hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
二相流動－変形－化学的浸透の統合的連成による遅い流れ場での泥質岩岩石物理学の創成

3.極めて遅い流れ場での空間的に不均質な二相流体流動に伴う変形過程の検討に向けて、水で飽和した泥質岩中に極めて遅い流量でガスを圧入する予察的室内実験を実施した。空間的に不均質な二相流体流動として、コア試料の中心軸に沿った局所的なガスの流動を仮定し、変形-二相流体流動連成解析を実施したものの、実験結果は再現されなかった。ガスの流路のパターンの単純さが原因となった可能性があり、今後ガスの流路としてより現実に近いものを適用し、解析を試みる必要があると考えている。進捗については、概ね予定通りである。ただし、以下の点について、課題が明確になっている。1.反射係数の塩濃度依存性の計算コードについては、連成解析コードに組み込むためには、物質量保存式の計算フローとの整合性の問題や、数値安定性の問題があることが明らかとなった。これらの点は、次年度以降も引き続き検討を継続し、改良していく必要がある。2.化学的浸透に関連する室内実験の結果には、大きな計測誤差が含まれており、数理モデルと比較しながら詳細に議論するには、実験系の見直しを行う必要があると考えられる。化学的浸透と変形の連成過程に関して、泥岩試料内に濃度差を与えることにより化学的浸透を引き起こし、それに伴う変形を計測する室内実験を行った。歪計測は分布式光ファイバーセンシング(以下DOFS)および電気式歪ゲージの2通りで行った。実験では、泥岩の側面及び上面にシリコンを塗布し、これらの面が周囲の溶液と接しないようにした上で、泥岩を間隙水より10g/L程度濃度の高い溶液中に設置し、1次元的に化学的浸透が発生する条件で実験を行った。実験結果より、10日程度の実験においては、DOFSによって安定した歪計測を行えること、歪ゲージによる計測では時間的に密な計測を行え、実験初期に有意義な情報が得られることがわかった。実験では、稚内層泥岩および小鹿野町層泥岩の2種類の泥岩を用いたが、両者で100με程度の周方向の収縮が計測された。海水の濃度が30g/L程度であることを考えると、沿岸域において半透膜性を持つ地層が100με程度変形することは普遍的である可能性がある。極めて遅い流れ場での二相流体流動に伴う変形過程の検討に向けては、水で飽和した泥岩試料にガスを圧入する室内実験を実施した。試料内部のCT値分布と試料の周方向の歪分布のデータを取得することにより、試料全体における不均質な二相流体流動と特徴的な収縮歪の観察に成功した。さらに、塩が析出する現象を含め、泥岩中の塩水流動および水蒸気輸送の室内実験を行った。数値解析技術に関しては、前年度に導出した多孔質弾性体中の二相流動ー溶存物質浸透ー変形ー熱輸送の連成理論に基づき、有限差分法によるシミュレータのコーディングを行った。今年度は、二相流動ー溶存物質浸透ー熱輸送の連成解析まで完了した。また、数値拡散による誤差評価のために、極座標系において分子拡散と水力学的分散の両方を含んだ移流分散方程式の解析解を導出し、コードの精度検証を行った。泥岩の化学的浸透に関する課題について、室内実験・原位置試験と数値計算の両方を並行的に行っていくことを予定しており、これまでに化学的浸透に関する原位置試験・室内実験を実施してきた。一方、数値計算に関しては、COMSOLを用いた計算を行っているが、原位置試験の結果の再現を試みる過程で濃度挙動がうまく計算されていないことがわかったため、現在その問題の評価と検証を行っている。
幼児の活動量増加と活動意欲形成に関する研究

本研究では,幼児の身体活動量を増加させ身体活動意欲を形成するために,以下の4つの課題を設定し遂行した.1.幼児における身体活動量と運動能力の関係:運動能力では4歳後半から男女差がみられ,女児では運動能力が高低に二極化する傾向が認められ,身体活動量の多寡が運動能力に影響を及ぼすことが示唆された.2.幼児における身体活動評価尺度の開発:「よく動く子」の概念を具体化するための調査から尺度項目を収集し,それをもとに尺度項目を決定し,信頼性と妥当性の検証を行った.その結果,「プレイ」「リーダー」「チャレンジ」「ソーシャル」の4因子15項目で構成される「子どもアクティビティ尺度」が開発された.3.幼児における身体活動量増強のための介入と検証:行動科学の理論と技法に依拠し,活動量増強をねらいとした「動いてみたくなる」短期的プログラムを作成し,愛知県R幼稚園において介入を行いその効果を検証した.環境,保育者,親からのアプローチを複合させた今回の介入構想は,特に非活動群への効果が顕著に見られ,幼児の身体活動量増強の観点として有用な知見が得られた.4.「こころとからだで表わす」プログラムの実践と考察:身体表現活動を核にした保育実践をもとに,幼児におけるこころとからだの相互作用を検討し,プログラムの意義を明らかにした.本研究では,幼児の身体活動量を増加させ身体活動意欲を形成するために,以下の4つの課題を設定し遂行した.1.幼児における身体活動量と運動能力の関係:運動能力では4歳後半から男女差がみられ,女児では運動能力が高低に二極化する傾向が認められ,身体活動量の多寡が運動能力に影響を及ぼすことが示唆された.2.幼児における身体活動評価尺度の開発:「よく動く子」の概念を具体化するための調査から尺度項目を収集し,それをもとに尺度項目を決定し,信頼性と妥当性の検証を行った.その結果,「プレイ」「リーダー」「チャレンジ」「ソーシャル」の4因子15項目で構成される「子どもアクティビティ尺度」が開発された.3.幼児における身体活動量増強のための介入と検証:行動科学の理論と技法に依拠し,活動量増強をねらいとした「動いてみたくなる」短期的プログラムを作成し,愛知県R幼稚園において介入を行いその効果を検証した.環境,保育者,親からのアプローチを複合させた今回の介入構想は,特に非活動群への効果が顕著に見られ,幼児の身体活動量増強の観点として有用な知見が得られた.4.「こころとからだで表わす」プログラムの実践と考察:身体表現活動を核にした保育実践をもとに,幼児におけるこころとからだの相互作用を検討し,プログラムの意義を明らかにした.幼児を対象にした運動能力測定の結果、4歳後半からすでに男女差がみられ、女児では運動能力評定点が高い低いに別れる二極化傾向がみられた。保育者らの観察から、日常の生活のなかで運動する子としない子に別れているのではないかという印象が語られたため、生活習慣記録機(ライフコーダ)を用いて4歳児の身体活動量を測定した。結果は以下のようであった。(有意水準P<0.05)1.1日あたりの平均歩数は、男児13757歩、女児11138歩であった。女児では運動能力上位群が下位群に比べて有意に多かった。男児では両群間に有意差が認められなかった。2.1日あたりの平均運動量は、女児では運動能力上位群が下位群に比べて有意に多かった。3.1日あたりの全運動の平均積算時間及び高強度の平均活動時間は、女児では運動能力上位群が下位群に比べて有意に長かった。これらのことから、調査対象園の女児に関しては日常生活のなかで運動する子と運動しない子に別れている傾向がみられ、それらが運動能力に影響を及ぼしていると考えられた。また、運動能力下位群女児に対して保育者が感じていた「静かに遊ぶことが多い」という漠然とした印象が活動歩数や運動強度の問題として示された。さらには行動観察から、活動量の少ない原因として他者と関わる力の弱さが認められ、身体活動意欲形成の重要な要因が示唆された。また本研究では、これらの基礎的な測定調査と合わせて、活動意欲形成のための「こころとからだで表すプログラム-身体表現あそび-」の方法を検討し保育現場での実践を試みている。本研究における平成14年度の主な目的は、幼児の身体活動をとらえるための評価尺度の開発と、身体活動意欲増強のための「こころとからだで表わすプログラム」の作成及び実践であった。幼児の身体活動をとらえるための評価尺度の開発では、主として幼稚園・保育園内での子どもの生活を焦点にした尺度の開発をめざし、その手立ての第1段階として評価尺度の項目を収集した。愛知県内の幼稚園・保育園の保育者を対象にした郵送による質問紙調査を行い、152名の保育者の記述の分析から「よく動く子」の概念を具体化することを試みた。保育者の記述からは1195例の記述が抽出され、内容の読み取りから56項目に分類された。さらにそれらは、運動遊びの傾向<運動遊びへの志向運動遊びの内容身体活動の量や強度運動遊びの空間>遊び(運動遊びを主とした)における行動傾向<自己実現と創意工夫社会的行動好奇心と持続性活動の積極性>、日常生活の行動以上の3側面<9要因

