hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
免疫シグナル伝達におけるrasGAP結合蛋白質Dok及びDok-2の機能解析

申請者らは、多様なチロシンキナーゼの共通基質であるrasGAP結合蛋白質p62をドッキング蛋白質Dokとして同定し、独自に樹立したDok欠損マウスを用いてB細胞抗原受容体下流で負のシグナル伝達に機能していることを発見した。申請者らの従前の研究によって、Dokとその類縁分子であるDok-2の二重欠損マウスにおいて白血球の過形成による脾臓の腫脹が頻発し、末梢血の白血球成分が増加することが明らかとなった。そこで申請者は、Dok、Dok-2の免疫シグナル伝達における機能と作用機序の解明を目的として、それらの二重欠損マウスにおける増殖抑制機構を検討した。まず、二重欠損マウスにおいて異常増殖を呈する細胞種を特定したところ、末梢血では顆粒球と単球の増加が、骨髄、脾臓ではそれらの前駆細胞の増加が認められた。そこで、骨髄球と顆粒球の産生に重要な造血幹細胞数についてコロニー法にて解析したところ、顆粒球・単球系の幹細胞が顕著に増加していることが判明した。さらに、顆粒球・単球系の幹細胞分化、増殖に重要なサイトカインに対する血液細胞の増殖応答を調べたところ、それら全てにおいてDok、Dok-2二重欠損による増殖応答の亢進が認められた。他方、詳細な病理学的解析によってDok、Dok-2二重欠損マウスの多くに糸球体腎炎の発症が認められた。この腎炎には免疫グロブリンの沈着が認められたことから自己免疫疾患であることが示唆された。以上の結果から、Dok及びDok-2は多様な免疫担当細胞の増殖と機能を負に制御していることが判明した。現在、この抑制の分子機構について会合蛋白質の探索とその機能解析を中心に検討すると共に自然免疫及び獲得免疫に対するDok、Dok-2欠損の影響を詳しく検討している。免疫シグナル伝達に必須のチロシンキナーゼは、様々な免疫受容体の細胞内領域やLAT、BLNK等のアダプター分子をリン酸化することでSH2やPTBを持つ分子をシグナル系にリクルートする。代表者らが発見したマルチアダプター分子Dokとその類縁分子、Dok-2、Dok-3は全て免疫担当細胞に高く発現する。昨年度までの本研究により、我々はDok、Dok-2欠損マウスを樹立し、DokがB細胞受容体下流で増殖とMAPキナーゼに抑制性のシグナル分子であることを発見した。本年度の研究においては、DokのB細胞受容体下流での作用機序に関する解析と、Dok及びDok-2の免疫系全般における生理機能の解析等を計画した。1.Dok、Dok-2欠損マウスのT細胞機能を詳細に検討する為にC57BL/6マウスへの戻し交配を進め、現在、前者が10代目、後者が7代目となり、既に解析を始めている。2.Dok/Dok-2二重欠損マウスは、5ヶ月齢以降、高頻度に脾臓の腫脹を呈するようになり、腫脹した脾臓においては、白脾髄の過形成と赤脾髄におげる髄外造血が認められた。また、そのように腫脹した脾臓においては顆粒球様細胞の過増殖が確認された。現在、この過増殖細胞の性状を詳細に検討すると共に、Dok、Dok-2欠損の骨髄球系細胞の分化や増殖に関する影響を検討している。3.Dok-3欠損マウス作成に関しては、ターゲティングベクター作成の為に、その遺伝子構造の検討を始めた。4.B細胞受容体下流でのDokの作用機序に関しては、Dokの上位の制御因子として報告されたSHIPについて検討し、そのカルボキシ末端にあるリン酸化チロシンを含む配列がDokのPTBドメインの標的になることを培養細胞における再構成系によって確認した。

現在、この抑制の分子機構について会合蛋白質の探索とその機能解析を中心に検討すると共に自然免疫及び獲得免疫に対するDok、Dok-2欠損の影響を詳しく検討している。
中枢神経のシナプス後部構造の形成

シナプスの後部、スパインは非常にアクチン繊維に富む構造で、常時形態変化をしていることが知られている。スパインの形成、形態変化にはスパインに局在するアクチン結合蛋白が重要な役割をしているに違いない。私はスパインのアクチン結合蛋白、ドレブリンに注目して研究を行った。(1)まず、ドレブリンのアクチン結合部位について知るために、CHO細胞に発現させたGFP-ドレブリンについて詳細な観察を行った。いろいろなドレブリン断片をGFPとつなげて発現させたところ、アクチン繊維の変成を起こす断片は、必ずアクチン繊維との結合を示した。つまり、アクチン繊維の変成を起こすためにはアクチン繊維との強い結合が必要であることがわかった。重なっていない断片の両方でアクチン結合とアクチン繊維変性が見られた。従って、ドレブリンのアクチン結合部位には、弱いアクチン結合サイトが複数、クラスター状に分布していると考えられる。アミノ酸残基233-317が、アクチン繊維への結合とアクチン繊維の変性を起こすのに十分であった。全長cDNAで見られるような、あらゆる変性(アクチンの詰まった細い突起の伸長、アクチン繊維の屈曲、輪状化)が見られた。つまり、この部分がドレブリンのアクチンへの作用に必要十分であることが分かった。(2) GFP-ドレブリンを初代培養神経細胞に入れると、スパインに局在し、スパインが長くなることは昨年度に報告した。今回は、アクチン結合部位を欠損させたドレブリンを作成し、GFPとつなげて神経細胞に導入した。GFPによる蛍光はスパインにも弱く見られたが、樹状突起により強く認められた。従って、ドレブリンがスパインに局在するためにはアクチン結合部位が必要であることがわかった。また、GFP-ドレブリンを発現して長くなったスパインが本当にシナプス後部なのかどうかを、シナプトフィジンの抗体で確認した。ドレブリンは成体哺乳類において神経細胞のスパインに特異的に発現しており細胞骨格に結合している。また、ドレブリンは試験管内でアクトミオシン活性を阻害する性質を持っている。これらのことから、ドレブリンはスパイン中のアクトミオシン系を制御することによって、スパインの形態制御に関わっていると考えている。ドレブリンを蛍光標識するためにGFPのcDNAをドレブリンのいろいろなcDNA断片とつなぎ、CHO細胞に導入した。アクチン結合能を持つドレブリンフラグメントがついていると、GFPの蛍光はアクチン繊維に沿って観察され、さらにあるものではアクチン繊維の変形、細胞の形態自体に変形が見られた。アクチンへの結合は中央部の28残基だけでも弱く見られ、ここらへんを中心とした領域でドレブリンはアクチン繊維とつくことがわかった。アクチン繊維や細胞形態の変形に必要なドメインを同定することはできなかった。次にGFP-ドレブリンを神経細胞に発現させて、過剰なドレブリンによる影響を調べた。ラット20日齢胎児の大脳皮質の分散培養を3週間飼うと、培養3週間目には神経細胞はシナプスを形成しスパインを発達させる。GFPのみをトランスフェクトした神経細胞では、細胞体、樹状突起がよく光ったが、GFP-ドレブリンを発現させたものではスパインが強く光った。つまり、GFPとつなげて発現させたドレブリンも内因性のドレブリンと同様にスパインに局在することがわかった。このとき、スパインの長さが細胞による違いを超えて、有意に長くなっていた。このことはドレブリンがスパインの形態を制御する蛋白であるという我々の仮説を支持する。
牛群における新規カビ毒防除法の臨床的な検証と代謝内分泌学的評価

