hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
認知機能改善薬ST101誘導体の標的分子の機能解明と創薬研究

SAK3 (0.5mg/kg)を経口投与するとT型カルシウムチャネルを介して、海馬のアセチルコリン遊離を促進した。嗅球摘出マウスに経口投与すると、海馬のCa2+/カルモデュリン依存性プロテインキナーゼII(CaMKII)を活性化して認知機能を改善した。さらに、アルツハイマー病モデルAPP23マウスに3ヶ月間SAK3(0.5mg/kg)経口投与すると大脳皮質におけるアミロイドベータ蛋白質の蓄積を抑制し、認知機能を改善することを確認した。安全性と薬物動態について前臨床試験を実施している。電気生理実験および細胞実験において、SAK3のST101に対する優位性のPOCを取得した。さらに、アルツハイマー病モデル動物APP23マウスでアミロイドベータ蛋白質産生抑制のエビデンスを得ることができた。27年度が最終年度であるため、記入しない。神経薬理学慢性投与APP23マウスの大脳皮質の遺伝子のマイクロアレイ解析により、アミロイドベータ蛋白質産生抑制にメカニズムを追究する。さらに、ラットをもちいた薬物動態試験により、脳内動態を明らかにすることでST101に対する優位性を証明する。ST101のシーズとしての最適化を進めるために、誘導体を合成し、その中で活性の高いSAK3について国際特許(PCT/JP2013/51388)を出願した。ST101およびSAK3の中枢神経系の作用機序としてアセチルコリン遊離促進作用を確認した。アルツハイマー病モデルマウスにSAK3を2ヶ月間投与して、アミロイドβ産生抑制に対する効果をドネペジルと比較検討する。アルツハイマー病モデルマウスにおいてSAK3慢性投与後に、脳内におけるアミロイドβの代謝関連遺伝子について検討し、アミロイドβ産生抑制の機序を明らかにする。T型カルシウムチャネルは心臓においても発現が高いことから、心臓毒性について検討する。
キャリア密度を制御したバイモーダルな結晶粒径分布を持つ高性能熱電変換材料の創製

酸化亜鉛ZnO系化合物について、キャリア密度を制御した大小2つの結晶粒径(バイモーダルな結晶粒径)から成る複合焼結体を作製し、その熱電特性を評価した。錯体重合法により粒径1μm程度の(Zn0.898Mg0.1Al0.002)O粉末を、ホットプレス法により粒径25μmの(Zn0.99Al0.01)O粉末を得た。これら2種類の粉末から作製した複合焼結体の電気伝導率および熱伝導率は(Zn0.99Al0.01)O粉末の体積分率が増加するにつれて単調に増加する傾向が見られ、無次元性能指数ZTは(Zn0.99Al0.01)Oの体積分率が約33.3%の試料において1073Kで最も高い0.12が得られた。本研究は、キャリア密度を制御した大小2つの結晶粒から成る複合焼結体(バイモーダルな結晶粒径分布を持つ焼結体)を作製し、その熱電特性を評価することを目的とする。スクッテルダイト化合物CoSb3および酸化亜鉛ZnO系について検討を行った。CoSb3系については、粗大結晶粒粉末としてCoSb3インゴットを乳鉢で粉砕し、篩により粒径32μmから63μmの範囲になるように分級したものを、微細結晶粒粉末としてメカニカルミリング処理により粒径1μm以下となるように調整したものを用意した。粗大結晶粒粉末から作製した焼結体の573Kの電気伝導率σは229.8SCm-1、熱伝導率κは4.89Wm-1K-1、微細結晶粒粉末から作製した焼結体のσは158.4Scm-1、κは4.23Wm-1K-1であり、粒径制御によりσおよびκの異なる粉末粒子を作製できた。これら粉末の混合物を焼結して作製した複合焼結体では、粗大結晶粒粉末の体積分率の増加とともに電気伝導率σおよび熱伝導率κは単調に増加し、無次元性能指数ZTは微細結晶粒のみから成る焼結体で673Kにおいて最大0.15が得られた。ZnO系については、溶液化学的手法の一種である錯体重合法により粒径1μm程度の(Zn0.898Mg0.1Al0.002)Oの組成を持つ粉末を作製した。一方、錯体重合法およびホットプレス法により(Zn0.99Al0.01)Oの粒径25μmの粉末を得た。この系においては、Alの添加量を変えることにより試料のσを、Mg添加によりκを制御することができた。これら2種類の粉末から作製した複合焼結体のσおよびκは(Zn0.99Al0.01)O粉末の体積分率が増加するにつれて単調に増加する傾向が見られ、ZTは、(Zn0.99Al0.01)O粉末の体積分率が約30%の試料において最も高い0.13が得られた。平成24年度は主に酸化亜鉛ZnO系熱電変換材料について検討を行った。ZnOの電気伝導率は絶縁体に近いほど小さいが、Znの一部(2%)をAlで置換することにより適度な電気伝導率を示すようになる。(Zn0.99Al0.01)Oの組成を持つ酸化亜鉛粉末を錯体重合法により作製した。錯体重合法は金属ークエン酸錯体の形成と、その後のクエン酸とエチレングリコール間の脱水エステル化重合反応を基本とする溶液化学プロセスの一種である。得られた粉末をホットプレスにより1373Kで80MPaの加圧下10時間熱処理して焼結体とし、メノウ乳鉢で粉砕して粒径25μmの粉末を得た。一方、錯体重合法により粒径1μmの(Zn0.898Mg0.1Al0.002)Oの粉末を作製した。ここで、Alの添加量を変えることにより試料のキャリア密度を制御することが可能であり、またMg添加は格子歪みの導入による熱伝導率低減の効果が期待される。実際、(Zn0.99Al0.01)O粉末から作製した焼結体の1073Kにおける電気伝導率σは1.1×10-7Sm-1、熱伝導率κは7.5Wm-1K-1であり、(Zn0.898Mg0.1Al0.002)

