hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
エネルギー分散型XMAおよび中性子放射化分析による堆積岩の組成分析

西南日本内帯の丹波帯・超丹波帯・舞鶴帯の古生界チャート、泥質岩について野外における分布,産状調査をおこなった。それら堆積岩の年代を含有される放散虫によって検討したところ、超丹波帯について新知見が得られ、短報として報告した。主要元素,微量元素組成についてはXMAおよびNAAによって分析数を増大させることができた。従来のものとあわせ合計215個のデータについて整理し、データベースとすることができた。またXMAおよびNAAによる分析結果を他の分析方法によるものと比較するために、島根大学理学部の蛍光X線分光分析装置による分析も行なった。この結果主要元素については、非常に良い一致が見られ、また微量元素については、両者の系統的な分析値の相違が明らかとなった。丹波帯の古生界チャート・泥質岩について、組成上の特徴として把握されたことは次の点である。1.緑色岩直上の上部石炭系,下部ペルム系は【Fe_2】【O_3】,Mn,Co等に富むとともに、セリウム負異常を示しており、海洋底形成後の熱水活動を受けている。2.中部ペルム系は、特徴は少ないが、一部に【Fe_2】【O_3】が多くセリウム負異常を示すものが認められ、熱水活動は一部この時期にまで及んだ。3.上部ペルム系は、泥質成分の少ない淡灰色層状チャートで、希土類分布パターンでは軽希土類が増加する。セリウム異常は無いかまたは僅かな正異常が認められる。4.丹波帯上部古生界の特徴を他地域のものと比較すると、舞鶴帯ではZr,Hf等が多く、明らかに陸源物質の影響が強い。超丹波帯や秋吉帯などでは、中部ペルム系に酸性凝灰岩が多く、またセリウム正異常が見られるなど、熱水活動のない、より陸域に近い深海堆積物としての特徴が把握される。
対話文章デ-タの自動解析による句・単語対応の自動決定に関する研究

研究目的の第一である日英対照言語デ-タとしては、天声人語の文章やサイエンティフィツクアメリカンの文章、英和、和英辞典に現れる対訳例文等を集め、かなりの量のデ-タベ-スを作成した。これは、現在および将来も増やしていく予定である。第二の目的である日英テキストの比較対照については、文単位での対応関係を自動的に作り出すアルゴリズムを考え、そのプログラムを作った。英語の1文が日本語の2文になったり、日本語の2文が英語の1文に対応するということがあるので、これは機械的に単純に行なうことはできないが、長い文は他の言語でも長い文になっているだろうという文の長さを判断の目安として行なったところ、かなりより文対応の結果をうることができた。しかし、文の中のある長さの句が他の言語でどの句に対応するかを自動的に判断することは、日英語間では困難であることも明らかとなった。第三の目的は、大量に記憶された対訳例文(句)を利用して、これを翻訳に利用することであり、これについては、翻訳者が訳例を簡単に検索することが出来る日英翻訳支援システムのプロトタイプを作った。種々の訳しにくい表現は、辞書でしらべてみても見出し語がなかったり、また適切な訳があたえられていなかったりする。このため、できるだけ多の訳例をデ-タベ-スに蓄積し、訳すべき表現にできるだけ近い表現をデ-タベ-スから取り出すことが中心的な問題となる。これを文字列照合の技術で実現することができた。(1)対訳文章としては,Scientific American(雑誌)の5冊分,英語単語にして約10万語,その日本語訳テキストの約30万文字を対象とし,英語OCR,日本語OCRによるテキストデ-タの計算機入力を行った。(2)このテキストデ-タの計算機内でのファイルシステムを作成し,英語と日本語との対応が取りやすいよう工夫した。(3)日本語デ-タについては,単語単位への分割を行うことが必要なので,日本語形態素解析のシステムをSUNワ-クステ-ション上に作成した。これは他へ移植可能となっている。(4)日本語テキストの形態素解析のシステムをうまく働かせるためには,単語辞書をうまく用意する必要があるので,ユ-ザがテキストの分野に応じて形態素文法を定義することのできる辞書システムを作った。(5)英語文章とその翻訳の日本語文章との文単位の対応づけの予備実験を行った。その対応を計算機で自動的に行わせた結果,(i)日本語文章の1パラグラフに対して英語文章の23パラグラフが対応する場合がある程度存在し,英語の1パラグラフに対して日本語の23パラグラフが対応する場合は少ないこと,(ii)英語の1文が日本語の24文に対応する場合と,逆に日本語の1文が英語の24文に対応する場合とが,それぞれ同程度に生じるという結果が得られた。この結果の妥当性を人手でチェックしたところ,自動対応の精度がそれほど良くないことが判明した。その原因は,短い文の場合に,英文と日本語文との対応を誤りやすいということにあり,これは1文中の英語の語群と日本語の語群との類似性係数の計算式が語数の少ないときに良くないというところにある。次年度はこれを抜本的に改良して良い結果を得るように,現在検討中である。研究目的の第一である日英対照言語デ-タとしては、天声人語の文章やサイエンティフィックアメリカンの文章、英和、和英辞典に現れる対訳例文等を集め、かなりの量のデ-タベ-スを作成した。

英語の1文が日本語の2文になったり、日本語の2文が英語の1文に対応するということがあるので、これは機械的に単純に行なうことはできないが、長い文は他の言語でも長い文になっているだろうという文の長さを判断の目安として行なったところ、かなりよい文対応の結果をうることができた。しかし、文の中のある長さの句が他の言語でどの句に対応するかを自動的に判断することは、日英語間では困難であることも明らかとなった。第三の目的は、大量に記憶された対訳例文(句)を利用して、これを翻訳に利用することであり、これについては、翻訳者が訳例を簡単に検索することが出来る日英翻訳支援システムのプロトタイプを作った。種々の訳しにくい表現は、辞書でしらべてみても見出し語がなかったり、また適切な訳があたえられていなかったりする。このため、できるだけ多くの訳例をデ-タベ-スに蓄積し、訳すべき表現にできるだけ近い表現をデ-タベ-スから取り出すことが中心的な問題となる。これを文字列照合の技術で実現することができた。
セルフィング株を用いた鼓藻類の交配様式派生の研究

