hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
冷温帯に生育するアカエゾマツを用いた過去500年の気候の復元

年輪解析法による冷温帯過去500年間の気候変動の復元を目的に実施した研究は、(1)各地点から採取したアカエゾマツの年輪幅変動の同時性は、砂丘系では認められなかったが、蛇紋岩系と湿地系で同時性が確認された。(2)他の気候のプロキシレコードと対比した過去300余年間の気候変動の推定値を年輪幅変動から導出した。結果として、採取した試料のうち、年輪数が500年に達する固体は3本のみで、多くは年輪数が300年前後のため、過去への復元に関する限り300余年に留まり、当初の目的を達することが出来なかった。しかし、年輪年代学の適用は、高温多湿な地域で不適と考えられてきたが、北海道のアカエゾマツにも樹木の年輪成長の同時性が確認され、気候変動の復元に貢献できるものと期待される。これを基に世界的な気候変勤ともよく同調し、さらに他プロキシレコードとの比較から過去5001000年の気候復元に向けた努力をする予定である。日本における年輪解析法による冷温帯から亜寒帯の過去500年間の気候変動の復元を目的に実施した計画は以下の通りである。(1)北海道内のアカエゾマツ採取予定地のうち、湿地系(北海道大学・雨龍地方演習林)、蛇紋岩地系(同中川地方演習林)、砂丘地系(春国岱)の3カ所(サンプル20個体以上)を成長錘で採取し、現在乾燥処理を行っている。すでに、年輪計測の終了した地点もあるが、今年度採取した試料は、次年度の計画に入るまでに全て年輪計測は完了する予定である。(分担野田真人)。(2)浅根性のアカエゾマツは、土壌水の移動量が成長に大きく関与していることから、水位と水分観測について、融雪時に設備を設置して観測を開始する予定である。湿地系の調査期間は、2年間にわたって継続し、時間的変化を詳細に調査する計画である。(分担原口昭)。(3)主要設備との関連:要求設備のデンシトメータ用光電部や水位、水分計は購入済みで、融雪時までに改良および設置を完了する予定である。本年度は、試料採取と機器の設備が中心であった。平成10年度以降は、湿地系のアカエゾマツの水位観測について最終年度まで引き続き継続する。新たな立地として火山灰礫地系と継続的に砂丘地系について解析と調査を行う予定である。当該年度において、4立地のアカエゾマツの採取は完了する。年輪解析法を用いた冷温帯から亜寒帯の過去500年間の気候変動の復元を目的に実施した計画は以下の通りである。(1)北海道内のアカエゾマツ採取予定地のうち、湿地系(北海道大学・雨龍地方演習林)、蛇紋岩地系(同中川地方演習林)の2ヶ所(サンプル20個体以上)を成長錘で採取し、現在解析処理を行っている。計画の砂丘地系(春国岱)は、採取許可の関係で次年度に採取する予定である。(2)浅根性のアカエゾマツは、土壌水の変動が成長に大きく関与していることから、水位と水分観測について、融雪時に測器を設置し、1年間にわたって観測を行った。湿地系の土壌水の変動調査は、次年度も継続し、2年間の時間的変化を詳細に調査する計画である。本年度は、土壌水の変動調査と試料採取を中心に行った。さらに中川地方演習林で新たに樹齢約600年生の蛇紋岩地系の試料が見つかり、これを現在解析中である。平成11年度は、湿地系のアカエゾマツの水分・水位観測について引き続き継続する。今年度実行できなかった砂丘地系(春国岱)の追試について、次年度に調査を行う予定である。次年度は最終年度に当たるため、解析に必要な個体数に満たなかった地点を補充し、過去500年の気候の復元の知見を得る計画である。(1)各地点から採取したアカエゾマツの年輪幅変動について、砂丘系では認められなかったが、蛇紋岩系と湿地系で同時性が確認された。(2)他の気候プロキシレコードと対比した過去300余年間の気候変動の推定値を導出した。

本年度は、最終年度に当たるため、これまでの調査・解析結果を総合的に取りまとめるための討議が中心になった。したがって、研究費の使途は討議のための資料整理と旅費が中心になった。結果として、収集した試料には生育地点の制約上、過去への復元に関する限り300余年に留まり、当初の目的を達することが出来なかった。しかし、年輪年代学の適用は、高温多湿な地域で不適と考えられてきたが、北海道のアカエゾマツにも樹木の年輪成長に同時性が確認され、気候変動の復元に貢献できるものと期待される。これを基に世界的な気候変動ともよく同調し、さらに他プロキシレコードとの比較から過去5001000年の気候復元に向けた努力をする予定である。
放射線感受性におけるヒストン修飾とゲノム損傷応答のリンケージ解析

