hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
英語学習者の自律性を高めるためのブレンド型学習システムの運用とその評価

本研究では、1年目から2年目にかけて、学習支援システム(LMS)を使用したオンライン上の学習と教室における学習を組み合わせたブレンド型英語学習環境を構築した。最終年度には、ブレンド型学習によって学習者の自律性の伸長が、どのようにして実現され得るかを、それまでの実践における学生対象のアンケートや面談調査等の結果から明らかにした。学生を対象としたアンケートの結果からは、学生達は、LMSを使用した学習に対して、学習方法のレパートリーが増え、内容を高く評価したという点で、概ね肯定的な意見を持っていることがわかった。その一方で、LMSをブレンド型学習において利用する際の課題も明らかになった。具体的には、学習コンテンツ開発と、LMSの利用方法に関する課題であった。本研究においてLMSは、個別学習とその記録の目的で使用した。そのため、インターネット上の良質な無料動画サイト(TED Talks等)に関連した教材や、独自の動画や音声教材をLMS上で共有した。しかし、約4割の学生たちは、本ブレンド型学習で大きな役割をしめていた、グループ学習としての国際交流において、そのような教材は有用ではなかったと否定的な感想を示した。結果として、課題克服のためには、国際交流における言語コミュニケーションの構成要素を特定した上で、構成要素に基づいたより洗練された教材の開発が必要であることが明らかになった。さらに、学習者の自律のためには、個別性よりもむしろ、学習者間や言語使用者間の相互依存的な関係性がより重要であると考えられる。本研究においてLMSは、個別学習の目的のみで利用するように設計されていたが、個別学習のみならず、協働学習の目的でもLMSを利用できるような学習設計が今後は重要であろう。今後も実証研究を通して、学習プログラムが学習者の自律性の伸長に与える影響をさらに明らかにしていく予定である。本研究は、英語学習者の自律性を高めるため、LMS(Learning Management System)を利用した英語学習システムを構築し、1オンラインとオフライン、個別学習とグループ学習を組み合わせたブレンド型英語学習環境を構築するとともに、2これを利用した学習を通してその有用性を明らかにし、3当該システムおよびこれを利用したブレンド型英語学習における学習者の自律性への質・量的な影響を明らかにすることを目的とする。平成28年度の研究実施計画としては、ブレンド型学習システム環境を整え、学生の自学の質や量に関するデータを収集する目的で、「学生の自律性を高めるためのブレンド型学習システムの構築」を目指した。その結果限定的ではあるが、研究を遂行することができた。まず、これまでの取り組みの考察の一部を、「Evaluation of a Course Comprised of International Exchange Meetings in a Japanese EFL Engineering Program Context: A Case Study」と題する論文としてまとめ、公表した。本論文では、国際交流の学生への効果やその評価方法について考察し、研究手法という観点からも今後の研究の発展に役立てる示唆を得ることができた。さらに、複数の学会で、本研究に関連した内容の発表を行うことができた。さらに、ネイティブ英会話話者の教師を交えた少人数英会話セッションや、海外からの短期留学生たちや地元の佐世保米軍基地の初等中等教育学校との交流を行いながら、グループワークなどの協働学習を推し進めた。また、LMSを用いた学生による学習の振り返り(自己評価)を行うと同時に、学生たちの相互評価(ピアアセスメント)も行い、英語学習に関するメタ認知力を養いながら、自律学習へのトレーニングを行った。平成28年度の研究実施計画においては、「LMS(Learning Management System)の運用」と「教材開発」の2つの点に焦点を絞り研究を行うこととしていた。ところが、平成28年度に入り、それまで継続して運用を予定されていた、LMSのBlackboardから別のLMSに変更するという可能性が高専機構から示されることとなり、決定まで研究実施が保留になるという事態に直面した。その後幸い、Blackboardの継続使用が決定されたが、それまでの期間、別のLMSに移行した場合の対応などを考慮しなければならないことになり、研究実施に影響を与えることとなった。ただし、それ以外の研究項目としての、海外からの短期留学生たちや地元の佐世保米軍基地の初等中等教育学校との交流におけるプレゼンテーションの実施や、協同学習の推進、並びに、これらの活動を通した自己評価によるメタ認知力の養成に関しては、予定通り行うことができた。平成28年度に継続して、平成29年度はブレンド型学習システムを整え、学生の自学の質や量に関するデータを収集する目的で、「学生の自律性を高めるためのブレンド型学習システムの構築」に取り組んだ。これまでに継続して行ってきたネイティブ英会話話者の教師を交えた少人数英会話セッションや、海外からの短期留学生たちや地元の佐世保米軍基地の初等中等教育学校との交流を通した協働学習、さらに学習者による英語力の自己評価と学生たちの相互評価(ピアアセスメント)を通した、自律学習に必要とされる学習に関するメタ認知力の涵養に加え、29年度は、LMSのBlackboard上における個別学習を促進した。その結果、オンラインとオフラインにおける個別学習とグループ学習を組み合わせたブレンド型英語学習が可能になった。

さらに、構築したシステムの有用性を評価するために、学生対象のアンケート(多肢選択式)と、学生による自身の学習の振り返りや自己評価を実施し、それに加えて、Blackboard使用データを蓄積することで、データ収集も進めた。今年度の取り組みは昨年度と同様、複数の学会で発表を行い、研究成果を公表することができた。平成29年度は、前年度まで交流を行っていたシンガポールからの短期留学生との交流が中断されるという想定外の出来事が起こったため、当初の予定を少し変更することを余儀なくされた。しかし、それ以外の研究項目としての、中国からの短期留学生たちや地元の佐世保米軍基地の初等中等教育学校との交流におけるプレゼンテーションの実施や、協同学習の推進、並びに、これらの活動を通した自己評価によるメタ認知力の養成に関しては、予定通り行うことができた。さらに、ブレンド型学習を促進するため、平成28年度に十分に行うことのできなかった「LMS(Learning Management System)の運用」と「教材開発」を進めることができた。具体的には、教員によって準備された独自の教材を作成しLMS上にアップすると同時に、無料で使用できるインターネット上の良質な教材にリンクをはり、学生達がLMS上からアクセスできるように整えた。さらに、学生が自身の学習を振り返るための学習ダイアリーをLMS上に設け使用することで、自律学習を促進する環境を整備した。本研究では、1年目から2年目にかけて、学習支援システム(LMS)を使用したオンライン上の学習と教室における学習を組み合わせたブレンド型英語学習環境を構築した。最終年度には、ブレンド型学習によって学習者の自律性の伸長が、どのようにして実現され得るかを、それまでの実践における学生対象のアンケートや面談調査等の結果から明らかにした。学生を対象としたアンケートの結果からは、学生達は、LMSを使用した学習に対して、学習方法のレパートリーが増え、内容を高く評価したという点で、概ね肯定的な意見を持っていることがわかった。その一方で、LMSをブレンド型学習において利用する際の課題も明らかになった。具体的には、学習コンテンツ開発と、LMSの利用方法に関する課題であった。本研究においてLMSは、個別学習とその記録の目的で使用した。そのため、インターネット上の良質な無料動画サイト(TED Talks等)に関連した教材や、独自の動画や音声教材をLMS上で共有した。しかし、約4割の学生たちは、本ブレンド型学習で大きな役割をしめていた、グループ学習としての国際交流において、そのような教材は有用ではなかったと否定的な感想を示した。結果として、課題克服のためには、国際交流における言語コミュニケーションの構成要素を特定した上で、構成要素に基づいたより洗練された教材の開発が必要であることが明らかになった。
3次元複合建築壁体に生じる熱・水分応力の境界要素解析に関する研究

