hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
気孔孔辺細胞における光情報のイオン輸送への変換機構

孔辺細胞を用いてフォトトロピン依存の気孔開口に関与する蛋白質成分を同定した。ABA情報伝達系で生成される脂溶性フォスファチジン酸(PA)が青色光情報伝達系の蛋白質脱リン酸化酵素1(PP1)を阻害し、PP1がABAと青色光のクロストーク点になる事を示した。次に、フォトトロピン2の自己リン酸化部位がSer-761とSer-762であることを決めた。ついで、熱画像測定により青色光応答の変異体を選抜し、フォトトロピンの基質になる新規キナーゼBLUS1を同定した。さらに、孔辺細胞に発現している11のisogens(AHA1-AHA11)の中でAHA1が気孔開口に重要な役割を果たす事を示した。気孔孔辺細胞の光によるイオン輸送はおもに青色光に応答するフォトトロピンの働きによってであり、phot1とphot2が重複して機能する事が明らかになっている。本年度は、phot2の自己リン酸化部位に関する研究を進め、phot2キナーゼの活性化ループに存在するSer-761とSer-763が気孔開口に必須の働きをする事を見いだした。一方、この青色光情報伝達系と植物ホルモンアブシジン酸とはクロストークする事が知られているが、その分子機構は不明であった。アブシジン酸の気孔開口阻害作用は細胞膜H^+-ATPaseの光によるリン酸化を阻害する事によるものである事が明らかになっていたが、アブシジン酸からのシグナルの標的分子がフォトトロピンと細胞膜H^+-ATPaseのシグナル伝達を仲介するプロテインフォスファターゼ1の触媒サブユニットである事を証明した。このとき、アブシジン酸からのシグナルはフォスフォリパーゼDを介して生ずるフォスファチジン酸である事を突き止め、この物質が触媒サブユニットと直接結合し、阻害作用を示す事を明らかにした。さらに、フォトトロピンからのシグナル伝達にシグナル因子RPT2がフォトトロピンからの直後の情報伝達に関与することが報告されている。われわれは、この事に疑いをもっており、RPT2の気孔開口における役割を詳細に調べた、その結果、RPT2を欠いだ変異株rpt2は表皮、生葉でも青色光に応答して気孔を対照とほぼ同じくらい開口し、また、rpt2変異株の孔辺細胞プロトプラストも、青色光に応答して気孔開口の駆動力を生ずる水素イオンを放出することを証明した。この結果はRPT2が光による気孔開口には関与しない事を示している。以前の研究によって気孔開口の青色光受容体としてフォトトロピン1、2(phot1,phot2)が重複して機能する事、下流の標的として細胞膜H^<+>-ATPaseが働く事を証明し、さらに、両者の間をタイプ1プロテインフォスファターゼ(PP1)が仲介する事を示した。しかし、phot1とphot2からのシグナルが両方ともPP1を介して下流に伝えられるのか、片方だけがPP1を介するのか不明であった。その点を、解明するためphot1とphot2の変異体を用いて、それぞれに阻害剤トートマイシンの効果を調べた。その結果、気孔開口、青色光依存のH^<+>放出、細胞膜H^<+>-ATPaseのリン酸化が同様に阻害された。この結果はPP1がphot1とphot2からの両方のシグナルを受けて下流に伝えている事を示している。一方、青色光特異的な気孔開口に関する変異体をスクリーニングする方法を確立した。気孔が開くと葉温が低下することを利用して、サーモグラフィーを応用して、気孔開口の変異植物の探索を行った。この方法を了DNA挿入株、EMS等の変異原処理した植物に適用し、一次スクリーニング、二次スクリニーングにより多くの変異体を得た。現在、三次スクリーニングにより気孔開口を直接測定し、原因遺伝子の同定に向けて研究を進めている。ソラマメ孔辺細胞を用いて青色光照射を行い、この細胞のタンパク質を2次元電気泳動法で分離し、リン酸化レベルの変動するタンパク質の同定を目指した。このとき、2D-DIGE(two-dimensional differential gel electrophoresis)法を用い、感度よく検出する方法を確立した。得られたタンパク質を質量分析にかけ、複数のタンパク質を得たが、抗体を作出し、求めるタンパク質であるかどうか調べている。昨年、青色光特異的な気孔開口変異株のスクリーニング法を確立した。この方法により、多数の変異体が単離され、最終的に気孔を直接測定する3次スクリーニングを経たものを複数取得した。この中でBLUS1 (Blue light signaling1)と名付けた興味深い株について記す。この変異体はサーモグラフィーによると、青色光によりほんのわずか葉温が上昇し、葉温の低下する野生型と大きく異なった。また、青色光依存の気孔開口が完全に消失していた。

孔辺細胞プロトプラストの青色光によるH^+放出は完全に阻害され、その一方、フジコッキンによるH^+放出は阻害されず、この結果と一致して細胞膜H^+-ATPaseの活性は影響を受けなかった。青色光によるH^+-ATPaseの活性化は完全に消失していた。一方、フォトトロピンの自己リン酸化は正常であった。これらの事実はblus1変異がフォトトほピンと細胞膜H^+-ATPaseの間に特異的に起こっている事を示す。MaP-basedクローニングにより、この原因遺伝子として、これまで機能不明であった新奇のプロテインキナーゼを同定した。この遺伝子は変異体の表現型を相補した。このBLUS1タンパク質が青色光情報伝達系のかなり上流(下に示すフォスファターゼの上流)に位置する間接的証拠を得ており、現在、詳細を調べていう。一方、タイプ1プロテインフォスファターゼ(触媒サブユニット)がフォトトロピンと細胞膜H^+-ATPaseの情報伝達を仲介する事をすでに報告した。このフォスファターゼは触媒サブユニットと調節サブユニットからなる。この調節サブユニット(PRSL1 : phosphatase regulatory subunit)を触媒サブユニットと相互作用するタンパク質として単離し、機能を調べた。このサブユニットの変異体は気孔開口が阻害されており、その表現型はPRSL1遺伝子導入によって相補され、調飾サブユニットとして機能することが証明された。昨年度に発見しBLUS1と名付けた新規キナーゼはフォトトロピンと細胞膜H+-ATPaseの情報伝達を仲介する、正に制御する新規因子であった。BLUS1は55kDaの分子質量を有し、そのN-末にキナーゼドメインをC-末に制御ドメインを有し、青色光によってC-末のSer-348がリン酸化された。このリン酸化は下流への情報伝達に必須でSer-348をAlaに置換するとシグナルが流れなくなった。このリン酸化は素早く起こり、細胞膜H+-ATPaseよりずっと早く、フォトトロピンの自己リン酸化の時間変化に近かった。この事実は、BLUS1がフォトトロピンにより直接リン酸化される可能性を示している。そこで、フォトトロピンの免疫沈降を行うとBLUS1が共沈してきた。さらに、試験管内でBLUS1はphot1と物理的に相互作用をした。In vitroにおいても同様にphot1はBLUS1のSer-348をリン酸化した。さらに、phot2によってもBLUS1はリン酸化された。以上の結果は、BLUS1がフォトトロピンの直接の基質であることを示している。この結果は、フォトトロピンの細胞内の基質を初めて同定したものである。さらに、blus1変異体は気孔の青色光依存の開口を完全に欠いており、その生理学的役割を調べるに理想的な株であった。そこで、様々な環境条件で気孔開口の測定を行った。低いCO2濃度にしたとき野生株の気孔はその青色光応答によって大きく増加し、低CO2濃度でも高い光合成を保った。しかし、blus1は低CO2濃度にわずかしか応答せず、光合成による炭酸固定は大きく阻害された。
電子顕微鏡イメージング法によるイネ萎縮ウイルスの吸着、複製、輸送時の構造解析

