hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
強相関電子系のための全電子第一原理GWΓコードの開発

プログラムのインプリメントとともに、膨大な数の試験実行とデバッグ作業が必要なため、これまで通り、横浜国立大学大学院工学府博士課程に在籍中で研究代表者の研究室所属の大学院生にプログラムの作成の補助を依頼して作業を進める。これらの研究を推進するに当たり、以下のように研究費を使用する計画である。(1).新しい計算手法(方法論)、具体的な計算アルゴリズム、そして計算結果をまとめて報告書やレポート、英文学術論文誌に投稿するための原稿を作成するために研究室にネットワーク・プリンターを購入する。本研究で使用するプリンターはLinuxマシンから直接出力できる必要があるので、既存のプリンターは使うことができない。あるいは、新しいプリンターを購入する代わりに、既存のプリンターにPostScriptインターフェースとハードディスクを増設することで対応する。費用的にはどちらも変わらないので、どちらが良いか検討して相応しい方を購入する。(2).また、これに関連して、印刷費やトナー代(ドラムカートリッジ代を含む)が必要である。(3).本研究で得られる計算結果を可視化するためのPC用のソフトウェアも若干購入する必要がある。(4).本研究の結果を一流の学術論文誌に投稿・掲載するための論文投稿料(掲載料・別刷料金を含む)が必要である。(5).海外での国際会議や国内会議(学会、研究会)での発表を行うための旅費(それぞれ、研究代表者および大学院生、各1名分)が必要である。(6).これまで通り大学院生にプログラム作成補助の謝金を支払う。(7).他大学の全国共同利用の大型計算機(スーパーコンピュータ)の利用負担金が必要である。
多倍長精度の数値繰込群による素因数分解へのアプローチ

研究実施計画に沿って、多倍長精度で時間依存密度行列繰込群を用いる量子回路シミュレータZKCM_QCの改良を進めた。この計算手法で計算コストを決定づける特異値分解の内部ルーチンにGPGPUを用いると高速になるが一方で計算精度が落ちる。落ちた計算精度をCPU計算でRayleigh商反復により回復させることで多倍長精度を維持するのだが、安定性向上のため繊細な技術的な改良を行った。この精度回復の詳細について、学会発表2件で述べた。また、ZKCM_QCを用いて主要な量子アルゴリズムのシミュレーションを行ってきており、2018年度前半の時点では、Deutsch-Jozsaアルゴリズムについてはある程度構造のあるオラクルの場合、回路幅218量子ビットの回路をPCワークステーションで浮動小数点精度256ビットでおおよそ27分でシミュレートできている。また、Shorのアルゴリズムについては、回路幅60量子ビット、回路深さおおよそ70万の回路を14.5時間17時間でシミュレートできている。Shorのアルゴリズムのシミュレーションでは私はまだ所用時間が合成数のビット長に対して指数的に増大するデータを見つけていないが、競合する研究グループであるメルボルン大学のWangらの結果には所用時間が急激に増大していると思われるデータ点がある。同様の手法を使っていてかなり異なる結果になっている理由としては、(1)私は多倍長精度で計算しており計算中ゼロ特異値と微小特異値を混同することはほぼないが、Wangらは仮数部53ビット精度での計算のため混同している可能性があること、(2)私はQFTベースの算術回路を使っているのに対してWangらは巾乗剰余を通常の算術回路ベースでデータに作用させており、回路構成が異なること、が考えられる。以上の結果についても同じ学会発表で述べた。まず、計算ライブラリの開発状況については、計画からやや遅れている。GPGPU対応については、計画通り、特異値分解に用いるルーチンの一部にGPGPUをユーザにとって簡単に使用できるようにした。それによる計算精度低下の回復については、研究実績の概要に書いたとおり対応している。一方でMPI対応については、並列化を固定精度で行う計画であったが、開発が進んでいない。次に、実験環境の整備については、計画からやや進んでいる。科研費でPC7台を部品として購入し、大学内の競争的資金で購入した他の部品と組み合わせ、種々の設定をしてクラスタマシンを構築した。これは全体として42CPUコア(84スレッド)を持っており、これまでより大きな回路幅の量子回路のシミュレーションが行える。また、計画では2年目からの予定であったスーパーコンピュータの利用について、大学内の競争的資金を使って九州大学のスーパーコンピュータ"ITO"でライブラリの動作テストができた。ソースコードの手直しなく動作したが、GPGPUを用いた場合の速度が想定外に遅いため、現在コードの見直しをしている。最後に理論研究については、巾乗剰余の回路中で計算コストが増大している点をシミュレーションデータから見つけてその部分の回路構造を重点的に解析することにしていたが、これまでのシミュレーション結果では明瞭なものが見つかっていないため解析ができていない。以上から、やや研究の進捗は遅いものの、計画の変更は不要と考えている。まず、開発している計算ライブラリ自体について、2013年にフルペーパーを執筆して以来論文にはしてこなかったため、ここ数年の開発状況をまとめて、科学計算ソフトウェア分野もしくは計算物理分野の雑誌に投稿したい。本研究の主題であるShorの素因数分解量子アルゴリズムのシミュレーションについては、計算ライブラリの改良を進めつつより大規模なシミュレーションを行う。1年目に製作したクラスタマシンを使って並列化の効果が出るように試行錯誤しつつMPIを用いた固定精度での並列化を組み入れる。固定精度といっても回路規模に応じて必要な精度は確保できるように、少なくともコンパイル時に精度選択できるようにしたい。また、九州大学のスーパーコンピュータ"ITO"を用いたときに妥当な速度が出るようにライブラリを改良しつつ、やはり大規模なシミュレーションを行う予定である。現状、シミュレーションを実行する計算機の構成によってGPGPU利用部分の所用時間にばらつきが生じている。2年目のできるだけ早期にこの問題を解消したい。理論解析については、現在までの進捗状況で述べたように、巾乗剰余回路中のどの部分がシミュレーションコストを支配しているか、未だ見当がついていない。まず明瞭なシミュレーションデータが得られるように大規模なシミュレーションを行い、その結果から解析すべき回路構造を特定したい。