>にまとめられた。現在、この尺度項目が幼児の身体活動評価として適合するかを検討するために、再現性や内的整合性を調べる信頼性の検証、内容的妥当性及びライフコーダを用いた身体活動量の測定結果の相関による併存的妥当性の検証の手続きを進めている。身体活動意欲増強のための「こころとからだで表わすプログラム」については、4、5歳児を対象とした身体表現遊びを計画・実践し、幼児が身体表現遊びのなかで物語をつくる過程について、からだを使って動くことによってイメージを想起していく様相を検討した。それによって、身体表現遊びやごっこ遊びのなかで保育者が幼児の表現意欲を喚起させるための援助の視点を示すことができた。1)幼児の身体活動評価尺度の開発平成14年には、「よく動く子」の概念を具体化する調査から尺度項目の収集を行い、平成15年度は、その56項目から23項目を選出し、さらに探索的な因子分析により4因子15項目の尺度項目を決定した。その後、信頼性の検討として、内的一貫性と再現性を調査し、最後に妥当性の検討として、構成概念妥当性と、ライフコーダを用いた活動量による併存的妥当性を調べた。その結果、「プレイ」「リーダー」「チャレンジ」「ソーシャル」の4因子で構成される「子どもアクティビィティ尺度」が開発された。2)幼児の身体活動量増強のための介入と検証愛知県内の私立R幼稚園を対象にして、活動量増強をねらいとしたプログラムを作成し介入を行い、効果を検証した。「動いてみたくなる」ための短期的プログラムとして、行動科学の理論と技法に準拠したアプローチを構想した。介入効果については、ライフコーダを用いた活動歩数測定の結果、男女児ともに活動歩数の増加が見られ、特に非活動群への介入効果が顕著であった。環境からのアプローチ、保育者からのアプローチ、親からのアプローチを複合させた短期的な介入の構想は、幼児の活動量を増強させる観点として有効であり、介入に際しての有用な知見を得ることができた。3)「こころとからだで表すプログラム」の実践と考察身体表現遊びのなかで物語をつくる過程のモデル(平成14年度作成)に準拠して、幼児の模倣という行為に着目し、模倣のパターンの分類を試みた。こころが動くことによってからだが動き、からだを動かすことによってこころが動くという相互作用の意義を確認した。
DNA二重鎖切断の認識・修復の分子機構の解明とがん放射線治療への応用

最終年度にあたる本年度は、DNA-PKによるXRCC4タンパク質のリン酸化の詳細な検討と意義の解析を中心に行った。前年度までに、XRCC4のリン酸化部位を計4カ所同定し、既報の1カ所を加え、計5カ所の部位に対するリン酸化状態特異的抗体を作製し、変異体を発現する細胞を樹立した。リン酸化状態特異的抗体を用いたウェスタン・ブロッティング法により、全ての部位において細胞内でリン酸化が起こっていることが確認された。既報の1カ所については放射線照射によるリン酸化状態の変化は認められなかったが、我々が同定した4カ所はいずれも放射線照射後の亢進が認められた。DNA-PK欠損細胞、DNA-PKおよびATM阻害剤の効果などを検討した結果、2カ所については、DNA-PK欠損細胞あるいはDNA-PK阻害剤下での減弱を確認することができた。また、変異体を発現する細胞について解析を行った結果、2カ所のリン酸化部位を欠損する細胞で、放射線感受性の亢進が認められたことから、DNA修復において重要な役割を担うリン酸化部位であることが示唆された。この意義を明らかにするために、リン酸化によるタンパク質間相互作用の調節の可能性を探った。まず、FHAドメインを有するタンパク質との相互作用を解析した結果、複数のリン酸化部位の関与に加え、リン酸化に依存しない結合様式の存在が示唆された。また、リン酸化および非リン酸化ペプチドをリン酸化状態特異的に結合する分子の探索を行った。その結果、リン酸化によって結合が増強する分子が1種類、逆に、リン酸化によって結合が減弱あるいは喪失する分子が数種類見出された。DNA-PKによるXRCC4のリン酸化によってこれらの分子との結合、乖離が調節され、このことがDNA二重鎖切断修復に重要である可能性が示唆された。本年度はDNA-PKによるXRCC4およびXLFのリン酸化の解析を行った。DNA-PKはDNA二重鎖切断のセンサーと考えられる分子であり、一方、XRCC4およびXLFはDNA ligase IVとともにDNA二重鎖切断の結合反応を司ると考えられている分子である。従って、DNA-PKによるXRCC4およびXLFの調節機構を明らかにすることは、DNA二重鎖切断修復の全体像を理解する上で極めて重要である。具体的には、まず、我々が最近同定したリン酸化部位3ヵ所(XRCC4について1ヵ所、XLFについて2ヵ所)についてリン酸化状態特異的抗体を作成した。この抗体を用いたWestern Blotting実験によって、XRCC4のこの部位でのリン酸化が細胞内で実際に起こっており、それが放射線照射後に亢進することを実証した。このリン酸化部位は生物種間で高度に保存されており、DNA修復において重要な役割を担う可能性がある。リン酸化部位の生理的意義を探るために、このリン酸化部位に変異を加えたXRCC4を欠損細胞に導入し、安定発現株を樹立した。本年度は3年計画の1年目であるため、今後、この細胞の放射線感受性やDNA修復能などを検討することを計画している。また、このXRCC4の新規リン酸化部位および周辺の配列から、リン酸化を介して他の修復タンパク質との相互作用が調節されている可能性が強く示唆された。そこで、免疫共沈実験により、XRCC4と他の修復関連分子との相互作用の可能性を検討した。XLFの2ヵ所について、本年度行った諸検討の範囲では、リン酸化が検出されなかった。リン酸化が起こっていても、微量である可能性などが考えられた。本年度は、DNA-PKによるXRCC4のリン酸化の意義の解析を中心に行った。昨年度の研究も含めて、これまでにXRCC4の4カ所のリン酸化部位を同定し、それぞれに対するリン酸化状態特異的抗体を作製した。本年度は、更にもう1カ所に対するリン酸化状態特異的抗体を作製した。また、これら計5カ所のリン酸化部位をアラニンに置換した変異体cDNA発現ベクターを構築し、これをXRCC4欠損細胞M10に導入して、安定発現株を樹立した。その放射線感受性をコロニー形成法で評価した結果、うち2カ所のリン酸化部位を欠損する細胞で明らかな放射線感受性の亢進が認められた。この結果から、これらのリン酸化部位がDNA二重鎖切断修復におけるDNA-PKとの協調に重要であることが示唆された。また、リン酸化部位の保存性を探るため、DT40細胞からトリXRCC4cDNAをクローニングした。その結果、上記で重要と示唆された2つのリン酸化部位がトリXRCC4にも存在することが確認され、DNA-PKによるXRCC4のリン酸化制御が鳥類と哺乳類間で保存された役割を持つことが示唆された。更に、2カ所のうち1カ所はスレオニンであったことから、FHAドメインを有するタンパク質との相互作用の可能性が考えられた。FHAドメインタンパク質は多数あるが、その中から可能性が高いと考えられたタンパク質について結合実験を行った。その結果、リン酸化部位欠損体でも結合が見られ、少なくとも別の結合部位があると考えられた。更に、ペプチドを固相化したアフィニティー・カラムを作製して他の結合分子を探索した。リン酸化状態

