hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
アミノ酸酸化酵素における分子集合形成と機能発現に関する物理化学的研究

またこのpH範囲において、結合に関与する解離基はただ1つのみであり、この解離基はリガンドにおけるチッソ原子(プロトンの脱着)である事が判明した。そしてプロトンの付加したリガンド(カチオン型)のみが還元型DAOと結合でき、プロトンの解離したもの(ニュートラル型)は結合できない。これは、酸化型DAOにはニュートラル型リガンドも結合しうるという事実(Massey等による)と異った知見であり以下の分子集合形成機構を強く示唆するものである。即、酸化型DAOにおいては活性中心に含まれるフラビンは電気的に中性であり、還元型DAOのフラビンは電気的に陰性である。還元型DAOにおいてはフラビン分子の負電荷とリガンドの正電荷との間の静電相互作用が分子集合形成に重要な機構を与えているものと思われる。なお本年度はDAOの構造をNMR法により研究する前段階としてアルブミンの分子構造についても少々の研究を行っている。フラビン酵素は三つの酸化還元状態で安定して存在できる.即,酸化型,セミキノン型,完全還元型の三状態である.このことがフラビン酵素の多機能性の一因となっている.セミキノン型はさらにアニオン型とカチオン型の二状態をとりうるが,オキシダーゼ群として分類されるフラビン酵素はすべてアニオン型セミキノンの状態となる.ここではDーアミノ酸酸化酵素を用いてアニオン型セミキノンの安定化機構について検討した.本研究はまたフラビンー蛋白相互作用および酵素ーリガント相互作用の機構についても明らかにするものである.結果は以下にまとめられる.(1)既に明らかにされているように,本酵素を還元するとアニオン型セミキノンが発生する.さらに還元を続けると完全還元型となる.(2)安息香酸存在下で本酵素を光還元するとセミキノンの形成はみられず完全還元型へと変化する.この場合安息香酸には正電荷が存在しない事が重要である.この結果は既に報告されている電気化学的還元による結果と一致する.(3)ピコリン酸,イミノ酸の存在下で本酵素を還元するとアニオン型セミキノンがが出現し,これは完全還元型へは移行しない.共鳴ラマン分光法により,セミキノンに結合しているこれらのリガントはチッソにプロトンの付加したカチオン型であり,さらにこれらのリガントはフラビンのC(4a)ーN(5)の位置と強く相互作用している事が結論された.以上よりフラビン近傍での正電荷をもった分子の存在が,負電荷をもったアニオン型セミキノンを安定化していると考えられる.従ってリガントの存在しない時にはアポ蛋白の正電荷がフラビン近傍に存在しているはずである.Dーアミノ酸酸化酵素(DAO)のアニオン型セミキノンにピコリン酸は1:1で結合し、長波長領域に電荷移動吸収帯を生ずる。解離定数は25°CpH7.0の条件で30μMであった。解離定数のpH依存性からこの結合にはプロトン1コが関与することが判明した。また結合するのはピコリン酸の窒素のところがプロトン付加したカチオン型のものであり、ニュートラル型のものは結合しない事が示唆された。ピルビン酸とアミン類を共存させて酸化型DAOをジチオナイトで還元すると、ピコリン酸の場合と同様の吸収スペクトルが得られた。
戦時中国における刑事裁判の実態

中国・台湾各地の公文書館に所蔵される刑事訴訟関連文書を用いて、戦時(1930年代後半1940年代前半)の中国における裁判の実態を明らかにする。本研究は、刑事事件の発生から裁判の終結に至るまでの全体像を描出するために、統計や判例集など既存の史料を徹底的に読みこむと同時に、新たに公開・整理された一次史料を大いに利用することで、日々の刑事事件の処理状況について総合的な分析を行うことを目指す。
直接数値シミュレーションデータのウェーブレット解析

第一段階として、遷移期および発達した乱流状態にあるチャネル流・混合層流の直接数値シミュレーション(DNS)データ・ベースを生成した。計算にはフーリエ級数展開によるスペクトル法を、チェビシェフ多項式展開または高次精度差分法と併用した.次に、正規直交型LMB(Lemarie,Meyer and Battle)ウェーブレット基底関数によるウェーブレット変換コードを作成し、高速フーリエ変換を併用して畳み込み積分計算の高速化を図った.第二段階では、DNSデータにウェーブレット変換を施すことにより、乱流中に局所・間欠的に存在する様々なスケールの構造の空間局所的な分離を、ウェーブレット展開係数中の各オーダーの係数の抽出・除去により行い、乱流エネルギー生成機構との相関の高い構造の解明を行った.ここでは、各方向に128の格子点を用いたDNSデータの一様な二方向に変換を施し、最小のスケール(m=1)から最大のスケール(m=7)までの分離を行った.その結果、いずれの流れ場においても、大きなスケール(m=4^5)のエネルギー生成に関与する秩序的な構造が、小さなスケール(m=1,2)まで自己相似的に存在することがわかった。乱流の数値解析手法の一つであるラージ・エディ・シミュレーション(LES)法では、全スケールを格子間隔以上(Grid scale,GS)とそれ以下(Sub-grid scale,SGS)に分け、粗視化した変動のモデルとしては、GSとSGS間の明確なスケールの分離を仮定した渦粘性係数モデルと、最小のGSと最大のSGSの相似性に基づいたスケール相似則モデルが用いられている.本ウェーブレット解析の結果は、LESでは渦粘性モデルの精度は低い事、また、スケール相似則モデルの精度は高く、格子間隔近傍の相似性をSGSのかなり小スケールまで拡張できる事を示した.さらに、エネルギー伝達関数のウェーブレット解析を行い、平均としてはエネルギーはGSからSGSに伝達されるものの、SGSからGSへの逆カスケードも無視できない大きさをもっている事を示した.第一段階として、遷移期および発達した乱流状態にあるチャネル流・混合層流の直接数値シミュレーション(DNS)データ・ベースを生成した。乱流の数値解析手法の一つであるラージ・エディ・シミュレーション(LES)法では、全スケールを格子間隔以上(Grid scale,GS)とそれ以下(Sub-grid scale,SGS)に分け、粗視化した変動のモデルとしては、GSとSGS間の明確なスケールの分離を仮定した渦粘性係数モデルと、最小のGSと最大のSGSの相似性に基づいたスケール相似則モデルが用いられている.本ウェーブレット解析の結果は、LESでは渦粘性モデルの精度は低い事、また、スケール相似則モデルの精度は高く、格子間隔近傍の相似性をSGSのかなり小スケールまで拡張できる事を示した.さらに、エネルギー伝達関数のウェーブレット解析を行い、平均としてはエネルギーはGSからSGSに伝達されるものの、SGSからGSへの逆カスケードも無視できない大きさをもっている事を示した.
細胞極性形成を担う蛋白質間相互作用の研究

