hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
がん関連遺伝子の発現と放射線感受性の関連およびその癌治療への応用の可能性

1.がん関連遺伝子発現を調べるための幾つかのマウス細胞株について、in vitroおよびin vivo放射線感受性を調べ、比較した。5種類の株のうちEMT-6株が最も放射線抵抗性(Do=2.5Gy)であった。他の株の感受性はFSa-II株ではDo=1.8Gy、3LL、FM3A、およびSCCVII株ではDo=1.3-1.4Gyであった。マウス移植腫瘍3LLとSCCVIIにおける30Gy照射後の腫瘍増殖遅延は同等であり、in vivoの感受性はin vitroの放射線感受性の程度と対応していた。2.がん関連遺伝子としてc-mycとR-rasの細胞内発現をノーザンハイブリダイゼシ-ョンにより調べた。in vitro培養された細胞において、c-mycの発現は見られたが、R-rasの発現は検出できなかった。c-mycの発現量の多さは、細胞のin vitro放射線感受性と一致しなかった。H-ras、c-fos、p53について検索するためDNAプローブの作成を行った。これらがん関連遺伝子の発現の解析は今後の課題である。3.正常およびSV40大型T抗原形質転換ケラチノサイトのin vitro放射線感受性を調べた。正常ケラチノサイトに比べ形質転換した細胞は放射線感受性が高く、正常細胞Do=1.3Gy、形質転換細胞Do=1.2Gyであった。用いた形質転換細胞では野生型p53の発現が抑制されている。最近の研究では、野生型p53は放射線照射後の細胞をG1期で休止させDNA損傷の回復に寄与するとの考えが提案されている。今回の結果はこの考えと矛盾しない。今回の研究では、腫瘍の放射線感受性を予測するがん関連遺伝子を特定することはできなかった。腫瘍細胞におけるがん関連遺伝子のなかで、野生型p53の役割の解明が期待される。平成4年度はin vitro細胞株の放射線感受性と,それら細胞株におけるがん関連遺伝子の発現を調べた。マウス腫瘍由来細胞株EMT6,FM3AおよびFSa-IIを調べた。FSa-IIが最も放射線抵抗性であった。がん関連遺伝子の発現を知るため細胞内mRNAをノーザンブロッティング法を用いて解析した。EMT6細胞およびFM3A細胞においてrasおよびmyc遺伝子の発現を確認した。FSa-II細胞ではrasの発現量が,他の2種の細胞株に比べ多いことは確認できなかった。放射線抵抗性と関連するような明確な種類のがん関連遺伝子とその発現は現在のところ不明である。遺伝子発現量の定量化について検討する必要があるかもしれない。上記以外のがん関連遺伝子として,fosおよびrafに関してその発現を検索しているが,再現性に問題があり定量的な議論をするには至っていない。またヒト腫瘍株(HeLa,KB株)についても上記4種のがん関連遺伝子の検索を開始した。固形腫瘍においても放射線感受性とがん関連遺伝子との関連を知るためマウス腫瘍SCCVIIの放射線感受性をin vivo-in vitroコロニー法で決定した。この腫瘍内でのがん関連遺伝子の発現を知るため抗体を利用したABC組織染色法を用いて免疫組織学的に検討した。SCCVII腫瘍においてras遺伝子の発現がみられた。SCCVII腫瘍に比べ放射線感受性の異るルイス肺癌腫瘍の性質について検索が開始された。今年度は新たにルイス肺癌由来マウス実験腫瘍細胞株の放射腺感受性を調べ、またがん関連遺伝子の発現を調べた。細胞内がん関連遺伝子mRNA量をノーザンハイブリダイゼーション法を用いて解析した。3LLでmycの発現を確認したが、SCCVII細胞では発現が確認できなかった。SCCVIIではconstitutiveな発現が少ないか、あるいは他の原因があるのか検討している。

myc発現量と放射線感受性との相関は見い出していない。またrasについても現在まで明確な相関は見出していない。fos、raf、およびmosについてはそのプローブDNAに問題があるようで、新たにDNAを増殖、精製し直した。これを用いて解析を始めた。表皮ケラチノサイトにrasを導入し形質転換細胞を造ることを試みた。電気パルス法およびリポフェクション法を用い、ras遺伝子を導入できたと考えられる細胞が得られ、この細胞内でのras発現の確認と放射線感受性について検討を始めた。2種類のマウス腫瘍SCCVIIおよび3LLについて放射線治療前のマウス腫瘍(SCC-VII、3LL)内rasとp53の発現をABC染色法を用い検索を開始した。両者でrasを検出できた。幾つかの細胞株で放射線感受性とがん関連遺伝子の発現を調べることができ、また遺伝子導入の方法を改善し、導入細胞を得ることができた。腫瘍・細胞内がん関連遺伝子発現に関して、情報がいまだ一部のがん関連遺伝子のみに限られている。p53遺伝子の発現を含めてfos,mos等についてさらに検討する必要があると考えている。1.がん関連遺伝子発現を調べるための幾つかのマウス細胞株について、in vitroおよびin vivo放射線感受性を調べ、比較した。5種類の株のうちEMT-6株が最も放射線抵抗性(Do=2.5Gy)であった。他の株の感受性はFSa-II株ではDo=1.8Gy、3LL、FM3A、およびSCCVII株ではDo=1.3-1.4Gyであった。マウス移植腫瘍3LLとSCCVIIにおける30Gy照射後の腫瘍増殖遅延は同等であり、in vivoの感受性はin vitroの放射線感受性の程度と対応していた。2.がん関連遺伝子としてc-mycとR-rasの細胞内発現をノーザンハイブリダイゼーションにより調べた。in vitro培養された細胞において、c-mycの発現は見られたが、R-rasの発現は検出できなかった。c-mycの発現量の多さは、細胞のin vitro放射線感受性と一致しなかった。H-ras、c-fos、p53について検索するためDNAプローブの作成を行った。これらがん関連遺伝子の発現の解析は今後の課題である。3.正常およびSV40大型T抗原形質転換ケラチノサイトのin vitro放射線感受性を調べた。正常ケラチノサイトに比べ形質転換した細胞は放射線感受性が高く、正常細胞Do=1.3Gy、形質転換細胞Do=1.2Gyであった。用いた形質転換細胞では野生型p53の発現が抑制されている。最近の研究では、野生型p53は放射線照射後の細胞をG1期で休止させDNA損傷の回復に寄与するとの考えが提案されている。今回の結果はこの考えと矛盾しない。4.今回の研究では、腫瘍の放射線感受性を予測するがん関連遺伝子を特定することはできなかった。
受精前後における遺伝子発現リプログラミングへのヒストン変異体の関与について

