hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
虚血性網膜疾患の移植による治療の試み

臨床的にもインドシアニングリーン造影検査にて脈絡膜血流の遅延で低酸素状態が疑われる症例が存在する。さらに我々は加齢黄斑変性をはじめさまざまな眼内増殖疾患の増殖膜に発現するサイトカイン遺伝子の変化を確認してきた。血管内皮細胞増殖因子(VEGF)などは、加齢黄斑変性症の増殖膜などに有意に増加していることが判明したが、今回in vitroの実験でも低酸素でVEGF遺伝子の発現が強まることを確認した。それ以外にも各種増殖膜に脳由来神経成長因子(BDNF)など様々のサイトカインが多数発現していることが判明した。一方網膜虚血の実験より網膜内層とくに神経節細胞やアマクリン細胞は初期に障害される代表的な細胞として知られる。BDNFなどは神経節細胞やアマクリン細胞の保護効果があることが予測されたため、BDNFcDNAを虹彩色素上皮細胞(IPE)に導入しBDNF遺伝子ならびに、その蛋白質の発現がコントロールよりも有意に多く発現している細胞を利用して虚血による網膜細胞の障害に保護効果があるかどうかを確認してきた。また、in vivoではこの遺伝子導入細胞は視細胞外節の貧食能を強調することも判明した。実際にこれらの研究の一部は当教室で施行してきている加齢黄斑変性の自己虹彩色素上皮細胞移植にも利用された。今回の研究は虚血性疾患が対象であったが、以前も報告しているように移植につきまとう拒絶反応が、採取のしやすい自己IPEの利用により改善されること以外に、さまざまな眼疾患の遺伝子治療を将来めざす場合の重要なステップにもなる可能性があると考えられた。
北東アジア認識から見た19世紀末英米露政治思想の比較可能性に関する複合的研究

本年度は、研究計画のうち、ロシア帝国における中国や朝鮮など東アジアからの移民と、ドゥホボールやモロカンなどの宗教移民に関する研究を先行させ、ほぼ予定した成果を生むことができた。現地在住の研究者の協力を得て、サンクト・ペテルブルクの公文書館において調査を行い、国内では入手できない資料を入手し、それを利用しつつ研究を進めて、著書をまとめることができた。この著書の中で、少数派の宗教に対する体制宗教の態度と政府の政策との関係、中国をはじめとする北東アジアに対する欧米の基本的な見方を明らかにし、西欧において政治的動揺が顕著に現れる19世紀末という時代にあって、北東アジアの問題が自国の認識に深く関わっていることを示した。特にロシアが、北東アジアと西欧の間にあって、西欧とは異なった自意識をもちながら北東アジアの諸民族の間では他者でしかありえないという複雑な状況の中で自らのアイデンティティを模索したことを確認した。これに関連して研究報告を1回行い、論文2編の執筆を行った。本研究は4つのテーマにつき、ロシア及び英米の対比を行うことを課題としているが、本年度においては後述する事情のため、まず東アジア移民及び宗教移民の問題に焦点を合わせ、特にロシアについて、成果を挙げることができた。このテーマに関する英米の状況並びにロシア帝国及び清の先住民に関するに関する研究は2019年度に持ち越すことになったが、それでも本格的な研究のための準備を2018年度中に行うことができた。著書刊行の必要から、研究計画において挙げた四つのテーマに関する研究のうち、著書との関りがより深い第3と第4のテーマに関する研究を先に進めた。すなわち、中国・朝鮮など東アジアからの移民と、ドゥホボールやモロカンなど、セクト信者を中心とした宗教移民に対するロシア帝国内の思想状況に関する研究である。これらについては口頭報告の中で成果の一部を発表したものの、年度内に公刊することができなかった。ただし入稿は終わっており、31年度の早い時期に公刊される。具体的には、10月にロシア史研究会で「明治維新と大改革」と題する報告を行い、それに基づく論文を2019年5月に雑誌『ロシア史研究』に発表する予定である。また論文「ゴレムィキン内相期のロシアにおける地方自治の諸問題」を執筆し、これも同じく2019年5月発行の雑誌『阪大法学』に掲載される。現在、『模索するロシア帝国』と題する著書を執筆し、ほぼ完了した。本研究の折り返し点となるべき著作であり、秋に大阪大学出版会より刊行の予定である。ラマ教を信じるモンゴル系の人々に対する英米露清の態度や見方については、国内及び英米露に所蔵されている文献の調査に着手し、31年度の後半にこれについての研究を本格化させるための準備を進めている。それ以外の北東アジアの先住民に関する研究については、少し遅れているが、今後本格的に進める予定である。2019年度後半から、広域的宗教であるラマ教を信じるモンゴル系の人々に関する研究に比重を移す。英米露清の知識人がこの地域と民族チベット人及びモンゴル系の遊牧民に対してもった認識を記した文献について調査し、関係文献目録を作成する。秋までにロシアを中心とした研究を完了したのち、それを踏まえて調査の範囲を広げる。すなわち、ロシア及び日本が態度を積極化させるなかで、英米がこの地域とどのような文化的関りをもとうとしたのか、中国の側からする政治的自己認識と北東アジアの他民族との関係の模索の中で、伝統的な中華思想がどのように変容したのかについての調査研究を進める。このために、2019年度には、夏季にイギリス(主としてロンドン)での調査研究を、秋季に中国での調査研究を予定している。2020年度はそれまでの研究をまとめ、学会等で研究報告を行い、論文にまとめる。さらにこの研究で行った個別の分析をより大きな研究の枠組みに結び付けていく。

すなわち、中国・朝鮮など東アジアからの移民と、ドゥホボールやモロカンなど、セクト信者を中心とした宗教移民に対するロシア帝国内の思想状況に関する研究である。これらについては口頭報告の中で成果の一部を発表したものの、年度内に公刊することができなかった。ただし入稿は終わっており、31年度の早い時期に公刊される。具体的には、10月にロシア史研究会で「明治維新と大改革」と題する報告を行い、それに基づく論文を2019年5月に雑誌『ロシア史研究』に発表する予定である。また論文「ゴレムィキン内相期のロシアにおける地方自治の諸問題」を執筆し、これも同じく2019年5月発行の雑誌『阪大法学』に掲載される。現在、『模索するロシア帝国』と題する著書を執筆し、ほぼ完了した。本研究の折り返し点となるべき著作であり、秋に大阪大学出版会より刊行の予定である。ラマ教を信じるモンゴル系の人々に対する英米露清の態度や見方については、国内及び英米露に所蔵されている文献の調査に着手し、31年度の後半にこれについての研究を本格化させるための準備を進めている。それ以外の北東アジアの先住民に関する研究については、少し遅れているが、今後本格的に進める予定である。2019年度後半から、広域的宗教であるラマ教を信じるモンゴル系の人々に関する研究に比重を移す。英米露清の知識人がこの地域と民族チベット人及びモンゴル系の遊牧民に対してもった認識を記した文献について調査し、関係文献目録を作成する。秋までにロシアを中心とした研究を完了したのち、それを踏まえて調査の範囲を広げる。すなわち、ロシア及び日本が態度を積極化させるなかで、英米がこの地域とどのような文化的関りをもとうとしたのか、中国の側からする政治的自己認識と北東アジアの他民族との関係の模索の中で、伝統的な中華思想がどのように変容したのかについての調査研究を進める。このために、2019年度には、夏季にイギリス(主としてロンドン)での調査研究を、秋季に中国での調査研究を予定している。2020年度はそれまでの研究をまとめ、学会等で研究報告を行い、論文にまとめる。さらにこの研究で行った個別の分析をより大きな研究の枠組みに結び付けていく。年度末に勤務先を変わる予定であったことから、物品費に関しては消耗品費を中心とし、備品の購入を控えたため。また、前任校の退職を前にした残務整理等により、出張による調査研究を行う時間が十分にとれなかったこともある。ただし次年度使用額はごくわずかである。
非コードRNAによる細胞内構造構築機序の解明

