hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
枯草菌転写制御ネットワークの全体像の解明

枯草菌を種々の培養あるいはストレス状況に曝した、遺伝子クラスタリングのDNAマイクロアレイ解析、および転写制御変異株を用いた、標的遺伝子候補を抽出するアレイ解析により、500に及ぶマイクロアレイ解析データを獲得した。この膨大な転写制御知見のうち、枯草菌の窒素代謝に関する遺伝子クラスタリング解析、代謝に関連した転写制御蛋白質のDNAマイクロアレイ解析による標的遺伝子候補の抽出、および分子遺伝学的解析から、合成系を代表する分岐鎖アミノ酸合成の制御を中心に据える炭素代謝制御(CcpAが関与)、窒素代謝制御(CodYとTnrAが関与)と緊縮制御(RelAが関与)のネットワークを想定できた。DNA結合転写制御因子のDNAマイクロアレイ解析結果に基づく、個々のレギュロンの機能解析では、ECFシグマ因子の網羅的解析を終了させることができた。また、2成分制御系レギュロンの網羅的機能解析をほぼ終了させた。後者の解析の結果、34個の2成分制御系のうち、機能の全く推測できないものは6個程度になった。さらに、数百のHTH転写制御蛋白質の支配するレギュロンのDNAマイクロアレイ解析結果に基づく網羅的機能解析では、MarR、TetRとMerRファミリーの薬剤耐性に関与するHTH転写制御蛋白質の支配するレギュロンの分子遺伝学的研究を進め、これらのファミリーに属する制御蛋白質の殆どで、少なくとも一つの主要な標的遺伝子を見出した。特に、YsiAが脂肪酸分解制御に関与するグローバルな制御因子であることを見出した事は特筆に値する。これらの結果の殆どとこれまで蓄積されてきた文献情報により、転写制御ネットワークの輪郭を把握した6この5年間に渡る研究成果は、39編に登る学術論文(次ページにリスト)と100回を超える学会発表で公表した。枯草菌の転写制御ネットワークは、DNA結合蛋白質(シグマ因子、2成分制御系の応答制御因子およびHTH蛋白質)が支配するレギュロン発現の総和と考えられる。平成12年度は、枯草菌DNAチップの大量供給体制を整え、DNAマイクロアレイ技術を確立した。この技術により、枯草菌のグルコース抑制を受ける遺伝子を検索し、種々の炭素源での増殖時に特異的に発現する遺伝子のクラスタリングを行い、また20種類のDNA結合蛋白質の支配するレギュロンの構成遺伝子候補を抽出した。とくに、機能既知のみならず機能未知の2成分制御系の応答制御因子の支配するレギュロンの標的遺伝子の抽出にも極めて有効な方策を見出したことは、2成分制御系の網羅的な解析を可能にするもので注目される。これらの成果のうち、枯草菌のマイクロアレイ技術、グルコース抑制を受ける遺伝子の抽出とその抑制のCcpA依存性については、既に公表している[NucleicAcids Res.29(3):683-692(2001)]。このような研究実績は、枯草菌のみならず細菌のDNAマイクロアレイ解析を国際的に先導するものであるといえる。さらに、機能未知DNA結合制御蛋白質の支配するレギュロンの機能解明に取り組み次のような成果を挙げた。シグマ因子の生体外機能解析実験のために、RNAポリメラーゼホロ酵素のβ'にT7-Tagをつけて迅速精製し、シグマ因子過剰発現株からシグマ因子蛋白を回収する方法を開発した。また、SigYは栄養源飢餓に、SigZは低温での増殖に関与している知見を得た。尚、DNA結合蛋白質に関する文献情報の収集を終了し、転写制御ネットワーク解明のための大量のマイクロアレイデータの生物情報学的処理、DNA結合蛋白質の認識するシス配列の解析およびリガンドの同定等に向けての研究体制を整えつつある。枯草菌の転写制御ネットワークは、DNA結合制御蛋白質(シグマ因子、2成分制御系の応答制御因子およびHTH制御蛋白質)が支配するレギュロンの発現総和であり、これらのレギュロン発現制御をDNAマイクロアレイ解析を基軸として解明せんとしている。

平成13年度は、昨年度確立したDNAマイクロアレイ技術を用いて、7種のECFファミリーのシグマ因子と27の2成分制御系の網羅的な標的遺伝子候補の抽出を終了した。2成分制御系の網羅的な解析は既に公表し、国際的に注目されている[J.Bacteriol.183(24):7365-70(2001)]。その他の20種類のDNA結合制御蛋白質のマイクロアレイ解析をも終了している。これらのDNA結合制御蛋白質のマイクロアレイ解析は2成分制御系間の相互作用等種々の興味ある遺伝子発現制御系を示唆しており、NorthemやlacZ融合解析でそれらの標的遺伝子の解析を行っているDNA結合制御蛋白質は、19種類に上っている。そのうち3種の制御蛋白質(TnrA、YrkPとYccH)を大腸菌で過剰合成させ、ゲル移動度シフト法等の生体外系を用いたこれらの蛋白質の認識するcis配列の解析に入っている。さらに種々の炭素源および窒素源での増殖時に発現する遺伝子の解析および胞子発芽時の逐次的なマイクロアレイ解析をも終了し、炭素と窒素代謝およびこの形態変化に伴う遺伝子発現の全貌を掴むことができた。これら多量のDNAマイクロアレイ解析うち既に30解析は論文として公表したが、残り150解析を越えるマイクロアレイ結果の公表を図っている。また、これらのマイクロアレイ解析結果を表示するツール(枯草菌WebGen-Net)を開発するとともに、本計画研究結果とDNA結合転写制御蛋白質に関する文献情報との統合データベースを構築している。枯草菌の転写制御ネットワークの根幹は、シグマ因子、2成分制御系の応答制御因子、およびHTHタンパク質による転写制御で構成されている。平成14年度の前半までに、シグマ因子、応答制御因子と既知HTHタンパク質の標的遺伝子を探索する破壊株あるいは過剰生産株を用いたDNAマイクロアレイ解析を終了した。また、遺伝子のクラスタリングを目指した、炭素代謝と窒素代謝のDNAマイクロアレイ解析に引き続き、アミノ酸合成のフィードバック制御のアレイ解析を終了させ、10数個の機能未知遺伝子がアミノ酸合成に関連していることを見いだした。以上のような本研究の進展により新規な転写制御系が多く明らかになり、ほぼ14年度の研究目的を達成できたといえる。約200種類のHTH転写制御因子の支配するレギュロンの網羅的機能解析は、薬剤耐性遺伝子のHTH転写制御因子を多く含む、MarR、TetRとMerRファミリーの制御因子の支配するレギュロンの解析を優先して進めた。既にMarR22因子、TetR19因子およびMerR6因子のタンパク生産系を構築した。TnrAレギュロンの解析に続き、LmrAとYvmBレギュロンの標的転写単位の同定に成功した。現在、19の制御因子の少なくとも一つの主要な標的を見出している。さらに、それぞれが結合する配列のうち9因子のシス配列を定めることに成功した。また、枯草菌の基幹代謝制御因子の多重制御をうけるilv-leuオペロンの発現制御の解析により、炭素代謝、窒素代謝、緊縮制御が密接に連動している事を明らかにしつつある。この連動の本体の解明を進め、代謝制御ネットワークを統合的に捉えられるようにする。
全身諸臓器の正常・腫瘍組織における細胞周期・細胞死関連蛋白の網羅的発現解析