ヒストン変異体に着目して遺伝子発現リプログラミングのメカニズムの解明を試みることを計画した。すなわち、受精前後におけるヒストン変異体のゲノム上の配置の変化を解析し、その変化がクロマチン構造および遺伝子発現に及ぼす影響を明らかにする。さらにその変化を調節するメカニズムを解明することで遺伝子発現リプログラミングの調節機構を明らかにしていくという計画となっている。本年度は、特にヒストンH3変異体について、受精前後におけるクロマチンへの局在の変化とその発生への役割を調べた。まず、H3変異体の免疫染色を行うことに際し、H3.1とH3.2はアミノ酸が1残基しか異なっておらずこれを区別できる抗体が存在しないため、この両方を認識する抗体を用いることにした。その結果、H3.3は受精前後およびその後の初期発生過程においてほぼ一定の割合で核局在が認められたのに対し、H3.1/H3.2は受精前から受精後の1細胞期まで核内に非常に低いレベルでしか検出されなかった。その後2細胞期の中期から次第に核局在が増加していくことが分かった。ただし、検出感度を上げてさらに詳細に解析したところ、1細胞期胚ではH3.1/H3.2は雌性前核にのみ核小体付近のヘテロクロマチン領域に比較的多く局在していることが明らかとなった。次に、1細胞期でH3.1/H3.2の核局在レベルが低いことの生物学的意義を明らかにするために、H3.1、H3.2およびH3.3のcRNAを作成しこれを1細胞期胚に顕微注入した。その結果、H3.3のcRNAを顕微注入した胚は正常に胚盤胞期まで発生したが、H3.1あるいはH3.2のcRNAを顕微注入したものでは、胚盤胞期への発生率が著しく低下した。以上より、1細胞期胚の特に雄性前核のヘテロクロマチン領域においてH3.1/H3.2が低レベルであることが初期発生に重要であることが明らかとなった。本年度の計画は、研究実績の項で記したように、受精前後におけるヒストンH3変異体の局在とその発生への役割を明らかにするものであった。ヒストンH3変異体は遺伝子発現の調節に重要な役割を担っていることから、その受精前後の変化はゲノムリプログラミングのメカニズムを解明するための重要な基礎情報となるものである。そして実験の結果、H3変異体の中でH3.3のみが1細胞期胚で多く核局在しており、H3.1およびH3.2は非常に低いレベルであることが明らかとなった。この結果は、H3変異体が1細胞期における特異的な遺伝子発現に関わっている可能性を示すものであり、今後の解析により受精前後の遺伝子発現リプログラミングのメカニズムの解明が大きく進展することが期待される。したがって、本研究プロジェクトは、ここまでの結果で十分な進展があったものと考えられる。(1)1細胞期胚においてH3.1/H3.2変異体が低レベルであることの生理学的意義の解明ーとくに遺伝子発現調節への役割についてこれまでの結果より、H3.1/H3.2が1細胞期胚で核局在することにより発生停止が起こることが明らかとなったが、その原因は明らかになっていない。そこで、H3.1/H3.2のcRNAを顕微注入した胚での転写活性および遺伝子発現パターンを解析する。また、発生停止の原因が遺伝子発現の異常であるとは限らないことから、DNA複製についても解析を行う。また、受精前の卵においてもH3.1/H3.2は低レベルであることから、その生理学的意義を調べるために1細胞期胚同様にこれらのcRNAを顕微注入することでその卵形成への影響を調べる。(2)2細胞期以降にH3.1/H3.2の核局在が増加することの生理学的意義の解明2細胞期にH3.1/H3.2の核局在が増加するが、これをRNAiにより抑制することによる遺伝子発現パターンおよび発生への影響を調べる。以上の実験により、H3変異体のゲノムリプログラミングあるいは遺伝子発現リプログラミングへの関与を明らかにしていく。

その結果、H3.3のcRNAを顕微注入した胚は正常に胚盤胞期まで発生したが、H3.1あるいはH3.2のcRNAを顕微注入したものでは、胚盤胞期への発生率が著しく低下した。以上より、1細胞期胚の特に雄性前核のヘテロクロマチン領域においてH3.1/H3.2が低レベルであることが初期発生に重要であることが明らかとなった。本年度の計画は、研究実績の項で記したように、受精前後におけるヒストンH3変異体の局在とその発生への役割を明らかにするものであった。ヒストンH3変異体は遺伝子発現の調節に重要な役割を担っていることから、その受精前後の変化はゲノムリプログラミングのメカニズムを解明するための重要な基礎情報となるものである。そして実験の結果、H3変異体の中でH3.3のみが1細胞期胚で多く核局在しており、H3.1およびH3.2は非常に低いレベルであることが明らかとなった。この結果は、H3変異体が1細胞期における特異的な遺伝子発現に関わっている可能性を示すものであり、今後の解析により受精前後の遺伝子発現リプログラミングのメカニズムの解明が大きく進展することが期待される。したがって、本研究プロジェクトは、ここまでの結果で十分な進展があったものと考えられる。(1)1細胞期胚においてH3.1/H3.2変異体が低レベルであることの生理学的意義の解明ーとくに遺伝子発現調節への役割についてこれまでの結果より、H3.1/H3.2が1細胞期胚で核局在することにより発生停止が起こることが明らかとなったが、その原因は明らかになっていない。そこで、H3.1/H3.2のcRNAを顕微注入した胚での転写活性および遺伝子発現パターンを解析する。また、発生停止の原因が遺伝子発現の異常であるとは限らないことから、DNA複製についても解析を行う。また、受精前の卵においてもH3.1/H3.2は低レベルであることから、その生理学的意義を調べるために1細胞期胚同様にこれらのcRNAを顕微注入することでその卵形成への影響を調べる。(2)2細胞期以降にH3.1/H3.2の核局在が増加することの生理学的意義の解明2細胞期にH3.1/H3.2の核局在が増加するが、これをRNAiにより抑制することによる遺伝子発現パターンおよび発生への影響を調べる。以上の実験により、H3変異体のゲノムリプログラミングあるいは遺伝子発現リプログラミングへの関与を明らかにしていく。
亜硝酸還元の増強とメタン生成の低減に向けたルーメン微生物の分子制御機構の解析

