hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
裸子植物ソテツの体温振動を支える光依存的発熱分子メカニズムの解明

H30年度は、ソテツの花の発熱関連遺伝子と推定されている2つの遺伝子について、光照射後と消灯後に、経時的に雄花の小胞子葉・小胞子のうおよび雌花の大胞子葉・胚珠のサンプリングを行い、当該組織のRNA調製とリアルタイムPCRによる発現解析を行った。前年度に、新学術領域研究「先端ゲノム支援」の採択課題を選定され、RNA-seq解析研究を推進できたことにより、リアルタイムPCRのインターナルコントロール探しも順調に行うことができた。なお、H28年度とH29年度の研究成果を含む論文が、植物分野で世界的に有名な雑誌であるPlant Physiologyに掲載された。研究実績にも記載したように、申請研究の1年目(H29年度)に新学術領域研究「先進ゲノム支援」に採択されたことにより、本申請研究で予定していたRNA-seq解析については、飛躍的に進展させることができた。また、本年度は、Plant Physiologyに論文が受理されたことから、現在までの進捗状況としては、(1)当初の計画以上に進展している、に該当すると考えている。今後、ソテツの花が光に依存して体温を変化させる際に、発現変動がみられる遺伝子の探索を行う予定である。そのためにはまず、一定の光条件下においたソテツの花序から、経時的に一部の組織を採取する必要があり、採取による組織の痛みが、発熱能力に影響を与えないよう、工夫をしながら採取する必要がある。また、H29年度までにAOXキャパシティが検出された組織については、より詳細な呼吸特性を、様々な基質や阻害剤を用いて調査する。申請研究の2年目(H30年度)に行ったリアルタイムPCRによる発熱関連遺伝子の解析では、花ごとに発現レベルのバラツキが大きかった。これは、サンプリングの際、ソテツの幹から切り取った花の成長ステージにバラツキがあったためと考えられた。そのため、次年度の研究では、ソテツの花を採取するタイミングをしっかりと検討して研究を進める。また、次年度も引き続き、AOXキャパシティが検出された組織については、より詳細な呼吸特性を、様々な基質や阻害剤を用いて調査する。発熱する花の呼吸測定用機器購入のため、次年度使用額が生じた。
エクソゾームによるスギ花粉症治療の可能性

エクソゾームは、ドナー細胞の細胞質内にある親水性の蛋白、細胞膜、その近傍にある蛋白とともに小胞体を形成し、MHC class I、IIの抗原情報を含んでいる。この情報が隣接した細胞内に取り込まれたり、細胞表面の受容体を刺激したりする。そこで舌下免疫療法にて著効した患者血漿中からエクソゾームがそのような効果があるか調べることを目的として、まず血漿中からエクソゾームの分離を試みた。その結果15μgから80μgのエクソゾームが分離できた。さらにウエスタンブロットを行うとMHCクラスIIα鎖、CD9、CD86のバンドが検出できた。しかし抗CryJ1抗体では、バンドは検出できなかった。以上からエクソゾームの回収は可能であるが、やはり量が少ないことが問題であり、更なる検討には、回収量の改善と検出感度の向上が必須であることが判明した。本年度は未治療のスギ花粉症患者10名と、スギ抗原特異的舌下免疫療法実施中の患者10名から200mlの採血を行い、全血清からエクソソームの抽出を行った。まずエクソゾームに含まれる蛋白を両者で比較することを目的とした。両者の血清を100,000gの超遠心にかけて得られたエクソゾームを含むペレットをPBS100μlで溶解し、濃度を測定した。全サンプル中で最も高濃度のものは17.5μg/μlであったが、低濃度のものは3.0μg/μlであった。この範囲は、個人差もあると思われるが、手技に習熟していないための損失もある可能性が考えられた。こうして粗ペレットから300μg1750μgの蛋白が抽出できることを確認し、ペレットを蔗糖密度勾配で14時間超遠心し、蔗糖密度1.131.19g/mlの濃度でエクソゾームを含むと考えられるサンプルを分離した。この手技によって得られたエクソゾームサンプルの蛋白量は多いもので80μg、少ないもので15μgであった。この量では、得られたサンプルを様々な蛋白でwestern blotするには、サンプル量が不足する可能性が想定された。第一段階として、DCから産生されるエクソゾームに多く含まれるCD86の発現をWestern blotにて検討したが、得られたエクソゾーム分画のサンプルでは、検出できなかった。おそらく全血清を用いたため、DC由来エクソゾームが多く含まれているとは限らないことと、200mlの採血ではエクソゾーム量が少ない可能性があることが判明した。次年度は、手技的改善と細胞培養上清からのエクソゾーム回収を行い、検討していく。新しい細胞間連絡物質として注目されているエクソゾームをスギ花粉症患者から分離し、その中にスギ抗原に関する情報が含まれていないか検討した。方法として患者末梢血200mlを採取し、血清を分離した。さらに2回の超遠心処理をし、得られた沈殿内においてエクソゾームが含まれていることが判明した。沈殿物をPBSで溶解し、さらに庶糖密度勾配で14時間超遠心した。13の庶糖密度分画内で1.131.19g/mlの濃度分画にエクソゾームが含まれていることを確認できた。そこでこの1.131.19g/mlの濃度を示す分画を回収して、抗CD9抗体を用いてウエスタンブロットを行うと、目的とする分子のところにバンドを認めた。さらに抗MHC classII alpha鎖抗体によって同じ様にウエスタンブロットを行うと、濃度は薄いが確実にバンドを認めた。以上のことから遺伝情報を含むエクソゾームの存在は確実となった。そこでスギ抗原であるCryJ1に対する抗体を用いてウエスタンブロットを行ったが、バンドは認められなかった。同様のことをスギ花粉症患者10名において行ったが、いずれの症例でもバンドは認められなかった。これらのことは、得られたエクソゾームを含む分画にスギ抗原情報が含まれていないのか、それともスギ抗原のペプチドが遺伝情報として含まれているのか、二つの可能性が示唆された。そこでこれまで報告されているいくつかのスギ抗原ペプチドに対する抗体を受託した。できた抗体でエクソゾームが含まれる分画において同様のウエスタンブロットを直ちに行う予定である。今回、考えていた以上に血清中から十分なエクソゾームを回収することが困難であることが、明確にできた。
米国保健医療システムにおける非営利組織の機能分析

