hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
代謝関連アミノ酸のキラルメタボロミクスを実現する多次元分析法開発と診断指標の探索

平成30年度は、代謝関連アミノ酸の網羅的キラル識別分析を実現するため、分析対象をオルニチン及びホモシトルリンへと広げ、多次元HPLCを用いる高選択的分析法の開発を行った。シトルリンおよびホモシトルリンを分析対象とする二次元キラルHPLC分析法の構築に際しては、一次元目に微粒子充填型ODSカラム(内径1.0 mm、全長250 mm)を用いた。二次元目の光学分割については生体内の夾雑成分との良好な分離が可能であったKSAACSP-105Sカラム(内径1.5 mm、全長250 mm)を選択した。構築した二次元キラルHPLCシステムは相関係数0.9999以上の直線性を示し、再現性及び回収率についても良好な結果が得られた。ヒト血漿、尿の分析を行った結果、血漿中にL-ホモシトルリン及びL-シトルリンが、尿中にL-ホモシトルリン及びD,L-シトルリンが明瞭に認められ、シトルリンの%Dは7.3%であった。二次元HPLCによるヒト臨床検体分析において、夾雑成分の影響を受ける試料が存在したため、更に高選択的な分析法として三次元HPLCシステムを開発した。分析対象はシトルリン、ホモシトルリン及びオルニチンとした。一次元目の逆相分配においては150分以内に、二次元目の陰イオン交換分離においてはそれぞれ60分以内に分析対象のアミノ酸を他の内在性化合物から分離した。三次元目の光学分割にはKSAACSP-001カラム(内径1.5 mm、全長250 mm)を用い、各分析対象アミノ酸について分離度1.96以上の良好な光学分割が得られた。構築した三次元HPLCシステムをヒト臨床検体として血漿及び尿分析へ適用した結果、二次元HPLCシステムを用いた分析では夾雑成分の影響を受けていた試料についても、微量代謝関連キラルアミノ酸の明瞭な検出が可能であり、極めて高い選択性を有する三次元HPLCシステムの構築に成功した。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。平成29年度は、代謝関連アミノ酸の網羅的キラルメタボローム法の第一段階として、尿素回路関連化合物であるシトルリン鏡像異性体を分析対象に選択し、三次元HPLCを用いる高選択的分析法の開発を行った。本三次元HPLC分析法では、一次元目のモノリス型ミクロODSカラムにより、シトルリンをD体とL体の混合物として疎水性相互作用を用いて他の内在性化合物から分離する。オンラインで分取したシトルリン画分を、二次元目の陰イオン交換カラムの静電相互作用により更に分離した後、三次元目のパークル型光学分割カラムに導入して鏡像異性体の分離を行う。一次元目の逆相分配については移動相に含まれるアセトニトリル濃度を、二次元目および三次元目の陰イオン交換分離、光学分割についてはそれぞれ移動相中の酸濃度とメタノール・アセトニトリルの組成比を変化させて分離条件を精査した。その結果、一次元目および二次元目において、共に約60分でシトルリンを他の内在性化合物から分離し、三次元目においては約40分でα=1.19の良好な光学分割を達成した。構築した三次元HPLCシステムについて定量性を検討した結果、シトルリン鏡像異性体はいずれもインジェクト量当たり10 fmolから5 pmolの範囲において相関係数0.9998以上の直線性を示した。また、標品シトルリンおよびマウス尿試料における再現性は日内・日間変動のいずれもRSD 4.0%以下であり、マウス尿試料を用いた回収率についても良好な結果が得られた。本分析法をマウスおよびヒト尿試料へ適用した結果、夾雑成分の影響を受けることなく尿中微量シトルリン鏡像異性体の極めて良好な分析が可能であり、三次元HPLCを用いるシトルリン鏡像異性体の高選択的分析法の構築が達成された。平成29年度は、申請者がこれまでに開発した多次元HPLC分析法を基盤としてカラムや移動相条件の精査を行い、三次元HPLCシステムを用いる高選択的な代謝関連アミノ酸キラルメタボローム法を構築する計画であった。本年度は、代謝関連アミノ酸の網羅的キラルメタボローム法の第一段階として、尿素回路関連化合物であるシトルリンを分析対象として選択した。一次元目の逆相分配条件、二次元目の陰イオン交換分離条件、三次元目の光学分割条件の検討および生体試料を用いた条件の最適化、バリデーションを行い、三次元HPLCシステムを用いる高選択分析法の構築を達成した。他の代謝関連アミノ酸についても分離条件の検討を進めており、当初の計画通り進展していると考えられる。

ヒト血漿、尿の分析を行った結果、血漿中にL-ホモシトルリン及びL-シトルリンが、尿中にL-ホモシトルリン及びD,L-シトルリンが明瞭に認められ、シトルリンの%Dは7.3%であった。二次元HPLCによるヒト臨床検体分析において、夾雑成分の影響を受ける試料が存在したため、更に高選択的な分析法として三次元HPLCシステムを開発した。分析対象はシトルリン、ホモシトルリン及びオルニチンとした。一次元目の逆相分配においては150分以内に、二次元目の陰イオン交換分離においてはそれぞれ60分以内に分析対象のアミノ酸を他の内在性化合物から分離した。三次元目の光学分割にはKSAACSP-001カラム(内径1.5 mm、全長250 mm)を用い、各分析対象アミノ酸について分離度1.96以上の良好な光学分割が得られた。構築した三次元HPLCシステムをヒト臨床検体として血漿及び尿分析へ適用した結果、二次元HPLCシステムを用いた分析では夾雑成分の影響を受けていた試料についても、微量代謝関連キラルアミノ酸の明瞭な検出が可能であり、極めて高い選択性を有する三次元HPLCシステムの構築に成功した。平成30年度は、平成29年度に構築したシトルリン鏡像異性体を対象とする三次元HPLC分析システムを基盤として、他の代謝関連アミノ酸についても逆相分配、陰イオン交換および光学分割条件を検討し、生体試料中の微量代謝関連アミノ酸鏡像異性体の高選択的な分析を可能とする三次元HPLC分析システムを構築する。構築した分析法については、生体試料を用いて分析条件の最適化、バリデーションを実施し、各種疾病モデル動物およびヒト臨床検体を用いる尿・血中キラルアミノ酸メタボローム解析へと適用する予定である。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
ヨーロッパ共同体法の展開と各国私法(とくに契約法)の現代化

