hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
リンパ管新生を阻害するビスアセチレンアルコール標的分子の探索

沖縄県西表島産海綿(Callyspongia sp.)より発見したビスアセチレンアルコールについて、不斉合成と各種誘導体を用いた構造活性相関の検討により,合成した両エナンチオマーの細胞増殖阻害活性が4倍異なるというユニークな生物活性を見いだした。この細胞増殖阻害活性発現には,分子両末端の"1-yn-3-ol"が必須であり、その細胞増殖阻害機構が,微小管とは異なる2量体タンパク質の安定化と推定し、磁気ビーズ固定化による標的タンパク質の同定を企画した。現在、炭素鎖長20の一方に"1-yn-3-ol"を有する誘導体を合成しており、今後、本プローブを用い、標的タンパク質の同定を行う予定である。平成27年度はこれまでにビスアセチレンアルコールエナンチオマー2種とメソ体1種,及び11種の誘導体の他、炭素鎖長の異なるビスアセチレンアルコール(C16及びC24)を合成し,構造活性相関を解析した。調製した誘導体についてヒト子宮頸がん(HeLa)に対する増殖疎外活性を検討し、それぞれのIC50値を算出した。その結果、これまでの研究成果と併せ考え、標的探索用プローブを炭素鎖長24、分子両末端に"1-yn-3-ol"を有するビスアセチレンアルコールが最適構造と決定した。しかし、本化合物に購入したアジドビーズ(磁気ビーズ)をクリックケミストリーにより固定化した場合、分子片方のアセチレンがトリアゾールを生成し、標的タンパク質との親和性が消失することが懸念された。そこで、分子中に3個の"1-yn-3-ol"基を有する化合物をMacroModel(Schrodinger Suite社)を用い、構造最適化とコンフォメーション探索を行った。コア構造にトリメシン酸(1,3,5-benzenetricarboxylic acid)を用い、これにδ-valerolactoneから誘導したhept-6-yne-1,5-diolをエステル化したトリスアセチレンアルコールがビスアセチレンアルコール(C24)とほぼ同一のコンフォメーションを有することを確認した。現在、hept-6-yne-1,5-diolとトリメシン酸のエステル化を検討している。また、トリメシン酸の代わりにグルタミン酸を用いても、同様のコンフォメーションを有することをMacroModelにより確認しており、アミノ基にNHSービーズを固定化することで、標的タンパク質のプローブを調製する。おおむね順調であるが、トリカルボン酸の溶解性が低く、調製したアセチレンアルコール体のエステル化が難航してる。現在、カルボキシル基をより活性の高い酸クロライドに変換し、エステル化を行っている。また、H27年度は多摩川精機が主催する磁気ビーズ講習会に参加し、リガンドのビーズへの固定化、リガンドー結合たんぱく質のアフィニティー精製、たんぱく質の溶出と電気泳動法について、技術取得した。前年度合成したビスアセチレンアルコール誘導体の構造活性相関解析により得られた結果を基に、標的分子探索プローブの合成を行った。当初、炭素鎖20の両末端に"1-yn-3-ol"ユニットを導入した、ビスアセチレンアルコールとアジドビーズのクリックケミにより探索プローブを合成する予定であったが、末端アセチレンの想定外の反応が予想されたため、プローブの分子設計を見直し、δ-valerolactoneから誘導した"hepta-6-yne-1.5-diol"と1,8-diodooctaneあるいはN-(3-aminopropyl)diethanolamineとのWilliamsonのエーテル合成を行った。しかし、3位の2級アルコールの反応性が高く、期待したエーテル体は得られなかった。この結果より、プロパルギル位のアルコールの反応特異性が、活性に関与していると推定し、新たに炭素鎖末端に各2個のアセチレンを有するテトラアセチレンアルコールを合成した。Hexadecanedialに5等量のethynylmagnesium bromideを反応し、末端に4個のアセチレンと3級アルコールを有する新規化合物を合成した。また、Y.Genisson等が末端にキラルなalkynylcarbinolを有する化合物の合成と活性を報告しており、論文中、長鎖アルキルの一端にalkynylcarbinolを有する化合物の活性も報告していたことから、stearylaldehydeのGrignard反応により、monoおよびbisアセチレンアルコール体を合成した。これら化合物についてHL60細胞株に対する増殖阻害活性試験を行った結果、両末端に4個のアセチレンを有する化合物は対応するビスアセチレンアルコールの約1/18の活性が確認された。一方、炭素鎖長20のモノアセチレンアルコールのIC50は3.2microMであった。"hepta-6-yne-1.5-diol"の3位アルコールの反応性が予想外に高く、2級アルコールをMOM保護しWilliamsonエーテルを行ったが、目的のエーテル体は得られなかった。新たに合成したモノ、テトラアセチレンアルコールにある程度の細胞増殖阻害活性を確認した。また、申請者が提案している長鎖ビスアセチレンアルコールの活性発現構造(MacroModelを用いたコンフォメーション解析)を11月にハワイ大学で開催された第8回US-Japanシンポジウムで発表したところ、Baylor大学Romo教授より高い評価と分子設計に関する有用な情報を提供していただいた。Hexadecanedialを出発原料として合成したテトラアセチレンアルコール及びstearylaldehydeを出発原料として合成したモノおよびジアセチレンアルコール体のがん細胞増殖阻害活性試験の結果、テトラアセチレン体及びジアセチレン体の活性は弱く、やはり活性の発現にはアルキル鎖末端の"1-yn-3ol"が必須であることを確認した。

