hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
プロテオームとミネラロームを統合した石灰化解析イメージング法の開発

平成29年度まで、軟骨内骨化における軟骨の石灰化を対象として、ミネラロームを検討するために、生後2週齢ラットの下肢を4%パラホルムアルデヒドで固定し、非脱灰でパラフィン包埋し試料として利用した。切片をミネラルの構成元素であるカルシウムとリンおよび有機質の構成元素である炭素の基質における分布と濃度についてSEM-EDXを利用して解析した。また、基質のタンパクの分布については、抗II型コラーゲン抗体と抗X型コラーゲン抗体を用いた蛍光抗体法による免疫染色で検討し、SEM-EDXおよび蛍光抗体法の実験条件を確立した。平成30年度では、生後2週齢ラットを新たに固定し、下肢の非脱灰パラフィン包埋試料を作製し、検討を進めた。研究代表者の妊娠以降、体調管理のため研究活動を制限せざるを得ず、10月以降、研究を中断した。研究代表者が、出産と育児のため、10月以降、研究を中断したから。(1)研究中断前に作製した4%パラホルムアルデヒド固定した生後2週齢ラット下肢の非脱灰パラフィン包埋試料を用いて、ミネラルの構成元素であるカルシウムとリンおよび有機質の構成元素である炭素の基質における分布と濃度について、SEM-EDXを利用して可視化する。(2) SEM-EDX解析した切片に抗II型コラーゲン抗体と抗X型コラーゲン抗体を用いた蛍光抗体法による免疫染色を施し、II型コラーゲンおよびX型コラーゲンの分布を可視化する。(3)画像統合ソフトを用い、SEM-EDX解析イメージングと免疫染色イメージングを組織切片上に設定した基準点を利用して統合し、ミネラルとII型コラーゲンおよびX型コラーゲンの位置情報を統合したイメージングとして可視化する。(4)生後2週齢ラットの下肢を4%パラホルムアルデヒドで固定後、凍結包埋して連続切片を作製し、切片を質量顕微鏡解析用として導電性を持たせ酸化インジウムスズがコーティングしてある専用スライドガラスに載せる。切片は超低温フリーザーに保管する。(5)超低温フリーザーに保管した切片を凍結乾燥し、組織切片上に基準点を機械的に設定し、蒸着操作なしに低真空モードに設定した走査電子顕微鏡でSEM-EDX解析し、下肢骨のミネラロームのSEM-EDX解析イメージングをデータとして取得する(7)上記で保管した切片にDHB(2,5-ジヒドロキシ安息香酸)のマトリックスを塗布して、質量顕微鏡で検討し、試料のプロテオームを解析しデータを取得する。(8)画像統合ソフトを用い、ミネラローム(SEM-EDX解析イメージング)と(7)プロテオーム(質量顕微鏡解析イメージング)を統合し、石灰化解析イメージングとして可視化する。研究代表者等のこれまでの研究は、硬組織の発生成長や修復の過程で、基質を構成するタンパクがミネラルと相互作用し、石灰化を進行させる可能性を示してきた。基質の多様なタンパク構成(プロテオーム)とミネラル構成(ミネラローム)が同時に可視化できれば、両者の相互作用と石灰化の理解は深まるが、その研究技術は現在まで得られていない。本研究計画は、タンパクーミネラル相互作用を解析する研究基盤として、プロテオームを可視化する質量分析イメージング法とミネラロームを可視化するエネルギー分散型X線分析(SEM-EDX)イメージング法を統合し、両者を同時に可視化する石灰化解析イメージング法を開発することを目的とした。平成29年度では、軟骨内骨化における軟骨の石灰化を対象として、ミネラロームを検討するために、生後2週齢ラットの下肢を4%パラホルムアルデヒドで固定し、非脱灰でパラフィン包埋して試料として利用した。平成30年度では、同一切片にSEM-EDXと免疫染色を施して、ミネラルとコラーゲン分子を同時に可視化する技術を検討する。その上で、SEM-EDX解析と質量顕微鏡解析を同一切片で実施する方法論を検討する。抗II型コラーゲン抗体の選定および同抗体による免疫染色条件の設定に予想以上の時間を要したため。また、SEM-EDX解析後の組織切片に免疫染色を施す実験条件の設定に時間を要しているため。

平成29年に実施した予備実験においては、エネルギー分散型X線分析(SEM-EDX)でミネラルの集積を検討した組織切片では、同一切片で引き続き免疫染色を施した際、免疫染色性が低下する場合が多かった。平成30年度では、SEM-EDX解析の際にコラーゲン分子の抗原性を保持し、同一切片に免疫染色を施してミネラルとコラーゲン分子を同時に可視化する至適な実験条件と技術を検討する。その上で、SEM-EDX解析と質量顕微鏡解析を同一切片で実施する方法論を検討する。(1)研究中断前に作製した4%パラホルムアルデヒド固定した生後2週齢ラット下肢の非脱灰パラフィン包埋試料を用いて、ミネラルの構成元素であるカルシウムとリンおよび有機質の構成元素である炭素の基質における分布と濃度について、SEM-EDXを利用して可視化する。(2) SEM-EDX解析した切片に抗II型コラーゲン抗体と抗X型コラーゲン抗体を用いた蛍光抗体法による免疫染色を施し、II型コラーゲンおよびX型コラーゲンの分布を可視化する。(3)画像統合ソフトを用い、SEM-EDX解析イメージングと免疫染色イメージングを組織切片上に設定した基準点を利用して統合し、ミネラルとII型コラーゲンおよびX型コラーゲンの位置情報を統合したイメージングとして可視化する。(4)生後2週齢ラットの下肢を4%パラホルムアルデヒドで固定後、凍結包埋して連続切片を作製し、切片を質量顕微鏡解析用として導電性を持たせ酸化インジウムスズがコーティングしてある専用スライドガラスに載せる。切片は超低温フリーザーに保管する。(5)超低温フリーザーに保管した切片を凍結乾燥し、組織切片上に基準点を機械的に設定し、蒸着操作なしに低真空モードに設定した走査電子顕微鏡でSEM-EDX解析し、下肢骨のミネラロームのSEM-EDX解析イメージングをデータとして取得する(7)上記で保管した切片にDHB(2,5-ジヒドロキシ安息香酸)のマトリックスを塗布して、質量顕微鏡で検討し、試料のプロテオームを解析しデータを取得する。(8)画像統合ソフトを用い、ミネラローム(SEM-EDX解析イメージング)と(7)プロテオーム(質量顕微鏡解析イメージング)を統合し、石灰化解析イメージングとして可視化する。申請者が、出産と育児のため、10月以降研究を中断したことから研究の進捗が予定より遅れ、次年度使用額が生じた。
転写型遺伝子サイレンシング（TGS）によるシンテッポウユリの花色改変

