hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
電子顕微鏡直接観察に立脚した新規蛍石構造強誘電ナノ粒子の創成

水熱合成法により酸化ハフニウム(HfO2)ならびに酸化ハフニウムジルコニウム(Hf1-xZrxO2)のナノ粒子を合成し、その結晶構造、微構造、化学組成などをX線回折(XRD)測定ならびに透過型電子顕微鏡法などを用いて評価した。計画の初年度である昨年度は水熱合成によるHfO2ナノ粒子の結晶化条件を検討して、160°C以上の条件で結晶化した粒子が得られることを見出した。これらの条件で合成したナノ粒子では蛍石型の結晶構造を有する粒子が得られた。酸化ハフニウムジルコニウムにおいてはハフニウム(Hf)とジルコニウム(Zr)が均一に固溶した粒子が得られていることが分かった。また、XRD測定から得られたナノ粒子の結晶相は単斜晶であり、強誘電性を示す直方晶では無いことが明らかとなった。また、ナノ粒子の粒径は数10nm程度であったが、Zrの固溶量が増えるにつれて増加する傾向にあった。今後、粒径を更に小さくするなどして直方晶化を目指す予定である。また、一方で強誘電性を示すナノ粒子であるチタン酸バリウム(BaTiO3)について原子分解能走査透過型電子顕微鏡(STEM)による原子位置の解析を並行して行った。粒径30nm以下のナノ粒子において、Tiイオンが単位格子の中心から有意に変位していることが認められ、強誘電相であることが明らかとなった。また、表面においてはBaイオンの位置が大きく変位していることが認められ、誘電性に影響を与えていることが示唆されることも併せて明らかとなった。初年度は当初の計画に基づいて、水熱合成法による酸化ハフニウム(HfO2)ならびに酸化ハフニウムジルコニウム(Hf1-xZrxO2)のナノ粒子の合成を試みた。ナノ粒子を蛍石型の構造で結晶化させることに成功したことは当初の計画通りであった。また、ジルコニウム(Zr)を添加ならびに固溶させることにも成功し期待以上の成果も得られている。加えて、予期していなかった成果として、Zrの固溶量に応じて粒径が大きくなるという現象を見出すことができ当初の計画以上の知見が得られたと考えている。この成果は今後Hf1-xZrxO2のナノ粒子の粒径を制御する上において非常に重要な知見となり得る。結果として、計画初年度で結晶化したナノ粒子の合成、X線回折による結晶構造評価、透過型電子顕微鏡法による粒径、結晶構造、化学組成の解析手法が一通り確立され、研究の方法論が確立されたことは当初の計画通りであった。加えて、並行して行っていたチタン酸バリウム(BaTiO3)ナノ粒子の原子分解能走査透過型電子顕微鏡(STEM)解析において大きな進展があった。BaTiO3中の単位格子におけるチタン(Ti)イオンの変位を5 pm程度の精度で測定できる技術を確立することができ、Tiイオンの変位分布が流径10-30 nm程度の大きさの粒子で明瞭に測定できるようになった。その結果、当該のBaTiO3ナノ粒子が甲誘電性を示す構造であることが明らかとなる成果が得られた。これは当初の計画では想定していなかった成果で計画以上のものである。計画初年度に酸化ハフニウム(HfO2)ならびに酸化ハフニウムジルコニウム(Hf1-xZrxO2)ナノ粒子の合成ならびに評価手法が一通り確立できたことを踏まえて、今年度は以下の方策で研究を進める予定である。得られたナノ粒子を強誘電性を示す直方晶にすることが今後の最大の課題である。第一の方策としては粒径を小さくすることであり、具体的には20 nm以下のものを目指す。小さい粒子を得るためにまず最初に合成時間の短縮を試みる。加えて準安定の直方晶を得る方策としては、応力の印加、電場の印加、酸素空孔の導入などが考えられる。これらの方策を逐次、あるいは全て同時に試みることで直方晶のナノ粒子を得ることを試みる。直方晶の粒子が得られたら、圧力応答顕微鏡(PFM)を用いた強誘電性の確認や平板型試料の作製による強誘電ヒステリシスループの測定を試みる。また、チタン酸バリウム(BaTiO3)ナノ粒子の原子分解能走査透過型電子顕微鏡(STEM)解析も引き続き並行して行う。現在、最小のもので粒径が15nm程度のものまで観察を行うことができているが、より小さな粒径8 nm程度のものまでの観察を試みる予定である。より小さな粒子については結晶性の低下が一つの課題となっているため、結晶性の改善が強誘電BaTiO3ナノ粒子の更なる微細化をもたらす可能性がある。

また、ナノ粒子の粒径は数10nm程度であったが、Zrの固溶量が増えるにつれて増加する傾向にあった。今後、粒径を更に小さくするなどして直方晶化を目指す予定である。また、一方で強誘電性を示すナノ粒子であるチタン酸バリウム(BaTiO3)について原子分解能走査透過型電子顕微鏡(STEM)による原子位置の解析を並行して行った。粒径30nm以下のナノ粒子において、Tiイオンが単位格子の中心から有意に変位していることが認められ、強誘電相であることが明らかとなった。また、表面においてはBaイオンの位置が大きく変位していることが認められ、誘電性に影響を与えていることが示唆されることも併せて明らかとなった。初年度は当初の計画に基づいて、水熱合成法による酸化ハフニウム(HfO2)ならびに酸化ハフニウムジルコニウム(Hf1-xZrxO2)のナノ粒子の合成を試みた。ナノ粒子を蛍石型の構造で結晶化させることに成功したことは当初の計画通りであった。また、ジルコニウム(Zr)を添加ならびに固溶させることにも成功し期待以上の成果も得られている。加えて、予期していなかった成果として、Zrの固溶量に応じて粒径が大きくなるという現象を見出すことができ当初の計画以上の知見が得られたと考えている。この成果は今後Hf1-xZrxO2のナノ粒子の粒径を制御する上において非常に重要な知見となり得る。結果として、計画初年度で結晶化したナノ粒子の合成、X線回折による結晶構造評価、透過型電子顕微鏡法による粒径、結晶構造、化学組成の解析手法が一通り確立され、研究の方法論が確立されたことは当初の計画通りであった。加えて、並行して行っていたチタン酸バリウム(BaTiO3)ナノ粒子の原子分解能走査透過型電子顕微鏡(STEM)解析において大きな進展があった。BaTiO3中の単位格子におけるチタン(Ti)イオンの変位を5 pm程度の精度で測定できる技術を確立することができ、Tiイオンの変位分布が流径10-30 nm程度の大きさの粒子で明瞭に測定できるようになった。その結果、当該のBaTiO3ナノ粒子が甲誘電性を示す構造であることが明らかとなる成果が得られた。これは当初の計画では想定していなかった成果で計画以上のものである。計画初年度に酸化ハフニウム(HfO2)ならびに酸化ハフニウムジルコニウム(Hf1-xZrxO2)ナノ粒子の合成ならびに評価手法が一通り確立できたことを踏まえて、今年度は以下の方策で研究を進める予定である。得られたナノ粒子を強誘電性を示す直方晶にすることが今後の最大の課題である。第一の方策としては粒径を小さくすることであり、具体的には20 nm以下のものを目指す。小さい粒子を得るためにまず最初に合成時間の短縮を試みる。加えて準安定の直方晶を得る方策としては、応力の印加、電場の印加、酸素空孔の導入などが考えられる。これらの方策を逐次、あるいは全て同時に試みることで直方晶のナノ粒子を得ることを試みる。直方晶の粒子が得られたら、圧力応答顕微鏡(PFM)を用いた強誘電性の確認や平板型試料の作製による強誘電ヒステリシスループの測定を試みる。また、チタン酸バリウム(BaTiO3)ナノ粒子の原子分解能走査透過型電子顕微鏡(STEM)解析も引き続き並行して行う。現在、最小のもので粒径が15nm程度のものまで観察を行うことができているが、より小さな粒径8 nm程度のものまでの観察を試みる予定である。
波浪観測データを用いた超強風条件における海面抵抗係数の推定

