hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
蛋白質高次構造の新しい解析法の開発

本研究班では、対象分子の存在状況や目的に応じた高次構造の解析法、さらに分子間相互作用の解析法の開発を行った。すなわち、固体NMRによる新しい蛋白質高次構造研究法の開発を行い、膜蛋白質のような無配向固体状態の蛋白質の構造解析を行うために新しい固体NMR法を開発した。また、溶液NMRによる溶液中の生体高分子の高次構造解析法の開発を通して、一連の転写因子の構造解析を行った。また、免疫グロブリンGを研究対象とし、様々な安定同位体標識技術を開発し、高分子量の糖蛋白質複合体から有用なNMR情報を得る方法論を確立した。さらに、蛋白質・リン酸化蛋白質の化学合成法の研究を行い、構造解析に必要な量の単純蛋白質、リン酸化蛋白質を効率よく合成しする方法の開発を開発するとともに、安定同位体標識アミノ酸ならびに核酸塩基の合成法を確立した。標識DNAを利用して、蛋白質-DNA複合体の構造を世界ではじめてNMRにより解析することに成功した。生体超分子X線結晶構造解析法の開発を行い、イネ萎縮ウイルスのX線結晶構造解析のための分解能を20A分解能程度から原子レベルにまで引き上げた。生体高分子間の相互作用や生体高分子集合体の構造の研究のために、X線小角散乱システムおよび中性子結晶構造解析のためのデータ収集法および検出器を開発した。巨大蛋白質・複合体の構造解析のためのアルゴリズムの開発を行い、蛋白質および蛋白質DNA複合体の立体構造をNMRデータより効率よく生成できる新しいアルゴリズムを開発することができた。藤原は、固体状態の^<13>Cでフルラベルした核酸について、同種核間双極子相互作用を用いて2次元相関スペクトルを得た。またアミノ酸について二面角情報を含んだ固体2次元スペクトルを測定し、そのスペクトルを解析中である。白川は、マウスOct-3 POU-homeoドメインについては、主鎖の原子核についてR.M.S.D.で0.44オングストロームまで精密に立体構造を決定した。大腸菌RNA polymeraseαサブユニットC末端ドメインについてもほぼ全ての帰属を終え、2次構造を決定した。嶋田は、巨大タンパク質の動的・静的高次構造解析法を確立のための研究対象として抗ダンシル抗体及び抗NP抗体を取り上げ解析した。その結果、安定同位体標識抗原認識フラグメントFab、Fvおよび補体系活性化ドメインFcに関し、主鎖アミド基由来シグナルの部位特異的帰属が可能になった。相本は、チオエステル法によるシステイン含有蛋白質の合成法を開発し、RNAポリメラーゼ中に存在するバルナーゼ様ドメインの合成に成功した。小野は、同位体標識ヌクレオシド及びアミノ酸の多量合成法の開発研究に着手し、^<13>C/^<15>N-標識アデノシン、グアノシンを微生物発酵により合成する方法、α-位、又はβ-位を^<13>Cで標識したアミノ酸類を化学的に合成する手法の確立に目処を付けた。月原は、分子量が大きな超分子複合体の結晶の結晶構造解析を行うために、回折強度を精度良く収集する方法を確立することができた。また対称性の高い蛋白質集合体の構造を決定するための非結晶学的対称による平均法のプログラムを作成した。中村は、NMR解析によって得られる距離情報を用いたdistance geometry法を拡張して、分子複合体に適応できるようにしたアルゴリズムを開発した。この手法を用いて、がん原遺伝子産物c-MybのDNA結合最小領域とDNAとの複合体構造を決定した。藤原は,^<13>Cや^<15>Nで一様に標識した固体核酸(アデノシン)に多次元固体化学シフト相関NMRを適用することで、^<13>C,^<15>N-NMRシグナルの完全な同定が出来た。^<13>Cで一様に標識したアミノ酸アラニンに新しく開発した異方的相互作用相関NMRで二面角情報を得られることがわかった。白川は,大腸菌RNAポリメラーゼ_αサブユニットC末端ドメインの溶液中の立体構造を決定し、DNAと相互作用する部位の同定を行った。

また、大腸菌のシグナル伝達因子であるArcBのHisキナーゼドメインの多くの核シグナルの帰属を終了した。加えて、カイコ転写因子FTZ-F1の転写活性化のメディエーター蛋白質であるMBF1のFTZ-F1,TBP結合ドメインのマッピングを行った。嶋田は,核磁気共鳴法によるタンパク-タンパク質相互作用様式の解析を行う。本年度は,抗体定常領域フラグメントFc(分子量50K)と可溶性Fcレセプター(分子量25K)に焦点をあて,13Cおよび15N安定同位体標識したFcを用いて,可溶性Fcレセプター結合領域を同定を行なった。また,Fcレセプターの安定同位体標識法の確立を検討している。小野は,標識グルコース,酢酸,尿素などを出発原料とする安定同位体標識DNAオリゴマーの合成法を確立した。また,標識RNAオリゴマーの合成に着手し,安定なヘア-ピン構造を形成する塩基配列を持つRNAデカマ-を合成した。一方,DNA修復酵素Adaの精製法を検討し,NMR構造解析に用いる目処を付けた。Ada蛋白質-標識DNA複合体のNMR解析に着手した。相本は,チオエステル法を発展させ,システイン含有蛋白質であっても簡便に合成できる方法を開発し,アドレノメジュリンならびにc-Myb蛋白質のDNA結合ドメインの合成に成功した。月原は,ウシ心筋チトクロム酸化酵素の構造を2.8Å分解能で決定した。2つのヘム、CuA部位、CuB部位及びZn部位を確定した。13種のサブユニットをすべて構造決定することもできた。この結晶構造解析では分子量40万の2量体の構造を決定したことになり、最も大きな分子の構造決定の一つである。また電子伝達の経路も見つかった。中村は,NMRによる蛋白質とDNAとの複合体構造を決定する際に、広いサンプリング空間を探索しつつ、実験データを満たす複合体の立体構造を高い効率で生成する手法を開発し、その手法の有効性を詳細に調べ、実際の応用も行った。藤原は、13Cで完全標識した生体分子について、固体NMRで、二面角と距離を決める多次元NMR測定法を開発した。アミノ酸と核酸に適用したところ、二面角の精度は約5度、C-C距離は0.05nmであった。白川は、カイコMBF1コアドメイン、大腸菌ArcBのリン酸基転移ドメイン、11ファージCro蛋白質ジスフィド架橋変異体、ヒト遺伝子修復因子XPAの損傷DNA結合ドメインの立体構造の決定を行った。加藤は、NMR情報に基づいて,マウス免疫グロブリンG分子上のFcレセプター結合部位を同定し,Fcレセプター結合部位の高次構造の構築に糖鎖の存在が必要であることを示した。また,NMR解析のために,この糖鎖を安定同位体標識する方法を開発した.相本は、チオエステル法によるシステイン含有蛋白質の合成法を開発し、アドレノメジュリン、リン酸化c--Myb(1-141)の合成に成功した。小野は、平成7年度までに確立した安定同位体標識DNA/RNAオリゴマーの合成法を活用して、任意の位置のヌクレオシド残基が均一に標識されたDNAドデカマ-及び標識RNAデカマ-を合成した。また、立体選択的に13C/2Hで多重標識されたヌクレオシド類の合成法を確立し、構造解析手法の開発研究に活用した。
ヒト組織キマ-ゼ・アンジオテンシン系の各種病態の進展に果たす役割の検討