ユリの花弁が白くなるメカニズムはよく分かっていない。ユリの花弁は発達の過程でカロテノイド蓄積量が減少することより、カロテノイドを分解するCCD4を解析した。テッポウユリ、オリエンタルハイブリッドユリ、スカシユリからそれぞれ2つのCCD4遺伝子(LhCCD4aとLhCCD4b)が単離された。オリエンタルハイブリッドユリとスカシユリでは、LhCCD4aは発現パターンがカロテノイドの消長と一致したが、LhCCD4bは一致しなかった。テッポウユリではLhCCD4aとLhCCD4bのいずれも、カロテノイド蓄積の減少と発現様式が一致しなかった。ユリの花弁でカロテノイドが分解されるメカニズムは複雑である。種子繁殖性のユリであるシンテッポウユリには白花しか無い。本研究ではNew plant breeding technique (NPT)を用いて黄色のシンテッポウユリを育成する。シンテッポウユリでは、花弁で特異的にカロテノイド色素(黄色)を分解するCCD4が働くため同色素が花弁に貯まらないと考えられる。Virus Induced Gene Silencing (VIGS)を利用して転写型遺伝子サイレンシング(TGS)をCCD4遺伝子に誘導して転写を抑制し、花弁でカロテノイドの分解を抑える(黄色になる)。この個体を自殖すると、ウイルスは種子伝搬しないので、目的の遺伝子(carotenoid cleavage dioxygenase4 [CCD4])にのみ変異(プロモーター領域のメチル化)が入り、遺伝子組換えの痕跡は残らない植物ができる。実際に、ウイルスを除去した後もCCD4遺伝子の発現抑制が数世代にわたって続くことを検証する。初年度はまずCCD4遺伝子の単離を行った。結果、スカシユリとシンテッポウユリから単離することができた。スカシユリには少なくとも2種類のCCD4遺伝子が存在していた。そのうちの1つは、花弁が白くなるときに発現量が増加し、またこの増加は黄花の品種では認められなかったことより、花弁の白色化に貢献しているものと考えられた。もう1つのCCD4遺伝子は、花弁におけるカロテノイド色素の消長と発現パターンが一致していなかった。シンテッポウユリより単離したCCD4は前者のホモローグと考えられた。初年度にCCD4遺伝子(target gene)の全長を単離することに成功した。順調な滑り出しと評価する種子繁殖性のユリであるシンテッポウユリには白花しか無い。シンテッポウユリでは、花弁で特異的にカロテノイド色素(黄色)を分解するCCD4が働くため色素が花弁に貯まらないと考えられる。この個体を自殖すると、ウイルスは種子伝搬しないので、目的の遺伝子(CCD4)にのみ変異(プロモーター領域のメチル化)が入り、遺伝子組換えの痕跡は残らない植物ができる。平成28年度はシンテッポウユリ、スカシユリ、オリエンタルハイブリッドユリよりCCD4遺伝子を単離し、発現プロファイルを明らかにした。これらのユリの間で発現様式が微妙に異なることが明らかとなった。また発現の増減とカロテノイドの蓄積量との間に関連があることも示すことができた。つぎにCCD4の配列の中でsiRNAの候補となる配列を予測し、それをCucumber Mosaic Virus (CMV)由来のウイルスベクターに導入して、ユリならびにベンタミアナタバコに接種した。現在、形質の変化を調査している。初年度に単離したCCD4遺伝子の断片をCMV(キュウリモザイクウイルス)のユリ株に導入し、シンテッポウユリに接種する(Virus Induced Gene Silencing [VIGS])。CCD4遺伝子のpost-transcriptional gene silencing (PTGS)とtranscriptional gene silencing (TGS)を誘導して(白い花弁が黄色くなると期待される)、CCD4遺伝子の機能を明らかにするとともに、TGSを起こした個体の中から有望なものを選抜し、後代における形質の安定性を評価する。細胞工学3月に発注した物品(年度内に納品済み)の支払いが済んでいないためであり、実際は年度末において若干予算をオーバーしている予算執行は計画どおりであり、使用計画に変更は無い
発生初期における巻雲の氷晶発生・成長機構解明に関する実験的研究

氷晶核形成モードおよび環境条件の違いによる巻雲内氷晶の生成・成長機構を解明するため、発生初期における巻雲の微物理特性を雲生成チェンバー等により再現し、詳細雲微物理ボックスモデルによる定式化改良への反映に取り組む基礎的研究を実施している。実大気中に存在するエアロゾルは多種多様であり時空間的に変動も大きく、特に巻雲は他の雲種と比較して低温域・高々度かつ広領域にて出現するため、自然の巻雲内で働く氷晶発生機構は観測が困難なことから未解明の部分が現在でも多く、発生環境の違いによるインパクトも大きいと指摘されている。地上観測モニタリングシステムを用いて、実大気エアロゾルの雲核能・氷晶核能に関するデータ取得を通年で継続し詳細な解析を進めた。雲核や氷晶核の計測では、長距離輸送を想定してサンプリングした気塊の起源を後方流跡線解析から求めて、その領域区分からみた季節毎の特徴を調べた。雲核能を表すパラメータ(吸湿度)からは、9月頃に極大、6月頃に極小となった。さらに起源となる領域区分として海上が大、大陸遠方が小の傾向を示した。氷晶核能を表すパラメータ(氷晶核形成の活性化サイト数密度)からは、年々変動が大きいものの5月と9月頃に高く、2月頃に低い傾向を示した。領域区分として中国東部や日本周辺で概して小となったが、季節分布として共通的な特徴は見出されなかった。人為起源の代表的エアロゾルである金属酸化物を例として、室内実験データより雲核能・氷晶核能を調べて氷晶発生の定式化改良を行った。氷晶核計と雲生成チェンバー実験では、氷晶発生が検出される活性化温度に顕著な差があり、計測方法に固有な活性時間の違いが原因の一つと考えられる。同じ雲生成チェンバーによる実験結果より、酸化アルミニウムから得られた氷晶核能パラメータの値は、自然起源のダスト粒子と同程度であることが分かった。二年目の冷凍機故障から完全復旧には予算等の都合から極めて厳しく、-30°C以上の比較的高い温度領域での制限等を受ける実験環境となった。これまで得られた実験や観測データと数値実験の結果を基にした比較解析を中心にすることで計画を一部変更して進めた。これまで得られた観測・室内実験から得られた知見、最新の先行研究を基に、代表的な巻雲の設定(エアロゾル種や環境条件)の違いが氷晶発生機構へ与える影響の観点から、主に詳細雲微物理ボックスモデルによる感度実験を整理する。この結果を基に、現時点で用いられている雲粒・氷晶発生の定式化に基づいた再現性を議論する。観測・室内実験、数値実験の成果を学会・論文等での発表に繋げる。氷晶核形成モード及び環境条件の違いによる巻雲内氷晶の生成・成長機構を解明するため、発生初期における巻雲の微物理特性を雲生成チェンバー等の室内実験施設により再現し、詳細雲微物理ボックスモデルによる定式化改良への反映に取り組む研究を実施している。実大気中に存在するエアロゾルは多種多様であり、特に巻雲は他の雲種と比較して低温・高々度で出現するため、巻雲内で働く氷晶発生機構は未解明の部分が多く、発生環境の違いによるインパクトも大きいと考えられる。地上モニタリング観測システムを用いて、各種エアロゾルのほか実大気エアロゾルの雲核能・氷晶核能に関するデータ取得を各シーズンで継続し解析を行った。つくば地上で観測されたエアロゾル・雲核・氷晶核数濃度の変動については、国際会議や国内研究集会にて発表した。雲核能としての吸湿度、氷晶核能としての氷晶核活性化サイト数密度といった定式化改良に必要なパラメータに着目した解析から、雲生成チェンバーやボックスモデルの各手法による実験結果の相互比較が可能となった。雲生成チェンバー室内実験は、上昇速度が比較的大きい事例を主にこれまで発表してきたが、巻雲発生時に起こりえる比較的小さい事例を設定して、エアロゾル二種の外部混合による再現実験を試行した。ボックスモデル数値実験は、吸湿度や氷晶核活性化サイト数密度を導入したプログラム改良を行い、エアロゾル種や環境条件を変えた感度実験としてテストランを行った。本研究の目的の一つは、氷晶核能・雲核能の定式化改良である。地上モニタリング観測システムを用いて各種エアロゾル単独での特性は概ね把握することができた。ただし、これらが混合した場合に雲粒・氷晶発生がどう変化するか、実際に確かめる必要があり、まずはエアロゾル二種が外部混合した事例で、雲生成チェンバー実験および詳細雲微物理ボックスモデルを用いた実験結果の比較解析を詳細に行うのが二年目以降の計画である。-30°C以下の室内実験は冷凍機不調が原因してほとんど実施できなかったが、一年目の準備段階として、雲生成チェンバーによる標準粒子を用いた予備実験、ボックスモデルによるテストランは概ね達成できた。地上観測モニタリングシステムを用いて、各種エアロゾルのほか実大気エアロゾルの雲核能・氷晶核能に関するデータ取得を通年で継続し詳細な解析を進めた。