特異的抗体を用いたウェスタン・ブロッティング法により、全ての部位において細胞内でリン酸化が起こっていることが確認された。既報の1カ所については放射線照射によるリン酸化状態の変化は認められなかったが、我々が同定した4カ所はいずれも放射線照射後の亢進が認められた。DNA-PK欠損細胞、DNA-PKおよびATM阻害剤の効果などを検討した結果、2カ所については、DNA-PK欠損細胞あるいはDNA-PK阻害剤下での減弱を確認することができた。また、変異体を発現する細胞について解析を行った結果、2カ所のリン酸化部位を欠損する細胞で、放射線感受性の亢進が認められたことから、DNA修復において重要な役割を担うリン酸化部位であることが示唆された。この意義を明らかにするために、リン酸化によるタンパク質間相互作用の調節の可能性を探った。まず、FHAドメインを有するタンパク質との相互作用を解析した結果、複数のリン酸化部位の関与に加え、リン酸化に依存しない結合様式の存在が示唆された。また、リン酸化および非リン酸化ペプチドをリン酸化状態特異的に結合する分子の探索を行った。その結果、リン酸化によって結合が増強する分子が1種類、逆に、リン酸化によって結合が減弱あるいは喪失する分子が数種類見出された。DNA-PKによるXRCC4のリン酸化によってこれらの分子との結合、乖離が調節され、このことがDNA二重鎖切断修復に重要である可能性が示唆された。
肝門部胆管癌におけるクリニカルシークエンスパネルを用いたゲノム解析とその応用

胆管癌、特に肝門部胆管癌に対する根治的な治療法が手術であることに異論はなく、手術の標準化、術後管理の向上、徹底した術前シミュレーションなどにより短期成績は改善しているものの、腫瘍としての悪性度は非常に高く、依然十分な治療成績は得られていない。非切除例や術後再発例も多いが、薬物療法や放射線療法などの併用が期待に反し希少性から十分な新規治療法の開発は非常に遅れていると言わざるを得ない。そこで年間の肝門部胆管癌切除症例数が全国有数である当院にて癌組織の変異を次世代シークエンサーにて網羅的に解析し、治療法の確立に有用なデータを集積することを目的に検討を開始した。実際に肝門部胆管癌に対して根治手術を受けたおよそ100例の患者の検体からこれまで80例の切除検体パラフィン固定切片からgenetic DNAを抽出し、スライドからDNAを抽出後、対象とする遺伝子のみを補足して濃縮し、次世代シークエンサー(NGS)を用いて遺伝子配列を調べ、前出の約400種類の遺伝子における遺伝子変異(一塩基変異、挿入・欠失、融合遺伝子、コピー数増減)、マイクロサテライト不安定性などを同定を試みた。当初の予定にくらべて安定したDNAを抽出できる確率が低いことがわかり、結果現在30例に対してDNA抽出が確認された。抽出には検体固定における様々な条件(固定年数、適切なホルマリン濃度、固定時間)が影響していることが考えられたため、2018年からの切除検体は良好な保存状態でありこれらから予定の検討を行うことを計画している肝門部胆管癌に対して根治手術を受けたおよそ100例の患者の検体からこれまで80例の切除検体パラフィン固定切片からgenetic DNAを抽出し、スライドからDNAを抽出後、対象とする遺伝子のみを補足して濃縮し、次世代シークエンサー(NGS)を用いて遺伝子配列を調べ、前出の約400種類の遺伝子における遺伝子変異(一塩基変異、挿入・欠失、融合遺伝子、コピー数増減)、マイクロサテライト不安定性などを同定を試みた。しかし当初の予定にくらべて安定したDNAを抽出できる確率が低いことがわかり、現在30例に対してDNA抽出が確認された。予想より難航したDNA抽出には検体固定における様々な条件(固定年数、適切なホルマリン濃度、固定時間)が影響していることが考えられたため、2018年からの切除検体は良好な保存状態でありこれらから予定の検討を行うことを計画している。また他癌腫でDNA抽出後の解析プロセスがある一定の結果得つつあるためこれらを踏襲する形で研究を推進させる予定である。今年度分は概ね順調に使用したが、実験計画に一部滞りがあったため次年度の成果に合わせて次年度分とともに諸経費とする予定である
長DNA断片クローニング技術の開発

