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マイクロバイオセンサ-の開発

本研究課題では免疫センサ-、医療用酵素センサ-、環境計測用バイオセンサ-の研究の盛んなフランス・ドイツのグル-プと共同研究を遂行し、各種マイクロバイオセンサ-の開発及びそれらの実用化を図る。具体的には以下の示すように研究調査及び共同研究を遂行した。民谷助教授(東大先端研)は、ブライシュ工科大学、ペルピニアン大学を訪問、滞在し、共同研究を実施した。特にブライシュ工科大学では、シュミット教授らが新規に合成した人工脂質を水晶振動子上にLB膜法によって固定化し、これを用いて安定なにおいセンサ-を作製するための基礎特性を検討した。ペルピニアン大学では、農薬センサ-開発のために研究討論を実施した。博士課程の学生を軽部研に派遣し、具体的に共同研究を実施することとなった。横山博士(東大先端研)は、ポ-ルサバチエ大学・モ-リスコンタ教授の研究室に滞在した。コンタ教授は、電気化学的手法によるNAD_+の再生産に関する研究を行っている。すなわちNADH酸化酵素であるジアホラ-ゼ、メディエイタ-であるフェリシアン化カリウムを用いNAD^+を電気化学的にリサイクルするものである。最近では、これと乳酸デヒドロゲナ-ゼとを組み合わせた乳酸センサ-に関する研究も行っている。また分光電気化学測定により、酵素反応と電気化学反応を同時にモニタリングしている。これにより乳酸センサ-作製の最適条件を見しだしている。一方、横山は、微小バイオセンサ-の専門家であり、滞在中に、直径30μmの微小白金極上に乳酸デヒドロゲナ-ゼ、ジアホラ-ゼを固定化した微小乳酸センサ-を作製し、その特性を調べることにより、微量分析法の開発を実施した。鈴木博士(東大先端研)は、ブライシュバイク工科大学、リヨン大学、コンピエ-ヌ工科大学を訪問し、研究討議を行い、共同研究の可能性について話し合った。ブラウンシュバイク工科大学では印刷技術を利用した集積型マイクロバイオセンサ-の研究を行っているが、このような集積型バイオセンサ-では所定の箇所のみ何種類かの酵素を固定化する必要がある。この目的のため鈴木らが行っている光架橋性ポリマ-を利用した酵素固定化法は適しており、共同研究の可能性を議論した。リヨン大学では酵素溶液に浸すだけで共同結合できる膜を利用している。この方法はきわめて簡単に酵素を均一に固定化できる。この材料をマイクロサンセ-に適用する方法について検討した。コンピエ-ヌ大学では酵素固定化技術全般の日仏両国の研究の現状について情報を交換し、共同研究性を議論した。久保助教授(創価大)は、コンピエ-ヌ工科大学、ペルピニアン大学、を訪問した。コンピエ-ヌ工科大学のト-マス教授の研究室では、バイオセンサ-やバイオリアクタ-などの研究を中心に行っている。組み換え菌を利用したバイオリアクタ-については、かなり精力的に研究が進められており、制御技術としてバイオセンサ-の利用がきわめて重要と考えられた。また、ペルビニアン大学のマ-ティ教授の研究室では、農薬計測用バイオセンサ-の開発が行われている。とくにマ-ティ教授は農薬測定用の酵素とCO_2センサ-を必要としており、日本側からは、これらを供給できるため、今後この方面で共同研究をすすめていくことを話し合った。
マルチパルスレーザーホログラフィによる流下液膜の蒸気吸収・伝熱促進機構の解明と熱工学的評価

吸収冷凍機吸収器の高性能化を目的に,現行の伝熱管型ではないプレート型吸収熱交換器を試作し,プレート外壁面上を流下するLiBr水溶液の流動状況の可視化観察と,その際に流下する薄液膜の表面ならびに内部に生じる界面活性剤添加によるマランゴニ対流の発生・成長機構について検討するために,レーザーホログラフィ実時間干渉法による静止LiBr水溶液膜を対象とした界面撹乱の可視化観察を行った.まず,カラーハイスピードビデオカメラを用いたプレート型吸収器の伝熱面上を流下するLiBr水溶液の流動状況の可視化観察から,水蒸気を吸収しつつ流下するLiBr水溶液は,一様な液膜厚さで流下するのではなく,界面活性剤添加による吸収の空間的な不均一性のために,断続的な筋状流れを形成していることがわかった.そして,この筋状流れの時空間的な変化は吸収伝熱性能に大きな影響を与えることを示した.ついで,静止LiBr水溶液膜を対象とした可視化観察から,吸収開始直後(数ミリ秒のオーダー)に液表面にベナールセル状の規則性を持った微小セルが発生することを初めて示した.そして,この微小セルはごく短時間のうちに消滅し,液膜内部の流動を伴った大きな渦を引き起こすことを示した.また,その際,極細熱電対を用いた溶液表面温度の測定を行い,界面活性剤添加の場合には,吸収開始直後に表面において空間的な温度分布が生じること,そして,その分布は時間的に変化することを明らかにした.以上の結果,プレート型吸収熱交換器の性能は現行の水平伝熱管型吸収熱交換器の性能を1020%上回る良好な結果を得た.特に横溝波形形状のプレートのほうが性能向上を期待できることも分かった.そして,静止液膜ならびに流下液膜を対象とした可視化観察により,その性能向上には,冷媒水蒸気吸収時にLiBr水溶液に生じるマランゴニ対流が大きく貢献していることを実験的に明らかした.吸収冷凍機吸収器の高性能化を目的に,現行の伝熱管型ではないプレート型吸収熱交換器を試作し,プレート外壁面上を流下するLiBr水溶液の流動状況の可視化観察と,その際に流下する薄液膜の表面ならびに内部に生じる界面活性剤添加によるマランゴニ対流の発生・成長機構について検討するために,レーザーホログラフィ実時間干渉法による静止LiBr水溶液膜を対象とした界面撹乱の可視化観察を行った.まず,カラーハイスピードビデオカメラを用いたプレート型吸収器の伝熱面上を流下するLiBr水溶液の流動状況の可視化観察から,水蒸気を吸収しつつ流下するLiBr水溶液は,一様な液膜厚さで流下するのではなく,界面活性剤添加による吸収の空間的な不均一性のために,断続的な筋状流れを形成していることがわかった.そして,この筋状流れの時空間的な変化は吸収伝熱性能に大きな影響を与えることを示した.ついで,静止LiBr水溶液膜を対象とした可視化観察から,吸収開始直後(数ミリ秒のオーダー)に液表面にベナールセル状の規則性を持った微小セルが発生することを初めて示した.そして,この微小セルはごく短時間のうちに消滅し,液膜内部の流動を伴った大きな渦を引き起こすことを示した.また,その際,極細熱電対を用いた溶液表面温度の測定を行い,界面活性剤添加の場合には,吸収開始直後に表面において空間的な温度分布が生じること,そして,その分布は時間的に変化することを明らかにした.以上の結果,プレート型吸収熱交換器の性能は現行の水平伝熱管型吸収熱交換器の性能を1020%上回る良好な結果を得た.特に横溝波形形状のプレートのほうが性能向上を期待できることも分かった.そして,静止液膜ならびに流下液膜を対象とした可視化観察により,その性能向上には,冷媒水蒸気吸収時にLiBr水溶液に生じるマランゴニ対流が大きく貢献していることを実験的に明らかした.本年度は,実機吸収器の高性能化のために現在開発を行っている平滑平板型ならびに波型のプレート式吸収熱交換器を対象としたLiBr水溶液の流動状況の可視化観察と,その際に流下する薄液膜の表面ならびに内部で生じる界面活性剤添加によるマランゴニ対流の発生・成長機構について検討するために,He-Neレーザーを光源とした,レーザーホログラフィ実時間干渉法による静止LiBr水溶液膜を対象とした界面撹乱の可視化観察実験を行った.まず,ハイスピードカラービデオカメラを用いたプレート式吸収器の伝熱面上を鉛直下方に流下するLiBr水溶液の流動状況の可視化観察から,水蒸気を吸収しつつ流下するLiBr水溶液は,一様な液膜厚さで流下しているのではなく,界面活性剤添加による吸収の局所的な不均一性のために,断続的な筋状流れを形成していることがわかった.そして,この筋状流れは溶液流量の増加に伴い時空間的に大きく変化すること,また,吸収伝熱性能に大きな影響を与えることを明らかにした.ついで,静止LiBr水溶液膜を対象とした可視化観察から,吸収開始直後(数ミリ秒のオーダー)に液表面にベナ-ルセル状の規則性を持った微小セルが発生することを始めて示した.

