hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ストレス性高カテコラミン血症が術後遷延痛を引き起こすメカニズムの解明

ストレス環境に暴露されると交感神経が興奮し高カテコラミン血症となる。カテコラミン濃度が持続的に高い状態が続くことは、心不全、糖尿病などを惹起するだけでなく、ガンの発症にも影響を及ぼすことが示唆されている。知覚神経にもbetaアドレナリン受容体が発現し、痛覚伝達に影響を及ぼしていることが示唆されているが、高カテコラミン血症が痛覚伝達に及ぼす影響は十分に解明されていない。本年度においては、カテコラミン分解酵素であるCOMTの阻害剤を腹腔内投与することにより作成するラット高カテコラミン血症モデルを確立し、モデル動物における痛覚閾値を測定した。その結果、高カテコラミン血症モデルでは痛覚過敏を誘発することがあきらかとなった。今後、知覚神経におけるアドレナリン受容体の発現を解析し、高カテコラミンで誘発される疼痛の分子機序を解明したい。モデル動物の作成には成功したが、カテコラミン受容体の発現解析には至っていないため、次年度の課題としたい。一次知覚神経におけるカテコラミン受容体の発現を免疫組織化学法とウェスタンブロッティング法、リアルタイムPCRなどで解析し、高カテコラミン状態における発現変化を明らかにする。さらに、高カテコラミン状態における痛覚過敏がアドレナリン受容体阻害剤で抑制されるか検証し、ストレス性疼痛の治療法を提案したい。本研究ではラット慢性高カテコラミン血症モデルを作成し、その痛覚閾値を測定して痛覚過敏の有無を観察しつつ、一次知覚神経におけるアドレナリン受容体の発現変化を調査して、高カテコラミン血症における一次知覚神経のアドレナリン受容体の働きを解明することを目的とする。本年は高カテコラミン血症モデルを作成するため、カテコラミン分解酵素阻害剤をラットに投与しカテコラミン血中濃度を測定しつつ痛覚過敏を有無を検証する計画を立案した。しかしながら、研究遂行に必要な時間を十分に確保することが困難となり、研究実施に支障をきたした。研究の遂行に必要な時間の確保が困難となり、実施に支障をきたしているため。エフォートを見直し、研究実施に必要な時間を確保する。高カテコラミン血症を惹起するカテコラミン分解酵素阻害剤は既知のものを利用することができるため、薬剤と実験動物を入手し研究を開始する。研究実施に必要な時間を確保することが困難であり、本年度の実施を予定していた研究計画を次年度に行う計画としたため。モデル動物の確立と行動解析は達成することができた。しかしながら、アドレナリン受容体の発現解析のための準備が不足しており実験を実行することができなかった。次年度以降の課題とする。
脳虚血耐性獲得機序の新展開-ATP受容体を介する細胞内分子機構と細胞間相互作用-

虚血耐性は軽微な虚血の前負荷により、引き続く致死的負荷に対して抵抗性を獲得する現象であり、その強力な神経細胞保護効果は、脳梗塞治療開発の観点から注目されている。従来神経細胞のみをターゲットにした研究がなされてきたが、これのみでは説明が困難であり、神経系全体に視点を移した研究の必要性が近年示唆されている。一方、生体エネルギー通貨のアデノシン三リン酸(ATP)は、その受容体を介し、神経細胞同士または神経細胞グリア細胞間の情報伝達物質としても機能する。本研究では、脳虚血耐性現象におけるATP受容体シグナル経路を介した細胞内および細胞間分子情報伝達機構を検討する。
共役ポリマー超階層ナノ構造の単一光子発生源としての特性解明

共役ポリマー超階層構造をナノサイズ化することにより高効率単一光子発生源を創製することが本研究の目的である。ある種のπ共役ポリマーは、結晶状態において構成する分子の遷移双極子が協同的に振る舞うことで、巨大遷移双極子モーメントを形成することが知られている。そのため、ナノサイズの結晶を作製すれば、ただ1つまたは極めて少数の巨大遷移双極子モーメントを有する超階層構造となり、単一光子発生源として振る舞うことが期待される。ナノ結晶1粒からの発光を検出し、単一光子発生源としての特性を追求することが本研究の目的である。これを達成するため、以下の研究項目を重点的に行った。1、(チオフェン/フェニレン)コオリゴマーのナノ結晶作製数種類の(チオフェン/フェニレン)コオリゴマーを対象とし、再沈法によりナノ結晶作製を試みた。これらの物質は溶媒への溶解性が極めて悪いことからナノ結晶作製は困難であるが、様々な作製条件を試み、50nm程度のナノ結晶が作製できる条件を見出した。しかしながら、作製したナノ結晶の分散安定性が悪いため、さらなる探索が必要であると考える。代表的な共役ポリマーであるpoly[2-methoxy-5-(2'-ethylhexyloxy)-p-phenylenevinylene](MEH-PPV)をホストポリマー薄膜中に分散させ、単一分子鎖の単一光子発生特性を詳細に測定した。ホストポリマーの種類に依存し、単一光子発生特性が大きく異なることを見出した。この挙動はホストポリマーに依存しMEH-PPVのコンフォメーションが変化しているためであると考えた。また、用いるMEH-PPVの分子量にも依存し、単一光子発生特性が異なることを見出した。
高度モバイルマルチメディアアプリケーション実現のためのシステム構築に関する研究