氷晶核の計測は、一般に数濃度が低く測定が困難であり、粒径依存性もあることから、インパクターのカットオフ径を変更した場合の氷晶核能を調べるデータ取得も行った。地上でのモニタリング観測結果からは、氷晶核数濃度は年々変動が大きいものの5-6月頃に極大になる傾向が見られ、一つの要因として自然起源のダスト粒子の寄与が考えられる。人為起源の代表的エアロゾルである金属酸化物を例として、雲生成チェンバー実験等により雲核能・氷晶核能を調べて定式化改良を行った。氷晶核計によるデータ解析によれば、酸化鉄は-35°C、酸化アルミニウムは-30°Cから氷晶核として働くシグナルが検出された。雲生成チェンバー実験の結果では10°C以上高温で氷晶発生を計測し始め、この差異は計測方法に固有である活性時間の違いが原因の一つと考えられる。本研究では、種々のダスト粒子、人工氷晶核、吸湿性粒子における氷晶核能・雲核能の単独での特性を把握した上で、混合した場合の特性を調べることが目的の一つである。雲生成チェンバーによる実験は、二年目で起きた冷凍機故障からの復旧作業中であり、室内実験と数値実験による結果の比較検討はやや遅れている。三年目の計画の早い段階で復旧させる予定であるが、地上モニタリング観測システムを用いた各種エアロゾルの特性調査や詳細雲微物理ボックスモデルによる雲粒・氷晶発生の予備実験のほうを中心に進めた。氷晶核形成モードおよび環境条件の違いによる巻雲内氷晶の生成・成長機構を解明するため、発生初期における巻雲の微物理特性を雲生成チェンバー等により再現し、詳細雲微物理ボックスモデルによる定式化改良への反映に取り組む基礎的研究を実施している。実大気中に存在するエアロゾルは多種多様であり時空間的に変動も大きく、特に巻雲は他の雲種と比較して低温域・高々度かつ広領域にて出現するため、自然の巻雲内で働く氷晶発生機構は観測が困難なことから未解明の部分が現在でも多く、発生環境の違いによるインパクトも大きいと指摘されている。地上観測モニタリングシステムを用いて、実大気エアロゾルの雲核能・氷晶核能に関するデータ取得を通年で継続し詳細な解析を進めた。雲核や氷晶核の計測では、長距離輸送を想定してサンプリングした気塊の起源を後方流跡線解析から求めて、その領域区分からみた季節毎の特徴を調べた。雲核能を表すパラメータ(吸湿度)からは、9月頃に極大、6月頃に極小となった。さらに起源となる領域区分として海上が大、大陸遠方が小の傾向を示した。氷晶核能を表すパラメータ(氷晶核形成の活性化サイト数密度)からは、年々変動が大きいものの5月と9月頃に高く、2月頃に低い傾向を示した。領域区分として中国東部や日本周辺で概して小となったが、季節分布として共通的な特徴は見出されなかった。人為起源の代表的エアロゾルである金属酸化物を例として、室内実験データより雲核能・氷晶核能を調べて氷晶発生の定式化改良を行った。氷晶核計と雲生成チェンバー実験では、氷晶発生が検出される活性化温度に顕著な差があり、計測方法に固有な活性時間の違いが原因の一つと考えられる。同じ雲生成チェンバーによる実験結果より、酸化アルミニウムから得られた氷晶核能パラメータの値は、自然起源のダスト粒子と同程度であることが分かった。
多自由度集積化マイクロステージ

