hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ヒートアイランド現象の抑制を目指した冷房排熱の帯水層処分システムの実用化

流動系モデリング観測井,民間の井戸,湧水および河川水を対象に,温度測定および水質分析のための採水を行った。温度測定はデジタルサーミスタ温度計(分解能0.01°C)を用いて,深度2m間隔で測定した。水質分析は現地にて水温,pH,電気伝導率を,産総研にて主要溶存成分濃度を測定した。次に地下水調査結果および既存の地質情報に基づき,地下水・熱輸送モデリングソフトFEFLOWを用いて弘前平野および周辺山地の地下水流動系を再現する広域モデルを構築し,観測井における地下水位・水温の測定値および地下水流向流速測定の結果を用いてモデルを検証した。弘前市におけるフィールド試験では,クロスフローの影響を受けた熱交換井の非常に高い熱交換応力が確認され,冷房排熱の地層処分の可能性について有用な知見を得ることができた。また,広域数値モデリングのための地下水フィールド調査は予定通り実施されている。25年度が最終年度であるため、記入しない。弘前平野における2地点でクロスフローの影響を受けた熱交換井のTRTを実施し,フロスフロー流速と冷房排熱の地層処分の可能性について有用な知見を得ることができた。また,地下水の広域流動系モデリングでは,フィールド調査と数値計算を80%程度終了し,良好な結果が得られている。1.複数の帯水層を有す地盤での長期排熱試験青森県黒石市に青森県産業技術センター内の複数の帯水層が存在する地盤において,深度80mの試験井を掘削し,ストレーナ仕上げとする。地下水の流向流速測定を外注により実施し,坑井内のクロスフローの状況を確認する。次に,同坑井において熱負荷およびU字管本数を変化させてTRTを実施し,熱媒体温度および坑井内温度データを収集する。2.弘前平野における地下水フィールド調査と広域地下水流動系モデリング平成24年度から継続して観測井,民間の井戸,湧水および河川水を対象に,温度測定および水質分析のための採水を実施する。温度測定はデジタルサーミスタ温度計を用いて,深度2m間隔で測定する。次に地下水調査結果および既存の地質情報に基づき,地下水・熱輸送モデリングソフトFEFLOWを用いて弘前平野および周辺山地の地下水流動系を再現する広域モデルを構築し,観測井における地下水位・水温の測定値および地下水流向流速測定の結果を用いてモデルを検証する予定である。山形市におけるクロスフローが存在する地盤においてTRTを実施し,冷房排熱の地層処分に関するデータをさらに蓄積する予定である。また,弘前平野において構築した数値モデルを用いて,同平野における排熱可能量を定量的に検討する予定である。
破壊のメゾスコピックダイナミックス

破壊は、ごく単純に考えれば原子結合の破綻を素過程とする材料の破断現象である。しかしながら現実には、複雑多様な材料内部の微細構造の影響を受けつつ、あるいは局所構造を作り出しながら破断が進行する動的過程として観察され、きわめて多彩な様態を呈する事象である。機械・構造要素の微細化を急速に進め、材料の高機能化の進展を支えている、今日の技術の要請に応えるためには、こうした複雑多様な破壊現象を、旧来のad hoc的視点を脱却して、物資基本構造とそのダイナミックスに根拠を置いて、統一・総合的にとらえる方法論の確立が必要である。本研究では、破壊現象をミクローマクロ間の力学的相互干渉の問題として、物理/数理理論的ならびに実験的に検討することにより得られる知見をベースに、メゾスコーピックスケールに見られる破壊過程の複雑多様性を、破断面の動的生成過程として力学的にとらえることができるような、普遍的のある方法論の創出を目指した調査活動を行った。具体的には、(1)破壊の数理力学(エネルギ論、連続体論)的取り扱い、および解析シミュレーションの方法論の追究、(2)き裂発生過程ならびに進展過程の複雑系ダイナミックスとしての数理的、物理的追究、(3)原子構造変化にかかわる電子相関、電子-イオン核の動的相互作用、そこから引き起こされる電子構造転移現象、(4)き裂進展に伴う(を促す)メゾスケール不均一構造とその形成といった課題について調査を進めると共に、3回の研究集会と1回のシンポジウムを開催し、今後推進すべき研究課題をまとめた。
金属・絶縁体単結晶極薄膜 超高速電子デバイスの基礎研究

本研究は、金属・絶縁体を用いた超高速電子素子を実現するための基礎研究として、原子層オーダーの金属・絶縁体超格子の物性に関する理論的・実験的な学問的基礎を確立するとともに、これを用いた超高速電子素子を形成し、その基礎特性を明らかにすることを目的とし、本年度は以下に述べる研究成果を得た。金属・絶縁体極薄層を用いた新しい量子効果超高速デバイスを提案し、その実現のため、コバルトシリサイドおよび弗化カルシウムからなる金属・絶縁体極薄ヘテロ多重層の結晶成長技術を確立し、提案したデバイスの要素となる金属・絶縁体共鳴トンネルダイオードおよびホットエレクトロントランジスタの基本的動作をはじめて達成した。さらに、提案したデバイスの実現に必要不可欠となる金属・絶縁体量子井戸構造における共鳴準位の構造依存性を明らかにするとともに、共鳴トンネルトランジスタを試作し、そのトランジスタ動作を達成した。金属・絶縁体量子井戸の共鳴準位の構造依存性は、3重障壁共鳴トンネルダイオードの微分負性抵抗特性の井戸幅依存性を、実験と理論で比較することにより明らかにした。井戸幅が数十数原子層厚における微分負性抵抗特性の実験結果は、共鳴点電圧の井戸幅による変化および観測される共鳴の個数に関して、自由電子質量を用いた共鳴準位の理論計算とほぼ一致し、これにより金属極薄膜中の共鳴準位の理論的予測と設計が可能になった。また、共鳴トンネルトランジスタでは、絶縁体中の金属極薄膜層からのベース電極取り出しを主とするデバイス形成技術の確立により、温度77Kにおいて、この材料系では初めての微分負性抵抗を伴うトランジスタ動作を達成した。以上の成果により、金属・絶縁体を用いた量子効果超高速三端子素子を実現するために必要な理論的・実験的基礎が得られた。本研究は、金属・絶縁体を用いた超高速素子を実現するための基礎研究として、金属・絶縁体単結晶極薄膜の形成技術を確立し、原子層オ-ダ-の金属単結晶極薄膜および金属・絶縁体超格子の物性に関する理論的・実験的な学問的基盤を確立するとともに、この極薄膜多重構造を用いた電子素子を形成し、その増幅特性や応答速度等の基礎特性を明らかにすることを目的として行っており、本年度は以下に述べる成果を得た。(111)Si基板上に、イオンビ-ムエピタキシ-法によるCaF_2極薄膜の低温成長と、Siのエピタキシャル成長とそれにつづくCoの室温固相成長によるCoSi2極薄膜形成により、CoSi2/CaF2極薄膜多重ヘテロ構造を実現することに成功した。この方法により得られた、CaF2で挟まれたCoSi2極薄膜の抵抗率を測定したところ、バルクの7倍程度(70μΩcm)と結晶性に改善の余地があることが示唆されたため、結晶成長後に860°Cの熱処理を行ったところ、抵抗率が30μΩcm程度まで低減し、熱処理が結晶性改善にきわめて有効であることが明らかになった。これらの方法を用いて、3種障壁と2重井戸構造からなるCoSi2/CaF2共鳴トンネルダイオ-ドを試作し、77Kの温度において金属・絶縁体では始めての電子共鳴による負性抵抗特性を実現した。さらに、ホットエレクトロントランジスタを試作し、77Kの温度において、やはり金属・絶縁体では始めての3端子増幅動作を実現した。共鳴トンネルによる電子放出部と電子波干渉の制御部からなる、金属・絶縁体量子干渉型3端子素子を提案し、この素子が超高速応答可能であることを理論的に示した。これらの成果により、金属・絶縁体極薄膜ヘテロ構造の物性に関する学問的基礎の確立と超高速素子の実現に必要な基礎的知見が得られた。

