hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
CD4陽性記憶T細胞発生・維持におけるOX40の機能的役割

【目的】記憶T細胞の成立・維持機構は十分に解明されておらず、特に、CD4陽性記憶T細胞の成立・維持機構の解析はCD8+T細胞のそれに比べてほとんど進んでいない。以前より、OX40-OX40L系がCD4陽性記憶T細胞の成立に関与することは知られていたが、その機序については全く不明である。本研究では、記憶T細胞成立・維持に重要とされているT細胞恒常性維持増殖おけるOX40の役割を明らかにする。【結果】OX40欠損マウス由来CD4陽性T細胞をリンパ球欠損マウスあるいは放射線照射野生型マウスに移入し、その恒常性維持増殖を測定した結果、OX40シグナルがCD4陽性T細胞恒常性維持増殖に促進的に機能することを見出した。次に、T細胞恒常性維持に必須のサイトカインIL-7とOX40との機能的冗長性・特異性を明らかにするために、上記CD4陽性T細胞移入実験において阻害性抗OX40L抗体および抗IL-7受容体抗体投与を行った。その結果、CD4陽性ナイーブT細胞恒常性維持増殖は、抗IL-7受容体抗体投与のみでほぼ完全に抑制され、抗OX40L抗体はほとんど抑制が見られなかった。他方、CD4陽性記憶T細胞の恒常性維持増殖は、どちらかの抗体単独投与により強く抑制され、さらに両者の投与により完全に抑制された。すなわち、CD4陽性ナイーブT細胞とCD4陽性記憶T細胞恒常性維持は異なる機序で制御され、特に後者はOX40シグナル依存的であることが示唆された。当初RAG2欠損マウス、OX40L/RAG2二重欠損マウスをレシピエントとした移入実験を計画していたが、レシピエントに存在する抗原提示細胞上のOX40Lのみならず、ドナー由来のCD4陽性T細胞にも機能的なOX40Lが存在することを見出したため、OX40-OX40Lシグナルを完全に阻害するために計画を変更し放射線照射によりリンパ球減少させたマウスにコントロール抗体または阻害性抗OX40L抗体投与下で野生型マウスより分離した多クロン性CD4陽性T細胞を移入した。その結果、移入後1週間及び2週間目のCD4陽性effector memory T細胞の細胞数、細胞分裂ならびにPMAとイオノマイシンによる再刺激に対するインターフェロンγやIL-2などサイトカイン産生能がOX40-OX40Lシグナルの阻害により著しく抑制されることが明らかとなった。さらにin vitroでの実験により1L-7とOX40Lのシグナルは独立してCD4陽性effector memory T細胞の分裂に関わることが示唆されたため、阻害性抗IL-7R抗体あるいは阻害性抗OX40L抗体単独投与と両者投与下でCD4陽性T細胞の分裂を比較したところ、両者投与によりCD4陽性T細胞の分裂が認められなくなることを見出した。このことからin vivoにおいてもリンパ球減少時にはCD4陽性effector memory T細胞が回復する過程にIL-7とOX40シグナルが独立して作用していると考えられた。現在確認実験およびOX40L発現組織の同定を試みている。
琉球海溝沿岸におけるマイクロアトールを用いた地殻変動と海成段丘形成に関する研究

本研究は、沈み込み型プレート境界に位置する日本列島太平洋側、とりわけ琉球海溝沿岸において、定常的地殻変動と地震性地殻変動との相互作用を具体的に解明することによって完新世海成段丘の形成メカニズムをより精密に解読し、ひいては地震や津波の長期発生予測による地域の防災・減災に寄与することを目的とする。具体的な研究方法は、琉球海溝に面する南西諸島に分布するマイクロアトールを利用して、その形状、分布高度および形成年代などを調査し、検潮計では捉えられない過去数100年間以上の古水深の長期変動、すなわち陸地の定常的な隆起・沈降様式を具体的に明らかにする。
腎疾患における生体内酸化ストレス動態の非侵襲的画像化解析と抗酸化療法への応用

本研究では,in vivo計測の利点を生かし,腎疾患発症前の段階からラジカル消去能を各臓器毎にESR画像化解析を行い,リアルタイムの酸化ストレス変化を追跡し,病態発症・進展への関与を明らかにすることを目的とした.1.ストレプトゾトシン(STZ)投与Nrf2遺伝子欠損マウスにおける検討In vivo ESR測定の結果STZ投与Nrf2遺伝子欠損マウスではSTZ投与野生型に比べスピンプローブCarbamoyl-PROXYLの消失半減期がSTZ投与1週後では短縮し,2週以降は延長に転じた.STZ投与モデルはNOの強い関与が知られているが,STZ投与Nrf2遺伝子欠損マウスにNO合成酵素阻害剤L-NAMEおよびマンニトールを投与するとCarbamoyl-PROXYL消失半減期は回復した.このことよりSTZ投与Nrf2遺伝子欠損マウスではペルオキシナイトライト-ヒドロキシラジカル系を介した酸化ストレス亢進が存在することが示唆された.2.虚血再潅流障害による急性腎不全モデルにおける検討片腎摘出,片腎30-45分の虚血再潅流モデル作成し,ESRイメージングにより腎局所での酸化ストレス変動評価の可能性を検討した.Carbamoyl-PROXYL静注後約30分間に4-6回程度のESRイメージが撮像可能であり,静注直後の像から特定された腎,肝など特定領域の画素値を経時的に片対数グラフにプロットするとR^2=0.90程度の相関関数を持って近似可能であった.この方法により得られた腎の半減期は,虚血再潅流後3日目に延長し,7日目では部分的な回復に留まることを示した.一方従来のL-band ESR測定では上腹部でのCarbamoyl-PROXYL半減期は7日目には虚血前のレベルに戻り,腎でのESRイメージングの結果と解離した.このため臓器ホモジネートを作成し,フェリシアン化カリウムを用いて臓器中の還元能をex vivoで測定したところ,その結果はESRイメージングの結果と合致するものであった.以上よりESRイメージング法が従来のL-band ESR法よりも腎障害時の酸化ストレス評価として適切であると考えられた.本研究では,in vivo計測の利点を生かし,腎疾患発症前の段階からラジカル消去能を各臓器毎にESR画像化解析を行い,リアルタイムの酸化ストレス変化を追跡し,病態発症・進展への関与を明らかにすることを目的とする.(1)ストレプトゾトシン(STZ)投与Nrf2遺伝子欠損マウスにおける検討In vivo ESR測定の結果STZ投与Nrf2遺伝子欠損マウスではSTZ投与野生型に比べスピンプローブCarbamoyl-PROXYLの消失半減期がSTZ投与1週後では短縮し,2週以降は延長に転じた.STZ投与モデルはNOの強い関与が知られているが,STZ投与Nrf2遺伝子欠損マウスにNO合成酵素阻害剤L-NAMEおよびマンニトールを投与するとCarbamoyl-PROXYL消失半減期は回復した.このことよりSTZ投与Nrf2遺伝子欠損マウスではペルオキシナイトライト-ヒドロキシラジカル系を介した酸化ストレス亢進が存在することが示唆された.(2)虚血再潅流障害による急性腎不全モデルにおける検討片腎摘出,片腎30-45分の虚血再潅流モデル作成し,ESRイメージングにより腎局所での酸化ストレス変動評価の可能性を検討した.Carbamoyl-PROXYL静注後約30分間に4-6回程度のESRイメージが撮像可能であり,静注直後の像から特定された腎,肝など特定領域の画素値を経時的に片対数グラフにプロットするとR2=0.90程度の相関関数を持って近似可能であった.この方法により得られた腎の半減期は,虚血再潅流後3日目に延長し,7日目では部分的な回復に留まることを示した.一方従来のL-band ESR測定では上腹部でのCarbamoyl-PROXYL半減期は7日目には虚血前のレベルに戻り,腎でのESRイメージングの結果と解離した.このため臓器ホモジネートを作成し,フェリシアン化カリウムを用いて臓器中の還元能をex vivoで測定したところ,その結果はESRイメージングの結果と合致するものであった.以上よりESRイメージング法が従来のL-band ESR法よりも腎障害時の酸化ストレス評価として適切であると考えられた.本研究では,in vivo計測の利点を生かし,腎疾患発症前の段階からラジカル消去能を各臓器毎にESR画像化解析を行い,リアルタイムの酸化ストレス変化を追跡し,病態発症・進展への関与を明らかにすることを目的とした.1.ストレプトゾトシン(STZ)投与Nrf2遺伝子欠損マウスにおける検討In vivo ESR測定の結果STZ投与Nrf2遺伝子欠損マウスではSTZ投与野生型に比べスピンプローブCarbamoyl-PROXYLの消失半減期がSTZ投与1週後では短縮し,2週以降は延長に転じた.STZ投与モデルはNOの強い関与が知られているが,STZ投与Nrf2遺伝子欠損マウスにNO合成酵素阻害剤L-NAMEおよびマンニトールを投与するとCarbamoyl-PROXYL消失半減期は回復した.このことよりSTZ投与Nrf2遺伝子欠損マウスではペルオキシナイトライト-ヒドロキシラジカル系を介した酸化ストレス亢進が存在することが示唆された.2.虚血再潅流障害による急性腎不全モデルにおける検討

