hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
智歯抜歯時に生じた重篤な舌神経障害を早期回復させる細胞生物学的研究

我々は、舌神経修復時に切除した断端神経腫をマイクロアレイ解析した結果、損傷のない舌神経の4倍以上の高発現を認めた遺伝子を20種同定した。今回、これらの20種の遺伝子によって翻訳されるタンパク質に特異的な抗体を用いて、切除した断端神経腫の標本組織を免疫組織学的に解析し、予後良好な症例に特異的分布するタンパク質を同定する。同定できたタンパク質を添加し、人為的に切断・再神経吻合を行った家兎(各群3羽)の神経再生に影響があるか確認する。コントロール群として家兎の舌神経を切断・再吻合し食事の摂取量と体重の増減を測定し、術後1カ月と術後3カ月時に創部の組織におけるマイクロアレイ解析で得られたタンパク質の定量と免疫組織学的解析を行う。マイクロアレイ解析によって得られたタンパク質を各タンパク質ごとに(各群3羽)人為的に切断・再神経吻合を行った家兎の神経縫合部位に添加する。コントロール群と同様に食事の摂取量と体重の増減を測定し、術後1カ月と術後3カ月時に創部の組織における各タンパク質の定量と免疫組織学的解析を行い、比較検討する。次に単独のタンパク質だけでなく複数のタンパク質の相互作用・相乗作用の可能性の有無を探索する。予後良好な症例に特異的に分布するタンパク質が複数存在する際に、人為的に切断・再神経吻合を行った家兎の神経縫合部位に複数添加する。添加するタンパク質はすべての掛け合わせを行う。同様に食事の摂取量と体重の増減を測定し、術後1カ月と術後3カ月時に創部の組織における各タンパク質の定量と免疫組織学的解析を行い、比較検討する。各群によって得られた値をもとに、神経再生の程度を比較検討し、神経再生に大きく影響を与える単独のタンパク質または複数のタンパク質を同定し報告する。最善の神経再生誘導法の探索につなげていきたい。神経修復時に切除した断端神経腫からcDNAマイクロアレイ解析を行った結果、損傷のない舌神経の4倍以上の高発現を認めた遺伝子を20種同定した。これらの20種の遺伝子によって翻訳されるタンパク質に特異的な抗体を用いて、切除した断端神経腫の標本組織を免疫組織学的に解析し、予後良好な症例に特異的分布するタンパク質を同定することに成功した。現在マウスの坐骨神経を用いた神経損傷後・再吻合したモデルで予後の評価中である。現在、術後1カ月後、術後2カ月後での坐骨神経での神経再生の程度を組織学的に評価を行っている。今後の研究の推進方策として、マウスでの坐骨神経の神経損傷後の再吻合モデルでの評価が終了後は、実際に家兎の舌神経を用いて舌神経損傷後の再吻合したモデルで神経再生の程度組織学的評価を行い、食事摂取量・体重の減少量も評価していく予定である。それと併行して、マイクロアレイ解析で特定した予後の良好な症例における特異的に発現したタンパク質をマウスの坐骨神経損傷・再吻合モデルの神経損傷部位に添加し、神経再生の程度を組織学的に評価する。マウスでの神経再生の評価後、同様に家兎の舌神経損傷・再吻合モデルにおいてもタンパク質を添加し、神経再生の程度を食事の摂取量・体重の減少・組織検査し、評価する。

現在、術後1カ月後、術後2カ月後での坐骨神経での神経再生の程度を組織学的に評価を行っている。今後の研究の推進方策として、マウスでの坐骨神経の神経損傷後の再吻合モデルでの評価が終了後は、実際に家兎の舌神経を用いて舌神経損傷後の再吻合したモデルで神経再生の程度組織学的評価を行い、食事摂取量・体重の減少量も評価していく予定である。それと併行して、マイクロアレイ解析で特定した予後の良好な症例における特異的に発現したタンパク質をマウスの坐骨神経損傷・再吻合モデルの神経損傷部位に添加し、神経再生の程度を組織学的に評価する。マウスでの神経再生の評価後、同様に家兎の舌神経損傷・再吻合モデルにおいてもタンパク質を添加し、神経再生の程度を食事の摂取量・体重の減少・組織検査し、評価する。実際に家兎の舌神経損傷・再吻合モデルの研究の詳細な部分を確立するために、今年度は費用の少ないマウスでの予備実験を行った。次年度では実際に家兎の舌神経損傷・再吻合モデルにおいて、神経再生を誘導するタンパク質を添加し、神経再生の評価を行うため、神経損傷後の再吻合に利用する家兎とリコンビナントタンパク質の購入に費用がかかる予定である。
トラフグ特異的寄生虫の宿主認識分子機構の解明

トラフグ鰓に特異的な寄生虫はクサフグには寄生しない。本研究はこの現象に関わる分子の同定を目指した。トラフグの膜タンパク質を昆虫細胞表面に提示させる実験系を確立することはできたが、実際の分子の同定には至らなかった。並行して両種の鰓における発現量の異なる遺伝子を探索した結果、我々がかつて体表粘液から発見した免疫関連因子、パフレクチンが含まれていた。この分子を寄生虫が逆利用して宿主特異性を示しているのかもしれない。トラフグ養殖に深刻な被害を与える寄生虫Heterobothrium okamotoiは、鰓に着底後鰓腔壁に寄生する一方、皮膚には付着するものの脱落し、クサフグでは鰓にも寄生できない。このような宿主特異性はリガンド-レセプター間の相互作用によりもたらされていると思われる。平成22年度においては、そのようなレセプターを高効率に同定するために有効であると考えられる、細胞表面ディスプレイ法の開発と至適化を行った。初めに市販の昆虫細胞発現ベクターpIBを改変し、2つのSfiIサイトをもたせた。これにモデルタンパク質としてEGFPのDNA断片を挿入したものを昆虫細胞(High Five^<TM>)に導入した。その後抗生物質により選択培養を行い、得られた細胞をフローサイトメーターに供したところ、EGFPを発現することが明らかとなった。次に、N末端にインフルエンザウイルスのノイラミニダーゼの膜貫通領域とV5エピトープを融合させたEGFPを細胞に導入し同様に解析したところ、EGFPの発現が認められた。この細胞の表面のみをビオチン化し、V5エピトープに対する抗体を用いた免疫沈降を行ったところビオチンが検出されたことから、膜貫通領域を融合させたEGFPは細胞膜上に提示されることが示された。さらに、N末端にFLAGタグを融合させたトラフグ免疫関連膜タンパク質CD8αおよびCCR7を発現させ、免疫染色後に解析を行った。これらはI型膜タンパク質および7回膜貫通型タンパク質のモデルとして選ばれたものであるが、いずれも細胞表面に提示されることが示された。以上から、本実験系を用いてトラフグ膜タンパク質を昆虫細胞の表面に提示させることが可能であると考えられ、今後鰓由来cDNAのライブラリーを発現させることにより寄生虫に対するレセプターが同定できることが期待される。まず前年度に確立した細胞表面ディスプレイにより、トラフグ特異的な寄生虫Heterobothrium okamotoiに対するレセプターの同定を目指した。トラフグ鰓の完全長cDNAを調製し、発現ベクター(pISD2)に組み込んで発現ライブラリーを得た。これを昆虫細胞(High Five^TM)にトランスフェクトさせて細胞ライブラリーを作製した。これにビオチン化したH. okamotoiの膜タンパク質、およびストレプトアビジン磁気ビーズを反応させ結合した細胞の濃縮を行った。その結果、細胞は回収できたが数が少なく、また生残率も極めて低かったために2次スクリーニングまで進めなかった。今後、実験条件を至適化したりするなどの改善が望まれる。これと並行してサブトラクティブPCR法により、トラフグとクサフグの鰓における発現量に差がある遺伝子の探索を試みた。これまで約300クローンについて配列を決定し、いくつかの候補膜タンパク質分子を得ている。この中に我々がかつてトラフグ体表粘液から発見したパフレクチンが含まれていたため、この分子に着目してさらに研究を進めた。クサフグの鰓で発現しているパフレクチンcDNAの塩基配列を決定し、これをトラフグの配列と比較することにより両者とも増幅可能なプライマーを設計した。これを用いた半定量的RT-PCRの結果、トラフグの方がクサフグよりもパフレクチンの発現量がはるかに多いことが示された。トラフグパフレクチン特異的な抗体を用いたウエスタンブロッティングでも同様の結果が得られた。これらの結果とH. okamotoiはトラフグには寄生するがクサフグにはしないこと、およびトラフグパフレクチンはこの寄生虫の虫体表面に対する結合能があることから、本来は生体防御の役割を果たしているパフレクチンを寄生虫が逆に利用することで宿主特異性が示されている可能性が考えられた。
Designing a Platform when Preferences over Trading Partners are Unknown