平成9年度の作業は、収集したデータの整理・解析・検討と報告書のとりまとめである。米国における官庁統計・官報の2次資料並びに電子メール等により入手した財団及びNPOの活動に関する統計資料を使用したデータベース作成と同時に、財団及びNPOの活動に関する数量的基礎付けの作業を行った。作成したデータベースをもとに、SAS処理を通して単純・クロス集計/多変量解析技法等を使用し、活動の動態を数量的に分析、検討した。また、NPO活動・ファウンデーションの活動を、調査した事例に従い数量的に分析し、各々の特徴に従い分類し、各分類カテゴリーの背景的仮説理論構築の作業を通じNPOの米国保健医療システムにおける機能を解明した。ついでNPO活動の特徴点に関しての概括的整理及び内容的整理の補足資料収集(電子メール等使用による外部データベースを手がかりとする)をなし、収集した各種データの分析・検討を行うとともに理論的分析と統合し、活動の特徴点の明確化のため実証的裏付け作業を行った。得られた知見としては、アメリカ非営利セクターについて、年間収入規模や資産額という経済的側面において、少数だが経済的に大規模な組織と多数の小規模で零細な草の根的非営利組織に二分される非営利セクター二重構造が存在することが判明した。この二重性は、経済的分野の二重性に止まらず、非営利組織の機能的側面にも反映しており、特に組織内の専門職の果たす役割に多大な影響を与えていることがわかった。つまり既存システムを補完する大規模組織内の専門職は既存の分業化そして特化した役割を発揮するよう機能し、その一方草の根的組織においては全体をコーディネートすると同時に地域コミュニティのニーズの掘り起こし及び充足する主体とし機能していることが判明した。この調査及び研究の結果を「米国保健医療システムと非営利組織の機能分析(報告書)」としてまとめた。平成8年度は、既存の研究成果およびデータを参考にアメリカ非営利セクターの全体像と非営利組織の機能に関する仮説の構築を行いつつ、その仮説の検証を行うべく保健医療関連の活動をカリフォルニア州において行っている1600の団体に対して郵送法による質問紙調査を平成9年1月から3月にかけて実施し、現在その集計および分析を行っている。集計および分析の途中結果から得られる知見として、以下の二点があげられる。アメリカの非営利セクターは、サービス提供非営利組織の周囲にそれらを資金、情報などの面から支援する多様な非営利組織や財団より構成され、一つの「重層的システム」をなしている。従って、アメリカの非営利セクターはその意味で独立した一つのセクターをなしている。しかし、年間収入規模や資産額といった経済的側面よりすると、少数だが経済的に大規模な組織と多数の小規模で零細な草の根的非営利企業に二分される。(非営利セクターの二重性)この二重性は、単に経済的規模の二重性にとどまらず、非営利組織の機能的側面にも反映していると思われる。すなわち、大規模な組織は既存システムの補完的機能を果たし、草の根の組織は既存のシステムに対する監視や改革の機能を持ち、さらにはシステムの自立的運営を目指す傾向が見て取れる。またこのような二重性は、っこれらの組織における専門家の果たす役割にも大きな影響を及ぼしているのであり、既存システムを補完する大規模組織では既存の分業の一環として専門家が機能し、草の根的組織では活動の全体をコーディネートする機能を果たしている傾向が見られる。この点は、専門性が決定的な役割を果たす保健医療領域の非営利活動においてはもっとも顕著に現れていると考えられる。今後は、収集された文献・資料・データのよりいっそうの分析・検討を行い報告書作成に当たる。

作成したデータベースをもとに、SAS処理を通して単純・クロス集計/多変量解析技法等を使用し、活動の動態を数量的に分析、検討した。また、NPO活動.ファウンデーションの活動を、調査した事例に従い数量的に分析し、各々の特徴に従い分類し、各分類カテゴリーの背景的仮説理論構築の作業を通じNPOの米国保健医療システムにおける機能を解明した。ついでNPO活動の特徴点に関しての概括的整理及び内容的整理の補足資料収集(電子メール等使用による外部データベースを手がかりとする)をなし、収集した各種データの分析・検討を行うとともに理論的分析と統合し、活動の特徴点の明確化のため実証的裏付け作業を行った。得られた知見としては、アメリカ非営利セクターについて、年間収入規模や資産額という経済的側面において、少数だが経済的に大規模な組織と多数の小規模で零細な草の根的非営利組織に二分される非営利セクター二重構造が存在することが判明した。この二重性は、経済的分野の二重性に止まらず、非営利組織の機能的側面にも反映しており、特に組織内の専門職の果たす役割に多大な影響を与えていることがわかった。つまり既存システムを補完する大規模組織内の専門職は既存の分業化そして特化した役割を発揮するよう機能し、その一方草の根的組織においては全体をコーディネートすると同時に地域コミュニティのニーズの掘り起こし及び充足する主体とし機能していることが判明した。この調査及び研究の結果を「米国保健医療システムと非営利組織の機能(報告書)」としてまとめた。
ケミカルバイオロジーへの展開を指向したキノコ子実体形成ホルモン候補物質の合成研究

キノコの子実体形成誘導活性を持ち,多くのキノコ類における存在が確認されている新規なD環開裂型骨格を有するステロイド誘導体strophasterol AおよびBの全合成の完成を目指した。前年度の研究では,ergosterolを原料として,B環上の2つの二重結合のC, D環部への移動,Jones酸化によるD環へのケトン基の導入,alpha-ヒドロキシ酸中間体の酸化開裂,生じたD環開裂型のケトカルボン酸のセレノエステル化とラジカル環化による側鎖二重結合への巻き込み等を経て,strophasterolの側鎖部位に存在する5員環の構築に成功した。本年は,工程の効率化による供給体制の強化,B, C環部の化学修飾によるstrophasterol Aの全合成の完成,もう一つの合成標的であるstrophasterol Bの合成を進めた。前年度の合成経路において,工程数および収率の面で問題となっていたD環部へのケトン基の導入を経るD環開裂型ケトカルボン酸の調製に関しては,Jones酸化生成物を大過剰の亜鉛と濃硫酸で処理することにより,水酸基の還元除去,生成したエノンの共役還元,ケトンの還元,および脱水反応が一挙に進行して,D環部に二重結合を1つだけ持つ中間体を得ることに成功し,そのエポキシ化とJones試薬による酸化開裂により,D環開裂型ケトカルボン酸の得る工程を大幅に短縮するとともに,収率の向上に成功した。また,側鎖部にtrans置換型5員環を持つ重要中間体ケトンからはstrophasterol AのB環部の官能基修飾を残すのみの中間体を得るとともに,そのケトン基をエノールチオエーテルに変換した後,ラネーニッケルによる脱硫とジアステレオ選択的水素添加により,cis型の5員環を持つ重要中間体も得ることが出来た。両化合物とも,B環への酸素官能基の導入が成功すれば,全合成が完成する。27年度が最終年度であるため、記入しない。ステロイド骨格のD環が開裂し,側鎖との間に新たなシクロペンタン環を形成した前例のない炭素骨格を有するstrophasterol類には,キノコの子実体形成誘導ホルモンではないかとの期待が高まっている。本化合物群がキノコ界初のホルモンであることを証明するとともに作用機構解明に向けた研究を推進する上で大きなネックとなっているstrophasterol類の量的供給を目指して,2014年度はstrophasterol Aの全合成に取り組んだ。比較的安価な天然ステロール原料であるergosterolに対して,B環上の2つの二重結合をC環およびD環に移動させ,そのクロム酸酸化によりgamma-ヒドロキシ-alpha,beta-不飽和ケトン中間体を得た。その化合物に対し,二段階の金属還元を行ってD環上にケトン基を有するステロイド誘導体とし,さらに位置選択的シリルエノールエーテル化とRubottom酸化によりalpha-ヒドロキシケトンに変換した。A環部の水酸基を保護した後,alpha-ヒドロキシケトン部位の酸化開裂を検討したところ,常法である過ヨウ素酸酸化やし酢酸鉛酸化では反応が全く進行しなかったが,クロム酸による酸化開裂が高収率で進行することを見出し,合成の最初の課題であったD環部の開裂に成功した。得られたケトカルボン酸をセレノールエステルとした後ラジカル還元を行ったところ,側鎖の二重結合とシクロペンタノン環を形成した化合物を与え,新たに生成した5員環上のケトン基を化学選択的に還元することでstrophasterol AおよびBに特徴的な全炭素骨格を有する重要中間体の構築に成功した。第2の大きな課題を解決したと考えている。

