hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
薬物代謝関連遺伝子の発現における転写後調節の役割

A-to-I RNA編集はRNA上のアデノシンがadenosine deaminase acting on RNA (ADAR) 1またはADAR2によってイノシンに置換される転写後修飾である。本研究では、RNA編集がヒトにおける薬物代謝関連遺伝子の発現と機能に与える影響を解明することを目的とした。分化型HepaRG細胞において、siRNA導入によるADAR1またはADAR2のタンパク質発現量の低下を確認した上で、主要薬物代謝酵素であるシトクロムP450 (CYP)の各分子種のmRNA発現量を評価した。ADAR1ノックダウンによってCYP3A4 mRNAの顕著な発現増加が認められたことから、CYP3A4はADAR1による強い負の発現制御を受けることが示された。ADARsノックダウンによるCYP3A4 mRNA安定性の変化は認められなかったことから、ADAR1はCYP3A4の発現を転写レベルで制御することが示された。CYP3A4の発現を転写レベルで正に制御することが知られている恒常的アンドロスタン受容体(CAR)のmRNAおよびタンパク質発現量がADAR1ノックダウンによって増加したことから、ADAR1がCARの発現を負に制御することがADAR1ノックダウンによるCYP3A4発現増加の一因である可能性が示唆された。また、この負の発現制御において、ADAR1がCAR mRNAのスプライシングを変化させている可能性が示唆された。以上より、RNA編集酵素ADARは主要薬物代謝酵素であるCYP分子種およびその発現を制御する転写因子であるCARの発現を制御することが示され、ヒトにおける薬物代謝制御におけるRNA編集の重要性について有用な知見を得ることが出来た。29年度が最終年度であるため、記入しない。葉酸代謝の鍵となる酵素であり、癌化学療法剤メトトレキサートの標的分子として知られているジヒドロ葉酸還元酵素(dihydrofolate reductase, DHFR)の発現がA-to-I RNA編集によって制御されているか検討した。ヒト乳がん由来細胞株において、DHFR 3'非翻訳領域上に26個のRNA編集サイトが存在することを見出した。RNA編集酵素ADAR1ノックダウンによりDHFR 3'非翻訳領域上のRNA編集レベルの低下とそれに伴うDHFR mRNAおよびタンパク質発現量の低下が認められたことから、DHFR発現はADAR1によるRNA編集によって正に制御されることが示された。インタクトな細胞では、DHFR mRNAはRNA編集によってmiR-25-3pとmiR-125a-3pによる発現抑制を回避するが、ADAR1をノックダウンするとRNA編集レベルの低下に伴いこれらのmiRNAsの認識配列が形成され、発現抑制を受けることを明らかにした。このRNA編集によるDHFRの発現制御機構は、乳がん細胞の増殖やメトトレキサートに対する感受性に影響を及ぼした。ADAR1発現量およびDHFR 3'-UTR上のRNA編集レベルは正常組織より乳がん組織において高いことを明らかにし、乳がん組織におけるRNA編集の亢進がDHFRの高発現につながる可能性を示した。以上より、DHFR発現制御においてRNA編集が重要な役割を有することを明らかにし、癌の進行や抗がん剤に対する耐性化メカニズムに対して新たな知見を与えることができた。RNA編集がヒト肝臓における薬物代謝能に影響を与えているか明らかにするために、ヒト肝由来細胞を用いて、ADARをノックダウンまたは過剰発現した時のCYPやグルクロン酸転移酵素の酵素活性評価を行う。加えて、RNA編集による薬物代謝関連遺伝子発現制御メカニズムの解明に向けて、RNA編集による翻訳タンパク質のアミノ酸置換やスプライシング異常、microRNAによる発現制御の変化に着目した検討を行う。
メラノーマに対する遺伝子改変iPS細胞由来M1マクロファージ療法の開発

B6マウスに同一の遺伝的背景を持つマウスメラノーマを播種させ、同系統のiPS細胞由来マクロファージ(iPS-MP)で治療する実験系を用いて、IL-15、OX40L、4-1BBLによる遺伝子改変、あるいはSTINGリガンドの付与による効果増強を検証した。IL-15、OX40、4-1BBL遺伝子改変を行なったiPS-MPは、遺伝子改変をおこなっていないiPS-MPよりも、有意に腫瘍の播種を抑制した。また、STINGリガンドの付与も同様の傾向を示した。iPS-MPのin vitroの解析としては、マクロファージとしての特性を確認するため、フローサイトメトリー解析による細胞表面分子の解析、サイトカインアレイを用いた解析等についての解析を行なった。また、OX40L、4-1BBLを強制発現させたときのiPS-MPの抗原提示能、T細胞活性化能をマウス体内でのin vivo primingの系で検証した。結果として、抗原特異的なキラーT細胞の増加、メモリーT細胞の増加を示すデータを得た。IL-15を導入したiPS-MPについては、in vivo primingの系において、NK細胞を活性化することを確認した。また、ヒトへ応用する前臨床研究として、iPS-MPの腫瘍化や自己免疫現象等の副作用発現がないか検証するために、B6マウスのiPS-MLにIL-15を遺伝子導入したもの、あるいは遺伝子導入していないiPS-MPを投与し、長期経過を観察した。予想通り、MHCが同じ、iPS-MPは腫瘍化する傾向を認めたが、allogenicなiPS-MPを用いれば、宿主の免疫によって徐々に排除され、腫瘍化しないことを確認した。また、このとき、各臓器に自己免疫現象も起きていないことを組織学的に確認した。計画した実験については、すべて進行中で、かつ結果も順調に得られている。上記の実験のうち、OX-40Lについてはとくに順調に進行し、論文投稿中である。IL-15および4-1BBLについても、論文作成中の段階である。現在、順調に計画は進捗しているため、このまま実験を継続する。IL-15、OX40L、4-1BBLに関する成果を論文化、学会発表へと持っていく。STINGリガンドを用いた実験系は、まだ解析すべき実験が多くのこっているが、このまま継続すれば、研究機関内には結果を得ることができると考えている。適正な研究費使用に努め、ほぼ予定通り研究に使用したが、603円という少額が残存した。これについては、翌年度の物品購入に使用する予定である。
ヒト染色体6qに存在する癌抑制遺伝子群の同定

6番染色体長腕の欠失はリンパ系造血器腫瘍で最も高頻度に観察される染色体異常の一つである。我々はこれまでにFISH法を用いた欠失解析によって、その標的遺伝子の候補の一つとしてBlimP1遺伝子を同定したが、6qには少なくとも6つの独立した欠失集積領域が確認されており、同領域には複数の癌抑制遺伝子の存在が想定される。そこで、本研究では、Blimp1の機能解析を進めるとともに、ゲノムアレイCGHを用いて網羅的に欠失領域の高解像度地図を作製することにより、6qの癌抑制遺伝子群を網羅的に同定することを計画した。(1)Blimp1の機能解析では、Blimp1のプロモーター領域のメチル化の解析により、本遺伝子の不活化がホモ接合性欠失や点突然変異のみでなく、CpGアイランドのメチル化によっても生ずることを明らかにするとともに、本蛋白が核内では二量体として存在し、300kDおよび350kDの蛋白と結合していることを明らかにした。また、Cre-LoxPシステムを用いたBlimP-1の条件的遺伝子欠損マウスの作成を行った。(2)CGHの基礎条件の検討とプローブDNAの調製6番染色体長腕の欠失はリンパ系造血器腫瘍で最も高頻度に観察される染色体異常の一つである。(2)CGHの基礎条件の検討とプローブDNAの調製
英文読解における関連性効果：タスクに応じた注意配分と記憶表象

