hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
超効率血管脳移行AAVベクターによるマーモセットでのin vivoノックアウト

・AAV-PHP.BとCRISPR-Cas9システムを組み合わせたノックアウト(KO)を試みた。マウスでのGrm1遺伝子をターゲットとした。AAVのパッケージングリミットの問題からsplit-Cas9システムを採用したことで、2種類のAAV-PHP.Bをマウスへ静脈投与した。2重感染が生じればKOされることが期待できる。さらに効率を上げるため、gRNAは3箇所をターゲットとしたgRNAを同時に発現するtriple-CRISPRシステムを用いた。Grm1は小脳に特に強く発現しており、KOによって運動学習が障害されることが予想されるため、ロータロッドテストによって運動学習の測定を行った。結果、運動学習に障害は観られなかった。サクリファイスし、小脳を免疫染色して脳内での発現を調べた結果、Cas9タンパク質は発現していたためAAV-PHP.Bとsplit-Cas9システムは正常に働いていたが、Grm1の発現低下は生じていなかったことが分かった。原因としてtriple-CRISPR用ソフトを使って設計したが、gRNAの認識が不十分な可能性が考えられた。研究実施計画に記載した平成30年度の予定は、AAV-PHP.Bを用いたマーモセットの小脳mGluR1をターゲットとしたCRISPR/Cas9システムでのin vivoノックアウトである。ただし、AAV-PHP.Bを当初の予定通りにマーモセットへ使用するわけにはいかなくなったため、CREATE法を用いたAAV-PHP.Mの開発を引き続き行う予定である。それと平行し、AAV-PHP.Mの開発成功に備えて、予定通りにCRISPR/Cas9システムの開発をin vitroで進める。まずマーモセットmGluR1をターゲットにしたgRNAを設計し、検定をしなければならないが、それにはマーモセットの細胞を用いる必要があるため。このため、比較的簡単に単離可能な初代培養線維芽細胞かHEK293T細胞へレンチウイルスベクターを用いてマーモセット由来mGluR1 cDNAをゲノムDNAへ挿入させることで、SaCas9用gRNAのセレクションを行う。AAV-PHP.Mを作り出すことが出来れば、計画通り、上記でセレクションしたgRNAおよびSaCas9、3G Tetシステムを用いることでマーモセットmGluR1のin vivoノックアウトを進める。
心筋内向き整流カリウムチャンネルの三重構造モデル

心筋内向き整流カリウム(K)チャンネルの内向き整流特性の機序として、電位依存性のチャンネル開閉機構と細胞内マグネシウム(Mg)イオンによるブロックがあることをすでに報告しているが、本研究では、マグネシウムと同様に生理的に細胞内に存在するナトリウム(Na)イオンの効果を調べた。コラゲナ-ゼで単離したモルモット単一心室筋細胞の膜内側をNaを含んだ液(5ー40mM)で潅流すると、内向き整流Kチャンネルの外向き電流の振幅が減少した。電流記録のノイズレベルには変化がなく、減少の程度は脱分極が強くなるほど、またNa濃度が高くなるほど大きい。したがって、Naイオンはオ-プンチャンネルブロッカ-として働くこと、またブロックのキネティクスが非常に速いことが示唆される。Naがない時の電流値を基準に標準化した電流とNa濃度の関係から、1個のNaイオンがチャンネル内部の部位に結合することで、外向き電流がブロックされることがわかった。細胞内外のK濃度が150mMの場合、Kの平衡電位より30mV正側での解離定数(K_D)は90mM、50mV正側で55mM、70mV正側で37mM、90mV正側で25mMであった。K_Dの電位依存性より計算したNaの結合部位の電場内分率は、内側より0.54でMgの結合部位の0.57に近い値であった。Mgによるブロックの際認められたユニット電流の1/3と2/3の大きさをもつサブレベルは、Naによるブロックでは出現しなかった。これは細胞内NaによるブロックがMgの場合よりずっと速いキネティクスでおきるためと考える。また、細胞外Naイオンの内向き電流に対する効果を調べるため、125mKNaClと25mMKClを含む液を細胞外液として用い内向き電流のキネティクスを調べた。平均開時間は過分極が強まると減少するが、Naの代わりにNーメチルDーグルカミンを含んだ液の場合と、大差がなく、Naは細胞外からはブロッカ-としては働かないと結論した。
赤潮を引き起こす海洋植物プランクトンは未知なる経路で リン源を獲得するのか

植物プランクトンの大増殖に起因する赤潮は、世界各地の水産業に深刻な被害をもたらしている。本課題では、赤潮の発生機構を解明するため、その原因生物による新奇なリン源獲得経路を明らかにしようとした。厳密な培養試験の結果、赤潮原因生物は、様々な形態の有機リン化合物からリン源を獲得し、増殖可能なことを世界で初めて証明した。これらのことは、赤潮の発生に対して有機態リンが極めて重要な役割を果たすことを意味する。本研究では、赤潮の発生機構を解明するため、その原因生物による新奇なリン源獲得経路を明らかにすることを目的とする。具体的には、海洋に広く豊富に溶存することが近年明らかになりながらも、原因生物のリン源としては検討されていない有機リン化合物「リン酸ジエステル」に着目し、それを原因生物が分解・利用できるのかを厳密な培養実験によって明らかにしようとした。最終年度は、海洋植物プランクトン培養株の「リン酸ジエステル」分解活性と利用能を明らかにし、研究期間中に得られた成果と総合することで、赤潮原因生物の新奇リン源獲得経路を考察した。培養試験に供した多くのプランクトンの中で、ノリの色落ちを引き起こす珪藻Rhizosolenia setigeraあるいはChaetoceros属などの赤潮原因藻から「リン酸ジエステル」の分解を担う酵素活性を検出することに成功した。この活性は、環境水中の無機態リンが不足した条件下で顕著に増大することがわかった。当該酵素を有する種は、無機態リンと同等に「リン酸ジエステル」を利用可能なことが判明した。一方で、プランクトン種間で当該酵素の活性・基質特異性ならびに「リン酸ジエステル」利用能は大きく異なることがわかった。これらのことより、いくつかの赤潮原因プランクトンは、無機態リンが枯渇しやすい海洋環境下にて、有機リン化合物「リン酸ジエステル」を分解・利用できることがわかった。また、当該分解活性が高く「リン酸ジエステル」化合物を幅広く利用可能な種は、利用能を有しない種よりも「リン酸ジエステル」から多くのリン源を速やかに獲得できる可能性があり、リンを巡る競合において有利かもしれない。以上、本研究で得られた結果から、有機リン化合物「リン酸ジエステル」が、赤潮という植物プランクトンの大増殖現象に深く関わる可能性を世界に先駆けて明らかにすることができた。具体的には、海洋に広く豊富に溶存することが近年明らかになりながらも、原因生物のリン源としては検討されていない有機リン化合物「リン酸ジエステル」に着目し、それを原因生物が分解・利用できるのかを厳密な培養実験によって明らかにする。本年度は、まず沿岸海水より植物プランクトンを単離し、それらの中で「リン酸ジエステル」分解活性を有する種を網羅探索した。培養試験に供した多くのプランクトンの中で、ノリの色落ちを引き起こす赤潮原因珪藻Rhizosolenia setigera等から「リン酸ジエステル」の分解活性を検出することに成功した。この活性は、環境水中の無機態リンが不足した条件下で顕著に増大し、かつプランクトン種間で大きく異なることがわかった。これらのことより、いくつかの赤潮原因プランクトンは、無機態リンが枯渇しやすい海洋環境下にて、有機リン化合物「リン酸ジエステル」を分解できることがわかった。また、当該活性を有する種は、他の種よりも「リン酸ジエステル」からリン源を速やかに獲得できる可能性があり、リンを巡る競合において有利かもしれない。以上、本年度に得られた研究結果から、海洋植物プランクトンのリン源として、これまで全く考慮されてこなかった有機リン化合物「リン酸ジエステル」が、植物プランクトンの大増殖・赤潮という現象に深く関わる可能性を、世界に先駆けて明らかにすることができた。本研究では、「リン酸ジエステル」を利用可能な赤潮原因プランクトンを探索し、その利用能を明らかにすることを目的にしている。この目的の達成に向けて、1)リン酸ジエステル分解能を有する赤潮原因プランクトンの網羅探索、2)当該プランクトンのリン酸ジエステル分解活性に及ぼす環境因子・生理状態の影響評価、3)リン酸ジエステル利用能の解明、以上3つの小課題に取り組む。これまでに、無機態リン枯渇時にリン酸ジエステル分解活性を誘導する赤潮原因プランクトンを見出すことに成功しており、当初の計画通り小課題1と2を当該年度に達成することができた。得られた成果の一部は、すでに学会等で報告していることから、研究の目的は概ね順調に達成されていると評価した。この目的の達成に向けて、「リン酸ジエステル」を利用可能と思われる赤潮原因プランクトンを分離することに成功し、その無菌株を確立することができた。