非コードRNAを骨格にして形成される核内構造体の構成タンパク質の役割を多面的に研究した。まず新たにSWI/SNF複合体が構造体形成に必須なこと、その際に既知のクロマチン再構築活性とは異なる新規複合体会合機能を果たしていることを見出した。次に構造体形成に必須なRNA結合タンパク質のプリオン様ドメイン(PLD)が、構造体会合に必要であることを見出した。このPLDは試験管内でヒドロゲル構造を形成する性質を持つことから、この性質が構造体構築を司る機構であることが示唆された。またPLDタンパク質との相互作用によって構造体骨格の非コードRNAが、難抽出性を示すことが明らかになり、その抽出法を確立した。核内構造体パラスペックルの構造構築には、NEAT1 longnoncoding RNA (lncRNA)に依存したタンパク質の会合プロセスが必須である。今年度は構造構築におけるタンパク質機能に焦点をあわせ、これまで実施者が明らかにしてきた必須RNA結合タンパク質の相互作用様式の解析及び新規会合因子であるクロマチンリモデリング複合体の解析を併せて実施した。まずこれまでNEAT1 lncRNAの蓄積に影響を与えずにパラスペックル構造の会合を担っているカテゴリー1Bタンパク質として分類されているFUS, DAZAP1, HNRNPH3が共通して保有するプリオン様ドメインを重要性を検討した結果、これらのドメインがパラスペックル形成に需要な役割を果たしているプレリミナリーデータを得た。一方で新たなパラスペックル構造の会合因子として同定したSWI/SNFクロマチンリモデリング複合体の機能解析を進めた結果、この複合体がクロマチンがほとんど含まないパラスペックル内部においてパラスペックル構成タンパク質同士の相互作用ネットワークの形成に重要な役割を果たしていることを見出だした。特にSWI/SNF複合体サブユニットは、NEAT1 lncRNAと直接相互作用する一方で、カテゴリー1と呼ばれる必須タンパク質とNEAT1に依存せずに相互作用していることも明らかになった。このことは、SWI/SNF複合体がパラスペックル内相互作用形成を促進しているだけでなく、そこに関わる必須因子をNEAT1近傍にリクルートするのに働いていると考えられる。この他にパラスペックルへのタンパク質着脱機構の解析のために、可逆的転写阻害剤を用いた新規パラスペックル合成系の至適化を行った。核内構造体パラスペックル形成に必須な役割を果たすアーキテクチュラルRNA(arcRNA)、NEAT1 lncRNAに相互作用するタンパク質因子の機能解析によって、いくつかの重要な知見を得た。これまで実施者らが同定したパラスペックル形成に必須なRNA結合タンパク質RBM14, FUSの働きには、RNA結合ドメインだけでなく、それらが共通してもつプリオン様ドメインによるヒドロゲル形成活性が重要であることを、西オーストラリア大との共同研究によって明らかにし、J Cell Biol誌にその成果が掲載された。一方、RNA結合タンパク質以外の必須因子として前年度までに発見していたSWI/SNFクロマチン再構築複合体の働きをさらに詳細に解析し、この複合体がNEAT1 lncRNAや他の必須タンパク質とRNA-タンパク質およびタンパク質間相互作用し、これらの因子を空間的に集約するパラスペックル会合のハブとして機能していることを明らかにした。さらにCRISPR-Cas9ゲノム編集技術を用いてSWI/SNF複合体の活性サブユニットBRG1のATPase部位に変異を導入したところ、パラスペックルの会合機能には影響を与えないことが明らかになった。これによってSWI/SNF複合体は、ATPに依存したクロマチンリモデリング活性と異なる新規な作用機構によって、NEAT1に依存したパラスペックル形成のハブとして働いていることが示された。この成果論文はPNAS誌に掲載された。パラスペックル形成に必須なタンパク質因子の新しい働きを複数明らかにすることができ、2報の論文を国際的に評価の高いジャーナルに掲載できたことから、当初の計画以上に進展したと判断できる。1.前年度までに詳細に明らかにしてきたパラスペックル核内構造体の構成タンパク質の中の、特にプリオン様タンパク質の役割の解析を進めた。まずパラスペックルの構造骨格として機能するNEAT1 lncRNAが、通常のRNA抽出操作に対して著しい難抽出性を示すことを明らかにし、この性質は注射針に抽出液を通すなどの力を加えることによって抽出できることを発見した。この難抽出性を司る原因が、プリオン様タンパク質とNEAT1との複雑な相互作用ネットワークによることを明らかにするために、パラスペックルを構成する複数のプリオン様タンパク質のKO細胞株を作製し、その中からFUSというRNA結合性のプリオン様タンパク質が、NEAT1の難溶性に関わることを見出した。さらにFUS KO細胞へのレスキュー実験によって、プリオン様ドメインを欠いたFUSではレスキューができないことが明らかになり、FUSのプリオン様ドメインが難溶性を決定することが明らかになった。さらにFUSの結合領域であるNEAT1領域を欠失させた変異NEAT1は難溶性が著しく弱まることが明らかになった。これによって、FUSとNEAT1のRNA-タンパク質相互作用の重要性が明らかになった。この難溶性は、パラスペックル構造体の構造構築を支える性質であることも明らかになった。2. NEAT1の難溶性を考慮して、パラスペックル構成因子の定量解析を実施し、1つのパラスペックルには約50分子のNEAT1が含まれることが明らかになった。また1分子のNEAT1に結合する各プリオン様タンパク質の定量解析を行うためのCLIP-seqデータを収集した。

