hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ミー散乱増強光の時空間制御による核内分子デリバリー

超高速ミー散乱増強光を用いて、細胞全体の機能を損なわない高スループット・細胞核プロセシング技術を創出することを目的とした。そして、細胞膜と核膜の一括アブレーションによる核内へのダイレクト分子デリバリーを試みた。実験研究により、蛍光標識したプラスミドDNA/リポソーム複合体を細胞に導入すると、レーザー照射直後に複合体が細胞質だけでなく細胞核内においても観察され、また、導入したプラスミドDNAの発現によるGFP由来の蛍光が得られた。以上より、細胞膜と核膜の一括アブレーションにより、細胞膜だけでなく核膜の透過性も亢進した核内への分子デリバリーが示唆された。初年度となる平成26年度は遠方場集光増強光の多光子過程による細胞核プロセシングを実施した。誘電体粒子へのフェムト秒レーザー照射により発生する増強光につき、レーザーパラメータ(スペクトル、偏光等)および誘電体粒子の大きさと屈折率に対する特性を研究した。Finite-Difference Time Domain(FDTD)法により遠方集光増強光の電界強度分布およびポインティング・ベクトルを計算し多光子吸収が生じる領域を求めたところ、直径2ミクロンのポリ乳酸(PLA)粒子では、細胞膜上に結合した粒子下に生じる電界強度分布は核膜にアクセスできる焦点距離であることを明らかにした。続いて、乳酸・グリコール酸共重合体(PLGA)粒子により得られる電界強度分布を計算した。PLGAではPLAに比して周囲と微粒子の屈折率差が大きく、粒子表面から0.46ミクロンの位置において入射光に対して約20倍の電界増強度が得られた。以上の結果は、PLGAを使用することでPLAよりも小さいレーザー照射強度により細胞膜への小孔ができることを示唆しており、生体損傷が小さい手法となることが期待できる。理論計算と並行して、実験実証を行った。細胞膜上に結合した多数のPLA粒子もしくはPLGA粒子にフェムト秒レーザーを照射し遠方場集光増強光を発生させ、細胞膜への小孔形成を試みた。フェムト秒Ti:Sapphireレーザーの基本波(中心波長800 nm、パルス幅80 fs)を一様照射した。PLGA粒子を用いることによりPLA粒子を用いた場合よりも低いレーザー強度により細胞内への蛍光分子導入が可能であった。さらに、接着状態の細胞と浮遊状態の細胞に対して同手法を試みたところ、細胞核内への導入効率は浮遊状態の細胞の場合の方が高いことが示された。3年計画の2年目である平成27年度は、集光増強光の多光子過程による細胞プロセシングを核膜穿孔に注力して実施した。増強光分布および生分解性ポリマー微粒子と細胞の相対位置により核膜穿孔確率が変化するとの予想から、接着状態の細胞と浮遊状態の細胞を対象として細胞膜穿孔と核膜穿孔を試み比較した。接着状態の細胞は培養ディッシュ底面に接着した細胞であり、細胞上面に微粒子が位置するものの、細胞の形状により微粒子は裾野部分に多く、細胞核上方に存在するものは少ない。浮遊状態の細胞では、微粒子分布の偏りは小さく接着状態に比べて細胞核上方の微粒子存在確立は高い。このため、マイクロ流路内を移動する浮遊状態の細胞への外来分子導入を試みた。生分解性ポリマー微粒子を細胞膜に結合した培養ヒト上皮癌細胞(A431細胞)と導入分子である蛍光分子をマイクロ流路内に流し、フェムト秒レーザーを照射した。微粒子は、乳酸・グリコール酸共重合体(poly(lactic-co-glycolic acid), PLGA)微粒子およびポリ乳酸(Poly lactic acid, PLA)微粒子を使用し比較した。屈折率の高いPLGA微粒子ではPLA微粒子よりも高い集光強度が得られ、同じレーザーフルエンスにおいて高い細胞内導入効率が得られた。また、接着状態よりも浮遊状態の細胞への細胞核内導入効率が高く、微粒子と細胞の相対位置および増強光分布が重要であることが示された。さらに、副次的成果として、PLGA微粒子の高い増強度によりレーザーの入射強度を低くすることが可能であり、マイクロ流路の損傷軽減が得られた。平成27年度の計画通り核膜プロセシングに着手し、微粒子と細胞の相対位置および増強光分布により核内導入効率が変化することを実験実証した。また、核内分子導入では細胞膜および核膜の穿孔だけでなく、導入分子の細胞内における挙動も重要であることを示した。最終年度である平成28年度は、計画通りフェムト秒レーザーと微粒子を用いた細胞核内デリバリーの研究を実施した。まず、プラスミドDNAの細胞内導入において第一の障壁となる細胞膜とプラスミドDNAの間に生じる静電反発力を軽減するため、カチオン性リポソームとプラスミドDNAの複合体を作製し、レーザーとの併用効果を調べた。リポソーム濃度が高いほど細胞と導入分子の静電反発力は低下し、それに伴い細胞内導入効率が上昇することがわかった。ただし、導入したプラスミドDNAの大部分は細胞の核内ではなく細胞質に存在した。細胞質から核内への移行は細胞分裂時に一時的に核膜が消失することに起因すると考えられる。次に、第二の障壁である核膜の透過を目的とし、微粒子近傍に生じる光増強場の強度分布に着目して集光点の距離を利用した細胞膜と核膜の一括アブレーションを試みた。直径の異なる微粒子(直径0.75マイクロメートルおよび3.0マイクロメートルのもの)を用いることで微粒子下に生じる集光点の位置を細胞膜ではなく細胞核膜に近いところに得られる条件を検討した。

集光点において同一の最大光強度となる条件でレーザー照射を行ったにも関わらず、細胞核膜に近い位置に集光点が得られる3.0マイクロメートルの微粒子を用いた条件のみ細胞核内に導入分子由来の蛍光が得られ、遺伝子の発現が観察された。将来展望として、本研究成果をもとに微粒子とフェムト秒レーザーによる標的細胞小器官のレーザー操作が期待される。超高速ミー散乱増強光を用いて、細胞全体の機能を損なわない高スループット・細胞核プロセシング技術を創出することを目的とした。そして、細胞膜と核膜の一括アブレーションによる核内へのダイレクト分子デリバリーを試みた。実験研究により、蛍光標識したプラスミドDNA/リポソーム複合体を細胞に導入すると、レーザー照射直後に複合体が細胞質だけでなく細胞核内においても観察され、また、導入したプラスミドDNAの発現によるGFP由来の蛍光が得られた。以上より、細胞膜と核膜の一括アブレーションにより、細胞膜だけでなく核膜の透過性も亢進した核内への分子デリバリーが示唆された。平成26年度の達成目標であった遠方場集光増強光の理論解析および細胞を用いた実験実証を予定通り実施したことに加え、PLGAを使用することでこれまでに使用していたPLAよりも高い増強度と外来分子導入効率を得られることを計算および実験により示した。最終年度である平成28年度は、予定通り細胞膜と核膜の一括アブレーションに挑戦する。平成27年度の研究により、当初重要視していなかった細胞内における導入分子の挙動が提案方法においても重要であることが分かったため、研究開始時の実施内容から発展させ、可能な範囲で導入分子挙動の制御についても検討する。レーザープロセシング近接場局在増強光の多光子過程による細胞核プロセシングに着手するとともに、細胞膜透過性亢進および細胞内における外来分子の挙動制御を試みることで核内移行効率の向上に挑戦する。
生涯学習スタッフの養成プログラムの実態に関する国際比較研究