ヒト肺癌および胃癌組織を用いて、組織型の違いによる細胞死(アポトーシス、オートファジー、ネクロプトーシス)の誘導に関して免疫組織化学的解析を行った。肺癌では、組織型(腺癌・扁平上皮癌・小細胞癌)の違いにより細胞死誘導に差が生じている可能性が示唆された。胃癌ではアポトーシスによる細胞死が主に誘導されており、分化型胃癌ではアポトーシスとオートファジーが協調的に制御されている可能性が認められた。本研究は、全身諸臓器の正常および腫瘍組織における細胞周期・細胞死関連蛋白の発現を網羅的に解析し、各組織における発現パターンの違いを明らかにすることにより、細胞周期・細胞死のパターンに基づく癌治療の個別化や予後予測に向けた基礎データを得ることを目的としている。平成27年度は、肺癌、大腸癌、甲状腺癌を対象に免疫組織化学染色を行い、なかでも肺癌の組織型による細胞周期および細胞死関連タンパク発現の差異を解析した。肺癌は組織型や遺伝子変異の有無が治療方針に大きく関わり、近年分子標的治療を含めた個別化治療が発展している。細胞周期や細胞死の異常は細胞増殖・癌化に関連し、このような生物学的特性を解明することが癌治療への応用につながると期待されている。そこで、肺癌50例(腺癌20例、扁平上皮癌19例、小細胞癌11例)に対して、Ki-67、p53、p21、cyclin A、cyclin B、cyclin D、cleaved caspase-3(CC3)、polo-like kinase-1(PLK-1)抗体による免疫組織化学染色を行った。Ki-67、cyclin A、cyclin B、cyclin D、CC3、PLK-1の陽性率は、腺癌(15.9%、4.3%、10.0%、50.5%、0.6%、5.5%)、扁平上皮癌(44.5%、23.2%、22.7%、41.1%、5.6%、25.5%)、小細胞癌(46.4%、25.9%、28.6%、0.1%、6.4%、19.1%)で、組織型間で陽性率に有意差が認められた。すなわち、Ki-67、cyclin A、cyclin B、CC3、PLK-1の陽性率は腺癌において、cyclin Dの陽性率は小細胞癌において有意に低値であった。肺癌では組織型ごとに細胞周期の状態が異なるため、細胞増殖および細胞死への誘導に差が生じている可能性が示唆された。平成27年度は、肺癌・甲状腺癌・大腸癌の薄切および免疫組織化学染色が終了したが、今後対象臓器をさらに増やしていく計画である。また、各臓器の腫瘍部および正常部のデータも解析していく。本研究の目的は、全身諸臓器の正常および腫瘍組織における細胞周期・細胞死関連蛋白の発現を網羅的に解析し、それらの発現パターンに基づく癌治療の個別化や予後予測に向けた基礎データを得ることである。平成27年度は、肺癌、大腸癌、甲状腺癌を対象に免疫組織化学染色を行い、特に肺癌の組織型による細胞周期および細胞死(アポトーシス)関連蛋白発現に関して解析した。その結果、肺癌では組織型により細胞増殖・細胞死への誘導に差異が生じている可能性が示唆された。平成28年度は、肺癌の組織型による細胞死経路の相違をさらに検討するため、microtubule-associated protein 1 light chain 3 (LC3) (オートファジーマーカー)、Mixed lineage kinase domain-like( MLKL:ネクロプトーシスマーカー)抗体による免疫組織化学染色を加えた解析を行った。LC3Bの陽性率は、腺癌2.3%、扁平上皮癌21.6%、小細胞癌44.5%で、組織型間で有意差が認められた(P < 0.001)。すなわち、LC3Bの陽性率は腺癌において低く、小細胞癌で高値を示した。MLKL陽性細胞はきわめて少なく、腺癌および小細胞癌ではほとんど見られなかった。しかし、扁平上皮癌では、約60%の症例において陽性細胞の小集塊が認められた。肺癌を対象に、アポトーシス、オートファジー、ネクロプトーシス細胞死の誘導に関して免疫組織化学的解析を行ったところ、腺癌・扁平上皮癌・小細胞癌という組織型により細胞死誘導に差が生じている可能性が示唆された。今後、さらに関連蛋白の発現を解析し細胞死誘導の相互作用について明らかにする必要があると考えられる。平成28年度は、オートファジーおよびネクロプトーシス経路の誘導について免疫組織学的に解析するため、最適な抗体の選定を行った。ネクロプトーシスに関しては、陽性所見は得られたが肺癌での陽性細胞が少なかったため、種々の組織・症例を陽性コントロールとし、最適な染色条件を確立させた。また、LC3B抗体は、特異的な陽性所見を得るため、各社からの市販抗体・数種類について条件設定を行った。繰り返し検討を行い、最適な抗体および染色条件を得た。本研究の目的は、全身諸臓器の正常および腫瘍組織における細胞周期・細胞死関連蛋白の発現を網羅的に解析し、それらの発現パターンに基づく細胞死の活性化経路を明らかにし、効率的な癌治療の選択に役立つ基礎データを得ることである。平成27年度は、肺癌、大腸癌、甲状腺癌を対象に免疫組織化学染色を行い、特に肺癌の組織型による細胞周期およびアポトーシス関連蛋白発現に関して解析した。