畜産現場において、家畜に給与する飼料中のカビ毒(真菌が産生する二次代謝産物で、ヒトを含む動物に対して毒性や発ガン性が有る)の防除対策は世界的な克服課題である。本研究は、実験動物モデルで腸管からのカビ毒吸収阻害作用が報告されたオリゴ糖(FOS)を牛飼料に添加投与し、添加前後の尿中カビ毒濃度を指標とした牛でのカビ毒吸収阻害効果を初めて検証することを目的とした。黒毛和牛肥育牛群におけるDFAIII添加によるMT吸収阻害効果を検証することを目的とし、比較は15頭ずつの2群間で、FOS添加群と無添加の対照群とした。FOSは朝と夕方の2回添加を2週間継続し、Day0(実験開始日)、添加1週間後(1wk)、2wks、3wksにそれぞれ採尿および採血を行った。測定は尿サンプルはLC/MS/MS法により尿中ゼアラレノン(ZEN)とその代謝物であるα-ゼアラレノール(ZOL)およびβ-ZOL濃度の測定を、またFOS添加による腸管からのイオン吸収能の変化を確認するために血清中のCa、Mg、iP濃度の測定も行った。その結果、FOS添加群において添加期間中の尿中ZEN、α-ZOL、β-ZOL濃度は対照群と比較して有意に低下することが確認された。さらに、3wksにおいてiP濃度が有意に高くなった。本研究の結果から、飼料へのFOS添加により、尿中ZENおよびその代謝物濃度が低下すること、すなわち腸管からのZEN吸収が低減することが明らかとなり、それはFOS添加により腸管タイトジャンクションの消化管バリア機能増強による腸管からのMT吸収阻害効果による可能性が示された。本申請課題においては以下の4研究課題、1FOS添加が消化管バリア機能に与える臨床的評価、2カビ毒浸潤動態と血中抗ミューラー管ホルモン(AMH)濃度との関連性、3カビ毒浸潤動態とメタボローム解析との関連性、及び4牛卵管上皮細胞培養モデルを用いたZEN浸潤の繁殖性への影響、を行う予定であり、1と2についてはすでに試験を終えて、得られた成果は論文としてすでに発表を行なっている。2と3に関してはすでにサンプリングは終えており、2については追加測定を検討しているものの、すでにある程度の結果は得られており、今後得られる測定結果と併せて最終的な解析を行う予定である。一方、3については当初ガスクロマトグラフィー質量分析法(GC/MS)を用いた研究を行う計画であったが、ガスクロマトグラフィー測定に必要なヘリウムガスのわが国における供給がストップしているために、測定を中断している。現在、ヘリウムガスの供給を待つとともに、3の研究課題を代替する液体クロマトグラフィー液体クロマトグラフィー(LC/MS)法を用いる別の研究課題を行うための、測定系の確立作業を行なっている。以上のことから、おおむね順調に進展しているとの評価を行なった。現在までの進捗状況で記載の通り、現在研究課題2及び3についての検討を主に行なっており、2に関しては牛群を追加してサンプリング数を増やすとともに、継続して血中AMH濃度の測定を行なって、データベースの蓄積を行うこととする。3に関しては、GC/MSが使用できない場合を念頭に、現在行なっているLC/MS法の確立を目指すとともに、当初想定していたメタボローム解析を代替するために、血中低級脂肪酸濃度の解析を行って、添加したFOSにより腸管内で明らかに発酵過程を経て、低級脂肪酸合成が行われたことを確認するとともに、FOS添加が腸管上皮細胞タイトジャンクションの消化管バリア機能に間接的な影響を与えた可能性を検証することを目的にした研究を推進する。

本申請課題においては以下の4研究課題、1FOS添加が消化管バリア機能に与える臨床的評価、2カビ毒浸潤動態と血中抗ミューラー管ホルモン(AMH)濃度との関連性、3カビ毒浸潤動態とメタボローム解析との関連性、及び4牛卵管上皮細胞培養モデルを用いたZEN浸潤の繁殖性への影響、を行う予定であり、1と2についてはすでに試験を終えて、得られた成果は論文としてすでに発表を行なっている。2と3に関してはすでにサンプリングは終えており、2については追加測定を検討しているものの、すでにある程度の結果は得られており、今後得られる測定結果と併せて最終的な解析を行う予定である。一方、3については当初ガスクロマトグラフィー質量分析法(GC/MS)を用いた研究を行う計画であったが、ガスクロマトグラフィー測定に必要なヘリウムガスのわが国における供給がストップしているために、測定を中断している。現在、ヘリウムガスの供給を待つとともに、3の研究課題を代替する液体クロマトグラフィー液体クロマトグラフィー(LC/MS)法を用いる別の研究課題を行うための、測定系の確立作業を行なっている。以上のことから、おおむね順調に進展しているとの評価を行なった。現在までの進捗状況で記載の通り、現在研究課題2及び3についての検討を主に行なっており、2に関しては牛群を追加してサンプリング数を増やすとともに、継続して血中AMH濃度の測定を行なって、データベースの蓄積を行うこととする。3に関しては、GC/MSが使用できない場合を念頭に、現在行なっているLC/MS法の確立を目指すとともに、当初想定していたメタボローム解析を代替するために、血中低級脂肪酸濃度の解析を行って、添加したFOSにより腸管内で明らかに発酵過程を経て、低級脂肪酸合成が行われたことを確認するとともに、FOS添加が腸管上皮細胞タイトジャンクションの消化管バリア機能に間接的な影響を与えた可能性を検証することを目的にした研究を推進する。当初予定していたGC/MSを用いたメタボローム解析を行う研究について、上述の通りGC/MSの使用が不可能であったために、そのための消耗品類や実際に測定を行うための移動にかかる旅費などを執行できなかったことが大きい。さらに、日程の調整できなかったことによる、海外共同研究者を訪問しての共同研究の打ち合わせ作業ができなかったこともその理由である。本年度は昨年度の代替試験、測定を行う予定であり、それにかかる消耗品類や旅費として使用する予定である。さらに、共同研究打ち合わせを行うための、海外旅費としても使用する予定である。
極域における積雪の長期的動態解明のための衛星計測マイクロ波データ解析手法の開発

