hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
胃癌における染色体11p15領域の解析

11p15に位置するMUC遺伝子群(MUC2,MUC5AC,MUC6)の発現を胃癌手術検体、胎児胃、肥厚性胃炎の症例で検討した。MUC2,MUC5ACの上流域について免疫細胞化学的および、メチル化シトシン特異的制限酵素(HpaII)で切断後のPCRにて検討した。6種の胃癌細胞株(MKN-1,MKN-7,MKN-74,TMK1,AGS,NU-GC-3)および、それらにEBVを持続感染させた細胞株について検討した。また実際の手術検体でもMUC2,MUC5ACの上流域のメチル化状態を決定し、昨年度までに免疫組織化学的に得られていた発現と比較した。その結果、胃癌細胞株ではMUC2はTMK1で陽性であったが、EBV感染後のTMK1では陰性とEBV感染による違いが得られた。制限酵素処理後のPCRによる検索ではNU-GC-3のみ非メチル化状態で、他はメチル化状態であった。MUC5ACについてはTMK1,MKN1,NUGC3は非メチル化状態でEBV感染後にはいずれもメチル化状態となり、メチル化の亢進を認めた。しかし、免疫細胞化学的な発現ではTMK1のみが陽性で、いずれもEBV感染による違いは認めなかった。手術症例ではEBV関連胃癌3例を含む22症例を検討し、MUC2は免疫組織化学的に8例で陽性であり、DNAは全例でメチル化状態であった。MUC5ACのメチル化状態は13例で検索しえたが、全例メチル化状態であった。免疫組織化学的には11例で陽性であった。培養細胞ではEBV感染によるDNAメチル化の亢進を一部で認め、我々が既に報告しているEBV関連胃癌での高メチル化状態を示唆する変化であった。しかし、蛋白発現には影響を見いだせず、他のプロモータ部位のDNAメチル化、あるいはメチル化以外の因子がEBV関連胃癌のMUC2,MUC5AC低発現に効いている可能性が考えられた。上記の結果が得られたため現在投稿準備中。本年度は胃癌手術検体を用いて、11p15に位置するMUC遺伝子群(MUC2,MUC5AC、MUC6)の発現を調べた。MUC遺伝子は胃の上皮によって発現が異なり、MUC2は腸上皮化生を伴った上皮(ゴブレット細胞)、MUC5ACは腺窩上皮、そしてMUC6は腺窩上皮および幽門腺上皮に発現することが知られている。まず、胃癌においてMUC遺伝子の発現プロフィールと臨床病理学的因子を比較検討した。胃がん手術検体74例のホルマリン固定パラフィンブロックより作成した切片を用いて、MUC2,MUC5AC, MUC6蛋白に特異な抗体を用いて、免疫組織化学的に検討した。これに加え腸上皮化生上皮に陽性となるCD10に対する抗体も用いて検討した検討した74例中MUC2に対する抗体では28例(38%)、MUC5ACでは42例(57%)、MUC6は28例(38%)に陽性所見を認めた。CD10は18例(24%)に陽性所見を認めた。臨床病理学的因子とこれらの結果を比較検討すると、組織型においてMUC5ACで分化型の腺癌に有意差は無いが多い傾向が認められた。また、EBV感染との強い相関が見られた。

このため、MUC2またはCD10陽性のグループを腸型、MUC5ACもしくはMUC6が陽性のグループを胃型とし、両者が陽性のグループを混合型、両者が陰性のグループを分類不能型と分けると、EBV陽性の胃癌は18例認め、このうち7例(39%)が分類不能型で、9例(50%)は胃型を示した。EBV陰性胃癌では56例中胃型が17例(30%)、腸型が18例(32%)、混合型18例(34%)、分類不能型3例(5%>で、明らかにEBV感染陽性の胃癌では胃型もしくは分類不能型に多く、混合型も含め腸型の形質を示すことが低頻度であった。このようにEBV陽性の胃癌で特異な所見が見られた機序について、さらに検討を進める予定である。昨年度は11p15に位置するMUC遺伝子群(MUC2,MUC5AC, MUC6)の発現を、胃がん手術検体74例のホルマリン固定パラフィンブロックより作成した切片を用いて、MUC2,MUC5AC, MUC6蛋白に特異な抗体と、これに加え腸上皮化生上皮に陽性となるCD10に対する抗体も用いて、免疫組織化学的に検討した。その結果、EBV感染との強い相関が見られ、胃型腸型両者とも陰性となるグループと胃型のグループに大半が入り、特に陰性胃癌と比較し、両者とも陰性となるグループの頻度が特異的に高く認められた。このため今年度は、このようにEBV陽性の胃癌で特異な所見が見られた機序についてその意義を調べるため、胎児胃4例と肥厚性胃炎と臨床診断が加えられた症例の胃生検検体一例を用いて調べた。胎児胃では体部腺は未熟で、腺組織はわずかだが、腺頸部においてMUC5AC, MUC6両者に陰性を示す細胞の胞巣を認めた。これらの細胞は腺窩上皮や体部腺の主細胞への分化前の細胞と考えられた。また、肥厚性胃炎生検検体ではよく発達した体部腺の腺頸部に同様に、両者とも陰性の細胞が少数ではあるが認められた。EBV感染陽性の胃癌ではこのような分化前に細胞が癌化していることが考えられ、癌が進展、分化を示しても、胃型の分化を示すのみで、腸型を示すことはまれであると考えられる。上記の結果得たので現在投稿準備中である。また、胃型、腸型の形質がどのような機序で選択されているか明らかにするため、MUC2,MUC5ACそれぞれのプロモータ領域のメチル化に関する実験の準備を進めている。昨年度までに11p15に位置するMUC遺伝子群(MUC2,MUC5AC,MUC6)の発現を胃癌手術検体、胎児胃、肥厚性胃炎の症例で検討した。今年度はMUC2,MUC5ACの上流域について免疫細胞化学的および、メチル化シトシン特異的制限酵素(HPaII)で切断後のPCRにて検討した。6種の胃癌細胞株(MKN-1,MKN-7,MKN-74,TMK1,AGS,NU-GC-3)および、それらにEBVを持続感染させた細胞株について検討した。また実際の手術検体でもMUC2,MUC5ACの上流域のメチル化状態を決定し、昨年度までに免疫組織化学的に得られていた発現と比較した。その結果、胃癌細胞株ではMUC2はTMK1で陽性であったが、EBV感染後のTMK1では陰性とEBV感染による違いが得られた。制限酵素処理後のPCRによる検索ではNU-GC-3のみ非メチル化状態で、他はメチル化状態であった。MUC5ACについてはTMK1,MKN1,NUGC3は非メチル化状態でEBV感染後にはいずれもメチル化状態となり、メチル化の亢進を認めた。しかし、免疫細胞化学的な発現ではTME1のみが陽性で、いずれもEBV感染による違いは認めなかった。手術症例ではEBV関連胃癌3例を含む22症例を検討し、MUC2は免疫組織化学的に8例で陽性であり、DNAは全例でメチル化状態であった。
細胞内部位特異的光架橋を用いた出芽酵母SCF複合体に対する基質同定法の開発