アァイトレオウイルスの生活環を構成する主要なステッフにおいて、昆虫細胞内でウイルスが構築する超分子構造の解明を目指し、本特定領域研究計画研究班員である大村敏博博士との共同研究のもと、3D電子顕微鏡イメージング法をウイルス感染細胞に適用した。本年度は、当初の計画にもあったRDVと同属のレオウイルス科Rice Gall Dwarf Virus (RGDV)について、その感染細胞内に共焦点顕微鏡や通常の透過型電子顕微鏡観察において興味深い超分子構造の存在が認められたため、3D電子顕微鏡イメージングによる解析を行った。RGDVを感染させた媒介昆虫細胞において、ウイルス複製部位であるバイロプラズムでは、ウイルスのコアタンパク質P5だけでなく、非構造ウイルスタンパク質であるPns7とPns12を含んでいることが、大村ら農研センターグループの研究でわかった。実際、微小管の脱重合剤の添加は、ウイルスと微小管との会合抑制し、ウイルスの複製に著しい影響を与えることなく、細胞からのウイルス放出を阻害した。RGDV感染媒介昆虫細胞のプラスチック切片の電子線トモグラフィーを行ったところ、微小管に沿って規則正しく並んでいるRGDVが認められた。本解析を行う上で、撮影時のデフォーカス量の検討を行ったところ、チューブリンに相当する球状体が認められるほど分解能を向上させることができた。また、トモグラムのスライス像は、微小管とウイルスとの間になんらかの分子が存在することを示唆するものであったが、同定までは当該年度にはできなかった。RGDVが感染細胞において観察されるミトコンドリア周辺へのウイルス粒子の特異的な集合状態を電子線トモグラフィーで三次元可視化したところ、ウイルス粒子とミトコンドリアの間には、隙間があり、直接結合しているのではないことが明らかになった。Rice Gall Dwarf Virus(RGDV)は、RDVと同じファイトレオウイルス属で大きさも構成タンパク質の種類も非常に類似している一方で、病徴等が異なり、RDVの研究には比較対象として大変役に立つ。故に我々は、本課題にRGDVの解析も研究対象として加えることにした。本年は、RGDV感染の昆虫細胞から作製したプラスチック切片の電子線トモグラフィーを行った。大村博士らが発見したように、太さ約25nmの微小管の周りに成熟した大きさのウイルス粒子が観察された。しかし、今回トモグラフィーのテータ(トモグラム)から新たに分かったことは、このウイルス間における微小管よりも細い繊維の存在である。あたかもワイルスどうしを結びつけているように存在していた。これらは、作製したトモグラムのスライス像をコンピュータ上で観察することで判明した。この繊維の同定や役割の解析は、計画班の大村博士らとの新たな共同研究の課題として浮上した。また、ミトコンドリア周辺のRGDVの集積機構解明のためにトモグラム像を調べたところ、ウイルス粒子とミトコンドリアの間には、間隙が存在することが分かった。本特定領域のシンポジウムにおいて、総括班の吉川博士らによるこの間隙におけるなんらかの因子の存在-ウイルス粒子をミトコンドリア外膜につなぎとめるーの確認を指摘して頂き、今後の課題となった。本課題で高分解能の構造解析を予定していたRDVのPns10チューブルは、RGDVでは、Pns11蛋白質に相当する。農研センターにおいてSf9細胞で発現させたPns11が、Pns10同様、チューブル構造をin vitroで形成することを確認し、クライオ電子顕微鏡による氷包埋像の観察を行い、三次元構造解析のためのデータ収集を始めた。
視知覚・運動連関の獲得過程における機能的神経回路の創成原理の探索

生物学における多くの事象は、“揺らぎ"を含んでいる。本研究では、特に、学習によって、神経回路が揺らぎを含みながら、どのように変化していき、依然として揺らぎをもった状態で、機能的神経回路が創成されるのかについて明らかにすることを目指している。平成29年度には、低コントラストの視覚刺激と高コントラストの視覚刺激を用いて、難易度が異なる課題を遂行するラットの一次視覚野の神経活動を解析した。この結果、学習によって、特徴的な神経活動を示すようになり、また、細胞集団の神経活動は、学習前後で大きな試行間ばらつきを維持しているものの、学習後には精度高く情報を保有するようになることが明らかになった。平成30年度では、学習後には、大きな揺らぎが存在しながらも、縦縞・横縞の情報を正確に保持できている原因を探索した。この結果、学習によって、縦縞・横縞の発火頻度の違いが、単一細胞レベル、多細胞レベル、いずれにおいても、大きくなることが明らかになった。一方、縦縞、横縞の応答選択性は、学習によって多少の変化は認められるものの、大きな変化は観察されなかった。したがって、学習で発火頻度が全体的に同程度に増大することが、揺らぎながらも正確な情報表現を可能にしていると考えられた。実際、学習前には存在せずに、学習後に出現するようになる特徴的な神経活動を示す細胞の、自発的な活動、視覚応答、いずれにおいても、発火頻度が高かった。さらに、学習後には、視覚誘発電位(VEP)が大きくなることが確認された。学習後には、興奮性が高まり、情報をより分離して表現するようになることがわかった。平成29年度までに明らかになっていた、学習後には、大きな揺らぎが存在しながらも、情報を正確に保持できているという現象の原因を探索することに成功したので。これまでの研究によって、学習によって、大きな揺らぎを維持しながらも、情報を正確に保持できていることが明らかになり、さらには、発火頻度を全体的に同程度に増大させることによって、情報をより強く分離して表現するようになることが、揺らぎながらも正確な情報表現を可能にしていると考えられた。しかしながら、試行間ばらつきが存在し続ける意義について明らかにできていない。神経活動を操作するなどして、揺らぎの存在意義を探索する。視覚刺激のコントラストとは、対象物の明るさとその背景の明るさの対比のことで、刺激強度を特徴づける。平成29年度は、まず、低コントラストのときと高コントラストのときとで、難易度が異なる課題を遂行するラットの一次視覚野の神経活動を解析し、試行ごとに揺らぎながらも保持される情報の精度について解析した。この結果、学習後の課題遂行中に多く観察され、学習前の受動的な視覚刺激提示や学習後の麻酔下ではほとんど観察されないような、特徴的な神経活動が明らかになった。さらに、このような神経活動を示す細胞は、機能的にも重要であることが確認された。また、学習後の課題遂行中の試行ごとの細胞集団の神経活動から、提示された視覚刺激についてデコーディングを行った。これによって、神経活動が保持する情報の精度を解析した。学習後の課題遂行中には、学習前や麻酔下に比べて、情報の精度は高かった。ここで、通常、試行間ばらつきが低くなるほど、情報の精度は高くなると考えられる。しかしながら、情報の高い精度を示した学習後の神経活動の試行間ばらつきは、麻酔下に比べて高い値を示した。さらに、学習前に比べて若干、試行間ばらつきは小さくなったものの、ほぼ同程度の大きさを示した。以上から、学習後において、特徴的な神経活動を示すようになり、また、細胞集団の神経活動は、学習前後で高い試行間ばらつきを維持しているものの、学習後には精度高く情報を保有するようになることが明らかになった。学習後の課題遂行中、学習前、麻酔下のラット一次視覚野から神経活動を記録し、学習の前後や麻酔の有無での神経活動の変化、そして、学習後にも残存する揺らぎの存在を確認することに成功した。大きな揺らぎが存在しながらも、情報を正確に保持できていることがわかった。

