hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
IFN-ζ/limitin研究成果に基づく副作用の少ないIFN治療戦略の確立

(1)IFN-αとIFN-ζ/Limitin間の生理活性の違いに関わる責任アミノ酸の決定:IFN-ζ/Limitinは、IFN-αやIFN-βと同等の免疫調節作用・抗腫瘍作用・抗ウイルス作用を持つ。しかし、IFN-ζ/Limitinは、(1)骨髄球系前駆細胞のコロニー形成(CFU-GM)や赤芽球系コロニー形成(BFU-E)には影響せず、長期骨髄培養における骨髄球産生も抑制しない(2)マウスにIFN-αを腹腔内投与すると濃度依存性に骨髄中のCFU-GM/MやBFU-Eの減少が認められるが、IFN-ζ/Limitin投与ではCFU-GMやBFU-Eの減少は認められない(3)Bリンパ球前駆細胞のコロニー形成(GFU-IL7)や巨核球前駆細胞のコロニー形成(GFU-Meg)に対してIFN-αと同等の抑制作用を発揮するためにはより大量のIFN-ζ/Limitinが必要であるなど、IFN-ζ/LimitinはIFN-αと比較して骨髄抑制作用が軽微であった。骨髄抑制が少ない点においてIFN治療に関する副作用軽減やIFS治療成績の向上が期待できるIFN-ζ/Limitinであるが、残念ながら、そのヒト型遺伝子は未だ同定されていない。我々は、マウスIFN-αとIFN-ζ/Limitin間のアミノ酸配列の違いに基づき作製した変異IFN-α1(m1-IFN-α1m7-IFN-α1)とoriginal IFN-α1の生理活性の比較を行った。m3-IFN-α1(ループDE付近に3アミノ酸変異を持つIFN-α1)は、変異を持たないIFN-α1と同等の抗ウイルス活性を示すものの、GFU-IL7,CFU-GM,BFU-E各コロニー形成抑制作用が著明に減弱していた。さらに、m3-IFN-α1をマウスに注射した場合、IFN-α1注射時と異なり、Bリンパ球・赤芽球・骨髄球各前駆細胞数はコントロールと比べ変化を認めなかった。一方、m1-IFN-α1(ヘリックスC付近に4アミノ酸変異を持つIFN-α1)は、IFN-a1と比較して、より強い抗ウイルス活性を示すとともに同等の骨髄抑制作用を示した。即ち、本研究により、IFN-ζ/Limitinの特徴である骨髄抑制作用減弱および抗ウイルス活性増強に関わる責任アミノ酸を決定することが出来た。(2)IFNの骨髄抑制作用に関わる分子メカニズムの解析:SUMO化を受けない変異Daxx KA(630と631番目のリジン残基をアラニン残基に置換)をBaF3細胞株に過剰発現すると、Daxxの細胞内局在が変化するとともにIFNによる増殖抑制も消失することを見出した。本研究成果は、IFNによる副作用軽減の治療戦略の確立に繋がるものである。

(2)IFNの骨髄抑制作用に関わる分子メカニズムの解析:SUMO化を受けない変異Daxx KA(630と631番目のリジン残基をアラニン残基に置換)をBaF3細胞株に過剰発現すると、Daxxの細胞内局在が変化するとともにIFNによる増殖抑制も消失することを見出した。本研究成果は、IFNによる副作用軽減の治療戦略の確立に繋がるものである。IFN-ζ/limitinは、我々が同定した新種のI型IFNである。IFN-ζ/limitinは、IFN-αやIFN-βと同様に免疫調節作用・抗腫瘍作用・抗ウイルス作用を持つ。しかし、IFN-ζ/limitinはIFN-αと比較して骨髄抑制作用が少ないという特徴を有している。このように、副作用が少ない点において、IFN-ζ/limitinはがん治療薬・ウイルス性肝炎治療薬として既知のIFN-αやIFN-βより優れていると考えられる。残念ながら、IFN-ζ/limitinのヒト型遺伝子はまだ同定されていない。そこで我々は、人工的にIFN-ζ/limitin様ヒトインターフェロンを開発することを目的として、IFN-αとIFN-ζ/limitin間のアミノ酸配列の違いを基に両者の生理活性の違いに関わる責任アミノ酸の決定を試みた。受容体結合部位(ループABやヘリックスCおよびヘリックスD・E周辺)のアミノ酸の中でIFN-αとIFN-βで一致しIFN-ζ/limitinだけが異なるアミノ酸を選びだした。該当するIFN-α1アミノ酸をIFN-ζ/limitinのものに置換した変異IFN-α1を作製した。作製した7つの変異IFN-α1のうちの1つ(m3-IFN-α1)は、変異を持たないIFN-α1と同等の抗ウイルス活性を示すものの骨髄抑制作用(コロニー形成抑制作用)が減弱していた。また、他の変異IFN-α1(m2,m4,m5,m7-IFN-α1)は、全ての生理活性を消失していた。m1,m6-IFN-α1は、変異を持たないIFN-α1と同等の抗ウイルス活性と骨髄抑制作用を示した。m3-IFN-α1に含まれる3つのアミノ酸変異の影響を解析する為に、各々1つのアミノ酸変異を持つm3a,m3b,m3c-IFN-α1を作製した。m3-IFN-α1は変異を持たないIFN-α1と同等の抗ウイルス活性と骨髄抑制作用を示したが、m3b-,m3c-IFN-α1ともに骨髄抑制作用のみが部分的に減弱していた。以上、人工的ヒトIFN-ζ/limitin作製時、重要なアミノ酸を同定した。IFN-αとIFN-ζ/limitinの生理活性の相違がどのような機序によるかについて解析した。IFN-ζ/limitinはIFN-α/β受容体と結合するが、他の受容体が存在するかは不明である。我々は、IFN-ζ/limitinをbeitとしたツーハイブリッド法にて、IFN-ζ/limitin結合蛋白として1つのII型膜蛋白を同定した。既知のIFN受容体全てがII型膜蛋白であることから、この蛋白がIFN-ζ/limitin受容体としての機能を有する可能性がある。骨髄抑制が少ない点においてIFN治療に関する副作用軽減やIFN治療成績の向上が期待できるIFN-ζ/Limitinであるが、残念ながら、そのヒト型遺伝子は未だ同定されていない。我々は、マウスIFN-αとIFN-ζ/Limitin間のアミノ酸配列の違いを基に作製した変異IFN-α1(m1-IFN-α1m7-IFN-α1)とoriginal IFN-α1の生理活性の比較を行った。m3-IFN-α1(ループDE付近に3アミノ酸変異を持つIFN-α1)は、
中部山岳地帯における野生動物の生態と病態からみた環境汚染に関する研究

