hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
難治性根尖性歯周炎に関わるバイオフィルムの遺伝子工学的制御法と科学的診断法の開発

本研究課題は,根管内と根尖孔外のバイオフィルム構成細菌の遺伝子解析による同定結果と臨床症状の相関性を追究し,難治性根尖性歯周炎の科学的(細菌学的)診断法の開発を目指すとともに,細菌のバイオフィルム関連遺伝子に基づいた制御法やクオラムセンシング関連物質の阻害剤や抗菌剤等を用いた化学的抑制法の開発を目的として遂行した。その結果,根尖孔外バイオフィルムの形成には特定細菌種が高頻度に関わり,いくつかの臨床症状と相関していることが明らかとなった。また,抗バイオフィルム作用を示すクオラムセンシング関連物質の阻害剤や抗菌剤およびバイオフィルム形成に関連する遺伝子を発見し,これらによる化学的あるいは遺伝子的バイオフィルム抑制法の臨床適用に向けた緒を築いた。この研究成果は,難治性根尖性歯周炎の新たな治療戦略の確立に有用な示唆を与えるものであると自負している。研究代表者らは,難治性根尖性歯周炎の主な原因の一つとして根尖孔外バイオフィルムの存在を発見し,そのバイオフィルムの形成機序に関わる仮説を提唱した。他方で,機械的除去が困難なバイオフィルムに対する化学的抑制法,すなわち抗バイオフィルム作用を有する薬物等に関する開発研究を行ってきた。本研究は,このような背景をもとに以下の2部のプロジェクトから構成されている。(1)根管内と根尖孔外のバイオフィルム細菌の遺伝子をターゲットとして難治性根尖性歯周炎の科学的診断法の開発を目指す。(2)バイオフィルムの形成阻害・抑制を目的として,遺伝子工学的手技あるいはクオラムセンシング関連物質の阻害剤を用いた化学的抑制法の開発を目的とする。両プロジェクトは同時並行的に遂行している。本研究では,4年間で100症例の難治性根尖性歯周炎症例より根尖孔外バイオフィルム試料を採取するとともに、感染根管症例から根管内バイオフィルム試料を採取し、それぞれの試料について既に確立した遺伝子解析法によりバイオフィルム細菌を同定後その構成比率を解析する予定である。本年度は,数症例のバイオフィルムサンプルより,16S rRNA遺伝子を増幅し,プラスミドライブラリーを作製した。現在,シークエンサーにより細菌を同定中である。一方で,研究代表者らが根尖性歯周炎の難治化に強い関連性があることを報告したPorphyromonas gingivalisを用いて,バイオフィルム系と浮遊系で発現遺伝子を経時的に解析し,その発現遺伝子の相違を検索するため,まず各増殖過程における浮遊系のP.gingivalis細胞の遺伝子発現を検索した。誘導期,対数期,静止期,死滅期のそれぞれの過程で,数種の遺伝子において発現強度が異なり,その中には他の細菌種でバイオフィルム形成との関連が示唆されている遺伝子が含まれていると推察された。現在,マイクロアレイ法に必要なゲノムDNA量を回収するため,バイオフィルム形成モデルに改良を加え,その採集量の確認実験を行った上で経時的にDNAを抽出し,遺伝子をプロファイリングすることにより,浮遊系のP. gingivalis細胞で強発現していた遺伝子との関係を検索中である。他方で,根尖性歯周炎罹患歯の60根管に対し,感染根管治療時の拡大終了後にEr:YAGレーザーを照射し,その有用性を細菌学的および組織化学的に評価した。レーザー照射群42試料において,照射前には15試料から細菌が同定されたが,照射後はその内9試料では細菌が検出されなかった。照射前に検出された平均細菌数は37.7CFU/根管で,照射後も細菌が検出された6試料の平均細菌数は1.7CFU/根管で有意に低下した。また,非照射の1サイズ拡大後の試料の細菌数に比べ,照射後の残存性細菌数は,有意に低かった。これらより,根管内へのレーザー照射は,残存細菌の有効なコンドロール法の1つであることが示唆された。本年度は, 19例の難治性根尖性歯周炎の根尖孔外および6例の感染根管内から得られたバイオフィルム試料より, 16S rRNA遺伝子を増幅し,プラスミドライブラリーを作製した後,シークエンサーにより細菌を同定した。根尖孔外サンプルと根管内試料から,それぞれ68種類と32種の細菌を検出した。また,根尖孔外では18試料,根管内では6試料すべてにおいて, uncultured bacteriumが存在した。根尖孔外バイオフィルムからはPorphyromonas gingivalis, Prevotella sp., Bacteroides bacterium, Bacteroides sp.が最も高頻度に検出され4試料から同定された他, Tanerella forsythensisやCapnocytophaga sp.などの歯肉縁下のデンタルバイオ

フィルム構成細菌種が多数検出された。感染根管内のバイオフィルムにおいてもP. gingivalisが6試料中4試料という高い頻度で同定された。その他, Prevotella sp.,また,平成20年度の繰越し期間中に行った, P.gingivalis ATCC33277株のバイオフィルム形成過程における遺伝子発現の経時的変化に関するマイクロアレイ法のデータを解析した。フローセルモデルを用いて作製したバイオフィルムを付着期,成長前期,成長後期,成熟期の4つの過程に分類し,各々の時期において1.5倍以上発現量が変化していた78遺伝子(全2090遺伝子中)を抽出した。そして,データベースと4過程での発現量の変化の頻度により,最終的に9遺伝子(PGN0088, PGN0098, PGN0208, PGN0845, PGN973, PGN1092, PGN1131, PGN1287, PGN1309, PGN)を抽出した。さらにW83株のデータベースよりバイオフィルム細胞の遺伝子密度を制御しているlux S遺伝子と相同性が100%の遺伝子, PGN2089の発現量の変化が, ATCC33277株のバイオフィルム細胞の増殖曲線と負の相関を示すことを明らかにした。現在,これら10遺伝子についてリアルタイムPCRにより,マイクロアレイ法の結果を検証している。難治性根尖性歯周炎あるいは慢性根尖性歯周炎の根尖孔外および感染根管より得られた105のバイオフィルムサンプルより,16S rRNA遺伝子を増幅し,プラスミドライブラリーを作製した。14サンプルについては,シークエンサーにより細菌を同定した。根尖孔外(n=10)と根管内(n=4)サンプルからの細菌の検出頻度は100%で,14試料すべてからuncuitured bacteriumが検出された。根尖孔外バイオフィルムからは,Porphyromonas gingivalis, Tanerella forsythensis(forsythia), Prevotella sp., Porphyromonas sp.が5試料以上から検出され他,Prevotella intermediaやCapnocytophaga sp.などの歯肉縁下のバイオフィルム構成細菌種が多数検出された。感染根管内のバイオフィルムにおいてもPorphyromonas sp.が全試料から検出され,Fusobacterium nucleatumやP.gingivalisの他,Prevotella sp., Eubacterium sp, Bqcteroides heparinolyticus, Actinomyces sp.といった細菌種が検出された。現在さらにバイオフィルムサンプルを収集するとともに,遺伝子を抽出したサンプルのシークエンシングを,同時平行的に行っている。また,前年度に行ったP.gingivalis ATCC33277株のバイオフィルム形成過程における遺伝子発現の経時的変化に関するマイクロアレイ法のデータをもとに,バイオフィルム形成に関わっていると推察される10遺伝子を抽出した。
中国雲南省西北部の三江併流地域を境にしたアジア広域分布植物の遺伝的分断現象の解析