本研究は、生涯学習活動が盛んな世界の主要国を対象として、成人教育及び高等教育などの教育機関、及び産業,労働,厚生,スポーツなどの生涯学習関連機関における生涯学習スタッフの種類や養成プログラム等を明らかにし、比較分析を行い、生涯学習スタッフ養成の実態と日本における課題を明らがにすことを目的とする。平成9年度は、(1)日本における生涯学習スタッフの現状をこれまでの成果から整理し、その結果から(2)訪問面接調査のための調査票の作成を行った。(3)作成した調査票により、アジア・太平洋地域及びヨーロッパ地域における成人教育及び高等教育を中心とした教育機関を対象とした調査を実施した。研究対象地域としたオーストラリア、カナダ、タイ、スペイン、フランス、ドイツ及びスウェーデンの7カ国で、各国の文部省及び教育関連機関を調査した。平成10年度は、生涯学習関連機関として、産業、労働、厚生、スポーツなどの教育機関外の諸機関を対象とした調査研究と、総合的な報告書を作成した。(1)前年度に作成した調査票により、アジア・太平洋地域及びヨーロッパ地域における生涯学習関連機関を対象とした調査を行う。研究対象地域としたオーストラリア、カナダ、タイ、スペイン、フランス、ドイツ及びスウェーデンの7カ国を対象とし、各国の労働省及び産業省など代表的な生涯学習スタッフの養成を行う各機関を調査した。(2)調査の結果から、各国の生涯学習スタッフの養成状況について、それぞれの機関における生涯学習スタッフの養成のプログラム、スタッフの専門的位置づけ、養成の効果などの視点から実態を明らかにした。本研究は、生涯学習のスタッフが世界においてどのような目的、方法、内容、プログラムによって育成されているかを明らかにし、今後の日本における生涯学習振興に寄与しようとするものである。本年度は、次の研究活動を行った。(1)日本における生涯学習スタッフの現状をこれまでの成果から整理し、その結果から(2)訪問面接調査のための調査票の作成を行う。(3)作成した調査票により、アジア・太平洋地域及びヨーロッパ地域における成人教育及び高等教育を中心とした教育機関を対象とした調査の実施を行う。研究対象地域としたオーストラリア、カナダ、タイ、スペイン、フランス、ドイツ及びスウェーデンの7カ国を対象とし、各国の文部省及び教育関連機関を調査した。共通の質問事項による面接訪問調査を行うとともに、各国の生涯学習の発展状況について、統計や資料を入手し、その概要を把握した。(4)特にドイツでは、世界の成人教育研究資料を大量に蓄積するユネスコ教育研究所への調査を行い、各国の各省庁における生涯学習スタッフの養成状況についての事前調査を兼ねて行った。(5)最後に、教育機関を中心とした生涯学習スタッフの養成状況について、各国の比較研究の成果をまとめるとともに、次年度の文部省以外の生涯学習関連機関を対象とした訪問面接調査の研究計画の作成を行った。本研究は、生涯学習のスタッフが世界においてどのような目的、方法、内容、プログラムによって育成されているか、を明らかにし、今後の日本における生涯学習振興に寄与しようとするものである。本年度は、生涯学習関連機関として、産業、労働、厚生、スポーツなどの教育機関外の諸機関を対象とした調査研究と、総合的な報告書を作成する。(1)全年度に作成した調査票により、アジア・太平洋地域及びヨーロッパ地域における生涯学習関連機関を対象とした調査を行う。研究対象地域としたオーストラリア、カナダ、タイ、スペイン、フランス、ドイツ及びスウェーデンの7カ国を対象とし、各国の労働省及び産業省などの代表的な生涯学習スタッフの養成を行う各機関を調査した。(2)調査の結果から、各国の生涯学習スタッフの養成状況について、それぞれの機関における生涯学習スタッフの種類と年間養成人数、養成のプログラム、スタッフの専門的位置づけ、養成の効果などの視点から実態を明らかにした。(3)最後に日本と比較検討を行い、日本の行政機関や教育機関における生涯学習スタッフ養成の必要性と課題を検討し、最終報告書を作成した。
新規機能性核酸の開発を目指した人工塩基対の創製

A-TとG-Cの塩基対に人工の塩基対を加えることにより、遺伝情報を拡張し、RNAやタンパク質中に新たな構成成分を部位特異的に導入する技術の創出を目指して、生物のシステム(複製・転写・翻訳)で機能する人工塩基対の開発研究を進めた。申請者は、既に、転写と翻訳で機能する人工塩基対(s-y塩基対)を開発しているので、その知見に基づいて、複製においても機能する人工塩基対の開発に挑戦した。その結果、ユニークな性質を示す種々の人工塩基対(v-y、s-z、s-Paなどの塩基対)を開発することができ、最終的に、複製と転写において相補的に機能する人工塩基対(Ds-Pa塩基対)を作り出すことができた。すなわち、このDs-Pa塩基対を含むDNAをPCRで増幅することもでき、また、どちらの人工塩基(DsとPa)もRNA中に転写で取り込ませることができる。さらに、申請者らが開発したyやPaなどの人工塩基に機能性の置換基(蛍光色素、ビオチン、ヨウ素、アミノ基など)を結合させた転写用の基質を合成し、人工塩基対による転写系でこれらの基質をRNA中に取り込ませ、種々の機能性RNAを作り出し、本技術の応用化の可能性を示した。以上のように、申請者は、従来の遺伝子操作技術に代わる遺伝情報拡張技術を可能とする人工塩基対の開発に世界に先駆けて成功した。今後は、この人工塩基対システムを幅広い分野に利用したベンチャー企業を設立し、本技術の普及を図ると共に医療に役立つ技術と製品を社会に提供したい。これまでに当研究室が開発した人工塩基対(2-アミノ-6-チエニルプリン:sと2-オキソピリジン:y)の転写効率を高めるために、sに代わる新たな人工塩基の開発を行った。そして、2-アミノ-6-チアゾイルプリン(v)とyの人工塩基対が、転写において、s-y塩基対と同程度の高い選択性を有し、さらに、天然型塩基対と同程度の高い転写効率を示すことがわかった。これにより、鋳型DNA中のvに相補して、効率良くRNA中に人工塩基yを部位特異的に導入することができるようになった。また、s-y塩基対では不可能であった2つのyを続けてRNA中に導入することも、v-y塩基対により可能になった。このように、s-v塩基対を用いて、RNAやタンパク質中に人工のコンポーネントを導入する手法を確立することができた。v-y塩基対の開発により、転写でRNA中に人工コンポーネントを効率よく導入することが可能になったので、yの5位に種々の機能性置換基を持つ誘導体を化学合成し、これらのRNA中への取り込みを調べた。そして、5-ヨードy、5-フェニルエチニルy、5-ビオチン化yの三リン酸誘導体の合成に成功し、これを転写によりRNA中に部位特異的に取り込ませることができた。5-ヨードyは、光架橋化コンポーネントとして、多分子との相互作用の研究に、5-フェニルエチニルyは、RNAの高次構造の熱安定性の向上に、また、5-ビオチン化yは、RNAの固定化に、それぞれ利用できることを確認した。複製においても機能する人工塩基対の開発研究は、天然型塩基を効率よく排除できる人工塩基の開発に専念した。そして、新たに開発した人工塩基の1つが、鋳型塩基として、天然型塩基の基質を効率よく排除できることがわかった。そこで、この人工塩基と塩基対を形成する可能性が高いと考えられる相補塩基のデザインを行った。昨年度までに、転写・翻訳において、天然型の塩基対と同程度の選択性と効率を示す人工塩基対の開発に成功した。そこで、本年度は、これらの人工塩基対を用いた応用研究と、また、複製においても高い選択性と効率を示す人工塩基対の開発研究をそれぞれ進めた。応用研究では、転写でRNA中に部位特異的に取り込ませることができる人工塩基対に、種々の蛍光色素(FAM.TAMRAなど)を結合させた転写用の基質を化学合成した。

