hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
椎間板由来、体性幹細胞を用いた末梢神経再生における基礎的研究

様々の幹細胞を併用した神経再生治療が研究されているが、我々は、椎間板内の髄核前駆細胞のその移植ソースとしての可能性を検証した。マウス髄核から、髄核前駆細胞をメチルセルロース培地を用い培養した。この細胞はRTーPCRでは神経幹細胞と類似した遺伝子発現を有した。また本細胞をシュワン細胞誘導培養地で誘導すると、シュワン細胞に形態的に類似した細胞へ誘導でき、また、その誘導後細胞を、マウス坐骨神経切断モデルへ移植すると、形態的にも機能的にも、シュワン細胞と同様に、その再生を促すことを確認した。これは、神経損傷に対する細胞移植治療の観点から、本細胞が、その一つの選択肢となりうる可能性を示すものであった。我々は、椎間板髄核内に球状コロニー(CFU-S)を形成する体性幹細胞を確認している。一方、その神経系細胞への分化能の評価は未知であり、その神経系細胞への分化能につきin vitro,in vitroでの評価を施行した。マウス尾椎より顕微鏡下に椎間板髄核を採取し、メチルセルロースによる浮遊培養させCFU-S形成した。得られたCFU-Sを、抗Nestin抗体で免疫染色、RTーPCRにてNestin、Musashi1、Sox2の発現を評価。さらに、CFU-Sをシュワン誘導培養を施行し、抗GFAP抗体・抗S100抗体による免疫染色評価をした。次に、CFU-S細胞を免疫不全マウス坐骨神経切断モデルへ移植し、移植神経の組織評価と熱逃避試験、foot print testを施行した。結果は、髄核細胞由来CFU-Sは、免疫染色でNestinの高い染色性を示し、RT-PCRでもNestin、Musashi1、Sox2などの神経幹細胞マーカーの発現を認め、さらに誘導培養後得られた細胞はシュワン細胞マーカーの抗GFAP抗体・抗S100抗体とも陽性であった。神経切断部への移植でも、神経の再生と同部に残存する髄核由来シュワン細胞を認め、機能評価においても神経機能の回復を認めた。本細胞は、神経幹細胞に類似した性質を持ち、機能的シュワン様細胞へ分化能も認めた。本結果を、The Global Spine Congress 2013、日本整形外科学会基礎学術集会2013、The Orthopaedic Research Society 2014で報告し、World Forum for Spine Research 2014で報告予定である。また、海外雑誌に投稿準備中である。今後順次、移植細胞数の変更による再生神経の機能的、ヒト髄核細胞→マウス坐骨神経、等の実験形を検討していく。本研究で、マウス椎間板内より得られた髄核組織を、メチルセルロース培地で10日間浮遊培養し、NP cell-spheroid coloniesを形成させた。このcoloniesより得られた髄核前駆細胞をシュワン細胞誘導培地にてシュワンへ誘導し、得られた誘導後細胞をマウス坐骨神経中央切断モデルへ移植した。移植後形態的評価として免染と電鏡を行った。また、機能評価として、Walking track analysis(WTA)とHot water behavior test(HWT)を施行。(結果)免染では、神経切断部中央において残存するGFP陽性細胞を認め、シュワンのマーカーとされるS100も陽性で、切断後再伸長するβIIIーtublin陽性の軸索を認めた。また、残存するGFP陽性細胞は多くが、ミエリン鞘を形成していた。電顕でも同様に再生軸索を認めた。WTAとHWTいずれも移植群の有意な機能回復を認めた。マウスの髄核前駆細胞は、既存の誘導培地を用いてシュワン細胞に類似した細胞へ誘導が可能であり、機能的にもミエリン鞘の再構築を通して神経再生に関わることを証明できた。これは、末梢神経再生の移植治療において、一つの選択肢となりうる可能性を示唆するものであった。しかしながら、本研究は、マウスを用いた実験であり、人を含む他の種でも同様の検討が必要と考える。また本研究では、比較的若い週令の同種由来の変性の少ない椎間板細胞から移植細胞をバンキングする手法であり、そのドナーの確保に限界がある。臨床を見据えた場合、外科治療において破棄される椎間板の再利用や、同種新鮮椎間板バンクの設立などの対応策は考慮されるものが、より有効な移植細胞数の検討や、シュワン細胞への誘導前段階の髄核前駆細胞の移植による神経再生効果の検討など臨床を見据えて、より効率的な移植方法の検討等を進めている。《目的》近年、様々の幹細胞を併用した神経再生治療が研究され、良好な成績が散見されるが、椎間板に存在する髄核由来のadult stem cell(髄核前駆細胞)を神経再生の移植ソースとして応用出来るかを検証し、末梢神経治療においてその臨床応用を目指すものである《方法》マウス尾椎より採取した髄核細胞から、メチルセルロース浮遊培養地にて、髄核球状コロニーを作成し、同由来の髄核前駆細胞を採取。本髄核細胞の性質の確認のため、免染、RTーPCRを施行。続いて、シュワン細胞誘導培養法にて、髄核前駆細胞をシュワン細胞への誘導し、免染を施行。さらに得られた誘導後細胞を、マウス坐骨神経切断モデルへ移植し、免染、および機能評価として、Walking track analysisとHot water behavior testを施行した。神経切断長は3mm、7mmで施行した。《結果》髄核前駆細胞は神経幹細胞と類似した遺伝子発現をもち、シュワンへ誘導が可能であった。誘導後髄核細胞は、神経損傷部で、その再生を促し、機能的にもシュワン細胞に類似するものであった。

しかしその神経欠損長が大きくなると、再生能力には限界がある結果であった。《考察》髄核前駆細胞は、その局在や遺伝子発現を考慮すると神経系のadult stem cellことが考えられ、シュワン細胞へ分化が可能で、神経再生を促す事を証明出来た。これは、近年有効性が期待される末梢神経損傷に対する細胞移植治療の観点から考えると、その移植細胞として一つの選択肢となりうる可能性を示唆した。しかし、現段階では、より欠損長の長い神経切断モデルでの神経再生には、本細胞単独の移植では限界があると言わざるを得ない。今後は、神経栄養因子の併用移植など、より少ない移植細胞数で、効率的な神経再生を促す移植方法の検討が必須と考えられる。上記内容を現在、英文誌に投稿中である。様々の幹細胞を併用した神経再生治療が研究されているが、我々は、椎間板内の髄核前駆細胞のその移植ソースとしての可能性を検証した。マウス髄核から、髄核前駆細胞をメチルセルロース培地を用い培養した。この細胞はRTーPCRでは神経幹細胞と類似した遺伝子発現を有した。また本細胞をシュワン細胞誘導培養地で誘導すると、シュワン細胞に形態的に類似した細胞へ誘導でき、また、その誘導後細胞を、マウス坐骨神経切断モデルへ移植すると、形態的にも機能的にも、シュワン細胞と同様に、その再生を促すことを確認した。これは、神経損傷に対する細胞移植治療の観点から、本細胞が、その一つの選択肢となりうる可能性を示すものであった。研究成果はまずまず、順調であり、学会報告も当初予定数よりも多く達成出来ている。しかしながら、最終的な論文のパブリッシュまでがやや難航しており今後の努力を要する。整形外科臨床業務との併用であるが、現段階までの、結果を論文として発刊されることを努力しつつ。同様の実験形のより詳細な研究結果を出せるよう邁進する。おおむね順調な結果を認め、発表等のアウトプットもまずまずと考えている。当初予定よりも、消耗品の金額が押さえられたことによると考える。現状を最低ラインとし、臨床との並列であるが、更なる時間調整をシビアにし、本研究に加速をつけていきたいと考えている。論文の校正代と継続する実験形の消耗品等に当てる予定である。臨床との平行の研究であり、実験の一部遅延があり、当初予定額より少ない支出となっている。本年度の研究時間の調節をよりシビアに施行し、実験を遂行してく予定であり、繰越金も用いて可能となる実験となる算段である。
エラー反応を予測する脳活動の研究

