hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
腎障害の進展における抗酸化防御機構の関与

有用な免疫抑制薬であるシクロスポリンによる腎障害が問題となっている。抗酸化防御機構の司令塔、Keap1-Nrf2系が不活化されたマウス、および恒常的に活性化しているマウスにてこの腎障害を検討した。Keap1-Nrf2系の不活化により腎臓の酸化ストレスの増加、尿細管障害の増強があり、シクロスポリンは腎臓の酸化ストレスを増強させる一方、抗酸化防御機構の作動を介して酸化ストレスや腎障害を軽減していた。Keap1-Nrf2系が恒常的に活性化されたマウスでは、予測に反して腎障害の軽減を認めず、酸化ストレスとは独立した別のメカニズムも腎障害に関与していることが示唆された。Nrf2欠損マウスを用いて、シクロスポリン(CyA)投与による腎障害を検討した。腎組織では間質繊維化はごく軽度で、CyA投与による有意な線維増生を認めるに至らなかった。各種遺伝子発現の検討をwild type+vehicle(WT+veh)群、knockout(KO)+veh群、WT+CyA群、KO+CyA群の4群に分けて検討した。繊維化の指標としてTGFβ1mRNAを検討した。CyA投与によりTGFβ1の発現はやや減弱した(約70%程度になる)が、Nrf2欠損マウスにCyAを投与するとTGFβ1の発現は増加傾向(1.2倍程度になる)を示し、組織学的にはKO+CyA群における繊維化の増悪は明らかではなかったものの、TGFβ1発現は増悪傾向が認められた。次にNrf2の下流にある抗酸化防御遺伝子として、hemoxygenase-1(HO-1)、NQO1、GTSM1を検討した。この中でCyA投与により発現増強を認めたのはHO-1のみで、約6.7倍となった。この発現増強は、Nrf2欠損マウスでは約3分の1に抑制された。HO-1はTGFβ1の発現を抑制することが知られており、Nrf2欠損マウスではCyA投与時のHO-1発現が十分でなく、結果としてTGFβ1の発現が増強したと考えた。尿細管障害の指標としてVnn1、Kim1の発現を検討したところ、CyA投与によりKim1発現の著明な増強を認めた。Nrf2欠損の影響として、一部の個体でKim1発現がさらに増強する現象が見られたものの、個体差が大きく、有意差を呈するには至らなかった。Keap1ノックダウンマウスを用いた検討をするべく、マウスの繁殖を行ったが、繁殖に時間を要しており、十分な個体数を得るまでに至っていない。野生型マウス(WT)およびNrf2ノックアウトマウス(KO)に、コーン油(WT+veh群とKO+veh群)またはCyA(WT+CyA群とKO+CyA群)を腹腔内投与し、腎組織MDA定量、各種遺伝子発現を検討した。Nrf2の下流にある抗酸化防御因子であるHO-1, NQO1, GSTM1の遺伝子発現を検討したところ、CyA投与により発現増強したのはHO-1のみで、この発現増強はNrf2 KOマウスでは著明に抑制されたことから、Nrf2を介した現象であることが示された。腎繊維化は組織学的には顕著に出現しなかったが、繊維化の指標となるTGFb1は、WTではCyA投与の影響はほとんどなかったものの、KOではCyA投与により増強した。また、尿細管障害の指標となるKim1の発現はCyA投与で増強(平均24.8倍)し、KOでその傾向が強かった。腎の酸化ストレスの指標となる腎組織MDAは、WTではCyA投与による影響は軽微であったが、KOではCyA投与により有意に増加した(WT+veh群0.056±0.007 vs. KO+CyA群0.139±0.012 nmol/mg.prot)。WTおよびKeap1ノックダウンマウス(KD)に、コーン油(WT+veh群とKD+veh群)またはCyA(WT+CyA群とKD+CyA群)を投与し、上記と同様の検討を行った。WTではGSTM1の発現増強は認めなかったが、KDではCyA投与により発現が増強しており、過剰なNrf2の存在が関与していると考えられた。KD+CyA群ではHO-1のみならずGSTM1の発現も増強し、抗酸化防御機構が十分に作動することから、腎障害の軽減を予測したが、腎TGFb1、Kim1の発現はバラツキが大きく有意差はなく、むしろ一部のマウスでは増強されており、予測と反する結果であった。Nrf2ノックアウトマウスにおいて糸球体ポドサイト特異的な障害を惹起した。蛋白尿に関しては、対照群と同程度の高度蛋白尿を呈した。糸球体硬化の評価については、スコアリングによる評価、およびネフリンの染色性などを指標に評価している。

傾向としてはNrf2遺伝子の不活化により糸球体障害が増悪しているが、顕著な差異を認めない。Nrf2ノックアウトマウスにおいてシクロスポリン腎障害を惹起するモデルについては、シクロスポリンによる腎障害が軽微なものにとどまってしまったため、評価が困難な状況となっている。投与量、投与法について再検討を開始している。Nrf2マウスの飼育については、年度途中において、ヘテロ接合体の妊孕性が低下し、コロニーの維持が困難となってしまった。そのため、人工授精した受精卵を仮親に移植してヘテロ接合体を得る作業を必要とした。Keap1ノックダウンマウスにおいて糸球体ポドサイト特異的な障害を惹起したマウスにおいては、蛋白尿の出現が抑制され、また、糸球体硬化病変の軽減を認めた。このモデルにおいて、Keap1との結合を免れたNrf2蛋白が核内において過剰に存在していることを証明することを試みている段階である。Keap1ノックダウンマウスの飼育はCGEHDにて実施している。原因は不明であるが、Keap1ノックダウンマウスにおいては、腎盂の拡大を伴った腎奇形を有する確率が高いことが観察された。その割合はおよそ3分の1から、時に2分の1程度のこともあり、実験に支障を来している。何故水腎症を呈するのかについては、本研究の目的とやや異なるが、小児における腎障害を来す原疾患として腎尿路奇形が注目されていることから、この点についても研究の余地があると考えるに至っている。Nrf2ノックアウトマウスを用いた実験系では、CyAにより腎臓でのHO-1発現が増強しており、その増強はNrf2を介していることが今回の検討で証明された。しかしながらシクロスポリンによる腎繊維化の程度が軽微であったため、投与量を変えて検討する必要が生じた。従来の投与量よりも多い50mg/kgを投与しても著明な繊維化を得ることはできなかったが、100mg/kgの投与では投与中に個体の死亡が多くなるため、最大投与量として50mg/kgの投与を選択した。組織学的な解析は当初PAS染色を用いて行い、後に繊維化を定量化する目的でシリウスレッド染色を行ったが、線維増生を有意に示すことができなかった。そのため、遺伝子発現を主に観察することを目的として、動物実験を行った。Nrf2欠損の影響として、すぐ下流にある遺伝子発現は著明に抑制されているが、最終的に繊維化に影響を与える点については、明確な関連性を見いだすことにやや難航している。CyA投与による腎繊維化が従来の報告に比して軽微である原因は不明であり、その点でも実験の進行が遅れ気味となっている。Keap1ノックダウンマウスでNrf2欠損マウスと同様の検討を行うことでNrf2の関与がより明確になるものと考えているが、繁殖を始めるにあたり、当初、交配がうまくいかず、個体数を増やすのに時間を要している。nullalleleを有する系統のマウスと、loxP配列を有する系統のマウスの2系統を十分に増やしてからでないと、null alleleとloxP配列を有するコンパウンドへテロ接合体を有する目的のマウスを一度に十分量提供できないため、現在叙述の2系統を増やしている。最終的に実験に使用するコンパウンドへテロマウスの十分な個体数を得るためには、人工受精を行ってでも多くの同胞を得ることを計画している。Nrf2ノックアウトマウスを用いた実験系では、コロニーを増やす際に、従来飼育していたヘテロ接合体の妊孕性が低下しており、次第にコロニーの維持が困難となる事態に陥った。
特異的タンパク質分解による新規活性型Ras分子標的癌治療薬の開発

