hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
シリコンナノ膜をベースとした新奇低次元構造・物性制御

Si(111)-SOI構造を介したGaNのSi(001)に対する接合構造をMBE法により作成し、Si(111)-SOI構造の面方位変換が対称性の異なる系の接合に有用である事を示した。また、操作トンネル顕微鏡および4探針電気伝導測定を用いてSi(111)-SOI表面の電気伝導特性が大きく表面に依存することを見いだすなど、様々な低次元系の電気伝導特性の解明を行った。本年度においては、清浄表面をもつSi(111)-SOIの電気伝導を走査トンネル顕微鏡(STM)の探針及び超高真空4端子電気伝導測定装置を使用して測定した。表面清浄化処理後STMにより7x7再構成表面を確認した厚み14nmのSOIテンプレート層に対してSTMの探針を接触させたところ、サブミクロン程度のコンタクトサイズを仮定して10^7ohm台のシート抵抗に相当する抵抗値が観測された。この抵抗値は表面をGaで被覆する事によって10^<10>ohm台まで上昇し、電気伝導機構に対する表面の大きな役割を示唆する結果となった。その一方で、超高真空中の4端子測定を行うと流す電流に大きく抵抗値が依存し、電圧降下による試料の局所加熱効果が100pA程度の電流でも無視出来ない事が分かってきた。この効果を避けるため10pA程度の電流で4端子測定を行ったところ、測定の安定性に問題が有るものの温度依存性が低い10^9ohm台のシート抵抗が観測された。この測定後Gaの蒸着を行って抵抗測定を行ったところ、常温でのシート抵抗は10^<10>ohm台まで上昇し、温度変化から求められるバリアエネルギーの値も0.4eV程度まで上昇した。現在この測定の安定化にむけてさらに実験を継続している。一方でより制御された4端子測定を行うためユニソク製の4探針STMを導入した。現在原子分解能を確認して、さらにSOIの測定に向けて装置の整備を続けている。本年度においては、引き続き極薄SOIの抵抗測定を継続して行った。温度可変プローバーによる測定においては、昨年度来測定の問題点となってきた測定電流による加熱効果が、プローブの接触抵抗の変化と相まって電気抵抗の誤差を生じる原因となっている事が考えられ、安定した抵抗測定を行う事は難しい事が判明した。そのため、昨年度より整備を進めている4探針STM装置を使用した安定した電流注入を行う事をめざし、装置の整備に集中的に行った。その結果、超高真空中での清浄表面の作成およびその原子分解能観察に成功しており、4探針をSTM装置として使用しつつ電気伝導測定を行う基礎的準備が整った。これまでの研究により、研究対象となっているシリコン表面においては、金属的かどうか議論が分かれてきた系においても半導体的な電気伝導特性を示す事が分かってきた事から、4探針STM装置においても試料部における常温までの高精度温度調整が必要となっており、現在装置の改良に取り組んでいる。また、SOI構造上に集積するナノ構造の研究にも精力的に取り組み、シリコン上に形成された銀アイランド構造のエネルギー分析PEEM実験によって、銀表面においては非占有自由電子バンドに有る電子が表面ポテンシャルによる散乱を受けずに通過することが出来るという興味深い知見を見いだした。このような系をSOIに対して複合化させる事によって半導体・金属間接合におけるバリスティック電子の高度な制御が可能になるのではないかと考えられる。これまでの超高真空4探針プローバーによる測定により、シリコンの表面準位の電気伝導は半導体的であり常温付近での精密な温度制御が必要で有る上、測定結果が接触抵抗におけるジュール熱からもたらされる局所的な温度のむらによって左右されるため、探針の表面に対するコンタクトに関してより高精度な制御が必要となる事が分かった。そのため本年度においては、4探針STM装置においても試料部における常温までの高精度温度調整を行う事を目指して装置の改良を行い、85Kから380Kまでの範囲で試料部の温度を可変するための加熱および温度制御機構を整備し、動作を確認する事に成功した。この装置を用いてシリコン上に製膜した原子層レベルの金属超薄膜のSTM観察および4探針電気伝導測定を行い、基板のシリコンやバルク金属とは異なる薄膜固有の電気伝導特性を測定する事に成功した。本研究成果は薄膜固有の物性発現という観点から重要であるものと考えられる。また、酸化膜構造上に集積するナノ構造の研究にも精力的に取り組み、電極構造をパターン化したシリコン酸化膜上にてペンタセン分子の薄膜成長を行い、分子の異方性からペンタセン分子の薄膜成長が電極パターン周辺において抑制される事を見いだし、自己組織化膜を電極構造上に作成する事によりこの問題が解決できることを示した。本研究においてもFET構造を作成した電気伝導測定を行う事により、この成長機構が実際に素子の特性を左右する事を示した。本研究の成果は絶縁体膜上における有機デバイス作成過程の制御の指針を与えると共に、SOIテンプレートを使用したシリコンドット構造と有機薄膜の複合構造の作成に関しても有用な指針を与えるものと考えている。
肝切除術後に出現した抗組織因子抗体のエピトープの同定および阻害機序の解明

我々は肝切除術を受けた患者の一部に、術後一過性にウシとウサギのTF活性を阻害するが、サルとヒトのTF活性を阻害しない抗体(IgGλ-タイプ)が出現することを発見した。このことは、この抗TF抗体がTF分子上の種特異性を示す部位に結合することにより、TF-VII(a)因子複合体の形成を阻害することを示唆している。ウシTF-VIIa因子複合体によるX因子活性化に対する本TF抗体の阻害効果を検討したところ、KmとVmaxを共に低下させることが判明した。TF抗体の出現機序については、肝切除術中に局所の止血のために多量に用いられた、ウシ真皮由来のコラーゲン製剤の中に混入した変性ウシTFが免疫原となったことをウェスタンブロッティング法を用いて明らかにした。ウシTFの細胞外ドメインに対応するcDNAをpAM82に挿入した発現ベクターを作成し、これを用いて酵母AH22株を形質転換し、得られた培地よりウシ可溶性リコンビナントTFを大量に調製した。このウシ可溶性TFは、N末端側から213番目のアミノ酸までで構成されている。ウシ可溶性TFをトリプシンで短時間消化すると、Arg129-Ala130のペプチド結合が切断され、アミノ末端側とカルボキシル末端側の2つのドメインに分解された。ウェスタンブロッティング法による検討にて、本TF抗体が2つのドメインをともに認識することが分かった。ウシ可溶性TFをシアン酸カリウムで処理すると、そのVIIa因子合成基質水解活性の増強効果は時間とともに消失し、VIIa因子との結合能が消失することがリガンドブロッティングにより判明した。この修飾TFをトリプシン消化後、逆相HPLCでペプチドマッピングを行ったところ、Lys-17のε-アミノ基のカルバミル化によって、可溶性TFのVIIa因子に対する親和性が著しく低下することが明らかとなり、この残基がVIIa因子との相互作用に大きく寄与していることが推定された。TF分子のアミノ末端側とカルボキシル末端側のそれぞれ100アミノ酸残基からなる2つのサブドメインに、VII(a)因子結合部位が含まれていることが次第に明らかとなってきている。ヒト、ウシ、ウサギ、マウスのTFのアミノ酸配列を比べると、残基番号81-90の領域と残基番号197-218の領域で相同性が低く、こうした領域がTFの種特異性に関連が深いと推定される。従って、肝切除術後に出現した抗TF抗体は、これらのドメイン上に存在する2つのVII(a)因子結合部位と結合することにより、明確な種特異性を示してウシTFとヒトVII(a)因子との複合体形成を阻害したものと考える。外因系血液凝固反応は、VII(a)因子が、血管内皮細胞あるいは単球、マクロファージなどの膜上に提示された組織因子(TF)と複合体を形成することにより惹起される。