O粉末から作製した焼結体のσは2.8×10-8Sm-1、κは5.4Wm-1K-1であった。これら2つの粉末から作製した複合焼結体のσおよびκは、(Zn0.99Al0.01)O粉末の体積分率が増加するにつれて単調に増加する傾向が見られた。一方、無次元性能指数ZTは、(Zn0.99Al0.01)O粉末の体積分率が約30%の試料において最も高くなる傾向が見られ、1073Kにおいて最大0.13の値が得られた。高電気伝導率(σ)および高熱伝導率(κ)を有する結晶粒と、低σおよび低κを有する結晶粒から成る複合焼結体では、前者の体積分率が小さい時はそのσは小さな値に保たれるが、約30%に達したところで急激に増加する現象がしばしば観測される。このような現象はパーコレーション現象として知られている。一方、κには一般にパーコレーション現象は観測されない。パーコレーション現象を記述するBruggemanによる理論式に従えば、高σ、κの成分の体積分率が約50%の組成においてσ/κの値が上昇することが予測される。σ/κは熱電変換材料の性能を示す無次元性能指数ZT(=S2・σ・T/κ、Sはゼーベック係数、Tは温度)に比例することから、σ/κの値の上昇は熱電変換材料の性能向上につながる可能性がある。パーコレーション現象を記述するBruggemanの理論式によれば、高電気伝導率(σ)および高熱伝導率(κ)の成分と、低σおよび低κの成分から成る複合体のσ/κの値は、両成分のσおよびκの差が大きいほど大きくなる。たとえば、両成分のσおよびκの比がともに1:0.1である場合は、複合体のσ/κの値はそれぞれの成分単独の場合に比べて最大1.2倍程度であるが、1:0.01である場合は4倍以上になる。平成24年度に作製した(Zn0.99Al0.01)Oと(Zn0.898Mg0.1Al0.002)Oでは、σの比は1:0.26、κの比は1:0.7程度であり、かなり小さかった。従って、複合体化によりσ/κの値を上昇させるには成分のσおよびκの差をもっと大きくすることが必要である。そこで、25年度ではたとえば(Zn0.898Mg0.1Al0.002)O粉末のメカニカルミリングによる結晶粒微細化によるσおよびκの減少、(Zn0.99Al0.01)O粉末の高温長時間熱処理による結晶粒成長によるσおよびκの増大などの手法により必要な特性を有した粉末の調整を行い、これら粉末より複合焼結体を作製してパーコレーション現象によりσ/κおよび無次元性能指数ZTの向上が達成できるかを検討する予定である。平成25年度も24年度同様、粉末試料の合成および複合焼結体の作製、その熱電特性評価の実験を継続して行っていく予定である。試料作製用として高純度試薬、石英反応管、ホットプレス焼結用カーボンダイス、パンチ棒等の購入が必要である。また、熱電特性測定用として高純度ガス、白金線などの購入を予定している。成果報告および情報収集のための出張旅費、特に25年度は熱電変換に関する国際会議ICT2013が神戸市にて開催されるため、その参加登録費および出張旅費が必要である。
極微な領域規制に基づくメソ薄膜の形態発現と光応答系の創成

約30年前に研究が創始された液晶配向プロセスは、すでに液晶ディスプレイの製造にも応用され産業的にも重要であるが、その現象の基礎的理解には未解明な部分が多い。本研究では、これまで扱われてこなかった、高分子液晶物質が微小な構造をもつ場合や、凹凸形成を伴う膜を対象として、その挙動を解明することを目的とした。具体的には、ブロック共重合体のミクロ相分離構造の光配向、インクジェット塗布した際の微小領域での相分離挙動、光応答リンクル形成等を対象とし、光配向プロセスにおける新たな展開と理解の深化を進めた。また、研究途上での予期せぬ展開として、高分子液晶膜の配向を空気側から制御する新たな光配向手法も提案した。1)微小領域規制に基づく形態発現と光応答高分子システムの構築平成23年度にSIJテクノロジ製超微量インクジェット加工装置を購入し、その立ち上げを行った。アゾベンゼン液晶高分子を中心として、溶媒や濃度さらには基板の種類を変化させ微小液滴噴霧のための適切な条件を探索した。現在その条件設定は継続中である。基礎データとして、今後研究に供するために新たなアゾベンゼンを持つブロック共重合体を合成し、相分離挙動を薄膜状態にて観測した。今回、室温にて結晶性のオクタデシル基を側鎖として有するブロックと液晶性アゾベンゼンのブロックからなるラメラ構造を有するジブロック共重合体を合成した。ラメラ周期は光反応により変化し、ある膜厚以下の薄膜状態では、このジブロック共重合体はラメラが垂直する配向をとることがわかった。この垂直ラメラ構造は適切な条件下偏光照射にて面内にある程度配向させうることもわかった。こうした配向状態は、AFM観測、紫外可視吸収スペクトル観測、斜入射X線散乱(GI-SAXS)測定等によって確認した。2)光応答表面リンクル形成膜厚5mm程度のシリコーンエラストマー基板を作製し、親水化処理したシリコンウエハー上に液晶性アゾベンゼン高分子を成膜しこれをシリコーンに転写することで表面膜を設けた。エラストマーを圧縮することでリンクルが形成されることを確認し、表面膜の膜厚を変えることによりリンクル周期が変化することも確認した。紫外光照射により、リンクル周期が減少するあるいは消滅することがわかり、光照射でアゾベンゼン薄膜の弾性率が大きく変化することを見出した。サブフェムトトリットルの超微量液滴から得る高分子ブレンド膜、ブロック共重合体膜、有機無機ハイブリッド膜の構造や物性の諸特性の解明と展開、および表面リンクル現象の光制御に関する新たな高分子機能化学の創成を行う。高度に次元規制を受けた膜状態からいかなる自己集合現象を示すかについて詳細かつ系統的な理解を得るとともに、それに基づく階層構造を有する新たな光応答システムの構築を目指す。平成24年度は以下の結果を得た。1)微小領域規制に基づく形態発現と光応答高分子システムの構築超微量インクジェット装置にて、ポリメチルメタクリレートとπ共役系高分子のブレンドにて塗布条件を種々検討し、1μm程度の径で塗布できる条件を探索した。その相分離構造を分子間力顕微鏡に手観測したところ、スピンキャスト膜よりかなり小さいブロック共重合体レベルでの特性サイズの相分離構造が形成されることわかった。アゾベンゼン高分子とポリスチレンのブロック共重合体膜において、表面張力の小さいブロック共重合体を少量混合してアニール処理することでこのポリマーが表面偏析をし、空気界面からのメソゲン配向制御が可能であることがわかった。2)光応答表面リンクル形成膜厚5 mm程度のシリコーンエラストマー基板を作製し、親水化処理したシリコンウエハー上に液晶性アゾベンゼン高分子を成膜しこれをシリコーンに転写することで表面膜を設けた。リンクル周期が光照射で変化することからアゾベンゼン薄膜の弾性率が大きく変化すること考えられるので、本基盤研究で購入したプローブ顕微鏡にて光照射による表面の弾性率の変化を定量的に評価した。その結果、リンクルの周期変化と良い相関が得られることがわかった。一方、転写による方法では、表面薄膜の剥離の可能性があることが判明したので、表面をアゾベンゼン高分子でグラフトする手法に着手した。1.微小領域規制に基づく形態発現と光応答高分子システムの構築:微小領域規制の系として、高分子ブレンド系およびブロック共重合体系を扱っている。ブレンド系については、本研究で購入した超微小インクジェット装置を用い、微小領域にて、スピンコート等の通常の製膜では得られない、ブロック共重合体のミクロ相分離に匹敵するレベルの相分離構造が得られることを見出した。ブロック共重合体薄膜系では、微小領域の制御に先立ち、スピンコート薄膜でのミクロ相分離構造の光配向挙動の把握を進めた。ミクロ相分離構造の方位を偏光を用いて変換できることを明らかにし、その過渡的変化に対するリアルタイム観測を放射光施設(つくばPF)にて行った2.光応答表面リンクル形成:シリコーンエラストマー膜の表面上に液晶性アゾベンゼン薄膜を設ける手段として、薄膜の転写と表面グラフト重合を行った。これらの方法により、リンクルの形成とその消去が光で可能であることを見出した。紫外光でパターニングを行うことで、未露光の部分のみリンクルが生じ、リンクル構造自身の光描画が可能であることを示した。3.ブロック共重合体薄膜の光配向及び空気表面からの液晶材料の光

