hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
皮膚リーシュマニア症におけるリーシュマニア原虫とmacrophargeの相互関係

1)対象:南米エクアドル共和国、エルカルメン市の限局性皮膚リーシュマニア症(LCL)患者35例、エスメラルダス地方の汎発性皮膚リーシュマニア症(DCL)患者1例、及びLeishmania(L)amazonensis感染BALB/cマウス20匹。2)方法LCL35例中、Smear検査もしくは原虫培養にてリーシュマニア原虫が確認された13例の病変部より得られた皮膚切片に対し、抗ヒトリゾチーム抗体を用いた免疫染色、電顕的観察を行った。免疫染色ではリーシュマニア原虫感染マクロファージの活性を検討した。電顕的観察ではリーシュマニア原虫感染マクロファージのparasitophorous vacuole(PV)の形成を観察した。リーシュマニア感染BALB/cマウスでは病変部より得られた皮膚切片のPV形成を電顕にて観察した。3)結果マクロファージ活性について:LCLでは抗リゾチーム抗体陽性細胞が真皮全層にわたり観察されたが感染マクロファージと非感染マクロファージでは染色態度に著明な差はみられなかった。これに対しDCLでは感染マクロファージ、非感染マクロファージとも非常に弱く染色された。PV形成について:DCLではlargehuge PVが形成されたが、LCLではPVはほとんど観察されなかった。感染BALB/cマウスでは全例largehuge PVが観察された。4)考案1)対象:南米エクアドル共和国、エルカルメン市の限局性皮膚リーシュマニア症(LCL)患者35例、エスメラルダス地方の汎発性皮膚リーシュマニア症(DCL)患者1例、及びLeishmania(L)amazonensis感染BALB/cマウス20匹。4)考案
蛋白質ナノチューブを用いた機能分子システムの創製

蛋白質を機能階層的に組織化する方法により、中空シリンダー構造のナノチューブやコア-シェル型のナノクラスターを合成し、その分子配置や配列を利用した新しい機能の創出、さらにはそれらを用いた機能分子システムの創製に成功した。1人工金属蛋白質、2蛋白質ナノチューブ、3蛋白質クラスターに関する成果を研究報文22報として発表。成果内容は、新聞、英国化学会誌(Chemistry World)などで紹介され、注目を集めている。生命現象の根幹を支配し、多彩な高次機能をつかさどる蛋白質は、分子進化により創り出された究極の超構造体である。その蛋白質を機能材料創製の基本ユニットとして用いる戦略は、合理的分子設計の一つであり、バイオナノテクノロジーのフロンティアといえる。本研究は、蛋白質や金属ナノ粒子を所望の序列で階層的に組織化する方法(鋳型内交互積層法)により中空シリンダー構造のナノチューブを構築し、その一次元内孔空間や管壁の動特性と協奏した機能の発現、さらにはそれらを基板と融合させ、従来に類例のない機能分子システムの創製を目指す。蛋白質ナノチューブの合成と形態観察初年度は計画に従い、蛋白質ナノチューブの効率高い合成法の確立とその形態観察に注力した。多孔性ポリカーボネート(PC)膜をテンプレートとして、鋳型内交互積層法により蛋白質ナノチューブを合成。ヒト血清アルブミンをつなぐ正電荷層(グルー層)としては、高分子量のポリ-L-アルギニンが最適であることを見出した。得られた複合膜からテンプレートを除去する際の溶媒には、DMFが有効であることを確認した。マイクロシリンジポンプ(設備備品)を新規購入し、再現性の高い合成プロトコールを確立。ナノチューブの内径・外径・管壁厚・長径の測定は、電界放出形走査電子顕微鏡(FE-SEM)、透過電子顕微鏡(TEM)観察により行った。さらに、このナノチューブ合成法が他の蛋白質(フェリチンなど)にも適用できることを示した。現在、糖蛋白質、酵素、抗体など、様々な階層組成からなる蛋白質ナノチューブの合成に取り組んでいる。生命現象の根幹を支配し、多彩な機能をつかさどる蛋白質を機能材料創製の基本ユニットとして用いる戦略は、合理的な分子設計の一つであり、バイオナノテクノロジーのフロンティアといえる。本研究は、蛋白質や金属ナノ粒子を所望の序列で階層的に組織化する方法(鋳型内交互積層法)により中空シリンダー構造のナノチューブを構築し、その管壁や一次元内孔空間を利用した新しい機能の創出、さらにはそれらを基板と融合させ、従来に類例のない機能分子システムを創製することを目的としている。平成22年度から研究代表者が中央大学・理工学部へ異動したが、計画の推進に支障はなく、益々強力な体制で研究を継続している。1.ナノチューブ管壁階層構造の解析2.ハイブリッドナノチューブの合成と機能再内層に酵素(α-グルコシダーゼ)を配置したナノチューブの内孔では、糖の加水分解が生起することを明らかにした。また、フェリチンやコバルトフェリチンからなるナノチューブを熱処理し、蛋白質成分を完全に焼成除去すると、金属酸化物のみかなるナノチューブが得られることを見出した。金ナノ粒子/高分子電解質の組合せでナノチューブの調製に取り組んでいるが、さらなる条件の最適化が必要である。一方、抗体を再内層に配置したナノチューブを精密合成し、感染能力のあるヒトB型肝炎ウイルス(Dane粒子)を高い効率で取り込ませることに成功した。この成果は、英国王立化学会の会誌"Chemistry World"でニュースとして取り上げられた。生命現象の根幹を支え多彩な機能をつかさどる蛋白質を機能材料創製の基本ユニットとして用いる戦略は、合理的な分子設計の一つであり、バイオナノテクノロジーのフロンティアといえる。1.金属ナノ粒子を含有するナノチューブの合成金属ナノ粒子を階層成分として含むハイブリッドナノチューブの合成に初めて成功した。金ナノ粒子と高分子電解質(ポリ-アルギニン)のみの組合せでは望みの中空管が全く得られなかったため、金ナノ粒子にヒト血清アルブミンを混合したところ、均質なナノチューブが合成できた。管壁は(金ナノ粒子/アルブミン)層とポリ-L-アルギニン層の交互積層膜から構成される。形態と構造はFE-SEM、TEMにより解析。熱処理で有機成分を焼成除去すると、金ナノ粒子のみからなるナノチューブが得られた。2.金属置換アポフェリチンナノチューブを用いた金属酸化物ナノチューブの合成銅置換アポフェリチンとポリ-L-アルギニンからなるナノチューブの合成に初めて成功した。FE-SEMにより三次元構造を解析。熱処理で蛋白質殻を焼成除去すると、酸化銅ナノチューブが得られた。