このVII(a)因子とTFの分子間相互作用部位の決定は、外因系凝固反応の機作を知るうえで中心課題の一つである。我々は肝切除術を受けた患者の一部に、術後一過性にウシとウサギTFの活性を阻害するが、サルとヒトTFの活性を阻害しない抗体(IgGlambda-タイプ)が出現することを発見した。このことは、この抗TF抗体がTF分子上の種特異性を示す部位に結合することにより、TF-VII(a)因子複合体の形成を阻害することを示唆している。本抗体の阻害機序を解明するために、ヒト血漿よりモノクローナル抗VII因子抗体カラムにてVII因子を精製し、これにヒトXIIa因子を作用させてVIIa因子を得た。ウシTF-VIIa因子複合体によるX因子活性化に対する患者IgGの阻害効果を検討したところ、KmとVmaxを共に低下させるnoncompeitive inhibitorであることが判明した。即ち、本抗体はTF分子上のVIIa因子との結合部位に作用することにより、阻害することが示唆された。近年我々は、ヒトTFのcDNAを用いて、酵母での可溶性TFの発現に成功した。この発現系を用いて、ウシTFの細胞外ドメインに対応するcDNAをpAM82に挿入した発現ベクターを作成し、これを用いて酵母AH22株を形質転換した。得られた培地より、CM-Sepharoseカラムを用いてウシ可溶性リコンビナントTFの大量調整に成功した。このウシ可溶性TFは、N末端側から213番目のアミノ酸までで構成されている。患者に出現した抗TF抗体がウシ可溶性リコンビナントTFに結合することを、ウェスタンブロッティング法にて確認した。現在、ウシ可溶性リコンビナントTFをプロテアーゼで限定分解後のペプチド断片と、抗TF抗体との結合をドットブロッティング法にて検討中である。さらに、本抗TF抗体の出現機序については、肝切除術中に局所の止血のために多量に用いられたウシ真皮由来のコラーゲン製剤の中に混入した変性ウシTFが免疫原となったことを、ウェスタンブロッティング法を用いて明かにした。我々は肝切除術を受けた患者の一部に、術後一過性にウシとウサギのTF活性を阻害するが、サルとヒトのTF活性を阻害しない抗体(IgGλ-タイプ)が出現することを発見した。ウシTFの細胞外ドメインに対応するcDNAをpAM82に挿入した発現ベクターを作成し、酵母AH22株を形質転換した。得られた培地より、CM-Sepharoseカラムを用いてウシ可溶性リコンビナントTFの大量調製に成功した。ウシ可溶性TFをトリプシンで短時間消化すると、Arg129-Ala130のペプチド結合が切断され、アミノ末端側とカルボキシル末端側の2つのドメインに分解された。ウェスタンブロッティング法による検討にて、本TF抗体が2つのドメインをともに認識することが分かった。ウシ可溶性TFをシアン酸カリウムで処理すると、そのVIIa因子合成基質水解活性の増強効果は時間とともに消失し、VIIa因子との結合能が消失することがリガンドブロッティングにより判明した。
難治性消化器癌におけるＳＥＴ関連ヒストンメチル化修飾酵素の分子病理学的検討

ヒストン修飾変化と癌との関連性が注目されており、EZH2やSETDB1を含むSETドメインと呼ばれる保存された領域を持つヒストンメチル化修飾因子(酵素)の発現異常が多くの癌で検出されている。我々は胃癌組織を用いてSET関連遺伝子の一つであるSETDB2の免疫組織化学染色を行い、SETDB2タンパク質が胃癌の約30%で高発現していることを明らかにした。臨床病理学的諸性状との関係ではSETDB2の発現異常頻度は進行胃癌で高く、患者予後が有意に悪かった。機能的解析の結果、SETDB2を強制発現すると、胃癌細胞の増殖および浸潤能が亢進した。更にSETDB2はヒストンH3K9のトリメチル化活性機能を持つことが示唆された。SETDB2は癌抑制遺伝子WWOXとCADM1のプロモーター領域にリクルートされると、その部分のヒストンH3K9トリメチル化を介してこれら遺伝子の発現を抑制していることを明らかにした。またエピジェネティック阻害薬(X)を処理するとSETDB2高発現胃癌細胞株の細胞増殖が低下した。これらの研究は一過性発現実験系であるため、更にレンチウイルスを用いたSETDB2を安定的に発現する胃癌細胞株とゲノム編集法を用いたSETDB2ノックアウト細胞株の樹立を行うことで検証実験を行っている。更にSETDB2と複合体を作るタンパク質を明らかにし、現在解析を進めている。また膵神経内分泌腫瘍におけるDAXX遺伝子の発現低下ヒストンH3K9のトリメチル化の関連、膵癌でのヒストンリジンメチル化酵素KDM6Aの発現低下とヒストン脱アセチル化酵素阻害剤の有効性、および胃癌におけるヒストンアルギニンメチル化酵素PRMT6の発現亢進を明らかにするなど、エピジェネティクス構成因子の異常と臨床病理学的諸因子との関連や機能的役割の解析を行った。初年度は胃癌におけるSETDB2発現亢進に関する論文発表ができたので、平成29年度はその機能的役割を解析するため、SETDB2のFLAG付きおよびGFP付きベクターを導入した安定発現細胞株とCRISPR/Cas9によるノックアウト細胞株を樹立した。SETDB2高発現細胞株を用いて、免疫沈降法によるSETDB2と結合する因子の探索を行った。またSETDB2を高発現させた細胞株にエピジェネティック治療薬を複数試したところ、一部の治療薬でSETDB2発現抑制と細胞増殖抑制効果が得られた。この治療薬(X)は他のSET関連酵素の阻害剤でもあり、平成30年度は免疫沈降解析を更に進め、SETDB2と複合体形成しているタンパク質(Y)を明らかにした。近年、H3K9トリメチル化に関わるSET関連タンパク質SETDB1とSUV39H1がヒストンシャペロンの1つであるDAXXと結合することが報告された。我々の検討では膵神経内分泌腫瘍においてDAXXは標的遺伝子PCDH7のH3K9トリメチル化を介してがん抑制的に働くことを明らかにした。更に、ヒストンアルギニンメチル化酵素PRMT6とヒストン脱メチル化酵素KDM6の異常がそれぞれ膵臓癌と胃癌で多いことを報告した。マウスの実験系において、KDM6AやPRMT6では造腫瘍性実験を進めたが、SETDB2に関してはやや遅れている。しかし、ヒト組織検体を用いたクロマチン免疫沈降法(Chromatin Immunoprecipitation ChIP)を確立することができるなどの成果が得られるなど全体的には十分な成果が得られている。胃癌におけるSETDB2の発現異常を報告したので、引き続き、その機能解析と阻害剤探索を進めている。ヒストン修飾因子の解析においてChIP解析は必須であるが、従来より細胞株を用いた解析が多くの施設で行われているものの、組織検体ではChIPの条件設定が難しかった。本研究において組織を用いたChIP解析が可能になったので、難治性癌組織を用いたヒストン修飾変化の解析を行っている。マウス実験系に関してはSETDB2に関する抗癌剤投与を行うことを計画したが、in vitroでの成果までの到達であり、この部分の未使用額が生じた。現在、いくつかのヒストンSET関連酵素は、複合体(例えば、MLL4はKDM6Aと複合体形成する)を作って機能していることが報告されており、タンパク質間相互作用が注目されている。論文を作成する上でSETDB2の阻害剤についてより詳細に検討すること、および機能的実験(相互作用するタンパク質の解析)の追加が必要となり、最終年度以降も研究を継続することとなった。DAXX、KDM6A、PRMT6とSET関連酵素との相互作用についても検討が必要と考えている。以上の理由をもとに、補助事業期間の延長申請を行い、承認された。ヒストン修飾変化と癌との関連性が注目されており、EZH2やSETDB1のようなSETドメインと呼ばれる保存された領域を持つ遺伝子の発現異常が多くの癌で検出されている。我々は胃癌組織を用いてSET関連遺伝子SETDB2の免疫組織染色を行い、SETDB2が胃癌の約30%で高発現していることを明らかにした。臨床病理学的諸性状との関係では進行胃癌におけるSETDB2の発現異常頻度が高く、それらは患者予後が有意に悪かった。またSETDB2は胃癌組織内で発現が異なる場所が存在し、SETDB2の組織内heterogeneityの可能性が示唆された。

