hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
同種骨髄移植後の急性および慢性GVHDにおける口唇生検の免疫組織化学的検討

皮膚、粘膜上皮および粘膜下組織は、同様にICAM-1,HLA-DR陽性となるが、小唾液腺の方が鋭敏であった。眼病変は口腔病変よりも出現率が低くまた眼瞼結膜生検は患者の苦痛も大きく染色性も劣るので、検査としては適さないと考えられた。対照群は、偏平苔癬以外では免疫組織化学的染色陰性であった。偏平苔癬の粘膜上皮、粘膜下組織では、慢性GVHDの染色結果に類似していた。同種骨髄移植後の慢性GVHDの早期診断における口唇生検の有用性を検討するために以下のことを行った。【目的】同種骨髄移植後に慢性GVHDと思われる口腔症状を呈した症例の口唇生検を行い、肉眼的口腔臨床所見と組織学的所見の比較を行う。さらに肉眼的口腔臨床所見をタイプ別分類して、肉眼的口腔臨床所見のみからも慢性GVHDの診断が可能かどうかも検討する。【対象】白血病、悪性リンパ腫、重症再生不良性貧血などのため、同胞または骨髄バンクから同種骨髄移植を受けた後、口腔症状を呈した例。【方法】口腔の肉眼的所見とその後の臨床経過を検索し、口唇生検材料のH-E染色と免疫組織化学的染色による検討を行った。【結果】慢性GVHDの比較的早期に、口腔症状として口腔乾燥症と共にいわゆる口腔扁平苔癬とは肉眼的にも識別できる病変が出現した。それは、肉眼的には1.粘膜壊死・潰瘍形成型、2.粘膜萎縮型、3.口腔扁平苔癬様型、4.粘膜粗造化・白色化型、5.粘膜壊死・瘢痕化型などの口内炎を呈する所見であった。口唇生検材料の組織所見では上皮下、小唾液腺への円形細胞浸潤、上皮基底細胞および唾液腺細胞の破壊が見られた。粘膜萎縮型、粘膜粗造化白色化型では浸潤細胞が少ない傾向にあった。浸潤細胞は、CD8よりもCD4陽性細胞が多い傾向にあった。また、一部の例でNK細胞の関与を調べる目的でCD56、CD57についても検索したところ、ほとんど染色されなかった。同種骨髄移植後の急性および慢性GVHDの早期診断における口唇生検の有用性を検討するために以下のことを行った。【目的】同種骨髄移植後に急性および慢性GVHDと思われる口腔症状を呈した症例の口唇生検を行い、組織学的所見を検討して肉眼的口腔臨床所見との比較を行う。【対象】白血病、骨髄異型性症候群、重症再生不良性貧血などのため、同胞または骨髄バンクから同種骨髄移植を受けた後、口腔症状を呈した例。【方法】口腔の肉眼的所見とその後の臨床経過、および口唇生検材料のH-E染色と免疫組織化学的染色による検討を行った。【結果】慢性GVHDの比較的早期に、口腔には口腔乾燥症と共にいわゆる口腔扁平苔癬とは肉眼的にも識別できる病変が出現した。口唇生検材料の組織所見では上皮下、小唾液腺へのCD4、CD8細胞浸潤、上皮および上皮下のHLA-DR、ICAM-1陽性所見、上皮基底細胞および唾液腺細胞の破壊が見られた。臓器別に慢性GVHD症状の発現する頻度を検討した結果、皮膚・眼・肝臓よりも口腔が発現頻度が高く早期に症状が出現し、他臓器を観察するよりも口腔を観察する方が有利であると考えられた。例数を重ねると、口唇生検の組織所見に対応する口腔の肉眼的所見が推測できるようになり、口腔の肉眼的所見から診断ができる例もあることがわかり、これを「慢性GVHD口内炎」と呼んで6つの型別((1)白色化・粘膜粗造化、(2)扁平苔癬様糜爛、(3)血管拡張様糜爛、(4)潰瘍形成・粘膜壊死、(5)粘膜壊死・瘢痕化、(5)粘膜萎縮)に分類し肉眼的識別の判断基準を作ろうと試みた。
冒険遊び場づくりの実態と地域コミュニティ施設としての可能性

都市の屋外空間における冒険遊び場等の外遊びの場所づくり活動について、文献等調査によって網羅的把握を行うとともに、活動場所および活動主体のタイプの異なる冒険遊び場の事例、小学校施設を活用した子どもの居場所づくりの事例、冒険遊び場で実施された小屋づくりワークショップの事例、等の具体的事例について事例調査、実態把握を行った。これら調査を通じて、冒険遊び場のような外遊びの場を地域社会のコミュニティの場として形成する際の課題、またそのような場所づくりを行う際に、そして存続させる際に必要となる計画学的知見について考察した。子どもの遊び環境を作り出していく冒険遊び場づくり活動のなかに、都市、地域、屋外公共空間の計画学に反映できる視点を見いだすと同時に、冒険遊び場のような外遊びの場を、新たな地域社会のコミュニティの場、施設として形成して行くことの可能性を検証するものである。具体的には、国内の冒険遊び場づくりの活動等を対象とし、調査、実態把握に基づき、そのような場を地域社会のコミュニティの場として形成するための条件、またそのような場所づくりを行う際に、そして存続させる際に、必要となる計画学的知見を得ることを目指している。今年度は以下を行った。1)網羅的調査:日本国内における冒険遊び場およびこれに類する活動や取り組み、特に都市の屋外空間における外遊び場および外学びの場について、既往研究の悉皆的整理、文献等情報の調査を通じて、網羅的に把握し整理を行った。またこれをもとに「地理的状況」/「空間的状況」/「社会的状況」の側面から、これらの場所を成立させている与件について、考察整理を試みた。2)事例調査:上記と並行して、より具体的実証的に、実施されている1プレーパークを対象として、実態把握を行い、多様な世代が関わるコミュニティの場として機能していること、地域コミュニティ施設としての可能性について考察した。翌年度以降の遊び場づくりのより詳細な実態把握および調査計画を策定するための先行調査とした。具体的には、利用者属性、意識、空間・行動観察、行動圏についての把握、場所づくりWSの実施と検証を試みた。今年度は昨年度に引き続き以下の1)2)をすすめ、加えて3)を行った。1)網羅的調査:日本国内における冒険遊び場およびこれに類する活動や取り組み、特に都市の屋外空間における外遊び場および外学びの場について、既往研究の悉皆的整理、文献等情報の調査をすすめ、昨年度に加え今年度に新たに得られた情報を含め整理を行った。またこれをもとに「地理的状況」/「空間的状況」/「社会的状況」の側面から、これらの場所を成立させている与件についての考察整理を継続した。2)事例調査:昨年に引き続き、より具体的実証的に、冒険遊び場の1事例を対象として、実態の把握、場所づくりWSの検証をすすめ、多様な世代が関わるコミュニティの場として機能していること、地域コミュニティ施設としての可能性について考察をすすめた。3)他事例の調査:上記と異なる事例として、小学校施設を活用した事例を対象とし、それらの運営、管理の状況について、人的、組織的状況や、運営、管理の方法について把握した。さらに運営者の一部に、ヒアリングおよびアンケートを行い事業に対する意識や課題について把握を試みた。一事例の調査、検証整理を優先しておこなっていることから、当初から予定していた網羅的調査における現地での調査確認が遅れている。事例調査において、詳細調査のための調査試行中である。具体的には、国内の冒険遊び場づくりの活動等を対象とし、調査、実態把握に基づき、そのような場を地域社会のコミュニティの場として形成するための条件、またそのような場所づくりを行う際、また存続させる際に、必要となる計画学的知見を得ることを目指している。1)網羅的調査:日本国内における冒険遊び場およびこれに類する活動や取り組み、都市の屋外空間における外遊びの場および外学びの場について、既往研究の悉皆的整理、文献等情報の調査をすすめ、今年度に新たに得られた情報を含めて整理を行った。また「地理的状況」/「空間的状況」/「社会的状況」の側面から、これらの場所を成立させている与件についての考察整理を継続した。2)事例調査:一昨年、昨年に継続して、より具体的実証的に、冒険遊び場の1事例を対象として、その実態把握をすすめた。また、多様な世代が関わるコミュニティの場として機能していること、地域コミュニティ施設としての可能性について考察をすすめた。3)他事例の調査:上記と異なる事例として、昨年度の小学校施設を活用した事例の調査に続き、今年度は活動場所および運営者のタイプの異なる3つの冒険遊び場の事例を対象として、観察調査およびヒアリング調査を行い、各事例の活動状況、運営管理の状況、人的状況等について把握した。

