hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
河川から沿岸への物質輸送量解読により評価する海洋物質循環系への栄養塩インパクト

一方、沿岸海水の懸濁粒子のCN同位体組成の季節変化を計測しつつ、セディメントトラップ捕集粒子の分析をおこない、海洋生物の有機態組成の季節変化を調べた。その結果、十勝川河口に近い水深20m程度までの沿岸水中では表層の05mまでの懸濁粒子は、陸上高等植物起原の有機物が有意に占めていた。それより下層では植物プランクトン起原の有機物が優勢であった。十勝沖の大型セディメントトラップは水深1500mに繋留し、主として親潮水の影響下にある海水からの有機物フラックスを、栄養塩負荷量の変化について通年調査を行いつつある。十勝川から流出する河川水に含まれる有機粒子、窒素化合物、栄養塩の通年変化を把握するために、ほぼ毎月、河口近くの狭量からのサンプリングを行った。河川水の硝酸濃度は80100μMと高く、N/P比も72115と高いことを確かめた。十勝川水系で行った調査研究の結果を解析するとともに、新たに東海地方の河川沿岸水系での研究を展開した。望星丸によって,駿河湾,伊勢湾および遠州灘から黒潮域にかけて化学海洋学的測定(T, S, Ch1-a, Nutrients, Ba)を実施した。沿岸から流出する物質の輸送先にあたる黒潮との関係を明らかにするため,Ra-228をトレーサーとして渦拡散による沿岸系冷水の混合速度を求めた。また静岡平野の安倍川及び巴川とその河口域の観測結果と浜松の汽水湖である佐鳴湖とその周辺河川において、河川および地下水の硝酸汚染が沿岸海洋環境に及ぼす影響を定量的に理解するために,水温,塩分,pH,栄養塩(溶存無機態,溶存有機態,粒子態),主要イオン成分の化学成分の分析を行った。この沿岸域への硝酸の過剰供給は、外洋域へのケイ酸の供給量を減少させると推測された。一方、十勝川による栄養塩負荷は、2005年6月から9月の増水期でDIN、DIPの供給フラックスはそれぞれ1.3 mol/m2/yr、0.009 mol/m2/yrとなった。これらが沿岸海域で全て消費しつくされると、レッドフィールド比より炭素換算で8.4 mol C/m2/yr程度を固定することとなる。これは、親潮海域での年間基礎生産(12.2 mol C/m2/yr)の7割に相当し、少なからぬ寄与と見積もられた。十勝川から沿岸海域に輸送されたDIN、DIP、Siの年間輸送量はそれぞれ、690、4.0、2740 x 10^6 molと見積もられた。海洋へ輸送された栄養塩の元素比は、N/P比=176.6、Si/N比=4.0、Si/P比=700となり、十勝沿岸では珪藻類の増殖に有利であると示唆された。台風などに伴う大雨イベントでは、特に窒素の輸送に大きな影響を与えていた。わずか1週間で年間輸送量の約8%にあたるDINが輸送されることがわかった。陸域-河川-海洋における一連の物質循環によって豊かな生態系が維持され,資源を生み出している四国の四万十川と仁淀川で河川水系調査を行い,沿岸から黒潮域までの水塊と堆積物を結ぶ水平・垂直的な物質輸送プロセスの観測を行った。また,仁淀川河口域から黒潮域まで観測点をもうけ,毎月一回海洋調査を行った。農業と都市化の影響が強い静岡県主要河川水の栄養塩濃度を測定するとともに,静岡市の対照的な二河川である安倍川(清流)と巴川(染された河川)及び下流沿岸域で観測を行った。静岡県主要河川水でみると一級河川では,硝酸濃度は,2798μmol/lと比較的低濃度だったのに対し,二級河川では82504μmol/lと大きな濃度変動を示した。一方,これら河川でリン酸塩濃度は0.219.2μmol/l,ケイ酸塩濃度は109413μmol/lの範囲であり,これら栄養塩濃度の変動には,流域面積の違いに加えて,そこでの土地利用の違いや都市化の差異が影響しているものと考えられ,特に三方原や牧ノ原台地に集水域のある河川においては特に高い硝酸濃度が観測された。十勝川から太平洋に輸送される溶存成分と粒状成分が沿岸の生物生産にどのように影響を与えているかを明らかにするために行ってきた過去約3年の結果を総括し国際学会で発表した。
胚発生におけるゲノムDNAメチル化の機能と調節機構