ミカヅキモClosterium ehrenbergiiの交配群Aは本来ヘテロタリックで外交配を行う。しかし特異的な交配型遺伝子を持つマイナス株を片親に持つF_1には、プラス及びマイナスのどちらの交配型とも接合子を形成するセルフィング株が生じた。正常なプラス株及びマイナス株との交配接合子及びセルフィング接合子の3種類の接合子を発芽させ、F_1及びB_1個体の生存率、交配型及びセルフィングの性質の遺伝解析を行った。セルフィング接合子からはセルファ-のみならずプラスとマイナスのF_1子孫が生じるが生存率が非常に低いこと、マイナス株との交配接合子からはプラスとマイナス株が1対1、プラスとの交配接合子からはプラスに対してマイナスとセルファ-の合計が1対1に分離しB_1子孫の生存率はそれほど低くないことを確認した。また、セルフィングにおいて対合中の配偶子嚢を剥離し、各々のペアを再びクロ-ン培養することによって、セルフィング株のクロ-ン培養中にセルフィングの性質を保持したマイナス細胞以外に正常なマイナス及びプラスの細胞を生じることを確認した。本研究により、ヘテロタリズムを制御している対立遺伝子が酵母などで知られているような交配型転換機構によって、mt^-からmt^+に転換することによってセルフィングが起こることが明らかになった。また、本来外交配を行っているミカヅキモをセルフィングによって内交配させることによって、複相の有性生殖期にのみ働く遺伝子系に生じる突然変異が劣性有害遺伝子群として外交配の集団中に蓄積、保持されていることも示された。ヘテロタリズムからホモタリズムが派生する過程では、上記のようなmt^-からmt^+への一方向のみならず、その逆のmt^+からmt^-への交配型転換も自由に起こる機構が生じるだけでなく、どのような生態的場で外交配による遺伝的荷重から解放されるのかと言った問題が存在することが明かとなった。しかし、後者は今後の興味ある重要な研究課題と考えられる。ミカヅキモClosterium ehrenbergiiの本来ヘテロタリックな交配型AのJ5ー48ー2(マイナス)株ではまれにセルフィングが起こる。J5ー48ー2を片親に持つF_1株には、高頻度にセルフィングを起こし、しかもプラス及びマイナスのどちらの交配型とも接合子を形成する株が生じた。セルフィング株を用いた交配実験において、正常なプラス株及びマイナス株との接合子及びセルフィング接合子の3種類の接合子を発芽させ、F_1及びB_1個体の生存率、交配型及びセルフィングの性質の遺伝解析を行った。その結果、セルフィングによって形成された接合子からはセルファ-のみならずプラスとマイナスの子孫が生じ、マイナス株との交配で得られた接合子からはプラズマとマイナス株が1対1、プラス株との交配で得られた接合子からはプラスに対してマイナスとセルファ-の合計が1対1に分離することを確認した。又、セルフィングクロ-ンにおいて対合中の配偶子嚢を剥離し、各々のペアを再びクロ-ン培養するとプラスとマイナス、プラスとセルファ-、プラスとプラスの組合せの株が得られ、マイナスとナイナスやマイナスとセルファ-の組合せは得られない事実をも確認した。以上の実験結果から、1.セルフィングの性質はマイナスの子孫のみに伝わること、2.セルフィング株のクロ-ン培養中に体細胞分裂により、セルフィングの性質を保持したマイナス細胞以外に正常な(セルフィングを行わない)マイナス及びプラスの細胞を生じること、3.マイナスより転換したプラスの細胞は体細胞分裂だけではなく減数分裂を経ても安定なプラスの交配型の遺伝子を保持していることなどが結論された。

この事は、このミカヅキモの交配型遺伝子がマイナスからプラスへと一方向不可逆的に転換することによると考えられ、その転換の機構について目下研究を続行中である。ミカヅキモClosterium ehrenbergiiの交配群Aは本来ヘテロタリックで外交配を行う。しかし特異的な交配型遺伝子を持つマイナス株を片親に持つF_1には、プラス及びマイナスのどちらの交配型とも接合子を形成するセルフィング株が生じた。正常なプラス株及びマイナス株との交配接合子及びセルフィング接合子の3種類の接合子を発芽させ、F_1及びB_1個体の生存率、交配型及びセルフィングの性質の遺伝解析を行った。セルフィング接合子からはセルファ-のみならずプラスとマイナスのF_1子孫が生じるが生存率が非常に低いこと、マイナス株との交配接合子からはプラスとマイナス株が1対1、プラスとの交配接合子からはプラスに対してマイナスとセルファ-の合計が1対1に分離しB_1子孫の生存率はそれほど低くないことを確認した。また、セルフィングにおいて対合中の配偶子嚢を剥離し、各々のペアを再びクロ-ン培養することによって、セルフィング株のクロ-ン培養中にセルフィングの性質を保持したマイナス細胞以外に正常なマイナス及びプラスの細胞を生じることを確認した。本研究により、ヘテロタリズムを制御している対立遺伝子が酵母などで知られているような交配型転換機構によって、mt^-からmt^+に転換することによってセルフィングが起こることが明らかになった。また、本来外交配を行っているミカヅキモをセルフィングによって内交配させることによって、複相の有性生殖期にのみ働く遺伝子系に生じる突然変異が劣性有害遺伝子群として外交配の集団中に蓄積、保持されていることも示された。ヘテロタリズムからホモタリズムが派生する過程では、上記のようなmt^-からmt^+への一方向のみならず、その逆のmt^+からmt^-への交配型転換も自由に起こる機構が生じるだけでなく、どのような生態的場で外交配による遺伝的荷重から解放されるのかと言った問題が存在することが明かとなった。しかし、後者は今後の興味ある重要な研究課題と考えられる。
東地中海サプロペルの形成機構

東地中海で実施された国際海洋掘削計画(Ocean Drilling Project,ODP)Leg160航海(1995年4-5月)に乗船参加して、5地点から研究試料約2,000個を採取した。そのうち、本年度は複数の分析手法による高分解能分解によって、(1)最も長い堆積記録のコア969F-1H(クレタ島南、地中海海嶺上)における過去40万年間の古海洋環境変動を明らかにし、(2)コア969F-1Hで得られた過去40万年間の変動を面的に拡げて、古海洋環境変動の考察を加えるためにコア967D-1H(キプロス島南、エラトステネス海山の北)を同じように分析した。そして最後に(3)サプロペルの形成システムを考察した。サプロペルの形成に関する最近の研究では、個々のサプロペルの形成をモンスーン循環の揺らぎを生み出す歳差運動の極小時期に関連させて、成層状態の発達と生物生産量の増加の複合モデルが考えられている。本研究で明らかになった結果を要約すると、(1)サプロペルの形成要因はサプロペルごとに異なる。(2)S3-S7のサプロペルが堆積した時期の海洋環境は表層に低塩分水が拡がり底層は停滞して貧酸素状態にあり、陸上起源の有機物が多く供給された。S1,S10,S11は、S3-S7に比べると、温暖で混合された表層水環境で海洋起源の有機物が特徴的に生産され保存された。(3)サプロペル堆積時には東縁部の方がより暖かく低塩分水の影響が強かった。これらの結果は、概括的にはこれまでに提唱されたサプロペル形成モデルと調和的であるが、今回の高分解能分析によって個々のサプロペルの形成要因が異なることが明らかになった。現在のところ、少なくとも3種類の類型が推定され、今後更に、形成環境を詳細に検討し確定する必要がある。1.東地中海のODPコア2本(キプロス島南のエラトステネス海山北部斜面から採取した967D, 6.5mとクレタ島南のレバント海盆とイオニア海盆を分断しているリッジ上の969F,9.3m)中の有孔虫殻の酸素・炭素同位体比に基づく古環境解析を行い,次の3点を明らかにした。(1)東地中海における浮遊性有孔虫殻のδ^<18>Oが希釈されて軽くなった。間氷期の暖かい時期に賢所で河川水の影響が強く現れている。(2) 967Dコア中の浮遊性有孔虫殻のδ^<18>Oは969Fコア中のそれより全体的に軽い値を示し,地中海南東部の表層水のδ^<18>Oは東へ行くほど軽くなっている。之は北大西洋シシリ-海峡を通じて流入してくる表層水は東流する過程で蒸発するため塩分が大きくなり,海水のδ^<18>Oは重くなるが,ナイル川河口付近では河川水の影響で河口から遠ざかるほど,つまり西に行くほど海水のδ^<18>Oは重くなることを示唆している。(3)西側と黒海からの表層水中の栄養塩がナイル川からの淡水中のそれより多かったために969Fコアの生物生産性は967Dコアのそれより高かったと考えられる。2. ODPコア969FのC/N比,有機態炭素・窒素同位体比の分析結果から次の3点が明らかになった。(1)サプロペルは酸化したサプロペルや軟泥に比べて陸上起源有機物を多く含んでいる。(2)陸上起源有機物を運んでくる淡水は,同時に大量の栄養塩を東地中海に供給し活性化した生物生産によって海洋起源有機物が増加した。(3)サプロペルは,陸上起源有機物と海洋起源有機物の両者が共に増加し,とくに陸上起源有機物が急増した結果,形成されたと考えられる。

