hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
極低温・超高分解能レーザー光電子分光の開発と低温超伝導体の超伝導機構の解明

世界の追随を許さない最低温度と最高分解能の未踏性能を持つヘリウム3クライオスタット搭載型の角度分解光電子分光装置を開発し、エキゾチック低温超伝導体の機構解明に取り組んだ。我々は、1K以下の試料部到達温度を達成し、また、光電子アナライザーとsCMOS型検知器システムを連動制御するソフトウェアを開発することで、高速フレームレート測定を可能とした。本研究により、世界で初めて、鉄系超伝導体がトポロジカル超伝導を示すことを実証した。更に、バルク超伝導体上に薄膜成長させたトポロジカル物質において、近接効果由来の超伝導ギャップがスピン偏極バンドに開く観察に成功した。本プロジェクトでは、試料部最低到達温度500mK、及びエネルギー分解能50μeVという前例にはない性能を持つ角度分解光電子分光装置を開発する。H25年度は、新装置開発の指針となる全システムの設計図を完成させた。プロジェクト成功への鍵となる主要パーツは以下の3つで、それぞれ極限的性能が求められる。(1)ヘリウム3クライオスタット:熱負荷の無い状況下で300mKの冷却性能を基本として、現実的熱負荷条件下(約10meV)で、500mKの到達温度を達成可能な冷却機構を設計。(2)光電子アナライザー:光電子スリットに対して垂直方向に飛び出す光電子をも収集し、運動量空間イメージング技術の劇的な高度化をもたらす新型電子レンズを搭載する。また、その性能を最大限に発揮する検知器を選定すると共に、電子レンズ制御とそれをリンクするソフトウェアの開発。(3)磁気シールド搭載真空チャンバー:目標となる分解能を達成する上で、低エネルギーレーザー光源の活用が不可欠であるが、その代償として、固体内から飛び出す光電子の運動エネルギーが低くなり、外部磁場に対して極めて敏感な光電子観測を求められる。我々は、試料チャンバー内への地磁気の混入を極限まで防ぐため、チャンバー内部に搭載するミューメタルシールドの設計を見直し改良。以上のような装置開発が着実に推進する中、H25年度の経費で購入した主な物品は上記(3)の磁気シールド搭載真空チャンバーである。ガウスメーターによる性能試験から、試料部における内部磁場は地磁気(約0.5G)の1万分の1程度であり、侵入磁場をほぼ完全にシャットアウトすることに成功した。そのほかにも、超高真空を作り出すポンプシステムの導入と、次年度に開発予定のヘリウム3クライオスタットを搭載可能な駆動ステージ一式、及びその冷媒となるヘリウム3ガスを購入した。本研究では、世界の追随を許さない測定温度500mK、最高分解能50μeVの未踏性能を持つヘリウム3クライオスタット搭載型の角度分解光電子分光装置を開発し、エキゾチック低温超伝導体が持つ超伝導ギャップの直接観測を通して、超伝導転移温度の飛躍的向上への指針確立を目指す。プロジェクト成功への鍵となる主要パーツは、ヘリウム3クライオスタット、光電子アナライザー、磁気シールド搭載真空チャンバーであり、全てにおいて極限的性能が求められる。H26年度で購入した主な物品はヘリウム3クライオスタットであり、以下の高性能の達成に成功した。現実的な熱負荷条件下(約10mW)で500mKの到達温度を達成可能な冷却機構を設計した。実験の結果、最低到達温度として480mKを得ることが出来た。また、900mkで冷却能力、約20Wが達成できている。光電子分光測定では、試料に光を照射し、真空中へ放射される光電子を観測する。外部からの熱の侵入を妨げるために入射光と光電子用の窓を設置し、それらをとおして入り込む外部からの熱輻射が試料の冷却を妨げる。そのために多段のサーマルシールドを装備させた。また、室温と接するクライオスタット最先端部からの熱伝導も考慮する必要がある。そのため、理論値に基づきマニュピュレータの長さを選定し、また、ヘリウム4の液体貯蔵タンクからの冷媒を供給することで外部熱伝導を極力抑えた。高性能光電子分光器は当初予定ではH27年度に購入予定であったが、計画が予定以上に進んだために、H26年度に予算の前倒しを行い、研究の加速を計画した。しかし、より高分解能を目指すためにより高度な技術開発を行う事とした。そのために、H27年度に予算の繰越を行った(前倒しのうえ、その繰越を行ったために、結果的に当初予定どおりのH27年度納入になったので、計画の遅れはない)。装置開発を掲げる本プロジェクトにおいて最重要となる装置全体を俯瞰する設計図がキックオフ初年度の早い段階で完成ている。また、具体的装置性能を掲げた上で、各主要パーツの極限的性能の達成へ向けて、同時並行的に開発をスタートできた。磁気シールド搭載真空チャンバーの設計及び開発は当初の計画通りに推進でき、それを具現化した実際の性能特性は予想を遥かに上回った。ヘリウム3クライオスタットでは、ヘリウム4液体で満たす1Kポットを通過して先に伸び、ヘリウム3ガスの流れ道となるキャピラリーの最適化を繰り返すことで、設計にほぼ近い冷却能力を達成できている。一方、光電子アナライザーの設計に関しては、半球型アナライザー内に設置された光電子が飛び込むスリットへのコーティング技術を改善することで、角度分解光電子分光イメージングに更なる信頼性をもたらした。更に、高分解能を目指して高分解能検知器の綿密な設計を行った(実際の購入はH27年度)。

