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分子科学における動的過程の実験的理論的研究

わが国とスウェ-デンとが共通に関心をもち,かつ共に高いレベルを保持している分子科学の諸分野において相互に研究者を派遣し,国際共同研究の態勢をつくり,研究の発展に貢献しようとする目的で本研究課題がとりあげられた.昭和63年3月分子研長倉所長とウプサラ大学シ-グバ-ン教授の間で共同研究の合意書が取り交わされ,これが今回の三年間の共同研究のベ-スになっている.とくに光電子分光及び光化学磁場効果の分野をはじめ,時間分割分光,シンクロトロン放射光科学,理論化学の分野も含められた。ウプサラ大学はESCAのメッカであり,K.シ-グバ-ン教授(昭和56年ノ-ベル物理学賞受賞)の開拓的な仕事が今も受けつがれている.同教授は現在レ-ザ-ESCA計画を遂進中で,新しい装置の開発に取り組んでいる.とくにレ-ザ-技術を導入するESCAとトロイダル回折格子を用いる高分解能光電子分光において,分子科学研究所の協力を求めている.分子研木村らはすでにレ-ザ-光電子分光で進んだ技術をもっており,シ-グバ-ン教授に協力することができた.木村の協力研究者であった阿知波洋次都立大助教授をウプサラに派遣し,レ-ザ-光電子装置の立上げに協力し,ウプサラで最初の光電子スペクトル(レ-ザ-による)が得られた.一方,共鳴線(NeI,HeII)用のトロイダル回折格子は日立の原田達男博士の協力を得て,実現し,高分解能実験の成果を期待している。ウプサラ大物理学研究所C.ノ-ドリング教授はESCAの初期に活躍した人であるが,現在はX線分光の研究を行っているが,ルント大学のシンクロトロン放射光施設でも新しい装置を製作しており,本研究課題の二年目に分子研に招へいすることができ,今後のシンクロトロン放射光研究における共同研究についても意見交換を行い有益であった。光化学反応の磁場効果の研究では長倉三郎総合研究大学院大学学長が開拓的な業績をあげているが,今回のスウェ-デンとの共同研究では,第一年次にウプサラ大学を訪問し,アルムグレン教授と光化学磁場効果について討議をかわした.谷本助教授(広島大)も光化学反応の磁場効果の研究でウプサラ大を訪れ,アルムグレン教授とミセル溶液に代表される微視的不均一溶液系の物理化学過程のダイナミックについて討議した.それぞれ今後の協力関係の基礎がきづかれた。時間分解分光では,カロリンスカ研究所のリグラ-教授は生体系のピコ秒時間分解蛍光分光法およびピコ秒光応答反応について,シンクロトロン放射光による研究と合せて,わが国との協力を希望しており,今後の協力関係が期待できる分野であることがわかった.生体分子構造の分野では分子研北川教授と小倉助手がイェテボリ大学及びシャルマ-ス大学のマルムストロ-ム教授を訪れ,チトクロ-ム酸化酵素に関して密接な協力研究を行った.今後の共同研究の基礎づくりができた。とくに小倉助手はニケ月の滞在で,マルムストロ-ム教授の研究室で,チトクロ-ム酸化酵素の時間分解吸収分光の研究とプロトン輪送の分子機構の理論的研究を行った。東大佐藤助教授はリンシェ-ピン大学の表面物理化学研究室のサラネック教授を訪れ,二ヵ月滞在し,この間に電子分光法による導電性高分子(とくに共役系高分子)とその表面の電子構造の研究で大きな成果をあげ,今回の日本-スウェ-デン共同研究の一つのハイライトでもあった。分子研長嶋助手はストックホルム大学シ-グバ-ン教授を訪れ,ニヵ月滞在して遷移金属錯体の電子構造の理論的計算を行うための計算機プログラムの開発について協力研究を行った。さらに分子研春日助教授は一年目にルント大学マツクス研究所(放射光実験施設)を訪れ,ストレッジリングの加速電子の不安性に関する種々のテスト実験を共同で行い,両者の放射光施設の発展のために有益な実験デ-タが得られた。三年目にはウプサラ大学で,分子科学第一シンポジュ-ムを開催することができ,日本から6名がスウェ-デンから12名の講演者がでて,全部で50名ほどのシンポジュ-ムであったが,極めて有意義なものであった.スウェ-デンとの交流のパイプは少しづつ太くなっており,今後の協力関係が期待できる.わが国とスウェ-デンとが共通に関心をもち,かつ共に高いレベルを保持している分子科学の諸分野において相互に研究者を派遣し,国際共同研究の態勢をつくり,研究の発展に貢献しようとする目的で本研究課題がとりあげられた.昭和63年3月分子研長倉所長とウプサラ大学シ-グバ-ン教授の間で共同研究の合意書が取り交わされ,これが今回の三年間の共同研究のベ-スになっている.とくに光電子分光及び光化学磁場効果の分野をはじめ,時間分割分光,シンクロトロン放射光科学,理論化学の分野も含められた。ウプサラ大学はESCAのメッカであり,K.シ-グバ-ン教授(昭和56年ノ-ベル物理学賞受賞)の開拓的な仕事が今も受けつがれている.同教授は現在レ-ザ-ESCA計画を遂進中で,新しい装置の開発に取り組んでいる.とくにレ-ザ-技術を導入するESCAとトロイダル回折格子を用いる高分解能光電子分光において,分子科学研究所の協力を求めている.分子研木村らはすでにレ-ザ-光電子分光で進んだ技術をもっており,シ-グバ-ン教授に協力することができた.

