hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
無酸素条件下における新規結晶化法の開発

これまでの実験から、無酸素条件下の結晶化では、サンプル状態の的確な把握が重要であることが明らかになった。特に酸化還元に関与するタンパク質の場合、酸化還元状態の違いが結晶化に大きな影響を与える。そこで無酸素チャンバー内で分光測定が簡便に行えるようなシズテムが必要なため、チャンバー内でのUV-vis吸収スペクトルの測定結果をチャンバー外のPCに転送可能なシステムを構築した。無酸素条件下で作成した結晶を外部に持ち出す際には、ガラス製のディプレッショングラスに真空グリース(Apiezon社製)を用いて封をすることで、長期間(1週間以上)安全に持ち出せることがわかった。この方式を用いればチャンバー外部の顕微鏡等で色、形状等の詳しい観察が容易になる。ガラスの材質を変更すれば、無酸素状態を保ったまま結晶の分光測定を可能にするセルを作成する事ができると考えられた。今年度はフェレドキシン-フェレドキシン還元酵素系以外への応用として、鉄硫黄クラスターを含むtRNA修飾酵素(SAM)を用いて、無酸素条件下で鉄硫黄クラズター再構成、結晶化を試み、これらを成功させた。これに加え、D-アスパラギン酸酸化酵素(DDO)の結晶化を嫌気条件下で行い、結晶を得る事に成功した。対照実験として行った酸素存在下での結晶化と比較したところ、嫌気条件下での結晶化のほうが再現性よく結晶が得られる事が判明した。これは、タンパク質に対する酸化ストレズの低下が主たる原因と考えられるが、詳しくは更に分析を進める必要がある。更に、無酸素条件下で得たDDOの結晶を用いて結晶構造決定に成功した。いくつかの反応中間体結晶も無酸素条件下で作成し構造決定した。平成18年度は、主に酸化還元に関与する蛋白質群の結晶化に力を入れ、以下の結果を得た。まず、微生物由来の電子伝達蛋白質であるフェレドキシン(BphA3)に関して、酸化型の結晶を得た。本蛋白質は、分子表面にCys残基を持つため、非常に結晶化が困難であったが、条件を検討することで結晶を得ることができた。次に、BphA3の還元型の結晶を得るために、申請者らが開発してきた無酸素条件下結晶化用の無酸素チャンバーを利用して、実験を行った。BphA3をチャンバー内でジチオナイトを用いることで還元し、これを無酸素条件下で結晶化することで、還元型の結晶を得ることができた。構造解析の結果、BphA3は、酸化型と還元型で構造が異なることを見出した。次に、BphA3と電子の授受をするフェレドキシン還元酵素であるBphA4とBphA3との複合体の結晶化を試みた。本複合体は、還元状態では安定な複合体を形成するが、酸化状態では複合体の形成が極めて弱いことが明らかになっている。このため、複合体の結晶化には無酸素条件の利用が不可欠である。無酸素チャンバー内でBphA4を還元し、酸化型のBphA3と混合して結晶化を行ったところ、複合体の結晶を得ることに成功した。さらにこの結晶をもとに結晶構造を決定することにも成功した。この結晶構造は、電子伝達の中間体複合体としては初めてのものである。これまでに、フェレドキシンとフェレドキシン還元酵素の複合体の結晶構造は3例ほど決定されているが、いずれも両者が酸化型の構造で、反応中間体と言えるものではなかった。また、上で述べたBphA3の酸化型、還元型の結晶構造とBphA3-BphA4複合体の結晶構造を比較することで、BphA3とBphA4の間の酸化還元依存的な相互作用調節機構に関して新しい知見を得ることができた(現在論文投稿中)。上記に加え、2原子酸素添加酵素BphC(JF8)の結晶化の検討も無酸素条件で行った。無酸素条件下での結晶化を行うことで、酵素-基質複合体の結晶構造の決定、さらには、活性中心のMnをFeに置換したFe置換BphC(JF8)の結晶化、および構造解析に成功した。特にFe置換体に関しては、超高分解能の回折データを収集することに成功しており、MnタイプのBphC(JF8)の結晶構造と比較することで、蛋白質のイオン選択性に関して新しい知見が得られるものと期待している。平成18年度は、以上の実験を通じて無酸素チャンバー内での結晶化に関して、標準となる手法を確立することができた。

今年度はフェレドキシン-フェレドキシン還元酵素系以外への応用として、鉄硫黄クラスターを含むtRNA修飾酵素(SAM)を用いて、無酸素条件下で鉄硫黄クラズター再構成、結晶化を試み、これらを成功させた。これに加え、D-アスパラギン酸酸化酵素(DDO)の結晶化を嫌気条件下で行い、結晶を得る事に成功した。対照実験として行った酸素存在下での結晶化と比較したところ、嫌気条件下での結晶化のほうが再現性よく結晶が得られる事が判明した。これは、タンパク質に対する酸化ストレズの低下が主たる原因と考えられるが、詳しくは更に分析を進める必要がある。更に、無酸素条件下で得たDDOの結晶を用いて結晶構造決定に成功した。いくつかの反応中間体結晶も無酸素条件下で作成し構造決定した。
スペックル干渉法による鼓膜振動挙動の可視化

診断の際、最も確信の持てるデータは、視覚に訴える画像情報である。しかし、現在病院で一般的に用いられている中耳病変の診断法は、鼓膜の振動の様子を直接計測しているわけではなく、診断の信頼性は十分とは言い難い。また、これまでにも鼓膜振動挙動を計測する試みは数多く行われていたが、いずれの方法も臨床応用には不向きであった。そこで本研究では、スペックル干渉法を応用した、微小振動挙動計測システムの開発を行った。そして、モルモット正常鼓膜の振動挙動計測、および中耳に操作を加える前後で振動挙動計測を行った結果、以下のことが明らかとなった。1.モルモット正常鼓膜は、入力音周波数1500Hz以下では一体となって振動し、3500Hz以上では分割振動を呈し、その間の周波数では移行型のモードとなることが明らかとなった。2.中耳骨包開放により、低周波数域で振動振幅が増加し、高周波数域で振動様式が変化した。これは、中耳骨包内の空気が鼓膜振動に対し、剛性成分として働くためと考えられる。3.本計測システムにより、会話領域の範囲内の入力音圧での鼓膜振動挙動計測が可能であった。また、中耳操作前後での振動挙動の違いを検出できた。よって、本計測システムの臨床応用への可能性が示唆された。しかし、これまで鼓膜の振動を直接計測できる装置は開発されていない。そこで本研究では、スペックル干渉法を用いた、鼓膜振動挙動計測システムを構築し、種々の病態の鼓膜振動挙動に及ぼす影響について明らかにする。本年度は、半導体レーザの発振波長と位相を変調することにより、測定感度を向上させる先端的手法を適用した鼓膜振動挙動計測システムを定盤上に構築した。そして、サンドペ-パ-にて表面を粗面に加工した厚さ0.3mm直径30mmのアルミ板、食品用ラップを用いて製作した人工中耳、および側頭骨標本の鼓膜の振動挙動の可視化を試みた。その結果、以下のことが明らかとなった。1.半導体レーザ波長を変調することにより、測定感度を向上することができた。2.本研究の鼓膜振動挙動計測システムで、10100nm程度の微小振動を有する鼓膜の振動モードを、十分に検出できることが分かった。今後の計画として、定盤上に構築したシステムを、光ファイバで結ぶことにより、コンパクト化し、また、取得したスペックル画像を、容易に解析するためのソフトプログラムの開発を行う予定を立てている。しかし、現在病院で一般的に用いられている中耳病変の診断法は、鼓膜の振動の様子を直接計測しているわけではないので、診断の信頼性は十分とは言い難い。また、これまでにも鼓膜振動挙動を計測する試みは数多く行われてきたが、いずれの方法も臨床応用には不向きであった。代って、本計測システムの臨床応用への可能性が示唆された。
Wntシグナル伝達制御因子APCによる細胞形態の調節機構の解明