動作遂行中のエラー反応を脳波の事象関連電位から予見できるかについて検討した.単調な予測反応を反復させる課題では,反応誘発電位の陽性成分にその後のパフォーマンス結果が反映されることを見出した.陽性成分が高振幅の時にエラー誘発刺激を提示しても正反応となる一方で,低振幅時に提示すると反応抑制は機能せず,誤反応となることが明らかとなった.本研究で得た知見は,ヒューマンエラー予防に役立つものと期待される.動作遂行中のエラー反応を脳波の事象関連電位から予見できるかについて検討した.単調な予測反応を反復させる課題では,反応誘発電位の陽性成分にその後のパフォーマンス結果が反映されることを見出した.陽性成分が高振幅の時にエラー誘発刺激を提示しても正反応となる一方で,低振幅時に提示すると反応抑制は機能せず,誤反応となることが明らかとなった.本研究で得た知見は,ヒューマンエラー予防に役立つものと期待される.エラー反応の発生メカニズムの一つと考えられている「行動モニタリング機能の一過性低下」は,エラー反応の発生以前から生じている可能性が高い.実際にこの考えを支持する知見が報告されている.エラー反応そのものよりも,それ以前の試行での脳内情報処理を調べるほうが応用研究に繋げやすい.本研究では,エラー反応の先行試行で事象関連電位(event-related potential:以下ERP)と機能的MRIを測定し,関連成分同定とその発生源を明らかにすることを目指した.平成21年度では,現有32チャネル脳波計とfMRIとの同時記録ができるシステムを構築した.その一方で,128チャネルデジタル脳波計を用いて,行動モニタリング機能低下に関与する脳活動を探った.先ず交互反応課題を用い,注視点上下に規則的に交互提示される視覚刺激を,低頻度確率(5%)で裏切るルアー刺激を挿入しエラーを誘発した.ルアー刺激先行試行での反応時間とERPを測定した結果,両者にルアー試行結果を予見する特徴を見出した.本課題ではエラーよりもむしろ正反応が予測できることを示唆するものだった.エラー反応そのものと,反応結果に対する予期の研究では,情動・動機づけプロセスを無視することはできない.そこで別の実験では,意思決定課題中に呈示したフィードバック信号への情動予期を反映するstimulus-preceding negativity(SPN)と,フィードバック信号に誘発されるfeedback-related negativity(FRN)を測定した.その結果,自分の意思で行動選択できる条件では,意思決定できない条件に比較して,SPNは大きく発達した.同じ課題にfMRIを適用した結果,SPN増大の発生源は大脳基底核と島皮質であることが示された.今後は同様の課題でERPとfMRIの同時記録を行うことになる.平成22年度では,前年度の意思決定課題で得た脳波データを再分析に供し,行為と結果の随伴性(action-outcome cont ingency: AOC)のさらなる検証に努めた.自分で反応選択の意思決定ができるChoice条件ではAOCは強くなる一方で,意思決定できず受動的に結果だけを知らされるNoChoice条件ではAOCは低い.Choice条件は右手第2指と第3指で二者択一の選択を行うギャンブリング課題であったが,NoChoice条件では刺激に対して第1指のボタン押しを行うだけだった.これらの条件はランダムに提示され,選択反応の2.5秒後に金銭獲得・損失結果を視覚的にフィードバックした.フィードバック信号への情動予期を反映するstimulus-preceding negativity (SPN)は,Choice条件で大きく,特に右前頭部で顕著だった.これに対応して,負のフィードバック信号に誘発されたfeedback-related negativity (FRN)もChoice条件で大きかった.同様の課題を用いたfMRI計測では前部帯状回(anterior cingulate cortex: ACC)に顕著な賦活が認められ,FRN増大の原因と推察された.さらに今年度は,脳波とfMRIの同時計測時に眼球運動も記録できるか検証した.眼球運動のモニタは脳波測定では不可欠であり,サッカード眼球運動等の記録は,脳波・fMRI同時計測研究を推進させることにつながる.実験の結果,サッカード由来の眼電位変動は,fMRI由来のアーチファクトによって観察困難であったが,オフラインでノイズ除去することができた.サッカード眼球運動の停留時点で脳波を加算平均すれば,視覚野由来のラムダ反応が観察されるため,現在,fMRI信号との対応付けを行っている.平成23年度では,これまでの実験データを論文に纏める作業に従事した.パフォーマンスモニタリング機能に注目した一連の実験の結果,エラー関連陰性電位(error-related negativity ; ERN)は反応の困難性を反映する一方で,N2成分から分離できることを,time-frequency analysisやsource analysis(電流発生源分析)に供することで明らかにした(Clinical Nurophysiology誌で報告).エラー予測性の観点では,パフォーマンスモニタリングは,エラーを誘発する事象より以前から強まっていることが理想となる.従来の研究の多くは,エラー反応時にパフォーマンスモニタリングが駆動することを強調しているが,正反応時に駆動しても良いことになる.この点を確認するために,一致タイミング課題を工夫し,最大力量発揮のタイミングコントロールに関するパフォーマンスモニタリングを検討した.その結果,タイミングコントロールが首尾良くできる条件では,運動電位(moter potential : MP)が大きくなることを見出し,MPが望ましい反応に関するパフォーマンスモニタリングの指標となり得ることを示した(Experimental Brain Research誌で報告).また,フェイント刺激を挿入した交互反応課題では,正反応に先行して運動関連陽性成分の増強が認められ,抑制過程の指標となることを示した(現在論文審査中).