さらに、学習後には、視覚誘発電位(VEP)が大きくなることが確認された。学習後には、興奮性が高まり、情報をより分離して表現するようになることがわかった。平成29年度までに明らかになっていた、学習後には、大きな揺らぎが存在しながらも、情報を正確に保持できているという現象の原因を探索することに成功したので。試行間ばらつきの存在を観察することができ、その試行間ばらつきが存在している状況においても、情報を正確に保持できていることがわかった。しかしながら、試行間ばらつきが存在している意義や、学習の前後での揺らぎの特徴について詳細には明らかにできていない。これらについて解析を進める。これまでの研究によって、学習によって、大きな揺らぎを維持しながらも、情報を正確に保持できていることが明らかになり、さらには、発火頻度を全体的に同程度に増大させることによって、情報をより強く分離して表現するようになることが、揺らぎながらも正確な情報表現を可能にしていると考えられた。しかしながら、試行間ばらつきが存在し続ける意義について明らかにできていない。神経活動を操作するなどして、揺らぎの存在意義を探索する。平成29年度は、実験よりも、実験データの解析に力を注いだ。このため、当初予定していたよりも研究経費がかからなかった。しかしながら、平成30年度以降では、新たな実験を数多く行う必要がある。このため、実験機器を購入するなどの必要があると考えている。平成30年度は、実験よりも、実験データの解析に時間を費やした。2019年度以降では、新たな実験も行う予定である。このため、実験機器を購入する必要があると考えている。
多段複合型工程を対象としたスケジューリング・システムの開発

多段複合型工程を対象として,生産計画・スケジューリングを行うシステムと,その手法の開発を行った。多段複合型工程とは,資材を分解して半製品・製品を作成する分解型工程と,資材・半製品を組み立てて製品を作成する組立型工程が組み合わせられた工程である。数値実験の結果,条件によりヒューリスティックとメタ戦略を選択する方法が有効であった。実装した情報システムは,最近の標準ウェブ技術により多くのウェブブラウザでの利用が可能となった。対象領域である素材型産業とその製品素材を資材として購入し製造を行う製造業からなるサプライチェーン(SC ; Supply Chain)について調査とその結果に基づくモデル化を行った。鋼板サプライチェーン(鋼板製造とそこで生産された鋼板を用いる製造業),および水産加工品サプライチェーン(生鮮品から加工品の資材を作る工場と加工品を製造する工場)のモデル化を行った。これらはいずれも,上流に分解型工程・下流に組立型工程をもつ多段複合型工程となっている。また,このような工程をもつサプライチェーンに適用可能な計画・スケジューリングモデルを作成するため,SCP (Supply Chain Plannlng)およびロジスティクスに関する調査を行った。これらの調査を元にした,計画・スケジューリング手法の開発に先だって,中長期の計画を除いたスケジューリング・アルゴリズムに関する検証を行った。従来,比較的良い結果が得られるとされ良く用いられるランダムキー型遺伝的アルゴリズムについて,スケジューリング問題に適用した場合の問題点を明らかにし,それを改善した手法を開発し発表した。また,この発表内容はまとめ直して投稿し,論文として掲載済である。さらに,この結果を踏まえ,計画・スケジューリングの統合および,対象の多段複合型工程への適用についてまとめた。各製品の資材所要量の和が全体の資材所要量とはならない,余剰品の廃棄量を減らすため製品の追加を提案する必要があるなどの,従来明らかにした分解型工程の特性に加え,複数の種類の資材から同一(互換)製品が生産可能な場合についての考慮を行った。この内容の一部は投稿済であり,次年度(平成23年8月)発表予定である。1.生産計画・スケジューリング手法の開発在庫計画・輸送計画を除いた生産計画・スケジューリングの統合手法を開発した。余剰部品の発生を抑止しつつ,需要予測や受注を元にした生産量を満たす生産計画・スケジューリングを行うため,(1)ヒューリスティックを元にした手法,(2)組合せ最適化問題として定式化し既存のメタ戦略を適用した手法,(3)各品目の生産量を統計的な分布を持つ値として表現し,そこから求められる資材所要量や余剰部品の量の分布を求める手法の3つを開発し,数値実験を通して比較を行った。多くの場合,(1)が有効であり,計算時間に余裕がある場合には(2)が有効であった。(3)では,計算量が多い割に前述手法と比較して特に優れた結果が得られていない。SCP,ロジスティクス,生産計画・スケジューリングを考慮したモデルを作成した。また,このモデルに基づき,既存のスケジューリング手法の組合せを比較した。多くのテスト問題においては,先行研究で開発した,生産スケジューリングと輸送の統合スケジューリングのためのメタ戦略手法が有効であった。3.多段複合型工程をもつサプライチェーンを対象としたシステムの実装先行研究で構築したウェブベースのスケジューリング・システムに機能を追加することによって実装を行った。過去の開発において障害となったSVG (Scalable Vector Graphics)とECMAスクリプトの組合せに関する問題の多くは,各社ウェブブラウザの改良によってほぼ解決し,目標とした仕様通りに構築できた。
レドックス制御による白血病細胞の分化・アポトーシス誘導療法の基礎的研究