本課題では日華植物区系に広域分布をする植物種を対象にして,分子系統地理学や染色体ゲノムの解析を行うことによって地理的な境界を探索し,ヒマラヤ造山運動が種分化様式にもたらした影響を調べた.キク科モミジバグマ属Ainsliaeaの分子系統では,(1)雲南省西北部から以西のヒマラヤ地域,(2)雲南省より東側から日本列島まで,(3)四川省の3系統群に分かれ,その分岐は第三紀末から第四紀初期にかけてであると推定された.すなわち,ヒマラヤの造山運動と雲南省西北部における三江併流地域(横断山脈)形成の時期と矛盾しないことが明らかになった.さらに中国東南部から台湾・南西諸島・日本列島にかけてのグループは第四紀後期に急速な種分化を遂げた単系統群であり,形態的には相互に大きく異なる反面で,遺伝的には未分化であることが特徴的であることが明らかになった.ドクダミ科ドクダミ(Houttuynia cordata)では、三江併流地域を中心にしてネパールから日本列島に至るまでの各地域集団間を研究対象にして,分子系統地理学的に解析するとともに,染色体数を解析した.ドクダミにはそれまで知られていなかった種内倍数性(2n=64,72,80,96,112,128)が多数あり,三江併流地域ではその多様性が高く,日華植物区系の東端にあたる台湾と日本では2n=96だけが,西端のネパールでは112だけが検出された.東アジア日華植物区系に広域分布する植物は,雲南省西部地域を境に東西に分化しており,また台湾・日本の島嶼系へ分布域が拡大する際には,中国大陸にある多様性の一部を持ち出す形で行われたと考えられる.葉緑体DNAを用いた分子系統地理学的解析は現在も継続中である.本課題では日華植物区系に広域分布をする植物種を対象にして,分子系統地理学や染色体ゲノムの解析を行うことによって地理的な境界を探索し,ヒマラヤ造山運動が種分化様式にもたらした影響を調べた.キク科モミジバグマ属Ainsliaeaの分子系統では,(1)雲南省西北部から以西のヒマラヤ地域,(2)雲南省より東側から日本列島まで,(3)四川省の3系統群に分かれ,その分岐は第三紀末から第四紀初期にかけてであると推定された.すなわち,ヒマラヤの造山運動と雲南省西北部における三江併流地域(横断山脈)形成の時期と矛盾しないことが明らかになった.さらに中国東南部から台湾・南西諸島・日本列島にかけてのグループは第四紀後期に急速な種分化を遂げた単系統群であり,形態的には相互に大きく異なる反面で,遺伝的には未分化であることが特徴的であることが明らかになった.ドクダミ科ドクダミ(Houttuynia cordata)では、三江併流地域を中心にしてネパールから日本列島に至るまでの各地域集団間を研究対象にして,分子系統地理学的に解析するとともに,染色体数を解析した.ドクダミにはそれまで知られていなかった種内倍数性(2n=64,72,80,96,112,128)が多数あり,三江併流地域ではその多様性が高く,日華植物区系の東端にあたる台湾と日本では2n=96だけが,西端のネパールでは112だけが検出された.東アジア日華植物区系に広域分布する植物は,雲南省西部地域を境に東西に分化しており,また台湾・日本の島嶼系へ分布域が拡大する際には,中国大陸にある多様性の一部を持ち出す形で行われたと考えられる.葉緑体DNAを用いた分子系統地理学的解析は現在も継続中である.本課題では日華植物区系に広域分布をする植物種:タデ科ギシギシ属のキブネダイオウ(Rumex nepalensis)とドクダミ科ドクダミ(Houttuynia cordata)を対象にして、地域集団間の系統関係を分子系統学的に解析するとともに,化石の年代や地理的分布,現生種との比較形態を併せて,日華植物区系に広域に分布を広げることになった植物の起源と分布域拡大の過程について解明することを目的に進めた。材料の採集は,研究課題の中心となる雲南省北西部の三江併流地域で徹底して行った.また,雲南省南西部とネパールにおいても研究材料の入手をした.入手した植物はDNAを抽出して葉緑体DNAハプロタイプを決定した.また,ドクダミにおいては染色体数と核ゲノム量の解析も行った.これまでの結果では,ドクダミとキブネダイオウともに中国雲南省西部を境にして東西に種内の葉緑体DNAハプロタイプが分かれる傾向があることが判明した。またドクダミでは,2n=64,72(FMC=1.8-1.9)が雲南省西部に分布し,中部・東部には2n=128(FMC=3.0-3.2)と96も分布する,しかし台湾と日本では2n=96(FMC=2.4)だけが検出された.

従って東アジア日華植物区系に広域分布するこの二植物は,雲南省西部地域を境に東西に分化しており,また台湾・日本の島嶼系へ分布域が拡大する際には,中国大陸にある多様性の一部を持ち出す形で行われたと考えられる.なお,本研究は開始後1年が経過しただけであり,この研究課題による研究成果は次年度以降に得られることを確信している.本課題では日華植物区系に広域分布をする植物種を対象にして,分子系統地理学や染色体ゲノムの解析を行うことによって地理的な境界を探索し,ヒマラヤ造山運動が種分化様式にもたらした影響を調べた.キク科モミジバグマ属Ainsliaeaの分子系統では,(1)雲南省西北部から以西のヒマラヤ地域,(2)雲南省より東側から日本列島まで,(3)四川省の3系統群に分かれ,その分岐は第三紀末から第四紀初期にかけてであると推定された.すなわち,ヒマラヤの造山運動と雲南省西北部における三江併流地域(横断山脈)形成の時期と矛盾しないことが明らかになった.さらに中国東南部から台湾・南西諸島・日本列島にかけてのグループは第四紀後期に急速な種分化を遂げた単系統群であり,形態的には相互に大きく異なる反面で,遺伝的には未分化であることが特徴的であることが明らかになった.ドクダミ科ドクダミ(Houttuynia cordata)では、三江併流地域を中心にしてネパールから日本列島に至るまでの各地域集団間を研究対象にして,分子系統地理学的に解析するとともに,染色体数を解析した.ドクダミにはそれまで知られていなかった種内倍数性(2n=64,72,80,96,112,128)が多数あり,三江併流地域ではその多様性が高く,日華植物区系の東端にあたる台湾と日本では2n=96だけが,西端のネパールでは112だけが検出された.東アジア日華植物区系に広域分布する植物は,雲南省西部地域を境に東西に分化しており,また台湾・日本の島嶼系へ分布域が拡大する際には,中国大陸にある多様性の一部を持ち出す形で行われたと考えられる.葉緑体DNAを用いた分子系統地理学的解析は現在も継続中である.
エコロジカル・エンジニアの基礎養成を目指した環境教育の導入