また共同研究によって電子顕微鏡と超解像顕微鏡を用いて、各構成因子のパラスペックル内のおおまかな存在領域を明らかにした。上記研究成果は、EMBO Journal、J Cell Biolの一部として発表した。非コードRNAを骨格にして形成される核内構造体の構成タンパク質の役割を多面的に研究した。まず新たにSWI/SNF複合体が構造体形成に必須なこと、その際に既知のクロマチン再構築活性とは異なる新規複合体会合機能を果たしていることを見出した。次に構造体形成に必須なRNA結合タンパク質のプリオン様ドメイン(PLD)が、構造体会合に必要であることを見出した。このPLDは試験管内でヒドロゲル構造を形成する性質を持つことから、この性質が構造体構築を司る機構であることが示唆された。またPLDタンパク質との相互作用によって構造体骨格の非コードRNAが、難抽出性を示すことが明らかになり、その抽出法を確立した。本年度は、1.パラスペックル形成に必須なカテゴリー1Bタンパク質の作用機構の解析、2.新たなパラスペックル会合因子であるSWI/SNF複合体の作用機構の解析、3.パラスペックル内外へのタンパク質の脱着機構解析のための解析系の構築という3つの項目について研究を実施した。1については、このカテゴリーのタンパク質が共通して保有しているプリオン様ドメインの重要性を示唆するプレリミナリーデータを得ることでき、2についてはSWI/SNF複合体のパラスペックル内の微細局在解析及びパラスペックル因子間の相互作用解析を通して、クロマチンとは無関係なSWI/SNF複合体の新規な機能を明らかにすることができた。3については、パラスペックル構造をde novoに形成させるための過程をモニターするために可逆的転写阻害剤を利用した系を至適化することに成功した。以上の成果からほぼ計画通りに進行したと評価できる。今年度に取り入れたゲノム編集技術を、これまでRNAI技術に頼っていた機能阻害実験の代わりに全面的に導入することによって、これまでよりクリアかつ長期的な機能阻害効果をモニターする系を立ち上げて、本研究をさらに強固なものにしていく予定である。28年度が最終年度であるため、記入しない。分子生物学本年度新たに得られた新知見をさらに発展させるために以下の研究内容を計画している。1.カテゴリー1Bタンパク質の欠損細胞へのレスキュー実験系を整備し、プリオン様ドメインの変異体を用いたレスキュー実験を実施しプリオン様ドメインの有用性を明らかにする。さらにこれを基にパラスペックル構造形成を支える分子間相互作用基盤を同定する。2. SWI/SNF複合体のクロマチンリモデリング活性が、パラスペックル形成に必須であるかどうかを明らかにするためにBRG1またはBRMサブユニットの触媒活性に必要なATPaseドメインに変異を施した変異型
鳥類下垂体ホルモン遺伝子活生化の分子機構

前年度の研究成果の延長としてキジ科及びガンカモ科のPRL及びGHの遺伝子初期活性化の共通機構を明らかにするためにそれぞれの遺伝子のプロモーターのクローニングを行った。またキジ科やガンカモ科は早生性であるために比較対象として晩生性のセキセイインコのPRLcDNA及びプロモーターのクローニングを行った。その結果、PRLのプロモーターは翻訳開始点より上流約200塩基は鳥類において広く保存されている事が新たに解明された。またGHのプロモーターはガンカモ科では翻訳開始点より900塩基上流まで強く保存されていることが明らかになり、GHの共通発現制御機構は翻訳開始点より約350塩基までにより支配されていることが明らかになった。本年度の結果はPRL及びGH遺伝子が胚発生においてどのように活性化されるかを解明するにあたりそれぞれの遺伝子のプロモーターについてどの領域を用いてゲルシフトアッセイやレポーターアッセイを行えばよいか、つまりどの場所に活性化因子が結合する可能性があるかを明白にしたといえる。セキセイインコPRLcDNAのクローニング結果より鳥類では糖鎖結合配列が複数あることが示されたがウェスタンブロット解析より鳥類において糖鎖は同じ位置において付加されていることも新たに判明した。また前年度にクローニングを行ったPRL及びGHの転写調節因子であるPit-1cDNAを利用して大腸菌におけるリコンビナントタンパク質の発現を誘導させる事ができた。さらにPit-1cDNAの塩基配列を基に、ペプチド合成を行い、そのペプチドを用いて抗体作成を行った。本年度得られた抗体はリコンビナントPit-1をウェスタンブロット解析においてアイソフォーム特異的に認識する事が示された。この結果は免疫沈降法を用いることで未だ解明されていないアイソフォームの機能を明らかにする事ができると言える。ニワトリ種卵を購入し、孵卵開始より3日までは12時間毎に胚を採取し、3日以降は7日まで頭部を、8日以降は下垂体原基を17日まで採取した。採取した組織よりRNA抽出を行い逆転写反応後PCRによりPit-1,プロラクチン(PRL)及び成長ホルモン(GH)の発現開始時期を同定した。Pit-1の遺伝子発現は個体により2日において検出されたもの、3日において検出されたものと違いが認められ、発生ステージの違いが存在するため、ステージにより検討したところ発生胚が卵黄上で左に回転するステージ13より14(ハンバーガーハミルトンの発生ステージ)においてPit-1遺伝子の発現が開始することが示された。胚発生初期においてはPit-1mRNAアイソフォーム(Pit-1γ)の発現は認められず、13日以降のステージにおいて発現が開始する事が示された。またGHは胚発生の6日より、PRLは胚発生8日より発現が開始することが明らかになった。Pit-1アンチセンスオリゴヌクレオチド投与がGH及びPRLの遺伝子発現におよぼす影響を成鶏及び発生後期の下垂体細胞培養により検討したところ、Pit-1アンチセンスオリゴヌクレオチドによりPit-1、GH、PRLすべて遺伝子発現が減少することが示され、センスオリゴヌクレオチドでは変化は認められなかったことからPit-1は自身を、GH、PRLはともにPit-1により転写制御調節が行われている事が明らかになった。発生初期胚(3日)の卵白中にアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与した場合は5日及び7日胚における遺伝子発現にはセンスオリゴヌクレオチドを投与したコントロール群とPit-1及びGHの発現量の差が認められなかった。濃厚卵白がアンチセンスヌクレオチドの発生胚への到達を阻害していると考えられ、ニワトリキメラ作成の方法を応用して検討することが今後の課題である。キジ目以外の家禽の代表であるアヒルの成長ホルモン(GH)の転写制御領域を含む全DNA配列(5.25kb)、プロラクチン(PRL)のcDNA(1.45kb)及び全DNA配列(6.3kb)を決定した。アヒルGHのプロモーター領域(0.9kb)は、翻訳開始点より上流0.3kbまではキジ目GHと相同性が高いが、それ以外の領域には相同性は認めらず、翻訳開始点より上流0.3kbまでの領域が鳥類におけるGH遺伝子発現共通機構に関与すると考えられた。またPRLに関しては翻訳開始点より上流230塩基のクロ-ニングに成功したが、キジ目のPRLプロモーターと非常に高い相同性を示し、共通機構がPRLに関しても存在する可能性が考えられた。さらにPCR-SSCPによるアヒルGHのプロモーター領域の多型解析を行い、4個所に変異が認められる事を明らかにした。さらにイントロン3にも多型配列が存在する事も明らかにした。イントロン1にはアヒルintersperse repeatlike DNA配列に非常に高い相同性を示す領域が存在し、マスコビダック、カルガモ、ガチョウにおいても保存されている事が明らかになった。本研究で検出した多型配列及び特徴的配列はガンカモ科の鳥類の研究を進める上での有用なマーカーと言える。GHとPRLの初期遺伝子活性化に関与すると考えられている転写因子Pit-1のcDNAクローニングを行い、アイソフォームの発現がニワトリやシチメンチョウと同様にアヒルにおいても認められる事を明らかにした。様々な鳥類のイントロン1領域のクローニングを試みた結果、オオタカにおいてはアイソフォームが存在しても機能的には何の影響も示さない事を配列より明らかにした。