これらの結果は、概括的にはこれまでに提唱されたサプロペル形成モデルと調和的であるが、今回の高分解能分析によって個々のサプロペルの形成要因が異なることが明らかになった。現在のところ、少なくとも3種類の類型が推定され、今後更に、形成環境を詳細に検討し確定する必要がある。(1)S3S7のサプロペル形成時には、表層に低塩分水が拡がり底層は停滞して貧酸素状態にあり、陸上起源有機物が多く供給された.S1,S10,S11は、S3S7に比べると、温暖で混合された表層水環境で海洋起源の有機物が特徴的に生産され保存された.(2)ナポリ泥火山のモートから採取した第四紀後期のラミナ状サプロペル(S5)の走査型電子顕微鏡による研究は、サプロペル形成をもたらしたフラックスの季節規模に新しい考察をもたらした.サプロペルは本質的に有機物が豊富な珪藻軟泥であり、オパールは地形的な窪みに保存された.この場所の底層水は地中海の特徴であるシリカに未飽和な海水から少なくとも断続的に妨げられた.ラミナ状サプロペルに樹脂を満たして磨いた薄片の後方散乱電子像は、Rhizosolenia属の珪藻を含有するラミナと典型的な珪藻ブルーミング種を含有する混合群集のラミナとの互層を示した.Rhizosolenia属から成るラミナは珪藻マットの形態による季節規模の珪藻集団の堆積を証拠づけた.これらの珪藻マットは有孔虫や石灰質ナノ化石の研究から報告されたサプロペル形成時の深海性クロロフィル最大層が存在したに違いないと言う推定を支持した.サプロペル形成のマット堆積モデルは、(1)成層状態の存在によって深層に閉じ込められた栄養塩類は垂直に沈降するマットによってのみ利用され得る、(2)マットの大量堆積は成層状態の断続的な中断をもたらす高生産の証拠である、の2つから構成されている.
墓葬出土書籍より見た戦国・秦漢の出版文化

研究成果の一部をまとめた「簡牘時代の書誌学研究序説」において、簡牘書籍の形態面、とくに冊書としての編綴方法の詳細な分析を行し、編綴と収巻の観点を掘り下げて、書籍と記録・帳簿との違いを摘出した。分析対象としたのは、事例の豊富な辺境出土簡牘と秦漢時代の墓葬出土簡牘である。その結果、簡牘に書写すべきコンテンツによって、編綴・収巻方法に違いがあり、その違いが(少なくとも筆写段階では)書かれるものが書籍なのか、記録なのかの違いに対応することを指摘した。具体的には、記録類では書かれる内容が日々蓄積され、最終的な書写内容が最期まで確定しないために、いわばファイル方式で次々と簡が賦課されていく方式をとらざるを得ず、その結果、冒頭簡からの編綴・収巻方法がとられることになるのに対して、書くべきコンテンツの確定している書籍の場合には、必要とされる簡牘数もあらかじめ想定されており、かつ冒頭部分から読み始めることを可能とするために、末尾簡からの収巻方法がとられ、その結果編綴も末尾から行われることが判明した。書籍か記録かという弁別は、従来その内容に依存して議論されてきたのであるが、断簡が多く内容全体を把握できない墓葬出土書籍の場合、かかる単純な相違からする議論がきわめて有効であることは言をまたない。本特定領域では、「何が出版物か」を議論する必要のない版本時代の研究課題が当然の事ながら多数を占めるが、その中で本課題は、典籍のテキストが固定される以前の時代における「出版物」の概念を論ずるための基礎的論点の提示という成果を上げることができた。また、書式上の相違から記録類の分析を実際に試みたのが論考「出土簡牘より見たD21遺址の性格」(冨谷至編『辺境出土木簡の研究』、朋友書店、2003年)である。簡牘を編綴した冊書という特殊な形態をとる戦国・秦漢時代の書籍の研究では、まず「モノ」としての冊書を詳細に検討することが必要である。現物を実見して調査する機会が限定されている状況にあって、最善の方法として写真版を中心に規格・素材・編綴方法を出土簡牘ごとに精査し、「経書は三尺」とされるような規格化がどのように進行したかを検討した。墓葬出土簡牘の中から『詩経』『儀礼』『論語』を採り上げて如上の視点から検討した結果、規格どおりの冊書がある一方で、それからはずれる冊書も存在することが明らかとなった。これは規格に合致する「正本」とは別に、いわば「私家版」のような経書も作成・流通していたことを示唆しており、墓葬出土簡牘にはかかる「私家版」の占める比率が高いことを想定すべきことが明らかとなった。また、編綴方法、具体的には緯編(ひも)の数量や編綴位置と書籍内容との相関も一定の見通しを得ることができた。すなわち、上端と下端にひもを通す編綴方法と、中間部のみにひもを通す編綴方法があり、これは簡の長さそのものとは無関係であることが判明した。概して、書籍の範疇に入れられる出土簡牘には前者の傾向が、記録の範疇に入れられる簡牘には後者の傾向が強いことが看取され、これが、ある出土簡牘が当時書籍と見なされていたか否かを判断する一定の基準となりうることが明らかとなった。また、編綴のひもを固定するための切り込みの有無も、書籍か否かの判断基準として有効であることも判明した。また、書式上の相違から記録類の分析を実際に試みたのが論考「出土簡牘より見たD21遺址の性格」
粘度および酸化還元電位を用いた培養液統合指標の確立と養水分吸収制御への適応