SETDB2は癌抑制遺伝子WWOXとCADM1のプロモーター領域にリクルートされると、その部分のヒストンH3K9トリメチル化を介してこれら遺伝子の発現を抑制していることを明らかにした。またエピジェネティック阻害薬(X)を処理するとSETDB2発現が低下した。この研究はtransientな実験系であるため、引き続きSETDB2を安定的に発現する胃癌細胞株、およびゲノム編集法を用いたSETDB2ノックアウト細胞株の樹立を進めている。また、肝癌や膵癌においてもSETDB2タンパク質の免疫組織染色を進めており、難治性癌におけるSETDB2の役割を引き続き検討中である。我々は既に胃癌でSET関連遺伝子SET7/9が癌抑制的な働きを持つことを報告している。現在、SET7/9のノックアウト細胞の樹立を進めている。今後、これらの細胞株を用いて機能的解析を進める。初年度は胃癌におけるSETDB2発現亢進に関する論文発表ができた。更に、肝癌や膵癌でもSETDB2の発現解析を開始した。また機能的解析を行う上で、SETDB2の安定発現細胞株とノックアウト細胞株の樹立も順調に進めている。しかし、SET関連遺伝子の発現が異なる組織内領域についての分子生物学的解析およびマウスの実験系においてはやや遅れている。ヒストン修飾変化と癌との関連性が注目されており、EZH2やSETDB1のようなSETドメインと呼ばれる保存された領域を持つ遺伝子の発現異常が多くの癌で検出されている。我々は胃癌組織を用いてSET関連遺伝子SETDB2の免疫組織染色を行い、SETDB2が胃癌の約30%で高発現していることを明らかにした。臨床病理学的諸性状との関係ではSETDB2の発現異常頻度は進行胃癌で高く、患者予後が有意に悪かった。機能的解析の結果、SETDB2を強制発現すると、胃癌細胞の増殖および浸潤能が亢進した。更にSETDB2はヒストンH3K9のトリメチル化活性機能を持つことが示唆された。これらの研究は一過性発現実験系であるため、更にレンチウイルスを用いたSETDB2を安定的に発現する胃癌細胞株とゲノム編集法を用いたSETDB2ノックアウト細胞株の樹立を行った。さらに我々は既に胃癌でSET関連遺伝子SET7/9が癌抑制的な働きを持つことを報告しており、SET7/9のノックアウト細胞の樹立を行った。今後、これらの細胞株を用いてSETDB2とSET7/9の機能的解析を進める。新たに膵神経内分泌腫瘍におけるDAXX遺伝子とヒストンH3K9のトリメチル化の関連
生物から環境への「反作用」に着目した生態学・地球化学・進化学的理論研究