現地での測定が極めて困難な超強風条件における海面抵抗係数について,暴風域外で観測された波浪観測データから逆推定可能なデータ同化システムに現地データを適用し,海面抵抗係数を風速の関数として推定した結果,風速30m/s以下の風速範囲については,複数の擾乱事例について,任意に設定した複数の初期値からほぼ同様の推定結果を得ることができ,従来,利用されているMitsuyasu・Hondaの式が概ね妥当であることが確認できた.さらに,強風が発生していない観測地点であっても,強風域で発生し伝播してきたうねりが観測されていれば,データ同化により強風速範囲の海面抵抗係数が推定可能であることを明らかにした.本研究は、第3世代波浪推算モデルWAMのエネルギーソース項のうち、風から波へのエネルギー輸送に関する海面抵抗係数の風速依存性に着目し、WAMにデータ同化手法(4次元変分法)が組み込まれた波浪推算モデル(ADWAM)を仮想の観測装置とすることで、全国港湾海洋波浪情報網(ナウファス)により、2時間間隔で提供されている潮岬の有義波高の時系列データを観測値として、風速別の海面抵抗係数を推定したものである。初年度はデータ同化の現地適用について試行を実施し、現地への適用が可能なモデルであることを確認するとともに、妥当な推定結果が得られる計算条件を明らかにした。また、強風の発生域から離れた観測点の波浪を観測値としてデータ同化実験を行った場合であっても、強風域で発生し伝播してきたうねりが観測されていれば、データ同化により強風速範囲の海面抵抗係数が推定可能であることを明らかにした。さらに、2004年から2008年までの5年間の潮岬における推算波高をNOWPHASの観測波高と比較し、波高が精度良く再現できている気象擾乱事例を抽出した。2年目である最終年度は、できるだけ多くの擾乱事例を対象にデータ同化を実施し、結果として複数の擾乱事例において、任意に設定した複数の初期値からほぼ同様の推定結果を得ることができた。さらに、風速30m/s以下の風速範囲については、従来、利用されているMitsuyasu・Hondaの式が概ね妥当であることが確認できた。現地での測定が極めて困難な超強風条件における海面抵抗係数について,暴風域外で観測された波浪観測データから逆推定可能なデータ同化システムに現地データを適用し,海面抵抗係数を風速の関数として推定した結果,風速30m/s以下の風速範囲については,複数の擾乱事例について,任意に設定した複数の初期値からほぼ同様の推定結果を得ることができ,従来,利用されているMitsuyasu・Hondaの式が概ね妥当であることが確認できた.さらに,強風が発生していない観測地点であっても,強風域で発生し伝播してきたうねりが観測されていれば,データ同化により強風速範囲の海面抵抗係数が推定可能であることを明らかにした.4次元変分法が組み込まれた波浪推算モデル(ADWAM)を実海域に適用し、全国港湾海洋波浪情報網(ナウファス)により2時間間隔で提供されている有義波高を観測値として、風速別の海面抵抗係数を推定した。観測地点は強風の影響を受けて発生した波が到達しやすいと考えらる太平洋側の地点のうち、本検討で設定した計算格子間隔0.5度であっても表現が容易であり、地形による遮蔽の影響が少ないと想定される潮岬を対象とした。データ同化の対象期間については、2004年から2008年の5年間について、気象庁のベストトラックデータを参照し、波浪観測地点である潮岬に比較的大きい台風が接近する期間とした。データ同化で推定される海面抵抗係数は使用する現地観測データの精度に依存するため、外力条件である気象データや観測波高に誤差が多く含まれる場合には解が不安定になり、推定結果を得ることができないことがある。そこで、海面抵抗係数に従来の提案式を用いた波浪推算結果を確認し、波浪観測結果を概ね再現できている期間を対象として海面抵抗係数の推定を実施することとした。その結果、異なる初期条件から推定を開始し、同程度の推定結果を得ることができた。得られた海面抵抗係数は従来の提案式とも近い値を示しており、適切な値が推定できたものといえる。また、当該擾乱事例では、波浪観測地点で発生していた風速が10m/s程度であったにもかかわらず、観測地点では発生していなかった風速30m/s程度の海面抵抗係数まで推定することができた。このことから、観測地点で強風が発生していなくても、強風で発生した波浪が伝播し、観測地点で観測されれば、本データ手法により、強風条件での海面抵抗係数を推定可能であることが明らかとなった。申請者は当該助成による研究を開始する前の時点で、4次元変分法が組み込まれた波浪推算モデルを改良することにより、現地での測定が困難な超強風条件における海面抵抗係数を暴風域外で観測された波浪観測データから逆推定可能なデータ同化システムを開発しており、このデータ同化システムにより推定される海面抵抗係数の妥当性については数値実験により確認済みである。本研究はこれまでの研究を継続し、本データ同化システムを実海域に適用することで強風条件における海面抵抗係数を推定するものであるため利用環境を整備する手間は無く、直ちに現地データの適用に着手することが可能であった。使用する波浪の観測データについては既に全国港湾海洋波浪情報網(ナウファス)により、長期間にわたり観測されているデータを活用するため、新たに観測を実施する必要がない。