本研究の目的は、日本人英語学習者の読解における関連性効果を検証することである。具体的には、読解前に与えるタスク教示と読解するテキスト情報との関連性に焦点を当て、英語学習者が(a)読解中にタスクに関連したテキスト情報に注意を向けることができるか、(b)関連情報を読解後に記憶することができるか、を明らかにする。今年度の研究では、英語学習者の読解において関連性効果は表れるのか、また学習者の英語熟達度によって関連性効果は異なるのかを明らかにするための実験を行った。日本人英語学習者である大学生を対象とし、テキスト中に含まれる特定の情報に注意を向けさせる「タスク条件」と内容理解を目的として読解させる「統制条件」にランダムに分け、条件に応じた教示を読解前に与えた。その後、実験用ソフトウェアSuperLabを用いて難易度の異なる2つの説明文をコンピュータ画面上に1文ずつ提示し、1文ごとの読解時間を測定した。読解後には、英文の内容について覚えていることをすべて書き出す筆記再生課題を課した。タスク条件と統制条件で読解時間と筆記再生率を比較した結果、関連情報の読解時間はタスク条件の方が統制条件よりも長く、また筆記再生率はタスク条件の方が統制条件に比べて高かった。これらの結果から、英語学習者の読解において、読解中のプロセスと読解後の記憶表象に関連性効果が表れることが示された。さらに、関連性効果はテキストの難易度や学習者の熟達度に影響を受ける可能性も示唆された。本研究は、英文読解における関連性効果に焦点を当てて、学習者・テキスト・タスクの相互作用を明らかにすることにより、英語学習者の読解プロセスとテキスト記憶を新たな観点から解明できるという点で学術的・教育的な意義があると考えられる。計画通り、学習者の英語熟達度と関連性効果の検証を行うことができた。具体的には、予備実験を含む複数の実験を通してデータ収集を行うことができ、国際学会におけるポスターセッションや投稿論文を通して成果を発表することができた。今後の研究では、1年目の研究で収集したデータの分析や考察を引き続き行っていくことに加えて、再読プロセスにおける関連性効果の検証にも取り組んでいく。具体的には、これまでの実験で使用した手法を応用し、1度目の読みと再読時の読みを比較することによって、英語学習者の読解中の注意資源の分配や読解後の記憶表象をさらに詳しく検証していく。1年目の研究で、英語学習者の読解において関連性効果が観察されたが、再読時には1度目とは異なる読解プロセスが観察されうる。先行研究に基づくと、再読時では(a) 1度目の読みよりも関連情報にさらに選択的に注意を向けるようになる、(b) 1度目の読みに比べて関連情報以外のテキスト情報にも注意を向けるようになる、などの複数の可能性が考えられる。また、1年目の研究で関連性効果に学習者要因やテキスト要因が関わっている可能性が示されたことから、今後もこれらの要因を考慮した研究デザイン立て、実験を実施する。

1年目の研究で、英語学習者の読解において関連性効果が観察されたが、再読時には1度目とは異なる読解プロセスが観察されうる。先行研究に基づくと、再読時では(a) 1度目の読みよりも関連情報にさらに選択的に注意を向けるようになる、(b) 1度目の読みに比べて関連情報以外のテキスト情報にも注意を向けるようになる、などの複数の可能性が考えられる。また、1年目の研究で関連性効果に学習者要因やテキスト要因が関わっている可能性が示されたことから、今後もこれらの要因を考慮した研究デザイン立て、実験を実施する。今年度実施した実験について、学習者の熟達度を要因として考慮するため、幅広い熟達度を持つ協力者のデータが必要であった。しかし、協力者としてリクルートできた学習者の熟達度のばらつきが想定よりも小さかったため、次年度に追加でデータを収集する必要性が生じた。そのため、追加で行う実験に伴う出張旅費や協力者の謝礼として助成金を使用する予定である。
ヒ素結合タンパク質のキャラクタリーゼーションと生体影響評価への応用

ヒ素をセファロースに固定したカラムを用いて、ヒ素に親和性の高いタンパク質を調べた。5価のヒ素には選択的に結合するタンパクは無かったものの、3価のヒ素に対していくつかのタンパク質は強い親和性を示した。次に、promyelocytic leukemia (PML)を発現している細胞より可溶性のタンパクを抽出し、ヒ素結合セファロースカラムを用いて、PMLのヒ素への結合能を調べた。PMLのシステインを多く含むRINGフィンガードメインに、ヒ素が3配位で結合するものと考えられた。ウェスタンブロットや蛍光免疫染色の結果から、ヒ素の曝露によりPMLにSUMO化が起きていることが確認された。ヒ素による井戸水・大気の汚染は、中国、インドやバングラディッシュなどの途上国で大きな環境問題となっており、世界で数千万人もの慢性ヒ素中毒疾患者がいると報告されている。3価のヒ素化合物は5価に比べて毒性が高いこと、有機ヒ素化合物の毒性は価数の違いにより、無機ヒ素の場合よりさらに大きく変化することなどが指摘されている。本研究では、ヒ素反応性タンパク質を包括的に調べ、そのキャラクタラリゼイーションを行うことにより、生体内におけるヒ素の標的分子と反応機構を明らかにすることにより、環境汚染物質であり、また前骨髄性白血病の治療薬としても実際用いられているヒ素化合物と、生体分子との反応性を直接調べることにより、環境毒性学と臨床応用の両面に資することを目的としている。まず、ヒ素化合物であるアニサリル酸をチオール化合物を用いて5価から3価へ還元し、さらにスペーサーを介してセファロースに固定化した。固定化されたヒ素を、プラズマ質量分析計を用いて測定し、結合したヒ素の含量測定を行った。HepG2細胞の細胞可溶性画分のタンパク質を用いて、担体に結合したヒ素とのアフィニティーを調べるとともに、グルタチオンやジチオスレイトールを用いて結合タンパク質の溶出条件を検討し、ヒ素結合タンパク質の溶出条件の検討を行った。ヒ素は代謝過程において、ヒ素メチル化酵素(AS3MT)と結合するものと考えられるが、AS3MT導入細胞を用いて細胞内のヒ素の動態について調べた。環境汚染物質であり、また前骨髄性白血病の治療薬としても実際用いられているヒ素化合物と、生体分子との反応性を直接調べることにより、環境毒性学と臨床応用の両面に資することを目的とし、ヒ素反応性タンパク質を包括的に調べた。その中でも、急性前骨髄性白血病の原因タンパク質の一つであるpromyelocytic leukemiaに注目して、ヒ素の白血病細胞に対する反応機序を考察した。また、そのため、ヒ素結合アフィニティークトマトグラフィーの確立に努めた。細胞の可溶性画分のタンパク質のうち、ヒ素に結合能の高いタンパク質をカラムに結合させたのち、40mMのグルタチオン溶液で溶出させた。ヒ素の蛋白への結合は、ヒ素のシステイン残基への求電子反応により起こるものと推定されるが、システインを含むタンパク質の中でも、RINGフィンガー構造を持ち亜ヒ酸の処置により高い治癒率を示す急性前骨髄性白血病の原因物質とも考えられているPMLにも注目して、本タンパク質を過剰発現させた細胞を作製し、ヒ素を曝露した細胞におけるPMLタンパク質へのヒ素の結合を調べた。各フラクションは溶出液を限外濾過膜で濃縮した後、電気泳動を行い、ウエスタンブロット後anti-PML抗体を用いて、ヒ素結合カラムからのPML溶出プロファイルを確認したものである。PMLはヒ素結合カラムに結合した後、過剰のグルタチオンにより溶出されていたことが明らかとなった。一方、PMLタンパク質を多く発現した細胞を0.1-30 μMの亜ヒ酸に曝露し、PMLの細胞内存在形態を蛍光免疫染色法を用いて調べるとともに、ウェスタンブロット法を用いて、PML蛋白の修飾について調べた。PMLはヒ素と結合した後に、不溶性が高まり、またSUMO蛋白により修飾を受けていることが分かった。CHO-K1細胞、ならびにC端にDDKタグがPML(variant 5)とともに安定に発現しているCHO-K1細胞(CHO-PML)を用いた。CHO-PMLは、リポフェクタミン(LTX)でPML遺伝子を導入した後、G418耐性細胞を選択し、PMLの発現は、ウェスタンブロット法を用いて調べた。また、細胞質と核におけるPMLの存在割合を調べるため、NE-PER Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagents (Pierce)を用いてタンパクを抽出した後、ウェスタンブロット法を用いて各分画のPML量を調べた。CHO-K1細胞、あるいはCHO-PML細胞に、0.5mMのBSOの存在、非存在下で亜ヒ酸(iAs3+)を最終濃度0-300 μMで添加し、24時間後の細胞生存率をWST-8法を用いて調べた。

