hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
情報通信資本は自然災害による被害を軽減させるか？:国際パネルデータによる検証

近年、世界各国は携帯電話やインターネットなど情報通信資本の著しい普及、進歩を経験している。この進歩は、自然災害による被害を軽減させる効果をもたらしているのであろうか。この研究では、1980年から2013年の世界120ヶ国のデータを用いて、携帯電話やインターネットの情報通信資本の普及が自然災害による死者数にどのような影響を与えているのかを固定パネル推計を用いて検証した。得られた結果は情報通信資本の中でも携帯電話の普及は、有意に自然災害による死者数を減少させる効果があり、またその減災効果は、学校教育年数が高い国ほど大きくなることを示すものであった。本研究の目的は、情報通信資本が様々な自然災害による人的・経済的被害を軽減させる効果があるか否かを理論的・実証的に分析することである。本年度は研究計画に沿って、以下の研究活動を行った。1)関連文献のサーベイ:私が共同研究者であるMarkSkidmore氏の所属するミシガン州立大学に3週間程度滞在し、ともに議論を重ねて必要な文献を確認し参照した。2)関連データの整理:ミシガン州立大学に滞在中に、分析を行う際にどのようなデータが適切であり必要であるのかについての議論を行い、主に一般公表されている複数のwebサイトから原データを入手し、分析に必要なデータを作成した。3)実証分析:整理されたデータを用いて、2種類のクロスカントリー・パネルデータによる回帰分析を行った。一つ目は、情報通信産業が自然災害の被害に直接影響を与える効果に関するものである。回帰分析では、被説明変数に自然災害による被害の指標を考え、「自然災害によって死亡した人数」を用いた。また説明変数である情報通信産業の指標については、「一般電話普及率」、「インターネットの普及率」、「携帯電話普及率」を用いた。その結果、携帯電話の普及率は、自然災害による死者数を有意に軽減させる効果があることが確認された。二つ目は、情報通信産業が人々の信頼関係を強めることで、自然災害の被害を軽減させるという効果である。近年、信頼関係が自然災害の被害を軽減さえる効果があることが指摘されており、もし情報通信技術の発達によって、信頼関係が促進されるのであれば、この径路を通じて、災害被害を軽減さえる効果があると考えられる。回帰分析では、被説明変数に「他人をどの程度信頼できるか」という指標を用い、説明変数には先と同様な情報通信産業の指標を用いた。分析の結果は、情報通信技術は人々の信頼関係を有意に促進する効果があることを示すものとなった。研究2年目にあたる本年度は、私が共同研究者であるMark Skidmore氏の所属するミシガン州立大学に3週間程度滞在し以下の研究活動を行った。1)関連データの整理:昨年度に引き続き、分析を行う際にどのようなデータが適切であり必要であるのかについての議論を行い、分析に必要なデータを整理・作成した。2)実証分析:整理されたデータを用いて、情報通信産業が自然災害の被害にどのような影響を与えるかについて、クロスカントリー・パネルデータによる回帰分析を行った。その結果、特に携帯電話の普及率は、自然災害による死者数を有意に軽減させる効果があることが確認された。また、情報通信産業を用いる際の人々の能力に関しても着目し、同じ情報通信産業の普及度合いであっても、それを十分に使いこなせる能力をもつ人々が多いほど、自然災害による被害が軽減されるという結果となった。具体的には、人々の能力を表す指標に「学校教育年数」を用いて、「学校教育年数と情報通信産業の普及との交差項」を作成し、その値が有意に自然災害による被害を軽減させる効果があることが示された。3)論文の作成:実証分析で得られた結果をもとに、論文の草稿の作成に取り組み、論文のアウトラインを作成した。本研究の目的は、情報通信資本が様々な自然災害による被害を軽減させる効果があるか否かを実証的に分析することである。1年目、2年目の研究では、「関連文献のサーベイ」、「関連データの整理」、「実証分析」、「論文の作成」などを行ってきた。研究最終年度にあたる本年度は、私が共同研究者であるMark Skidmore氏の所属するミシガン州立大学に3週間程度滞在し以下の研究活動を行った。1)研究発表:作成した論文をミシガン州立大学のセミナーで発表し、多くの有益なコメントが得られた。2)論文の改訂、完成:セミナーで得られたコメント等にもとづき、論文の改訂作業を行い、完成させた。3)論文の投稿:完成した論文“Information/communication technology and natural disaster vulnerability"を海外査読誌であるEconomics Lettersに投稿し、受理された。上記論文では、1980年から2013年における120ヶ国のパネルデータを用いた固定効果パネル推計による分析を行った。具体的には、情報通信資本として「携帯電話の普及率」および「インターネットの普及率」を用いて、それらの普及率が「自然災害による死者数/自然災害の影響を受けた人々」にどのような影響があるかを検証した。得られた結果は、情報通信資本は、自然災害による死者数を軽減させる効果があり、取り分け「携帯電話の普及率」がその効果が強いことが示すものであった。

更に人々がより学校教育を多く受けている場合ほど、その効果が大きいことが示された。これらの結果は、社会・経済における新たな情報通信資本の役割を示唆するものであり、自然災害による被害を軽減させる重要な政策の指針となるものである。近年、世界各国は携帯電話やインターネットなど情報通信資本の著しい普及、進歩を経験している。この進歩は、自然災害による被害を軽減させる効果をもたらしているのであろうか。この研究では、1980年から2013年の世界120ヶ国のデータを用いて、携帯電話やインターネットの情報通信資本の普及が自然災害による死者数にどのような影響を与えているのかを固定パネル推計を用いて検証した。得られた結果は情報通信資本の中でも携帯電話の普及は、有意に自然災害による死者数を減少させる効果があり、またその減災効果は、学校教育年数が高い国ほど大きくなることを示すものであった。本年度は、昨年度に引き続き1)関連する文献のサーベイ・整理、2)関連データの整理、3)実証分析、4)理論的背景の考察、5)論文の作成・発表の5項目を行う予定であった。1)、2)に関しては作業が完了し、3)、4)に関しても、研究のアウトラインを含め、ほぼ完了した。5)については草稿を作成し、現在、改訂作業を行っている。経済学研究計画に沿って、引き続き研究を行っていく。平成27年度は、私が共同研究者であるMark Skidmore氏の所属するミシガン州立大学に3週間程度滞在し、これまで行ってきた実証分析結果を整理しまとめた上で、論文の作成を行う。また国内外のセミナーや学会等で研究成果を発表していく。論文発表で得られたコメントをもとに改訂し、海外査読誌への投稿を行う。更に作成されたデータを電子メールやインターネットを用いて公表していくことを考えている。本年度は、1)関連する文献のサーベイ・整理、2)関連データの整理、3)実証分析、4)理論的背景の考察の4項目を行う予定であったが、1)、2)に関しては作業がほぼ完了した。3)については、最初の回帰分析およびそれを改訂する作業を行い、現在も進行中である。4)については、3)の実証分析と関連させながら、分析をすすめている。研究計画に沿って、引き続き研究を行っていく。平成26年度は、これまで行ってきた実証分析結果を整理しまとめた上で、論文の作成を行い、国内外の学会で発表していく。平成27年度は、学会等で得られたコメントをもとに改訂し、海外査読付雑誌に投稿していく。また作成されたデータを電子メールやインターネットを用いて公表していきたい。
トンネル構造および光誘起電界機能をもつ化合物半導体の光触媒作用