本研究は、金属・絶縁体を用いた超高速電子素子を実現するための基礎研究として、金属・絶縁体単結晶極薄膜の形成技術を確立し、原子層オーダーの金属単結晶薄膜および、金属・絶縁体超格子の物性に関する理論的・実験的な学問的基礎を確立するとともに、この積層構造を用いた電子素子を形成し、その増幅特性・応答速度等の基礎特性を明らかにすることを目的とし、本年度は以下に述べる研究成果を得た。昨年度までに得られた、コバルトシリサイドおよび弗化カルシウムからなる金属・絶縁体極薄へテロ多重層の結晶成長技術を用いて、超高速電子素子の基本となるホットエレクトロントランジスタを試作し、金層・絶縁体では初めてのトランジスタ動作を達成した。動作温度は77Kで、0.9以上の電子伝送効率およびエミッタ接地動作において150にもおよぶ徴小信号増幅率が得られた。得られたトランジスタ特性は、通常の半導体の場合と異なり、電流飽和特性ではなく、この理論的・実験的検討が今後の課題となったが、ここで得られた結果により、金属・絶縁体を用いた超高速三端子素子実現の可能性が開かれた。さらに、同じく金属・絶縁体極薄へテロ多重層の結晶成長技術を用いて、金属・絶縁体では初めての共鳴トンネルダイオードを試作し、徴分負性抵抗動作を達成した。素子は77Kおよび室温において動作し、電流電圧特性におけるピーク/バレー比は77Kで最大25、室温では2であった。この結果により、金層・絶縁体ヘテロ構造における電子波の共鳴が実証された。以上の成果により、金属・絶縁体を用いた量子効果超高速三端子素子を実現するために必要な電子伝導および電子波共鳴に関する理論的・実験的基礎が得られた。本研究は、金属・絶縁体を用いた超高速電子素子を実現するための基礎研究として、原子層オーダーの金属・絶縁体超格子の物性に関する理論的・実験的な学問的基礎を確立するとともに、これを用いた超高速電子素子を形成し、その基礎特性を明らかにすることを目的とし、本年度は以下に述べる研究成果を得た。昨年度までに、新しい金属・絶縁体量子効果超高速デバイスを提案し、その実現のため、コバルトシリサイドおよび弗化カルシウムからなる金属・絶縁体極薄ヘテロ多重層の結晶成長技術を確立し、これを用いた超高速デバイスの要素となる共鳴トンネルダイオードなどの基本的動作を達成しているが、本年度はこの成果をさらに拡張し、提案したデバイスの実現に必要不可欠となる金属・絶縁体量子井戸構造における共鳴準位の構造依存症を明らかにするとともに、共鳴トンネルトランジスタを試作し、そのトランジスタ動作を達成した。金属・絶縁体量子井戸の共鳴準位の構造依存症は、3重障壁共鳴トンネルダイオードの微分負性抵抗特性の井戸幅依存症を、実験と理論で比較することにより明らかにした。井戸幅が数十数原子層厚における微分負性抵抗特性の実験結果は、共鳴点電圧の井戸幅による変化および観測される共鳴の個数に関して、自由電子質量を用いた共鳴準位の理論計算とほぼ一致し、これにより金属極薄膜中の共鳴準位の理論的予測と設計が可能になった。また、共鳴トンネルトランジスタでは、絶縁体中の金属極薄膜層からのベース電極取り出しを主とするデバイス形成技術の確立により、温度77Kにおいて、この材料系では初めての微分負性抵抗を伴うトランジスタ動作を達成した。以上の成果により、金属・絶縁体を用いた量子効果超高速三端子素子を実現するために必要な理論的・実験的基礎が得られた。
癌分子標的治療にむけたホスホプロテオミクス技術に基づくシグナル伝達システムの同定

本年度は、質量分析計によって計測した野生型EGFR発現細胞および変異型EGFR(Y992F)発現細胞シグナル伝達の時系列情報を再現する数理モデルの構築、及び数理モデル予測の実験による検証を行った。EGFRシグナル伝達計算機モデルのパラメーター(生化学反応の係数,及びタンパク質の発現量)の推定はサブペタスケールコンピュータを用いてモンテカルロ粒子フィルタ法を繰り返し適用することにより達成した。次に構築した数理モデルを用いてシグナル伝達動態の差異の原因となるパラメーター変化を探索した。その結果、細胞間のタンパク質発現量の違いおよびいくつかの生化学反応速度の違いが大きな寄与をしていると予測された。予測されたタンパク質発現量の差異、および生化学反応速度の変化を実細胞を用いて検証したところ、計算機モデルの予測を支持する結果が得ることができた。さらに、野生型EGFR発現細胞には影響を与えず、変異型EGFR発現細胞のシグナル伝達を正常化する薬剤標的分子を数値実験により探索した。その結果、特定の脱リン酸化酵素を候補分子として得ることができた。今後、ノックダウンおよび阻害剤を用いた実験によって候補分子の薬剤標的としての有用性を検証して行く予定である。加えて、計算機実験と並行し各種EGFR変異体を安定発現した細胞株をFlp-in Systemを用いて樹立した。ホスト細胞としてNIH3T3細胞を用いた。自己リン酸化部位の変異及び、がん細胞で顕著に観察される変異を野生型EGFRプラスミドに導入した。EGFRプラスミドとFLP recombinaseプラスミドをNIH3T3細胞にトランスフェクションし、薬剤選択した後にクローニングを行った。EGFRの発現解析を行ったところほぼ全てのクローンで同程度のEGFRの発現があることが確認された。今後、本細胞株をリン酸化プロテオミス解析し、変異によるEGFRシグナル伝達異常の定量的解明を進める。
埋め込み型バイオ人工肝臓の開発を目指した肝組織再構築の試み