半導体微細加工技術および圧電基板との接合技術、圧電薄膜堆積技術などを駆使し、プローブ高密度記録メモリに利用する1.5cm角サイズの他自由度マイクロXYZステージを作製・評価した。このステージでは、多数のマイクロアクチュエータを集積化し、精密で多自由度の動きを実現した。最終年度である本年度は、ムーニー型の変位拡大機構を集積化したシリコン・PZTのハイブリット構造をもつマイクロステージの作製技術をより発展させ、より大きな変位を得ることができるステージを試作した。積層型アクチュエータ素子の作製技術を改良して、より大きな力と変位が得られた。また、変位拡大機構の最適化を図った。具体的には、反応性イオンエッチングを用いたシリコンの微細加工技術により柔らかいばねをもつステージ構造を作製し、精密な位置決め技術により別に作製した積層PZTアクチュエータを組み込んだ。精密な位置決めはPZTアクチュエータを位置決めするテンプレートを用い、XYZステージ構造に転写した。また、アクチュエータとPZTアクチュエータを部分的に金属の電界メッキにより接合する技術を開発した。この部分メッキを行うため、XYZステージに直接レジストを塗布して、フォトリソグラフィーにより金属パターンをパターニングして、接合部分にのみ電界メッキができるプロセスとした。作製したマイクロステージは70Vの印加電圧でおよそ80μmの変位が得られた。フィードバック制御によりナノメートルの位置精度を達成できるように容量型の変位センサを集積化した。作製したマイクロステージのダイナミクスを評価および解析した。その結果、約500Hz程度までの高速駆動が可能であることがわかった。本研究では、半導体マイクロマシニング技術を利用し、ポータブルのプローブ型高密度記録メモリに利用する多自由度XYZステージを開発する。このステージでは、多数のマイクロアクチュエータやセンサを集積化し、小型でありながら複雑で精密な動きを実現する。ハードディスクなど他の記録メディアは、物理的限界に近づきつつあり、1T(テラ)bits/inch^2の記録密度を超える記録メモリが必要とされている。開発している記録システムは、1000個以上並んだ原子間力顕微鏡のプローブ、および高精度に動くXYステージから構成される。XYステージを動かし、異なる場所に記録再生を行う。本研究では、微細加工技術を駆使し、通常は微細加工できないPZTなどの特殊な材料を精密に加工する技術、様々な要素を小型、集積し、ナノメートルの精度で動く小型のXYZステージを開発する。本年度は、2次元の自由度で変位拡大機構を有するシリコン・ハイブリッド型圧電マイクロステージを設計し、その作製技術を開発した。中央のステージの周りに4つのアクチュエータが配置しており、それぞれのアクチュエータに、変位拡大機構が集積化されている。この、PZTの内部に電極が形成され、積層のピエゾアクチュエータとして動作する。上部および下部の両方に、フォトリソグラフィーで電極パターンを形成し、内部電極と電気的にコンタクトした。単位体積あたりでは最も大きな力を発生できる圧電アクチュエータを(PZT)を加工して、Siの微細加工技術と組み合わせたハイブリッド構造を試作した。
抗体アレイチップを用いた電気化学イムノアッセイシステムの構築

本研究では,抗体をアレイ状にスポット固定した抗体アレイチップの作製と実用化を目指した簡易診断デバイスの開発を行った.抗体アレイチップを利用した血中タンパク質の検出を化学発光計測と走査型電気化学顕微鏡で評価し比較・検討した結果,化学発光計測を利用した場合は高感度な測定を実現するために測定対象がmmオーダーである必要があり,チップ化した際には1桁2桁の感度が低下することが示唆された.それに対して,電気化学測定では,測定対象をスケールダウンしても感度が低下することなく定量が実現可能であった.次に,抗体アレイチップと電気化学測定システムを利用した簡易診断デバイスの試作を行った.試作したデバイスを利用することで,胃がんマーカー(ペプシノゲン)を高感度に測定可能であった.試作機は,システム全体で4kg以下であり,可搬性の高い簡易診断デバイスを実現した.今後,「point-of care testing」(POCT)デバイスとして幅広い応用が期待される.また,抗体固定化電極による電気化学イムノアッセイシステムの構築,イムノアッセイによる環境汚染物質の全自動測定システムの開発を行った.アミノエタンチオールとグルタルアルデヒドを用いてフタル酸ジブチル(DBP)抗体を直径300μmのAu電極上に固定化し,抗体固定化電極とした.抗体固定化電極を使用して,DBPの競合法イムノアッセイを行い,電流計測により評価した.その結果,抗体を固定化したマイクロ電極を用いてフタル酸ジブチルを定量可能であることを示した.さらに,実用化を目指して1チップに動作電極,参照電極,対極を配置した量産型チップを作製し,新たに開発した全自動イムノアッセイシステムと組み合わせることで,溶液反応を含めた全自動イムノアッセイシステムの試作を行った.本研究では,抗体をアレイ状にスポット固定した抗体アレイチップの作製と実用化を目指した簡易診断デバイスの開発を行った.抗体アレイチップを利用した血中タンパク質の検出を化学発光計測と走査型電気化学顕微鏡で評価し比較・検討した結果,化学発光計測を利用した場合は高感度な測定を実現するために測定対象がmmオーダーである必要があり,チップ化した際には1桁2桁の感度が低下することが示唆された.それに対して,電気化学測定では,測定対象をスケールダウンしても感度が低下することなく定量が実現可能であった.次に,抗体アレイチップと電気化学測定システムを利用した簡易診断デバイスの試作を行った.試作したデバイスを利用することで,胃がんマーカー(ペプシノゲン)を高感度に測定可能であった.試作機は,システム全体で4kg以下であり,可搬性の高い簡易診断デバイスを実現した.今後,「point-of care testing」(POCT)デバイスとして幅広い応用が期待される.また,抗体固定化電極による電気化学イムノアッセイシステムの構築,イムノアッセイによる環境汚染物質の全自動測定システムの開発を行った.アミノエタンチオールとグルタルアルデヒドを用いてフタル酸ジブチル(DBP)抗体を直径300μmのAu電極上に固定化し,抗体固定化電極とした.抗体固定化電極を使用して,DBPの競合法イムノアッセイを行い,電流計測により評価した.その結果,抗体を固定化したマイクロ電極を用いてフタル酸ジブチルを定量可能であることを示した.さらに,実用化を目指して1チップに動作電極,参照電極,対極を配置した量産型チップを作製し,新たに開発した全自動イムノアッセイシステムと組み合わせることで,溶液反応を含めた全自動イムノアッセイシステムの試作を行った.
ハイブリッド式光検出器を用いたカロリメータの開発研究