DNAメチル化機構は、遺伝子発現調節能を細胞分裂を超えて次の細胞世代に伝達しうるエピジェネティクス機構である。哺乳類ゲノムのDNAメチル化プロファイルは、全能性・多能性を獲得する生殖細胞分化および初期胚発生において大きく変化する。これまでDNAメチル化酵素DNMT1ノックアウトマウスが胎生致死であることから、初期胚におけるDNAメチル化プロファイル形成が正常な胚発生・細胞分化に必須であると考えられてきた。一方、生化学的解析からDNMT1分子が酵素活性非依存的転写抑制能をもつことが示され、蛋白質分子構造が完全に破壊される従来のDNMT1ノックアウトマウスの表現型は、DNMT1の酵素機能と非酵素機能の双方を反映している可能性が指摘されていた。この問題を解決するため、我々は酵素活性を特異的に消失する点突然アミノ酸変異(Cys1229Ser)を導入した新しいDNMT1変異マウスDnmt1^<ps>を作製し、従来のDNMT1ノックアウトマウスDnmt1^cの表現型と比較をおこなった。その結果、我々は(1)DNMT1の酵素活性消失がDNMT1ノックアウトマウスの胎生致死表現型の主因であること、(2)DNMT1細胞核複製部位局在がゲノムDNAメチル化状態に依存的であることを明らかにした。今回の結果は、複製の結果生じるヘミメチル化標識がDNMT1複製部位局在の主要なシグナルであるというモデルを支持した(Takebayashi, et. al. 2007)。さらに共同研究を通して、DNAメチル化結合分子Np95/Uhrf1が、DNMT1のDNAメチル化依存的複製部位局在を介してDNAメチル化継承機構に必須の役割を果たすことを明らかにした(Sharif, et. al. 2007)。以上の結果により、哺乳類胚発生におけるDNAメチル化修飾の意義を明確にし、DNAメチル化継承機構の理解を深めることができた。DNAメチル化は、代表的なエピジェネティクス分子機構の一つであり、哺乳類初期胚ゲノムにおいて大規模に再プログラム化される。我々はこれまでDNAメチル化酵素Dnmt3aおよびDnmt3bの遺伝子単離、生化学的解析、遺伝子ノックアウトを行ない、変異ES細胞や変異マウスを系統的に作成してきた。これらを用いた遺伝学的解析の結果、Dnmt3aおよびDnmt3bは初期胚ゲノム再プログラム化の重要ステップであるde novoメチル化に必須であることを明らかにした。本研究では、胚発生におけるDNAメチル化形成の調節機構および生理機能を明らかにすることを目的とする。本年度は、初期胚発生におけるde novoメチル化の細胞生物学的機能解析および標的遺伝子群探索の為、in vitro細胞培養実験系の確立とこれを用いたパイロット実験を行っている。この過程で我々は、特定の培養条件下で[Dnmt3a-/-,Dnmt3b-/-]ES細胞が胚体外細胞系列への分化傾向をもつことを見いだしている。この条件下で転写発現変化が起こる遺伝子をサブトラクションで探索したところ、Dnmt3a/Dnmt3b変異にともないDNAメチル化消失および顕著な転写上昇を示す複数の遺伝子を単離している。これらの知見は胚発生におけるDNAメチル化パターン形成の分子機構解析のための基盤となることが期待される。一方、本研究では、特定細胞系列や後期発生におけるDNAメチル化形成の役割解明のため、Cre-LoxPシステムを用いた組織特異的条件的ノックアウトを行う。本年度は、血管内皮細胞系列、神経冠細胞系列特異的Cre組み換え酵素発現トランスジェニックマウスとDnmt3a-loxP,Dnmt3b-loxPマウスとの交配を開始している。DNAメチル化は、細胞分裂を超えて次の細胞世代に伝達しうる遺伝子発現制御機構、すなわちエピジェネティクス分子機構のひとつであり、細胞分化能の調節や組織特異的遺伝子発現の維持など、個体発生の多くの局面で重要な役割を果たすと考えられている。哺乳類初期胚および生殖細胞系列において、ゲノム全体のDNAメチル化は、脱メチル化と新たなDNAメチル化パターン形成(de novoメチル化)によって、大規模に再編成される。初期胚におけるde novoメチル化活性は、時期特異的に発現するDNAメチル化酵素Dnmt3aおよびDnmt3bによって制御される。Dnmt3a/Dnmt3bダブルノックアウト(DKO)マウスでは、初期胚におけるde novoメチル化活性が消失し、体節形成期(胎生8日目)で発生停止することが明らかになっていた。DKOマウス胚体において分化マーカー遺伝子発現を解析したところ、本来転写不活性化されている栄養外胚葉細胞特異的遺伝子が異所的に発現していた。胚体外組織である胎盤を構成する栄養外胚葉系列は、桑実胚期において将来胚体を構成する内部細胞塊系列と分かれる。通常、内部細胞塊由来であるES細胞は、栄養外胚葉細胞に分化しにくいことが知られている。分化マーカー遺伝子発現、細胞形態、細胞DNA量解析から、分化誘導したDKO ES細胞は、栄養外胚葉細胞へ効率よく分化することが示唆された。我々は、初期胚におけるDNAメチル化動的制御の役割の一つは、哺乳類胚発生における最初の細胞分化である胚体-胚体外細胞系列分化の形質維持ではないかと考え、研究を進めている。

我々は、胚発生で特異的に制御されるDNAメチル化酵素Dnmt3aおよびDnmt3bの機能解析を行うことによって、胚発生および細胞分化におけるDNAメチル化の役割を明確にすることを目的としている。特に、我々は哺乳類胚発生最初の細胞分化である内部細胞塊-栄養外胚葉分化に着目して研究を進めている。本年度、我々は初期胚発生におけるDnmt3aおよびDnmt3bの標的遺伝子候補として、栄養外胚葉に強く発現するX染色体ホメオボックス遺伝子Psx1を同定した。詳細な解析の結果、Psx1は、非発現組織である内部細胞塊由来組織で高度にメチル化され、発現組織である栄養外胚葉由来組織では低メチル化となる、組織特異的メチル化遺伝子であることがわかった。胚盤胞およびDnmt3a/Dnmt3bノックアウトマウスの解析から、Psx1の組織特異的メチル化および組織特異的発現は、胚盤胞の着床後におけるDnmt3a/Dnmt3b依存的なde novoメチル化によって形成されることを明らかにした。さらに我々はPsx1遺伝子座周辺約0.7Mbにわたって、同様のDNAメチル化制御が起こっていることを発見した。これらの結果は、Dnmt3a/Dnmt3b依存的なDNAメチル化機構は高次クロマチン構造を調節することによって、遺伝子クラスターをドメインとして制御している可能性を示唆する。今後、Dnmt3a/Dnmt3bによる組織特異的メチル化調節、染色体ドメインレベルの制御機構の解析、およびDnmt3a/Dnmt3b標的遺伝子(群)のさらなる探索を計画している。DNAメチル化は、細胞分裂を超えて次の細胞世代に伝達しうる遺伝子発現制御機構、すなわちエピジェネティクス分子機構のひとつである。これまで細胞分化能や組織特異的遺伝子発現と、細胞種特異的、遺伝子特異的なDNAメチル化プロファイルとの相関関係が数多く報告されてきた。しかし、実際の個体において組織特異的遺伝子発現とDNAメチル化プロファイルの因果関係を遺伝学的に明確に示した例はきわめて少ない。我々は、DNAメチル化酵素による遺伝学的解析により、胚発生、幹細胞、細胞分化におけるDNAメチル化によるエピジェネティクス機構の役割を明確にすることを目的としている。今年度は、昨年度の報告書に記述したPsx1(現在Rhox6と呼ばれる)およびその周辺ゲノム領域Rhoxクラスターをさらに詳細に解析した。その結果、発生特異的に制御されるDNAメチル化酵素Dnmt3による細胞系列特異的DNAメチル化が、Rhoxクラスターを含む広範なゲノム領域の内部細胞塊/エピブラスト系列特異的な遺伝子発現抑制に主要な役割を果たすことを、実際のマウス個体を用いて遺伝学的に示す成果が得られ、論文発表した(Oda et al. 2006)一方、細胞分化におけるDNAメチル化機構の主要な機能は分化形質の維持であると考えられてきた。このことは、分化がまだ起こっていない幹細胞ではDNAメチル化による制御機構がなくても機能維持ができる可能性を示唆する。この仮説を検証するため、我々は哺乳類の主要なDNAメチル化酵素をすべて機能欠損した胚性幹細胞(TKO ES細胞)を樹立した。
エナメル器星状網細胞の上皮間葉転換は血管新生の誘導メカニズムになり得るか？