半導体光触媒による人工光合成型エネルギ-変換の高効率化を達成するために異なるトンネル構造を持つTi系酸化物における光触媒作用を調べた。酸化物として、Perovskite型空間のトンネル構造を持つWadsley-Andersson型酸化物M_2Ti_nO_<2n+1>(M=H,アルカリ金属原子、n=6,8)、およびChemical-Twin型のトンネル構造をもつ酸化物M'Ti_nO_<2n+1>(M'=アルカリ土類金属原子,n=4)を用いた。前者の酸化物においては、八面体Ti0_6が互いに角および稜で連絡した構造が平行に結び付き、TiO_6単位がn個抜けたトンネル構造(以下において、nPと記す)をもつ。3P構造のNa_2Ti_6O_<13>,4P構造のH_2Ti_7O_<18>および1P構造のTiO_2(B)にRuを担持した後、種々の温度で酸化処理し光触媒とした。水の分解反応に対する光触媒活性を比較すると、4P型のH_2Ti_7O_<18>酸化物および1P型のTiO_2(B)において、水素のみしか生成せず活性も低い。これに対し3P型のNa_2Ti_6O_<13>酸化物では、水素と酸素の生成割合は523823Kの酸化処理では,ほぼ化学量論比で生成した。4P構造の酸化物において酸素生成が見られないのは、電荷発生体である4P構造の特性によるものと考えられた。TiO_6ユニットの連結構造が、平行ではなく互い違いに連絡して形成されるChemical-Twin型のトンネル空間をもつBaTi_4O_9酸化物にRuを担持し、848Kで酸化処理し光触媒とした場合に、反応当初より水素がほぼ化学量論比で生成し、その定常活性もこれまでに得られたRuO_2/Na_2Ti_6O_<13>触媒の最も高い値の約3.6倍程高い活性を示すことが見出された。トンネル構造を持つ酸化物を用いた光触媒では、活性発現の処理として酸化処理のみでよいことから、長時間の反応に対して活性が安定であることが示された。この光触媒作用の特徴は、トンネル構造がRu活性体を分子サイズあるいはクラスタ-サイズで強く保持し、励起電荷の伝達を促進する効果に優れていることに基づくものと考えられた。
中国医学の観点を取り入れた食事調査法の開発

中医学における食事の影響を評価するにあたり、食材をそれらがもつ中医学的な性質である性味(五性、五味、帰経)に基づいて整理する必要がある。当該年度において、現代の我が国で一般的に食されている食材の五性、五味、帰経に関する先行文献の調査を行い、それらに基づき五性、五味、帰経の観点からデータベースにまとめた。データベースへの食品の登録件数は388件で、食品群別には穀類が23件、いも・でん粉類が6件、砂糖・甘味類が7件、豆類が14件、種実類が22件、きのこ類が10件、野菜類が89件、果実類が44件、魚介類が75件、藻類が6件、肉類が43件、卵類が9件、乳類が5件、油脂類が7件、し好飲料類が12件、調味料・香辛料類が16件であった。これらを性味の観点から分類すると、五性の「熱」の性質を持つとされたものはのべ5件であり、同様に「温」は120件、「平」は161件、「涼」は65件、「寒」は55件であった。五味のうち「酸」の性質を持つとされたものはのべ52件であり、同様に「苦」は49件、「甘」は344件、「辛」は58件、「鹹(カン:塩辛さを表す)」は60件、「渋」は14件であった。帰経について「肝」の経に入るとされたものはのべ158件、同様に「心」は65件、「肺」は141件、「脾」は262件、「腎」は154件、「胃」は209件、「大腸」は70件、「小腸」は12件、「膀胱」は17件であった。データベースに収載した388件の食品のうち、日本では一般的に食されていない93件を除く295件について今後検討を進めていく。初年度における研究計画は中医学・西洋医学の視点による食品分類を行うことであり、計画通り達成されている。また2年目の研究計画は食事調査の質問紙作成および再現性・妥当性検証であり、現在その準備を進めている。次年度以降は作成したデータベースに基づいて日本人の食事としての五性、五味、帰経への寄与が大きい食材を同定し、既存の食物摂取頻度調査票と統合し、新たな食物摂取頻度調査票を作成する。その上でこの食物摂取頻度調査票と秤量法による食事調査を3日間×4季節について実施し、その内容について栄養学の観点から食品群、栄養素摂取量を評価するとともに五性、五味、帰経についても評価を行い、食物摂取頻度調査票による調査結果との相関を検討し、質問紙調査の妥当性を評価する。

その上でこの食物摂取頻度調査票と秤量法による食事調査を3日間×4季節について実施し、その内容について栄養学の観点から食品群、栄養素摂取量を評価するとともに五性、五味、帰経についても評価を行い、食物摂取頻度調査票による調査結果との相関を検討し、質問紙調査の妥当性を評価する。食事調査の準備としてその実施に必要な解析装置等物品の購入を予定していたが、内容の更なる検討のため、次年度以降に購入することになった。また当該年度に実施した食品データベース構築を研究者自身が行ったため、そのために予定していた人件費を次年度以降の食事調査関連の人件費に充てることとした。
翻訳フレームを持たない新規なポリAプラスRNA群の機能解析

タンパク質をコードせずRNAとして機能すると考えられるpolyA tailを持っnon-coding RNA/antisense RNAが多くの生物種で見つかってきており、さまざまな生命現象に関わっている事が知られつつある。しかし、生物種間での一次構造の保存性が低いためか、包括的な単離はまだなされていない。我々は分裂酵母において減数分裂特異的に転写誘導される遺伝子群(meu遺伝子群と命名)の網羅的単離を行い、それらの機能を解析してきた。その過程でポリAテールを持っていながら蛋白質をコードしない新しいタイプのmRNA(non-coding RNA)や100種類近くのアンチセンスRNA群、および単一のゲノム領域から複数の転写産物が発現されているという珍しい多重転写領域を見つけた。このような領域の多重転写産物は、現在盛んに進められているDNAマイクロアレイを用いた解析をおこなうことでは単離不可能である。実際、多くのnon-coding RNAは30個以上のアミノ酸を持つ蛋白質はコードできない。分裂酵母の遺伝子数は、およそ6000個と見積もられているため、我々の見つけた割合である1000個のcDNAを解析して50種類以上のnon-coding RNA/antisense RNAを見つけたことから推察すると、全分裂酵母ゲノム内にこのようなRNAが300種以上存在する可能性が考えられる。現在プロテオーム解析の重要性が指摘されているが、我々の得た結果から、アールエノーム(RNAome)の解析もより重要度が増してくることを示唆される。その意味で今回の我々の結果はRNAの重要さを再認識させたという点でゲノム解析に新しい視点を与えると信ずる。
解析函数の空間における微分方程式の研究へのエネルギー評価の導入