今後は、当該プランクトンの「リン酸ジエステル」利用能を評価する予定である。具体的には、赤潮原因プランクトンの細胞収量・増殖速度が、「リン酸ジエステル」の化合物の種類・濃度あるいはプランクトン種によって有意に変動するのかを統計学的解析により定量評価する。収集された実験データをもとに、リン源として「リン酸ジエステル」を新たに位置づけた、赤潮原因種による新奇なリン源獲得経路が存在する可能性を明確化するとともに、その経路を組み入れた新たな赤潮発生機構を構築・提示する。一連の研究結果はテーマごとに論文としてまとめ、国際科学雑誌に投稿する。平成23年度の計画に基づく経費執行について、4月に支払すべき経費が残っているため、次年度使用額が存在するように見えるが、実際には、全額を執行予定である。そのため、次年度の研究は、当初の計画通り進める予定である。
胎生期母体投与薬剤による、成長後の神経心理学的発達特性とその機序の解明

本研究では、神経発達障害の成因を探索するため、ヒト妊娠中に汎用される薬剤を用いて、産仔の神経心理学的な発達特性と免疫組織学的検討を行った。母体マウスに子宮収縮抑制剤(β2刺激薬)リトドリンと抗うつ剤を投与し、産仔にオープンフィールド試験、強制水泳試験を施行した。摘出脳の前頭前野と海馬中心に、脳由来神経栄養因子とミクログリアの免疫染色を行った。子宮収縮抑制剤投与群では、行動試験にて不安の高さを示唆し、胎生期の母体薬剤投与が産仔若齢期の行動に影響する可能性を示唆した。形態学的には、大脳皮質の層構造異常や限局的な萎縮は明らかではなく、ミクログリアの局所定量分析では、有意な変化は確認できなかった。【目的】発達障害の成因は、神経形態、神経伝達物質分泌や受容体制御等に関する遺伝的素因に加え、周産期の低酸素や感染、早産低出生、化学物質暴露など子宮内環境による発症への関与が注目され始めている。とりわけ医薬品は催奇形性試験を含めた厳密な安全性試験を経るものの脳の発達や行動への影響には不明な点が多い。発達障害は症状診断からなるスペクトラム概念であり、ヒト対象試験では究明に限界がある。本研究では実験動物へ、ヒト妊娠中に汎用される薬剤を投与し、産仔の神経心理学的な発達特性と脳内生理の解明を目的とする。初年度は子宮収縮抑制剤投与マウス作成と行動解析を目的とした。【方法】初年度はリトドリン塩酸塩投与予備試験を行った。1)交配成立後雌連続皮下注射:低用量-常用量(30,150,300mg/kg、以下いずれも体重あたり)3群、高用量(500,1000mg/kg)2群、2)成熟雌単回経口投与:常用量(100mg/kg)、高用量(1000mg/kg)、陽性対照区(抗うつ剤)、3)成熟雌雄連続経口投与:常用量21日間投与、いずれも対照区は同量の生食水を用いた。薬剤投与後にはオープンフィールド試験を行った。【結果】1)連続皮下注射の低用量-常用量3群は妊娠継続6割であり、安定した産仔娩出が困難であった。高用量群は投与3日以内で母体死亡し、産仔行動解析には至らなかった。2)単回投与では常用量群と対照群間では総移動距離、中央滞在時間・割合に差は認められず、高用量群では総移動距離が有意に減少した。陽性対照群では総移動距離、中央滞在時間・割合が有意に増加した。3)連続投与群は、対照群と行動試験での差異はなかったが、雌雄間に有意な差が認められた。【結語】成熟マウスでは、薬剤投与群と対照群ともに雄の総移動距離および中央滞在時間・割合は増加したが、薬剤投与による自発運動の変化は認められなかった。今年度は子宮収縮抑制剤および抗うつ剤投与マウス母体作成と産仔の行動解析を進めた。【方法】1)交配成立後雌連続投与区:リトドリン塩酸塩常用量-高用量(100,500mg/kg経口投与、以下いずれも体重あたり)2群、2)抗うつ剤投与陽性対照区:フルボキサミンマレイン酸塩100mg/kg経口投与、3)対照区は同量の生食水を用いた。産仔の6,9,12週齢にオープンフィールド試験、13週齢に強制水泳試験を行った。【結果】1)出生仔の総移動距離は、各群とも週齢が増すごとに減少した。2)リトドリン高用量群で、雄は9週齢、雌は6週齢での中央滞在時間が減少し、不安の高さを示唆した。常用量群における差異は認めなかった。3)抗うつ剤投与群では性差を認め、9週齢の雄は中央滞在時間の増加が顕著で、不安の低さを示したが、6週齢、9週齢の雌では中央滞在時間の減少を認め、不安の高さを示す逆説的な結果であった。4)雄への強制水泳試験では、抗うつ剤投与群に不動時間の高まる抑うつ傾向、リトドリン高用量群で不動時間の短縮傾向を示したが、各群に統計学的有意差は認めなかった。【結語】子宮収縮抑制剤投与群では、マウス6週齢、9週齢での不安の高さを示唆した。胎生期の母体薬剤投与が産仔若齢期の行動に影響する可能性を示唆した。【目的】発達障害の成因は、神経形態、神経伝達物質分泌や受容体制御等の遺伝的素因に加え、周産期の低酸素や感染、早産低出生、化学物質暴露等の子宮内環境による発症への関与が注目されている。医薬品は安全性試験を経るものの脳の発達や行動への影響には不明な点が多い。