片腎摘出,片腎30-45分の虚血再潅流モデル作成し,ESRイメージングにより腎局所での酸化ストレス変動評価の可能性を検討した.Carbamoyl-PROXYL静注後約30分間に4-6回程度のESRイメージが撮像可能であり,静注直後の像から特定された腎,肝など特定領域の画素値を経時的に片対数グラフにプロットするとR^2=0.90程度の相関関数を持って近似可能であった.この方法により得られた腎の半減期は,虚血再潅流後3日目に延長し,7日目では部分的な回復に留まることを示した.一方従来のL-band ESR測定では上腹部でのCarbamoyl-PROXYL半減期は7日目には虚血前のレベルに戻り,腎でのESRイメージングの結果と解離した.このため臓器ホモジネートを作成し,フェリシアン化カリウムを用いて臓器中の還元能をex vivoで測定したところ,その結果はESRイメージングの結果と合致するものであった.以上よりESRイメージング法が従来のL-band ESR法よりも腎障害時の酸化ストレス評価として適切であると考えられた.
化学的・物理的な刺激に応答して固体光物性を変調するナノ分子デバイスの創出

本研究では、これまで有機塩を用いて得られている知見にダイナミクスの要素を取り入れ、ゲスト分子の吸着・脱離反応(化学的刺激)および熱・圧力による多形転移(物理的刺激)に応答して固体光物性を変調できる超分子系の構築を目的とした。本年度の目的としては、スルホン酸基を導入した蛍光性分子と市販品である種々の一級アミンからなる塩を作成し、単結晶X線回折装置を用いて、超分子構造を解析することにより化学的・物理的外部刺激に応答的な超分子系の探索を行った。さらにこの超分子系を用いて、外部刺激応答的な固体発光特性の動的な変調を達成した。本年度の成果を以下に列挙する。1.様々な有機化合物を用い、外部刺激に応答的な超分子系のスクリーニングを行った。赤外吸収分光法、核磁気共鳴分光法、熱重量分析法、粉末X線回折法、単結晶X線回折法などを用いて超分子系の構造を調べ、目的とする超分子系の絞込みを行った。化学的刺激であるゲスト分子を包接した超分子系などの構造が明らかとなった。さらに固体蛍光分光法により超分子系の固体発光特性を調べたところ、包接されているゲスト分子に依存的な固体発光特性が観測された。2.この超分子系について、熱、ゲスト分子の吸着・脱離、圧力などの様々な刺激を与えたときの超分子構造変化および固体発光特性変化を検討した。測定は、時間分解X線回折法および固体蛍光分光法を用いた。3.種々の外部刺激を組み合わせることにより、三つの超分子構造を回るサイクルをもつ超分子系の構築に成功した。このサイクルによって固体発光特性を可逆的に変化させることができた。4.化学的刺激を変化させることにより、同一の物理的刺激に対しても、超分子構造および固体発光特性の応答性が異なる超分子系を確立することができた。
コンピュータグラフィックスを用いた人体モデルへの着装シミュレーション

本研究はCG技術を応用し、衣服装着時の人体をリアルに表示するものであり、次の技術により構成される。(1)人体モデルの計測、(2)人体のスムーズかつ精度のよいモデリング法および表示、(3)人体の形状モデルの自由形状変形、(4)衣服の着装シミュレーション。(1)については、レンジデータによる実測データを基に多角形で表現される人体形状を作成した。(2)については、多角形メッシュデータから、等濃度曲面で表現される形式(メタボールと呼ばれる)への変換プログラムを開発した。これは、インタラクティブに行う方法と、最急降下法によりメタボールのパラメータを最適化し、高精度の人体表面モデルの作成法を開発した。(3)については、標準の人体モデルを測定値に基づいて変形する方法、FFD(自由形状変形)法の理論を改良した方法を提案した。最後に、(4)においては、メタボールで構成される人体への着装シミュレーションを行い本研究の有用性を検証した。これらの成果は、画像電子学会誌、情報処理学会の研究会等に報告することができた。本研究はCG技術を応用し、衣服装着時の人体をリアルに表示するものであり、次の技術より構成された。(1)人体モデルの計測、(2)人体のスムーズな表面形状の表現法および表示、(3)人体の形状モデルの変形、(4)衣服の着装、(5)リアルな人体および衣服のリアルな表示。このうち(1)から(3)まで完了した。すなわち、(1)に関しては、計測データに基づいた多角形データを入手した。(2)については、多角形メッシュデータから、等濃度曲面で表現する形式(メタボールと呼ばれる)に変換を行うプログラムの開発を行った。このメタボールへの変換は完全な解が得られる保証はないので、会話形式による入力支援システムが実現できた。また。断面図表示など形状把握の為の種々の機能を備えた。(3)に関して、すべての人について形状測定する訳には行かないので、標準人体のモデルができると、それを必要に応じて変形できるシステムとした。なお、このためFFD(自由形状変形)理論を改良したものを利用した。以上の成果を情報処理学会グラフックとCADにおいて報告することができた。本研究はCG技術を応用し、衣服装着時の人体をりあるに表示するものであり、次の技術により構成される。(1)については、レンジデータによる実測データを元に多角形で表現される人体形状を作成した。これは、インタラクティブに行う方法と、最終降下法によりメタボールのパラメータを最適化し、高精度の人体表面モデルの作成法を開発した。
歯髄炎の病態形成におけるリンパ球浸潤機構と歯髄線維芽細胞の役割に関する研究

