hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
再プログラム化によるヒト体細胞幹細胞化のための基盤技術開発

体細胞を多能性幹細胞に変換する再プログラム化技術の発展を目的に、体細胞と胚性幹(ES)細胞との細胞融合による体細胞核の再プログラム化を応用した。その結果、1)ヒトES細胞はヒト体細胞核の再プログラム化能をもつ、2)ヒト融合細胞からの染色体除去が可能、3)染色体除去によりES細胞では相同染色体組換による正常2倍体細胞の出現、が明らかになった。これらの成果は、人工多能性幹(iPS)細胞への応用が期待される。本研究課題は、ES-体細胞融合細胞からES細胞由来の染色体のみを取り除くことで体細胞由来の多能性幹細胞を作り出すための基盤技術の開発を目的としている。方法として、(1)染色体除去の新分子ツール、染色体除去カセット(CEC)の開発、(2)染色体除去の高効率化をもたらす技術の開発、(3)ECE-ES細胞ライブラリーの作製、(4)ES細胞全染色体へのCECの導入、(5)ホストES細胞の開発、(6)ヒトES細胞と体細胞の新細胞融合技術の開発、を挙げていた。マウス細胞を用いた研究成果として、(1)ECE-ES細胞ライブラリーの作製の成功、(2)ES細胞へ40コピー以上のCECの挿入、(3)染色体の一斉除去による細胞死の誘導、(4)染色体除去技術を用いた遺伝子量バランスの重要性、を明らかにすると共に、(5)ES細胞:体細胞=1:1の融合システムの開発を行った。マウスES細胞実験・マウスES細胞にレンチウイルスを用いて20-40コピーのCECを導入した細胞株(CEC20 or CEC40)を得た。・CEC20またはCEC40細胞株と体細胞との融合細胞を作成し、Cre処理を試みたがCECが完全に取り除かれたクローンは得られていない。・CECが各染色体に導入されたライブラリーを作成した。そのうち第4,6,10,17,19番染色体にCECが導入された物に関して、CECのホモ化を試みた。・CEC19ホモ化融合細胞のCre処理により2本の第19番染色体除去を試みたが、除去後一本複製されて3本になった物が有意に増殖してきた。遺伝子量補償に関わる重要な遺伝子の存在が示唆された。・CEC4およびCEC10のホモ化融合細胞の作成を試み、遺伝子量補償責任遺伝子の存在に関して検証を行っている。ヒトES細胞実験・ヒトES細胞にCECを導入し、クローンを複数個樹立した。・ヒトES細胞とヒト体細胞の電気細胞融合のための条件設定を行った。1.マウスES細胞およびES-体細胞融合細胞からの染色体除去a)マウスES細胞からの染色体除去染色体除去カセットCEC (LoxP-GAG-GFP-IRES-Neo-LoxP)を導入した正常ES細胞のライブラリーから第4、10、19番染色体にCEC導入が確認されたES細胞を選択した。これらのES細胞の組み換え酵素Creの処理により染色体除去を試みた。その結果、GFP陰性細胞がFACSソーティングとその後のクローニングにより株化されたが、CEC染色体は除去され、相同染色体の重複により正常核型に戻っていた。ヒトES細胞でも同様の現象が確認されるか興味深い。b)マウスES-体細胞融合細胞からの染色体除去ES-体細胞融合細胞から第4,10,19番染色体除去を行った。その結果、1本の除去では、4n=79(GFP陰性)核型の細胞クローンが得られた。一方、2本除去による4n=78核型のクローンは得られず、相同染色体が重複した4n=79(GFP陰性)のクローンのみが得られた。これらの発見は、染色体上の遺伝子による遺伝子量補償の重要性を示している。ヒトES-体細胞融合細胞での染色体除去が興味深い。2.ヒトES細胞およびES-体細胞融合細胞からの染色体除去b)第12番染色体にCECの導入を確認したES細胞株を樹立したd) CEC導入ES細胞と体細胞(TIG)を電気的に細胞融合し、クローニングすることに成功した。e)ヒトES-TIG(体細胞)融合細胞からの染色体除去を試みている。方法として、1)染色体除去の新分手ツール、染色体除去カセット(CEC)の開発、2)染色体除去の高効率化をもたらす技術の開発、3)ECE-ES細胞ライブラリーの作製、4)ES細胞全染色体へのCECの導入、5)ホストES細胞の開発、6)ヒトES細胞と体細胞の新細胞融合技術の開発、を挙げていた。

マウス細胞を用いた研究成果として、1)ECE-ES細胞ライブラリーの作製の成功、2)ES細胞へ40コピー以上のCECの挿入、3)染色体の一斉除去による細胞死の誘導、4)染色体除去技術を用いた遺伝子量バランスの重要性、を明らかにすると共に、5)ES細胞:体細胞=1:1の融合システムの開発を行った。ヒト細胞を用いた研究成果として、1)ES-体細胞の電気融合に融合細胞の作製技術の開発、2)融合細胞からの染色体除去の成功、3)ヒト融合細胞における遺伝子量バランスの重要性、が明らかになった。ヒトとマウス細胞において、生きた細胞の核からの選択的染色体除去技術により、細胞は25%迄の遺伝子変動には寛容性があるが、50%になると細胞死を招く事が明らかになった。こめ細胞死は、多くの遺伝子発現が一挙に変動するためた誘導される可能性と、細胞には遺伝子量の変動に敏感な遺伝子量モニタリング遺伝子が存在する可能性を示唆している。現在、遺伝子量モニタリング遺伝子の存在を仮定して、その同定に向けて実験を進めている。本研究課題は、ES-体細胞融合細胞からES細胞由来の染色体のみを取り除くことで体細胞由来の多能性幹細胞を作り出すための基盤技術の開発を目的としている。方法として、1)染色体除去の新分子ツール、染色体除去カセット(CEC)の開発、2)染色体除去の高効率化をもたらす技術の開発、3)ECE-ES細胞ライブラリーの作製、4)ES細胞全染色体へのCECの導入、5)ホストES細胞の開発、6)ヒトES細胞と体細胞の新細胞融合技術の開発、を挙げていた。マウス細胞を用いた研究成果として、1)CEC-ES細胞ライブラリーの作製の成功、2)ES細胞へ40コピー以上のCECの挿入、3)染色体の一斉除去による細胞死の誘導、4)染色体除去技術を用いた遺伝子量バランスの重要性、を明らかにすると共に、5)ES細胞:体細胞=1:1の融合システムの開発を行った。この細胞死は、多くの遺伝子発現が一挙に変動するために誘導される可能性と、細胞には遺伝子量の変動に敏感な遺伝子量モニタリング遺伝子が存在する可能性を示唆している。一方、マウス2倍体ES細胞から、染色体除去技術を用いて特定の染色体を除去すると、予想よりも高頻度で相同染色体重複により、CEC標識のない正常2倍体ES細胞が得られた。これらの結果は、相同染色体組み換え技術の人工多能性幹(iPS;induced pluripotent stem)細胞への応用の可能性を示している。
加齢黄斑変性患者の精神健康状態把握・改善の探索的研究

