hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
膜蛋白のプロテオーム解析による神経膠芽腫浸潤関連分子の同定と機能解析

遊走assayを用いて、上記の初代培養細胞と世界的に広く使用されている7種類の神経膠芽腫細胞株(U87, U251, T98G, SNB19, U118, SF 767, G112)からそれぞれ高遊走細胞と非遊走細胞を収集した。2,細胞膜蛋白の分離とプロテオミクス解析による浸潤細胞特異的膜蛋白の同定過去の報告(Nunomura K, et al, Mol Cell Proteomics 2005)に倣い、細胞膜蛋白の抽出を行う。すなわち、上記で回収した細胞の細胞膜を細胞膜不透過性型ピチオンでラベリングし、細胞を溶解、アビジンカラムを用いて細胞膜のみ分離抽出した。得られた細胞膜蛋白はmassfingerprintingとMALDI(Matrix-assisted laser desorption/ionization,マトリックス支援レーザ脱離イオン化)-TOF(Time-of-flight/飛行時間型)analysisにより網羅的なアミノ酸解析から蛋白プロファイルを作成した。高遊走細胞と非遊走細胞で発現に差がある膜蛋白の同定中であり、浸潤細胞で機能している候補膜蛋白を特定中である。神経膠芽腫初代培養細胞と神経膠芽腫細胞株で共通し、新規性の高い10個の候補分子を優先分子とした。また、非遊走細胞と比較し、高遊走細胞で高い発現を示す膜蛋白と低い発現を示す膜蛋白を同定した。
動脈硬化予防のための日米住民のアディポサイトカイン濃度と摂取栄養素に関する研究

両地域の血清アディポサイトカインの濃度差は男性ではBMI、運動量の違いによって説明可能であった。一方、女性においてはこれらのみでは説明できず、タンパク質、n-3多価不飽和脂肪酸、アルコール、食物線維、および鉄分の摂取量差により説明可能となった。またレプチンは肥満により誘導される血圧上昇の重要な一介在因子であると想定された。さらに肥満にはレプチンを介する以外の血圧上昇作用があることが判明した。われわれはこれまでに栄養と血圧に関する国際共同研究INTERMAPの副研究として日本人と日系ハワイ人のランダムサンプルを対象として1997-98年に実施されたINTERLIPID研究の既存データからメタボリックシンドロームの有病率を算出し、さらに凍結保存血清を用いて新たにアディポネクチンを測定した。年齢には差がない日本住民259人(男130人、女129人)、ハワイ在住日系米人267人(男136人、女131人)を対象とした結果、平均BMIは男女とも日系米人で高く(男:23.4vs28.1kg/m^2,P<0.01;女:23.4vs25.9kg/m^2,P<0.01)、同一診断基準を用いたメタボリックシンドロームの有病率も男女とも日系米人で高かった(男:3.9vs23.2%,P<0.01;女:2.3vs9.7%,P<0.05)。また血清アディポネチン濃度は男女とも日系米人で低かった(男:8.1vs6.7・g/ml,P<0.01;女:12.9vs9.3・g/ml,P<0.01)。この差異の原因を検討するため男女を合わせたデータを用い多変量回帰分析を用いて解析した。Body mass index(BMI)や運動量に両地域で有意な差があったが、これらのみで両地域の差を説明できなかった。両地域における摂取栄養素の差の内、タンパク質とn-3多価不飽和脂肪酸を解析モデルに代入すると両地域差が消失した。遺伝的に同一と想定される両地域住民の血中アディポネクチン濃度の差は生活習慣、特に食習慣の差によって説明できた。以上の結果を論文にまとめ、米国の国際的学会雑誌に投稿した。栄養と血圧に関する国際共同研究INTERMAPの副研究として日本人と日系ハワイ人のランダムサンプルを対象として1997-98年に実施されたINTERLIPID研究の既存データからメタボリックシンドロームの有病率を算出し、さらに凍結保存血清を用いて新たにアディポネクチンを測定した。また血清アディポネチン濃度は男女とも日系米人で低かった(男:8.lvs6.7μg/ml,P<0.01;女:12.9vs9.3μg/ml,P<0.01)。この成果は米国心臓病学会疫学部門で報告し、論文は米国臨床栄養学雑誌に掲載された。肥満は心血管疾患発症と死亡を増加させる。その少なくとも一部に肥満による血圧上昇が関与している。動物実験ではレプチンと血圧の関連は明確に示されているが、ヒトでの検討では結果に不整合がある。今回、遺伝因子は等しいが生活習慣の違いにより肥満度が大いに異なる(BMI : 1747kg/m^2)日本在住日本人とハワイ在住日系米人計416人を対象として肥満、血清レプチンと血圧の関連について検討した。血清レプチン濃度別に4群に分けると、男女、日米どの4群内でも血清レプチン濃度が高くなるとBMI、収縮期血圧、拡張期血圧は増えた。平均年齢には変わりがなかった。性別調整の部分相関解析を行うとBMI、対数変換レプチン濃度、収縮期血圧、拡張期血圧のそれぞれの間で有意な関係があった。

重回帰分析を用いて収縮期血圧および拡張期血圧に及ぼすBMI、対数変換レプチン濃度とその他の交絡因子の影響を検討すると、BMI、対数変換レプチン濃度共に収縮期血圧および拡張期血圧に対して独立に影響を与えることが判明した。レプチンは肥満により誘導される血圧上昇の重要な一介在因子であると想定される。さらに肥満にはレプチンを介する以外の血圧上昇作用があることが判明した。
光応用電界・磁界ベクトルセンサによる電力系統の監視制御