歯髄炎はう蝕細菌の侵襲に対して歯髄の免疫応答が惹起された状態であり、炎症が進展するに従って著しいリンパ球浸潤が認められ、病態の進展に関与していることが示唆されている。また、歯周炎も口腔内細菌を起因とする炎症性疾患であり、病変には多数の炎症性細胞浸潤が認められる。しかしながら、どのような機構で炎症性細胞が病変局所に浸潤しているか、不明な点が多い。今回我々は、炎症性細胞浸潤に関与しているとされるケモカインに着目し、それらの炎症局所での発現について検索した。さらに歯髄組織ならびに歯周組織の主な構成細胞の一つである線維芽細胞に着目し、それらのケモカイン産生能について調べた。歯髄炎病変局所では、T細胞浸潤に関与しているCCL20ならびにCXCL10の発現が認められ、同一部位にそれぞれのレセプター(CCR6およびCXCR3)を発現している炎症性細胞浸潤が認められた。また、歯周炎病変局所でもT細胞浸潤に関与しているCCL20,CXCL12ならびにフラクタルカイン発現が認められ、それぞれのレセプターを発現している炎症性細胞(CCR6,CXCR4,CX3CR1)発現細胞の浸潤が認められた。これらの結果から歯髄炎ならびに歯周炎病変局所には多種のケモカインが存在し、それらが炎症性細胞の浸潤を制御している可能性が示唆された。これらのケモカインをターゲットにした炎症を制御するアプローチが考えられ、さらなる研究が必要であろう。歯髄炎病変局所には多数の白血球の浸潤が見られ、歯髄炎の病変進行に深く関わっていることが示唆されている。しかしながら、白血球がどのようなメカニズムで歯髄組織へ浸潤しているかについては不明な点が多い。そこで、我々は培養歯髄線維芽細胞を用い、それらを細菌由来物質[リポポリサッカライド(LPS)、ペプチドグリカン(PGN)、リポタイコ酸(LTA)]で刺激し、好中球浸潤に関わっているとされるインターロイキン8(IL-8)発現、炎症性細胞浸潤・定着に関与しているとされる接着分子であるintercellularadhesion molecule-1 (ICAM-1)とvasucular adhesion molecule-1 (VCAM-1)発現、ならびに白血球を炎症局所に移動させるのに不可欠な血管新生に関わっているvascular endothelial growthfactor (VEGF)発現について解析を行った。それぞれの分子のmRNA発現はreverse transcriptional-PCR (RT-PCR)を用い解析し、IL-8とVEGFタンパクの培養液中への産生はenzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)法を用い、ICAM-1とVCAM-1の線維芽細胞表層での発現はFlow Cytometryを用い解析を行った。IL-8 mRNAとタンパクはLPS, PGNならびにLTAにより誘導され、その発現量は濃度依存的に増加した。また、VEGFタンパクもLPS, PGNならびにLTAにより濃度依存的に誘導された。ICAM-1とVCAM-1はLPSあるいはPGNにより細胞表面にその発現は増加したが、LTA刺激ではほとんどその発現は変化しなかった。これらの結果より、細菌由来物質は歯髄由来線維芽細胞から白血球浸潤に関与するとされるタンパク(IL-8,VEGF, ICAM-1,VCAM-1)発現を誘導することが明かとなった。これらのことより、歯髄炎炎症局所に存在する細菌は歯髄線維芽細胞を刺激し、白血球浸潤に関与するタンパクを発現させることにより炎症の増悪に関与していることが示唆された。さらにこれらの白血球浸潤に関与している分子発現のメカニズム、実際に白血球を用いた機能的解析、ならびに炎症歯髄組織でのこれらのタンパク、mRNAの発現に関してさらに解析を進めていく予定である。歯髄炎および歯周炎は口腔内の代表的な炎症性疾患であり、細菌の侵襲に対して歯髄や歯肉組織での免疫応答が惹起された状態にあることが知られており、炎症が進展するに従って著しいリンパ球浸潤が認められ、病態の進展に関与していることが示唆されている。

しかしながら、どのような機構で炎症性細胞が病変局所に浸潤しているか、不明な点が多い。今回我々は、炎症性細胞浸潤に関与しているとされるケモカインに着目し、それらの炎症局所での発現について検索した。さらに歯髄組織ならびに歯周組織の主な構成細胞の一つである線維芽細胞に着目し、それらのケモカイン産生能について調べた。歯髄炎病変局所では、T細胞浸潤に関与しているCXCL10の発現が認められ、同一部位にそのレセプターであるCXCR3を発現している炎症性細胞浸潤が認められた。また、歯周炎病変局所でもT細胞浸潤に関与しているCCL20,CXCL12ならびにフラクタルカイン発現が認められ、それぞれのレセプターを発現している炎症性細胞(CCR6,CXCR4,CX3CR1)発現細胞の浸潤が認められた。これらの結果から歯髄炎ならびに歯周炎病変局所には多種のケモカインが存在し、それらが炎症性細胞の浸潤を制御している可能性が示唆された。これらのケモカインをターゲットにした炎症を制御するアプローチが考えられ、さらなる研究が必要であろう。
タイヤ-路面間の可視化に基づく摩擦発生の基礎的研究