平成17年度は申請した計画に従い研究をおこなった。バイオ人工肝臓の開発では諸外国で体外循環式の開発が行われおり臨床実験も行われている。ラジアルフロー型バイオリアクターを用いることにより当研究所においても豚肝不全モデルにて動物実験が行われ成果を挙げている。今後は体内埋め込み型の人工肝臓が重要と考えその開発を行っている。その基礎実験を今年度は研究をすすめた。不死化類洞内皮細胞、不死化伊東細胞、肝癌細胞株をラジアルフロー型バイオリアクターにて共培養して肝組織を再構築した。その再構築した肝組織の形態と機能を検討した。形態的には肝細胞間に毛細胆管構造が認められ、類洞内皮細胞の表面には篩板状小孔が観察され生体に近い形態が得られた。機能面では培養上清中に尿素が認められ、オルニチン回路の酵素のmRNAの発現が上昇していた。3次元培養することによる機能、形態変化の要因として細胞間結合装置が重要と考えられそのひとつであるgap junctionについて検討をおこなった単独で培養するよりも共培養したほうがコネキシン32の発現は減少したが、26の発現が上昇した。Gap junctionを不可逆的に阻害するオレアミドを投与したところ再構築肝類洞内皮細胞には篩板状小孔は再出現しなかった。またswinholide Aを投与しても反応は認めなかった。本年度はGap junctionの機能を増強させるマレイン酸イルソグラジンを投与し肝細胞間のコミュニケーションを増強した結果、機能面にはあまり影響は与えなかったが、内皮細胞上の篩板状小孔は増加した。平成16年度は申請した計画に従い研究をおこなった。形態的には肝細胞間に毛細胆管構造が認められ、類洞内皮細胞の表面には筋板状小孔が観察され生体に近い形態が得られた。しかし肝臓特異的な機能のアルブミン産生に関してはmRNAのレベルで減少していた。これは今回使用した不死化肝細胞の特性によるものと考えられcell sourceの問題も今後の検討課題となった。筋板状小孔に関してはアクチンインヒビターであるSwinholide Aを投与したところ再構築肝類洞内皮細胞に出現した小孔は増加した。これはin vivoと同様の反応をしめした。3次元共培養することによる機能、形態変化の要因として細胞間結合装置が重要と考えられそのひとつであるgap junctionについて検討をおこなった単独で培養するよりも共培養したほうがコネキシン32の発現は減少したが、26の発現が上昇した。Gap junctionを不可逆的に阻害するオレアミドを投与したところ再構築肝類洞内皮細胞には筋板状小孔は再出現しなかった。
うつ病の予防的心理教育・治療的集団療法の開発

生涯発達におけるうつ病の予防的心理教育と治療的集団療法のプログラムを開発するために、第1に大学生を対象に自己チェック表を作成し、予防的心理教育を行った。その結果約3割の者が実際に相談や受診をする効果が認められた。第2に高校生に対してうつ病と密接な関連があるストレス反応とレジリエンスとの関連について調査・研究を行い、うつ病予防の知見を得た。第3に日本人に有効な治療法についての検討を行うために日・英の大学生を対象に「うつ病の疾病理解と治療に関する認識」について調査研究を行い、それらの研究の知見をもとに、新たな治療技法「課題達成法」を開発し、個別の事例に適用し成果を得ると共に集団に向けた知見を得た。本研究は、生涯発達におけるうつ病前、治療中、治療後のうつ病の患者に対する予防的介入および治療的・集団療法的介入をシステマティックにアプローチする方法についての調査研究である。今年度は、大学生におけるうつ病の気づきへ向けた効果的な予防教育の検討をおこなうため、以下のような調査および心理教育をおこなった。まず大学生に対してうつ病の理解に関する調査票を作成した。その調査票をもとに、大学生151名を対象に調査をおこなった。また心理教育については、予防のために大学生がより気づきやすいような心理教育の内容とした。調査前にはプレ調査を実施し、心理教育後にポスト調査をおこない、健康教育の前後での知識量の変化、相談・受診に対する抵抗感、抑うつ度への影響について検討した。本研究は、生涯発達におけるうつ病前、治療中、治療後のうつ病の患者に対する予防的介入および治療的・集団療法的介入にアプローチする方法についての調査研究である。今年度は、生涯発達という視点から、まず、高校生301名に対して質問紙調査を行った。今回はうつ病と密接な関連があるストレス反応について調査を行い、うつ病に陥らないようにどのようにして回復していくか、ということについて「レジリエンス(弾力性)、(回復力)」との関連を調べ高校生のうつ病予防について研究した。また、うつ病に対するアプローチの構築を目指すために、うつ病研究・実践が進んでいるイギリスの大学生59名と日本人大学生250名に対して、うつ病の認識に文化差が関係しているか、ということについて調査を行い、日本人に有効な治療法についての検討を行った。本研究は、生涯発達におけるうつ病前、治療中、治療後のうつ病患者に対する予防的介入および治療的・集団療法の開発についての研究である。生涯発達という視点から、今年度は成人うつ病者を対象として、病前性格、病気以前の生活の仕方などを聞き取り、予防的プログラム開発のためのデータ収集を行った。また、うつ病の治療的集団療法を行うに当たって、まず、個別のケースについて心理教育を行い、更に、課題達成法や動作法などを試みた。その結果、個々のケースのうつ状態はかなり改善し、うつ病治療についての有効な知見を得ることができた。しかし、今回は、症状などに差があり、集団での実施は困難であった。今回の研究から集団で実施する場合は症状の段階ごとのプログラム作成の必要性が示唆された。今後は、多くの被検者を集め、症状の段階ごとに行うことが望ましいと考える。高校生への調査において、ストレス反応の「抑うつ・不安感情」に対して、レジリエンスの「自己信頼」と「他者信頼」が関連していることが明らかとなり、特に「自己信頼」が高いと抑うつが増すという結果は、高校生独自の反応ではないかと考えられ、高校生のうつ病予防・治療において大きな示唆を得ることができた。臨床心理学平成27年度は、うつ病経験者の聞き取り調査を行い、予防的プログラムの開発を行う。心理教育をおこなった後の調査では、知識については身体症状に対する関心が高まった。抑うつ感は低下しなかったが、心理教育後に大学の相談室を利用したり、受診したものが数名みられた。このことから、本心理教育は、大学生のうつへの気づきを促したと言えるのではないかと考えられる。また、この調査により今後の研究を進める上でも多くの示唆を得ることができた。印刷を自分たちで行ったため、印刷費用がかからなかった為。平成26年度は、昨年度と同様にうつ病の理解に関する調査および心理教育を高校生におこなう。そのため、調査の質問項目等を吟味し高校生にわかりやすい調査票を作成する。また、心理教育においても高校生がより身近に感じられるように内容をより吟味する。そのようにして作成した調査票および心理教育を実施する。また生涯発達という視点から大人にうつ病患者の聞き取り調査をおこない、予防的プログラムの開発をおこなう。最終年度にあたり、プログラムの印刷を業者に依頼する予定である。印刷を自分たちでおこなったため、印刷に関わる人件費がかからなかったから。印刷のための人件費として使用。
イルカiPS細胞の樹立