また、これらの細胞を10 μMのiAs3+に1ー8時間暴露し、細胞層をHBSSで洗浄した後湿式灰化して、細胞に取込まれたヒ素の量をICP-MSを用いて定量した。一方、CHO-PML細胞を、3 μMあるいは30 μMのiAs3+に2時間暴露してPMLの免疫染色に供した。細胞を固定後、0.1%のTriton X-100で処理し、抗PML抗体、蛍光標識2次抗体で細胞を染色し、核をDAPIで対比染色した。PMLは、CHO-PML細胞においてもウェスタンブロット膜上に幾つかの異なる分子量のタンパクとして発現していた。また、タンパク質重量当たりでは細胞質より核に多く存在していることが確認されたが、免疫染色を施した細胞の蛍光顕微鏡を用いた観察においてもこのことが確認された。当初の計画では、ヒ素結合タンパク質を分離するための担体を作製することにあったが、アニサリル酸を用いて計画通りヒ素をつけた担体の作製に成功した。25年度が最終年度であるため、記入しない。国内外のヒ素に特化した学会発表に加え、海外誌に論文発表し高い評価を受けている。また、毒性関連の学会でも極めて注目を集めている。ヒ素に結合するタンパク質を調べる過程において、Promyelocytic Leukemia (PML)に存在するRING finger domainにシステイン残基が多く存在し、極めて強くヒ素と反応することを見いだし、PML分子とヒ素との反応性という観点から、非常に興味深い結論を導き出しつつある。これは、毒性学的見地から重要な発見であり、細胞内に取り込まれたヒ素の毒性発現機構を解明する上で鍵となるものと考えられる。また、細胞内のグルタチオンをbuthionine sulfoximineを用いて低下させた細胞を用いてヒ素の細胞毒性に関して研究を進めた点は、副次的成果ではあるが、ヒ素結合タンパク質のシステイン残基とグルタチオンのシステイン残基との競合反応を調べる上で重要な知見が得られたものと考えている。配列状近傍に複数のシステインを含むタンパク質の中でも、RING構造を持っており亜ヒ酸の処置で治癒率が高い急性前骨髄性白血病の原因物質とも考えられているタンパク質であるPMLにも注目して、本タンパク質を過剰発現させた細胞を作製し、ヒ素を曝露した細胞におけるPMLタンパク質へのヒ素の結合、ならびにヒ素を結合したPMLタンパク質の細胞内動態について調べる。Promyelocytic lukemia (PML)には、RING(Really Interesting New Gene)finger, B box, coiled-coilからなるRBCCモチーフが存在するが、RING fingerドメインには多くのシステインが互いに近傍となるように存在しており、ヒ素と結合のではないかとランが得られている。PMLを強制発現させた細胞では、三価の無機ヒ素がPMLに捕捉されるため細胞毒性が低くなることも予想されることから、今後の研究ではPMLの発現がiAs3+に対する感受性をどのように変調させるかどうかを明らかにする。
光学活性な金属錯体の単分子膜による光学活性の界面への集積と制御

平成6年度までに得られた結果により、単分子膜の挙動において不純物の与える効果が大変重大であるとの感触を申請者らは得ていた。そこで平成7年度以降の実験においては、合成した試料をすべて高速液体クロマトグラフによって精製し、さらにメンブレンフィルターによってダストを完全に除去することで再現性のある面厚-分子占有面積曲線を得ることができた。水面上に展開した金属錯体の単分子膜を圧縮-展開する過程を位相差顕微鏡によってin-situ観察したところ、β-ジケトンを配位子とするルテニウム(III)錯体のいくつかは界面上で極めて均一な分散状態と面圧存在下でのガラス状態との間で可逆的な変化を示すことが明らかになった。この結果は、典型的な両親媒性分子の多くが通常の測定温度では微結晶の集合体として振る舞うこととは対照的である。それらの単分子膜が相変化を示す面圧の前後で膜を基板に引き上げ原子間力顕微鏡(AFM)観察を行った。キラルな金属錯体で修飾した粘土鉱物HPLCカラムにより光学分割に成功した金属錯体についてラセミ混合物・エナンチオマーとの間でLB膜のAFM像を分子解像度で得ることに成功した。ラセミ混合物の膜といずれか一方のエナンチオマーだけからなる膜の間で分子のオーダリングが膜引き上げ時の圧力に応じて異なることがAFM像から明らかになった。現在、蛍光を示す金属錯体の光学分割を行い、光学収率の絶対値を決定するためにNMR測定を進めている。
新規高血圧関連遺伝子HCaRGは腎細胞癌の腫瘍形成を抑制する

