hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
広島県下医療施設の抗菌薬使用数量と耐性菌分離率並びに分離株の性状に関する調査研究

さらに、医療施設における抗菌薬の使用状況に関する情報をもとに本研究成果を総合的に解析・評価し、調査対象となった耐性菌毎に各抗菌薬のAUD、DOT、AHIなどのカットオフ値を確定するなど、地域の医療事情の特性に合致する新たな抗菌薬管理プログラムの基盤を確立し提案する予定である。昨年度実施したパルスフィールド電気泳動法(PFGE)によるMRSAの型別分類法に加えて、本年度はSCCmecによる型別分類法を実施した。さらに、MRSA標準菌株を10菌株に増やして実施した。実験に使用した標準菌株はATCCより入手したS. aureus PFGE typing strainを用いた。PFGEの実施条件はアメリカ疾病管理予防センター(CDC)より報告されている標準化法に従った。遺伝子型別による系統樹の作成には分子系統樹作成ソフト(GelCompar II)を用いた。SCCmecによる型別分類法はY. Kondo (Antimicrob. Agents. Chemoth.,2007)らの報告に従いMultiplex PCRを実施した。その結果、今回調べたMRSA標準菌株のPFGEならびにSCCmec型は報告されている遺伝子型と一致した。以上のことから、報告者が実施した方法によりMRSAの型別分類が実施できるものと考え、今年度の目的は概ね達成できているものと考える。抗菌薬の不適切な使用は耐性菌選択圧を高めるだけでなく,耐性菌による院内感染の拡大にも直結する社会的な問題となっている.また,地域医療圏における抗菌薬の使用と耐性菌の出現や拡大に関する情報共有も決して十分とは言えず,抗菌薬の有効性・安全性を確保し,耐性菌を制御できる抗菌薬管理プログラムの構築は急務となっている.本研究は広島県下の複数(510施設程度予定)の急性期型病院の主要な注射用抗菌薬の使用数量(抗菌薬使用密度: Antimicrobial Use Density:AUD)、治療日数(Days of Therapy:DOT)及びAUDから算定される使用割合(Antibiotic Heterogeneity Index:AHI)を経月・経年的に調査し、臨床現場におけるmethicillin-resistant Staphylococcus aureus(MRSA)の分離状況との関係性について評価・解析することを目的とする。本年度は医療施設より分離されたMRSA102株について遺伝子型別分類を実施した。その結果、パルスフィールド電気泳動法(PFGE)による型別分類法では16の遺伝子型に分類された。2種類のPFGE型において、異なる医療施設から離された株が存在したことから、これらの型では、広島県の地域内で伝播している株である可能性が考えられる。これらの共通の遺伝子型を有する菌のMultilocus sequence typing(MLST)を決定した結果、ST764およびST8系統に属することがわかった。
散乱電磁波を利用する流動液体の広帯域・低侵襲な動的材料定数測定手法

本研究は,配管中などを流れる液状物体の性質や状態を動的に評価するため,サンプリングを行うオフライン計測や流路内へのセンサ設置等を行うこと無しに,非侵襲的に管中の液体試料の高周波比誘電率および誘電損失を測定する測定手法の確立を目的としている.これまでに,球状容器に封入した水に対し照射した単一周波マイクロ波の散乱波電力と誘電率の関係を解析し,実験的にも強い相関があることが分かっている.この手法による円筒容器内の水の散乱波電力の理論的な解析を基に,水を長尺のパイプ中に封入して電波吸収体で遮蔽することでその一部を電波的に露出した状態について,分極の分布を考慮する誘電特性の補正係数を実験的に導出している.さらに,ポンプによる液体循環機構を構成し,液体回路の一部の管状部に上記の領域制限構造を持たせて測定を行った.その結果,照射電磁界の変化速度(周波数)が液体の流速より十分早い範囲で,静止した液体から得られる散乱波スペクトラムの測定結果と流動する液体の散乱波測定結果の間に有意な差異はなく、本測定法が液体循環系へ適用できることが分かった.また,工業的に重要な潤滑や油圧作動に用いる油試料を測定対象とし,上記手法を拡張して広帯域の連続スペクトラムの差分評価を行う手法を開発した.