ヒストンメチル化によるヒストン修飾によって放射線感受性が変化することが明らかとなった。ヒストン修飾によって放射線感受性を人為的に変化させることが可能になることが期待される。また、放射線感受性に重要である放射線照射によるDNA2重鎖切断修復における相同組み換え(HR)と非相同末端結合(NHEJ)修復について分子生物学的な検討を行った。これらの結果より新規放射線治療のシーズとなりうる成果が得られたといえる。1.ヒストンをコードする遺伝子のクローニングとその発現ベクターの構築Histone E2AX及びそのバリアントHistone H2AVをクローニングし、その過剰発現による影響をみた。これまでのところ、放射線感受性に大きな影響を与えないという結果が出ている。発現ベクターは、各種作製しているが、Histone H1のクローニングは、終了していない。今後も、各種ヒストンの修飾部位における点突然変異を有するクローンの作成を含み、多種類のヒストンcDNA(野生型及び変異型)の発現ベクターを構築してゆく必要がある。これにより、ヒストン構造と放射線感受性の関連性を明示したい。2.ヒストン遺伝子クローンの遺伝子導入HAもしくはv5ペプチドタグの付加した発現ベクターを用いて、複数のstableトランスフェクタントを作製中である。これまでの結果では、放射線照射に多大な影響を与えるという結果にはいたっていない。今後も、トランスフェクタントの作製を継続する。3.ヒストンメチル化レベルの評価システムの構築メチル化ヒストン蛋白に特異的に結合する蛋白質HP-1 alphaの発現が、様々な条件にて、変化することを見出した。現在、この生物学的意義を解析中である。メチル化ヒストンH3及び抗メチル化ヒストンH4の抗体を用いて、ChIPアッセイを施行しているが、放射線感受性との関連性は、明らかではない。更なる検討が必要と判断している。1.DNA二重鎖切断による修復蛋白の挙動複数のがん細胞ヘヒストンH4K20のメチル化酵素SUVH20をターゲットとするsiRNAの遺伝子導入後、放射線照射後に生じるDNA2重鎖切断を評価した。DNA2重鎖切断は、リン酸化H2AXに対する特異的抗体を用いて共焦点顕微鏡によって検出し、foci形成の数によって評価した。その結果、いずれの細胞株においても、SUVH20発現の低下により、放射線照射後のヒストンのリン酸化H2AXが持続的に維持され、DNA修復能が低下、もしくはDNA損傷が増加することが判明した。2.クロマチン高次構造の解析クロマチンの構造の変化は、PI、DAPI、BrdUの多重染色を行い、フローサイトメトリーを用いて、詳細に解析中である。(このシステム構築に時間を要している。)3.リエントリーの評価(修復能の総合的評価)放射線照射後に再開される細胞分裂の時間を測定し、DNA修復活性を評価した。この系においてもSUVH20の抑制によって修復能が低下することが判明した。また、コロニーアッセイにても同様な結果を得た。すなわち、ヒストンH4のK20のメチル化は放射線照射後のDNA修復に重要であることが判明した。ヒストン修飾とDNA損傷との関わりを示した意義は高い。また、H4K20のメチル化は、p53BPの結合領域との報告があり、本実験結果との関わりも興味深い。今後、SUVH20の抑制によるヒストンの高次構造の変化とDNA修復との関連性を明らかにしてゆきたい。放射線治療は、癌治療における主役のひとつを担っているが、必ずしもすべての癌で照射効果の期待ができない場合がある。また、照射後の副作用によって様々な生理機能を損なう場合もある。これらの課題に対し、放射線感受性を生物学的に解明し、それを改変させることが、問題の解決につながる可能性がある。本研究では、こうした観点から、放射線照射のターゲットであるDNAの3次元的な構造へ影響を及ぼすヒストン構造に着目し、その修飾の違いと放射線感受性とのリンケージを解析した。今年度は、ヒストンメチル化酵素Suv420H2をノックダウンし、ヒストンのメチル化レベルを低下させ、放射線感受性を解析した。Suv420H2は、ヌクレオゾーム内に存在するヒストンH4のリジン20をメチル化する酵素である。複数の細胞株において、メチル化を減弱させることによって明らかに放射線感受性が変化した。すなわちメチル化が低下すると、ヒストン構造が変化し、放射線への感受性が高まるらしい。このことから、ヒストンメチル化レベルを変化させることによって、放射線感受性が改変しうることが明らかになった。本研究では、さらにこの現象が生体内で生じることを証明するために、持続的に遺伝子をノックダウンさせるベクターを構築した。Suv420H2とともにメチル化を制御するSuv420H1をターゲットとするsiRNAを組み込んだ遺伝子ベクターを導入し、放射線感受性を解析したが、これまでのところ、明らかな効果は得られず、うまくターゲット遺伝子の発現を抑制できていないことが判明した。本研究の成果によって、ヒストンのエピジェネテックな調節により、放射線感受性を人為的に改変しうる可能性を提示できた意義は高い。今後はこれを発展させ、放射線治療にうまく組み込む手段を考案し、研究を発展させるべきと考えている。
日本の猫の四肢に発生した骨原発性骨肉腫の外科切除後の予後解析

【背景と目的】1987年の米国のBitettoらの報告より、一般的に猫の四肢骨肉腫は患肢断脚術のみで予後良好とされているが、実際の臨床の現場では外科治療後に肺転移が認められる症例も少なくない。そこで本研究では、国内の猫の四肢骨肉腫の患肢断脚後の予後について調査することを目的とした。【方法】研究デザインはヒストリカルコホート研究、1997年1月2012年12月の過去15年間で、アイデックスラボラトリーズ、ノースラボおよびマルピー・ライフテックの国内3ヵ所の病理診断施設にて猫の四肢に発生した骨肉腫と診断され、患肢断脚術が実施された症例を調査対象とした。生存期間は外科手術日死亡日と定義し、Kaplan-Meier法にて累積生存曲線を求めた。遠隔転移の有無および生存期間と関連する因子の解析では、年齢および腫瘍発生部位を調査因子とした。多変量解析にはロジスティックモデル、Cox比例ハザードモデルを使用した。p<0.05を有意差ありと判定した。【結果】調査対象となった34例の年齢の中央値は11歳齢(218歳齢)、性別は雄が19例(うち去勢雄16例)、雌は15例(うち不妊雌11例)、体重の中央値は4.3kg (2.710.9kg)であった。病変部位は大腿骨13例、脛骨6例、橈骨3例、上腕骨4例、肩甲骨3例、手根骨3例、中足骨もしくは後肢趾骨2例であった。追跡期間の中央値は316日(91678日)で、追跡期間中の局所再発率は10.7%(3/28)、リンパ節転移率は4.5%(1/22)、遠隔転移率は48.0%(12/25)であった。遠隔転移が認められた12例の転移部位は肺9例、肺および皮膚1例、骨2例であった。全症例の中央生存期間は489日(91678日)であった。いずれの因子も遠隔転移の有無との関連は認められなかった。多変量解析にて年齢が生存期間と関連し、若齢であることが負の予後因子となった(p=0.012、ハザード比=0.76、95%CI : 0.61-0.94)。【考察】国内の猫の四肢骨肉腫は患肢断脚後に補助化学療法が適応となる可能性と定期的な画像検査の必要性が示唆された。
古拙法から学問法へ-裁判文書、とくに開廷儀式文言から見た西洋中世法の変革-

本研究は、「古拙法と学問法とのはざま」といった観点から、とくに11世紀に注目した。11世紀に注意をはらうことで、10世紀から13世紀に至る、ヨーロッパ法史上の画期的な時期を全体として視野に収めることが可能となり、法の変革をめぐる研究に広がりを持たせることができる。1 11世紀は10世紀に連結する面をもっていた。これは、神判のなかに現れていた。神判が異教的社会からキリスト教社会に受け継がれていったのは、「真理」観念が両者の社会に共通する性格をもっていたことによっていた。それらいずれの社会においても、人間とその周囲の諸力との、そして人間と神との調和的宇宙観に基礎をおいた真理観念が存在していた。しかし、他方では、すでにアンセルムスに見られるように、神の超越的存在に基礎をおいた真理の観念もまた表明されていた。2 11世紀は12世紀に繋がる面を持っていた。これは、「神の平和」運動に関係していた。フランスにおける神の平和では古来の贖罪システムが発動していたのにたいし、1083年のケルンにおける神の平和では、平和の破壊にたいする制裁として刑事刑が導入され、また、非行者を社会から排除するという考え方のもとに、有害な分子を無害化しようとする刑事政策的な側面もでてきている。他方で、しかし、法の「回復」を目的とした、賠償による方式は、まだ捨て去られてはいない。3このように11世紀は、法の変革史のうえで、古さと新しさとの両面を合わせもった時代であった。このことは、裁判の開廷儀式文言の成立を考える上で重要な視点となる。裁判における儀式主義化は、おそらく11世紀あたりから始まってくるものと思われる。このことに関係するのは、裁判支配権と裁判二分制の登場であり、神の恩寵を引き合いに出そうとする、社会のキリスト教化である。西洋法の性格は、第十一世紀から十二世紀にかけて、古拙法から学問法に変わる。では、法の変化は裁判や訴訟においてどのように現れていたのであろうか。本年度はこの点にしぼって考えた。その結果として、一つは、一三四三年南ドイツで、牛を盗んだ父親を息子が殺した事件の裁判において、二つの観念が、いずれも他方を圧倒することなく同居していた。一つは、盗みによって毀損された法を治癒するといった、法をいわば自動装置とみる思考方法。もう一つは、父親殺しという息子の行為をキリスト教的、倫理的判断を加えて断罪評価しようとする思考方法である。私はこの事件を取り上げたハッテンハウア-教授の一論稿を『熊本法学』84号(1995年9月発行予定)で邦訳し、あわせて詳細な解説を付すことで、新旧法観念の同居現象の有する意味を明らかにする予定でいる。もう一つ、法の性格の変化は、裁判形態の変遷に関係していた。これを具体的に示す文書の一つに、魔女被告事件を述べた一六○四年の、ゲンゲンバッハ市に関わる復讐断念の誓約文書がある。ここでは、当初告訴手続きで始まった訴訟は、第二段階で職権手続きによって引き継がれていた。第一段階の告訴手続きにおいては、当事者の激しい、言葉の応酬による弁論を中心として古拙法が展開していた。しかるに、都市当局は、この法によっては事件が解決困難と考えて、これ以上当事者手続きに委ねずに、法鑑定によった学識裁判に判断をまかせた。ここでは、とくに証明問題が、職権による調査に依存した。