本研究では物質工学科第2学年の分析化学基礎実験に「環境水中のCOD測定」として身近な環境や生態系の保全に関心を持たせるような実験プログラムを組み込むことを目的とした。授業振替により7月の丸一日を中海調査とCOD測定にあてた。当初1隻の大きな船で中海に出る計画であったが、予算の関係で9班に分かれた41名の学生は6隻の小型船に分乗し、午前中に中海の3ヶ所を回り、分担して採水、DO測定、採泥および気象観測等を行った。午後から各班で試料水のCOD測定を行った。夏休み明け班毎にプレゼンを行い、「中海の環境を守るために清掃活動などの地域住民の活動などにも目を向け、ごみを出さない工夫も必要だと思った。」等の意見が出された。また、学生に対しアンケートを実施したが、結果の概要は以下の通りである。これまでに中海と身近に接した経験は、83%がない。今回のテーマに興味を持てたかは、83%が興味を持てた。中海での実習では何が一番印象に残ったかは、中海の状態や中海を間近で見られたことが多く上がり、船に乗れたことや船での採水も上った。「中海の環境」に対し何かしようという気になったかは、80%の学生がその気になっていた。卒業研究で「中海の環境」に関するテーマをやってみたいと思ったかは、5%がもともとあり、63%が少しはあった。テーマ全体を通じて「良かった点」としては、「身近な対象物を用いて実験できて良い経験になった。」、「中海が汚れているのは知っていたが、具体的な汚れ具合がわかって良かった。アンケート結果より、普段身近に中海と接している学生は少なかったが、多くの学生が興味を持ってこのテーマに取り組んでくれた。ほとんどの学生が中海に対して何かしようという気になっており、環境に関する卒業研究にも興味を持ってくれている。プレゼン時の意見からも身近な環境に対する意識の高まりが見られ、目的に対する一定の成果が得られた。
抗がん剤漏出による皮膚傷害機構の解明と治療法及び予防法の確立

これまでの研究で、起壊死性抗がん剤に分類される微小管機能阻害薬の血管外漏出時に認められる急性の皮膚傷害には、製剤による酸化ストレス作用と微小管機能障害が関与することを示してきた。また、傷害の軽減には冷罨法が適切であることが示唆されている。(1)微小管機能阻害薬の血管外漏出による皮膚傷害に関して、その添加剤の影響について正常ヒト皮膚線維芽細胞(SF-TY)を用いて検討した。タキサン系抗がん剤であるパクリタキセル(PTX)及びドセタキセル(DOC)に含まれている添加剤は、血管内皮に対しても短時間の曝露で細胞傷害性を示すことが明らかとなった。また、これらの添加剤に含まれる濃度のエタノールは血管内皮への細胞傷害性を示さず、界面活性剤のポリオキシエチレンヒマシ油及びポリソルベート80が細胞傷害へ関与している可能性が示唆された。さらに、PTX及びDOCが引き起こす酸化ストレスには主薬自体も関与して増強していることが明らかとなった。そして、この酸化ストレスは、冷罨法によって抑制される可能性が示唆された。(2) SF-TYを用いたβ-チューブリンおよびβ-アクチンの免疫染色によりビノレルビン(VNR)の細胞周期に依存しない微小管阻害の進行を解析した。VNRによる微小管重合阻害は短時間の曝露では細胞骨格にほとんど影響しないが、長時間の曝露では細胞骨格の破綻が確認でき、曝露時間が延長するほど破綻の強度が増加した。VNRによる細胞分裂に関連しない微小管重合阻害は、急性期の細胞傷害における細胞形態の破綻に対する引き金になる可能性が考えられた。しかしながら、その重合阻害は冷罨法によって遅延・抑制されることが示唆された。冷罨法は細胞骨格の基盤であるβ-アクチンの形態維持に寄与し、VNR曝露による細胞骨格破綻への流れに対して抑制的に働くと考えられた。微小管機能阻害薬であるパクリタキセル及びドセタキセルの皮膚細胞傷害作用に、それらの製剤の添加剤が関与していることが示された。また、起壊死性抗がん剤であるビノレルビンの細胞傷害の細胞骨格破綻に関するメカニズムの知見を得ることができた。さらには、研究成果につき、フォーラム2018衛生薬学・環境トキシコロジー、日本薬学会第139回,第8回国際医療福祉大学学術大会にて発表することができた。これまでの研究では,細胞傷害性メカニズムの一つに,脂質の過酸化による細胞膜の破壊が関与することが明らかになっている。さらには,冷罨法による細胞傷害の抑制や適切な濃度のステロイド剤の添加による炎症性サイトカインの産生抑制が認められ,臨床での有用性の可能性が示唆された。そこで,種々の起壊死性抗がん剤ごとの急性期および慢性期の傷害性と関連する炎症性サイトカインや細胞傷害因子の発現状況を確認する。さらには,ヒト培養細胞を用いて,酸化ストレス等の細胞傷害性に及ぼす因子や,血管障害性,抗がん活性に基づく細胞毒性,さらには生体防御因子の発現と温度変化との関連性を含めて,臨床での様々な皮膚傷害に対応した処置方法ならびに予防方法を確定する。罨法や副腎皮質ステロイド剤の投与により,組織傷害に関連するサイトカインや,メタロチオネインやHSP(ヒートショックプロテイン)といった生体防御に関連した分子の動態を解析し,病態や薬剤の特徴に沿った臨床での予防やケアに有用な分類を提唱する(1)微小管機能阻害薬であるビノレルビン(VNR)の血管外漏出による皮膚傷害抑制効果に対してのメカニズムを,正常ヒト皮膚線維芽細胞(SF-TY)を用いて検討した。細胞膜破壊によるnecrosisは37°CでVNR(臨床用薬液の10倍希釈溶液)を曝露した細胞では有意に増加したが,23°Cで曝露した細胞では有意に抑制された。一方apoptosisは,曝露24時間後ではいずれの温度においてもほとんど検出されず,37°Cで曝露した細胞では曝露72時間後に有意に増加し,23°Cでは抑制された。VNRを37°Cで曝露した細胞では細胞傷害性が増加したが23°Cでは対照群レベルまで抑制された。従って,VNRの細胞傷害はダブリング以前はnecrosisが主であり,以後は薬理作用によるapoptosisが主となると考えた。VNRによって引き起こされるnecrosisとapoptosisのいずれに対しても冷罨法が抑制効果を示すことが明らかとなった。(2)SF-TYを用いた免疫染色によりVNRの細胞周期に依存しない微小管阻害の進行を解析した。VNR(臨床用薬液の10倍希釈溶液)を48時間まで経時的に曝露し,β-チューブリンの免疫染色を行った。VNRの曝露直後から一部の細胞の微小管が極端に短縮された像が認められ,数時間かけてほぼ全体の細胞で短縮が認められた。冷罨法では,VNRの微小管重合阻害の進行を曝露初期の段階から遅らせ,曝露後4時間までの寄与が大きいと考えられた。一方でアクチンフィラメントに対しての影響は少なく,VNRによる細胞内微小管重合阻害は,急性期の細胞傷害における細胞形態の破綻に対する影響は少ないと考えられた。その重合阻害は冷罨法によって遅延・抑制されることが示唆され,暴露初期の微小管重合阻害は微小管の細胞骨格形成への影響ではなく,細胞内の機能に関わる役割に影響を及ぼすと考えられた。起壊死性抗がん剤であるビノレルビンの細胞傷害のメカニズムに関する知見を得ることができた。