加熱酸化試験による劣化や,水分および空気の混入による影響の評価実験を行い,その結果,特に加熱時間すなわち油劣化度と測定結果評価量の間に高い相関があることを確かめた.さらに,スペクトラム評価の精度向上のため,信号処理により直接波と散乱波の干渉改善する方法を提案した.併せて,測定系の実用性を高めるために,送受信アンテナの兼用化を行い,また周囲環境からの反射の影響を改善するためニューラルネットを用いたスペクトラム分析手法を導入した.測定環境として、より正確な基本特性取得のため電波暗室の特性改善を行っている.当初計画では精度の良い流体試料の測定環境の構築のため,アンテナと液体循環配管の配置の最適化を検討して電波暗箱を設計製作する予定であった.液体循環系を含む測定環境からの電波の不要反射の影響を再評価したところ,測定精度の改善にために既設シールド室内に電波吸収体を設置する改造を実施することに計画を変更し,電波吸収体の最適配置の検討および施工工事業者の選定などのため遅れが生じた.また,測定系の実用性を向上させるため,送受信アンテナの兼用化を図り,また取得データポイント数を増やしたことにより,データ解析手法の変更が必要となり,新たに周波数領域での処理手法とニューラルネット識別系の設計にためシステム化の遅れを生じた.当初想定した小型電波暗箱での測定から,他の配管や壁等による反射の影響を軽減してより正確な評価が可能なシールド室の暗室化を行い,その内部にて測定評価を実施するため,既に電波吸収体を導入済みである.この後,敷設を行い測定評価する.測定対象物として電解質の濃度を変えた液体試料を用いて,非接触・非侵襲な動的測定を実施し,本測定法の特性を検証する.流動する液状物体の性質や状態を,サンプリングしてのオフライン計測や配管内へのセンサの侵襲的設置を行わずに動的に評価するため,管中を流動または滞留する液体試料の高周波比誘電率および誘電損失を,連続的かつ非侵襲に測定する測定手法の確立を目的としている.初めに,球状誘電体試料に照射したマイクロ波の散乱波電力が物質の誘電特性と強い相関があることを利用する測定手法を確立した.その後,この手法により理論的に解析できる円筒状容器内の液体の散乱波電力を基に,長尺パイプ中に封入した液体試料を電波吸収体により領域制限した場合の測定結果に関して分極の分布を考慮する誘電特性の補正係数を導出した.一方,潤滑や油圧作動に用いる油試料に関して,上記手法を拡張して広帯域の連続スペクトラムの差分評価を行う手法を開発し,加熱酸化試験による劣化や,水分および空気の混入による影響の評価実験を行い,特に加熱時間すなわち油劣化度と測定結果評価量の間に高い相関があることを確かめることができた.また,スペクトラムの評価に際して直接波と散乱波の干渉対策と分離が精度向上には必要であるが,得られたスペクトラム特性に対する信号処理により改善できることを確かめた.次に,油などの液体循環系へ本手法を適用できることの検証のため,ポンプにより液体を循環させる機構を導入し,その液体回路の一部の管状部に上記領域制限を実施する構造を持たせて電波暗室内で測定した.その結果,照射電磁界の変化速度(周波数)が液体の流速より十分早い範囲では,静止した液体から得られる散乱波スペクトラムの測定結果と流動する液体の散乱波測定結果の間に有意な差異はないことを確認した.当初計画では精度の良い流体試料の測定環境の構築のため,アンテナと液体循環配管の配置の最適化を検討して電波暗箱を設計製作する予定であった.これに対して,学会での議論を通してアンテナの本数および配置の見直しを行い,また液体循環系を付け加えるための改造により設計に遅れが生じた.サンプリングを要するオフライン計測や流動経路内へのセンサの設置を行わずに,配管中などを流れる液状物体の性質や状態を動的に評価するため,管中の液体試料を非侵襲的にその高周波比誘電率および誘電損失を測定する測定手法の確立を目的としている.初めに,球状容器に封入した液体試料を用い,照射した単一周波マイクロ波の散乱波電力が試料の誘電率と強い相関があることを確認した.その後,この手法により,円筒状の容器内の液体の散乱波