研究の遂行にあたっては、大学院生1名および技術職員の協力を得ることができた。平成24年度は、過去5年間について擾乱事例を抽出し、本データ同化システムによる海面抵抗係数の推定を行った結果、一擾乱について、妥当な推定結果を得ることができた。当該年度の研究計画は、データ同化の現地適用の試行および、妥当な推定結果が得られる計算条件を明らかにすることであり、おおむね順調に進展しているものといえる。平成25年度は、平成24年度に明らかにした安定な推定結果が得られる計算条件のもとで、強風別の海面抵抗係数について推定を行う。推定される海面抵抗係数が不安定になり、妥当な推定結果が得られない擾乱ケースに対しては、一度の計算でデータ同化を実施する期間を出来る限り長期間とすることで、各時刻の観測データが有する誤差の影響を相対的に小さくするとともに、同化期間中に対象領域で多様な風速を網羅できるようにする予定である。次いで、得られた海面抵抗係数の風速別分布について、既往の研究事例との比較を行うほか、データ同化で利用していない期間や観測地点を対象として、得られた係数による波浪予測計算を行い、観測値の再現性を確認することで、妥当性の検証を行う計画である。ただし、データ同化により推定される海面抵抗係数は、擾乱ケースごとに異なる分布となることも考えられる。そこで平成24年度に抽出した気象擾乱について、可能な限り多くのケースを対象にデータ同化による海面抵抗係数の推定を実施することで推定された海面抵抗係数の普遍性を高めるとともに、得られた風速別の海面抵抗係数については、統計的に整理することで、最適な海面抵抗係数の設定について検討する計画である。平成24年度は、海面抵抗係数を推定するデータ同化システムの現地適用に際し、大量の情報を計算機内に記憶する必要があるデータ同化について、計算条件を変化させながら検討を行ったため、記憶容量を十分に有し、かつ計算性能に優れた新規のワークステーションを申請者用および研究に協力する大学院生用に計2台購入した。平成25年度は、平成24年度に得られた推定結果を整理するため、研究に協力する大学院生用に、解析用PCおよび解析用ソフトウェアライセンスを購入する予定である。得られた研究成果については、国内学会1件および国際学会2件で発表を予定しており、これらについての論文投稿料、印刷費および旅費が必要である。また、平成25年度の研究では、できるだけ多くの擾乱条件についてデータ同化の計算を実施する必要があることから、気象データを追加購入するとともに、膨大な計算結果を保管するためのハードディスクを購入する計画である。
セファロスポリン分解型β-ラクタマーゼ活性中心機能の研究

病原細菌の主要群であるグラム陰性細菌は、染色体性のセファロスポリン分解型クラスCβ-ラクタマーゼを生産し、オキシイミノ系の第3世代セファロスポリン剤にも高度耐性を示す.β-ラクタム剤耐性菌制圧のために多数のβラクタム誘導体やβ-ラクタマーゼ阻害剤が開発されたが、クラスCβ-ラクタマーゼ生産菌の制圧には成功していない.これはこのタイプの酵素の活性中心構造とその機能についての理解がきわめて乏しいためである.本研究はCitrobacter freundiiが生産するセファロスポリン分解型クラスCβ-ラクタマーゼの活性中心構造とその機能について、部位特異的変異導入法により解析した.活性中心ポケット表面に存在すると予想される一連のアミノ酸座位の変異酵素を作出し、機能アミノ酸残基の検索を行った.この結果、既に明らかにした触媒機能残基Ser64,Lys67,Lys315のほかに、新たにTyr150を触媒反応の重要機能残基として同定し、各残基の触媒反応における役割を明らかにした.さらに保存性Asn152が基質結合に関与するアミノ酸残基であることを発見した.一方、以前の研究で発見したGlu219ループ領域のアミノ酸変異によるオキシイミノ系セファロスポリン剤分解活性上昇現象を酵素化学的に究明し、これが変異による酵素-基質アシル中間体の安定性の顕著な低下によることを明らかにした.この知見は、1アミノ酸置換によってこの酵素がより協力なセファロスポリン分解酵素に分子進化することを示している.また分子動力学計算を用い、酵素-基質相互作用のシミュレーションを行って、β-ラクタム剤とβ-ラクタマーゼ活性中心との相互作用を3次元的に考証した.以上の成果から、クラスCβ-ラクタマーゼの触媒反応機構の詳細なモデルを提唱することができた.本酵素の活性中心構造と機能が分子レベルで理解できたことによって、今後の新タイプのβ-ラクタム剤開発に理論的ドラッグデザインの道を開き、さらには新型耐性菌の性質予測とその対策にも大きく貢献できると考えられる.病原細菌の主要群であるグラム陰性細菌は、染色体性のセファロスポリン分解型クラスCβ-ラクタマーゼを生産し、オキシイミノ系の第3世代セファロスポリン剤にも高度耐性を示す.β-ラクタム剤耐性菌制圧のために多数のβラクタム誘導体やβ-ラクタマーゼ阻害剤が開発されたが、クラスCβ-ラクタマーゼ生産菌の制圧には成功していない.これはこのタイプの酵素の活性中心構造とその機能についての理解がきわめて乏しいためである.本研究はCitrobacter freundiiが生産するセファロスポリン分解型クラスCβ-ラクタマーゼの活性中心構造とその機能について、部位特異的変異導入法により解析した.活性中心ポケット表面に存在すると予想される一連のアミノ酸座位の変異酵素を作出し、機能アミノ酸残基の検索を行った.この結果、既に明らかにした触媒機能残基Ser64,Lys67,Lys315のほかに、新たにTyr150を触媒反応の重要機能残基として同定し、各残基の触媒反応における役割を明らかにした.さらに保存性Asn152が基質結合に関与するアミノ酸残基であることを発見した.一方、以前の研究で発見したGlu219ループ領域のアミノ酸変異によるオキシイミノ系セファロスポリン剤分解活性上昇現象を酵素化学的に究明し、これが変異による酵素-基質アシル中間体の安定性の顕著な低下によることを明らかにした.この知見は、1アミノ酸置換によってこの酵素がより協力なセファロスポリン分解酵素に分子進化することを示している.また分子動力学計算を用い、酵素-基質相互作用のシミュレーションを行って、β-ラクタム剤とβ-ラクタマーゼ活性中心との相互作用を3次元的に考証した.以上の成果から、クラスCβ-ラクタマーゼの触媒反応機構の詳細なモデルを提唱することができた.本酵素の活性中心構造と機能が分子レベルで理解できたことによって、今後の新タイプのβ-ラクタム剤開発に理論的ドラッグデザインの道を開き、さらには新型耐性菌の性質予測とその対策にも大きく貢献できると考えられる.Citrovacter freundii GN346の生産するクラスCβ-ラクタマーゼ遺伝子クローンを鋳型とし、オリゴDNAを用いた部位限局ランダム変異導入法によって変異β-ラクタマーゼ遺伝子ライブラリーを作成した。本酵素の3次元構造をもとに予想した、活性中心ポケットを構成する4領域(57アミノ酸座位)を標的アミノ酸配列とした。各種β-ラクタム剤に対する耐性レベルの変化によって、酵素活性に影響を受けた変異β-ラクタマーゼ遺伝子をスクリーニングし、得られた変異遺伝子の塩基配列を決定した。138個(41アミノ酸座位)の独立したアミノ酸変異遺伝子を単離同定した。この中から既に報告したSer64,Lys67およびLys315のほかに、新たにTyr150とAsn152が酵素活性に重要な機能アミノ酸残基であることを見出した。この研究によって、本酵素の活性中心ポケットに露出したアミノ酸残基のほとんどをスクリーニングし、重要残基はほぼ同定できたと考えられる。予備的に測定した変異酵素の酵素動力学的パラメータ変化から、Tyr150が触媒反応に、Asn152が基質結合に関与することが示唆された。平成6年度の課題としてこれら残基の機能を詳細に解析するために、それぞれ系統的にアミノ酸置換を導入した部位特異的変異酵素遺伝子を作成した。一方、RI標識基質(^<14>C-Benzylpenicillin)を用いた酵素素反応の速度変化を評価する解析系を確立した。

