hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
本邦新生代における寒冷系貝類化石群の成立過程とその変遷

常磐炭田地域では初期中新世に寒冷系の貝類が南下した事件が予想されているので,これを検証するために,平市付近の五安・中山層の貝類を検討した。しかし,明白な証拠は得られず,更に検討する必要がある。本年度で成果が得られたのは北海道歌登地域の新第三系に関する年代決定である。この地域の志美宇丹層から初めて珪藻化石を検出し,これがCoscinodiscus yabeiーDenticulopsis dimorpha帯に相当することが明らかとなり,本層がカムチャッカ半島のエトロン層中・上部に対比されることとなる。昨年度来得られていたタチカラウシナイ層に関する年代が中期中新世中期で,カムチャッカでのカケルト層エトロン層下部に対比していた事をより確実にする結果が得られたこととなる。また志美宇丹層から相当量の貝化石新資料を得ることができたが,その中にカムチャッカ半島で記載されていたMizuhopecten slodokevitsch Sinelinikovaが含まれていることを確かめた。これらの資料により,北海道とカムチャッカ半島の新第三系の対比・貝類化石群の変遷がより確実に比較できることになった。新生代の古気候・古海中気房の解釈に関連して,本研究の課題である寒冷系貝類の認識論の基礎となる問題について,日本古生物学会1992年年会(九州大学)で「新生代化石生物温度計の試みーその論理と適用ー」をテ-マにシンポジウムを企画開催し,異なる多くのタクサの研究者と意見交換ができた。特に寒冷(亜寒帯・寒帯など)気候をどのように過去の生物相に適用解釈してゆくかの問題点が整理できたと考えている。本研究の目的は本邦新生代における浅海性貝類の変遷を総括し、寒冷系貝類の成立過程についての地史的・古環境的背景を多角的に考察し、親潮的寒冷貝類の具体的成立過程とその原因を明確に示す事にあった。そのために、寒冷系とはどのように定義する事ができるのか、更に本邦の非温暖性貝類の時間・空間的消長を明確にする必要があった。平成2-3年度は文献等によって現生北方系貝類種属の水温特性を把握しながら、より客観的な海洋気候を区分認識し、浅海性貝類と海洋気候の対応関係を明確にする事に努めた。また北海道を中心に浅海性貝類化石含有の第三系の地質年代を明確にしながら、貝類群集の変遷内容と古海洋気候的の関連を検討した。平成4年度は過去2年間で得られた結果を更に総合的に再検討し、寒冷系を判断する基準をつくり、その基準に基づいて新第三紀の貝類化石群集の古海洋気候復元と、寒冷系貝類の出現過程やその背景を明確にする事が出来た。結果現在の海洋生物地理的立場から、浅海域における寒冷とは、現在の親潮を中心とする亜寒帯と高緯度地域の寒帯に分布する種属に基づいて判断すべきで、温帯には冷温帯・中間温帯・暖温帯の3帯を設定し、これらを寒冷系と呼ぶべきではない。ここで得られた寒冷系の貝類相を基準に北西太平洋地域の新第三系の貝類化石群の繁栄時の海洋気候を推定した結果、中新世には現在の親潮に相当する寒冷海は出現しておらず、更に寒冷系の代表と考えられてきた鮮新世竜ノ口動物群は冷温帯下で繁栄したものであると結論づけた。即ち寒冷海の出現は第四紀初頭になって北海道渡島半島の瀬棚層の貝類化石記録によって示される。この寒冷系貝類出現の背景は、世界的寒冷化にともなって日本海やオホーツク海などの北西太平洋地域の中緯度地域の閉鎖的沿海が、冷温帯から亜寒帯への貝類種属の適応放散に場を提供した事が要因である。
近赤外分光測定装置を用いた新生児虚血性脳障害の予防に関する実験的研究

1)近赤外分光測定装置(NIRS)を用いて7生日新生仔豚の脳内酸化,還元ヘモグロビン,チトクロームオキシダーゼ(酸化Hb,還元Hb,Cyt aa_3)が非侵襲的にモニター可能かに関してまず検討した.全身麻酔下で5匹の仔豚の頭部にNIRSのoptodeを固定し(パルスオキシメターによるSpO_2も同時測定),低酸素や過換気の条件下で酸化,還元Hbの推移を観察したところ,低酸素にともなう酸化Hbの低下(還元Hbの上昇)をリアルタイムに測定できた,FiO_20.21での過換気条件下では,酸化Hbは低下することもわかった.2)次に10匹の仔豚でインドメサシン(0.2mg/Kg)静注前後の変化を観察したところ,静注直後から酸化Hbの著名な低下(総Hb=脳血液量も著名に低下)を全例に認めた.この変化は1時間以上持続した(N=2).またインドメサシン投与20分後に過換気にした場合,酸化Hbや総Hbがさらに低下するか検討した(N=8).十分な酸素投与下ではPaCO_215-25mmHgの過換気でインドメサシンで認めた変化以上に低下することはなかった.インドメサシンによるCytaa_3の変化に関しては症例を増やして統計解析中である.まとめ:NIRSにより新生仔豚の脳内酸化/還元Hb,Cytaa_3が非侵襲的連続的にモニター可能で,インドメサシンや低酸素,過換気による脳内変化をリアルタイムにとらえることが可能である.インドメサシン投与時は,低酸素および脳内血液量の低下に注意する必要がある.1)近赤外分光測定装置(NIRS)を用いて7生日新生仔豚の脳内酸化,還元ヘモグロビン,チトクロームオキシダーゼ(酸化Hb,還元Hb,Cyt aa_3)が非侵襲的にモニター可能かに関してまず検討した.全身麻酔下で5匹の仔豚の頭部にNIRSのoptodeを固定し(パルスオキシメターによるSpO_2も同時測定),低酸素や過換気の条件下で酸化,還元Hbの推移を観察したところ,低酸素にともなう酸化Hbの低下(還元Hbの上昇)をリアルタイムに測定できた,FiO_20.21での過換気条件下では,酸化Hbは低下することもわかった.2)次に10匹の仔豚でインドメサシン(0.2mg/Kg)静注前後の変化を観察したところ,静注直後から酸化Hbの著名な低下(総Hb=脳血液量も著名に低下)を全例に認めた.この変化は1時間以上持続した(N=2).またインドメサシン投与20分後に過換気にした場合,酸化Hbや総Hbがさらに低下するか検討した(N=8).十分な酸素投与下ではPaCO_215-25mmHgの過換気でインドメサシンで認めた変化以上に低下することはなかった.インドメサシンによるCytaa_3の変化に関しては症例を増やして統計解析中である.まとめ:NIRSにより新生仔豚の脳内酸化/還元Hb,Cytaa_3が非侵襲的連続的にモニター可能で,インドメサシンや低酸素,過換気による脳内変化をリアルタイムにとらえることが可能である.インドメサシン投与時は,低酸素および脳内血液量の低下に注意する必要がある.
旧植民地域における言語盛衰に関する総合的研究－ミクロネシアを事例として