その結果、肺癌では組織型により細胞増殖・アポトーシスへの誘導に差異が生じている可能性が示唆された。平成28年度は、肺癌の組織型による細胞死経路の相違をさらに検討するため、LC3B、MLKL抗体による免疫組織化学染色を加えた。LC3Bの陽性率は、腺癌において低く、小細胞癌で高値を示した。MLKL陽性細胞は極めて少なく、腺癌および小細胞癌ではほとんど見られなかった。しかし、扁平上皮癌では約60%の症例において陽性細胞の小集塊が認められた。以上の結果から組織型により細胞死誘導(アポトーシス、ネクロプトーシス、オートファジー細胞死)に差が生じている可能性が示唆された。平成29年度は、胃癌における細胞死関連蛋白の発現とそれらの相関について解析した。胃癌40例を対象とし、CC3、MLKL、LC3Bに対する抗体を用いて免疫組織化学染色を行った。MLKLおよびLC3B陽性細胞は少数であったが、CC3陽性細胞は全腫瘍細胞中020%に認められた。各マーカーの相関を分化度別に調べたところ、分化型においてCC3とLC3Bに正の相関がみられたが、それ以外に相関は見出されなかった。以上の結果から、胃癌ではアポトーシスによる細胞死が主に誘導されており、分化型胃癌ではアポトーシスとオートファジーが協調的に制御されている可能性が示唆された。今後は、さらに関連蛋白の発現を解析し細胞死誘導の相互作用について明らかにする必要があると考えられる。ヒト肺癌および胃癌組織を用いて、組織型の違いによる細胞死(アポトーシス、オートファジー、ネクロプトーシス)の誘導に関して免疫組織化学的解析を行った。肺癌では、組織型(腺癌・扁平上皮癌・小細胞癌)の違いにより細胞死誘導に差が生じている可能性が示唆された。胃癌ではアポトーシスによる細胞死が主に誘導されており、分化型胃癌ではアポトーシスとオートファジーが協調的に制御されている可能性が認められた。平成28年度は、胃癌を対象に組織型による細胞周期および細胞死関連タンパク発現の差異を解析する。平成27年度に免疫組織化学染色を終えている大腸癌、甲状腺癌に関しても、腫瘍部と正常部について染色結果を解析する。また、新たなプログラム細胞死であるネクロプトーシスについても特異的マーカーを用いて解析を行っていく予定である。現在、胃癌に関しても解析が進行中であり、胃癌・肺癌・大腸癌・甲状腺癌について腫瘍部および隣接する正常組織における各種細胞増殖・細胞死関連蛋白の発現を解析していく。また、細胞死の関連性・相互作用を明らかにするため、さらに関連蛋白の発現を解析していく。免疫組織化学初年度に自動封入装置を購入したため、研究計画の迅速な遂行を目的とし、試薬・消耗品代を考慮し、経費の前倒し請求を行った。初年度(平成27年度)に自動封入装置を挿入したため、試薬・消耗品代を考慮し、前倒し請求を行いった。平成28年は、試薬・消耗品等を購入を計画的に購入した。最終年度(平成29年度)は、さらに試薬の購入、英文論文校正等の支出が見込まれるため、経費の次年度繰り越しを行った。平成28年度の迅速な研究遂行のために消耗品(スライドガラス)を購入し、研究準備を行っている。免疫組織化学に使用する試薬に関しては、平成28年度に随時購入を進めていく。平成29年度は、細胞死関連蛋白に対する抗体、免疫組織化学検出用高感度キットなどの購入を行う。また、英文論文投稿に際し、英文校正を行う。
配列ナノ空間物質の伝導 熱伝導・電気伝導・超伝導

特定領域研究の計画研究として、配列ナノ空間を有する物質群の熱伝導、電気伝導および超伝導に関して研究を遂行した。配列ナノ空間を有する物質の特徴と物性を現在の研究状況に関して基礎物性を調べて将来の展望を考えた。特にナノ構造物質して物質を分類して重要な物性発現を確認するための具体的な研究を実行した。原子および分子が内包空間に閉じ込められた物質においては、フォノンの非調和性や外部へのエネルギーの放出に関して特別な物性が発現する事を実際の実験系で確認した。本物質系における無秩序系の低い熱伝導度は超伝導物性などは物性として興味深く、フォノンの非調和性との関係から議論した。本特定領域における本研究グループの研究は、配列ナノ空間を有する物質群の伝導・磁気物性に関するものである。特にIV族元素(C, Si, Ge)を構成要素として形成されるナノ配列空間を有するナノ多面体幾何構造物質に関して、広範囲の電気伝導、熱伝導、磁性に加えて比熱を測定することにより、フォノンと電子状態との相関を詳細に研究している。また計画研究班の位置づけとして、他のグループとの関連で物性の観点から協力して特定領域研究を進展させる。本特定領域研究では、配列ナノ空間を有する物質群の伝導・磁気物性を研究した。H19年度では、純粋なIV族元素(C,Si,Ge)を構成要素として形成されるナノ配列空間を有する多面体ネットワーク物質の電気伝導と熱伝導を中心に研究した。多面体をネットワークとして組み合わせてできる固体は配列ナノ空間を有し、その配列ナノ空間の中にアルカリ金属元素(Na,K,Rb,Cs)、アルカリ土類金属元素(Sr,Ba)、磁性元素Euなど種々の元素を導入することができる。その結果として伝導ならびに磁性に極めて興味深い電子物性を発現する事が知られている。これらのクラスタからなるネットワーク固体の物性は、これまで個々には研究されてきたが、まだ断片的な理解しか達成されていない。本年度では、種々の伝導と磁性を中心として電子物性を詳細に検討して、物性と構造との関係を総合的に理解することに注力した。本目的のために、従来保有している設備を用いて、様々な物質の物性を測定する一方、多目的使用のグローブボックスを導入して、大気中で不安定な物質まで含めて種々の物性を合成し、同時に物性が測定できるシステムを構築した。この合成・測定一環システムの導入により、高精度に種々の物質を合成し、また合成した物質の電子物性を測定できるようになった。このような真空一貫測定システムにより、種々のクラスタネットワーク固体から得られる物性データに基づき、基本的理解を進め次年度からの展開をはかる予定である。本特定領域研究では、配列ナノ空間を有する物質群の伝導・磁気物性を研究している。H20年度では、IV族元素(C, Si, Ge)を構成要素として形成されるナノ配列空間を有する多面体ネットワーク物質の単結晶育成を主体として研究を進展させた。その結果、p, n両方のキャリヤを制御した単結晶育成にBa_8Ga_<16>Ge_<30>系の試料で成功した。一方、Sr_8Ga_<16>Ge_<30>系に関しては、n型の試料だけが単結晶として得られた。この原因をX線回折による構造の結果をもとにして議論することができた。これらの高品質の試料を用いて光電子分光の結果と電気伝導の結果を総合的に解釈した。多面体をネットワークとして組み合わせてできる固体は配列ナノ空間を有し、その配列ナノ空間の中にアルカリ金属元素(Na, K, Rb, Cs)、アルカリ土類金属元素(Sr, Ba)、磁性元素Euなど種々の元素を導入することができる。これらのクラスタからなるネットワーク固体の物性は、これまで個々には研究されてきたが、まだ現在のとろろ断片的な理解しか達成されていない。そこで、物性と構造との関係を総合的に理解する目的のために、ホール測定まで含めて様々な物質の物性を高精度に測定する一方、比熱の時間依存を正確に測定して、内包原子の運動と比熱で観測される時間依存性の原因を追求した。今後、高精度測定された種々の物質の構造と物質の電子物性を総合的に解釈することを計画している。H21年度では、H20年度に確立したIV族元素であるSi,Geを構成要素として形成されるナノ配列空間構造物質の単結晶育成法を用いて、キャリヤ濃度を幅広く変化させた試料を対象として、キャリヤに依存する物性とフォノンに依存する物性を独立に評価する研究を遂行した。