最近、急性前骨髄球性白血病(APL)に対して、As_2O_3(ヒ素)が治療に使用され、レチノイン酸耐性の白血病においても高い完全寛解率が得られることで注目されている。抗癌剤は、白血病細胞にアポトーシスを誘導するが、As_2O_3も、Caspase-3の活性化を伴うアポトーシスを誘導するといわれている。我々は、ヒトAPL細胞株であるNB4より、As_2O_3耐性NB4(NB4/As)を樹立し、両細胞を比較することで、Caspase-3に集束するアポトーシスシグナルの基礎的検討を行った。As_2O_3は、NB4に対し、Caspase-8を活性化させ、その基質であるBIDを分断化させ、ミトコンドリア膜電位の低下を伴うアポトーシスを誘導することがわかった。一方、NB4/Asでは、As_2O_3によるCaspase-8以下の活性化が認められなかったが、細胞内グルタチオン(GSH)合成酵素阻害剤であるBSOで処理し、GSH濃度を低下させることで、As_2O_3に対するアポトーシス感受性の回復が認められた。亜ヒ素酸(As203)がレドックス制御を介して急性前骨髄球性白血病(APL)のアポトーシスを誘導するとの仮説を検証するため、最初に、大腸菌に発現させた白血病特異蛋白(PML-RARα)に対する亜ヒ素酸および還元剤(2-メルカプトエタノール(2-ME))の影響を検証した。1)へ4LおよびPML-RARα蛋白は、非還元下では、oligomerizationをおこすが、亜ヒ素酸具存下では、この現象は濃度依存性に抑制されモノマーとなった。還元下では、亜ヒ素酸添加の有無による影響はみられなかった。一方RARα蛋白は、非還元下でもオリゴマー形成をみなかった。これらの結果はPML側にヒ素感受性に関与する部分があり、亜ヒ素酸により酸化還元状態が変化し、分子内、分子間S-S結合に影響を与えていることを示唆した。次にAPL細胞株NB4のヒ素感受性に対する種々の酸化剤、還元剤の影響を検証した。過酸化水素、ジアミド(一SH基特異的酸化剤)、グルタチオンの培養液への添加では、亜ヒ素酸にアポ卜ーシス誘導に有意な影響はみられなかった。最近、細胞内グルタチオン濃度の低下が、亜ヒ素酸感受性を増加させるとの報告があり注目されている。そこで種々の薬剤による細胞内グルタチオン濃度の変化と亜ヒ素酸の相互作用について現在検証中である。さらにAPL細胞株NB4とNB4の亜ヒ素酸低感受性変異株NB4/Asを比較し、亜ヒ素酸PML-RARα蛋白の消失は、アポトーシス感受性とは関係ないこと、また、カスペース経路は、感受性株のみで、活性化されることを見い出した。今後両細胞株のレドックス制御とカスペース活性化の関連を明らかにする予定である。As_2O_3は、NB4に対し、Caspase-8を活性化させ、その気質であるBIDを分断化させ、ミトコンドリア膜電位の低下を伴うアポトーシスを誘導することがわかった。一方、NB4/Asでは、As_2O_3によるCaspase-8以下の活性化が認められなかったが、細胞内グルタオチン(GSH)合成酵素阻害剤であるBSOで処理し、GSH濃度を低下させることで、As_2O_3に対するアポトーシス感受性の回復が認められた。
国語科の説明的な文章の読みの授業に「K－W－L」を導入する効果の検証

国語科の説明的な文章の読みの授業に「KーWーL」を導入し、その効果を検証した。「KーWーL」は、Kーkown(知っていること)、Wーwant(知りたいこ,と)、Lーlearned(学んだこと)の頭文字で、アメリカのDonna M. Ogleが開発した読書教育のためのチャートである。日本の読解指導には適さないとされるが、「KーWーL」の目指している意図的・目的的な読書は、子どもが主体となって教材と関わって読み、「納得の読み」や「教材を突き抜ける読み1へと導く一つの方法となる考え、実践研究を試みた。実際に教材「オオカミを見る目」(東京書籍1年)で「KーWーL」を用いて授業を行った結果、1既有知識を活かした読みの方法として, 2他者との交流のツールとして、3意図的目的的な読書活動として、4読解と読書をつなぐ方法として、5PISA型読解力育成の方法として、6実感を伴った読みの方法として、の6点において効果が認められた。とりわけK、W、Lの各段階で交流を取り入れることにより、「構成」「表現」といった読解指導にも有効に機能し、生徒個々の文脈に沿った自然な形で、読解と読書活動とを結びつける有効な方法と成り得た点、L欄の交流の中で再度教材と対峙することで、「構成」「表現」「題名」「筆者の考え方」について自分の意見を持ち、その是非を問い、書き換える学習へと発展し、PISA型読解力の求める「書かれたテキストを理解し、利用し、熟考する能力」の育成となる点は特筆すべき効果である。生徒の授業後の振り返りやアンケート結果からも、「KーWーL」が説明的な文章を読む際のツールとして有効性があることが明らかになった。詳細については、『香川大学教育実践総合研究第28号』に掲載した。
超音波による非侵襲的な遺伝子導入を可能とする造影ガス封入リポソームの開発

