの反復配列の総和〔(ta)_p(ca)_q:p+q〕をもって決定した。遺伝子頻度は、アリール34(187bp:28.0%)が最も高く、ついでアリール30(179bp:20.7%)、アリール35(189bp:13.4%)の順であった。Gene diversityは0.837であった。全試料DNAについてシークエンシングを行ったところ、13アリールのうちアリール27、2931、3335および37の8アリールに同鎖長異型(p=1120と26、q=1321)が確認され、29パターンに分類された。Gene diversityは0.935となり、識別精度は向上した。平成11・12年度の本報告書において報告したvWA・DYS389・DYS390ローカスにDXS986ローカスを加えて検査することで、男女の混合試料においては性別判定のみならず、より精度の高い個人識別も期待され、法医鑑識上、極めて有益である。
影響力/権力概念の再検討ー米国シンクタンクの事例を通じて

本研究は、アメリカの公共政策研究機関すなわち「シンクタンク」に焦点をあて、影響力/権力概念の再検討を行うことを目的とした。アメリカの政治学界では、従来の関係論的な影響力の客観的証明を、あるいは統計学的実証性を過度に重視する傾向から、シンクタンクそのものを対象とした研究は未発達である中、本研究はシンクタンクの影響力について巨視的に、また権力の実体論に傾斜しながら、アメリカのシンクタンクには、1政策アイディア生産者・提供者としての影響力、2政治運動としての影響力、3政府高官供給源としての影響力、これら三つの影響力の形態が見られることを明らかにすることで、新たな影響力概念の構築を目指した。最終年度となる平成30年度では、引続き基礎的資料・データの収集やシンクタンク関係者及び専門家らへの聴き取り調査を行うとともに、研究成果をまとめる作業に従事し、1970年代以降のアメリカ政治においてシンクタンクが概ね上記の三つの影響力を行使してきたことを確認した。同時に、最終年度は現状分析にも力を入れた。すなわち、共和党政権でありながら、現トランプ政権において保守系シンクタンクが「冷遇」されている状況が端的に物語るように、今日シンクタンクを取り巻く環境は大きく変化しつつある。ポピュリズムの台頭は政策エリートの世界に対しても大きな衝撃を与えており、今後の動向次第ではシンクタンク世界の再編が生じる可能性は否定できない。このような可能性とそのアメリカ政治への含意については既にいくつかの論文等で発表しているが、今後より深く掘り下げて考察していきたいと考えている。本研究は、アメリカの公共政策研究機関すなわち「シンクタンク」に焦点をあて、権力/影響力概念の再検討を行うことを目的としている。アメリカの政治学界では従来の関係論的な影響力の客観的証明を、あるいは統計的実証性を過度に重視する傾向から、シンクタンクそのものを対象とした研究は未発達であると言ってよい。こうした中で、本研究はシンクタンクの影響力について巨視的に、また権力の実体論に傾斜しながら捉えようとしている。具体的には、アメリカのシンクタンクには、1政策アイディア生産者・提供者としての影響力、2政治運動としての影響力、3政府高官供給源としての影響力、これらの三つの影響力の形態が見られることを明らかにしようとしている。初年度となる本年度では、基礎的資料・データの収集を行うとともに、主にワシントンDCにおいてシンクタンク関係者への聴き取り調査を実施した。特に聴き取り調査では、報道や研究書では入手できないシンクタンクに関する貴重な情報が得られ、その具体的な成果としてシンクタンクの政治運動としての側面についての分析が進展した。すなわち、保守系シンクタンクに着目することにより、イデオロギー系シンクタンクが、1政策の情報源、2人材の育成、3連合の構築、これらの三つの機能を果たすことで政治運動を推進しているという、本研究の仮説がある程度証明されたと考えている。