本研究課題では、標的特異的タンパク質分解法によって、最も有名な癌遺伝子産物の一つ活性型Rasタンパク質の分解を誘導する化合物(SNIPER)の開発を目指す。今回、2種類のSNIPERを合成したが、何れのSNIPERもRasタンパク質を分解する活性を有していなかった。さらにRasタンパク質に結合する化合物を同定するために、in silico docking simulationを行い728個のRasリガンド候補化合物を得ることが出来た。また、対象とした標的タンパク質が、実際にプロテインノックダウンによって分解出来るか否かを事前に検証できるシステムも別途構築した。rasは腫瘍全体の約3分の1で活性化変異が認められている最も普遍的な癌遺伝子であり、その産物である低分子量Gタンパク質Rasは抗腫瘍薬開発上、最も有効な分子標的の一つと考えられる。本研究課題では、Specific and No-genetic IAP-dependent Protein eraser(SNIPER)を用いたプロテインノックダウン法によって、癌細胞中の活性型Rasタンパク質を特異的に標的し、分解に導くための基盤技術を開発することを第一の目的とするため、活性型Rasに特異的に結合するリガンドの同定が必須である。これまでに、少なくとも8種類のRasタンパク質結合低分子化合物候補を得ており、これらのリガンド候補をビオチンで標識し、in vitro pull-down assayを行い実際にRasタンパク質に結合する活性があるかどうかを検証した。その結果、2種類の化合物は実際に細胞内でRasタンパク質に結合することが確認できたため、これらの化合物とベスタチンのハイブリッドSNIPER (Ras)を合成した。しかしながら、これらの化合物由来のSNIPER (Ras)は細胞に作用させてもRasタンパク質を分解する活性を発揮しなかった。一方、活性化型Rasに特異的に結合するリガンドをスクリーニングすることに平行して、Rasタンパク質が実際にSNIPERによってユビキチン化され、プロテアソームによる分解に導く事が可能かどうかを検証するためのシステムを構築中である。本検証システムは、発現ベクターによってタグ付きのRasを培養細胞に発現させて、そのタグに対する特異的リガンドを用いたプロテインノックダウンを行い、発現させたRasを分解に導くというものである。本検証システムによって、Rasに対するプロテインノックダウンの効果を事前に予測することが可能となる。rasは腫瘍全体の薬3分の1で活性化変異が認められている最も普遍的な癌遺伝子で有り、その産物である低分子量Gタンパク質Rasは抗腫瘍薬開発上、最も有効な分子標的の一つと考えられる。本研究課題では、Specific and Nongenetic IAPs-dependent Protein ERaser(SNIPER)を用いたプロテインノックダウン法によって、癌細胞中の活性化型Rasタンパク質特異的に標的し、分解に導くための基盤技術を開発することを第一の目的としている。そのため、本研究の目的達成には(活性化型)Rasに特異的に結合するリガンドの同定が必須ある。我々は過去の報告を参考にして、少なくとも8種類の低分子化合物をRasタンパク質結合リガンド候補として合成した。これらの化合物はビオチン標識し、in vitro pull-down assayにて実際にRasタンパク質に結合する活性があるかを検証した。その結果、2種類の化合物が実際にRasタンパク質と相互作用することが確認できたため、これらの化合物とベスタチンのハイブリッドを合成(SNIPER化)し、その活性を評価した。しかしながら、これらの化合物由来のRasに対するSNIPERは、細胞内でRasタンパク質を分解する活性を有していなかった。次に我々は、in silicoドッキングシミュレーションを実施し、活性化型KRasに結合する化合物群を網羅的に解析した。従来までの同様のスクリーニングはRasの酵素活性の阻害を指標にしていたため、どうしても狙うポケットが限られていたが、我々のプロテインノックダウン法を基礎とした方法では酵素活性の阻害は必要ない。即ち、いわゆるsilent binderをスクリーニングすれば十分であるため、先行研究とは違った戦略でスクリーニングを行うことが出来た。その結果、複数の候補化合物を同定することが出来、二次スクリーニングを経て、順次SNIPER化し、活性を評価していく予定である。医歯薬学同定したRasタンパク質結合低分子化合物(リガンド候補)を用いて合成したSNIPER (Ras)がRasタンパク質を分解する活性を有していなかったため、リガンド候補の探索に立ち戻らなくてはならない。また、複数のリガンドスクリーニングの系を計画していたが、系の立ち上げ自体に時間を要している。これまでの研究計画通り、リガンドのスクリーニング、リガンドとベスタチンのハイブリッド(SNIPER)の作製、および作製したSNIPERの活性の評価、分子構造のチューニングを行う予定である。また、Rasに対するプロテインノックダウンの効果を事前に予測するシステムが立ち上がり次第、本システムによる検証を行う予定である。年度末に参加した学会の旅費の支払いを26年度にまわしたため。25年度末に参加した学会の旅費の支払いに充てる。
児童・青年期の解離傾向-その発達因とこころの問題に与える影響について