タイヤ(ゴム)-ガラス板間について,水膜存在下の路面を想定した接触状態における真実接触部を光誘起蛍光法によって可視化した.摩擦発生と真実接触部との因果関係を基礎的に解析する実験的手法の確立を目的とした.可視化画像より求めた輝度ヒストグラムに対し,ガウス分布フィッティングによる真実接触面積抽出手法を開発し,その妥当性をヘルツ接触理論との比較より確認した.そして,往復動滑り摩擦と転がり滑り摩擦の両実験が可能な試験機を開発した.その摩擦力測定精度が氷上の摩擦係数にも適合することを確認し,摩擦力と真実接触面積を同時に測定できることを示した.タイヤ(ゴム)-ガラス板間について,水膜存在下の路面を想定した接触状態における真実接触部を光誘起蛍光法によって可視化した.摩擦発生と真実接触部との因果関係を基礎的に解析する実験的手法の確立を目的とした.可視化画像より求めた輝度ヒストグラムに対し,ガウス分布フィッティングによる真実接触面積抽出手法を開発し,その妥当性をヘルツ接触理論との比較より確認した.そして,往復動滑り摩擦と転がり滑り摩擦の両実験が可能な試験機を開発した.その摩擦力測定精度が氷上の摩擦係数にも適合することを確認し,摩擦力と真実接触面積を同時に測定できることを示した.1.光誘起蛍光法可視化システムの最適化と真実接触面積の抽出LED照明光,および物品費で購入したデジタルカメラを使用して,申請者らが提案している接触面積の抽出法を非回転状態で検討した.その結果,輝度4096階調の詳細な輝度ヒストグラムの取得が可能となった.しかし,良好なS/N比を得るためには1秒の露光時間を必要とし,動的測定に向けての蛍光剤濃度,データ処理,露光時間等の改善を必要とした・2.転がり一滑り摩擦試験機システムの開発開発した摩擦試験機は,タイヤ駆動用と円盤駆動用のモータ回転数を各々調整可能で,様々な滑り率Sを設定出来る.平行ばねに取り付けたひずみゲージで検出した接線力・垂直力から接線力係数μを算出し,μ-S特性を取得する.光誘起蛍光法により可視化した接触面の撮影は円盤に設けたサファイア製可視化窓より行う.試験機の摩擦測定性能評価を室温,乾燥状態と湿潤状態のもと,以下の条件下で行った.ジュラルミン製円盤の表面性状を(a)無加工,(b)#1000エメリー紙を貼付,(c)#240エメリー紙を貼付,の3通りに変化させ,模型タイヤ面圧を320kPa,円盤回転速度を170mm/s一定,すべり率を±20%の範囲に設定した.その結果,(a)では,湿潤状態における接線力係数は乾燥状態の2分の1程度の値となった,(b)では,条件(a)の値より乾燥路面で約13%,湿潤路面で約113%大きい値をとった,(c)では,条件(a)の場合より,それぞれ約23%,約133%大きな値をとり,水膜による接線力係数の低下は条件(b)の場合よりも小さかった.以上のように,本試験機は室温下では妥当なμ-S特性を得ることが出来た.1.転がりー滑り摩擦試験機の摩擦力測定精度の改良開発した摩擦試験機の摩擦力測定機構をひずみゲージ式から微小変位測定方式に変更した.DCモータの駆動電流測定に基づくトルク(摩擦力)測定や渦電流式変位測定も検討したが,総合的に静電容量微小変位測定方式は,以下の点で優れていた.すなわち,(a)正負の摩擦力測定が可能,(b)ノイズが小さい,(c)氷結路面上のタイヤの摩擦係数μより小さい鉱油潤滑下の摩擦測定(垂直荷重14N)において,μ=0.01相当の摩擦力測定が可能,という点てあった.2.真実接触面積測定における統計的解析法の検討真実接触面積を統計的に抽出する新たな手法として,取得した光誘起蛍光画像の輝度ヒストグラムへのガウス分布フィッティングを検討した.形状が明確なPMMA光学レンズを使用した場合,低輝度側輝度ヒストグラムより抽出した真実接触面積はヘルツ理論値にほぼ一致する傾向を示した.一方,粗面化したPMMA光学レンズの場合,複合ガウス分布により抽出する必要があり,輝度ヒストグラムの微分等による分布波形の分離を試みた.この試みはWorld Tribology Congress 2009で発表した.さらに,光干渉画像に対してではあるが,背景補正の輝度ヒストグラムに及ぼす影響を検討し複合ガウス分布への有効性を確認したので,今後,本光誘起蛍光画像への適用可能性が示された.3.実験環境の整備低温下の実験環境構築のために,冷凍冷蔵庫等の設置を行った.1.接触部蛍光画像の露光時間短縮化による動的測定の実施導入したC-MOSカメラ(アナログゲインの拡大)とLED照明装置によって,10ms程度の露光時間でも有効な輝度ヒストグラムが取得でき,動的な真実接触部抽出が可能となった.2.ゴム半球を用いた往復動滑り実験における摩擦力と接触部画像の同時取得基本的なヘルツ接触を利用して,ゴム半球の蛍光剤混入水湿潤下接触挙動の実験的測定を試みた.滑り速度0.66mm/s,ゴム半径10mm,振幅0.96mm,加振周波数0.18Hz,平均接触圧力340kPa(垂直荷重2.9N),露光時間20ms,撮影間隔120msの条件下でデータを取得した.

その結果,接線力および接触面積-変位線図(ヒステリシス線園)において,摩擦接触状態(固着,微小滑り,巨視的滑り)に応じて真実接触面積が変化することを実証できた.3.模型タイヤを用いた転がり-滑り実験における摩擦力と接触部画像の同時取得アルミ製円盤転がり速度69mm/s,滑り率変化範囲±25%,平均接触面圧130kPaの条件の下,蛍光剤混入水湿潤下でのタイヤ駆動実験を行った.目的の一つである摩擦力と真実接触面積の同時測定が可能となった.タイヤの真円度不足や転がり軌道(円周690mm)中に一個のガラス板観察窓(直径30mm)設置のために同一タイヤ接触部が観察できなかった.そのため,測定した接触面積にばらつきが多く,滑り率の明確な影響の傾向が得られなかった.しかし,制動側滑り率は駆動側に比べてやや大きな接触面積を示し,従来得られている傾向を確認できた.
マメ科植物を冒すウイルスの病原遺伝子の解析と診断への応用

ダイズの重要病害ウイルスであるダイズモザイクウイルス(SMV)は種子伝染性であり、その病原型から5系統に分類されているが、血清学的診断法による識別が困難である。本年度は、SMV2系統(SMV-B及び-C系統)について、既に解析された外被タンパク領域の遺伝子構造(塩基配列)をもとに、遺伝子診断法の確立を図った。SMV-B及びC系統は團場での多発が報告されており、塩基配列も90%以上の相同性を持つ。そこで2系統間で共通な2ケ所の塩基配列からSMVに特異的なプライマーを作製し、PCR法により解析したところ、何れのSMV系統においても感染葉からウイルス遺伝子断片が増幅されることを確認した。さらに一般團場から採集したSMV感染ダイズ葉を、このPCR法の他、従来より行われているELISA法(酵素結合抗体法)及びDIABA(Dot Immuno Binding Assay)により診断・比較したところ、ELISA及びDIBAでは陰性であった検体からもPCR法によりウイルスが検出された。さらに、増幅されたウイルス遺伝子断片の中で、B及びC2系統間で塩基配列の異なる部分に特異的なDNAプローブを各々作製し、ハイプリダイゼーション法により、増幅されたウイルス遺伝子からその系統を判別することが可能であることを確認した。以上の事から、PCRを用いた本遺伝子診断法は、高感度であるのみならず、ウイルス系統の固定・識別も可能であることから、今後、原種採取團場における健全大豆種子(ウイルスフリー種子)の育成に、とりわけ有用であると思われる。これらの成果については、平成5年度北陸病害虫研究会において発表し、現在論文準備中である。
スフィンゴ脂質による神経伝達物質放出機構の解析