そして、これらの蛍光性基質と相補人工塩基を含む鋳型DNAを用いることにより、T7 RNAポリメラーゼの転写系で、RNA中の任意の部位を特異的に蛍光標識できた。この手法を用いて、特定の物質に結合するRNAアプタマーを蛍光標識化することにより、新たな検出システムを開発した。複製においても機能する人工塩基対の開発は、転写レベルでの人工塩基対の研究をさらに進めることにより、新たな可能性が見出された。これまでに開発されている人工塩基対で、転写で機能するものは、全て塩基対を形成する塩基間で水素結合による相互作用を利用したものであった。しかし、複製においては、Eric Koolらが、水素結合の相互作用を持たない疎水的な人工塩基対が機能することを報告している。もし、転写においても疎水性の人工塩基対が機能すれば、複製・転写・翻訳の全てで機能する人工塩基対のデザインの幅が広がる。そこで、水素結合の相互作用を必要としない人工塩基対にフォーカスして研究を進めたところ、水素結合を必要としない人工塩基の組み合わせでも、転写で相補的に機能するものを見つけた。さらに、その塩基対の様式から、新たな人工塩基対の設計が可能になった。その結果、現在、複製においても非常に選択性の高い人工塩基対が作られつつある。新たな機能性バイオポリマーを開発するための革新的な技術の開発を目指して、複製・転写・翻訳において機能する人工塩基対を作り出すことが本研究の目的である。最終年度にあたる本年度は、最終目標である複製に於いても機能する人工塩基対の開発に成功した。昨年度までに、いろいろな特性を有する十種類程度の人工塩基をデザイン・合成することが出来た。そこで、これらの人工塩基を網羅的に組み合わせて、それぞれの塩基対の複製と転写における選択性を調べた。その結果、予期しなかった人工塩基の組み合わせで、転写に於いて高い選択性と効率を示すものを見つけた。この知見を基にして、さらに新たな人工塩基対をデザイン・合成したところ、複製と転写に於いて高い選択性を示す人工塩基対(Ds-Pa塩基対)を開発することができた。このDs-Pa塩基対を含む二本鎖DNAを用いて、20サイクルのPCRを行ったところ、増幅されたDNAにはDs-Pa塩基対が95%以上保存されていた。このDNAが一回増幅する時の人工塩基対のフィデリティーは99.8%程度であった。この値は、これらの人工塩基を含むDNAの化学合成の純度に近く、したがって、PCRにおけるDs-Pa塩基対のフィデリティーは、99.8%よりもさらに高いものと推測される。このDs-Pa塩基対は、転写に於いても相補的に機能し、鋳型DNA中のDsに対してPaを、またPaに対してDsを、それぞれRNA中に選択的に導入することができた。さらにPaにビオチンを結合した基質も作製し、この基質も鋳型DNA中のDsに相補してRNA中に選択的に取り込まれることもわかった。したがって、このDs-Pa塩基対を遺伝子に組み込むことにより、核酸をべ一スにした新たなテクノロジーを作り出すことが出来るようになった。さらに、複製でも機能する人工塩基対が開発されたことから、細胞内の実験にも本技術を応用できる状況になった。Ds-Pa塩基対は、翻訳に於いては効率よく機能しなかったが、これまでに開発された転写や翻訳で機能する人工塩基対(s-y塩基対やs-Pa塩基対)とDs-Pa塩基対を組み合わせることにより、複製・転写・翻訳の全てにおいて遺伝情報を拡張することが可能になった。
CRF及びACTH関連ペプチドの基礎的、臨床的研究

【目的】視床下部CRF-下垂体前葉ACTH-副腎皮質コルチゾール系の合成と分泌調節機構を解明する目的で、CRFとACTHの前駆物質であるPOMC遺伝子発現転写活性因子を含む調節メカニズム、ネガティブフィードバック、CRF結合蛋白等について検討した。【結果】1.ストレスによるCRF及びPOMCの遺伝子発現が促進する前にearly gene productであるc-fos、c-junのmRNAが増加する。一方、e-fos、c-junのantisense oligoを投与すると、CRF遺伝子発現には影響しないがPOMC遺伝子発現は抑制された。2.ストレスによるCRF遺伝子発現は、antisense CREBを室傍核に投与することにより抑制され、cAMPアナログにより増加した。PMAの影響は少なかった。3.CRFの合成・分泌に対しNPY、アンギオテンシンII、ノルアドレナリン、柴苓湯は促進的に、β-endorphinやαMSHは抑制的に作用することが明かとなった。4.人血中CRF結合蛋白濃度と血中cortisol濃度との間には負の相関関係があった。又ヒトのCRFを静注すると、CRF結合蛋白の2量体形成が促進された。【考察】1.CRFとPOMCの遺伝子発現にはA-キナーゼ-CREBの系が重要な役割を果たしている。FOSとJUNが結合したAP-1のCRF遺伝子発現に及ぼす影響は少ない。2.CRF遺伝子発現を促進する神経伝達物質の種類が明かにされつつあるが、それがどのメカニズムと関係しているのか調べることが今後の検討課題である。3.CRF結合蛋白の糖質コルチコイド及びCRFに対する反応性はCRF受容体と類似しており、その類似性の解明が受容体とcarrier proteinとの違いを明かにするものと思われる。〈目的〉視床下部CRF及び下垂体前葉POMCの遺伝子発現に関与する転写活性因子を明らかにする.〈方法と結果〉1.ラットにインスリン低血糖刺激を行うと,視床下部室傍核のCRF mRNAの増加の他にimmediate early geneであるc-junやc-fosのmRNAも増加した.一方下垂体前葉のPOMCmRNAの増加と共にc-junの増加も見られた.低血糖刺激によるこれら遺伝子発現の増加は糖質コルチコイドの前投与により抑制された.2.ラット下垂体前葉細胞やクッシング病下垂体腺腫細胞にCRF又はcAMPアナログを添加すると,ACTH分泌,c-fos mRNA,次いでPOMC mRNAレベルが増加したがc-junの増加は見られなかった.一方バゾプレッシン又はPMAを添加すると,ACTH分泌とc-fos mRNAが増加したがPOMC mRNAの増加は見られなかった.3.CRF遺伝子発現へのAキナーゼ及びCキナーゼ系の作用を検討する為,ラット室傍核(CRF産生部位)にcAMPアナログ又はPMAを投与すると,CRF mRNAレベルはcAMPにより増加したがPMAの影響はごくわずかであった.又CRF分泌刺激物質のうちNPYや柴苓湯がCRF mRNAレベルを増加させることが明らかとなった.〈考案〉今までの結果から,POMC及びCRFの遺伝子発現にAキナーゼ系が重要な働きをしていることが明らかとなった.このAキナーゼ関連の転写活性因子のうち,c-fosがCRFやPOMCのmRNAが増加する前に活性化されたが,c-junの活性化ははっきりせずJUN-FOS complexであるAP-1が,POMCやCRFの遺伝子発現の転写活性にどの程度関わっているのかはもう一つ明らかではない.この点を解明するためには今後antisense oligoなどを用いた検討が必要である.【方法と結果】