全く新規な炭素骨格の構築であったため,過去に前例がなく,D環開裂までに多くの時間を費やす結果となった。また,重要中間体への合成ルートをなんとか見つけることに重点を置いたため,各反応工程の最適化と工程数の削減・効率化が課題として残されている。とは言え,strophasterol類の全炭素骨格を組み上げることができたことは一定の成果だと思われる。27年度が最終年度であるため、記入しない。今後は重要中間体の調製の収率向上と工程数の削減について検討しながら,全合成の完成に向けた最後の課題であるA/B/C環部の官能基化を行う。既に得た重要中間体はC環上にケトン基を有しており,そのケトン基を手がかりとしてalpha-位に臭素を導入した後に脱離させalpha,bata-不飽和ケトンを得た後,二重結合のジブロモ化と脱離により,ジエンケトン構造を構築したいと考えている。その後に,電子豊富な二重結合をエポキシ化し,脱離を伴うエポキシドの開環によりstrophasterol Aの全合成を達成する。この最短経路での合成計画がうまく行かない場合でも,エノン系さえ構築できれば,種々の官能基を駆使することでstrophasterol Aに到達できると思われる。strophasterol Aが完成次第,B,C,Dの合成に着手し,全てのstrophasterol類の全合成を達成するとともに,C,Dの立体化学を決定する。strohasterol Aについては,構造活性相関研究とその結果に基づくプローブの調製に取りかかる。
特異関数の自動多重数値積分アルゴリズムの研究

これままで多次元の積分空間で積分軸に対して斜めに走るような特異点の山脈を有する被積分関数を自動的に積分する手法として、特異点付近を超立方体に細分して積分する方法について考案している。この積分プログラムについて以下のような進展があった。(1)領域分割の条件を検討し直した。これにより無駄な領域分割を減らすことができ、計算時間の短縮が計られた。(2)与えれた積分精度に達したときに計算を終了する方法として、逐次的に積分を行うこととし、各回の積分は与えられた精度よりも粗い精度で積分して、各回の積分値と分散を累積する手法を採用した。(3)この積分ルーチンのベクトル計算機用のプロトタイプを作成した。(4)この積分ルーチンによる実際の散乱振幅の積分計算を遂行中である。上記の積分ルーチンでは積分空間を超立方体に分割するために積分次元に対して指数的に超立方体の数が増えるので高次元で実用的でない。そこで、領域を超直方体に分割する積分ルーチンを開発中である。多次元の積分を考えたときにどれか一つの積分軸だけについて領域を2つの部分に分割することにすれば、次元に依存しないので高次元で利用できる可能性がある。この新しい版については領域分割、各超直方体での積分の手法について今後詰める必要がある。以上について、日本物理学会第49回年会(1994.3.29)で報告する。
睡眠中における脳内の神経活動がソングバードの歌学習に果たす機能

鳴禽類ソングバードの大脳基底核Area Xは、臨界期における発声学習に必須の領域である。この領域におけるニューロンがさえずり行動に特異的な活動を示すだけでなく、睡眠中においてもさえずり関連活動と同様のリプレイ様活動を示すことが明らかになった。発声行動中だけでなく睡眠中における大脳基底核の自発的神経活動も、臨界期における発声学習に重要な機能を果たすことが示唆された。さらに、行動中におけるソングバード基底核の神経活動を擾乱し同時に神経活動の計測も可能な新しい実験系を確立した。さらに、学習臨界期を過ぎた成鳥においても、同様の現象が見出された。しかも成鳥においては、基底核から記録された局所電場電位が睡眠中ガンマオシレーションを示し、同時記録した約半数のArea Xニューロンが位相同期を示すことも明らかになった。これらの結果から、基底核Area Xはさえずり行動中においてのみ活動を上昇させるだけでなく睡眠中にも特徴的なリプレイ活動を示し、この睡眠中における基底核の自発的神経活動が臨界期における発声学習に重要な機能を果たすことが示唆された。これらの研究成果について投稿論文を作成し、学術雑誌に掲載された。さらに、この睡眠中のリプレイ様活動を阻害することで、実際に発声学習が阻害されるかどうか検証する必要がある。そこで神経活動を擾乱する方法のひとつとして、刺激電極をニューロン活動記録用電極の近傍に慢性的に埋め込み、電気刺激によって近傍におけるニューロン活動が実際に擾乱されることが確認できる実験系を確立した。今後は、この電気刺激を使った手法や薬理学的手法、光遺伝学など様々な手法を用い睡眠中の神経活動を擾乱することで発声学習に対する影響を検証していく必要がある。睡眠中における脳内の神経活動が記憶・学習に果たす機能を明らかにすることは、現代脳科学における重要問題のひとつである。近年、行動中に見られた神経細胞の発火パターンがその後の睡眠中に再現されるリプレイと称される現象が、脳の様々な領域で発見されている。このリプレイ現象は記憶の固定化に関わる重要な神経過程と考えられているものの、記憶・学習との因果関係は依然証明されたとはいえない。本研究では、臨界期にさえずりを学ぶソングバード(鳴禽類小鳥)の歌学習を研究対象とし、申請者がこれまで独自に見出してきた大脳基底核における睡眠中のリプレイ様活動が、ソングバードの歌学習に果たす機能を明らかにすることを目指す。これまでに、行動中のソングバードの大脳基底核Area Xから神経活動記録をおこない、以下の点を明らかにしてきた。1.学習臨界期における幼鳥では、Area Xニューロンはさえずり行動特異的な活動を示し、かつ徐波睡眠中に一過的な活動の上昇を示す。2.学習臨界期を過ぎた成鳥では、さえずり関連活動を示すArea Xニューロンは、睡眠中にも一過的な活動の上昇を示し、同時に記録した局所電場電位は高周波のオシレーションを示す。これら結果の取りまとめをおこない、それぞれ論文として発表した。さらに、睡眠中のArea Xの神経活動を擾乱するために脳内に刺激および記録電極を埋め込み、電気刺激によって基底核ニューロンの自発発火活動を可逆的に変化させることが可能であることを確かめた。これまでに得られた結果を2報の論文にとりまとめた。従って、おおむね順調に進んでいるといえる。これまでに得られた結果についてさらなる解析をおこなう。H23年度未使用分については、今年度新たに必要になると思われるPC等の購入に、H24年度請求額分については、データ解析等に必要なソフトウェア等の購入に使用する予定である。
大地震時における企業防災診断システムの開発と展開