また、そのような最近の例として、ヘリテージ財団によって2010年に設立された政治団体であるヘリテージ・アクション・フォー・アメリカがオバマケアへの反対運動の中核として機能していることについても詳細な分析を加えた。これらの研究成果については既に短い論文の中で発表しているが、今後学会等で報告していく予定である。一方、政策アイディアの生産者・提供者としての影響力と、政府高官供給源としての影響力については資料収集の段階にとどまった。政治運動としての影響力の解明に成功したことは、シンクタンクに関する既存の理解の再考を迫るものであり、大きな意義を有する。すなわち、基本的に政策研究と提言活動に従事しているという、従来のシンクタンク理解の再検討を迫るものであり、アメリカにおける政策専門家についての認識を大きく変える可能性を有している。その一方で、政策アイディアの生産者・提供者としての影響力と、政府高官供給源としての影響力については極めて膨大な資料・データの収集が必要なこともあり、まずはこちらの作業に専念せざるを得なかった。また、トランプ現象をいかに捉えるかという課題も浮上した。トランプはさまざまな点で異例であるが、シンクタンクとの関係でも従来の政治家とは異なっていた。党派に関係なく、大統領候補はシンクタンク研究員の助言を積極的に受け入れる傾向があり、伝統的に共和党候補は保守系シンクタンクの全面的な協力を確保してきた。しかし、2016年大統領選挙はこのようなパターンが繰り返されたとは言い難く、トランプが助言を求めたのは一部の保守系シンクタンク関係者のみであった。また、トランプ政権で政府高官に任命された保守系シンクタンク研究員は少数にとどまっており、この点も歴代共和党政権との大きな違いである。こうしたトランプとシンクタンクの関係を注視する必要があり、今後の検討課題である。アメリカの政治学界では、従来の関係論的な影響力の客観的証明を、あるいは統計的実証性を過度に重視する傾向から、シンクタンクそのものを対象とした研究は未発達である中、本研究はシンクタンクの影響力について巨視的に、また権力の実体論に傾斜しながら、アメリカのシンクタンクには、1政策アイディア生産者・提供者としての影響力、2政治運動としての影響力、3政府高官供給源としての影響力、これらの三つの影響力の形態が見られることを明らかにすることで、新たな影響力概念の構築を目指している。平成29年度では、引続き基礎的資料・データの収集、ワシントンDCにおけるシンクタンク関係者への聴き取り調査、及び専門家との意見交換を実施した。そして、特筆すべき研究成果として『アメリカ政治とシンクタンクー政治運動としての政策研究機関』(2017年)の刊行をみた。

同書は、シンクタンクの政治運動としての影響力を、学術的に初めて明らかにしたものである。また、他の残りの影響力分析についても研究が進展した。政策アイディア生産者・提供者としての影響力に関しては、経済政策の展開とシンクタンクの関係についての事例研究を行い、政府高官供給源としての影響力については、歴代政権のシンクタンク出身者に関する多くのデータを収集した。さらに、現在のトランプ政権についての分析も本格的に開始し、歴代政権と比べてシンクタンク関係者が少ない実態とその背景の分析を試みた。同書は大平正芳記念財団による大平正芳賞(平成30年度)を受賞することが決定されている。1.シンクタンクに焦点をあてた学術書(『アメリカ政治とシンクタンク』)を刊行した。同書において、シンクタンクの政治運動としての側面が明らかにされた。3.アメリカ合衆国ではシカゴ大学、シカゴ国際問題評議会、マルケット大学(ミルウォーキー)、ドレイク大学(デモイン)、スタンフォード大学、ミシガン大学等での講演を行い、またオーストラリア国立大学にも招聘された。本研究は、アメリカの公共政策研究機関すなわち「シンクタンク」に焦点をあて、影響力/権力概念の再検討を行うことを目的とした。