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日本の地方空港における効率的な所有・運営体系の日英比較に基づく実証的研究

本研究の目的は、その多くが赤字とされる日本の地方空港の効率的運営を考察することである。空港民営化の先駆けとして知られるイギリスを比較対象として、DEA(包絡分析法)という効率性の計測手法を用いて分析を実施した。その結果、(1)空港の民営化、(2)空港機能とターミナル機能の一体的経営(日本では別組織で運営されている)、(3)LCC(低費用航空会社)やチャーター便の積極的な誘致、が空港運営に対する効率化の鍵であることが明らかとなった。空港民営化が世界的な潮流となるなか、わが国でも空港の効率的経営が重要課題となっており、とりわけ地方空港の採算に関して注目が高まっている。わが国の地方空港の特徴として、二元的な所有・運営構造が指摘され、空港本体は国または地方自治体、旅客ターミナルビルは株式会社(第3セクター)が所有・運営している結果、空港本体(エアサイド)と旅客ターミナルビル(ランドサイド)との相互の補完関係による空港全としての効率性を達成でない問題点が指摘されている。他方で、空港民営化の先駆けとなったイギリスでは、殆どの地方空港がターミナルビルを含めて一体的に所有・運営されている。そとで、わが国の地方空港が効率的経営を目指すなかで、ターミナルビルとの一体的経営が有効であるか否か、くわえて空港の(官民の)所有権構造が効率性にどう影響を与えているかについて、日英の地方空港の定量的な比較研究を通じて明らかにすることが本研究の目的である。分析には空港の効率性計測では一般的なノンパラメトリックな手法であるDEA(包絡分析法)を用いて、(1)日本の地方空港では、ターミナルビルとの一体的経営をおこなうことで空港全体の効率性が改善される、(2)空港の所有形態は公営より民営のほうが相対的に高い効率性達成する、という2種類の仮説を検証した。その結果、地方空港においても民営が公営よりも効率性に優れていることが明らかとなり、さらには日本もイギリスも空港本体とターミナルビルとの一体経営により空港全体の収支改善が期待されるものの、効率性においては日本の非航空系部門がイギリスより劣ることが明らかとなった。本研究の目的は、わが国の地方空港における効率的運営を考察することである。近年の研究では、わが国の地方空港の多くが赤字運営とされており、こうした状況を改善することが求められている。イギリスでは、地方空港においても民営化が進んでおり、イギリスの地方空港の効率性に影響を及ぼす要因について定量分析を通じて導出することにより、これをわが国に対する示唆とする。はじめに、昨年度(平成20年度)の研究において、日本とイギリスの地方空港の経営効率性をDEA(包絡分析法)により計測して比較したところ、イギリスの民間所有空港が効率性に優れていることが明らかとなった。さらに、空港機能とターミナル機能を一体的に経営しているイギリスの空港では、一体的経営により非航空系部門(ターミナルの商業施設など)における効率性の相対的優位が確認された。そこで、今年度(平成21年度)の研究において、わが国と比較して高い効率性を達成しているイギリスの地方空港に関して、どのような要因が効率値に影響を与えるか分析した。DEAにより得られた効率値を被説明変数として回帰分析を実施した結果、1.LCC(低費用航空会社)やチャーター便が地方空港の航空系活動の効率性に最も重要な影響を与えること、2.ヒースローとの定期路線の有無が地方空港の航空系活動の効率性の上昇要因となること、3.空港の所有権構造は地方空港の効率性に有意な影響を与えるものの、その程度はLCCやチャーター便が与える影響に比べれば小さいこと、などの帰結が導出された。わが国では、イギリスのようなLCC市場は未成熟であり、したがって地方空港の効率的運営に対するLCCの活用は一朝一夕になしうる課題でないものと考えられる。しかしながら、チャーター便に関しては、一部の地方空港で既に活用されている事例もあり、空港の効率的運営に対して有効であることが示唆される。
FRETを用いたアンジオテンシンII受容体シグナル可視化の試み

アンジオテンシンII(AII)シグナルは心不全の病態生理において極めて重要な意義を持つ.我々は,心筋細胞の伸展刺激によりリガンドであるAIIが存在しなくてもAT1受容体活性化が生じることを見いだした[Nat Cell Biol 2004;6:499).伸展刺激によるAII非依存性のAT1受容体活性化がどのような機序でおこり,どのように心不全発症に関与しているのかについては現時点では不明である.そこで本研究では,FRETの技術を用いてAT1受容体シグナルを可視化し,さらにそれを利用して心不全発症機構の解析を行うことをその日的とした.FRETプローブの作成には,黄色の蛍光を発するYFP(yellow fluorescence protein)および青色の蛍光を発するCFP(cyan fluorescence protein)の2種類の蛍光蛋白を同一分子内に人為的に組み込む必要がある.これを433nmで励起すると,YFPとCFPが物理的に離れた場所にある場合はCFPが励起され青色の蛍光を発するのに対して,YFPとCFPが近接して存在する場合にはCFPが励起されて発する蛍光によってさらにYFPが励起され,黄色の蛍光が得られる(FRET現象).AT1受容体のようなG蛋白質共役型受容体の場合は,活性化によって第3細胞内ドメインがC末細胞内ドメインから離れるように構造変化が起こると考えられているので,第3細胞内ドメインおよびC末細胞内ドメインにそれぞれYFPとCFPを組み込むと,受容体活性化によってFRETが減弱すると考えられる.平成17年度には通常の方法でFRETプローブの作製を試みたが,高いFRET効率が得られるプローブが作製できず,平成18年度はさらにYFPとCFPを入れ替える,あるいは,YFPやCFPの前後に数アミノ酸のspacerを挿入するなどの改変を行った.FRET効率に若干の改善が認められたものの残念ながらAT1活性化を画像化するのに十分なFRETプローブは得られなかった.今後は2分子FRETなど異なる機序によるAT1活性化を画像化を目指して研究を進めていきたい.アンジオテンシンII(AII)シグナルは心不全の病態生理において極めて重要な意義を持つ.我々は,機械的伸展刺激がAT1受容体を介して心筋細胞肥大をおこすことを見いだし(Circulation 1994 ; 89 : 2204),さらに心筋細胞の伸展刺激によりリガンドであるAIIが存在しなくてもAT1受容体活性化が生じることを見いだした(Nat Cell Biol 2004 ; 6 : 499).伸展刺激によるAII非依存性のAT1受容体活性化がどのような機序でおこり,どのように心不全発症に関与しているのかについては現時点では不明である.そこで本研究では,FRETの技術を用いてAT1受容体シグナルを可視化し,さらにそれを利用して心不全発症機構の解析を行うことをその目的とした.平成17年度においては,AT1受容体のcDNAを改変してFRETプローブの作成を試みた.FRETプローブの作成には,黄色の蛍光を発するYFP(yellow fluorescence protein)および青色の蛍光を発するCFP(cyan fluorescence protein)の2種類の蛍光蛋白を同一分子内に人為的に組み込む必要がある.これを433nmで励起すると,YFPとCFPが物理的に離れた場所にある場合はCFPが励起され青色の蛍光を発するのに対して,YFPとCFPが近接して存在する場合にはCFPが励起されて発する蛍光によってさらにYFPが励起され,黄色の蛍光が得られる(FRET現象).AT1受容体のようなG蛋白質共役型受容体の場合は,活性化によって第3細胞内ドメインがC末細胞内ドメインから離れるように構造変化が起こると考えられているので,第3細胞内ドメインおよびC末細胞内ドメインにそれぞれYFPとCFPを組み込むと,受容体活性化によってFRETが減弱すると考えられる.現時点ではFRET効率が30%を超えるようなプローブの作成には成功できておらず,今後cDNAの更なる改変を行い,高いFRET効率が得られればそれを用いてAT1受容体活性化機構の解析を行う予定である.アンジオテンシンII(AII)シグナルは心不全の病態生理において極めて重要な意義を持つ.我々は,心筋細胞の伸展刺激によりリガンドであるAIIが存在しなくてもAT1受容体活性化が生じることを見いだした[Nat Cell Biol 2004;6:499).伸展刺激によるAII非依存性のAT1受容体活性化がどのような機序でおこり,どのように心不全発症に関与しているのかについては現時点では不明である.そこで本研究では,FRETの技術を用いてAT1受容体シグナルを可視化し,さらにそれを利用して心不全発症機構の解析を行うことをその日的とした.FRETプローブの作成には,黄色の蛍光を発するYFP(yellow fluorescence protein)および青色の蛍光を発するCFP(cyan fluorescence protein)の2種類の蛍光蛋白を同一分子内に人為的に組み込む必要がある.これを433nmで励起すると,YFPとCFPが物理的に離れた場所にある場合はCFPが励起され青色の蛍光を発するのに対して,YFPとCFPが近接して存在する場合にはCFPが励起されて発する蛍光によってさらにYFPが励起され,黄色の蛍光が得られる(FRET現象).AT1受容体のようなG蛋白質共役型受容体の場合は,活性化によって第3細胞内ドメインがC末細胞内ドメインから離れるように構造変化が起こると考えられているので,第3細胞内ドメインおよびC末細胞内ドメインにそれぞれYFPとCFPを組み込むと,受容体活性化によってFRETが減弱すると考えられる.