また、活動場所、運営資金、人材の観点から、比較考察を行い、冒険遊び場づくり活動の運営課題について把握を試みた。これまでの研究実施経緯において、当初予定していた国内各地の網羅的調査より、一事例の調査、検証整理を優先して行った方が効果的であると判断し、一事例の調査、検証整理を優先してすすめてきたことから、網羅的調査にかかる調査確認が遅れている。本研究は、子どもの遊び環境を作り出していく冒険遊び場づくりの活動等のなかに、都市、地域、屋外公共空間の計画学に反映できる視点を見いだすと同時に、冒険遊び場のような外遊びの場を、新たな地域社会のコミュニティの場、施設として形成して行くことの可能性を検証・考察するものである。具体的には、国内の冒険遊び場づくりの活動等を対象として、研究期間を通じて以下の1)2)3)の調査、実態把握を行い、これらを通じて、冒険遊び場のような外遊びの場を地域社会のコミュニティの場として形成するための条件、またそのような場所づくりを行う際に、そして存続させる際に、必要となる計画学的知見について考察した。1)冒険遊び場およびこれに類する活動や取り組み、特に都市の屋外空間における外遊び場および外学びの場について、既往研究の整理、文献等情報の調査、現地調査等を行い実施活動事例の網羅的把握を試みた。2)より具体的実証的に、冒険遊び場の1事例を対象として、研究期間を通した継続的調査による実態把握、場所づくりWS等の検証から、参加者属性や意識、空間・行動等の特徴を把握した。対象事例が多様な世代が関わるコミュニティの場として機能していること、またその地域コミュニティ施設としての可能性について考察を行った。3)学校施設を活用した事例、活動場所および運営者のタイプの異なる冒険遊び場の事例、公共空間での子どもの遊び発生事例等を対象とした実態調査を行い、場所や活動、運営管理の状況等を把握し、場所づくりにおけるこれらの課題について考察した。都市の屋外空間における冒険遊び場等の外遊びの場所づくり活動について、文献等調査によって網羅的把握を行うとともに、活動場所および活動主体のタイプの異なる冒険遊び場の事例、小学校施設を活用した子どもの居場所づくりの事例、冒険遊び場で実施された小屋づくりワークショップの事例、等の具体的事例について事例調査、実態把握を行った。これら調査を通じて、冒険遊び場のような外遊びの場を地域社会のコミュニティの場として形成する際の課題、またそのような場所づくりを行う際に、そして存続させる際に必要となる計画学的知見について考察した。網羅的調査において、国内各地の事例を文献等情報の調査を通じて把握したが、現地に赴いての調査確認を欠いている。事例調査において、調査試行中である。1)継続調査:前年度の調査を継続して行う。網羅的調査については、現地確認をすすめて考察整理の精度をあげる。事例調査については、これまでの調査結果の分析をすすめ、詳細調査を検討する。2)他事例の調査:網羅的調査と具体的事例調査により得られた知見をもとに、異なる調査対象事例を選定する。先行の調査結果にもとづき、調査計画をたてる。
熱成層高サイクル熱疲労条件の推定を例としたクロスフィジックス逆問題解析手法の構築