継続して、機能分子システムとしての可能性を探索している。生命現象の根幹を支え多彩な高次機能をつかさどる蛋白質は、進化の過程を経て最適化されてきた究極の超構造体である。その蛋白質を機能材料創製の基本ユニットとして用いる戦略は、合理的な分子設計の一つであり、バイオナノテクノロジーのフロンティアといえる。本研究は、蛋白質、人工ヘム蛋白質、金属ナノ粒子を所望の序列で階層的に組織化する方法により、構造明確なナノチューブやナノクラスターを構築し、その分子配置・配列を利用した新しい機能の創出、さらにはそれらを用いた機能分子システムの創製を目指している。最終年度である平成25年度は、以下の成果を得ることができた。1)蛋白質ナノチューブの機能拡張これまで、多孔性ポリカーボネート膜を用いた鋳型内交互積層法により、中空シリンダー構造の蛋白質ナノチューブを合成し、その構造と機能の相関を明らかにしてきたが、最終年度もさらなる機能拡張へ展開した。具体的には、金ナノ粒子含有ナノチューブの触媒作用(ニトロフェノールの還元)、アルブミンマイクロチューブの大腸菌捕捉、リパーゼナノチューブ内孔空間におけるラクトンの開環重合を実証した。2)蛋白質クラスターの創製ヘモグロビンの分子表面に複数個のヒト血清アルブミンを結合させた構造明確な(ヘモグロビン-アルブミン)クラスターを合成し、その構造と酸素配位平衡を明らかにした。さらにアルブミンにフラビンを包接させることで、外部添加したNADHから中心ヘモグロビンへの電子移動経路を構築、ヘム鉄を還元することに成功した。この蛋白質クラスターは生体投与可能な人工酸素運搬体となり得る。最後に、延5年間にわたる研究成果をまとめ、蛋白質や金属ナノ粒子を望みの序列で階層的にプログラムした超構造体の合成、構造、高次機能を総括した。平成24年度は以下の成果を得ることができた。1)人工ヘム蛋白質の合成管壁成分となるアルブミンに遺伝子組換え技術を用いて酵素活性を付与することに成功した。具体的には、アルブミンのヘムポケット内にあるイソロイシン-142とロイシン-182をヒスチジンに変換することで、人工ペルオキシダーゼを構築。種々のヘムを結合させて得た組換えアルブミン-ヘム錯体が、基質(グアイアコールなど)の酸化反応を触媒することを実証した。酵素パラメーター(Km、kcat)とヘムポケット構造の相関を明示した。2)ナノチューブの基板への固定とナノチューブアレイの構築
新規オートファジー実行に関わるAag4の機能解析

オートファジーは細胞内の不要なタンパク質やオルガネラを分解するシステムであり、飢餓や薬剤ストレスなどで誘導される。我々は、オートファジーに必須とされてきたAtg5やAtg7に依存しない、新たなメカニズムによるオートファジー(新規オートファジー)を発見した。その後の研究で、出芽酵母において、新規オートファジー不能Aag4変異株の単離に成功し、哺乳動物における相同遺伝子Aag4を同定した。&#8232;本研究では、(1)出芽酵母におけるAag4の機能解析を行うこと、また、(2)哺乳動物におけるAag4の機能解析を行うこと、さらに、(3) Aag4欠損マウスを作製し、新規オートファジーの生体内での役割を明らかにすることを目的とした。これまでに、(1)出芽酵母、哺乳動物の両者において、Aag4が新規オートファジーを制御する分子として同定できた。また、(2)出芽酵母Aag4欠損株および哺乳動物Aag4を欠損したマウス線維芽細胞に対して電子顕微鏡観察を行った。その結果、Aag4が新規オートファジーのステップにおいて、隔離膜形成過程を制御していること、(3) Aag4が細胞質からゴルジ体に局在を変化させ隔離膜形成を行っていることを明らかにすることができた。さらに、(4)脳特異的Aag4欠損マウスを作製し、解析した結果、Aag4を欠損したマウスでは神経変性疾患様症状を呈することを見出し、新規オートファジーが脳内で生理的役割を担っていることが明らかになった。本研究では、(1)出芽酵母におけるAag4の機能解析を行うこと、また、(2)哺乳動物におけるAag4の機能解析を行うこと、さらに、(3) Aag4欠損マウスを作製し、新規オートファジーの生体内でのの役割を明らかにすることを目的とした。これまでに、(1)出芽酵母において、Aag4が新規オートファジーに関わる分子として同定できた。また、(2)出芽酵母Aag4欠損株に対して電子顕微鏡観察を行った。その結果、Aag4が新規オートファジーの如何なるステップに関与するか明らかにすることができた。さらに、(3)哺乳動物Aag4を欠損したマウス線維芽細胞を作成し、この細胞株では、新規オートファジーが抑制されていることを明らかにすることができた。当初から計画していたように、出芽酵母において、Aag4が新規オートファジーに関わる分子と同定でき、新規オートファジー素過程の如何なるステップで機能しているかを明らかにできた。また、哺乳動物細胞においても、新規オートファジーに関わっていることを明らかにできた。以上の理由により、本プロジェクトの今年度の達成度は概ね順調に進展していると考える。(1)哺乳動物において、Aag4が新規オートファジー実行過程のどのステップに関与するかを明らかにする。(2) Aag4とこれまでに同定している新規オートファジー分子との相互作用、上下関係を明らかにし、分子機構を系統的に明らかにする。(3) Aag4のノックアウトマウスの解析を行い、新規オートファジーの生体内でのの役割を明らかにする。
運動ニューロン細胞死と栄養因子

発生過程における運動ニューロンの細胞死は、発生した運動ニューロンの約半数が細胞死に陥るもので、神経支配標的である筋由来の栄養因子によってその生存が決められていると考えられている。この細胞死の分子機構を解析するために、多種類の神経細胞が混在する脊髄から運動ニューロンを精製する事は有効な手段である。ニワトリ初期胚脊髄では運動ニューロンと床細胞の細胞表面に選択的に結合するSCI抗体を用いたパンニング法により、運動ニューロンを精製し、これからRNAを抽出し、cDNAライブラリーを作成した。次に、nerve growthfactor(NGF)の高親和性レセプターが、他の細胞増殖因子と同様にチロシンキナーゼ活性部位を持っていた事から、運動ニューロン栄養因子のレセプターもチロシンキナーゼ活性部位を持つ事を期待し、上記のcDNAライブラリーからPCR法によりチロシンキナーゼ活性部位を持つクローンを得、約100クローンをシークエンスした。そのうち3個のクローンは、これまで未知のクローンであったことから、より長いそれぞれのクローンをライブラリーからクローニングし、in situハイブリダイゼーションによりその発現部位を同定し、運動ニューロンに特異的に発現されているクローンをさらに解析している。
金属と陶材の焼き付けにYAGレーザーを応用するための基礎的研究