イルカのリソースは限られるため、まずイルカ繊維芽細胞の不死化を行った。腹びれイルカ初代線維芽細胞にSV40T・hTERTを導入したところ不死化し、細胞株を樹立できた。それらを用いてヒトリプログラミング因子Oct3/4、Sox2、L-Myc、Klf4、Lin28遺伝子を導入したところ、コロニー状の細胞集団が観察された。AP染色により染色が確認できコロニーは脱分化状態であることが示唆された。次に正常イルカ線維芽細胞を用いてiPS化を試みた。しかし用いた線維芽細胞は増殖が悪くiPS化は成功しなかった。今後新たな線維芽細胞を得て再度試みる。また鯨類由来リプログラミング因子のクローニングも進めている。腹ビレイルカを含め、イルカ細胞のリソースは限られているので、まずiPS細胞の確立の前段階としてイルカの繊維芽細胞培養技術の確立と不死化を行った。腹びれイルカ初代線維芽細胞を6well dish上で培養し、Blasticidin S耐性遺伝子を有する組換えレンチウイルスを用いて不死化因子SV40TおよびhTERT遺伝子を導入した。感染実験では単独あるいは混合ウィルス液を、量を調節し計6通りの条件を試みた。導入2日後にBlasticidin Sを添加して感染細胞を選別した結果、SV40T発現レンチウイルス液1 mL、SV40TおよびhTERT 1 mL共感染条件下でBlasticidin S耐性細胞を得ることができた。これらの細胞は一般的なヒト線維芽細胞の分裂限界を超え、現在も分裂を行っている。さらなる性状解析のため、得られた細胞をシングルセルに単離し増殖曲線を作成したところ、これらの細胞は不死化因子導入前の線維芽細胞と比べて著しく増殖速度が上がっていることが分かった。さらに、これらの細胞からタンパク質を抽出しAnti-SV40Tantigen抗体を用いてWestern blottingを行い、SV40Tの発現を確認することができた。これらの結果から、得られたSV40T導入細胞およびSV40T・hTERT導入細胞は不死化されており、腹びれイルカの細胞株の樹立に成功したと結論づけた。次に、得られた細胞株を用いてエレクトロポレーション法によりヒト由来未分化誘導因子Oct3/4, Sox2, L-Myc, Klf4, Lin28遺伝子を共導入し、腹びれイルカiPS細胞の樹立を試みた。導入条件は1650 V, 10 msec, 3回および1300 V, 20 msec, 2回の2条件を試みた。導入1ヵ月後、これら2条件においてコロニー状の細胞集団が観察された。得られたコロニーに対して多能性マーカーであるアルカリフォスファターゼ染色を行ったところ染色を確認することができた。これにより、得られたコロニーは脱分化状態であるという可能性が示唆された。前述のように組み換えレンチウイルスを用いて腹びれイルカ初代線維芽細胞にSV40TおよびhTERT遺伝子を導入し、細胞株を樹立することができた。腹びれイルカの細胞資源は限りがあり大変貴重であるが、細胞株を樹立したことにより腹びれイルカの遺伝情報の保全および腹びれイルカ線維芽細胞を用いた実験を容易に行うことが可能になった。また、本研究の最終目標である腹びれイルカiPS細胞の樹立については試験段階として不死化した腹びれイルカ線維芽細胞を用いてヒト由来未分化誘導因子の導入を行い、iPS細胞様細胞集団を得ることができている。これらのiPS細胞様細胞集団は多能性マーカーアルカリフォスファターゼ染色により染色されたことからiPS細胞である可能性が高く、さらなる検証が必要ではあるが腹びれイルカ初代線維芽細胞を用いても同じ手法が使えると考えられる。これらの結果を踏まえ、本研究は現段階でおおむね順調に進んでいると考える。前年度に確立した手法に基づいて腹びれイルカiPS細胞樹立の試験段階として不死化した腹びれイルカ線維芽細胞を用いてヒト由来未分化誘導因子(OCT3/4, SOX2, KLF4, L-MYC, LIN28)の導入を行い、多能性マーカーであるアルカリフォスファターゼ染色で陽性反応を示すiPS細胞様細胞集団を得ることは再現できている。しかし、得られたiPS細胞様集団は継代および凍結保存・解凍後のフィーダー細胞への接着が著しく悪く、未だiPS細胞の樹立を確認できていない。このことに関しては、通常用いられる線維芽細胞ではなく不死化した線維芽細胞を用いているためコロニーの性質が異なっている可能性が考えられる。そこで、不死化した腹びれイルカ線維芽細胞に代わり腹びれを有さない通常のイルカの細胞を用いてヒト由来未分化誘導因子の導入を試みた。しかし、不死化した線維芽細胞から得られたようなiPS細胞様コロニーは観察できなかった。その理由として用いた線維芽細胞は細胞増殖率が悪くコロニーを形成する最適な細胞密度まで達しなかった可能性がある。今後はより細胞増殖効率の良い若いイルカの初代培養細胞を用い、未分化誘導因子導入時の細胞密度も考慮に入れたうえでイルカiPS細胞の樹立を試みる必要があると考えられる。同様に、ヒト由来未分化誘導因子がイルカiPS細胞樹立に適さない場合も考え、現在鯨類由来未分化誘導因子のクローニングを行っている。

これまで用いてきた未分化誘導因子(OCT3/4, SOX2, KLF4, L-MYC, LIN28)に加え、iPS細胞の作製効率を上げるため鯨類由来のHHEX/HLX遺伝子もクローニングを行い、クローニングが完了し次第イルカ線維芽細胞に導入し、最終目標であるイルカiPS細胞の樹立を目指し、引き続き研究を進める。イルカのリソースは限られるため、まずイルカ繊維芽細胞の不死化を行った。腹びれイルカ初代線維芽細胞にSV40T・hTERTを導入したところ不死化し、細胞株を樹立できた。それらを用いてヒトリプログラミング因子Oct3/4、Sox2、L-Myc、Klf4、Lin28遺伝子を導入したところ、コロニー状の細胞集団が観察された。AP染色により染色が確認できコロニーは脱分化状態であることが示唆された。次に正常イルカ線維芽細胞を用いてiPS化を試みた。しかし用いた線維芽細胞は増殖が悪くiPS化は成功しなかった。今後新たな線維芽細胞を得て再度試みる。また鯨類由来リプログラミング因子のクローニングも進めている。不死化した腹びれイルカ線維芽細胞を用いてヒト由来未分化誘導因子を導入することによりiPS細胞様細胞集団を得ることができたが、アルカリフォスファターゼ染色の他にSSEA-4染色など複数の多能性マーカーによるさらなる検証を行い、得られたiPS細胞様細胞集団がiPS細胞か判断する。それらの結果を踏まえ、得られた細胞がiPS細胞であれば、次に通常イルカ初代線維芽細胞を用いてヒト由来未分化誘導因子を導入し、最終的に不死化していない腹びれイルカ初代線維芽細胞に応用する予定である。一方得られた細胞がiPS細胞でないという結論に至った場合、イルカ由来未分化誘導因子をクローニングし、再び不死化した腹びれイルカ線維芽細胞を用いて導入・検証を行う予定である。水圏生物工学イルカ細胞取得に関して、共同研究者を訪問することを考えていたが、都合により延期した。29年度は、共同研究者施設を訪れ、新たに細胞を取得し、研究を進める。
DNAワクチンによるデンタルプラーク形成抑制とそれによる抗う蝕作用の検討