以上のことから、極低温・超高分解能レーザー光電子分光の実現に向けて、各々の主要パーツでは、当初設定目標を上回る極限化が進んでおり、本プロジェクトは今後、予想以上の成果が見込まれる。本研究では、世界の追随を許さない測定温度500mK、最高分解能50μeVの未踏性能を持つヘリウム3クライオスタット搭載型の角度分解光電子分光装置を開発し、エキゾチック低温超伝導体が持つ超伝導ギャップの直接観測を通して、超伝導転移温度の飛躍的向上への指針確立を目指す。プロジェクト成功への鍵となる主要パーツは、ヘリウム3クライオスタット、光電子アナライザー、磁気シールド搭載真空チャンバーである。H27年度の経費で購入した主な物品はそのうちの超高分解能光電子分光器(H26年度の繰越)であり、以下の極限性能の達成に成功した。アナライザー内に設置される光電子スリットに対し、垂直方向に飛び込む光電子をも収集し、試料を固定したままでの運動量空間イメージングを実現する新型電子レンズを搭載した。50μeVの分解能を達成するために、光電子分光器スリットのコーティング、光電子分光器の静電半球のコーティングを綿密に行う事により、高分解能が達成することが明らかになった。また、その性能を最大限に発揮する検知器を選定すると共に、電子レンズ制御とそれをリンクするソフトウェアを共同開発した。より具体的には、先進性を加味して、従来のCCDカメラではなく、超高分解能sCMOSカメラを検知器として導入し、さらにはペルチェ冷却をも整備した。これにより、暗電流と読み取りノイズを極限まで切り捨てた、高速フレームレート光電子カウンティングシステムが構築でき、解像度20μeVクラスでの測定技術を確立することが出来た。なお、高性能光電子分光器は当初予定ではH27年度に購入予定であったが、H26年度に予算の前倒しによる研究の加速を計画した。しかし、高分解能を目指し、高度な技術開発を行う事うために、H27年度に予算の繰越を行った(結果的に当初予定どおりのH27年度納入になったので、計画の遅れはない)。装置開発を掲げる本プロジェクトにおいて最重要となる装置全体を俯瞰する設計図がキックオフ初年度の早い段階で完成している。また、具体的装置性能を掲げた上で、各主要パーツの極限的性能の達成へ向けて、同時並行的に開発をスタートできた。磁気シールド搭載真空チャンバーの設計及び開発は当初の計画通りに推進でき、それを具現化した実際の性能特性は予想を遥かに上回った。ヘリウム3クライオスタットでは、ヘリウム4液体で満たす1Kポットを通過して先に伸び、ヘリウム3ガスの流れ道となるキャピラリーの最適化を繰り返すことで、設計にほぼ近い冷却能力を達成できている。一方、光電子分光器の分解能を上げるために、スリットと、静電半球のコーティングの均一性が大事であることを明らかにした。更に、光電子分光器の高分解能に対応する検知器とソフトウェア開発では、従来のCCDカメラよりも、感度、角度解像度、エネルギー解像度、及びフレーム率の主要項目全てにおいて劇的な改善をもたらすsCMOSカメラの導入した。その上で、光電子画像処理の高速化を成し遂げることで、極限的エネルギー分解能測定を実現しうる装置環境を整えた。光電子アナライザーに関しては、半球型アナライザー内に設置された電子レンズの調整を進めることにより、角度分解光電子分光イメージングに更なる信頼性をもたらした。
薄膜とクラスターの表面反応過程

クラスター・超微粒子になると体積に比べて表面の割合が増し、反応性が高まる。微粒子独特の構造・形態および盛んにおこる接合成長も、0次元物質の特性を示している。微粒子と薄膜の反応法では微粒子の形態変化を調べることによって,拡散の方向が分かり,回折パターンの解析により生成物が分かる。CuがSe固体中を拡散することは実験的にも電子状態による理論的解析からも良く知られている。拡散の方向が変化することをCu film-Se粒子によるモデル実験により、初めて明らかにした。銅膜は真空蒸発法による多結晶薄膜およびエピタクシャル成長した単結晶薄膜を用いた。ガス中蒸発法によりセレン超微粒子を作った。セレン粒子のサイズは我々の提案した二段ボ-ト法を使用し,10nmから500nmのサイズの粒子を銅膜上に乗せた。セレン粒子は球状で非晶質である。サイズ500nmオーダーの粒子を置くと,銅がセレン中を拡散して,セレン粒子からセレン化銅がウニのように成長した。これは銅の拡散が支配的であることを示している。100nmオーダーの粒子の際にはセレンの球状粒子の形が多面体に変化し,銅セレン化した。これは銅とセレンの相互拡散が起こっていることを示している。大きさ20nm以下のセレン粒子を置くと,セレンが銅膜の表面を拡散して,セレン粒子よりも大きい範囲にわたって銅過剰のセレン化物が生成した。これは粒子サイズにより拡散方向が異なることを見事に示している。ナノ構造になると異なる現象がみられたことを示しており,今後の重要な展開分野となる。Sb-SeおよびSi-C,C-SiO系でも新事実が出てきつつある。
Cu,Zn-スーパーオキサイドディスムターゼの変異と筋萎縮性側索硬化症

遺伝性の筋萎縮性側索硬化症(ALS)の患者ではCu,Zu-SOD遺伝子(SOD1)に変異をが報告されているが、日本人の2家系に新しい遺伝子変異を見い出した。しかし、SOD1に変異をもつALSの患者では、赤血球中のSOD活性が低下しているが、それが変異酵素の比活性の低下によるものか、それとも酵素の不安定さを反映した結果なのか明らかではなかった。そこで、この点を明確にするために哺乳動物により近い昆虫細胞にバキュロウイルスベクターを用いて遺伝子導入し、発現されたリコンビナントSODの酵素学的性質を調べた。野生型Cu,Zu-SODをまず発現させたところ、大量のタンパク質の産生が認められたものの活性は検出できなかった。しかし、培地にCuを添加することによって酵素活性の回復が認められた。この産生系では昆虫細胞中の可溶性タンパク質の約1/3がCu,Zu-SODとなるため、産生されたリコンビナント酵素をイオン交換とゲルろ過カラムによって容易に精製できた。同様にして三種類の変異Cu,Zu-SODを発現させ精製したところ、Gly^<41>→Asp、His^<43>→Argはそれぞれ正常の約47%と66%の活性を示し、Gly^<85>→Argでほぼ100%の活性を有していた。さらに精製酵素を用いて、活性低下の原因が酵素の安定性の低下を反映していることを明らかにした。こうしたCu,Zu-SODの活性低下によるO_2の蓄積は、生体におけるFenton反応を加速し、反応性の高いヒドロキシラジカルの産生を促す結果、運動神経の傷害を起こすものと考えられる。
南アジア系社会における肉食文化の比較民族誌的研究

本研究の目的は、グローバル市場への包摂が急速に進む南アジアにおいて、従来カーストや民族、及び宗教に強く規定されると見なされがちであった食肉をめぐる文化を比較民族誌的に再考することである。2018年度の研究の成果は、大きく3つに分けて捉えることができる。第一の成果として、これまで、経済文脈から切り離され社会政治的文脈のもとで描かれがちであった「カースト」「宗教」「民族」の研究視角に、食肉とそれを取り巻くネットワークがもたらす動態を捉える視角を接合し、この視角から展望できる動態を明らかにしたことである。この成果に関連して、国内シンポジウムにて講演すると共に、意見交換を行った。第二の成果として、これまで世界的にも民族誌が描かれてこなかったネパールの食肉加工カーストの人びとの社会について詳細かつ動態的な民族誌を英語で記述したことである。この成果は、査読付き国際論文集に投稿したところ採択され、2018年度に出版された。第三の成果として、グローバル化時代の南アジア都市社会を時間軸・空間軸で厚みをもって記述したことである。これにより、グローバル化を一方向ではなく、食肉というカーストや宗教に基づくローカル規範と結びついていたモノの市場化が創発する人々の実践とそれが地域社会を下からいかに再編していくのかという視点から、より錯綜した動態を明らかにした。この成果に関して、国立民族学博物館が主催する研究会で口頭発表し、意見交換することを通して、理論の洗練を行った。この成果について、論文として投稿の準備を進めている。フィールドワークや分析など、大きな問題なく順調に進展できている。今後も、研究計画書に記載していた通り、南アジア系社会での肉食文化の展開についてフィールドワークを進めていくこととする。ハラール肉に関する展開をフォローアップするために、当初の計画には記載していなかったが、東南アジアの南アジア系移民コミュニティでのフィールドワークを追加することも今後の研究の視野に入れている。年度末に行った出張の処理手続が年度を超えることとなったため。
ハ-ダ-腺の分泌機構について