(1)テロメアベクターの試作テロメアー繰り返し配列を1Kbもったベクターにこの領域内に存在するD1S437、D1S459それぞれのSTSマーカーをプライマーとしてPCRで増幅したDNA断片(5Kb)を組み込んだ。homologous recombinationの頻度の高いchikenDT40細胞にヒト1番染色体を微小核融合で導入したうえでこのベクターをターゲッティングし細胞の増殖を行うことにより、特定のSTSマーカーより遠位側と近位側の欠失をもった1番染色体断片を作製し得るかどうか検討した。その結果は期待どうりの染色体欠失を惹起できたものは10%以下であった。近年テロメアの機能に関連するいくつかの蛋白コンポーネントが明らかとなりつつあり、これらとの関連でベクターを改良したいと考える。また紡錘糸形成と染色体分裂に関するテロメアの動態なども検討した上でさらに発展させることも肝要と考えられた。(2)光架橋プライマーによる増幅D1S437、D1S459等種々のSTSマーカーをsense,antisenseともpsoraren付着型で合成すした。ヒト1番染色体をもつマウスA9細胞よりDNAを抽出し、変性した後これらのプライマーをアニールさせる。その後長波長紫外線で処理しプライマーをDNAに架橋し強固に固着させる。これをDNA polymeraseで処理しプライマー間を伸張させた。この際NTPとしてdigoxigenin-dUTPを取り込ませる。その後変性を行い、一本差分解酵素(exonucleaseIII,Bal31)を用いて変性DNAを分解した。両端に架橋プライマーをもつ伸張DNAは分解されないと考えられるので、この後digoxigenin抗体でつり上げ精製した。この系はおおむね作動することが分かったが、我々の条件ではDNA polymeraseであまり長い断片は合成されず、またdigoxigenin抗体でのつりあげもあまり効率が良くなくこの回収方法とともに両者の改良が必要と考えられた。本研究の目的は数十から数百キロのDNA断片を容易にクローニングする新しい染色体工学的手法を確立することである。このため1)テロメアベクターのターゲティングと2)光架橋プライマーによる常温ポリメラーゼ伸張、による目的の領域の長断片DNAの増幅を試みた。homologous recombinationの頻度の高いchikenDT40細胞にヒト1番染色体を導入したうえでこのベクターをターゲッティングすることにより、特定のSTSマーカーより遠位側と近位側の欠失をもった1番染色体断片を作製し得るかどうか検討した。テロメアー繰り返し配列の効果的な長さは1Kbでよいのか否か等についても検討を行った。現在のところ1kbベクターでSTSマーカーより遠位側の欠損を持った染色体断片が5-10%の頻度で得られているが、より長いテロメアのほうが効率的に目的の断片を得られる可能性もあるため2、3,4kbのベクターも作製した。これらについても同様の検討を行う予定である。(2)光架橋プライマーによる増幅D1S437、D1S459それぞれのSTSプライマーをpsoraren付着型で合成した。ヒト1番染色体をもつマウスA9細胞よりDNAを抽出し、変性した後これらのプライマーをアニールさせた。その後長波長紫外線で処理しプライマーをDNAに架橋し強固に固着させた。これをDNA polymeraseで処理しプライマー間を伸長させる試みを行ったが、効率的な伸長が得られずpolymeraseの種類、反応条件を再検討する予定である。

この系はおおむね作動することが分かったが、我々の条件ではDNA polymeraseであまり長い断片は合成されず、またdigoxigenin抗体でのつりあげもあまり効率が良くなくこの回収方法とともに両者の改良が必要と考えられた。
前立腺癌の冷凍手術に関する研究-細胞の変形限界について-

現在、日本ではほとんど実施されていない臓器の冷凍手術を普及させるには、手術のプロトコルの確立および手術法やモニター技術の改善による組織の凍結破壊の確実性と精度の向上が重要である。その技術を支えるのは科学的基礎としての細胞の凍結障害のメカニズムの解明である。これについて、従来から緩速凍結時の場合には細胞外凍結に起因する化学的効果が細胞損傷の主要因であると考えられてきたが、最近、氷晶による細胞の圧迫も凍結障害の一因である可能性が高いことが明らかになってきた。本研究の目的は、この影響、すなわち圧迫変形が細胞の損傷に及ぼす影響を定量的に明らかにすることにある。本研究ではヒト由来の前立腺癌細胞株PC-3の懸濁液を試料として、平行な二平面で挟まれた細胞の生存率と変形度の関係を明らかにした。直径の予め判っているガラスビーズをスペーサとして用いる「サンドイッチ法」という実験法を考案し、以下の結果を得た。1.常温(23°C)の場合、隙間11.4μmでは80%以上が生き残るが、5.9μmでは4050%の細胞が損傷を受け、5.9μmになると約90%が破壊される。つまり、細胞は元の直径の約30%まで変形すると約半数が、約20%まで変形するとほとんどが損傷する。この場合の細胞表面積の増加は計算ではそれぞれ約50%および100%になる。2.生存率と隙間すなわち変形度との関係についての実験結果は0°Cと23°Cでほぼ同じであったが、37°Cではそれより低くなった。細胞膜の脂質の相転移温度が1020°Cであることを考慮すると、細胞の損傷は細胞膜の性質で決定されるのではなく、細胞骨格の変形が主な原因ではないかと考えられる。本研究は、この影響、すなわち圧迫変形が細胞の損傷に及ぼす影響を定量的に明らかにすることを目的としている。実験はヒト由来の前立腺癌細胞株PC-3の生理食塩水懸濁液を試料として行った。平行な二平面で挟まれた細胞の生存率と変形度の関係を明らかにするため、直径の予め判っているガラスビーズをスペーサとして用いる「サンドイッチ法」を考案し、0°C、23°C、37°Cでの実験を行った。生存率と隙間すなわち変形度との関係についての実験結果は0°Cと23°Cでほぼ同じであった。隙間11.4μmでは80%以上が生き残ったが、5.9μmでは4050%の細胞が損傷を受け、5.9μmになると約90%が破壊された。この結果によると、細胞は元の直径の約30%まで変形すると約半数が損傷することになる。また、計算によるとこの場合の細胞表面積の増加は約50%になる。一方、37°Cでは生存率は0°Cおよび23°Cの場合より低く、その程度は隙間が狭くなるほど大きくなった。細胞膜の脂質の相転移温度が1020°Cであることを考慮すると、以上の結果より、細胞の損傷は細胞膜の性質で決定されるのではなく、細胞骨格の変形が主な原因ではないかと考えられる。

現在、日本ではほとんど実施されていない臓器の冷凍手術を普及させるには、手術のプロトコルの確立および手術法やモニター技術の改善による組織の凍結破壊の確実性と精度の向上が重要である。その技術を支えるのは科学的基礎としての細胞の凍結障害のメカニズムの解明である。これについて、従来から緩速凍結時の場合には細胞外凍結に起因する化学的効果が細胞損傷の主要因であると考えられてきたが、最近、氷晶による細胞の圧迫も凍結障害の一因である可能性が高いことが明らかになってきた。本研究の目的は、この影響、すなわち圧迫変形が細胞の損傷に及ぼす影響を定量的に明らかにすることにある。本研究ではヒト由来の前立腺癌細胞株PC-3の懸濁液を試料として、平行な二平面で挟まれた細胞の生存率と変形度の関係を明らかにした。直径の予め判っているガラスビーズをスペーサとして用いる「サンドイッチ法」を用いた実験により以下の結果を得た。1.常温(23°C)の場合、細胞は元の直径の約30%まで変形すると約半数が、約20%まで変形するとほとんどが損傷する。この場合の細胞表面積の増加は、計算ではそれぞれ約50%および100%になる。2.生存率と隙間すなわち変形度との関係についての実験結果は0°Cと23°Cでほぼ同じであったが、37°Cではそれより低くなった。細胞膜の脂質の相転移温度が1020°Cであることを考慮すると、細胞の損傷は細胞膜の性質で決定されるのではなく、細胞骨格の変形によるのではないかと考えられる。3.隙間が小さい場合の生存率は、高張液中では等張液の場合よりやや高く、低張液中では逆にやや低い。これは細胞の収縮や膨張などの体積変化による細胞表面積の変化に起因すると考えられるが、表面積の拡大限界は等張の場合とは異なる。したがって、変形限界は表面積の増加率のみで決定されるわけではない。この溶液濃度の影響についてはさらに実験を継続する必要がある。
ユビキタス結合の触媒的直接変換法の開発と応用