Shorのアルゴリズムのシミュレーションでは私はまだ所用時間が合成数のビット長に対して指数的に増大するデータを見つけていないが、競合する研究グループであるメルボルン大学のWangらの結果には所用時間が急激に増大していると思われるデータ点がある。同様の手法を使っていてかなり異なる結果になっている理由としては、(1)私は多倍長精度で計算しており計算中ゼロ特異値と微小特異値を混同することはほぼないが、Wangらは仮数部53ビット精度での計算のため混同している可能性があること、(2)私はQFTベースの算術回路を使っているのに対してWangらは巾乗剰余を通常の算術回路ベースでデータに作用させており、回路構成が異なること、が考えられる。以上の結果についても同じ学会発表で述べた。まず、計算ライブラリの開発状況については、計画からやや遅れている。GPGPU対応については、計画通り、特異値分解に用いるルーチンの一部にGPGPUをユーザにとって簡単に使用できるようにした。それによる計算精度低下の回復については、研究実績の概要に書いたとおり対応している。一方でMPI対応については、並列化を固定精度で行う計画であったが、開発が進んでいない。次に、実験環境の整備については、計画からやや進んでいる。科研費でPC7台を部品として購入し、大学内の競争的資金で購入した他の部品と組み合わせ、種々の設定をしてクラスタマシンを構築した。これは全体として42CPUコア(84スレッド)を持っており、これまでより大きな回路幅の量子回路のシミュレーションが行える。また、計画では2年目からの予定であったスーパーコンピュータの利用について、大学内の競争的資金を使って九州大学のスーパーコンピュータ"ITO"でライブラリの動作テストができた。ソースコードの手直しなく動作したが、GPGPUを用いた場合の速度が想定外に遅いため、現在コードの見直しをしている。最後に理論研究については、巾乗剰余の回路中で計算コストが増大している点をシミュレーションデータから見つけてその部分の回路構造を重点的に解析することにしていたが、これまでのシミュレーション結果では明瞭なものが見つかっていないため解析ができていない。以上から、やや研究の進捗は遅いものの、計画の変更は不要と考えている。まず、開発している計算ライブラリ自体について、2013年にフルペーパーを執筆して以来論文にはしてこなかったため、ここ数年の開発状況をまとめて、科学計算ソフトウェア分野もしくは計算物理分野の雑誌に投稿したい。本研究の主題であるShorの素因数分解量子アルゴリズムのシミュレーションについては、計算ライブラリの改良を進めつつより大規模なシミュレーションを行う。1年目に製作したクラスタマシンを使って並列化の効果が出るように試行錯誤しつつMPIを用いた固定精度での並列化を組み入れる。固定精度といっても回路規模に応じて必要な精度は確保できるように、少なくともコンパイル時に精度選択できるようにしたい。
内喉頭筋運動ニューロン活動に対するセロトニン、サブスタンスPの影響

ラットを灌流固定後脳を摘出し、脳幹軸位断の連続切片を作製し、neutral redによる染色にて疑核の位置と広がりを確認した。この結果、疑核の細胞内電気活動を記録する目的で作製する脳幹スライス標本の厚さを500μmとすると、ラット1個体からは多くとも2スライスの標本しか得られないことが昨年度までに明らかとなった。このスライス標本を人工脊髄液で灌流しながら、recording chamber内で微小ガラス電極を刺入した。しかし、1.疑核の領域が狭く、境界が不明瞭である2.疑核の神経細胞の密度が低いためあるいは細胞のviabilityの問題か、実際に微小ガラス電極が細胞を捉える確率が非常に低く、また細胞を維持できる時間も不十分であった。これらの課題は昨年から引き続くものであり、これを解決するため、研究代表者が本技術を取得した米国アーカンソー州のアーカンソー医科学大学解剖学教室と連絡を取り、解決策を協議中である。筆者はこれまでニワトリ胚の脊髄スライス標本を用い、脊髄前角運動細胞の細胞内電気活動を検討してきた。同様の手法による脳幹スライス標本からの電気活動記録は前記アーカンソー医科大学で現在行われ、その成果も報告されており、近々本研究の問題は解決することが期待できる。今後、成ラット疑核ニューロンの細胞内電極による記録を確立した後、同ニューロンのセロトニンおよびサブスタンスPに対する反応性を検討する予定である。ラットを灌流固定後脳を摘出し、脳幹軸位断の連続切片を作成し、neutral redによる染色にて疑核の位置と広がりを確認した。この結果、疑核の細胞内電気活動を記録する目的で作成する脳幹スライス標本の厚さを500μmとすると、ラット1個体からは多くとも2スライスの標本しか得られないことが明らかとなった。また、疑核の神経細胞の密度が低いためあるいは細胞のviabilityの問題か、実際に微小ガラス電極が細胞を捉える確率が非常に低く、また細胞を維持できる時間も不十分であるという問題点が明らかとなった。このため、現段階では満足できる細胞内電気活動記録が得られていない。この点に関しては、電極の改良などにより対処可能と考えられる。この際、運動細胞の同定には脊髄前根からの逆行性電気刺激を用いたが、内喉頭筋の運動ニューロンである疑核から記録する場合、逆行性電流による運動細胞の同定手技を用いることができず、他の同定法もまた現在検討中である。
腎細胞癌に対するHLA-A2拘束性マルチペプチドワクチンの開発

