hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
マウス迷走神経終末を順行性に標識できる手法の確立―隠れ糖尿病発症機構の解明―

研究目的は、隠れ糖尿病の発症機構の解明である。インスリン分泌の調節因子として4型メラノコルチン受容体(MC4-R)が注目されている。MC4-R GFPマウスの形態学的な解析より、MC4-R発現神経が延髄迷走神経背側運動核から、直接、膵β細胞へ投射し、インスリン分泌を調節している可能性が示唆された。そこで、マウス迷走神経終末を順行性に、効率良く標識する方法を検討した。その結果、高輝度蛍光物質を標識した順行性トレーサーとIVIS Imaging systemを併用すれば、検討時間の節約ばかりか、実験動物の削減をももたらす可能性が出てきた。トレーサーの使用条件は決定していなく、今後の課題である。本研究は、食後の血糖上昇に応じた瞬時のインスリン分泌不足が原因と考えられている「隠れ糖尿病(=初期の耐糖能異常症)」のメカニズムを探るため、その一環として、延髄の迷走神経背側運動核を起点とする副交感神経が、膵臓のインスリン分泌細胞(β細胞)に連絡する神経回路を解剖学的に明らかにする方法を確立することを目的としている。これまでのととろ、その神経回路の解析には、順行性の神経標識トレーサー、Phaseolus vulgaris-leucoagglutinin(PHA-L)、Biotinylated Dextran(BDA)、レポーター遺伝子としてLacZを用いた組換えアデノウイルス(Ad-LacZ)、Fluoro-ruby(FR)などを圧注入あるいは電気泳動的に注入し、生存後、膵臓を、ホルマリンなどのアルデヒド系固定剤で化学固定、その組織切片を作製後、さらに、その切片上で、上記神経標識トレーサーに対する抗体を用いるなどして免疫組織染色を施さなければ神経標識トレーサーの膵臓への到達の有無や到達部位を知ることはできなかったが、今年度は、トレーサーが目的とする内臓部位へ到達していることを確認した後に初めて動物を犠牲にし、解析を進行することの可能になるとても効率の良い方法を検討するに至った。この方法によって、時間的な効率化がもたらされるばかりか、実験動物の匹数の大幅な減少が実現可能になるものと考えられる。近年増加傾向にある「隠れ糖尿病(空腹時の血糖値は正常でも食後の血糖値が正常値よりも上昇する病態で、糖尿病に移行する可能性が高い。)」は「初期の耐糖能異常症」に位置づけられ、食後の血糖上昇に応じた瞬時のインスリン分泌不足が原因と考えられている。また、その「耐糖能の低下」は迷走神経の切除により惹起されることが報告されているが、発症機構については不明な点が多い。そこで、野生型のマウスを用い、迷走神経がどのような神経回路を介して膵臓のインスリン分泌細胞(β細胞)と連絡しているのかを解剖学的に明らかにするため、その迷走神経終末を順行性に可視化できる条件を探索することにした。その神経標識で用いる順行性トレーサーとしては、Phaseolus vulgaris-leucoagglutinin(PHA-L)(電気泳動)、Biotinylated Dextran Amine(BDA)(電気泳動、圧力)、レポーター遺伝子としてLacZを用いた組換えアデノウイルス(Ad-LacZ)(圧力)、Fluoro-ruby(FR)(電気泳動、圧力)などが候補として考えられている。これまでのところ、BDAの電気泳動的な注入(生存期間2週間)による可視化(BDAの局在については、蛍光色素標識Streptavidinによる組織化学)を試みたが、膵臓内部への到達条件すら見つかっていない状況である。その他の順行性トレーサーの検討についてはこれからである。本研究の目的は、2つある。1つは、隠れ糖尿病の発症メカニズムを探ることである。隠れ糖尿病では、空腹時の血糖値は正常だが、食直後、インスリン分泌が間に合わないために一時的にせよ血糖が著しく上昇してしまう病態を呈する。インスリン分泌は、主に、延髄に細胞体をもつ迷走神経の指令によって調節されているが、その神経がどのような経路を通して膵臓のβ細胞に指令を与えているのかは、上記の迷走神経終末の存在部位がよく分かっていないため不明であり、その結果として、隠れ糖尿病の発症メカニズムも分かっていないと言っても過言ではない。本研究の2つ目の目的は、その迷走神経終末を同定することである。従来は、順行性トレーサーを注入、いくつかの生存期間を適当に設定せざるをえず、しかも、マウスを犠牲にし、化学固定をおこなった上で組織化学的にトレーサーの存在部位を同定するしかなかった。しかし、最近、マウスを生きたまま、順行性トレーサーの存在部位を可視化することのできる画期的な方法が開発されていることを見出し、本研究に導入可能か否かをより具体的に検討するに至った。その結果、順行性トレーサーを注入する前に、高輝度のプローブをトレーサーにうまく結合することができれば(両者を化学的に結合させることの可能なキットも開発されている)、上記の方法を併せ用い、非常に効率的にトレーサーの存在部位を同定することが可能であることが分かってきた。本研究は、近年増加傾向にある「隠れ糖尿病」の発症機構の解明が目的であった。「隠れ糖尿病」は、空腹時の血糖値が正常でも食後の血糖値が正常値よりも著しく上昇する病態であり、糖尿病に移行する可能性が高い、「初期の耐糖能異常症」に位置づけられている。その発症の原因としては、食後の血糖上昇を抑えるべくインスリンの分泌が適切におこなわれていないためと考えられている。膵β細胞からのインスリン