本研究は、旧植民地域で形成される多言語社会における言語変化のメカニズムを総合的に解明することを主たる目的とし、パラオの旧宗主国の言語である日本語と英語の盛衰に関する言語内的および外的要因、過程、程度をマクロ・ミクロの両視点から精緻に調査研究したものである。「社会的ネットワーク分析」の導入、「集中モデル」や「ダイナミックモデル」の検証などを含む本研究成果は、接触社会言語学分野の理論構築にも資するものであると考える。本研究では、旧植民地域で形成される多言語社会における言語変化のメカニズムを総合的に解明することを主たる目的とし、パラオの旧宗主国の言語である日本語と英語の盛衰の言語内的・外的要因、過程、程度をミクロな視点から精緻に調査している。4ヵ年計画の初年度の研究として、本年度はパラオ日本語変種およびパラオ英語変種の言語学的分析を行うためのデータを揃え、変異理論を用いて本格的に分析するための所要の整備を進めた。具体的には、パラオで現地調査を行い、両言語の会話データを収集し、帰国後は電子ファイルに変換するとともに会話を活字化し、調査対象となる言語変異の各変異形の頻度等を調べ、統計ソフトへの入力作業およびパイロット的な定量的分析を行った。途中段階ではあるものの、これらの研究成果は第43回欧州言語学会(43rd Annual Meeting of the Societas Linguistica Europaea)において報告し、関係専門家によるフィードバックを参考にしつつ、さらに研究を深めている。また本年度、国際学術雑誌『Multilingua』より公刊された論文「The role of social networks in the post-colonial multilingual island of Palau : Mechanisms of language maintenance and shift」が、日本オセアニア学会賞を受賞した。本稿は、パラオにおける旧宗主国言語の盛衰の言語外的要因をマクロな視点から分析したものであるが、今後、本研究でミクロな視点から言語内的要因を分析するうえで活かされる。本研究では、旧植民地の諸地域で形成される多言語社会における言語変化のメカニズムを総合的に解明することを主たる目的に、パラオの旧宗主国の言語である日本語および英語の盛衰に係る言語内的・外的要因や変遷過程、度合いを、統計的な手法も織り交ぜながら、ミクロな視点から精査している。4ヵ年計画の2年目の研究として、本年度は昨年度に引き続き、両言語のデータ収集を予定していたものの、震災による影響のため余儀なく微修正を強いられ、収集済みの膨大な会話データの電子化・活字化の処理を図った。さらに、調査対象となる言語変異の変異形ごとの使用頻度等を調査し、現在、定性および定量の両面からその分析を進めている。4ヵ年計画の最終年度の研究として、本年度はこれまでの調査・研究を総括しつつ、比較研究も織り交ぜながら、次なる研究に向けての土台を整備した。そもそも本研究は、旧植民地の諸地域で形成される多言語社会における言語変化とそのメカニズムを総合的に解明することを目指したものであり、本年度はこれまでの研究内容を補足・充実させるとともに、総括的かつ総合的な分析・研究を展開した。(2)パラオ英語に関する分析では、音韻・統語・語用論の側面から言語学的特徴を明らかにしつつ、ダイナミックモデル(Dynamic Model)を援用した考察を加え、他の旧植民地英語との比較研究も行ったところである。その途中成果を3度にわたる招待講演において公表、さらに国際学会においても報告した。こうした発表の場で得られた貴重なフィードバックをケンブリッジ大学出版より近刊予定の編著書『Further Lesser-Known Varieties of English』(2014)に所蔵される「Palauan English: History, status and linguistic characteristics」にも反映させたところである。本研究では、旧植民地の諸地域で形成される多言語社会における言語変化のメカニズムを総合的に解明することを主たる目的に、パラオの旧宗主国の言語である日本語および英語の盛衰に係る言語内的・外的要因や変遷過程・度合いを、統計的な手法も織り交ぜながら、ミクロな視点から精査している。4ヵ年計画の3年目の研究として、本年度は両言語のデータを収集し、現在、膨大な会話データの電子化・活字化の処理を進めている。さらに、調査対象となる言語変異の変異形ごとの使用頻度等を調査し、定性および定量分析も進行中である。まず、パラオ日本語に関しては、タグ「デショ」「ダロ」に焦点を当てた語用論的変異と変化に関する研究の途中成果を2つの国際学会において報告するとともに、国内では「パラオ日本語の語用論的変異と変化」として『南太平洋の言語的世界』(渓水社)に所収されることになった。パラオ英語に関する分析でも、研究の途中成果を中間報告の形で2つの国際学会において報告するとともに、本学紀要より「Palauan English as a newly emerging postcolonial variety in the Pacific」として公表し、音韻・音声・統語各レベルにおけるパラオ英語の言語学的特徴をまとめた。さらに精度を高め、Dynamic Model (Schneider 2007)の検証を加えたものが『The Lesser-known Varieties of English』(ケンブリッジ大学出版)に所収されることになっている。

最終年度となる来年度は、パラオにてデータ収集・分析をさらに進めるとともに、他の旧植民地域との比較研究を展開し、これまでの調査・研究の集大成を図り、一定の方向性を示すとともに、関係専門家からの助言を得ながら、次なる研究に向けての土台を整備する予定である。震災の影響により、当初の予定・計画、すなわちパラオでの新たな現地調査やその統計分析といった研究代表者が担うべき事項に変更を強いられたことは否めない。その反面、きわめて貴重であるものの、これまで未整理.未分析となっていた膨大な一次データの電子化や活字化、データ化を図ることができ、現在の研究の土台を補足・強化することができた意義は大きいと考える。その結果、パラオ日本語の語用論的な変化に関する研究成果をまとめ、また、パラオ英語の音韻的特徴を定性的に示唆するに至るなど、一定の成果・達成度が得られたといえる。25年度が最終年度であるため、記入しない。震災の影響により、2011年度に遅れていたデータ収集と研究成果の公表を、2012年度におおむね取り戻すことができ、一定の成果・達成度が得られたといえる。今後は、定性的な分析のみならず、変異理論を用いた本格的な定量分析も進める上で、話者からの必要な一次データをより多く入手するため、パラオでの現地調査を再開する必要がある。申請当初、13年目に予定していたデータ収集時期を、1、34年目へ変更するため、本研究計画の最終年度となる4年目は、データ収集と分析を同時並行的に行わなければならず、総括にも多少のしわ寄せがもたらされることは避けられないが、申請当初の目的自体はおおむね達成できると思われ、また達成できるよう取り組む予定である。申請当初、13年目に予定していたデータ収集時期を、震災の影響により、1、34年目へ変更したため、本研究計画の最終年度となる4年目は、データ収集と分析を同時並行的に行わなければならず、総括にも多少のしわ寄せがもたらされることは避けられないが、申請当初の目的自体はおおむね達成できると思われ、また達成できるよう取り組む予定である。
早期肝細胞癌診断基準客観化に関する病理学的検討