【背景】アンジオテンシン(Ang)IからIIへの変換は、血中ではほぼ100%ACEよるのに対して、近年、ヒト心室においては、その大部分(80%以上)はACE阻害薬で抑制されない、キマ-ゼによることが報告された。我々は、最近、ヒト動脈においても、心室と同様にそのAngII産生の80%はキマ-ゼによることを報告した。しかし、ラットやマウスのキマ-ゼは、ヒトと異なり、むしろAngII分解酵素であることが知られており、動物での薬物効果が、必ずしもヒトに反映されない可能性が考えられる。そこで、今回の研究の目的は、動脈におけるAngII産生にキマ-ゼとACEの果たす役割、すなわち、ヒトにおける健常動脈と粥状硬化の動脈におけるAngII産生能、ACE、キマ-ゼの存在比率について検討し、ヒトにおける動脈硬化進展に対する血管壁RA系の役割を明らかにすることである。【方法】生前及び術前ACE阻害薬を使用していないヒト大動脈(正常大動脈、粥状硬化大動脈、大動脈瘤の膜分画を作成しAngI、及び各種阻害薬の存在下で37°C、15分間、インキュベイションし、生成されたAngII量を逆相高速液体クロマトグラフィーにて測定した。カプトプリル投与群にて抑制されたAngII産生量をACE活性、キモスタチン投与にて抑制された産生量をキマ-ゼ様活性として評価測定した。さらに正常大動脈及び病変大動脈をACE抗体、キマ-ゼ抗体を用い、免疫組織化学的に検討した。【結果】粥状硬化、動脈瘤病変では総AngII産生量は、それぞれ4.06【plus-minus】2.7nmol/min/mg prot.(=u)、5.1【plus-minus】2.4uと正常動脈1.11【plus-minus】0.5uに比し有意に(p<0.01)増加していた。その内訳はいずれの病態でも80%以上は、キマ-ゼ依存性であり、ACE依存性のものは少量であった。キマ-ゼによるAngII産生量は動脈瘤病変で正常大動脈に比し有意に(p<0.05)増加していた。免疫組織学的研究では、キマ-ゼは主として大動脈外膜に存在しており、ACEとは存在場所を異【背景】アンジオテンシン(Ang)IからIIへの変換は、血中ではほぼ100%ACEよるのに対して、近年、ヒト心室においては、その大部分(80%以上)はACE阻害薬で抑制されない、キマ-ゼによることが報告された。免疫組織学的研究では、キマ-ゼは主として大動脈外膜に存在しており、ACEとは存在場所を異近年、組織レニン-アンジオテンシン系の動脈硬化の発症や進展に関与している可能性が示唆されてきた。また、ヒト動脈壁におけるアンジオテンシン(Ang)IからIIへの変換はAngI変換酵素(ACE)よりむしろキマ-ゼによるものが大きいことが報告されている(ACE :キマ-ゼ様活性比=20:75)。そこで我々は、正常大動脈、大動脈硬化病変、および大動脈瘤において総AngII産生能を測定し、さらにACEとキマ-ゼ様活性の比率について比較検討した。剖検組織(死後12時間以内)と手術標本より得た正常大動脈、大動脈硬化、大動脈瘤の膜分画を調整し蛋白濃度を測定後、10^<-4>

MのAngI及び各種添加物(バッファーのみ、Captopril10^<-4>M、Chymostatin10^<-5>M)を加え、100mMNaClの存在下で15分間インキュベイションしAngII産生量を逆相高速液体クロマトグラフィー(HPLC)にて測定した。Captopril又はChymostatinにて抑制されたAngII産生量を測定し、それぞれACE活性、Chymase活性として評価した。その結果、大動脈硬化、大動脈瘤いずれにおいても総AngII産生量(大動脈硬化:3.38±0.95n mol/min/mgprot、大動脈瘤:3.32±0.62)は正常大動脈(1.02±0.18)と比較し有意(p>0.05)な増加が認められた。AngI変換能でACE活性は、正常大動脈6%、動脈硬化5.5%、大動脈瘤0.4%であったのに対してキマ-ゼ様活性は84.5、90.7、94.5%であった。すなわち、大動脈瘤では正常大動脈と比較しキマ-ゼ様活性が有意に増加していた。結論として、ヒトの大動脈病変においては局所でのAngIからIIへの変換能の亢進がみられた。また、このAngII産生にACEよりもキマ-ゼが強く関与している可能性が示唆された。【背景】アンジオテンシン(Ang)IからIIへの変換は、血中ではほぼ100%ACEよるのに対して、近年、ヒト心室においては、その大部分(80%以上)はACE阻害薬で抑制されない、キマ-ゼによることが報告された。我々は、最近、ヒト動脈においても、心室と同様にそのAngII産生の80%はキマ-ゼによることを報告した。しかし、ラットやマウスのキマ-ゼは、ヒトと異なり、むしろAngII分解酵素であることが知られており、動物での薬物効果が、必ずしもヒトに反映されない可能性が考えられる。そこで、今回の研究の目的は、動脈におけるAngII産生にキマ-ゼとACEの果たす役割、すなわち、ヒトにおける健常動脈と粥状硬化の動脈におけるAngII産生能、ACE、キマ-ゼの存在比率について検討し、ヒトにおける動脈硬化進展に対する血管壁RA系の役割を明らかにすることである。【方法】生前及び術前ACE阻害薬を使用していないヒト大動脈(正常大動脈、粥状硬化大動脈、大動脈瘤の膜分画を作成しAngI、及び各種阻害薬の存在下で37°C、15分間、インキュベイションし、生成されたAngII量を逆相高速液体クロマトグラフィーにて測定した。カプトプリル投与群に抑制されたAngII産生量をACE活性、キモスタチン投与にて抑制された産生量をキマ-ゼ様活性として評価測定した。さらに正常大動脈及び病変大動脈をACE抗体、キマ-ゼ抗体を用い、免疫組織化学的に検討した。【結果】粥状硬化、動脈瘤病変では総AngII産生量は、それぞれ4.06±2.7nmol/min/mg prot.(=u)、5.1±2.4uと正常動脈1.11±0.5uに比し有意に(p<0.01)増加していた。その内訳はいずれの病態でも80%以上は、キマ-ゼ依存性であり、ACE依存性のものは少量であった。キマ-ゼによるAngII産生量は動脈瘤病変で正常大動脈に比し有意に(p<0.05)増加していた。免疫組織学的研究では、キマ-ゼは主として大動脈外膜に存在しており、ACEとは存在場所を異にしていた。【結論】ヒト大動脈の粥状硬化、動脈瘤病変ではキマ-ゼによるAngII産生が病変の進展に寄与している可能性が考えられる。
MBE-VLS法によるシリコン基板上GaAs系ナノワイヤ構造の作製と評価

