hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
古墳時代中期・畿内中枢地域における埴輪生産組織の研究

その結果、東京国立博物館所蔵埴輪は西都原169号墳および同170号墳、京都大学総合博物館所蔵埴輪は西都原169号墳および同171号墳から出土したことが確定した。畿内型埴輪の地方波及例としての当該埴輪の調査研究を行う上での基礎作業がようやく終了したことになる。これは畿内中枢部の埴輪生産における工人編制を考える上でも非常に重要な成果である。上記の調査研究は、いずれも、学生アルバイトの協力を得ながら、調査記録の整理作業や、写真資料の整理作業を進めることができた。当該研究費は、本来、平成2325年度の3ヶ年で終了予定であったが、諸般の事情のため、補助事業延長申請を行うこととなった。平成26年3月19日付で同申請が認められたため、本研究を平成26年度まで継続することとなった。平成26年度には、基本的には平成2325年度までに遂行した調査研究の成果報告書の編集および刊行のみを行うこととなった。平成27年3月に、本研究費による調査研究成果を盛り込んだ報告書を刊行した。本報告書には、古墳時代中期・畿内中枢地域における埴輪出土事例である城陽市久津川古墳群出土埴輪の調査研究成果および、地方における畿内的埴輪の出土事例である宮崎県西都原古墳群出土埴輪の調査研究成果を所収した。前者については、三辻利一氏(奈良教育大学名誉教授、大阪大谷大学元教授)の協力のもと、蛍光X線分析法にもとづく胎土分析を実施した。実測・観察可能な埴輪については可能なかぎり全個体から分析試料を採取し、古墳相互の胎土の比較研究を行うとともに、各埴輪の考古学的属性との照合作業を実施した。これは、今後、畿内中枢部における同工品分析に必要な基礎データとなるものである。また後者については、各機関に所蔵されている西都原古墳群出土埴輪の悉皆調査の成果を踏まえ、西都原171号墳出土円筒埴輪(宮崎県立西都原考古博物館所蔵)の全実測図を掲載した。これにより、地方における畿内的埴輪の代表的事例である西都原古墳群出土埴輪の調査研究を推進する上で必要不可欠な基礎データを提示することができた。今後は、上記の研究成果を踏まえた上で、畿内中枢地域の埴輪生産組織および、地方における畿内的埴輪の生産組織についての分析をさらに広範に推進したいと考えている。日本考古学今年度の研究活動において、畿内中枢部の埴輪生産組織の実態解明に向けて、百舌鳥御廟山古墳・白鳥陵古墳を始めとする主要古墳出土埴輪の調査研究を順調に進めることができた。ただし、当初予定していた大阪府下の地元各自治体が所蔵している古市古墳群・百舌鳥古墳群の中小古墳出土埴輪については、報告書などによる資料集成および資料整理を進めることはできたが、実物調査はまだ十分には進展していない。宮内庁書陵部所蔵の百舌鳥御廟山古墳では、50本を上回る非常に良好な大型円筒埴輪が出土しており、その調査研究に予想以上の時間を要したことが一因である。調査未了・未着手の上記資料については、次年度の継続課題として鋭意取り組みたい。今年度の研究活動において、畿内中枢部の埴輪生産組織の実態解明に向けて、百舌鳥御廟山古墳および久津川古墳群出土埴輪の調査研究を順調に進めることができた。ただし、本年度中に本研究の研究成果報告書を刊行する予定であったが、百舌鳥御廟山古墳出土の大量の埴輪の調査研究および久津川古墳群出土の大量の埴輪の調査研究について、予想以上の時間を要したため、本年度中の刊行は難しいと判断し、平成25年2月15日付で「補助事業期間延長」を申請した。なお、同3月19日付で「補助事業期間延長」が承認されている。
パーキンソン病者が安全に行える「指リズム歩行トレーニング」の開発

パーキンソン病者は、病棟や自宅での自主練習中の転倒事故が多い。よって、すくみ足や小刻み歩行などの歩行障害が出現したパーキンソン病者であっても、安全に実施できる効果的なセルフトレーニング法の開発が急務の課題である。そこで今回、パーキンソン病者が安全にセルフトレーニングできる「指リズム歩行トレーニング」を開発し、その効果判定をランダム化比較試験による多施設共同研究によって検証することを目指した。
分布・資源量推定と騒音影響評価に向けたイセエビの音声コミュニケーションの解明

2つの水槽を外部濾過装置でつなぐことで、エアレーション音などの環境雑音を極力抑え、イセエビ鳴音を明瞭に観察できる静音水槽ユニットを構築した。静音水槽ユニットで超小型音響ロガーを用いることで、イセエビの鳴音を個体識別しながら行動を観測するシステムを作り上げ、鳴音の持つ生態学的特性を明らかにした。イセエビの鳴音は、触覚で発するパルス構造の広帯域音であり、個体サイズによりパルス間隔や周波数帯が若干異なっていた。一方で個体サイズや雌雄によらず、イセエビの鳴音は、テンポラル構造、音圧および発声時の行動が異なる以下の4つのタイプに大まかに分類された:(1)隠れ場に留まっている時などの静穏時に発する、音圧の小さい、10ー15秒間隔で定期的かつ頻繁に発する音、(2、3)静穏時に稀に発する、音圧の大きい、テンポラル構造の異なる2種の音、(4)攻撃時などの物理的接触を伴う時に発する、音圧の大きい音。発声頻度は個体差が大きく、収容密度に依存しなかった。観察されたタイプ1の鳴音の発声頻度は1日当たり2-704回、タイプ2と3の鳴音はそれぞれ5-38回と0-33回、タイプ4の鳴音は4-202回であった。イセエビは、夕方、および明け方に活発に行動したが、どのタイプの鳴音の発声頻度にも日周変動は観察されず、日中や深夜にも頻繁に発声した。イセエビを複数収容した場合のタイプ1ー3の鳴音の発声頻度は、全ての個体で多い場合、および全ての個体で少ない場合のいずれかであった。このことから、これら3タイプの鳴音は、攻撃行動を回避するための前段階としての、威嚇の意義を持つコミュニケーション音である可能性が考えられた。一方で、複数収容した場合のタイプ4の鳴音の発声頻度は、大型個体で小型個体よりも多く、大型個体が発声した際に小型個体は後退行動を示すことが明らかとなった。26年度が最終年度であるため、記入しない。
遺伝子導入法による筋原線維形成機構の解析