本研究の目的は、マイクロ波を利用する衛星の計測データを解析することにより、極域における積雪物理量の変動を長期にわたり監視する方法を明らかにし、実証することである。おもに、以下の3項目の開発を行った。1.積雪物理量の推定アルゴリズム衛星搭載マイクロ波センサの地表分解能の範囲内を一様な積雪模型で表し、マイクロ波が内部を伝搬する際に、模型を構成する物理量(深さ、層の数、粒径、密度、含水率)により受ける影響のシミュレーションを、利用するセンサの方式と性能の違いを考慮に入れて行った。つぎに、模型表面の放射率や複素後方散乱係数から逆に模型構造を決定するアルゴリズムの開発と検討を行った。2.衛星搭載マイクロ波放射計の観測データの解析手法検討対象とした衛星マイクロ波放射計は、MOS-1のMSRとADEOS-2のAMSRである。マイクロ波放射計は衛星から見かけた輝度温度を観測するので、観測データから積雪表面における放射率を求める方法を開発した。北海道を観測したMSRデータを解析したところ、求めた深さと粒径の積雪物理量は、地上の積雪特性に良く対応することがわかった。さらに、同様の解析方法が、地上観測データが得られない極域のMSR観測データに対しても適用可能であることを確かめることができた。3.衛星搭載合成開口レーダの観測データの解析手法検討対象とした合成開口レーダは、L-bandの周波数を利用し、高い地表分解能が得られるJERS-1のSAR(入射角固定)とALOSのPALSAR(入射角可変)である。これらの衛星が複数の軌道から観測して取得した複素後方散乱係数から、深さと密度の積雪物理量を推定する解析手法を開発した。この手法の有効性を検証するために、PALSARと同等の性能を有するPi-SARによる航空機観測実験と地上観測実験を北海道で行い、取得したデータの解析結果を報告した。本研究の目的は、マイクロ波を利用する衛星計測データを解析することにより、極域における積雪物理量の変動を長期にわたり監視する方法を明らかにし、実証することである。そのため、計測方式と性能が異なる複数の衛星搭載マイクロ波センサが取得するデータを解析し、観測する衛星センサの違いによらない共通の積雪物理量を継続的に抽出推定する手法の開発を行っている。ここで利用する衛星センサはマイクロ波放射計と合成開口レーダである。研究初年度の実績を以下に概説する。観測が予定されている高性能マイクロ波センサ(ADEOS-2のAMSRとALOSのPALSAR)のデータから、地上観測データの助けを借りずに複数の雪氷物理量を精度よく抽出する方法を検討した。ここで得られた解析手法を従来型のマイクロ波センサ(MOS-1のMSRとJERS-1のSAR)の極域観測データにも適用できるように改めた。つぎに、地上観測データが存在する北海道を観測したMSRデータを解析して有効性や限界を確かめ、アルゴリズムを改良した。現在は、地上観測データの無い極域を観測したMSRデータを解析している。北海道の観測データの解析では、輝度温度として得られるMSRデータから、積雪表面における放射率を推定する方法を明らかにしたことも成果の一つである。PALSAR等のL-band SARについての検討では、データに含まれる位相情報と振幅情報を利用して、深さ、密度、含水率を推定する解析アルゴリズムを開発した。これを、平成16年2月に北海道で実施されたPi-SAR航空機検証実験で取得される観測データに適用し、有効性を実証する予定である。マイクロ波放射計と合成開口レーダが陸域(北海道)の積雪を衛星観測したデータの解析手法を開発し、積雪物理量の推定を試みてきた。また、この手法を極域の氷床や海氷を覆う積雪にも適用できるように工夫してきた。

推定しようとする物理量は積雪の深さ、層の数、粒径、密度、含水率であるが、それぞれの衛星センサの方式と性能により推定できる物理量の数と精度に違いが生じる。精度は違っても共通に推定できる物理量を見出し、極域における積雪の長期的な動態を知る方法を実証的に明らかにすることが本研究の目的である。衛星マイクロ波放射計については、MOS-1のMSRとADEOS-2のAMSRを検討対象とした。ここでは、衛星観測データから積雪表面における放射率を求める方法を工夫した。また、MSRの2週波数の観測データを使って、3つの未知物理量(深さ、粒径、密度)の推定を行うアルゴリズムを開発した。このアルゴリズムが、極域で取得されたMSR観測データに対して適用可能であるかの検証を現在行っている。MSRより多くの物理量を精度よく推定できる見込みのあるAMSRについては、短期間で観測を終えたため、アルゴリズムの有効性を検証できなかった。衛星搭載合成開口レーダについては、L-bandの周波数を利用し、高い地表分解能が得られるJERS-1のSAR(入射角固定)とALOSのPALSAR(入射角可変)を検討対象とした。これらの衛星観測データから、北海道や極域の積雪を対象に、深さと密度を推定する二つの手法を開発した。PALSARによる観測に先立ち、同等の性能を有するPi-SARによる積雪の航空機観測が、2004年と2005年の2月に実施された。観測データに、二つのアルゴリズムを適用して積雪物理量を推定し、地上で取得した物理量と比較を行い、アルゴリズムの有効性を検証中である。衛星に搭載されたマイクロ波放射計と合成開口レーダが積雪を観測したデータの解析手法を開発し、積雪物理量の推定を試みてきた。また、この手法を極域の氷床や海氷を覆う積雪にも適用できるように工夫してきた。まず、北海道のMSR観測データから積雪表面における放射率を求める方法を考案した。求めた2週波数の放射率から、3つの物理量(深さ、粒径、密度)の推定を行うアルゴリズムを開発し、結果が地上の積雪状況に合うことを確かめた。また、地上データの無い極域で取得されたMSR観測データに対しても適用可能であることを確かめた。AMSRは、多くの物理量を精度よく推定できる見込みがあったが、短期間で観測を終えたため、開発したアルゴリズムの有効性を十分に検証できなかった。
大学教育のエスノグラフィー