対象物質は、p,n両方のキャリヤを制御したBa_8Ga_<16>Ge_<30>ならびにSr_8Ga_<16>Ge_<30>系n型単結晶である。広いエネルギー領域の比熱を非調和振動ポテンシャルモデルと調和振動ポテンシャルモデルを用いて解析して、その結果、電子およびホールキャリヤに依存する電子比熱項であるゾンマーフェルトγ項と非調和振動ポテンシャル間のトンネリング運動に起因するα項を分離して求める事に成功した。その結果、n型Ba_8Ga_<16>Ge_<30>に比較してn型Sr_8Ga_<16>Ge_<30>ではα項の値が非常に大きい事が明確になった。この理由は、Sr_8Ga_<16>Ge_<30>では基本的に籠構造は内包原子の中心振動を与える調和振動ポテンシャルを形成する籠構造と非中心振動を与える非調和振動ポテンシャルを形成する籠構造の2種類の籠構造が存在することが、H20年度の軟X線光電子分光の研究から知られているが、非調和振動を与える籠構造においてGaとGeの原子配置に乱雑性が存在するために、ガラスと同様に無秩序性が存在する事に起因する事によるものと解釈される。このような現象は、III-III-IV族と数種類の構成元素を有するクラスレートで普遍的に観測される現象であると考えられる。本特定領域研究では、配列ナノ空間を有する物質群の伝導・磁気物性を研究している。H22年度では、クラスレート構造を有する内包空間に閉じ込められた原子の非調和運動が創出するラットリングフォノンが、伝導電子とどのような相互作用をするかに関して、単結晶育成法を用いてキャリヤ濃度を幅広く変化させた試料を対象として詳細に研究した。本研究では、キャリヤに依存する物性とフォノンに依存する物性を独立に評価する研究手法を適用して解析した。その結果、電子に依存する電子比熱項であるゾンマーフェルトγ項と非調和振動ポテンシャル間のトンネリング運動に起因するα項を分離して評価することに成功した。実験の結果として、非講和フォノンが存在する場合、電子-フォノン相互作用の大きさは、2倍程度増強される可能性がある事が示された。またこの結果は、精密な単結晶構造解析の結果と比較して検討する事により、内包原子の電価分布の広がりに基づいて決定される静電ポテンシャル局面の大きさと良い一致が得られる事を示した。また、pとnのキャリヤを変化させたBa_8Ga_<16>Ge_<30>の試料においては、p型物質の籠骨格における欠陥が物性に大きな影響を及ぼす可能性を磁化率の測定から示す事ができた。一方電子状態に関しては、グラフェンなどにみられる特異な電子状態であるディラックコーン電子状態に関して研究を進めた結果、鉄砒素2次元構造を有する物質Ba(FeAs)_2において同様の質量零のディラックコーン状態が観測され、その電子状態が磁場に対する線形な磁気抵抗として観測される事を見出した。以上記載したような特異な非調和フォノンならびにディラック電子状態は、新しい物性研究として発展すると考えられる。東日本大震災の影響で、業者の配達が間に合わず15,020円の繰越を行ったが、研究は予定通り完結する事ができた。本特定領域研究の目的は、配列ナノ空間を有する物質を対象とする事により、新しい物質科学を探究するものである。
造山帯中の緑色岩からみたスーパープリューム活動史

全マントル規模の上昇流の地球史を通じた調査を行うためには,造山帯中に付加した緑色岩の岩石学的研究および年代学的研究が必要となる.西南日本外帯のみかぶ帯について,このような観点から研究を行い,以下の成果を得た.みかぶ帯の緑色岩は,Nb/Zr比の低い岩石群とNb/Zr比の高い岩あるいは海台の玄武岩石群から構成される.Nb/Zr比の低い岩石群は関東山地から四国までの広い地域に分布し,ソレアイト系列に属する.微量成分全岩組成の特徴は,中央海嶺玄武岩に類似する.Nb/Zr比の高い岩石群は,四国東部の剣山地域にのみ観察され,アルカリ岩系列に属する.微量成分全岩組成の特徴は,大洋島玄武岩に類似し,斑晶晶出順序と合わせて考えると,ハワイのような大洋島起源の海山が付加したものと考えられる。関東山地から四国地方まで広く分布するNb/Zr比の低い岩石群の起源を特定するため,緑色岩から火成起源角閃石を分離し,K-Ar法を用いて放射年代を測定した.関東山地のK-Ar年代は,199Ma(誤差10Ma),紀伊半島鳥羽地域の年代は142153Ma(誤差は最大で8Ma),四国東部地域のK-Ar年代は143186Ma(誤差は最大で10Ma)であった.みかぶ帯を主に構成するNb/Zr比の低い岩石群の形成場は,単一の海台あるいは単一のホットスポットから導かれた海山列ではない.起源の同一性・分布範囲・年代幅を考慮すると,約3000kmにおよぶ活動範囲と少なくとも60Maの活動期間をもつ火成活動により形成された海山群が想定され,その成因として全マントル規模の上昇流による活動が示唆される.全マントル規模の上昇流の地球史を通じた調査を行うためには,造山帯中に付加した緑色岩の岩石学的研究および年代学的研究が必要となる.西南日本外帯のみかぶ帯について,このような観点から研究を行い,以下の成果を得た.みかぶ帯の緑色岩は,Nb/Zr比の低い岩石群とNb/Zr比の高い岩あるいは海台の玄武岩石群から構成される.Nb/Zr比の低い岩石群は関東山地から四国までの広い地域に分布し,ソレアイト系列に属する.微量成分全岩組成の特徴は,中央海嶺玄武岩に類似する.Nb/Zr比の高い岩石群は,四国東部の剣山地域にのみ観察され,アルカリ岩系列に属する.微量成分全岩組成の特徴は,大洋島玄武岩に類似し,斑晶晶出順序と合わせて考えると,ハワイのような大洋島起源の海山が付加したものと考えられる。関東山地から四国地方まで広く分布するNb/Zr比の低い岩石群の起源を特定するため,緑色岩から火成起源角閃石を分離し,K-Ar法を用いて放射年代を測定した.関東山地のK-Ar年代は,199Ma(誤差10Ma),紀伊半島鳥羽地域の年代は142153Ma(誤差は最大で8Ma),四国東部地域のK-Ar年代は143186Ma(誤差は最大で10Ma)であった.みかぶ帯を主に構成するNb/Zr比の低い岩石群の形成場は,単一の海台あるいは単一のホットスポットから導かれた海山列ではない.起源の同一性・分布範囲・年代幅を考慮すると,約3000kmにおよぶ活動範囲と少なくとも60Maの活動期間をもつ火成活動により形成された海山群が想定され,その成因として全マントル規模の上昇流による活動が示唆される.
デジタルデバイスを用いたコミュニケーションデザインプログラムの開発