1.野生動物の病態に関する研究1)各種野生動物の各臓器と糞便から人畜共通病原体サルモネラ、エルシニア、リステリア、Q熱リケッチア、クラミジア、インフルエンザウイルスなど多数を分離・同定した。2)各種野生動物血清中に日本脳炎ウイルス、ハンタウイルス、LCMウイルス、ジステンパーウイルス、イヌ肝炎ウイルス、クラミジア、Q熱リケッチア、レプトスピラ、トキソプラズマなどに対する抗体が検出された。3)各種野生動物特にクマ、タヌキ、テン、イタチ、ヌ-トリアなどに、各種寄生虫や原虫(糸状虫、回虫、鞭虫、鈎虫、裂頭条虫、血色食道虫、ヘパトゾーン原虫など)の寄生状況を明らかにした。4)環境汚染物質(PCB、DDE、BHなど)の残留は陸生動物で比較的少ないが、鳥類特に魚食性および猛禽類で高く、食物連鎖による生物濃縮が進んでいることが明らかになった。5)ニホンザル、タヌキ、キツネなどに肺の炭粉沈着が高頻度に認められ、生息域の環境汚染の指標になることおよび大気の汚染が山間部まで拡がっていることが判明した。2.野生動物の生息動態に関する研究ツキノワグマは春季にブナの豊凶に対してエサ(食物)の種類を変化させることで安定した食物を得ている。クマの行動圏は雌よりも雄のほうが広く、生息地は無植生地およびブナ林が好まれる。雌と雄の性成熟年齢は23歳および4歳で、雌の平均排卵数は1.89、平均着床数は2.00、平均連れ子頭数は1.86と算定される。これらの結果は、クマが食性や繁殖に関わる行動を年によって柔軟に変化させ、変動する環境に対してうまく適応させていることが判明した。ニホンジカ雌は1.5歳で性成熟に達する。この知見は今後の保護管理政策の指針となる。3.傷病野生動物の治療に関する研究中型鳥類の上腕骨骨折修復における骨髄内骨セメントとプレート固定併用法を開発し、またタヌキやキツネなどの顎骨折治療法を開発し、骨修復と飛翔能力を証明した。また、ウ、ツミ、フクロウ、ゴイサギ、タヌキ、キツネなどの外傷治療例から傷病動物(鳥類)は低体温と脱水状態および体力の回復後に本格的な外科治療を施すべきであると思われる。1.野生動物の死体の収集環境庁自然保護局中部山岳国立公園管理事務所に協力を依頼した。また、中部山岳地帯の各県(岐阜、長野、富山など)の林政部自然保護課、獣医師会、猟友会、野鳥の会、剥製店などに死体及び糞便の収集の協力を依頼した。現在までにクマ、シカ、イノシシ、イタチ、リス、ヌ-トリア、タヌキ、サル、ハクビシン、アナグマ、野ネズミなど各種5頭から130頭を収集した。またムクドリ、スズメ、カモ類、ヤマドリ、キジ、キジバト、カラスなどの鳥種各30羽から150羽を収集して、死体から病態や環境汚染との関わりについて解析中である。2.野生動物の生息動態に関する研究

平成3年度は、ラジオテレメトリ-による生態学的調査を行う目的で、岐阜県大野郡白川村の8箇所に捕獲檻を設置し、7月11月の間、週2回の巡回を行ったが、捕獲し得た例はなかった。しかし、いったん檻に侵入したあと逃走したと判断される例があった。現在、檻の設置場所、檻の構造、おとりの餌などについて改良検討している。平成3年4月平成4年1月の間、雄23頭、雌12頭、性別不明2頭、合計37頭の生殖器・下顎第4前臼歯・腎臓・胃内容を採取した。第4臼歯の観察による年齢査定が終了した9個体の年齢別内訳は、1歳3頭、2歳1頭、3歳2頭、8、12および14歳はそれぞれ1頭であった。生殖器の観察による性成熟の判定では、雄4頭中1頭のみが成熟、雌9頭はすべて成熟していた。平成3年23月に捕殺された雌ニホンジカ60頭の卵巣を採取して繁殖調査を行った結果、性成熟は1.5歳で達することがわかった。3.野生動物の病態に関する研究クマでは全身の結合組織中に糸状虫病変が多数認められ、糞便からは食中毒原因菌のサルモネラなどが検出された。シカでは肺や腸管などに寄生虫が多数認められた。サルでは消化管に寄生虫の認められるものが67%、何らかの疾患を示したものが52%検出された。ヌ-トリアでは36%に何らかの病変が、またウサギには条虫の寄生が高率に確認された。野ネズミではツツガムシの寄生が、また糞便から高率に薬剤耐性大腸菌が検出された。鳥類の病態については解析中である。以上の成績から、野生動物は予想された以上に各種の病変が認められ、現在これらの病態と環境汚染との因果関係を追求中である。1.野生動物の病態に関する研究1)各種野生動物の死体と糞便から人畜共通病原体サルモネラ、エルシニア、リステリア、Q熱リケッチア、クラミジアなど多数を分離、同定中である;2)各種野生動物の血清中に日本脳炎ウイルス、ハンタウイルス、LCMウイルス、クラミジア、Q熱リケッチア、レプトスピラ、トキソプラズマなどに対する抗体が検出された;3)各種野生動物、特にクマ、タヌキ、テン、イタチ、ヌートリアには、約5080%の各種寄生虫や原虫(糸状虫、回虫、鞭虫、鉤虫、裂頭状虫、血色食道虫、ヘパトゾーン原虫など)の寄生状況を明らかにしつつある;4)野生動物種における環境汚染物質(PCB,DDE,BHなど)の蓄積は比較的少ないことが明らになった;5)ニホンザル、タヌキ、キツネ、クマを対象に肺の炭粉沈着症の出現頻度を病理組織学的に解析した結果、野生動物の生息域の環境汚染の指標として利用できることが示唆された。2.野生動物の生息動態に関する研究白山山系東南端に位置する岐阜県白川村において、ツキノワグマのラジオテレメトリィ法を開発した。これまでに、おとし檻を用いて延べ11頭(うち再捕獲1頭)を捕獲し、麻酔後身体計測、採血、精巣バイオプー等を行った後に解放し、追跡調査中である。他に有害鳥獣捕獲により30個体を収集した。これらの材料から精子形成には季節的変動が存在すること、また性成熟は3歳であることが判明した。3.傷病野生動物の治療の関する研究中型鳥類の上腕骨骨折修復における骨髄内骨セメントとプレート固定併用法を開発し、骨修復と飛翔能力を証明した。また、ツミ、フクロウ、ゴイサギ、タヌキなどの外傷治療例から傷病動物には低体温と脱水状態および体力の回復後に本格的な外科的治療を施すべきであると思われる。1.野生動物の病態に関する研究1)各種野生動物の各臓器と糞便から人畜共通病原体サルモネラ、エルシニア、リステリア、Q熱リケッチア、クラミジア、インフルエンザウイルスなど多数を分離・同定した。
花崗岩形成機構における流体の挙動