この研究は日本、中国、アメリカ、ベルギーの大学で、どのような教育実践が行われているのかについて調査した。大学側の教育理念だけではなく、大学教育の関係者、特に大学生と教員はそれぞれどのようの思いがあるのかを理解することを目的とした。この研究結果は日本のこれからの大学教育実践の発展について参考になると考えている。本研究の目的は三つの国の社会歴史文化背景における大学文化がいかに構築されたかを理解することである。エスノグラフィーの手法でフィールドワークを行い、キャンパスライフや授業の観察、学生や教員およびほかの大学関係者にインタビュー、大学の歴史や状況に関するドキュメントなどを調査し、質的研究のデータを収集する。計画によると昨年度と今年度は日本、中国、アメリカの各国にて2つずつの大学で各年度それぞれフィールドワークを実施する予定である。2012年5月と8月に中国の大学二つ、2013年3月にアメリカの大学一つにてフィールドワークを実施した。日本の大学でも日常的にデータ収集を行っている。以上のフィールドワークで収集したデータを最初段階の分析を行い、2013年2月にペンシルベニア大学で開催された34th AnnualEthnography in Educationの学会で中国と日本の大学生の大学教育の認識の違いについて発表した。この発表は日本と中国の文化背景による学生たちの認識の構築に焦点を当てたものである。上記で言及したフィールドワークでのデータ収集とデータ分析結果の学会発表は今後の研究を進める方針に重大な意義を持つ。本研究は社会歴史文化背景における大学教育実践の解釈を目指している。エスノグラフィーの手法を用い、日本、中国、アメリカの大学でフィールドワークを行い、フィールドノート、インタビュー、ドキュメントなどのデータにディスコース分析を行った。2012年度は、主にインタビューデータを元にし、日本、中国の学生の大学教育に関する認識に焦点を当てて分析した。2013年度は、ナラティブ、特にディジタル・ナラティブのデータを加えて大学生の自己認識(subjectivity)について分析した。2014年度は、それまで二年間のデータの総合的な分析見直しを行った。文化背景における教育理念についてのディスコース分析と、学生の視点から見た教育実践のディスコース分析という二つの側面から論文の作成を進めている。2014年7月末から二週間、中国寧夏回族自治区にて少数民族の教育についてフィールドワークを行った。学会参加として、2014年5月末、中国石家荘で行われたKnowledge Globalization Conferenceに参加し、世界中の異なる教育現場の研究者と交流し、自分のデータの分析視点を広げた。10月に大阪で開催されたInternational Academic Conference on Social Sciences (IACSS)にてSituated Learning and Learner Agencyのタイトルで論文を発表した。エスノグラフィーの手法を用い、日本、中国と第三国の大学でフィールドワークを行い、フィールドノート、インタビュー、ドキュメントなどのデータを収集しディスコース分析を行った。2012年度は、主にインタビューデータを元にし、日本、中国の学生の大学教育の認識に焦点を当てて分析した。2014年度は、それまで二年間のデータの総合的な分析の見直しを行った。教育政策についてのディスコース分析と、学生の視点から見た教育実践のディスコース分析という二つの側面から分析結果をまとめていった。2015年度は特別研究員として滞在していたベルギーのゲント大学でフィールドワークを続けていた。大学の授業に参加し、授業の過程を録画し、ビデオデータを収集した。授業外で、学生へのインタビューも行った。上記のデータの分析結果を二回に渡って、2015年11月スペインのSeveliaで行われた学会ICERI2015にで、INVESTIGATING VIRTUAL LEARNINGCOMMUNITY: A QUALITATIVE CASE STUDYというタイトルで、28年3月スペインのValeciaで行われた学会INTED2016にで、LEARNING ONLINE AND OFFLINE: HOW DO THEY GO TOGETHERというタイトルで研究結果を発表した。四年間渡って、日本と海外四つの国のキャンパスでの教育実践の多様性なデータを収集し、文化背景のおける大学教育の意義と方法について理解を深めた。研究成果をまとめ、日本の大学教育の今後の発展に貢献したいと願っている。アメリカと日本の大学の学期のずれと、受け入れ側教員と私の日程の都合の不具合で予定したアメリカの大学でのフィールドワークが遅れたことが研究が遅れた理由の一つである。そして、3年目のデータ分析をまとめる時点で多視点的になり、予想より時間がかかった。社会言語学主に遅れたのは予定したアメリカの大学へのフィールドワーク調査である。理由としては2012年度に関しては、アメリカ側受け入れ予定の先生が春学期研究休暇のため、取りやめとなった。2013年度に関しては、私の大学内の業務日程とアメリカ側受け入れ予定の先生の日程が合わないためである。

一つ目、申請計画で参加する予定だった2012年9月にスペインで開催される予定だったEuropean Conference on Educational Researchについて、科研費の申請が承認された時点で、発表の申請締切日が過ぎていたため、参加することを断念した。二つ目、2013年3月に行う予定だったもう一つのアメリカの大学でのフィールドワークは、受け入れ予定の先生が2013年春学期研究休暇を承認されたため、取りやめになった。アメリカの大学で実施を予定していたフィールドワークがお互いの不都合のため、行えなかったことと、それに関連してデータ分析の学会発表も遅れたことは次年度使用金額が生じた理由である。アメリカでのフィールドワーク調査に関して、私と受け入れ側の日程合わせ関係や滞在する時間の制限による、データ収集の方法を見直すべきである。2013年度は日本の大学キャンパスで、エスノグラフィーに加えてディジタルナラティブの手法を用いオーディオ・ビジュアル的なナラティブデータを収集した。その経験を生かして、アメリカの大学生や教員などとのインタビューを行う方法が考えられる。大学教育に関するデータを収集しながら、ディジタル時代の新たなデータ収集の方法を探索したい。2013年2月と5月の研究発表のフィードバックによる、更なるフィールドワークを行い、データ収集と分析を進める。従来の観察とインタビューを続けて行う以外に、今年はデータの種類にビジュアルデータを加えていく予定である。ディジタル・ナラティブの手法のデータ収集を取り入れたい。この方法を取り入れる理由は二つである。まず、データの内容と研究視点の面である。今までのフィールドワークで行った観察やインタビューは、研究者である私の視点から教育現場を見て、私のスタンスから質問し、そのデータを私が設定した理論的な枠組みを取り入れた解釈である。これから研究対象者(学生や教員など)が自分自身の視点から、ナラティブの形式で大学の教育経験を語って欲しい。そのため、ナラティブのデータ収集を行う。次に、データ形式の面である。ディジタル時代に入り、大学教育実践の中も内容から表現の形式まで深くインターネット化、ディジタル化されている。その変化を深めている大学文化を理解するために研究者自身もディジタルの手法の表現を理解する必要があり、更にその表現方法を分析する必要がある。そして、オーディオ・ビジュアル的なデータはさらに強い記録的、表現的な力を持つと思われる。
Thellium-201を用いた基礎的研究(心疾患モデルでの心筋重量比の推定)