高血圧症や糖尿病は臓器障害を引き起こすだけでなく、腎癌の独立した危険因子であることが報告されているが、その成因は明らかになっていない。HCaRGは腎尿細管に強く発現し、障害後の再生をコントロールしている。このHCaRGを高発現させた腎細胞癌細胞では、癌細胞の増殖が抑制され、プログラム細胞死が増加していた。この細胞をマウスの皮下に移植したところ、HCaRGは腫瘍の増大や血管新生を抑制した。高血圧病態下の腎臓は常にストレスを受けており修復のために常にHCaRGの発現が亢進している。しかし、HCaRGの発現が低下した場合には、HCaRGによる修復作用が失われ腎細胞癌のリスクが高まると考えられた。高血圧症は心血管系臓器障害や腎臓障害を引き起こすだけではなく、腎癌の独立した危険因子であることが報告されている。しかし、高血圧症が腎癌を引き起こす明確な成因は明らかになっていない。Hypertension-related, calcium-regulated gene (HCaRG/COMMD5)はヒト腎細胞癌で発現が低下しているだけではなく、腫瘍径が大きく予後不良であった患者の正常尿細管においても発現が低下していた。そこで、腎細胞癌におけるHCaRGの抗腫瘍効果を明らかにするために、HCaRGを高発現させた腎細胞癌細胞株・悪性黒色腫細胞株を用いて、HCaRGの細胞増殖や細胞死に与える影響について検討した。HCaRGの高発現は、ErbB受容体の発現を低下させ、その下流のRAS/MAPキナーゼやPI3キナーゼ/Akt/mTOR経路の活性化を抑制していることが分かった。そのために癌細胞の成熟化が促され、細胞周期が遅くなり細胞増殖が抑制されていた。また、細胞死に与える影響を調べたところ、アポトーシスには関与していなかったが、分裂期細胞死を伴ったネクローシスを介した細胞死を誘導していることも明らかになった。このHCaRG高発現腎細胞癌細胞をマウス皮下に同種移植したところ、HCaRGは生体内においても明らかに腫瘍の増大を抑制することが分かった。今後、これらの検体を用いて腫瘍血管新生や癌転移におけるHCaRGの働きを明らかにして行く予定である。しかし、何らかの原因でHCaRGの発現が低下した場合に、HCaRGによる細胞の修復が失われ腎障害や腎細胞癌のリスクが高まると考えられた。今後、尿細管のHCaRGの発現を改善させることで、高血圧症性腎障害や腎細胞癌の予防につながるのではないかと期待される。高血圧症や糖尿病などの生活習慣病は腎機能障害を引き起こすだけでなく、腎癌の独立した危険因子であることが報告されている。しかし、これらの生活習慣病が腎癌を引き起こす明確な成因は明らかになっていない。Hypertension-related, calcium-regulated gene (HCaRG/COMMD5)の発現が、正常尿細管において低下していた腎癌患者の腫瘍径は大きく、予測される予後も悪化していた。そこで、腎細胞癌に対するHCaRGの抗腫瘍効果を明らかにするためHCaRGを高発現させた腎細胞癌細胞株を用いて、腫瘍細胞の表現型、増殖、プログラム細胞死について検討した。HCaRGは、p21を介し腫瘍細胞の間葉上皮移行を促進した。その結果、細胞周期の進行が遅くなり増殖が抑制された。さらにHCaRGはアポトーシスに関与しないが、分裂期細胞死を伴ったネクロプトーシスを誘導することが分かった。このHCaRG高発現腎細胞癌細胞をマウスの皮下に同種移植したところ、HCaRGは生体内において腫瘍形成を抑制することが分かった。また、腫瘍内血管新生も抑制することが分かった。新しい腎癌治療法開発のための新たな分子標的探索のため、腫瘍形成に関わるシグナル伝達系の解析を進めた。HCaRGはEGFRのプロモーター領域のhypermethylationを介して、ErbB受容体の発現・活性化を低下させ、下流のRAS/MAPキナーゼやPI3キナーゼ/Akt/mTOR経路の活性化を抑制していることが分かった。高血圧や糖尿病病態下の腎臓は常に障害を受けており、このような腎蔵では尿細管修復のためにHCaRGの発現が亢進していると考えられる。しかし、遺伝的な要因や過度な障害でHCaRGの発現が低下した場合に、HCaRGによる尿細管上皮細胞の修復作用が失われ、不完全な細胞修復により慢性腎臓病や腎細胞癌のリスクが高まるのではないかと考えられた。今後、正常尿細管におけるHCaRGの発現を高めることで、腎障害や腎癌の新たな予防法につながるのではないかと期待される。腎臓病昨年度は、モントリオール大学付属

CHUM研究所の協力を得てHCaRG高発現癌細胞株細胞を用い、HCaRGの持つ癌細胞増殖抑制効果のメカニズムについて詳細に検討を行った。以前我々は、HCaRGは遺伝的高血圧ラットの腎尿細管に強く発現しており、急性腎障害後の尿細管上皮細胞においてp53経路とは独立したp21の発現を誘導し、虚血によって障害を受け脱分化した尿細管上皮の再分化を促進させ、腎機能障害や生存率を速やかに改善させることを報告している。今回の実験では、HCaRGは腎細胞癌においてErbB受容体のepigenetic gene silencingを促していた。ErbB受容体の発現が抑制されることで、その下流の情報伝達経路の活性化が抑制され、腫瘍増殖が抑制されていることが明らかになった。更に、アポトーシス介さない分裂期細胞死を伴ったネクローシスを介したプログラム細胞死を誘導していることも同時に明らかになった。HCaRG高発現腎細胞癌細胞をマウスの皮下に同種移植したモデルでは、癌細胞の増殖が抑制されているだけではなく、腫瘍血管新生も明らかに抑えられていることが分かった。これらの研究結果については、昨年度中に国内学会で発表を行い、現在専門誌に論文を投稿準備中である。本年度は、悪性黒色腫の癌細胞株を用いて、その他の癌でもHCaRGが抗腫瘍増殖効果を示すのかどうかを腎細胞癌モデルと同様の実験を通じて検証を行う予定である。また、癌細胞の特徴の一つでもある細胞浸潤、移動能の亢進についても検討を行う。培養細胞を用いた実験では、細胞移動について創傷治癒実験を、細胞浸潤についてマトリゲルチャンバーを用いて評価する。移動・浸潤時の細胞内シグナルを解析するため、HCaRGとアクチンなどの細胞移動に重要な働きをしている因子の抗体を用いて免疫染色を同時に行う。これらの実験によりHCaRGの腫瘍転移に与える影響を検討し、そのメカニズムを明らかにする。動物実験モデルとしてHCaRG高発現癌細胞株クローンをマウスの尾静脈より投与し、2週間後に肺の癌転移結節の数と大きさを顕微鏡下とスライド上で観察する。この実験によりHCaRGの癌転移に対する影響を生体内で明らかにする。さらに、本大学泌尿器科の協力を得て、ヒト腎細胞癌とその周辺の腎臓の組織における遺伝子発現を免疫染色法を用いて解析し、HCaRGと腎細胞癌、さらには腎臓病などの疾病とその発病リスクなどの関係を明らかにしていく予定である。最終的には、モントリオール大学から授受されたHCaRG高発現遺伝子改変マウスを用いて、鉄ニトリロ三酢酸の腹腔内反復投与などの方法で腎細胞癌の発癌誘導を行い、HCaRGの癌発生の予防効果を、動物モデルを用いて検証していく予定である。発生した次年度使用額内で購入可能な必須の使用予定物品が存在しなかったため。翌年度分として請求した助成金と合わせて、実験動物の購入や、ヒト腎細胞癌とその周辺の腎臓の組織を免疫染色法を用いて遺伝子発現解析をするために必要な消耗品などの購入に充てる予定である。
V字型の進行曲面波の漸近安定性