ハイブリッド式光検出器(以下HPD)は、強磁場中で利用可能で、単光電子(single photoelectron)も検出可能であることが我々の研究からわかっている。この研究課題では,HPDを実際の測定器(カロリメータ)に応用するための開発研究と性能評価を目的とした。平成10年度HPD本体および周辺機器の開発研究・HPDの基本性能(応答の線形性、増幅率のの温度依存性、長期安定性など)のテストを行った。・低ノイズの前段増幅器を用いたHPD信号の読み出し回路を製作した。・波長変換ファイバーを用いたシンチレータ光の読み出し法の開発研究を行った。平成11年度粒子検出器プロトタイプの製作と性能評価・昨年度までの研究成果に基づき、カロリメータの前置検出器のプロトタイプ(プリシャワー検出器、シャワーマックス検出器)を製作した。・米国フェルミ国立加速器研究所に前置検出器プロトタイプと、以前われわれが作成したハドロンカロリメータを持ち込み、ビームテスト実験を行った。・ビームテスト実験のデータ解析を行い、カロリメータ前置検出器の性能評価を行った。満足できる性能が得られることを確認し、国際学術誌に投稿した。1. HPD本体の開発研究(1)高圧電源、恒温槽、湿度センサ、テスト光源などを用いて、HPDの基本性能のテストを行うテストベンチを構築した。(2)構築したテストベンチを用いて、すでに以下の測定を行っている。また、その結果を浜松ホトニクス社にこ報告し、フィードバックをかけている。-HPD増輻率の長期安定性HPDゲインの温度依存性HPDにヒートサイクルをかけたときの安定性2. HPD周辺機器の開発研究(1)低ノイズの前段増幅器を用いたHPD信号の読み出し回路を製作した。ただし、まだHPDと一体ではなく、外付の回路である。(2)波長変換ファイバーを用いたシンチレータ光の読み出し法の開発に取り組んでいる。-非常に薄い(1ミリ厚)シンチレータ板からの読み出し短冊状のシンチレータ板からの読み出し3. HPDを利用した粒子検出器プロトタイプの製作(1) HPDを光読み出しに用いる粒子検出器のプロトタイブとして、プレシャワーカウンターおよびシャワーマックスカウンタの設計、製作およびシミュレーションを進めている。これらのカウンタを電磁カロリメータの前部に設置することで、粒子の識別能力を高めることができる。-プレシャワーカウンタは4ミリ厚の鉛板と1ミリ厚のシンチレータ板のサンドイッチ型であり、タイル・ファイバー方式でシンチレータ光を光検出器の光電面まで導く。-シャワーマックスカウンタは5ミリ厚のシンチレータ板を短冊状に並べ、各シンチレータからの光を、やはりタイル・ファイバー方式で光検出器の光電面まで導く。(2)上記プロトタイプ検出器を1999年度前半に完成させ、宇宙線を用いたテストの後、米国フェルミ国立加速器研究所の高エネルギービームを用いて性能評価を行う予定である。1.粒子検出器プロトタイプの製作昨年度までの研究成果に基づき、カロリメータの前置検出器(プレシャワーカウンタ、シャワーマックスカウンタ)のプロトタイプを製作した。これらのプロトタイプは光検出器としてHPD(ハイブリッド式光検出器)を利用することが可能である。(1)プレシャワーカウンタは4ミリ厚の鉛板と1ミリ厚のシンチレータ板のサンドイッチ型であり、タイル・ファイバー方式でシンチレータ光を光検出器の光電面まで導く。(2)シャワーマックスカウンタは5ミリ厚のシンチレータ板を短冊状に並べ、各シンチレータからの光を、やはりタイル・ファイバー方式で光検出器の光電面まで導く。2.粒子検出器プロトタイプの性能テスト(1)次項で述べる本テストに備え、プロトタイプの動作テストを神戸大学内で宇宙線を用いて行った。(2)米国フェルミ国立加速器研究所に今回製作した前置検出器と、以前われわれのグループが作成したハドロンカロリメータを持ち込み、中間子テストビームラインに設置した。10GeVから100GeVの高エネルギーを持つ電子、パイ粒子、およびミュー粒子を測定器に入射し、以下の性能を評価するためのデータを収集した。-前置検出器を設置した場合のカロリメータ全体の性能(応答の線形性、エネルギー分解能)-プレシャワーカウンタおよびシャワーマックスカウンタを用いた電子とパイ粒子の識別能力-シャワーマックスカウンタによる位置分解能現在、データ解析が進行中である。
イネのレトロエレメント、p-SINE1の発現制御の分子機構と、転移様式の研究

イネ植物体の各組織、およびDNAメチル化阻害剤5-アザシチジン(5-azaC)や熱(42°C)処理をしたイネOc培養細胞、におけるレトロポゾンp-SINE1の転写産物を5'RACE法とprimer extension法を用いて解析した。その結果、(1)いずれの組織、細胞においてもp-SINE1配列の5'端付近で始まる転写産物と、5'端に10塩基対以上の様々な付加配列を持つものとが発現していること、(2)全転写産物に対する5'端付近で始まる転写産物の割合が、植物体の穂や5-azaC処理をした培養細胞で顕著に大きいこと、(3)5'端付近で始まる転写産物の多くが、p-SINE1の特定のサブファミリーから転写されたものであること、が明らかになった。2.p-SINE1配列の転写制御に関与するメチル化塩基の特定ゲノムDNAにおけるp-SINE1配列のメチル化されている塩基を、bisulfite genomic sequencing法で特定したところ、p-SINE1配列内のCGおよびCNG配列のシトシン残基が全てメチル化されていることが示唆された。3.p-SINE1のRNAポリメラーゼIII(polIII)によるin vitro転写系の確立タバコBY-2細胞核抽出液を用いたin vitro転写系によって、polIIIによるp-SINE1の転写産物と思われるRNAを検出することに成功した。4.p-SINE1配列に挿入していた新規転移因子の同定p-SINE1の解析の過程で、p-SINE1配列に挿入していた転移因子を発見し、それが、30塩基対を単位とする縦列型反復配列を含む、ユニークな構造を持つイネの新規転移因子であることを明らかにした。1.イネにおけるp-SINE1RNA分子種の解析(1)DNAメチル化阻害剤処理をしたイネOc培養細胞、およびイネ植物体(根、穂)におけるp-SINE1転写産物の配列を5'RACE-PCR法を用いて決定した。以前解析したDNAメチル化阻害剤処理をしないOc細胞の場合では、p-SINE1配列の5'端に付加配列を持つ産物が多く得られたが、本研究のDNAメチル化阻害処理をした細胞の場合は、p-SINE1のコンセンサス配列に近い配列を持ち、p-SINE1配列の5'端丁度から始まる産物が多く得られた。これは、コンセンサス配列に近い配列を持つp-SINE1メンバーからの転写が、DNAメチル化によって優先的に抑制されていることを示唆する。また、植物体の根と穂では、発現しているp-SINE1分子種の多くが異なっていたことから、p-SINE1メンバー間での発現の組織特異性に差があることが示唆された。(2)primer extension法を用いてOc培養細胞で発現するp-SINE1RNAの5'端を解析した。その結果、5'端近傍から始まる転写産物と5'端に様々な長さの付加配列を持つ転写産物が存在することが示唆された。2.p-SINE1配列の転写制御に関与するメチル化塩基の特定bisulfite genomic sequencing法によって特定のp-SINE1ゲノムメンバーにおけるメチル化されている塩基を予備的に調べたところ、配列内の全てのCpGおよびCpNpG配列のシトシン残基がメチル化されていることが示唆された。1.イネにおけるp-SINE1分子種の解析イネ植物体の各組織、およびDNAメチル化阻害剤5-アザシチジン(5-azaC)や熱(42°C)処理をしたイネOc培養細胞、におけるレトロポゾンp-SINE1の転写産物を5'RACE法とprimer extension法を用いて解析した。
再構築された幹細胞ニッチェ中を用いた歯根膜由来幹細胞の未分化維持増殖