実験動物として当初予定していたラットでは、腺細胞内に含有するポルフィリンが強い蛍光を発し、また腺房分離時の細胞・組織の変性も著明であり、ラットのハ-ダ-腺はIn Vitroの実験に向かないことが判明した。そこで他の動物のハ-ダ-腺を用いて単離腺房標本の作成を試みたところ、モルモットでIn Vitroの実験系が確立できた。鋼管灌流をおこなったIn Vivoの実験と併せ、以下の知見を得た。1.単離腺房にコリン作動性薬物のカルバコ-ルを10^<-6>M以上の濃度で作用させたところ、筋上皮細胞の収縮と腺細胞からの分泌が電顕的に確かめられた。刺激物質の濃度が高ければ高いほど形態的な変化が著しかった。拮抗物質のアトロピンでこの反応は抑制された。細胞外のカルシウムを除くとカルバコ-ルの効果は無くなった。種々のカテコ-ルアミンは効果を示さなかった。2.G蛋白刺激作用のあるフッ化ナトリウムに対して、モルモットのハ-ダ-腺腺房が反応を示した。マウスのハ-ダ-腺の灌流標本でも、、フッ化ナトリウム刺激で、ベタネコ-ル刺激時と同様の果粒放出像が観察された。3.単離腺房細胞および筋上皮細胞内のカルシウム濃度をFuraー2で測定した。カルバコ-ル刺激で両細胞共に細胞内カルシウムは上昇した。細胞外カルシウムを除くことにより、刺激後の細胞内カルシウム濃度の上昇は実質的に抑制された。カテコ-ルアミンやニコチンでは細胞内カルシウ上昇はみられなかった。4.刺激前と刺激後の細胞内骨格を観察する目的で、アクチンフィラメントに対する免疫組織化学をおこなったが、腺細胞内のアクチンフィラメントを染め出すことは、いまのところできていない。一方、単離腺房標本における免疫組織化学では、筋上皮細胞の広がりが立体的に観察することができた。5.メラトニンに対する免疫組織化学をおこなうために、試料作製時にマイクロウエ-ブ照射固定や凍結乾燥をおこなったが、果粒内の脂質固定はできなかった。一方、マイクロウエ-ブ照射固定とオスミウムフェロシアン化法を併用することにより、脂質果粒の果粒膜成分が重層していることが明らかになった。果粒内の脂質は、膜に包まれたまま開口放出されていた。膜に包まれたまま果粒内容(脂質)が放出される特異な開口放出が、コリン作動性薬物で促進され、その際に細胞内カルシウムの上昇がおきていることが今回の研究で明らかにされた。この研究成果は第97回日本解剖学会総会(平成3年4月、愛媛大学)にて発表する。
人工細胞の環境に対する応答および機能性人工細胞の構築の研究

抗菌性ペプチドのマガイニン2のボア形成のメカニズムを解明するために、脂質膜の表面電荷密度がポア形成に与える効果を単一GUV法により研究した。正味の負の電荷を持つジオレオイルボスファチジルグリセロール(DOPG)と中性のジオレオイルポスファチジルコリン(DOPC)の混合膜のGUV(DOPG/DOPC-GUV)を作成し、DOPGの膜内濃度を変えることにより(30-60mol%DOPG)、GUV膜の表面電荷密度を制御した。すべての種類のGUVで、急速なカルセインの漏れを観測し、マガイニン2がポアを形成することがわかった。マガイニン2と1個のGUVをt分間相互作用させたときに、調べたすべてのGUVの中で漏れが起こったGUVの割合(または確率)P_<LS>(t)は、単一GUV法では漏れの特性を表す重要なパラメーターである。同じ表面電荷密度を持つGUVにおいては、P_<LS>(6min)はマガイニン2の濃度ともに増加した。また、P_<LS>(6min)=0.5になるマガイニン2濃度は、膜の表面電荷密度が小さくなるにつれて、大きく増大した。GUV膜とマガイニン2の静電相互作用をポアッソン-ボルツマン方程式に基づいて考え、またマガイニン2の脂質膜への結合定数を実験的に求めることにより、脂質膜界面に結合したマガイニン2の濃度(膜界面におけるマガイニン2と脂質のモル比)X_bを求めることに成功した。膜の表面電荷密度にかかわらず、ある臨界濃度のX_bのところから急激にP_<LS>(6min)が増大することがわかった。このことは、膜に結合したマガイニン2の膜界面での濃度が、ポア形成に重要な役割を果たすことを示す。1.アクチンやアクチン/フィラミンA-ゲルは、細胞の力学応答や浸透圧応答で重要な役割を果たしている。したがって、人工細胞の構築においても、それらのメカニズムを解明することは重要である。我々は、すでにオスモメーターを用いた実験より、アクチンフィラメントが浸透圧に基づく水の流れを抑制し、アクチン/フィラミンA-ゲルが水の流れを完全に止めることを見出している。本研究では、この現象を非平衡の熱力学を用いて解析し、浸透圧に共役してアクチンフィラメントの化学ポテンシャルが増大し、その結果アクチンフィラメントを含む水溶液の水の化学ポテンシャルが減少することを見出した。このことにより、上記のアクチンフィラメントの浸透圧応答に対する実験結果を合理的に説明できる(J.Phys.Chem.B, 110, 13572, 2006)。2.単一GUV法を用いて、抗菌性ペプチドのマガイニン2と脂質膜の相互作用に対する膜の表面電荷密度の効果を研究した。負の電荷を持つジオレオイルポスファチジルグリセロール(DOPG)と電気的に中性のジオレオイルホスファチジルコリン(DOPC)の混合膜で、30mol%から60mol%までDOPGの濃度を変えた膜のGUVを作成し、マガイニン2との相互作用を調べた。その結果、どの膜でもマガイニン2は脂質膜中にポアを形成したが、DOPGの膜内濃度が減少するにつれて(つまり膜の表面電荷密度が減少するにつれて)、ポアを形成するのに必要な水溶液中のマガイニン2の濃度は大きく増大した。この実験結果の解析より、膜に結合したマガイニン2の濃度がポア形成のしやすさを決定することが示唆された(投稿準備中)。3.緑茶カテキンは抗菌性活性があり、PC膜のリポソームから蛍光プローブの漏れを誘起することが知られているが、そのメカニズムは不明であった。単一GUV法を用いて、カテキンの一種であるエピガロカテキンガレートとPC膜の相互作用を調べた結果、リポソームの破裂が漏れの原因であることがわかり、さらにその破裂のメカニズムを解明した(Biophys.J.92, 3176, 2007)。