ヨーロッパ私法は大きな変化を遂げつつあり、EU裁判所やEU指令がいっそう大きな役割を果たしているが、それだけではEUで機能する法を作り出せてはいない。そのような中で、ヨーロッパの私法学は、契約法のみならず不法行為法の分野においても、学問的な歩みを急速に進めている。本研究は、このようなヨーロッパの動向を総合的に考察し、主としてEU各国の契約法の現代化を中心としながら、ヨーロッパ私法がどのような変容を遂げようとしているのかを析出することを目的とした。具体的な成果は、次のとおりである。1.現在のヨーロッパ私法の動向の分析。とくに、マックスプランク研究所バーゼドー教授を招聘し、ヨーロッパ私法の平準化ないし法統一における、原理面・手続面での課題を明らかにした。2.ヨーロッパ契約法原則および国際統一売買法、ユニドロワ商事契約原則に関わる動向の分析。特にヨーロッパ契約法原則に関するテキストの検討を行った。3.契約外責任についてのヨーロッパ法統一の動きを概観した。4.2002年のドイツ債務法改正(現代化)に関するドイツの議論を検討した。5.EU指令およびそれらの国内法として制定された法の傾向を分析。契約法についての邦訳作業を行っている。6.EU各国民法典の教科書や条文の蓄積、邦訳作業を行っている。本研究の主たる目的は、EU法の共通化・平準化といった展開の中で、ヨーロッパ各国の私法(とりわけ契約法)の現代化に向けての取り組みを分析することにある。平成14年度は、従来の研究成果(『ヨーロッパ私法の動向と展開』として日本評論社より刊行予定)を基礎として、以下の取り組みを行った。第1に、現在のヨーロッパ私法の動向を正確に分析し、比較法方法論への理解を深めるべく、マックスプランク研究所理事のバーゼドー教授を招聘し、「ヨーロッパ私法の漸進的生成」とのテーマで研究会を開催した。研究会において、ヨーロッパ共通私法における各国法の平準化や法統一における、原理面、手続面での課題なども明らかとなった。また、立命館大学で開催されたホンディウス教授を招いての研究会(テーマ「EUにおける民法典の発展に関する展望」)などにも参加し、討議した。第2に、EU各国民法典の教科書、さらに条文の蓄積を随時行っている。第3に、研究会を定期的に開催した。本年度は、とくに外国人研究者の研究報告についての検討を中心に行った。上記(第1の点)に加え、2002年1月のドイツ債務法改正(現代化)の対象となった売主の義務に関する規定(とりわけドイツ民法典443条1項1文について)に対してなされたレーネン教授の批判的考察につき、研究会で取り上げ、その検討を行った。平成15年度は、これまでの研究計画に従い、定期的に研究会を開催するとともに平成14年度の作業を継続した。第1に、私法領域に関係するEU(欧州連合)指令およびEU各国でそれらの国内法として制定された法律を収集し、その傾向を分析。第2に、ヨーロッパ契約法原則、および、国際統一売買法、ユニドロワ商事契約原則を関係した動向分析。第3に、EU各国民法典の収集。とくに契約法部分の邦訳作業の継続。第4に、ヨーロッパ私法の動向を正確に分析し、比較法方法論を深めるため、いくつかの個別テーマを素材にして外国人研究者をセミナー開催のために招聘し、他大学の研究者に呼びかけ、公開の共同討議の場を設けた。平成15年10月にはヴルブカ博士による報告、オーストリア消費者保護法を受けて、討議した。第5に、その際、近時、私法領域で多数出されているEU指令を検討。また、海外研究者との交流も行った。とくに、マックス=プランク研究所においてバーゼドー教授とともに、EU司法裁判所の判決を検討し、分析した。また、オスナブリュック大学にてアーレンス教授から、ヨーロッパ消費者法の展開について、またドイツ不正競争防止法の改正作業について情報提供を受けた。また、中田研究員が、マックス-プランク研究所において研究専念期間を利用して六ヶ月間に滞在し、ヨーロッパ私法の方法論について検討を行った。

また滞在中に、オスナブリユック大学、チュービンゲン大学にて講演会を行い、日本の消費者法の展開と、法学教育の動向について報告し、日独法、さらにEU法との比較検討を行い、集中的に討議をした。なお、平成15年度は、本研究以前および本研究作業での成果を含めて、これまでの継続的な研究会の成果の中間的まとめとして、川角・中田・松岡・潮見編『ヨーロッパ私法の動向と課題』(日本評論社)を編集し、出版した。来年度以降の研究の展開について、打ち合わせを行い、さらなる研究体制の充実を行うこととした。本年度は、最終年度でもあり、これまで通り研究計画に忠実に従いつつ、研究作業を遂行した。とくにヨーロッパ私法の領域での動向に重点をおき、作業を進めた。具体的には定期的に研究会を行い、またその成果をとりまとめている。具体的には、EUにおける契約法の平準化・ヨーロッパ契約法の作成を目的として組織されたヨーロッパ契約法委員会が作成したヨーロッパ契約法原則に関するテキストの検討を中心としつつ、他方で契約外責任についてのヨーロッパ法統一の動きについても概観した。加えて、EU法レベルでの動きに対応した各国私法の現代化をめぐって、とりわけドイツ新債務法の検討を行った。また、新たな関係資料を収集した。なお、研究成果の一部として、川角由和氏による翻訳「エドアルト・ピッカー著『物権的妨害排除請求権』(1)」(龍谷法学37巻2号・同(2)・龍谷法学37巻3号)などが発表された。開催した研究会は以下の通りである。第1回研究会2004年7月16日益澤彩氏(甲南大学)「ヨーロッパ不法行為法について」第2回研究会2004年10月16日ヨーロッパ契約法原則(PECL)翻訳検討(検討対象は、PECL8:101条note 2から8:103まで)第3回研究会2004年11月20日ヨーロッパ契約法原則(PECL)翻訳検討(検討対象は、PECL第8条8:103条以降)。第4回研究会2004年12月10日報告(1)川角由和氏「ドイツ新債務法の一断面-「差額説」と「新解除法」」報告(2)藤井徳展氏(大阪市立大学)「PECLにおける債権譲渡法制-債権譲渡による資金調達の円滑な利用に向けて-」第5回研究会2004年2月25日ヨーロッパ契約法原則(PECL)翻訳検討第6回研究会2004年3月25日野田和裕氏(広島大)による分割履行に関する報告。以上。
OPTN機能異常を基盤とした神経変性疾患の病理学、細胞学的検討と治療薬候補の探求