スフィンゴシン1燐酸(S1P)は酵母からヒトに至る真核生物に広く存在し、血管内皮細胞や繊維芽細胞等の増殖促進作用やアポトーシス抑制能など多彩な機能を有する脂質情報伝達物質である。中枢神経系ではS1Pやその産生酵素スフィンゴシン・キナーゼ(SK)が豊富に存在することから、末梢組織との類似性から神経細胞の増殖や生存に重要であると推測されてきたが、神経に特異的な機能に関しては不明であった。最近我々はS1Pが海馬神経細胞にはたらいて脱分極非依存性に神経伝達物質グルタミン酸の放出を引き起こすことを報告した。そこでSKの海馬に於ける組織分布を免疫組織化学の手法を用いて解析した結果、苔状線維に特異的に発現していることを見いだした。更に、海馬のスライスに於けるS1Pにより惹起されるグルタミン酸の放出を電気生理学的手法を用いて調べると、CA3領域に限局して微小興奮性シナプス後電流(mEPSP)が認められた。これらの結果はSK/S1Pシグナル伝達系が、海馬のCA3領域で機能していることを強く示唆している。今後更にSKノックアウトマウスを用いた実験から、SK/S1Pシグナル伝達系の個体に於ける生理作用を調べてゆきたい。最近我々はラットの海馬の苔状線維にSKが豊富に存在することを免疫組織化学の手法を用いて明らかにした。これらの事実よりSKが神経伝達物質(グルタミン酸)の放出に関与する可能性を証明するために、SKの阻害剤やSKの産物S1Pのグルタミン酸放出に与える影響を海馬の初代神経培養細胞を用いて解析した。その結果海馬神経細胞の静止状態においてもS1Pがそれ自身グルタミン酸の自発放出を引き起こすことを見出した。現在これらのS1Pの作用が海馬の神経細胞に特異的な現象か否かを調べるために別の神経系を用いて解析を行っている。
骨髄内直接移植法を用いた新規マウス造血幹細胞の同定とその幹細胞特性の解明

高効率の骨髄生着を可能とする骨髄腔内移植(IBMI)法を用い、マウス骨髄造血幹細胞(HSC)が、c-kit^+Sca-1^+Lineage^-(KSL)分画外にも存在するかどうか検討した。c-kit陰性分画(c-kit^-Sca-1^+Lin^-)細胞移植では、IBMI法を用いても、骨髄長期生着を再現性良く認めることはなかった。しかし極まれに長期造血再構築が認められるケースがあり、c-kit陰性分画には、極めて低頻度あるいは低効率で骨髄生着するHSCの含まれる可能性が残った。一方c-kit^low分画には、低頻度ではあるがHSCの存在を認め、その特性を検討した。我々は、予備的研究データに基づき、成体C57BL/6マウス骨髄からFACS Ariaセルソーターを用いてc-kit^+Sca-1^+Lin^-(KSL)およびc-kit^-Sca-1^+Lin^-(K^-SL)分画を採取し、骨髄腔内直接移植法を用いてレシピエントマウスに移植、造血幹細胞(HSC)の特質である長期骨髄再構築能を検討している。当初は致死量放射線照射マウスを対象に移植実験を行ったが、KSL細胞と異なりK^-SL細胞の骨髄生着頻度は極めて低いことが判明した。これは、KSL細胞とK^-SL細胞の質的差異である可能性を考慮し、移植方法の改善を試みた。致死量照射を厳格化するとK^-SL細胞の生着頻度が低下することが示唆されたため、照射量の低減を試み、一部に生着頻度の改善を認めた。これにより、データの確度が高まり、新規HSC存在の有無をより明瞭に示すことが可能になると期待している。K^-SL細胞が新規HSCであれば、KSL細胞とのヒエラルキー上の関係を明らかにする必要がある。我々は、この一環として、K^-SL細胞からKSL細胞の誘導が可能であるかどうかインビトロに検討を行いつつある。ウシ胎児血清添加/非添加に加え、種々のサイトカインの組合せの検討を行ったが、これまでのところ液体培養下においてK^-SL細胞の増殖は認められていない。しかし、ストローマ細胞との共培養により、K^-SL細胞は増殖し、かつ、KSL細胞様の細胞表面形質を現し始めることを確認した。現在さらなる検討を加えつつあるが、上記インビトロ培養系がK^-SL細胞の造血系における位置付けを明らかにする手段となることが期待される。我々は、成体C57BL/6マウス骨髄からFACSセルソーターを用いてc-kit^+Sca-1^+Lin^-(KSL)およびc-kit^-Sca-1^+Lin^-(K^-SL)分画を採取し、経静脈的移植法および骨髄腔内直接移植法を用いてレシピエントマウスに移植、造血幹細胞(HSC)の特質である長期骨髄再構築能を検討してきた。当初、致死量放射線照射マウスをレシピエントとして移植実験を行ったが、K^-SL細胞の骨髄生着効率の低さがデータ蓄積の障害となったため、致死量未満の照射量を用いる実験系の改善を図った、これにより、K^-SL細胞は一次移植マウスにおいては長期造血を示すことが明らかとなった。しかし二次移植マウスにおける長期造血を維持することはできず、厳密な意味においてKSL細胞中にHSCが存在することには否定的な結果となった。尤も更なる実験系の改善により、K^-SL細胞の長期骨髄再構築を認める可能性は残されている。一方、上記の研究過程において、我々はKSL細胞集団とK^-SL細胞集団の中間に存在するc-kit^<low>Sca-1^+Lin^-(K^<low>SL)細胞に二次移植マウスを含めた移植レシピエントにおける長期骨髄再構築能が存在することを見出した。この細胞は、ストローマ非存在下に増殖し、増殖細胞はKSL細胞を培養した場合と近似の細胞表面抗原パターン(c-kit発現を含む)を示した。従って現時点における我々の結論は、移植実験系を用いる限りHSCは弱いながらもc-kitを発現する細胞であり、c-kitを高発現し得る細胞であると言うことである。K^<low>SL細胞からKSL細胞が産生され得ることは、インビボおよびインビトロにおいて示された。今後さらにこのK^<ow>SL細胞の特性を検討する予定である。なお研究の過程で、KSL細胞におけるCXCR4発現に関し、従来と異なる知見を得たため、誌上に報告した。

我々は、成体C57BL/6マウス骨髄からFACSセルソーターを用いてc-kit^+Sca-1^+Lin^-(KSL)およびc-kit^-Sca-1^+Lin^-(K^-SL)分画を採取し、経静脈的移植法および骨髄腔内直接移植法を用いてレシピエントマウスに移植、造血幹細胞(HSC)の特質である長期骨髄再構築能を検討してきた。しかし、K^-SL細胞は、二次移植マウスを含めた長期造血を維持することはできず、K^-SL細胞中にHSCが存在することには否定的な結果となった。一方、上記の研究過程において、我々はKSL細胞集団とK^-SL細胞集団の中間に存在するc-kit^<low>Sca-1^+Lin^-(K^<low>SL)細胞に二次移植マウスを含めた移植レシピエントにおける長期骨髄再構築能が存在することを見出した。この細胞は、経静脈的移植法によってレシピエント骨髄に生着し、骨髄中にてc-kitを強く発現するKSL細胞を産生した。マウスHSCは、CD150陽性CD48陰性分画に含まれると考えられている。そこで、CD150^+CD48^-K^<low>SL細胞に対して更なる検討を加えたところ、この細胞集団は細胞周期のG0期に偏在することが明らかとなった。一方、CD150^+CD48^-K^<low>SL細胞はCD150^+CD48^-KSL細胞と同等に骨髄中の低酸素領域に存在し、また、これら両細胞集団は一様に血液かん流の容易に到達しうる領域に存在することが示唆された。この結果から、HSCが低酸素状態にある理由は通説とは異なり、何らかのより能動的な作用によると考えられることを、我々は提唱した。なお上記の研究結果は、現在学術論文として投稿中である。
有機機能材料の組成分布・分子量分布同時分析システムの開発