1.ラット脳室にαMSHを投与すると、正常ラットのACTH分泌は抑制されないが、両側副腎摘出ラットでは抑制された。2.人血中のCRF結合蛋白レベルとcortisolレベルは負の相関を示し、人CRFを静注するとCRF結合蛋白は2量体を形成した。3.ラット室傍核にノルアドレナリンを微量注入すると、CRF遺伝子発現が促進した。4.インスリン低血糖およびメトピロンによるCRF遺伝子発現促進作用は、c-fos、c-junのantisense oligoの室傍核注入によっては影響を受けなかったが、cAMP response element binding protein(CREB)のantisense oligoにより抑制された。5.漢方薬である柴苓湯をラットに投与すると、CRF遺伝子発現が増加し、さらにはステロイド投与による視床下部CRF、下垂体ACTHの合成と分泌への抑制が軽減された。【考察】1.CRF分泌に及ぼすACTH関連ペプチドのshort feedback作用は、ステロイドによるlong feedback作用の非存在下で発現する。2.CRF結合蛋白は糖質コルチコイドによりdown-regulateされ、CRFにより2量体形成が促進されることから、CRF受容体との類似性が今後大きな問題となる。3.CRFの遺伝子発現にはAキナーゼ-CREBの系が重要な役割を果たしており、ノルアドレナリンや柴苓湯がどのようなメカニズムで作用するか、今後の検討課題である。
電気刺激による脳内移植細胞の分化誘導法に関する研究

in vitroでは、培養神経幹細胞に対して低頻度電気刺激を行うことにより、神経幹細胞は陰極に遊走する傾向があり、神経系への分化を示し、脳由来神経栄養因子の分泌が増加していた。in vivoでも、脳梗塞モデルラットに対し電気刺激により脳梗塞体積が減少し、内在性の神経幹細胞の遊走が促進されることが示された。パーキンソン病モデルラットに対しては、神経幹細胞移植+電気刺激療法を施行したところ、より強い治療効果が得られ、広い範囲に移植細胞が生存していたが、ドパミン神経への分化については影響を与えなかった。電気刺激療法はパーキンソン病をはじめ臨床応用されており、本研究はさらなる治療効果を得るために細胞療法と組み合わせられないか、あるいは内在性の幹細胞を賦活化させることはできないのか、といった点に焦点をおいている。本年度はまず、ラット神経幹細胞を分離培養し、これに電気刺激をin vitroで持続的に行ったところ、神経幹細胞は刺激開始から1日後には電極に集まることを明らかにした。刺激強度が強すぎると細胞障害性を呈することから刺激強度はなるべく低く設定することが肝要であると分かった。細胞形態に関しては著明な変化を認めなかった。来年度以降、電気刺激により、神経幹細胞から栄養因子などの分泌が増加するのかどうか、あるいはその後の分化能に変化を与えるのかなどを明らかにする予定である。引き続き、神経幹細胞の遊走能に影響を与えることに着目して、脳梗塞モデルラットに対する電気刺激療法を行った。脳梗塞作成から急性期に持続電気刺激を開始すると、行動学的に著明な改善が得られ、脳梗塞のサイズは減少していた。また、内在性の神経幹細胞の遊走が促進され、脳梗塞周辺に新生神経細胞を確認することが出来た。来年度以降、さらにそのメカニズムを分子生物学的に明らかにし、刺激条件・刺激時期についても検討を重ねる予定である。さらに、これらの結果を受けてパーキンソン病モデルラットに対する神経幹細胞移植に電気刺激療法を組み合わせた研究を進めて行きたい。19年度までに、in vitroでの幹細胞の分化・遊走に対する電気刺激の効果を確認したが、20年度の研究で、用いる神経幹細胞の状態や刺激条件のわずかな差異でも実験結果が左右されることが分かった。一つ確実に分かったことは、電気刺激により、神経幹細胞陰極方向へ向かう遊走が増加することであり、in vivoでも遊走能が増加する事実と一致した。また、神経幹細胞におけるBDNF(脳由来神経栄養因子)の分泌も増加することが明らかになった。脳梗塞モデルラットに対する電気刺激療法についてもさらに研究を進め、硬膜外刺激と同様に脳実質内刺激でも強い神経保護効果を示すことが明らかになった。さらに、脳実質刺激により、亜急性期における行動学的改善や脳梗塞に陥った組織における内在性神経幹細胞の遊走と神経細胞への分化を確認することができた。分子生物学的には、電気刺激によりPI3Kが活性化されて生ずる抗アポトーシス作用が関与することも明らかになった。パーキンソン病モデルラットに対しては、これらの結果を反映させて、神経幹細胞移植+硬膜外電気刺激を行った。モデル作成から1週間後に神経幹細胞移植を行い、同日より電気刺激を開始したところ、行動学的・組織学的改善が得られた。移植された神経幹細胞のドパミン神経への分化は残念ながら非電気刺激群と比較して有意差が得られなかったが、電気刺激群では、損傷線条体における移植細胞の分布が広がっていた。これは、神経幹細胞の有する遊走能が賦活化されたためと考えられる。
脂肪細胞の生理と病理における機能ゲノム研究