本研究では、陶材焼付用合金の表面をレーザーにより改質した場合の表面状態を解明し、その処理面に陶材を焼付け、焼付強度を測定し、通法の電気炉で焼き付けた場合との比較、検討を行うことを目的とした。本年度は、チタン板および陶材焼付用貴金属合金の表面をレーザー処理した場合に生成する処理層(改質層)を以下の方法で観察し、Ni-Cr合金合と比較した。(1)処理面を電子顕微鏡で観察した結果、表面部のわずかな荒れと50μm程度の照射痕と見られる溝が観察され、また、表面状態を分析した結果、レーザーを照射した試料では照射痕と見られる溝が観察された。これは、Ni-Cr合金と同様の性状であった。(2)処理面の表面粗さを10点平均粗さ(Rz)で求めた結果、チタン板ではNi-Cr合金と同様の荒れを示した。一方、貴金属合金では両者と比べて荒れはかなり増加した。(3)処理面のビッカース硬度は、Ni-Cr合金の照射前が244.4であったが、照射後は280.6と硬化した。チタン板は照射前が322.1であったが、照射後は356.6と同じように硬化した。一方、貴金属合金では、照射前が304.2であったが、照射後は288.2と低下した。(4)処理面をX線回折で定性分析したが、照射前と照射後ともNi-Cr合金、チタン板ともに金属に相当するピークが観察され、酸化膜の認定はできなかった。一方、貴金属合金では金属に相当するピーク以外に酸化銀と推測されるピークが観察された。(5)焼付強さを照射前後で比較すると、すべての金属で明らかな増加が観察された。しかしサンドブラストした試料と比較すると、Ni-Cr合金、チタン板では、有意差が見られなかったが、貴金属合金では低下した。本研究では、陶材焼き付け用合金の表面をレーザーにより改質した場合の表面状態を解明し、その処理面に陶材を焼き付け、結合状態、約付け強度等を測定し、通法の電気炉で焼き付けた場合との比較、検討を行うことを目的とした。本年度は、陶材焼き付け用非貴金属合金の表面をレーザー処理した場合に生成する処理層(改質層)を以下の方法で観察した。(1)処理面を電子顕微鏡で観察した結果、表面部のわずかな荒れと50μm程度の照射痕と見られる溝とが観察された。また、表面をサンドブラストした後、レーザーを照射した試料では照射痕と見られる溝がかなり荒れるのが観察されたが、表面部の荒れは減少した。(2)処理面を表面粗さ計で計測し、10点平均粗さ(Rz)を求めた結果、照射前の資料では、Rz=0.4(μm)であったものが、レーザー照射後はRz=4.1(μm)となり、かなり粗面化していることが判る。また、表面をサンドブラストした試料では、Rz=2.4(μm)のものが、Rz=4.7(μm)になり、両法による表面荒れには大きな差は見られなかった。(3)処理面をビッカース硬度計で計測した結果、照射前の表面硬さは、244.4であったが、照射後は280.6と硬化した。また、サンドブラストした試料は278.6の表面硬さを示したが、レーザー照射後の試料では286.4となり、硬さでも両法間に差は認められなかった。(4)処理面をX線回折で定性分析したが、照射前と照射後ともNi-Cr合金に相当するピークが観察され、変化は見られなかった。このことから、サンドブラストの有無に関わらず、レーザー照射後は類似した表面状態に成っているものと考えられる。次年度は、この面に陶材を焼き付け、結合状態、焼き付け強度等を測定していく予定である。

一方、貴金属合金では金属に相当するピーク以外に酸化銀と推測されるピークが観察された。(5)焼付強さを照射前後で比較すると、すべての金属で明らかな増加が観察された。しかしサンドブラストした試料と比較すると、Ni-Cr合金、チタン板では、有意差が見られなかったが、貴金属合金では低下した。
太陽系以外の惑星系の力学的安定性とその力学的進化

最近続々と太陽系外の恒星に惑星が発見されていて、この報告を書いている時点で76個の惑星がドップラー観測から発見されている。この中で複数の惑星が発見されているのは7組(νAndromedae, GJ876, HD83443, HD1683443, HD82943, HD74156, 47Uma)である。本課題ではこれらの惑星系の長期安定性を研究した。これらのうちHD83443, HD1683443, HD74156, 47Umaの惑星系は2惑星間の距離が大きく離れていて安定である。残りの3惑星系は相互距離が近く、かつ離心率が大きいので近接遭遇が起こり系が不安定となる可能性があるので、これらの惑星系についての安定性を解析的並びに数値シミュレーションによって研究し以下のような結果を得た。1)これらの惑星系の安定性メカニズムには近点の連動と平均運動共鳴がある。2)νAndromedaeには3個の惑星があり外側の2個の惑星間の近点が連動して両惑星の近接遭遇が避けられていて、また1番内側の惑星への他の2惑星からの摂動は小さいので惑星系は長期安定である。3-1)GJ876の惑星系は観測から求まる最小質量の時には2:1平均運動共鳴によって安定性が保たれている。3-2)GJ876星系の質量が大きい場合には惑星間相互作用が大きくなり2:1平均運動共鳴だけで惑星系は安定となり得ず、さらに近点の連動によって惑星系は安定化されている。4)HD82943の惑星系は2:1平均運動共鳴状態に近いが、現在発表されている軌道要素ではこの惑星系は不安定である。太陽系以外の惑星系として最初に発見されたνアンドロメダ惑星系は、外側の2個の惑星の近点が連動することによって安定化されている。この近点の連動は永年共鳴ではないことを、線形の永年摂動を用いて示した。すなわち系の独立な2個の固有値のうち、ひとつの固有値に対応する振幅がどちらの惑星についても最大となるとき近点の連動がおこるのである。2惑星系について近点の連動が起こる軌道要素を離心率と近点経度の差(Δω)空間で求め、その安定性を調べた。近点の連動が起こるとき近点経度の差は0度または180度のまわりを秤動し、離心率も同期して変動する。秤動の振幅が大きくなると、離心率の変化が大きくなり、軌道は不安定となる。180度のまわりの秤動では、内側の惑星の遠点と外側の惑星の近点が接近し軌道は不安定となる。本年度は最近発見された太陽系外星系GJ876の力学的安定性を中心に研究した。Marcy達はLickとKeck天文台における6年間のドップラー観測より、GJ876が少なくとも2つの惑星をもっていることを見いだした。Marcy達は惑星質量として最小値を仮定し、数値シミュレーションを実行し、この惑星系は2:1平均運動共鳴によって安定であることを示した。我々は彼らとは異なる初期条件の下で数値シミュレーションを行い、惑星系の安定性を調べた。外側の惑星を近星点におき、内側の惑星の平均近点離角を0度から360度まで変化させて軌道が安定であるものを探した。その結果元期における平均近点離角l_1が-60°<l_1<60°のとき、惑星系は2:1平均運動共鳴状態(臨界引数θ_c=λ_1-2λ_2+ω_1)にあって、相互接近がさけられ安定であることがわかった。このとき両惑星の近星点は独立の運動していて連動していない。

惑星の質量にはsiniの不定性があるので、両惑星が同一平面内にあると仮定して、惑星の質量を1倍から20倍まで変化させて、惑星系の安定性を調べた。惑星質量を2倍したあたりから近星点の連動が起こり、質量が10倍したあたりまで惑星系は平均運動共鳴と近星点の連動によって安定であることがわかった。この近星点の連動現象を半解析的な永年摂動論で説明できた。
人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞を用いた注意欠陥・多動性障害の生物モデルの構築

