hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
動物実験に伴う腎症候性出血熱発生の予防制圧に関する研究

本年度も動物実験に伴う腎症候性出血熱(HFRS)の発症は認められなかった。9機関より検査依頼の人9、ラット230、マウス25、野鼠を含む各種動物血清についてIFAを行い各々4、9、0、11、検体に抗体陽性の成績をえたが4000倍強陽性は高田が捕獲したドブネズミ1検体であった。昭和61年同じ地区から8000の高抗体価を有するドブネズミが確認されており狭い地区での野鼠汚染が注目される。他はすべて低度中等度陽性で実験ラットは何れも弱陽性であった。実験者に1名の弱陽性を認め実験ラットを含めてこれがウイルス感染の残影か否か依然として明らかでない。このような施設でも感染源となる強陽性ラットは認められない。堂前は実験感染ラット脳、肺材料を累代接種した高抗体価を示すラット脳乳材を5mg新生仔ラットipに接種して20週後血清中陰性2、陽性7例で陽性は何れも抗体価2000以上を示し、HFRSウイルス微量感染で経過と共に陰性、陽性個体が極端に分かれることが明らかし、12株のラット復水癌細胞の凍結融解液を各1リッターの新生仔ラットに接種したが40週後全てIFAで陰性を示し12株の復水癌細胞は本ウイルス汚染を受けていないことを確認した。山西はHFRSウイルスの実験感染マウスでT細胞特にL3T4、Lyt2^+T細胞、細胞障害性T細胞が感染防御に重要な役割を担うことを明らかにした。またB-1株をマウス脳に接種継代しホルマリン処理脳材料から不活化ワクチンを調整し実験的HFRSウイルス感染マウスでその免疫効果を実証した。本症回復患者が45年後も中等度(512)の抗体を保有することが明かにされたが抗体を励起維持するHFRSウイルスまたは抗原の体内定着が推定され、この実象と木村が新生仔ラットB-1株感染、死直前の脳、肺、腎等の組織細胞の細胞質に、免疫電顕像で存在を明らかにした抗原巣との関連が注目される。本研究は昭和53年度以降動物実験に伴う腎症候性出血熱(HFRS)発生の予防制圧を究極の目標とする一連の班研究の最終段階の任務を担うものである.中井はHFRSウイルスの基本構造を電顕像により解析しHantiaan(HV)株はエンベロープを有する110nmの球状粒子で,その表面は格子様構造を呈する,ラット由来のBー1他2株は大小2つの球状粒子で尾部を有する粒子が観察され,媒介動物を異にするHFRSウイルス各型の形態学的異同を明らかにした.山西はHV76ー118株感染マウスの脾細胞をウイルス感染膜腔マクロファージを標的細胞として共に培養し,ウイルス特異的な細胞障害性Tリンパ球(CTL)活性を証明し,HV及びBー1株によって誘導されたCTL活性は互いに株間交叉反応性を示しHVはBー1に比し高い活性を誘導し,感染マウスからのHFRSウイルス排除にCTLが重要な役割を担っていることを証明した.堂前はBー1株感染ラット脳・肺材料を12代継代接種しrecipient血清中に高い抗体上昇を認め,感染後2年半を経過した個体の脳・肺からウイルスの分離に成功し,回復患者血清が長期に渡って中等度抗体を持続することと併せてHFRSウイルスの生体内長期残存の可能性を明らかにした.

浜田は昭和56年から62年に至る間の購入SPFラットに13.5%の低IFA抗体陽性個体を証明し実験ラットの安全性確保のためその意義解明の必要性を強調している.高田は港湾及び近傍地区の補獲ラット血清検査を行い逐年生息ラット減少の傾向が認められるがドブネズミ,クマネズミにそれぞれ15.5%,10%に陽性を認め前者に4096倍の高陽性例の存在を報告している.発症例126,発症機関22を数えた動物実験に伴う本症は昭和59年末以来発症が停止し,これはウイルス分離,検査体制の確立,本症に対する実験者の認識の徹低等実験動物の品質の吟味,動物実験環境の改善について本研究班の成果が上ったものと考えられる.当班は昭和53年以来動物実験に伴う腎症候性出血熱(HFRS)の予防制圧を究極の目標として活動した科研研究班の最終段階の任務を負うものである。昭和59年末まで発症機関数22、患者数は126に達したが、昭和60年以降発症は停止している。この間、当班では発症状況の調査、解析して散発的発症、汚染区域の限局性、汚染源が実験ラットである、発症及び汚染ラットの自然停止・消滅などの事象の把握から病因ウイルスの感染性を考察してこれを分離、検査診断体制を確立した。班では毎年研究成果と集積した情報を内容として報告書を作成し、昭和56年から「本症診断の手引、予防指針」を併記して各機関に配布した。同年以降の発症者の減少と昭和60年以降の停止は動物実験に関与する人々の本症特にその予防制圧に対する認識が周知徹底した結果と考える。施設の汚染要因である汚染ラットの購入、汚染野鼠の侵入が確認された。死亡率、症状・経過からラット由来のHFRSウイルス株は原株よりも人に対する病原性が弱いとされているが両ウイルス株間の抗原群の異同、粒子サイズ・表面構造・形状の差異、新生仔ラット由来株がラットに対し致死効果を示すが原株接種はその成長にも影響しない等媒介動物を異にするHFRS各株の性状について顕著な差異があることが各班員によって明らかにされた。感染様式として血液、体液、排せつ物、臓器に由来する感染性エアゾルの経気道感染を主とし創傷感染も実証され、汚染ラットの観血的実験が実験者への感染発症の大きな要因であることが推定された。汚染ラット腫瘍からのウイルスの自然ならびに実験的消去も実証された。動物実験に伴う本症発生の予防制圧は品質管理された実験動物を用い的確な環境で飼育し正確な技術で実験を行う、すなわち科学的動物実験が基本であることが確認された。現在HFRS発症は動物実験の場では制圧され、班研究の目標は達成されている。
酸化的ストレスの分子標的と個体レベルでの障害性発現機構に関する研究