等速成長効果のある平均曲率流方程式においてV字型進行曲面波の安定性について得られた結果を報告いたします.方程式υ=H+kを全平面R^2で考える.ここで,υは曲面の法線方向の速度を表し,Hは曲率を表し,kは与えられた正の定数で,等速成長効果を表す.曲面がy=u(x, t)とグラフで表される場合に方程式はu_t=(1+u^2_x)^<-1>u_<xx>+k(1+u^2_x)^<1/2>となる.任意のc∈(k,+∞)に対しcを速度とするV字型進行曲面波とよばれる進行波のワンパラメータ族が存在することが従来より知られていた.この進行曲面波がどのような与えられた摂動(擾乱)に対し,漸近安定であるか,またそうでないかについて次の結果が得られた.比較定理により摂動が増大しないという意味での安定性については直ちにしたがう.摂動が時間とともに減衰するのかという漸近安定性については未知であった.本研究では,優解と劣解を構成することにより,与えられた摂動が遠方で減衰する場合に対して,V字型進行曲面波の漸近安定性を証明した.この優解は任意に大きく,また劣解は任意に小さくとることができるので,空間大域的に漸近安定であることがわかる.すなわち,どのような大きい摂動であってもそれが遠方で減衰するならば,V字型進行曲面波は元の形に復元される.また,与えられた摂動が減衰しない場合においては,適当な比較関数を構成することにより,漸近安定でない例を構成した.私は,研究課題「V字型進行曲面波の漸近安定性」について,2001年に,このような解が存在すること,速度を決めるごとにこのような解が一意であること,またその漸近安定性を示しました.漸近安定性については遠方で減衰する摂動に対してのみ示しています.一方,この条件をはずすと,さいしょに与えられた摂動が増幅しないが,時間とともに消滅することもない例,すなわち進行曲面波が漸近安定とならない摂動の例を構成しました.V字型進行曲面波を初等関数を用いてexplicitに表示することができ,これがある極限操作のもとに平均曲率流におけるGrim-Reaper解に収束することがわかりました.これらの結果については,別紙にある通り,国際学術雑誌Methods and Applications of Analysisに掲載受理されております.また口頭発表については,2001年7月11日から18日にカナダのBritish Columbia大学で行われた国際研究集会集会で発表し,つづいて,7月27日から31日にかけて同じくカナダのWestern Ontario大学で行われた国際研究集会でも発表しました.3週間ほどのカナダ滞在中,F.Hamel氏やH.Bcrestycki氏とディスカッションし情報交換を行いました.国内の発表については,10月3日より6日にかけて九州大学で行われた日本数学会秋季総合分科会において一般講演を行いました.また11月1日より2日に東北大学で行われました研究集会「仙台非線形偏微分方程式ワークショップ」においても結果を報告しました.東北大学の柳田先生や横浜市立大学の栄先生達とディスカッションさせていただきました.2002年についても引続き研究を進めて参ります.等速成長効果のある平均曲率流方程式においてV字型進行曲面波の安定性について得られた結果を報告いたします.方程式υ=H+kを全平面R^2で考える.ここで,υは曲面の法線方向の速度を表し,Hは曲率を表し,kは与えられた正の定数で,等速成長効果を表す.曲面がy=u(x, t)とグラフで表される場合に方程式はu_t=(1+u^2_x)^<-1>u_<xx>+k(1+u^2_x)^<1/2>となる.任意のc∈(k,+∞)に対しcを速度とするV字型進行曲面波とよばれる進行波のワンパラメータ族が存在することが従来より知られていた.この進行曲面波がどのような与えられた摂動(擾乱)に対し,漸近安定であるか,またそうでないかについて次の結果が得られた.比較定理により摂動が増大しないという意味での安定性については直ちにしたがう.摂動が時間とともに減衰するのかという漸近安定性については未知であった.本研究では,優解と劣解を構成することにより,与えられた摂動が遠方で減衰する場合に対して,V字型進行曲面波の漸近安定性を証明した.この優解は任意に大きく,また劣解は任意に小さくとることができるので,空間大域的に漸近安定であることがわかる.すなわち,どのような大きい摂動であってもそれが遠方で減衰するならば,V字型進行曲面波は元の形に復元される.また,与えられた摂動が減衰しない場合においては,適当な比較関数を構成することにより,漸近安定でない例を構成した.
映画における制作・保存・配給のインフラプラットフォームの構築

本研究の最終目的である、映画制作、アーカイブ、配給(配信)までの要素を統合したインフラプラットフォームの開発のための初期段階として、2005年の本研究科設立以来製作された映画のオリジナルデータ、映画に関わる資料データ等の整理を行った。また、各作品に関連する諸権利についても纏め、今後映画配信を行うにあたりクリアすべき権利問題について精査した。上記に加え、修了生たちの国際的な活躍に伴い、国内のみならず国外からも作品上映の希望が寄せられることが多くなったため、オンライン上での上映申請と映画のデジタルデータの受け渡しの実現に向けたシステムを手がけ始めた。この場合、上映許可に関するいちばん厄介な問題だと思われる権利処理についてもデータベースと連動するように進めている段階である本研究科設立以来、この13年間で製作された作品はかなりの数にのぼる。それらのオリジナルデータおよび作品制作に関連する情報をデータベース化できたのは、アーカイブの本格的なデジタル化に向けた大事な土台となるであろう。一方で、映画の上映・配信に付随する権利問題については、引き続き精査していく必要があり、より効率的な権利問題の解決に向けて、さらに研究を深めていきたいと考える。しかしながら、全体として、本研究の最終目標である、制作、アーカイブ、配給(配信)の3分野を統括した管理・運用システムの構築による新しい映画管理の提案が、上述した海外での上映等においても効果が期待できるのではないかと考え、国内だけにとどまらない国際的な視野においての映画・映像教育にも寄与できる可能性が出てきたため、現在までの達成度を“おおむね順調に進展している"と評価した次第である。今年度作成したデータベースの精度を高めると同時に、東京藝術大学のサイト上でアーカイブ検索等を試験的に実施する。それらの結果をもとに、さらに技術的な問題や内容を検証していく。また、上述したオンライン上映申請を始動させるために、この部分のシステムの構築を進める。日本語版の他に英語版を作成し、海外からの申請を容易にする。最終的にはあらゆるデータベースと連動し、効率的な申請・上映許可を目指し、作品のさらなる国内外での上映機会を増やす。映画配信の権利的問題点については、さらに精査し、著作権等をクリアにする工程を記録することで、ますます複雑になる権利処理について、次世代の映画・映像教育を受ける人たちの指針となるようにする。また、権利問題をクリアした作品を随時東京藝術大学のサイトを通じて試験的に配信し、技術的な検証を行うと同時に、研究成果を一般に還元していく。本研究科でこれまで製作された作品は上述したとおりかなりの数にのぼり、それらをデジタルデータとして保存するアーカイブ用のサーバ機器を購入する必要がある。また配給(配信)に伴う権利処理は煩雑で、かなりの人的労力が必要である。従って、データ管理およびシステム構築の人材に加え、権利処理を行う実務的人材も必要とする。データベースの精度を高めると同時に、各作品の権利処理を進めていく。その間に、本学のサイトを通じてネット配信を試験的に実施し、そのためのサーバを含めた技術的問題を随時解決していく。
バリアフリーを実現するCAPTCHAの開発