歯の発生後期には,エナメル器(上皮)に血管が複雑に入り込んだ構造をとるので,この過程から新規血管新生のメカニズムの解明を考えた。上皮特異的にβ-galを発現する遺伝子改変マウスを用いて,上皮間葉転換とそれに関わる因子の検索を行った。またFlk1(VEGF2R)ーGFPマウスによって血管構築を観察した。その結果,星状網の細胞は内エナメル上皮細胞の増殖によって中間層細胞を経由して発生すること,星状網の血管構築には低酸素反応因子Hif1の発現から酸素濃度の変化とHif1の発現が深く関わっていること,を明らかにした。また血管網はエナメル基質の石灰化のためにエナメル芽細胞の分化との関連も示唆された。歯の発生過程では,後期になるとエナメル器星状網は血管が複雑に入り込んだ構造を形成するようになる。血管新生の分子機構は,細胞培養や分子生物学的研究から解明されつつあるが不明な点も多い。そこで,この星状網と血管新生との関係を詳細に調べることによって,従来にない血管新生の新しいメカニズムの発見につながると考えた。我々は,星状網細胞の一部がビメンチンやslugなどを発現する結果を得たことから,上皮間葉転換(EMT)によって生じる間葉系幹細胞(MSC)が血管新生に重要な役割を果たしている可能性を考え,この仮説を証明する計画を立てた。上皮特異的プロモーターを用いた(K14-cre)マウスとRosa26Rマウス(あるいはRosa26R-YFP)の交配によるTGマウス(K14-cre/Rosa26R)の作製とK14-cre/Rosa26Rエナメル上皮細胞株を作製した(昨年度)。この細胞株を用いた培養では,TGF-βの存在下で間葉系細胞マーカーやslugなどのEMTマーカーが上昇することが認められた。また血管内皮細胞との関係を調べるためにFlk1(VEGF2R)ーGFPマウスによる歯胚周囲での血管構築を観察した。その結果,歯胚周囲に血管網を構築した後に,鐘状期後期なると星状網内に血管内皮細胞が浸潤して中間層細胞の外側に新たな血管網を構築することを認めた。この血管構築とエナメル芽細胞の分化とは密接に関連していた。星状網細胞の発生との関連を調べるために,GFPマウスを用いて歯胚発生過程での細胞の動態を観察した。その結果,星状網の細胞は内エナメル上皮細胞の増殖によって中間層細胞を経由して発生することが明らかとなった。血管と星状網との構築については,現在TGマウス(K14-cre/Rosa26R)とFlk1(VEGF2R)ーGFPマウスとを交配してリアルタイムで星状網内の血管構築を観察することによってさらに明らかにしていく予定である。表皮や粘膜上皮などの上皮組織内には血管は見られない。歯の発生の鐘状期後期になるとエナメル器星状網は血管が複雑に入り込んだ構造を形成するようになる。我々は,上皮間葉転換(EMT)によって生じる間葉系幹細胞(MSC)が血管新生に重要な役割を果たしている可能性を考え,この仮説を証明する計画を立てた。上皮特異的プロモーターを用いた(K14-cre)マウスとRosa26Rマウス(あるいはRosa26R-YFP)の交配によるTGマウス(K14-cre/Rosa26R)の作製とK14-cre/Rosa26Rエナメル上皮細胞株を作製した。現在,このマウスとこの細胞株を用いてEMTの変化をモニターする実験系を作製中である。また血管内皮細胞をCD31,K14-cre/Rosa26Rエナメル上皮由来細胞を抗ガラクトシダーゼで2重染色を行った結果,同時に発現する細胞が認められたため,上皮細胞の血管構築への関与が推測できた。しかし,レーザー顕微鏡の解像度の問題もあり,電子顕微鏡での解析を進めている。星状網の血管内皮細胞が中胚葉由来の細胞かを検討するためにMesp1-creとRosa26Rマウスを交配したTGマウス(Mesp1-cre/Rosa26R)を用いて星状網内の血管内皮細胞を検出した。その結果,星状網内の血管内皮細胞の多くは,中胚葉由来であることが確認できたが,Mesp1発現細胞に由来しないと考えられる細胞も存在することから,エナメル上皮細胞が血管構築に関わってくる可能性も考えられた。

24年度では基本的実験系が確立できてきたので今後は解析を進めていく予定である。1)上皮特異的プロモーターを用いた(K14-cre)マウスとRosa26Rマウスの交配によるTGマウス(K14-cre/Rosa26R)は順調に作製できている。それに加え,このマウスからエナメル上皮細胞株も樹立できそうであるので,今後の研究に大いに活用できる。2)K14-cre/Rosa26RTGマウスを用いてエナメル器星状網内の血管構築細胞について,CD31とβ-Galの2重染色を行った結果,エナメル上皮に由来する細胞が血管構築に関わっている可能性が強く示唆される結果を得ることができた。3)Mesp1-creとRosa26Rマウスを交配したTGマウス(Mesp1-cre/Rosa26R)を用いて星状網の血管内皮細胞が中胚葉由来の細胞かを検討した。概ね,予想通りの結果を得ることができた。4)歯の発生の帽状期から鐘状期後期に至る過程での遺伝子発現解析を行い予定であったが,網羅的解析を行うには十分な研究費ではなかったことから,この研究は断念した。しかし,基本的な,前もって候補としていた遺伝子発現については定量的PCRを用いてデータを得ることができた。5)Flk1-GFPマウスの腎被膜下に生後一日齢の第1大臼歯歯胚を移植して,歯胚に進入する血管内皮細胞の動態と星状網上皮との相互作用をを詳細に観察する実験系を構築した。K14-cre/Rosa26Rマウスをもとに,ケモカインCXCR4, N-cadherin,ビメンチン,EMTに関わるTgf-β,slug等の免疫染色と,βーガラクトシダーゼ染色の2重染色を行い,星状網細胞がEMTを起こしているかを確認する。血管内皮細胞転写因子であるETS-1,また血管内皮細胞の増殖や分化に関わる成長因子のVEGFやIL-8等の免疫染色と,β-gal染色の2重染色を行い,星状網細胞が血管内皮細胞に分化したかを検討する。また,ダブルビームによる走査型電子顕微鏡によって星状網細胞と血管内皮細胞との3次元的ミクロ構造を観察する。また血管内皮細胞に発現するFlt1-GFPマウスを用いて,歯胚外から進入する血管網と星状網上皮との相互作用をリアルタイムイメージングを用いて観察する。中胚葉のマーカーであるMesp1のプロモーターを用いたMesp1-cre/Rosa26Rマウスは作成済みなので,このマウスで星状網内の血管内皮細胞が中胚葉由来であるかを確認する。この研究に加え,ペリサイトが神経堤由来であることを確認して,星状網上皮細胞のEMTとの関連性をさらに追求する。K14-cre/Rosa26Rマウスの星状網細胞を分離培養して,成長因子(たとえばTGF-βなど)を培地に加えることで,EMTが生じるかについて検討する。上皮細胞のマーカー,間葉細胞のマーカー,EMTに関わる遺伝子,さらには血管内皮細胞マーカーについての発現を時間経過的にRT-PCRアレイで検索する。また,歯胚のスライスカルチャーによって星状網内のEMT現象をリアルタイムイメージングで観察する。EMTが証明されれば,血管内皮細胞株Huvecとの共培養を行い,遺伝子発現変化をもRT-PCRアレイで検索する。以上の研究結果を基に,星状網細胞と血管内皮細胞との関係について考察する。実験動物の購入費,維持費
ファゴサイトシスにおける細胞内プロテアーゼの役割の解析