この手法を用いて、既に同定した機能アミノ酸残基Lys67がアシル化ステップ、Lys315が脱アシル化ステップで機能する重要残基であることを明らかにした。また本酵素の3次元構造モデルをグラフィックコンピュータで構築した。反応モデルを推測するために酵素-基質複合体(ミカエリス複合体およびアシル酵素反応中間体)の安定構造を分子動力学計算で推定し、同定した機能アミノ酸残基と基質との相互作用を3次元的に考察した。前年度の成果として、オリゴDNAを用いた部位限局ランダム変異導入法によってCitrobacter freundii GN346の生産するクラスCβ-ラクタマーゼ遺伝子を鋳型とした変異β-ラクタマーゼ遺伝子ライブラリーを作成し、各種β-ラクタム剤に対する耐性レベルの変化よって酵素活性に影響を受けたβ-ラクタマーゼ遺伝子をスクリーニングし、既に報告したSer64,Lys67およびLys315のほかに、新たにTyr150とAsn152が酵素活性に重要な機能アミノ酸残基であることを見出した。本年度は、まずこれら変異酵素遺伝子を大量発現系に組込み、大量の精製変異酵素を得た。各変異酵素の酵素動力学的パラメータ変化と、RI標識基質(^<14>C-Benzylpenicillin)を用いた酵素反応の速度変化を評価する解析法を行って、Lys67がアシル化ステップ、Tyr150とLys315が脱アシル化ステップに、またAsn152は基質結合に関与することを示す成績を得た。また本酵素の3次元構造モデルをグラフィックコンピューターで構築した。反応モデルを推測するために酵素-基質複合体(ミカエリス複合体およびアシル酵素反応中間体)の安定構造を分子動力学計算で推定し、同定した機能アミノ酸残基と基質との相互作用を3次元的に考証した。この結果は酵素化学的解析結果と矛盾せず、以下の反応モデルを構築した。アシル化部位Ser64水酸基は、β-ラクタム剤ラクタム環カルボニル炭素近傍に位置し、Lys67末端アミノ基の補助によってカルボニル炭素を求核攻撃し、アシル酵素中間体を形成する。次いでTyr150水酸基がこのアシル基近傍に位置する水分子を活性化する一般塩基として作用し、アシル酵素中間体が加水分解され、分解生成物を生じる。また、以前の研究で発見したGlu219ループ領域のアミノ酸変異によるオキシイミノ系セファロスポリン剤分解活性上昇現象を酵素化学的に究明し、これが変異による酵素-基質アシル中間体の安定性の顕著な低下によることを明らかにした。
新規細胞移植モデルの確立を目指した肝幹細胞の分化・増殖機構の解明

研究代表者らは、細胞表面抗原によって濃縮したマウス肝幹・前駆細胞を用いて、その分化と増殖の分子機構を解析し、目的分子の発現を調節した移植系を用いて、肝幹・前駆細胞による細胞移植効率の向上を図る研究を行った。その結果、MT1-MMPを介したシグナル伝達により、肝幹・前駆細胞由来の胆管の管腔形成が促進されること、EGFシグナル制御との相関によって、肝細胞への分化が抑制されることが示された。また、BMP-4は肝幹・前駆細胞の増殖を負に制御することが示された。本研究の成果は、将来の自己由来幹細胞を用いた肝再生医学の進歩に貢献しうると考えられる。研究代表者らは、これまでに確立してきた肝幹細胞生物学研究の学術基盤をもとに、細胞表面抗原によって高度に濃縮したマウス肝幹細胞画分を用いて、その分化・増殖に関わる新たな分子機構を解析し、特定の標的分子の発現を調節することにより移植ドナー細胞の「至適成熟度」を決定し、これらの結果を基盤に、ヒトiPS細胞を用いた新規ヒト肝臓キメラマウスモデルの構築を試みる研究を行い、今年度は下記の成果を得た。(1)マウス肝幹・前駆細胞の分離、培養、in vitroでの形質解析と肝幹・前駆細胞におけるMT1-MMPの機能解析:マウス肝幹・前駆細胞の分離、培養技術の最適化をさらに進め、安定した分化誘導培養が可能になった。MT1-MMPの強制発現、MT1-MMP欠損マウスを用いたマウス肝幹・前駆細胞における機能解析の結果、in vitroでの増殖能には有意差を認めない一方で、MT1-MMPが肝細胞成熟化には抑制的に、胆管の管腔形成モデルでは促進的に機能することが示された。これらの結果を論文として報告した(Otani, Kakinuma, Asahina, Watanabe et al, Biochem Biophys Res Commun. 2016)。(2) MT1-MMP欠損マウスを用いたTranscriptome解析:MT1-MMP欠損マウス由来の肝幹/前駆細胞、及びMT1-MMP欠損マウス由来の新生仔期肝臓を用いてTranscriptome解析を行い、肝幹/前駆細胞のMT1-MMP機能低下によりEGFシグナルの亢進が誘導されることが示された。以上の結果を前述の論文(Otani et al. 2016)及びJDDW 2015シンポジウム(第19回日本肝臓学会大会)で発表した。当初計画したとおり、(1)マウス肝幹・前駆細胞の分離、培養、in vitroでの形質解析と肝幹・前駆細胞におけるMT1-MMPの機能解析については、想定通りの進捗を得た。すなわち、その結果をまとめ国内外の学会において発表し、さらに原著論文として採択されることができた。本論文の結果は、これまで、まったく不明であったMT1-MMPの肝幹・前駆細胞機能を解析し、門脈周囲の肝幹・前駆細胞による胆管形成を促進的に制御し、正常に進行させるために重要な因子であること、さらにMT1-MMPが肝幹・前駆細胞の成熟化に寄与することをそれぞれ世界で初めて示し、胆管形成に係わる新たなメカニズムを提示しえたと言える。次に(2)MT1-MMP欠損マウスを用いたTranscriptome解析についても想定通りの進捗を得た。網羅的な検索から得られたデータは上記(1)で示す研究の成果を裏打ちするデータであったと共に、新たにMT1-MMPの機能低下がEGFシグナリングの代償的な亢進を惹起すること、その結果、肝細胞成熟化が進行する可能性が示された。これらの結果を基盤に次年度の研究をさらに推進することが可能になり、今後の発展が期待できると考えている。(1)マウス肝幹・前駆細胞の分離、培養、in vitroでの形質解析と肝幹・前駆細胞におけるMT1-MMPの機能解析:マウス肝幹・前駆細胞の分離、培養技術の最適化を進め、さらに安定した分化誘導培養が可能となった。MT1-MMPの強制発現、MT1-MMP欠損マウスを用いたマウス肝幹・前駆細胞における機能解析の結果、肝細胞成熟化に抑制的に、胆管形成に促進的に機能することを見いだし報告した(Biochem Biophys Res Commun, 2016)。さらにBMP-4シグナルが、胆管形成に抑制的に機能することを報告した(Hepatol Res, 2016)。(2)ApoE欠損マウスをレシピエントとしたマウス肝幹・前駆細胞移植後の細胞動態の解析:さらにApoE欠損マウスをレシピエントとして移植を行うと、ドナー細胞が産生するApoE蛋白によって高コレステロール血症が長期改善し、細胞移植の治療効果が得られることを確認した。血清中の総コレステロールとApoE蛋白を定量することによって、ドナーキメリズムのモニタリングと定量化したところ、MT1-MMPを強制発現すると、移植効率が高くなることが示された。(3)ヒトiPS細胞由来細胞によるヒト