本研究課題では生物から環境への影響(反作用)の生態学・進化学・地球化学的意味を理論的に考察することを目標とし、微生物生態系を対象とした数理モデリングと解析を行った。反作用がある場合と無い場合のモデルの応答について定性的・定量的な解析を行った結果、生物による環境への寄与は生態系の安定性や個体群の絶滅リスクに影響を与える他、物質の循環速度や存在形態、系のエネルギー状態と密接に関係することが明らかになった。本研究では微生物群衆と物理化学的環境の相互作用を理論的に説明することを目指した数理モデル研究を展開する。今年度は特に(1)植物プランクトンとpHの相互作用モデル、(2)化学合成細菌と系の化学的エネルギー量の相互作用モデルの2つのモデルの解析を行い、国際学会で発表した。更に(3)光合成・従属栄養バクテリアと有機態炭素の相互作用に関する2つの数理モデル研究について2本の論文を発表した。(1)について当初は化学合成細菌とpHの相互作用に着目する予定であったが、二酸化炭素濃度上昇に伴う海洋酸性化に対する植物プランクトンとpHの相互作用の応答を知ることが急務であったため、対象を植物プランクトンに変更した。研究成果を2つの国際学会並びに1つの国内学会で発表し、現在論文執筆中である。また、共同研究者にモデル検証のための培養実験を依頼している。(2)について化学合成細菌と系の化学エネルギー量の相互作用モデルの解析を行い、化学合成細菌が系のエネルギー量に与える影響を理論的に考察し、地球化学分野で用いられる化学反応式のみで記述された「Energetic Model」では化学合成細菌の存在や増殖を予測するのに不十分であることを導いた。この結果について1つの国際学会で発表を行い、現在論文をGeomicrobiology Journal誌に投稿中である。また、本研究に関連する共同研究をUniversity of WaterlooのDr. Philippe Van Cappellenと開始した。(3)についてシアノバクテリアが湖沼で有機物を供給することで生じるレジームシフト現象に関する論文を執筆、Journal of Theoretical Biology誌に掲載された。海洋の微生物ループにおける溶存有機態炭素分解と微生物群衆の相互作用に関する論文を執筆、Chemosphere誌に掲載された。本研究では、物理化学的環境から生物への「作用」に焦点を当ててきた従来の多くの生態学モデルに対し、生物から物理化学的環境への「反作用」に着目し、生物と環境の相互作用の理論的法則性の解明に望んできた。生物による物理化学的環境への影響、その結果として生じる生物の増殖動態や適応度の変化を知ることは、地球化学的な物質の挙動や生物の生理・生態系の成り立ちを理解する上で非常に重要である。平成23-24年度は植物プランクトンや従属栄養バクテリアがリン・亜鉛・炭素の循環に影響することで、それぞれの個体群の増殖動態や微生物ループの構造に及ぶ影響について、数理モデリングとその解析によって検証した。これらの研究成果について2本の論文を国際誌(Journal of Theoretical Biology誌並びにChemosphere誌)に投稿、受理された。また、本研究成果について国内学会で1件の招待講演、シンポジウムで1件の講演、国際学会で1件の口頭発表を行った。平成24-25年度は酸化還元反応を促進することによって代謝に必要なエネルギーを得る化学合成細菌群衆を対象とし、化学反応と化学合成細菌の個体群動態をモデル化し、エネルギー収量と反応速度の変化に対する細菌個体群の応答について調べた。化学合成細菌はバイオリメディエーション技術に用いられる他、地球上の様々な栄養塩・重金属の循環に密接に関わる。この研究成果について1本の論文を国際誌(Geomicrobiology Journal)に投稿、受理された他、現在2本の論文を執筆中である。また、本研究成果について国内学会で1件の口頭発表、国際学会で2件の口頭発表を行った。本研究を通し、カナダのUniversity of WaterlooのEcohydrology Research Groupとの共同研究に着手することとなり、現在進展中である。主に微生物群衆とpHの相互作用系を対象とし、平成23年度は申請書の計画通り数理モデルの構築と解析を遂行した。当初の予定とは異なり、化学合成細菌群衆ではなく植物プランクトン群衆によるpH改変のモデル化を行うこととした。これは二酸化炭素濃度上昇に伴う海洋酸性化の進行に対し、植物プランクトン-pH間の相互作用系がどのように応答するのかを調べることが急務であると認識したためである。モデル解析の結果、植物プランクトンが光合成と呼吸を介してpHを変化させることにより、化学平衡のみで決定するpH変化よりもpH変化が緩衝される場合があること、また、プランクトンバイオマス量変化に応じ、pHのレジームシフトが生じる可能性が明らかになった。

これらの結果について現在論文を執筆すると共に、平成24年度より他の研究助成事業による共同研究にて、異なる二酸化炭素条件下での植物プランクトンの培養実験に着手し、実験結果との比較によるモデルの検証を予定している。モデルの正当性を証明することができた暁には、将来の海洋酸性化を予測する上で重要な知見を与えることができる。尚、現在同時進行で化学合成細菌群衆によるpH改変のモデル解析にも取り組んでいる。平成23年度は上述の研究とは別に、植物プランクトン・バクテリアがリン・亜鉛・炭素の循環に与える影響について2本の論文を執筆、現在査読を経て再度投稿中の状態である。また、これらの研究成果について国内の学会で1件、その他セミナーで1件口頭発表を行った。本研究では化学合成細菌とpHの相互作用系に着目した数理モデル研究を推進する予定であった。しかしながら、植物プランクトンとpHの相互作用系の理解の性急な必要性を考慮し、研究対象を植物プランクトンに拡張し、現状微生物群衆と物理化学的環境の相互作用を理論的に説明することを目指している。植物プランクトンとpHの相互作用系についてはモデル解析によりいくつかの重要な結果を得て、2つの国際学会で成果を発表することができた。化学合成細菌群衆については特に系のエネルギー状態に着目した研究を行い、1つの国際学会で研究成果を発表、また、その発表内容を現在国際誌に投稿中の状態である。更に次年度よりDr. Philippe Van Cappellenとの共同研究により、特に鉄酸化・還元細菌に着目した微生物と鉄循環の相互作用系モデルの構築・解析を進める予定である。加えて、光合成・従属栄養バクテリアと有機態炭素の相互作用に関する2本の論文を出版することができた。上記の成果から、研究の目的はおおむね達成できていると評価する。先述の通り、当初の予定とは異なり化学合成細菌群衆ではなく植物プランクトン群衆を対象とし、植物プランクトンとpHとの相互作用系のモデル構築、解析を遂行した。対象は異なれど、モデル解析については順調に進展しており、現在論文を執筆中である。また、次年度からは計画書に記したとおり実証研究に踏み切るに至ったため、研究はおおむね順調に進展していると判断した。今後は1)植物プランクトンとpHの相互作用モデル、(2)化学合成細菌と系の化学的エネルギー量の相互作用モデルの発展と解析を主とした研究を推進すると共に、これまでの研究成果を国際誌で発表することを優先する。1)について共同研究者の培養が完了次第、統計解析によって実験データを用いたモデルの妥当性の検証を行う。モデルの妥当性が確認された暁には、ハイインパクトファクターの雑誌への投稿を目指す。モデルの妥当性が確認されなかった場合にはモデルの見直しを行い、最終年度中に論文を投稿する。2)について今後は化学合成細菌の中でも特に鉄酸化・還元細菌をターゲットとし、鉄酸化・還元細菌と鉄循環過程の相互作用系の理論研究を推進する。
放鷹文化と鷹書類の研究

