hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
膜結合性転写因子ATF6の小胞体ストレス応答性出芽機構

本研究では、小胞体膜結合性転写因子ATF6の活性化機構に関与する因子として我々が同定した新規ATF6結合タンパク質p45に関する解析を行い、以下の成果を得た。(1)p45と相同性の高いp50を新たに同定し、p45と同様に、p50も構造異常タンパク質の蓄積に応答してATF6と結合することを見い出した。さらにATF6との結合に必要なp45とp50のアミノ酸領域を同定した。(2)相同組み換え効率の高いニワトリDT40細胞を用いて、p50が欠損した細胞を樹立した。(3)質量分析法を活用してATF6複合体の構成成分を明らかにするための実験系を確立した。本研究では、新規ATF6結合タンパク質として同定したp45に着目し、小胞体膜結合性転写因子ATF6の活性化機構を明らかにすることを目的としている。平成21年度の解析では、複数のp45変異体を作製し、ATF6との結合に必要なp45のアミノ酸領域の特定を行った。その結果、p45のN末端領域を約100アミノ酸除くと、小胞体ストレスに応答したATF6との相互作用が消失することが明らかとなった。N末端領域には進化的に高度に保存されている連続する9つのアミノ酸が含まれており、この9アミノ酸について、ATF6との結合に関する必要性と十分性をさらに詳しく検証している。また、遺伝子データベースを用いた検索により、哺乳動物においては、p45と相同性の高いp50が存在することを見い出した。p45はN末端にシグナル配列、C末端に膜貫通ドメインを有する膜タンパク質であるが、p50はN末端にシグナル配列のみを有する可溶性タンパク質である。細胞内へのトランスフェクションと免疫染色解析から、p50は小胞体局在性のタンパク質であると考えられた。さらに、免疫沈降法による結合実験を行ったところ、p45と同じく、p50も小胞体ストレス依存的にATF6と相互作用することが明らかとなった。興味深いことに、p45とp50同士も小胞体ストレス依存的に相互作用すること、p45とp50を共発現させるとATF6との相互作用が増強されることから、p45とp50は複合体を形成して機能すると予想された。以上の結果は、p45とp50がATF6の活性化機構に関与していることを強く示唆している。両者の機能をさらに詳しく解析することにより、ATF6の活性化機構の解明につながることが期待される。本研究は、小胞体ストレスに応答した膜結合性転写因子ATF6の活性化分子機構を明らかにすることを目的としている。平成22年度では以下のような解析を行った。1.申請者が同定した新規ATF6結合タンパク質p45、p50の機能を確実に明らかにするため、マウスに比べて遺伝子破壊がはるかに容易なニワトリBリンパ球由来細胞DT40を用いて、p45およびp50を破壊した細胞の樹立に着手した。まず、DT40においても哺乳動物と同様に、小胞体ストレスに応答してATF6がプロテオリシスを受けて活性化することを確認した。また、DT40細胞においてATF6遺伝子を破壊すると、マウス細胞の場合と同様に小胞体ストレスに応答したBiPの転写誘導がほぼ消失した。この結果は、DT40がATF6経路を解析するモデル細胞として適していることを示している。そこで、実際にp50遺伝子の破壊を開始し、ヘテロ欠損細胞の作製を完了、ホモ欠損細胞の候補株を複数単離した。p50遺伝子が破壊されていることを確認した後、ATF6のプロテオリシスに対する影響を検討する予定である。2.さらなる新規ATF6結合タンパク質を同定するために、TAPタグを付加したATF6の小胞体内腔ドメイン(ATF6(C)-TAP)を発現するプラスミドDNAを作製し、ATF6(C)-TAPの細胞内挙動を詳しく解析した。全長型ATF6は膜タンパク質であるが、ATF6(C)-TAPは膜ドメインを持たないため、細胞からの可溶化と免疫沈降が容易であった。ATF6(C)-TAPの共沈降物を質量分析法により解析したところ、小胞体局在性のシャペロンであるPDIとカルネキシンをATF6結合タンパク質として新規に同定することができた。ATF6(C)-TAPは、全長型ATF6と同様に小胞体ストレスに応答してゴルジ体に移行することから、ATF6(C)-TAPの免疫沈降条件を最適化することにより、ATF6の活性化に関与する新規因子を同定することが可能と考えられる。
マクロ環型尿素分子を用いた逆ベシクルの創製と機能制御