木村の協力研究者であった阿知波洋次都立大助教授をウプサラに派遣し,レ-ザ-光電子装置の立上げに協力し,ウプサラで最初の光電子スペクトル(レ-ザ-による)が得られた.一方,共鳴線(NeI,HeII)用のトロイダル回折格子は日立の原田達男博士の協力を得て,実現し,高分解能実験の成果を期待している。ウプサラ大物理学研究所C.ノ-ドリング教授はESCAの初期に活躍した人であるが,現在はX線分光の研究を行っているが,ルント大学のシンクロトロン放射光施設でも新しい装置を製作しており,本研究課題の二年目に分子研に招へいすることができ,今後のシンクロトロン放射光研究における共同研究についても意見交換を行い有益であった。光化学反応の磁場効果の研究では長倉三郎総合研究大学院大学学長が開拓的な業績をあげているが,今回のスウェ-デンとの共同研究では,第一年次にウプサラ大学を訪問し,アルムグレン教授と光化学磁場効果について討議をかわした.谷本助教授(広島大)も光化学反応の磁場効果の研究でウプサラ大を訪れ,アルムグレン教授とミセル溶液に代表される微視的不均一溶液系の物理化学過程のダイナミックについて討議した.それぞれ今後の協力関係の基礎がきづかれた。時間分解分光では,カロリンスカ研究所のリグラ-教授は生体系のピコ秒時間分解蛍光分光法およびピコ秒光応答反応について,シンクロトロン放射光による研究と合せて,わが国との協力を希望しており,今後の協力関係が期待できる分野であることがわかった.生体分子構造の分野では分子研北川教授と小倉助手がイェテボリ大学及びシャルマ-ス大学のマルムストロ-ム教授を訪れ,チトクロ-ム酸化酵素に関して密接な協力研究を行った.今後の共同研究の基礎づくりができた。とくに小倉助手はニケ月の滞在で,マルムストロ-ム教授の研究室で,チトクロ-ム酸化酵素の時間分解吸収分光の研究とプロトン輪送の分子機構の理論的研究を行った。東大佐藤助教授はリンシェ-ピン大学の表面物理化学研究室のサラネック教授を訪れ,二ヵ月滞在し,この間に電子分光法による導電性高分子(とくに共役系高分子)とその表面の電子構造の研究で大きな成果をあげ,今回の日本-スウェ-デン共同研究の一つのハイライトでもあった。分子研長嶋助手はストックホルム大学シ-グバ-ン教授を訪れ,ニヵ月滞在して遷移金属錯体の電子構造の理論的計算を行うための計算機プログラムの開発について協力研究を行った。さらに分子研春日助教授は一年目にルント大学マツクス研究所(放射光実験施設)を訪れ,ストレッジリングの加速電子の不安性に関する種々のテスト実験を共同で行い,両者の放射光施設の発展のために有益な実験デ-タが得られた。三年目にはウプサラ大学で,分子科学第一シンポジュ-ムを開催することができ,日本から6名がスウェ-デンから12名の講演者がでて,全部で50名ほどのシンポジュ-ムであったが,極めて有意義なものであった.スウェ-デンとの交流のパイプは少しづつ太くなっており,今後の協力関係が期待できる.
在宅認知症高齢者に対する都市型地域ネットモデルの構築とその社会的有用性の検証

A市の既存データから分析した結果、区及び地域における指標で大きな差が生じていることが明確となった。例えば、区レベルの高齢化率という指標においては、ある区では、高齢化率が高く、約40%近くなっている一方、他方の区では、約20%前後となっており、区レベルの高齢化率において大きな差が見られた。また、社会資源数や社会資源の内容についても、区レベルや地域レベルにおいて大きな差が見られ、認知症高齢者の地域生活を支える基盤については、区及び地域により大きく異なることが明らかとなった。認知症高齢者に対する地域支援ネットの中心的な担い手は、地域包括支援センターを中心とするネットワーク内の人々であり、また、認知症初期集中支援チームのメンバーである。しかし、地域包括支援センターの職員や認知症初期集中支援チームのネットワーク力やサービスの質のレベルに大きな差も生じており、そのネットワーク力やサービスの質の均質化が大きな課題である。介護支援専門員に対する質問紙調査の分析結果から、一人暮らし高齢者に対する支援での難しさを整理すると、以下の7点があげられる。(1)高齢者の個別ニーズ把握に関する難しさ、(2)適切なケアプランの作成に関する迷いや難しさ、(3)高齢者個人を支援していくための体制づくりに関する難しさ、(4)多職種連携を行うことに関する難しさ、(5)高齢者の家族を含むキーパーソンが存在しないために生じる支援の難しさ、(6)高齢者とのコミュニケーションの難しさ、(7)地域での社会資源の少なさから生じる支援の難しさ、などがある。当初の計画通りに、【地域ネット研究班】において、都市部における認知症高齢者の地域生活継続を支える基本的な社会資源や地域ネットの現状分析が行われた。そして、【地域特性・指標分析班】において、大都市部の地域特性や要件整理が行われ、次年度の研究を進めるための基本的な内容が整理された。研究成果を踏まえ、今後、【地域ネット研究班】においては、都市部における認知症高齢者の地域生活継続の支援を行うための地域ネットを構成する担い手として、どのような機関や関係者が存在するのかを明らかにする。また、【地域特性・指標分析班】においては、都市部における認知症高齢者の地域生活継続の支援を行うための地域ネットを構築するにあたって、地域特性が異なる場合、どのような要件が加味される必要があるのかを、継続して明らかにしていく。
神経芽腫に対する遺伝子治療の検討

小児悪性腫瘍に対しても極めて積極的な治療が行なわれるようになり、その治療成績は向上してきている。しかし、進行神経芽腫に代表される予後不良癌の治癒率はいまだ低く、新たな治療法の導入が不可欠である。今回、われわれは遺伝子治療の有効性につき基礎的検討を行なった。1)免疫遺伝子治療の検討:レトロウイルスベクターLXSNにサイトカイン遺伝子を組み込み、マウス神経芽腫細胞C1300に感染させ遺伝子導入を行いサイトカイン産生C1300細胞を得た。IL-2,GM-CSF産生C1300腫瘍細胞の接種は腫瘍の生着・増殖を認めなかった。腫瘍の生着を拒絶したマウスに親株を接種しても増殖を認めなかった。肝転移モデルにおいてもIL-2,GM-CSF産生腫瘍細胞は転移を抑制した。さらにIL-2,GM-CSF産生腫瘍細胞は先行接種増殖した親株細胞の増殖を抑制した。以上、腫瘍原性の抑制、腫瘍免疫の誘導、癌治療効果を確認した。2)自殺遺伝子治療の検討:進行神経芽腫に高発現するMidkine遺伝子をプロモーターとし、HSV-TK(ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ)とGCV(ガンシクロビール)の組み合わせによる自殺遺伝子治療の検討を行った。MidkineをプロモーターとすることによりMidkineを高発現しているヒト神経芽腫細胞に特異的にHSV-TKを発現させGCVに対する感受性を高めることが確認された。以上、神経芽腫に対する免疫遺伝子治療、ならびに自殺遺伝子治療の抗腫瘍効果が明らかとなり臨床応用へ向け有用な基礎的結果が得られた。1)腫瘍免疫の誘導IL-2,IL-4,GM-CSF各サイトカイン産生C-1300(マウス神経芽腫細胞株)腫瘍細胞を用いて、実験を行なった。AJマウス皮下にサイトカイン産生腫瘍細胞を接種し、腫瘍が生着しなかったマウス皮下に親株細胞を接種し、腫瘍増殖を観察した。その結果、IL-2,GM-CSF産生腫瘍細胞を接種したマウスにおいて親株の生着も拒絶された。また同時に行なった同系で抗原性の異なる腫瘍細胞株を接種した場合には、腫瘍増殖を認めた。すなわち、protective immunityとspecific immunityの誘導が確認された。2)癌治療効果の検討親株をマウス皮下に接種し、肉眼的に確認できるまで増殖してきた時点で反対側皮下にIL-2,GM-CSF産生腫瘍細胞を接種したところ、親株の増殖は抑制された。一部は完全消失を道認めた。また、マウス肝転移モデルを用いて親株を尾静脈より先行接種し、その後IL-2,GM-CSF産生腫瘍細胞を皮下接種し肝転移の抑制も確認した。1)Midkineプロモーターと自殺遺伝子(単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子)を挿入したベクターの作製と遺伝子導入腫瘍細胞の作製Midkineは悪性度の高い神経芽腫に強く発現しているのでMidkineプロモーター領域に注目した。そしてMidkineのゲノム遺伝子を用いて、その領域の転写活性化を検討し、5'上流約550bpの領域に腫瘍細胞特異的な転写活性を認めることを確認し、このプロモーター領域の下流に自殺遺伝子(単純ヘルペスウィルスのチミジンキナーゼ遺伝子(HSV-TK))を結合させレトロウィルスベクターを作製した。上記で作製したベクターをヒト神経芽腫細胞NGPに感染させ、MidkineをプロモーターとしHSV-TK遺伝子が導入された腫瘍細胞(MK-TK)を作成した。MK-TK、NGP wild type(WT)、HSV-TK遺伝子のみを導入したNGP(TK-R)の3種類の細胞を用いて実験を行なった。これら細胞をplateにまき、各濃度のガンシクロビールを添加培養し、viabilityを測定した。MK-TK群において、ガンシクロビール濃度依存性にviable cell数の減少を認め、viabilityの低下を認めた。他の2群はviabilityに大きな変化は認めなかった。II.自殺遺伝子治療の検討

