hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
劇症型A群レンサ球菌感染症のマウスモデルの解析

我々は、A群レンサ球菌をマウスに筋注すると急性期から回復した後に約3週間経過してそれ以降に敗血症を起こして突然死するマウスが存在することを見出し「遅延死」と名付けた。この病態は劇症型A群レンサ球菌感染症(STSS)に酷似しており、動物モデルになると考えた。本年度は、このモデルがヒトのSTSSにおける病態といえるかどうか、血清中のサイトカインを解析することにより検討した。溶連菌SP2株(STSS由来株)10^7CFUをddYマウスの上肢に筋注後20日目以降にマウスがショック状態になった時点で、全採血を行い、血清中サイトカインを測定した(遅延死マウスモデル)。サイトカインの測定にはBD Cytometric Bead Array (CBA) Systemを用いた。一方、マウスに溶連菌を静注すると5日以内にほとんどのマウスが死亡することがすでにわかっている(急性死マウスモデル)。したがって、我々がSTSSマウスモデルとして提唱している遅延死と急性死との病態の違いを明らかにするために、コントロールとして溶連菌SP2株10^7CFUをddYマウスの尾静脈にi.v.し、静注後マウスがショック状態となった時点で、同様に全採血を行い、血清中サイトカインを測定した。その結果、遅延死マウスにおいてはTNF-α,IFN-γ,IL-10,IL-12p70がp<0.01の有意差をもって急性死より高値を示した。ヒトのSTSSにおいても高サイトカイン血症がその病態に深く関与していることが指摘されているが、今回の結果はヒトのSTSSにおける血清中サイトカインの動きと酷似していた。すなわち、このモデルがヒトのSTSSにおける病態を示していることが裏付けられた。また、これらのサイトカインのうちのいずれかがSTSSと関連している可能性が示唆された。この病態は劇症型A群レンサ球菌感染症(STSS)に酷似しており、動物モデルになると考えている。本研究の目的は、この「遅延死」の機序を解明することである。STSSは、打撲や外傷が発症の契機となったという報告がある。今回、A群レンサ球菌感染後のマウスに筋肉挫滅をくわえ、遅延死の影響について検討した。さらに、遅延死を起こしたマウスより回収した菌は莢膜を強く発現しており、病原性も強くなっていることより、多数の病原遺伝子の中でも莢膜成分であるヒアルロン酸を合成するhasA遺伝子に注目し、hasA変異株を作成し、遅延死への影響について検討した。1.A群レンサ球菌SP2株(STSS由来株)をマウスの上肢に筋注した。筋注後10日後と20日後にマウスの下肢に挫滅を加え、その後の生存を観察した。その結果、感染後20日目に筋組織を挫滅すると遅延死が有意に早まることがわかった。しかし、10日後に筋組織を挫滅した場合では、ほとんど差は認めなかった。一方、マウスが菌血症をおこし始める時期を調べると多くのマウスが感染20日以降であった。以上より、菌血症を起こす時期に、筋組織が挫滅されると、その部位に血中のGASが定着・増殖し遅延死が促進されると考えられた。感染後、急性期の回復後に、菌接種部位を切除すると、生存率が高まった。遅延死マウスにおいては、感染局所に生存する菌が敗血症を起こして全身臓器に播種され増殖したものと考えられた。2.ddYマウスに、SP2野生株とhasA変異株を10^7CFU筋注した場合、hasA変異株では、死亡したマウスは認めなかった。遅延死の発症には、莢膜の発現が必要条件であることが示唆された。

ヒトのSTSSにおいても高サイトカイン血症がその病態に深く関与していることが指摘されているが、今回の結果はヒトのSTSSにおける血清中サイトカインの動きと酷似していた。すなわち、このモデルがヒトのSTSSにおける病態を示していることが裏付けられた。また、これらのサイトカインのうちのいずれかがSTSSと関連している可能性が示唆された。
中高年からの運動習慣の形成・定着のためのスポーツ活動支援施策に関する基礎的研究

本研究の目的は、中高年者を対象に運動・スポーツ活動の現状を明らかにするとともに、運動・スポーツ活動を阻害する要因および促進する要因を明らかにし、中高年者のためのスポーツ活動支援策を提案することであった。本研究では、20歳以上の成人2,005名を対象に調査を実施した。1.青・壮年者では週3日以上運動・スポーツを実施している者(以下、運動・スポーツ実施者を単に実施者と言う)は1割強・週12日または月12日実施者が約4割、運動・スポーツを実施していない者(以下、非実施者)は4割程度であった。非実施者が半数近くを占めたが、実施意志のある者が非常に多く、運動・スポーツに対する結果予期(運動・スポーツの実施によってどのような結果が得られると思っているか)についても、実施者と同様に肯定的に捉えており、非実施者でも条件さえ整えば運動・スポーツを実施する可能性が示唆された。実施者および非実施者ともに、施設整備、指導者およびスポーツ仲間の確保、気軽に楽しめるスポーツ種目等について要望が高く、総合型地域スポーツクラブ等の推進の必要性が示唆された。また、非実施者においては運動・スポーツの効果や楽しさの実感をもたせるような導入プログラムの実施が必要であると考えられた。2.高齢者では週3日以上の実施者は3割弱、週12日または月12日の実施者が3割強、非実施者は4割程度であった。非実施者では青・壮年者と比較して運動・スポーツ活動に対して無関心の者が非常に多かったが、運動・スポーツに関心のある者は実施者と同様に、運動・スポーツ活動を肯定的に捉えていた。また、実施者全般にスポーツ仲間の存在や身近な施設の整備に対する要望が強く、実施頻度の少ない者では指導者の確保、クラブの設置、施設やスポーツ教室等に対する情報の提供、手軽に楽しめるスポーツ種目の普及等の要望も強く、組織的な普及対策の必要性が示唆された。また、運動・スポーツ活動に対して興味関心が低い高齢者に対しては、まず運動やスポーツの効果や楽しさを体感できるような導入的なプログラムの実施が必要であると考えられた。本研究の目的は、中高年者を対象に運動やスポーツ活動の現状を把握すると共に、運動・スポーツ活動を阻害する要因および促進する要因を明らかにすることである。本年度は、20歳60歳の勤労者および60歳以上の高齢者を対象に調査を実施し、以下の結果を得ることができた。1.60歳以上の高齢者の54.8%が運動やスポーツを実施していると回答し、男女別ではほぼ同程度の割合であった。年代別では60歳74歳の前期高齢者(56.3%)に比較し、75歳以上の後期高齢者(52.6%)の実施率がやや減少する傾向にあるものの、有意な差異は認められなかった。また、運動やスポーツを実施しなかった高齢者の中でも2つのタイプ(運動やスポーツをしたいと思っている者:運動希望者、運動やスポーツをしたいとは思わない者:運動拒否者)が存在していた。運動やスポーツの実施による影響や効果について、運動習慣のある者及び運動希望者では運動やスポーツの効果を肯定的に捉えており、運動拒否者では運動やスポーツの効果を肯定的に捉える傾向は弱かった。2.20歳60歳の勤労者における男性の71%、女性の58%が月12日以上運動を実施している(運動習慣あり)と回答し、その割合は男性において有意に高い傾向を示した。年代別では女性においてのみ有意差が認められ、女性では40歳代以上の者において運動習慣のある者の割合が高かった。現在、運動やスポーツを実施していない勤労者では運動やスポーツの効果を肯定的に捉える傾向が弱く、運動習慣のある勤労者では運動実施頻度が多い者程、運動やスポーツの効果を肯定的に捉える傾向が示唆された。3.運動・スポーツ活動支援策として、運動やスポーツの楽しさを実感できるプログラムや機会を提供し、運動やスポーツに対する肯定的な姿勢を育成すると共に、運動やスポーツを行える身近な場所の提供、運動仲間やクラブの育成及びそれらに関する情報発信の重要性が示唆された。