本研究は市場参加者間の相互アクセスを独占的に供給するプラットフォームの利潤最大化問題を考察したものである。プラットフォームは一つまたは複数のユーザーグループを市場に提供し、同一ユーザーグループ参加者同士について相互アクセスを可能にする。しかし各市場参加者が他のどの市場参加者へのアクセスに価値を見出しているかは彼らの私的情報であり、プラットフォームはその情報を収集する必要がある。本研究ではサブスクリプション価格とユーザーグループの構成が私的情報の関数として決定されるようなメカニズムデザインの問題を考え、市場参加者の私的情報を正しく集約し、外部性のある下での均衡選択の問題を解決しながらプラットフォームの利潤を最大化する最適メカニズムについて考察を行っている。特に市場参加者の数が十分に多い場合にどのようなメカニズムが最適となるかについて、各市場参加者が望ましいと感じる他の市場参加者の数の期待値が市場参加者全体と比較して多い場合と少ない場合のそれぞれについて特徴づけを行う。現在までのところ期待した成果が得られつつある。分析はほぼ終了し、論文の執筆も最終段階にある。今後は学術セミナー等での報告と学術誌への投稿へ重点を移していく予定である。本年度は主に分析及び論文の執筆に重点を置いていたため、広報活動に必要として計上した予算に未使用分が生じた。
Social Isolationのメカニズムに関する

1.制御主体の違いが不安反応に及ぼす影響:二人の被験者が電撃に対し直列につながれている状況を設定し,回避行動を行なう主体の違いが不安反応の程度に及ぼす影響について実験的に検討した.制御主体が自分である場合の不安が最も高く,最低度の不安は相手まかせの他者制御条件で見られた.2.不安反応に及ぼす他者共在の効果:回避不可能な脅威事態においては,共在他者が自分と同じ運命にあり,しかも親和的関係にある場合に最も不安が低くなることがわかった.脅威の回避可能性の如何にかかわらず,他者が共在してその他者に依存できることは,脅威事態における不安を低減させる方向に作用するものと考えられる.3.社会的孤立の実態研究として,在宅一人暮らし老人の孤独感とソーシャル・ネットワークの関係についての調査を行なったところ,ソーシャル・ネットワークの大きさと孤独感との間に有意な相関がみられた.4.恒暗閉鎖環境下の長時間隔離が睡眠・覚醒に及ぼす影響:恒暗閉鎖環境に被験者を72時間孤立させ,環境情報の急激な遮断がヴィジランスに及ぼす影響を測定した. 24時間ごとの平均睡眠時間は漸減するものの,全被験者に著明な過眠が見られた.過眠は中程度睡眠の現象と対応しており,徐波睡眠やレム睡眠の変化は少なかった.白日夢や幻覚の体験には大きな個人差が見られ,知覚・認知障害が孤立に必ず随伴するわけではないことが示された.5.社会的隔離事態における共在他者が親和と遂行に及ぼす効果:3名集団を閉鎖環境室に隔離して作業を行なわせ,一人ずつ退出させて2時間後に被験者を室内に孤立させた.被験者の不快と不安は一人残されたとき最高に達し,課題への意欲は最低になったが,被験者は情緒支持的な共在者よりもむしろ課題志向的な他者の行動を希求した.不安への対処方略として課題解決行動を行なったものと考察された.1.制御主体の違いが不安反応に及ぼす影響:二人の被験者が電撃に対し直列につながれている状況を設定し,回避行動を行なう主体の違いが不安反応の程度に及ぼす影響について実験的に検討した.制御主体が自分である場合の不安が最も高く,最低度の不安は相手まかせの他者制御条件で見られた.2.不安反応に及ぼす他者共在の効果:回避不可能な脅威事態においては,共在他者が自分と同じ運命にあり,しかも親和的関係にある場合に最も不安が低くなることがわかった.脅威の回避可能性の如何にかかわらず,他者が共在してその他者に依存できることは,脅威事態における不安を低減させる方向に作用するものと考えられる.3.社会的孤立の実態研究として,在宅一人暮らし老人の孤独感とソーシャル・ネットワークの関係についての調査を行なったところ,ソーシャル・ネットワークの大きさと孤独感との間に有意な相関がみられた.4.恒暗閉鎖環境下の長時間隔離が睡眠・覚醒に及ぼす影響:恒暗閉鎖環境に被験者を72時間孤立させ,環境情報の急激な遮断がヴィジランスに及ぼす影響を測定した. 24時間ごとの平均睡眠時間は漸減するものの,全被験者に著明な過眠が見られた.過眠は中程度睡眠の現象と対応しており,徐波睡眠やレム睡眠の変化は少なかった.白日夢や幻覚の体験には大きな個人差が見られ,知覚・認知障害が孤立に必ず随伴するわけではないことが示された.5.社会的隔離事態における共在他者が親和と遂行に及ぼす効果:3名集団を閉鎖環境室に隔離して作業を行なわせ,一人ずつ退出させて2時間後に被験者を室内に孤立させた.被験者の不快と不安は一人残されたとき最高に達し,課題への意欲は最低になったが,被験者は情緒支持的な共在者よりもむしろ課題志向的な他者の行動を希求した.不安への対処方略として課題解決行動を行なったものと考察された.1.社会的隔離事態において他者共在がストレス反応に及ぼす影響の検討大学生54名を被験者に、ホワイトノイズを脅威刺激として用い、集団的孤立事態(4条件)におけるストレス量を心拍と主観的不安測度で測定した。その結果、集団的孤立事態においては、自己制御の可能性が増大するほどストレス量が増大することがわかった。一方、個人的孤立事態においては、自己制御の可能性が低いほどストレス量の増大が認められた。このことは、集団的孤立事態においては他者への依存度が著しく増大し、決断や選択決定の主体を他者に委ねようとする傾向が強くなることを示唆する結果といえる。2.社会的孤立の応用的研究として、在宅一人暮らし老人を対象として社会調査を行ない、老人の孤独感とソーシャル・ネットワークとの関係を明らかにした。母集団は60年7月の広島県老人基本実態調査において「ひとりぐらし」と回答した者8,770人、標本として600人を等間隔抽出して、面接法による調査を実施した。回収率は69.5%その結果、ソーシャル・ネットワークの大きさと孤独感との間には有意な相関がみられ、社会的孤立下における対処手段として、対人関係の網が有効であることが明らかになった。3.隔離期間の長さと環境照度がストレス反応に及ぼす効果に関する研究志願者の中から男子大学生7名を被験者として、それぞれ1人条件で連続72時間の恒暗閉鎖環境実験を実施した。実験に耐えられず中断した2名を除く5名のポリグラフデータを分析した。主な結果をまとめると、(1)全ての被験者に過眠傾向が認められた。全期間(72時間)の合計睡眠時間は平均41時間(56.9%)に達した。