OPTN変異を持つALS(ALS-OPTN)の症例において、すでに知られているTDP43以外にタウやαシヌクレインの凝集がみられることを報告した。神経炎症系のシグナルについては、多系統萎縮症の剖検脳におけるNLRP3インフラマソーム関連タンパクとOPTNの関連について検討し、NLRP3インフラマソーム関連タンパク陽性ミクログリアが病変部胃の変性の程度に応じて、増加することを報告した。また、初代培養細胞から確立したミクログリアでαシヌクレインフィブリルなどの凝集タンパクでの刺激を行い、ウェスタンブロッティングを行い、IL1beβが増加することを確かめた。また、初代培養細胞から確立したオリゴデンドロサイト前駆体細胞でαシヌクレインの取り込みがおこり、オートファジーのマーカーであるp62が増加していることを報告し、多系統萎縮症のモデルとなりうる可能性を報告した。さらに、認知症の原因の多くをしめる疾患であるアルツハイマー病とALS-OPTNの顆粒空胞変性において、NFκBシグナルについて、検討したところ、活性型であるリン酸化p65がアルツハイマー病とALS-OPTNの海馬で凝集しており、疾患群で増加していることを確認し報告した。また、OPTNによって、NFκBを制御さしている直鎖型ユビキチンがアルツハイマー病で凝集していることを報告した。このように、今年度は、OPTNの制御対象であるNFκBや神経炎症のシグナルががALSだけでなく、アルツハイマー病や多系統萎縮症でも亢進していることを裏付ける結果を報告した。今年度の主な研究内容として、大阪市立大学の分子病態学の徳永文稔教授と本研究の共同研究者の和歌山県立医科大学神経内科伊東秀文教授らとの共同研究で、オプチニューリン(optineurin、OPTN)と直鎖状ユビキチン鎖との関係が、ALS病態において果たす役割について報告した。徳永らはユビキチンが特異的な連結をした、いわゆる「直鎖状ユビキチン鎖」の構造をとることで、神経炎症や神経細胞死に重要なNF-кB(エヌエフ-カッパービー)を介したシグナル伝達経路が活性化されることを報告していた。さらに徳永らは、今回の研究で、細胞モデルにおいて、OPTNが直鎖状ユビキチン鎖に選択的に結合し、NF-кBや細胞死を抑制していることを示した。そこで、当研究室では、共同研究で神経病理学的解析を行い、OPTNの遺伝子変異を有する患者由来剖検脊髄の標本において、直鎖状ユビキチンや活性型NF-кB因子(リン酸化p65)が細胞質凝集体に染色され、細胞死の指標である活性型カスパーゼ3の染色も亢進していることを神経病理組織学的に示した。このことから、実際にオプチニューリン変異に起因するALS患者の運動ニューロンでは、直鎖状ユビキチン鎖や活性化NF-kBが蓄積し、神経細胞死を引き起こしていることをが示唆され、今後、ALS治療の標的になる可能性が示唆された。そのほかにも、珍しい経過をきたしたALSの剖検例の学会報告、京都大学の研究者とALSにおけるTDP43や多系統萎縮症におけるカスパーゼ9の活性など、本病態に関連が深い機序に関して検討し発表した。今後は、孤発性のALSや他の変性疾患についても同様の解析を進めてゆき、上記の経路のより広い病態への関与を追及してゆく。OPTNの遺伝子変異を有する患者由来剖検脊髄の標本では直鎖状ユビキチンや活性型NF-кB因子(リン酸化p65)が細胞質凝集体に染色されること、細胞死の指標である活性型カスパーゼ3の染色も亢進していることを神経病理組織学的に示した。同様の検討を孤発性ALSや他の変性疾患でも行っている。また、NFκB経路以外にも、選択的オートファジーのアダプタータンパクについて免疫組織学的検討を行い、OPTNの遺伝子変異を有する患者由来剖検脊髄では、OPTN以外のオートファジー経路が亢進していることを示唆する結果を得ている。OPTN変異を持つALS患者でTDP-43以外にリン酸化タウやαシヌクレインの沈着が起こっていることを論文報告した。このことから、OPTNはALS以外の変性疾患にも広くかかわっている可能性を考えた。そこで、αシヌクレイン陽性疾患でのOPTNの関与について検討したところ、多系統萎縮症の被殻において、コントロールに比べると、活性化ミクログリアでOPTNやParkinが陽性であることを見出した。また、神経炎症系のシグナルについて検討したところ、ミクログリアにおいて、NLRP3インフラマソーム関連タンパクが陽性であることを見出した。既報告から、NLRP3インフラマソームはオートファジー経路によって分解されることが知られており、オートファジー経路の活性化によって、インフラマソーム経路の制御を試みることにした。そのため、初代培養細胞、ミクログリアでαシヌクレインフィブリルでの刺激を行い、OPTN、p62のWBやインターロイキンの測定を行った。また、2017年の報告で、大阪市立大学の分子病態学の徳永文稔教授らとの共同研究で、ALS-OPTNの剖検脳ででNFκBシグナルの構成タンパクであるリン酸化p65が異常沈着していることを報告したのを受けて、他疾患で検討したところ、リン酸化p65は、認知症の原因疾患であるアルツハイマー病のタウオパチー病理などの変性疾患において、顆粒空胞変性や、神経突起にも沈着していることを見出した。

そのほか、電子顕微鏡でアルツハイマー病やALSなどの認知症の症例を観察し、標本の固定の条件の検討を行った。そのほか、本城らと、アルツハイマー病の病理標本を検討し、異常タンパクの蓄積によって引き起こされる小胞体ストレスに重要なタンパク質であるPDIとP5がオリゴデンドロサイトで減少していることを報告した。昨年度、論文で報告したOPTNの遺伝子変異を有する患者由来剖検脊髄の標本で直鎖状ユビキチンや活性型NF-кB因子(リン酸化p65)は、孤発性ALSやアルツハイマー病での凝集物が見られた。興味深いことに、リン酸化p65は、オートファゴソームとの関連性が報告されている顆粒空胞変性で多く陽性がみられた。一方で、選択的オートファジーのアダプタータンパクについて他のアダプタータンパクであるp62、NDP52、NBR1での免疫組織学的検討を行い、孤発性ALSやアルツハイマー病の剖検脳でコントロールとの差異を見出すために検討を行ったが、既に知られているp62やOPTN陽性の凝集物以外には、オートファジー経路が亢進している確証は得られなかった。このため、染色性の明らかになっているp62やOPTN陽性と、他の炎症系シグナルとの関連を中心に検討することにした。OPTN変異を持つALS(ALS-OPTN)の症例において、すでに知られているTDP43以外にタウやαシヌクレインの凝集がみられることを報告した。神経炎症系のシグナルについては、多系統萎縮症の剖検脳におけるNLRP3インフラマソーム関連タンパクとOPTNの関連について検討し、NLRP3インフラマソーム関連タンパク陽性ミクログリアが病変部胃の変性の程度に応じて、増加することを報告した。また、初代培養細胞から確立したミクログリアでαシヌクレインフィブリルなどの凝集タンパクでの刺激を行い、ウェスタンブロッティングを行い、IL1beβが増加することを確かめた。また、初代培養細胞から確立したオリゴデンドロサイト前駆体細胞でαシヌクレインの取り込みがおこり、オートファジーのマーカーであるp62が増加していることを報告し、多系統萎縮症のモデルとなりうる可能性を報告した。さらに、認知症の原因の多くをしめる疾患であるアルツハイマー病とALS-OPTNの顆粒空胞変性において、NFκBシグナルについて、検討したところ、活性型であるリン酸化p65がアルツハイマー病とALS-OPTNの海馬で凝集しており、疾患群で増加していることを確認し報告した。また、OPTNによって、NFκBを制御さしている直鎖型ユビキチンがアルツハイマー病で凝集していることを報告した。このように、今年度は、OPTNの制御対象であるNFκBや神経炎症のシグナルががALSだけでなく、アルツハイマー病や多系統萎縮症でも亢進していることを裏付ける結果を報告した。OPTNの遺伝子変異を有する患者由来剖検脊髄の標本で見られたことが孤発性ALSにおいてもみらえることを示し、OPTNを介したNFκBの経路がALS病態一般に関連しているかを検討する。さらには、認知症の原因の多くをしめる疾患であるアルツハイマー病のタウオパチー病理などの変性疾患にも関連している可能性を考えており、今後も同様に病理学的解析を進めていく。神経炎症系のシグナルについて、ミクログリアにおけるNLRP3インフラマソーム
おとり遺伝子による口腔癌浸潤・転移抑制