本研究の自的は、炭素-水素結合などのユビキタスな結合を直接変換し有機骨格を構築する一般的手法の確立である。H20年度までに、芳香環やヘテロ芳香環の炭素-水素結合を直接化学変換する新しい触媒の開発に成功した。例えば、電子豊富なヘテロ芳香族化合物とヨウ化アリールのクロスカップリングを促進するユニークなイリジウム触媒を新たに開発した。トリシクロヘキシルホスフィンが特異的に優れた配位子であることが明らかとなり、等モル量のヘテロ芳香族化合物とヨウ化アリールでの効率的カップリングを実現できた。さらに、ユニークな位置選択性を発現するパラジウム触媒を開発することにも成功した。本触媒はチオフェン誘導体のβ位を選択的にアリール化する優れた触媒である。これまで、チオフェン誘導体の官能基化はα位で優先的に進行することが知られており、本発見はチオフェン類のβ位選択的官能基化の道を拓くポテンシャルをもつと考えられる。芳香族化合物とアリールボロン酸の芳香環連結反応が、銅塩で進行することも見出すことにも成功した。ピロールやインドールを基質として用いるとマルチプルアリール化が進行し、ヘテロ芳香環をコアにもつスターバースト型の拡張π電子系の迅速構築が可能である。さらに、ヘテロ芳香族化合物とハロゲン化アリールのビアリールカップリングを促進するニッケル触媒を開発した。本法を用いることで、40年ぶりの痛風新薬として脚光を浴びているフェブキソスタットの超短工程合成にも成功した。H21年度(45月)も引き続き、開発した新反応・新触媒の精度を高める検討を行ったが、若手研究(S)に採択されたため、本研究を終了した。本研究の目的は、炭素-水素結合などのユビキタスな結合を直接変換し有機骨格を構築する一般的手法の確立である。H19年度は、芳香環やヘテロ芳香環の炭素-水素結合を直接化学変換する新しい触媒の開発に成功した。例えば、芳香族化合物とハロゲン化アリールのクロスカップリングを促進するユニークなロジウム触媒、イリジウム触媒、白金触媒を開発した。いずれの触媒反応も炭酸銀を添加剤として用いるという特徴をもつ。DFT計算を用いた機構解明研究により、遷移金属錯体と炭酸銀の協同的な作用が効率的な炭素-水素結合切断の鍵であることが示唆された。さらに、芳香族化合物とアリールボロン酸の芳香環連結反応が、銅塩で進行することも見出した。材料科学や医農薬開発における最も重要な構造単位のひとつであるビアリール骨格を、合成化学的に最も理想的な炭素-水素結合の触媒的直接変換によって構築した意義は明白である。H20年度は、芳香環やヘテロ芳香環の炭素-水素結合を直接化学変換する新しい触媒の開発に成功した。例えば、芳香族化合物とハロゲン化アリールのクロスカップリングを促進するユニークなイリジウム触媒(Angew. Chem. 2009,"Hot Paper")、パラジウム触媒(論文投稿準備中)を新たに開発した。DFT計算を用いた機構解明研究により、遷移金属錯体と炭酸銀の協同的な作用が効率的な炭素-水素結合切断の鍵であることが示唆された(論文投稿準備中)。芳香族化合物とアリールボロン酸の芳香環連結反応が、銅塩で進行することも見出すことにも成功した(Org. Lett. 2008)。さらに、ヘテロ芳香族化合物とハロゲン化アリールのビアリールカップリングを促進するNi触媒を開発した(Org. Lett. 2009)。例えば、Ni(OAc)_2/bipy触媒とLiOt-Buの存在下でベンゾチアゾールとヨードベンゼンを作用させ85°Cで撹拌すると、2-フェニルベンゾチアゾールが高収率で得られる。この触媒は種々のヨウ化アリールや臭化アリールのカップリングに有効である。さらに、チアゾール、オキサゾール、ベンゾオキサゾール、ベンゾイミダゾールなどのヘテロ芳香環のアリール化にも有効であることが明らかとなった。興味深いことに配位子をdppfにすると、塩化アリールやアリールトリフラートを用いたカップリングに有効な触媒となることも見出した。機能の宝庫であるヘテロビアリール骨格を極めて安価なNi(OAc)_2・4H_2O($126for 1kg : Strem Chemicals,Inc.)を触媒前駆体に用いて構築した意義は明白である。

芳香族化合物とアリールボロン酸の芳香環連結反応が、銅塩で進行することも見出すことにも成功した。ピロールやインドールを基質として用いるとマルチプルアリール化が進行し、ヘテロ芳香環をコアにもつスターバースト型の拡張π電子系の迅速構築が可能である。さらに、ヘテロ芳香族化合物とハロゲン化アリールのビアリールカップリングを促進するニッケル触媒を開発した。本法を用いることで、40年ぶりの痛風新薬として脚光を浴びているフェブキソスタットの超短工程合成にも成功した。H21年度(45月)も引き続き、開発した新反応・新触媒の精度を高める検討を行ったが、若手研究(S)に採択されたため、本研究を終了した。
マルチチャンネル型表面プラズモン共鳴センサの開発とアレルギー物質の多成分同時測定