(2)睡眠・覚醒パターンの乱れは第1日目が最も激しく、完全な多相性睡眠を示し、3日目で定型的な単相性が回復した。(3)脳波のスペクトル分析から、開始後30時間ごろに最大ストレス時点があり、これ以降で負荷が軽減されることが示唆された。
周産・新生児期における薬物代謝酵素活性の特性変動を考慮した適切な医薬品投与設計

ラット新生仔肝において、薬物代謝酵素であるxanthine oxidaseとaldehyde oxidase活性変動が観察された。また、ラット胎盤においてはタンパクあたりの活性変動は認められなかったが、妊娠後期には胎盤が増加することを考慮すると、胎盤重量を考慮した医薬品投与設計が必要である。胎児や小児に使用される医薬品の多くは、その用法・用量が未承認である。現在、小児の薬物治療領域において、使用経験の少ない医薬品の投与量はYoung式やAugsberger式等を用いることにより、決定される場合が多く、薬物代謝酵素の活性変動と投与されている用量との関係は、十分に検討がなされていない。また、代謝酵素が異なる医薬品に、これらの式をすべて適応させることは極めて困難であり、小児の成長に伴う代謝酵素活性の変動を十分に反映できない。さらに、胎児期における薬物投与量も医師の経験によって決定される場合が多く、胎盤中の酵素活性変動を十分反映できていない。従って、医薬品毎における各代謝酵素の寄与率及び胎児(胎盤)・小児の成長に伴う酵素活性の変動を考慮した用量の設計が必要であると考えられる。今年度は、妊娠20日齢のラットを用い、胎仔肝および胎盤における薬物代謝酵素活性を検討した。検討を行った薬物代謝酵素は、aldehyde oxidase(AO)およびxanthille oxidase(XO)である。AOに関しては、胎仔肝および胎盤にてAO活性が観察された。(成獣肝臓の1/100)また、XOは、胎仔肝臓にその活性が認められないものの、胎盤においては、成獣ラット肝の1/8の活性が観察された。また、Western blotting法により、各組織のタンパク発現量を検討した。その結果、AOは、胎仔肝および胎盤に発現が観察され、XOは胎盤に発現が認められた。また、両代謝酵素ともタンパク発現量と活性の間に相関が認められた。組織による活性差は、タンパク発現に起因するものと考えられる。来年度は胎盤形成直後から出産直前までの酵素変動を検討するとともに、XO、AOとも種差が報告されているため、ヒトにおける変化も検討する予定がある。ラット妊娠日齢に伴う薬物代謝酵素xanthineoxidase(XO)およびaldehyde oxidase(AO)の活性変動を検討した。加えて、出生後の生後日齢に伴うXO活性変動も検討した。妊娠14,16,20日の雌ラットを屠殺後、胎盤を摘出した。同様に生後0,1,2,3,4,5,6週齢のラットを屠殺後、肝を摘出し、Cytosol画分を作成した。その後、Cytosol画分中のXO活性及びAO活性を測定した。なお、XO活性は、1-methylxanthineの酸化活性にて、AO活性は、N1-methynicotinamideの酸化活性にて評価した。ヒトにおいては、妊娠42週目の胎盤を購入し、AO活性を測定した。タンパクあたりの胎盤XOおよびAO活性を認めたものの、各妊娠日齢に伴う活性差は認めなかった。また、種の異なるヒトにおいて、胎盤中AO活性の有無を検討したところ、その活性を認めた。妊娠中は急激な胎盤重量の増加が認められることを考慮すると、組織あたりの活性は変動していると考えられる。従って、胎盤を通して、胎児に医薬品を投与する場合は胎盤中のAO活性を考慮する必要がある。出生後の新生仔に関して検討を行った結果、XO活性は生後日数に伴いその活性の上昇が認められ、4週齢にて成獣と同等の活性を示し、AOと同様の活性変動を示した。また、これら酵素活性とそれらタンパク発現量の間には相関が認められ、発育に伴うXO活性変動は、タンパク発現により制御されている可能性が示唆された。これらの結果より、XOもAO同様に成長を考慮した医薬品投与設計が必要と考えられる。
青枯病感受性誘導機構の解明と青枯病感受性感知システムの開発