1.実施内容(1)ラットを用いた慢性心負荷モデルの作成;モノクロタリン投与による右室圧負荷、肺動脈弁閉鎖不全惹起による右室容量負荷、腹部大動脈-下大静脈吻合による両室容量負荷、大動脈縫縮による左室圧負荷および大動脈弁破壊による左室容量負荷モデルを作成した。(2)正常ラットおよび作成した負荷ラットを麻酔し人工呼吸器管理下に心拍数、血圧、両室収縮期および拡張期圧を測定した。その後、3040μCiの塩化タリウムを静注し約1015分後に脱結屠殺した。(3)心臓を摘出し心室中隔を含む左室と右室に分け重量を測定した後、ガンマウェルカウンターでradioactivityを測定した。2.結果(1)心筋重量の変化;右心室の重量/体重は正常コントロールに比し右室圧負荷、右室容量負荷および両室容量負荷モデルにおいて有意に造影した(p<0.01)。左心室重量/体重は左室圧負荷および左室容量負荷モデルで増加した(p<0.01)。左右心筋重量比はコントロールに比べ右室圧負荷(p<0.01)、右室容量負荷(p<0.01)および両室容量負荷モデル(p<0.05)において低下し、左室圧負荷および左室容量負荷モデルで増加した(p<0.01)。(2)心室圧の変化;右室収縮期圧は右室圧負荷(p<0.01)、右室容量負荷(p<0.01)および左室容量負荷モデル(p<0.05)で増加した。右室拡張期圧は、右室容量負荷モデルで増加した(p<0.01)。左室収縮期および拡張期圧はともに両室容量負荷、左室圧負荷および左室容量負荷モデルで増加した(p<0.01)。左右心室圧比は右室圧負荷および両室容量負荷モデルにおいて低下し(p<0.01)、左室圧負荷モデルで増加した(p<0.01)。(3)左右タリウム比は負荷の種類によらず左右心筋重量比と極めて良好に相関し(r=0.982,p<0.001)、圧負荷モデル群においてのみ左右心室圧比と良好に相関した(r=0.039,p<0.001)。3.知見左右心筋重量比および圧負荷疾患における左右心室圧比の推定には、左右タリウム比を測定することが有用であると示唆された。
ヒト骨肉腫培養細胞におけるインテグリン分子の発現と浸潤能における役割

我々はこれまでに,低転移性であるヒト骨肉腫培養細胞OSTを用いて,細胞外マトリックスの分解に関わるMMP-9の発現が,浸潤転移にどのような役割を果たしているかを調べてきた.今回は,OSTにおける各種インテグリンの発現をRT-PCR法を用いてスクリーニングし,TNFα刺激によりどのインテグリンが増加あるいは減少するのか調べた.また,Fibronectin(FN),vitronectin(VN)をリガンドとする細胞接着試験を行った,さらに,細胞内伝達機構を調べる目的でPKC assayも行った.結果と考察未処理OSTはα2,α3,α5,α6,αv,β1,β3,β5を発現しているが,TNFα刺激を受けるとα5の発現が激減した.免疫沈降法においても細胞表面のα5の減少が示された.αv,β1,β3,β5の発現には差は見られなかった.細胞接着試験では,FNに対する接着性に差はなかったが,VNに対する接着性はTNFα刺激で有意に低下した.またPKC活性はTNFαにより有意に低下した.FNは現在までに,FN分子中の細胞接着に関与する構造はRGD配列であることがわかっており,主としてα5β1(VLA-5)インテグリンがこの配列を認識する細胞膜レセプターであると言われている.OSTではα5の発現低下により正常に機能するフィブロネクチンレセプターの合成が障害され,基質に対する接着性の低下が運動能の増加をもたらし,さらにはMMP-9の分泌増加と相まって最終的にOSTの転移の増加につながったのではないかと推測している.PKC assayにおいて,protein kinaseの活性化剤として知られているPMA刺激でもPKCの活性が低下したので,OSTではインテグリンによって引き起こされる細胞内伝達機構にalternative pathwayがある可能性が示唆された.我々はこれまでに,低転移性であるヒト骨肉腫培養細胞OSTを用いて,細胞外マトリックスの分解に関わるMMP-9の発現が,浸潤転移にどのような役割を果たしているかを調べてきた.今回は,OSTにおける各種インテグリンの発現をRT-PCR法を用いてスクリーニングし,TNFα刺激によりどのインテグリンが増加あるいは減少するのか調べた.また,Fibronectin(FN),vitronectin(VN)をリガンドとする細胞接着試験を行った,さらに,細胞内伝達機構を調べる目的でPKC assayも行った.結果と考察未処理OSTはα2,α3,α5,α6,αv,β1,β3,β5を発現しているが,TNFα刺激を受けるとα5の発現が激減した.免疫沈降法においても細胞表面のα5の減少が示された.αv,β1,β3,β5の発現には差は見られなかった.細胞接着試験では,FNに対する接着性に差はなかったが,VNに対する接着性はTNFα刺激で有意に低下した.またPKC活性はTNFαにより有意に低下した.FNは現在までに,FN分子中の細胞接着に関与する構造はRGD配列であることがわかっており,主としてα5β1(VLA-5)インテグリンがこの配列を認識する細胞膜レセプターであると言われている.OSTではα5の発現低下により正常に機能するフィブロネクチンレセプターの合成が障害され,基質に対する接着性の低下が運動能の増加をもたらし,さらにはMMP-9の分泌増加と相まって最終的にOSTの転移の増加につながったのではないかと推測している.PKC assayにおいて,protein kinaseの活性化剤として知られているPMA刺激でもPKCの活性が低下したので,OSTではインテグリンによって引き起こされる細胞内伝達機構にalternative pathwayがある可能性が示唆された.
1)Aktの下流で機能する分子の検索Aktの下流でEs細胞の分化多能性を制御する因子を明らかにするために、Aktを活性化させたEs細胞についてcDNAマイクロアレイを用いた解析をおこなった。この結果を参考に、本年度も引き続き下流分子の同定をおこなった。候補となる遺伝子を強制発現するES細胞を作成したが、HF非存在下で未分化性を維持することのできるES細胞を得ることができなかった。また、Aktの下流で機能する分子を同定する為のスクリーニング系を構築し、下流分子の同定をおこなった。スクリーニング系としてPCA法(Protein Complementation Assay)を用いた。ES細胞の遺伝子ライブラリーを作成し、Aktをbaitとしてスクリーニングを行ったが、HF非存在下で未分化性を維持できるAktの下流分子得るととができなかった。2)新規遺伝子の解析cDNAマイクロアレイ解析の結果、コントロールのES細胞では、分化に伴い発現が減少するが、Akt-ES細胞では発現が変化しない200個の遺伝子の中からホメオポックスを持つ新規遺伝子を単離し、Eoboxと命名した。これまでにEoboxを発現するマウスES細胞を樹立し、この遺伝子は、ES細胞の未分化性を維持には関与しないことが明らかになっている。また、各組織においては、卵巣特異的に発現しており、特に生殖細胞で発現することを明らかにしている。この遺伝子の生体内での機能を明らかにするために、昨年に引き続き、欠損マウスの作製を試みた。その結果、Eobox欠損マウスは、野生型マウスと比べて特に変わった表現系を示さないことが明らかになった。交付申請書の記載に基づいて研究を行い、以下の成果を得た。1.Aktの下流で機能する分子の検索:我々は、PI3キナーゼシグナルの下流であるセリン・スレオニンキナーゼAktの活性化型を発現するマウスES(Akt-ES)細胞は、LIF非存在下において未分化性を維持できることを既に見出している。今回、F活性化型Akt発現により、LIF非存在下で分化多能性を維持できるか調べるために、Cre-loxPシステムを用いて活性化型Aktを欠失できるES(LoxP-Akt-ES)細胞を樹立した。LIF非存在下で未分化性を維持した後にAktを欠失したLoxP-Akt-ES細胞は、キメラマウスに寄与することができ、in vitroで様々な細胞へと分化した。この結果から、活性化型Akt発現によりLIF非存在下で分化多能性が維持できることが示された。そこで、Aktの下流でES細胞の分化多能性を制御している因子を同定するために、Akt-ES細胞についてcDNAマイクロアレイ解析を行った。解析の結果、コントロールのES細胞において、分化に伴い発現が変化する遺伝子の大部分は、Akt-ES細胞では発現が変化しないごとが明らかになった。2.新規ホメオボックス遺伝子の解析:cDNAマイクロアレイ解析の結果、コントロールのES細胞では、分化に伴い発現が減少するが、Akt-ES細胞では発現が変化しない200個の遺伝子の中ゆらホメオボックスを持つ新規遺伝子を単離した。まず、この遺伝子のES細胞における機能を解析するために、新規ホメオボックス遺伝子を発現するマウスES細胞を樹立した。このES細胞は、コントロールの細胞と同様に、LIF非存在下では未分化性を維持することはできなかった。次に、各組織における新規ホメオボックス遺伝子の発現パターンを調べたところ、卵巣特異的に発現しており、特に生殖細胞で発現することが明らかになった。1.ES細胞の分化多能性維持におけるAktの機能:これまでにPI3キナーゼシグナルの下流であるセリン・スレオニンキナーゼAktの活性化型を発現するマウスES(Akt-ES)細胞は、LIF非存在下においても未分化性を維持できることを明らかにした。今回、活性化型Akt発現により、LIF非存在下で分化多能性を維持できるか調べるために、Cre-loxPシステムを用いて活性化型Aktを欠失できるES(LoxP-Akt-ES)細胞を樹立した。以上の結果をまとめ、『Oncogene』誌に論文を発表した。平成18年度は、Aktの下流で機能する分子を同定する為のスクリーニング系を構築し、Aktの下流分子を明らかにする予定である。2.新規ホメオボックス遺伝子の解析:cDNAマイクロアレイ解析の結果、コントロールのES細胞では、分化に伴い発現が減少するが、Akt-ES細胞では発現が変化しない200個の遺伝子の中からホメオボックスを持つ新規遺伝子を単離した。これまでに新規ホメオボックス遺伝子を発現するマウスES細胞を樹立し、この遺伝子は、ES細胞の未分化性を維持に働かないこと、各組織においては、卵巣特異的に発現しており、特に生殖細胞で発現することを明らかにしている。この新規ホメオボックス遺伝子の生体内での機能を明らかにするために、欠損マウスの作製を試みた。平成18年度は、引き続き欠損マウスの作製をおこなう予定である。
この結果を参考に、本年度も引き続き下流分子の同定をおこなった。候補となる遺伝子を強制発現するES細胞を作成したが、HF非存在下で未分化性を維持することのできるES細胞を得ることができなかった。また、Aktの下流で機能する分子を同定する為のスクリーニング系を構築し、下流分子の同定をおこなった。スクリーニング系としてPCA法(Protein Complementation Assay)を用いた。ES細胞の遺伝子ライブラリーを作成し、Aktをbaitとしてスクリーニングを行ったが、HF非存在下で未分化性を維持できるAktの下流分子得るととができなかった。2)新規遺伝子の解析cDNAマイクロアレイ解析の結果、コントロールのES細胞では、分化に伴い発現が減少するが、Akt-ES細胞では発現が変化しない200個の遺伝子の中からホメオポックスを持つ新規遺伝子を単離し、Eoboxと命名した。これまでにEoboxを発現するマウスES細胞を樹立し、この遺伝子は、ES細胞の未分化性を維持には関与しないことが明らかになっている。また、各組織においては、卵巣特異的に発現しており、特に生殖細胞で発現することを明らかにしている。この遺伝子の生体内での機能を明らかにするために、昨年に引き続き、欠損マウスの作製を試みた。その結果、Eobox欠損マウスは、野生型マウスと比べて特に変わった表現系を示さないことが明らかになった。
新規駆動系実現のための超大偏心許容形等速軸継手の研究開発