肝臓キメラマウスモデルの構築:構築に向けてヒトiPS細胞由来肝幹・前駆細胞の誘導培養技術の最適化を進め、新規細胞株の樹立に成功した(Sci Rep, 2016)。当初の予定通り、(1)マウス肝幹・前駆細胞の分離、培養、in vitroでの形質解析と肝幹・前駆細胞におけるMT1-MMPの機能解析については想定通りの進捗を得て、その結果は原著論文に採択された。本論文の結果は、これまで不明であったMT1-MMPの肝幹・前駆細胞での機能を解析し、肝幹・前駆細胞による胆管形成の調節に重要であることを世界で初めて示すことに成功した。その結果から導いた研究によって、BMP-4シグナルが肝幹・前駆細胞から胆管形成の調節に重要な因子であること、その機能が抑制的に作用すること、さらには肝幹・前駆細胞の増殖に強く抑制的に働くことも見いだし、この結果は原著論文に採択された(Hepatol Res, 2016)。(2)ApoE欠損マウスをレシピエントとしたマウス肝幹・前駆細胞移植後の細胞動態の解析に関しても想定通りの進捗がみられ、結果は(3)の研究に反映することが可能になっており、次年度の研究にも継続することが可能になっている。従って、本項目が大きく進捗することが想定されている。(3)ヒトiPS細胞由来細胞によるヒト肝臓キメラマウスモデルの構築は、当初は最終年度に実施する予定であったが、進捗が順調であったため、想定より早く着手することが可能になった。ヒトiPS細胞から肝幹・前駆細胞を誘導する方法の効率改善に成功し、その結果の一部を原著論文に報告し、採択された(Sci Rep, 2016)。これらの点から、既に達成した原著論文報告に加えて、研究計画は当初の目的を達成しつつ、想定以上の早さで進捗しており、次年度はさらに大きく進捗することができると考えている。研究代表者らは、これまでに確立してきた肝幹細胞生物学研究の学術基盤をもとに、細胞表面抗原によって高度に濃縮したマウス肝幹細胞画分を用いて、その分化・増殖に関わる新たな分子機構を解析し、特定の標的分子の発現を調節することにより移植ドナー細胞の「至適成熟度」を決定し、これらの結果を基盤に、ヒトiPS細胞を用いた新規ヒト肝臓キメラマウスモデルの構築を試みる研究を行い、今年度は下記の成果を得た。(1)マウス肝幹・前駆細胞の分離、培養、in vitroでの形質解析と肝幹・前駆細胞におけるMT1-MMPの機能解析:マウス肝幹・前駆細胞の分離、培養技術の最適化を進め、さらに安定した分化誘導培養が可能となった。MT1-MMPの強制発現、MT1-MMP欠損マウスを用いたマウス肝幹・前駆細胞における機能解析の結果、肝細胞成熟化に対して肝間葉系細胞が支持的に作用することが示された。(2)ApoE欠損マウスをレシピエントとしたマウス肝幹・前駆細胞移植後の細胞動態の解析:さらにApoE欠損マウスをレシピエントとして移植を行うと、ドナー細胞が産生するApoE蛋白によって高コレステロール血症が長期改善し、細胞移植の治療効果が得られることを確認した。血清中の総コレステロールとApoE蛋白を定量することによって、ドナーキメリズムのモニタリングと定量化したところ、MT1-MMPを強制発現すると、移植効率が高くなることが示された。(3)ヒトiPS細胞由来細胞によるヒト肝臓キメラマウスモデルの構築:構築に向けてヒトiPS細胞由来肝幹・前駆細胞の誘導培養技術の最適化を進め、昨年度新規細胞株の樹立に成功した(Sci Rep, 2016)。
白血病幹細胞のNotchを中心とした分子病態の解明とその検査法、標的治療法の開発

今年度は研究実施計画に基づき、Notch関連遺伝子のsiRNAを用いて、白血病細胞の分化、増殖への効果、タンパクおよび遺伝子発現量の変化を解析した。【目的】siRNAを用いたNOTCH1とNOTCH2の遺伝子発現の抑制の、白血病細胞の細胞増殖と下流のシグナル伝達系に対する効果を解析した。【材料と方法】急性Tリンパ芽球性白血病(T-ALL)細胞株2種と急性骨髄性白血病(AML)細胞株2種の細胞株に対し、NOTCH1、NOTCH2を標的としたsiRNAを導入した。ノックダウンの細胞増殖とタンバク質発現に対する効果は、比色法WST-8アッセイとイムノプロット法を用いて解析した。【結果】T-ALL細胞株において、NOTCH1のノックダウンはNOTCH2のノックダウンと同様に細胞増殖抑制効果を示し、アポトーシスを誘導した。MYCタンパク発現壁はNOTCH1をノックダウンした細胞では減少したが、NOTCH2をノックダウンした細胞では変化がみられなかった。AML細胞株では、NOTCH1とNOTCH2のノックダウンは,細胞増殖に有意な変化は起こさなかった。また、NOTCH2のノックダウンはNotch1蛋白の発現を増加させることなく活性型Notch1断片を増加させた。【考察】本研究より、NOTCHのノックダウンがNOTCH1変異をもつ2種のT-ALL細胞株の増殖を抑制させることを示した。NOTCH siRNAがT-ALL細胞株のDND-41とKOPT-K1の増殖を抑制することを示した研究は本研究が初である。我々が知る限りT-ALLにおけるNotch2の役割はまだ報告されていない。本研究から、NOTCH2変異をもたないT-ALL細胞が、NOTCH1のノックダウンだけでなく、NOTCH2のノックダウンによっても細胞増殖が抑制されたことを見出した。【結論】Notchシグナリングにおけるこれらの新しい知見は、白血病に対して有効なNotchを標的とした分子標的治療薬の開発や分子生物学的検査法の確立の基礎となることが期待される。当初の計画に沿って順調に研究が進展し、本研究の目的である白血病細胞におけるシグナル伝達系の分子機序の一端を明らかにすることができた。その結果、白血病に対する新たな分子標的治療開発の基礎となる知見が得られた。本研究から、Notch1だけでなく、Notch2も白血病細胞の増殖に関与していることが明らがになったが、その分子機序はまだ明らかになっていない。よって、白血病細胞の増殖におけるNotch1、Notch2の機序と役割を解析し、その細胞特性を解明する必要があると考える。さらに、Notchシグナル阻害剤の増殖抑制効果が白血病幹細胞や患者由来の白血病細胞にも当てはまるか否かを調べ、症例ごとの薬剤感受性検査法を樹立する必要がある。本研究では、白血病の分化、増殖に関与しているNotch、Wnt、Hedgehog関連遺伝子の発現がそれぞれのシグナル伝達系へ与える作用および白血病幹細胞の分化、増殖に与える効果を検討し、シグナル伝達系の分子機序を解明することを目的としている。今年度は白血病細胞におけるNotchシグナルとmTORシグナルの相互作用について学会で報告した。現在、Notch関連遺伝子のsiRNAを用いて、白血病細胞の分化、増殖の効果、タンパクおよび遺伝子発現量の変化を解析中である。24年度に行った研究結果の概要を以下に示す。1.白血病細胞株に対してNotchリガンド刺激を行い、Notchシグナルを活性化させたときの他のシグナル伝達系ヘタンパクの変化をイムノブロット法で、種々の遺伝子の発現量の変化を定量RT-PCR法で解析した。その結果、Notchリガンド反応性の白血病細胞株において、Notchシグナル活性化がmTORシグナル系の蛋白と遺伝子を活性化させることが確認された。このことからNotchシグナルとmTORシグナルは相互的に作用している可能性を見出した。白血病細胞でNotchリガンド刺激によるNotchシグナル活性化がmTORシグナルへ及ぼす効果を解析したのは本研究が世界初である。2.白血病細胞に対し、Notch関連遺伝子のsiRNAをエレクトロボレーション法によって細胞に導入し、Notchシグナルに特異的な遺伝子の発現を抑制後、白血病細胞の分化、増殖に対する効果を評価し、他のシグナル伝達系への作用を解析した。エレクトロボレーション法によるノックダウン効果は、遺伝子発現では7割以上の減少、イムノブロット法ではバンドがほぼ消失するまでのノックダウンが得られ、導入1週間後でも遺伝子発現の減少が確認できた。また、一部の白血病細胞においてNOTCH1遺伝子のノックダウンによってmTORシグナル系の蛋白と遺伝子の発現が抑制されることを確認した。この結果と、結果1で見出した結果から、白血病細胞におけるNotchシグナルとmTORシグナルの相互作用の存在がより明らかになったといえる。MYCタンパク