建築壁体の耐久性向上は、地球温暖化防止にも大きな貢献が期待できる重要な研究課題であって、熱・水分性能設計とは密接な関連があり、長周期の熱・水分同時移動性状を考慮した、弾・塑性場の柔軟かつ強力な数値予測法が必須の検討手段となる。多次元建築複合壁体の空気移動を伴う熱・水分性能の数値予測に関しては、近年いくつかの報告があるが、これを応力場の予測と連成させて、建築壁体の耐久性能予測への応用を試みる研究は、殆ど行われていない。ここでは、建築材料の弾・塑性性状を考慮できる、3次元複合壁体に対する熱・水分応力のDR境界要素解析法(DRはDual Reciprocityの略である)を開発し、その予測精度と適用限界を明らかにすることを目的として研究を行ない、以下の成果を得た。1)前年度に得た成果を用いて、熱・水分弾・塑性応力問題の2次元汎用解析法を試作した。また、汎用化と利便性向上のための計算コード改良も併せて行なった。2)2次元非線形熱・水分同時移動のDR境界要素解析法を開発し、2次元計算体系全体の境界型解法として構築を試み、計算結果の基礎的な検証を行なった。3)熱・水分弾・塑性応力の構成関係モデルを組み込んだ、3次元熱・水分弾・塑性応力問題のDR境界要素解析法を、前年度に得た成果を基に試作し、計算結果の基礎的な検証を行なった。4)近年劣化が激しく、効果的な熱・水分性能改修が強く求められている、北米での煉瓦壁体を検討事例として、断熱材や防水層の貼付形状が、その熱・水分応力性状に与える影響を比較し、耐久性向上に効果のある改修法を探った。なお、3次元非線形熱・水分同時移動のDR境界要素解析法の開発も並行して進め、基本ルーチンを検証し、計算結果の基礎的な検証は行ったが、3次元計算体系全体の汎用性の高い境界型解法として構築は未だ十分に完了しておらず、今後の継続的に開発する予定である。建築壁体の耐久性向上は,地球温暖化防止にも大きな貢献が期待できる重要な研究課題であって,熱・水分性能設計とは密接な関連があり,長周期の熱・水分同時移動性状を考慮した,弾・塑性場の柔軟かつ強力な数値予測法が必須の検討手段となる.多次元建築複合壁体の空気移動を伴う熱・水分性能の数値予測に関しては,近年いくつかの報告があるが,これを応力場の予測と連成させて,建築壁体の耐久性能予測への応用を試みる研究は,殆ど行われていない.既に開発した2次元複合壁体に対する熱・水分弾性応力の境界要素解析法を拡張・発展させ,建築材料の弾・塑性性状を考慮できる,3次元複合壁体に対する熱・水分応力のDR境界要素解析法(DRはDual Reciprocityの略である)を開発し,その予測精度と適用限界を明らかにすることを目的として研究を行ない,本年度は以下の成果を得た.1,多孔質な建築材料内での熱・水分同時移動による弾・塑性応力を記述する構成関係式を文献調査し,建築壁体の耐久性能予測という観点から,妥当な計算効率・精度を有する構成関係モデルを選定した.2,既存計算プログラム利用により熱・水分場計算は除外できるものとして,3次元複合壁体に対する熱・水分弾性応力問題のDRMを用いた汎用境界要素解析法を開発した.三角形・四辺形一定要素に関する境界積分の半解析的評価式も導出した.

また,いくつかの簡単な熱弾性問題に関して,計算精度を解析解と比較検討し,開発した計算法の熱・水分弾性応力問題に対する妥当性を検証した.3, 1次元および2次元非線形熱・水分同時移動のDR境界要素解析法の開発を試みた.非定常・非線形による反復計算の効率的処理法を検討すると共に,計算結果の基礎的な検証を行なった.建築壁体の耐久性向上は,地球温暖化防止にも大きな貢献が期待できる重要な研究課題であって,熱・水分性能設計とは密接な関連があり,長周期の熱・水分同時移動性状を考慮した,弾・塑性場の柔軟かつ強力な数値予測法が必須の検討手段となる.多次元建築複合壁体の空気移動を伴う熱・水分性能の数値予測に関しては,近年いくつかの報告があるが,これを応力場の予測と連成させて,建築壁体の耐久性能予測への応用を試みる研究は,殆ど行われていない.ここでは,建築材料の弾・塑性性状を考慮できる,3次元複合壁体に対する熱・水分応力のDR境界要素解析法(DRはDual Reciprocityの略である)を開発し,その予測精度と適用限界を明らかにすることを目的として研究を行ない,以下の成果を得た.1)前年度に得た成果を用いて,熱・水分弾・塑性応力問題の2次元汎用解析法を試作した.また,汎用化と利便性向上のための計算コード改良も併せて行なった.2)2次元非線形熱・水分同時移動のDR境界要素解析法を開発し,2次元計算体系全体の境界型解法として構築を試み,計算結果の基礎的な検証を行なった.3)熱・水分弾・塑性応力の構成関係モデルを組み込んだ,3次元熱・水分弾・塑性応力問題のDR境界要素解析法を,前年度に得た成果を基に試作し,計算結果の基礎的な検証を行なった.4)近年劣化が激しく,効果的な熱・水分性能改修が強く求められている,北米での煉瓦壁体を検討事例として,断熱材や防水層の貼付形状が,その熱・水分応力性状に与える影響を比較し,耐久性向上に効果のある改修法を探った.なお,3次元非線形熱・水分同時移動のDR境界要素解析法の開発も並行して進め,基本ルーチンを検証し,計算結果の基礎的な検証は行ったが,3次元計算体系全体の汎用性の高い境界型解法として構築は未だ十分に完了しておらす,今後の継続的に開発する予定である.
二酸化炭素の大気を有する惑星へ突入する探査システムに作用する非平衡輻射の解明