またキジ科やガンカモ科は早生性であるために比較対象として晩生性のセキセイインコのPRLcDNA及びプロモーターのクローニングを行った。その結果、PRLのプロモーターは翻訳開始点より上流約200塩基は鳥類において広く保存されている事が新たに解明された。またGHのプロモーターはガンカモ科では翻訳開始点より900塩基上流まで強く保存されていることが明らかになり、GHの共通発現制御機構は翻訳開始点より約350塩基までにより支配されていることが明らかになった。本年度の結果はPRL及びGH遺伝子が胚発生においてどのように活性化されるかを解明するにあたりそれぞれの遺伝子のプロモーターについてどの領域を用いてゲルシフトアッセイやレポーターアッセイを行えばよいか、つまりどの場所に活性化因子が結合する可能性があるかを明白にしたといえる。セキセイインコPRLcDNAのクローニング結果より鳥類では糖鎖結合配列が複数あることが示されたがウェスタンブロット解析より鳥類において糖鎖は同じ位置において付加されていることも新たに判明した。また前年度にクローニングを行ったPRL及びGHの転写調節因子であるPit-1cDNAを利用して大腸菌におけるリコンビナントタンパク質の発現を誘導させる事ができた。さらにPit-1cDNAの塩基配列を基に、ペプチド合成を行い、そのペプチドを用いて抗体作成を行った。本年度得られた抗体はリコンビナントPit-1をウェスタンブロット解析においてアイソフォーム特異的に認識する事が示された。この結果は免疫沈降法を用いることで未だ解明されていないアイソフォームの機能を明らかにする事ができると言える。
炭化水素混合系の浸透気化および蒸気透過分離用の高性能膜の開発

省エネルギー的経済価値の高い分離系として、ベンゼン(Bz)などの芳香族系とシクロヘキサン(Cx)、n-ヘキサン(Hx)等の脂肪族系との分離、及び、プロピレンとプロパン等のオレフィン/パラフィン分離を対象に、高透過・高選択性で耐久性に優れる高性能膜を開発することを目的とし、以下の成果を得た。欠陥の少ないY型ゼオライト膜を合成できた。Y型ゼオライト膜は、選択吸着性に起因して、メタノール/メチル-t-ブチルエーテルのようなアルコール/非極性有機液体の浸透気化(PV)で優れたアルコール選択透過性を、またBz/Cx、Bz/Hx系の蒸気透過(VP)分離で、高いBz選択透過性を示した。非対称中空糸ポリイミド膜を前駆体として作製した中空糸炭化膜、は分子ふるい作用により、優れたプロピレン/プロパン及び1,3-ブタジエン/n-ブタン分離性能を示した。また、スルフォン化フェノール樹脂共重合体を前駆体として作製した複合炭化膜は、優れた酸素/窒素分離性能を有し、今後焼成条件を検討することにより炭化水素混合系の分離への適用が期待できる。これまでに報告した優れたPV分離性能を有するゴム状及びガラス状高分子膜について、Bz/Cx系およびBz/Hx系の収着・拡散挙動を調べ、後者では、競争収着および拡散のカップリング効果が観測された点で、前者と大きく異なった収着・拡散挙動を示すことが分かった。放射性同位元素を用いる過渡応答透過を測定することにより、定常状態PV透過下での透過成分の拡散係数を測定する方法を開発した。チアントレン環含有ポリイミド、側鎖にホスフェート基などを有する共重合ポリ(メタクリレート)、一連の全芳香族多分枝ポリイミドとそれをコアとしポリエチレンオキシドをアームとするスターポリマーを合成した。これらの高分子は、芳香族/非芳香族炭化水素分離用の新規な膜素材として期待できる。ポリエチレオキシドセグメント化ポリイミド(PEO-PI)膜のベンゼン、n-ヘキサン、シクロヘキサン蒸気の収着は、フィック型拡散とFlory-Rehner型収着等温線で表され、混合液体の収着もFlory-Rehner式により表された。一方、ガラス状ポリイミド膜での純蒸気の収着は非フィック型拡散挙動を示し、収着等温線はラングミュアー型であった。また、混合液体の収着は競争吸着の挙動を示し、マイナーな収着成分(n-ヘキサンなど)の収着量が著しく減少した。高密度ポリエチレンまたはシラスポーラスガラス管を用い、化学反応法またはArプラズマ法などで基材上にラジカルを発生させ、グリシジルメタクリレートをグラフト重合させて複合膜を作製したが、まだベンゼン/シクロヘキサン系の浸透気化分離で分離性の高い膜は得られていない。テトラエチルオルソシリケートとポリエチレオキシドセグメント化ポリイミドからゾル-ゲル法によりシリカ/ポリイミドハイブリッド膜を作製した。この膜は、ベンゼン/シクロヘキサン系の浸透気化分離で分離係数はほぼ同じでポリイミド膜より3倍大きな透過流束を示し、膜の耐久性に優れていた。ポリイミド非対称中空糸膜を窒素気流中で600°Cまで加熱し、非対称中空糸炭素膜を作製した。