配向制御:ブロック共重合体のミクロ相分離構造の光配向のスイッチング挙動の観測を進めるうちに、空気界面の制御がホモポリマー液晶系とブロック共重合体系ともに本質的に重要であることが明らかとなった。光配向表面はこれまで専ら固体基板が用いられており、多くの知見が得られている。本研究では空気側の表面に設けた20 nm程度のアゾベンゼンブロック共重合体の超薄膜を用いて、空気側から高分子液晶膜の分子配向を光で自由に制御する方法を初めて提案した。1)微小領域規制に基づく形態発現と光応答高分子システムの構築:種々の高分子ブレンドについて超微量インクジェット加工装置を用いて塗布し、相分離挙動を観測した。p型とn型の共役高分子のブレンドについて混合に関する情報をAFMおよび蛍光挙動により観測した。一方で、高分子表面での描画された高分子のアニーリング時の拡散挙動に関して高分子同士の濡れ性とのかかわりで興味深い挙動を観測した。2)光応答表面リンクル形成:PDMSエラストマー表面にアゾベンゼン高分子液晶の薄膜を設けた系において、アゾベンゼンを光照射でシス型にすることで、リンクルが消滅する現象を見出した。また、光応答しないメソゲンとの共重合体にて、リンクル波長を光で変化させうることも示した。3)空気界面からの高分子液晶の配向制御:シアノビフェニルを側鎖にもつ高分子液晶にて、主鎖がアクリレートかメタクリレートでメソゲンの配向が大きく異なる現象を見出した。これらの高分子液晶薄膜の表面に異なる高分子をインクジェット加工装置にて描画することで、空気界面の作用でメソゲンの配向パターニングができることも示した。4)光配向プロセスの高度化と多様化:光二量化を起こす側鎖を持つ液晶において、その光配向挙動をNEXAFS分光により、表面とバルク膜の配向状態を比較し評価する手法を開発した。申請者らは、液晶性高分子薄膜を中心とした界面での光形態制御や配向現象について系統的な知見を蓄積してきたが、膜形態は巨視的なものに限られてきた。本研究では、二次元方向にも極微界面の規制を加えた膜系の検討を発案する。具体的には、サブフェムトリットルの微小量液滴から得る高分子ブレンド膜、ブロック共重合体膜、有機無機ハイブリッド膜の構造や物性の諸特性の解明と展開、および表面リンクル現象の光制御に関する新たな高分子機能化学の創成を行う。高度に次元制御を受けた膜形態からいかなる自己集合現象を示すかについて、詳細かつ系統的な理解を得るとともに、そえに基づく階層構造を有する新たな光応答システムの構築を目指した。また、本研究の遂行に不可欠な光配向プロセスの高度化と多様化を進めることも目的とした。期待以上といえる以下の成果が得られた。1)エラストマー上に形成させた液晶性高分子の光反応により、表面リンクルの自在な操作ができることを示した。2)空気界面からの高分子液晶の配向制御に関して、シアノビフェニル系高分子では、主鎖がポリアクリレートかポリアクリレートで全く配向が異なることを見出し、その要因が空気界面からの配向作用であることをインクジェット法を用いて明確に示した。また、エネルギーの低いX線を用いるなどして、薄膜内での液晶メソゲンの配向の膜厚方向のプロファイルを示した。3)光異性化を示す表面膜により、シアノビフェニル液晶の配向を光で可逆的にスイッチングできることを見出した。
Boron10・モノクローナル抗体による癌の選択的原子炉療法の研究

本研究の特色は癌細胞表面にある多種の坑原エピトープに夫々特異結合する多種類の単クローン抗体(MoAb)を作成し、これを【^(10)B】担体とした【^(10)B】MoAbを合成投与して熱中性子捕捉療法を行う点にある。単独でも有効であるが、今迄開発して来た代謝活性利用の方法(例えばp-borono-phenylalanine塩酸塩【^10B-1】-BPA・HCl投与下で同療法を行う黒色腫治療)を併用すれば相加相乗効果が期待できる。下記の業績も両者に跨っている。1.NaHをNa・【^10B-12】【H_(11)】N【H_3】に働かせ【H_3】を【Na_3】に置換後Cl【CH_2】COO【CH_3】と反応、水解。Na・【^10B-12】【H_(11)】C【H_2】COOHと推定される生成物をcarbodiimide法でpoly-D,L-lysineに付加。【^(10)B】含量は高いが水に不溶。水溶化して抗体へ結合の予定。2.肺癌患者リンパ球とマウス骨髄腫の融合株より得た単クローン抗体4G12はIgM入型で、組織染色で広い悪性腫瘍特異性を示す。良性腫瘍に無反応。ヒト肺癌ヌードマウスに投与した【^(12G)I】標識4G12の腫瘍/筋肉濃度比は高く42。3.Top【II】の阻害剤novobiocinは遅い(S-)PLD修復も阻害する。抗癌剤mAMSA,VP16,VM26も亦Top【II】を阻害するので3者のS-PLD修復阻害の有無、PLD修復とTop【II】の関係を研究中。4.【^nB-1】・BPA・HClをcarboxymethy 1-cellulose含有生理食塩水に溶解、中和して得た懸濁液を用い、ラット腹腔内と皮下投与で急性毒性(【LD_(50)】)3,000mg/kg)、1日1回28日間ラット皮下投与で亜急性毒性(0,300,700,1500mg/kgで体重・摂食・摂水量)試験。副作用無。5.鉛製コリメータを製作し、患部以外の被曝を低下。細胞内【^(10)B】濃度分布を考慮した吸収線量計算から見た細胞生残率データの評価。生体内重水濃度を高めて深部照射する可能性を検討。6.【B_1】-BPA・HCl水溶液はpH1の強酸性、中和すれば沈澱生じ静注不適。糖との錯体形成を利用しこの難点を解決。例えばpH8のfructose液100mlは【B_1】-BPA 3gを溶解。7.ICR/NFS4元交配のMCH(AF)ヌードマウスにヒト・マウス黒色腫を移植した実験系で【^10B-1】-BPA投与+中性子照射群は中性子単独群に較べ有意に増殖抑制。良性腫瘍に無反応。副作用無。