わが国において、鷹狩りの実技がもっとも盛んに行われた中世から近世(12C19C)において成立した鷹書の調査に取り組んだ。この時期の鷹狩りは、もっぱら武家によって実践されており、その主要な担い手として、将軍家や各地の大名家に仕えた鷹匠たちの存在が重要である。本研究では、そのような鷹匠の末裔諸家に伝来した文献類を取り上げ、その叙述内容の検討を通して当時の鷹狩りに関する新たな知見を得た。さらには、その成果を踏まえて、武家流放鷹文化の実相を明らかにすると同時に、それに伴う鷹書研究の適正な手法をある程度確立することができた。本研究課題を進める際の研究母体である鷹書研究会の例会を本年度は2回開催した(平成25年7月21日、平成26年3月17日、いずれの会場も長野県短期大学)。各例会では、研究分担者の中澤克昭と二本松泰子及び山本一が持明院家の鷹書や富山市立図書館所蔵の鷹書についての調査結果を報告し、その研究成果を共有した。また、研究分担者の二本松泰子は伝承文学研究会平成25年度大会の公開シンポジウム「諏訪信仰と伝承文学」においてパネラーとして登壇し「鷹書からみた中世の諏訪」というテーマで報告した(平成25年9月7日、於長野県短期大学)。すなわち、諏訪円忠の子孫である貞通の鷹書類について取り上げ、それらに記載されている諏訪信仰がどのような特性を有するのかについて明らかにした。その成果は論文化してすでに公刊している。同じく二本松泰子は韓国の鷹書である『鷹鶻方』の諸本に関する調査を進め、日韓放鷹文化の比較研究の端緒を開いた。すなわち、李瑢編とされる『古本鷹鶻方』(15世紀成立)と李エン編とされる『新増鷹鶻方』(16世紀成立)の両書に引用されている魏彦深作の漢詩と我が国最古の鷹書とされる『新修鷹経』に見える漢詩文との比較検討を通して、鷹書に漢詩が記載されている意味について考察を進めた。その成果の一部は生き物文化誌学会第11回学術大会で発表した(平成25年7月7日、於星薬科大学)。このような日韓放鷹文化の比較研究は、当初の予定通り次年度以降の本研究の中心的課題としてゆく予定である。そのほかにも、本研究課題の集大成として目指している鷹書類の注釈テキスト刊行に向けて、蒐集したテキスト類の本文翻刻やその記載内容のデータベース化を進める作業も進めることが出来た。これらは鷹書類から放鷹文化を多角的に理解するために必須の基礎情報であることから、今後も作業を続けてゆく予定である。当該年度は本研究の活動基盤となる鷹書研究会の例会を、平成23年5月5日(土)、7月29日(日)の計2回開催した。また、同研究会が平成20年度以来毎年恒例として開催している放鷹文化講演会を10月28日(日)(テーマ:信濃の鷹狩り、於:長野県長野市)と12月1日(土)2日(日)(テーマ:富士と鷹狩り、於:静岡県富士宮市)の2回に渡って開催した。その成果としては、まず、本研究の主要目的である宮内庁書陵部に所蔵されている諏訪流の鷹書類について、相応量のテキストを調査・蒐集することができた。それらはいずれも書誌情報を整理してデータベース化し、その文化的影響力の実態を明らかにしてゆくための研究を進める基礎作業を推進した。さらには、諏訪流の鷹書と所縁深い西園寺家やその縁戚関係にある持明院家の鷹書についても調査を進め、公家流の鷹書類の特性についても一部明らかになった(西園寺家の鷹書に関する研究成果は伝承文学全注釈叢書『立命館大学図書館西園寺文庫蔵鷹書類』2014年度内に三弥井書店から公刊予定)。その成果を以て、今後、武家流の放鷹術である諏訪流放鷹術の相対的な意義について明らかにしてゆく準備作業が整えられた。また、放鷹文化講演会については、その参加人数が長野市で200人、富士宮市で600人と盛会であった上、NHKや地元新聞社などのマスコミに取り上げられ、本研究の成果を広く一般に広める機会となった。その他、本研究のもうひとつの主要な目的である朝鮮の鷹書類についても研究が進んだ。当該年度は、朝鮮で成立した鷹書のうち、古本『鷹鶻方』について注目した。すなわち、韓国国立中央図書館蔵『鷹鶻方全』(古古7-30-44)の奥書を検討して、同書が我が国に伝来した経緯を明らかにし、日韓放鷹文化交流史の一側面について言及した。その成果は研究分担者である二本松泰子が公刊論文にして発表した。本年度において本研究課題を推進するために実施した主な研究活動は以下の2点である。1韓国国立中央図書館での実施調査2本研究課題の活動基盤となっている鷹書研究会主催の放鷹文化講演会の開催上記のうち1については、朝鮮の鷹書である『鷹鶻方』の種々の写本や版本及び関連文献をを調査した。中でも李兆年編(14世紀)とされる『高麗古本鷹鶻方』(貴古朝68-41)は日本に伝来しなかったテキストであるため、現物は当館でしか閲覧できない朝鮮本である。今回の調査で同写本に古ハングル文字の書き込みが確認できた。このことから、同本は“高麗本"とは称するものの、実際に書写された時代はもう少し下がるものと予想される。

また、李瑢編(15世紀)の『古本鷹鶻方』(古古7-30-44)は、韓国において『新編集成馬醫方』『新編牛醫方』と併せて「獣医学書」と一括認識されている点が注目される。というのも、たとえば我が国では、寛文6年(1666)に成立した『和漢書籍目録』の「軍書」に「馬書」「馬経大全」「同乗方」「朝鮮馬書」が分類されているが、その項目に「鷹書」は分類されておらず、“馬書"と“鷹書"は別種の伝書とみなされていたことが窺える。このような事象を端著として、日韓における伝書のテキスト享受と放鷹文化交流の実相を一端を明らかにすることができた。2については、第9回放鷹文化講演会「松代藩と鷹狩り」を開催し、かつて松代藩士であった祢津氏に関する鷹狩りをテーマにした講演会を行った。同講演会をきっかけに同氏の末裔である祢津家当主から当家伝来の鷹書類が存在することをご教示いただき、調査する機会を得ることができた。そのことによって、“祢津流の放鷹術"には、従来知られてきた祢津松鷂軒の流れを汲むもののみならず、松代藩に仕えた祢津家嫡流による流派が存在することが明らかになった。採択期間最終年度であった平成27年度は、本研究課題の集大成として、鷹匠伝来鷹書における文化伝承の解明に特化して調査を進めた。前年度まで集中的に調査を進めた西園寺家や持明院家など公家流の鷹書は、その内容のほとんどが他家(他流派)伝来鷹書からの引用で、独自性が無いことがほぼ確認できたため、放鷹文化の実情を探る手がかりとして、あまり役に立たないことが解明された。同様に、慈円や藤原定家などの名前が冠せられることの多い「鷹百首」類も、鷹狩りの現状とは無縁の歌集で、そもそも鷹書の範疇に入れるべき書物ではないことも確認できた。それに対して、「鷹匠」伝来の鷹書は、実際に鷹狩に従事した書写者の実情を反映したもので、その文化的環境に即した叙述が多く収録されているのである。そこで、本年度は、埋もれた鷹書類のうち、鷹匠伝来のもの限定で調査を進め、本邦放鷹文化研究に必要な基礎資料の体系化を目指した。その結果、加賀藩と仙台藩に仕えた鷹匠の依田氏と佐藤氏に伝来した鷹書類を発見することができた。なかでも、加賀藩の鷹匠である依田氏に伝来した蔵書群は、80点を越える鷹書と20点を越える鷹文書からなる文献群である。当家は信濃国小縣郡依田荘(長野県上田市丸子町)を本貫地とする一族で、近世前期にまず富山藩に仕え、のちに加賀藩に仕官した。同氏伝来の鷹書群は家康に仕えた祢津松鷂軒(政直)の流派である「祢津流」のテキストと自称しており、中世末期近世期に隆盛した同派の伝播媒体となっていたことが予想される。一方、仙台藩の佐藤氏に伝来した鷹書類は、伊達政宗に仕えた廣田宗綱を開祖とする「廣田流」を称するものであった。このような他家の名前を冠する流派のテキスト群のデータを入手することにより、当時の武家流の放鷹文化の実相について、流派の展開からアプローチする手がかりを得ることができた。その成果は成稿し、公刊論文にして発表した。これまでの鷹書研究は、公家に流布したものや鷹百首類なども一様に「鷹書」と見做して調査対象とされてきた。しかし前述のとおり、放鷹文化の実相を探る手がかりとして有益なのは、実際に鷹狩に従事した鷹匠が伝来した鷹書である。それらは、鷹匠の家に伝わることから、ほぼ個人蔵である。ところで、鷹書は、一般に周知されていないことから、個人蔵のものは概ね埋もれたままになっている。相当数の現存が予想されるものの、注目度が低いことから、所在不明となる恐れが高く、その保存と整理が急務である。そのことも含めて、本研究では、個人蔵鷹書の調査を特に重視する方針に転換した。
コンクリートの耐凍害性に及ぼす寒中施工の養生の影響