また,研究成果につき,日本薬学会第138回,国際医療福祉大学学術大会にて発表することができた。これまでの研究で、起壊死性抗がん剤に分類される微小管機能阻害薬の血管外漏出時に認められる急性の皮膚傷害には、製剤による酸化ストレス作用と微小管機能障害が関与することを示してきた。また、傷害の軽減には冷罨法が適切であることが示唆されている。(1)微小管機能阻害薬の血管外漏出による皮膚傷害に関して、その添加剤の影響について正常ヒト皮膚線維芽細胞(SF-TY)を用いて検討した。タキサン系抗がん剤であるパクリタキセル(PTX)及びドセタキセル(DOC)に含まれている添加剤は、血管内皮に対しても短時間の曝露で細胞傷害性を示すことが明らかとなった。また、これらの添加剤に含まれる濃度のエタノールは血管内皮への細胞傷害性を示さず、界面活性剤のポリオキシエチレンヒマシ油及びポリソルベート80が細胞傷害へ関与している可能性が示唆された。さらに、PTX及びDOCが引き起こす酸化ストレスには主薬自体も関与して増強していることが明らかとなった。そして、この酸化ストレスは、冷罨法によって抑制される可能性が示唆された。(2) SF-TYを用いたβ-チューブリンおよびβ-アクチンの免疫染色によりビノレルビン(VNR)の細胞周期に依存しない微小管阻害の進行を解析した。VNRによる微小管重合阻害は短時間の曝露では細胞骨格にほとんど影響しないが、長時間の曝露では細胞骨格の破綻が確認でき、曝露時間が延長するほど破綻の強度が増加した。VNRによる細胞分裂に関連しない微小管重合阻害は、急性期の細胞傷害における細胞形態の破綻に対する引き金になる可能性が考えられた。しかしながら、その重合阻害は冷罨法によって遅延・抑制されることが示唆された。冷罨法は細胞骨格の基盤であるβ-アクチンの形態維持に寄与し、VNR曝露による細胞骨格破綻への流れに対して抑制的に働くと考えられた。微小管機能阻害薬であるパクリタキセル及びドセタキセルの皮膚細胞傷害作用に、それらの製剤の添加剤が関与していることが示された。また、起壊死性抗がん剤であるビノレルビンの細胞傷害の細胞骨格破綻に関するメカニズムの知見を得ることができた。さらには、研究成果につき、フォーラム2018衛生薬学・環境トキシコロジー、日本薬学会第139回,第8回国際医療福祉大学学術大会にて発表することができた。これまでの研究では,細胞傷害性メカニズムの一つに,脂質の過酸化による細胞膜の破壊が関与することが明らかになっている。さらには,冷罨法による細胞傷害の抑制や適切な濃度のステロイド剤の添加による炎症性サイトカインの産生抑制が認められ,臨床での有用性の可能性が示唆された。そこで,種々の起壊死性抗がん剤ごとの急性期および慢性期の傷害性と関連する炎症性サイトカインや細胞傷害因子の発現状況を確認する。さらには,ヒト培養細胞を用いて,酸化ストレス等の細胞傷害性に及ぼす因子や,血管障害性,抗がん活性に基づく細胞毒性,さらには生体防御因子の発現と温度変化との関連性を含めて,臨床での様々な皮膚傷害に対応した処置方法ならびに予防方法を確定する。
幼稚園園庭における環境デザインと教育的意義に関する生態システム論的研究