本研究では、酸化的ストレスの分子標的を個体レベルで明らかにする目的で、まずThioredoxin/Adult T cell derived factor (Trx/ADF)の過剰発現及び欠失動物での応答性を参照しつつ、Trx/ADFを指標として、生体レベルでの酸化的ストレスへの応答を追究し、この過程での金属イオンの役割をHPLC/HR-ICP-MS(微量元素の超高感度分析装置である二重収束型高分解能(HR)ICP-質量分析計)などを駆使して、明らかにするものである。HPLC/HR-ICP-MS法を用いることにより、分離された蛋白質に結合した微量元素をオンラインで検出することが可能となるが、このために不可欠なことは、測定金属に適したバックグラウンドレベルの低減化である。本年度はまずこれを実施した。さらに、同一タンパク質ながら金属の有無によって立体構造の異なるものについて分離条件の検討を行い、また、含有微量金属を指標に酸化ストレス消去系に関与する酵素等の変動を調べた。さらに、Trx/ADFはジスルフィド還元酵素であるため、硫黄(S)レベルでの検出も実施した。その結果、酸化ストレスに対して鋭敏に反応する臓器として知られる造血組織のホモジネート上清においては、低分子量の硫黄(S)含有化合物種の割合が他臓器のそれに比し、非常に高いことが明らかとなった。また、亜鉛(Zn)について、銅(Cu)とともにモニターしたところ、同じ保持時間に検出されるタンパク質(SOD)以外のタンパク質で、遺伝子過剰発現動物、欠失動物、正常動物においてZn結合量が異なっているタンパク質が見出された。この他Mnのピークも数本見られた。本研究では、酸化的ストレスの分子標的を個体レベルで明らかにする目的で、まずThioredoxin/Adult T cell derived factor (Trx/ADF)の過剰発現や欠失する動物での応答性を参照しつつ、Trx/ADFを指標として、生体レベルでの検証を行うことにより、この過程での金属イオンの役割をHPLC/HR-ICP-MS(微量元素の超高感度分析装置である二重収束型高分解能(HR) ICP-MS)などを駆使して、明らかにしようとするものである。HPLC/HR-ICP-MS法により、分離した蛋白質に結合した微量元素をオンラインで検出可能となるが、このために必要不可欠なことは、測定金属に適したバックグラウンドの低減化である。昨年度ではまずこれを行った。今年度は、同一タンパク質ながら金属の有無によって立体構造の異なるものの分離検討を行い、含有微量金属を指標に酸化ストレス消去系の酵素等の変動を調べた。なお、Trx/ADFはジスルフィド還元酵素であるため、硫黄(S)レベルでの検出も行った。本研究では酸化ストレスに対して敏感に反応する臓器として知られる造血組織およびホモジネート上清において、低分子量の硫黄(S)含有化合物種の割合が他臓器のそれに比し、非常に高いことが明らかとなった。また、亜鉛(Zn)について、銅(Cu)とともにモニターしたところ、同じ保持時間に検出されるタンパク質(SOD)以外のタンパク質が認められ、かつ、遺伝子改変動物、欠失動物で、それらの金属結合量が異なっている可能性が示された。
不均一系触媒を用いた連続フロー法によるタミフル及びその類縁体の全合成

不均一系触媒を用いる連続フロー法による有機合成は、様々な利点を有している。医薬品等の連続生産を志向する場合には多段階の反応を連結させる必要があるため、高活性・選択性・長寿命を有する触媒の開発が求められる。(1)不均一系塩基触媒を用いる連続フローアルドール縮合反応の開発塩基触媒を用いるアルドール縮合反応は最も効率的な分子の基本骨格を形成する手法である。これまで不均一系塩基触媒は報告例が非常に限られていた。水に対して安定かつ強塩基性を有する触媒として陰イオン交換樹脂が有効に機能することを見出した。この触媒は種々のケトンやニトリルを求核剤として用いることが可能であり、連続フロー条件下、種々の不飽和ケトン及びニトリルが高収率で得られることを見出した。一方で、本触媒の欠点として熱不安定を有することが判明した。この問題を解決するために触媒活性点と担持部位の間にスペーサーを導入した触媒の開発を行った。本触媒は高温反応条件においても安定性を示し、アセトニトリルを求核剤として用いるアルドール縮合反応の開発に成功した。以上の手法を活用し、医薬品原体であるドネペジルやフェニラミンの中間体の連続生産を達成した。(2)不均一系キラルカチオン性ロジウム触媒を用いる連続フロー不斉水素化反応の開発今日の不均一系触媒による連続フロー反応において、エナンチオ選択的な触媒反応の実現は、いまだ困難な課題である。今回、ヘテロポリ酸をアンカーとして用いる固定化法に着目し、担体のデザインを行った。アミン修飾メソポーラスシリカを担体として用い、連続フロー条件下エナミドの不斉水素化反応の検討を行った。本触媒は高活性・高選択性・長寿命を有することが明らかとなった。また金属の溶出も検出限界以下であり、触媒が強固に担持されていることが明らかとなった。メソ孔のサイズが触媒の活性や寿命に影響を与えることを明らかとした。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。連続フロー条件での触媒的アルドール型の炭素ー炭素結合生成反応を実現するため、不均一系塩基触媒の開発を行った。まずはバッチ条件でアセトフェノンとアルデヒドのアルドール縮合反応について種々個体塩基の検討を行った結果、イオン交換樹脂として広く用いられているポリスチレン担持アンモニウムハイドロキサイドが高活性な不均一系触媒として機能することを見出した。本触媒は、広く個体塩基触媒として知られる金属酸化物と比較し、強塩基性を有するとともに水存在下においても高活性な塩基触媒として機能することは新たな知見である。特に、ベンゾフェノンのような芳香族ケトンを求電子剤として用いることも可能であり、連続フロー条件において、すでに開発しているオレフィン・ニトリルの水素化反応と組み合わせることで、医薬品原体の中間体の合成も達成した。本研究は現在、論文原稿執筆中であり近日中に論文誌に投稿予定である。また、これまで不均一系触媒を用いる連続フロー条件における水素化反応の開発を行ってきたが、より複雑な構造を持つ医薬品原体の合成を志向し不斉水素化反応の開発に着手した。特に固定化法に関して、配位子の担体への固定化ではなく金属錯体全体を担体へと固定化する手法に着目し検討を行った。無機酸化物の表面をヘテロポリ酸で修飾し、ヘテロポリ酸とクーロン相互作用でカチオン性金属錯体を固定化する手法の検討も行った。錯体としては、キラルリン配位子を有するロジウム錯体を用いた。現在の最適触媒ではエナミドの不斉水素化が98%のエナンチオ選択性で進行し、金属種の溶出も3%以下に抑えることが可能である。本年度は、まず連続フロー条件でのアルドール反応の実現を目指して不均一系塩基触媒の開発を行った。比較的酸性度の低い基質に関しては、市販のイオン交換樹脂が有効に機能し幅広い基質一般性をもって目的の反応を進行させることを見出した。一方で、より酸性度に低い基質に関しては、触媒構造の改良を行い比較的高温条件においても高活性かつ安定な触媒の開発に成功した。特に、この触媒を用いて医薬品原体の中間体のフロー合成を達成したことは評価に値する。また、医薬品構造に多く含まれるキラルアミンの連続フローでの合成を志向して不均一系触媒によるエナミドの不斉水素化反応の開発に着手した。触媒としてキラルリン配位子を有するカチオン性ロジウム錯体を用いて、ヘテロポリ酸修飾無機酸化物に担持する手法を用いた。本触媒はバッチ条件での反応において高活性・選択性を示し活性種の溶液への溶出も抑えられた。今後は、触媒をカラムにパックし連続フロー反応へ用いることで、キラルアミンの連続フローでの合成の実現が期待される。