本研究においては,早期肝細胞癌の生検診断法を確立する目的で,最近の生検例597例中から高分化型(wHCC),典型的(cHCC)症例を夫々29例,15例えらびそれらの結節部と非結節部即ち硬変部(LC)とを比較検討した.またこれまで境界病変(BL)とされた症例10例を含めて検討した.診断の客観をはかるために,各異型要素を数値として示すべく画像解析を行った.指標としては細胞索の厚さ,細胞の大きさ,核細胞貭比(N/C比),核密度である.結果:wHCCはLCに比して,有意に細胞索が狭小化し,細胞は小型化,N/Cが上昇した.そしてそれらは一定面積内の核密度の上昇として反映された.これらの指標は各症例ごとに結節部とLC部を対比することによってより鮮明に示された.早期のwHCCの診断は核密度が1.8倍を越える場合には平均的に可能であり,判別分析によれば1.3倍を越えればかなりの確度で可能であることが示唆された.BLに関しては数値はLCとwHCCの中間に止まり,その帰属を客観的に決定することはなお不可能であった.考察:本研究の主眼であるwHCCとLCとの組織学的鑑別は,画像解析の結果から平均細胞面積(大きさ)とN/C比であることが明らかにされた.そして両者は核密度として反映されるので,これがもっとも容易に評価しうる信頼度の高い指標であることが結論された.それは一定条件下では数値として両病変を区別することに応用しうる.以上の結果はHCCの生検診断の客観化に大きく貢献するものと考えられる.本研究の成果の一部は,すでに平成3年度に論文として公表されている.本研究においては,早期肝細胞癌の生検診断法を確立する目的で,最近の生検例597例中から高分化型(wHCC),典型的(cHCC)症例を夫々29例,15例えらびそれらの結節部と非結節部即ち硬変部(LC)とを比較検討した.またこれまで境界病変(BL)とされた症例10例を含めて検討した.診断の客観をはかるために,各異型要素を数値として示すべく画像解析を行った.指標としては細胞索の厚さ,細胞の大きさ,核細胞貭比(N/C比),核密度である.結果:wHCCはLCに比して,有意に細胞索が狭小化し,細胞は小型化,N/Cが上昇した.そしてそれらは一定面積内の核密度の上昇として反映された.これらの指標は各症例ごとに結節部とLC部を対比することによってより鮮明に示された.早期のwHCCの診断は核密度が1.8倍を越える場合には平均的に可能であり,判別分析によれば1.3倍を越えればかなりの確度で可能であることが示唆された.BLに関しては数値はLCとwHCCの中間に止まり,その帰属を客観的に決定することはなお不可能であった.考察:本研究の主眼であるwHCCとLCとの組織学的鑑別は,画像解析の結果から平均細胞面積(大きさ)とN/C比であることが明らかにされた.そして両者は核密度として反映されるので,これがもっとも容易に評価しうる信頼度の高い指標であることが結論された.それは一定条件下では数値として両病変を区別することに応用しうる.以上の結果はHCCの生検診断の客観化に大きく貢献するものと考えられる.本研究の成果の一部は,すでに平成3年度に論文として公表されている.
再構成クロマチンの動的立体構造と遺伝子機能

生体の遺伝情報を伝えるDNAは、その大きさが数10μmから数cmにもおよぶ巨大分子であり、細胞内ではコンパクトに折り畳まれた凝縮状態で存在している。このようなDNAが細胞中、その折り畳み構造をどの様に変化さるのかを解明することは、遺伝子の機能を明らかにする上で重要な課題であると思われる。本研究では、単一分子鎖法の活用により、長鎖DNAおよび再構成クロマチンの動的な高次構造を追究し,細胞内環境条件(イオンやATPさらに遺伝子発現に関係する生理活性物質)が高次構造にどのような影響をもたらすのかを明らかにすることを目的とした。さらに、再構成クロマチンを用いた,in vitroでの転写、発現の実験も並行させて推進し、遺伝子活性の自己制御の機構の解明をめざした。[研究経過および成果]1.DNAを内包した細胞サイズのリン脂質小胞体(リポソーム)の生成手法を確立し、この系が細胞のモデルとして有用であることを示した。さらに、その応用として、抗がん剤であるダウノマイシンによる、細胞サイズリポソームに内包したDNAへの作用を調べたところ、ダウノマイシンは、リポソーム内のDNAに対して、分子鎖を引き伸ばし、脱凝縮させてから切断反応を引き起こすことを明らかにした。2.ビタミンC(アスコルビン酸)がDNAの高次構造に及ぼす影響を調べ、単一のDNA分子の中で、コンパクトに折りたたまれた凝縮部分と、コイル状に引き伸ばされた部分が共存する、"pearling"構造が誘起されることを見出した。3.長鎖DNAから再構成したクロマチンを用いて、活性酸素によるDNAの二本鎖切断反応を観察し、ビタミンCによってどの程度抑制されるのかを測定した。現在、定量的な解析を進めている。4.DNAの高次構造と遺伝子活性との関連性を明らかにするため、長鎖DNAを用いた転写実験を現在行っている。生体中でDNAは、コンパクトに折り畳まれた構造(凝縮状態)で存在する。一方、水溶液中でDNA分子は、ポリアミンやヒストンタンパク質をはじめとする種々の凝縮剤の作用により、ランダムコイル状態から凝縮状態へと転移する。この様なin vitroでのDNAの分子内転移機構の分子レベルでの解明は、in vivoにおけるDNAの折り畳み構造と複製や転写機構との関係を理解する上でも非常に重要であると考えられる。具体的な成果として、(1)水溶液中での単一DNA分子の高次構造変化を、T4ファージDNAを用いて観察し、同じ凝縮剤でも凝縮剤の濃度や溶液中のイオン強度の変化等環境条件に応じて、多様な凝縮構造を引き起こすことを明かにした。(2)DNAの折りたたみ構造変化が制限酵素に対する感受性を変えることを示した。(3)細胞サイズリポソームに長鎖DNAを内包した細胞モデルを用いて、抗がん剤によるDNAと膜双方に対する影響を調べた。蛍光顕微鏡下で、実時間での形態変化観察を試みた結果、ダウノマイシンは、膜に作用して、小胞化、断片化等の顕著な形態変化をひきおこし、リポソーム内のDNAに対しては、切断反応を引き起こすことが明かになった。今後、このような細胞デル系も用いることにより、細胞内環境に近いナノ環境条件を試験管内で再現し、高次構造と生物学的機能との関係を追究していきたいと考えている。生体の遺伝情報を伝えるDNAは、その大きさが数10μmから数10mmにもおよぶ巨大分子であり、細胞内ではコンパクトに折り畳まれた凝縮状態で存在している。