超音波は、医療現場において超音波診断をはじめ体外衝撃破砕など様々な形で利用されている。パーフルオロプロパンを内封したバブルリポソームを新規に考案し、超音波を用いて遺伝子の非侵襲的な送達の基礎研究を行った。基本構成脂質をDSPCとPEG2000脂質としREV法とEXTRUSION法でリポソームを調製した。10mlバイアル瓶にリポソーム溶液をいれ、ゴム栓とアルミシールで密栓した。ここにパーフルオロプロパンガスを注射針を通じて入れ加圧状態とした。これをBRANSON2510で超音波照射しバブルリポソームを調製した。(2)In Vivo実験:ルシフェラーゼプラスミド50μgをマウスに尾静注し、肝臓または心臓の部分を、径7mmの超音波発振プローブを用いて、体外より1MHz、2.5W/cm^2の条件で1分間照射した。12日後に、肝臓と心臓を取り出し、ルシフェラーゼの発現を調べたところ、超音波を照射した臓器にのみルシフェラーゼの発現を見ることが出来た。本研究課題で開発された、バブルリポソームは、vitro、vivoを問わず、細胞への傷害性が少なく、超短時間で遺伝子導入が可能であり、siRNAも導入できた。今後、バブルリポソームの物性評価や大量調製法などを検討する必要があるが、国内には、有用なバブル製剤がなく、その供給を熱望されているので、早急に実用化を目指す必要がある。パーフルオロプロパンを内封したバブルリポソームを新規に考案し、超音波を用いて薬物や遺伝子の非侵襲的な送達の基礎研究を行った。基本構成脂質をDSPC、DPPC、DOPC、DMPCとし、コレステロールやPEG2000脂質を添加しREV法とEXTRUSION法でリポソームを調製した。DSPCおよびDPPCからなるバブルリポソームにおいてエコーガスの内封量が高く、その保持率はDSPCが最も高く、2時間後でも90%以上保持していた。DSPCバブルリポソームを試験管にとり、SONOPOREで超音波照射しキャビテーションの有無を確認した。照射前は白く濁っていたが、DUTY50%、10秒間の超音波照射で、白い濁りは完全に無くなり、内封ガスがリポソームより噴出したことが確かめられた。COS-7細胞3×10^4cells/wellに、DNA量として1μgのfreepDNAまたはpDNA/protamine複合体及びバブルリポソームを添加して、直ちにDUTY50%、10秒間超音波照射した。照射後、培地を交換し48時間培養しルシフェラーゼ酵素活性を測定した。PEGリポソームが高いルシフェラーゼ発現を示し、また、pDNA/PRT複合体よりもfree DNAの方が高い発現を示した。PEGリポソームは分散性が高く、超音波照射によるリポソームのキャビテーションを万遍なく起こさせることが出来るためと考察された。Vitroかつ基礎の段階であるが、超短時間で簡便な操作で培養細胞に遺伝子を導入することが可能になった。
腰痛による労働者の出勤状況と医療費支出に影響する二次予防戦略を含む因子の特定

対象は研究協力施設における外来患者で、OMPTセラピストもしくはMDTセラピストの評価・治療を受ける腰痛を主訴とする18歳以上の労働者とする。手術後や骨折整復の後療法目的の患者は対象としない。同意を得られた対象者からアンケートを用いて、評価・治療開始時、開始1カ月、3カ月、6カ月、12カ月の計5時点で、医療費・休職日数・遅刻早退日数をはじめ、症状の程度や心理社会的内容についてアンケート調査を実施する。
市民共創による公共建築計画に寄与するデザイン基礎教育の検証と実践的モデルの構築

平成30年度は、建築図面の読み取り能力の涵養課程を、建築系科目履修の段階と照らし合わせながら明らかにする実験的研究に着手した。公共建築を検討するに際し市民共創活動を効果的に行うには、非建築学習者に対する図面情報伝達手法の検討が重要であり、本研究成果のはたす役割は大きいと考える。また同時に被験者の性格特性を把握し読図能力との関連性も一考した。具体的には、数回にわたる予備実験を踏まえて、被験者を大学に所属する建築学科学生およびそれ同年齢の非建築学生とし、建築家が設計し個性的な間取りの小住宅(延べ床面積115m2)の空間において、初見の図面を用いて実験を行い、あわせて性格特性五因子(Big-five)を測定してその関係について考察した。被験者は延べ63名(建築系30名、非建築系33名)で、年齢を追うごとに建築系と非建築系の有意差が明確になることや、図面参照回数の相違、性格特性5因子の中でも協調性や外向性の因子との影響をとらえることができた。しかし、本実験の実施方法と分析方法の改善の可能性について随時議論した結果、予想以上の時間を要したため、今年度に研究計画書で予定していた専門家へのヒアリングは実施することができなかった。一方で、近年の公共施設再編の動きの中で、市民共創の在り方として住民組織への運営委託や施設譲渡などの動きがみられることに着目した。当初は予見できなかったアプローチであるが、行政関係者とのヒアリング通じて、今後、公共コミュニティ施設が担う役割を再考する上で重要なカギを握ると考えられる。そこで、民間セクターが運営し交流や市民活動に利用できる施設の運営実態を明らかにし公共施設との相違点をみいだした。その結果、公共コミュニティ施設の利用目的に比べて民間のものは目的が複数に及ぶことが多く、利用者は人との出会いや会話などの交流のために意識的に使い分けていることが明らかになった。平成30年度は、これまでの研究成果からえた申請当初は予見していなかったが重要であるアプローチの市民共創に資する市民教育の手法の手がかりとなる実験を行い、その準備や立ち上げに時間を要した。加えて、性格特性五因子(Big-five)を用いて分析を進めるにあたり、分析手順や結果考察の妥当性を確認する作業に、当初の予想以上の時間がかかった。そのため、平成29年度末をもって退官した本多を中心に平成29年度に予定していた公共建築の市民共創に対する専門家へのヒアリング調査が、未着手になっている。積極的な研究展開で申請当初よりも2課題多く取り組んだが、いずれも研究代表者および分担者が主力となり枠組みの慎重な改善が必要であったため、年度初めに予定していた代替補助人員による研究推進は適任者が手配できず、研究全体はやや遅れている。令和元年度は研究の最終年度であり、平成29年度から続くの遅れをとり戻すために、研究体制を立て直し研究成果の取りまとめを精力的に進めたい。研究を進める過程で得た新たなアプローチを複数加え、立体的な研究構成としたことや挑戦的な機会を見いだすことができているので、当初の研究目的に対してより明確な結果を得ることと確信している。ADの研究計画の中で、2016年度は当初の予定に従い研究AとBに着手した。研究Aでは、現状の建築市民教育の課題を探るために、市民参加で建設される公共建築において建築初学者への教育方法と現実に建設される建物の乖離点を把握し、建築初期教育における教育体系を構築するための課題を明らかにした。具体的には1)建築初学者はエスキスや模型により俯瞰で建物全体の形状について把握し形状の検討を行うことは容易であるが、実際に建てられたときの仰視によるイメージを予想し検討することは難しい。2)建築小学者と実務者の間において、使いやすさの認識、および計画を行うにあたり重要とする項目についての意識の相違がある。3)建築初学者は、見慣れた“標準的なプラン"を受容する傾向があり、他の外部条件等を勘案したプランへの再考を促すのは困難な場合が多い。の3点が明らかになった。研究Bでは市民と実務者の視点の相違を、公共建築もしくはそれに準ずる不特定多数の人が利用する建築・都市計画関連賞を受賞した建築を対象とし、専門家の意見として建築関連誌に記載されているコンセプト及び賞の講評文を、一般市民の意見として同一建築に対するSNS上の口コミに着目して分析し比較することで明らかにした。結果から、実務者は建築計画時に幅広く周辺環境との調和や地球環境維持を考慮に入れた上で提案し、短期的な視点ではなく計画段階において長期的な視野を持っている点が改めて確認された。一方で、一般市民は各建物の固有の建築ディテールやイベント的な要素に着目しやすい傾向があり。SNS上の投稿全般において建築に関する記述や写真は少ないものの、その中で外観デザインに対しては注目されやすいことが確認された。しかし、あくまで日常の風景の一部であり、その建築設計の意図やデザインの効果にかかわる洞察については、ほぼ全く興味がないということがSNSからは読み取れた。ほぼ当初の研究計画通りに2016年度の内容である研究A(建築初学者への教育上の課題把握)と研究B(実務者と市民の視点の相違把握)を進めることができ、それぞれに一定の成果を得た。この研究成果は2017年度に学会などで公表し、更に新しい知見を交えて洞察を深める予定である。従って研究A、Bともに完了ではなく、より深い研究成果を求めて2017年度も継続したい。