今年度は,MBE-VLS法をによるSi基板上へ無触媒によりGaAs系ナノワイヤの成長メカニズムを利用したGaAs/AlGaAsコアシェル構造を作製し,光デバイス応用のための光学的特性評価を行った。(111)Si基板上に580°Cで10分間GaAsナノワイヤを成長した後,5分間の成長中断,そして600°Cで180分間AlGaAsシェル構造の成長を行った。これにより,直径約1.8μm,長さ約5μmのマイクロワイヤを得ることが出来た。このAlGaAsマイクロワイヤにおけるフォトルミネッセンス(PL)測定を行った結果,PLスペクトルにおいて3つの肩がある2つのピークが確認された。これらのピークはAlGaAs基礎吸収端のエネルギーよりも低く,AlGaAsピークの半値幅よりも狭いピークが得られていることから,干渉による発光であると考えられる。このことをより詳細に調べるために,PLの偏光特性を測定した。その結果,TM偏光された5つのピークが観測され,ウィスパリング・ギャラリー・モード(WGM)による干渉であることが分かった。そこで,WGMを考慮して各ピークの同定を行ったところ,六角形に共振する2つのWGMと,三角形に共振する3つの準WGM(q-WGM)であることがわかった。また,別の同様の試料において励起強度に対するPL特性を調べたところ,励起強度が53.5kW/cm^2においてWGMによる発振と考えられる鋭い発光を示し,Q値が703と比較的高い値であることがわかった。このことから,ナノワイヤを用いた光デバイスへの応用が期待できる。MBE法とVLS法を組み合わせた方法によりSi基板上へGaAsナノワイヤの作製を試みた。今年度は、(111)Si基板へのGaAsナノワイヤの成長条件を変化させることで,その成長形態について考察を行った。触媒としては直径15nmの金コロイドを用い、成長温度は580°Cで行った。ナノワイヤの形状はSEMにより評価した。また、Asフラックス量を固定した場合とGaフラックス量を固定した場合でV/III比を変化させナノワイヤ形成にどのような影響を与えるかを調べた。Gaフラックスを3.5×10^<-7>torr、成長時間を843 secにし、V/III比を6から100まで変化させGaAsナノワイヤを成長させた結果、V/III比の増加と共に、ワイヤの平均長が0.5μmから5.5μmまで長くなり、先端直径は140nmから24nmまで細くなった。Asの圧力が低いとAu/Ga共晶からのGaAs結晶化速度が遅くなるため、ワイヤ先端のAu/Ga液滴のサイズが大きくなり、その結果ワイヤ径が太くなったと解釈される。V/III比の増大と共にワイヤ長が長くなったのは、V/III比によるナノワイヤの側面でのGaの拡散長が変化し、基板からのGaの供給量が変化したためと考えられる。次に、Asフラックスを1.0×10^<-5>torrに固定し、Gaのフラックス量を1.4×10^<-7>から3.5×10^<-7>torrまで変化させ、成長時間を一定とした時、ワイヤ径は4050nmとほぼ一定であり、ワイヤ長がGaフラックス量に反比例して長くなることが分かったが、成長レートはGaのフラックス量に依存せず一定であることが分かった。以上のことから、GaAsナノワイヤのMBE-VLS成長においてはAs供給律速になっているものと思われる。今年度は、MBE法とVLS法を組み合わせた方法によりSi基板上へ無触媒によりGaAsナノワイヤの作製を試みた。自然酸化膜を有する(111)Si基板へのMBE法によりGaAsを成長させると,Ga液滴がナノサイズで形成され,そのGa液滴が触媒のように作用しGaAsナノワイヤがVLS成長することがわかった。また,加熱したままAsを照射した状態で成長中断を行うとGa液滴がGaAs結晶化し,GaAsナノワイヤ頂上のGa液滴が消失することが実験によりわかった。この無触媒による成長メカニズムを用いることで,GaAs/AlGaAsコアシェルナノワイヤ構造,あるいはシェル構造であるAlGaAsの真ん中にGaAs量子井戸層を設けることに成功した。この成長した試料については,低温でのカソードルミネッセンス法により,量子井戸における量子化した準位に関する発光を観測することができた。またデバイス応用を目指し,(001)Si基板にストライプの溝(トレンチ壁)を形成し,電子線露光装置およびMBE-VLS法を用いて,Siトレンチ壁面からGaAsナノワイヤを対壁に位置を制御して架橋することにも成功した。一方デバイス応用の際に問題となる空乏化を防ぐ目的で,バンドギャップの小さいInAsナノワイヤをSi基板上へ無触媒MBE-VLS法により成長することも試みた。成長条件によっては,余分な多結晶を抑制しつつInAsナノワイヤを無触媒により成長することにも成功した。このAlGaAs

マイクロワイヤにおけるフォトルミネッセンス(PL)測定を行った結果,PLスペクトルにおいて3つの肩がある2つのピークが確認された。これらのピークはAlGaAs基礎吸収端のエネルギーよりも低く,AlGaAsピークの半値幅よりも狭いピークが得られていることから,干渉による発光であると考えられる。このことをより詳細に調べるために,PLの偏光特性を測定した。その結果,TM偏光された5つのピークが観測され,ウィスパリング・ギャラリー・モード(WGM)による干渉であることが分かった。そこで,WGMを考慮して各ピークの同定を行ったところ,六角形に共振する2つのWGMと,三角形に共振する3つの準WGM(q-WGM)であることがわかった。また,別の同様の試料において励起強度に対するPL特性を調べたところ,励起強度が53.5kW/cm^2においてWGMによる発振と考えられる鋭い発光を示し,Q値が703と比較的高い値であることがわかった。このことから,ナノワイヤを用いた光デバイスへの応用が期待できる。
Fkbp5ノックアウトマウスを用いた廃用性およびステロイド性骨粗鬆症の病態解明