培養液の粘性測定にあたって,低粘度液体の測定法について検討した.振動式粘度計では25°C条件での純水の粘度の測定値は0.88 mPa・sと理論値ともほぼ一致し,NaCl 1.5%および3%溶液との間で有意差が見られ区別することが可能であった.次いでこれらの試験水を用いて,各ストレス条件下の種子による吸水を検討した.本実験に使用したストレスは塩ストレス(NaCl, KCl),浸透圧ストレス(PEG),温度ストレス(低温,高温)とし,種子の吸水量の測定を行った.種子吸水試験の結果,低温による吸水抑制,塩ストレスによる吸水抑制,浸透圧ストレスによる吸水抑制が表れ,温度ストレスおよび塩ストレスに関しては粘度との間に直線関係が認められた.コマツナの湛液栽培では,培養液の粘性と根による水吸収の関係を検討した.培養液の設定は大塚ハウスA処方の培養液(通常濃度区,EC: 1.4 dS/m)を用いて,養分割合を変更せずに5倍希釈の濃度(低濃度区)と5倍の濃度(高濃度区)に設定した.培養液の粘性に関しては,生育期間中に一貫した傾向が見られなかったことから,改善点として(1)測定法を低粘度での感度が良い振動式粘度計に変更し,(2)地上部の生育による影響を最小限にするため培養液の設定変更を短期間のみとした.また,(3)不純物の混入による粘度測定への影響が考えられるため,粘度測定時に濾過を行い,(4)測定頻度を生育中期から日変化とした.さらに,(5)培養液の管理法を追加方式ではなく全量交換とした.粘度の日変化にも差が見られ,低濃度区<通常濃度区<高濃度区と濃度の上昇によって粘度が増加した.根による水吸収に関しては,低濃度区は通常濃度区と差が見られなかったが,高濃度区においては水吸収の抑制が見られた.定植21日目以降に関して培養液の粘度と水吸収量の関係を見てみると,直線関係にあることが示唆された.26年度が最終年度であるため、記入しない。26年度が最終年度であるため、記入しない。
虚血・小胞体ストレス応答経路関連microRNAの腎臓病態生理活性の解明

慢性腎臓病(CKD)におけるエピゲノム変化の病態生理学的意義を明らかにすることを目的とし、1)ヒト尿細管上皮細胞発現microRNAにはCKD発症進展に関与するストレスシグナル(小胞体ストレス、酸化ストレス)により発現が変動するmicroRNAが存在し、その中にストレス適応応答経路の活性化を制御し、細胞恒常性維持に関与するmiR-205を同定し、2)糸球体濾過機能を携わる足細胞に発現するヒストン脱アセチル化酵素(Sirt1)は非エピゲノム活性も有し、細胞骨格関連分子コータクチンの脱アセチル化を介してアクチン細胞骨格の重合・安定性を亢進し、糸球体障害時の蛋白尿を軽減できることを明らかにした。我々はこれまでに、エピゲノムと腎臓病の関係を明らかにする研究の一環として、尿細管上皮細胞に発現するmiRのプロファイリングを行い、その中から尿細管細胞障害時に発現が変動するmiR群を明らかにしてきた。特にmiR205は尿細管に恒常的に発現し、酸化ストレスや小胞体ストレス環境下ではその発現が著明に低下することを報告してきた。本研究では、miR-205のヒト近位尿細管細胞株(HK-2)における病態生理学的意義の解明を試み、1) miR205は尿細管細胞が酸化ストレス(虚血再灌流後)や小胞体ストレス(tunicamysin, tapsigargin)に曝露すると尿細管細胞障害(生存・増殖率低下や細胞内活性酸素種産生増加)に伴ってその発現が著明に低下するが、逆に虚血ストレス下(1% O2, 24hr)では有意にmiR205発現が亢進すること、2)miR205はprolyl hydroxylase (PHD)1を標的遺伝子としてその発現を制御し、その結果、PHD1標的遺伝子(虚血応答経路転写因子HIFー1,小胞体ストレス応答経路転写因子ATF4)の発現低下、つまりストレス適応反応の低下を招くこと、3)miR205はPHD2、PHD3には作用せず、PHDアイソフォーム特異的な機能特性にも関与することが分かってきた。虚血再灌流モデルラットを用いたin vivo解析では、腎皮質におけるmiR205の発現は短期間ではin vitroと同様に尿細管細胞障害亢進に伴ってmiR205の発現は低下するが、その後miR205の発現は有意に亢進することが判明した。以上,尿細管細胞においてストレス障害時にmiR205発現は低下し、PHD1発現調節を介して低酸素応答経路や小胞体ストレス応答経路の不均衡を招くが、尿細管修復時にはmiR205の発現が亢進し尿細管細胞の機能恒常性を回復させる可能性が示唆された。近年、腎臓病の病態形成・進展に関わる要因として、腎臓細胞におけるエピゲノム変化が注目されている。つまり、腎障害を引き起こす様々なストレス(虚血、代謝異常、炎症など)は腎臓細胞のゲノム構造を変化させたり、microRNA(20から25塩基ほどの小さなRNAでmRNAの転写や翻訳を制御する)の発現レベルを変動させることが分かってきた。そうしたエピゲノム変化が細胞の遺伝子発現パターンをダイナミックに制御し、病態形成・進展に関与することが推測される。ゲノム構造、特にヒストンとDNAの巻きつきの強さを変化させる因子としてクロマチンのアセチル化酵素や脱アセチル化酵素がよく知られており、それらの発現が腎病態において変動することや、それを正常化することで病変が改善できる可能性などが示唆され今後の治療戦略として注目されている。我々も腎機能恒常性におけるエピゲノムの病態生理学的意義の解明を目的に、エピゲノム制御因子のひとつであるSIRT1(ヒストン脱アセチル化酵素で、酵母の長寿遺伝子Sir2のヒトホモログ)のポドサイトにおける役割を検討してきた。その結果、予想に反しSIRT1がヒストン脱アセチル化を介してエピゲノムを変化させるだけでなく、非ヒストン蛋白の脱アセチル化を制御し、ポドサイト機能に関与することを見いだした。具体的にSIRT1は細胞骨格関連分子コータクチン(cortactin)の脱アセチル化を制御し、脱アセチル化コータクチンがアクチン細胞骨格の重合・安定性を促すこと、それがポドサイトの機能的形態維持に深く関与し、破綻すると蛋白尿の原因になることなどを明らかにした。これら成果から、ポドサイトの新たな細胞骨格制御機構(SIRT1-cartactin-actin経路)を見いだし、SIRT1によるポドサイト保護を介した新たな腎保護戦略が示唆された。我々はこれまでに、慢性腎臓病におけるエピゲノム変化の病態生理学的意義を明らかにし、新たな視点から慢性腎臓病の病因論を理解するための研究の一環として、ヒト尿細管上皮細胞に発現するmicroRNAのプロファイル、さらに慢性腎臓病の発症進展に関与するストレス刺激(小胞体ストレス、酸化ストレス)で有意に発現が変動するmicroRNA群の同定などを報告してきた。本研究では、そうした一連の成果を基盤として、ヒト尿細管上皮細胞株(HK-2)のmicroRNA発現プロファイルから、虚血による酸化ストレス(低酸素・再酸素化)や小胞体ストレス(tunicamycin, tapsigargin処理)によって発現が変動するmicroRNAを同定、その病態生理学的活性の解明を行った。