有機溶媒中で自己形成する分子組織体はバルク相とは異なるユニークな微視的環境を提供できるために、分子認識や触媒反応の場としての活用が期待できる。しかしながら、水中ミセルに対する有機溶媒中の逆ミセルが活発に研究されているのに対して、水中のベシクルに対する有機溶媒中のそれは殆ど研究例がない。そこで、我々は、特定のコンフォメーションをとるように予めプログラムされた機能性分子としてレゾルシナレンに立体的に嵩高い光学活性尿素を8つ導入した分子の開発に取り組んだ。本研究では、有機溶媒中における逆ベシクルの形成を目指して、より立体障害の少ないアルキル尿素を導入したレゾルシナレン誘導体を分子設計し、開発することに成功した。水素結合形成能および会合特性を検討したところ、クロロホルム中において粒径が400-700nmのベシクル状会合体を形成することを、DLS、XRDおよびTEMによって明らかにした。唯一、逆ベシクルを形成することが報告されているMendozaの分子が環状尿素によるface-to-face型の水素結合を利用して自己会合体を形成しているのに対して、本研究では、side-by-side型の水素結合をバンドル状に寄り集めて制御することで、同様な逆ベシクルが形成できることを初めて明らかにした。さらに、逆ベシクルの尿素ドメインには塩化物イオンなどのアニオンがゲストとして捕捉されることも実証した。本研究の成果は、有機合成化学および分子認識化学に基づいて、側鎖が分子内水素結合によって寄り集まるようにプログラムされた機能性分子を用いてユニークな逆ベシクルを開発するための有益な知見として意義深い。極性官能基に由来する分子間相互作用の制御は、機能性分子集合体の構築において重要な要因である。我々はレゾルシナレン骨格に柔軟なアルキル(ヘキシル)鎖を有する尿素誘導体を8つ導入したマクロ環型オクタ尿素がクロロホルムなどの非極性有機溶媒中において自己会合体を形成することを見出している。そこで、導入した尿素残基が形成する分子内および分子間水素結合の形成が重要であるとの考えられることから、以下の研究計画1)に従っで研究を実施した。1)モジュール法により多様な類似化合物群を合成し、逆ベシクルなどの自己組織体の構築に適する分子設計指針を確立する。まずは、レゾルシナレン骨格に導入する尿素誘導体の種類を変えたマクロ環型オクタ尿素を分子設計し、合成した。具体的には、アダマンチル、メチルベンジルなどを有する尿素誘導体を合成した。これまでのところ新たに得られたマクロ環型オクタ尿素は有機溶媒中で会合体を形成する実験データは得られていない。従来のヘキシル尿素型のマクロ環型オクタ尿素では分子間水素結合によって会合体の形成が有利であったのに対して、今回合成したアダマンチル、メチルベンジルなどを有するマクロ環型オクタ尿素では側鎖の嵩高さのために、分子内水素結合の形成が抑制されたものと考えられる。結果として、分子内水素結合により8つの側鎖が寄り集まったマクロ環化合物を得ることができた。とりわけ、光学活性なメチルベンジルを有する尿素誘導体は側鎖がねじれたキラルな分子内ナノ空間を与えることが期待されることから、マクロ環型オクタ尿素のキラリティーに基づく機能性の開発についても検討を行う必要があると考えられる。タンパク質などの生体分子は、水素結合等の分子内相互作用を巧みに利用して複雑に折り畳まれた高次構造を形成し、多様な機能を発現している。これらの所謂セルフフォールディングに起因する機能の発現においては、極性官能基に由来する分子間相互作用の制御が重要である。そこで、機能性分子を用いてセルフフォールディング分子として、我々はレゾルシナレン骨格に柔軟なアルキル鎖を介して不斉点を配した尿素誘導体を導入したマクロ環型オクタ尿素(R)-1,(S)-1を分子設計し、合成した。得られた1は、非極性溶媒中において尿素部位間の水素結合形成に起因して八つの側鎖が寄り集まったキラルな高次構造を与えた。すなわち、クロロホルム中のCDスペクトルは、(R)-1は280nmに正、255,260,265nmに負のCD帯を示し,(S)-1は(R)-1と対称なCDスペクトルを与えた。水素結合形成に起因する剛直な分子構造を反映して、側鎖末端の不斉部位から大環状骨格への不斉の伝達がこの特徴的なCD帯として観測されることを明らかにした。更に、アニオン性ゲストの包接に伴って、側鎖末端から大環状骨格への不斉性の伝達が解消されることも明らかにした。一方、スペーサーのアルキル鎖長をより長くした参照化合物では、分子内水素結合の形成が困難であり、結果として不斉性の伝達は認められなかった。研究の当初においては、逆ベシクルの形成を目的としていたマクロ環型オクタ尿素に不斉性の伝達という新たな機能を賦与することに成功した。

本研究では、有機溶媒中における逆ベシクルの形成を目指して、より立体障害の少ないアルキル尿素を導入したレゾルシナレン誘導体を分子設計し、開発することに成功した。水素結合形成能および会合特性を検討したところ、クロロホルム中において粒径が400-700nmのベシクル状会合体を形成することを、DLS、XRDおよびTEMによって明らかにした。唯一、逆ベシクルを形成することが報告されているMendozaの分子が環状尿素によるface-to-face型の水素結合を利用して自己会合体を形成しているのに対して、本研究では、side-by-side型の水素結合をバンドル状に寄り集めて制御することで、同様な逆ベシクルが形成できることを初めて明らかにした。さらに、逆ベシクルの尿素ドメインには塩化物イオンなどのアニオンがゲストとして捕捉されることも実証した。本研究の成果は、有機合成化学および分子認識化学に基づいて、側鎖が分子内水素結合によって寄り集まるようにプログラムされた機能性分子を用いてユニークな逆ベシクルを開発するための有益な知見として意義深い。
小胞輸送分子ESCRTを介したC型肝炎ウイルスの感染制御

我々は、エクソゾーム分泌とウイルス動態は酷似していることから、ESCRT経路とHCVとの関係を解析した。ESCRT構成分子の機能低下Huh7細胞を樹立し、JFH1を感染させたところ、上清に放出される感染性HCV粒子は減少した。免疫電顕をおこなうと、HCVコアタンパクとmultivesicular body内のintraluminal vesicleは共局在していた。以上のことからHCVはHrs依存性エクソゾーム経路を利用してアセンブリを行っていることが示唆された。(1)ESCRT分子のHCVにおける役割を検討するために、まず、HCVが含まれるとされるエクソゾームとHrsの関連性を検討した。Hrsノックアウト樹状細胞においては、エクソゾームの放出量が抑制されており、ovalbuminによって刺激を行い、そのエクソゾームを回収したところ、OT-IトランスジェニックマウスのT細胞に対する抗原提示能も減少していた。以上のことからHrsはエクソゾーム放出に必須の分子であり、エクソゾームを介した抗原提示能にも関わっている可能性が示唆された。(BBRC, 2010)(2)HrsノックダウンHuh7細胞にHCV株JFH1を感染させると、上清中に放出されるHCV-RNAは有意に減少した。細胞内HCV-RNAやコアタンパク発現量には変化がなかったが、細胞内の感染性HCV粒子はHrsノックダウン細胞において減少していた。以上のことから、HrsはHCVアセンブリに関与している可能性が示唆された。(3)HCV感染細胞の上清を精製し、ショ糖密度勾配遠心にて分画すると、HCVコアタンパクとエクソゾームマーカーであるCD63はほぼ同じ分画に存在した。共焦点顕微鏡を用いて観察すると、multivesicular bodyとHCVコアタンパクは部分的に共局在しており、免疫電顕をおこなうと、HCVコアタンパクおよびエンベロープタンパクはmultivesicular body内のintraluminal vesicleにも存在していた。以上のことからHCVはHrs依存性エクソゾーム経路を利用している可能性が示唆された。(BBRC,2010)(2)HrsノックダウンHuh7細胞にHCV株JFH1を感染させると、上清中に放出されるHCV-RNAは有意に減少した。MVB形成に必須とされるVPS4ノックダウン細胞においても、HCV放出の減少がみられた。エクソゾーム放出に必須のRab27bノックダウン細胞においても、HCV放出の減少がみられた。(Virology,2012)
Lax Trans formationを用いたPolymorphismの意味づけ

総称関数とは、複数の引数の型に対して適用可能な関数のことである。型つきのオブジェクト指向言語の動作を、総称関数を用いて表現し、その性質を調べ、新しい言語の設計に対する指針を与えようというのが、この研究の目標である。そのような計算として、λ-mergeや、オーバーロードの機構を改良し、Lax Transformationに対応する動作をするものに制限したλmについて研究してきた。λ-mergeのオーバーロードの機能は、一種のアドホックな多相(Polymorphism)と考えることができる。この多相では、どの型に対しても統一的な動作をするパラメトリックな多相に対応したものは表現できなかった。このことは、遅延束縛を表現できないことを意味し、オブジェクト指向に対応する型システムとして用いるための、大きな障害となっていた。そこで、オブジェクト指向に対応するλ-mergeの部分計算に型変数を導入し、パラメトリックな多相を表現できるようにすることにより、遅延束縛の動作を表現できる計算を考えた。ここでは、全ての型が、exactに表現されており、オブジェクト指向に対する静的解析、プログラム変換などへの応用が期待される。型変数をレコードに制限し、また、高階な関数の利用も制限したため、string Normalizationが成り立ち、自然なファンクタによる領域の上で意味を与えることができる。この結果については、Workshopにおいて発表を行なった。
癌転移におけるコンドロイチン硫酸の役割に関する分子メカニズムの解明

