hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
アサリに寄生するパーキンサス属原虫の病害性の評価およびその対策に関する研究

本研究では、アサリ資源量を左右する着底直後の生活史初期個体への感染状況を野外調査で調べた。愛知県A地点で採集調査を行ったところ、殻長約2 mm以上の個体からは寄生が認められたが、それ以下の体サイズの個体から寄生が認められず、殻長2 mm以下の個体が感染後速やかに死亡して生き残らないことが示唆された。A地点でアサリの寄生状況と塩濃度・温度を調べて先行調査の有明海沿岸と比較したところ、愛知県における寄生レベルの方が有明海より低水準にあることが昨年に続いて確かめられた。塩濃度については、愛知県で低く推移することが多かった。以上のことから、愛知県では低塩分により寄生レベルが低く抑えられていることが示唆された。愛知県で複数年野外調査したところ、いずれの年でも冬に個体群が消滅しており、宿主であるアサリ個体群の消滅に伴い本虫も水域から消失し、その後新たに着底したアサリへの生が少ないことが示唆された。従って、アサリ増殖場を設ける際には、感染源となる天然アサリをできるだけ取り上げて、水域の虫体を取り除くことが効果的と示唆された。そこで、次のような野外実験を試みた。アサリの寄生レベルが高いことで知られる調査地点Bで、感染源となる感染アサリを可能な限り取り除いた「アサリ除去区(10 m×10 m)」を作った。アサリ除去区と対照区に未感染アサリを放流し、その後の感染状況を3か月間追跡調査した。しかしながら、アサリ除去区と対照区に放流した未感染アサリの間に感染状況に差が見られなかった。以上のことから、感染アサリの除去範囲が狭く実験区外から遊走子が流れてきたと考えられた。26年度が最終年度であるため、記入しない。1.生活史初期のアサリに対して示すPerkinsus属原虫の病署性の評価【実験】未感染初期稚貝(殻長0.51mm程度)をR. olseniで攻撃して陰性対照個体と飼育したところ、攻撃区の生残率は2割程度にまで減少したのに対し、対照区では7割以上と高かった。この結果から、本虫はアサリ初期稚貝にも感染して病害性を示すことが実験的に示された。【野外調査】本属原虫の感染域である神奈川県海の公園と愛知県で、月l回の採集調査を行い、生活史初期の個体の寄生状況を調べた。その結果、殻長2mm以下の個体からは寄生が認められなかった。人為的にはそれらの個体も感染することを鑑みると、野外では、濾水能力に乏しい初期稚貝が虫体を取り込めなかったか、感染個体が速やかに死亡して生き残らないためと考えられた。(なお、当初の計画では有明海の調査継続予定であったが、愛知県ではアサリの資源量が多く寄生強度が低いことが予備調査で分かっていた。このため、愛知県で調査を行い、代表者を含めた研究チームが2013年1月まで実施してきた有明海と結果を比較し、3水域間での寄生状況・環境状況の比較を可能にした。)2.本属原虫への対策の観点からみたアサリ増殖場の有すべき条件の特定【野外調査】愛知県ならびに海の公園で定期調査を行い、寄生強度と環境データを有明海沿岸(2009年6月2013年1月)における結果と比較した。その結果、塩濃度が低く推移した愛知県における寄生レベルが特に低く、低塩濃度によって寄生レベルが低く抑えられていることが示唆された。【実験】アサリに寄生した状態のP. olseniの増殖が、低塩分ならびに低水温で抑制されるか調べた。(1)低塩分の影響未感染のアサリ種苗をP. olseniで攻撃し、陰性対照個体と共に塩濃度15、18、23、30でそれぞれ飼育した。その結果、いずれの塩濃度でも寄生強度は同様に上昇し、アサリの体内では海水の塩濃度がP. olseniの増殖に及ぼす影響が小さいことが示された。(2)低水温の影響攻撃したアサリと陰性対照のアサリを水温13、18、23°Cの水槽で飼育した。その結果、18°Cと23°Cでは体内でP. olseniが増殖したが、13°Cでは顕著な増殖は認められず、13°Cでは体内での増殖が抑制されることが示された。以上の実験から、アサリの体内では、13°Cの低水温では殆ど増殖しないことが示された。以上の結果から、本虫の増殖の活性の低い冬季にアサリ種苗を放流することで、しばらくの間アサリ体内の寄生強度が低く抑えられる可能性がある。一方、寄生レベルへの塩濃度の影響は少なく、低塩濃度水域での寄生レベルを決定する要因を調べる必要がある。

以上のことから、愛知県では低塩分により寄生レベルが低く抑えられていることが示唆された。愛知県で複数年野外調査したところ、いずれの年でも冬に個体群が消滅しており、宿主であるアサリ個体群の消滅に伴い本虫も水域から消失し、その後新たに着底したアサリへの生が少ないことが示唆された。従って、アサリ増殖場を設ける際には、感染源となる天然アサリをできるだけ取り上げて、水域の虫体を取り除くことが効果的と示唆された。そこで、次のような野外実験を試みた。アサリの寄生レベルが高いことで知られる調査地点Bで、感染源となる感染アサリを可能な限り取り除いた「アサリ除去区(10 m×10 m)」を作った。アサリ除去区と対照区に未感染アサリを放流し、その後の感染状況を3か月間追跡調査した。しかしながら、アサリ除去区と対照区に放流した未感染アサリの間に感染状況に差が見られなかった。以上のことから、感染アサリの除去範囲が狭く実験区外から遊走子が流れてきたと考えられた。26年度が最終年度であるため、記入しない。年次計画に記述した1年目の内容については、概ね以下の様に実施できた。年次計画予定した、生活史初期における寄生状況の調査と感染実験については、行うことができた。複数の水域で定期調査を行い、寄生状況と環境条件の比較を行うことができた。予定していた、本属原虫の活性の低下する要因の解明についても、野外調査と実験を行うことができた。その結果、塩分は本属原虫の低寄生レベルを決定する要因ではないことが分かった。それに加えて、寄生状況は13°C程度の低水温によって強く抑制されることも明らかにされた。野外調査では、低塩濃度が虫体の増殖を抑えることが示唆されたが、攻撃試験では低塩濃度は増殖に影響しなかった。このことから、低塩濃度によっては本属原虫の防除は困難と思われる。一方で、愛知県では数年に1回の頻度でアサリが貧酸素水塊によって大量死しており、宿主が死滅することで虫体も消滅し、新たに虫体が水域に侵入するまでの間、寄生レベルが低く抑えられている可能性がある。したがって、アサリの種苗の生産場や増殖場においては、漁獲時にアサリをほぼ全て取り上げることで、その場所の寄生強度を低く保つことができる可能性がある。このことを実証するためにも、まず、年次計画2年目に記した水平感染実験を行う必要がある。また、年次計画に記した増殖モデルに加えて、屋外における水平感染についても実験的に調べる必要があると考えられる。
マイクロリアクターを利用した金属酸化物ナノ粒子・ナノシートの高効率表面修飾