以上については、『熊本法学』83号(1995年6月発行予定)掲載の拙稿をみられたい。以上の二事例は、西洋法の性格がまさに変わろうとする時期のものではないが、これら現実に起きた代表的な裁判を通して中世盛期における法の変遷に関して一定のイメージをえることはできる。〈古拙法から学問法へ〉の観点からヨーロッパ法の性格の変遷を問題とするについて本研究は11世紀に注目した。11世紀を追究することで、古拙法から学問法への変遷を媒介した文化要素をとりだし、全体として10世紀から13世紀にいたる法史・社会史上の中心時代を考察する視点が確保できた。1 11世紀は10世紀に繋がる側面を有していた。これは神判のなかによく現われていた。神判が異教社会からキリスト教社会へと受け継がれていったのは、両社会の世界観に共通性があったことによる。〈法〉と密接に関連した〈真理〉観念が異教社会と中世初期キリスト教社会とで性格を等しくし、いずれにおいても人間とその周囲の諸力との、人間と神との調和的宇宙観に基礎をおいていた。2 11世紀は12世紀に繋がっていく新しい側面をもっていた。それは〈神の平和〉運動に関わっていた。フランスにおける神の平和では依然、古来の贖罪システムが発動していた。これにたいし1083年のケルン大司教下の神の平和においては、平和の破壊にたいする制裁は〈社会からの非行者の排除〉の思想を土台にしていて、加害者と被害者との賠償による和解現象は背後に退いていた。3以上のように11世紀は法の展開の上で古さと新しさとを有していた。それは、裁判の開廷儀式というものを考えるうえで重要な視点となる。法における形式化、儀式化はおそらくこの時代あたりから始まってくる。形式とか儀式は古拙法そのものの特徴のような印象を受けるが、元来的には、そのときどきの人や社会のありかたを越えて古拙法を後代に伝えていくために必要な要素であった。その意味で、古拙法から学問法への変遷を媒介する役割をも果たしうるのである。この点については、今後適切な文書史料において実証する作業が残されている。
異常透過回折現象を用いる高感度小角散乱X線撮像法の開発

本研究の目的は,新たに開発した小角散乱X線撮像法は(USAXS)を用いて,従来の吸収コントラストX線撮像方式では困難であった初期乳癌の特徴である微小石灰化や腫瘤の形成のない段階での早期の微小腫瘍細胞などを描出することである.これまでに提案されているUSAXS法は,散乱が生じやすい微小石灰化等を描出できるものの,感度が不足しており,微小な腫瘍組織を描出するには至っていない.平成30年度は,乳房組織内の微小な腫瘍組織を描出する感度を有す,小角散乱測定用結晶光学系を設計及び製作し,撮像システムを高エネルギー加速器研究機構フォトンファクトリーBL14Bビームラインに構築して基礎実験を行った.まず,実験用に準備した微小粒子を含む物理ファントムを用いて,本撮像システムの描出能を評価した.従来のDEI方式による小角散乱撮像法と比べ,描出能は向上したものの,描出能は入射ビームの平行性と関係があり,平行性を高めるためにX線をコリメートするとビーム強度が落ちる課題がある.次年度で,実用的な条件を探索する.また,本手法による測定データからX線画像を再構成する手法を開発した.30年度後半の実験では生体組織を撮像した.現在,撮影データに再構成法を適用し,評価を進めている.現システムの一番の課題は,シングルスリットを用いたスライスビーム撮像方式による長時間撮像であり,今後,マルチスリットを導入し,短時間に撮像できるように改良を進める.実施計画で示した項目の通りに研究が進んでいるため.平成31年度は,被写体前に設置した非対称モノクロコリメータのb値を変え,入射ビームの平行性を最適化し,実用的なビーム強度と画質の探索を行う.また,現在はスリットを用いたスライスビーム撮像方式を撮影しているため長時間撮像が必要であるが,今後はマルチスリット化し,一度に撮像できるように改良する.さらに,高画質かを目指すために再構成法の改良を同時に進める.様々な生体試料を撮影し,本手法の有効性を示す.本手法の詳細な撮像性能であるコントラスト分解能・空間分解能・必要露光量等についても従来法と比較しながら評価する.本研究の目的は,新たに開発した小角散乱X線撮像法は(USAXS)を用いて,従来の吸収コントラストX線撮像方式では困難であった初期乳癌の特徴である微小石灰化や腫瘤の形成のない段階での早期の微小腫瘍細胞などを描出することである.これまでに提案されているUSAXS法は,散乱が生じやすい微小石灰化等を描出できるものの,感度が不足しており,微小な腫瘍組織を描出するには至っていない.平成30年度は,乳房組織内の微小な腫瘍組織を描出する感度を有す,小角散乱測定用結晶光学系を設計及び製作し,撮像システムを高エネルギー加速器研究機構フォトンファクトリーBL14Bビームラインに構築して基礎実験を行った.まず,実験用に準備した微小粒子を含む物理ファントムを用いて,本撮像システムの描出能を評価した.従来のDEI方式による小角散乱撮像法と比べ,描出能は向上したものの,描出能は入射ビームの平行性と関係があり,平行性を高めるためにX線をコリメートするとビーム強度が落ちる課題がある.次年度で,実用的な条件を探索する.また,本手法による測定データからX線画像を再構成する手法を開発した.30年度後半の実験では生体組織を撮像した.現在,撮影データに再構成法を適用し,評価を進めている.現システムの一番の課題は,シングルスリットを用いたスライスビーム撮像方式による長時間撮像であり,今後,マルチスリットを導入し,短時間に撮像できるように改良を進める.実施計画で示した項目の通りに研究が進んでいるため.平成31年度は,被写体前に設置した非対称モノクロコリメータのb値を変え,入射ビームの平行性を最適化し,実用的なビーム強度と画質の探索を行う.また,現在はスリットを用いたスライスビーム撮像方式を撮影しているため長時間撮像が必要であるが,今後はマルチスリット化し,一度に撮像できるように改良する.さらに,高画質かを目指すために再構成法の改良を同時に進める.様々な生体試料を撮影し,本手法の有効性を示す.本手法の詳細な撮像性能であるコントラスト分解能・空間分解能・必要露光量等についても従来法と比較しながら評価する.次年度使用額は,若手研究における独立基盤形成支援(試行)による追加配分のため,次年度以降に使用する計画である.
抗RANKL抗体医薬品デノスマブによる重篤副作用発症機構解析