我々の本研究に関する一連の取り組みは、腎細胞癌に関してはCA9およびVEGFR1ワクチンを用いた臨床研究を行い、その安全性、有用性について報告してきた。2013年度より、腎癌に対するマルチペプチドワクチンの開発に着手し(基盤研究B:25293336)、EPOR、PDL-1についてはHLA-A24拘束性のペプチドワクチンを開発し、特許申請を行った。現在、HLA-A24陽性患者に対して、CA9/EGFR1,-2/EPOR/PDL-1/HIF-1のマルチペプチドワクチンによる臨床研究を計画中である。今回の研究目的は、腎細胞癌に対して日本人で2番目に多いHLA-A2拘束性ペプチドワクチンの開発にある。今回の研究計画は、以前に開発したHLA-A24拘束性ワクチンと同じ手法で、HLA-A2拘束性のペプチドワクチン開発を同じ5つの標的分子(CA9、VEGFR、EPOR、PDL1、HIF1)をターゲットにして、epitopeを同定することである。すでに、近畿大学医学部倫理委員会承認のもとに腎細胞癌患者に十分なインホームドコンセントの上、本研究に協力同意を得たHLA-A2陽性担癌患者から随時全血採血を行い、末梢血単核球細胞(PBMC)を採取して-80°Cに冷凍保存している。今年度(最終年)は、昨年度に引き続き、これまでの基礎的研究からある程度の種類に絞り込んだHLA-A2拘束性ペプチド(CA9、VEGFR、EPOR、PDL1、HIF1)の中から、ワクチンとして有用と思われる候補を絞り込むため、末梢血単核球細胞からのペプチド特異的CTLの誘導能を評価する。2013年度の上記基盤研究(B)で、シークエンスを記述してしまい、特許を申請後に断念した経緯から、途中経過は報告できない。現在、各ペプチドの候補順位をつけ、順次CTLアッセイにて、最終のワクチン候補の同定を実施中である。HLA-A2陽性の転移性腎がん患者が少なく、これまでに保存してきた末梢血からのPBMCが底をついてきたため、一旦、インターフェロンγリリースアッセイをストップし、現在、HLA-A陽性の腎がん患者さんから、末梢血を採取させていただき、PBMCをできるだけ多く、液体窒素内に保存しているところである。少なくとも、今後15人分のPBMCが必要であり、同一患者さんばかりに協力をお願いできないことから、スクリーニングCTLアッセイを開始するのが遅れる予定である。これまでは、転移性腎細胞癌患者さんに限定して、患者負担を少しでも軽減させるために腎摘除術の術中に採血してきたが、十分なPBMCが確保できないと思われる。そのため、転移のない新たな患者さんにお願いしてHLAタイピングをスクリーニングし、HLA-A2陽性であれば、末梢血採血について研究協力を説明し協力いただく。それにより、今回のCTLアッセイをスムーズに施行できる十分なPBMCを確保する予定である。我々はこれまでに腎癌に関してはCA9およびVEGFR1ワクチンを用いた臨床研究を行い、前立腺癌に対してはテーラーメイドワクチン療法を行い、安全性、有用性について報告してきた。2013年度より、腎癌に対するマルチペプチドワクチンの開発に着手し(基盤研究B:25293336)、2014年度にEPOR、PDL-1についてはHLA-A24拘束性のペプチドワクチンを開発し、特許申請を行った。2016年度は、HLA-A24拘束性、HIF-1αに対するペプチドワクチンを開発し、特許申請した(出願番号:特願2016-209180)。今回の研究は、日本人で2番目に多いHLA-A2拘束性ペプチドワクチンの開発にある。これまでの基礎的研究から、CA9;5種類、EGFR1;2種類、EGFR-2;2種類、EPOR;5種類、PDL1;5種類、HIF1:5種類のHLA-A2拘束性ペプチドに絞り込み、研究用ペプチド合成を外注した。続いて、今回選択されたペプチド候補に対して、末梢血単核球細胞からのペプチド特異的CTLの誘導能を評価するため、近畿大学医学部倫理委員会承認のもとに腎細胞癌患者に十分なインホームドコンセントの上、本研究に協力同意を得たうえで、HLAタイピング検査を行い、HLA-A2陽性担癌患者から採血して末梢血単核球細胞(PBMC)を採取して-80°Cに冷凍保存している。現在、TAP欠損HLA-A2拘束性培養細胞T-2細胞(ターゲット細胞)と各ペプチドおよびPBMCを用いたinterferon release assayを行い、その結果から、候補ペプチドを絞り込んでいる状況である。

すでに、近畿大学医学部倫理委員会承認のもとに腎細胞癌患者に十分なインホームドコンセントの上、本研究に協力同意を得たHLA-A2陽性担癌患者から随時全血採血を行い、末梢血単核球細胞(PBMC)を採取して-80°Cに冷凍保存している。今年度(最終年)は、昨年度に引き続き、これまでの基礎的研究からある程度の種類に絞り込んだHLA-A2拘束性ペプチド(CA9、VEGFR、EPOR、PDL1、HIF1)の中から、ワクチンとして有用と思われる候補を絞り込むため、末梢血単核球細胞からのペプチド特異的CTLの誘導能を評価する。2013年度の上記基盤研究(B)で、シークエンスを記述してしまい、特許を申請後に断念した経緯から、途中経過は報告できない。現在、各ペプチドの候補順位をつけ、順次CTLアッセイにて、最終のワクチン候補の同定を実施中である。HLA-A2陽性の転移性腎がん患者が少なく、これまでに保存してきた末梢血からのPBMCが底をついてきたため、一旦、インターフェロンγリリースアッセイをストップし、現在、HLA-A陽性の腎がん患者さんから、末梢血を採取させていただき、PBMCをできるだけ多く、液体窒素内に保存しているところである。少なくとも、今後15人分のPBMCが必要であり、同一患者さんばかりに協力をお願いできないことから、スクリーニングCTLアッセイを開始するのが遅れる予定である。今回の研究計画は、これまでと同様の方法で、日本人でA24に続き2番目に多いとされるHLA-A2拘束性のペプチドワクチン開発を同じ5つの標的分子(CA9、VEGFR1、EPOR、PDL1、HIF-1)をターゲットにして、epitopeを同定することである。初年度の計画は、まず、ペプチドの準備を行い、すでに、CA9、EGFR1、EGFR-2、EPOR、PDL1、HIF1のHLA-A2拘束性ペプチドを絞り込み、研究用ペプチド合成を外注した。続いて、今回選択されたペプチド候補をさらに絞り込むため、末梢血単核球細胞からのペプチド特異的CTLの誘導能を評価するため、十分なインホームドコンセントの上(近畿大学医学部倫理委員会承認済)、HLA-A2陽性腎細胞癌患者から採血して末梢血単核球細胞(PBMC)を採取して-80°Cに冷凍保存を継続する。TAP欠損HLA-A2拘束性培養細胞T-2細胞(ターゲット細胞)とペプチドおよびPBMCを用いたinterferon release assayやLuminexを用いたペプチド反応性IgGを検出する抗体アッセイ結果から、候補順位をつけ、順次51Cr release cytotoxicity assay (CTLアッセイ)にて、最終のワクチン候補を同定する。可能であれば、各ペプチドで刺激されたCTLの特異性をcold inhibition assayにて確認する。これまでは、転移性腎細胞癌患者さんに限定して、患者負担を少しでも軽減させるために腎摘除術の術中に採血してきたが、十分なPBMCが確保できないと思われる。そのため、転移のない新たな患者さんにお願いしてHLAタイピングをスクリーニングし、HLA-A2陽性であれば、末梢血採血について研究協力を説明し協力いただく。それにより、今回のCTLアッセイをスムーズに施行できる十分なPBMCを確保する予定である。
シャペロニンの認識する蛋白質折れたたみ過程の共通構造とは何か