金属酸化物ナノ粒子や金属酸化物ナノシートなどの金属酸化物ナノ材料は,その大きさが十分小さい場合は,金属酸化物が有する特性に加えて透光性を示すことから,有機高分子を用いた有機ー無機ハイブリッド材料のナノフィラーとして広く検討されている.しかし,金属酸化物ナノ材料は凝集してしまうと透光性が失われるため,表面修飾により有機官能基を金属酸化物ナノ材料の表面に固定化し,有機高分子マトリクス中での高分散を達成することが必要となる.そこで本研究では,効率的な金属酸化物ナノ粒子・ナノシートの表面修飾法として,マイクロリアクターを用いた二相流による表面修飾法の開発を目的としている.本年度は,これまで報告されていない液-液二相系による無機ナノシートの表面修飾の条件探索を目的として,mLスケールでの液-液二相系を用いて,無機ナノシートの表面修飾を行った.本年度は,イオン交換性層状ペロブスカイト(HLaNb2O7・xH2O,HLaNb)ナノシートの水分散液とリン酸オレイルを溶解したシクロヘキサンを用い,ガラス容器に液-液二相系を形成させ,界面でのリン酸オレイルによる表面修飾を行った.HLaNbナノシートの水分散液は,テトラブチルアンモニウムイオンを層間に導入した後,超音波を用いた剥離により調製した.二相状態を形成させた後,界面に泡立ちが起きないように水相とシクロヘキサン相をゆっくり撹拌した.最初は水相は白濁し,シクロヘキサン相は透明であったが,徐々に水相は透明となり,シクロヘキサン相は白濁した.シクロヘキサン相の生成物は,ナノシートの表面にリン酸オレイル基が固定化されたものであった.水相のpHが高いと反応が進行しないことから,ナノシート表面のテトラブチルアンモニウムイオンがプロトンと交換されることにより,反応が進行していることが推定された.2018年度の成果は,マイクロリアクターにおける二相流による表面修飾をナノシートに適用するための基礎的検討に相当し,この結果からHLaNbナノシートの水分散液ととリン酸オレイルを溶解したシクロヘキサンを用いたマイクロリアクターにおける二相流による表面修飾へ展開する.mLスケールでの液-液二相系は,金属あるいは金属酸化物のナノ粒子の表面修飾には広く応用されてきた.その際,水相にあるナノ粒子が修飾後に有機相に移動する"相間移動“現象が知られている.2018年度の結果は,"相間移動“がナノシートでも起こることを見出しており,同様の現象がマイクロリアクターの二相流でも期待できる.加えて,2018年度の成果は,新しいナノシートの表面修飾法と考えており,表面修飾技術の発展の観点からも重要な進展であると考える.金属酸化物ナノ粒子については,予備的検討の結果を踏まえ,2019年度はマイクロリアクターを用いた表面修飾の最適条件の探索を予定している.金属酸化物ナノシートについては,2018年度のmLスケールでの液-液二相系の結果と予備的検討結果を踏まえ,マイクロリアクターを用いた表面修飾の条件探索を予定している.金属酸化物ナノ粒子・ナノシートの表面修飾後,生成物の分析を固体高分解能核磁気共鳴分光分析,赤外分光分析,走査型電子顕微鏡,元素分析等により行い,その結果を作製条件にフィードバックすることにより研究を推進する.金属酸化物ナノ粒子や金属酸化物ナノシートなどの金属酸化物ナノ材料は,その大きさが十分小さい場合は,金属酸化物が有する特性に加えて透光性を示すことから,有機高分子を用いた有機ー無機ハイブリッド材料のナノフィラーとして広く検討されている.しかし,金属酸化物ナノ材料は凝集してしまうと透光性が失われるため,表面修飾により有機官能基を金属酸化物ナノ材料の表面に固定化し,有機高分子マトリクス中での高分散を達成することが必要となる.そこで本研究では,効率的な金属酸化物ナノ粒子・ナノシートの表面修飾法として,マイクロリアクターを用いた二相流による表面修飾法の開発を目的としている.本年度は,これまで報告されていない液-液二相系による無機ナノシートの表面修飾の条件探索を目的として,mLスケールでの液-液二相系を用いて,無機ナノシートの表面修飾を行った.本年度は,イオン交換性層状ペロブスカイト(HLaNb2O7・xH2O,HLaNb)ナノシートの水分散液とリン酸オレイルを溶解したシクロヘキサンを用い,ガラス容器に液-液二相系を形成させ,界面でのリン酸オレイルによる表面修飾を行った.HLaNbナノシートの水分散液は,テトラブチルアンモニウムイオンを層間に導入した後,超音波を用いた剥離により調製した.二相状態を形成させた後,界面に泡立ちが起きないように水相とシクロヘキサン相をゆっくり撹拌した.最初は水相は白濁し,シクロヘキサン相は透明であったが,徐々に水相は透明となり,シクロヘキサン相は白濁した.シクロヘキサン相の生成物は,ナノシートの表面にリン酸オレイル基が固定化されたものであった.水相のpHが高いと反応が進行しないことから,ナノシート表面のテトラブチルアンモニウムイオンがプロトンと交換されることにより,反応が進行していることが推定された.2018年度の成果は,マイクロリアクターにおける二相流による表面修飾をナノシートに適用するための基礎的検討に相当し,この結果からHLaNbナノシートの水分散液ととリン酸オレイルを溶解したシクロヘキサンを用いたマイクロリアクターにおける二相流による表面修飾へ展開する.mLスケールでの液-液二相系は,金属あるいは金属酸化物のナノ粒子の表面修飾には広く応用されてきた.