組み換えDNAの導入による標識筋蛋白質の強制発現および標識筋蛋白質の細胞内微量注入により、筋蛋白質アイソフォームの動態、選別、相互作用、代謝回転の態様などをとらえ、筋原線維の形成および維持の分子機構を解析した。その結果、ミオシンアルカリ軽鎖(LC)、トロポニンI(TnI)アクチンについて以下のことが明らかになった。心筋の筋原線維に対するLCの組み込まれやすさは、非筋型<遅筋型<遅筋・心室筋型<速筋型の順に上昇し、また線維芽細胞のストレスファイバーに対しては、非筋型<遅筋・心室筋型<遅筋型<速筋型の順に上昇する。またこのようなアイソフォームの選別は、LCの第2EF-handにおけるアミノ酸の違いに基づくものである。筋原線維の太いフィラメントへのLCの組み込み、あるいはその部位でのLCの置換は、H帯寄りの部分よりA帯の末端部で起こりやすい。TnIについては、速筋型は心筋および骨格筋の筋原線維に取り込まれるが、心筋型は心筋の筋原線維にのみ取り込まれ、骨格筋の筋原線維には取り込まれない。またこのような違いはTnIのN末側半分におけるアミノ酸の違いによるものである。筋原線維におけるアクチンの代謝回転は、横紋のある部分では横紋のない部分よりも遅く、前者は安定した構造であると考えられた。また筋型アクチンの方が非筋型アクチンよりも筋原線維に取り込まれやすい。線維芽細胞のストレスファイバーにおいては、横紋のない筋原線維よりもアクチン分子の代謝回転が速く、両者は形態や構成分子は似ているが、その性質は全く異なるものであると考えられた。1)cDNA導入による構造形成解析ラットおよびニワトリ心室筋の培養細胞にミオシンアルカリ軽鎖の各アイソフォームのcDNAを導入し、発現した蛋白室の筋原線維への取り込みの態様を調べた。導入するcDNAには外来の抗原をコードする塩基配列(タグ)を組み込んでおき、発現した蛋白質をタグに対する抗体で特異的に標識することにより内在性の蛋白質から識別し、その細胞内分布を共焦点レーザー顕微鏡で観察した。その結果、非筋型のアルカリ軽鎖は細胞内全体に瀰慢性に分布するが、速筋型のアルカリ軽鎖は筋原線維のA帯に局在することが明らかになった。このような分布の違いは、アルカリ軽鎖の各アイソフォームとミオシン重鎖との親和性の違いを反映するものと考えられる。そこで、アイソフォーム間で一部を入れ替えたキメラcDNAを培養心筋細胞に導入し、ミオシン重鎖との親和性に影響するドメインの決定を試みた。その結果、アルカリ軽鎖を構成する4つのEFハンドドメインのうち第2ドメインにおける15個のアミノ酸が重要であることが判明した。このドメインはミオシン重鎖と直接結合はしないが、本領域におけるアミノ酸の違いがドメインの立体構造や他のドメインとの位置関係に影響して、ミオシン重鎖との親和性に差が生ずるものと考えられた。2)生きた細胞での筋蛋白質の動態蛍光標識した筋型および非筋型アクチンを培養ニワトリ心筋および線維芽細胞に注入し、標識アクチンを取り込んだ筋原線維(MF)とストレスファイバー(SF)をレーザー光でブリーチしたのち、蛍光の回復を調べた。その結果、MFは発育が進むほど蛍光の回復が遅くなり安定していくこと、またMFに非筋型アクチンは入りにくいことが判明した。SFではMFより回復は早く、筋型と非筋型のアクチンの取り込みに差がみられなかった。これは本構造の原始的で未熟な性質を反映しているものと考えられた。1)構造形成におけるアイソフォーム選別と蛋白質相互作用:非筋および速筋型ミオシン軽鎖のキメラcDNAを培養心筋細胞に導入し、蛋白質のどの部分がアイソフォームの選択的集合に重要であるかを調べた。

本来非筋型軽鎖は筋原線維に局在しにくいが、第2EFハンド内の12個のアミノ酸を非筋型から速筋型のものに置換すると筋原線維に組み込まれるようになることから、この部位がミオシン軽鎖アイソフォームの選別に重要であることが判明した。これらのアミノ酸の違いがミオシン重鎖との結合部位の位置関係に影響して両者の親和性に差が生ずることにより、アイソフォームの選択的集合が行われるものと考えられた。培養心筋および線維芽細胞に各タイプの軽鎖cDNAを導入することにより、ミオシン重鎖・軽鎖間の親和性に対する重鎖アイソフォームの影響を調べた。心筋型重鎖に対する軽鎖の親和性は、速筋型>遅筋・心室筋型>遅筋型>非筋型の順に高かったが、非筋型重鎖に対しては速筋型>遅筋型>遅筋・心室筋型>非筋型の順であった。このことから、蛋白質どうしの親和性は双方のアイソフォームに依存することが明らかになった。また速筋型軽鎖はどちらの重鎖に対しても高い親和性を示すことから、このアイソフォームは各種の重鎖に強く結合し速筋に適した機能を遂行するように進化したものと考えられた。2)蛍光蛋白質(GFP)融合筋蛋白質の発現による構造形成動態の解析:ミオシン軽鎖およびトロポニンにGFPを組み込んだcDNAを培養心筋細胞に導入し、発現したGFP融合筋蛋白質の蛍光を高感度顕微鏡カメラでとらえることにより、生きた細胞内での筋蛋白質の動態を観察した。筋蛋白質は発現1日目には細胞質内に瀰漫性に存在するが、その後時間経過とともに筋原線維内の所定の部位に局在するようになった。今後、このような動態を超微細形態レベルでさらに詳細に解析する予定である。1)蛍光蛋白質GFPとの融合筋蛋白質の発現による構造形成の動態の解析速筋型ミオシンアルカリ軽鎖(LC3f)のcDNAとGFPのcDNAとを組み合わせてニワトリ胚心室筋の培養細胞に導入し、発現した融合蛋白質(LC3f-GFP)の動態を蛍光顕微鏡に装着した高感度冷却CCDカメラで解析した。遺伝子の導入から1416時間後では、LC3f-GFPの多くは細胞内に字瀰漫性に分布していたが、一部は筋原線維上に一定の周期で局在していた。その後、同一の細胞を観察し続けた結果、それから約10時間後(遺伝子導入から26時間後)には、LC3f-GFPは筋原線維のA帯に局在するに至った。LC3f-GFP発現初期の細胞に蛍光ファロイジン染色を施し、共焦点レーザー顕微鏡で観察したところ、LC3f-GFPは初期にはZ線付近すなわちA帯の両端に局在することが判明した。これらのことから、ミオシン軽鎖は筋原線維の太いフィラメントの末端部から徐々に組み込まれて行くことが明らかになった。2)構造形成における筋蛋白質アイソフォームの選択的集合心筋型(CTnI)および速筋型トロポニンI(FTnI)の筋原線維への組み込まれ方の差異について、エピトープタグ標識したcDNAを培養心筋および骨格筋細胞に導入することにより調べた。CTnIおよびFTnIはそれぞれ心筋および骨格筋の筋原線維には高い親和性をもって組み込まれるが、FTnIが心筋の筋原線維にもよく組み込まれるのに対して、CTnIは骨格筋の筋原線維にはほとんど組み込まれなかった。両者のキメラcDNAを発現させてみると、TnIの後半部(C末側)がアイソフォーム特有の選択的集合に重要であることが判明した。
人工骨髓の開発・実用化と免疫学の新概念確立に関する研究