そして,この微小セルはごく短時間のうちに消滅し,液膜内部の流動を伴った大きな渦を引き起こすことを示した.以上のことから,可視化観察により,これまで不明であった水蒸気吸収時にLiBr水溶液に生じるマランゴニ対流の発生・成長の過程の概略を実験的に明らかにできたと考える.昨年度に引き続き,既存の伝熱管型ではない二種類のプレート型吸収熱交換器を対象とした吸収実験と,静止臭化リチウム水溶液膜を対象とした界面撹乱の可視化観察実験を行った.さらに今年度は,縦型管内吸収式吸収熱交換器についても,界面活性剤添加による蒸気吸収・伝熱促進効果を実験的に調べた.また,平滑型プレート吸収熱交換器を対象に,臭化リチウム水溶液膜への冷媒蒸気吸収について,数値シミュレーションを行った.まず,プレート型試作吸収器を用いた性能実験からは,試作したプレート型吸収熱交換器の冷凍能力が現行の水平伝熱管型吸収熱交換器の性能を1020%上回る結果を得た.特に横溝波形形状のプレートが性能向上が期待できることが分かった.この性能向上の原因について調べるために,数値シミュレーションによりプレート型吸収器の基本特性を明らかにするとともに,臭化リチウム水溶液の流動状況の可視化観察と溶液温度分布の測定実験から局所吸収熱交換特性を明らかにした.以上の結果から,従来行われてきた入口・出口の状態のみから吸収熱交換器の性能を求める手法は不十分であることを指摘し,局所熱交換特性に基づいて求めた実質熱通過率を提案した.さらに,熱工学的な観点からプレート型吸収熱交換器の評価を行うために,熱交換単位数,温度効率および吸収効率を求め,現行タイプの吸収熱交換器との性能比較を行った.その結果,プレート型吸収器の温度効率は現行タイプに比べて1.6倍ほど上回るようになること,しかし,吸収効率にはほとんど差が見られないことを明らかにした.
頭部外傷実験モデルラットを使った急性期脳損傷における新しい神経保護薬の探求

頭部外傷性脳損傷(TBI)の治療薬でその臨床効果が確認されたものはない。我々は新しい神経保護作用の期待できる薬物として大黄の有効成分の一つであるエモジンの生体内投与による効果をTBIモデル動物を用いて検討した。記憶・学習に関係深いと考えられている海馬シナプス伝達の長期増強(LTP)がTBIのみの群で障害されて、TBI後にエモジンを投与した群ではLTPの障害が認められなかった。エモジンがTBI後の脳保護薬として有効であることを示唆する結果が得られた。本研究は新しい神経保護作用の期待できる薬物(大黄の主有効成分であるエモジン)が本当に外傷性脳損傷(TBI)の中枢神経系ニューロンの機能異常を改善し、新しい神経保護薬として効果があるのかについて、TBI実験モデル動物を用いて検討するものである。TBIの治療困難な後遺症の一つとして記憶障害があげられる。本研究では記憶や学習の細胞レベルでのモデルと考えられている長期増強(LTP)を指標として、TBI後のシナプス可塑性の障害およびそれに対するエモジンの効果について研究している。今年度は研究分担者が初めて頭部外傷モデルを作製するにあたり、液体打撃後死亡することが頻発したが、麻酔法を工夫することにより、安定して頭部外傷モデル動物の作製ができるようになった。予備実験として、エモジンの投与による毒性や投与方法を検討した。その結果、安全性や吸収性は確認された。次に液体打撃を与えて1週間後に頭部外傷モデルラットから得られた海馬核を含む脳スライス標本において、電気生理学的手法を用いて海馬CA1領域における興奮性シナプス後電位を記録し、高頻度電気刺激によるLTP誘発実験を行った。Shamコントロール群に比べて、外傷群においてLTPの誘発が減弱しているのが確認された。エモジンの効果をみるために、液体打撃の10分後にエモジン(10mg/kg)を腹腔内に投与し、1週間後に海馬スライス標本におけるLTPについて検討した。その結果、TBI後にも関わらず、エモジンを投与した群からのスライス標本では、Shamコントロール群と同じ程度のLTPが観察された。このことは、外傷後早期にエモジンを投与するとLTPの誘発障害が改善されることを意味する。これを踏まえ、エモジンの作用をさらに検討するため低濃度のエモジンの効果、投与時間を遅らせた場合の効果について現在検討中である。本研究は新しい神経保護作用の期待できる薬物(大黄の主有効成分であるエモジン)が本当に外傷性脳損傷(TBI)の中枢神経系ニューロンの機能異常を改善し、新しい神経保護薬として効果があるのかについて、TBI実験モデルラットを用いて検討するものである。中等度の液体打撃を頭頂部に与えた1週間後に、海馬核を含む脳スライス標本から電気生理学的手法を用いて海馬CA3-CA1シナプス伝達活動を海馬CA1領域で記録した。高頻度電気刺激によりシナプス伝達効率が促進され、それが長時間続く現象(長期増強;LTP)が起こり、これは記憶や学習の細胞レベルでのモデルと考えられているものである。平成20年度の研究でShamコントロール群に比べて、外傷群においてLTPの程度が有意に減弱し、外傷後早期(10分後)にエモジンの腹腔内投与(10mg/kg)をした群では、Sham群と同等レベルのLTPが起こることが示唆された。本年度はTBIによる細胞脱落の有無、高頻度刺激前の基礎的伝達における入力-出力関係、より低濃度のエモジンの効果、投与時間を遅らせた場合の効果などについて検討した。その結果、TBI後特に細胞脱落はなく、基本的シナプス伝達は外傷群でかえって促進されていることが示唆された。また低濃度エモジン(1mg/kg)の早期投与によりLTP改善傾向がみられ、外傷後4-5時間後にエモジンを投与した群でもLTPは外傷のみの群に比べて改善した。これらのことから、1)外傷後のLTPの障害は機能的な障害であり、エモジンによりこれが改善されること、2)エモジンによるLTP改善効果は、投与時期が数時間後でもみられることから、エモジンは神経保護薬としての有用性が高いことが考えられる。外傷性脳損傷(TBI)の後遺症として記憶障害、注意障害、遂行機能障害などの高次脳機能障害が臨床上問題となっている。我々は新しい神経保護作用の期待できる薬物として大黄の主有効成分であるエモジンが、本当にTBI後の中枢神経系ニューロンの機能異常を改善し、新しい神経保護薬として効果があるのかについて、TBI実験モデル動物を用いて検討した。液体打撃法(FPI)を用いて中等度の衝撃により作製した頭部外傷モデルラットの脳スライス標本から電気生理学的手法を用いて海馬CA1領域における興奮性シナプス後電位を記録した。記憶・学習に関係するといわれている長期増強(LTP)はFPI群において有意にLTPの誘発・維持が減弱していた。