悪性度の高い神経芽腫はMidkineの発現が著しく高い。そこでMidkineをプロモーターとして用い、自殺遺伝子と組み合わせれば特異的な遺伝子治療が可能である。対象と方法◇細胞と動物:細胞としてヒト神経芽腫細胞NGP、ヒトメラノーマ細胞A875、ヒト線維芽細胞HFFを用いた。動物はBALB/e nu/nuヌードマウスを用いた。◇自殺遺伝子導入腫瘍細胞の作成:Midkine(MK)遺伝子と単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子(HSV-TK遺伝子)を挿入したレトロウイルスベクターLXSNを作成し、各腫瘍細胞に感染させ自殺遺伝子導入腫瘍細胞を作成した。◇癌治療効果:ヌードマウス皮下にWT細胞、TK-MK細胞を接種し、腫瘍の大きさが100mm^3となったところでGCV(30mg/kg/day)あるいは生理的食塩水を腹腔内に5日間投与した。経時的に腫瘍の大きさを観察した。結果1.Midkine遺伝子の発現神経芽腫細胞NGPはMidkine遺伝子を高発現した。線維芽細胞HFFの発現は低く、ヒトメラノーマ細胞A875では発現を認めなかった。2.ガンシクロビール投与に対する腫瘍細胞の反応MK+TK遺伝子導入NGP細胞では、GCVに強い感受性を示し、腫瘍細胞の死滅を認めた。HFF細胞、A875細胞ではGCVに対する感受性を認めなかった。3.癌治療効果GCVの腹腔内投与により、MK+TK遺伝子導入NGP細胞は腫瘍増殖が抑制され、すべての腫瘍が消失した。
要介護認定の発生リスクが高い高齢者の選出方法の開発

基本チェックリストの項目を複合的に活用することで、要介護認定リスクの高い者を効率よく選出できるアルゴリズムを構築するために、65歳以上の高齢者約3万人を約3年5か月間追跡した。結果、追跡開始時点において「年齢が82歳以上」、「単独世帯」、「今日が何月何日かわからない時がある」、「自分が役に立つ人間だと思えない」の条件を満たすサブグループと「年齢が84歳以上」、「単独世帯でない」、「バスや電車で1人で外出していない」、「この1年間に転んだことがある」の条件を満たすサブグループにおいて、特に要介護認定割合が高かった。本研究は、全国で利用されている基本チェックリスト(要介護状態に移行する可能性が高い高齢者を把握する調査票)の返信・未返信状況および回答状況・未回答状況、性別、年齢、家族構成のデータを利用して、要介護認定の発生リスクが高い高齢者の選出アルゴリズムを開発することが目的である。その目的を達成するために、研究協力自治体のもと、2012年4月1日時点において要介護認定を受けていない65歳以上の高齢者を抽出し、調査日(基本チェックリスト配布日)までに死亡・転出、要介護認定を受けた者を除いた約5万人の追跡調査を行っている。本年度は下記のことを実施した。1.基本チェックリストの返信者および未返信者を含む53,873人のデータ入力(基本チェックリスト返信の有無、性別、生年月日、返信者の基本チェックリスト25項目、要介護認定年月日、要介護認定区分、要介護認定有効期間開始年月日、受給者取消年月日、転出・死亡年月日など)とその確認作業を実施した。2.データのクリーニング・加工作業を行った。また、年齢やBMI、各対象者の基本チェックリストの「該当あり」データの合計数および「未回答・誤記入」データの合計数などの連続データは、要介護認定発生との非線形関係が予測されたため、要介護認定発生の有無別にそれぞれ5分位、10分位にカテゴリー化した変数を新たに作成した。3.コード表およびデータ解析用データベースを作成した。今後はロジスティックモデル、ROC解析、CART、ランダムフォレストを適用して、データ解析を進める予定である。本研究は要介護認定の発生リスクが高い高齢者の選出方法の開発を行うものである.全国で利用されている基本チェックリスト(要介護状態になる可能性がある高齢者を把握するための調査票)やその返信状況・未記入状況,基本的属性(性別,年齢,家族構成など)の情報を用いて,保健師などの現場の担当者が支援の必要な高齢者を迅速に把握できるようなツールを開発することを目的としている.具体的には,「ベースライン時点で要介護認定を受けていない高齢者を3年間程度追跡し,基本チェックリストやその回収・回答状況,基本的属性などを用いて,どのような条件の組合せの者が要介護認定の発生リスクが高いのか,どのような対象に介護予防を行ったら効率的なのか,その全貌を視覚的に明らかにする」,「ベースライン時点で要介護認定を受けていない高齢者を追跡し,1年後および3年後に基本チェックリストの有用性の検証およびスクリーニング指標の検証を行うとともに,そのカットオフポイントを抽出する」,以上の2つである.本年度はその目的達成のために次のことを実施した.1.本学の倫理委員会で本研究に対する倫理審査を受け承認を得た.2.研究協力の自治体と,追跡対象者,追跡期間,データの保管,解析結果の公開などの打ち合わせを行った.3.研究デザインおよびデータ解析方法(データマイニング:ツリーなど,ROC解析,ロジスティックモデル)を立案した.4.研究課題を遂行するための情報収集を研修や文献で行った.要介護認定を受けていない32,975人の高齢者を9か月間追跡した結果,新規の要介護認定発生者は1,137人(3.4%)であった.基本チェックリストのBMIの項目を除いた24項目について,「好ましい状態」の回答者に対する「好ましくない状態」および「未記入」の回答者の調整オッズ比(性,年齢,世帯構造で補正)を算出した.その結果,「好ましい状態」に対する「好ましくない状態」のオッズ比は全項目で有意な関連が認められた(オッズ比の範囲1.524.09).一方,「好ましい状態」に対する「未記入」のオッズ比については,15項目で有意な関連を認めたが,"日用品の買物をしていますか","預貯金の出し入れをしていますか","家族や友人の相談にのっていますか","この1年間に転んだことはありますか","半年前に比べて固いものが食べにくくなりましたか","お茶や汁物等でむせることがありますか","口の渇きが気になりますか","自分で電話番号を調べて,電話をかけることをしていますか","今日が何月何日かわからないことがありますか"の9項目については有意な関連は認められなかった.新規の要介護認定発生と未記入の項目数(うつ予防・支援の5項目とBMIを除く19項目)との関連を性,年齢,世帯構造で補正して検討した結果,オッズ比は1.04(95CI:0.99-1.09)で有意な関連は認められなかった.またROC解析を行った結果AUCは0.53(95%CI:0.512-0.54)で,未記入数はスクリーニング指標としては有用でない可能性が高いことが示唆された.2016年には最終研究結果を報告する予定だったが,諸事情により研究対象の追跡期間を延長し,3年6か月に設定することにした.

