hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
自励振動による単分散液滴列の生成と表面での液膜生成機構の解明

昨年度、当初の予想とは異なり、液滴列の制御によって侵入率が低下することが明らかになった。そのため、液滴列の制御のみならず、より複雑な圧力振動を印加させるために、音波を使用して水中にある気液界面の制御に挑戦し、微細孔への液体侵入促進について試みた。まず、水中に設置された微細孔にトラップされた気体の固有振動数について、バネー質量系を用いたモデル化を行なった。質量としては孔中を移動する流体と孔から湧き出す流れをモデル化し、気体の圧縮による体積変化をバネとした際の比較から固有振動数を導いた。その結果、液滴列では侵入が困難だった1ミリメートル程度で高アスペクト比の微細孔では、数百ヘルツの固有振動数と見積もられた。次にこの見積もられた固有振動数の正当性について評価するために、水中スピーカーを用いて液体中で周波数の異なる音波を先端の封じられた微細孔へ照射し、界面振幅を調査した。その結果、概ね予測したモデル式と界面振幅が最大となる周波数が一致し、提案した固有振動数の正当性を示すことができた。次に、音波を用いて微細孔への液体侵入促進について検討を行った。その結果、固有振動数付近の音波で確かに液体侵入が促進されること。またその侵入機構は昨年度までに明らかにされた液滴列照射と酷似していることが明らかにされた。一方で、液中での液体侵入では、気液界面からの液滴生成のみならず、孔付近での気泡生成も重要な要因であることが分かった。さらに、周波数掃引を用いることで、液体侵入がより促進されることが示された。液滴の固体壁面への衝突現象は,塗装や冷却などの幅広い工業分野で見られる重要な物理現象であり,数多くの研究が行われている.その液滴衝突を利用した工業技術の1つに表面洗浄がある.噴流を用いた洗浄は古くより利用されているが,その気流に脈動や圧力変動を加えることにより洗浄効率が上がることが知られている.そのため液体噴流を用いる洗浄においても,液体を液柱として連続的に衝突させるよりも,液滴として衝突させ洗浄効率を上げる試みが多くなされているが,単一液滴の衝突現象に関する知見は十分にあるが,液滴が連続的に衝突する現象については知見が限られている.そこで本研究では,水とエタノールの液注および液滴列が円形平板に衝突した場合について,その液体流量および衝突させる平板直径を変更し,形成される液膜構造,特に跳水直径の観察を行った.その結果,液滴列の衝突によっても液柱と同様に跳水が観察された.その跳水直径は,液柱の場合と比較して液滴列衝突の方が,平板端からの影響がない場合には大きくなった.しかし,表面張力の小さな液体を使用した際には高流量域において液柱および液滴列衝突による跳水直径の大きさが逆転し,液柱衝突時の方が大きな跳水が形成された.また,平板直径を小さくすると,液柱衝突では平板端で液膜厚さが小さくなり跳水直径が急激に増加した.一方で液滴列衝突の場合,常流の厚さは液柱衝突ほど薄くはならなかった.これらの結果は液滴衝突時に液柱よりも高速水平方向流れが形成され,さらにその流れによって液膜内に複雑な流れ構造が形成されたことやSplashの発生の有無が要因であると予想する.これらの知見は,液膜厚さによって表面でのせん断応力分布が大きく異なるため,洗浄範囲に大きく関連すると考えられる.実績の概要で示したように,液滴列を衝突させることによって,液柱と異なる構造が確認されたため.また液滴列衝突による,微細孔への液体侵入促進効果があることも分かってきており,さらなる進展が予測される.一方で予備実験によって制御手法には懸念が存在したため,圧力の印加方法を大きく変更する.昨年度明らかにした、先端が封じられた微細孔への液滴列衝突による液体侵入促進効果についてその詳細メカニズムを調査した。異なる内径の細孔に対して液滴列を衝突させ、その際の液滴侵入の様子を高速度カメラで観察した。その結果、液滴列衝突時に発生した圧力変化によって気液界面が振動し、その界面の先端より液滴が発生した。その発生した液滴が管壁へ付着し、この過程が繰り返されることによって気柱が分離した。また高速液滴衝突時には、直接気液界面が変形することによる気柱分離プロセスも観察された。これらの過程が繰り返され、さらに気柱分離が進み、最終的に排出されるという気体排出機構が明らかになった。このように気液界面の変形が重要なため、表面張力に低い液体で行った実験の方が、同程度の衝突速度でも侵入率が高くなった。またこの様子は液柱衝突時には観察されなかった。次にこの液滴列による液体侵入促進効果の細管径の違いや液滴列の周波数による影響を調査した。その結果、液滴列による液体侵入促進効果は比較的大きな、すなわち1ミリメートル程度の細管で有効であり、0.1ミリメートル程度まで径が小さくなると巻き込み気泡の影響で、液体が侵入しても場合によっては気泡が再度細管内へと取り込まれあまり効果が無いことが示された。また加振機によって一定周波数の液滴列と、何も制御しない液滴列を比較して同程度の衝突速度の液滴列を比較すると、液滴列の周波数を制御しない方が、液体侵入が促進されることが明らかになった。液滴列による形成液膜や液滴列による液体侵入促進効果が明らかになり、さらにそのメカニズムがある程度解明できたため。