1日本の花崗岩の角閃石-黒雲母についてδDとX_<Fe>のデータがかなり集まったので,花崗岩類のI-, S-, A-タイプあるいは磁鉄鉱系列,イルメナイト系列というような分類とどのような関係があるのかを考察した.(1)日本のS-タイプ花崗岩は西南日本外帯の新第三紀花崗岩と日高山地のミグマタイトである.今年度はこれらを集中的に分析した.その結果,外帯の花崗岩は, 1つの岩体内ではδDもXFeも比較的まとまった値をもつが外帯花崗岩全体としてみるとδDが-50〓から-120〓までばらついている.日高帯のミグマタイトの方が,まとまった値をもつ.(2)日本でA-タイプの花崗岩とされている足摺岬花崗岩は,世界でもっとも典型的なA-タイプとされているフィンランドのラパキビ花崗岩とくらべると,角閃石-黒雲母ペアーのX_<Fe>がほゞ同じ値をもつ点は似ているが,岩体全体ではX_<Fe>が0.50.9までばらつくことがはっきり違う.(3)磁鉄鉱系列とイルメナイト系列では, δD-XFe図で角閃石-黒雲母ペアーが平衡型の特徴を示すものでも,イルメナイト系ではX_<Fe>がほゞ似たような値をもつのに,磁鉄鉱系列花崗岩では,分化が進むと角閃石・黒雲母ともにX_<Fe>が小さくなることがわかった.(4)このような違いは,マグマの含水量や酸素フェガシティーと関係があると考えられる.花崗岩形成時の水の挙動についてさらに考察を進める.2角閃石・黒雲母・白雲母・火山ガラスの脱水反応と水素同位体の分配実験を行い,それらがレーリー分溜モデルで説明できることがわかった.3妙高火山の角閃石とガラスのδD, X_<Fe>を測定したが,昨年度得られた焼岳火山の角閃石のデータと同じでないことがわかった.火山岩についてはさらに他の火山の岩石についてデータを集めて,総合的に考察する必要がある.1日本の花崗岩の角閃石-黒雲母についてδDとX_<Fe>のデータがかなり集まったので,花崗岩類のI-, S-, A-タイプあるいは磁鉄鉱系列,イルメナイト系列というような分類とどのような関係があるのかを考察した.(1)日本のS-タイプ花崗岩は西南日本外帯の新第三紀花崗岩と日高山地のミグマタイトである.今年度はこれらを集中的に分析した.その結果,外帯の花崗岩は, 1つの岩体内ではδDもXFeも比較的まとまった値をもつが外帯花崗岩全体としてみるとδDが-50〓から-120〓までばらついている.日高帯のミグマタイトの方が,まとまった値をもつ.(2)日本でA-タイプの花崗岩とされている足摺岬花崗岩は,世界でもっとも典型的なA-タイプとされているフィンランドのラパキビ花崗岩とくらべると,角閃石-黒雲母ペアーのX_<Fe>がほゞ同じ値をもつ点は似ているが,岩体全体ではX_<Fe>が0.50.9までばらつくことがはっきり違う.(3)磁鉄鉱系列とイルメナイト系列では, δD-XFe図で角閃石-黒雲母ペアーが平衡型の特徴を示すものでも,イルメナイト系ではX_<Fe>がほゞ似たような値をもつのに,磁鉄鉱系列花崗岩では,分化が進むと角閃石・黒雲母ともにX_<Fe>が小さくなることがわかった.(4)このような違いは,マグマの含水量や酸素フェガシティーと関係があると考えられる.花崗岩形成時の水の挙動についてさらに考察を進める.2角閃石・黒雲母・白雲母・火山ガラスの脱水反応と水素同位体の分配実験を行い,それらがレーリー分溜モデルで説明できることがわかった.3妙高火山の角閃石とガラスのδD, X_<Fe>を測定したが,昨年度得られた焼岳火山の角閃石のデータと同じでないことがわかった.火山岩についてはさらに他の火山の岩石についてデータを集めて,総合的に考察する必要がある.
植物における動物ステロイドホルモンの生合成と性分化制御の解明

植物から動物ステロイドが検出されるが、植物におけるその生合成経路と生理作用は明らかにされていない。本研究では、モデル植物であるシロイヌナズナの内生動物ステロイドの分析を行うことにより、動物ステロイド生合成は植物ホルモンのアブシジン酸に制御されている可能性を見出した。また、花において動物ステロイドのプロゲステロンの含量が高かった。さらに、雄株と雌株が分かれるアスパラガスでは、雄株よりも雌株の方がプロゲステロンの含量が高かった。これらのことから、動物ステロイドと植物の生殖生長との関連性を明らかにした。植物から動物ステロイドが検出されるが、植物におけるその生合成経路と生理機能は明らかにされていない。本研究では、(1)変異体による逆遺伝学的研究手法を用いて植物における動物ステロイドの生合成経路(生合成酵素)の解明を行った。さらに、(2)動物ステロイドの植物における生理機能、特に性分化(雌雄分化)における役割の解明を試みた。(1)の研究として、動物のプレグネノロンからプロゲステロンへの合成酵素遺伝子3β-HSDに類似したシロイヌナズナの遺伝子にT-DNAが挿入された変異体について、内生動物ステロイドの分析を行った。その結果、正常種と比べて、表現型と内生動物ステロイドに大きな違いは認められなかった。この候補遺伝子に類似した遺伝子がシロイヌナズナのゲノムに複数存在するので、それらの機能が重複している可能性が考えられた。そこで、別の動物ステロイド生合成酵素の系統樹から推測した候補遺伝子についてもT-DNA挿入変異体を取得して解析したところ、その変異体は発芽できない異常な種子をつけることがわかった。また、シロイヌナズナの花、茎や葉などの器官別の内生動物ステロイド分析を行ったところ、花の内生量が一番高かった。これらのことから、シロイヌナズナにおいて動物ステロイドは生殖生長において重要な役割があることが示唆された。加えて、(2)の研究として、雄花と雌花が別々の個体につく雌雄異株植物の内生動物ステロイドの分析を進めた。アスパラガスを分析材料として、雄株と雌株に分けるためにPCRを用いて雌雄鑑定を行ったのち、雌雄差のない段階での茎葉部の内生動物ステロイドの分析を行った。その結果、雄株と比べて雌株の方が、内生動物ステロイド含量が高い傾向が見られた。このことから、アスパラガスの雌雄分化に動物ステロイドが関与している可能性が示唆された。本研究では、(1)変異体による逆遺伝学的研究手法を用いて植物における動物ステロイドの生合成経路(生合成酵素)の解明を行っている。さらに、(2)動物ステロイドの植物における生理機能、特に性分化(雌雄分化)における役割の解明を試みている。本年度は、(1)の研究として、強心配糖体を生産する植物のジギタリスにおけるプレグネノロンからプロゲステロンへの合成酵素遺伝子3β-HSDに類似したシロイヌナズナの遺伝子の解析を進めた。T-DNAが挿入されたシロイヌナズナの変異体を取得し、ホモの変異体を単離して、現在、各種カラムクロマトグラフィーにより動物ステロイドの精製を進めている。また、動物の酵素遺伝子との系統樹から推測した動物ステロイド生合成酵素の他の候補遺伝子についてもT-DNA挿入変異体を複数取得してホモ変異体の単離を進めた。遺伝子によっては類似性から機能が重複していると考えられるものもあったので、交配により二重突然変異体の作出を進めた(2)の研究としては、雄花と雌花が別々の個体につく雌雄異株植物の内生動物ステロイドの分析を進めた。雌雄異株植物であるホウレンソウを雄株と雌株に分けるためにPCRを用いて雌雄鑑定を行ったのち、それらの動物ステロイドの分析を行った。このとき、生殖生長と栄養条件の関係も調べるために、貧栄養や過剰栄養条件で育てた材料を分析したが栄養条件による動物ステロイド生産への影響は認められなかった。また、今回の生育条件では動物ステロイドの生産量は低く、雌雄における動物ステロイド含量の差異を確認することはできなかった。おおむね計画どおりに進捗しているが、共同研究者であるハンガリーの生物学研究所のSzekeres博士が十分な研究費を獲得できなかったことから、当初予定していたRNAi法による候補遺伝子の低発現株の作出は断念せざるをえなかった。しかしながら、候補遺伝子に関しては、すでに10種類以上のT-DNA挿入変異体を得ているので、それらの分析により期待しうる十分な結果が得られると考えている。当初の計画どおりに進める。(1)の研究に関しては、シロイヌナズナのT-DNA挿入変異体の内生動物ステロイドについてLC-MS/MSやGC-MSを用いた機器分析を進める。また、候補酵素タンパク質を大腸菌等で発現させて、基質ステロイドを代謝させ、その機能解析を行う。