既存の衝撃波管を改良して膨張波管とし,火星大気突入模擬環境において大気突入システムの模型を試験する装置を開発した.また,ゲート機能付き赤外線カメラを調達し,極短時間の赤外分光システムを開発した.これらによって,国内では唯一の,火星大気突入環境の赤外輻射スペクトル分布を計測可能な実験系を開発し,世界で初めて火星大気突入カプセル周りの赤外スペクトル分布を計測することに成功した.試験結果に基づいて,世界最高精度の高温CO2に係る輻射データベースを開発し,輻射加熱を予測する数値コードの精度を,従来の50%程度から90%まで大幅に改善することに成功した.これは現時点で世界最高の精度である.(1)極短時間遠赤外分光システムの詳細設計:本研究の主要な観測装置である極短時間遠赤外分光システムについて,遠赤外分光器,液体窒素冷却型遠赤外線ICCD,液体窒素冷却システム,遠赤外光学系,校正装置(準黒体光源;内製)より構成されるシステムの詳細設計を行い,各構成品の調達を行った.ICCD以外の構成品に関しては平成27年3月末までに調達を完了し,動作確認を行った.しかし,ICCDについては,業者製造・検証過程で不具合が生じ,平成26年度末までに調達が完了しなかった.その間,装置を設置する衝撃波管側については,作業を前倒し、機械的・電気的インタフェース条件に基づいた準備を完了した.なお,ICCDの調達の未完了によって生じる計画の変更について,他の構成品の動作確認を行うとともに、平成27年度に予定していた作業を前倒しにすることで,全体としてのスケジュールが計画通りに完了するように,調整を行った.(2) CO2,CO分子の回転ー振動遷移のモデル化:実験準備と平行して,CO2,COの回転ー振動遷移に伴う遠赤外線スペクトルの放射・吸収係数のモデル化を行った.本アクティビティでは,既存の量子化学計算コード(Gaussianを想定)を用い,また最新の分光学定数を用いて分子のintra-molecular potentialを定義し,これに基づいた回転ー振動準位の定量化を高い励起準位まで行った.また遷移モーメントの実験値,文献値(ab initio解析結果など)の再調査を行い,既存の輻射解析コードのデータベースのアップデートを行った.以上,ICCDの調達未完了を除けば,ほぼ計画通りに進めることができた.(1)遠赤外分光システムの組立:遅延していたICCDカメラが納品され,極短時間遠赤外分光システムの組み立てを行い,校正・試運転し,運用可能な状態へ整備した.ここでは,遠赤外光学系を含めた全系を黒体炉によって校正し,量子効率の波長依存性の定量化,および絶対強度校正を行った.また対物以外からの遠赤外線迷光を遮断するために,光路周りに設置する液体窒素シュラウドの製作・調整を行った.以上によって,衝撃波管へ遠赤外分光システムの取り付けが完了し,CO2大気を作動ガスとする分光計測が実施可能となった.(2)静的輻射モデルの検証:衝撃波を高圧・低速で運用し,衝撃波背後に熱的平衡領域を形成させて,熱化学平衡にあるCO2からの赤外放射スペクトルの分光計測を行った.また,輻射解析コードにより数値スペクトルを作成し,比較を行った.その結果,数値スペクトルは計測スペクトルの約1/2の強度しかなく,過小評価することが分かった.その原因を探った結果,輻射解析コードで従来用いていたCO2の回転振動遷移データベースが不十分であることが分かった.これまで用いてきたHITEMPデータベースは,温度範囲が低い(3000 K)のに対し,対象とするプラズマは6000 K程度まで温度が上昇するため,高準位からの放射が顕著となる.HITEMPデータベースには高準位からの遷移データが(低温では微少のため)割愛されており,これが過小評価の原因となっていることが判明した.そこで,CO2の回転振動遷移用のデータベースとして,CDSDデータベースを導入した結果,数値スペクトルは実験スペクトルと一致するようになった.これにより,静的輻射モデルの検証が完了し,遷移確率の精度が保証された.以上により,当初計画していた平成27年度の計画を,計画通りに完了することができた.ICCDカメラの納期遅延(当初では平成27年3月までに納品される予定であったが,平成27年6月に納品された)があったためやや遅延していたが,作業工程を入れ替えて,平成27年度の作業を一部前倒して平成26年度中に着手していたため,ICCDカメラ納品後,システムのインテグレーションを完了し,システムの校正・試運転を行う段階で,当初計画をキャッチアップすることができた.また,輻射解析コードの改良についても,当初計画通り,実験スペクトルを対象として,精度を改善することができた.1.輻射モデルの総合検証と改善FY27より進めてきたCO2とCOの赤外スペクトルモデルの検証および改善を,FY27までに整備した極短時間赤外分光システム,および高速衝撃波管の膨張波管モードを用いて,模型を試験気流に暴露し,模型周りの赤外分光スペクトル分布を取得することによって行った.CO2とCOの赤外回転振動スペクトルについては,地道な文献調査等によって,現時点で世界で最も正確と考えられるスペクトルデータベースを構築し,実験との一致も従来の50%程度から90%以上への大幅な改善を達成することができた.

一方,火星大気突入環境を模擬した試験気流中に暴露された模型周りの赤外スペクトル分布を取得したのは世界初の成果である.これらの成果を,2017年1月の米国航空宇宙学会・年会において報告した際には,大変高い関心を集め,活発な議論が行われた.上記の成果によって,火星大気突入カプセル周りの輻射加熱,特に背面の赤外輻射加熱率の予測精度は,計画当初に設定した誤差20%以内を大幅に超えて達成できた.2.ミッション概念設計への応用将来の火星探査ミッションを想定し,大気突入カプセル周りの輻射環境を上記の改善された輻射予測手法によって再評価したところ,特に赤外輻射加熱率が主導的となる背面エアロシェルにおいて,50 %近い熱防御システムの重量低減が可能となる予測が得られた.これによって900 kgの火星大気突入システム(ローバを着陸させるシステム)を想定する場合,火星地表へ運搬可能な重量を22 kg,およそ理学観測機器2つを新たに追加することが可能とな,大きな成果であるといえる.3.成果とりまとめ以上の成果を取りまとめ,国内会議,国際会議において広く紹介するとともに,学術雑誌へ成果の投稿を行った.このうち幾つかについては,既に掲載が決定されている.既存の衝撃波管を改良して膨張波管とし,火星大気突入模擬環境において大気突入システムの模型を試験する装置を開発した.また,ゲート機能付き赤外線カメラを調達し,極短時間の赤外分光システムを開発した.これらによって,国内では唯一の,火星大気突入環境の赤外輻射スペクトル分布を計測可能な実験系を開発し,世界で初めて火星大気突入カプセル周りの赤外スペクトル分布を計測することに成功した.試験結果に基づいて,世界最高精度の高温CO2に係る輻射データベースを開発し,輻射加熱を予測する数値コードの精度を,従来の50%程度から90%まで大幅に改善することに成功した.これは現時点で世界最高の精度である.(1)極短時間遠赤外分光システムの詳細設計については、システムを構成する構成品のうち,ICCDについては新規技術を扱うなど技術的に難しい面もあり業者製造・検証過程で不具合が生じ、平成27年度末までの調達が完了しなかった.それ以外の構成品に関しては調達を完了し,動作確認を行った.ICCDの調達の未完了による遅れは,取り付け装置である衝撃波管の改修作業を前倒しして行い,機械的・電気的インタフェース条件に基づいた準備を完了したため,全体としての遅れを回避することができると考えられる.(2) CO2,CO分子の回転ー振動遷移のモデル化については,当初計画通り,CO2,COの回転ー振動遷移に伴う遠赤外線スペクトルの放射・吸収係数のモデル化を行うことができた.以上,全体として,若干の遅れがあるものの,修正された新しい計画によって,研究期間内に当初の目標まで達成できると考えている.当初計画の通り進める.
環境応答性転写因子の高精度同定法の確立