GUV膜とマガイニン2の静電相互作用をポアッソン-ボルツマン方程式に基づいて考え、またマガイニン2の脂質膜への結合定数を実験的に求めることにより、脂質膜界面に結合したマガイニン2の濃度(膜界面におけるマガイニン2と脂質のモル比)X_bを求めることに成功した。膜の表面電荷密度にかかわらず、ある臨界濃度のX_bのところから急激にP_<LS>(6min)が増大することがわかった。このことは、膜に結合したマガイニン2の膜界面での濃度が、ポア形成に重要な役割を果たすことを示す。
アミノ基をSN2反応の脱離基に変換する実用的な反応の開発

アミノ基をSN2反応の脱離基に変換する実用的な反応の開発するために、アミノ基に様々な化学変換を行い、適切な脱離基の候補を探索した。その結果、脱離基として有望な官能基を開発した。そしてこの脱離基に対して、様々なアルキル鎖を導入し、その脱離能を測定、評価する過程で優れた反応性を持つベンジル化剤の開発に成功した。ベンジル化は保護基として有機合成化学において汎用されるが、導入する条件は通常、強酸・強塩基を用いるため、精密合成、特に多くの官能基を持つ天然物合成においては、その有用性にも関わらず使用が難しい。さらに、汎用されるベンジル化剤ベンジルブロミドのようなアルキル化剤は催涙性・皮膚刺激性・変異原性などの毒性があり、扱いづらい。ところが、この試薬の反応は中性条件下、基質であるアルコールと混ぜるだけでベンジル化が進行するほどの反応性を持ち、上述したような、合成上の問題点を解決している。また、(1)白色固体で吸湿性がない。(2)空気中で秤量可能。(3)室温で安定。という、実験者にとって有用な特性を持ち、扱いやすい。毒性に関しては、高反応性ゆえに懸念されるところだが実際には、水溶性であり、容易に水と反応するため、アルキル化剤であるにもかかわらず、毒性がないと考えられる。現在までに収率を81%にまで改善しており、さらなる最適化を研究中である。また、ベンジル化剤のみならず、その他のアルキル化剤一般に適用できるように、脱離基の最適化を進行中である。(3)室温で安定。
術後化学療法を支援する人工知能システムの開発

我々は人工知能が最も得意とする画像認識技術に着目しこれを、がんの化学療法に応用することを目指す。がん細胞のDNA, RNAシークエンスを実施し、そのデータを基に効果のある抗がん剤の組み合わせを決定することができれば、術後化学療法の効果は飛躍的に上昇し結果としてがんの予後改善につながると考えられる。そこで本研究では約200種のがん細胞のDNA,RNAシークエンスデータおよび各々の細胞の265種の抗がん剤への感受性データから人工知能(AI)を用いて深層学習を行いDNA,RNAシークエンスデータから最適な抗がん剤の組み合わせを導き出す治療支援システムの構築を目指す。
ハイパーブランチブラシブロック共重合体による新規フォトニック結晶の開発

本研究では、側鎖にハイパーブランチポリアミド(HBPA)を有するブラシブロック共重合体を合成し、その自己組織化によって、短波長から長波長の任意の光を効率的に反射する新規フォトニック結晶の開発を目的とする。今年度は、まず、開始剤存在下でエステル部位にトリエチレングリコール鎖を有するAB2モノマーの連鎖縮合重合を行い、分子量分布の狭いハイパーブランチポリアミドを合成した。続いて、ハイパーブランチポリアミドのフォーカルポイントを官能基変換して、ノルボルネンイミド部位を有するハイパーブランチポリアミドマクロモノマーを得た。次に、ノルボルネンイミド誘導体に原子移動ラジカル重合の開始部位を導入し、そこからスチレンのラジカル重合を行い、ノルボルネンイミド部位を有するポリスチレンマクロモノマーを得た。次に、ノルボルネンイミド部位を有するポリスチレンマクロモノマーを用いて開環メタセシス重合の条件検討を行った。まず、Grubbs触媒とポリスチレンマクロモノマーの濃度の検討を行った結果、Grubbs触媒には第二世代Grubbs触媒に3-クロロピリジンを作用させたものが適しており、ポリスチレンマクロモノマーの濃度は0.025Mが適していることがわかった。さらに、この重合系に3,5-ジクロロピリジンを添加すると、生成ポリマーの分子量分布が少しだけ狭くなった(Mw/Mn=1.54)。また、使用するポリスチレンマクロモノマーの分子量分布を1.15から1.05に変えて重合すると、生成ポリマーの分子量分布はより狭くなった(Mw/Mn=1.25)。さらにポリスチレンマクロモノマーの濃度を0.0125Mにして重合を行うことで、より分子量分布の狭いポリマー(Mw/Mn=1.16)が生成することを明らかにした。また、ハイパーブランチポリアミドマクロモノマーの開環メタセシス重合も進行することがわかった。ノルボルネンイミド部位を有するポリスチレンマクロモノマー、ハイパーブランチポリアミドマクロモノマーの合成経路を確立できた。さらにポリスチレンマクロモノマーを用いて開環メタセシス重合の適切な条件を明らかにでき、ハイパーブランチポリアミドマクロモノマーの重合も進行することがわかった。この条件を用いれば、ブラシブロック共重合体が合成できると思われる。次年度は、今年度明らかにした開環メタセシス重合の適切な条件を用いてブラシブロック共重合体の合成を検討する。まず、マクロモノマーの重合させる順番を検討し、どちらを先に重合するのが適しているかを明らかにする。次に、主鎖の重合度を種々変えたものを合成する。得られるブラシブロック共重合体を自己組織化させて、得られる組織体の構造をSAXS、SEM、TEMを用いて解析する。さらに、反射率測定を行い、主鎖の重合度(分子量)と反射光のλmaxの関係を明らかにする。
両大戦間期炭鉱業経営と事業費予算管理の展開