その結果、ストレス依存的に発現変動するmicroRNA群のひとつとしてmicroRNA 205 (miR-205)が尿細管恒常性維持に必要なmicroRNAであることを報告しており、1) miR-205は尿細管上皮細胞のストレスに対する適応応答を適切に制御、2)その標的遺伝子としてPHD1 (prolyl hydroxylase 1)の遺伝子発現制御を司る、3)miR-205の発現低下はPHD1発現亢進を介して低酸素/小胞体ストレスシグナルを亢進させて細胞内ROS上昇と尿細管上皮細胞死を招くことなどを明らかにした。さらにmiR-205は加齢腎臓皮質の老化に伴う病理変化に伴ってその発現が有意に低下することも明らかにした(p<0.05)。これらの成果から、加齢に伴う腎臓尿細管上皮細胞の低酸素ー酸化ストレスや小胞体ストレス亢進の機序の一つとして、miR-205発現低下がストレス適応応答能の低下を引き起こしている可能性、ひいてはエピゲノム制御による腎臓保護効果の可能性が示唆された。慢性腎臓病(CKD)におけるエピゲノム変化の病態生理学的意義を明らかにすることを目的とし、1)ヒト尿細管上皮細胞発現microRNAにはCKD発症進展に関与するストレスシグナル(小胞体ストレス、酸化ストレス)により発現が変動するmicroRNAが存在し、その中にストレス適応応答経路の活性化を制御し、細胞恒常性維持に関与するmiR-205を同定し、2)糸球体濾過機能を携わる足細胞に発現するヒストン脱アセチル化酵素(Sirt1)は非エピゲノム活性も有し、細胞骨格関連分子コータクチンの脱アセチル化を介してアクチン細胞骨格の重合・安定性を亢進し、糸球体障害時の蛋白尿を軽減できることを明らかにした。本研究において、尿細管上皮細胞において様々なストレス(虚血や小胞体ストレス)の経過や負荷の違いによって発現が変動するmicroRNA群、さらにはストレス適応応答を制御するmicroRNA群を同定してきた。なかでもmiR205に関しては、その標的遺伝子としてPHD1を同定し、尿細管上皮細胞においてストレス適応反応の適切な活性制御に働くこと、それが細胞機能維持の恒常性に繋がる事を明らかにしてきた。しかし、さらに新しいストレス関連microRNA群の標的遺伝子同定や病態生理学的機能解析は、論文掲載に至るまでの十分なレベルまで研究が進められなかった。その一方で、microRNA同様にエピゲノムに関与するSIRT1の糸球体ポドサイトにおける機能解析を発展させることが出来、招待講演や論文によって研究成果の発表を行えた。医歯薬学本研究の最終年度として尿細管において虚血・小胞体ストレスで発現が変動するmicroRNA群の標的遺伝子同定を進める。2つのストレスによる発現変動が著しいmicroRNAに焦点を絞り、それらの標的遺伝子をin silico,あるいはストレスシグナル関連因子群の中から同定する。それら成果によって、microRNAによる標的遺伝子発現制御の尿細管細胞機能維持における役割、さらには腎臓における病態生理学的意義を解析する。また、これまでに明らかにしてきたポドサイトにおけるSIRT1-cortactin-actinの相互作用の分子メカニズムを更に詳細に検討し、ポドサイト機能恒常性におけるこれら相互作用の重要性を明らかにする。これは本研究課題の波及課題で、ポドサイトバイオロジーに関する新しい研究課題としての発展を目指す。本研究において、尿細管細胞において虚血や小胞体ストレス負荷によって発現が変動するmiR群、さらには虚血や小胞体ストレスに対する適応反応経路を制御するmiR群を同定することができた。
低分子化合物による幹細胞遊走の制御と再生医学への応用

先の研究で、間葉系幹細胞の遊走を活性化する低分子化合物を複数同定している。本研究では、同定した化合物の刺激による幹細胞遊走の特性を解析し、さらに動物組織内での化合物刺激による幹細胞の遊走活性と組織再生の効果を調べた。その結果、PL-17とPL-C1について、糖尿病マウスを使った皮膚創傷モデルにおいて組織再生を増強すること、そして皮膚創傷による幹細胞誘引モデルにおいて化合物塗布が皮膚創傷部へ幹細胞の集積を増強していることが示唆された。今後、これらの化合物を使ってさまざまな組織再生モデルへの応用が期待される。本研究では、間葉系幹細胞の細胞遊走を亢進させる化合物を見つけるために、天然物ライブラリーからボイデンチャンバー法を用いた探索を行い、間葉系幹細胞の遊走を活性化する低分子化合物を複数同定した。前年度の研究によって、そのうちPL-70、PL-17とPL-C1は、比較的高い間葉系幹細胞の遊走活性を有し、細胞特異に強い感受性も認められた。そこで3つの化合物について細胞内シグナル伝達系との関連性の解析を進めた。また、次年度の準備のため動物実験のためのモデル確立も併せて行った。PL-70刺激による細胞遊走に関連するシグナル伝達系について、ウエスタンブロッティング法を用いて細胞内機能分子の活性化状況を調べたが、特定のプロテインキナーゼの影響を受けていなかった。さらに化合物刺激した細胞染色像で細胞骨格の状況を調べたところ、細胞内アクチン骨格の発達に違いがあった。また、アクチン重合試験において、抑制効果が認められた。これらから、PL-70は細胞内アクチンに直接作用する可能性が示めされた。次にPL-17とPL-C1刺激による細胞遊走に関連するシグナル伝達系について、細胞内機能分子の活性化状況を調べたところ、細胞内でチロシンリン酸化が起きていた。キナーゼ阻害剤によって細胞遊走も抑制されるので、PL-17とPL-C1は特定のチロシンプロテインキナーゼの活性化を起こすことで細胞遊走を活性化する可能性が考えられた。さらに化合物を付加したビーズと相互作用するタンパクの分離分析を行い幾つかの分子に絞り込んだ。以上の結果より、PL-70、PL-17とPL-C1について細胞遊走に関与している細胞内機能タンパクと相互作用している可能性が示唆された。また、動物実験のためのモデル作製については、骨髄移植モデル、細胞遊走モデル、創傷治癒モデルを確立することができた。先の研究で間葉系幹細胞の細胞遊走を亢進させる物質探索のために、天然物ライブラリーからスクリーニングを行い、間葉系幹細胞の遊走を活性化する低分子化合物を同定している。本研究では、同定した化合物の刺激による細胞遊走の特性とシグナル伝達を解析することでメカニズムを解明し、さらに、動物組織内での化合物刺激による幹細胞の遊走活性と組織再生の効果を調べることで再生医学へ応用するための基礎確立を目的とした。平成23年度と平成24年度には、化合物刺激による細胞遊走活性の機能特性解析と、化合物刺激による細胞遊走活性のメカニズム解析のうち細胞内機能分子の活性化確認、そして動物実験のためのモデル作製の準備を行った。平成25年度では、前年度までの化合物による細胞遊走活性の解析を基にして、PL-17とPL-C1について動物モデルを使って化合物の幹細胞遊走活性と創傷治癒の効果を調べた。幹細胞誘引作用について、第一段階の解析として、先ず化合物を尾静注した動物において、その血中に骨髄などから間葉系幹細胞の細胞が動員されてくるかFACS解析を使って検証したところ、間葉系幹細胞分画の細胞数が増加していた。次の段階として、血流から化合物によって幹細胞誘引がされるのかを検証するために、ルシフェラーゼ発現間葉系幹細胞を尾静注した皮膚創傷モデルにて、化合物の投与での幹細胞の誘引作用を調べたところ、化合物塗布した創傷部で幹細胞の集積増強が認められた。さらに化合物の組織再生への影響を調べるため、全層欠損層からの創傷治癒モデルにて化合物を塗布し、創面積の縮小、及び組織再生を組織染色法で評価したところ、有意に治癒効果が認められた。以上の結果より、PL-17とPL-C1について、動物体内で幹細胞誘引に作用すること、そして組織再生を増強する可能性が示唆された。さらに今後、これらの化合物を使ってさまざまな組織再生モデルを試していく予定である。今回我々は、間葉系幹細胞の細胞遊走を亢進させる化合物を見つけるために、天然物ライブラリーからボイデンチャンバー法を用いて探索を行い、間葉系幹細胞の遊走を活性化する低分子化合物PL-70、PL-17、PL-C1、PL-G9を同定した。