この運動関連陽性成分をERN,MPと共に記録することで,ビジランス作業(管制官のモニタ監視作業等)から,スキルを要する動作課題(熟練工の作業やスポーツ等)に至るまで,ヒューマンエラーを防止し,パフォーマンスの正確性を維持することに貢献し得ると考えられる.
低コスト牧草由来のセルロースナノファイバー抽出技術の開発

本研究は植物から低エネルギー消費で手頃な装置を用いて、セルロースナノ繊維を抽出する処理法の開発である。そのナノ繊維の抽出法をナノフィブリル化と言う。現在主流のナノフィブリル化過程では、高価な装置に依存しており、高エネルギーの入力に対して収率が非常に低い。研究成果は下記にまとめて示す。1.ナノフィブリル化用に最適化された容器を備えた料理用ミキサーに基づく方法により、数分処理でナノ繊維の生産が実現できた。2.新たなナノ繊維強化ポリ乳酸が開発された。高強度で環境に優しい完全に生分解性複合材料である。本研究は植物から低エネルギー消費で手頃な装置を用いて、セルロースナノファイバーを抽出する処理法の開発である。現在主流のナノフィブリル化プロセスでは、高価な装置に依存しており、高エネルギーの入力に対して収率が非常に低い。平成27年度計画の予定と成果は以下のようになった。1.牛糞の浄化法の最適化:洗浄工程では繊維を牛糞から分離するために食器洗い洗剤を用い、その後得られた繊維をアルカリ性の排水パイプ洗浄剤の水溶液で拡販することにより漂白されることを明らかにした。2.料理用ミキサーのナノフィブリル化用容器デザインの開発:牧草は消化された牛糞の繊維よりフィブリル化が困難なので、牧草のフィブリル化に注目し容器の設計を行った。改良設計は繊維とミキサーのブレードとの衝突の確率を向上させるために容器の容量を2Lから1Lへ減少させ、繊維懸濁液の高速乱流化させる。未解繊の太い繊維をブレードの周辺に金網で閉じ込む。ブレードの軸と軸受の摩擦で発生される熱の放散のため容器の材料をアルミニウムに変え冷却用ヒートシンクの機能を持たせる。さらに泡立ちを防ぐために真空状態でかくはんフィブリル化を行う。3.料理用ミキサーフィブリル化で得られたナノファイバーの評価:ミキサー処理で得られたナノファイバー紙状シートは主流のマイクロフルイダイザー処理で得られたナノファイバーシートの引張強度は同等であり、200MPaを超えている。しかし弾性率は比較的低く約8MPaである。市販セルロースナノファイバーより強いシートであり、弾性率も同等である。ミキサー処理で得られた牧草由来のナノファイバー紙状シートをオーディオスピーカーの振動板に応用の可能性が考えられる。本研究の現在の状態はほとんど計画通りである。最終のミキサー容器試作品は完成し、繊維のフィブリル化に必要な機能も搭載できている。ナノファイバー生産を行う同時にデザインを改良し続ける。バッチ処理であるが、十分なセルロースナノファイバーの生産が可能であるため手頃なミキサーでナノフィブリル化が可能になり超音波処理の機械的前処理の過程にもなる。さらに牧草繊維のナノフィブリル化に成功されたことによって、牛糞由来の繊維のフィブリル化にも適切だと考えられる。平成28年度計画の予定と成果は以下の様になった。1.料理用ミキサーのナノフィブリル化用容器の設計改良によりナノフィブリル化の効率が向上された。容器の容量減少、真空吸引で攪拌、容器素材をアルミニウムに置き換え並びに水流冷却を搭載された。その結果、長時間連続的処理が可能になった。ミキサー処理後超音波ホモジナイザーによりセルロースナノファイバー形態を用途に必要な細かさを調整できるようになった。2.高角細胞である牧草からの繊維より農業副産物由来の柔細胞に当たる繊維がナノフィブリル化が容易であり、従って果物、根、地下茎等の搾りかすがセルロースナノファイバーの適切な原料であることが明らかになった。3.項目1の方法により柔細胞から抽出されたセルロースナノファイバーを用いて光学的に透明な複合材料の開発が可能になった。牧草由来の牛糞より柔細胞に基づく農業副産物がナノフィブリル化に適切なことにより、後者のフィブリル化のためにミキサー処理実験を優先的に進めている。超音波ホモジナイザーによる処理はミキサーによる前処理に続いて効率的であるが、柔細胞繊維の場合は超音波処理のみでフィブリル化を行う可能性を実験的検討中。そのため得られたナノファイバーを用いた材料の開発はわずかに遅れている。現在主流のナノフィブリル化課程では高価で高エネルギー消費な装置で行い、収率は非常に低い。平成29年度計画の予定と成果は以下の様になった。1.超音波ホモジナイザー処理に基づく柔細胞からナノファイバーの抽出を行う予定でしたが、装置の不具合で実験が続けられない状態になった。したがって料理用ミキサーの容器をさらに改善し、様々な農業副産物原料のスクリーニングを続けることによって果物の搾りかすよりナノフィブリル化が容易な原料が明らかになった。2.セルロースナノファイバー強化ポリビニルアルコール複合材料及び全セルロース複合材料の開発に成功した。

1.ナノフィブリル化用に最適化された容器を備えた料理用ミキサーに基づく方法により、数分処理でナノ繊維の生産が実現できた。2.新たなナノ繊維強化ポリ乳酸が開発された。高強度で環境に優しい完全に生分解性複合材料である。平成28年度では超音波ホモジナイザーを導入しミキサー処理に基づく一括法を連続処理過程に変換する。牛糞由来の繊維は浄化後直接超音波でフィブリル化できる可能性はあるが牧草繊維は細胞壁を破壊するため機械的前処理が必要となる。それはミキサー処理では短時間で十分である。さらに超音波処理過程では懸濁液の循環経路の途中にナノファイバーを分離させる装置が必要となるのでデカンテーションタンクを用いて行う。超音波処理の開発とともにミキサー処理過程の改善を続ける。手頃な装置でフィブリル化処理を行う過程は限られた予算の研究室でもセルロースナノファイバーの提供を自給自足できると考えられる。連続処理に基づくセルロースナノファイバーの大量生産の予定に伴いセルロースナノファイバーに基づく複合材料を試作し、補強性能の評価によってナノフィブリル化処理過程を改良する。平成29年度では超音波ホモジナイザー処理のみに基づく柔細胞繊維から一括法で抽出できる連続過程の技術を完成させる予定。完全研究室内生産ナノファイバーを用いて材料開発を行う。材料科学当該年度で使用する予定であったガラス器具について、当初の予定より使用経費を抑えることができたため、その差額により次年度使用額が生じた。当初予定していたガラス器具および薬品が予定よりも安く購入することが出来たため、未使用額が生じた。実験のための消耗品の購入に使用する予定。実験のための消耗品の購入と学会参加費および旅費に使用する予定。
配位子による金－磁性へテロ構造ナノ粒子の磁気異方性制御と磁気温熱療法への応用