園庭には、一方には、教育設備としての園庭があり、他方には、社会資本としての園庭がある。園庭は、子どもの活動の生態系において多様な機能をもち、重層的な意味を有し、生活と学校教育に連続性をつくる機会を提供している。本研究では、園庭の歴史的変遷や園庭デザインの今日的特性、園庭利用の実際と子どもの活動の実態を調査、検討し、園庭の環境デザインの在り方と教育的意義について明らかにした。1.園庭デザインの今日的特性についての調査:園庭研究に関する種々の情報収集を行うとともに、特色ある園庭を有していたり、園庭の活用に特徴を有する幼稚園について関東から九州地域の5園を選定し、実地調査を行った。園庭の設計、遊具・用具の設置、動植物関係施設の設計、教材の選定と設置などの観点を調査し、利用方法の確認、形態や設置方法を含めてスチール写真など映像記録媒体により記録した。また、調査園の保育者に園環境設定の目的や子どもの活用、それに対する保育上の評価についてインタビューを行った。主な遊具・用具、主な設備については共通性がみられたが、例えば砂場と水場と用具置き場のとの位置関係や、それらとブランコや滑り台などの遊具との位置など配置のあり方によって、保育における活用の仕方や遊びへの期待が異なることが明らかになった。また、植栽等やちょっとした起伏の配置など立体化のあり方には多少の個性が見られ、園外の環境利用を含めて、園庭環境の特徴づけを促していた。2.園庭利用の実際と子どもの活動の実態についての調査:奈良女子大学附属幼稚園において、子どもの園庭利用の実際について、フィールド観察を行った。ビデオ撮影によって記録を採取した。3歳児用の園庭では、3歳児が斜面を利用しモノの持ち運びや滑り降り、斜面下の隠れ空間の利用が見られた。広い園庭では、45歳児を中心に遊具や用具を使った一般的な遊びや運動が展開されたほか、虫探しや大きな斜面を利用した遊びなど探索的、探検的な遊びが見られた。3歳児も一部は斜面を上がったり、小屋に入るなど、環境探索を活発に行う姿がみられた。本年度の研究より、幼稚園における教育と生活の重層化は、子どもが主体的に探索することが可能となる要素や余地がどのように確保されているか、注目したいと考えた。1.園庭の歴史的変遷についての調査:園庭に関する公刊物や対象幼稚園での記録の収集を行い、身体観、歴史的社会的状況、地域文化的特質などの観点から分析を行った。2.園庭デザインの今日的特性についての調査:地域特性の異なる奈良市内の幼稚園5園を対象に、実地調査を行った。園庭の設計、遊具・用具の設置、動植物関係施設の設計、教材の選定と設置などの観点を調査し、利用方法や形態、設置方法を含めてスチール写真など映像記録を採取した。また、調査園の保育者に園環境設定の目的や子どもの活用方法、それに対する保育上の評価についてインタビューを行った。主な遊具・用具、主な設備については共通性が高かったが、例えば砂場と水場と用具置き場のとの位置関係や、それらとブランコや滑り台などの遊具との位置など配置のあり方、園舎と園庭の位置関係によって、保育における活用の仕方や遊びへの期待が異なっていた。また、植栽等や築山の配置など立体化のあり方には多少の個性が見られ、園外の環境利用を含めて、園庭環境の特徴づけを促していた。3.園庭利用の実際と子どもの活動の実態についての調査:奈良女子大学附属幼稚園において、子どもの園庭利用の実際について、フィールド観察を行った。研究スタッフはそれぞれデジタルカメラによって撮影記録を採取するとともに、観察後のカンファランスによって、園庭環境の異相性と重層性を捕捉した。カンファランスは録音し、逐語記録を作成し、マイクロな分析を開始している。また、岐阜県の私立幼稚園と奈良市の公立幼稚園各1園の協力を得て、園庭を活用したプロジェクト活動の観察調査を行った。大学生に園庭で展開する遊びのデザインを試行的に実施させた。以上より、保育者や子ども、大学生、研究者などのポジショニングによって、環境の資源化可能性が顕在化された。1.園庭の歴史的変遷についての調査:1912年に保育が開始された奈良女子高等師範学校附属幼稚園の史料を収集し、園庭の形態の変遷と幼稚園教育実践における園庭の役割や機能の変遷、園庭の成立過程の検討を行った。創設時は元小学校を代用園舎としており、平坦で複数箇所に園庭があった。「自由遊戯」の保育が導入されるにつれ、「変化のある園庭」とそこでの「日々の指導」が重視されるようになった。大正時代末以降は急速に整備され、集団遊びや模倣遊戯、栽培など遊びや活動の特徴に応じた園環境がつくられていった。2.園庭デザインの今日的特性についての調査:園環境をよく工夫している幼稚園について、保育参観含めて実地調査を行った。限られた屋外の環境資源について「特徴づけ」を行うことで園児の自主的な活用を促していた。

植栽を工夫し、日常的な栽培経験を可能にすると共に、隠れ場となる空間を設置していた。隣接する小学校の校庭に対して開放的であるなど「境界づけ」についても特徴を有しており、保育理念の明確化によって、園独自の園庭デザインが促されていることが明らかになった。3.園庭利用の実際と子どもの活動の実態についての調査:私立A幼稚園における「におい」のアートワークショップにおいては、子ども・保育者とも「においをかぐ」ことを通して園庭を探索し、園庭ににおいを見いだすこと自体を楽しむと共に、それまで見過ごしていた季節的変化を発見し、日常の遊びの世界を拡張させた。公立B幼稚園において子どもの「投げる」行為に着目すると、投てき物や的によって動作を調整したり、当たり方の違いによって的となる植物の季節的変化に気づいたり、築山の利用でより高度な身体技巧を促すなど、身体能力の向上と共に、身体動作によって子どもの園庭理解が促されることが明らかになった。公立C幼稚園での園庭でのレストランごっこでは、調理場と食堂、会計など、巧みな「境界づけ」によって遊びが展開されることを明らかにした。
顔面肩甲上腕型筋ジストロフィーにおけるエピジェネティック変化と病態機序の解明

常染色体優性遺伝形式をとるFSHDは、遺伝性神経筋疾患の中で3番目に頻度の高い社会医学的に重要な疾患である。染色体4q35-ter領域に存在する3.3kbの繰り返し配列(D4Z4)の数が減少することによる疾患であるが、1991年遺伝子座が同定されて以後、その具体的発症機序は未だ明らかでない。本研究では、1)我々が開発したlong PCR法を利用したFSHD遺伝子診断法を活用し、FSHD250家系について、リピート数とサザンプロット解析の結果を比較・検討した。その結果、リピート数の多い患者、およびモザイクなど複雑なgenotypeの症例ではlong PCRでの検出は困難であったが、リピート数6個までは、PCRの方が正確であった0両者の長・短所を理解した上での解析が必要であると考えられた。現在リピート数と臨床症状との関連はデータ解析中である。2)骨格筋を用いての:FSHD遺伝子診断は、サザンプロット法では不可能である。そこでPCR法を用いてリピート数を同定し、60例の4q35 FSH:Dを見いだした。そこで筋病理変化とリピート数の関連を検討したが、病理変化は極めて多様で、リピート数との相関は明らかでなかった。3)筋病理変化の多様性を反映するように、骨格筋を用いた網羅的遺伝子発現解析結果も、また多様であり、疾患特異的あるいはリピート数との関連を示唆する遺伝子発現変化を見いだすことはこれまでのところできていない。さらに詳細な解析が必要である。4)D4Z4リピート近傍に存在する遺伝子群の発現、およびスプライシング異常の有無を骨格筋を用いて検討したが、これまで報告されているような変化は見いだすことができなかった。以上の結果より、臨床的・筋病理学的に多様で、遺伝学的にも複雑な本疾患の染色体欠失と病態との関連を明らかにするためには、新たな視点、方法論が必要とされるかもしれない。
A high-resolution gamma-ray tracking detector for in-beam spectroscopy of unstable nuclei

本研究では、エネルギー分解能に優れたゲルマニウム検出器を導入してインビームガンマ分光を強化し、従来不可能であった高エネルギーγ線のピーク同定、偶奇核の分光や励起準位の寿命測定が可能にする。我々は日米欧の国際共同プロジェクトを構築し、国内外の高性能ゲルマニウム検出器を集め、2020年に理化学研究所「RIビームファクトリー」で得られる大強度高速不安定核ビームを利用した実験を行う。我々日本グループが、科学的インパクトが最も大きい4つの主要なテーマ、「Ca同位体の奇数核の分光」、「78Niおよびその周辺の分光」、「100Sn領域の分光」、「8重極変形領域の探索」を推進し、核構造の統一的な理解を進める。理研のRIビームファクトリー(RIBF)は日本の誇る優れた加速器施設であり、世界に先駆けて不安定核ビームを提供してきた。本研究は、日米欧の国際共同プロジェクトとして、エネルギー分解能に優れたゲルマニウム検出器を新たに導入しインビームガンマ分光研究を展開する。RIBFの能力と本提案による高分解能ガンマ線検出器を組み合わせることにより、原子核の構造が安定核から不安定核にどのように変化していくのかを明らかにする事が期待される。また、本研究により、当該分野の我が国の先進性をさらに高める事ができると評価される。
サルiXEN細胞を用いた胚盤胞補完法の開発