最終年度に当たる本年度は、脊椎動物の特徴である骨髄造血系の発生と鰓腸腸管呼吸器の肺呼吸への進化の相関性を人工骨髄器官を用いて骨髄造血巣を原始動物に発生させる実験進化学手法を応用して解明した。これにより骨髄造血系が主役として機能している免疫システムの本態を明らかにし、免疫病の発症の機序を解明し、予防法と治療法を樹立した。この結果、新しい免疫学の概念を樹立することが出来た。原始型の脊椎動物である二種類のサメ、ドチザメとネコザメ及びアホロートル・ゼノプスを陸上げする実験を行い、HLAの発生を解明した前年度に続いて、陸上げを境として白血球の性賞が革命的に変化し、同時に交感神経系と錐体路系が発生することを組織学的に世界に先駆けて検証する事が出来た。これによりこころと精神の発生までも明らかにすることが可能となり、免疫学とこころ・精神の関連性も解明された。本研究により原始型が高等動物の胎児に相当することを異種移植実験により完壁に検証し、ヘッケルの生命反復学説を分子生物学的に検証し、真性生命発生原則として提唱した。また陸上げ実験により、第二革命で鰓〓から発生する肺や胸腺、組織免疫系や交感神経系、臓器の栄養血管系のすべてがLamarckの用不用の法則にもとずいており、この法則が細胞遺伝子の引き金が物理化学的刺激によって引かれる化生(Metaplasia)で起こることを分子生物学的に検証した。これらの成果をBolognaで開かれた第13回国際シンポジウムCramics in Medicineで発表し多大な反響があった。脊椎動物を規定する骨の人工合成物質のヒドロキシアパタイト多孔体を用いて、生体力学刺激により進化で発生する高次組織の骨髄造血巣を、内骨格に軟骨しか持たないサメを用いて筋肉内に発生させる実験進化学手法により脊椎動物の3つの謎、すなわち進化の原因子、免疫システムの発生と骨髄造血系の発生原因のすべてが、重力作用への生命体の力学対応にあることを検証した。これにより新しい免疫病の治せる医学に立脚した正しい免疫学の体系が世界に先がけて樹立された。平成13年2月24日に日本免疫病治療研究会を発足させた。これらの業績を専門の雑誌の他に2001年度に7冊の本にまとめて出版した。年度内に研究を完成させることが出来たことは誠に喜ばしい限りである。骨髄造血のメカニズムの解明は、白血病の治療等の観点から今日緊急課題となっている。一方、治療法の確立していない人類にほぼ特有の免疫病発症の予防と治療の観点から、正しい免疫学の概念の樹立もまた緊急課題となっている。本研究は、実験進化学手法を用いて進化における骨髄造血発生の謎を解明し、これを応用して免疫システムの謎を究明することを目的としている。1997年度の成果を以下に記す。本年度は、電極骨髄チャンバーと哺乳類由来のコラーゲン複合アパタイト骨髄チャンバーを、系統発生を代表する原始脊椎動物と哺乳類に移植して得られた所見に基づいて次の二つの重要な仮説を提示し、これを検証する実験を行った。

1)骨髄造血の発生が、海中動物の浮力に相殺された1/6Gから上陸にともなう1Gへの対応による血圧の上昇に依存し、これが流動電位に変換され、この電位で軟骨細胞の遺伝子が発現して造血・造骨細胞が供役して誘導される。2)この時同時に主要組織適合抗原も誘導される。3)従って重力作用を受ける前の原始脊髄動物(無顎類と軟骨魚類)と両生類・鳥類・哺乳類との間の交換移植術が成立するはずである。実験の結果、サメに電極を入れてもアパタイト多孔体を移植しても、ともに椎軟骨部に脊椎動物特有の骨化と共役した造血巣が認められた。これはヒヨコのものと形態的に区別ができなかった。また、原始脊椎動物相互間との移植はもとより高等動物への移植も成立した。このことから、原始型には主要組織適合抗原の遺伝子(クラスI,クラスII)はあるが遺伝子の発現のない事が明示された。原始動物は胎児の世界と同様に免疫寛容である事が世界にさきがけて検証された。これにより新しい免疫学の概念が樹立され、同時に骨髄造血の謎と進化の機序が解明された。これを日本人工臓器学会に発表するとともに内科学誌「治療」に12回連載にわたりして発表した。また、科学図書ブルーバックスに「生物は重力が進化させた」として出版し大反響となり、NHK総合テレビにも取り上げられるほどの成果が得られた。人工骨髄造血器の実用化研究により、本年度は以下の成果が得られ、実用化の前段階にまで達することが出来た。1)系統発生学の研究から、原始脊椎動物における骨髄造血の起源が、間葉組織のうち腸管周囲組織と筋肉系にあることが明らかとなった。2)原始脊椎動物には主要組織適合抗原(MHC)遺伝子複合体は存在するが、その発現がなく休眠状態であり、従って組織免疫が寛容状態となっている。3)MHCの遺伝子発現の引き金が重力作用にあり、造血が腸管から骨髄に移るときに白血球のMHCが作動してHLAが哺乳類の胎児で発現する。原始型も同様である。4)原始型の生体組織は哺乳類に移植可能であり、移植した組織が骨組み(Scaffald)となってハイブリッド型に哺乳類の組織に置き換わる。このときヒドロキシアパタイト(HA)が血管誘導に重要な働きをする。5)哺乳類の人工骨髄造血巣は筋肉でHAの有無にかかわらず流動電流(10mA)によって間葉系細胞の遺伝子発現の引き金が引かれて誘導される。以上のことから生命体はエネルギーやエネルギー源の物質に対しては開放系であり、力学機能体としては閉鎖系であることが明らかとなった。また同じ遺伝形質のまま、主として力学刺激によって「用不用の法則」に従って遺伝子のスイッチがオン・オフとなって形態と機能が変わることが明らかとなった。同時に脊椎動物の個体発生が系統発生を大筋で反復することが明らかとなり、これらは、主として力学刺激の重力作用等を引き金としており、用不用の法則でコントロールされていることも明らかとなった。これらの成果をまとめて内科月刊誌「治療」に15回連載し、医学会に大きな反響があった。さらに、これを1冊にまとめ「重力対応進化学」として文部大臣の推薦序文を頂き本年度の3月に出版した。来年度にはいよいよ臨床的に実用化の道に入る予定である。本年度は、脊椎動物を、その定義物質である軟骨と骨に着目し、系統発生を遡って原索類のホヤの棘に軟骨を検証し、物証に基づく進化学を世界にさきがけて樹立することが出来た。
幼稚園児から成人における科学概念の獲得と変化に関する研究