3相交流の電力系統で観測される電界の回転ベクトルを非接触で測定することができる、オプトエレクトロニクスを応用したポッケルスセンサを試作し、実際に模擬3相交流導体系に配置して電界ベクトルを測定することにより、センサシステムの特性を評価した。導体系のモデルは、一辺7cmの正三角形の頂点位置に導体が配置され、3相の変圧器に接続されている。また、地絡事故を模擬するための水銀リレースイッチが1つの導体と中性点間に挿入されている。センサの基本特性として、出力の線形性は、電界が5kV/cmまで確認された。また、数十Hz20MHzの応答周波数を得ることができた。これを、ステップ応答によって確認した。なお、センサ作製に当たり、光源(LED,LD,SLD)や光ファイバ(シングルモード,マルチモード,パンダ)の選択および組み合わせについて、詳細な検討を行うことにより、オプトエレクトロニクスセンサ製作時に重要となるポイントを蓄積することができた。更に、センサの構成要素である偏光板の設定角度の誤差に起因する出力の変化を補正する方法を考案するに至った。パソコンを利用することにより、回転ベクトルの軌跡、中心位置を解析し、表示するセンサシステムを構築することに成功した。上記導体系モデルにおける定常時のベクトルの先端の軌跡は、円を描くがこれを本センサシステムによって確認した。また、地絡事故の実験的シミュレーションを通じて、そのときの電界ベクトルの軌跡の変化から、事故が発生した相導体の判定や事故時の電圧の位相情報の抽出が可能であることを示した。また、事故位置の特定方法について提案を行った。これらの成果は、電力系統運用の高信頼度化、高効率化を図るために必要とされる、正確かつ高速な系統状態の計測に応用できると考える。電力系統の状態計測を正確かつ高速に行うことを目的として、新しいオプトエレクトロニクスセンサの開発を行った。そのひとつがポッケルス素子を用いた光電界センサであり、まずセンサの小型化に向けて、光導波路技術を導入した。一方、同じくポッケルス素子を用いて、送電導体周辺に存在する電界の回転ベクトル(回転の中心位置、ベクトルの軌跡)を非接触で測定する手法を提案し、新しいセンサの試作を開始した。研究の進捗状況及び実験結果は以下の通りである。1.マッハツェンダ干渉計を光導波路で構成したセンサについて検討を行った結果、位置分解能や感度が実用上必ずしも十分でないことがわかった。2.z-cut LiNbO_3上の一本の導波路に、TEおよびTMの2つのモード光を伝搬する方式のセンサを新たに試作し検討を行った結果、このセンサにおいては測定感度の温度依存性が問題点となることを指摘した。3.上記問題点を解決できるセンサとして、y-cut LiNbO_3上のz軸方向導波路を利用することを提案した。導波路幅7μmで、長さ4.39mmのセンサを製作し、交流およびインパルス電界に対する良好な応答特性、および外部温度擾乱に対する安定な特性を確認した。4.上記センサの測定周波数の広帯域化およびS/N比の改善をめざして、光源の高周波変調を導入した。5.電界の回転ベクトルを1つのポッケルス素子だけで測定する手法を提案し、その手法の実現可能性について理論的検討を行った。その結果、1つの光ビームをポッケルス素子に入射し、出力光を2つに分岐してそれぞれを異なる偏光方向をもつ検光子を通すことにより測定可能であることを確認した後、センサの試作を行った。

導体系のモデルは、一辺7cmの正三角形の頂点位置に導体が配置され、3相の変圧器に接続されている。また、地絡事故を模擬するための水銀リレースイッチが1つの導体と中性点間に挿入されている。センサの基本特性として、出力の線形性は、電界が5kV/cmまで確認された。また、数十Hz20MHzの応答周波数を得ることができた。これを、ステップ応答によって確認した。なお、センサ作製に当たり、光源(LED,LD,SLD)や光ファイバ(シングルモード、マルチモード、パンダ)の選択および組み合わせについて、詳細な検討を行うことにより、オプトエレクトロニクスセンサ製作時に重要となるポイントを蓄積することができた。更に、センサの構成要素である偏光板の設定角度の誤差に起因する出力の変化を補正する方法を考案するに至った。パソコンを利用することにより、回転ベクトルの軌跡、中心位置を解析し、表示するセンサシステムを構築することに成功した。上記導体系モデルにおける定常時のベクトルの先端の軌跡は、円を描くがこれを本線差システムによって確認した。また、地絡事故の実験的シミュレーションを通じて、そのときの電界ベクトルの軌跡の変化から、事故が発生した相導体の判定や事故時の電圧の位相情報の抽出が可能であることを示した。また、事故位置の特定方法について提案を行った。これらの成果は、電力系統運用の高信頼度化、高効率化を図るために必要とされる、正確かつ高速な系統状態の計測に応用できると考える。
イネ細胞質優性不稔および不稔回復の分子機構の解明

細胞質雄性不稔と稔性回復システムはハイブリッドライスの開発には不可欠である。イネの細胞質雄性不稔とその回復の分子機構を明らかにするため、BT型細胞質雄性不稔を回復する稔性回復遺伝子(Rf-1)を単離することを目的とした。フィンガープリント解析で開発したRf-1遺伝子近傍の2つのDNAマーカーを起点にRf-1遺伝子の詳細な位置の特定に成功した。さらに、この領域の塩基配列および発現の解析からミトコンドリアのRNAの修飾に関与すると考えられるPPRタンパク質をコードする遺伝子を見出し、これが稔性回復遺伝子(Rf-1)であると結論した。琉球大学の新城らが育成したChisurah Boro II由来のBT型細胞質とその稔性回復遺伝子(Rf-1)に関する準同質遺伝子系統(MTC-10A、MTC-10R)を材料として用いた。MTC-10AとMTC-10Rの交配後代のBC1F3世代、6104個体の遺伝子型の解析から、Rf-1遺伝子の座乗領域を22.4kbの範囲に絞り込むことに成功した。この領域について、Rf-1遺伝子を持つMTC-10Rの塩基配列を解析した。同時に、この領域の発現解析を行ない、2個のORF(Rf-1AおよびRf-1B)を見出した。Rf-1遺伝子を持たないMTC-10Aではこれらの遺伝子が構造変異を起こしており、機能を消失していることが明らかとなった。Rf-1AとRf-1Bの塩基配列は極めて保存性が高く、推定アミノ酸配列からは10個のPPRモチーフを有することが推定された。さらに、Rf-1Aについては推定アミノ酸配列からこのタンパク質がミトコンドリアに局在することが示唆され、N末端にミトコンドリア移行シグナルが存在するものと考えられた。これに対して、Rf-1Bではミトコンドリアへの移行シグナル部分が欠失していた。他の稔性回復系統ではシグナル配列部分も保存されており、T65Rとその原品種であるChinsurah Boro IIでは、シグナル配列部分での1塩基伸長により機能を消失していると考えられた。すなわち、10回のPPRモチーフとミトコンドリアへの移行シグナルを含む791アミノ酸からなるPPRタンパク質をコードするRf-1AがRf-1遺伝子であると結論した。今年度までの研究計画の目標は、次ぎの2点である。1.開発したRf-1遺伝子近傍のDNAマーカーを利用した巨大DNAクローン(TAC)の選抜、および、選抜したTACクローンを起点としたコンティグの作成。2.ファインマッピング用集団の作成。1.TACコンティグの作成インディカ型イネのゲノム由来のTACクローン、20736個をスポットしたフィルターのスクリーニングを行なった。このフィルターでイネゲノムの約5倍がカバーされると計算される。3つのRf-1遺伝子近傍のDNAマーカーを用いてスクリーニングを行なった。2つに関してはポジティブクローンが得られなかった。残り1マーカーでは複数のクローンが得られたが、解析の結果、何れについても構造が異なっておりホモログであると推測された。結果としてRf-1遺伝子近傍のDNAマーカーに対応するクローンは得られなかった。