野菜残渣の飼料化をはかり、食品リサイクル率の向上と飼料コストの削減を狙うと同時に、反芻家畜からのメタン生成を低減させることを最終目的として、ルーメン内微生物の亜硝酸還元能の増強に着目した。本研究期間では、高濃度の硝酸を給与した場合の反芻胃内における共生微生物生態系について解析し、Selenomonas ruminantiumという細菌のうち、特に硝酸・亜硝酸還元能を持つ菌株が増加し、反芻胃内の亜硝酸還元において主要な役割を担うことを見出した。野菜残渣の飼料化をはかり、食品リサイクル率の向上と飼料コストの削減を狙うと同時に、反芻家畜からのメタン生成を低減させることを最終目的として、ルーメン内微生物の亜硝酸還元能を増強するための研究を行った。通常飼料または高硝酸飼料をヤギに給餌した。高硝酸飼料を給餌した場合には、いずれのヤギも亜硝酸中毒を引き起こしたことから、野菜残渣などの硝酸態窒素含量の高いものを飼料化するためには、亜硝酸還元を増強する必要があることが再確認された。ルーメン微生物混合系における硝酸還元酵素および亜硝酸還元酵素の活性は、高硝酸飼料の給餌時に大きく増加したことから、基質である硝酸や亜硝酸により、各酵素の合成が誘導されると考えられた。これらの飼料給与時のヤギのルーメン内微生物の存在数をリアルタイムPCR法を用いて測定した。メタン生成菌の数は低下したが、プロトゾアの数は大きく増加した。この結果は、高硝酸飼料給餌ヤギにおいてメタン生成が低下したことと一致した。しかし、プロトゾア数が増加する理由については現在のところ不明である。主要なルーメン細菌の数について調べたところ、Selenomonas属の菌数が増加した。本菌の中に亜硝酸還元能を持つものも存在するので、高硝酸給与時にルーメン内の亜硝酸濃度が高くなることで優勢になったと考えられる。一方、繊維分解菌および真菌の数は減少した。このことは、繊維消化率が低下したことと一致した。繊維消化率の低下を防ぐためには、亜硝酸還元能を増加させる必要があると考えられた。そのための手段として、ルーメン細菌の亜硝酸還元酵素の活性を増強することが考えられるので、昨年度に単離した未同定の亜硝酸還元菌の特性を調べた。更に、本菌の遺伝子構造を調べるため、本菌の染色体DNAを断片化し、ペアエンドライブラリーを作製した。エマルジョンPCRにより各断片を増幅し、パイロシークエンスを行った。野菜残渣の飼料化をはかり、反芻家畜からのメタン生成を低減させることを最終目的として、ルーメン内微生物の亜硝酸還元能を増強するための研究を行った。日本在来のヤギ(平均体重約30 kg)に硝酸塩を含む飼料を給餌し、その添加限界量を調べたところ、10 g/日の硝酸塩を給餌すると亜硝酸中毒を引き起こされたので、それ以下の量の硝酸塩を給与し、ルーメン内微生物叢への影響を調べた。飼料成分を解析したところ、1日あたりの供与量は粗タンパク質78 g、粗脂肪12 g、NDF 143 g、灰分50 g、およびNFE 209 gであった。硝酸塩添加飼料の給与により、ルーメン内の揮発性脂肪酸の総生成量は低下したが、酢酸/プロピオン酸濃度比、アンモニア濃度、および乳酸濃度は増加した。リアルタイムPCRによる解析の結果、メタン菌、プロトゾア、および真菌類の総数が硝酸塩の給与により大きく減少することが示された。一方、ルーメン内の主要な細菌種または属の多くにおいては、その存在数は硝酸塩添加の影響をさして受けなかったが、Streptococcus bovisおよびSelenomonas ruminantiumの菌数は大きく増加した。更に、S. ruminantiumの硝酸還元酵素および亜硝酸還元酵素の遺伝子に特異的なプライマーを設計し、ルーメン内の遺伝子量を測定したところ、どちらの遺伝子量も硝酸塩の給与により増加した。これは、硝酸塩添加により硝酸・亜硝酸還元能を持つS. ruminantiumの菌株が増加したことを示唆する。従って、特に硝酸含量の高い飼料を反芻動物に給与した場合には、ルーメン内での硝酸・亜硝酸の還元においてS. ruminantiumが主要な役割を担うと考えられた。高硝酸態窒素含有飼料を安全かつ有効に与え、メタン生成を抑制するためには、亜硝酸還元能の増強が極めて重要と考えられる。このためには、亜硝酸還元能の高い新規単離菌を見つけ出し、その菌の亜硝酸還元酵素の活性を増大させるように育種・改良する必要があると考えられる。そこで、本年度は、先ず新規単離菌の探索を行った。そして、それらの菌の特性を調べるとともに、亜硝酸還元酵素の生化学的特性を解析した。硝酸含量の異なる飼料をヤギに給餌したところ、高硝酸飼料を給餌したヤギからの方が、亜硝酸還元菌が単離される確率が高かった。

16SrRNA解析から、単離された亜硝酸還元菌は、Lactobacilus属、Veillonella属、またはClostridium属と推定される菌であった。そこで、菌属に特異的なプライマーを用いてリアルタイムPCRを行った結果、高硝酸飼料給与時にこれらの菌が増加する傾向が見られたので、これらの菌はヤギルーメン内での亜硝酸還元を担うと考えられた。Veillonella属の亜硝酸還元菌について、その詳細を調べた。本菌の亜硝酸還元酵素は細胞質に局在した。また、亜硝酸の存在下で培養すると亜硝酸還元酵素の合成が促進されると考えられた。亜硝酸を添加した混合ルーメン微生物培養系に、本菌を総菌数の約0.5 %となるように添加したところ、亜硝酸還元速度が増加した。その結果、亜硝酸による発酵およびセルロース消化の抑制が軽減され、メタン生成が抑制された。従って、硝酸塩含量の高い飼料または硝酸塩を添加した飼料と共にプロバイオティクスとして本菌を投与することにより、発酵や繊維消化の抑制を招かないでメタン生成を抑制できる可能性がある。自己評価達成度30 %実験1の“亜硝酸還元酵素活性の制御機構の分子レベルでの解析"のテーマでは、昨年度に達成されなった亜硝酸還元酵素の単離精製を引き続き行った。2段階のカラムクロマトを行うことで、比活性を10倍近く増加させることはできたが、作業工程の進行に伴い、総活性値が大きく低下してしまった。カラムの種類、酵素の保護剤、界面活性剤の種類、緩衝液等を検討したが、大きな改善は見られなかった。このため、計画書に記載した本年度の計画を遂行することが出来なかった。実験2の“未知の亜硝酸還元能の高い菌の検索、およびその菌のルーメン内での増殖を促進する条件についての検討"のテーマでは、高硝酸飼料または低硝酸飼料をヤギに給与し、ヤギの生理的反応およびルーメン液性状を調査し、これらのヤギにおけるルーメン微生物の生態分子レベルで解析し、給与飼料と宿主とルーメン微生物との関連性を明らかにすることが出来た。しかし、当該年度の目標であるトランスクリプトーム解析には至らなかった。コスト的な問題のため、パイロシークエンス法ではなく、クローンライブラリー法での解析を試みたが、解読した遺伝子の90%以上が16S rRNA遺伝子であり、機能遺伝子の解析には至らず、多数に存在する16S rRNA遺伝子を取り除く工夫が必要と思われた。どちらの実験テーマにせよ、いくつかの成果は見られたが、一筋縄でいかないことが多かった。計画書の段階で、トライ&エラーに関する部分を過小に見積っていたと思われ、当初の計画が過密であったことが反省点である。自己評価達成度70 %未知の亜硝酸還元能の高い菌の検索、およびその菌のルーメン内での増殖を促進する条件についての検討というテーマの下で、本年度は計画通りに、未知の亜硝酸還元能の高い菌の検索を行い、いくつかの亜硝酸還元菌を単離することに成功した。また、これらの菌の実際のヤギルーメン内での存在数と、飼料中の硝酸含量によりどのような影響を受けるかを観察することができた。ただし、菌層全体の変動を解析するには至らなかったので、次年度に解析を繰り越した。一方、亜硝酸還元能の高い新規単離ルーメン菌における亜硝酸還元酵素の活性の調節を目的に、得られた単離菌の特性を調べ、プロバイオティクス菌として有効である可能性を示し、一定の成果は得られた。
若年層女性雇用就農者の人材マネジメントとキャリアデザインに関する実証的研究