おとり遺伝子とは転写因子プロモーター領域に結合する塩基配列を含んだ二本鎖合成オリゴヌクレオチド(20塩基対程度)のことであり,これをHVJ(Hemagglutinating virus of Japan)ウイルスベクターを用いて癌細胞に導入した。最初に転写因子Sp-1を標的にした。まず、蛍光色素でラベルしたSp-1おとり遺伝子をHVJリポソームに組み込み、その導入効率を検討した。導入開始後3時間で、蛍光色素は80%以上の癌細胞に取り込まれ、6時間ではそれらは核内に移行した。Sp-1おとり遺伝子を導入した癌細胞はサイトカインTNF-αによって促進される血管新生因子VEGF、TGF-β、組織因子、uPAの産生および癌細胞の増殖および浸潤を著明に抑制した。以上の結果はおとり遺伝子を用いる癌浸潤抑制療法として、発展する可能性を示唆している。一方、現在、AP-1やNF-kBおとり遺伝子を用いたものでは十分な癌浸潤抑制効果が十分得られていないことや、生体(in vivo)での効果の有無など、今後、検討すべき点を多く残している。口腔癌細胞の浸潤はEGFやTNFαなどのサイトカインによって促進されデキサメサゾンによって抑制されるが、この機序にmatrix metalloprotease9(MMP-9)とurokinase plasminogen activator(uPA)のプロテアーゼ発現が強く関与していた。そこで、MMP-9とuPA発現を制御している転写因子(AP-1)を標的としたdecoy ODNs(AP-1が認識する7塩基を含む二本鎖合成オリゴヌクレオチド=おとり遺伝子)を作製した。AP-1のdecoyODNsをHVJ-リポソームに組み込み、培養癌細胞に作用させると、おとり遺伝子は速やかに癌細胞核内に導入された。さらに、遺伝子導入癌細胞はEGFやTNFα処理によって誘導されるMMP-9やuPAの発現を著しく抑制した。
ヒトジアシルグリセロールキナーゼα及びγ遺伝子の転写調節機構の検討

ジアシルグリセロールキナーゼ(DGK)は動物リン脂質合成系の代謝中間体であるジアシルグリセロールキナーゼをリン酸化してホルファチジン酸に変換する酵素である。DGKは哺乳動物においてそれぞれ全く異なった細胞、組織分布をしている8種類のアイソザイムがクローニングされている。このうち、当研究室でクローニングした3つのアイソザイム(α,γ,δ)についてHL-60の分化に伴う変化を検討した。HL-60をTPA刺激によりマクロファージに分化させると、刺激1日後からDGK活性が増加した。また、DMSO刺激による顆粒球への分化の際にも刺激2日後からDGK活性が増加した。さらにこれらの活性の増加は膜画分での活性の増大に由来するものであった。つぎにウェスタンブロッティングにより各アイソザイムの量の変化を調べたところ、TPA及びDMSOのどちらで刺激した場合でもDGKαは膜画分及び可溶性画分の両方で増加していた。また、DGKδは膜画分で顕著に増加していた。しかし、DGKγの増加は認められなかった。さらに、これらのアイソザイムのmRNAの量の変化をRT-PCRにより検討した。DGKαはやや増加したものの、DGKγはTPA刺激1日後から激減した。また、DGKδも分化とともに減少する傾向がみられた。以上のことから分化に伴うアイソザイムの量の増加は単純にmRNAの量の増加によるものではないことが示された。
痛みの慢性化形成過程における扁桃体ノルアドレナリン機構の解明と介入

慢性痛の本態は中枢神経系の可塑的変化にあることが臨床・基礎的な様々な知見から示唆されており、扁桃体は様々な疼痛モデル動物でシナプス伝達の増強が報告されている。本研究ではノルアドレナリンによる神経活動修飾作用が疼痛下での扁桃体の可塑的変化の一因となるという仮説を立てた。ノルアドレナリン神経特異的Cre発現ラットを作製し、ウイルスベクターによる光遺伝学ツールを適用することにより、扁桃体で光誘発内因性ノルアドレナリン放出を誘導しそれによる応答を電気生理学的に記録した。また、扁桃体ノルアドレナリン神経終末を特異的に神経毒で脱落させ、扁桃体ノルアドレナリンが疼痛関連行動の表出に関与する事実を見出した。チャネルロドプシンによる光誘発内因性ノルアドレナリン放出誘導、および、内因性ノルアドレナリン放出下の侵害受容性扁桃体シナプス伝達への影響の解析を目指し研究を進めた。包括型脳科学研究推進支援ネットワークリソース・技術支援より、ノルアドレナリン合成酵素ドパミンβヒドロキシラーゼ(DBH)プロモーター制御下にCreリコンビナーゼを発現するトランスジェニックラット(以下、DBH-Creラット)F0世代9匹を非営利的に譲受した。DBH-Creラットを野生型Wistarラットと交配し、今後本研究に用いる次世代個体を獲得した。Cre依存的赤色蛍光タンパク発現系保有ラット(東北大学八尾寛博士より譲受)とDBH-Creラットを交配し、ノルアドレナリン神経が赤色蛍光陽性となる動物を作製し、脳内の赤色蛍光タンパクの発現量・発現部位の確認、および、赤色蛍光タンパクと免疫染色によるDBH陽性像との比較を行い、Creの発現を評価した。DBH-Creラット9系統中、3系統で主要ノルアドレナリン神経核(青斑核、孤束核等)でのCre依存的に赤色蛍光タンパクが発現している事実を確認した。系統により赤色蛍光タンパク発現細胞数が異なったが、発現細胞の分布には系統間での著しい違いは認められなかった。一方、ノルアドレナリン神経終末の赤色蛍光は蛍光顕微鏡下での検出が困難な強度の発現レベルであった。現在Cre依存的チャネルロドプシン発現系保有ウイルスベクターのDBH-Creラットノルアドレナリン神経核への微量投与、および、Cre依存的チャネルロドプシン発現系保有ラットとDBH-Creラットの交配を計画・推進中で、これらの系でのチャネルロドプシンの十分な発現の後、形態学的および電気生理学的解析を行う。DBH-Creラットの系統維持・系統選別に計画立案時に予想していたよりも時間と労力がかかったため、平成27年度に計画した光による内因性ノルアドレナリン放出誘導の系の確立が達成されていない。現時点で3系統のDBH-Creラットを確立することができたため、次年度には本動物を用いた実験系を円滑に運用することが可能な環境が整った。チャネルロドプシンによる光誘発内因性ノルアドレナリン放出の系の確立、および、内因性ノルアドレナリン放出誘発下の侵害受容性扁桃体シナプス伝達解析を目指し研究を推進した。前年度までに本課題研究拠点に導入したノルアドレナリン合成酵素ドパミンβヒドロキシラーゼ(DBH)プロモーター制御下Creリコンビナーゼ発現トランスジェニックラット(以下、DBH-Creラット)のうち、最も導入遺伝子コピー数の多い系統を選定し、交配により必要動物を獲得した。この動物のノルアドレナリン神経核にCre依存的チャネルロドプシン発現系保有ウイルスベクターを導入すべく以下に取り組んだ。1)青斑核または孤束核へのベクター注入、2)ベクター導入部位での発現とチャネルロドプシン機能の確認を目的とした急性脳スライス標本でのノルアドレナリンニューロンからのパッチクランプ記録、ならびに、3)扁桃体ニューロンからのパッチクランプ記録と内因性ノルアドレナリン作用検証のためのプロトコルの確立。現在までに、青斑核ニューロンチャネルロドプシン発現系では、青斑核への限局した分子発現が確認できたが、扁桃体を含む急性脳スライスではウイルスベクター由来蛍光物質陽性神経線維が認められていない。そのため、ウイルスベクターを変更し神経終末での十分な量のチャネルロドプシン発現条件を現在検討している。孤束核ニューロンチャネルロドプシン発現系では、孤束核へのベクター注入を試みている。前年度までにDBH-Creラットの系統維持・系統選別に時間がかかってしまった影響で、全体的に進捗が遅れている。また、ウイルスベクター導入後神経終末での十分なチャネルロドプシン発現を得るために5週間程度の時間経過が必要であるため、実験結果のフィードバックに時間がかかることも遅延の一因である。しかしながら、現在は研究計画推進に必要な道具、実験材料、実験技術がそろい、順調に進捗している。扁桃体中心核は青斑核や孤束核などのノルアドレナリン神経核と双方向性に密に投射しあう事実が解剖学的に明らかにされている。扁桃体とそれらノルアドレナリン神経核が互いの神経活動を調節しあうことにより疼痛制御に関わると考えられるが、その詳細なメカニズムは未解明である。本研究では、ドパミンβヒドロキシラーゼ(DBH)プロモーター下にCreリコンビナーゼを発現するDBH-tTA-2A-Cre BAC Tg ratと、ウイルスベクターによるCre依存的チャネルロドプシン発現遺伝子導入を組み合わせ、光刺激による内因性ノルアドレナリン放出が扁桃体ニューロン活動に与える影響の解明を目指した。蛍光タンパク発現ウイルスベクターをノルアドレナリン神経核へ局所注入した結果、孤束核へのウイルス注入により扁桃体中心核内に孤束核由来ノルアドレナリン神経の投射が観察された。