イネのゲノムシークエンスプロジェクトによりイネのBACクローンに関する情報とそのシークエンス情報が公開されつつあるためスクリーニングは中断し、公開された塩基配列情報を元にRf-1遺伝子の詳細な位置の解析を開始した。公開されている塩基配列でRf-1遺伝子に近接すると考えられるものを抽出し、マイクロサテライトの検索を行なった。対象とした6個のBACクローン全てでマイクロサテライトが見出された。2塩基をモチーフとするマイクロサテライトを利用して10個のDNAマーカーを作成した。これらの中からファインマッピングに用いる系統間で多型を示すマーカーを選抜した。2.ファインマッピング集団の作成Rf-1遺伝子領域内での詳細な連鎖分析を行なうための材料の育成を行なった。すなわち、遺伝子型Rf-1/rf-1で細胞質がCMS型のF_1植物の花粉を遺伝子型rf-1/rf-1で細胞質が正常型の植物に交配して得た植物体を5個のDNAマーカーを用いて解析し、Rf-1遺伝子近傍で組換えを起こした個体を選抜した。さらに、得られた組換え個体の自殖後代の遺伝子型を解析し、Rf-1遺伝子近傍で組換えを起こし、かつ遺伝子型がヘテロとなっている個体を選抜した。現在、選抜した個体を栽培中である。今後、これらの植物体から得られる大量の自殖後代を用い、1.で作成したDNAマーカーでRf-1遺伝子の位置を絞り込む予定である。研究目標:Rf-1遺伝子近傍に位置するDNAマーカーを基点とし、染色体歩行法によりRf-1遺伝子を単離することを目標とした。そのため、本年度は以下の点を目標として実験を行った。(2)連鎖分析によるRf-1遺伝子領域の絞込み研究結果:(2)Rf-1遺伝子領域の絞込み(ファインマッピング)(1)マッピング用集団の作成Rf-1遺伝子に関する準同質遺伝子系統間のBC_1F_1からRf-1遺伝子近傍で組換えを起こした個体をDNAマーカーで選抜した。選抜した10個体の後代(BC_1F_2)600個体をスクリーニングし、より内側で組み換えを起こし、かつ、Rf-1遺伝子領域がヘテロな遺伝子型を有する20個体選抜した。さらに、その自殖後代(BC_1F_3)約6000個体を育成し、ファインマッピング用集団とした。(2)ファインマッピング用DNAマーカーの開発とファインマッピングRf-1遺伝子のマッピングデータとDNAマーカーの塩基配列から対応するBACクローンの選抜を行った。対応するBACクローンの部分塩基配列を元にマイクロサテライトマーカーを作成した。このマイクロサテライトマーカーの開発過程でマイクロサテライトを標的とする新規なトランスポゾン、Micron、を見出した。開発したマイクロサテライトマーカーを用いてBC_1F_2世代を解析した結果、Rf-1遺伝子は2個のBACクローンでカバーされる領域の約120kbの範囲に座乗することが明らかとなった。さらに、BC_1F_3世代でファインマッピングするため、対応する領域の15箇所についてSTS化し、Rf型系統とrf型系統の塩基配列を比較し、塩基配列レベルでの多型を見出した。これらのマーカーを用いてRf-
硫化物系高リチウムイオン伝導材料の液相合成

本研究は、液相系からリチウムイオン伝導性硫化物を得ることを目的として行った。その中で、リチウム含量の大きいリチウムイオン伝導性硫化物ガラスがNメチルホルムアミドに溶解することを見出した。得られた溶液を150°Cで真空乾燥すると結晶が析出し、約3×10-6 Scm-1の導電率を示した。また、前駆体溶液に電極活物質を分散後、乾燥させることにより、活物質表面に硫化物固体電解質をコートすることができた。この活物質を用いて全固体電池を構築したところ、良好に作動した。本研究は、液相系からリチウムイオン伝導性硫化物を得ることを目的としている。そのアプローチとして、P2S5とブチルリチウムを出発原料とした硫化物系リチウム塩の液相合成、リチウムイオン伝導性硫化物ガラスの有機溶媒を用いたウェットミリングによるリチウムイオン伝導性硫化物スラリーの作製、さらに、リチウムイオン伝導性硫化物ガラスの溶媒への溶解・再析出によるリチウムイオン伝導性硫化物の作製について検討した。P2S5とブチルリチウムを出発原料とした硫化物系リチウム塩の液相合成では、アルゴン中で3時間反応させることにより、リチウムイオン伝導性硫化物塩の前駆体溶液を得ることができた。これを真空乾燥すると淡黄色の固体が得られた。得られた固体は混合物であり、真空乾燥後に固体は、室温で10-7Scm-1オーダーの導電率を示すことがわかった。有機溶媒を用いたウェットミリングでは、トルエンを溶媒に用いた場合について検討した。ボールサイズが4mmφ、トルエンの重量比が硫化物ガラスに対して5倍としてウェットミリングした場合、得られたスラリーからトルエンを除去すると、一次粒径13μm、二次粒径約10μmの硫化物ガラスが得られることがわかった。一方、リチウム含量の大きいリチウムイオン伝導性硫化物ガラスに関して、溶解可能な溶媒を探索したところ、Nメチルホルムアミドに溶解することを見出した。この溶液を基板に塗布し、150°Cで真空乾燥すると、結晶が析出することがわかった。得られた結晶は、約1×10-5 Scm-1を示し、基板の上に膜として形成可能であることも確認した。このコートされた活物質を用いて全固体電池を構築したところ、良好な作動特性を示すことが確認できた。この年度は、P2S5とブチルリチウムを出発原料とした硫化物系リチウム塩の液相合成、リチウムイオン伝導性硫化物ガラスの有機溶媒を用いたウェットミリングによるリチウムイオン伝導性硫化物スラリーの作製、さらに、リチウムイオン伝導性硫化物ガラスの溶媒への溶解・再析出によるリチウムイオン伝導性硫化物の作製について検討した。得られた固体は混合物であり、分離・精製には至っていないが、真空乾燥後に固体は、室温で10-7Scm-1オーダーの導電率を示すことがわかった。ウェットミリングに用いるトルエンの量、ミリング用ボールのサイズなどについて検討を行った。その結果、ボールサイズが4mmφ、トルエンの重量比が硫化物ガラスに対して5倍としてウェットミリングした場合、得られたスラリーからトルエンを除去すると、一次粒径13μm、二次粒径約10μmの硫化物ガラスが得られることがわかった。得られたスラリーを基板に塗布し、乾燥することにより、リチウムイオン伝導性硫化物の膜が形成できることも確認した。さらに、リチウム含量の大きいリチウムイオン伝導性硫化物ガラスに関して、溶解可能な溶媒を探索したところ、Nメチルホルムアミドに溶解することを見出した。いずれの系についても、溶液系から膜を形成できることを確認しているが、分離・精製、あるいは単相化などには至っていない。このような検討を優先したために、電気化学的評価が十分には行えていないので、「やや遅れている」と判断した。リチウムイオン伝導性を有機溶媒に溶解して溶液系とし、塗布後乾燥することによって膜を得る系が、リチウムイオン伝導性硫化物薄膜を得る手法として、非常に有効であるのではないかと考えている。したがって、今後は、この手法を中心に検討を進める。ガラス組成や溶媒の種類、溶解・乾燥方法が、析出してくる結晶相に与える影響について詳しく検討を行い、よりリチウムイオン伝導性の高い膜を得ることを目指す。さらに、電気化学的評価を詳細に行う。硫化物系リチウム塩の合成については、さらに様々な出発原料について検討を進める。