しかしながら、エモジンを外傷後早期に腹腔内投与(10mg/kg)した群ではsham群と同等のLTPが誘発され、エモジンに神経保護作用があることが示唆された。エモジンの投与を外傷後4-5時間で行った場合、低濃度エモジンを投与した場合でもLTPの改善がみられた。腹腔内にエモジンを投与したエモジンが脳内に到達しているかを調べるために、高感度液体クロマトグラフ法(HPLC法)を用いて、脳組織内エモジンの濃度を測定した結果、海馬組織内にエモジンが到達していることが確かめられた。エモジンの効果はアデノシンA1受容体の阻害剤の同時投与で阻害されないことから、A1受容体を介しての作用は主な機序でないことが示唆された。TBI後のエモジン投与による海馬CA1領域におけるLTPの改善機序はまだ不明であるが、外傷後4-5時間後の投与でも効果があることから、臨床応用にも効果が期待できる。
単球系幹細胞を用いた次世代血管再生医学と骨髄由来心筋の収縮特性・電気伝導の解析

血管再生を目的とした骨髄細胞移植医療の確立には、特異的に血管分化する骨髄細胞分画の単離・同定が必要である。造血系幹細胞が骨髄中の内皮前駆細胞であると報告されてきたが、単球系幹細胞も内皮前駆細胞であるとの報告も多い。この点を明らかにするために、骨髄単球系細胞の内皮分化能、バルーン傷害血管における機能的内皮再生による内膜肥厚の抑制効果を検討した。【方法】骨髄由来単球系幹細胞はCD14陽性細胞をソートして採取しVEGF存在下で培養し、造血系細胞マーカー、内皮系マーカー、間葉系マーカー抗体にて免疫染色を行い分化誘導を検討した。ヌードラット頸動脈をバルーン傷害して内膜肥厚モデルを作製し、直後にPKH2-GL蛍光染色したヒト骨髄由来CD14陽性細胞を動脈内に投与した。【結果および考察】VEGF存在下で培養された骨髄由来CD14陽性細胞はVEGF存在下で造血系細胞マーカー(CD14,CD45,CD11b)を失い、内皮系マーカー(Tie2,CD34,Flk)出現が観察された。間葉系マーカーは陰性であった。バルーン傷害後に移植された骨髄CD14陽性細胞は傷害部位にMCP-1依存性に接着し、内膜肥厚を完全に抑制した。末梢血由来CD14陽性細胞では接着は観察されなかった。接着した骨髄CD14陽性細胞は造血系細胞マーカー(CD14,CD45,CD11b)を失い、内皮系マーカー(vWF, eNOS)を発現していた。再生内皮はエバンスブルーの侵出が抑制され、アセチルコリン依存性の拡張を示した。HUVECを用いたflow assayではMCP-1で刺激された骨髄CD14陽性細胞が明らかに高い接着能を示した。骨髄由来CD14陽性単球系幹細胞はbeta-integrin定常発現量が末梢血由来CD14陽性単球系細胞より著明に亢進していた。MCP-1により活性化beta-integrinが増加していた。CCR2発現は差がなかった。【結論】骨髄由来単球系幹細胞は内皮前駆細胞への分化能を持ち、MCP-1依存性にバルーン傷害内膜に強固に接着した。内皮再生により内膜肥厚は抑制され再狭窄も阻止された。PTCA後の内皮再生を目的とした細胞治療に応用可能と考えられた。この研究成果により、造血系幹細胞より大量に骨髄中に含まれる単球系細胞が内皮前駆細胞を構成することが明らかになった。

ヒト虚血心への血管再生を目的とした骨髄細胞移植医療の確立には、特異的に血管分化する骨髄細胞分画の単離・同定、再生心筋の分子・個体レベルでの病態心での機能解析だけでなく、移植心筋部位・細胞導入方法の検証などをふまえての多施設臨床試験が必要である。血管内カテーテル治療後再狭窄予防としてsirolimus溶出ステントの著明効果が報告されたが、これは内皮再生化ではなく血管平滑筋増殖抑制である。骨髄細胞など生体材料からの傷害冠血管内皮再生化や自家骨髄系内皮細胞被覆ステントの開発が待たれる。私達は骨髄CD14+単球細胞は内皮前駆細胞としての機能を充分にもち、虚血部ではVEGF存在下で完全な血管内皮細胞に分化し、MCP-1ケモカインにより傷害血管内皮に強固に接着し内皮再生化・内膜肥厚抑制することを見いだした(Circ Res 2004;93:980-989)。これは骨髄細胞中に豊富に含まれる単球系細胞が血管内皮幹細胞として機能し、血管内皮だけの再生を強力に誘導可能な生体材料として、重症狭心症や傷害冠血管内皮再生化に利用可能であることを示唆していた。この研究成果をもとに、1)血管に特異的分化する骨髄細胞分画の免疫学的位置づけ・成熟内皮への分化誘導法確立、2)骨髄細胞より分化再生した心筋細胞の分子・個体レベルでの機能解析,3)虚血心への多施設血管新生臨床試験への展開、血管内皮再生工学による再狭窄予防法の開発を行う。【目的】骨髄単核球移植による血管新生効果が臨床的にも確立されている。内皮系幹細胞の関与が大きいが新生血管内皮に集積する細胞起源は明らかでない。骨髄由来単球系幹細胞の内皮細胞分化の可能性とバルーン傷害血管での内皮再生による内膜肥厚の抑制効果を検討する。【方法】骨髄由来単球系幹細胞はCD14陽性細胞をソートして採取しVEGF存在下で培養し、造血系細胞マーカー、内皮系マーカー、間葉系マーカー抗体にて免疫染色行い分化誘導を検討した。ヌードラット頸動脈をバルーン傷害して内膜肥厚モデルを作製し、直後にPKH2-GL蛍光染色したヒト骨髄由来CD14陽性細胞を動脈内に投与した。【結果および考察】VEGF存在下で培養された骨髄由来CD14陽性細胞はVEGF存在下で造血系細胞マーカー(CD14,CD45,CD11b)を失い、内皮系マーカー(Tie2,CD34,Flk)出現が観察された。間葉系マーカーは陰性であった。バルーン傷害後に移植された骨髄CD14陽性細胞は傷害部位にMCP-1依存性に接着し、内膜肥厚を完全に抑制した。末梢血由来CD14陽性細胞では接着は観察されなかった。接着した骨髄CD14陽性細胞は造血系細胞マーカー(CD14,CD45,CD11b)を失い、内皮系マーカー(vWF, eNOS)を発現していた。再生内皮はエバンスブルーの侵出が抑制され、アセチルコリン依存性の拡張を示した。HUVECを用いたflow assayではMCP-1で刺激された骨髄CD14陽性細胞が明らかに高い接着能を示した。骨髄由来CD14陽性単球系幹細胞はbeta-integrin定常発現量が末梢血由来CD14陽性単球系細胞より著明に亢進していた。MCP-1により活性化beta-integrinが増加していた。CCR2発現は差がなかった。【結論】骨髄由来単球系幹細胞は内皮前駆細胞への分化能を持ち、MCP-1依存性にバルーン傷害内膜に強固に接着した。内皮再生により内膜肥厚は抑制され再狭窄も阻止された。PTCA後の内皮再生を目的とした細胞治療に応用可能と考えられた。
荒天下の船体動揺および操船限界評価のための数学モデルの研究