骨細胞ネットワークが破綻した骨芽細胞特異的Bcl2トランスジェニック(tg)マウスを用いて、骨細胞ネットワークの機能を解明してきた。このマウスを用い、非荷重時に骨細胞ネットワークの存在下でのみ、骨芽細胞と骨細胞に発現誘導されるFkbp5(FK506 binding protein 5)を同定した。Fkbp5は、ステロイドレセプターに結合するシャペロン分子の1つである。Fkbp5の骨における機能を明らかにするため、ノックアウト(Fkbp5-/-)マウスを作製した。Fkbp5-/-マウスは、非荷重時およびグルココルチコイド投与時に野生型マウスと比較し、より強度の骨量減少を来たした。骨細胞ネットワークが破綻した骨芽細胞特異的Bcl2トランスジェニックマウスを用いて、骨細胞ネットワークの機能を解明してきた。このマウスを用い、非荷重時に骨細胞ネットワークの存在下でのみ誘導されるFkbp5(FK506 binding protein 5)を同定した。1.グルココルチコイドレセプター(GR)、プロゲステロンレセプター(PR)、アンドロゲンレセプター(AR)、エストロゲンレセプター(ER)の転写活性化能に対するFkbp5の機能解析GR, PR, AR, ERa, ERbそれぞれに対するレポーターベクター、標準化用のレニラルシフェラーゼベクターを、野生型マウスおよびFkbp5-/-マウスから得た頭蓋冠由来骨芽細胞にそれぞれ導入、デキサメサゾン、プロメゲストン、ジヒドロテストステロン、b-エストラジオールを種々の濃度で添加、48時間培養後にルシフェラーゼ活性を測定した。GRに対するレポーターベクターを用いたデキサメサゾンの添加実験のみ、Fkbp5-/-骨芽細胞で野生型骨芽細胞に対してレポーターアッセイの上昇を見た。2.非荷重実験8週齢の雄および雌の野生型マウスとFkbp5-/-マウスを用いて1週間尾部懸垂を行い、マイクロCTで骨密度および骨量を比較した。雄マウスでは、Fkbp5-/-マウスでのみ、骨密度低下および骨量が低下していた。雌マウスでは野生型マウスおよびFkbp5-/-マウスともに骨密度低下および骨量が低下していたが、その程度はFkbp5-/-マウスの方が強かった。骨細胞ネットワークが破綻した骨芽細胞特異的Bcl2トランスジェニックマウスでは、Bcl2がアクチン切断酵素であるゲルゾリンと結合、その機能を阻害し、骨細胞突起の著減をきたし、骨細管も著減する。そのため、骨細胞は徐々にアポトーシスをきたし、骨細胞ネットワークが破綻する。このマウスは、非荷重状態にしたとき、野生型マウスで起こる骨量減少が起こらない。このマウスを用いて、非荷重状態の時に骨芽細胞および骨細胞に発現誘導される遺伝子を探索した。そして、非荷重時に骨細胞ネットワークの存在下でのみ誘導されるFkbp5(FK506 binding protein 5)を同定した。Fkbp5-/-マウスおよび野生型マウスの骨芽細胞を用いて、グルココルチコイドレセプター、プロラクチンレセプター、アンドロゲンレセプター、エストロゲンレセプターの転写活性化能に対するFkbp5の機能をレポーターアッセイで解析した。Fkbp5の欠失は、グルココルチコイドレセプターの転写活性化能を増加させたが、その他のレセプターの活性化能は変化を認めなかった。徐放性プレドニゾロンペレット(低容量1.25m/kg/day、高容量3.2 mg/kg/day)あるいはプラセーボペレットを植え込み、骨量をマイクロCTにて比較した。高容量プレドニゾロンペレットでは、Fkbp5-/-マウスは4週間以内に全例が死亡した。低容量プレドニゾロンペレットでは、死亡例は少なかったが、野生型マウスに比較し、骨量減少が顕著であった。したがって、Fkbp5は、グルココルチコイドによる骨量減少に関与することが明らかとなった。グルココルチコイドレセプター(GR)、プロゲステロンレセプター(PR)、アンドロゲンレセプター(AR)、エストロゲンレセプター(ER)の転写活性化能に対するFkbp5の機能解析は修了し、Fkbp5-/-骨芽細胞では、グルココルチコイドにのみ過剰に反応することを明らかに出来た。

尾部懸垂を用いた非荷重実験も修了し、Fkbp5-/-マウスでは、雄、雌ともに非荷重時における骨量減少が野生型マウスより強く起こることを明らかに出来た。また、骨芽細胞分画および骨細胞分画を用いた遺伝子発現解析も修了している。ただし、Fkbp5-/-マウスを2.3 kb Col1a1 GFPトランスジェニックマウスと交配して、外骨膜側と内骨膜側の骨芽細胞を、セルソーターを用いてGFPで分離する方法は、予備実験に時間がかかり、まだ確立できていない。骨代謝学1.セルソーターを用いたGFP陽性骨芽細胞の分離は、週齢、尾部懸垂日数の検討等を行い、I型コラーゲンの低下が起こるが、GFPを陽性として分離できる条件検討を行う。2.グルココルチコイド投与実験を行う。8週齢の野生型マウスおよびFkbp5-/-マウスの背部皮下に、徐放性プレドニゾロンペレット(低容量1.25m/kg/day、高容量3.2 mg/kg/day)あるいはプラセーボペレットを植え込み、1週間ごとに体重を測定するとともにマウスの挙動を観察する。4週間後に屠殺、大腿骨をマイクロCT、骨組織形態計測で比較する。TUNEL染色で、骨芽細胞、骨細胞におけるアポトーシスを比較する。屠殺時に血清を採取し、血糖、コレステロール、中性脂肪、アルブミン、コリンエステラーゼ、CPK、LDH等を測定し、プレドニゾロンの耐糖能、脂質代謝、筋に対する作用を調べる。筋重量を測定するとともに組織切片で筋細胞面積を計測し、筋萎縮を比較する。また、消化管潰瘍や出血がないか腸管を調べる。骨芽細胞分画および骨細胞分画を用いて、リアルタイムRT-PCRおよびマイクロアレイ解析を行う。マイクロアレイ解析で選択された遺伝子は、リアルタイムRT-PCRで確認後、発現ベクターを作製する。初期培養骨芽細胞に導入、アルカリホスファターゼ染色、von Kossa染色を行うとともに、骨芽細胞マーカーの発現をリアルタイムRT-PCRで調べ、骨芽細胞分化・機能に関与するか調べる。また、発現ベクターを導入した初期培養骨芽細胞を骨髄細胞と共培養、破骨細胞形成支持能を調べる。3.1で確立した方法を用いて、尾部懸垂実験およびグルココルチコイド投与実験マウスより、外骨膜側骨芽細胞分画、内骨膜側骨芽細胞分画、骨細胞分画RNAを抽出し、マイクロアレイ解析を行う。Fkbp5-/-マウスを2.3 kb Col1a1 GFPトランスジェニックマウスと交配して、外骨膜側と内骨膜側の骨芽細胞を、セルソーターを用いてGFPで分離する方法を検討するのに時間がかかった。そのため、2.3 kb Col1a1 GFPトランスジェニックマウスとFkbp5-/-GFPトランスジェニックマウスからGFP陽性細胞を外骨膜側と内骨膜側それぞれより単離して、マイクロアレイ解析(外注)を行うことが出来なかった。プレドニゾロンペレット(680千円)、Real Time PCR関連試薬、牛胎児血清、培養液の購入、マイクロアレイの外注(200千円/1ペアx6ペア=1,200千円)、マウス維持費: 15千円/月x 12ヶ月=180千円、国内旅費@50千円x2人=100千円に使用する。
C型肝炎ウイルス増殖に関わる宿主因子の同定とその肝病態における役割