十分な量のエントレインドエアを混入させた若材齢コンクリートを対象として、コンクリートの耐凍害性に及ぼす寒中コンクリートの養生方法について検討した。本研究で得られた主な知見を以下に示す。(1)湿潤養生が困難な初期材齢に12日程度の適度な乾燥を許容し、その後に十分な湿潤養生を行う方法は、強度発現性状をほとんど損なうことなく、耐凍害性を著しく改善する実用的な方策として有効である。(2)養生方法が同じならば、養生終了時の所要圧縮強度は、水セメント比が小さい場合ほど小さくてよい。(3)養生方法が同じならば、通常の水セメント比の範囲(W/C=4565%)においても、水セメント比を小さくすることによって必要養生日数を大幅に短縮できる。(4)自然環境におけるような緩やかな凍結融解作用を受ける場合にコンクリートに生じる内部劣化は、独立した形の極めて微細なものと考えられ、セメントの水和能力が多く残存していれば、これを修復することが可能である。(5)水セメント比を小さくすれば、凍害による内部劣化の修復能力の増大、養生終了後の強度増進による劣化抵抗性の増大、自己乾燥による飽水度の減少などの、コンクリートの耐凍害性を向上させる効果が高まる。(6)飽水状態に近いコンクリートの耐凍害性能は、その圧縮強度のみによって決まる。このような含水状態で、十分な耐凍害性を確保するために必要な圧縮強度は、約230kgf/cm^2である。本年度の研究計画に対応させた研究実績の概要は以下のようである。エントレインドエアを十分(約6%)に混入したAEコンクリートを対象とし、その打込み後0.510日(20°C)に、1日1回の緩速凍結融解(+10-18°C)を10サイクル与えた場合の内部劣化の程度を動弾性係数の変化で調べた試験では、(1)初回凍結を受ける直前の圧縮強度が小さいほど内部劣化が大きくなること、(2)同じ強度レベルでも、水セメント比が大きい場合ほど内部劣化が大きくなること、等の傾向を示す結果が得られた。ただし、この緩速凍結融解試験による動弾性係数の低下は比較的小さく、最も条件の悪い場合(水セメント比が65%、初回凍結を受ける際の圧縮強度が28kgf/cm^2)でも(修正)相対動弾性係数の値は85%以上であった。また、圧縮強度も、初回凍結を受ける際の強度が大きいものほど低下率は小さくなったが、本来有していると考えられる強度の約80%は確保されていた。そして、これらの劣化を生じた供試体を水中に76日間静置しておいたところ、耐凍害性能と圧縮強度は健全な状態にまで完全に回復することが確認された。これらの結果から、本研究で緩速凍結融解を与えた供試体の内部劣化は、セメントの水和が継続すれば比較的容易に修復可能な微細なひび割れであると考えられた。しかしながら、この程度の劣化であっても、それらがそのまま残存すれば、コンクリートの耐凍害性能が損なわれ、特に水セメント比が55%以上の範囲においてこの悪影響が顕著になることが認められた。前年度から持ち越された若材齢コンクリートの耐凍害性能に関する試験では、(1)十分な空気が混入されるならば、コンクリートの水セメント比や含水状態に関係なく、230kgf/cm^2の圧縮強度が得られるまで養生することにより十分な耐凍害性が確保できること、(2)寒中コンクリートの施工では湿潤養生を避けることが耐凍害性の観点から極めて有利であり、打込み直後から12日程度適度に乾燥させても強度発現に悪影響を及ぼさないこと、などの新たな知見が得られた。

また、厳しい自然環境下における一冬の凍結融解作用を模した1日1回の緩速凍結融解(+10-13°C)を60サイクル与えた試験では、(1)緩速凍結融解の間に、長さ変化率の値にほとんど影響を及ぼさない程度の極めて微細な劣化がコンクリート中に生じること、(2)この微細な内部劣化は、その後の耐凍害性に影響を及ぼし、その程度は水セメント比が大きい場合や含水量が多い場合に特に著しくなること、(3)水セメント比が60%を超える範囲では、内部劣化が修復される効果はあまり期待できないこと、(4)水セメント比が45%以下の範囲では、極めて厳しい環境下でも、比較的容易に十分な耐凍害性を確保できること、(5)湿潤養生しない場合の養生終了時の所要圧縮強度は、水セメント比が60および65%の場合に、それぞれ、約50および150kgf/cm^2であり、湿潤養生の場合に比べて著しく小さくなること、等の実用上極めて有用な結果が得られた。
高速液体クロマトグラフィー質量分析計による体組織試料の分析とデータベースの作製

高速液体クロマトグラフィー(HPLC)・質量分析計(MS)(LC/MS)を用い、ヒト体組織試料中の薬毒物スクリーニング分析法を確立する目的で研究を行った。MSのイオン化はfast atom bombardment(FAB)法、インターフェースはキャピラリーチューブ(55μm,i.d.)とfritを用いた。LCはカラムスイッチングシステム・Develosil C_<18>(0.3mm,i.d.)キャピラリーカラム(濃縮・分離)を用い、ミクロ流量用に改造したシステムで行った。移動相は水・メタノール系に酢酸を加えた系をベースとし、分離は高極性から低極性物質まで検出できるようにメタノール濃度勾配グラディエントにより行った。試料の前処理は、毛髪はアルカリにより溶解させた後、その他の試料は過塩素酸により除蛋白した後(尿を除く)、Extrelutを用いて固相抽出を行った。内部標準物質(IS)として7-エチルテオフィリンを用いた。多くの薬毒物はこのグラディエント溶離により、分離・検出された。検出されたピークはISの保持時間(RT)と対比することによる相対保持時間(RRT)を求めた。化合物Xの相対保持時間RRT(X)=RT(X)/RT(IS)×1000で求めた。LC/FAB-MSにはデータベースがなく、マススペクトルが得られてもGC/MSのような検索が出来ない。今回はRRTとマススペクトルを検索ファイルに登録し、それらから検索できるように入力した。今回は血液・尿・毛髪について、ほぼいつも検出される物質、および向精神薬や睡眠薬等50の物質について登録を行った。入力データをさらに増やすことにより、今まで不可能とされてきたLC/MSによる薬毒物スクリーニング分析が実現できると考えられる。しかし、数千数万とある化合物を考えると、個人レベルでの入力には限界があり、商業レベルでのLC/FAB-MSにおけるマススペクトルパターンによる検索データベースの供給が強く求められることも再認識された。
低出力超音波パルスの血管新生作用と内軟骨性骨化に対する効果の検討