発達障害はスペクトラム概念であり、ヒト対象試験では究明に限界がある。本研究では実験動物へ、ヒト妊娠中に汎用される薬剤を投与し、産仔の神経心理学的な発達特性と脳内生理の解明を目的とする。【方法】本研究では子宮収縮抑制剤および抗うつ剤投与マウス母体作成と産仔の行動解析を行った。交配成立後雌連続投与区:リトドリン塩酸塩常用量-高用量(100,500mg/kg経口投与、以下いずれも体重あたり)2群、抗うつ剤投与陽性対照区:フルボキサミンマレイン酸塩100mg/kg経口投与、対照区:同量の生食水を用いた。産仔の6,9,12週齢にオープンフィールド試験、13週齢に強制水泳試験を行った。脳を摘出し、前頭前野と海馬中心に脳由来神経栄養因子とミクログリアの免疫染色を行った。【結果】1)オープンフィールド試験にて、出生仔の総移動距離は、各群とも週齢が増すごとに減少した。2)リトドリン高用量群で、雄は9週齢、雌は6週齢の中央滞在時間が減少した。3)抗うつ剤投与群では性差を認め、9週齢の雄は中央滞在時間が増加し、6週齢、9週齢の雌では中央滞在時間が減少し、不安の高さを示す逆説的な結果であった。4)強制水泳試験では、抗うつ剤投与群に不動時間の高まる抑うつ傾向、リトドリン高用量群で不動時間の短縮傾向を示した。形態学的には、大脳皮質の層構造異常や限局的な萎縮は明らかではなかった。【結語】子宮収縮抑制剤投与群では、不安の高さを示唆し、胎生期の母体薬剤投与が産仔若齢期の行動に影響する可能性を示唆した。静止型および活性型ミクログリアの局所定量分析を進める。初年度の予備試験では、実験動物への負担が最小限となるよう考慮した上で、成獣モデルへの投与法および投与量の調節を行ったが、胎生期の薬剤投与モデル作成に長期間を要した。次年度は、交配成立後の雌マウスに経口投与にて薬剤投与を行った。常用量投与群では安定した産仔の娩出が可能であったが、高用量では産仔の体重増加不良、死亡、奇形例を認めた。交配後、行動試験に至るまでに4か月要し、安定した産仔の確保が困難であったため、達成度の遅れを認めた。なお行動試験では、多数のマウスを使用したが、順調に行うことができた。【目的】神経発達障害の成因は、神経形態、神経伝達物質分泌や受容体制御等の遺伝的素因に加え、周産期の低酸素や感染、早産低出生、化学物質暴露等の子宮内環境による発症への関与が注目されている。医薬品は安全性試験を経るものの脳の発達や行動への影響には不明な点が多い。【方法】子宮収縮抑制剤および抗うつ剤投与マウス母体作成と産仔の行動解析を行った。交配成立後雌連続投与区:リトドリン塩酸塩常用量-高用量(100,500mg/kg経口投与)2群、抗うつ剤投与陽性対照区:フルボキサミンマレイン酸塩100mg/kg経口投与、対照区:同量の生食水を用いた。
分裂酵母の接合型変換組換え反応の試験管内再構築系による機能解析

接合型変換は、ゲノム上のmat領域で起こる相同組換えに起因するが、その反応機構は不明である。分裂酵母Swi2-Sw5複合体は、この相同組換え反応に関与することが知られていた。そこで、本研究は、Swi2-Swi5複合体を精製し、その生化学的機能をあきらかにし、接合型変換の試験管内再構成系を構築して解析することによって、その反応メカニズムを解明することを目的とした。その結果、Swi2-Swi5複合体は、それ自体単体でD-loop形成活性を有することを発見した。Swi2には、ATフックドメインを含むN末端部位と、この配列を含まないC末端側の2つのDNA結合ドメインがあるが、実際に2つのドメインのそれぞれがDNA結合能を有することを証明し、さらに、C末端側のドメインにD-loop形成活性があることを示した。これらの結果はSwi2-Swi5複合体が接合型変換時の組換えに直接関与することを強く示唆するものである。本研究は、分裂酵母Swi2-Swi5複合体依存的な接合型変換相同組換え反応を試験管内再構成し、その機構の解明を目的とする。平成21年度は、1. Swi2-Swi5複合体の精製法の確立、2. Swi2のDNA結合ドメインの解析、3. Swi2結合タンパク質との結合部位の同定、の解析を行った。それぞれの進捗状況は以下の通りである。1.大腸菌発現システムでSwi2-Swi5複合体の発現は可能であったが、分解産物が多く、これを改善する必要があった。これに代わる方法として昆虫細胞発現系、及び無細胞発現系を試みたが大腸菌発現系と同様にSwi2の分解を防ぐことはできなかった。これに平行し、Swi2と結合するSwi6を加えたSwi2-Swi5-Swi6の共発現・精製を行ったが、大幅な改善は見られなかった。これらの原因として、Swi2と結合・安定化する未同定のタンパク質の存在が推測される。現在分裂酵母からの直接精製の準備を行っている。2. ATフックドメインを含むSwi2のN末端部N1(1-400アミノ酸)及びN2(81-320アミノ酸)の精製に成功し、これらのDNA結合能をEMSA法で比較した。N2はN1より結合能が1/5程度減弱していたことから、DNA結合にはATフックを含むかなり広域が必要であることが判明した。また、ゲル濾過解析からN1は単量体より高分子側に存在する画分が存在することが判明し、Swi2が多量体で機能する可能性が示唆される。3. Swi2の高密度部分欠失変異タンパク質を作成し、Swi5との共発現を指標にSwi5結合領域の同定を行った。その結果、Swi2 621-722アミノ酸部分がSwi5との結合に必須部位であることが判明した。また、Swi2 361-722アミノ酸部分(Rad51結合領域を含む)をSwi5との複合体として精製することに成功した。分裂酵母の接合型変換は、ゲノム上のmat座位において高度に制御された相同組換えにより起こるが、詳しいメカニズムは不明である。これまでの遺伝学的な知見から、Swi2-Swi5複合体は、mat領域の直近にあるSRE領域に局在し、相同組換えによる遺伝子変換反応に直接に関わる因子であると考えられている。本研究は、試験管内再構成系を構築して、接合型変換におけるSwi2-Swi5複合体の機能を解明することを目的とした。まず、タンパク質発現条件と精製法の確立を図ることからスタートし、様々な改良によって最終的に、Swi2-Swi5複合体の全長タンパク質の精製に成功した。この精製したSwi2-Swi5複合体標品を用いて、組換えに関連する活性について、試験管内反応系を用いて生化学的に様々な活性を検討した。その結果、Swi2-Swi5複合体は、ATP非依存的なD-loop形成活性を有することを発見した。N末端が短縮したSwi2(381-722アミノ酸)とのSwi5複合体も、この反応を触媒したので、活性中心はC末端に存在すると考えられた。また、このD-loop形成反応は、mat領域のSRE配列を含むDNAを基質に用いた時の方が、それ以外の非特異的配列で行った場合よりも、高い反応効率を示した。これらの解析結果は、Swi2-Swi5が、接合型変換時の相同組換えにおいて、初期反応である単鎖DNA侵入反応を直接触媒する可能性を強く示唆するものである。
消化器癌の浸潤転移における細胞内シグナル系の細胞接着の制御機構の異常に関する研究