平成30年度は、以下の内容に取り組んだ。第一に、女性を雇用している農業法人に対してヒアリング調査を実施した。女性雇用就農者に対しては、自身のキャリアや農業を職業とすることに対する考え、就職先として農業法人を選択した理由・就農経緯、担当業務等について聞き取りを行った。あわせて、農業法人の代表者から法人の設立経緯、経営方針(経営理念)、採用方針・採用方法等についても伺った。その他、女性正社員との比較のため、パート従業員についてもヒアリング調査を実施した。これらの調査で得られたデータをもとに、学会報告を行った。第二に、女性雇用就農者のキャリア形成と比較するため、農業法人の女性経営者、新規就農した女性、家族経営に関わっている女性、移住や起業している女性等を対象にキャリア等に関するヒアリング調査を実施した。第三に、本研究テーマに関連する研究大会や各種セミナー等に参加し、情報収集に努めた。特に、農業以外の産業における女性のキャリア形成について、企業や行政における女性に対する人材育成・定着に向けた支援の実施に関する実態やキャリアパスに関する取り組み等について情報収集を行い、農業分野と比較できるような資料を収集した。あわせて、文献レビューも行った。第四に、代表者・分担者双方の研究実施状況についての確認及び調査に関する情報共有、次年度以降の研究内容等の検討を目的とした研究会を実施し、円滑な研究実施ができるように努めた。今年度は、若年層女性雇用就農者のライフコースからみた就農プロセスやこれまで実際に形成してきたキャリアに関する実態分析に関して、農業法人の経営者や就農した女性への調査等を中心に実施した。プライベートな内容に関する調査であることから、調査対象者・法人と良好な関係構築を築きながら、調査を実施しているところである。現時点では、調査の実施や資料収集に問題が生じていないことから、おおむね順調に進展していると判断した。来年度は、若年層女性雇用就農者のキャリアデザインに関する実態分析を中心に行いたいと考えている。新たな事例への調査も計画しているが、関連機関などへの調査協力依頼を行い、研究遂行に支障がないように努めたい。次年度使用額146,314円は、研究費を効率的に使用して発生した残額である。翌年度分として請求する研究費とあわせて研究計画遂行のために使用する。
魚類グロビン遺伝子の発現調節の分子機構

1個体のコイのゲノムライブラリーより得られた8個の異なるαおよびβグロビン遺伝子の全構造を解析した。これら各8個の遺伝子のタンパク質翻訳領域についてアミノ酸配列を比較したところ、それぞれタイプ1(No.1、3、5、6、7)、タイプ2(No.2)およびタイプ3(No.8)の3つのタイプに分類できた。タイプ3以外のαおよびβグロビン遺伝子はhead to headの位置関係にあり、タイプ3はtail to tailの位置関係で存在していた。コイの血液細胞の核タンパク質にはタイプ1グロビン遺伝子の上流領域に結合する転写因子が存在することが明かとなった。コイの3タイプのαおよびβグロビン遺伝子は発生段階において発現する時期が異なることがRT-PCR法による解析により明かとなった。タイプ1グロビン遺伝子については少なくとも6個の遺伝子が1個体に存在することから、これらのプロモーター領域の構造を解析したところ、No.1とNo.3、No.5、6および7がそれぞれ相同性の高い構造をしており、No.4の遺伝子はどちらのタイプとも相同性は低かった。このことから、タイプ1には少なくとも3つのサブタイプが存在することが考えられた。スズキ目魚類であるストライプバスより、3種類のαグロビン遺伝子および5種類のβグロビン遺伝子が得られた。コイやストライプドバス等の魚類のαおよびβグロビン遺伝子はほ乳類・鳥類・両生類とは異なるクラスターを形成し、脊椎動物のαおよびβグロビン遺伝子が複製しファミリーが形成される以前に、魚類と両生類は分化したと考えられた。魚類のαおよびβグロビン遺伝子はその発現時期毎にそれぞれ同じクラスターに属したことから、魚類のグロビン遺伝子の発現調節のためのスイッチングは、魚類において独自の進化により獲得してきたものと考えられた。スズキ目魚類であるストライプドバスのグロビン遺伝子の第2エクソン両域をPCRにより増幅し、塩基配列を決定したところ、3種類のαグロビン遺伝子および5種類のβグロビン遺伝子が得られた。グロビン遺伝子の分子進化について解析したところ、コイやストライプドバス等の魚類のαおよびβグロビン遺伝子はほ乳類・鳥類・両生類とは異なるクラスターを形成し、脊椎動物のαおよびβグロビン遺伝子が複製しファミリーが形成される以前に、魚類と両生類は分化したと考えられた。魚類のαおよびβグロビン遺伝子はその発現時期毎にそれぞれ同じクラスターに属したことから、魚類のグロビン遺伝子の発現調節のためのスイッティングは、魚類において独自の進化により獲得してきたものと考えらえた。ストライプドバスのαおよびβグロビン遺伝子のゲノム上での位置関係は、コイと同じくHead to Head構造であることが明らかとなった。このことから、魚類のαおよびβグロビン遺伝子のゲノム上での位置関係は魚類に特有であることが示唆された。コイ成魚の血液細胞で特異的に発現しているタイプ1グロビン遺伝子の転写成魚機構を解明するために、異なる細胞・臓器の核タンパク質と遺伝子上流との結合性をゲルシフト法により調べた。コイのタイプ1グロビン遺伝子の上流領域に血液の核タンパク質は結合したが、肝臓および筋肉の核タンパク質の顕著な結合は見られなかった。このことから、血液細胞にはタイプ1グロビン遺伝子の上流領域に結合するタンパク質が存在することが明かとなった。コイのグロビン遺伝子のクラスター構造を明らかにするために、150kb以上の長鎖のDNA断片をクローン化できるBACベクターにてゲノムライブラリーを構築し、グロビン遺伝子クライスターをクローン化した。クローンには、タイプ1とタイプ3の遺伝子がコードされていたが。タイプ2の遺伝子はコードされておらず、別の領域に存在するものと考えられた。コイの3タイプのαおよびβグロビン遺伝子は発生段階において発現する時期が異なることがわかった。特にタイプ1は特徴的な発現パターンを示した。まず、胚時期に発現し、ふか直後にはほとんど発現しなくなるが、成長とともに発現量が増加して来た。