植物免疫を活性化する、サリチル酸の合成及び応答に関与する可能性のある遺伝子群を多様な発現解析をもとに同定した。さらに、選抜遺伝子群のプロモーター配列に有意に濃縮されるシス配列候補を同定した。選抜遺伝子群に含まれる22転写因子タンパク質を合成し、シス配列候補との結合能を調査した結果、LST1転写因子が得られた。多様なトランスクリプトームデータから、SA合成やSAの初期認識に関与する可能性のある遺伝子群を選抜した。解析に供試した発現データは、1)4週齢の野生型シロイヌナズナ(Col-0)葉に病原性細菌であり、強いSA依存的免疫機構を活性化するP. syringaeavrRpt2を接種したもの、2)同病原菌をNPR1欠損変異体であるnpr1植物葉に接種したもの、3)播種後12日目のCol-0葉に病原性糸状菌であるHyaloperonospora arabidopsidisを接種したもの、4)同齢のCol-0葉に細菌の鞭毛成分であるflg22を処理し、免疫系を活性化したもの、5)4週齢のCol-0葉にUV-Bを曝露したもの、6)同齢のCol-0葉にオゾンを曝露したもの、7)同じくCol-0葉に一酸化窒素を処理したもの、そして、8)SA合成系を活性化する、SAアナログのBTHを処理した4週齢の葉を用いた。全ての発現データセットにおいて、SA合成に関与するICS1の発現が有意に上昇していることを確認している。上記18の各プロファイルにおける発現遺伝子は、対照区と比較して1.52倍以上発現しており、全てのサンプルで発現が認められる遺伝子のみを選抜した。これらの遺伝子群を引き続くプロモーター解析に供試する。初年度は、多様なマイクロアレイ解析を行い、これまでにサリチル酸シグナルに重要であることが報告されている多くの遺伝子を含め約250の遺伝子を得ることができた。特筆するべきは、選抜遺伝子群には機能未知の転写因子が含まれることから、新規重要因子が網羅的に合成できたと考えている。予備的に選抜遺伝子群のプロモーター解析を行ったところ、特徴的なシスエレメントが極めて高頻度に出現することが明らかになり、同配列を認識する転写因子の同定に向け、クローニング等を進めている。以上より、当初予定した計画通りに進んでいるものと評価できる。植物免疫系を誘導するホルモンであるサリチル酸(SA)の合成やSAの初期認識に関与する可能性のある遺伝子群を選抜した。解析に供試した発現データは、1)4週齢の野生型シロイヌナズナ(Col-0)葉に病原性細菌であり、強いSA依存的免疫機構を活性化するP. syringaeavrRpt2を接種したもの、2)同病原菌をNPR1欠損変異体であるnpr1植物葉に接種したもの、3)播種後12日目のCol-0葉に病原性糸状菌であるHyaloperonospora arabidopsidisを接種したもの、4)同齢のCol-0葉に細菌の鞭毛成分であるflg22を処理し、免疫系を活性化したもの、5)4週齢のCol-0葉にUV-Bを曝露したもの、6)同齢のCol-0葉にオゾンを曝露したもの、7)同じくCol-0葉に一酸化窒素を処理したもの、そして、8)SA合成系を活性化する、SAアナログのBTHを処理した4週齢の葉、由来のものを用いた。各刺激においてSAが合成されることは確認している。各刺激に応答して有意に発現上昇している遺伝子を選抜し、各マイクロアレイデータの全てにおいて陽性を示した約350遺伝子をSA合成関連遺伝子群とした。選抜遺伝子群をシス解析プログラムに供試した結果、WRKY転写因子が認識するW-boxやTGA転写因子が認識するTGA-boxが同定された。最も高頻度に検出されたシス配列候補はLS10と呼ばれる配列であり、現在までに対応する転写因子は未同定である。本シス配列を認識する転写因子を同定するために、選抜遺伝子群に含まれる22転写因子を無細胞タンパク質合成系を用いて合成し、AlphaScreenシステムにより、シス候補配列との結合の有無を調査した。その結果、同シス候補を認識するLS10認識転写因子、LST1を同定した。同定した転写因子のT-DNA挿入ラインをABRC等のストックセンターから取り寄せ、同時に過剰発現体を作出する。これらの4週齢の植物葉にP. syringaeavrRpt2を接種し、SAの蓄積やSA依存的遺伝子発現を調査し、当該転写因子の免疫系への関与を明らかにする。SA誘導系に影響は認められないものの、病害抵抗性反応が抑制されている変異体は、SA認識以降に不具合があると考えられるので、SAシグナルにおけるマーカー遺伝子であるPR-1、WRKY38やWRKY60の発現解析を行う。SAシグナル伝達における鍵転写補助因子であるNPR1は、同遺伝子群の活性化に必須であるので、NPR1の蓄積が生じているかもウェスタンブロットにより検討する。同様に、当該転写因子がNPR1と相互作用することにより、標的遺伝子群の転写調節を行っている可能性についても言及するため、AlphaScreen systemやpull-down法により相互用の有無を調査する。

最終的にはプロモーター解析で得られた情報を基にChIP(クロマチン沈降法)-PCRを行い、in vivoにおいて予測シスエレメントに結合するかを検討する。これらの結果から、標的転写因子のSAシグナル伝達系における役割を結論付ける。植物病理学
移植心冠動脈硬化の分子機構の解明と遺伝子治療