本研究課題は、各所所蔵の炭鉱業関係資料を利用し、わが国の主要炭鉱企業によって実施された予算管理に代表される会計管理実務の時系列変化を検証することによって、わが国の会計史研究に対して新たな視点と解釈を提供することを企図としている。分析結果は次のとおりである。(1)炭鉱業各社は、他の一般企業の会計実務を凌駕する、先進的な会計管理ツールとタイトな報告制度を初期段階から導入することに成功しており、その意味で経営的視点をもっとも重視した組織体であった。(2)炭鉱業各社の会計的先進性は、明治以降、主要鉱区・炭田の買収を通じて拡張と多角化を続けた旧財閥系企業の鉱業部門の経済特性に強い影響を受けていた。本研究は、九州大学・慶応大学・福島大学の各図書館・センター所蔵の炭鉱関係資料を利用し、鉄道・海運などの動力供給源であった日本の主要炭鉱会社を重点的に選別し、各社の利益管理ツールならびに各種報告制度に関する情報を抽出し、データベース分析を行ううことによって、戦前・戦後を通じた日本の基幹産業における会計実務というコンテクストから、我が国の会計制度の歴史的展開に関する議論に一定の貢献を果たすことを目的としている。平成24年度は、井華鉱業および三井鉱山を調査分析対象とし、両社が持株会社整理委員会に提出した財務情報の属性を、財閥解体と過度経済力集中の排除というコンテクストから分析した。分析の結果、次の2点が明らかになった。1財閥系炭鉱会社の伝統的会計実務は、自社解体の実施に際して十分に機能し、2財閥解体の過程で採用された会計実務(会社分割にあたって持株会社整理委員会によって検討された予想貸借対照表の作成)は、1947年7月に連合国軍最高司令官総司令部(GHQ)によって指示された「工業会社及ビ商事会社ノ財務諸表作成ニ関スル指示書」の内容の実現を通じて、戦後会計制度創設の重要な基盤を提供した。この研究結果は、日本の財閥組織によって提供された会計情報のクオリティに関する議論に貢献することができる。というのも、初期の研究結果は、当該情報のクオリティを一般に粗雑なものであったと整理する一方、近年の研究成果は、それとは対照的に、財閥系の各会社によって当時採用されていた会計実務は、日本固有の経済環境下では、問題なく機能していた可能性があると指摘しているからである。本研究の成果は、後者の見解を支持するうえで重要なエビデンスを提供する。本研究は、九州大学・慶応大学・福島大学の各図書館・センター所蔵の炭鉱関係資料を利用し、鉄道・海運などの動力供給源であった日本の主要炭鉱会社を重点的に選別し、各社の利益管理ツールならびに各種報告制度に関する情報を抽出し、データベース分析を行うことによって、戦前・戦後を通じた日本の基幹産業における会計実務というコンテクストから、我が国の会計制度の歴史的展開に関する議論に一定の貢献を果たすことを目的としている。平成25年度は、昨年度作成した三井鉱山、井華鉱業(住友石炭鉱業)の利益管理ツールならびに報告制度と統制制度に関する時系列データベースをもとに、これに三菱鉱業(未完成)のデータベースを加え、各社が持株会社整理委員会に提出した会計データを精緻に分析することによって、(1)各社の原価計算手続、予算統制手続および部門別場所別利益管理手法が、非常に早い段階から高度に発達しており、これらが戦後直後の財閥解体にあたっても有効に機能したこと、(2)従来の「工業会社及ビ商事会社ノ財務諸表作成ニ関スル指示書」に対する理解とは異なり、各社が持株会社整理委員会の指示に従い、会社分割案を実施するにあたり分割後の予想貸借対照表を作成するに際し、当該指示書の規定が参照・利用され、さらにそこで形成された実務が戦後直後の各社の財務諸表作成実務にも引き継がれていたことを明らかにした。この分析結果に基づき、研究論文を執筆し、各種学会で報告した。現在、査読付き雑誌に投稿することを検討中。また、上記の研究結果とは別に、古川鉱業および日本鉱業の予算統制等の利益管理ツールならびに各種報告制度とそれを通じた統制制度に関する情報を抽出し、各社のデータベースを作成した。本研究は、九州大学・慶應義塾・福島大学各図書館・センター所蔵の炭鉱関係資料を利用し、鉄道・海運等の動力供給源であった日本の主要炭鉱会社を重点的に選別し、各社の予算統制等の利益管理ツールならびに各種報告制度とそれを通じた統制制度に関する情報を抽出し、データベース分析を行うことによって、戦前・戦後を通じた日本の基幹産業における会計実務というコンテクストから、予算統制の歴史的展開に関する議論に対して一定の貢献を果たすことを目的としている。平成23年度は北海道炭礦汽船を調査分析対象とし、同社の利益管理ツールならびに報告制度と統制制度に関する時系列データベースを作成した。分析の結果、次の諸事項が明らかとなった。

北海道炭礦汽船は、1949年、国策による石炭増産要請に応じるため、また戦中に生じた乱掘と設備の荒廃に対処するため、新炭鉱の開発・現炭鉱の拡張整備・増産に直結する諸設備の近代化を図った。同事業拡張計画の遂行には持株会社整理委員会による承認が必要であったが、このために同社は詳細な資本予算および事業予算計画を立案し、提出した。増資や米国対日援助見返資金の利用に加えて主要な資金源となったのは市中借入であったが、資産再評価を行ってもなお貸借対照表の信用度指標に問題があり、これを改善するために、財閥解体のために同委員会に委譲していた同社保有株式の処分代金を事前交付するよう合わせて要請した。資産再評価による貸借対照表指標の改善はこれまでの研究でも明らかにされているところであるが、北海道炭礦汽船のケースはそれ以外の事例が存在したことを示している。また、同処分代金の交付には「持株会社の整理の遂行のため」という条件が付されていたことからすると、同社の事業拡張計画と当該趣旨との整合性が問われよう。以上の結果をさらに検討拡充し、今後研究報告のかたちにまとめる予定である。本研究は、九州大学・慶応大学等の各図書館・センター所蔵の炭鉱関係資料を利用し、エネルギー供給源であった日本の主要炭鉱会社を重点的に選別し、各社の利益管理ツールならびに各種報告制度に関する情報を抽出し、データベース分析を行うことによって、戦前・戦後を通じた日本の基幹産業における会計実務というコンテクストから、日本の会計制度の歴史的展開に関する議論に一定の貢献をなすことを目的としている。当初は、平成26年3月末までに、全体の研究を完了させる予定でいたが、とりまとめの途中で三菱鉱業に関する追加的資料が入手できたため、研究期間を延長して、同社の会計実務に関する追加的な分析を行った。分析の結果、(1)日本国内の炭鉱業は、他の一般企業の会計実務を凌駕する、先進的な会計管理ツールと精緻な報告・管理制度を、初期段階から導入・確立することに成功しており、その意味で、もっとも経営的視点を重視した組織体であったということ、および(2)こうした会社の会計的先進性が、他方で、明治以降、官営鉱山・炭鉱の払下げと主要鉱区・炭田の買収を通じて、拡張と多角化を続けた旧財閥系企業の鉱業部門の経済的特性に強い影響を受けていたということが明らかにされた。上記Discussion Paperを改訂し、平成26年中に、会計史研究に関する国際ジャーナルに投稿した。現在、一次審査を通過して、二次審査に向けて再改訂中の状況にある。会計学当初の計画では、三井鉱山に加えて、三菱鉱業も調査分析対象とする予定であったが、同社のデータベースについては、平成24年度終了時点において、依然として作成途上にあるからである。三菱鉱業のデータベースを作成する際に、新史料が発見されたため、急きょ予定を変更して、研究期間の延長を計画することになったが、その他の企業、とくに古川鉱業および日本鉱業のデータベースを完成させ、一定程度の分析基盤を整えられたことから、当初予定された研究計画に対して、おおよその達成度には至っていると考える。当初の計画では、北海道炭礦汽船に加えて、住友石炭鉱業も分析対象とすることを予定していたが、同社のデータベースについては平成23年度末現在作成途中にあるからである。
担癌動物における誘導性ヒスタミンの免疫調節因子としての役割に関する研究