平成30年度においては,計画通り5非線形動力学解析と実験による限界偏心時の特性把握を実施した.平成29年度は,当初の計画をより発展させて,ばねによって適切な予圧を作用させることのできる新規改良機構を考案し開発試作した.この改良は,動力学解析モデルによりゴシックアーク溝の溝中心にボールを安定させ,回転変動率を低下させるために有効であることが確認できたため,本年度はこの構成を基に実験装置として,軸継手内部に作用する力を測定する装置を考案し,設計製作及び実験を行った.この実験装置は,ボールが接触する溝を別体構成とし,その間にピエゾ形圧電素子を配置している.さらに,溝の位置精度を向上させるために,ボルト固定後に再度溝形状の加工を実施し,溝を一体加工した場合と同様な精度を得ている.この実験装置により,軸継手内部に作用する力の測定が可能になり,動力学理論解析との比較整合性の検証が可能になった.限界偏心時の再現自体を実験装置により実施すると,実験装置が破損し,正しい計測が不可能になる場合がある.そこで,限界偏心やオーバーロードの再現は,解析モデルにて実施することにする.この内部力測定の実験結果により,実験と動力学理論解析との整合性は,定性的には一致しており,1回転中2回の力のピークが確認できている.この箇所で適正なHertz接触面圧になるように,作用トルク,回転数,及び偏心量を決定すると良いことがわかる.実験と動力学理論解析とを定量的に一致させるためには,摩擦特性の変化などを理論的に考慮する必要があり,今後の研究を待たなければいけないが,回転中の回転角度相対位置(ボール,溝,及び保持器)にて,限界偏心時の特性を把握できることがわかったことは,新規改良機構案,理論解析モデルの有効性の確認とともに大きな成果であった.これらの理論解析と実験解析を基に設計基準となる寿命特性への研究と繋げていく.本研究開発の目的は、超大偏心量許容形等速軸継手の部品間のすきまやHertz接触などを考慮した理論解析と実験から、等速性と動力伝達率への影響を明らかにすることである。さらに、限界偏心時の特性を実験により確認し、解析により限界偏心時の特性を理論的に把握することである。初年度である平成28年度においては、計画通り次の3項目を実施した。1等速性及び動力伝達効率測定試験機の製作完了:この試験機は、入力側に配置されたサーボモータにより、軸継手に対して一定速回転入力(最大3000min-1)を与え、出力側に配置されたパウダブレーキにより動力吸収を行う構造である。軸継手の入出力両側にはそれぞれトルクメータとロータリエンコーダ(1回転6000パルス分解能)を配置し、等速性および動力伝達効率の同時計測可能なものとしている。特に等速性については、微小な回転変動を計測する必要があるため、0.06degの角度分解能を有している。2非線形動力学解析基本モデルの作成完了:すき間やHert接触などの非線形要素を考慮した非線形動力学解析基本モデル(3次元解析モデル)の作成を完了した。モデルの溝形状については、本年度当初予定していたサーキュラアーク溝だけでなく、ゴシックアーク溝についても基本モデルを完成した。まずは、接触部の解析上の摩擦係数を0.01として解析を行った結果、回転変動率の実験結果と定性的に一致していることを確認することができた。3動力伝達効率測定実験(動力伝達効率から非線形動力学的解析の摩擦係数の同定):トルクメータと回転数から、動力伝達効率の算出を行っている。その中で、回転数計測の角度分解能が高いため、ノイズと思われる変動成分がデータに加算されている。これらをフィルタリング処理し、動力伝達効率を算出する。ここで算出された動力伝達効率と回転変動率から、解析上の摩擦係数をさらに同定していく。超大偏心量許容形等速軸継手の研究開発の2つの重要な要素である実験と解析において、基本となる『等速性及び動力伝達効率測定試験機』の製作が完了したことと、『非線形動力学解析基本モデル(3次元解析モデル)』の作成が完了したことは、この研究を遂行する基礎ができたことである。等速性及び動力伝達効率測定試験機のデータ取得も等速性については順調に行われているが、動力伝達効率については、ノイズ成分が加算されていることを発見し課題として抽出された。これらはフィルタリング処理などを行うなどの対策を講じている。非線形動力学解析基本モデル(3次元解析モデル)については、本年度当初予定していたサーキュラアーク溝だけでなく、ゴシックアーク溝についても基本モデルを完成することができ、解析については研究計画より大きく進捗させることができた。実験と解析の基礎が完了し、試験機については若干のデータ処理上の調整は残すものの、解析モデルについては、当初計画を上回る進捗が得られたことから、『(2)おおむね順調に進展している。』と判断している。本研究開発の目的は,超大偏心量許容形等速軸継手(以下軸継手)の部品間のすきまやHertz接触面圧などを考慮した理論解析と実験から,等速性と動力伝達率への影響を明らかにすることである.二年目である平成29年度においては,計画通り4非線形動力学解析によるパラメータスタディ(等速性変動要因及び動力損失要因の抽出)を実施した.平成28年度に作成した本軸継手の非線形動力学解析基本モデルを用いて,等速性の変動要因を抽出し,等速性の変動を0.5%以下に抑制する最適形状を決定していく.