癌抑制遺伝子APC(adenomatous polyposis coli)は、細胞骨格である微小管に結合するタンパク質であり、主に腸管上皮細胞及び神経細胞における細胞骨格形成に関与している。実際、APCは微小管を束化する活性をもつことが明らかになっており、APCはこの活性を利用して細胞骨格の形態変化を引き起こし細胞の形を変化させる。平成17年度に、APCの微小管束化活性がMAGUK(membrane-associated guanylate kinase)ファミリータンパク質であるPSD(post synaptic density)-95との結合により促進されることを明らかにした。さらに平成18年度には、マウス脳からAPCに結合する脳特異的な因子EBF3-Sを生化学的な手法を用いて同定した。本年度は、APCとEBF3-Sの結合様式をin vitroで調べた。その結果、EBF3-SはAPCのC末領域(アミノ酸:2772-2843)を介して、直接結合することが明らかとなった。この領域はAPCの微小管束化活性領域に含まれ、かつPSD-95との結合領域にも隣接する。また、EBF3-Sも微小管に結合するタンパク質であることから、EBF3-SはAPCによる微小管の束化活性の調節メカニズムに何らか関与しているかもしれない。現在、in vitro及びin vivoの実験系を用いて、この可能性を探っているところである。本年度は、研究計画に従い、APCによる微小管安定化の指標となる"微小管の束化"に注目し、この反応がMAGUKファミリーとの相互作用によって調節を受けるかどうかを調べた。培養繊維芽細胞COS-7細胞にAPCとPSD-95を導入し、微小管の構造変化を蛍光免疫染色法によって調べた。その結果、APCを単独で導入した細胞と比較して、APCとPSD-95を同時に導入した細胞のほうが、APCによる微小管の束化は促進された。さらにPSD-95と相互作用できない変異APC(APCΔC)とPSD-95を共に導入した細胞では、微小管の束化の促進は見られなかった。またPSD-95は、形成を促された微小管束の特性(微小管重合阻害剤への耐性及びアセチル化修飾)に対して、何ら影響しなかった。以上のことから、APCの有する微小管の束化活性は、PSD-95との相互作用を介して調節されており、このシステムによって細胞の形態は決定付けられている可能性が示唆された。以上の結果は、現在論文としてまとめ、国際雑誌に投稿・レビュー中である。癌抑制遺伝子APC (adenomatous polyposis coli)は、細胞骨格である微小管に結合するタンパク質であり、主に腸管上皮細胞及び神経細胞における細胞骨格形成に関与している。実際、APCは微小管を束化する活性を有していることが明らかになっており、APCはこの活性を利用して細胞骨格の形態変化を引き起こす。また、APCはMAGUK(membrane-associated guanylate kinase)ファミリータンパク質であるhDlg(humanDiscslarge)やPSD(post synaptic density)-95と、C末端を介して結合することが明らかになっている。平成17年度に、APCの有する微小管の束化活性が、PSD-95との結合により促進されることを明らかにし(この結果は、本年度国際雑誌Neuroscience Lettersに掲載された)、これは、実際生体内において、APCとPSD-95との相互作用が細胞の形態変化を引き起こすことを示唆する。本年度は研究計画に従い、PSD-95との結合によるAPCの微小管束化活性促進のメカニズムを明らかにする目的で、マウス脳においてAPCに結合する因子の同定を行った。方法としては、APCの各ドメインをbaitとして用い、pull down法さらに液体クロマトグラフィー/質量分析によってその結合因子の同定を行った。その結果、APCとPSD-95との結合領域が存在するC末領域に、EBF3-Sという因子が結合することが明らかとなった。EBF3-Sについては、脳特異的に発現しているタンパク質である。またEBF3-Sは微小管に結合するタンパク質であることから、APCとPSD-95による微小管の束化活性促進のメカニズムに何らか関与しているかもしれない。また現在、APCの他の部位に結合する因子の同定を順次行っている状況である。

この領域はAPCの微小管束化活性領域に含まれ、かつPSD-95との結合領域にも隣接する。また、EBF3-Sも微小管に結合するタンパク質であることから、EBF3-SはAPCによる微小管の束化活性の調節メカニズムに何らか関与しているかもしれない。現在、in vitro及びin vivoの実験系を用いて、この可能性を探っているところである。
ヒト抗体ファージ提示ライブラリの構築及びOS免疫測定原理に基づく診断用チップの開発