モバイルIPv6における主要な問題点の一つに,サービス中断時間を生じるハンドオーバ遅延が存在する.これまで様々な方式が提案され,その遅延時間は削減されるようになったが,それらの方式は,対価として冗長経路問題を生じ,結果としてパケット到着順序逆転,ネットワーク帯域過剰消費などの問題を抱える.我々は,本問題に対処するため,逆転ルータを用いたプロアクティブハンドオーバ手法を提案している.昨年度からこの方式をR-MIPとして纏め上げ,評価を行った.さらに,今年度は,モバイル環境におけるマルチキャスト通信に着目し,リアルタイム通信を享受するユーザがハンドオーバする際に,ネットワーク帯域消費,遅延,マルチキャストツリー再構築負荷の観点から,有効なハンドオーバ方式を検討・提案した.本方式は,これまで研究してきたR-MIPを原点とし,それをモバイルマルチキャスト環境に適用させたものとなる.すなわち,将来のインターネットがよりインテリジェントになることを想定し,ネットワークのインテリジェンスにより,効率的なハンドオーバを実現する.上記の研究のほか,複数の無線端末を包含するモバイルルータのモビリティ,携帯電話ネットワークとインターネット系プロトコルMobileIPの融合,そして,車車間通信の信頼性向上についても検討し,これらについては,所属研究室の学生のテーマとして,発展させることに寄与してきた.今後も,将来のモバイルネットワークを想定し,その上で効率的なコンテンツ配信サービスを実現可能とするネットワークプロトコルを検討していきたい.また,R-MIPについては,現在はネットワークのインテリジェンスにより実現されているが,これを,端末側の機能として実現する方式も引き続き検討していきたい.モバイルIPv6における主要な問題点の一つに,サービス中断時間を生じるハンドオーバ遅延が存在する.これまで様々な方式が提案され,その遅延時間は削減されるようになったが,それらの方式は,代価として冗長経路問題を生じ,結果としてパケット到着順序逆転,ネットワーク帯域過剰消費などの問題を抱える.我々は,本問題へ対処するため,転送ルータを用いたプロアクティブハンドオーバ手法を提案している.提案方式は転送ルータ発見手法とプロアクティブハンドオーバ手法から構成され,ハンドオーバの際に転送ルータを検出・利用することにより,冗長経路を回避する.シミュレーション実験より,提案方式は冗長経路を削減可能であり,結果として,パケット到着順序逆転,ネットワーク帯域過剰消費問題を回避可能なことが示された.提案方式は従来ネットワークと協調動作可能であるため,段階的な展開が可能であり,ネットワークの境界付近に設置することにより,多数のモバイル端末のQoS向上が可能である.また,ネットワークのインテリジェンスのみによって実現されるため,モバイル端末に特別な機能を要求しない.尚,本研究実績は,昨年度までのTampere University of Technologyにおける研究成果を発展させ,R-MIP(Routing-Aware Handover Scheme for Mobile IP)として,纏め上げられたものである.今後は,ネットワークインテリジェンスではなく,モバイル端末自身に機能を持たせることにより実現されるR-MIPを検討する必要がある.モバイルIPv6における主要な問題点の一つに,サービス中断時間を生じるハンドオーバ遅延が存在する.これまで様々な方式が提案され,その遅延時間は削減されるようになったが,それらの方式は,対価として冗長経路問題を生じ,結果としてパケット到着順序逆転,ネットワーク帯域過剰消費などの問題を抱える.我々は,本問題に対処するため,逆転ルータを用いたプロアクティブハンドオーバ手法を提案している.昨年度からこの方式をR-MIPとして纏め上げ,評価を行った.さらに,今年度は,モバイル環境におけるマルチキャスト通信に着目し,リアルタイム通信を享受するユーザがハンドオーバする際に,ネットワーク帯域消費,遅延,マルチキャストツリー再構築負荷の観点から,有効なハンドオーバ方式を検討・提案した.本方式は,これまで研究してきたR-MIPを原点とし,それをモバイルマルチキャスト環境に適用させたものとなる.すなわち,将来のインターネットがよりインテリジェントになることを想定し,ネットワークのインテリジェンスにより,効率的なハンドオーバを実現する.上記の研究のほか,複数の無線端末を包含するモバイルルータのモビリティ,携帯電話ネットワークとインターネット系プロトコルMobileIPの融合,そして,車車間通信の信頼性向上についても検討し,これらについては,所属研究室の学生のテーマとして,発展させることに寄与してきた.今後も,将来のモバイルネットワークを想定し,その上で効率的なコンテンツ配信サービスを実現可能とするネットワークプロトコルを検討していきたい.また,R-MIPについては,現在はネットワークのインテリジェンスにより実現されているが,これを,端末側の機能として実現する方式も引き続き検討していきたい.
複言語環境下の包括的言語教育：日本人学校における日本語・外国語・現地語教育

本研究は複言語環境で成長する学生の言語能力の向上に役立てるため、複言語環境下の生徒の言語実態を把握することで日本語教育、外国語教育、現地語教育の包括的言語教育の構想を検討することを目的とした。ブリュッセル日本人学校における調査からは,外国語としての英語と現地語としてのフランス語については,複言語環境に身を置いた期間や外国語学習の好き嫌いではなく,生徒の年齢が言語能力と最も相関関係を示したことが確認された。また調査から、三言語以上の教育環境では現地語教育と外国語としての英語教育に着目すると、日本の中等教育レベルにおける英語以外の言語を対象とする具体的教育内容の不明示性が課題として導かれた。本年度は本研究の目的を達成するために以下の研究活動を行った。(1)「帰国子女の三言語能力の測定」の準備作業の一環として、日本語(母語)、英語(外国語)、フランス語(現地語)の三言語能力習得状況および三言語能力の測定方法を探るため、所属学会の関係者、並びに国内の中等・高等教育機関における帰国子女の言語教育従事者へのインタビューを実施し,情報収集に努めた。(2)言語能力測定方法、言語能力評価方法,複言語教育政策を主とした関連書籍を購入し、「帰国子女の三言語能力の測定」の準備作業を進めるための積極的な情報の収集に努めた。(1)前年度までの準備作業を受けて、「帰国子女の三言語能力の測定」としての「帰国子女の三言語能力の測定準備」のための具体的な測定項目を選定し、母語としての日本語、外国語としての英語、現地語としてのフランス語、以上三言語テストを作成した。また、全体の言語適性を調査するための言語適性テストも作成した。(2)「日本人学校の実態調査」の準備作業の一環として、インフォーマントの言語生活状況把握のための調査協力者アンケートと、「三言語教育の調査準備」調査シートとして、日本人学校の語学教育担当者に対して行う調査票の作成も行った。(3))「日本人学校の実態調査」としての「日本人学校への調査協力依頼」を行い、計画していたパリ日本人学校での実施が諸事情により困難であったため、結果としてブリュッセル日本人学校において平成27年2月に「三言語教育の実態調査」を行った。(1)前年度、ブリュッセル日本人学校において実施された「三言語教育の実態調査」の結果分析。(2)三言語教育測定項目にかかわる検討課題の一つであった語彙にまつわる学術誌上での論文発表と、前年度にブリュッセル日本人学校において実施された「三言語教育の実態調査」の結果分析に基づく一成果としての国際学会における口頭発表。昨年度の研究実績として実施したブリュッセル日本人学校での「三言語教育の実態調査」について、結果分析を行うことができ、またその結果を公表することができた。本研究は複言語環境で成長する学生の言語能力の向上に役立てるため,日本語教育と外国語教育の包括的言語教育の構想を検討することを目的として,以下の研究活動を行った。(1)帰国子女の三言語能力習得状況および三言語能力の測定方法を探るための,国内の中等・高等教育機関における言語教育従事者へのヒアリング調査の実施。(2)日本人学校の実態調査として,ブリュッセル日本人学校における三言語教育にかかる実態調査の実施とその結果分析,ならびに結果公表。(3)複言語環境下における言語教育の実状調査の一環として,Ecole internationale PACA(調査済みの教育機関と対象が同じ三言語教育を実施している機関)における三言語教育の調査の実施。(4)言語教育調査結果を分析する中で明らかになった課題(日本の中等教育レベルにおける英語以外の言語に向けた具体的な教育指針が示されていないこと)に取り組むための,「フランス語の学習指針」策定研究会の実施(6回),ならびに策定研究会の研究活動成果として研究発表の実施(3回)。昨年度取得していた産前産後の休暇および育児休業の取得に対して、補助事業期間の延長申請が本年度に認められたことを受け、実質的には研究計画の初年度および次年度の一部で予定していた準備作業と研究活動を本年度に実施することができたため、昨年度の遅れを取り戻すことができた。昨年度までに調整を加えた研究計画の中でまだ実施されていない「帰国子女の三言語能力の測定」を進め、昨年度実績で得た分析結果との横断的分析を行う。その過程で、日本人学校や帰国子女の言語能力が測定可能な教育機関に限らず、他の教育機関での調査の可能性や有用性も検討するべきだと考えている。また、日本人学校での言語教育調査結果を分析する中で、日本の中等教育レベルにおける英語以外の言語(本研究ではフランス語が該当)について、具体的な教育指針が示されていないことが課題の一つとして浮き上がった。従ってその課題に取り組むための研究活動も並行して実行していく。