本研究では、浜本等が提案した船体水線面固定座標系での波浪中の操縦運動推定法を基に、船速が0付近まで低下する荒天海象を対象とした6自由度の操縦運動および船体動揺計算法を開発した。本計算法では、実験的に明らかにした高プロペラ荷重度状態での自航要素や船体・舵の干渉係数等の変化が考慮されている。本計算法の一例として、大型タンカーを対象に荒天中の保針状態での船体運動を推定し、荒天中の操船限界、安全航行に必要な最低機関出力の評価を行った。その結果、本船の連続最大出力ではビューフォト風力階級7相当の海象中の向波・斜向波では操縦性能を保証する最低船速を満足できないことを明らかにした。第一に、既存のモデルを基に、船体水線面固定座標系での6自由度船体運動時系列計算プログラムの作成を実施した。平成26年度終了時点では、外乱(波漂流力、一様風)中の前後・左右・回頭方向の3自由度の操縦運動の推定を可能とした。推定結果を波浪中の自由航走模型試験結果と直接は比較していないが、過去の文献から同様の状態における操縦運動の推定結果と比べておおよそ妥当であることを確認している。また、非線形性を考慮した各時刻の瞬間における波面に対するフルードクリロフ力の計算を可能にした。現段階までに作成されたプログラム自体から得られる新たな知見は少ないが、研究の目的としている「荒天中の船体運動特性」の評価には上述の外力の考慮は不可欠であるため、今後その評価を可能とする6自由度船体運動時系列計算プログラムの基礎を作成することができたという点で意義がある。第二に、極度の高プロペラ荷重度と大斜航中における自航要素および船体と舵・プロペラの干渉に関する係数の変化を平水中の拘束模型試験にて調査をした。模型船は低速肥大船としてタンカー(KVLCC1)を採用した。これにより、船速が0付近まで低下する荒天状況を想定した船体に働く流体力特性と船尾流場の変化の傾向を明らかにした。また、本試験結果によって明らかとなった微係数の変化を上述のプログラムで考慮可能とするように拡張をおこなった。平水中の通常操船の範囲における操縦運動推定では、これらの変数は実船の自航点付近で一定とみなされることが多く、極度の高プロペラ荷重度におけるそれらの変化は過去にあまり明らかにされていない。そのため、荒天中の船体運動の推定精度の向上には、本実験結果が非常に有用であると考える。加えて、既存の定常直進中の操縦応答推定プログラムを用いて、荒天中の操縦運動推定に対するこれら微係数の変化の影響力を明らかにした。平成26年度には、波漂流力を考慮した前後・左右・回頭方向の3自由度操縦運動の推定プログラムを作成した。本年度では第一に、これに波浪強制力と船体動揺による流体反力を考慮し、波浪中での左右・横・縦揺れを含む6自由度の船体動揺計算を可能にした。本計算では、荒天中で船速が0付近まで低下する状態での操舵による応答を推定可能にするために、平成26年度に本研究で実施した水槽試験結果から高プロペラ荷重度状態での自航要素や船体・舵の干渉係数等をモデル化し適用した。また、過去の規則波中旋回試験結果を用いて本計算法はおおよそ妥当なあることを検証した。この検証によると横揺れの推定精度は高くない。この改善には過去の運動の影響の考慮が必要であると考えられ、この適用は今後の課題とする。第二に、本計算法を用いて大型タンカーを対象に荒天中の保針状態での船体運動を推定し、荒天中の操船限界、安全航行に必要な最低機関出力の評価を行った。その結果、本船はビューフォト風力階級7の海象中の向波・斜向波では操縦性能を保証する最低船速を満足できないこと、斜追波付近では横揺れが大きくなる傾向があることを明らかにした。また、本船の連続最大出力を想定の1.15倍にした場合に最低船速を満足できることがわかった。本計算は一例であるが、本計算法は船速が0付近まで低下する荒天海象中で対象とした船舶の操船限界の推定を可能とし得る。さらに、他の様々な船型に対して同様の評価をすることで、操船限界の基準が明らかとなり海難事故の減少に寄与できるため、本研究による成果は意義がある。本研究期間では比較を行えなかったが、大波高中の操縦運動と船体動揺、交付申請時に対称の一部としていた追波中の波乗り現象による船速の増加や不規則波中の応答に関して直接模型試験と比較し、本計算法の適用範囲の検証およびこれらの状態でも適用可能な計算法への改善が必要と考える。