PL-70とPL-G9は菌類成分由来、PL-17とPL-C1は植物成分由来であった。それらのうちPL-70とPL-17について機能解析を進めた。PL-70が動物体内で幹細胞を誘引するかを検証するために、GFP発現骨髄幹細胞の骨髄移植モデルにて、化合物を含んだマトリゲルプラグを皮下に埋め込み、GFP発現細胞をトレーサーとして使って誘引作用を調べたところ、コントロールと比べて誘引作用が認められた。また、PL-70刺激による細胞遊走に関連するシグナル伝達系について、培養細胞とウエスタンブロッティング法を用いて細胞内機能分子の活性化状況を調べたが、MAPKやAKTは影響を受けていなかった。さらに化合物刺激した細胞を固定して、細胞染色像で細胞骨格の状況を調べたところ、細胞内アクチン骨格に作用する可能性が示唆された。次にPL-17が動物体内で幹細胞を誘引するかを検証するために、GFP骨髄移植モデルにて、化合物を含んだマトリゲルプラグを埋め込み誘引作用を調べたところ、誘引作用が認められた。また、PL-17刺激による細胞遊走に関連するシグナル伝達系について、細胞内機能分子の活性化状況を調べたところ、特定のプロテインキナーゼの活性化に影響していた。以上の結果より、PL-70とPL-17それぞれの化合物が、動物体内で幹細胞誘引に作用すること、細胞遊走に関与している細胞内機能タンパクと相互作用している可能性が示唆された。さらに、化合物の機能とメカニズム解析を進めている。間葉系幹細胞の細胞遊走を亢進させる物質を見つけるために、天然物ライブラリーから探索を行い、間葉系幹細胞の遊走を活性化する低分子化合物を同定している。そこで本研究では、同定した化合物の刺激による細胞遊走の特性とシグナル伝達を解析することでメカニズムを解明し、さらに、動物組織内での化合物刺激による幹細胞の遊走活性と組織再生の効果を調べることで再生医学へ応用するための基礎確立を目的とした。平成24年度では、前年度に得られた化合物の細胞応答特性と細胞内シグナル伝達系を関係付けるため、細胞内機能分子の活性化状況を確認することと、動物実験のためのモデル作製の準備を目標とした。PL-70、PL-17とPL-C1についてそれぞれ機能解析を進め、化合物刺激でのシグナル伝達系の解析を行った。さらに化合物と相互作用する分子の探索を行い幾つかの分子に絞り込んだ。また、動物実験についても骨髄移植モデル、ルシフェラーゼなどのトレーサー発現細胞移入モデル、創傷治癒モデルについてコントロール実験をおおむね実施できた。以上の結果から、24年度の予定目標をおおむね達成することができた。間葉系幹細胞の細胞遊走を亢進させる物質を見つけるために、天然物ライブラリーからボイデンチャンバー法を用いて探索を行い、間葉系幹細胞の遊走を活性化する低分子化合物を同定している。そこで本研究では、同定した化合物の刺激による細胞遊走の特性とシグナル伝達を解析することで、メカニズムを解明し、さらに、動物組織内での化合物刺激による幹細胞の遊走活性と組織再生の効果を調べることで再生医学へ応用するための基礎確立を目的とした。平成23年度では、化合物刺激による細胞遊走活性の機能特性解析と、化合物刺激による細胞遊走活性のメカニズム解析のうち細胞内機能分子の活性化確認を目標とした。PL-70とPL-17についてそれぞれ機能解析を進め、動物体内で幹細胞誘引に作用すること、さらに化合物刺激によっておきる細胞遊走に関わる細胞内機能タンパクと相互作用する可能性が示された。
レ-ザ光束によるサブミクロン粒子の制御技術の開発に関する研究

波長488,438nmの可視光,300nmの紫外光を水平面上にそれぞれ走査して汚染粒子から半導体ウエハを防御するレ-ザ光バリアを構成し,光束中での微粒子の振舞い,光子・微粒子・周囲気体分子・熱の相互作用現象解明と微粒子の遠隔操作法,排除法の検討を行った。その結果,以下のように従来の研究にはみられない有効な研究成果が得られた。1.波長488nmの収束レ-ザ光でポリスチレンラテックスの直径1μm20μmの粒子を収束点附近でトラップし,粒子の三次元の遠隔移動操作を誠みた結果,粒子は安定に捕捉され,遠隔操作されることが明らかとなった。ダイレクトレ-ザ光走査による光バリアでは直径1μm20μmのポリスチレン粒子は光進行方向に排除できるが,そのためにはレ-ザ光のガウス分布光強度を確実に保つことが必要であることが分った。2.出力1W程度の488nmレ-ザ光バリアでは気流中に懸濁したサブミクロン粒子がそれを突破することが明らかとなった。そのため光圧力効果を高めるための共鳴吸収効果が理論的,実験的に検討され,粒径がコンマ数μmずつ異なると共鳴吸収効果が著しく異なることなど,複素屈折率,粒径,入射光波長の変化による芝鳴吸収の効果等が明らかにされた。3.ガウス分布強度レ-ザ光で粒子を操作するときに必要な光進行方向や光軸直交方向等に働く光圧力をMie光散乱から計算するプログラムを完成させた。これによってレ-ザ光束中での任意の位置で粒子に働く光圧力のシミュレ-ト法が確立された。4.レ-ザ光束中で粒子が反光照射方向に突然逆走するという珍奇な現象が観測され,その解明の光照射方向,反対方向の飛翔する粒子の速度や粒子捕捉力の大きさが定量的に測定された。その原因は光泳動力や共鳴吸収放流射力によると推測されるが,それらを明らかにするため真空容器内で粒子をレ-ザ光束によって遠隔操作する実験研究が行われている。水平に設置されたウエハ上にガルバノミラ-を用い,Arレ-ザ488nm波長光と紫外光を走査して水平面上にレ-ザ光束バリアを構成した。1)488nm波長のこのバリア光に収束光を用い,ポリスチレンラテックスの直径1μm以上20μmまでの粒子を収束点附近でトラップし,粒子の三次元の遠隔移動操作を行った。その結果,水平方向での光走査でもトラップ粒子は安定に捕捉され,遠隔操作されることが明らかとなった。また,Arレ-ザのダイレクト光走査による光バリアでは直径1μm20μmまでのポリスチレン粒子が光進行方向にとばされて,比較的容易に排除できる。しかしそのためには光バリアはレ-ザ光のガウス分布光強度をしっかりと保つことが必要であることが明らかとなった。2)出力1W程度の488nmアルゴンレ-ザ光のバリアでは気流中に懸濁したサブミクロン粒子がそれを突破することが実験的に明らかとなった。