本研究の目的は、熱成層等による配管内の高サイクル熱疲労条件を、配管の外側で観測した温度分布あるいはひずみ分布から推定する逆問題解析手法を構築することにある。本年度の研究成果は以下の通りである。1.配管内部のスラグ流に伴う配管内面の周期的温度変動を外面温度観測から推定する問題に対する逆解析手法を構築し、観測誤差の影響を明らかにした。まず、内面温度変動に対する外面温度変動の温度減衰率と時間遅れを、温度変化の周波数とスラグ流の流速の関数により表した。この結果を用いて、周波数分解された外面温度履歴に、減衰率の逆数を乗じ、時間遅れを逆に早めることにより、配管内面の温度分布を求めた。また、外面の複数点における温度観測結果をもとに、スラグ流の流速を推定した。温度変化に複数の周波数成分が含まれる場合においても、良好な推定ができることが明らかとなった。外面で計測する温度履歴に含まれる観測誤差が推定結果に及ぼす影響を調べた。数理解析結果と有限要素解析結果に表れる温度減衰率の相違を考慮することにより、外面温度履歴より内面温度履歴およびスラグ流の速度を精度よく推定することができた。2.配管の減肉の状況を把握するため、外面温度変動履歴から配管減肉量を推定した。外面の計測精度が推定結果に及ぼす影響を明らかにした。3.配管にき裂が存在する場合、起動時および停止時には、高温流体あるいは低温流体の流入により、過渡的に高い応力拡大係数がき裂先端に発生する。内面温度履歴をべき関数で与えた時の応力拡大係数の解析結果を重ね合わせることにより、この応力拡大係数の過渡値を最小にするような、起動時あるいは停止時の流体温度履歴の与え方を求めた。提案した逆解析手法により、応力拡大係数の過渡的最大値が低減できることがわかった。本研究の目的は、熱成層等の高サイクル熱疲労条件を配管の外側で観測した温度分布あるいはひずみ分布から推定する逆問題解析手法を構築することにある。1.薄肉配管の熱伝導の現象が周波数により異なることに着目し、振幅の減衰率および時間遅れに関する数理解析を実施し、これらを周波数の関数として表した。配管外面温度履歴を周波数分解したものに、減衰率の逆数を乗じ、時間遅れを逆に早めることにより、配管内面の温度分布を推定する手法を提案した。この手法による推定結果を有限要素解析結果と比較した結果、この手法が原理的に有効であることが明らかになった。さらに推定精度を向上させるため、減衰率算定の修正方法を提案した。2.配管内部のスラグ流に伴う配管内面の周期的温度変動を外面温度観測から推定するため、数理解析を実施した。その結果、温度減衰率と時間遅れを、周波数とスラグ流の流速の関数により表すことができた。この結果を用いて、周波数分解された外面温度履歴に、減衰率の逆数を乗じ、時間遅れを逆に早めることにより、配管内面の温度分布を推定する手法を提案した。数値解析により、手法が有効であることが明らかとなった。また、配管外面の温度変動からスラグ流の流速を推定する方法を提案するとともにその有効性を有限要素解析により明らかにした。さらに、配管の減肉の状況把握のため、外面温度変動履歴から配管減肉量を推定する方法を提案し、その手法の有効性を数値解析により確認した。3.推定された配管内面の温度履歴を用いて、配管内の熱応力を推定し、寿命を評価する方法を提案した。
ホウ素化合物を利用した環境に負荷の低い木材保存システムの開発

ホウ素系の化合物は毒性が低く、環境にやさしい薬剤として世界的に期待されているが、木材に注入した後、雨水などによって溶出することが問題であった。われわれは、PVAなどのバイオアクティブ・ポリマーならびにNHAなどの固定化溶液を使用し、木材中にホウ素系化合物を固定する手法を開発するとともに、溶出性の評価および腐朽菌やシロアリに対する効力を評価してきた。この結果、アミン化合物のNHAがホウ素化合物と結合し、ホウ素の固定と腐朽菌やシロアリに対する効力を飛躍的に増大させることを発見した。さらに、allyl glycidyl etherとmethyl methacrylateを同時に重合させることによって、ホウ素化合物の溶脱性を抑止するとともに、寸法安定性を向上させるなど、いわゆる化学修飾木材としての機能を付与することに成功した。この成果は、国際学術雑誌に発表した。今後、これを実用化技術に展開するためには、処理法や評価法について効率性の視点から研究を行い、システムとして確立する必要がある。さらにこれらの研究の過程で、代表的な木材汚染菌であるAspergillus nigerが木材防腐剤であるCCA(銅・クロム・ヒ素)薬剤を分解することを見いだした。毒性の高いCCA薬剤は、現在ではほとんど使用されていないが、過去に生産された処理木材が今後解体材として多量に排出されることが予測され、今後安全に廃棄する方法が強く求められているものである。われわれの見つけたCCAの無毒化法は、菌の代謝によって生成する有機酸、特にシュウ酸を利用し、金属塩を可溶性の錯体に変換し取り除くことにある。さらにEDTAなどの錯体形成剤との併用により抽出能力を飛躍的に高め得ることを明らかにした。今後より高い抽出能力をもつ菌類の探索とそのメカニズムの解明、さらに有害金属の抽出システムの確立が不可欠である。この成果は、平成14年9月のインドネシアでの国際会議や平成15年3月に九州大学で開催された日本木材学会年次大会で発表してきた。今後、これを実用化技術に展開するためには、処理法や評価法について研究を行いシステムとして確立する必要がある。さらにこれらの研究の過程で、代表的な木材汚染菌であるAspergillus nigerが木材防腐剤であるCCA薬剤を分解することを見いだした。さらにEDTAなどの錯体形成剤との併用により抽出能力を飛躍的に高め得る可能性も得た。
術後の急性心筋梗塞予防のための周術期心筋マーカーモニタリング用センサの創製

本研究の目的は、手術後の主な死亡原因の一つである急性心筋梗塞を予防するために、光バイオセンサを利用した周術期血中心筋マーカーモニタリングシステムの要素技術を構築することであった。血中の心筋マーカー濃度を連続計測できれば急性心筋梗塞の予測・早期発見にむすびつくと考え、研究を進めてきた。28年度には繰り返し免疫測定が可能な光バイオセンサの構築を行うとともに、モデル実験によるセンサシステムの評価・改良を行った。29年度には、引き続きマウス、抗マウス抗体によるモデル実験を行い、装置の最適化や、システムの修正などを行うとともに、本センサによる繰り返し測定の可能性を検証した。本研究の目的は、手術後の主な死亡原因の一つである急性心筋梗塞(acute myocardial infarction, AMI)を予防するために、表面プラズモン共鳴(surface plasmon resonance, SPR)バイオセンサを利用した周術期血中心筋マーカーモニタリングシステムの要素技術を構築することである。血中の心筋マーカー濃度を連続計測できればAMIの予測・早期発見が可能となり、予防や効果的な治療へ大きく貢献する新規の診断技術にむすびつくと考え、研究を進めてきた。28年度は(1)繰り返し免疫測定が可能なSPRバイオセンサの構築と、(2) mouse IgG、anti-mouse IgGを用いた、モデルサンドイッチアッセイによるセンサシステムの評価・改良を行った。SPRの励起には波長633 nmのレーザーを使用し、プリズムによる全反射測定法を用いた。センサチップの金基板はガラス基板上にチタンと金薄膜をスパッタ法にて製膜し、作製した。また、連続計測のためにpolydimethylsiloxane(PDMS)にてフローセルを作製し、センサチップ上にプラズマ接合により装着した。SPRセンサの光学特性評価として、屈折率の異なる溶液を負荷したところ、屈折率に応じたセンサ出力が確認され、既製品と同等の屈折率分解能が得られた。また構築したSPRセンサにてモデル免疫測定を行ったところ、出力が観察され本センサの可能性が示された。以上のように、当該年度に予定していた(1)の研究目的を達成し、(2)は現在も進行中である。申請課題の目的は、手術後の主な死亡原因の一つである急性心筋梗塞(AMI)を予防するために、表面プラズモン共鳴(SPR)バイオセンサを利用した周術期血中心筋マーカーモニタリングシステムの要素技術を構築することである。特に28年度では(1)繰り返し免疫測定が可能なSPRバイオセンサの構築と、(2) mouse IgG、anti-mouse IgGを用いた、モデルサンドイッチアッセイによるセンサシステムの評価・改良であった。これに対し申請者は、光学系の構築や連続的な免疫測定のためのフローセルの作製などを行い、システムの光学基礎特性を評価した。さらにモデルサンプルを用いた免疫測定実験にも取り掛かり、28年度の目標を概ね達成した。29年度は、28年度に構築したSPRバイオセンサを用いて、(2) mouse IgG、anti-mouse IgGによる、モデルサンドイッチアッセイによるセンサシステムの評価・改良を行った。はじめにセンサチップの作製にて、ガラス基板にスパッタした金薄膜上に膜タンパクであるORLA85の自己組織化単分子膜を形成することで、抗体の安定的な固定化と繰り返し再生が可能なセンサ感応部を構築した。そこへmouse IgGを結合・固定化させてみたところ、使用するbufferのpHや、クロスリンクの回数に依存して、固定化効率が変化することが分かった。調べたところ、pH 6.0の緩衝液中で結合させ、3回クロスリンクを行うことで、1度結合した抗体の内、約96.3%が固定化されることが示された。次に、定量特性を調べたところ0.4-210 nMの濃度範囲でanti-mouse IgGの定量が可能であった。最後にanti-mouse IgGを10回繰り返し測定したところ、出力の変動係数は7.5%と非常に再現性良く連続で測定することが可能であった。28年度で得られた結果を基に、まずは(2)のモデルサンドイッチアッセイによる改良を引き続き行う。特に抗体の結合や連続測定の点に関しては、各条件(pHや濃度など)を最適化する必要がある。またフローセルに関しても、フロー部の高さや流速などの条件を比較し、より迅速かつ高感度な測定を実現する。その後は(3)緩衝液中および血清中心筋トロポニン(cTn)の連続測定によるセンサの評価・最適化を行い、(4)光学系・流路・表面修飾・測定法の改善による更なる感度・再現性・検出時間の向上を図っていく。