分泌調節は、延髄に起始核をもつ迷走神経が担っているが、これまでのところ、これを含む副交感神経回路は、途中、必ず、神経節を介して連絡しているものとされてきた。しかしながら、強力な食欲抑制因子の受容体として知られているメラノコルチン4リセプターを可視化することのできるGFPマウスを用いた形態学的な解析からは、上記迷走神経が、神経節を介することなく、直接に膵β細胞へ情報を伝達している可能性が考えられるようになった。この可能性を探るためには、順行性の神経標識トレーサーを延髄の迷走神経背側運動核に注入し、それが膵β細胞の近傍に到達していることを形態学的に確認する必要があるが、今のところ、上記神経標識トレーサーを、上記迷走神経の終末に到達させるための適切な注入条件が見出されていないため、その証拠は得られていない。さらに多種類のトレーサーを用いて、それらの濃度、注入方法(圧注入、および、電気泳動的注入)、および、生存時間を検討する必要がある。研究目的は、隠れ糖尿病の発症機構の解明である。インスリン分泌の調節因子として4型メラノコルチン受容体(MC4-R)が注目されている。MC4-R GFPマウスの形態学的な解析より、MC4-R発現神経が延髄迷走神経背側運動核から、直接、膵β細胞へ投射し、インスリン分泌を調節している可能性が示唆された。そこで、マウス迷走神経終末を順行性に、効率良く標識する方法を検討した。その結果、高輝度蛍光物質を標識した順行性トレーサーとIVIS Imaging systemを併用すれば、検討時間の節約ばかりか、実験動物の削減をももたらす可能性が出てきた。トレーサーの使用条件は決定していなく、今後の課題である。本研究を効率的に進めるための新しい方法を、より具体的に検討していたたため、遅れが生じた。組織学順行性トレーサーと高輝度プローブとの結合を成功させ、さらに、そのトレーサーを用いて、迷走神経終末の存在部位を肉眼的に可視化し、そこではじめて化学固定を行い、トレーサの存在部位における形態を電子顕微鏡レベルまで明らかにしたい。本研究を進めるための新たな方法の検討を行っていたことと、他の研究(13.研究発表)も行っていたため、本研究の実質的な進行に遅れが生じた。脳定位固定装置について、申請時の外国製と最近発売された国産機種との比較検討(実際に、業者から両者を借用)に追われていたため。トレーサーの存在部位を同定するにあたり、従来はマウスを解剖して同定しなければならなかったが、新型の機器(IVIS)が開発されたことにより、マウスを生きたまま同定することができるようになり、研究を効率的に進められるようになった。そのため、研究計画を変更してトレーサーの存在部位の同定を行うことにしたため、未使用額が生じた。今年度は、従来よりも格段に効率的な方法を検討することができた(9.研究実績の概要)。残り少ない時間に、より良い成果を挙げるためにも、上記解析方法を取り入れ、順行性トレーサーの最適条件を見出すことを第一目標とする。生存期間が長いとされる順行性トレーサーPHA-Lによる検討を優先させる。上記の新型機器を用いる方法では、順行性トレーサーと高輝度プローブとの結合が必要不可欠である。
糸球体上皮細胞(タコ足細胞及びボウマン嚢上皮細胞)の機能と病的反応の検討

1.糸球体上皮細胞の成熟と老化ラットにおいて,糸球体上皮細胞は基底膜形成時期に一致し,post-mitotic細胞となり,同時期に中間系FilamentのViemntinが出現し,形態的に足突起形成が確認される。この時期以降糸球体上皮細胞数は変化なく,基底膜延長に対しては突起の延長により基底膜を被覆する。post-mitotic細胞となった後,糸球体あたりの糸球体上皮細胞数は一定で,種々の病態において超微形態的に細胞質内の小器官に変化が観察される。したがって,糸球体上皮細胞の変性老化現象の存在が示唆される。2.糸球体上皮細胞の培養糸球体上皮細胞の培養系には2種類の細胞が報告されているが,超微形態,細胞骨格蛋白の解析から,大型樹枝状細胞が,in vivoの糸球体上皮細胞由来である。この培養細胞は細胞増殖マーカーのPCNAが染色されるが,多核化しても,決して細胞数の増加は観察されない。in situの上記性質に一致する。3.糸球体上皮細胞と塩基性線維芽細胞増殖因子(b-FGF)糸球体上皮細胞の増殖因子としてしられるb-FGFとそのreceptorは糸球体に存在することをNorthern Blottingで確認した。糸球体成熟段階で,S時期には糸球体上皮細胞,Bowman嚢上皮細胞,近位尿細管にb-FGFの染色が観察されるが,成熟が進むにつれて,近位尿細管に限局してくる。しかし,糸球体上皮細胞の障害,変性が進行するにつれて,再度糸球体上皮細胞質内にb-FGFが染色されてくる。4.今後の展開不可逆的糸球体硬化過程のtriggerとして,基底膜からの糸球体上皮細胞の剥離減少に注目してきた。今後は,上記結果から,糸球体上皮細胞の変性,脱分化に注目し検討する。また,b-FGFによるintegrinの発現,c-fos,c-junを介しての細胞内情報伝達系について,分節状硬化病変形成に関連して解析する。
充分な見出し項目数を有する学習者向け日日辞典のコンセプト提案

本研究は、「充分な見出し項目数を有する学習者向け日日辞典」(以下、本辞書)のコンセプトを提案することを目的としており、それに向けて、見出し語リスト、定義語彙、各項目内の構造の3点を検討している。見出し語リストについては、語数を決めたうえで、具体的なリスト作成に入る。見出し語数は、既存の日本語関連辞書の一部から必要と思われる語を抽出し、その割合から逆算する。たとえば、既存の辞書の見出し語数が仮に5万語だとしよう。5万語のうち100語を抽出し、その100語中、本辞書に必要な見出し語が30語だった場合、逆算すると本辞書に必要な見出し語数は元の辞書の30%に当たる1万5千語となる。この試算方法により、本辞書には約3万語の見出し語が必要であるという結論に至っている。実際の見出し語リスト作成には、筑波ウェブコーパスから抽出された『NLT 1.30頻度リスト』を使用する。このリストには、約10万語が含まれているため、そこから頻度や日本語非母語話者の辞書使用場面を考慮しながら、約3万語を抽出する。現在は、頻度順位11000位の語と頻度順位900110000位の語の中から抽出中である。定義語彙については、野呂・徳田(2007)が提出した定義語彙リストを使って、実際に語義記述を進めながら調整する。リストの使用についての許可は、野呂氏から非公式に得ているが、作業は未着手である。各項目内の構造については、難易度、表記、発音・アクセント、語義、用例、品詞、活用形、文法情報、選択制限、コロケーション、語種、レジスター、ニュアンス、慣用表現、複合語、派生語、類義語、反意語、文化的情報、語源を組み込む。これまで、実験的に18語を記述したが、今後、さらなる記述を試み、構造を検討する。2017年度は、研究代表者が別の辞書編纂に時間を取られていたため、本研究が大幅に遅れていたが、2018年度は、その辞書の編纂・出版も完了し、本研究に力を入れることができ、遅れを取り戻しつつある。しかしながら、研究代表者は、非常勤講師であり、現在、家庭の経済的理由のため、授業数を増やして収入を増やさざるを得ない状況にある。特に2019年度の前期は週13コマの授業があり、7月末までは十分な時間が取れないが、8月以降は、さらに本研究を進めていけると考えている。本辞書に必要な見出し語リストの語数については、一応の結論が出ているので、実際のリスト作成と語義記述を進める。「研究実績の概要」で述べたように、現在、見出し語リスト作成に着手している。具体的には、代表者・分担者・協力者が本辞書に必要と考える語を『NLT 1.30頻度リスト』から抽出するわけであるが、現在、各自の日常業務が煩雑であり、若干の遅れが出ている。夏季休暇には遅れを取り戻すべく対策を講じたい。見出し語リストが完成した後に、語義を記述しながら、定義語彙と項目内の構造を検討し、確定していく。見出し語リストの進捗によっては、本研究を1年延長することも視野に入れておきたい。昨年度は、「充分な見出し項目数を有する学習者向け日日辞典」のコンセプトについて提案する準備段階の活動を行い、研究発表を行う段階には至っていない。まず、代表者以外は、辞書編纂に関わった経験がないため、辞書作りの基本的事項について、代表者・分担者・協力者が合意を形成できるように、打ち合わせ・メーリングリストでの情報交換と各自の研鑽を進めた。一方で、全員が辞書編纂に関連する日本語教育についての知見を得ることに努めた。また、留学生の辞書使用の現状を把握する必要があると考え、アンケートのプロトタイプ調査を実施した。辞書編纂に際しては、見出し項目のカバーする範囲や数、配列の方法などを含むマクロ構造と、各項目内に記載すべき情報や語義記述の方法などを含むミクロ構造の両方の視点を考える必要がある。本研究においては、「充分な見出し項目数」を課題としているため、まずは、何をもって「充分」と言えるのかについて、理論的かつ実践的な方法論を模索し始めた。具体的には、「文章中の単語の出現頻度の数と順位は一定である」というジップの法則の応用、国語辞典のみならず各言語の代表的な辞書の項目数の調査、固有名詞を含む百科的項目の必要性の調査、学習者の視点を考慮したN1など日本語検定試験の語彙項目の調査などを検討している。ミクロ構造については、Oxford Advanced Learners DictionaryやLongman Dictionary of Contemporary Englishが基本語3000語で、各語義の記述をしている点を参考に、日本語でも同様の方法が可能であるかどうかを検討するが、これは「充分な見出し項目」の後に考察することとした。上記の活動と並行し、代表者は、科研とは別の辞書編纂を進めてきた。その辞書の情報を、著作権上の問題がない形で使用できるかどうかについても検討中である。最大の理由は、上述した、科研とは別の辞書編纂に、研究代表者が多くの時間を取られたためである。明治時代に編纂された、近代的国語辞典の嚆矢とも言える大槻文彦の『言海』を始めとして、辞書編纂は緻密かつ膨大な作業が要求され、予定が大幅に遅れることもしばしばである。研究代表者が編集主幹となっている、その辞書も例にもれず、当初の予定から1年近く遅れることとなり、それが現実的に本研究の活動に大きく影響を与えた。