本研究では金ー磁性ヘテロ構造ナノ粒子表面の金原子に配位する有機分子によって引き起こされるナノ粒子の磁気特性変化の観測と磁気ハイパーサーミア用発熱担体としてのナノ粒子の応用展開をはかることを目的とし,金ー酸化鉄ナノ粒子の合成を行ってナノ粒子そのものを変えずに表面を修飾する分子を置換した試料を用いて交流磁場による発熱実験を行った。この結果,金ー磁性粒子界面の平坦な試料においてオレイルアミンで修飾した粒子に比べ,ジメルカプトコハク酸で修飾した粒子の比吸収率が増大した。これは,粒子表面の修飾分子がナノ粒子の磁気特性に影響を及ぼしていることを示唆しており,界面が重要であることが明らかとなった。本研究では金ー磁性ヘテロ構造ナノ粒子表面の金原子に配位する有機分子配位子によって引き起こされるナノ粒子の磁気特性変化について系統的に調べて制御法を確立する他,高周波磁場による金ー磁性ヘテロ構造ナノ粒子の加熱実験を行い,磁気ハイパーサーミア用発熱担体としてのナノ粒子の応用展開をはかることの2点を目的としている。平成24年度では,オレイルアミンで修飾した平均粒径17.5 nmのFe3O4ナノ粒子と,平均粒径6.2 nmのナノ粒子を接合し,金ー磁性ヘテロ界面をもつAu-Fe3O4ダンベル型ナノ粒子の合成を行った。この試料を用いて交流磁場による発熱実験を行った結果,発熱能力の指標となるSARの実験値はFe3O4ナノ粒子の粒径を磁気的直径とした理論値に比べて著しく小さいことが分かった。試料の磁化曲線に対して粒径分布関数を考慮して解析したところ,TEMで観測されたFe3O4ナノ粒子の粒径17.5 nmよりも小さな平均粒径(12.4 nm)と,大きな分布幅をもつとして計算したものとよく一致することが分かった。また,磁化曲線から導かれた実効的な磁気的直径を用いて計算したSAR値は実験値に近い値となった。この現象は粒径を変化させて合成したFe3O4単体のナノ粒子についても見られ,これらはFe3O4ナノ粒子表面もしくは金ナノ粒子との接合界面のひずみに起因したスピンディスオーダーによってバルクに比べて磁気モーメントが減少することによるものであることが示唆される。平成25年度では,オレイン酸で修飾したFe3O4ナノ粒子と,金ナノ粒子を接合し,金ー磁性ヘテロ界面をもつAu-Fe3O4ダンベル型ナノ粒子に加えて,複数の金ー磁性ヘテロ界面をもつAu-Fe3O4フラワー型ナノ粒子の合成を行った。この試料を用いて交流磁場による発熱実験を行った結果,発熱能力の指標となるSARの実験値はダンベル型ナノ粒子に比べてフラワー型ナノ粒子の方が著しく小さくなった。これはFe3O4ナノ粒子と金ナノ粒子との接合界面のひずみに起因したスピンディスオーダーによって,バルクに比べてFe3O4ナノ粒子の磁気モーメントが減少することによるものであると考えられる。また,ナノ粒子そのものを変えずにFe3O4ナノ粒子表面を修飾するオレイルアミンを,チオール基を含む低分子配位子であるDimercapt succinic acid(DMSA)に配位子置換したものと,Pluronic F127高分子で置換した試料を合成した。これらの試料を用いて交流磁場による発熱実験を行った結果,オレイン酸で修飾した粒子の実験値に比べDMSAで修飾した粒子のSARが2倍程度増大した。一方,F127高分子修飾粒子のSARはオレイン酸修飾粒子に比べて減少した。これらの結果は,粒子表面の修飾分子がナノ粒子の磁気特性に影響を及ぼしていることを示唆している。本研究では金ー磁性ヘテロ構造ナノ粒子表面の金原子に配位する有機分子配位子によって引き起こされるナノ粒子の磁気特性変化、特に磁気異方性について系統的に調べて制御法を確立する他,高周波磁場による金ー磁性ヘテロ構造ナノ粒子の加熱実験を行い、磁気異方性や飽和磁化に依存する比吸収率を高くするための最適条件を見出して、磁気ハイパーサーミア用発熱担体としてのナノ粒子の応用展開をはかることの2点を目的としている。平成23年度では磁性ナノ粒子と原子1層程度の金とのヘテロ界面をもつ、コアシェル型ナノ粒子の合成を行ってその磁気特性評価を行うことに加え、磁気光学効果を用いたナノ粒子の磁気異方性評価実験装置の開発を行い以下の結果を得た。

1)コア粒径約5 nmのFe3O4ナノ粒子と、これをシェル厚約1 nmの金で覆ったFe3O4/Auコアシェル型ナノ粒子を合成し、配位子としてオレイルアミンを使用して表面修飾を行った。X線回折と透過型電子顕微鏡によって目的の試料が得られたことを確認した後、交流帯磁率測定によってFe3O4ナノ粒子とFe3O4/Auコアシェル型ナノ粒子の磁気特性を調べた。その結果,Fe3O4ナノ粒子に比べてFe3O4/Auコアシェル型ナノ粒子で保磁力の増大と交流帯磁率の実部のピーク温度に上昇が観測されたが,交流帯磁率の虚部のピーク温度には違いは見られず、2つの試料間で本質的な磁気異方性の変化が生じていないことが示唆された。2)本補助金を用いて、磁場変調と磁気光学効果を用いた複素交流帯磁率測定を原理とする磁気異方性評価実験装置を製作した。Coフェライトナノ粒子の複素交流帯磁率を測定し、磁気異方性に依存するネール緩和スペクトルが測定できることを確認した。本研究では金ー磁性ヘテロ構造ナノ粒子表面の金原子に配位する有機分子配位子によって引き起こされるナノ粒子の磁気特性変化について系統的に調べて制御法を確立する他,高周波磁場による金ー磁性ヘテロ構造ナノ粒子の加熱実験を行い,磁気ハイパーサーミア用発熱担体としてのナノ粒子の応用展開をはかることの2点を目的としている。最終年度ではナノ粒子表面のスピンディスオーダーによって磁化が減少し,理論値を下回っていたFe3O4球状ナノ粒子の比吸収率(SAR)を改善するために,合成法を変えて表面にファセットをもつ多面体状Fe3O4ナノ粒子を合成した。この試料を用いて交流磁場による発熱実験を行った結果,発熱能力の指標となるSARの実験値は球状ナノ粒子に比べて高く,前述の磁気モーメントの減少の原因を大幅に抑えていることが示唆された。また,別に合成した多面体状の金ナノ粒子を接合し,金ー磁性ヘテロ界面をもつAu-Fe3O4多面体状ナノ粒子の合成を行った。ナノ粒子そのものを変えずにナノ粒子表面を修飾するオレイルアミンを,チオール基を含む低分子配位子であるDimercapt succinic acid(DMSA)に配位子置換した試料を用いて交流磁場による発熱実験を行った結果,オレイン酸で修飾した粒子の実験値に比べDMSAで修飾した粒子のSARが2倍程度増大した。これらの結果は,粒子表面の修飾分子がナノ粒子の磁気特性に影響を及ぼしていることを示唆しており,金ー磁性粒子界面のラフネスが重要であることが明らかとなった。磁性申請書に記載した「研究の目的」と平成24年度の研究計画どおり研究を実行できており、おおむね順調に進展していると判断した。申請書に記載した「研究目的」と「研究計画」はおおむね実行できているが、論文発表が遅れているためやや遅れていると判断した。申請書に記載した「研究の目的」と平成23年度の研究計画どおり研究を実行できており、おおむね順調に進展していると判断した。次年度も金ー磁性ヘテロ界面をもつダンベル型ナノ粒子を合成し、金表面の修飾分子を変化させた実験を行っていく予定である。次年度は最終年度であり、研究の推進はもちろんだが成果発表に力点を置く予定である。次年度からはコアシェル型のヘテロ構造ナノ粒子だけでなく、ダンベル型など様々な金ー磁性ヘテロ界面をもつナノ粒子を合成し、今年度製作した実験装置を用いて磁気異方性の評価を行っていく予定である。装置開発に導入した備品の購入は23年度で終了したため、次年度以降は主として試料合成用試薬等の消耗品を購入するために研究費を使用する予定である。
政府統計ミクロデータを用いた全国の住宅防災・復興政策に関する応用統計研究