本研究では、癌の転移の分子メカニズムにおけるコンドロイチン硫酸(CS)の役割を解明し、CSを用いた創薬の可能性を追求した。その結果、肺癌細胞の転移に関わるCS鎖の受容体として, Receptor for Advanced Glycation End-products (RAGE)を同定した。さらに、CSの合成に関わる酵素の遺伝子発現を抑制すると、肺への癌細胞の転移が阻害されることも見出した。従って、CSの癌転移における役割の解明だけでなく、将来的な抗癌剤の開発に繋がるものと考えられる。これらの成果について国際誌に原著論文3報、総説2報を発表した。また、国内・国際学会での発表を15回行った。以前我々は、コンドロイチン硫酸鎖中のE-unit構造(GlcA-GalNAc(4S,6S))を認識するファージ抗体が、マウスLewis肺癌細胞を強く染色し、その細胞の肺への転移がこの抗体によって、著しく阻害されることを見出していた。また、興味深いことに、種類の異なる多くのヒトの癌組織がこの抗体で強く染色された。そこで本研究では、これらの癌の転移の分子メカニズムにおけるコンドロイチン硫酸の役割を解明し、コンドロイチン硫酸を用いた創薬の可能性を追求した。その結果、ごく最近、肺癌細胞の転移に関わるコンドロイチン硫酸(CS)鎖の受容体として,Receptor for Advanced Glycation End products (RAGE)を同定した。さらに、抗RAGE抗体で、肺癌細胞の転移が有意に阻害されることも見出した。また、コンドロイチン硫酸鎖の合成に関わるN-アセチルガラクトサミン4-硫酸-6-0-硫酸基転移酵素の遺伝子発現をノックダウンすると、肺への癌細胞の転移が抑制されることも見出した。これらの知見は、コンドロイチン硫酸の癌転移における役割の解明だけでなく、将来的な抗癌剤の開発に繋がるものと考えられる。さらに、上述したE-unitを多く含むイカ軟骨由来のCS鎖およびエビ頭部由来のヘパラン硫酸が、日本脳炎ウイルスの感染を阻害できることも発見し、抗ウイルス薬の開発に向けて、一歩を踏み出した。コンドロイチン硫酸鎖の生合成に関わるグルクロン酸転移酵素(GlcAT-I)の遺伝子変異が、ラーセン症候群を引き起こす遺伝病も同定した。また、コンドロイチン硫酸鎖中のグルクロン酸をイズロン酸に異性化する、デルマタン硫酸合成反応に関わり、双極性躁鬱病の原因遺伝子と推察されるデルマタン硫酸エピメラーゼ2(DSE2)の脳における遺伝子発現制御と糖鎖構造変化の相関を明らかにした。以前、コンドロイチン硫酸鎖中の特定の硫酸化配列Eユニット(GlcA-GalNAc(4S,6S))が、マウスLewis肺癌細胞の肺への転移に深く関与していることを見出していた。そこで、本研究では、コンドロイチン硫酸による癌の転移の分子メカニズムにおける役割を解明し、創薬の可能性を追求した。その結果、昨年度は肺に特異的に発現しているReceptor for Advanced Glycation End-products (RAGE)を同定した(Journal of Biological Chemistry, 2012)。今年度は、RAGEと結合する糖鎖構造を網羅的に明らかにするため、まずRAGEと結合するコンドロイチン硫酸のオリゴ糖画分を非酵素処理で大量調製した。具体的には、高温・高圧の亜臨海水を用いて、イカ軟骨由来のコンドロイチン硫酸を処理し、低分子化した。その生成物をゲルろ過クロマトグラフィーでサイズ分画し、各種のオリゴ糖を調製した。さらにヘパリンについても同様に低分子化した。それらのサイズ依存性オリゴ糖を用いて酵素結合免疫吸着検定法(ELISA)により、RAGEとコンドロイチン硫酸の結合に必要な鎖長が少なくとも10糖が必要であることを見出した。さらに、RAGEが認識する糖鎖配列解析をハイスループットにするため、コンドロイチン硫酸のオリゴ糖鎖を基盤に固相化したマイクロアレイを開発した。国際誌に総説1報を発表し、国際学会での発表を6回行った。以前我々は、コンドロイチン硫酸(CS)鎖中のE-unit構造(GlcA-GalNAc(4S,6S))を認識するファージ抗体が、マウスLewis肺癌細胞を強く染色し、その細胞の肺への転移がこの抗体によって、著しく阻害されることを見出していた。その結果、肺癌細胞の転移に関わるCS鎖の受容体として, Receptor for Advanced Glycation End-products (RAGE)を同定した(Journal of Biological Chemistry, 2012)。

また、コンドロイチン硫酸鎖の合成に関わるN-アセチルガラクトサミン4-硫酸-6-O-硫酸基転移酵素の遺伝子発現をノックダウンすると、肺への癌細胞の転移が抑制されることも見出した(BioMed Research International, 2013)。これらの知見は、CSの癌転移における役割の解明だけでなく、将来的な抗癌剤の開発に繋がるものと考えられる。さらに、CSが関わる癌の転移に関する総説がFEBS Journal (2013)に掲載された。また、C型肝炎ウイルスが肝臓のヘパラン硫酸と相互作用することも見出し(Glycoconjugate Journal, 2012)、抗ウイルス薬の可能性を示唆した。これらの研究論文を含めて、国際誌に原著論文が3報、総説2報を発表した。また、国内学会発表5回、国際学会での発表を4回行った。当初の計画以上に進展している理由としては、査読有りの学術雑誌10編に論文が受理されたこと、および学会での発表も14件にのぼるからである。そのうち1報はCell Pressの姉妹誌の「American Journal of Human Genetics」に掲載された。また、世界的に有名な「Journal of Biological Chemistry」に2報掲載された。さらに、研究内容についても日本人の死因の1位を占める「がん」をターゲットとし、これまでほとんど解析されてこなかったコンドロイチン硫酸のがん転移における役割を明らかにしつつある。具体的には肺の転移に関わるコンドロイチン硫酸の受容体としてReceptor for Advanced Glycation End products (RAGE)を同定し、さらなる研究の発展が期待される。また、コンドロイチン硫酸あるいはその抗体、抗RAGE抗体に、肺への癌細胞の転移阻害活性も見出したことから、将来的な抗癌剤の開発に繋がることも期待できる。25年度が最終年度であるため、記入しない。具体的には肺の転移に関わるコンドロイチン硫酸の受容体としてReceptor for Advanced Glycation End products (RAGE)を同定し(Mizumoto et al., Journal of Biological Chemistry, 287 (23), 18985-18994)、さらにコンドロイチン硫酸の生合成に関わるN-acetylgalactosamine 4-sulfate 6-O-sulfotransferaseのノックダウンが肺への癌転移を抑制することも発見した(Mizumoto et al.,BioMed Research International, 2013, 656319)。また、コンドロイチン硫酸あるいはその抗体、抗RAGE抗体に、肺への癌細胞の転移阻害活性も見出したことから、将来的な抗癌剤の開発に繋がることも期待できるからである。
遺伝子組換え菌からのパルス電界を利用した有用遺伝子産物の生産