電力の理論的な解析を基に,液体試料を電波吸収体で遮蔽した長尺のパイプ中に封入した状態でその一部を電波的に露出した場合の測定結果に関して,分極の分布を考慮する誘電特性の補正係数を導出した.一方,潤滑や油圧作動に用いる油試料に関して,上記手法を拡張して広帯域の連続スペクトラムの差分評価を行う手法を開発し,加熱酸化試験による劣化や,水分および空気の混入による影響の評価実験を行い,その結果,特に加熱時間すなわち油劣化度と測定結果評価量の間に高い相関があることを確かめた.また,スペクトラム評価の精度向上のため,信号処理により直接波と散乱波の干渉改善する方法を提案した.次に,液体循環系への適用の検証のため,ポンプによる液体循環機構を導入し,液体回路の一部の管状部に上記の領域制限構造を持たせて測定を行った.その結果,照射電磁界の変化速度(周波数)が液体の流速より十分早い範囲で,静止した液体から得られる散乱波スペクトラムの測定結果と流動する液体の散乱波測定結果の間に有意な差異はないことを確認した.一方,実用的な測定系のために,送受信アンテナの兼用化と,周囲環境からの反射の影響を改善するためスペクトラム分析手法としてニューラルネットなどの確率統計手法の導入を進めるとともに,正確な基本特性取得のため電波暗室の特性改善を行っている.当初計画では精度の良い流体試料の測定環境の構築のため,アンテナと液体循環配管の配置の最適化を検討して電波暗箱を設計製作する予定であった.実用的システムとするため,送受信アンテナの兼用化を図り,また取得データポイント数を増やしたことから,データ解析手法の変更が必要となった。さらに,液体循環系を含む測定環境からの電波の不要反射の影響を再評価したところ,測定精度の改善にために既設シールド室内に電波吸収体を設置する改造を実施することに計画を変更したため遅れが生じた.本研究は,配管中などを流れる液状物体の性質や状態を動的に評価するため,サンプリングを行うオフライン計測や流路内へのセンサ設置等を行うこと無しに,非侵襲的に管中の液体試料の高周波比誘電率および誘電損失を測定する測定手法の確立を目的としている.これまでに,球状容器に封入した水に対し照射した単一周波マイクロ波の散乱波電力と誘電率の関係を解析し,実験的にも強い相関があることが分かっている.この手法による円筒容器内の水の散乱波電力の理論的な解析を基に,水を長尺のパイプ中に封入して電波吸収体で遮蔽することでその一部を電波的に露出した状態について,分極の分布を考慮する誘電特性の補正係数を実験的に導出している.さらに,ポンプによる液体循環機構を構成し,液体回路の一部の管状部に上記の領域制限構造を持たせて測定を行った.その結果,照射電磁界の変化速度(周波数)が液体の流速より十分早い範囲で,静止した液体から得られる散乱波スペクトラムの測定結果と流動する液体の散乱波測定結果の間に有意な差異はなく、本測定法が液体循環系へ適用できることが分かった.また,工業的に重要な潤滑や油圧作動に用いる油試料を測定対象とし,上記手法を拡張して広帯域の連続スペクトラムの差分評価を行う手法を開発した.加熱酸化試験による劣化や,水分および空気の混入による影響の評価実験を行い,その結果,特に加熱時間すなわち油劣化度と測定結果評価量の間に高い相関があることを確かめた.さらに,スペクトラム評価の精度向上のため,信号処理により直接波と散乱波の干渉改善する方法を提案した.
開口放出部位を模した脂質平面膜法を用いた分泌小胞局在ＣａチャネルＯｒａｉ２の解析

マスト細胞は炎症性メディエーターを放出して、アレルギー反応において重要な役割を果たしている。このメディエーターの開口放出は細胞内Ca2+濃度上昇によって誘導される。Ca2+流入は主にCRACチャネルを介したストア作動性Ca2+流入である。CRACチャネルのひとつであるOraiには3つのアイソフォームがあるが、我々は、Orai-2が主に分泌顆粒に局在することを見出した。Ora-2をノックダウンすると、細胞内Ca2+ストアからのCa2+放出が抑制され、また脱顆粒も抑制された。マスト細胞では、Orai-2は細胞内Ca2+ストアからのCa2+放出に影響して、脱顆粒を制御している。昨年度構築したRNAi法によるOrai2のノックダウンマスト細胞株の構築、ノックダウンマスト細胞株の細胞内Ca2+濃度動態と開口放出活性の実験から、Orai2をノックダウンすることによって、細胞内CaストアからのCaの放出が抑制されることが明らかとなった。今年度は次のような研究を行った。1. Orai2がマスト細胞以外の細胞では、どこに局在するかを検討した。その結果、COS7細胞とHeLa細胞では、Orai2はOrai1と同様、細胞膜に局在し、細胞質のオルガネラへの局在はほとんど認められなかった。このことから、Orai2の分泌小胞への局在は、マスト細胞に特徴的な分布であることが明らかとなった。2.