フォスファチジン酸脱リン酸化酵素遺伝子の発現を指標に、青枯病菌によるベンサミアーナ植物における自然免疫抑制モデル系を開発し、フォスファチジン酸を基質とするジャスモン酸介在自然免疫誘導に関わるシグナル伝達系を明らかにした。フォスファチジン酸脱リン酸化酵素遺伝子の発現誘導には、青枯病菌が分泌する複数のエフェクターを必要とすることを明らかにした。さらに、その自然免疫は、青枯病菌のみならずベンサミアーナに病原性を示すPseudomonas syringaeにも作用し、これらの細菌はIII型分泌系を介して分泌するエフェクターによりこの自然免疫を回避することを明らかにした。感受性誘導阻害により、植物の自然免疫を活用する青枯病防除技術開発の基盤研究として、青枯病感受性誘導機構を網羅的に解明することを目的とする。そのための第一の目的である青枯病菌がIII型分泌系を介して宿主細胞内に分泌する青枯病感受性誘導を行うタイプIIIエフェクターの同定を行った。まず、青枯病菌OE1-1株のゲノム情報を基にして、OE1-1株のタイプIIIエフェクター候補遺伝子を選抜した。さらに、ベンサミアーナ植物感染3時間後の、OE1-1株でのそれらタイプIIIエフェクター遺伝子の発現を時系列的に解析し、OE1-1株において特異的に発現が誘導されるタイプIIIエフェクター遺伝子を40個選抜した。さらに、一過的発現用Agrobacteriumベクターを用いて、OE1-1株のタイプIIIエフェクターライブラリーを作製した。また、青枯病菌は、植物へ侵入直後に、細胞間隙で植物細胞表面に固着し、そしてそれに続いてバイオフィルム形成を行うことを明らかにした。そして、この細胞間隙での植物細胞表面への固着とバイオフィルム形成が、青枯病菌が宿主植物細胞内にIII型分泌系を用いてタイプIIIエフェクターを分泌するために不可欠であることを明らかにした。新規二次代謝産物であるラルフラノン類化合物6種とレクチンRS-IILがそれらに関与しており、ラルフラノン類化合物6種とレクチンRS-IILの生合成に関わる遺伝子発現制御システムを明らかにした。そして、ラルフラノン類化合物6種とレクチンRS-IILの生合成に関わるシグナル伝達系の解析から、細胞間隙液がラルフラノン類化合物6種とレクチンRS-IILの生合成に適した環境条件であることを明らかにした。タイプIIIエフェクターの分泌のタイミングについての貴重な知見を得ることができた。その目的を達成するために、第一に、青枯病菌のIII型分泌系構築機構を解明するとともに、III型分泌系を介して宿主植物内に分泌する、植物免疫阻害による感受性誘導を行うエフェクターの同定・機能解析を行う。第二に、宿主植物における青枯病感受性誘導シグナル伝達系を解明する。これらの青枯病感受性誘導に関わる青枯病菌-宿主植物相互作用の結果を基に、青枯病感受性感知システムを開発し、青枯病感受性誘導機構を網羅的に解明する。その中で、平成26年度は、(1)青枯病菌日本株における青枯病感受性誘導エフェクターの機能解析と(2)青枯病感受性誘導シグナル伝達系の解明を実施した。とくに、青枯病菌日本株のエフェクターのNicotiana benthamianaでの一過的発現系を確立するとともに、青枯病菌におけるエフェクター発現制御系の解明を行った。とくに、エフェクター遺伝子の発現を制御する新たな転写制御因子として、PrhNタンパク質を同定するとともに、PrhNによる発現制御機構と青枯病菌の病原性について解明した。さらに、先行研究で明らかになったエフェクター遺伝子の転写制御因子PrhGタンパク質とHrpGタンパク質の機能解析を行い、それぞれのタンパク質のC端に、転写活性を支配するドメインが存在することを明らかにした。また、N. benthamianaの植物免疫阻害に主要な働きをするフォスファチジン酸脱リン酸化酵素遺伝子のプロモータ領域を特定することができ、青枯病感受性感知システムの構築が可能となった。その中で、平成27年度は、(1)青枯病菌日本株における青枯病感受性誘導エフェクターの機能解析と(2)青枯病感受性誘導シグナル伝達系の解明を実施した。とくに、エフェクター遺伝子の発現を制御する転写制御因子HrpGの、植物に感染時の機能解析を行い、HrpGタンパク質は青枯病菌が植物感染時にリン酸化されることを明らかにした。アミノ酸点変異を導入しリン酸化されなくなったHrpGタンパク質は、青枯病菌細胞質内で分解され、リン酸化HrpGタンパク質は分解されないことを明らかにした。リン酸化HrpGタンパク質により、III型分泌系構成タンパク質ととともにエフェクター遺伝子の発現が誘導され、植物感染時に特異的にエフェクターを、III型分泌系を介して分泌することが明らかとなった。

さらに、Nicotiana benthamianaの植物免疫シグナル伝達系において起点となるフォスファチジン酸と結合能力を有するSucrose non-fermenting related kinaseが、植物免疫シグナル伝達系に関与することを明らかにした。青枯病感受性誘導に関わる青枯病菌日本株のエフェクターの網羅的同定にはいたらなかったが、エフェクター遺伝子の発現制御機構の全容解明に近づいた。さらに、先行研究において、細胞間隙侵入後の、宿主植物上におけるバイオフィルム形成とその機構の解明がすすんだことにより、青枯病菌は細胞間隙に侵入後、宿主植物の細胞表面に固着し、III型分泌系を構築し、エフェクター分泌を宿主細胞内に分泌し、植物免疫を阻害することで、宿主細胞表面で増殖し、その増殖によりクオラムセンシングが起動し、バイオフィルム形成を行うことと、一連の侵入過程に関わる青枯病菌内でのシグナル伝達系を明らかにされた。これらの結果から、細胞間隙侵入後の宿主植物表面でのバイオフィルム形成時の、エフェクターの宿主細胞内への注入と作用時期の推定を行うことができ、青枯病感受性感知システムの構築に有益な知見を得ることができた。感受性誘導阻害により、植物の自然免疫を活用する青枯病防除技術開発の基盤研究として、青枯病感受性誘導機構を網羅的に解明することを目的とする。第1の研究目標として、青枯病菌がIII型分泌系を介して宿主細胞内に分泌する青枯病感受性誘導を行うタイプIIIエフェクターの同定・機能解析を行う。第2の研究目標として、宿主植物における青枯病感受性誘導シグナル伝達系を解明する。これらの青枯病感受性誘導に関わる青枯病菌-宿主植物相互作用の結果を基に、青枯病感受性誘導機構を網羅的に解明する。本年度は、一過的発現系を用いて、青枯病菌OE1-1株のゲノム解析から推定されたタイプIIIエフェクターをタバコ植物で発現させ、自然免疫抑制に関わるタバコ植物におけるSec14Pに介在されるリン脂質シグナル伝達、とくにフォスファチジン酸脱リン酸化酵素遺伝子の発現誘導について解析を行った。ひとつずつのエフェクター遺伝子発現により、有意なフォスファチジン酸脱リン酸化酵素遺伝子の発現が誘導されることはなかった。また、Sec14P遺伝子の発現を抑制したタバコ植物に、青枯病菌とともにPseudomonas属細菌の感染が有意に増長し、これらの細菌による病害に対する感受性が増すことを明らかにした。すなわち、Sec14Pに介在されるリン脂質シグナル伝達により誘導されるタバコ植物の自然免疫を活用することにより、マルチ型の耐病性を植物に付与できると考えられた。さらに、感受性誘導以降の宿主植物の細胞間隙における青枯病菌細胞の挙動を集団構造学的に解析した。宿主細胞上に固着後、植物免疫を回避した青枯病菌は、宿主細胞上で著しい増殖を行い、クオラムセンシングを介して機能的分化を行い、宿主細胞上に、集団細胞構造物であり、病原性に不可欠なマッシュルーム型バイオフィルムを形成することを明らかにした。フォスファチジン酸脱リン酸化酵素
起靭性・超強度セラミックス/金属系双方向ナノコンポジットの開発研究