この触媒は種々のケトンやニトリルを求核剤として用いることが可能であり、連続フロー条件下、種々の不飽和ケトン及びニトリルが高収率で得られることを見出した。一方で、本触媒の欠点として熱不安定を有することが判明した。この問題を解決するために触媒活性点と担持部位の間にスペーサーを導入した触媒の開発を行った。本触媒は高温反応条件においても安定性を示し、アセトニトリルを求核剤として用いるアルドール縮合反応の開発に成功した。以上の手法を活用し、医薬品原体であるドネペジルやフェニラミンの中間体の連続生産を達成した。(2)不均一系キラルカチオン性ロジウム触媒を用いる連続フロー不斉水素化反応の開発今日の不均一系触媒による連続フロー反応において、エナンチオ選択的な触媒反応の実現は、いまだ困難な課題である。今回、ヘテロポリ酸をアンカーとして用いる固定化法に着目し、担体のデザインを行った。アミン修飾メソポーラスシリカを担体として用い、連続フロー条件下エナミドの不斉水素化反応の検討を行った。本触媒は高活性・高選択性・長寿命を有することが明らかとなった。また金属の溶出も検出限界以下であり、触媒が強固に担持されていることが明らかとなった。メソ孔のサイズが触媒の活性や寿命に影響を与えることを明らかとした。本年度は、不均一系ロジウム触媒を用いた連続フロー条件でのエナミドの不斉水素化によるキラルアミンの合成に引き続き取り組む。現在までの検討により、ヘテロポリ酸修飾無機酸化物を担体することでカチオン性キラルロジウム錯体が固定化され、バッチ条件での評価の結果、目的のエナミドの水素化反応が高収率・エナンチオ選択性で進行することが確認されている。また種々の比較実験の結果、担体の表面塩基性が触媒の担持に重要な役割を担っていることが示唆された。そこで、より詳細な無機担体の検討によりさらなる高活性な触媒の創出に取り組むとともに、固体触媒をカラムにパックすることで連続フロー条件での不斉水素化反応にも取り組む。本触媒系の特徴として調製したキラルロジウム錯体を直接担体へと担持させることができるため、容易に配位子の変更が行える点が挙げられる。そこで、構造の異なる基質や反応形式についても配位子の検討を行うことで、高立体選択的触媒の開発を目標にする。また、連続フロー法の特徴の一つとして多段階の化学変換を中間体の単離をすることなく実現できることが挙げられる。そこで、現在基質として用いているエナミドの合成、及び生成物であるアミドの加水分解による脱保護についてもフロー条件での実現可能性について探索を行う。いずれの反応においても既存法では等量以上の金属試薬や過剰量の酸・塩基が用いられており新たな合成ルートの考案や高活性な触媒の開発が必要となる。最終的には、以上の基質合成・不斉水素化・脱保護の3反応を組み合わせ、入手容易な原料からキラルアミンを合成する多段階連続フロー合成の実現を目標とする。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
社会的企業の中間的就労創出と「労働の場のエンパワメント」機能に関する実証的研究

本研究の目的は、就労・移行支援の担い手として構想されている社会的企業(労働統合型社会的企業)の位置と役割を、「中間的就労」と「労働の場のエンパワメント」という2つの側面から検討することにある。課題の焦点は、1)一般就労への移行を中心とした単線的なキャリア支援を超えた、多様な働き方を許容する就労(支援)システムの地域的構築の論理の解明、2)就労という結果だけでなく、労働そのものの意味(働くことの意味)を問い直す拡張的学習としての契機を内包する社会的企業実践の展開条件と課題を実証的に明らかにすることにある。平成26年度は、生活困窮者自立促進支援モデル事業を実施している自治体、支援実施団体、当事者へのヒアリング調査を実施した。京丹後市(京都府)を対象とした自治体調査では、生活福祉課、市民課(多重債務相談・支援室、市民相談室)、商工振興課(消費生活センター)をまとめた「寄り添い支援総合サポートセンター」を設置し、各相談支援の担当課を横断できる支援体制を構築している取り組みの検討を通して、「相談事業」から見えてくる複合的な課題に対してさまざまな地域資源と結び付ける行政の役割と可能性を明らかにすることができた。その一方で、当事者ヒアリングを通して、相談者が抱える困難は多様であり、一元的な支援では限界があることも明らかにされている。とくに、相談者の多くがその日の生活に窮している状況に鑑みると、就職にむけた支援が中心になっているのが実態であるが、単なる就職への移行支援だけでなく、個々の適性や能力を確認し、伸ばしていくための学びの機会へのニーズは高く、職業訓練や体験的な職場など、技能習得のみならず社会復帰への段階的な支援の必要性が支援者・当事者の双方から指摘されている。本研究が主たる対象とする「中間的就労」の機能も、このような困難を抱えている当事者を中心に据えた支援を意識し、社会的な居場所、体験的な訓練・就労を包含した多様な働き方を実現する地域的支援システムの構築をベースとして構想する必要があろう。そのためには、当事者と支援者の双方向的支援ネットワーク形成とともに、当事者同士の自律的なピアサポート体制など、多様な支援チャンネル構築に向けた検討も残された課題である。平成27年度は、平成27年(2015年)4月1日に施行された生活困窮者自立支援法の各自治体の実施状況の定点調査および「中間的就労(就労訓練事業)」の事業者認定にかかわる実態と論点の検討を行った。「中間的就労」は、各自治体の必須事業(自立相談支援事業/住宅確保給付金)と任意事業(就労準備支援事業/一時生活支援事業/家計相談支援事業/子どもの学習支援事業)に加え、同制度のもう一つの重要な柱として確立された仕組みであり、生活困窮者の自立(移行)支援の場としての就労訓練事業実施事業所の認定を通して、就労困難者の受け入れ促進を主たる目的としている。しかし、この間の実施状況の調査からは、認定を受ける事業所数は少なく、メリットもあまりないことが指摘されている。また、必須事業や任意事業との連携(不足)も重要な課題として浮上している。そのため、単なる訓練・就労の受け入れではなく、多様な働きかたを許容する職場や地域的支援システム構築の検討を中心課題に設定している本プロジェクトでは、「中間的就労」を「中間的労働市場」の形成という観点から捉え直し、障害や困難を抱えた人びととともに働く現場から、その制度を生かし、より人間らしい働き方を可能とする仕組みや直面する課題の整理を試みた。そのうえで、平成27年9月に日本の代表的な社会的企業の一つであるワーカーズコープの実践者とともに「中間的就労と協同労働」研究会(月1回実施)を立ち上げ、先進事例の実践検討会と集約的ヒアリング調査のフレームワークの検討に着手している。生活困窮者自立支援法施行以降の各自治体の支援状況に関するデータは厚生労働省を中心に定期的に報告されていることもあり、その実施状況などの全国的動向の把握・分析は比較的スムーズに実施することができた。そのため、次のステップである質的なヒアリング調査の実施に向けた実務者との研究会などに多くの時間と労力を割くことができた。本研究は、2015年(平成27年)4月に施行した「生活困窮者自立支援法」に先駆けて実施した生活困窮者調査から得た知見をもとに、とりわけ同制度の事業スキームの一つである「就労訓練事業(中間的就労)」に焦点を当て、それらの取り組みが職業的自立(移行支援)に果たす役割と課題を明らかにすることを目的とした。その成果は、国内の学会報告(社会政策学会/日本社会教育学会/日本協同組合学会)や海外(韓国)の招待講演等で発表し、制度としての中間的就労の現状と課題についての論考も執筆した。また、実務者(ワーカーズコープ)との共同で「中間的就労と協同労働」研究会を定期的に開催し、事例研究を重ねる中で全国約300事業所の中間的就労に関する実態調査(アンケート調査)にも取り組んでいる。同制度がスタートして以降の全国の自治体や支援に取り組む社会的企業の調査からは、生活困窮者の「相談」事業の次のステップ(就労)につなげるためには多くの困難があることが明らかになった。とりわけ、職業訓練を中心とした「中間的就労」や一般就労への移行を前提とした自立支援のみならず、多様な働き方を許容するコミュニティ労働市場の形成が喫緊の課題であることが明らかとなり、あらたに「中間的労働市場」という枠組みから生活困窮者の自立支援・就労支援のあり方を検討することの必要性を提起するにいたった。