佐藤超函数(解析函数)の枠組、ウルトラディストリビューション(Gevrey族)の枠組及びディストリビューション(C^∞函数)の枠組で、エネルギー評価の観点から統一的に(擬)微分作用素の局所可解性を取り扱い、例として主部がD_1^2+・・・+D_<n-1>^2+x_n^2D_n^2である作用素に対して、それぞれの枠組における局所可解性のための必要条件・十分条件を与えた。ディストリビューションの枠組では、局所可解性の研究においてエネルギー評価が非常に有効な手段であることは古くから知られていた。また佐藤超函数の枠組に対しては"Classical Microlocal Analysis in the Space of Hyperfunctions, Springer Lecture Notes in Math.vol.1737"において、如何にエネルギー評価を用いればよいかを示した。今年度の研究においてウルトラディストリビューションの枠組においても同様の取り扱いが可能であることを示した。感覚的な言い方をすれば局所可解性の研究はディストリビューションの枠組で考えることが一番難しく、不確定性原理に基づくエネルギー評価法を発案し用いることにより、不十分ではあるが、ディストリビューションの枠組においても局所可解性の十分条件を得た。今年度の後半は、双曲型方程式系に対するCauchy問題のC^∞適切性についても研究した。、特に主部が定係数である1階双曲系に対して非常に制限された条件の下ではあるが、C^∞適切性のための必要十分条件を得た。この結果は作用素の行列式が比較的簡単に定義される場合のものであり、一般の状況で如何に行列式を定義すれば良いかについても考察した。しかし個別の例に対して行列式を定義したにすぎず、不十分な結果に終わってしまった。今後の発展につなげたいと思う。佐藤超函数-実解析函数の枠組みで考える.formalanalytic symbolをシンボルにもつ擬微分作用素p(x,D)が余接バンドルの点(x^0,ξ^0)でanalytic microhypoellipticである,すなわち(x^0,ξ^0/|ξ^0|)の余球面バンドルにおける近傍Uが存在して,層準同型p(x, D):C|u→C|uが単射であると仮定する.ここでCはマイクロ函数の層を表す.そのとき,転置作用素^tp(x,D)に対して,(x^0,-ξ^0/|ξ^0|)の余球面バンドルにおける近傍υが存在して,p(x,D):C(υ)→C(υ)が全射になること(超局所可解性)を示した.ここでC(υ)はυ上のマイクロ函数の全体のつくる空間を表す.佐藤超函数の枠組みで擬微分作用素p(x,D)を考える(正確には、p(x,D)を解析汎函数の空間を佐藤超函数の空間に写す作用素と考える)。そのとき、与えられた有界領域Ωにおいて、転置作用素^tp(x,D)に対する解析性の伝播についての仮定の下で、p(x,D)のΩにおける可解性、すなわち、与えられたΩ上の佐藤超函数f(∈B(Ω))に対して、p(x,D)u=f in Ωを満たす解析汎函数uが存在することを示した。この結果は、p(x,D)が微分作用素である場合に、Cordaro-Trepreauによって既に証明されていたが、彼らの方法を適用して結果を擬微分作用素に拡張することは、難しいと考えられていた。私が以前に"Classical Microlocal Analysis in the Space of Hyperfunctions, Springer Lecture Notes in Math.vol.1737"において導入したcut-off作用素(cut-off函数をシンボルに持つ擬微分作用素)を用いることにより、彼らの証明法が適用できることが分かり、結果を擬微分作用素の場合に拡張した。また、応用として、河合-柏原によって導入されたマイクロ双曲型作用素に対する佐藤超函数の枠組みでの半大域的な可解性定理を得た。さらに前年度マイクロ函数の空間において、^tp(x,D)の解析的準楕円性よりp(x,D)の(超)局所可解性が導かれることを示したが、この結果も上述の形で半大域的可解性の定理に拡張できることを示した。distributionの枠組みでは、対応する結果はHormander等によって既に与えられていて、(擬)微分方程式論においては基本的な定理の一つになっている。distributionの枠組みで用いられる手法を、我々の開発した方法によって、佐藤超函数の枠組みでの研究にも適用できることを示す一つの例を与えたことにもなっている。

感覚的な言い方をすれば局所可解性の研究はディストリビューションの枠組で考えることが一番難しく、不確定性原理に基づくエネルギー評価法を発案し用いることにより、不十分ではあるが、ディストリビューションの枠組においても局所可解性の十分条件を得た。今年度の後半は、双曲型方程式系に対するCauchy問題のC^∞適切性についても研究した。、特に主部が定係数である1階双曲系に対して非常に制限された条件の下ではあるが、C^∞適切性のための必要十分条件を得た。この結果は作用素の行列式が比較的簡単に定義される場合のものであり、一般の状況で如何に行列式を定義すれば良いかについても考察した。しかし個別の例に対して行列式を定義したにすぎず、不十分な結果に終わってしまった。今後の発展につなげたいと思う。
tRNA擬態タンパク質分子を核とした翻訳終結機構の解明

真核生物ペプチド鎖解離因子eRF3のX線構造決定と高次構造に基づく機能検証を行った。真核生物ペプチド鎖解離因子eRF3は、tRNA擬態性タンパク質であるペプチド鎖解離因子eRF1と結合することで、協調的に翻訳終結反応を遂行するGTP結合タンパク質であり、かつ一方で翻訳終結効率の制御と、細胞内での様々な生理機構を担う因子群との対応を行うハブとして位置づけられる要分子である。解明されたX線結晶構造はGTPおよびGDPの2つのモードに対応するものであり、これらの比較からeRF3がこれまでに明らかにされたGTP結合タンパク質とは異なる新規な機能モードを保持するタンパク質である新事実が明らかになった。また、eRF1との結合領域を高次構造上で推定し実証することで、tRNA擬態タンパク質であるeRF1が、実際にGTP結合タンパク質との相互作用においてもtRNA結合モードを擬態していると言う新知見が明らかになった。翻訳終結過程におけるリボソーム再生反応に共同で機能する、リボソーム再生因子(RRF)および、伸張因子EF-Gの機能解析を詳細に行った。まず、これまでに明らかにしたEF-GのtRNA擬態領域との相互作用によるRRF機能発現機構に加えて、EF-G tRNA擬態領域によるtRNA転座活性(tRNA translocase)機能との機能相関性をin vivoおよび、in vitroで検証した。tRNA転座活性に著しい欠損を示す点変異(H583K)を導入した変異型大腸菌EF-Gタンパク質は、in vivo、in vitro双方のアッセイ系において全く正常にリボソーム再生反応を触媒することを実証した。tRNA転座反応とRRFとの機能協調性は相関しないというこの新知見はこれまで部分的な実験から提唱されていた逆の趣旨の定説をより強固に覆すものであり、リボソーム再生機構におけるRRFの機能性について新たな方向性を切り開く事となった。tRNA転座活性に著しい欠損を示す点変異(H583K)を導入した変異型大腸菌EF-Gタンパク質は、in vivo、in vitoro双方のアッセイ系において全く正常にリボソーム再生反応を触媒することを実証した。明らかにしたX線結晶構造はGTPおよびGDPの2つのモードに対応するものであり、これらの比較からeRF3がこれまでに明らかにされたGTP結合タンパク質とは異なる新規な機能モードを保持するタンパク質である新事実が明らかになった。