本研究では微生物にパルス電界を印加したときの、遺伝子産物などの有用タンパク質の放出特性に関して研究を行った。使用菌株としてタンパク質放出特性を調べる上で形態がよく調べられているモデル微生物として酵母を用い、その放出特性に関して検討を行った。また遺伝子組換え菌としてBacillus stearothemophilus由来の耐熱性アミラーゼを産出する組換え大腸菌Escherichia coli/pHI301を使用した。高電圧パルス発生電源としてはコンデンサーに充電された電気エネルギーをスパークギャップを通して処理槽に印加し、5kVから15kV程度のパルス電圧を印加することが可能である装置を用いた。まず酵母を蒸留水に懸濁してパルス電界を印加したところ,わずか数十秒の処理時間で酵母内のタンパク質が放出されることがわかった。また印加するパルス電界強度によるインベルターゼとアルコール脱水素酵素の放出特性を調べたところ、比較的低いパルス電界(810kV)でインベルターゼが放出され始め、アルコール脱水素酵素は14kV以上のパルス電界を印加しないと放出されないことが判明し、電界強度のコントロールによる細胞内タンパク質の選択的放出の可能性が示唆された(J.Electrostatics,in press)。Escherichia coli/pHI301を蒸留水に懸濁して10kVのパルス電界を印加した場合、超音波処理で完全に菌体を粉砕さた場合(1500U/ml)に比べて、わずか50U/mlしかアミラーゼ放出が認められなかった。そこでNaClの添加効果を調べたところ、5%NaCl中で最大約1250U/mlと超音波処理の場合の80%を放出させることができた。また1%NaClの時には放出量約1100U/mlで比活性は約15U/mg-proteinとなり、超音波処理の約8倍で放出させることが可能であった。現在、本研究で得られた成果をまとめて論文投稿するために準備している。
補体様分泌因子とグルタミン酸受容体クロストークによるシナプス成熟の分子機構解明

入力線維が分泌するC1q/TNFファミリー分子が、シナプス前部のneurexin受容体と、シナプス後部のグルタミン酸受容体とを機能的につなぐ"橋"として機能し、シナプス形成とシナプス機能を制御する分子基盤を明らかにすることが本研究の目的である。グルタミン酸受容体であるカイニン酸受容体サブユニットGluK2 GluK4およびAMPA型グルタミン酸受容体GluA1サブユニットは細胞外のATD領域において分泌性因子C1ql2 C1ql3と結合する。このATD領域が、シナプス前部と後部を機能的に繋ぐ新たな領域である可能性を探った。C1ql2 C1ql3はシナプス前部のneurexinとも結合する。ここからシナプスを挟んでシナプス後部のグルタミン酸受容体とともに複合体形成する可能性を検討した。GluK4はC1ql2 C1ql3を介してneurexin3 S5領域と複合体を形成するが、GluK2およびGluA1はしないことが判明した。また、C1ql2 C1ql3両遺伝子、あるいはneurexin3 S5領域欠損マウスの苔状線維-CA3シナプスにおいて、シナプス前部でのシナプス小胞の枯渇が同程度早いという結果を見出した。このことは上記複合体がこのシナプスにおいて機能している可能性を示唆している。培養神経細胞の系においてGluK2 ATD領域にグルタミン酸作動性のシナプス前部を分化させる機能があることを見出した。このシナプス前部分化にはneurexin受容体の集積が見られなかったこと、GluK2 ATD領域はneurexinとの相互作用しなかったことから、GluK2のATD領域にはneurexin以外の相互作用分子がシナプス前部に存在する可能性が明らかとなった。入力線維からシナプス間隙に分泌されたC1q/TNFファミリー分子であるC1ql2およびC1ql3、シナプス前部のneurexin受容体、シナプス後部のグルタミン酸受容体という、これら3者が機能的なタンパク質複合体を形成することによる、シナプスを挟んだ相互作用の分子基盤を明らかにすることが目的である。この複合体が、シナプス後部側へどのような機能を持つかについてであるが、シナプス後部グルタミン酸受容体であるGluK2のATD領域に、C1ql2およびC1ql3が結合すること、C1ql2およびC1ql3両遺伝子欠損マウスではシナプス後部のGluK2のシナプス局在が見られなくなったことは既に報告した。逆にGluK2を欠損させたマウスでは、シナプス間隙において分泌されたC1ql2およびC1ql3のシナプス局在が見られなくなった。この複合体のシナプス局在に対するシナプス前部neurexin受容体の効果を見るために、neurexin3 S5領域欠損マウスを解析したところ、シナプス後部GluK2、シナプス間隙C1ql2およびC1ql3のシナプス局在には変化は見られず、シナプス前部neurexin受容体は、シナプスにおけるC1ql2/3 -カイニン酸受容体複合体の局在に影響しないことが明らかとなった。次に、この複合体がシナプスを挟んで形成されることがシナプス前部の機能に与える効果について、C1ql2/3両遺伝子欠損マウス、およびneurexin3 S5領域欠損マウスを用いて解析した。両系統マウスの苔状線維-CA3シナプスにおいて、シナプス小胞の枯渇の増強というシナプス前部分化への共通した表現型を解明できた。今後は以下の2点について研究を進める。1)シナプス後部に局在するAMPA型グルタミン酸受容体サブユニットであるGluA1のATD領域にも、C1ql2およびC1ql3が結合することをすでに見出している。これまで、C1ql2およびC1ql3両遺伝子欠損マウスでは、苔状線維-CA3シナプスにおけるAMPA型グルタミン酸受容体応答に変化がないことを示した。しかし、C1ql2およびC1ql3は、当シナプスに豊富に存在するAMPA型グルタミン酸受容体サブユニットGluA2やGluA3には結合しないため、AMPA型グルタミン酸受容体応答に対するC1ql2 C1ql3の効果は、GluA1サブユニット特異的に解析する必要がある。そこで、培養神経細胞にカルシウムが透過するタイプのGluA1を強制発現させた材料に対し、C1ql2やC1ql3を過剰投与することによって、GluA1サブユニットホモマーに対するC1ql2 C1ql3の効果を電気生理学的に明らかとすると同時に、特異的抗体を用い局在解析を行う。2)シナプス後部に局在するカイニン酸受容体にシナプス前部分化を誘導する機能があることが明らかとなった。C1ql類との相互作用の必要性を明らかとする。また新たな分子基盤を探索する目的で、GluK2のATD領域に結合するシナプス前部受容体の同定を行っている。この過程で候補となりうる2つの受容体を明らかとすることができた。今後はこれら分子が、カイニン酸受容体によるシナプス前部分化の誘導にどのように関与するか、欠損マウスの解析を含め、電気生理学的あるいは細胞生物学的に解析を進める予定である。神経細胞同士の間に新しくシナプスを形成させる作用を持つ分子は、シナプスオーガナイザーと総称され、シナプス形成を引き起こす分子として機能する数多くの分子が同定されてきた。しかしながら、どのように、特有のシナプス伝達様式を持つシナプスの個性が生み出されるのかについて、その分子メカニズムには不明な点が残されている。免疫系古典的