23年度は分離精製、単相を得ることに時間を費やしたので、電気化学評価が十分できなかったために、次年度に使用することになった研究費が発生した。24年度は電気化学的評価を積極的に行うために、多くの試料を合成するため、そのための高純度試薬、また、電気化学的評価のための電極材料などで物品費を使用する。また、23年度は一度も学会発表等を行わなかったために、これも次年度使用する研究費の発生の原因となった。24年度は本研究内容に関して学会等でも発表することを予定しており、国内旅費も使用する予定である。
肺胞微石症に対する分子機構の解明と臨床応用可能な治療法の開発

肺胞微石症はSLC34A2遺伝子変異が原因で肺胞内にリン酸カルシウム結石を生じる希少肺疾患である。日本は世界で最多の症例報告があるが現在まで有効な治療法はなく、その開発が急務である。申請者は、同疾患モデルマウスを作製して病態解析を行ない、低リン食治療が進行抑制・病勢の改善に寄与することを明らかにした。一方で、低リン食治療は軽微ながら栄養障害が原因と考えられる体重減少の副作用を認めたことから、臨床応用へはさらなる改善が望まれる。また肺胞マクロファージが微石除去に関与することが明らかになりつつあるが、その役割についてはまだ不明な点が多い。そのため本研究申請では、これまでの研究をさらに発展させ、低リン食治療とリン吸着剤の併用法の治療効果と副作用について検討し、さらに肺胞マクロファージの機能解析を進め肺胞微石症の病態を分子・細胞レベルで解明する。これまでの研究結果と合わせて新治療法を用いた臨床応用へと導く研究としたい。新たな治療法開発としてこれまで明らかになった低リン食療法を応用して、慢性腎不全に適応のあるリン吸着剤を同疾患に応用する検討をおこなっている。これまでに低リン食と同様に治療効果を認め、副作用も許容範囲内であることがわかってきた。また分子病態の解明にあたり、プロテオミクス解析・リピドミクス解析・3D顕微鏡などを駆使して、肺胞マクロファージを中心とした微石のリモデリング、脂質貯留に至るメカニズムmの解析が進行中である。現在までにマクロファージ関連因子やアラキドン酸代謝など同疾患に特徴的と思われる結果を得られており、近日中に論文化して発表する予定である。これまでの検討で治療法についてはほぼ確立できた。近年施行された全国調査の結果、本邦における肺胞微石症症例の数は10未満と非常に少なくなっており、大規模なRCTは難しい。しかし、米国シンシナティ大学やシンシナティ小児病院を中心としたRare lung disease Consortiumが症例の集積を進めており、同大Frank Macormack教授のグループと共に、臨床治験へとステージを進めたい。また、分子病態の解明は先進的技術であるプロテオミクス解析やリピドミクス解析を駆使することで多くの事が分かってきた。特にこれまで肺胞微石症モデルマウスの肺ではPhospholipidosisと呼ばれる肺内への脂質貯留が明らかになっていたが、今回の研究の結果、肺内では微石が形成するだけでなく慢性的な炎症が生じ、特徴的な脂質メディエーターが病態形成に関与していることがわかってきた。今後はこれらオミクス解析で明らかになった分子について掘り下げて検討することで、肺胞微石症の分子病態を解明したい。効率的な物品調達をおこなったため。次年度に予定していた国際学会や物品調達に次年度使用額を使用する予定である。
核融合炉材料開発

核融合炉材料は、その表面に被覆を施すことにより、トリチウム透過防止障壁、腐食防止、MHD絶縁などの機能を付加する事が可能になる。本研究では、核融合科学研究所、東京大学、マックスプランクプラズマ物理研究所の協力で、大面積、高速度でトリチウム透過防止障壁被覆および柵絶縁被覆を行う手法を開発し、核融合ブランケット構造材料での適用性の評価を行うことを目的とした。平成13年度は核融合科学研究所で試作開発した高純度低放射化バナジウム合金(NIFS-HEAT-2)の上に、トリチウム透過障壁用窒化アルミニウム被覆をマックスプランクプラズマ物理研究所のアークプラズマ成膜装置を用いて行った。この被覆は酸素不純物の抑制により被覆強度が向上することが明らかになった。平成14年度は液体リチウムとの両立性に優れる酸化物絶縁体であるEr203の被覆を行ない、形成速度が最大になるように、最適条件を見出した。平成15年度はEr203の被覆を中心に、構造とリチウム耐食性をマックスプランクプラズマ物理研究所、東京大学、核融合科学研究所で評した。その結果、成膜時の基板温度を500°C以上に上げると、得られた被覆の結晶性が高く、500°Cでリチウム浸漬しても腐食はほとんど見られなかった。また、基板温度が室温でも成膜後600°Cでアニールすると同様な結晶性とリチウム耐食性を示した。一方、基板温度が室温のままでは、結晶性が低く500°C液体リチウム浸漬で大きな腐食が生じる事が分かった。このように高温基板温度あるいはアニールによる結晶化が重要である事が分かった。平成16年度は本手法による被覆を皿型のバナジウム合金試料に施し、液体リチウム接触状態での絶縁性の連続測定を行い、ピット孔食の絶縁低下に及ぼす効果を明らかにした。平成17年度はこれらの成果のとりまとめを進めている。核融合炉材料は、その表面に被覆を施すことにより機能を高めることが検討されている。必要な機能はブランケットの形式により様々であるが、トリチウム透過防止障壁、腐食防止、MHD絶縁被覆などがある。本研究では、核融合科学研究所、東京大学、マックスプランクプラズマ物理研究所の協力で、大面積、高速度でトリチウム透過防止障壁被覆およびMHD絶縁被覆を行う手法を開発し、核融合ブランケット構造材料での適用性の評価を行うことを目的とした。核融合科学研究所で開発製作した高純度低放射化バナジウム合金(NIFS-HEAT-2)の上に、トリチウム透過障壁用酸化アルミニウム被覆をマックスプランクプラズマ物理研究所のアークスパッタ成膜装置を用いて行った。成膜においては、アルミニウムと酸素の元素比が化学量論値から外れない様、最適条件を見出した。得られた被覆材を東京大学において、溶融塩Flibe中に浸漬し、安定性を確かめた。さらに、同じ装置を持いて、NIFS-HEAT-2の表面にMHD圧力損失低減用窒化アルミニウム被覆を試みた。窒化アルミニウムが充分な電気絶縁性を有するには、窒素とアルミニウムの元素比を化学量論値から外さない事と、酸素不純物を極力低減することが重要である。本研究では、装置でその前に用いていた酸化物の影響などで、酸素のの混入が抑えられずまた窒素とアルミニウム比の調整も充分でなく、必要な絶縁性能が得られなかった。今後は、被覆条件と被覆雰囲気を調整し、絶縁皮膜の製作手法の高度化と、得られた窒化アルミニウム被覆の液体リチウムにおける安定性を明らかにして行く予定である。