非実施者では青・壮年者と比較して運動・スポーツ活動に対して無関心の者が非常に多かったが、運動・スポーツに関心のある者は実施者と同様に、運動・スポーツ活動を肯定的に捉えていた。また、実施者全般にスポーツ仲間の存在や身近な施設の整備に対する要望が強く、実施頻度の少ない者では指導者の確保、クラブの設置、施設やスポーツ教室等に対する情報の提供、手軽に楽しめるスポーツ種目の普及等の要望も強く、組織的な普及対策の必要性が示唆された。また、運動・スポーツ活動に対して興味関心が低い高齢者に対しては、まず運動やスポーツの効果や楽しさを体感できるような導入的なプログラムの実施が必要であると考えられた。
中空導波路を用いた大きな可変特性を可能とする新しい光制御デバイス

現在の光通信システムでは、様々な光デバイスが幅広く使用されている。中でも小型化・集積化を可能とする光導波路デバイスは広く研究・開発されており、石英系PLC (Planar Lightwave Circuit)は代表的な成功例である。しかしながら、今後予想される高速・高密度な波長多重通信システム(WDM)、高度な光ルーティングシステムへの適用を考えると、環境に左右されない安定した動作・広帯域な可変動作・低消費電力化・小型化等、更なる光デバイスの高性能化が望まれていた。可変中空導波路は中空コアの厚さ変化による巨大な伝搬定数変化、空気の低い屈折率温度依存性による低温度依存性が期待できる新しい光導波路構造である。本研究では、この可変中空導波路構造に着目し、その可変機能光デバイスへの応用を目指した。中空導波路を構成する片側のDBR上にBraggグレーティングを装荷した可変中空導波路Bragg反射鏡構造を提案し、中空コアの厚さ変化による160nmを超える巨大なBragg波長可変動作、0.0044nm/Kという従来の導波路に比べ12桁低い温度依存性を初めて実験的に実証した。また、可変光機能デバイスへの応用として、可変中空導波路を用いた可変分散補償器・波長可変フィルタ構造を提案し、それぞれ-8259psec/nm、9nmの可変動作を実証し、可変中空導波路を用いた高性能可変光制御デバイスの可能性を示した。
腰部神経根性疼痛に対するアシアロエリスロポエチンの効果に関する研究

腰部神経根に髄核を留置することで、プロテインキナーゼの発現の増加と神経損傷が惹起され疼痛閾値が低下した。貧血の治療としてすでに臨床で使用されているエリスロポエチンと、類似薬で血球増加作用のないアシアロエリスロポエチンを投与することにより、プロテインキナーゼの発現が1日目に抑制され、疼痛閾値の低下が21日目より回復することが明らかになった。腰椎疾患に対する症状を軽減することが期待できる。髄核留置モデルを用いて、アシアロエリスロポエチン(A-Epo)投与後の疼痛閾値の変化について検討した。至適濃度と投与タイミングの予備検討を施行した。A-Epoの至適濃度は不明であることから、腰部脊髄神経圧挫モデルを用いてのエリスロポエチン投与効果を検討した論文を参考に、A-Epoの濃度を設定した。1)疼痛発現後に治療開始の効果検討治療群では、髄核留置後7日目にA-Epo腹腔内投与を開始した。連日投与し、35日まで疼痛閾値を計測した。対照として髄核留置後に薬物投与しない(未治療)群と、髄核を留置しない(sham群)を設定し、同時期の計測を施行した。術後7日目の時点で、髄核留置群では、疼痛閾値が低下した。Sham群では疼痛閾値が低下しなかった。治療群と未治療群では、疼痛閾値の低下が持続し、疼痛閾値の低下の改善は認められなかった。2)モデル作製前投与からの効果検討治療群では、髄核留置の前日よりA-Epo腹腔内投与を開始した。連日投与し、術後28日目まで疼痛閾値を計測した。術後7日目では疼痛閾値は、治療群と未治療群では差が認められなかった。術後14日目以降では、治療群で疼痛閾値の低下が回復し、術後28日目までのsham群と差が認められなかった。未治療群と比較して有意に疼痛閾値が高値であった。以上の結果より、次年度は、モデル作製前投与による検討で、組織学的検討を施行する予定である。ラット髄核留置(NP)モデルを用いて、アシアロエリスロポエチン(Epo)が神経保護作用を有するか否かについて検討を行った。実験系はNPモデルに、未投与のNP (-)群、Epoを投与するNP-Epo (+)群、Epoに溶媒を投与するNP-Veh群とsham群の4群を設定した。行動学的検討では、NP (-)群とNP-Veh群では、疼痛閾値の低下が術後28日間持続し、sham群と比較して有意に低下した。NP-Epo (+)群では、術後14日以降に疼痛閾値が上昇し、術後28日間には、未治療のNP (-)群と比較して有意に閾値が回復した(p<0.05)。また、組織学的検討では、神経損傷マーカーであるATF-3の発現を比較した。NP-Epo (+)群にて、術後7日、14日と28日目で、NP (-)群と比較してATF-3の発現が抑制された(p<0.05)。我々は、NPモデルにてのサイトカインの発現について報告した(Tachihara H, et al, Spine33,2008)。サイトカインの刺激によりp-38が活性化され、アポトースに関与することが知られている。今回は、活性化されたp-38をウエスタンブロット法にて発現をEpo投与の有無による相違を検討した。NP-Epo (+)群では、未治療のNP (-)群と比較して有意にリン酸化p-38の発現量が少なく、リン酸化が抑制された(p<0.05)。以上のことから、腰椎椎間板ヘルニアに類似したラット髄核留置モデルを用いて、Epoはリン酸化p-38の発現を抑制し、神経損傷の程度は未治療群に比較して弱く、早期に疼痛閾値が回復することが明らかになった。本研究の結果から、腰椎椎間板ヘルニアの治療薬として期待できる。
クロマチン制御因子Ｍａｍｏによる極細胞中における遺伝子発現制御機構の解析