タイプ1グロビン遺伝子については少なくとも6個の遺伝子が1個体に存在することから、これらのプロモーター領域の構造について解析したところ、No.1とNo.3、No.5、6および7がそれぞれ相同な構造をしており、No.4はどちらのタイプとも相同な構造を有していなかった。このことから、タイプ1には少なくとも3つのサブタイプが存在すると考えられた。このことから、タイプ1の発現パターンを明らかにするために、発生段階の異なるコイの胚を用いてタイプグロビン遺伝子の発現解析を行った。αおよびβグロビン遺伝子のcDNAを5つの異なる発生時期(胚胎形成期、尾部形成期、心臓形成期、血液循環開始期、孵化直前)より作製し、これらを鋳型にタイプIのプライマーで増幅し、増幅DNA断片をT-vectorにクローン化し塩基配列を決定した。αグロビン遺伝子は各5段階ごとに50クローンずつ塩基配列を解析したところ、すべての発生段階においてNo.3、No.5、No.7タイプが発現していた。No.3タイプは心臓形成期および血液循環開始期に発現量の増加がみられ胚胎形成期には少量のNo.6タイプも発現していた。しかし、No.4タイプについては、現在までにその発現が確認できていない。
ボワソナード民法典に関する総合的研究-近代日本民法の出発点に立ち帰って-

1.ボワソナード民法典(旧民法典の財産法部分)の編纂過程にかんして、各種の草案および立法資料を調査・蒐集・分析することによって、編纂の全体的プロセスと特徴を共同研究によって解明し、「ボワソナード民法典の編纂(中間報告)」として取りまとめた。また、この本論部分に「資料解題」を付し、各種立法資料の位置付けと内容の検討の結果を提示した。(「研究成果報告書」参照。)とくに、立法過程の全体(1879年より1890年の法典公布まで)を分析することにより、形の上でよく似た(しかし内容的には同一ではない)サイクルが、2回くり返されていることが明らかとなった。これをまとめると、下表のようである。2.1における検討の成果に基づき、重要な立法資料の刊行を、具体的に計画中である。3.分担研究については、その全体をまとめて出版物として発表するため、準備中である。まず、法務図書館ならびに東京大学箕作文庫を対象として、ボワソナードに関する資料を十分に調査するとともに、その入手と整理を行った。そして、ボワソナード法典自体については、各種仏文草案および日本語の各種翻訳版の先後関係と異同を検討した上で、各種草案の資料集を出版する前提を整えた。それとともに、「ボワソナード民法典研究の手引き」を出版するための第一段階として各分担執筆者による初稿原稿が近くできあがる。こうした最初の研究成果を学界の共有財産とする予定である。また、基礎資料となる旧民法典の条文については、日本語・仏語両方を最新の自動読取ソフトを用いて読み取りデータベース化した。さらに、今後の民法学にとって重要だと思われる資料を選定して、復刻版として出版することを働きかけ、一定の成果を得た(旧民法典の理由書の出版〔仏語版、信山社〕)。この復刻の作業は、今後も継続してゆく予定である。今年度でほぼ、当初の予定通り、研究の基礎的な資料を入手・整理することができた。とくに[手引き]の作業に見通しをつけることができるところにまできたのは、大きな成果である。また、研究会においては、これまで各人がばらばらに行ってきた研究から得た知見を交換することができ、参加者はそれぞれ多くの有益な教示を得ることができた。こうして、初めて本格的にボワソナード民法典について正面から議論できる機会が与えられたことは、重要である。このような研究会を通じての交流によって、参加者一同、研究意欲が一層かきたてられた。各人の研究分担部分については、その多くは各人による検討段階にあるが、すでにボワソナード研究史、賃貸借、離婚法、などについて報告を得て、研究会における検討を済ませた。(1)ボワソナード民法典(以下、ボ法典と省略)の編纂過程の検討を続行し、種々の段階における草案テクストの確定作業を大幅に進捗させた。また、引き続き各種の立法資料の調査・入手・整理を継続した。(2)各分担研究者の担当分野については、以下のテーマで報告が行われた。ボ法典の制度ないし規定に関しては、「物権変動論」および「物権の二重譲渡理論」、「時効理論」、「水法規定」、「抵当権」など。法典および立法過程の背景については、「ボワソナードのフランス時代における法学部とその教育」、「ウィグモアとボワソナード」など。研究会では、きわめて活発な討議が展開され、研究上新たな知見を得、大きな成果をあげた。(3)「ボ法典研究の手引き」については、各分担者による初稿原稿が提出され、検討会でその検討を行なった。それに基づき、修正作業が着実に進められた。(4)1990年11月、パリで開催された「日仏シンポジウム」の「報告集」を翻訳する計画の具体化に入った。1.「ボワソナード民法典の編纂過程」については、引き続き各種の立法資料の調査・蒐集・分析を続行すると共に、4名の編纂過程検討グループを形成し、くり返し検討会を開いて、その全体像を明らかにすることに努めた。そしてこれと併行して、95年夏からは、「ボワソナード民法典の編纂」と題する原稿(第1次稿)の執筆を開始した。これを基礎として、上記4名が10回以上集まり、検討・修正・加筆し、全体をとりまとめた。

「研究成果報告書」の第一編「ボワソナード民法典の編纂(中間報告)」がこれであり、本論部分において編纂過程の全体プロセスと特徴を解明すると共に、「資料解題」を付し、対象とした各種の草案ならびに立法資料を逐一詳細に検討し、系統的に排列することを試みた。2.各分担研究者の分担課題については、本年度は、以下のテーマで報告が行われた。「ボアソナード草案における借地」、「ボワソナード旧民法における合意覆滅(効力否認)規定の諸相」。なお、分担研究の全体をまとめて、出版物として発表するため、準備を進めている。3.1における検討の成果に基づいて、重要であると判断される各種立法資料の刊行を、具体的に計画中である。
等価分布応力下におけるき裂結合力モデルに関する研究