昨年度から継続したものとして、論文に関しては、既に投稿していた英語論文1本の修正と再投稿を行い、今年度採択に至った。内容は、侵入記憶と解離の関連性についての研究であり、解離は、他のファクターを考慮しても、侵入記憶の強さに独立に影響を与える因子であることが明らかになった。また、国内論文1本の修正と再投稿を行い、採択となった。内容は、解離の防衛機制としての特徴に関する研究であり、解離は回避的な要素が強いことを明らかにした。また、学会発表に関しては、海外での発表を一つと、国内での発表を二つを行った。今年度は、解離のうつに与える影響および親から受けた養育態度との関わりについての研究報告を、神戸で行われた世界心身医学会議にて発表し、さらに知見をまとめて海外ジャーナル2誌に投稿した。これらについては現在審査中である。研究内容を概説する。養育態度が後のうつ傾向に与える影響は一般に知られており、配慮のなさや過保護や養育態度の影響性が報告されてきた。またその関係性を媒介する心理的ファクターについても、自尊感情や原因帰属などの様々な要因が取り上げられてきた。本研究ではストレスへの防衛機制である解離を新たな媒介変数としてとりあげ、養育態度とうつへの関係性への影響力を検討した。また、認知行動療法の知見から、うつと強い関連があるとされている回避的コーピングをとりあげ、その影響力について、解離傾向のそれとの比較検討を同時に行った。その結果、解離は過保護な養育態度や一貫性のない養育態度によって促進され、その結果うつ傾向にも強い影響を与えていることが明らかになった。回避的コーピングとの比較においては、解離傾向の方がうつ傾向に対して強い影響力を持っていることが示された。それと平行して、自傷行為および自殺企図と解離の関係性についての調査は、N大学病院精神科にて今年度は50程度のデータコレクションを行った。来年度も引き続きデータを収集していく予定である。来年度は、記憶の特異な一側面とされる侵入記憶と解離の関連性についての研究を行う予定である。侵入記憶はPTSD(Post-traumatic Stress Disorders:心的外傷後ストレス障害)患者に特異な症状とされているが、そのメカニズムについてはあまり知られていない。PTSDの理論を元に、感情の不安定性、思考抑制、そして解離傾向などの心理的ファクターをとりあげ、その影響性についての比較検討を行う予定である。今年度は、そのための文献調査および日本心理学会やトラウマティックストレス学会に参加しての調査活動を行った。既に投稿していた英語論文二本の修正と再投稿を行い、今年度採択に至った(11.研究発表欄参照)。養育態度と抑うつの関係性が、ストレスへの防衛機制である解離によって、どのような影響を受けているのかについて検討した。その結果、過保護な養育態度や一貫性のない養育態度が、解離傾向を促進し、結果的に抑うつ傾向を強めていることが明らかになった。今年度は新たに、記憶の特異な一側面とされる侵入記憶と解離の関連性についての研究を行った。PTSDの理論を元に、感情の不安定性、思考抑制、反すう傾向、そして解離傾向などの心理的ファクターをとりあげ、その影響性についての比較検討を行った。その結果、解離は、他のファクターを考慮しても、侵入記憶の強さに独立に影響を与える因子であることが明らかになった。その知見を海外のジャーナルに投稿し、現在審査中である。またH19年度は、その結果を、海外の学会でも報告予定である。それ以外にも、解離の防衛機制としての特徴を明らかにしたものをまとめ、国内のジャーナルに投稿し、現在審査中である。それと平行して、自傷行為および自殺企図と解離の関係性についての調査は、N大学病院精神科にて今年度までに100程度のデータコレクションを行った。
紫外線誘発DNA損傷6-4光産物の哺乳類細胞における損傷乗り越え複製

本研究では紫外線により誘発されるDNA損傷の一つである6-4光産物(6-4PP)の損傷乗り越え複製(TLS)機構と、それに伴う突然変異誘発の分子機構の解析を目的として、さまざまなTLSポリメラーゼ欠損細胞を用いて細胞内TLSアッセイを行った。その結果、主要なTLSポリメラーゼであるPolη(イータ)、Polι(イオタ)、Polκ(カッパ)をすべて欠損した細胞でも6-4PPに対するTLS活性がみられ、細胞内ではこれらのTLSポリメラーゼ以外に複製ポリメラーゼ等が6-4PPのTLSに関わっている可能性が示唆された。一方でPolζ(ゼータ)の活性サブユニットであるRev3欠損細胞ではTLS活性が消失することから、Polζが6-4PPのTLSを完了するために必須のextenderであることが示された。そこでPolζによる突然変異誘発メカニズムについてさまざまな配列中の6-4PPを用いて解析したところ、Polζは損傷の次の塩基に対して高い頻度で突然変異を引き起こすこと、およびその変異頻度はDNA損傷前後の塩基配列の影響を大きく受けることが明らかとなった。1.基質の高効率な作成方法の確立部位特異的損傷乗り越え複製アッセイ(細胞内TLSアッセイ)の基質となる、化学合成損傷塩基を含む閉環状プラスミドの高効率な作成方法を検討した。その結果、一本鎖プラスミドDNAに損傷塩基を含むオリゴヌクレオチドをアニーリングさせ、DNAポリメラーゼによるDNA合成とライゲーションを同時に行うことで、簡便かつ非常に効率よくcccDNAを得る方法を確立した。2.細胞内TLSアッセイを用いた6-4PPに対するTLS効率と正確さの解析上記1.の方法により作成した基質を用いてさまざまなTLSポリメラーゼ欠損細胞でアッセイを行った。その成果の一つとして、ミスマッチ修復因子の一つであるMsh2欠損細胞では6-4PPの3'に対する誤った塩基の取り込み頻度が有意に上昇することから、ミスマッチ修復機構が損傷乗り越え複製と共役して紫外線誘発突然変異の抑制に働くことを明らかにした。この結果は共同研究者であるオランダのグループとともに現在投稿準備中である。3.TLSポリメラーゼ欠損細胞の紫外線感受性および突然変異誘発頻度解析TLSポリメラーゼ欠損細胞を用いた紫外線感受性および紫外線誘発突然変異頻度解析により、これまで"誤りがちな"TLSポリメラーゼと考えられてきたPolκが紫外線誘発突然変異の抑制に働く可能性を見出し、第33回日本分子生物学会年会・第83回日本生化学会大会合同大会(BMB2010)にて学習院大学理学部の学生と共同で研究発表を行った。本研究では紫外線により誘発されるDNA損傷の一つである6-4光産物(6-4PP)の損傷乗り越え複製(TLS)機構と、それに伴う突然変異誘発の分子機構の解析を目的として、さまざまなTLSポリメラーゼ欠損細胞を用いて6-4PPの細胞内高感度損傷乗り越え検出アッセイ(細胞内TLSアッセイ)を行った。その結果、損傷に対して直接塩基を取り込むinserterとして働く主要なTLSポリメラーゼであると考えられているPolη、Polι、Polκをそれぞれ欠損した細胞では6-4PPの3'Tに対する誤った塩基の取り込み頻度に差があるものの、全体としてTLS活性はほぼ同程度であった。さらに、意外にもこれらのinserterをすべて欠損した三重欠損細胞においても野生型細胞とほぼ同程度の6-4PPのTLS活性がみられ、細胞内ではこれらのTLSポリメラーゼ以外に複製ポリメラーゼ等他のDNAポリメラーゼが6-4PPのTLSに関わっている可能性が示唆された。