そこで、蛍光顕微鏡による単一分子鎖観察法を活用することにより、折り畳み構造を決定付けている種々の因子を系統的に調べ,生化学的手法も併用してDNAの高次構造が生物的機能とどの様に関連するのかを追究した。具体的な研究成果としては、mM以上のアスコルビン酸より、DNAの高次構造が著しい変化を引き起こし、特徴的な部分凝縮構造が生じることを見出した。食事により摂取されたビタミンC(アスコルビン酸)は、脳や免疫関連組織においては他の組織に比べてmMオーダーで高濃度存在し、重要な役割を果たしていることが示唆されているが、コラーゲン合成の補酵素としての働きや、活性酸素除去作用以外の働きについては、実験的な裏付けに乏しく、その役割については未だ不明な点が多い。本研究で明らかになったような、DNAの高次構造に対するアスコルビン酸の作用はこれまで知られておらず、生体内でのアスコルビン酸の役割を考える上でも意義のある研究結果であるといえる。このような、アスコルビン酸のDNAに対する特異な作用についての研究結果は、Eur.J.Biochem.誌に掲載され、表紙としても採用されたことを特記しておきたい。これまでの研究をさらに発展させて、長鎖DNAから再構成したクロマチンの動的な高次構造を単一分子鎖法により追究し,細胞内環境条件(イオンやATPさらに遺伝子発現に関係する生理活性物質)が高次構造にどのような影響をもたらすのかを明らかにし、さらに、再構成クロマチンを用いた,in vitroでの転写、発現の実験も並行させて推進し、遺伝子活性の自己制御の機構の解明をめざした。[研究経過および成果]1.これまで高感度・高倍率の蛍光顕微鏡を用いて、個々のDNA分子の溶液中のコンフォメーションを直接観測し、長鎖DNAの高次構造変化を系統的に研究してきた。本年は、この研究手法を二本鎖切断反応に応用し、活性酸素による長鎖DNAの二本鎖切断反応を"その場"観察し、速度解析を行うことに成功した。2.すでにビタミンC(アスコルビン酸)がDNAの高次構造に及ぼす影響を調べ、単一のDNA分子の中で、コンパクトに折りたたまれた凝縮部分と、コイル状に引き伸ばされた部分が共存する、"pearling"構造が誘起されることを報告しているが、このような高次構造変化と抗酸化作用との関係を現在解析している。3.長鎖DNAから再構成したクロマチンを用いて、活性酸素によるDNAの二本鎖切断反応を観察し、ビタミンCによってどの程度抑制されるのかを測定した。現在、定量的な解析を進めている。4.ビタミンCによる抗酸化作用と遺伝子活性との関連性を明らかにするため、長鎖DNAを用いた転写実験を現在行っている。
越境拡散浮遊粒子状物質に含まれるタンパク質の定量分析の試み

研究の目的は,大気中浮遊粒子状物質に含まれるタンパク質の定量分析法を確立し,越境移動の浮遊粒子状物質中に含まれるタンパク質の測定を行い,大気環境学と生化学を横断する斬新な研究に初期的なデータを蓄積することである.平成29年度では、実験室内においてBCA法を用いた定量分析の操作手順と抽出精度の検討を重点的に実施した.検量線法が最も適応である標準溶液濃度の範囲を確定し,実大気へ試験的に使用した結果,浮遊粒子状物質中のタンパク質を正確に定量するには,サンプルの採集は数立方メートル以上の空気が必要であることがわかった.また,天気条件や地上からの高度の違いによって,大気浮遊粒子中のタンパク質量が大きく異なる結果もあった.これらの結果から,天気や大気汚染の状況の変化に伴う大気中のタンパク質の定量分析が可能となった.平成30年度では,確立された方法を利用して,九州西岸(平成30年4ー5月)および中国東部沿岸域(平成31年1月)において観測を実施し,越境大気汚染気団中のタンパク質の定量評価を試験的に行った.サンプルの採集は,気象条件を参考にして流れ経路別の気団に対して気団毎に行なった.また,浮遊粒子状物質中のタンパク質の量と浮遊微生物の濃度の関係も調べた.実大気浮遊粒子状物質中のタンパク質の量は天気及び大気汚染の状況によって大きく異なり,その値は数十から数十万μg/立米の範囲であった.特に黄砂時(浮遊粒子状物質が非常に多い時)は,数千から数十万(μg/立米)であった.令和元年5月現在,取得したデータをとりまとめながら,海外の研究者と連携して5月には熊本県天草西岸と中国沿岸都域青島市で,6月には中国の砂漠域での観測を準備している.また,本研究計画の成果を国内外の学会で発表する予定や,開発された方法と得られた結果をもとにして学術論文の原稿を作成しており,専門雑誌に投稿する予定もある.この研究の目的は,汎用のタンパク質定量分析法を用いて大気中浮遊粒子状物質に含まれるタンパク質の定量分析法を確立し,黄砂やヘイズなどの越境移動の浮遊粒子状物質中に含まれるタンパク質の測定を行い,大気環境学と生化学を横断する斬新な研究サブジェクト「大気中のタンパク質の濃度変化およびそのアミノ酸構造の解明」に初期的なデータを蓄積することである.平成29年度では、まず標準溶液と実大気中のサンプルを利用して実験室内においてBCA法を用いた定量分析の操作手順と抽出精度の検討を重点的に実施した.操作手順などを検討するために,タンパク質の抽出率,検量線の再現率,吸光度の測定を繰り返し行なった.また,大気中浮遊粒子状物質中のタンパク質について,試験的な測定も行なった.その結果,標準溶液の濃度0.5-10μg mL-1の吸光度が超純水の吸光度とほぼ一致した.よって,本実験において濃度5.0-10μg mL-1の範囲で検量線法が最も適応であることを確定した.実大気(熊本市にて)へ試験的に使用した結果,大気中のタンパク質濃度は0.2-1.07μg m-3であった.このことから,サンプルの採集は数立方メートルの空気を採集しないと,浮遊粒子状物質中のタンパク質に対して、正確な定量が難しいことがわかった.また,天気条件の違いによって,大気浮遊粒子中のタンパク質量が大きく異なる結果もあった.同一地点でも,地上からの高度の違いによって,大気浮遊粒子中のタンパク質の濃度が異なることも分かった.これらの研究活動によって,天気や大気汚染の状況の変化に伴う大気中のタンパク質の定量分析が汎用なBCA法を利用して可能となった.平成29年度予定された実施内容のPicotan/Picotein法を用いて分子量別のタンパク質の相対量(割合)の測定がまだ行えていない.実大気浮遊粒子状物質中のタンパク質の濃度が極めて低く,精確に定量できるまでに時間がかかった.既にその相対定量に必要な設備等の準備ができたので,平成30年度の当初の研究内容を実施しながら,その相対量(割合)も測定する.研究の目的は,大気中浮遊粒子状物質に含まれるタンパク質の定量分析法を確立し,越境移動の浮遊粒子状物質中に含まれるタンパク質の測定を行い,大気環境学と生化学を横断する斬新な研究に初期的なデータを蓄積することである.平成29年度では、実験室内においてBCA法を用いた定量分析の操作手順と抽出精度の検討を重点的に実施した.検量線法が最も適応である標準溶液濃度の範囲を確定し,実大気へ試験的に使用した結果,浮遊粒子状物質中のタンパク質を正確に定量するには,サンプルの採集は数立方メートル以上の空気が必要であることがわかった.また,天気条件や地上からの高度の違いによって,大気浮遊粒子中のタンパク質量が大きく異なる結果もあった.これらの結果から,天気や大気汚染の状況の変化に伴う大気中のタンパク質の定量分析が可能となった.平成30年度では,確立された方法を利用して,九州西岸(平成30年4ー5月)および中国東部沿岸域(平成31年1月)において観測を実施し,越境大気汚染気団中のタンパク質の定量評価を試験的に行った.サンプルの採集は,気象条件を参考にして流れ経路別の気団に対して気団毎に行なった.また,浮遊粒子状物質中のタンパク質の量と浮遊微生物の濃度の関係も調べた.実大気浮遊粒子状物質中のタンパク質の量は天気及び大気汚染の状況によって大きく異なり,その値は数十から数十万μg/立米の範囲であった.