(2)の研究に関しては、雌雄異株植物であるアスパラガスの雄株と雌株の内生動物ステロイド分析を行う。また、果実や花、茎葉などの器官別に内生動物ステロイドの分析も行う。これらの研究により、植物における動物ステロイドの生合成酵素の同定および性分化との関連性の解明に取り組む。該当なし
褥瘡の発生に及ぼす体温・血流に関する臨床看護学的研究

現在までの褥瘡に関する実験・調査等による研究過程から,褥瘡の発生は皮膚と骨に近い組織によると予測し,その実証デ-タを得るために,平成2年度は予備実験・予備調査を実施した。その結果をもとに,臨床実験と調査を平成3年度に行い,次の結果を得た。なお,実験・調査の対象は4病院の褥瘡のある高齢患者(褥瘡高齢者)25名,褥瘡になり易い高齢患者(易褥瘡高齢者)15名,及び普通生活をしている健康な高齢者(健康高齢者)8名である。1.栄養・貧血に関する血液検査値は,全項目ともに褥瘡高齢者・易褥瘡高齢者の方が健康高齢者より,有意に低い。2.サ-モグラムによる皮膚温は,健康高齢者は体位変換直後の温度より,10分後の方が低下しているが,褥瘡・易褥瘡高齢者のそれは,10分後の測定値に上昇がみられた。3.褥瘍・易褥瘡高齢者の深部温(10mm)は,仙骨近位部(仙骨部),中殿筋部ともに,体位変換直後より10分後の方が上昇している。4.健康高齢者の深部温は,臥床前では仙骨部の方が中殿筋部より高いが,体位変換直後のそれは中殿筋部の方が仙骨部より高く,しかも,温度の上昇幅の値も中殿筋部の方が大きい。以上から,褥瘡ができる状況のときは,発赤や表皮剥離が起こる以前から,骨に近い組織に変化が生じているものと考えられる。また,組織を形成するタンパク質が不足し,組織に栄養を供給する血液の組成が不十分であれば,体圧などで血液の供給が悪くなった組織に壊死変化が生じやすいので,これに対応する看護技術の検証が,今後の課題である。褥瘡の発生は、皮膚と骨に近い筋内層の圧迫による血流障害から生じると、現在までの研究過程から予測し、その実証デ-タを得るため、本年度は基礎テスト、及び予備テストを実施し、以下のような結果を得た。1.褥瘡発生事例の臨床での面接・観察による調査を、次年度のテスト対象とする病院の入院患者、及び在宅患者で、褥瘡のある10名について実施した。その結果、褥瘡発生は体位変換を自分で行えず、失禁状態の人に多い。また、肥満や肥満傾向の人に多いことは、自分の体重による圧迫の影響が考えられる。2.臨床テストの予備テストを、65歳以上の9名を対象に、5種類のマットレスによる敷寝具を使用して、各々臥床前と仰臥位30分後に測定した。その結果、皮膚温は仙骨部の方が左右肩甲骨部より高く、このことは表皮に近い部分の血管分布や血液量との関係、及び仰臥位での寝床圧迫を、広範囲に受ける傾向によるものとみられる。3.敷寝具のマットレス(M)について、背部皮脂厚がほぼ同じである4名を比較すると、臥床前後の温度差が高い順は、(a)スプリングM>(b)通気孔のあるポリウレタンM>(c)中ポリエステル繊維M>(d)ポリウレタンのプロフィ-ルカットMであった。4.病床(寝床)気候の皮膚に対する影響を知るため測定したところ、敷寝具マットレスの温度差の最も高い(a)と低い(c)について、19歳の女子学生を被検者として基礎テストを実施した。その結果、寝床内温度はいずれも(a)>(c)であったが、温度には個人差があった。

現在、2.3.を深部温や血流との関係から実証するための、基礎実験をはじめており、次年度は入院患者と在宅患者の協力を得て、臨床テストを実施し結論を出したい。高齢者の褥瘡の発生しやすい状態を知るために、入院治療中の褥瘡のある患者(褥瘡高齢者)25名、褥瘡状態をおこしやすいが現在は外見的には褥瘡のない患者(易褥瘡高齢者)15名、および健康で普通生活をしている高齢者(健康高齢者)8名の皮膚温、深部温および血流を測定し比較分析した。また、これと平行して、看護婦に面接調査を行い、さらに血流検査報告書を調査したところ、次のような結果を得た。1.栄養・貧血に関する血液検査値は、全項目ともに褥瘡高齢者、易褥瘡高齢者の方が健康高齢者より、有意に低い。2.サ-モグラムによる皮膚温は、健康高齢者は体位変換直後の温度より、10分後の方が低下しているが、褥瘡、易褥瘡高齢者のそれは、10分後の測定値に上昇がみられた。3.褥瘡、易褥瘡高齢者の深部温(10mm)は、仙骨近位部(仙骨部)、中殿筋部ともに、体位変換直後より10分後の方が上昇している。4.健康高齢者の深部温は、臥床前では仙骨部の方が中殿筋部より高いが、体位変換直後のそれは中殿筋部の方が仙骨部より高く、しかも、温度の上昇幅の値も中殿筋部の方が大きい。以上から、褥瘡ができる状況のときは、癸赤や表皮別離が起こる以前から、骨に近い組識に変化が生じているものと考えられる。また、組識を形成するタンパク質が不足し、組識に栄養を供給する血液の組成が不十分であれば、体圧などで血液の供給が悪くなった組識に壊死変化が生じやすいので、これに対応する看護技術の検証が、今後の課題である。
反復性中耳炎に対するインフルエンザ菌外膜蛋白粘膜ワクチンの開発