言語教育、言語学昨年度の研究進捗状況から、当初計画していた「帰国子女の三言語能力の測定」と日本人学校における「三言語教育の実態調査」の実施時期を前後させ、先に日本人学校での調査が一段落したが、他の教育機関での調査の可能性、有用性も検討するべきだと考えている。今後はまず調査結果の集計と分析を進めること、並びに帰国子女の三言語能力の測定が実施できるよう、準備作業と研究活動を継続する。本年度、合計八ヶ月間の産前産後休業および育児休業を取得していたため、当初予定していた(1)「帰国子女の三言語能力の測定」に必要な具体的な測定方法の設定、並びに(2)「日本人学校の実態調査」についての準備作業が進められなかった。昨年度までの調整を加えた研究計画の内、「帰国子女の三言語能力の測定」がまだ行われていないため、当該測定にかかる一連の経費ならびに測定結果の分析にかかる経費が発生しておらず、当初予定との差額が生じている。昨年度の研究進捗状況から、当初計画していた「帰国子女の三言語能力の測定」と日本人学校における「三言語教育の実態調査」の実施時期を前後させ、先に日本人学校での調査を行ったことで当初予定との差額が生じている。またそのため次年度に「帰国子女の三言語能力の測定」を実施予定であることから、次年度も引き続き助成金が生じる。「帰国子女の三言語能力の測定」にかかわる一連の経費ならびに測定結果の分析にかかるものが主な使用計画であるが、日本人学校での言語教育調査結果を分析する中で浮き上がった一つの課題(日本の中等教育レベルにおける英語以外の言語について具体的な教育指針が示されていないこと)に取り組むための研究活動にも使用予定である。なお、本研究目的を達成するために、日本人学校や帰国子女の言語能力が測定可能な教育機関に限らず、他の教育機関での調査の可能性や有用性も検討するべきだと考えていることから、状況に応じて複言語環境である他機関における調査等実施の可能性も否定できない。産前産後休業および育児休業の取得により、当初の研究計画に比べて遅れが生じているが研究目的並びに研究方法に変更はない。しかしながら本研究の目標達成のためには、(1)「帰国子女の三言語能力の測定」と(2)「日本人学校の実態調査」の実施時期を向こう二年間に変更せざるを得ないため、補助事業期間の延長申請を行い、承認を受けた上で研究再開予定である来年度から順次研究活動と準備作業を進めることで対応する予定である。日本人学校における三言語教育実態調査の分析、帰国子女の三言語能力の測定、及び三言語間の能力分析にかかるものが主な使用計画であるが、他の教育機関における調査の可能性、有用性も検討するべきだと考えていることから、状況および分析結果等に応じて複言語環境である他機関における更なる言語調査実施の可能性も否定できない。本年度,合計八ヶ月間の産前産後休業および育児休業を取得していたため、当初予定していた準備作業が進められず、本年度の研究費に未使用額が生じ、次年度の使用額にも変更が生じた。次年度以降、補助事業期間延長申請の承認を受けた上で、(1)「帰国子女の三言語能力の測定」と(2)「日本人学校の実態調査」を適切な時期に順次実施する予定であり、それに応じた研究費の執行を行う予定である。
下肢閉塞性動脈硬化症における血流予備能の研究

閉塞性動脈硬化症の症例において、心電同期を併用した撮像から血流解析を行い両側大腿動脈の最大流速、平均流速、平均血流量を算出し、これらの値を健常ボランティア群で得られた値と比較し、健常ボランティアと閉塞性動脈硬化症の症例でのこれらの値に統計学上有意な差が認められるかどうか検討した。また、運動負荷後にも同様の測定を行い運動負荷による最大流速、平均流速、平均血流量が有意に増加するかどうか、また、ボランティアと症例群とでこれらの上昇程度に有意な差が認められるかどうか検討した。健常ボランティア、閉塞性動脈硬化症症例共に、運動負荷により最大流速、平均血流量共に有意に増加したが閉塞性動脈硬化症では最大流速、平均流速、平均血流共に健常者に比べ運動負荷による増加率が低い傾向があり、症例によってはむしろ運動負荷後で値が低下した例もあった。しかしながら、健常ボランティアとの比較では増加率に統計学的有意差は認めなかった。波形の解析においては、閉塞性動脈硬化症では逆行性血流の低下が見られ、順行性血流のみの場合もあり、健常者のパターンとは異なることが明らかになった。また、造影剤を急速注入して下肢骨格筋の造影効果の検討も行い、造影剤の到達時間や造影効果の程度について検討を行った。健常ボランティアでは造影剤投与後動脈に遅れて骨格筋の造影効果が見られ4060秒後にプラトーとなったが、閉塞性動脈硬化症症例では暫増するパターンを呈しプラトーに達しない例がほとんどであった。1例で、筋肉によって急峻な立ち上がりを示した例があったが、その筋肉の疼痛などは見られず、その要因については特定困難であった。動脈の造影から骨格筋の造影までの時間は閉塞性動脈硬化症で遅延する傾向があった。ボランティア、閉塞性動脈硬化症症例共に骨格筋の造影効果に左右差は認められなかった。本年度は主に血管ファントムを用いた実験を施行した。まず、ガラス管で作成した種々の狭窄をもつ血管ファントムを作成し、そのファントムに造影剤の希釈液をポンプで流し、MRAの撮像並びにPhase contrast法によるcine MRIで流速測定を行った。希釈濃度は溶液のT1値が血液とほぼ同等となる2000倍とし、速度を変化させて流速測定の精度を検討した。ガラス管ファントムは、内径10mmで、狭窄率50%,75%としそれぞれ狭窄長が短・長の2種類、計5つのタイプのファントムを用いた。流速は510cm/sec.と変化させ、Phase contrast法での流速測定の精度を検討した。撮像方法の検討では、Phase contrast法においては信号が最大となる流速(Vmax)を設定する必要があるが、Vmax=5,10,40cm/sec.と変化させたところ,Vmax=5,10cm/sec.では、測定値に大きなばらつきがあり、不適切であることが分かった。Vmax=40cm/sec.では、実測値と良い相関を示し、測定方法として適していることがわかった。狭窄部では、狭窄率約50%の狭窄モデルでは狭窄部はMRAでも良好に描出され、流速測定も可能であったが、狭窄率75%以上では狭窄部の乱流が強く信号低下が著しく、流速測定も困難であった。以上より、臨床例での流速測定は、血管径5mm以上の血管で行うのが望ましいと考えられた。腸骨動脈狭窄の5例で大腿動脈の流速測定を行ったが、今回の症例では特に左右差は認められなかった。