アメリカの政治学界では、従来の関係論的な影響力の客観的証明を、あるいは統計学的実証性を過度に重視する傾向から、シンクタンクそのものを対象とした研究は未発達である中、本研究はシンクタンクの影響力について巨視的に、また権力の実体論に傾斜しながら、アメリカのシンクタンクには、1政策アイディア生産者・提供者としての影響力、2政治運動としての影響力、3政府高官供給源としての影響力、これら三つの影響力の形態が見られることを明らかにすることで、新たな影響力概念の構築を目指した。最終年度となる平成30年度では、引続き基礎的資料・データの収集やシンクタンク関係者及び専門家らへの聴き取り調査を行うとともに、研究成果をまとめる作業に従事し、1970年代以降のアメリカ政治においてシンクタンクが概ね上記の三つの影響力を行使してきたことを確認した。同時に、最終年度は現状分析にも力を入れた。すなわち、共和党政権でありながら、現トランプ政権において保守系シンクタンクが「冷遇」されている状況が端的に物語るように、今日シンクタンクを取り巻く環境は大きく変化しつつある。ポピュリズムの台頭は政策エリートの世界に対しても大きな衝撃を与えており、今後の動向次第ではシンクタンク世界の再編が生じる可能性は否定できない。このような可能性とそのアメリカ政治への含意については既にいくつかの論文等で発表しているが、今後より深く掘り下げて考察していきたいと考えている。引き続き基礎的資料・データの収集と、現地ワシントンDCでの聴き取り調査を行いながら、初年度の研究成果をさらに発展させるとともに、政策アイディア生産者・提供者としての影響力と、政府高官供給源としての影響力についての分析を加速させたい。以上の研究を進める上で、当然トランプ政権との関わりについても一層の注意を払っていく。
表面フォノンポラリトンによる薄膜の熱伝導率促進

解析で予測されている表面フォノンポラリトンによる熱輸送促進を示すため,微細加工技術により,二酸化シリコンの極薄自立薄膜を作製し,3オメガ法により横方向熱伝導率を測定した.薄膜の熱伝導率は,バルク状材料よりも大きな値を示したが,100nmより薄い薄膜を生成できず,明確な表面フォノンポラリトンの熱輸送促進を示すまでには至らなかった.しかし,窒化シリコン膜生成との積層薄膜を作製することで,二酸化シリコン極薄膜を生成する手法,細線加熱による横方向熱伝導率を測定するノウハウを確立し,さらなる極薄膜を生成して表面フォノンポラリトンによる熱輸送促進を確認するための一連の手法を確立した.20nm500nm厚さの自立シリカ薄膜を製作し,x線分析によりその純度の高さを確認した.自立シリカ薄膜の熱伝導率を3オメガ法で計測した結果,500nm厚さの薄膜で1.25W/(m・K),150nm厚さの薄膜で6W/(m・K)であった.薄い自立膜の熱伝導率は理論解析の結果と比較して有意に高い値になってしまっており,これは熱伝導率計測で用いる熱モデルにおいて,アルミ細線を通した熱損失を考慮していなかったためと考えられる.そこで,熱損失の効果を無視しうるほど低減するために自立薄膜の寸法を変更した結果,280nm厚さの薄膜で0.935W/(m・K),130nm厚さの薄膜で0.928W/(m・K)という値が得られた.また,時間領域サーモリフレクタンス用の自立薄膜の製作も実施した.ポンプ光の吸収を高めるためにアルミパッドを50nm150nm厚さの自立シリカ薄膜の中央に成膜した.サーモリフレクタンス計測で得られた実験結果を解析結果にフィッティングすることが難しかったため,今後は,その要因を明らかとするとともに,良好なフィッティングが行える新しい解析モデルを構築していく.加えて,表面フォノンポラリトン(SPhP)の周波数域を拡大するために,粗さを付けたガラス表面の反射率を測定した.シリカ微粒子をガラス板表面に配置することで表面粗さを増大させた.微粒子の半径は1ミクロンで,粒子間の距離は入射光の波長と比較して十分大きい.