本研究者らのこれまでの研究成果を基礎にして、(1)ナノサイズのセラミックス、金属が第2相としてセラミックス及び金属の結晶粒内に相互に分散したセラミックス/金属ナノ複合材料を焼結法で作製し、(2)これら材料のミクロ及びナノ構造を高分解能電子顕微鏡などで観察すると共に、(3)製造したナノ複合材料の強度・靭性等の機械的特性を測定評価する。これをもとに(4)ナノ分散したセラミックスや金属の役割を明確にし、(5)最終的には、超靭性・超強度を示すセラミックス/金属双方向ナノ複合材料の開発が可能であることが示された。以下、その結果を報告する。ナノメーターサイズの金属をセラミックスマトリックスの粒子内あるいは粒界に分散させた粒界及び粒内型傾斜機能ナノ複合材料を、種々のプロセスにより作製することに成功した。これら材料では、数10100nmの微細な金属が均一に分散しており、室温での破壊強度、硬度などの機械的性質が単相材料に比較して著しく改善されることが示された。セラミックス/金属の界面には反応相などは無いものの、金属の種類やそのサイズによって構造の乱れが存在することが示された。また、このようなセラミックス/金属ナノ複合材料をさらに、制御することによってMo/Zirconiaでは、セラミックス/金属と金属/セラミックスの相互ナノ複合材料を作製することができた。この相互ナノ複合化の効果を用い作製した材料の機械的特性は、強度、靭性とも大幅に改善された。これらの特性は、従来、転移強化セラミックスでは限界と考えられて来た強度、靭性のトレードオフを打破するものと位置付けられる。これらの優れた特性の発現は、ジルコニアの変態強化機構に加え、金属相添加によるクラック近辺での応力緩和機構に基づく本質的な靭性の改善、及び、相互ナノ複合化によろ組織の微細化などの相乗効果に起因するものと想定される。以上の一連の研究を通じて、従来にないレベルでの傾斜機能材料の開発に繋がるナノレベルの組織制御や界面制御によるセラミックス/金属ナノ複合材料の作製とその機械的特性の改善に成功した。この様なセラミックス/金属ナノ複合材料では機械的特性の改善のみならず、電気的・磁気的な新たな機能を付与することも将来的に可能であると考えられ、最終的には機械的特性と何らかの機能性を合わせもった機能性構造材料が具現できるものと期待される。セラミックス/金属系のナノコンポジットに関し、以下の成果を上げた。1)Al_2O_3粉末にMo或いはW金属粉末を混合し、それをアルゴン中で加熱焼結させる方法で、セラミックスの結晶粒中にMo、W金属ナノ粒子を分散させたセラミックス/金属ナノコンポジットの製造に成功した。2)Al_2O_3粉末にWO_3或いはMoO_3酸化物を均一に混合し、この混合物を焼結途中で水素中で加熱し、金属酸化物のみを金属に還元し、その後に焼結させる方法でAl_2O_3セラミックス中に、前記の方法よりより微細な1040nmのW或いはMo金属粒子を分散したセラミックス/金属ナノコンポジットの製造に成功した。

3)Al_2O_3粉末にNiO、Ni(NH_3)H_2Oをアルコール中で均一に混合し、この混合物を焼結途中で水素中で加熱し、Ni酸化物や硝酸塩を金属ナノ粒子に変え、その後に焼結させる方法で、Al_2O_3結晶粒中にNiナノ粒子を均一に分散させた、Al_2O_3/Ni系ナノコンポジットの製造に成功した。4)以上のAl_2O_3/金属ナノコンポジット系において、何れの複合系において金属ナノ粒子により、Al_2O_3の強度が1.52倍以上も改善可能であることを見い出した。5)NiやWナノ粒子を分散させた複合系においては、予想とは逆に、NiやWナノ粒子分散により室温強度のみでなく高温強度の改善も可能であること、またNiナノ粒子分散の場合は、機械的特性の改善と共に強磁性特性の付与も可能であることを見い出した。6)この結果は、ナノコンポジット技術が複数の機能を調和させた複合材料の創製を可能にすることを示していると考えられる。7)更にZrO_2にMo金属を混合し、この混合物を加熱焼結させる方法で、ZrO_2の中に約20nmのMo金属が、また数ミクロンのMo金属粒子中に約50100nmのZrO2粒子が分散した、双方向ナノコンポジットの製造に成功した。セラミックス/金属系のナノコンポジットに関して以下の成果を上げた。1.Al_2O_3粉末にMo金属酸化物、Ni金属酸化物、W金属酸化物、Cu金属酸化物をアルコール中で均一に混合し、この混合物を焼結炉に入れ、300-600°Cの温度で水素ガスを流すことにより、平均粒径0.3ミクロンのAl_2O_3粉末中に5-10nmの金属超微粉末が均一に分散した出発原料を作製するプロセスを確立した。2.この混合粉末を1200-1500°Cで焼結させることにより、10-40nmの金属粒がAl_2O_3の結晶粒中に均一に分散した緻密なセラミックス/金属径ナノコンポジットの作製に成功した。電子顕微鏡観察の結果、金属ナノ粒子とセラミックスの界面に不純物は存在せず、Al_2O_3と金属ナノ粒子は原子レベルで直接結合していることを見出した。3.また、これらのセラミックス/金属系ナノコンポジットが、1000MPa以上の超強度を示すと共に、予想とは逆に高温でも優れた機械的特性を示すことを見出した。4.Al_2O_3/NiとAl_2O_3/Cu系のナノコンポシゼットに関しては、前者では優れた機械的特性と強磁性特性が、また後者の場合には優れた機械的特性と電気伝導特性が共生していることを明らかにした。5.昨年度に報告したZrO_2/Mo系のみでなく、Al_2O_3/Mo系でも、ミクロンサイズのセラミックス結晶粒中にナノサイズの金属ナノ粒子が、また同時にミクロンサイズの金属結晶粒子にナノサイズのセラミックス粒子が分散した双方向ナノコンポジツトの製造に成功した。6.これらの双方向ナノコンポジットは、2000MPa以上の超強度と10MPaml/2以上の超靱性を示すことを明らかにした。本研究者らのこれまでの研究成果を基礎にして、(1)ナノサイズのセラミックス、金属が第2相としてセラミックス及び金属の結晶粒内に相互に分散したセラミックス/金属ナノ複合材料を焼結法で作製し、(2)これら材料のミクロ及びナノ構造を高分解能電子顕微鏡などで観察すると共に、(3)製造したナノ複合材料の強度・靱性等の機械的特性を測定評価する。これをもとに
大脳白質線維の画像解析による慢性頭痛の病態解明、診断治療への応用