生殖細胞系列の細胞中では、vasa遺伝子(vas)が特異的に発現することが知られており、vasの発現を活性化する制御機構には不明な点が多い。本研究ではショウジョウバエ母性因子Mamoによるvasの発現活性化制御の分子機構の解明を目的として解析を行った。これまでに、MamoのC2H2型Znフィンガードメイン(MZD)がvas遺伝子座のイントロンにある配列と直接結合することを明らかにした。また、野生型と比較してMZD強制発現胚中では、MZD結合領域周辺でヒストンH3K27のアセチル化のレベルが高くなることが分かった。さらに、H3K27のアセチル化に関与するCBPとMZDが遺伝学的に相互作用することが明らかになった。これらのことから、MZDがCBPといったヒストン修飾酵素と相互作用し、vasの発現を制御する可能性が考えられる。次に、vas遺伝子座のイントロンにあるMZD結合領域がvasの発現活性化に必要なのかを調べるために、CRISPR/Cas9システムを用いてMZD結合領域を欠失した系統を作製した。その結果、MZD結合領域を欠失した胚中では、生殖細胞中における内在性vasの発現が野生型に比べて有意に低下することが明らかになった。このことから、vas遺伝子座にあるMZD結合領域がvasの発現活性化に必要なエレメントであることが示唆される。次にMZDがvas遺伝子以外の遺伝子の発現に影響を与えるのかを解析するために、野生型胚とMZD強制発現胚を用いてRNA-seq解析を行った。その結果、減数分裂関連遺伝子であるc(3)G遺伝子の発現量が、野生型胚に比べてMZD強制発現胚中で増加することが示唆された。そこで、c(3)G遺伝子の発現量を解析した結果、野生型胚と比べてMZD強制発現胚中ではc(3)G遺伝子の発現量が有意に増加することが分かった。このことから、c(3)G遺伝子の発現もvasと同様にMZDによって発現活性化を制御されることが示唆される。26年度が最終年度であるため、記入しない。これまでに生殖細胞中で、vas遺伝子などの生殖細胞関連遺伝子の発現を活性化する分子機構は明らかになっていない。本研究では、生殖細胞中でショウジョウバエのクロマチン制御因子Mamoが生殖細胞の形成及び発生に必要なvas遺伝子の発現を活性化するメカニズムを解明することで、生殖細胞の分化メカニズムの解明を試みた。まず、MamoのC2H2型zinc-fingerドメインがDNAに対する結合能をもち、さらにDNA結合に必要なコンセンサスを明らかにした。このコンセンサス配列をもとにvas遺伝子座にあるMZD結合部位の候補を検索したところ、13カ所あることがわかった。そこで、これらの結合部位の候補とMZDがin vivoで結合するのかを解析するためにChIP解析を行った。その結果、MZDがvas遺伝子座中のイントロンにある配列と結合することがわかった。また、MZD強制発現胚中のMZD結合部位周辺ではピストンH3K27のアセチル化(H3K27Ac)レベルが野生型に比べて増加することが明らかになった。これらのことから、MZDはvas遺伝子座に直接結合し、vas遺伝子座のピストン修飾状態を変えることでvas遺伝子の発現を制御している可能性が考えられる。しかし、MZDにはピストン修飾に関わるドメインは含まれていないため、MZDがなんらかのヒストン修飾因子と相互作用することが予想される。そこで、ヒストンH3K27Acに関わることが知られているCBPに注目し解析を行った。その結果、MZDを胚全体で強制発現させるとvas遺伝子の発現量が増加するが、CBPとMZDを胚全体で同時に強制発現させたところ、MZDだけを強制発現させた場合よりもさらにvas遺伝子の発現量が増加することが分かった。このことから、MZDとCBPが遺伝学的に相互作用すると考えられる。生殖細胞中での遺伝子発現については多くの研究が行われてきたが、遺伝子発現の制御機構に関する知見は乏しい。本研究からvas遺伝子の発現制御にクロマチン構造が重要であることが示唆される。今後、ヒストン修飾を中心としたクロマチン構造の制御が、生殖細胞中の遺伝子発現を制御する分子機構を明らかにしていく予定である。

このことから、vas遺伝子座にあるMZD結合領域がvasの発現活性化に必要なエレメントであることが示唆される。次にMZDがvas遺伝子以外の遺伝子の発現に影響を与えるのかを解析するために、野生型胚とMZD強制発現胚を用いてRNA-seq解析を行った。その結果、減数分裂関連遺伝子であるc(3)G遺伝子の発現量が、野生型胚に比べてMZD強制発現胚中で増加することが示唆された。そこで、c(3)G遺伝子の発現量を解析した結果、野生型胚と比べてMZD強制発現胚中ではc(3)G遺伝子の発現量が有意に増加することが分かった。このことから、c(3)G遺伝子の発現もvasと同様にMZDによって発現活性化を制御されることが示唆される。26年度が最終年度であるため、記入しない。これまでvas遺伝子に関して多くの研究がされてきたが、直接作用する因子は見つかっていなかった。本研究により、MZDがvas遺伝子座に直接結合することを明らかにし、さらにMZD結合部位周辺のH3K27Acレベルが高くなることを見いだした。さらに、MZDのコファクターとしてCBPを同定した。これらのことから、今まで明らかになっていなかったクロマチン構造を介したvas遺伝子の発現制御機構を明らかにできると期待できる。MZDとCBPが遺伝学的に相互作用することがわかったが、生体内で物理的に相互作用するかは不明である。そこで、MZD-FLAGとCBP-V5の両方を強制発現させた胚を用いて共免疫沈降実験を行う。また、これまでMZDのDNA結合に必要なコンセンサス配列を明らかにしたが、それはin vitroの実験系であるSELEX実験をもとに行ってきた。vas遺伝子座に含まれるMZD結合部位の検索にもこの情報を使っているため、in vivoでMZDがvas遺伝子座のどの部分に結合するのか、その全体像は明らかにできない。そこで、MZD-FLAG強制発現胚と抗FLAG抗体を用いたChIP-seq解析を行い、MZDがvas遺伝子座のどの部分に結合するのかを解析する。
Sobolev型不等式の臨界に表れる幾何構造の抽出と距離空間の一般化