癌の骨転移に伴う疼痛緩和や骨粗鬆症に対し、抗RANKL抗体医薬デノスマブが近年用いられているが、この薬剤による重篤な低カルシウム血症の惹起の可能性も懸念されている。このような副作用は、開発時に意図していない機構で発症することが多く、その機構解析は難渋する傾向にある。副作用発症機構が解析可能となれば、副作用回避方策の提案に繋がり、安全や薬物治療に貢献することが期待されるため、本研究では、まず副作用メカニズムをシステム薬理学的視点で解析する方法論を構築し、その応用としてデノスマブの副作用メカニズムの解析を試みた。癌の骨転移における骨破壊を伴う疼痛の緩和や、骨粗鬆治療に対して使用されているデノスマブは、高頻度で低カルシウム血症を生じ重篤な経過を辿るケースも報告されている。そこで、本申請研究では、この発症機構を解析を進めている。デノスマブは、抗RANKL抗体であるため、RANKL分子を発現する種々の臓器を介して副作用を生じていることが想定された。一方で、生体内におけるカルシウム恒常性は、多臓器間の連関により綿密に維持されていることが想定される。そこで、カルシウム恒常性維持に関わる分子機構とRANKL分子が関与するシグナル伝達との連関をシステム生物学的に解析することを計画し、研究を遂行している。文献検索により、RANKL分子およびカルシウムの生体内への取り込みおよび排泄を担う分子群それぞれと機能的に連関する分子群の探索、さらにその分子群に連関する分子の探索、を繰り返し行いRANKL分子とカルシウム恒常性維持にに関わる分子群との分子ネットワークを構築した。現在、このネットワークの解析を進めている。一般的なネットワークの構造解析に加え、より定量的かつ動的な挙動を解析する技術開発を進め、方法論開発に一定の目処が立ちつつある。また、解析結果を動物実験で再現するために必要となる、ヒトRANKL遺伝子を導入した遺伝子改変マウスの作出も進めており、次年度の動物実験による検証に備えている。RANKLに対する分子標的薬であり、骨粗鬆症治療薬であるデノスマブは、重篤な低カルシウム血症を惹起することあり、そのメカニズムをin vivoにて検証することを本年は試みた。デノスマブは、ヒトおよびサルのRANKLに結合するものの、マウスRANKLに対しては結合性を示さない。そのため、昨年度から引き続き、ヒトRANKL分子を発現するマウスの樹立を、BACクローンの遺伝子挿入により試みていたが、ヒトRANKLを充分量発現するマウスは作出できなかった。そのため、遺伝子改変マウスを用いないアプローチでの解析を試みることとした。デノスマブを用いたマウスでの解析は困難なため、デノスマブのRANKLへの結合が起点になるシグナル伝達が、カルシウム恒常性に影響を与える可能性を検証するため、マウスにおいて、RANKLを起点とするシグナル伝達を惹起する作用がある抗体(あるいは抗体フラグメント)の作出を試みた。ファージディスプレイ法を用いたスクリーニングにより、RANKLに結合しシグナル伝達を惹起しうるRANKL刺激抗体と、RANKLに結合するもののシグナル伝達を惹起しないRANKL無刺激抗体の作出に成功した。そこで、これらの抗体をマウスに投与し、血中カルシウム濃度に与える影響を評価したところ、RANKL刺激抗体では、高カルシウム血症となる傾向が認められた。一方で、ヒト培養細胞を用いた検討により、デノスマブは、RANKLシグナル惹起能は、比較的低いことも確認された。これらのことから、デノスマブは、生理的なRANKL逆シグナル誘導因子を阻害することで、低カルシウム血症を惹起する可能性が想定される。現在、昨年度抽出したカルシウム変動を惹起しうる重要因子への影響等の解析を中心に、上記の可能性の検証を詳細に進めている。当初の予定していた研究計画については、概ね順調に進捗している。加えて、当初予定していなかったネットワーク解析法の新規技術基盤の構築も行うことに成功しつつある。この技術基盤は、本申請研究への大きく貢献するだけではなく、システム薬理学解析において広く応用できる技術であり、当初の計画以上の学術的貢献が期待できる状況となった。システム薬理学今後は、以下の点を中心に研究を遂行する。1.ネットワーク解析の技術基盤の確立:単純なネットワーク構造に基づく解析のみならず、新規開発している動的挙動を定量的に評価する方法論の確立する。2.デノスマブが低カルシウム血症を惹起するキー分子機構の抽出:新規技術基盤を用いて、デノスマブにより低カルシウム血症が惹起される分子機構を定量的に予測し、どの分子、あるいは、シグナル経路が副作用発現に中心的な役割を果たすかを予測する。3.ヒトRANKLを発現マウスを用いた低カルシウム血症モデルの作出:作出したヒトRANKLを発現するマウスにデノスマブを投与し、低カルシウム血症を惹起するか検証する。

また、重篤な低カルシウム血症発現にがんへの罹患がキーファクターとなっている可能性も想定されるため、がん細胞を移植したヒトRANKL発現マウスを用い、カルシウム恒常性に与える影響を解析する。4.構築した低カルシウムモデルにおけるメカニズム検証;新規ネットワーク解析法にて予測された分子が実際に低カルシウム血症の原因となっているを、3で構築するモデルマウスにて検証する。効率的な研究遂行のために、研究計画の実行順序および解析内容を一部変更し、ネットワーク解析技術の構築を優先した。そのため、当初予定されていた細胞培養実験や動物実験等を一部次年度へ繰り越したために、次年度使用額が生じている。上記に理由により、昨年度に遂行予定であった一部の動物実験・細胞陪乗実験を含めて本年度遂行予定である。その実験にかかるかかる費用(おもに物品費)として、次年度使用額を充てる予定である。
新規抗酸化物質ETS-GSを用いた次世代脳保護薬の開発