骨折治癒過程におけるCOX2の役割を明らかにするために、10週齢(若週齢)および40週齢(高週齢)COX2ノックアウト(KO)マウスとワイルドタイプ(WT)マウスの両側大腿骨骨折モデルを計4群に分けて作製した。片側に低出力超音波パルス(Low intensity pulsed ultrasound ; LIPUS)を照射したものを照射群、反対側を非照射群とした。それぞれの群を骨折後時系列で犠牲死させ、LIPUSが骨折治癒過程に与える効果を軟X線撮影、μCT撮影、組織化学染色および組織免疫染色を用いて検討した。高週齢COX2 KOマウスでは、骨折後10日の膜性骨化と軟骨形成は、高週齢町マウスと同等に認められた。骨折後21日では内軟骨性骨化を認める一方で、骨折部に隣接する仮骨中心部の線維性組織が広範囲にわたり残存していた。このモデルに対してLIPUSを骨折後1日から照射しても、骨折治癒過程に大きな変化は認められなかった。これらの結果から、LIPUSの骨折治癒促進効果を示す機序にはCOX2が必須であると考えられた。そこで骨折部にプロスタグランジンE2受容体であるEP2,EP4アゴニストを局所投与したところ、骨折後21日目の内軟骨性骨化の遅延は、高週齢WTマウスと同等まで回復した。この条件下でLIPUSを照射したところ、骨折21日目には硬性仮骨架橋を認めるようになった。よって、LIPUS照射による骨折治癒、特に内軟骨性骨化促進作用機序にはCOX2が深く関与し、EP2,EP4以下のシグナルが必須であることが解明された。さらに、組織学的検討においてLIPUS照射群でのみ、仮骨周囲を構成する線維性組織にはVEGFシグナル陽性所見を認め、同部位に一致して旺盛な血管新生を認めた。これらの結果から、VEGFシグナルカスケードと骨折治癒過程における内軟骨性骨化の間には、何らかの相関関係が存在することが示唆された。若週齢WTマウスでは、骨折後3日で血腫形成、5日で炎症性細胞の浸潤、膜性骨化および軟骨形成、7、10日で軟骨架橋と内軟骨性骨化、14日で硬性仮骨架橋形成による骨癒合を認め、21日で骨癒合とリモデリングを認めた。若週齢COX2 KOマウスの骨折治癒はWTマウスと同等に認め、COX2の有無による著変は認めなかった。高週齢骨折モデルの骨折治癒過程は、若週齢に比して軟骨形成と内軟骨性骨化にかかる期間が延長を示した。このモデルにLIPUSを骨折後1日から照射しても、骨折後10日の膜性骨化と軟骨形成に変化は認めなかった。しかし、硬性仮骨架橋を認めるまでの内軟骨性骨化にかかる期間を著しく短縮した。これらの結果から、LIPUSは高週齢骨折モデルにおける骨折治癒遅延に対しても骨折治癒促進効果を示したと考えられた。高週齢COX2 KOマウスでは、骨折後10日の膜性骨化と軟骨形成は、高週齢WTマウスと同等に認められた。

よって、LIPUS照射による骨折治癒、特に内軟骨性骨化促進作用機序にはCOX2が深く関与し、EP2,EP4以下のシグナルが必須であることが解明された。さらに、組織学的検討においてLIPUS照射群でのみ、仮骨周囲を構成する線維性組織にはVEGFシグナル陽性所見を認め、同部位に一致して旺盛な血管新生を認めた。これらの結果から、VEGFシグナルカスケードと骨折治癒過程における内軟骨性骨化の間には、何らかの相関関係が存在することが示唆された。
動脈硬化における小胞体ストレス及びミトコンドリアに対するWFS1の役割の解明

WFS1欠損マウスの動脈硬化に関する影響についての研究1、カフ傷害における内膜肥厚に関する影響。8週齢のWFS1欠損マウスを用いて、片側の大腿動脈にカフ傷害を施し、3週間後に同部位の動脈を採取、内膜の肥厚度の検討や免疫組織学的検討を行う。カフ留置部位の血管からmRNAを抽出し、炎症反応や小胞体ストレス、酸化ストレス応答に関連した分子の発現を検討し、また具体的なメカニズムを調べるため細胞系を用いて検討を行った。2、WFS1・アポEダブル欠損マウスにおける粥状動脈硬化の検討。高コレステロール食を負荷したWFS1・アポE二重欠損マウスを用いて大動脈全体の内面を脂肪染色することで、動脈硬化病変を定量化し、また大動脈の免疫組織学的検討を行なう。大動脈全体からmRNAを抽出し、炎症反応や小胞体ストレス、酸化ストレス応答に関連した分子の発現を検討した。3、血管内皮細胞のミトコンドリア形態の観察。WFS1欠損マウスの血管内皮細胞のミトコンドリアの形を電子顕微鏡を用いてミトコンドリアについても検討した。WFS1欠損マウスの血管では、ミトコンドリアの膨大化やクリステの減少など、形態変化が認められた。以上WFS1欠損マウスを用いた実験結果から小胞体ストレス関連タンパクWFS1は小胞体ストレス、炎症ストレスと酸化ストレスを軽減する役割があり、動脈硬化の発症発展の段階で防御的に影響を果たしている可能性をしさした。酸化ストレス反応や炎症反応増加につながる機序として、ミトコンドリア機能低下の関与が想定される。全身でのWFS1欠損マウスの動脈における表現型の解析1)カフ障害におけるWFS1欠損の影響の検討8週齢のWFS1欠損マウスを用いて、片側の大腿動脈にカフ傷害を施し、3週間後に同部位の動脈を採取、内膜の肥厚度の検討や免疫組織学的検討を行う。カフ留置部位の血管からmRNAを抽出し、炎症反応や小胞体ストレス、酸化ストレス応答に関連した分子の発現を検討する。WFS1の全身での欠損マウスを用い、カフ傷害における炎症性反応性内膜肥厚についての影響を検討した。WFS1欠損マウスでは野生型マウスに比べ、炎症性反応性内膜肥厚が有意に進んでいた。またカフ内の血管での遺伝子発現についてRT-PCR方法を用いて検討を行った結果、WFS1欠損マウスでは野生型マウスに比べカフ傷害による血管での炎症性因子や、平滑筋増殖因子などの発現が有意に上昇していた。またWFS1の血管内膜肥厚に対する影響に対して詳しいメカにズーム調べるため骨髄移植実験を行った。骨髄移植後、同様にカフ傷害を施し、内膜肥厚について解析を行った。結果、WFS1欠損骨髄を移植したマウス群でカフ傷害内膜が有意に肥厚していた。血球由来のWFS1が炎症に対する血管の内膜肥厚に重要な役割を果たしていると考えられた。また、この実験結果の元で、ex vivo、in vitroの実験を行った。腹膜由来のmacrophageとJ7741A細胞を用いてWFS1欠損と過剰発現の条件での炎症に対する反応をRT-PCR方法で検討を行った。結果、macrophageでWFS1が炎症に対して保護的な役割を果たしている結果を得られた。事前に厳密な計画を立て、共同研究者の全力的なご協力を得て、研究が順調に進んでいる。前年度に引き続き、骨髄移植を用いた動脈硬化におけるWFS1の役割の検討を行った。骨髄移植実験を行うことで、全身にWFS1を有する、骨髄のみWFS1を有する、骨髄のみWFS1を欠損する、全身にWFS1を欠損する、計4群のマウスを作成し、カフ傷害による反応性内膜肥厚や粥状動脈硬化進展についての検討を行った。2)単離細胞・培養細胞を用いたストレス応答の検討in vivoでは動脈硬化形成に強く関与しているマクロファージや血管内皮細胞、平滑筋細胞の相互作用があり、詳細な分子メカニズムを解析するのが難しいため、それぞれの単離細胞や培養細胞を用いて様々な検討を行った。各培養細胞に小胞体ストレス(tunicamycin, thapsigargin)や酸化ストレス(酸化LDL,過酸化水素など)、炎症(LPS、TNFーαなど)を誘導し、細胞蛋白やmRNAレベルで生体内ストレス応答について詳細に検討した。WFS1欠損マウスから単離されたマクロファージや培養細胞のWFS1をノックダウンした状況で、1と同様の検討を行い、小胞体ストレス応答から発信される生体内ストレス応答調節について解析を行った。また、各種細胞の様々なストレス環境下で、細胞のカルシウム濃度を測定し、ミトコンドリアを観察し、これらの機能に関連する遺伝子の発現について解析をした。動脈硬化に需要な役割をしている細胞間の相互作用やつながりを検討するため、マクロファージと血管内皮細胞共同培養することを検討した。共同研究者の協力を得ながら、実験計画を立てて、順調に進んでいる。