研究実施計画では平成26年度終了時点の目標は、拘束模型試験の実施と6自由度船体運動時系列計算プログラムの概略の作成をし、追波中で船速が増加する波乗り現象やブローチングによる転覆の計算を可能とすることとしていた。しかし、実際の進捗では、拘束模型試験は予定通り実施したが、6自由度船体運動時系列計算プログラムの概略の作成を完了しておらず、3自由度の操縦運動から転覆を含む6自由度の船体運動に拡張する段階の途中までしか完了していない。そのため、「やや遅れている。」と評価した。船舶海洋工学第一に6自由度船体運動時系列計算プログラムの概略の作成を完了し、追波中で船速が増加する波乗り現象やブローチングによる転覆の計算を可能とする。また、過去に弊所で実施した自由航走模型試験結果と比較し、本プログラムの妥当性を確認する。そのために、まず船体による波の拡散から生じる力(ディフラクション力・ラディエーション力)の計算を可能とする。荒天中の大波高では、船体動揺の推定精度を向上するにはこれらの流体力の非線形性を考慮する必要があるが、時間節約のために簡略化をして線形理論を基に計算を行っていく。その後、実船の主機作動制限を関連付けて計算を行い荒天中の船体運動特性を明らかにしていく。研究開始当初の目標は不規則波中の運動の解析までを目標としていたが、平成26年度の進捗の遅れを考慮して、最低限の計算結果を得るためにまずは規則波中の運動を対象とする。また、主機作動制限も簡易的な定常状態のモデルを扱っていく。その後、可能な限り不規則波中の運動に発展させる。また、操舵を含むような主機作動制限等を考慮していく予定とする。6自由度船体運動時系列計算を行うための計算機一式と種々の計算データを保存するための大容量記憶装置の購入を平成26年度に予定していた。しかし、進捗の遅れから時系列計算はまたおこなっておらず、数値計算に必要な計算機の性能も未だ不確定な部分があったため購入を見送った。これらを次年度に購入する必要がある。主な物品費としては第一に上述の計算機一式の購入を予定している。作成した時系列計算プログラムの計算速度にも依存するがモニターと合わせておよそ60万円前後を検討している。加えて、計算データを保存する大容量記憶装置を購入する。さらに時系列計算の6自由度の煩雑な定式化を行うにあたり、数式処理システムMathematica(約20万円)の購入を予定している。また、学会発表の欄に記載した2件の学会参加費と論文投稿費にも使用予定である。旅費は、学会発表の欄に記載した2件の学会(国内1件,国外1件)に加えて平成27年度の成果を国内で1件発表するための学会の費用として計50万円程度使用予定である。
中空球殻磁性体の2次元自己集積化と電気および磁気特性

一般的に、マグネタイト(Fe_3O_4)はソフト磁性体であることが知られている。本研究では、サブミクロンサイズのFe_3O_4中空球を作製し、これが通常のバルクおよびナノ粒子よりも大きなMH_<max>と保磁力H_cを示すことを明らかにした。これは、中空球構造に閉じ込められた渦状のスピン配列に由来すると考えられ、中空球構造にすることで磁気記憶装置などに必要とされるハードな磁気材料が作製できることを示唆する。また、通常Fe_3O_4は黒色であるが、緑色のFe_3O_4中空球を得た。拡散反射スペクトルから、510nmにピークが観測され、ミー散乱理論を用いたシミュレーションによってこの実測値を再現することができ、内部が空洞であり殻がFe_3O_4である中空構造と可視光の波長に匹敵する直径を有することから説明されうる。本研究で見出した緑色Fe_3O_4は、新しい磁気光学材料を開発する上での新しい道筋になる。最後に、Fe_3O_4中空球からなるマクロサイズの薄膜を作製した。この薄膜の磁化曲線は、磁場を薄膜面に平行にかけた場合と垂直にかけた場合で大きな違いはなかった。この結果は、個々の中空球の等方的な構造に由来して、薄膜が2次元の形状異方性を持たないことを示す。中空球の等方的な磁化は磁気異方性を制御する新しい方法となる。このようなマクロサイズでの中空球の2次元集積化はデバイスなどへの応用が可能であることを示す。以上、本研究により、中空球構造による新しい物性を見出すことができた。低密度、中空形状、生体適合性はバイオ(ドラッグデリバリーなど)や工学での応用をも可能にするであろう。中空球殻構造という不安定な形状に起因する物性探索を目的とした研究を本課題では行なった。まず、ポリスチレン・ビーズをテンプレートとして、中空球殻磁性体の合成を行なった。具体的には、均一沈殿法を用いて無機物水酸化物を均一にコーティングし、空気中あるいは水素気流下でか焼することによって、この構造の酸化物や金属を合成した。本年度は、酸化鉄および酸化コバルトからなる直径約600nm程度の中空球の大量合成に成功し、それらの物性測定を行なった。酸化鉄中空球の系では、マグネタイトとヘマタイトの作り分けに成功し、マグネタイト中空球の磁化曲線を測定することにより、保磁力の大きな温度依存性を見出した。このような大きな温度依存性は、中空球においてのみ観測され、様々な磁気測定を行なった結果、中空球が有する特異なドメイン構造に基づくことを明らかにした。また、酸化鉄中空球の表面修飾にも成功しており、これらを規則正しく基板に並べる段階にまで達した。続いて、酸化コバルト中空球に観測された低温での大きな残留磁化について詳細な検討を行なった。その結果、中空球に由来する特異な緩和機構が関与していることを明らかにした。現在、これらの情報を基に、他の酸化物や金属からなる中空球を作成しており、さらなる新規な物性を探索している。その他、表面修飾した中空球殻の二次元周期構造の作製も引き続き行う予定であり、機能性電極などの開発を考えている。直径約600mm、厚み約40mmの酸化鉄(マグネタイト)中空球の物性および自己集積化に関する研究を本課題では行なった。前年度までの研究において、マグネタイト中空球の大量作製法をすでに確立している。今年度は、作製したマグネタイト中空球の磁化曲線を測定することにより、保磁力の大きな温度依存性を見出し、これが中空球の有する特異なドメイン構造に由来することを明らかにした。Fluidic cell法を用いて、このマグネタイト中空球の単粒子層膜の作製を試みた。水酸化鉄でコートされたポリスチレンビーズを水に分散させ、それを50μmのギャップで隔てられた2枚のスライドグラス中に挿入した。溶媒の蒸発とともに微粒子は凝集し、単粒子層を形成した。これをか焼することによって有機物を蒸発させ、マグネタイト中空球がつくる単粒子層膜を作製した。同様の方法により、多層膜の作製にも成功した。これら薄膜の磁気測定を2Kで行った結果、粉末サンプルよりも薄膜のほうがその保磁力はかなり小さく、また単層膜の方が多層膜よりもその保磁力が小さかった。これは、保磁力に中空球粒子間の相互作用が大きく影響していることを示す。現在、相互作用に関する詳細を調べるため、マイクロSQUIDによる単一中空球粒子の磁気測定をおこなっているところである。また、この直径60nmのマグネタイト中空球は緑色を示した。通常のマグネタイト粒子が黒色を示すことを考えると、これは中空球という構造に由来したミー散乱の影響などが考えられる。このようなグリーンマグネタイトも本研究の大きな成果の一つである。