しかし制御された液滴列の方が侵入効果が下がるのは予想外であった。これは液滴衝突による圧力振動が一定周波数である必要は無く、むしろ不規則な圧力変動によって孔内の液滴生成が促進された可能性がある。そのため、この印加する圧力周波数や圧力振幅の影響について最終年度にて調査を行う。昨年度、当初の予想とは異なり、液滴列の制御によって侵入率が低下することが明らかになった。そのため、液滴列の制御のみならず、より複雑な圧力振動を印加させるために、音波を使用して水中にある気液界面の制御に挑戦し、微細孔への液体侵入促進について試みた。まず、水中に設置された微細孔にトラップされた気体の固有振動数について、バネー質量系を用いたモデル化を行なった。質量としては孔中を移動する流体と孔から湧き出す流れをモデル化し、気体の圧縮による体積変化をバネとした際の比較から固有振動数を導いた。その結果、液滴列では侵入が困難だった1ミリメートル程度で高アスペクト比の微細孔では、数百ヘルツの固有振動数と見積もられた。次にこの見積もられた固有振動数の正当性について評価するために、水中スピーカーを用いて液体中で周波数の異なる音波を先端の封じられた微細孔へ照射し、界面振幅を調査した。その結果、概ね予測したモデル式と界面振幅が最大となる周波数が一致し、提案した固有振動数の正当性を示すことができた。次に、音波を用いて微細孔への液体侵入促進について検討を行った。その結果、固有振動数付近の音波で確かに液体侵入が促進されること。またその侵入機構は昨年度までに明らかにされた液滴列照射と酷似していることが明らかにされた。一方で、液中での液体侵入では、気液界面からの液滴生成のみならず、孔付近での気泡生成も重要な要因であることが分かった。さらに、周波数掃引を用いることで、液体侵入がより促進されることが示された。実際の洗浄においては,凹凸がある表面を液体で満たし,化学的および物理的作用によって洗浄,その後乾燥させる.このような視点においては,表面の微細構造を短時間に液体で満たすことが重要となる.初年度の実験によって,液滴列が衝突した場合と液柱が衝突した場合において,液滴列の方が早く微細孔を濡らすことが実験で確認出来ている.そのため,その詳細物理について観察する予定である.液滴列衝突による圧力変化が重要であることが示されたため、今後は圧力変化をある程度制御可能な水中スピーカーを用いて液体中での音波による液体侵入について調査を行う。すなわち、先端を封じられた微細孔に対して、液滴列では実現不可能な範囲の周波数帯まで圧力振動を印加しその際の液体侵入を可視化する。また圧力振動に対する微細孔内の気体振動モデルを構築し、そのモデルと実験との比較検討を行う。当初の予定であった自励振動を気流を用いて発生させるためには,非常に高速かつ大きな構造物が必要なことが実験により明らかとなった.またロックイン現象が多く観察され,振動数の制御が困難であった.またそのような高速流では液体が微粒化されてしまい制御には程遠い結果となっため,振動方法を大きく変更した.そのため,レーザーフォーカス変位計の購入が不要となり次年度使用額が生じた.当初の予想とは異なり、液滴列の制御によって侵入率が低下したため、液滴列の制御よりも圧力振動の制御へと研究の方向性を変え、その実験装置を最終年度に組むため。気流による予備実験の結果を活かし,圧力印加方法の工夫を行う.水中でも音波を印加可能なスピーカーおよびその音圧測定装置を購入し,実験を行う.
膀胱粘膜内神経と免疫系との関係

知覚神経に存在するといわれる神経ペプチドの一種substance P(SP)は、最近の研究で炎症と関することが明らかになってきた。そこで手術時にえられたヒト膀胱粘膜に対して、抗SP抗体を用い免疫染色をおこなった。SP陽性神経はヒト膀胱の粘膜固有層に豊富に存在していた。電顕で観察するとSP陽性神経終末のうち89.6%は自由終末であり、そこには大型の有芯シナプス小胞と小型の無芯シナプス小胞が混在していた。またSP陽性終末の一部はシュワン氏鞘を欠いており、SPがこれらの部位から放出されている可能性が示唆された(Hisiotochemistry、印刷中)。次に、膀胱炎を呈しているヒト膀胱粘膜に対して種々の抗体を用いて免疫染色をおこなった。膀胱炎では、リンパ球が多数浸潤しておりリンパろ胞様にリンパ球が集積している部位がよく観察される。このリンパろ胞様にみえる部位に交感神経、peptide histidine isoleucine陽性神経neuropeptide Y陽性神経が認められ、これらの神経と免疫系との関連が示唆された。SP陽性神経については現在検索中である。今後、神経とリンパ球表面マーカーとの2重染色や電顕による観察を予定している。動物実験では、現在ラットやネコを用いて種々のアジュバントを膀胱内に注入し、炎症の時期により膀胱粘膜内神経がリンパ球などの免疫担当細胞とどのようにかかわっているのかを光顕および電顕で観察している。
PML bodyによる新規雄性遺伝子群の転写制御メカニズムと生物学的意義の解明

核内構造体はゲノムDNAと共に核の中に収められているにも関わらず、これまでその機能はほとんど明らかとなっていない。その最大の要因として核内構造体とクロマチンの相互作用を検出する技術が限られていたことが挙げられる。核内構造体の1つであるPML bodyは核内に局在する球状の構造体で、細胞のガン化やアポトーシスなどに関与することが示唆されている。また、その構成因子には多くのクロマチン関連因子が含まれていることから、遺伝子転写制御の場としても働くと考えられている。しかし、PML bodyが具体的にどういった遺伝子と相互作用し、どのように遺伝子の発現を制御しているのかはほとんど明らかにされていない。本研究はPML bodyの近傍微小空間を生きた細胞内で特異的にラベルし、そこに含まれるクロマチンを分離精製するための新規技術「ALaP(APEX mediated Chromatin Labeling and Purification)法」を開発し、PML bodyの転写制御における役割を明らかにすることを目指した。その結果、我々はPML bodyと相互作用するクロマチン領域をゲノムワイドに同定することに世界で初めて成功した。また、相互作用するクロマチン領域を解析した結果、PML bodyが特定のクラスター化した遺伝子群の転写をまとめて制御することを見出した。さらに、PML body欠損細胞で詳細な解析をした結果、PML bodyによる遺伝子転写制御にはDNAメチル化が大きな役割を果たしていることを明らかとした。これまで核内構造体の転写への役割はほとんど明らかにされていない。本研究では、新たな技術を開発することで、こうした技術的な困難を打開し、核内構造体の転写制御における新たな機能を見出すことに成功した。現在まで、研究は期待通り進展しており、核内構造体による遺伝子転写制御の研究をより発展させることが期待できる。本研究によってPML bodyが転写を制御する遺伝子領域が見出されたことから、今後はPML bodyによる転写制御の分子メカニズムに焦点を当て研究を行う。具体的には、PML bodyがいかにして特定の遺伝子領域を認識し、相互作用するのかを明らかにする。また、PML body構成因子の中で転写制御に関与しているものを見出すことで、PML bodyの転写制御を体系的に理解することを目指す。
多スピン共役高分子でみられる巨大な磁気モーメントと新しい電磁物質としての展開