Par6、atypical protein kinase C(aPKC)、Par3からなる3者複合体(Par complex)は、線虫から哺乳類に至る種々の細胞の極性形成に必要な蛋白質複合体である。Par6のCRIB-PDZ領域には、低分子量G蛋白質が結合し、細胞極性形成に必須の役割を果たすと考えられているが、Par6と低分子量G蛋白質との結合がどのように制御され、細胞極性形成に至るのかはよくわかっていない。本研究の目的は、我々が見出した蛋白質Par6BPを中心に、細胞極性形成の分子メカニズムを解明することである。平成21年度は、平成20年度に引き続きPar6BPの上皮細胞極性形成における役割の解析を、上皮細胞のモデルとして用いられる、イヌ腎上皮細胞由来のMDCK細胞を用いて行った。MDCK細胞を細胞外基質内で培養する3次元培養系では、この細胞はcystと呼ばれる球状の細胞塊を形成する。Cystはその内部に空洞、すなわちlumenを持ち、このlumenを一層の細胞のapical membraneが取り囲む。正常な細胞からなるcystはlumenを1つしか持たない。一方、Papr6BPをknockdownした細胞では複数のlumenを持つcystを形成した。さらにこのphenotypeは再びPar6BPを発現させるとレスキューされることから、Par6BPは3次元培養系において上皮細胞の極性形成に必須の役割を果たすことが明らかとなった。Par6、atypical protein kinase C(aPKC)、Par3からなる3者複合体(Par complex)は、線虫から哺乳類に至る種々の細胞の極性形成に必須な蛋白質複合体である。Par6のCRIB-PDZ領域には、低分子量G蛋白質が結合し、細胞極性形成に必須の役割を果たすと考えられているが、Par6とこれらの低分子量G蛋白質との結合がどのように制御され、細胞極性形成に至るのかはよくわかっていない。本研究の目的は、我々が単離した蛋白質Par6BPを中心に、極性形成の分子メカニズムを解明することである。平成19年度は以下の結果を得た。COS7細胞を用いた免疫沈降実験により、Par6とPar6BPが共沈すること、両者のリコンビナント蛋白質を用いたpull-down assayから、Par6BPはPar6のCRIB-PDZ領域に直接結合することを明らかにした。さらに、Par6BP、Par6と共に、active formの低分子量G蛋白質をCOS7細胞で過剰発現させ、免疫沈降を行ったところ、Par6BPは、Par6と低分子量G蛋白質の結合を阻害することがわかった。このように、Par6BPがPar6のCRIB-PDZ領域に結合することでPar complexと低分子量G蛋白質の結合を阻害する負の制御因子であることが示唆された。現在はPar6BPの上皮細胞極性形成における役割の解析を、上皮細胞のモデルとして用いられる、イヌ腎上皮細胞由来のMDCK細胞を用いて進めている。本研究の目的は、我々が見出した蛋白質Par6BPを中心に、細胞極陛形成の分子メカニズムを解明することである。平成20年度は、Par6BPの上皮細胞極性形成における役割の解析を、上皮細胞のモデルとして用いられる、イヌ腎上皮細胞由来のMDCK細胞を用いて行った。MDCK細胞の極性形成はtight junction(TJ)形成を指標として観察される。このTJ形成の観察には、TJマーカーであるZO-1の細胞染色法による観察、およびTJ形成に伴う電気抵抗値の変化を測定するtransepithelial electrical resistance(TER)測定法の二つの方法がよく用いられる。そこでこの2つの方法を用いて、Par6BPをknockdownしたMDCK細胞では極性形成に影響が出るかどうかを観察した。Par6BPをknockdownするMDCK細胞はcontrolのMDCK細胞に比べ、ZO-1の細胞染色法によりTJ形成が明らかに遅れることがわかった。また、Par6BPをknockdownするMDCK細胞はcontrolのMDCK細胞に比べ、TER値の立ち上がりが遅れ、さらにpeak値も低かった。これら二つの結果から、Par6BPはMDCK細胞の極性形成に必要であることがわかった。

Cystはその内部に空洞、すなわちlumenを持ち、このlumenを一層の細胞のapical membraneが取り囲む。正常な細胞からなるcystはlumenを1つしか持たない。一方、Papr6BPをknockdownした細胞では複数のlumenを持つcystを形成した。さらにこのphenotypeは再びPar6BPを発現させるとレスキューされることから、Par6BPは3次元培養系において上皮細胞の極性形成に必須の役割を果たすことが明らかとなった。
20世紀東南アジア大陸部の河川・海域世界―メコンデルタから越境する生存ルート