本研究では,まず認知心理学・科学哲学・理科教育学より統合的・学際的に理論的研究を行った後,当該領域には例のない地道な実証的研究を行った。初年度には,振り子の運動を題材として,数カ月間,現地に滞在し,幼稚園児の5歳児から88歳の高齢者を対象に,年齢的横断的に調査を行った。その結果,学校理科学習の効果は,30代,40代の大人においても持続的に機能しており,従来考えられた以上に学校理科学習による教育的介入の効果が持続的であることが示された。また,学校理科学習の効果は,単なる科学概念の獲得にとどまらず,メタサイエンスのような科学についての概念の獲得にも影響を及ぼしている可能性が示唆された。次年度には,単純電気回路を題材とし,富山県と佐賀県といったサンプルとされた県内全中学校を対象として単純電気回路の認知に及ぼす文脈依存性に関する調査を行った。その結果,まず,学習者の居住地域や負荷の違いは,単純電気回路の認知に影響を及ぼしているようには見えず,むしろ,学校理科による教育的加入や調査手続が影響していることが示された。つまり,認知研究には調査方法が敏感に効いてくる可能性が示唆されると同時に,今後,認知論的に理科学習を考えていく上で,生得的な要因及び教育的介入のあり方を再考する必要性が確認された。さらに、両年度を通じて,教室という混沌(カオス)の中で現場の先生方と叱咤激励しあいながら共同実践を行った。こうした本研究の成果は,アメリカやイギリスで関連領域の研究者よりレビューを受け,我が国ばかりでなく,世界的にも極めて例の少ない報告としてまとめられた。本年度、本研究では、特定地域を抽出し、幼稚園の五歳児から成人までを対象に物理概念の獲得と変化について学年横断的に調査・研究を行った。幼稚園児のような年少児については、質問紙法による調査ができないため、個人面接法により調査を行わなければならなかった。さらに、成人に対する調査については、何度も現地へ出向き、慎重に調査交渉及び研究組織の確立を行わなければならなかった。そして、研究計画として、物理概念の獲得に関する調査、知的環境に関する調査の二種類の調査項目について調査研究を行った。こうして、特定地域に長期滞在する計画を立案・実行し、詳細に調査を行った結果、次のようなことが明らかになった。(1)幼稚園の五歳児でさえも既に物理事象に関する概念を獲得していて、特定のトピックスにつていは、成人よりも正答率の高いものがあった。(2)多くの課題については、学校理科学習の効果を示すように、学年の上昇に伴い、正答率の上昇し、30代、40代においてもその効果は持続的に機能している。(3)幼稚園から学年が上奏するにつれて、科学概念に関する知的環境における理科教科書の占めるウェートが高くなる。以上の研究実績に基づき,来年度は,他の領域のトピックスについて同様な研究方法により検討する必要があること,そして,同じトピックスを用いて他領域にて調査を行う必要が見いだされた。本年度、本研究では、佐賀県と富山県を抽出し、物理概念の獲得と変化に関する調査を行い、様々な歴史的・社会的制約下での子ども達の科学概念の獲得と変化のプロセスについて検討を行った。先行研究を理論的に再検討し、細心の注意を払い、調査課題を作成し、調査交渉及び研究組織の確立を行い、単純電気回路をトピックスとして、大規模な郵送アンケート調査を行った。その結果、次のようなことが明らかになった。1,先行研究において、安藤らが指摘するように、アンケート調査を行う際には、選択肢あるいは応答カテゴリーの作成において、先行研究の成果に過度に頼ることなく、自ら綿密な手続きを行う必要がある。2,単純電気回路の負荷の違いといった課題文脈の違いによっては各電流モデルの選択率に違いは見られない。

3,佐賀県と富山県といった学習者の居住地域の違いにより、学習者の選択する電流モデルの出現傾向に違いは見られない。4,中学1年、3年といった学習者の学年及び居住地域に関わらず、負荷に関する知識を学習者に提示することが、単純電気回路の認知に影響を及ぼしている。こうした結果より次のようなことが示唆された。Osborneらが見いだした四つの電流モデルが世界中で見いだされていることと併せて考えると、先行研究では、日常経験あるいは学校理科学習の効果を中心に論じられる傾向がある単純電気回路に関する学習者の認知に、生得的な要因が影響している可能性が十分にあると思われる。そして、理科のように、電気やエネルギーといった目に見えない科学概念を獲得していく際には、恐らく教師の提示による知識が、子どもの学習に大きく影響を及ぼすだろう。
流体解析を応用したダウン症児OSASの部位特定と歯科的治療モデルの構築

ダウン症児の睡眠時無呼吸症候群有病率は約50%と定型発達児と比較しても高く、治療方法の早期確立が望まれる。我々は米国スタンフォード大学との共同研究を実施し、ダウン症モデルマウスである、DP16モデルマウスを用いて、気道の流体解析を行い、ダウン症若年者の睡眠時無呼吸症候群の現象解析と、マウス顎骨の形態計測を行い、顎顔面形態の発育異常に関して解析を行った。結果として、DP16モデルマウスはワイルドタイプと比較して、有意に気道通気障害および下顎骨の過成長が見られた。さらに、DP16モデルにおいて脳脊髄液(CSF)のオレキシン/ハイポクレチン濃度を測定して、DP16マウスのサーカディアンリズムを調査した。結果的にDP16マウスは徐波睡眠(SWS)の傾向が減少し、REM睡眠の増加傾向が見られた。これは、睡眠中のアミロイドβタンパク質の排出阻害要因と考えられ、ダウン症の認知症の早期発症の関連因子の可能性が本研究により明らかとなった。また、治験例として、12歳の重度の睡眠時無呼吸症候群を有する、ダウン症男児に対して上顎急速拡大により、睡眠時無呼吸症候群が改善した例を経験した。これは従来の治療法である、アデノイド・口蓋扁桃摘出術を実施しても、OSASの著しい改善がみられず、予後が不良であることが多かったが、本治療法が有用であることを示唆する結果であるとともに、今後の治療法研究に関する展開が期待される。さらに、口腔筋機能訓練(MFT)が困難であるダウン症児に対して舌機能賦活装置を用いて、低位舌を改善する筋機能訓練方法を開発した。初年度はDown症候群児を対象に実際の治験を行い、その結果を第33回日本障害者歯科学会学術大会にて発表し、学術大会優秀発表賞を獲得した。以下はその発表概要である。緒言:我々はOSASを伴うDown症候群児に上気道3次元モデルから呼吸状態を再現する流体シミュレーション(CFD)を用いて通気障害部位を特定し、その部位に作用する上顎側方急速拡大(RME)で症状改善を認めた症例を経験したので報告する。患児:12歳1か月、男児、BMI 21.5kg/m2経過:歯列不正を主訴に受診し、診断の結果、上顎骨劣成長と口腔周囲筋の低緊張による巨舌を認めた。また、問診より睡眠時のいびきや胡座での睡眠態癖を認めたため、睡眠呼吸障害を疑い、耳鼻咽喉科に紹介した。簡易PSG検査よりRDI(respiratory disturbance index)28.6、3% ODI(oxygen desaturation index)24.9と、OSASが疑われた。形態分析から上顎骨劣成長に伴う鼻腔狭窄、アデノイド・口蓋扁桃肥大を認め、また、CFDでは鼻腔およびアデノイドでの通気障害を認めた。保護者はATの希望がなく、歯列不正に対してRMEによる上顎側方拡大のみを行った。拡大後いびき等の自覚症状が軽減され、RDI 6.7、3% ODI 13.3と改善した。形態分析では、咽頭気道形態に明らかな変化は認めなかったが、CFDでは鼻腔部分の最大速度は12.5m/sから5.4m/sに、咽頭気道部の最大陰圧も-173.5Paから-36.6Paに軽減し、通気障害が改善された。考察:本症例では、通気障害が示された鼻腔が、上顎骨側方拡大に伴い拡大され、OSAS症状が改善したと考えられた。またCFDはOSAS原因部位の特定に有効であった。初年度は実際の治験を実施し、実施の閉塞性睡眠時無呼吸症候群(OSAS)を有するDown症候群児に対して、通気障害が示された鼻腔が、上顎骨側方拡大に伴い拡大され、OSAS症状が改善したと考えられたことを証明できた。また流体シミュレーション(CFD)はOSAS原因部位の特定に有効であった。上記の内容は当初の研究計画通りであり、これらの結果を学術大会にて公表し、評価を得ることができた。OSAS障害部位の特定方法および、その歯科的治療法を確立できた点において、研究はおおむね順調に進展しているといえる。また、Down症候群児の保護者に対して睡眠に関するアンケート調査も実施しており、アンケート結果をとりまとめて、今年度以降はその結果を公表することが目標である。研究代表者である佐藤秀夫は、睡眠医学研究のメッカである、米国スタンフォード大学にて2017年7月から2018年3月まで滞在し、同大学、西野精治教授と共同研究を実施した。共同研究内容は、ダウン症モデルマウスである、DP16モデルマウスを用いて、気道の流体解析を行い、ダウン症若年者の睡眠時無呼吸症候群の現象解析と、マウス顎骨の形態計測を行い、顎顔面形態の発育異常に関して解析を行った。