本研究は脂肪細胞の遺伝子発現変化などの解析を通じて、脂肪細胞の生理機構を明らかとするとともに、肥満や肥満に関連する疾患の分子機構の解明や新規な治療標的の同定を目指したものである。まず、DNAマイクロアレイ解析によって、脂肪細胞の分化過程でMKP-1の発現が増強することを見出し、MKP-1がPPARγの活性調節を通じて脂肪細胞分化を制御することを明らかとした。転写制御因子であるKLF15も脂肪細胞分化過程で発現が増強する遺伝子である。その機能の解析を行い、KLF15が脂肪細胞分化に必須の役割を果たすとともに、肝臓では糖新生系酵素遺伝子の発現制御に関わることを明らかとした。PDK1欠損マウスの胎児線維芽細胞よりPDK1を欠損した褐色脂肪細胞株の作成に成功し、脂肪細胞のグルコース取り込みにおけるPDK1の役割を明らかとした。また肝臓特異的PKCλ欠損マウスの解析などを通じ、PKCλが脂肪酸の産生やインスリン感受性の決定に重要な機能を示すことも見出した。また、肝臓特異的なSTAT3欠損マウスの解析などを通じて、STAT3が糖新生を制御するとともに体重の制御にも関わることを見出した。さらに肝臓STAT3シグナルの活性化は肥満モデルマウスの高血糖や脂肪肝を改善することを見出し、メタボリックシンドロームの治療標的としてのSTAT3の有用性も明らかとした。また、肝臓のSTAT3は中枢のインスリン受容体によって活性化すること、この経路は肥満インスリン抵抗性動物では強く活性化していることを見出した。脂肪組織において肥満の誘導時に特徴的に発現が変化する遺伝子を同定するためDNAマイクロアレイによる解析を行った。その結果、脂肪組織に高発現し、肥満によってその発現が増強するケモカイン遺伝子及びユビキチンリガーゼ遺伝子を同定した。現在、肥満の病態におけるこれらの遺伝子の関与を解析中である。Cre-Lox Pシステムを用いてPDK1遺伝子を脂肪細胞において特異的に欠損させた細胞系を確立した。その細胞を用いた解析により、PDK1が脂肪細胞におけるインスリの代謝調節作用、特に糖取りこみの分子機構に必須の機能を果たすことを明らかとした。糖尿病や代謝症候群では脂肪肝を高頻度に併発する。インスリンシグナル伝達への関与が示唆されているatypical PKCλの一つであるPKCλを肝臓特異的に欠損したマウスを作成しその代謝変化を解析した。肝臓特異的PKCλ欠損マウスでは結果インスリンによるSREBP-1遺伝子発現が低下し、肝臓の中性脂肪量も低下することが明らかとなった。また、このマウスでは対照と比してインスリン感受性も増強していた。これらの結果は肝臓のPKCλ依存性のシグナルは糖尿病や代謝症候群におけるインスリン感受性や脂肪肝の治療のターゲットとなることを示唆するものと考えられる。肝臓特異的なSTAT3欠損マウスの解析により、糖新生系遺伝子の発現抑制に働くといういうSTAT3の新機能を明らかとした。また、肥満インスリン抵抗性糖尿病モデルマウスであるdb/dbマウスの肝臓にアデノウイルスを用いて活性型STAT3を発現させたところ、糖新生系酵素遺伝子の発現の低下とともに、耐糖能、高インスリン血症及び脂肪肝が著しく改善した。糖尿病や代謝症候群の治療において肝臓のSTAT3シグナルは、耐糖能をはじめ種々の代謝異常の改善につながる新規な治療ターゲットとなると考えられた。脂肪組織において肥満の誘導時に特徴的に発現が変化する遺伝子を同定するためDNAマイクロアレイによる解析を行い、その結果、脂肪組織に高発現し、肥満によってその発現が増強するケモカイン遺伝子及びユビキチンリガーゼ遺伝子を同定した。ユビキチンリガーゼ遺伝子に関しては培養脂肪細胞における野生型や機能欠損型変異体の過剰発現実験とともに、yeast two hybrid法を用いて、その標的蛋白の同定を試みている。また、遺伝子欠損マウスの作成も合わせて行っている。ケモカインに関しては、ヒト試料を用いた解析を行っており、その血中濃度と肥満の病態との相関を見出した。

また、DNAマイクロアレイ解析により、脂肪細胞の分化の過程でMAPキナーゼを特異的に脱リン酸化する酵素であるMKP-1の発現が誘導されることを見出した。前駆脂肪細胞から成熟脂肪脂肪の分化過程では、細胞増殖期にはMAPキナーゼ活性が高く、増殖を停止し終末分化へ移行する時期にはMAPキナーゼ活性が低下する。MKP-1の強制発現実験、アンチセンスRNAを用いた発現抑制実験などから、脂肪細胞分化過程でのMAPキナーゼ活性の変化はMKP-1の発現によって直接制御されることを明らかとした。また、MKP-1の発現誘導が抑制された前駆脂肪細胞は成熟脂肪細胞への分化がほぼ完全に抑制され、この作用は転写調節因子PPARgの活性の制御によることを明らかとした。これらの結果は、脂肪細胞の分化の過程で、MKP-1が増殖から分化への切り替えスイッチとして働くことを示唆するものであり、肥満における脂肪組織の増大の機構の理解にも寄与するものと考えられる。ケモカインC10がマウス脂肪組織において高発現し、肥満誘導によってその発現が増加することを明らかとした。C10に構造上もっとも類似したヒトケモカイン遺伝子についてその遺伝子の多型性を検討したところ、4つのハプロタイプに分類されることが明らかとなった。2型糖尿病患者と健常対象者においてハプロタイプの頻度を検討した結果、ハプロタイプ3の出現頻度が糖尿病において対象の1.5倍となることが明らかとなった(頻度:糖尿病0.105、健常0.106,p=0.003)。すなわち、本遺伝子は2型糖尿病の疾患感受性を規定する遺伝子の一つであることが示唆された。また、ELISA系を確立し本ケモカインの血中濃度を検討した結果、血中濃度とインスリン抵抗性の指標や内臓脂肪量が逆相関することが明らかとなった。IL-6は肥満に伴い脂肪細胞から分泌されるアディポサイトカインの1種であり、肥満におけるインスリン抵抗性の発症に関与すると考えられている。高インスリン正常血糖クランプ解析の結果、IL-6を欠損するマウスはインスリンによる肝糖産生の抑制能が減弱することが明らかとなった。脳室内にインスリンを投与すると肝臓で」STAT3が活性化し糖産生が抑制される。ところが、IL-6を欠損するマウスでは脳室内インスリン投与による肝臓のSTAT3の活性化は阻害され、糖産生の抑制効果も減弱していた。また、脳室内インスリン投与により肝臓でのIL-6の産生は増加した。すなわち、中枢性のインスリン作用により肝臓でのIL-6の産生され、STAT3の活性化を促すことにより糖産生が抑制されることが明らかとなった。一方、肥満インスリン抵抗性マウスであるdb/dbマウスにIL-6の中和抗体を投与すると耐糖能が改善したことから、肝臓における一過性のIL-6の産生は生理的な糖代謝制御に重要な役割を果たすものの、肥満における慢性かつ全身性のIL-6の増加はインスリン抵抗性の発症に関わる可能性が示唆された。
弾性大変形ダイナミクスとソリトン理論