また、H27年度の研究成果で、一方のアルキル鎖末端に"1-yn-3ol"を有する炭素鎖長11のモノアセチレンアルコールに活性は確認されなかったが、H29年度に、stearylaldehydeのGrignard反応により合成した炭素鎖長20のモノアセチレンアルコールのIC50は3.2microMであった。本化合物の活性は対応するビスアセチレンアルコールの1/18であったが、本化合物をリードとし、新たなプローブ合成に着手した。1,16-hexadecanediol(16HDol)を1等量のBoc-glycineをエステル化し、収率37%で16HDol-Boc-glycineを調製した。未反応の水酸基をPCC酸化しアルデヒドに変換した後、grignard試薬(ethynylmagnesium bromide)によりアセチレンアルコールを導入した。今後、Boc基をTFAで脱保護し、NH2-リガンド固定用のNHS-COOH beadsによりアセチレンアルコールの標的タンパク質探索用プローブを合成する予定である。また、上記、glycineをエステル結合したリガンドはエステラーゼにより加水分解を受けやすいと考えられることから、16HDolをDMF中PBr3でモノブロム化したアルコールをPCC酸化、Grignard試薬によるアセチレンアルコールの導入後、isoindoline-1,3-dioneにより、ブロム基をアミノ基に変換したプローブも現在合成中である。沖縄県西表島産海綿(Callyspongia sp.)より発見したビスアセチレンアルコールについて、不斉合成と各種誘導体を用いた構造活性相関の検討により,合成した両エナンチオマーの細胞増殖阻害活性が4倍異なるというユニークな生物活性を見いだした。この細胞増殖阻害活性発現には,分子両末端の"1-yn-3-ol"が必須であり、その細胞増殖阻害機構が,微小管とは異なる2量体タンパク質の安定化と推定し、磁気ビーズ固定化による標的タンパク質の同定を企画した。現在、炭素鎖長20の一方に"1-yn-3-ol"を有する誘導体を合成しており、今後、本プローブを用い、標的タンパク質の同定を行う予定である。今後はトリメシン酸をコアとするトリスアセチレンとグルタミン酸をコアとするアミノビスアセチレンを合成し、これらのHeLa細胞に対する増殖阻害活性を検討し、アジドビーズ及びNHSービーズへの固定化を経て、標的タンパク質のアフィニティー精製を行う予定である。現在、16-hexadecanolide及びDimethyl Octadecanedioateを出発原料に、ethynylmagnesium bromideとのGrignard反応を行い、"1-yn-3-one"を一末端に、もう一端に1級アルコールあるいはカルボン酸有するアセチレンアルコールを合成している。このアルコールあるいはカルボン酸体にNH2あるいはepoxy磁気ビーズを固定化し、標的タンパク質探索プローブを合成する。また、末端アルコールの部分酸化により得られるアセチレンアルコールのカルボン酸を合成し、アミノ磁気ビーズを用いたプローブ合成を行う。
eNOS遺伝子導入骨髄細胞で被覆したハイブリッド人工血管のin vivo評価

ラット骨髄から初代培養した骨髄間質系幹細胞(MSC)にアデノウィルスを用いて内皮型一酸化窒素合成酵素(eNOS)遺伝子を導入し(MSC/eNOS)、in vitroでのeNOS発現が確認できたため、この細胞を小口径人工血管(内径2mm)内腔に播種した。人工血管でのeNOSの発現を確認するため、抗体を用いて免疫組織学的実験を行ったが、ラットeNOSに対する適切な抗体が見つからなかったため困難であった。そこで、His tagを付加した部分的DNAを元に抗体を作製することを試みている。MSC/eNOSを人工血管に播種したが、人工血管上での一酸化窒素の分泌を確認するための免疫組織学実験は、ラットeNOSに対する適切な抗体が見つからなかったため困難であった。一方、MSC/eNOSを播種した人工血管をウサギ(日本白色家兎)腹部大動脈への移植実験を行って入が、腹部大動脈と移植した人工血管との間に口径差を認め未だに安定した成績が得られていない。今後は、人工血管径の変更が必要と考えられた。そこで、MSC/eNOSの生体での効果を疾患モデルで確認することにした。モノクロタリンで誘導した肺高血圧症ラットに、MSC/eNOSを経静脈的に移植し、肺高血圧症の結果生じる右室収縮期圧と右室肥大、生存期間の変化を測定した。モノクロタリン投与後3週間で右室収縮期圧は有意に上昇し右室肥大が見られた。モノクロタリン投与後1週間目にMSC/eNOSを経静脈的に投与したところ、右室収縮期圧の上昇は有意に抑制された。モノクロタリン投与後3週後にMSC/eNOSを投与した群では、上昇した右室収縮期圧は低下しなかったが、生存期間が延長した。これらの効果は、eNOSの遺伝子導入をしていないMSCを投与した群よりも良好であった。これらの結果から、MSC/eNOSの生体での遺伝子発現効果が確認された。今後も継続して抗eNOS抗体の作製にとりくみ、また同時にMSC/eNOSを播種した人工血管での遺伝子発現効果を確認するために、RIを用いた方法などの導入も予定している。アデノウィルスによる内皮型一酸化窒素合成酵素(eNOS)遺伝子の強発現が、細胞死を誘導することが確認されたため、遺伝子導入ベクターとして、テトラサイクリン発現制御システムを有するアデノウィルスを採用した。テトラサイクリンの少量の添加によっても遺伝子発現が抑制された。これにより、ヒト胎児腎細胞内でのeNOS遺伝子の増幅が確実に行えるようになった。ウサギの細胞培養を行うにあたり、分離方法や遺伝子導入の至適な方法を検討するため、元来用いていたラットの骨髄細胞を用いた。骨髄細胞のうち、骨髄間質系細胞を分離・培養した。骨髄間質系細胞の倍化時間は約72時間であった。高い感染多重率を必要としたが、それに耐えうる生存力を有していたため、高い遺伝子導入効率を得ることが可能であった(感染多重率2000により遺伝子導入効率90%)。

eNOSの発現は、基質として放射性同位物質によって標識したアルギニンを用い、生成物であるシトルリンをシンチレーションカウンターで測定した。その結果、シトルリンは、37°C、8分間の反応で、時間軸に対して直線的な増加を認めた。この反応は、競合阻害物質であるN^G-Nitro-L-arginine methyl ester(L-NAME)の添加によって、完全に阻害された。骨髄間質系細胞の移植後の動態を確認するために、PKH-26を用いた細胞標識を行った。ホルマリンを用いた細胞固定では、PKH-26の蛍光性の低下は認められず、継代によっても蛍光性は維持された。人工血管内腔での細胞の生着を確認するため、包埋と固定方法を検討したが、切片作成時に細胞の人工血管からの解離が起こるため、未だ適切な方法について検討中である。ラット骨髄から初代培養した骨髄間質系幹細胞(MSC)にアデノウィルスを用いて内皮型一酸化窒素合成酵素(eNOS)遺伝子を導入し(MSC/eNOS)、in vitroでのeNOS発現が確認できたため、この細胞を小口径人工血管(内径2mm)内腔に播種した。人工血管でのeNOSの発現を確認するため、抗体を用いて免疫組織学的実験を行ったが、ラットeNOSに対する適切な抗体が見っからなかったため困難であった。そこで、His tagを付加した部分的DNAを元に抗体を作製することを試みている。MSC/eNOSを人工血管に播種したが、人工血管上での一酸化窒素の分泌を確認するための免疫組織学実験は、ラットeNOSに対する適切な抗体が見つからなかったため困難であった。一方、MSC/eNOSを播種した人工血管をウサギ(日本白色家兎)腹部大動脈への移植実験を行っているが、腹部大動脈と移植した人工血管との間に口径差を認め未だに安定した成績が得られていない。今後は、人工血管径の変更が必要と考えられた。そこで、MSC/eNOSの生体での効果を疾患モデルで確認することにした。モノクロタリンで誘導した肺高血圧症ラットに、MSC/eNOSを経静脈的に移植し、肺高血圧症の結果生じる右室収縮期圧と右室肥大、生存期間の変化を測定した。モノクロタリン投与後3週間で右室収縮期圧は有意に上昇し右室肥大が見られた。モノクロタリン投与後1週間目にMSC/eNOSを経静脈的に投与したところ、右室収縮期圧の上昇は有意に抑制された。モノクロタリン投与後3週後にMSC/eNOSを投与した群では、上昇した右室収縮期圧は低下しなかったが、生存期間が延長した。これらの効果は、eNOSの遺伝子導入をしていないMSCを投与した群よりも良好であった。これらの結果から、MSC/eNOSの生体での遺伝子発現効果が確認された。今後も継続して抗eNOS抗体の作製にとりくみ、また同時にMSC/eNOSを播種した人工血管での遺伝子発現効果を確認するために、RIを用いた方法などの導入も予定している。
サービス連携に基づく状況依存型多言語コミュニケーション環境の実現