マウスColon26株化細胞を10^6cells/0.2ml、BALB/cマウスの背部皮下に移殖し、担癌動物を作製した。担癌マウスと対照の偽手術マウスの体重と腫瘍塊の大きさを経時的に測定したところ、担癌マウスでは、移殖後14日以降、有意の体重減少が見られ悪液質を誘導することができた。移殖後7日、14日、21日、24日目にマウスのひ臓、肺、肝臓、腎臓を採取し、一部はヒスタミン測定用、一部はヒスチヂン脱炭酸酵素(HDC)活性測定用とした。担癌マウスの各臓器のヒスタミン含量には観察期間中有意の変化は認められなかったが、HDC活性は14日目以降ひ臓、肺、肝臓で有意の上昇を示し、24日目には対照動物の約1.5-3倍になった。腎臓では有意の変化は認められなかった。次にColon 26株化細胞を親株としてサブクローニングされた悪液質誘導株Clone-20と悪液質非誘導株Clone-5の2つの株化細胞について同様の実験を行い、HDCの誘導と悪液質の発生との関係について検討した。ヒスタミン含量は、正常マウス、悪液質誘導担癌マウス(C-20)、悪液質非誘導担癌マウス(C-5)間に調べたいずれの臓器においても差は認められなかった。一方HDC活性は、C-20で移殖後7日目で肺とひ臓において有意の上昇を認め、その上昇は14日めには正常マウスの4-6倍にも達した。C-5群のHDC活性は、C-20群と正常群の中間的値であった。以上の結果から、担癌モデルマウスにおいては、強いHDC活性の誘導が起こることが明らかとなり、担癌状態において肺あるいはひ臓において産生されるヒスタミンが炎症反応、免疫応答を調節する可能性が強く示唆された。
HTLV-1型関節炎(HAAP)の病態とその発症機序に関する免疫組織学的研究

1)抗HTLV-1抗体陽性者(carrier)の関節液中の白血球数は50-2000/mm、平均579/mmであり抗体陰性変形性関節症患者10症例(non-carrier)の50-1300/mm、平均315/mmと比べ高い値を認めた。またcarrierの関節液中には1-19%のATL様異常リンパ球を認め、末梢血中の0-3%に比べ有意に高い値であった。一方、関節液中のガンマグロブリン量、抗HTLV-1抗体価は末梢血のそれらと比べて低い値を示した。また関節症変化をX線学的に評価し比較検討したが、両群間に有意な差は認めなかった。2)関節滑膜の組織学的検索では、carrierの一部に滑膜の絨毛様、乳頭様増殖像を認め、軽度の細胞浸潤とリンパ球の集蔟像を認めたが、両群間に明らかな差異は認められなかった。また組織所見と抗体認めたが、両群間に明らかな差異は認められなかった。また組織所見と抗体価との関係についても、両者間で有意な関連性はなかった。免疫組織学的所見では、浸潤したリンパ球はほとんどがT細胞でありB細胞は極めて少ない。また集蔟部におけるT細胞のCD4/CD8比は両群とも1.0-2.5とCD4優位であった。HLA-DR抗原の発現は滑膜細胞、リンパ球の一部、血管内皮細胞および間質部の紡錘形の線維芽細胞の一部に認められたが、その程度は両群間で差異がなかった。3)共同研究者の加藤らの開発したリンパ管の酵素組織化学的同定法(5'-nucleotidase alkaline phosphatase二重染色法)を用いて関節滑膜のリンパ管分布について検索した。本法を用いることにより毛細血管と毛細リンパ管は鮮明に染別することができた。二ホンサルでは、膝関節滑膜リンパ管網は表層直下に存在する血管網より深層部に存在し、特に関節近位部の内側と外側に極めてよく発達していた。またヒトの膝関節滑膜リンパ管もサルと同様の分布状態を呈し、疎性結合組織部および脂肪組織部を被う滑膜には、よく発達した毛細リンパ管網の存在することが明らかとなった。4)慢性関節リウマチ患者の関節滑膜の検索を行った結果、滑膜の絨毛様増殖部位の浅層部には、著明に発達した血管網が存在するがリンパ管網の発達は著しく劣っていることが判明した。平成3年度に計画していた研究13とそれらの研究実績は以下の如くである。1.抗HTLVー1抗体陽性患者の膝関節滑膜、とくに細胞性中皮層の電顕組織化学的(微細形態)特徴を、慢性関節リウマチや抗HTLVー1抗体陰性患者のそれらと比較検討してきた。現在までに抗HTLVー

1抗体陽性患者に特徴的な所見は見い出されてないが、引きつづき本検索を遂行中である。2.抗HTLVー1抗体陽性患者の関節液、血液、髄液の抗体価の測定、生化学的検索を行い、デ-タを集績、解析中である。3.抗HTLVー1抗体陽性と陰性の変形性関節症患者の関節液および血液の生化学的所見、X線所見さらに滑膜組織の免疫組織学的検索を行い、それらを比較検討した。その結果、抗体価の高さとX線上での骨・関節変化の進行度との間には関連性は認められず、滑膜組織の免疫組織学的検索においても、浸潤リンパ球はいずれもT細胞であり、集簇部におけるT細胞のCD4/CD8比にも優位な差は認められなかった。また滑膜組織細胞のHLAーDR抗原の発現に関しても差異は認められなかった。(HTLVー1研究会,1991年5月鹿児島市)。4.さらに平成4年度に予定していた滑膜の微小循環路としての血液・滑膜関門・リンパ管の微細構造および微細分布について、共同研究者の加藤らの開発したリンパ管の酵素組織化学的同定法(5'ーnucleotidase alkaline phosphatase二重染色法)による検索を行い、本同定法の有用性を明らかにした(日本整形外科基礎学術集会,1991年8月京都市)。また本同定法を用いてヒト膝関節滑膜のリンパ管分布に関して新しい知見を得たので報告した(国際リンパ学会,1991年10月パリ)。1.平成3年度にひきつづき抗HTLV-1抗体陽性患者の関節滑膜の細胞性中皮層の電顕組織化学的特徴を慢性関節リウマチや抗HTLV-1抗体陰性患者のそれらと比較検討したが、抗HTLV-1抗体陽性患者に特徴的な所見は見出せなかった。2.共同研究者の加藤らの開発したリンパ管の酵素組織科学的同定法(5'-nucleotidase alkaline phosphatase二重染色法)を用いて関節滑膜のリンパ管分布にいて詳細に検索した。本法を用いることにより従来光顕では鑑別が難しいとされた毛細血管と毛細リンパ管は鮮明に染別することが出来た。ニホンサルを用いた検索では、膝関節滑膜リンパ管網は、表層直下にある血管網より深層部に存在し、特に関節近位部の内側と外側に極めてよく発達しているという新しい知見を得た。また、ヒトの膝関節滑膜リンパ管もサルと同様の分布状態を呈し、疎性結合組織部及び脂肪組織部を被う滑膜には、よく発達した毛細リンパ管網の存在することが判明した。3.抗HTLV-1抗体陽性変形性関節症患者及び抗HTLV-1抗体陰性変形性関節症患者の凍結関節滑膜の酵素組織化学的同定法によりリンパ管の同定を行い浸潤細胞(主リンパ球)の関係についてモノクローナル抗体を用いて検索を行っているが、結果を出すには致らずひきつづき検索をつづける。4.酵素組織化学的同定法を用いて慢性関節リウマチ患者の関節滑膜の毛細血管及びリンパ管の検索を行った結果、滑膜の絨門様増殖部の浅層部には、著明に発達した血管網が存在するが、リンパ管網の発達は著しく劣っていることが判明した。このことが関節液の排導障害一原因であると考えられた。
タンパク質導入系ＬＥＮＡによる安全な分化・脱分化誘導法の確立