上記の問題意識のもと、本研究は研究計画を再構築し、研究計画最終年度前年度応募を行うこととした。新たに採用された研究では、職場内での働く関係性や労働編成過程への当事者の主体的関与(協同労働)の実践的理論の構築を基盤に、その実践が地域へと広がりを見せる中で、支援者ー被支援者の関係を超えた双方向的なインクルージョン(社会的包摂)学習が如何にして生成するのかという問いを設定し、その展開条件と課題を実証的に明らかにしたい。本研究の目的は、就労・移行支援の担い手として構想されている社会的企業(労働統合型社会的企業)の位置と役割を、「中間的就労」と「労働の場のエンパワメント」という2つの側面から検討することにある。課題の焦点は、1)一般就労への移行を中心とした単線的なキャリア支援を超えた、多様な働き方を許容する就労(支援)システムの地域的構築の論理の解明、2)就労という結果だけでなく、労働そのものの意味(働くことの意味)を問い直す拡張的学習としての契機を内包する社会的企業実践の展開条件と課題を実証的に明らかにすることにある。生活困窮者自立促進支援モデル事業の概要と各自治体における就労支援への基本的スタンスの確認・検討をもとに、2015年度から本格的にスタートする生活困窮者自立支援制度にとりくむ自治体と社会的企業調査の基本的な調査枠組および論点は、一定程度整理することができた。引き続き「中間的就労と協同労働」研究会での検討を重ね、以下の調査・研究活動に取り組む。1生活困窮者自立支援制度の活用状況と課題・論点整理、2生活困窮者自立支援制度にかかわるワーカーズコープの取り組み状況と課題の検討(ワーカーズコープの生活困窮者自立支援事業の取り組み状況、中間的就労事業者認定の動向把握(経年)など)、3生活困窮者就労支援と就労の場の創造に取り組んでいる先進事例調査。平成28年度の調査研究の中心的活動となる3では、多様な働き方を許容する職場と、その文化が困難を抱える人びとの新たな受け入れへと展開しているワーカーズコープの先進事例を取り上げ、1)当事者とともに働くことがワーカーズの実践にとってどのような意味を有しているのか、2)それは、どのような意味で「支援ー被支援」の関係を超えたものとなっているのか、3)当事者とともに働くことが協同労働の実質化・発展にどのような効果を与えているのか、4)当事者とともに働くことによって浮上してきた(乗り越えなければならない)課題とは何か(制度、専門性、ピアサポート/ピアスタッフ、労働編成過程、コミュニティ形成など)についての質的調査が主たる内容となる。これらの協同労働による自立支援と仕事づくりをめざすワーカーズコープの取り組みの検討を通して、制度として「中間的就労」に取り組む社会的企業の意義と限界(課題)、さらには「中間的就労」の実質化としての「中間的労働市場」の形成にむけた実践的論理の提起を試みたい。社会教育学依然として自立支援や就労支援につながっていない多くの人びとの存在が指摘されるなかで、支援のあり方のみならず、「支援につなげる支援」の重要性が前年度の調査を通して明らかになった。これまでの研究は「排除に至るまでの過程」に焦点化しがちであったが、「就労支援に至るまで(リカバリー)の過程」に着目し、当事者視点を重視した支援のあり方の検討枠組み構築にむけた包括的な調査研究活動に取り組みたいと考えている。
哲学的思索の中から美学的関心が胚胎・生成することに関する日欧比較思想的研究

美学の生成を哲学的思索からの論理必然的成果として確認することを意図する本研究の総合的成果として、別冊報告書に発表するものは次の5点の論文である。[論文番号に即して第1,2...論文と略称]以上の論文で明らかにしたことは美学生成の多様性である。哲学分野の欧語範疇語の邦語訳に際して西周は漢学・中国哲学における類似の概念を援用し、そのうえで、名目論的に扱われる哲学的美学的概念の展開は、功利主義的実践的志向に基づいていた[第1論文]。また、近代日本を例とする美学・美意識の生成には、西洋の学問・芸術・文物・風俗の新奇さの魅力に抗しながら、伝統的・慣習的な趣味・美意識の葛藤があった[第2論文]。和辻哲郎において美学への関心は倫理学との葛藤があり両者の綜合として芸術や美は共同体を前提とするという命題が定立され「第3論文」、また、具体的な水を例としてその美学的表象を『桂離宮』において見てみると庭園の美全体の中では作用因的役割に限定されている[第4論文]。清水博の創作的場所論は西田幾多郎の場所論の影響を受けながらそれを批判して科学技術の視点で議論を展開するが、新たな情報の創造として美を規定すると、哲学・情報学と美学との接続が可能となる[第5論文]。1)共同研究としての成果:研究計画の確認にしたがって、3名の共同研究者が一堂に会し、さらに客員として瀧一郎を迎えて研究発表と全体討論を行うことができたのは2月11日-13日の合宿においてであった。米山優著『モナドロジーの美学』の内容に即してライプニッツ、西田幾多郎、アランのそれぞれの章のコメンテイターを決めて質疑応答を行い、米山による解説と解釈をうけて討論した。米山の上記著は、本研究の射程と展望を得る上できわめて示唆の多いものである。また合宿時には、瀧(「ベルクソンのエクリチュール」)と高橋(「プラトン『パイドロス』によるスタイル」)との研究報告もなされた。2)論著として発表された成果:上記米山の著書、高橋による口頭発表をはじめとして、浜下の研究成果は、西周の美学についての論文が共著『日本の芸術論』(神林恒道編、ミネルヴァ書房、近刊予定)において、またヒュームのコンヴェンション概念についての論文も発表される(『habitus研究論文集』に収録予定)。3)以上の成果をふまえて、科学研究費補助金による本研究課題における問題点・論点の所在をあらためて確認することができた。すなわち、美学生成の契機は個々の哲学者により多種多様であるが、和洋の哲学史に主要な傾向を整理すると、<a>実存的生の理念である超越的・実在論的な美のイデア追究として、また<b>感性の可能性とその論理追究の感性学として、さらには、<c>観念の様相を規定する試みとして、美学が構想されている。以上のような研究1年目の成果を踏まえて、さらに詳細に課題に取り組み、その成果を発表することが2年目に継続される。平成12年度の研究実施計画に即して、各研究分担者の成果報告(いずれも英文)を3つの国際学会においておこなった。上記の、全部で5点の研究報告と、全体の総括・反省をふまえて、研究成果報告書を編集・公刊を予定している。(4月上旬に完成予定)
非平衡浮遊砂輸送解析並びに現地観測に基づく中小港湾埋没過程の解明と埋没対策の提案