シャペロニンに結合できる折れたたみ中間体とはどんなものなのであろうか?その結合の熱力学的な性格を調べるために,滴定型熱量計で,結合にともなう熱の出入り(ΔH)を温度を変えて測定した。シャペロニンとしては,大腸菌のGroEL,折れたたみ中間体のモデル(基質タンパク質)として還元α-ラクトアルブミンとペプシン(中性pH)を用いた。実験してみると,意外なことに,還元α-ラクトアルブミンと中性ペプシンでは,シャペロニンに対する結合のようすが相当違うという結果がでた。まず,塩依存性が違う。シャペロニンと還元α-ラクトアルブミンの結合は,塩があっても無くても(±0.2MKCl)解離定数(Kd)はあまり変化しなかった。しかし,中性ペプシンは塩存在下でのみシャペロニンと結合した。その解離定数(Kd)は,還元α-ラクトアルブミンとシャペロニンの結合と同じような値であった。塩がない条件では結合しないらしい(ΔH0)。また,ΔHの温度依存性をみると,シャペロニンと還元α-ラクトアルブミンの場合は,負の依存性があった。これは両者の結合に疎水的相互作用が大きな役割を果していることを示唆する。しかし,シャペロニンと中性ペプシンの結合にともなうΔHは温度依存性がほとんど無かった。疎水的相互作用の貢献は少ないものと思われる。結局,シャペロニンと基質タンパク質の相互作用はそれぞれの基質タンパク質ごとに異なる,という可能性を考える必要がでてきた。また、私たちはシャペロニンと基質タンパク質の相互作用を、表面プラズモン共鳴でも調べた。還元α-ラクトアルブミンを固体チップに固定して,これに対するシャペロニンの結合をリアルタイムで測定した。これから求めた解離定数(Kd)は,上記の熱測定から求めたものより三桁も低かった。この相違は、還元α-ラクトアルブミンを固定したことによる影響と考え、追究している。
アデノ・アデノ随伴ウイルスハイブリッドベクターを用いた BTK遺伝子修復研究

我々はBTK遺伝子のexon2-19、およびGFP、ピューロマイシン耐性遺伝子を搭載したアデノ・アデノ随伴ウイルスハイブリッドベクターを作製した。このベクターとCRISPR-Cas9を用いると、感染させた臍帯血由来CD34陽性細胞から24個のピューロマイシン耐性赤芽球コロニーを得て、そのうち10個のコロニーでBTK遺伝子座における相同組み換えを認めた。その頻度は感染させた細胞あたり1.8 x10-5であった。本ベクターとCRISPR-Cas9システムにより、造血幹細胞における相同組み換えによるBTK遺伝子の変異修復を行える可能性を示した。ターゲティング効率の向上を目的として、改良型アデノ・アデノ随伴ウイルスハイブリッドベクターを作製した。CD34陽性造血幹細胞における相同組換えの検出に適する薬剤耐性遺伝子を検討した。In vitroでの骨髄CD34陽性造血幹細胞からのB細胞系への分化能を評価するため、正常ヒト臍帯血由来CD34陽性細胞と同様に、骨髄CD34陽性造血幹細胞からのB細胞系への分化誘導を試み、フィーダー細胞、サイトカインの種類、濃度などの条件を検討した。ヒト血球系細胞株において、アデノ・アデノ随伴ウイルスハイブリッドベクターと人工ヌクレアーゼの併用時のターゲティング効率を算定した。同様に、正常ヒト臍帯血由来CD34陽性細胞からのコロニーアッセイにおいて、アデノ・アデノ随伴ウイルスハイブリッドベクターと人工ヌクレアーゼの併用時のターゲティング効率を算定した。結果、ヒト血球系細胞株及び正常ヒト臍帯血由来CD34陽性細胞のターゲティング効率は、ともに高効率であった。異なったウイルスベクターと人工ヌクレアーゼの組み合わせによる遺伝子ターゲティング効率を調べるため、平成26年度に作製した、改良型アデノ・アデノ随伴ウイルスハイブリッドベクターを用いて、ヒト血球系細胞株K562細胞における、遺伝子ターゲティングを行った。結果、異なった組み合わせを用いた場合でも、同程度の効率での遺伝子ターゲティングを認めた。また、正常ヒト臍帯血由来CD34陽性細胞からのコロニーアッセイにおいて、アデノ・アデノ随伴ウイルスハイブリッドベクターと人工ヌクレアーゼの併用時の遺伝子ターゲティングを引き続き行った。人工ヌクレアーゼの種類、導入方法を改良することで、平成26年度での検討に比べて、より効率よく遺伝子ターゲティングを行うことができた。アデノ・アデノ随伴ウイルスハイブリッドベクターと人工ヌクレアーゼを併用することで、ターゲティング効率の向上を認めた。分子生物学平成26年度に得られた結果を基にして、in vitroで正常ヒト臍帯血由来CD34陽性細胞及び患者由来骨髄CD34陽性造血幹細胞のターゲティング・B細胞系への分化誘導実験を試みる。ヒトXLAモデルマウスを用いた遺伝子ターゲティング解析とB細胞再構築の検討を行う。実験に使用を予定していた細胞培養用の培地が、製造過程で問題が発生し納期が大幅に遅れたため、B細胞系への分化誘導実験の一部を行うことができなかったため、次年度使用額が生じた。正常ヒト臍帯血由来CD34陽性細胞及び患者由来骨髄CD34陽性細胞でのターゲティング・B細胞系への分化誘導実験を行い、その経費に充てることにしたい。
環境刺激によるシロイヌナズナの小胞体ストレス応答経路の活性化機構