このため更に短かい波長光か共鳴吸収波長光を光バリアに用いる必要性があらためて再認識され,これに対してサブミクロン粒子の光散乱,吸収強度の計算プログラムを完成し,任意の条件下のレ-ザ光束中でのサブミクロン粒子に対する光圧力,光泳動,熱泳動,粘性などの影響が計算され,サブミクロン粒子に対する光バリアの構成要件が更に検討されつつある。3)レ-ザ光束中での粒子の挙動については種々の実験的事実が明らかとなった。例えばレ-ザ光束中では光束構成の条件によっては光進行方向と逆向きに走る粒子が散見されたなど。また、滞電粒子の挙動が写真撮影され,その挙動の理論的解析がなされた。4)本研究に必要な計測法の開発が行われた。大気中浮遊粒子(二相流中の粒子)の形状,寸法別の粒子挙動,速度の測定法が開発された。またサブミクロン粒子の形状認識の光学的新手法も開発された。波長λ=488nm,438nm,約300nm程度,のレ-ザ光をそれぞれ水平面上に走査して、水平設置ウエハ上にレ-ザ光バリアを構成し,レ-ザ光束中での微粒子の振舞い,光子・粒子・周囲気体分子・熱の相互作用現象の解明と微粒子の遠隔操作法の検討を行った。新しく観測された現象の解明など研究の新展開があり,その完成が待たれるが,一応初期の研究目標の主要部分は達成され,以下のような有効な成果が得られた。1)ガウス分布強度レ-ザ光で粒子を操作するために必要な光進行方向,光軸直交方向等に働く光圧力をMie散乱から計算するプログラムソフトを完成させた。これによって、レ-ザ光束中での任意の位置で粒子に働く光圧力のシミュレ-ト法が確立された。2)光圧力効果を高めるために,入射レ-ザ光の波長λ,粒子径Dpを変えたとき粒子の光共鳴吸収効果が理論的,実験的に検討された。その結果,共鳴吸収効果は粒子の複素屈折率と粒径パラメ-タα(=πDp/λ)の変化に大きく依存し,例えば粒径がコンマ数ミクロンずっ異なるとその効果は著しく異なることなど,その効果が定量的に明らかにされた。3)光圧力による粒子の捕捉,排除技術には照射レ-ザ光がガウス分布強度を保つことが非常に重要であることが実験及び理論計算から明らかにされた。4)レ-ザ光束中で粒子が光照射方向と反対方向に突然逆走するという珍奇な現象が観測されているが,それらダイレクトレ-ザ光中で光照射方向及び逆方向へ飛翔する粒子の速度や,収束レ-ザ光の焦点近傍での粒子捕捉力の強さが定量的に測定された。それらの現象の解明がなお行われている。5)真空容器内レ-ザ光圧力実験装置が完成し,光束中での反光圧力と推測されている光泳動力,共鳴吸収放射力などの可否が検討されている。
微生物由来の細胞傷害性タンパク質パラスポリン4の作用機構解明

パラスポリン4はCACO-2細胞をはじめとする哺乳動物ガン細胞由来の培養細胞に対して高い細胞傷害活性を示す一方で、正常細胞に対しては細胞傷害活性を示さないことから、その作用機構を解明することでガン治療薬・ガン診断薬としての利用化が期待できる。本研究においては、パラスポリン4をヒト培養ガン細胞に投与した際のパラスポリン4や細胞内外の物質の挙動をいろいろと検討し、パラスポリン4が細胞膜に対する穴空けトキシンであることを解明した。1.パラスポリン4(PS4)レセプターの探索CACO-2細胞の膜画分をSDS-PAGEにより分画して、トキシンオーバーレイアッセイによりPS4と結合する画分を探索し、約250kDaの位置にPS4と強く結合する画分を得ることができた。低密度のアクリルアミドゲルで該当するバンドを確定しようとしたが、当該部分には微弱なバンドが多数あり、PS4と結合するバンドを特定することはできなかった。そこで2次元電気泳動による分画を試みたが、分子量が大きいため1十分な量のタンパク質をゲル内に取り込むことができなかった。現在PS4を固定化したカラムを用いてCACO-2細胞の膜画分からのPS4結合画分の濃縮を試みている。2.PS4立体構造の解明に向けた変異体の作成立体構造解明のためにPS4結晶の作製を試みたが、アモルファスな凝集物ができるだけで結晶が得られなかったことから、PS4に変異を入れて、結晶化を試みた。PS4の凝集はβシートに関連した凝集と考えられたことから、β凝集予測プログラムであるTANGOにより関連するアミノ酸を予測したところ111番目のイソロイシンがもっとも可能性が高かった。そこでこれをアラニンとした変異体(I111A)を作製した。また、PS4を2分割や3分割した変異体を作製し、6分割した3番目が凝集に関与していると特定した。これはTANGOの予測と一致していたが、I111A変異体は高分子凝集体を生じ、目的としていた「凝集しないPS4変異体」は得られなかった。3.PS4の作用に関する細胞生理学的検討PS4の投与から細胞死に至る過程を、LDH活性の細胞外溶出により測定したところ、シクロヘキシミドによるアポトーシス誘導と比較して、PS4投与直後から細胞外のLDH活性の増加が見られ、PS4の作用は予想したとおりポアフォーミングによるものと推察された。1.パラスポリン4の作用に関する細胞生理学的検討パラスポリン4投与から細胞死に至る過程について活性の細胞外溶出、細胞外からの分子の流入、作用におけるパラスポリン4多量体の形成などを検討したところ、すべての互についてパラスポリン4がポア形成型毒素であるという結果が得られた。また、作用課程におけるカスパーゼ活性を測定したところ有意な上昇は見られず、パラスポリン4はアポトーシスを誘導していないと考えられた。2.パラスポリン4レセプターの探索CACO-2細胞の膜画分を可溶化し、SDS-PAGEや2次元電気泳動により膜タンパク質を分画し、PVDF膜に転写してトキシンオーバーレイアッセイを行い、パラスポリン4と結合するタンパク質をPVDF膜上に得て、これについてMass Fingerprinting法による同定を試みたが、当該タンパク質が微量なだめ同定することが出来なかった。さらにSulfo-SBEDといった修飾剤を用いて、パラスポリン4を修飾し、Sulfo-SBED経由で受容体にビオチンを修飾することで、受容体探索を試みることとし、パラスポリン4へのSulfo-SBED修飾を行ったが、修飾課程でパラスポリン4が沈殿し、活性のあるSulfo-SBED修飾パラスポリン4を得ることが出来なかった。パラスポリン4はCACO-2細胞をはじめとする哺乳動物ガン細胞由来の培養細胞に対して高い細胞傷害活性を示す一方で、正常細胞に対しては細胞傷害活性を示さないことから、レセプターを介して細胞に作用していると考えられる。そこで本研究においてはCACO-2細胞におけるパラスポリン4レセプターの探索を目的とした。また、前年度までの研究成果として、パラスポリン4が細胞膜に対する穴空けトキシンであることが判明したため、パラスポリン4の立体構造解明のためにパラスポリン4結晶の作製を試みた。その際にパラスポリン4活性体はアモルファス状の凝集物を形成するため、立体構造解析にかけられるような結晶は得られていないため、凝集体を形成しないようなパラスポリン4変異体やGSTやEGFPなどとの融合タンパク質の作成を行った。パラスポリン4のレセプター探索のためにレセプターに光架橋でビオチンを修飾する架橋剤のパラスポリン4のアミノ基への修飾を試みたが、活性を持つ架橋剤修飾パラスポリン4を得ることが出来なかった。同様の架橋剤をSS結合でパラスポリン4へ修飾するために、パラスポリン4活性体のC末ヘシステインを導入した変異体の作成を行った。6種類の変異体の作成を試みて、5種類の変異体を得ることが出来た。