ノックダウン株へのOrai2の導入による救済実験を行ったところ、細胞内CaストアからのCa2+の放出が抑制はあ一部回復したが、100%は回復しなかった。3.抗原刺激ではなく、細胞内CaストアからのCa2+の放出を誘導するタプシガルギンで刺激すると、ノックダウン株の細胞内Ca濃度上昇は野生株と差は認められなかった。また、タプシガルギン刺激による開口放出の阻害も認められなかった。このことは、Orai2のノックダウンによってCaストア内のCa量が減少したわけではないことを示唆する。4.分泌小胞膜に局在するOrai2が、いかにして細胞内CaストアからのCa2+の放出を制御するのかを明らかにするために、蛍光蛋白質GFPを結合したOrai2と小胞体(ER)とのOraiと相互作用する事が示唆されている、TRP(transient receptor potential)チャネルとOrai2の相互作用を検討するために、3種類のTRPチャネルのクローニングを行った。我々は、細胞内Caストアの枯渇によって活性化される細胞膜に発現するCaチャネルであるOraiについて、アレルギー担当細胞であるマスト細胞での役割を検討してきた。Oraiの3つのサブタイプのうち、Orai2だけが分泌小胞に局在することを明らかにした。平成25年度は、Orai2が細胞刺激に伴う細胞内CaストアからのCa放出を制御するメカニズムについて検討した。そのために、Orai2と相互作用するTRP(transient receptor potential)チャネル、TRPC1との相互作用を検討したが、マスト細胞におけるOrai2との相互作用を確認することはできなかった。そこで、Orai2による細胞内CaストアからのCa放出制御にOrai2のCaチャネルとしての作用、およびOraiの活性化に必須のタンパク質STIMとの相互作用が必要であるかどうかを検討することとした。そのために、STIMなしに恒常的活性化型となる変異をOrai2に導入したもの(Orai2(G135D))、およびSTIMとの相互作用ができなくなる変異をOrai2に導入したもの(Orai2(W113P))を発現させた。その結果、恒常的活性化型をマスト細胞に発現させると、恒常的なCa流入による細胞毒性により、メカニズム解明に至らなかった。STIMとの相互作用ができないものについては、現在検討を続けている。研究期間全体として、分泌小胞に局在するOrai2がマスト細胞の抗原刺激によるエクソサイトーシスを正に制御すること、抗原刺激による細胞内CaストアからのCa放出は制御するが、タプシガルギンによるCa放出には影響しないこと、細胞外からのCa流入への関与は少ないことを明らかにした。CaストアからのCa放出の機構については明らかにならなかったが、Oraiの新しい機能を見出した意義は大きい。花粉症や喘息などの即時型アレルギーは、マスト細胞から分泌されるヒスタミンによって惹起される。ヒスタミンは、細胞内の分泌小胞内に蓄えられており、刺激に伴う細胞内Ca濃度上昇がトリガーとなり、開口放出によって分泌されう。この細胞内Ca2+濃度上昇を担うCa2+チャネルとしてOraiとよばれるCaチャネルが同定された。Oraiには3つのサブタイプ(Orai1,2,3)がるが、我々は、マスト細胞においてOrai2が細胞膜ではなく分泌小胞膜上に局在することを見出した。そこで次のような研究を行った。

(1)RNAi法によるOrai2のノックダウンマスト細胞株の構築:複数のOrai2を特異的にノックダウンするために、複数のオリゴRNAを設計し、Orai2の安定低発現株を得た。(2)Orai2のノックダウンマスト細胞株の細胞内Ca2+濃度動態:(1)で得られたOrai2の低発現株について、抗原刺激に対する細胞内Ca2+濃度上昇をFura-2を用いて測定したところ、細胞内CaストアからのCa2+の放出が低下していた。(3)Orai2のノックダウンマスト細胞株の開口放出活性評価:Orai2の低発現株について、抗原刺激に対する開口放出活性をβ-ヘキソサミニダーゼの活性を指標に測定したところ、開口放出による分泌が低下していた。Orai2のノックダウンによって、細胞内CaストアからのCa2+の放出が抑制されることは全く予期しない結果であった。今後、この点について追究していく必要がある。Orai2をノックダウンすることによって、細胞内CaストアからのCaの放出が影響を受けることは全く想定外であった。そこで、その結果の確認を行ったところ、Orai2のノックダウンによって、抗原刺激に伴う細胞内CaストアからのCaの放出が抑制されることを確認した。