また、eRF1との結合領域を高次構造上で推定し実証することで、tRNA擬態タンパク質であるeRF1が、実際にGTP結合タンパク質との相互作用においてもtRNA結合モードを擬態していると言う新知見が明らかになった。真核生物ペプチド鎖解離因子eRF3のX線構造決定と高次構造に基づく機能検証を行った。真核生物ペプチド鎖解離因子eRF3は、tRNA擬態性タンパク質であるペプチド鎖解離因子eRF1と結合することで、協調的に翻訳終結反応を遂行するGTP結合タンパク質であり、かつ一方で翻訳終結効率の制御と、細胞内での様々な生理機構を担う因子群との対応を行うハブとして位置づけられる要分子である。解明されたX線結晶構造はGTPおよびGDPの2つのモードに対応するものであり、これらの比較からeRF3がこれまでに明らかにされたGTP結合タンパク質とは異なる新規な機能モードを保持するタンパク質である新事実が明らかになった。翻訳終結過程におけるリボソーム再生反応に共同で機能する、リボソーム再生因子(RRF)および、伸張因子EF-Gの機能解析を詳細に行った。まず、これまでに明らかにしたEF-GのtRNA擬態領域との相互作用によるRRF機能発現機構に加えて、EF-G tRNA擬態領域によるtRNA転座活性(tRNA translocase)機能との機能相関性をin vivoおよび、in vitroで検証した。tRNA転座活性に著しい欠損を示す点変異(H583K)を導入した変異型大腸菌EF-Gタンパク質は、in vivo、in vitro双方のアッセイ系において全く正常にリボソーム再生反応を触媒することを実証した。tRNA転座反応とRRFとの機能協調性は相関しないというこの新知見はこれまで部分的な実験から提唱されていた逆の趣旨の定説をより強固に覆すものであり、リボソーム再生機構におけるRRFの機能性について新たな方向性を切り開く事となった。
レクチンによる糖鎖部分の検出を用いる穀醤と魚醤の色素の識別

レクチンとしてConAを選び、Jack beanから抽出し精製した。ConAはセファローズ6Bカラムに固定化した。また、ConAを固定化する前のホルミルセファローズをトリス塩酸緩衝液(pH7.4)で不活化したブロッキングセファローズを調製した。穀醤と魚醤の色素がレクチン(ConA)カラムに最も多く保持され、かつ溶出されるクロマト条件を検討した。その結果、(1)CaCl_2,MgCl_2,MnCl_2各1mMを溶解した0.01Mトリス塩酸緩衝液(pH7.2、0.2M食塩を含む)で平衡化したConAカラムを低温(4°C)下でクロマトすること。(2)試料の醤油をカラムに負荷したあと8-12時間カラムの溶出をとめ、レクチンに保持させる時間を十分にとる。(3)溶出はトリス緩衝液、ハプテン糖の0.4Mα-D-メチルマンノシドを含むトリス緩衝液、最後に0.1Mホウ酸緩衝液(pH8.0)で行った。クロマトの検出は可視部の吸収(主に450nm)によった。本実験において、ConAカラムを再使用するときクロマトパターンの再現性が劣ることがみとめられた。これについては、グルコースとグリシンから調製した非透析性モデルメラノイジンを用いて検討した結果、まず、ブロッキングしたセファローズカラムに試料を通して一般吸着する成分を除き、その後ConAカラムにかけるとレクチンカラムからの色素回収率が100%近いことを認めた。国産の穀醤はハプテン糖を含む緩衝液で溶出される色素成分があるので、ConAに親和性を示す色素成分が存在した。しかし、その色素換算したConA親和性成分の割合は醤油全体0.5%程度であった。一方、タイの魚醤は穀醤よりレクチン親和性色素成分が少なく、0.1%程度であった。モデルメラノイジンは3%程度ConA親和性の色素があるのに対し、醤油は極めて微量であった。その理由として、(1)用いたレクチンが妥当であったか。(2)メラノイジンの重合構造にの中に糖の構造を反映する部分が殆どない。
金属蛋白質・金属酵素による物質変換と情報変換の化学