利用文脈に応じるサービス連携の高品質化では、利用者とサービス品質を含む2次元のデータに利用者の文脈を反映する状況の次元を導入し、サービス品質を最大化するための状況依存型サービス推薦(Situated Service Recommendation)アルゴリズムを初期に提案した。この成果をサービスコンピューティングのトップ国際会議IEEE SCC 2018において発表した。また、実証実験に向けて、多言語サービス基盤「言語グリッド」における言語サービスの層と多言語アプリケーションの層の間に、サービス呼び出しコンポーネント層を実現し、多言語コミュニケーションのデザイン環境として拡張した。この成果を国際会議IC4E 2019においてPlenary Talkを行った。また、多様なIoS/IoTサービスを多言語コミュニケーション現場に適用する際のサービス間の相互影響について分析を行った。IoSとIoTを統合するサービス基盤の高度化では、ネットワーク化されたサーバー上に、エージェント群を展開し、センサー・デバイス群を制御することが求められる。そこで、本研究では分散環境を制御するマクロエージェントと、分散問題解決のためのマイクロエージェントの2層構成のアーキテクチャを設計した。マクロエージェントは、各サーバー上に予めインストールされ、メタシナリオに従って周囲のマクロエージェントと通信し自己組織的にネットワークを形成する。一方、マイクロエージェントは、各サーバー上のデータ構造として実装され、マクロエージェントの制御下で問題解決を行う。これにより、マイクロエージェントは物理的な分散環境を意識することなく、別のサーバ上のマイクロエージェントとインタラクションをとることが可能になる。利用文脈に応じるサービス連携の高品質化では、2段階の状況依存型サービス推薦手法を提案し、おおむね順調に進展している。具体的には、まずデータのスパース性を対応するため、機械学習を用いてサービスデータの拡張を行った。次に、テンソル分解を用いてサービス品質を予測した。多言語サービス基盤において、178,126回のサービス呼び出しデータを用いて初期的に提案手法を検証し、従来の手法よりもサービ品質の予測精度で14%向上させている。また、多言語コミュニケーションにおける状況依存型サービス連携の分析の一例として,機械翻訳サービスの出力を人が観察した際の表情をカメラで取得し分析した。データの分析には、深層学習の一つで時系列解析に特化したLSTM (Long short-term memory)を利用し、翻訳サービスが出力した翻訳文と原文を併記した文を見た人の表情値の変化から、翻訳文の誤訳検出を行った。その結果、誤訳を見た際の表情値の変化パターンの特定を検証し有効性を確認している。IoSとIoTを統合するサービス基盤の高度化では、2層構成の大規模マルチエージェントアーキテクチャを設計し、おおむね順調に進展している。具体的には、ユーザの移動に伴うエージェントの参加、離脱が自由なオープンなシステムを構築するために、実行時の環境に応じてシナリオをエージェントに動的に割り当てられるよう、シナリオの実装と、その実装のエージェントへの割り当てを分離したアーキテクチャの構成とした。さらに、シナリオの割り当てのようなメタ制御を担当するマクロエージェントを制御するために、メタシナリオを記述するために必要となる言語機能を同定し定義した。この成果に基づいて、国際ワークショップMMAS 2018をオーガナイズし、研究発表と議論を行った。利用文脈に応じるサービス連携の高品質化では、これまで提案してきた状況依存型サービス推薦手法の拡張に取り組む。現在はサービスの利用データから時間や位置などの文脈情報を状況として扱っているが、今後は、利用者の文脈情報から自動的に状況を抽出し、IoS/IoT統合環境において、新しいサービス連携のフレームワークとして考案する。また、多言語コミュニケーション環境の実証実験では、今後は、観光や医療支援などの多言語現場の対話エージェントの実現を実証対象とし、状況依存型サービス連携技術の基盤研究成果を順次的に実世界に適用する。IoSとIoTを統合するサービス基盤の高度化では、IoS/IoT統合基盤を実現するためのサービスインタフェースの標準化を行い、IoT環境のセンサー・デバイスサービスの管理機構を実装し、サービス間の相互接続と運用を可能とする仕組みを考案する。大規模マルチエージェントアーキテクチャでは、シナリオ記述言語を拡張し、メタシナリオの処理系を実装する。これにより、マクロエージェントが自己組織的にネットワークを形成し、シナリオの実行可能なマイクロエージェントの発見およびシナリオの割り当てを可能とする。まずは初期実装を終えて、センサー・デバイスと言語サービスを連携させて、多言語コミュニケーションを支援するシステムのプロトタイプを構築する。

一方、マイクロエージェントは、各サーバー上のデータ構造として実装され、マクロエージェントの制御下で問題解決を行う。これにより、マイクロエージェントは物理的な分散環境を意識することなく、別のサーバ上のマイクロエージェントとインタラクションをとることが可能になる。利用文脈に応じるサービス連携の高品質化では、2段階の状況依存型サービス推薦手法を提案し、おおむね順調に進展している。具体的には、まずデータのスパース性を対応するため、機械学習を用いてサービスデータの拡張を行った。次に、テンソル分解を用いてサービス品質を予測した。多言語サービス基盤において、178,126回のサービス呼び出しデータを用いて初期的に提案手法を検証し、従来の手法よりもサービ品質の予測精度で14%向上させている。また、多言語コミュニケーションにおける状況依存型サービス連携の分析の一例として,機械翻訳サービスの出力を人が観察した際の表情をカメラで取得し分析した。データの分析には、深層学習の一つで時系列解析に特化したLSTM (Long short-term memory)を利用し、翻訳サービスが出力した翻訳文と原文を併記した文を見た人の表情値の変化から、翻訳文の誤訳検出を行った。その結果、誤訳を見た際の表情値の変化パターンの特定を検証し有効性を確認している。IoSとIoTを統合するサービス基盤の高度化では、2層構成の大規模マルチエージェントアーキテクチャを設計し、おおむね順調に進展している。具体的には、ユーザの移動に伴うエージェントの参加、離脱が自由なオープンなシステムを構築するために、実行時の環境に応じてシナリオをエージェントに動的に割り当てられるよう、シナリオの実装と、その実装のエージェントへの割り当てを分離したアーキテクチャの構成とした。さらに、シナリオの割り当てのようなメタ制御を担当するマクロエージェントを制御するために、メタシナリオを記述するために必要となる言語機能を同定し定義した。この成果に基づいて、国際ワークショップMMAS 2018をオーガナイズし、研究発表と議論を行った。利用文脈に応じるサービス連携の高品質化では、これまで提案してきた状況依存型サービス推薦手法の拡張に取り組む。
プラスミンおよびプラスミノゲンアクチベータ-による凝固活性化に関する研究