サリチル酸とシロイヌナズナの小胞体ストレス応答の関係および植物の小胞体ストレス応答における情報伝達経路の一つIRE1-bZIP60経路の細胞質スプライシングの連結反応に関与する未知のRNAリガーゼについて以下の研究をおこなった。サリチル酸と小胞体ストレス応答の関係の解明サリチル酸処理による小胞体シャペロンの転写レベルの誘導や小胞体ストレス応答関連転写因子bZIP60の活性化をこれまでに明らかにしていた。bZIP60と同様に小胞体ストレス応答関連転写因子bZIP28のサリチル酸による活性化について調べた。bZIP28特異的な抗体によるイムノブロット解析の結果、サリチル酸を処理したサンプルで活性型bZIP28が検出された。そのためサリチル酸が植物の小胞体ストレス応答を活性化すると考えられた。bZIP60の細胞質スプライシングに関わるRNAリガーゼの同定bZIP60の細胞質スプライシングにおける連結反応を触媒するRNAリガーゼの候補としてtRNAリガーゼAtRlg1に着目して関係を調べた。大腸菌を宿主として作製したIRE1組換えタンパク質とbZIP60 RNAを反応すると切断が見られた。次にIRE1が切断したbZIP60 RNAとAtRlg1組換えタンパク質を反応すると連結によって生じたRNAが確認された。つまり、試験管内においてAtRlg1はIRE1が切断したbZIP60を連結する活性をもっていた。さらに、植物体におけるAtRlg1の局在を細胞分画により調べると、細胞質スプライシングが起きると考えられる小胞体膜を含む膜画分からAtRlg1の一部が検出された。以上の結果からAtRlg1がbZIP60の細胞質スプライシングに関与する可能性が示唆された。26年度が最終年度であるため、記入しない。構造異常タンパク質が小胞体内へ蓄積するとBipに代表される小胞体シャペロンの協調的誘導などが見られる。これを小胞体ストレス応答という。シロイヌナズナの小胞体ストレス応答のシグナル伝達経路にIRE1-bZIP60経路がある。これまでに、病原菌感染やサリチル酸処理によりBipを含む小胞体ストレス応答関連遺伝子の一部が誘導されることが報告されているが、その情報伝達機構は不明な点が多い。本研究ではサリチル酸処理による小胞体ストレス応答関連遺伝子の誘導とIRE1-bZIP60経路の関わりを調べた。まず、サリチル酸処理によって活性化されたbZIP60が標的とする遺伝子の同定を試みた。小胞体ストレスにより活性化されたbZIP60が標的とする遺伝子としてBIP3やSar1がある。これらの遺伝子について解析を行った。その結果、サリチル酸により活性化されたbZIP60はBZP3やSar1を制御していることが明らかとなった。次に、サリチル酸による植物の免疫応答における重要な制御因子であるNPR1との関係を調べた。NPR1変異体におけるbZIP60の活性化や別P3やSar1について解析を行ったところ、サリチル酸処理によるbZIP60の活性化やBZP3やSar1の誘導が見られた。以上の結果から、サリチル酸はIRE1-bZIP60経路を介してシャペロンなどの標的遺伝子を誘導していることが明らかとなった。真核細胞のオルガネラの一つである小胞体では、種々のストレスにさらされたことで構造異常タンパク質が蓄積することがある。これに対し、異常タンパク質の折りたたみを促進するシャペロンなどの遺伝子が協調的に誘導される。このような現象は、小胞体ストレス応答と呼ばれている。植物の場合、シロイヌナズナで、小胞体ストレス応答のシグナル伝達経路は、主に二つが知られている。一つは、小胞体膜貫通型センサータンパク質IRE1と転写因子bZIP60からなるIRE1-bZIP60経路であり、もう一つは、膜結合型転写因子bZIP28による経路である。これまでの植物における小胞体ストレス応答の研究では、主に化学薬剤によるタンパク質の立体構造の形成阻害により、人為的に小胞体ストレスを起していた。そのため、植物の小胞体ストレス応答の生理的な環境での知見は限られていた。これまでに、植物で小胞体ストレス応答の指標となる小胞体シャペロンの誘導が起きる刺激として、病原菌感染や防御応答が報告されていた。特に、植物ホルモンの一種で、病害応答に関わるサリチル酸が小胞体シャペロンを誘導する。本研究では、サリチル酸処理による小胞体シャペロンが誘導される機構について研究を行った。その結果、いくつかの小胞体シャペロンは、IRE1-bZIP60経路依存的に誘導されていた。さらに、bZIP28特異的な抗体を作成し、サリチル酸処理を行った植物でbZIP28の検出を行ったところ、bZIP60と同様にサリチル酸処理で活性化していた。以上の結果から、サリチル酸処理による小胞体シャペロンの誘導は、小胞体ストレス応答のシグナル経路を介して起きていることが明らかとなった。

bZIP60と同様に小胞体ストレス応答関連転写因子bZIP28のサリチル酸による活性化について調べた。bZIP28特異的な抗体によるイムノブロット解析の結果、サリチル酸を処理したサンプルで活性型bZIP28が検出された。そのためサリチル酸が植物の小胞体ストレス応答を活性化すると考えられた。bZIP60の細胞質スプライシングに関わるRNAリガーゼの同定bZIP60の細胞質スプライシングにおける連結反応を触媒するRNAリガーゼの候補としてtRNAリガーゼAtRlg1に着目して関係を調べた。大腸菌を宿主として作製したIRE1組換えタンパク質とbZIP60 RNAを反応すると切断が見られた。次にIRE1が切断したbZIP60 RNAとAtRlg1組換えタンパク質を反応すると連結によって生じたRNAが確認された。つまり、試験管内においてAtRlg1はIRE1が切断したbZIP60を連結する活性をもっていた。さらに、植物体におけるAtRlg1の局在を細胞分画により調べると、細胞質スプライシングが起きると考えられる小胞体膜を含む膜画分からAtRlg1の一部が検出された。以上の結果からAtRlg1がbZIP60の細胞質スプライシングに関与する可能性が示唆された。26年度が最終年度であるため、記入しない。本研究の重要な課題であったサリチル酸処理により活性化されたbZIP60の標的遺伝子が明らかになったため。IRE1/bZIP60経路は小胞体ストレスとサリチル酸どちらも同じ遺伝子を標的としていることから、サリチル酸が小胞体ストレスを引き起こす可能性が示唆された。bZIP28抗体を作成したことで、内生のbZIP28をタンパク質レベルで検出することができる様になったから。また、bZIP28抗体を用いることでサリチル酸がbZIP28も活性化することがわかり、植物の場合、サリチル酸処理が小胞体ストレスを起こす可能性が高いことが明らかになったため。サリチル酸が小胞体ストレスを引き起こしている可能性が予想されるが、その原因は明らかとなっていない。そのため、サリチル酸が小胞体ストレスを引き起こす原因を明らかにすることを試みる。具体的には、サリチル酸処理により発生する活性酸素種などが原因となっていることも考えられるので、変異体などを用いた実験による解析を計画している。これまでの実験結果をまとめ、論文として発表する。また、次の段階として、サリチル酸による小胞体シャペロンの誘導がより生理的環境に近い状態で起こりうるか検証する。具体的には、現在実験に用いている化学合成されたサリチル酸塩の外生処理にかえて、病原菌やエリシターによる内生サリチル酸を誘起した場合でも小胞体シャペロンが誘導されるか調べる。
哺乳類における未知の(第4の)タキキニン系ペプチドの検索とその生化学的研究