幸い、その辞書の編纂作業は終了し、研究代表者もそこで得た手法やデータを参考としながら、本研究に注力できると考えている。本研究は、「充分な見出し項目数を有する学習者向け日日辞典」(以下、本辞書)のコンセプトを提案することを目的としており、それに向けて、見出し語リスト、定義語彙、各項目内の構造の3点を検討している。見出し語リストについては、語数を決めたうえで、具体的なリスト作成に入る。見出し語数は、既存の日本語関連辞書の一部から必要と思われる語を抽出し、その割合から逆算する。たとえば、既存の辞書の見出し語数が仮に5万語だとしよう。5万語のうち100語を抽出し、その100語中、本辞書に必要な見出し語が30語だった場合、逆算すると本辞書に必要な見出し語数は元の辞書の30%に当たる1万5千語となる。この試算方法により、本辞書には約3万語の見出し語が必要であるという結論に至っている。実際の見出し語リスト作成には、筑波ウェブコーパスから抽出された『NLT 1.30頻度リスト』を使用する。このリストには、約10万語が含まれているため、そこから頻度や日本語非母語話者の辞書使用場面を考慮しながら、約3万語を抽出する。現在は、頻度順位11000位の語と頻度順位900110000位の語の中から抽出中である。定義語彙については、野呂・徳田(2007)が提出した定義語彙リストを使って、実際に語義記述を進めながら調整する。リストの使用についての許可は、野呂氏から非公式に得ているが、作業は未着手である。各項目内の構造については、難易度、表記、発音・アクセント、語義、用例、品詞、活用形、文法情報、選択制限、コロケーション、語種、レジスター、ニュアンス、慣用表現、複合語、派生語、類義語、反意語、文化的情報、語源を組み込む。これまで、実験的に18語を記述したが、今後、さらなる記述を試み、構造を検討する。2017年度は、研究代表者が別の辞書編纂に時間を取られていたため、本研究が大幅に遅れていたが、2018年度は、その辞書の編纂・出版も完了し、本研究に力を入れることができ、遅れを取り戻しつつある。しかしながら、研究代表者は、非常勤講師であり、現在、家庭の経済的理由のため、授業数を増やして収入を増やさざるを得ない状況にある。特に2019年度の前期は週13コマの授業があり、7月末までは十分な時間が取れないが、8月以降は、さらに本研究を進めていけると考えている。第1・第2ステージ(5月1月)計画段階では、「充分」というに値する語数を第1ステージで決め、その内容を第2ステージで決めるという方法を考えていた。しかしながら、昨年度の議論の中で、語数と内容は同時に決定していくべきものであることが認識できた。その決定に向けて、ジップの法則を応用するためのコーパスの選定とそれに必要なツールの調査、代表的辞書の項目数の調査、超級レベルのインフォーマントにとっての未知語の調査、固有名詞を含む百科的項目の検討(研究代表者が編集主幹となった辞書を参考に)を進めている。第3ステージ前半(1月3月)本研究で提案する辞書のミクロ構造については、研究代表者が辞書学の知識と経験に基づいてプロトタイプを提出し、研究分担者および研究協力者が日本語学および日本語教育の知見に基づいて改善していくという方法を取る。最終的には、数十語の語義を執筆する予定だが、今年度中にまずは十語程度の執筆を行いたい。
クロロフィル二次代謝産物を新規指標とした海洋の微細藻類食プロティストの生態の解明