またResponder群の治療前後の比較では、ROIとして抽出した疼痛関連領域の多くで治療後有意なFCの低下が認められたが、Non-responder群では有意なFCは検出されなかった。慢性片頭痛では高頻度の発作を有する患者で、低頻度発作の患者と比較して強いFCが認められたことが報告されており、本研究においても頭痛に対する鍼治療の効果はFCの低下と相関する可能性が示唆された。これらの結果は神経放射線学会、ニューロモデュレーション学会、日本頭痛学会、茨城県頭痛研究会などに発表してきた。これまでの研究結果をClinical Neurology and NeurosurgeryとNeuromodulationの2つのインパクトファクターのある国際学術英文雑誌に発表し出版した。結果として、一次性頭痛患者では治療によって、右視床や右内包、右放線冠、右小鉗子、左右に脳梁など右半球を中心に治療後有意なFAの低下が認められた。また疾患別に同様の解析を行ったところ、前兆のない片頭痛群では同様の結果が得られたが、緊張型頭痛群では治療前後に有意な変化は得られなかった。以前に行った1.5T DTIの解析では、正常コントロールに比較して、前兆のある片頭痛、薬物乱用頭痛でFAの低下が認められた。以上の結果より、DTIは片頭痛の診断、治療の予後予測に有効である可能性があり、また片頭痛や薬物乱用頭痛の病態を理解するためにも貢献が期待できる。症例の蓄積は予定通りであり、全体としては十分であるが、サブ解析を行うためには一部の頭痛病態の症例が不足している。今後、症例を追加して、この病態の解析を継続する。昨年まで一次性頭痛に対するDiffusion tensor imagingを撮像し、鍼治療前後での画像の変化を解析してきた。今年度は、さらに高度な画像解析であるNODDI(neurite orientation dispersion and density imaging)とresting state functional MRI(rsfMRI)による撮像を行ってきた。NODDIは通常のPCでは解析に時間がかかっており、多数例での検討は継続中である。rsfMRIでは大脳皮質に標準アトラスを参照して関心領域を設定し、解析ソフトを使用して関心領域間のfunctional connectivityを解析した。対象は前兆のない片頭痛および緊張型頭痛と診断した成人患者である。頭痛の診断は国際頭痛分類にもとずき、日本頭痛学会専門医指導医である主任研究員が行っている。倫理委員会の承諾を得て、患者本人より文書で説明し、同意書に署名を得ている。鍼治療は後頭部皮下の4カ所に鍼を刺入し、筋収縮が行い電圧で通電治療を、週1回で3ヶ月間行った。片頭痛と緊張型頭痛に対する治療は通常通り行い、研究期間中は内服は同様で継続した。臨床的には鍼治療により頭痛は多くの症例である程度改善した。鍼治療前後で片頭痛では広範囲にfunctional connectivityの低下を認めたが、緊張型頭痛では変化は限局していた。片頭痛では大脳皮質の疼痛関連領域の感作があり、鍼治療によりこの感作を調整できた可能性が考えられる。NODDIの結果とともに、解析方法を変えての解析も今後、検討している。NODDIの解析には予想以上の時間を要しており、この解析は進んでいないが、今後も継続すれば、解析できる予定である。撮像自体は順調に進んでいる。resting state functional MRIは撮像も解析も順調である。diffusiontensor imagingは分子の拡散の方向と量を定量できるが、それが神経線維の分散なのか、軸索密度の違いなのかは明らかでない。新しいdiffusiontensor imagingの解析法であるNODDI(neurite orientation dispersion and density imaging)ではそれが区別できる。今後はNODDIによるさらに詳細な解析方法による解析も予定している。現在の撮像、解析を継続していく。正常ボランティアの撮像を、今後行い、患者と比較することにより病態、診断への貢献を目指す。既存の物品を使用したため、物品費は抑えられた。国際学会にも参加したが、国内開催であったため、旅費も抑えられた。人件費は使用しなかった。学会には参加したが、旅費などは他の研究費を使用したため、本研究費の使用が少なかった。謝金も今年度は使用しなかった。正常ボランティアの撮像を予定しており、今後に撮像する放射線技師への謝金を使用する予定である。次年度には海外への国際学会への参加、発表、人件費を必要とする研究を計画しており、今年度の余剰金は消費する見込みである。
次世代シークエンサーによるグリオーマLOH領域の網羅的解析

摘出脳腫瘍標本における遺伝子変異解析:九州大学脳神経外科手術症例のうち、神経膠腫162例に対して、capillary sequencerを用いてIDH1/2変異解析および1p,19q 10, 17pのLOH解析を行い、臨床像や予後との関連を検討した。IDH1に変異を認めるprimary glioblastomaは特異的な臨床像を呈することが判明し、またgrade IIIのoligodendroglial tumorにおいては、IDH変異と1p/19q LOHの結果から臨床経過が明確に異なる3つのタイプに分類できることを示した。次世代シークエンサーを用いた脳腫瘍幹細胞における網羅的遺伝子変異解析:九州大学脳神経外科における摘出腫瘍から確立した、神経膠芽腫の腫瘍幹細胞株4例を対象に、TruSeq_Amplicon_Cancer_Panelを用いてアンプリコンPCRを行いillumina miSeqにてシークエンスを実施し、CLC Genomics WorkBenchを用いてマッピングおよび変異解析を行った脳腫瘍幹細胞における網羅的遺伝子変異解析九州大学脳神経外科における摘出腫瘍から確立した、神経膠芽腫の腫瘍幹細胞株4例を対象に、TruSeq_Amplicon_Cancer_Panelを用いてアンプリコンPCRを行いillumina miSeqにてシークエンスを実施し、CLC Genomics WorkBenchを用いてマッピングおよび変異解析を行った。摘出脳腫瘍標本における遺伝子変異解析九州大学脳神経外科手術症例のうち、神経膠腫203例(GBM 91例、AA 24例、AO29例、DA 23例、OD17例、その他27例)に対して、capillary sequencerを用いてIDH1/2変異解析および1p,19q 10, 17pのLOH解析を行った。摘出脳腫瘍標本における発現解析九州大学脳神経外科手術症例のうち、神経膠腫136例(GBM 74例、AA 16例、AO 18例、DA 15例、OD 13例)より神経膠腫解析パネルを作成した。神経膠腫悪性化に関与する遺伝子に対してmRNAと、神経膠腫に関連するmicroRNAの発現解析を行った摘出脳腫瘍標本における遺伝子変異解析:九州大学脳神経外科手術症例のうち、神経膠腫162例に対して、capillary sequencerを用いてIDH1/2変異解析および1p,19q 10, 17pのLOH解析を行い、臨床像や予後との関連を検討した。次世代シークエンサーを用いた脳腫瘍幹細胞における網羅的遺伝子変異解析:九州大学脳神経外科における摘出腫瘍から確立した、神経膠芽腫の腫瘍幹細胞株4例を対象に、TruSeq_Amplicon_Cancer_Panelを用いてアンプリコンPCRを行いillumina miSeqにてシークエンスを実施し、CLC Genomics WorkBenchを用いてマッピングおよび変異解析を行った現在、解析対象として腫瘍組織からのDNAが即利用可能な症例が200例以上得られている。これらの各症例では臨床所見、画像所見、および経過、また病理所見をデータベース化しているため、多変量解析を行うことが可能な状態となっている。また、上記のように各症例でLOH解析やIDHなどの主要な既知遺伝子異常の解析を進めており、またRNAの抽出を並行して行うことで、グリオーマと関連が深い遺伝子群に対してmRNAやmicro RNAの発現解析のデータも並行して蓄積してきている。これらの所見と、次世代シークエンス解析の結果を照らし合わせることで、より有意義な発見に繋がることが期待できると考えている。また、いくつかの症例については、cell line化が達成されたものもあるため、これらの症例ではcell lineからのDNAを対象とすることで、より正確なシークエンス解析を得られると考えている。グリオーマのアニマルモデルの確立においては、現在汎用されているグリオーマ培養細胞(U87など)を利用したモデルの確立は達成しており、前述したcell line化した腫瘍でもモデル確立が可能かどうかを模索しており、これらのモデルによる実験も可能となる前段階に到達している。上記のように、現時点で200例を超えるグリオーマ症例からの腫瘍組織DNAを抽出済みであり、次世代シークエンサー解析に用いることが可能な状態となっている。ただし、次世代シークエンサー解析は非常にコストが高いため、対象症例を限定して解析を行う必要があると考えている。また、実験計画時である2010年以降に、グリオーマに対する次世代シークエンサーによる網羅的な解析の報告が相次いでおり、有意義な新規研究を行うためには、解析対象を綿密に検討することが重要であると考えられる。現在、各症例の臨床所見、画像所見、および経過、また病理所見の詳細を検討し、LOH解析やIDH遺伝子変異の有無といったデータとも照らし合わせ、比較的少数例が対象であっても、有意義な新規所見を得ることが期待できるプロジェクトとなるような解析群(例として、小児例、早期再発例、10番染色体のLOHを欠くglioblastoma、など)を選択する方針である。その上で、次世代シークエンサー解析を行う方針としている。また、次世代シークエンス解析は最近、単純な全ゲノム配列の解析以外にも、エキソン配列のみを対象にするなどといったカスタム解析が可能になっているため、このような手法を応用して、より効率的な解析を行うことも併せて検討している。記のように対象症例を決定した後に、次世代シークエンサーによる網羅的な解析を行う。ノイズなどを含んだ配列異常が多数見つかると想定されるため、従来型のダイレクトシークエンスによる確認実験を行う。