雑誌論文「脱植民地化過程のメコンデルタにおけるクメール人の言語・仏教・帰属」『アジア・アフリカ地域研究』、また単著『戦争と難民ーメコンデルタ多民族社会のオーラル・ヒストリー』を刊行した。また、台湾で行われた東南アジア学会(2016 Annual Conference on Southeast Asian Studies in Taiwan, 2016年9月22日、23日)において、最優秀論文賞を獲得した。さらに、東南アジア研究所主催のゾミア研究会の企画・運営に携わり、国内外の研究者を招聘して計12回の研究会(うち国際ワークショップは4回)を開催した。本研究は、20世紀に長期的な戦争を経験したベトナム、カンボジアの人々が、いかなる人間関係に頼り生き残りを図っていたのかという問題について、東南アジア大陸部各国をつなぐメコン河流域とシャム湾沿岸部という空間に着目して考察するものである。本研究を通じて、近代国民国家が膨張した20世紀でも、動乱期には、国家体制を掘り崩す政治権力の空白地帯が各地に拡がり、人々の生存ルートが生成されていったことを明らかにする。平成27年度の成果は、以下3点挙げられる。第1に、本研究の基盤となった報告者の博士論文『統治と生存の社会史ーベトナム南部メコンデルタの戦争と社会主義』が京都大学アジア・アフリカ地域研究科の審査で受理され、報告者は2015年7月に博士号を取得した。博士論文では、メコンデルタのソクチャン省フータン村に焦点を当て、そこの住民達が、20世紀後半の戦争や社会主義による政治的混乱のなかで、国家政策にどのような対処をし、危機的な状況のなかでいかに生存を確保しようとしていたのかを解明した。第2に、博士論文の前半部分をさらに発展させるために執筆した「脱植民地化過程のメコンデルタにおけるクメール人の言語・仏教・帰属」が、『アジア・アフリカ地域研究』15(1) pp.20-48に掲載された。この論文では、フランス植民地時代が終焉した20世紀半ばに、メコンデルタのクメール人が、ベトナムとカンボジアという2つの国家とどのように関わらざるを得なくなったのかついて分析した。第3に、本研究の基本的な枠組みを、『越境する「弱者たち」の語りーメコンデルタ多民族社会の戦争と現在』としてまとめ、2016年10月にブックレットという形式で刊行する予定である。本書では、19世紀末から21世紀までという長期的な時間軸のなかで、メコンデルタで生じてきた広域的な人間の移動と地域社会の再編をめぐる人々の語りを分析した。本研究は、ベトナム、カンボジア、さらにタイという広域的な空間を対象とする研究であり、多くの調査研究時間を必要とする。2015年度において、報告者は、7月まで本研究の基盤となる博士論文の執筆に追われ、本研究に関連する調査研究活動を十分に遂行することができなかった。報告者は、2015年11月にメコンデルタ沿岸部ソクチャン省フータン村、ベトナムーカンボジア国境付近のチャウドック、チトン県、ティンビエン県、また2016年1月に再度フータン村でフィールドワークを行った。この調査では、1970年代後半に、ベトナムーカンボジア国境付近で生じていた紛争や、それが地域社会にもたらした影響、また華僑・華人商人の国外脱出に関する貴重な情報を得ることができた。しかしながら、それらの情報はまだ断片的であり、今後はより多くの地域と住民達を対象にインタビュー調査を行う必要がある。また、当初2015年度中に行う予定であったカンボジアでの現地調査はまだ実現できていない。文献史料調査については、ホーチミン市第二公文書において、フランス植民地時代や南ベトナム政府時代のメコンデルタにおける政治社会状況に関する史料を入手することができたが、それら史料によって得られる情報は、ベトナムのものに限定されていた。これらの調査で得られたデータは、「研究実績の概要」で挙げた投稿論文やブックレットで発表したものの、全国規模の学会誌や、著名な国際学会でこれらの成果をまだ発表していない。本年度は、全体的に大きな成果を得られたと考えられる。2研究成果も積極的に刊行し、風響社ブックレットシリーズから、2016年11月に単著『戦争と難民ーメコンデルタ多民族社会のオーラル・ヒストリー』を出版した。同著は、メコンデルタ沿岸部の多民族的な一地域社会において戦争や貧困から人の移動が起こり、民族の異なる人々の接触から新たな社会関係が築かれていく過程を論じた。3京都大学東南アジア研究所に行ってきたゾミア研究会の企画・運営に携わり、国内外の研究者を招聘して計12回の研究会(うち国際ワークショップは4回)を開催した。そのうち、計2回は、「水のゾミア」という企画であったが、この企画では、河川や海域が国家の政治的影響力の弱い場所としてどのように存在していたのかを議論した。

今後の推進方策としては、20世紀の動乱期に生じていた国境を越えた範囲での人々の移動についてさらに考察を深めるため、本研究の当初の予定どおり、カンボジアやタイにまで調査範囲を広げていく予定である。調査予定では、カンボジアの国境付近のタケオ州やラタナキリ州、また首都プノンペンやカンボジア第2の都市バッタンバン、さらにかつて難民キャンプが設置されていたタイのサケオ県などにおいてフィールドワークを実施し、ベトナムからカンボジア、タイまで、メコン河流域で生成されていた非合法ルートを利用して逃亡を図っていたランドピープルの人々について情報を収集する。さらには、ベトナムにおいてシャム湾に面した港町ラックザーやハーティエン、カンボジアの港町コンポンソムなどにおいてもフィールドワークを行い、海域ルートの全体的な状況を明らかにし、ボートピープルと呼ばれた人々が、いかなる人間関係に頼ってどのように移動していたのかについて考察する。日本国内では、文献史料と突き合わせながら、以上の調査で得られた情報について分析を進める。これまでは主にベトナム語史料を分析してきたが、2016年度には、クメール語やフランス語の史料の分析を進め、ベトナム、カンボジア両国で起こっていた人間の移動という現象を、包括的に捉えることを試みる。以上の調査研究で得られた成果は、2016年12月の東南アジア学会において報告する予定である。さらには、学会での意見やコメント、批判を踏まえ、2017年13月の間に、英文学術誌Southeast Asian Studiesにおいて発表する。28年度が最終年度であるため、記入しない。地域研究、社会史、政治史28年度が最終年度であるため、記入しない。
海中微生物探査のためのマイクロ現場分析システムの開発