ユビキチン・プロテアソーム系を介したタンパク質分解は様々な生命現象に重要な働きをしている。基質特異性を決めるユビキチンリガーゼ(E3)の研究が盛んに行われている。しかしながら技術的困難さにより現時点までにE3と基質の関係が明らかになっているのはごく僅かである。そこで本研究では、E3対する基質を、細胞内部位特異的光架橋法および免疫沈降法の組み合わせにより同定し、さらにはこれら酵素・基質関係により制御される分子機構を明らかにすることを目的としている。Hrd3はHrd1と複合体を形成しE3として機能する。Hrd3のHrd1結合領域と予想される部位にアンバーコドンを導入し、紫外線照射による架橋反応の検討を行った結果、アンバーコドンの部位依存的に特異的タンパク質が結合してくる条件を見出した。これらの過程で、この方法は、相互作用することが明らかになっている分子間での最少結合部位を同定することに適しているが、新たな結合因子の同定には適していないことが判明した。この方法の替わりに酵母two-hybrid法を用いてSCFMet30の新たな基質p50を同定した。p50はSCFMet30により細胞周期依存的にその安定性を制御されていることを明らかにした。現在Met30によるp50分解の意義を細胞生物学的に解析している最中である。ユビキチン・プロテアソーム系を介したタンパク質分解が様々な生命現象に重要な働きをしていることが明らかになり、注目を集めてきている。中でも、基質特異性を決めるユビキチンリガーゼ(E3)の研究が盛んに行われている。Hrd3はHrd1、Usa1そしてDer1と複合体を形成しE3として小胞体品質管理に機能する。Hrd3の任意の部位にアンバーコドンを導入し、紫外線照射による架橋反応の検討を行った結果、アンバーコドンの部位依存的に特異的タンパク質が結合してくる条件を見出した。この方法の代わりに酵母two-hybrid法を用いてMet30の新たな基質p50を同定した。p50はプロテアソーム阻害剤MG132処理で安定性が亢進することより、ユビキチンープロテアソーム系を介して分解されることが示唆された。Met30は内在性のタンパク質レベルでp50と結合した。Met30の不活化によりp50の安定性が亢進した。そこで本研究では、E3、なかでもCullin型E3に対する基質を、細胞内部位特異的光架橋法および免疫沈降法の組み合わせにより同定し、さらにはこれら酵素・基質関係により制御される分子機構を明らかにし、最終的にはユビキチン依存性タンパク質分解という観点から様々な生命現象を系統立てて解明することを目的としている。出芽酵母SCF複合体はRbx1、Cdc53、Skp1およびF-boxタンパク質の4量体からなるが、そのなかでF-boxタンパク質が基質を認識する役割を担っている。

データベースを利用して出芽酵母F-boxタンパク質遺伝子(21種類存在する)をクローニングし、免疫沈降法用ベクター(免疫沈降のために3xFLAG Tagを付加している)を作製した。続いて、紫外線照射による架橋反応の条件検討を行っている。具体的には既報のFーboxタンパク質Cdc4を用いて、その基質Sic1が架橋産物として検出できる紫外線照射条件を検討中である。Cdc4のC末側にBPAを導入する部位を替えてSic1との結合がみられる条件を探している最中である。本研究では、細胞内部位特異的光架橋法および免疫沈降法を用いてE3の基質の同定およびその機能解析を目的としている。まず、細胞内部位特異的光架橋法を効率的に行うための条件検討を既報のFーboxタンパク質Cdc4とその基質Sic1を用いて行っているが、まだいい条件の設定にいたっていないため、やや遅れていると判断した。細胞内部位特異的光架橋法を効率的に行うための条件検討を既報のFーboxタンパク質Cdc4とその基質Sic1を用いて継続して行い、実験条件の最適化を図る。引き続き、F-boxタンパク質のC末側の任意の部位のアミノ酸残基に対応するコドンをアンバー終止コドンに置換し、BPAが導入されるようにする。これらの変異を加えたF-boxタンパク質と相互作用するタンパク質を、細胞内部位特異的光架橋法および免疫沈降法を用いて同定する。F-boxタンパク質と新規基質候補タンパク質の内在性レベルでの結合を免疫沈降法により確認する。次に、F-boxタンパク質群の新規基質候補タンパク質の安定性に及ぼす影響の検討する。そして、昆虫細胞発現系を用いてSCF複合体を精製し、新規基質候補タンパク質に対する試験管内ユビキチン化反応を検討する。F-boxタンパク質と新規基質候補タンパク質を出芽酵母に発現させ、新規基質候補タンパク質の安定性に及ぼす影響を検討する。さらには、F-boxタンパク質による新規基質候補タンパク質の分解制御が細胞生物学的にどのような影響を及ぼすかを検討する。細胞内部位特異的光架橋法を効率的に行うための条件検討に酵母培養用培地、シャーレ、アミノ酸類が必要である。また免疫沈降するための抗体やWestern blottingのための発色試薬が必要である。F-boxタンパク質のC末側の任意の部位のアミノ酸残基に対応するコドンをアンバー終止コドンに置換し、BPAが導入するためのプライマー、PCR試薬が必要である。昆虫細胞を実験に用いるがそれらを培養するためのシャーレや培地さらには血清が必要である。酵母の変異株の作製あるいは新たに同定した遺伝子の発現ベクター作製するためのプラーマーやPCR試薬さらには制限酵素が必要である。作製した発現ベクターを細胞に導入するための試薬や抗生物質が必要である。新たに同定したタンパク質に対する抗体が必要である。新たに同定した基質候補のE3との結合や発現量を調べるために行なう免疫沈降法やWestern Blottingのための試薬が必要である。新たに同定したE3と基質に制御される生命現象を解明するために細胞周期を同調させる試薬やDNA損傷を起こす薬剤などが必要である。本研究で得られた成果を広く発信するためには、分子生物学会など国内の学会参加に伴う旅費は必須である。
幾何構造の変形と大域的変分問題