本研究では、総務省統計研修所等の協力を得て、(1)住宅・土地統計調査の個票データを用いた全国の住宅建替え・耐震補強工事についての統計解析、(2)全国消費実態調査の個票データを用いた全国の住宅ローンを抱える家計について統計解析、(3)住宅・土地統計調査および全国消費実態調査を用いた住宅保障に関する統計解析を行い、(4)又、研究進行中に発生した東日本大震災後の被災地の社会調査に参加しデータ分析を行い、住宅防災・復興政策の検討に資するような統計資料の作成を行った。2010年度は,総務省統計研修所の共同研究制度を利用して,住宅・土地統計調査(昭和53年から平成20年分)の個票データを用い,全国の住宅の耐震改修工事や建て替えと,住宅属性(構造,建築時期等とや世帯属性(家族構成,収入等)との関係性や地域特性についてのデータ分析を進めた.具体的には,まず,我が国の住宅と耐震化の動向の把握を進めた.詳細には,住宅の動向について,住宅数,空家率,所有形態,建て方,構造,建築時期の推移を地域ごとに整理した.また,世帯と住宅の関係について,世帯年収と住宅の関係,家計を主に支えるものの従業上の地位と住宅の関係,世帯の型と住宅の関係の推移を整理した.さらに,住宅耐震化の動向として,耐震診断と耐震改修工事の状況,住宅属性ごとの耐震診断結果,耐震性能が不足する住宅数の推定,建築時期ごとの住宅数の変遷,住宅寿命の推計,滅失および新規供給の傾向,住宅取得方法の変遷と中古購入の増加,借家住宅の建て方・構造・建築時期について整理した.その上で,耐震診断結果と住宅の関係性,耐震診断,耐震改修工事と住宅,世帯,地域の関係性をロジスティック回帰分析で探索した.加えて,都道府県単位でのデータ集計を行い,耐震化関連指標との関係性を見た上で,階層的クラスター分析を行なった.市区町村単位でもデータ集計を行い,耐震化関連指標との関係性を見た上で,マルチレベル分析を行った.上記作業についてとりまとめ,考察を加えて,2011年度前半に総務省統計研修所リサーチペーパーとして刊行し,引き続き学術論文の作成を進める予定である.近年,政府統計の二次利用に向けた制度整備が進展しつつあり,我が国の住宅研究においても,政府統計の個票データを用いた分析の展開可能性を模索することが期待される.2011年度は,昨年度からはじめた住宅・土地統計調査を用いた分析を継続して進め,2011年9月に総務省統計研修所リサーチペーパー第28号として「住宅・土地統計調査から見る住宅耐震化の趨勢」をとりまとめた.具体的には,住宅や世帯,住宅耐震化の動向を整理した上で,耐震診断や耐震改修工事と住宅,世帯,地域の関係性を分析した.持家住宅の耐震診断結果を見ると1981年の建築基準法改正以降でも,耐震性能が不足している比率が高い場合があることや,長期地震発生確率が高い地域で,耐震性能が不足している住宅が多いが,耐震改修工事は十分に進んでいない傾向が見出された.また,都道府県や市区町村によって,耐震化率と,新設住宅比率や耐震改修実施率等の関係性が異なっていること,さらに,全体的に耐震化率が低い都道府県では,耐震化率が低い市区町村で耐震改修工事が少ない傾向が見られるなどを見出した.本研究実施期間に,東日本大震災が発生した.東日本大震災後の被災地の社会調査を見ると,住宅ローンを抱えたまま被災された方が少なくなく,生活者の目線から我が国の住宅のリスクを考えていく上で,住宅金融の問題は避けて通れないものと考えるに至った.そこで,2011年度は,政府統計の個票データを用いた住宅研究の展開可能性模索の一環として,住宅ローンについて扱いがある全国消費実態調査を用いた分析を行い,別に実施されたインターネット調査を,全国消費実態調査と傾向スコアを用いて補正推計する方法,補正推計したデータを用いて家計へのストレスが返済へ与える影響を分析する方法などを検討した.平成23年度までに、住宅・土地統計調査の個票データを用いて、耐震診断や耐震改修工事と住宅、世帯、地域の関係性の分析を進めた。分析作業については、総務省統計研修所リサーチペーパー第28号として「住宅・土地統計調査から見る住宅耐震化の趨勢」をとりまとめた。平成24年度は、これまでの成果に調整を加えて、学術論文を執筆して、日本建築学会計画系論文集へ投稿し、審査結果を踏まえて修正作業を行い、平成25年6月号への掲載が決定した(先に記したRPと同じ主題として、副題を「新規住宅供給が耐震化率へ与える影響と耐震改修工事の政策的意義」とした)。また、総務省統計研修所との共同研究を継続し、引き続き統計分析作業を進めた。具体的には、住宅・土地統計調査を用いて、住宅所有形態について作業を加えた。また、住宅についても扱いがある全国消費実態調査の個票データも利用し、家計と住宅状況の関係分析も行なった。

住宅・土地統計調査を用いた分析結果については、「1980年代後半から2000年代後半にかけての我が国の住宅保障に関する統計資料(1)」として総務省統計研修所へリサーチペーパー原稿を提出した。全国消費実態調査を用いた分析結果については、平成25年3月に提供されたデータに誤りが含まれていたことが判明し、差し替える必要が発生したため、今後データを差し替えてリサーチペーパーとする予定である。関係して、岩手県釜石市および福島県双葉地方の避難者や住宅ローンに関する社会調査のミクロデータを用いた分析作業も進めた。それらの分析作業を進めながら、住宅防災・復興政策について検討を行ない、「複眼的な政策分析に基づく居住環境リスクに対する住宅保障政策の検討」という研究が必要であるとの視点を獲得し、新たに3か年の研究計画を作成し、基盤研究(C)へと応募し、平成2527年度の研究として採択されるに至った。交付申請書の計画通り,昨年度からはじめた住宅・土地統計調査を用いた分析を継続して進め,年度内に総務省統計研修所リサーチペーパーとしてとりまとめ刊行できた.24年度が最終年度であるため、記入しない。2012年度も総務省統計研修所との共同研究を継続し,分析作業を継続できる体制を整えたので,引き続き作業を進める.具体的には,住宅・土地統計調査を用いたこれまでの分析作業に調整を加えて,学術論文を執筆投稿する予定である.また,住宅についても扱いがある全国消費実態調査の個票データも利用して,家計と住宅状況の関係分析も加え,住宅の防災・復興政策の検討につなげる.24年度が最終年度であるため、記入しない。
セルフアセンブリング法により調製した機能性表面の分光学的研究