また、通常Fe_3O_4は黒色であるが、緑色のFe_3O_4中空球を得た。拡散反射スペクトルから、510nmにピークが観測され、ミー散乱理論を用いたシミュレーションによってこの実測値を再現することができ、内部が空洞であり殻がFe_3O_4である中空構造と可視光の波長に匹敵する直径を有することから説明されうる。本研究で見出した緑色Fe_3O_4は、新しい磁気光学材料を開発する上での新しい道筋になる。最後に、Fe_3O_4中空球からなるマクロサイズの薄膜を作製した。この薄膜の磁化曲線は、磁場を薄膜面に平行にかけた場合と垂直にかけた場合で大きな違いはなかった。この結果は、個々の中空球の等方的な構造に由来して、薄膜が2次元の形状異方性を持たないことを示す。中空球の等方的な磁化は磁気異方性を制御する新しい方法となる。このようなマクロサイズでの中空球の2次元集積化はデバイスなどへの応用が可能であることを示す。以上、本研究により、中空球構造による新しい物性を見出すことができた。低密度、中空形状、生体適合性はバイオ(ドラッグデリバリーなど)や工学での応用をも可能にするであろう。
日本人の耐糖能およびβ細胞機能と膵組織学的特徴との関連について久山町研究での検討

肥満などのインスリン抵抗性の存在下では、血糖値を正常に保つためにインスリン需要が大きくなる。膵β細胞はこれに対して、代償性に質的、量的に活動を高めて対応するが、長期に及ぶと疲弊し、機能的、或いは量的な破綻を起こすことにより2型糖尿病が発症すると推測されている。ヒトにおいてβ細胞量がどの程度変動するかについては、生体においてβ細胞量を正確に評価することは非常に困難であるため依然不明な点が多い。日本人における遺伝的背景を含む糖代謝関連因子とα・β細胞量との関係についても、十分に明らかでない。2型糖尿病患者でのβ細胞量の低下は日本人においても報告されているが、これまでの剖検例による検討では、死亡前の治療や栄養状態の変化などもあり、生前に正確な耐糖能レベルや糖代謝指標を評価することは困難であった。また、ゲノムワイド関連解析によりKCNQ1などの2型糖尿病疾患感受性遺伝子とβ細胞機能との関連が示唆されているが、ヒトにおけるβ細胞量との関係性についての報告はない。そこで、福岡県久山町における剖検例の成績を用いて、生前に75g経口糖負荷試験(OGTT)により評価された耐糖能レベル、糖代謝指標、及び2型糖尿病疾患感受性遺伝子とα・β細胞量の関連について検討する。本研究の成果は、日本人における膵内分泌細胞の生理的・病的変化を明らかとし、2型糖尿病の発症予防、根治療法の確立に寄与することが期待される。2002年、2007年、2012年のいずれかの久山町健診でOGTT実施後5年以内に死亡した住民のうち、死後36時間以上の剖検例や病理所見で膵癌や膵炎を認めた者を除いた103名を対象として、生前の耐糖能レベルは正常耐糖能(40名)、境界型(空腹時血糖異常または耐糖能異常、31名)、糖尿病(32名)に分類した。剖検時に得られた膵組織から膵切片を作成し、免疫染色後に全膵面積あたりのβ細胞面積、α細胞面積を測定し、耐糖能による変化を検討した。ゲノムワイド関連解析が行われている98名を対象とし、β細胞面積およびα細胞面積と既報において2型糖尿病疾患感受性遺伝子と報告されている遺伝子の1塩基多型との関連について検討する予定。海外学会での成果報告や成果報告投稿を行うことができず、そのために計上していた経費を次年度へ繰り越した。今後、β細胞のターンオーバーを定量化するため、各症例に対して、β細胞の複製やアポトーシスに関しても評価を検討しており、抗体購入費などに使用予定。また2019年9月に開催される第55回欧州糖尿病学会での成果報告のため演題登録を行っており、採択されれば成果発表のための旅費として使用予定。
重症薬疹の治療効果予測のためのバイオマーカーの確立

薬疹においては、発症初期にその進展・予後を明らかに出来る指標はない。本研究では、臨床診断が確定した重症薬疹患者の発症初期の血清を用いてretrospectiveにmultiplex biometric immunoassayによりサイトカイン及びケモカインを測定した。その結果、Stevens-Johnson症候群、中毒性表皮壊死症、また、薬剤性過敏症症候群では、ある一定の組合せによるサイトカイン変動が検出された。これらの結果はバイオマーカーの変動を個々に捉えるのではなく、それらを組合せて評価することで、初期から重症薬疹の予知が可能になることを示した。今後、治療の選択に寄与すると考えられる。重症薬疹にはStevens-Johnson症候群(SJS)、中毒性表皮壊死症(TEN)、薬剤性過敏症症候群(DIHS)などが含まれ、この中でSJSとTENは主として皮膚と粘膜に障害を引き起こす疾患である。近年、その病態についてはT細胞、サイトカイン、グラニュライシンなど様々な視点から研究され、成果が報告されてきている。しかし、SJSやTENの治療に関してはステロイド大量投与、シクロスポリン、免疫グロブリン製剤(IVIG)、血漿交換療法、Tumor necrosis factor(TNF)-α阻害薬投与などが施行されてきているが、その有効性については、まだ一定した見解は得られていない。本年度の研究では、プレドニゾロン大量内服療法(PT)とメチルプレドニゾロンパルス療法(MPT)で治療を行ったSJS症例とTEN症例のバイオマーカーの変動をretrospectiveに解析し、比較検討した。MPTはメチルプレドニゾロン1000mgを3日間連続して施行する方法を用いた。対象は当科にてSJS又はTENと診断されて入院加療した症例で、PTあるいはMPTを施行された患者である。PT施行した3症例の内訳はSJSは2名、TENが1名である。MPTを施行した9症例の内訳は、SJSが3名、SJS/TENオーバーラップが2名、TENが4名である。いずれも保存血清を用いて検査を施行した。バイオマーカーとしてはInterferon(IFN)-γ、TNF-α、Interleukin(IL)-6、IL-10を治療前後において採取した検体を解析した。PTではIFN-γとIL-10が治療前に比較して治療後に有意に減少し、その後さらにIFN-γのみが有意に減少した。また、治療開始後測定した4つのサイトカイン全てが減少するという傾向を示した。一方、MPTでは4日目(MPT直後)にIFN-γとIL-6が治療前に比較して有意に減少していた。IL-10はPTでは治療後に有意に減少していたのに対して、MPTでは直後にに明らかな変動はなく、20日前後に増加傾向が認められた。PTとMPTでは治療後のバイオマーカーの変動に明らかな相違が認められた。本年度は当科にて入院加療し、最終的に薬疹の臨床病型、すなわちStevens-Johnson症候群(SJS)、中毒性表皮壊死症(TEN)、薬剤性過敏症症候群(DIHS)、固定薬疹などの診断が確定された症例の保存血清を用いてバイオマーカーを検索し、解析を加えた。この結果、これまでSJS症例とTEN症例は一連の同じ病態に属する疾患として広く認識されてきていたが、sFasLは発症初期のTEN症例において顕著に増加していたのに対して、驚いたことに、この増加はSJS症例では認められなかった。また、多種類のサイトカイン及びケモカイン測定の結果について、臨床病型を踏まえて評価した結果では、その後の経過でTENに進展した群においては、sFasLに加えてIP-10とIL-6が著明に上昇し、IL-2, IL-10が減少した。一方、TENの軽症型とみなされてきたSJSに進展する群では、IL-10, IFN-γが上昇していた。バイオマーカーの組み合わせ評価が有用なことが明らかになった。前年度まではStevens-Johnson症候群(SJS)及び中毒性表皮壊死症(TEN)のメチルプレドニゾロン療法後前後のバイオマーカーの検索を進めた。本年度は、新規にSJS/TENでの変動が指摘されているsFasL、グラニュライシンなどのバイオマーカーも追加して解析した。検索が遅延していた薬剤性過敏症症候群(DIHS)においても同様にバイオマーカーの解析を開始した。この結果、これまではTENとSJSは一連の病態と考えられてきたが、sFasLは発症初期のTENにおいて顕著に増加していたのに対して、SJSではsFasLの増加は認められなかった。また、多種類のサイトカイン及びケモカイン測定の結果を、SJS、TEN、DIHSなどの臨床病型を踏まえて解析した結果、TENにおいては、sFasLに加えてIP-10、IL-6が著明に増加し、IL-2、IL-10が減少していた。これに対して、TENの軽症型とみなされてきたSJSに進展した群では、IL-10、IFN-γが上昇していた。一方、経過が遷延したり、自己免疫性甲状腺炎などの後遺症を残す特徴を有するDIHSでは、TNF-α、IL-5、IL-10の増加が認められた。本研究では増加するバイオマーカーだけでなく、その減少するものも含めて検討し、さらにそれらを単独ではなく組合せて評価することにより、重症薬疹への進展の予測が的確にできることを明らかにした。特にsFasLの結果は、これを他のバイオマーカーと組合せて評価することにより、最重症型薬疹であるTENへの進展を予知することが可能になることを示している。