来年度新たなMRI装置が導入されることになり、時間分解能・コントラスト分解能が向上した最新の撮像方法も使用できることになったので、新たな装置を用いて新年度からはボランティア並びに臨床例での研究を中心に行う予定である。本年度は、昨年4月に新たに設置された装置を用いて閉塞性動脈硬化症における血流量の測定と血流パターンの解析を行った。MRIのPhase contrast法で、下肢の血流に関し、心電同期を併用した撮像を行い検討を行った。大腿動脈および膝窩動脈は体軸に対しほぼ垂直に走行しているので、流速の計測や波形の解析に適していると考えられ、両側同時に撮像し、測定を行った。不整脈がある場合には撮像時間がやや延長するものの、ほぼ問題なく計測が可能であった。Fast Card法とシネPC法との比較検討も行ったが、シネPC法の方が流速・流量の値が低めにでる傾向が見られたが、波形は類似しており、ほぼ同様で、良好な相関が得られた。波形の解析では、計測部の中枢側に高度の狭窄や閉塞がある場合には波形が変化して、平坦化を示し、拍動の低下を現すものと考えられた。この波形に変化のパターンにより、血流障害の程度がある程度推測可能と考えられた。造影剤を用いた血流分布の検討では、血流の画像に及ぼす影響を完全に消失させることが困難で、特に動脈の造影効果の程度がinflowの影響により計測困難であった。静止組織ではflowの影響は特にないので、今後症例を重ね血流動態の解析を行う予定である。今回血流を増加させるために、加温を行ったが、明らかな血流量の増加は認められなかった、今後は加温時間を延長させ血流量が増加するかどうか検討するが、加温により十分な血流増加が得られない場合には血管拡張剤などの薬剤負荷による血流増加も試みる予定である。今年度は、主に運動負荷前後の下肢の血流量や最大流速の変化を研究した。運動負荷前後でのMRIによるデータ収集が連続して行なえるのが望ましいので検査台上で仰臥位で施行可能な足関節の底屈および背屈運動とした。これを十分力を入れて行い下腿のこわばり感や痛みを感じた時点で負荷を終了とし直ちにデータ収集を行なった。下肢の疼痛や間歇性跛行や疼痛のない健常ボランティアと閉塞性動脈硬化症症例とで、運動負荷後の最大流速や平均血流量の増加の程度を検討し、健常者と症例群とで増加の程度に有意差があるかどうか検討した。この検討は1.5T MRI装置を使用し、シネMRIの手法を用いて行なった。健常ボランティア、症例群共に運動負荷によって最大流速や平均血流量の負荷前の値に比べ有意な増加を示したが、増加の程度は両者間で有意差が認められなかった。また、造影剤投与による骨格筋の造影効果の検討では、連続的に撮像を行いROIを設定して時間信号強度曲線を算出して検討を行なった。骨格筋の造影効果はわずかであったが、脂肪織よりは明らかに高かった骨格筋は健常ボランティアでは動脈の造影に遅れて造影され、注入開始から4060秒後にプラトーとなったが、閉塞性動脈硬化症症例では暫増パターンを呈しプラトーに達しない場合が殆どであった。1例のみ早期に造影される筋肉が見られたが、特に同筋肉の痛みなどの症状がなく、閉塞性動脈硬化症の病態との関連は明らかにしえなかった。なお、健常ボランティアでも症例群でも筋肉の造影パターンにはいずれの筋肉をとっても特に左右差を認めなかった。
膀胱癌における予後規定因子の検討