また、治験例として、12歳の重度の睡眠時無呼吸症候群を有する、ダウン症男児に対して上顎急速拡大により、睡眠時無呼吸症候群が改善した例を経験した。これは従来の治療法である、アデノイド・口蓋扁桃摘出術を実施しても、OSASの著しい改善がみられず、予後が不良であることが多かったが、本治療法が有用であることを示唆する結果であるとともに、今後の治療法研究に関する展開が期待される。ダウン症の睡眠時無呼吸症候群に関する、流体解析分析が終了しており、さらに米国スタンフォード大学との共同研究により、ダウン症のアルツハイマー型認知症の早期発症の原因として睡眠時無呼吸症候群を含む睡眠関連疾患との因果関係について、徐々に明らかになっており、本研究テーマである、ダウン症児OSASの早期改善が、認知症予防になる可能性を示唆することができた。ダウン症児の睡眠時無呼吸症候群有病率は約50%と定型発達児と比較しても高く、治療方法の早期確立が望まれる。我々は米国スタンフォード大学との共同研究を実施し、ダウン症モデルマウスである、DP16モデルマウスを用いて、気道の流体解析を行い、ダウン症若年者の睡眠時無呼吸症候群の現象解析と、マウス顎骨の形態計測を行い、顎顔面形態の発育異常に関して解析を行った。結果として、DP16モデルマウスはワイルドタイプと比較して、有意に気道通気障害および下顎骨の過成長が見られた。さらに、DP16モデルにおいて脳脊髄液(CSF)のオレキシン/ハイポクレチン濃度を測定して、DP16マウスのサーカディアンリズムを調査した。結果的にDP16マウスは徐波睡眠(SWS)の傾向が減少し、REM睡眠の増加傾向が見られた。これは、睡眠中のアミロイドβタンパク質の排出阻害要因と考えられ、ダウン症の認知症の早期発症の関連因子の可能性が本研究により明らかとなった。さらに、口腔筋機能訓練(MFT)が困難であるダウン症児に対して舌機能賦活装置を用いて、低位舌を改善する筋機能訓練方法を開発した。今後はDown症候群児の閉塞性睡眠時無呼吸症候群(OSAS)に関する疫学調査により実態の把握と、有効な診断・治療法の確立が目標である。現在、保護者に対して睡眠に関するアンケート調査も実施しており、アンケート結果をとりまとめて、今年度以降はその結果を公表予定である。また、CTデータを用いて、アデノイド、口蓋扁桃肥大と鼻腔通気障害の程度、そして顎顔面形態の関係性を明らかにする研究を実施しており、疫学調査、治験の両面から本研究を推進する予定である。ダウン症児OSASを改善する目的で、口腔筋機能療法、上顎急速拡大、下顎前方誘導装置などの歯科的治療法の開発と治験を実施するとともに、ダウン症OSASの予後に関しての研究を推進してきた。今後は、歯科的治療法とくに、口腔筋機能療法に関する新たな手法の開発と、口腔内装置との併用療法に関しての方策に関する研究を推進する予定である。研究は概ね予定通りに進捗した。進捗状況の中で、当初予定していた実験が、平成29年度に実施するのが望ましいと判断したため、一部予算を繰り越すことで、今後の研究がスムーズに展開するように図った。前年度からの研究が順調に進展し、計画が進行している。
ウシ黄体内局所調節因子としてのプロラクチンとステロイドホルモンに関する研究