【目的】慢性拒絶とも呼ばれる移植心冠動脈内膜肥厚は長期予後を決定する重要な要素である。病態には不明な点が多く予防法がない。細胞周期調節遺伝子は血管内膜肥厚において重要な役割を果たしていることが諸種のモデルで示されているが、移植心における検討はなされていない。細胞周期調節遺伝子の発現と、アンチセンス遺伝子導入による内膜肥厚進展予防効果について検討した。【方法】BALB/cマウスの心臓を摘出してHVJ-liposome法によりFITCラベルしたODNを導入しマウスに異所性に移植した。さらに、細胞周期調節遺伝子であるCDK2 kinaseに対するアンチセンスODNを導入した心臓を同様に移植した(n=9)。遺伝子導入しない群(n=6)と、センスcdk 2 kinase ODN(n=7)、スクランブルODN(n=6)の導入群を比較とした。移植片生着延長のためFK506を投与し、第30日に摘出した。肥厚内膜の内弾性板内占拠率を定量化し、VCAM-1とCDK2 kinaseのmRNA組織内発現を検討した。【結果】FITCラベルしたODNは移植後14日まで移植心内に広く発現した。無導入群、センス群、スクランブル群では冠動脈内膜肥厚(62.3±20.9%,70.5±20.8%,60.6±20.6%)を認めたのに対し、アンチセンス導入ではその進展は著明に制御(14.3±5.3%)された。血管内膜でのVCAM-1の発現は無導入群、スクランブル群、センス群で著しく、アンチセンス群では抑制されていた。CDK2 kinase、PDGFmRNA発現も同様であった。【結論】移植心冠動脈硬化における血管平滑筋増殖には細胞周期調節遺伝子が関与しており、アンチセンスCDK2 ODNの導入はその進展予防に効果がある。
介護保険施設における痴呆症をもつ入所者に関するリスクマネジメントの導入と理論化

痴呆症をもつ入所者に関するリスクならびにリスクマネジメントの実態について、文献検討をもとに全国調査、聞き取り調査、学会での情報交換会を行い(20022003年度)、実態を把握した上で、介入のための理論的枠組みを作成し、4施設への介入研究を実施し、効果を検討した(20042005年度)。介入内容は施設の状況に応じ様々であったが、共通した支援として、職員の情報(知識、考え方等を含む)が増すようにしながら、スタッフ間の相互理解を図る支援、援助事例の分析やインシデント報告書等の分析をスタッフに公開しながら、対象者の安全、安楽、満足、能力の発揮とケアとの関係の理解を促進する支援、さらにリスクマネジメントのシステムの発展への支援があった。これらはケアリングを基盤として実施していた。介入による成果として、転倒事故や誤嚥・窒息、感染症の減少があった。あるいは減少しなくともスタッフは事故の予防、発生時の対処が可能と認識できるようになり、問題視されなくなっていた。職員の認識においても、「リスクマネジメントに関わるケアの実践」「痴呆症の人へのケア」「チームの中で動因となる実践」について、積極的に関わる方向へと変化がみられた。このことは、介入によって研究者が意図した変化をもたらすことができたと考えられた。研究者の介入内容・効果について、それぞれの関係を分析、検討し、リスクマネジメントの理論として図示した(2005年度)。介入内容は、施設管理者が痴呆症をもつ入所者のリスクマネジメント活動として意図的に実施していくことが可能であり、リスクマネジメントの質的向上に寄与すると考えられた。介護保険施設における痴呆症をもつ入所者のリスクマネジメントに関する実態について全国調査を行った。調査用紙作成にあたっては、各研究者1、2箇所の施段を担当して面接調査を行った上で、調査の枠組みについて検討し、転倒・骨折・誤嚥・窒息・栄養不良・暴力・離施設・感染・基礎疾患の悪化・治療や処置に関わる事項と広範囲の内容とした。調査用紙配布先の選定方法は、2分の1の抽出率で、施設別、県別に層化抽出を行った。配布数は4848、回収数は1507(回収率31.1%)、有効回答数は1480(有効回答率30.5%)であった。施設の種類別に有効回答数・率をみると、介護老人福祉施設(特別養護老人ホーム、以下特養)763(30.8%)、介護老人保健施設(以下老健)487(33.1%)、療養型病床群をもつ病院(以下療養型)217(24・1%)であった。施設の種類別に調査結果を概観したところ、療養型ではリスクマネジメントが比較的実施されており、老健、特養で実施できにくい状況が伺えた。また、老健では転倒・骨折事故発生が多く、かつ抑制全廃に取り組んでおり、リスクマネジメントの必要性が高いことが伺えた.特養では福祉職や事務職である回答者が多く、このことが身体の悪化に関わる事項への回答に影響している可能性が予測された。また、特養では看護職がリスクマネジメントに関与していないことが予測された。今後、さらに詳細な分析を行う予定である。また、質問紙調査の解釈、今後の介入研究の準備のために面接調査を行った。各研究者が14箇所担当し、計16施設のリスクマネジメントの実施経過や課題について聞き取り調査した。各施設とも介護保険導入を契機にリスクマネジメントの取り組みが進んでおり、ケアの質向上についての努力と一致しているが、マネジメントの考え方が十分導入できていない施段がある可能性が示唆された。本年度は全国調査の結果を質的、量的に分析した。介護保険施設のうち、施設の種類別に課題を明らかにしたほか、全体的な課題としで、リスクマネジメント実施のためのマニュアル作成の必要性があると考えられた。また、リスクマネジメントの様々な方策を整理した。

さらに、介護保険施設において痴呆症を持つ入所者のリスクマネジメントを実施する上での困難は、"質の高いケアを提供したい思い"と"入所者と施設・職員の安全が保障できない諸要因"が絡み合って起こっていると考えられた。これらは、学会等で報告し、広くディスカッションを行った。特に、日本老年看護学会学術集会においてインフォメーションエクスチェンジを開催し、実態調査結果を報告して参加者からの意見を募った。調査結果をもとに介護保険施設における痴呆症をもつ入所者に関するリスクマネジメントの考え方と方策を検討した。特に重要な点として、リスクマネジメントは施設のケア理念をもとにケア全体の質向上と共に行われるべきことがあげられた。介入研究にあたり、ベースラインデータを調査するための調査票を作成し、施設に研究協力を依頼した。ベースライン調査は現在進行中であり、この結果を協力施設担当者と共に検討し、介入内容を決定し平成16年度に実施していく予定である。介入研究にあたっては、研究者と施設の職員が協働し、脅かされない関係のもとで進めることとした。全国調査から理論的に構築してきた介入研究に向けての経過は中間報告書としてまとめ、調査協力者に送付した。本年度は4施設での介入研究を実施した。まず、各施設職員全員を対象に事前調査を実施(調査内容:事故の実態および対策、リスクマネジメント(RM)の認識、職務への認識、セルフエスティーム)。1年後に同調査を実施し、介入の効果を検討する予定である。介入は、RMの視点からケアの質向上と事故防止対策に関して下記を実施。介入内容については研究者間で意見交換を行い、方向性を出している。(1)A施設(特別養護老人ホーム)各職種、立場別に職員とのミーティングを実施し、現状と課題を出してもらった。そこで課題とされた、「嚥下困難者への食事介助」「胃ろう造設者への口腔ケア」について研修を実施。感染性疾患は例年に比べ少なくなっており、ケアの質の改善にむけた意見が介護職員から出されるようになった。職種間の情報伝達がスムーズでない状況は続いている。(2)B施設(介護老人保健施設)事故防止委員をサポートした取り組みを実施。RMについての学習会開催、インシデントレポート投入箱の設置、インシデントレポートの内容を整理し事故内容別に課題を確認。また、特に転倒の多い事例についてケア介入を実施。その入居者の希望にそった環境づくりを実施する中で転倒事故はなくなり、職員もケアの工夫について学ぶことができている。(3)C施設(特別養護老人ホーム)RM委員会および職員全体に向けた報告会での介入を実施。RMについての学習会、事故報告書の分析を実施。また、異食行為のある入所者について事例分析を行い、援助の方向性を出し継続してもらった。その結果、異食は少なくなった。また、職員が入居者での関わり方を学んだため、ケアの質は高くなっている。(4)D施設(介護老人保健施設)事故防止のための委員会を基盤に、2つのフロアの取り組みに参加しサポートした。1つは転倒予防策の検討、もう1つは離施設事例の検討を実施。担当者主導の取り組みから、フロアスタッフ全体への取り組みに拡がるきざしがみえてきている。本年度は4年間の研究の最終年度である。
反復配列を用いたオオサンショウウオ科3種の系統関係と種内変異