その際,水相にあるナノ粒子が修飾後に有機相に移動する"相間移動“現象が知られている.2018年度の結果は,"相間移動“がナノシートでも起こることを見出しており,同様の現象がマイクロリアクターの二相流でも期待できる.加えて,2018年度の成果は,新しいナノシートの表面修飾法と考えており,表面修飾技術の発展の観点からも重要な進展であると考える.金属酸化物ナノ粒子については,予備的検討の結果を踏まえ,2019年度はマイクロリアクターを用いた表面修飾の最適条件の探索を予定している.金属酸化物ナノシートについては,2018年度のmLスケールでの液-液二相系の結果と予備的検討結果を踏まえ,マイクロリアクターを用いた表面修飾の条件探索を予定している.金属酸化物ナノ粒子・ナノシートの表面修飾後,生成物の分析を固体高分解能核磁気共鳴分光分析,赤外分光分析,走査型電子顕微鏡,元素分析等により行い,その結果を作製条件にフィードバックすることにより研究を推進する.
細胞チップを用いた新興感染症に対するヒト抗体の迅速作製法の開発

本研究により、以下の研究成果を得た。1.抗原特異的Bリンパ球の自動検出法のための細胞チップの検出方法の条件をさらに検討した。特に、課題となっている低頻度の抗原特異的Bリンパ球検出については、利用率が10%以上の新しいチップの開発に成功した。また、CCDカメラを用いた新しい高速スキャナーをさらに改良し、1秒毎の測定法により、検出感度と再現性を向上することができた。さらに、検出感度を上げるために、非特異的なCa2+の動きを阻害する試薬(例えばATP阻害剤など)を用いてノイズの減少させる実験を行ったが、ATP阻害剤はCa2+ノイズに大きな影響は与えなかった。2.リンパ球チップを用いて、病原体特異的Bリンパ球の検出、抗体遺伝子のクローニング、リコンビナント抗体の作製を行った。HBsワクチン接種後の健常人をボランティアとし、リンパ球チップを用いて、HBs抗原特異的Bリンパ球の同定および抗体遺伝子解析を行った。HBs特異的抗体遺伝子のV領域配列をヒトIgGのC領域配列と結合させた発現型ベクターを構築し293T細胞に導入し、20種類以上のリコンビナント抗体を得た。同様な方法を用いて、15種類以上のインフルエンザ(A型、B型)に対するヒト型リコンビナント抗体の取得に成功した。3.細胞チップによる抗体産生細胞の検出法の開発を行った。免疫マウスの脾細胞あるいはHBsワクチン接種健常人ボランティアの末梢血のBリンパ球を、抗原をコートしたリンパ球チップに1個づつ播種し、特異的抗体産生細胞の検出を、FLISPOT法(ELISPOTの変法)で行った。この検出系の確立により、抗原特異的抗体のmRNAを大量に発現する1個の抗体産生細胞を得ることが可能となり、リコンビナントの作成を画期的に容易することができた。感染症は抗生物質の発見、ワクチンの開発等で制圧せしめたかに思えたが、薬剤耐性菌の出現、エイズの世界的な広がり、アジアにおけるSARSやトリインフルエンザの感染の急激な広がりに見られるように、従来の治療法では制圧できない新興感染症が台頭してきており、近未来の人類の脅威になってきている。その中で、近年、標的特異的医薬としての抗体医薬が見直され、その特異的な作用機序から感染症に対する特効薬として注目を集めている。我々は、最近、Bリンパ球が1個入る大きさのマイクロウェルが4.5万から23.5万ウェル、アレイ状に規則正しく配置されたチップ(マイクロウェルアレイチップ)を作製し、その各ウェルにBリンパ球を1個ずつ配置して抗原で刺激し、個々のBリンパ球の抗原に対する応答を解析できる細胞マイクロチップシステムの開発を行ってきた。本年度はマイクロウェルチップの検出方法の条件をさらに検討し、検出感度、再現性の向上を図った。また、CCDカメラを用いた新しいマイクロアレイスキャナーの開発を行った。CCDカメラで抗原刺激後、10mSec毎、10分間、細胞蛍光強度を撮影し、その蛍光強度のデータをコンピューターで解析して、抗原刺激後の1細胞内でのCa濃度の変化を追うシステムを開発した。さらに、HBsワクチン接種した健常人ボランティアの末梢血から、細胞チップを用いてHBs抗原特異的Bリンパ球を検出し、抗体遺伝子を解析後、HBs抗原に特異的に結合するリコンビナント抗体を数個得た。また、バキュロウイルスに膜蛋白を発現する実験系を確立し、これを用いて膜蛋白抗原を細胞チップに利用できることを、HEL-トランスジェニックマウスの系で実証した。

特に、課題となっている低頻度の抗原特異的Bリンパ球検出については、利用率が10%以上の新しいチップの開発に成功した。また、CCDカメラを用いた新しい高速スキャナーをさらに改良し、1秒毎の測定法により、検出感度と再現性を向上することができた。さらに、検出感度を上げるために、非特異的なCa2+の動きを阻害する試薬(例えばATP阻害剤など)を用いてノイズの減少させる実験を行ったが、ATP阻害剤はCa2+ノイズに大きな影響は与えなかった。2.リンパ球チップを用いて、病原体特異的Bリンパ球の検出、抗体遺伝子のクローニング、リコンビナント抗体の作製を行った。HBsワクチン接種後の健常人をボランティアとし、リンパ球チップを用いて、HBs抗原特異的Bリンパ球の同定および抗体遺伝子解析を行った。HBs特異的抗体遺伝子のV領域配列をヒトIgGのC領域配列と結合させた発現型ベクターを構築し293T細胞に導入し、20種類以上のリコンビナント抗体を得た。同様な方法を用いて、15種類以上のインフルエンザ(A型、B型)に対するヒト型リコンビナント抗体の取得に成功した。3.細胞チップによる抗体産生細胞の検出法の開発を行った。免疫マウスの脾細胞あるいはHBsワクチン接種健常人ボランティアの末梢血のBリンパ球を、抗原をコートしたリンパ球チップに1個づつ播種し、特異的抗体産生細胞の検出を、FLISPOT法(ELISPOTの変法)で行った。この検出系の確立により、抗原特異的抗体のmRNAを大量に発現する1個の抗体産生細胞を得ることが可能となり、リコンビナントの作成を画期的に容易することができた。
２価鉄動態を切り口にした逆行性輸送異常と神経細胞死の分子機序の解明と創薬研究