膀胱癌におけるE-cadherin、cathepsin Dおよびnm23蛋白の臨床的意義を免疫組織化学とEG遺伝子mutationの有無により検討した。膀胱全摘除術を試行した94症例のパラフィン切片を用いてE-cadherin(done6F9)の免疫染色性、cathepsin Dの免疫染色性、nm23蛋白の免疫染色性、Ki67(doneMIB1)の免疫染色陽性率、TUNEL法によるアポトーシス指数(Al)、Feulgen染色による5cexoeedngrate(5cER)を評価した。E-cadherinは細胞膜染色性(EC-M)と細胞質染色性(EC-C)を別々に評価し、EC遺伝子のmutationの有無はexon6から14までの各exonを含む領域をPCR法で増幅しSSCP法にて解析した。94例中59例(62.3%)でEC-Mが減少し、19例(20.2%)がEC-C陽性であった。EC-Mの減少は組織学的深達度および異型度、Ki67陽性率、Alおよび5cERとの間に正の相関を認めた。EC-C陽性率は5cERとのみ正の相関を認めたが、EC-C陽性19例ではEC遺伝子のmutationは観察されなかった。CathepsinD陽性率は組織学的異型度、深達度および5cERに対して負の相関を示した。一方、nm23蛋白陽性率は組織学的異型度と正の相関を認めたが、深達度と5cERとの間には有意な関係を認めなかった。多変量解析では予後に関してEC-MとEC-Cはともに有意な規定因子ではなかったが、生存率では組織学的深達度とcathepsin D陽性率が、非再発率ではKi67陽性率が独立した規定因子であった。以上の結果から膀胱癌におけるE-cadherinの臨床的意義は組織学的所見、cathepsin D陽性率および増殖能に比較し乏しいと考えられた。また膀胱癌におけるE-cacherin遺伝子の異常の頻度は低いと考えられた。目的)膀胱癌組織におけるcathepsin D,E-cadherinおよびnm23蛋白の発現を免疫組織化学的に評価し、その予後に寄与する影響を検討した。(対象と方法)膀胱全摘除術を施行した87症例を対象とし、得られたパラフィン包埋切片を用いて、cathepsin Dと腫瘍の浸潤および転移に関連するE-cadherinおよびnm23蛋白の免疫染色を行った。核DNA量はFeulgen染色により5c exceeding rate(5cER)を求めた。一部の症例ではcathepsin DとPCNAの二重染色法による評価と、cathepsin DとFISH法による11番染色体数的異常との関連性も検討した。(結果)cathepsin D陰性腫瘍は55例(63.2%)にみられ、浸潤癌では約半数に認められた。E-cadherin染色性の低下およびnm23蛋白陽性例は各々53例(60.9%)および43例(49.4%)であった。た腫瘍先進部ではcathepsin D陽性細胞の減少に反しPCNA陽性細胞とnm23蛋白陽性細胞は増加していた。11番染色体のhyper diploid aberrationはcathepsin D陽性腫瘍に比較し陰性腫瘍で高頻度に認められた(P=0.03)。CathepsinD染色性の増加はpT分類と5cERに負の相関を示し(p=0.0032およびp=0.030)、E-cadherin染色性の低下は組織学的異型度、pT分類および5cERと相関を示した(各々p=0.002,p=0.031およびp<0.0001)。一方、nm23蛋白染色性の増加は組織学的異型度とのみ正の相関を示した(p=0.012)。単変量解析ではcathepsin D染色性の低下およびE-cadherin染色性の低下は非再発率の低下(p=0.0052およびp=0.0356)、cathepsin D染色性の低下は生存率の低下に関連した(p=0.0035)。多変量解析ではpT分類と5cERが非再発率(p<0.0001およびp=0.048)、またpT分類とcathepsin D染色性が生存率に関し独立した規定因子であった(p=0.0001およびp=0.0469)。(結論)CathepsinD染色性の低下は膀胱癌症例の補助的な予後規定因子になりうると考えられた。

94例中59例(62.3%)でEC-Mが減少し、19例(20.2%)がEC-C陽性であった。EC-Mの減少は組織学的深達度および異型度、Ki67陽性率、Alおよび5cERとの間に正の相関を認めた。EC-C陽性率は5cERとのみ正の相関を認めたが、EC-C陽性19例ではEC遺伝子のmutationは観察されなかった。CathepsinD陽性率は組織学的異型度、深達度および5cERに対して負の相関を示した。一方、nm23蛋白陽性率は組織学的異型度と正の相関を認めたが、深達度と5cERとの間には有意な関係を認めなかった。多変量解析では予後に関してEC-MとEC-Cはともに有意な規定因子ではなかったが、生存率では組織学的深達度とcathepsin D陽性率が、非再発率ではKi67陽性率が独立した規定因子であった。以上の結果から膀胱癌におけるE-cadherinの臨床的意義は組織学的所見、cathepsin D陽性率および増殖能に比較し乏しいと考えられた。また膀胱癌におけるE-cacherin遺伝子の異常の頻度は低いと考えられた。
難治性潰瘍に対する酸素環境設計と新しいバイオマテリアルによる血管新生療法の開発

創傷治療のポイントはいかに血管新生を促進して修復・再生を誘導するかである。本研究では最適酸素供給効率に基づく生体内環境設計の下新しいバイオマテリアルによる強力な血管新生療法を開発する。昨年度までにコラーゲンとポリグリコール酸の共重合によるナノファイバーを試作し、同バイオマテリアルが創傷治癒血管新生に及ぼす影響を微小循環可視化モデルで検証した本年度までに異なる酸素環境下における創傷治癒をin vivoで検証し局所酸素療法の臨床応用に着手した。高齢化や生活習慣病の蔓延によって褥瘡、糖尿病、血管病変などに起因する慢性創傷・難治性潰瘍が急増している。とくに足潰瘍難治化による下肢切断はQOLのみでなく生命予後・医療経済にも重大な影響を及ぼすためこれまでにない強力な創傷治癒促進療法が望まれている。創傷治癒過程では血管新生というプロセスが鍵を握っていることに異論の余地はなく、治療のポイントはいかに血管新生を促進して修復・再生を誘導するかである。開発技術の「実用化」の可能性を高めるために、可能なかぎり既に臨床場で用いられている実績のある材料・薬剤を組み合わせることにより開発を進める。本年度までにコラーゲンとポリグリコール酸の共重合によるナノファイバーを試作し、同バイオマテリアルが創傷治癒血管新生に及ぼす影響を微小循環可視化モデルで検証した。
MRIによる脳損傷部位と高次機能障害との対応に関する神経心理学的研究

最終年度は純粋失読(pure alexia)の検討を続け、非古典型を中心とするII例の神経症状と病巣部位から、純粋失読の発現機序を論ずることができた(研究成果報告書参照)。この成果は、従来の主張の確認の範囲内のものではあるが、これまでのような腫瘍例や動静脈奇形例における外科的手術と脳梗塞例におけるX線CTによる病巣局在ではなく、MRIによる精密病巣局在の結果明らかにされたものである点に意義がある。他にさまざまな病状を持つ多数の病例の検討が行われたが、その中から重要なものをあげれば以下の通りである。1.失行を伴わない左半側失書例(left nnilatelal agraphid without aprdxja):9年間の教育歴を持つ74才右利きの男性で、右手の書字には問題はなく、左手は、失行がなく仮名が書け、漢字の模写の可能なのに漢字が書けない。MRIの正中失状断像で、脳梁幹の後半分に低信号域が認められ、脳梁の部分的切断によって漢字の選択的な失書が起こることから明らかにされた。従来漢字と仮名の漢字システムは、左半球内で別個の局在を示すことが明らかにされているが、本症例は、半球間伝導路でも両者が互いに独立していることを示唆するものである。2.純粋語ろう例(pure word deafness):55才右利き男性で、失語がなく、環境音、音楽の認知はほぼ正常なのに、言語の聴覚的理解と復唱に著しい障害を示す。MRIにより、左側頭頂上葉皮質下に低信号域が認められ、Wernicke領野はほとんど正常であった。この病巣から、左聴放線と右聴覚野から脳梁を介する交連線維の双方が連合性に離断されたため、Wernicke領野が聴覚情報から孤立して純粋語ろうが生じたものと考えられた。本研究では、MRIが離断症候群の実証に有効なことを示している。現在神経心理学の分野で、病巣部位と臨床症状との関係が明確にとらえられ、発現機序がほぼ解明されている高次機能障害の一つに純粋失読があり、書字言語の中枢にあたる左半球頭頂葉後部皮質、角回に書字情報が到達しないためとして説明されている。この理論は既に前世紀の終りに、左半球後頭葉内側部の視覚投射野と能梁膨大部に病巣を持つ純粋失読例を報告したDejerineによって提唱されており、以降多数の症例によって確認されているが、最近では、Dejerineの示した古典的な病巣以外でも、書字情報が左半球角回に到達しないかたちの病巣であれば、純粋失読が生ずることが明らかにされ、非古典型純粋失読と呼ばれている。研究代表者は昭和63年度には、3例の純粋失読例と1例の失読失書例の病巣をCT、MRIによって確認し、従来の純粋失読に関する理論の妥当性を立証することができた。症例1はCT、MRIでは古典的純粋失読と診断され、剖検によって能梁膨大部の損傷が、近辺の皮質損傷による二次性のものであることが確認された。症例2は、CT、MRIにより、左半球後頭葉内側部深部白質の病巣が明らかにされ、視覚連合野から角回に出る線維の切断と判定された。