5.鉛製コリメータを製作し、患部以外の被曝を低下。細胞内【^(10)B】濃度分布を考慮した吸収線量計算から見た細胞生残率データの評価。生体内重水濃度を高めて深部照射する可能性を検討。6.【B_1】-BPA・HCl水溶液はpH1の強酸性、中和すれば沈澱生じ静注不適。糖との錯体形成を利用しこの難点を解決。例えばpH8のfructose液100mlは【B_1】-BPA 3gを溶解。7.ICR/NFS4元交配のMCH(AF)ヌードマウスにヒト・マウス黒色腫を移植した実験系で【^10B-1】-BPA投与+中性子照射群は中性子単独群に較べ有意に増殖抑制。
6階層モデルに基づくマルチモーダル対話システムのフレームワーク構築と実装

本研究ではマルチモーダル対話システムの6階層モデルを情報処理学会試行標準委員会の標準として取り纏め,公開を行った.また,6階層モデルに基づいたマルチモーダル対話システムのプロトタイプとして,一般的なWebブラウザからアクセス可能なマルチモーダル対話システムのプロトタイプを開発した.本研究ではマルチモーダル対話システムの6階層モデルを情報処理学会試行標準委員会の標準として取り纏め,公開を行った.また,6階層モデルに基づいたマルチモーダル対話システムのプロトタイプとして,一般的なWebブラウザからアクセス可能なマルチモーダル対話システムのプロトタイプを開発した.本研究では,マルチモーダル対話システムの6階層モデルの仕様策定,階層間APIの標準化,および参照システムの構築と公開を行い,研究者間で共通に利用できるマルチモーダル対話システムのプラットホームとして完成させることを目指している.平成20年度は6階層モデルの各階層の詳細と,階層間APIに関して,以下の内容を検討した.・各層に関して,標準の記述言語を決定する予定であったが,フレームワークの自由度を高めるため,特に標準言語は設けないことにした.・階層間の情報授受について,ソケット通信等を利用した通信のメッセージ/イベントをまとめた.・以上の検討項目を文書かまとめ,情報処理学会の試行標準として公開の準備作業を行った.また,情報処理学会試行標準委員会のひとりのメンバーがW3Cのf2fミーティングにおいて本取り組みに関する報告を行った.本研究では,マルチモーダル対話システムの6階層モデルの仕様策定,階層間APIの標準化,および参照システムの構築と公開を行い,研究者間で共通に利用できるマルチモーダル対話システムのプラットホームとして完成させることを目指している.平成21年度は6階層モデルの標準化とプロトタイプシステムの開発に関して,以下の項目を実施した.・昨年度までに検討してきたマルチモーダル対話システムの6階層モデルについて,各階層の役割,および階層間APIを文書化した.また,この内容を情報処理学会試行標準委員会に提出し,平成22年2月3日に第12番目の試行標準として公開した.URLは13.の備考を参照されたい.・上記の施行標準に従ったマルチモーダル対話システムとして,PC上の一般的なブラウザで動作するwebベースのマルチモーダル対話システムを試作した.このシステムは申請者らがGalateaプロジェクトおよび音声対話技術コンソーシアム(ISTC)において開発を進めてきたGalateaツールキットをベースにしており,実写真から作成した擬人化エージェントとのマルチモーダル対話をwebブラウザ上で行うことができる.ブラウザ側の処理はデファクトスタンダード(Flash, Java Applet, Java Script等)のみを利用して実現しているため,一般的なwebユーザが特別なソフトウェアやプラグインをインストールすることなくマルチモーダル対話を体験できる.6階層モデルに準拠することによりシステムの構成変更に対する柔軟性が増したことから,モダリティや対話記述言語を切り替えることが容易になった.本研究では,マルチモーダル対話システムの6階層モデルの仕様策定,階層間APIの標準化,および参照システムの構築と公開を行い,研究者間で共通に利用できるマルチモーダル対話システムのプラットホームとして完成させることを目指している.このうちマルチモーダル対話システムの6階層モデルの仕様策定および階層間APIの標準化については平成21年度までに完了している.平成22年度は参照システムの構築の一環として,マルチモーダル対話システムのプロトタイプ開発に関して,以下の各項目を実施した.・多様な端末で動作するマルチモーダル対話システムの実現を目指して,スマートフォン上で動作するシステムを試作した.このシステムは平成21年度に作成したPC上の一般的なブラウザで動作するマルチモーダル対話システムをベースに構築した.・ユーザとシステムとのシームレスなマルチモーダル対話を実現するために,対話エージェントが端末間を自由に行き来するためのシステムのアーキテクチャとプロトコルを検討した.また,プロトタイプを作成して,PCとスマートフォンの間を対話エージェントが移動することを確認した.・開発者が容易にマルチモーダル対話システムを開発できるよう,Webアプリケーションの開発にしばしば用いられるJavaScript用の対話APIを作成した.これによりエージェントによる発話,エージェントの移動,ユーザの発話受付やマルチモーダル入力等がJavaScriptプログラム内で自由に記述できるようになった.
微小振動波を利用した生体内硬度画像の開発と臨床応用に関する研究

1.前年度までの振動発生装置では、剖検肝、切除肝では出力が不十分と考えられたため、高出力の振動発生装置を再度開発し、ファントム実験からやり直した。2.実験用ファントムは、前年度までのファントムと同様に硬度の異なるものを複数作成した。これらを用い、高出力振動発生装置の機能を検証した。3.高出力振動発生装置では、前年度までの発生装置より更に均一な振動波が、ファントムのより深部にまで到達することが確認された。4.人の剖検肝の内部を伝播する振動波を画像化することに成功した。5.正常肝と硬変肝とのMR硬度画像における硬度の違いが描出された。肝の線維化の違いが硬度に反映され、さらに硬度画像上で、正常肝と硬変肝が識別可能であることが示唆された。6.切除された肝腫瘍内を伝播する振動波を画像化することに成功した。柔らかい腫瘍である肝細胞癌内では波長が短く、硬い腫瘍である胆管細胞癌や転移性肝細胞癌内では、波長が長くなることが確認され、肝腫瘍の鑑別に有用であると考えられた。7.生体組織硬度計を用いて測定した硬度の実測値と、MR硬度画像における硬度を比較すると有意な相関が見られ、MR硬度画像は、正確に硬度を反映するものであることが証明された。8.今後は超高速撮影による撮影時間の短縮、振動発生装置の改良を行い、生体への応用、その有用性を確立する予定である。1.周波数、出力ともに可変の、1000Hz以下の振動波の発生装置を開発した。振動発生装置は、磁性体を用いず、均一な横波を対象に照射できるものとした。2.測定システムとして、sequenceを修正するためのparameter-generator、wave-generatorとして、MFG206 functiongeneratorを用いた。Wave generatorとaudio amp.間には、オシロスコープを設置し、電圧や波形を観察しながら実施するシステムを構築した。3. MR撮影に関しては、各種のパルスシークエンスを比較した結果、FLASH法が最適と考えられた。4. MR撮影時には、すべての起点をトリガーパルスとし、トリガーパルスからMPGパルス印加までの時間(delay time)が可変となるよう、シークエンスソフトを改良した。5.以上の方法で、ファントム内を通過する振動波を画像として描出することに成功した。さらに、delay timeを変化させることにより、振動波の到達深度の異なった画像が得られた。6.来年度は、硬度が判明した複数のファントムを使用し、硬度とMRにより計測された硬度との比較を行う。さらに、動物臓器あるいはボランティアを用い、硬度計測を試みる予定である。1.昨年度作成した、周波数、出力ともに可変な、1000Hz以下の振動発生装置、トリガーパルスからMPGパルス印加までの時間(delay time)が可変となるよう改良したシークエンスソフトを用い、ファントム実験を行った。2.ファントムは、内部硬度が均一で硬度の異なるファントムを複数作成した。また、硬度の異なるファントムを内部に包括するファントムも作成した。これらを用い、MR画像の違いについて検討した。3.硬度のことなる物質内を通過する際には、振動波の波長が変化し、屈折することが確認された。4.振動波は硬度が低い物質内に侵入すると波長が長くなり、硬度が高い物質内では波長が短くなることが確認され、硬度の実測値とMRにより計測された硬度が相関することを証明した。5.動物臓器および動物臓器内に作成した擬似病変を用い、これらの内部を伝搬する振動波を画像化することに成功した。6.動物臓器の硬度や動物臓器内に作成した擬似病変の硬度とMR画像から得られた硬度が相関することを確認した。7.現在は、人の剖検肝を用い、実測硬度とMRでの計測硬度との比較が進行中である。8.来年度は、人の正常肝と瀰漫性疾患、腫瘍との硬度の違いを明らかにし、MR硬度画像の有用性を確立させる予定である。また、振動波のズレをMR画像の濃度差として描出するソフトを開発し、硬度のみを表現した新しい硬度画像を作成する予定である。