一方でPolζ(ゼータ)の活性サブユニットであるRev3欠損細胞ではTLS活性が消失することから、Polζが6-4PPのTLSを完了するための伸長反応に必須のextenderであることが示された。そこでPolζによる突然変異誘発メカニズムについてさまざまな配列中の6-4PPを用いて解析したところ、損傷の次の塩基に対して高い頻度で突然変異を引き起こすこと、およびその変異頻度はDNA損傷前後の塩基配列の影響を大きく受けることが明らかとなった。さらに、ミスマッチ修復因子の一つであるMsh2欠損細胞では6-4PPの3'に対する誤った塩基の取り込み頻度が有意に上昇することから、ミスマッチ修復機構が損傷乗り越え複製と共役して紫外線誘発突然変異の抑制に働くことが明らかとなった。本研究では紫外線により誘発されるDNA損傷の一つである6-4光産物(6-4PP)の損傷乗り越え複製(TLS)機構と、それに伴う突然変異誘発の分子機構の解析を目的として、さまざまなTLSポリメラーゼ欠損細胞を用いて細胞内TLSアッセイを行った。その結果、主要なTLSポリメラーゼであるPolη(イータ)、Polι(イオタ)、Polκ(カッパ)をすべて欠損した細胞でも6-4PPに対するTLS活性がみられ、細胞内ではこれらのTLSポリメラーゼ以外に複製ポリメラーゼ等が6-4PPのTLSに関わっている可能性が示唆された。一方でPolζ(ゼータ)の活性サブユニットであるRev3欠損細胞ではTLS活性が消失することから、Polζが6-4PPのTLSを完了するために必須のextenderであることが示された。そこでPolζによる突然変異誘発メカニズムについてさまざまな配列中の6-4PPを用いて解析したところ、Polζは損傷の次の塩基に対して高い頻度で突然変異を引き起こすこと、およびその変異頻度はDNA損傷前後の塩基配列の影響を大きく受けることが明らかとなった。24年度が最終年度であるため、記入しない。
養液栽培における根域統合環境制御に向けた根の生理機能の環境応答解析

本研究の目的は,養液栽培における根域の物質移動現象を解析し,持続的かつ生産性の高い肥培管理法を提案することである。この目的を達成するために,本年度(2年度目)においては,根のイオン吸収のモニタリングとモデル化を進め,さらに余剰廃液削減方法について検討した。課題Iでは,人工光型植物工場において数品目の作物(リーフレタス,サラダナ,イチゴ,トマト,ナス,ピーマン)を育成し,様々な環境の下で養水分吸収速度を評価した。測定時に異なる条件に制御した環境としては,昨年度までに実施した養液温度および養液濃度に加えて,根域酸素濃度についても検討した。課題IIでは,培地耕条件下における根域環境の解析と調節法の検討を目的として,培地耕条件下における根の養水分吸収速度と培地含水量および酸素量との関係を解析した。培地内の環境は,前年度までに構築した計測システムを用いて測定した。培地耕条件下における養分吸収速度に対する根域環境の影響は,既存の水耕栽培条件下で構築した蒸散統合型養分吸収モデルを応用することで表現できることを明らかにした。課題IIIでは,余剰廃液の節減に向けた肥培管理法の開発を目的として,根の生理モデルに基づいた根域養分動態のシミュレーションを試みた。本年度では窒素に着目した。根における窒素吸収速度に加えて,植物の成長速度および代謝速度と環境との関係をモデル化することで,根域の養分動態をより精度良く,長期間に渡ってシミュレーション可能であることを明らかにした。課題Iおよび課題IIでは,培地耕条件下における養水分吸収と各種環境要素との関係を測定し,モデルにより解析した。これらの測定の結果,それぞれの環境が養水分吸収に与える影響を定量化することができた。また,培地内水分含量および培地内水分の溶存酸素含量が養水分吸収に与える影響を評価できた。これらの結果は,培地耕条件においても,簡易に評価可能な定量的指標を用いて根の養分吸収能を把握することが可能であることを示唆しており,根域環境の統合的制御の実現に向けた知見を得ることができた。課題IIIでは,当初の目的の一つである肥培管理の最適化に応用可能な,根域養分動態のシミュレーションモデルを構築することができた。これらのことから,現在までの達成度は「おおむね順調に進展している」と判断した。今後は,これまでに実施した,培地耕条件下における環境と植物の養分吸収との関係のモデル化をふまえ,より最適な培地環境の制御条件の探索を実施する。特に,これまでの研究の過程で,養分吸収速度に加えて,植物の成長速度および代謝速度に関するモデルを統合することで,根域の養分動態を長期シミュレーション可能なモデルを構築できた。このモデル駆使して,肥料として与えた窒素を植物に効率的に全量吸収させ,栽培時に余剰な養液廃液を発生させない肥培条件を求め,その有効性を検証する予定である。本研究は,地下部および地上部の環境と植物の養分吸収との関係を,新規に構築する測定システムを用いて評価し,根の生理活性や吸収機構を考慮したモデルにより解析することを目標としている。この目的を達成するために,本年度(初年度)においては,様々な環境条件下における根の物質吸収の評価と培地耕栽培条件下における根域の環境要素の評価を試みた。課題Iでは,植物生産場の環境と植物の養分吸収との関係の解析を目標として,まず,地下部および地上部の環境を自由に設定可能な人工光型植物工場において植物サンプルを育成し,養水分吸収に対する養液温度,養液濃度および品目の作用を評価し,これまで構築してきた蒸散統合型イオン吸収モデルにて解析した。その結果,吸水速度やイオン吸収速度と養液温度および養液濃度との関係をモデルにより評価することができた。また,品目による吸水速度や養分吸収速度の違いや,イオン種間の吸収拮抗作用の程度についても定量化できた。次に,課題IIでは,培地耕条件下における根域環境の解析と調節法の検討を目的として,まず,測定に用いる培地耕式システムの培地水分条件を評価・制御するために,培地耕水分センサーを構築した。本センサーは,非常に安価な部品のみで構成され,多数のポットに設置することで,それぞれの培地水分条件を評価・制御することが可能であった。次に,培地内の酸素条件を評価するため,ニードル式マイクロ酸素濃度計を用いて培地内の酸素分布を測定し,培地内水分含量が高い条件において根の呼吸による酸素濃度の低下を測定可能であることを明らかにした。課題Iの植物生産場の環境と植物の養分吸収との関係の解析においては,まず,地下部および地上部の環境を自由に設定可能な人工光型植物工場において植物サンプルを育成し,養水分吸収に対する養液温度,養液濃度および品目の作用を評価し,これまで構築してきた蒸散統合型イオン吸収モデルにて解析した。その結果,当初の計画通り,構築した根の養水分吸収速度測定システムは,測定中の操作の多くを自動化でき,根の養水分吸収速度を簡易的に測定可能であった。また,異なる養液温度における測定の結果,養液温度が高くなるほど,根の養水分吸収速度も高くなるという関係性を評価でき,構築したシステムは根の養水分吸収速度測定に適用可能であることが明らかになった。また,吸水速度やイオン吸収速度と養液温度および養液濃度との関係をモデルにより評価することができた。