その後将来的には、本研究で確立した4つの要素技術を基礎とし、血液中に含まれるcTnなどの心筋マーカーを連続測定することができる周術期血中心筋マーカーモニタリングシステムの構築、またその小型化へと移行し、心筋マーカー濃度の連続的な時間変化情報に基づくに新たな医療診断技術へと応用・展開していきたいと考えている。バイオセンサ本研究内容による学会参加などの旅費が発生しなかっため。主に試薬やガラスなどの消耗品、学会参加などのための旅費へ支出する。
小腸粘膜固有層のTLR5陽性病原体運搬細胞による腸内病原細菌の体内伝播とその阻止

腸管では定常状態においても感染時においても、樹状細胞が粘膜組織で貧食した抗原の情報を所属リンパ節に移動してリンパ球に伝達する事が知られている。以前われわれは細菌鞭毛成分フラジェリンを認識するTLR5の遺伝子欠損マウスを解析し、経口投与したマウスチフス菌が小腸粘膜固有層のCD11c発現TLR5陽性細胞を病原体運搬細胞として利用し、腸間膜リンパ節や脾臓および肝臓へ伝播することを見いだした。今回われわれは以下の小腸粘膜固有層樹状細胞の新しい機能を明らかにした。1.フラジェリンの刺激によってB細胞をIgA産生形質細胞に分化させた。この分化には、腸管関連リンパ組織(バイエル板と孤立リンパ小節)は関与しなかった。2.T細胞に働きかけ、フラジェリンの刺激に反応して抗原特異的なT_H-17細胞とT_H1細胞を誘導した。3.レチノイン酸を産生し、濃度依存的にIgA産生細胞やT_H-17細胞を誘導した。4食物抗原を取り込んで腸間膜リンパ節に移動しFoxp3 Tregを誘導した。このように小腸粘膜固有層樹状細胞の動きや機能は複雑であるが、小腸粘膜での様々な抗原取り込みに関与する分子機構などの今後の研究が注目されている。様々な病原性微生物が粘膜を通じて体内に侵入してくる。病原細菌の体内伝播を阻止できれば、重篤な全身感染を未然に防ぐことができる。今回われわれは小腸粘膜固有層にCD11cの発現が異なる4種のユニークな細胞群の中でCDllc^<hi>CDllb^<hi>CD1O3^+DCが選択的にTLR5を発現することを明らかにした。次に、このCD11c^<hi>CD11b^<hi>CD103^+DCにおけるケモカイン受容体の発現について解析した。RT-PCR解析の結果、小腸粘膜固有層CD11c^<hi>CD11b^<hi>CD103^+DCはCCR1とCCR7を発現し、なかでもCCR7の発現が最も高かった。そのリガンドであるCCL21に対する遊走応答を確認した。CCR7遺伝子欠損マウスがチフス菌感染に対して強い抵抗性を獲得するかを試している。
ヒト関節軟骨細胞におけるIL1B遺伝子発現に関わるDNAメチル化機構の解明