また得られたすべての変異体は細胞傷害活性を示した。また、これらの変異体について精製を行った。凝集体を形成しないようなパラスポリン4変異体を作成するために、GST、EGFP、NusAなどとパラスポリン4との融合蛋白質を作成したが、活性を持つ変異体を得ることが出来なかった。
緑肥作物を用いた種多様性によるバイオマス増加、安定への効果とそのメカニズムの解析

数種の植物を混植すると生産性が高まることが知られているが、そのメカニズムとして、光や養水分が相補的に利用されるためであると考えられている。しかし、養分の相補的利用を考える上で重要な形態的特性である根の分布パターンは、混植した圃場条件では測定が困難なためほとんど行われてこなかった。そこで、新たに開発されたマルチカラー根染色法を用いて、単植と混植両方の3種類の緑肥作物の根の分布パターンを調査した。ソルガムは、他の植物と混植にすると、単植に比べて根の分布が深くなり、混植によるバイオマスの増加にもっとも貢献していた。クロタラリアは単植、混植ともに深い根の分布パターンを示した。ヒマワリは根の分布が浅く、混植にすると特に降雨の少ない条件で著しく生育が劣った。本研究で明らかになった根の分布パターンは、それぞれの植物の混植での地上部の生育パターンの密接に関わっていた。植物の種多様性と生産性や安定性との間には正の相関関係があることが示されている。本研究では、種多様性の高い植生に見られる現象を緑肥作物栽培に応用し、混作で栽培することによるバイオマス増加効果の検証、およびそのメカニズムの解析を行った。供試作物として、マメ科植物、C4植物、C3植物からそれぞれ播種時期が同じで乾物収量が多く、アレロパシー効果の影響の少ないクロタラリア、ソルガム、ヒマワリを選定した。処理として、3種それぞれの単作、2種ずつの組み合わせの混作、および3種類の混作の計7種類の作付け区を設け、3反復、2作期(夏作、秋作)でその生育と収量を調査した。また、それぞれの区画内に38Lの不織布ポットを埋め、生育途中で掘りあげて種毎に異なる色の染色液を注入することで根を染め分け、深さ別の種毎の根域分布の解析を行なった。地上部バイオマスは、単作にくらべて混作で夏作、秋作ともに有意に増加した。構成種ごとにバイオマスの推移を解析したところ、必ずしもすべての種が混作によって大きくなっているわけではなく、組み合わせによって単作よりも大きくなる種と小さくなる種が混在していた。地下部も同様に、単作に比べて混作でバイオマスが増加した。深さ別に解析を行った結果、ソルガムの単・混作の処理と深さの間に交互作用が有意に検出された。すなわち、ソルガムでは単作の場合には深くなるにつれて根の量が減少するが、混作にすると深さ20cm以降の根量が増加する傾向が見られた。これらの結果、および生育前期と後期それぞれの生長解析の結果から、混作による増収要因は、混作による群落の光条件やバイオマスの分配割合の変化、あるいは構成種それぞれのバイオマスの増加ではなく、混作条件で他種よりも有利な種のバイオマス増加に起因する可能性が示唆された。

これらの結果、および生育前期と後期それぞれの生長解析の結果から、混作による増収要因は、混作による群落の光条件やバイオマスの分配割合の変化、あるいは構成種それぞれのバイオマスの増加ではなく、混作条件で他種よりも有利な種のバイオマス増加に起因する可能性が示唆された。植物の種多様性と生産性や安定性との間には正の相関関係があることが示されている。本研究では、種多様性の高い植生に見られる現象を緑肥作物栽培に応用し、緑肥を混作で栽培することによるバイオマスの増加効果を検証し、そのメカニズムの解析を行った。供試作物として、マメ科植物、C4植物、C3植物からそれぞれ播種時期が同じで乾物収量が多く、アレロパシー効果の影響の少ないクロタラリア、ソルガム、ヒマワリを選定した。処理として、3種それぞれの単作、2種ずつの組み合わせの混作、および3種類の混作の計7種類の作付け区を設け、3反復、4作期の生育と収量を調査した。単作の地上部バイオマスは、年次や季節によって異なった。特に、ソルガムは堆肥を投入した直後の2008年に極端にバイオマスが大きくなった。また、クロタラリアはキャベツ栽培後で無機態窒素量が高かった2009年にバイオマスが少なくなり、ソルガムとの混植ではほとんど生育しなかった。ソルガム・ヒマワリ、およびソルガム・クロタラリア・ヒマワリの混作下では、単作に比べてバイオマスが大きく、さらに作期間の変動係数が小さかった。混作下で安定して高いバイオマスが得られたメカニズムとして、それぞれの作期の環境条件に適した種が台頭することで、適さなかった種のバイオマスの減少が補填されたことが考えられる。これは、作期毎に3種のバイオマスの比率が異なっていたこと、生長解析や根系分布の解析によると光や養水分の条件改善や、植物間のプラスの相互作用の影響が見られなかったことなどから示唆された。本研究では、種多様性の高い植生に見られる現象を緑肥作物栽培に応用し、緑肥を混作で栽培することによるバイオマスの増加効果を検証し、そのメカニズムの解析と、緑肥としての効果の検証を行った。作期と年次によりバイオマスは大きく異なったが、試験期間と通してソルガム・ヒマワリ、およびソルガム・クロタラリア・ヒマワリの混作下では、単作に比べてバイオマスが大きく、さらに作期間の変動係数が小さかった。特にソルガムは混作下で深く根を張る傾向がありバイオマスの増加に最も貢献していた。また、3種類の混作による緑肥のすきこみ栽培と、定植前リン酸施用を組み合わせることにより、緑肥の後作キャベツのリン利用率がさらに向上するか否かについて検討した。緑肥については、すき込み後のキャベツの収量に関して効果は認められなかった。したがって、定植前リン酸施用と縁肥すき込みの組み合わせによる明確な効果は認められなかった。緑肥によるリン供給効果のメカニズムを明らかにし、定植前リン酸施用との組み合わせによる効果の可能性を検証するには、AM菌非宿主作物(キャベツ)だけでなく、宿主作物を供試作物とした同様の試験が必要であると考える。