任意応力分布下に存在するき裂に対し等価分布応力の概念に基づくき裂結合力モデルの定式化を行い,有限要素法や既存の破壊靱性評価法との比較・検討,三点曲げ試験などにおけるCTOD評価法との関連性について検討を行った.構造的応力集中場に存在する表面き裂に対して本手法を適用しCTODを算出した.有限要素法や既存の算式との比較を行い提案法の妥当性について検討した.実構造中に存在する三次元き裂の応力拡大係数と全く等しく変化する他の系におけるき裂は,弾性力学的にほぼ同じ力学的環境下になると考えられる.すなわち,三次元表面き裂最深部のき裂長さ-応力拡大係数の関係を無限板中の直線き裂上に再現する仮想応力である等価分布応力を求めることができれば,三次元の破壊現象をそれと等価な二次元破壊問題へと置き換えることができる.さらに等価分布応力上でのき裂結合力モデルを構築することで,当初Wellsが定義したき裂先端開口変位値と同じ物理量(き裂先端位置での活固有変位)が計算でき,大規模降伏条件下での脆性破壊解析や,無き裂からの高精度な疲労き裂進展解析が期待できる.一方,これまでの脆性破壊基準ではき裂底でのR止まりの開口変位をCTODと定義したり,実き裂先端から±45度の線を引き,それとき裂面との2か所の交点間の距離をCTODとするなど,実測できる量に着目した種々のCTODが定義されてきた.これらは,Dugdaleモデルで定義したもともとのCTODとは異なり,破壊力学理論での物理的意味が明確ではない量である.これまでに,さまざまなCTODが提案されてきた理由として,Dugdaleモデルは一様応力分布下のみでしか定式化されておらず,任意応力分布下におけるき裂結合力モデルのCTODを得る手法が確立されてこなかったためである.本研究では,任意応力分布下でもき裂結合力モデルを取り扱えるように定式化を行う.無き裂からのき裂生成をモデル化するために極小き裂生成時の特異性を考慮したEDSについて検討した.また,活固有変位が脆性破壊基準の一つになり得るかについて検討を行うため,脆性破壊試験モデルや溶接継手モデルに対して三次元有限要素法解析を用いて開口変位および活固有変位を求め詳細な検討を行っている.当初予定したプログラム開発を行なっており順調に進展していると思われる.今後,試験を行なう予定であるが,限られた予算での試験になるため,データが思わしくない場合,過去の試験データを活用させていただく予定である.軽量かつ高強度な輸送機器や溶接構造物を設計するために破壊靱性値の高い鋼材や溶接材料が提案されてきている.一方そのような条件下でのき裂や切欠を有する構造物の評価に関する研究は十分ではなく,大規模降伏条件下での破壊力学的評価が必要とされている.破壊試験片や構造的応力集中場に存在する表面き裂に対して大規模降伏条件下においても破壊評価が可能なき裂結合力をベースとした破壊力学理論の研究を行なっており,今年度は昨年度に継続して開口変位(Crack Mouth Opening Displacement: CMOD)やき裂先端開口変位(Crack Tip Opening Displacement: CTOD)の評価を行うためのプログラム開発を行った.き裂を含む固体や構造の二次元/三次元弾塑性有限要素法(Finite Element Method: FEM)解析により得られたCMOD,CTOD,活固有変位および既存の破壊靱性値との比較を行なった.活固有変位とはき裂を含む構造物の弾塑性FEM解析を行い,き裂平面に垂直な線上に沿うリガメント部のき裂面垂直方向の塑性ひずみを積分した線分にき裂結合力が弾性的に作用して得られる線分の長さである.さらに脆性破壊試験のための試験片および試験ジグの設計を行い,低温環境下での鋼材の三点曲げ脆性破壊試験を実施しCMODやCTODに関する基礎的知見を得た.プログラム開発やFEM解析の結果から,二次元問題だけでなく三次元破壊力学解析においても活固有変位が脆性破壊評価を行うための破壊基準として有効である可能性を示すことができた.任意応力分布下に存在するき裂に対し等価分布応力の概念に基づくき裂結合力モデルの定式化を行い,有限要素法や既存の破壊靱性評価法との比較・検討,三点曲げ試験などにおけるCTOD評価法との関連性について検討を行った.構造的応力集中場に存在する表面き裂に対して本手法を適用しCTODを算出した.有限要素法や既存の算式との比較を行い提案法の妥当性について検討した.無き裂からのき裂生成をモデル化するために極小き裂生成時の特異性を考慮したEDSについて継続して検討を行なってゆく.さらに脆性破壊試験を行なう予定である.試験機の都合により小型の試験片での試験になると思われるが,試験結果とFEMおよび開発したプログラムとの比較を行い本研究の成果をまとめる.船舶海洋工学
森林資源の利用とネットワーク・ダイナミクス

本研究では生漆生産者と漆木植栽農家の行動と、彼らが有する社会的ネットワークとの関連について、昭和初期からの歴史的経緯をふまえて検討した。その結果、生漆生産行動と漆木植栽行動に社会的ネットワークが影響していたことが明らかとなった。また、有賀(1966)が重厚なモノグラフによって明らかにした大家族制度にも、漆器生産の影響があることが明らかになりつつある。生漆生産者を対象とした社会的ネットワークと資源利用に関する調査のための予備的調査・検討を行った。とくに、生漆生産者らが関係している農山村の社会構造を明らかにすることと、ウルシ木所有者のウルシ木育成や販売の意思決定要因を解明することを目的として、予備的調査・検討を行った。農山村における社会構造解明に関しては、岩手県北部の村落構造に関する古典的な文献の精読と現地での聞き取り調査を進めた。これまでに、集落内の本家・分家関係には単一の本家が存在する場合や複数の本家が存在する場合など様々なケースがあること、組織の機能によって集落内で形成される組織と集落を超えて形成される組織が存在すること、本家・分家関係および集落の組織ともに時代によって変化してきていることなどを確認することができた。ウルシ木所有者の意思決定要因に関しては、岩手県二戸市におけるウルシ木所有者を対象とした聞き取り調査を行った。これまでに、雑穀や豆類を栽培する必要性が薄れていくなどウルシ木植栽の背景に変化があったこと、ウルシ木を販売する場合に本家・分家関係を通して行われる場合とそうでない場合が存在することなどを確認することができた。以上の知見は平成22年度中に実施する予定の本調査において活用する予定である。岩手県内を主な対象地として,生漆および漆器生産のパフォーマンスと生産に関わる人々の社会的ネットワークとの関連について調査を進めた。具体的には,(1)過去に漆木を植栽した農家をおもな対象として,漆木植栽の経緯,漆苗木の当時の入手方法,植栽後の管理方法,植栽当時の土地利用等について聞き取り調査を行った。(2)その結果,漆木そのものの生産性の変化のほかに,雑穀やタバコなどの漆以外の作物の生産性や生産条件の変化や,地域の就労条件の変化によって,漆木育成の経済・社会条件が変化してきていることが明らかになりつつある。(3)また,調査を進めるなかで,1980年代から90年代にかけて,この地域の多くの農家が漆木を積極的に植栽したことによって,現在の漆木資源の維持に結びついていることが,次第に明らかになりつつある。そこで,今後,この時期の漆木植栽に関わった関係者への聞き取り調査をさらに進める予定である。(4)この地域の1930年代における家と家との間の様々な社会関係,漆器を含む経済活動等について調査した記録資料を入手した。そこでこの資料の解読作業を進め,その一部を公表する準備を進めた。今年度の調査を通して,漆木資源管理・利用のパフォーマンスとネットワークの変動との連関について検討するための材料がおおむね揃ったため,次年度は理論を踏まえて,両者の連関について分析を行う予定である。ただし,一部では,次年度も補足調査が必要である。(1)岩手県北地方の昭和初期の漆器生産と社会関係に関する資料の解読を進めた。この資料は、経済史家の土屋喬雄が同地域のS家について有賀喜左衛門らと共同で調査した際の調査ノートである。S家の大家族制度については有賀によって重厚なモノグラフが著されているものの、有賀のモノグラフではS家の生産に関する事柄には触れられていない。そのため、本資料の解読により、大屋、別家および名子によって構成される大家族制度の典型とされた地域において、漆器生産などの山村に特有の生産活動が果たしていた役割が明らかになりつつある。(2)昨年度までに実施した生漆生産者ならびに漆木植栽農家を対象とした調査に基づいて、生漆生産者や漆木植栽農家の行動と彼らのネットワークとの関連を分析した。この分析を通じて,戦後,日本中の生漆産地が生産を中止したり,生産量を大きく減少させていった中で,岩手県北地方において生漆生産が持続的に行われてきた条件を検討した。昭和初期から現在までを通観すると、漆木が多く植栽される地域は時期によって変化していったと考えられ、そうした変化には自治体独自の政策の影響や中心的な人物がもつネットワークの影響があったと考えられる。(3)昨年度までに実施した生漆生産者を対象とした調査データに基づいて,生漆に関する情報のあり方の変化が,生漆生産者と生漆購入者との関係変化をもたらすことに関して,ゲーム理論的な検討を行った。これまでのところ、生漆の認証制度の創設やインターネットなどによる生漆の価格や品質についての情報流通のあり方が変化したことが、生漆生産者の行動を変化させた可能性があると考えられる。
糖尿病における患者教育プロセスを重視した教育方法の開発に向けた基礎的研究