1.前年度までの振動発生装置では、剖検肝、切除肝では出力が不十分と考えられたため、高出力の振動発生装置を再度開発し、ファントム実験を再施行した。2.実験用ファントムは、前年度までのファントムと同様に硬度の異なるものを複数作成した。これらを用い、高出力振動発生装置の機能を検証した。3.高出力振動発生装置では、前年度までの発生装置より更に均一な振動波が、ファントムのより深部にまで到達することが確認された。4.人の剖検肝の内部を伝播する振動波を画像化することに成功した。5.正常肝と硬変肝とのMR硬度画像における硬度の違いが描出された。肝の線維化の違いが硬度に反映され、さらに硬度画像上で、正常肝と硬変肝が識別可能であることが示唆された。6.切除された肝腫瘍内を伝播する振動波を画像化することに成功した。柔らかい腫瘍である肝細胞癌内では波長が短く、硬い腫瘍である胆管細胞癌や転移性肝細胞癌内では、波長が長くなることが確認され、肝腫瘍の鑑別に有用であると考えられた。7.生体組織硬度計を用いて測定した硬度の実測値と、MR硬度画像における硬度を比較すると有意な相関が見られ、MR硬度画像は、正確に硬度を反映するものであることが証明された。
q-Selberg積分の研究

Macdonaldによって導入されたいわゆるMacdonald多項式は、既に各方面でその重要性を認識されつつあるが、本研究ではとくに、q-Selberg積分、q-超幾何関数との関連を考察した。具体的には、以下のとおり、1.Macdonald多項式に付随したq-超幾何関数を定義した。これは、以前に定義した。Jack多項式に付随した超幾何関数の自然なq-類似になっており、また1変数のときは、通常のq-超幾何になっている。さらにしかるべくパラメータを制限するとき、このq-超幾何は、q-Selberg積分の級数展開を与える。両者が同一のq-差分方程式をみたすことから導びかれるのである。このことの福産物として、Macdonald多項式のJackson積分に関するKadcllの定理(の一般化)が証明される。また、Forresterによるある種のconstant terw identity予想が証明される。これは最近S.CooperがZeilbergerによる組み合わせ論的方法を用いて示したものである。2.S.MilneによるSchur多項式に関連したJacobi三重積公式、及びRamanujan14型のq-総和公式をMacdonald多項式の場合へ拡張した。1のq-超幾何に関するq-二項定理を用いる。またこのq-二項定理自身Macdonald多項式の特殊値のexplicit formslaと同値であるが、q-差分方程式を用いる独立な証明を与えることができた。理念的には大分簡単な証明になっている。以上の結果は現在投稿中である。
イヌ化抗体によるパルボウイルス感染症の治療

(1)イヌパルボウイルス(以下、CPV)に対する中和モノクローナル抗体の作製とcDNAクローニングCPVをCRFK細胞で増殖し、密度勾配超遠心法で精製した。これを抗原として、マウスを免疫し、ハイブリドーマを作製した。ハイブリドーマはELISA、間接蛍光抗体法、中和能でスクリーニングし、最終的に6クローン(CP1a6a)を単離した。このうち、IgG1サブタイプであり、CPVに対する結合性の高いCP3aを選んでRNAを抽出し、PCRにより免疫グロブリン(Ig)H鎖、L鎖cDNA両方をクローニングし、塩基配列を決定した。(2)イヌIgcDNAクローニングビーグル犬の脾臓細胞よりRNAを調製し、既知の塩基配列をもとにPCR法によりイヌIgcDNAをクローニングし、塩基配列を決定した。イヌIgγ鎖4クローンは約470アミノ酸からなっていた。定常領域のアミノ酸配列の比較から、ヒトもしくはマウスIgγ鎖とは60-70%の相同性であった。また、κ鎖は242アミノ酸からなるクローンが得られ、ヒトもしくはマウスIgκ鎖とは58%の相同性であった。λ鎖は231アミノ酸からなり、ヒトもしくはマウスIgγ鎖とはそれぞれ85、73%の相同性であった。(3)抗原結合部位(CDR)移植によるイヌ化抗体の作製CP3a抗体の可変領域の塩基配列よりContact法に従ってCDRを推定した。また、同様にイヌ抗体の可変領域について推定した。CP3a抗体のCDRをイヌの予想されるCDRの代わりに交換したイヌ化抗体可変領域をH鎖、L鎖両方について設計し、イヌ抗体可変ドメインに相当するDNA断片を全合成した。これらをそれぞれ相当するイヌH鎖、L鎖の定常領域遺伝子と結合し、1つのバキュロウイルスへのトランスファーベクターに組み込み、Sf21細胞を用いて組換えバキュロウイルスを作成した。組換えウイルス感染細胞の培養上清中に、イヌ抗体の発現タンパク質が抗イヌIg抗血清を用いて検出された。本課題ではイヌパルボウイルスに対する中和モノクローナル抗体を「イヌ化」し、試作抗体を用いてイヌパルボウイルス感染症を治療することを目標としている。今年度はイヌ化抗体を設計・作製するために必要な「部品」の準備を行った。1.パルボウイルスに対する中和モノクローナル抗体を作製し、抗体タンパク質をコードするcDNAクローンを単離した。(1)イヌパルボウイルスを培養し、超遠心法で精製した。これを抗原としてマウスに免疫し、脾臓細胞を用いて細胞融合を行った。(2)ハイブリドーマを感染細胞を用いた間接蛍光抗体法、また、精製抗原を用いたELISAでスクリーニングし、最終的に中和活性を有する6クローンを単離した。(3)樹立したハイブリドーマ株よりIsogen^<TM>を用いてRNAを抽出し、5 ́raceを行って5 ́端の塩基配列を決めたあと、特異プライマーを用いていLA-PCRによりlmmunoglobulin(lg)Light、Heavy両鎖のmRNA全長を増幅した。PCR断片をベクターにクローニングした。2.イヌの抗体をコードするcDNAクローンを得る。(1)イヌ脾臓細胞を調製し、試験管内で2μg/ml LPS存在下で培養した。継時的に培養上清を調製し、イヌ抗体の生産を抗体(Bethyl社)を用いてウエスタンブロツティングで確認した。lgM、lgG2の発現が認められた。培養後の細胞よりmRNAを調製し、発現ライブラリーを作製した。