近年のソリトン理論の研究により、ソリトンの可積分構造と幾何学との結びつきが色々と分かってきたが、それらは主として数学的な研究にとどまっていた。しかし本研究では、1次元幾何性を持つものとして弾性棒に着目し、実際の弾性の基礎式や構成方程式を導入する事により、ソリトンの大変形運動を弾性棒のダイナミクスの解析に応用した。まず1次元弾性体理論とソリトン理論とを結びつける基礎方程式を完成し、これを摂動論を用いることにより詳細に検討し、従来では理論的には扱えなかった弾性体の大変形運動の解析を行った。そしてソリトンの厳密解を利用することにより、様々な新しいクラスの弾性体の運動を表す解析解を求めることが出来た。まず、紐を伝わるループについて、紐が伸びたときの効果を考慮した解析解を求めた。そして次にブリザ-解と言われる包絡振動型の解が、ロッドを高周波で振動することにより生じうることが示された。さらに、高次のソリトン理論を用いることにより、新しいタイプの大変形波の解を求めることが出来た。これらは、実際に海底でのケーブル、人工衛星のテザ-などで生じうる運動であり、工学的な意義も大きいと思われる。次に、連続弾性体を離散モデル化し、そしてソリトン理論による解析の離散化版を同時に考えることによって、以上の解に対する数値計算を行った。特にループについては詳細に検討し、様々な擾乱に対して安定であることが言えた。今後は様々な構成方程式の導入により、ダイナミクスがどのような変化を受けるか、また、可積分の離散化の手法を用いて連続弾性体、離散棒の運動を統一的に議論し、その比較検討を行ってゆきたい。
ボーズーアインシュタイン凝縮系に対する3次元量子渦糸シミュレーション

1.新規に開発したシミュレーションコードを用いて、希薄中性原子気体のボーズ-アインシュタイン凝縮系に対するGross-Pitaevskii方程式の3次元動的シミュレーションを行い、量子渦糸の3次元的ダイナミクスを可視化して定性的性質を明らかにした。特に、渦の進入から結晶化に到る過程において、これまで予見されていなかった渦糸乱流状態の存在をシミュレーションにより指摘した。さらに実際の実験との比較により、散逸係数の決定および実験では見ることができない詳細なダイナミクスを明らかにした。2.フェッシュバッハ共鳴付近でのフェルミ原子気体の量子渦の性質をあきらかにするため、フェルミオンーボソンモデルに対するボゴリュボフードゥジャン方程式導出した。さらにそれを数値的に解いて、BEC領域からBCS領域に到る広範囲におけるフェルミ原子気体中の量子渦糸の詳細な性質を明らかにした。3.液体ヘリウムの超流動乱流状態を記述するGross-Pitaevskii方程式の3次元動的シミュレーションを行い、量子渦糸乱流状態が構成する自己相似構造を見出した。これが流体乱流の自己相似則(コルモゴロフ則)と同等であることを示し、量子渦糸乱流におけるのカスケード過程の詳細を明らかにした。[1]希薄中性原子気体のボーズ-アインシュタイン凝縮体を記述するGross-Pitaevskii方程式の3次元動的シミュレーションを行って、回転系での量子渦糸の3次元ダイナミクスを明らかにした。まず初期段階で、シュミレーションプログラムをベクトル・並列型スーパーコンピューターに最適化し、数値計算の高速化を実現した。その後,系統的な3次元シミュレーションをおこなって、次の事柄を明らかにした。(1)全系のダイナミクスは1つの散逸過程をなしており、エネルギー散逸の割合によって3つの状態に分けられる。(2)渦はトーマスフェルミ端付近で衝突、つなぎ替え等の3次元的な相互作用を起こして、渦糸乱流状態が存在する。また、ケルビンモードのような3次元的な運動をすることも判明し、これまでの2次元モデルでは解析できない事実を明らかにした。(3)トーマスフェルミ端外に存在する幽霊渦の個数と(実)量子渦の個数との関係、また渦糸格子状態での幽霊渦と量子渦の関係にを明確にした。[2]液体ヘリウム4の超流動乱流状態を理解するため、超流動密度のダイナミクスを記述するGross-Pitaevskii方程式に対する3次元大規模シミュレーションを行い、量子渦糸のダイナミクスが超流動定常乱流状態や超流動乱流遷移にどのように寄与しているかを直接的に明らかにした。特に、無散逸の場合に生じる短波長励起をかき消す現象論的散逸項を回復長よりも小さいスケールに導入する事により、得られたエネルギースペクトルがKolmogorovの-5/3則に一致する事が明らかとなった。[1]希薄中性原子気体のボーズ-アインシュタイン凝縮体を記述するGross-Pitaevskii方程式に対する3次元動的シミュレーションを行って、回転系での量子渦糸の3次元ダイナミクスを解析をおこなった。その結果、(1)実験結果と対比させる数値シミュレーションを行なって、現実系での散逸係数を決定した。また、2次元系と3次元系での散逸係数の違いを明らかにした。(2)実験における回転異方性の時間発展や最終状態に対する実験結果を再現することに成功した。(3)回転軸方向に周期ポテンシャルを付加した状況での量子渦糸状態を解析した。[2]液体ヘリウム4のダイナミクスを記述するGross-Pitaevskii方程式に対する3次元大規模シミュレーションを行い、量子渦糸のダイナミクスが超流動定常乱流状態や超流動乱流遷移にどのように寄与しているかを直接的に明らかにした。無散逸の場合に生じる短波長励起を打ち消す現象論的散逸項を回復長よりも小さいスケールに導入する事により、得られたエネルギースペクトルがKolmogorovの-5/3則に一致する事を明らかにした。[3]超伝導研究においては、時間依存のギンツブルクランダウ方程式をマックスウエル方程式及び熱拡散方程式と連立させた3次元数値シミュレーションを行うことで、超伝導体内の熱拡散問題を考察した。特に超伝導体に中性子照射を行なった場合の熱拡散問題を考察し、MgB2超伝導体の中性子検出器応用が可能であること数値シミュレーションにより示した。
胎盤構造形成の分子機構