家族性パーキンソン病患者よりvacuolar protein sorting-associated protein 35(VPS35)が原因遺伝子として同定された。VPS35機能異常により逆行性輸送の破綻が考えられる。しかし、この輸送経路は比較的近年に同定された経路であり、分子機構や疾患への関与など解析が遅れているのが現状である。未だVPS35機能異常とパーキンソン病発症との因果関係を示す有力な説は少ないが、divalent metal transporter 1(DMT1)のミスソーティングという報告がある。DMT1は、2価鉄(Fe2+)の細胞内取込みおよびエンドソーム内のFe2+をオルガネラへ輸送する際に重要な役割を担っている。本研究ではオルガネラ特異的なFe2+蛍光プローブを活用し、Fe2+動態を可視化することで、VPS35を含む逆行性輸送経路異常とPD発症機序の因果関係を解明し、新規の創薬基盤を創出することである。これまでに、リソソームおよびゴルジ体特異的なFe2+プローブを活用して、siRNA法によりVPS35をノックダウンさせたSHSY5Y細胞において、VPS35機能異常により、DMT1のミスソーティングが起こることで、リソソームへのFe(II)イオンの蓄積が起きたことを可視化することができた。本年度は、より病態との関連を明らかにするため、変異VPS35発現のSHSY5Y細胞においても同様の検討をした。結果、ノックダウン時と同様なリソソームへの蓄積を確認できた。さらにリソソームへのFe2+異常蓄積をレトロマー安定化化合物であるR55処置することで改善することを明らかにした。研究成果として、VPS35を含む逆行性輸送経路異常とパーキンソン病発症機序の因果関係を解明を目指すために、VPS35機能異常とFe(II)動態の錯乱に関する以下の新知見を見出した点において順調に伸展していると考えている。まず、変異型のVPS35を発現するSHSY5Y細胞において、VPS35ノックダウン時と同様に、DMT1のミスソーティングが起こり、DMT1がリソソームへ蓄積することを確認できた。また、オルガネラ特異的なFe2+蛍光プローブを用いて、Fe2+蛍光プローブの蛍光強度がゴルジ体で低下した一方で、リソソームにおいては上昇したことを明らかにすることができた。さらに化合物R55を処置することでその異常蓄積を抑制できた。申請書に従って、さらに現状を鑑み、以下のように研究を遂行していく。本年度は、これまでに上記で見出したVPS35機能異常とFe(II)動態の錯乱に関する結果について、よりパーキンソン病の病態に近づけるため、「条件付き不死化ヒト中脳細胞系(LUHMES)」を用いて本研究結果の普遍化させる。また、VPS35以外のパーキンソン病原因遺伝子に関しても検討を実施する。In vivo実験系の準備を対応していく。すなわち細胞内の2価鉄(Fe2+)動態が撹乱することでオルガネラの恒常性も破綻し、細胞死に繋がることが推測されている。本年度は、主にFe2+動態をオルガネラ特異的なFe2+蛍光プローブを用いて、VPS35機能異常時におけるFe2+動態の攪乱を明らかにした。具体的には、リソソームおよびゴルジ体特異的なFe2+プローブを活用して、siRNA法によりVPS35をノックダウンさせたSHSY5Y細胞において、プローブの蛍光強度がゴルジ体で低下し、リソソームで上昇した。また、DMT1がリソソームに蓄積をした。これらの結果から、VPS35機能異常により、DMT1のミスソーティングが起こることで、リソソームへのFe(II)イオンの蓄積が起きたことを可視化することができた。研究成果として、VPS35を含む逆行性輸送経路異常とパーキンソン病発症機序の因果関係を解明するために、VPS35機能異常とFe(II)動態の錯乱に関する以下の新知見を見出した点において順調に伸展していると考えている。まず、siRNA法を用いてVPS35をノックダウンさせたSHSY5Y細胞において、DMT1のミスソーティングが起こり、DMT1がリソソームへ蓄積することを確認できた。また、オルガネラ特異的なFe2+蛍光プローブ(ゴルジ、リソソーム)を用いて、VPS35をノックダウンさせたSHSY5Y細胞において、Fe2+蛍光プローブの蛍光強度がゴルジ体で低下した一方で、リソソームにおいては上昇したことを明らかにすることができた。

また、VPS35のノックダウンだけでなく、家族性パーキンソン病で見出された変異型のVPS35を用いても同様な結果をすでに得ている。現在、パーキンソン病の病態に近づけるために、「条件付き不死化ヒト中脳細胞系(LUHMES)」を用いて同様な検討を実施中である。このことにより、本研究の成果を普遍化することが可能に成ると考える。また、上記のようなVPS35の機能異常に起因したDMT1の逆行性輸送経路異常に対して、薬剤を用いて制御できる可能性をすでに見出している。一方で、パーキンソン病モデルマウスなどのin vivo実験系の準備などに時間がかかっているため、早急に対応していく予定である。家族性パーキンソン病患者よりvacuolar protein sorting-associated protein 35(VPS35)が原因遺伝子として同定された。VPS35機能異常により逆行性輸送の破綻が考えられる。しかし、この輸送経路は比較的近年に同定された経路であり、分子機構や疾患への関与など解析が遅れているのが現状である。未だVPS35機能異常とパーキンソン病発症との因果関係を示す有力な説は少ないが、divalent metal transporter 1(DMT1)のミスソーティングという報告がある。DMT1は、2価鉄(Fe2+)の細胞内取込みおよびエンドソーム内のFe2+をオルガネラへ輸送する際に重要な役割を担っている。本研究ではオルガネラ特異的なFe2+蛍光プローブを活用し、Fe2+動態を可視化することで、VPS35を含む逆行性輸送経路異常とPD発症機序の因果関係を解明し、新規の創薬基盤を創出することである。これまでに、リソソームおよびゴルジ体特異的なFe2+プローブを活用して、siRNA法によりVPS35をノックダウンさせたSHSY5Y細胞において、VPS35機能異常により、DMT1のミスソーティングが起こることで、リソソームへのFe(II)イオンの蓄積が起きたことを可視化することができた。本年度は、より病態との関連を明らかにするため、変異VPS35発現のSHSY5Y細胞においても同様の検討をした。結果、ノックダウン時と同様なリソソームへの蓄積を確認できた。さらにリソソームへのFe2+異常蓄積をレトロマー安定化化合物であるR55処置することで改善することを明らかにした。研究成果として、VPS35を含む逆行性輸送経路異常とパーキンソン病発症機序の因果関係を解明を目指すために、VPS35機能異常とFe(II)動態の錯乱に関する以下の新知見を見出した点において順調に伸展していると考えている。まず、変異型のVPS35を発現するSHSY5Y細胞において、VPS35ノックダウン時と同様に、DMT1のミスソーティングが起こり、DMT1がリソソームへ蓄積することを確認できた。また、オルガネラ特異的なFe2+蛍光プローブを用いて、Fe2+蛍光プローブの蛍光強度がゴルジ体で低下した一方で、リソソームにおいては上昇したことを明らかにすることができた。さらに化合物R55を処置することでその異常蓄積を抑制できた。申請書に従って、さらに現状を鑑み、以下のように研究を遂行していく。
アンドロゲン受容体がアロマターゼ発現に与える影響