チャネルロドプシン発現用ウイルスベクターを用い扁桃体急性脳スライス標本に対し光刺激を行い内因性ノルアドレナリン放出を誘発しh電流への影響を解析したところ、わずかではあるが光刺激による振幅変化が生じた。今後さらに光照射パターン等の条件を検討する必要がある。青斑核への遺伝子導入では扁桃体中心核での蛍光タンパク陽性線維が観察できなかったが、これについてはウイルスベクター投与の段階に検討の余地がある。さらにノルアドレナリン神経がどのような痛み行動に影響するのかを解析するために、扁桃体中心核に抗DBHサポリンを微量注入しDBH発現神経終末の選択的脱落を誘導し疼痛関連行動解析を行った。その結果、扁桃体中心核ノルアドレナリン神経終末の脱落によって炎症性疼痛モデルにおける温度嗜好性が変容することが明らかになり、扁桃体において内因性ノルアドレナリンが疼痛関連行動調節に関わることが示された。慢性痛の本態は中枢神経系の可塑的変化にあることが臨床・基礎的な様々な知見から示唆されており、扁桃体は様々な疼痛モデル動物でシナプス伝達の増強が報告されている。本研究ではノルアドレナリンによる神経活動修飾作用が疼痛下での扁桃体の可塑的変化の一因となるという仮説を立てた。ノルアドレナリン神経特異的Cre発現ラットを作製し、ウイルスベクターによる光遺伝学ツールを適用することにより、扁桃体で光誘発内因性ノルアドレナリン放出を誘導しそれによる応答を電気生理学的に記録した。また、扁桃体ノルアドレナリン神経終末を特異的に神経毒で脱落させ、扁桃体ノルアドレナリンが疼痛関連行動の表出に関与する事実を見出した。平成27年度に確立したノルアドレナリン神経特異的Creリコンビナーゼ発現ラット(DBH-Creラット)に対し、現在ウイルスベクターによるチャネルロドプシンの発現を誘導している。チャネルロドプシンの発現量については、ウイルスベクターの種類やタイターの検討を行いながら発現系の機能の向上を進める。また、Perairaらの報告(Nature Neurosci. 2016)からシナプスでのモノアミン放出確率が非常に低い可能性が示唆されているため、光刺激パターンや刺激時間・回数等の条件検討を検討する。Cre依存的赤色蛍光タンパク発現系による検討結果から扁桃体の神経終末でのチャネルロドプシンの発現が神経伝達物質放出誘導に不十分である可能性が示唆される。その場合は、Cre発現系保有ウイルスベクターとCre依存的チャネルロドプシン発現系保有ウイルスベクターを組み合わせて改善を試みる。ノルアドレナリン神経特異的Creリコンビナーゼ発現ラット(DBH-Creラット)青斑核・孤束核ノルアドレナリンニューロンへのウイルスベクター導入によるチャネルロドプシン発現系の確立を現在進めている。ウイルスベクターの種類(プロモーター、チャネルロドプシンの種類など)などを検討し、神経終末でのチャネルロドプシン発現の向上を目指す。
近見反応の大脳高次視覚領内神経機構についての研究

本研究では眼の近見反応、特に輻輳運動系・焦点調節系間の相互連関の大脳機構を明らかにするため、ネコ大脳視覚連合領の1つ、外側上シルビウス領(LS領)を対象とし運動関連領域の広がり、誘発運動の潜時、眼球運動関連ニュ-ロン活動を分析した。本年度は従来の焦点調節の研究に次ぎ輻輳運動を中心とした研究を行った。実験には記録・刺激用チェンバ-を装着した覚醒ネコを用いた。眼球運動は磁気サ-チコイル法、眼の屈折力は赤外線オプトメ-タを用いて記録した。1)LS領内での系統的脳内微小激により、その中央部にあるPMLS領の吻・尾側2ヶ所にある中心視領域で焦点調節・輻輳運動が誘発された。輻輳運動・焦点調節の双方が誘発される刺激部位の他、輻輳運動または焦点調節の一方のみが誘発される刺激部位も一部に見出された。PMLS領の尾側領域刺激による誘発輻輳運動の最短潜時は、LS領刺激による誘発外眼筋筋電図潜時(20-30msec)にほぼ一致した。一方、吻側領域刺激による輻輳運動の潜時は有意に長かった。従って、PMLS領内に機能分化があり、処理された結果は尾側領域から脳幹輻輳運動領域へ出力されることが示唆された。2)輻輳運動と相関を持つLS領細胞活動を検索した。60個のニュ-ロンの約8%では、視覚刺激より引き起こされた輻輳運動の速度変化と相関した細胞活動変化が認められた(輻輳関連ニュ-ロン)。3)輻輳関連ニュ-ロンは視標の接近・離反運動のみでなく、フロントパラレル面内での視標の運動、両眼視差変化、視標大きさ変化等の視覚刺激に比較的非選択的に応じた。従ってこの群の細胞は輻輳運動に相関した活動を示すと共に、視標が前方、あるいは斜め前方から接近・離反する際に賦活される視覚ニュ-ロンでもあると考えられた。4)以上の結果、及び従来の研究結果からLS領は輻輳運動系ならびに焦点調節系の視覚・運動連関に役割を果たすことが示唆された。
輸出入の評価を可能とする建築用LCA原単位データベースの構築手法の確立