しかしながら、Orai2と小胞体の相互作用の実験からクリアな結果が得られず、依然として分泌小胞に局在するOrai2が、細胞内CaストアからのCa2+の放出の制御する手掛かりがつかめず、達成度の点からはやや遅れていると判断される。RNAi法によるOrai2のノックダウンマスト細胞株の構築、ノックダウンマスト細胞株の細胞内Ca2+濃度動態と開口放出活性の実験は予定通り行われた。しかしなgら、Orai2をノックダウンすることによって、細胞内CaストアからのCa2+の放出が影響を受けることは全く想定外であった。そこで、その結果の確認を行うとともに、Orai2による細胞内CaストアからのCa2+の放出の制御機構を明らかにすべく、実験計画を再検討したため、達成度の点からはやや遅れていると判断される。今後の研究として、次の項目を中心に実験を行う。1. Oraiと相互作用する蛋白質としてしられているTRPとのタンパク質間相互作用を検討する。2. Orai2による細胞内CaストアからのCa放出制御には、Orai2の細胞質ドメインが細胞内Caストアの膜上の蛋白質と相互作用が関わっている可能性がある。そこで、Orai2の細胞質ドメインのみを強発現させ、これによってCaストアからのCa放出がどのような影響を与えるか検討を行う。3.分泌小胞自体がCaストアとして働き、Orai2が分泌小胞からのCa放出に関与している可能性を検討する。平成24年度は、当初の計画であった、ノックダウン株へのOrai2の導入による救済実験を行うほか、Orai2による細胞内CaストアからのCa2+の放出の制御機構を明らかにすべく、次の2点について中心的に実験を行う。(1)Orai2と細胞内Caストアの可視化解析分泌小胞膜に局在するOrai2が、いかにして細胞内CaストアからのCa2+の放出を制御するのかを明らかにするには、両者の細胞内での相互位置関係の情報が不可欠である。
カルボニルスルフィドなどの含硫・温室効果気体の発生とそのモニタリングに関する研究

カルボニルスルフィド(以下COSと略)は成層圏に5×10^<11>g存在し、地表からの放出量が5×10^<12>g/yという推定値が提出されている。この推定値が正しければ、COSの放出量は二酸化炭素の1/1000,又同様に微量温質効果気体であるフロンの約1000倍ということになる。COSはCO_2に較べて長波長側の赤外領域に吸収帯をもち,温室効果気体としても重要である。本研究では発生の実態が十分把握されていないCOSをはじめとする含硫気体の発生を、広島市周辺と瀬戸内海西部でモニタリングした。大気中のCOSはPorapakーQをつめた捕集管で捕集した後、FPDーガスクロマトグラフで定量した。まず広島大学豊潮丸航海(6月6日ー7日)において瀬戸内海伊予灘,周防灘海上における大気を測定したが、この時はCOSは測定されず、CS_2のみ伊予灘において60pg/lという値が1回だけ得られた。また広島市中心部(広島大学総合科学部)では10pg/lの値が得れるが、1日の変化は極めて複雑であり、一定の傾向は得られなかった。これは風向、排ガスの寄与など複雑な要因がからみ合うためであると考えられる。一方広島市太田川河口域の海面直上の大気を採取したところ、夏期(8月1日)において15ng/lのCOSを観測したが、特に日照の強い昼間部(11:00ー16:00)でCOSの濃度が増加することを確認した。これに対し冬期(12月19日)においては、10pg/l以下のCOSしか測定できなかった。このことは日照及び気温(水温)がCOSの発生に重要な因子となる事を示唆している。そこで様々な硫黄化合物の水溶液にXeーランプ光を照射したところ、チオ-ル基をもつシステイン酸やナルカプトエタノ-ルからはCOSが発生すること、又SーS結合をもつ化合物からはCOSと共にCS_2が発生することが明かとなった。以上の結果は水圏における光化学反応によりCOSが発生すること、又この過程が水圏から気圏への硫黄のフラックスの存在を示すこと等の点で極めて重要と考える。
日本の生物学史研究の歴史と将来展望に関する研究