本研究では,現場型微生物遺伝子解析装置に装置について,主にマイクロ加工技術を応用して研究開発を行った.その結果,深海などの極限環境の現場でも用いることが可能で,小型・軽量な装置,IISA-Gene(Integrated In-situ Analyzer-Gene)の開発に成功した.IISA-Geneを現場運用可能な装置として完成させるために以下の開発・評価を行った.1)PDMS及びガラスを材料として主にPCR法を用いた遺伝子解析が可能なマイクロ流路チップ及び温度制御チップを設計・製作した.2)PDMS表面にたいして界面活性剤等を用いた表面処理を行うことによって,酵素等の吸着を抑制し,反応の効率を向上できた.3)環境中の微生物からDNAを精製する機構について,カオトロピック試薬との混合よる細胞破砕,及び流路中に充填されたガラスビーズによるDNAの精製法を採用し,IISA-Geneへの集積化を行った.4)蛍光色素を用いたPCR産物の検出を行うために光ファイバ,光源及び光検出器機構の製作・評価を行い,PCR産物の検出が可能であることを確認した.5)小型のポンプ及びバルブからなる送液系を構築し,マイクロチップと組み合わせることで現場運用が可能な集積化システムを構築した.6)ヒータ・ポンプ・バルブ等の制御を行うための電源・制御系,それを収納する耐圧容器及びIISA-Gene本体の油漬容器について設計・製作を行った.7)深海の極限環境を模擬するための「深海環境模擬装置」を構築した.実際にそれを用いて水深3000m相当の高圧力条件下で遺伝子解析が可能であることを確認した.IISA-Geneを実際の海洋環境で稼働するために独立行政法人海洋研究開発機構の海洋調査船及び無人探査機を用いた調査航海を実施し,石垣島沖海底の熱水噴出地帯において現場運用によるデータを得ることができた.本研究では,現場型微生物遺伝子解析装置に装置について,主にマイクロ加工技術を応用して研究開発を行った.その結果,深海などの極限環境の現場でも用いることが可能で,小型・軽量な装置,IISA-Gene(Integrated In-situ Analyzer-Gene)の開発に成功した.IISA-Geneを現場運用可能な装置として完成させるために以下の開発・評価を行った.1)PDMS及びガラスを材料として主にPCR法を用いた遺伝子解析が可能なマイクロ流路チップ及び温度制御チップを設計・製作した.2)PDMS表面にたいして界面活性剤等を用いた表面処理を行うことによって,酵素等の吸着を抑制し,反応の効率を向上できた.3)環境中の微生物からDNAを精製する機構について,カオトロピック試薬との混合よる細胞破砕,及び流路中に充填されたガラスビーズによるDNAの精製法を採用し,IISA-Geneへの集積化を行った.4)蛍光色素を用いたPCR産物の検出を行うために光ファイバ,光源及び光検出器機構の製作・評価を行い,PCR産物の検出が可能であることを確認した.5)小型のポンプ及びバルブからなる送液系を構築し,マイクロチップと組み合わせることで現場運用が可能な集積化システムを構築した.6)ヒータ・ポンプ・バルブ等の制御を行うための電源・制御系,それを収納する耐圧容器及びIISA-Gene本体の油漬容器について設計・製作を行った.7)深海の極限環境を模擬するための「深海環境模擬装置」を構築した.実際にそれを用いて水深3000m相当の高圧力条件下で遺伝子解析が可能であることを確認した.IISA-Geneを実際の海洋環境で稼働するために独立行政法人海洋研究開発機構の海洋調査船及び無人探査機を用いた調査航海を実施し,石垣島沖海底の熱水噴出地帯において現場運用によるデータを得ることができた.平成14年度の研究において、これまで開発を進めてきた環境微生物遺伝子解析用マイクロ分析チップを用いてPCR法により遺伝子増幅を行い、環境微生物のモデルとして用いた大腸菌のゲノムDNAから約1500塩基対の遺伝子断片を高効率かつ連続的に増幅することに成功した。また、送液のためのポンプ・増幅されたDMの検出部分も含めた小型分析装置としての全体的な構造・仕様を決定するに至った。上述の環境微生物遺伝子解析用マイクロ分析チップを、深海・地底などの極限環境下で使用することを想定した性能評価を行うために、深海環境模擬装置を導入した。当初の計画では深海における熱水環境を再現するためには、10000m相当水圧(1000気圧)、かつ、装置内水温範囲2°C250°Cが模擬できるものを構想していた。しかし、装置総重量および実験上の安全性を考慮し、6000m相当水圧(600気圧)までを実現でき、さらに装置内水温については室温から2°Cまで調節することができるものとした。この仕様では、熱水環境の再現は困難であるが、それ以外の深海環境をほぼ再現出来ると考えられる。また、高圧部外に設置した超高感度CCDカメラ及び対物レンズからなる光学観察系よって、極限条件下におけるマイクロ分析チップの状態及び反応の評価が可能な仕様となった。また、遺伝子解析の前段階として必要不可欠な要素である、細胞溶解・遺伝子抽出を行うマイクロ分析チップの開発、細胞溶解法の検討などにもあらたに着手した。本年度の研究において現場型微生物遺伝子解析装置,その中でも特に遺伝子解析に必要不可欠な反応操作であるPCR(Polymerase Chain Reaction)を行う部分について,主にマイクロ加工技術を応用しながら研究開発を行った.その結果実際に深海などの極限環境の現場でも十分に用いることが可能なほど小型・軽量且つ省電力な装置の開発に成功した.

遺伝子の増幅効率に関しても,適当な材料表面処理法の確立等によって向上することが出来た.またその開発の過程でマイクロ加工技術を応用して製作した装置を現場応用するために必要なシステム構成に関するノウハウを多く得ることが出来た.さらに深海などの高圧・低温の環境を模擬するための高圧実験水槽システムを構築し,実際にそれを用いて30MPa(水深3000m相当)の高圧力条件下でPCRが可能であることを確認することが出来た,この様に高圧力下でPCRの様な複雑な生化学反応操作が可能であることを示すことが出来たことが高い評価を受けている.また,装置の制御系に関しても小型の制御コンピュータを導入することによって現場で遺伝子解析装置を稼働させることの出来るシステムも構成することが出来た.これによって現場で微生物の遺伝子解析を行うための基盤技術が一通り確立したといえ,最終的に現場遺伝子解析を行うための装置のプロトタイプを完成することが出来た.尚,これらの発表に関してはそれぞれの会議の予稿集に掲載され、また海外論文誌においても掲載が決定している.また,研究の方針について特に海洋科学技術センターと連絡を取りながら継続して進行中である.本年度は前年度までに製作した現場型微生物遺伝子解析装置(名称をIISA-Gene : Integrated In Situ Analyzer-Geneとした)のプロトタイプについて,高圧実験水槽システムを使用してその性能評価を行った.また,実際に深海などの現場で分析を行うことを目的としてマイクロプロセッサによるヒータ・ポンプ・バルブ等の制御を行うための電装系及びそれを収納する耐圧容器について設計・製作を行った.PCR等の反応を行う部分について油漬構造とするための容器の設計・製作も同時に行った.また,環境中に生息する微生物の遺伝子解析を行うために,同装置内でカオトロピック試薬及びガラスビーズを用いて微生物細胞から遺伝子(DNA)を精製する機構についても集積化を行った.さらに蛍光色素を用いた光学的な検出を行うために光ファイバ,耐水圧光ファイバコネクタ及び光電子増倍管からなる検出機構についても製作・評価を行った後に集積化することに成功した.これにより海水などの環境サンプルの導入からPCRによる遺伝子断片の増幅,蛍光による遺伝子断片検出までを単一の小型装置で自動的に行うことが可能となった.尚,製作したIISA-
マツのクロロプラストmRNAにおけるRNAエディティング部位の決定

高等植物葉緑体内では、転写直後の前駆体RNA上の一部のCがRNAエディティングによりUに変換され、さらにプロセシングやスプライシングを経て成熟RNAとなる。我々は全塩基配列を解析した裸子植物クロマツの葉緑体ゲノム(119,707bp)に存在する62種類の蛋白質遺伝子および葉緑体DNAで保存性の高いORFについて、RNAエディティング予想部位の検証を進めた。<方法>クロマツ葉緑体のRNAse処理全DNAおよびDNAseI処理全をテンプレートとするcDNAを調製し、目的部位に対するプライマーセットを設計合成してPCR法でそれぞれのDNAを増幅した。得られたDNAを必要な場合はクローン化し、両者のシーケンスを行って比較解析を行った。<結果>26箇所でRNAエディティングを確認した。これらの中には、以下のような新たなエディティングタイプが含まれている。1)ACG->AUGエディティングによる新たなORF形成を確認した。この事例は、DNA配列からは直接的には確認され得ないORFが存在することを示すものである。2)CAA->UAAエディティングによる終止コドン形成(2例)を確認した。この事例も、DNA配列から直接的な確認の出来ない読み枠の形成に関与するものである。3)GCA->GUA,CCC->UCC,ACU->AUU,CUG->UUGというエディティングタイプを確認した。これらは、従来報告の無いRNAエディティング事例である。確認されたエディティング部位周囲におけるコンセンサス配列の検出を試みて、アライメントを行ったが充分な相同性は認められず、エディティング部位の検出機構については手掛かりが得られなかった。<考察>開始コドンや終止コドンの形成に関与するRNAエディティング例を確認出来たことによって、葉緑体の遺伝情報発現系におけるRNAエディティングの役割が、従来認められていたものよりも幅広いものであることが示された。これらの事例が他の葉緑体においても確認出来るかどうかが更に検討されるべきであろう。全塩基配列を確定したクロマツ葉緑体DNAの遺伝子について、RNAエディティングが予測された297箇所の内、平成7年度内には、atpA,atpF,petB(exon2),petD(exon2),petG,psaB,psbA,psbB,psbE,psbL,rpl2,rps14,ycf7(ORF62b),ORF320の14の遺伝子領域の49箇所についてエディティングの有無を検索した。これらの検索には、発芽後2週間のクロマツ幼葉から抽出した葉緑体DNAと、DNaseで処理した全RNAテンプレートとしたcDNAとを調製し、検索部位に対応する断片をPCR法によって増幅、精製した後、直接あるいはクローン化後シーケンスして塩基配列の比較を行った。検索した部位の内26箇所についてRNAエディティングの存在を確認した。これらのエディティングは、全てCからUへの転換であった。これは、従来被子植物葉緑体でのみ報告されてきたRNAエディティングの存在を、裸子植物のものでも証明したものであるが、とりわけORF62bの例では、開始コドンと終止コドンを形成するエディティングが共に存在しており、これらのエディティングの結果、他の葉緑体ゲノムで保存性の高いycf7(ORF31)と極めて相同性の高い産物の形成が予測される。