学生は社会において、立場の違う多様な人と共同することが求められる。そこでは、他者や世界に関心を持って共感し、人と人の間の意味ある関係を作ること、つまり、コミュニケーション力が重要である。日本学術会議が作成・公表している大学教育の質保証のための参照基準でもすべての分野において、ジェネラルスキルのひとつとしてコミュニケーション能力が含まれる。本研究では、そのような力を育む場として、気心が知れた限られた仲間内ではない、価値観や背景の異なる他者と出会い、ともに表現活動を行う教育プログラムを開発した。プログラムを実践するためツールとして、1デジタル絵本の素材(画像、音声、テキスト)をWebサーバにおいて絵本として統合、閲覧するWebサイト、2ページごとに素材をアップロードし、絵本を編集するWebアプリ、3ネットワークのない場所でも独立して機能するタブレット端末(iPad)用閲覧アプリ、4参加者のための制作プロセスを説明したワークブック「制作のてびき」、5学生が対話を進める際の手助けとする冊子「対話ガイド」、6絵本の構想カードを開発した。6は既存の25作品の絵本をテーマ、キャラクター、表現の観点で分析し、カード化したもので、ストーリーを構想する際、視点を広げ、発想の発端として使用する。28,29年度に続き、老人保健施設の入所者をパートナーとして、教育プログラムを実践した。3年間の実践で9名の学生(大学院修士生)が、80-95歳の施設の利用者のべ14名(女性13名、男性1名)とペアとなり、デジタル絵本を制作した。完成したデジタル絵本は、世代、立場を越えた共同制作の成果としてWebサイトで公開している。さらに、最終年度では、一般のケアの現場や他の教育現場でも教育プログラムの導入を検討することができるよう、ワークブック(4)、冊子(5)をWebサイト(1)で公開した。立場の異なる他者とのコミュニケーション力を育むため、他者と共に「表現する」教育プログラムのデザインを行う。具体的には、行動に制約があるような状況の高齢者とパートナーとなり,その人との語りを通して、共に物語を構想し、タブレット端末上で見る形のデジタル絵本を制作する内容のプログラムである。これまでに、教育プログラム内容を検討し、デジタル絵本として素材ファイルを統合、公開するWebアプリ、閲覧に使用する携帯端末用アプリを開発した。28年度には、それらを使い、老人保健施設において、デジタル絵本制作プロジェクトを実践し、プログラム内容を検証した。プログラム終了後パートナーと学生に対して、各過程の満足度などを5段階で選択し、その理由を自由記述で問うアンケートを行った。プロジェクト後、できた絵本に満足しているか、制作は楽しかったかを尋ねた質問では、8名のパートナーの内7名が最高評価で回答した。活動に参加したことで、その日1日の気分が改善され、ポジティブな感情をもてることを重視する介護現場の観点で評価を得た。また、共同制作の観点でみると、パートナーの回答には、普段話せないことを話せた、チャレンジであり新鮮で楽しい経験だったという感想に加えて、自分の拙い絵も絵本となると面白い、自分の声が入ると印象が変わるなど、表現への言及があった。この点で、ケア現場での通常の傾聴とは違い、共同制作プロジェクトは自己肯定感を高めるメリットをもつ。また、普段「ケアされる」立場の高齢者が、制作活動において自分の話をテーマとして提供し、絵を描いたり、ナレーションを読んだり、「何かをしてあげる」能動的立場に立ち、それに満足を感じたことは、固定的立場の転換という当初の狙いを満たすプログラムとして機能したと考える。当該年度の計画は、(1)教育プログラム内容の検討、(2)デジタル絵本制作用アプリの開発であった。(1)に関して、構築した教育プログラムに基づき、開発したアプリを使用し、老人保健施設にてデジタル絵本の制作プロジェクトを実施し、教育プログラムの内容を検証した。パートナーの話を出発点としつつ、抽象度を高め、制作者や家族以外の読者が楽しみ、思索できる作品を目指した。その結果、プログラム内容を大きく変更する必要はないと判断している。また、(2)については、老人保健施設での実践を受けて、仕様の検討を進めた。多くの教育現場で本教育プログラムの実施が容易になるように、制作のためのWebアプリの仕様を検討、設計を行った。加えて、閲覧用Webアプリに改善を加えた。デジタル絵本を構成する素材ファイル(画像、音声、テキスト)をWebサーバ上に配備し、それを統合し閲覧するための2つのツールを用意している。ひとつは絵本をWebブラウザで閲覧するためのWebアプリ、もうひとつは環境を問わずに閲覧するためのタブレット端末用アプリである。これらは絵本を共同制作者同士で共有するとともに、完成版を公開するツールとして活用する。28年度は、携帯端末用アプリがなくても、ネットワーク環境があればどこでも閲覧ができるWebアプリの機能を検討し、デジタル絵本の数が増えた場合にも見やすいように変更を行った。学生は社会において、立場の違いを越え、多様な人と共同することが求められる。そこでは、世界や他者に関心を持って共感し、人と人の間の意味ある関係を作ることが重要である。そのためには、専門教育に加えて、ジェネラルスキルのひとつとしてコミュニケーション力の育成が必要である。本研究では、そのような力を育む場として、共に「表現」する教育プログラムを構築し、そのためのツールを開発することを目的とする。具体的には、行動に制約があるような状況の高齢者とパートナーとなり、その人との語りを通して、共に物語を構想し、PCやタブレット画面上で見る形のデジタル絵本を制作する(「ふたりえほんプロジェクト」と呼ぶ)。学生の学びとともに、自由に動けないパートナーに高齢者にとっても、能動的な立場でプログラムに参加することで、作る喜びを共有する場となる。

デジタル絵本は、画像、音声の素材ファイルとテキストからなり、それらを制作後、Webサーバにアップロードし絵本として統合する。これまでに、絵本を鑑賞するツール(Webブラウザで閲覧するためのWebアプリと、iPad用アプリ)を開発した。29年度には、素材ファイルとテキストを元に絵本ページを編集するWebアプリ(えほんエディタ)を開発した。これにより、簡単な操作で絵本を編集、公開できるようになった。加えて、プロジェクト参加者が、制作プロセスを理解するために、プロジェクトの内容を説明した冊子「制作のてびき」を作成した、また、学生が対話内容や絵本構想の途中経過を記録として残せるように、スケッチノートを作成した。加えて、学生が対話を進める際の手助けとなる対話ガイド、素材ファイルの準備やエディタの使用方法を記載したテクニカルガイドを用意した。これらのツールを使い、老人保健施設において、教育プログラムを実践し、結果を考察した。当該年度の計画は、(1)絵本制作用のアプリの開発、(2)ワークブックの制作、(3)プロジェクトの実施、であった。(1)については、Webアプリとして、Webブラウザの画面上で、ページの編集ができるえほんエディタを開発した。エディタは、(a)タイトル,作者の設定、(b)ページごとの画像ファイル、音声ファイル、テキストの設定、(c)ページの追加、削除、順番の変更、(d)プレビュー、(e)公開,非公開の設定(制作途中の保存)の機能をもつ。画像、音声ファイルの素材は、ページごとにWebブラウザ上にドロップすることでWebサーバへアップロードできる。(2)のワークブックは、冊子(制作のてびき、対話ガイド、テクニカルガイド)とスケッチノート、それらをまとめて保管、携帯するためのバインダの形で実現した。参加者が共に冊子とバインダをもつことで、制作チームとしての一体感を醸成し、プロジェクトを進めることへの気持ちを高める意図がある。プロジェクト実施後の参加学生の振り返りでは、これから制作をするというモチベーションについてポジティブな反応があった。これらのツールを使い、老人保健施設の利用者をパートナーとし、5チームでプロジェクトを実施した。学生は社会において、立場の違う多様な人と共同することが求められる。そこでは、他者や世界に関心を持って共感し、人と人の間の意味ある関係を作ること、つまり、コミュニケーション力が重要である。日本学術会議が作成・公表している大学教育の質保証のための参照基準でもすべての分野において、ジェネラルスキルのひとつとしてコミュニケーション能力が含まれる。本研究では、そのような力を育む場として、気心が知れた限られた仲間内ではない、価値観や背景の異なる他者と出会い、ともに表現活動を行う教育プログラムを開発した。
安定なシラベンゼン類の創製とその構造・反応性