本研究では、核融合科学研究所、東京大学、マックスプランクプラズマ物理研究所の協力で、大面積、高速度でトリチウム透過防止障壁被覆およびMHD絶縁被覆を行う手法を開発し、核融合ブランケット構造材料での適用性の評価を行うことを目的とした。昨年度は核融合科学研究所で開発製作した高純度低放射化バナジウム合金(NIFS-HEAT-2)の上に、トリチウム透過障壁用酸化アルミニウム被覆をマックスプランクプラズマ物理研究所のアークスパッタ成膜装置を用いて行ったが、本年度は酸化物絶縁体であるEr2O3の被覆を行なった。成膜においては、形成速度が最大になるように、最適条件を見出した。得られた被覆材をマックスプランクプラズマ物理研究所、東京大学、核融合科学研究所で評価した。その結果、Er、O以外の不純物がほとんど存在しないこと、バルクと同じ結晶性を有することなどが明らかになった。また、東京大学に置いて、RFスパッタ装置を用いて、Er2O3被覆の製作を行ない、製作法による構造の違いを比較した。これらの被覆の絶縁性、液体Li中の安定性、温度サイクルによる健全性を評価し、500°C付近までの安定な特性を確認した。今後より高温までの特性の確認と海面構造、皮膜内微細構造の評価を行なう予定である。核融合炉材料は、その表面に被覆を施すことにより、トリチウム透過防止障壁、腐食防止、MHD絶縁などの機能を付加する事が可能になる。平成13年度は核融合科学研究所で開発製作した高純度低放射化バナジウム合金(NIFS-HEAT-2)の上に、トリチウム透過障壁用酸化アルミニウム被覆をマックスプランクプラズマ物理研究所のアークプラズマ成膜装置を用いて行い、平成14年度は酸化物絶縁体であるEr203の被覆を行ない、形成速度が最大になるように、最適条件を見出した。平成15年度はEr203の被覆を中心に、構造とリチウム耐食性をマックスプランクプラズマ物理研究所、東京大学、核融合科学研究所で評価した。その結果、成膜時の基板温度を500°C以上に上げると、得られた被覆の結晶性が高く、500°Cでリチウム浸漬しても腐食はほとんど見られなかった。また、基板温度が室温でも成膜後600°Cでアニールすると同様な結晶性とリチウム耐食性を示した。一方、基板温度が室温のままでは、結晶性が低く500°C液体リチウム浸漬で大きな腐食が生じる事が分かった。このように高温基板温度あるいはアニールによる結晶化が重要である事が分かった。しかし、基板温度が高温でも膜厚が数ミクロンになると、昇温、冷却の繰り返しで膜が剥離する事が分かり、温度変動に対しての安定性を保つためには、被覆厚さを大きくしないほうが良いことが明かになった。
クローン動物作出のための移植核リプログラミング因子の同定と解析

分化した細胞核を移植するクローン動物作出では、正常な初期胚発生を行うには、発生過程に必要な遺伝子群が発現する状態にならなければならない。このような遺伝子発現の多様性を取り戻すためのリプログラミング因子を同定することは、クローン動物を効率よく作出するために重要と考えられる。正常の初期胚発生過程においてDNAメチル化パターンが大きく変化することが報告されており、我々はリプログラミング因子の一つとして、脱メチル化修飾を行う遺伝子の存在を想定した。本研究では脱メチル化遺伝子を最終的に単離する目的で、DNAメチル化パターンの異なる4細胞期胚と桑実期胚からRNAを分離し、サブトラクション法を用いて発現差異を示す遺伝子の網羅的探索を行った。337個の4細胞期胚、214個の桑実期胚からIsogenを用いてtotal RNAを抽出した。抽出されたtotal RNAは各サンプル共に50ng以下と微量ではあったが、このRNAを鋳型としてSMART PCR cDNA Synthesis Kitを用い、cDNAの合成、増幅を行った。4細胞期胚、桑実期胚から合成されたcDNAをそれぞれTester cDNA、Driver cDNAとしてPCR-Select cDNA Subtraction Kitを使用してサブトラクションを行った。特異的に発現するcDNAを選択的に増幅するために、1st、2nd PCRを行うことにより400bp長を中心としたPCR産物が得られ、これらをTAクローニングベクターに挿入しサブトラクションcDNAライブラリーの作成に成功した。現在までランダムに48個のクローンを選定し解析を行った結果、200bp長以上のインサートを含むクローン(14個)において新規の遺伝子は確認されていないが、本研究により作成されたcDNAライブラリーは新規遺伝子探索の基礎になるものと考えられた。体細胞が核移植により遺伝子発現の多様性を取り戻し、初期胚発生を再開できるようになるには遺伝子のリプログラミングが必要である。我々はこのリプログラミングを担う因子の一つとして、ゲノムDNA上のメチルCpGを脱メチル化するdemethylaseの存在を仮定した。初期発生過程において、精子および卵子の両配偶子由来の一部の遺伝子は、4細胞期胚から8細胞期胚にかけてCpGの脱メチル化がおこり、後期桑実胚から胚盤胞の時期にかけて再度メチル化されることが知られている。そこで我々はdemethylaseは初期発生過程において発現時期に差異があると考え、4細胞期胚と桑実胚からmRNAを抽出し、サブトラクション法を用いてdemethylaseを含む新規遺伝子の網羅的探索を計画した。5週齢のBDF1雌マウスにPMSGを5単位腹腔内に注射し、さらに48時間後にhCG5単位を同様に注射することにより過排卵誘発を施し、BDF1雄マウスと交配させた。hCG投与後52時間後に卵管から4細胞期胚を回収し、また桑実胚はhCG投与後70時間後に卵管および子宮より還流法により回収した。回収された初期胚は、mRNA抽出する目的の数に達するまでマイナス80°Cのフリーザーで保存した。現在4細胞期胚は337個、桑実胚は89個回収されている。今後はさらに桑実胚の回収を行い合計桑実胚数が300400個に達した時点でmRNAを抽出しサブトラクション法を行う予定である。
バースト短波帯加熱による高品質殺菌技術の開発