本研究では、胚盤胞補完法を用いた幹細胞由来臓器移植の実現に向けて、新たな細胞源として期待されるXEN細胞を用いた胚盤胞補完法の開発を目的とし実験を行った。本年度は、申請者がこれまでの研究で確立したイヌ人工誘導XEN細胞(iXEN細胞)の培養維持方法を応用することでサルES細胞に比べて、より安定して樹立・培養が可能なヒトiPS細胞からのiXEN細胞の誘導を試みた。その結果、ヒトiPS細胞をイヌiXEN細胞培地にて培養することで、一部、XEN細胞に類似した形態を有する細胞が観察されたが、本細胞は培養維持できなかった。次に、ヒトiPS細胞を既存の手法を用いて、より多分化能の優れたnaive状態に誘導し、イヌiXEN細胞培地にて培養したところ、イヌiXEN細胞に類似した扁平、多角形の形態を有する細胞コロニーが得られ、本細胞コロニーは継代培養することができた。これまで、ヒトiPS細胞からiXEN細胞を作製した報告はなく、イヌiXEN細胞培地はヒトiXEN細胞の培養維持においても有用である可能性が示唆された。また、XEN細胞は後期胚盤胞期胚から分離される幹細胞であり、多能性幹細胞と同様の自己増殖能を有する一方で、その分化能は内胚葉系細胞のにみ限定されていることから、多能性幹細胞に比べ腫瘍化リスクが少ないと考えられている。本手法を用いて、XEN細胞と同様の性質を有するヒトiXEN細胞が作製できれば、再生医療における新たな細胞源としてだけではなく、胚発生研究や動物体内で臓器をまるごと作製する胚盤法補完法など様々な分野に応用できると考えられる。29年度が最終年度であるため、記入しない。
ユーカリ属植栽地における土壌養分収奪性の検証

ユーカリ属植物は土壌養分の収奪が著しいとよく言われるが、日本に育つユーカリにおいてもそのような問題が生じるかを、他の植生がある土壌と比較・検証した。ユーカリ林、クスノキ林、スギ・ヒノキ林、二次林の各林床からそれぞれ6か所、初夏と晩秋に土壌のサンプリングを行った。それらを構成する樹木の平均樹高・胸高直径は、ユーカリ林で15.7m、22.7cm、クスノキ林で21.6m、40.6cm、二次林で11.2m、15.1cm、スギ・ヒノキ林で11.8m、17.2cmであった(クスノキ林、二次林については材積比で主要構成樹種の値)。サンプルは分析まで乾燥して保存した。乾土5gに超純水25m1を加えよく振り混ぜ、遠心分離した上清を各種の分析に用いた。分析項目は硝酸、アンモニウム、リン酸、カルシウム、マグネシウム、電気伝導度である。リン酸は水には溶出しなかったので、1/20容量の0.1M塩酸を加え試料を調整した。分析を行った結果、硝酸はどの林でも初夏に多く、晩秋にはどの林でも概ね検出限界未満となった。ユーカリ林ではリン酸の減少はほとんど見られず残存率は97%であるのに対して、クスノキ林は77%スギ・ヒノキ林は72%であった。二次林は他と異なり、初夏より晩秋が多く272%であった。アンモニウムの残存率はどれも大差がなく62-69%であった。マグネシウムは大多数のサンプルで検出限界未満で、カルシウムはユーカリ林で検出限界未満が多かったものの、全般に数値が小さく大きな差異は見受けられなかった。電導度の初夏から晩秋への残存率はユーカリ林56%、クスノキ林48%、二次林41%、スギ・ヒノキ林43%であった。収奪が激しいといわれるユーカリであるが、他の植生に比較して特別に収奪が激しいことを支持する数値は示されなかった。もちろんこれらの指標だけで厳密な議論ができるものではないが、日本の豊かな森林の一画にユーカリを植栽した場合には、ユーカリの収奪性はまったく問題とならないと思われた。
光電子ホログラフィー解析システムの開発

本研究の目的は、蛍光スクリーン上に表示された光電子回折パターンをCCDカメラで2次元的に測定するシステムの構築と、測定された光電子回折パターンをホログラフィーの手法を用いて表面構造解析を行う解析プログラムの開発である。2次元回折パターンの測定システムについては、冷却CCDカメラとデータ測定・解析用コンピュータにより、回折パターンの測定・表示を行うシステムを完成することができた。このシステムの特徴は,CCD(電荷結合素子)の各ピクセル毎に16ビットという広いダイナミックレンジでデータを取り込むことが可能であることである。実際に、低速電子回折パターンや中速電子回折パターンの測定を行いこのシステムによる測定の精度、性能の評価を行った。その結果、システムが非常に広いダイナミックレンジを持ち、光電子回折パターンの測定にも十分に対応できる性能であることが確認された。今後、実際の光電子回折パターン・ホログラフィーへの適用を行っていく予定である。測定・解析プログラムに関しては、前述のようにCCDカメラの画像をコンピュタ-に取込み、ディスプレイに表示を行うことが現在可能になっている。デジタル化されたデータは、通常の濃淡表示だけでなく、等高線表示や、プロファイルの表示も可能であり、測定表示プログラムに関してはほぼ完了した。現在、光電子回折パターンをホログラフィーによって解析するプログラムの開発を行っている段階であり、今後は得られた実空間像(表面構造)を表示する部分の作成も行う予定である。
骨免疫制御を可能にするインプラントナノ表面形態の探索