予備実験の結果,得られた吸収スペクトルはミー散乱理論との一致が良好で,また,SPhP周波数における特異な光の吸収も観察された.しかしながら,微粒子サイズを2ミクロンに変更したにもかかわらず,吸収周波数の変化が観察されなかった.次年度は,SPhPの伝播距離を減衰全反射法で計測する装置を導入して計測を行う.自立薄膜の形状が正方形であり,また,寸法が大きすぎたため,アルミ細線ヒーター自身の熱伝導による熱損失が大きくなってしまい,3オメガ法による面方向熱伝導率の予備計測の結果は予想を大きく上回るものとなってしまった.熱コンダクタンスの見積もりより,アルミ細線ヒーターの厚みを150nmよりも薄くする必要があることがわかった.サーモリフレクタンス計測では,自立膜中央への厚さ200nm,直径10ミクロンのポンプ光吸収用のアルミパッドの成膜が難航したが,複数のサンプルに対し計測を実施することが出来た.しかし,計測温度のフィッティングに用いる解析モデルが不適当であったため,計測された熱伝導率が0.5 W/(m・K)以下と予想を下回る結果となった.現在,近接場ふく射を新たに加味した適切なフィッティングが行える解析モデルの構築を行っている.レーザー周期加熱と薄膜熱電対による温度計測を組み合わせた熱拡散率測定も試みたが,薄膜熱電対を構成するニッケル薄膜の膜質に問題があり,正常に機能する薄膜熱電対を製作することができなかった二酸化ケイ素の超薄膜の面方向熱伝導率を測定し、膜厚100nm以下になると熱伝導率が増加することを示した。測定には3オメガ法を用いた。この測定のためにヒーターと温度センサーを有する二酸化ケイ素の自立膜が必要となるが、一般的なクリーンルームの工程で作製するノウハウを利用して必要な構造を作製した。二酸化ケイ素には圧縮の残留応力が発生するが、強い残留応力が働いたままウェットエッチプロセスを実施すると、膜厚100nm以下の超薄膜が割れる。残留応力を緩和するため、引っ張り応力を有する窒化ケイ素薄膜を膜厚制御して生成し、必要な二酸化ケイ素超薄膜を保護した。窒化ケイ素を取り除く最後の工程はドライエッチングを利用することで、必要な超薄膜を生成した。表面には熱伝導率測定に必要なヒーターと温度センサーを線幅10ミクロンのアルミ細線で生成した。細線構造生成にはリフトオフプロセスを用いている。ヒーターからの熱の漏れが測定結果に影響を及ぼさないよう考慮して、二酸化ケイ素の平面サイズ、細線の幅、長さを設定した。その結果、膜厚80nmの二酸化ケイ素薄膜でバルク状二酸化ケイ素の熱伝導率に対して1.5倍程度大きい値が計測された。薄膜の膜厚方向の熱伝導率測定はじめ、通常、フォノンのみの熱輸送を考えると膜厚が薄くなるについて、熱伝導率は減少することがよく知られている。熱伝導率が増加した本研究結果については、解析予測通り、表面フォノンポラリトンに起因する熱伝導率促進と考えている。実際に平均自由行程の長い表面フォノンポラリトンによる熱伝導では、薄膜の平面サイズもサイズ効果に表れると考えられるが、幅1mm以下の薄膜では熱伝導率が下がる傾向が測定された。

今後、表面フォノンポラリトンの直接測定などを通して、考察を深める必要がある。解析で予測されている表面フォノンポラリトンによる熱輸送促進を示すため,微細加工技術により,二酸化シリコンの極薄自立薄膜を作製し,3オメガ法により横方向熱伝導率を測定した.薄膜の熱伝導率は,バルク状材料よりも大きな値を示したが,100nmより薄い薄膜を生成できず,明確な表面フォノンポラリトンの熱輸送促進を示すまでには至らなかった.しかし,窒化シリコン膜生成との積層薄膜を作製することで,二酸化シリコン極薄膜を生成する手法,細線加熱による横方向熱伝導率を測定するノウハウを確立し,さらなる極薄膜を生成して表面フォノンポラリトンによる熱輸送促進を確認するための一連の手法を確立した.