発現壁はNOTCH1をノックダウンした細胞では減少したが、NOTCH2をノックダウンした細胞では変化がみられなかった。AML細胞株では、NOTCH1とNOTCH2のノックダウンは,細胞増殖に有意な変化は起こさなかった。また、NOTCH2のノックダウンはNotch1蛋白の発現を増加させることなく活性型Notch1断片を増加させた。【考察】本研究より、NOTCHのノックダウンがNOTCH1変異をもつ2種のT-ALL細胞株の増殖を抑制させることを示した。NOTCH siRNAがT-ALL細胞株のDND-41とKOPT-K1の増殖を抑制することを示した研究は本研究が初である。我々が知る限りT-ALLにおけるNotch2の役割はまだ報告されていない。本研究から、NOTCH2変異をもたないT-ALL細胞が、NOTCH1のノックダウンだけでなく、NOTCH2のノックダウンによっても細胞増殖が抑制されたことを見出した。【結論】Notchシグナリングにおけるこれらの新しい知見は、白血病に対して有効なNotchを標的とした分子標的治療薬の開発や分子生物学的検査法の確立の基礎となることが期待される。研究における方法論や手技は既に習得済みである。また、本研究から新しい知見も得られており、当初の計画に沿って順調に研究が進展している。当初の計画に沿って順調に研究が進展し、本研究の目的である白血病細胞におけるシグナル伝達系の分子機序の一端を明らかにすることができた。その結果、白血病に対する新たな分子標的治療開発の基礎となる知見が得られた。Wnt、Hedgehog関連遺伝子のsiRNAを細胞に導入して、これらのシグナルを阻害することによる白血病幹細胞への効果を調べる。また、siRNAによる作用が患者細胞にも当てはまるかを調べるため、同意を得た白血病患者の血液残余検体から分離した白血病細胞を用いて、同様の検討を行う。以上の結果から、Notch、Wnt、Hedgehogシグナルが各症例の白血病幹細胞にどう関与しているかを総括する。また、上記で行った解析法のうち、どのようなことを検査として行えば、この関与が簡便にわかるかを検討する。さらに、現在までに得られている各シグナル阻害剤の効果に関する結果が、siRNAによるシグナル阻害の結果と一致するかを解析し、シグナル阻害剤の作用がそのシグナルに特異的なものであるかを検討する。特異性が高いことがわかれば、将来、そのシグナル阻害剤が分子標的治療薬となりうる可能性があり、阻害剤が有効となりうる症例を選別できる検査法を上記の解析方法を元に検討する。本研究から、Notch1だけでなく、Notch2も白血病細胞の増殖に関与していることが明らがになったが、その分子機序はまだ明らかになっていない。
IL-1R antaqonist発現による胃癌悪性度評価と遺伝子療法への応用

臨床研究【方法と結果】胃癌38例の癌部、非癌部および胃癌細胞株(KAT O III、MKN-28)におけるsIL-1ra(分泌型)、icIL-1ra(細胞内局在型)mRNAの発現をRT-PCR法を用いて解析した。免疫染色は抗IL-1ra抗体による間接酵素抗体法にて行った。RT-PCR:sIL-1ra mRNAは癌部で20/38(52.6%)、非癌部で7/38(18.4%)に発現しており、癌部での発現率が高かった(P<0.01)。KATOIIIおよびMKN-28ではsIL-1ra mRNAの発現は認めなかった。一方、icIL-1ra mRNAは癌部、非癌部、KATOIII、MKN-28全てに認めた。癌部におけるsIL-1ra mRNAの発現を基準にしてsIL-1ra(+)20例、sIL-1ra(-)18例の2群に分け、各病理学的因子との関連性を検討したところ、sIL-1ra mRNAとリンパ節転移、肝転移との間に正の相関を認めた(P<0.02)。また、リンパ管侵襲および組織学的進行度と正の相関傾向を認めた。免疫染色:sIL-1ra mRNAを発現している胃癌組織では免疫担当細胞にIL-1ra proteinが強く発現していた。【結論】sIL-1ra mRNA発現胃癌症例はリンパ節転移および肝転移を高率に伴っており、胃癌の悪性度を反映する有用な因子であると考えられた。基礎研究【方法と結果】PHA+PWM刺激マウス単核球よりRT-PCR法にてマウスIL-1ra cDNAを作成し,pRC/CMV vectorにHind III-XbaIにて組み込んだ.マウスLLCおよびcolon-26細胞にリポフェクチン法にてIL-1ra遺伝子を導入し、現在転移実験を進行中である.臨床研究【方法と結果】胃癌38例の癌部、非癌部および胃癌細胞株(KAT O III、MKN-28)におけるsIL-1ra(分泌型)、icIL-1ra(細胞内局在型)mRNAの発現をRT-PCR法を用いて解析した。基礎研究【方法と結果】PHA+PWM刺激マウス単核球よりRT-PCR法にてマウスIL-1ra cDNAを作成し,pRC/CMV vectorにHind III-XbaIにて組み込んだ.マウスLLCおよびcolon-26細胞にリポフェクチン法にてIL-1ra遺伝子を導入し、現在転移実験を進行中である.
神経・内分泌系による胸腺ホルモン分泌調節に関する研究ー胸腺ホルモン分泌性(胸腺上皮性)細胞初代培養系を用いてー