このタイプは、左側脳室後角の下外側に病巣があることから、後角下外側型非古典型純粋失読と名づけられた。第3例は左角回直下の深部白質に病巣が確認され、角回直下型非古典型純粋失読と名づけられた。第4例は失読失書例にあたるが、病巣が左後頭葉深部白質から外側面の皮質にまで及んでいる点が、失書を呈さなかった第2例と異っていた。この病巣から、後頭葉内側部から外側部にかけてのわずかな損傷により、失書の有無が決ってくることが明らかにされた。前年度に引き続いて純粋失読(pure alexia)の検討を続け,非古典型を中心とする11例の神経症状と病巣部位から、純粋失読の発現機序を論ずることができた(研究成果報告書参照)。この成果は、従来の主張の確認の範囲内のものではあるが、これまでのような腫瘍例や動静脈奇形例における外科的手術と脳硬塞例におけるX線CTによる病巣局在ではなく、MRIによる精密病巣局在の結果明らかにされたものである点に意義がある。他にさまざまな症状を持つ多数の症例の検討が行われたが、その中から重要なものをあげれば以下の通りである。1.先行を伴わない左半側失書例(left unilatolal agraphid withoutaprdxia):9年間の教育歴を持つ74才右利きの男性で、右手の書字には問題はなく、左手は、失行がなく仮名が書け、漢字の模写も可能なのに漢字が書けない。MRIの正中矢状断像で、脳梁幹の後半分に低信号域が認められ、脳梁の部分的切断によって漢字の選択的な失書が起こることが明らかにされた。従来漢字と仮名の書字システムは、左半球内で別個の局在を示すことが明らかにされているが、本症例は、半球間伝導路でも両者が互いに独立していることを示唆するものである。2.純粋語ろう例(pure word deafness):55才右利き男性で、失語がなく、環境音、音楽の認知はほぼ正常なのに、言語の聴覚的理解と復唱に著しい障害を示す。MRIにより、左側頭頭頂葉皮質下に低信号域が認められ、Wernicke領野はほとんど正常であった。この病巣から、左聴放線と右聴覚野から脳梁を介する交連線維の双方が連合性に離断されたため、Wernicke領野が聴覚情報から孤立して純粋語ろうが生じたものと考えられた。本研究は、MRIが離断症候群の実証に有効なことを示している。
造血幹細胞(CD34+細胞)からのNK細胞の分化・誘導

前年度までに我々は骨髄中に存在するCD34-CD33-CD25+Lin-(CD3、CD16、CD56陰性)の細胞分画にはIL-2に反応してNK細胞に分化できる前駆細胞が存在するが、純化したCD34+Lin-細胞分画からはIL-2だけではNK細胞は分化してこないことを報告した。ところがCD34+Lin-細胞をストローマ細胞と共培養するとIL-2の存在下でNK細胞が分化してきた。これは造血幹細胞からNK細胞が分化するにあたり、IL-2に加えてストローマ細胞が産生するなんらかの因子が必要であることを示唆している。そこで本年度はストローマ細胞の代わりに種々のサイトカインをIL-2と組み合わせてCD34+Lin-細胞分画からNK細胞を分化させることを試みた。FACSで正常人骨髄よりCD34+Lin-細胞を分離回収し、IL-2とGM-CSF、G-CSF、IL-1、IL-4等のサイトカインを組み合わせて培養したところ、IL-2とSCFがあればストローマ細胞なしでもNK細胞が分化してくることが明らかになった。これらのNK細胞は形態学的にも、またK562を標的としたキラー活性を持っているという点でも、CD56、CD16陽性という点でもNK細胞であることが確認された。さらにCD34陽性をCD33によってさらに陽性、陰性に分画した。興味深いことにIL-2とSCFの存在下でNK細胞はCD34+33+細胞分画からは分化してきたが、最も未分化なCD34+33-分画からは分化してこなかった。しかしCD34+CD33-分画の細胞をIL-3とSCFの存在下で一週間培養し、その後IL-2を加えることによりNK細胞を得ることができた。以上のように、本年度の研究を通じてNK細胞を骨髄造血幹細胞から分化させる系を確立し、NK細胞が造血幹細胞由来であることを直接的に証明すると同時に、その初期分化の段階で必要とされるサイトカインを同定することができた。我々は先にヒト骨髄細胞からNK細胞を生成する培養系を確立した。この培養系ではNK細胞は骨髄細胞からIL-2の存在のみで生成された。このことより骨髄細胞にはIL-2反応性NK前駆細胞が存在することが考えられた。NK細胞の骨髄幹細胞からの分化機構を明らかにする第1段階としてこのIL-2反応性NK前駆細胞を純化し、その性状を明らかにした(Blood,in press)。すなわち、IL-2反応性NK前駆細胞はIL-2受容体を有していることに着目し、IL-2受容体の発現を検索したところ、α鎖を有する細胞の中にNK前駆細胞が存在することが明らかになった。IL-2反応性NK前駆細胞はヒト骨髄細胞のおよそ3万個の中に1個存在し、表面形質ではCD33-,CD34-,CD25+,CD2-,CD5-,CD11b-,CD16-,CD56-であった。さらに、血球1元説によればNK細胞もまた骨髄幹細胞から由来することが考えられる。骨髄幹細胞はCD34抗原を有することを利用し、幹細胞からNK細胞を培養する系を確立した。すなわち、FACSにて純化したCD34+細胞を種々のcytokineを添加しNK細胞の生成の有無を検討した。その結果、NK細胞を誘導するためには骨髄間質細胞由来のSCFとIL-2が必要であった。NK細胞の生成はSCFの濃度依存性に増加した。