近年、電子素子の集積度は急速に向上し、旧来の方法では限界に到達しつつある。このため、分子1個1個を素子とするいわゆる分子素子の概念が提案されている。しかし、その実現には多くの課題を解決しなければならず、その前段階として分子集合体による機能発現が試みられている。本研究はこのような観点から機能性分子をセルフアセンブリング法により表面に規則的に配列させることにより、所望の機能を持った表面を創製し、その配向性を走査型トンネル顕微鏡(STM)、ルミネッセンス測定、赤外線反射分光法、二次高調波発生(SHG)分光法などにより評価し、機能発現との関係を定量的に把握することを目的として行った。本年度は1.二次高調波発生分光法システムの立ち上げと金電極表面反応への適用、2.電位変調反射赤外分光法による単分子構造の電位依存性の追跡、3.光誘起電子移動を実現する為の単分子層の構築、4.水晶振動子マイクロバランス(QCM)法による、メルカプトキノン/ハイドロキノン単分子層/電解質溶液界面での物質移動過程などについて研究を行った。以下各項目毎に述べる。1.二次高調波発生分光法システムの立ち上げと金電極表面反応への適用研究協力者(八木)がウイスコン大学マディソン校におもむき、二次高調波発生(SHG)分光法システムを習得するとともに、SHG分光法により金電極表面の酸化物形成/還元過程およびテルル化カドミウムの析出過程の追跡を行なった。帰国後習得技術を元に研究室保有のシステムに改良を加え、SHG分光システムの立ち上げに成功した。金電極表面反応の追跡に適用する事により、システムが機能する事を確認し、現在単分子系への適用を図っている。2.電位変調反射赤外分光法による単分子構造の電位依存性の追跡研究室保有のFTIR装置を改良し、セルに工夫を加える事によって、単分子層構造の電極による変化を追跡可能な電位変換反調赤外分光法の構築に成功した。これまで種々のアプローチで検討を行ない、フェロセニルアルカンチオール単分子層修飾電極について検討し、分子フェロセン部位の酸化/還元にともなうアルキル鎖およびフェロセン環の配向変化の追跡に成功した。また酸化/還元部位を持たないメルカプトアルカンニトリル単分子層修飾電極について、電位による配向変化の追跡に成功し、電荷-双極子相互作用および電場の効果で説明した。3.光誘起電子移動を実現する為の単分子層の構築光感応基であるポルフィリン、電子伝達部であるキノンおよび電極吸着部位であるチオール基を有する分子を合成し、金表面に単分子配列させた。この単分子層修飾電極について光電流測定を行い、電子のベクトル輸送が起こっている事を認めた。4.水晶振動子マイクロバランス(QCM)法による、メルカプトキノン/ハイドロキノン単分子層/電解質溶液界面での物質移動過程ハイドロキノンは二段階の解離過程を含む事からキノン/ハイドロキノンの電気化学特性はpHに依存する事が期待される。ここではチオール部位を介して金電極表面に固定したキノン/ハイドロキノンについて電気化学応答および表面重量変化を電気化学QCM法で測定した。pK_<a1> pK_<a2>ともキノン/ハイドロキノン系よりは吸着分子の方が大きくなっており、この原因としてチオール基の効果と吸着による効果が考えられる。またEQCM法による測定の結果低pH領域では酸化/還元にともなう物質輸送は殆ど観察されなかったのが、高pH化域では酸化にともなう重量減がみられ、カチオンの移動をともなっている事がわかった。以上3年計画の最終年度として予定以上の研究の進展が見られた。2.電位変調

反射赤外分光法による単分子構造の電位依存性の追跡研究室保有のFTIR装置を改良し、セルに工夫を加える事によって、単分子層構造の電極による変化を追跡可能な電位変換反調赤外分光法の構築に成功した。これまで種々のアプローチで検討を行ない、フェロセニルアルカンチオール単分子層修飾電極について検討し、分子フェロセン部位の酸化/還元にともなうアルキル鎖およびフェロセン環の配向変化の追跡に成功した。また酸化/還元部位を持たないメルカプトアルカンニトリル単分子層修飾電極について、電位による配向変化の追跡に成功し、電荷-双極子相互作用および電場の効果で説明した。3.光誘起電子移動を実現する為の単分子層の構築光感応基であるポルフィリン、電子伝達部であるキノンおよび電極吸着部位であるチオール基を有する分子を合成し、金表面に単分子配列させた。この単分子層修飾電極について光電流測定を行い、電子のベクトル輸送が起こっている事を認めた。4.水晶振動子マイクロバランス(QCM)法による、メルカプトキノン/ハイドロキノン単分子層/電解質溶液界面での物質移動過程ハイドロキノンは二段階の解離過程を含む事からキノン/ハイドロキノンの電気化学特性はpHに依存する事が期待される。ここではチオール部位を介して金電極表面に固定したキノン/ハイドロキノンについて電気化学応答および表面重量変化を電気化学QCM法で測定した。pK_<a1> pK_<a2>ともキノン/ハイドロキノン系よりは吸着分子の方が大きくなっており、この原因としてチオール基の効果と吸着による効果が考えられる。またEQCM法による測定の結果低pH領域では酸化/還元にともなう物質輸送は殆ど観察されなかったのが、高pH化域では酸化にともなう重量減がみられ、カチオンの移動をともなっている事がわかった。以上3年計画の最終年度として予定以上の研究の進展が見られた。1.情報交換セミナ-および研究計画の詳細打ち合せの実施6月のEliis,Corn両教授を迎えて北大において情報交換セミナ-を開催し、北大内の本研究関係者及び他研究者へのWisconsin大学での研究状況の周知をはかった。さらに詳細な研究計画の打ち合わせを行った。2.セルフアセンブリング法による表面創製技術の開発チオ-ル基を表面結合基、フェロセン基(酸化還元機能)やルテニウムトリスビピリジル基(発生機能)を機能性官能基とする種々炭素鎖長の長鎖アルキル化合物の合成法を確立した。またこれらの化合物を金やITO上に配列、固定する技術も完成した。3.表面固定分子層の評価法の確立(1)水晶振動マイクロバランス法による表面固定過程および酸化還元過程のinーsituの追跡に成功した(北大)。(2)角度分解XPSにより固定分子の空間的配置を調べ、フェロセン部位が単分子層の最外部に位置している事を確認した(北大)。(3)9月/10月に魚崎がウィスコンシン大学を訪問し、偏光変調FTーIRによる表面固定分子の配向決定を試みた。本法が単分子層の配向決定に強力な武器であることが確認できた。しかしながら日本から持参した化合物試料が分解し測定結果は実際の構造を反映したものではなかった。この点については来年度ウィスコンシン大学において合成を行い直ちに測定を行くべく計画している。
エナメル質成熟化の新パラダイム：エンドサイトーシスに拠らない蛋白脱却機構の証明