課題IIでは,まず,測定に用いる培地耕式システムの培地水分条件を評価・制御するために,培地耕水分センサーを構築した。本センサーは,非常に安価な部品のみで構成され,多数のポットに設置することで,それぞれの培地水分条件を評価・制御することが可能であった。次に,培地内の酸素条件を評価するため,ニードル式マイクロ酸素濃度計を用いて培地内の酸素分布を測定し,培地内水分含量が高い条件において根の呼吸による酸素濃度の低下を測定可能であることを明らかにした。これらのことから,当初の計画通り,培地耕条件下における根域環境を解析することができた。本研究の目的は,養液栽培における根域の物質移動現象を解析し,持続的かつ生産性の高い肥培管理法を提案することである。この目的を達成するために,本年度(2年度目)においては,根のイオン吸収のモニタリングとモデル化を進め,さらに余剰廃液削減方法について検討した。課題Iでは,人工光型植物工場において数品目の作物(リーフレタス,サラダナ,イチゴ,トマト,ナス,ピーマン)を育成し,様々な環境の下で養水分吸収速度を評価した。測定時に異なる条件に制御した環境としては,昨年度までに実施した養液温度および養液濃度に加えて,根域酸素濃度についても検討した。課題IIでは,培地耕条件下における根域環境の解析と調節法の検討を目的として,培地耕条件下における根の養水分吸収速度と培地含水量および酸素量との関係を解析した。培地内の環境は,前年度までに構築した計測システムを用いて測定した。培地耕条件下における養分吸収速度に対する根域環境の影響は,既存の水耕栽培条件下で構築した蒸散統合型養分吸収モデルを応用することで表現できることを明らかにした。課題IIIでは,余剰廃液の節減に向けた肥培管理法の開発を目的として,根の生理モデルに基づいた根域養分動態のシミュレーションを試みた。本年度では窒素に着目した。根における窒素吸収速度に加えて,植物の成長速度および代謝速度と環境との関係をモデル化することで,根域の養分動態をより精度良く,長期間に渡ってシミュレーション可能であることを明らかにした。課題Iおよび課題IIでは,培地耕条件下における養水分吸収と各種環境要素との関係を測定し,モデルにより解析した。これらの測定の結果,それぞれの環境が養水分吸収に与える影響を定量化することができた。また,培地内水分含量および培地内水分の溶存酸素含量が養水分吸収に与える影響を評価できた。これらの結果は,培地耕条件においても,簡易に評価可能な定量的指標を用いて根の養分吸収能を把握することが可能であることを示唆しており,根域環境の統合的制御の実現に向けた知見を得ることができた。課題IIIでは,当初の目的の一つである肥培管理の最適化に応用可能な,根域養分動態のシミュレーションモデルを構築することができた。これらのことから,現在までの達成度は「おおむね順調に進展している」と判断した。これまでに実施した,様々な環境条件下における根の物質吸収の評価と培地耕栽培条件下における根域の環境要素の評価をふまえて,今後は,培地耕条件下における環境と植物の養分吸収との関係の評価と制御法の確立を進めていく。課題Iでは,前年に引き続き,様々な環境条件下における物質吸収の評価と解析を進め,培地が根の物質吸収プロセスに影響を与えるメカニズムを詳細に解析し,その作用を表現する客観的な数値パラメータの導入を検討する。
脂肪幹細胞(ADSC)移植による放射線誘発急性障害、特に骨髄障害回避の検証

Aグループ:ICRメスマウスにX線7Gyを全身照射した直後に、ICRオスマウスのADSC(脂肪幹細胞)を伏在静脈(1X10^6個/500μl,iv)あるいは腹腔内(2.5X10^6個/1ml,ip)に投与し、生存率を経時的に観察した。またADSC培養上清中のエクソソームやマイクロソームも組織再生効果を示すとの報告があったので、ADSC培養上清移植群(培養上清2mlX5日,ip)も設定し実験を行なった。iv移植群は6Gy(移植群65匹、非移植群42匹)、6.5Gy(移植群43匹、非移植群24匹)、7Gy(移植群40匹、非移植群20匹)群を設定し実験を行なった。7Gy照射群は照射線量が高すぎて移植群と非移植群間の生存率に有意差はみられなかった。6.5Gy照射群は現在経過観察中で解析できる日数に到達していない。6Gy照射群は約300日を経過観察中であるが、この時点で移植群(生存率54%)と非移植群(生存率27%)の両群間に有意差がみられている。ip実験群は7Gy(移植群25匹、非移植群50匹)群を設定し実験を行い、ADSC培養上清移植群は7Gy(移植群25匹、非移植群50匹)群を設定し実験を行なったが、移植群と非移植群間の生存率に有意差はみられなかった。Bグループ:C57BL/6メスマウスにX線6.5Gy全身照射した直後に、C57BL/6オスマウスのADSCを伏在静脈(1X10^6個/500μl, iv)に投与し(移植群69匹、非移植群48匹)、生存率を経時的に観察中である。ここまでの実験で、生存率の差をみるためには66.5GyのX線全身照射が至適線量であることがわかった。ip移植ではiv移植の2.5倍のADSCを移植したが効果はみられなかった。ADSC培養上清移植群でも効果はみられず、移植細胞数やエクソソーム等の濃度を上げるなどの検討が必要であると考えられた。H30年度はADSCのiv移植だけではなく、ip移植や予定外の実験であるADSC培養上清移植を行なったが、iv移植群以外では移植群と対照群間の生存率に有意差はみられなかった。ip移植やADSC培養上清移植では移植細胞数や培養上清の濃縮等実験条件の検討を行う必要があるが、本研究はADSCのiv移植で放射線被ばくマウスの骨髄障害回避をみるのが狙いなので、31年度以降は予定通りBグループの条件で実験を進めていく。進捗状況はAグループでn数が200匹以上となり、Bグループもすでにn数は100匹となっており、実験は予定通り進んでいる。照射線量検討のための実験では、同じX線全身照射線量に対しマウス放射線感受性にロット差がみられたものの、至適線量は7Gy以下6Gy前後ということが示唆された。セルソーターを用いてADSCのみを選択収集し培養を行うプレ実験も行っており、ADSCマーカーとしてCD44+、Sca-1+、CD117-を用いることとした。移植細胞のメスレシピエント体内での動態を観察する目的で、オス由来ADSCを移植することによりY染色体上のオスマーカー遺伝子を検出するプレ実験も行い、マーカー遺伝子には予定していたSRY遺伝子やEif2s3y遺伝子ではなく、Ssty2遺伝子がマウスの場合有用であることをみいだした。同様に移植細胞のメスレシピエント体内での動態を観察する目的で、生体染色色素PKH26を用いADSC幹細胞を培養中に染色したのちiv移植を行う準備もしている。また、目的臓器の機能細胞と幹細胞を混合して移植を行うと、目的の臓器で効率よく再生が行われるとの報告があり、我々も骨髄細胞とADSC混合移植を試すために、マウスの骨髄細胞の効率的な回収方法と培養方法の実験条件策定のためのプレ実験も行なっている。H31年度以降は申請書に示した通り、グループBの実験を継続しn数を増やして、ADSCのiv移植が確実にマウス放射線被ばく群に対し延命効果があることを明確に示していく。これらの実験と並行して、セルソーターでADSCのみをCD44+、Sca-1+、CD117-をマーカーにして抽出後培養してからiv移植を行い延命効率を上げる実験を行う。また、延命効率を上げる実験として骨髄細胞とADSC混合移植を試みる計画も進めていく。延命効果の機序を解析するためにまず移植細胞のメスレシピエント体内での動態を観察する目的で、iv移植後レシピエントから継時的に臓器を取り出し、Y染色体マーカーであるSsty2遺伝子を目印にして、リアルタイムPCRを行い分子生物学的な解析を行う。さらに、生体染色色素PKH26を用いADSCを培養中に染色したのちiv移植を行って、レシピエントから移植後継時的に臓器を取り出し組織学的な解析も行うこととしている。