本年度の研究実施計画に基づき以下の諸点を中心に研究を予定通り遂行した。1.生物学史関連論文のデータベース化「生物学史研究」、「科学史研究」、「Historia Scientiarum」「Journal of History of Biology」等、国内外の専門雑誌に掲載された生物学史関係論文の題名、著者、領域等をデータベース化した情報をインターネット上で公開できる準備を整えた。どのホームページからのリンクによるアクセスが最適なのか検討した。情報環境が整備され次第ネット上で公開する予定である。2.研究成果め報告及び研究に対するレビュー・情報交換これまでの研究成果をまとめ、2001年7月8日から14日までメキシコ・シティにいて開催された第21回国際科学史会議において"The progress of studies in the history of biology in Japan"と題して報告した。その際、イタリア、メキシコ、アメリカの研究者と意見交換を行ないレビューを受けた。3.1次資料の活用米国のジョンズ・ホプキンス大学大学院で学び、日本の動物学に大きな貢献をした動物学者の入学動機、受講科目、担当教員等を1次資料を使ってまとめた。4.成果報告書の作成3年間の成果を中心に、研究課題全般ついての冊子体の報告書を作成した。1.国内で刊行されている生物学史関係の専門雑誌「生物学史研究」(1955年創刊)および、「科学史研究」(1941年創刊)、「Historia Scientiarum」(1961年創刊)の創刊号から1990年代半ばまでに掲載された生物学史関係論文のリストアップを行った。そして、これらの題名、著者、ジャンルなどをパーソナル・コンピュータに入力し、データベース化を行った。さらに整備し、インターネット上で公開できる準備を進めている。2.生物学史関係の図書、雑誌の収集に努め、研究遂行に必要な資料をほぼ揃えることができた。3.生物学史以外の学術史領域の研究状況を知るため心理学史関係の研究者と緊密な連絡・情報交換を行った。日本心理学会第63回大会ラウンドテーブル「日本心理学史の展開:明治期・大正期における海外心理学の受容と導入」において指定討論者として議論を行った。4.明治期以降の日本の動物学史の展開を考える上で重要と考えられる動物学者、箕作佳吉および実験動物学の成立に大きな貢献をしたと捉えられている谷津直秀の滞米在学記録を米国研究機関から入手した1次資料および日本側の資料からまとめ論文として発表した。さらに、これまでの日本の生物学史研究で手薄であった大正期の性科学、異常心理学(当時の呼称は変態心理学)に対する生物学的知識の貢献を文献的に調査し、論考としてまとめた。1.国内で刊行されている「生物学史研究」、「科学史研究」、「Histria Scientiarum」に掲載された生物学史関係論文の題名、著者、領域等のパソコンへの入力を終え、さらにキーワード検索ができるようにキーワードを設定した。2.外国の生物学史研究の動向を知るため、「Journal of History of Biology」掲載論文の特徴を解析した。その結果、同誌では1970年代以降、進化論に関する論考が増加し、全論文の約3割を占めることが明らかになった。また、生化学・分子生物学の歴史に関する研究も多数見られた。一方、日本の上掲誌でも進化論関係の論文は多いが、その数は2割以下であった。生化学・分子生物学史はごく少数しかみられなかった。3.日本の生物学の展開に大きな影響を与えたと考えられている米国ウッズホール臨海実験所の刊行物を分析した。1890年代から日本人研究者が同実験所へ赴き、研究を行なっているが、具体的な内容が窺える保存資料は乏しかった。4.日本では明治初期の生物学者に静岡県出身が多いことが判り、浜松市を中心に現地調査を行なった。しばしば言及される県民性や風土と生物学者の出現に強い関連があるとは思われなかった。また、県史、郷土史を調べても産業界で活躍した出身者に比べて記述が乏しかった。1.生物学史関連論文のデータベース化

「生物学史研究」、「科学史研究」、「Historia Scientiarum」「Journal of History of Biolgy」等、国内外の専門雑誌に掲載された生物学史関係論文の題名、著者、領域等をデータベース化した情報をインターネット上で公開できる準備を整えた。どのホームページからのリンクによるアクセスが最適なのか検討した。情報環境が整備され次第ネット上で公開する予定である。2.研究成果の報告及び研究に対するレビュー・情報交換これまでの研究成果をまとめ、2001年7月8日から14日までメキシコ・シティにおいて開催された第21回国際科学史会議において"The progress of studies in the history of biology in Japan"と題して報告した。その際、イタリア、メキシコ、アメリカの研究者と意見交換を行ないレビューを受けた。3.1次資料の活用米国のジヨンズ・ホプキンス大学大学院で学び、日本の動物学に大きな貢献をした動物学者の入学動機、受講科目、担当教員等を1次資料を使ってまとめた。4.成果報告書の作成3年間の成果を中心に、研究課題全般ついての冊子体の報告書を作成した。