補体経路タンパク質C1qや腫瘍壊死因子TNFが属するC1q/TNFファミリーの一員であるCbln1は、グルタミン酸受容体GluD2とneurexinに同時に結合し、小脳顆粒細胞ープルキンエ細胞シナプス形成を推し進める。また申請者は、C1ql2とC1ql3はシナプス後部のカイニン酸型グルタミン酸受容体のアミノ末端領域に直接結合し、カイニン酸受容体局在をシナプス前部からシナプスを越えて規定すること、同時にneurexin3受容体に結合することを発見し、シナプスを跨いでneurexin3-C1ql2/3-カイニン酸受容体複合体が形成されるという分子基盤を提唱した。海馬苔状線維ーCA3シナプスにおいて、C1ql2/3は苔状線維末端から分泌し、シナプス前部軸索末端表面を含むシナプス間隙に局在化する。この分泌機構やシナプス局在化機構へのneurexin3受容体の関与の可能性を探るため、C1ql2 C1ql3と結合するneurexin3スプライシングアイソフォーム発現パターンの時空間的解析を行った。スプライシング特異的な発現パターンの解析は、ターゲットとなる領域の長さが短い場合in situ hybridization解析は困難である。そこでneurexin3のexon25bにストップコドンとPST配列-P2A配列-EGFP cDNAをノックインした、neurexin3 exon25b EGFPノックインマウスを作製し、発現パターンを時空間的に解析した。neurexin3 exon25b EGFPノックインマウスは、この組み換え遺伝子をhomoに持つと、exon25bコード領域を欠損したneurexin3を発現するマウスとなる。海馬苔状線維ーCA3シナプスにおいて、C1ql2/3は苔状線維末端から分泌し、シナプス前部軸索末端表面を含むシナプス間隙に局在化し、シナプス後部のカイニン酸受容体のシナプス局在を制御する。このC1ql2/3分泌機構やシナプス局在化、カイニン酸受容体の局在化機構へのneurexin3受容体の関与の可能性を探るため、このneurexin3 exon25b領域欠損マウスを用いて解析を行った。このマウスのGFP発現解析と、in situ hybridizationの結果から、neurexin3 exon25bは海馬苔状線維ーCA3シナプスが形成され始める、P8-9を中心に発現が上昇していることが明らかとなった。しかしながらneurexin3 exon25bを欠損させたマウスにおいても、正常にC1ql2/3は分泌し、カイニン酸受容体とシナプスにおいて共局在することが明らかとなった。このneurexin3-C1ql2/3-カイニン酸受容体複合体のシナプス局在自体にはneurexin3 exon25bの関与は少ない模様であった。一方、neurexin3 exon25b領域欠損マウスにおいて、シナプス前部の機能に異常表現型が見られ、このシナプス前部機能に対する、複合体によるシナプス間隙を超えての調節機構の関与を明らかにするため、カイニン酸受容体欠損マウス、C1ql2/3欠損マウスにて、同様の表現型が見られるかを解析予定である。
ナノ微細構造を持つ固体表面における伝熱機構の究明