平成17年度には通常の方法でFRETプローブの作製を試みたが,高いFRET効率が得られるプローブが作製できず,平成18年度はさらにYFPとCFPを入れ替える,あるいは,YFPやCFPの前後に数アミノ酸のspacerを挿入するなどの改変を行った.FRET効率に若干の改善が認められたものの残念ながらAT1活性化を画像化するのに十分なFRETプローブは得られなかった.今後は2分子FRETなど異なる機序によるAT1活性化を画像化を目指して研究を進めていきたい.
次世代先端医療のための糖鎖連結ハイブリッド金属錯体の構築と実用展開

高齢化社会を迎えるわが国では、患者に負荷の少ない低侵襲性の医療の発展が強く望まれている。このような観点から本研究では、生体適合性物質である糖質を連結した高性能光線力学療法用光増感剤(糖連結クロリン)および抗がん性貴金属錯体(アミノ糖連結Pd(II),Pt(II)錯体)の開発を行った。それらの機能評価の結果、次世代先端医療用としての実用展開が期待される高性能な化合物であることが明らかとなった。金属イオンと有機物を素材とする金属錯体は、生命活動に必須の微量金属イオンの役割やバイオメカニズム解明の可能性をもたらすなど、近年、生命科学の発展に大きなインパクトを与えている。生理活性無機有機複合体という物質領域は生物無機化学と生物有機化学に端を発し、従来の錯体や有機化学の化合物概念を遥かに凌駕する複雑な化学として成長している。欧米先進国においては、既に10年ほど前から金属イオンの動物・人体内での挙動とその医薬としての有用性を見出すための研究が開始されており、化学者・薬学者および医学者が共同して無機薬理学という新しい学問領域を創成している。しかし、残念ながらこの分野のテーマの大部分は欧米で開拓されたものであり、欧米諸国と比較して立ち後れているのが現状である。日本の試薬企業においては金属イオンの生体に対する毒性が強調されるあまり、一般的に、金属イオンを医療に応用することにはおよび腰であるように思われる。このように企業がなかなか参入しない分野に対してこそ大学の研究者が先駆的に参加し、基礎化学を展開し、先導役を果たしていく事に重要な意味があると考えられる。本研究課題では、我々が世界に先駆けて独自に切り開いてきた糖質の配位化学という研究領域を基盤として、この分野に切り込み、配位環境の制御により生体適合性に優れた生理活性無機有機複合体の設計とバイオメカニズムの解明を目指している。1.本研究は、当研究室で世界に先駆けて切り開いてきた糖質の配位化学を基盤にして、糖鎖を連結させた先端医療用金属錯体および核画像診断薬の合成とそのバイオメカニズムの解明を目指すものである。本年度は先端医療用金属錯体の基礎としてS-グリコシド配位子の設計およびCu(II)錯体の合成とキャラクタリゼーションを行った。2.糖質がN-グリコシド結合、O-グリコシド結合により配糖体が形成され重要な生理機能を担っていることはよく知られている。本研究では、まだ金属イオンとの相互作用が十分解明されていないS-グリコシド結合に注目し、D-グルコースと2,2'-ジピコリルアミン(DPA)分子をS-グリコシド結合で連結した配位子を新たに合成した。糖部位は、水酸基がアセチル基で保護された配位子と脱保護された配位子を用意した。次に、それらの配位子を用いた銅(II)錯体の合成を行い、その固体状態および溶液内構造についてX線結晶構造解析、電子吸収スペクトル、CDスペクトル、EPR測定、EXAFS測定等を用いて検討した。3.糖部位がアセチル基で保護された配位子を用いた銅(II)錯体の構造は、X線結晶構造解析よりDPAの3つの窒素原子、塩化物イオン、アノマー位のチオエーテル硫黄原子が配位した歪んだ五配位四角錐構造であり、Cu-S結合距離がかなり長くなっていることが明らかとなった。錯体の溶液中のCDスペクトルにおいてコットン効果が観測されることから、硫黄原子が銅イオンに配位し、金属まわりに不斉な環境が存在することがわかった。アセチル保護体、脱保護体の銅錯体は同様のコットン効果を示すことから、どちらもチオエーテル硫黄原子の絶対配置は同じであると考えられる。以上、本研究結果は等質をS-グリコシド結合により連結させた医療用金属錯体の開発にとって重要な知見を与えるものとみなされる。1.本研究は、糖鎖を連結させた先端医療用金属錯体の合成とそのバイオメカニズムの解明を目指すものである。本年度はClick Chemistryを利用した糖連結配位子{4-(2-pyridyl)-1,2,3-triazole(=pyta)}骨格を配位部位とする新規糖連結配位子の合成およびその発光性糖連結Re(I)錯体への展開を行った。2.アジド化合物{benzyl azideとグルコースを連結した化合物2-azidoethyl 2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-glucopyranoside}とアセチレン化合物(2-ethynylpyridine)をTHF-H_2O混合溶媒に溶かし、これに1M sodiumascorbate、CuSO4を加えて、50°Cで撹拌することによりpytaおよびD-Glc連結pytaを合成した。得られた配位子と[ReCl(CO)_5]をメタノール中で加熱撹拌することによりRe(I)錯体を合成し、それらのキャラクタリゼーションを行った。以上、本研究結果は医療用金属錯体の開発にとって重要な知見を与えるものとみなされる。