これまでにHCV-IRES発現細胞RCF-26を用いてHCV-IRES関連因子の中でLa,PTB,eIF2 gamma,PSMA7がHCV-IRES活性に重要な働きを有していることを示した。本研究ではHCVレプリコンを用いて、これらの翻訳因子がHCVの複製に与える影響を検討した。siRNAを用いて各翻訳因子の発現を特異的に抑制した場合、EMCV-IRESを有する従来型HCVレプリコン(NNeowt)の複製は抑制されなかったが、HCV-IRESのみを有する新たに構築したHCVレプリコン(MH14C)の複製は著明に抑制された。従ってこれらの翻訳因子の抑制はHCV-IRES活性の低下を介して、HCVの複製を抑制したものと考えられる。興味深いことに、実際のC型慢性肝炎肝組織におけるこれらの翻訳因子の発現とHCVの複製との関連を検討すると、La,eIF2 gamma,PSMA,PCBP2の発現が、肝組織内のHCV-RNAと有意に相関することが明らかになった。マイクロアレイを用いた正常肝18例、C型慢性肝炎肝組織37例の肝組織遺伝子発現プロファイル解析ではこれらの遺伝子はC型慢性肝炎肝組織で誘導される一群の遺伝子クラスターに群別された。さらにLaの発現制御を検討すると、LaはHCVタンパク自身の発現によって誘導されることが明らかとなった。Laプロモーター領域をクローニングし、ルシフェラーゼ・レポーターアッセイにて検討すると、HCVのあるタンパクが、Laプロモーターを活性化していることが明らかとなった。以上より、Laは細胞周期亢進によっても誘導されるほか、HCV感染そのものによっても誘導されることが明らかとなった。これまでにHCV-IRES発現細胞RCF-26を用いてHCV-IRES関連因子の中でLa, PTB, eIF2 gamma, PSMA7がHCV-IRES活性に重要な働きを有していることを示した。また平成17-18年度とHCVレプリコンを用いて、これらの翻訳因子がHCVの複製に与える影響を検討した。これらの遺伝子発現と細胞周期の関連を検討すると、細胞の合成期・分裂期で発現が亢進しており、HCVレプリコンの複製も、細胞の増殖期で盛んであり、細胞の静止期で低下する現症が認められた。興味深いことに、実際のC型慢性肝炎肝組織におけるこれらの翻訳因子の発現とHCVの複製との関連を検討すると、La, elF2 gamma, PSMA7の発現が、肝組織内のHCV-RNAと有意に相関することが明らかになった。以上より、Laは細胞周期充進によっても誘導されるほか、HCV感染そのものによっても誘導されることが明らかとなった。
オブジェクト指向分析・設計におけるオブジェクトの進化の法則の研究

オブジェクト指向に基づく分析・設計の過程においてオブジェクトモデル(クラス図)を構成するオブジェクトおよび関連は,生成された後さまざまな変化を繰り返し,またある場合には途中で消滅する。これをオブジェクトモデルあるいはオブジェクトの進化と呼ぶ。現在一般的に用いられているオブジェクト指向方法論はまだ未成熟であり,いかなる条件が満たされたときオブジェクトおよび関連にいかなる操作を加えるべきかが十分に定式化されていない。このため分析・設計者が独自の経験と勘に基づいて判断しているのが実態である。その結果,作成されるオブジェクトモデルに多様性が生じ,また方法論に従ったとしても分析・設計の品質が保証されるとは限らない。本研究ではオブジェクトモデルの進化のメカニズムを解明し,またその結果に基づき分析・設計方法論の改善を図る。1.進化パターンの抽出既存のオブジェクトモデルおよび文献等よりクラス図の変形規則を収集し,それらを分類,整理することにより規則集を編纂した。これまでにオブジェクトと関連の識別パターン,オブジェクトの属性化パターン,属性のオブジェクト化パターンなど約20種類を発見した。2.オブジェクト識別効率の比較評価モデルの生成において分析の最初の段階で正確にオブジェクトを識別することはモデリング効率の向上にとってきわめて重要である。そこで,各方法論のオブジェクト識別能力を評価するため分析の初期段階で識別した初期オブジェクトが分析の最終段階まで残っている割合,すなわち初期オブジェクトの残存率を測定した。データ駆動手法の代表例であるランボーのOMTと振る舞い駆動手法の代表例であるヤコブソンのOOSEを対象とし,これらを用いて小ないし中規模の問題数例をモデル化した。その結果,OOSEが効率よく初期オブジェクトを識別できることを確認した。
高度に制御された高分子網目の合成とゲル化機構に関する研究