本研究においては、金属錯体を活性中心に含む金属蛋白質および金属酵素を研究対象とし、その配位空間を利用した物質変換と情報変換の機構を分子レベルで明らかにした。具体的には、物質変換を行う金属酵素として一酸化窒素還元酵素と二原子酸素添加酵素、情報変換を行う金属蛋白質として酸素センサー蛋白質を取り上げた。一酸化窒素還元酵素は、急速凍結法をESR法を組み合わせ、二核鉄錯体の活性中心における反応機構を提案した。また、膜結合型蛋白質である本酵素の構造解析にも世界で初めて成功し、構造を基盤に提案した反応機構を議論することにも成功した。哺乳動物においてトリプトファン代謝の重要な酵素である二原子酸素添加酵素(インドールアミン2,3ジオキシゲナーゼ)の構造を世界で始めて報告し、その構造を基盤に触媒反応の分子機構を提案した。鉄に結合した酸素分子と酵素に結合した基質(トリプトファン)との空間的な配置が触媒反応において重要な要因であると結論した。根粒菌の存在し、酸素濃度を感知し、窒素固定酵素の発現を制御している酸素センサー蛋白質において、鉄配位空間において酸素を他の二原子分子(一酸化窒素、一酸化炭素)と見分ける機構を提案した。また、この酸素センサー蛋白質と類似の構造を持つと考えられる好熱菌のセンサー蛋白質の低分解能構造解析に成功し、分子内および分子間での情報変化の経路を同定し、その機構についても議論した。金属イオンを活性中心に有するいくつかのタンパク質・酵素(金属タンパク質・金属酵素)を取り上げ、その分子構造、特に反応場である金属配位空間の精密な構造情報を基に、これらの生理活性や反応機構を分子レベルで理解することを目的に研究を進めた。研究対象としては、1.一酸化窒素還元酵素、2.酸素添加酵素、3.酸素センサータンパク質を取り上げている。本年度は、一酸化窒素還元酵素(Nitric Oxide Reductase : NOR)の反応機構解析に大きな進展があったので報告する。本研究では、脱窒菌Pseudomonas aeruginosaより膜蛋白質NORを高度に精製し、その中の4つの鉄すべてをFe^<2+>に還元した後にNOと反応させ、その際に生成する短寿命の反応中間体の電子状態ならびに配位酵素に注目した。反応追跡には、還元酵素とNO水溶液を混合した後に0.510ミリ秒の時間で急速に凍結できる装置(大阪大学蛋白質研究所高橋聡助教授が設計作製したもの)をもちいて反応中間体の試料を調製し、ESRスペクトルを測定した。混合-凍結時間を0.510ミリ秒に変えた試料、混合-凍結時間を0.5ミリ病に固定し試料の温度を変えたもの、一酸化炭素(CO)存在下での急速凍結試料などの測定の結果から、本酵素の触媒反応機構を提案した。この機構を、脱窒カビのNORの反応機構を詳細に比較検討した。また、この反応機構の構造的な裏付けを得るために、すなわちどのような配位空間で本反応が行われているのか分子レベルで理解する目的で、結晶構造解析を目指した単結晶作成も試みた。現在、約6Å分解能のX線回折像が得られる結晶を得ている。さらに分解能向上を目指して結晶化条件の検索を行っている。研究対象としては、(1)一酸化窒素還元酵素、(2)酸素添加酵素、(3)酸素センサータンパク質を取り上げている。本年度は、センサー蛋白質の構造機能解析に大きな進展があったので報告する。まずは、酸素センサー蛋白質FixLにおいて、酸素-鉄の配位空間を形成しているいくつかのアミノ酸残基(Arg200、Arg208、Ile209、Ile210、Arg214)に注目し、FixLによる酸素濃度感知におけるこれらの役割を検討した。方法は、それぞれをAlaに置換した変異体を調製し、これら変異体への酸素結合・解離速度、結合定数、鉄の自動酸化速度(Fe^<2+>→Fe^<3+>)および自己リン酸化活性を測定した。

その結果、Arg200、Arg208、Ile209、Ile210は、鉄への酸素の結合を制御し、鉄-酸素結合を安定化するような配位空間を形成する役割を果たしており、一方Arg214は酸素脱着による自己リン酸化活性制御に重要な役割を果たしている事が明らかとなった。さらに、FixLと一次構造の相同性が高い(約27%)好熱菌のセンサー蛋白質に注目し、その構造をX線結晶構造解析ならびにX線小角散乱法により解析した。その結果、4.8Å電子密度を得る事に成功した。センサー部位と触媒部位との接触やHKとRRの結合の様式を世界で始めて確認した。金属イオンを活性中心に有するいくつかのタンパク質・酵素(金属タンパク質・金属酵素)を取り上げ、その分子構造、特に反応場である金属配位場周辺の精密な構造情報を基に、これらの生理活性や反応機構を分子レベルで理解することを目的に研究を進めた。本年度は、ヘム結合型二原子酸素添加酵素インドールアミン2、3ジオキシゲナーゼ(IDO)に関する研究において大きな進展があった。二原子酸素添加反応は、空気中の酸素分子から2酸素原子を直接基質に取り込ませる反応を触媒する金属酵素である。IDOは、トリプトファン(Trp)の生体内代謝の最初かつ律速段階のステップを触媒する。この反応の化学が非常にユニークである事に加え、必須アミノ酸Trpの約95%がこの経路で代謝されること、感染症においてIDOが爆発的に誘導される事、生成物のキノリン酸が神経毒であることなどなど生理学的にも非常に重要な酵素である。我々はヒト由来のIDOの結晶構造を世界で初めて報告した。この酵素は約50年前に当時京大医学部の早石修教授らによって発見されたが、それ以来の構造決定である。全体はαヘリックスで構成され、小さなドメインと大きなドメインのインテーフェイスにヘムが位置し、そこで配位空間を形成している。鉄の第五配位子としてHisのイミダゾールが配位しており、ヘム面に対してその反対側が活性部位、すなわち酸素分子が結合する空間が形成されている。この配位空間には、基質となるTrpも結合すると推定できるが、その近傍には、インドール環のNHを引き抜くことのできる塩基性の残基は存在していなかった。この結果と、配位空間を形成するいくつかのアミノ酸残基の変異体解析の結果を合わせて、反応機構を提案した。空気中の酸素分子から2酸素原子を直接基質に取り込ませる反応を触媒するヘム結合型二原子酸素添加酵素インドールアミン2、3ジオキシゲナーゼ(IDO)は、トリプトファン(Trp)の生体内代謝の最初かつ律速段階のステップを触媒する。昨年度、その結晶構造を世界で初めて報告したが、今年度は、その構造を基盤に、部位特異的変異体を数十種作成し、その活性測定ならびに酵素反応解析を行なった。また、鉄に酸素が配位した構造の特性を明らかにする目的で、フロー法をもちいた共鳴ラマン分光測定を行ない、Fe-O_2伸縮振動を560cm^-1に観測した。
2つのコンデンシンの染色体分布を規定するメカニズム