中低緯度の貧栄養海域では,プロクロロコッカス属のピコシアノバクテリアが高度に優占することが知られているが,これら直径が0.6μm程度の微細な球形細胞については,「濾過食者である多細胞動物プランクトンが植物プランクトンを補食する」という海洋生態系の古典的なパラダイムが通用しない。本研究では,「プロティスト(原生生物)による食胞作用によるプロクロロコッカスの捕食を起点とした,より大型の生物へエネルギーを供給する食物網が存在する」という仮説を立て,プロクロロコッカスに固有な光合成色素であるジビニルクロロフィル類の捕食者による代謝産物に着目することで,その証明を試みた。まず,昨年度の航海(調査船よこすかYK14-12航海;本研究の予備検討)で得られていた三陸沖の北太平洋の外洋の表層水試料を用いて,懸濁物の化学分析と微細藻類を捕食する候補生物の分離培養を試みた。すなわち,有光層内の表層海水の懸濁物の濾過試料からは,微子藻類に起因すると考えられるクロロフィル類(Chl-a,b,,およびc類)に加えて,プロティストによるそれら微細藻類の捕食を示唆するシクロエノール類(132,173-Cyclopheophorbide a enol[cPPB-aE]および132,173-Cyclopheophorbide b enol[cPPB-bE])が検出された。これらの比率は採水深度によって優位に変化し,現場における捕食プロセスとの関連づけた議論が可能であると考えられた。また,実験室で海水試料にChl-dを産生するAcaryochloris marinaを添加したところ,顕微鏡下で微細な鞭毛虫類やアメーバ類などのプロティストによる捕食が観察されたことに加えて,未知のクロリン化合物が検出された。培養系内でChl-dのみが基質たりうること,cPPB-aEやcPPB-bEと同様なSoret帯の複雑化やQy帯の大きなred shiftなどから,この化合物は13(2),17(3)-Cyclopheophorbide d enol[cPPB-dE]であると考えられた。そこでこの化合物の標準試料を合成して化学構造を確認し,新規化合物であることを確かめた。次に,三重大学の練習船勢水丸SE1525航海(2015年)で海洋表層水を層別採水し,微細なピコ藻類捕食性のプロティストの分離を試みた。これまでに,バクテリアを捕食する二本鞭毛虫(Developayella sp.)や浮遊性のアメーバなどの分離株を作成した。現在,これら試料を用いて微細藻類の捕食実験を進めている。平成27年度は,新しい分析装置の導入(HPLC-MS/MS)とその分析系の立ち上げがひとつの大きな課題であった。残念ながら減額の影響で,当初予定していたフルセットを年度内にそろえることは困難であったが,価格交渉により,なんとか,本研究課題にどうしても不可欠な装置の主要部分を購入し,不完全な状況ではあるものの分析をおこなえる状況にこぎ着けた。これに関しては,平成28年度の予算で残りの必要モジュールを買い足して,完全な形で分析の系を立ち上げられる見通しが立った。一方で,海洋調査から得られた試料を用いて,ピコ藻類を人為的に与えることで,捕食が行われることを顕微鏡下の観察で明らかにした。また,捕食により生じると考えられるクロロフィルの代謝産物であるシクロエノール類を色素分析により確認できたことで,これを量的に評価する手がかりを得た。また,これらの実験や環境試料の定量分析で必要不可欠である2種類のシクロエノール類を合成することに成功した(ともに新規化合物)。また,上述の観察で確認された,微細藻類を捕食しうる様々な微少な無色鞭毛虫類を複数分離し,単離培養することに成功した。一部については,遺伝系統解析を行うことができた。期間の前半では,前年度の三重大学の練習船勢水丸(SE1525航海)で得られた海水試料に基づいて研究を進めた。まず,熊野灘沖表層で得られた海水に実験室で培養されたプロクロロコッカスを添加したところ,鞭毛虫など多数の無色プロティストの増殖が認められ,かつ,この培養懸濁物を高速遠心機で回収してペレットにしてHPLCを用いて分析したところ,プロクロロコッカスに特異的な色素であるジビニルクロロフィル類に加えて,それらの誘導体として,ジビニル体のCPE類(DV-CPE類)が有意な量検出された。これらを総合すると,プロクロロコッカスを餌として無色プロティストが増殖し,その捕食・消化過程においてクロロフィルの無毒化代謝産物としてDV-CPE類が産生されたと解釈された。なお,この化合物の同定には,本研究で有機合成によって得られた標準物質を用いた。さらに,同じ熊野灘表層水から分離・単離培養された鞭毛虫類3株のうち,2株では,プロクロロコッカスを餌として増殖し,かつ,DV-CPE類の産生が認められたが,残り1株では,増殖は認められるものの,DV-CPE類の産生は認められなかった。期間の後半では,中央水産研究所の漁業調査船蒼鷹丸による2度の調査航海(11月および3月)で得られた試料に基づいて研究を進めた。

これらの航海では,黒潮以南の貧栄養海域の採水試料について,線上にてタンジェンシャルフロー濾過器で限外濾過膜を用いて濃縮した後,高速遠心分離機を用いて全ての懸濁物をペレット化して,液体窒素で凍結させて持ち帰った。これらの懸濁物試料を抽出して分析したところ,ジビニルクロロフィル類とともに,DV-CPE類が検出された。さらに,試料水に船上でプロクロロコッカスの培養物を餌として与え,無色プロティストの増殖を確認し,うち4種類については単離培養株を確立し,現在も単離培養の試みを継続している。平成28年度までに,(1)プロクロロコッカスが外洋環境で様々なプロティストに捕食されている可能性が示され,(2)この過程でDV-CPE類が産生され,ある程度プロクロロコッカスの被食の指標として利用できるが,(3)全てのプロクロロコッカス捕食性プロティストがDV-CPE類を産生するわけではなく,この指標の定量的な評価には注意を要することが示された。さらに,(4)天然環境(黒潮以南の貧栄養海域)の懸濁物質中からDV-CPE類が検出されたが,これは,同化合物の天然環境からの初めての報告であるとともに,プロクロロコッカス類が天然環境下でプロティストに捕食されていることを示唆する初めての傍証であり,DV-CPE類を環境指標として開拓するという本研究のランドマーク的な成果であったと言える。また,28年度には,念願であった黒潮以南の貧栄養海域での調査を二度にわたっておこない,プロクロロコッカスとの補捕食者に関する様々な知見を得ることができた。特に,培養されたプロクロロコッカスを環境試料に投入することで,プロクロロコッカスを餌として特異的に増殖する様々なプロティストの存在を確認するとともに,それらのいくつかを単離培養することができた。さらに,タンジェンシャルフロー濾過法で限外濾過膜による懸濁粒子の濃縮と,それらの高速遠心分離機による回収という,プロクロロコッカスのような極微細なピコ藻類を含む試料の新しい採集法の確立も行うことができた。以上の研究手法の確立により,DV-CPE類を環境指標として研究していくための本格的な基盤が形成できたと考えている。加えて,平成28年度の予算で,平成27年度に購入してあった分析装置に,クロロフィル誘導体の分析のために必要な残りのモジュールを買い足すことができたため,分析の系を立ち上げられることができた。ただし,その本格的な運用は次年度に持ち越した。期間の前半では,主に,前年度の中央水産研究所の漁業調査船蒼鷹丸による2度の調査航海(2016年11月および2017年3月)で得られた試料に基づいて研究を進めた。まず,船上でプロクロロコッカスを添加した粗培養カルチャーにおいて増殖した鞭毛虫類およびアメーバ類について,分子系統学的な解析を試みた。すなわち,プロクロロコッカスを定期的に添加し続けることで粗培養カルチャーの維持をしつつ,マイクロキャピラリーを用いて単離培養株の作成を順次おこない,そのうち合計12株について,18S rDNA塩基配列に基づいて分子系統解析をおこなったところ,それぞれ無色鞭毛虫4属とアメーバ1属に分類された。さらに,粗培養カルチャーのバルク懸濁粒子に対してDNAを抽出して18S rDNAの大腸菌クローンライブラリを作成して解析したところ,6属の無色プロティストが量的に重要な構成者であると認められたが,うち2属は単離培養が未成功の生物であると考えられた。なお,先行研究などから,少なくともうち5属はCPE代謝をおこなう生物であると考えられた。
第四紀のニホンザルの進化に関する古生物学的研究