教育効果がなく、自己管理ができていない患者の場合、教育のプロセスに問題があることも予測される。Kate Lorigは、慢性疾患患者の患者教育において重要なことは、ニーズアセスメント、到達目標の設定、教育を受けた患者の教育に対する評価であると述べている。患者教育に対する評価をどのように実施し、その結果をどのようにフィードバックするかが、患者教育を成功に導くひとつの方法だと考える。そこで、第一の研究では、糖尿病患者に対する教育がどのように実施されているか、看護師は糖尿病教育に対しどのような認識をもっているのかを把握し、糖尿病教育の一翼を担っている看護師の役割を明らかにすることを目的として、「臨床看護師の糖尿病患者教育活動に関する研究-佐賀県・福岡県における患者教育プロセスに焦点をあてた実態調査-」を行った。次の段階として患者教育を行う際には患者の教育に対するニーズを把握しておくことが必要だと考え、「糖尿病患者教育に対する患者のニーズ調査」を実施した。第三の研究では、糖尿病の合併症予防のためには患者の自己管理が最も重要であるが、自己管理を困難に感じている患者が多数存在するために効果的な教育方法が模索されている。そこで、糖尿病の自己管理と社会生活の調整に伴う困難な気持ちから肯定的な気持ちへと変化した対処を明らかにすることを目的として、「糖尿病の自己管理と社会生活の調整に伴う困難な気持ちとその対処-肯定的な気持ちへ変化した対処を中心に-」を実施した。最後の章に今日の活動を「糖尿病患者教育に関するチームとしての取り組み」とのテーマでまとめた。糖尿病は忍耐強い治療努力、特に患者の自己管理が要求される。そのため、多くの病院で教育や指導が実践されている。患者が生涯を通して自己管理をしていけるよう援助していくには、療養生活全体の援助を行う看護職の役割が大きい。そこで今回、地域糖尿病療養指導士の育成をしている佐賀・福岡県において、診療科に内科を掲示している20床以上の366病院で、患者教育を担当している看護職を対象に糖尿病患者教育活動に関する実態調査を行った。有効回答数は183、有効回答率は50.0%であった。また、地域糖尿病療養指導士の資格を持っている人は42名(23.0%)であった。教育項目において、低血糖の症状と対策が92.3%、インスリンの自己注射が90.2%、食事療法は83.6%、合併症については80.3%、尿糖・血糖自己測定法は79.8%、運動療法76.5%、糖尿病の病態65.6%、糖尿病コントロールの指標65.0%、糖尿病と感染症60.1%、フットケア55.2%、ストレス管理19.1%、民間療法13.1%、社会資源12.6%の人が実施していた。また、教育方法において、患者のレディネスを把握しいていると回答した人は83.6%、ニーズを把握している84.1%、教育到達目標を設定している65.6%、教育評価をしている48.1%、教育計画書を作成している29.0%、の順であった。自ら実施した教育・指導に対して満足感を感じている人は25.1%に留まった。所属している病院の教育システムに満足している人も21.3%と少なかった。さらに、地域糖尿病療養指導士資格の有無別で比較すると、糖尿病療養指導士の方が、教育内容が多く、教育方法においても充実していた(p<0.05)。以上の結果より、フットケア、心理・社会的側面を含めた教育、教育結果を患者へフィードバックさせるための評価の実施、看護者への教育の必要性が示唆された。【研究目的】前年度の看護職に対する研究結果を踏まえ,研究目的は教育の受け手である患者側から患者教育の基礎資料を得るため,糖尿病患者が自己管理を続ける上での困難な体験やその対処法,適応状態にいたるまでの経過を明らかにすることである。【研究方法】多様な療養法の個別の経過を探索するために,グランデッドセオリーアプローチによる個別面接調査を行った。

対象は外来を受診している糖尿病患者で,面接調査に同意の得られた19名である。【結果】自己管理を続ける上での困難な体験は,「食事量の制限があること」,「役割遂行や社会生活と治療の両立」,「外出時のインスリン注射」,「低血糖の体験」などであった。これらの困難な体験に対する対処法は,現在の適応状態別にみると適応状態のよい人は「食事量の制限があること」について,食事療法に対する慣れや負担感が少なく,食事療法を健康食ととらえ,自分なりにうまく食事摂取方法を工夫し,実行していた。不適応状態の人は食事に対する満足感がない,厳しい食事管理への負担感や怒りなどを表現しており,食事療法を生活に統合させることでの失敗体験を積み重ねていた。「役割遂行や社会生活と治療の両立」については適応状態のよい人は,肯定的な人間関係を構築し,社会的支援を獲得し,社会的役割と治療の両立を行っていた。不適応状態の人は,糖尿病に対する否定的な気持ちが強く,周囲に病気を悟られないよう行動し,ストレスを感じていた。「外出時のインスリン注射」についてはトイレや外出先で注射するという同様の対処法をとっていたが,認識の違いにより適応状態に違いがみられた。「低血糖の体験」では,普段から準備している,低血糖予防のため過食となる,教育を受けるなどの対処法をとっており,対処法がわかっている,周囲から援助を受けるという適応状態がよい人と,症状発現に対する漠然とした不安を示す不適応の人が認められた。本研究は、糖尿病患者の療養生活に関わる方法や教育活動の実態を明らかにし、特に患者の日常生活の援助を行っている看護職の教育活動や患者側からの評価を通して、自己管理を継続できるような教育方法についての基礎的資料を得ることを目的としている。平成13年度の研究で得られたデータを基に、平成14年度の研究は、糖尿病患者が自己管理を行う上での困難な体験とそれに伴う気持ちの変化に焦点をあて、糖尿病の自己管理と社会生活の調整に伴う困難な気持ちから肯定的な気持ちへと変化した対処を明らかにすることを目的としている。平成13年度の結果の「役割遂行や社会生活と治療の両立」に関する気持ちの変化に焦点をあて更なる分析を質的に行った。分析の結果、困難な気持ちには、『つき合いにおける食事療法の負担感』があり、「食事療法をつき合いの制限と感じる」、「自分が糖尿病であることを知られたくない」思いがあった。困難な気持ちから現在の肯定的な気持ちへと変化した対処には、「糖尿病の告白」、「自分なりの食事自己管理基準での実行」、「仕事上の責任回避」があり、糖尿病患者は対処法を単独で用いたり複数の対処法を組み合わせて用いることで、ストレスフルな状況を乗り越え、前向きに糖尿病の自己管理を捉え社会生活の調整を行っていた。3年間の研究結果に基づき、糖尿病患者が職場や家庭、地域における役割を果たしながらより望ましい療養生活を継続していけるように、個々の患者が抱えている問題に対して医師・看護師・栄養士で構成された医療チームがその専門性を発揮し協力して患者の療養生活を支援する個別患者教育を実践している。患者個々のインタビューで得られた情報から、(1)患者の情報を共有するためのデータベースの作成、(2)問題の抽出、(3)患者の到達目標の設定と介入方法の検討、(4)患者教育、(5)評価を行っており、今後の研究として継続していく予定である。
四肢の発生における位置価の決定に関わる因子についての研究