共重合体の組成分布と分子景分布をそれぞれ独立に,かつ連続的に測定できる分析システムの開発を目的に,降温吸着クロマトグラフィー(TDAC)とサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)の連続システムの設計試作とスチレン-メタクリル酸メチル共重合体への適用を研究した。TDACではシリカゲルカラムを用い,カラム温度を高温から低温に順次降下させるTDACによる共重合体の組成差分離法の手法を確立した。TDAC装置は通常のHPLC装置にプレヒートチューブ,バイパスカラムなどを付設して作成した。UV検出器波長は260nm及び233nmであり,移動相は二塩化エチレン-エタノール混合溶媒である。カラム温度60゚Cのもとで試料溶液をカラムに注入し,以後5゚Cごとにカラムを降温させて共重合体をカラムから溶出させ,CV2波長でモニターする。各温度におけるクロマグラムから,2波長のそれからは各温度における溶出物の組成を,233nmのクロマトグラムからは共重合体溶出呈を示す。ほぼスチレン組成の沿って分離された。この方法により組成差分離が出来ることを確かめた後,TDACカラムの溶出物をオンラインでサイズ排除クロマトグラフィーカラムの導き,分子量および分子量分布を測定した。SECクロマトグラムはUV検出器により2波長のもとで測定した。別に求めたカラム較正曲線から分子量及び分子量分布を計算し,組成分布と分子量分布の等高線図を作成した。このようにTDACとSECの両システムを連結することにより,TDACからのフラクションを分取することなく,SECシステムに導入し,共重合体の組成及び分子量の両分布の同時分析システムを確立することが出来た。スチレンーメチルメタクリレ-ト共重合体を試料とし,固定相にシリカゲル,移動相にクロロホルムーエタノ-ル,又は二塩化エチレンーエタノ-ルをそれぞれ用いる液体吸着クロマトグラフィ-により,カラム温度を順次段階的に下げることによる,この共重合体の組成差分離法を検討した。カラムは恒温槽に入れ,カラムに常に一定温度の移動相が流れるように,装置上の工夫を行った。エタノ-ル含有量一定のクロロホルムーエタノ-ル移動相により,共重合体試料を60°Cに一定としたカラムに注入し,ポリマ-の大部分を吸着させる。ついでカラム温度を5°Cごとに段階的に下げ,カラムからの溶出液を捕集する。各捕集物をKBγ板上におき,溶媒を蒸発させてフイルムを作成し,赤外吸収スペクトルを測定してその組成を求める。この結果,カラム温度を下げることにより,メタクリレ-ト成分の多い部分が溶出してくることが認められた。つぎに,移動相を二塩化エチレンーエタノ-ルとし,カラム出口に紫外吸収検出器2台を装着し,一方の波長を230nm,他方を254nmに設定し,この2つの波長におけるカラム溶出液の紫外吸収強度を同時に測定するシステムを設計した。初期カラム温度を60°Cとし,カラム温度を5°Cごとに段階的に下げ,それぞれの温度におけるカラム溶出物の組成を分取することなく求めることができた。その結果,移動相にクロロホルムを用いた場合と同様,カラム温度の低下とともにメタクリレ-トの多い成分が溶出してくることが分り,本法により,スチレンーメチルメタクリレ-ト共重合体の組成差分離ができることが明らかになった。共重合体の組成分布と分子量分布をそれぞれ独立に、かつ連続的に測定できる分析システムの開発を目的に、降温吸着クロマトグラフィー(TDAC)とサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)の連続システムの設計試作とスチレン-メタクリル酸メチル共重合体への適用を研究した。

TDACではシリカゲルカラムを用い、カラム温度を高温から低温に順次降下させるTDACによる共重合体の組成差分離法の手法を確立した。TDAC装置は通常のHPLC装置にプレヒートチューブ、バイパスカラムなどを付設して作成した。UV検出器波長は260nm及び233nmであり、移動相は二塩化エチレン-エタノール混合溶媒である。カラム温度60°Cのもとで試料溶液をカラムに注入し、以後5°Cごとにカラムを降温させて共重合体をカラムから溶出させ、UV2波長でモニターする。各温度におけるクロマトグラムから、2波長のそれからは各温度における溶出物の組成を、233nmのクロマトグラムからは共重合体溶出量を示す。ほぼスチレン組成の沿って分離された。この方法により組成差分離が出来ることを確かめた後、TDACカラムからの溶出物をオンラインでサイズ排除クロマトグラフィーカラムに導き、分子量および分子量分布を測定した。SECクロマトグラムはUV検出器により2波長のもとで測定した。別に求めたカラム較正曲線から分子量及び分子量分布を計算し、組成分布と分子量分布の等高線図を作成した。このようにTDACとSECの両システムを連結することにより、TDACからのフラクションを分取することなく、SECシステムに導入し、共重合体の組成及び分子量の両分布の同時分析システムを確立することが出来た。
オントロジー利用に基づいた対話を援用したサービスロボットのための統合物体認識