日本列島各地の第四紀以降の堆積物から発見されているニホンザル化石を整理し直し、第四紀以降、特に更新世のニホンザルの地理的変異と年代変化に関して形態学的な解析をおこなった。特に化石として残りやすい歯牙や頭骨の形態をCT機器や接触型・非接触型三次元計測器を用いて計測し、3次元データとして蓄積した。現在これらのデータを統合した解析をおこなっている。またニホンザルと近縁と考えられている東アジア、特に中国大陸のマカクザルの化石についてもデータ収集を行い、ニホンザルと比較検討しながら、ニホンザルの起源に関する研究を行った。日本列島各地の第四紀以降の堆積物から見つかっているニホンザルの化石を整理し直し、第四紀以降のニホンザルの地理的変異と年代的変化という観点から、ニホンザルの進化史に関して解析を行なった。今年度は初年度であるので、特に歯の細かな形態特徴を解析するために、ローランド社の接触式三次元計測器(Pixform Pro II)を購入し、計測を行っている。またニホンザルの歯牙化石の歯種同定を目指して、写真撮影で歯の咬合面の輪郭を抽出し、それを幾何学的形態解析法を用いて解析してみたところ、かなりの確率で歯種の区別ができることがわかった。この成果をまとめて国内の学術誌(「霊長類研究」)に投稿した(伊藤ほか、印刷中)。また岩手県花巻市の風穴洞窟と愛媛県大洲市敷水の採掘場から発見されていたニホンザル頭骨化石の内部構造をCT機器を用いて撮像し、現在その結果を現生のマカクザルや東アジア各地で見つかっていたマカクザルの頭骨化石と比較している。とくにベトナムから見つかっていたべニガオザルとされていた頭骨化石の解析結果は、論文としてまとめて国際誌(International Journal of Primatology)に掲載された(Ito et al., 2009)。また日本各地の後期更新世の地層から見つかっていたニホンザル化石の歯牙の計測をおこない、それぞれ現生種との比較を行って、ニホンザルの地理的変異と年代的変化について統計的な解析を行なった。その結果を論文としてまとめて,現在国内の学術雑誌(「哺乳類科学」)に投稿中である(西岡ほか、投稿中)。日本列島各地の第四紀以降の堆積物から見つかっているニホンザルの化石を整理し直している。今年度は主として第四紀以降のニホンザルの地理的変異と年代的変化を、近隣諸国・地域から出土しているマカクザル化石標本と比較しながら解析を行なった。(1)ニホンザルの歯牙化石の歯種同定を目指して、写真撮影で歯の咬合面の輪郭を抽出し、それを幾何学的形態解析法を用いて解析してみたところ、かなりの確率で歯種の区別ができることがわかった。この成果をまとめて国内の学術誌『霊長類研究』に発表した(伊藤ほか、2011)。(2)岩手県花巻市の風穴洞窟から見つかっていた後期更新世のニホンザル頭骨化石と、愛媛県大洲市敷水の採掘場から発見されていた後期更新世のニホンザル頭骨化石を外部形態(3次元デジタル計測器)と内部構造(X線CT機器)の両面から観察・計測した。(3)日本各地の後期更新世の地層から見つかっていたニホンザル化石の歯牙の計測をおこない、それぞれ現生種との比較を行って、ニホンザルの地理的変異と年代的変化について統計的な解析を行なっている。その結果を論文としてまとめて,現在国内の学術雑誌『哺乳類科学』に発表した(西岡ほか、印刷中)。日本国内で見つかっているニホンザル化石を、近隣諸国・地域から見つかっている鮮新世更新世のマカクザル化石を比較し、ニホンザルの起源と進化に関する古生物学的解析を行っている(Zhang et al., 2010)。日本各地の遺跡などから発見されているニホンザルの化石標本を現生種と比較の上でその形態的変異を検討している。平成23年度は富山県黒部川流域の通称「サル穴」と呼ばれる洞窟から見つかった3000-500年前のニホンザル化石の解析を行った。発見者である富山大学理学部の柏木健司博士と協力して、現生種との比較を行う一方で、同洞窟から見つかっていたニホンザルの糞の産状についての報告をまとめて学会誌に投稿中である(柏木ほか、査読中)。また日本各地の更新世以降のマカクザル歯牙化石の計測データの解析結果を論文としてまとめて学会誌に出版した(西岡ほか、2011)。またニホンザルの祖先種と想定される日本周辺地域の化石種の検討を並行して行った。具体的には、韓国、中国南部(広西壮族自治区)、台湾などの更新世の遺跡から見つかったマカクザル化石のデータを収集し、ニホンザルとの比較検討を行った。台湾のマカクザル化石については英文の論文を国際専門誌に投稿し、現在印刷中である(Chang et al.,in press.)。韓国と中国南部のマカク化石についてもニホンザルとの詳細な検討をしており、現在記載論文を作成中である。

また3次元計測器(3Dプロッター)を用いてこれまでに収集したマカクザルの遊離歯化石の複製模型からその外部形状を計測し、3Dソフトを用いて外部形態のコンピュータ上での解析をおこなっている。また研究協力者の伊藤毅が中心となって、マカク類の頭骨化石の内部構造をCT機器を用いて撮像し、その内部構造を解析し国際専門誌に発表した(Ito et al.,2011)。この研究結果をもとにニホンザルの頭骨における形態的特徴を環境適応の観点から検討中である。また化石標本との比較のため、四国地方で猿害駆除として殺された現生ニホンザルの遺体を回収し、骨格標本を作成中である。京都大学霊長類研究所骨格標本資料室に保管されている「岩本コレクション」のニホンザル化石標本約50点を中心に、日本各地の遺跡などから発見されている化石標本と比較検討の上、ニホンザル化石の形態的変異を検討した。本年度は、日本各地のニホンザル化石の計測データの解析結果を基に研究のとりまとめを行った。また日本周辺地域(韓国・中国・台湾など)の更新世以降の遺跡から見つかっていたマカクザル化石との比較を行い、更新世のニホンザルの進化に関して古生物学的観点から検討した。ニホンザルの祖先種と想定される化石種は、主に中国大陸の2種(Macaca robustusとM. anderssoni)が考えられてきた。両者の形態的な区別は非常に難しく、同種であるとする研究者も多かった。これまで行ったM. anderssoniの模式標本の詳しい解析から、両者が異なる種群に含まれる可能性が高いことが判明した。また、これまでに収集した中国大陸や韓国、台湾などのマカク化石標本との比較を通して、ニホンザルの形態的進化について検討した。特に接触型3次元計測器「3Dプロッター」と非接触型の「ワンショット3D測定マクロスコープ」の両方を、対象物に応じて使い分けて計測し、現在デジタルデータを処理して論文作成に使用している。日本各地の遺跡などから発見されているニホンザルの化石標本を現生種と比較の上でその形態的変異を検討した。平成24年度は富山県黒部川流域の通称「サル穴」と呼ばれる洞窟から見つかった3000-500年前のニホンザル化石を検討した。一方、同洞窟から見つかっていた現生ニホンザルの糞の産状についての報告をまとめて学会誌に報告した(柏木ほか、2012)。また日本各地の更新世以降のマカクザル歯牙化石の計測データの解析を継続している。ニホンザル(Macaca fuscata)の祖先種と想定される日本周辺地域のマカク化石種のデータ・キャストを収集し、現生及び化石ニホンザルとの比較を行っている。具体的には、韓国中部の後期更新世遺跡、中国南部の広西壮族自治区の前期後期更新世の洞窟堆積物、台湾の中期更新世遺跡、タイの後期更新世とみられるマカク化石、中国北中部の複数の中後期更新世のマカク化石などのデータを、文献資料と化石標本キャストから収集した。台湾のマカクザル化石については英文の論文を国際専門誌で発表した(Chang et al., 2012)。また韓国の遺跡から見つかったマカク化石の再検討を行った論文を執筆した(Lee et al., in press)。特に韓国のマカク歯牙化石はニホンザルとの形態的な類似点が多く、ニホンザルの祖先種である可能性が高いことが確認された。収集した歯牙化石のキャストは、接触式
超臨界水酸化を要素技術とする物質・エネルギー循環システムの構築