ナノテクノロジーと熱工学の融合分野において,ナノ微細構造が壁面付近での伝熱促進技術の鍵として非常に注目され,多孔質体のナノ構造物が熱伝達率を著しく向上させた実験結果が報告されている.しかし,ナノ微細構造が界面近傍の熱伝導層のエネルギー伝達を変化させる可能性があるとしても,流動抵抗と熱抵抗の両方を同時に抑えることは従来の概念からは考えにくいという疑問が残こる.本研究では,分子動力学法を用いてナノ微細構造による伝熱促進効果のメカニズムを解明することを目的とし,ナノ微細構造を持つ固体壁面を対象とし,界面濡れ性はどのような表面微細構造によって変化するのか,またどのような表面微細構造が抵抗低減及び熱伝達率向上に有効なのかについて調べた.疎水性界面においては流動抵抗が低減され熱抵抗が大きいが,親水性界面では固液ポテンシャル場による数分子層の界面吸着が生じ,熱抵抗が小さくて流動抵抗は大きいことより,固体表面における液体分子の濡れ挙動がナノ構造表面の伝熱の主役と考えられる.その特徴として界面濡れ性(界面近傍のポテンシャル場)がナノ構造の寸法や形状などによって変化し,熱伝達率に影響を及ぼしていることを検証した.また,液滴の接触角は,ナノ微細構造のサイズや形状等によって変化することを確認し,界面における微細構造を制御することによって撥水性を向上できることが分かった.さらに,液滴の接触角度について,従来の理論的記述法との整合性を検討し,界面の分子挙動を考慮した新たな記述法を提案した.近年,ナノテクノロジーと熱工学の融合分野において,ナノ微細構造が壁面付近での伝熱促進技術の鍵として非常に注目されている.シリコン微細加工技術を用いて作成されたナノ微細構造が基板の撥水性あるいは親水性を強化でき,また多孔質体のナノ構造物が熱伝達率を著しく向上させた実験結果が報告されている.これらの現象を解明するには,界面の物理化学を含めた分子の理解が求められている.本研究では,ナノ伝熱のメカニズムを解明するための基礎研究として,まず分子動力学法を用いてナノ微細構造による界面濡れ性の変化のメカニズムを解明することを試みた.数種の微細凹凸構造を持つ固体壁面を対象とし,液滴の接触角の観察から界面濡れ性がどのように変化するのか,またどのような表面微細構造が親水性あるいは疎水性界面形成に有効なのかについて検討した.すなわち,固体表面のナノ構造が見かけの接触角度に与える影響を分子動力学シミュレーションにより検討した.その結果,完全濡れの表面に対しては影響が小さく,ナノ微細構造を加えても接触角度に大きな変化が現われなかったものの,部分濡れの表面に対して影響は著しく,液滴の接触角度はナノ微細構造のサイズや形状等によって変化することを確認できた.界面における微細構造を制御することによって撥水性を向上できると考察するとともに,表面構造と見かけの接触角に関する従来の理論式であるWenzelの式が不完全であることを検証した.ナノテクノロジーと熱工学の融合分野において,ナノ微細構造が壁面付近での伝熱促進技術の鍵として非常に注目され,多孔質体のナノ構造物が熱伝達率を著しく向上させた実験結果が報告されている.しかし,ナノ微細構造が界面近傍の熱伝導層のエネルギー伝達を変化させる可能性があるとしても,流動抵抗と熱抵抗の両方を同時に抑えることは従来の概念からは考えにくいという疑問が残こる.本研究では,分子動力学法を用いてナノ微細構造による伝熱促進効果のメカニズムを解明することを目的とし,ナノ微細構造を持つ固体壁面を対象とし,界面濡れ性はどのような表面微細構造によって変化するのか,またどのような表面微細構造が抵抗低減及び熱伝達率向上に有効なのかについて調べた.疎水性界面においては流動抵抗が低減され熱抵抗が大きいが,親水性界面では固液ポテンシャル場による数分子層の界面吸着が生じ,熱抵抗が小さくて流動抵抗は大きいことより,固体表面における液体分子の濡れ挙動がナノ構造表面の伝熱の主役と考えられる.その特徴として界面濡れ性(界面近傍のポテンシャル場)がナノ構造の寸法や形状などによって変化し,熱伝達率に影響を及ぼしていることを検証した.また,液滴の接触角は,ナノ微細構造のサイズや形状等によって変化することを確認し,界面における微細構造を制御することによって撥水性を向上できることが分かった.さらに,液滴の接触角度について,従来の理論的記述法との整合性を検討し,界面の分子挙動を考慮した新たな記述法を提案した.
事業承継問題が中小企業の海外進出の意思決定に与える影響について

平成30年度前半には、まず現段階での研究成果を海外学会で報告し、フロアから有益なコメントを得た。それをもとに、理論モデルの修正、および調査票原案の修正を行った。また、前年度までの調査内容を踏まえたものを論文として執筆した。まず、同族企業の事業承継問題を扱った文献のレビュー論文を執筆した。そこでは、後継者の選択や事業承継の成否には、同族企業特有の家族間のつながり、それに伴う感情的な要因などといった操作化することの難しい多くの要因が関わってくることを指摘した。そのうえで、中小同族企業経営者の後継者が現れることに関する期待が企業行動に影響を与えうる可能性を指摘した。さらに、中小企業の事業承継問題と密接にかかわる、中小企業経営者のキャリア見通しに関する論文を執筆した。そこでは、これまで年齢によって操作化されてきたキャリア見通しを、調査を通じて直接計測することで、既存研究では、経営者のキャリア見通しが短くなることが企業行動に与える影響は過少推定されていることを明らかにした。平成30年度の後半には、前年度作成した調査票原案をもとに調査票の最終案を作成し、都内の中小製造業企業を対象とした調査を行った。そこでは、前年度の文献調査および同行調査から得られた知見をもとに、後継者の有無、事業承継計画の有無などといった、後継者との心理的距離などといった事業承継の成功に影響を与えうる要因について尋ねた。回答は平成30年度末にすでに入手している。平成30年度の研究計画においては、国内外での学会発表および、調査の実施を予定していた。最終的な目標であった調査の実施まで達成できており、おおむね順調に進展していると考えられる。2018年度に実施した調査の回答結果について単純集計をまとめ、統計分析を行う。また分析結果をもとに論文を執筆し国内外の学会で報告する予定である。平成29年度の前半は主に、調査票設計の下準備としての中小企業関連の文献調査、および中小企業の実際の動向に関する調査を行った。その結果得られた主要な知見は以下の2点である。まず、中小企業の中でも経営者一族による株式所有が行われている同族企業においては、財務的なリターンだけではなく、家族が企業に影響力を行使する力の維持や、家族による支配の継続といった、家族の情緒的なニーズを満たす非財務的側面も、不確実性を伴う投資に関する意思決定の重要な準拠枠組みとなっていることを確認した。この点については社会情緒的資産(Socioemotional Wealth)という概念をもちいて理論的・実証的研究が行われている。さらに、中小規模の企業においては後継者の確保が大きな問題となっている一方で、この問題を取り上げた既存研究においては、後継者の有無が現職の経営者の戦略的意思決定にどのような影響を与えるかという点については、その重要性が指摘されているものの、直接的には取り上げられていないことが明らかになった。平成29年度の後半は、文献調査および動向調査から得られた知見をもとに、分析モデルを作成し、調査票の原案を作成した。調査票の原案作成後、調査票における質問項目が分かりやすいものとなっているか、適切なページ数、実施時期、また専門用語の解説が不足していないかなどといったチェックを外部調査期間とともに行った。また現段階での研究成果を国内外の学会で報告し、フロアから有益なコメントを得た。平成29年度の研究計画においては、、調査票設計の下準備としての中小企業関連の文献調査、および都内中小企業に対するインタビュー調査を行う。そこから得られた情報をもとに、モデルを作成し、調査票の原案を作成することを予定していた。最終的な目標であった調査票の原案作成まで達成できており、おおむね順調に進展していると考えられる。平成30年度は、作成した調査票原案をもとに中小企業経営者に対してインタビュー調査及びプレテストを行い、調査票の最終版を作成する。完成した調査票は年度後半に東京23区の中小企業に配布する。得られたデータを整理し分析を行う。

平成30年度後半から平成31年度にかけては、分析から得られた結果もとに論文を執筆し、国内外の学会で報告する。得られたコメントをもとに論文を修正し学術誌に投稿する。2018年度に実施した調査の回答結果について単純集計をまとめ、統計分析を行う。また分析結果をもとに論文を執筆し国内外の学会で報告する予定である。年度末に平成30年度に行う国際学会での報告が決定したため、平成29年度末以降残っていた助成金は次年度に使用することとした。予定していた国内学会での報告を行うことができなかったため、次年度使用額が生じた。次年度使用額については、本年度の国内学会参加の旅費として使用する予定である。
再生医療に用いる新規高品質間葉系幹細胞の開発