アロマターゼはアンドロゲンをエストロゲンに変換する酵素であり、乳癌の増殖に関わる重要な酵素である。一方、グルココルチコイド受容体(GR)とretinoicacidreceptor-relatedorphanreceptor(ROR)αは核内ホルモン受容体であり、乳癌での発現が確認されている。我々は乳癌組織におけるRORαの発現解析を行い、RORαがアロマターゼ遺伝子の新規制御因子であることを同定した。それはアロマターゼプロモーターI.4上にRORα応答領域を見出したことによる。このプロモーターの約200bp上流にはGR応答領域が存在し、骨や脂肪組織においてGRがアロマターゼ制御因子である。乳癌組織を用いたRORα、GRおよびアロマターゼのmRNA発現解析結果によると、RORαおよびGRにはアロマターゼ発現との間に正の相関関係を確認できた。RORαはエストロゲン受容体陽性乳癌またはHER2陰性乳癌で発現が高く、核異型度の高い乳癌で発現が低いことを示した。また、正常乳腺と乳癌を比較したところ、正常乳腺の発現量が有意に高いという結果を得た。つまり、乳腺組織が癌化するに伴いRORαの発現は低下し、さらに癌が低分化になるにしたがい発現が低下している。RORαの働きに関しては未解明な点が多いが、筋肉や大脳、小脳、さらにはリンパ球など全身の多くの臓器・細胞に発現しており、それぞれの臓器の正常な発達や恒常性を保つ方向に働いていると考えられる。アロマターゼはアンドロゲンをエストロゲンに変換することから,乳癌の分化・進展に大きく関わる重要な酵素であり,近年では重要な治療ターグットとなった.一方で,アンドロゲン受容体(AR)は乳癌に発現していることが分かっているものの,乳癌にとって増殖傾向に働くのか抑制傾向に働くのか,その影響は明らかではない.実験1:乳癌組織におけるARとアロマターゼの発現解析を行った.乳癌手術症例78例より乳癌手術時に新鮮な検体を取得し,mRNAを抽出後real-time RT-PCR法にて定量した.乳癌におけるARの発現と臨床病理学的因子(ER,PgR,HER2,年齢,腫瘍径,核異型度,リンパ節転移の有無,脈管侵襲の程度など)と比較検討したが,特に傾向は認めなかった.アロマターゼの発現量ともとくに相関は認めなかった.そのため,ARに関する実験は一次打ち切りとした,グルココルチコイド受容体(GR)もARと同様な核内ホルモン受容体であり,乳癌における発現が確認されている.GRに関して同様にmRNAの測定を行ったところアロマターゼの発現との間に正の相関関係を認めた.また,すでに作成してあるアロマターゼプロモーターI.4のルシフェラーゼ発現ベクターを用いてレポータージーンアッセイを行ったところ,GRの発現はROR発現とともに著名な相乗効果を認めた.その原理に関しては解析していない.アロマターゼはアンドロゲンをエストロゲンに変換することから,乳癌の分化・進展に大きく関わる重要な酵素であり,近年では重要な治療ターゲットとなった.一方で,アンドロゲン受容体(AR)は乳癌に発現していることが分かっているものの,乳癌にとって増殖傾向に働くのか抑制傾向に働くのか,その影響は明らかではない.実験1:乳癌組織におけるARとアロマターゼの発現解析を行った.乳癌手術症例78例から乳癌手術時に新鮮な検体を取得し,mRNAを抽出後,real-time RT-PCR法にて定量した.乳癌におけるARの発現と臨床病理学的因子(ER,PgR,HER2,年齢,腫瘍径,核異型度,リンパ節転移の有無,脈管侵襲の程度など)と比較検討したが,特に傾向は認めなかった.アロマターゼの発現量とも特に相関は認めなかった.そのため,ARに関する実験は一次打ち切りとした.実験2:グルココルチコイド受容体(GR)もARと同様な核内ホルモン受容体であり,乳癌における発現が確認されている.GRに関して同様にmRNAの測定を行ったところアロマターゼの発現との間に正の相関関係を認めた.

また,既に作成してあるアロマターゼプロモーター1.4のルシフェラーゼ発現ベクターを用いてレポータージーンアッセイを行ったところ,GRの発現はROR発現とともに著名な相乗効果を認めた。相乗効果の原理に関しては解析不十分であり今後の課題である.その途中過程において,我々のレポータージーンアッセイでの結果では,従来報告されたグルココルチコイド応答領域と異なる位置でグルココルチコイドの応答性を認めているアロマターゼはアンドロゲンをエストロゲンに変換する酵素であり、乳癌の増殖に関わる重要な酵素である。一方、グルココルチコイド受容体(GR)とretinoic acid receptor-related orphan receptor (ROR)αは核内ホルモン受容体であり、乳癌での発現が確認されている。我々は乳癌組織におけるRORαの発現解析を行い、RORαがアロマターゼ遺伝子の新規制御因子であることを同定した。それはアロマターゼプロモーターI.4上にRORα応答領域を見出したことによる。このプロモーターの約200bp上流にはGR応答領域が存在し、骨や脂肪組織においてGRがアロマターゼ制御因子である。乳癌組織を用いたRORα、GRおよびアロマターゼのmRNA発現解析結果によると、RORαおよびGRにはアロマターゼ発現との間に正の相関関係を確認できた。このことから、1乳癌組織におけるアロマターゼ発現はRORαにより直接制御されており、2乳癌組織においても骨や脂肪組織と同様にGR制御があることが考えられる。また、乳癌培養細胞を用いた実験ではアロマターゼプロモーターI.4遺伝子の活性がRORαとGRそれぞれ単独よりも両者の共発現により著明な相乗効果があることを確認した。RORαはエストロゲン受容体陽性乳癌またはHER2陰性乳癌で発現が高く、核異型度の高い乳癌で発現が低いことを示した。また、正常乳腺と乳癌を比較したところ、正常乳腺の発現量が有意に高いという結果を得た。つまり、乳腺組織が癌化するに伴いRORαの発現は低下し、さらに癌が低分化になるにしたがい発現が低下している。RORαの働きに関しては未解明な点が多いが、筋肉や大脳、小脳、さらにはリンパ球など全身の多くの臓器・細胞に発現しており、それぞれの臓器の正常な発達や恒常性を保つ方向に働いていると考えられる。研究当初の予想に反してアンドロゲンとアロマターゼ発現の間に特別な相関を認めなかったため,研究方向の修正を必要とされたため.また,研究分担者が平成23年度より異動により減員したため.24年度が最終年度であるため、記入しない。臨床検体を用いた実験においては順調に進めており,一方で培養細胞を用いた実験においては技術者の養成が必要であり,調整中である.24年度が最終年度であるため、記入しない。
臨床応用への展開を目指すEGFRを標的とした組換え型ヒト型化diabodyの構築