非コンパクトリーマン多様体及び無限グラフにおいて、空間の大域的幾何構造と幾何学的不等式、熱核の長時間挙動の密接な関係は多くの研究者により研究されてきた。本研究ではSobolev不等式、Poincare不等式などの幾何学的不等式の成立条件に関連する幾何構造解明を目的に非コンパクトリーマン多様体の連結和を考察し、連結部分の幾何構造と等周不等式、Poincare不等式、熱核の長時間挙動の詳細な関係を明らかにした。本研究の最初の年である2009年度は当初の計画通り,2009年7月11月,ドイツBielefeld大学に滞在し,Alexander Grigoryan教授と共同で研究目的1:「Sobolev型不等式の臨界に表れる幾何構造の抽出」の1-1「Bottleneck effectを通したPincare不等式の必要十分条件」,1-3「連結和上の熱核の評価に対応するSobolev型不等式」に該当する研究を行い,熱核のbottleneck型評価から空間の機何学的性質を抽出することに成功した.2つの非コンパクトリーマン多様体の連結和の空間は,Molchanov, Kuzmenko, Heinonen, Koskelaらによるこれまでの研究によりLiouville propertyやPoincareの不等式が成立しないなど,ユークリッド空間とは調和解析的に異なる空間として注目されてきた.Grigoryan, Saloff-Costeは2009年の論文において,非コンパクトリーマン多様体の連結和上のそれぞれ別のendに属する2点間の熱核はbottleneck effectを受けて小さくなることを明らかにした.本研究ではこの結果の逆を研究し,空間のある2つの部分間における熱核がbottleneck型評価を持つならば,(1)その間のある部分のcapacityが有限であること,(2)ball上のfirst Neumann固有値がユークリッド空間のballの半径に対する減衰スピードよりも小さいこと(Poincare不等式が成り立たないこと),を明らかにした.これはスペクトル幾何的にも非常に興味深い結果であると言える.本成果は9月以降の学会発表にて発表し,現在投稿準備中である.本年度は研究目的の研究「1 : Sobolev型不等式に現れる幾何構造の抽出」に従い、ポアンカレの不等式が成り立たず、従来の枠組みが適用できない非コンパクトリーマン多様体の連結和上の解析を主テーマとした。特に、空間の解析的性質と幾何構造の関係を探るために連結部分が非コンパクトである連結和上の熱核の長時間挙動についてビーレフェルト大学のAlexander Grigoryan教授とともに研究し、次の事実を明らかにした。・2つのユークリッド空間の連結和で、連結部分が凸などの良い条件を持てば等周不等式が成り立つことを明らかにした。これによりこのような連結和では熱核が上からのグローバルなガウス型評価を持つことがわかった。・2つのn次元ユークリッド空間内の0≦m≦n-2次元部分空間に沿った連結和,および0≦α<1の増大度を持つ回転体に沿った連結和という典型的な非コンパクト部分集合に沿った連結和の例において,hitting probabilityのシャープな評価を求めた。・熱核が上下からガウス型評価を持つ非コンパクトリーマン多様体のある非コンパクト部分集合を除いた領域上のDirichlet熱核の下からのガウス型評価を明らかにした。・以上の事実を用いて、2つのユークリッド空間の非コンパクト部分集合に沿った連結和の上記で述べた2つの典型的な例において、互いに異なるエンドに属する2点間における熱核の長時間挙動のシャープな評価を求めた。これらの成果はGrigoryan教授と共同で論文としてまとめ,現在投稿準備中である。本年度も引き続き研究目的の研究「1:Sobolev型不等式に現れる幾可構造の抽出」のためにポアンカレの不等式が成り立たず、従来の枠組みが適用できない非コンパクトリーマン多様体の連結和上の熱核の長時間挙動についての研究を研究協力者であるGrigoryan氏と共同で行った。まず1-1「連結部分が非コンパクトな連結和上の熱核に表れるbottleneck effect」に関連した研究として、2つのユークリッド空間を回転体の表面で連結和をとった空間上の熱核の挙動の研究を行い、その回転体の構造と熱核のボトルネック間評価についての精密な評価を与えた。この結果はGrigoryan氏との共著論文としてまとめ、現在投稿中である。また、この結果を踏まえ、連結部分の構造と熱核のボトルネック間評価についての密接な関係についての研究が現在進行中である。研究1-2「Sobolev型不等式の臨界に表れる幾可構造の抽出」1-3「連結和の特徴を反映したSobolev型不等式の導出」の部分的な結果として、適切な条件を持つ非コンパクトリーマン多様体の部分集合をとり、その境界でDirichlet条件を持つような領域上の第1固有値の評価から部分集合の境界のCapacity評価が得られた。これについては今後条件をより自然な形に整えて連結和を特徴づけるSobolev型不等式の解明を行う。

上記の研究と関連して、連結和上のFaber-Krahn不等式についての研究を行った。Feber-Krahn不等式は熱核の上からのガウス型評価と同値であることがGrigoryanにより得られている。これまでコンパクトな連結部分を持つ連結和に関してはGrigoryan,Saloff-Coste,Carronの先行結果があるが、2つの空間上でFaber-Krahn不等式が成り立つとき、その連結和もFaber-Krahn不等式が成り立つことを示した。本年度は研究課題1「連結和の特徴を反映したSobolev型不等式の導出」に基づき、連結部分が回転面であるような連結和上の熱核の長時間挙動のシャープな評価を得た。まず、この空間で等周不等式が成り立つことを示した。これによりglobalには上からのガウス型評価が成り立つことがわかった。次に、ユークリッド空間からhitting probabilityが小さいような部分集合を取り除いた空間では熱核の下からの良い評価があることを明らかにした。最後に、回転面へのhitting probabilityを計算することにより、回転面という非コンパクト部分集合のボトルネック構造が熱核に与える影響を明らかにすることができた。この結果はより一般の連結構造をもつ空間の熱核の詳細な評価を求めるための基礎となる結果である。また、関連するSovolev型不等式の導出を行うための重要な手掛かりとなる結果である。以上の結果はBielefeld大学のGrigoryan教授と共同で論文としてまとめ、受理された。また、これらの結果は東北大学、金沢大学や香港中文大学などで行われたセミナー、研究集会、国際学会等で発表した。研究1-2「Sobolev型不等式の臨界に表れる幾何構造の抽出」のためにはある有界領域上の固有関数の詳細な振る舞いを調べる必要がでてきたが、この部分に関しては未発展の部分が多く時間がかかるため。24年度が最終年度であるため、記入しない。現時点では研究2の部分は研究協力者の太田慎一氏、お茶の水女子大学の桑田和正氏と研究打ち合わせを行っているが新しい結果を得るまでには至っていない。そこでまずは研究1-2のSobolev型不等式(固有値の評価)と連結部分の構造との関係の研究を重点的に行い、それを踏まえて距離空間への一般化への着想を得ることを目標に研究を行う。
超微粒子のブラウン運動を利用した固体高分解能^1H NMR

液体中の分子においては高速の回転ブラウン運動や並進ブラウン運動によって陽子間の双極子相互作用は平均化され共鳴線幅は尖鋭化するするのに対し、固体内では注目している核種のスピンは周囲にある他核種からの双極子場に曝され、外部磁場以外に重畳した磁場の下でその線幅は液体中にある核種に比して非常に広くなっている。これは双極子場の非常に強いプロトンでは特に顕著で固体高分解能プロトンNMRを実現することは磁気共鳴研究者の夢であった。これまでNMRの線幅を先鋭化するには二つの方法が知られていた。スピン空間内での平均化と実空間内での平均化である。これまで前者の方法に基ずくCRAMPS法が知られており。多数の有機化合物に適用されてきた。一方我々は固体結晶をナノサイズにすることにより液体中のブラウン運動を利用して線幅の尖鋭化が可能なことをAIF_3イオン性結晶において実証した(線幅100Hz)。また有機結晶としてはじめてテレフタル酸において尖鋭化が可能なことを証明した(1994,Chem. Lett. (2155-2158)。リングプロトンオルト位のスピン-スピン結合を分離したため線幅は10Hz以下と見積もられる。これが我々の知るところリングプロトンの線幅の最小値である。本提案において研究するものは原料物質を不活性低圧ガス中で加熱することにより蒸発、凝集の過程を通してナノサイズの粒子を気相中に結晶成長させるガスフロー法による超微粒子作製である(UFP-NMR法)。これまでの研究でできるだけサイズの揃った粒子を作成することが線幅を先鋭化するの一番重要な因子であることが分かっているため蒸発の温度制御に細心の注意を払った。以上の工夫の基に我々は半値幅として1.52.0Hzを得ることに成功した。それは我々が当初目標とした「芳香族リングプロトンに対し線幅1Hzを切ること」にほぼ匹敵し当初の目的は達成されたと考えている。
歯原性上皮の腫瘍化における骨内微小環境と細胞分解系制御の相関