平成29年度は、優れた公共建築を市民と共創するために市民側のに求められる予備知識の明確化を目的に、デザイン初学者に三次元思考力を習得させるための基礎造形教育の効果を、専門学校学生の作品の変化の追跡調査から検討した。美しさの比率の理解は比較的すすみやすいが、力の流れや荷重点の理解は難しいことが明らかになった。また、平成28年から引き続き建築初学者を対象とした公共建築設計コンペを題材に、特に構造計画に焦点をあててデータ分析を行った。具体的には大阪府主催「あすなろ夢建築コンペ」の平成26年・28年(いずれも用途は集会所)の入選作品を対象とし、設計主旨文と個々の作品の審査員による講評文を文節化してコンペ募集要項に明示されている評価項目を指標に特徴と明らかにした。また入選案における構造形式の特徴を明らかにした上で、最優秀案の実際の建設時に生じた構造上の変更点との差異を示し、初学者指導上の課題を検討した。さらに、公共建築立て替え時のニーズ把握の一助として、役割が見直されつつある公民館が、公共施設の再編の流れの中で、他用途との複合化などによって相乗効果が図れるのではないかという考えのもと、他の公共施設と複合あるいは隣接している公民館の空間構成を明らかにする研究に取り組んだ。結果として、公民館と複合化しやすい用途は教育系と文化系で、隣接化しやすい用途は教育系と役場系であり、大阪府下3市の公民館の多くは、共用施設が入口にとどまり複合化あるいは隣接化による空間的な融合が図られていないことが明らかになった。これより多用な複合化や隣接化による相乗効果も含めた評価手法と、それに対する市民の理解が今後求められていると考えられる。平成29年度は、研究分担者の本多友常(摂南大学)が定年退官前の最終年度であり、諸藩の事情から本研究の活動に従事することができなかった。そのため、本多を中心に平成29年度に予定していた公共建築の市民共創にたいする専門家へのヒアリング調査が、未着手になっている。また、初年度の平成28年度から継続する研究を進める中で、対象とする市民をワークショップなどに参加意向をもつ、建築に興味のある市民と位置づけ、デザイン初学者向けのプログラムを中心に検討することが、本研究の目的に近づくために重要であることが明らかになってきた。そこで本年度は、初学者向けの教育手法の検討を、申請当初よりも1課題多く取り組んだため、上記の本多の担当部分を代替補助する人員を確保することができなかった。平成30年度は、建築図面の読み取り能力の涵養課程を、建築系科目履修の段階と照らし合わせながら明らかにする実験的研究に着手した。公共建築を検討するに際し市民共創活動を効果的に行うには、非建築学習者に対する図面情報伝達手法の検討が重要であり、本研究成果のはたす役割は大きいと考える。また同時に被験者の性格特性を把握し読図能力との関連性も一考した。具体的には、数回にわたる予備実験を踏まえて、被験者を大学に所属する建築学科学生およびそれ同年齢の非建築学生とし、建築家が設計し個性的な間取りの小住宅(延べ床面積115m2)の空間において、初見の図面を用いて実験を行い、あわせて性格特性五因子(Big-five)を測定してその関係について考察した。被験者は延べ63名(建築系30名、非建築系33名)で、年齢を追うごとに建築系と非建築系の有意差が明確になることや、図面参照回数の相違、性格特性5因子の中でも協調性や外向性の因子との影響をとらえることができた。
放線菌ゲノム情報に基づいた二次代謝生合成・誘導制御・形態分化の分子基盤の統合深化