今年度は、バースト短波帯水中加熱装置の試作と試作した装置による殺菌効果の検証を行った。27MHzの短波帯電源の出力を1kHzの周波数、任意のパルス幅でオンオフすることにより0%100%のバースト短波帯交流を作成し、オシロスコープで生成された波形を確認した。得られたバースト短波帯交流は整合器を介して、以下の水槽の平行平板電極に給電した。水槽はコの字型のポリカーボネート製壁面を両側から2枚のチタン電極板で挟み込む形で構成し、水槽内に満たした水道水は外部の恒温槽を循環することで、任意の温度に加熱される。0.2%濃度の食塩水300mLをモデル食品とし、大腸菌培養液1mL添加したものを試料とした。試料および光ファイバー温度計のプローブをプラスチックバックに投入し真空包装したものを上記の水槽内の水道水に浸漬した。両平行平板電極に各種のバースト短波帯を印加し、試料を加熱し、試料内の温度が所定の温度に到達後、直ちに試料を水槽から取り出し、氷水で室温以下まで冷却した。試料の温度履歴と短波帯印加前後の大腸菌の菌数をカウントした。1kWの短波帯交流を99秒印加して試料を65°Cまで昇温させたものと、2kWの50%バースト短波帯交流を98秒印加して試料を65°Cまで昇温させたもので残存大腸菌を比較したところ、短波帯交流は4対数、バースト短波帯交流は7対数減少したことが分かった。今年度は、当初の計画通り、バースト短波帯加熱装置の開発および殺菌の基礎実験を実施し、予想通りの成果が得られている。次年度は、短波帯のパワーメーターを導入し、食品に印加される電圧、電流、電力を正確に測定する。これにより、バースト短波帯が微生物に与える電界効果を明らかにする。また、バースト短波を液体食品の連続処理を可能とする電極を開発し、試験に供する。2年目に、50万円以上の短波帯のパワーメーターを購入する予定となっており、その他、実験に必要な消耗品等を購入する資金が不足することが予想されたため、1年目の助成金を繰り越すこととした。
植物の恒温性を支配する負の活性化エネルギーに関する研究

本研究は、ザゼンソウ等の恒温性を有する発熱植物を対象に、その体温調節を支配するメカニズムを明らかにすることを目的にしている。恒温性を有する哺乳動物における体温調節は交感神経系を介して行われていることが明らかにされているが、神経系を有さない植物がいかなる原理・メカニズムに基づいてその体温を制御しているかという問題は、生物学における未解明の大問題である。本研究においては、植物の呼吸調節に関わる活性化エネルギーに着目し、植物の恒温性が温度に依存した活性化エネルギーの変動により達成されている可能性を追求する。本年度においては、ザゼンソウ肉穂花序におけるメタボローム解析により、温度により特異的に変動する代謝経路の探索を試みた。さらに、次世代シーケンサーにより得られた遺伝子解析データについて詳細な解析を開始し、熱制御に関与すると予想される遺伝子群の絞り込みを行った。興味深いことに、ザゼンソウの熱産生に密接に関与していると考えられるシアン耐性呼吸酵素(AOX)よりも高レベルで発現している遺伝子が少なくとも2種類存在することが判明した。これらの遺伝子群は従来植物の熱産生と関連付けて検討されたことがなく、今後より詳細な解析が必要である。一方、発熱組織におけるレドックス制御について特にミトコンドリア型チオレドキシンをターゲットとした解析を行った。その結果AOXの還元反応を触媒するチオレドキシンの同定と機能解析に成功し、得られた成果を原著論文として発表した。これらの成果は、負の活性化エネルギーにより制御されるザゼンソウの恒温性メカニズムの基盤をなす知見である。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。当該年度においては、フィールドにおけるザゼンソウ肉穂花序の温度データを用いた詳細な解析を行った。具体的には、肉穂花序温度を複数の温度に固定した条件でその呼吸活性を測定した一連の結果を修正アレニウスモデルにより解析し、全活性化エネルギー(Eo)の算出に成功した。さらに、ザゼンソウ肉穂花序由来のミトコンドリアを用いた呼吸解析においてもEo値の算出が可能であることが判明した。特に、ミトコンドリア呼吸解析から、ミトコンドリアにおけるイソクエン酸脱水素酵素が触媒する吸熱反応がザゼンソウの恒温性に関与していることが示された。従来の発熱制御は熱産生レベルの調節に研究の主眼が置かれていたが、本知見は、恒温植物の熱制御が発熱反応のみならず、吸熱反応も機能を有することを示しており、重要な発見である。得られた結果を基に、ザゼンソウの呼吸制御メカニズムを考察し、負の活性化エネルギーが産生されるシステムをモデル化することができた。また、ハス花托における呼吸データについても同様の解析を行い、Eo値と温度との関連性を明確にすることができた。興味深いことに、非発熱植物から得られた温度と呼吸速度に関するデータを用いた同様の解析においては負の活性化エネルギーが生じることはなく、負の活性化エネルギーが産生されるメカニズムは恒温植物において特徴的なものであることが推察された。ザゼンソウに関する解析結果については、原著論文として投稿し、審査の上、アクセプトされ、公表することができた。当初計画どおりに解析が進み、ザゼンソウから得られた結果については原著論文として発表することができた。従って、これまでの研究進捗状況はおおむね順調であると考えている。恒温性を有する哺乳動物における体温調節は交感神経系を介して行われていることが明らかにされているが、神経系を有さない植物がいかなる原理・メカニズムに基づいてその体温を制御しているかという点の解明が本研究の目的である。これまでの熱力学的解析から細胞内代謝の化学平衡点の温度によるシフトが恒温植物の温度調節メカニズムに関連していることが示唆されていたが、本年度においては、ザゼンソウ肉穂花序において、異なる温度において呼吸に関する平衡反応を形成させた状態のサンプルを用い、その代謝変動に関わるメタボロームおよびトランスクリプトーム解析に着手した。トランスクリプトーム解析については、新学術領域研究「学術研究支援基盤形成・先進ゲノム支援」の支援を受け、次世代シーケンサーを用いたRNA-seqデータの解析を行い、一部の遺伝子において温度依存的な発現変化が観察されることが判明した。また、メタボローム解析を行った結果、特異な代謝経路に関わるメタボライトの変動が温度と関係していることが明らかとなった。本年度の解析により得られた結果は、温度による細胞内化学平衡の移動を説明しうる、研究開始当初は予期していなかった知見を含んでいた。得られた結果に基づき、問題とする代謝経路を構成する遺伝子群のクローニングを行い、塩基配列の決定を完了した。さらにクローン化した遺伝子を大腸菌における発現ベクターに組み込み、タンパク質の発現系の構築を行った。異なる温度において反応を平衡化した肉穂花序を用いたトランスクリプトームおよびメタボローム解析が予定どおり進展している。

恒温性を有する哺乳動物における体温調節は交感神経系を介して行われていることが明らかにされているが、神経系を有さない植物がいかなる原理・メカニズムに基づいてその体温を制御しているかという問題は、生物学における未解明の大問題である。本研究においては、植物の呼吸調節に関わる活性化エネルギーに着目し、植物の恒温性が温度に依存した活性化エネルギーの変動により達成されている可能性を追求する。本年度においては、ザゼンソウ肉穂花序におけるメタボローム解析により、温度により特異的に変動する代謝経路の探索を試みた。さらに、次世代シーケンサーにより得られた遺伝子解析データについて詳細な解析を開始し、熱制御に関与すると予想される遺伝子群の絞り込みを行った。興味深いことに、ザゼンソウの熱産生に密接に関与していると考えられるシアン耐性呼吸酵素(AOX)よりも高レベルで発現している遺伝子が少なくとも2種類存在することが判明した。これらの遺伝子群は従来植物の熱産生と関連付けて検討されたことがなく、今後より詳細な解析が必要である。一方、発熱組織におけるレドックス制御について特にミトコンドリア型チオレドキシンをターゲットとした解析を行った。その結果AOXの還元反応を触媒するチオレドキシンの同定と機能解析に成功し、得られた成果を原著論文として発表した。これらの成果は、負の活性化エネルギーにより制御されるザゼンソウの恒温性メカニズムの基盤をなす知見である。次年度以降の研究においては、負の活性化エネルギーが生じるより詳細な分子メカニズムを明らかにして行きたいと考えている。特に、メタボローム解析やトランスクリプトーム解析のデータなども取り入れることが有用であると考えている。現在までにドライ解析から得られているデータを基に、より詳細な統計解析を進めることが論文化のために重要である。また、ウェット解析については、問題とする代謝経路の温度応答を試験管内で再現できる実験系の構築が必要であると考えており、関連する実験を推進する予定である。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
我が国における降雨の時空間分布の経年変化の検証