ケイ素は周期律表において炭素の直下に存在する14族元素であることから、有機化学の中心的元素である炭素をケイ素に置き換えた化合物は非常に興味深い研究対象である。特に、有機化学における最も基本的な化合物の一つであるベンゼンのケイ素類縁体シラベンゼンについては極低温マトリックス中での分光学的検出は行われていたものの、安定に合成された例はなかった。本研究では、以前の我々の研究で実現された2-シラナフタレンの合成の経験をふまえ、ケイ素上にのみ置換基を持つシラベンゼンの合成を行った。シラべンゼンを速度論的に安定化するための立体保護基として2,4,6-トリス[ビス(トリメチルシリル)メチル]フェニル基(Tbt基)を用いた。ペンタ-1,4-ジインとジブチルスズの反応でスタナシクロヘキサ-1,-4ジエンを合成し、それをシラベンゼンの前駆体であるケイ素上にTbt基とクロロ基を持つシラシクロヘキサジエンに導き、ついでジイソプロピルアミドで脱塩化水素することにより初めて安定なシラベンゼンの合成に成功した。このシラベンゼンは、^<29>SiNMR(92.5ppm)、^1J_<Si-C>(83Hz)、UV(301,323,331nm)から非局在化した芳香族性を持つ化合物であることが明らかとなった。この結論は、X線結晶解析でTbt置換シラベンゼンがほぼ完全に対称であることからも支持された。Si=Cは結合長1.765Åと1.770Åで通常のケイ素-炭素二重結合と単結合の中間であり、C-C結合長は1.381-1.399ÅでほぼベンゼンのC-C結合長と同じであった。得られたシランゼンゼンは光照射によりシラベンズバレンに異性化し、シラベンズバレンは熱によりシラベンゼンに戻るという極めて興味深い反応性を示した。これまでにもオレフィンに対応するシレン、ジシレン、カルベンに対応するシレン、カルボカチオンに対応するシリレニウムイオン等において興味深い研究が報告されている。しかしながら、有機化学における最も基本的な化合物の一つであるベンゼンのケイ素類縁体シラベンゼンについては極低温マトリックス中での分光学的検出は行われていたものの、安定に合成された例はなかった。本研究では、以前の我々の研究で実現された2-シラナフタレンの合成の経験をふまえ、ケイ素上にのみ置換基をもつシラベンゼンの合成を行った。シラベンゼンを速度論的に安定化するための立体保護基として2,4,6-トリス[ビス(トリメチルシリル)メチル]フェニル基(Tbt基)を用いた。ペンタ-1,4-ジインとジブチルスズの反応でスタナシクロヘキサ-1,4-ジエンを合成し、それをn-ブチルリチウムとの反応でジリチオ体を得た。これとTbtSiH^3との反応でシラヘキサ-1,4-ジエンを得、そのケイ素上にN-ブロモコハク酸イミドで臭素を導入した。最後にこれをt-ブチルリチウムで脱臭化水素をして、初めての安定なシラベンゼンの合成に成功した。このシラベンゼンは^<29

>Si-NMRで92.5ppmに吸収を持ち、^1H-NMRの対称性から非局在化した芳香族性を持つ化学種であることが示された。メタノールおよびベンゾフェノンとの反応も検討し、1,2-付加以外にl,4-付加反応性も示すことが明らかとなった。ケイ素は周期律表において炭素の直下に存在する14族元素であることから、有機化学の中心的元素である炭素をケイ素に置き換えた化合物は非常に興味深い研究対象である。これまでにもオレフィンに対応するシレン、ジシレン、カルベンに対応するシレン、カルボカチオンに対応するシリレニウムイオン等において興味深い研究が報告されている。しかしながら、有機化学における最も基本的な化合物の一つであるベンゼンのケイ素類縁体シラベンゼンについては極低温マトリックス中での分光学的検出は行われていたものの、安定に合成された例はなかった。昨年度の研究において、ケイ素上に立体保護基として2,4,6-トリス[ビス(トリメチルシリル)メチル]フェニル基(Tbt基)を持つシラベンゼンの合成に成功し、その^<29>Si-NMRおよび^1H-NMRにより芳香族性を持つことを明らかにした。しかし、得られたシラベンゼンの純度が充分高くなかったためX線結晶解析に必要なきれいな単結晶が得られなかった。本年度は合成経路を再検討することにより良い単結晶を得、X線結晶構造解析に成功した。Tbt置換シラベンゼンはほぼ完全に対称である。Si=Cは結合長1.765Åと1.770Åで通常のケイ素-炭素二重結合と単結合の中間であり、C-C結合長は1.381-1.399でほぼベンゼンのC-C結合長と同じであった。得られたシラベンゼンは光照射によりシラベンズバレンに異性化し、シラベンズバレンは熱によりシラベンゼンに戻るという極めて興味深い反応性を示した。
磁場をもつ１０次元超対称Ｙａｎｇ－Ｍｉｌｌｓ理論の現象論的解析

磁場を持つトーラス上へコンパクト化された高次元超対称ヤン-ミルズ理論を解析して現実的な模型の構築・拡張可能性を探った。前年度は上記の10次元超対称ヤン-ミルズ理論に基づく最も単純な模型を解析し、ヒッグス粒子の質量が正しく再現されることを明らかにした。26年度は更に発展させ、模型に残るパラメータを変化させた時に、超対称粒子の質量スペクトラムとヒッグス粒子の質量がどのように変化していくのか調べあげた。このパラメータ空間においてヒッグス粒子の質量の再現性だけでなく、超対称粒子に対する実験からの様々な制限を重ね合わせ、LHC実験との総括的な整合性を明らかにした。また、オービフォールド構造を導入した場合に模型構築の多様性が現れることが前年度に分かっていたので、その多様性をいくつかの指標によって分類した。特に有意義であったのは対称性による分類でオービフォールドのない場合と比べて新たなフレーバー対称性が現れることが分かった。次元の異なる複数の超対称ヤンーミルズ理論を組み合わせた系の4次元有効理論導出にも取り組んだ。特に超場形式を用いた定式化が主な成果である。具体的な系を二つ考え実際に超場形式による4次元有効理論を導出することができた。これによって従来の模型の拡張可能性が大きく広がり、様々な現象論的応用が期待される。前年度にはゲージ相互作用による超対称性の破れの伝達によって超対称スペクトラムが従来の模型と比べてずれる可能性があることを示した。26年度はその解析を進めると同時に、ゲージーノ粒子の質量に重要な特徴が見られる可能性があると明らかにした。複数のゲージーノ質量の比が特定の値をとる場合に超対称素粒子標準理論における微調整問題が緩和されるということが先行研究によって指摘されており、その特定の値が本研究の拡張された模型において再現されうることを示した。26年度が最終年度であるため、記入しない。高次元超対称Yang-Mills理論において、余剰次元空間をトーラスコンパクト化し背景磁場を導入することで素粒子標準理論に整合する現象論模型の構築をすることを目標に研究を進めた。これまでの研究で10次元超対称Yang-Mills理論に基づきひとつの模型が得られていたが、それをより現実的な模型にする上で必要な拡張が可能であるか検討した。その結果、具体的に2つの可能性が考えられたのでそれらについて考察し、それが現象論にどのような影響を及ぼすのかを調べた。基本とした模型は、超弦理論の枠組みでは複数枚のD-ブレーンを考えることに対応している。この枚数を増やすか、あるいはそれと次元の異なるD-ブレーンを追加した系を考えることでこれまでの模型を拡張することができる。この2つの模型拡張の方法において、超対称粒子のスペクトラムが新たな寄与を受けてずれていく可能性があるという共通した特徴がみられた。そこでその典型的な振る舞いを調べた。また、LHC実験においてHiggs粒子が発見されその質量が特定されたことで、あらゆる現象論模型が更に精密に検証可能になった。上記の模型においてHiggs粒子の質量を求めたところ、LHC実験の結果に整合することを明らかにした。超対称粒子のスペクトラムは量子効果を通じてHiggs粒子の質量に影響する。そこで超対称スペクトラムとの関係も調べた。更に一般化した背景磁場を導入することや、余剰次元空間にオービフォルドと呼ばれる新たな幾何学構造を導入することによっても模型のバリエーションが与えられることが分かったので、それらについても標準理論との整合性を調べた。