AD/HD患者から人工多能性幹細胞(iPS細胞)を作成するにあたり、適切な基準による患者の選定が重要となる。対象にはDSM-IVのAD/HD診断基準に合致し、併存障害が合併していない小児期あるいは成人期の患者とした。特に自閉症スペクトラム症候群との併存については、注意深く対象患者を選定した。健常人およびAD/HD患者からiPS細胞の作成を行った。AD/HDでのドーパミン神経系は腹側被蓋野から側座核や前頭葉皮質に投射する中脳皮質辺縁系が重要な役割を果たしていると考えられている。iPS細胞からの中脳皮質辺縁系と黒質線条体系ドーパミン神経を区別して分化誘導について取り組んだ。注意欠陥・多動性障害(AD/HD)は主に小児の精神疾患であり多動性、不注意、衝動性を症状の特徴とする発達障害の一つである。AD/HD患者から人工多能性幹細胞(iPS細胞)を作成するにあたり、適切な基準による患者の選定が本研究の推進には重要となる。平成25年度より研究代表者が東北大学精神・神経生物学分野から神戸大学精神科への移籍に伴い、神戸大学精神科の児童思春期グループの研究者とともに、研究に協力可能なAD/HD患者の選定を進めている。対象にはDSM-IVのAD/HD診断基準に合致し、簡易構造化面接法であるM.I.N.Iを実施して併存障害が合併していない小児期の患者としている。患者の症状を可能な限り統一するための選定の作業を行なった。研究代表者が東北大学精神・神経生物学分野から移籍した神戸大学精神科では、幹細胞を用いた本研究課題の実施に必要な実験設備が十分に整備されていなかったことから、平成25年度は幹細胞培養の実験設備を整えることから開始した。京都大学山中研より平成25年度から神戸大学に移られたiPS細胞応用医学分野の青井貴之教授の研究グループと連携を始め、本研究課題を推進している。青井教授の研究グループが有する最新の技術を導入してiPS細胞の培養実験を行うことができた。しかし、平成25年度は研究代表者が東北大学から神戸大学に移籍することによりiPS細胞の解析にまで至らなかったことから、表現系の解析実験は次年度以降の課題として残った。現在、国立国際医療研究センター国府台病院の連携研究者と共同で、研究に協力可能なAD/HD患者の選定を進めている。患者の症状を可能な限り統一するための選定の作業を行なっている。一方でiPS細胞を使用しての神経細胞への分化を行うにあたり、実験系の確立を進めている。iPS細胞と同様に多能性幹細胞である胚性幹細胞(ES細胞)を使用して、カテコールアミン神経細胞への分化誘導の実験の確立を行った。分化誘導にはSDIA法を用い、誘導後14日ではカテコールアミン神経細胞の指標となるチロシン水酸化酵素が発現していることを確認した。また、カテコールアミン神経の中でもドーパミン神経細胞は従来のSDIA法で作製可能であったが、ノルエピネフリン神経細胞は作製できないため、ノルエピネフリン神経細胞を作製するための条件の検討を行なっている。過去の知見から、生体内においてノルエピネフリン神経細胞の分化にはBMP4が必要であることが明らかになっていたため、SDIA法の分化誘導培地に各濃度条件としたBMP4を添加しノルエピネフリン神経細胞への分化を試みたが、現在までのところ誘導条件は確定していない。AD/HDは主に小児の精神疾患であることから死後脳を含めて神経組織を得られないことが病態解明の大きな妨げとなっていた。平成26年度は神戸大学精神科の児童思春期グループの研究者とともに、研究に協力可能なAD/HD患者を選定した。特に自閉症スペクトラム症候群との併存については、注意深く対象患者を選定した平成26年度は幹細胞培養の実験設備が整ったことから、iPS細胞応用医学分野の研究グループと連携を始め、本研究課題を推進した。

同研究グループが有する最新の技術を導入して健常人およびAD/HD患者からiPS細胞の作成を行った。AD/HDでのドーパミン神経系は腹側被蓋野から側座核や前頭葉皮質に投射する中脳皮質辺縁系が重要な役割を果たしていると考えられている。情動・認知機能と運動調節機能と異なる機能を有する中脳皮質辺縁系と黒質線条体系のドーパミン神経がどのように形成されるのかについては十分に解明されていなかったことから、iPS細胞からの中脳皮質辺縁系と黒質線条体系ドーパミン神経を区別して分化誘導について取り組んだ。精神医学研究代表者が東北大学精神・神経生物学分野から移籍した神戸大学精神科では、幹細胞を用いた本研究課題の実施に必要な実験設備が十分に整備されていなかったことから、本研究課題の推進に遅れが生じた。本研究には小児のAD/HD患者の選定と研究への同意が必要であるが、症状の質を勘案した適切な患者の選定に対して当初の予定よりも時間を要している。診断条件に合致するAD/HD患者の組織から作製したiPS細胞を用いて、カテコールアミン神経細胞への分化誘導条件により神経細胞を作製し、神経の形態や遺伝子発現を健常群と比較し、神経科学的、精神薬理学的解析を行う。さらに、代表的なAD/HD治療薬(アンフェタミン、メチルフェニデート、アトモキセチン、グアンファシン)を投与した際の形態変化、遺伝子発現変化を比較検討することで、AD/HD治療薬が患者由来と健常人由来のモノアミン神経細胞への作用の違いを検討する。診断条件に合致する小児のAD/HD患者から血液サンプルを提供いただき次第、iPS細胞の作製を開始する。作製したiPS細胞を用いて、本年度確立を進めたカテコールアミン神経細胞への分化誘導条件により神経細胞を作製し、神経の形態や遺伝子発現を健常群と比較し、神経科学的、精神薬理学的解析を行う。iPS細胞から分化誘導された神経細胞の樹状突起やスパイン密度を計測して発達過程の解析を進める。研究代表者が東北大学から神戸大学に移籍したことから本研究課題の推進が遅れ、次年度使用額が生じた。iPS細胞を神経細胞への分化誘導する幹細胞の培養に加えて、作成された神経細胞の神経科学的、精神薬理学的解析に使用する。次年度使用額は、当初計画したAD/HD患者由来のiPS細胞作製を次年度に延期することによって生じたものであり、延期したiPS細胞の作製に必要な経費として平成25年度請求額と合わせて使用する予定である。具体的には、研究協力者への謝金、研究を進めるために必要な細胞培養やiPS細胞作製に用いる培地や試薬類に研究費の大半を使用する。得られた研究成果の発表や最新の研究の情報収集のために学会に参加する。
ＯＸ４０リガンドを分子標的にした難治性喘息治療法の開発