DNAワクチンとは,抗原遺伝子を組み込んだ発現ベクターにより生体内で直接抗原タンパクを発現させ,免疫応答を惹起するもので,我々はグルコシルトランスフェラーゼ(GTF)を標的とするDNAワクチンを構築する試みを行ってきたが,免疫反応を惹起する必要なタンパクレベルでの発現にいたらなかった.構造解析を行ってシグナル直下の約350AAの大きさの多型性領域に高い抗原性を決定し、そこを標的とする新たなDNAワクチン(pSecTag2-gtfB、pSecTag2-gtfC、pSecTag2-gtfD)を構築し,そこからさらにアデノウイスルのプロモーターをもつpAFC3をベースとしたDNAワクチンプラスミド(pAFC3-gtfB, pAFC3-gtfC, pAFC3-gtfD)を作成した.1.DNAワクチンの標的部位の抗原性の解析今回作成したpSecTag2-gtfB、pSecTag2-gtfC、pSecTag2-gtfDには大腸菌における発現プロモーターとしてLacプロモーターを持つので、大腸菌を用いてリコンビナントタンパクを発現させて、そのリコンビナントタンパクの抗原性を解析した.E.coli BL21-AI(Invitrogen)に形質転換し,0.2%のアラビノースを添加して発現を誘導した菌体を、抗GTF抗体をもちいてウエスタンブロットにて解析すると、すべてのDNAワクチンプラスミドで抗体との反応が認められたが、pSecTag2-gtfCが最も強く、pSecTag2-gtfBでは誘導されたタンパクの分解傾向が認められた.2.DNAワクチンプラスミドによる抗原タンパクの発現マウス由来293細胞に3種のDNAワクチンプラスミドを感染後、RNAを抽出し、それぞれのgtfに特異的なプライマーを用いてサザンプロットを行った.その結果、pSecTag2-gtfB、pSecTag2-gtfCに抗原タンパクの発現が認められたが、そのバンドはpSecTag2-gtfCが最も明確であった.これらの結果より、GTFに対するDNAワクチンプラスミドとしてGTFCを標的とすることが、最も効果が高い可能性が示唆された.今後は,pAFC3シリーズを用いて,in vitroおよびラット実験齲蝕系を用いたin vivoにおける抗う蝕作用を解析してゆく予定である.DNAワクチンとは,抗原遺伝子を組み込んだ発現ベクターにより生体内で直接抗原タンパクを発現させ,免疫応答を惹起するもので,我々はグルコシルトランスフェラーゼ(GTF)を標的とするDNAワクチンを構築する試みを行ってきたが,免疫反応を惹起する必要なタンパクレベルでの発現にいたらなかった.構造解析を行ってシグナル直下の約350AAの大きさの多型性領域に高い抗原性を決定し、そこを標的とする新たなDNAワクチン(pSecTag2-gtfB、pSecTag2-gtfC、pSecTag2-gtfD)を構築し,そこからさらにアデノウイスルのプロモーターをもつpAFC3をベースとしたDNAワクチンプラスミド(pAFC3-gtfB, pAFC3-gtfC, pAFC3-gtfD)を作成した.1.DNAワクチンの標的部位の抗原性の解析今回作成したpSecTag2-gtfB、pSecTag2-gtfC、pSecTag2-gtfDには大腸菌における発現プロモーターとしてLacプロモーターを持つので、大腸菌を用いてリコンビナントタンパクを発現させて、そのリコンビナントタンパクの抗原性を解析した.E.coli BL21-AI(Invitrogen)に形質転換し,0.2%のアラビノースを添加して発現を誘導した菌体を、抗GTF抗体をもちいてウエスタンブロットにて解析すると、すべてのDNAワクチンプラスミドで抗体との反応が認められたが、pSecTag2-gtfCが最も強く、pSecTag2-gtfBでは誘導されたタンパクの分解傾向が認められた.2.DNAワクチンプラスミドによる抗原タンパクの発現マウス由来293細胞に3種のDNAワクチンプラスミドを感染後、RNAを抽出し、それぞれのgtfに特異的なプライマーを用いてサザンプロットを行った.その結果、pSecTag2-gtfB、pSecTag2-gtfCに抗原タンパクの発現が認められたが、そのバンドはpSecTag2-gtfCが最も明確であった.これらの結果より、GTFに対するDNAワクチンプラスミドとしてGTFCを標的とすることが、最も効果が高い可能性が示唆された.今後は,pAFC3シリーズを用いて,in vitroおよびラット実験齲蝕系を用いたin vivoにおける抗う蝕作用を解析してゆく予定である.DNAワクチンとは,抗原遺伝子を組み込んだ発現ベクターにより生体内で直接抗原タンパクを発現させ,免疫応答を惹起するもので,我々はグルコシルトランスフェラーゼ(GTF)を標的とするDNAワクチンを構築する試みを行ってきたが,免疫反応を惹起する必要なタンパクレベルでの発現にいたらなかった.そこで今年度は,発現量の増加を図るために以下の点について検討を加えた.1.DNAワクチンの標的とするエピトープの再検討GTFのアミノ酸配列をもとに,ソフトウェアをもとに抗原性を解析したところ,シグナル直下の約350AAの大きさの多型性領域に高い抗原性が存在することが示唆された.そこで今回のワクチン実験はこの領域を標的とした.2.DNAワクチン発現システムの再検討今回はより強い発現が望めるアデノウィルスを用いることとし,ワクチンの構築を試みた.(1)標的抗原遺伝子を含むクローンの作成標的部位をコードする遺伝子領域をPCRにより増幅し、プラスミドベクターpSecTag2Bにそれぞれ連結し、標的抗原遺伝子を含むクローンを作成しpSecTag2-gtfB、pSecTag2-gtfC、pSecTag2-gtfDとした。