カルパインは、高等動物のあらゆる細胞に存在する重要なタンパク質分解酵素と考えられているが、本酵素と細胞機能の関係は明らかになっていない。本研究では、食細胞機能とカルパインとの関係を知るために、カルパインの細胞内動態を細胞レベルで解析する方法を開発し、食細胞におけるカルパインおよびその内在性阻害タンパク質であるカルパスタチンの解析をおこなった。1.活性型カルパインに特異的な抗体の作成と細胞内タンパク質分解反応の新しい解析法の確立カルパインは細胞質に不活性前駆体として存在し、カルシウムイオン濃度の上昇などに伴って自己触媒的に末端部分が切断・遊離し活性型に変化する。ここでは活性型カルパインのアミノ末端領域の配列の短いペプチドを利用して、活性型カルパインに特異的な抗体を作成した。この抗体は、前駆体型カルパインには全く反応せず、組織・細胞レベルでの活性型カルパインの検出に有効であると考えられる。2.前駆細胞の食細胞への分化誘導におけるカルパインの動態マクロファージの前駆細胞であるU937培養細胞を種々の分化誘導剤で刺激したときの細胞内におけるカルパインの活性化を先に作成した抗体を用いて解析した。分化誘導後のスーパーオキシド産生能を指標に細胞を破砕し、活性型カルパインの生成量を調べると、活性型は細胞全体の前駆体カルパインの0.1%以下であった。また、種々のカルパイン阻害剤を分化誘導時に加えてもこれを抑える作用を示さなかった。さらにカルパスタチンは、量質ともに変化しなかった。3.食細胞の活性酸素産生能とカルパインの関係食細胞のスーパーオキシド産生や脱顆粒にカルパインが関与しているという報告があるので、正常人末梢血好中球のスーパーオキシド産生能に対するカルパイン阻害剤の影響を調べた。好中球をカルシウムイオノフォアおよび走化性ペプチド(fMLP)で刺激すると、スーパーオキシドが産生されるが、細胞をあらかじめ阻害剤で処理しておいてもスーパーオキシドの産生量に変化は認められなかった。したがって、カルパインは、食細胞のスーパーオキシド産生には直接関係していないと考えられる。
Lidocaine依存性てんかんモデルマウスの作製

初年度に、マウスSCN2A遺伝子に目的とするアミノ酸置換を組み込むためのターゲティングベクター作成に取り組んだ。エクソン21の前後のイントロンを含む713bpをPCRで増幅し、これをtemplateにしRandom Primer DNA Labeling Kitを用い、^<32>Pで標識したクローニングプローブを作成した。このプローブを用い、マウス脳由来cDNAをスクリーニングした。3次スクリーニングまで行い最終的に4クローンを単離し、高濃度ファージ溶液を得た。しかし、その核酸配列が目的とするフラグメントとは異なることが最終的に判明した。残り1年で目的とするモデルマウス作成は困難と判断し、最終年度は今回発見したNa_v1.2のI1473M変異のin vitroでの電気生理について研究を進めた。その結果、以下の事が明らかとなった。(1)電流電圧特性が変異体では-1.3±0.3nA(Cont.-1.8±0.2)と低下した。(2)電位依存性活性化曲線に有意な変化は無いが、不活性化曲線は-62.3±1.2(Cont.-68.8±1.2)mVと左方移動した。(3)不活性化からの回復曲線はτ=4.4±0.8(Cont.2.7±0.4)msと遅延した。以上より変異体は興奮性が低下すると考えられ、脳波所見や臨床症状と一致した。次に、リドカイン(Ld)の影響について検討した。Ld濃度0.5mMではNaチャンネル抑制率に有意な違いは無かったが、臨床使用濃度に近づけ、10^<-6>Mで検討すると以下の結果が得られた。(1)電流電圧特性が変異体では陰性側に変位した。(2)電位依存性活性化曲線が-44.9±0.6(Cont.33.4±0.6)mVと左方変位した。(3)不活化曲線に有意な変位はなし。これらの結果は、低濃度Ldが変異体Naチャンネルの活動性を亢進することを意味しており、変異体をもつ患者でLdが特異的に有効であったことと合致している。これまで、LdはNaチャンネルブロッカーとして認知されており、作用部位も特定されている。今回の結果は、これまでの概念とは異なり、Ldが濃度依存性に異なる作用機序と作用部位をもつ可能性を示唆しており、極めて重要な発見と考えられる。マウスSCN2A遺伝子に目的とするアミノ酸置換を組み込むためのターゲティングベクター作成に取り組んだ。このアミノ酸置換はエクソン21内にある核酸アデニンをグアニンに点変異することにより生じる。そこで、エクソン21の前後のイントロンを含む713bpをPCRで増幅し、これをtemplateにしRandom Primer DNA Labeling Kitを用い、^<32>Pで標識したクローニングプローブを作成した。