胃癌手術切除標本を用いて、E-cadherin,α-catenin,β-catenin,IQGAP1の細胞内局在を免疫組織化学的手法により検討した。IQGAP1については、その局在は正常胃粘膜では、全例細胞膜に局在していたが、高分化型胃癌では細胞質に、低分化型胃癌では細胞膜に局在しており、IQGAP1の局在と組織型との間に有意な相関が認められた。また、IQGAP1とE-cadherin,α-cateninの発現との相関の検討では、IQGAP1の局在が細胞膜のものではE-cadherin,α-cateninの発現は減弱しており、細胞質のものでは減弱していなかった。さらに、組織抽出液を可溶性及び非可溶性分画に分けたウエスタンブロット法による定量的な検討においても、免疫組織染色と同様の結果が得られた。さらに、胃癌細胞株を用いた検討でも同様の結果が得られた。最近in vitroでIQGAP1がβ-cateninと直接結合することが示された大腸癌において、IQGAP1とβ-cateninの発癌過程における発現の相関について検討した。腺腫において、IQGAP1,β-catenin共に全例細胞膜に発現していた。分化型大腸癌では、胃癌と同様にIQGAP1はほとんどが細胞質に局在していた。さらに、IQGAP1とβ-cateninの発現の相関について、検討すると、β-cateninが過剰発現していた症例のほとんどが、IQGAP1は細胞質に局在していた。また、胃癌の時と同様に、ウエスタンブロット法による検討を行ったところ、可溶性分画に発現するIQGAP1は、同じく可溶性分画に発現するβ-cateninと相関してた。これらの結果をまとめると、IQGAP1はその局在により、E-cadherinによる細胞接着機能の制御及び発癌における細胞内シグナル系への関与の可能性が示唆された。まず、当科で外科的切除を施行した胃癌症例について、E-cadherin,a-catenin,b-catenin,Tiam1,IQGAP1の免疫組織学的検討を行った。Tiam1に関しては、E-cadherin,b-catenin,IQGAP1の発現及び臨床病理学的因子と相関はみられなかった。IQGAP1については、正常粘膜では、全例細胞膜に局在していたが、高分化型癌では細胞質に、低分化型癌では細胞膜に局在し、これらに有意差が認められた。また、E-cadherin,a-cateninの発現との相関を検討したところ、IQGAP1の局在が細胞膜のものでは、、E-cadherin,a-cateninの発現は減弱しており、細胞膜のものでは、減弱していなかった。これらの間にも有意差は認められた。さらに、臨床病理学的因子との検討を行ったところ、INFとIQGAP1の局在の間に有意差が認められた。また、組織抽出液を可溶性及び非可溶性分画に分け、ウエスタンブロット法による検討を行ったところ、E-cadherin,a-cateninは、非可溶性分画にのみ発現していたが、IQGAP1は可溶性及び非可溶性分画の両方に発現しており、正常粘膜に比して、高分化型では可溶性分画、低分化型では非可溶性分画に多く発現が認められ、免疫組織染色と同様の結果が得られた。胃癌細胞株を用いた検討でも、同様の結果であった。これらをまとめると、胃癌組織において、IQGAP1はその局在によりE-cadherinによる細胞間接着の機能を制御している可能性が示唆された。

前年度に胃癌におけるIQGAP1の発現に関して、組織型による発現の局在の違い、及びE-cadherin, α-cateninとの発現の関連性についての結果が得られたが、さらに、最近in vitroで、IQGAP1がβ-cateninと直接結合することが示された。そこで、発癌の過程において、APCのmutationと共にβ-cateninの過剰発現がみられる大腸癌において、IQGAP1とβ-cateninの発癌過程における発現について検討した。正常大腸粘膜では、胃と同様にIQGAP1,b-catenin共に全例細胞膜に発現していた。腺腫においてもIQGAP1,β-catenin共に全例細胞膜に発現していた。分化型大腸癌では、胃癌と同様にIQGAP1はほとんどが細胞質に局在していた。さらに、IQGAP1とβ-cateninの発現の相関について、検討すると、β-cateninが過剰発現していた症例のほとんどが、IQGAP1は細胞質に局在していた。また、胃癌の時と同様に、大腸癌組織抽出液を可溶性及び非可溶性分画に分けて、ウエスタンブロット法による検討を行ったところ、可溶性分画に発現するIQGAP1は、同じく可溶性分画に発現するβ-cateninと相関している傾向にあった。これらの結果をまとめると、大腸癌の発癌過程において、β-cateninの発現の変化に伴い、IQGAP1はその局在を変化させ、発癌における細胞内シグナル系に何らかの関与をしている可能性が示唆された。
安全な多言語並列計算基盤のための型付中間言語