発達したπ共役系を主鎖骨格とし、その非ケクレ位側鎖に安定ラジカルを共役して結合させた純有機の「多スピン共役高分子」を対象に、その巨大な分子磁気モーメントによって誘起されるナノメートルスケールでの磁気応答を、分子磁気ドット像としてはじめて定量的に観測することを目的とした。分子レベルで働く磁気相互作用を、高分子内でのスピン密度と多重度をパラメータとして描像し、ナノサイズで磁気応答するはじめての有機材料として特徴づけた。(1)物性測定に供する試料として、直鎖状のポリ[4-(2,6-ジ-t-ブチルフェノキシル)またはジ(p-メトキシフェニル)アミニウム-1,2-フェニレンビニレン]、同星型体および架橋拡張体ほか、ポリ(N-(2,2,6,6-テトラメチルピペリジン-1-オキシ-4-イル)-2-メチルアクリルアミド)を量合成した。(2)磁気力顕微鏡による分子磁気ドットとしての画像化を進め、原子間力顕微鏡像と対比させながら、分子形状を確定するとともに、磁性探針の磁化方向によるポジネガ反転、分子量(径)の大小およびラジカル発生率(スピン濃度)の増減に対応した分子像の巾および像の凹凸度を明示した。(3)高分子鎖間で反強磁性に働く空間を介しての相互作用を温度依存性、高分子濃度、希釈剤の影響などから抽出して観測した。高分子鎖間での新しい相互作用として把え、静電引力による高分子コンプレックス生成と対比させながら、相互作用を解明した。(4)MFM磁気応答する有機物質の適用範囲を拡張するため室温長寿命ラジカルニトロキシドをもつポリメタクリレートのナノ粒子、また参照として希土ガドリニウムイオンを保持したポリメタクリル酸のナノ粒子を作製し、多スピン共役高分子での磁気応答の特性を明らかにした。以上より、純有機物質による高密度かつ多値表現可能な磁気記録材料の実現に向けて道筋をまとめた。発達したπ共役系を主鎖骨格とし、その非ケクレ位側鎖に安定ラジカルを共役して結合させた純有機の「多スピン共役高分子」を対象に、その巨大な分子磁気モーメントによって誘起されるナノメートルスケールでの磁気応答を、分子磁気ドット像としてはじめて定量的に観測することを第1目的とした。分子レベルで働く磁気相互作用を、高分子内でのスピン密度と多重度をパラメータとして描像し、ナノサイズで磁気応答するはじめての有機材料として特徴づけつつある。

発達したπ共役系を主鎖骨格とし、その非ケクレ位側鎖に安定ラジカルを共役して結合させた純有機の「多スピン共役高分子」を対象に、その巨大な分子磁気モーメントによって誘起されるナノメートルスケールでの磁気応答を、分子磁気ドット像としてはじめて定量的に観測することを第1目的とした。分子レベルで働く磁気相互作用を、高分子内でのスピン密度と多重度をパラメータとして描像し、ナノサイズで磁気応答するはじめての有機材料として特徴づけた。本年度は主に次の3項目の成果を得た。(1)星型拡張多スピン高分子を基盤上に分子分散させ、磁気力顕微鏡(MFM)で観測、スピン発生率(分子内のスピン濃度)の増減に対応した磁気応答の多値表現を定量的に実証した。また基盤表面と多スピン高分子間の相互作用による、MFM像の鮮明度の差違も観測した。(2)星型多スピン高分子を合成するための反応経路を開拓し、収率よく供給する手順を確立した。ポリフェニレンビニレンを梯子状に拡張するため、テトラベンゾシクロオクタデセンの非ケクレ位である4箇所にラジカル前駆部を導入したサブパートの合成方法も検討した。(3)MFM磁気応答する有機物質の適用範囲を拡張するため室温長寿命ラジカルニトロキシドをもつポリメタクリレートのナノ粒子、また参照として希土ガドリニウムイオンを保持したポリメタクリル酸のナノ粒子を作製し、多スピン共役高分子での磁気応答の特性を明らかにした。以上より、純有機物質による高密度かつ多値表現可能な磁気記録材料の実現に向けて道筋をまとめた。
精密有機合成に有用な高選択的還元反応剤の開発

i-【Bu_2】AlH(DIBAH)は有機合成で繁用される還元剤で、α、β-不飽和カルボニル化合物のカルボニル基を還元してアリルアルコールを生成する。われわれは配位子量のヘキサメチルりん酸トリアミド(HMPA)を共存させるとDIBAHの還元反応性が著しく変わり、カルボニル基の還元を行うことなくカルボニル基に共役した炭素-炭素二重結合の共役還元を行うことを見出した。さらにこのDIBAH-HMPA系に触媒量のメチル銅(MeCu)を添加すると共役還元反応性が著しく高められることがわかった。このα、β-不飽和カルボニル化合物の新しい共役還元剤、DIBAH-HMPAおよびMeCu-DIBAH-HMPAの適用範囲は広く、種々のα、β-不飽和アルデヒド、ケトン、エステルに用いることができ、β-炭素上の置換基の存在によっても影響されないことがわかった。このように官能基選択性にすぐれたMeCu-DIBAH-HMPAはまたステロイドおよび関連化合物である隅角メチル基を有するヒドリンデノンの立体選択的トランス共役還元を行なう。隅角メチル基を有するヒドリンデノンの立体選択的トランス共役還元は実現されておらず、接触還元やBirch還元ではシス共役還元が起こるので、隅角メチル基を有するヒドリンダン環合成法からみてMeCu-DIBAH-HMPAの有用性は高い。さらに大きな利点として銅化合物の種類を変えることにより還元の立体選択性を制御できることで、HCu-DIBAH-HMPAではシス共役還元が優先的に起こる。カルボニル基の代りにシアノ基を有するα、β-不飽和ニトリルのα、β-還元はHMPAを必要とせずMeCu-DIBAH系によって行えることも明らかになった。以上精密有機合成で有用なMeCu-DIBAH-HMPAという新しい還元剤を開発することができた。
膠原病におけるアポトーシス誘導・表皮細胞及び血管内被細胞に対する自己抗体