オオサンショウウオ科2属3種(オオサンショウウオ、Andrias Japonicusチュウゴクオオサンショウウオ、A.davidianus、アメリカオオサンショウウオ、Cryptobranchus allegantensts)のゲノムDNAの高頻度反復配列(1987年度)と5SrDNA(1988年度)における塩基配列の変異を指標として系統関係を類推した。高頻度反復配列においては、8個体(AJ:5、Ad:2、Ca:1)の抽出DNAを多数の制限酵素で切断し、特徴のある断片をプローブとしてサザンブロットハイブリダイゼーションを行った。断片がそれぞれの種に存在するか否かを調べ検討したところ、A.japonicusとA.davidianusがより近縁であることが判明した。3種に共通して存在するHindIII断片の塩基配列を比較したが、系統関係を示す有効なデータは得られなかった。5SrDNAについては、7個体(Aj:4,Ad:2,Ca:1)からの23配列を用いた比較解析を行ったところ、3種の分化が起こっていることが示唆された。また、属間の変異率が属内の2種間に比べ、非常に高い値を示した。さらに、C.alleganiensis固有の固定は7塩基存在し、A.japonicusの遺伝子領域内において1塩基の固定が確認された。A.japonicusは4地城よりの各個体から得られた全ての配列に共通した変異であることから、固有の変異である事が示唆され、他の2種におけるこの塩基は、種間で共通しており、A.davidianusの個体間でも変異は見られなかった。他の両生類7種の既知の5SrDNA遺伝子領域を用いた系統解析では、オオサンショウウオ科は無尾目と分岐し、比較的近い有尾目と同じクレードを構成した。これらの結果は、従来の形態学的な分類を支持するものである。一方、今回の研究では、A.japonicusの地域差は認められなかった。また、A.davidianusの個体間の差も存在しなかった。現存するオオサンショウウオ科(Cryptobranchidae)Andrias属のオオサンショウウオ(Andrias japonicus)、チュウゴクオオサンショウウオ(A.davidianus)、とCryptobranchus属のアメリカオオサンショウウオ(Cryptobranchus alleganiensis)の系統関係をゲノムDNAの反復配列を用いて再検討すべく、A.japonicus5個体、A.davidianus2個体、C.alleganiensis1個体の、計8個体からDNAを抽出・精製し、多数の制限酵素で処理後、電気泳動、サザンブロットハイブリダイゼーション等を行った。共通した反復配列が存在するかどうかを指標として検討した結果、3種間の関係は従来の分類と同様に、A.japonicusとA.davidianusがより近縁であることが示唆された。次に、3種に共通して存在する約130bpのHin dIII断片をクローニングし、塩基配列の決定を行った。全79配列を比較解析処理し、近隣接合法等の系統樹の作成を試みたが、C.alleganiensisの配列以外はクラスターを形成しなかった。A.davidianus2個体が1つのグループを形成できず、また、A.japonicusの各個体間の位置関係も用いた系統樹ごとに異なっていた。今回用いた配列は3種間で保存されていることから、3種が分化する前から存在したと考えられる。しかし、その後種分化が生じた後も種の独自性を生まなかったことは、種分化後の増幅や協調がほとんど無かったことを示唆している。

次年度は、他の反復配列である5SrDNAの解析を行い、種間並びにA.japonicusの各地域間における系統関係の検討をおこなう。オオサンショウウオ科2属3種(オオサンショウウオ、Andrias Japonicus:4頭、チュウゴクオオサンショウウオ、A.davidianus:2頭、アメリカオオサンショウウオ、Cryptobranchus alleganiensis:1頭)の5S rDNA(約440bp)を各個体ごとにPCR法にて増幅、クローニングし、塩基配列を求めた。5S rDNAは、よく保存されている遺伝子領域と、種によって長さや塩基配列が大きく異なるスペーサー領域から成る。3種からの23配列の5S rDNAを用いた比較解析を行ったところ、種内変異率より種間変異率の方が高く、3種の分化が起こっていることが示唆された。また、Andrias属内の2種間に比べ、2属間の変異率は、両領域共に、非常に高い値を示した。さらに、C.alleganiensis固有の固定は7塩基存在する。また、A.Japonicusの遺伝子領域内において1塩基の固定が確認された。A.Japonicusは4地域よりの各一個体から得られた全ての配列に共通した変異であることから、A.Japonicus固有の変異である事が示唆された。また、他の2種におけるこの塩基は、種間で共通しており、A.davidianusの個体間でも変異は見られなかった。塩基配列による、Andrias属2種間の明確な差が確認されたのは本研究が初の報告となる。さらに、他の両生類7種の既知の5S rDNA遺伝子領域を用いた系統解析では、オオサンショウウオ科は無尾目と分岐し、比較的近い有尾目と同じクレードを構成した。これらの結果は、従来の形態学的な分類を支持するものである。一方、今回の研究では、A.Japonicusの地域差は遺伝子領域、非転写スペーサー領域共に認められなかった。また、A.davidianusの個体間の差も存在しなかった。
リズム知覚生成の個人差に関する音楽神経科学研究