本研究は、小型で持ち運び可能で、多成分を同時に測定できる表面プラズモン共鳴現象を利用する免疫センサを開発し、人間の持つアレルギー体性を迅速に診断する測定法を開発しようとするものである。本年度は、アレルギーにより生成されるヒスタミンおよびイムノグロブリンE(IgE)を表面プラズモン(SPR)センサにより測定する方法を確立するとともに、マイクロフローセルの試作および5チャンネルの表面プラズモン共鳴センサの試作を行った。成果は以下の通りである。(1)チオール化合物の単分子膜をSPRセンサの金薄膜に固定化し、ペプチド結合によりヒスタミンコンジュゲートを固定化したセンサチップを作製し、抗ヒスタミン抗体に対する競合法による高感度なヒスタミンの測定法を確立した.また、センサチップは、再生液の使用により、繰り返し利用が河能であった。(2)IgEに対する2つの抗IgE抗体を利用する、IgEのサンドイッチ免疫測定法を確立した。すなわち、一つの抗IgE抗体を固定化したセンサチップを用いて、他の抗IgE抗体と複合体を形成させたIgEをSPRセンサで測定する方法である。約10ppbの検出下限濃度を達成した。(3)ポリジメチルシロキサンを用いて流路幅1mm、長さ10mm、深さ20,40,100μmの5チャンネル用のマイクロチャンネルフローセルを開発した。(4)波長770nmのLED光源、2042チャンネルのリニアCCD素子を利用して、センサの大きさが170(W)x110(D)x150(H)mmの5チャンネルのSPRセンサを開発した。重量は約1.5kgである。濃度の異なるシュックロース溶液を用いて性能を評価した。濃度0-20mMの範囲において、センサ信号と濃度に良好な直線関係が見られ、検出下限濃度は約0.3mMであり、屈折率感度としては10^<-6>RIUレベルであった。本年度は、アレルギーにより生成されるヒスタミンを表面プラズモン(SPR)センサにより測定する方法を確立するとともに、マイクロフローセルの試作および5チャンネルの表面プラズモン共鳴センサの試作を行った。(1)種々のタンパク質のヒスタミンコンジュゲートを合成し、これらをSPRセンサの金薄膜に固定化し、抗ヒスタミン抗体に対する結合を評価した。その結果、STI(soybean Trypsin inhibitor)を用いるタンパク質コンジュゲートはペプシンによる分解を受けないので、センサ表面のコンジュゲートの脱離なしに、生成するコンジュゲート-抗体複合体を解離させうることがわかった。その結果、センサ金薄コンジュゲート固定化膜の繰り返し利用が可能であった。(2)STIタンパク質コンジュゲートを固定化したSPRセンサを用いて、間接競合法によりヒスタミンの免疫測定を行った結果、約1ppbの検出下限濃度を達成した。(3)ポリジメチルシロキサンを用いて流路幅1mm、長さ10mm、深さ20,40,100μmのマイクロチャンネルフローセルを試作し、シュックロースに対するSPRセンサの感度を測定した。その結果、深さが浅くなるにつれて、感度が増加する事が分かった。(4)波長770nmのLED光源、2042チャンネルのリニアCCD素子を利用して、5チャンネルのSPRセンサを試作した。センサスポットが直径5mmで、1mm間隔に直線状に5つ並ぶものを試作した。

各スポット部分に穴を開けたシリコンシートを金薄膜にセットしたバッチ式セルを作製し、シュックロースを試料として、SPRの光強度を測定した。その結果、シュックロース濃度3%以上において、光強度は濃度の増加に応じて増加した。本研究は、小型で持ち運び可能で、多成分を同時に測定できる表面プラズモン共鳴現象を利用する免疫センサを開発し、人間の持つアレルギー体性を迅速に診断する測定法を開発しようとするものである。本年度は、アレルギーにより生成されるヒスタミンを表面プラズモン(SPR)センサにより測定する方法を確立するとともに、マイクロフローセルの試作および5チャンネルの表面プラズモン共鳴センサの試作を行った。成果は以下の通りである。(1)金薄膜センサチップ上にアルカンチオールの単分子膜を形成し、ペプチド結合を介してヒスタミンを固定化しする方法を確立した。このヒスタミン固定化センサチップを用いて、抗ヒスタミン抗体を含む種々の濃度のヒスタミンを試料とし、SPRセンサ応答を調べたところ、検出下限濃度が約3ppbのヒスタミンを測定することができた。(2)昨年度試作した5チャンネル型SPRセンサの基本的特性をフロー系及びバッチ系で調べたところ、受光部のラインセンサの位置を共鳴角直後に設定することにより、最もよい感度を示すことが分かった。スクロース溶液を試料として、検出可限濃度1mMを達成した。(3)蒸着装置を用いて16mm x 16mm x 0.15mm^tのカバーガラス上に、巾0.85mm、長さ10mmの金薄膜を形成し、5ラインのセンサチップを作成した。蒸着膜の厚さが50μm程度の金薄膜が良好な共鳴応答を示した。また、作成したセンサチップを用いてスクロース溶液に対する応答を調べたところ、各チャンネルごとのSPR信号は若干異なるが、スクロース溶液に対して00.1mol/kgの濃度範囲で直線性の良好な検量線を得ることができた。アレルゲン物質の摂取や被曝により体内に生成されるイムノグロブリンE (IgE)やヒスタミンを表面プラズモン(SPR)センサにより測定する方法を確立するとともに、マイクロチャンネル型のフローセルの試作するとともに5チャンネルの表面プラズモン共鳴センサの試作を行った。(1)金薄膜センサチップ上にIgEのCe2ドメインを認識する抗IgE抗体を固定化し、試料のIgEにIgEのCe3ドメインを認識する抗IgE抗体を過剰に加えて、センサチップ上で生成する抗体-IgE-抗体のサンドイッチ複合体をSPRセンサで測定する方法論を確立した。検出下限濃度は約10ppbであり、アレルギー診断に十分な感度を示すことがわかった。また、センサチップに直接IgEを捕捉して測定する直接法に比べて感度が約4.5倍向上することが分かった。この向上の原因を、センサチップ上でのラングミューア型の等温吸着平衡式より算出した抗原-抗体の結合定数から明らかにすることができた。
SPINT1を介した胎盤絨毛形成・維持機構の解明:正常および異常妊娠における役割

胎盤ラングハンス細胞の特異的なマーカーであるSPINT1機能を解明するために、in vivoにおける関連分子の発現解析、RNA干渉技術を用いた機能解析を行うことを目的として研究を行った。ヒト胎盤においてSPINT1および関連因子が妊娠週数とともに上昇する新知見を得た。さらに、shSPWINT1によるin vitro栄養膜細胞解析モデルを作製した。初期の胎盤形成時だけでなく、妊娠期間を通してSPINT1が絨毛形成機構、および絨毛構造の恒常性維持機構においても重要な役割を果たしている可能性が示唆された。我々は、ヒト胎盤絨毛の構造が、成書の記載(定説)とは異なり、正期胎盤においてもラングハンス細胞層は断裂せず、層構造が維持されていることをはじめて明らかにしてきている。今回の研究により、胎盤ラングハンス細胞の特異的なマーカーであるSPINT1(肝細胞増殖因子(HGF)に関連する、セリンプロテアーゼインヒビターであるHGFactivator inhibitor 1型)機能、SPINT1が特異的に発現しているラングハンス細胞層の新しい機能を解明するために、1)ヒト由来ラングハンス細胞の培養細胞系(初代培養、細胞株)において、RNA干渉技術(RNAi)でラングハンス細胞におけるSPINT1mRNAをノックダウンすることにより、ラングハンス細胞の形態変化(特に接着装置の動態)と、SPINTl関連因子の発現変動を解析、さらに、2)異常妊娠の胎盤絨毛におけるSPINT1とその関連因子について、組織化学的解析と生化学的解析を行うことを目的として、研究を開始した。SPINTlに対するGFP融合shRNA(shSPINT1)を作成し、絨毛栄養膜細胞株を用いて、ベクターの抑制効果の検証を進めている。また、正常胎盤と妊娠高血圧症候群(異常妊娠)のSPINT1、および、それに関連する分子による胎盤絨毛組織の分子構築を、光顕レベルで電子顕微鏡の解像力に迫る、独自に開発した超高分解能蛍光顕微鏡法を軸に解析を行った。サイトケラチン7の免疫染色から、正常胎盤絨毛組織と比較して、妊娠高血圧症候群の胎盤絨毛組織では、絨毛栄養膜のサイトケラチンの分布に異常を示す所見を得た。さらに、現在、詳細な分子構築の解析を画像解析ソフトを用いて進めている。本研究は、胎盤ラングハンス細胞の特異的なマーカーであるSPINT1の胎盤絨毛栄養膜における機能を解明することを目的に、RNA干渉技術(RNAi)でSPINT1mRNAをノックダウンすることにより、ラングハンス細胞における、接着分子とSPINT1関連因子(HGF受容体(MET)等)の発現変動を解析した。In vitroのモデル系としてBeWo細胞等にて、SPINT1が発現していることを免疫組織化学およびreal-time PCRにて検証した。次に、BeWo細胞を用いて、作製した3つのsiRNA(siSPINT1)抑制効果の検証を行い、mRNAレベル、蛋白質レベル、および免疫組織化学レベルにおいて、十分なSPINT1抑制効果を持つことを明らかにした。ノックダウンBeWo細胞において、E-cadherin(CDH1)には著明な変化が観察されなかったが、matriptase(ST14)の発現低下と、METの発現増強を認めた。妊娠高血圧症候群において、胎盤の酸素濃度が低下し、栄養膜からのfms-related tyrosine kinase 1等の放出、胎盤機能不全が引き起こされる。そこで、in vitroのモデルとして低酸素状態で培養したBeWoにおけるSPINT1解析をさらに進めた。興味深いことに、低酸素環境では、SPINT1の発現低下とともに、CDH1およびST14の発現低下が観察された。これは、正常の胎盤環境とは異なり、病的環境において、SPINT1、spiINT1関連分子、および接着分子の動態が大きく変動し、胎盤絨毛組織の病的構造変化に関与する可能性を示唆する所見である考えられる。今回、siRNAによるin vitro栄養膜SPINT1解析モデルの確立に成功した。共焦点顕微鏡および免疫電子顕微鏡による詳細な形態学的解析及び網羅的なシグナル伝達系の生化学的解析が課題として残された。成果は投稿準備中である。
認知言語学の日本語教育への具体的導入-日本語教科書改善のために-