本研究は、当研究室により世界で初めて巻き戻しによる調製に成功した最小の組換え型二重特異性抗体(diabody)の中で、極めて高い抗腫瘍効果を示した上皮増殖因子受容体(EGFR)を標的としたEx3 diabody(Ex3)の医用へのより現実的展開を目的としている。今年度は、1.ヒト型化Ex3の機能改変と評価、2.抗腫瘍エンハンス分子融合Ex3の機能評価、3.Ex3の強力な傷害性に関与する因子、作用機序の解明、の観点から研究を進めた。実績は以下の通りである。(1)前年度作製したヒト型化Ex3を各種機能評価を行った結果、著しい活性の低下が見られた。そこで、機能回復のために直接抗原結合に関与しない残基に変異を導入した10種の変異体を作製したところ、いくつかに活性の回復が見られたため、その中で最もヒト由来配列の多いものをヒト型化Ex3とした。ヒト型化前のEx3とのすべての比較実験において、同等の効果を示し、またマウスを用いたin vivo治療実験でも延命効果が見られたことからもヒト型化Ex3の構築に成功したと言える。(2)昨年度構築した、等研究室で全合成法により構築した抗腫瘍サイトカインIL-21との融合Ex3(IL-21-Ex3)の機能評価を行ったところ、予期しない著しい活性の低下が見られた。この事は、Ex3の末端部位が構造形成、あるいは強力な活性に必要であることを示唆する重要な知見である。(3)蛍光試薬を用いた経時変化観察により、Ex3はアポトーシスを誘導するような働きがあることが分かった。またチロシンキナーゼの阻害能も調べたところ傷害性との相関が見られなかった。即ちチロシンキナーゼの阻害による成長阻害よりもEx3は明らかに早い傷害性を誘導しているという、既存の分子標的治療薬とは異なる作用機序を示唆する結果を得た。今年度は、(1)臨床試薬としての繰り返し投与に耐えうるためのCDR graftingによるヒト型化、(2)低免疫原性、かつ効果の増強をねらった強力な抗腫瘍エンハンス分子との融合、(3)Ex3の強力な傷害性に関与する因子の解明、の観点から研究を進めた。(1)Ex3を構成する二種の抗体の中で抗CP3抗体は既にヒト型化した配列が報告されているため、発現宿主、大腸菌に最適化した遺伝子を全合成法により作製した。当研究室によりクローニングされたもう一方の抗EGFR抗体に関しては抗体の直接抗原と相互作用するアミノ酸残基以外の配列(FR)の相同性検索を行い最も相同性の高いヒト由来のFRを選択し、同様に遺伝子を全合成した。その後、それぞれを組み合わせ、ヒト型化Ex3を作製した。今後、ヒト型化前後の活性を評価する。(2)本研究室で既に確立させたdiabody-抗腫瘍エンハンス分子融合蛋白質作製手順に基づき、近年同定され、また当研究室で遺伝子を全合成させた低免疫原性分子であるヒト由来のサイトカインIL-21との融合Ex3を作製した。今後融合前後での活性の増減を評価する。(3)Ex3の作用機序の解明への糸口として、共焦点蛍光顕微鏡を用いた観察法の確立を目指した。アポトーシス、ネクローシスを識別する蛍光試薬を用いた観察によりEx3の傷害性は両者の関与を示唆する結果が得られた。今後、癌細胞、活性化リンパ球、あるいはEx3自身を蛍光染色させて、局在性や作用機序の解明を目指す。

(3)蛍光試薬を用いた経時変化観察により、Ex3はアポトーシスを誘導するような働きがあることが分かった。またチロシンキナーゼの阻害能も調べたところ傷害性との相関が見られなかった。即ちチロシンキナーゼの阻害による成長阻害よりもEx3は明らかに早い傷害性を誘導しているという、既存の分子標的治療薬とは異なる作用機序を示唆する結果を得た。
複合的人道危機から逃れた難民を受け入れたことによって生じたケニア女性の健康問題

難民を受け入れることにより負担が増大するホストコミュニティーの健康状況を調査することを目的に東アフリカウガンダ共和国難民定住地で調査を行った。難民定住地内の長期滞在者は、同じ出身国である南スーダンからの新規難民流入によりウガンダ政府から貸与されている土地を奪われること、水などの天然資源を分かち合わねばならぬこと、新規流入者が敵対勢力であることなどを起因とする小競り合いが増えたことなどから存在を脅かされていることが健康負担となっていることが面接結果から判明した。研究初年度に引き続き、調査対象地域における現地調査実施の可能性を探ってきた。しかし、研究対象地域であるケニア共和国における治安の悪化、一般市民を巻き込んでの爆発事件など予測不能な事態が発生していたことから、現地赤十字社や国際非政府団体などと連絡をとり相談してきたが、不測の事態発生の可能性が大きいとの助言を受け、今年度中における現地調査は控えることとした。過去2年間のケニア共和国内、特に研究調査対象地域であるケニア共和国と隣国ソマリアとの国境周辺や隣接の州における状況等から、当該調査対象地域における研究実施可能性が低いと考えるに至っている。理由は、ケニア国内の治安が流動的であり、現地に研究拠点を持たず、訪問により現地調査を行う研究者にとっては非常に困難な事態になってきていること、本研究の主旨から隣国や周辺国との関係性が重要でありケニア国内の事情だけでは治安・情勢の判断がつかず、調査の実施が困難であることである。上記2点を踏まえて今年度後半から、ケニア共和国に類似の問題を持ち、かつ英語圏における研究対象国の選出を始め、研究調査対象地域の拡大を試みている。研究調査地域の候補としてザンビアとネパールを選出した。ザンビアはケニアと同じアフリカ大陸の国であり、政治的には安定しているものの周辺国からの難民を長期にわたって受け入れている国家である。ネパールは、1996年以降の共産主義勢力の台頭により国内ほぼ全土において暴動が発生し、長きに渡って続いてきた王政が倒れ、その国内暴動時に多くの国内避難民が発生、多くの地域において受け入れるという事態が発生した。加えて、長期にわたり隣国からの難民を受け入れている国家でもある。平成26年度は、上記2カ国において現地調査を実施したいと考えている。研究第1年度であった平成24年度は、インターネットなどを通じて現地の情報収集を行い、それを基に、研究調査対象地域であるケニア共和国東北州ガリッサ県を訪問し、平成22年度に発生した旱魃による被災状況、またその被災による人々の健康被害状況を把握することが目的であった。当該研究対象地域は、元来、隣国ソマリアとの国境近くであり治安の悪化が懸念されていた場所である。加えてケニア側が国境付近のソマリアの武力集団に対し軍隊を派遣したこと、2007年に国内大暴動を引き起こした大統領選挙後、初の大統領選挙が行われたこと、などから研究対象地域の治安悪化が進み、常駐の人道援助でさえ一次退去せざるを得ない状況であったことなどから、研究対象地域訪問延期を余儀なくされた。よって、第1年度に計画していた現地状況の把握には至らず、2年度目(平成25年度)に持ち越しとなった。科学研究費助成事業採択後、研究調査地域であるケニアへの渡航調整を複数年にわたり行ってきたが、隣国ソマリアとの治安問題やケニア国内のテロ事件などで状況の改善は見られず、最終的にケニア国内、特に隣国ソマリアからの難民うけ入れ地域でのホストコミュニティー(ケニア国民)の状況を観察することは非情に困難であると判断し、ケニア国内での研究を断念した。ただ、東アフリカ地域においては、多くの国々が近隣諸国からの難民の受け入れを行っており、気候や開発途上国である状況など類似の点も多い。そこで、日本学術振興会に照会をおこない、「研究の本来の目的が同じであれば調査地変更はやむをえない」との回答を受け、ウガンダで調査を実施した。現地調査は、平成27年2月25日から平成27年3月9日に、ウガンダ政府難民局の許可を得てウガンダ北西部のKIRYAMDONGO REFUGEE SETTLEMENTで実施した。訪問時の滞在難民数は38,077人であった(2015年2月27日現在)。副指揮官と難民リーダーのひとりとの調整後、15名の難民と二つのNGO担当官との面接を行った。結果、本研究はホストコミュニティーに着目し、難民を受け入れたことによる健康への影響に着目するのが本来の目的であったが、今回の調査地において「受け入れ地とその人々(ホストコミュニティー)」をあらためて考え直す機会に恵まれた。難民キャンプ地として長く、歴史あるキャンプ(滞在地)においては、旧流入組(長期滞在者)と新参者の間での軋轢が生じており、特に南スーダンからの難民に関しては、新参者が過去の紛争の敵対者であり、その人々の流入により生活が圧迫されることとなった長期滞在者は強い疲弊感を抱いている。ホストコミュニティーの状況を考えていく上では、受入国と難民だけでなく、新規流入者を受け入れた難民(長期滞在者)の状況を考えていく必要性がある。平成24年度の科学研究費助成事業採択後、研究対象地域の治安悪化のため対象地域を再考する必要があり、研究の開始が大幅に遅れ現在進行中である。平成27年度は平成28年1月25日から2月7日までウガンダ共和国KIRIYANDONGO REFUGEE SETTLEMENTで難民の面接調査を行った。訪問時の当該定住地の難民の数は46,000人余りであり、2013年12月の南スーダン内の危機的状況から大挙して逃げ込む状況は落ち着いているが、現在も難民の流入がある。