変形性関節症(OA)と非OAのヒト大腿骨頭から関節軟骨を採取し、その軟骨細胞から発現している遺伝子を、網羅的(24,460遺伝子)に解析・比較した。以前申請者が欧米人検体で得たデータと異なり、日本人ではOAにおいてIL1Bの発現の亢進はなかった。また日本人で以前報告されたOA関連3遺伝子に加え、新たにに未報告の19遺伝子が、日本人のOA関連遺伝子である可能性が示された。さらにOA軟骨細胞での遺伝子発現パターンは、日本人と欧米人で異なる可能性が示唆された。OA発症に関わるMMP13のDNAメチル化を介した発現調節に関係する転写因子として、FOS、LEF1、CREB3L4が候補に挙がった。本研究の目的は、変形性関節症で軟骨基質破壊を惹起するインターロイキン-1B(IL1B)の発現が、ヒト関節軟骨細胞内でプロモーター領域のDNAメチル化機構を介して調節されるにあたり、i)どの転写因子の作用がDNAメチル化状態の影響を受けるか、ii)何がDNAメチル化状態を変化させるかを、DNAメチル化解析や結合タンパク分析などの手法により明らかにすることである。平成26年度には、『研究課題1. IL1Bプロモーター上で、CpG脱メチル化を介した発現調節に作用する、主たる転写因子の同定』を目標とした実験を行ってきた。具体的には、変形性関節症および健常(大腿骨頚部骨折由来)の軟骨組織を液体窒素で凍結破砕し、RNAを抽出する。抽出したRNAを、各種転写因子、細胞内伝達物質を含めた網羅的遺伝子発現解析(マイクロアレイ)に用いる。マイクロアレイ解析に用いるRNAは高純度、高濃度であることが求められる。軟骨組織、こと健常軟骨は大量な細胞外基質に比して細胞成分が非常に乏しいため、純度の高いRNAを抽出することに、技術的な困難さがある。現在限られた個数のヒト大腿骨頭軟骨から、如何に高品質のRNAを抽出するかという点で試行を繰り返しており、近日中に方法を確立できる目処が立ちつつある。一度安定的な抽出方法が確立されれば、サンプル数を蓄積し、マイクロアレイ解析に移る予定である。マイクロアレイ解析によりIL1Bの発現に関与する転写因子や細胞内伝達物質のネットワークが解明されれば、その細胞内伝達経路をターゲットとした解析を進める予定である。変形性関節症(OA)と非OAの大腿骨頭から関節軟骨を採取し、その軟骨細胞から純度の高いRNAを抽出した。OA 9症例と非OA6症例由来のRNAを、遺伝子発現解析チップ3D-Gene(東レ)を用いて網羅的に遺伝子発現解析を行い、2群間の比較解析を行った。解析した全24,460遺伝子中、非OA群と比較してOA群で917遺伝子で発現亢進が、773遺伝子で発現低下がみられた。以前申請者が英国で欧米人検体から得たデータと異なり、日本人ではOAでのIL1Bの発現亢進はなかった。さらにOA検体と非OA検体のクラスター解析を、総当り式に計54通り(9x6検体)の組み合わせで行った。その結果、54通り全てにおいてOAで発現が亢進していたものは116遺伝子、低下したものが36遺伝子あった。また日本人で以前報告されたOA関連3遺伝子を含む48遺伝子から成るクラスターを解析すると、うち19遺伝子は未報告のOA関連遺伝子であることが示唆された。過去にOA関連遺伝子と報告されたものは、日本人で3遺伝子、欧米人で50遺伝子ある。本研究では、日本人の上記3遺伝子全てで2群間での発現量に有意差がみられた。一方欧米人のOA関連50遺伝子のうち、2群間で発現に有意差があったものはわずか16遺伝子であった。OA軟骨細胞での遺伝子発現パターンは、日本人と欧米人で異なる可能性が示唆された。日本人と欧米人でのOA軟骨細胞における形質の違いを比較した報告は過去になく、重要な知見である。一方本研究で使用した日本人OA検体では、欧米人同様にMMP13の発現が亢進していた。その発現調節に関わり、かつプロモーター領域のDNAメチル化によりその機能が変化する可能性がある転写因子を網羅的に解析した。その結果、OAで発現が亢進する転写因子としてFOSとLEF1が、低下する転写因子としてCREB3L4が同定された。今後、その機能解析を進める必要がある。研究協力先からの大腿骨頭サンプルの回収数が申請当時の想定より少ない。このためRNA抽出の試行回数が十分確保できているとはいえず、時間を要していることが原因と考えられる。関節軟骨の分子生物学上記のごとく、質の高いRNAをヒト軟骨組織から抽出する技術の確立を急ぐ。

また大腿骨頭サンプルをより多く確保するため、場合によっては、研究協力施設を広げることも検討する。マイクロアレイ解析によりIL1Bの発現に関与する転写因子や細胞内伝達物質のネットワークが解明されれば、その細胞内伝達経路をターゲットとした解析を進める予定である。すなわち、本研究計画書の『実験2.レポーターアッセイによる候補転写因子の作用解析』以下の実験を、すみやかに開始、遂行する。ターゲットとなる転写因子に目処が付いた段階で、レポーターアッセイに必要な発現ベクターの作成に取り掛かり、研究計画推進の効率化に努める。当初の計画より実験の進捗にやや遅れが生じており、実験に使用する試薬等の購入費が少なかったため、繰越金が発生した。引き続き実験を遂行するための試薬等の費用にあてられる予定である。
糖分子鎖集合体の微細構造制御に基づく物質分離機能の発現に関する研究

カルボキシ基やスルホン酸基などの解離基を固定キャリヤーに持つ陽イオン交換膜が,無機および有機の陽イオンをそれらの濃度勾配に逆らって上り坂輸送により分離,濃縮し,またアミノ基を固定キャリヤーに持つ糖鎖分子集合体であるキトサン膜がハロゲン化物イオンを上り坂輸送することから,平成9年度は糖鎖分子集合体膜としてキトサン膜と四級化キトサン膜を用いて,生体模擬成分であるアミノ酸,有機酸,核酸塩基などの濃度勾配に逆らった上り坂輸送について検討し,アミノ酸/有機酸混合系,核酸塩基類の混合系における交差上り坂輸送による分離,濃縮について報告した。これらの上り坂輸送は,膜を介した左右両液のpH変化に著しく依存することが明らかになった。平成10年度はこの点をさらに明確にするため,四級化キトサン膜による核酸塩基類の上り坂輸送の機構について詳細に検討し,輸送の方向の違いを四級化キトサン膜と核酸塩基類との荷電状態変化との関係を明らかにした。本年度は,静電化学的相互作用を利用する上り坂輸送ではなく,中性分子と膜との特定の認識能を利用する上り坂輸送について検討した。すなわち,レクチンの一種であるコンカナバリんA(Con.A)とグルコースなどとの特定の認識能を用いる上り坂輸送を検討した。具体的にはビニル化Con.Aとヒドロキシエチルメタクリレートとの共重合体(Con.A-PHEMA)膜を調整し,膜と隔てた両側に等濃度のグルコースを入れ,一方側を塩基性,他方を酸性としたとき,グルコースの濃度勾配に逆らって塩基性側から酸性側へ上り坂輸送されることが明らかとなった。このグルコースの上り坂輸送は,Con.Aとグルコースとの錯体形成に依存していることが明らかとなってきた。
反転対称性の破れた磁性体における非相反マグノンの研究

磁性体の秩序状態からの素励起であるマグノンはスピン流の担い手として近年大きな注目を集めている。反転対称性が破れた磁性体においてはマグノン伝播に非相反性(順方向伝播と逆方向伝播の不等価性)が予想される。この効果はマグノンスピン流の整流を可能にするなど興味深いが、バルク磁性体中のマグノンに対する実験的な検証は極めて少ない。我々は中性子非弾性散乱を駆使し反転対称性の破れた種々の強磁性体・反強磁性体における非相反マグノンを検証する。さらに外場による非相反マグノン制御の可能性を探索する。これらにより非相反マグノンとその外場制御の学理構築を目指す。
:脂質合成からみた酵母小胞体の機能分化と小胞体形成機構の解明