培養ヒト表皮細胞を用いて,蛍光抗体間接法にて,各種膠原病患者血清(全身性強皮症30例,全身性エリテマトーデス20例,皮膚筋炎20例)による抗核抗体価をあらかじめ測定し,紫外線照射によってアポトーシスを誘導した培養ヒト表皮細胞を基質とした抗体価との比較を試みた。各種膠原病血清はいずれも抗核抗体陰性あるいは交代価が低値のものを選択して使用した。紫外線照射前の陽性率は,全身性強皮症37%,全身性エリテマトーデス60%,皮膚筋炎30%であった。紫外線照射後に抗核抗体が陰性から陽性となったものは全身性強皮症7例,全身性エリテマトーデス2例,皮膚筋炎3例であった。また,あらかじめ陽性であったものの。紫外線照射後に4倍以上抗体価が上昇したものは全身性強皮症4例,全身性エリテマトーデス2例,皮膚筋炎2例であった。以上の結果は,これらの膠原病患者血清中にアポトーシスを誘導された培養ヒト表皮細胞に特異的な自己抗体が存在することを示唆している。次に,同様の実験をTGF-βによってアポトーシスを誘導したヒト臍帯静脈由来血管内被細胞によっても施行した。結果は新たにTGF-β処理後に4倍以上抗体価が上昇したものは全身性強皮症で7例,全身性エリテマトーデスで3例,皮膚筋炎3例であった。以上の結果は,膠原病特に全身性強皮症の抗核抗体出現のメカニズムの1つとして,アポトーシスによって誘導された非寛容蛋白の露出の関与が示された。培養ヒト表皮細胞を用いて,蛍光抗体間接法にて,各種膠原病患者血清(全身性強皮症10例,全身性エリテマトーデス10例,皮膚筋炎10例)による抗核抗体価をあらかじめ測定し,紫外線照射によってアポトーシスを誘導した培養ヒト表皮細胞を基質とした抗体価との比較を試みた。各種膠原病血清はいずれも抗核抗体陰性あるいは抗体価が低値のものを選択して使用した。紫外線照射前の陽性率は,全身性強皮症40%,全身性エリテマトーデス70%,皮膚筋炎30%であった。紫外線照射後に抗核抗体が陰性から陽性となったものは全身性強皮症2例,全身性エリテマトーデス1例,皮膚筋炎2例であった。紫外線照射後に4倍以上抗体価が上昇したものは全身性強皮症1例,全身性エリテマトーデス2例,皮膚筋炎1例であった。次年度は,同様の実験をTGF-βによってアポトーシスを誘導したヒト臍帯静脈由来血管内被細胞によっても施行する予定である。更に,免疫ブロット法を用いて新たに検出された自己抗体がアポトーシスを起こしたDNAに対するものであるか,新たに誘導されたアポトーシス関連蛋白に対するものであるかも明らかにしたい。
メカノケミカル固相重合を用いる新規高分子医薬の製造法の基礎と開発

メカノケミカル固相重合法の反応装置に依存しない一般性ある重合反応性および生成高分子特性(分子量)の指標を確立するため、粉砕エネルギーとこれらの特性との関係について検討した。まず、仕事関数が既知のガラスビーズを用いて粉砕機の粉砕エネルギーをBondの式により算出した。その結果、粉砕エネルギーは粉砕周渡数の3乗に比例し、Roseらの結果とも一致した。かかる知見を基に、モデル高分子としてポリメタクリル酸メチル(PMMA)のメカノケミカル反応を実施した。PMMAのメカノケミカル反応においては、メカノラジカル生成と同時にその失活も進行しており、速度論的解析よりESRスペクトルにおいて観測されるラジカルよりも多量のラジカルが本反応過程において生成していることを明らかにした。また、メカノラジカル生成と分子量減少とは反比例の関係にあることも示された。さらに、種々の粉砕エネルギーにおける医薬品モノマーのメカノケミカル反応を実施した。いずれの粉砕エネルギーにおいても生成高分子は単分散性に近い分子量分布を有し、かつ粉砕エネルギーによる分子量制御が可能であることが明らかになった。また、粉砕エネルギーより重合の進行率を予測することも可能であり、粉砕エネルギーを指標とすることにより一般性ある重合反応性および生成高分子特性(分子量)の予測が可能であることを明らかにした。一方、本重合法により得られる高分子プロドラッグからの薬物放出速度制御のため、高分子側鎖に種々の官能基を導入し、その薬物放出速度への影響についても検討した。その結果、側鎖官能基の親水性に加え、塩基性側鎖においてはそのpK_bも重要な因子であることが示唆された。したがって、ハイブリッド型高分子プロドラッグ構築においては薬物の組み合わせによる薬物放出促進あるいは抑制への注意が必要であることが示唆された。医薬品添加物存在下におけるメカノケミカル同相重合の動力学および生成高分子プロドラッグからの薬物放出特性について検討した。医薬品添加物として汎用されている乳糖の存在下において、医薬品モノマーのメカノケミカル固相重合を実施すると、乳糖がない場合と比較して、より速やかに重合が進行し、かつ、より低分子量の高分子プロドラッグが得られた。さらに、生成高分子プロドラッグは、メカノケミカル固相重合の特徴の1つである極めて単分散性に近い分子量分布を有することを明らかにした。同様な結果は、医薬品添加物としてステアリン酸マグネシウムを用いた場合にも得られた。本方法により得た乳糖含有高分子プロドラッグは、高分子プロドラッグを合成した後、乳糖との混合により調整したブレンドマーよりも薬物放出が速やかに進行し、乳糖が高分子プロドラッグ粉末中により均一に分散していることが示唆された。このように、高分子プロドラッグ粉末中に乳糖の粒子がより均一に分散した高分子プロドラッグは通常の方法では得ることが難しく、本方法によってのみ可能であることを明らかにした。上述の高分子プロドラッグ粉末を含め、水不溶性高分子プロドラッグからの薬物放出に関して、より理論的に評価するために、単純なモデルを想定し薬物放出速度式を導いた。すなわち、高分子プロドラッグ粉末からの薬物放出においては、高分子ー薬物間の加水分解反応と遊離した薬物が高分子粉末中を拡散し放出拡散される過程が重要であると考え、速度式を導いた。その結果、本速度式は実験結果をよく再現し、かつ、本速度式より導かれる加水分解反応速度定数および拡散係数は高分子プロドラッグの特徴をよく表しており、本速度式の水不溶性高分子プロドラッグへの適用の有用性が示された。
胃粘膜防御の増強によるDNA損傷の修飾と胃発癌抑制

消化器発癌の実験的研究において、一定量の低濃度の化学発癌剤の投潰傷は100%の動物に癌が発生するわけではない。そこで胃発癌過程を胃潰傷発生と置き換えるという仮説を立ててみた。攻撃因子としては化学発癌剤であり、一方、防御因子として胃粘膜の防御に影響を与える因子が存在し、胃粘膜が化学発癌剤に暴露されることを保護しており、その強弱が癌発生の個体差として示されるのではないかと仮説した。胃粘膜防御因子増強作用を有するRepamipideをN-Ethyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidine(ENNG)誘発マウス十二指腸発癌過程に投与し、腫瘍発生率を検討した。C57B1/6雄マウスにENNGを100mg/L投与し、同時にRebamipideを20or50mg/kgの濃度で混餌投与した。腫瘍発生率はENNG単独群では66.7%であったが、ENNG+20mgRebamipide群では58.1%、ENNG+50mgRebamipide群では45.2%と腫瘍発生率は低下したが有意の抑制ではなかった。ついで、RepamipideのN-methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidine(MNNG)誘発ラット腺胃発癌過程への影響を検討した。Wistar雄ラットにMNNGを80mg/L投与し、Rebamipideを20mg/kg混餌投与し、腫瘍発生率を検討した。肉眼的腫瘍発生率はMNNG単独群では76.9%であったが、MNNG+Rebamipide群では61.5%と腫瘍発生率はRebamipide投与により低下したが有意の抑制ではなかった。しかし、組織学的にはCarcinomaとAdenomaの発生率はMNNG単独群では69.2%で、MNNG+Rebamipide群では30.7%とRebamipide投与により有意に(p<0.05)抑制した。また、MNNG投与によるラット腺胃粘膜のDNA損傷を8-OHGuaについて検討したが有意の上昇を認めず、Repamipideによる影響を検討することは出来なかった。消化器発癌の実験的研究において、一定量の低濃度の化学発癌剤の投与では100%の動物に癌が発生するわけではない。動物に同系のものを使用し、一定量の化学発癌剤を投与しているにもかかわらず癌が発生する動物と発生しない動物があり、この両者間で何が異なっているのかを検討することは発癌メカニズムの解明の助けになると推察される。そこで胃発癌過程を胃潰瘍発生と置き換えるという仮説を立ててみた。その証明として胃粘膜防御機構である粘膜血流や粘液合成・分泌が動物の個体間で差がありプロスタグランディン(PG)E2、I2などのcytoprotectionが関与しているのではないかを検討する。また、活性酸素によるDNA損傷の指標として胃粘膜の8-ヒドロキシグアニン(8-OH-dG)を測定し粘膜の障害を検討する。さらに胃粘膜防御因子増強作用を有するRepamipideを投与し癌発生にどのような影響を与えるか検討する。