各ファージクローンを大腸菌LE392に取り込ませ培養増殖した後、Qiagen Lambda Midi Kitを用いプレートライセート法にてファージDNAを得た。このファージDNAを制限酵素Not 1で切断し、プラスミド(pBlueScript)にサブクローニングした。サブクローンを精製し、competent cellに形質転換した後、プレートに塗布培養した。そしてblue-whiteselection法にてサブクローンされたコロニーを得た。コロニーの一部をLE培地で震振培養し増殖させ、さらにアルカリ法にて純度の高いプラスミドを得ることができた。このプラスミドについてオートシークエンサーを用い核酸配列を決定し、目的とするエクソンを含んだフラグメントであることを確認した。今後、ネオマイシン耐性遺伝子、lox P配列、HSV-TK遺伝子を単離されたDNAフラグメントに組み込んでターゲティングベクターを完成させる。初年度に、ターゲティングベクターを作成するため、マウスgenomeライブラリーから4つのクローンを得てサブクローニングした。しかし、その核酸配列が目的とするフラグメントとは異なることが最終的に判明した。残り1年で目的とするモデルマウス作成は困難と判断し、本年度は今回発見したNav1.2のI1473M変異のin vitroでの電気生理について研究を進めた。その結果、以下の事が明らかとなった。(1)電流電圧特性が変異体では-1.3±0.3nA(Cont.-1.8±02)と低下した。(2)電位依存性活性化曲線に有意な変化は無いが、不活性化曲線は-62.3±1.2(Cont.-68.8±1.2)mVと左方移動した。(3)不活性化からの回復曲線はτ=4.4±0.8(Cont.2.7±04)msと遅延した。以上より変異体は興奮性が低下すると考えられ、脳波所見や臨床症状と一致した。次に、リドカイン(Ld)の影響について検討した。Ld濃度0.5mMではNaチャンネル抑制率に有意な違いは無かったが、臨床使用濃度に近づけ、10^<-6>Mで検討すると以下の結果が得られた。(1)電流電圧特性が変異体では陰性側に変位した。(2)電位依存性活性化曲線が-44.9±0.6(Cont.33.4±0.6)mVと左方変位した。(3)不活化曲線に有意な変位はなし。これらの結果は、低濃度Ldが変異体Naチャンネルの活動性を亢進することを意味しており、変異体をもつ患者でLdが特異的に有効であったことと合致している。これまで、LdはNaチャンネルブロッカーとして認知されており、作用部位も特定されている。今回の結果は、これまでの概念とは異なり、Ldが濃度依存性に異なる作用機序と作用部位をもつ可能性を示唆しており、極めて重要な発見と考えられる。
眼圧調節における若年性優性遺伝性緑内障原因遺伝子ミオシリンの機能:貧食能への関与

培養細胞に様々な変異を持つミオシリンコンストラクトを導入し、貪職能を解析した。いずれの培養細胞においても残念ながら貪職能に大きな変化は見られなかった。培養細胞におけるミオシリンの発現局所を、チュビュリン、アクチン、キネシン、などの抗体と共染色して観察したが、明らかな関連は認められなかった。ミオシリンのコンストラクトの解析から野生型のミオシリンの局在はC末端を234アミノ酸除いても変化が認められなかった。電子顕微鏡によるリコンビナントミオシリンの観察の結果ミオシリンはフィラメントを形成するタンパク質であることが明らかとなった。また、C末端を234アミノ酸除いたコンストラクトは線維形成が認められなかった。このことより、ミオシリンの局在にはN末端が重要であり、線維形成にはC末端が重要であることが示唆された。ミオシリンに対する抗体を用いて、網膜組織に存在するミオシリンを精製する方法を確立した。今後はこの方法を用いて組織における天然型ミオシリンの性質を解析する予定である。また、甲状腺におけるミオシリンの発現を調べるためにラットミオシリンのクローニングを行った。今後は動物モデルとしてはラットを用いて解析をすすめて行く予定である。ミオシリンは緑内障の原因となっている遺伝子であるが、今回この遺伝子をpEGFP-N3ベクター(Clonetech社,Ca)にPCRを用いて増幅した断片を、EcoRI/BamH3制限酵素にて切断しベクターに導入した。GFP蛋白質との融合蛋白質を作成した。Greenfusionprotein(GFP)蛋白質は生体内における蛋白質の局在を生きたままの状態で蛍光を発し観察するためのマーカー蛋白質である。ミオシリンの細胞内の局在を検討するために、リボフェクション法にて横紋筋由来のSJRH30細胞、COS細胞にミオシリンを導入し観察した。GFPのみとミオシリンGFPの融合蛋白質、非導入細胞をそれぞれ蛍光顕微鏡を用いて解析した。GFPのみを導入した細胞は細胞質、核の全体に強い蛍光強度を認めた。GFP.ミオシリン融合蛋白質の発現を解析したところ、局在は編み目状の局在を示した。ミオシリンが細胞内において編み目状の局在を示したことより、細胞の構造に関わっている蛋白質であることが確認された。ミオシリン蛋白質のC末端を短縮した変異蛋白質を作成し、培養細胞に導入し観察したところ、蛍光顕微鏡レベルでの大きな変化は見られなかった。このことから、細胞内の局在にはミオシリンのロイシンジッパードメインの存在が重要であるものと考えられた。また、PMAで培養細胞を刺激したが、蛋白質の局在に大きな変化は見られなかった。
５－アミノレブリン酸の新規分子機能の解明