エナメル質が高度な石灰化組織となるためには、幼弱エナメル質に含まれる大量の有機成分を取り除き、結晶成長のための空間を確保する必要がある。本研究で我々は、エナメル質の有機性基質の分解と脱却経路を明らかにすることを目的に、ラットとヒト歯胚を形態学的手法で検索し、トームス突起と波状縁に有機アニオン輸送体(OAT)が備わっていること、エナメル芽細胞はそのOATを介して基質の断片をサイトゾルへ送り込み、ユビキチン・プロテアゾーム系で消化する能力を有することを明らかにした。従来、エナメル基質の脱却は大部分がエナメル芽細胞のエンドサイトーシスに拠るとされてきたが、実験的証明はない。分泌直後のアメロゲニンC-末端の分解は、有機アニオンの性質を持つ断片を大量に生じるが、形成期エナメル芽細胞によって速やかに吸収されるため、生化学的には検出できないという。我々はこのアメロゲニンC末断片の吸収に、腎尿細管型有機アニオン輸送体(OAT)を介す、エンドサイトーシスに拠らない吸収機構が働いている可能性を提唱し、本研究でその検証を試みることとした。研究初年度は先ずOAT1,OAT2,0AT3に対する特異抗体を用いてラット切歯、臼歯におけるそれらの歯胚内局在を免疫組織化学的に検証し、1.OAT2は基質形成開始とともにエナメル芽細胞のトームス突起に発現し、基質形成完了とともに急速に消退する、2.OAT1は成熟期になって初めてRAの波状縁に発現し、RA-SAの周期変化に一致して発現と消退を繰り返す、3.OAT3はエナメル芽細胞は陰性で中間層細胞に局在することを確認した。次いで蛍光有機アニオンであるLucifer Yellow(LY)を静注してその動態を追跡したところ、LYが投与後すみやかに形成期エナメル芽細胞のサイトゾルとエナメル質へ移行すること、サイトゾルへの移行がエンドサイトーシスに拠らないことが確認された。また、アメロゲニン免疫染色では基質形成期後期と成熟期早期エナメル芽細胞のサイトゾルに免疫反応が確認され、更にユビキチンとプロテアゾームの免疫活性も確認された。そこでラットにプロテアゾーム阻害剤を投与した後にアメロゲニン免疫染色を行ったところ、エナメル芽細胞サイトゾルのアメロゲニン免疫反応が有意に増強した。これらの所見はエナメル芽細胞のサイトゾルにアメロゲニン分解システムが存在することを意味しており、エナメル芽細胞がエンドサイトーシスと非エンドサイトーシス型の基質吸収・脱却機構を具備している可能性が強く示唆された。平成25年度は、ヒト歯胚におけるエナメル蛋白質のサイトゾル内処理機構の検証と、ラット歯胚の器官培養系を用いたOATの機能解析を中心に研究を遂行した。ヒト歯胚における有機アニオン輸送体の局在とエナメルタンパク質の処理機構:海外共同サイトゾル内蛋白分解関連分子の局在を免疫組織化学的に検討した。基質形成開始期のエナメル芽細胞は、遠位端の細胞膜にOAT2の免疫活性を認めた。OAT3はトームス突研究者より供与されたヒト歯胚のパラフィン包埋試料を用い、OAT1, 2, 3,アメロゲニン、起と細胞内小胞構造が陽性で中間層は陰性であった。形成期エナメル芽細胞は細胞内が一様にアメロゲニン陽性で、プロテアゾームも陽性であったことから、基質形成初期のエナメル器では、OAT3を除く関連分子の局在はヒト歯胚とラット歯胚でほぼ同様であることが示された。免疫反応の検出感度と再現性の検証:本研究は免疫組織化学を主たる研究手法とするため、染色感度と免疫局在の再現性の確認は極めて重要である。エナメル芽細胞のサイトゾルに見られた拡散性の反応は抗原の賦活化処理をしないと殆ど検出できない。異なる個体から作成した複数のサンプルで同様な結果が得られ、データの再現性、信頼性が再確認された。ラット歯胚器官培養系へのOAT阻害剤の影響:ラット臼歯歯胚の器官培養系に高濃度のOAT阻害剤probenecid(10mM, 20mM)を添加し、非添加群とともに高酸素分圧(95% O2, 5%CO2)下で短期培養して、エナメル芽細胞のアメロゲニン免疫反応を検討した。OAT阻害剤添加群は細胞形態が良く維持され、ゴルジ装置に強いアメロゲニン免疫反応が認められたが、サイトゾルに反応はなかった。非添加群との差の検証はサンプル数を増やす必要があり、研究最終年度に引き続いて本研究を行うこととした。エナメル質がほぼ巨大アパタイト結晶で占められる高度石灰化組織となるためには、結晶成長に先だって有機性基質の大部分が脱却され、巨大結晶を誘導するための十分なスペースが確保される必要がある。我々は本研究で、エナメル芽細胞にはエンドゾーム・ライソゾーム系による基質の脱却・分解経路に加え、有機アニオン輸送体organic anion transporters (OATs)が関与する“エンドサイトーシスに依らない基質の脱却

経路"が存在すること、この新規の脱却経路では基質断片の最終分解がサイトゾル中で進行し、それにはユビキチン/プロテアゾーム系が関与していることを実験的に明らかにしてきた。本年は上述の結果の再現性を確認するとともに、ラット切歯を用いて新たに成熟期エナメル芽細胞の形態変化とサイトゾル分解系の関係を精査した。成熟期早期のエナメル芽細胞層では、ユビキチンの免疫局在がRAで強くみられるのに対しSAではそれが消退すること、逆にプロテアゾームの免疫反応は、RAのサイトゾルには殆ど見られないのに対しSAで強発現すること、を確認した。入手したヒト歯胚はすべて基質形成期早期のものであったため、同様な検討はできなかったが、これらの所見は、少なくともラット切歯では、成熟期早期のエナメル芽細胞はRAの状態でサイトゾルに取り込んだamelogenin断片をユビキチン化し、SAに状態を変化させた際にプロテアゾームによる分解処理を行っていることを示唆するものと考えられる。本研究によって、これまで不明であった成熟期エナメル芽細胞の周期的形態変化の意義の一端を明らかにすることが出来た。26年度が最終年度であるため、記入しない。形態系基礎歯科学26年度が最終年度であるため、記入しない。立案した5つの実験計画のうち1.有機アニオン輸送体の歯胚内免疫局在、2.アメロゲニンおよび3.ユビキチン1プロテアゾームのエナメル芽細胞サイトゾル内免疫局在、4.エナメル器内における有機アニオンの動態の可視化実験は、それぞれほぼ計画通りに進行し、その成果を複数の国内外の学会で発表した。また、国際誌にも1編の論文が掲載された。当初予定していた歯胚培養系を用いた検証実験は研究2年次へ先送りとなった。立案した4つの課題のうち、以下の2つの課題はおおむね予定通り遂行できた。課題2.「歯胚の器官培養系へのOAT阻害剤とユビキチン・プロテアゾーム阻害剤投与の影響の検討」は器官培養条件を定めて実験群と対照群の形態およびアメロゲニン免疫染色結果を比較検討した。結論は未だであるが、最終年度に継続実施し個体数を増やして有意差の有無を明らかにする。課題3.「ヒト歯胚における有機アニオン輸送体の局在とエナメルタンパク質のサイトゾル内処理機構の検討」は海外研究協力者から試料の提供を受け、計画通り完了した。課題1のエナメル質基質断片の免疫電顕による局在の検討は、研究最終年度の課題とした。課題4のOATノックアウトマウスの表現形解析は、同マウスの入手が不可能となったため、断念した。歯胚の器官培養系に有機アニオン輸送体阻害剤、プロテアゾーム阻害剤等を作用させ、それらがナメル質基質の脱却や石灰化に及ぼす影響を精査して、エンドサイトーシスに依らないエナメルタンパク脱却機構の存在を証明する。サイトゾル蛋白分解系がエナメル質の高度石灰化に果たす機能的意義を実験的に検証する。次年度は本研究計画の最終年度にあたり、今年度までにデータ取得が完了しなかった2つの研究課題について実験を継続実施して完了するとともに、既に完了した実験についてもデータの再現実験を行う。また、過去2年に渡って実施した本研究の結果から、その存在が明らかとなったエナメル芽細胞のサイトゾルにおけるアメロゲニンの免疫反応が、エナメル芽細胞の蛋白合成分泌系における品質管理に関わる現象である可能性も想定し、新たな視点からデータの再検討を試みる予定である。
βー1,3ーグルカン生合成阻害物質に関する化学的研究