2015年度はデータクリーニングやハンドリングを実施し解析データベースを構築した.今後は得られたデータ(基本チェックリストやその回収・回答状況,基本的属性など)をもとに「どのような条件の者が要介護認定の発生リスクが高いのか」,「どのような対象に優先的に介護予防を行う必要があるのか」,「同チェックリストを返信しない人の傾向や要介護認定の発生はどのような現状か」について,データマイニングや回帰モデルを用いて将来要支援・要介護になるおそれがある者の傾向や全貌を明らかにする予定である.また地域包括支援センターや自治体担当者向けの有用なスクリーニングツールを作成する予定である.さらに基本チェックリストの有用性(未記入や誤記も含めて)の検証およびスクリーニング指標の検証を行う予定である.また,研究期間延長に伴い新たに次のことについて検討することにした.まずは2012年7月2013年3月に要介護認定を受けた者が,2015年12月時点(約3年後)において要介護認定状態がどのように変化しているか追加検討することにした.具体的には要介護状態から改善している者と要介護状態が持続している者を比較しその特徴をやリスク要因を探索することにした.さらに追跡期間は短いが死亡リスク要因についても併せて検討することにした.諸事情により研究対象の追跡期間を延長し,3年6か月に設定することにした.32,901人を2012年7月27日から8か月間追跡した。エンドポイントは追跡期間中に要介護認定を受けた又は要介護認定有効期間が始まったかのいずれかとした。訓練データで作成した決定木モデルを検証データにあてはめ、ROC曲線の下側曲線下面積(AUC)を求めた結果、082(95%CI:0.80-0.84)で予測可能性があることが示された(訓練データのAUC:084)。特に「年齢が80歳以上」、「単独世帯でない」、「バスや電車で1人で外出していない」、「外出の回数が減った」、「物忘れがある」、「預貯金の出し入れをしていない」の条件を満たすサブグループにおいては124人中39%が要介護認定を受けていることが示された。基本チェックリストの未記入数と要介護認定割合の分布を確認した結果、未記入数が多くなるにつれて要介護認定割合が高まるなどの一定の傾向は認められなかった。また対象を引き続き2015年12月18日までの3年5か月間追跡した。エンドポイントは追跡終了時点において要介護認定を受けていることとした。訓練データで作成した決定木モデルを検証データにあてはめた結果、ROC曲線のAUCは079(95%CI:0.77-0.80)で予測可能性があることが示された(訓練データのAUC:081)。特に「年齢が82歳以上」、「単独世帯」、「今日が何月何日かわからない時がある」、「自分が役に立つ人間だと思えない」の条件を満たすサブグループにおいては102人中65%が要介護認定を受けていることが示された。同様に「年齢が84歳以上」、「単独世帯でない」、「バスや電車で1人で外出していない」、「この1年間に転んだことがある」の条件を満たすサブグループにおいては133人中63%が要介護認定を受けていることが認められた。未記入数と要介護認定割合の関係は、8か月間追跡した結果と同様であった。基本チェックリストの項目を複合的に活用することで、要介護認定リスクの高い者を効率よく選出できるアルゴリズムを構築するために、65歳以上の高齢者約3万人を約3年5か月間追跡した。
ポリセオナミドを構造基盤とした機能性分子の創製と人工機能制御