自己免疫疾患における新しい抗原提示機構とその意義について

IgGのどの部分がHLA-DRに結合しているのかを調べるため、IgGを断片化したベクターを作成した。また、抗原提示に必要とされる関連分子をクローニングした。それぞれのベクターとHLAを共発現させることで、HLAとIgGの結合部位を探索した。複数のHLAについて候補部位を同定した。また、その複合体を発現させた細胞を用意し、関節リウマチ患者のリウマチ因子陽性、陰性の血清をそれぞれ収集し、患者由来の抗体がどのようにHLA/IgG複合体を認識するのかを調べた。また、それらの複合体は、一過性発現だけではなく、恒常的に発現している細胞を作成するため、複数のレンチウイルスベクターを作成し、培養細胞上に抗原を提示させた。こちらは今後のT細胞の反応性の実験で用いる予定である。おおむね順調に進展している。HLA-DR/IgGの複合体を発現する細胞を組織で調べるため、多重免疫染色の方法を検討する。また、In vitroにおいて複合体の提示が起こりやすい条件を探索する。また、その他の自己免疫疾患における自己抗原のClass2 MHCによる提示の有無について検討する予定である。次年度の資金と合算して効率的に物品調達を行う予定である。未使用額の発生は効率的な物品調達を行った結果である。
波長同調を要しないレーザー光音響ラマン分光によるガス検知の研究

昨年度は、申請者が考案した新しいスキームでの光音響ラマン分光(PARS)の実践を行なったが、本年度は同じ光音響分光については更なる感度向上や対象の拡大をおこなった。水素(H_2)及びメタン(CH_4)に続き二酸化炭素CO_2や酸素O_2に対象を広げ、実験を行なうことで、CO_2については30ppmという検知感度を得ることができ大気中CO_2のモニタリング似も適用可能であることを示せた。一方、O_2については、0.7%O_2の感度にとどまり、適用は可能であったものの感度が向上しない例があることも確認できた。PARSでは測定場の圧力が変化したり、高温であった場合には検知系を配置できない。また、リモート検知も困難である。そこで、こうした問題を解決できるような非線形ラマン分光法に適用をこころみた。最初に行なったのはコヒーレント反ストークスラマン分光(CARS)である。CARSは一般に燃焼計測などで用いられる手法であるが、本スキームによってもH_2やCH_4検知が可能であることが示された。しかしながら、感度の面では理論的にも、実験的にもPARSには劣っていることが分かった。次に、適用したのは誘導ラマン利得分光である。本法では理論的にも感度良い検知が可能であり、予備的実験ながら、H_2で60ppmの検知限界を得ることができた。今後はこうした結果をふまえ、これら新しい非線形ラマン分光法による検知感度の向上と、対象ガスの充実を図りたい。本年度は、申請者が考案した新しいスキームでの光音響分光での検知の実践を主体として行なった。当初の予定通り、波長を変えることができないものの、非常に安定して使用できるQスイツチNd:YAGレーザーの第二高調波(波長532nm)を使用し、水素(H_2)およびメタン(CH_4)の検知実験をおこなった。波長532nm、100200mJのレーザービームを直径5mmにコリメートして、長さ2mのラマンセルに入射した。ラマンセルには検知対象ガスと同じガスを110気圧の高圧で充填した。まず、ラマンセルから取り出されるストークス光の特性を測定し、光音響ラマン分光法に適用した際に最も良好な信号が得られるように最適化した。その結果、ラマンセル内圧力は水素で0.9気圧、メタンで5気圧と低い圧力の方が、ラマン変換効率は下がるものの、基本波光とストークス光の時間的・空間的マッチングが良好な事が重要であり、信号SN比の向上につながることが分かってきた。こうした最適化の後、得られた基本波光とストークス光を集光しつつ、光音響セルに入射した。光音響セルには窒素(N_2)ガスで希釈した測定対象ガスを1気圧で充填し、発生した音響信号をガラス製の共鳴管と高感度マイクロフォン(小野測器,MI-221)を用いて、オシロスコープで測定し、FFTを通して共鳴周波数付近を積算して光音響信号を得た。共鳴管やマイクのアラインメントについても最適化を行なった結果、H_2で2ppm、CH_4で1ppmの検知下限を達成し、本法が実際に高感度ガス検知に適用可能であることを初めて示した。今後はこうした結果をふまえ、検知感度の向上、他のガス類などの検知、同様のスキームが適用可能なガス分光検知について研究を行なう。