[目的]:急性心筋梗塞に対して血栓溶解療法を施行するとトロンビン形成が生じ、それが冠動脈再閉塞につながる可能性が示唆されているが、その凝固活性化の機序については不明である。今回、この点を明らかにするために血漿に血栓溶解剤を添加して凝固活性化について検討を試みた。[方法]:正常クエン酸血漿および各凝固因子欠乏血漿に種々の濃度のt-PA、プラスミンを添加して、F1+2、TAT、FPA、D-dimerを測定し、その生成量を比較した。また、精製したプロトロンビンにt-PA、プラスミンを加え、F1+2の生成の有無についても検討を加えた。以上の試験に抗凝固剤を添加した際の影響も検討した。[成績]:正常クエン酸血漿にt-PA、プラスミンを添加すると濃度依存的にF1+2、TAT、FPAは上昇した。これはヘパリンを100単位/mlの濃度であらかじめ添加しておくと抑制された。1000単位/ml(治療血中濃度)のt-PAを各凝固因子欠乏血漿に加えた結果、第V、X因子欠乏血漿ではF1+2はほとんど生成されず、第VII、XII因子欠乏血漿ではコントロール血漿に比較してF1+2の生成量は明らかに低下した。なお、大量のプラスミンを生理的濃度の精製プロトロンビンに添加した際、F1+2の生成が認められたが、これは同量のプラスミンを正常血漿に添加した際に生成される量の約1/10と少量であった。[結語]:t-PAをクエン酸血漿に添加すると凝固活性化が生ずるがこれには外因系凝固機序の活性化および第XII因子の関与が示唆され、また、プラスミンによる直接のプロトロンビン活性化の可能性もあり、その機序は複雑であると思われた。
バルトネラ菌由来血管内皮細胞増殖促進因子の分子生物学的解析と臨床応用

(1)Bartonella henselaeが分泌する血管内皮細胞増殖促進因子の精製と物理化学的性状を明らかにした。精製は、陰イオン交換カラムとMicrocon Ultracel YM3を用いた。半透膜を利用する精製・濃縮法は不適であった。本因子は強度の塩基性等電点を有する14kDaのタンパク質であり、細胞調節タンパクの性状に矛盾しない物質であったが、泳動ゲルからの回収処理で容易に失活化したため確実なアミノ酸配列の決定に疑問が残った。(2)タンパク質精製のために、新たにB.henselae迅速培養法を開発し、同菌の臨床分離や同菌からのタンパク回収が容易となった。ネコひっかき病の診断・予防・疫学調査、同菌のタンパク解析に有用であり、同法にてノラネコから複数のB.henselaeを分離し、野性ネコに広く分布しているB.henselae株の病原性比較を行い、血管内皮細胞増殖促進活性、好中球走化性促進活性等に差異がないことを示した。(3)分離株中に血管内皮細胞増殖促進活性を有するがB.henselae用のプライマーで検出されない株を見出した。菌体タンパク電気泳動パターンでB.henselaeと差異があり、同活性を有するBartonella属または別属の新菌種である可能性が高かった。(4)同菌の多彩な生物活性のうち、好中球走化性促進活性因子が分泌性物質であり、N-formylpeptideではないことを明らかにした。B.henselae感染では特徴的なリンパ節炎を生じるが、リンパ管内皮細胞からのCCR21分泌と好中球表面のCCL7リガンド発現が亢進することを示し、病巣形成機序およびリンパ管内皮細胞と好中球の相互作用の解明につながる知見であった。(5)培養上清によるマウス皮内の血管新生は認められず、動物による特異性の今後の検討が必要である。ウサギ血液加BHI寒天平板培地上にBHIブロスを重層する培養法(BHI+BHI法)でB.henselaeの比較的迅速な増殖を認めた。重層法の固形培地ならびに液体培地の見直しを行った。液体培地に胎児ウシ血清、ヘミン、ヘマチン、鉄イオン等を添加した。その結果、BHIブロスは基礎培地として不適であることが分かった。基礎培地をBrucellaブロス(BB)に替えた培地ではヘミン、ヘマチンの添加により良好な増殖が観察された。また、ウサギ血液加BB寒天培地にBBブロスを重層する培養法(BB+BB法)では極めて良好な増殖が得られた。この培養法がB.henselaeの迅速培養に適しているかどうかを、ネコ血液からのB.henselae分離率と分離日数の点で検証した。BB法は、平板でなく組織培養フラスコを用いて従来よりも多量のネコ血液を接種する方法を採った。その結果、BHI平板法での分離率が4.8%、コロニー形成に約1ヶ月を要したが、BBフラスコ法では分離率35.7%と向上し、コロニー形成は710日に短縮した。このBBフラスコ法は接種血液量が多い、雑菌の混入が少ない、培地の乾燥が遅い、残存する液体中でB.henselaeの増菌が期待できる、分離率がよい等の利点を有していた。