またADSC培養上清中のエクソソームやマイクロソームも組織再生効果を示すとの報告があったので、ADSC培養上清移植群(培養上清2mlX5日,ip)も設定し実験を行なった。iv移植群は6Gy(移植群65匹、非移植群42匹)、6.5Gy(移植群43匹、非移植群24匹)、7Gy(移植群40匹、非移植群20匹)群を設定し実験を行なった。7Gy照射群は照射線量が高すぎて移植群と非移植群間の生存率に有意差はみられなかった。6.5Gy照射群は現在経過観察中で解析できる日数に到達していない。6Gy照射群は約300日を経過観察中であるが、この時点で移植群(生存率54%)と非移植群(生存率27%)の両群間に有意差がみられている。ip実験群は7Gy(移植群25匹、非移植群50匹)群を設定し実験を行い、ADSC培養上清移植群は7Gy(移植群25匹、非移植群50匹)群を設定し実験を行なったが、移植群と非移植群間の生存率に有意差はみられなかった。Bグループ:C57BL/6メスマウスにX線6.5Gy全身照射した直後に、C57BL/6オスマウスのADSCを伏在静脈(1X10^6個/500μl, iv)に投与し(移植群69匹、非移植群48匹)、生存率を経時的に観察中である。ここまでの実験で、生存率の差をみるためには66.5GyのX線全身照射が至適線量であることがわかった。ip移植ではiv移植の2.5倍のADSCを移植したが効果はみられなかった。ADSC培養上清移植群でも効果はみられず、移植細胞数やエクソソーム等の濃度を上げるなどの検討が必要であると考えられた。H30年度はADSCのiv移植だけではなく、ip移植や予定外の実験であるADSC培養上清移植を行なったが、iv移植群以外では移植群と対照群間の生存率に有意差はみられなかった。ip移植やADSC培養上清移植では移植細胞数や培養上清の濃縮等実験条件の検討を行う必要があるが、本研究はADSCのiv移植で放射線被ばくマウスの骨髄障害回避をみるのが狙いなので、31年度以降は予定通りBグループの条件で実験を進めていく。進捗状況はAグループでn数が200匹以上となり、Bグループもすでにn数は100匹となっており、実験は予定通り進んでいる。照射線量検討のための実験では、同じX線全身照射線量に対しマウス放射線感受性にロット差がみられたものの、至適線量は7Gy以下6Gy前後ということが示唆された。セルソーターを用いてADSCのみを選択収集し培養を行うプレ実験も行っており、ADSCマーカーとしてCD44+、Sca-1+、CD117-を用いることとした。移植細胞のメスレシピエント体内での動態を観察する目的で、オス由来ADSCを移植することによりY染色体上のオスマーカー遺伝子を検出するプレ実験も行い、マーカー遺伝子には予定していたSRY遺伝子やEif2s3y遺伝子ではなく、Ssty2遺伝子がマウスの場合有用であることをみいだした。同様に移植細胞のメスレシピエント体内での動態を観察する目的で、生体染色色素PKH26を用いADSC幹細胞を培養中に染色したのちiv移植を行う準備もしている。また、目的臓器の機能細胞と幹細胞を混合して移植を行うと、目的の臓器で効率よく再生が行われるとの報告があり、我々も骨髄細胞とADSC混合移植を試すために、マウスの骨髄細胞の効率的な回収方法と培養方法の実験条件策定のためのプレ実験も行なっている。H31年度以降は申請書に示した通り、グループBの実験を継続しn数を増やして、ADSCのiv移植が確実にマウス放射線被ばく群に対し延命効果があることを明確に示していく。これらの実験と並行して、セルソーターでADSCのみをCD44+、Sca-1+、CD117-をマーカーにして抽出後培養してからiv移植を行い延命効率を上げる実験を行う。
マウス胎仔創傷治癒における炎症反応の解析