ETS-GSは、生体内抗酸化物質であるビタミンE、グルタチオン、タウリンが化合した新規抗酸化物質である。我々は、ETS-GSが虚血再灌流に伴う脳障害を軽減できるかどうかを検討した。in vitroでは、ETS-GSの物質特性について、ヒドロキシルラジカルをはじめ、各種ラジカルの消去作用を確認した。また、毒性試験に関しても、治療用量での臓器障害は認めなかった。一方、ラット蘇生モデルを用いて脳保護効果を検討した結果、呼吸停止による蘇生モデルの血行動態の安定化に難渋し、脱血モデルへのプロトコールの修正を余儀なくされた。今後、さらなるモデル確立と、ラジカル消去能の病態改善効果検討が必要である。これまで、酸化ストレスの定量的評価法の一つとして、ラジカルをはじめ、多くの酸化ストレスマーカーの測定を行なってきた。しかし、検体採取から測定までの時間、検体の処理、保存法によって、データにばらつきが出るため、より精度を高めるESR(電子スピン共鳴)を用いた測定法として、昨年度は、生体から検体を遊離させることなく、例えば血液を体外循環させ、その過程で測定をする経時的な測定法の確立を模索してきた。しかし、流体検体から安定したラジカル信号をとらえることが難しく、定点での検体採取、測定が、現時点でのもっとも信頼できるデータ収集法と結論づけられる。一方で、同研究グループが、臨床の現場において血液検体からアスコルビン酸ラジカルをESR装置を用いて測定し、的確な周術期の酸化ストレス評価になりうることを見出している。今後、その手法を本研究における酸化ストレス測定法の一つとして組み込める可能性が示唆される。本年度は、昨年度に続きESRを用いたETS-GSや薬剤の抗酸化作用のin vitroの検討を行った。また、これまで血液検体を用いた経時的評価をラジカル種の選択も含め、検討していたがラジカル自体をとらえることが難しく、定点観測での再検討を現在行っている。薬物そのものの抗酸化作用が生体内でどう影響するのか、その作用機序解明にはまだ至っていない。今後、その評価法の確立を含め動物実験を再開していく。本年度は、業務上、実質的な動物を用いた研究に進むことができなかった。一部、蘇生モデルとして、これまでの心肺停止による脳虚血再灌流のモデルと並行して、脱血、送血による灌流モデルの検討を開始しており、より安定したモデルでの検討を行う。ETS-GSのESRによるin vitroの検討を行い、物質特性としての抗酸化能の評価を行っているが、生体内での抗酸化作用を数値化して評価する試みは、依然として難渋している。昨年度に続き、部分体外循環を利用し、ESRによるラジカル測定をリアルタイムで測定する試みは、今年度も有効なデータ収集が困難であった。理由として、部分体外循環そのものが動物に大きな侵害刺激をもたらし、測定器への接続するために体外循環部分のルートが長くなり、結果として体外循環持続そのものが困難であったことが挙げられる。また、定点観測においても、ラジカル検出を認めず、CYPMPOの生体内での不安定性がラジカル検出に影響を与えている可能性やヒドロキシルラジカルといった非常に短命なラジカル検は、生体内で有効な検出感度がなかったことなどが考えられる。また蘇生モデルに関しては、引き続き呼吸停止による蘇生モデル、脱血、送血を用いた蘇生モデルで、ETS-GSによる改善効果を検討行なった。以前と同様のプロトコールでの呼吸停止蘇生モデルであるが、コントロールとともに生存期間が短く、ETSの投与による病態や生存率の改善効果は認めなかった。また、脱血、送血による蘇生モデルの作成、ETS投与効果については、蘇生モデルとして、生存率、血行動態の安定化には至らなかったが、さらなる検討により、体温調整や、輸血施行を行うことで、今後モデルの確立が見込まれる状況である。ESRによる、生物検体測定手法の検討に試行錯誤しているため、やや予定プロトコールが遅れている。血液のような流体検体を経時的な測定法の確立を模索していたが、安定したラジカル信号をとらえることが難しいことから、定点での検体採取、測定に方針を固める予定である。現在、動物検体を用いたデータ収集を再開しており、蘇生モデルを用いた検討を行う。これまで、呼吸停止に伴う心肺停止モデルを用いていたが、心停止時間、蘇生率の変動が大きく、より循環動態を厳密に調節できる脱血、返血操作による低灌流モデルも併用しながら、抗酸化物質の脳保護効果を検討していく。また、経時的な酸化ストレスの評価法も、血液検体での測定法の確立をめざしていく。麻酔・集中治療遅れている動物を使用する従来のプロトコールを本年度は遂行し、データ収集につとめる。

一方で当研究グループでは、生体内の酸化ストレス、抗酸化能を評価する一つの手段として、ESR装置を用いたアスコルビン酸ラジカルの測定を進めてきており、昨年度も人血清を用いたデータ収集によりその手法が確立されつつある。このアスコルビン酸ラジカル測定が、本研究プロトコールにおいても有用なデータ収集が可能かを再検討し、従来の予定プロトコールに組み込んでいくかを検討課題として加えていく。今年度は動物実験の遂行ができず、in vitroのみの検討であった為。ESR測定法の検討に時間が費やされたため、費用が比較的かかる動物実験系の検討に入れなかったため、資金を繰り越すこととなった。平成28年度は既に動物実験を再開しており、引き続き動物モデルの検討を行っていくことで、繰り越し資金を使用する予定である。今後、遅れていた動物実験系を進め、昨年度の測定法の検討をもとに、プロトコールの遂行に努めることで、繰り越し資金を使用する予定である。
データベースビューを基盤とするハイパーメディア環境

現在のマルチメディアシステムは,対話と出力方法が決まった特殊化された形式のオブジェクトを基本にして構成されている.そのため定型的な機能は高いが,柔軟性と拡張性に劣るものとなっている.多目的利用を考えた場合,オブジェクトはできるだけ汎用の形式でデータベースに格納し,それぞれの目的ごとに特殊化したビューの形式で各マルチメディアシステムおよび各利用者のマルチメディアインタフェースを構成すべきである.従来のデータベースでは,ビューもまたデータベースであるという考えを基本としている.本研究では,実際に画面上に表示されたオブジェクト(表示オブジェクトと呼ぶ)をビューとして捉え,このビューとデータベースビューとの関係を明らかにした.この枠組みに基づくと,利用者インタフェースは,データベースのビューであり,必要に応じて動的に対応する表示オブジェクトを生成するための計算記述として定義する.ビュー定義としての計算記述により,動的に生成される表示オブジェクトを仮想ノードとし,ビュー定義を差分的に変更する計算記述により起動される仮想ノード間の遷移を仮想リンクと考えると,ビューを基本とする利用者インタフェースは仮想ハイパーメディアと見なせる.現在のマルチメディアシステムは,対話と出力方法が決まった特殊化された形式のオブジェクトを基本にして構成されている.そのため定型的な機能は高いが,柔軟性と拡張性に劣るものとなっている.多目的利用を考えた場合,オブジェクトはできるだけ汎用の形式でデータベースに格納し,それぞれの目的ごとに特殊化したビューの形式で各マルチメディアシステムおよび各利用者のマルチメディアインタフェースを構成すべきである.従来のデータベースでは,ビューもまたデータベースであるという考えを基本としている.本研究では,実際に画面上に表示されたオブジェクト(表示オブジェクトと呼ぶ)をビューとして捉え,このビューとデータベースビューとの関係を明らかにした.この枠組みに基づくと,利用者インタフェースは,データベースのビューであり,必要に応じて動的に対応する表示オブジェクトを生成するための計算記述として定義する.ビュー定義としての計算記述により,動的に生成される表示オブジェクトを仮想ノードとし,ビュー定義を差分的に変更する計算記述により起動される仮想ノード間の遷移を仮想リンクと考えると,ビューを基本とする利用者インタフェースは仮想ハイパーメディアと見なせる.
オミックスデータから薬物の標的分子を網羅的に予測するための機械学習法の開発