病的近視は加齢黄斑変性と同様に脈絡膜新生血管の発生や広範囲の網脈絡膜萎縮が観察され、中心視野が犯される。生活に大きな影響を与える両眼性の患者をみることも少なくない。近視には眼軸長の影響が大きいことが知られているがその分布や異常値の定義などは行われていないため眼軸長の基礎データや病的な眼底との関連について調査・報告を行った。加齢黄斑変性(AMD)は現在、我が国の後天性失明・視力障害の原因の一角を占めている。米国では法的盲の原因の第1位となっており、我が国でも生活の欧米化と高齢化に伴って今後患者数の増加が予想されているが、発症原因やその病態把握は未だ明らかでなく、根治的な治療法も確立されていない。そのため視機能が大きく障害されたAMD患者は既に多数存在し、今後も急速に増加することが予想される。しかしこれまでAMDに対して心理的面での影響を調査した研究は少なく、どれほどの患者がどの程度の社会性不安障害に陥っているかを与えているかは明かでない。本研究ではAMDにおける精神健康状態、社会性不安障害の頻度・程度の調査、認知機能の調査し、最終的にはAMD患者専用の不安調査票を作成し日常診療において患者・医療従事者双方の円満・円滑な関係を助けることを目的として研究を開始した。AMD患者における精神状態に関しては多施設臨床試験においてNEIVFQ-25、EQ-5Dという海外では標準的な眼科心理アンケート・健康アンケートの日本語版の調査が行われていることがわかり、その規模から個人で行う本研究の意義は相対的に小さくなったため病的近視の研究に切り替えて研究を行った。病的近視はAMDと同様に脈絡膜新生血管の発生や広範囲の網脈絡膜萎縮が観察され、中心視野が犯される。近視には眼軸長の影響が大きいことが知られているがその分布や異常値の定義などは行われていないため本年は眼軸長の基礎データ収集を主に行い発表を行った。またAMDにより視機能が障害されると文字の読み書き、他人の顔の認識、自動車の運転など日常生活が大きく障害される。AMD患者における精神状態に関しては多施設臨床試験においてNEI VFQ-25、EQ-5Dという海外では標準的な眼科心理アンケート・健康アンケートの日本語版の調査が行われていることが判明し、その規模から個人で行う本研究の意義は相対的に小さくなったため病的近視の研究に切り替えて研究を行った。
慢性マルチニューロン記録法による前頭連合野多重認知マップ形成の解析

本研究の目的は,前頭連合野の認知マップ(特に,ワーキングメモリとターゲット選択(選択的注意))の脳内再現を明らかにすることにある.この問題にアプローチするため,2頭のサルに,眼球運動性の遅延反応課題(oculomotor delayed-response, ODR),視覚探索課題(oculomotor visual search, OVS)と遅延視覚探索課題(oculomotor delayed visual search, ODVS)を訓練した.ODR課題は,サルが数秒の遅延期の前に呈示された視覚手がかり刺激の位置に向かって記憶誘導性サッケードをすることが要求されるため,視空間性のワーキングメモリを調べるのに適当であり,OVS課題では,1つのターゲット刺激とその周りに妨害刺激を含んだ刺激配列が呈示され,サルは妨害刺激の中からターゲットを選び出し,その方向に向かってサッケードすることが要求されるため,ターゲット選択が必要である.さらに,ODVSはこれらを組み合わせた課題で,手がかり刺激として,1つのターゲット刺激と妨害刺激が呈示されるので,手がかり刺激呈示期にはターゲット選択を,そしてそれに続く遅延期の間にはその情報を保持しなければならないので,ワーキングメモリを必要とした.サルがこれらの課題を遂行中に,前頭連合野の局所へ微量のムシモール(5μg/μl,1μl)を注入し,局所的な機能脱落を起こして,課題遂行への効果を調べた.その結果,ODR, ODVSの両方の課題が障害される部位に加えて,ODVS, OVSが障害される部位が存在すること,また,OVSが障害される部位はODVS, ODRが障害される部位と重複していることが明らかになった.これらの結果は,ターゲット選択に関与する領域とワーキングメモリに関与する領域が重複して再現されていること,さらに,ターゲット選択-ワーキングメモリに関与する領域が並列的に再現されていることを示唆する.今後はこの問題をさらにニューロンレベルで調べていく予定である.本研究の目的は,前頭連合野の認知マップ(特に,ワーキングメモリとターゲット選択(選択的注意))の脳内再現を明らかにすることにある.この問題にアプローチするため,2頭のサルに,眼球運動性の遅延反応課題(oculomotor delayed-response, ODR),視覚探索課題(oculomotor visual search, OVS)と遅延視覚探索課題(oculomotor delayed visual search, ODVS)を訓練した.ODR課題は,サルが数秒の遅延期の前に呈示された視覚手がかり刺激の位置に向かって記憶誘導性サッケードをすることが要求されるため,視空間性のワーキングメモリを調べるのに適当であり,OVS課題では,1つのターゲット刺激とその周りに妨害刺激を含んだ刺激配列が呈示され,サルは妨害刺激の中からターゲットを選び出し,その方向に向かってサッケードすることが要求されるため,ターゲット選択が必要である.さらに,ODVSはこれらを組み合わせた課題で,手がかり刺激として,1つのターゲット刺激と妨害刺激が呈示されるので,手がかり刺激呈示期にはターゲット選択を,そしてそれに続く遅延期の間にはその情報を保持しなければならないので,ワーキングメモリを必要とした.サルがこれらの課題を遂行中に,前頭連合野の局所へ微量のムシモール(5μg/μl,1μl)を注入し,局所的な機能脱落を起こして,課題遂行への効果を調べた.その結果,ODR, ODVSの両方の課題が障害される部位に加えて,ODVS, OVSが障害される部位が存在すること,また,OVSが障害される部位はODVS, ODRが障害される部位と重複していることが明らかになった.これらの結果は,ターゲット選択に関与する領域とワーキングメモリに関与する領域が重複して再現されていること,さらに,ターゲット選択-ワーキングメモリに関与する領域が並列的に再現されていることを示唆する.今後はこの問題をさらにニューロンレベルで調べていく予定である.
菌体膨出誘起物質バルジシンの合成および構造一活性相関の研究