本研究は、一価カチオン選択的なイオン透過とP388マウス白血病細胞に対して強力な細胞毒性を示す巨大ペプチド天然物であるポリセオナミドBを誘導体化し、外的因子により標的部位のみでイオンチャネルを形成し、選択的な細胞毒性を発現する分子の創製を目指すものである。本年度は、イオンチャネル活性の制御に先立ち、ポリセオナミドBの作用機序解明を目指した。すなわち、ポリセオナミドBは、細胞膜におけるイオンチャネル形成に伴う細胞死の誘導が提唱されているが、本仮説を裏付ける検証は行われていない。また、その細胞内局在は完全に未知であるため、細胞内動的挙動および作用機序解析を遂行した。まず、前年度までに確立した合成法を用いて、細胞内挙動追跡に必要な蛍光標識体を合成した。続いて、ポリセオナミドBおよび蛍光標識体を用いた解析により、ポリセオナミドBが細胞膜電位の脱分極、およびリソソーム-細胞質間プロトン濃度勾配の解消という2つの生物作用を有することを初めて明らかにした。すなわち、ポリセオナミドBは細胞膜でイオンチャネルを形成し、ナトリウムイオンの輸送により脱分極を引き起こすことに加え、エンドサイトーシス経路を介した細胞内移行により集積したリソソームでイオンチャネルを形成し、プロトンの輸送によりリソソーム-細胞質間プロトン濃度勾配を消失させることが示唆された。さらに、これら2つの生物作用を併せ持つポリセオナミドBが、最終的にアポトーシスを誘導することも示唆された。本研究が明らかにしたポリセオナミドBの詳細な作用機序に基づき、選択的細胞毒性を発現する分子創製への展開が期待される。29年度が最終年度であるため、記入しない。本年度は、ポリセオナミドのイオンチャネル活性を制御するために、まず細胞毒性発現機構の解明を目指した。すなわち、ポリセオナミドは細胞膜でイオンチャネル活性を示し細胞死を引き起こすことが想定されているが、細胞内局在に関しては完全に未知である。またイオンチャネル活性と細胞毒性の相関についても詳細は不明な点が多いため、これらを明らかにすることを目的として研究を遂行した。従来のポリセオナミドBの合成法は、側鎖極性官能基によるペプチド鎖の会合・凝集や副反応により、直線的な合成が困難であった。そのため、合成終盤に多段階の液相反応やHPLC精製を要し、多種類の誘導体合成には適さなかった。そこで、詳細な作用機序解析のための誘導体合成を志向し、固相上でポリセオナミドBの全体構造を構築する新合成法を立案した。これを実現するため、側鎖ヒドロキシ基に新たに保護基を導入して凝集や副反応を抑制し、ポリセオナミドBの固相全合成を達成した。固相反応を主体とした新合成法は従来法と同一の総収率でポリセオナミドBを与え、液相反応を主体とした従来法と比較して精製の点で飛躍的に効率化されたと言える。また、巨大複雑構造ペプチドの合成における保護基の有用性という新たな知見を与えた。ポリセオナミドBは側鎖に極性官能基を有する多数の非タンパク質構成アミノ酸をその構造中に含む。そのため、凝集や副反応が問題となり、これまで固相合成による全体構造の構築は困難であった。本研究では、適切な保護基の設計と導入により、ポリセオナミドBの固相全合成に成功した。これにより、多段階の液相反応やHPLC精製を要した合成が飛躍的に簡便な操作で実施できるようになった。また確立した合成法は、従来法に比べて直線的であるにも関わらず、同等の総収率(4.5%)でポリセオナミドBを与えた。したがって、本法は量的供給の観点からも優れており、詳細な細胞毒性発現機構を明らかにするための基盤が整ったと言える。。

さらに、これら2つの生物作用を併せ持つポリセオナミドBが、最終的にアポトーシスを誘導することも示唆された。本研究が明らかにしたポリセオナミドBの詳細な作用機序に基づき、選択的細胞毒性を発現する分子創製への展開が期待される。ポリセオナミドBの固相合成法の確立により、迅速な誘導体合成が可能となり、詳細な作用機序解析を行う基盤は整った。今後は、上記のとおり確立した合成法を用い、蛍光団を導入したポリセオナミド誘導体を合成し、共焦点蛍光顕微鏡を用いた細胞内局在解析により、ポリセオナミドがイオンチャネルを形成しうる細胞内構造を明らかにする。さらに、作用機序解析を進める上で必要な誘導体を合成し、イオンチャネル活性と細胞毒性の相関から細胞毒性発現機構に関する知見を得る計画である。以上により、外的因子によるイオンチャネル機能制御および選択的に細胞毒性を示す誘導体の創製、さらにはポリセオナミドBを基盤とした医薬品リード化合物の創出へと展開することを目指す。29年度が最終年度であるため、記入しない。
ニュ-ラルネットワ-ク理論の電力系統への応用

近年.生物の頭脳の情報処理形態を模倣した計算装置及び計算理論.つまりニュ-ラルネットワ-クコンピュ-タについての研究が、ハ-ドウェアとソフトウェアの両面から盛んに行なわれている。このコンピュ-タは、アナログで超並列といった特徴を持ち、現行のコンピュ-タにはない優れた能力を有するものと考えられ、ソフトウェアの面でも色々な研究が行なわれている。本研究の目的は、このニュ-ラルネットワ-ク理論の電力系統への適用性を探り、電力系統に適した手法を開発することであった。現在、神経細胞(ニュ-ロン)モデルとしては、色々の型が提案されているが、本研究では特に、ラメルハ-ト型モデルとホップフィ-ルド型モデルを用いて理論開発を行った.ラメルハ-ト型モデルはパタ-ン認識に有効であり、ホップフィ-ルド型モデルは最適化計算に威力を発揮すると言われている。本研究では、過渡安定度判定に、ラメルハ-ト型のバックプロパゲ-ション法を応用し、従来の方法では解沢困難ないくつかの問題を解決した。すなわち、電力系統のオンライン過度安定度判定法としては大きく分けて、エネルギ-関数法とパ-セプトロン法を用いたパタ-ン認識法があるが、エネルギ-関数法は、同期機のモデルとして制御器付きのモデルを採用できないという欠点、また従来のパタ-ン認識法としては、系統構成の変化や発電機台数の変更に対応できないという欠点があった。本研究により、これらの欠点は全てラメルハ-ト型のパタ-ン認識では解沢できることが判明した。また、電力系統の状態推定計算法として、ホップフィ-ルド型モデルの適用を行なった。この結果、ホップフィ-ドモデルの定式化そのものが状態推定計算の定式化に対応できることが判明した。ガウスニュ-トン法、高速二次法ならびに高速分離法による状態推定計算への適用可能性を検討し、新しい形の入出力関数を提案した。
逆問題の手法による調査データの復元とその二次分析