真核細胞では、コンデンシン1とIIと呼ばれる2つのタンパク質複合体が分裂期染色体の構築に中心的な役割を果たしている。これらは、分裂中期染色体上では姉妹染色分体の軸上に局在する一方で、互いに異なる分布パターンを示す。本研究において細胞生物学的手法を駆使した解析の結果、コンデンシンIIはDNA複製直後に染色体への結合を開始して、複製された染色体を分裂期で適切に凝縮するために、S期での姉妹染色分体の構造変換に大きく貢献している可能性が示された。コンデンシンIとコンデンシンIIは、染色体の凝縮と分離に中心的な役割を果たしているタンパク質複合体である。中期染色体では、2つのコンデンシンは、いずれも姉妹染色分体の軸上に局在するが、その分布パターンは互いに重ならない。そこで本研究では、中期染色体における2つのコンデンシンの分布を規定する要因を明らかにすることで、コンデンシン複合体の染色体構築における機能を理解することを目指している。細胞遺伝学的な染色体バンド(分染パターン)とコンデンシンの染色体分布の比較を行ったところ、コンデンシンIIの分布はS期後期に複製されるG-band領域に集まる蛍光が見られた。G-bandに対応するヒストン修飾パターンとの比較においても、この傾向は確かめられた。そして、脱アセチル化酵素の阻害剤であるトリコスタチンAで処理した細胞では、コンデンシンIとIIの染色体上での局在が、姉妹染色分体のより中心軸に集まる傾向がみられた。今回の結果からは、染色体バンドとの関連はまだ明確ではないが、ヒストン修飾パターンがコンデンシンの局在に影響を与えている可能性が示唆されたこれは染色体凝縮因子であるコンデンシンとその基質であるクロマチンの相互作用を示唆した点で意義がある。また人工染色体を用いた解析により、機能的セントロメアを構成するCENP-Aクロマチン領域にはコンデンシンIIが局在している一方、ヘテロクロマチンを構成するヒストンメチル化領域(H3K9me3)にはコンデンシンIが優位に分布していることが示された。人工染色体は、全長にわたってヒトセントロメア配列を含むが、その一部にしかセントロメアは形成されない。したがって、コンデンシンIとIIのセントロメアにおける局在の違いは、DNA配列ではなく、クロマチンの高次構造と密接に関連することが示唆された。コンデンシンIとIIは、染色体の構築と分離に中心的な役割を果たしているタンパク質複合体である。これらの複合体は中期染色体で、いずれも姉妹染色分体の軸上に局在する一方で、互いに重ならない分布パターンを示す。さらにおもしろいことに、2つのコンデンシンの染色体分布は個々の染色体に特異的なパターンを示す。しかし、各コンデンシンの機能とその時空間制御についての理解はあまり進んでいない。本研究では、コンデンシンの分布を規定する染色体側の要因について明らかにすることを目指して研究を進めた。今年度の成果は次の2項目である。1.コンデンシンの分布を変化させる要因コンデンシンの染色体分布を変化させるものとして、(1)ヒストン修飾、(2)DNA複製、を検討したところ、トリコスタチンAによるヒストンの高アセチル化、アフィディコリンによる複製ストレスによって、コンデンシンIあるいはIIの染色体局在が変化する可能性が示唆された。しかし、染色体の軸上に分布するタンパク質の分布パターンや細胞学的な量的解析は前例が無い。そこで、顕微鏡下での個々の染色体の識別と免疫染色の蛍光量の測定とを組み合わせた手法を考案した。2.人工染色体におけるコンデンシン分布染色体の構築と維持のために必要最小限の構造からなる人工染色体では、体細胞のセントロメア近傍におけるコンデンシンIとIIの分布が保持されていた。すなわち、コンデンシンIIはキネトコア内層を構成するCENP-Aにごく近い部位に、コンデンシンIはヘテロクロマチンを構成するヒストンH3K9me3と重なる領域に局在した。この結果から人工染色体は、セントロメアの形成におけるコンデンシンIとIIの役割の違いを解析するモデルとしても有効であることが示された。コンデンシンIとIIは、染色体の凝縮と分離に中心的な役割を果たしているタンパク質複合体である。これらの複合体は、分裂中期染色体で姉妹染色分体の軸上に局在するが、互いに異なる分布パターンを示す。そこで本研究では、2つのコンデンシン複合体の染色体構築における役割の違いを理解することを目指し、これらの染色体分布を規定する要因を明らかにすることを目指した。これまでの研究で、コンデンシンIIは分裂期染色体のG-バンド領域に集中する傾向が分かっている。この染色体領域はS期の遅い時期に複製される領域である。そこで本年度は、コンデンシンIIの染色体分布はDNA複製と関連しているのではないかという作業仮説を立てて、その検証を進めた。その結果、コンデンシンIIが染色体凝縮以前のS期の段階ですでに染色体への結合を開始していることが分かった。

この結合量は、弱い複製の撹乱によって増加した。この時、コンデンシンIとIIの染色体上での局在は重複する傾向が見られた。しかし、DNA損傷部位とコンデンシンIIの染色体局在に関連はみられず、コンデンシンIIの除去しても複製は阻害されず、DNA損傷や姉妹染色分体交換は増加しなかった。ところが、複製を弱く撹乱した細胞からコンデンシンIIを除去すると、単独の処理では見られない分裂期染色体の形態異常が引き起こされた。さらに、S期におけるコンデンシンIIの染色体結合は姉妹染色分体の接着に働くコヒーシンの動態にも影響を受けることが分かった。これらの結果から、コンデンシンIIはDNA複製やDNAの損傷・修復には関与していないが、複製された染色体に結合して、適切に分割・凝縮しうる構造へS期の間に変換する役割をもつことを示唆する。コンデンシンIIの染色体分布が分裂期だけでなくS期での役割を反映している可能性は、本研究で初めて示された。
Phytotelmataの昆虫群集構造:棲息場所の構造と種間関係

ウツボカズラ捕虫嚢、クワズイモ葉腋、樹洞、竹切株などの溜まり水に棲息する蚊幼虫を中心とした水生節足動物群集の構造解明、および多様性が高い群集の形成と維持を可能にする要因の分析を進めた。ウツボカズラ捕虫嚢群集については、今年度の文部省科学研究費海外学術調査で新たに得られたイリアンジャヤ、モルッカ、カリマンタン、ジャワ、スマトラのサンプルの同定を進め、大きなグループ分けは終了したが、詳細な同定は未了である。群集の多様性に係わる要因についての最終的な分析は次年度になされるが、既同定サンプルと文献資料の分析から、多様性の高い群集が存在する地域(たとえばボルネオのような単位)でも、ウツボカズラ種あたりの棲息地は多様性の低い群集しか存在しない地域と同じレベルにあることが明らかになった。この事実は、ある地域のウツボカズラ種数によって表される棲息場所の多様性が多様な種にすみつきの機会を提供し、その結果、個々のウツボカズラ種の個々の群落の群集の多様性も高くなったことを強く示唆する。群集研究材料としてのPhytotelmataの利点を生かして得られた結果だが、群集多様性の形成に係わる最も基本的な一般性の高い側面と考えられる。クワズイモ葉腋の群集については、群集多様性における南北にわたる地理的勾配の有無を確認するため南九州から南西諸島にかけてのサンプルを更に収集し、おおまかな同定を進めた。樹洞、竹切株などの群集については、佐賀県加部島での3年間の調査結果を分析し、これらの棲息場所での多種共存は、たとえ捕食者が存在しなくても、ニッチの分化により維持される可能性があることを明らかにした。また樹洞の湛水率と降雨量の正の相関を利用して過去の気象データから過去の樹洞湛水率変動を推測できることを示した。これらの結果は、疾病媒介蚊の管理という応用面からも意義がある。
希土類イオン交換処理による高飽和磁化フェライトの開発