【目的】多くの哺乳動物において、黄体は様々な生理活性物質を合成分泌し、これらの物質によって黄体の機能が局所的に制御されている可能性が示されているが、ウシ黄体におけるエストロジェン(E)の作用は完全には明らかにされていない。本研究では、ウシ黄体におけるEの生理的役割を明らかにする目的で、以下の実験を実施した。【方法】1)発情周期各期のウシ黄体におけるERs(ERα,ERβ)タンパク発現量及びERα/ERβ比をウエスタンブロット法(WB)により調べた。2)中期黄体細胞に,PGF2α(10^<-8>-10^<-6>M)または腫瘍壊死因子(TNFα;0.0145-1.45nM)及びインターフェロンγ(IFNγ;0.0125-1.25nM)を添加し24時間培養後、ERs mRNA及びERsタンパク発現をRT-PCRおよびWBにより検討した。【結果及び考察】1)ERαタンパク発現は初期及び中期において高く、ERβ/ERα比は退行期において高かった。2)TNFαは黄体細胞のERα及びERβmRNA発現を抑制し、IFNγはERβmRNA発現及びERβ/ERαmRNA比を抑制した。以上より、EはERαを介して黄体機能の維持に関与し、ERβを介して黄体退行に関与している可能性が考えられる。また、TNFαならびにIFNγは黄体細胞のERβ/ERα発現量の比を減少させることにより黄体機能の維持に役割を果たしている可能性が示唆された。【目的】プロラクチン(PRL)は、主に下垂体前葉において産生されるが、ヒト卵巣においてPRLの合成分泌されることが報告されており、卵巣がPRL産生源の一つであることが示唆されている。また、げっ歯類においてPRLは主要な黄体機能維持因子として知られているが、ウシ黄体におけるPRLの生理的役割は全く明らかにされていない。本研究ではウシ黄体におけるPRL産生ならびに生理的役割を明らかにする目的で、以下の項目について検討を行った。【研究項目および方法】1)ウシ黄体を初期(排卵後2-3日)、中期(排卵後8-12日)、後期(排卵後15-17日)および退行期(排卵後19-21)に分類し、組織におけるPRL、long PRLR(l-PRLR)ならびにshort PRLR(s-PRLR)mRNA発現量の変化を半定量的RT-PCRにより解析した。2)初期、中期および退行期の黄体におけるPRLタンパク発現の局在を免疫組織化学法により検討した。3)培養中期黄体細胞にPRL(100、200ng/ml)を添加し、P4ならびにPGF2α濃度をEIAにより測定した。【結果】1)ウシ黄体においてPRL、l-PRLRおよびs-PRLR mRNAは発情周期を通じて認められた。また、PRL mRNA発現量およびs-PRLR mRNA発現量に対するl-PRLR mRNA発現量の比は、退行期において他の周期と比較して低かった。2)黄体組織におけるPRLタンパク発現は中期および退行において認められ、血管内皮細胞および平滑筋細胞に局在していることが明らかとなった。3)黄体細胞のP4およびPGF2α分泌に及ぼすPRLの影響は認められなかった。以上より、ウシ黄体はPRL産生源の一つであることが示された。【目的】我々はestradiol 17β(E)が卵胞だけでなく,ウシ黄体においても産生されることを報告した。ラット及びブタの黄体においてprostaglandin F2α(PGF)がE合成酵素(aromatase : arom)及びE receptor(ER)発現を調節することが知られているが,ウシ黄体おけるE産生調節機構ならびにER発現調節機構は明らかにされていない。本研究では,E産生能ならびにER発現の調節機構を解明する目的で,以下の研究を行った。【方法】1)発情周期各期のウシ黄体におけるERs(ERα,ERβ)タンパク発現量及びERα/ERβ比をWestern blot法により調べた。2)中期黄体細胞に,PGF(10^<-8>-10^<-6>M)を添加し24時間培養後,ERs及びarom mRNA発現をRT-PCRにより検討した。3)黄体細胞にPGF(10^<-6>M)を添加し2-24時間培養後,ERs及びarom mRNA発現をRT-PCRにより検討した。【結果および考察】1)発情周期を通じたERβタンパク発現量の有意な変化は認められなかったが,ERαタンパク発現及びERα/ERβ比は退行期において他の周期と比較して有意に低かった。2)ERs及びarom mRNA発現はPGFにより減少した。3)PGFは24時間の培養において黄体細胞のERαならびにarom mRNA発現を抑制し,6時間以降の培養においてERβmRNA発現を抑制した。以上の結果から,PGFがウシ黄体におけるE産生能及びER発現調節因子の一つである可能性が示された。また,初期から後期にかけてERα/ERβ比の高いことからERαが黄体機能維持に関与している可能性が考えられる。この成果は、日本繁殖生物学会(平成18年9月,名古屋)において発表するとともに、現在、生殖科学の専門誌に投稿するための準備中である。【目的】

多くの哺乳動物において、黄体は様々な生理活性物質を合成分泌し、これらの物質によって黄体の機能が局所的に制御されている可能性が示されているが、ウシ黄体におけるエストロジェン(E)の作用は完全には明らかにされていない。本研究では、ウシ黄体におけるEの生理的役割を明らかにする目的で、以下の実験を実施した。【方法】1)発情周期各期のウシ黄体におけるERs(ERα,ERβ)タンパク発現量及びERα/ERβ比をウエスタンブロット法(WB)により調べた。2)中期黄体細胞に,PGF2α(10^<-8>-10^<-6>M)または腫瘍壊死因子(TNFα;0.0145-1.45nM)及びインターフェロンγ(IFNγ;0.0125-1.25nM)を添加し24時間培養後、ERs mRNA及びERsタンパク発現をRT-PCRおよびWBにより検討した。【結果及び考察】1)ERαタンパク発現は初期及び中期において高く、ERβ/ERα比は退行期において高かった。2)TNFαは黄体細胞のERα及びERβmRNA発現を抑制し、IFNγはERβmRNA発現及びERβ/ERαmRNA比を抑制した。以上より、EはERαを介して黄体機能の維持に関与し、ERβを介して黄体退行に関与している可能性が考えられる。また、TNFαならびにIFNγは黄体細胞のERβ/ERα発現量の比を減少させることにより黄体機能の維持に役割を果たしている可能性が示唆された。
新規細胞系樹立による放射線ＤＮＡ損傷修復経路と突然変異の関係解明

放射線で生じるDNA二重鎖切断(DSB)の主要な2つのDSB修復系路(相同組換えと非相同末端結合)を中心に、DSB修復過程と突然変異や遺伝的不安定性を直接的に関連づけて解析するために、時間と部位を制御してゲノムDNAにDSBが導入でき、その修復効率や精度と突然変異誘発を解析できる新たな視点に立った細胞系を樹立した。また、配列特異的人工ヌクレアーゼにより内在ゲノムに部位特異的DSBを導入する突然変異実験系を樹立して解析した結果、DSB修復の効率と質はそれぞれ異なる修復経路に依存することや、N末変異NBS1タンパク質の発現が遺伝的安定性を変えることなく放射線感受性を上昇させることなどを発見した。本課題は、Nbs1やKu70がそれぞれ制御するクラシカルな2つのDNA二重鎖切断(DSB)修復系路(相同組換え:HRと非相同末端結合:NHEJ)を中心に、放射線被ばくによって引き起こされたDSBの修復過程と突然変異や遺伝的不安定性の誘導を直接的に関連づけて解析可能にすることを目的としている。その目的を達成するために、分子生物学・細胞工学的手法を用いて、内在ゲノムDNAへの時間・部位特異的なDSB導入による新規の突然変異実験系を樹立し、細胞周期進行などに伴うDSB修復機構の変化から、突然変異の頻度やスペクトルまでを包括的に解析することを具体的計画としている。震災を受けての課題再構成初年度となった平成24年度は、震災で被害を受けたものの、維持または再建できた細胞実験系を活用して、あらためて確実に実験データを収集するととも,に、新たな部位特異的DNA二重鎖切断による突然変異実験系の樹立を進めた。本課題の主要な細胞系である時間・部位特異的DSBによる相同組換え修復系については、ほぼデータ取得が完了したので、最終的に論文としてまとめる作業に取りかかっている。また、一般に主要とされるHRとNHEJという2つのDSB修復機構の中心となる制御タンパクNbs1とKu70をダブルノックアウトした細胞の解析も終盤となっており、次年度にはまとめに入る予定である。一方で、内在ゲノムの部位特異なDSBによる突然変異実験系については、当初から使用してきた独自の突然変異高感度検出系の細胞では、バックグラウンドの突然変異がかえって解析の障害となることが判明したので、年度終盤からは別の細胞系で樹立を目指すことに変更し、細胞の準備に取りかかったところである。本課題は、Nbs1やKu70がそれぞれ制御する2つのDNA二重鎖切断(DSB)修復系路(相同組換え:HRと非相同末端結合:NHEJ)を中心に、放射線被ばくによって引き起こされたDSBの修復過程と突然変異や遺伝的不安定性の誘導を直接的に関連づけて解析可能にすることを目的としている。平成25年度は、内在ゲノムを標的とする新たな部位特異的DNA二重鎖切断による突然変異実験系の樹立を進めたが、十分なタンパク発現をする細胞が得られなかったため、最終的に有効な細胞系の樹立には至っていない。そのため、あらたな酵素系での検討にとりかかった。本課題の主要な細胞系である時間・部位特異的DSBによる相同組換え修復系についても論文の受理には至っていないので、データを追加する作業を続けている。一方で、NBS1タンパク質の機能制御部位と放射線感受性ならびに突然変異との関係の解析については、論文を国際学術雑誌に公表することができた。また、DSB修復機構の中心となる制御タンパクNbs1とKu70をダブルノックアウトした細胞の解析についてもコメット解析での確認を残すところまできている。平成26年度は、内在ゲノムを標的とするジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)を用いた新たな部位特異的DNA二重鎖切断による突然変異実験系について、アプローチを変えながら実験系を樹立することに主眼をおいた。その結果、これまでと違う細胞系に変えることで、時間制御はできないものの、有効なデータが取得できるシステムを組み上げることができた。最終年度の平成27年度中には、平成26年度の解析結果を論文として公表を目指したいと考えている。また、新たなゲノム編集酵素系についてもテストし、こちらも有効に動くことが確認できたが、効率にはあまり差がなかった。一方、本課題のもうひとつの主要な細胞系である時間・部位特異的DSBによる相同組換え修復系については、まだ論文の受理には至っていないので、データを追加する作業を継続している。