1)ファージライブラリからの甲状腺ホルモンの高感度検出系の構築血液中の甲状腺ホルモン(Thyroxine,T4)量は甲状腺疾患の診断マーカーとして重要であり、その簡便迅速な測定系の確立は最近の放射能不安解消の観点からも急務といえる。我々は最近,董研究員の開発したpDongシステムを用いて免疫マウスよりT4の高感度なOS-ELISAに適した抗体を選択することに成功した。これは,ハイブリドーマを介さずOS-IAに適した抗体を選択した初めての例である。さらに,ここで得られた抗体をマイクロ流路検出系に用いて,数マイクロリットルのサンプルより20分以内で血清中のT4濃度を測定することに成功した。2)高病原性トリインフルエンザウイルス抗体的開発高病原性(H5N1)トリインフルエンザウィルスは,特に迅速高感度な診断を要するターゲットである。そこで東京都臨床医学研究所の芝崎博士らと共同でOS-IAでこのウィルスを迅速高感度に検出するための抗体開発を行った。この際ウイルスの表面蛋白質ヘマグルチニン(H5-HA)ペプチドで免疫したマウス由来抗体ライブリを作製し,ここから,このペプチドに特異的に結合する抗体をパニングにより多数取得することができた。さらにこれらの抗体を用いて,HA蛋白質ペプチドの高感度なOS-ELISA実施にも成功した。さらに,GFP-HA融合蛋白質を発現するモデル感染細胞染色の実験で,これらの抗体が細胞内のHAとも結合することが確認された。現在実際の感染細胞でのウイルス粒子の検出をImmunoPCR法との組み合わせを含めて検討している。3)この他,抗原結合によりその酵素活性が促進される抗体酵素融合タンパク質の作製,多数の低分子認識抗体遺伝子のクローニングなど,多くの仕事に関わりそれぞれにつき成果をあげることができた。本年度は(1)ペプチド抗体のHTP取得とタンパク検出への応用と,(2)抗体産生ハイブリドーマを用いたOS-ELISA用融合タンパク発現系の最適化を目標に研究を行った。(1)では,L鎖をヒト由来抗体とするFab提示ファージライブラリを用いて,これまでOS-ELISAに成功しているBGPペプチドを含む各種低分子を抗原としたスクリーニングを行い,多数の特異的結合クローンを得た。しかし残念ながらOS-ELISAへの適性がやや悪くなる例が多く,現在癌患者由来を含む各種ヒト抗体ライブラリから新たな特異的抗体選択を試みている。一方,ランダム化したVHドメインを提示するファージを,固定化したVLドメインに対して微量の抗原ペプチド存在下で選択するオープンサンドイッチ選択法を試み,選択の結果,従来より数百倍高感度にBGPペプチドを検出できる抗体の取得に成功した(Iwai et al., in press)。これは抗原キャリア複合体を用いない新しい低分子認識抗体選択法であり,現在同様の方法を他の低分子認識抗体でも実施して良い結果を得つつある。(2)については,主に融合タンパク発現効率の向上をはかった。具体的には昨年度成功したトランススプライシング法(論文3)においてアンチセンス核酸の利用によるcisスプライシングの抑制を検討し,複数種類のアンテセンス核酸によりtransスプライシング効率向上の再現性を確認したが,更なる効率向上までには至らなかった。相同組換え法においてはターゲッティングベクター上にコードされる抗体酵素間リンカー配列を再検討し,従来より長いリンカー配列をもつベクターを用いた抗体産生細胞での相同組換えの結果,より高いS/N比で抗原検出ELISAを実施することに成功した。最後にL鎖融合蛋白質発現法により複数のIgM抗体産生細胞を用いて酵素抗体融合蛋白質の発現に成功した。具体的にはがん細胞認識IgM抗体にルシフェラーゼ融合L鎖を導入発現させ,細胞内でIgMを酵素標識し,がん細胞を特異的に発光検出することに成功した。
疾患患者由来ｉＰＳ細胞の神経系分化誘導による中枢神経発達障害の病態解析

小児の発達障害は、神経細胞が発生・発達・成熟していく過程の障害である。これまでに多くの発達障害患者において、その原因となるゲノム異常を明らかにしてきたが、これらのゲノム異常が真に中枢神経発達障害に関連していることを証明するには、実験動物において再現することが必要となるが、動物種の違いから、ヒトの中枢神経の高度な機能における病態を実験動物で証明するには限界があるという状況であった。そこで、当該疾患患者皮膚線維芽細胞の提供を受け、疾患iPS細胞を樹立し、神経系に分化させることで病態を解明することを着想するに至った。本研究においては、神経遊走異常のために発達障害を来した患者の皮膚線維芽細胞から疾患iPS細胞を樹立し、神経誘導因子を加えることにより神経系に分化させ、発達障害の原因となる遺伝子がニューロンにどのように機能不全を来たし、細胞のどのような形態異常やあるいはシナプス伝達異常などの生理学的な異常を示すのかを明らかにすることを目指した。神経遊走機能異常のために大脳皮質形成不全を来し、そのために発達障害を示した患者において、iPS細胞を樹立し、神経系細胞に分化誘導し、遺伝子発現解析を行ったところ、特定の遺伝子発現が低下していることが明らかとなった。別の大脳皮質形成不全患者において確認したところ同様の結果を示していた。このことから、この遺伝子は神経遊走に関連していることが明らかとなった。正常な病理組織で免疫組織染色したところ、この遺伝子は遊走段階の神経細胞で染まったため、この遺伝子が神経遊走に関連していることが確認できた。24年度が最終年度であるため、記入しない。申請者はこれまで、700人以上の小児神経疾患患者を対象にアレイCGH解析で網羅的に解析し、そのうち17%において何らかのゲノムコピー数の異常を見出し、中枢神経の発達障害におけるゲノムコピー数異常の意義を明らかにしてきた。これらの中には過去にまったく報告のない新規ゲノム変異も多く含まれ、新規の遺伝子機能を次々と明らかにしてきた。ゲノムコピー数異常が真に中枢神経発達障害に関連していることを証明するためには、ヒトの中枢神経の高度な機能における病態を解析する必要があり、実験動物で証明するには限界がある。そこで本研究では、異常なgenotypeが明らかである疾患患者から樹立したiPS細胞を神経系に分化誘導させ、ゲノム異常を示す遺伝子が細胞にどのように機能不全を起こし、細胞の形態異常やシナプス伝達異常を示すかを免疫染色法や遺伝子発現解析などを使って明らかにすることを目的としている。本年度においては、従来のレトロウイルスによる遺伝子導入による樹立方法以外に、エピソーマルベクターを用いた樹立方法を新たに導入して、いくつかの疾患iPS細胞を樹立した。樹立できたiPS細胞が真に多能性を持っているかどうかを確認し、integrationによるゲノム再構成が起こっていないかどうかを検証し、真に使用するに耐ええる細胞であることを確認した。得られたiPS細胞を浮遊培養後、接着培養させ、神経系に分化誘導し、この誘導過程における遺伝子発現の変化について遺伝子発現解析を行い、特定の疾患では特定の遺伝子群の発現が影響を受けていることを明らかにした。今後はさらにゲノム異常を示す遺伝子がニューロンにどのように機能不全を来たし、細胞のどのような形態異常やあるいはシナプス伝達異常などの生理学的な異常を示すのかを、免疫染色法やCaイメージング法などを使って明らかにする。目的の疾患iPS細胞を徐々に樹立している。今後は神経系に分化誘導させ、病態解析に供する。神経系細胞への分化誘導方法はまだ確立した方法がない。他の研究機関との共同研究により、情報交換を行いながら、研究を推進している。
近代エジプトにおける女性運動:1922年エジプト名目「独立」以降の展開を中心に