本研究は、様々な高水準言語の連携による安全で高性能な並列計算を可能とする汎用性を持つ型付中間言語の設計に挑んだ。既存の依存型、fractional permissionによる型検査技法をベースとし、逐次一貫性メモリモデルのためのデータレース回避の型検査技法、部分配列のpermissionを取り出せる空間的fractionの導入、複数の高水準言語からメタ呼出しを通して型付中間言語レベルで準備した共有データ構造を操作させる安全な方式、をそれぞれ検討できた。汎用性の高い型付中間言語、すなわち広く様々な高水準言語からの翻訳の共通のターゲットとしての低水準の型付中間言語を、安全で高性能な言語処理系(計算基盤)が作成できる形で定義することは、高水準言語間の連携などの点で言語処理系技術に貢献しようとする研究者の挑戦的な夢である。さらにマルチコア化を活用した共有メモリによる高性能な多言語並列計算の安全性確保(データレース回避の検証等)は極めて挑戦的である。本研究では近年の型理論の成果(依存型等)を踏まえて、その設計に挑戦している。本研究は型付中間言語MILを開発する形で進めている。平成26年度は、MILの汎用性ならびにMILレベルにおけるメモリモデルと安全性確保(データレース回避の検証)のサポートを中心に研究を進めた。汎用性では、正確なごみ集めのサポートや、配列、依存型のための存在型・全称型、クロージャのサポートに注意した。MILレベルにおけるメモリモデルは、既存のアプローチと同様、データレースがない(data-race-freeな)プログラムについては逐次一貫性(sequential consistency)が得られるという点を基礎とする。データレース回避が検証できないプログラムは型検査をパスしないという点で安全性を確保することを目標としており、そのような中で、現状の技術でデータレース回避(data race freedom)を検証するには、プログラム論理、fractionalな所有権、分離論理などに基づいていくことで一定の範囲がカバーできるとの方向性を得た。本研究は型付中間言語を開発する形で進めているが、平成27年度は、型付中間言語レベルでの実装を視野にいれつつも、spawn, syncコンストラクト等による並行処理が記述できる高水準言語のレベルでのデータレース回避について研究を進めた。fractional permissionに関する既存研究を拡張することで、高水準言語レベルでは、並列高水準言語で記述された再帰的並列LU分解という行列計算の例題におけるデータレース回避の検査が可能との確信を得た。拡張としては、配列(行列)の部分配列(行列)に関するpermissionを取り出すための空間的fractionを導入している。研究課題が挑戦的であることもあるが、スレッドが扱える高水準言語レベルでのデータレース回避の検査を、高水準のスレッドをデータ構造で実現する型付中間言語レベルでも再現するための手法の整理などもさらに必要となっている。本研究では近年の型理論の成果(依存型等)を踏まえて、その設計に挑戦した。型付中間言語レベルでのメモリモデルとして、既存のアプローチと同様、データレースがない(data-race-freeな)プログラムについては逐次一貫性(sequential consistency)が得られるという点を基礎とし、データレース回避を検証するような型検査が現状の技術で一定の範囲がカバーできるとの方向性を得た。その後、型付中間言語レベルを視野にいれつつも、spawn, syncコンストラクト等による並行処理が記述できる高水準言語のレベルで例題を用いてデータレース回避について研究し、fractional permissionに関する既存研究を拡張し、配列(行列)の部分配列(行列)に関するpermissionを取り出すための空間的fractionを導入した。最終年度は、確実に安全な、複数の高水準言語による並列処理方式として、型付中間言語レベルで、fractional permissionを扱える共有データ構造を準備し、複数の高水準言語の逐次インタプリタを並列に実行し、メモリが分離していると型検査可能なインタプリタにメタ呼出しを通してのみ共有データ構造を操作させる方式を考えた。また、翻訳と組み合わせたり、単一言語の複数インタプリタ並列実行も可能との方向性を得た。研究課題が挑戦的であることもあるが、データレース回避の検証に限っても、フェーズが変わったことをどのように表現するか未定である。

最も挑戦的な多言語(複数の高水準言語)については、せめて有望なアプローチ方法を見出したい。例えば、多言語間では、抽象的なイベント通知、同期待ちのみ可能とするところから始めることも考えられる。計算機科学比較的需要が高い応用例に限定した議論も行いたい。平成26年度に効率よく予算を利用するため集約可能な物品購入を持ち越したが、平成27年度には使用しなかったため。効率よく予算を利用するため集約可能な物品購入を次年度に持ち越したため。持ち越した物品購入を計画している。
一見”正常範囲”の経過から発生する周生期由来の脳機能異常を解明する

早産児の認知機能や高次脳機能障害の原因として広汎性白質障害が注目されているが,その受傷機転は解明されていない.本研究では新生児の子宮外環境への適応過程に注目し,脳微細構造の発育変化を,光散乱係数を用いて観察した.新生児集中治療病棟入院児60例において出生早期の光散乱係数は内的因子のほか,周生期ストレスを含めた外的因子にも影響をうけている可能性が考えられた.高次脳機能障害に関連する病態を早期に認識し介入する方法を確立すべく,脳循環,脳酸素代謝も含めた解析をすすめている.本研究においては中低リスク新生児における学齢期以降の高次脳機能障害の原因を多角的な脳機能観察ツールによって突き止めるとともに、介入可能な標的を明らかにすることを目的としている。研究初年度には、本研究の前提として、新生児集中治療室に入院した児において各種パラメータの情報を経時的にどの程度収集できるのかを検討した。パラメータは直接的に脳機能を評価するMRIや近赤外光スペクトロスコピーだけでなく、間接的な脳機能の評価として自律神経系、内分泌学的な評価項目(生化学的検査、呼吸心拍情報、胎動情報など)も含んでいる。その結果、各種ツールは当初の予想通りベッドサイドで非侵襲的に実施可能であることが改めて確認された。ただ症例によっては病状により急性期に実施不可能であったり、症例の入院期間によりフォローアップが途中で途切れたりと症例により情報収集量に差が見られた。またツールによっては現時点で新生児におけるvalidation自体が進んでいないものもあり、今後症例間の比較検討をするにあたり、データの解析方法から検討し直す必要があるものも見られた。ただしそれぞれのツールはもともと当施設で稼働中の研究プロジェクトでも使用されているものであり、解析方法が確立されているものも多い。これらのパイロット研究の成果を基に、今後はパラメータ収集の精度を上げること、時系列データの効率的な収集法を考えることになる。本研究においては中低リスク新生児における学齢期以降の高次脳機能障害の原因を多角的な脳機能観察ツールによって突き止めるとともに、介入可能な標的を明らかにすることを目的としている。研究初年度には、各種パラメータの情報が収集可能であることを確認した。2年目はパラメータの選別、時系列データの収集を年間の目標として取り組んだ。年度途中の施設異動もあり、収集不可能なパラメータ、時系列データの収集を中断せざるを得ない部分もあった。ただその中でも長期的に使用可能なパラメータも明らかになりつつあり、継続可能な研究計画を立案、データ収集を開始しつつある。施設異動の関係で、本年度の目的であった時系列データの収集が中断してしまった。しかしパラメータの選別は継続可能なものを、とう観点から進みつつある。研究1年目には各種パラメータの情報が収集可能であることを確認し、2年目以降はパラメータの選別、時系列データの収集を目標として取り組んだ。しかし研究期間途中での異動もあり、収集不可能なパラメータ、時系列データの収集を中断せざるを得ない部分もあった。現在は継続可能な研究計画を立案、データ収集を開始している。施設異動の関係で時系列データの収集が中断してしまったこと、測定器械の故障で計測が中断していたことが遅延の原因としてあげられる。しかし現在は器械のトラブルも解消し、測定を再開している。近年中低リスク新生児における学齢期以降の高次脳機能障害を中心とした発達障害が注目されている。本研究ではその原因を多角的な脳機能観察ツールによって突き止めるとともに、介入可能な標的を明らかにすることを目的としている。2016年度に我々は近赤外線時間分解分光法(TRS-NIRS)を用いて、生後まもなく頭部から取得された光散乱係数は在胎週数や体重などの内的成熟度だけでなく,出生児の状態,特にApgarスコアに代表されるストレス深度や,血液ガスpHやBase-excess,呼吸管理の要否などに関連した変動をみせることを報告した。これに続いて2017年度には予定日周辺に取得した光散乱係数と臨床変量との関係を検討した。NICUに入院した新生児60例を対象に退院前(予定日周辺)TR-NIRSを行い、光散乱係数と臨床変量を線形回帰分析で評価した。その結果予定日前後の光散乱係数は在胎週数、出生体重・身長・頭囲、Apgar score(1分・5分)、検査時の日齢、修正在胎週数、早期栄養確立と正の相関を認めた。このことから予定日前後の光散乱係数は検査時点での成熟度とともに、出生時点での内的成熟度、胎外での栄養状態と関連した変動を見せることが明らかになった。本研究期間に残された課題として経時変動の評価とその操作因子の解明、短・長期エンドポイントとの関係性の検討があげられる。今後はTRS-NIRSの繰り返し評価可能であるという利点を活かして散乱係数を経時的に測定し臨床経過との比較検討を進めることで、短期エンドポイントであるMRI評価および長期エンドポイントである認知機能、高次脳機能を占う早期マーカーの確立を目指したい。早産児の認知機能や高次脳機能障害の原因として広汎性白質障害が注目されているが,その受傷機転は解明されていない.