さらに、ウサギ血液加BB寒天培地上にBBブロスを重層する培養法(BB+BB重層フラスコ法)とヘマチン添加BB液体培地とでのB.henselaeの増殖を比較するとBB+BB重層フラスコ法の液体培地の菌による混濁が速やかに生じることが確認され、B.henselaeの迅速培養にBB+BB重層フラスコ法を用いることにした。血管内皮細胞増殖促進因子の精製と好中球走化性因子の確認現在、血管内皮細胞増殖促進因子の精製のためにBB+BB重層フラスコ法で菌を増殖させ培養上清を蓄積している段階である。新に、培養上清に好中球走化性因子が分泌されている可能性を示すデータを得ており、確認実験を実施中である。ウサギ血液加BHI寒天平板培地上にBHIプロスを重層する培養法(BHI+BHI法)を用いてノラネコの血液より23株のB.henselaeを分離した。全ての分離株の培養上清には内皮細胞増殖促進活性因子が分泌されており、培養上清添加により血管内皮細胞増殖は約2倍に促進した。増殖促進効果は最大3倍を示した。また、好中球に対する走化性誘導能も培養上清は有していることを明らかにした。走化性誘導能に関しては、活性に分離株で差が認められた。血管内皮細胞増殖促進因子の精製2次元電気泳動により上記分離株の培養上清中タンパク質のプロファイルを確認した。分子量の大きいタンパクは酸性等電点を、分子量の小さいタンパクは塩基性等電点を示す傾向にあり、全ての菌株培養上清に共通して同程度に認められるタンパク群と、濃度が各株で異なるタンパク群が認められた。また、培養上清をperfusion chromatographyにて分画すると血管内皮増殖促進活性は陰イオンカラムにおける非吸着画分に流出し、血管内皮細胞増殖因子はカラムに対する挙動から塩基性等電点を有する物質であることが推測された。2次元電気泳動によりこの分画には酸性等電点を示す16kDaタンパク、中性等電点を示す80kDaタンパクおよび塩基性等電点を示す小分子量のタンパク群が存在していた。現在、これらのタンパクを精製、濃縮し血管内皮細胞増殖促進活性を確認し、TOF-MS解析を行う準備段階にある。(1)Bartonella henselaeが分泌する血管内皮細胞増殖促進因子の精製と物理化学的性状を明らかにした。精製は、陰イオン交換カラムとMicrocon Ultracel YM3を用いた。半透膜を利用する精製・濃縮法は不適であった。本因子は強度の塩基性等電点を有する14kDaのタンパク質であり、細胞調節タンパクの性状に矛盾しない物質であったが、泳動ゲルからの回収処理で容易に失活化したため確実なアミノ酸配列の決定に疑問が残った。(2)タンパク質精製のために、新たにB.henselae迅速培養法を開発し、同菌の臨床分離や同菌からのタンパク回収が容易となった。ネコひっかき病の診断・予防・疫学調査、同菌のタンパク解析に有用であり、同法にてノラネコから複数のB.henselaeを分離し、野性ネコに広く分布しているB.henselae株の病原性比較を行い、血管内皮細胞増殖促進活性、好中球走化性促進活性等に差異がないことを示した。(3)分離株中に血管内皮細胞増殖促進活性を有するがB.henselae用のプライマーで検出されない株を見出した。菌体タンパク電気泳動パターンでB.henselaeと差異があり、同活性を有するBartonella属または別属の新菌種である可能性が高かった。(4)同菌の多彩な生物活性のうち、好中球走化性促進活性因子が分泌性物質であり、N-formylpeptideではないことを明らかにした。
メダカを用いた体表模様パターン形成機構の解明

hagoromoはゼブラフィッシュのストライプパターン変異体から単離された遺伝子であり、体表模様形成に重要な働きがあると考えられている。これまでの本研究から、熱帯に生息するメダカを含め体表模様が多様な魚類において選択的スプライシングにより、多くの種類のmRNAが生成されることが明らかとなっていた。しかし、それらmRNAから翻訳されるタンパク質の種類やその局在は未知である。そこで本年度は、hagoromo mRNAから生成することが予想されるタンパクが生体内のどの組織にどれくらいの量が局在しているかを明らかにし、その機能を解析することを目的とし研究を行った。タンパク質の検出方法としてHagoromoタンパク質の抗体を作製することを試みた。抗体の作製には目的タンパク質を大量に発現、精製しウサギなどに免疫を行う必要がある。そこで始めにHagoromoタンパク質の大腸菌での大量発現を行った。このタンパク質はユビキチン系のE3複合体内のF-box WD40と相同性を持ちF-box domainとWD40 repeatdomainからなると予想される。全長hagoromo cDNAからの発現では多種の条件を検討しても目的タンパク質を発現できなかった。しかしWD40 repeat domainのみでは発現に成功した。発現したHagoromoタンパク質は封入体を形成したために、Guanidineで可溶化させ精製を行い、その後透析により徐々にGuanidineを除去し、refoldingさせた。今後、このタンパク質の抗体を作製しHagoromoタンパク質の局在を検出する予定である。今年度はメダカ、もしくはその近縁魚類の体表模様形成におけるhagoromo遺伝子の選択的スプライシングの役割を明らかにすることを主眼に置き実験を行った。始めにメダカよりhagoromo遺伝子を単離することを試みた。ゼブラフィッシュ、フグ、シクリッドのhagoromo遺伝子の配列をもとに魚類共通にhagoromo遺伝子をRT-PCRで増幅できるようなプライマーを設計した。このプライマーを用いメダカRNAを鋳型にRT-PCRによりhagoromo遺伝子の部分配列を単離した。この配列をもとに上流向き、下流向きのプライマーを作成し5',3'-RACE法により全長配列の単離に成功した。同様の方法で性的二型が大きくオスの体表模様が派手なNothobranchius属、Aphyosemion属の卵生メダカよりhagoromo遺伝子を単離した。これら三種におけるhagoromo遺伝子の選択的スプライシングの解析を行ったところ、Aphyosemion属の種において選択的スプライシングが見られ、exon 7の除かれたmRNAが発現していることが明らかとなった。次にさらに多くのスプライシングパターンを見いだすために、卵体性メダカの仲間で品種改良により多くの体表模様の品種が生み出されているグッピーに着目した。グッピーは品種改良がはじまってからまだ150年程しか経っておらず、原種と品種では遺伝的に極めて近縁であると考えられる。卵生メダカと同様の方法でグッピーよりhagoromo遺伝子を単離した。この配列をもとにグッピーの原種と3品種を用いてhagoromo遺伝子の選択的スプライシングの解析を行った。その結果、原種では選択的スプライシングは見られなかったが、3品種のすべてで選択的スプライシングが見られ、それぞれの品種で発現するmRNAのパターンは異なっていた。これらmRNAの配列を決定してみたところ、exon 7の除かれたmRNA、exon 3の除かれたmRNA、exon 2,3の除かれたmRNAなどが発現していることが明らかとなった。来年度はインジェクション法などを用い、メダカにおけるhagoromo遺伝子の選択的スプライシングの機能を解析していく予定である。
重力の量子論的効果が存在する統計模型における量子臨界現象の解明

統計力学において物理量の揺らぎが発散し長距離相関を引き起こす現象を、臨界現象と呼ぶ。特に絶対零度で起こる臨界現象が知られており、その揺らぎの種は量子揺らぎであるため、量子臨界現象と呼ばれる。本研究では重力の量子論的効果が存在する2次元空間の統計模型の内、原子等の磁気モーメントを模したイジングスピンを含むカザコフ模型で量子臨界現象を議論する。重力の量子論的効果は2次元空間自体の揺らぎを引き起こすため、それに起因する量子臨界現象は極めて異質であると予想される。本研究はカザコフ模型の量子臨界現象が示す性質を体系的に理解することを目的とする。
電子エネルギー損失分光法を用いた薄膜成長機構に与える水素原子の役割に関する研究