(2)すでに基礎免疫を行っているビーグル犬にパルボウイルスを感染させ、脾臓細胞よりRNAを調製した。lg lambda、kappa鎖断片の塩基配列をもとに合成したプライマーを用いて、本RNAを鋳型としたRT-PCRで増幅を確認した。本断片をベクターにクローニングし、塩基配列を確認した。(1)イヌ抗体cDNAの塩基配列を決定した。イヌ免疫グロブリンγ鎖4クローンは約470アミノ酸からなっていた。定常領域のアミノ酸配列の比較から、ヒトもしくはマウス免疫グロブリンγ鎖とは60-70%の相同性であった。また、κ鎖は242アミノ酸から成るクローンが得られ、ヒトもしくはマウス免疫グロブリンκ鎖とは58%の相同性であった。λ鎖は231アミノ酸からなり、ヒトもしくはマウス免疫グロブリンγ鎖とはそれぞれ85、了73%の相同性であった。(2)イヌパルボウイルスに対するマウスモノクローナル抗体の抗体cDNAをH鎖、L鎖両方をクローニングし、塩基配列を決定した。(3)マウスモノクローナル抗体の可変領域の塩基配列を立体構造が判明しているモノクローナル抗体のアミノ酸配列と比較し、Contact法により抗原結合部位(CDR)を推定した。また、同様にイヌ抗体の可変領域についての推定を行った。(4)マウスモノクローナル抗体のCDR配列をイヌの予想されるCDR領域と交換したイヌ抗体可変領域をH鎖、L鎖両方について設計した。設計した塩基配列をもとにイヌ抗体可変領域遺伝子を全合成した。(6)組換えウイルス感染細胞において、イヌ抗体の遺伝子を特異抗血清を用いて検出した。以上のことから、組換えイヌ化抗体が作成されたことが確認された。
曲率とリン脂質非対称性による膜タンパク質機能の理解

平成30年度は、リン脂質非対称膜リポソームの作製の自動化とナノサイズのリン脂質非対称膜リポソームの作製の検討を行った。リン脂質非対称膜リポソームの作製自動化に関しては、6つのウェルを持った回転テーブルと1つの固定ウェルから構成されている。回転テーブルを回転させることにより、様々な種類の平面リン脂質膜を形成して、ジェット水流を印加によってリポソームを形成される。ステッピングモータを用いて、回転テーブルの速度や回転させる時間の間隔等を制御した。回転テーブルの速度によって、平面リン脂質膜の形成効率が変化することが分かった。また、平面リン脂質膜の形成効率は、回転テーブルの回転回数にも依存することが分かった。マイクロコンピュータで、回転テーブルの回転とジェット水流印加を制御することに成功し、リポソーム作製の自動化に成功した。ナノサイズのリン脂質非対称膜リポソームの作製については、ジェット水流法によるリポソーム作製法の条件を変えることにより実現した。リン脂質非対称膜の確認は、金コロイドのリポソームへの結合の有無で判断した。さらに、総説の執筆や学会発表を精力的に行った。サイズの異なるリン脂質非対称膜リポソームの形成に成功している。したがって、曲率の異なるリン脂質非対称膜リポソームによる膜タンパク質の機能観察を行うことが可能になった。大量なサイズ均一なリポソームを作製するために、リポソームの自動作製のさらなる検討を行う。リン脂質非対称リポソームに膜タンパク質を再構成し、膜タンパク質の機能を観察する系を構築する。
コンピュータ・シミュレーションによる心筋細胞発生過程の探究

複雑な多細胞生物は、さまざまな遺伝子発現パターンによって、ひとつのゲノム情報から多彩な機能を持つ細胞を発生・分化させている。近年、生物個体を構成する空間的・時間的な発現パターンのプロファイルが大量に獲得されているが、それぞれの発現パターンの機能的意義は必ずしも明らかではない。本研究では、心筋細胞の発生過程の連続的なモデリングに取り組んだ。すでに構築していた胎生初期、胎生後期、新生仔期、成体の4段階のモデルを結ぶ中間部分のモデル化を試みた。その過程で、より妥当な発生経路を同定するために、心筋細胞がおかれている環境(外的拘束)だけでなく、遺伝子発現量を決定する発現調節システム(内的拘束)についても考慮することが有用であるとの洞察を得た。真核生物に特徴的な発現調節システムによって、実現可能なデザインは大きな制約を受けていると思われる。内的拘束に基づいて心筋細胞が存在可能な状態空間を限定し、その上で外的拘束に基づき現実に心筋細胞が発生過程とともに推移する状態の軌跡を同定することを試み、内的拘束の数理モデルを構築した。こうした試みは、さまざまな生命システムのデザインが、どの程度の必然性をもって成立しているかを探る上で有用となるものである。心筋細胞の発生過程という時間に沿った変化のモデル化と平行し、空間に沿った変化のモデル化にも取り込んだ。対象には空間的な発現パターンの不均質性を持つ肝小葉のアンモニア代謝を選択し、髪歯類の肝臓に見られる部位特異的な遺伝子発現調節が、アンモニア代謝のエネルギー効率向上に寄与している可能性を示した。今後、これらの探究を展開することにより、各対象についての個別の理解を得るとともに、遺伝子発現パターンの多様性によって構成される高次生命現象が持つ共通の特徴の抽出を試みる。平成18年度は、開発した心室筋細胞発生過程の代表的4時点のモデルの間を結ぶための手法について検討した。数値計算クラスタを構築し、ソフトウェアとしては細胞シミュレーション環境E-Cell3を用いてシミュレーションを実行した。心室筋細胞の数理モデルとして、野間(京大・院医)らの開発したKyotoモデルを用いているが、開発者の研究グループと議論の機会を持ち、基盤となるモデルの妥当性についても検討、確認した。その結果、胎生初期のモデルに関して、シミュレーションを用いて探究するに値する事象を見いだしたので、平成19年度中に解析を進める予定である。4時点のモデルを結びあわせ、連続的に発生過程を再現する連続モデルの構築のために、胎生初期から胎生後期、新生仔期、成体の順に1段階ずつ次の段階へと推移するモデルの開発を進めた。自動能の有無、膜電位時系列の類似性を指標とした評価関数を作成し、これを用いて、遺伝的アルゴリズムによって次の段階のモデルへと推移していく経路を探索した。各段階を結ぶ経路を見いだすことはできたが、この経路上の各世代(時点)において、生理学的に妥当な表現型を有しているかを検討する必要がある。また、評価関数に含まれるべき要素についても、単に活動電位の時系列の類似性だけでなく、不応期の長さなどを考慮する必要があるかもしれず、今後、評価関数についてもバリエーションを用意して、最適な評価関数の確立を目指していく。
金属粉末シートを用いたレーザ積層法による3次元ポーラスネットワーク構造の創製