本研究は,幾何構造の変形に関連する種々の非線型方程式を,非コンパクト多様体上の大域的変分問題の立場から研究することを目的とし,次の成果を得た.1.研究代表者・西川は,双曲型空間内の非有界凸多面体間の調和写像のディリクレ境界値問題について研究し,m次元およびn次元双曲型空間内に与えられた非有界凸多面体に対し,それらの境界間の区分的にC^1級な連続写像で適切な境界条件をみたすものは,凸多面体内部へ調和写像として拡張できることを証明した.2.研究分担者・堀畑は,相対論に関係した問題である,境界つきミンコフスキー空間から球面への調和写像の存在について研究し,ガレルキン法を用いてその弱解を構成した.3.研究分担者・新井は,強擬凸領域上のベルグマン・ラプラシアンを一般化した,境界で退化する2階楕円型偏微分作用素Lについて研究し,Lu=0の解からなるHardy空間をアトムおよび拡散過程によって特徴付け,その応用として強擬凸領域上の解析関数からなるHardy空間に関するボイタシュチーク(Wojtaszczyk)予想を解決した.4.研究分担者・高木は,活性因子と抑制因子からなる2成分の反応拡散方程式系を軸対称な領域において研究し,活性因子の拡散係数が非常に小さく,抑制因子の拡散係数が十分大きい場合に,活性因子の分布が領域の対称軸と境界の交点のごく小さい近傍に集中するような定常解の存在を証明した.5.研究分担者・板東は,開ケーラー多様体上のアインシュタイン・エルミート束について研究し,2次元複素ユークリッド空間上のアインシュタイン・エルミート束が2次元複素射影空間上の無限遠直線上で自明なベクトル束に対応するというDonaldsonの定理を,より一般の開ケーラー多様体の場合へ拡張した.本研究は,幾何構造の変形に関連する種々の非線型方程式を,非コンパクト多様体上の大域的変分問題の立場から研究することを目的とし,次の成果を得た.1.研究代表者・西川は,双曲型空間内の非有界凸多面体間の調和写像のディリクレ境界値問題について研究し,m次元およびn次元双曲型空間内に与えられた非有界凸多面体に対し,それらの境界間の区分的にC^1級な連続写像で適切な境界条件をみたすものは,凸多面体内部へ調和写像として拡張できることを証明した.2.研究分担者・堀畑は,相対論に関係した問題である,境界つきミンコフスキー空間から球面への調和写像の存在について研究し,ガレルキン法を用いてその弱解を構成した.3.研究分担者・新井は,強擬凸領域上のベルグマン・ラプラシアンを一般化した,境界で退化する2階楕円型偏微分作用素Lについて研究し,Lu=0の解からなるHardy空間をアトムおよび拡散過程によって特徴付け,その応用として強擬凸領域上の解析関数からなるHardy空間に関するボイタシュチーク(Wojtaszczyk)予想を解決した.4.研究分担者・高木は,活性因子と抑制因子からなる2成分の反応拡散方程式系を軸対称な領域において研究し,活性因子の拡散係数が非常に小さく,抑制因子の拡散係数が十分大きい場合に,活性因子の分布が領域の対称軸と境界の交点のごく小さい近傍に集中するような定常解の存在を証明した.5.研究分担者・板東は,開ケーラー多様体上のアインシュタイン・エルミート束について研究し,2次元複素ユークリッド空間上のアインシュタイン・エルミート束が2次元複素射影空間上の無限遠直線上で自明なベクトル束に対応するというDonaldsonの定理を,より一般の開ケーラー多様体の場合へ拡張した.
クルクミノイドの細胞内への取り込みの制御:疾病治癒への応用に向けて

クルクミノイド(CNs)はウコン等の香辛料に含まれる脂溶性ポリフェノールである。抗炎症・抗酸化などの有益な生理作用を持つ一方で、生体利用能が低く、その疾病治癒への応用は制限されている。これまでに細胞試験により、添加したCNsは培地に添加した血清中アルブミン(ALB)と結合し、その取り込みが抑制される事、本現象がCNsの生理作用に影響しうる事を検証した。生体内でも、CNsがALBと結合し、その結果、疾病部位へのCNsの取り込みを抑制する事が予想される。本研究では、細胞試験や生体内でのCNsの取り込み量を増加させ、疾病治癒へと応用する事を目指し、薬物輸送システムを用いてCNsとALBとの相互作用を制御する技術を構築する。
知的環境適応型VLSI基盤技術の構築と高信頼脳型LSIシステムへの応用展開

本研究では,脳の情報処理過程における学習・記憶,超並列,自律分散といった様々な原理に基づく柔軟かつ複雑な処理をハードウェアアルゴリズムとして実装することにより,高次の処理を極めてコンパクトなシステム構成で実現することを目指す.特に本研究においては,脳の可塑性(環境適応性)と呼ばれる機能にヒントを得,従来の延長上にない知的環境適応型新概念LSI設計技術の確立を到達目標とする.本技術の実現においては,入力情報を適切に処理する計算アルゴリズムのみならず,本アルゴリズムを如何にしてコンパクトかつ低消費電力なハードウェアとして実装するかが重要な課題となる.そこで,主たる海外共同研究者として,集積回路設計技術ならびにパワーマネジメント技術の第一人者であるカナダ・トロント大学のWai Tung Ng教授を受入先として選定し,昨年度末から本年度半ばにかけ,海外共同研究先であるトロント大にて6ヶ月間に渡る研究を行った.Wai-Tung Ng教授および講座の配属学生・研究生らとの議論を元に,本研究者がこれまで提案してきた高信頼LSI設計技術と,Ng教授が専門とするセンシング技術およびLSIモニタリング技術を融合することによる,センサからの時系列入力情報を内部に蓄積することで,動作環境に即した適切な処理へと機能を変化させる新概念VLSI設計技術の基盤構築に向けた研究を行った.主たる渡航先外国機関であるトロント大を訪れ,昨年度に構築した研究環境および長期滞在のための居住環境において,6ヶ月間に渡る共同研究活動を行うことができた.また,共同研究者との打合せを通し,研究内容を大きく前進できたとともに,渡航中に進めた研究成果は既に複数の国際学会および学術論文誌で発表済みである.以上のことから,本研究の進捗は概ね順調に進展していると判断できる.海外共同研究によって得られた知見を元に,受入研究者とのWebミーティング等を通した情報交換も継続しつつ,その研究成果を取りまとめ,国際学会および学術論文への発表を継続する.内定年度:2017本研究では,脳の情報処理過程における学習・記憶,超並列,自律分散といった様々な原理に基づく柔軟かつ複雑な処理をハードウェアアルゴリズムとして実装することにより,高次の処理を極めてコンパクトなシステム構成で実現することを目指す.特に本研究においては,脳の可塑性(環境適応性)と呼ばれる機能にヒントを得,従来の延長上にない知的環境適応型新概念LSI設計技術の確立を到達目標とする.本技術の実現においては,入力情報を適切に処理する計算アルゴリズムのみならず,本アルゴリズムを如何にしてコンパクトかつ低消費電力なハードウェアとして実装するかが重要な課題となる.そこで,主たる海外共同研究者として,集積回路設計技術ならびにパワーマネジメント技術の第一人者であるカナダ・トロント大学のWai Tung Ng教授を受入先として選定し,本年度より海外渡航を開始した.海外共同研究先であるトロント大を訪れ,研究環境および長期滞在のための環境の構築を進めるとともに,Wai-Tung Ng教授との打合せを通し,次年度における研究推進の方向性を検討した.教授らとの議論を通して,本研究者がこれまで提案してきた高信頼LSI設計技術と,Ng教授が専門とするセンシング技術およびLSIモニタリング技術を融合することによる,センサからの時系列入力情報を内部に蓄積することで,動作環境に即した適切な処理へと機能を変化させる新概念VLSI設計技術の基盤構築に向けた研究を開始した.本年度終了時の段階で既に主たる渡航先外国機関であるトロント大を訪れ,研究環境の構築を開始しているとともに,長期滞在のための居住環境等についても整えつつある状況である.また,共同研究者との打合せも開始し,次年度以降の方針についても検討を開始している.以上のことから,本研究の進捗は概ね順調に進展していると判断できる.本研究では,脳の情報処理過程における学習・記憶,超並列,自律分散といった様々な原理に基づく柔軟かつ複雑な処理をハードウェアアルゴリズムとして実装することにより,高次の処理を極めてコンパクトなシステム構成で実現することを目指す.特に本研究においては,脳の可塑性(環境適応性)と呼ばれる機能にヒントを得,従来の延長上にない知的環境適応型新概念LSI設計技術の確立を到達目標とする.本技術の実現においては,入力情報を適切に処理する計算アルゴリズムのみならず,本アルゴリズムを如何にしてコンパクトかつ低消費電力なハードウェアとして実装するかが重要な課題となる.そこで,主たる海外共同研究者として,集積回路設計技術ならびにパワーマネジメント技術の第一人者であるカナダ・トロント大学のWai Tung Ng教授を受入先として選定し,昨年度末から本年度半ばにかけ,海外共同研究先であるトロント大にて6ヶ月間に渡る研究を行った.Wai-Tung Ng教授および講座の配属学生・研究生らとの議論を元に,本研究者がこれまで提案してきた高信頼LSI設計技術と,Ng教授が専門とするセンシング技術およびLSIモニタリング技術を融合することによる,センサからの時系列入力情報を内部に蓄積することで,動作環境に即した適切な処理へと機能を変化させる新概念VLSI設計技術の基盤構築に向けた研究を行った.主たる渡航先外国機関であるトロント大を訪れ,昨年度に構築した研究環境および長期滞在のための居住環境において,6ヶ月間に渡る共同研究活動を行うことができた.また,共同研究者との打合せを通し,研究内容を大きく前進できたとともに,渡航中に進めた研究成果は既に複数の国際学会および学術論文誌で発表済みである.以上のことから,本研究の進捗は概ね順調に進展していると判断できる.本年度に行った研究方針の打合せを引き続き進め,次年度以降の研究内容の明確化を図る.同時に,主たる共同研究者のみならず,渡航先外国機関であるトロント大に所属する他の研究者との連携の可能性についても並行して検討し,Face-to-Faceの打合せを通したさらなる研究展開を模索する.