中国で刊行された日本語教材および中国語を母語とする日本語学習者の産出する日本語の分析を通して<主観的な事態把握>の概念の日本語教育への示唆を目的とした。日本語母語話者の主観的事態把握の指標となりうる言語形式を特定し、日本語母語話者、中国語母語日本語上級学習者、中国語母語日本語初中級学習者を対象に対照言語調査を実施した。調査結果の量的質的分析により、中国語母語日本語学習者の事態把握が日本語母語話者のそれより客観的傾向があることを明らかにした。その結果をもとに、日本語教材に必要な改善点を提案した。本研究は、日本語教育教材の日本語の記述に<主観的な事態把握>という概念を取り入れることで中国語を母語とする日本語学習者の理解と習得をいかに促しうるかを明らかにすることを最終目標とする。本年度は、以下のような研究活動を行った。(1)中国で開発・出版された日本語専攻生対象の日本語教材の分析:1)当該教材の日本語による表記部分から日本語の<好まれる言い回し>を逸脱する個所を抽出し、教材の<事態把握>の傾向を分析した。その結果を2007年度日本認知言語学会にて研究発表した。2)当該教材を日本語で全訳し、平成20年度の教材分析のデータどした。(2)<事態把握>の日中対照の予備調査:1)中国語母語の日本語学習者が産出する、日本語の<好まれる言い回し>の逸脱を予測するために、日本在住の中国語母語上級学習者5名に面談調査を行い、予備調査の調査対象項目を絞り込んだ。2)1)をもとに視覚刺激(絵など)を検討し、予備調査項目を決定して、調査票原案を作成した。3)2)の調査票原案を中国語母語の日本語研究者2名の助言をもとに修正した。4)3)の予備調査票を用いて、以下の要領で予備調査を実施した。実施時期:2008年1月調査対象:日本語母語話者57名、日本在住の中国語母語日本語学習者32名5)4)の結果をデータベース化し、統計処理をして有意差がある項目を特定し、平成20年度に実施予定の本調査の基礎資料を作成した。本研究は、中国語を母語とする日本語学習者の産出する日本語の分析を通して〈主観的な事態把握〉の概念の日本語教育への示唆を明らかにすることを目的とし、科研2年度は以下のように研究を進めた。(1)分析枠組みの調整と本調査の準備:平成19年度に実施した予備調査結果のうち、日本語母語話者と学習者で統計的に有意差が確認された項目を〈事態把握〉の観点から分析し、池上(2003,2004,2006a,2006bなど)の「自然な日本語」、「日本語らしさ」を司るとされる〈主観的な事態把握〉を指標する表現形式の分析結果について、日本認知言語学会第9回(2008年9月)で発表した。(2)既存の日本語教科書分析の継続(近藤、姫野、足立)平成19年度に行った既存の初級・中級日本語教科書の日本語訳(全訳)を用い、(1)の枠組みで教科書・教材の(事態把握)の傾向の分析を始めた。(3)本調査の実施(近藤、姫野、足立)次の要領で本調査を実施し、最終年度の対照分析の基礎資料を作成の準備を行った。1)本調査の調査票作成:(1)の分析枠組みに基づき、予備調査の結果から本調査の詳細(調査対象、使用する視覚的刺激回答方法など)を決定し、適宜修正を加えた。2)本調査の実施:中国在住の中国語母語日本語学習者約300名を対象に(3)-1)の調査票による調査を、海外研究協力者の協力を得て実施した。調査実施地域:北京地域と西安地域調査協力者数:当該地域の日本語学習者(主専攻・副専攻)計240名程度調査協力機関数:10大学(内訳:北京市内9大学、西安市内1大学)※海外研究協力者:彭広陸先生(北京大学外国語学院日本言語文化学部・教授)・孫敦夫先生(西安外国語大学・教授)3)本調査の結果分析:結果のデータ化にあたり、彭広陸先生、孫敦夫先生より専門的な助言を得た。また、翻訳課題については、王安先生(島根大学学国語教育センター)に専門的な助言とデータ化への協力を得た。本研究は、中国語を母語とする日本語学習者の産出する日本語の分析を通して<主観的な事態把握>の概念の日本語教育への示唆を明らかにすることを目的とする。科研最終年度の本年度は、以下のように研究を進めた。(1)分析枠組みの構築(近藤、池上、足立、姫野):昨年度の継続で、予備調査結果を踏まえ、「自然な日本語」、「日本語らしさ」を司るとされる<主観的な事態把握>を指標する表現形式について学習者対象調査のデータの分析枠組みを構築した。