5-アミノレブリン酸(ALA)はほぼ全ての生物が合成できる一次代謝物で,代謝産物のテトラピロール類は血液や各種酵素中のヘム,窒素・硫黄同化酵素中のシロヘム,植物の葉緑素(クロロフィル),ビタミンB12などとして生体内で重要な働きをする。しかも植物では,ALAを与えることで環境ストレス耐性増強を惹起することが現象的に知られていた。本研究では,ALAはヘム機能の回復に寄与するがクロロフィルの増大には直結しないこと,ALAによる直接的な酵素活性制御,トマトとシロイヌナズナにおけるALA誘導性転写因子の同定,の成果を得た。テトラピロール代謝経路の中間基質である5-アミノレブリン酸(ALA)を植物に投与すると、本経路の代謝産物であるクロロフィルやヘムが増加するが,比較的高濃度のALAを植物にあらかじめ投与しておくと、塩ストレス等への耐性向上に効果があることが明らかになった。後者は、ALAが細胞内の抗酸化酵素の活性を向上させることが、ストレス耐性の向上をもたらす要因の1つとして考えられるが,外生のALAが核遺伝子発現の調節にどう関わるかは十分分かっていない。そこで,外生のALAがテトラピロール代謝経路、活性酸素消去系、ストレス応答系遺伝子群の発現に与える影響を調べた。その結果,テトラピロール代謝経路のクロロフィルおよびヘムの合成に関わる遺伝子群の発現が,ALA投与後,非常に早い時間で誘導されることが分かった。また、低濃度のALAを投与すると、APX、Prxといった活性酸素消去系遺伝子の発現が上昇し、活性酸素の蓄積を抑制する効果をもたらすのに対して、高濃度のALAでは,ストレス応答に関わる遺伝子群が顕著に発現変動を示すことが分かった。これらのデータは、外から与えたALAによる濃度依存的な生理活性の違いについて遺伝子発現レベルで異なる制御の存在を示唆している。5-アミノレブリン酸(ALA)は微生物から植物,動物までおよそ全ての生物の一次代謝物質であり,ヘム,シロヘム,クロロフィルとなって酸化酵素や光受容体,窒素・硫黄代謝酵素の活性中心として細胞内各所で重要な機能を果たしている。植物でALAは葉緑体内で合成されるが,これを細胞外から投与すると、低濃度でもクロロフィルやヘムが増加し,光合成活性や窒素代謝などが昂進する。さらに高濃度で投与すると、塩ストレス等への環境ストレス耐性が向上する。そこで本年度は,こうした生理効果を最大限引き出して産業活用を促進するために重要な情報である,外から与えたALAの細胞内や葉緑体内への取り込み系(輸送体)の探索を行った。ALAは肝臓賦活剤として30年以上前に医薬登録済みであり,動物細胞でその輸送体がすでにいくつか報告されている。我々はシロイヌナズナでそのホモローグを含む20以上の遺伝子を候補としてピックアップし,それらのT-DNA挿入変異株についてALA感受性の変化を調べた。その結果,4つの遺伝子の欠損株で同時に高濃度ALAと高照度条件にした際の生育不良や白化が抑制されることを見出した。また農業の現場ではこうした物質を単剤使用することはなく,他の物質と併用することで最大効果を引き出すのが普通である。ALAは高濃度で与えるほど負の効果も表れてくるため,これを緩和,消去できる物質の探索を進めた。そのためには実験室条件で迅速,簡便,高精度に多検体を省スペースで検証できる系の開発が必要だったので併せて進めた。そして,ALAと併用することで相乗効果が見られる物質を少なくともひとつ見出すとともに,先述の条件を満たし,かつ添加物質の交換,濃度も正確にコントロールできるユニークな検証(栽培)系を開発することができた。植物において5-アミノレブリン酸は葉緑体におけるテトラピロール合成経路の中間基質であり,植物の葉や根に水溶液を投与すると,クロロフィル量の増加,光合成能の増強、硝酸還元酵素等の活性上昇,環境ストレス耐性の向上など多様な生理活性が惹起される。しかし環境ストレス耐性の向上は現象論の域にとどまっており,分子機構は不明である。そこで,ALAによって塩ストレス耐性が向上し,かつ塩ストレス応答遺伝子が多数知られるトマトで,ALA誘導性遺伝子を探索後,シロイヌナズナにおけるホモログ遺伝子のALA応答性の検証,効果的な耐塩性向上法の検討を行い,ALAによる塩ストレス耐性向上の分子機構のモデル提唱を目指した。トマトへのALA投与によって塩ストレス応答性の2つの遺伝子発現が投与2時間後をピークに上昇した。そこでシロイヌナズナのホモログ遺伝子について調べたところ,一方のホモローグはいずれもALA応答性を示さなかった。しかし,他方の転写因子と相同性のもののうちのひとつが応答性を示した。また塩ストレス下での発芽率と生存率が,ALA処理方法を工夫することで顕著に上昇した。このときクロロフィル量は増加せず,先述の転写因子は転写量が5倍に増加した。

これらを含む結果から、ALA投与による塩ストレス耐性向上効果のモデルとして,(1)クロロフィル合成の促進は必須ではない,(2)ALA等によって発生するROSをシグナルに抗酸化酵素が発現,活性化する,(3)ALAが直接的に特定の酵素を活性化する,機構を提唱した。これは今後,ALAの分子機能解析と塩害土壌への応用を進める上で意義ある成果である。ALAの環境ストレス応答を向上する新規機能の分子機構のなかでも,ALAを予め投与しておくことで塩ストレスが向上する現象については全く分子機構の解明が進んでいない。その現状において,我々はテトラピロール代謝経路、活性酸素消去系、ストレス応答系遺伝子群の発現が変動することのみならず,濃度依存的に異なるパターンで変化するという発見をした点において,まず計画以上に進展していると評価する。すなわちテトラピロール代謝経路のクロロフィルおよびヘムの合成に関わる遺伝子群の発現は,ALA投与後,非常に早い時間で誘導され,低濃度のALAで、APX、Prxといった活性酸素消去系遺伝子の発現が上昇し、活性酸素の蓄積抑制効果をもたらしうるのに対して、高濃度のALAでは,ストレス応答に関わる遺伝子群が顕著に発現変動を示した。また2つめの評価ポイントはALA誘導性転写因子AtRAP2.6の同定とその発現制御の解析結果である。トマトの塩・ALA誘導性JERF1のホモログとして着目したAtRAP2.6は外生のALAによって惹起されるだけでなく,内生ALAを高蓄積する変異体やレブリン酸の添加によるALA以降の代謝阻害,そして塩ストレスでそれぞれ高発現することを確認し,ALA誘導性転写因子として初めて同定に成功した。H22秋の当該研究申請時にALA研究に携わり,かつH23年度も戦力となるはずであった3名の学生のうち,当方の院試に合格していたB4は家庭の事情で他大学への進学を選択し,M1のうち1名は健康上の問題から採択通知を受けた頃から休学状態となり(H23秋に退学),もうひとりのM2も就職活動が修士論文執筆時期のH24.1まで長期化した。そのため今年度は極度の人員不足に苦心することとなり,当初計画していた精製タンパク質をもちいた生化学実験などスキルとまとまった時間が必要な研究よりも,細切れ時間で経験値が低くても可能な定量PCRとフィーディング実験に軸足を置くことで打開を図った。その甲斐あって,この困難な状況下において当初計画に対しての遅れはあるもののも,研究費を最大限に活用することで,ALA誘導性転写因子のひとつやALA効果を発揮させやすい処理方法で進展があったのは大きな成果であった。濃度の違う外生ALAを与えた際のテトラピロール代謝経路の遺伝子発現と代謝物の挙動にどの程度の一致性,時間的ラグ,変動幅の相違があるかをHPLC解析する。またALAの予防的処理をした植物としない植物に塩ストレスを与えた際の遺伝子発現パターンの違いを観察する。またこのとき活性酸素の発生量に違いがあるかどうかをNBT染色,DAB染色で検証,硝酸還元酵素活性,ヘム活性を常法に従って測定・比較する。一方,AtRAP2.6についてはすでにノックアウト変異体を確立しており,この株で外生ALAを与えた遺伝子発現パターンの解析を進める。
プロトン共役電子移動を利用した高活性ニッケル（ＩＩ）水素生成錯体触媒の開発と展開