本研究は小胞体の分化の実体を把握し、それがどのような分子機構によって生ずるのかを、細胞化学・分子遺伝学的手段を用いて解明することを目指した。そのため、本研究計画では酵母を材料として、小胞体に存在するリン脂質の合成系を構成するいくつかの酵素の小胞体中における分布と、それらが小胞体に組み込まれ、維持される機構の解明を図った。(1)これまで、ミクロソームを遠心分離によって沈殿物として回収して、その後に緩衝液に再懸濁して分画する方法は良好な結果を与えなかったので、小胞体を沈殿物とせずに行う密度勾配遠心法を検討した。(2)分離・分画した各区小胞体成分の免疫学化学的分析。使用する抗血清としては、phosphatidylserine(PSS)、phosphoethanolamine cytidylyltransferae(ECT)などに対するものを調製し、精製した。(3)特に、PSSについて変異を導入し、酵素中の細胞内局在性決定領域がアミノ末端の114アミノ酸の親水性領域とそれに続く15アミノ酸の疎水性領域にあり、どちらも小胞体に局在するのに必要であることを示唆する結果を得た。また、ECTについては、大腸菌で生産させたとき、膜画分に一部回収されたことから、恐らく酵母でも小胞体に結合しているのではないかと示唆された。リン脂質phosphatidylethanolamineの含量が大幅に低下したect pss二重遺伝子変異株では、小胞体構造の変化を含む大幅な膜構造の変化が観測された。本研究は小胞体の分化の実体を把握し、それがどのような分子機構によって生ずるのかを、細胞化学・分子遺伝学的手段を用いて解明することを目指す。そのため、本研究計画では酵母を材料として、小胞体に存在するリン脂質の合成系とステロールの合成系に注目し、それら合成系を構成するいくつかの酵素の小胞体中における分布と、それらが小胞体に組み込まれ、維持される機構の解明を図る。本年度における結果は以下のとおりである。(1)小胞体分画方法の検討と分画した各小胞体成分の脂質合成活性の検討。これまで、ミクロソームを遠心分離によって沈殿物として回収して、その後に緩衝液に再懸濁して分画する方法は良好な結果を与えなかったので、小胞体を沈殿物とせずに行う庶糖密度勾配遠心法を検討し、分布する酵素の種類を調べた。(2)分離・分画した各区小胞体成分の免疫化学的分析。免疫化学的手法により、酵母各小胞体脂質合成酵素タンパク質の分布を調べる。使用する抗血清としては、phosphatidylserine synthase、phosphoethanolamine cytidylytransferaeなどに対するものは調製済み出あるが、それらをさらに精製した。(3)特に申請者らが詳しく構造の分析を行っている、phosphatidylserine synthaseとphosphoethanol-amine cytidylytransferaseについて変異を導入し、酵素中の細胞内局在性決定領域の検出中である。(1)小胞体分画方法の検討と分画した各小胞体成分の脂質合成活性の検討(2)分離・分画した各区小胞体成分の免疫化学的分析これらのうち、(1)に関連して、チトクロームP450は小胞体酵素で、チトクロームP450レダクターゼとともに特殊化された小胞体を形成すると考えられるが、n-アルカンの酸化初発反応を行うチトクロームP450(酵母Candida maltosaに由来)の遺伝子ALK1をGAL1遺伝子プロモーターの下流に結合し、S.cerevisiaeに導入し、ガラクトース含有培地で培養したときに発達する、チトクロームP450に富む小胞体構造に関連する脂質合成酵素活性の変化を検討した。

結果として、PSS、phosphatidylinositol synthase、あるいはまた、phosphatidylcholineを合成するCDP-choline経路の酵素などには変化が無く、チトクロームP450の分布する小胞体の発達と小胞体のリン脂質合成酵素活性には直接の相関は見いだされなかった。(2)に関しては抗体の調製が不調で、特筆すべき進歩がなかった。(3)についてはPSSの親水性アミノ末端領域を欠失させた誘導体タンパク質がin vitroでは野生型のものと同等の活性があるにもかかわらず、in vivoで生産させると、本来の小胞体よりも速く沈降する画分に分布し、欠失させた領域がPSSの細胞内分布に必須であることが明らかとなった。このとき、宿主の生育が遅くなったが、リン脂質組成は正常のものと変わらず、細胞内における分布の異常が生育の阻害を結果すると言う興味深い結果を得た。
ジメチルジヒドロピレン架橋一次元遷移金属錯体中の電子移動の可逆的スイッチング