バルジシンはある種のβーラクタム抗生物質と合わせて用いると、大腸菌のような細菌にバルジ(膨出部)形成とよばれる形態変化を誘起し抗生物質の抗菌活性を増強する化合物である。しかしながらこの化合物単独では全く抗菌作用を示さないという興味ある性質を有している。われわれはバルジシンの構造と特異な活性に興味を持ち、数年前よりその合成群研究を開始し、本年度ようやく全合成を完了した。まずバルジシン合成に必要となる新アミノ酸バルジシニン((2S,4S,5R)ー4ーヒドロキシー5ーヒドロキシメチルプロリン)の合成経路を確立し、原料アミノ酸として十分な量を調製した。次に、われわれが以前に行ったバルジシンアナログの合成法に基づいてNーアセチルグルコサミン部分とバルジシニン部分をオキサゾリン法で縮合したが、今回触媒として用いるPートルエンスルホン酸の結晶水を除去し、完全な非水条件下でオキサゾリン誘導体の分解をできるだけおさえるように工夫し、縮合収率を何上させることができた。さらに、接触還元による最終脱保護の段階で、通常の加圧還元条件ではバルジシニンの5位ヒドロキシメチル基の保護に用いたベンジルオキシメチル基がバルジシニンのイミノ基に転位した後還元が進行し、Nーメチルバルジシンが、生成した。この予期せぬ副反応を防ぐために種々条件を検討した結果、ギ酸アンモンと水酸化パラジウムを用いる接触水素移動還元により目的を達成できることがわかった。以上のように天然バルジシンの全合成に成功すると同時に、今回偶然に副成したNーメチルバルジシンが天然物より弱いながらもバルジ形成作用を有することがわかり、以前に調製したデヒドロキシメチルバルジシンが全く活性を示さなかったことから、バルジシンの活性発現にはバルジシニンの5位ヒドロキシメチル基が重要であることがわかった。
ユビキタス・ネットワークを活用した事業創造に関する研究

今日のICT革命はユビキタス・ネットワークを展望する新しい段階に至っている。それはたんに普及成熟ではなく、草の根の主体的な情報発信と関係性形成を現実化することである。だがそれが中小企業ネットワークやベンチャーなど事業創造とどう関わるかは明らかでなく、本研究はこの課題に先駆的に取り組んだものである。ユビキタス・ネットワークの経済的役割に関しては、第1に21世紀のICT革命の新たな特徴を明らかにし、第2に中小企業にとってユビキタス・ネットワークがもつ意義と課題を分析し、第3にWeb2.0の位置づけを示した。それに基づきユビキタス・ネットワークを活用した事業モデルとしてウェブソーシングを提起し、それを実現する道筋を理論的に示した。さらに以上の前提として日本製造業の復活に潜むリスクを分析した。事業創造環境の国際比較に関しては米国の起業家教育およびその背景となる経済政策の実態を分析し、日米中三国を比較してそれぞれの特質を明らかにした。起業家教育の前提となる経済学については、新古典派のリアルビジネスサイクルの理論とケインズ派のニューケインジアンモデルの接近の問題点を指摘した。以上をとりまとめた報告書の構成は以下の通りである。第1部ユビキタス・ネットワーク論I 21世紀初頭の歴史的位置IIユビキタスネットワークと中小企業III大衆文化としてのインターネットIVウェブソーシング論Vモノづくり復活を考える第2部ビジネス環境の国際比較VI中日米の企業管理と経済の共通点と相違点(中国語)VII経済理論における各学派の位置(英語)これらの研究のためにアメリカ・中国の事例を視察し、また両国の研究者と交流し、さらに研究成果の一部は国際会議で発表した。本年度は本研究の初年度に当たり、研究実施計画に基づいて以下のように研究を進めた。野口はネットワーク経済分析を担当し、中国の珠江デルタにおける日本、台湾の進出企業および華僑企業を視察し、それらの連携の実態をヒアリングした。視察に基づき日本企業のモノづくり復活に関する学会のワーキングペーパーを執筆し、その内容を学会にて口頭発表した。つぎに21世紀の最初の5年間を情報化の観点から分析し、それに基づいて中小企業IT化の課題を広く検討した。その成果の一部をオフィス・オートメーション学会にて口頭発表するとともに共同執筆論文を作成した。またユビキタス・ネットワークと中小企業について中小企業研究誌に寄稿し、国際会議への投稿も準備中である。山名は事業創造モデル分析を担当し、ネットワーク社会における企業のあり方について中小企業経営者と意見交流を行い、IT化の不均衡の実情をヒアリングした。台湾中山大学日本学研究所を訪問し、中国の創業政策の台湾への影響について意見交流を行った。また中国の大連市を訪問し、進出日本企業に関する調査を行ったほか、大連理工大学、大連海事大学において世界経済動向とマクロ経済モデルに関して研究発表および意見交換を行った。また北京市の清華大学において中国のマクロ経済学研究状況を調査した。情報経済学に関して投資変動分析およびランダム時系列分析に基づく新たな方法について検討した。これらの研究成果の一部は学会にて口頭発表したほか書籍および論文において発表した。本年度は本研究の2年目で最終年度に当たり、本年度の研究実施計画に基づいて以下のように研究を進め、研究期間終了後、研究成果報告書を作成した。野口は中小企業ネットワークを活性化するために、ユビキタス・ネットワークがどのような条件を持たねばならないか、どのように構築を進めるべきかについて研究を進めた。ウェブ技術の新展開が中小企業の将来にもつ意義を分析し学会発表したほか、ウェブソーシングのコンセプトを国際会議において提案した。また景気回復に伴う日本製造業の国内回帰ないし復活について分析し、それがはらむリスクについて学会報告を行った。中小企業ネットワークにかかわる官民の動向、施策についても検討した。それらをふまえネットワークに関連する諸概念を整理し、中小企業ネットワークのプラットフォームを構築するための基礎理論を他の共著者とともに著書にまとめた。

山名は市場競争原理を指向するとされる日本企業の特徴を、アメリカ、中国、韓国と比較して分析し、それらの国々を訪問して起業環境について学術討論を行った。とくに日本、中国、韓国での企業アンケートによって、日本企業の終身雇用は崩れておらず成果主義賃金は限定的であること、売上げよりも長期持続と利益を重視していること、それに対し中国企業は利益よりも短期の成果を重視し、韓国企業は両者の中間であること、国際ビジネスではこれらのちがいを考慮すべきであり、中国では市場主義のもたらす問題点に目を向ける必要があることなどが明らかになった。それらについての国際学術討論のために中国語、英語の論文を作成した。
アディポネクチン受容体遺伝子多型が肥満合併症に及ぼす影響