DIHSにおいても変動する特異的なバイオマーカーグループが明らかになり、初期の典型的な症状の発現前にDIHSへの進展を推測することが可能になった。これらの結果は、初期治療の選択が必須な重症薬疹において極めて有用な所見と位置づけられる。薬疹においては、発症初期にその進展・予後を明らかに出来る指標はない。本研究では、臨床診断が確定した重症薬疹患者の発症初期の血清を用いてretrospectiveにmultiplex biometric immunoassayによりサイトカイン及びケモカインを測定した。その結果、Stevens-Johnson症候群、中毒性表皮壊死症、また、薬剤性過敏症症候群では、ある一定の組合せによるサイトカイン変動が検出された。これらの結果はバイオマーカーの変動を個々に捉えるのではなく、それらを組合せて評価することで、初期から重症薬疹の予知が可能になることを示した。今後、治療の選択に寄与すると考えられる。Stevens-Johnson症候群(SJS)、中毒性表皮壊死症(TEN)のサイトカイン及びケモカイン全般の初診時における検体の解析は順調に進んでいる。しかし、SJS症例とTEN症例への継時的な解析や、ステロイドパルス療法、血漿交換療法における治療介入前後の解析は、症例の検体集積が少ない状況を反映して進行は遅れている。このため、本年度は固定薬疹の中で、粘膜症状を有し重症型ともとらえられる多発型固定薬疹症例も選択して初診時の血清を用いて種々のバイオマーカーの検索を進めた。また、SJS症例とTEN症例の検索ではより詳細な初診時の状態を把握するために、当初予定していたバイオマーカーにIL-16, sFasL, granulysinなどを追加して、研究を拡大、進展させた。得られた結果の解析については、今まで、重症薬疹では個々のバイオマーカーのレベルに重点をおいて検索されてきていたが、本年度の結果の検証においては、バイオマーカーをグループ化してとらえ、そのグループ間の相違を比較した。この方法を用いた解析において、始めて、各疾患の初期の病態の相違が把握でき、初期の治療の選択にも有用となることが推測された。また、今まで解析が遅延傾向にあった薬剤性過敏症症候群(DIHS)症例においてもバイオマーカーの解析を開始した。医歯薬学薬剤性過敏症症候群(DIHS)は、経過中にさまざまなヘルペスウイルスが再活性化して病態に関与する全く異なる重症薬疹である。また、近年、本疾患が完全に回復した後に、バセドー病や橋本病、エリテマトーデスなどの自己免疫疾患や劇症1型糖尿病などの後遺症や続発症が出現することが明らかにされてきている。しかし、現在、このような後遺症や続発症の発現にどのような因子が関与するのかについては、全く検証されてきていない。このため、今後の研究では、どのような因子が後遺症や続発症発現の予後に関与するかを1つの視点として、DIHS症例のバイオマーカーを積極的に検索する。当教室で検体を保有している症例の補液療法のみの保存的治療法と全身性ステロイド治療法で加療された2つのDIHS症例群間において、バイオマーカーを選択して比較解析するとともに、その継時的な変動の相違についても検証を目指す予定である。
クォーラムセンシング阻害に対する耐性株の出現可能性および環境適応メカニズムの追究

クォーラムセンシング阻害は、菌を殺菌する効果を持つ抗生物質などとは異なり、菌を死滅させることなく病原性発現を抑制することができるため、次世代の感染症治療法として期待されている。本研究では、細菌はクォーラムセンシング阻害に対する環境適応機能を持っていないのかという疑念のもと、クォーラムセンシングが働くことでアデノシンを同化できる条件下におき、クォーラムセンシング阻害に対する耐性菌の探索を行ったところ、mexRとnalC遺伝子に変異を持った緑膿菌の菌株がクォーラムセンシング阻害に対して耐性を示すことがわかった。また、緑膿菌はクォーラムセンシング阻害剤を変換することも明らかにした。本研究の目的は、細菌のクォーラムセンシング阻害に対する耐性菌株の出現可能性を追究し、環境適応機能を分子レベルで明らかにすることである。現在のところ、クォーラムセンシング阻害剤による病原処理は、細菌に対して選択性を付与したいので耐性菌などが出現しないと報告されている。本研究では、本当にクォーラムセンシング阻害に対して、細菌は環境適応する術を持ち合わせていないのかという疑問を追究するための取組みである。本研究期間内で、1クォーラムセンシング阻害剤に対する耐性菌株の取得、2耐性に関わる遺伝子の同定、3耐性機構の解明を行い、どのようにクォーラムセンシング阻害を回避できるのかなどを追究し、細菌のクォーラムセンシング阻害剤に対する環境適応機能を分子レベルで明らかにすることを最終目的としている。平成25年度においては、緑膿菌の増殖がアデノシン存在下ではクォーラムセンシングに依存することに着眼して、トランスポゾン変異導入手法によりクォーラムセンシング阻害剤であるCー30存在下で増殖が回復する変異株の探索行った。また、ガリウム耐性菌の探索も行った。その結果、数株の変異株が分離でき、遺伝子変異部位がmexRとnalC遺伝子であることがわかった。これらの遺伝子は、細胞内から細胞外へと排出を盲進するポンプ活性の抑制に関わる機能を持っており、Cー30による阻害効果の減少は、これらの遺伝子変異によりCー30の細胞外への排出が盲進されたことが原因であることが示唆された。平成26年度においては、クォーラムセンシング阻害剤に耐性を示したmexR変異株を用いて、耐性メカニズムの解明ならびにクォーラムセンシング阻害剤が代謝変換についての追究、さらに新しい耐性変異株取得に向け、AHLラクトナーゼの過剰発現システムの構築を目的に研究を進めた。その結果、mexR変異株においては、野生株と比較して、クォーラムセンシング阻害剤C30を細胞外への放出が盲進しており、平成25年度の成果で考察した「阻害剤が細胞外へ排出されることで阻害効果が低減し耐性を持つ」というメカニズムを明らかにした。また、野生株において、クォーラムセンシング阻害剤C30が代謝変換されていることを見出し、C30の分子内にある二つのブロモ基が外れている化合物に変換されていることを明らかにした。また、AHLラクトナーゼ存在下で起こるクォーラムセンシング阻害に対する耐性機構を明らかにするために必要な過剰発現システムを構築した。応用微生物学平成25年度中に当初の計画の通り、変異株の探索に成功した。また、得られた変異株のクォーラムセンシング阻害剤耐性メカニズムについても明らかにした。平成25年度の研究を進める中で、クォーラムセンシング阻害剤Cー30が代謝されるという結果が見られた。平成26年度においては、当初の計画のとおりに、その他の阻害剤に対する耐性の有無を確認、そしてその詳細なメカニズム解明はもちろんのこと、クォーラムセンシング阻害剤の代謝変換の意義についても研究を進める予定である。平成25年度においては、当初の計画のとおり、研究費を使用させていただいた。2000円弱のあまりが出たが、無理に残額をゼロにすることなく、次年度の研究費として使用させていただくことにした。残額は少額であるが、平成26年度においても、主に物品購入費に充てる予定である。
赤血球膜異常症における遺伝子発現制御とそのメチル化の意義