高等植物葉緑体内では、転写直後の前躯体RNA上の一部のCがANAエディティングによりUに変換され、さらにプロセシングやスプライシングを経て成熟RNAとなる。我々は全塩基配列を解析した裸子植物クロマツの葉緑体ゲノム(119,700bp)に存在する62種類の蛋白質遺伝子および葉緑体DNAで保存性の高いORFについて、RNAエディティング予想部位の検証を進めた。<方法>クロマツ葉緑体のRNAse処理全DNAおよびDNAseI処理全RNAをテンプレートとするcDNAを調製し、目的部位に対するプライマーセットを設計合成してPC法でそれぞれのDNAを増幅した。得られたDNAを必要な場合はクローン化し、両者のシーケンスを行って比較解析を行った。<結果>26箇所でRNAエディティングを確認した。これらの中には、以下のような新たなエディティングタイプが含まれている。1)ACG->AUGエディティングによる新たなORF形成を確認した。この事例は、DNA配列からは直接的には確認され得ないORFが存在することを示すものである。2)CAA->UAAエディティングによる終止コドン形成(2例)を確認した。この事例も、DNA配列から直接的な確認の出来ない読み枠の形成に関与するものである。3)GCA->GUA,CCC->UCC,ACU->AUU,CUG->UUGというエディティングタイプを確認した。これらは、従来報告の無いRNAエディティング事例である。確認されたエディティング部位周囲におけるコンセンサス配列の検出を試みて、アライメントを行ったが充分な相同性は認められず、エディティング部位の検出機構については手掛かりが得られなかった。<考察>開始コドンや終止コドンの形成に関与するRNAエディティング例を確認出来たことによって、葉緑体の遺伝情報発現系におけるRNAエディティングの役割が、従来認められていたものよりも幅広いものであることが示された。これらの事例が他の葉緑体においても確認出来るかどうかが更に検討されるべきであろう。
ＳＶＭを用いた危険なシステムコールに着目した異常検知システムの開発

本研究では、Windows系のプログラム検知方法について危険なシステムコールに着目しルールベースによる検知とSVMによる識別を組み合わせることで検知が可能となるシステムの開発を行い検知の可能性を確認した。また、SVMを用いてプログラムの特徴に着目した不正プログラム検知手法をWHIPSへ実装し、99.4%の高い検知率で検知が行えることを確認した。さらに、SVMによる不正プログラム検知手法を応用しWebアプリケーションに対する攻撃を検知するためのWAFをWebサーバのモジュールとして実装し有効性について検討した。Windows系の不正プログラム検知方法について危険なシステムコールに着目したシステムの開発を行った。ルールベースによる検知とSVMによる識別を組み合わせることで、検知ができることを確認した。また、SVMを用いてプログラムの特徴に着目した不正プログラム検知手法にWHIPSへの実装を行い、99.4%の高い検知率で検知が行えることを確認し、危険なシステムコールに着目した振る舞いによる検知手法を組み合わせたシステムについて実装を行っている。現在、OSを問わずにシステムコールに着目して検知を行えるようにするため、セキュア仮想モニタ(VMM)であるBitVisorを改良しゲストOSのWindowsが発行したシステムコール履歴を取得することが出来るようにした。また、BitVisorにSVMを実装することに成功し、今後、本研究で行っている検知手法をVMMで行うことでOSを問わない不正プログラム検知システムの実現を目指す。WindowsおよびUNIXにおいて上記のシステムによる不正プログラム検知が可能になることで、ウイルスやワーム等の不正なプログラムによるシステムへの感染を防ぐことが可能になり、より安全なコンピュータ環境の実現に寄与できるものと考える。また、SVMによる不正プログラム検知手法を応用し、Webアプリケーションに対する攻撃を検知するためのWeb Application Firewall(WAF)をWebサーバのモジュールとして実装し有効性について検討した。学習データによる検知率は100%となり、未知の評価データについても99.69%と高い検知率を確認することができた。Windows系の不正プログラム検知方法について危険なシステムコールに着目しルールベースによる検知とSVMによる識別を組み合わせることで検知が可能となるシステムの開発を行い検知の可能性を確認した。さらに、二つの手法を組み合わせるた不正プログラム検知システムを開発中である。また、Mac OS X上において実装するためにシステムコールの調査と不正なプログラムによる危険なシステムコールの分類を行いMac OS Xにおけるカーネル拡張によるプログラムの開発について設計を行ったが、完成までは至らなかった。また、OSを問わずにシステムコールに着目して検知を行えるようにするため、セキュア仮想モニタ(VMM)であるBitVisorを改良しゲストOSのWindowsが発行したシステムコール履歴を取得することが出来るようにし、BitVisorにSVMを実装することでOSを問わない不正プログラム検知システムの実現の可能性を確認した。これにより、WindowsおよびUNIXにおいて上記のシステムによる不正プログラム検知が可能になることで、ウイルスやワーム等の不正なプログラムによるシステムへの感染を防ぐことが可能になり、より安全なコンピュータ環境の実現に寄与できるものと考える。しかし、開発したシステムについては、現時点で実用化できる段階まで完成度が高くないことから、さらに完成度を高める必要がある。また、SVMを用いてプログラムの特徴に着目した不正プログラム検知手法について提案し、その有効性を確認するためのシミュレーション実験を行っている。プログラムの特徴に着目した検知手法と危険なシステムコールに着目した振る舞いによる検知手法を組み合わせることで、さらに高い検知率が期待できる。次に、Windows系で有効であることが示された手法をMac OS X上において実装するためにMac OS Xにおけるシステムコールの調査と、不正なプログラムによる危険なシステムコールの分類を行った。現在、Mac OS Xにおけるカーネル拡張によるプログラムの開発について調査と試作を行っている。Windows系およびMac OS Xにおいて上記のシステムによる不正プログラム検知が可能になることで、ウイルスやワーム等の不正なプログラムによるシステムへの感染を防ぐことが可能になり、より安全なコンピュータ環境の実現に寄与できるものと考える。また、SVMによる不正プログラム検知手法を応用し、Webアプリケーションにおいて発生するクロスサイトスクリプティングやSQLインジェクション攻撃を検知するためのWeb Application Firewall(WAF)への実装を提案し、実際にWebサーバのモジュールとして実装し有効性について検討した。実験に必要な正常なプログラムおよび不正なプログラムのシステムコール時系列のデータ収集については順調に進んでおり、実験データを用いたシミュレーション実験については予定どおり進んでいる。現在、Windows系におけるSVMを用いた不正プログラム検知システムの実装において性能を向上を行っている。