このプロセスは,主に部品間のすきまなどをパラメータとし,非線形動力学解析を行う.具体的なパラメータとしては,保持器の孔とボールとすきま,保持器と回転部材の軸方向すきま,ボールと案内溝の回転時の接触角,ボールに対する案内溝の半径,及び保持器の孔形状などが挙げられる.基本的に回転変動率は,高回転になるほど回転変動率が下がる傾向にある.しかし,偏心量1mmの場合1000min-1以上は回転変動率が高い場合がある.構造的な対策としては,ゴシックアーク溝内のボールを溝中心位置に安定させるために,軸方向の予圧が必要だと考えられる.そこで平成29年度は,当初の計画をより発展させて,ばねによって適切な予圧を作用させることのできる新規改良機構を考案し設計した.この動力学解析モデルを作成し,ばねにより軸方向力を作用した軸継手の性能,ゴシックアーク溝での高回転時の回転変動率を解析し比較した.その解析では,ばね定数が回転変動に与える影響は少なく,一定の予圧を与えれば安定し,ゴシックアーク溝の溝中心に安定させ,回転変動率を低下させるために,軸方向予圧が必要であることがわかった.これらの新規改良機構案と解析による性能確認を実施できたことは大きな成果であった.平成29年度に計画していた動力損失要因の追求より,新たな観点からの軸継手の新規改良機構案の検討を優先させたが,概ね順調に進行している.この新規改良機構案がブレークスルーとなるため,今後の研究スピードの加速が期待できる.平成30年度においては,計画通り5非線形動力学解析と実験による限界偏心時の特性把握を実施した.平成29年度は,当初の計画をより発展させて,ばねによって適切な予圧を作用させることのできる新規改良機構を考案し開発試作した.この改良は,動力学解析モデルによりゴシックアーク溝の溝中心にボールを安定させ,回転変動率を低下させるために有効であることが確認できたため,本年度はこの構成を基に実験装置として,軸継手内部に作用する力を測定する装置を考案し,設計製作及び実験を行った.この実験装置は,ボールが接触する溝を別体構成とし,その間にピエゾ形圧電素子を配置している.さらに,溝の位置精度を向上させるために,ボルト固定後に再度溝形状の加工を実施し,溝を一体加工した場合と同様な精度を得ている.この実験装置により,軸継手内部に作用する力の測定が可能になり,動力学理論解析との比較整合性の検証が可能になった.限界偏心時の再現自体を実験装置により実施すると,実験装置が破損し,正しい計測が不可能になる場合がある.そこで,限界偏心やオーバーロードの再現は,解析モデルにて実施することにする.この内部力測定の実験結果により,実験と動力学理論解析との整合性は,定性的には一致しており,1回転中2回の力のピークが確認できている.この箇所で適正なHertz接触面圧になるように,作用トルク,回転数,及び偏心量を決定すると良いことがわかる.実験と動力学理論解析とを定量的に一致させるためには,摩擦特性の変化などを理論的に考慮する必要があり,今後の研究を待たなければいけないが,回転中の回転角度相対位置(ボール,溝,及び保持器)にて,限界偏心時の特性を把握できることがわかったことは,新規改良機構案,理論解析モデルの有効性の確認とともに大きな成果であった.
顎骨骨髄炎患者由来株のβ-lactam剤耐性とβ-lactamase活性