本研究の完成年度に当たる平成18年度は、研究実施計画の通り、前年度までに得られた結果により、復元部分を再検討し、二次分析部分の開発を行った。復元部分については、復元前の手作業の部分の自動化、復元処理の高速化、欠損値処理の手法(確定要素のパターンから不確定要素を推測)を応用した復元法のプログラム化の3点を実現した。とくに復元前の手作業の部分で、発表論文の図表を画像データとして取り込み、画像認識させた上で数値化する手法を開発した。二次分析部分については、唯一のデータに復元できないが複数の候補データセットを求めることが可能な場合についての研究を行った。分析手法は、すべての候補データセットの統計分析結果を導き出すものであるが、データセット数が非常の多い場合、非常に長い計算時が必要であった。復元に使った分岐限定法を応用することで計算時問の大幅な短縮を実現した。また、複数個の候補データの全分析結果を比較し、その違いを導き出すプログラムを開発した。さらにその分析結果の違いをどのように評価するかを研究した。評価方法は、統計値の幅による評価と統計値の出現頻度による評価の2つの手法によって評価した。欠損処理の手法を応用することよって求めた単一データセットと分析結果と候補データセットによって求めたデータセットの分析結果を比較することによって双方の分析結果に説得力をもたせた。復元したデータセットとその研究成果をインターネット並び論文等で公開する準備を整えた。著作権の確認が済み次第随時公開していく予定である。本研究の初年度に当たる平成16年度は、研究実施計画の通り関連研究のレビューと資料情報収集に焦点を絞って活動した。レビューする文献を調査データの復元に限定した場合、先行研究が少ないことがわかった。よって、関連領域(調査データの欠損値問題、調査以外のデータを復元している研究、復元と関係がある逆問題)の文献をレビューした。その中で、欠損処理の手法が、調査データの復元にも応用できることがわかり、我々がすでに開発している組合せ最適化問題の手法と比較しながら研究を進めていくことになった。逆に、組合せ最適化問題の手法が欠損値問題に応用できないかどうかも探った。調査データの復元には、天文学的な量の計算を行わなければならない場合ある。その非常に多くの計算を高速処理するために、高速計算のための環境の準備を行った。ハード面では、高速計算専用パソコンの選定、設置、運用、ソフト面では、高速計算に適したOSのインストール、高速計算のためのプログラムの開発を行った。新しい復元対象を選定のために調査データを扱った古典的文献のレビューも行った。レビューしつつ、(1)二次分析する必要があるかどうか、(2)扱っている調査データが公開されているかどうか、(3)もし公開されていないのならば、その文献において提示されている情報から復元が可能どうか、(4)もし、不可能ならば、復元をしないで二次分析できないかどうか、などの可能性を探った。資料情報収集の方は、数理社会学会、社会学会等の関連学会並びに研究集会に参加し、資料情報収集を行った。また、本研究と関連がある学会参加者と会合を設定し、本研究に関する情報交換を行ったり、技術面の指導を受けたりした。本研究の2年度目に当たる平成17年度は、研究実施計画の通り、復元する一般的な手法の開発に焦点を絞って活動した。復元手法の開発は、(1)復元が可能かどうか、(2)単一データセットまで復元が可能がどうか、(3)複数候補データセットまで復元した場合、そのデータセットが2次分析に耐えうるものなのかどうかの3つの判断が必要である。(1)については、復元の定義を「単一データセットまで復元するもの」とするならば、(1)=(2)となる。また、復元できるかどうかは、不確定要素の数とその不確定要素に関する情報量によって決まる。これは、調査データの種類によって不確定要素の現れ方とその不確定要素に関する情報の形態が違うので、一般的な手法は開発できない。しかし、復元の定義を「単一あるいは複数候補データセットまで復元するもの」とするのであれば、不確定要素に関するすべての組合せを求めれば復元可能となる。これに関する一般手法を開発し、ソフトウェアーとして完成させた。しかし、復元の目的は、2次分析であるから、2次分析できなければ意味がない。つまり(3)の判断が重要である。候補データセットが非常に多くても分析結果が1から4つぐらいならば、問題ない。但し、データセットが多すぎで現在の計算機のメモリの制限、計算速度の限界で計算できなくならないようにしなければならない。そこで、候補データセットを少しでも少なくする手法が必要となる。不確定要素とその不確定要素に関する情報によって連立方程式が組めれば、分岐限定法というアルゴリズムで候補データセットが少なくなることがわかった。また、そのソフトウェアーを完成させた。現在は、不確定要素とその不確定要素に関する情報から効率よく連立方程式にもっていく手法を開発している。候補データセット群を2次分析する手法は、前年度明らかになった欠損値処理の手法と組合せの分析が進んだ。

二次分析部分については、唯一のデータに復元できないが複数の候補データセットを求めることが可能な場合についての研究を行った。分析手法は、すべての候補データセットの統計分析結果を導き出すものであるが、データセット数が非常の多い場合、非常に長い計算時が必要であった。復元に使った分岐限定法を応用することで計算時問の大幅な短縮を実現した。また、複数個の候補データの全分析結果を比較し、その違いを導き出すプログラムを開発した。さらにその分析結果の違いをどのように評価するかを研究した。評価方法は、統計値の幅による評価と統計値の出現頻度による評価の2つの手法によって評価した。欠損処理の手法を応用することよって求めた単一データセットと分析結果と候補データセットによって求めたデータセットの分析結果を比較することによって双方の分析結果に説得力をもたせた。復元したデータセットとその研究成果をインターネット並び論文等で公開する準備を整えた。著作権の確認が済み次第随時公開していく予定である。
高スピン偏極材料のナノ構造解析とスピン偏極率測定

スピントロニクス素子の高特性化の鍵となる高スピン偏極率材料の微細構造解析を行い、微細構造と特性の相関から高特性化の指針を得ることを目的として研究を行った。Co基ホイスラー合金を用いたトンネル型磁気抵抗および巨大磁気抵抗(それぞれTMR、CPP-GMR)素子の微細構造を電子顕微鏡で詳細に検討することにより、高い磁気抵抗比を実現するためにはCo基ホイスラー合金電極の規則度が高い必要があることがわかった。また高い規則度を得るためには下地層との格子整合も重要である。さらに、Co_2FeAlSiを強磁性電極、Agをスペーサ層としたCPP-GMR素子を用いて、バルク及び界面のスピン非対称性をスピン拡散長を考慮したValet-Fertのモデルにより見積もり、高いGMR比を得るための指針を示した。本研究では強磁性電極の物性と素子構造を詳細に解析し、トンネル型磁気抵抗(TMR),巨大磁気抵抗(GMR)素子で高いMR特性を得るための材料設計指針を提案することを目的とする。具体的には、(1)MR素子の微細構造解析による特性発現のメカニズムの解明、(2)MR素子用の強磁性電極薄膜のスピン偏極率を点接触アンドレーエフ反射(PCAR)を用いて直接測定し、同時に膜の微細構造観察を行うことにより、高スピン偏極率を示す強磁性電極材料の探索と製膜法を確立することを目的としている。具体的には、MR素子用の強磁性電極薄膜のスピン偏極率を点接触アンドレーエフ反射(PCAR)を用いて直接測定し、同時に膜の微細構造観察を行うことにより、高スピン偏極率を示す強磁性電極材料の探索と製膜法を確立することを目的としている。本年度は、Co基ホイスラー合金に第4元素を添加することにより高いスピン偏極率を示すホイスラー合金の探索を行った。その結果、Co_2Ti_xMn_<1-x>Sn系でx=0.25のときにスピン偏極率が0.65、Co_<2-x>Fe_xCrGa系でx=0.05のときに0.65が得られた。この値はハーフメタルの予想に反して低いものであったが、Co基ホイスラー合金のPCAR法により得られたスピン偏極率の中では最も高いものである。Co_2Ti_xMn_<1-x>Sn系のスピン偏極率の増加は、E_fの制御によるものと考えられる。計算によるとCo_2MnSnのE_fはバンドギャップの右端に存在するが、MnをTiで置換していくとE_fレベルがギャップ中央へシフトする。そのため不規則構造の存在によりバンドギャップ付近に余分な状態ができても、E_fがギャップの中央へシフトしたことにより、その影響を受けにくくなったためと考えられる。Co_<2-x>Fe_xCrGa系のスピン偏極率の増加E_fレベルの↑スピンの状態密度の増加によるものと考えている。他のグループから提供された膜(磁性半導体の(Ga_<0.95>Mn_<0.05>)_<0.5>As_<0.5>のアトムプローブ解析、ホイスラー合金薄膜のTEM観察、CoFeB/MgO/CoFeBのアトムプローブ解析)の微細構造解析も同時に行っている。具体的には、(1)MR素子の微細構造解析による特性発現のメカニズムの解明する、(2)MR素子用の強磁性電極薄膜のスピン偏極率を点接触アンドレーエフ反射(PCAR)を用いて直接測定し、同時に膜の微細構造観察を行うことにより、高スピン偏極率を示す強磁性電極材料の探索と製膜法を確立することを目的としている。本年度は、低温でのハーフメタル性が証明されているCo_2MnSi(CMS)を用いたMR素子の微細構造解析を行った。CMS/MgO/CMSのTMR素子をHAADF観察した結果、L2_1構造の直接観察に成功し、規則度とTMR比に強い相関があることが明らかとなった。また、高いGMR比を報告しているCMS/CuまたはAg/CMSのCPP-GMR阻止の微細構造解析を行った。