特に黄砂時(浮遊粒子状物質が非常に多い時)は,数千から数十万(μg/立米)であった.令和元年5月現在,取得したデータをとりまとめながら,海外の研究者と連携して5月には熊本県天草西岸と中国沿岸都域青島市で,6月には中国の砂漠域での観測を準備している.また,本研究計画の成果を国内外の学会で発表する予定や,開発された方法と得られた結果をもとにして学術論文の原稿を作成しており,専門雑誌に投稿する予定もある.前年度に確立された方法を利用して,九州西岸および中国東部沿岸域において大気中浮遊粒子状物質を観測し,越境大気汚染気団中のタンパク質の定量評価を試験的に行う.また,Picotan/Picotein法を用いて分子量別のタンパク質の相対量(割合)の測定も実施する.平成30年5月現在まで既に熊本県天草半島西海岸と中国東部沿岸都市青島市においてフィルターサンプルを複数採集している.サンプルの採集は,気象条件を参考にして流れ経路別の気団(アジア大陸からの気団,東シナ海からの気団,局地的な気団)に対して,気団毎に行なった.また,浮遊粒子状物質中のタンパク質の量と浮遊微生物の濃度の関係も調べる.これらの研究活動で取得するデータを取りまとめ,国内外の学会で発表するに合わせて,学術論文の原稿を作成して専門雑誌に投稿する.更に,国内外の専門家に訪問し,「大気中のタンパク質の濃度変化およびそのアミノ酸構造の解明」を目的にして新たな展開を計画する.
海外における子供のまちづくり学習の現況調査及び日本での実施体制確立に関する研究

1.海外における現況調査は、平成13年度は英国とフィンランド、平成14年度は米国、台湾、平成15年度は東南アジア、韓国、平成16年度は中国において行った。「子どものまちづくり」教育という観点で調査を進めていくと、やはり欧州諸国が先進的な手法をすでに様々な形で実施していることが確認できた。充実した指導書なども入手しその分析をすると同時に専門家集団へのヒアリングも行った。米国においては明確な「まちづくり教育」は存在しなかったが、「子どもの権利」教育の一環として市民意識、コミュニティ意識などが育つ土壌があることが確認された。一方、訪問したアジアの各地では未だにこのような学習において系統的な研究が見られなかった。ただ、韓国においてはNGO等の市民団体が都市計画専門家の力を得て、児童に身近な問題から次第にまちづくりに視野を広げていく運動を実際に達成した事例も確認できた。以上の海外調査結果をもとに、各国の学校・NPO(専門家)・企業及び行政の体制等の比較と評価を行った。2.平成13年度は次年度に義務教育課程で施行される「総合的な学習」のテーマの一つとして「まちづくり学習」が確立されるように、東村山第七中学校において継続的に実践してきた研究を、子ども・学校の先生・ボランティアスタッフの3者に対するツール及び授業カリキュラムについて提案することを目的としてさらに継続した。平成14年度においては当該中学において1,2年生全員の必修カリキュラムとして正式に採用となり定着する方向になった。同時に、テキストの作成・提供の必要性を痛感し、平成15年度初めに現場の教師用テキスト「まちづくり賛歌」を作成、出版した。しかし実際は専門的知識のあるボランティアの助力なしに継続的に当該プログラムを実施するのは困難である。この事実をふまえ、最終年度はさらに新しい継続的な教育プログラムの工夫についてとりまとめた。平成13年度は、研究計画通りに以下の2つを柱として研究を行った。1.「ヨーロッパにおける子どものまちづくり学習調査」では、フィンランドと英国を対象としてヒアリング調査及び文献調査を行った。フィンランドでの調査では、行政へのヒアリングだけでなく、父兄(その中には外国人も含まれる)や教育関係者へのヒアリングをすることができた。英国での調査では、「ラーニング・スルー・ランドスケープ・トラスト」と「グラウンド・フォー・チェンジ」両組織に対してヒアリングを行った。特に、人材育成や情報構築の仕方・工夫などにっいて、またガイドライン(指導書)の役割と使い方についての意見交換を行った。2.「日本におけるまちづくり学習」では、平成14年度から導入される総合的学習の時間において、子どものまちづくり学習を適用することが可能かどうかの実践研究及び東京都内の中学校を対象としたアンケート調査によって次のことを明らかにした。(1)複数科目の教諭の協力を得ることによって、総合的学習の時間で子どものまちづくり学習を適用することは十分可能である。また、教諭の意識喚起にも強い影響を与える。また、地元のボランティアセンターや企業からも授業に参加して頂いたりするなどの新しい交流も生まれ、まちづくりの拠点としての中学校の活用という新たな見地も得られた。(2)多くの中学校でも子どものまちづくり学習を取り入れたいと考えていることがわかったが、サポートしてくれる団体との協力関係の構築に自信がないということがわかった。(1)今年度は、米国、中国、台湾においてヒアリング調査及び文献調査を行った.子供を対象としてのまちづくり教育が進んでいる欧州の国々と相違して、これらの国々ではそのような教育手法が定常的には確立されてはいなかった。台湾においては着目すべきものがなかったが、上海の「上海城市規劃展示館」では、当市がいかに計画され、将来どのように発展していくのかが視覚的に展示され、あらゆる年代に理解されるように工夫されていた。