タキキニンペプチドは痛覚に関与したり、脳神経系において神経伝達物質として働くなどその生理作用は極めて広く、これまでに多くの精力的な研究が行なわれている。我々は、これまでの脳神経系で作動する生理活性ペプチドの系統的検索研究において、それまで哺乳類唯一のタキキニン系ペプチドとして同定されていたサブスタンスP以外に、新しく2種類の哺乳類タキキニンとしてニュ-ロメジンK,ニュ-ロメジンLを単離,構造決定し、哺乳類におけるタキキニン系ペプチドが、これらの3種類のペプチドにより構成されることを明らかにしている。本研究において、我々は最近、カエル(Rana catesheiana)の脳および消化管組織中の生理活性ペプチドの系統的検索を行ない、モルモット回腸収縮活性を指標として新しい4種類のタキキニン系ペプチド;ranatachykinin(ラナタキキニンA,B,C,D)を単離,構造決定した。このうちラナタキキニンA,B,Cについては、C末端部に活性発現に重要と考えられているーPheーXーGlyーLeuーMetーNH_2という既知のタキキニン系ペプチドに共通な構造を有している。しかし、ラナタキキニンDは、そのN末端構造はラナタキキニンAと類似するが、C末端部構造がーPheーXーAlaーProーMetーNH_2で、共通配列のGlyーLeuがAlaーProに置換されており、既知のタキキニンとは著しく異なる特徴的な構造であることが明らかになった。それゆえ既知のタキキニン系ペプチドで開発したラジオイムノアッセイ(RIA)系では検出できず、哺乳類にもこれに対応する第4の未知のタキキニンペプチドが存在する可能性が大きいと考えられる。現在、このラナタキキニンDを中心にして、これに対して作成した抗体を用いて、ブタ脳および消化管抽出物についてのスクリ-ニングを行なう一方,cDNA解析の面からも、哺乳類における新しいタキキニンの単離、構造決定の研究を進めている。
奇形腫形成ならびに組織分化における分子機構の解明

奇形腫は、その腫瘍内に一見正常組織と思えるような23胚葉由来の様々な組織を内在させており、その特異性から学術的な研究対象として古くから注目されている腫瘍である。この腫瘍の起源とされている細胞が始原生殖細胞(Primordial Germ Cells ; PGC)である。PGCは胎生期の間に生殖細胞へと分化することで全能性を失うが、PGCが分化せずに残存すると奇形腫が発生するとされている。しかし、我々は分化した生殖細胞を培養した精子幹細胞(Germline Stem Cells ; GSC)が非人為的に全能性を回復することが稀にあることを見出した。すなわち、奇形腫はPGCの残存以外にも、分化したはずの生殖細胞が全能性を回復してしまうことで起きる可能性があることが示唆された。本研究の目的は、生殖細胞の非人為的な全能性の回復についての分子メカニズム、またPGCから生殖細胞への分化についての分子メカニズム、両細胞における増殖に対しての分子メカニズムについて理解を深めることにより、生殖細胞の性質であると考えられる「全能性回復のしやすさ」についての分子的理解を深めることである。また、本研究の意義は生殖細胞以外では非人為的に全能性を回復する例は見当たらず、全能性を再獲得させるためには遺伝子導入などによりips細胞を作製しなければならない。より人為的な誘導を避けながら全能性を獲得した細胞を得るための理論を構築できることにある。その一環として、放射線で誘導されるGSCアポトーシスの分子機構についての研究を深めた。すなわち、p53-Trp53inp1-DR5 pathwayが非常に重要な役割を担っていることが発見された。これにより、特にTrp53inp1が酸化ストレスに対する応答に関連している分子であることから、ストレスとGSCとの関係について更に理解を深める必要があることが示唆された。目標とすべき内容について、精子幹細胞の分野ではあまり扱われていなかった遺伝子の効果を追究し、長らく不明であったGSCの放射線によるアポトーシスに関与するシグナル経路を同定することができたため。血液幹細胞では、細胞内に浸潤する不要な化学物質(Hoecnst等)を積極的に細胞外へ汲み出す細胞群(Side Population細胞:SP細胞)が存在し、幹細胞としての機能を強く有すると言われている。そこで、同様のことが精子幹細胞で認められるかを検討した。その結果、ex vivoでの精子幹細胞とin vitroのGS細胞のどちらでも、SP細胞の出現自体がstochasticであり、汲み出すためのATPポンプをコードする遺伝子(Abcg2)を強制発現させたことによるGS細胞の幹細胞能上昇は認められなかった。このことから、SP細胞の概念はGS細胞には当てはまらないと言える。また、表面抗原による精子幹細胞の濃縮法についても検討した。これまでのトリブシンによる細胞単離法ではあまり濃縮に適する表面抗原を同定できなかった。報告者はその原因がトリプシンによる表面抗原自体の破壊にあると考え、トリプシンを使わずに細胞を単離するバッファーを調合することに成功した。このバッファーはトリプシンを用いる場合に比べ単離能は若干劣るものの、ex vivoでの細胞単離にも十分使用可能である。また、FACS法などにより、トリプシンを使用していては発現を認めることができなかったNectin3をはじめとする種々の表面抗原が発現していることを認めることができた。そこで、今年度は生殖細胞の増殖に着目し、その分子機構を解明するという計画に従いFGF2シグナルとGS細胞増殖との関連を中心に研究を進めた。その結果、FGF2はMAPKシグナルを活性化し、生殖細胞の増殖に重要であるとされる転写因子であるEtv5の発現、さらにはEtv5によるBcl6bの発現を促進させることが判明した。また、MAPKを常時活性化させたGS細胞や、Etv5あるいはBcl6bを過剰発現させたGS細胞は、FGF非存在下でも長期培養できることが明らかとなった。さらに、MAPKを常時活性化させた場合とBcl6bを過剰発現させたGS細胞は、精細管内に移植することによって生殖細胞腫が形成された。以上のことから、FGF2-MAPK-Etv5-Bcl6bシグナルカスケードがGS細胞の増殖に大きく寄与していることを証明することができた。

また、本研究の意義は生殖細胞以外では非人為的に全能性を回復する例は見当たらず、全能性を再獲得させるためには遺伝子導入などによりips細胞を作製しなければならない。より人為的な誘導を避けながら全能性を獲得した細胞を得るための理論を構築できることにある。その一環として、放射線で誘導されるGSCアポトーシスの分子機構についての研究を深めた。すなわち、p53-Trp53inp1-DR5 pathwayが非常に重要な役割を担っていることが発見された。これにより、特にTrp53inp1が酸化ストレスに対する応答に関連している分子であることから、ストレスとGSCとの関係について更に理解を深める必要があることが示唆された。精子幹細胞の自己複製能について、増殖因子の1つであるFgf2がどのように関与しているかという分子機構を明らかにしたことは、全体の目的である奇形腫を形成する細胞の増殖にも大いに関与していることが期待され、その進展が認められたため。目標とすべき内容について、精子幹細胞の分野ではあまり扱われていなかった遺伝子の効果を追究し、長らく不明であったGSCの放射線によるアポトーシスに関与するシグナル経路を同定することができたため。奇形腫形成の要因となる刺激について、DNAに損傷が起きた際の精子幹細胞やGS細胞の反応を見ることで、奇形腫形成における分子機構の一端を解明することができると思われるので、放射線照射実験を加え、DNA損傷によるストレスへの反応を他の幹細胞や体細胞と比較することを試みる。
一般住民における非アルコール性脂肪肝の進展に関する分子疫学研究