26年度が最終年度であるため、記入しない。模型のバリエーション・拡張可能性について複数の可能性を調べ、従来の模型における課題を克服する具体的な模型構築には至らなかったが、それぞれの現象論的な性質はある程度調べることが出来た。またヒッグス粒子の質量についてもLHC実験との整合性を明らかにすることが出来た。しかし、並行して検討していたKaluza-Kleinモードを含めた模型の定式化までは完成させることは出来なかった。模型の拡張方法・定式化について更に調査を進め幅広い現象論的展開を視野に入れた具体的な模型の構築を目指す。
ヘルペスウイルスの感染機構の解明

ヘルペスウイルスのグライコプロテインB(gB)とPILRとの結合様式を解析から、PILRはペプチドと糖鎖の双方に結合部位があるレセプターであることが明らかにした。水痘・帯状疱疹ウイルスのgBとMAGとの相互作用を解析し、gB上の特定の糖鎖が水痘・帯状疱疹ウイルスの感染時の膜融合に関与していることを明らかにした。また、容易にウイルスに改変を加える新たな方法としてCRISPR-Cas9を用いたヘルペスウイルスの遺伝子改変方法を樹立した。ヒトヘルペスウイルスの一つであるHHV6の膜融合アッセイを樹立することにより、gB、gH、gL、gQがHHV6の膜融合に必須な分子であることを明らかにした。我々は、ヘルペスウイルスのエンベロープ分子と宿主分子との相互作用を研究することにより、Paired immunoglobulin like-type 2 receptor (PILR) αやMyelin associated glycoprotein (MAG, Siglec 4)といった細胞表面分子が、単純ヘルペスウイルスや水痘帯状疱疹ウイルスのGlycoprotein B (gB)と会合し、ウイルス感染時の膜融合に重要な役割を担っていることを明らかにしてきた。特に、gBは全てのヘルペスウイルス属のウイルスに保存されており、ウイルス感染時の膜融合に重要な役割を担うgBのレセプターとしてPILRαやMAGを同定したことは、ヘルペスウイルスの感染機構を解明する上で非常に重要な発見である。そこで、本研究では、PILRαやMAGを介したウイルス感染時の膜融合の分子機構を解明すると共に、様々なヘルペスウイルスの細胞内侵入におけるこれらのレセプターの機能を明らかにすることにより、ウイルスの感染メカニズムを解明することを目的にした。さらに、PILRαやMAGとgBとの相互作用を構造生物学的に解析することによって、ウイルス侵入分子メカニズムや新たな制御方法の開発を目指して研究を進めた。特に、gBと会合するPILRの構造解析、gB-PILR相互作用機序の解明、水痘帯状疱疹ウイルスの感染機構の解明等を実施した。その結果、PILRの構造解析に成功したとともに、PILRと結合する特定の糖鎖構造の同定に成功した。また、水痘帯状疱疹ウイルスと会合するMAGとの相互作用から、MAGと同様な認識機構を持つ分子が水痘帯状疱疹ウイルスの感染に関与することを明らかにした。本研究成果は、ヘルペスウイルスの感染機構や感染予防法の開発に重要であると考えられた。特に、gBと会合するPILRの構造解析、gB-PILR相互作用機序の解明、水痘帯状疱疹ウイルスやHHV-6の感染機構の解明等を実施した。その結果、PILRの構造解析に成功したとともに、PILRと結合する特定の糖鎖構造の同定に成功した(投稿中)。また、水痘帯状疱疹ウイルスと会合するMAGとの相互作用から、宿主細胞の糖鎖構造が水痘帯状疱疹ウイルスの感受性に影響を与えることを明らかにした。また、HHV-6の膜融合機構を解析することによって、初めて膜融合に関わるエンベロープ分子を明らかにすることに成功した。ヘルペスウイルスのグライコプロテインB(gB)とグライコプロテインH(gH)は全てのヘルペスイルスに幅広く保存されており、感染時の膜融合に必須な分子である。我々はPILRやMAGが、特定のヘルペスイルスだけではなく、単純ヘルペスイルス、水痘帯状疱疹ウイルス等の種々のヘルペスイルスのgBと会合し、感染に深く関与していると思われることを明らかにしてきた。特に、gB上のO型糖鎖修飾がPILRとの結合に重要な役割を担う。

そこで、gBとPILRとの結合様式を解析することにより、PILRと結合するgBの糖ペプチドの同定に成功した。さらにgBの糖ペプチドを用いてPILRの構造解析を行った結果、PILRはペプチドと糖鎖の双方に結合部位があるユニークなレセプターであることが明らかになった(Kuroki et al. PNAS 2014)。さらに、水痘・帯状疱疹ウイルスのgBとMAGとの相互作用を解析することにより、gB上の特定の糖鎖が水痘・帯状疱疹ウイルスの感染時の膜融合に関与していることを明らかにした。また、ウイルス分子の機能を明らかにするためには特定のウイルス分子の改変が必要であるが、BACを用いたり相同組換えを用いたりする方法では、多大な労力が必要であった。そこで、容易にウイルスに改変を加える新たな方法としてCRISPR-Cas9を用いたヘルペスウイルスの遺伝子改変方法を樹立した(Suenaga et al. Microbes Immunol. 2014)。26年度が最終年度であるため、記入しない。医歯薬学26年度が最終年度であるため、記入しない。ヘルペスウイルスのgBと会合するPILRの認識に関わる糖鎖構造を明らかにした他、水痘帯状疱疹ウイルスの感染に関わる新たなレセプターの同定に成功した。ヘルペスウイルスのgBと会合するPILRの認識に関わる糖鎖構造を明らかにした他、水痘帯状疱疹ウイルスの感染感受性に関与する分子機構を明らかにした。また、HHV-6の膜融合機構を明らかにした。今後、単純ヘルペスウイルスや水痘帯状疱疹ウイルスばかりでなく、他のヘルペスウイルスの解析を進めることによって、様々なヘルペスウイルスの感染に関わる重要な分子機構が解明できるようになることが期待される。今後、単純ヘルペスウイルスや水痘帯状疱疹ウイルスばかりでなく、HHV-6等の他のヘルペスウイルスの解析を進めることによって、様々なヘルペスウイルスの感染に関わる重要な分子機構が解明できるようになることが期待される。
新しい腫瘍マーカーMK-1の癌の診断と治療における有用性の検討