哺乳類胎仔は皮膚再生が可能だが、出生後は瘢痕を残すようになる。そのメカニズムの一部として創傷部位における炎症反応が関与していると考えられた。マウス胎仔の創傷部位を観察することにより、真皮が再生しなくなる胎生17日目の時期とほぼ一致して多数の好中球が集積するようになること、好中球を胎生早期の創部へ注射すると創傷治癒が遅延すること、好中球エラスターゼが再生を阻害する因子の候補として考えられることが分かった。哺乳類は胎生の一定時期までは皮膚再生が可能であるが、それ以後、皮膚は再生せず瘢痕を残して修復される。本研究では、創傷部皮膚における炎症反応を解析することにより、胎生期に再生が可能であるメカニズムを探求することを目的としている。胎生13日目から17日目までのマウス胎仔背部皮膚に全層切開創を作成し、創部へ集積する炎症細胞を観察した。いずれの胎齢でも受傷後24時間で細胞数が最大となることが分かった。胎生13日目においてもマクロファージの集積を認めたが、そのほとんどが活性化していない在住マクロファージであった。胎齢の進行に伴い集積する細胞数が増加し、活性化した細胞の割合が増加することが分かった。また、胎生17日目になると、それ以前には認めなかった好中球が多数綱部へ集積するようになることが分かった。以上より、炎症細胞の中でも特に活性化したマクロファージや好中球が皮膚再生を阻害している可能性が考えられた。そこで、成獣マウスの腹腔内より採取したマクロファージや好中球を胎仔の創部へ直接注射して同様に治癒経過を観察する実験を行ったところ、好中球を注射した群では、マクロファージを注射した群や対照群と比較して創傷治癒が遅れることが分かった。これらから、マウス胎仔の皮膚創傷治癒において、好中球が創部へ集積しないことが再生を可能としている理由のひとつである可能性が強く示唆された。現在のところ、好中球がもたらすどのような具体的要因により再生が阻害されるのかについては不明であるが、今後、好中球エラスターゼやMMPなどに焦点を絞って検討する予定である。これら再生を阻害する要因を除去することにより、治癒困難な創傷の治療、瘢痕の抑制など臨床への応用が期待できると考えている。哺乳類は胎生の一定時期までは皮膚再生が可能であるが、それ以後は瘢痕を残して修復される。創傷部における炎症反応がその原因のひとつであると仮定し研究を行った。マウス胎仔背部皮膚に全層切開創を作成し、創部へ集積する炎症細胞を観察した。胎生13日目から16日目の創部においては、そのほとんどがマクロファージであったが、胎生17日目以降になるとそれに加えて多数の好中球が集積するようになることが分かった。以前の研究から、胎生17日目以降の創傷では皮膚付属器を含めた真皮の構造が再生しなくなることが分かっていたが、これが好中球の集積開始時期と一致していることから、好中球が皮膚再生を阻害する一因である可能性が考えられた。実際、マクロファージや好中球を胎生13日目の創部へ注射して治癒結果を観察したところ、好中球を注射した群では、マクロファージを注射した群や対照群と比較して創傷治癒が遅れることが分かった。好中球エラスターゼは強い抗菌作用を持つと同時に、肺の線維化など生体に不利な反応も引き起こすことが知られている。皮膚の創傷治癒においても瘢痕形成に関与している可能性が考えられたため、本年度は好中球エラスターゼに注目して実験を行った。成獣ICRマウスの背部皮膚に全層欠損層を作成し、好中球エラスターゼ阻害薬を皮下注射したところ、対照群と比較して有意に創傷治癒の促進を認めた。現在、好中球エラスターゼ欠損マウスにおける皮膚創傷治癒について解析を進めている。マウスモデルにおいて、皮膚の創傷治癒が遅延するものは数多く報告されているが、野生型マウスより創傷治癒が促進されるものはほとんど存在しない。正常皮膚の創傷や難治性潰瘍の治癒を促進するために好中球エラスターゼの活性を阻害するという新規治療方法確立の可能性が示された。
心筋虚血時の細胞浮腫と細胞外カリウム,pH動態

【方法】ラット摘出心にてKe測定用電極を左室壁に刺入し'Keの経時的変化を記録した。左室内にバルーンを挿入し心機能を測定した。37°C30分潅流後,45分の全虚血とし,S群では酸素化したCP(K20mM)を6ml/minで2分間1回投与,M群ではさらに15,30分後に6ml/minで1分間投与し,虚血終了後30分の再潅流を行った。またCPにouabain0.1mM,amiloride0.2mMを添加しそれぞれMO群,MA群としM群と同様の投与を行った。【結果】S群ではKeは5.9mMよりCP投与終了時19.8±0.2mMに上昇したが、直後より減少し4分後には18.6±0.7mMまで低下した。その後上昇し45分後26.1±2.5mMに達した。M群ではKeは初回CP投与後、S群とほぼ同様の変化を示し,2回目のCP注入後20.6±0.8mMとなり,5分後17.1±1.2mMまで減少した後,再上昇した。3回目のCP注入後20.1±0.3mMとなり,7分後14.4±1.5mMまで低下した後,再上昇し,虚血末期には16.1±2.2mMに達した。Keの一時的低下はCP初回投与後よりも再投与後のほうが有意に大きかった(p<0.05)。M群はEDPで虚血末期,再潅流後にてS群に比して有意に低値を示した(p<0.01)。MO群では3回目CP投与後のKeの低下(Ke18.1±2.5mM)がM群に比して有意に抑制され(p<0.05),EDPはM群に対して有意に高値を示した(p<0.01)。またMA群でも3回目CP投与後のKeの低下(Ke16.3±0.9mM)はM群に対して有意に抑制された(p<0.05)。【総括】CP注入後にみられたKeの一時的低下はouabainによって抑制されたことから、この現象にNa-K pumpによる細胞外Kの取り込みが関与している可能性を示唆する。またこの現象がamilorideにても抑制されたことからNa-H exchangeも関与していると示唆される。CPのmultidose投与は、虚血中に蓄積した細胞外のH^+を洗い去るためNa-H exchangeを活性化させ,一時的[Na]i増加をきたすと推定される。そのためmultidose投与により誘発されたは細胞内Na蓄積はNa-K pumpをより活性化させ,Keの低下の拡大をもたらし、最終的に[Na]iを減少させ,Na-Ca exchangeにより細胞内Caが流入しCa過負荷が生ずるのをを抑制したと考えられた。

CPのmultidose投与は、虚血中に蓄積した細胞外のH^+を洗い去るためNa-H exchangeを活性化させ,一時的[Na]i増加をきたすと推定される。そのためmultidose投与により誘発されたは細胞内Na蓄積はNa-K pumpをより活性化させ,Keの低下の拡大をもたらし、最終的に[Na]iを減少させ,Na-Ca exchangeにより細胞内Caが流入しCa過負荷が生ずるのをを抑制したと考えられた。
遠隔操作型アンドロイドを用いた身体感覚転移に基づく適応的インタフェースの開発

ロボット工学と神経科学および臨床心理学の3つの分野を跨ぐチャレンジングな研究を実施した。研究分担者のマリヤムさんは、ロボットと神経科学両方のバックグラウンドを持っており、彼女の特殊な研究背景と能力を活かして、脳波計(EEG)を用いたセラビーロボットの開発に着手した。この研究の最終目標は、心的な課題を抱える人間の「こころ」を、ロボットとの相互作用によって、癒すという壮大なものである。日本国内ではアンドロイドや人型ロボットの開発が他国と比較して進んではいるものの、応用に関してはエンターテイメント的な部分での活用に留まっているのが現状である。介護や教育への活用を目論んだ研究もあるが、研究段階から次の段階には進んでいない。こうした背景にあって、具体的応用を阻んでいるのは、ロボットの外見ではなく、ロボットの(人間との)コミュニケーション能力の貧弱さであると我々は考える。セラピーロボットの開発には、これまでに無い斬新な手法で、ロボットと人間とのコミュニケーションを円滑にする必要がある。そこで、我々は、セラピー技法の1つとして用いられている「催眠」に着目した。催眠は、臨床場面では頻繁に活用されている手法である。これまで、成人(約100名)を対象とした脳活動計測実験を行った。人間の施術者が被験者と対峙している場面における脳活動状態を計測・分析することで、被暗示性と相関する脳活動が発見された。この研究は、現在も引き続き進行中であり、脳活動をリアルタイムに活用して、ロボットにフィードバックすることで、セラピーロボットに向けた研究を行っている。28年度が最終年度であるため、記入しない。
真珠腫上皮の増殖のメカニズムとその抑制機構の解明