1.本研究は、当研究室で世界に先駆けて切り開いてきた糖質の配位化学を基盤にして、糖鎖を連結させた先端医療用金属錯体および核画像診断薬の合成とそのバイオメカニズムの解明を目指すものである。さて、光医療の最先端である光線力学療法(Photodynamic Therapy : PDT)は患者の機能温存、すなわちQuality of Life(QOL)の高いクリーンな治療法として注目を集めている。本年度はこのような観点から、生理機能性分子として糖鎖に着目し、糖鎖を付与した新規光増感剤(糖鎖連結ポルフィリン、クロリン誘導体)の合成、および子宮頸部がんの培養細胞(HeLa細胞)に対する光毒性(PDT効果)を検討した。2.5,10,15,20-tetrakis(pentafluorophenyl)-porphyrin(H_2TFPP)はβ-pyrrole位への1,3-双極子付加反応およびペンタフルオロフェニル(Ph^F)基のパラ位がチオラートアニオンによる求核置換反応を受け易いことが知られている。本研究ではチオラートアニオン源としてS-グリコシド配糖体を用いることで、この特異的な反応を糖連結光増感剤合成へ適用した。さらに、1,3-双極子付加反応を利用してD-グルコース(D-Glc)およびD-ガラクトース(D-Ga1)がS-グリコシド結合で連結した新規糖連結フッ素クロリン{(H_2TFPP-SGlc、H_2TFPP-SGal)}を合成した。次いで、これらを光増感剤として用いてHeLa細胞に対するPDT試験を行った。3.H_2TFPPの特異的な反応を利用することでHeLa細胞に対して極めて高い光毒性を有する新規糖連結光増感剤の開発に成功した。本研究結果は、糖質を連結させた医療用ハイブリッド体の開発にとって重要な知見を与えるものとみなされる。1.本年度は、世界に先駆けて独自に切り開いてきた糖質の配位化学という研究領域を基盤として、抗がん性貴金属錯体として糖鎖連結白金およびパラジウム錯体の開発を行った。2.1)D(+)グルコサミン、2-ピリジンカルバルデヒドおよびK_2[PtCl_4](またはNa_2[PdCl_4])を作用させることにより、ワンポット反応で、糖鎖連結白金錯体[Pt(GlcN=py)Cl_2]およびパラジウム錯体[Pd(GlcN=py)Cl_2])を高収率で得た。単結晶X線構造解析により、いずれの金属中心も平面四配位型のシスプラチンcis-[PtCl_2(NH_3)_2]によく似た構造をとっていることを明らかにした。2)上記パラジウム錯体[Pd(GlcN=py)Cl_2]のピリジン部位をキノリノールに変えた新規パラジウム錯体[Pd(GlcN=quinolinol)Cl_2]の合成を行った。元素分析、^1H NMRおよび^<13>CNMR測定より、シッフ塩基の配位した目的の錯体の生成を確認した。また、^1H NMRの糖部位のシグナルより、α-isomerであることが判明した。パラジウム錯体水溶液(紅紫色)の電子スペクトルの吸収極大波長は218,262,300nmに出現し、それぞれ短波長側からπ→π*transition,π→π*transition、MLCTと帰属した。蛍光スペクトルは、390nmの励起光で測定を行ったが、蛍光を示さなかった。次いで、1)で合成した金属錯体のin vitro抗がん性試験を行った。
衝突状態にある分子対から開始する光化学反応

本年度は色素レーザー装置を整備することにり、以下の実験を行ない成果を得ることができた。(1)ファンデルワールス分子内反応により生成した生成物のエネルギー分布の決定......励起状態酸素原子O(【^1D_2】)と【N_2】Oとの反応を分子内で起させるために【N_2】Oの二量体を超音速自由噴流中に生成させ、これに193nmの光を照射した。二量体中の一方の【N_2】Oが光分解されて生成するO(【^1D】)が他方の【N_2】Oと反応して、NO分子を与える事が判明した。更に、生成したNOの振動・回転状態を知るために、0-50nsの時間遅れで検出用レーザーを照射し、NOをA状態に励起してLIFを測定した。その結果、NOの振動状態が、v=0とv=4に山を持つ2つの振動分布の重なりとして表わされることが判明した。また、回転温度は全体に低く、室温以下と標価された。一方、LIFのドップラー巾の測定から、高い振動準位にあるNOの方が大きい運動エネルギーを持つ事が分った。これらの事実は、O(【^1D】)と【N_2】Oとの衝突によって生成する2つのNOが異なるエネルギー分布を持つ事を示しており、恐らくは新らしくO(【^1D】)との間に生成するNOが高い並進・振動エネルギーを持つものと考えられる。(2)クロロベンゼン-メタノール錯体の生成と反応......この反応系を調べるための予備実験として、クロロベンゼン-メタノール錯体のLIFおよびMPIスペクトルを測定した。その結果、クロロベンゼンモノマーと錯体形成したものとのスペクトルの各吸収波長での強度が測定法によって大きく異なることが判った。これは、クロロベンゼンがファンデルワールス錯体を形成することによって、間交差を起し易くなることを示しており、この事は増感りん光法によって、生成した三重項クロロベンゼンを測定することで支持された。
符号付きリーマン面のモジュライ空間の数論的分解の研究