(1)学会発表第5回ジェンダー史学会(2008年11月30日開催)にて、エジプトの女性運動が近隣地域の女性たちと連帯・協力していく歴史的背景について、1938年にカイロで開催された「パレスチナ防衛のための東洋女性会議」を取り上げた。これは、「独立」を果たした1922年以降のエジプトの女性運動か展開していく背景・過程を明らかにしたものである。エジプトの女性運動が、国内のみならず地域や国際情勢とも密接に結びついていることを示した。(2)社会主義、共産主義、労働運動に参加した女性たちの思想・行動に関する資料収集・検証2007年2月から2009年3月にかけて、運動に参加した女性たちの回想録や伝記、当時の左翼系雑誌における女性による記事や、女性に関わる記事を収集した。現在、これらり資料を解読しながら、当時の社会的・歴史的状況への位置づけを試みている。また、2009年1月から3月にかけての現地調査においては、後の人々が当時の女性たちをどのように評価したかについて、194050年代に活躍した女性たちの次の世代による文献も収集し、またインタビューも行った。本年度は、研究目的である1922年以降のエジプトの女性運動に関する資料収集・解読を主に行った。具体的には以下の2つのテーマを中心に研究を進めている。(1)エジプトの共産主義運動と女性運動エジプトにおいて共産主義運動に参加、あるいはそれらの参加者たちと行動をともにした女性たちが存在したが、エジプトの共産主義運動研究においてそうした女性たちが取り上げられることはほとんどなかった。また、これまで20世紀初頭の女性運動を指導してきた女性たちと、こうした共産主義運動に参加、思想に共鳴した新しい世代の女性たちの違いを生み出した背景も注目されてはいない。名目上の独立を果たしたものの、国内の政治闘争、アラブ地域におけるパレスチナ問題、さらに国際的には第2次大戦に向けた列強の駆け引きなどにより、エジプト人女性の立場はより複雑となった。こうした複雑な立場を背景にした主張・行動を分析し、当時の歴史的・社会的状況に位置づけることは、歴史研究、地域研究、ジェンダー研究において非常に重要である。(2)1938年「パレスチナ防衛のための東洋女性会議」パレスチナ支援のためにエジプトのフダー・シャアラーウィーが開催を呼びかけたこの会議には、中東各国の女性たちが参加した。それぞれの国内・地域の事情から参加した女性たちの主張や会議に対する社会の反応について、会議録や当時の新聞・雑誌から検証を進めている。イギリスとの同盟が強化されていく時期のエジプトにおいてこの会議が開催された意味を分析することで、エジプト国内外の歴史的状況をより明らかにしていくことを目指している。
血栓形成関連因子の変動からみた運動強度閾値の季節・日内変動

スポーツ活動時にみられる「向」血栓性は血小板、VWF、ADAMTS13(血栓形成関連因子)の三者に生じるバランスの乱れに起因していることが推察される。血栓化傾向の著増する「運動強度閾値」の存在することが明らかにされ、スポーツ実施に際しては「運動強度」に十分注意する必要性が示唆されている。しかし、日本のように四季が認められる地域では、実際のスポーツ活動において、血栓化傾向は外気温等の環境の影響を受けることが予想され、「運動強度閾値」も季節や時間帯により変化することが考えられる。本研究は、スポーツ時にみられる「向」血栓性の日内・季節変動、およびその老化の影響について検討するものである。
顎顔面領域軟骨欠損部に対する新たな軟骨再生法の確立

1.同定した新規軟骨分化誘導剤、永久軟骨再生に必須の遺伝子群のIn vitro軟骨分化誘導能の評価と分化メカニズムの解明前年度にスクリーニングで同定した軟骨分化誘導剤をin vitroで特異的に肥大化を起さないで軟骨初期分化を誘導することを明らかにした。それらによって、活性化される転写因子(下流のシグナル)を同定するために、軟骨分化誘導剤投与群、コントロールとして非投与群のmRNAの比較をgene chip microarrayを用いて行った。15000遺伝子を搭載したgene chipを用い、2.5倍以上で発現増加、0.4倍以下で発現減少という基準でデータベースを用いた解析を行った。今後は内軟骨性骨化に重要な転写因子をメインに解析を進め、その相互作用を解析し、軟骨分化誘導シグナルの解明につなげる。2.iPS化したマウス皮膚線維芽細胞の軟骨分化誘導iPS化に必要な4遺伝子(Sox2,Oct4,c-Myc,Klf4)をレトロウイルスを用いて、マウス皮膚線維芽細胞に遺伝子導入し、多能性幹細胞であることを証明した後に、前年度に同定した軟骨分化誘導剤を添加し、iPS細胞の軟骨分化を検討した。今後は細胞シート工学を応用した温度感受性培養皿上で軟骨分化誘導剤による軟骨細胞シート作成し、動物モデルを用いて、解析する予定である。軟骨細胞特異的に発現する2型コラーゲンプロモーター断片(Co12)の下流にクラゲの発光蛋白(GFP)遺伝子を組み込んだ合成遺伝子を導入し、Co12GFP ATDC5細胞株を樹立した。軟骨細胞分化をGFP蛍光を指標にリアルタイムで簡便かつ非侵襲的にモニタリングすることができようになり、その細胞株に軟骨分化を誘導するインシュリンを投与し、GFP蛍光蛋白発現を蛍光顕微鏡下にて確認したところ、GFPの蛍光を発することが確認できた。さらに軟骨特異的遺伝子(2型コラーゲン、アグリカン、コンドロモジュリンー1など)の発現と軟骨基質の合成と蛍光との相関も確認できた。2.天然及び合成低分子化合の検索既存の天然及び合成低分子化合物ライブラリーの中からCo12GFPシステムを利用し軟骨分化誘導能を有するものを検索した。1.で樹立したCo12GFP ATDC5細胞株を96穴プレートに播種し、天然及び合成低分子化合物をそれぞれ添加し、スクリーニングを行った。ライブラリーの中で、特異的にGFPの蛍光を発するものがいくつか同定され、mRNAを回収し、リアルタイムPCR法で軟骨分化マーカーである2型コラーゲンやアグリカン、肥大分化マーカーである10型コラーゲンを解析し、基質合成能をトルイジンブルー・アルシアンブルー染色で評価した。今後は同定された低分子化合物の軟骨分化誘導のメカニズム、軟骨欠損マウスモデルでの検討を行う予定である。
超弦理論およびM理論の現象論的研究