1992年の9月22日から10月14日にかけての約3週間と1993年の9月13日から10月25日にかけての約6週間の2回にわたって、千葉県飯岡漁港において、中小港湾の埋没機構を探るための長期観測を実施した。その観測において、流速や濃度等に関する多点同時連続計測及びリモコンヘリコプターを用いた流況観察を行った結果、港口部付近に発生する流れと浮遊砂濃度変動に関する基本的なデータを取得することができ、その解析から、以下のようないくつかの興味深い現象が見出された。1)100s程度の周期を有する長周期変動成分が、特に港口部付近において有意な大きさで存在する。2)その原因は、飯岡漁港の形状に起因する増幅機構と人射波自体のスペクトル特性の両方の相乗効果によるものである。3)このような長周期変動に伴って、港口部端部付近には大規模な水平剥離渦が発生し、それに伴って大量の底質の巻き上げ・輸送が発生する(なお、このような港口部での水平大規模渦の発生を抑制するような港口部防波堤の形態を考案しており、現在特許出願中である)。このような現地観測と平行して、中小港湾での底質輸送を定量的に表現するための新しい数値モデル構築に関する研究を行った。その結果、上記のような水平大規模渦を直接表現し得る、浅い水域の乱流場を対象にした新しい数値計算法の構築に成功し、それを基本的な浅水域乱流場である沿岸流場に適用して、モデルの妥当性を確認するとともに、この種の流れの力学過程における水平大規模渦の役割を具体的に明らかにした。さらに、底質の巻き上げや輸送機構をモデル化する上で基礎となる、底面振動乱流境界層の基本的な力学構造を室内実験により解明することに成功した。昨年の9月22日から10月14日にかけての約3週間、千葉県飯岡漁港において、中小港湾の埋没機構を探るための長期連続観測を実施した。初期の計測器設置時における計測器破損や、期間中の計器信号出力の不良など、いくつかのトラブルに見まわれたため、当初意図した内容のデータは得られなかったが、港口部付近における流れや浮遊砂濃度変動に関する基本的なデータを取得することができた。データ解析の結果、以下のようないくつかの興味深い現象が見いだされた。1)流速変動のスペクトル解析によって港口部内外での長周期変動成分の現れ方を調べた結果、100s程度の周期の長周期変動成分が、特に港口部付近において有意な大きさで存在することがわかった。2)この、100s程度の周期の流速変動が、港内のセイシュによるものか、あるいは入射波の波群性に伴うものかについては現在解析中であるが、浮遊砂濃度の時間変動記録のスペクトル解析結果からも、浮遊砂濃度変動に同じ周期の変動成分が有意な大きさで存在することが明らかとなった。3)現地観測での目視観測により、港口部においてほぼ周期的に浮遊砂の高濃度領域が現れることが見いだされ、それが防波堤端部での大規模な渦塊の周期的な発生によるものであることが確認された。4)この渦塊の発生周期は入射波の周期よりもかなり長く、上記の100s程度の周期に近かったものと予想された。したがって、浮遊砂濃度の100s程度の周期の変動は、上記の長周期流速変動に伴う剥離渦の防波堤端部からの周期的生成に起因するものである可能性が高い。最後の4)項については、現在は推測の域を出ていないが、これに関する検討を行うため、現在、室内実験と数値計算の両面から、より詳細な解析を行っているところである。昨年の9月13日から10月25日にかけての約3週間、千葉県飯岡漁港において、中小港湾の埋没機構を探るための長期連続観測を実施した。

一昨年の9月22日から10月14日にかけて行った前回の観測では、計測器設置時における計測器破損や期間中の計器信号出力の不良など、いくつかのトラブルに見まわれた。その反省をふまえて、今回は、計測器の設置方法やセンサーに改良を加えた。さらに、今回の観測では、前回の観測で港口部において目視観測された水平大規模渦の挙動を明らかにするために、模型ヘリコプターによる空中写真およびビデオによる撮影を行った。以下に、主要な解析結果を述べる。1)流速変動や水位変動のスペクトル解析を行い、港口部内外での長周期変動成分の現れ方を調べた結果、前回観測されたのと同様の、100s程度の周期の長周期変動成分が、特に港口部付近の流速場において有意な大きさで存在することがわかった。2)この、100s程度の周期の流速変動が顕著に現れる原因を探るため、飯岡漁港の湾水振動計算を詳細に行った結果、108s程度のところに、かなり高い増幅率が現れることがわかった。一方、沖波データの解析結果から、入射波自体にも100s程度の周期にスペクトルピークがしばしば現れることが示された。これらのことから、飯岡漁港においては、その幾何形状に起因する増幅機構と入射波自体のスペクトル特性の両方の相乗効果で100s程度の周期の変動が顕著に現れることが明らかになった。3)今回港口部付近に集中して設置した複数の流速計のデータの解析から、港口部に発生する水平大規模渦によるものと思われる流速変動成分を抽出することに成功した。4)この水平大規模渦の実態をより直接探るために行った上記の空中撮影により、港口部での長周期流速変動に伴って、港口部端部より流れが剥離し、時間とともに水平大規模渦に発達していくとともに、底質を巻き上げ濁る様子を映像で記録することに成功した。
外界ストレスに応答するYB1遺伝子の多機能性―翻訳・転写・修復のクロストーク

Y-box binding protein (YB-1)はバクテリアから真核細胞まで進化的に広く保存された核酸結合蛋白である。これまでに我々を含め解明したYB-1の機能としては(1)細胞質では翻訳の制御、(2)核内では転写の亢進、抑制、(3)外界ストレス時のDNA damageにおける修復、(4)細胞質、核内のRNAなどのshuttle蛋白としての機能などの多機能性を有した蛋白であると考えられている。本年度得られた結果としては1)YB1に結合する蛋白を探索した結果10数種類単離できた。2)翻訳に関与するIRP2との結合様式を詳細に検討した結果、YB1とIRP2は直接結合し、鉄存在下で結合が見られる。IRP2による翻訳調節にYB-1が鉄存在下で関わることを初めて明らかにした。3)IRP2のRNAへの結合がYB-1の存在下に阻害されることを見いだした。4)細胞内でIRP2とYB1は鉄存在下で結合する事を見いだした。さらに5)YB1の5'非翻訳領域の翻訳調節機構についてYB1の5'非翻訳領域にYB1自身が結合し翻訳効率を調節していることを明らかにした。Y-box binding protein(YB-1)はバクテリアから真核細胞まで進化的に広く保存された核酸結合蛋白である。これまでに我々を含め解明したYB-1の機能としては(1)細胞質では翻訳の制御、(2)核内では転写亢進、抑制、(3)外界ストレス時のDNA damageにおける修復、(4)細胞質、核内のRNAなどのshuttle蛋白としての機能などの多機能性を有した蛋白であると考えられている。本年度得られた結果としては、1)YB1に結合する蛋白を探索した結果10数種類単離できた。5)YBIの5'非翻訳領域の翻訳調節機構について明らかにしつつある。
磁性ナノテクノロジーによる細胞内局所加温技術の創出