抗PspA特異的抗体価の年齢的変化健康小児10名を1グループとして、2ヶ月、4ヶ月、5ヶ月、1歳、2歳、3歳、4歳、5歳の8グループの血清を用いて、酵素抗体法(ELISA)でPspAに対する特異的抗体価を測定し、小児における肺炎球菌特異的血清抗体価の年齢的な変化を検討した。特異的抗PspA抗体価はIgG,IgM,IgAともに、年齢に伴って上昇することが判明した。このうち、IgM,IgAは加齢と共に徐々に抗体価の上昇がみられたが、IgGは母親からの胎盤経由の受動免疫により出生時から生後6ヶ月までは低下傾向を示した。その後2歳まではゆっくりであるが、抗体価の上昇が認められ、2歳以降は急激に抗体価の上昇を認め、成人では小児期のピーク値よりもやや低下していた。このPspAに対する特異的IgG抗体の年齢に伴う変化は、インフルエンザ菌の共通抗原であるP6に対する特異的IgG抗体価の上昇パターンと極めて類似していた。2)インフルエンザ菌共通抗原であるP6蛋白を経鼻免疫し、鼻咽腔におけるインフルエンザ菌のコロニー形成抑制効果について検討した。鼻咽腔におけるインフルエンザ菌のクリアランス実験マウスのインフルエンザ菌鼻咽腔感染モデルを作成し、P6蛋白を経鼻免疫した群と対照群とで比較検討し、P6蛋白の経鼻免疫ワクチンによる疾患予防効果について研究した。すなわち、マウスに経鼻的にnontypableインフルエンザ菌を接種し、P6経鼻免疫群および非免疫群で鼻咽腔からの細菌クリアランスの程度および消失期間などを比較検討したところ、非免疫群ではインフルエンザ菌のクリアランスに接種後7日を要したが、P6経鼻免疫群では3日でクリアランスが認められ、経鼻免疫によりクリアランスの著明な短縮がみられた。この結果からP6蛋白の経鼻免疫が疾患予防効果を有する可能性が示された。1)中耳腔における起炎菌の分子生物学的検索中耳炎の反復は炎症の再燃あるいは再発によって起こる。中耳炎は経耳管的に鼻咽腔の細菌が感染することによって発症する場合がもっとも多いと考えられている。本来無菌的な中耳粘膜において、中耳炎罹患患児ではどの程度の期間細菌ゲノムが存在するのか検討を行う。すなわち、インフルエンザ菌(NTHI)、肺炎球菌(SP)、カタラーリス菌(MC)の外膜蛋白をコードするシークエンスからプライマーを作製し、中耳貯留液中、中耳粘膜内のインフルエンザ菌、肺炎球菌、およびカタラーリス菌をPCR法により検出した。10例、18貯留液の細菌学的検討では、培養にて2検体が陽性であったが、PCR検索ではNTHIが16/18(84.4%)に認められ、さらにSP,7/18(39%),MC,7/18(39%)と細菌ゲノムが検出された。すなわち通常の培養で検出されないにもかかわらず、高率に起炎菌DNAゲノムが認められ、中耳腔における細菌処理が不十分なことが推測された。2) nontypableインフルエンザ菌の外膜蛋白およびP6蛋白の抽出P6蛋白の抽出はMunson&Granoffの方法を用いた。すなわちP6が緩衝液B(1%SDS-0.1MTris-0.5MNaCl-0.1%βmercaptoethanol,pH8.0)に対して不溶性であることを利用したものである。先ず中耳貯留液から分離したインフルエンザ菌から上記の方法で、外膜蛋白とリポオリゴ糖からなる外膜複合体を抽出し、次にこの複合体を緩衝液Bに溶解し37°Cで30分培養後超音波処理を行った。21,000Gで30分遠沈後、沈渣を緩衝液Bおよびリボヌクレアーゼに溶解する。以上の操作を3回繰り返し、沈渣を硼酸緩衝液(pH9.5)に溶解し65°C、30分熱処理した。不溶物質を10万G、1時間の遠沈により除去し、上清中にP6蛋白を得た。電気泳動にて分子量16,000の付近に単一のバンドが得られ、その純度および再現性が確認できた。3)健康対照児および中耳炎患児の血清中および中耳貯留液、鼻咽腔洗浄液中のP6特異的抗体の検索抗P6-固相ELISAにより抗P6抗体を測定した。健康対照群における検索では、円に対する血清抗体は殆どがlgGであり、lgGサブクラスの検索では、P6に対する抗体活性はlgG1およびlgG3に認められ、lgG2およびIgG4分画にはほとんど特異的抗体活性は認められなかった。鼻咽腔洗浄液ではP6特異的分泌型lgA抗体が検出された。反復性中耳炎患児では、P6特異的抗体の年齢に伴う上昇が対照群に比較して有意に不良であり、P6蛋白に対する免疫不全の存在が示唆された。さらにlgGサブクラスの検索ではlgG3抗体の上昇が不良であった。以上より、本年度の研究では、中耳炎予防ワクチンの開発において、インフルエンザ菌の外膜蛋白のうち、P6が有望であり、粘膜におけるlgAおよび血清中でのlgGの上昇を誘導する投与法を検討する必要があることが判明した。1)中耳炎反復症例における起炎菌に対する特異的免疫能を検索し、反復感染機序の宿主側の要因を検討した。方法:36例の反復性中耳炎患児および20例の健康対照児を検索対象とした。

これらの患児および対照児から採取した血清中のインフルエンザ菌外膜蛋白P6に対する特異的IgG抗体および肺炎球菌莢膜多糖体(pneumococcal capsular polysaccharIde:PCP)に対する特異的IgG2抗体をELISA法により測定した。成績:抗PCP-IgG2抗体は健康対照児では生後2歳まではゆっくりと上昇するが、2歳から3歳までの間では抗体価の上昇は認められず逆に徐々に低下した。3歳を越えると特異的抗体価が急速に上昇した。健康対照児では抗P6-IgG抗体価も同様に2歳から3歳の間で上昇が見られずやや低下する傾向が認められた。この2-3歳が中耳炎にもっとも罹患しやすい年齢層であり、健康児でも中耳炎の起炎菌に対する抗体価がこの年齢で上昇が不良であることが罹患しやすさの大きな原因ではないかと考えられた。一方、反復性中耳炎患児では、48.1%において抗PCP-IgG2抗体が低値(平均値-2x標準偏差値以下)を示しており、さらに55%において抗P6-IgG抗体が低値を示していた。上述の成績は反復性中耳炎患児では中耳炎起炎菌に対する特異的免疫能が何らかの原因により障害されていることを示唆している。2)P6蛋白の経鼻免疫および全身免疫によるP6特異的抗体の産生鼻関連リンパ組織(NALT)を利用した経鼻免疫によるワクチン投与の有効性を実験動物(マウス)を用いて検索した。方法:インフルエンザ菌の外膜蛋白P6を以下の方法で経鼻免疫し、特異的抗体産生、特に特異的分泌型IgA抗体の産生について比較検討した。A群:経鼻免疫を2週間,隔日(7回)で施行、B群:経鼻免疫を、初回免疫後2週間後に追加免疫それぞれのグループについて最終免疫後1,2,3,4週、2ヵ月後に鼻分泌液および血清中のP6特異的抗体(IgG,IgM,IgAおよび分泌型IgA)を酵素免疫測定法により定量した。成績:血清中抗P6-IgG抗体は、A群では有意な上昇が認められ、最終免疫後より3週間高値を維持した。B群では有意ではあるがA群に比較すると軽度の抗P6-IgG抗体の上昇が認められた。鼻咽腔洗浄液中の抗P6-IgA抗体もA群で有意な上昇が認められ、最終免疫後3週間高値が維持された。しかしB群では抗P6-IgA抗体の上昇が認められたが2週間後には低下した。抗PspA特異的抗体価の年齢的変化健康小児10名を1グループとして、2ヶ月、4ヶ月、5ヶ月、1歳、2歳、3歳、4歳、5歳の8グループの血清を用いて、酵素抗体法(ELISA)でPspAに対する特異的抗体価を測定し、小児における肺炎球菌特異的血清抗体価の年齢的な変化を検討した。特異的抗PspA抗体価はIgG,IgM,IgAともに、年齢に伴って上昇することが判明した。このうち、IgM,IgAは加齢と共に徐々に抗体価の上昇がみられたが、IgGは母親からの胎盤経由の受動免疫により出生時から生後6ヶ月までは低下傾向を示した。その後2歳まではゆっくりであるが、抗体価の上昇が認められ、2歳以降は急激に抗体価の上昇を認め、成人では小児期のピーク値よりもやや低下していた。このPspAに対する特異的IgG抗体の年齢に伴う変化は、インフルエンザ菌の共通抗原であるP6に対する特異的IgG抗体価の上昇パターンと極めて類似していた。2)インフルエンザ菌共通抗原であるP6蛋白を経鼻免疫し、鼻咽腔におけるインフルエンザ菌のコロニー形成抑制効果について検討した。鼻咽腔におけるインフルエンザ菌のクリアランス実験マウスのインフルエンザ菌鼻咽腔感染モデルを作成し、P6蛋白を経鼻免疫した群と対照群とで比較検討し、P6蛋白の経鼻免疫ワクチンによる疾患予防効果について研究した。
ヒト歯髄細胞より分離した線維芽細胞と血管内皮細胞による3次元共培養系の確立