また、今年度から行っている仮想マシンモニタであるBitVisorへのシステムの実装についても順調に進んでいる。また、研究テーマを応用したWAFへの実装については一通り完成し、実環境における評価実験を行う予定である。実験に必要な正常なプログラムおよび不正なプログラムのシステムコール時系列のデータ収集については順調に進んでおり、実験データを用いたシミュレーション実験については予定どおり進んでいる。現在、Windows系におけるSVMを用いた不正プログラム検知システムの実装において性能を向上させるためにアルゴリズムの改良を行っているが、その部分において不具合が発生しており、実用化に向けたチューニングが遅れている。なお、Mac OS Xへの提案手法の検討については、当初の予定より若干前倒しで進めることができている。また、提案手法を用いたWAFへの応用について研究を進めている。Windows系OSへの実装についてさらに開発を進め、検知能力および性能を評価するための実験を行う予定である。BitVisorへ実装しているプログラムの特徴に基づく検知手法についても完成を目指す。また、現在検討中のMac OS Xへの提案手法の実装方法についてさらに調査検討を行い、システムの概要設計を行う予定である。今年度の計画において遅れているWindows系OSへの実装についてさらに開発を進め、検知能力および性能を評価するための実験を行う予定である。また、昨年度検討したプログラムの特徴に基づく検知手法についてもシステムへの追加機能として実装を検討する予定である。購入予定のノートパソコンと旅費により研究成果の学会等への発表及び論文誌への投稿を行う予定である。購入予定のノートパソコンと旅費により研究成果の学会等への発表を行う予定である。
尿細管細胞機能変換を介した腎内炎症環境制御機構の解明

これまでの解析から、転写因子GATA2は急性腎臓病時の腎内炎症を活性化させる機能をもつことがわかった。そして、複数の炎症性サイトカイン遺伝子の発現が、GATA2の影響下に制御されることがわかった。本年度は、GATA2欠損が全身的な炎症に与える影響についても解析を進めた。グラム陰性菌内毒素であるリポ多糖(LPS)投与による急性の敗血症誘導に対して、GATA2へテロ欠損マウスは野生型コントロールと比較して有意に耐性を示した。敗血症時には、ヒスタミン産生亢進がアナフィラキシーショックや肺水腫をもたらす。そこで、ヒスタミン産生の律速酵素であるヒスチジン脱炭酸酵素遺伝子座を含むBAC DNA(大腸菌人工染色体)を用いたGFPレポータートランスジェニックマウス(Hdc-GFPマウス)を樹立し、生体内でのヒスタミン産生細胞モニターリングを試みた。その結果、LPS誘導性敗血症時には、肺にヒスタミン産生細胞が最も顕著に遊走されることが分かった。さらに、GATA2へテロ欠損マウスではヒスタミン産生細胞の遊走が軽減した。これらの結果から、GATA2は敗血症時の肺への炎症細胞浸潤とヒスタミン産生を亢進させる因子であることが示唆された。次に細菌感染による敗血症モデルとして、盲腸結紮穿孔(CLP)腹膜炎誘導に対するGATA2へテロ欠損マウスでの症状を検討した。その結果、GATA2へテロ欠損マウスはCLP腹膜炎による急性期の炎症誘導に対しては耐性を示すが、その後の病期には腹腔内の細菌感染の遷延とそれに伴う慢性炎症を示すことが分かった。これらの結果から、GATA2は炎症性サイトカイン産生亢進による急性期炎症惹起にかかわる機能があるが、病原細菌に対する防御機構を担う機能も持つことがわかった。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。急性腎臓病は心臓血管系手術などによる一過性腎虚血に合併し、重篤化すると不可逆的な腎線維化をともなう慢性腎臓病へと進行するリスクがある。これまで、急性尿細管壊死に陥った近位尿細管が炎症性サイトカインを産生し、病態形成の中心的な役割を担うと考えられてきた。一方で他の尿細管細胞が病態形成に関わる可能性は明らかでなかった。腎集合管は尿細管の最下流に位置し、尿からの水再吸収により尿濃縮に関わる。本研究では腎集合管に特異的に発現するGATA2転写因子に着目し、GATA2が腎臓病時の腎内炎症環境形成に関わる可能性を明らかにすることを目指す。初年度は、尿細管細胞特異的にCre酵素を発現するPax8-CreマウスとGATA2条件付き欠失マウスを交配し、腎集合管細胞特異的にGATA2を欠失するマウス(G2CKOマウス)を作出した。このG2CKOマウスに対して一過性腎虚血再還流(Ischemia-Reperfusion Injury; IRI)による急性腎臓病を誘導した。その結果、興味深いことにG2CKOマウスは腎障害誘導に対して耐性を示した。G2CKOマウスの腎集合管細胞を単離しトランスクリプトーム解析を行ったところ、GATA2を欠失する腎集合管細胞では、Tnf、Ccl12、Cxcl10、Tnfなどの炎症性サイトカイン遺伝子の発現誘導レベルが減弱していた。腎集合管由来細胞株(mIMCD細胞)にGATA2を過剰発現すると、これらのサイトカイン遺伝子群の発現レベルが上昇することを確認した。また、アントラキノン系化合物であるミトキサントロンにGATA因子阻害活性があることがわかり、mIMCD細胞にミトキサントロンを添加するとサイトカイン遺伝子群の発現レベルが、抑制されることがわかった。これらの結果から腎集合管細胞は虚血再還流腎障害の病態形成において確固たる役割を担い、複数の炎症性サイトカイン・ケモカイン遺伝子群がGATA2の制御下にあることが明らかとなった腎集合管細胞特異的なGATA2欠失マウス(G2CKOマウス)が予定どおり得られたため、解析が順調に進んだ。その結果、G2CKOマウスは急性腎臓病誘導に対して耐性を持つことが解った。これまで急性腎臓病の病態形成おいて、近位尿細管が中心的な役割を担うと考えられてきたが、今回の結果から、腎集合管細胞も病態形成に関わることが、初めて明らかとなった。また、ミトキサントロンによるGATA因子阻害活性が、病態時の炎症性サイトカイン誘導を抑制する可能性があることが見いだされ、急性腎臓病の治療に応用できる可能性が示唆された。これらの知見が初年度に得られたため、次年度以降はGATA因子阻害剤により、急性腎臓病の発症を予防できる可能性を追究する。また、GATA因子による炎症性サイトカイン遺伝子発現誘導に関して、分子生物学的な解析を重点的に進めていく。ヒトIL6遺伝子ルシフェラーゼーレポーターマウスによる、インビボイメージング解析を用いた炎症評価系も予備実験が順調に進み、腎内の炎症状態が再現性良く定量的非侵襲的に評価できることが解った。今後、G2CKOマウスでの腎臓病重症度の評価や、薬剤による腎臓病治療の評価系として応用していく。GATAファミリー因子のGATA3の腎臓内での機能解析の結果、GATA3は腎糸球体