本研究は、中小企業を対象とした総合的で簡便な企業防災診断システムの開発とその展開を目的としたものである。企業防災診断システムは、防災カルテ、耐震診断、被害予測、被害低減対策マネジメントから構成される。基礎データを得るため、大地震における建物・設備、生産設備等の物理的被害と経営的被害の調査及びそのデータベース化や、企業防災力の現状把握調査などを実施した。また、この防災診断システムの有効性についても確認した。企業の被害実態の把握、物理的被害と経営的な被害の関係解明のための分析等、主に基礎的データの収集と分析、簡易な被害予測手法の実用化に向けた開発を行った。(1)企業の被害実態の把握2008年の岩手・宮城内陸地震被害の実態を把握するため、アンケート調査と現地ヒアリング調査を行った。(2)被害のデータベース化、および物理的被害と経営的な被害の関係についての分析2008年の岩手・宮城内陸地震被害のデータベース化と、2004年新潟県中越地震および2007年能登半島地震との比較分析を行った。(3)建物・生産設備等物理的被害及び経営的被害額に関する簡易な被害予測手法の開発先の分析に基づき、簡易な被害予測式を検討した。(4)防災カルテの高度化簡易防災カルテと視覚的に理解しやすいレーダーチャートでの提示をweb上で公開し、詳細防災カルテとその表示手法のさらなる高度化を検討した。(5)事業継続計画(以下BCP)の概念図に基づく企業防災診断指標の確立パターン化にあたっては、新潟県中越地震で被害を受けた企業のヒアリング調査を行い、診断指標について検討した。近年、中小企業を対象とした総合的な企業防災診断システムの構築とその展開は喫緊の課題である。本研究は、当該年度の主目的である、防災カルテ、耐震診断、被害予測、被害低減対策マネジメントという一連の流れを持つ簡易防災診断システムの有効性について調査を実施した結果、その有効性を確認することができた。しかし、被害低減対策マネジメントについては、マネジメントを受けたいとする企業が、費用があまりかからないという条件でも半数程度に留まることも明らかとなった。並行して、企業の防災力の現状を見る防災カルテ調査や、建物や生産設備等の耐震性に関する建物診断調査を実施した。防災カルテによる調査では、「金銭」や「情報」面の対策が低く、「物的対策」や「人的訓練」面が高いこと、そしてハード面が進まずソフト的な対応に留まっている現状もある。建物診断調査では、建物立地の地盤、建物や生産設備等の耐震性などに問題がある企業が約2割程度あり、家具・什器や生産設備に対する予防対策が遅れている。また、地震動による人の心理学的・生理学的影響に関わる実験を実施した。年齢層別、性別では、心拍、血圧、唾液アミラーゼなどの生理的影響は、高齢者や男性に、また状態不安をみるSTAIなどの心理的影響は若年者や女性に生じやすい傾向があることが明らかとなった。一方、これまで新潟県中越地震、能登半島地震、岩手宮城内陸地震などにおける建物・設備、生産設備等の物理的被害とその直接的・間接的経営への影響度を分析してきたが、平成22年度には該当する大地震が発生しなかったため、調査・データベース化は行わなかった。研究は、まず過去の大地震における企業の業種や経営基盤、地震動の大きさなどに応じた物理的被害実態の把握だけでなく、これまでやられてこなかった経済的被害についても調査し、そのデータベース化を行った。次に建物・建物設備・生産設備に関する実用化のための簡易な被害予測手法を開発し、将来大地震の到来が予想される地域における企業の物理的及び経済的被害予測が可能となった。また、事業継続計画(以下BCP)の概念図に基づく企業の資産・負債・資本等から得られる経営判断指標を提案するとともに、さらに専門家でなくても視覚的に理解しやすい防災カルテと総合的な防災力を簡易に評価できる手法の高度化を図っている。一方、建物、各種設備の耐震化などのハード面とともに、地震動による人体への影響を踏まえた対策を強化させる必要があるため、地震動による高齢者人体への生理心理的影響を把握したうえで、揺れ体験の効果や高齢者に対する地震情報提供の方法などについても知見を得る実験を実施した。また、企業防災における緊急地震速報の利活用の実態や課題を知り、緊急地震速報の将来性について把握する必要から、ユーザーとしての企業とこれを配信する利用協議会、そしてこれらを構築する立場にある研究者の三者に対してアンケート調査を実施した。そして、こうして開発した実用的手法を利用して、手法の信頼性の確認調査、モデル企業への具体的な地震防災対策のマネジメントを行った。今後は、診断システムの普及、経営的被害に基づく対策に関する指針作りなどへとさらなる実用的展開を図る必要がある。
SCIDマウスにおけるプリオン病耐性のメカニズム