1.胸腺上皮性細胞(TEC)培養上清からの生理活性物質の分離(1)Wistar系ラット由来TEC株(ITー45R1)の培養上清からゲル濾過カラム及び逆相クロマトにより胸腺生理活性物質の分離を行った。その結果、分子量2.5kDの分画にconcanavalin A及びphytohemagglutinin応答能誘導活性が認められ、逆相クロマトを用いた分離法により前者は疎水性分画に分離され、その標的細胞は低比重性胸腺リンパ球(TL)で、後者は親水性分画に分離され、標的細胞は高比重性TLであった。また、ラットTL群の約80%はモルモット赤血球と結合しロゼットを形成するが、3kD分画は非形成TLに作用し、ロゼット形成能を賦与しえた。さらに、この活性ポリペプチドは逆相クロマトにより2種の亜分画に分離された。(2)リンパ球優位型胸腫腺ラット由来TEC株(TAD3)を用いて、上記と同様に活性物質を分離した結果、10kD分画にTL増殖誘導活性が認められ、その標的細胞はCD4ー8ー細胞で、活性発現に胸腺内粘着細胞の関与が示唆された。2.TEC機能に対する神経伝達物質及びホルモンの影響1.胸腺上皮性細胞(TEC)培養上清からの生理活性物質の分離(1)Wistar系ラット由来TEC株(ITー45R1)の培養上清からゲル濾過カラム及び逆相クロマトにより胸腺生理活性物質の分離を行った。2.TEC機能に対する神経伝達物質及びホルモンの影響胸腺微小環境における上皮性細胞(TEC)はポリベブチド(POP)を分泌し、これが前駆T細胞に作用し、T細胞へと分化・成熟させるといわれているが、その分泌機作と調節については全く不明である。この重要課題解決の為、(I)TEC培養の設定、(II)I培養上清中へ分泌されたPOPの精製法確立、(III)POP分泌構への神経・内分泌系の関与の実証、等に取り組み、一定の成果をあげた。(I)TEC初代培養法を設定したが、他種細胞の混在は避け難くTEC細胞株を研究用材料とした。(II)(1)TEC培養上清を大量採集し、冷結乾燥後、燐酸緩衝液に溶かし、これをゲル濾過カラム装着の高速液体クロマト(HPLC)にかけ、4種のPOP分画(A,B,C,D,推定分子量,10,7,3,2,5,KD)を分離した。(2)A分画はPTC増殖誘導活性を保持することを発見した。このPOPの精製と構造決定はT細胞減少に併う免疫不全症の治療薬(遺伝子組み換え法による)開発の基礎となろう。(3)D分画はコンカナバリンA応答能とフィトヘムアグルチニン応答能の誘導活性を持つが、この分画を逆相クロマトカラム装着のHPLCにかけると、前者は疎水性POF亜分画に、後者は親水性POP亜分画に濃縮されることが判明した。(III)(1)培養TECのpreーconfuentstateにアセチルコリン(Ach)を投与すれば、DNA合成能および有糸分裂指数の亢進が誘導されるが蛋白合成能は抑制された。(2)(1)の系をAch受容体の競合的阻害剤であるαーブンガロトキシンにて前処置すると、上記の変化は認められなかった。これはTECの活性POP分泌にcholinergic agonistの関与を示唆し、現在TEC表面膜におけるAch受容体の存在を分子生物学的に検討中である。(3)(1)のシステムに成長ホルモン又はサイロキシンを添加すると、Ach投与と類似の結果が得られた。(4)似上は、仮説(申諸者の提唱)"神経・内分泌系による胸腺ホルモン分泌調節"を支持するものでさらなる解析を計画している。胸腺内前駆T細胞(PTC)を成熟T細胞へと分化・成熟させる、胸腺上皮性細胞(TEC)株由来ポリペプチド(POP)の合成・分泌機作については未だ全く不明である。この重要課題解決の為、(1).TEC株培養系の設定、(2).(1)の培養上清中へ分泌されたPOPの精製法確立、(3).POP分泌機構への神経・内分泌系の関与の実証、に取り組み、一定の成果を挙げることができた。(1).正常ラット胸腺由来TEC株培養系を設定したが、(2)の目的達成の為にはある一定量以上のPOP採取が必要とされ、POP分泌のより盛んなことが判明している胸腺腫ラット

由来TEC株を樹立し研究用材料とした。(2).TEC培養上清を採集し、凍結乾燥後、燐酸緩衝液に溶解しゲル濾過カラム装着高速液体クロマト(HPLC)にかけ、得られたPOP分画のうち推定分子量10kDの分画にPTC増殖誘導活性を保持することを発見した。(3).蛋白合成の盛んな時期のTEC株培養系に神経刺激伝達物質のアセチルコリン(Ach)を添加すると、その蛋白合成能が亢進する事が明かとなり、生物活性保持POPの分泌にAchの関与が示唆された。さらにそのTEC細胞膜上にAch受容体が分子生物学的にも、細胞生理学的にも存在し、従来から明らかにされている神経終板におけるAch受容体の親和性にほぼ近似したそれを有する事が判明した。また、この受容体が加齢に伴って、Achとの結合性が低下する事が、主として上皮性細胞からなる臓器培養胸腺由来間質細胞を用いて示唆された。以上は、申請者の提唱するところの“神経・内分泌系による胸腺ホルモン分泌調節"を支持するもので、加齢に伴う免疫能の低下をも示唆するものである。胸腺内アセチルコリン受容体のT細胞分化・成熟機構に関わる意義について、さらなる研究を計画している。本年度の研究実施計画に記載したように、胸腺上皮性細胞株の培養液をRPMI1640培地+10%非働化牛胎仔血清から無血清培地への順化を行った。用いた無血清培地は抗thymosin α1モノクロ-ナル抗体を用いた酵素抗体法により、交差反応が認められないGIT培地を選んだ。GIT培地を用いて培養した胸腺上皮性細胞株の無刺激時及び神経刺激伝達物質の1つであるアセチルコリン刺激時の培養上清中へのthymosin α1分泌量を測定した。その結果、無刺激時、アセチルコリン刺激時共に検出感度以下であった。現在、上記の方法で培養した胸腺上皮性細胞株をホモジネ-トし、細胞内でのthymosin α1の合成量の変化が誘導されているのか否かを検討中である。アセチルコリン刺激により胸腺上皮性細胞の蛋白合成が促進されていることから、胸腺上皮性細胞での胸腺ホルモンの合成が誘導される可能性が示唆されているが、分泌刺激には他の物質等を必要とする可能性がある。次に、他の胸腺ホルモンの分離・精製であるが、ラット胸腺リンパ球のマイト-ゲン応答能誘導活性を有する分子量2.5kDの分画は高速液体クロマトグラフィ-によるゲル濾過及び逆相カラムにより比較的純度が高い活性因子の分離が可能であると考えられる。前回逆相カラムにて分離した分画は活性は認められたが、高感度で蛋白量を測定できる紫外線の吸収による測定法でも検出し得ないほど微量であったため、今回大量の培養上清よりの分離・精製を行い、電気泳動法による純度検定及び精製を行う。これによりアミノ酸配列の分析に必要な量が得られれば、アミノ酸配列の決定を行う。また、これまでの結果より、胸腺上皮性細胞培養上清中にはごく微量の活性物質しか分泌されていないのではないかと考えられるため、胸腺上皮性細胞のホモジネ-トからの活性物質の分離・精製の準備も行っている。2.合成thymosin α1(Tα1)に対する単クロ-ン抗体及びポリクロ-ナル抗体の調製ができ、これらを用いて各種ホルモン及び神経伝達物質によるTα1合成量の変化の検討が可能となった。3.合成Tα1はラット胸腺リンパ球群のnonーRFC subsetに対して作用し、RFCへと変化させる活性を保持していた。また、nonーRFC及びRFC subsetの表面マ-カ-解析によりnonーRFC subsetはCD4ー8ー,CD4+8ー,CD4+8ー細胞からなることが、RFC subsetはCD4+8+細胞からなることが判明した。
楕円曲線上の等角不変確率場の繰り込みとその多重相関関数が表現する保型形式