本研究の目的は、高分解能電子エネルギー損失分光(HREELS)法及び反射高速電子線回折(RHEED)を用いて、エピタキシャル成長及び選択成長などの成長初期における結晶表面状態の評価を行い、それらの成長過程を決定することである。特に、膜の成長を大きく左右する水素の役割に着目し、IV族半導体エピタキシャル成長機構及び膜の結晶性に与える表面吸着水素の影響について調べた。得られた主な結果は以下の通りである。1)Si_2H_6を用いた、基板温度550°C以下のSi(100)基板上のSi膜のエピタキシャル成長においては、成長の活性化エネルギーが、Si(100)表面からの水素脱離の活性化エネルギーと一致しており、水素の脱離反応が成長を律速することがわかった。また、Si膜を成長するときに原子状水素を同時供給すると水素の表面被覆率が増加し、Si膜の成長速度を抑えることができることを見出した。これは、水素による成長制御の可能性を示唆している。さらに、表面吸着水素が、Si原子及びSi水素化合物の表面拡散を阻害する結果を持つことを明らかにした。2)Ge2.5ML/Si(100)基板上のSi膜の成長において、Ge原子の表面偏析が観察された。成長速度の変化からその減衰長を見積もり、表面編成現象を定量的に評価した。原子状水素を同時供給することにより、Ge原子の表面偏析は抑制されるものの、成長条件によってはSi膜の3次元島状成長を促進することがわかった。この結果は、表面吸着水素がSi膜の成長機構にも大きく影響を及ぼすことを意味している。この成長メカニズムについては現在検討中である。高分解能電子エネルギー損失分光(HREELS)装置を用いてシリコン基板表面における水素原子および反応原子の結合状態を調べ、表面反応に与える水素の影響を明らかにした。本年度は、特にシリコンの初期酸化に注目し、研究を行った。超高真空中で熱清浄化したシリコン表面を原子状水素に晒して作製した水素終端シリコン表面は、全ての未結合手が水素で終端されたダイハイドライド構造であった。この表面は基板温度350°Cまで酸化されず、水素終端処理がシリコン表面の不活性化に有効であることが確認された。さらに高温にした結果、表面の水素の脱離とともに酸素の吸着が観測され、シリコンの酸化には未結合手が必要であることが明らかとなった。一方、フッ酸溶液処理により作製した水素終端シリコン表面は、原子状水素の吸着により作製した表面と同様にダイハイドライド構造であったが、HREELSスペクトル中にわずかに炭化水素および酸素の吸着が観測された。この表面を室温で酸素雰囲気に晒したところ、スペクトルに変化は見られなかった。この結果は、この処理方法により表面に残留した不純物が、シリコン表面の不活性化にはほとんど影響しないことを示している。今後は、フッ酸処理により作製した水素終端面の昇温酸化を調べ、原子状水素を用いて作製した水素終端面との比較から、表面不純物や表面平坦性が表面反応過程に及ぼす影響などについて明らかにしていく。本研究の目的は、高分解能電子エネルギー損失分光(HREELS)法を用いて、エピタキシャル成長及び選択成長などの成長初期における結晶表面状態の評価を行い、それらの成長過程を決定することである。1)Si (100)表面における水素の吸着は、ダイマーのダングリングボンドに吸着した後、Si-Siダイマー結合を切って吸着しダイハイドライド構造を形成する。水素飽和吸着面からの水素の熱脱離も二段階の脱離過程を持つ。

最初の水素の脱離は熱処理温度300°Cから始まり、この脱離により水素の吸着状態はダイハラドライド状態からモノハイドライド状態に変化する。第二段階の水素の脱離は熱処理温度400°Cから起こり、Si-H状態からの水素の脱離に対応する。このときの活性化エネルギーは2.3eVであった。2)基板温度550°C以下のSi (100)基板上のSi膜のエピタキシャル成長においては、成長の活性化エネルギーが上記の水素脱離のそれと一致しており、水素の脱離反応が成長を律速することがわかった。また、Si膜を成長するときに原子状水素を同時供給すると、水素の方面被覆率が増加し、成長速度を抑えるだけでなく、Si原子及びSi水素化合物の表面拡散を阻害する効果を持つことが明らかになった。3)Ge2.5ML/Si (100)基板上のSi膜の成長において、Ge原子の表面偏析が観察され、成長速度の変化からその減衰長を見積もった。原子状水素を同時供給することにより、Ge原子の表面偏析が抑制されたが、成長条件によってはSi膜が3次元島状成長することがわかった。この結果は、表面吸着水素がSi膜の成長機構にも大きく影響を及ぼすことを意味している。この成長メカニズムについては現在検討中である。
近赤外レ-ザ-光を用いる生体酸素代謝の無侵襲測定。特に本法の臨床応用をめざして

1)近赤外レ-ザ-分光測定装置の設計試作:最大400mwまで出力可変連続発振近赤外レ-ザ-ダイオ-ドを4個使用する4波長解析システムを試作した。現在安全性の面から100mw以下の出力で780、850、830nmの3波長を用いて実験、臨床に使用している。組識透過又は反射レ-ザ-光はシソコン受光素子で検出しCPUにより独自に作製した則定演算式を用いて組織中の酸化へモグロビン(Hb)量、血液量の測定を施行している。測定演算式は独自のアルゴリズムにより実験的に決定した。2)基礎研究はラットを用い試作装置および測定演算式の検定を行いHbの測定に関して満足すべき結果を得た。近赤外分光法を用いて脱血ショツク・ラットを対象に組織障害の可逆性をミトコンドリヤ酸素代謝を中心に険討し興味ある結果を報告した。3)臨床応用は実測10mwの低出力レ-ザ-を用い上述の3波長測定を行なった。ヒト四肢筋肉血液量、酸素濃度変化の測定から開始し乳児成人頭部での反射法による計測を試み実用化に近づいた。光学センサ-部の改良、外乱光遮光の工夫により手術室で主に体外循環を用いる心臓大血管手術時の脳酸素濃度血液量モニタ-に応用し本法の有用性を確認した。本法では臨床においては測定値の定量化が極めて困難であったが組織内光路長をほぼ決定する事により測定値の標準化が可能となった。4)今後の課題としてはより高出力レ-ザ-使用による透過測定法の臨床応用、脳筋肉チトクロ-ムオキシダ-ゼ酸素濃度の正確な測定法の開発とその臨床導入が待たれる。5)以上の成果は学会、論文等に公表して来たが本法の今後の普及と実用化は目の前にあると言える。1.高感度近赤外分光測定装置の試作:脳、四肢筋肉組織など血液に含まれる酸化および還元ヘモグロビン量、全ヘモグロビン量を光を用い無侵襲に測定する事を目的に多目的分光装置の開発を試みた。光源に4個の半導体レ-ザ-素子を用い、4波長レ-ザ-光を順次に組織に照射しその透過または反射光をシリコン受光素子で検出する方式を採用した。用いた近赤外レ-ザ-素子の波長、出力特性などは後に公表するが、約10cmの厚さを有す生体組織の透過測定を目的としている。この4波長の組織吸光変化を受光素子で感知増巾の後に組織ヘモグロビン、およびチトクロ-ム酸化酵素の吸収変化として標示するため独自に決定した測定式を用いた。この演算測定式の詳細はその原理および算出方法などを含めすでに報告した(代表者文献参照されたい)。2.非侵襲センサ-の試作:集光したレ-ザ-光を石英ファイバ-で導光し、プリズムを用いて皮膚面を直角に照射せしめた。この目的で小型軽量の送光用プロ-ブを試作した。受光には1.0×1.0×0.4cm大の受光素子を内蔵した軽量接着性に優れた光センサ-を工夫した。3.ヒト赤血球を対象に780、805、830mmの近赤外3波長を用いるより安定した測定法(臨床応用をめざした)を検討し、ラットを用いたin vivo検定で満足すべき結果を得た。4.低出力レ-ザ-を用いた基礎的検討により、ヒトの四肢筋肉内血液量、酸化ヘモグロビン量などの測定に成功し、実用化に大きく近づいた。