この研究プロジュクトにおいて、穴空きリーマン面のモジュライ空間の数論的側面を研究してきた。特に、Weil-Petersson計量やTakhtajan-Zograf計量を精密に研究するためにDeligne対の定式化を用いて解析を行った。それらの研究の中で、特に特異双対的計量に関して、対数的Mumford等長同型を示し、その結果を用いてWeil-Petersson計量とTakhtajan-Zograf計量が代数的である事を示した。これらの事から自然にWeil-Petersson計量やTakhtajan-Zograf計量の数論的分解のついての可能性が提示されたが、このことはSelbergゼータ関数の分解の可能性も示唆する。さらに、今の段階で、Weil-Petersson計量の数論的分解についてはMasurの技法を用いて良い結果を得る。問題はTakhtajan-Zograf計量の数論的分解である.そのためにEisenstein級数の退化を詳しく調べる必要がある.これは今後の課題になる。(代数的側面についてはかなりよくわかる.Weil-PetersonおよびTakhtajan-Zograf直線束は交点理論的に定義されていて境界に拡張する.)この研究プロジェクトにおいて、穴空きリーマン面のモジュライ空間の数論的側面を研究してきた。特に、Weil-Petersson計量やTakhtajan-Zograf計量を精密に研究する為にDeligne pairingの定式化を用いて解析を行った。それらの研究の中で、特に特異双対的計量に関して,対数的Mumford共形同型を(阪大の藤木明とともに)示し、その結果を用いてTakhtajan-Zograf計量が代数的である事を示す事に成功した。これらの事から自然にWeil-Petersson計量やTakhtajan-Zograf計量の数論的分解についての可能性を探る問題が提示されたが,この事はSelbergのゼータ関数の分解の可能性も示唆する。今後のこの研究の方向として,リーマン面の退化族に対して、一般のadmissible計量がどのように退化するかを精密に解析する必要があることを述べておく。(代数的側面についてはかなりよくわかる.Weil-PetersonおよびTakhtajan-Zograf直線束は交点理論的に定義されていて境界に拡張する.)
藻食の非光合成原生生物における光合成酸化ストレスへの対処機構の解明

本研究では、非光合成原生生物が藻類を明条件下で捕食した時、捕食者側は細胞内に取り込んだエサ由来の光合成酸化ストレスに晒されるのか、もしそうならば捕食者は藻食であるために光合成酸化ストレスに対する何らかの対処法を持っているのかという問題を提起し、その追及を通して真核生物による葉緑体の獲得過程の理解を深めることを目的とした。湿原から単離したアメーバを捕食者、シアノバクテリアを光合成性のエサとして行ったRNA-seq解析より、アメーバがシアノバクテリアを明条件下で捕食しているときにはアクトミオシン関連の遺伝子群がダウンレギュレートするという結果が得られた。これを受け、光合成酸化ストレスへの対処という観点から、明条件下では光合成酸化ストレスの原因であるエサの取り込みが抑制させるという仮説を立てた。この検証のために、蛍光ビーズを用いてアメーバが光合成性または非光合成性のエサを捕食しているときの明条件と暗条件での捕食速度を比べると、光合成性のエサでは明条件で捕食速度の低下がみられた。また、この条件下で既に食胞内に取り込まれているエサはより早く取り除かれると予想した。細胞膜を蛍光色素で染色したエサを用いて消化速度を調べると、光合成性のエサを明条件で捕食しているときには、暗条件と比べて加速した。ここまでの結果から、アメーバは、光合成性のエサを安全に捕食するために、細胞内に存在するエサの量を光合成酸化ストレスの強度に応じて、捕食速度や消化速度を介して調整していると解釈した。本研究で以前に得た結果である光合成生物を強光下で捕食すると一部のアメーバが死ぬことを合わせて考えると、単細胞捕食者がエサ由来の光合成酸化ストレスへの対処機構を獲得することは、光合成生物の捕食の段階が必須である細胞内共生を通した葉緑体獲得過程をたどるための基本的な条件の一つとして重要な意味を持つと考えられる。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では、非光合成原生生物が光合成生物を明条件下で捕食した時に、捕食者は細胞内に取り込んだエサの光合成由来の酸化ストレスに晒されるのか、またその場合に捕食者は何らかの対処法を持っているのかという理解を通した真核生物による葉緑体の獲得過程の理解を目的とした。湿原より単離したアメーバを捕食者、シアノバクテリアを光合成性のエサとして以前行ったRNA-seq解析より、アメーバがシアノバクテリアを明条件下で捕食しているときにはアクトミオシン関連の遺伝子群がダウンレギュレートするという結果が得られた。これを踏まえ、光合成酸化ストレスへの対処という観点から、明条件下では光合成酸化ストレスの原因であるエサの取り込みが抑制させるという仮説を立てた。この検証のために、蛍光ビーズを用いてアメーバが光合成性または非光合成性のエサを捕食しているときの明条件と暗条件での捕食速度の差を調べると、光合成性のエサの場合には明条件で捕食速度が低下することが実証された。この結果を受け、この条件下で既に食胞内に取り込まれているエサはより早く取り除かれると予想した。細胞膜を蛍光色素で染色したエサを用いて消化にかかる時間を調べると、光合成性のエサを明条件で捕食しているときには、暗条件と比べて捕食速度が加速した。ここまでの結果をまとめると、アメーバは、光合成性のエサ由来の酸化ストレスを回避しつつ、エサとしても利用するために細胞内に存在するエサの量を光合成酸化ストレスの強度に応じて捕食速度や消化速度を介して調整していると考えられる。本研究で以前に得た結果である光合成生物を強光下で捕食するとアメーバが死ぬこと、及び今年度の結果を合わせて考えると、捕食者が光合成酸化ストレスへの対処機構を獲得することは、光合成生物の捕食に始まる細胞内共生を通した葉緑体獲得過程を辿るための基本的な条件の一つとして重要な意味を持つと考えられる。現在までの進捗を申請書における研究計画と比較すると、研究目的の範囲内ではあるが実験系確立の困難や新しいデータを踏まえてのいくつかの変更があった。明条件下において光合成生物を消化中のアメーバが晒されるであろうと予想された光合成酸化ストレスを定量するために複数の方法で活性酸素種の定量を試みたが評価可能な実験系を構築することはできなかった。代替案として、この条件におけるアメーバの細胞数の減少の定量、死細胞の検出および細胞破裂の観測を行った。RNA-seq解析で観測された液胞型プロトンポンプのアップレギュレートから予測した食胞酸性化の定量の試みは当該遺伝子の発現変動の幅が1.5倍を切るほど小さいということもあり保留としたが、この発現変動傾向および本来予定していた他の実験の結果からも予測された消化促進の定量化には成功した。RNA-seq解析については新しいサンプルも加えて当初の予定どおりにデータの解析を進めた。また、アクトミオシン関連の遺伝子群のダウンレギュレートから予測したアメーバの移動速度低下の定量は以前の結果においてその差が小さかったことから保留し、同様に予測され、顕微鏡での観察からも予測していた捕食速度の低下を定量した。ここまでの結果をまとめ論文作成に移った。当初の予定に対して実験の内容は異なるが研究目的はおおよそ達成できたことから、おおむね順調に進展していると評価した。