iPS細胞は再生医療を実現するために欠かせないが、臨床応用には安全性で改善が求められる。本研究は安全なiPS細胞を作成するための技術構築を目的とする。安全性が懸念される過程の一つに、体細胞からiPS細胞を誘導する際のゲノム損傷がある。申請者らは独自に開発したタンパク質導入系LENAを応用してこの解決を試みる。我々はiPS細胞誘導の基本4因子の一つOct3/4が安定にLENAに取り込まれ、ヒト標的細胞に送達できる事を示した。しかし、体細胞から脱分化した細胞を導出するには改良を要することが判明した。安定した結果を得るため、実験系を鋭意改良しながらゴールに向かって研究を進めている。我々はレトロウイルス基礎研究をもとにレンチウイルス様ナノ粒子(Lentivirus-like nanoparticle,LENA)を用いたタンパク質デリバリー法を開発した。iPS細胞を利用した再生医療において、治療用細胞の悪性化やウイルスベクターの混入には大きな懸念がある。これを払拭するにはタンパク質デリバリー法は最適である。本研究ではLENA技術をコアとして既法で得られるものより格段に安全性の高いiPS細胞を樹立する方法を確立する。概念検証を行うため、本年度はOct3/4によるヒト繊維芽細胞からCD45^+細胞への脱分化誘導能の検証を試みた。Oct3/4導入用LENA発現ベクターを構築して、293T細胞からOct3/4-LENAを調整した。粒子内におけるOct3/4の安定性をイムノブロット法にて検証した。LENA系によるヒト繊維芽細胞からiPS細胞への脱分化誘導を試みたが、CD45^+細胞への脱分化は検出されなかった。Oct3/4の転写因子機能を検証するためOct3/4活性を検出するレポータープラスミドを一過性に導入したHeLa細胞にOct3/4-LENAを暴露し、経時的にルシフェラーゼアッセイを行った。その結果、転写活性は検出限界以下となった。本実験系を繰り返し施行する中で、LENAによる活性のある転写因子の細胞内導入には鋭敏かつ安定なレポター系の作出とそれに基づく適切なLENA産生プロトコルおよび暴露プロトコルの評価が重要である事が明らかになった。これはLENA法を他の脱分化誘導因子に適応拡大し、LENA系によるヒト繊維芽細胞からiPS細胞への脱分化誘導を行う上で極めて重要な基盤情報となる。プラスミドベクターを用いたトランスフェクション法がこれまでの中でもっとも安全性が高いとされているが、トランスフェクション法においても宿主ゲノムを損傷する可能性は高く、より確実に安全性を担保できる方法の確立がiPS細胞の臨床応用には必須と考えられる。我々はレトロウイルス基礎研究をもとにレンチウイルス様ナノ粒子(Lentivirus-like nanoparticle, LENA)を用いたタンパク質デリバリー法を開発した。既法で得られるものより格段に安全性の高いiPS細胞を樹立する方法としてLENA技術を基盤としたタンパク質デリバリー法は最適である。本研究ではLENA技術をコアにした脱分化法を開発し、再生医療を実用化するために有用な基盤技術を提供する。平成25年度までに、我々は脱分化因子Oct3/4を含有するLENAの調整に成功し、各種条件を試験する事により至適な条件でこれを暴露する事により293細胞で脱分化マーカー遺伝子の一つであるfgf-4の発現増強を確認した。この活性は同じ脱分化因子Sox2を有するLENAを共存させることにより増強される可能性が示唆された。この結果は2つの研究機関で独立に実施されて再現性が認められた。この結果はタンパク質の直接導入による安全なヒトiPS細胞の誘導やdirect reprogrammingによる治療が技術的に可能であることを示唆している。本研究は安全なiPS細胞を作成するための技術構築が目的である。iPS細胞は再生医療を実現するために欠かせないとされているが、臨床応用には安全性の面で改善が求められている。本研究は体細胞からiPS細胞を誘導する際に使用される転写因子が細胞のゲノムを傷つけないようにしてiPS細胞を誘導するという課題に対して、申請者らが独自に開発したタンパク質導入系LENAを応用して解決できないかを追求する。LENAはレンチウイレウスベクターから感染性を欠落させた偽粒子に転写因子を取り込ませ、標的細胞にあたかも感染するかのようにタンパク質だけを導入する実験系である。iPS細胞を作るために必要な基本4因子の一つとして知られるOct3/4をつかってタンパク質が安定にLENAに取り込まれるかを検討したところ、無事にタンパク質が検出された。さらに、転写因子として標的細胞で機能するかを検討したところ、転写因子の活性が検出された。しかし、この活性は体細胞から脱分化した細胞を導出するには弱いことが判明した。

これをうけて、転写因子機能を増強することにした。LENA実験系を鋭意改良しながらゴールに向かって一歩ずつ進めている。26年度が最終年度であるため、記入しない。分子細胞生物学26年度が最終年度であるため、記入しない。本年度はOct3/4導入用LENAによる概念検証実験として、Oct3/4導入用LENAの調整とタンパク質導入能の検証とOct3/4-LENAによるヒト繊維芽細胞のダイレクトリプログラミングの検証を企図していたが、転写因子の活性検出において実験系を改善すべきである事が判明したため、これに注力した事が研究計画の推進に影響している。脱分化因子の機能を再現性よく鋭敏に測定するための実験系として、レポーター細胞による方法よりも、脱分化マーカーのRT-PCRが最も有用であることが明らかになるまでに時間を要したことが最も大きな理由である。さらに、独立の研究機関による実験の再現性を確認するために時間を要した事も要因である。しかし、後者の要因に関しては時間以上に価値のあることと認識している。LENAによる転写因子活性導入の効率を測定する実験系の改良を行い、LENA産生プロトコルおよび暴露プロトコルの最適化を第一の目標とする。具体的なOct3/4導入によるエフェクター効果を検出する鋭敏且つ定量的な方法として、signaUnoise比が高いレポーターHeLa細胞株を樹立しluciferase reporter活性の検出を試みると同時に、RT=PCRによる内在性Oct3/4標的遺伝子発現誘導を評価する。これを確立した上で再度Oct3/4-LENAによるヒト繊維芽細胞のダイレクトリプログラミングの検証を行い、他の脱分化誘導因子に適応拡大する。ベクター系と物理的なLENA含有転写因子の安定性評価系が確立したので、他の脱分化因子Sox2、H-f4、c-Mycへの適応拡大の第一段階として各因子を含有するLENAの構築を行う。我々は脱分化因子Oct3/4-LENAにより293細胞で脱分化マーカー遺伝子fgf-4の発現増強を確認した。この活性は同じSox2-LENAを共存させることにより増強される可能性が示唆された。今年度は上記の結果をさらに確固たるものにするため、Oct3/4の標的因子である第2、第3の脱分化マーカー遺伝子NanogやOct3/4を評価する。また、潜在的に実験結果に影響する「LENA調整時に発生するLENA産生細胞からの脱分化マーカー遺伝子の混入効果」について検証する。さらに、脱分化を生物学的に評価するため、Oct3/4-LENAによるヒト繊維芽細胞のダイレクトリプログラミングをSox2-LENAの共存下で実施する。脱分化のマーカーとしてCD45を用い、CD45陽性細胞への分化誘導の効率と再現性を評価する。
卵巣がんの新規治療標的ーBRCA1修復システムに属するがん抑制遺伝子