なお、DSB修復機構の中心となる制御タンパクNbs1とKu70をダブルノックアウトした細胞の解析についても論文としてまとめるべく、裏付けデータの取得を続けている。本課題は、Nbs1やKu70がそれぞれ制御する2つのDNA二重鎖切断(DSB)修復系路(相同組換えと非相同末端結合)を中心に、放射線被ばくによって引き起こされたDSBの修復過程と突然変異や遺伝的不安定性の誘導を直接的に関連づけて解析可能にすることを目的としている。その目的を達成するために、分子生物学・細胞工学的手法を用いて、内在ゲノムDNAへの時間・部位特異的なDSB導入による新規の突然変異実験系を樹立し、細胞周期進行などに伴うDSB修復機構の変化から、突然変異の頻度やスペクトルまでを包括的に解析することを具体的計画とした。平成27年度は、時間制御まではできなかったものの、本研究課題で樹立した内在ゲノムDNAを標的とするジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)による部位特異的DSBで誘発される突然変異実験系を用いて、修復機構に欠損を持つ細胞における突然変異の出現頻度と変異スペクトルに関する比較解析に取り組んだ。その結果、遺伝子突然変異を引き起こす主要なDNA損傷修復機構に加え、その鍵となる過程に関する新たな知見が得られ、DSBから突然変異に至る全容の解明に大きく近づくことができ、国際放射線科学会議(ICRR2015)および国際マイクロビームワークショップ(IWM2015)で発表した。一方、本課題のもうひとつの主要な細胞系である時間・部位特異的DSBによる相同組換え修復系については、昨年度までに得られた成果をまとめて国際放射線科学会議(ICRR2015)で発表するとともに、修復を制御する損傷応答シグナルとの関連を引き続き解析している。放射線で生じるDNA二重鎖切断(DSB)の主要な2つのDSB修復系路(相同組換えと非相同末端結合)を中心に、DSB修復過程と突然変異や遺伝的不安定性を直接的に関連づけて解析するために、時間と部位を制御してゲノムDNAにDSBが導入でき、その修復効率や精度と突然変異誘発を解析できる新たな視点に立った細胞系を樹立した。また、配列特異的人工ヌクレアーゼにより内在ゲノムに部位特異的DSBを導入する突然変異実験系を樹立して解析した結果、DSB修復の効率と質はそれぞれ異なる修復経路に依存することや、N末変異NBS1タンパク質の発現が遺伝的安定性を変えることなく放射線感受性を上昇させることなどを発見した。本課題の主要な部分である、時間・部位特異的DSBによる相同組換え修復系について論文公表に至っていないことについて若干の遅れがある。その一方で、内在遺伝子を標的とする部位特異的なDSBによる突然変異実験系については論文にまとめられるだけのデータが取得できた。これらを合わせて判断すると、若干の遅れがあるものの、平成27年度までに当初目標には到達できるものと考えている。27年度が最終年度であるため、記入しない。放射線生物学内在ゲノムDNAに対するZFNを用いた部位特異的損傷導入系については、最低限の目標としていた実験システムは樹立できたので、さらにベクターを改変して、少しでも調節性能を高めた系に変えたいと考えている。平成27年度は最終年度のため、成果の公表にも活動の重点をおき、最終的に論文として出すことを目指したいと考えている。
ハイブリッド型Bayes統計の展開

Bayes法は1970年代に大きく転換した。そしてその後の進展はすさまじい。この転換を要求側から促した流れが,低次元モデルの利用から高次元モデルの利用への転換にある。低次元モデルを用いた職人芸から,論理に忠実な解析への転換である。供給側からの流れは,計算機器と機能向上と計算技術の進歩にある。特に計算技術の進歩は目に見えやすいことから,多くの研究がなされている。ところが,研究の進展の中で大きな混乱も見られる。論理に対して忠実であるよりも,コンピュータの貢献が優先すると考える研究者がいるからである。本研究では,推論に役立つBayes理論の進展を目指して初期の目標を達成した。先ずターゲットして,共役事前分布と一般化線型モデルの共通性を追求することを挙げた。一見制約的な条件の下に実際的な手法の提案をすることにある。理論を重視することにより,他の成果との関連が明確になるので研究結果に蓄積が効く。その結果,提案するモデルがより信頼できるものになる。研究遂行の切り口として,用いる特殊関数と近似法の範囲を拡げることがある。実際これまでの研究でも特殊関数の利用より周辺分布の表現により推論を容易にすることが出来た実用的なモデルである,指数分布族の属する誤差項を持つ一般化線形モデルがかなり解明できた。当初は,見通しの利かない面があったが,研究期間の終盤になって大きく進展できた。更に,また形にはなっていないが,長い間気がかりであったBayes因子に対抗する新しい提案の着想が纏まってきた。母数の推定については,規準が簡明であるので研究は進みやすいが検定の問題が絡むと壁に当たりやすい。しかし,この研究では,推定を予測として把えていたので,予測の延長として検定を把えることが出来た。一般化線型モデルにおいて多くの層がある場合を考えている。このモデルでは通常は回帰係数に主な関心があり、各層独自の母数には格段の関心をもたない。こうしたモデルではしばしば各層別の母数は邪魔物変数として興味の対象外とすることが多い。しかし当然ある程度の関心は払われる。考えるモデルでは各層に層別母数α_kとそうに共通な母数βを含む。前者に共役事前分布を仮定する。ここでポイントは重要な母数βには事前分布を仮定していないことである。従ってBayes法と尤度法をハイブリッド型で利用する必要がある。この接近法で、新しい推定方式の構築を試みている。一般化線型モデルの基礎とBayes法での共役解析の基礎との間に、直観的に感じられる、著しい対応があることにある。この点に着目して研究を行いつつある。まず、解析的な接近が可能な場合を取り扱う。このためには、周辺密度が特殊関数で表現できる場合が初めの目標となる。この接近法は期待通りにその適用範囲が広そうであることが確認できた。最も期待できるのは、多重2x2モデルの場合である。他にも誤差関数がべき乗分散関数をもつ指数分布族に含まれる場合であり、これにはポアソン分布・ガンマ分布が含まれる。理論的な議論の展開に加えて、より実践的な結果を得るためにシミュレーションを行いその性能を調べた。大西は、年度終わりよりオーストラリアに滞在して、降雨を初めとした実データに即した研究を推進している。研究は順調に進行して逐次研究メモ・口頭発表を行っている。更により具体的に目に見える成果を上げる努力をしている。ターゲットとして、共役事前分布と一般化線型モデルの共通性を追求することを挙げた。これは、一見制約的な条件の下に実際的な手法の提案をすることにある。