平成16年度には,手法の提案と試算を,平成17年度にはその手法の適用を行なった.時間的集中度については,都市化の進んでいる都市と進んでいない都市との比較という観点から県庁所在地の人口密度の上位10都市(東京特別区および大阪,横浜,など)と下位10都市(佐賀,長野,静岡など)の計20都市を対象とし,各都市における地上気象観測所の19762003年の8月の時間降水量を抽出した.一雨(降水量が観測されてから降水量が0mmになるまで)を全て抜き出し,一雨総雨量,一雨中の時間最大降水量,降雨の継続時間,時間的集中度,のそれぞれについて,経年変化を線形と仮定し,得られた線形トレンドの有意性検定により,経年変化の有無とその程度を調べた.その結果,経年変化が5%または1%有意と検定されたのは,時間最大降水量の増加傾向として東京,横浜,さいたま,千葉,鳥取の5地点,継続時間の増加傾向として大阪,総雨量の増加傾向として福岡,であった.すなわち,人口密度の上位10都市のうち4都市で時間降水量が年々大きくなっていることが示された.しかし,本研究の主眼である雨の降り方を表す時間的集中度については,有意な経年変化は認められなかった.また,空間分布ついては東京および岐阜のアメダス観測点の8月の時間降水量を用いて,降雨が空間的にばらついている程度の経年変化を求めたが,経年変化は減少傾向(空間的に集中傾向)ではあったものの有意とはならなかった.なお,降雨の時空間分布を検証するのに従来より用いられているDAD解析におけるDA関係と,レーダーアメダスを用いた本研究で提案した手法を比較したところ,両者は同様の傾向を示すことが分かった.平成16年度には,手法の提案と試算を,平成17年度にはその手法の適用を行なった.時間的集中度については,都市化の進んでいる都市と進んでいない都市との比較という観点から県庁所在地の人口密度の上位10都市(東京特別区および大阪,横浜,など)と下位10都市(佐賀,長野,静岡など)の計20都市を対象とし,各都市における地上気象観測所の19762003年の8月の時間降水量を抽出した.一雨(降水量が観測されてから降水量が0mmになるまで)を全て抜き出し,一雨総雨量,一雨中の時間最大降水量,降雨の継続時間,時間的集中度,のそれぞれについて,経年変化を線形と仮定し,得られた線形トレンドの有意性検定により,経年変化の有無とその程度を調べた.その結果,経年変化が5%または1%有意と検定されたのは,時間最大降水量の増加傾向として東京,横浜,さいたま,千葉,鳥取の5地点,継続時間の増加傾向として大阪,総雨量の増加傾向として福岡,であった.すなわち,人口密度の上位10都市のうち4都市で時間降水量が年々大きくなっていることが示された.しかし,本研究の主眼である雨の降り方を表す時間的集中度については,有意な経年変化は認められなかった.また,空間分布ついては東京および岐阜のアメダス観測点の8月の時間降水量を用いて,降雨が空間的にばらついている程度の経年変化を求めたが,経年変化は減少傾向(空間的に集中傾向)ではあったものの有意とはならなかった.なお,降雨の時空間分布を検証するのに従来より用いられているDAD解析におけるDA関係と,レーダーアメダスを用いた本研究で提案した手法を比較したところ,両者は同様の傾向を示すことが分かった.降雨の時空間分布ともに,1時間降水量を基礎資料として用いることとし,時間分布の場合はアメダス観測値,空間分布の場合はレーダーアメダス解析雨量,によりデータを入手した。対象降雨は時空間的に集中した降雨が多いとされている8月の全ての雨とし,時間分布の場合は19762003年の28年間を,空間分布の場合はレーダーアメダスの観測期間が5kmメッシュで行なわれた19952000年の6年間である。また,対象地点は時空間的に集中する雨が降るようになってきているといわれている東京,比較対象として岐阜,青森などである。レーダーアメダス解析雨量データを対象に,降雨の空間的な集中の程度を表す指標である空間的な分散(値が小さいほど空間的に集中している)を求め地域間の比較をしたところ、東京は岐阜と比べると空間的な分散が小さく空間的に集中して強い雨が降っていることが示された。しかし、大阪・名古屋では東京の様に降雨が空間的に集中している傾向は見られなかった。また,雨域(雨が降っている範囲)の広さについても,東京では雨域が狭い雨が多い傾向がみられたが,大阪,名古屋では特にそのような傾向はみられなかった。また,降雨の時間的な集中の程度を表す指標である時間的な分散については、アメダス観測値を対象に経年変化を調べたが,東京を含むいずれの地点も明確な減少(降雨が時間的に集中)傾向はみられなかった。17年度は,アメダス観測値を用いて降雨の空間的な集中の程度を表現することで,空間分布についても経年変化を調べると共に,時間分布の経年変化についても対象地点を増やして検証していく予定である。

時間的集中度については,都市化の進んでいる都市と進んでいない都市との比較という観点から県庁所在地の人口密度の上位10都市(東京特別区および大阪,横浜,那覇,名古屋,さいたま,福岡,千葉,神戸,熊本の各市)と下位10都市(佐賀,長野,静岡,福島,青森,松江,秋田,富山,鳥取,山口の各市)の計20都市を対象とし,各都市における地上気象観測所の19762003年の8月の時間降水量を抽出した.20都市の内,富山については降水量の欠測が多く検討対象から除外した.一雨(降水量が観測されてから降水量が0mmになるまで)を全て抜き出し,一雨総雨量,一雨中の時間最大降水量,降雨の継続時間,時間的集中度,のそれぞれについて,経年変化を線形と仮定し,得られた線形トレンドの有意性検定により,経年変化の有無とその程度を調べた.その結果,経年変化が5%または1%有意と検定されたのは,時間最大降水量の増加傾向として東京,横浜,さいたま,千葉,鳥取の5地点,継続時間の増加傾向として大阪,総雨量の増加傾向として福岡,であった.すなわち,人口密度の上位10都市のうち4都市で時間降水量が年々大きくなっていることが示された.しかし,本研究の主眼である雨の降り方を表す時間的集中度については,いずれの都市においても有意な経年変化は認められなかった.8月の全ての降雨を対象としたことに原因があるかもしれない.また,空間分布については東京および岐阜のアメダス観測点の8月の時間降水量を用いて,降雨が空間的にばらついている程度の経年変化を求めたが,経年変化は減少傾向(空間的に集中傾向)ではあったものの有意とはならなかった.なお,降雨の時空間分布を検証するのに従来より用いられているDAD解析におけるDA関係と,レーダーアメダスを用いた本研究で提案した手法を比較したところ,両者は同様の傾向を示すことが分かった.
ビーズテクノロジーを用いた脂質結合タンパク質の網羅的解析