海外共同研究によって得られた知見を元に,受入研究者とのWebミーティング等を通した情報交換も継続しつつ,その研究成果を取りまとめ,国際学会および学術論文への発表を継続する.
新規な含イオウ活性種を鍵とする炭素-炭素結合形成反応の開発

高選択的でかつ高効率で進行する新しい合成反応の発見と開発は有機合成化学に於ける重要な課題の一つである。これまで新しい炭素骨格変換反応の開発にはカルボニル基、アルケニル基、アルキニル基などの官能基が広く利用されてきた。一方、本研究ではアミドの酸素原子をイオウ原子で置き換えた同族体であるチオアミドを用いた含イオウ活性種の発生とそれを利用する炭素-炭素結合形成反応の開発を行った。・含イオウアニオン性活性種を鍵とする炭素-炭素結合形成反応チオアミドと2当量のBuLiとの反応は0°Cから室温で速やかに進行し、チオアミドジアニオンが発生した。それを用いたオキシランの開環反応は、窒素に隣接する炭素上で選択的に進行し、さらに反応混合液を水洗処理することでチオカルバモイル基が再生した。この反応を利用して有用な化合物群の一つである1,3-アミノアルコールやオキサジンの合成法を確立した。・含イオウカチオン性活性種を鍵とする炭素-炭素結合形成反応チオアミドのMeOTfを用いたメチル化反応はチオイミニウム塩を数秒以内に与えた。さらに得られたチオイミニウム塩にリチウムアセチリド、有機マグネシウム反応剤の連続付加を行った。その結果、新規な炭素骨格を有する三級プロパルギルアミンを高効率かつ高選択的に導くことができた。さらに有機亜塩反応剤との反応でエンイン骨格を有する三級アミンの新合成法も達成された。以上、本研究で鍵となる活性種はいずれも市販の原料から簡便に合成されるチオアミドを用いており、従来法では合成が困難であった誘導体を容易に導く新合成経路が確立された。その求電子体との反応は、窒素に隣接する炭素上で選択的に進行し、さらに反応混合液を水洗処理することでチオカルバモイル基が再生した。またチオアミドジアニオンとヨウ素との反応では、チオアミドジアニオンの酸化的カップリング反応が進行しジアミン誘導体を高収率でしかもdl体を優先的に与えた。なおこれらの反応はチオアミドに特徴的であり通常のアミドでは進行しない。さらに得られたチオイミニウム塩にリチウムアセチリドを作用させることで、通常は安定性が低いS,N-アセタールやアレンアミンを与え、これらは安定に単離することができた。なおアミノアレンの生成は、MeS基の1,3-転位を伴って進行している。

・含イオウアニオン性活性種を鍵とする炭素-炭素結合形成反応チオアミドと2当量のBuLiとの反応は0°Cから室温で速やかに進行し、チオアミドジアニオンが発生した。それを用いたオキシランの開環反応は、窒素に隣接する炭素上で選択的に進行し、さらに反応混合液を水洗処理することでチオカルバモイル基が再生した。この反応を利用して有用な化合物群の一つである1,3-アミノアルコールやオキサジンの合成法を確立した。・含イオウカチオン性活性種を鍵とする炭素-炭素結合形成反応チオアミドのMeOTfを用いたメチル化反応はチオイミニウム塩を数秒以内に与えた。さらに得られたチオイミニウム塩にリチウムアセチリド、有機マグネシウム反応剤の連続付加を行った。その結果、新規な炭素骨格を有する三級プロパルギルアミンを高効率かつ高選択的に導くことができた。さらに有機亜塩反応剤との反応でエンイン骨格を有する三級アミンの新合成法も達成された。以上、本研究で鍵となる活性種はいずれも市販の原料から簡便に合成されるチオアミドを用いており、従来法では合成が困難であった誘導体を容易に導く新合成経路が確立された。
アルツハイマー病脳における異常なチロシンリン酸化とチロシンホスファターゼ異常