環境影響を定量化するライフサイクルアセスメント(LCA)は以前にも増し様々に活用されている。我が国や先進国では、評価に不可欠な原単位データベース(DB)が開発されてきているほか、一部の国では主要製品等のデータが作成されているが、網羅的なDBを持つ国は世界的にはごく僅かである。建築分野でも輸入建材が少なくなく、最近では国産と輸入の差異を意識した評価も増加してきている。そこで、本研究は日本の原単位DBから海外のデータを簡易かつ可能な限り精度高く推計する手法を構築することを目的とした。具体的には以下の内容を検討した。(ア)比較・検証用のインベントリデータ整備:海外における主要な材料等のデータを収集し、国ごとの違いを明らかにした。(イ)インベントリデータに差異を生じさせる因子の分析:(ア)の収集データをもとに、各国のCO2などの排出量の違いが生じる要因を分析し、電力原単位、燃焼効率、燃焼用燃料構成比、燃料の質、環境対策等が大きな要因になっていることを示した。(ウ)各国で容易に収集可能なデータ(統計資料等)の調査:推計に活用でき得るデータの整備状況について調査し、世界各国で共通して得られるIEAの統計資料や、日本と取引量が多い主要な12か国については、それぞれの国の個別の統計等を収集し、それらを基にした手法の構築・データの活用可能性を明らかにした。(エ)推計手法の構築:予備調査で作成した試案や、(ア)(ウ)をもとに、海外データの簡易推計手法を構築した。(オ)収集データと推計データの比較による精度検証:(ア)(エ)の結果をもとに、推計データベースを構築し、(ア)で収集したデータとの比較、日本のデータを同様の方法で推計し比較することで、推計精度を明らかにした。その結果、おおむね良好な精度を担保できていることが分かった。本研究は、LCAの実施に不可欠なバックグラウンドデータベースについて、これまでに構築されてきた国内のデータをもとに、簡易的な方法を用いて海外の原単位を推計する手法を構築することを目的としている。1年目は、(ア)比較・検証用のインベントリデータ整備、(イ)インベントリデータに差異を生じさせる因子の分析、(ウ)各国で容易に収集可能なデータの調査、(エ)推計手法の構築の4つに主眼を置いて研究を実施した。(ア)比較・検証用のインベントリデータ整備:比較・特に中国やタイのデータを先行して調査した。その結果、中国では、多数の統計資料があることが確認できた。タイは、タイのカーボンフットプリントのデータなどがあることが分かった。(イ)インベントリデータに差異を生じさせる因子の分析:(ア)で収集したデータについて、我が国のデータベースとの差異の検討を行った。その結果、日本と海外のインベントリデータについて、差異を生じさせる要因が多数あることを示した。(ウ)各国で容易に収集可能なデータの調査:全世界で共通のフォーマットで入手できるデータベースには、IEAのEnergy Balances/Statistic of OECD/non-OECD Countriesなどがあった。加えて、その国独自の詳細な統計がある場合は、それを用いて推計精度が高いデータベースを構築することとし、中国やタイについては産業連関表を用いて検討した。(エ)推計手法の構築:本推計手法は、大別して2種類設定することとした。1つは、全世界で共通したフォーマットで入手できるデータを用いて推計する手法、もう1つは、その国の事情に合わせ、より精度高く詳細なデータが得られる場合は、それを用いて推計する手法である。これを踏まえ、現段階で考えられる最良の方法で、試作版の中国とタイの推計データベースを構築することができた。本研究は、研究採択が10月下旬であり、1年目の研究は実質的に5か月程度しか研究期間がなかった。そのため、本来1年目で計画していた内容をすべて達成することはできていない。そうした事情から、「(3)やや遅れている」と判断した。ただし、5か月で成し遂げた成果と見た場合には、「(1)当初の計画以上に進展している」と判断している。具体的に、1年目の計画として掲げた内容のうち、研究開始以降約5か月で達成できていない内容として、以下を挙げることができる。(ア)比較・検証用のインベントリデータ整備:限られた時間の中で、まず、中国とタイを優先して検討を行うこととした。そのためその他の国のデータ等が十分に収集できていない。このため、中国とタイ以外のデータを収集し、差異を生じさせる要因などについて分析する必要があると考えている。また、環境負荷物質については、エネルギー消費原単位やCO2排出原単位を優先することとした。1年目にも可能な範囲で検討する予定だったSO2などの他の環境負荷物質については可能な範囲では情報収集を行ったものの、十分に情報収集がし切れていない状況である。(イ)インベントリデータに差異を生じさせる因子の分析:上述の理由から、SO2等のエネルギー・CO2以外の環境負荷物質については差異を生じさせる要因についても十分に検討が実施し切れていない。これらについては、次年度以降に早急に取り組むべき課題の一つと認識している。CO2排出量などの環境負荷量を算出するためには、ライフサイクルアセスメントの実施が不可欠である。LCA実施において、バックグラウンドデータベースは必要不可欠である。我が国のバックグラウンドデータベースは整備が進んでいる。輸入が多い我が国にとって海外の評価が必要不可欠となるが、海外のデータベース整備は十分ではない。本研究は、日本のバックグラウンドデータベースを用いて、海外のバックグラウンドデータを推計する手法を構築するものである。