メサンギウム細胞の発生維持に必須であることが解り、こちらは論文として発表することができた(Moriguchi et al., 2017. Mol Cell Biol)。これまでの我々の研究から腎臓内の集合管細胞特異的にGATA2を欠損するマウスは、一過性腎虚血再還流障害(Ischemia-Reperfusion Injury; IRI)に対して耐性を示すことが明らかとなり、GATA2が腎臓内での炎症を活性化させる腎臓病増悪因子としての側面をもつことが明らかとなってきた。その後の解析から複数の炎症性サイトカイン遺伝子の発現が、GATA2の影響下に制御されることが明らかとなった。本年度は、新規に同定したGATA因子阻害剤であるミトキサントロン投与が、IRIによる急性腎障害誘導に対して予防効果および治療効果を示すか検討した。通常の野生型マウスに対して、IRI誘導とミトキサントロン前投与もしくは後投与を行い、腎臓の組織学的な変化を経時的に観察した。その結果、ミトキサントロン投与により用量依存的に腎障害が軽減することを見出した。IRI誘導後の腎内炎症性サイトカイン発現レベルはミトキサントロン投与により有意に減少することもわかった。IRI腎障害時の腎内への炎症細胞浸潤が、GATA2欠失により軽減することもフローサイトメトリー解析により明らかになった。ヒトIL6遺伝子BAC DNAとルシフェラーゼレポーターを用いて樹立した炎症モニターマウスによるインビボイメージングでの評価でも、ミトキサントロンの持つ抗炎症作用は明らかであった。これらの結果から、ミトキサントロンによる薬剤的なGATA因子阻害には、IRI誘導後の腎内炎症性サイトカイン発現を抑制することにより腎障害を軽減する効果があると考えられた。G2CKOマウスで観察された急性腎障害への耐性に関して解析を進め、G2CKOマウスでは急性腎障害誘導時の血清クレアチニンや尿素窒素レベルなど腎不全パラメーターのレベルが改善することがわかった。また、G2CKOマウスでは急性腎障害誘導時の尿細管細胞アポトーシスが軽減することもわかった。新規GATA阻害剤のミトキサントロンの持つ抗炎症作用と、虚血再環流腎障害に対する治療/予防効果を証明することができた。解析には我々の樹立した炎症モニターリングマウスによるインビボイメージングシステム解析を効果的に用い、薬剤のもつ治療効果を定量的かつ経時的に評価することができた。ここまでの結果は論文として発表し(Yu et al., 2017. Mol Cell Biol)一定の成果をおさめることができた。また、GATA2標的遺伝子探索のためのクロマチン免疫沈降実験に関して、腎集合管由来のmIMCD細胞とマスト細胞由来のP815細胞にて条件検討が進んだ。骨髄球系細胞特異的GATA2欠失マウスの作出も完了し、次年度以降、腎障害をはじめ炎症性病態モデルの導入を行う。以上のような経過から、今年度の研究に関して概ね順調に進展していると考える。これまでの解析から、転写因子GATA2は急性腎臓病時の腎内炎症を活性化させる機能をもつことがわかった。そして、複数の炎症性サイトカイン遺伝子の発現が、GATA2の影響下に制御されることがわかった。本年度は、GATA2欠損が全身的な炎症に与える影響についても解析を進めた。
運動課題遂行中脳波の分析による知覚-動作制御過程への認知的情報処理の関与について