薬物・標的タンパク質間相互作用の同定は、医薬品開発において最重要課題である。ポストゲノム研究では、ゲノム、トランスクリプトーム、プロテオームなどの遺伝子やタンパク質に関する大量のオミックスデータが得られるようになってきた。同時に、膨大な数の化合物や薬物に関するケミカル情報や生理活性情報も蓄積されている。本研究プロジェクトでは、そのような薬物やタンパク質に関する膨大なオミックスデータを融合解析し、未知の薬物・標的タンパク質間相互作用を予測するための機械学習の手法を開発することを目的としている。初年度である平成25年度は、薬物やタンパク質に関する様々なデータを収集し、薬物・タンパク質ペアの特徴を表現する手法の開発を行った。薬物の化学部分構造、副作用、タンパク質の機能ドメインなどの様々なデータを記述子で表し、それを組み合わせることで薬物・タンパク質ペアの特徴をフィンガープリント(高次元のバイナリ特徴ベクトル)で表現する方法を提案した。次に、薬物・タンパク質間相互作用ペアを解析する手法を開発した。機械学習の分野で有望視されている分類器を適用し、各薬物・タンパク質ペアを相互作用の可能性を予測した。同時に、相互作用に関連があるとモデルから推測される薬物の化学部分構造、副作用、機能ドメインなどの特徴を抽出し、生物学的な考察を行った。またクロスバリデーション実験によってその有用性を確認した。提案手法と解析結果について、国際学術雑誌(BMC Systems Biology誌やMolecular Informatics誌など)への論文発表を4件行った。平成26年度は、薬物やタンパク質に関する様々なデータを追加的に収集し、薬物・タンパク質ペアの特徴を記述子として表現する手法の改良を行った。薬物の化学部分構造、薬理作用、タンパク質の機能ドメイン、パスウェイなどの様々なデータを組み合わせて、薬物・タンパク質ペアの特徴を高次元の連続値ベクトルで表す記述子を構築し、昨年度に検討したフィンガープリントとの性能比較を行った。教師付き学習に基づく機械学習の分類モデルを適用し、薬物・タンパク質ペアの相互作用を予測した。同時に、相互作用に関連があるとモデルから推測される薬物の化学部分構造、薬理作用、機能ドメイン、パスウェイに対して生物学的な考察を行った。その解析結果を検索するウェブアプリケーションを開発した。これまでの成果について、平成26年度は国際学術雑誌への論文発表を2件、国際学会での口頭発表を2件、国際学会でのポスター発表を2件、国内学会での口頭発表を6件行った。本研究プロジェクトは、おおむね順調に進展していると考えることができる。平成27年度は、前年度までに開発してきた機械学習の予測モデルを拡張し、より効率的なアルゴリズムを設計した。これまで用いた薬物の化学構造や薬理作用データでの大規模解析を行うと共に、薬物応答遺伝子発現情報を用いた薬物の標的分子の予測を試みた。小規模データでの解析であるが、遺伝子発現プロファイルを用いる事で薬物の化学構造の依存せずに標的分子の予測ができ、作用機序の理解に繋がることを確認した。薬物の標的分子の網羅的予測を行い、その結果の生物学的な考察や妥当性の検証を行った。予測された標的タンパク質を通じて、薬物が本来開発された疾患とは別の疾患への効能発見の可能性も検証した。これまでの成果について、平成27年度は国際学術雑誌への論文発表を4件、国際学会での口頭発表を4件、国内学会での口頭発表を8件行った。本研究プロジェクトは、おおむね順調に進展したと考えることができる。

平成26年度は、薬物やタンパク質に関連する様々なデータの収集を引き続き行い、データの更なる拡充を行った。それらのデータに基づき、薬物やタンパク質の特徴を表す記述子の改良を行った。薬物の化学構造を表現するために、官能基や原子の環境情報を考慮できるKCF-Sという記述子を用いた。薬物の薬理作用情報を表現するため、FDA AERSに登録されている約1万種類の副作用の報告頻度で薬理作用プロファイルを表現した。タンパク質に関しては、パスウェイ、連続アミノ酸の頻度や機能ドメインの頻度によるプロファイルを表現した。これらを組み合わせて薬物・タンパク質ペアの特徴を高次元の連続値ベクトルで表す記述子を構築し、昨年度に検討したフィンガープリントとの性能比較を行った。当初の計画通りに、薬物・タンパク質ペアの記述子の構築をすることができた。次に、薬物とタンパク質の記述子を基に、ペアワイズなカーネル回帰やスパース分類器を適用し、薬物・タンパク質ペアの相互作用ネットワークを解析および予測した。クロスバリデーション実験で性能評価した結果、薬物の薬理作用プロファイルを記述子に用いることで、化学構造に依存せずに相互作用タンパク質を予測できることが確認できた。予測された薬物・タンパク質間相互作用ペアのリストを整備し、その解析結果を検索するウェブアプリケーションを開発した。当初の計画通りに、提案手法のアルゴリズムのプロトタイプを実装することができた。これまでの成果について、平成26年度は国際学術雑誌への論文発表を2件、国際学会での口頭発表を2件、国際学会でのポスター発表を2件、国内学会での口頭発表を6件行った。本研究プロジェクトは、おおむね順調に進展していると考えることができる。27年度が最終年度であるため、記入しない。バイオインフォマティクスこれまでに行った研究の知見をもとに、提案手法の理論やアルゴリズムを更に発展させる。手法のパラメータを最適化して大規模データに適用可能なアルゴリズムを実装する。平成25年度、平成26年度で判明した問題点を修正し、アルゴリズム設計にフィードバックを与えて、提案手法の更なる改善に努める。例えば、各薬物・タンパク質ペアを高次元記述子で表す際のメモリーの大量消費問題に対処するため、提案手法にデータ圧縮の技術を導入することで、高次元記述子でも適用できるようにアルゴリズムを改良する。専門知識を持つ研究協力者と定期的に研究打ち合わせを行い、提案手法を早期に修正および改善できるように心がけ、研究プロジェクトの円滑な進行を促す。日本や欧米で承認された全て薬物に対して提案手法を適用し、より大規模な薬物・標的タンパク質間相互作用ネットワークの予測や詳細な解析を行う。
造血幹細胞の運命決定に関与する分子の同定