プリオン感受性の高いNZWマウスをドナーとして1.脾細胞移入、2.脾臓の移植、3.リンパ節の移植の3つの方法によりSCIDマウスの免疫系の再構築を試みた。その後、CJD-F1株のNZWマウス脳の10%あるいは1%乳剤上清50μlを腹腔内接種した。また、確認のために脳内接種も行った。【結果】1.脳内接種したマウスは典型的な症状を呈したので、接種後160日で安楽死させた。脳は海綿状変性が顕著であり典型的なCJDであった。異常プリオン蛋白の沈着は、脾やリンパ節の濾胞樹状細胞(FDC)では全く認められなかった。腹腔内接種群は300日を超えて観察中であるが、発症も異常プリオン蛋白も認めていない。2.移植後、9週くらいでSCIDマウスのリンパ球数が急激に増加し、リンパ球の割合が好中球より高くなった。さらに、16週には白血球数が5,000を超えた。この時点で、再構築ができたものと判断し、CJD-F1株を実験1と同様に腹腔内接種した。現在、接種後10週を経過したが、何ら変化を認めていない。3.リンパ節片のみを移植した場合は、レシピエントであるSCIDマウスの血液像に何の変化も認められず、組織片の定着は認められなかったので、免疫系の再構築ができなかったものと結論し、接種実験は行わなかった。【まとめ】脾細胞移入後の脳内接種では160日の潜伏期間で典型的なCJDを発病し、異常プリオン蛋白の沈着が脳にのみ起こることが確認された。しかし、腹腔内接種群において300日を越えても発症せず、異常プリオン蛋白も検出されないことは、脾細胞の移入がSCIDマウスのプリオンに対する感受性に影響を与えていない可能性が示唆された。実験2は現在観察期間中であるが、この増加リンパ球がドナーとレシピエント、どちらの由来なのか調べる予定である。また、骨髄移植による次の実験を実施中である。
脳障害機転に伴う免疫応答と中枢神経系細胞の相互関与の探究ならびに脳蘇生への展開

一過性の軽度の脳虚血において、部位特異的な遅発性神経細胞死が見られることは周知の事実であるが、一過性の軽度の脳虚血を反復することでいわゆる遅発性細胞死が広範囲にわたってみとめられることを見いだした。具体的にはgerbilにおいて5分間の脳虚血状態を3時間間隔にて4回反復した後には、大脳皮質、視床、線条体、海馬と広範囲にわたり神経細胞死をみとめ、かつ海馬顆粒細胞、大脳皮質、視床、線条体においては神経細胞死が典型的なアポトーシス形態を示すことを超微形態から見いだした。しかしながら、海馬錐体細胞層においては典型的なアポトーシス形態は示さず、免疫応答としての神経膠細胞の浸潤を著明にみとめたが、それを誘導する伝達物質は今回明らかにすることができなかった。また、視床下部、脳幹においては生命維持に重要な機能をつかさどると考えられる神経細胞が低酸素に対して、著しい抵抗性をしめすことがわかったが、これには神経細胞自体の抵抗性ならびに周囲細胞からの環境要因としての免疫応答の違いが関与しているのではないかと考えられる。一方、脳細胞は低酸素状態によりすべての細胞が同じように障害されるわけでなくしかも細胞群により障害が認められる時期が異なるとされてきたが、短時間の反復虚血による神経細胞死が遅発性のアポトーシスの機序に関連しておこりうること考えられることから脳蘇生を行いうる可能性がある。虚血後脳蘇生の目的にて低体温による脳保護効果につき検討したところ、反復虚血後においても脳保護効果が示唆され、免疫応答細胞の浸潤をみとめない所見をつかんだ。また、脳虚血後の発熱と免疫応答ならびに神経細胞死の関係を明らかにすべくプロスタグランジン受容体の特異的拮抗薬を用い前処置したモデルにおいて脳虚血を作成し、どの様な免疫系細胞応答がみとめられ、脳虚血後の発熱の抑制が脳保護に関与するのかにつき現在継続して検討している。今回の一連の研究により一過性の軽度の脳虚血において、それを反復することでいわゆる遅発性細胞死が広範囲にわたってみとめられることを見いだした。しかしながら、海馬錐体細胞層においては典型的なアポトーシス形態は示さず、免疫応答としての神経膠細胞の浸潤を著明にみとめた。視床下部、脳幹においては生命維持に重要な機能をつかさどると考えられる神経細胞が低酸素に対して、著しい抵抗性をしめすことがわかった。脳細胞は低酸素状態によりすべての細胞が同じように障害されるわけでなくしかも細胞群により障害が認められる時期が異なるとされてきたが、短時間の反復虚血による神経細胞死が遅発性のアポトーシスの機序に関連しておこりうること考えられることから脳蘇生を行いうる可能性がある。また、反復虚血後も視床下部、脳幹においては神経細胞が遅発性のアポトーシスの所見をみとめなかったが、神経内分泌機能を視床下部室傍核の神経細胞におけるオキシトシン、及びバソプレッシンの免疫組織化学にて検討したところ、これら下垂体後葉ホルモン分泌細胞には形態学上の変化が見られず低酸素状態に対して著しい抵抗性がみとめられた。また、脳虚血後の発熱と免疫応答ならびに神経細胞死の関係を明らかにすべくプロスタグランジン受容体の特異的拮抗薬を用い前

処置したモデルにおいて脳虚血を作成し、どの様な免疫系細胞応答がみとめられ、脳虚血後の発熱の抑制が脳保護に関与するのかにつき現在継続して検討している。
腫瘍細胞の組織間隙から毛細リンパ管への移動様式のリアルタイム解析

1.マウスを用いた毛細リンパ管への腫瘍細胞移動のリアルタイム観察モデルの確立(1)3種類のマウスの背側皮下にDorsal Skinfold Chamber(DSC)を埋め込み,静脈・リンパ管の観察を行い経時的に観察可能な条件を検討した。また免疫組織化学的手法を用い,皮下のリンパ管の走行を検討した。(2)毛細リンパ管の同定・可視化のためにリンパ管内へ移動するトレーサーとして,経静脈的(尾静脈)にFITCデキストランの投与,経皮的にエバンスブルーや各種サイズのマイクロスペアを用い,投与濃度,投与量,経過観察時間を検討した。2.腫瘍のリンパ管への移動を促進する因子,抑制する因子の検討(1)in vitroでの検討に先立ちマウスのリンパ管内皮の培養を行った上でin vitroレベルでリンパ管内皮細胞の生物学的特徴の評価を行うことを検討した。内皮細胞の培養のためマイクロビースにて細胞をソートする方法や酵素処理にて細胞分離を行う方法,またリンパ管を摘出しカニュレーションを行い,内皮細胞を剥離する方法を検討した。マウスリンパ管内皮細胞の培養条件検討のため各種因子を添加し評価した。(2)ヒトリンパ管内皮細胞を用いリンパ管内皮細胞の一般的生物学的特徴をまず明らかにすることを検討した。発売されているヒト毛細リンパ管内皮細胞と手術患者さんから頂いたセンチネルリンパ節に近い(集合)リンパ管内皮細胞,またリンパ管内皮との比較検討のためHUVEC(ヒト臍帯静脈血管内皮細胞)を用いて検討をおこなった。LYVE-1,Rrox-1,Podpoplanin,VEGFR1,2,3,NOS1,2,COX1,2,HO1,2などの免疫組織化学的な検討,VEGFA,Cに対するVEGFR1,2,3発現に関して検討した。(3)リンパ側の因子の検討のため,pHの変化,酸素分圧の変化がリンパ管内皮へ与える影響に関して検討した。
日本市場におけるバリュープレミアム：ＢＭ対ＥＰファクターの関係