さらにCD34+細胞をCD33+,CD33-とに細分画するとNK細胞はCD33+,CD34+細胞から直接由来することが判明し、NK細胞の起源を考えるうえできわめて興味深いことと思われた(投稿中)。NK細胞の前駆細胞が骨髄に存在することは以前から知られていたが、その正確な起源と分化の過程ならびに他の血球細胞との関係については不明の点が多い。昨年度までにストローマ細胞とIL-2の存在下でCD34+Lin-細胞分画からNK細胞を分化誘導できることを示した。本年度は種々のサイトカインをIL-2と組み合せることによりストローマ細胞無しでCD34+Lin-細胞分画からNK細胞を分化させることを試みた。FACSで正常人骨髄よりCD34+Lin-細胞を分離回収し、IL-2とGM-CSF、G-CSF、IL-1、IL-4等のサイトカインを組み合せて培養したところ、IL-2とSCFがあればストローマ細胞なしでもNK細胞が分化してくることが明らかになった。このようにして得られた細胞は、形態学的にも、K562を標的としたキラー活性を持っているという点でも、CD56陽性、CD16陽性という点でもNK細胞であることが確認された。CD34陽性の造血幹細胞は均一な細胞集団ではなく、最も未分化なものからある程度分化した前駆細胞までいろいろな分化段階の細胞を含んでいる。我々は過去にCD34+CD33-細胞分画中に最も未分化な造血幹細胞が含まれていることを報告した。そこでCD34陽性をCD33によってさらに陽性、陰性に分画した。興味深いことにIL-2とSCFの存在下でNK細胞はCD34+33+細胞分画からは分化してきたが、最も未分化名CD34+33-分画からは分化してこなかった。しかしCD34+CD33-分画の細胞をIL-3とSCFの存在下で一週間培養し、その後IL-2を加えることによりNK細胞を得ることができた。以上のように、本研究を通じてNK細胞を骨髄造血幹細胞から分化させる系を確立し、NK細胞が造血幹細胞由来であることを直接的に証明すると同時に、その初期分化の段階で必要とされるサイトカインを同定することができた。
感性と状況認識の空間移動理解における役割の解明

人は街を景色や雰囲気でとらえ,自分の周囲の動的および静的な事物を直感的に認知しながら歩いている.つまりこれらの感性情報処理や状況認識により,人は環境の中の自分の移動を理解しているのである.本研究では,これらの無意識の認知や理解を客観な実験データにより記述し,両者の関係を定量的に解析した.そして,これらの感性情報処理や状況認識が空間移動理解に果たす役割を明らかにした.人は街を景色や雰囲気でとらえ,自分の周囲の動的および静的な事物を直感的に認知しながら歩いている.つまりこれらの感性情報処理や状況認識により,人は環境の中の自分の移動を理解しているのである.本研究では,これらの無意識の認知や理解を客観な実験データにより記述し,両者の関係を定量的に解析した.そして,これらの感性情報処理や状況認識が空間移動理解に果たす役割を明らかにした.人が空間を移動するとき,時々刻々変化する膨大な情報の中から何を選択的に取得しているか,またその時その人は空間移動をどのように理解しているか,そしてその取得情報と空間移動理解とはどのように関係しているか,ということを研究するための基礎的な方法論を確立し,基本的な関係を明らかにした.つまり,人が空間移動を行う実験の構成法と運用法,その実験から人が取得している外界情報のデータ化手法,およびその空間移動の理解のデータ化手法,そして両データの相関解析の方法をそれぞれ確立し,実際に全体を通して実施した.さらにこの一連の実験により,移動時における情報取得の違いが空間移動理解に与える影響について明らかにした.実験については,初年度は実験の安全性とデータの再現性を重視し,予め記録した移動のビデオ映像を用いた実験とした.そして取得情報のデータ化は,視覚情報の再認テストを中心に手法を確立した.また,空間移動理解のデータ化は,方向認識テストと地図再生テストを中心に確立した.従来の空間移動理解の研究が主観的で定性的なデータに基づくものが多かったのに対し,これらのデータは客観的で定量的なものである.このため,相関解析には多変量解析やその他の非線形な数値解析の手法を駆使することが可能となった.この解析の結果,空間移動理解能力の高い人は,ランドマークよりも交差点などの空間的特徴に注目していることや,移動時の取得情報が空間全体の中での位置と関係づけて認識されていることなどが分かった.これらの事実は,移動者本人も気づいていない無意識の能力,すなわち暗黙知の特性を表しており,上述の研究方法により明らかになったものである.人は歩いているとき,街や通りを景色や雰囲気でとらえ,直感的に自分の移動を理解している.この感性情報処理や状況認識と空間移動理解との関係を客観的かつ定量的に解明することが本研究の目的である.初年度である22年度は,ビデオにより撮影した動画を被験者に見せることによる実験を行った.当該年度は,被験者が実際にルートを歩行する実験を行った.そして,次の2つの課題についての研究を行った。【1】実験の習熟度とルートの環境が空間移動理解に及ぼす影響に関する研究実験ルートが初めての被験者とよく知っている被験者が,それぞれ昼と夜とに分かれてそのルートを歩行する実験を行った.そしてその後,被験者は道案内文と地図を作製した.この実験によるデータを解析した結果,習熟度は地図よりも案内文に大きな影響を与え,その表現を豊かにする事などが分かった.また,環境に関しては,夜の方が距離に関する表現が多くなることなどが分かった.【2】環境音が空間移動理解に及ぼす影響に関する研究被験者は初めての実験ルートを歩行した.このとき,被験者の半数は普通に環境音が聞ける状態で歩行し,残りの半数はノイズ音を発するヘッドホンを装着して環境音がやや聞きにくい状態で歩行した.この実験によるデータを解析した結果,環境音の中でも自然音が距離の把握を正確にしていること,環境音がある方が歩行距離を長めに見積もる傾向のあることなどが分かった.今年度の新たな研究は次の二つである.第一の研究は,3年間の最終段階として計画されていたもので,目的地が予め決められていない自由歩行おける空間移動理解を明らかにするものである.自由歩行において人は,移動により変化する環境空間から得られる感性情報を処理し,状況認識を行う.そしてその結果は,新たな感性情報への興味や状況認識の必要性を生み,新たな移動を誘発する.このインタラクションが,自由歩行の進行を促がし,次の経路を生成する.この仕組みを実験データから明らかにする.研究の結果,眼前に見える風景が大きく変化する地点で,川や公園などが印象を与えて進路をこれまでとは異なる性質の道へ誘導することなどが明らかになった.第二の研究は,これまでの2年間の研究から生じた新たな課題である.すなわち,移動対象空間の環境が変化したとき,空間認知のメカニズムはどのように変わるかという研究である.具体的には環境の変化として積雪に注目した.積雪はランドマークとなる多くのものを覆い隠すため,一般に積雪時には空間移動理解は困難となる.そのとき,つまり積雪に覆われたとき,積雪のないときに比較して,空間移動理解のメカニズムはどのように変化するか,また,その変化は空間移動理解がよくできている人とそうでない人とで差異があるのかという課題に取り組んだ.