骨髄由来間葉系幹細胞(MSC)は低酸素培養を行うと未分化状態を維持したまま増殖することが知られており、より簡便に細胞を低酸素下代謝状態に保つために低酸素模倣剤Deferoxamine (DFO)の有用性が示されている。12時間という比較的短時間のDFO添加により増殖性低下、酸素消費量低下、ATP産生低下を伴うミトコンドリア活性低下が起きていた。12時間DFO treatmentした細胞のマイクロアレイ解析では遺伝子発現に及ぼす影響を網羅的に評価したところ、HIF1αパスウェイや解糖系の亢進が認められた。また変動したupstream遺伝子としてHIF1α、NUPR1、EGLNなどが挙げられ、MSCにおいてDFOをより高濃度短時間投与することにより、解糖系優位の代謝変化を誘導することができることが示された。ストレスなどにより誘導され、オートファジー亢進による生存に関与することが知られているNUPR1がupstream遺伝子の一つとして挙げられた。NUPR1はDFO濃度依存的に発現が上昇しNUPR1をノックダウンしたところ増殖性の低下が起こった。さらにstaurosporine投与によりNUPR1ノックダウン細胞でアポトーシスの亢進が認められたことから、DFO投与によって誘導されるNUPR1はMSCにおいても細胞保護性オートファジーに関与し、Drug resistanceにとって重要な分子であると考えられた。上記結果を論文投稿した(J Clin Biochem Nutr. 2019 in press)。今後さらに遺伝子発現解析、代謝解析、ミトコンドリアの評価、未分化能維持、遺伝的安定性の解析を行う予定である。・培養ヒト骨髄細胞を用いた低侵襲肝臓再生療法患者間葉系幹細胞の評価をフローサイトメーターや遺伝子発現解析などを継続した。薬剤投与ではミトコンドリアを抑制する低酸素状態の代謝に関わる薬剤に絞り、鉄キレート剤DFOに着目しMSCのステムネス維持や抗アポトーシス効果の評価を行い有効性が認められた。この薬剤を使用することで培養間葉系幹細胞を用いて幹細胞老化と再生に関する知見を得た。今後論文投稿を行う予定である。・高品質な間葉系幹細胞の作製法の検討これまでに有用であることをin vitroで評価した低酸素培養と鉄キレート剤についてさらにそのメカニズムについて解析を行った。間葉系幹細胞を鉄キレート剤で処理することで、低酸素培養と同様の代謝変化が起こることを確認した。さらに鉄キレート剤投与でオートファジーが亢進することとNUPR1という遺伝子が重要であることを見いだし、J Clin Biochem Nutrition誌に投稿しアクセプトされた(平成30年度査読付き英語論文数筆頭著者3報、共著3報)。特にミトコンドリア機能に着目し、より高い治癒効果を持つMSCを創出することを目指す。目的の高品質なMSCが得られれば効率の良い肝硬変に対する再生療法を開発につながることが期待される。本研究ではMSCの品質向上の可能性のある薬剤として鉄キレート剤に着目し、各種鉄キレート剤の評価を継続する。またmiRNAインヒビターライブラリーのスクリーニングでミトコンドリア代謝を制御する効率の良いmiRNAを同定し、遺伝子発現解析、代謝解析、ミトコンドリアの評価、未分化能維持、遺伝的安定性の解析を行う。さらに特にミトコンドリア機能に着目し、より高い治癒効果を持つMSCを創出することを目標に研究を継続する。本研究を遂行することで、再生療法で使用するMSCのミトコンドリアの機能を調節することで高品質MSCを作製できる。さらに骨髄細胞の抗炎症作用の増強、障害肝への遊走能の向上、遺伝的安定性の維持、細胞老化の抑制、ステムネスの維持を効率良く行えることが考えられ、より効率の良い肝硬変治療につながることが期待される。

薬剤投与ではミトコンドリアを抑制する低酸素状態の代謝に関わる薬剤に絞り、鉄キレート剤DFOに着目しMSCのステムネス維持や抗アポトーシス効果の評価を行い有効性が認められた。この薬剤を使用することで培養間葉系幹細胞を用いて幹細胞老化と再生に関する知見を得た。今後論文投稿を行う予定である。・高品質な間葉系幹細胞の作製法の検討これまでに有用であることをin vitroで評価した低酸素培養と鉄キレート剤についてさらにそのメカニズムについて解析を行った。間葉系幹細胞を鉄キレート剤で処理することで、低酸素培養と同様の代謝変化が起こることを確認した。さらに鉄キレート剤投与でオートファジーが亢進することとNUPR1という遺伝子が重要であることを見いだし、J Clin Biochem Nutrition誌に投稿しアクセプトされた(平成30年度査読付き英語論文数筆頭著者3報、共著3報)。特にミトコンドリア機能に着目し、より高い治癒効果を持つMSCを創出することを目指す。目的の高品質なMSCが得られれば効率の良い肝硬変に対する再生療法を開発につながることが期待される。本研究ではMSCの品質向上の可能性のある薬剤として鉄キレート剤に着目し、各種鉄キレート剤の評価を継続する。またmiRNAインヒビターライブラリーのスクリーニングでミトコンドリア代謝を制御する効率の良いmiRNAを同定し、遺伝子発現解析、代謝解析、ミトコンドリアの評価、未分化能維持、遺伝的安定性の解析を行う。さらに特にミトコンドリア機能に着目し、より高い治癒効果を持つMSCを創出することを目標に研究を継続する。本研究を遂行することで、再生療法で使用するMSCのミトコンドリアの機能を調節することで高品質MSCを作製できる。さらに骨髄細胞の抗炎症作用の増強、障害肝への遊走能の向上、遺伝的安定性の維持、細胞老化の抑制、ステムネスの維持を効率良く行えることが考えられ、より効率の良い肝硬変治療につながることが期待される。動物実験施設で回虫が見つかったことから新たにマウスの購入を行うことができなかったため、翌年度にマウスの購入を延期したため。
抗菌性と骨形成促進作用を併せ持つ生体活性インプラントの開発