ダイレクトシークエンスの段階では、解析症例数を増やすことがコスト的に可能である。200例以上の解析を行うことが可能なため、複数症例で再現性のある結果が得られたものを抽出することで、偶発的な変異を除外できると考えられる。これらのスクリーニングを経た遺伝子に対して、様々な因子との多変量解析に進む。個々の遺伝子変異やその組み合わせの、予後や臨床像との相関や治療反応性との関連を、統計学的に分析する。候補分子のグリオーマにおける作用を確認するために、in vitroとin vivoの実験系で検証する。各遺伝子を組み込んだベクターもしくはsiRNAを作成して、遺伝子発現を制御する。miRNAに対しては、pre-miRNAやanti-miRNAを作成する。グリオーマ培養細胞で遺伝子(or miRNA)発現を制御し、増殖能や浸潤能の変化を観察する。各操作を行った培養細胞からRNAを抽出して、マイクロアレイで遺伝子発現プロファイルを解析し、影響を受けるシグナル伝達系を同定する。In vivoの実験としては、遺伝子やmiRNAを制御したグリオーマ培養細胞もしくは腫瘍幹細胞を免疫不全マウスの脳内に移植し、腫瘍形態や生存期間の変化を評価する。これらの実験を通じて、真にグリオーマと関連の深い新規遺伝子の発見を目指す方針である。
生体用低磁場EPRI/MRI融合イメージング技術の開発

小動物用750MHz電子スピン共鳴イメージング(EPRI)用の磁気回路を用い、低磁場(27mT)核磁気共鳴イメージング(MRI)を可能にする要素技術の開発を行った。高インダクタンス(数mH)を有する勾配コイルを駆動できる定電流電源を製作し、50us程度の応答を有するグラジエントパルスの生成が可能となった。また、EPRプローブの外側にNMRプローブを配置することで、サンプルを移動させることなく、NMR信号が取得できることを示し、その結果、EPRI画像とMRI画像を同じ磁気回路を用いて計測することに成功した。小動物用750MHz電子スピン共鳴イメージング(EPRI)の磁気回路を用いて、低磁場核磁気共鳴イメージングを可能にする要素技術の開発を行った。1EPRI/MRI融合イメージングプローブの開発: EPRI用共振器(Muti-coil parallel-gap resonator)の外側にソレノイドコイルを配置することで、イメージング対象物とEPRI共振器を移動させることなく対象物の水素原子核からのNMR信号を取得することに成功した。その成果をISMRMにて発表する予定である。2勾配磁場電源の開発:DAC用ICを用いて勾配信号生成回路と電圧電流変換回路を製作した。電圧電流変換回路出力抵抗の調整と駆動電圧を±60Vとすることで、勾配磁場切替時の応答時間を10us程度に調整することができた。小動物用750MHz電子スピン共鳴イメージング(EPRI)用の磁気回路を用いた低磁場(27mT)核磁気共鳴イメージングを可能にする要素技術の開発を目指し、平成27年度は、MRIコンソールと制御ソフトウエアの開発を行った。低磁場NMRは、信号強度が極端に低いため、信号対ノイズ比を高める必要がある。そのため、投影数の増加と繰り返し時間の短縮(30ms)を目標とした。MRIコンソールは、主にNMRコンソールと平成26年度に開発した勾配用電圧電流変換回路から構成されるため、平成27年度は、高速にデータ転送が可能なNMRコンソールを新たに開発した。NMRコンソールは、Altera社製FPGA IC (Cyclone V)とFTDI社製FT2232HからなるNMR制御回路、NMR信号励起用送信D級アンプ回路、NMR信号受信用低ノイズ電流電圧変換アンプ回路から構成した。制御ソフトの開発は、NMR制御回路-PC間のデータ転送部分にアップル社製Xcode、GUIとデータ処理にNational Instument社製LabVIEW、FPGAプログラミングにAltera社製Quartus IIをそれぞれ用いて行った。その結果、データ転送時間を、目標の30ms以下とすることに成功した。勾配毎にデータ転送が可能となり、FPGA上に全ての勾配データや、取得データを記憶する必要がなくなったため、MRI画像取得に用いたRadial 3D gradient echoシーケンスの投影数を641まで増加することが可能となった。また、同一の磁気回路を用いることにより、サンプルを移動させることなくEPRIとMRIの画像取得に成功した。その成果を国際会議(ISMRM 2015)において発表した。当初計画通りに進んでいるため。センシング工学低磁場MRIでは、信号強度が低いため、信号強度を積算する効果のある放射線状に投影データを取得するRadial 3D Gradient echoシーケンスを用いることを予定している。また、信号対ノイズ比を高めるため、単位時間あたりの信号取得回数を増やし、繰り返し時間を30ms程度まで可能にできるMRIコンソールの開発を行う。すべての勾配シーケンスや、取得データをFPGA上に記憶させるのは困難なため、投影毎にデータ転送を可能にすべく、高速USB I/O ICを用いた高速データ通信回路とその制御ソフトウエアを開発する。研究に必要な資材の購入には少額(1583円)となったため、来年度の予算と合わせ使うこととした。少額のため、当初計画どおりに進める。
結核体質/アレルギー体質の遺伝子診断システムの構築