本年度は、8年間の非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)の変化に注目し、持続もしくは消失に関与している要因を明らかにするために前向き研究を行った。経過中の脂肪肝発現と消失時には腹部超音波検査での脂肪肝判定にバラツキが混在することから、脂肪肝有り無しの定義を、それぞれ2回連続して有り、もしくは無しとした。対象者は、あまみ島嶼地域の一般住民健診受診者の男女3,069名のうち、8年後まで追跡できた831名(男296名、女535名)である。8年間のNAFLD発生は23例/463例(5.7%)、消失例は62例/256例(24.2%)であった。さらに、肝線維化マーカーである血清中M2BPGiとTypeIVコラーゲン7sを用いて、脂肪肝の発生・持続・消失時における肝線維化の程度について、女性228名を対象に前向きに観察した。ベースライン時のM2BPGiとTypeIVコラーゲン7sは、脂肪肝の発生・持続・消失群で対照群に比し高値を示した。5年後の変化では、M2BPGiは持続群と発生群で対照群より有意に上昇し、消失群では持続群より変化量が小さいもの、値は対照群と同様に上昇した。一方、TypeIVコラーゲン7sでは有意な変化が認められなかった。このことより、肝臓の繊維化は、脂肪肝が無くても年齢とともに進むこと、NAFLDの存在は肝線維化をより進行させること、脂肪肝が消失しても線維化は年齢ともともに進行することが示唆された。肥満やメタボリック症候群の増加に伴い増加しているNAFLDの分布は、男性で40歳代、女性で60歳代をピークに増加から減少に転じることが報告されているが、本研究の結果から、NAFLDは消失しても、年齢とともに肝線維化進展は持続していることが示唆され、NAFLD発生を防ぐことが、肝繊維化予防のためにも重要であることが示唆された。非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)は、肥満やメタボリック症候群の増加に伴い増加しつつある。この中には脂肪肝炎や肝硬変、肝癌に進展するものがあるが、その病態は必ずしも明らかではなく、ハイリスク者や進展予防に関するエビデンスは限られている。本研究では、一般住民における非アルコール性脂肪性肝疾患の進展に関わる環境・宿主要因を明らかにし、その進展予防対策に質することを目的とする。20052009年と2012年の日本多施設コホート研究ベースライン調査に参加し、健診で腹部エコー検査を受けた男女6,609名について、生活習慣情報、健診結果、動脈硬化検査(CAVI)と腹部超音波検査結果からなるデータセットを完成させた。まず、横断的研究を行い、ベースライン時における、要因と脂肪肝リスクとの関連を検討した。その結果、BMIと飲酒がそれぞれ独立して、脂肪肝リスクと関連していることが明らかになった。次に、NAFL(非アルコール性脂肪肝)を症例、脂肪肝を有さない対象者を対照として、症例・対照研究を行った。その結果、男女ともにBMIと脂質異常がNAFLと有意に関連していることが明らかになった。さらに、脂肪肝の病態進展(肝線維化)の程度を評価するための指標としてFIB4 index値を用いて、3グループ(低・中・高)に分類し、NAFLと生活習慣病や生活習慣との関連についてロジスティック回帰モデルを用いて、オッズ比で見積もった。その結果、男女とも高年齢と高血圧あり、男性では多い日常生活活動量、女性では喫煙ありが、高いFIB4 index値と関連していることが認められた。そして、これら要因は脂肪肝の進展に関連している可能性が示唆された。一方、動脈硬化の指標であるCAVI値とFIB4 index値との関連は認められなかった。当初計画に加え、今年度は、追跡全期間中に健診で受けた超音波検査結果情報を継続的に収集するために、上記対象者全員に情報提供に関しての依頼文を送付した。オプトアウト形式での既存資料収集に関して、拒否されたのは6名(0.09%)のみであった。また、SNP解析は対象者を絞り込んで行う予定であり、そのためのDNA抽出は順調に進んでいる。NAFLD発症の関連要因について検索するために、ベースライン調査と5年後の第二次調査の2つのポイントにおける前向き研究のデータセットを完成させた。対象者は、あまみ島嶼地域の一般住民1,711名である。ベースライン調査時に、腹部超音波検査で脂肪肝と判定された対象者は747名(43.7%)、第二次調査では696名(40.7%)であった。ベースライン時と5年後の脂肪肝有無の変化について比較したところ、脂肪肝無し継続が791名(82.1%)、脂肪肝無しから有りに変化が173名(18.0%)、脂肪肝有り継続が523名(70.0%)、脂肪肝有りから無しに変化が224名(30.0%)であった。脂肪肝無しから有りへの変化に比べ、脂肪肝有りから無しへの変化の割合が大きく、腹部超音波検査による脂肪肝の診断に大きなバラツキが存在している可能性が示唆された。今後、バラツキの影響をできるだけ排除して脂肪肝を定義するために、経時的な複数回の腹部超音波検査結果をもとに脂肪肝の評価を行う必要がある。そして、脂肪肝を経時的に観察することで、より正確なNAFLD/NASHの進展に関連する要因を明らかにできるのではないかと考えられた。