1.均一網目構造の形成過程における反応動力学に関する研究アミン末端と活性エステル末端をそれぞれ有する二種類の四分岐PEG (Tetra-PEG)の架橋反応速度を分光法を用いて調査した。反応速度定数(kgel)のプレポリマーの分子量依存性と濃度依存性を調べたところ、kgelはプレポリマーの分子量や濃度に依存せず、1本鎖PEGの反応速度定数に一致することを見出した。またkgelは一般的な拡散律速反応やラジカル重合の架橋反応よりも小さいことが判明した。ここからゲル化反応は拡散律速ではなく、反応律速であることを見出した。それゆえに、反応中にプレポリマーは溶液中を十分に拡散することができ、均一な混合されることが示唆された。均一なゲルを得るためには、反応律速系になるように反応末端を選ぶ必要があることが示唆された。2.親油性高分子電解質ゲルの構造解析親油性高分子電解質ゲルは北大佐田研で合成された、低極性溶媒でも大きく膨潤することができるゲルのことである。このゲルはTFPB-とTBA+をpoly (octadecyl acrylate) (pODA)に導入することで作製される。本研究ではジクロロメタン中における親油性高分子電解質とゲルの構造をDLSとSANSによって調査した。SANS測定より、pODAは半径1.5nmで長さが14nmの剛直な棒状分子であり、荷電基を導入しても構造に変化がないことが判明した。またジクロロメタン中ではpODAの第2ビリアル係数は正であり、良溶媒であることが判明した。DLS測定からは荷電基の導入により、1.遅い拡散の出現、2.ゲル中における協同拡散定数の増加、3.浸透弾性率の増加、といった高分子電解質に特徴的な挙動を観察することができた。これらの結果はジクロロメタン中でイオン対が解離し、高分子電解質として働いていることを示している。pODAが良溶媒であること、そして解離可能なイオン対の導入により、このゲルが高い膨潤能を有することが結論付けられた。26年度が最終年度であるため、記入しない。1.小角中性子散乱と動的光散乱による立体規則性を変えたPNiPAMの構造解析動的光散乱及び小角中性子散乱(SANS)を用いて、立体規則性がPNiPAM水溶液の相分離プロセスに与える影響を調査した。SANS測定より、メソ比率が増加するにつれて疎水性が増すことが明らかとなった。この結果は、メソ体の方がラセモ体よりもより疎水的であるという、二量体や三量体のシミュレーション結果とも一致する。[Katsumoto, Y. ; et al., J. Phys. Chem. B, 2010, 114, 13312-13318, and Autieri, E., et al, J. Phys. Chem. B, 2011, 115, 5827-5839]さらにメソ比率は単一の高分子鎖の静的な形状や収縮挙動には影響を与えないが、高分子鎖どうしの凝集挙動に大きな影響を与えることが明らかとなった。メソ比率が低い場合は相分離点付近で急激に相分離を起こす一方で、メソ比率が高い場合には徐々に凝集していく様子が観察された。ここから立体規則性を調整することで、PNiPAM水溶液の相分離挙動は制御できることが明らかとなった。2.小角中性子散乱による高分子網目内部の不均一性の観察Tetra-PEGゲルとはダイヤモンド型の高分子網目を有する均一ゲルである。本研究では二種類の欠陥をゲル内部に導入し、欠陥が網目構造に与える影響を調査した。第一に高分子濃度を減らした上で、そのゲル化過程に対して時分割SANS測定を行った。するとφ<φ^*ではゲル化とともに散乱強度と相関長が大きくなったものの、φ>φ^*ではほとんど変化しなかった。ここでφとφ^*はそれぞれ高分子の体積分率と重なり合い濃度における高分子の体積分率である。次に系統的に結合欠陥を導入したTetra-PEGゲルを作製し、水中で膨潤させることで不均一性をより拡張させた。SANS測定よりas-prepared状態では散乱関数はほとんど変化しなかったものの、swollen状態では結合欠陥の増加とともに系統的に散乱関数が変化した。このような一連の実験結果を基にして、結合欠落と不均一性の相関をシンプルな模式図を用いて検討した。

このゲルはTFPB-とTBA+をpoly (octadecyl acrylate) (pODA)に導入することで作製される。本研究ではジクロロメタン中における親油性高分子電解質とゲルの構造をDLSとSANSによって調査した。SANS測定より、pODAは半径1.5nmで長さが14nmの剛直な棒状分子であり、荷電基を導入しても構造に変化がないことが判明した。またジクロロメタン中ではpODAの第2ビリアル係数は正であり、良溶媒であることが判明した。DLS測定からは荷電基の導入により、1.遅い拡散の出現、2.ゲル中における協同拡散定数の増加、3.浸透弾性率の増加、といった高分子電解質に特徴的な挙動を観察することができた。これらの結果はジクロロメタン中でイオン対が解離し、高分子電解質として働いていることを示している。pODAが良溶媒であること、そして解離可能なイオン対の導入により、このゲルが高い膨潤能を有することが結論付けられた。26年度が最終年度であるため、記入しない。交付申請書に記載したテーマである「ゲルにおける結合欠陥と弾性率の関係性」と「ゲル内部の結合欠陥と不均一構造の関係性」ともに順調に進み、前者は論文を投稿中、後者はMacromolecules誌に掲載済みである。これに加えて、「小角中性子散乱と動的光散乱による立体規則性を変えたPNiPAMの構造解析」も同時に研究を進め、Macromolecules誌に掲載されている。「ゲルにおける結合欠陥と弾性率の関係性」に関しては論文を投稿中であり、その査読意見によっては大幅な加筆修正が必要になるものと予想される。また最近では、高強度ゲルを作製するための必要条件を探索すべく、そのゲル化反応の速度論に関する研究が進展を見せており、論文としてまとめる予定である。
デンプン貯蔵細胞分化特異的に発現するKH-RNA結合ドメインを持つ遺伝子の解析