本研究では、人間の知覚に依存しないで認証を可能にするCAPTCHAを開発する。従来は主に人がもつ特定知覚を明示的に使用することにより、応答者が自動プログラムでは無いことを判別していた。一方で提案するCAPTCHAは人間がもつ文意文脈の理解能力に基づいた認証を行う。これにより、利用者は視覚や聴覚といった特定知覚に依存せずに認証でき、高齢者や身体障害者でも容易にかつ安全に利用できるバリアフリー型CAPTCHAの実現を目指す。
19世紀のアジアを描く英国人旅行家の旅行記とその旅に関する歴史地理学的研究

本研究では、19世紀の世界をリードした西欧の中でもとりわけ重要だった大英帝国の人々が行った旅や探険とその記録としての旅行記について、アジアに関するものに絞り、歴史地理学的観点を主軸に据えつつ、歴史学者や言語学者の参画も得て多面的に研究し、そのことを通して、未開拓のこの分野の研究の新たな地平を切り開く一歩にした。また、その成果を地理学のみならず歴史学や文学の世界にも提示して学問分野の枠組みを越えることの有効性を具体的に提示し、かつそれを一般社会にも還元することを試みた。このため、I英国人旅行家の旅と旅行記に関する研究、II英国人の旅と旅行記に関するフィールドワーク的研究、III旅のルートの地図・衛星画像上での復原、IV19世紀のアジアを描く英国人の旅行記文献目録編纂という枠組みで研究を進めた。Iでは、このような研究の出発点となるテキストの翻訳に力点を置く研究と、それ以外の理論的研究に分け、前者については最も重要かつ代表的な作品と目されるJourneys in Persia and Kurdistanについてそれを行い、後者については、最重要人物であるイザベラ・バードやその他の人々の日本・ペルシャ・チベット・シベリアへの旅と旅行記を対象に研究した。IIについては、イザベラ・バードの第IV期の作品であるJourneys in Persia and Kurdistanと、第V期の作品であるKorea & Her NeighboursおよびThe Yangtze Valley and Beyondを対象とし、このような研究が不可欠であり、旅行記の新しい読み方になることを明示した。またツイン・タイム・トラベル(Twin Time Travel)という新しい旅の形の重要性を提示し、社会的関心を惹起した。IIIでは縮尺10万分の1という従来例のない精度でバードの揚子江流域の旅のルートを復原すると共に、この種の研究に衛星画像の分析を生かすことができる可能性を西アジアについて示した。また今後の研究に必須の財産となる目録を編纂した(IV)。8人のメンバーのうち、金坂、秋山、勝田の3名はそれぞれ中国長江流域、チベット、トルコにおいて、19世紀英国人旅行家の旅の跡を追跡すると共に、現地での資料収集に努めた。また全員が担当地域の旅行記に関する情報の収集に努め、データベース作成を進めた。その際、地図資料の活用に留意した。また、天野と山田は研究分担地域に関する情報収集を東京において行い、小方は研究対象地域に関する衛星画像データを用いた旅行記の分析を進めた。金坂は19世紀英国を代表するイザベラ・バードの第V期の旅が大英帝国と密接に結びつくものであったとの新説を論文として発表した他、彼女の旅行記The Yang-tze Valley and Beyondの翻訳書における詳しい解説(第2巻369401頁)の中でもこのことを論じた。3月16日には本年度の各人の研究実績の報告会を研究会をかねて京都大学大学院人間・環境学研究科で行なった。地理学を主とする学際的な調査組織である利点を率直な議論を通して生かすことができた。勝田は『オスマン語文法読本』を刊行したが、この仕事は19世紀のトルコの旅行記を解読していく上でも有用である。また金坂はイザベラ・バードの旅行記『中国奥地紀行1.2』を翻訳したが、ヴィクトリア時代の英国人旅行家の旅行記の最重要作品の1つと目されかつ、彼女の旅行記(著書)最後の作品であるが故に、一定の社会的貢献を果たすと考えられる。

メンバーのうち金坂は、昨年度に行ったトルコ東部のイザベラ・バードの旅に関する歴史地理学的調査の取り纏めを進め7月の研究会で成果の一端を報告するとともに、バードの中国東北部の旅に関する同様の調査を11月に藩陽(旧奉天)と北京において、現地関係者の協力も得て行い、その成果の取り纏めを進め、さらには研究全体に関わる資料の収集に努めた。また天野は、煙台・大連・営口・藩陽において、またソウルおよび北朝鮮国境地域の坡州において同様の調査をバードの旅に即して実施し、金坂が提示する新しい旅の概念「ツイン・タイム・トラベル」の有効性を確認し、その成果の一端を3月の研究会で詳細に報告した。秋山は昨年度チベットで行った現地調査を踏まえて、チベットに関連する資料の整理を進めるとともに、チベットに関する英国人の旅行記についての文献調査を行った。山田はシベリアヘの英国人旅行家の旅行記の書誌的分析を北海道大学などの所蔵資料を用いて行い、その成果を3月の研究会で報告した。他方、西アジアについては、まず、新谷が英国人旅行家のトルコ・ペルシャの旅と旅行記に関する資料を収集するとともに、バードの『ペルシャ・クルディスタン紀行』の分析と翻訳を試み、勝田は昨年度に実施したトルコ東部のツイン・タイム・トラベル的調査およびその際に収集したトルコ語関係資料に基づき、バードの上記旅行記の該当箇所の検証と翻訳作業を進めた。これに対して、坂本は中東イスラム世界に関わった英国人に関する検討と、本研究課題にとって最も重要な人物でありながら従来日本における研究の乏しいカーゾン,G.N.の旅と旅行記に関する研究を進め、その成果の一端を3月の研究会で報告した。小方はベル,B.の旅行記に記されたシリアの都市遺跡の衛星画像分析と対応させた考察を昨年度に引き続き進めた。このように各人が、全体として多面的でシステマティックな研究の完成に至ることを明確に意識して研究を進め、その成果と課題を2回の研究会で確認し、報告書の構成についても骨格を固めた。15年度末に全員が集まって行った研究集会の折に打合せた方向に沿って各自研究を進め、2004年にその成果を持ち寄っての研究集会を開き、成果報告書作成のための最終打ち合せを行った。研究実績の概要は以下の通りである。まず金坂は、19世紀英国人旅行家の旅行記のデータベース化を進める一方、2004年10月がイザベラ・バードの没後100年になることに鑑み、彼女の日本の旅に関する新しい知見を新聞に連載した。また、本研究が金坂が生み出し注目されつつあるツイン・タイム・トラベルという概念の有効性を他の旅行記や旅行家にも適応できることを雑誌に発表した。さらに、金坂が本科研をも利用して撮影してきた写真を集めた写真展「イザベラ・バードの旅の世界の今」を開催すると共に、山形県と平取町の主催でも開催してもらえ、社会的反響を呼ぶことができた。研究成果の社会への還元はNHKテレビの放送を通じても行った。次に、坂本はバードやカーゾンの旅行記の歴史学的分析のためにトルコに赴き、その成果を研究会で発表すると共に研究成果報告書の執筆を進めた。
中国の統治における広域行政区画の出現