検索の結果、adipoR1遺伝子のイントロンに9つのSNPs、3'-UTRに1つのSNP、プロモータ領域に5つのSNPsを同定した(R1SNP 1-R1SNP 15とする)。R1SNP 6とR1SNP 7、R1SNP 9とR1SNP 10は完全な連鎖不平衡にあったため、以後の解析はR1SNP 6とR1SNP 9を除いた13箇所で行うこととした。また、adipoR2遺伝子のエクソンに1つのSNP、イントロンに3つのSNPs、3'-UTRに1つのSNP、プロモータ領域に2つのSNPsを同定した(R2SNP 1-R2SNP 7とする)。R2SNP 4とR2SNP 5とR2SNP 6は完全な連鎖不平衡にあったため、解析はR1SNP 4とR1SNP 5を除いた5箇所で行うこととした。新たに見つかったアディポネクチン受容体の遺伝子多型を多数検体でタイピングを行う必要がある。多数検体でのタイピングでは、Invador法を用いる。このため、現在Invador法で用いるプライマー、プローブを設計し、多数検体でのタイピングを進めている。
肝炎の炎症進展及び治癒過程に関与する宿主遺伝子発現動態の解析

HBVトランスジェニックマウス(Tg)にHBV抗原特異的CTL(HBs-CLT)を移入することにより惹起される肝炎モデルを用い、肝炎の病態及び炎症進展機序に関する検討を行った。CTL移入後の肝傷害はCTLクローン毎に異なり、クローンによってはピークのALT値で10倍以上の差を認めた。異なるCTLクローンにより引き起こされる病態の差は、TNF-α、IFN-γなど、CTLから産生されるサイトカイン量に依存しないことより、それ以外のCTLの機能の差、CTLによって活性化される他のeffector細胞、あるいは何らかの宿主側因子によって規定される可能性がある。これらの可能性を検証するため、TNF-αノックアウトマウス(KO)、NKT KOとHBV Tgとを掛け合わせたマウスを用いて、TNF-α、あるいはNKT細胞が肝炎進展過程に与える影響についてさらに詳細に解析した。HBV Tg/TNF-αKOへのHBs-CTL移入では、HBV Tgに移入した場合に比較し、トランスアミナーゼの最高値は20分の1以下に低下した。TNF-αの産生細胞、産生量を制御する因子、それ以外の遺伝子発現に与える影響については、今後詳細に検討する予定である。一方、HBV Tg/NKT KOへのHBs-CTL移入では、HBV Tgへの場合に比較し、トランスアミナーゼ値は有意に上昇した。HBV Tgの肝内NKT細胞の解析では、CTL移入3時間後に、IL-10遺伝子の発現が増強していた。これより、急性肝炎初期において、NKT細胞は、抗炎症性サイトカインであるIL-10を介して肝炎の増悪を抑制する働きを有す可能性があると考えられた。免疫担当細胞、サイトカインとも、炎症の場において多面的な作用を担っており、その詳細な解析は、肝炎における炎症軽減、肝再生促進などを目的とした治療法確立のためには必須のものと考えられる。我々は、B型肝炎ウイルス(HBV)トランスジェニックマウス(tg)にHBV抗原特異的CTLを移入することにより惹起される肝炎モデルを用い、肝炎の病態、及び炎症進展機序に関する検討を行ってきた。このモデルにおいては、CTL移入後、CTLの抗原表出肝細胞に対する直接障害(apoptosis)、Tリンパ球、多核白血球など非特異的炎症細胞浸潤により引き起こされるfocal necrosis、肝細胞がHBs抗原を蓄積している場合に主としてマクロファージにより引き起こされるmassive necrosisというように経時的、段階的に炎症は進展し、肝組織像としても、ヒトにおける急性肝炎(focal necrosis)、劇症肝炎(massive necrosis)に類似する。現在までに、focal necrosisからmassive necrosisに至る過程では、TNF-α、IFN-γが重要な役割を果たすことが明らかにされている。また、CTL移入後の肝障害はCTLクローン毎に異なり、クローン間でALT値に10倍以上の差を認め、移入後の炎症の経過、転帰も異なってくる。肝障害の程度の差はCTLの産生するTNF-α、IFN-γなどのサイトカインの量によるものではないことが現段階でわかっており、CTLの活性化の程度、接着因子の発現の程度など、CTL自身に関連する何らかの因子によって規定されていると考えられる。このモデルにおいて、CTLの肝細胞への直接障害の後、何故、炎症局所に非特異的な細胞浸潤がもたらされ炎症が増幅されるのか、肝炎の重症化に関わる宿主側の因子は何なのか、肝炎が治癒するもの、遷延するものの差はどこにあるのか、などの問題を、包括的かつ効率的に解析するために、DNAマイクロアレイを用いたトランスクリプトーム解析を用いての検討を行っている。

我々は、B型肝炎ウイルス(HBV)トランスジェニックマウス(tg)にHBV抗原特異的細胞傷害性Tリンパ球(CTL)を移入することにより惹起される肝炎モデルを用い、肝炎の病態と炎症進展機序に関する検討を行ってきた。このモデルでは、CTL移入後、CTLの抗原表出肝細胞に対する直接障害(apoptosis)、Tリンパ球、多核白血球など非特異的炎症細胞浸潤により引き起こされるfocal necrosis、肝細胞がHBs抗原を蓄積している場合に主としてマクロファージにより引き起こされるmassive necrosisというように経時的、段階的に炎症は進展し、ヒトにおける急性肝炎(focal necrosis)、劇症肝炎(massive necrosis)に類似した組織像を呈する。CTL移入後の肝障害の程度はCTLクローン毎に異なり、移入後の炎症の経過、転帰も異なつてくる。現在、この肝障害の重症度を規定する因子について、CTLの活性化の程度、接着因子の発現の程度など、CTL側の因子を解析するとともに、炎症の場である肝組織で発現する遺伝子の動態や、炎症の程度による発現の差について、DNAマイクロアレイによるトランスクリプトーム解析により検討中である。また、TNF-αノックアウトマウス(KO)とHBV-tg、NKT-KOとHBV-tgとをそれぞれ掛け合わせたマウスに、同様にCTL移入を行うと、HBV-tgにおける肝障害に比較して肝障害の程度は軽くなる。これはTNF-α(あるいはマクロファージなどのTNF-α産生細胞)およびNKT細胞が、肝障害の成立、増悪に関与していることを意味している。これらの肝障害における役割も明確にするため、やはりDNAマイクロアレイを用いたトランスクリプトーム解析を用いての同様の検討を行っている。
老化・がん化耐性げっ歯類ハダカデバネズミ特異的な核内受容体遺伝子重複の機能解析