2次元トーラスの複素構造を上半平面によって自然にパラメータ付けする。その上の複素数値点過程を非同次項に持つコ-シ-リーマン方程式の解として確率場が定まる.上半半面への群SL_2(Z)の作用のもと解はモデュラー共変性を持つ.この性質が多重相関関数をトーラス上の有理点で評価したものの保型性を導く.しかしながら解としての確率場は2乗以上のべきに対しては可積分とはならないことが分かり,そのままでは表現できる保型形式に大きく制限を付けてしまう.ところが楕円関数を用いた解の表示から,モデュラー共変性を保ったまま確率場のべき乗に相当するもの,renormalized productと仮に呼ぶ,が自然に構成され,表現できるクラスを広げることができる。renormalized productの構成はwick積のアナログともいえ,実際,点過程の粒子密度が大きい極限での確率場のガウス超過程への収束(中心極限定理)が,同時にrenormalized productのwick積への収束にいたることが示せる.但し中心極限定理の成立する典型的な状況と相違するのは,コ-シ-リーマン方程式の非同次項が,各点独立なポァッソン点過程を確率が0であるようなファイバーで条件を付けて得られるものであるために元々持っていた独立性を大きく崩してしまっている点にある.独立性を壊すような拘束条件はコ-シ-リーマン方程式が可解であるために必要な条件であり,本研究の重要テーマであった.この点は,ポァッソン点過程のレビー測度が適度な密度を持てば比較的困難なしに克服できる.2次元トーラスの複素構造を上半平面によって自然にパラメータ付けする。renormalized productの構成はwick積のアナログともいえ,実際,点過程の粒子密度が大きい極限での確率場のガウス超過程への収束(中心極限定理)が,同時にrenormalized productのwick積への収束にいたることが示せる.但し中心極限定理の成立する典型的な状況と相違するのは,コ-シ-リーマン方程式の非同次項が,各点独立なポァッソン点過程を確率が0であるようなファイバーで条件を付けて得られるものであるために元々持っていた独立性を大きく崩してしまっている点にある.独立性を壊すような拘束条件はコ-シ-リーマン方程式が可解であるために必要な条件であり,本研究の重要テーマであった.この点は,ポァッソン点過程のレビー測度が適度な密度を持てば比較的困難なしに克服できる.
総合的学習の主体的・協同的学習スキル育成手法の開発と体系化に関する研究

総合的な学習に先進的に取り組み、学習スキルの育成を進めている学校(鳴門教育大学附属小学校、京都市立御所南小学校、大阪市立西淡路小学校、上越教育大学附属小学校、小松島市立南小松島小学校、鳴門教育大学附属中学校、香川県寒川町立天王中学校等)への訪問調査と共同開発研究を行った。主体的・協同的な問題解決スキルに関しては、国内外の教育現場における理論的・実践的研究およびビジネス書、研究先進校の訪問調査・授業参観から、その抽出・整理と育成方法の検討を進めた。その一方で、抽出された主体的・協同的な問題解決スキル育成のための具体的な学習活動の開発(ワークシートの開発を含む)と単元開発の設計・実施・評価を共同研究校と行った。具体的なスキル活用場面が組み込まれた授業の記録と分析、子どものワークシートの分析を通して、スキル育成方法の評価・改善を行った。付箋紙とKJ法による体験からの問題整理スキルの育成、ウェッビング法による課題設定スキルの育成と問題解決過程の客観化、アドバイスカードによる相互評価・自己評価スキルの育成、HP作成によるプレゼンテーションスキルの育成、ポートフォリオ法による学習の記録と振り返りスキルの育成など、具体的なスキル育成方法の有効性が明らかになった。また、訪問調査および共同開発研究の途上において、主体的・協同的な学習スキルの明確化とスキル活用を意識したカリキュラム開発の必要性だけでなく、子どもたちの主体的・協同的な問題解決学習を支援するための学習環境整備の必要性(特に「開放性」と「交流性」)が明らかになった。しかし、国語や生活科、社会科の教科書分析や事例分析も行ったものの、総合的な学習と教科学習におけるスキルの関連と違いの検討と小学校から中学校を通した主体的・協同的な問題解決スキルの体系化は十分に行うことができなかった。総合的学習に先進的に取り組んでいる学校(京都市立御所南小学校、大阪市立西淡路小学校、上越教育大学附属小学校、小松島市立南小松島小学校、八女市立川崎小学校、鳴門教育大学附属中学校、大阪教育大学附属池田中学校、香川県寒川町立天王中学校等)への訪問調査と共同開発研究を行った。主体的・協同的な学習スキルに関しては、国内外の理論的・実践的研究および文化人類学等の諸科学の研究方法に関する文献、ビジネス書、研究先進校の訪問調査・授業参観を通して、その抽出・整理と育成方法の検討を進めている。一方で、抽出された学習スキル育成のための具体的な単元の設計、実施、評価を共同研究校の教師と行った。具体的な学習スキル活用場面が組み込まれた授業の記録と分析、子どものワークシートの分析を通して、学習スキルの体系化、学習スキル育成方法の評価・改善を行った。付箋紙とKJ法による体験からの問題整理、ウェッビング法による問題解決過程の客観化、アドバイスカードによる相互評価・自己評価、ポートフォリオ法による学習の記録と振り返りなどが小・中学校を問わずに有効に活用されている。プレゼンテーションスキルおよび問題発見・解決スキルに関しては測定尺度項目の作成を進めている。研究途上において、次の2つの点が明らかになってきた。一つは、スキルの体系化と具体的な学習場面でのスキル活用を意識したカリキュラム開発の必要性である。一つは、子どもたちの主体的かつ協同的な学習を支援するための学習環境整備の必要性である。主体的・協同的な問題解決スキルの抽出および整理に当たっては、国内外の教育現場における理論的・実践的研究およびビジネス書、研究先進校の訪問調査・授業参観をもとに行った。