歯原性上皮の腫瘍化や分化・進展に関わる細胞増殖・分解の制御分子を検索し、骨内微小環境下での低酸素状態関連分子についても検討した。増殖因子受容体EGFR、HER2-4は歯原性上皮に発現し、EGFRとHER4の発現が顕著だった。これらの分子の遺伝子異常はみられなかった。オートファジー関連分子ATG7、LC3、p62は、主として基底膜近傍の歯原性上皮性細胞に発現した。顆粒細胞型エナメル上皮腫での発現は顕著だった。低酸素状態関連分子HIF-1、CA IXの発現は、歯嚢よりエナメル上皮腫で高く、充実性エナメル上皮腫で単嚢胞性エナメル上皮腫より高い傾向を示した。CD34陽性新生血管については計測中である。歯原性上皮の骨内微小環境での腫瘍化や進展における細胞分解系制御因子の影響を解明するため、オートファジー関連分子について検索した。1.方法:エナメル上皮腫64例(初発49例、再発20例;充実型28例、単嚢胞型11例を含む)と対照の歯嚢9例を用い、ATG7、LC3、p62の発現・局在について免疫組織化学により解析した。2.結果:ATG7、LC3、p62は、主として歯原性上皮性細胞に発現がみられた。基底膜近傍の細胞で中央部の細胞より強い発現がみられた。ATG7は、エナメル上皮腫で歯嚢より有意に高く発現した。また、ATG7、LC3、p62の発現は、単嚢胞型エナメル上皮腫で充実性エナメル上皮腫より有意に高かった。顆粒細胞型エナメル上皮腫において、顆粒を有する腫瘍細胞でのこれらのオートファジー関連分子の発現は顕著であった。さらに、LC3とp62の発現は、再発症例において初発症例より有意に低かった。3.考察:歯原性組織におけるオートファジーは腫瘍発生による骨内微小環境の変化に影響されることが示唆された。これらに関わる分子制御機構は、腫瘍組織の組織構築や細胞分化とも関わり、予後の判定因子となり得る可能性がある。歯原性上皮の骨内微小環境での腫瘍化や進展における細胞活性制御因子の影響を解明するため、HERファミリー分子について検索した。1.方法:エナメル上皮腫65例(初発49例、再発20例;充実型58例、単嚢胞型11例を含む)と対照の歯嚢10例および含歯性嚢胞11例を用い、EGFR、HER2、HER3、HER4の発現・増幅・変異について免疫組織化学およびchromgenic in situ hybridization(CISH)法、DNAダイレクトシークエンス法により解析した。2.結果:EGFRおよびHER2-4は、歯原性上皮に免疫組織化学的に発現がみられた。EGFRとHER4の発現は、HER2とHER3より強かった。HER2の発現は、エナメル上皮腫において歯嚢と含歯性嚢胞より有意に低かった。Her2とHER4の発現は、濾胞型エナメル上皮腫のおいて叢状型エナメル上皮腫より有意に高かった。EGFRとHER3の反応性は、再発例で初発例よりやや強かった。CiSH法で、エナメル上皮腫におけるEGFR・HER2の増幅はみられなかったが、いずれも濾胞型で叢状型より有意にシグナル増加が認められた。DNAシークエンス法で、エナメル上皮腫においてEGFRの変異はみられなかった。3.考察:歯原性組織におけるHERファミリー分子、特にEGFRとHER4の発現は腫瘍発生や骨内進展に関わることが示唆され、これらの分子は、予後の判定因子や、治療の標的分子となり得る可能性がある。歯原性上皮の骨内微小環境での腫瘍化や進展における細胞分解系制御因子の影響を解明するため、低酸素状態関連分子について検索している。1.方法:エナメル上皮腫64例(初発49例、再発20例;充実型28例、単嚢胞型11例を含む)と対象の歯嚢10例を用い、HIF-1、CA IX、CD34の発現・局在について免疫組織化学により解析した。2.結果:HIF-1、CA IXは、歯原性上皮精細胞および間質間葉系細胞に発現がみられた。これらの発現は、歯嚢よりエナメル上皮腫で高く、充実型エナメル上皮腫で単嚢胞型エナメル上皮腫より高い傾向を示した。CD34は、間質の新生血管内皮細胞に陽性を示し、現在、観察単位面積当たりの血管密度の計測を行っている。また、HIF-1、CA IXの発現とCD34陽性血管の関連について検索中である。3.考察:歯原性組織の腫瘍発生に骨内微小環境下の低酸素状態が影響することが示唆された。

この低酸素状態およびこれに伴う血管新生は、腫瘍組織の組織構築とも関わり、骨内進展の判定因子となり得る可能性がある。医歯薬学歯原性腫瘍の発症における骨内微小環境内の変化を示す因子として、オートファジー制御分子の様々な変化を見出し、興味深い結果と考えられる。歯原性腫瘍の発症および骨内進展に関わる骨内微小環境内の因子として、まず、HERファミリー分子について検索し、興味深い結果を得ている。歯原性腫瘍の骨内微小環境での細胞分解制御に関わるユビキチン・プロテアソーム系分子や骨内進展に関わるシグナル伝達分子について、種々の検索を進めている。また、腫瘍発生や腫瘍細胞分化に関わる分子の網羅的解析についても予備実験を進めている。歯原性腫瘍の骨内微小環境での細胞分解制御に関わるオートファジー関連分子およびユビキチン・プロテアソーム系分子について、種々の検索を進めている。また、腫瘍発生や腫瘍細胞分化に関わる分子の網羅的解析についても準備を進めている。オートファジー関連分子およびユビキチン・プロテアソーム系分子については、RT-PCR、ウエスタンブロット法、in situ hybridization法、免疫組織化学、酵素活性測定についての試薬・キットが必要である。また、分子の網羅的解析については、マイクロアレイ関連の試薬・キットならびに結果解析についての費用が必要となる。
カニクイザルを用いた造血幹細胞遺伝子治療の前臨床試験