現在,アルミ細線を通した熱損失を低減するために新しくデザインした厚み100nm200nmの自立薄膜に対して計測に取り組み始めている.計測結果として,表面フォノンポラリトン(SPhP)の効果は,膜厚が減少しても熱伝導率が一定となる結果として現れると予測している.また今年度は,SPhPによる熱伝導率促進がより顕著に現れる500K程度の高温まで実験を行う予定である.SPhPの伝播距離が大きく,自立薄膜の寸法5mmが不十分で,高温でもSPhPの熱伝導率促進効果が観察されない場合は,自立薄膜の寸法をさらに大きくして測定を行う.時間領域サーモリフレクタンス計測では,近接場ふく射を考慮に入れた,より良好なフィッティングが行える新しい伝熱モデルを考案する.減衰全反射測定装置では,反射スペクトルの計測結果からSPhPの伝播距離を知ることができる.また,伝播距離の計測結果から,自立膜サイズによる伝播距離の制限の有無を知ることができ,また,自立膜端部の反射率測定で伝播距離が制限を受ける様子を実際観察することができると予測される.シリカ粒子を用いたSPhP周波数領域の拡大に関する研究では,表面形状のパワースペクトルの取得が課題となっている.微粒子は基板に固定されていないため,AFMの利用は難しく,表面の顕微写真をフーリエ変換することにより,表面形状のパワースペクトルを取得し,吸光・反射特性との関連を調べていく.熱工学
同定実験計画の最適化に関する考察

制御系設計を行なうにあたり、よいモデルを得ることは重要である。一般に同定結果は、モデルや手法の選択、,観測データの独立性、外乱や無視したモデル化誤差の影響によって大きく左右される。そこで、本研究ではよりよいモデルを得るための同定実験を設計することを目指し、同定に用いる入力信号を設計する問題に着目した。ただし、センサの配置問題等においても同様の議論はできると考えている。同定入力信号を設計するための評価関数として、外乱や非構造的な不確かさからパラメータ推定誤差までの誘導ノルムを用いて、その誘導ノルムは小さくなるように入力信号や同定時に用いる周波数重みを設計する問題を考えた。入力信号もクラスを時系列信号とした場合にも、今までに研究してきた正弦波の線形結合の場合と同様、誘導ノルムを最小にするという意味で最適な周波数重みは、入力信号の関数として解析的に与えることができた。また、その結果を用いると、周波数重みと入力信号を同時に最適化する問題を、入力信号を最適化するLMI問題に帰着することができた。これらの結果を論文としてまとめ、現在投稿中である。また最適な周波数重みが入力信号の関数と;して与えられることに着目し,適応制御などのパラメータ推定機構を含む制御系でのパラメータ推定則の周波,数重みを設計できるかどうかを検討し、簡単な場合には有効性が確認できた。実際の対象に対して実装することを考えた場合には、まだ不十分である。制御系設計を行なうにあたり、よいモデルを得ることは重要である.一般に同定結果は、モデルや同定手法の選択、観測データの独立性、外乱や無視したモデル化誤差の影響によって大きく左右される.そこで、本研究ではよりよいモデルを得るための同定実験を設計することを目指し,同定に用いる入力信号を設計する問題に着目して、研究を進めてきた。同定入力信号を設計するための評価関数として、外乱や非構造的な不確かさからパラメータ推定誤差までの誘導ノルムを用いて、その誘導ノルムは小さくなるように入力信号を設計する問題を考え、以下の問題を考えた。1.前年度までに分母パラメータが未知の場合におけるテーラー展開に基づく最適な同定実験を設計するための評価関数の一提案を行なった。しかしながら、その方法では評価関数の近似を行なっており、その影響の見積もりを考える必要があった.または評価関数を修正する必要があった。近似の影響を見積もることはできたが、それを設計に生かすには不十分であり、この点は来年度の継続して研究を進めることにする.2.