本研究は、高飽和磁化を有するフェライトの開発を目標とし、非平衡相の生成が期待されるイオン伝導性β系フェライトの希土類イオン交換の可能性ならびに、その電気・磁気的性質について検討することを目的としている。本年度の研究では、希土類イオン交換に必要と考えられる過剰のK^+を含有するホスト材料(β′′,β′′′′-フェライト)の合成を試みたが、まず、そのためにマスフローコントローラにより流量調整されたAr-O2系混合ガス系の酸素分圧制御炉を作製した。作製された酸素分圧制御炉では10^<-3>10^0atmまでの範囲で任意に酸素分圧を制御することができ、この炉を用いてCdイオンにより安定化されたβ′′,β′′′′-フェライトを作製した。次の段階として、上述の方法により作製されたβ′′,β′′′′-フェライトに希土類イオン交換を試みた。希土類イオン交換の原料としては市販の塩化ネオジムを用いたが、この塩化物は非常に水和しやすいために本実験ではHClガス中で溶融塩を生成し、この溶融塩を用いてイオン交換を行った。希土類イオン交換処理を施した試料はSEM-EDX・粉末X線回析法によりその生成相が同定された。SEM-EDXの観察からは、溶融塩が粒界から含浸しβ′′・β′′′′-フェライトと反応すること、溶融塩に長時間直接接触した部分ではα-Fe_2O_3相への分解が起こること、試料の内部においては含有量は僅かであるが希土類イオン交換が起きていることが明らかとなった。従って、今後も課題としてα-Fe_2O_3相への分解をできる限り抑制し、より多くの希土類イオンが交換されるような条件を確立する必要が有る。
消化管の生理活性物質の外分泌に関する免疫電子顕微鏡的研究

[腸管EC細胞におけるセロトニンの管腔分泌に関する免疫電子顕微鏡学的研究]ラット十二指腸潅流実験で、セロトニンは血中と管腔中の二方向に分泌され、腸管内圧亢進刺激によって管腔中へ分泌されるセロトニン量が著明に上昇することを以前発見したが、今回、enterochromaffin(EC)細胞におけるセロトニンの外分泌機構を形態学的に証明することを目的とした。ラットにin vivoで十二指腸末端をクランプし、内圧亢進刺激直後に組織を固定し、pre-&post-embeddingmethodにて、抗セロトニン抗体とIgG-Goldを用い、EC細胞におけるセロトニンの細胞内局在を免疫電子顕微鏡学的に観察し、正常対照群と比較検討した。正常対照群では、セロトニン分泌顆粒が細胞基底部のみに分布する細胞と細胞基底部と管腔側に二層性分布をする細胞の2種類が認められた。正常対照群の管腔側のセロトニン分泌顆粒は、基底部よりも小さく、電子密度の高い顆粒であった。正常対照群では、IgG-Goldは分泌顆粒上のみに認められたが、腸管内圧亢進刺激群では、IgG-Goldが分泌顆粒上だけでなく管腔側細胞質にも一様に認められた。また、内圧亢進刺激群では、管腔側顆粒の増大や電子密度の低下、中抜け顆粒の増加や管腔側細胞質面積の増大等が認められた。腸管EC細胞におけるセロトニンの管腔分泌が、細胞基底側とは異なる分泌様式で行われている可能性を形態学的に示した。
文字の動的スタイリングによる情報表現およびインタラクションの研究

アニメーションする文字のような、文字の表示属性(文字の位置、向き、大きさ、色、フォントなど)を経時的に、およびインタラクティブに変更する、動的スタイリング技術を確立し、応用を探ることを目的として、読みやすさや気づきやすさ、動きによって感じられる感情などの視覚特性の評価、汎用的にデータ交換や処理を行うためのXML記述言語と処理ソフトウェア群の開発、文字の動きで付加的な情報を表現するアプリケーションの開発を行った。本研究の目的は,テキスト情報を表示する際に文字に割り当てられる表示属性(文字の位置,向き,大きさ,色,フォントなど)を経時的に,およびインタラクティブに変更する,動的スタイリング技術を確立し,応用を探ることにある.このために,動的スタイリングの効果の分析,記述言語の整理・拡張,ツールキット化,アプリケーションの開発,の4つの項目について,平成20年度は下記の研究開発を行った.1.動く文字による情報表現手法の効果について調査するために,作業中の画面の周囲にスクロールする文字列を提示する周辺情報提示方法について,周辺情報への気づきやすさとメインタスクへの妨害の度合いに関する評価実験を行った.その結果,文字の動きが速いほど気づきやすく,文字の大きさには影響されないことがわかった.2.記述言語の整理・拡張,およびツールキット化を目標として,W3CのTimed Textなどの関連技術動向および参考資料を調査し, Processingを開発環境としてパタン化されたアニメーション表現までをサポートするライブラリ仕様を策定し,開発に着手した.3.提案手法の有用性を示すために,電子メールの概要を文字アニメーション化してユーザに通知するアプリケーション、および電子掲示板における感情表現を抽出してアスキーアートのアニメーションで視覚化し閲覧支援するアプリケーションを開発,効果を確認した.なお,1及び3については京都工芸繊維大学の辻野嘉宏教授,倉本到准教授,上田晃寿氏,古屋啓介氏の研究協力を得た.本年度は,1.動的スタイリングの効果の分析,2.記述言語の整理・拡張,3.ツールキット化,4.アプリケーションの開発,の4つの項目について下記の研究開発を行った.1.昨年度に引き続き,周辺情報提示における文字列のスクロール表示に関して,実際の文字を使用して認知処理を要するタスクを課した評価実験を行い,認知時間およびタスク集中度に対する提示文字列の大きさ,速度,方向の影響を分析した.その結果,提示速度が遅く,文字が大きいほどメインの作業を妨害しないこと,ある速度を境目に,それより遅い場合は文字が大きいほど認知時間が長く,速い場合は文字が大きいほど短くなることが分かった.この結果は周辺情報提示に動く文字を利用する際の指針となる.2.文字アニメーションを効果的に利用したコンテンツを分析したところ,楽曲の歌詞を音楽に同期させて表現するものが多いことが分かった.このようなコンテンツを作成する際には従来の時間記述では効率が悪いと考えられる.そこで,拍やテンポなどの音楽の時間記述方法の導入を検討し,仕様を決定した.3.Java言語で作成したプレーンテキストへの文字アニメーション自動マークアップ処理ライブラリについて英語対応を充実させるためOpenNPLの導入作業を進めている.4.RSSやマイクロブログの視覚化手法,小説の小型端末上での閲覧アプリケーション,デバイスの振り方でメッセージを選択・スタイリングする自己目的的コミュニケーションツール,などの各種アプリケーションの開発を進めている.なお,以上の研究について京都工芸繊維大学の辻野嘉宏教授,倉本到准教授,上田晃寿氏,古屋啓介氏,村山元基氏の研究協力を得た.本年度は,1.動的スタイリングの効果の分析,2.記述言語の整理・拡張,3.記述言語の処理プログラム開発,4.アプリケーションの開発,の4つの項目について下記の研究開発を行った.1.文字に動きを付与した際に,感じ取ることのできる感情・印象の変化を分析する評価実験を行った.その結果,動きによる感情の変化の方向に関して感情語は3つのグループに分けられ,それぞれのグループに対して感情を強める効果,弱める効果,対になる感情を想起させる効果のある動きが存在することがわかった.2.前年度検討した音楽との同期を効率的に記述するための,拍やテンポなどの音楽の時間記述方法を導入したXML記述言語について作例および下記処理系の実装および使用実験を行い実現可能性と有効性を確認した.3.上記のXML記述言語を解釈して表示・再生するための処理プログラムを実装した.4.デバイスの振り方でメッセージを選択・送受信する自己目的的コミュニケーションツールについて実装・評価実験を行い,有効性を検証した.この結果に基づき,振り方でメッセージの動きを付けをするメッセンジャーアプリの検討を行った.また,小型端末向けの文章の自動Rapid Serial Visual Presentation化ツールの仕様を検討した.以上の成果により,文字の動的スタイリングの利用に関する基礎的な知見および処理等の方法論を確立することができた.なお,以上の研究について京都工芸繊維大学の辻野嘉宏教授,倉本到准教授,山本景子助教,上田晃寿氏,古屋啓介氏,村山元基氏の研究協力を得た.
トウトマイシン生合成遺伝子のクローニングと解析