2006年8月27日から9月7日、中国山西・陜西省(山西省:永済、河津、稷山、新絳、万栄、禹門、陜西省:韓城、〓陽、西安)で調査を行った。その目的は(1)中国河東地方の地形調査(2)宋・金・元代碑刻史料調査である。(1)に関して、文書行政がどのような環境・現実下で行われたのかが大きな問題点としてあり、現地でのフィールドワークを遂行し「文書行政」という言葉の裏に存在した現実を確認し、文書行政・地理環境・行政区画の関係を考察した。(2)に関して、従来1013世紀に勃興した王朝は「南流」(北宋-南宋-元朝)と「北流」(北宋-金朝-元朝)とに分断され別個の歴史世界として考察されてきた。本研究では北宋に広域区画路が地方統治の要となり中央の王朝交代に揺るがない地方行政体制が形成され、その結果が「南流」と「北流」双方の前提となったことを挙げ、分断された歴史世界を共通の次元で考察する視座を得た。しかし、金元代は文献史料が少なく、またそれを補う石刻史料も清朝金石学において等閑視されているため、この調査により「北流」世界の考察のための基礎的研究を進めた。また、制度史的観点から宋代の広域行政区画を考察した成果は、2006年8月23日に中国上海で開催された国際学会で発表する機会を得、海外の研究者から多くの意見を聞くことができた。2007年1月4日から11日、中国河南省(鄭州市・新郷市・滑県・登封県)で調査を行った。目的は黄河周辺の地理的環境と宋代行政区画との相関の調査である。この地域は宋代には黄河河道において最も狭隘な地形で、黄河の氾濫が頻発し河道の変化も度々起こった。そのため所属する行政区画(路)は度々変更された。また、滑州を巡り、堤防決壊時という緊急時における行政手続きが議論されている。その地域に実際に赴き、文書処理という行政手続き問題の根に当地の地理的環境という具体的な現実問題が存在したことを確認した。2005年6月26日から7月1日に宋朝の北辺国境地帯であった中国河北(正定、雄県、鄭州鎮、覇州)を調査した。鄭州鎮には宋代城壁跡が残存し天然の要害が無い河北方面における当時の辺境防備のあり方を実見した。これを以前に調査した陝西の地形と対比させ、宋代の最重要案件であった辺境防備という側面から地域差を確認。これは現実の地域差と全国一律に制定される制度としての行政区画との関係の問題を考える上で重要である。この知見は早稲田大学宋代史ゼミナール「『俄蔵黒水城文献』宋西北辺境軍政文書裁判案件訳注稿(III)」(『史滴』27、2005)の調査記に活かされている。また、中国史上に広域行政区画が出現する大きな原因の一つとして挙げている中央と地方の文書管理について火災・戦火による文書消失後の復元過程から考察を進めた。中央の文書を復元する際、北宋中期は各州から文書を直接収集したが、南宋初期には州より広範な区域を管轄する路から文書を収集した。これは監察区として成立した路が北宋後半から南宋にかけて文書管理機能を拡充させ、行政区画として役割を果たせる基盤を得たことを背景とした。従来路の権限は縮小するとされたが、文書管理の側面から言えば権限は増し、中央にかかる文書処理の負担を軽減させた。その結果として、北宋の都であり、かつ当時の文書管理センターであった開封が金軍によって占拠された後も、宋朝ほ完全瓦解することなく路の文書管理機能を利用し南宋としての統治を可能とした。この知見は2005年度宋代史研究会で口頭発表(「宋代文書行政における危機管理」)した。北京大学図書館、国家図書館で地方史を中心として資料の収集整理を進めた。11月には河南地方(鄭州、開封、許昌)へ赴き石碑の残存状況を中心に調査した。これは金朝統治下における旧北宋領において中央と地方の関係を石碑に記された文書の動きから検討するためである。

しかし、金元代は文献史料が少なく、またそれを補う石刻史料も清朝金石学において等閑視されているため、この調査により「北流」世界の考察のための基礎的研究を進めた。また、制度史的観点から宋代の広域行政区画を考察した成果は、2006年8月23日に中国上海で開催された国際学会で発表する機会を得、海外の研究者から多くの意見を聞くことができた。2007年1月4日から11日、中国河南省(鄭州市・新郷市・滑県・登封県)で調査を行った。目的は黄河周辺の地理的環境と宋代行政区画との相関の調査である。この地域は宋代には黄河河道において最も狭隘な地形で、黄河の氾濫が頻発し河道の変化も度々起こった。そのため所属する行政区画(路)は度々変更された。また、滑州を巡り、堤防決壊時という緊急時における行政手続きが議論されている。その地域に実際に赴き、文書処理という行政手続き問題の根に当地の地理的環境という具体的な現実問題が存在したことを確認した。
トランスポゾンを用いた慢性肉芽腫症に対する新たな遺伝子治療の開発