1.N-Ethyl-N′nitro-N-nitrosoguanidine(ENNG)投与によるマウス十二指腸発癌における胃粘膜防御因子増強剤の腫瘍発生の抑制効果の検討:ENNGを100mg/Lの濃度でC57/B16マウスに4週間投与する。その後、水道水を15週間投与し、同時に胃粘膜防御因子増強剤のRebamipideを0.1%と0.001%(6mg/kg)の濃度で混餌投与して胃粘膜防御因子を増強し、実験開始第16週目に十二指腸を摘出し、癌発生率を検討し、胃粘膜防御因子の増強による発癌の抑制効果について現在検討中である。2.N-Methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidine(MNNG)投与によるラット腺胃粘膜におけるDNA損傷について:MNNGを100mg/Lの濃度でWiatarラットに24時間自由飲水させた後に、経時的に胃粘膜を摘出し、8-OH-dG濃度を個別に測定し、胃粘膜の損傷と胃癌発生との相関について現在検討中である。8-OH-dG濃度の測定はDMH投与によるラット大腸粘膜にて検討し、その測定手技は安定したものとなっている。消化器発癌の実験的研究において、一定量の低濃度の化学発癌剤の投与では100%の動物に癌が発生するわけではない。そこで胃発癌過程を胃潰瘍発生と置き換えるという仮説を立ててみた。攻撃因子としては化学発癌剤であり、一方、防御因子として胃粘膜の防御に影響を与える因子が存在し、胃粘膜が化学発癌剤に暴露されることを保護しており、その強弱が癌発生の個体差として示されるのではないかと仮説した。昨年度はENNGマウス十二指腸発癌系において胃粘膜防御因子増強作用を有するRepamipide投与にて腫瘍発生率が低下することを報告した。今年はRepamipideをMNNG誘発ラット腺胃発癌過程を投与し、その影響を検討した。Wistarラットを3群に分け、N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine(MNNG)を80mg/Lの濃度で28週間投与する。その後、水道水を20週間投与した。同時にRebamipideを20mg/kgの濃度で実験第11週より終了時まで混餌投与して胃粘膜防御因子を増強し、実験開始第48週目に腺胃を摘出し、癌発生率を検討し、胃粘膜防御因子の増強による発癌に対する影響について腫瘍発生率、発生腫瘍数、腫瘍径について肉眼的、組織学的に検討した。その結果、腫瘍発生率はMNNG単独群では76.9%であったが、MNNG+Rebamipide群では61.5%と腫瘍発生率はRebamipide投与により低下したが有意の抑制ではなかった。しかし、組織学的にはCarcinomaとAdenomaの発生率はMNNG単独群では69.2%で、MNNG+Rebamipide群では30.7%とRebamipide投与により有意に抑制した。
メダカにおける脳の性分化メカニズム

脊椎動物では一般的に、出生前後の時期に生殖腺で産生される性ホルモンの作用により、脳の性分化が引き起こされると考えられてきた。しかし近年、脳が自立的に性分化することを示唆する報告もなされており、脳の性分化を引き起こす分子メカニズムの包括的な理解が求められている。本研究では、実験モデルとしてメダカを用い、魚類の脳における性分化の分子メカニズムを明らかにすることを目指すこととした。昨年度までのスクリーニングによって、「性成熟したメダカの脳内で発現に性差を示す遺伝子群」(以下、性依存的遺伝子と呼ぶ)を同定してきた。本年度はまず、それらの遺伝子がいつから性差を示し始めるのかを調べた。その結果、性染色体に載っている遺伝子を除くと、全ての性依存的遺伝子が初期発生過程では性差を示さず、第二次性徴の出現に伴って性差を示し始めることが分かった。このことから、メダカの脳の性分化は、哺乳類よりもかなり遅い時期に起こることが明らかとなった。また、生殖腺で産生される性ホルモンの関与が予想された。そこで、メダカを種々の性ホルモンで処理し、その際に、性依存的遺伝子の発現量がどのように変動するかを解析した。その結果、多くの遺伝子が性ホルモンによる発現制御を受けることが明らかとなった。このことから、やはりメダカの脳の性分化は、生殖腺で産生される性ホルモンにより引き起こされることが示唆された。また、これまでの解析により、性依存的遺伝子のいくつかは、分泌性のタンパク質をコードしていることが予想されているので、それらのタンパク質に対する特異抗体を作製した。
回転モーターF1の回転ポテンシャル全容の計測