理論を重視することにより、他の成果との関連が明確になるので研究結果に蓄積が効く。その結果、提案するモデルがより信頼できるものになる。研究遂行の切り口として、用いる特殊関数と近似法の範囲を拡げることがある。実際これまでの研究でも特殊関数の利用より周辺分布の表現により推論を容易にすることが出来た実用的なモデルである、指数分布族の属する誤差項を持つ一般化線形モデルがかなり解明できた。本研究の当初は、見通しの利かない面があったが、本年度になって大きく進展できた。研究の途中から中央大学で研究を続行することになり、ある種の刺激を得ることが出来た点がある。また、院生の協力を得ることが出来た。その結果、ガンマ回帰モデルでのhybrid型ベイズモデルを実装することができた。これは、これまでに研究してきたロジットモデルを拡張する内容となった。ガンマ回帰モデルの方が理論的にも扱い易く、しかも既存の手法が貧弱であることからその成果が実用化されることが期待される。更に、また形にはなっていないが、長い間気がかりであったBayes因子に対抗する新しい提案の着想が纏まってきた。この着想は、ベイズ手法の根幹にも係わるもので、本研究の構想の副産物である。母数の推定については、規準が簡明であるので研究は進みやすいが検定の問題が絡むと壁に当たりやすい。本研究では、推定を予測として把えていたので、予測の延長として検定を把えることが出来た。その結果、Lindley paradoxとして指摘されていたベイズモデルでの周辺尤度の利用の限界を指摘することが出来た。このことは逆に見ると、KL分離度を評価関数とする我々の接近方法の妥当性を示唆している。
濃度勾配コラーゲンゲルによる関節軟骨欠損修復に関する研究

関節軟骨の全層欠損を修復するため用いられるコラーゲンの足場について家兎を用いて実験を行った。濃度勾配を有するラーゲンの足場が、骨髄由来の未分化間葉系細胞の総員能力の違いについて差があるか否かを検討するため、濃度勾配の異なる2種類のコラーゲンを作成し家兎の膝関節内の軟骨欠損部位に埋入した。結果として33%の濃度勾配を有するコラーゲンが最も細胞動員が良好で、組織学的なスコアも他のものに比べて優位に良好であった。本年度の研究では先ず濃度勾配コラーゲン円柱を作成した.0.18%、0.24%、0.28%の3種類の濃度勾配コラーゲン円柱を作成し、走査顕微鏡でそのコラーゲンネットワークを観察・比較した.結果、濃度の異なる3種類の濃度勾配コラーゲン円柱は、明らかにコラーゲンネットワークの密度が異なっていた.また、その境界部は明瞭に識別されており、我々の仮定に一致した濃度勾配コラーゲン円柱が作成されたことが確認された.第二段階では本来、全く修復されない5mm径の軟骨欠損を実験用家禽に作成し、濃度の異なる3種類の濃度勾配コラーゲン円柱を挿入した.挿入後、8週まで定期的に観察したところ0.24%濃度勾配コラーゲン円柱を挿入した群は、組織学的に良好な軟骨を形成していた.組織学的スコアーリングも他の濃度勾配コラーゲン円柱を挿入した群に比べて有為に良好であった.実験の第三段階では細胞動態マーカーや軟骨機能マーカーを用いた組織化学的手法で、細胞動員や細胞増殖能を評価する予定で、現在進行中である.これまでの細胞動態マーカーの研究では当初の我々の仮説に一致して、濃度勾配コラーゲン円柱の中心部に未分化間葉系細胞が動員されており、軟骨の修復程度に一致して、0.24%濃度勾配コラーゲン円柱で最も良好な細胞動員を認めた.現在、in vitroでの細胞動員をシミュレートすべく培養細胞でのin vitro濃度勾配未分化間葉系細胞動員システム作成中であるが、未だ有効な濃度勾配の決定には至っていない.今回の実験の目的は,軟骨欠損部中央に有効に増殖細胞(骨髄間葉系幹細胞)を誘導するために,新しい濃度勾配を有するコラーゲンゲルを作成し,軟骨全層欠損の修復に対する有用性を検討する事とした。約13週齢の日本白色家兎を使用して,大腿骨膝蓋窩に直径5mm,深さ5mmの全層欠損を作成し,コラーゲンは0.3%のtype1コラーゲンを用いた。任意の濃度でゲル化させ,0.18%のコラーゲンゲルの中心上方部に0.24%コラーゲンゲルを挿入し,33%濃度勾配コラーゲンゲル(33%勾配群)を作成した。同様の方法で中心部に0.27%コラーゲンを挿入して50%濃度勾配コラーゲンゲル(50%勾配群)も作成し,さらに対照群として,勾配のない0.18%コラーゲンゲルを移植するコントロール群も作成した。この3群のコラーゲンをランドマイズドに先ほどの全層欠損に移植し,手術後1週,2週,3週,4週,8週,12週目に屠殺した。評価はBrdU陽性細胞数を欠損部の中心と辺縁とで比較し,トルイジンブルー染色で再生組織のスコアリングを行い,またtype1,type2collagenの免疫染色も行った。さらにIn-vitro studyとして,濃度勾配差に対する骨髄間葉系幹細胞の遊走性をTranswe11を用いて検証した。結果は33%勾配群において,欠損部の中心部で増殖細胞が多く観察され中心部への細胞誘導効果が認められた。とくに術後2週目で有意差をもって欠損中心部に多くの増殖細胞を誘導することに成功した。また組織学的評価では33%勾配群で術後4週,8週で組織学的に優れた軟骨修復が得られた。In-vitroにおけるコラーゲンの濃度差に対する骨髄間葉系幹細胞の遊走性においても,適切な濃度差が存在することが判明した。濃度勾配を有するコラーゲンは欠損部中心への増殖細胞の誘導能を有し,関節軟骨再生への臨床的有用性が示された。今回の実験では、前回報告した濃度勾配コラーゲンによって軟骨欠損部中央に集められた増殖細胞(骨髄間葉系幹細胞)に対してBMP-2を投与し、効率よく軟骨へ分化誘導させるための至適な投与タイミングを検討する事とした。日本白色家兎を使用して、大腿骨膝蓋窩に直径5mm、深さ5mmの全層欠損を作成し、前回報告した33%濃度勾配コラーゲンゲル(CG gel)を作成し、全ての膝に移植した。BMP-2をmini osmotic pumpを用いて1週間持続的に1.12μg/週を投与した。以下の4群で実験を行った。