本研究では、ハダカデバネズミにおいて見出した新規の核内受容体遺伝子変異が生体にどのような影響を与えているかを解明することを目的とする。本年度はまず、ハダカデバネズミにおける変異型受容体のin vitroでの機能解析を行うため、293T細胞に変異型受容体の過剰発現を行った際に野生型受容体の転写活性及び遺伝子/タンパク質発現が影響を受けるかを調べた。核内受容体応答配列を用いたレポーターアッセイの結果、変異型受容体の共発現により野生型受容体の転写活性が上昇することがわかった。一方で、変異型受容体の有無によって、野生型受容体の遺伝子レベル・タンパク質レベルでの発現量に差異は認められなかった。当該受容体はリン酸化やユビキチン化により活性や安定性が変化することから、翻訳後修飾への影響について検討を進める。また、生体における変異型・野生型受容体の組織特異的な発現パターンを明らかにするため、公共データベースに登録されている各種組織のトランスクリプトームデータを活用し解析を行った。ハダカデバネズミのゲノムデータが不完全であるため当該受容体の遺伝子配列が欠落しているという問題点があったが、ゲノム配列を必要としない解析手法を立ち上げることで、組織ごとの発現量の推定が可能となった。さらに、ハダカデバネズミとそれぞれ分岐年代が異なるダマラランドデバネズミ、モルモット、ラット、マウスの4種について公共データあるいは組織由来RNAを用いて、核内受容体遺伝子の重複あるいは変異が生じているかを検討し、遺伝子変異がハダカデバネズミ特異的であることを支持する結果を得た。本年度はin vitroにおける核内受容体遺伝子変異の機能解析を実施し、変異型受容体が野生型受容体の転写活性化に寄与することを明らかにした。また、公共データを活用し、核内受容体遺伝子の発現パターン及び種特異的変異を解析する解析系を立ち上げることができた。変異型受容体がどのような機構で野生型受容体の転写活性に影響するのかを明らかにするため、活性化に伴う翻訳後修飾にとくに着目し、ウェスタンブロットによる解析を行う。また、変異型受容体がナンセンス変異依存mRNA分解機構による分解を受けている可能性について検討を行う。ハダカデバネズミの内在性受容体を検出可能な抗体は存在しないことから、抗体の作製ないしRNA in situ hybridizationにより対応する。またハダカデバネズミ細胞株を用いて核内受容体標的遺伝子の発現が変異型受容体により調節されるかを明らかにする。消耗品について複数業者から相見積もりを取ったところ、予定していた金額より低価格で購入することができた。差額については、研究の発展により消耗品購入費が増加する可能性があるため、消耗品費に組み込んで使用する。
脳児脳のischemic preconditioningによる虚血耐性発現機構

本年度はヒツジ胎仔脳虚血モデルを用い、昨年度の追加実験を行い、胎仔脳組織におけるIPCによる虚血耐性発現に関し以下の検討を行った。[方法]1.妊娠125日前後の妊娠ヒツジ慢性実験モデルを作成した。術後7日目に胎仔の臍帯血流遮断1分、再灌流10分を4回繰り返す、IPCを実施した。2.IPC後3日目に、脳障害必発モデルとして確立されている臍帯血流遮断5分、再灌流30分を4回繰り返した。3.3日後に胎仔脳を灌流固定し、脳障害の程度を検討した。4.IPCを実施しない群をコントロールとして同様の実験を行った。5.さらに同様のIPCモデルにおいて、アデノシンのagonistおよびアデノシンの産生を増加させる5'-nucleotidaseをIPC前に投与。また、同様にアデノシンのantagonistである8-sulfophenylthephylline,prazocinおよびアデノシン分解を促進するadenosine deaminaseをIPC前に投与し、アデノシンが虚血耐性発現機構において担う役割を検討した。[結果]1.IPC施行群で、脳虚血耐性は有意に亢進した。2.IPC施行群において、虚血・再灌流に対するアデノシンの上昇が有意に著明であった。3.アデノシンのagonistおよびアデノシンの産生を増加させる5'-nucleotidaseをIPC前に投与するとIPCの効果が高まった。4.アデノシンのantagonistである8-sulfophenylthephylline,prazocin投与およびアデノシン分解を促進するadenosine deaminase投与はIPCの虚血耐性効果を減弱させた。[結論]胎児脳組織のIPC発現においてアデノシンは中心的な役割を担うことが示唆された。本年度はヒツジ胎仔脳虚血モデルを用い、胎仔脳組織におけるIPCによる虚血耐性発現の検討を行った。まず、ヒツジ胎仔慢性実験モデルの作成をした。妊娠125日前後の妊娠ヒツジ母獣にカテーテル類を装着する。さらに胎仔帯に臍帯オクルーダを装着し胎仔慢性実験モデルを作成した。次にIPCによる胎仔脳組織の虚血耐性発現機構の検討を行った。IPC後3日目に、脳障害必発モデルとして確立されている臍帯血流遮断5分、再灌流3分を4回繰り返した。3日後に胎仔脳を灌流固定し、脳障害の程度を検討した。また、同時にIPCを実施しない群をコントロールとして同様の実験を行ったこれらの結果として、以下の所見を得た、1.IPCを施行したほうが、虚血耐性が高まることが判明した。2.IPCを施行したほうが、虚血・再還流時にアデノシンの上昇が著明であることが判明した。この結果に基づき、来年度は、本年度と同様のIPCモデルを作成し、アデノシンのagonistおよびアデノシンの産生を増加させる5'-nucleotidaseをIPC前に投与、同様にアデノシンのantagonistである8-sulfophenyl-thephylline,prazocinなどをIPC前に投与し、アデノシンが虚血耐性発現において担う役割を検討する予定である。本年度はヒツジ胎仔脳虚血モデルを用い、胎仔脳組織におけるIPCによる虚血耐性発現に関し以下の検討を行った。[方法]1.妊娠125日前後の妊娠ヒツジ