喘息難治化のメカニズムの1つに、T細胞レベルでのステロイド抵抗性がある。T細胞活性化にはT細胞受容体(TCR)を介する抗原特異的シグナルと共刺激分子を介する抗原非特異的シグナルが必要であるが、TCRシグナルのみの活性化と比較して、TCRシグナルと共刺激シグナル両方を活性化するとステロイド抵抗性が高くなることが知られている。本研究では、共役分子の1つであるOX40リガンドとステロイド抵抗性の関係を調査した。OX40リガンド欠損マウスではステロイド薬の効果が高く、低濃度のステロイド薬で喘息反応が抑制された。したがって、OX40リガンドは難治性喘息治療薬開発の新たな分子標的となる可能性が考えられた。重症・難治性喘息症例においては、その多くはステロイド抵抗性であるため、高容量吸入ステロイドはもちろん、経口ステロイドに加えてテオフィリン、抗ロイコトリエン薬、長時間作用型β刺激薬等、多種類の治療薬を併用してもなお満足な治療効果が得られていない。そのため、現行の薬物治療では十分な効果が期待できない。喘息重症・難治化のメカニズムの1つに、in vivoのT細胞レベルでステロイド抵抗性が明らかになっている。T細胞活性化にはT細胞受容体(TCR)を介する抗原特異的なシグナルと共刺激分子を介する抗原非特異的シグナルが必要であるが、申請者らのin vitroの実験から、TCRシグナルのみの活性化と比較して、TCRシグナルと共刺激シグナル両方を活性化するとステロイドに対する抵抗性が高くなるという結果が得られている。そのため、共刺激シグナルの遮断はT細胞のステロイド抵抗性を改善し、重症・難治性喘息に効果を示すことが期待される。OX40リガンド(OX40L)は抗原提示細胞上に発現している共役分子の1つで、T細胞上に発現しているOX40と結合して共刺激シグナルの活性化、活性化T細胞の生存や増殖を増強することが知られている。OX40Lトランスジェニックマウスでは、CD4陽性記憶T細胞数が増加し、その機能も著しく亢進することが分かっている。そこで本研究では、OX40/OX40Lを介した共刺激シグナルがT細胞のステロイド抵抗性に与える影響を検証する目的で、OX40L欠損マウス(OX40L-KOマウス)で喘息モデルを作製して検討した。その結果、OX40L-KOマウスではステロイド薬の効果が高く、低濃度のステロイド薬で、気道過敏性の亢進や気管支肺胞洗浄液中への好酸球浸潤が抑制された。これらの結果から、OX40ならびにOX40Lは、難治性喘息治療薬開発の新たな分子標的となる可能性が考えられた。喘息治療ガイドラインの普及と薬物療法の進歩により、軽度中軽度の喘息症例に対して吸入ステロイド薬が十分にコントロール可能となってきた。しかしながら、重症・難治性喘息症例においては高容量吸入ステロイドに加えて経口ステロイド、テオフィリン、抗ロイコトリエン薬、長時間作用型β刺激薬等多種類の治療薬を併用してもなお満足な治療効果が得られていない。このことから重症・難治性喘息症例に早急な対策を講じる必要があるが、その多くはステロイド抵抗性であるため、現行の薬物治療では十分な効果が期待できない。そこで本研究では、OX40/OX40Lを介した共刺激シグナルがT細胞のステロイド抵抗性に与える影響を検証する目的で、OX40LKOマウスで喘息モデルを作製して検討する。このことにより、難治性喘息治療薬開発に向けて、分子標的としてのOX40ならびにOX40Lの有用性を評価する。1. OX40L欠損マウスは、低容量ステロイドで気道過敏性亢進が抑制された。T細胞依存性喘息モデルを作製して研究を行なった。OX40Lノックアウト

マウスに鶏卵白アルブミン(OVA)反応性T細胞クローンを移入、OVAチャレンジして非アトピー型喘息反応を誘発した。気道過敏性はBuxco社の非拘束型全身プレチスモグラフィーを用い、メサコリン塩酸塩を吸入させた時の気道抵抗を測定して評価した。事前にデキサメタゾン(Dex)を投与したOX40Lノックアウトマウスでは気道過敏性亢進が減弱していた。一方、Dexを事前に投与しなかったマウスではOX40L欠損の影響は見られなかった。2. OX40L欠損マウスは、低容量のステロイドで好酸球浸潤が抑制された。上記1と同様に、OX40L欠損マウスに非アトピー型喘息反応を誘発した。好酸球浸潤は、マウス気管支肺胞洗浄液(BALF)中に含まれる好酸球数を測定して定量的に評価した。BALFはカニューレ用い、PBS中に回収し、好酸球の確認を容易にするため、ギムザ液でBALF中の細胞を染色してから測定した。事前にDexを投与したOX40Lノックアウトマウスではマウス気管支肺胞洗浄液(BALF)中に含まれる好酸球数が有意に低下していた。すなわち、OX40L欠損は好酸球浸潤を低下させた。平成24年度に予定していた「OX40L欠損マウスは低容量のステロイドでT細胞浸潤が抑制される」については現在進行中であるが、予想通りの結果が得られている。したがって全体を通して概ね順調に進展していると評価した。平成25年度は、平成24年度に計画していた「OX40L欠損マウスは低容量のステロイドでT細胞浸潤が抑制される」を評価し、さらに下記の2項目について評価する。さらに研究成果を学会ならびに論文にて発表する。1. OX40L/OX40シグナルの欠如は、低容量ステロイドでT細胞増殖が抑制される。OX40L欠損マウス由来の抗原提示細胞でT細胞を刺激し、T細胞の増殖速度を測定する。T細胞は上記13で使用したT細胞クローンを使用する。具体的には、抗原存在下にT細胞クローンと抗原提示細胞を共培養して48時間後におけるT細胞増殖を評価する。T細胞増殖は3H-チミジン取り込み法を用いて測定する。これにより、T細胞増殖抑制に関して、OX40L欠損がステロイド感受性を増加させることを証明する。2. OX40L/OX40シグナルの欠如は、低容量ステロイドで炎症性サイトカイン産生が抑制される。OX40L欠損マウス由来の抗原提示細胞でT細胞を刺激し、炎症性サイトカインの濃度を測定する。T細胞の刺激方法は上記1と同様に行なう。刺激48時間後に、培地中のインターロインキン(IL)-4、IL-5、IL-13、IL-17などのサイトカイン濃度をELISA法で測定する。これにより、炎症性サイトカイン産生抑制に関して、OX40L欠損がステロイド感受性を増加させることを証明する。平成24年度計画分のうち「OX40L欠損マウスは低容量のステロイドでT細胞浸潤が抑制される」を実施中であるため、平成24年度使用予定であった研究費の一部を繰り越した。平成25年度の研究費は、細胞培養に関する費用(培養用プラスチック器具、培地、ウシ血清(FBS))、動物購入費用などに当てる予定である。
多嚢胞性卵巣症候群の診断精度の向上に関する検討