本研究では新生児の子宮外環境への適応過程に注目し,脳微細構造の発育変化を,光散乱係数を用いて観察した.新生児集中治療病棟入院児60例において出生早期の光散乱係数は内的因子のほか,周生期ストレスを含めた外的因子にも影響をうけている可能性が考えられた.高次脳機能障害に関連する病態を早期に認識し介入する方法を確立すべく,脳循環,脳酸素代謝も含めた解析をすすめている.本年度の目的であった症例の蓄積、データの収集は進んでいる。急性期のデータ収集については病的新生児においても多くは施行可能であることが示された。また最終目標である発達予後の評価方法も外来診療で確立されている。縦断的なデータ収集のための研究計画を長期的な観点から練り直す必要がある。またパラメータもある程度選別され、評価項目の減少にもつながることから、そこからいかに説得力のあるデータを出すかというのを考える必要がある。計測ツールについても操作できる者が限られるため、研究に参加、協力可能な人材を養成する必要がある。縦断的なデータ収集が必須のため症例数を増やす必要がある。新生児各種パラメータについて、取得したデータを解析可能な形に変換できるかどうかを検討する必要がある。近赤外線スペクトロスコピーや超音波検査など日常的に使用されていて、かつポイント毎に得られるパラメータの解析は比較的簡単にできるが、呼吸心拍情報や、体動を評価するアクチグラフなど長期連続データについては収集されたデータの解析方法に確立されたものがない。そのため解析方法から検討する必要がある。またより多くの症例を対象とするために情報収集スケジュールを再度検討する必要がある。呼吸心拍情報の収集が可能なモニタリングシステム、ソフトウェアが必要。呼吸心拍情報解析のためのソフトウェア、コンピュータが必要である。現在、呼吸心拍情報を取得できるモニターが2台のみであり、データ集積に限りがある。病的新生児は最低でも1週間は当施設に入院しており、長期連続データを継続して取得できることは本研究の特徴でもある。現在、呼吸心拍情報を取得できるモニターが2台のみであり、データ集積に限りがあり、呼吸心拍情報解析のためのソフトウェア、コンピュータが必要であるため。呼吸心拍情報を解析するソフトウェア、コンピュータを購入する計画がある。長期連続データを継続して取得し解析することは本研究の特徴でもある。呼吸心拍情報解析のためのソフトウェア、コンピュータの購入呼吸心拍情報解析のためのソフトウェア、コンピュータを購入する計画がある。
細胞接着分子の発現制御遺伝子の包括的評価によるがん血行性転移の予測診断法の研究

癌患者の診療において早期に血行性転移をきたす転移危険群の的確な予測診断を可能にするため、遠隔血行性転移に関与する各種の細胞接着分子を検索した。我々は従来から、癌の血行性転移ではセレクチンなどの細胞接着分子とその糖鎖リガンドに媒介される癌細胞と血管内皮細胞の接着が重要であると提唱しているので、とくにこの細胞接着分子系の発現の検索に重点を置いた。癌細胞の表面にシアリルLe^aやシアリルLe^xが強く発現する患者では血行性転移がおきやすいが、これらの癌細胞の糖鎖と結合する血管内皮側のE-セレクチン分子の発現も血行性転移の起こり易さを規定する要因と考えられる。今年度は大腸癌につきLe^a糖鎖とE-セレクチンとを一対のペアマーカーとして検索して評価した。その結果、Le^a糖鎖とE-セレクチンとを共に強発現する患者群が有意に血行性転移の頻度が高かった(P<0.001,N=54)。癌細胞におけるシアリルLe^aやシアリルLe^x発現に関与するCMP-シアル酸、UDP-Gal、UDP-GlcNAc、UDP-GalNAc、GDP-フコースなどの糖ヌクレオチドトランスポーター遺伝子発現を検索し、UDP-GalトランスポーターのmRNA発現が癌組織で非癌粘膜組織よりも有意に増加する事を認めた。既に中等度のUDP-GalトランスポーターmRNAを発現する細胞株への導入でLe^aとTF抗原の発現が誘導され、発現が非癌大腸上皮と同程度に低い細胞株を選んで導入すると、これらに加えてシアリルLe^xの発現が誘導された。以上の結果は、これらの糖鎖の合成においてゴルジ体への糖ヌクレオチド供給が律速となっている事を示唆する。UDP-GalトランスポーターcDNA導入細胞をガラクトースに富んだ培地で培養すると糖鎖発現がさらに増大するのが観察された。この事は、充分量のUDP-Galトランスポーターが発現した条件下では、さらに上流からのUDP-ガラクトース供給が律速となっている事を示唆する。この上流要因をさらに検討するためガラクトース代謝に関連する遺伝子の発現の調査を開始し、現在までに三種の遺伝子の発現増加を認めている。
藍藻ホスホリブロキナーゼのX線構造解析による反応機構と活性制御機構の解明