Alzheimer病(AD)脳ではチロシン残基の異常なリン酸化が指摘されている。酸性ホスファターゼ(AcP)のうち、低分子量AcPにリン酸化されたチロシン残基を脱リン酸する作用があることが報告されている。本研究では、AD脳におけるチロシン残基の異常なリン酸化機構における低分子量AcPの役割について検討した。Sephadex G-100カラムゲルクロマトグラフィーを用いてAcPを分離溶出すると、ヒト脳には高分子量と低分子量のAcPが存在していた。AD群では対照群に比べ低分子量AcP活性が有意に低下していた。高分子量AcP活性は対照群とAD群間で有意な差は認められなかった。ウシ脳より低分子量酸性ホスファターゼを分子量約17kDaの活性を有するタンパクとして精製した。これを抗原に作製した特異抗体により、低分子量AcPがニューロンの細胞質および神経突起部に局在していることを確認した。ラット脳組織にこの低分子量AcPを作用させることにより、この低分子量AcPが分子量約170kDaタンパクのリン酸化されたチロシン残基を脱リン酸することが明らかとなった。また、EGF receptorに対する特異抗体を用いた免疫化学的検討により、この分子量約170kDaタンパクが、EGF receptorであることが示唆された。今回の検討で、ヒト脳組織の細胞質分画に分子量の異なるAcPが存在し、AD脳においては低分子量AcP活性が対照脳に比べ有意に低下していることが示された。この低分子量Acpがチロシン残基を脱リン酸する脳内基質が分子量約170kDaのタンパクであり、EGF receptorそのものである可能性が示された。低分子量AcPは、EGF receptorのリン酸化状態の調節を介してEGF-EGF receptor coupling signal transduction機構に重要な働きをしている可能性が示唆された。
ランタノイド触媒を用いる新規合成反応の開発

本研究ではまず、種々のランタノイドトリフラートを触媒とするシリルエノラートのヒドロキシメチル化を検討した。その結果、いずれのランタノイドトリフラートを用いた場合も反応は円滑に進行し、特にイッテルビウムトリフラート(Yb(OTf)3)は、安価で優れた活性を示すことがわかった。反応はわずか1mol%のYb(OTf)3の存在下でも円滑に進行し、種々のシリルエノラートに適用可能である。反応は高い位置選択的を示し、立体障害の大きなシリルエノラートを用いても、収率よく目的とするヒドロキシケトンを得ることができた。ランタノイドトリフラートは、ホルムアルデヒド以外の通常のアルデヒドとシリルエノラートとのアルドール反応の触媒としても有効である。反応は水-THF中、室温で円滑に進行する。アクロレイン、クロロアセトアルデヒドといった水溶性のアルデヒドは水溶液のまま反応に用いることができる。また、通常のルイス酸条件下では用いることの難しいフリーの水酸基を有するアルデヒドや窒素原子を有するアルデヒドを用いた場合も反応は円滑に進行し、対応するヒドロキシケトンを収率良く得ることができる。一方、ランタノイドトリフラート触媒は、有機溶媒中でも用いることができる。さらに、マイケル反応、Diels-Alder反応においても有効に作用する。また、Friedel-Craftsアシル化反応の有望な触媒としても期待される。反応はわずか5mol%のランタノイドトリフラート触媒の存在下でも円滑に進行し、目的とする芳香族ケトンが高収率で得られた。
化学的翻訳後修飾を指向した非古典的な核内受容体制御法の開発

核内受容体型転写因子は医薬開発の重要な標的であるが、古典的なリガンドでは制御できない種々の生理機能が報告されている。本研究では、低分子化合物による核内受容体の新たな制御法開発を目的として、古典的リガンドとは異なる新規作用メカニズムを有する制御化合物の創製を行った。具体的標的としてアンドロゲン受容体(AR)を設定し、化学的翻訳後修飾を意図したARコバレントモディファイアの創製を行った。ARのN末端ドメイン(NTD)に結合すると報告されているジフェニルメタン誘導体について周辺化合物の構造展開を行い、AR-NTDの転写活性を促進あるいは抑制する化合物の創製に成功した。核内受容体は生命の根源的な活動を制御するリガンド依存的な転写因子であり、医薬開発の重要な標的である。従来、核内受容体に対しては、リガンド結合ドメイン(LBD)へ結合して受容体の転写活性を制御するリガンド化合物が多数開発されてきたが、近年、古典的なリガンドでは制御できない種々の機能が明らかになり、新たな制御法の開発が必要とされる。本研究では、核内受容体型転写因子の機能に対する新たな制御法の開発を目的として、古典的リガンドとは異なる新規標的部位および新規作用メカニズムを有する核内受容体モジュレーターの創製を行う。具体的標的として核内アンドロゲン受容体(AR)を設定し、人工翻訳後修飾のミミックを意図したARコバレントモディファイヤーの創製を行うとともに、核内受容体を含む転写因子の統合的な制御法の開発を発展的目標とする。ARへのユニークな作用が報告されている化合物として、ジフェニルメタン誘導体EPI001が知られている。EPI001は、従来のARリガンドとは異なり、ARのLBDではなく、N末端ドメイン(NTD)に結合することが示されている。本研究課題では、EPI001を基盤として、その基本的な構造活性相関の検討と、ARの活性を様々に制御する化合物の創製を目指す。本年度においては、構造活性相関の把握を目的とした化合物展開を行い、コバレント結合部位の必要性を明らかにするとともに、骨格構造の構造展開から、EPI001と比較してより高活性の化合物の創製に成功した。得られた構造活性相関の情報は、新規ARモジュレーターのさらなる発展に有益な知見である。今年度は、既に構築した評価系を用い、ARのNTDに対して作用する化合物の構造活性相関研究を行った。具体的には、リード化合物であるクロロヒドリン構造を有するジフェニルメタン誘導体EPI001の構造を基盤として、1)コバレント結合形成をしていると考えられるクロロヒドリン部位の構造活性相関、2)化合物の生物活性に寄与していると考えられる機能性部位の構造展開、3)ジフェニルメタン骨格の構造展開、の3点について検討した。その結果、化合物のARーNTD制御活性(転写亢進活性)にはコバレントな結合を形成しうる求電子性部位が必要なこと、および機能性部位の構造によりARーNTD転写亢進活性の強度が変化することを見いだした。また、ジフェニルメタン構造をベンズアニリド構造に変換すると活性が減弱する一方で、ジフェニルエーテル構造にすると活性が増大することも見いだした。本研究課題では、ARのN末端ドメイン(NTD)に結合すると報告されている化合物EPI001を基盤として、構造活性相関の検討と、ARの活性を様々に制御する化合物の創製を目指した。前年度、基本的な構造活性相関の把握を目的とした化合物展開を行い、標的に求電子的に反応するコバレント結合部位の必要性を明らかにするとともに、骨格構造の構造展開から、EPI001と比較してより高活性の化合物の創製に成功した。本年度はさらなる構造展開を行い、EPI001とは異なる活性を有する化合物を見いだすことに成功した。EPI001は、我々の構築した評価系においてはAR転写活性を亢進するが、今回新たに見いだした化合物は、本評価系にてAR転写抑制活性を示す。以上より、転写活性の亢進および抑制のいずれにも制御可能な化合物を創製した。本研究で創製した化合物および得られた構造活性相関の情報は、新規ARモジュレーターのさらなる発展に有益な知見である。