超弦理論挿M理論の進展は、時空の構造の豊かな構造を明らかにしつつある。こうした発展に刺激され、本研究では素粒子の統一理論の様々な問題について新たなアプローチを試みた。特に、高次弦理論にもとづく研究として1。高次元理論においてソリトン的な背景場の近傍にカイラルフェルミオンが局在化できるという現象を用いた、大統一模型の諸問題への新たな機構の提案2。大きな余剰次元の模型や、ランドール・サンドラムの余剰次元の模型に関する研究3。TeVスケールの余剰次元に標準模型の粒子が住んでいる場合の現象論。特に、LHCなどのコライダー実験での信号についての新しい提案4。低いエネルギースケールに弦スケールがある場合の異常U(1)理論を用いた有効超対称理論の研究等を行った。また、この他にも超弦理論の低エネルギー有効理論として期待される超対称統一理論についての研究を行った。特に、Brookhaven研究所におけるミューオンの異常磁気能率の測定が、標準模型の予言との有為なずれを与える結果となったため、超対称標準理論の枠で、いかにこのずれを説明できるか、議論し、スレプトンの質量が軽い場合には、超対称理論からの寄与が大きくなり、実験を説明できることを示した。さらに、超大統一理論の古典的な予言の一つであるボトムクォークとタウレプトンの質量比に関して、現在の実験の制限を加味した詳細な研究を行い、大統一スケールで大きな補正効果がないとうまく行かないことを示した。この結果は、大統一理論における模型構築に対する強い制限になると期待される。これらの結果は、論文またはプレプリントとして公表されている。超弦理論の最近の進展は、弦理論の真空がブレイン的な配位等の豊かな構造をもっていることを明らかになった。そうした進展が一つの契機になって、現象論的な方面でもゲージヒエラルキーに対する新たなアプローチとして大きな余次元の理論が注目されるなど新しい展開が起こっている。今年度の本研究においては、この大きな余次元のアプローチの中で考えなければならない諸問題について考察を行なった。まず、標準模型のゲージ場がTeVスケールでコンパクト化が起こっている時にどのような現象論的な影響を及ぼすかを調べ、現在の電弱相互作用の精密測定がそのようなゲージ場のカルザクラインモードに厳しい制限を与えていることを示した。つづいて、このような制限のもとで、将来の加速器実験でどのように検出するかについて研究を行い、LHC実験において非常に特徴的な信号を与え得ることを示した。また、大きな余次元の理論において、プランクスケールと電弱スケール以外のエネルギースケールをどのようにして作り、またどのような現象論的、宇宙論的な特徴が現れるかを詳細に調べた。アクシオンの場合を例にして、とくに厳しい宇宙論的な制限があることを示した。また、これとは異なるアプローチとして超弦理論の低エネルギー有効理論として考えられる超対称理論についても研究を進めた。とくに、Rパリティが破れている時のニュートリノ質量の生成、および、加速器実験における特徴的な信号についての考察を行なった。超弦理論やM理論の低エネルギー極限では、超対称性標準模型が実現されていると期待される。この理論はもう一方で、標準模型におけるヒッグスセクターのいわゆる自然さの問題を解決し、この世界の粒子の質量の起源を説明できるものとして期待される。今年度は、主に、超対称標準模型における現象論的側面について研究を進め、より基礎的な理論である超弦理論からの現象論的示唆は何か、また将来超対称性が実験的に見つかった時に超弦理論にたいして何が言えるかについて、考察を進めた。

具体的には、1.弦理論の基本的なエネルギースケールが小さき時に実現可能な超対称粒子からのFCNC過程への寄与を押えるシナリオ(小嶺、山田、山口)、2.これとは別にある種の弦理論で実現されると考えられるno-scaleシナリオに対する現象論的考察(小嶺、山口)、3.Rパリティが破れた時でも最も軽い超対称粒子が宇宙の暗黒物質になり得るシナリオ(高山、山口)、4.ごく最近のミューオンの異常磁気双極子の測定値が標準模型の予言と食い違うことから超対称性の間接的な証拠ではないかと考えられるが、その点に関する一般的な考察(小嶺、諸井、山口)等を行った。超弦理論やM理論は、高次元の統一理論を記述するものの候補として期待されている。近年、超対称統一模型の諸問題をこうした高次元理論のアプローチから解決しようという試みがなされ、注目されている。山口は、柿崎と共に、高次元理論においてソリトン的な背景場の近傍にカイラルフェルミオンが局在化できるという現象を用いて、大統一模型の諸問題、即ちヒッグス3重項と2重項の分離を説明することや、正しいフェルミオン質量行列を出すと主に陽子崩壊の抑制等を説明する新しい機構を提唱した。後者の方では、大統一理論の破れを局在化にうまく取り入れることが現実的な模型を作る上で重要であることを見た。また、諸井、小嶺と共に、Brookhaven研究所におけるミューオンの異常磁気能率の測定が、標準模型の予言との有為なずれを与える結果となったため、超対称標準理論の枠で、いかにこのずれを説明できるか、議論し、スレプトンの質量が軽い場合には、超対象理論からの寄与が大きくなり、実験を説明できることを示した。さらに、小嶺と共に、超大統一理論の古典的な予言の一つであるボトムクオークとタウレプトンの質量比に関して、現在の実験の制限を加味した詳細な研究を行い、大統一スケールで大きな補正効果がないとうまく行かないことを示した。この結果は、大統一理論における模型構築に対する強い制限になると期待される。これらの結果は、論文またはプレプリントとして公表されている。
体心立方金属中での稀ガズ原子固体の形成

金属中に重い稀ガス原子(Ar、Kr、Xe)を多量にイオン注入すると、室温でも高圧状態の稀ガズ原子固体が形成される。これは、しばしば固体バブルとも呼ばれる。面心立方および六方晶金属中では母体と同じ結晶構造を持ち、結晶方位は母体結晶と揃っている。このバブルが形成されると、電子顕微鏡、電子線回折法等で観察可能となり、その成長、移動、構造等が調べられているが、形成の初期段階(核形成)は観察できないため調べられていなかった。そこで、我々は、これまで、イオンチャネリング法により、面心立方金属につき、イオン注入後のここの稀ガズ原子の結晶格子内位置、および、それらの注入量に対する変化を調べることにより、バブル形成の初期段階(核形成の過程)を調べてきた。本研究では、体心立方結晶を取り上げ、イオンチャネリング法により、バブル形成の核形成の過程を調べ、面心立方金属についての結果と比較する。試料はFe単結晶で、これに150keVのXe^+を1×10^<14>、4×10^<14>、1×10^<15>、1×10^<16>Xe/cm^2の種々の量、イオン注入し、Xe原子の格子内位置を決定するため、1.5MeV He^+ビームを用い、後方散乱チャネリング実験を行った。Xe原子の大部分は格子置換(S)位置およびランダム(R)位置を占める。注入量が少ない時には、その割合は少ないが、格子間四面体(T)位置、格子点から<111>方向に0.085nmずれた(D)位置にも存在する。TおよびD位置占有はXe原子と注入の際形成された原子空孔(V)との相互作用の結果で、それぞれ、XeV_4複合体、および最近接格子点に空孔が存在する結果Xe原子が<111>方向にずれているXeV複合体と考えられる。R位置はさらに多くの空孔と複合体を形成しているXe原子に対応している。これまでに、メスバウアー効果の実験でもXe原子が内部磁場の異なる4種の位置に分布していることが報告されていたが、本実験結果を考慮すると、それらは内部磁場の小さくなる順にS,D,T,R位置に対応付られる。注入量の増加と共にS,TおよびD位置を占める割合は減少し、R位置を占める割合ば増加する。この結果は、注入の初期段階でXeV、XeV_4のようなXe原子と空孔との複合体が形成され、これが核となってXeバブルへと成長することを示唆している。Xeバブル形成のためにXe原子の移動が必要とされるが、その機構としてXeV_3の形での移動を提案した。一方、面心立方金属A1中のKrの場合は、体心立方金属の場合とは異なりKrV_4、KrV_6型の複合体が核となる。面心立方結晶中では稀ガス原子が母相と方位を揃えて結晶化するが、その機構を考慮すべく、現在、A1中のKrにつき注入量をさらに細かく変化させKr原子の格子内位置を調べている。金属中に重い稀ガス原子(Ar、Kr、Xe)を多量にイオン注入すると、室温でも高圧状態の稀ガス原子固体が形成される。面心立方および六方晶金属中では母体と同じ結晶構造をもち、結晶方位は母体結晶と揃っている。このバブルが形成されると、電子顕微鏡、電子線回折法等で観察可能となり、その成長、移動、構造等が調べられているが、形成の初期段階(核形成)は観察出来ないため調べられていなかった。そこで、本研究では、体心立方結晶を取り上げ、イオンチャネリング法により、イオン注入後の個々の稀ガス原子の結晶格子内位置、および、それらの注入量に対する変化を調べることにより、バブル形成の初期段階(核形成の過程)を明らかにし、これまでに行った面心立方金属についての結果と比較する。料はFe単結晶で、これに150keVのXe^+を1x10^<14>,4x10^<14>,1x10^<15>,1x10^<16>Xe/cm^2の種々の量、イオン注入し、Xe原子の格子内位置を決定するため、1.5MeV He^+ビームを用い、後方散乱チャネリング実験を行っている。実験、解析は現在継続中である。これまでの結果では、Xe原子の大部分は格子置換(S)位置およびランダム(R)位置を占め、注入量が少ない時には、その割合は少ないが、格子間四面体(T)位置、格子点から僅かずれた(D)位置にも存在する。TおよびD位置占有はXe原子と原子空孔との相互作用の結果と考えられる。注入量の増加と共にS.TおよびD位置を占める割合は減少し、R位置を占める割合が増加する。この結果は、注入の初期段階でT、D位置を占めるようなXe原子と原子空孔との複合体が形成され、これが核となってXeバブルへと成長することを示唆している。