1.線維芽細胞用に用いたMEMを共培養に用いると内皮細胞は増殖せずに減少した。一方、内皮細胞用の培養液を用いると、最初は線維芽細胞の増殖は抑制されたが、2-3日で異なる環境に適応できてきて、ゆっくりと増殖を始め、しだいに内皮細胞の増殖を抑制し内皮細胞は減少してきた。またFBSの濃度を5-20%の範囲で調べると濃度の高い方が両細胞ともよく増殖したが、共培養系に最適な濃度は決定できなかった。共培養用の培養液の選択等、条件を決定するのは困難で、現在検討中である。2. 3次元培養系を用いて歯髄から分離した線維芽細胞の増殖能に及ぼすレーザーの影響を調べ、2次元培養系と比較した。エネルギー密度0.52と1.04 J/cm^2の半導体レーザー(波長830nm)を用いた実験では1.04 J/cm^2の照射条件において2次元培養では有意差はなかったが、3次元培養では有意差が認められた(p<0.01)。エネルギー密度0.1と1.0 J/cm^2のアルゴン・ダイレーザー(波長632nm)を用いた実験でも同じく、0.1J/cm^2の照射条件において2次元培養では有意差はなかったが、3次元培養では有意差が認められた(p<0.01)。また、細胞遊走実験では2次元より3次元培養系の方が明らかにレーザーによる細胞に及ぼす効果が認められた。このように3次元培養系を用いた方が細胞にとってより生体に近い条件であり、レーザーの効果、薬剤の毒性等を調べる研究に適していると考えられた。1.齲蝕のない健全な第3大臼歯で抜歯予定の患者から同意を得て、抜歯後すぐにペニシリンとストレプトマイシンを含むMEMで洗浄、保存し、クリーンベンチ内でセメント-エナメル境にて歯髄組織を傷つけないようにして歯科用バ-を用いて切断し、歯髄組織を摘出し、培養を開始した。歯髄線維芽細胞は増殖遊離能が強いことから細かく切断した組織片を培養することにより遊出してきた細胞を分離培養し、形態学的に線維芽細胞と同定した。線維芽細胞は主にMEM培養液に10%FBSを加えてを培養した。歯髄血管内皮細胞は、機械的細胞分離培養法にて分離してきた細胞をカルチャーディシュに対する付着能(速度)の違いにより血管内皮細胞を分離した。CD36に対する抗体と形態学的方法を用い血管内皮細胞を同定した。この細胞は血管内皮細胞専用の培養液に20%FBSを加えて培養した。2.ゲルの操作性という観点からすると濃度が高い方(1.5mg/ml以上)がよかったが、コラーゲン濃度の上昇は線維芽細胞の増殖を妨げたので、ゲルを使用した3次元細胞培養となると、結局コラーゲンゲル濃度は1.0-1.2mg/ml(0.1-0.12%)が最適と考えられた。一方、血管内皮細胞はコラーゲンゲル濃度が1.0-2.0mg/mlのレベルでは増殖能にほとんど影響がなかったので、単独の細胞培養では濃度が高い方(2.0mg/ml)が遊離と考えられたが、線維芽細胞との共培養となると1.0mg/mlの方がよいと考えられた。3.線維芽細胞用に用いたMEMを共培養に用いると内皮細胞は増殖せずに減少した。一方、内皮細胞用の培養液を用いると、最初は線維芽細胞の増殖は抑制されたが、2-3日で異なる環境に適応できてきて、ゆっくりと増殖を始め、しだいに内皮細胞の増殖を抑制し始めた。共培養用の培養液の選択は難しく、現在検討中である。
疾走動作の観察評価はどこまで可能か？