(2)標的抗原発現カセットを含む組換えコスミドの調製pSecTag2-gtfB、pSecTag2-gtfC、pSecTag2-gtfDから、「CMVプロモーター+目的遺伝子+BGH poly(A)site」を,それぞれ切り出し、これをコスミドベクターpAFC3にライゲーションし,ファージにパッケージングを行った。このサンプルをE.coli DH10Bに感染させて得られたコロニーからコスミドDNAを抽出し、アデノウイルスゲノムに対して発現カセットが順方向に1個挿入された組換えコスミドDNAを調製した。次年度にはこれらを用いて感染実験を行う予定であるDNAワクチンとは,抗原遺伝子を組み込んだ発現ベクターにより生体内で直接抗原タンパクを発現させ,免疫応答を惹起するもので,我々はグルコシルトランスフェラーゼ(GTF)を標的とするDNAワクチンを構築する試みを行ってきたが,免疫反応を惹起する必要なタンパクレベルでの発現にいたらなかった.そこで昨年度シグナル直下の約350AAの大きさの多型性領域に高い抗原性を決定し、そこを標的とする新たなDNAワクチン(pSecTag2-gtfB、pSecTag2-gtfC、pSecTag2-gtfD)を構築した.1.DNAワクチンの標的部位の抗原性の解析今回作成したpSecTag2-gtfB、pSecTag2-gtfC、pSecTag2-gtfDには大腸菌における発現プロモーターとしてLacプロモーターを持つので、大腸菌を用いてリコンビナントタンパクを発現させて、そのリコンビナントタンパクの抗原性を解析した.DNAワクチンプラスミドはE.coliBL21-AI(Invitrogen)に形質転換した.0.2%のアラビノースを添加して発現を誘導した菌体を、抗GTF抗体をもちいてウエスタンブロットにて解析すると、すべてのDNAワクチンプラスミドで抗体との反応が認められたが、pSecTag2-gtfCが最も強く、pSecTag2-gtfBでは誘導されたタンパクの分解傾向が認められた.2.DNAワクチンプラスミドによる抗原タンパクの発現マウス由来293細胞に3種のDNAワクチンプラスミドを感染後、RNAを抽出し、それぞれのgtfに特異的なプライマーを用いてサザンブロットを行った.その結果、pSecTag2-gtfB、pSecTag2-gtfCに抗原タンパクの発現が認められたが、そのバンドはpSecTag2-gtfCが最も明確であった.これらの結果より、GTFに対するDNAワクチンプラスミドとしてGTFCを標的とすることが、最も効果が高い可能性が示唆された.
緑膿菌を主とする微生物に対する新世代ワクチンの開発

緑膿菌感染症は、多剤耐性菌が多く出現し、日和見感染症の中で最も重要な感染性疾患の一つである。そこで、緑膿菌感染症を免疫学的手法で予防あるいは治療を行い、多剤耐性緑膿菌(MDRP)感染症を克服するのが今回の目的である。これまで緑膿菌ワクチンは死菌を用いたものが、商品化されているが、緑膿菌すべての成分が入っているため多くの蛋白が混合しており、免疫原性が必ずしも強くなく、しかも発熱などの副作用もよく見られる。今回我々は、DNAワクチンを主として検討したところ、以下の点が判明した。1)PcrV, OprF/Iおよび、鞭毛抗原より成り立っているDNAワクチンが、もっとも感染防御能が強いことを見出した。一方、エラスターゼ、プロテアーゼ、いくつのかのエクソエンザイムを使ったDNAワクチンはほとんど防御能が無いことが判明した。そこで、現在臨床に向けての方向も視野に入れ、この有効な3つの蛋白をひとつの遺伝子で発現させ、1本の蛋白として臨床に応用できるか否かも含めて検討している。また、現在、中国海正薬業公司でヒトへの応用へ向けて今までの検討をもとに、進む予定でもある。2)今回のもう一つの新しい知見としては、鞭毛のTLR5活性化部位のアミノ酸一つを変え、抗原性を変えることにより、緑膿菌のワクチン効果が著しく高めることが出来た。この変異を起こさせたワクチンは、TLR5活性化部位に対して抗体が産生されなくなり、従って、TLR5活性化が持続的に起こり、好中球やマクロファージによる緑膿菌排除能が強く活性化されることが判明した。今まで、死菌ワクチンを使っていたが、今後このような精製された更に予防効果の高いワクチンが医療方面で大変大切なことである。今後なるべく早く中国の製薬会社とワクチン実用化に向けて全力をあげて行く。DNAワクチンは、安全性が高いが効果は弱いことから、免疫原性を高める為の検討を行った。緑膿菌DNAワクチンの基盤的研究のため、PAO1株ゲノムDNAよりPCR法で対応する遺伝子を増幅し、外膜蛋白(OprF/I)、III型分泌機構関連蛋白(PcrV)及び鞭毛抗原FlaA、FliC、FliDを標的とするDNAワクチンを作製した。各々のワクチン単独及び混合したものをマウスに筋注エレクトロポレーション法で免疫すると、各抗原に対するTh1優位の特異的抗体(IgG2a>IgG1)が誘導された。2LD_<50>の緑膿菌(D4またはPAK株)を経鼻感染させたところ、OprF/I、PcrV、PilAの三者混合免疫(多価ワクチン)では100%のマウスが10日以上生存した。また同じマウスで、菌感染後2時間以内に肺胞洗浄液中のMIP-2、24時間後にはIFN-γが有意に増加し、3時間以内に肺胞内に好中球の集積、マクロファージの増加を認め、敗血症の進行を完全に抑制することが明らかとなった。菌を免疫マウスの血清IgGと混合して、非免疫マウスに感染させると、多価ワクチン免疫血清IgGのみで強力に感染防御効果を示した。これより、我々の今回作製したワクチンはTh1優位の抗体を誘導し、気道・肺胞における自然免疫を活性化させ迅速かつ強力に菌を排除することが判明した。次に、単独で強力な感染防御能を誘導したFliCによる自然免疫活性化作用機序を検討した所、TLR5に認識され、NF-κBを活性化し、マクロファージからTNF-αを強く誘導することが判明した。一方このFliCのいくつかの部位の単一アミノ酸変異体を作製し、鞭毛の特定部位がTLR5活性化に必須であることが判明した。