超臨界水酸化プロセスにおいて、炭素を含む有機物の二酸化炭素への変換、重金属を含む無機物の固体としての回収ならびに各成分の分離による資源化、さらに、反応熱のエネルギーとしての回収からなる循環システムを解析した。これまでに超臨界水酸化技術を核とした廃棄物処理・資源/エネルギー回収システムの解析のための各物性値の推算法を確立した。また、プロセスシミュレータSimsci ProIIによる上記システムのシミュレーションを行っている。ステンレス製の回分反応器ならびに流通反応器を用いて酸化分解実験を行った。試料としては実廃棄物として下水処理場から排出される余剰汚泥、焼酎廃液、糖蜜のアルコール蒸留廃液を用いた。酸素源として過酸化水素水を用いた。反応後の液相の生成物について全有機炭素量(TOC)の測定、残存するアンモニアおよび有機酸の分析を行った。回分反応の結果から、各種廃棄物におけるTOC基準の分解反応に対する1次反応速度定数を求めた。さらに、汚泥等の廃棄物中の炭素分は直接二酸化炭素を生成する反応と酢酸等の難分解性中間体を経て最終生成物に反応する反応の並発逐次反応であると仮定した反応モデルを構築し、実験データをシミュレートした。また、中間生成物であるアンモニアの分解速度定数を求めた。汚泥の分解におけるアンモニア分解速度定数は純粋なアンモニア分解の文献値の延長線上にあった。超臨界水酸化反応器からのエネルギー回収の観点から2重管型の超臨界水熱交換器を作製し、熱交換挙動を測定した。熱交換効率については、超臨界条件下では効率が下がり、特に、臨界点付近で最も小さくなっていることがわかる。これは臨界点近傍では水の熱容量が非常に大きくなることによると思われる。
進化的視座から脚式ロコモーションの統一的理解を目指す数理的研究

生物界の2大勢力、脊椎動物(魚類以外)と節足動物が採用している移動手段である脚式ロコモーションについて、力学の視点および進化の視点から研究を行った。進化の過程で、一度脚を得たらその後は減っていく一方に見える。節足動物の中では例外的に高速で走行することができ、速度に応じて使用脚数を変えるスナガニに着目し、数理モデルを用いて解析することで、脚数減少の理由付けを与えた。同時に進化の過程における脚数の減少に対する一応の解釈を得た。また、動物の運動と制御を解析するための記述法として、ダイナミックフログラフというプラットフォームを提案した。和歌山県白浜町および沖縄県西表島において、スナガニ(および近縁種のツノメガニ)を捕獲し、歩行と走行の計測を実施した。自然な状態での歩行・走行を実現するために、現地の砂を用いて走行レーンを作り、高速度撮影を行った。その画像解析によって、歩容ダイアグラムを作成した。その結果、低速歩行時には8脚全部を用いているが、速度が増していくにつれ、使用脚数が8脚から7脚、さらに6脚、5脚へと減少方向に遷移することが確認された。4対の歩脚に頭側から1,2, 3, 4と番号をつけF, Hで進行方向前方と後方を示すとする。8脚から7脚の遷移ではF4脚が、7脚から6脚の遷移ではR4脚が使われなくなる。6脚から5脚の遷移においてはF1脚が使われなくなる場合とF3脚が使われなくなる場合の2通りが観察された。第2脚(F2, R2)は最も強い脚でどのような状況でも使用されている。現段階までの計測では、4脚までの遷移は観察されていない。いずれにせよ、歩行(走行)速度の増大に対応した使用脚数の減少は、実験的に確認された。また、高速走行時においては、完全に接地脚のない時間帯が存在しており、厳密な意味での「走行」であることも確認された。このとき、スナガニは明らかに慣性領域の運動に踏み込んでいる。さらに、完全に明確とは言えないが、高速走行時においては、前方脚の「引き」よりは、後方脚の「蹴り」がより強く駆動力を生み出しているようである。カニの歩行の数理モデルの構築を試みているが、スナガニの胴体および脚構造を完全に取り入れた形でのモデリングはかなり困難であるため、なんらかの単純化が必要であり、現在その方法を検討中である。スナガニの歩行・走行を記述する数理モデルを構築した。水平方向のみの運動量の流れのみを記述することで、1次元的なシンプルなモデルになっている。このモデルによって、速度の増加とともに使用脚数が減少し、かつデューティー比が減少していくという現象を再現するとともに、その理論的な解釈を与えることができた。また、同側の脚はできるだけ反位相に動かす方が速度を稼げるということも示された。これにより、トロット的歩容は観察され、ギャロップ的歩容が見られないことの理由も与えられた。小さいデューティー比を実現するには、鉛直方向に大きな運動量を流し込む必要があり、そのためには強い瞬発力を出せる強力な脚が必要となる。このモデルの示すところは、少数の強力な脚を持つ方が、多数のあまり強力でない脚を持つより高速度が得られるということである。脚歩行を行う動物が、より速い移動速度を実現する方向に進化しようとするならば、脚に振り向ける資源を多くの脚に分配するよりも、少数の強力な脚に投下する方が有利であることを示すことができた。生物の進化をロコモーション(特に脚歩行)の観点から見直した。進化に関しては、近年の分子系統学の進歩で、従来の定説が覆されたりする状況が多々あり、明確な進化系統樹が描ききれていないようで、考えていたより状況は複雑である。それでも、進化のパスが明確に結ばれているところでは、当初立てた仮説である「進化とともに脚数は減少する」というテーゼは、ほぼ間違いなく成立していることを確認した。このことは上記の理論解析の帰結と整合する。動物の運動と制御を考えるには、運動量の流れと情報の流れを同時に記述し、解析できるような記述法が必要である。我々は、力学モデルを等価回路に変換し、制御経路と重ねるDynamic Flow Graphというプラットフォームを提案した。数理生命科学当初の予定では、ゴキブリの計測も予定していたが、技術的な理由(脚の接地・不接地の確認が困難)で断念した。スナガニの方の計測に関してはおおむね順調に進んでいる。問題は数理モデルで、完全にカニの身体全体を記述するようなモデリングは難しく、本質を失わないでどの程度簡単化できるかを模索中である。この作業は1年目で終わらせる予定であったので、遅れの原因となっている。適切な程度の単純化による数理モデルを構築する。脚の形状をどこまで単純化するかが鍵となっている。