整形外科手術で用いるインプラントの重大な合併症として、「インプラント周囲の感染」と「インプラントの弛みやインプラント周囲の骨脆弱化」がある。前者については、難治性、長い加療期間、安静によるADL低下、それらに伴う高額な医療費が問題となっている。後者については、高齢化に伴い骨粗鬆症などの脆弱な骨が増加している昨今では、発生の危険性が増加しており、極めて重大な問題である。本研究の目的は、いずれの問題にも対応しうる抗菌性を有するイオンと骨形成促進作用あるいは骨吸収抑制作用を有するイオンを同時に徐放するバイオ機能を付加したインプラントの開発である。今回、われわれは抗菌性イオンである銀(Ag)イオンと骨形成イオンであるストロンチウム(Sr)イオンを同時に徐放するSr+Ag処理チタンと、抗菌性と骨吸収抑制作用を併せ持つガリウム(Ga)イオンを徐放するGa処理チタンの検証を行っている。Sr+Ag処理チタンのin vitro実験では、明らかな細胞毒性は認めず、Sr処理チタン単独より高い骨分化促進作用を確認した。また、Sr+Ag処理チタンは未処理チタン、Sr処理チタンと比較して、黄色ブドウ球菌と大腸菌の増殖を抑制する傾向を認めた。Sr+Ag処理チタンのin vivo実験では、未処理チタンと比較して、骨結合性の向上を認めた。Ga処理チタンのin vitro実験では、明らかな細胞毒性は認めなかった。また、未処理チタンと比較して、黄色ブドウ球菌の増殖を抑制する傾向を認めた。今後もSr+Ag処理チタン、Ga処理チタンについて、抗菌性と骨代謝への影響を明らかにするために、in vitro・in vivoともに実験検証を行っていく。Sr+Ag処理チタンの骨代謝に関するin vitro実験では、材料上にマウス骨芽細胞様細胞(MC3T3-E1)を播種して評価を行った。XTT試験による細胞増殖評価では、未処理チタンと比較して明らかな細胞毒性は認めなかった。Sr+Ag処理チタンの抗菌性に関するin vitro実験では、材料上に黄色ブドウ球菌、大腸菌を播種して評価を行った。未処理チタン、Sr処理チタンと比較して、両細菌ともに増殖を抑制する傾向を認めた。Sr+Ag処理チタンの骨代謝に関するin vivo実験では、ラットの大腿骨にインプラントを挿入後に力学試験によって骨結合性を評価した。未処理チタンと比較して、有意に高い値を示した。Ga処理チタンの骨代謝に関するin vitro実験では、材料上にMC3T3-E1細胞を播種して評価を行った。Ga処理チタンの抗菌性に関するin vitro実験では、材料上に黄色ブドウ球菌を播種して評価を行った。未処理チタン、Ga処理チタンと比較して、細菌増殖を抑制する傾向を認めた。Ga処理チタンの骨代謝に関するin vitro実験では、MC3T3-E1細胞を用いた骨形成能評価とマウスマクロファージ様細胞(RAW264.7)を用いた骨吸収抑制能評価を行う予定である。Ga処理チタンの抗菌性に関するin vitro実験では、大腸菌についても材料上に播種して評価を行う予定である。Ga処理チタンの骨代謝に関するin vivo実験では、日本白色家兎の脛骨にインプラントを現在埋入中であり、力学試験、組織学的調査で骨結合性を評価する予定である。Sr+Ag処理チタン、Ga処理チタンの抗菌性に関するin vivo実験では、ラットの長管骨髄腔内に菌液を注入後にインプラントを留置して評価を行う予定である。

未処理チタン、Sr処理チタンと比較して、両細菌ともに増殖を抑制する傾向を認めた。Sr+Ag処理チタンの骨代謝に関するin vivo実験では、ラットの大腿骨にインプラントを挿入後に力学試験によって骨結合性を評価した。未処理チタンと比較して、有意に高い値を示した。Ga処理チタンの骨代謝に関するin vitro実験では、材料上にMC3T3-E1細胞を播種して評価を行った。XTT試験による細胞増殖評価では、未処理チタンと比較して明らかな細胞毒性は認めなかった。Ga処理チタンの抗菌性に関するin vitro実験では、材料上に黄色ブドウ球菌を播種して評価を行った。未処理チタン、Ga処理チタンと比較して、細菌増殖を抑制する傾向を認めた。Ga処理チタンの骨代謝に関するin vitro実験では、MC3T3-E1細胞を用いた骨形成能評価とマウスマクロファージ様細胞(RAW264.7)を用いた骨吸収抑制能評価を行う予定である。Ga処理チタンの抗菌性に関するin vitro実験では、大腸菌についても材料上に播種して評価を行う予定である。Ga処理チタンの骨代謝に関するin vivo実験では、日本白色家兎の脛骨にインプラントを現在埋入中であり、力学試験、組織学的調査で骨結合性を評価する予定である。Sr+Ag処理チタン、Ga処理チタンの抗菌性に関するin vivo実験では、ラットの長管骨髄腔内に菌液を注入後にインプラントを留置して評価を行う予定である。
哺乳類の生殖腺支持細胞と生殖細胞の相互作用の探求

本研究では、「生殖細胞が支持細胞の性分化に作用するか」を検証するため、支持細胞と生殖細胞の性別が異なる雌雄キメラ生殖腺を作出し、生殖細胞が支持細胞の形質転換を誘導するかを詳細に解析する。実験の流れを以下に示す。i)支持細胞特異的に発現するAMH遺伝子のプロモーター領域とヒトジフテリア毒素受容体遺伝子を融合したDNAを導入することで、ジフテリア毒素の投与によって任意の時期に支持細胞のみを特異的に死滅させることができる遺伝子導入マウス(AMH-TRECK-Tgマウス)を作出する。ii)支持細胞を除去した生殖腺に、同性の支持細胞を移植し、支持細胞置換系を確立する。iii)支持細胞置換系を応用し、任意の分化段階の異なる性の支持細胞を移植し、雌雄キメラ生殖腺を作製し解析する。25年度は、i)、ii)を主目的とし、以下の成果を得た。1、AMH-TRECK-Tgマウスを3ライン作出した。さらに、実験に適したラインを1ライン選抜し、長期移植実験に向けて免疫不全系統にバッククロスを開始した。(現在進行中)2、ジフテリア毒素処理の濃度、投与方法を検討し、実験に適切な条件を設定した。3、毒素処理後の支持細胞除去を確認した。4、Tgマウスの雄に毒素を投与し、さらに別の雄個体より採材したセルトリ細胞を精細管内に移植した。移植後10日で移植細胞の定着が認められ、雄においてセルトリ細胞置換に成功した。5、セルトリ細胞置換に関しての成果をまとめ、学会で発表し、論文を執筆した。(現在投稿中)(抄録なし)本研究では、「生殖細胞が支持細胞の性分化に作用するか」を検証するため、支持細胞と生殖細胞の性別が異なる雌雄キメラ生殖腺を作出し、生殖細胞が支持細胞の形質転換を誘導するかを詳細に解析する。(現在投稿中)(抄録なし)