本研究課題では、わが国において制度的にユニークな経営者利益予想を利用して、もう一つの有効なバリューファクターが日本市場では存在する点を理論と実証を通して明かした。日本市場においてはB/Mと予想E/Pの2つのバリュー効果が収斂しないで並立しうる。主要な成果は"Investment Value of Management Earnings Forecasts"(T. Hiraki, A. Watanabe, M. Watanabe, SSRN, 2014)として公開している。また、本課題から派生した残りの成果はJCF (2014)およびJBF(2015)などにおいて既に発表している。本研究課題の目的はわが国株式市場ではなぜ株価(リターン)予測においてバリュー効果としては簿価・時価比率(BM)しか顕在化しないとされてきたのか、そしてそれは果たして正しいのかを理論と実証で明かすことである。また国際比較の見地で分析する。本研究課題の第1年目では理論と実証モデル化の精緻化を行うと同時に、日本市場でしか利用可能でない経営者予想利益を用いたFEPファクターがBMファクターと共に日本市場では有効にリターン・クロスセクションを説明する点を明かした。成果は初版ドラフトHiraki, T., A. Watabane and M. Watanabe (2012)としてSSRNの個人ウエブサイトでの閲覧に供した。さらに内外の学会(日本ファイナンス学会、Northern Finance Association )の年次大会やや日米豪の大学ワークショップなどで発表した。2013年度を通してファイナンスのトップ2ジャーナルに投稿を行うも現在までacceptされるまでには至ってない。その間数度大きな改定を行い、現在SSRNの個人サイトには改定後の最新版が登録されている。世界からフルダウンロード数は現在130程度である。2013年度における改定の中心は予想利益効果の頑健性をさらに向上させることと、価格モーメンタムとは異なる予想利益発表効果の影響に対しても調整した後にも残るFEP効果の有効性を投資価値として明示した点である。本研究課題の目的は日本の株式市場にはおいてはなぜバリュー効果としての簿価時価比に基づくリターンクロスセクションしかこれま統計的にも経済的にも有意とされてこなかったのかを、理論をベースに制度的要因と関連付けながら解明することであった。そのなかで、本(初)年度においては、会計学における残余利益と割引率サイドに要評価の基軸をおいたファイナンスにおける評価を統合し、予想データがある限り2つのバリューファクターは1つに収れんしないで、簿価時価比と予想益回りが実現されるリターンクロスセクションを説明しうる理論モデルまず精緻に確立した。同時にその適応性を試すうえで必要とされる詳細な日次でのリターンを含む企業属性のデータベースの構築を完成させた。年度後半においては分析をスピーディーに行い、最初の成果を論文にすることができた。この初年度の成果では、Hiraki, A. Watanabe and M. Watababe, "The InvestmentValue of Management Earnings Forecasts,"としてSSRN(http://working papers.ssrn)に正式登録し、世界に向けて発信した。この論文に対しては今日まで約100人の異なる研究者からフルペーパーでのダウンロードが記録されている。これをベースにした学会報告は、2012年5月の日本ファイナンス学会年次大会、同年10月のNorthern Finance Association (カナダ、ナイアガラフォールズ)などで行った。さらには年度を通してUniversity of Technology, Sydny,横浜国立大学、名古屋大学、京都大学などで積極的にワークショップをこなしてきた。論文としての完成度が高くなってきたので、ファイナンストップジャーナルでの掲載を目指して改定作業に入っている。これまでわが国株式市場ではリターンのクロスセクション予想関係においては簿価時価比率でみたバリュー効果しか有効でないとされてきた。本研究ではもう一つ有効なバリュー効果としてFEP(Forecasted Earning Price比率)の有効性を実証した。学会発表や世界の主要大学でのワークショップで論文は改定を経て、現在は、Hiraki, Watanabe and Watanabe (2014)としてSSRNに掲載し、2年間で約150のダウンロードを数えている。最終年度においてもファイナンス分野でのトップジャーナルからの論文発表(投稿)に果敢に挑戦したが、採用許諾を得るにまだ至ってない。現在は日本以外でも経営者の利益予想が注目されてきたので、世界市場を実証の対象としたリサーチに昇華させることを考えている。ファイナンス主たる成果が目標としていたファイナンストップジャーナルにacceptされるまでには至っていない。この掲げていた目的は達成されずにいるが、関連論文ではファイナンス分野で評価の高い2つの世界的ジャーナルから条件付き掲載許可と改定・再投稿の成果を収めている。これらを総合して、やや遅れているのではないかと判断する。

実績の概要で述べたように、初年度の成果として完成度の高い論文を社会科学、なかんずく、金融経済学(Financial Economics)では世界最大のレポジトリーであるSSRNに登録し、成果を広く世界に発信している。そして改定版は国内外の学会と大学でで発表され、それなりの評価を得てきている。したがって、現在まで研究計画は概ね順調に推移しているといえる。最終的には残り2年で、さらに研究内容をより拡充させて世界的なジャーナルから数点学術論文として完結させる予定である。初年度の成果と構築した理論的枠組とデータベースをもとに、初期計画にある残された課題は2年以内に十分達成可能と考える。さらに、ある程度予期していたことであるが、本研究推進中に以下の2論文を副産物として生み出すことができたので記しておく。これらの論文も研究の第2年目あるいは第3年目を通して最終目標である世界的に認知されているファイナンスジャーナルからの発表を目指す。この副次的目標は、おそらくすでに学会発表を世界でこなしてきたので、主目標である日本市場におけるバリュープレミアムの組織的解明に関する数点の論文の公刊よりも早く実現される可能性が高い。本研究課題は理論と実証モデル化の精緻化を行い、日本の株式市場固有のFEP(経営者予想利益)ファクターがBMファクターと共存的に日本市場では有効にバリュー効果としてリターン・クロスセクションを説明することを目的とした。この目的は今日までほぼ達成できているといえる。しかし、検証期間(日次でほぼ30年)の中で、一時的にFEPファクターの予測が明確に反転する、つまりFEPクラッシュが発見されるに至っている。新たな視点でこのアノマリーのアノマリーをも同時に解明することは、主論文の完成度を上げるうえで有益と思えるので、残り1年の研究推進方策としてこの課題を追加的に取りあげていく予定である。H25年度においてまだ達成されてない主論文を刊行することに加え、刊行がほぼ約束されている2論文の最終化を鋭意行う。さらに本研究課題は資産管理実務に対する含意が色濃いことから、現在準備を行っている実務家向けの論文を12編刊行する予定である。初年度においては、日本の株式市場ではバリュー効果として簿価(BP比)と経営者予想利益(FEP=予想1株当り益回り)が併存し、新たに確立した理論と整合する価値ある重要な発見を行うことができた。今後はその制度的背景との関係を十分整理して発見をより頑健なものにしていく。その結果、株式市場のリターンクロスセクション研究においてこれまで統一的見解を欠いてきたパズルが日本発の研究として世界の金融経済学リタラチャ-に一石を投じることになる。
EBウイルス感染症モデル動物の作製