磁性ナノ粒子は磁石に引き寄せられる性質のみならず、MRIにおける造影効果や、交流磁場中で発熱する性質をもつ。本研究では、酸化鉄の10 nmのマグネタイト表面を正電荷脂質膜で修飾することでマグネタイトカチオニックリポソームを作製し、単一細胞が加温可能な技術を開発した。方法論として、合成生物学的アプローチを導入して、レポーター遺伝子の発現を指標に細胞の熱ストレスを解析するシステムを構築した。HSP70B'プロモーターとTet-Offシステムの融合により構築した熱誘導型人工プロモーターは、熱ショックがかかるとポジティブフィードバックシステムにより、EGFPが高発現し続けることで、温熱ストレスを被った履歴のある細胞が可視的に判別できる。細胞に機能性磁性ナノ粒子を取り込ませて、交流磁場を照射すると、培地の温度上昇は見られないが、目的遺伝子が発現した。このことは、細胞内局所における磁性ナノ粒子の発熱によって、HSP70B'プロモーターが駆動したと考えられる。さらに、磁性ナノ粒子を合成生物学的アプローチで細胞内に生産させる方法を開発した。鉄貯蔵タンパク質であるフェリチンの遺伝子をHeLa細胞に導入して磁性ナノ粒子を細胞内で形成させることによって、遺伝子的に細胞を磁気標識することに成功した。フェリチン遺伝子の発現により磁気標識された細胞は、磁気分離が可能となり、また、MRIの造影効果が得られた。さらに、熱誘導型人工プロモーターを導入したHepG2細胞にフェリチン遺伝子を導入して磁場を照射すると、レポーター遺伝子であるEGFPが発現することから、フェリチン導入細胞が交流磁場で発熱することを見いだした。今後、EGFPを治療遺伝子などの目的遺伝子に交換することで、磁場誘導型の遺伝子治療といった医療への応用が可能であると考えられる。29年度が最終年度であるため、記入しない。磁性ナノ粒子は、磁石に引き寄せられる性質のみならず、MRIにおける造影効果や、交流磁場中で発熱する特性をもつ。我々は、酸化鉄の10 nmのマグネタイト粒子の表面を様々なバイオマテリアルで修飾することで、標的細胞指向型の機能性磁性ナノ粒子を開発してきた。この技術により、外部からの交流磁場照射によって、細胞を特異的に加温することに成功している。本研究では、1細胞から組織、さらには生体内局所加温が可能な本技術を用いて、温度生物学における加温制御技術を構築する。H28年度は、申請書に従って、以下の通り研究を進めた。方法論として、合成生物学的アプローチを導入して、レポーター遺伝子の発現を指標に細胞の熱ストレスを解析するシステムの構築を行った。HSP70B'プロモーターとTet-Offシステムの融合により構築した熱誘導型人工プロモーターは、熱ショックがかかるとポジティブフィードバックシステムにより、EGFPが発現し続けることで、温熱ストレスを被った履歴のある細胞が可視的に判別することができた。また、この細胞に機能性磁性ナノ粒子を取り込ませて、交流磁場を照射すると、培地の温度上昇は見られないが、遺伝子発現することが分かった。このことは、細胞内局所における磁性ナノ粒子の発熱によって、HSP70B'プロモーターが駆動することで、EGFPの遺伝子発現がみられたと考えられる。また、磁性ナノ粒子を合成生物学的アプローチで細胞内に生産させる方法を検討した。HeLa細胞にフェリチン遺伝子を導入して磁性ナノ粒子を細胞内で形成させることによって、細胞の磁気分離が可能となり、さらにMRIの造影効果や交流磁場による発熱が得られることを見いだした。合成プロモーターの遺伝子発現プロファイル解析およびフェリチン遺伝子による細胞磁気標識の検討はかなり順調に進んだ。一方で、リアルタイムで磁性ナノ粒子の発熱を観察するための装置開発がやや遅れているため。H29年度も申請書の研究計画に従って、精力的に研究を進める。

1)熱ストレス応答を可視化できる評価系の構築については、現状の遺伝子回路では100%の遺伝子導入細胞で熱ショックによる遺伝子発現が起こらないことも考えられるので、改良型の遺伝子発現システムを搭載した細胞の樹立も同時に行い、遺伝子発現誘導プロファイルを調べる。2)フェリチン遺伝子を用いたオルガネラ特異的発熱技術の開発については、引き続き、単一細胞でのフェリチンを介した熱誘導型遺伝子発現システムの開発を行うとともに、フェリチン遺伝子に核やミトコンドリア移行シグナル配列を導入し、磁場照射によるオルガネラ特異的発熱技術を確立する。3)磁性ナノ粒子の発熱をリアルタイムで観察できるLive cell imagingsystemの構築については、顕微鏡観察下で使用可能な磁場発生装置の開発を続けると共に、培養細胞に交流磁場を照射して発熱させ、細胞内におけるナノ蛍光温度プローブの蛍光顕微鏡画像を捉える技術を確立する。これらの研究を行うことで、磁性ナノテクノロジーによる細胞内局所加温技術を完成させる。29年度が最終年度であるため、記入しない。
筋収縮反応と筋疲労後の回復時間を改善させる新たなストレッチング方法の確立