多嚢胞性卵巣症候群(PCOS)の診断精度向上のため、血中ホルモンの至適評価法を検討した。1)血中LH値の至適測定時期は、無月経の時期または消退出血11日目以降がよい。また、肥満例ではLH/FSH比が有用である。2)頻用されている測定系における高LHの基準値を設定した。3)テストステロン(T)について、最新の測定系での基準値を設定し、以前のものよりもPCOS患者でT高値率が高くなることを明らかにした。今回の研究結果により、PCOSの診断精度が向上するものと思われる。多嚢胞性卵巣症候群(PCOS)患者における血中LH値の再現性と測定時期、CLIA法(アーキテクト)を用いた場合の判定基準について検討した。1)PCOS患者の血中LHの至適採血時期に関するよる検討:日産婦1993でPCOSと診断した32例から非治療期に採血を行い、計79検体について採血時期とLH値の関係について検討した。SPAC-SにてLHを測定した結果、血中LH値≧7mIU/mLは全検体(n=79)の55.7%であった。消退出血開始日からの日数別では、110日(n=42)で42.9%、ll20日(n=18)で66.7%、21日以上(n=19)で73.7%であった。LH/FSH比>1は全検体の62%であり、周期110日で47.6%、ll20日で66.7%、21日以上で89.5%であった。複数回の採血を行った13症例で、全ての検体がLH/FSH比≧1であった症例は46.2%であった。また、肥満例(BMI25以上)ではLH基礎値が低くLH/FSH比が有用であった。以上よりPCOSを疑う症例の血中LH値は、無月経の時期か、消退出血を起こした周期では11日目以降が適していると考えられた。2)CLIA法のアーキテクトLH、FSHを用いた場合のLHカットオフ値の検討:アーキテクトとRIA法のスパックSの相関について検討した。成人男性、正常月経周期女性、閉経期女性、正常妊婦、排卵障害患者、計185検体を対象に両測定系にてLH,FSHを測定し相関を求めたところ、アーキテクトはスパックSの測定値に比べLHが約1.2倍、FSHが約0.8倍となった。PCOSの診断におけるLH基礎値高値の基準値としてアーキデクトを用いた場合はLH値≧8.95mIU/mlかつLH/FSH比≧1.25が妥当であると考えられた。多嚢胞性卵巣症候群(PCOS)の診断における高LHの基準は、スパック-S以外の測定系では明確でない。そこで、エクルーシス試薬LH^-、FSH IIを用いた際の高LHの基準値について検討した。まず、正常月経周期女性72例(卵胞期)、PCOS症例128例のLH、FSH濃度をエクルーシスで測定した。正常月経周期女性のLHまたはLH/FSH比の測定値の対数正規分布を確認の上、平均値+1標準偏差の値、LH 8.548mLU/ml、LH/FSH比1.253を基準値とした。PCOS患者におけるLH高値率は、LHが69.5%、LH/FSH69.5%で、過去の報告と同等であった。PCOSの診断におけるLH基礎値高値の基準として、エクルーシス試薬を用いた場合には、LH値≧8.55mIU/mLかつLH/FSH比≧1.25が妥当であると考えられた。PCOS患者の血中テストステロン濃度について、エクルーシス試薬テストステロンで検討した。対象は正常月経周期女性90名、治療を行っていない時期のPCOS患者142名の血液検体で、測定値の対数正規分布を確認し、平均値+1.96標準偏差の値、0.69ng/mlを基準値とした。PCOS患者における高テストステロン高値率は、33.8%(48/142)であった。過去の報告の14.3%よりも高く、エクルーシス試薬テストステロンは、PCOS患者のホルモン測定に適していると考えられる。多嚢胞性卵巣症候群(PCOS)の診断では、血中アンドロゲン値は重要である。現行のエクルーシス試薬テストステロン(旧キット)を用いた血中テストステロン(T)値測定では、T前駆体との交差反応により正しい評価が困難であった。最近、特異度を改善したエクルーシス試薬テストステロンII(新キット)が開発された。今回の検討で新キットの基準値を策定した上で、更に、新旧両キットでのPCOS患者等における高T陽性率を比較した。

正常月経周期女性、閉経女性、成人男性の計235検体を新旧両キットで測定しその相関を検討した。乖離例を含む3検体はLC-MS/MS法でTを再測定し新旧キットでの値と比較した。また新キットによるT基準値の範囲を、各群で平均値±1.96標準偏差から算出した。更に、正常月経周期女性、PCOS以外の排卵障害患者、PCOS患者の計203検体のT値を新旧両キットで測定し、各々のキットの正常範囲上限をカットオフ値とし、PCOS症例ではT高値率、他の症例ではT非高値率を比較検討した。その結果、旧キットと新キットの相関は高かった。男性検体では両者の測定値はほぼ同じであったが、正常女性検体で新キットは旧キットに比して約40%低値を示した。LC-MS/MS法の測定値は、新キットの値に近かった。新キットでのT基準値は、正常女性群で0.110.47ng/ml、閉経女性群で0.040.43ng/ml、男性群で1.48.7ng/mlと算出した。また、新旧キットのT非高値率は正常月経周期女性で共に98.9%、PCOS以外の排卵障害患者で共に96%であった。PCOS患者でのT異常高値率は旧キットで30.2%、新キットで44.2%と、新キットで高かった。新キットはTに対する特異度が高く、旧キットに比べ女性でのT測定値が約40%低くなり、LC-MS/MSの測定値と近い値を示すことから、女性のT測定に適していること、また、PCOS患者でのT高値率が高く、PCOSの診断において有用性が高いと考えられた。
一般余次元のアファインはめ込みの分類および構成

1.諸幾何構造を保つ一般余次元のアファインはめ込みとして,とくに正則中心アファインはめ込みを,松添博(東北大)と協力することにより研究した.(1)正則中心アファインはめ込みの剛性を示し、内在的に特徴付けた.すなわち,2つの正則中心アファインはめ込みが同じ接続を誘導すれば,それらはアファイン合同であることを示した.また,局所的な設定で,アファイン接続が正則中心アファインはめ込みから誘導されるための必要十分条件を射影曲率テンソル等を用いて記述した.(2)非退化な正則アファイン超曲面に対して,その余法線写像は正則中心アファインはめ込みになることがわかる.逆に,正則中心アファインはめ込みが与えられたとき,これを余法線写像とする非退化な正則アファインはめ込みを構成できるだろうか.構成できるとしたら,それはどのくらい自由度があるだろうか.この問題に対して,我々は解答を与え,正則中心アファインはめ込みとある種の条件をみたす計量の組から,非退化な正則アファイン超曲面を構成する方法を得た.これはルリューブルの結果(1888年)を複素幾何学の場合に一般化したことにあたっている.2.3次元アファイン空間内のアファイン極小曲面の研究はカラビ等により古くからなされていたが,その概念を拡張し,余次元2のアファインはめ込みに対して極小中心アファインはめ込みを定式化して,その例を構成した.その際,黒瀬俊(福岡大)等との情報交換が役立った.1.諸幾何構造を保つ一般余次元のアファインはめ込みとして,とくに正則中心アファインはめ込みを,松添博(東北大)と協力することにより研究した.(1)正則中心アファインはめ込みの剛性を示し、内在的に特徴付けた.すなわち,2つの正則中心アファインはめ込みが同じ接続を誘導すれば,それらはアファイン合同であることを示した.また,局所的な設定で,アファイン接続が正則中心アファインはめ込みから誘導されるための必要十分条件を射影曲率テンソル等を用いて記述した.(2)非退化な正則アファイン超曲面に対して,その余法線写像は正則中心アファインはめ込みになることがわかる.逆に,正則中心アファインはめ込みが与えられたとき,これを余法線写像とする非退化な正則アファインはめ込みを構成できるだろうか.構成できるとしたら,それはどのくらい自由度があるだろうか.この問題に対して,我々は解答を与え,正則中心アファインはめ込みとある種の条件をみたす計量の組から,非退化な正則アファイン超曲面を構成する方法を得た.これはルリューブルの結果(1888年)を複素幾何学の場合に一般化したことにあたっている.2.3次元アファイン空間内のアファイン極小曲面の研究はカラビ等により古くからなされていたが,その概念を拡張し,余次元2のアファインはめ込みに対して極小中心アファインはめ込みを定式化して,その例を構成した.その際,黒瀬俊(福岡大)等との情報交換が役立った.
新規指向性ライブラリーを用いた迅速な機能性抗体取得法の開発