この膜は、酸素/窒素分離の分離係数は大きくないが、プロピレン/プロパン系では、プロピレンのパーミアンスが50GPUでプロパンに対する分離係数が12-15、また、1,3-ブタジエン/n-ブタン系では、ブタジエンのパーミアンスが80GPU、分離係数が50の優れた性能を示した。収着量は、ほとんど同じなので、分離は分子ふるい機構によると考えられる。ホスホネート基含有のゴム状高分子の架橋膜は、ベンゼン/n-へキサン(Bz/Hx)系のような直鎖脂肪族炭化水素からの芳香族炭化水素の透気化分離において、今までに報告されている優れた性能の膜と同レベルの性能を示した。しかし、Bz/シクロヘキサン(Cx)系のような非直鎖脂肪族炭化水素からの分離性能は低かった。一方、繰り返し単位中に3個のスルホニル基を有するチアントレン5,5、10、10-テトラオキシド含有ポリイミド膜は、後者の分離系で、溶解度選択性と拡散選択性の両方の寄与があり、高い分離性能を示した。ポリエチレンオキシド(PEO)またはポリジオキソラン(PDO)をソフトセグメントとするポリウレタン膜およびアルキル置換テトラエチルオルソシリケートとのゾルーゲルプロセスによる有機無機ハイブリッド膜を作成した。まだ、浸透気化分離に耐久性のある膜は作成できていないが、炭酸ガス/窒素ガス分離において、PDO膜は、そのより強い極性のため、PEO膜より優れた分離性能を示したので、浸透気化分離に対しても高い性能が期待できる。ポリイミド等の耐熱性高分子を前駆対とし、その中空糸膜または多孔性無機支持体上に塗布した複合膜を熱分解して炭素膜を作製した。フェノール樹脂系の複合炭素膜は、オレフィン/パラフィン系混合ガス分離において、優れた性能を示した。ポリイミド系の中空糸炭化膜は作成条件を検討中である。XおよびY型ゼオライト膜の作成条件を検討し、従来よりさらに優れた有機液体蒸気分離性能を有する膜を作成できた。たとえば、150°CでBz/Hx、Bz/Cx系において、透過流速0.50と0.30kg/m2h、分離係数44と190であった。繰り返し単位中に2個のスルホン塩基を含むポリイミドの合成条件を検討し、丈夫な膜を作成でき、水蒸気の収着.透過挙動を調べた。今後、芳香系/非芳香族炭化水素系の浸透気化分離などを調べる。ホスホネート基含有のポリメタクリレート架橋膜は、ベンゼン/n-ヘキサン(Bz/Hx)系のような直鎖脂肪族炭化水素からの芳香族炭化水素の透気化分離において、ポリ(エチレンオキシドイミド)セグメント化共重合膜に比べて、透過流速は小さいが、高い分離係数を示した。一方、ホスホネート基含有のポリスチレン架橋膜は、Bz/Hx系での分離性能はむしろ低かったが、トルエン/n-オクタン系分離では、優れていた。浸透気化分離性能を溶解選択性と拡散選択性に分けて検討し、前者の重要性を示した。ポリ(エチレンオキシドイミド)セグメント化共重合架橋膜及び、スルフォニル基含有ポリイミド膜におけるBz/Hx及びBz/Cx系の浸透気化分離挙動を溶解過程と拡散過程に分けて検討した。前者は、ミクロ相分離構造をとり、ゴム状のポリエチレンオキシド相が透過に関与し、後者は典型的なガラス状高分子であり、両者で溶解過程及び拡散過程共に、著しく異なる挙動を示した。6FDA/BPDA-DSDAポリイミドの非対称中空糸膜を前駆体とする炭化膜作製し、オレフィン/パラフィン分離性能を調べた。前駆体膜のスキン層の経時変化による緻密化、スキン層に存在する欠陥の分離性能に及ぼす影響を明らかにした。スルフォン酸基を有するフェノール樹脂系の複合炭化膜は、スルフォン酸基が熱分解でのガス発生源となり、微細孔構造を制御でき、優れたガス分離性能を示した。オレフィン/パラフィン分離への適用が期待できる。
新規非分解系エンドサイトーシス経路の生理的機能と病態との関連

マクロパイノサイトーシスは細胞による大型で非選択的な物質取り込みである。我々は、従来のマクロパイノサイトーシスとは形態的に異なる全く新しい取り込み様式を見出した。本研究は、新規非分解系エンドサイトーシスの生理的機能を明らかにすることを目的としている。主に顕微鏡観察(蛍光顕微鏡および走査性電子顕微鏡)を用い、輸送される分子の同定や新規非分解系エンドサイトーシスの機能不全による細胞への影響を解析する。病原菌やウイルスは細胞内においてリソソームでの分解を逃れることでその感染が成立する。新規輸送経路の分子調節機構の解明は、ウイルスや病原菌の感染予防の創薬ターゲットを提案する知見になると考える。
安全な麻酔管理のための簡便な自律神経検査法の研究

研究(A):14名の術前患者を対照群、糖尿病群、高血圧群に分類し侵襲の少ないTilt up試験と深呼吸試験を施行し、心電図RR間隔、非観血的動脈圧、手指血流を連続的に測定し、手術中の血行動態変動との関係を検討した。深呼吸試験における糖尿病群、高血圧群のRR間隔の変化量は対照群の61%、83%に減少した。Tilt up試験では対照群の収縮期血圧がTilt up前値の96%に減少したのに対して、糖尿病群、高血圧群は62%、81%に減少した。この時、対照群は有意な代償性心拍増加をみたが糖尿病群では殆ど心拍増加を生じなかった。手術中は糖尿病群において他の2群に比べて明らかに大きな血行動態変動がみられた。トノメトリ法による持続血圧測定は急激な血圧変動に追従できないほどの問題はあるが、無侵襲で正確な情報を提供した。深呼吸時、Tilt-up試験の心拍変動、収縮期血圧変動は手術中の循環変動の良い指標となると考える。研究(B):短時間手術を受ける患者30名を笑気-酸素-プロポフォール-フェンタニルで麻酔し自律神経回復過程を観察した。手術前中後の心拍変動を最大エントロピー法を用いてスペクトル解析した。最初の13名では手術直後に投与したナロキサンが心拍変動に影響しないことを確かめた。残りの17名ではプロポフォール麻酔下ではHFC、total powerが減少しLFC/HFCが増加した。この変化は3時間後には手術前日の値に回復した。心拍変動のスペクトル解析は麻酔覚醒の客観的指標になることが示唆された。術前の自律神経検査をできるだけ無侵襲で行い、その血圧、心拍数変化から術中の循環変動を予測することが今回の研究の目的である。日本コーリン社のトノメトリ法による持続血圧測定は多少の問題はあるが、無侵襲で正確な情報を提供した。最初の計画では患者に深呼吸とバルサルバ法で負荷をかける予定だったが、侵襲の少ない検査にするためにバルサルバ法をやめ、特殊な装置をベッドに装着し患者を約60゚立位にした時の血圧、心拍数変化を観察した(Tilt-up試験)。心拍変動は諏訪コ-ポレーションのシステムソフトMemCalcで解析した。深呼吸負荷では最大RR間隔、最小RR間隔をそれぞれ6回採取し、その平均差のRRMAX-RRMINを求め、RR間隔全体の標準偏差も算出した。Tilt-up試験では(1)resting in supine(2)supine→tilt-up(3)during tilting(4)tilting→supineの4時点で血圧、心拍変動を記録した。患者は対照群、糖尿病群、高血圧群に分類し比較した。(結果)対照群6例、糖尿病群2例、高血圧群2例のデータを記録した。深呼吸負荷でRRMAX-RRMINは対照群157±26(mean±SEM)、糖尿病群143±33、高血圧群130±34msecであった。自律神経が正常な対照群が最も大きな変動を示した。Tilt-up試験では糖尿病群、高血圧群の収縮期血圧がtilt-up20秒後に基準値の68%、70%まで減少し60秒後でも基準値に戻らなかった。これに対し対照群の収縮期血圧は殆ど変化しなかった。Tilt-up試験中の心拍変動をLFC,MFC,HFCに分けて経時的変化をみたが、3群間で差がなかった。手術当日の循環変動を、気管内挿管時、手術中の2時点の収縮期血圧、心拍数の最大変化量で比較した。変動の順位を下記に記す。気管内挿管時:収縮期血圧変動は糖尿病群>高血圧症群