1.骨髄非破壊法による自家骨髄移植法の開発:サルを用いて検討した。サルの長管骨から骨髄を吸引し空きスペースを作り、そこに遺伝子導入した自家CD34^+細胞を直接戻す。この際、選択的増幅遺伝子を導入することによって、移植後、生着した造血幹細胞を増幅できるかどうか検討した。本年度は1頭のカニクイザルを用いて本法を試みたところ、移植細胞の生着が確認された。さらに頭数を重ねて検討を続けたい。2.選択的増幅遺伝子の改良:サルの造血細胞に対して毒性をもつ可能性のあるGFP遺伝子をベクターから取り除いた。また、選択的増幅遺伝子の分子スイッチにあたるエストロゲン受容体に点突然変異を導入することによって、内因性のエストロゲンに反応せずタモキシフェンなどの合成ステロイドにのみ反応する特異性の高い選択的増幅遺伝子を作成し、カニクイザルを用いてその有効性を試験した。一部のサルでは有効性が認められた。すべてのサルで有効性を得るためにはさらに強力な選択的増幅遺伝子の開発が必要であると思われた。3.SIVベクターによるサルの造血幹細胞への遺伝子導入:サル免疫不全ウイルス(SIV)ベクター等のレンチウイルスベクターは、その感染に際して細胞分裂を必要としない特徴がある。造血幹細胞は分裂頻度が低い上、分裂させると容易に分化してしまうため、細胞分裂を起こさなくても遺伝子導入できるレンチウイルスベクターはきわめて有望である。サルを用いる実験の予備的検討として、NOD/SCIDマウスへの移植の系を用いて、SIVベクターによってヒト造血幹細胞へ効率よく遺伝子導入するための条件を検討中である。
マレー境域世界におけるタイ仏教徒コミュニティの研究

本研究は、マレーシアのクダー州に所在する44のタイ上座仏教寺院を調査対象とした。調査と考察の結果、クダー州においては、Bukitと呼ばれる内地の標高15-100mの地域に16世紀から20世紀初頭にかけて、タイ南部から農民が移住してきて多数の寺院と村落を作っている。彼らはタイ国籍者と区別するために、自らをシャム人と呼び、マレーシアの先住民(ブミプトラ)であることを意識している。古い村落はクダーの河川交通の主流であったクダー川とムダ川沿いに存在している。1950年代にはNewVillage政策によってタイ国境近くの村落は強制移住を余儀なくされ、その結果、コミュニティが崩壊した場合もある。シャム人人口は過去50年の間に徐々に減少し、過疎化も進んでいるが、シャム人村落が大きなところでは寺はコミュニティの中心、タイ語教育の中心であり、タイ国からの僧侶や建築支援を受けてこの20年の間に施設が充実しつつある。また、都市部に近くシャム人が少ないところでは、クダーやペナンの華人が寺を支え、納骨堂や華人的立像などを寄付するなど華人化が進行している。シャム村落の分布を調べると、19世紀以前のクダーのマレー政権が沿岸部を領域の中心とみなし、内地に関してはほとんど政治的関心を持っていなかった可能性がわかった。本研究は代表者の単独で執行される海外調査が中心となる。初年度はタイ国境に接するクダー州におけるタイ寺院40カ所余りのうち27カ所の訪問調査を行った。マレーシア北部にタイ寺院が存在することはマレー半島東海岸のクランタン州の例などが知られているが、歴史的なタイ人村落の成立年代ではクダー州はクランタン州と同等に多く、また、タイ寺院と村落の数は圧倒して多い。しかし、タイ仏教の研究者でもそのタイ寺院と村落の実態については正確に把握されていないのが現状である。今年度の調査は半島の山間部に点在するタイ寺院とその村落の所在を確認するとともにその分布から地理的な村落の成立過程、あるいはタイ人村落の移住経路について調査を行った。また、現在華人との関わりが強くなりつつある、タイ寺院の改築においてタイ国からの出稼ぎ者が多く雇われていることなどが実態として見えてきた。調査はタイ語とマレー語でおこなわれ、古い資料の探索のために次年度以降はクダーの州立図書館やペナン州の公文書記録などの探査を必要とすると同時に、引き続きタイ寺院の所在確認と重要な地域においての詳細な聞き取り調査を遂行予定である。また、ペナン州においては、すでに華人社会と深い関わりのあるタイ人や南タイからの移住民(華人系・タイ系)あるいはビルマ人など都市華人世界におけるタイ人コミュニティの事情について聞き取りを行った。19年度に引き続き、海外調査に基づく基礎データ収集を中心とする研究を行った。今年度は、マレーシアクダー州、ペナン州におけるタイ仏教寺院、24箇所の訪問調査を行って、クダーのほぼ全域をカバーした。その結果タイ寺院の分布は、過去約300年以前からのタイ南部からの移民経路と深く係わっていることが確認できた。特に、クダー南部を河口部とし、クダー領内を蛇行しながら、半島東部へさかのぼるムダ側流域のタイ系寺院の分布はクダーの歴史的成立過程と係わる。この初期タイ系移民の居住地域はタイ語を話すムスリム集団の居住域とも重なり、大規模灌漑水路を必要としない、内陸の水稲作地域である。また、タイ仏教寺院は、少数派ブミプトラ(先住民)であるタイ系住民の拠点であると同時に、非ブミプトラである華人系住民の在家の宗教的行事の場ともなっており、その関係は非常に多様であり、少数箇所のサンプル調査では不十分なことが判明してきた。次年度はひきつづき現地のインタヴュー調査、資料調査をおこない、これらの寺院と地元コミュニティにおける関係を地域の歴史的側面、近年の開発による経済的な側面、マレーシアにおける仏教組織の扱いなどの面から解明する。なお、クダー州におけるタイ寺院の正確な所在地点については、次年度GPSによる確認を行うが、暫定的なものとしてオンライン上の地図を作成した。調査過程であるため、ur1はまだ、現時点では限定公開である。

21年度は本調査の最終年度であり,調査としては前年度までに得られたデータの補完的データ収集と分析にあてた。その結果,マレーシアクダー州の全タイ仏教寺院を踏破してそれぞれの基礎的データを収集した。このような調査は今までマレーシア国内でも試みられたことがないので,まずは寺院関係資料のデータベース化を行った。またデータベースの他に,執筆予定の論考の中では以下のことを指摘する予定である。1クダー州のタイ寺院の歴史と分布からタイ系移民がマレー半島中部以南に移植したのは少なくとも300年前と考えられること。2.シャム(タイ)人集落はマレーシアのブミプトラではあるがマイノリティであるためいままでほとんど注目されなかった。また,かつてこの地域が「タイ」領であったことを理由に歴史資料や精査の対象にならずその分布には注目されなかったこと。3.シャム系住民の分布調査によると,マレー系住民の大多数が標高4M以下の低湿地でのマレー式天水田sawa padiに集中しているのに対し、シャム系住民は標高が25m以上の内地の扇状地でタイ式感慨水田Naaを営んでいること。またシャム系住民とともに南タイから移住してきたマレームスリムもその近くに住みサムサムと呼ばれるタイ語話者村落があったこと。4.以上からタイ系住民が南タイのパタルンなどの穀倉地域から300年程度昔から漸進的に「田をもとめて」クダー内陸に浸透しタイ語地名圏も同様にクダーには広がっていること。がわかった。5.王族中心の歴史資料に記されないマクロな住民の記録と移動が地域研究と歴史資料の比較によって証明された。6.タイ寺院の現在から,シャム系住民とマレーシア華人との宗教生活におけるつながり,納骨や寄進などでの接触が都市部で密になりつつあること。
薬剤誘導型酸化ストレスによる薬剤排出ポンプの活性および遺伝子発現の制御