本研究では、(1)金属粉末シートを用いたレーザ積層法、並びに(2)金属材料シートを用いたレーザ積層法による3次元ポーラスネットワーク構造の創製技術の確立を目指して検討を行った。1)チタン粉末の細粒化および薄膜シートの使用による膜厚方向の高分解能化積層法(1)においては、平均粒径φ20μmのチタン粉末を用いて焼結後のシート厚さ(分解能)約100μmが得られた。2)高分解能レーザカッティング装置の構築積層法(1)でのレーザ焼結幅は約120μmで、積層法(2)では、高集光性レンズを導入した光学系により、約200μm幅(シート膜厚200μm)、約130μm幅(シート膜厚110μmの)でのレーザカッティングに成功した。3)放電プラズマ焼結時の空間保持材および焼結条件の最適化積層法(1)においては、焼結時の体積収縮率のバランスにより塩化ナトリウム粉末が最適な空間保持材であることを明らかにした。一方、積層法(2)では、酸化アルミニウム粉末を充填し、焼結体の変形を抑制した。また、積層した構造体にチタンロッドを複数本配置してシートの積層位置合せの誤差を±約70μmに低減した。4)(1)チタン粉末シート、(2)金属材料シートを用いた積層法による3次元ポーラスネットワーク構造の作製技術の検討歯科インプラント作製技術として検討した結果、積層法(1)と(2)のいずれにおいても、気孔率4550%、人工骨への応用に適する約300μmの微細空孔を有するポーラス構造体の作製に成功した。しかしながら、積層法(1)では作製したシートの各断面形状やサイズのばらつき、それに伴う低構造体強度、積層法(2)ではシートに付着したドロスの悪影響、構造体表面への微細構造の付与技術が課題となる。以上の結果、予定していた歯科インプラントの作製及びその評価の実施に至らなかった。今後は、積層法(1)・(2)を組み合わせることにより各課題の補間や改善、他技術への応用展開等が期待される。昨年度は、チタン粉末シートを用いたレーザ積層法による3次元ポーラスネットワーク構造の作製技術の確立を目指し、以下の項目を検討したので、その結果を示す。1)高精度な構造設計を可能とする4面体要素を利用した3次元ポーラスネットワーク構造設計方法の導入設計概念に対応したソフトウェアが購入できなかったため検討には至っていない。2)厚さ方向の高分解能化を目指したチタン粉末の細粒化およびシートの薄膜化レーザ焼結において、より球状で微細かつ均一な粒径のチタン粉末が最適であることを確認し、微粒化方法としてガスアトマイズ法が最適と判断した。同方法による平均粒径φ20μmのチタン粉末から作製したシート膜厚は約150μm、焼結後の各シートの厚さ、すなわち分解能は100μm以下であった。3)高集光性レンズの導入による高分解能レーザシートカッティング装置の構築高性能レンズの導入のほか、レーザのビームプロファイルなどのレーザパラメータにも着目し、最適化を行った結果、膜厚200μmのチタンシートのレーザカット実験において、ビームスポット径とぼぼ同等の約200μm幅でのレーザカッティングを確認した。

4)放電プラズマ焼結実験時の空間保持材とその充填方法、および焼結条件の最適化による高精度造形方法の確立空間保持材として、酸化アルミニウム、窒化ホウ素、塩化ナトリウムを選択し、また、充填時の加圧や低真空・還元雰囲気での焼結条件を導入した結果、保持材の熱膨張率と破壊による体積収縮率が最適な塩化ナトリウムにおいて、良好な焼結結果が得られた。5)異なる溶剤の使用や異種材料シートの積層により作製した構造物の内部ポーラスネットワークの評価チタン粉末シート、およびレーザカッティングチタンシートの積層焼結実験を行った結果、人工骨への応用に適した300μmの微細空孔を有する3次元ポーラス構造体の作製に成功した。昨年度においては、チタン粉末シート、または金属材料シートを用いた積層法による3次元ポーラスネットワーク構造の作製技術の確立を目指し、それぞれの技術の特徴や課題などについての比較検討を行った。以下にその概要を示す。1)薄膜シートの使用による膜厚方向の高分解能化金属材料シートを用いた積層法において、初年度よりも薄い膜厚110μmのチタンシートを用い、幅約130μmでのレーザカッティングに成功した。この値はチタン粉末シートを用いる方法と同程度の膜厚分解能に相当する。しかしながら、表面に付着したドロスの研磨工程でのシートのゆがみが観察され、後の放電プラズマ焼結時に悪影響を及ぼすことが明らかとなった。2)放電プラズマ焼結条件の最適化による高精度造形方法の確立金属材料シートを用いた積層法における放電プラズマ焼結の際、構造体の気孔率増大に伴い、焼結時の局所構造への圧力負荷が原因と推測される焼結体の変形が観察されたが、空間保持材として酸化アルミニウム粉末を気孔に充填することにより改善した。また、シート積層時、構造体のZ軸方向(圧力方向)に貫通するφ2mmのチタンロッドを複数本配置した結果、XY方向の積層位置エラーが、初年度の半分以下の±約70μmに低減した。3)チタン粉末シート、または金属材料シートを用いた積層法による3次元ポーラスネットワーク構造の作製技術の検討有気孔ネットワークを持つ歯科インプラント作製技術への応用を検討した結果、チタン粉末シートによる積層法では、作製したシートの断面形状、及び焼結体サイズのばらつき、及びそれに伴う低構造体強度が課題となる。一方、金属材料シートを用いた積層法では、生体親和性向上に不可欠となる構造体表面への微細構造の付与技術が課題である。従って、予定していた歯科インプラントの作製及びその評価の実施には至っていない。
寿命関連遺伝子フォークヘッド型転写因子の機能解析