具体的標的としてアンドロゲン受容体(AR)を設定し、化学的翻訳後修飾を意図したARコバレントモディファイアの創製を行った。ARのN末端ドメイン(NTD)に結合すると報告されているジフェニルメタン誘導体について周辺化合物の構造展開を行い、AR-NTDの転写活性を促進あるいは抑制する化合物の創製に成功した。本年度に創製した高活性化合物について構造展開をさらに綿密に検討することにより、活性および選択性が向上した化合物の創製が可能になるものと考えている。一方、本研究課題は、ARの活性を様々に制御する化合物の創製を目指している。リード化合物は本研究者の評価系において転写亢進活性を示すが、転写亢進活性に必要な構造要素を明らかにし、その部位を精査することにより、転写抑制活性を有する化合物となる可能性が考えられる。今後は、高活性化と、転写抑制化合物の創製という2つの課題について注力していく。創薬化学
カイラルなゲージ理論の格子上での定式化に関する研究

格子上の新しいカイラル対称性の取り扱い方法の理解とその応用に対して、今年度は6編の論文を発表した。内容としては、(i)ゲージ群がU(1)の格子ゲージ理論におけるトポロジカル電荷を、一般の次元に対して構成し、その意味を議論した。(ii)超場形式で定式化された超対称ゲージ理論におけるゲージアノマリーを、一般のホモトピー経路に対して計算する簡明な処方箋を与え、いくつかの例に対して適用した。(iii)一般化されたGinsparg-Wilosn(GW)関係式を満たす格子上のディラック演算子に対して、荷電共役が自然に定義し得ないことを指摘し、その意味を議論した。また、GW関係式を満たすディラック演算子を使って定式化されるカイラルな格子ゲージ理論において、定式化において不可避なCP対称性の破れが引き起こす効果を明らかにした。(iv)GW関係式を満たすディラック演算子から定義される格子上の軸性アノマリーの基本的構造を、有限の格子間隔、有限の体積の場合について明らかにした。(v)Overlapディラック演算子から定義される格子上の軸性アノマリーの古典連続極限を、任意の次元に対して計算した。(vi)ゲージ場が空間依存性を持たないいわゆるreduced modelに通常の格子ゲージ理論を"埋め込む"ことによって、reduced modelにもアノマリーの名残があることを初めて指摘した。(vii)GW関係式と密接な関係がある、格子上のカイラルフェルミオンのもう一つの定式化であるdomainwall fermionの問題点を指摘し、この定式化においても、CP対称性の破れが不可避であることを示した、である。この研究の目的は、Luscherらによって創始された、カイラルゲージ理論の格子上での明白にゲージ不変な定式化を、非アーベル的なゲージ群の場合に拡張すること、および、この定式化から引き出す事のできる物理的結論を解析する事である。今年度は、以下のような成果を得た。(1)この定式化に関連してLuscherによって提案された、4+2次元のトポロジカルな場が、降下方程式(descent equation)という代数関係を満たす事を示し、これに基づいて、この場の積分がカイラルフェルミオンの積分測度を特徴づけるファイバー束を分類する整数(Chern数)を与える事を示した。さらに、この事実が、無限に広い格子上での異常項の情報を、有限サイズの格子に焼き直すことに利用できることを議論した。(2)以前から、我々が行っている無限に広い格子上での局所コホモロジーの一般論をまとめ、現時点で解析可能な最も広い条件下での格子上の量子異常項の構造決定を行った。(3)有限サイズの格子上での異常項の構造がアーベル的なゲージ群の場合には本質的に決定できることに着目し、この事実を利用して2次元理論でのボゾン化を格子上で定式化する試みを行った。(4)以前から、菊川、中山によって、電弱相互作用SU(2)×U(1)のゲージ群の場合が無限に広い格子上では取り扱えることが指摘されていた。この結果を有限の格子に拡張する試みを行った。(5)カイラルなゲージ理論での基本的な離散対称性はCPであるが、この格子定式化ではCP対称性が明白ではない。この性質が、この定式化に固有の問題である事を示し、(6)さらに、このCPの破れの効果が理論のどこに影響するかを完全に明確にした。これらの成果の一部は既に雑誌に投稿済であり、残りの部分に関しても近日中に論文として発表する予定である。
脊髄小脳変性症の遺伝背景の解析と新規遺伝子同定に基づく病態解明

我々は常染色体優性遺伝家系において、電位依存性カルシウムチャネルCACNA1Gのミスセンス変異を同定した。しかしCACNA1G変異例については我々の研究実施中に他グループから論文報告がなされたため、病理所見を中心に論文を作成中である。また、劣性遺伝性家系、孤発性SCD例の解析では、3家系4名においてこれまでにほとんどSCDの原因として報告のないERCC4変異を同定し報告した。脊髄小脳変性症(spinocerebellar degeneration: SCD)は、およそ60%は孤発性、30-40%は優性遺伝性、数%が劣性遺伝性である。孤発例の大部分は原因不明であり、家族例においても依然原因不明な一群が存在する。申請者らは近年、新型DNAシーケンサーを使用した脊髄小脳変性症家系例の解析を行い、新規遺伝子や新規表現型の報告を行ってきた。その解析を通じて、常染色体優性家系および劣性遺伝性脊髄SCD家系において有力な新規責任遺伝子候補を複数同定している。そこで本研究では、新規責任遺伝子候補の孤発例、家族例における変異・多型の遺伝子解析、機能解析、剖検を得た家系における病理学的解析を通じて、SCDの責任遺伝子、疾患関連遺伝子を解明し、新たな疾患メカニズム、治療ターゲットを明らかにすることを目的とする。平成27年度は我々が同定した新規責任遺伝子候補の中でも、ADSCA_I家系で同定したカルシウムチャネル遺伝子のミスセンス変異について、ミスセンス変異が細胞局在、タンパク凝集性については影響を与えないことを哺乳類培養細胞を用いて確認した。構造予測の面からミスセンス変異が、電位依存性チャネルの電位センサードメインに位置するgating charge residueであることを明らかにした。そのため、培養細胞を用いたパッチクランプを行い、変異によりカルシウム電流が変化することを確認した。また、変異のノックインマウスを作成し、現在表現型解析を行っている。また、剖検例が得られているため、当該カルシウムチャネルに対する抗体を用いて、詳細な病理学的検討を行った。上記のような解析を通じて現在論文準備中である。当初我々が主要なターゲットとして解析を行う予定であったチャネル遺伝子のうち一方であるカルシウムチャネルについては、前述のように細胞モデルを用いた機能解析、病理学的解析を順調に行うことができた。他グループから同遺伝子変異の報告もあり、脊髄小脳変性症の原因遺伝子であることが確実となっている。引き続きモデルマウスを用いて、疾患発症に至る病態解析を行っていく予定であり、おおむね予定通りに研究が進んでいる。もう一方のAR家系でホモ接合性ナンセンス変異が認められたチャネル遺伝子(遺伝子Y)の機能解析、新型DNAシーケンサーを用いた脊髄小脳変性症責任遺伝子スクリーニング・疫学的データの集計については、十分な進捗していない面がある。その解析を通じて、常染色体優性(家系および劣性遺伝性脊髄SCD家系において有力な新規責任遺伝子候補を複数同定している。平成27年度は我々が同定した新規責任遺伝子候補の中でも、優性遺伝性家系で同定したカルシウムチャネル遺伝子のミスセンス変異について、ミスセンス変異が細胞局在、タンパク凝集性については影響を与えないことを哺乳類培養細胞を用いて確認した。平成28年度は作成した変異のノックインマウスの表現型解析を行っている。上記のような解析を通じて現在論文投稿中である。また劣性遺伝性の4家系について新規ではないものの、ほとんど報告のない遺伝子変異が判明し、論文作成中である。当初我々が主要なターゲットとして解析を行う予定であったチャネル遺伝子のうち一方であるカルシウムチャネルについては、前述のように細胞モデルを用いた機能解析、病理学的解析を順調に行うことができ、現在論文投稿中である。現在変異ノックインマウスを用いて、疾患発症に至る病態解析を行っており、おおむね予定通りに研究が進んでいる。もう一方の劣性遺伝性家系においてはホモ接合性ナンセンス変異が認められたチャネル遺伝子(遺伝子Y)については研究が進捗していない面もある。しかしながら、劣性遺伝性家系の解析を通じては、遺伝子Y変異家系以外に4家系で原因が判明しており、論文作成中である。