一方、米国ボストンの「こども博物館」では各国の町のセット等も展示されており、子供連に分かり易く町の成り立ちを教育する手法の一環となっていた。また小学校低学年では隣町の生徒との交流を通してコミュニティの教育をおこなっているが、都市計画の観点は取り扱っていなかった。一方、「子供の権利」を守る意識が高く、子供達に市民としての自覚や忠誠心を教育していく過程で地域に対する愛着、つまりは町に対する関心が定着していくのではないかという観点から、特にその方面に詳しい弁護士や現地で子弟に教育を受けさせている邦人の父兄などにもヒアリング調査を実施した。(2)総合的学習の時間に「まちづくり学習」を適用することを一つの目標としてきたが、東村山第七中において当研究が1、2年生全員の必修カリキュラムとして正式に採用となり定着しつつある。9月には目黒区立烏森小学校における総合的学習を支援する目的で、5年生を対象に地域の環境を通して「まちを考える学習」の導入の講義も実施した。このような試みを通じて都市計画の専門家のみならず企業、法人、行政などの団体を関与させ、学校が自主的にこの学習を展開させる体制を構築していけるかがこれからの重要な課題であることがわかった。それとともに、教師が参考に出来るようなテキストの作成・提供が必要であることも痛感し、その作成に取りかかっている。今年度は主に東南アジア、韓国における子どものまちづくり学習の実態調査を行った。シンガポールにおいては交通問題などでかなり注目すべき都市計画は見られるが、マレーシアと共に子どものまちづくり学習については、未だに系統的な研究が見られないようだ。韓国においても同様で、ソウルに一極集中する人口に対応するだけで手一杯の行政の様子が分かった。ただし、ここでは児童の通学路の安全を図る運動から、NGO等の市民団体や、都市計画専門家の力を得て、通学路を見直すことで街を知り、それが一坪公園作り運動などに繋がり、大人達も巻き込んで行政を動かす原動力になっていたケースが見られ、児童に身近な問題から次第に視野を広げていく運動が実際に達成されていた。市民団体の地位が日本と異なるとはいえ、行政主導ではないまちづくりの原点を見る思いだった。平成9年より取り組んできた東村山第七中学校における「まちづくり学習」の集大成として、本年度始めに現場の教師用テキスト「まちづくり賛歌」を作成、出版した。しかし、結果的には現場の教師が専門的知識のあるボランティアの助力なしに学習カリキュラムを実行していくことは困難であることも事実である。そのため学習プログラムを普遍的なものにするために、さらに新しい工夫を検討していたところ、同市立第四中学校で15年度に始動した「四中ホリデーネットワーク(地域で活躍する中学生)」の活動に着目した。これは中学校と町会・青少年対策委員会、青年会議所などの地域諸団体とPTAとの連携によって大人と子供が一緒に活動出来る場を作り、地域における中学生の存在感を回復し、地域構成要棄としての自意識を育てていこうとする試みである。
環日本海地域の経済・環境協力と国際政治・経済システム

本研究は、環日本海地域を構成する諸国の最近の経済発展の状況を捉え、それがこの地域の環境要素に与える影響を、特に水質問題に焦点を当てて分析するとともに、主に地方政府の手による国際経済交流・協力関係の促進と国際環境問題発生回避の努力の現状を、国際経済・環境協力先進地域であるバルト海海域との比較を通じて評価し、今後のあり方を模索することを目的として行われた。第一に、作業にあたって、同地域の経済・環境条件を把握するため、北畠(1990)が提唱する経済=環境勘定体系の枠組みにしたがって、環日本海地域を構成する各国の経済=環境勘定表を1990年度のデータにより作成した。第二に、日本海海域における水質汚濁物質の年間流入総量を推計し、それを黄海・渤海などの周辺海域の推計と比較して総体的な水質汚染の深刻度を定量評価した。第三に、同海域の将来の水質汚染シミュレーションのために、金(1996)らが開発した日本海海洋モデルを改良して、地域経済開発事業の進展によるBOD・CODの変動を予測するためのモデルを作成する作業に着手した。第四に、環日本海交流をめぐって活躍する各主体の活動について、とくに新潟県の動きに焦点を当て、その事業推進のダイナミックスおよびそこで活動する国内・国外の各主体間の関係を分析した。第五に、環日本海環境協力の現状を調査し、バルト海や地中海の環境協力事業例との比較を通じて、今後の同地域における経済・環境協力のあり方について考察した。環日本海地域各国の経済事情及び国際経済・環境協力等に関する最近の動向を把握するための情報収集と整理を進め、平成2年時点のデータによって経済・環境勘定体系データベースを更新した。これに基づいて、環境分野においては特に海洋汚染問題に絞って研究を進めた。同年現在の環日本海地域への環境負荷について、水質汚濁負荷量の推定を行い、並行研究によって得られた北東アジア他海域の水質汚濁負荷量推定結果との接合をはかった。この結果、同地域における水質汚濁負荷分布の実態がはじめて全体的・定量的に解明された。これにより、水質汚濁負荷量推定結果の更新と精確化を達成しただけでなく、並行研究結果との接合によって、北東アジア海域全体の水質汚濁状況に対して、統一的な方法論に基づいた定量的な推定結果の相互比較ができたことは、重要な科学的貢献である。この成果は国際的な研究集会において公表された。国際経済・環境協力の分野では、UNDPによる図們江開発計画の進展をフォローするとともに、比較対象であるバルト海・地中海における国際環境協力形成過程に関する文献収集と検討を進め、国際協力の基軸国が経済発展によって得られた政治的影響力を行使して国際環境協力機構を成立させる過程および国際環境協力事業の発展に関する動態について知見を深めた。日本海と同様な政治的環境を持った地域における国際環境協力の成立・展開過程の検討によって、今後、21世紀に向けて展開が予想される同地域における経済・環境協力構想の進展を展望する上において、重要な示唆を得ることができた。環日本海地域の経済・環境協力については、来年度研究の予備作業として各政治主体の最近の動向に関するデータの整理を行った。この分野の成果公表は来年度に予定されている。

第三に、同海域の将来の水質汚染シミュレーションのために、金(1996)らが開発した日本海海洋モデルを改良して、地域経済開発事業の進展によるBOD・CODの変動を予測するためのモデルを作成する作業に着手した。第四に、環日本海交流をめぐって活躍する各主体の活動について、とくに新潟県の動きに焦点を当て、その事業推進のダイナミックスおよびそこで活動する国内・国外の各主体間の関係を分析した。第五に、環日本海環境協力の現状を調査し、バルト海や地中海の環境協力事例との比較を通じて、今後の同地域における経済・環境協力のあり方について考察した。
IV型線毛のライブイメージングによる機械的刺激応答機構の解明