本研究では、分子内電子移動、分子-電極間電子移動の能動的制御を目指した新規なレドックス多核遷移金属錯体群の創製を目指した。まず、架橋部位としてフォトクロミック分子、ジメチルジヒドロピレン(DHP)を組み込んだ遷移金属錯体系を新規に創製した。2個のフェロセン(Fc)をレドックス核として用いた、可逆な光異性化能(繰り返し能も高い)を有するビス(フェロセニル)ベンゾジメチルジヒドロピレンの合成に初めて成功し、ベンゾジメチルジヒドロピレン(BzDHP)部位の可逆な光異性化によるFc間電子的相互作用の可逆的スイッチング(Fc間の酸化還元電位差:閉環体にて63mV、開環体にて16mV)を達成した。さらにFc部位の酸化のみによるBzDHP部位の開環体から閉環体への熱的異性化を新規に発見した。これは光異性化により金属核間電子的相互作用を制御し、さらに電子移動後の構造変化まで解析に成功した初めての系である。また、分子内電子移動の能動的制御を錯体と電極間の多電子移動制御へと拡張を検討し、架橋部位としてカルボニル金属錯体(カルボニル基の架橋モードの多様性の利用)を用いた。モリブデンカルボニル基を架橋部位として持ち、レドックス核として2個のロダジチオレン錯体を用いた異種金属三核錯体を新規に合成し、特異な1段階2電子還元反応(溶媒-支持電解質に依存しない)を初めて発見した。この現象と連動する構造変化(カルボニル基架橋モード変化)、基底スピン状態変化(ニュートラル体:セミブリッジングカルボニル基、基底1重項、2電子還元体:ブリッジングカルボニル基、基底3重項)を実験的、理論的に解明することに成功した。さらに、レドックス核としてコバルタジチオレン錯体を用いた、類似の構造を有する異種金属三核錯体では、カルボエル基の架橋モード変化に伴う還元様式を溶媒-支持電解質により自在に変化できることを見出した。光異性化に伴い一電子酸化還元電位をスイッチできるジメチルジヒドロピレン(DHP)と多様なレドックス応答、発光応答を有する遷移金属錯体をπ共役スペーサーで連結した一連の新規錯体群を創製し、DHPの電子状態変化と遷移金属錯体の電子状態変化を連動できる系の構築を目指している。本年度はDHPの光異性化による遷移金属錯体の電子状態の制御、および遷移金属錯体のレドックスによるDHPの光異性化能の制御について調べた。DHPと2個の(ビス)テルピリジンルテニウム錯体をエチニル基で連結した新規複核錯体は吸収スペクトルと励起スペクトルの比較から室温でDHP部位からと考えられる発光が観測された。これは、(ビス)テルピリジンルテニウム錯体部位のMLCTからの失活が抑制されたためと推察している。DHPと2個のフェロセンをエチニル基で連結した新規フェロセン共役DHPでは、種々の溶媒中で579nmの可視光照射により閉環体から開環体に、303nmの紫外光により元の閉環体に戻る光異性化挙動を示し、その異性化率はTHF中で97%と見積もられた。電気化学測定ではジクロロメタン中でフェロセン部位に由来する可逆な2段階1電子酸化が観測され、DHP部位を介したフェロセン間の電子的相互作用の存在が示された。このフェロセン部位の酸化還元電位は溶媒依存性を示し、溶媒により混合原子価状態の安定性が異なることも明らかとなった。この錯体を光異性化し開環体として後、化学的にフェロセン部位を一電子酸化したときの吸収スペクトルは閉環体の一電子酸化体のそれと一致したことから、開環体の一電子酸化体は速やかに閉環体の一電子酸化体に変換されることがわかった。すなわち、開環体の安定性はフェロセン部位の価数によって大きく異なることを見出した。これは、フェロセン部位のレドックスによりDHPの光異性化能を制御することが可能な系であることを示している。ジメチルジヒドロピレン(DHP)類は光によりπ共役系の組み換えによる閉環、開環構造間の可逆な異性化を起こしそれに伴い酸化還元電位が大きく変化する。一方フェロセン(Fc)に代表されるレドックス核間の電子的相互作用は、架橋π共役系のエネルギーレベルを外場により可逆にシフトすることにより制御できると考えられる。そこでDHPを架橋部位として用いることで、光によるπ共役系の変化により電子的相互作用の変化を誘起しうると考え、DHPとFcをπ共役系(エチニル基)で連結した新規錯体1を合成、同定した。錯体1はTHF溶液中、578nmの可視光および303nmの紫外光を交互に照射することにより、DHP部位の可逆な光異性化が観測された。1のサイクリックボルタモグラム(CV)(ジクロロメタン溶液)ではFc部位の可逆な2段階1電子酸化還元波が観測され、その電位差は109mVと算出された。光異性化後1(開環体)のCVでは、酸化側掃引においてFc部位の1段階2電子の酸化波が、還元側掃引においては閉環体と類似の2段階1電子の還元波が観測された,これは開環体の1電子酸化体および2電子酸化体が電極表面上で速やかに閉環体に変化するためと考えられ、化学的にFc部位を酸化したときの吸収スペクトルが閉環体の酸化体のそれと一致したことからも確認された。

以上の反応スキームからFc部位の酸化還元電位(1,3-ジクロロプロパン溶液、218K)およびその電位差を算出し、1(閉環体)では63mV、1(開環体)では16mVと求められた。両状態においてDHP部位を介したFc核間の電子的相互作用の存在が示されたが、その程度は架橋π共役系の酸化還元電位がFc部位に近い閉環体のほうが大きいことがわかった。以上より、フォトクロミック錯体1はDHP部位の可逆な光異性化によりFc核間の電子的相互作用を可逆に制御できる錯体であることが示された。本研究では、分子内電子移動、分子-電極間電子移動の能動的制御を目指した新規なレドックス多核遷移金属錯体群の創製を目指した。まず、架橋部位としてフォトクロミック分子、ジメチルジヒドロピレン(DHP)を組み込んだ遷移金属錯体系を新規に創製した。2個のフェロセン(Fc)をレドックス核として用いた、可逆な光異性化能(繰り返し能も高い)を有するビス(フェロセニル)ベンゾジメチルジヒドロピレンの合成に初めて成功し、ベンゾジメチルジヒドロピレン(BzDHP)部位の可逆な光異性化によるFc間電子的相互作用の可逆的スイッチング(Fc間の酸化還元電位差:閉環体にて63mV、開環体にて16mV)を達成した。さらにFc部位の酸化のみによるBzDHP部位の開環体から閉環体への熱的異性化を新規に発見した。これは光異性化により金属核間電子的相互作用を制御し、さらに電子移動後の構造変化まで解析に成功した初めての系である。また、分子内電子移動の能動的制御を錯体と電極間の多電子移動制御へと拡張を検討し、架橋部位としてカルボニル金属錯体(カルボニル基の架橋モードの多様性の利用)を用いた。モリブデンカルボニル基を架橋部位として持ち、レドックス核として2個のロダジチオレン錯体を用いた異種金属三核錯体を新規に合成し、特異な1段階2電子還元反応(溶媒-支持電解質に依存しない)を初めて発見した。この現象と連動する構造変化(カルボニル基架橋モード変化)、基底スピン状態変化(ニュートラル体:セミブリッジングカルボニル基、基底1重項、2電子還元体:ブリッジングカルボニル基、基底3重項)を実験的、理論的に解明することに成功した。さらに、レドックス核としてコバルタジチオレン錯体を用いた、類似の構造を有する異種金属三核錯体では、カルボエル基の架橋モード変化に伴う還元様式を溶媒-支持電解質により自在に変化できることを見出した。
B細胞受容体を介するB細胞活性化分子機序の解析