申請者らは近年、新型DNAシーケンサーを使用した脊髄小脳変性症家系例の解析を行い、新規遺伝子や新規表現型の報告を行ってきた。その解析を通じて、常染色体優性家系および劣性遺伝性脊髄SCD家系において新規責任遺伝子候補を同定した。本研究は、新規責任遺伝子候補の孤発例、家族例における変異・多型の遺伝子解析、機能解析、剖検を得た家系における病理学的解析を通じて、SCDの責任遺伝子、疾患関連遺伝子を解明し、新たな疾患メカニズムを明らかにすることを目的として開始した。我々が新規責任遺伝子候補の中でも常染色体優性遺伝家系で同定したT型電位依存性カルシウムチャネルCACNA1Gのミスセンス変異について、ミスセンス変異が細胞局在、タンパク凝集性については影響を与えないことを哺乳類培養細胞を用いて確認した。構造予測の面からミスセンス変異が、電位依存性チャネルの電位センサードメインに位置するgating charge residueであることを明らかにし、また剖検例が得られているため、病理学的検討を行って学会報告した。CACNA1G変異例については我々の研究実施中に他グループから論文報告がなされたため、病理所見を中心に論文を作成中である。また、劣性遺伝性家系、孤発性SCD例の解析においては、4家系において、これまでにほとんどSCDの原因として報告のないERCC4変異を同定し、英語論文として報告した。我々は常染色体優性遺伝家系において、電位依存性カルシウムチャネルCACNA1Gのミスセンス変異を同定した。しかしCACNA1G変異例については我々の研究実施中に他グループから論文報告がなされたため、病理所見を中心に論文を作成中である。また、劣性遺伝性家系、孤発性SCD例の解析では、3家系4名においてこれまでにほとんどSCDの原因として報告のないERCC4変異を同定し報告した。平成28年度はADSCA_I家系において同定されたカルシウムチャネルの変異について、ノックインマウスを用いた表現型解析を行っていくことを中心的な研究テーマとする。ノックインマウスの表現型解析、病理学的所見のヒト剖検例との比較、検討をまずおこなう。また、野生型およびノックインマウス初代培養神経細胞およびマウススライスカルチャー上において、current clamp法ならびにvoltage clamp法を用いて神経細胞の発火活動を記録する。ADSCA_I家系においては高次脳機能障害を呈する例があることが分かっており、マウススライスカルチャー上ではlong term potentiation(LTP)誘導刺激を与えLTP成立に対する影響についても検討する。上記解析系を用いて、カルシウムチャネル変異が引き起こす病態を阻害する薬剤同定を目指したい。
ソ連・ロシアにおける制度設計-マクロ政治制度の選択と継続に関する一考察-

現行のロシア憲法制定過程で草案作成に関与した法律家、政府及び議会関係者に対するインタビューを現地で実施し、ソ連崩壊後のロシアでどのように制度が設計されてきたかに関する実証的研究を行った。実証的研究と並行して、制度設計に関する比較政治学の既存理論とロシアにおける理論研究を合わせた体系的な理論構築を行い、最終的には実証と理論という2つの視座から本研究の仮説を論証することを目指した。平成19年度における本研究実施計画は、(1)実証的研究の立場からソ連崩壊後のロシアにおける制度設計を考察し、その研究成果を踏まえたうえで、(1)理論的研究の立場から制度設計に関する比較政治学の既存理論とロシアにおける理論研究を合わせた体系的な理論構築を行うことを目的としていた。目的(1)については、「大統領制と議院内閣制をめぐる議論の変遷-ロシアにおける政治制度変更の可能性」と「ロシア『市民社会』の現代的位相」の両論文を研究成果としてあげることができる。前者においては、ロシア大統領制の普遍性と独自性の双方を明確に把握するために、比較の視座の中に同国の政治制度をどのように一般化することができるのかという点を検討した。本論文では、ロシア憲法の草案内容をめぐって活発な議論が展開された1990年代前半の時期には多様な制度構築の可能性が開かれていたことを指摘し、議院内閣制国家へと制度変更が行われなかった政治的背景を考察した。他方、後者においては、ロシア大統領制の継続に関する構造的要因を探るひとつの手がかりとして「市民社会」の存在に着目した。現代ロシアにおける「市民社会」の不活発さの原因を歴史的変遷をたどって探り出し、ソ連・ロシアに特有な国家社会関係が制度の継続にも影響を及ぼす点を示唆した。目的(2)は、論文「新興民主主義国における政治制度の構築-ロシアにおける大統領制導入をめぐって」によって部分的に達成された。本論文ではおもに、比較政治学の土壌のなかにロシア地域研究を取り込み、理論と実証という2つの視座から分析を行った。理論的考察の部分においては、制度設計に関する比較政治の既存理論にロシアにおける理論研究を統合し、制度設計に関する理論が同国においてどのように消化・吸収されているのかを分析した。また、ロシア憲法の制定過程を実証的に分析したという点では目的(1)の一部も達成している。平成20年度の研究実施計画では、(1)憲法の草案起草者や政府及び議会関係者らに対するインタビュー調査をロシアで実施し、(2)(1)と前年度(平成19年度)の研究成果をふまえ、経験的事実と理論的考察という2つの視座から、本研究の仮説を論証することを目的としていた。目的(1)に関しては、ロシア憲法の制定に関わった憲法委員会の中心人物であったオレグ・ルミャンツェフを始め、現在ロシアの立憲体制設立の貢献者、及び、政治学者にインタビューを行い、現在の政治体制の特徴であるロシア大統領制の抱える問題点等に関して知見を得た。目的(2)の下準備として、平成20年度の後半は、(a)ゴルバチョフの側近らの私的メモを整理し、ペレストロイカ期のソ連・ロシアにおける大統領制導入をめぐる議論を検討すると同時に、(b)現代ロシアにおける大統領制と政策立案過程の特徴について論じ、1980年代後半から現代に至るまでのロシア大統領が抱える問題について総括的な考察を行った。(a)については、私的アーカイブが保管されている社会経済政治学研究国際財団ゴルバチョフ・フォンドを訪問し、ペレストロイカ期ソ連における大統領制導入に関して、ゴルバチョフ周辺の側(当時の大統領補佐官であったゲオルギー・シャフナザーロフやアナトーリ・チェルニャーエフら)からの議論を閲覧・分析することに努めた。(b)については、3論文-「ロシアのメドベージェフ政権の政策動向」「ロシアにおける中小企業活性化に向けた法制改革」「ロシアの緊急経済政策の現状」-を執筆した。現在は、本研究の仮説-マクロ政治制度の選択には主意主義的アプローチによる説明が優位であるのに対し、制度の継続には主意主義的アプローチと構造的アプローチを合わせた統合的アプローチによる分析が不可欠である-を論証するため執筆を進めている。
母の産後うつと児のアレキシサイミア傾向の関連の解明