本研究では、抗体ライブラリーに指向性を持たせることで迅速且つ着実に目的の抗体を取得できる"新規指向性ライブラリーを用いた生体外選択"による機能性抗体の取得法の開発を目指している。昨年度までに、酸化亜鉛を抗原として、ペプチド移植と生体外選択手法を組み合わせることで高機能性抗体の取得に成功し、さらに結合機構解析により親和性向上機構を明らかにした。本年度は、1、酸化亜鉛以外の無機材料結合ペプチドを利用した本手法の汎用性検討、2、取得した抗体の材料特異性評価、3、無機材料結合抗体を利用したナノ粒子機能化とバイオインターフェース応用を試み、新規指向性ライブラリーによる抗体取得法の開発達成と取得した抗体の有用性を示すことを試みた。本年度は、以下の研究成果を得た。1、酸化アルミナ結合ペプチド、酸化コバルト結合ペプチド、金結合ペプチドをそれぞれ抗体に移植したところ、抗原への結合性を示し、抗原指向性を保持したままライブラリー化、生体外選択を行うことでペプチド移植抗体よりもそれぞれ60倍、10倍、20倍親和性が向上し、開発した手法の汎用性を示した。2、取得した抗体について、種々の無機材料に対する特異性評価を行ったところ、抗体の特異性は移植したペプチドの機能に依存することが明らかとなり、本手法確立のための重要な知見を得た。3、取得した金結合性抗体と金粒子とを混合したところ、高塩濃度存在下でも粒子が分散し、高親和性抗体の被覆効果による粒子の高機能化に成功した。さらに二重特異性抗体を作製し、酸化亜鉛や金基板上への高密度生体分子固定化による高感度センサー、金粒子の光散乱を利用した腫瘍細胞イメージング、異種材料間の架橋によるナノ粒子アセンブリなどのバイオインターフェース応用を示すことに成功した。以上の結果より、新規指向性ライブラリーを用いた生体外選択による機能性抗体の取得法の開発を達成した。本研究では、抗体ライブラリーに指向性を持たせることにより確実に目的の抗体を取得できる"新規指向性ライブラリーを用いた生体外選択"による機能性抗体の取得法の開発を目指している。ライブラリーに指向性を持たせることでライブラリー規模の問題を解決し、迅速に機能性抗体を取得できるシステムを構築できると考える。本年度は、1、移植した機能を保持したままでのライブラリーの構築、2、生体外選択手法による高機能性抗体の取得、3、取得した抗体の機能評価、を試み、ペプチド移植抗体を起点とした新規指向性ライブラリー構築のための基盤技術確立にむけた展望を示すことを目指した。本年度の研究成果は以下の通りである。1、ペプチド移植抗体を起点としたライブラリーの構築:ペプチド移植抗体の相補性決定領域3(CDR3)に対し、既報の多種多様な無機材料結合ペプチド中に高頻度で現れるアミノ酸を要素とした人工ライブラリーを設計し、理論上の規模を満たすライブラリーを構築することに成功した。2、生体外選択手法による親和性向上:構築したライブラリーをもとにファージ表面へ抗体を提示させ、酸化亜鉛(Zn0)に対して親和性吸着操作を4回繰り返した結果、ランダム化した箇所におけるアミノ酸配列の濃縮を確認した。3、取得した抗体の機能評価:取得した抗体について結合定量評価を行ったところ、クローン4F2がZn0に対して解離平衡定数がK_p=9nMと非常に強い親和性を持つことがわかった。ペプチドを移植したのみの抗体においては、K_p=176nMであったことから、Zn0に対する親和性を約20倍上昇させることに成功した。また選択したクローンは酸化亜鉛以外の金属酸化物には結合しなかったことから、特異性を保持したまま結合力を向上させることに成功した。本研究では、抗体ライブラリーに指向性を持たせることで迅速且つ着実に目的の抗体を取得できる"新規指向性ライブラリーを用いた生休外選択"による機能性抗体の取得法の開発を目指している。昨年度までに、抗原として酸化亜鉛に特化し、移植したペプチドの機能を保持したままでのライブラリー化、及び、生体外選択手法による高機能性抗体の取得に成功した。本年度は、1、抗酸化亜鉛抗体の酸化亜鉛に対する詳細な結合解析、2、タンパク質接合技術を利用したバイオインターフェース分子の作製、3、酸化亜鉛以外の無機材料結合ペプチドの移植、を試み、本手法により作製した抗体の有用性を示すと共に、新規指向性ライブラリーの確立へ向けた基盤技術構築を目指した。本年度では、以下の研究成果を得た。1、本手法により得られた高親和性抗酸化亜鉛抗体について、結合力を生み出す領域である相補性決定領域(CDR)中の移植したペプチド配列と選択された配列をそれぞれ野生型配列へ再置換した変異体を作製し、結合評価を行った。その結果、それぞれ単独配列のみでは高い親和性を生み出せず、お互いの協同的作用が高親和性創出に重要であることがわかり、ライブラリー構築のための重要な知見を得た。2、遺伝子工学的手法を用いて、抗酸化亜鉛抗体と抗GFP抗体を融合した二重特異性抗体を作製し、酸化亜鉛基板へ吸着させた。更にGFPを添加したところ、二重特異性抗体を介して基板上へGFPを固定化させることに成功し、バイオインターフェース分子としての有用性を示した。3、酸化アルミナ結合ペプチド及び酸化コバルト結合ペプチドを抗体に移植したところ、抗原に対して結合性を示し、ペプチドの機能を移植することに成功した。この結果により、本手法の汎用性確立のための展望を示した。

本年度は、1、酸化亜鉛以外の無機材料結合ペプチドを利用した本手法の汎用性検討、2、取得した抗体の材料特異性評価、3、無機材料結合抗体を利用したナノ粒子機能化とバイオインターフェース応用を試み、新規指向性ライブラリーによる抗体取得法の開発達成と取得した抗体の有用性を示すことを試みた。本年度は、以下の研究成果を得た。1、酸化アルミナ結合ペプチド、酸化コバルト結合ペプチド、金結合ペプチドをそれぞれ抗体に移植したところ、抗原への結合性を示し、抗原指向性を保持したままライブラリー化、生体外選択を行うことでペプチド移植抗体よりもそれぞれ60倍、10倍、20倍親和性が向上し、開発した手法の汎用性を示した。2、取得した抗体について、種々の無機材料に対する特異性評価を行ったところ、抗体の特異性は移植したペプチドの機能に依存することが明らかとなり、本手法確立のための重要な知見を得た。3、取得した金結合性抗体と金粒子とを混合したところ、高塩濃度存在下でも粒子が分散し、高親和性抗体の被覆効果による粒子の高機能化に成功した。さらに二重特異性抗体を作製し、酸化亜鉛や金基板上への高密度生体分子固定化による高感度センサー、金粒子の光散乱を利用した腫瘍細胞イメージング、異種材料間の架橋によるナノ粒子アセンブリなどのバイオインターフェース応用を示すことに成功した。以上の結果より、新規指向性ライブラリーを用いた生体外選択による機能性抗体の取得法の開発を達成した。
一酸化窒素合成酵素完全欠損マウスを用いた大動脈瘤／大動脈解離発症の解明