BRCA1は、2本鎖切断(DSB)されたDNAの修復に働く。BRCA1はリン酸化されるタンパクであるが、リン酸化による機能制御は不明である。申請者は、Ppp6c(PP6の触媒サブユニット)がBRCA1に結合すること、さらに脱リン酸活性を持たない変異型Ppp6cはより強く結合することを見いだした。このデータは、PP6の失活がBRCA1の過剰リン酸化を起こすことを示唆した。申請者は、PP6活性の低下がBRCA1の異常を起こし、それによるDNA修復異常が卵巣がんや乳がんの発生原因となるとの仮説を持った。卵巣がんにおいては、BRCAの変異または、その周辺の遺伝子変異が発症に関連していることが知られてきた。我々は、PP6が卵巣がんの抑制遺伝子として働くか否かを明らかにするために、Ppp6c欠失マウスを作製した。Ppp6cヌルマウスは胎生致死であることが分かった。そこで、次にPpp6cを組織特異的に欠失できるマウス(Ppp6cflox/flox)を作製した。これまで、生体内で、Ppp6cががん抑制的に働くか否かの解析は行われていなかった。そこで、申請者は、一般的にがん抑制遺伝子の同定に用いられているマウス皮膚発がん実験を使って検証することにした。Ppp6c欠失皮膚に対する紫外線照射実験により、Ppp6cが皮膚においてはUV誘発発がんの抑制遺伝子であることが分かった。またこの腫瘍において2本鎖DNA切断が高頻度に見出され、DNA修復異常が起きていることが示唆された。これらのデータを基にして、我々は、卵巣の腫瘍化について、「PP6機能不全→BRCA1リン酸化異常→DSB蓄積→がん遺伝子・がん抑制遺伝子の変異→腫瘍化」の仮説をもった。我々は、Ppp6cを卵巣特異的に欠損させ、がん抑制遺伝子として働くか否かの検討を開始した。BRCA1は、卵巣がんや乳がんに関連するがん抑制遺伝子である。申請者は、独自にPpp6c(PP6の触媒サブユニット)がBRCA1に結合すること、さらに脱リン酸活性を持たない変異型Ppp6cはより強く結合することを見いだした。このデータは、PP6がBRCA1の脱リン酸化を制御することや、PP6の失活がBRCA1の過剰リン酸化を起こすことを示唆した。申請者は、PP6活性の低下がBRAC1の異常を起こし、それによるDNA修復異常が卵巣がんや乳がんの発生原因となるとの仮説を持った。申請者らは、PP6が卵巣がんの抑制遺伝子かどうかを確かめるためPpp6c欠失マウスを作製したところ、Ppp6c欠失マウスは胎生致死であることが分かった。一般に、がん抑制遺伝子の同定には、信頼性のある皮膚発がん実験の系が使われている。まずこの系を使って検証を開始した。Ppp6c欠失皮膚に紫外線照射をすると、正常皮膚では腫瘍形成しない時期にも関わらず、腫瘍形成が認められた。またそれは皮膚扁平上皮がんであることが分かった。この事は、Ppp6cが皮膚においてはUV誘発発がんの抑制遺伝子であることを示した。卵巣がんでは、RASの上流にあたるEGFR、ERB2、FMSの過剰発現が報告されている。また、下流のPI3K、AKT2の増幅が報告されている。このことから、卵巣に変異型RASを発現させ、それと同時にPpp6cを欠失させることによる腫瘍形成の影響を調べることにした。そのため、我々が作製したPpp6cflox/floxマウスをKrasLSL-G12D/+マウス(ジャクソン研から購入)と掛け合わせてPpp6cflox/flox; KrasLSL-G12D/+マウスを作製した。このマウスに、開腹手術により卵管漏斗を介してAde-CREを感染させることによって、卵巣に2重変異(Ppp6c欠損と活性化型KRAS変異)を導入させた。興味のあることに、活性化型KRASの発現のみでは異常は認められないが、2重変異(Ppp6c欠損と活性化型KRAS変異)導入で早期にマウスは死亡した。一部死亡例の直前に解剖したところ、広範な腹膜播種が認められた。

卵巣がんにおいては、BRCAの変異または、その周辺の遺伝子変異が発症に関連していることが知られてきた。我々は、PP6が卵巣がんの抑制遺伝子として働くか否かを明らかにするために、Ppp6c欠失マウスを作製した。Ppp6cヌルマウスは胎生致死であることが分かった。そこで、次にPpp6cを組織特異的に欠失できるマウス(Ppp6cflox/flox)を作製した。これまで、生体内で、Ppp6cががん抑制的に働くか否かの解析は行われていなかった。そこで、申請者は、一般的にがん抑制遺伝子の同定に用いられているマウス皮膚発がん実験を使って検証することにした。Ppp6c欠失皮膚に対する紫外線照射実験により、Ppp6cが皮膚においてはUV誘発発がんの抑制遺伝子であることが分かった。またこの腫瘍において2本鎖DNA切断が高頻度に見出され、DNA修復異常が起きていることが示唆された。これらのデータを基にして、我々は、卵巣の腫瘍化について、「PP6機能不全→BRCA1リン酸化異常→DSB蓄積→がん遺伝子・がん抑制遺伝子の変異→腫瘍化」の仮説をもった。我々は、Ppp6cを卵巣特異的に欠損させ、がん抑制遺伝子として働くか否かの検討を開始した。上記プレリミナリーな結果に基づき、充分な匹数を用いて本実験を行う。1活性化型KRASを発現するマウス(KrasLSL-G12D/+)を20匹、2活性化型KRAS発現とPpp6c欠損をもつマウス(Ppp6cflox/flox; KrasLSL-G12D/+)を20匹、3Ppp6c欠損をもつマウス(Ppp6cflox/flox)を20匹、4野生型を20匹用いる。それぞれ、前述のように卵巣表層上皮細胞に2重変異またはKRAS変異を導入させる。それぞれの変異で発生する卵巣腫瘍について、その数、大きさ、病理学的所見について比較する。消耗品費が当初の想定よりもわずかに少なく済んだため。次年度の消耗品費に上積みし、より迅速な計画進捗をねらう。