スペーサーにCuを用いた場合は多く欠陥が含まれている一方、Agスペーサーでは欠陥が少ないことが明らかとなった。また、昨年度に続きCo基ホイスラー合金に第4元素を添加することにより高いスピン偏極率を示すホイスラー合金の探索を行った。その結果、Co_2MnGa_<0.5>Sn_<0.5>合金でホイスラー合金中最も高い0.72というスピン偏極率を得た。これは、Co_2MnSnのSnをGaで置換することにより、E_fレベルが↑スピンの状態の大きな位置に移動したためと考えられる。本研究では強磁性電極の物性と素子構造を詳細に解析し、トンネル型磁気抵抗(TMR),巨大磁気抵抗(GMR)素子で高いMR特性を得るための材料設計指針を提案することを目的とする。具体的には、(1)MR素子の微細構造解析による特性発現のメカニズムの解明する、(2)MR素子用の強磁性電極薄膜のスピン偏極率を点接触アンドレーエフ反射(PCAR)を用いて直接測定し、同時に膜の微細構造観察を行うことにより、高スピン偏極率を示す強磁性電極材料の探索と製膜法を確立することを目的としている。本年度は600%以上のTMR比が実現しているCoFeB/MgO/CoFeB-強磁性トンネル接合のキャップの効果についてTEMによる微細構造観察を行った。TaキャップしたMTJが500°Cで最大600%のTMR比を示すのは、熱処理によりCoFeBがCoFeに結晶化するときにBが吐き出されコヒーレントトンネルが可能なMgOとCoFeとの整合界面が実現しているためということが明らかになった。一方で、PdキャップをしたMTJは300°Cで160%のTMR比を示したのちに減少する。これは、上部CoFe層が(001)配向から(110)、(111)配向に変化することと上部CoFeB層とPd層の相互拡散によって(Co,Fe)-Pdが形成されることに起因することが明らかになった。Co_2FeAlSi/Ag/Co_2FeAlSiの膜構造を持つCPP-GMR素子を作製し、バルク散乱非対称性係数(β)の評価を行った。室温で34%、14Kで80%のGMR比を得たほか、βは14Kで0.77、室温で0.70であり、室温でのCo_2FeAlSiのスピン拡散長は14Kで約3nmであることが明らかとなった。Co_2FeAlSi/Ag/Co_2FeAlSiの膜構造を持つCPP-GMR素子を作製し、スピン拡散長を考慮したValet-Fertモデルにより界面のスピン非対称性係数(γ)の評価を行った。このCPP-GMR素子は室温で34%、14Kで80%のGMR比、βは室温で0.77、14Kで0.77、室温でのCo_2FeAlSiのスピン拡散長は14Kで約3nmであることが昨年度までに明らかになっている。Co_2FeAlSiとAgの積層回数を変化させることにより見積もった界面抵抗AR_<F/N>は約0.25mΩμm^2で、温度依存はない。
ドラベ症候群ラットのてんかん責任脳領域の探索と細胞移植治療の実現化を目指す研究

本研究は、乳児期に発症する難治てんかん症候群の一つであるドラベ症候群について、てんかん発作発生に関与する脳領域を解剖学的に解明し、正常神経細胞を移植し治す新規治療法(細胞移植治療法)の実現化を目指すものである。今回、ドラベ症候群のモデルラットと小動物用MRI装置を用いて、マンガン造影MRI(MEMRI)という撮像法により、疾患ラット脳における過剰興奮を示す領域の可視化を試みた。その結果、幼若期の疾患ラットでは健常ラットと比較し、一部の脳領域において興奮性が増強することを見出した。さらに、熱刺激により確実にてんかん発作を起こすという疾患ラットの性質を利用し、熱刺激後の疾患ラットおよび健常ラットのMEMRI画像を比較したところ、疾患ラットでは熱刺激により、前述の脳領域の興奮性が変化する傾向にあった。すなわち、これらの脳領域がてんかん発作発生に関与している可能性が高い。今後、脳波や脳組織を用いた詳細な解析を進め、てんかん発作発生領域を同定することができれば、これを標的とした細胞移植治療の効果を検証する。細胞移植治療によりてんかん発作の発生を抑制し、有意な症状の改善が得られた場合、本症のみならず、打つ手のなかったその他の遺伝子異常による素因性難治てんかんに対し、根本治療の可能性を切り開く点で、その医学的、社会的意義は極めて大きいと考える。さらに、MRIを用いて、てんかん脳における異常な神経回路の成熟過程を可視化することができれば、これまでにない側面からの病態解明へ大きく前進することができるだけでなく、多様なてんかん診療の新たな研究基盤となることが期待される。MEMRIにおける熱負荷条件の検討に必要な脳波解析が進んでいないため、やや遅れているとした。疾患ラットでは、熱で確実に発作が誘発される特徴をもつが、実際に発作を起こしてしまうと、脳浮腫などの影響から脳の興奮性がMEMRIに反映されないことが報告されている。したがって、熱負荷による脳の興奮性をMEMRIで捉えるためには、「電気的なてんかん発射を増加させるが、発作は生じない」程度の負荷にする必要がある。熱負荷は現在、新生児用保育器を用いて行なっているが、理想的には脳波モニタリングを行なった上で適切な器内温度、湿度、負荷時間を決定する必要がある。すなわち、平常時、熱負荷中での脳波記録を比較し、てんかん性異常波(棘波、速波、棘徐波)の出現頻度、振幅、連続性などを評価し、負荷の程度を決定することが望ましい。しかし、脳波測定時の筋電図によるアーチファクトの調整が困難であり、熱負荷による微細な脳波変化を捉えることができていないため、脳波測定条件や解析プログラムを改良する必要がある。1.脳波解析:脳波電極装着時の固定法の改善、脳波測定時の電極保定の工夫、アーチファクト除去プログラムの作成により、脳波条件を改良する。その結果、てんかん性異常波が出現する熱負荷条件を選定することができれば、決定した熱負荷条件下でのMEMRI画像解析へと進む。2.発作発生に関与する脳領域の同定:ラットの脳組織切片を用いて、平常時および熱負荷時のMEMRIで興奮性の高い脳領域について、組織学的に細胞構成などの変化を解析する。さらに、RNAやタンパク発現解析と合わせて、てんかん発作発生に関与する脳領域を同定する。3.細胞移植実験:健常ラットの内側基底核原基より採取した細胞から誘導した抑制性神経前駆細胞を用いて、2で同定したてんかん発作発生に関与する脳領域を標的とし、疾患ラット脳内に細胞移植実験を行う。移植による治療効果の評価は、MEMRIや脳波所見の変化、熱負荷による発作誘発閾値、発作症状の強度、持続時間などを比較して行う。また、移植細胞の免疫組織学的評価、電気生理学的評価を行い、背景の裏付けを行う。効果を明らかにできれば移植リソースとしてヒトiPS細胞由来神経細胞を用いた実験へとシフトしていく。