胎盤形成は哺乳類の個体発生に必要不可欠であるだけでなく、短期間に形態的にも機能的にもめまぐるしい変遷を遂げる生物学的モデルとして興味深いが、特に合胞体形成に関与する分子については不明な点が多い。FRP-1分子の機能特性を生かし、巨細胞形成に関わるFusogen・及びそのLigandの同定を初めとして胎盤形成の本質に迫ることが本研究の目的である。本年はヒトtrophoblasts由来細胞であるBeWo細胞を含む培養細胞や胎盤組織を含む人体組織を用い、細胞融合制御因子CD98/FRP-1 HeavychainとLight chainの発現を解析した。ヒト組織と腫瘍細胞において、LAT1をはじめとするFRP-1/CD98Lcと、その機能に深く関係するFRP-1の発現について調べた。PT-PCRとReal-Time PCRによる分析では、腫瘍細胞では、すべての細胞株でLAT1のmRNAとFRP-1のmRNAが発現していたが、その発現パターンはLAT1とFRP-1hcで異なっていた。また、FACSによる解析では、すべての腫瘍細胞株でLAT1タンパク質とFRP-1タンパク質がともに存在することがわかった。これはLAT1の機能的な発現に、FRP-1が必要であるという報告と一致する。ヒト組織のRT-PCRとReal-Time PCRによる分析では、LAT1のmRNAは、胎盤、骨髄、精巣、脳で高く発現していた。こうしたLAT1/FRP-1複合体の特徴は、細胞の成長・増殖やアミノ酸関連化合物の生成に必要なアミノ酸を供給するアミノ酸トランスポーターとしての役割を支えているものと思われる。今後、このアミノ酸トランスポーター活性とウイルス誘導細胞融合制御の機能的関係を解析する予定である。近年、CD98/FRP-1のLight chainが解明され、CD98/FRP-1とLight chainのHeterodimerがアミノ酸トランスポーター活性を有する事が明らかになった。そこで、BeWo細胞におけるCD98/FRP-1とLight chainの発現調節を解析した。胎盤中におけるCD98/FRP-1とLight chainの蛋白発現レベルは経時的に増加し、その局在は主としてPlacental apical membraneである事を証明した。その発現はProtein kinase Cによって調節している事も分かった。これらの結果はCD98/FRP-1とLight chainのHeterodimerが胎盤における機能発現に重要な役割をはたしている事を示唆している。本年はヒトtrophoblasts由来細胞であるBeWo細胞を用い、細胞融合とCD98/FRP-1との関係及び細胞融合の過程を解析した。BeWo細胞を抗CD98/FRP-1抗体の存在下で培養すると、細胞が凝集し、胎盤類似の網目状を形成する事が明らかになった。この網目状になったBeWo細胞を抗CD98/FRP-1抗体の存在下でさらに培養しても合胞体形成を誘導する事はできなかった。この培養過程におけるADAM Familyの変化を解析したが、現在のところ有意な結果を得ていない。これらの結果はCD98/FRP-1とLight chainのHeterodimerが胎盤におけるアミノ酸トランスポートに重要な役割をはたしている事を示唆している。

こうしたLAT1/FRP-1複合体の特徴は、細胞の成長・増殖やアミノ酸関連化合物の生成に必要なアミノ酸を供給するアミノ酸トランスポーターとしての役割を支えているものと思われる。今後、このアミノ酸トランスポーター活性とウイルス誘導細胞融合制御の機能的関係を解析する予定である。近年、CD98/FRP-1のLight chainが解明され、CD98/FRP-1とLight chainのHeterodimerがアミノ酸トランスポーター活性を有する事が明らかになった。そこで、BeWo細胞におけるCD98/FRP-1とLight chainの発現調節を解析した。胎盤中におけるCD98/FRP-1とLight chainの蛋白発現レベルは経時的に増加し、その局在は主としてPlacental apical membraneである事を証明した。その発現はProtein kinase Cによって調節している事も分かった。これらの結果はCD98/FRP-1とLight chainのHeterodimerが胎盤における機能発現に重要な役割をはたしている事を示唆している。
【特定行為　指導ツール】の開発に関する研究－在宅における介護職版－

平成24年度社会福祉士及び介護福祉士法の改正により、介護職員等による喀痰吸引等が実施可能となった。在宅療養者への特定行為に関しては、訪問看護師が介護職に指導することが求められている。研究1では、看護職が介護職に対して行う特定行為における指導の現状と課題を明らかにするため、訪問看護ステーションおよび訪問介護事業所を対象に質問紙調査を実施した。研究2では、先進施設における特定行為に関する指導方法を明らかにするため、先進施設の看護師と介護士を対象に面接調査を実施した。研究3では、webシステムを利用し、写真とコメントの情報で構成される介護職版【特定行為指導ツール】を開発した。平成24年度より痰の吸引および経管栄養等の医行為(以下、特定行為)が介護職員等にも認められた。これに伴い在宅では訪問看護職が介護職に対して療養者の個別性を踏まえた特定行為を指導することが求められる。本研究では、看護職が介護職に対して行う特定行為における指導の現状と課題を明らかにし、介護職版【特定行為指導ツール】の開発を目指している。研究1では、看護職が介護職に対して行う特定行為における指導の現状と課題を明らかにすることを目的とし、質問紙調査を実施した。先行研究を参考に質問項目を作成し、プレテスト実施後に全国の訪問看護ステーション2000箇所および訪問介護事業所2000箇所を対象とした特定行為の指導に関する実態調査を実施した。その結果、看護職側は、特定行為に関する指導も含め、ケア全般に関する情報の伝達や記録における時間的・作業的負担を課題として挙げており、介護職側は「看護職が用いる専門用語の理解」「介護職の医療に関する知識」「療養者の状況報告に関する適切な判断」において困難を感じていることが明らかとなった。これらのことから特定行為を指導する際には、介護職にわかりやすい用語を用いて指導すること、医療に関する知識を提供しつつ説明すること、療養者毎に異なるアセスメントのポイントと起こり得るリスクについて説明する必要性などが示唆された。平成25年度は、研究2として、先進施設における特定行為に関する指導内容および指導方法を明らかとするため、先進施設の視察と看護職および介護職に対する面接調査を実施した。平成24年度より,痰の吸引および経管栄養等の医行為(以下,特定行為)が介護職員等にも認められた。本研究では,看護職が介護職に対して行う特定行為における指導の現状と課題を明らかにし,介護職版【特定行為指導ツール】の開発を目指している。研究1では,看護職が介護職に対して行う特定行為における指導の現状と課題を明らかにすることを目的とし,質問紙調査を実施した。先行研究を参考に質問項目を作成し,群馬県内の訪問看護ステーション3か所,訪問看護事業所3か所を対象にプレテストを実施した。次に作成した質問紙調査を用い,全国の訪問看護ステーション2000箇所および訪問介護事業所2000箇所を対象とした特定行為における指導方法に関する実態調査を実施した。その結果,599件の訪問看護ステーションより回答が得られ,有効回答は567件,有効回答率は,28.4%であった。利用者数は,平均72.0±40.3名,1か月の平均訪問件数は436.2±259.1件であった。介護職との連携方法としては,利用者宅の連絡ノート95.8%,電話93.3%,カンファレンス86.8%,ファックス58.2%が用いられていた。「ケア方法の情報を共有するための記録は手間がかかる」の回答は70.4%,「ケア方法の情報を共有するための記録または申し送り(伝達)は時間がかかる」の回答が62.1%であることから,特定行為に関する指導も含め,ケア全般に関する情報共有において伝達や記録に時間的・作業的負担があり,情報の共有における課題が明らかとなった。現在,訪問看護ステーションの自由記載の内容について質的に分析を行っており,さらに,介護事業所425件より得られた回答についても分析を行っている。平成24・25年度に明らかとなった看護職が介護職に対して行う特定行為における指導の現状と課題等を基に、平成26年度は研究3として介護職版【特定行為指導ツール】(以下、指導ツール)を開発した。指導ツールは遠隔地での使用も可能なモバイル端末を用いたシステムとし、画像とテキストから構成される試作システムとした。