フェニルプロパノイド類は、他の薬剤と併用した場合、特に両親媒性分子や脂溶性分子と組み合わせた場合、多剤耐性薬剤排出ポンプ群の遺伝子発現抑制を介して、相乗的かつ持続的な抗真菌作用を発揮する。加えて、フェニルプロパノイド類と部分構造が似ているポリフェノールの一種、ウコン由来のクルクミンもほ乳動物細胞や出芽酵母の薬剤排出を抑制する。平成29年度、クルクミンのハーフサイズの分子であるデヒドロジンゲロンに出芽酵母における薬剤排出抑制効果を見いだした。本物質はショウガの根茎に微量含まれている成分である。フェニルプロパノイド類は活性酸素種も誘導産生することから、薬剤排出抑制と活性酸素種との相関を検討した。まず、クルクミンやデヒドロジンゲロンが活性酸素種を誘導するかどうかを検討した。その結果、クルクミンは活性酸素種の測定に用いるプローブと蛍光波長が重なっており、活性酸素種の定量は不可能であった。一方、デヒドロジンゲロンは活性酸素種を全く産生誘導しないことが判明した。従って、薬剤排出ポンプの遺伝子発現の制御には必ずしも活性酸素種の産生誘導は必須ではないことがわかった。また、薬剤排出ポンプによって直接排出される蛍光色素を用いてアッセイを行った結果、クルクミンおよびデヒドロジンゲロンは薬剤排出ポンプ遺伝子PDR5の発現抑制に加えて、薬剤排出を直接抑制している可能性も示唆された。加えて、デヒドロジンゲロンの薬剤排出抑制効果はフェニルプロパノイド類やクルクミンより弱いことから、活性酸素種は薬剤排出抑制効果を増強する可能性が示唆された。一方、活性酸素種の由来について検討したが、ミトコンドリアDNA欠損株やNADPHoxidase欠損株においても、フェニルプロパノイド類は活性酸素種を産生誘導したことから、活性酸素種の由来を特定することはできなかった。フェニルプロパノイド類は、ドデカノールやフルコナゾールなど含む他の薬剤と併用すると、多剤耐性薬剤排出ポンプの遺伝子発現抑制を介して相乗的かつ持続的な抗真菌作用を発揮する。アネトールは遺伝子発現抑制に加えて、細胞膜上にある薬剤排出ポンプの活性を抑制している可能性が示唆された。本物質群が非特異的に細胞膜および細胞膜上のタンパク質類に影響を与えている可能性があるため、本物質群が細胞膜障害作用を示すか、また細胞膜上の他のタンパク質H+-ATPaseの活性を抑制するのか検討した。その結果、本物質群は細胞膜障害作用を示さず、H+-ATPaseの活性も全く阻害していないことが判った。以上より、フェニルプロパノイド類は薬剤排出ポンプの活性だけを特異的に阻害している可能性が強く示唆された。フェニルプロパノイド類と構造・物性が類似する物質としてウコンの根茎に含まれる脂溶性物質クルクミンが挙げられる。本物質は様々な生理活性を示す可能性が報告されている。しかしながら、微生物に対する活性についてはほとんど報告がなされていない。出芽酵母をクルクミンで単独処理した場合、その生育にはほとんど影響が見られなかったが、一過性の殺菌作用を示すドデカノールとクルクミンとを組み合わせた場合、相乗的な抗真菌作用を発揮すること、また、クルクミンは薬剤排出ポンプの活性を抑制していることがわかった。さらに、クルクミンが薬剤排出ポンプの遺伝子発現に影響するか検討した。その結果、ドデカノール処理することで薬剤排出ポンプPDR5の発現量が増大するが、クルクミンを併用させるとその発現量が大幅に低下することが判明した。以上の結果より、クルクミンは出芽酵母の薬剤排出を抑制することでドデカノールの菌体外への排出を抑制し、相乗的抗真菌作用を示すことが示唆された。各種薬剤を用いて細胞膜障害作用やプロトンATPaseの活性を測定する実験がメインであったため、研究は順調に進んでいると判断された。フェニルプロパノイド類は、他の薬剤と併用した場合、多剤耐性薬剤排出ポンプ群の遺伝子発現抑制を介して相乗的かつ持続的な抗真菌作用を発揮する。フェニルプロパノイド類の多くは活性酸素種も産生誘導し、これが薬剤排出ポンプ遺伝子発現を抑制する可能性がある。フェニルプロパノイド類について活性酸素種(ROS)に関する構造活性相関を行うとともに、ROSの由来についても検討を行った。その結果、炭化水素側鎖がROS産生誘導と抗菌活性の発現に必須であることがわかった。また、ミトコンドリアDNA欠損によって呼吸不全となったrho0株に対してもフェニルプロパノイド類はROSを産生誘導したことから、誘導されたROSは呼吸鎖由来ではないことがわかった。平成28年度、フェニルプロパノイド類と構造・物性が類似する物質としてクルクミンに薬剤排出ポンプ抑制活性を見いだしていたが、高い脂溶性のため、応用の範囲が限られることが判明した。今年度はショウガの根茎に含まれるデヒドロジンゲロンに注目した。本物質はクルクミンの1/2の化学構造を持つ水溶性の高い分子である。出芽酵母をデヒドロジンゲロンで単独処理した場合、その生育には全く影響が見られなかったが、一過性の殺菌作用を示すドデカノールとデヒドロジンゲロンを併用した場合、相乗的な抗真菌作用を発揮すること、また、デヒドロジンゲロンは薬剤排出ポンプの活性を抑制していることがわかった。さらに、デヒドロジンゲロンが薬剤排出ポンプの遺伝子発現に影響するか検討した。その結果、ドデカノール処理することで薬剤排出ポンプPDR5の発現量が増大するが、デヒドロジンゲロンを併用させるとその発現量が低下することが判明した。