EBウイルスはBリンパ球に特異的に発現している補体レセプター(CR2,CD21)を介して細胞へ吸着し、一部の霊長類しか感染しない。このことがEBウイルスはBリンパ球指向性、狭い宿主域を規定している。EBウイルスの感染には吸着の段階でのバリアーに加えて、EBウイルスプラスミドの維持機構が関わっている。我々は各種動物細胞にCD21を強制発現することにより、ラットの細胞にEBウイルス感染することが明らかにした。以上の結果は、ヒトCD21発現すればラットのリンパ系細胞でEBウイルスが感染する可能性が示している。この背景に基づいてヒトCD21発現トランスジェニックラットを作製し、リンパ球細胞へのEBウイルス感染が成立するかを検討した。ラットのリンパ系細胞にEBVレセプター(CD21)を発現せるために,免疫グロブリンプロモーター/エンハンサーの下流にCD21のcDNAを連結したDNAを構築した。常法に従い、ホルモンによる過剰排卵の後に交尾させたラットより受精卵を採取し、上記DNA構築をマイクロインジェクションした後、仮親となる偽妊娠ラットの卵管内に移植した。得られた仔ラットの中から導入遺伝子を有する仔ラットをPCR法、サザンブロット法により選択し、ヒトCD21トランスジェニックラットの系統を樹立した。樹立されたトランスジェラットのリンパ系細胞におけるヒトCD21の発現をRT-PCR、フローサイトメーターにより確認した。上記ラットのリンパ系細胞へのEBV感染能はRT-PCR,蛍光抗体法により検討した。(1)上記ヒトCD21トランスジェニックラットのリンパ系細胞においてはヒトCD21の発現が認められた.同じ系統のウェルドラットリンパ系細胞ではCD21の発現は全く認められなかった.(2)ヒトCD21トランスジェニックラットのリンパ系細胞にEBVを感染させてEBERの発現はRT-PCRにより確認し、EBNA蛍光抗体法陽性の細胞も認められた。以上の結果からラットのリンパ系細胞にヒトCD21を発現させることによりEBVの感染成立が明らかとなった。EBウイルス(EBV)はBリンパ球表面に強く発現しているCD21分子をレセプターとして細胞へ吸着する。CD21の有無が感染性を規定しており、EBVはヒトおよび一部の霊長類のBリンパ球にしか感染しない。本研究ではEBV感染症モデル動物の作製を目的として、CD21トランスジェニックラットを作製している。先ず、CD21遺伝子のcDNAクローンをラット免疫グロブリン遺伝子プロモーターに連結したプラスミドを構築し、得られたプラスミドを各種ラット由来Bリンパ球株に導入し、ラットリンパ球中でCD21が発現することをRT-PCR法により確認した。次いで、定法に従ってCD21トランスジェニックラットを作製している。現在までに2,135の卵にマイクロインジェクションし、8匹のラットより仔が生まれ、その内3匹のラットからの仔にCD21が導入されていることを確認した。現在これらラットの系統化を進めつつ、CD21のリンパ球での発現を確認しつつある。また、クラスII分子がEBV感染のコレセプターとなっているという報告がある。ラット由来の細胞株へCD21と共にクラスII分子を発現させると、EBVの感染率が著しく亢進することが確認された。従って、CD21とクラスII分子のダブルトランスジェニックラットがCD21単独のトランスジェニックラットより理想的な感染モデルとなる可能性が高い。そこで、クラスII分子のトランスジェニックラット作製も行っている。クラスII遺伝子のcDNAクローンをラット

免疫グロブリン遺伝子プロモーターに連結したプラスミドを構築し、得られたプラスミドを各種ラット由来Bリンパ球株に導入し、ラットリンパ球中でクラスII分子が発現することをRT-PCR法により確認した。次いで、定法に従ってCD21トランスジェニックラットを作製している。EBウイルスはBリンパ球に特異的に発現している補体レセプター(CR2,CD21)を介して細胞へ吸着し、一部の霊長類しか感染しない。このことがEBウイルスはBリンパ球指向性、狭い宿主域を規定している。EBウイルスの感染には吸着の段階でのバリアーに加えて、EBウイルスプラスミドの維持機構が関わっている。我々は各種動物細胞にCD21を強制発現することにより、ラットの細胞にEBウイルス感染することが明らかにした。以上の結果は、ヒトCD21発現すればラットのリンパ系細胞でEBウイルスが感染する可能性が示している。この背景に基づいてヒトCD21発現トランスジェニックラットを作製し、リンパ球細胞へのEBウイルス感染が成立するかを検討した。ラットのリンパ系細胞にEBVレセプター(CD21)を発現せるために,免疫グロブリンプロモーター/エンハンサーの下流にCD21のcDNAを連結したDNAを構築した。常法に従い、ホルモンによる過剰排卵の後に交尾させたラットより受精卵を採取し、上記DNA構築をマイクロインジェクションした後、仮親となる偽妊娠ラットの卵管内に移植した。得られた仔ラットの中から導入遺伝子を有する仔ラットをPCR法、サザんブロット法により選択し、ヒトCD21トランスジェニックラットの系統を樹立した。樹立されたトランスジェラットのリンパ系細胞におけるヒトCD21の発現をRT-PCR、フローサイトメーターにより確認した。上記ラットのリンパ系細胞へのEBV感染能はRT-PCR,蛍光抗体法により検討した。(1)上記ヒトCD21トランスジェニックラットのリンパ系細胞においてはヒトCD21の発現が認められた.同じ系統のウェルドラットリンパ系細胞ではCD21の発現は全く認められなかった.(2)ヒトCD21トランスジェニックラットのリンパ系細胞にEBVを感染させてEBERの発現はRT-PCRにより確認し、EBNA蛍光抗体法陽性の細胞も認められた。以上の結果からラットのリンパ系細胞にヒトCD21を発現させることによりEBVの感染成立が明らかとなった。
脳損傷後の機能回復過程における可塑的変化の解明