歯根膜細胞(PDL)、間葉系幹細胞(MSC)、および線維芽細胞(NHDF)より形成した脱細胞化マトリックスを作製した。脱細胞化前にはアクチンおよび細胞核が観察されたが、脱細胞化後には観察できなかったことから、細胞が除去できていることを確認できた。作製した脱細胞化マトリックス上にPDLは接着することができ、その接着はPDLが形成した脱細胞化マトリックス上で最も多かった。さらに、PDLの増殖性を評価したところ、脱細胞化マトリックス上でPDLは増殖できたが、PDLおよびMSCが形成した脱細胞化マトリックス上ではその増殖は抑制された。このように、歯根膜細胞のニッチェの生体外での再構築が期待できる。歯根膜細胞、間葉系幹細胞、およびヒト線維芽細胞より形成した脱細胞化マトリックスにより、歯根膜細胞を培養できるか、さらに、培養した際に歯根膜細胞の増殖に違いが見られるか評価した。3種類の細胞を2週間培養後、脱細胞化処理を行った。脱細胞化前後のサンプルで細胞核およびアクチン線維を染色したところ、脱細胞化前には明瞭な細胞核およびアクチン繊維を観察することができたが、脱細胞化後では観察することができなかった。さらに、脱細胞化後のサンプルをクマシーブリリアントブルー染色を行ったところ、青色に染色されたことから、脱細胞化後でも細胞が形成した細胞外マトリックス(ECM)が残存していることが明らかになった。作製した3種類の脱細胞化マトリックスに歯根膜細胞は接着することができ、特に歯根膜細胞が形成した脱細胞化マトリックス上でよく接着していた。また、各脱細胞化マトリックス上で歯根膜細胞の増殖を比較したところ、線維芽細胞が形成した脱細胞化マトリックス上では歯根膜細胞は通常の培養基板上と同様によく増殖した。一方、間葉系幹細胞、歯根膜細胞が形成した脱細胞化マトリックス上では、歯根膜細胞の増殖は抑制されていた。間葉系幹細胞はもとより、歯根膜細胞には幹細胞が含まれていることが知られている。幹細胞を含む細胞集団が形成した脱細胞化マトリックス上では歯根膜細胞の増殖が抑制されると考えられた。今後、歯根膜細胞の中の細胞集団に増殖の違いが見られたのか明らかにする必要がある。本研究では、歯根膜細胞のニッチェを構築するための脱細胞化マトリックスの作製と機能評価を行った。その結果、幹細胞を含む細胞集団と含まない細胞とで細胞増殖が異なることが明らかとなった。このような違いが生じるメカニズムを明らかにすることにより、歯根膜細胞のニッチェの生体外での再構築が可能になると期待できる。歯根膜細胞を維持するための脱細胞化マトリックスを作製するために、平成24年度は扱いやすい癌細胞を用いて、脱細胞化処理の検討を行い、脱細胞化マトリックスを作製し、実際に培養まで行った。さらに、脱細胞化マトリックスのキャラクタリゼーションを行うための評価系を立ち上げ、PCR法、免疫染色法によるECM成分の評価系、細胞増殖、細胞接着数の評価系を構築できた。上記の評価系を立ち上げたことから、平成25年度には、実際に歯根膜細胞、間葉系幹細胞、線維芽細胞を用いて脱細胞化マトリックスを作製する。さらに歯根膜細胞を培養し、その接着性、増殖能を評価する予定である。また分化能については骨芽細胞、脂肪細胞への分化に注目し、その評価系を一部立ち上げた。また平成24年度に研究系の立ち上げに作製した癌細胞の脱細胞化マトリックス上の機能を評価したところ、正常細胞が作製したマトリックス上では癌細胞の増殖が抑制された。このことは、発癌時において、癌細胞が増殖するためには、正常組織のECMを分解し、リモデリングを行う必要があることを示唆している。さらに、抗癌剤の耐性についても評価を行っている。癌細胞が作製したマトリックス上では、特に5-フルオロウラシルに対する耐性が、通常の培養プレートと比較して200倍以上亢進していた。この結果は、作製した脱細胞化マトリックスが抗癌剤のスクリーニング用の細胞培養基板として利用できる可能性があることを示している。新設の研究室であるために平成24年度には評価系の立ち上げ、脱細胞化マトリックスの作製方法の確立を行った。その結果、評価系、作製方法の確立を平成24年度に行うことができた。しかしながら、テーマである歯根膜細胞を用いたマトリックスをいまだ作製していないため、やや遅れていると判断した。平成25年度は実際に歯根膜細胞、間葉系幹細胞、線維芽細胞を用いて脱細胞化マトリックスを作製し、歯根膜細胞を培養する。培養した歯根膜細胞については、その接着性、増殖性、継代をした際の分化能について評価する。
木星極域起源の準周期的低周波電波バースト現象の励起過程に関する研究