>対照群、心拍数変動は高血圧症群>糖尿病群>対照群手術中:収縮期血圧変動は糖尿病群>高血圧群>対照群>、心拍数変動は糖尿病群>対照群>高血圧群深呼吸時の心拍変動、Tilt-up試験の収縮期血圧変動が手術中の循環変動の良い指標となりそうである。症例数が増加した時点で多変量解析を行う予定である。研究(A)14名の術前患者を対照群、糖尿病群、高血圧群に分類し侵襲の少ないTilt up試験と深呼吸試験を施行し、心電図RR間隔、非観血的動脈圧、手指血流を連続的に測定し、手術中の血行動態変動との関係を検討した。深呼吸試験における糖尿病群、高血圧群のRR間隔の変化量は対照群の61%、83%に減少した。Tilt up試験では対照群の収縮期血圧がTilt up前値の96%に減少したのに対して、糖尿病群、高血圧群は62%、81%に減少した。この時、対照群は有意な代償性心拍増加をみたが糖尿病群では殆ど心拍増加を生じなかった。手術中は糖尿病群において他の2群に比べて明らかに大きな血行動態変動がみられた。トノメトリ法による持続血圧測定は急激な血圧変動に追従できないなどの問題はあるが、無侵襲で正確な情報を提供した。深呼吸時、Tilt-up試験の心拍変動、収縮期血圧変動は手術中の循環変動の良い指標となると考える。ただし、今回の自律神経検査は、不整脈、膝痛、腰痛のある患者では正確な評価ができないなどの問題があり、今後検討が必要である。研究(B):短時間手術を受ける患者32名を笑気-酸素-プロポフォール-フェンタニルで麻酔し自律神経回復過程を観察した。手術前中後の心電図を記録し心拍変動をMemCalcシステムによる最大エントロピー法を用いてスペクトル解析した。最初の15名では手術直後に投与したナロキサンが心拍変動に影響しないことを確かめた。残りの17名ではプロポフォール麻酔下ではHFC、total powerが減少しLFC/HFCが増加した。この変化は3時間後には手術前日の値に回復した。心拍変動のスペクトル解析は麻酔覚醒の客観的指標になることが示唆された。
拡散尖度MRIで迫る口腔癌：リンパ節転移予測因子としての画像診断マーカーの考案

拡散尖度MRIは拡散強調MR画像の比較的新しい解析法として知られ、生体組織における構造を反映するともいわれる。拡散尖度MRIより得られる各パラメータは組織におけるみかけの拡散(D)とみかけの尖度(K)であり、定量値として算出することができ、口腔癌患者の既存MRI拡散強調MR画像データより口腔癌原発巣についてこれらのパラメータとリンパ節転移や予後との関連性について評価することを目的とした。平成30年度においては当該研究をレトロスペクティブ研究として本学歯学部倫理審査委員会への研究許可申請を行い、許可を得た。一般的に口腔癌の術後における再発や転移は術後2年間に多く生じることが知られる。よって、当該研究においても術後2年以上経過した症例を対象としたいと考え、2013年10月以降にMRIが撮像され、外科的手術が施行され、病理組織学的診断により扁平上皮癌と診断された症例を対象とした。また、術後再発症例である、化学放射線療法中である、拡散強調MR画像上で病変が特定できないといった除外基準を設定した。現在2015年7月まで本学歯学部附属病院電子カルテシステム上で、51症例が特定され、そのうち13例が除外され、38症例が研究対象となり、TNM分類や術後経過(再発、転移の有無)といった臨床情報を取得した。現在、平成29年に作成した科学計算ソフトmatlabによる拡散尖度MRI解析プログラムを用いて、DKI解析を行なっており、各パラメータおよびパラメータの組合せと上記した臨床情報との関連性について解析を行なっている。2015年7月以降の症例についても現在調査中である。拡散尖度MRIより得られる各パラメータは組織におけるみかけの拡散(D)とみかけの尖度(K)であり、定量値として算出することができる。当該研究では拡散強調MR画像を撮像された口腔癌患者の既存MRIデータより口腔癌原発巣についてこれらのパラメータとリンパ節転移との関連性について評価することを目的とする。平成28年度においては拡散尖度MRI解析を行うために科学計算ソフトmatlabを使用した解析プログラムの作成、修正を行なった。エラーとして生じるパラメータの異常値の影響をなるべく避けること、各ピクセルにおけるDとKの関係を維持することを考慮し、各症例からピクセルベースで得られるDおよびKの実データから確率密度関数を用いて、データの可視化および確率密度の解析を行なうことで、上記した二つの課題をクリアし、実用できるレベルに至ったものと考えられる。この手法はApplication of Diffusion Kurtosis Imaging to Odontogenic Lesions: Analysis of the Cystic Component. J Magn Reson Imaging. 2016:44: 1565-1571にも適応した。よって、当該研究においても術後2年以上経過した症例を対象としたいと考え、現在、本学歯学部倫理審査委員会への研究許可申請の準備を行なっている。解析方法については平成28年度にて確立したものと思われる。現状で、対象となりうる症例数については調査中であり、症例の蓄積程度にもよると考えられるが、全体の達成度としてはおおむね順調と考える。拡散尖度MRI(DKI)は拡散強調MRI(DWI)の比較的新しい解析法として知られ、生体組織における構造を反映するともいわれる。DKIより得られる各パラメータは組織におけるみかけの拡散係数(D)とみかけの拡散尖度(K)であり、定量値として算出することができる。当該研究では拡散強調MR画像を撮像された口腔癌患者の既存MRIデータより口腔癌原発巣についてこれらのパラメータとリンパ節転移との関連性について評価することを目的としていた。現在、DKIプログラムによる解析を行っている。その方法として、以前の手法である確率密度関数を用いて求めるパラメータと上記作成されたマップ上でのROIにより求めるパラメータのいずれが精度が良いかも検討項目とした。一般的に口腔癌の術後における再発や転移は術後2年間に多く生じることが知られ、症例の蓄積および各例における経過を得るため、その経過観察中である。レトロスペクティブ研究として本学歯学部倫理審査委員会への研究許可申請をし、解析を行う。解析法はすでに確立しており、他の研究において利用され、おおむね良好な結果が得られ、その研究成果は報告されている。しかしながら、対象となりうる症例数についてはやや少数であり、現段階においても蓄積中である。