今年度の研究にて、単独で最も効果のあるものはFliCであり、次にPcrV、OprF/Iの順であり、また3種抗原標的多価ワクチンは非常に強い感染防御能のあることが判明した。難治性緑膿菌感染症を予防及び治療に可能な、免疫原性の高いワクチンを開発することを目的として以下の研究をおこなった。緑膿菌はA型(FlaA)またはB型(Flic)いずれか一方の鞭毛抗原を発現し、鞭毛を構成している。A型もしくはB型鞭毛抗原を標的とするDNAワクチンを免疫すると、同じ型の鞭毛よりも異なる型の鞭毛を発現する緑膿菌に対しての感染防御能を強く誘導した。この現象は、鞭毛抗原免疫時に誘導される抗体が、鞭毛抗原型特異的なToll-like receptor(TLR)5活性化領域を中和することで宿主自然免疫応答を阻害し、緑膿菌に対する感染防御効果を減弱することが原因であった。緑膿菌に対する感染防御能はTLR5ノックアウトマウスでは野生型より減弱し、鞭毛抗原を介する自然免疫応答は緑膿菌排除に重要であることが判明した。以上の重大な問題を克服するため、TLR5活性化領域の抗原性をアミノ酸置換により減弱させた変異型Flic(不活化鞭毛)DNAワクチンを作製した。このDNAワクチンで免疫すると、A型、B型、どちらの鞭毛抗原を発現する緑膿菌に対しても強力に感染防御することが示された。次に、緑膿菌のワクチンを使用した臨床試験の予備検討をおこなった。変異型鞭毛成分(mFlaA/mFliC)、細胞壁成分(OprF/I)、III型分泌機構還元タンパク質(PcrV)の三者混合免疫(多価ワクチン)は、強力な感染防御能をもつことを報告してきた。今回の検討ではこの3つのコンポーネントを、1つの融合タンパク質として枯草菌及び大腸菌に発現させた。このタンパク質を抽出、精製後、経鼻的にマウスに投与し免疫した所、非常に多種の緑膿菌に抵抗性の強いマウスが得られた。そこで、このタンパク質の特許取得と同時平行して、中国の海正医薬公司との臨床試験に向けて共同研究をスタートした。今後、臨床の場に我々の研究成果が実ると思われる。
近代日本における都市特性に関する比較研究-近代三都比較研究の文献学的考察-

近年ようやく国内における近代都市比較研究が行なわれるようになったが,その成果はとぼしい.よって本研究は,近代都市比較研究の基盤整備を目的として,東京・大阪・京都の三都比較に関する文献の収集と検討を行なった.本年度研究の実施計画:近代都市研究及び都市に関する新聞記事・雑誌記事を中心に渉猟し,三都に関するものを収集し,その内容にしたがって分類した.本年度研究の内容:収集した文献は,東京・大阪・京都の三都を比較したものを中心に,東京・大阪・京都,京都・東京の二都を比較したものにおよび,全部で約350件に及んだ.これらについて分類し,内容の分析を行なった.それによれば,近代に入ってからの三都比較は,大正期前・中半にピークを迎え,以後,京都が比較の対象となることは少なくなり,もっぱら東京・大阪の二都比較が行なわれることとなる.近世においては,江戸・京都の二都比較が中心で,それも京都に対する江戸からの批判がもっぱらであったが,近代,それも大正期をすぎたあたりから,大阪から東京への批判が多くなる.戦後は,東京に対する批判は次第に高まる傾向をみせ,高度成長期をすぎたころには,東京を「敵視」するものまで登場するようになっている.この背景には,近世,近代,現代(戦後)へと三都の,国内での位置・関係の変化があったことを指摘できる.つまり,近世における江戸の成長,戦後における東京の突出という現象が,それを端的に示していよう.また,三都の比較は,政治,経済,風俗,生活等の各分野におよび,日本分化・社会の多様性を示すものとなっている.本年度の研究は新聞・雑誌・週刊誌の記事までも視野に入れ,厳密な意味で比較とは言えないものまで広く収集した.近年ようやく国内における近代都市比較研究が行なわれるようになったが,その成果はとぼしい.よって本研究は,近代都市比較研究の基盤整備を目的として,東京・大阪・京都の三都比較に関する文献の収集と検討を行なった.本年度研究の実施計画:近代都市研究及び都市に関する新聞記事・雑誌記事を中心に渉猟し,三都に関するものを収集し,その内容にしたがって分類した.本年度研究の内容:収集した文献は,東京・大阪・京都の三都を比較したものを中心に,東京・大阪・京都,京都・東京の二都を比較したものにおよび,全部で約350件に及んだ.これらについて分類し,内容の分析を行なった.それによれば,近代に入ってからの三都比較は,大正期前・中半にピークを迎え,以後,京都が比較の対象となることは少なくなり,もっぱら東京・大阪の二都比較が行なわれることとなる.近世においては,江戸・京都の二都比較が中心で,それも京都に対する江戸からの批判がもっぱらであったが,近代,それも大正期をすぎたあたりから,大阪から東京への批判が多くなる.戦後は,東京に対する批判は次第に高まる傾向をみせ,高度成長期をすぎたころには,東京を「敵視」するものまで登場するようになっている.この背景には,近世,近代,現代(戦後)へと三都の,国内での位置・関係の変化があったことを指摘できる.つまり,近世における江戸の成長,戦後における東京の突出という現象が,それを端的に示していよう.また,三都の比較は,政治,経済,風俗,生活等の各分野におよび,日本分化・社会の多様性を示すものとなっている.本年度の研究は新聞・雑誌・週刊誌の記事までも視野に入れ,厳密な意味で比較とは言えないものまで広く収集した.
土壌汚染修復のための迅速測定・診断技術の開発

土壌汚染調査や汚染土壌修復時に適用可能性のある複数の分析方法が提案、市販されているが、測定事例が少なく、公定法との相関が不明であるなど、前処理も含めた実際の土壌調査での適用性は不明確であった。そこで、既存の測定方法の整理、土壌からの金属等の溶出挙動に基づいた迅速な前処理方法の検討と測定精度の向上を図ると共に、実際の土壌試験で共存する主要な無機物の濃度データを蓄積し、迅速に測定・診断できる技術を開発した。現在,土壌の汚染現場や修復現場で利用可能性のある測定技術が上市あるいは研究されているが,具体的にどのような性能を持ち,どのような場面で使用できるのか明確ではないことから,まず,既存の測定技術に関して定量下限や測定可能元素,価格などの情報を収集して整理した。これからの中から土壌への適用可能性があり,迅速性,簡易性に優れる測定方法として,電気化学的測定法,吸光光度法,検知管法を選択し,土壌溶出液等に適用した際の性能評価を行った。その結果,土壌汚染の評価,診断に使える可能性があることが示された。具体的には,電気化学的測定法については,Pb,Cdについて高感度な分析が可能であることから,非汚染の判断に利用できる可能性があることが分かり,吸光弧度法については,Cr6+,F,Bについて試験を行い,感度的に高い確度での非汚染判断に用いることができる元素は限られてしまうが,明らかな汚染があることの判定や汚染の疑いがある場合に利用できる可能性が示された。検知管法についてはAsを含む溶出液に適用した結果,溶出基準値付近で擬陽性を示すことがあるが,擬陰性の例は確認されず,安全側での汚染判断に使用できる可能性が高いことが明らかとなった。なお,分析方法の一部については,測定妨害が認められたため,その妨害除去についても検討した。また,土壌調査現場あるいは修復現場での汚染診断のための一次スクリーニングに使用できる技術としての迅速溶出法の推計精度を高めるために溶出データを蓄積した。このデータを蓄積することにより,土壌汚染現場でのどの程度の精度で測定,判断が可能なのかが明確となり,また現実に即した測定、診断技術を開発することができると考えられる。平成19年度に行った既存分析法の特徴の整理結果および基礎的な土壌への適用性の検討結果を受けて、平成20年度には分析の正確性を損ねる共存物による妨害影響の低減を図るため、まず土壌溶出試験液および土壌含有量試験液中の共存元素濃度の測定を複数の土壌について実施した。この土壌溶出液中の共存物質濃度と吸光光度分析法に使用する試薬供給メーカーが表示している共存しても影響のない濃度を比較して優先的に妨害影響を検討すべき元素を選定した。これらの優先度が高い元素について、妨害影響の程度を明らかにする試験を、混合標準液を用いて行った。その結果、妨害を受ける程度は分析元素によって異なったが、全体的にはマンガンや鉄、アルミニウムが土壌溶出液に存在しうる濃度で測定を妨害する可能性があり、特に鉛測定時のマンガンやフッ素測定時のアルミニウムは測定値への影響が大きいことが分かった。また、カドミウム測定時には亜鉛の共存に注意する必要があることが分かった。一方、六価クロムやホウ素、シアンについては主要な土壌共存物の影響は小さいと考えられた。また、カドミウムおよびフッ素については、妨害影響を低減する方法として、分析対象元素と妨害元素の溶出挙動の違いを利用した方法に適用可能性があることが示された。さらに、これまでの研究において現場で適用可能な迅速溶出法として、多数の溶出挙動データに基づき1分間の手振とうで得られた測定値から公定法値を推計する方法を提案していたが、推計誤差が大きく精度が低いという問題があった。そこで本研究では精度を高めるための方法として、溶出時間を1分という短時間から30分まで延長した場合の測定値への影響を検討した。その結果、公定法の1/41/12の溶出時間であっても、簡易法として十分な精度で測定値を得られることが示された。
静脈麻酔薬が血管平滑筋のアンジオテンシンII受容体に及ぼす影響の検討