当該年度は、アジア地域を対象に特に日本への輸入額が多い主要7か国(中国、韓国、台湾、タイ、インドネシア、ベトナム、マレーシア)に対象を拡大し、これらの国についての推計手法を構築した。また、対象とする環境負荷物質もエネルギー消費量、CO2排出量だけではなく、SO2やNOxなどについても推計手法の構築を試みた。具体的に、我が国最大級のバックグラウンドデータベースであるIDEA Ver.2を用いて推計することを前提とし、1電力原単位、2燃焼効率、3燃料の種類別のエネルギー構成比のデータを対象国のデータに変換することで推計する手法を提案した。また、データが収集できた場合は、4環境対策(例:脱硫・脱硝)5燃料の質(例:硫黄含有量)も考慮した。これらの推計のために必要な統計データ等を対象国それぞれについて調査し、各国で整備されている統計データを用いて、本旨に合致するような推計方法を提案することができた。なお、中国については、4について詳細なデータを得ることができたため、他に比べて精度の高い推計が期待できる。また、以上を踏まえて、推計のために必要な各種のデータベースも構築でき、IDEA Ver.2に実装すれば推計データベースを構築できる段階まで到達できた。昨年度実施した、(ア)比較・検証用のインベントリデータ整備、(イ)インベントリデータに差異を生じさせる因子の分析を踏まえて、基礎的な(エ)推計手法の構築を行った。また、可能な限り精度の高い推計とするために、(ウ)各国で容易に収集可能なデータ(統計資料等)の調査を行い、各国で入手可能なデータを活用した(エ)推計手法の構築を行った。現状の進捗としては、まず、世界各国共通で入手できる統計データ等から推計する手法が構築できた。従って、(ア)(エ)に関しては、最低水準には到達できたと考える。また、より精度の高い推計を行うため、各国で入手可能な統計を活用した推計は、日本への輸入額が多いアジア7か国ではあるが推計手法を構築できた。加えて、中国を中心として、SOxやNOxの推計方法の検討もできており、進捗としてはおおむね順調に進んでいると判断している。本研究は、1年目が実質5か月であったため、研究期間が1年5か月ではあるが、上述のような進捗状況から、当初の2年目の計画内容をおおむね達成できていると考えている。環境影響を定量化するライフサイクルアセスメント(LCA)は以前にも増し様々に活用されている。我が国や先進国では、評価に不可欠な原単位データベース(DB)が開発されてきているほか、一部の国では主要製品等のデータが作成されているが、網羅的なDBを持つ国は世界的にはごく僅かである。建築分野でも輸入建材が少なくなく、最近では国産と輸入の差異を意識した評価も増加してきている。そこで、本研究は日本の原単位DBから海外のデータを簡易かつ可能な限り精度高く推計する手法を構築することを目的とした。具体的には以下の内容を検討した。
ターゲットオブラパマイシン複合体２のストレス応答機構の解析

ラパマイシンの標的因子であるターゲットオブラパマイシン(TOR)が形成するTOR複合体2(TORC2)は栄養、ストレスなどの情報を統合し、代謝や生存・増殖を制御する細胞内情報伝達因子である。研究代表者らは既に分裂酵母TORC2制御因子の候補を得ていたことから、本研究では、これら候補タンパク質によるTORC2経路のストレス応答の制御機構を解析した。その結果、これらが異なる刺激に応答し、異なる機構でTORC2を制御することが示され、それらのうちTORC2のグルコース飢餓応答に関する成果を論文として発表した。今後、これらの制御機構の詳細な解析およびヒトのTORC2への応用への展開が期待される。本申請研究の目的は栄養状態およびストレスなどに応答し、代謝や細胞増殖を制御するターゲットオブラパマイシン(TOR)の制御機構を解析することにある。TORは細胞内情報伝達を担うタンパク質リン酸化酵素で、二つの異なるタンパク質複合体を形成し、それぞれ異なる機能を有すると考えられている。本研究では、そのうちの複合体2(TORC2)の解析を行う。平成26年度は、(1)TORC2のグルコース飢餓応答を解析しその結果を論文として発表し、(2)TORC2構成因子であるSin1のストレス応答性MAPキナーゼSpc1との結合領域を同定した。(1)分裂酵母TORC2の基質であるGad8のリン酸化レベルを指標にし、TORC2経路のグルコース応答を解析した。その結果、TORC2経路がグルコースのアナログである2-デオキシグルコースに応答しないこと、および、cAMP-PKA経路に非依存的にグルコースに応答することを見いだした。一方、低分子量型Gタンパク質のRyh1変異株の解析により、Ryh1がTORC2経路のグルコース応答に重要な役割を担うこと、および、グルコース飢餓環境下でRyh1非依存的にこの経路が活性化することを見いだした。これらの結果を論文として公表した(Hatano et al., Cell Cycle, 146, 848, 2015)。(2)酵母ツーハイブリッド法により、Sin1の塩基性アミノ酸が集合する領域とSpc1の酸性アミノ酸に富む領域を介してこれらのタンパク質が結合することを突き止めた。また、Spc1はTORC2経路のグルコース応答には関与しないこと、Spc1によるTORC2経路の制御は転写因子であるAtf1依存的に起こることを見いだした。これは「Spc1によるSin1を介したTORC2経路の制御」という本研究の作業仮説の一つを否定する結果であり、今後の研究計画に若干の変更が必要であると考えている。本研究の目的は、代謝や細胞増殖を制御するターゲットオブラパマイシン(TOR)の栄養状態や浸透圧などの環境ストレスに対する応答機構を明らかにすることにある。TORはシグナル伝達を担うタンパク質リン酸化酵素で、二つの異なるタンパク質複合体を形成し、それぞれが異なる機能を有すると考えられている。本研究では、それらのうち殆ど解析されていないTOR複合体2(TORC2)の制御にフォーカスする。初年度の平成26年度は、低分子量Gタンパク質であるRyh1がTORC2のグルコース応答を制御することを見出し、その成果を公表した(Hatano et al. Cell Cycle, 146, pp848, 2015)。また、ストレス応答性MAPキナーゼであるSpc1によるTORC2経路の制御が転写因子であるAtf1を介することを見出した。この結果は、「Spc1がTORC2の直接的な制御因子である」という申請時の作業仮説とは異なるため、研究計画の変更に必要が生じた。27年度は(1)TORC2構成タンパク質であるSin1のリン酸化によるTORC2経路への影響、そして(2)TORC2経路の酸化ストレスおよび高浸透圧に対する応答を解析した。さらに、(3)新規TORC2制御因子の探索の準備に取り掛かった。(1)Sin1タンパク質のリン酸か部位はすでにHayashiらにより報告がある。これらの部位に変異を導入したがTORC2の活性に変化は見られなかった。(2)申請時、申請者はTORC2-Gad8経路の酸化ストレス応答にRyh1及び解糖系酵素であるTdh1が必要であることを既に見出していた。27年度はこれらの間の遺伝学的及び物理的相互作用を解析し、今後の研究展開の方向性を決める上で重要な知見を得た。また、Spc1およびAtf1によるTORC2制御を仲介する因子の候補としてPyp1, Gpd1などを得た。これらは28年度の研究計画の推進に大きく寄与する重要な成果である。平成26年度にグルコースによるTORC2-Gad8経路の制御機構に関する解析する必要性が生じ、これを優先的に行った。そのため、当初26年度に行う計画であった酸化ストレス応答を解析することで、Ryh1及びTdh1によるTORC2経路の分子機構を明らかにする実験を27年度に行った。実験系が確立できていない実験が残されている点は負の評価となるが、それ以外は概ね完了した。27年度以降の計画に盛り込んだSpc1によるTORC2-Gad8経路の制御機構の解析は27年度内に完了した。その結果は当初の予想とは異なり、Spc1の作用を仲介する因子の存在を示唆するものであった。このため、この因子の探索を行い複数の候補を単離した。