生体分子モーターは、基質となるヌクレオチドの加水分解エネルギーを利用して働いている。実際にATP駆動型の分子モーターについて言えば、活性部位でのATP、ADP・Pi、ADP、Piといったそれぞれの化学状態に応じた力を一連の化学サイクルに沿って順次発生することで一方向に動くと考えられている。そこで、力発生の設計図とでも言うべきポテンシャルエネルギーをヌクレオチドの化学状態ごとに直接1分子測定することを試みた。具体的には、回転分子モーターF1-ATPaseを用いて、結合するヌクレオチドを直接見ながら1分子回転操作し、ADP1個結合の回転トルクを測定し、その積分から回転ポテンシャルを決定した。回転分子モーターF1-ATPase(以後単にF1という)の回転のポテンシャルエネルギーを、3つの触媒部位におけるヌクレオチドの化学状態と回転角度の関数として直接1分子計測によって決定することを試みている。F1をガラス基盤上に固定し、回転子に取り付けた磁気ビーズを磁気ピンセットによって回転させ、ビーズの磁場からのズレでトルクを求める。同時に、蛍光性ヌクレオチドの蛍光1分子イメージング(偏光/デフォーカス蛍光イメージング)によって結合数、結合サイトを直接観察すれば、ヌクレオチドの化学状態ごとの回転ポテンシャルエネルギーを決定できる。予備的ではあるが、結合ヌクレオチド無しとADP1個を結合した状態のポテンシャルを決定できた。360度あらゆる角度のポテンシャルを精度良く見積もるために、磁気ピンセットの改良を行った。2対の磁極を用い、各対の発生する磁力の強度を変化させることで、磁場の方向を変化させている。残留磁場の小さな磁極材料を採用することで、磁場の方向を正確に制御できるようなり、角度ごとの磁場強度の誤差を最小限にできた。また、磁極の形状を工夫し、以前よりも少ない電流で試料上の磁場強度を上げられるようになった。回転子に付ける磁気ビーズに関しては、これまで使用してきたビーズの大きさ・形状がかなり不揃いだったので、今回新たに材質・大きさともに検討し直した。加水分解によって駆動される回転において、燐酸解離のタイミングは未だ議論の余地がある。化学反応と回転の共役モデルを完成させるために、加水分解が遅いATPアナログであるATPγSを用いて無負荷回転観察を行った。分解生成物であるチオ燐酸の解離は、燐酸に比べて遅いことが分かった。そのチオ燐酸の解離が、ATPγSの結合後320度には観察されなかった。間接的ではあるが、200度で燐酸解離が起こっていると考えられる。F1-ATPaseの回転ポテンシャルエネルギー(内部エネルギー)の測定を進めていたが、この分子のモーター機能における化学-力学共役のスキームに関して我々の主張と矛盾する結果が他から報告されたため、その検証実験を最優先して進めてきた。燐酸の解離のタイミングについてはこのモーターにおいて未だ議論の余地があった。回転ポテンシャルエネルギーの決定においても直接観察できないヌクレオチド化学状態は回転モデルに基づいて解釈する必要があり、確立していない化学-力学共役のスキームに頼るのは信頼性に関わる大きな問題であった。それ故にモデルの完成を優先して燐酸解離の検証をおこなった。加水分解が遅いATPアナログであるATPγSを用いて回転観察を行ったところ、分解生成物であるチオ燐酸の解離は燐酸に比べて遅くなることが分かった。そのチオ燐酸の解離ついて調べたところ320度にはチオ燐酸の解離が確認できなかった。加水分解が起こる200度での(チオ)燐酸の解離を示唆する結果となった。また、野生型F1において加水分解が起こる角度を蛍光性ATPアナログを用いて検証したところ、これまでの提唱通りに200度で起こっていることが確認できた。好熱菌由来のF1の化学-力学共役スキームについてようやく見通しがつき、これまで通り我々のモデルを主張できることが分かった。また、今回の検証実験において未解決の高速反応を観察することもできた。他種モデルにおける矛盾解決の一助となる可能性がある。ヌクレオチドの化学状態は蛍光性ヌクレオチドの偏光・デフォーカス蛍光イメージングから直接観察するのだが、加水分解反応や燐酸解離の化学反応はそれら1分子観察からでは同定できない。直接観察することができないヌクレオチドの化学状態は回転モデルに基づいて解釈する必要がある。そのために、化学-力学共役スキームの完成が本研究課題にとっては重要であり、検証実験を最優先でおこなう必要があった。思った以上に時間を要してしまったがモデルについてはほぼ見通しがつきつつあり、今後は回転のポテンシャルエネルギーの決定に戻る予定である。回転分子モーターF1のポテンシャル(内部)エネルギーを、回転角度の関数として、3箇所ある触媒部位のヌクレオチドの化学状態ごとに、1分子計測によって直接決定しようと試みてきた。F1をガラス基盤上に固定し、回転子に取り付けた磁気ビーズを磁気ピンセットで回転操作し、ビーズと磁場の向きのズレからトルクを、その積分値としてポテンシャルを求める。同時に、蛍光性ヌクレオチドの蛍光1分子イメージングによって結合した部位を直接観察しヌクレオチドの化学状態を決定する。今のところ化学状態の変化は蛍光1分子イメージングから測定できないため、この回転モーターの化学-力学共役スキームからの推定が必要となる。燐酸解離のタイミングには未だ議論の余地がありスキームの完成を優先させてきた。ATPγSの分解生成物であるチオ燐酸の解離が燐酸に比べて遅いことを利用して、ATPγS結合後にチオ燐酸解離が320度で起こっていないことを確認していた。

チオ燐酸と燐酸の解離速度に有意な違いがあり確かにその違いを見分けられているのかがこの実験の重要なポイントであった。いくつかの温度条件下でおこなったところどれも同様の結果となり、再現性のある信頼できる測定であることが分かった。最終的に好熱菌由来のF1では加水分解と同じ200度で(チオ)燐酸の解離が起こっているという結論に至った。ADP解離のタイミングついてはこれまで蛍光性ATPによる実験でしか調べられていなかったが、過剰ADP条件下で通常のATPによる高速回転観察から予想通り0度でADPの解離が起こっていることを示した。ポテンシャルに関しては、結合ヌクレオチド無しの状態とADP1個を結合した状態の測定に成功している。今後の課題は、データ数を増やすこととその他のヌクレオチド条件の測定を進めることである。生体分子モーターは、基質となるヌクレオチドの加水分解エネルギーを利用して働いている。実際にATP駆動型の分子モーターについて言えば、活性部位でのATP、ADP・Pi、ADP、Piといったそれぞれの化学状態に応じた力を一連の化学サイクルに沿って順次発生することで一方向に動くと考えられている。そこで、力発生の設計図とでも言うべきポテンシャルエネルギーをヌクレオチドの化学状態ごとに直接1分子測定することを試みた。具体的には、回転分子モーターF1-ATPaseを用いて、結合するヌクレオチドを直接見ながら1分子回転操作し、ADP1個結合の回転トルクを測定し、その積分から回転ポテンシャルを決定した。ポテンシャルを計測する上で問題になると予想された点は、これまでに着実に解決されている。予備的な実験での試行錯誤も終わり、後はデータを蓄積するだけのところまで来ている。蛍光性ヌクレオチドの直接1分子観察であっても、現在のところ、ATPからADPと燐酸に分解されるような化学状態の変化を知ることはできない。加水分解またはATP合成が起こるような条件下では、そのヌクレオチドの化学状態の変化を回転モデルから予想する必要がある。そのためにも、化学反応と回転の共役モデルを完成させることが重要である。これまで、ポテンシャル計測と平行して行ってきたが、モデル解明に多少時間を費やし気味であったため、達成度をやや遅れているとした。回転ポテンシャルエネルギーの測定のための主要な実験系の改良はすでに初年度において完了している。結合ヌクレオチドが1個だけでなく2個の時のポテンシャルを決定して行く。蛍光性ヌクレオチドの濃度を上げないといけないので、背景が明るくなり測定がさらに困難になるが、ある程度の濃度までは可能であることを実証済みである。今回の燐酸解離の検証でその性質を知ることができたチオ燐酸を燐酸アナログとして利用し燐酸結合状態のポテンシャル測定に役立てる予定である。生物物理学回転モデルに関しては、燐酸解離が200度で起こっているという直接的な証拠が得られるような実験を試みる予定である。そして、早急に成果をまとめたい。F1-ATPaseの回転ポテンシャルエネルギーは、データをとり続け、できるだけ多くの化学状態におけるポテンシャルを決定する。
尿酸排泄トランスポータBCRPのジスルフィド結合に着眼した痛風発症機構の解明