放線菌Streptomycesrochei 7434AN4株は、3つの線状プラスミドpSLA2-L,-M, -Sをもち、2つのポリケチド抗生物質ランカサイジン(LC)・ランカマイシン(LM)を生産する。本研究では、放線菌における二次代謝生合成、形態分化、シグナル分子制御の統合深化を目指し、平成30年度は以下の3課題を遂行した。(1)特異生合成マシナリーの機能解析【二次代謝生合成】まず、アゾキシアルケン化合物KA57-Aの生合成マシナリーに注目した。KA57-A生合成遺伝子(azx)クラスター中のポリケチド生合成酵素(PKS)遺伝子について、遺伝子破壊株の代謝プロファイル変化を解析したところ、親株と変化が見られなかった。クラスター中のPKSはKA57-A生合成に関与していないことが強く示唆された。また、LC生合成におけるキノン要求性デヒドロゲナーゼOrf23の機能解析を行い、基質特異性を明らかにした。(2)多面発現制御による未同定二次代謝産物の抽出と生合成【シグナル分子制御】:シグナル分子結合部位Trpが保存されていた転写リプレッサーについて遺伝子変異を施したところ、親株に見られない化合物の蓄積が認められ、フェニルプロパノイドや芳香族アミノ酸誘導体であった。これらの蓄積原因に関して興味が持たれる。(3)ゲノム比較による形態分化関連遺伝子の抽出と同定【形態分化】染色体末端欠失株において、「2-39株以外に共通して見いだされる領域」に気中菌糸形成因子の存在が示唆されたため、該当する138 ORFs (SRO_6607-SRO_6744) (nt 7,275-7,431 kb of the 7434AN4 chromosome)に注目した。そのうちの1つwhiBの相補株についてコロニー生育及びSEM測定を行ったところ、コントロール株との顕著な差異は認められなかった。【二次代謝生合成】:[課題1]アゾキシアルケン化合物の生合成マシナリーの先導的解明、[課題4]ポリケチド合成酵素の機能同定とハイブリッド抗生物質の創製、[課題6]比較メタボロームによる未同定二次代謝産物の抽出と生合成[課題1]において、アゾキシアルケン化合物マニワマイシン生合成遺伝子クラスターの次世代シークエンス解析も行い、バラニマイシン、KA57-Aとの共通ORFを抽出できた。また[課題4]において、ポリエン化合物ペンタマイシンの生合成クラスターについて、P450酵素の遺伝子破壊実験により確認した。さらにC10の直鎖ポリケチド化合物シトレオジオールの生合成遺伝子について、C-メチル基転移酵素を指標に探索し、該当クラスターを3つにまで絞り込んだ。また、LC生合成におけるキノン要求性デヒドロゲナーゼの機能解析を達成した。【形態分化】:[課題2]染色体環状化株における欠失領域の特定、[課題5]ゲノム比較による形態分化関連遺伝子の抽出と同定[課題2]において、次世代シークエンスにより欠失領域の推定に成功した。しかし、ロングリードに長けているPacBioシークエンスにおいても、両端融合配列の取得には至らなかった。当該領域にトランスポゾンなどきわめて高度な重複配列の存在が考えられた。[課題5]において、未解明形態分化関連遺伝子の存在が示唆された138ORFの解析に着手している。【シグナル分子制御】:[課題3]シグナル分子制御シグナルカスケードの網羅的解析、[課題7]多面発現制御による休眠二次代謝のゲノムマイニング[課題3]において、リプレッサーsrrB変異について、遺伝子発現と代謝の経時変化を指標に解析したところ、活性化因子srrYの後期発現がSrrBによって抑制されることが分かった。[課題7]においてリセプター遺伝子の変異解析により、通常非生産の代謝産物活性化を見いだした。【二次代謝生合成】:[課題1]にて掲げるアゾキシアルケン化合物の特異なアゾキシ結合形成メカニズムについて、今後は共通因子に絞り込んで網羅的遺伝子破壊実験を行う。さらに、in silico比較解析と酵素変換実験なども組み合わせ、アゾキシ結合形成メカニズムの先駆的解明を目指す。さらに[課題6]に着手し、本菌の休眠二次代謝産物と考えられている特異生合成マシナリー(C-P化合物、擬オリゴ糖など)の遺伝子発現活性化と代謝産物取得を目指す。【形態分化】:各染色体環状化株における表現型と遺伝子欠失領域の関係を明らかにし、次いで、欠失領域の遺伝子相補実験を行う。具体的には、まず、コスミドの取得やPCR walkingによる融合配列の取得を目指す。それと並行して、欠失領域に含まれる138ORFのうち、6つの制御遺伝子に着目し、これらをクローニングして2-39株に形質転換し、胞子形成の回復の有無を調べる。【シグナル分子制御】:現在までに制御遺伝子改変による代謝増強・休眠二次代謝の覚醒戦略を立案できた。今後は生合成クラスターの発現標的の特定なども行い、制御カスケードの全貌解明を目指す。本研究では、二次代謝生合成、形態分化、シグナル分子制御の統合深化を目指しており、平成28年度は以下の3課題を遂行した。

[課題1]アゾキシアルケン化合物の生合成マシナリーの先導的解明【二次代謝生合成】; S.rochei染色体にコードされたアゾキシアルケン化合物KA57-A生合成遺伝子クラスターの網羅的遺伝子破壊および代謝産物解析を行った。短鎖脂肪族アミンの酸化酵素およびキナーゼ遺伝子が、本化合物の生合成に必須であることを明らかにした。[課題2]染色体環状化株における欠失領域の特定【形態分化】; YN-P7, YN-P145株における染色体の環状化領域特定のため、Illumina HiSeq2000次世代シークエンサー解析を行った。両株とも染色体末端の配列は欠失しており、その欠失領域は野生株7434NA4株と比較して0.98 Mb, 1.51 Mbであることが分かった。今回の解析では両端融合配列の取得には至らず、PCR walkingによる決定を目指す。[課題3]シグナル分子制御シグナルカスケードの網羅的解析【シグナル分子制御】; TetR型リプレッサー遺伝子srrBの機能解析を目指し、各種遺伝子破壊株のLC, LM生産量を調べた。その結果、srrB変異によりLCは11倍、LMは4倍の生産量増大が認められた。[課題1]において、KA57-A生合成に必要不可欠なクラスターの特定に成功した。他のアゾキシアルケン生合成遺伝子クラスターの塩基配列解析も進めており、in silico比較解析と遺伝子破壊実験、さらに酵素変換実験などを通じて、アゾキシ結合形成メカニズムの先駆的解明が期待できる。[課題2]において、次世代シークエンスにより欠失領域の推定に成功した。しかし、両端が融合した塩基配列のデータ取得には至らなかった。本領域にトランスポゾンなど高度重複配列の存在が考えられるため、コスミドの取得やPCR walkingによる融合配列の取得を目指す。[課題3]において、リプレッサー変異による代謝増強に成功した。本成果により、制御遺伝子改変による休眠二次代謝の覚醒戦略を立案できた。放線菌における二次代謝生合成、形態分化、シグナル分子制御の統合深化を目指し、平成29年度は以下の3課題を遂行した。(1)特異生合成マシナリーの機能解析【二次代謝生合成】:Streptomyces rochei遺伝子破壊株解析を通じて見出したアゾキシアルケン化合物KA57-A、ポリケチド化合物ペンタマイシン、シトレオジオールの生合成マシナリーに注目した。KA57-A生合成に関し、ヘキシルアミン以外の鎖長のアミンを添加してprecursor-directed生合成に賦したところ、C6以外の鎖長を有するアゾキシアルケンは取得できなかった。このことより、本生合成における厳密な鎖長認識が示唆された。(2)シグナル分子制御シグナルカスケードの網羅的解析【シグナル分子制御】:TetR型リプレッサー遺伝子srrBの変異によりLCは11倍、LMは4倍の生産量増大が認められたが、経時変化を調べたところ、親株と比較して培養後期での抗生物質生産が引き続き顕著に認められた。srrA, srrB, srrYの発現を調べたところ、転写活性化因子遺伝子srrYの発現がsrrB変異株においては培養後期も引き続いて認められた。
スタチンによる細胞種特異的なオートファジー、細胞死誘導機構の解明