前後軸にそった四肢のパターン形成に、肢芽後部のZPA(zone of polarizing activity)と呼ばれる領域の間充織細胞が中心的な働きをしている。従来、ZPAのシグナルはレチノイン酸であると言われていたが、レチノイン酸は肢芽細胞を極性化することによって間接的に作用すると考えられている。本研究では、位置価の決定に関わるホメオボックス遺伝子の発現調節のメカニズムを解明するために、以下の点を調べた。1.HoxDの発現に関わるシグナル:ニワトリ胚の肢芽にマウスのZPAを移植し、HoxDの発現を調べた実験などから、ZPAに由来する因子とAER(apical ectodermal ridge)に由来する因子の両者がHoxDの発現誘導とそれによる位置価の決定に必要であると考えられる。2.肢芽で発現する他のホメオボックス遺伝子:mshに近縁のMsx1、Msx2はAERおよびAERの直下の間充織で発現しており、特にMsx1はAER因子によって発現が誘導されるが、ZPAによる影響は見られない。また、pairedに近縁のホメオボックスを持つPrx1は肢芽の間充織で特異的な発現が見られるが、AERによる影響は受けず、肢芽間充織細胞としての個性の決定に関係していると考えられる。3.パターン形成に関わる増殖因子とそのレセプター:四肢形成におけるFGFとTGF-betaのファミリーの増殖因子の役割を理解するために、これらのレセプターの肢芽での発現を調べた。FGFレセプター(FGFR1FGFR4)について調べると、FGFR2は外胚葉および肢芽の中心部の間充織細胞で特異的な発現が見られ、一方、FGFR1、3、4は肢芽全体で均一な発現が見られた。FGF-4はニワトリ胚の肢芽でもAERで特異的な発現が見られる。さらに、FGF-4を肢芽の近くで強制発現すると過剰指形成が誘導されることから、FGF-4はAER因子の1つであると考えられる。TGF-betaファミリーのタイプI、IIレセプターは膜結合のSer/Thrキナーゼ様の構造をとる。その中のアクティビンレセプター、IIAとIIBは初期の肢芽では弱い発現しか見られないが、発生が進むと筋芽細胞、表皮、軟骨膜での発現が見られ、これらの組織の形成に関与していると思われる。肝細胞増殖因子(HGF)を産生している線維芽細胞MRC-5は初期の後肢肢芽の前部に移植すると重複肢を誘導する。ニワトリ肢芽でのHGF遺伝子の発現はAER直下の間充織で見られる。前後軸にそった発現強度に差は見られないが、AERの形成とHGFの発現に時間的、空間的な相関が認められる。したがって、HGFはAERの誘導または維持に関与する因子の1つと考えられる。

前後軸にそった発現強度に差は見られないが、AERの形成とHGFの発現に時間的、空間的な相関が認められる。したがって、HGFはAERの誘導または維持に関与する因子の1つと考えられる。
TLR4-MD-2複合体によるリポ多糖認識とTLR4二量体形成メカニズムの解明

MD-2-lipidA複合体の構造解析を行うため、MD-2の大腸菌発現系の構築を行った。結果、MD-2は不溶性画分に得られたため、変性剤存在下での精製、リフォールディングを試みたが変性剤の除去によりMD-2は沈殿し、精製は困難であった。そこで、コールドショック発現誘導とシャペロンとの共発現により、MD-2を可溶化した状態で発現することに成功した。発現ベクターのクローニングを行い、大腸菌を用いた発現系の構築を行った。発現したMD-2は不溶性画分として得られた。不溶性画分として発現する場合、大腸菌の増殖が妨げられない、不純物が少ないなどの利点がある。不溶性画分を変性剤によって可溶化した後、精製法、リフォールディング法の検討を行った。可溶化の後、逆相精製を行った。その後凍結乾燥したサンプルをバッファーに溶解させる条件を検討した。pH、塩の種類と濃度などのバッファー条件を検討したが、いずれの条件においてもMD-2は凝集し、単量体で溶解させることが困難であった。次に、第一段階の精製をHisタグアフィニティ精製に変更した。精製したフラクションの変性剤濃度を透析法、希釈法により低下させた段階で、MD-2の溶解性が著しく低下し、沈殿が生成した。MD-2のジスルフィド結合、疎水性アミノ酸残基が多く存在することから不溶性画分からの可溶化、リフォールディングを行うことは困難であると判断した。MD-2を可溶性画分として得るために、コールドショック発現誘導とシャペロンとの共発現を行った。pColdベクターにクローニングし、シャペロンコンピテントセルBL21(DE3)を用いて各種シャペロンとの共発現実験を行った。結果、いずれのシャペロンとの共発現においても可溶化が見られ、特に、トリガーファクターとの共発現において、最もMD-2は可溶化した。大腸菌で可溶性MD-2が発現できれば、大量に安価で調製できるため、活性測定や構造解析に有効な手段となり得る。結果、いずれのシャペロンとの共発現においても可溶化が見られ、特に、トリガーファクター(TF)との共発現において、最もMD-2は可溶化した。よって、トリガーファクターをタグとした融合タンパク(His)_6-TF-MD-2の発現実験を行った。結果、菌体破砕上清の可溶性画分に大量に(His)_6-TF-MD-2が得られた。菌体破砕上清画分をヒスタグアフイニティにより精製し、続いてゲルろ過で精製を試みた。しかし、MD-2はトリガーファクターと会合し、単量体にすることは困難であった。精製の際のバッファーに界面活性剤を添加するなどの検討を行ったが、会合を防ぐことはできなかった。次に、MD-2はジスルフイド結合を形成しないシステイン残基を有するため、これがMD-2の不溶化の原因であると考えた。類縁タンパク質ではバリンであるため、システインをバリンに換えた変異体をクローニングし、大腸菌でのタンパク質発現実験を行った。結果、培養菌体破砕後、MD-2の大部分が不溶性画分に得られ、期待した効果は得られなかった。