このバブルが形成されると、電子顕微鏡、電子線回折法等で観察可能となり、その成長、移動、構造等が調べられているが、形成の初期段階(核形成)は観察できないため調べられていなかった。そこで、我々は、これまで、イオンチャネリング法により、面心立方金属につき、イオン注入後のここの稀ガズ原子の結晶格子内位置、および、それらの注入量に対する変化を調べることにより、バブル形成の初期段階(核形成の過程)を調べてきた。本研究では、体心立方結晶を取り上げ、イオンチャネリング法により、バブル形成の核形成の過程を調べ、面心立方金属についての結果と比較する。試料はFe単結晶で、これに150keVのXe^+を1×10^<14>、4×10^<14>、1×10^<15>、1×10^<16>Xe/cm^2の種々の量、イオン注入し、Xe原子の格子内位置を決定するため、1.5MeV He^+ビームを用い、後方散乱チャネリング実験を行った。Xe原子の大部分は格子置換(S)位置およびランダム(R)位置を占める。注入量が少ない時には、その割合は少ないが、格子間四面体(T)位置、格子点から<111>方向に0.085nmずれた(D)位置にも存在する。TおよびD位置占有はXe原子と注入の際形成された原子空孔(V)との相互作用の結果で、それぞれ、XeV_4複合体、および最近接格子点に空孔が存在する結果Xe原子が<111>方向にずれているXeV複合体と考えられる。R位置はさらに多くの空孔と複合体を形成しているXe原子に対応している。これまでに、メスバウアー効果の実験でもXe原子が内部磁場の異なる4種の位置に分布していることが報告されていたが、本実験結果を考慮すると、それらは内部磁場の小さくなる順にS,D,T,R位置に対応付られる。注入量の増加と共にS,TおよびD位置を占める割合は減少し、R位置を占める割合ば増加する。この結果は、注入の初期段階でXeV、XeV_4のようなXe原子と空孔との複合体が形成され、これが核となってXeバブルへと成長することを示唆している。Xeバブル形成のためにXe原子の移動が必要とされるが、その機構としてXeV_3の形での移動を提案した。一方、面心立方金属A1中のKrの場合は、体心立方金属の場合とは異なりKrV_4、KrV_6型の複合体が核となる。面心立方結晶中では稀ガス原子が母相と方位を揃えて結晶化するが、その機構を考慮すべく、現在、A1中のKrにつき注入量をさらに細かく変化させKr原子の格子内位置を調べている。金属中に重い稀ガス原子(Ar、Kr、Xe)を多量にイオン注入すると、室温でも高圧状態の稀ガス原子固体が形成される。これは、しばしば固体バブルとも呼ばれる。面心立方および六方晶金属中では母体と同じ結晶構造をもち、結晶方位は母体結晶と揃っている。このバブルが形成されると、電子顕微鏡、電子線回折法等で観察可能となり、その成長、移動、構造等が調べられているが、形成の初期段階(核形成)は観察出来ないため調べられていなかった。そこで、我々は、これまで、イオンチャネリング法により、面心立方金属につき、イオン注入後の個々の稀ガス原子の結晶格子内位置、および、それらの注入量に対する変化を調べることにより、バブル形成の初期段階(核形成の過程)を調べてきた。試料はFe単結晶で、これに150keVのXe^+を1×10^<14>, 4×10^<14>, 1×10^<15>, 1×10^<16>Xe/cm^2の種々の量、イオン注入し、Xe原子の格子内位置を決定するため、1.5MeVHe^+ビームを用い、後方散乱チャネリング実験を行った。
コミュニケーションのための教育文法に基づく日本語教材作成のための基礎的研究