歯科用インプラント頸部に生じる周囲骨吸収は未だ決定的な解決策のない課題である.破骨細胞の前駆細胞となるマクロファージ(MΦ)はインプラント周囲骨吸収の発症に深く関与する.また,MΦはM1型あるいはM2型のサブタイプに分極し,歯周炎においては,M1型MΦが特異的に破骨細胞形成を抑制することが知られている.MΦの分極化は,リガンド刺激によって引き起こされるだけでなく,足場付着時の細胞内メカノトランスダクション機構を介した細胞形態変化によっても制御される.そのため,申請者は,MΦの分極を制御するナノ表面形態をインプラント頸部に付与することで,骨免疫環境を介して破骨細胞の形成を抑制し,インプラント頸部の骨吸収を防ぐ技術を着想した.平成29年度では、平滑面(機械研磨面),ミクロ粗面(酸処理面)および実験的ナノ粗面のチタンインプラントをラット上顎骨第一大臼歯抜歯後の歯槽骨に埋入し,4週間の待機期間を経て骨結合を確認した後に,インプラント周囲炎モデルの構築を試みた.インプラント埋入4週後に,4-0絹糸をインプラント頸部に結紮し,4週間留置することによりインプラント周囲炎を惹起させた.マイクロCTによるインプラント周囲骨吸収の定量的評価およびインプラント周囲組織の脱灰および非脱灰切片による組織学的評価を行った.その結果,3-0絹糸の結紮により,破骨細胞形成を伴うインプラント周囲骨吸収が惹起させることに成功した.また,インターフェロンγと腫瘍壊死因子αまたはインターロイキン4を用いたMΦ細胞株のM1およびM2への誘導に成功し,マウス単球・MΦ用細胞株や破骨細胞前駆細胞を用いた細胞培養試験の準備が整った.インプラント周囲炎のラット上顎モデルを成立することができた.また,インプラント周囲組織の脱灰切片の作製に成功した.現在,インプラント周囲組織の炎症状態や破壊様相,破骨細胞の出現度およびインプラント周囲骨吸収の程度に関して,各種チタンインプラント表面性状で違いがみられるかどうかを組織学的に検証中である.また,マウス単球・マクロファージ用細胞株や破骨細胞前駆細胞を用いて細胞培養試験を行い,M1およびM2マーカーの発現誘導や破骨細胞誘導性に関して,各種チタン表面性状で違いがみられるかどうかを分子生物学的に検証中である.ラット上顎第一大臼歯相当部の顎堤に各種表面性状のミニインプラントを埋入し,4週後にインプラント頸部に4-0絹糸を結紮し,4週間留置する.その後,マイクロCT解析により骨吸収量を,脱灰切片のヘマトキシリン・エオジン染色やマッソン・トリクローム染色,TRAP染色,TUNEL染色およびin situハイブリダイゼーションにより破骨細胞出現量やMΦサブタイプの分布,周囲組織の破壊程度を分析し,各種表面性状の違いによるインプラント周囲炎に関わる骨免疫機構におよぼす影響を組織学的および組織形態計測学的に検証する予定である.また,マウス単球・マクロファージ用細胞株であるJ774A.1細胞や破骨細胞前駆細胞であるRAW264.8細胞を各種チタン表面性状上で培養し,M1およびM2マーカーの発現や破骨細胞誘導性を,リアルタイムPCRやウェスタンブロッティング分析,転写因子のレポーターアッセイ,TRAP染色などにより評価する予定である.歯科用インプラント頸部に生じる周囲骨吸収は未だ決定的な解決策のない課題である.破骨細胞の前駆細胞となるマクロファージ(MΦ)はインプラント周囲骨吸収の発症に深く関与する.また,MΦはM1型あるいはM2型のサブタイプに分極し,歯周炎においては,M1型MΦが特異的に破骨細胞形成を抑制することが知られている.MΦの分極化は,リガンド刺激によって引き起こされるだけでなく,足場付着時の細胞内メカノトランスダクション機構を介した細胞形態変化によっても制御される.そのため,申請者は,MΦの分極を制御するナノ表面形態をインプラント頸部に付与することで,骨免疫環境を介して破骨細胞の形成を抑制し,インプラント頸部の骨吸収を防ぐ技術を着想した.平成29年度では、平滑面(機械研磨面),ミクロ粗面(酸処理面)および実験的ナノ粗面のチタンインプラントをラット上顎骨第一大臼歯抜歯後の歯槽骨に埋入し,4週間の待機期間を経て骨結合を確認した後に,インプラント周囲炎モデルの構築を試みた.インプラント埋入4週後に,4-0絹糸をインプラント頸部に結紮し,4週間留置することによりインプラント周囲炎を惹起させた.マイクロCTによるインプラント周囲骨吸収の定量的評価およびインプラント周囲組織の脱灰および非脱灰切片による組織学的評価を行った.その結果,3-0絹糸の結紮により,破骨細胞形成を伴うインプラント周囲骨吸収が惹起させることに成功した.また,インターフェロンγと腫瘍壊死因子αまたはインターロイキン4を用いたMΦ細胞株のM1およびM2への誘導に成功し,マウス単球・MΦ用細胞株や破骨細胞前駆細胞を用いた細胞培養試験の準備が整った.インプラント周囲炎のラット上顎モデルを成立することができた.また,インプラント周囲組織の脱灰切片の作製に成功した.

現在,インプラント周囲組織の炎症状態や破壊様相,破骨細胞の出現度およびインプラント周囲骨吸収の程度に関して,各種チタンインプラント表面性状で違いがみられるかどうかを組織学的に検証中である.また,マウス単球・マクロファージ用細胞株や破骨細胞前駆細胞を用いて細胞培養試験を行い,M1およびM2マーカーの発現誘導や破骨細胞誘導性に関して,各種チタン表面性状で違いがみられるかどうかを分子生物学的に検証中である.ラット上顎第一大臼歯相当部の顎堤に各種表面性状のミニインプラントを埋入し,4週後にインプラント頸部に4-0絹糸を結紮し,4週間留置する.その後,マイクロCT解析により骨吸収量を,脱灰切片のヘマトキシリン・エオジン染色やマッソン・トリクローム染色,TRAP染色,TUNEL染色およびin situハイブリダイゼーションにより破骨細胞出現量やMΦサブタイプの分布,周囲組織の破壊程度を分析し,各種表面性状の違いによるインプラント周囲炎に関わる骨免疫機構におよぼす影響を組織学的および組織形態計測学的に検証する予定である.また,マウス単球・マクロファージ用細胞株であるJ774A.1細胞や破骨細胞前駆細胞であるRAW264.8細胞を各種チタン表面性状上で培養し,M1およびM2マーカーの発現や破骨細胞誘導性を,リアルタイムPCRやウェスタンブロッティング分析,転写因子のレポーターアッセイ,TRAP染色などにより評価する予定である.(理由)実験条件の確立がやや遅れたことや主な支出対象であった実験機器の納品予定日が年度内に間に合わなかったことにより,次年度使用額が生じた.(使用計画)平成30年度の実験計画に組み込み,必要な実験機器の購入,組織学的評価および細胞培養試験に関連する試薬や消耗品の購入に充てる予定である.
プロセス用大口径均一プラズマ発生技術