カニの進化的な位置は、エビからの進化形であり、この過程において縦方向から横方向への進行方向の変化が起こっている。これには、力学的な理由が存在しているはずで、その点についても考察を行う。高速度撮影用のカメラの購入を予定していたが、研究分担者の石黒氏の研究室で高性能のものを購入したため、必要がなくなった。パリ第7大学の関本氏とのディスカッションのための旅費にまわす。
米国における芸術教育の理論的基礎づけに関する研究-“Journal of Aesthetic Education"誌の1960年代〜80年代における論調の変遷を中心に-

2.それらの諸論文の参考文献、および同誌の書評欄を手掛かりに、上記の理論傾向の根拠とされる文献の収集を行った。その収集および分析は現在も継続中であるが、主要な理論的根拠としては、シンボリズムおよび分析哲学の影響の強い現代英米の美学と、近年、発展の著しい認知心理学の成果とが挙げられる。3.今年度は特に前者の思想的源泉と目されるE,カッシーラーの哲学がどのように受容されているかに焦点づけて分析を行った。その結果、上記論者たちはカッシーラーの「シンボル」概念による人間の精神的営みの多様性、「世界の数多性」という視点に基づいて、多様な世界認識の一様式として芸術活動の(従って芸術諸教科の)自律的地位をカリキュラム内に確立しようとする、という基本的構図が明らかになった。その反面、彼らにおいてはカッシーラーの哲学が本来持っていた、カント的二元性(「現象」と「物自体」、「感性界」と「叡知界」)の克服という実践的動機は捨象され、或いは芸術諸教科の自律性を侵すものとして排除されてしまい、認識論的文脈への限定化・単純化の上に理論構築がなされていることも明らかにされた。(この点に関しては、裏面記載の論文にて詳述した。)4.このような認識論的文脈への限定化・単純化が、芸術教育の意義を矮小化しかねない問題性をはらむことについては、別論文において、さらに思想史的検討を通じて指摘すべく、現在執筆中である。
環境因子による肥満細胞多様性の修飾

1.ラット腹腔より単離した結合組織型の肥満細胞へのin vitroでのNO_2暴露により、その後の抗原や抗IgE抗体により誘導されたヒスタミン、βーヘキソースアミニダ-ゼ遊離の抑制が認められた。神経性因子であるサブスタンスPによる誘導されたヒスタミン、βーヘキソースアミニダ-ゼ遊離も抑制された。ところが、カルシウムイオノフォアA23187による遊離作用にはほとんど影響を与えなかった。2. NO_2暴露による生体内に生じるnitrite,nitrateの影響を検索するために寄生虫感染ラットから腹腔の結合組織型肥満細胞を、消化管より粘膜型肥満細胞をそれぞれ単離しin vitroでnitrite,nitrate処理し、その後のメディエ-タ-遊離を検索した。粘膜型肥満細胞では、nitrite,nitrateのみで10%程度のヒスタミン遊離を誘導した。ところが、結合組織型肥満細胞ではほとんどその遊離で認められなかった。3. Nitrite,nitrate処理後の結合組織型、粘膜型肥満細胞において抗原、抗IgE抗体により誘導されるヒスタミン遊離は、有意に亢進した。nitriteと比較では、両者に差が認められなかった。この亢進作用は温度依存性であった。4.ホルムアルデヒド溶液による結合組織型、粘膜型肥満細胞への影響について、細胞毒性は500μg/mlの濃度から粘膜型肥満細胞でみられたが、結合組織型肥満細胞では認められなかった。ホルムアルデヒド処理後の結合組織型肥満細胞での抗原により誘導されるヒスタミン、βーヘキソースアミニダ-ゼの遊離は、10ー20μg/mlの濃度では有意な亢進がみられたが、100μg/mlのホルムアルデヒドでは著しい抑生が認められた。一方、粘膜型肥満細胞ではいずれの濃度でも亢進はみられず、濃度依存の抑制がみられた。A23187による遊離も結合組織型肥満細胞ではIgE抗体依存の結果と同様であり、低濃度では亢進が認められた。5.ホルムアルデヒドガスと溶液との影響を比較する目的で、5ppmホルムアルデヒドガスのin vitro暴露を結合組織型肥満細胞で行なった。その後の抗IgE抗体刺激によるヒスタミン遊離、A23187によるヒスタミン遊離ともに有意な亢進が認められた。なお、走査電顕の観察では、肥満細胞表面上にホルムアルデヒドの影響は認められなかった。6.WEHIー3細胞の培養上清を用いて骨髄細胞から肥満細胞の分化・増殖する系を確立し、ホルムアルデヒドの影響について検索した。肥満細胞はアルシアンブル-・サフラニンとトルイジンブル-染色により同定したが、5μg/mlでは、細胞の増殖が著しく抑制され、1μg/mlでは肥満細胞の分化が抑制された。7.種々の濃度のホルムアルデヒドによる前処理をしたあとの結合組織型肥満細胞における抗腫瘍活性の変動について調べた。WEHIー164標的細胞に対するcytotoxicityは、ホルムアルデヒド濃度依存的に抑制された。この抗腫瘍活性は、抗TNF抗体処理によりほとんど認められなくなった。8.ホルムアルデヒドの蛋白合成系への影響を検索するために、ホルムアルデヒド処理したあとの結合組織型肥満細胞を2時間培養した。そして、^<35>Sーメチオニンで1時間ラベルし、その蛋白をSDSーPAGEで解析した。その結果、ホルムアルデヒド処理によりこれまでの他の細胞で報告されているようなストレス蛋白の誘導がみられることを明らかにした。