学習目的,および,日本語レベルを考慮した, 4技能別の日本語教材(試行版,紙版)を作成した。4技能あわせて1000弱のコンテンツが完成した。これは「学習者が行いたい/行わなければいけないコミュニケーション活動に必要な能力」という観点から,広く「文法」をとらえたものである。その教材を日本語教育機関の協力を得て実際に試用しフィードバックを受け,それに基づき改良を加えた。コンテンツの作成と同時に,ウェブでの公開のために仕様書を技能別に作成した。5月に,研究分担者が集まり,教材作成の基本的なコンセプトについて,以下のように確認した。(1)聞く,話す,読む,書くの4技能で,独立した教材にする。総合教材の形は取らず,聞く,話す,読む,書くの4技能で,それぞれが独立した教材にする。(2)文型から出発せず,実用的な揚面・機能から出発する。テ形とか受身文といった形から出発せず,あくまでも学習者が日本語を使う必要に迫られそうな場面や機能から出発した教材にする。実際の会話や文章をあらゆる手段を使って推測し,自分の能力の範囲でできる限りコミュニケーションを成立させる能力が身に付くようなものにする。社会言語能力の説明も重視する。(3)紙とCDだけでなく,パソコンを使ったマルチメディア教材にする。できるだけパソコンを使ったマルチメディア教材にする。学習者にも漢字の手書きは求めず,パソコンで漢字を選べればよいということにする。辞書も,ネット上の辞書や電子辞書を使うのを標準にする。(4)一斉授業で使うことを前提とせず,個別学習ができるものにする。教師の指導による一斉授業を前提としないで,どこにいてもパソコンで自習できるものにする。学習者の母語も最大限,活用し,母語で説明できるものは母語で説明するようにする。(5)最終的には,学習目的や母語などが違うさまざまな学習者に対応できるものにする。最終的には,学習目的や周りの言語(方言)環境,学習者の母語などによって,学習する内容が自由に選べるようなものにする。これを承けて,78月に,さまざまな日本語教育現場で教える執筆協力者(約70名)を募り,4技能に配属した。技能別のメーリングリストを立ちあげ,意見交換を行った。10月12月にかけて,技能ごとに打ち合わせの機会をもち,必要な基礎調査や具体的な作業手順などについて,意見交換を行った。現在は,メーリングリストを通じた意見交換,および,作成した試作教材の改編作業を行っている。本研究では,6名の代表者・分担者のほかに,国内外の現場で日本語教育に携わる約60名の協力者からなる研究組織をとっている。代表者・分担者は,四技能(「読む」「書く」「話す」「聞く」)の責任者あるいは副責任者をつとめている。次のような分担である。「話す」グループ責任者:小林ミナ(代表者),副責任者:名嶋義直(分担者)「書く」グループ責任者:小林ミナ(代表者),副責任者:堤良一(分担者)「読む」グループ責任者:野田尚史(分担者),副責任者:松岡洋子(分担者)「聞く」グループ責任者:松崎寛(分担者),副責任者:なし約60名の協力者は,このいずれかの技能グループに所属し,技能ごとに教材作成作業を行っている。平成18年度は,17年度の成果を受けて,とくに学習者ニーズの調査・分析,目標言語調査を行った。あわせて,既存教材の内容形式を調査し,その問題点を議論した。そして,その結果を踏まえて,教材のフォーマットについて試行版を作成した。試行版の作成は,平成19年度も継続的に行っている。試行版は,従来の冊子体の教科書だけでなく,カード型のモジュール教材,および,本プロジェクトの最終的な目標であるweb版教材の3種類を想定している。通常の議論,試作教材の回覧などは技能ごとにたちあげたメーリングリスト上で行っているが,8月11月にかけて,技能ごとに打ち合わせ会をもち,ニーズ・目標言語調査の分析結果や試行版教材について意見交換を行い,今後の作業方針を確認した。打ち合わせ会以降は,意見交換の内容を踏まえて,試作版を質,量の両面からさらに充実されることをめざして活動を行っている。平成19度中には,国内外の現場の協力を得て、実際に試作版を使ってもらい,フィードバックを得る予定である。平成19年度には、最終年度である平成20年度に「教材の試用・公開」および「ウェブ化」を実現するために、次のような活動を行った。「読む」教材平成19年10月に分担者・協力者が集まり,打ち合わせ会を行った。「初級」「中級」「上級」「漢字系」の4つのユニットごとに、各々が作成した教材について、意見交換,および、修正作業を行った。また、ウェブ化について具体的な方針を確認した。平成20年3月の時点で、約200課の教材試作版が完成している。「聞く」教材

平成19年12月に分担者・協力者が集まり打ち合わせ会を行い、教材ひな型について意見交換を行った。平成20年3月の時点で、「店で自分が買いたいものに必要な情報を得る」場面を中心に、ひな型が完成している。「話す」教材平成20年1月に分担者・協力者が集まり、各々が作成した教材について、意見交換,および、修正作業を行った。この生時点で、約150の「状況設定」を揃えることができた。この「状況設定」に「練習問題などを整備することにより、約150課の教材が完成する。「書く」教材平成20年1月に分担者・協力者が集まり、各々が作成した教材について、意見交換、および、修正作業を行った。持ち寄られた教材一つ一つについて、適否の判断を行い、本プロジェクトの方針についてより理解を深めることができた。4技能に共通して(1)打ち合わせ会後に、ウェブ教材の仕様などを検討する「ウェブ化班」をそれぞれ立ち上げた。技能ごとに、その特徴を生かしたウェブ教材にするには、どのような機能、デザインが必要かを検討し、年度末には業者暫定システムの作成を依頼するに至った。(2)最終年度である平成20年度に、どのように研究成果の発表を行うかについて、検討を行った。本研究は,次の3点を目的としている。目的(1)4技能(読む,書く,話す,聞く)ごとに独立した文法シラバスを作成する。(2)目的(1)の文法シラバスに基づき,学習目的,および,日本語レベルを考慮した4技能別の日本語教材(試行版)を作成する。(3)目的(2)で作成した教材を実際に試用し,フィードバックを得る。この目的を達成するために,最終年度である平成20年度は,次のような活動を行った。<四技能別の教材コンテンツ作成>昨年度までに引き続き,ウェブ教材のコンテンツを,技能ごとのグループで作成した。4カ年の活動の結果,4技能をあわせて1000弱の教材サンプルが完成した。作成過程においては,技能ごとに年に1回の打ち合わせ会を開催し意見交換を行った。今後は,関係する専門家の協力を得て,ウェブ教材として順次公開していく予定である。<研究成果の発表>次の2つの学会で研究成果を発表した。小林ミナ・名嶋義直・品田潤子・宮崎聡子(2008年7月11-13日).「コミュニケーションのための「話す」教材」(一般発表:口頭),日本語教育国際大会(釜山外国語大学,韓国).桑原陽子・中道一世・野田尚史(2008年10月12日)「「読む」コミュニケーションのための初級教材の作成と試用」(一般発表:ポスター),2008年度日本語教育学会秋季大会(山形大学).<研究成果報告書の作成>4カ年の活動を報告書(A4版396ページ,800部)にとりまとめ,関連機関,研究者に送付した。
Redox理論に基づく肝移植患者の管理-肝エネルギー代謝と肝移植後免疫細胞のRedox状態との関係