近年脂質ラフトが注目を集めている。この脂質ラフトにはシグナル伝達に関与する膜タンパク質が集積するとされているが、実際にどのタンパク質がラフトに集積しているのかについての報告は多くなく、さらには脂質分子と膜タンパク質間の相互作用についは不明な点が多い。そこで本研究では、ビーズ上にラフトなどの脂質膜表面を再現し、脂質膜に結合する膜表在性タンパク質を網羅的にプロテオーム解析することを目的とした。ラフト構成脂質であるスフィンゴミエリンと、通常のリン脂質について、アルキル鎖末端をアミノ化した誘導体を調製し、これらを半田ビーズ上にアミド結合を介して固定化した。その際、固体化法を工夫することで90%程度の高い固定化率を達成した。次に、これらのビーズに対して、マウス脳可溶化液を混合し、脂質に特異的に結合するタンパク質を回収した。その結果、スフィンゴミエリンに特異的に結合した2種類のタンパクを回収し、質量分析によってそれらを同定した。さらに、これらのタンパク質について、スフィンゴミエリンとの結合性を確認する実験を行い、そのうち1種類についてはスフィンゴミエリン特異性が高いことが明らかとなった。このタンパク質は、神経伝達物質の放出の際に重要な働きをしている1回膜貫通型の膜タンパク質であるが、脂質ラフトとの関連についてはこれまで報告がない。したがって、今回の結果は、脂質ラフトが神経伝達にも関与している可能性を示唆している。今後、このタンパク質とラフトとの関連についてさらに詳細に検討していく。25年度が最終年度であるため、記入しない。この脂質ラフトにはシグナル伝達に関与する膜タンパク質が集積するとされているが、実際にどのタンパク質がラフトに集積しているのかについての情報は多くなく、さらには脂質分子と膜タンパク質間の相互作用についは不明な点が多い。そこで本研究では、ビーズ上に脂質ラフトなどの脂質膜表面を再現し、脂質膜に結合する膜表在性タンパク質を網羅的にプロテオーム解析することを目的とする。これにより、種々の脂質を用いて脂質膜特異的な膜表在性タンパク質の解析を行い、脂質と膜タンパク質間のクロストークを明らかにする。24年度は、ラフト構成脂質であるスフィンゴミエリンと、通常のリン脂質について、アルキル鎖末端をアミノ化した誘導体を調製した。これらを、磁気ビーズ上にアミド結合を介して固定化し、極めて高い固定化率を達成した。当初の24年度研究計画では、スフィンゴミエリン特異的な膜タンパク質の回収までを行う予定であった。しかし、予想以上に研究が順調に進行し、膜タンパク質の同定、さらには脂質との相互作用解析までを行うことができた。また、得られたタンパク質については(具体名は控えます)、これまで脂質ラフトとの相互作用は報告されていないが、機能的に興味深いタンパク質である。これが実際に脂質ラフトを認識すると、脂質ラフトの生理的役割に新たな機能を付与できると期待され、今後の解析に興味が持たれる。以上、研究の進捗、並びに得られた結果ともに当初の予想を上回るものであった。まずは、これまで順調に研究が進行していることから、従来の方策で今後も研究を展開する。具体的には、上述の今回得られたタンパク質に蛍光標識を導入し、このタンパク質がラフトに集積する様子を顕微鏡などで観察し、さらに機能面での解析も行う。また、マウス脳以外のタンパク質ソースを用いてさらなるスフィンゴミエリン特異的タンパク質の探索を継続する。

また、スフィンゴミエリン以外の脂質、例えばスフィンゴ糖脂質やコレステロールなどもビーズに固定化し、それらに特異的なタンパク質の取得も目指す。生体膜は生命現象の根幹をなす極めて重要な部分であるが、「なぜ生物は多様な脂質を持つのか」、「それぞれの脂質分子はどのような機能を持っているのか」といった簡単な疑問にも答えることができない。今後の研究により脂質とタンパク質間の特異的相互作用を明らかにし、生体膜が関与する生命現象の解明へとつなげていきたい。25年度が最終年度であるため、記入しない。
捕乳動物細胞における二本鎖RNAが誘導するDNAメチル化機構の解明

RNAi(RNA干渉)は、二本鎖RNAが誘導する配列特異的な遺伝子サイレンシングである。この現象は、はじめに線虫で発見されたが、その後、植物やショウジョウバエ、哺乳動物でも起こることが明らかになってきた。このRNAiにおいて21-25塩基の短いRNA (siRNA)は、細胞質で実行蛋白質(RISC)と複合体を形成して配列特異的にmRNAを切断する。一方で植物では、遺伝子プロモーターに存在しているCpG配列を標的とした二本鎖RNAは、DNAメチル化を誘導してその遺伝子の発現を転写レベルにおいて抑制することが知られていた。しかし、哺乳動物細胞では、そのような機構が存在するかは不明であった。最近我々とアメリカのグループは、ヒト細胞においてCpG配列を標的とした二本鎖RNAがDNAメチル化を誘導することを見出した(Kawasaki and Taira, Nature, 2004 ; Morris et al., Science, 2004)。この発見は、生物学的に興味深いだけでなく人為的に特定の遺伝子発現を転写レベルで制御できる可能性を示唆すると考えられる。しかしながら哺乳動物細胞における二本鎖RNAによるDNAメチル化現象は、その機能や役割について不明な点が多い。本研究ではこの二本鎖RNAによるメチル化現象の機能解明を行うことを目的とした。はじめに特定遺伝子のプロモーター領域を標的とした二本鎖RNA(2127塩基)を設計して合成二本鎖RNAを作製した。次に二本鎖RNAによるDNAメチレーション誘導について、二本鎖RNAの標的とする配列の違いによるメチル化の効率をメチレーション特異的PCRによって検討した。その結果、二本鎖RNA(2127塩基)は、効果的にDNAメチレーションを誘導することがわかった。特にCpG配列を多く含む配列を標的とした二本鎖RNAがDNAメチレーション効果的に誘導した。またRNAiはヘテロクロマチンサイレンシングに関わることが最近報告されている。ヘテロクロマチンサイレンシングはヒストンH3のリシンのメチル化が観察されることが知られている。そこでこれらの二本鎖RNAがヒストンH3メチル化を誘導するかについてCHIP法を用いて検討した。その結果、二本鎖RNAを標的とした領域にヒストンH3メチル化が誘導されることがわかった。これらのことから、二本鎖RNAはDNAとヒストンの両方をメチル化に関わることが示唆された。