指導ツールの実証実験として、群馬県内の訪問看護ステーション1か所に、指導ツールおよび指導ツールの手引きを試験的に使用してもらい、半構造的面接調査により、看護職および介護職から指導ツールについての課題および成果を明らかとした。その結果、看護職からは、療養者宅に手順書を置いておくことで、適宜介護職への指導が可能となるというように、指導ツールとしての有効性が挙げられ、さらに手順書作成過程において家族の意向を確認できたというように、家族介護者-看護師間の情報共有の手段としての活用可能性も示唆された。課題としては、介護職への説明資料を追加作成することに対する負担が挙げられた。追加内容としては、解剖生理やケア実施時の根拠説明などであり、標準化可能な内容であったため、引用可能なコンテンツとして指導ツール内に設定することで作成における負担軽減につながると考えられた。介護職からは、観察ポイントやケア方法が理解しやすいとの意見があり、指導ツールの有効性が示唆された。在宅ケア研究1の調査は完了し、結果を学会にて報告した。研究2の調査については、現在データの分析中である。平成26年度に実施予定の研究3では、介護職版【特定行為指導ツール】の開発および実証実験を予定しているが、モバイル端末を用いる方法で準備している。平成24年度に訪問看護ステーションおよび訪問介護事業所を対象とした質問紙調査を実施し,回答のデータ入力作業は完了している。また,結果の一部を学会で発表した。平成26年度は、研究3として介護職版【特定行為指導ツール】の開発を予定している。本研究では遠隔地での使用も可能なモバイル端末を用いたシステムの開発を予定しており、システムの開発、システムの設置・管理については、近畿大学および群馬県立県民健康科学大学の協力を得て実施する予定である。また、【特定行為指導ツール】の実証実験においては、指導ツールの手引きを作成する予定である。指導ツールは、視覚的情報として画像データを用いるため、「情報の管理」などの留意点や手続きを含めた運用についての手引きを作成する。指導ツールのプレテストとしては、群馬県内の訪問看護ステーション1か所に、指導ツールおよび指導ツールの手引きを試験的に使用してもらい、半構造的面接調査により、看護職および介護職から指導ツールについての課題および成果について聞き取る。聞き取った結果に基づき指導ツールを改良し完成させる。平成25年度は,研究2として,先進施設における特定行為に関する指導方法を分析する。対象は,研究1の結果から得られたリスト,在宅看護・在宅介護の関連雑誌,ホームページ等で公表されている情報を収集し,総合的評価により積極的・特徴的な看護職・介護職の連携が特定行為に関してなされている施設を20ヵ所選定する。データ収集方法は,研究代表者が現地へ赴き,各施設の視察と看護職および介護職に対する面接調査により,特定行為に関する指導内容および指導方法について資料を収集する。面接の経過はその場で筆記するとともに承諾を得てICレコーダーに記録する。分析方法は,視察および面接の記録から特定行為に関する指導内容および指導方法について質的に分析し,看護職が介護職に対して行う特定行為における指導として重要な要素を抽出する。
薬物依存形成に関与する転写因子とこれを標的とした治療薬の開発

モルヒネ長期投与により変化する一本鎖DNA結合蛋白のPurαをすでに見いだしている。そのDNA結合活性を増強する因子の存在を見いだし、これを精製したところ、カルモデュリン(CaM)であった。CaMは、PurαのDNA結合活性を約10倍増強した。また、長期モルヒネ投与は、CaMIII遺伝子のうち、CaMIII遺伝子のみを活性化することを見いだした。さらに、Purαは、CRE/CREBのエンハンサー活性や突起伸展を抑制することを見いだした。以上、モルヒネによる遺伝子発現には、CRE/CREBとは異なった、Caを介するシグナル系が関与している可能性を示した。一方、電気刺激やメタンフェタミンなどにより、脳の部位特異的に誘導される最初期遺伝子Arcが知られているが、Arc蛋白に結合する新規蛋白質Amidaを単離し、解析した。Amidaは核に移行し、神経細胞死を起こすこと、さらにArcはAmidaと結合し、核に運ばれ、細胞死を抑制することを見いだした。また、AmidaはCdc2/cyclinBにより、セリンー180がリン酸化され、DNAとの結合活性が変化することを見いだした。長期メタンフェタミン投与により、何らかの機作によりAmidaとArcに比率が変化し、Amidaによる細胞死が進行し、これが難治性興奮薬精神病の原因の一つではないかと推察している。すでにモルヒネを長期投与した時に、脳内の一本鎖cAMP Response Element結合蛋白質(一本鎖CRE-BP)のDNA結合活性が減少することを見出し、これをクロー二ングしたところPurαと同じものであることが分かった。しかし、モルヒネ長期投与ではpurα量の変化は認められなかった。次に、PurαのDNA結合には、活性化因子が必要であることを見出し、これを精製したところ、Calmodulin(CaM)であることが分かった。カルシウムによる遺伝子応答系としては、すでにCa-CaM/CaM kinase-CREBが知られているが、我々が見出したCa-CaM-Purαの経路は新しいカルシウム-・遺伝子応答系であり、薬物依存などの現象に深く関係していること推察される。Purαが結合するコンセンサス配列は、プリンに富む塩基配列で、多くの遺伝子の上流に存在することが知られており、CREBよりも広い範囲の遺伝子発現に関係していると考えられる。さらに、大麻の活性物質であるカンナビノイドの受容体を介する細胞内伝達系は、モルヒネのそれと類似しているので、モルヒネと同様なデータを得ている。ー方、覚醒剤やコカインの慢性投与により、妄想や幻覚などの精神分裂病に類似した症状が出ることから、精神分裂病のモデルとして用いられている。我々は、電気ショック痙彎時に海馬で誘発される最初期遺伝子のArcを取り上げ、Arcと結合する新しい蛋白質を単離し、これをAmidaと名付けた。Amidaは、核移行シグナルを持ち、核に移行して神経細胞死を引き起こした。また、Amidaは、Arcと複合体を形成し、Arcを核内に移行させる。ArcはAmidaの細胞死活性を抑制する作用を持つことが分かった。覚醒剤やコカインによる興奮性精神病の発現にArc-Amidaが関係している可能性がある。1)メタンフェタミンで誘導最初期遺伝子Arcと結合する蛋白質Amidaを単離した。Amidaは、核移行シグナルを持ち、細胞死を引き起こした。さらに、Arcは、Amidaと結合し、共に核に移行し、Amidaの細胞死活性を抑制した。以上のことから、メタンフェタミン精神病の成立過程に、Amidaの神経細胞死が関係している可能性が示唆された。2)慢性モルヒネ脳において変化するPurαの活性化因子として、カルモジュリンを見出した。プロモータ領域にPURエレメントを持つ遺伝子をプローブとして、CaMの存在・非存在下で、Purαの結合を調べたところ、CaMの存在下で、Purαの結合が増加した。このことより、Ca/CaM→Purα系を介する遺伝子発現調節の可能性が示唆された。3)PurαがCRE/CREB活性にどの様な影響を及ぼすかを調べた。フォルスコリン処理したPC12細胞の突起伸展、CREエンハンサー活性およびc-fos