本研究は,藍藻ボスホリブロキナーゼ(PRK)の反応機構ならびに活性調節機構をX線構造解析によって解明することを目的とし,以下の実験を行った。藍藻Synecococcus由来PRKの大量培養・精製系を構築した。精製手順は、藍藻PRKを大量に生産した大腸菌を破砕し,硫安分画,Niアフィニティークロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーで精製を行った。その後、動的溶液光散乱法装置(DLS)を用いて,溶液状態でのサンプルの結晶化能を確認した。続いて、His-tagドメインを有した酵素を用いて、結晶化を行った。恒温インキュベータ(20°Cと4°C)で、種々の結晶化条件の検討を行ったところ、PEG3350を沈殿剤として用いた条件で、0.2x0.2x0.2mm程度のX線回折実験に適した大きさの単結晶を作成することに初めて成功した。しかし、大型放射光施設Spring-8にてX線回折実験を行ったところ回折能3.8Å程度と、構造解析には不十分であった。次に,ThrombinによってHis-tagドメインを切断し、さらに、PRKの本体をゲル濾過クロマトグラフィーにより精製した。その後、結晶化を行ったところ,0.05mm程度の単結晶を作成することに成功したが、大きさが不十分であり、構造解析可能な回折データが得られなかった。次に、PRKの活性調節因子であるCP12タンパク1質の精製系の構築にとりくんだ。PRKとCP12の結合をpull-downassayにて確認したが、結晶が得られなかった。続いて、CP12タンパク質のPRK結合ペプチドを合成し、PRKとCP12の結合をpull-down assayにて確認し、その後結晶化を行ったところ、0.05mm程度の単結晶を作成することができた。現在、結晶の改善を目指し、PRKとCP12ペプチド複合体の結晶化を行っている。本研究は、カルビンサイクルを構成している酵素の一つである藍藻ホスホリブロキナーゼ(PRK)の反応機構ならびに活性調節機構をX線構造解析によって解明することを目的とし、以下の実験を行った。藍藻Synecococcus由来PRKの大量培養系(BL21(DE3)plysS/pET16b)を構築した。精製手順は、藍藻PRKを大量に生産した大腸菌を破砕し、硫安分画、Niアフィニティークロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーで精製を行った。その後、動的溶液光散乱法装置(DLS)を用いて、溶液状態でのサンプルの結晶化能を確認した。恒温インキュベータ(20°Cと4°C)で、種々の結晶化条件の検討を行ったところ、PEG3350とisopropanolを沈殿剤として用いた条件で、0.2x0.2x0.2mm程度のX線回折実験に適した大きさの単結晶を作成することに初めて成功した。しかしながら、大型放射光施設SPring-8にてX線回折実験を行ったところ回折能3.8Å程度と、回折強度データの若干の改良が見られたものの、構造解析には不十分であった。次に、His-tagドメインが高品質結晶の育成を妨げている可能性を考慮し、ThrombinによってHis-tagドメインを切断し、さらに、PRKの本体をゲル櫨過クロマトグラフィーにより精製した。その後、結晶化を行ったところ、0.05mm程度の単結晶を作成することに成功したが、大きさが不十分であるため、更なる結晶の品質向上を自指し、溶液状態制御による品質向上を試みている。また、同時に、PRKの活性調節因子であるCP12タンパク質の発現系の構築にとりくみ、PRKとCP12の結合の確認をpull-down assayにて確認した。

続いて、CP12タンパク質のPRK結合ペプチドを合成し、PRKとCP12の結合をpull-down assayにて確認し、その後結晶化を行ったところ、0.05mm程度の単結晶を作成することができた。現在、結晶の改善を目指し、PRKとCP12ペプチド複合体の結晶化を行っている。
精密重合法を用いた末端型C_<60>オリゴマーの合成とその応用

本科学研究費補助金による平成9年度10年度の研究では、新規な炭素同素体であるフラーレンC_<60>を機能性素材として利用することを目的として、各種リビング重合法による末端型C_<60>ポリマー(オリゴマー)誘導体の精密合成を検討すると共に、それらの構造・機能特性についても検討を加えた。得られた成果を以下にまとめる。1. CH_3CH(OiBu)Cl/ZnI_2系開始剤によるリビングカチオン重合により得たビニルエーテル(VE)類のリビングオリゴマーカチオン種を、C_<60>オクチニル誘導体の炭素アニオン種と反応させることで、1本の単分散VEオリゴマー鎖がC_<60>に付加した1,2-付加誘導体が比較的収率よく合成できることを見いだした。2.得られたオリゴマー誘導体は、C_<60>が備える電気的性質を保持しつつ、汎用有機溶剤に対する良好な溶解性を有しており、C_<60>が均一に分散したポリマーブレンド薄膜を調製することができた。さらに、側鎖にCOOH基を有するVEオリゴマーを付加させることで、極めて良好な水溶性を有するC_<60>オリゴマー誘導体を初めて合成することに成功した。3.リビングラジカル重合法を用いて合成した単分散ポリスチレン(PS)-ニトロキシル付加体から高温で遊離するPSラジカルをC_<60>と反応させることで、2本の単分散PS鎖が1,4位に付加したC_<60>誘導体が簡便に効率よく合成できることを見いだした。4.さらに、2本の単分散ポリスチレン(PS)、ポリ-p-ビニルフェノール(PVP)あるいはPSとPVPの2元ブロック連鎖(PS-PVP)を枝ポリマーとする一連のC_<60>含有ポリマー合成し、溶液中での分子集合体形成などの溶解挙動を詳細に検討した。また、PS含有C_<60>誘導体のPSマトリックスに対する溶解挙動がUV測定により解析できることを明らかにした。本年度は、ビニルエーテル(VE)類のリビングカチオン重合法を基礎技術として、構造の明確な末端型フラーレン(C_<60>)ビニルオリゴマー誘導体を各種合成し、それらの溶解特性や電気化学的性質を調べると共に、C_<60>が均一に分散した薄膜ならびにブレンド膜の作製についても検討した。得られた研究成果を以下に記す。1.C_<60>オクチニル誘導体より調製される炭素アニオン種を、CH_3CH(OiBu)Cl/ZnI_2系開始剤によるリビングカチオン重合を用いて別途調製した、アルキルVEのリビングオリゴマーカチオン種とイオンカップリング反応させることで、3570%の収率で目的の付加生成物を合成することができた。UV-VIS、^1H-および^<13>C-NMRによる詳細な解析の結果、生成物は両イオン種が1対1で結合した設計通りの構造を有すること、さらに1,2-付加反応が選択的に進行したことを明らかにした。2.アルキルVEオリゴマー鎖を有する誘導体は、既存の各種C_<60>低分子量誘導体に比して、汎用有機溶剤に対する溶解性の向上が認められ、C_<60>単体が備える電子的性質を保持していることを電気化学的手法により確認した。さらに、C_<60>ポリメチルVE誘導体は、ポリVEのみならずポリスチレンとも相溶であり、溶剤キャスト法によりC_<60>が均一に分散したポリVE-ポリスチレンブレンド薄膜を作製することができた。