湿原から単離したアメーバを捕食者、シアノバクテリアを光合成性のエサとして行ったRNA-seq解析より、アメーバがシアノバクテリアを明条件下で捕食しているときにはアクトミオシン関連の遺伝子群がダウンレギュレートするという結果が得られた。これを受け、光合成酸化ストレスへの対処という観点から、明条件下では光合成酸化ストレスの原因であるエサの取り込みが抑制させるという仮説を立てた。この検証のために、蛍光ビーズを用いてアメーバが光合成性または非光合成性のエサを捕食しているときの明条件と暗条件での捕食速度を比べると、光合成性のエサでは明条件で捕食速度の低下がみられた。また、この条件下で既に食胞内に取り込まれているエサはより早く取り除かれると予想した。細胞膜を蛍光色素で染色したエサを用いて消化速度を調べると、光合成性のエサを明条件で捕食しているときには、暗条件と比べて加速した。ここまでの結果から、アメーバは、光合成性のエサを安全に捕食するために、細胞内に存在するエサの量を光合成酸化ストレスの強度に応じて、捕食速度や消化速度を介して調整していると解釈した。本研究で以前に得た結果である光合成生物を強光下で捕食すると一部のアメーバが死ぬことを合わせて考えると、単細胞捕食者がエサ由来の光合成酸化ストレスへの対処機構を獲得することは、光合成生物の捕食の段階が必須である細胞内共生を通した葉緑体獲得過程をたどるための基本的な条件の一つとして重要な意味を持つと考えられる。これまでに行ったRMA-seq解析では一部のサンプルを除いて再現実験を行っていない。したがって可能な範囲で再現性を確認した上でこれまでの結果に統合し論文を投稿する予定である。これまでは解析対象を三種類のアメーバのみに限ってきたため、研究対象である非光合成単細胞捕食者における光合成性のエサ由来の光合成酸化ストレス対処機構の一般性にはまだ追求の余地がある。これについては、当初の予定通りアメーバに限らず様々な系統の藻類捕食者を採集し、本研究で確立した実験系を適用することで達成可能であると期待している。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
カルシウムによる肝臓メタロチオネインの合成とその意義

多くの重要な細胞機能が細胞内カルシウム濃度の可逆的な変動によって調節されていることが明らかにされつつあり、カルシウムの生理作用とその発現機構に多くの研究者の興味が集中している。本研究代表者は最近、カルシウムの投与によりマウス肝臓中にカルシウムを含まず比較的多量の亜鉛を含有する低分子量蛋白質が増加することを見出し、この蛋白質が重金属結合蛋白質として知られるメタロチオネイン(MT)であることを明らかにした。そこで本研究では細胞内カルシウム濃度とMTとの関係について検討した。肝臓中のMT合成を誘導する塩化亜鉛を様々な投与量(0150μmol/kg)で、【^(45)Ca】【Cl_2】(175nmol/kg)と共にマウスに投与したところ、12時間後の肝臓中MTおよび亜鉛濃度は亜鉛の投与量に依存して増加し、多く蓄積するようになった亜鉛のほとんどがMTに結合していた。また、この時投与1時間後の肝臓中【^(45)Ca】濃度も亜鉛の投与量に依存した増加を示した。そこで亜鉛とは異なる機構で肝臓中MTを誘導すると考えられるデキサメタゾンを【^(45)Ca】【Cl_2】と共に投与したところ12時間後の肝臓中MTおよび亜鉛濃度の上昇は観察されたが、1時間後の肝臓中【^(45)Ca】濃度の増加は認められなかった。これらの結果から、亜鉛によるMTの合成誘導にCaの細胞内流入が関与している可能性が考えられたのでラット初代培養肝細胞を用いて細胞内カルシウム濃度とMTとの関係を検討した。その結果、培地中に亜鉛を添加して22時間培養することによって細胞内MT濃度は有意に増加したが、亜鉛添加2時間後の【^(45)Ca】の細胞内取り込み量は培地亜鉛濃度の影響をほとんど受けなかった。また培地中にカルシウムを比較的高濃度に添加したところ、細胞内カルシウム濃度の増加は観察されたものの、細胞内MT濃度は有意な変動を示さなかった。これらの結果から、カルシウムによるMTの誘導は動物体内でのみ起こる現象と考えられる。
概日リズムのペースメーカーホルモン・PDFの核内受容体

概日リズムは多くの生物に見られる行動やホルモン分泌などをはじめとした生体リズムである。このリズム形成には多くの分子が関わっている。本研究では昆虫で行動リズム伝達を制御する、18アミノ酸からなる神経ペプチド、Pigment-dispersing factor (PDF)の細胞核内レセプター(受容体)の同定を夜行性昆虫フタホシコオロギで試み、PDFの核内での相互作用の相手として有力視されているTIMELESSタンパク質のcDNAクローニングと発現を中心に以下の実験を実施した。1:昆虫TIMELESSのcDNAクローニングPDFの相互作用の相手として有力であるTIMELESSタンパク質(全長約1200 AA)のcDNAクローニングを夜行性昆虫フタホシコオロギと、同じく夜行性昆虫であるカイコガで行った。その結果、フタホシコオロギでは約400 AAをコードする部分構造が明らかとなった。一方、カイコガでは全長配列(ca.1200 AA, ca.4200 bp)の解析に成功した。現在、フタホシコオロギの全長配列の解析と並行し、カイコガTIMELESSのS2細胞による発現を実施中である。2:フタホシコオロギpdfのゲノム解析フタホシコオロギPDF前駆体は他の昆虫PDF前駆体と比較するときわめて特異な構造をしている。それはN末端に分泌シグナルを持たないこと、前駆体構造が異常に短いことである。特に分泌シグナルではなく、塩基性アミノ酸に富んだ核移行シグナルをもつ。今回、この特異な構造をより詳細に解析するためにフタホシコオロギpdfのゲノム解析を行った。その結果、cDNAクローニングにより得られた同一の配列が得られた。しかしながら、5'非翻訳領域にゲノム配列とmRNA配列に相違が見られ、これがスプライシングサイトであることが判明した。つまりフタホシコオロギpdfは複数のエキソンにまたがってコードされていることが明らかとなった。このことは、現在までにゲノム解析が実施されているショウジョウバエやガンビエハマダラカでは見られず、昆虫では初めての例である。生物時計の中で約24時間周期の概日リズムを発振する概日時計は、脳内の時計ニューロンが構成するペースメーカーによって形成される。本研究では、生物時計の分子機構解明を目的として、昆虫生物時計で重要な働きをもつと考えられる神経ペプチド・PDFに対する核内受容体探索を実施する。本年度は、フタホシコオロギの大量飼育を実施するのに並行して、予備的にショウジョウバエについても検討した。[^3H]Nle^<15>-PDFをトレーサーとして用いてショウジョウバエ頭部にホモジネートに対する飽和結合試験を行なったところ、明らかな特異的結合が観測された。スキャッチャード解析の結果、[^3H]Nle^<15>-PDFの受容体に対する解離定数K_Dは35.6nMと見積もられた。この結果より、昆虫脳膜画分にPDF受容体が存在することが初めて明らかにされた。PDFが、時計ニューロン・細胞核における機能的共役分子として機能している、すなわち、機能的な受容体が存在する可能性を解析するため、時計タンパク質PERIODおよびTIMELESS、CLOCKおよびCYCLEのクローニング、タンパク質発現、生化学的解析を実施した。コオロギPERIODについては全構造の解析に成功し、PDFの機能的共役分子である可能性の高いTIMELESSについても構造解析がほぼ完成した。タンパク質発現のため、まず、ショウジョウバエにおいてCLOCKとCYCLE(1-434)の発現に取組んだ。大腸菌で発現し、これを精製して単品を得たが、時計タンパク質が発現によって単離、精製されたのはこれが初めての例である。表面プラズモン共鳴解析によってCYCLE、CLOCK(1-434)がヘテロダイマーを形成することが確認された。また、興味深いことに、CYCLEがホモダイマーを形成することが示された。しかし、PDFはいずれのタンパク質とも相互作用しないことが判明し、これらは共役分子でないことが確認された。