以上の結果より、デヒドロジンゲロンは出芽酵母の薬剤排出を抑制することでドデカノールの菌体外への排出を抑制し、相乗的抗真菌作用を示すことが示唆された。アネトールが産生誘導する活性酸素種はミトコンドリア由来でないことが判明した。また独特の芳香があるアネトールや疎水性が極端に高いクルクミンは応用の範囲が限られる。今年度、構造活性相関を行った結果、癖のある臭いがなく水溶性も高い、ショウガ由来のジヒドロジンゲロンにも薬剤排出抑制効果が認められた。現在、後者に関しては論文の投稿を予定している。フェニルプロパノイド類は、他の薬剤と併用した場合、特に両親媒性分子や脂溶性分子と組み合わせた場合、多剤耐性薬剤排出ポンプ群の遺伝子発現抑制を介して、相乗的かつ持続的な抗真菌作用を発揮する。加えて、フェニルプロパノイド類と部分構造が似ているポリフェノールの一種、ウコン由来のクルクミンもほ乳動物細胞や出芽酵母の薬剤排出を抑制する。平成29年度、クルクミンのハーフサイズの分子であるデヒドロジンゲロンに出芽酵母における薬剤排出抑制効果を見いだした。本物質はショウガの根茎に微量含まれている成分である。フェニルプロパノイド類は活性酸素種も誘導産生することから、薬剤排出抑制と活性酸素種との相関を検討した。まず、クルクミンやデヒドロジンゲロンが活性酸素種を誘導するかどうかを検討した。その結果、クルクミンは活性酸素種の測定に用いるプローブと蛍光波長が重なっており、活性酸素種の定量は不可能であった。一方、デヒドロジンゲロンは活性酸素種を全く産生誘導しないことが判明した。従って、薬剤排出ポンプの遺伝子発現の制御には必ずしも活性酸素種の産生誘導は必須ではないことがわかった。また、薬剤排出ポンプによって直接排出される蛍光色素を用いてアッセイを行った結果、クルクミンおよびデヒドロジンゲロンは薬剤排出ポンプ遺伝子PDR5の発現抑制に加えて、薬剤排出を直接抑制している可能性も示唆された。加えて、デヒドロジンゲロンの薬剤排出抑制効果はフェニルプロパノイド類やクルクミンより弱いことから、活性酸素種は薬剤排出抑制効果を増強する可能性が示唆された。一方、活性酸素種の由来について検討したが、ミトコンドリアDNA欠損株やNADPHoxidase欠損株においても、フェニルプロパノイド類は活性酸素種を産生誘導したことから、活性酸素種の由来を特定することはできなかった。昨年、4月に提出した計画通りに実験を進めていく予定である。実験材料として真核生物のモデル生物である出芽酵母および病原性酵母Candida albicansを用いる。細胞へダメージを与える薬剤のほとんどは、細胞に対して活性酸素種などの産生誘導をはじめとする何らかの酸化ストレスを与えることが知られている。酸化ストレスを与える可能性の高い薬剤を天然由来物も含めて多数準備する。但し、その産生レベル、活性酸素種の種類、攻撃するターゲットは薬剤毎に異なっている。主として蛍光プレートリーダーを用いて、種々のアッセイを行い、酸化ストレスの観点から薬剤を分類する。1細胞質全体における酸化ストレスの検出は細胞内グルタチオンを定量することで行う。
小胞体内腔タンパク質の酸化還元制御と神経機能

ERp44欠損マウスは、血圧を上げる作用をもつアンジオテンシンIIの濃度が低下して低血圧を示した。また、アンジオテンシンIIを分解するアミノペプチダーゼの1つERAP1が、小胞体内腔でERp44とジスルフィド結合し、ERp44欠損でERAP1が細胞外に多量に分泌され、その結果、アンジオテンシンIIを分解して低血圧を起こすことを明らかにした。また、敗血症のモデル実験では、ERp44とERAP1との相互結合が増加し、血圧低下を抑制した。以上の結果から、小胞体内腔に存在するERp44がERAP1の細胞の内外における局在を調節することでアンジオテンシン濃度を制御し、血圧を調節すると結論した。ERp44KOマウスは生後24時間で99%が死亡するので、成体のERp44の機能解析に適さない。そこで、Cre-loxPシステムを用いて、脳特異的ERp44コンデイショナルKOマウスを作製した。ERp44が高く発現する皮質、海馬および線条体での役割を明らかにするため、使用するCre-Transgenic (Tg)マウスとして前脳特異的CaMKII promoter-Cre Tgマウスを用いてコンディショナルマウスの作成を進めている。現在、CaMKII-Cre+Erp44+/-マウスの作成まで到達した。FRETを用いた、ERp44結合タンパク質との相互作用のモニタニングは、Fluorescent proteinとERp44とのリンカーの長さを変えた様々なコンストラクトを作成したもののFRETが見られるものが得られることがなかった為この計画は打ち切ることにした。今年度は、コンデイショナルEndoplasmic reticulum protein 44ノックアウトマウスの作成をすすめた。エキソン4をloxP配列で挟んだtargeting vectorをES細胞にインジェクション後、選択マーカーのネオマイシンを用いて薬剤耐性株を取得した。得られた株よりDNAを抽出後、PCR法およびサザンブロッテイング法にて相同組み換え株を選択した。取得した相同組み換え体ESをマウスにインジェクションしキメラマウスを作成した。そのキメラマウスをB6マウスと交配し2つの独立したラインを取得した後、Flpトランスジェニックマウスと交配し、frp配列で挟まれた選択マーカーを欠失させたマウスの作成に成功した。作成したマウスはEndoplasmic reticulum protein 44遺伝子の発現が正常であり、loxP配列挿入自体による発現への影響がないことを明らかにした。現在、脳特異的Endoplasmic reticulum protein 44欠損マウス(学習などの影響を見る為にバックグランドはC56BL/Jにしている)を作成する為に、CaMKII-Cre Tgマウスとの交配を進めている。また、細胞外刺激に応じたEndoplasmic reticulum protein 44とLeucineアミノペプチダーゼの相互作用の動態をFRET法を用いてリアルタイムで明らかにする為、各タンパク質のC末端にYFPとCFPを結合させた融合タンパク質を作成した。その両者をHeLa細胞に一過性に発現させ、FRETが生じているかどうかYFPのブリーチングにて検討した。その結果、明らかなFRETの変化はみられなかった。ERp44の学習などの脳機能への役割を明らかにする為にERp44のloxPアリルをもつマウスを作成した。また、脳特異的Erp44欠損マウスを作成する為に、CaMKII-Cre Tgマウスとの交配が完了し、行動実験や電気生理実験を現在進行している。一方、Thioredoxin様モチーフをもつ小胞体内腔タンパク質の一つERp44が、レドックス(S-S結合)依存的にロイシンアミノペプチダーゼの一つ、ERAP1に結合することを明らかにした。ERAP1は小胞体retention signalを持たないため、ERAP1の小胞体内腔への貯留は、ER貯留シグナルを持つERp44との相互作用に依存した。その結果、ERp44のノックダウン(KD)またはERAP1との結合に重要なシステイン残基への変異導入は、細胞外に分泌されるERAP1量の増加、小胞体に存在するERAP1量の減少をもたらすことを明らかにした。また、分泌されたERAP1の分子量は、小胞体内腔に存在するERAP1よりも大きく、高度にグリコシレーションされていることが明らかになった。また、過剰に分泌された血液中のERAP1により血中AngiotensinIIが分解され、成体ERp44KOマウスが低血圧を示すことを明らかにした。