3.側鎖エステル基を有するVEオリゴマーを用いて末端型C_<60>誘導体を合成し、次いで加水分解することで、ビニルオリゴマー部位の側鎖に水酸基あるいはカルボキシル基を有する水溶性末端型C_<60>VEオリゴマー誘導体を合成することに成功した。特に、既報の各種親水性C_<60>誘導体に比して、極めて大きな水への溶解度(C_<60>換算で約25mg/mL)を有するカルボン酸Na塩型誘導体をはじめて合成した。新規な炭素同素体であるフラーレンC@@S260@@E2を機能性素材として利用するためには、汎用有機溶媒に対する溶解性や成型加工性を改善する必要があり、C@@S260@@E2のポリマー誘導体化は有力な手段となりうる。本科学研究費補助金による平成10年度の研究では、安定ニトロキシルを用いた“リビング"ラジカル重合法による各種C@@S260@@E2含有ポリマーの精密合成を検討し、さらにそれらの構造・機能特性についても検討を加えた。得られた成果を以下にまとめた。1.リビングラジカル重合法を用いて合成した単分散ポリスチレン(PS)-ニトロキシル付加体から高温で遊離するPSラジカルのC@@S260@@E2に対する付加反応を詳細に検討した結果、C@@S260@@E2の特定部位(1,4位)に長さの揃った2本のPS鎖が付加したC@@S260@@E2誘導体が合成出来ることを見いだした。本法は、簡便で効率的なC@@S260@@E2含有ポリマーの新規合成法として有用である。2.上述の結果に基づき、2本の単分散ポリスチレン(PS)、ポリ-p-ビニルフェノール(PVP)あるいはPSとPVPの2元ブロック連鎖(PS-PVP)を枝ポリマーとする一連のC@@S260@@E2含有ポリマー、それぞれC@@S260@@E2-(PS)@@S22@@E2、C@@S260@@E2-(PVP)@@S22@@E2およびC@@S260@@E2-(PS-PVP)@@S22@@E2を合成し、有機溶媒中における多分子ミセル形成などの溶解挙動を検討した。何れのポリマーもほぼ分子設計通りに合成されたことを確認すると共に、誘導体のC@@S260@@E2部位換算での最大溶解度は枝ポリマーの種類と分子量に強く依存することを実験的に明らかにした。3.分子量を異にする一連のC@@S260@@E2含有ポリスチレン誘導体(C@@S260@@E2-(PS)@@S22@@E2)を合成し、ポリスチレンマトリックスに対する溶解挙動をUV測定により検討した。その結果、C@@S260@@E2-(PS)@@S22@@E2は枝ポリマーの鎖長に依存してバルクおよびブレンドフィルム中で単分子分散もしくは多分子ミセル形成することが明らかとなった。
リガンド模倣ペプチドの検索と生体内系への応用

本研究では、短いオリゴペプチドがそのアミノ酸配列により多様な立体構造を模倣できるというリガンド模倣ペプチドの考え方をもとに、非ペプチド性のリガンドの受容体に対する相互作用をオリゴペプチドを使って模倣しようと試みた。まず、そのために必要なランダムペプチド・ライブラリーを大腸菌ファージM13mp18を利用して作成した。このランダムペプチド・ライブラリーを検索することにより、カルモデュリン(CaM)に結合し、カルモデュリンを介するシグナル伝達を阻害する2種類のペプチド(ペプチド1:WDTYRISFおよびペプチド2:WPSLQAIR)を見出した。in vitro系においてペプチド1はCaMキナーゼIの活性を抑制したが、CaMキナーゼIIの活性は抑制しなかった。これとは逆にペプチド2はCaMキナーゼIIの活性を抑制したが、CaMキナーゼIに対する影響は少なかった。また、ペプチド1は植物由来のCDPKキナーゼの活性は抑制したが、ペプチド2は影響を与えなかった。これらの結果より、ペプチド1およびペプチド2はCaMが介する細胞内シグナル伝達に対してそれぞれ異なった影響を及ぼすペプチドであると考えられ、生体内においても特異的抑制効果を示すことが期待された。さらに、それらのペプチドを生体内で発現させるために必要と考えられる遺伝子転写の人為的誘導系を形質転換植物において開発した。この転写誘導系は動物のステロイドホルモンであるグルココルチコイドの存在下でのみ強い転写活性化能を示すキメラ転写因子(GVG)とそれが認識するプロモーターから構成されている。ルシフェラーゼ遺伝子をレポーターとして行った実験では、この系はタバコおよびシロイヌナズナの形質転換植物体内で転写誘導系として有効に働くことが証明された。この転写誘導系は形質転換植物体内で、植物に多面的な影響を与えることなく有効に働くものとして現在唯一のものであり、模倣ペプチドの発現以外にも多くの用途に使用できるものと期待される。カルモデュリン(CaM)に結合活性のあるペプチドの検索を、M13ファージをベクターとして作成されたランダムペプチド・ライブラリーの中から行なった。その結果、10アミノ酸長の2種類のペプチド(ペプチド1:WDTYRISFおよびペプチド2:WPSLQAIR)がCaMに対して非常に強い結合能を有していることが明らかになった。これらのペプチドは、CaMを活性化しないという意味において当初期待されたCaMに対するCaイオンの結合を模倣するものではなかったが、それらに関して非常に興味深い生理学的性質が見いだされた。無細胞系において、ペプチド1はCaMキナーゼIの活性を抑制したがCaMキナーゼIIの活性は抑制しなかった。これとは逆にペプチド2はCaMキナーゼIIの活性を抑制したがCaMキナーゼIの活性に対する影響は少なかった。また、ペプチド1は植物のCDPKキナーゼIの活性を抑制したが、ペプチド2は影響を与えなかった。これらの結果より、ペプチド1およびペプチド2はCaMに対してそれぞれ異なった性質を付与できるペプチドであると考えられ、生体内系における応用が期待される。cAMP・レセプター蛋白質(CRP)およびG蛋白質に結合するペプチドに関してもの検索が行なわれ、特異的に結合するものが複数同定された。これらの内、一部については無細胞系において結合様式の解析が行なわれている。カルモデュリン(CaM)に結合活性があり、CaMキナーゼ、CDPKキナーゼに対する阻害活性をもつペプチド(ペプチド1 : WDTYRISFおよびペプチド2 : WPSLQAIR)について、植物内で誘導的に発現させるために、形質転換シロイヌナズナで有効に働く人為的転写誘導系の開発を行った。

その結果、ラットのグルココルチコイドレセプター(GR)のホルモン結合ドメインと酵母の転写因子GAL4の結合ドメイン、ヘルペスウイルスの転写因子VP16の転写活性化ドメインを組み合わせたキメラ転写因子(GVG)がグルココルチコイド存在下でのみ強い転写活性化能を示すことが明らかとなり、この系を用いてリガンド模倣ペプチドの形質転換植物内における誘導的発現が可能となった。さらに、系の確立のためにルシフェラーゼ遺伝子をレポーターとして用いる予備的な実験を行った結果、与えるグルココルチコイドの種類や濃度を変えることにより、転写誘導の強さや持続時間が変化すること、グルココルチコイドは根、葉の表面などから容易に取り込まれることなどが判った。現時点において、この系は多面的な影響を与えることのない転写誘導系として形質転換シロイヌナズナ内で働く唯一のものである。また、この系においてキメラ転写因子を発現させるためのプロモーターは任意に換えることができるので、転写が誘導される植物内の器官を限定することも可能である。現在、ペプチド1およびペプチド2が器官特異的に発現誘導される形質転換シロイヌナズナを作成中である。なお前年度において検索されたcAMPおよびGTPの結合を模倣するペプチドについては、無細胞系において結合様式を解析した結果、蛋白質に対する非特異的結合である可能性が強いと考えられたので、現在検索方法の改善を検討中である。