現在2015年7月まで本学歯学部附属病院電子カルテシステム上で、51症例が特定され、そのうち13例が除外され、38症例が研究対象となり、TNM分類や術後経過(再発、転移の有無)といった臨床情報を取得した。現在、平成29年に作成した科学計算ソフトmatlabによる拡散尖度MRI解析プログラムを用いて、DKI解析を行なっており、各パラメータおよびパラメータの組合せと上記した臨床情報との関連性について解析を行なっている。2015年7月以降の症例についても現在調査中である。現状での対象となりうる症例数について把握し、本学歯学部倫理審査委員会への研究許可申請を行い、承認後解析を始める予定である。随時、その研究成果について、学会発表,論文投稿を行なう。対象となりうる症例数およびその術後経過について把握し、レトロスペクティブ研究として本学歯学部倫理審査委員会への研究許可申請を行い、承認後解析を始める。最終年度でもあることから、本年8月頃をもって区切りとし、その研究成果について、学会発表,論文投稿を行なう予定とする。論文別刷りの購入に際し、不足金が生じ、次年度会計での研鑽予定としため次年度使用額として生じた。英文校正に使用する予定としていたが、年度内での使用期限に間に合わなかった。そのため、次年度での使用予定とする。画像データの解析を行い、その結果を保存するための記録媒体の購入および最新情報を収集するための書籍の購入を予定している。また、成果については学会および英語論文の投稿を予定しているため、旅費および英文校正費に使用する予定である。
ゲーム内での目標を達成するために有効な方略に注目した教育方法の提案

本研究では、ゲーム型教材内での目標を達成するために有効な方略、いわゆる攻略法への向き合い方が、教育効果に与える影響を明らかにする。そのために、1ゲーム型教材の攻略法を分類し、その分類を元に2利用者がどのようにゲーム型教材と向き合うのかを示し、それらの関係が3時間経過によってどのように変化するのかを示し、4攻略法を考案する方法の違いによって攻略法の内容やその順序に違いが表れるのかを明らかにする。
スポーツ心臓の心肥大と心臓病の心肥大の成立機構の差違に関する分子生物学的研究

本研究プロジェクトは、心臓の特性が異なる生理的肥大心と病的肥大心の成立機序の違いを分子レベルで解明することを目指している。本年度は、運動トレーニングによる生理的肥大心の適応機序における関連遺伝子のプロファイリングを行うため、3,800遺伝子の発現を定量的に評価することができるマイクロアレイを用いて遺伝子発現の解析を行った。4週齢の雄SDラットにトレッドミルによる走トレーニング(30m/min,60分/日,5日/週)を8週間行い、心臓におけるmRNAの発現を解析・評価したところ、心肥大に関連する可能性のある75遺伝子が抽出された。さらに、マイクロアレイにより抽出されたこれら候補遺伝子のうち、glycogen synthase kinase(GSK)-3β、calcineurin-inhibitor(Cain)、そしてendothelin-1(ET-1)について詳細な検討を行った。GSK-3β、Cain、ET-1のmRNA発現を定量PCRで確認したところ、いずれのmRNA発現もトレーニングにより、有意に変化していた。また、これらのタンパク発現あるいはペプチド濃度も同様に変化していた。さらに、これらのタンパク発現あるいはペプチド濃度と心重量との間には、相関関係が認められた。一方、病的肥大心で発現が増加するbrain natriuretic peptide (BNP)やangiotensin-correcting enzyme(ACE)は、運動トレーニングにより変化しなかった。これらの結果より、運動トレーニングによる生理的肥大心の成立に関与する遺伝子は、病的肥大心の成立に関与する遺伝子とは一部異なる可能性が示唆された。本研究プロジェクトは,心臓の特性が異なる生理的肥大心と病的肥大心の成立機序の違いを分子レベルで解明することを目指している。今年度は,心臓エネルギー代謝系に関与する因子について,病的肥大心とスポーツ心臓にで分子レベルの比較検討を行った。高血圧などにより病的な心肥大が生じる。一方,慢性運動により心臓には生理的な肥大(スポーツ心臓)が生じる。今回,病的肥大心とスポーツ肥大心にて,エネルギー供給機構の主要酵素の遺伝子発現を検討した。病的肥大心モデルとして19週齢の自然発症高血圧ラット(SHR),スポーツ肥大心モデルとして15週間の水泳トレーニングした19週齢のWKYラット(水泳群),対照群として19週齢の安静飼育したWKYラットを用いた。SHRと水泳群の心臓は,共に左室肥大を生じた。CD36(長鎖脂肪酸の細胞内取り込みに関与)mRNA発現は,SHRにおいて水泳群および対照群より低かった。長鎖脂肪酸代謝の主要酵素であるcarnitine palmitoyltransferase(CPT)-1,acyl CoAsynthase, isocitrate dehydrogenase mRNAの発現は,SHRで水泳群および対照群より有意に亢進していた。CPT-2 mRNAの発現は,SHRおよび水泳群で対照群より有意に亢進していた。糖代謝の主要酵素のPhosphofructokinase mRNAおよび乳酸代謝の主要酵素のlactatedehydrogenase mRNAは,SHRで水泳群及び対照群より有意に高かった。高血圧による病的肥大心とスポーツ肥大心では,糖,乳酸,脂肪酸代謝経路の酵素遺伝子発現様式が異なることが示された。今年度は、心臓・血管調節性因子に着目して、病的肥大心とスポーツ心臓における分子レベルでの比較検討を行った。高血圧で生じる圧負荷肥大心(病的心肥大)と長期の運動トレーニングで生じる肥大心(スポーツ心臓すなわち生理的肥大心)では心臓の種々の特性が異なる。今回、これらの成因の異なる肥大心にて、種々の心臓・血管調節性因子の遺伝子発現を検討した。病的肥大心モデルとして19週齢の自然発症高血圧ラット(SHR)、生理的肥大心モデルとして15週間の永泳トレーニングを行ったWKYラット(運動群)を用い、心肥大作用に関連する種々の心臓・血管調節性因子のmRNA発現を検討した。安静飼育したWKYラットを対照群とした。SHRおよび運動群は共に左室肥大を引き起こした。SHRの肥大心におけるBNP、ACE、エンドセリン-1のmRNA発現は対照群より有意に増大していたが、運動群の肥大心では、対照群と差が無かった。β1-adrenergic receptor (β1AR) mRNAの発現は、SHRおよび運動群で対照群より有意に増加していたが、β1ARからの情報伝達を抑制するβ1AR kinaseのmRNAは、SHRで運動群および対照群より有意に亢進していた。また、心臓にて肥大抑制作用を有するアドレノメデュリンのmRNA発現は、水泳群でSHRおよび対照群より有意に低下していた。これらの結果より、高血圧による病的肥大心と生理的肥大心では、心臓・血管調節性因子の遺伝子発現様式が異なることが示された。すなわち、肥大心における心臓・血管調節性因子は、肥大の成因によって異なった変化をすることが示唆された。