申請者は、電気化学的な水素生成反応におけるプロトン共役電子移動(PCET)の役割に注目し、配位子へのPCETを高速に進行させるニッケル錯体触媒の開発を推進してきた。本年度は第一著者として2報論文を出しており、本研究分野の発展に大きく貢献した。1つ目の論文では、以前我々が報告したニッケル錯体触媒[Ni(dcpdt)2]2-の詳細な反応機構をDFT計算を駆使して明らかにした。[Ni(dcpdt)2]2-は二段階の逐次的な配位子中心PCETによって2電子還元3プロトン付加種を生成し、その後分子内PCET(1H+/1e-)によってニッケル(III)ヒドリド種を形成した後、発熱的に水素を生成することを、遷移状態計算などを用いて詳細に解明した(K. Koshiba. K. Yamauchi, K. Sakai, Dalton Trans. 2019)。2つ目の論文では、これまであまり着目されてこなかったヘテロレプティックなジチオレンニッケル錯体触媒に注目し、その水素生成触媒機能について調査を行った。その結果、別途合成したホモレプティック錯体と比較して、ヒドリド形成の際のプロトネーション速度が大きく異なり、その影響によってヘテロレプティック錯体触媒の方が低下電圧で触媒駆動することを明らかにした。DFT計算によって、この違いはヒドリド錯体のpKa即ち反応前後の熱力学的差異によるものではなく、還元種のSOMOのニッケル中心周辺の分布の違いが速度論的に影響していることを解明、配位子中心還元型のPCETにおける中心金属の寄与を初めて発見した(K. Koshiba, K. Yamauchi, K. Sakai, ChemElectroChem, 2019.)。以上のように、申請者の本年度の研究進捗状況は、期待通りに進展した。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。当該年度、申請者は水からの水素生成を促進する高耐久性ニッケル錯体触媒の開発を目指し、水に不溶なニッケル錯体触媒を電極上へ修飾し、不均一系触媒として水溶液中で評価するアプローチで研究を行った。導入した錯体触媒は、[FeFe]-H2aseと同様にプロトン受容性アミン部位を有するNiP4錯体であり、多層カーボンナノチューブ(MWCNT)と共に電極表面に修飾し、各種電気化学測定を行った。この手法で、反応機構解析に成功した例はないが、重水素化試薬を用いた水素生成速度の同位体効果を検証し、反応律速段階におけるプロトンの関与を追跡することで、反応機構の解明を進めたNiP4/MWCNT修飾電極の酸性水溶液中でのLSVから、開始過電圧100 mVで水素生成に伴う顕著な電流値の上昇を観測した。LSVから得られるTafel勾配は59 mV dec-1であり、触媒の2電子還元が水素生成の反応律速段階であることを明らかにした。このような挙動は、固体触媒では観測されない、分子性触媒特有の現象である。同様の測定を重水(D2O)溶液中で行い、Tafel勾配から算出される交換電流密度J0の変化を観測することで反応速度比KIEの決定を行った。その結果、上記の条件ではLSVの挙動、及びTafel勾配は変化せず、KIE = 0.95±0.01と算出され、プロトンが関与しない2電子還元過程が触媒反応の律速段階であることが見出した。一方、均一系条件下、酸添加アセトニトリル中においても同様に同位体効果実験を行い、触媒回転頻度からKIEを算出したところ、KIE = 2と示された。均一系においては律速段階においてプロトンが関与することで、不均一系条件と均一系条件で触媒反応の律速段階が変化することを明らかにした。これらの結果から、錯体触媒は電極への修飾によって錯体への電子移動速度が低下することを見出した。今年度は、初年度の研究計画として挙げていた「均一系条件下におけるニッケル錯体触媒の構造-活性相関」を同位体効果によって明らかにすることに成功した。それだけでなく、これら錯体触媒を電極上へ修飾する、不均一系条件における反応機構が変化する現象を新たに観測することに成功した。またこれらニッケル錯体触媒は過電圧が100mVであり、次年度の目標である「極低過電圧のニッケル錯体触媒の開発」の達成へと大きく近づく実験結果も得られている。当初の年度計画を上回るペースで遂行できていると同時に、新規性の極めて高い成果を得られたという観点から、(1)当初の計画以上に進展している、ということができる。当該年度、申請者は電気化学的な水素発生反応を促進する高活性ニッケル錯体触媒の開発を目指し、二つのアプローチで研究を推進した。一つ目は、我々が以前開発したニッケルビス(ジチオレン)錯体触媒の反応機構解析である。Angew. Chem. Int. Ed. 2017, 56, 4247-4251.にて報告したプロトン受容部位を有するニッケルビス(ジチオレン)錯体の反応機構解析をDFT計算を駆使して行った。DFT計算の計算条件の最適化は、実験値と計算値を比較することで厳密に行い、遷移状態の算出やIRC計算による反応経路探索も行った。その結果、プロトン受容部位導入ジチオレン配位子にて観測される「配位子上でのプロトン共役電子移動(PCET)」が二段階引き起こされることにより、反応中間体であるヒドリド種を形成し水素を生成することを突き止めた。

この配位子上でのPCET過程を経由したヒドリド形成、及び水素発生反応は本系にて初めて発見された興味深い反応過程であり、今後の水素発生触媒開発において重要な知見を得た。二つ目は、ニッケル(ビピリジン)(ジチオレン)錯体触媒系の確立である。先行研究においては、これまでビス(ジチオレン)錯体のみが水素発生触媒として注目されてきた。これまで多くのビス(ジチオレン)錯体が高活性な触媒として報告されている一方で、分子設計において大きな制限となっている事実も存在する。そのため、本アプローチにおいてモノジチオレン錯体、具体的にはニッケル(ビピリジン)(ジチオレン)錯体触媒系の確立を試みた。その結果、本系も水素発生触媒となり得る事実が明らかとなった。さらに興味深いことに、ジチオレン部位にプロトン受容部位を導入した際には、錯体の三電子以上の還元状態が水素発生触媒反応の活性種であることが分かった。この成果は、今後のジチオレン錯体触媒において貴重な知見となる。研究目標である、超高活性な水素生成錯体触媒の開発、具体的には極低過電圧で駆動する水素生成触媒の開発に向け、着実に進んでいる。研究計画時にはビス(ジチオレン)錯体による本目標の実現を目指していたが、本年度においてその実現妥当性が難しいことが明らかになった。しかしながら迅速に代替案であるモノジチオレン錯体触媒の展開に移行することができ、実際にモノジチオレン錯体が触媒活性を有することを実証できた。ビピリジン-ジチオレン錯体は構造柔軟性が高く、極低過電圧駆動の錯体触媒の設計にも応用が期待できる。引き続き研究目標に向け、新規性進歩性が高い成果を得られていると言える。申請者は、電気化学的な水素生成反応におけるプロトン共役電子移動(PCET)の役割に注目し、配位子へのPCETを高速に進行させるニッケル錯体触媒の開発を推進してきた。本年度は第一著者として2報論文を出しており、本研究分野の発展に大きく貢献した。1つ目の論文では、以前我々が報告したニッケル錯体触媒[Ni(dcpdt)2]2-の詳細な反応機構をDFT計算を駆使して明らかにした。[Ni(dcpdt)2]2-は二段階の逐次的な配位子中心PCETによって2電子還元3プロトン付加種を生成し、その後分子内PCET(1H+/1e-)によってニッケル(III)ヒドリド種を形成した後、発熱的に水素を生成することを、遷移状態計算などを用いて詳細に解明した(K. Koshiba. K. Yamauchi, K. Sakai, Dalton Trans. 2019)。2つ目の論文では、これまであまり着目されてこなかったヘテロレプティックなジチオレンニッケル錯体触媒に注目し、その水素生成触媒機能について調査を行った。その結果、別途合成したホモレプティック錯体と比較して、ヒドリド形成の際のプロトネーション速度が大きく異なり、その影響によってヘテロレプティック錯体触媒の方が低下電圧で触媒駆動することを明らかにした。DFT計算によって、この違いはヒドリド錯体のpKa即ち反応前後の熱力学的差異によるものではなく、還元種のSOMOのニッケル中心周辺の分布の違いが速度論的に影響していることを解明、配位子中心還元型のPCETにおける中心金属の寄与を初めて発見した(K. Koshiba, K. Yamauchi, K. Sakai, ChemElectroChem, 2019.)。
Niドーパント分布場の積極的導入によるアモルファスシリコンの大粒径結晶化