母獣にカテーテル類を装着し慢性実験モデルを作成した。術後7日目に胎仔の臍帯血流遮断1分、再灌流10分を4回繰り返す、IPCを実施した。2.IPC後3日目に、脳障害必発モデルとして確立されている臍帯血流遮断5分、再灌流30分を4回繰り返した。3.3日後に胎仔脳を灌流固定し、脳障害の程度を検討した。4.IPCを実施しない群をコントロールとして同様の実験を行った。5.さらに同様のIPCモデルにおいて、アデノシンのagonistおよびアデノシンの産生を増加させる5'-nucleotidaseをIPC前に投与。また、同様にアデノシンのantagonistである8-sulfophenylthephylline,prazocinなどをIPC前に投与し、アデノシンが虚血耐性発現において担う役割を検討した。[結果]1.IPCを施行した方が、脳虚血耐性は亢進した。2.IPCを施行した方が、虚血・再灌流に対するアデノシンの上昇が著明であった。3.アデノシンのagonistおよびアデノシンの産生を増加させる5'-nucleotidaseをIPC前に投与するとIPCの効果が高まった。4.アデノシンのantagonistである8-sulfophenylthephylline,prazocinなどはIPCの効果を減弱させた。[結論]アデノシンは胎児脳組織のIPC発現に大きく寄与していることが示唆された。本年度はヒツジ胎仔脳虚血モデルを用い、昨年度の追加実験を行い、胎仔脳組織におけるIPCによる虚血耐性発現に関し以下の検討を行った。[方法]1.妊娠125日前後の妊娠ヒツジ慢性実験モデルを作成した。また、同様にアデノシンのantagonistである8-sulfophenylthephylline, Prazocinおよびアデノシン分解を促進するadenosine deaminaseをIPC前に投与し、アデノシンが虚血耐性発現機構において担う役割を検討した。[結果]1.IPC施行群で、脳虚血耐性は有意に亢進した。2.IPC施行群において、虚血・再灌流に対するアデノシンの上昇が有意に著明であった。4.アデノシンのantagonistである8-sulfophenylthephylline, prazocin投与およびアデノシン分解を促進するadenosine deaminase投与はIPCの虚血耐性効果を減弱させた。[結論]胎児脳組織のIPC発現においてアデノシンは中心的な役割を担うことが示唆された。
小児アレルギー性疾患におけるT細胞サブセットとCCR7発現の病態生理的意義

生体では、未熟なナイーブT細胞は種々の抗原に暴露されることによって成熟する。その一部は活性化T細胞としてサイトカインなどを介して直接作用し、残りはメモリーT細胞となって生体内を循環しながら将来の抗原暴露に備えている。ケモカインレセプターのひとつであるCCR7の発現がT細胞の成熟段階と関連する可能性が示され、本研究では小児期を通しての発現を活性化マーカーのひとつであるCD45RO発現との関係で検討した。CD4+T細胞はCD45RO-CCR7+、+、CD45RO+CCR7-集団に、またCD8+T細胞はCD45RO-CCR7+、CD45RO-CCR7-、CD45RO+CCR7-集団に別れ、それぞれのサイトカイン産生を検討すると各集団間でその産生量は大きく異なり、CCR7ならびにCD45ROを指標としてT細胞の成熟過程を検討することの妥当性が明らかになった。次に、乳幼児から成人までの変化を検討したところ、T細胞の成熟が年齢に応じてダイナミックに変化していることが明らかになった。さらに、小児期早期に発症することが多いアレルギー疾患患児と健常児におけるCCR7の発現を比較検討すると、いくつかの年齢群においてCCR7に基づくサブセットの比率に有意差を認めた。アレルギー疾患の重要な病態のひとつとして、T細胞のTh1/Th2バランスがTh2優位な状態に傾いていることが知られている。CCR7発現とTh1/Th2細胞の関係をケモカインレセプターのCXCR3とCCR4をそれぞれのマーカーとして検討すると、Th1細胞ならびにTh2細胞におけるエフェクター細胞とメモリー細胞の割合は、それぞれ4:6であることが明らかになった。さらに、個体のTh1/Th2バランスの発達に関与する単球のIL-12産生能を年齢的に検討すると、低年齢ほどその産生が少なく学童期以上ではアレルギー疾患患者の産生能が健常者に比して有意に低値であることが明らかになった。以上のことより、小児期におけるT細胞の成熟はTh1/Th2細胞のバランスと共にダイナミックに変化していることが明らかとなり、その成熟過程の偏移がアレルギー疾患の発症ならびに病態に深く関与している可能性が示され、今後これらケモカインレセプターやサイトカイン産生能をマーカーとした病態評価が可能になることが期待される。このようT細胞の成熟過程は小児期早期から認められ、その時期にアレルギー性疾患の発症する頻度が高いことと考え合わせると、T細胞の成熟過程のアンバランスがアレルギー性疾患発症につながる可能性が示唆される。近年、ケモカインレセプターのひとつであるCCR7の発現が、T細胞の成熟過程と関連する可能性が示された。昨年度の研究では、ヘルパー(CD4陽性)T細胞とサプレッサー(CD8陽性)T細胞におけるCCR7発現とその機能を解析する目的で、それぞれの細胞を活性化マーカーの代表であるCD45ROとCCR7との関係で検討した。

まず、ヘルパーT細胞はCD45RO陰性CCR7陽性、CD45RO陽性CCR7陽性、CD45RO陽性CCR7陰性の3群に、一方サプレッサーT細胞はCD45RO陰性CCR7陽性、CD45RO陰性CCR7陰性、CD45RO陽性CCR7陰性の3群に大別された。それぞれの細胞のサイトカイン産生を検討すると各群間でその産生量は大きく異なり、CCR7ならびにCD45ROを指標としてT細胞の成熟過程を検討することの妥当性が示された。次に、0から15歳までのアレルギー性疾患患者ならびに非アトピー対照についいて末梢血T細胞におけるCCR7ならびにCD45RO発現を検討した。その結果、加齢とともに発現細胞の比率が変化することが明らかとなった。また、アレルギー性疾患患者と非アトピー対照との間では、いくつかの年齢群においてサブセットの割合に有意差を認めた。現在、Th1細胞マーカーであるCXCR3、Th2細胞マーカーであるCCR4の発現との関係を検討中である。生体では、未熟な(ナイーブ)T細胞は種々の抗原刺激によって成熟し、個体の免疫機能の発達に寄与している。成熟した活性化T細胞は、産生するサイトカインを介して直接作用するエフェクターT細胞と将来の抗原暴露に備えているメモリーT細胞の2群に大別される。ケモカインレセプターのひとつであるCCR7の発現がT細胞の成熟段階と関連する可能性が示され、小児期を通しての発現を検討した本研究でもCCR7発現は乳幼児期から年齢に応じてダイナミックに変化していることが明らかになった。さらに、小児期早期に発症することが多いアレルギー疾患患児と健常児におけるCCR7の発現を比較検討すると、いくつかの年齢群においてCCR7に基づくサブセットの比率に有意差を認めた。アレルギー疾患の重要な病態のひとつとして、T細胞のTh1/Th2バランスがTh2優位な状態に傾いていることが知られている。CCR7発現とTh1/Th2細胞の関係をケモカインレセプターのCXCR3とCCR4をそれぞれのマーカーとして検討すると、Th1細胞ならびにTh2細胞におけるエフェクター細胞とメモリー細胞の割合は、それぞれ4:6であることが明らかになった。さらに、個体のTh1/Th2バランスの発達に関与する単球のIL-12産生能を年齢的に検討すると、低年齢ほどその産生が少なく学童期以上ではアレルギー疾患患者の産生能が健常者に比して有意に低値であることが明らかになった。以上のことより、小児期におけるT細胞の成熟はTh1/Th2細胞のバランスと共にダイナミックに変化していることが明らかとなり、その成熟過程の偏移がアレルギー疾患の発症ならびに病態に深く関与している可能性が示され、今後これらケモカインレセプターをマーカーとした病態評価が可能になることが期待される。
陸上競技用ランニング動作自律移動型計測システム及び多次元解析システムの開発