結核体質/アレルギー体質関連遺伝子多型解析:1.結核体質・細胞内寄生性細菌感染症におけるTh1関連サイトカインの解析:細胞内寄生菌感染症では感染早期からin vivoおよびin vitroにおいてIFN-γが強く誘導され、その産生にはIL-12,IL-18 IL-15が関連していた。これらの機能異常は結核体質を呈することを示唆した(Mizuno et al. Clin Exp Immunol 2003)。・抗酸菌易感染性症例における感受性遺伝子解析:抗酸菌易感染性例(播種性BCG副反応)の患者においてTh1経路に関連した分子であるIFN-γ受容体1、受容体2、1L-12受容体B1、IL-12およびSTAT-1遺伝子解析を行い、日本人ではIFN-γ受容体1の遺伝子異常が主体であることを明らかにした(Sasaki et al. J Infect Dis 2002)。少なくとも結核体質の一部は遺伝子解析が可能となった。2.アレルギー体質Th1・Th2関連遺伝子多型と小児アトピー喘息の疾患感受性解析・IL-13 receptor, IL-13遺伝子多型について喘息との疾患関連性はみられなかった。・CD28,CTLA-4遺伝子多型について喘息との疾患関連性はみられなかった。・ヒスタミン受容体(H1,H2)、ヒスタミン分解酵素遺伝子多型について喘息との疾患関連性はみられなかった。少なくともアレルギー体質の一部は遺伝子解析が可能となった。結核体質:抗酸菌易感染例にIFN-γ受容体など抗酸菌排除に重要であるTh1経路のサイトカイン/受容体遺伝子の異常が報告されている。今回我々は播種性BCG副反応を呈した10症例で、一般免疫能検査、Th1サイトカイン産生・及びIFN-γ受容体1遺伝子の変異を検討し、3症例とその父親1例においてIFN-γ受容体1遺伝子の変異を見出した。症例1の親子例、症例2に翻訳開始地点より818番目に、症例3は811番目に4塩基欠損をヘテロで検出した。播種性BCG副反応例にIFN-γ受容体1遺伝子変異が3家系4症例に見出され、我が国の結核体質の一つであることを明らかにした。アレルギー体質:今回、Th2サイトカインを抑制するとされるIFN-γ、およびIFN-γのシグナル伝達に関わる関連遺伝子群、CD28/CTLA-4、ヒスタミンH1・H2レセプターとアトピー喘息の関連を検討した。CD28/CTLA-4、ヒスタミンH1・H2レセプターとアトピー喘息の関連は見られなかったがIFN-γイントロン1およびIRF-1の遺伝子多型がアトピー喘息と関連した。IFN-γレセプタ-1/2の遺伝子多型は有意な関連は示さなかった。今回我々は、IFN-γ、あるいはそのシグナル伝達に関連する遺伝子群の多型の組み合わせとアトピー喘息との間に明確な関連性を見出した。このことは、アトピー喘息の発症機序におけるTh1サイトカインの重要性を意義づけるとともに、Th1反応の誘導によるアトピー治療の可能性を示唆する結果と考えられる。結核体質:抗酸菌易感染性例の中に、抗酸菌排除に重要であるTh1経路のサイトカイン/受容体遺伝子の異常が報告されている。我々は、播種性BCG副反応を呈した10例を対象に、Th1経路に関連した分子について、IL-12受容体およびIL-18受容体の機能解析、Th1サイトカイン産生能、IFN-γ受容体1、受容体2、IL-12受容体B1、IL-12およびSTAT-1遺伝子のダイレクトシーケンスを行った。7症例については遺伝子解析を含めた各解析での異常は検出されなかったが、3症例とその父親1例においてIFN-γ受容体1遺伝子の4塩基欠損のヘテロ変異を見出した。このことからIFN-γ受容体1変異が結核体質の一つであることを示すとともに、結核体質の遺伝子診断に重要であることが示された。

アレルギー体質:Th1/Th2経路に関連した因子であるIFN-γ、IFN-γ受容体1、受容体2、IFN-γのシグナル伝達に関わる関連遺伝子群およびIL-13受容体α、ヒスタミン受容体(H1、H2)、ヒスタミン分解酵素およびβ2アドレナリン受容体の各遺伝子多型についてアトピー喘息との関連性を検討した。IFN-γ受容体、IL-13受容体α、ヒスタミン受容体およびヒスタミン分解酵素の遺伝子多型にはアトピー喘息との関連は見られなかったが、IFN-γイントロン1、IRF-1およびβ2アドレナリン受容体(27Gln/Glu)の遺伝子多型についてはアトピー喘息と有意な関連を認めた。IFN-γおよびIRF-1遺伝子との関連は、アトピー喘息の発症にIFN-γおよびそのシグナル伝達が重要であり、Th1への誘導による新たな治療の可能性があることを示唆し、β2アドレナリン受容体については喘息の治療反応性を規定している可能性が示唆された。これらの遺伝子多型の解析は疾患感受性や治療反応性を予測する上で重要であると考えられた。結核体質/アレルギー体質関連遺伝子多型解析:1.結核体質・細胞内寄生性細菌感染症におけるThl関連サイトカインの解析:細胞内寄生菌感染症では感染早期からin vivoおよびin vitroにおいてIFN-γが強く誘導され、その産生にはIL-12,IL-18 IL-15が関連していた。これらの機能異常は結核体質を呈することを示唆した(Mizuno et al. Clin Exp Immunol 2003)。・抗酸菌易感染性症例における感受性遺伝子解析:抗酸菌易感染性例(播種性BCG副反応)の集積を行い、Thl経路に関連した分子であるIFN-γ受容体1、受容体2、IL-12受容体B1、IL-12およびSTA T-1遺伝子解析を行い、日本人ではIFN-γ受容体1の遺伝子異常が主体であることを明らかにした(Sasaki et al. J Infect Dis 2002)。少なくとも結核体質の一部は遺伝子解析が可能となった。2.アレルギー体質Th1・Th2関連遺伝子多型と小児アトピー喘息の疾患感受性解析・IL-13 receptor, IL-13遺伝子多型について喘息との疾患関連性はみられなかった。・CD28,CTLA-4遺伝子多型について喘息との疾患関連性はみられなかった。・ヒスタミン受容体(H1,H2)、ヒスタミン分解酵素遺伝子多型について喘息との疾患関連性はみられなかった。少なくともアレルギー体質の一部は遺伝子解析が可能となった。