その結果、cDNAクローニングにより得られた同一の配列が得られた。しかしながら、5'非翻訳領域にゲノム配列とmRNA配列に相違が見られ、これがスプライシングサイトであることが判明した。つまりフタホシコオロギpdfは複数のエキソンにまたがってコードされていることが明らかとなった。このことは、現在までにゲノム解析が実施されているショウジョウバエやガンビエハマダラカでは見られず、昆虫では初めての例である。
ノンパラメトリックな手法を使った経済モデルの検定

ノンパラメトリック・セミパラメトリックな手法を使った経済モデルの検定方法、推定方法についての統計手法の研究を行なった。主な結果を説明すると、"Empirical likelihood, exponential tilting and GMM estimators witha number of momentconditions"ではセミパラメトリックな推定方法である経験尤度法、exponential tilting法、一般化モーメント法のモーメント条件が多い場合のバイアスを比べ、一定限度以上モーメント条件が増えるとバイアスがモーメント条件の数の線形関数のような形で増えることを発見している。"Aconsistenttest for omitted-variables in nonparametric regression"ではノンパラメトリックモデルで必要な説明変数が含まれているかどうかの検定を提案している。"A nonparametric Granger causalitytest"では線形以外の形でのGranger causalityでも検出できる検定方法について考察している。"A paradox of semiparametric estimators with infinite dimensional nuisance parameters"では無限次元の局外母数が未知の場合の方が、興味あるパラメータの推定量の分散が小さい場合があるといく逆説的な現象を研究し、なぜこのような現象が起るのかを明らかにしている。セミパラメトリックな推定方法であるEmpirical Likelihood推定法、Exponential Tilting推定法、GMM推定法の有限標本でのバイアス、標準偏差がモーメント条件が増えるとどのように変わっていくかをモンテカルロシミュレーションを使って分析した。Newey and Newey(2001)の漸近展開を使った予想ではGMM推定量のバイアスはモーメント条件が増えるにつれて線形に増えるが、Empirical Likelihood推定量とExponential Tilting推定量のバイアスはモーメント条件の増加により増えていかないというものであった。しかし、実験の結果はこの予想とは異なる。モーメント条件の数がデータ数の10%以内の場合はEmpirical Likelihood推定量とExponential Tilting推定量のバイアスはほとんど増えずにGMM推定量のバイアスは線形で増えていくという予想のとうりであったが、モーメント条件の数がデータ数の12-15%のところでEmpirical Likelihood推定量とExponential Tilting推定量のバイアスは急激に増えていきGMM推定量のバイアスを上回るという現象を発見した。またEmpirical Likelihood推定量とExponential Tilting推定量の標準偏差はモーメント条件の数が増えるにしたがって増えていくことも見いだした。漸近展開を使った理論的な予想では経験尤度推定量、exponential tilting estimatorのバイアスが一般化モーメント法のバイアスよりも小さく、また推定量の分散も小さいと考えられてきた。しかし、実験ではモーメント条件の数が標本数の約12%を超えたあたりから経験尤度推定量、exponential tilting estimatorのバイアスが急激に大きくなり一般化モーメント法のバイアスよりも大きくなることが観測された。また、一般化モーメント法推定量の分散は漸近理論で予想された通りモーメント条件の数が増えるにつれて小さくなっていくが、経験尤度推定量とexponential tilting estimatorの分散はモーメント条件の数が標本数の約12%を超えたあたりから大きくなることが観測された。この実験の設定ではバイアスコレクションを行った一般化モーメント法推定量がバイアス、分散の両面から一番よい小標本特性を持っていた。セミパラメトリックな推定手法であるEmpirical Likelihood(EL)法、Exponential tilting(ET)法、GMM法のモーメント条件の数が多い場合のバイアス、分散の性質をモンテカルロ実験を使って分析した。実験の方法は、内生的な説明変数を持った線型方程式を考え、操作変数の数を増やしていくことによってモーメント条件の数を増やしていった。具体的に実験方法を説明すると、yを被説明変数、x1とx2を説明変数、uを誤差項としy=b0+b1x1+b2x2+uとしてパラメータb0,b1,b2の推定問題を考えた。誤差項uと説明変数x1,x2の間にはという形で相関を持たせた。独立な標準正規確率変数でu,w1,w2は発生させた、操作変数はv=w+eと形で発生させその数を5から順に増やしていった。この実験によってわかったことはモーメント条件の数がデータ数の12-15%以下の場合はEL,ETのバイアスはGMMに比べて小さいが、それ以上モーメント条件の数が増えるとET、ELのバイアスの法が大きくなる。

また推定量の標準偏差もGMMの場合はモーメント条件の数が増えるにつれて減っていくが、ETとELの場合はモーメント条件の数がサンプル数の12-15%以上になると標準偏差が増えていくことが観測された。
北アフリカの砂漠爬虫類の分子系統学