物体認識の技術は,近年急速に進展してきているが,物を取ってくるようなサービスロボットに適用する程には,未だにその精度は十分ではない.そこで,自動的な認識に失敗した場合には,ユーザに物体に関する情報(物体の属性)を教えてもらうことで,ユーザが対象としている物体を認識する対話を援用した物体認識について検討している.本研究では,人の自然言語による物体表現と,人が知覚するレベルでの物体の構成との関係をオントロジーを用いて整理し,物体認識への適用,それを利用したサービスロボットの実現を目的として研究を行った.平成27年度では,まず前年度で構築したオントロジーの拡充を行い,構築したシステムにおいて対応可能な表現を多様化させた.また,物を取ってくれるロボットの実現のために,基盤となる技術である物体認識についても検討し,近年,物体認識の分野で盛んに研究が進められている畳み込みニューラルネットワーク(CNN)を用いた手法を適用させた.学習済みのCNNを特徴抽出器として用いる手法に着目し,ロボットが対象物の画像と共に実環境で獲得可能な情報(大きさ情報と赤外線反射輝度情報)から得られる特徴を認識に用いる手法を提案した.実験では構築したデータセットについてテストを行い,付加情報と共に分類を行った場合により高い精度で分類が可能であることを確認した.また,物体の見えを複数の方向から取得が可能な環境において,複数視点画像での認識結果を,認識の確信度に基づいて統合し,精度を改善する手法についても開発した.また,物体を検出するために必要である,画像のセグメンテーションについても検討し,時系列のデータを用いて物体を検出するシステムを構築した.以上の成果を小型ロボットを用いたシステムに実装し,対話を通じた物体認識の実験を行い,有効性を実証した.27年度が最終年度であるため、記入しない。27年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では,ユーザに物体に関する情報(物体の属性)を教えてもらうことでユーザが対象としている物体を認識する対話を援用した物体認識について検討している.そのため,人の自然言語による物体表現と,人が知覚するレベルでの物体の構成との関係をオントロジーを用いて整理し,物体認識への適用,それを利用したサービスロボットの実現を目的としている.本年度では,人が用いる物体表現について調査を行い,今までの調査結果と合わせ,人の物体表現に関する基礎的なオントロジーを構築した.これでは,人の物体表現の概念が,その表現がどのような物体の構成(属性)を示すかを表す「What-Description」と,その表現が物体のどの部分を示すかを表す「Where-Description」をその構成要素として持つように定義し,その下位の概念として人が実際に用いる表現の概念を定義した.また構築したオントロジーに基づいて動作する対話認識システムについても基礎的なものを開発し,実験室環境において実験を行い,その有効性を確認した.対話認識システムは,物体表現が与えられるとオントロジーを参照し,その表現の概念の記述に基づいて検出された物体の中から対象物を認識する.状況によっては表現が複数の物体を示すことがあるが,この問題の解決には,複数の候補物体の中でのその表現に対する優先度を人との対話の履歴から推定する枠組みを構築することで解決した.実験では,オントロジーに記述された規則に基づいて認識システムが対象物を認識することで,円滑な対話を行えることを確認した.また,被験者に協力してもらった実験から,人は対話で用いた物体の表現方法を,その後の対話においても物体の指示,理解に用いるという知見が得られ,表現をオントロジーに基づいて理解し対話に利用することはロボットと人のインタラクションにおいて重要な役割を持つことが分かった.物体認識の技術は,近年急速に進展してきているが,物を取ってくるようなサービスロボットに適用する程には,未だにその精度は十分ではない.そこで,自動的な認識に失敗した場合には,ユーザに物体に関する情報(物体の属性)を教えてもらうことで,ユーザが対象としている物体を認識する対話を援用した物体認識について検討している.本研究では,人の自然言語による物体表現と,人が知覚するレベルでの物体の構成との関係をオントロジーを用いて整理し,物体認識への適用,それを利用したサービスロボットの実現を目的として研究を行った.平成27年度では,まず前年度で構築したオントロジーの拡充を行い,構築したシステムにおいて対応可能な表現を多様化させた.また,物を取ってくれるロボットの実現のために,基盤となる技術である物体認識についても検討し,近年,物体認識の分野で盛んに研究が進められている畳み込みニューラルネットワーク(CNN)を用いた手法を適用させた.学習済みのCNNを特徴抽出器として用いる手法に着目し,ロボットが対象物の画像と共に実環境で獲得可能な情報(大きさ情報と赤外線反射輝度情報)から得られる特徴を認識に用いる手法を提案した.実験では構築したデータセットについてテストを行い,付加情報と共に分類を行った場合により高い精度で分類が可能であることを確認した.また,物体の見えを複数の方向から取得が可能な環境において,複数視点画像での認識結果を,認識の確信度に基づいて統合し,精度を改善する手法についても開発した.

また,物体を検出するために必要である,画像のセグメンテーションについても検討し,時系列のデータを用いて物体を検出するシステムを構築した.以上の成果を小型ロボットを用いたシステムに実装し,対話を通じた物体認識の実験を行い,有効性を実証した.人の用いる物体表現をロボットシステムの物体認識に利用することを目的として,本年度では,人の物体表現を収集するための調査を行い,基礎的な人の物体表現のオントロジーを構築した.また構築したオントロジーに基づいて動作する対話認識システムについても基礎的なものを開発し,実験室環境において有効性を確認する実験を行った.オントロジーの構築では,今回行った調査とこれまでの調査結果をもとに検討を行い,物体表現を中心として,基礎的なものを実装した.これにより,ユーザの行った表現がどのような表現であるかをシステム側で認識し,物体の認識にユーザの物体表現を効果的に活用することを可能にし,実験ではその有効性を示した.また実験室環境での実験実施のために,ロボットとユーザの姿勢同定を行うシステムについても検討,開発を行った.これでは,遮蔽の問題を考慮して複数のKinectセンサを環境に設置し,複数センサでの追跡結果を統合することでユーザの追跡を行う.またロボットの姿勢同定にもセンサから得られる3次元情報に対してパーティクルフィルタの枠組みを用いることで追跡を行った.これは本研究の直接的な成果ではないが,インタラクションを行うために必要な機能であり,今後の研究の遂行のために利用する.このように本年度では次年度において実環境を想定して実験を行うための基礎的な技術を開発した.今後は,実際にロボットが活動するような実環境を想定し,対話ロボットシステムの開発を進めていく.実環境では,対象となる物体が複雑に配置されていることが予想されるため,画像処理の物体の検出方法について検討する.また,ロボットとユーザとの対話においても様々な表現に対応可能なシステムにするため,オントロジー,対話認識システムについても拡充,発展させ,実験を行い,提案システムの有効性を確認する予定である.27年度が最終年度であるため、記入しない。初年度で検討,開発したものをもとに,実環境を想定した実験が可能なレベルのロボットシステムを開発し,実験により提案するロボットシステムの有効性を示す.主としては構築したオントロジー,対話認識システムを拡充,発展させる.初年度では人の物体表現を中心として基礎的なオントロジーを構築したが,実際にロボットが対象とする物体についてもオントロジーの構築方法を検討する必要がある.また,初年度では色や形など,その物体が普遍的に持つ属性についての表現を主に対象としてきたが,位置関係のようなシーン中にある他の物体との関係により生成される属性を示した表現も対象として取り扱えるようにする.また実証実験を行うために,ロボットの画像認識システムについても既存のシステムを発展させる.提案している対話認識システムでは目的の物体を検出できていれば,最終的に認識を行うことができる.ロボットが活動する実際の環境では,様々な物体が複雑に配置されていることが想定されるため,実環境で動作するシステムを構築するために,物体の検出(セグメンテーション)の問題に取り組む.ロボットシステムの評価には,実際に被験者を用いて行う.また高齢者介護施設に協力頂ける環境にあるため,実際の介護施設で体の不自由な方を含めてロボットを使用してもらい,評価を行う.
冬季の利用行動と都市空間意識を考慮した積雪寒冷都市の公共空間デザイン研究

本研究は、積雪寒冷都市における望ましい公共空間デザイン手法を構築するために、以下を明らかにする。冬季の公共空間において利用行動調査を行い、冬季の利用行動を促進する複合的公共空間デザイン(建築物、仮設構築物、装飾等)を明らかにする。ソーシャルネットワーキングサービスに投稿された、積雪寒冷都市の公共空間で撮影された写真の分析から公共空間に対する人の意識構造を把握し、人の意識を惹きつける公共空間デザイン要素を明らかにする。
Dmp1の分泌経路と翻訳後修飾が骨細胞の機能に果たす役割