Streptomyces spiroverticillatusにより生産されるトウトマイシン(TM)は、タンパク質脱リン酸化酵素(PP1及びPP2A)阻害剤である。TMは無水マレイン酸骨格と直鎖状ポリケチドが結合したユニークな構造を持つことから、TM生合成遺伝子の発現と調節を、遺伝子組換え手法を用いた生合成遺伝子群の取得と一次構造の解析により明かにすることを目的とする。まず、既知のType I PKSで高度に保存されている塩基配列を基にプライマーを合成し、TM生産菌染色体DNAとのPCRを行ったところ特異的断片が増幅された。PCR産物により特異的に認識される、TM生産菌染色体DNA由来の約1.8kbの遺伝子断片が、TM生合成遺伝子由来のものであることを証明するため、pIJ702を用いてトウトマイシン生産菌の形質転換効率の向上を目指し、2x10^4transformants/μgDNAの転換効率を得た。次に、上記遺伝子断片をチオストレプトン耐性遺伝子を組み込んだpUC19を用いてサブクローニングを行いプラスミド(pTM201)を構築した。TM生産菌プロトプラストに対して相同組換えによる形質転換を行い遺伝子破壊を試みた。得られた15株の形質転換体は、全てTM生産能を失っていたが、親株が生産するもう一つの抗生物質キサントスタチンの生産能を保持していた。サザンブロット法により、これらの閉鎖株のTM生合成遺伝子は欠失していることが明らかとなった。Streptomyces spiroverticillatusにより生産されるトウトマイシン(TM)は、白質脱リン酸化酵素(PP1及びPP2A)阻害剤である。TMはdialkylmaleicanhydride骨格と直鎖状ポリケタイドが結合したユニークな構造を持つことから、その生合成経路を明らかにすることを目的として以下の研究を行なった。TMは可視部吸収が弱く、また抗菌活性も弱いことから、通常の生合成研究で用いられる閉鎖株の取得、co-synthesisによる解析は不可能であった。そこで、生合成遺伝子群の取得、それらを用いた染色体遺伝子の不活化による変異株の取得を行なうことにした。最初に本目的のために必須であるTM生産菌のプロトプラスト化・再生・形質転換系の確立を試みた。プロトプラスト化およびその再生は、リゾチームの使用、ならびに他のStreptomyces属で報告されている培地の適用で各々可能であった。形質転換系は、生産菌の持つcryptic plasmidをcureすることにより、PIJ702,PIJ61等で形質転換可能となった。次に、TMの主鎖は、トレーサー実験より各々5つのacetate、propionateが取り込まれることが判っており、TypeIのpolyketide synthase(PKS)により生合成されると推定される。そこで既知のTypeIのPKSで高度に保存されている塩基配列を基にプライマーを合成し、TM生産菌染色体DNAとのPCRを行なったところ特異的断片が増幅された。現在、この断片が実際にTM生合成遺伝子をコードしているか否かを染色体上遺伝子の不活化法で検討している。トウトマイシンの生合成遺伝子のクローニングと解析を行うに当たり、昨年度までにその生産菌であるStreptomyces spiroverticillatusにおけるトウトマイシン生産性の向上化、形質転換時必要とされるプロトプラスト化及びその再生系の確立、さらにPCR法を用いた生合成遺伝子の部分塩基配列の取得を行った。本年度は、放線菌由来ベクターpIJ702を用いた形質転換効率の検討及び、トウトマイシン生合成遺伝子の不活化を行った。1)形質転換効率の検討:プロトプラスト調製温度及び、保存密度、トランスフォーメーション時におけるプロトプラスト密度、PEG(ポリエチレングリコール)種、濃度及び、温度、さらにトランスフォーメーション時間について検討を行った。その結果、プロトプラスト

調製温度:25°C、保存密度:1×10^8 cells/100ml、トランスフォーメーション時におけるプロトプラスト密度、1×10^7 cells/100ml、PEG(ポリエチレングリコール)種、濃度:PEG1000、終濃度32%、温度:4°Cもしくは49°C、トランスフォーメーション時間:0分の条件において、最も高い形質転換効率(4×10^4 transformants/mg DNA)を得ることに成功した。2)トウトマイシン生合成遺伝子の不活化:トウトマイシン生産菌染色体DNAのSau3A1を用いた部分分解物より、コスミドライブラリーを作成し、PCR法を用いて得られた部分塩基配列をプローブにし、生合成遺伝子の一部をコードすると考えられる断片を得た。本断片をpUC19を用いてサブクローニングを行い、さらに放線菌由来ベクターpIJ702と連結することによりシャトル化を行った。さらに本シャトルベクターをトウトマイシン生産菌に対して形質転換し、プロトプラスト再生法を用いて遺伝子破壊を行い、トウトマイシン非生産株を取得した。Streptomyces spiroverticillatusにより生産されるトウトマイシン(TM)は、タンパク質脱リン酸化酵素(PP1及びPP2A)阻害剤である。TMは無水マレイン酸骨格と直鎖状ポリケチドが結合したユニークな構造を持つことから、TM生合成遺伝子の発現と調節を、遺伝子組換え手法を用いた生合成遺伝子群の取得と一次構造の解析により明かにすることを目的とする。前年度までに、既知のType I PKSで高度に保存されている塩基配列を基にプライマーを合成し、TM生産菌染色体DNAとのPCRを行なったところ特異的断片が増幅された。PCR産物により特異的に認識される、TM生産菌染色体DNA由来の約1.8kbの遺伝子断片が、TM生合成遺伝子由来のものであることを証明するため、まずpIJ702を用いてトウトマイシン生産菌の形質転換効率の向上を目指し、2×10^4transformants/μgDNAの転換効率を得た。次に、上記遺伝子断片をチオストレプトン耐性遺伝子を組み込んだpUC19を用いてサブクローニングを行いプラスミド(pTM201)を構築した。TM生産菌プロトプラストに対して相同組換えによる形質転換を行い遺伝子破壊を試みた。得られた15株の形質転換体は、全てTM生産能を失っていたが、親株が生産するもう一つの抗生物質キサントスタチンの生産能を保持していた。現在、サザンブロット法により、それぞれの株の組み込み様式を検討中である。