計画3年目である本年度の研究業績は以下の4つであった。1)前年度までに開発したハーバードビート評価テスト(Harvard Beat Assessment Test: H-BAT)iOSアプリケーションの妥当性検証実験を実施した。オリジナルのMatlab版と新たに開発したiOS版とで取得したデータ、及び複数のiOSデバイスで取得したデータを比較し、結果の妥当性を検証した。得られた成果は、国際音楽情報処理学会(ISMIR)のLate-Breaking Demoにて発表し、今年度の北米音楽知覚認知学会(SMPC)でも発表の予定である(採択済)。2)慶應義塾大学医学部精神・神経科学教室MTRラボと共同で、健常者と統合失調症患者を対象にHBATを実施し、臨床症状評価と脳波計測、MRI計測を実施した。統合失調症の症状重症度とリズム知覚生成能の間の関連性を見出した中間解析の結果を、国際音楽知覚認知学会(ICMPC)、第40回日本生物学的精神医学会・第61回日本神経化学会大会合同年会、及びMotor Control研究会にて発表した。3)医療法人社団健育会湘南慶育病院と共同で脳卒中患者を対象にHBATを実施した。また健常者を対象にNIRSを用いてHBAT実施中の脳活動を評価する実験を実施した。脳損傷部位とHBATスコアの関連性、HBAT実施中のNIRS活動について現在解析中である。4)福島県立医科大学医学部神経精神医学講座と共同で、精神疾患患者を対象にリズムトレーニングを実施し、HBATのiOSアプリケーションを用いて介入前後のリズム知覚生成能の評価を行う研究を実施した。計画4年目も継続して研究を実施する予定である。1)に関しては、当初の計画よりもやや進展が遅れているが、研究成果を着実に学術論文としてまとめるべく研究を遂行している。2)に関しては、当初の計画以上に研究が進展している。MTRラボとの共同研究により研究が加速的に推進しており、複数の国内・国外学会にて順調に成果を発表することができている。3)は、今年度から開始された研究であり、計画以上の進展である。当初の計画では脳卒中患者のリズム知覚生成能を評価する計画になかったが、共同研究の機会をいただいたことで、脳卒中患者のリズム知覚生成能の個人差についても解明できる可能性が出てきた。4)についても今年度から開始された研究であり、計画以上の進展である。当初の計画ではリズムトレーニング介入前後のリズム知覚生成能の変化について評価する計画はなかったが、共同研究の機会をいただいたことで、統合失調症患者のリズム介入前後の知覚生成能の変化の個人差についても解明できる可能性が出てきた。以上の進捗状況を総合的に判断し、「当初の計画以上に進展している」と判断した。初年度である本年度の研究実績は、以下3つである。2)現有HBATの設置には、パソコンやMATLABソフトウェア、オーディオインターフェス、タッピング入力デバイス等の実験機器の設定が必要であり、一般にはなかなか普及しにくい。そこで、スマートフォン(iPhone)使用に対応したHBATアプリケーション(新型HBATアプリ)の開発に取り組み、試作品を作成した。前項研究実績1)に関しては、当初の計画通りであり、国内でHBAT実験を実施する体制を無事に整えることができた。2)に関しては、現状では新型HBATアプリの試作品を作成した段階であり、アプリの完成にはまだ至っておらず、当初の計画よりもやや進展が遅れている。3)に関しては、当初の計画以上に研究が進展している。HBATスコアの神経相関分析は、研究計画の34年目に行う予定であったが、初年度に研究の一部を実施することができた。予備的解析の段階ではあるが、HBATのBeat Interval Testというサブテストで評価したリズム知覚閾値の個人差と小脳の灰白質信号強度の個人差が相関するという興味深い分析結果をこれまでに得ており、今後成果の報告が期待できる。以上の進捗状況を総合的に判断し、「(2)おおむね順調に進展している」と判断した。計画2年目である本年度の主な研究実績は、以下4つであった。1)音楽リズムの知覚生成能力の個人差を評価するテスト「ハーバードビート評価テスト(Harvard Beat Assessment Test: HBAT)」のiOSアプリケーションの開発に取り組んだ。iOSアプリのβ版を開発し、取得データの妥当性について検証した結果を情報処理学会第80回全国大会にて発表した(今野&藤井, 2018)。2)慶應義塾大学医学部精神・神経科学教室MTRラボと共同で、健常者と統合失調症患者を対象にHBATを実施し、臨床症状評価と脳波計測、核磁気共鳴イメージング(Magnetic Resonance Imaging: MRI)計測を行った。得られたデータで統合失調症患者のHBATスコアと臨床症状評価スコアの関係について調べたところ、音楽リズム知覚生成能力の低下度と統合失調症臨床症状の重症度の間に関連性がある可能性を見出し、第13回日本統合失調症学会にて発表した(本多ら,越智ら,加藤ら, 2018)。3)ハーバード大学と共同研究を行い、健常人を対象にHBATとMRI計測を実施し、Voxel Based Morphometry(VBM)の手法を用いて、HBATスコアと脳灰白質信号強度の相関分析を行った。実験の結果として、小脳の灰白質強度の個人差とHBATスコアの個人差の間に関連性があることを見出し、得られた結果をNeuroImage誌上に発表した(Paquette, Fujii, Li, & Schlaug, 2017)。

4)トロント大学サニーブルック研究所と共同で、音楽聴取が視覚運動回転変換課題の学習プロセスに及ぼす影響を調査し、NeuroMusic学会にて発表した(Fujii et al., 2017)。前項1)に関しては、当初の計画よりもやや進展が遅れている。今後、より多くの人々を対象にHBAT iOSアプリの妥当性検証実験を実施し、iOSアプリの公表をすみやかに実現する必要がある。2)に関しては、おおむね順調に研究が進展している。引き続き、健常者と統合失調症患者を対象にHBATとEEG/MRI計測を実施すると共に得られたデータを解析し、成果の公表を目指し研究を推進する必要がある。3)に関しては、当初の計画以上に研究が進展した。HBATで測定した時間間隔変化の知覚判別域値と小脳の灰白質信号強度が相関するという興味深い実験結果を得て、NeuroImage誌上に研究成果を発表することができた。4)に関しては、当初の計画にはない実験であったが、音楽と運動学習の関係に迫る基礎的研究を着実に進展することができた。以上の進捗状況を総合的に判断し、「2 :おおむね順調に進展している」と判断した。計画3年目である本年度の研究業績は以下の4つであった。1)前年度までに開発したハーバードビート評価テスト(Harvard Beat Assessment Test: H-BAT)iOSアプリケーションの妥当性検証実験を実施した。オリジナルのMatlab版と新たに開発したiOS版とで取得したデータ、及び複数のiOSデバイスで取得したデータを比較し、結果の妥当性を検証した。得られた成果は、国際音楽情報処理学会(ISMIR)のLate-Breaking Demoにて発表し、今年度の北米音楽知覚認知学会(SMPC)でも発表の予定である(採択済)。2)慶應義塾大学医学部精神・神経科学教室MTRラボと共同で、健常者と統合失調症患者を対象にHBATを実施し、臨床症状評価と脳波計測、MRI計測を実施した。統合失調症の症状重症度とリズム知覚生成能の間の関連性を見出した中間解析の結果を、国際音楽知覚認知学会(ICMPC)、第40回日本生物学的精神医学会・第61回日本神経化学会大会合同年会、及びMotor Control研究会にて発表した。3)医療法人社団健育会湘南慶育病院と共同で脳卒中患者を対象にHBATを実施した。また健常者を対象にNIRSを用いてHBAT実施中の脳活動を評価する実験を実施した。脳損傷部位とHBATスコアの関連性、HBAT実施中のNIRS活動について現在解析中である。4)福島県立医科大学医学部神経精神医学講座と共同で、精神疾患患者を対象にリズムトレーニングを実施し、HBATのiOSアプリケーションを用いて介入前後のリズム知覚生成能の評価を行う研究を実施した。計画4年目も継続して研究を実施する予定である。1)に関しては、当初の計画よりもやや進展が遅れているが、研究成果を着実に学術論文としてまとめるべく研究を遂行している。
肥満細胞からのヒスタミン遊離における細胞骨格の関与に関する研究