MK-1測定用のELISAを確立した結果、癌患者の血清MK-1陽性率は他のマーカーに比べ低いが、疾患によっては有用であった。また、本研究室で作製したヒト抗MK-1モノクローナル抗体M13-57は、ヒト補体やヒトNK-LAK細胞との組み合わせで抗腫瘍効果を示し、その単鎖抗体57scFvとCD28/CD3ζからなるキメラT細胞レセプターを発現したT細胞は、MK-1発現癌細胞で活性化され、癌の免疫療法や遺伝子療法に有用と思われた。新しい腫瘍マーカーとして大きな期待が寄せられているヒト上皮細胞抗原MK-1について、その癌の診断と治療における有用性について調べるもので、平成20年度は、以下の点を検討した。まず、マウス抗MK-1抗体による癌細胞の分離同定法の確立を試みた。MK-1は、それに対する抗体を利用することにより、磁性粒子を用いた血中および便中の剥離がん細胞分離に利用可能である。MK-1に対して本研究室で作製したモノクローナル抗体M1-8とM6-35のin vitroでの大量調製法を検討した。その結果、CELLine^<TM>フラスコを用いた培養法により100mgスケールの抗体を調製する方法を開発した。次に、本研究室で作製したヒト抗MK-1モノクローナル抗体M13-13とM13-57およびM11-29のex vivoでの抗腫瘍効果を、MK-1発現癌細胞であるヒト胃癌細胞株MKN-45を標的として検討した。その結果、抗体とヒト補体やヒトNK-LAK細胞との組み合わせによる抗腫瘍効果を示した。さらに、ヒト型抗MK-1抗体の遺伝子療法における有用性を検討した。ヒト抗MK-1モノクローナル抗体遺伝子を単離し、単鎖抗体を作製して性状を解析した。抗体M13-13ないしM11-29のハイブリドーマより、ヒト抗体のH鎖およびL鎖のV領域を挟むプライマーを用いて、ヒト抗体V領域遺伝子を単離した。単離したH鎖およびL鎖のV領域遺伝子をリンカーで挟んで結合し、単鎖抗体遺伝子を作製し、マウスのSp2/0ミエローマ細胞に発現させて精製した。作製した単鎖抗体(ヒト抗MK-1scFv)のMK-1産生癌細胞との反応性を解析し、その遺伝子がMK-1産生癌に特異的な遺伝子治療に有用であることを示唆した。新しい腫瘍マーカーとして大きな期待が寄せられているヒト上皮細胞抗原MK-1について、その癌の診断と治療における有用性について調べるもので、平成21年度は、以下の点を検討した。まず、これまでの胃癌や大腸癌になどにおける解析結果に加え、胆嚢癌おけるMK-1発現の意義を検討した。胆嚢癌標本を対象にしたマウス抗MK-1抗体(FU-MK-1)による免疫染色の結果、MK-1発現が胆嚢癌の分化度、壁深達度、TNM stageと相関し、MK-1発現陰性例が有意に予後不良であることが明らかになった。また、肝転移、腹膜播種、静脈侵襲,神経・傍神経浸潤などの進行が胆嚢癌の予後不良因子であることも明らかになった。つづいて、ヒト型抗MK-1抗体の免疫遺伝子療法における有用性も検討した。具体的には、ヒト抗MK-1モノクローナル抗体(抗体M13-13ないしM11-29)のハイブリドーマよりヒト抗体のH鎖およびL鎖のV領域を挟むプライマーを用いてH鎖およびL鎖のV領域遺伝子を単離した。次いで、単離したH鎖およびL鎖のV領域遺伝子をリンカーで挟んで結合し、単鎖抗体遺伝子を作製するとともに、ヒトのCD8、CD28およびCD3ζ遺伝子と連続して結合させることによりキメラのT細胞レセプター(chimeric T cell antigen receptor : CAR)遺伝子を作製した。作製したCAR遺伝子をヒトのT細胞株であるJurkat細胞に発現させて、そのT細胞としての機能を解析した。その結果、CAR発現Jurkat T細胞は、CEA発現癌細胞に反応して活性化されることが証明された。以上の結果より、ヒト型抗MK-1抗体の免疫遺伝子療法における有用性が示唆された。新しい腫瘍マーカーであるヒト上皮細胞抗原MK-1について、癌の診断と治療における有用性について調べるもので、平成22年度は以下の点を検討した。まず、確立したMK-1測定用のELISAを利用し、癌患者と正常人血清中のMK-1を測定した。正常人30例ではすべて検出感度(2ng/ml)未満であった。種々の癌患者血清では100例中10例が陽性(2ng/ml以上)で、最高例は75ng/mlであった。主な内訳は、膵臓癌10例中1例(10%)、子宮頚癌7例中1例(14%)、大腸癌23例中2例(8%)、乳癌17例中2例(11%)が陽性を示した。

本研究では健常者のMK-1血清濃度は非常に低いことと、癌患者での血清MK-1陽性率は他のマーカーに比べ低い結果が得られた。しかし血清中に高値を示す例があり、MK-1を標的とする画像診断や免疫療法時に留意する必要が示唆された。つづいて、ヒト型抗MK-1抗体の免疫療法における有用性を検討した。具体的には、ヒト抗MK-1モノクローナル抗体(抗体M13-57)を産生するハイブリドーマ細胞よりヒト抗体のH鎖およびL鎖のV領域を挟むプライマーを用いてH鎖およびL鎖のV領域遺伝子を単離した。次いで、単離したH鎖およびL鎖のV領域遺伝子をリンカーで挟んで結合し、単鎖抗体(scFv)遺伝子を作製するとともに、IL-2との融合タンパクの作製を試みた。これを酵母発現ベクターであるpPICZαに組み込み、酵母の一種であるピキア・パストリスに発現させたところ、従来の大腸菌に比べて容易に精製できた。この融合タンパクは腫瘍細胞に対するNK-LAK細胞活性をインビボでもインビトロでもMK-1特異的にターゲットした。この低免疫原性でより優れた組織透過性を持つ融合タンパクを用いることにより、NK-LAK細胞をMK-1産生腫瘍特異的に作用させることが期待された。