平成30年度の本実験では,男性アスリート筋疲労プロトコールを確立し,ストレッチングの適切な実施時間を設定した.筋疲労前後の筋硬度の状態を測定する方法についても購入した機器を用いて確認し,測定が可能であることを確認することが出来た.また,ストレッチングプロトコールでの予備実験を実施した.本研究では,まず男性アスリート2名をサイクリックストレッチング群とスタティックストレッチング群に分別し,異なるストレッチング方法の急性効果を超音波で確認し,その後に疲労課題(連続ジャンプ)後の身体パフォーマンステストである跳躍高(Squat Jump,Counter Movement Jump;CMJ)と動的姿勢制御を示すDynamic Postural Stability Index(DPSI)を実施し,その効果を確認した.その結果は,スタティックストレッチングでは特に筋粘弾性が高まり,筋硬度が低くなることが確認できた.また,身体パフォーマンスでは,サイクリックストレッチングは動的姿勢制御であるDPSIの値がスタティックストレッチングに比べて低値を示し,サイクリックストレッチングが動的姿勢制御に効果を示すことが確認できた.昨年度に実施した結果と同様であることが確認できた.また,その後にサイクリックストレッチングとスタティックストレッチングのストレッチング介入をそれぞれ4週間の期間を設けて,実施しているところである.今後は対象者を増やし,サイクリックストレッチング群とスタティックストレッチング群に無作為に分けて,それぞれのストレッチングプログラムを実施し,疲労前後での各種のストレッチングが筋収縮反応や筋硬度に与える効果を示すとともに,このプログラムのスポーツ現場での普及を実施していく予定である.本研究は,疲労課題後のサイクリックストレッチングとスタティックストレッチングの長期実施による筋収縮反応や筋疲労後の回復時間,筋腱の粘弾性と筋硬度,身体パフォーマンスの効果を検証するため,筋収縮反応や筋硬度を測定するための消耗品の購入は必須であった.効果検証するための測定方法やプロトコールの確立に時間を要し,また,測定機器の故障などがあり,実験を実施するスケジュールが多少遅延した.しかしながら,平成30年度は男性アスリートを被験者として,ストレッチングの適切な実施時間を設定し,評価方法を確立することができた.その予備的研究の結果と本研究に関連する先行研究の結果を踏まえて,疲労課題前後でのストレッチング介入方法を決定し,予備実験を実施した.平成31年度はアスリートを対象としたストレッチングをサイクリックストレッチング群(7名),スタティックストレッチング群(7名)を無作為に分けて,ストレッチング介入を4週間実施していく予定である.そして,介入前後で疲労課題後の筋腱の粘弾性や筋硬度,身体パフォーマンステストを実施し,その介入効果判定を実施する.筋収縮反応速度の評価には,筋収縮反応速度測定機器で測定する.筋硬度の評価には,超音波画像診断装置を用いて腓腹筋内側頭の羽状角などを測定する.身体パフォーマンステストは跳躍高や動的バランスを評価することが出来るDynamic Postal stability Indexを実施する.実験終了後にデータ分析を行い,スポーツ関連学会,雑誌での論文発表を行う予定である.平成29年度の本実験において,男性アスリートに筋疲労前後の筋硬度を検証するための評価する機器やそれに関わる消耗品などを購入した.また,筋疲労プロトコールの検証やストレッチングの適切な実施時間を設定するための予備実験を実施し,関連する先行研究の検討によるストレッチングプロトコール,評価方法の検討,ストレッチング介入研究を実施するための対象者の募集を実施した.本研究では,まず男性アスリート5名にサイクリックストレッチングとスタティックストレッチングを実施し,異なるストレッチング方法の急性効果を筋硬度の変化を超音波や筋硬度計を使用して確認した.また,疲労課題(連続ジャンプ)後の身体パフォーマンステストとして,跳躍高(Squat Jump,Counter Movement Jump)を実施し,その効果を確認した.その結果,サイクリックストレッチングではスタティックストレッチングと同様に筋粘弾性が高まり,筋硬度が低くなることが確認できた.また,身体パフォーマンスでは,SSは筋疲労後の跳躍高の改善を示すことが確認できた.これらの結果を踏まえて,サイクリックストレッチングとスタティックストレッチングのストレッチング介入方法を決定した.今後,対象者をサイクリックストレッチング群とスタティックストレッチング群に分けてストレッチングプログラムを実施し,疲労前後での各種のストレッチングにおける筋収縮反応や筋硬度への効果を示すとともに,このプログラムのスポーツ現場での普及を実施していく予定である.本研究は,疲労課題後のCSとSSの長期実施による筋収縮反応や筋疲労後の回復時間,筋腱の粘弾性と筋硬度,身体パフォーマンスの効果を検証するため,筋収縮反応や筋硬度を測定するための機器は必須である.筋の粘弾性と筋硬度を測定するための機器や付属品の納品が予定より遅れた.その結果,全体に多少の遅延が生じている.平成29年度は男性アスリートを被験者として,ストレッチングの適切な実施時間を設定するための予備実験の実施,評価方法を検討した.その予備的研究の結果と本研究に関連する先行研究の結果を踏まえて,疲労課題前後でのストレッチング介入のプロトコールについて検討した.平成30年度の本実験では,男性アスリート筋疲労プロトコールを確立し,ストレッチングの適切な実施時間を設定した.筋疲労前後の筋硬度の状態を測定する方法についても購入した機器を用いて確認し,測定が可能であることを確認することが出来た.また,ストレッチングプロトコールでの予備実験を実施した.本研究では,まず男性アスリート2名をサイクリックストレッチング群とスタティックストレッチング群に分別し,異なるストレッチング方法の急性効果を超音波で確認し,その後に疲労課題(連続ジャンプ)後の身体パフォーマンステストである跳躍高(Squat Jump,Counter Movement Jump;CMJ)と動的姿勢制御を示すDynamic Postural Stability Index(DPSI)を実施し,その効果を確認した.

その結果は,スタティックストレッチングでは特に筋粘弾性が高まり,筋硬度が低くなることが確認できた.また,身体パフォーマンスでは,サイクリックストレッチングは動的姿勢制御であるDPSIの値がスタティックストレッチングに比べて低値を示し,サイクリックストレッチングが動的姿勢制御に効果を示すことが確認できた.昨年度に実施した結果と同様であることが確認できた.また,その後にサイクリックストレッチングとスタティックストレッチングのストレッチング介入をそれぞれ4週間の期間を設けて,実施しているところである.今後は対象者を増やし,サイクリックストレッチング群とスタティックストレッチング群に無作為に分けて,それぞれのストレッチングプログラムを実施し,疲労前後での各種のストレッチングが筋収縮反応や筋硬度に与える効果を示すとともに,このプログラムのスポーツ現場での普及を実施していく予定である.本研究は,疲労課題後のサイクリックストレッチングとスタティックストレッチングの長期実施による筋収縮反応や筋疲労後の回復時間,筋腱の粘弾性と筋硬度,身体パフォーマンスの効果を検証するため,筋収縮反応や筋硬度を測定するための消耗品の購入は必須であった.効果検証するための測定方法やプロトコールの確立に時間を要し,また,測定機器の故障などがあり,実験を実施するスケジュールが多少遅延した.しかしながら,平成30年度は男性アスリートを被験者として,ストレッチングの適切な実施時間を設定し,評価方法を確立することができた.その予備的研究の結果と本研究に関連する先行研究の結果を踏まえて,疲労課題前後でのストレッチング介入方法を決定し,予備実験を実施した.平成30年度はアスリートを対象としたストレッチングをCS群(10名),SS群(10名)に無作為に分けて,ストレッチング介入を実施していく予定である.そして,介入前後で疲労課題後の筋腱の粘弾性や筋硬度,身体パフォーマンステストを実施し,その介入効果判定を実施する.筋収縮反応速度の評価には,筋収縮反応速度測定機器で測定する.筋硬度の評価には,超音波画像診断装置を用いて腓腹筋内側頭の羽状角を測定する.身体パフォーマンステストは跳躍高や動的バランスを評価することが出来るDynamic Postal stability Indexを実施する.実験終了後にデータ分析を行い,スポーツ関連学会,雑誌での論文発表を行う予定である.
Bax様分子を介したカスパーゼ非依存的細胞死機構の遺伝学的解析