疾患ラットでは、熱で確実に発作が誘発される特徴をもつが、実際に発作を起こしてしまうと、脳浮腫などの影響から脳の興奮性がMEMRIに反映されないことが報告されている。したがって、熱負荷による脳の興奮性をMEMRIで捉えるためには、「電気的なてんかん発射を増加させるが、発作は生じない」程度の負荷にする必要がある。熱負荷は現在、新生児用保育器を用いて行なっているが、理想的には脳波モニタリングを行なった上で適切な器内温度、湿度、負荷時間を決定する必要がある。すなわち、平常時、熱負荷中での脳波記録を比較し、てんかん性異常波(棘波、速波、棘徐波)の出現頻度、振幅、連続性などを評価し、負荷の程度を決定することが望ましい。しかし、脳波測定時の筋電図によるアーチファクトの調整が困難であり、熱負荷による微細な脳波変化を捉えることができていないため、脳波測定条件や解析プログラムを改良する必要がある。1.脳波解析:脳波電極装着時の固定法の改善、脳波測定時の電極保定の工夫、アーチファクト除去プログラムの作成により、脳波条件を改良する。その結果、てんかん性異常波が出現する熱負荷条件を選定することができれば、決定した熱負荷条件下でのMEMRI画像解析へと進む。2.発作発生に関与する脳領域の同定:ラットの脳組織切片を用いて、平常時および熱負荷時のMEMRIで興奮性の高い脳領域について、組織学的に細胞構成などの変化を解析する。さらに、RNAやタンパク発現解析と合わせて、てんかん発作発生に関与する脳領域を同定する。3.細胞移植実験:健常ラットの内側基底核原基より採取した細胞から誘導した抑制性神経前駆細胞を用いて、2で同定したてんかん発作発生に関与する脳領域を標的とし、疾患ラット脳内に細胞移植実験を行う。移植による治療効果の評価は、MEMRIや脳波所見の変化、熱負荷による発作誘発閾値、発作症状の強度、持続時間などを比較して行う。また、移植細胞の免疫組織学的評価、電気生理学的評価を行い、背景の裏付けを行う。効果を明らかにできれば移植リソースとしてヒトiPS細胞由来神経細胞を用いた実験へとシフトしていく。前年度に動物飼育を盛んに行なっていたため、それを見越して前倒し請求をしたが、出生動物数が想定より少なかったため、飼育費用が残った。
胃癌におけるMSIとhMLH1遺伝子のメチル化およびプロモータ領域の多型の解析

背景:胃癌発生のメカニズムを遺伝子レベルで解明し、予防・治療に応用されることが期待されている。目的:胃癌におけるhMLH1遺伝子のプロモーター領域のメチル化とMSIとの関与を検討する。また、hMLH1遺伝子のプロモーター領域のメチル化やMSIとhMLH1の遺伝子多型や組織型、KRAS, BRAFとの関係も同時に検討する。対象:胃癌手術検体、インフォームドコンセントを得られた症例で、多重癌、多臓器癌合併例、残胃癌を除く。期間2002-03年度方法:(1)自治医科大学消化器一般外科で手術施行した胃癌症例を対象として、手術の際に得られた腫瘍、および非腫瘍部組織を研究試料として使用する。(2)この研究試料よりDNAを抽出しポリメラーゼ連鎖反応(PCR)よりMSIを検索する。(3)hMLH1のプロモーター額域のメチル化は、Na-bisulfite処理後、PCR-SSCP法およびdirect sequence法にて、プロモーター領域広範に検索する。(4)hMLH1遺伝子の多型および対立遺伝子の欠失をPCR-SSCP法およびdirect sequence法により検出する。結果:diffuse type 24例、Intestinal type 28例が対象となった。組織型が分化型と未分化型が混合している症例は除外した。1)MSI陽性率2)hMLH-1遺伝子メチル化およびプロモーター量領域の多型3)KRAS mutation4)BRAFmutation以上の検索を施行中であるMSIは未分化型で3例、分化型で1例陽性であった。DNAをbisulfite処理後のメチル化の有無をPCRで検出した。K-rasは3に認められ、すべてIntestinal typeであった。BRAFは全例で陰性であった。MSI陽性胃癌は胃癌全体の10-20%を占め、hMLH1のプロモーター領域のメチル化が関与していた。また、hMLH1遺伝子のプロモーター領域のメチル化やMSIとhMLH1の遺伝子多型や組織型、KRAS、BRAFとの関係も同時に検討する。期間:2002-03年度方法:(1)自治医科大学消化器一般外科で手術施行した胃癌症例を対象として、手術の際に得られた腫瘍、および非腫瘍部組織を研究試料として使用する。(3)hMLH1のプロモーター領域のメチル化は、Na-bisulfite処理後、PCR-SSCP法およびdirect sequence法にて、プロモーター領域広範に検索する。MSIは未分化型で3例分化型で1例陽性であった。メチル化に関してはDNAをbisulfite処理後のメチル化の有無をPCRで検出中である。BRAFはいまのところ全例で陰性である。2003年度も研究を継続する。