アレキシサイミア(Alexithymia)とは、自分の感情を識別し表現する能力の損傷であり、様々な精神疾患(うつ病など)及び身体疾患(慢性的腰痛)と関連している。アレキシサイミアの要因としては、幼少時の不安定な養育環境が知られているが、母の養育態度と関係が深い産後うつが児のアレキシサイミアと関連するかどうかは明らかではない。そこで、本研究では出生コホート研究の参加者を対象として、母の産後うつと児のアレキシサイミア傾向の関連を調べることを目的としていた。当初の計画では、コホートの全体参加者(約1100人)から産後うつがあった母(約100人)と産後うつがなかった母(約100人)を改めて呼び、児のアレキシサイミア傾向を質問紙及び生理指標で測定する予定であった。しかし、コホート研究のスケジュールの調整により、コホートの参加者の一部のみ測定を行うことは現実的に難しいことが分かった。そのため、測定計画であった子どものアレキシサイミア傾向の代わり、既にコホートで測定中である子どもの問題行動(behavioral problem)を子どもの精神健康の指標として使うことにした。子どもの問題行動には外在化問題と内在化問題があり、両方子どもの低い言語能力と関連するということから、アレキシサイミアと同様に子どもの精神健康を反映すると考えられる。研究計画の一部の変更により、研究1年目には、母の産後うつが児の問題行動に及ぼす影響を調べた。その結果の一部として、母の産後うつは児の特定遺伝子多型と交互作用しながら、児の外在化問題に影響を及ぼすことが確認された。このことから、母の産後うつは母と児のポジティブなコミュニケーションを低下させ、児の精神健康を低下させることが示唆される。この結果は国内学会で発表され、現在英文ジャーナルに投稿中である。研究実績の概要で上述したように、研究1年目には、アレキシサイミア傾向を関連することが分かっている外在化問題において、母の産後うつが影響を及ぼすことを確認し、その成果を発表した。子どもの低レベルの言語能力は問題行動と関連することが分かっているが、受容言語(receptive language)と表出言語(expressive language)の中でどの能力の発達が子どもの問題行動と関連するかは未だ分かっていない。そこで、研究2年目には、幼児期の受容言語と表出言語の発達が子どもの問題行動をどのように予測するかを調べる予定である。研究成果のまとめが多少遅れ、計画した海外学会での成果発表ができなかったため、旅費において残額が生じた。また、同様の理由で論文投稿が遅れ、論文掲載料の支出がなかった。この金額は、今年海外出張と論文掲載で支出する予定である。
イネの低温ストレス応答におけるトレハロース生合成遺伝子の分子機能解析

トレハロースをグルコース2分子に分解するトレハラーゼ活性は多くの植物に見出される。イネゲノム中には1コピーのコトレハラーゼ(OsTHL)遺伝子が存在する。そこで、OxTHLを単離し、推定アミノ酸配列の比較を行ったところ、OsTHLの配列はN末端側の配列を除いて、シロイヌナズナおよびダイズより既に単離されているトレハラーゼの構造と保存性が高かった。OsTHL遺伝子の発現をノーザン解析で調べたところ、150mMのNaCl処理により根組織において強く発現が誘導された。しかし、茎葉組織における発現はストレス後においても低いレベルであった。遺伝子レベルの発現誘導に呼応する形で、根組織におけるトレハラーゼ活性が上昇することも確かめられた。また、乾燥、低温ストレスによっても根、茎葉組織において発現誘導が観察された。次に、花芽及び種子形成過程におけるOsTHLの発現を調べた。花芽の発生に伴い発現増大がみられ開花直前の成熟えい花で最大レベルの発現が観察された。開花後は発現量は低下するが、胚発生が活発に起こる開花後5日目に一過的な誘導が見られた。OsTHLの機能性を明らかにするためOsTHLの過剰発現イネを作出した。カルスにおける導入遺伝子の発現確認後、トレハラーゼ活性を測定したところ、形質転換カルスではトレハラーゼ活性が顕著に増加した。したがってOsTHL遺伝子がトレハラーゼをコードすることが証明された。T2世代の形質転換体は通常条件で栽培した場合、野生型と比べ形態、生育上の大きな差が見られなかった。これらのストレス耐性については今後検討する。イネにおけるトレハロース代謝の調節機構を解析するため,イネゲノム情報を利用し,トレハラーゼ遺伝子(OsTHL)を単離した。OsTHLはイネのゲノムにコードされる唯一のトレハラーゼ遺伝子であった。次にトレハラーゼ遺伝子の発現様式をノーザン法により解析した。幼苗におけるOsTHLの発現は極めて低いレベルであったが,低温ストレスを受けると速やかに誘導された。また,低温ストレス以外では,乾燥,塩ストレスによっても発現が誘導された。ABA処理によっても発現が誘導されたが,その応答は比較的ゆっくりであり,各ストレスに対する応答においてABAが直接関与しないと考えられた。OsTHLの機能解析のため,組換えタンパク質を大腸菌において発現させた。GST融合タンパク質として産生させた組み換えタンパク質は種々の誘導条件を試行したものの,全て不溶性画分に分画され,その酵素活性について解析することは困難であった。出芽酵母のトレハラーゼ変異体を用いてOsTHLの機能解析を試みた。酵母のAth1欠損株はトレハロースを唯一の炭素源として生育できないので,OsTHLによりその形質が相補されるかどうかを検討した。OsTHLの発現により生育性は回復されなかつたが,その原因に関しては今後の検討課題である。OsTHLをユビキチンプロモーター下で高発現するコンストラクトを作製し,イネの形質転換を行った。細分化個体を得て,現在複数のTO植物体を育成している。