本研究は,全周の視野情報をリアルタイムに取得する全周撮像装置ODV(OmniDirectional Vision system)を用いることで,中距離走者の走行についての定量的なデータベースを構築し,さらには走行モデルの構築を通して,最適なトレーニング方法をユーザにフィードバックするものである.これまでに,本運動解析システムにおける撮像器の基本設計を行うとともに,システムの有効性確認のため,全周撮像装置による競技全体の運動解析システムと,通常カメラによる詳細動作解析システムの2つにシステムを分割し,それぞれ確認試験を行うことにより,システム全体の有効性を確認した.昨年度,400m走トラックというグローバルな規格を持つフィールドにおいて計測を行うために,新たな装置を設計・製作した.本装置は,トラック全体を撮像し競技の始終を解析する全周撮像光学系と,競技者を拡大撮影し,詳細な身体動作を解析するための局所撮像光学系,の2つの特殊光学系,及び1台のハイスピードカメラにより構成されている.ハイスピードカメラを用いることにより,通常のCCDカメラを用いた場合に比べて,より高速な撮像が可能になるため,動きの早い人の指先の動きなども捕らえることが可能となる.本年度は作成した装置の評価を行った.全周画像撮影部においては,全周において歪みなく撮影可能で,撮影した画像から走者を認識し,速度の算出が可能であることを確認した.また,局所撮像部においては,実トラックにおける撮影距離においても,体の各部位が判断可能なほどの解像度を持っていることがわかった.以上より,当初の目的をほぼ達成できたといえるが,最大撮影距離においては,撮影対象が不鮮明になり,体の各部位の判別が困難であったため,今後の改良が必要である.本研究は,全周の視野情報をリアルタイムに取得する全周撮像装置ODV(OmniDirectional Vision system)を用いることで,中距離走者の走行についての定量的なデータベースを構築し,さらには走行モデルの構築を通して,最適なトレーニング方法をユーザにフィードバックするものである.これまでに,本運動解析システムにおける撮像器の基本設計を行うとともに,システムの有効性確認のため,全周撮像装置による競技全体の運動解析システムと,通常カメラによる詳細動作解析システムの2つにシステムを分割し,それぞれ確認試験を行うことにより,システム全体の有効性を確認した.昨年度,400m走トラックというグローバルな規格を持つフィールドにおいて計測を行うために,新たな装置を設計・製作した.本装置は,トラック全体を撮像し競技の始終を解析する全周撮像光学系と,競技者を拡大撮影し,詳細な身体動作を解析するための局所撮像光学系,の2つの特殊光学系,及び1台のハイスピードカメラにより構成されている.ハイスピードカメラを用いることにより,通常のCCDカメラを用いた場合に比べて,より高速な撮像が可能になるため,動きの早い人の指先の動きなども捕らえることが可能となる.本年度は作成した装置の評価を行った.全周画像撮影部においては,全周において歪みなく撮影可能で,撮影した画像から走者を認識し,速度の算出が可能であることを確認した.また,局所撮像部においては,実トラックにおける撮影距離においても,体の各部位が判断可能なほどの解像度を持っていることがわかった.以上より,当初の目的をほぼ達成できたといえるが,最大撮影距離においては,撮影対象が不鮮明になり,体の各部位の判別が困難であったため,今後の改良が必要である.本研究は,全周の視野情報をリアルタイムに取得する全周撮像装置ODV (OmniDirectional Vision system)を用いることで,400m走トラックというグローバルな規格を持つフィールドにおいて,中距離走者の走行についての定量的なデータベースを構築し,さらには走行モデルの構築を通して,最適なトレーニング方法をユーザにフィードバックするものである.本システムは,1つの撮像器で競技全体の競技者の運動の解析を実現するとともに,関節角の推移といったような詳細な動作をも解析可能であるという,これまでに例のない高機能な運動解析システムを提案するものである.本年度は,本運動解析システムにおける撮像器の基本設計を行うとともに,システムの有効性確認のため,全周撮像装置による競技全体の運動解析システムと通常カメラによる詳細動作解析システムの2つにシステムを分割し,それぞれ確認試験を行うことにより,システム全体の有効性を確認した.まず,全周撮像装置による競技全体の運動解析試験については,トラックフィールドの縮小モデルで試験を行い,取得画像を処理することにより,競技者位置,速度,加速度,ピッチ,ストライドといったトラック競技における定量的なデータが取得可能であることを確認した.次に,競技者の詳細動作解析試験については,主に画像処理による無標点計測を目指し,人体モデルを利用したテンプレートマッチングによる動作解析を行い,各関節角について分解能の高いデータが取得可能であることを確認した.本年度は,撮像器の基礎設計と解析システムの有効性確認試験を行い,システムの基礎検証を行った.来年度は,実際の屋外フィールドにおいてデータ取得を行い,動作解析アルゴリズムの評価と改善を行うこととする.本研究は,全周の視野情報をリアルタイムに取得する全周撮像装置ODV(OmniDirectional Vision system)を用いることで,中距離走者の走行についての定量的なデータベースを構築し,さらには走行モデルの構築を通して,最適なトレーニング方法をユーザにフィードバックするものである.