フォークヘッド型転写因子FOXOファミリー(FOXO1,FOXO3,FOXO4)は、ストレス抵抗性獲得や分化制御など様々な細胞機能制御に関わることが明らかになりつつある因子である。骨格筋組織の加齢や炎症による萎縮は酸化ストレスによって誘導されるが、我々は前年度までに、この酸化ストレスによる筋管細胞の萎縮誘導と分化抑制にFOXOが重要な役割を果たすことを示した(投稿準備中)。そこで、今年度は酸化ストレスがFOXOを活性化する機構について解析を行った。FOXOの活性制御機構として大きなものは細胞内局在変化である。これまでにIGF-1/PI3K/Aktシグナル伝達系によるリン酸化によってFOXOが核外排出され活性を失うことが分かっているが、我々は、IGF-1の存在下においても酸化ストレスを与えることによってFOXOの速やかな核蓄積が起こることを見いだした。このとき、Aktによるリン酸化部位のリン酸基が失われていることが分かり、脱リン酸化反応がFOXOの核蓄積を促進していることが示唆された。この核蓄積と脱リン酸化反応はプロテインフォスファターゼの阻害剤で細胞を処理することによって抑制された。また、FOXOの転写活性も同様の阻害剤で抑制された。さらに、FOXOとプロテインフォスファターゼの結合も確認できたことから、酸化ストレスはFOXOの直接の脱リン酸化を誘導することによってFOXOの核蓄積を促進し、活性化させることが明らかとなった(投稿準備中)。酸化ストレスを受けた細胞では、このメカニズムによってFOXOの活性化を介した細胞周期の停止とDNA傷害の除去およびROS除去タンパク質の発現誘導による細胞のストレス抵抗性獲得が行われていると考えられる。また、酸化ストレスを受けた骨格筋組織の萎縮においても同様のシステムが機能していると考えられる。線虫の長寿制御遺伝子DAF-16は種々のストレスへの抵抗性を増大させることが明らかとなりつつある。私はこれまでに、DAF-16の哺乳類ホモログであるFOXOファミリー(FOXO1,FOXO3a,FOXO4)が酸化ストレスにより活性化され細胞周期停止・DNA修復と関わるGADD45遺伝子の発現を促進することで細胞を保護していることを示してきた。今年度は酸化ストレスからFOXO活性化に至るシグナル伝達経路を明らかにすることを目的として研究を進めた。FOXOは通常Aktによるリン酸化を受けており、exportin1(CRM1)や14-3-3と結合することによって核排出され細胞質に局在している。私たちはFoxO3およびFoxO4とEGFPとの融合蛋白質(FoxO3-,FoxO4-EGFP)を作成し、この遺伝子についてNIH3T3細胞における安定発現株を作成した。この細胞内でFoxO-EGFPは通常培養時に細胞質に存在したが、H2O2処理後30分ですみやかに核内に局在するようになった。また免疫沈降からFoxOと14-3-3との結合もH2O2処理によって抑制されることが明らかになった。CRM1をLeptomycin Bで阻害した場合もFoxOは核局在するが、酸化ストレスによるFoxOの核局在はCRM1の阻害とは異なる経路で起こっているようである。現在その機構について検討中である。一方、私は骨格筋におけるFOXOの役割についても追究した。骨格筋組織は炎症時に筋萎縮を起こすことが知られており、最近、酸化ストレスによるMuRF1蛋白質の転写誘導が筋委縮をもたらすことが報告された。筋細胞は分化とともにFOXO4を発現するようになる。また前回の研究から酸化ストレスによるFOXOの活性化が見出されたことから、酸化ストレスによって活性化されたFOXO4が筋委縮に関わるのではないかと考えた。そこでmyotubeを形成させた筋芽細胞株C2C12細胞に常活性型FoxO4(FoxO4-TM)を発現させたところmyotubeの委縮が観察された。このときFoxO4依存的にMuRF1の転写が増大することがノーザンハイブリダイゼイションで確認された。これらのことから酸化ストレスを受けた筋細胞ではFOXOが活性化してMuRF1を転写し、筋繊維の委縮を誘導していると考えられる。(投稿準備中)フォークヘッド型転写因子FOXOファミリー(FOXO1,FOXO3,FOXO4)はストレス抵抗性獲得や分化制御など様々な細胞機能制御に関わることが明らかになりつつある因子である。本研究において、今年度は骨格筋組織の分化と維持に対してFOXOが及ぼす影響について追究した。加齢による骨格筋の萎縮は高齢者の生活の質の低下を招く大きな問題となっているが、この筋萎縮の誘導因子の一つは酸化ストレスであることが分かってきた。私たちのこれまでの研究からFOXOは酸化ストレスにより活性化されることが明らかとなっているので、筋萎縮にも骨格筋組織で発現するFOXO4の活性化が関わっているのではないかと考えた。そこで分化誘導によってmyotubeを形成させた筋芽細胞株C2C12細胞に常活性型FOXO4(FOXO4-TM)を発現させたところ、myotubeの萎縮が観察された。このとき筋萎縮誘導因子であるユビキチンライゲースMuRF1の転写がFOXO4依存的に増大する事が確認された。また、FOXO4-TMを発現させた状態では筋分化も阻害されたことから、FOXOの活性化によって筋萎縮の促進と筋分化の抑制が起こり、骨格筋量が減少することが示された。次に、酸化ストレスの影響を調べた。

筋管形成したC2C12細胞について酸化ストレスをかけると内在性FOXO4の核蓄積亢進と筋管の萎縮が観察され、未分化のC2C12細胞について酸化ストレスをかけた場合にも同様にFOXO4の核蓄積亢進と分化阻害が観察された。従って、酸化ストレスを受けた骨格筋では活性化されたFOXOが骨格筋の萎縮と分化抑制を誘導することによって骨格筋量を減少させる可能性が示された。(投稿準備中)フォークヘッド型転写因子FOXOファミリー(FOXO1,FOXO3,FOXO4)は、ストレス抵抗性獲得や分化制御など様々な細胞機能制御に関わることが明らかになりつつある因子である。骨格筋組織の加齢や炎症による萎縮は酸化ストレスによって誘導されるが、我々は前年度までに、この酸化ストレスによる筋管細胞の萎縮誘導と分化抑制にFOXOが重要な役割を果たすことを示した(投稿準備中)。そこで、今年度は酸化ストレスがFOXOを活性化する機構について解析を行った。FOXOの活性制御機構として大きなものは細胞内局在変化である。これまでにIGF-1/PI3K/Aktシグナル伝達系によるリン酸化によってFOXOが核外排出され活性を失うことが分かっているが、我々は、IGF-1の存在下においても酸化ストレスを与えることによってFOXOの速やかな核蓄積が起こることを見いだした。このとき、Aktによるリン酸化部位のリン酸基が失われていることが分かり、脱リン酸化反応がFOXOの核蓄積を促進していることが示唆された。この核蓄積と脱リン酸化反応はプロテインフォスファターゼの阻害剤で細胞を処理することによって抑制された。また、FOXOの転写活性も同様の阻害剤で抑制された。さらに、FOXOとプロテインフォスファターゼの結合も確認できたことから、酸化ストレスはFOXOの直接の脱リン酸化を誘導することによってFOXOの核蓄積を促進し、活性化させることが明らかとなった(投稿準備中)。酸化ストレスを受けた細胞では、このメカニズムによってFOXOの活性化を介した細胞周期の停止とDNA傷害の除去およびROS除去タンパク質の発現誘導による細胞のストレス抵抗性獲得が行われていると考えられる。また、酸化ストレスを受けた骨格筋組織の萎縮においても同様のシステムが機能していると考えられる。