IV型線毛のダイナミクスについて光学顕微鏡下での計測に関する研究を行なった。これまでに,シアノバクテリアにおけるIV型線毛の1細胞レベルの動態と,光に応答したIV型線毛の短時間での制御機構について研究を進めてきたが,本年度は新しい生物種に注目した。1つ目はThermus thermophilusという好熱菌で,この種はバイオテクノロジーのモデル生物として知られていたが,これまでにIV型線毛に依存的な細胞運動性について,高精度に計測・観察された例はなかった。そこで,申請者は,本菌の至適温度である70°C下での細胞動態を計測する方法を確立し,また,たった5 nmの細さのIV型線毛を光学顕微鏡下で観察し,その動きをリアルタイムで計測することに成功した。2つめはHalobacterium salinarumという好塩性のアーキアで,狭義のIV型線毛は持たないが,IV型線毛と進化的に同一の起源だと考えられるアーキアべん毛(Archaellum)を持つことが知られている。アーキアべん毛は回転モーターであるが,バクテリアのべん毛とは全く異なる分子機構であり,詳細な動態計測,特にモーターの機能に注目した研究は行われていなかった。そこで申請者は,べん毛の回転を3次元的に様々な負荷環境下で測定することで,このモーターのエネルギー出力について計測することに成功した。また,この結果から,この回転モーターの新しい作業仮説を提案した。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。自然環境下ではバクテリアは浮遊状態と付着状態とを高頻度に遷移している。海洋で生息するバクテリアを除くと,かなりのものが表面の近くで生活をしており,液体と固体の境界での生存戦略を発達させている。その1つに,IV型線毛と呼ばれる接着に有利にはたらく繊維状構造がある。これは,接着と運動を担う構造物であると見なされており,1-5 μmの長さの繊維構造が伸長・接着・収縮という一連のサイクルを繰り返すことで,細胞は固体表面上を動くことができる。IV型線毛は幅広いバクテリアで見つかっており,緑膿菌や淋菌では病原性発揮に重要であることが示されている。これまでIV型線毛は光学顕微鏡下で見えないことが当たり前であった。線毛繊維の細さが8 nmしかないこと,その動きは毎秒1 μmに達する素早い動きであることからも,このアプローチが容易ではないことが想像がつく。最も難しい問題は,IV型線毛を直接蛍光標識する手法が確立していない点である。申請者は,IV型線毛からなる繊維構造を,光学顕微鏡下でダイレクトに可視化する実験系を構築した。当該年度では、シアノバクテリアのモデル生物であるSynecosystis sp. PCC6803を用いて,IV型線毛の動的な制御機構について明らかにした。つまり,外部環境の入力シグナルとして方向性のある光を照射し,細胞は光受容体を介して光の向きを認識し,IV型線毛を光軸に沿って非対称に活性化することで,一方向的な運動を達成する,という一連のプロセスを画像化することに成功した。シアノバクテリアのIV型線毛に関しては,光学顕微鏡下でのイメージング法を最適化し,一連の制御過程を可視化することに成功した。当初の目的の1つは達成しており,その内容は論文としてまとめて,米国科学アカデミー紀要誌に掲載されることが決定した。IV型線毛の多様性や,その制御メカニズムという観点からもインパクトを与えることができたのではないかと考えている。自然環境下ではバクテリアは浮遊状態と付着状態を高頻度に遷移している。海洋で生息するバクテリアを除くと,かなりのものが表面近くで生活をしており,液体と固体の境界での生存戦略を発達させている。当初の目的の1つは達成しており,その内容は論文としてまとめて,米国科学アカデミー紀要誌に掲載された。

IV型線毛の多様性や,その制御メカニズムという観点からもインパクトを与えることができたのではないかと考えている。IV型線毛のダイナミクスについて光学顕微鏡下での計測に関する研究を行なった。これまでに,シアノバクテリアにおけるIV型線毛の1細胞レベルの動態と,光に応答したIV型線毛の短時間での制御機構について研究を進めてきたが,本年度は新しい生物種に注目した。1つ目はThermus thermophilusという好熱菌で,この種はバイオテクノロジーのモデル生物として知られていたが,これまでにIV型線毛に依存的な細胞運動性について,高精度に計測・観察された例はなかった。そこで,申請者は,本菌の至適温度である70°C下での細胞動態を計測する方法を確立し,また,たった5 nmの細さのIV型線毛を光学顕微鏡下で観察し,その動きをリアルタイムで計測することに成功した。2つめはHalobacterium salinarumという好塩性のアーキアで,狭義のIV型線毛は持たないが,IV型線毛と進化的に同一の起源だと考えられるアーキアべん毛(Archaellum)を持つことが知られている。アーキアべん毛は回転モーターであるが,バクテリアのべん毛とは全く異なる分子機構であり,詳細な動態計測,特にモーターの機能に注目した研究は行われていなかった。そこで申請者は,べん毛の回転を3次元的に様々な負荷環境下で測定することで,このモーターのエネルギー出力について計測することに成功した。また,この結果から,この回転モーターの新しい作業仮説を提案した。今後は,シアノバクテリアだけでなく,他種のIV型線毛や,IV型線毛と進化的に同じ起源であると予測されている運動・分泌装置にも注目して,その制御メカニズムの普遍性を議論する。また,シアノバクテリアに関しては,ライブイメージングを展開させることで,接着・形状変化・収縮するという一連の動態をマイクロ・ナノスケールで詳細に画像化・定量化する。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
蛍光色素遺伝子導入マウスを用いたアロ抗原の生体内動態追跡による免疫寛容機構の解明

胚移植技術の習熟により、GFP Tg(B6)及びbm12マウスのSPF化に成功した。導入遺伝子の移植実験に対する影響を確認するために、GFP Tg(B6)マウスをドナー及びレシピエントに用いて、B6,bm1,bm12マウスとの間で皮膚移植実験を行った。その結果,導入GFP蛋白は弱い移植抗原として働くが、GFPマウスは通常の移植実験に使用可能なことが明らかになった.非Tgマウス間の皮膚移植によって次のことが明らかになった。A:B6マウスにクラスI MHC抗原のみ異なる(B6xbm1)F.1脾細胞を10^7個以上静脈内投与すると対応するbm1皮膚移植片が著名に生着延長する。B:B6マウスにクラスII MHC抗原のみ異なる(B6xbm12)F1脾細胞を10^8個静脈内投与してもbm12皮膚移植片は生着延長しない。GFPでマークされたB6,bm1またはbm12脾細胞10^7個を正常B6マウスに静脈内投与し、1,2,4または8週後にFACS解析を行い、以下のことを明らかにした.C:宿主と同系のB6脾細胞はすべての細胞分画が移入動物内で確認され,徐々に数を減じて移入後8週後には検出されなくなった.D:MHCクラスIの異なるbm1脾細胞はすべての細胞分画が移入動物内で確認されるが,移入後の検出細胞数はB6の場合の約半数で,移入後4週後には検出されなくなった.E:MHCクラスIIの異なるbm12脾細胞は,移入後検出される細胞数,期間はbm1と同様であったが,移入B細胞が特異的早期に消失する事が明かとなった.マウスSPF化が予想以上に困難であったため,今回の知見と免疫寛容現象の関係が明瞭に出来ず,成果の公表には至らなかったが,本アプローチが免疫寛容現象の未知の部分を解明する可能性が示唆された.また,本研究中に開発した分子生物学的手法を用いて,共同研究者が次に記載する論文を発表した.胚移植技術の習熟により、GFP Tg(B6)及びbm12マウスのSPF化に成功した。GFPでマークされたB6,bm1またはbm12脾細胞10^7個を正常B6マウスに静脈内投与し、1,2,4または8週後にFACS解析を行い、以下のことを明らかにした.C:宿主と同系のB6脾細胞はすべての細胞分画が移入動物内で確認され,徐々に数を減じて移入後8週後には検出されなくなった.D:MHCクラスIの異なるbm1脾細胞はすべての細胞分画が移入動物内で確認されるが,移入後の検出細胞数はB6の場合の約半数で,移入後4週後には検出されなくなった.E:MHCクラスIIの異なるbm12脾細胞は,移入後検出される細胞数,期間はbm1と同様であったが,移入B細胞が特異的早期に消失する事が明かとなった.マウスSPF化が予想以上に困難であったため,今回の知見と免疫寛容現象の関係が明瞭に出来ず,成果の公表には至らなかったが,本アプローチが免疫寛容現象の未知の部分を解明する可能性が示唆された.また,本研究中に開発した分子生物学的手法を用いて,共同研究者が次に記載する論文を発表した.まず、大阪大学微生物病研究所よりGFP Tgマウスの、また米国Jackson LaboratoryよりB6.C.H-2^<bm1>(bml)及びB6.C.H-2^<bm12>(bm12)マウスの供与を受けた。GFP TgマウスおよびB6.C.H-2^<bm12>(bm12)マウスはSPFではなかったので、当学部の動物実験施設内のConventional mouse roomに収容して、帝王切開法と胚移植法の両者でSPF化の試みを開始した。しかし、計5回以上の試みにも係わらず、GFPTg,bm12マウスの何れからも正常なSPF子を得られない現状にある。これはB6マウスに見られる一般的間,題とトランスジェニックマウスの子が通常より弱いためであると考えられ、現在解決の努力を行っている。この間、数個の塩基配列の違いであるB6,bm1,bm12マウスのGenotypingをPCRで行うことが可能であるかを検討したが、その結果、4組のPrimer setを用いて、B6,bm1,bm12および(bm1xbm12)Flを判別する測定系を確立することに成功した。マウスのSPF化が困難であるため、実験の予定は遅れている。