本年度は,本研究課題で解析を行っている遺伝子が,植物体内でどのような生命現象に関与しているのかを推定するために,植物体内においてデンプン貯蔵細胞分化,および脱分化を植物体内で検証できる実験系の構築とそれを制御する遣伝子の特定を進めた.これまでに,シロイヌナズナでは,水分屈性発現時に根端のデンプンを蓄積する細胞群であるコルメラ細胞においてアミロプラスト脱分化がおこることが示されている.そこで,この水分屈性発現過程においてコルメラ細胞内でどのような変化が起こることにより,デンプン貯蔵細胞の脱分化が起こるのかを観察により解析するとともに,当該遺伝子との関係の解析を試みた.その結果,テクノビット7100樹脂を用いた光学顕微鏡観察により,水分勾配刺激によりまず,デンプン貯蔵細胞内の液胞化が進行することが観察され,それに伴い細胞内デンプン粒が消失していくことが観察された.また,この現象は水分ストレスを与えるだけでも生じることも同時に観察された.さらに,この現象を担う生体内因子の探索を,種々の生体内因子を阻害する薬剤処理により行ったところ,カルシウムイオンのキレート剤であるEGTAを与えたときにデンプン粒消失が抑制されることが見いだされた.これらの結果を踏まえ,これらの現象と当該遺伝子との関係の解析を開始したが,現在のところ明瞭な結果は得られなかった.その原因としては,本研究で着目している遺伝子のホモログが関与していると考えられ,現在それらの種子もあわせて解析を行っている.これまでのデンプン貯蔵細胞分化,脱分化過程の研究成果について,総説集"Tobacco BY-2 cells, a new treatise"に発表を行うとともに,デンプン貯蔵細胞分化の有無で制御される植物の生理現象として,茎の回旋転頭運動があることを見いだし,この成果についても米国科学アカデミー紀要に発表した.本年度は課題名に記した遺伝子(SCI2)解析のために必要な,培養細胞における生理学的解析を完成させると同時に,タンパク質の生化学的な解析のための試料作成を行った.以下に個々の内容を記す.(1)これまで本分化誘導系において,オーキシンとサイトカイニンの役割が重要であることを明らかにしてきたが,近年オーキシン様の効果も有する植物ホルモンとして研究の進んでいるブラシノライドのデンプン貯蔵細胞における効果について検証した.その結果,ブラシノライドはデンプン貯蔵細胞分化に対し抑制効果(オーキシン様の効果)を有することが明らかになるとともに,細胞増殖に関してオーキシンとは異なる効果を有することを明らかにした.この結果は,これまで本実験系の課題であったデンプン貯蔵細胞分化と細胞増殖という2つの因子を分割できる可能性を示すものとして今後の解析に重要であると考えられ、その成果をJournal of Experimental Botany誌に報告した.また前述の成果も踏まえオーキシンとサイトカイニンによる分化誘導形の確立についてJournal of Applied Glycoscience誌に報告した.(2)16年度以降に行う予定であるSCI2タンパク質の生化学的解析の準備としてSCI2タンパク質の精製を試みた.手法として大腸菌における強制発現ベクターpQE30に当該遺伝子のcDNAを組み込み、6つのヒスチジン残基で標識された融合タンパク質の強制発現,及びニッケルカラムを用いた精製に成功した.SC12特異的抗体作成のため精製タンパク質の一部を用い,ウサギに免疫を行った.また,認識配列同定に用いるSELEX(systematic evolution of ligands by exponential enrichment)法の基質作成のためにオリゴヌクレオチドプールの作成を行った。本年度は昨年度の解析をもとにタバコ培養細胞BY-2,およびシロイヌナズナを用いた実験を行った.(1)昨年度作製した6つのヒスチジン標識をつけたSCI2タンパク質を大腸菌内で大量に合成させ,ニッケルカラムを用いて生成し,昨年度作製したオリゴヌクレオチドプールを用いてSELEX法によるSCI2タンパク質が認識する配列の同定を開始した.同時に,SCI2遺伝子の過剰発現,発現抑制形質転換BY-2細胞を作出するためにバイナリーベクターpIG121HMの35Sプロモーター下流にセンス方向およびアンチセンス方向にSCI2を導入したコンストラクトを作製した.現在形質転換体を実験に供試するために培養中である.(2)植物体におけるSCI2の機能同定には培養細胞同様にアミロプラスト分化/脱分化を連続的に観察できる実験系が必要である.これまでにモデル植物であるシロイヌナズナにおいて水分勾配刺激を根端に与えることにより根端のアミロプラスト中のデンプンが消失することが見いだされている.そこで,本年度はこの現象を確認するとともに,アミロプラスト分化/再分化とデンプン合成/分解に関わる遺伝子発現との相関をRT-PCR法により確認した.また,シロイヌナズナにおけるSCI2ノックアウト植物の種子をABRCより入手し,種を増やすための栽培を行っている.本年度は,本研究課題で解析を行っている遺伝子が,植物体内でどのような生命現象に関与しているのかを推定するために,植物体内においてデンプン貯蔵細胞分化,および脱分化を植物体内で検証できる実験系の構築とそれを制御する遣伝子の特定を進めた.これまでに,シロイヌナズナでは,水分屈性発現時に根端のデンプンを蓄積する細胞群であるコルメラ細胞においてアミロプラスト脱分化がおこることが示されている.そこで,この水分屈性発現過程においてコルメラ細胞内でどのような変化が起こることにより,デンプン貯蔵細胞の脱分化が起こるのかを観察により解析するとともに,当該遺伝子との関係の解析を試みた.

その結果,テクノビット7100樹脂を用いた光学顕微鏡観察により,水分勾配刺激によりまず,デンプン貯蔵細胞内の液胞化が進行することが観察され,それに伴い細胞内デンプン粒が消失していくことが観察された.また,この現象は水分ストレスを与えるだけでも生じることも同時に観察された.さらに,この現象を担う生体内因子の探索を,種々の生体内因子を阻害する薬剤処理により行ったところ,カルシウムイオンのキレート剤であるEGTAを与えたときにデンプン粒消失が抑制されることが見いだされた.これらの結果を踏まえ,これらの現象と当該遺伝子との関係の解析を開始したが,現在のところ明瞭な結果は得られなかった.その原因としては,本研究で着目している遺伝子のホモログが関与していると考えられ,現在それらの種子もあわせて解析を行っている.これまでのデンプン貯蔵細胞分化,脱分化過程の研究成果について,総説集"Tobacco BY-2 cells, a new treatise"に発表を行うとともに,デンプン貯蔵細胞分化の有無で制御される植物の生理現象として,茎の回旋転頭運動があることを見いだし,この成果についても米国科学アカデミー紀要に発表した.
貯水池周辺の大崩壊による段波の形成に関する研究