本研究は、造血幹細胞における未分化性維持や自己複製の分子機構解明の糸口として幹細胞群に共通する性質である色素排出機構に着目し、その責任分子の同定を目的として行ったものである。昨年度は、骨髄SP細胞(Hoechst33342色素を積極的に排出する造血幹細胞群)より全長型cDNA発現ライブラリーを作製し、遺伝子の機能的スクリーニングを行なった。その結果、造血幹細胞における色素排出機構の責任分子として、薬剤トランスポーター分子として報告されているBcrp1/ABCG2/MXR遺伝子を同定した。このBcrp1遺伝子は、ウズラ繊維芽細胞の細胞株等に強制発現させることによりHoechst33342色素を排出することから、造血幹細胞の色素排出機構を規定する分子の1つであることが示された。また、Bcrp1遺伝子の発現は、マウス・ヒトの造血幹細胞および骨髄SP細胞に特異的あることを確認した。(これらの研究成果については、同時期にBcrp1遺伝子がSP細胞に発現していることを突き止めた、Brian Sorrentino (St. Jude Children's Research Hospital)のグループとの共同研究でNature Medicine (2001,7(9);1028-1034)に報告した。)本年度は、Bcrp1遺伝子をヒトCD34陽性造血前駆細胞に強制発現させることによりHoechst33342色素を排出すること、また、造血幹細胞、赤芽球系細胞および巨核球系細胞の増殖に影響を及すことを明らかにした。(これらの研究成果については、投稿準備中である。)本研究は、造血幹細胞における未分化性維持や自己複製の分子機構解明の糸口として幹細胞群に共通する性質である色素排出機構に着目し、その責任分子の同定を目的として行ったものである。)
有機リン中毒性痙攣の危険因子、および各種抗痙攣薬の治療効果の研究

本年度は、昨年度におこなった有機リン系コリンエステラーゼ阻害薬誘発性けいれん波モデルに対するアトロピン(ムスカリン受容体遮断薬)の治療効果に着目し、その責任受容体を解明するために、選択的ムスカリン型アセチルコリン受容体(mAChR)拮抗薬の治療効果の検討をおこなった。ピレンゼピン(M1-mAChR拮抗薬)は、パラオキソンによるPS amplitudeとfEPSP slopeの低下を防止した。p-fluorohexahydro-sila-difenidolhydrochrolide(p-HHSiD:M3-mAChR拮抗薬)は、パラオキソンによるPS amplitudeの低下を防止したが、fEPSP slopeの低下は防止できなかった。メトクロピラミド(M2-mAChR拮抗薬)およびトロピカミド(M3-mAChR拮抗薬)はパラオキソンによるPS amplitudeとfEPSP slopeの低下を防止できなかった。ピレンゼピンおよびp-HHSiDは多発性スパイクの発生率とスパイク数を減少させたが、メトクロピラミドおよびトロピカミドは減少させなかった。M1およびM3 mAChRはGq/11タンパク質共役型受容体であり、この受容体の活性化はシナプス伝達を促進すると言われいている。有機リン誘発性てんかんは過剰なアセチルコリンの蓄積によるGq/11タンパク質共役型受容体刺激によって誘発される可能性が示唆された。平成26年度は有機リン系コリンエステラーゼ(以下OP-ChE)阻害薬による誘発性けいれんの実験モデルの確立、および誘発因子の検討を行った。主にラット海馬スライスからmulti electrode alley systemを用いた細胞外電位同時多点記録をおこなった。ラット海馬スライスのCA3-Schaffer collateral電気刺激により、CA1領域の錐体細胞層からpopulation spikeを、放線状層からfEPSPを記録した。同時に誘発けいれん波を発生させ、本研究モデルのコントロールとして確立させるべく実験を行った。OP-ChE阻害薬であるparaoxonはシナプス伝達強度を反映するとされるfEPSP slopeを低下させたが、細胞体興奮性を反映するとされるpopulation spike amplitudeには影響を与えなかった。またparaoxonは単独では誘発けいれん波を発生させなかった。一方、灌流液である人工髄液のカリウム濃度を上昇させる状況下では、population spike amplitudeは上昇したが、fEPSP slopeには変化を認めなかった。また、一定の高カリウム濃度においてparaoxonを適用すると、誘発けいれん波の発生を認めた。本年度の研究から、paraoxonおよび細胞外カリウムの上昇は細胞体興奮性を高め、その相乗的作用により誘発性けいれんが発生することが推測された。本年度は、有機リン系コリンエステラーゼ(OP-ChE)阻害薬誘発性けいれん波モデルに対する、有機リン中毒の臨床的治療薬であるプラリドキシム(PAM、オキシム剤)およびアトロピン(ムスカリン受容体遮断薬)の効果検討を行った。OP-ChE阻害薬誘発性けいれん波の活動性は単発の電気刺激で発生する多発性スパイクの発生率とスパイク数で評価した。PAMおよびアトロピンはパラオキソンに対する前、同時、後投与を評価した。PAMの前投与は、パラオキソンによるPS amplitudeとfEPSP slopeの低下を防止した。PAMとパラオキソンの同時投与は、PS amplitudeとfEPSP slopeを低下させた。PAMの後投与は、パラオキソンによるPS amplitudeとfEPSPの低下を防ぐことができなかったが、Wash outによりPS amplitudeの回復を認めた。また、すべての投与手段において、PAMは多発性スパイクの発生率とスパイク数を減少させなかった。アトロピンの前投与は、パラオキソンによるPS amplitudeとfEPSP slopeの低下を防止した。アトロピンとパラオキソンの同時投与は、PS amplitudeとfEPSP slopeに影響を与えなかった。アトロピンの後投与は、パラオキソンによるPS amplitudeとfEPSP slopeの低下を回復させた。また、すべての投与手段において、アトロピンは多発性スパイクの発生率を減少させた。前投与および同時投与ではスパイク数を減少させた。以上の結果から、高カリウム濃度におけるパラオキソンによる誘発性けいれん波は、わずかなムスカリン受容体刺激でも起こりうる可能性が示唆された。本年の検討では、パラオキソン誘発性けいれん波に対するPAMおよびアトロピンの治療効果を実験的に検証した。この結果は、本研究の目的であるOP-ChE阻害薬による誘発性けいれんに対する治療薬の有効性の違いを示唆するものと考えられる。

M1およびM3 mAChRはGq/11タンパク質共役型受容体であり、この受容体の活性化はシナプス伝達を促進すると言われいている。有機リン誘発性てんかんは過剰なアセチルコリンの蓄積によるGq/11タンパク質共役型受容体刺激によって誘発される可能性が示唆された。平成26年度の検討では、CA1領域でのpopulation spikeamplitudeおよびfEPSPslopeに対するparaoxonおよび細胞外カリウム濃度変化の影響を検討した。この結果は、OP-ChE阻害薬誘発性けいれん波の誘発因子の一部であると考えられ、本実験モデルのコントロールが確立したと考えられる。平成28年度は、27年度に検討できなかった、OP-ChE阻害薬誘発性けいれん波に対する各種麻酔薬、抗てんかん薬の効果を検討していく。また、現時点までの研究内容を国内外学会において発表いていく。平成27年度の検討では、本年の結果から確立したコントロールモデルを使用し、OP-ChE阻害薬誘発性けいれん波に対する各種麻酔薬および抗痙攣薬による治療効果の検討を行う予定である。実験動物および消耗品として使用予定であったが、年度末の実験計画に遅延が生じ購入を見送ったため。実験遂行に必要な材料、薬品等の消耗品として速やかに使用する予定である。
大脳皮質-大脳基底核ループによる動的運動制御機構の解明