前年度までは、入力信号を正弦波の線形結合に限定し、定常状態を用いて定式化を行っていたが、入力信号のクラスの一般化することを考えて、入力信号を時系列信号にして、時系列信号を最適化する問題を考えた。その結果、正弦波の線形結合の場合と同様、定式化することができ、入力信号と観測データにかける周波数重みを最適化する問題に関して、以下のことがわかった。(1)評価関数を最小にする最適な周波数重みは入力信号の関数として解析的に与えることができた。(2)周波数重みと入力信号を同時に最適化する問題は、効率のよい解法が提案されているLMI問題に帰着することができた。
移動ロボットの能動的環境認識のためのセンサ情報融合システム

1.センサデータ構造レーザレンジファインダを用いて地形認識を行い、地形の新しいデータ構造として拡張エレベーションマップを考案した。本マップ構造を用いることにより、移動ロボットの大きさと向きを考慮した経路計画が容易に行うことが可能となった。2.異種センサの融合移動ロボットにおいて内界センサの情報と距離画像情報とを総合的に処理することにより、効率的な自己位置同定手法を構築した。本手法を用いることにより、一種類のセンサを用いるよりも、自己位置の推定精度を向上させることができる。コンピュータシミュレーションにより、自己位置同定手法の有効性を確認した。3.マップマッチング異なった地点における地形情報をマッチングすることにより、地図情報の合成手法および相互の位置関係を決定する手法を考案した。特に、マッチングに必要な特徴点を能動的に探索するアルゴリズムを確立した。この手法は並列的に処理するため、演算処理の短縮化が可能となった。4.実験的検討実験用移動ロボットを用いて、特徴点の抽出手法、マップマッチング手法、自己位置同定手法の検討を行い、その有効性を検証した。
天然物生合成遺伝子の発現による大腸ガン原因物質の生合成および化学構造の決定

【背景・目的】コリバクチンは大腸菌IHE3034株が哺乳類細胞に感染した後、哺乳類細胞からの何らかのシグナル物質により誘導される化合物であると予測されている。従って、本化合物の単離は困難であり、未だ部分構造ですら明らかにされていない。一方、大腸がん発症患者の66.7 %から本菌が検出されている。そこで、本化合物の正体を有機化学的に明らかにし、大腸がん形成メカニズムの解明および予防のためのバイオマーカーとすることを目的として研究に着手した。【方法・結果】我々はコリバクチン生合成に必要とされるclbAclbQの各遺伝子を発現し、in vitro反応による生合成経路の再構築を試みた。これまで、ペプチド合成酵素(nonribosomal peptide synthase, NRPS)であるClbNより生合成が開始され、次にNRPSとポリケタイド合成酵素(PKS)複合体であるClbBへ受け渡されることが報告されていた。そこでClbN、ClbBの発現ベクターを作製し、これを用い大腸菌を形質転換した。得られた形質転換体の代謝産物をLCーMSに供した結果、ミリスチン酸、D-AsnおよびL-Ala縮合体の生成が観測された。本化合物はClbNとClbBのNRPSにより生合成されるものと予測され、ClbBのPKSによる代謝産物を確認することはできなかった。これはClbBのC末端にチオエステラーゼは存在せず、生合成中間体が切り出されなかったためと考えられた。そこで化学合成した推定生合成中間体を標品とし、ClbNとClbBの生合成産物を解析した。その結果、ClbNはN-myristoyl-D-asparagine (1)を生産していることが明らかとなった。次に、本化合物をClbBと反応させたところ、ClbB代謝産物は1とL-Alaおよびマロン酸縮合体(2)であることが特定された。続いて、2を基質に遺伝子クラスター内の各PKSと反応させたところ、新規代謝産物中間体を見いだすことに成功した。26年度が最終年度であるため、記入しない。