染色体欠損系統を用いたDrob-1の過剰発現によるrough eye表現型を増悪あるいは改善するドミナントモデイファイアースクリーニングによってDrob-1によるrough eye表現型をほぼ完全に回復させる遺伝子領域を同定している。この遺伝子領域には18個の遺伝子の存在が予測され、それぞれの遺伝子に関してinverted repeat cDNAを基本にした発現ベクターを構築した。ショウジョウバエ培養細胞S2に、構築したinverted repeat cDNA発現ベクターを導入・発現させS2に内在性の遺伝子をノックダウンし、Drob-1による細胞死が抑制されるかを指標にしたアッセイを全ての予想される遺伝子について行った。しかしDrob-1細胞死に影響のある遺伝子の同定には至らなかった。複眼とS2細胞ではDrob-1のエフェクター分子が異なる可能生もあるため、現在は複眼でそれぞれの遺伝子に対するinverted repeat cDNAを発現するトランスジェニックショウジョウバエを用いた実験系でのスクリーニングを進めている。遺伝子の機能欠損の影響を指標にして行う上記のドミナントモデイファイアースクリーニングに加え、申請者は遺伝子の機能獲得型スクリーニングも同時に進めた。異所発現スクリーニング法を用いて、ショウジョウバエ複眼に未知遺伝子群を強制発現させることにより、Drob-1発現による複眼の表現型を変化させる系統の同定を試みている。申請者はこの方法をショウジョウバエ全ゲノムに展開する事を目標に進めているが現在5000系統のスクリーニングが終了し、Drob-1による複眼の表現型を軽減する系統を1つ同定した。
補体活性を抑制した急性ショック・炎症フリー魚の作出

H30年度は作製した研究ツールのin vitroでの活性評価とゲノム編集による欠損系統の確立を中心に研究を進めた。H29年度に作製した抗ゼブラフィッシュC5a抗体(anti-zfC5a Ab)がzfC5aの活性を抑制できるか検証するため、ゼブラフィッシュ腎臓由来白血球を用いた遊走試験を行ったところ、ザイモサン活性化血清に対し遊走する白血球数がanti-zfC5a Ab投与によって顕著に減少したことから、anti-zfC5a AbのzfC5a活性阻害能が示され、またzfC5aがゼブラフィッシュ血漿中における主要な遊走因子であることが示唆された。一方で溶血活性を指標とした活性化前のzfC5に対する活性化阻害試験では、わずかに阻害がみられたものの遊走活性に比べ抑制率が低く、anti-zfC5a Abは活性化前のzfC5よりも活性化により産生されたzfC5aに対し優先的に阻害活性を発揮することが示された。CRISPR/Cas9法による欠損系統作製では、ターゲット遺伝子であるzfC5a受容体(zfC5aR)またzfC5aR様遺伝子(zfC5aR-like)に対するガイドRNAを作製し、これを顕微注入したゼブラフィッシュ胚への変異導入をHMA法により確認したところ、変異遺伝子を有したモザイク欠損魚が得られたため、現在これらを継代しホモ欠損系統の確立と各種試験に必要な数の欠損魚の確保を目指している。さらにAeromonas hydrophilaを用いた感染試験の条件検討も並行して行っており、anti-zfC5a Abを投与した抑制魚及びzfC5aR欠損魚に対しそれらの感染試験を行い、zfC5aの生体防御、炎症への寄与を検証する予定である。現在までに組換えzfC5a、anti-zfC5a Abの作製を予定通り完了させ、またzfC5aR及びzfC5aR-likeの欠損系統魚の作製も順調に進めている。H31年度にこれらの系統魚由来のzfC5aR欠損白血球を用いたzfC5aに対する遊走能の測定、zfC5a刺激時の遺伝子発現応答、活性酸素産生能を評価し、またこの欠損系統魚、抗体投与によるzfC5a抑制魚を用いた感染試験を行うことで、当初の目的であるzfC5aの魚類生体防御に対する寄与を評価し、zfC5a活性抑制時の炎症反応にどう影響するかを明らかにできると期待される。現在までの研究結果からzfC5aはゼブラフィッシュ生体内で感染局所に白血球を動員する主要な誘引因子として機能していると示唆されており、本研究で作製したzfC5a抑制魚、zfC5aR欠損魚は特に好中球を中心とした自然免疫研究のモデルとして広く活用できると期待される。In vivoの試験として、作製したanti-zfC5aAbをゼブラフィッシュ生体に投与し、C5aの活性を抑制した条件下で感染試験、また抗原を顕微注入し局所への生体内白血球遊走試験を行い、zfC5aの感染応答への寄与を調べる。またzfC5aR及びzfC5aR-like欠損魚のからそれぞれ白血球を回収し、これら2種の受容体のどちらがzfC5aの認識に関与するか、あるいはその活性化シグナルにどのような差異があるかをin vitroで検証する。具体的にはzfC5aへの遊走活性、zfC5a刺激による遺伝子発現の変動と活性酸素産生能、貪食活性、殺菌能などを指標とする。またこれらの欠損系統魚に対してはin vivoの試験として同様に感染試験を行い、それぞれの受容体の生体防御への寄与を明らかとする。このときの各種免疫組織での遺伝子発現応答をRNAseqまたはマイクロアレイで解析し、zfC5aの影響による炎症関連遺伝子の発現変動を検出、zfC5aの炎症誘導メカニズムの全容解明を目指す。H29年度は主に魚類の補体成分C5aの機能を亢進または抑制する研究ツールの準備として、大腸菌を宿主とした組換えゼブラフィッシュC5a(zfC5a)および抗zfC5a抗体の作製と機能の確認を行った。当初6xHisタグを融合させた完全長のzfC5aを発現させ、分子量約140,000の可溶性のタンパクとして得ることが出来たが、活性測定試験の結果から正しい立体構造を取っていない可能性が考えられたため、GSTタグとの融合体として新たに組換えタンパクを作製し、これを大腸菌内で発現させた結果、分子量約340,000の組換えzfC5aを得ることができた。この組換えzC5aをゼブラフィッシュ腎臓由来白血球に対し反応させたところ、ケモタキシスチャンバー下層への細胞の遊走がみられ、組換えタンパクがアナフィラトキシンとしての活性を有していることが示唆された。また作製した組換えzfC5aを抗原とし、ウサギに免疫することで抗zfC5aウサギ抗血清を作製した。得られた抗血清をウエスタンブロット法によりザイモサンで活性化(C5aフラグメントの産生)させたゼブラフィッシュ血清に対し反応させたところ、分子量約10,000のゼブラフィッシュC5aのサイズと一致するバンドが検出され、抗血清のゼブラフィッシュC5aへの反応性が示唆された。更にC5aレセプター(C5aR)欠損ゼブラフィッシュ系統を作製する準備段階として、CRISPR/Cas9システムの手法を確立し、チロシナーゼをターゲット遺伝子とした予備試験を行い、欠損魚を得ることができた。