木星極域の周期的な高エネルギー粒子加速・オーロラ発光等との関連が示唆されている準周期的低周波電波バースト現象Quasi-Periodic burst(以下、QPバースト)は、木星極域磁気圏における周期的で強力な粒子加速過程の情報を反映する重要な現象だと考えられている。しかし、その周期性(数分、15分、40分変動)の決定要因・発生領域・発生機構等の詳細は長年不明であった。本研究では、それらの根源的物理過程を考え、極域における粒子加速過程解明を目標に研究を行った。まず研究代表者は、カッシーニ探査機の波動データに基づき、励起機構に密接に関連のある、電波の偏波特性や到来方向を解析した。その結果、QPバーストの励起機構や伝搬過程に、新しい観測的制約を与える事ができた。また、電波伝搬モデリングと木星の低・高緯度領域で得られた偏波観測結果を組み合わせ、QPバーストの放射源位置や伝搬モードについて議論した。その結果、同現象はある特定の放射源位置とモードをもって励起している事が示唆された。さらに、示唆された放射源位置において、観測や伝搬モデリングと整合する波動が励起される可能性を、波動励起の理論計算に基づいて検証を行った。その結果、極域における高エネルギー粒子によって、観測・モデリングと整合する電波が励起される事が実証された。上記研究結果に関して、国内外の複数の学会において発表を行った。また、上記研究に関連する研究結果が、学術誌(Journal of Geophysical Research誌)に採択された。木星極域の高エネルギー電子バースト・急速なオーロラ発光等の物理過程と関連が示唆されている準周期的低周波電波バースト現象であるQuasi-Periodic burst(以下、QPバースト)は、木星極域磁気圏における周期的で強力な粒子加速過程の情報を反映する重要な現象だと考えられている。しかし、その様々な周期性(数分、15分、40分変動)の決定要因・発生領域・発生機構等の詳細は長年不明であった。本研究では、観測で認識されているすべての周期性のQPバーストに共通する周期性の決定要因・発生領域・発生機構等を考え、QPバースト発生の物理過程の総合的な解明を試みることを目標に研究を行った。本年度においてはまず、ユリシーズ・ガリレオ探査機によって観測された波動データに基づき、QPバーストの出現特性の統計解析をすべての周期性について行った。その結果、「QPバーストは木星近傍の特定領域では観測されない」等の、この現象に特有な出現特性が統計的に明らかになった。また、木星磁気圏中におけるQPバーストの伝搬課程をモデル計算し、観測で得られた統計解析と比較することによって、同現象の発生領域や発生機構を考察した。その結果、一部のQPバーストにおいては、今まで自己の研究において示唆された発生機構・発生領域等とは異なるものを持つ事が示唆された。現在はその差異についても考察中である。本年度得られた研究成果に関し、国内外の学会においてポスター・口頭発表を行った。また、本研究に関連のある研究結果をPlanetary and SpaceScience誌に投稿し、受理された。まず申請者は、QPバーストとそれに伴う粒子加速が、磁気圏内の変動に起因するのか、太陽風等の磁気圏外の変動に起因するのかを切り分けるために、磁気圏内の磁場変動や太陽風に関するデータ解析を行った。探査機の磁場データの解析から、QPバーストと同様の40分周期をもった磁気流体波成分の中に、特徴的な位相関係が検出された。また、ユリシーズ探査機の太陽風・波動データに基づき、QPバーストの出現と太陽風変動との対応も調査した。その結果、同現象の出現と太陽風変動の間に明確な関連は検出されなかった。この事から、同現象とそれに伴う粒子加速は、太陽風が直接的に励起するものでは無ことが示唆された。本研究は現在までに、QPバーストの出現特性解析と、電波伝搬のモデル計算を組み合わせることで、同現象の励起機構に対して新しい示唆を与えてきた。本研究はユリシーズ探査機の偏波観測により、示唆されたQPバーストの励起機構に関して観測的に検証を行った。その結果、本研究のモデル計算で示唆されている励起機構と矛盾しない観測結果が得られた。上記研究結果に関して、国内外の複数の学会において研究発表を行った。また、上記研究に関連する研究結果が、学術誌(Planetary and Space Science誌)に採択された。

まず研究代表者は、カッシーニ探査機の波動データに基づき、励起機構に密接に関連のある、電波の偏波特性や到来方向を解析した。その結果、QPバーストの励起機構や伝搬過程に、新しい観測的制約を与える事ができた。また、電波伝搬モデリングと木星の低・高緯度領域で得られた偏波観測結果を組み合わせ、QPバーストの放射源位置や伝搬モードについて議論した。その結果、同現象はある特定の放射源位置とモードをもって励起している事が示唆された。さらに、示唆された放射源位置において、観測や伝搬モデリングと整合する波動が励起される可能性を、波動励起の理論計算に基づいて検証を行った。その結果、極域における高エネルギー粒子によって、観測・モデリングと整合する電波が励起される事が実証された。上記研究結果に関して、国内外の複数の学会において発表を行った。また、上記研究に関連する研究結果が、学術誌(Journal of Geophysical Research誌)に採択された。
セルオートマトン法による駅構内複雑流動のシミュレーション

駅構内歩行者流動のシミュレーション名古屋に実在する鉄道会社の駅構内に於ける歩行者流動のシミュレーターを作成した.歩行に関するシミュレーターからのデーターと実データーとの比較対象を行い,構内に於ける歩行者流動がほぼ再現できたといえる.また,本シミュレーターでは,駅構内への障害物の配置が自由に出来るようになっている.これらのことによって,駅構内に於ける歩行流動を制御するための各種の方策を,シミュレーションによって評価でき,日常的な駅の利用者へのサービス向上をはかる,緊急時に於ける避難方策の策定などに寄与できる.本シミュレーターで構築したモデルは,設計段階での建物に適用し,建物内の歩行者流動の予測にも利用できると考えられる.避難流動のシミュレーション障害物,避難誘導員,避難標識,出口などの任意個数の設置が可能なシミュレーターを作成し,様々な設定での自然な避難流動を再現できることが確認された.煙も試行の段階であるが,組み込み,拡散する煙の中を避難する歩行者流動の再現に成功している.用いられたモデルとアルゴリズムを用いて,実際の高層建物内に於ける避難流動の再現が可能であり,緊急時に於ける避難計画の策定を,流動を創発させながら討することが可能である.基本セルオートマトンのカオス・フラクタル性についてウルフラムクラスIに属するルール番号40及び168の基本セルオートマトンが,カオス性を持つこと及び多様なリアプノフ指数の値を持ち得ることを具体的な計算によって示した.このことによって,ウルフラムのクラス分類が,十分でないこと,基本セルオートマトンの中に多様な様相を呈するものがあり,これらが複雑現象の簡明なモデルとしての使用可能性が示唆される.駅構内歩行者流動のシミュレーション名古屋に実在する鉄道会社の駅構内に於ける歩行者流動のシミュレーターを作成した.歩行に関するシミュレーターからのデーターと実データーとの比較対象を行い,構内に於ける歩行者流動がほぼ再現できたといえる.また,本シミュレーターでは,駅構内への障害物の配置が自由に出来るようになっている.これらのことによって,駅構内に於ける歩行流動を制御するための各種の方策を,シミュレーションによって評価でき,日常的な駅の利用者へのサービス向上をはかる,緊急時に於ける避難方策の策定などに寄与できる.本シミュレーターで構築したモデルは,設計段階での建物に適用し,建物内の歩行者流動の予測にも利用できると考えられる.避難流動のシミュレーション障害物,避難誘導員,避難標識,出口などの任意個数の設置が可能なシミュレーターを作成し,様々な設定での自然な避難流動を再現できることが確認された.煙も試行の段階であるが,組み込み,拡散する煙の中を避難する歩行者流動の再現に成功している.用いられたモデルとアルゴリズムを用いて,実際の高層建物内に於ける避難流動の再現が可能であり,緊急時に於ける避難計画の策定を,流動を創発させながら討することが可能である.基本セルオートマトンのカオス・フラクタル性についてウルフラムクラスIに属するルール番号40及び168の基本セルオートマトンが,カオス性を持つこと及び多様なリアプノフ指数の値を持ち得ることを具体的な計算によって示した.このことによって,ウルフラムのクラス分類が,十分でないこと,基本セルオートマトンの中に多様な様相を呈するものがあり,これらが複雑現象の簡明なモデルとしての使用可能性が示唆される.1.駅構内の群衆流動シミュレーションについての研究エージェントの意志決定モデルとして,中領域と近傍領域の二種類の情報処理を組み込んだシミュレーターを作成し,シミュレーターから創発させられたデーターと現場の生データとがよく一致することが確かめられた.これらの成果は論文として投稿準備中である.今後は,アルゴリズムの改善を行う.2.緊急時避難流動シミュレーションについての研究避難時における誘導員の導入,障害物の高低など現実的な要素を組み込んだシミュレーターを作成し,常識的に考え得る現象の再現に成功している.このことによって,作成されたシミュレーターによる様々なシミュレーションが可能になった.作成されたシミュレーターについては,学会発表を行うとともに論文としてまとめられ投稿中である.今後はさらに煙などの要素を現実的に組み込むとともにアルゴリズムの改善を行う.また,現実的な施設における避難流動の予測への適応を試みる.3.セルオートマトンが定義する離散力学系の性質についての研究ウルフラムクラスIに属するルール番号40のセルオートマトンが定義する離散力学系がデバネイの意味でカオス性をもつこと,任意に与えられた1/2以上1以下の値に対して,それをリアプノフ指数とする初期configurationが存在することを証明した.前者は論文として現在投稿中であり,後者は京都数理解析研究所での研究集会で発表済みであるが,国際会議での発表も準備中である.今後は,基本セルオートマトンの詳細な性質の検証と相互関係の明確化を目指す.1.駅構内の群衆流動シミュレーションについての研究名古屋に実在する鉄道会社の駅構内に於ける歩行者流動のシミュレーターについて,昨年度までのアルゴリズムを簡明化することに努めた。この結果,シミュレーターからの歩行データーと現場の生データーとの比較対象を行い,駅構内の於ける歩行流動がほぼ再現できたと考えられる。また,昨年度一部に見られたデーター間の不一致が解消された。さらに,障害物配置がマウス操作によって容易に出来るようになった。今後は,アルゴリズムの改善を行い,集札口周りの歩行流動の改善を図る。これらの研究については,学会発表を通して社会へ公表済みであり,論文として投稿する予定で,現在準備中である。2.緊急時避難流動シミュレーションについての研究昨年度までの,成果を活用しながら,研究代表者が勤務している大学校舎内の避難流動のシミュレーターを開発中である。これについては,学会発表を通じて社会に報告する予定である。