したがって、以後の実験に必要な蛍光顕微鏡の購入を見送り、現在のマウスSPF化技術の向上に必要なCO2インキュベーターと遠心機を購入した。またSPF化に先立ち、B7,CD40 ligand,Fas ligand,IL-2,Interferon γなどの免疫関連遺伝子mRNAのRT-PCRによる定量法を確立すべく実験を行っ胚移植技術の習熟により、GFP Tg(B6)及びbm12マウスのSPF化に成功した。導入遺伝子の移植実験に対する影響を確認するために、GFP Tg(B6)マウスをドナー及びレシピエントに用いて、B6,bm1,bm12マウスとの間で皮膚移植実験を行った。その結果,導入GFP蛋白は弱い移植抗原として働くが、GFPマウスは通常の移植実験に使用可能なことが明らかになった.非Tgマウス間の皮膚移植によって次のことが明らかになった。A:B6マウスにクラスI MHC抗原のみ異なる(B6xbm1)F1脾細胞を10^7個以上静脈内投与すると対応するbm1皮膚移植片が著明に生着延長する。B:B6マウスにクラスII MHC抗原のみ異なる(B6xbm12)F1脾細胞を10^8個静脈内投与してもbm12皮膚移植片は生着延長しない。GFPでマークされたB6,bm1またはbm12脾細胞10^7を正常B6マウスに静脈内投与し、1,2,4または8週後にFACS解析を行い,以下のことを明らかにした.C:宿主と同系のB6脾細胞はすべての細胞分画が移入動物内で確認され,徐々に数を減じて移入後8週後には検出されなくなった.D:MHCクラスIの異なるbm1脾細胞はすべての細胞分画が移入動物内で確認されるが,移入後の検出細胞数はB6の場合の約半数で,移入後4週後には検出されなくなった.E:MHCクラスIIの異なるbm12脾細胞は,移入後検出される細胞数,期間はbm1と同様であったが,移入B細胞が特異的早期に消失する事が明かとなった.マウスSPF化が予想以上に困難であったため,今回の知見と免疫寛容現象の関係が明瞭に出来ず、成果の公表には至らなかったが,本アプローチが免疫寛容現象の未知の部分を解明する可能性が示唆された.また,本研究中に開発した分子生物学的手法を用いて,共同研究者は次に記載する論文を発表した
遺伝性心筋症ゲノム解析および横断オミックス解析による新規分子標的の同定と創薬開発

遺伝性心筋症はさまざまな遺伝子の上に存在する多くの変異が原因に成り得ると考えられている。しかし十分明らかとはなっておらず、疾患の正確な分類とそれに対応する治療法の開発はまだ途上にある。独自に開発した遺伝性心筋症ゲノム変異データベースを用いて、そこから同定される遺伝性心筋症および心不全に関する5つの分子標的に対して、関連する類似変異の機能評価を行うともに、創薬研究の観点から新たな原因分子探索も行い、それらの生理活性の評価系を構築してそれに基づく心筋症治療薬創出研究基盤を構築する。
ヒトiPS細胞由来肝細胞による肝不全に対する革新的治療法の開発・展開

患者本人の細胞から肝細胞を作成し、移植することができれば、肝移植におけるドナー不足や拒絶反応などの問題を解決でき、肝不全に対する革新的な治療法になり得る。iPS細胞は多分化能を持ち、肝不全に対する人工肝細胞のもとになる可能性があるが、現在までに臨床応用可能となったiPS細胞由来肝細胞は存在しない。今回の目的は、iPS細胞を分化させ、iPS由来肝細胞を作成し、その肝細胞も肝不全モデル動物に細胞移植することで、iPS由来肝細胞が肝不全に対して、生体内で治療効果を有するかどうかを明らかにすることである。まず、iPS細胞株の樹立を行うこととした。ヒト肝切除検体より線維芽細胞を取り出し、その線維芽細胞に山中遺伝子を導入することで、ヒトiPS細胞を3種類作成し、培養の定型化を行った。作成したiPS細胞が幹細胞の特徴を有することをNanog、OCT3/4の免疫染色およびqPCRにてその発現を評価することで、確認した。このヒトiPS細胞の多分化能を評価するため、3D培養をおこなうことで、外胚葉、中胚葉、内胚葉に分化する能力を持っていることを免疫染色にてそれぞれ確認した。つぎにiPS細胞の内胚葉への分化を行うために、内胚葉への導入を行った。Activin、BMP4、FDF2の濃度を振り分けて、4日間培養し、最も分化効率が良かった濃度を同定した。この導入効率を確認するために、内胚葉の分化マーカーである。SOX17の発現量を免疫組織化学染色、qPCRにて確認した。この内胚葉を肝芽細胞に分化するため、HGFにて刺激を行った。このHGFの至適濃度を確認するため、濃度を振り分けて実験を行った。肝芽細胞に分化させた細胞は、アルブミン、HNF4Aの発現を認めた。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。