アンジオテンシンII受容体拮抗薬を投与されている患者はカルシウム拮抗薬を投与されている患者よりも、たとえその降圧作用が同等であっても、手術中に血圧が下がりやすいことが知られている。さまざまな静脈麻酔薬がアンジオテンシンIIの受容体の発現量に関与しているかどうか調べたところ、アンジオテンシンII1型受容体にも2型受容体にも影響していないということがわかった。静脈麻酔薬がレニン・アンジオテンシン系に及ぼす影響については今後もさらなる検討が必要であると考えられる。本研究は静脈麻酔薬のまた解明されていない低血圧のメカニズムを探り、臨床に展開するための基盤となる研究を行うことを目的としている。血管平滑筋細胞においてプロポフォールがアンジオテンシン1型受容体に影響を及ぼしているかどうかmRNA,蛋白レベルで検討したが、その発現量に大きな変化はなかった。そのため、別のアドレナリン受容体や、アンジオテンシンII 2型受容体についても同様の検討を行ったが、軽度の変化は認められたが、大きな変化ではなかった。静脈麻酔薬によって引き起こされる低血圧にはさらに別の機序が介在すると考え、ひとまずマイクロアレイで当りをつけるために現在準備中である。本研究の全体構想は以下の通りである。ACEIやARBを投与されている患者は、全身麻酔中に過度の低血圧を引き起こす可能性が高い。本研究によって、様々な静脈麻酔薬がレニン・アンジオテンシン系に直接影響しているかどうかを解明しようと試みた。そのために、血管平滑筋細胞において、プロポフォールやフェンタニルを含めた様々な静脈麻酔薬がアンジオテンシンII1型受容体のmRNA、蛋白発現に影響を与えるかどうかを検証し、そこに至るシグナルを詳細に解析することを当初目標とした。リアルタイムPCR法による検討の結果、血管平滑筋細胞においては、プロポフォールやフェンタニルが、アンジオテンシンII1型受容体の発現に影響を与えてはいなかった。チアミラール、ケタミンでも同様の検討を行ったがアンジオテンシンII1型受容体には影響していなかった。さらにアンジオテンシンII2型受容体でも検討したが発現量の増減は見られなかった。カルシウム拮抗薬投与中の患者よりもACEI/ARB投与中の患者の方が周術期には低血圧の頻度が高いため、静脈麻酔薬がレニン・アンジオテンシン系に何らかの影響を及ぼしている可能性は否定できないが、少なくとも現時点ではアンジオテンシンII受容体への影響は否定された。以上のことから、静脈麻酔薬とレニン・アンジオテンシン系に関する分子生物学的解析により、周術期のARB、ACEI投与に関するエビデンスを提示することはできなかったが、将来的な、周術期低血圧の治療戦略への足がかりのひとつにはなったと考えられる。本研究は静脈麻酔薬のまだ解明されていない低血圧のメカニズムを探り、臨床に展開するための基盤となる研究を行うことを目的としている。研究期間内には以下のことを明らかにする。1)血管平滑筋細胞において、プロポフォールやフェンタニルを含めた様々な静脈麻酔薬が、アンジオテンシンII受容体の発現に影響を与えるかどうかを検証する。2)アンジオテンシンII受容体の発現レベルが変化するのであれば、アンジオテンシンII受容体遺伝子のどの部分が静脈麻酔薬に反応しているかを検証する。3)AT1R発現に至るまでに介在する経路を同定する。平成23年度の研究実績としては、ラット血管平滑筋細胞において、麻酔薬によるAT1R発現調節に関して解析した*細胞の培養Sprague-Dawleyラットの胸部大動脈より血管平滑筋細胞を分離し、実験に用いた。*mRNAおよびタンパク発現の検討血管平滑筋細胞を静脈麻酔薬を用いて、様々な濃度、時間で刺激した後、RNAを酸性グアニジウム-フェノール-クロロホルム法により抽出した。アンジオテンシンII1型受容体(AT1R)のmRNAレベルを、リアルタイムPCR法(ABIー7500使用)により解析したが、AT1Rは減少傾向にはあるものの、至適な刺激条件の検討に時間がかかり、当初予定していたmRNAの検討後のタンパク発現の検討(ウエスタンブロット)までは実施できていない。静脈麻酔薬によって引き起こされる低血圧の機序を詳細に解明することは、周術期の安定した麻酔を行うための足がかりとなるため、非常に意義がある。さらに、ARBやACEIの手術当日の内服に関してのエビデンスを提示することができると考えられる。以上のことから、静脈麻酔薬がレニン・アンジオテンシン系に及ぼす影響を明らかにできれば、非常に特色のある研究となると思われる。当初、プロポフォールによる低血圧の発生にはレニン・アンジオテンシン系の深い関与があるという仮説の元に実験を進めていたが、アンジオテンシンII受容体の発現量にそれほど大きな影響を及ぼしていなかったため、研究の方針変更を余儀なくされた。ラット血管平滑筋細胞において、麻酔薬によるAT1R発現調節に関して解析したSprague-Dawleyラットの胸部大動脈より血管平滑筋細胞を分離し、培養を開始、実験に用いた。