大動脈瘤や大動脈解離の成因は、未だ十分に解明されていない。本研究では、大動脈瘤/大動脈解離の成因に一酸化窒素合成酵素(NOSs)が関与しているか否かを、NOSs完全欠損マウス(Triple n/i/eNOSs-KOマウス)を用いて検討した。NOSs完全欠損マウスに高脂肪食およびアンジオテンシンIIを長期投与したが、大動脈瘤/大動脈解離は誘発されなかった。実験条件に検討の余地があることが考えられた。一酸化窒素合成酵素系は、生体の恒常性維持に重要な役割を果たしており、動脈硬化の発症進展に一酸化窒素合成酵素系の破たんが関与しているのは広く知られている。動脈硬化を基盤とした病態のうち、大動脈瘤/大動脈解離については、その成因については多くが不明で、外科的手術や血管内治療以外の、根本的な予防や治療に結びつく内科的治療では、いまだに有効な治療薬は開発されていない。そこで3種類の一酸化窒素合成酵素が欠損した一酸化窒素合成酵素完全欠損マウスを用いて、大動脈瘤/大動脈解離形成モデルを樹立し、当該疾患における一酸化窒素合成酵素の役割や相互作用を解明することを着想した。近年のメタボリックシンドロームの増加により、大動脈瘤や大動脈解離などの動脈硬化性疾患が増加し、その征圧が我が国の医療における喫緊の課題となっている。しかし、大動脈瘤/大動脈解離の成因は未だ十分に解明されていない。一酸化窒素は、生体の恒常性の維持に重要な役割を担っている。一酸化窒素合成酵素には、神経型、誘導型、内皮型の3つのアイソフォームが存在する。過去に、すべての一酸化窒素合成酵素アイソフォームを欠損させた一酸化窒素合成酵素完全欠損マウスがメタボリックシンドロームや急性心筋梗塞を自然発症することが報告されている。これらの背景を踏まえて、本研究では、大動脈瘤/大動脈解離の成因を明らかにするために、一酸化窒素合成酵素系完全欠損マウスにアンジオテンシンIIを投与して、大動脈瘤/大動脈解離が惹起されるか否かを検討した。2ヶ月齢のオスの一酸化窒素合成酵素完全欠損マウスを実験に使用した。この一酸化窒素合成酵素完全欠損マウスに高脂肪食を3ヶ月から6ヶ月間経口投与し、さらに、アンジオテンシンIIを浸透圧ミニポンプを用いて高脂肪食投与の最後の1ヶ月間皮下投与し、大動脈の形態学的変化を解析した。高脂肪食/アンジオテンシンII負荷を行うと、半数前後のマウスが経過中に死亡した。しかし、死亡したマウスに大動脈瘤や大動脈解離は認められなかった。経過中死亡しなかったマウスの大動脈を単離し、その形態をマクロで観察したところ、一部のマウスにおいて大動脈径の拡大が認められたが、ほとんどのマウスでは大動脈径の拡大は認められなかった。また、大動脈解離の所見も見られなかった。考察として、高脂肪食の組成(コレステロール含有量、コール酸の有無)やアンジオテンシンIIの投与期間に検討の余地があると考えられた。一酸化窒素合成酵素系は、生体の恒常性の維持に重要な役割を果たしており、動脈硬化の発症進展に、一酸化窒素合成酵素系の破綻が関与していることは広く知られている。ところが動脈硬化を基盤とした病態のうち、冠動脈疾患と比較して、大動脈瘤/大動脈解離については、その成因については多くが不明で、外科的手術や血管内治療以外の、根本的治療に結びつく内科的治療では、有効な治療薬はいまだ開発されていない。そこで3種類の一酸化窒素合成酵素のすべてが欠損した一酸化窒素合成酵素完全欠損マウスを用いて、大動脈瘤/大動脈解離形成モデルを樹立し、当該疾患における一酸化窒素合成酵素の役割や相互作用を解明することを着想した。この一酸化窒素合成酵素完全欠損マウスでは、野生型マウスに比較し、生存率が低く、死因の半分以上が自然発症の心筋梗塞で死亡していることが判明しており、さらに内臓脂肪型肥満、高血圧、脂質代謝異常、耐糖能異常、インスリン抵抗性などいわゆるメタボリックシンドロームの病態を表現型として有しており、大動脈瘤/大動脈解離の病態を解明するうえで非常に有用なモデルである。本研究では、一酸化窒素合成酵素完全欠損マウスに対して高脂肪食を3から6か月間投与し、浸透圧ミニポンプを用いてアンギオテンシンII持続皮下投与を行うことで、効率的に大動脈瘤/大動脈解離を形成することをまず目標とした。現在、大動脈の継時的変化、形態学的特徴を解析し、大動脈以外の心血管系、臓器障害について解析中である。3種類の一酸化窒素合成酵素が欠損した一酸化窒素合成酵素完全欠損マウスを用いて、大動脈瘤/大動脈解離形成モデルを樹立し、当該疾患における一酸化窒素合成酵素の役割や相互作用を解明することをまず目標とした。

この一酸化窒素合成酵素完全欠損マウスでは、野生型マウスと比較し、生存率が低く死因の半分以上が自然発症の心筋梗塞で死亡していることが判明しており、さらに内臓脂肪型肥満、高血圧、脂質代謝異常、耐糖能異常、インスリン抵抗性などいわゆるメタボリックシンドロームの病態を表現型として有しており、大動脈瘤/大動脈解離を解明するうえで非常に有用なモデルである。本研究では、一酸化窒素合成酵素完全欠損マウスに対して、高脂肪食を3から6か月間投与し、浸透圧ミニポンプを用いてアンギオテンシンII持続皮下投与を行い、大動脈の継時的変化、形態学的特徴を解析を続けている。一酸化窒素合成酵素完全欠損マウスに対して、高脂肪食とアンギオテンシンIIを負荷し、特に腹部大動脈が形態学的に拡大傾向にあることが確認された。また、血圧や血漿総コレステロール値をはじめ生理代謝物質の解析も進行している。本研究では、一酸化窒素合成酵素完全欠損マウスに対して、高脂肪食を3から6か月間投与し、浸透圧ミニポンプを用いてアンギオテンシンII持続皮下投与を行うことで、効率的大動脈瘤/大動脈解離を形成することをまず目標とし、さらに薬理学的作用を比較検討し、病態解明の糸口を模索する。一酸化窒素合成酵素3種類それぞれの欠損マウスについても大動脈瘤/大動脈解離を作成し、一酸化窒素合成酵素個別の役割や相互作用、代償機構について検討する。そして大動脈瘤/大動脈解離形成進展における分子機序を解明し、新しい内科的治療法の確立を目指す。昨年度同様に主に動物実験施設使用料と物品費に充てる予定である。本研究の遂行に必要な設備・備品については、すべて現有しており、研究費は主に、実験試薬・実験器具の購入、マウスの飼育管理費等に充てる予定である。