本研究は、高コレステロール血症治療薬であるスタチン系薬剤の副作用、横紋筋融解症の原因を解明することを目的に行った。この研究期間内では、スタチン依存的に横紋筋肉腫由来細胞が死滅することを明らかにした。また、スタチン依存的な細胞死を抑制する可能性のある遺伝子として、細胞周期に関わる遺伝子を同定した。現在はこの遺伝子が、スタチン依存的な細胞死に対してどのように影響するのか解析を進めている。スタチンは、HMG-CoA還元酵素阻害薬で高コレステロール血症治療薬として使用されている。しかしスタチンには、低頻度ながら重篤な副作用で、筋肉のタンパク質分解が亢進する横紋筋融解症が報告されている。この原因については、アポトーシスの誘導などが考えられてきたが、詳細は明らかでない。このスタチンによる横紋筋融解症の原因を研究する中で、スタチンが、横紋筋肉腫由来A204細胞で非選択的なタンパク質分解機構であるオートファジーを顕著に誘導することを見出した。スタチンによるオートファジー誘導が横紋筋融解症の発症に関与すると考えて、本研究計画では、スタチンによるオートファジー、細胞死誘導の分子機構を明らかにすることを目的として、レトロウイルスを用いたgene trap法によるランダムな遺伝子破壊実験を行い、関連遺伝子の同定を行うこととした。平成21年度では、1、A204細胞のスタチンによるオートファジー、細胞死誘導条件の検討。2、レトロウイルスの作製と感染。3)スタチン耐性細胞のセレクションを行った。2、レトロウイルスの作製と感染を検討した際には、当初予定していたβガラクトシダーゼ遺伝子とネオマイシン耐性遺伝子を融合して発現するpROSA β-geoベクターよりもGFP遺伝子とネオマイシン耐性遺伝子を別々に発現するpDisrupベクターで、効率よく遺伝子破壊株を作製することができると結論し、使用するベクターの変更を行った。3、スタチン耐性細胞のセレクションでは、計画通り複数の濃度でのセレクションを行った。その結果、薬剤濃度により得られるクローン数が異なり、種々の異なる応答を示す細胞をクローニングすることに成功した。この結果は、スタチンによるオートファジー誘導に関連した、複数のパスウェイを見出すことができる可能性があり、今後の解析が期待される。高コレステロール血症治療薬のスタチンは、重篤な副作用として筋肉の細胞が障害をうける横紋筋融解症を起こす。本研究では、これまで明らかにしてきた横紋筋肉腫由来細胞でスタチンが起こす、非選択的なタンパク質分解機構のオートファジーと細胞死誘導が、横紋筋融解症の発症機構に関与していると考えて、その詳細な分子機構の解析を試みた。平成22年度では、(1)gene trap法を用いた遺伝子破壊株からのスタチン耐性細胞のクローニング、(2)耐性細胞の破壊遺伝子の同定、(3)耐性細胞のオートファジーと細胞死の関連について解析を行った。まず、セリバスタチン耐性細胞のクローニングを行い、合計5株の耐性細胞を得ることが出来た。この耐性細胞の破壊遺伝子を3'-RACE法で解析した結果、細胞周期や糖代謝などに関連した遺伝子を同定した。この中で、細胞周期に関連した遺伝子が破壊された耐性細胞について解析を進めた。この細胞についてスタチン依存的なオートファジー誘導を調べた結果、野生株と同程度の誘導が起きた。以上の結果から、同定した細胞周期に関連する遺伝子は、スタチン依存的なオートファジー誘導の経路とは異なる経路で、細胞死の誘導を調節していることが示唆された。今回得られた結果は、目的としていたオートファジーからの細胞死の誘導機構に直接関与するものではなかった。しかし、スタチンが引き起こす横紋筋細胞の障害を抑制する方法を考える上で重要な知見である。今後は、さらにスタチン耐性細胞のクローニングを進めて、オートファジー誘導に関連した因子の同定を目指す。また、細胞周期の調節に関与する遺伝子については、スタチン依存的な細胞死誘導を抑制する分子機構を解析する。
先天性筋無力症におけるアセチルコリンレセプターαのsplicing異常の解析

AChRのαサブユニットをコードする遺伝子CHRNA1上のinframe exonであるP3Aのalternative splicingを制御する因子の同定および機能解析を行った。変異配列とその前後15merを含んだoligo DNA(計31mer)およびその対象として同一部位の正常配列より、in vitro transcription法によりBiotin標識したUTPを取り込ませながらprobe RNAを合成した。HEK293細胞より抽出した核タンパクとprobeを混合し、probeと核タンパクを結合させた。このRNA/蛋白複合体をstreptavidineビーズにより精製し、結合蛋白をWestern blotting法により同定したところ、probeには、スプライシング制御因子であるPTBP1とHnRNP-Hが結合することが判明した。特に、HnRNP-Hは変異配列で結合が著明に減弱していた。以上により、αIVS3-8G→Amutationは、HnRNP-H結合部位を破壊し、HnRNP-Hが機能しなくなるため、alternativesplicingを引き起こすことが判明した。AChRのαサブユニットをコードする遺伝子CHRNA1上のinframe exonであるP3Aのalternative splicingを制御する因子の同定および機能解析を行っている。RNA配列および分子量から、この60kDaの結合タンパクはpolypyrimidine tract binding protein (PTBP)である可能性が示唆された。次に、抗PTBP抗体を用い、上記のUV cross-linkしたsampleを免疫沈降し、SDS-PAGEを行ったところ、この抗体により60kDaのタンパクが免疫沈降されることが確認された。以上により、αIVS3-8G→A mutationによるalternative splicingはPTBPによる制御を受けることが示唆された。現在、PTBPのdeletion mutantの発現plasmidを作成し、このalternative splicingに関わるdomainを同定中である。
高比放射能を実現する、汎用性の高い新規求電子的〔18F〕フッ素導入法の開発

求電子的フッ素化反応が必要な[18F]フッ素標識反応では、利用価値が高く、また汎用性に優れる求電子的[18F]フッ素導入試薬がなかったため、[18F]フッ素ガスを用いることが主流であり、比放射能が非常に低かった。本研究では上記の背景を受けて、合成化学的見地から求電子的[18F]フッ素化試薬を探索し、その合成法を確立することで、求電子的[18F]フッ素化試薬を安全かつ安定に供給することを目的として、研究を展開することにした。以上の目的を達成するために、平成23年度では非放射性フッ素を用いて、放射性フッ素で利用可能な求電子的フッ素化試薬の基礎的検討を行うことにした。簡便に入手可能な硫酸とサイクロトロンで容易に生成可能な[18F]KFの非放射性体に相当するフッ化カリウムを用いて、求電子的フッ素化試薬(KFSO3)を合成し、求電子的置換反応に対して反応性の高いトリブチルスズベンゼンと反応させたところ、収率30%でフッ化ベンゼンを得ることができた。引き続き、別の求電子的フッ素化試薬の調製、標識対象の電子的特性の変更を行い、調製した求電子的フッ素化試薬の汎用性について検討を行う予定である。汎用性に優れていると判断できる求電子的フッ素化試薬については、放射性フッ素を用いた標識についても検討を行う。本研究の遂行により、これまで低比放射能が問題となっていた多くの放射性薬剤に対して、高比放射能での合成が可能となり、5-FUを始めとして、高比放射能での18F標識合成法の確立が望まれていた多くの放射性薬剤に対しての、ブレイクスルーとなりうる。