当初計画にはなかった展開ではあるが、研究目的に沿っていると共に、実験は着実に前進しており、ほぼ予定通りの進捗であると判断できる。Spc1の作用を仲介する因子はTORC2経路を直接制御する新規因子である可能性があり、この実験の目的は当初計画の最後の盛り込んだ「新規TORC2-Gad8経路関連因子の探索・解析」と同じである。また、28年度に行う予定の新規TORC2-Gad8経路関連因子の探索に用いる酵母株、プラスミド等の作製に取り掛かり、その幾つかは既に取得した。以上のことを総合的に判断し、「おおむね順調に進展している」を選択した。ターゲットオブラパマイシン(TOR)は栄養状態やストレスなどに応答し、代謝や細胞増殖を制御するタンパク質リン酸化酵素である。TORは異なる二つのタンパク質複合体を形成するが、申請者はそれらのうちTOR複合体2(TORC2)に着目し研究を行ってきた。本研究課題の目的はTORC2のストレス応答機構を明らかにすることにあり、平成26,27年度において、グルコース飢餓、酸化ストレス、および高浸透圧ストレスに対する応答を解析し、TORC2経路のグルコース飢餓応答に関する成果を論文として公表した。また、Spc1とSin1の結合領域をそれぞれ同定した。さらに、Spc1のAtf1を介したTORC2の間接的な制御の存在を明らかにした。平成28年度は、1TORC2-Gad8経路のSpc1による間接的な制御に関わる因子としてGpd1を同定し、Spc1, Atf1, Gpd1をコードする遺伝子の遺伝学的解析を行い、Spc1およびAtf1はGpd1の発現を介してTORC2の高浸透圧ストレスに対する応答を制御することを明らかにした。また、2既知のTORC2制御因子であるRyh1およびTdh1を介したTORC2の高浸透圧ストレスに対する応答を遺伝学的に解析し、Ryh1およびTdh1はTORC2-Gad8経路の高浸透圧ストレスに対する応答には殆ど関与しないことが明らかにした。これらの結果は、TORC2のストレス応答の上流経路はストレスの種類ごとに異なることを示している。さらに、3TORC2の酸化ストレス応答に於いてRyh1とTdh1は異なる機構で制御することを示す結果が得られた。上記の解析を行っている際、非ストレス条件下におけるTORC2-Gad8経路の制御に関する知見が得られた。本研究課題の目的とは合致しないためさらなる解析は行わなかったが、これらは今後の研究の展開に重要な知見であると考える。ラパマイシンの標的因子であるターゲットオブラパマイシン(TOR)が形成するTOR複合体2(TORC2)は栄養、ストレスなどの情報を統合し、代謝や生存・増殖を制御する細胞内情報伝達因子である。研究代表者らは既に分裂酵母TORC2制御因子の候補を得ていたことから、本研究では、これら候補タンパク質によるTORC2経路のストレス応答の制御機構を解析した。その結果、これらが異なる刺激に応答し、異なる機構でTORC2を制御することが示され、それらのうちTORC2のグルコース飢餓応答に関する成果を論文として発表した。今後、これらの制御機構の詳細な解析およびヒトのTORC2への応用への展開が期待される。
「伝統」と「宗教」のダイナミズム－サラワクにおけるアダットとキリスト教－

平成24年度は、マレーシア・サラワク州における現地住民の慣習の成文化について、その歴史をサラワク最大のプロト・マレー系民族であるイバンに焦点をあてて明らかにしてきた。サラワクでは現地住民の慣習が成文化され、司法制度の末端機関に位置づけられる先住民裁判所で適用されている。イバンを始めとする現地住民の慣習は、植民地独立後に慣習伝統評議会によって草稿が作成された。今日、裁判所で適用されているこの慣習の記録は、植民地独立後にイバンの知識人や政治的リーダーがイニシアチブをとって取り組んできた成果である。しかし、そうした記録活動は、そもそも植民地政策のひとつとして始まったこと、そして植民地行政官の記述がその後の現地住民たちの記録活動に大きな影響を与えたことがわかった。なかでも、イバン慣習の記録には、イギリス人行政官A.J.N.リチャードの記述がその礎となっていることを明らかにすることができた。そこで、本研究では19世紀以降のサラワク行政に関する歴史研究を踏まえつつ、行政官リチャードがサラワク政府の任命により成文化したイバン慣習について、彼の記述をもとに分析した。分析からは、リチャードの単純に行政官という立場として捉えることのできない成文化に対する複雑な見解を考察した。彼が第二次世界大戦以前のブルック王国時代よりサラワクで地方行政官として勤務し、現地住民の文化や慣習に慣れ親しんでいたという背景を持つために、植民地時代にイギリスから導入されつつあった近代西洋的な司法制度に対して好意的ではなかったことが彼の記述から読み取れる。特に、非常にシステマチックな形式でまとめられながらも内容としてはイバン語を多用し、近代西洋化によって現地の文脈が損ねてしまうことを極力避けるように配慮した彼の記述は、そうした成文化に対して慎重な態度をとる彼の姿勢がうかがえる。こうした成文化の詳細な歴史の把握は、文字化され、裁判で適用されている今日の慣習の特徴やそこで生じる問題点を捉える上で重要となってくる。平成23年度は、マレーシア・サラワク州における、アダットと呼ばれる先住民たちの慣習について、その記述や記録に関する動きを、イギリス植民地時代以降に着目して明らかにしてきた。この時代は、西洋人研究者のみならず、現地の研究者たちもまた自らの文化を研究し始める時代でもあった。なかでも、B.サンディンは、当時の西洋人研究者から研究のスキルを学んだ初期のネイティブ人類学者である。彼のアダット記述に関して、第二次世界大戦後のサラワクの社会的・政治的変化と照らしあわせながら分析した。サンディンのアダット記述は、西洋人研究者たちのそれとは異なり、近代化が進む中でも適用されるべき法体系として記録することが主張されている。このことから、当時のサラワクの社会的状況および、ネイティブとしての彼の立場が、アダット記録に大きく反映していることがわかった。イギリス植民地、そしてマレーシア連邦加盟という経験のなかで、それまでサラワク最大の民族であったイバンの立場は、サラワク内とマレーシア半島部のマレー人同士の結託を機に変化を余儀なくされていった。こうした変化は、多くのネイティブたちに「我々の」文化や慣習の保存の重要性を意識させることとなると同時に、実際に、彼らに様々な行動を促した。そして今日、先住民たちのアダットを記録・保存するための機関である慣習伝統評議会もまた、そうした動きのひとつとして位置づけられる。評議会は、トゥン・ジュガというイバン出身の政治家によって創設された。そして、アダットの記録は、単に自文化の伝統・慣習の保存ではなく、先住民の利害を守るための文書・法典化でもあることがわかった。こうしたアダットの記録という営為は、サラワクの近代化に対する彼らの反応であり、近代化と伝統の保存を論じる上で本研究は今後も重要となってくる。