顎骨骨髄炎と診断され、外科的療法が必要である2症例(症例AとB)から試料を採取した。すなわち、腐骨除去術施行時に腐骨を採取し、滅菌した乳鉢と乳棒で磨砕後嫌気ボックス内にて輸送用液体培地(RTF)を加えよく撹拌した(原液)。この原液をRTFで希釈しCDC処方嫌気性菌用血液寒天培地(血液寒天培地)に塗抹後嫌気培養した結果、黒色色素を産生するコロニーが多数発育した。ついで、発育したコロニーのグラム染色性と酸素要求性を調べると両症例ともすべて嫌気性グラム陰性桿菌であった。生化学的性状試験とガスクロマトグラフィーの結果から属を同定すると黒色色素産生菌はすべてPrevotella intermedia(P.intermedia)であった。最小発育阻止濃度(MIC)と最小殺菌濃度(MBC)を、微量液体希釈法を用いて調べた結果、P.intermediaに対するβ-lactam剤のMIC_<90>はペニシリンG、アンピシリン、ピペラシリン、セファクロル、セファロチン、セフメタゾール、ラタモキセフはいずれも100μg/ml以上で、これら薬剤の抗菌性は低かった。しかし、イミペネムのMIC_<90>は12.5μg/mlであり抗菌性は高かった。ニトロセフィン法とβ-チェック法でβ-lactamase産生性を調べたところ、約30%の菌株から活性が検出された。ミクロヨード法でアンピシリンとセファゾリンを基質としてβ-lactamase活性を調べたところ高度産生株のβ-lactamase活性は50250mU/mgであった。EDTA-2Naを用いて外膜透過性障害を測定するとMICが1/4以下になる菌株が数株認められた。以上の事実は、顎骨骨髄炎の発症と進展に薬剤耐性P.intermediaが関与し、その耐性機構には少なくともβ-lactamaseと外膜透過性障害が関係していることを示唆している。
Egg-in-Cubeプラットホーム：3次元血管誘導と力学刺激応答試験への応用

当該申請者は,ニワトリの初期胚を用いて安価・簡易・高効率に薬剤試験や病態シミュレーションに利用できる生体プラットホーム(Egg-in-Cube)の開発を推進している.本研究課題では,これまで確立してきた2次元的な血管網の誘導技術を3次元に発展させるとともに,従来技術では実現が困難であった血管網の局所的な力学刺激応答試験に応用することを目的としている.本年度は以下のような研究を行なった.3次元的に血管を部分誘導する技術の確立:血管誘導を行うための流路(チャネル)の作製プロセスを改良し,血管誘導の成功率を60%程度(従来比2倍以上)まで向上させることに成功した.また,チューブ内(円筒形状)に誘導した血管は像の屈折により観察が難しいという問題に対応するために,寸法精度と観察性の高い四角形状のPDMSチューブの作製方法についても検討し,直径1 mmで長さ100 mm以上の長さのものが作製できるようになった.タイムラプス観察システムの開発:従来は1つの胚に対して1方向から撮影に限定されていたが、ロボットシステムと組み合わせることで新たに10つの胚に対して5面からの撮影を行うことができる観察システムを開発した.また,実際に1週間以上に渡って5分間隔で連続的な観察を行い,胚が成長を停止する様子等の詳細な観測ができるようになった.血管誘導メカニズムの解明:血管が誘導される際,流路の容積や形状がどのように影響しているかをより詳細に調査するために,人工殻の実験モデルを作成した.またこれに対して,圧力センサやカメラを取り付けて外部からシリンジポンプで精密に陰圧をかけた際の流路自体の変形や圧力変化について確認を行った.結果として,PDMS膜とチューブの接続部分の形状が血管の誘導成功率に大きく影響しているという知見が得られた.3次元的な血管誘導の成功率が大きく向上しただけでなく,誘導のメカニズムについても重要なパラメータが明らかになってきた.今後も,各種センサを用いた定量的かつ精密な計測を基盤として,生物と人工物を組み合わせたシステムの解析を進める.3次元血管誘導について:寸法精度と観察性の高い四角形状のPDMSチャネルを作成できるようになったため,これを取り付けた人工殻を用いて血管誘導した際のニワトリ胚成長への影響をより詳細に調査する.さらに,チャネルの中にどのように血管や血球が侵入するかという点について,開発したタイムラプス観察システムによって数日間に渡って調査を行い,通常の血管形成との差異を明らかにする.血管誘導のメカニズム解明について:実験モデルを用いた解析をさらに進めるともに,解析モデル(数理モデル)の作成についても着手し実験では条件変更や計測が難しいパラメータ(例えば酸素濃度勾配の変化等)の影響について調査する.最終的には,血管誘導に寄与する重要なパラメータを明らかにし,誘導長の制御性や誘導率をさらに向上させるための方法論を見出す.誘導した血管の力学刺激と評価について:実際に3次元的に部分誘導した血管のみに刺激を加えた際の生体応答を調査する.誘導した血管を含むチャネルをアクチュエータによって操作し,血管や血球の刺激応答計測が行えるようにする.また,その際の細胞個々の動態をより詳細に観察するために発光タンパク質を生成するトランスジェニックニワトリ胚やウズラ胚を導入することについても検討を行う.当該申請者は,ニワトリの初期胚を用いて安価・簡易・高効率に薬剤試験や病態シミュレーションに利用できる生体プラットホーム(Egg-in-Cube)の開発を推進している.本研究課題では,これまで確立してきた2次元的な血管網の誘導技術を3次元に発展させるとともに,従来技術では実現が困難であった血管網の局所的な力学刺激応答試験に応用することを目的としている.本年度は以下のような研究を行なった.3次元的に血管を部分誘導する技術の確立:血管誘導を行うための流路(チャネル)の作製プロセスを改良し,血管誘導の成功率を60%程度(従来比2倍以上)まで向上させることに成功した.また,チューブ内(円筒形状)に誘導した血管は像の屈折により観察が難しいという問題に対応するために,寸法精度と観察性の高い四角形状のPDMSチューブの作製方法についても検討し,直径1 mmで長さ100 mm以上の長さのものが作製できるようになった.タイムラプス観察システムの開発:従来は1つの胚に対して1方向から撮影に限定されていたが、ロボットシステムと組み合わせることで新たに10つの胚に対して5面からの撮影を行うことができる観察システムを開発した.また,実際に1週間以上に渡って5分間隔で連続的な観察を行い,胚が成長を停止する様子等の詳細な観測ができるようになった.血管誘導メカニズムの解明:血管が誘導される際,流路の容積や形状がどのように影響しているかをより詳細に調査するために,人工殻の実験モデルを作成した.またこれに対して,圧力センサやカメラを取り付けて外部からシリンジポンプで精密に陰圧をかけた際の流路自体の変形や圧力変化について確認を行った.結果として,PDMS膜とチューブの接続部分の形状が血管の誘導成功率に大きく影響しているという知見が得られた.3次元的な血管誘導の成功率が大きく向上しただけでなく,誘導のメカニズムについても重要なパラメータが明らかになってきた.今後も,各種センサを用いた定量的かつ精密な計測を基盤として,生物と人工物を組み合わせたシステムの解析を進める.