申請者はAMPA受容体のシナプス移行に注目し、いつどのようなタイミングでどの回路を用いて脳損傷後の機能回復に関与するかについて明らかにすることを目的とする。大脳皮質損傷後のどの時点で回復過程のAMPA受容体のシナプス移行の促進が惹起されたかは不明であるため、AMPA受容体のシナプス移行が促進される時期、さらにはどのような細胞において担われるかについて電気生理学的解析を用いて明らかにすることを本年度の目標としている。興奮性神経細胞もしくは抑制性神経細胞への興奮性伝達の変化を電気生理学的に解析するために、テストパルスを導入した際の膜容量もしくは細胞の形態をもとに興奮性神経細胞と抑制性神経細胞を判別したうえでその細胞への興奮性入力を記録することを試みた。トレーニング開始から2週目にリハビリテーション依存的に大脳皮質の損傷周囲5層の興奮性神経細胞において興奮性シナプス伝達の増加が観察された。また、そのような変化は抑制性神経細胞においてはみられなかった。このような結果からトレーニング開始から2週目において損傷周囲5層の興奮性神経細胞においてのみAMPA受容体のシナプス移行が促進されることが明らかになった。脳損傷後のリハビリテーションを施すいくつかのタイムコースにおいて、興奮性もしくは抑制性シナプス伝達の変化について計測することができたため。機能回復をする上で損傷周囲にどこからのシナプス入力が強化されているのかを明らかにする必要がある。障がいされた前肢機能がリハビリテーションにより回復した時点で使用される神経回路を同定するため、はじめに損傷後3週目においてトレーニングにより回復した動物の損傷周囲の皮質第5層に逆行性トレーサーであるフルオロゴールドを導入し、機能代償をする皮質領域のどこから神経接続があるのか明らかにし「代償領域」を同定する。さらにその回路の役割を明らかにするためにDREADDシステムを用いる。本研究では、「代償領域」と神経接続のある脳部位にアデノ随伴ウィルスを用いてDREADDであるヒトM4ムスカリン性アセチルコリン受容体(hM4Di)を発現させ、その領域の機能の阻害を試みる。ウィルスによりhM4Diを発現させた成体マウスに前肢のリーチング課題を学習させ、その後cryogenic lesionにより大脳皮質運動野前肢領域に損傷を施す。前年度と同様のプロトコールによりトレーニングを行い回復率を確認する。3週目の時点でCNOを投与し、その後にリーチング課題評価を行う。評価後に動物の脳を取り出してから固定し、DREADDの発現部位を確認する(mCitrine陽性の細胞を観察する)。CNO投与後に課題の成績が低下すれば、DREADDを発現させた部位が代償領域と神経接続のある脳部位ということがいえる。
ニガウリ種子ウリジン特異性リボヌクレアーゼMC1の構造と基質特異性に関する研究

1.グアノシンに対して高い基質特異性を獲得した2つのRNase MC1変異体(N71TとN71S)の結晶構造を決定し、基質特異性の改変メカニズムを検討した。まず、各変異体と基質類似体であるGMP(グアノシン一リン酸)との複合体の結晶を作製し、分子置換法によりそれらの結晶構造を1.6Åの分解能で決定した。その結果、両変異体とも基質結合部位において特異的にグアニンと相互作用していることが明かとなった。両変異体の基質結合様式はお互い非常に類似しており、Leu73とPhe80の側鎖によるグアニンとの疎水的相互作用、さらに、Gln9と変異を導入した71位のアミノ酸残基(Thr71およびser71)の側鎖および水分子を介したグアニンとの水素結合のネットワークが確認された。野生型RNase MC1と変異体の塩基結合様式を比較した結果、Asn71を側鎖の短いThrもしくはSerに置換することで基質結合部位が拡張し、ウラシルより大きなグアニンの挿入が可能になることが明かとなった。さらに、上記のようにグアニンは変異体タンパクおよび水分子と高度に水素結合を形成しており、この水素結合のネットワークが変異体のグアニン特異性に大きく関与していることを示唆した。Ph1771pのフォールディングは、六つのストランドから成る逆平行βシート(βバレル構造)とそれに付随したヘリックス構造から形成されていたPh1771pのβバレル構造は、これまでに立体構造が決定しているいくつかのRNA結合タンパク質と非常に類似していることが明かとなった。しかし、Ph1771pのアミノ酸配列はこれらRNA結合タンパク質とほとんど相同性が無いことから、これらが共通の祖先型RNA結合タンパク質から進化したことが推定された。Ph1771pの分子表面には極めて塩基性に富む領域が存在しており、この領域がRNase P RNAもしくはpre-tRNAと相互作用していることが推定された。この塩基性領域に存在する保存されたアルギニン残基をアラニンに置換した結果、RNase Pの活性が著しく低下することからも、この塩基性領域がPh1771pの機能に重要な役割を果たしていることが示唆された。グアノシンに対して高い基質特異性を獲得した2つのRNase MC1変異体(N71TとN71S)のX線結晶構造を決定し、基質特異性の改変メカニズムを検討した。まず、各変異体と基質類似体であるGMP(グアノシン-リン酸)との複合体の結晶を作製し、大型放射光施設SPring-8にてX線回折データを収集した。変異体とGMPとの複合体の結晶構造を、分子置換法により1.6Åの分解能で決定した。両変異体の基質結合様式はお互い非常に類似しており、Leu73とPhe80の側鎖によるグアニンとの疎水的相互作用、さらに、Gln9と変異を導入した71位のアミノ酸残基(Thr71およびSer71)の側鎖および水分子を介したグアニンとの水素結合のネットワークが確認された。さらに、グアニンを優先的に認識するタバコ由来RNase NWのグアニン結合様式(Kawano et al. Biochemistry,2002)と比較した。(RNase NWのThr78がRNase MC1の71位のアミノ酸残基に相当する。)その結果、全体的なグアニン結合様式は非常に類似しており、特に、変異体の71位のアミノ酸残基(Thr71とSer71)とRNase NWのThr78の側鎖が、グアニンと等価な水素結合を形成していることが明かとなった。以上の結果より、変異体の基質特異性の改変メカニズムを詳細に解析すると共に、RNase MC1の71位のアミノ酸残基が基質特異性を決定する重要なアミノ酸残基であることを示唆した。さらに、上記のようにグアニンは変異体タンパクおよび水分子と高度に水素結合を形成しており、この水素結合のネットワークが変異体のグアニン

特異性に大きく関与していることを示唆した。Ph1771pのフォールディングは、六つのストランドから成る逆平行βシート(βバレル構造)とそれに付随したヘリックス構造から形成されていたPh1771pのβバレル構造は、これまでに立体構造が決定しているいくつかのRNA結合タンパク質と非常に類似していることが明かとなった。しかし、Ph1771pのアミノ酸配列はこれらRNA結合タンパク質とほとんど相同性が無いことから、これらが共通の祖先型RNA結合タンパク質から進化したことが推定された。Ph1771pの分子表面には極めて塩基性に富む領域が存在しており、この領域がRNase P RNAもしくはpre-tRNAと相互作用していることが推定された。この塩基性領域に存在する保存されたアルギニン残基をアラニンに置換した結果、RNase Pの活性が著しく低下することからも、この塩基性領域がPh1771pの機能に重要な役割を果たしていることが示唆された。