2005年から2016年までの島嶼地域対象者3,720名における腹部超音波検査結果を含む全ての健診結果をオプトアウト形式で同意を得た上で入手し、データベースを完成した。現在、解析を進めており、より正確な脂肪肝の定義を新たに作成する。また、2017年に本土地域における第二次調査が終了したので、同地域対象者2,618名における腹部超音波検査結果を含む全ての健診結果について、同じくオプトアウト形式で同意を得た後、健診機関にデータ提供を依頼中である。宿主要因としてのSNP解析についてもBAR、BAR3、PNPLA3についてTaqMan PCRを用いて1000人の解析を行い、あわせてDNA抽出も継続して行っている。本年度は、8年間の非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)の変化に注目し、持続もしくは消失に関与している要因を明らかにするために前向き研究を行った。経過中の脂肪肝発現と消失時には腹部超音波検査での脂肪肝判定にバラツキが混在することから、脂肪肝有り無しの定義を、それぞれ2回連続して有り、もしくは無しとした。対象者は、あまみ島嶼地域の一般住民健診受診者の男女3,069名のうち、8年後まで追跡できた831名(男296名、女535名)である。8年間のNAFLD発生は23例/463例(5.7%)、消失例は62例/256例(24.2%)であった。さらに、肝線維化マーカーである血清中M2BPGiとTypeIVコラーゲン7sを用いて、脂肪肝の発生・持続・消失時における肝線維化の程度について、女性228名を対象に前向きに観察した。ベースライン時のM2BPGiとTypeIVコラーゲン7sは、脂肪肝の発生・持続・消失群で対照群に比し高値を示した。5年後の変化では、M2BPGiは持続群と発生群で対照群より有意に上昇し、消失群では持続群より変化量が小さいもの、値は対照群と同様に上昇した。一方、TypeIVコラーゲン7sでは有意な変化が認められなかった。このことより、肝臓の繊維化は、脂肪肝が無くても年齢とともに進むこと、NAFLDの存在は肝線維化をより進行させること、脂肪肝が消失しても線維化は年齢ともともに進行することが示唆された。肥満やメタボリック症候群の増加に伴い増加しているNAFLDの分布は、男性で40歳代、女性で60歳代をピークに増加から減少に転じることが報告されているが、本研究の結果から、NAFLDは消失しても、年齢とともに肝線維化進展は持続していることが示唆され、NAFLD発生を防ぐことが、肝繊維化予防のためにも重要であることが示唆された。今後、健診機関から腹部超音波検査結果を含む健診結果を入手し、よりきめ細かい情報をもとに、脂肪肝の進展に関する環境・宿主要因の解析を進めていく。より正確な脂肪肝の定義を決定した上で、症例と対照を抽出し、追加のDNA解析と保存血清を用いてHNP-1、タイプIVコラーゲン、microRNA34aの測定を行う。測定後、環境要因、宿主要因、肝線維化と比較、検討し、NASH/NAFLDの進展予測に関して解析を行う。
褐藻類における機能性オリゴ糖の生産に向けた有用酵素の機能解析及び改変

本研究課題は機能性を有するラミナリオリゴ糖の基本骨格を明らかにし、それにより糖質の構造と機能発現の関連性の解明を目的としている。具体的には、酵素工学的手法によりラミナリオリゴ糖を調製する方法の開発および高い機能性を有する基本構造の作製を目指した。本年度は採用の3年目であり、研究は順調に進捗した。昨年度に引き続き水産軟体動物のβ-グルカナーゼから得られた新たな糖質結合ドメインの機能解析を行った。これまでに本ドメインはアルギン酸などの酸性多糖に結合することが明らかとなったが、その結合の強さは明らかでない。その解析のため、Birte Svensson教授が在籍するTechnical University of Denmarkで研究活動を行った。当教授は酵素・タンパク質工学が専門であり、現在は様々な糖質とタンパク質の相互作用について研究している。当該年度における研究目標はその糖質認識ドメインと糖質の相互作用の強さを明らかにすることである。可溶性糖質とタンパク質の結合力の測定はアフィニティーゲル、表面プラズモン共鳴、等温滴定型カロリメトリーが挙げられる。アフィニティーゲルはタンパク質のテーリングが起こり正確な結合力を出すのが難しく、等温滴定型カロリメトリーは主に1:1の結合力を求める装置であり、本タンパク質と糖質の相互作用は凝集を引き起こすため正確な値が得られなかった。表面プラズモン共鳴ではその結合力を評価でき、解離定数2×10-8 (M)を求めた。また本ドメインは塩により結合能が異なる。表面プラズモン共鳴は塩濃度の異なる条件下での測定も可能であり、その評価についても本装置で測定が可能であることが分かった。28年度が最終年度であるため、記入しない。β1→3グルカンは免疫賦活化能や抗腫瘍性作用を持つ多糖である。同様にβ1→3グルカンのオリゴ糖のラミナリオリゴ糖も生理活性を持つ。多糖およびオリゴ糖における活性の発現は糖質認識タンパク質デクチン-Iで発現するためオリゴ糖による解析は有意である。ラミナリオリゴ糖の作製には褐藻類の貯蔵多糖であるラミナリンを酵素的に分解することで得られるが、これまでの酵素は賦活化能を持たないサイズのオリゴ糖まで分解した。そこでラミナリオリゴ糖の基本骨格を作製するため限定分解活性を有する酵素の取得を試みた。GH64はβ1→3グルコシド結合からなる多糖を5糖単位に切断するユニークな酵素であり、本酵素のクローニングを行った。放線菌Kribbella flavida DSM 17836よりGH64酵素(KfGH64)の取得に成功した。KfGH64の至適温度は45°C、至適pHは5.5であった。各pH条件下で4°C、24時間のインキュベートによりpH安定性を検討した結果、pH 4.0-7.0で安定であった。40°Cおよび37°Cで4日間インキュベート後の残存活性はそれぞれ80%と100%であった。KfGH64のラミナリン加水分解物を分析したところ、最も短い鎖長は5糖でありそれ以上の様々なサイズのものを生成した。このことからKfGH64は分枝を持つ適度な長さのオリゴ糖の調製に適することが分かった。しかしながらラミナリンは高価であるため、安価なβ1→3グルカンポリマーであるカードランからオリゴ糖の調製を試みた。カードランの加水分解を促進させるためカードランの前処理条件を検討した。その結果、もともと10%以下の分解率が最終的に70%以上となった。カードランの加水分解物は生成物の80%は5糖であり効率的なオリゴ糖の生産法を確立できた。β-(1,3)-グルカンは免疫賦活化能や抗腫瘍性作用など様々な生理活性を持つ糖質である。その生理活性は、糖鎖長の違い、β-(1,6)-結合、およびそれらによる構造の違いが関与していると考えられているが、糖質構造と生理活性の発現メカニズムの関連性は不明な点が残る。その解明には構造が明らかなオリゴ糖を酵素的に作製してその機能性を明らかにすることが自然免疫発現の仕組みを知るのに有効な手段と考えられた。オリゴ糖作製用に用いた水産軟体動物の酵素は相同性検索やモチーフ検索では機能が判定できなかった機能未知の領域があり、これが生成物の特異性に影響を与えているかどうか評価した。本領域(AkCBM)の機能性を糖質結合能と推測し、異種発現系にてAkCBMのみを生産し機能解析する計画を立案した。AkCBMは大腸菌発現系により作製が可能であり、予備実験では不溶性のβ-(1,3)-グルカンに結合せず、不溶性のアガーやキシランといった海藻に含まれる糖質に対して結合することが分かった。しかしアガーやキシランに対する結合力は一般的なCBMの結合力と比較して弱く、AkCBMは他の糖質に結合する可能性(真の結合糖質の存在)が考えられた。そこで可溶性糖質に対する結合能をアフィニティーゲル分析によって検討した。その結果AkCBMはウロン酸を持つ多糖に強く結合することから「ウロン酸結合型CBM」であることが明らかになった。