本研究の目的は,小学生の疾走動作を対象に,体育を専門としない小学校教員および短距離走の指導者における観察評価の観点を明らかにし,両者の比較を行うことで,体育授業で利用可能な観察ポイントについて検討することであった.主な結果として,指導者は,下肢の動作を中心に観察し,疾走動作の合理性を適切に評価していたが,小学校教員にはそのような傾向はみられなかった.また,小学校教員は特に「腕振り」に着目している傾向がみられ,観察,評価し易い観点であることが明らかになった.しかし,疾走能力を評価する上で適切な項目ではない可能性も示され,実際の体育授業の場面では,この点について考慮する必要があることが示唆された.本研究では疾走動作を対象にし、体育を専門としない小学校教員や一般生徒など比較的運動経験や観察経験の少ない者が、技術の習得状況について、適切に観察評価できる項目と出来ない項目を分類し、体育授業で利用可能な動作の観察ポイントを確立することであった。この目的を達成するために、昨年度は、小学生の疾走動作の撮影および分析、小学校教員に対する面接調査を行った。具体的には、小学校5、6年生、計31名を対象に、50m走を実施してタイムを測定するとともに、側方からパンニング撮影を行った。その後、小学校教員10名を対象に、撮影した動画を2回見せた後に2段階評価(A :良い、B :改善が必要)を行わせた。なお、どちらともいえない、判断できない場合は回答しないように指示した。また、評価後にAまたはBと評価した理由を自由記述させた。評価は、10人中8人以上の判断結果を採用し、「A :良い」をGood群、「B :改善が必要」をPoor群とした結果、6名がGood群、14名がPoor群に分類された。主な結果として、自由記述の内容をテキストマイニングしたところ、Good群では、「良い」、「フォーム」といった記述が多く、Poor群では、「腕」、「振り」といった記述が多かった。また、キネマティクス的な比較を行ったところ、肘角度の屈曲が保たれていない児童をPoor群としている傾向がみられた。このことから小学校教員は、腕、特に肘の屈曲・伸展に着目して動作の優劣を評価していることが示唆された。これまで、体育を専門としない教員における疾走動作の観点については明らかにされてこなかったため、この結果は、体育授業で利用可能な疾走動作の観察ポイントを確立する上で重要な知見であるといえる。当初予定していた計画は概ね順調に進んでいる。疾走動作の撮影および分析や体育を専門としない小学校教員に対する面接調査は予定通り進められたが、短距離の指導者や体育教員に対する面接調査を実施することができなかった。しかし、対象者への依頼や面接の時期についての計画を立てることができたため、大幅な遅れはないと考えられる。最終年度は,小学生の疾走動作を対象に,体育を専門としない小学校教員および短距離走の指導者における観察評価の観点を明らかにし,両者の比較を行うことで,小学校体育の場で適用可能な疾走動作の観察ポイントについて検討した.その結果,以下の3つのことが明らかになった.1指導者と小学校教員では,観察の観点が異なり,指導者は下肢や上半身と下肢との関係性,小学校教員は,上半身や全体の印象に着目している.2指導者は特に「接地時の遊脚の位置」,「接地時の重心の位置」,「脚の流れ」の3つの観点に着目していた.これらはバイオメカニクス研究で明らかにされた合理的な疾走動作を評価する項目と一致しており,「良い」動作や「改善が必要」な動作を見極めるうえでは,適切な観点であることが推察された.3小学校教員は,特に「腕振り」,「全体の印象」,「姿勢」に着目しており,これらは小学校学習指導要領解説やそれに関連する指導書の内容と一致していた.その中で,「腕振り」に関する内容は最も多く,バイオメカニクスの分析からも適切に評価できていた.しかし,指導者はほとんど「腕振り」に着目しておらず,「腕振り」の評価が低くても十分に疾走能力を発揮できる児童も多くいたため,疾走動作を評価する項目として適していない可能性が示された.また,「姿勢」については,小学校教員でも動きの変化を捉え易く,尚かつ合理的な疾走動作を評価できる観点の一つとして提案できる可能性が示された.本研究の目的は,小学生の疾走動作を対象に,体育を専門としない小学校教員および短距離走の指導者における観察評価の観点を明らかにし,両者の比較を行うことで,体育授業で利用可能な観察ポイントについて検討することであった.主な結果として,指導者は,下肢の動作を中心に観察し,疾走動作の合理性を適切に評価していたが,小学校教員にはそのような傾向はみられなかった.また,小学校教員は特に「腕振り」に着目している傾向がみられ,観察,評価し易い観点であることが明らかになった.しかし,疾走能力を評価する上で適切な項目ではない可能性も示され,実際の体育授業の場面では,この点について考慮する必要があることが示唆された.今後、短距離の指導者や体育教員の観察ポイントを明らかにし、昨年度明らかにした小学校教員における観察ポイントとの比較を行うことで、体育授業で利用可能な疾走動作の観察ポイントについて検討していく。また、本研究課題で得られた知見を学会や研究誌に発表することで、情報収集や情報発信を行う。身体教育学年度末の出張であったため、出張旅費の支出が次年度となった。次年度早々に支出する。
神経細胞移動を制御するLIS1カスケードおよびその制御機構の解明

本研究ではI型滑脳症(Miller-Dieker, ILS)の原因遺伝子産物であり、神経細胞移動を制御するLIS1のシグナル系について解明することを目的としている。我々は、これまでLIS1が細胞内I型PAFアセチルハイドロラーゼの触媒サブユニット(α1、α2)や、カビの核移動に異常がみられる変異株の原因遺伝子産物の一つであるNUDEの哺乳類ホモログ(NUDE、NUDEL)と結合することを明らかにしており、これらの分子の機能の解析を進めてきた。培養細胞においてNUDEは全ての細胞に発現が見られるのに対し、NUDELは神経系細胞のみに発現が見られ、また発生段階の脳においては、NUDEは分裂の盛んな細胞に、NUDELは神経細胞に強く発現しており、それぞれ、細胞分裂(NUDE)、神経細胞特異的な機能(NUDEL)を担っていることを示した。またこのうちNUDELは、PC12細胞において突起伸長に関与していること、初代培養神経細胞において軸索、成長円錐に発現していること、脳における発現は胎児から成体にかけて著しく増加することから、神経突起伸長あるいは軸索の維持にNUDELが重要な役割を果たし、神経回路形成に関与している可能性を明らかにした。また、α1、α2のノックアウ卜マウスを作製し、解析を行った。α2-/-、α1-/-;α2-/-マウスでは野生型に比べ、LIS1の蛋白発現量が3040%に減少(mRNAレベルではむしろ発現増加)しているのが見られ、α(特にα2)はLIS1と結合することにより、細胞内LIS1量を規定している可能性を示した。また解剖学的解析を行ったところ、α1-/-;α2-/-マウスでは少なくとも脳の神経細胞の層状構造に大きな異常は見られなかったが、精子形成異常が起きることを明らかにし、LIS1カスケードが神経回路形成だけでなく、精子形成にも関与している可能性を示した。血小板活性化因子PAFはこれまで炎症のメディエーターとしての位置づけでとらえられており、喘息、アレルギー等の疾患に関わるキー分子であると考えられている。そのうち、。型PAF-AHは、α1、α2、β3つのサブユニットからなり脳の神経細胞に多量に発現していた。また、βサブユニットは、神経細胞移動に異常を生じ、形態的には脳表面がツルツルになってしまう、。型滑脳症(ミラー・ディーカー症、Isolated Lissencephaly Sequence)の原因遺伝子LIS1の遺伝子産物そのものであった。。型PAF-AHの活性サブユニット(α1、α2)のマウスゲノムを単離し、ターゲットベクターを作製した。ES細胞に遺伝子導入し、組み換えたいES細胞を得た。ジャームライントランスミッションに成功し、α1、α2に関して、ホモ(-/-)マウスを得た。どちらも予想とは外れ、脳の形態異常は観察されなかった。しかし、α1、α2ダブルノックアウトマウスを作製した場合、雄が、不妊であることに気がついた。詳しく解析した結果、このマウスでは、精巣が顕著に萎縮しており、精子形成に異常があることがわかった。
扁桃体単一ニューロンの膜特性および海馬体との神経回路網に関する電気生理学的研究