さらに、マイクロアレイにより抽出されたこれら候補遺伝子のうち、glycogen synthase kinase(GSK)-3β、calcineurin-inhibitor(Cain)、そしてendothelin-1(ET-1)について詳細な検討を行った。GSK-3β、Cain、ET-1のmRNA発現を定量PCRで確認したところ、いずれのmRNA発現もトレーニングにより、有意に変化していた。また、これらのタンパク発現あるいはペプチド濃度も同様に変化していた。さらに、これらのタンパク発現あるいはペプチド濃度と心重量との間には、相関関係が認められた。一方、病的肥大心で発現が増加するbrain natriuretic peptide (BNP)やangiotensin-correcting enzyme(ACE)は、運動トレーニングにより変化しなかった。これらの結果より、運動トレーニングによる生理的肥大心の成立に関与する遺伝子は、病的肥大心の成立に関与する遺伝子とは一部異なる可能性が示唆された。
海藻食中毒に関連してオゴノリ科紅藻のPGE2生成酵素に関する研究

オゴノリ喫食による特異な食中毒がこれまでわが国で数回発生し、その原因は海藻酵素の触媒によりマラキドン酸から大量生成されたプロスタグランジンE2(PGE2)と推定されている。本研究ではオゴノリ類海藻のPGE2生成量の変動関連酵素の性質を明らかにし、海藻中毒の発生機構を解明し、その予防に資するとを目的とし、以下の結果を得た。1)オゴノリ(Glacilaria verrucosa)、シラモ(G. bursa-pastoris)およびツルシラモ(Glacilariopsis charoides)の3種を広島近郊の瀬戸内海沿岸で1994年から1995年の2年間毎月採取してその水抽出液のPGE2生成量をHPLC法により検討した。最高値は3種とも45μg/g生鮮藻体で、同じレベルにあった。2)PGE2生成能の季節変化では、オゴノリで5-7月に活性が認められ、他の月では不検出である等、季節変動を認めた。広島近郊産の試料では地域差は認められなかった。3)同一地産のオゴノリの藻体の大小によるPGE2生成活性を見ると大型(藻体長30cm以上)では年間を通じて活性が観察されない一方、中型(25-10cm)と小型(10cm未満)では季節による差はあるがかなり高い活性が検出され、藻体の成長による活性の消失が認められた。4)オゴノリ科の海藻はその生活史において雄性配偶体、雌性配偶体、四分胞子体の3種に分別されるが、雌性配偶体(嚢果をもつ)と他藻体の活性を比較したが、明確な差は観察されなかった。5)1か月冷凍貯蔵(-21°C)後には活性は半減した。6)反応液調製の際、液体窒素凍結後、処理すると、PGE2の生成量は数倍に上昇した。また低pHの抽出溶剤を用いるとPGE2が激減した。本研究ではオゴノリ類海藻のPGE2生成系に関与する酵素の基礎的データを得たが酵素の分離、精製には至らなかった。今後この反応に関与する酵素の分離を試みる計画である。
糖の吸収阻害性抗糖尿病薬の虚血心筋保護作用の発見とその実用化への試み-Ischemic preconditioningからnew pharmacological preconditioningへの新たな展開-

平成11年度は冠動脈狭窄ページング負荷によるイヌ狭心症に対するα-1、6-glucosidase inhibitor、N-hydroxyethyl-1-deoxynojirimycin(miglitol)の効果とそのメカニズムについて検討した。ビーグル犬15匹を対象に開胸し、安静時にはST変化のない程度の左前下降枝狭窄を作成した。心拍数160/minというページングによる負荷+isoproterenolによる収縮期血圧160mmHgという負荷10分間を行い、double productを2倍に増強し、それによるST低下の程度を観察した。miglitol非投与時をコントロールとした。miglitol投与後、ST低下の程度はコントロールと比較し、有意に改善した。カラーマイクロフェアを狭窄前、狭窄時、負荷狭窄時に注入し、局所心筋血流量を測定した。局所心筋血流量は狭窄前に比較し、狭窄時、負荷狭窄時には約80%に低下した。しかし、ミグリトーリ投与により影響を受けなかった。虚血領域の左室心筋のグリコーゲンおよびATPの減少はミグリトール群で改善した。虚血領域の左室心筋ではα-1、6-glucosidase活性はブロックされた。さらに、miglitolの虚血心筋保護効果はprotein kinase Cのブロッカーであるチエルリスリンによってブロックされた。すなわちミグリトールはα-1、6-glucosidaseブロックを通じて、負荷虚血時のグリコーゲン代謝をブロックし、ラクテートの産生をおさえ、虚血心筋保護効果を示した。この効果は側副循環や冠血流とは無関係であり、protein kinase Cの活性化と関連する。平成12年度はイヌ・ウサギおよびラットにおいて短期間虚血・再灌流を行いスタニングモデルを作成し、α-1、6-glucosidase inhibitorであるN-methyl-1deoxynojirimyam(NMDN)が再灌流中の心機能低下(スタニング)を予防できるか否か、予防とすればそのメカニズムは何かを検討した。心拍数はペーシングによって、収縮期圧は灌流液の圧を一定にすることによってコントロールした。その結果、次のことが明らかになった。1)NMDNは虚血前投与において非投与群と比較し、虚血中の左室の収縮能および拡張末期圧の上昇を改善しなかった。しかし、NMDN虚血前投与は非投与群と比較し、再灌流中の左室収縮能を増強し、左室拡張末期圧を有意に低下させた。すなわちスタニングを改善した。2)このスタニング改善効果は虚血後の再灌流時のNMDN投与ではみられなかった。3)NMDN虚血前投与は非投与群と比較し、虚血中の心筋細胞におけるグリコーゲンおよびATPの低下を有意に抑制し、ラクテートの増大を軽減した。また、CPK、LDHのcoronary sinusを介した灌流液中への流出の増大を有意に減少させた。以上より、α-1、6-glucosidase inhibitor、NMDNは、虚血時にα-1,6-glucosidaseの活性をブロックすることにより、グリコーゲン代謝の抑制を通じて、ラクテートの増大を軽減し、心筋細胞内のpHの低下を防ぎ、ATPの減少を予防する。そして、虚血時の心筋細胞内pHとATPの保持により再灌流中のスタニングを改善することが明らかになった。このことは、α-1、6-glucosidase inhibitorが新しい再灌流障害予防薬となる可能性を示唆し、狭心症・心筋梗塞の臨床にとって重要な所見である。