工業用に使われるプラズマは電子のエネルギー分布がマクスウェル分布からずれていることが多い。このため、このようなプラズマを二電子温度プラズマとして扱い、その特性を測定する方法を確立した。そして実際にマイクロ波プラズマを用いて、ラングミュアプローブによる測定結果から各電子温度および電子密度を求めることができることを確認した。このようなプラズマから取り出されるイオンのエネルギーとしては、特に低エネルギーの場合にはプラズマ電位によって加速される分を無視できないことが分かった。またこのプラズマ電位は、二つの電子温度のうち高いほうの電子温度に大きく左右されることを理論的に導いた。そしてマイクロ波イオン源から引き出したイオンのエネルギーを、質量分析計の磁界の自乗とイオンエネルギーが直線関係にあることを利用して測定し、このことを実験的に確かめた。一方、短波帯の高周波(13.56MHz)を誘導結合させることによるプラズマ(ICPプラズマ)発生技術により、大口径で均一なプラズマを発生させる実験をおこない、30cmの口径で、標準偏差±3%以下の不均一性で且つ10^<11>ions/cm^2以上の密度のプラズマを発生することができた。高周波アンテナとして数種類の構造のものを実験的に比較検討した結果、単純な一ターンのループアンテナを誘電体の中に埋めこんだ構造のもので上記結果を得ることができた。また、短波帯の高周波とマイクロ波を組み合わせ、同じプラズマに結合させるための構造について検討をした。その結果、短波帯の高周波アンテナに同軸ケーブルを結合させることでマイクロ波を重畳させることができることが分かった。
イヌ癌抑制遺伝子BRCA2の新規発現制御機構の解明：癌との関係性を見据えて

イヌ乳腺腫瘍発症の抑制遺伝子産物であるBRCA2は相同組換え修復に貢献することで細胞の腫瘍化を防いでいる。近年、BRCA2の発現量の低下が腫瘍発症と関係することが報告され始めている。これまでの研究から申請者はイヌBRCA2のイントロンに新規サイレンサー配列が存在することを見出した。平成29年度までに、イントロンの一部(50 bp)に転写を抑制する活性があることを証明し、そのDNA配列に相互作用するタンパク質を質量分析により数種類同定した。平成30年度においては、平成29年度に得られた結果をさらに詳しく研究した。サイレンサー配列が存在する領域を50 bpの長さで限定し、その配列と相互作用する可能性があるタンパク質を6種類特定していたので、この6種類のタンパク質について機能解析を行った。まず、これらのタンパク質を強制発現またはノックダウンした細胞を作製した。これらの細胞を用いてレポーターアッセイを用いた転写抑制活性の測定や定量的PCRによるBRCA2のmRNAの発現量を調べた。この結果、5種類のタンパク質を強制発現させると転写抑制活性が増加し、1種類のタンパク質の発現量を低下させると転写抑制活性が減少することが分かった。このタンパク質のノックダウン細胞では、内因性BRCA2の発現量も低下していることも分かったので、このタンパク質が転写抑制因子として機能している可能性が示唆された。申請者はイヌBRCA2のイントロンに新規サイレンサー配列が存在することを予備的な実験により発見した。この配列はBRCA2の発現制御に関与し、この制御機構の異常は腫瘍発症と関係すると考えられる。本研究計画では新規サイレンサー領域に相互作用する転写抑制因子を同定し、この転写抑制因子によるBRCA2の発現制御機構を解明することを第一の目的として、平成28年度の研究を行った。予備的研究により発見していたBRCA2のイントロンの一部(500 bp)に存在するサイレンサー配列がどの領域に存在するのかを50 bpの長さで限定することができた。すなわち、ルシフェラーゼを用いたレポーターアッセイにより、この50 bpが存在するとBRCA2のプロモーター活性は、著しく減弱した。サイレンサー配列が存在する領域を50 bpの長さで限定したので、次にどの様なタンパク質が相互作用することが可能であるか生化学的な手法により同定した。すなわち、サイレンサー配列を含む50 bp、または、サイレンサー活性を持たない50 bpを結合したアガロースビーズを用いて、HeLa細胞の核タンパク質抽出液から相互作用するタンパク質を精製した。精製したタンパク質群の中で、サイレンサー配列を含む50 bpに特異的に相互作用しているタンパク質を質量分析により数種類同定した。当初の計画通りにサイレンサー配列を含む領域の限定をすることができ、さらに、そこに相互作用していると考えられるタンパク質を同定できたため。申請者はイヌBRCA2のイントロンに新規サイレンサー配列が存在することを見出した。平成28年度までに、イントロンの一部(50 bp)に転写を抑制する活性があることを証明し、そのDNA配列に相互作用するタンパク質を質量分析により数種類同定した。平成29年度においては、28年度に得られた結果をさらに詳しく研究した。サイレンサー配列が存在する領域を50 bpの長さで限定したので、10 bp単位で変異を導入し、どの塩基配列が特に重要なのかルシフェラーゼを用いたレポーターアッセイにより検討した。変異を導入後に転写の抑制が解除される領域が少なくとも二カ所存在した。サイレンサー配列と相互作用する可能性があるタンパク質が特異的にサイレンサー配列と相互作用するのか調べるために、28年度と同様にビーズを用いた生化学的な精製法を行い、それらのタンパク質が検出されるかウエスタンブロットにより確認した。その結果、少なくとも3種類のタンパク質は、特異的な相互作用が観察された。これらのタンパク質を強制発現またはノックダウンした細胞を作製した。現在、この細胞を用いて、現在BRCA2の発現量の変化やChIPアッセイにより、細胞内において実際にサイレンサー配列に相互作用しているのか検討中である。転写抑制に関わるタンパク質を順調にスクリーニングすることが出来ているが、実験計画を立てた時点では、実験項目に無かった実験手法により、より詳しく機能解析を行う必要が出てきたため。

これらの細胞を用いてレポーターアッセイを用いた転写抑制活性の測定や定量的PCRによるBRCA2のmRNAの発現量を調べた。この結果、5種類のタンパク質を強制発現させると転写抑制活性が増加し、1種類のタンパク質の発現量を低下させると転写抑制活性が減少することが分かった。このタンパク質のノックダウン細胞では、内因性BRCA2の発現量も低下していることも分かったので、このタンパク質が転写抑制因子として機能している可能性が示唆された。現在、同定したタンパク質を発現する細胞を作製中であり、今後、この細胞を用いてChIPアッセイを行う事で、細胞内でも相互作用することを証明する予定である。また、この細胞を使い、レポーターアッセイを行う事で実際にプロモーター活性に影響を与えているのかも調べる。明らかにサイレンサー配列に相互作用し、プロモーター活性に影響を与えるタンパク質を同定する事が出来たら、腫瘍発症との関係性を調査する予定である。ChIPアッセイの実験手法の確立に時間を要していたが、概ね実験手法は確立できたので、平成30年度は順調に実験することが出来ると考えられる。今年度は、細胞周期を同調した実験手法により、BRCA2の発現解析を行うことと平行して、各種腫瘍細胞株や腫瘍サンプルにおける発現量解析を実施する予定である。効率的な試薬等の購入が行えたため、少額の差額が発生した。平成30年度においても試薬等の購入が必要なので、併せて使用する予定である。平成29年度においても試薬等の購入が必要なので、併せて使用する予定である。