わが国では、現在では2000を越えるダムが存在しており、地盤条件あるいは降雨条件の厳しいわが国では、地震あるいは豪雨によって貯水池周辺で大きな崩壊が生じる確率は無視できず、崩壊土が貯水池に流入する可能性は低くない。多量の崩壊土が貯水池内に流入すると、イタリアのバイオントダムのように巨大な波が発生し、大災害を引き起こしかねない。このような災害は、大崩壊の発生確率とともに、貯水池数に依存しており、わが国でのその発生確率は年々高くなっていると考えられ、貯水池の流域管理が重要な課題である。そこで、本研究は、このような貯水池内での大崩壊にともなう段波形成について検討することを目的としたものであり、具体的には1)災害事例(特に眉山災害)に関する研究2)土砂崩壊の予測法に関する研究3)崩壊土砂の運動特性に関する数値解析的研究4)崩壊土塊の水域流入に伴う段波の形成と伝播遡上特性に関する数値解析的研究を実施するとともに、最終的に上記の研究を総合し、200年前島原で発生した眉山の大崩壊に伴う災害の数値シミュレーションを試み、大崩壊に伴う段波災害をある程度予測することが可能であることを実証した。わが国では、地震あるいは豪雨によって貯水池内で大きな崩壊が生じる確率は無視できない。この場合、イタリアのバイオントダムの例にあるように貯水池内に段波が発生し、大災害を引き起こす可能性がある。本研究は、このような貯水池内での大崩壊にともなう段波形成をわが国の場合について検討することを目的としたものでる。本年度は、初年度であり、まず、貯水池内や閉鎖性水域内での土砂崩壊事例とそれにともなう段波の発生状況について調査を行った。特に、1963年イタリアのバイオントダム災害と、1792年島原の眉山崩壊に件う災害を中心に調査し、どちらの事例も災害による死者は2000人以上であり、このような災害における被害の大きさがあらためて認識された。次に、段波の形成特性を把握するため、模型実験によって、崩壊土量、流入速度、貯水池特性による段波の形成特性について検討した。また、流入土砂の先端形状によって段波の特性が異なってくると考えられるので、先端形状の影響についても検討を行った。この結果、形成される段波は、土塊の流入速度・先端形状に大きく影響し、最大波高は流入土厚の2倍以上になる可能性があることがわかった。さらに、2次元流れのシミュレーション法による段波の形成過程の数値計算法を構築し、実験結果や眉山崩壊による段波の再現計算を行った。また、崩壊規模および崩壊速度に関して、わが国における崩壊の事例を調査し、崩壊規模および崩壊速度に関して統計的解析を実施した。わが国では、現在2000を越えるダムが存在しており、これからの貯水池周辺で地震あるいは豪雨によって大きな崩壊が生じる確率は無視できず,その崩壊土が貯水池内に流入する可能性がある.この崩壊土が貯水池内に流入すると,場合によってはイタリアのバイオントダムのように巨大な波が発生し,大災害を引き起こしかねない.このような災害は,大崩壊の発生確率とともに,貯水池数に依存しており,わが国での発生確率は年々高くなっていると考えられる.そこで本研究は,発生した大崩壊が貯水池内等に流入することによって生じる段波について研究することを目的としており,本年度は,昨年に引き続き貯水池内での段波の発生に関する事例の収集を行い,実際発生した段波の状況について調査した.また.模型実験および実例を再現できる数値シミュレーションの構築を実施した.この数値シミュレーション法は,崩壊土塊の挙動のシミュレーション法と波の形成過程のシミュレーション法を合体する必要があるが,本年度は各シミュレーションモデルの妥当性を評価するまでに留まっており,両者のカップリングは来年度の課題として残った.一方,発生する波の大きさに関連する崩壊規模および崩壊速度に関しては,収集された資料に基づいて,わが国における崩壊規模および崩壊速度の発生確率を地山の地質あるいは崩壊の要因を考慮にいれて検討するとともに,200年前長崎県の島原で発生した眉山の大崩壊の資料を集め,その中の災害について検討した.わが国では、現在では2000を越えるダムが存在しており、地盤条件あるいは降雨条件の厳しいわが国では、地震あるいは豪雨によって貯水池周辺で大きな崩壊が生じる確率は無視できず、崩壊土が貯水池に流入する可能性は底くない。

多量の崩壊土が貯水池内に流入すると、イタリアのバイオントダムのように巨大な波が発生し、大災害を引き起こしかねない。このような災害は、大崩壊の発生確率とともに、貯水池数に依存しており、わが国でのその発生確率は年々高くなっていると考えられ、貯水池の流域管理が重要な課題である。そこで、本研究は、このような貯水池内での大崩壊にともなう段波形成について検討することを目的としたものであり、具体的には1)災害事例(特に眉山災害)に関する研究2)土砂崩壊の予測法に関する研究3)崩壊土砂の運動特性に関する数値解析的研究4)崩壊土塊の水域流入に伴う段波の形成と伝播遡上特性に関する数値解析的研究を実施するとともに、最終的に上記の研究を総合し、200年前島原で発生した眉山の大崩壊に伴う災害の数値シミュレーションを試み、大崩壊に伴う段波災害をある程度予測することが可能であることを実証した。
肝臓の免疫学的特異性を応用した免疫寛容誘導法の開発

肝臓は、他の臓器に比較して移植片が生着しやすく、また肝臓が生着することによって、それ以外の臓器の移植片の受容を促すなど、免疫学的に特異な臓器と考えられている。本研究では、全身投与された抗原に対する肝臓の免疫応答を肝移植の手法を用いて解析することを試みた。ラット脾細胞を静脈投与後1日目に肝臓を摘出する系で、摘出した肝臓を移植されたラットは脾細胞と同系の心臓に対する免疫応答が増強するのに対して、肝臓を摘出されたラットでは免疫応答が減弱していた。肝臓の摘出を抗原投与2日以降に行うとこの反応は消失した。脾細胞をγ線照射後に投与してもこの反応は変化しないが、肝の:Kupffer細胞の貪食能を抑制すると消失することより、肝臓の網内系が特異な肝臓の免疫応答の経路において重要な役割を演じていることが推察される。また、血清の移入にて免疫応答の亢進を生じさせることより、何らかの液性因子が関与している事が判明した。以上の結果より、抗原の全身投与後、肝臓の網内系が抗原を貪食するが、網内系よる抗原のプロセッシングが肝内に特異的な免疫応答が生じさせるのでは無いかと考えられた。この現象を利用して、肝移植における免疫寛容の誘導が可能になると思われ、今後の研究が期待される。平成12年度は、ドナー抗原提示後の肝内における免疫応答の解析のため抗原投与から肝摘出までのtimingの差による宿主のドナー抗原に対する反応性の変化を検討した。肝移植を1日目で施行した場合には、SLG groupでは早期に拒絶がおこり、SLR groupでは生着日数が延長した。肝移植を抗原投与後2日目以降に施行した場合には、SLG、SLRで認められた反応性の差異は認められなくなった。移入脾細胞をあらかじめγ線照射して移入しても反応に変化は無いが、Kupffer細胞を抑制するgadoliniumを投与すると、生着日数の変化が減弱した。すなわち、抗原移入後24時間で肝に抗原特異的な免疫応答が発生するが、この反応を惹起するためにドナー抗原は必ずしも生細胞である必要が無いこと、宿主のKupffer細胞が重要な役割を演じていることが判明した。以上の知見を元にして、現在平成13年度の実験計画を立案中である。前年度は、ドナー抗原提示後の肝内における免疫応答の解析のため抗原投与から肝摘出までのtimingの差による宿主のドナー抗原に対する反応性の変化を検討した。WS ratにDS ratの脾細胞を全身投与後.1日目又は2日目以降に肝を摘出しnaive ratに移植した群(SLG group)、肝摘出した後にnaive ratの肝を移植した群(SLR group)を作成した。抗原後10日目にDS ratの心臓を移植性移植し生着日数を観察した。平成13年度は、SLG群のラットの血清を無処置ラットに静注後に肝移植をした場合に、拒絶反応が増強される事より、何らかの液性因子が関与していることが判明した。