2、WFS1・アポEダブル欠損マウスにおける粥状動脈硬化の検討。高コレステロール食を負荷したWFS1・アポE二重欠損マウスを用いて大動脈全体の内面を脂肪染色することで、動脈硬化病変を定量化し、また大動脈の免疫組織学的検討を行なう。大動脈全体からmRNAを抽出し、炎症反応や小胞体ストレス、酸化ストレス応答に関連した分子の発現を検討した。3、血管内皮細胞のミトコンドリア形態の観察。WFS1欠損マウスの血管内皮細胞のミトコンドリアの形を電子顕微鏡を用いてミトコンドリアについても検討した。WFS1欠損マウスの血管では、ミトコンドリアの膨大化やクリステの減少など、形態変化が認められた。以上WFS1欠損マウスを用いた実験結果から小胞体ストレス関連タンパクWFS1は小胞体ストレス、炎症ストレスと酸化ストレスを軽減する役割があり、動脈硬化の発症発展の段階で防御的に影響を果たしている可能性をしさした。酸化ストレス反応や炎症反応増加につながる機序として、ミトコンドリア機能低下の関与が想定される。現在進行中の実験をさらに進み、すでに得られた結果を論文にまとめたいと思う。一方、apoE欠損マウスとかけ合わせ、高コレステロール食による粥状動脈硬化に対するWFS1影響についてさらに検討を進める方針である。さらに、WFS1のこの炎症及び高コレステロール食による動脈硬化に及ぼす影響に関するメカにズームを電子電子顕微鏡を用いて深めていく方針である。現在のところ、かなりの実験結果を得て、まとめる準備を進んでいる。今年度は細胞実験などを進めて、in vivoで得られた結果をさらに確かめる方向に進める予定である。全体的な結果をまとめ、論文作成準備をする予定である。
GATA転写因子群による細胞特異的転写調節機序の解析

GATA配列に結合する転写因子が遺伝子発現の赤血球特異性規定に重要な貢献をしていることが強く示唆されている.私たちは以前に,GATA因子がファミリーを形成していることを明らかにしたが,本研究において,ヒト白血病由来細胞株について広く調べてみると,GATA-1発現が赤血球・巨核球系の分化形質発現と強く相関するのに対して,GATA-2の発現はさらに未分化な造血細胞にも見られることを見出した.この結果から,GATA-2が造血前駆細胞において重要な機能を果しているのに対して,GATA-1はすでに分化がある程度進んだ細胞での形質発現に貢献していることが示唆される.私たちはまだ精巣型GATA-1の存在を発見したが,本研究において,精巣型および赤血球型プロモーターを含むGATA-1遺伝子のクローン化に成功し,その機能解析を実施した.赤血球型プロモーターに機能的なGATA配列が存在することはすでに知られていたが,本研究から,精巣型プロモーターにもGATA配列が存在し,重要な機能的貢献を果していることが明らかになった.ところで,同様にGATA-3遺伝子の解析を行ったところ,調節領域に存在するGATA配列は機能的に重要ではなかった.このことは,GATA-2とGATA-1の遺伝子の調節様式が異なることを示しており、転写因子それ自身の転写制御を考える上で興味深い.ところで,細胞より核を単離し,PFA固定後にGATA-1抗体N6で免疫沈降する方法で,GATA-1の標的遺伝子の単離・同定を試みた.赤血球系細胞単離核よりGATA-1・DNA複合体を精製してみると,その中にはすでに機能的GATA配列が存在することが知られているGATA-1遺伝子やエリスロポエチン受容体遺伝子の調節領域が濃縮され,細胞内でこれら遺伝子が実際にGATA-1の標的遺伝子となっていることが明らかとなった.GATA配列に結合する転写因子が遺伝子発現の赤血球特異性規定に重要な貢献をしていることが強く示唆されている.私たちは以前に,GATA因子がファミリーを形成していることを明らかにしたが,本研究において,ヒト白血病由来細胞株について広く調べてみると,GATA-1発現が赤血球・巨核球系の分化形質発現と強く相関するのに対して,GATA-2の発現はさらに未分化な造血細胞にも見られることを見出した.この結果から,GATA-2が造血前駆細胞において重要な機能を果しているのに対して,GATA-1はすでに分化がある程度進んだ細胞での形質発現に貢献していることが示唆される.私たちはまだ精巣型GATA-1の存在を発見したが,本研究において,精巣型および赤血球型プロモーターを含むGATA-1遺伝子のクローン化に成功し,その機能解析を実施した.赤血球型プロモーターに機能的なGATA配列が存在することはすでに知られていたが,本研究から,精巣型プロモーターにもGATA配列が存在し,重要な機能的貢献を果していることが明らかになった.ところで,同様にGATA-3遺伝子の解析を行ったところ,調節領域に存在するGATA配列は機能的に重要ではなかった.このことは,GATA-2とGATA-1の遺伝子の調節様式が異なることを示しており、転写因子それ自身の転写制御を考える上で興味深い.ところで,細胞より核を単離し,PFA固定後にGATA-1抗体N6で免疫沈降する方法で,GATA-1の標的遺伝子の単離・同定を試みた.赤血球系細胞単離核よりGATA-1・DNA複合体を精製してみると,その中にはすでに機能的GATA配列が存在することが知られているGATA-1遺伝子やエリスロポエチン受容体遺伝子の調節領域が濃縮され,細胞内でこれら遺伝子が実際にGATA-1の標的遺伝子となっていることが明らかとなった.