海馬体の内嗅野深層の電気刺激に誘発されるバースト発火の扁桃体外側核への伝播について,両部位を含む水平断ラット脳スライスを用いて,ガラス微小電極による細胞内記録法と金属電極によるフィールド電位記録により解析を行った。扁桃体の単一ニューロンのうち内嗅野深層ニューロンのバースト発火と同期して活動するものは主に錘体細胞に検出された。扁桃体の単一ニューロンが示した誘発電位は次の4タイプに分類された。1)内嗅野のバースト発火にほぼ相似形なバースト発火でガンマ波を含むもの,2)刺激後50msの間のみ持続する200ヘルツ程度の発火頻度を示すバースト発火,3)1発の活動電位のみ発火するもの,4)活動電位の発火は見られず興奮性シナプス後電位のみが観察されるものであった。こららの誘発電位は全て近傍のフィールド電位と同期して観察された。このことは2つの細胞から同時細胞内記録を行った実験データを用いた相関解析によっても,扁桃体外側核内の2ニューロンの顕著な活動同期性が明らかとなった。また,活動電位の発火を伴わない誘発電位を示した扁桃体外側核ニューロンはGABA-A受容体のアンタゴニストであるピクロトキシンの潅流液内への投与によってもその応答様式には変化が見られず,内嗅野からのシナプス入力自体に依存していることが示唆された。さらに,これらの誘発電位がAMPA型およびNMDA型の両方のグルタミン酸受容体を介して誘発されることを薬理学的に証明した。海馬体のうち特に内嗅野および傍海馬支脚の深層で特異的に観察される鋭波(200Hz)およびガンマ波(40-100Hz)を含むバースト発火について,その発生機序について長期増強(LTP)との関連において解折を行った。同部における興奮性シナプス後電位(EPSP)の増強効果はテタヌス刺激だけでなく低頻度刺激(0.1-0.05Hz)によっても起こることが特徴的であり,誘発されるEPSPの主要な構成成分はNMDA型およびAMPA型グルタミン酸レセプターによるものであり,誘発されるバースト発火の閾値が発火回数の増加と共に次第に減少していき,20-40回の発火の後には極めて一定になることが明らかとなった。そこで,各型のグルタミン酸レセプターに特異的に作用するアイタゴニストを用いて,各成分に分離したEPSPに対するテタヌスおよび低頻度刺激の増強効果を観察したところ,AMPA型グルタミシ酸レセプターを介するEPSPにはいずれの刺激でも著名な増強効果が観察されたが,NMDA型グルタミン酸レセプターを介するEPSPはいずれの刺激でも増強されなかった。いずれの型のグルタミン酸レセプターも単独ではバースト発火を誘発しなかったが,ピクロトキシン(GABA_Aレセプターのアンタゴニスト)の投与により,AMPAおよびNMDA型を介する各々の誘発電位に活動電位の発射と2秒間以上続く脱分極が観察された。また,これらの応答は深層のみの限局されたニューロンネットワークを含む組織小片においても観察された。以上のことより,同部のバースト発火はAMPA型グルタミン酸レセプターを介してEPSPの増強がおこり,AMPAおよびNMDA型グルタミン酸レセプターの協調によるEPSPが回帰性の抑制性入力より優位になることで発生し,以後,バースト発火の回帰性の興奮性入力による増強効果により閾植が低くなることが示唆された。
高速シークエンサーを用いた高感度多遺伝子検索システムによる液性検体からの変異検索

肺がんの遺伝子変異検査に最初に導入されたのはEGFR遺伝子変異検査であり,そこで遺伝子変異検査の基本事項が確立された。しかし,状態の悪い患者などでは必ずしも検体採取が容易でない.そのため,血液や尿などの液性検体中に存在するがん細胞由来DNAを用いたliquid biopsy検査が実用化された.上記を解決する例として新たな検査システムMINtSを作成した.MINtSでは多数の検体が同時検索できる.各単一遺伝子の感度,特異度を0.999以上にあげ,全体として感度,特異度0.99以上を実現した.このようなシステムが,臨床検査として望ましいと考えている.15年前まで,進展した非小細胞肺がんの治療は殺細胞性抗がん剤しか存在しなかった.上皮成長因子受容体(Epidermal growth factor receptor: EGFR)阻害薬が利用可能になり,さらにEGFR遺伝子変異が発見され,非小細胞肺がんの治療は大きく変わった.その後,多数の分子標的薬,免疫チェックポイント阻害薬が導入され,毎年のように標準的治療法が変更されている.現在,肺がんは悪性腫瘍治療のフロンティアとなっており,肺がん自体の治療だけではなく,他のがん種にも応用可能な様々な知見が得られると期待されている.次世代シークエンサーが基礎医学で広く使われるようになり,多遺伝子変異検査への期待が高まっている.多遺伝子変異検査には特有の問題があり,それを考える必要がある.単一遺伝子を0.99の感度(偽陽性率0.01)で検索する遺伝子変異検査は優秀な検査だが,その感度で100個の遺伝子を検索した場合を考えてみる.全く変異の無い組織を検索しても,各遺伝子0.01の割合で積み重なる偽陽性のため,65%の患者で偽陽性が生じ,遺伝子変異があると判定される.すなわち65%の患者に誤った分子標的薬が投与される危険性がある.この問題はLusserの法則として知られるもので,月面着陸を目指したアポロ計画の時に重要視された.ロケットでは各部品が99%の確率で正確に働いても1つの部品が故障すると正確に飛ばない.全ての部品が働くためには,各部品が正確に働く確率として99.9999%が求められた.多遺伝子変異検査でも同様のことが言える.単一遺伝子の検出感度を非常に高くし,全体として正確な結果を出す必要がある.多遺伝子変異検査の要件を満たし,さらにliquid biopsyサンプルに適応することを目的として本研究を立案した.様々な多遺伝子変異検査が考案されているが,いずれも検索遺伝子が多すぎる問題がある.数十数百の遺伝子を検索しても,driver遺伝子以外の遺伝子では臨床的意義が確立されていないため無駄な情報として捨て去るしかない.海外では,病理医が遺伝子変異検査を提出する国が多い.生検→パラフィン包埋→切片提出という流れである.海外から輸入された遺伝子検査システムは組織検体を用いるものが多い.日本では気管支鏡検査が盛んで,気管支鏡,超音波プローブを用いて小組織,細胞診検体を採取し,それでがん診断を行うことが多い.日本の遺伝子検査システムは細胞診検体も検査可能なものが多い理由の一つは,使用手技の違いもあると推定される.現在,肺がんでは,変異EGFR遺伝子,ALK融合遺伝子,PD-1発現の検索が必須である.全てを組織検体で検索すると,採取組織をほぼ使い切ってしまうため,これ以上遺伝子が増えたら検索は不可能になると危惧されている.細胞診検体は有用な検体であり,EGFR遺伝子は細胞診検体で十分に検索できる.次世代シークエンサーによる多遺伝子変異検査も可能である.臨床の実態に合わせて様々な検体が使用可能になるよう,基盤整備を行うことが望ましい.上記を解決するために,MINtSを作成した.検索遺伝子数をdriver遺伝子に限ると次世代シークエンサーの余力ができ,多数の検体が同時検索できる.それを利用して200検体が同時検索できるようにした.各単一遺伝子の感度,特異度を0.999以上にあげ,全体として感度,特異度0.99以上を実現した.このようなシステムが,臨床検査として望ましいと考えている.実診療で,肺癌の初回診断,再発診断,または臨床病期決定を目的として採取した細胞診検体または組織診検体の一部,あるいは治療目的で外科的に切除された肺組織の一部,さらに血漿などの液体検体を用い,包括的遺伝子変異検査システム(MINtS)を用いて遺伝子変異検査を行った.MINtSでは,multiplex PCRおよびmultiplex RT-PCRにより標的遺伝子領域を増幅し,増幅されたDNA分子の塩基配列を高速シークエンサーMiSeq(米国:イルミナ社)で読み取る.読み取った結果(一分子由来のデータはreadと呼ばれる)をコンピュータで処理し,統計解析を行って異常遺伝子の有無を判定する.本研究は,実用化を目的として包括的遺伝子変異検査システム(Mutation Investigator using the Next-era Sequencer: MINtSと命名)を設計,独立行政法人医薬品医療機器総合機構(PMDA)の対面助言を受け,独立行政法人医薬基盤研究所の進捗管理を受けながら実用化に必要なデータを収集している.MINtSは,前臨床試験,および凍結保存検体を用いた遺伝子変異検出試験を終了した.次の開発ステップとして,実診療で採取される検体を用いた性能試験が必要である.本研究はその目的でも兼ねている.検査対象サンプル選択基準要約は以下のとおりである.