ラット小腸平滑筋より分離精製したアクチンを過ギ酸で処理したものを抗原としてマウスを感作した。このマウスの脾臓細胞とミエローマ細胞とを電気細胞融合装置により融合させて抗体産生クローンを確立し、抗ラットアクチンモノクローナルIgG抗体を得た。また、ラット脳より単離したチュブリンを用い、同様の操作によって、抗チュブリンIgG抗体を得た。これらを用いて、肥満細胞からのヒスタミン遊離反応における細胞骨格の役割について検討した。実験には、主に卯白アルブミンによって感作したモルモットの肺肥満細胞及びラット腹腔より単離した肥満細胞を使用した。肺肥満細胞や腹腔肥満細胞の何れも、特異抗原やヒスタミン遊離物質で刺激した際、ミクロフィラメントの結合した顆粒が細胞外に脱出した(脱顆粒)。抗アクチン抗体やファロイジン染色を行った実験より、このフィラメントはアクチンフィラメントである事が明らかとなった。細胞内カルシウムイオン濃度の上昇と共に脱顆粒が誘発されたが、細胞内カルシウムイオン濃度が低下してくると、ミクロフィラメントの長さは次第に短くなり、脱出した顆粒の再取り込みが生じる事も明らかになった。電子顕微鏡による観察結果により、肥満細胞の内部には、細胞膜と顆粒あるいは顆粒間を複雑に連絡している細胞骨格のネットワークが存在する事も示された。抗アクチン抗体及び抗チュブリン抗体を用いた結果、細胞内部の複雑なネットワークには、ミクロフィラメント系と微小管系が存在する事が明らかになった。いずれも肥満細胞に脱顆粒を惹起させた際、顆粒の細胞外への押し出しや、細胞の形態変化に大きく関与している事が明らかになった。ラット好塩基球性白血病細胞の細胞株を用いて、更に詳細に細胞内の微小管の分布を検討した結果、細胞周辺部に極めて細かい微小管のネットワークが密に存在し、細胞の形態維持や組織への吸着に、これらが関与している事が示された。ラット小腸のアセトン粉末より,Spudich Wattの方法に従って,アクチンを精製した.このアクチンをギ酸処理した後,Freundの完全アジェバントと共にマウスに皮下注射して感作した.ELISAシステムを用いて抗体価が上昇したことを確認した後,脾臓を摘出した.脾臓細胞とマウスミエローマ細胞を細胞融合装置を用いて細胞融合を行った.ELISAシステムにより,抗アクチン抗体産生クローンを検索し,最終的に,抗アクチンモノクローナル抗体を得た.抗アクチンモノクローナル抗体を用い,蛍光抗体法を行ったところ,肥満細胞内の細胞膜裏打ち及び顆粒の間隙マニケ蛍光が分布した.また,蛍光標識抗体存在下に,肥満細胞に脱顆粒を惹起させると,顆粒を細胞外に押し出す様にならんだフィラメントの蛍光が認められた.アクチンそのものにローダミンを結合させた.蛍光標識アクチンの共存下に同様の実験を行うと,顆粒表面に強い蛍光が認められ,顆粒上にアクチン結合部化が存在することが示された.金コロイドを結合させた抗マウスIgGを用い,免疫電顕法を行ったところ,肥満細胞の細胞膜焼打ちと,顆粒間をつなぐアクチンフィラメントが確認された.また,顆粒の押し出しにもアクチンフィラメントが関与しているのを認めた.以上の結果,肥満細胞の脱顆粒には,アクチンフィラメントが重要な役割を担っていることが,今回初めて明らかとなった.細胞骨格調節因子であるカルモデュリンは,ラット脳よりアフィニティークロマトグラフィーによって精製し,アクチンの場合と同様の方法で,抗カルモデュリンモノクローナル抗体の作成に成功した.

この抗体を肥満細胞に注入すると,脱顆粒反応は抑制され,脱顆粒にカルモデュリンが関与していることが示された.現在免疫電顕でカルモデュリンと脱顆粒の関わりを検討している.ラット脳よりチュブリンを精製し,現在ELISAシステムを用いて抗体産生クローンを検討中である.前年度に作成した抗アクチンモノクローナルIgG抗体及び抗チュブリンIgG抗体を用いて、肥満細胞からのヒスタミン遊離反応における細胞骨格の役割について検討した。実験には、卵白アルブミンによって感作したモルモットの肺肥満細胞及びラット腹腔肥満細胞を使用した。肺肥満細胞や腹腔肥満細胞はいずれも、特異抗原やヒスタミン遊離物質で刺激した際、ミクロフィラメントの結合した顆粒が細胞外に脱出した(脱顕粒)、抗アクチン抗体やファロイジン染色を行った実験より、このフィラメントはアクチンフィラメントである事が明らかとなった。細胞内カルシウムイオン濃度の上昇と共に脱顆粒が誘発されたが、細胞内カルシウムイオン濃度が低下してくると、ミクロフィラメントの長さは次第に短くなり、脱出した顆粒の再取り込みが生じた。免疫電顕法による観察結果により、肥満細胞内部において細胞膜と顆粒あるいは顆粒間を複雑に連絡する細胞骨格のネットワークは、主にアクチンよりなるミクロフィラメントと主にチュブリンよりなる微小管によって構成されている事が示された。いずれも、顆粒の細胞外への押し出しや細胞の形態変化に大きく関与している。ラット好塩基球性白血病細胞の細胞株を用いて、更に詳細に細胞内の微小管の分布を検討した結果、細胞周辺部に極めて細かい微小管のネットワークが存在し、細胞の形態維持や組織への吸着に関与している事が示された。これらの実験を平行して、細胞内Ca貯蔵部位についても検討し、肥満細胞内Ca貯蔵部位は小胞体であることを明らかにした。ヒスタミン遊離刺激条件下に、細胞膜におけるリン脂質代謝が亢進し、イノシトール1,4,5ーシリン酸が遊離され、これが小胞体に作用してCaイオンを放出させることも明らかにした。抗アレルギー薬やcAMPによるヒスタミン遊離抑制機序の一つに、細胞内Ca貯蔵部位からのCaイオン放出抑制作用があることが強く示唆された。