本研究では、酸化ストレスが尿酸排泄トランスポータBCRPへ与える影響を明らかとすることとした。加齢性の酸化ストレスはキサンチンオキシダーゼに由来するため、その基質を用いてBCRP発現量への影響を検討した。その結果、キサンチンオキシダーゼ活性化はヒト消化管モデルCaco-2細胞のBCRP S-S bond形成を低下させる一方、ヒト腎由来HK-2細胞のS-S bondには影響しなかった。このことから、酸化ストレスによる尿酸排泄への影響は臓器により異なることが示唆された。痛風は、高尿酸血症に引き続きおこる生活習慣病で、激しい関節痛を生じ、さらには高血圧や腎臓病などの発症リスクを高める。このため、患者のQOL低下が著しく、効果的な治療法並びに予防法の確立が強く望まれる疾患のひとつである。2009年、排出系トランスポータであるBCRPが高容量性の尿酸輸送担体であることが示され、痛風発症の原因遺伝子であることが報告された。しかしながら、その発症機構は明らかとされておらず、効果的な予防法も確立されていない。痛風発症頻度は年齢に相関して増加することが知られており、加齢による何らかの生体変化が痛風発症に関連すると考えられる。そこで本研究では、加齢による活性酸素産生の増大に着目し、高容量性尿酸排泄トランスポータBCRPへの影響を検討することとした。加齢による活性酸素の増大はキサンチンオキシダーゼ活性化に由来することから、キサンチンオキシダーゼの基質であるキサンチンおよびヒポキサンチンをヒト消化管モデル細胞Caco-2細胞に添加し、BCRP発現への影響を検討することとした。その結果、キサンチンはBCRP発現量を増大させたが、ヒポキサンチンは影響を与えなかった。さらに、キサンチンオキシダーゼ活性化時に産生される活性酸素、尿酸はBCRP発現量に影響を与えなかったことから、キサンチンによるBCRP発現量の増大はキサンチン自体による影響と考えられた。また、BCRPはハーフトランスポータと呼ばれ、603番目のシステイン残基にS-S結合を形成し、ホモダイマーとして機能していることから、キサンチンオキシダーゼ活性化によるBCRP S-S結合への影響を検討した。その結果、キサンチンオキシダーゼ活性化によりBCRP S-S結合の形成は抑制されることが明らかとなった。今後はin vivoにおいてキサンチンオキシダーゼ活性化時のBCRP S-S結合、尿酸排泄能を評価する。加齢による活性酸素の増大はキサンチンオキシダーゼ活性化に由来することから、キサンチンオキシダーゼの基質であるキサンチンおよびヒポキサンチンを用いて、BCRP発現量への影響をS-S結合形成に着目して検討した。その結果、ヒト消化管モデル細胞であるCaco-2細胞においてキサンチンはBCRP発現量を増大させたが、BCRPホモダイマー量は変化しなかった。また、ヒポキサンチンはBCRP発現量に影響を与えなかったが、BCRPホモダイマー量は減少した。さらに、BCRP S-S結合形成を全BCRP発現量に対するホモダイマー量の比により評価したところ、両基質により低下していることが明らかとなった。一方、ヒト正常腎細胞由来HK-2細胞においてはキサンチン、ヒポキサンチンともにBCRPのS-S bond形成に影響を与えなかった。以上のことから、キサンチンオキシダーゼ活性化は小腸のBCRP S-S結合形成を低下させる一方、腎臓のBCRPには影響しないことが示唆された。、尿酸は腎臓から2/3が、小腸から1/3が排泄されることが知られているが、BCRPは腎臓に比べ小腸に多く発現している。本研究の成果は、痛風発症における小腸からの尿酸排泄の重要性を示唆する成果と考えられる。
イネの花粉形成初期の低温耐性に関与する遺伝子の単離及び機能解析

水稲育種母本北海PL5は北海244号にペルーの高度耐冷性系統ランベークの遺伝子を導入した耐冷性育種母本である。これまでに、北海PL5の第11番染色体には大きな耐冷性効果を持つ遺伝子座が含まれることが知られている。この研究の目的は、北海PL5を材料として、イネの農業形質として重要な耐冷性遺伝子をポジショナルクローニングし、その機能を解明することである。耐冷性候補領域にはreceptor like protein kinase遺伝子のクラスターが含まれることが分かっている。北海PL5における該当領域の塩基配列を決定した結果、既知の塩基配列とは大きく異なっている領域が存在することが分かった。北海PL5およびきらら397を材料として、一連のreceptor like protein kinase遺伝子に関してRTPCRによる発現解析を行ったところ、北海PL5においてのみ転写が認められたものがあった。また、同領域についてのきらら397の準同質遺伝子系統の耐冷性検定の結果、耐冷性効果を持つことが確認された。北海PL5の第11番染色体の耐冷性効果を持つ遺伝子座について、塩基配列および発現様式を明らかにしたことにより、一連のprotein kinase遺伝子が耐冷性に関与することが強く示唆された。また、該当領域はきらら397に対しても耐冷性効果を持つことは、育種上の有用性を示すものである。水稲育種母本北海PL5は北海244号にペルーの高度耐冷性系統ランベークの遺伝子を導入した花粉形成期の低温に対する高度耐冷性育種母本であり、第11番染色体に大きな耐冷性効果を持つ遺伝子座を含む。この研究では、北海PL5の耐冷性遺伝子の構造及び機能を解明するとともに、遺伝子の種内変異を解析して遺伝子多型と品種や生態型の分化との関係を解明することを目的としている。
マルチスポット表面放射集積半導体レーザを用いた2波長励起蛍光免疫センサの研究