(1)正常な大脳基底核の機能に関する研究線条体、淡蒼球外節・内節の活動を、覚醒下、課題遂行中のサルから記録し、大脳皮質刺激に対する応答や運動との相関を調べた。また、局所に薬剤を注入することにより、これらの神経活動が引き起こされるメカニズムについて検討した。(2)大脳基底核疾患の病態に関する研究MPTPを投与して作製したパーキンソン病モデルサルや、ヒト全身性ジストニアの原因遺伝子であるDYT1遺伝子を組み込んだジストニアモデルマウス、さらにはステレオ手術時に大脳基底核疾患患者などから大脳基底核の神経活動を記録することにより、これら大脳基底核疾患の病態について検討した。その結果、ハイパー直接路・直接路・間接路が順にダイナミックに働くことにより、不必要な運動が抑制され、必要な運動のみが正確なタイミングで引き起こされるというモデルが妥当であり、これによってある程度、大脳基底核疾患の病態を説明できることが示された。サルに上肢を使った遅延期間付きの到達運動課題を訓練しておく。訓練が完成後、一次運動野上肢領域(MI)、補足運動野上肢領域(SMA)を電気生理学的に同定し、刺激電極を設置する。回復後、薬物注入と記録が同時に行える電極を淡蒼球に刺入し、主に投射ニューロンから記録を行ったところ、以下のような結論を得た。(1)大脳皮質刺激に対して、淡蒼球ニューロンは早い興奮、抑制、遅い興奮の3相性のパターンで応じる。課題との関連を調べると、遅延期間に応じるものや、運動そのものに応じるものなどがあった。また、反応のパターンとしては、抑制されるものもあったが、多くは興奮性応答を示した。(2)記録している局所にNBQX(AMPA/kainate受容体の拮抗薬)とCPP(NMDA受容体の拮抗薬)の混合液を局所注入したところ、大脳皮質刺激による早い興奮と遅い興奮は減少した。それに伴って、運動時の興奮性応答も減少する傾向にあり、なかには抑制性反応に転じるものもあった。(3)さらにgabazine(GABA_A受容体の拮抗薬)を注入すると、大脳皮質刺激による抑制が減弱し、それに伴って、運動遂行時の反応も殆ど消失した。以上の実験結果は、淡蒼球での興奮性応答は、視床下核からのグルタミン酸入力によるものが大きいこと、また、主な入力としては、視床下核に加えて、線条体からのGABA性入力であることがわかった。一方、大脳基底核疾患の病態を調べる目的で、ジストニアモデルマウス、およびジストニア患者の定位脳手術に立ち会い、記録を行った。両者とも淡蒼球外節・内節の発射頻度が減少していると同時に、大脳皮質刺激によって淡蒼球外節・内節で観察される抑制が増強していることがわかった。この抑制の増強が、ジストニアの病態を考える上で重要であることが示唆された。大脳基底核の中で淡蒼球内節は、大脳皮質運動野からの入力を、大脳基底核の入力部である線条体と視床下核、および中継核である淡蒼球外節を介して受けている。淡蒼球内節は大脳基底核の外へ出力を送り、運動遂行に重要な役割を果たしていると考えられる。本実験では、覚醒下サル淡蒼球内節から細胞外活動を記録することにより、視床下核からのグルタミン酸作動性入力と、線条体と淡蒼球外節からのGABA作動性入力が、淡蒼球内節の自発発射活動や皮質由来の神経活動をどのようにコントロールしているのか調べた。皮質刺激によって淡蒼球内節のニューロンは、早い興奮+抑制+遅い興奮の3相性の応答パターンを示す。局所にNMDA受容体の拮抗薬であるCPPやAMAP/kainate受容体の拮抗薬であるNBQXを微量注入すると、淡蒼球内節の発射頻度が減少すると同時に、皮質刺激によって誘発される早い興奮と遅い興奮が消失した。また、GABA_A受容体の拮抗薬であるgabazineを局所注入すると発射頻度が上昇し、発振する傾向を示すと同時に、皮質由来の抑制が消失した。これらの結果は、皮質刺激において淡蒼球内節でみられる早い興奮、抑制、遅い興奮が、それぞれハイパー直接路(大脳皮質-視床下核-淡蒼球内節)、直接路(大脳皮質-線条体-淡蒼球内節)、間接路(大脳皮質-線条体-淡蒼球外節-視床下核-淡蒼球内節)を経由していること、また、これらの入力が淡蒼球内節の自発発射パターンを制御していることを示している。

また、昨年度に引き続き、大脳基底核疾患の病態を調べる目的で、ジストニアモデルマウス、およびジストニア患者の定位脳手術に立ち会い患者から記録を行った。両者とも淡蒼球外節・内節の発射頻度が減少していると同時に、大脳皮質刺激によって淡蒼球外節・内節で観察される抑制が増強していることがわかった。この抑制の増強が、ジストニアの病態を考える上で重要であることが示唆された。大脳皮質-大脳基底核ループの病態生理を明らかにする目的で、大脳基底核疾患のうちジストニアの病態生理について調べた。モデル動物として、ヒト全身性ジストニアであるDYT1ジストニア患者の原因遺伝子であるDYT1を組み込んだ遺伝子改変マウスを用いた。このマウスは、持続的に回転運動をするなど行動が亢進している。筋電図を記録してみると、主動筋と拮抗筋の共収縮、持続的収縮などジストニアに特徴的な異常な筋活動を示した。覚醒下で大脳基底核から神経活動を記録すると、淡蒼球外節と内節において、バースト発射やポーズ(休止期間)を伴う発射頻度の減少が見られた。大脳皮質運動野を電気刺激すると、淡蒼球外節・内節において、正常例においては観察されない早い興奮とそれに引き続く長い抑制という応答が観察された。また、大脳皮質運動野の上肢領域と口腔顔面領域を刺激し応答を記録することにより体部位局在を調べたところ、淡蒼球外節・内節の体部位局在が乱れていた。以上の結果からジストニアの病態について考えてみると、大脳皮質からの入力によって、淡蒼球内節に生じる長く続く抑制が、視床・大脳皮質を脱抑制することによって、不随意運動が起こっていると解釈できる。また、体部位局在が乱れていることから、ひとつの体部位の運動を意図した場合、他の体部位の視床・大脳皮質にも興奮が広がることが予想され、これはヒトジストニア患者で見られる筋電図のオーバーフロー現象に相当すると考えられる。