本年度、我々は、真珠腫上皮の増殖と分化に特異的に関連する遺伝子発現について検索する目的で、(1)真珠腫上皮と正常鼓膜上皮を手術時に採取し、両者の間で幾つかの増殖、分化、細胞死に関連する遺伝子の発現量に差がないか検索しようと試みた。手術時採取した真珠腫組織からRNAの採取を試みたところ、真珠腫の検体量は僅かで、組織が比較的硬く、また同一患者の真珠腫組織内であっても形状の均一性に著しく欠けることから、信頼性の置ける品質のRNAを守備よく採取することができなかった。そこで、真珠腫上皮の遺伝子発現を調べる前段階として、より均一性があり、また破砕しやすい組織からRNAを採取し、模擬的に実験を進めることを考えた。通常の慢性副鼻腔炎と好酸球性副鼻腔炎の患者から鼻茸を採取し、組織を破砕して、RNAを採取し、リアルタイムPCRを用いて、特定の遺伝子発現について差が認められるかを検索した。その結果、幾つかの遺伝子、とくに好酸球遊走に関与すると推測される数種のケモカイン遺伝子および細胞死に関連する遺伝子について優位な差が認められた。これらの知見、経験をもとに今後真珠腫上皮についても、より効率の良いRNA採取を検討し、遺伝子発現の大小をしらべ、真珠腫の病態と関連する遺伝子を同定することを目的として研究を進めたいと考えている。具体的には、真珠腫を先天性か後天性か、弛緩部型か緊張部型かなどで細かく分類し、各型別に組織検体を多く集め、debrisを除いた、真珠腫上皮部分のみを丁寧に採取することが必要である。このとき、迅速に処置しないとRNAが壊れてしまう可能性が高い。また試料保存用のRNAlaterに浸す時間もRNAが壊れない条件をきめなければいけない。(2)昨年度より継続して真珠腫上皮細胞の培養条件について比較検討するも、いずれも、Fibloblast様の細胞のみの増殖が認められた。これらが真珠腫上皮由来のものなのか、あるいは鼓膜上皮の正常部分より由来している線維芽細胞なのかを判定するにはいまだ至っていない。両者を選別する細胞表面マーカーの同定を目指したいと考えている。(3)中耳手術、副鼻腔手術において、これら研究対象となる組織を、可能な限り一定に採取するための一助として、ナビゲーション機器を用いた手術法の検討も平行して進めた。この際、ナビゲーション手術の新しい手法についても検討した。真珠腫をめぐる研究に際し、本年度に行った研究は以下のとおりである。1.手術時に採取した、真珠腫上皮の細胞をRPMI培地にて培養し、その上皮細胞を経時的に観察した。この場合、真珠腫の上皮細胞のうちで増殖してくるものがあるが、光学顕微鏡下の観察では、いずれもfibroblast様細胞が観察された。増殖した細胞について、これが真珠腫上皮細胞由来のものか、あるいは間質細胞由来のものか分別するために、現在真珠腫上皮細胞由来のマーカーとして考えられる分子を探索中である。2.真珠腫のうち、幼少時に発見されることの多い先天性真珠腫では、先天性中耳、内耳奇形を合併することが多い。体の種々の奇形を合併している場合もある。こうした奇形をもつ患者から採血し、また真珠腫を合併する症例では、手術時に検体を採取し、すでに報告されている幾つかの難聴関連遺伝子について異常の有無を検索することで、その患者の奇形および真珠腫の発生、進行に関与する遺伝学的背景を詳しく解析したいと考えた。実際の臨床の現場では、耳の先天奇形の患者に対しては、診断、治療に難渋し、症状および画像所見、家族背景などから推測して、病名をつけている場合がほとんどであるが、より客観的に診断し、病気の発症の背景を解析したいと考えた。現在、対象患者を選択中である。3.当科では、平成17年度にBrainLabo社のVectorVisionシリーズのうち、カメラと本体が一体型であるVectorVision^<【○!R】>Compactと分離型であるKolibri^<TM>を導入した。これらを使用して、中耳真珠腫手術をより安全に行う方法を模索して、ナビゲーションガイド下の手術条件、および手術法などを検討した。(耳鼻咽喉科展望49(1),2006印刷中)4.真珠腫中耳炎の合併が疑われた症例で、外耳道が著明に角化し、狭窄している疾患を発見した。この疾患の手術標本では、表皮部分は角化が著明に堆積し、真皮乳頭部の硝子化を伴っていた。従来の外耳道閉塞性角化症、外耳道真珠腫、脂漏性湿疹などと異なる性質を比較検討した。(英語雑誌投稿中)5.真珠腫性中耳炎も含めた耳鼻咽喉科疾患のクリニカルパスの効果、有用性を検討し、報告した。(日本クリニカルパス学会7(1)21-25,2005)本年度、我々は、真珠腫上皮の増殖と分化に特異的に関連する遺伝子発現について検索する目的で、(1)真珠腫上皮と正常鼓膜上皮を手術時に採取し、両者の間で幾つかの増殖、分化、細胞死に関連する遺伝子の発現量に差がないか検索しようと試みた。

そこで、真珠腫上皮の遺伝子発現を調べる前段階として、より均一性があり、また破砕しやすい組織からRNAを採取し、模擬的に実験を進めることを考えた。通常の慢性副鼻腔炎と好酸球性副鼻腔炎の患者から鼻茸を採取し、組織を破砕して、RNAを採取し、リアルタイムPCRを用いて、特定の遺伝子発現について差が認められるかを検索した。その結果、幾つかの遺伝子、とくに好酸球遊走に関与すると推測される数種のケモカイン遺伝子および細胞死に関連する遺伝子について優位な差が認められた。これらの知見、経験をもとに今後真珠腫上皮についても、より効率の良いRNA採取を検討し、遺伝子発現の大小をしらべ、真珠腫の病態と関連する遺伝子を同定することを目的として研究を進めたいと考えている。具体的には、真珠腫を先天性か後天性か、弛緩部型か緊張部型かなどで細かく分類し、各型別に組織検体を多く集め、debrisを除いた、真珠腫上皮部分のみを丁寧に採取することが必要である。このとき、迅速に処置しないとRNAが壊れてしまう可能性が高い。また試料保存用のRNAlaterに浸す時間もRNAが壊れない条件をきめなければいけない。(2)昨年度より継続して真珠腫上皮細胞の培養条件について比較検討するも、いずれも、Fibloblast様の細胞のみの増殖が認められた。これらが真珠腫上皮由来のものなのか、あるいは鼓膜上皮の正常部分より由来している線維芽細胞なのかを判定するにはいまだ至っていない。両者を選別する細胞表面マーカーの同定を目指したいと考えている。(3)中耳手術、副鼻腔手術において、これら研究対象となる組織を、可能な限り一定に採取するための一助として、ナビゲーション機器を用いた手術法の検討も平行して進めた。この際、ナビゲーション手術の新しい手法についても検討した。