コンパクトで多項目一括検査可能な2波長蛍光免疫センサへの応用を目指し、赤色および近赤外のマルチスポット表面放射集積半導体レーザの設計・作製を行った。赤色集積レーザにおいては5×5および7×7のマルチスポットが得られ、近赤外においても同様のマルチスポット出力が得られる出力結合器を作製した。またノッチフィルタとロングパスフィルタの組み合わせた励起光カットフィルタを用い、赤色・近赤外の半導体レーザ励起による蛍光検出予備実験に成功した。本年度は多項目一括検査可能な蛍光免疫センサへの応用を目指し、マルチスポット表面放射赤色集積半導体レーザのスポット数増大に重点を置いて研究を行い、以下の成果を得た。1.これまで3×3の2次元マルチスポットを形成できる多焦点2値位相シフトグレーティング結合器を集積した半導体レーザを実現してきたが、これを4本配列してレーザアレイとすることで6×6のマルチスポットアレイを得ることを試みた。等間隔の6×6マルチスポットを構成するよう各レーザのグレーティング結合器の設計を行い、レーザアレイを作製した。スポット強度が等強度となるよう各レーザに注入する電流を調整し、スポット中心間隔約390μmと設計値400μmに近い6×6マルチスポットを得ることに成功した。2. DBRレーザ発振器、テーパ型光増幅器および多数のスポット光を出射できる出力結合器を集積したレーザを設計・作製し、単一のレーザでより規模の大きいマルチスポットアレイを得ることを試みた。多焦点出力結合器は、単焦点の出力結合器のグレーティングラインに周期的な連続位相変調を与えることで任意のスポット数のマルチスポットアレイを形成する。例として5×5および7×7のスポットを等強度に出射する出力結合器を設計し、これを集積化したレーザを作製した。発振器、光増幅器それぞれに同期したパルス電流を注入し、出射光を測定した。スポット強度間に多少のばらつきはあったが、各集積レーザから5×5、7×7のマルチスポットアレイが得られ、多焦点出力結合器・増幅器集積化DBRレーザの実現に成功した。本年度は多項目一括検査可能な表面放射赤外半導体レーザの実現に向け多数のマルチスポット形成グレーティング出力結合器の設計・作製を行うとともに、半導体レーザによる2波長励起蛍光検出の予備実験を行った。1.780nm帯赤外半導体レーザ用の単焦点出力結合器のグレーティングラインに、周期的な連続位相変調を与えることで任意のスポット数のマルチスポットアレイを形成するグレーティング出力結合器を実現する。例として5×5および7×7のスポットを等強度に出射する出力結合器を設計し、赤外半導体レーザ用AlGaAs量子井戸導波路上に作製した。同じ導波路を用いて作製した半導体レーザからのレーザ光を導波路内に端面結合することで、作製した出力結合器からマルチスポット表面放射光を得ることに成功した。2.吸収ピーク波長が作製した赤色半導体レーザ(発振波長655nm)と赤外半導体レーザ(同780nm)に近い蛍光色素Alexa Fluor 647および同790を用意し、これらを別々のマイクロビーズに付着させカバーガラス上に配列した。赤色レーザ光をカットするロングパスフィルタと赤外レーザ光をカットするノッチフィルタを組み合わせて励起光カットフィルタとし、これを通してCCDカメラで蛍光観察を試みた。赤色半導体レーザでマイクロビーズアレイを照射したところAlexaFluor 647の付着したビーズのみが、赤外半導体レーザで同じビーズアレイを照射したところAlexaFluor 790の付着したビーズのみが観察され、半導体レーザによる2波長励起蛍光検出の予備実験に成功した。
アウトフローが生み出す多様なＸ線スペクトル状態の解明と超臨界降着天体への応用

超臨界降着とは、ブラックホールが大量のガスを吸い込み明るく輝く現象のことである。この状態にあると考えられる天体が近年多数観測で見つかった。しかし、この現象に関する理論には高度な数値計算を要するため解明が進んでいない。そこで本研究では、まず高速に計算を行うプログラムを開発する。そしてスーパーコンピューターXC50(国立天文台)を用いて、超臨界降着天体の数値計算を行う。特に光子の辿った軌道を解析することで、スペクトル成分と放射領域の対応を明確にし、超臨界降着の統一描像を確立する。さらに得られた計算結果を観測結果と比較し、超臨界降着がどのようなパラメータと関係しているかといった統計的性質も探る。
ラット褐色脂肪組織における絶食時特異的なユビキチン化標的タンパク質の探索

本研究では、絶食時/摂食時にユビキチン化の標的となる分子を同定することにより、タンパク質分解によるエネルギー代謝の調節機構を解明することを目的として研究を行った。Wistar系7週齢雄ラットを7日間の制限給餌の後に摂食群と絶食群の2群に分け、プロテアソーム阻害剤であるエポキソマイシンの投与量、投与法を検討した。その結果、ユビキチン化タンパク質の量に2群で差が認められる条件を決定した。我々は、絶食時の褐色脂肪組織における遺伝子発現応答をmRNAレベルで網羅的に解析することにより、多くのユビキチン-プロテアソーム関連遺伝子が発現上昇することをこれまでに見出している。本研究では、絶食時にユビキチン化の標的となる分子を同定することにより、絶食応答における特異的なタンパク質分解によるエネルギー代謝の調節機構を解明することを目的として研究を行った。Wistar系7週令雄ラット10匹に、5日間の馴化後、7日間、毎日10時から16時の間のみ通常飼料を自由摂取させる制限給餌を行った。本飼育8日目の10時に平均体重が同程度となるように2群に分け、16時まで1群には同様に餌を与え、もう1群は絶食とした。プロテアソーム阻害剤であるエポキソマイシンの投与量、投与法を検討した結果、本飼育7日目の16時に、80マイクログラム/Kg体重(溶媒は生理食塩水)で、イソフルラン吸入麻酔下で褐色脂肪組織直上の皮下に投与することで、ユビキチン化タンパク質の量に2群で差が認められることがわかった。一方、エポキソマイシンを投与するタイミングを、8日目の13時とすることで、絶食状態から摂食状態に遷移する際にユビキチン化されるタンパク質の検出もできそうであることもわかった。現在、ユビキチン化タンパク質をユビキチン化タンパク質結合レジンによって濃縮し、イソペプチダーゼを用いて切り出して検出する条件を検討している。条件が至適化できた段階で、2次元電気泳動によるユビキチン化タンパク質の同定を行う予定である。