細菌、真菌、高等植物は、細胞壁を有するという点において動物と異なり、微生物や植物の高い選択活性を有する化合物を見いだす上で、細胞壁は絶好のタ-ゲットの一つと考えられる。細菌細胞壁の主成分は、ペプチドグリカンであり、その生合成阻害剤としては、ペニシリン、セファロスポリンなど実用化されているものが多い。それに対し、真菌細胞壁の主要成分はキチン、マンナン、グルカンなどであるが、その特異的な生合成阻害物質の例は少ない。卵菌類に属する疫病菌Phytophthora属菌の細胞壁はβー1,6結合で高度に分枝したβー1,3ーグルカンを主成分としており、他の真菌類から特徴付けられる。本研究ではピ-マン疫病菌(P.capsici)の菌糸先端形態異常誘起活性物質を探索することにより、βーグルカンの特異的生合成阻害物質を見いだし得ると考えた。活性物質を糸状菌より検索の結果、Acremonium strictumの培養液中に活性が見いだされ、活性物質としてbisvertinoloneとcephalosporin P1の異性体を単離・同定した。さらにbisvertinoloneに関しては、種々の機器分析によりそれまで不明であった5個存在する全ての不斉中心の立体構造を絶対配置を含めて決定した。この2種の活性物質を酵母(S.cerevisiae)より調整したβー1,3ーグルカン生合成酵素系に作用させたところ、βーグルカン生合成を阻害することが明らかになった。しかしbisvertinoloneの活性は、in vivoの活性と比べると弱いため、他の作用点を持つ可能性が考えられた。Bisvertinoloneを含む培地で培養したP.capsiciの細胞壁を精製し、さらにそれを熱水抽出、冷アルカリ抽出、熱アルカリ抽出により分画したところ、bisvertinoloneで処理した菌の細胞壁は、熱水抽出物が、対照に比較して10培以上になり細胞壁の生合成が、阻害されたことは明かである。そこで種々の生物検定を行なったところ、抗菌活性、セルロ-ス生合成阻害活性は認められず、また抗酵母活性が認められたことから、βー1,6ーグルカンの生合成阻害活性を有する可能性が高いと考えられた。疾病菌Pytophthoracapsiciの細胞壁は、主としてセルロ-スとβ-1,3-グルカンよりなり、この菌の菌糸の形態異常を指標として、真菌の2次代謝産物中より活性物質のスクリ-ニングを行い、Acremonium strictumが、強い活性物質を生産していることを見いだした。本研究は、この活性物質の化学構造を明らかにすることを目的とした。活性物質の分子量は、512でFAB高分解能マススペクトルの測定により分子式C28H32O9と決定した。また水酸基をD置換しFABMSを測定することにより、5個の水酸基の存在が明らかになった。またPMRスペクトルより16,18ppmに水酸基のシグナルを認め、これらは、水素結合したエノ-ル性水酸基に由来すると考えられた。さらにPMR,CMRよりメチル基6個、このうちダブレットメチル2個シングレットメチル4個、メチン8個、4級炭素14個が存在することが判明した。PMRデカップリング測定から、2つの側鎖部分の構造が決定できたが、その他の部分は、4級炭素が多いため構造を推定できなかった。

そこで、HMBC法で測定を行い詳細にスペクトルを解析して全構造を推定するに至った。ところが、本物質は、L.S.Trifonovらが1986年にVerticillium intertextumの代謝産物としてすでに構造を決定している。bisvertinoloneと立体構造も含めて同一物と判明した。しかしながらCDスペクトルおよびNOE実験から、彼らが生合成的見地から推定した立体構造が誤っていることが明らかになり、絶対構造を含めて正しい立体構造を提出することが出来た。本物質の生物活性は、知られていないことから、今後in vitroでのβ-1,3-グルカン合成に対する阻害活性や、植物に対する生物活性について検討を加える予定である。細菌、真菌、高等植物は、細胞壁を有するという点において動物と異なり、微生物や植物に高い選択活性を有する化合物を見いだす上で、細胞壁は絶好のタ-ゲットの一つと考えられる。細菌細胞壁の主成分は、ペプチドグリカンであり、その生合成阻害剤としては、ペニシリン、セファロスポリンなど実用化されているものが多い。それに対し、真菌細胞壁の主要成分はキチン、マンナン、グルカンなどであるが、その特異的な生合成阻害物質の例は少ない。卵菌類に属する疫病菌Phytophthora属菌の細胞壁のβー1,6結合で高度に分枝したβー1,3ーグルカンを主成分としており、他の真菌類から特徴付けられる。本研究ではピ-マン疫病菌(P.capsici)の菌糸先端形態異常誘起活性物質を探索することにより、βーグルカンの特異的生合成阻害物質を見いだし得ると考えた。活性物質を糸状菌より検索の結果、Acremonium strictumの培養液中に活性が見いだされ、活性物質としてbisbertinoloneとcephalosporin P1の異性体を単離・同定した。さらにbisvertinoloneに関しては、種々の機器分析によりそれまで不明であった5個存在する全ての不斉中心の立体構造を絶対配置を含めて決定した。この2種の活性物質を、酵母(S.cerevisiae)より調整したβー1,3ーグルカン生合成酵素系に作用させたところ、βーグルカン生合成を阻害することが明らかになった。しかしbisvertinoloneの活性は、in vivoの活性と比べると弱いため、他の作用点を持つ可能性が考えられた。Bisvertinoloneを含む培地で培養したP.capsiciの細胞壁を精製し、さらにそれを熱水抽出、冷アルカリ抽出、熱アルカリ抽出により分画したところ、bisvertinoloneで処理した菌の細胞壁は、熱水抽出物が、対照に比較して10倍以上になり細胞壁の生合成が、阻害されたことは明かである。そこで種々の生物検定を行ったところ、抗菌活性、セルロ-ス生合成阻害活性は認められず、また抗酵母活性が認められたことから、βー1,6ーグルカンの生合成阻害活性を有する可能性が高いと考えられた。