今回の面接調査では、合計15人の女性に対し実施し、平成26年度の16名と合わせて合計31名の面接調査を実施することができた。面接対象者の選択に当たっては、目的である「ホストコミュニティーの健康問題」を調査すべく、キャンプマネージメントにかかわる難民代表者とも協議した。当該定住地には、ウガンダ国内からの移住者が滞在しているため、ウガンダ国民をホストコミュニティーとした。平成26年度は「ホストコミュニティー」「新規流入者」「2013年12月の危機以前からの滞在者」「特別な支援を要する家族」とカテゴリーを分けて合計16名に面接を行った。その結果、南スーダンの危機的状況発生以前から滞在する難民たちにとって、大量の難民の流入が土地や水他の自然資源の減少、治安の悪化につながり、難民定住地での滞在に対し大きな不安を抱えていた。これを受け平成27年度は「2013年12月の危機以前からの滞在者」を中心に面接を行った。結果、難民たちにとっては、かつての敵対勢力者の新規流入がもたらす治安の悪化や、将来を予測することができずにいることなどの困難は抱えているが、共存を目指した定住地内での活動が、効果を表しつつあり安定を取り戻している。しかし面接者の多くは、何らかの身体的健康問題を抱えている状況である。難民を受け入れることにより負担が増大するホストコミュニティーの健康状況を調査することを目的に東アフリカウガンダ共和国難民定住地で調査を行った。難民定住地内の長期滞在者は、同じ出身国である南スーダンからの新規難民流入によりウガンダ政府から貸与されている土地を奪われること、水などの天然資源を分かち合わねばならぬこと、新規流入者が敵対勢力であることなどを起因とする小競り合いが増えたことなどから存在を脅かされていることが健康負担となっていることが面接結果から判明した。上記、「研究実績の概要」に記載したとおり、研究対象国の治安問題で研究開始が大幅に遅れ、研究期間の最終年度の開始となってしまったため。国際看護今年度中に再度調査対象地域を訪問し、当該難民キャンプで長期滞在となっている難民に再度面接を行い、心身の健康状況を査定する。加えて、難民キャンプ地内にある医療機関や関連NGOから、長期滞在者の健康被害の状況に関し情報を収集する。上記研究実績に記載したとおり、予定していた研究調査対象地域の訪問ができていない状況である。現地訪問による調査が非常に重要な研究であり、かつ研究者の訪問が難民・避難民・受け入れ地域の人々にもたらす影響が非常に大きいことが予測される。そのために、訪問しての調査実施可能性を辛抱強く検討を重ねてきたが、今年度は訪問実施には至らなかった。インターネットなどでの情報収集などは可能であったが、大きな目的のひとつである現地調査がまったく行えなかったことが、遅延の最大の要因である。
種子貯蔵タンパク質の生合成と分解に関与するプロテアーゼに関する研究

種子貯蔵タンパク質は、生合成過程において限定分解を受けて前駆体より成熟化する。本研究ではイネ種子において限定分解を担うと考えられるアスパラギン残基特異的なプロテアーゼ(asparaginyl endopeptidase;AEP)の性質について検討した。まず、イネ種子AEPのcDNAを用い、組み換えAEP前駆体タンパク質を大腸菌により大量発現させた。その結果、このタンパク質は不溶性となり、酵素化学的性質をしらべることは困難であった。そこで、不溶性発現タンパク質の可溶化・再構成を試みた。その結果、0.7%ザルコシンにより可溶化し、その後還元型および酸化型グルタチオンの存在下で透析を行ってザルコシンを除くことにより、可溶性の組み換え体を得た。次に組み換え体の酵素活性を検討した。基質として、イネ種子の主要な貯蔵タンパク質であるグルテリンのプロセシング部位周辺の配列GCPNGLDETFのペプチドを用いた。このペプチドを組み換え前駆体タンパク質とインキュベートし、生成物をHPLCで精製した後、その構造をしらべた結果、生成物はGCPNとGLDETFであった。このことからイネ種子AEPは自己触媒的に活性を有する成熟型酵素となってアスパラギン残基のC末端側を切断することが明らかとなった。また実際にイネ種子においてグルテリンの成熟化に関与していることが強く示唆された。さらにノーザン分析によりmRNAの発現状態を観察したところ、イネ種子AEPは種子の登熟・発芽の両過程にわたって発現していることが確認された。またRT-PCRによるクローニングの結果、イネ種子にはこれまで解析してきたものとは一次構造の異なる、新たなAEPmRNAが発現していることも明らかとなった。本年度はイネ種子において限定分解を担うと考えられるAsn残基特異的なプロテアーゼ(AEP)の性質について検討した。イネ種子AEPはプロペプチドを有する前駆体として合成される。まず、既に取得したイネ種子AEPのcDNAを用い、組み換えAEP前駆体タンパク質を大腸菌により大量発現させた。その結果、このタンパク質は不溶性の封入体として発現し、そのままでは活性を持たず、酵素化学的性質をしらべることは困難であった。その結果、0.7%N-lauryl sarcosineにより可溶化し、その後還元型および酸性型グルタチオンの存在下で透析を行ってN-lauryl sarcosineを除くことにより、可溶性の組み換え体を得た。このことからイネ種子AEPは正確にAsn残基のC端末側を切断することが明らかとなり、また実際にイネ種子においてグルテリンの成熟化に関与していることが強く示唆された。このとき前駆体タンパク質は自己触媒的に成熟酵素となっていると考えられる。
急速凍結・ディープエッチング法による新鮮無固定赤血球膜の免疫細胞化学的研究