肝移植術後の拒絶反応に関しての研究はリンパ球反応を主とする組織学的研究から免疫応答としての伝達分子、接着分子の変化に関する研究に移行して来た。しかし、細胞そのものが維持される基本はそのエネルギー代謝にあるが、拒絶反応、免疫学的応答と細胞エネルギー代謝、特にリンパ球エネルギー代謝に関する研究は行われていなかった。本研究では、ヒト肝移植において免疫細胞、リンパ球、MTT-reducing activityの測定を行い、リンパ球energy chargeとの関係及びAKBRとの関係を明らかにしようとした。一方、京都大学においては、生体部分肝移植を世界で一番多くの症例に手掛けており、この点は、ハノ-ファー医科大学における脳死体からの肝移植の上記成績と比較する絶好の機会でもあった。まず、組織学的変化を病理学的に同一基準で観察する必要があり、本学病理部の山辺博彦博士をハノ-ファー医科大学に派遣、同博士が既にUCSFで修得して来た基準と大きくかわることがないことを確認したうえ、京都大学での生体部分肝移植に併発する拒絶反応の程度は脳死体からの肝移植にみられるそれよりも頻度が極めて少ないうえ程度が軽いことも確認された。移植後、患者のリンパ球MTT活性の変化は、AKBRの変化と共に測定したが、拒絶時のみならず、術後の感染症発生時にも亢進することが判明した。しかし、AKBR低下時、すなわち生命にかかわる問題時には明らかに反応することは明確でこの点を中心に論文として発表した。本国際学術の発展として、移植肝グラフトを評価する方法の一つとして遠赤外線分光々度計を利用したヘモグロビンの酸化還元を測定するMCPD法を導入し、移植後、再灌流一定時間での還元ヘモグロビンの程度が後の拒絶反応またはPrimary nonfunctioingにつながるものか否かについて検討している。この研究は平成6年度にまで継続して研究を行っていく。更に、平成元年度より継続測定してきた脳死ドナーのAKBRによるドナー肝グラフトのviabilityの評価法に関しても平成4年度科学研究費試験研究B(代表山岡義生)で作成したポ-タブルAKBR測定器をハノ-ファー医科大学に貸出しドナーチームが持参、現地で測定している。従来より、共同研究として継続しているヒト肝移植においてドナー肝のViabilityの評価を血中ケトン体比(AKBR)の測定により判定する方法をさらに発展させ、平成4年度試験研究(代表、山岡義生)によってポータブル型血中ケトン体比測定器を作成したものを直ちに、ハノーファー医科大学に持参し、ドナーチームがドナー病院で測定するため、現在測定法の教育を行なっている。移植後は従来の如くAKBRの値に応じた術後管理を行なっている。われわれが、生体部分肝移植で経験した如く緊急事態に陥る症例ではAKBR測定の意義は高く特に血管系(動脈、門脈、肝静脈)の事故では明らかな底下があり、直ちにドップラーエコーで確認し、対応が迅速になってきている。一方、免疫学的な変化をエネルギー代謝の面から検討した研究は行なわれていなかったため、新たにヒト肝移植において免疫細胞、リンパ球MTT-reducing activity測定を行ない、リンパ球energy cahrgeとの関係及び、AKBRとの関係を検討しているが肝移植後の炎症性変化でも変動がみられることからその特異性の点でさらに研究を重ねる必要がある。さらに、リンパ球の活性の評価をトリチウムサイミジンの取り込み(spontaneous proliferation)の測定なども同時に行なっているがこれも同様の難点があり、続行するか否か協議中である。

本年度は、計画をさらに病理部門にも拡大した。臨床病理の山邉博彦助教授がハノーファー医科大学に出張し、当地の病理部との検討の結果、現在本学で施行中の生体部分肝移植における拒絶反応の程度が、脳死からの肝移植に比較して極めて軽微であることも確認しえた。
新たな酸化ストレス依存性経路の同定

酸化ストレスにより誘導され、組織修復に関与する遺伝子を同定するために胎児線維芽細胞(MEFs)をin vitroでH_2O_2刺激し、ゲノムワイドなトランスクリプトーム解析を行い、組織修復に関与する候補遺伝子を同定し、Oxidative stress-inducible factor (OIF)と仮に命名した。Oif遺伝子はH_2O_2刺激によりmRNAレベルおよびタンパクレベルで誘導され、さらに劇症肝炎に伴い発現が誘導された。OIFは初代培養の肝細胞に添加することにより組織修復に関与する転写因子STAT3のリン酸化を誘導し、OIF自身もH2O2刺激依存性に肝細胞から主に分泌されることが明らかとなった。次にOif遺伝子の転写制御機構を解析した結果、MEK(ERKの活性化キナーゼ)のインヒビターや、Erk2 siRNA処理によりOifの発現が著明に抑制されたことからOif遺伝子の発現にはROS依存性のERK2の活性化が必要であることが示された。さらにOif promoterを用いたレポーターアッセイの結果、Oifの酸化ストレス依存性の発現誘導には上流に存在する二つのAP-1のエレメントが必須であり、この領域に変異を導入することにより、酸化ストレス依存性のプロモーターの活性化がほぼ完全に抑制されることが明らかとなった。そこでAP-1のエレメントに会合する転写因子をクロマチン免疫沈降法により検討したところFra1が恒常的にこのエレメントに結合しており、さらに酸化ストレスが加わることによりその結合が増強することが明らかとなった。さらにFra1 siRNAにより酸化ストレス依存性のOIF産生は著明に抑制されることが明らかとなった。以上のことよりROS-ERK2-Fra1という新たな酸化ストレス依存性のシグナル経路の存在が明らかとなり、さらにその経路を介してOIFの発現が誘導されることが初めて明らかとなった。酸化ストレスにより特異的に誘導される遺伝子群を同定するために胎児線維芽細胞(MEFs)をin vitroでH 2O 2刺激し、ゲノムワイドなトランスクリプトーム解析を行い、酸化ストレス依存性に誘導される遺伝子群700個を同定した。次にこれらの遺伝子群のなかから、in vivoにおいても酸化ストレス依存性に誘導されるかどうかを検討するために、マウスを用いて劇症肝炎のモデルである抗Fas抗体投与による劇症肝炎を誘導し、注射後に肝臓の還元型グルタチオン(GSH)が有意に減少することが明らかとなった。このことは劇症肝炎に伴い強い酸化ストレスが誘導されていることを示している。そこで、in vitroの解析で同定した遺伝子の中で、抗Fas抗体投与によるin vivoの酸化ストレスモデルで発現が上昇するかを検討した結果、OIF(oxidative stress-inducible factor)と命名した遺伝子を同定することに成功した。Oif遺伝子はH 2O 2刺激によりmRNAレベルおよびタンパクレベルでもin vitroおよびin vivoにおいて酸化ストレス依存性に誘導されることが明らかとなった。また劇症肝炎モデルにおいては、OIFは肝細胞が主に分泌しており、Kupffer細胞はほとんど産生していないことが明らかとなった。さらにOif遺伝子の発現をin vivoでモニタリングする(つまり酸化ストレスをモニタリングする)ために、Oif遺伝子を含むBACクローンを用いてOif遺伝子の第2エクソンに蛍光色素遺伝子であるEGFP(enhanced green fluorescence protein)を挿入したトランスジェニックマウス用のベクターを構築した。今後Oifの詳細な遺伝子制御のメカニズムの解析および作製したベクターを用いてトランスジェニックマウスを作製する予定である。