3.セルオートマトンが定義する離散力学系の性質についての研究ウルフラムクラスIに属するルール番号40のセルオートマトンが定義する離散力学系がデバネイの意味でカオス性をもつことを国際会議で報告した。さらにルール番号168のセルオートマトンもまたカオス性を持つことを示した。今後は,基本セルオートマトンの詳細な性質の検証と相互関係の明確化を目指す。
子宮頸がん撲滅へ向けての至適検診法導入への取り組み

子宮頸癌の至適検診制度を模索するため、住民検診(細胞診ーHPV検査併用)をフィールドとして研究を行った。1細胞診ASC-USでのHPV検査トリアージの実態調査、2細胞診単独年と併用検診の比較、3細胞診単独と併用検診のコスト比較、4検診受診率上昇のための施策検討、等を行った。ASC-US・HPV陽性群におけるCIN+(子宮頸部上皮内腫瘍以上)発生頻度と疾患構成分布がLSIL群とほぼ同じであることを示した(Asian Pac J Cancer Prev. 2019;20:81-85)。また細胞診単独年と比較は細胞診3万4千人、併用検診2万人の比較検討から、精検率は1.9%から4.3%と2.2倍に増加したが、CIN2+以上の年間発見数は2.8倍に上昇し、逆に精検受診者における正常者の割合(疑陽性率)は約40%減少した。併用検診でCIN1を含めると細胞診単独に比べ、多くの精検受診者を抽出するが、細胞診単独と比べてCIN2+の陽性反応的中率は上昇していることが示された。また3年単位でみると併用検診で総費用は30%上昇したが、CIN2+が数多く発見されているため、これを1名発見するコストは逆に25%減少した。コスト面からみても併用検診は利益があると考えられた(The 60th Annualmeeting of the JSGO,Kyoto,Sep 14-16,2018)。検診率に関する研究では、複数種類の検診案内を作成し各々の受診率がどのように変化するかを検討した。検診案内にある程度の検診に伴うリスクを説明したとしても検診率が下がらないことを示した(Arch Public Health. 2015;73:7)。検診の疫学的調査に加え、頸がん早期発見や予後に関するバイオマーカーなどの検出へ向けての基礎研究も並行して行ったが、最終的に検診に寄与するバイオマーカーの発見には至らなかった。小山地区の併用検診は順調に行われており、また検査結果の集積も予定通り行われている。2013年12月までで検診受診者は16,102人、うち併用検診を希望しなかった34人(0.21%)を除く16,068人のデータを集積した。細胞診NILM/HPV(-) 14,817人(92.2%)、細胞診NILM/HPV(+) 401人(2.5%)、ASC-US 469人(2.9%)、細胞診異常(LSIL)381人(2.4%)であった。生検結果が得られたものを精検群として集積し、併用検診の精度を検討する準備にはいっている。一方、追加で行う免疫染色等の検討も行っている。現在染色候補物質をどの段階で本研究に組み込むかの協議をおこなっているところである。同時に子宮頸がんに特異的なmicroRNAの検索も開始した。予後や発症予測マーカーとして新規に利用可能なマーカーが無いかを網羅的に検査する予定である。小山地区の併用検診は順調に3年目に入り継続して行うことが出来ている。また検診結果の集積も予定通り行われている。2014年6月(集計時点)までで17,840人である。2013年度からの受診者数の増が少ないのは、本検診では細胞診、HPV検査両方の結果が陰性、すなわちdouble-negativeの受診者は3年後の受診となるためであり、予定通りの推移である。不同意は35名(0.20%)であった。本年度は細胞診陰性ーHPV陽性群と細胞診ASC-US-HPV陰性群の2群が1年後に再受診した結果が得られた。細胞診陰性ーHPV陽性群は240名、うち1年後受診は131名(54.6%)であり、検診により60名(45.8%)が精密検査にまわった。うち12名にCIN1が、1名にCIN3が見つかった。一方、細胞診ASC-US-HPV陰性群は156名、うち1年後受診は100名(64.1%)であり、検診により精密検査となったものは3名(3%)にとどまった。このように同じ1年後受診を指示した群間で有病率に有意な差を見つけることができた。本結果は今後の検診間隔を決定する上で重要な結果となった。同地区において、検診受診率を上げる施策も検討した。受診勧奨はがきを数種類作成し、種類別の受診率測定をおこなった。年初勧奨にて検診未受診の20ー39歳の1,912名をランダムに3群に分け、受診再勧奨を行う前向きのRCTを行った。この結果、受診の利益、不利益を勧奨はがきに掲載しても受診率を下げることが無いことを論文として発表した(Fujiwara H et al. Arch Public Health. 2015 )。小山地区の併用検診は順調に4年目に入り継続して行うことが出来ている。総受診者数は2012年度から2014年度(2015.3まで)までの3年間で21,615人に達した。