5.ホルムアルデヒドガスと溶液との影響を比較する目的で、5ppmホルムアルデヒドガスのin vitro暴露を結合組織型肥満細胞で行なった。その後の抗IgE抗体刺激によるヒスタミン遊離、A23187によるヒスタミン遊離ともに有意な亢進が認められた。なお、走査電顕の観察では、肥満細胞表面上にホルムアルデヒドの影響は認められなかった。6.WEHIー3細胞の培養上清を用いて骨髄細胞から肥満細胞の分化・増殖する系を確立し、ホルムアルデヒドの影響について検索した。肥満細胞はアルシアンブル-・サフラニンとトルイジンブル-染色により同定したが、5μg/mlでは、細胞の増殖が著しく抑制され、1μg/mlでは肥満細胞の分化が抑制された。7.種々の濃度のホルムアルデヒドによる前処理をしたあとの結合組織型肥満細胞における抗腫瘍活性の変動について調べた。WEHIー164標的細胞に対するcytotoxicityは、ホルムアルデヒド濃度依存的に抑制された。この抗腫瘍活性は、抗TNF抗体処理によりほとんど認められなくなった。8.ホルムアルデヒドの蛋白合成系への影響を検索するために、ホルムアルデヒド処理したあとの結合組織型肥満細胞を2時間培養した。そして、^<35>Sーメチオニンで1時間ラベルし、その蛋白をSDSーPAGEで解析した。その結果、ホルムアルデヒド処理によりこれまでの他の細胞で報告されているようなストレス蛋白の誘導がみられることを明らかにした。
ヒトヘルペスウイルス6がコードする転写活性化因子IE2の構造および機能解析

本研究では平成29年度にHHV-6A IE2 C末端ドメインについて構造解析を行い、構造情報から示唆された特徴的な部位について変異体を作製し、転写活性化能をルシフェラーゼレポーターアッセイで解析する事によって、実際に機能部位である事を証明する事が出来た。この成果は国内学会および国際学会で発表を行うとともに、学術論文としてJournal of virologyに投稿し、公開した。平成30年度では、構造解析によって明らかとなった機能部位の意義についてより詳細な解析を行うために、さらにIE2 C末端ドメイン変異体の作製に取り組んだ。また組換えHHV-6Aウイルスを用いた解析を行うために、変異ウイルスの作製を進めた。またIE2 N末端領域の立体構造解析を行うために、平成29年度では二次構造予測に基づいて部分配列を設計し、大腸菌での発現を試みたが、発現時あるいは精製時に起こる分解による断片化が問題となっていた。平成30年度では、前年度で確認されたタンパク質の分解パターンから、アミノ酸配列上で切断が起こりやすい部位の推定を行い、その情報を考慮した上で複数の部分配列の設計を行った。その結果、マルトース結合タンパク質を付加した形で設計した複数のIE2 N末端領域の部分配列について、分解させることなく精製することに成功した。X線結晶構造解析を行うために、この精製タンパク質を用いて結晶化条件の探索を行った結果、単結晶X線回折測定実験に向けていくつかの候補となる溶液条件を見出すことができた。平成29年度では既に立体構造の決定に成功したHHV-6A IE2 C末端ドメインに関して、さらなる構造解析を行い、その機能部位について解析を行った。IE2 C末端ドメイン上には正電荷が集中する領域、類縁のヘルペスウイルス間で相同性の高い保存領域、そしてDNA結合モチーフであるヘリックスターンヘリックスに類似した構造領域があり、これらがIE2の機能部位である事が示唆されていた。そこで、推定された機能部位に変異を持つ各種のIE2変異体発現系を作製し、転写活性化能への影響を解析した。ルシフェラーゼレポーターアッセイ系による転写活性化能の評価法を確立し、各IE2変異体の転写活性化能を解析した結果、正電荷が集中する領域及び保存領域に変異を導入した場合では、いずれもIE2の転写活性化能が著しく減弱し、これらの領域がIE2-CTDにおける機能部位である事が示された。一方で、ヘリックスターンヘリックスに類似の構造領域への変異については、転写活性化能に影響が見られなかった。本成果について国内学会および国際学会で発表を行うとともに、学術論文としてJournal of virologyに投稿し、公開した。これに加え、IE2 N末端領域に関して新たに立体構造を行うために、N末端領域中の構造ドメインの解析を試みた。二次構造予測によってN末端領域中で二次構造が集中すると予想された部分配列の大腸菌発現系を用いて、タンパク質の発現および精製を行った。その結果、これらのN末端領域の部分配列では発現または精製中にタンパク質の分解が起こり、分解による断片化のパターンを考えても、安定な立体構造を形成していないことが示唆された。平成29年度では、HHV-6A IE2 C末端ドメインで見出された機能部位の変異解析を行う事ができ、その結果と構造解析の結果を合わせて、学術論文として発表する事ができた。当初の計画ではIE2 C末端ドメインとDNAの複合体についても立体構造を決定する予定であったが、本成果をまとめるにあたって、IE2 C末端ドメインが他のウイルスのDNA結合タンパク質と構造上の相同性を持つことが明らかとなり、DNA結合様式に関するモデルを作製する事が出来た。そのため、IE2 C末端ドメインとDNAとの複合体の立体構造解析については実施する必要性が低くなり、代替としてモデルによってDNA認識様式に関する一定の知見を得る事が出来た。N末端領域の構造解析に関しては、部分的な構造ドメインの決定及び単離には至らなかったものの、予想より広い領域が一体となって立体構造を形成している可能性が示唆され、N末端領域のドメイン構造に関して、次年度の研究に繋がる知見が得られた。以上の事より、研究計画全般としてはおおむね順調であると判断した。

平成30年度ではIE2 N末端領域の立体構造解析を目標として研究を実施する。平成29年度の研究結果から、N末端領域は広い範囲が一体となって一つの構造を形成している事が示唆されたため、より広いN末端領域の大腸菌発現系を構築し、発現を試みる。またアミノ酸配列解析を進めた結果、C末端ドメインの構造解析に用いたHHV-6A由来のIE2と、HHV-6Aと90%のゲノム相同性を持つHHV-6Bに由来するIE2では、そのC末端ドメインの配列類似性に反して、N末端領域では配列の相同性が比較的低いことも明らかとなっている。そこで、HHV-6AとHHV-6B両方のIE2についてN末端領域の発現を検討する。これらの検討により、いずれかのタンパクが発現できた場合には、分解断片の解析から発現領域の最適化を行い、精製法を確立する。精製タンパク質が得られた際には、結晶化を行い、大型放射光施設SPring-8でのX線結晶回折測定実験を実施する事で、その立体構造を解明する。また得られた精製タンパク質を利用する事で、共沈降法等によって、細胞内に存在すると予想されるIE2結合因子の同定を試みる。平成29年度では国際学会での発表を含め旅費の必要性が高く、物品費との調整の結果として2,417円の次年度使用額が生じた。この次年度使用額2,417円に関しては、平成30年度の研究を遂行するために必要な実験のための物品費として使用する事を計画している。