アガマ科トカゲ類の系統進化と古環境変動の関係を探るために、分子系統学的な研究を行なった。オーストラリアに生息するアガマ類であるフトアゴヒゲトカゲから、ミトコンドリアDNAの全塩基配列を決定した。16751塩基対の塩基配列中に、13コのタンパク質遺伝子、2コのrRNA遺伝子、22コのtRNA遺伝子に加え、2コの制御領域が同定された。重複した制御領域は、NADHデヒドロゲナーゼサブユニット5遺伝子と同サブユニット6遺伝子の間に挿入されていた。この新しい制御領域は、オーストラリア及びニューギニア原産のアガマ類のミトコンドリアDNAにおいて共通に見られたが、アジアやアフリカのアガマ類においては存在しないことも分かった。制御領域の塩基配列を調べたところ、種間の比較では大きく塩基配列が異なるが、同種内の重複した制御領域の塩基配列は殆ど同一であることが分かった。そのことから制御領域の塩基配列が種内で協調進化していることが示唆された。次にミトコンドリアDNAの一部領域の塩基配列を用いて分子系統樹を構築し、系統間における分子進化速度の一定性を仮定しないThorneとKishinoの方法を用いて分岐年代を推定したところ、オーストラリア・ニューギニアのアガマ類が単系統群を成し、漸新世ころにアジアの姉妹種(Physignathuscocincinus)と分岐したらしいことが示唆された。オーストラリア・ニューギニアのアガマ類の起源は、中生代の大陸分裂に伴う分断ではなく、ワレス線を超えての分散に求められるようである。
地域・方言アイデンティティと方言変容の関連性についての調査研究

本研究の目的は,地域社会の方言変容と,その地域の人々の方言・地域に対する意識との間に見られる関連性を解明することにある。この問題を考察するために,次の2地点で多人数調査を行い,相互の結果を全国レベルで比較する。(1)言語的には関西方言圏でありながら,文化・経済の面では名古屋を中心とした東海地方との繋がりの強い三重県北勢地方。(2)関西とは対照的に威信が低い「弱い方言」である東北方言圏のうち,特に関東方言の影響を地続きに受けていると考えられる福島県。2001年度は昨年度の調査を継続し,上記の地域(三重県津市内および福島県福島市内)において高・中・若年層インフォーマントを対象とした面接方言調査,アンケートによる意識調査を行った。面接調査の結果から,両地域の方言変容・衰退の度合いを把握し,アンケート調査によって人々の「方言意識」「地域帰属意識」を同時に測定した。昨年度の調査結果による予備的な分析で見られた「方言使用への抵抗感」「地域帰属意識」などの変数と「方言変容(個人ごとの方言使用度)」との間の関連性は,今年度分を加えたより多数のデータによっても同様に確認できた。現在,この関連性を生み出す因果メカニズムについて多変量解析の技法を用いた分析を行っている。本研究の目的は,地域社会の方言変容がその地域の人々の方言・地域に対する意識とどのような関連性を持つかという点を解明することである。現在でも根強い生命力を誇る関西方言圏に属しながら,文化・経済の面では名古屋を中心とした東海地方との繋がりの強い三重県北勢地方を対象に,人々の帰属意識・方言評価意識と現在の方言変容との関連性を計量的に把握する。同時に,関西とは対照的に「弱い方言」である東北方言圏でも同様の調査を行い,相互の結果を全国レベルで比較する。2000年度は三重県津市内および福島県福島市内に居住する,高・中・若年層インフォーマントを対象とした面接方言調査を行った。その結果,両地域の方言変容・衰退の傾向を確認し,またその一方で「新方言」とみなせる現象の発生を見出した。アンケート調査も併用し,人々の「方言意識」「地域帰属意識」を同時に測定した。現在までのデータをもとに,各インフォーマントの「方言使用度」「地域・方言に対する諸意識」を数量化し,相互の関連性についての予備的な分析を進めている。すでに「方言使用への抵抗感」「地域帰属意識」などの変数と「方言変容(個人ごとの方言使用度)」との間に有意な関連性が見出されている。本年度の調査をさらに来年度も継続し,より多くのインフォーマントからデータを収集する。2年間のデータによる,より安定的な分析結果に基づいて上記の関連性を生み出す因果メカニズムについての考察を行う予定である。
マイクロダイアリシス法を用いた気分安定薬の薬理作用に関する神経化学的研究

抗躁薬についてはリチウムの作用機序に関する研究が最も進展しているが、臨床効果と対応する所見は少ない。一方、うつ病ではクロニジン負荷試験、デスメチルイミプラミン負荷試験などの神経内分泌学的な研究から、脳内α-2アドレナリン受容体のの低下が指摘されている。α-2アドレナリン受容体はセロトニン、アドレナリン、GABA、ニューロペプチドYなどの種々の神経伝達物質によって調節を受けている。我々は躁うつ病の生物学的研究についてまとめると共に、作用機序に関して、動物を生存させたまま脳内物質の変動を測定できるブレインダイアリシス法によって検討を試みた。1)躁うつ病の生物学的研究について「精神医学と生物学の語らい」で総説した。2)躁うつ病の治療に関して、抗けいれん薬の効果を炭酸リチウムと比較して報告した。3)精神薬理学的研究においては、α-2受容体感受性が低くPNMTの酵素活性が高いFischer344では、対照のラットより環境への慣れの劣ることを第14回日本生物学的精神医学会で報告した。このFischer344において、中枢に移行するPNMT阻害薬であるDCMB投与時に末梢性のPNMT阻害薬投与時より強い多動状態が認められ、中枢でのPNMT活性阻害がFischer344の多動状態に大きな影響を与えていることが明らかになった。この結果は第15回日本生物学的精神医学会で報告した。4)ブレインダイアリシス法で検討した結果、ノルアドレナリンの代謝産物であるMHPGは、DCMBの投与で有意に増加し、末梢性PNMT阻害薬であるSKF29661の投与時では変化がなかった。5)α-2受容体を介する多動状態に関しては現在ノルアドレナリン、ニューロペプチドYを測定し、これに対する抗躁薬の効果についても現在研究中である。
樹状突起形態・機能の神経活動依存的制御の分子機構