ゲノムDNAの発現は、種々のpromoter昨日によって制御されていることが知られており、その一種にepigenetic controlがある。(1)SPTBおよびEPB3:SPTBでは、正常人35名(250クローン)の検討で、promoter領域に存在する5'-CpG-3' sitesは全て完全にunmethylated(メチル化度0%)であった。これに比べて、EPB3では、40名(588クローン)の検討で、全体として約2/3の5'-CpG-3' sitesに約80%以上の高度メチル化度を認めたが、一部にはメチル化度が約30%程度と低い5'-CpG-3' sitesが存在した。この部位は、methylationに関して他の5'-CpG-3' sitesと異なる、特殊な機能部位であると推定された。(2)ELB42:正常人23名(180クローン)の検索では、exon 1のcoding region内の5'-CpG-3' sitesが約90%のメチル化度を呈するのに対して、promoter領域の5'-CpG-3' sitesは平均約66%のメチル化度であり中等度のメチル化度を示していた。続いてP4.2が赤芽球系細胞にのみ発現する蛋白である観点から、正常ヒト末梢血BFU-Eを用いた二相性液体培養法から得られた培養赤芽球を用いて同様に解析したが、これらの成熟段階にある赤芽球では、すでに末梢血単核細胞と同程度のELB42メチル化度を示していることが判明した。そこで、この培養赤芽球よりもさらに幼弱で均一な赤芽球系細胞群と考えられるヒト赤芽球系培養樹立株UT-7/Epoの細胞を用いて解析したところ、ELB42遺伝子promoter領域およびcoding regionの5'-CpG-3' sitesは全てunmethylated(メチル化度0%)であった。以上から、主要赤血球膜蛋白遺伝子の発現に関してmethylationの特異な態度が明らかとなった。(1)SPTBおよびEPB3:SPTBでは、正常人35名(250クローン)の検討で、promoter領域に存在する5'-CpG-3'sitesは全て完全にunmethylated(メチル化度0%)であった。これに比べて、EPB3では、40名(588クローン)の検討で、全体として約2/3の5'-CpG-3'sitesに約80%以上の高度メチル化度を認めたが、一部にはメチル化度が約30%程度と低い5'-CpG-3'sitesが存在した。この部位は、methylationに関して他の5'-CpG-3'sitesと異なる、特殊な機能部位であると推定された。(2)ELB42:正常人23名(180クローン)の検索では、exon 1のcoding region内の5'-CpG-3'sitesが約90%のメチル化度を呈するのに対して、promoter領域の5'-CpG-3'sitesは平均約66%のメチル化度であり中等度のメチル化度を示していた。

そこで、この培養赤芽球よりもさらに幼弱で均一な赤芽球系細胞群と考えられるヒト赤芽球系培養樹立株UT-7/Epoの細胞を用いて解析したところ、ELB42遺伝子promoter領域およびcoding regionの5'-CpG-3'sitesは全てunmethylated(メチル化度0%)であった。以上から、主要赤血球膜蛋白遺伝子の発現に関してmethylationの特異な態度が明らかとなった。(1)SPTBおよびEPB3:SPTBでは、正常人35名(250クローン)の検討で、promoter領域に存在する5'-CpG-3'sitesは全て完全にunmethylated(メチル化度0%)であった。これに比べて、EPB3では、40名(588クローン)の検討で、全体として約2/3の5'-CpG-3'sitesに約80%以上の高度メチル化度を認めたが、一部にはメチル化度が約30%程度と低い5'-CpG-3'sitesが存在した。この部位は、methylationに関して他の5'-CpG-3'sitesと異なる、特殊な機能部位であると推定された。(2)ELB42:正常人23名(180クローン)の検索では、exon1のcoding region内の5'-CpG-3'sitesが約90%のメチル化度を呈するのに対して、promoter領域の5'-CpG-3'sitesは平均約66%のメチル化度であり中等度のメチル化度を示していた。続いてP4.2が赤芽球系細胞にのみ発現する蛋白である観点から、正常ヒト末梢血BFu-Eを用いた二相性液体培養法から得られた培養赤芽球を用いて同様に解析したが、これらの成熟段階にある赤芽球では、すでに末梢血単核細胞と同程度のELB42メチル化度を示していることが判明した。これに比べて、EPB3では、40名(588クローン)の検討で、全体として約2/3の5'-CpG-3' sitesに約80%以上の高度メチル化度を認めたが、一部にはメチル化度が約30%程度と低い5'-CpG3' sitesが存在した。この部位は、methylationに関して他の5'-CpG-3' sitesと異なる、特殊な機能部位であると推定された。(2)ELB42:正常人23名(180クローン)の検索では、exon1のcoding region内の5'-CpG-3' sitesが約90%のメチル化度を呈するのに対して、promoter領域の5'-CpG-3' sitesは平均約66%のメチル化度であり中等度のメチル化度を示していた。続いてP4.2が赤芽球系細胞にのみ発現する蛋白である観点から、正常ヒト末梢血BFU-Eを用いた二相性液体培養法から得られた培養赤芽球を用いて同様に解析したが、これらの成熟段階にある赤芽球では、すでに末梢血単核細胞と同程度のELB42メチル化度を示していることが判明した。