本研究は、行動目標を達成するための動作産出・調整における、知覚-動作遂行過程について、標的物の大きさに応じた掴み動作課題および標的物の大きさ認識課題遂行中の脳波を、異なる皮質部位の連携・情報の流れという点から分析・検討した。大脳皮質の各部位は、視覚情報の処理およびそれと動作との関連付け、対象物の認識、高度情報処理・動作の準備・産出などにそれぞれ関与しているが、これらが連携して課題が遂行される様子が明らかとなった。運動課題を達成するためには、動作とそれを展開する環境についての知覚過程と、課題遂行のために状況に応じた動作の組織化を行う動作産出過程の連携が必要である。特に、視覚情報を処理する大脳皮質経路は、Dorsal-Ventral streamsのふたつがあり、それらはそれぞれ動作を組織化する・認知活動によって対象物の特性を認識するということに関与していると考えられているので、認知機能が動作の組織化にどのように関与しているのかについて検討することは興味深い。そこで、本研究は、このしくみについて、Reaching-Graspingとize-matchingというふたつの知覚-動作課題を用いて検討した。これらの課題は、同じ視覚標的に対して同様の手指による関節運動を形成するのだが、その視覚-運動遂行の過程は、認知活動の観点からは異なるもの考えられる。10名の被験者について、それらの課題遂行中の脳波を計測し、異なる大脳皮質部位の脳波データ間における周波数成分の相関について時系列分析(Coherence analysis)を行った。課題遂行にける認知的活動の関与を示唆する有意なcoherenceが、前頭部と頭頂・後頭・側頭・中心回との間において、および側頭-中心回/頭頂間においてみられた。これらのcoherenceついては、Reaching-GraspingとSize-matchingにおいて同じようなパターンを示したものの、それらの課題間の有意な差が、後頭-頭頂、側頭-中心回/頭頂、および前頭-中心回間にみられ、課題遂行における認知的情報処理の違いを示唆した。現時点で得られた知見に関しては、2009年7月にフランスにて開催される運動制御に関する国際学会において発表する予定である。また、64チャンネルからなる脳波データは、多角的な観点から分析を試みる必要があると判断し、現在分析を継続中である。ヒトは意図した動作課題を遂行する際、その動作課題に関連した知覚情報に応じて動作を組織化する。本研究は、「この知覚-運動制御過程における、認知的情報処理活動の関与」について、「標的に対して手を伸ばしそれを捕捉する」動作(Prehension)と「標的物の大きさを判断し、(標的に対して手を伸ばすことなく)同様の捕捉動作によって、認識した大きさを表現する」動作課題(Matching)を用いて取り組むんだ。これの課題は標的サイズに関する同様の視覚情報に対して、)同様の手指関節運動が産出されるものの、Matching課題においては、視覚によって認識された標的サイズについて特定の摘み動作サイズを対応させるという認知的情報処理が介在すると考えられる。これらの課題遂行中の脳波を測定・分析することによって、大脳皮質レベルにおいて、課題遂行条件に応じて課題遂行のための認知的活動がどのように関与するのかを検討した。10名の被験者が画面上に表示された視覚標的に対してPrehensi6nおよびMatching動作をそれぞれ80回行った。課題条件の順序効果については、被験者毎に課題遂行順序を変えることによって相殺した。課題遂行中の脳波について、coherence分析により大脳皮質の各部位間の活動の連結性について検討した。Matching課題遂行では、より広範囲にわたる皮質部位間における連結性が示され、それらの部位間におけるシグナルのやり取りにより課題が遂行されていることが見出された。また、サイズに関する錯視を誘発する標的物に対して動作を行った場合、MatchingとPrehensionでは異なる部位間の連結性がその影響を受けており、同様の刺激に対する同様の課題動作産出であっても、課題遂行における認知的課題要求に応じて皮質レベルでの知覚-運動のためめ処理過程が翼なることが明らかになった。平成22年度は当該研究期間の最終年度にあたり、当初の目的どおり平成2021年度において得られた研究成果について総括し実験心理学・心理生理学・神経科学系の国際学会において発表を行った。本研究では、視覚標的に手を伸ばして掴む動作課題と、掴み動作と同様の手指関節動作を視覚によって認識した標的の大きさに対応させるという認知課題を用いて、課題動作中の脳波の周波数領域における分析によって、視覚情報を処理して課題に応じた動作を形成する過程について、皮質レベルの活動の観点から検討することを試みた。課題遂行中の皮質部位間の情報の流れを検討するCoherence(コヒーレンス)分析によって、機能的に異なる役割を担っている皮質の各部位がどのように連携しながら動作が遂行されているかを明らかにすることができた。認知的情報処理の関与を検討するために視覚標的として錯視を誘発する図形を用いた。これに対する動作課題および認知課題パフォーマンスについては、「認知機能の観点からは動作課題は錯視の影響を受けない」という主張について関連する一連の先行研究において論議が展開されてきている。これに関して本研究では、動作課題においても錯視が影響するという結果を得た。

これは研究当初の予測には反するものの興味深い知見である。そこで、被験者を錯視の影響を受けた群と受けなかった群に分けて脳波分析を行った揚合、錯視の影響を受けた群のコヒーレンスは、後頭野-頭頂野で顕著であり、錯視の影響を受けなかった群では前頭野内での部位間および前頭野-後頭・頭頂野間でのコヒーレンスが顕著であった。そのため、この点に関してさらなる分析および先行研究の検討により解釈を深めることに時間を費やすことを主眼とすることとなった。したがって、当初予定していた論文作成には遅れが生じ、現在進行中であるものの、平成23年度中に心理生理学または実験心理学系の国際誌への投稿予定である。
肥満由来の脳酸化亢進に伴うStg1発現上昇とトコトリエノールによる防御

申請計画通り、9月齢のC57BL/6マウスに高脂肪食(HFD)を5か月間投与して肥満モデルマウスを作製した。しかし、合計の動物数が60匹と多いため、一度に作製することはできず、2回に分けて実験動物を作製。現在、2グループ目が特別食を投与中である。また、トコトリエノール(T3)の効果を検証する目的で、T3添加群も同時に作製した。これまでの予備実験の結果を踏まえT3の添加量は、過去に当研究室で実施した際の10mg/100g dietから、50mg/100g dietへと増量した。第1グループの結果からは、これまでの短期投与ではT3の抗肥満効果が確認されていたが、今回の長期投与では最終的に体重差は無かった。よって、これまでの報告にあるT3の抗肥満効果は体重増加遅延作用であった可能性が新規に考えられた。5か月の投与期間終了後、モーリス水迷路試験とロータロッド試験を実施した。その結果、対照食とHFD群、それぞれにT3を添加した計4群で、いずれも認識機能と運動機能に有意な差は無かった。個体の中には最大遊泳時間で目標物まで到達できなかったものもあったので、今後はこれまでの最大遊泳時間を60秒としていたが120秒か180秒へと変更する予定である。行動試験終了後、マウスを解剖して大脳・小脳・海馬領・肝臓・心臓・腎臓・血液を別々に採取、-80°Cにて保存した。この検体については第2グループの解剖が終了し次第、申請書の当初の予定にもある解析を行う予定である。研究はおおむね当初の予定通りに推移している。今後も着実に計画通り研究を進める予定である。本研究は9月齢のマウスに高脂肪食を長期投与(5か月間)する実験の為、実検動物の作製に長期間を有するが、おおむね順調に肥満モデルマウスの作製は進んでいる。しかし、本実験ではT3量を多くしたこと、また動物数が多いことから、従来に比べT3や飼料の消費量が非常に大きく、欠品を出さないために飼料の調整・作成には慎重を期した。また、申請計画通り蛍光のマイクロプレートリーダーも設備備品として購入した。現在は、次年度から解析が開始できるようテスト使用を続けている。また、次年度にRT-qPCRによる解析を予定しているため、目的遺伝子のプライマーをBLASTにて設計し、増幅効率の確認作業を実施。設計したプライマーが正常に働くことも確認した。行動実験についてはT3添加により認識機能と運動機能が有意に改善すると思われたが、有意差は得られなかった。しかし、有意差が出ない場合については申請書にも記入済みだが想定されるケースであるので、継続して研究を続ける。まもなく第2グループの動物の作製が終了するので、直ちに行動試験を開始する。その後、申請書の予定通り、Western blottingとRT-qPCRにて酸性の可溶性タンパク質であるSecretogranin-1の発現変動について検討する。また、T3が脳まで確実に到達しているかを明らかにするために、高速液体クロマトグラフィ(HPLC)を用いてT3を測定する。Secretogranin-1で発現変動が確認できなかった場合には、他の候補タンパク質について同様の検討を行う。(既に同定しているが名称は記載できない)。以上の項目を2019年度に実施し、確実に研究計画を遂行させる。