(2)既存の日本語教科書分析の継続(近藤、姫野、足立):既存の初級・中級日本語教科書の教授項目のうち、<事態把握>の観点からの記述が必要な言語形式を予測した。(3)本調査の分析(近藤、姫野、足立):1)H20年度実施の本調査の結果をデータベース化した。2)H19年実施の予備調査の結果と1)を統合した結果を以下のように分析した。(1)調査結果の量的分析:(1)の分析枠組みで、本調査の適切性判断課題の結果を量的に分析し、予備調査結果に対照させ、日本語と中国語の<事態把握>の傾向の分析を進めた。(2)調査結果の質的分析:(1)の分析枠組みで、予備調査と本調査の自由記述課題および翻訳課題の結果を質的に分析し、日本語と中国語の<事態把握>の傾向が観察される言語形式を絞りこみ、求められる記述について考察した。(4)日本語教科書への応用(近藤、姫野、足立):(2)で抽出した既存の日本語教材の教授項目を(3)の結果に照らして、<事態把握>の母語による傾向差に留意した記述が必須であるものを8項目特定した。(5)学会発表:(近藤、池上、姫野、足立、王安(島根大学、研究協力者)):日本認知言語学会第10回大会及び北京大学での国際シンポジウムでワークショップを行い、(3)の分析結果と(4)の考察結果を発表し、<主観的な事態把握>を反映した記述の必要性を基にした日本語教育教科書改善の方向性を提案した。
単一細胞の生理反応をプローブとしたインテリジェント・マイクロセンサーの開発

細胞の環境関知能力を利用し、工学的手法によってその情報を収集・処理する生物マイクロセンサーの開発を目的としている。はじめにセンサー細胞として、遊泳能力があるゾウリ虫を用いた。細胞のミトコンドリアを電荷依存性の蛍光色素(ローダミン123:RH)で染色し、励起光を照射して蛍光を顕微鏡下で検出した。ミトコンドリアの膜電位が上昇するとRHは細胞内に多く取り込まれて、蛍光強度が増加する。また環境変化に応じて遊泳パターンを変化させる。細胞のばらつきがあるため、複数個の細胞の平均値を求めて評価した。環境因子として、酵母菌懸濁液中のpH、重金属、酸素濃度を変化させた。それにしたがって蛍光強度の増減が見られた。また、遊泳状態は特有のパターンを示した。ゾウリ虫について遊泳速度変化と蛍光強度変化を組み合わせた指標を作ると重金属の種類を区別できることがわかった。次に酵母菌をセンサー細胞として用い、環境中の重金属などの定量が可能かどうかを検証した。その結果酸素濃度と蛍光強度とのあいだに比例関係があることがわかった。さらに懸濁液中に水銀イオン、カドミウムイオンを加えた。これら金属イオンの存在によって蛍光が低下し、その度合いはイオン濃度が10μMから1mMの範囲で、濃度に比例することがわかった。酵母菌の直径は約5μmであり、ミクロな酸素濃度センサーが実現できたことになる。最後に顕微吸光スペクトル分析装置を試作して、酵素染色されたゾウリ虫の細胞内酵素活性分布を求めた。細胞内で酵素活性が分布する様子がとらえられた。これまで溶液で論じられていた酵素反応速度定数が、細胞を用いた生体反応系でも求まることを示した。これは細胞センサーを定量分析へ用いるための基礎となる。本研究の目的は、細胞の環境関知能力を積極的に利用し、工学的手法によって、その情報を収集・処理する生物マイクロセンサーの開発にある。はじめにセンサーモデル細胞として、酵母菌を用いた。酵母菌のミトコンドリアを電荷依存性の蛍光色素(ロ-ダミン123:RH)で染色し、外部から励起光を照射して、蛍光を顕微鏡下で検出した。個々の細胞のばらつきがあるため、まず50個の細胞の平均蛍光強度を求めて評価した。環境因子として、酵母菌懸濁液中の酸素濃度を増減させると、それにしたがって蛍光強度の増減が見られた。したがって、直径5μmの酸素濃度センサーが実現できたことになる。次に懸濁液中に水銀イオン、カドミウムイオンなど重金属イオンを加えた。次にレーザー光圧力による単一細胞の捕捉を試みた。1064nmの波長のレーザー光によって細胞の位置を、細胞を破壊することなく制御できることを確かめた。しかし液流があると流圧のため細胞が捕捉しきれなくなり、懸濁液中の細胞を1つ捕捉して水銀イオン液流を検出する試みは不成功に終わった。そこで、内径25μmのシリカキャピラリーチューブ内壁に酵母菌を付着させ、キャピラリーに水銀イオン液を導通させた場合のRH蛍光強度の変化を測定した。その結果、キャピラリー内の水銀濃度によって単一細胞の蛍光が増減することが確認でき、単一細胞センサーに関する所期の目的の1つを達成した。
新規な無機ナノボールの創出と特殊配列の付与

ナノ粒子の調製において、本研究では、これまでにあまり研究例のない、水に良く分散するナノ粒子とフッ素系溶媒に分散するナノ粒子を調製した。これらのナノ粒子は安定で、酸化されたり、沈澱を生じたりしない。特に、フッ素系配位子を用いた場合には遷移金属の微細で単分散なナノ粒子を安定に調製することが可能であることを見出している(特許出願済)。水に分散するナノ粒子は、末端に4級アンモニウム基をもった保護剤で保護したもので、どのようなpHでも正のゼータ電位を有している。そのため、アニオン性の高分子や二分子膜、無機物質表面に容易に吸着し、パターニングによる特殊配列の付与が可能であることがわかった。このような吸着力をもつナノ粒子は、これから期待される塗布用ナノ粒子材料の基材として非常に重要であることが考えられる。また、フッ素系保護剤により保護されたナノ粒子の構造および物性を詳細に検討したところ、これらのナノ粒子が(1)空気下で安定に調製できる、(2)空気中に安定に保存できる、(3)沈殿させて粉末状に保存ができる。(4)フッ素系溶剤を用いて簡単に薄く塗布できる。という特徴を有することが分かった。この塗布技術により、ナノ粒子の2次元パターニングが容易にできることが見出され、特殊配列の付与ができたといえる。このように本研究により、研究者らは新しい性質をもつナノ粒子の創成に成功した。また、それらに特殊配列を付与することを可能とし、ナノ粒子の新しい材料への応用についての展開の可能性を拓いたと考えられる。4級アンモニウム基を末端に持ち、逆末端にチオール部位を有し、その間を様々な鎖長のアルキル鎖で連結した保護剤を新規に合成した。それぞれの鎖長で、安定な金ナノボールの調製に成功した。得られたナノボールは容易に精製が可能で、安定に保持できることが分かる。イオン性テンプレートとして用いたものはDNAである。残基の種類によらずDNA表面はアニオン性を帯びていることが分かっているので、DNAはカチオン性ナノボールを1次元に配列させるための良いテンプレートとなるはずである。実際、λ-DNAとカチオン性ナノボール分散液とを混合すると、束になったDNA分子群にそってナノボールが一次元的に配列することが分かった。特に、短い鎖長の保護剤を用いた場合には高度に直線的にナノボールが配列した。さらには、鎖長を変化させるに従い、ナノボールの配列間隔をオングストロームオーダーで制御することが可能であり、これは、イオン性保護剤がナノボール表面にほぼ垂直に立って吸着していること、さらには、長鎖の保護剤を用いた場合には親水部たる4級アンモニウム基がお互いに入れ子型となり、できるだけコンパクトに配列しようとする現象に起因するものと考えられる。実際、非常に鎖長の短い保護剤を用いた場合には、入れ子型構造を取らず、ナノボール同士がファンデアワールス半径から考えられる距離で配列していることが観察された。このように、高密度電荷表面を有するナノボールもテンプレート上に高密度に配列可能であることが示された。