CYBB遺伝子変異のある慢性肉芽腫患者T細胞にセンダイウイルスを用いてOct3/4, Sox2, Klf4, c-Mycを導入しiPS細胞の樹立に成功した。さらに、PiggyBacトランスポゾンを用いて患者T細胞へCYBB遺伝子を導入し、同様の方法でiPS細胞の樹立に成功した。樹立したiPS細胞の多能性幹細胞マーカーの発現と免疫不全マウスへの移植によりテラトーマ形成能が確認できた。AGM-3細胞株細胞と共培養により単球、好中球へ分化誘導に成功したが、活性酸素産生は確認できなかった。以上からこの方法によって遺伝子改変したiPS細胞は目的遺伝子発現を維持することが困難であることが示唆された。PiggyBacトランスポゾン法を用いて、慢性肉芽腫症患者末梢血T細胞へ目的遺伝子遺伝子を導入し、T細胞の遺伝子改変を行った。薬剤にて遺伝子導入された細胞を選択しセンダイウイルスを用いてiPS細胞への誘導を行った。50個以上のES細胞様コロニーが出現し、それらのコロニーは遺伝子導入されていることを確認した。しかし改変T細胞由来のiPS細胞から顆粒球への分化誘導を行ったが、目的蛋白の発現、活性酸素産生能の回復を認めなかった。原因として目的遺伝子発現のCMV promoterがサイレンシングされた可能性があり、幹細胞での発現のよいEF1-αpromoteへ変更した。まずサイレンシングの有無を確認するためGreen Fluorescent Protein(GFP )を目的遺伝子として導入し、T細胞の遺伝改変を行い、センダイウイルスを用いてiPS細胞へ誘導を行った。GFP発現のあるiPS細胞様コロニーが出現したが、2ー3継代でその発現は消失し、目的遺伝子発現を維持することが困難であることが判明した。PiggyBacトランスポゾン法を用いて、慢性肉芽腫症患者末梢血T細胞へ目的遺伝子を導入し、T細胞の遺伝子改変を行った。薬剤にて遺伝子導入された細胞を選択肢しセンダイウイルスを用いてiPS細胞への誘導を行った。平成24年度は慢性肉芽腫症患者由来iPS細胞の樹立、樹立したiPS細胞から血球系への分化誘導、さらにPiggyBacトランスポゾン法を用いて、患者末梢血T細胞の遺伝子改変、改変細胞からのiPS細胞樹立までを実施した。しかし目的遺伝子の発現がなく、研究の進行は一旦遅れた。しかしpromoterのサイレンシングが原因と判明し、promoterを変更して研究を進めており、おおむね順調であると判断できる。改変T細胞由来のiPS細胞から顆粒球への分化誘導を行ったが、目的蛋白の発現、活性酸素産生能の回復を認めなかった。原因として目的遺伝子発現のCMV promoterがサイレンシングされた可能性があり、幹細胞での発現のよいEF1-αへの変更を行い、研究を進行していく。1) iPS細胞から誘導されるCD45陽性細胞をマグネットビーズで選択的に採取し、CD34, CD38, CD33, c-kitなどの造血幹細胞・前駆細胞に発現している表面マーカーをフローサイトメトリーで解析する。また、CD45陽性細胞からメチルセルロースによるコロニー形成能を調べる。2)CD45陽性細胞やCD34陽性・CD45陽性細胞をNOGマウスへ移植し、経時的に血液学的所見を確認する。また、修復iPS細胞好中球由来の活性酸素産生能を未修復iPS細胞由来好中球と比較する。3)遺伝子治療で白血病発症に至ったX-SCID、X-CGDではそれぞれRVベクターがLIM-only protein 2, MDS1-EVI1に挿入されたことが発癌に関与していた。このため、トランスポゾンベクターがこれらの領域に挿入されていないことを確認する。また、トランスポゾンベクターの癌原遺伝子内あるいはその近傍への挿入頻度をRVとランダムコントロールと比較する。4) CYBBトランスポゾンベクターにIRESを挟んで自殺遺伝子TSV-TKを挿入したベクターを作成する。このベクターを用いてiPS細胞の樹立と血液細胞への分化を図る。In vitroの系と、NOGマウスの移植の系でガンシクロビル投与により細胞死の誘導を確認する。平成24年度は遺伝子改変したiPS細胞からの血球で目的蛋白の発現を認めなく、原因解明のための研究の遅れと購入物品の納品日が次年度となったことにより、前年度未使用額が生じた。原因が解明したことで、さらにiPS細胞を樹立する予定である。そのためのiPS細胞作製用センダウイルスベクターキット、サブクローニング用試薬類、遺伝子導入試薬が必要となる。

PCR関連試薬(200)、iPS細胞培養培(300)、iPS細胞フィーダー細胞(200)、サイトカイン(200)、抗体(300)、CD34陽性細胞採取キット(200)、NOGマウス購入費(200)、調査研究旅行費、発表成果等(150)、投稿料(100)(千円)
多糖の構造制御合成とその分子生体機能

1多糖の構造制御合成とそれを利用した両親媒性ブロック共重合体の合成(1)3(e), 4(a)-ビス(ベンジルオキシ)-6, 8-ジオキサビシクロ〔3.2.1〕オクタンの開環重合を適切な条件下で行うことにより, 4-デオキシー(1→6)-α-DL-タボピラナンと4-デオキシー(1→6)-β-リボピラナンとを作り分けることに成功した.(2)1, 6-アンヒドロー2, 3, 4-トリーO-ベンジルーβ-D-グルコースの開環重合により,還元性末端に反応性塩素を有する(1→6)-α-D-グルカン誘導体を合成した.これを高分子開始剤として用いて, 6, 8-ジオキサビシクロ[3.2.1]オクタンを重合したのち保護基をはずし,親水性の(1→6)-α-D-グルカンと疎水性の多糖骨格構造とから成る両親媒性ブロック共重合体を得た.2糖質重合体の構造制御合成とその細胞培養材料としての応用(1)芳香環にクラフトースを導入したスチレンの重合体を合成し,その肝細胞接着特性を詳細に調べた.コラーゲンやフィブロネクチンなどの生体材料と比較して,ラクトース置換スチレン重合体の場合には,肝細胞の脱吸着を温和な条件で容易に制御できるので,肝細胞の保存・運搬用の材料としての応用が可能になった.(2)分子認識マーカとして機能するガラクトース糖鎖を側鎖にもつポリペプチドと分枝多糖を合成した.前者はポリグルタミン酸活性化エステルへの高分子反応,後者は無水糖誘導体の開環重合によって得た.また,隣接基関与による立体制御を応用して無水糖誘導体の開環重合を行い, (1→6)-β-D-ガラクトピラナンを合成した.1多糖の構造制御合成とそれを利用した両親媒性ブロック共重合体の合成(1)3(e), 4(a)-ビス(ベンジルオキシ)-6, 8-ジオキサビシクロ〔3.2.1〕オクタンの開環重合を適切な条件下で行うことにより, 4-デオキシー(1→6)-α-DL-タボピラナンと4-デオキシー(1→6)-β-リボピラナンとを作り分けることに成功した.(2)1, 6-アンヒドロー2, 3, 4-トリーO-ベンジルーβ-D-グルコースの開環重合により,還元性末端に反応性塩素を有する(1→6)-α-D-グルカン誘導体を合成した.これを高分子開始剤として用いて, 6, 8-ジオキサビシクロ[3.2.1]オクタンを重合したのち保護基をはずし,親水性の(1→6)-α-D-グルカンと疎水性の多糖骨格構造とから成る両親媒性ブロック共重合体を得た.2糖質重合体の構造制御合成とその細胞培養材料としての応用(1)芳香環にクラフトースを導入したスチレンの重合体を合成し,その肝細胞接着特性を詳細に調べた.コラーゲンやフィブロネクチンなどの生体材料と比較して,ラクトース置換スチレン重合体の場合には,肝細胞の脱吸着を温和な条件で容易に制御できるので,肝細胞の保存・運搬用の材料としての応用が可能になった.(2)分子認識マーカとして機能するガラクトース糖鎖を側鎖にもつポリペプチドと分枝多糖を合成した.前者はポリグルタミン酸活性化エステルへの高分子反応,後者は無水糖誘導体の開環重合によって得た.また,隣接基関与による立体制御を応用して無水糖誘導体の開環重合を行い, (1→6)-β-D-ガラクトピラナンを合成した.