「経験」に基づく情報を、神経回路内に長期的に「書き込む」シグナル伝達機構については多くの謎が残っている。本研究課題を通じ、(1)神経突起の形態制御を司る新たなCaMKK-CaMKカスケード、(2)シナプス活動が新規遺伝子発現を引き起こすメカニズム、(3)神経活動によって誘導された遺伝子産物がシナプスを修飾する逆シナプスタギング機構、等を解明し、「経験」が神経情報として神経回路に貯蔵される仕組みを世界に先駆けて明らかにした。1000億個のニューロンから構成される神経回路網は、普遍的な遺伝子プログラムに基づく設計図に由来する「剛」の性質と、個体毎に内部・外部の環境変化に刻一刻と対応しその経験を情報として回路内に書き込める「柔」の特性を併せ持つ。さらに、脳の活動は、神経回路を構成するニューロン間の情報受け渡しにコードされているが、一つ一つのニューロンの応答性は、細胞内の電気的シグナルと化学的シグナルの複雑な絡み合いから成り立つ。本研究課題では、神経情報を受容する樹状突起に特に着目する。そして樹状突起における分子シグナリングを、以下の3つの側面から徹底的に解明を試みる:(1)シグナル統合のコンパートメントとなる樹状突起の形成・成熟の分子機構.(2)シナプス活動により発生した局所シグナルが神経細胞体まで伝わり、転写・翻訳・細胞骨格動員などの機構の活性化により、細胞全体の応答性が変化する分子機構.(3)細胞全体の応答性の変化が、最初のシグナルを発生したシナプスの性質を選択的に、かつ長期的に修飾する分子機構.「経験」に基づく情報を、神経回路内に長期的に「書き込む」シグナル伝達機構については多くの謎が残っている。「経験」に基づく情報を神経回路内に長期的に「書き込む」ためには、一過性の電気的シグナルを何らかの化学的シグナル伝達機構によって増幅・固定・貯蔵し、長期間にわたる読み出しを可能とする分子機構が必要となる。そこで本研究課題では、樹状突起シグナリングを、(1)シグナル統合のコンパートメントとなる樹状突起の形成・成熟の分子機構、(2)シナプス活動により発生した局所シグナルが神経細胞体まで伝わり、転写・翻訳・細胞骨格動員などの機構の活性化により、細胞全体の応答性が変化する分子機構、(3)細胞全体の応答性の変化が、最初のシグナルを発生したシナプスの性質を選択的に、かつ長期的に修飾する分子機構、の3つの側面から徹底的に解明する。初年度においては、マウス個体の脳成熟過程における樹状突起形成にCaMKファミリーをメンバ-がどのように関与しているかを、in utero electroporation等により解析する実験系を構築した。また、シナプス活動に応答して転写活性化が引き起こされるときに、どのような樹状突起内シグナリングが必要か、さらに核内でどのような調節領域が関与しているかをArc遺伝子発現について詳細に解析した。さらに、Arcの樹状突起内動態を可視化するため、種々のウイルスベクターや、in utero感染・in utero電気穿孔法などを駆使、樹状突起内シグナル操作・計測の方法論の開発と最適化を行った。本研究課題では、神経情報を受容するシナプス近傍における樹状突起が、神経情報の統合をいかなるシグナリングのクロストークによって実践しているのか、さらに、そのような「場」を提供する樹状突起の形態が、神経情報によっていかに修飾・維持されているかについて、徹底的に解明していこうとするものである。本年度は、5年計画の2年目で次のような成果を得た。シナプス活動に応答して転写活性化が引き起こされるときに、どのような樹状突起内シグナリングが必要か、さらに核内でどのような調節領域が関与しているかをArc遺伝子発現について引き続き詳細な解析を進めた。シナプス活動応答性エレメントSAREを活性化するシグナルの正体についてさらなる解析を進めるとともに、複数の転写因子とその複合体が、活動依存性前初期遺伝子の発現誘導にどのように寄与するのかを明らかにした。このような核内メカニズムにより、生理的な文脈における強い可塑的刺激が核内に効率よく伝わることを解明した。このような樹状突起シグナリングの多層性を解析する目的で、新たな多重蛍光シグナル計測解析技術を開発した。これを海馬錐体細胞初代培養系に適用し、可塑的シグナルの多重計測に成功した。脳成熟過程における樹状突起形成におけるCaMKIgammaの作用を引き続き探索し、その脂質ラフト局在に加え、キナーゼ領域の基質特異性にも、極めて重要な意義あることを明らかにした。他のCaMK1ファミリーメンバーの作用も探索したが、いずれも樹状突起形成・伸展に対する効果は有意ではなかった。本年度は、5年計画の3年目で次のような成果を得た。樹状突起形態制御因子であるCaMKIγのノックアウト動物の解析を本格化し、行動表現型の有無を調べた。

さらにKO脳組織と野生型マウスの脳組織を比較し、リン酸化ペプチドームにおける差異を検索し、樹状突起形態形成に関連する因子の抽出を試みている。Synapse-to-soma,soma-nucleus signaling解析については、Arcを中心に解析を深めた。特にArcプロモータSARE領域のCRE部位に結合するCREB複合体の生理的意義について解明し、さらにArcの樹状突起内動態を可視化するArc-EGFPを用い、シナプス局在分子のArcリクルーティングに関するCaMKIIbetaの役割を明らかにした。またin vivo脳機能修飾法として必須のAAVウィルス調製法の最適化を行い、AAV1ならびにAAV2について大量調製法を確立した。本研究課題では、神経情報を受容するシナプス近傍における樹状突起が、神経情報の統合をいかなるシグナリングのクロストークによって実践しているのか、さらに、そのような「場」を提供する樹状突起の形態が、神経情報によっていかに修飾・維持されているかについて、徹底的に解明していこうとするものである。本年度は、5年計画の4年目で次のような成果を得た。樹状突起形態制御因子であるCaMKIγのノックアウト動物の解析を本格化し、BDNF刺激の下流での選択的カルシウムシグナルについて新たな知見を得、さらにCaMKIgamma基質の一つを同定している。synapse-to-soma signaling機構の解明については、SARE配列のモジュラー構造に着目し、多彩なシグナル入力の実体を突きとめるとともに、Arcがschema学習における各種脳部位活性化の指標として有効であることを示した。soma-to-synapse signaling機構については、細胞体で翻訳されたArc遺伝子産物がシナプスにターゲットされる過程を可視化することに成功した。またin vivo脳機能修飾法としてAAVウィルス調整法のさらなる改良を実施した。上記の成果の一部は、Tse et al.としてScience誌に掲載され、またOkuno et al.としてCell誌に掲載確定している。本年度は、5年計画の最終年度で次のような成果を得た。樹状突起形態制御因子であるCaMKIgammaのノックアウト動物の表現型解析から情動行動の異常を示唆する結果を得、その基質候補について探索を進め、CaMKIgammaによる活性化機序を明らかにした。synapse-to-soma signaling機構の解明については、SARE配列のモジュラー構造に基づき、刺激応答性をより強化した人工的プロモーターE-SAREを創出し、CREB/MEF2/SRFの協調的活性化による転写制御の重要性を証明した。