5.以上の成果の一部は第27回日本人工臓器学会、第7回国際人工臓器学会などに口頭発表した。6.今後の課題として脳、筋肉チトクロ-ム(aa3)の酸素濃度の正確な測定法の開発と臨床使用における安全性の確立などが挙げられる。1)高感度近赤外分光測定装置の試作:組織血液中の酸化および還元ヘモグロビン量、チトクロ-ム酸化酵素の酸化還元変化の無侵襲計測を目的に近赤外レ-ザ-分光装置を試作した。光源に最大出力400mwまで可変の4個(780,790,805,830,nm)の半導体レ-ザ-素子を用い4波長レ-ザ-光を組織に照射し反射又は透過光をシリコン受光素子で検出する方式を採用した。この4波長の組織吸光変化をマイクロコンピュ-タ-で処理し独自に決定した測定演算式により組織ヘモグロビン、チトクロ-ム酸化酵素の測定を行うものである。2)臨床応用:生体への安全性を考慮し、最大出力30mwの低出力で組織(脳、筋肉)酸化および還元Hb量の測定を試みた。この場合は780,805,830nmの近赤外3波長を用い独自のHb演算式によりほぼ満足するべき結果を得た。臨床使用は主に体外循環を用いた心臓大血管手術時の脳酸素モニタ-に応用しその有用性を確認した。本測定法の臨床応用には今だ幾つかの問題点が残されているが各症例間での測定値の標準化に成功し測定成績の比較検討が可能となった。以上から本計測法の実用化に大きく近づいたと結論される。3)基礎的研究としては出血性ショックラットを対象に脳組織傷害の程度とその可逆性をチトクロ-ム・オキシダ-ゼの挙動を中心に検討し興味ある事実を発見した。さらにPGI_2アナログの組織保護効果を近赤外分光法を用いて実証した。4)以上の成果は第43回日本胸部外科学会、第31回日本脈管学会その他に口頭発表し関心を集めた。5)今後の課題としてより高出カレ-ザ-の安全性の確立とチトクロ-ム酸化酵素の測定法の臨床導入が挙げられる。
タンパク質の立体構造の計算機による解析法の開発とそれを用いた立体構造の解析

1.タンパク質の立体構造解析プログラムFEDER/2の開発(1)タンパク質のみを対象としたプログラムFEDERを、ツリ-構造をもつ分子一般に拡張するため、アルゴリズムとデ-タ構造の改良を行った。(2)真空中だけでなく、水溶液中のシミュレ-ションも行うことができるようにするため、水和殻モデルによる水和エネルギ-の計算機能を追加した。(3)値の大きな極小植からの回避は極小化法の重要な機能の一つであるが、可変目的関数法、シミュレ-ティド・アニ-リング法、モンテカルロ法、linearized embedding法などの手法を適用できるよう改良した。(4)複数鎖からなる系を取り扱うことができるように、現在プログラムを改良中である。2.タンパク質の立体構造の解析(1)基準振動解析によって、動的視点から、タンパク質のドメイン構造を研究した。(2)真空中と水和エネルギ-を考慮した系でシミュレ-ションを行い、その比較研究を行った。(3)オキシトシンの溶液中のNMR距離解析デ-タをもとに立体構造決定の問題を取り扱い、その構造の多形性について研究を行った。(4)立体構造既知のタンパク質から統計的解析によって得られた経験的な距離情報が、アミノ酸配列だけから高次構造を推定しようとするときどれだけの情報量をもつか研究した。(5)極小化法を改良するために、BPTIのX線結晶構造をもとにNMR距離解析の擬似デ-タを作成し、初期値の問題、立体構造エネルギ-の問題などを研究した。1.タンパク質の分子シミュレ-ションへの水和エネルギ-の導入:従来から行われていた真空中でのタンパク質の立体構造エネルギ-に、原子の露出表面積に比例するとして水和エネルギ-項を加え、溶液中の立体構造エネルギ-計算が可能なプログラムを作製した。溶液中における計算が、タンパク質の振舞いにどのような影響を与えるかを調べるため、天然構造とほどけた構造という二つの初期構造のそれぞれに対して、真空中と溶液中の二つの状態でのモンテカルロ・シミュレ-ションを行った。シミュレ-ションの結果を検討したところ、従来の真空中のシミュレ-ションで顕著に現れる欠陥のいくつかが改良されることが確認できた。2.基準振動解析法によるタンパク質のドメイン構造の解析:従来、タンパク質のドメイン構造といえば、幾何的視点から定義された静的なものだけであったが、基準振動解析から得られる各残基ペアごとの運動方向の相関を調べることによって、動的な意味でのドメイン構造を定義することができることを示し、結晶構造が明らかにされているタンパク質に対して、そうしたドメインを同定するための計算方法を提案した。3.NMRから得られる水素原子間の距離情報に矛盾しない立体構造を生成するプログラムの開発と、得られた構造の多型についての研究:われわれが開発した二面角を独立変数とする立体構造エネルギ-計算用プログラムFEDERをより一般化し、更に、NMR距離解析にも利用できるようにした。応用問題として、オキシトシンの溶液中の立体構造に関するNMRデ-タから、その立体構造を決定し、更に、立体構造エネルギ-的観点から得られた構造を検討した。その結果、従来、タイプIのタ-ンをもつ構造だけが示されていたが、タイプIIのタ-ンをもつ構造も得られ、多型をもつ可能性があることを強く示唆した。1.タンパク質の分子シミュレ-ションへの水和エネルギ-の導入:昨年度、水和殻モデルによって水和の自由エネルギ-を見積るプログラムを開発し、真空中と溶液中におけるモンテカルロ・シミュレ-ションの比較を行ったが、本年度は、短いペプチド断片を取り上げ、水和エネルギ-を考慮したsimulated annealing法(SA法)を行うための最適のプロトコルを見出すための研究を始めた。まだ現在進行中であるが、すでにエネルギ-の高い極小構造の回避などの点でSA法の威力を確認している。