研究対象化合物である大腸ガン原因物質コリバクチンの生産菌より、コリバクチン生合成に必要と考えられる遺伝子をすべてBACという人工染色体にクローニングした。続いて、得られた遺伝子をそれぞれ薬剤耐性遺伝子、および複製開始点の異なる3種の大腸菌発現用の発現ベクターへと組むことに成功し、特定の遺伝子を強制的に発現させることを可能にした。これらの発現ベクターはすべて、特異的な配列を認識する制限酵素によって切断し、その大きさを計測することで正確に発現ベクターが構築されていることを確認した。こつぎに、構築した3種の発現ベクターをすべて、化合物生産用に開発された株である大腸菌BAP1株へと導入した。得られた形質転換体を培養し、コリバクチン生合成遺伝子の発現を誘導させようとしたが、形質転換前に比較して新規生産化合物を確認することはできなかった。その原因として本形質転換体の生育が著しく遅いことや、仮にコリバクチンを生産していたとしても、その生産化合物が生産者である形質転換体の生育を阻害していることが推測された。そこで、コリバクチンの生産を確認するべく、文献に従いHeLa細胞を用いた活性試験を行うこととした。その結果、多少ではあるが形質転換前に比較して細胞の核肥大等の特徴的な変化を観測することができた。近年の報告を参考に本結果について考察したところ、コリバクチン生合成遺伝子の発現量が多すぎる点や、発現量のバランスが悪いことが考えられた。そこで、本生合成遺伝子群中に存在する、転写因子ホモログに着目した。転写因子はその周囲にある遺伝子の発現を統制しているものであり、本転写因子の発現を促すことでコリバクチン生産能を覚醒することが可能であると期待した。まず、本転写因子について遺伝子情報より機能を推測すると、本因子はクオラムセンシングに関与するタイプであり、感染者である動物由来の動物ホルモンを感知し、毒性化合物の生産を促すタイプに当てはまることがわかった。そこで、本転写因子の発現および、転写因子の発現と動物ホルモンを添加する実験を行った。その結果、期待とは裏腹に新規化合物の生産を確認することはできなかった。現在、本化合物生産に関与する誘導剤の探索および転写制御に関する調査を行っている。

そこでClbN、ClbBの発現ベクターを作製し、これを用い大腸菌を形質転換した。得られた形質転換体の代謝産物をLCーMSに供した結果、ミリスチン酸、D-AsnおよびL-Ala縮合体の生成が観測された。本化合物はClbNとClbBのNRPSにより生合成されるものと予測され、ClbBのPKSによる代謝産物を確認することはできなかった。これはClbBのC末端にチオエステラーゼは存在せず、生合成中間体が切り出されなかったためと考えられた。そこで化学合成した推定生合成中間体を標品とし、ClbNとClbBの生合成産物を解析した。その結果、ClbNはN-myristoyl-D-asparagine (1)を生産していることが明らかとなった。次に、本化合物をClbBと反応させたところ、ClbB代謝産物は1とL-Alaおよびマロン酸縮合体(2)であることが特定された。続いて、2を基質に遺伝子クラスター内の各PKSと反応させたところ、新規代謝産物中間体を見いだすことに成功した。26年度が最終年度であるため、記入しない。研究対象化合物であるコリバクチンの巨大な生合成遺伝子群のクローニングに成功し、詳細な遺伝子実験を可能とした。また、本化合物の生産を生物活性試験によって確認することができた。コリバクチン生合成遺伝子群中に存在する転写因子の発現を促すことでコリバクチン生産能を覚醒することが可能であると考えている。本転写因子の適切な強制発現方法の探索、および転写因子に関与する動物ホルモン等の転写誘導剤の探索実験を行っている。これらは近年急速に発展しているバイオインフォマティックを駆使する。コリバクチンの生産量が増加したら、各種分離操作によって単離し、その化学構造を解明する。