細胞外基質であるDmp1は、骨芽細胞では発現せず、骨基質に埋まった骨細胞で特異的に発現する。発現したDmp1は、翻訳後修飾の過程で2つに切断され、NH2-端(N端)断片はプロテオグリカンと結合して骨小腔周囲に分布し、COOH-端(C端)断片はキナーゼ(Fam20C)によってリン酸化されて骨細管壁に分布し、骨細胞機能に関与すると考えられる。このように、N端断片とC端断片の分布と翻訳後修飾の違いから、骨細胞機能における両断片の果たす役割は異なると思われるが、その役割はよく分かっていない。リン酸化Dmp1の役割については、Fam20C過剰発現マウスの骨組織を用いて解析を行い、リン酸化セリン抗体を用いた形態学的解析ではDmp1のリン酸化が示唆された。しかし、未脱灰骨サンプルから、亜鉛を用いて補足したリン酸化抽出物の網羅的リン酸化解析では、Dmp1以外の多数の分泌蛋白質のリン酸化亢進が確認されるにも関わらず、リン酸化Dmp1は全く検出されなかったので、脱灰骨サンプルの調整を行って、網羅的リン酸化解析を行う準備をした。また、Dmp1の細胞内輸送を制御する輸送シグナル配列の同定を試みるため、1Dmp1全長配列のN端に赤色蛍光、C端に緑色蛍光を付けた発現ベクター、2全長配列を段階的に短くし、N端に赤色蛍光、C端に緑色蛍光を付けた2つのディレーション変異体発現ベクター、3N端に赤色蛍光を付けたN端断片のみのディレーション変異体発現ベクターを作製した。まず、Dmp1全長配列発現ベクターを、石灰化培地で培養しているMC3T3-E1細胞に遺伝子導入し、1日後に赤色蛍光と緑色蛍光の発色を確認した。Fam20C過剰発現マウスの骨組織におけるDmp1のリン酸化が、未脱灰骨サンプルを用いた網羅的リン酸化解析では検出できず、脱灰骨サンプルの調整を行う等、リン酸化Dmp1の検出方法に試行錯誤している。また、Dmp1の分泌経路の超微構造解析は、未脱灰骨の超薄切片作製に大きな課題があり、培養細胞の超微構造解析に変更した。Fam20C過剰発現マウスの骨組織におけるDmp1のリン酸化の生化学的証明は、未脱灰骨ではDmp1がハイドロキシアパタイトと結合して抽出できない可能性から、脱灰骨サンプルを用いて網羅的リン酸化解析を行う。Dmp1の分泌経路の超微構造解析は、未脱灰骨ではなく、培養骨細胞を用いて研究を進める。また、作製したDmp1変異体を骨細胞に遺伝子導入して、赤色蛍光と緑色蛍光の細胞内分布から、Dmp1の細胞内輸送を制御する輸送シグナル配列の同定を試みる。本年度は、Fam20CによるDmp1のリン酸化の意義について、Fam20C過剰発現マウスの骨格解析から検討を行い、以下の結果を得た。Fam20C過剰発現マウスの骨では、網羅的リン酸化解析により、骨基質を含む様々な分泌蛋白質のリン酸化亢進が認められた。また、Fam20C過剰発現マウスの骨組織の免疫染色では、Dmp1の分布に一致してリン酸化セリンの陽性反応が増強していたことから、本マウスの骨組織ではFam20CによるDmp1のリン酸化が亢進していることが示された。さらに、Fam20C過剰発現マウスの皮質骨では、石灰化亢進による骨形成の促進が認められた。以上から、骨細胞が産生したリン酸化Dmp1はマイナス荷電体となり、Caイオンを引き寄せる石灰化の核として骨形成に関与するという仮説を支持する結果が示された。今後、超微構造解析により、リン酸化Dmp1の分布する骨細管壁の境界板の石灰化レベルや骨細管内のプロテオグリカンとの界面の状態を検討する予定である。骨組織におけるDmp1のリン酸化の意義については、Fam20C過剰発現マウスの骨格解析から、順調に研究が進んでいる。一方、Dmp1の分泌経路の超微構造解析については、骨の未脱灰・超薄切片の作製と免疫染色のステップで試行錯誤の状態である。

リン酸化Dmp1の役割については、Fam20C過剰発現マウスの骨組織を用いて解析を行い、リン酸化セリン抗体を用いた形態学的解析ではDmp1のリン酸化が示唆された。しかし、未脱灰骨サンプルから、亜鉛を用いて補足したリン酸化抽出物の網羅的リン酸化解析では、Dmp1以外の多数の分泌蛋白質のリン酸化亢進が確認されるにも関わらず、リン酸化Dmp1は全く検出されなかったので、脱灰骨サンプルの調整を行って、網羅的リン酸化解析を行う準備をした。また、Dmp1の細胞内輸送を制御する輸送シグナル配列の同定を試みるため、1Dmp1全長配列のN端に赤色蛍光、C端に緑色蛍光を付けた発現ベクター、2全長配列を段階的に短くし、N端に赤色蛍光、C端に緑色蛍光を付けた2つのディレーション変異体発現ベクター、3N端に赤色蛍光を付けたN端断片のみのディレーション変異体発現ベクターを作製した。まず、Dmp1全長配列発現ベクターを、石灰化培地で培養しているMC3T3-E1細胞に遺伝子導入し、1日後に赤色蛍光と緑色蛍光の発色を確認した。Fam20C過剰発現マウスの骨組織におけるDmp1のリン酸化が、未脱灰骨サンプルを用いた網羅的リン酸化解析では検出できず、脱灰骨サンプルの調整を行う等、リン酸化Dmp1の検出方法に試行錯誤している。また、Dmp1の分泌経路の超微構造解析は、未脱灰骨の超薄切片作製に大きな課題があり、培養細胞の超微構造解析に変更した。Dmp1ディレーション変異体を作製し、蛍光を発色する各変異体を骨芽細胞系細胞へ導入する。蛍光発色の追跡により、その細胞内輸送経路を検討し、Dmp1のN端とC端断片の輸送シグナルの同定を検討する。また、超微構造解析により、骨細胞突起内のDmp1 C断片の輸送経路を検討すると同時に、ゲノム編集によりDmp1欠失細胞の作製を行う。Fam20C過剰発現マウスの骨組織におけるDmp1のリン酸化の生化学的証明は、未脱灰骨ではDmp1がハイドロキシアパタイトと結合して抽出できない可能性から、脱灰骨サンプルを用いて網羅的リン酸化解析を行う。Dmp1の分泌経路の超微構造解析は、未脱灰骨ではなく、培養骨細胞を用いて研究を進める。また、作製したDmp1変異体を骨細胞に遺伝子導入して、赤色蛍光と緑色蛍光の細胞内分布から、Dmp1の細胞内輸送を制御する輸送シグナル配列の同定を試みる。