2.NMRからタンパク質の溶液中の立体構造に関して得られるいくつかの原子ペアに対する距離情報は、立体構造を厳密な意味で一意的に決定するだけの質も量もないのが一般的である。そのためそれらの情報から立体構造を決定するために行う最適化法には、目的関数の値が低い構造を効率的に探索することはもちろんのこと、偏りなく可能な構造を生成することが要求される。本研究課題で開発中のプログラムFEDER/2の性能を評価する意味で、BPTIというタンパク質をモデル系としてそうした観点からのいくつかのテストを行い、非常に良い結果を得た。3.立体構造既知のタンパク質から統計的解析によって得られた経験的な距離情報を使って、アミノ酸配列だけから高次構造に関して、どのような情報が、どの程度の確信をもって引き出すことができるかをいくつかのタンパク質について調べた。この問題は、手法的にNMRにおける距離解析と通じるところがあり、今後立体構造エネルギ-計算と組み合わせて、立体構造のわからないタンパク質について、そのアミノ酸配列からもっともらしいいくつかの構造を生成し、評価する方法の開発へと発展させていきたいと考えている。極小化法改良の試み(1)立体構造エネルギ-導入の効果:タンパク質の立体構造を決定するうえで、立体構造エネルギ-が評価関数としてどの程度有用かを調べるため次のことを行った。まずBPTIのX線結晶解析デ-タをもとにNMR距離解析によって得られるであろう距離デ-タ(だだし、比較的質が悪く、一意的に立体構造が決まらないようなデ-タ)を作成し、その距離情報を持たす立体構造を目的関数の極小化によっていくつが求めた。次に得られた立体構造を目的関数と立体構造エネルギ-関数に関して極小化し、さらにエネルギ-関数のみを極小化した。こうして得られた立体構造を結晶デ-タと比較したところ、立体構造エネルギ-の導入が、限られた範囲ではあるが、立体構造決定に役立つことがわかった。2.極小化法改良の試み(2)linearized embedding法の適用:極小化の初期値をできる限り合理的に選択するための一つの方法として、NMR距離解析によって得られたデ-タから線形計画法を利用して二面角の値を推定するプログラム(Crippenが開発したlinearized embedding法の応用)を作成した。実際に極小化の初期値として利用したところ、利用しないときに比べ、顕著な効果がみられた。3.複数鎖への拡張:これまでプログラムは単一鎖からなる分子しか計算対象とすることができなかったが、複数の鎖からなる系に対しても適用できるようにプログラムを拡張することを計画し、現在進行中である。4.変数を固定する場合の効率化:タンパク質の折れたたみを議論するとき、タンパク質のもつ構造の階層性は重要な意味をもつ。そこで、それが自然に取り込まれるようなアルゴリズムをもったプログラムとするため、ある範囲の二面角を固定することができ、しかもその範囲を順次拡張することが効率的にできるよう改良中である。
支配株主の情報開示義務

支配株主の情報開示義務の問題については、アメリカの学会でも未だよく議論されていないようであるが、そのような義務は支配株主の信認義務の脈絡に位置づけられるようである。判例上、そのような義務を見出することも困難を極めたが、一応、支配株主の情報開示義務は、会社に対する開示と少数派株主に対する開示に分けられる。少数派株主に対する開示について判示したものに、Grant V.Winstead,476 So.2d 36(Åla.1985)があるが、そこでは支配株主の情報開示義務については否定されている。一方、会社に対する開示については、デラウェア州の裁判所において肯定的に示唆したものがある。Thorpe V.Cerbco,Inc.,676A,2d,436(Del.Supr.1996)は、East社の支配権獲得を目論むINA社がEast社の親会社であるCerbco社の取締役Erikson兄弟に交渉を申し込んできたところ、たまたまそのErikson兄弟がCerbco社の支配株主でもあり、Erikson兄弟はCerbco社における自己の支配株式をプレミアム付で売却することだけを優先し、Cerbco社の取締役会に情報開示せず、結局、Cerbco社がそのEast社株式をINA社に売却する交渉の機会を奪ったケースである。裁判所はErikson兄弟は、Cerbco社の取締役会に対して、INA社がEast社の支配権獲得を目論んでいることについて情報開示すべきであったと述べている。ただ、支配株主としてのErikson兄弟は、Cerbco社が保有するEast社株をINA社に売却することについては、デラウェア州法271条に基づき、拒否権を有していたので、いずれにしても、Cerbco社がそのEast社株式をINA社に売却することは不可能であったことを考慮すれば、Cerbco社に取引上の損害は発生していないと判示した。この判決は、支配株主が、同時に取締役でもあったため、判示されている義務が、支配株主としての義務なのか、取締役としての義務なのか、あるいは両方を含むのか、いまひとつ判然としないが、支配株式の譲渡の場合において、支配株式取得を目論む者に関する情報の会社に対する開示の必要性について、アメリカ、しかもデラウェア州の裁判所において議論されていることを見出せたことは意義深いものがある。支配株主の情報開示義務に関して、ドイツの株式法の状況について研究した。とりわけ、支配権の変動をもたらす支配株式取得による企業買収の局面をとらえて、支配株主の情報開示のあり方について検討した。このような企業買収においては、まず株主の保護が問題となり、またそれが敵対的企業買収であれば、支配権取得を意図する者と対象会社の経営者ないし、支配株主との関係も問題となる。敵対的企業買収において対象会社の経営者が企業の維持に務めるべく、積極的に防衛策を探ることにつき、ドイツでは、株式法119条1項8号に基づき、株主の権限であるとの理由で批判がある。そこで、株式を大量に保有する株主の開示規制が重要であるとされる。また敵対的な買収でなくても、支配株主が株式を売却する際に獲得する支配権プレミアムが、少数派株主との関係で問題となり、この意味でも、支配株主の開示規制は重要性を増す。わが国では、支配株主の取引については、商法は特別の規制を行っておらず、ただ、投資家保護の観点から、証券取引法が、5%ルールや公開買付等の規制を行なっているにすぎない。これに対し、ドイツでは株式法20条の「通知義務」を通じて、株主の開示規制が行なわれ、また、支配権プレミアムの問題につき、支配株主の行為規制として、平等取扱い義務が課せられるとの学説がある。次はアメリカの状況について検討していきたい。

この判決は、支配株主が、同時に取締役でもあったため、判示されている義務が、支配株主としての義務なのか、取締役としての義務なのか、あるいは両方を含むのか、いまひとつ判然としないが、支配株式の譲渡の場合において、支配株式取得を目論む者に関する情報の会社に対する開示の必要性について、アメリカ、しかもデラウェア州の裁判所において議論されていることを見出せたことは意義深いものがある。