研究の結果,積雪による空間情報の減少に対応するために2種類の戦略が存在することが明らかになった.一つ目の戦略は,より多くの努力を費やしてランドマークを探そうとするものであり,もう一つの戦略は,このような局所的情報収集を諦め,方向感覚を働かせて空間全体の理解に切り替えるものであった.両者のうちで空間移動理解能力が高かったのは,後者の戦略を取る人々であった.当初の計画通り,習熟の効果について研究の範囲を発展させた.また,実験法についても,初年度のビデオ観視実験に対し,実環境を歩行する実験を実施した.これらのことにより,本研究は順調に進展していると判断できる.24年度が最終年度であるため、記入しない。最終年度である3年目には計画通り,目的地のない自由歩行の問題を扱う.この場合は,これまでと異なり,被験者に所定のタスクを課すという実験法が取りにくく,行動観察の方法論を用いることとなる.このため,この場合も実験方法の検討も含め,新たな課題となる.24年度が最終年度であるため、記入しない。
ケミカルバイオロジーを利用したヒトヌクレオチド除去修復機構の解析

我々は、これまでにヒト細胞のヌクレオチド除去修復反応を阻害する低分子化合物を発見し、ERCC1-XPFのプロテアソーム依存的分解誘導が原因であることを明らかにしている。本研究では、この分解誘導の詳細なメカニズムを明らかにすべく、この反応に関わる因子の同定を試み、2種のポリユビキチン化関連因子を同定した。また、100種以上の構造類縁体を用いて活性を比較し、構造活性相関を明らかにした。一方、新たな化合物ライブラリーを用いたスクリーニングも実施したが、上記化合物と同レベルの高い阻害活性を示す化合物は得られなかった。A.新規NER阻害物質の探索と同定1)大規模ケミカルライブラリーを用いた新規NER阻害物質の探索:東大創薬オープンイノベーションセンターのコアライブラリー9,600化合物のうち半数以上のスクリーニングを完了し、5種類の陽性化合物を得た。活性の高いものについては類縁化合物を入手あるいは合成し、部分的な構造活性相関情報を得た。2)理研NPDepoライブラリースクリーニングから得た2種類の低活性化合物の解析:これまでに見つけた阻害活性の弱い2種類の化合物について、構造類縁体を入手して活性の高い化合物を探索したが、残念ながら期待するものは得られなかった。B. NER阻害物質NERiKU001の解析1)標的因子の同定とNER阻害機序の解析:標的因子の特定のために、化合物ビーズを利用した方法で結合タンパクをMS解析により同定し、候補因子を得た。現在、siRNAによるノックダウンによりERCC1-XPFの細胞内レベルが変動するか解析を行っている。一方、NERiKU001がERCC1のプロテアソーム依存的分解を誘導する際のE3リガーゼを特定するために、モニター細胞としてEGFP-ERCC1融合タンパクを安定発現する細胞株を樹立し、実際にNERiKU001処理で蛍光が減少することを確認した。また、ERCC1がユビキチン化されることを実証するためのユビキチン化タンパク検出系を導入し、検討を行っている。2)化合物の最適化:これまでに入手した約100種類の構造類縁体の修復阻害活性をもとに、そこから絞り込んだ化合物のERCC1-XPF減少活性と細胞毒性を測定し、各々についての構造活性相関を検討した。その結果、両者の活性は分離可能であることがわかり、各々の活性に重要な構造部分を同定し、より高活性・低毒性の化合物を得ることに成功した。A.新規NER阻害物質の探索と同定1)大規模ケミカルライブラリーを用いた新規NER阻害物質の探索:東大創薬オープンイノベーションセンターのコアライブラリー9,600化合物のスクリーニングをすべて完了し、前年度分も合わせて13種類のヒット化合物を得た。二次スクリーニングで12種に絞り込み、まとまった量をすぐに入手できるものは別のアッセイ系でも活性を評価した。また、一部の陽性化合物は類縁化合物を入手あるいは合成し、構造活性相関解析を開始した。B. NER阻害物質NERiKU001の解析1)標的因子の同定とNER阻害機序の解析:初年度に得た候補因子について、siRNAによるノックダウンを利用して解析を進めたが、真の標的因子であることを示すポジティブな結果が得られず、擬陽性と判断した。そこで、再度、複数の方法で化合物ビーズを作製し、結合タンパクのMS解析を行い、いくつかの候補因子を得た。現在、同様にsiRNAを用いて確認作業を行っている。一方、昨年度作製したERCC1-EGFP安定発現細胞株を用いて、NERiKU001処理後にERCC1がポリユビキチン化されることを検出し、E3リガーゼおよびユビキチン化部位の特定に利用できる直接的指標を得た。2)化合物の最適化:新たに4種類の類縁化合物を合成し、キーとなる部分の構造活性相関を明確にした。一方、NERiKU001の標的因子がまだ同定できなかったため、残念ながらインシリコのアプローチによる最適化には至っていない。A.新規NER阻害物質の探索と同定東大創薬オープンイノベーションセンターのコアライブラリー9,600化合物のスクリーニングより得たヒット化合物(12種)について、より信頼性の高いNER評価系であるELISAを用いてNER阻害活性の検証を行った。このアッセイでは、相当量の化合物が必要なため、商業ベースで手に入るものは購入し、入らないものは研究協力者の後藤氏に合成を依頼した。その結果、入手できた化合物の中で、新たに1種で弱いNER阻害活性を検出した。このNER阻害化合物は、6-4PPよりもCPDに対して修復阻害を示す可能性があり、詳細な解析を進めている。B. NER阻害物質NERiKU001の解析NERiKU001 (A6)によって誘導されるERCC1の分解誘導に関与するユビキチン・プロテアソーム系因子を同定する目的で、siRNAライブラリーを用いたスクリーニングを行ったところ、ノックダウンによりERCC1のA6誘導分解が抑制される2種の因子を見出した。これがNERiKU001 (A6)の直接的な標的である可能性について検討を行っている。一方、文献(Alekseev et al., 2014)で報告されたスピロノラクトンがXPBを分解誘導する反応系と、NERiKU001 (A6)によるERCC1分解誘導系を詳細に比較した結果、両化合物によるNER因子の分解誘導は各々XPBとERCC1に特異的であり、その動態はスピロノラクトンによるXPB分解誘導の方が速やかでより長く持続することがわかった。