これまでに,本運動解析システムにおける撮像器の基本設計を行うとともに,システムの有効性確認のため,全周撮像装置による競技全体の運動解析システムと,通常カメラによる詳細動作解析システムの2つにシステムを分割し,それぞれ確認試験を行うことにより,システム全体の有効性を確認した.昨年度,400m走トラックというグローバルな規格を持つフィールドにおいて計測を行うために,新たな装置を設計・製作した.本装置は,トラック全体を撮像し競技の始終を解析する全周撮像光学系と,競技者を拡大撮影し,詳細な身体動作を解析するための局所撮像光学系,の2つの特殊光学系,及び1台のハイスピードカメラにより構成されている.ハイスピードカメラを用いることにより,通常のCCDカメラを用いた場合に比べて,より高速な撮像が可能になるため,動きの早い人の指先の動きなども捕らえることが可能となる.本年度は,作成した装置の評価を行った.全周画像撮影部においては,全周において歪みなく撮影可能で,撮影した画像から走者を認識し,速度の算出が可能であることを確認した.また,局所撮像部においては,実トラックにおける撮影距離においても,体の各部位が判断可能なほどの解像度を持っていることがわかった.以上より,当初の目的をほぼ達成できたといえるが,最大撮影距離においては,撮影対象が不鮮明になり,体の各部位の判別が困難であったため,今後の改良が必要である.
膀胱、気管など中空臓器を異所移植により再生させる方法とそのメカニズム

本研究の特徴である、臓器を皮下に移植することにより、生体内で再生現象を起こさせた場合の変化について調べ、いくつかの重要な知見を得た。本年度に新たにわかったことを以下に記す。(1)気管の上皮細胞は移動に際し、重層扁平化(扁平上皮化生)したが、電子顕微鏡レベルでの観察では、移動先端の細胞は上層の扁平な細胞層と、下層の立方状の細胞層が区別できた。最上層の細胞の上面には徴絨毛が見られるなど、細胞極性は一部維持されていた。細胞間隙は開いており、そこに多数のヒダを出して隣の細胞と結合している。接触面にはデスモソームが見られる。移動先端では不規則な形と大きさのBleb状の構造が見られ、移動にとって重要な役割をしていることが推察された。この構造は中に差相棒ない小器官をほとんど持たずアクチンの断面と思われる点状構造のみが見られた。(2)気管は皮下に空間を作り、上皮の断端が宙に浮くように移植しても上皮間に薄い膜が張って、その内側に上皮が移動、再生した。この膜は上皮が移動した先端部を境にして、フィブリンが主体の中心部分と各種コラーゲンが主体の周辺部に区別される。そこで人為的にコラーゲン膜やフィブリン膜を作成して、この膜上で気管の上皮再生を促したところ、コラーゲン膜では良好な再生が見られたが、フィブリン膜には細胞は接着できなかった。なお、細胞接着タンパクのフィブロネクチンは細胞外マトリックス全体に幅広く分布していた。GFPラットをドナーとして用い、その皮膚を移植することにより、ドナー由来の部分を判定することができた。上皮だけでなく、新たに上皮化した部分の下の結合組織成分(多くは肉芽組織)の一部もドナー由来であった。また、その部分の血管も細い血管はレシピエント由来だったが、やや太い血管はドナー由来だった。両者の間に交通があるかどうかは不明である。気管の移植では、すみやかに上皮化が起こったが、上皮の移動の際に扁平上皮化生が起こり、細胞は重層化した。これは細胞の移動にとって何らかの有利な形質を獲得しているのかもしれない。免疫組織学的にはβ-catenin、E-cadherinなどが上皮の細胞膜領域に検出でき、epithelial-mesenchymal transitionが起こっているわけではないと考えられる。移動中の上皮にはγ-cateninが強く発現していた。また、種々の蛍光標識レクチンで染めたところ、一部のレクチンはドナー部分の上皮の線毛(LEL)や粘液分泌果粒(UEA-1、STL)を染めたが、移動を開始した上皮ではシグナルが著しく弱いか、全く見られず、上皮の性質に大きな変化が起こっていることが示唆されたこの移動中の気管の上皮から現在RNAを採取、subtractive cDNA cloningを行い、移動上皮に特異的な遺伝子のクローニングを目指して実験を行っている。また、この気管の上皮ではdegenerative PCRにより、homeoboxを持った遺伝子や、Wntファミリーに属すると思われる遺伝子のシグナルが検出される。現在これらの遺伝子がこれらの遺伝子群の中のどれに当たるのかをクローニング、遺伝子配列により検討中である。本研究の特徴である、臓器を皮下に移植することにより、生体内で再生現象を起こさせた場合に変化する分子について調べ、いくつかの重要な知見を得た。特に気管が材料として扱いやすくまた顕著な現象が起こるのでその結果について以下に記す。(1)気管の上皮は扁平上皮化生を起こして、移動を行う。この際、移動先端から遠い場所では線毛上皮の形を維持したままで移動を続けることもできる。扁平上皮化生に伴い、化生特異的なケラチンCK13が発現するようになり、粘液上皮に反応するレクチン、繊毛上皮に反応するレクチンはその反応を示さなくなる。(3)上皮の移動に伴い、細胞極性に関わる分子(Occludin、tubulinなど)の局在の変化や、接触阻害に関わる分子(IGF-BP-6など)の新たな発現など、様々な変化が見られた。またα-平滑筋アクチンの発現が移動上皮とその直下で顕著であり細胞移動に重要な役割を果たしていることが示唆された。(4)上皮細胞が移動していく足場の基質には、少なくとも構成分子の上から3種のものがかなり明瞭に区別できた。そのうち各種コラーゲンと間葉系細胞を顕著に含む初期肉芽と思われる組織が細胞移動の基質になっていると考えられる。この組織はまだ新生血管が侵入する以前から細胞移動の足場となることができ、上皮細胞の移動を引き起こすための必要最小限の条件を検討する上で有用な研究材料になると考えられる。

移動先端では不規則な形と大きさのBleb状の構造が見られ、移動にとって重要な役割をしていることが推察された。この構造は中に差相棒ない小器官をほとんど持たずアクチンの断面と思われる点状構造のみが見られた。(2)気管は皮下に空間を作り、上皮の断端が宙に浮くように移植しても上皮間に薄い膜が張って、その内側に上皮が移動、再生した。この膜は上皮が移動した先端部を境にして、フィブリンが主体の中心部分と各種コラーゲンが主体の周辺部に区別される。そこで人為的にコラーゲン膜やフィブリン膜を作成して、この膜上で気管の上皮再生を促したところ、コラーゲン膜では良好な再生が見られたが、フィブリン膜には細胞は接着できなかった。なお、細胞接着タンパクのフィブロネクチンは細胞外マトリックス全体に幅広く分布していた。