本年度はCre/loxPシステムを導入したmgcRacGAPのコンディショナルノックアウト(cKO)マウスを作製し、B細胞を含む血液細胞の分化、生存におけるmgcRacGAPの必要性を検討した。インターフェロン(IFN)により全身的にCreを発現するMx-Creマウスとの交配により血液細胞全般においてmgcRacGAPをKOしたところ、骨髄においてリンパ系、ミエロイド系の細胞数の減少を観察した。また、造血幹細胞を多く含むとされるKSL細胞の減少も確認された。これらの表現形は放射線照射したマウスへ骨髄移植を行った実験により血液細胞intrinsicな表現形であることも明らかにした。さらに申請者はB細胞特異的にCreを発現するmb1-Creマウスとの交配により、B細胞におけるmgcRacGAPの必要性を詳細に検討した。このマウスは骨髄においてB220+CD19-の分化段階のB細胞の発生は見られたが、それ以降の分化段階のB細胞の出現はほとんど見られなかった。最近に申請者らが報告したmgcRacGAP欠損B細胞株から得られた知見(Exp Cell Res. vol312 pp3517-3525: Yamada et al.)をもとに上記のマウスから採取したB細胞において、その生存及び細胞分裂を検討したところ、やはりmgcRacGAP欠損B細胞において細胞死の亢進、細胞分裂の障害が確認された。また、抗アポトーシス作用をもつBcl-xLの遺伝子導入によりmgcRacGAP欠損B細胞に見られた細胞死は抑制されたが、細胞分裂の障害は依然として確認された。以上の結果から、mgcRacGAPはB細胞を含む血液細胞の発生に非常に重要であり、血液細胞の生存、分裂に必須であることが明らかとなった。本年度はmgcRacGAP及びRukのCre/loxPシステムを導入したB細胞特異的遺伝子欠損マウスの作製を行った。遺伝子欠損マウス用コンストラクトをES細胞へ導入後、相同組み換えを起こしたES細胞株を樹立した。このES細胞を胚盤胞へ移入しキメラマウスを作製した。このキメラマウスをB細胞特異的にCre発現するマウスと交配することにより、B細胞特異的遺伝子欠損マウスを作製した。また、申請者はB細胞株であるDT40細胞株を用いてmgcRacGAPの欠損細胞株を樹立し、その解析をおこなった。mgcRacGAP欠損細胞株では、恒常的な細胞死が見られるほか、細胞質分裂の異常が認められ異常な多核細胞の出現がみられることが明らかとなった。さらに、mgcRacGAP欠損細胞株へ様々なmgcRacGAP変異体を導入することにより、mgcRacGAPのもつ機能の詳細な検討を試みた。GAP活性を消失した変異体は野生型mgcRacGAPと同様に欠損細胞で見られた表現形の回復が見られた。しかしながら、N末及びC末ドメインの欠損変異体では表現形の回復が認められなかった。以上の結果は、従来まで必須と思われてきたmgcRacGAPのもつGAP活性は機能発現に重要ではないことが明らかとなり、これまで知られていなかったアダプター的な役割を示唆するものである。現在、DT40細胞株より得られた結果を基に、作成した遺伝子欠損マウスの生化学的、組織学的解析を計画している。
臓器に生じた放射線誘発突然変異の発生頻度の経時変化とその臓器特異性についての解析

12週齢のNew HITECオス・メスマウスに^<137>Csγ線(1.1Gy/min)5Gyを全身照射し、照射後30、60、120、180日目(各群5匹)に突然変異検出臓器(脳、肝臓、脾臓、精巣)を摘出し凍結保存した。本突然変異検出アッセイで、突然変異頻度は非照射群で10^<-5>台となった。脳では対照群と比べて、オス・メスともに30日目と60日目の突然変異頻度が高くなる傾向があった。肝臓では、オスの180日目で増加の傾向があった。脾臓では、オス、メスともに、対照群の突然変異頻度が高い傾向にあった。精巣では、対照群の突然変異頻度と比べ全ての実験群で上昇はなかった。12週齢のp53ノックアウトNew HITECマウスも同様の照射を行ない、照射後30、60日目(各群2匹)に突然変異検出臓器(脳、胸腺、肝臓、脾臓、精巣)を摘出し凍結保存した。実験用個体作出が胚操作では全く得られず自然交配のみに頼ることとなり、かつ繁殖成績が極めて悪かったので、実験群は各群2匹で照射後30、60日までの観察となった。オスの肝臓で全群を通じて突然変異頻度が高い傾向があったが、p53欠損により突然変異の蓄積が増幅されるような傾向はなかった。本研究では、New HITECならびにp53ノックアウトNew HITECマウスどちらの照射群でも、経時的、また臓器別の突然変異頻度の大きな変化を見ることはできなかった。このことは、バックグランドの突然変異率が常に高く現れ、アッセイ方法に改善すべき点があること考えている。また、突然変異頻度にかなり個体差があり、各群の個体数を増やすことが必要であろう。今回はガンマ線5Gy1回照射で、通常マウスでは長期的に全身症状を示さない照射条件であり、明瞭な突然変異頻度の上昇がなかった可能性もある。今後は、今回得られた結果をふまえ、積極的に変異頻度を上げる照射条件で、これらの変異マウスを用い固有のがん発生と突然変異との関連を明らかにしていく予定である。精巣では、対照群の突然変異頻度と比べ全〓の実験群で上昇はなかった。12週齢のp53ノックアウトNew HITEC

マウスも同様の照射を行ない、照射後30、60日目(各群2匹)に突然変異検出臓器(脳、胸腺、肝臓、脾臓、精巣)を摘出し凍結保存した。実験用個体作出が胚操作では全く得られず自然交配のみに頼ることとなり、かつ繁殖成績が極めて悪かったので、本年度は各群2匹で照射後30、60日までの観察となった。オスの肝臓で全群を通じて突然変異頻度が高い傾向があったが、p53欠損により突然変異の蓄積が増幅されるような傾向はなかった。本年度の結果では、New HITECならびにp53ノックアウトNew HITECマウスどちらの照射群でも、経時的、また臓器別の突然変異頻度の大きな変化はなかった。このことは、アッセイ法に改善すべき点があることを示唆している。また、突然変異頻度にかなり個体差があり、各群の個体数を増やすことが必要であろう。今回はガンマ線5Gy1回照射で、通常マウスでは長期的に全身症状を示さない照射条件であり、明瞭な突然変異頻度の上昇がなかった可能性もある。今後は積極的に変異頻度を上げる照射条件で、これらのマウスで固有のがん発生と突然変異との関係を見る方向で実験を進める。12週齢のNew HITECオス・メスマウスに^<137>Csγ線(1.1Gy/min)5Gyを全身照射し、照射後30、60、120、180日目(各群5匹)に突然変異検出臓器(脳、肝臓、脾臓、精巣)を摘出し凍結保存した。本突然変異検出アッセイで、突然変異頻度は非照射群で10^<-5>台となった。脳では対照群と比べて、オス・メスともに30日目と60日目の突然変異頻度が高くなる傾向があった。肝臓では、オスの180日目で増加の傾向があった。脾臓では、オス、メスともに、対照群の突然変異頻度が高い傾向にあった。精巣では、対照群の突然変異頻度と比べ全ての実験群で上昇はなかった。12週齢のp53ノックアウトNew HITECマウスも同様の照射を行ない、照射後30、60日目(各群2匹)に突然変異検出臓器(脳、胸腺、肝臓、脾臓、精巣)を摘出し凍結保存した。実験用個体作出が胚操作では全く得られず自然交配のみに頼ることとなり、かつ繁殖成績が極めて悪かったので、実験群は各群2匹で照射後30、60日までの観察となった。本研究では、New HITECならびにp53ノックアウトNew HITECマウスどちらの照射群でも、経時的、また臓器別の突然変異頻度の大きな変化を見ることはできなかった。このことは、バックグランドの突然変異率が常に高く現れ、アッセイ方法に改善すべき点があること考えている。今後は、今回得られた結果をふまえ、積極的に変異頻度を上げる照射条件で、これらの変異マウスを用い固有のがん発生と突然変異との関連を明らかにしていく予定である。