本研究ではアモルファスシリコン(a-Si)上にNiの放射状の分布をつけアニールすることで、Ni誘起結晶化を制御し、中心からの核発生と扇形の結晶成長により、大粒径の多結晶膜を得ることを目指す。昨年度までに申請者が開発したコンビナトリアル手法によりNi量の最適化を進め、膜厚50nmのa-Siに対しNiが膜厚換算数pmで結晶化が促進されることを確認した。本年度は、アニール条件の最適化を進めた。既往の研究では、アニールの温度・時間・昇温速度に加え、プレアニールについてもこれらのパラメータが探索され、グループ毎に「レシピ」が作られてきた。しかしa-Siの成膜条件が変わると「レシピ」は使えず、かつこれらの6パラメータの最適化は非常に困難である。そこで、論理的考察により我々は実験パラメータを昇温速度1つに絞り込んだ。即ち、目的温度までの昇温速度を変えることで、これらのパラメータを一度に振れる。また、一度形成した結晶核は、800°C程度までは合一せずに残る為、結晶化初期の構造も保存される。この方法で、0.2°C/minで700°Cまで昇温した際、Ni量が10pmから減少する分布場で粒径30μmの結晶粒の形成を確認した。更に、680°Cでアニールを止めたサンプルでは、扇形の結晶粒も確認され、目標とした機構による大粒径化を示唆するもので、現在、検証を続けている。なお、本研究で利用したコンビナトリアル手法は、別材料でも大きな成果を挙げた。即ち、代表的なナノ材料である単層カーボンナノチューブでは、ナノ粒子触媒の開発が合成法の鍵となるが、本手法により1回の実験での触媒担持条件の最適化を可能とした。本研究では、アモルファスシリコン上にニッケルの放射状の分布をつけアニールすることで、ニッケル誘起結晶化により、中心から核発生させ、扇形に2次元的に結晶を成長させ、大粒径の多結晶膜を得ることを目指す。その為には、ニッケル需給を満たす放射状のニッケル濃度分布の形成が不可欠であり、シリコンウェハに微小な穴をあけたマスクを作製、基板から離して設置する方法を取った。穴サイズによりニッケル供給量を、マスター基板間距離によりニッケルの広がりを制御できる。結晶化は、主に、温度、時間、ニッケル濃度およびニッケルの広がりという4つの条件により決まると考えられ、高効率な検討手法が不可欠である。そこで、10通りのサイズの穴が10個ずつ開いたマスクを作製し、基板上に傾けて設置しニッケルを供給することで、ニッケル供給量と広がりの異なる100パターンを一度に形成する手法・CMD(Combinatorial Masked Deposition)法を確立した。サンプルをアニールし、結晶化させた後、X線回折、顕微ラマン分光、走査型電子顕微鏡により結晶化部、未結晶化部を判定し、光学顕微鏡像と対応付けた。これにより、100パターンを、アニール時間を除き、5時間で評価する手法を確立した。具体的な実験では、耐勢ガラス基板上にスパッタ法で300°Cにてアモルファスシリコンを100nm製膜、その上にスパッタ法とCMD法を組み合わせ、膜厚4nm以下のニッケルパターンを100個ずつ作製した。550600°C,160h急速熱アニールを行ったところ、高温・長時間ほど結晶化部のサイズが増大し、最大1mmの結晶化部が形成された。現在、核発生速度と結晶成長速度の分離・評価を行っている。昨年度までにNi濃度分布場の形成法を確立した為、本年度はNi濃度分布およびアニール条件の改良により、シリコン結晶粒の大粒径化と質の向上を試みた。昨年度までの実験により、直径1mm程度の円状の結晶化領域を形成できていたが、構造解析により、この結晶は微結晶構造を取っていることが分かった。これは、a-Si膜厚50100nmに対し、Niを数nm供給していた為、ニッケルシリサイドの量論に近く、核発生が高密度に起きた為と考えられる。そこで、Ni濃度を大幅に下げ、プロファイルの中心部のNi濃度が0.110pm程度と、極疎らにNi原子が存在するよう条件を変更した。このサンプルを急速熱アニールし、ラマン散乱分光で分析したところ、プロファイル中心部が数pmの条件で結晶成長が促進されることが分かった。なお、膜厚50100nmのアモルファスシリコンは可視光を良く吸収し褐色であるが、結晶化部は光を良く透過し、白色になった。現在、薄膜X線回折による面内結晶粒径の評価を進めている。

しかしa-Siの成膜条件が変わると「レシピ」は使えず、かつこれらの6パラメータの最適化は非常に困難である。そこで、論理的考察により我々は実験パラメータを昇温速度1つに絞り込んだ。即ち、目的温度までの昇温速度を変えることで、これらのパラメータを一度に振れる。また、一度形成した結晶核は、800°C程度までは合一せずに残る為、結晶化初期の構造も保存される。この方法で、0.2°C/minで700°Cまで昇温した際、Ni量が10pmから減少する分布場で粒径30μmの結晶粒の形成を確認した。更に、680°Cでアニールを止めたサンプルでは、扇形の結晶粒も確認され、目標とした機構による大粒径化を示唆するもので、現在、検証を続けている。なお、本研究で利用したコンビナトリアル手法は、別材料でも大きな成果を挙げた。即ち、代表的なナノ材料である単層カーボンナノチューブでは、ナノ粒子触媒の開発が合成法の鍵となるが、本手法により1回の実験での触媒担持条件の最適化を可能とした。