従来から赤血球膜裏打ち構造の形態学的研究では、樹脂包埋後の染色切片による透過型電顕法、あるいは赤血球膜脂質を界面活性剤で除去させた後に走査型電顕で観察する方法があった。本研究では、独自に開発した急速凍結・ディープエッチング法を使い、新鮮無固定赤血球膜を免疫細胞化学的に検索した。平成7年度には、新鮮無固定赤血球膜細胞質側を高解像力で三次元的に解析する方法を開発し、さらに赤血球膜骨格蛋白の抗体を作成した。平成8年度には、膜骨格蛋白の免疫染色標本により、その局在と結合様式を明らかにした。(1)ヒト新鮮無固定赤血球ペレットを遠沈して作成した。(2)赤血球内可溶性蛋白質を除去するために、グルタールアルデヒドとアミノプロピルトリエトキシシランを被覆した2枚のカバーガラス間で、赤血球をはさみ二分割した。(3)平成7年度に作成されたスペクトリン等に対するモノクロナール抗体で免疫染色した。(4)次いで液体窒素冷却イソペンタン・プロパン混合液(約-193°C)中で急速凍結した。(5)ターボ分子ポンプ装備エイコ-社製FD-3AS装置内(-95°C、2-6X10^<-7>Torr)で1530分間ディープエッチング(氷を昇華)をかけた。(6)白金(角度24°)と炭素(角度90°)を回転蒸着して、型のごとくレプリカ膜を作製した。(7)日立H-8100電顕でレプリカ膜よりステレオ写真を撮影し、三次元的解析を行った。これにより、固定により修飾を受けない新鮮無固定赤血球膜細胞質側に局在し、外力により動的に変化するin situスペクトリン網目状構造を明らかにすることができた。ヒト赤血球膜細胞質側にはスペクトリンがアクチン、バンド_<4・1>などの蛋白質と結合して網目状構造を形成している。さらにこれらの網目状構造はアンキリンやバンド_<4・1>を介して、細胞膜脂質二重層を貫通しているバンド_3やグリコフォリンに結合して、赤血球膜を安定化していると考えられている。本年度は新鮮無固定赤血球膜細胞質側を高解像力で三次元的に解析する方法の開発と膜骨格蛋白の抗体作成を行った。(2)赤血球内可溶性蛋白質を除去するために、細胞内電解質組成緩衝液中にてグルタールアルデヒドとアミノプロピルトリエトキシシランを被覆した2枚のカバーガラス間で赤血球をはさみ二分割した。(3)次いで液体窒素冷却イソペンタン・プロパン混合液(約-193°C)中で急速凍結した。(4)現有設備のターボ分子ポンプ装備エイコ-社製FD-3AS装置内(-95°C、2-6X10^<-7>Torr)で1530分間デイ-プエッチング(氷を昇華)をかけた。(5)白金と炭素を回転蒸着して、型のごとくレプリカ膜を作製した。(6)現有設備の日立H-8100電顕でレプリカ膜よりステレオ写真を撮影し、新鮮無固定赤血球膜骨格構造の三次元的解析を行い、細かい網目状構造を確認した。[モノクロナール抗体の作成](1)ヒト赤血球膜より、スペクトリンなどの蛋白をイオン強度のグラデイエントを用いたカラムクロマトシステムにより精製した。さらにSDS及びレクタンゲル電気泳動装置とゲル乾燥器により蛋白分析を行なった。

(2)各々の蛋白をBALB/Cマウスに免疫後に、脾臓を摘出してリンパ球を採取した。(3)培養ミエローマ細胞と融合させてモノクロナール抗体を作成した。(4)赤血球膜裏打ち構造を形成するスペクトリン蛋白などの数十種類のモノクロナール抗体を確認した。従来から赤血球膜裏打ち構造の形態学的研究では、樹脂包埋後の染色切片による透過型電顕法、あるいは赤血球膜脂質を界面活性剤で除去させた後に走査型電顕で観察する方法があった。本研究では、独自に開発した急速凍結・ディープエッチング法を使い、新鮮無固定赤血球膜を免疫細胞化学的に検索した。すでに平成7年度には、新鮮無固定赤血球膜細胞質側を高解像力で三次元的に解析する方法を開発し、さらに赤血球膜骨格蛋白の抗体を作成した。平成8年度には、膜骨格蛋白の免疫染色標本により、その局在は結合様式を明らかにした。(1)ヒト新鮮無固定赤血球ペレットを遠沈して作成した。(2)赤血球内可溶性蛋白質を除去するために、グルタールアルデヒドとアミノプロピルトリエトキシシランを被覆した2枚のカバーガラス間で、赤血球をはさみ二分割した。(3)平成7年度に作成されたスペクトリン等に対するモノクロナール抗体で免疫染色した。(4)次いで液体窒素冷却イソペンタン・プロパン混合液(約-193°C)中で急速凍結した。(5)ターボ分子ポンプ装備エイコ-社製FD-3AS装置内(-95°C、2-6X10^<-7>Torr)で1530分間ディープエッチング(氷を昇華)をかけた。(6)白金(角度24°)と炭素(角度90°)を回転蒸着して、型のごとくレプリカ膜を作製した。(7)日立H-8100電顕でレプリカ膜よりステレオ写真を撮影し、三次元的解析を行った。これにより、固定による修飾を受けない新鮮無固定赤血球膜細胞質側に局在し、外力により動的に変化するin situスペクトリン網目状構造を明らかにすることができた。