ブドウの果実生長におけるザントキシンの応用の解明

ブトウ果粒の生長曲線を含核数毎に調査した結果、無核果実では果実生長停滞期である第2期は有核果実に比べて短くなったが、種子数が1から3個の果粒では果粒の大きさは異なるものの、生長期間に差異は認められなかった。ブドウ果実から抽出した中性画分にアブシジン酸の前駆体であるザントキシンが存在することが明らかとなった。しかしながら、その含量は成熟開始期以降のアブシジン酸含量に比較してかなり低かった。種子と果肉における含量を比較すると、種子においてその含量が高く果実生長の停滞期である第1期終期において最も高かった。一方、果肉では種子においてみられたピークは無く、成熟期のアブシジン酸の増加とともに増加した。含核数別にアブシジン酸とザントキシンを果肉と種子で分析した結果、アブシジン酸含量は有核果実より無核果実において高く、有核果実では果肉種子ともに含核数による差異は認められなかった。また、ザントキシン含量もアブシジン酸同様果肉においては有核果実より無核果実において高く、無核果実では有核果実の果肉では認められなかったピークが第1期終期において認められた。このことから、ザントキシンは第1期の生長を抑制する作用を持ち、有核果実では種子がその供給源となり、無核果実では果肉自体でその制御を行っていると考えられた。しかしながら。果実生長第1期のザントキシンの外生処理は果実生長を抑制せず、成熟にも影響しなかった。処理濃度が50ppmと低かったことがこの要因であると考えられ、処理濃度について再検討する必要があると考えられた。しかしながら。
マウスES細胞の未分化状態維持に関与する新規遺伝子の機能解析

Ces1ノックアウトES細胞を用いてCes1遺伝子の未分化性維持に係わる機構を解析した。ノックアウト細胞はキメラ形成能を維持していたが、テラトーマ形成能を喪失していた。ノックアウト細胞から胚様体を形成しin vitro分化能を検討したところ、野生型ES細胞と違いは見られなかった。Zinc finger蛋白であるCES1は転写因子として機能していると考えられ、ChIP sequence法により解析した結果、特に遺伝子の転写開始点近傍に多くの結合が確認された。Ces1蛋白により発現抑制される遺伝子の転写開始点近傍に結合が多く見出され、CES1はrepressorとして機能していると推定された。未分化ES細胞特異的に発現する遺伝子として見出したCes1遺伝子の機能を解析するために、以下の実験を行った。1)Ces1遺伝子のコードする蛋白(CES1)に対する特異的抗体の作成:CES1蛋白の一部とGST (glutathione S transferase)の融合蛋白を大腸菌で作成し、精製後、ウサギに免疫し、抗血清を作成した。CES1蛋白部分については、zincfinger motifなどを含まない、特異性の高いペプチド配列部分を選定した。得られた抗体を用いて、マウスES細胞を免疫染色し、CES1蛋白の核局在を確認した。この抗体を用いてCES1蛋白がwestern blot法により検出できることを確認した。コントロールとして、Ces1遺伝子ノックアウトES細胞を用いた。2)遺伝子発現への影響の解析:ES細胞におけるCes1遺伝子発現の有無による他の遺伝子発現への影響を検討するため、Ces1遺伝子ノックアウトES細胞と過剰発現ES細胞の間でDNAマイクロアレイを用いて網羅的に解析した。4倍以上大きく発現の変化した遺伝子の一部についてはreal-time PCR法を用いて、発現レベルの詳細な比較を行い、マイクロアレイ解析の結果との整合性を確認した。3)分化能への影響の解析:Ces1遺伝子ノックアウトES細胞のin vitro分化能を胚様体形成により調べたところ、大きな異常は見出されなかった。一方、in vivoでは、Ces1遺伝子ノックアウトES細胞はテラトーマの形成能を失っていることが判明した。これらの結果から、Ces1遺伝子のES細胞機能における重要性が示された。本研究では、Ces1ノックアウトES細胞を用いてCes1遺伝子の機能を明らかにすることにより、細胞の未分化性維持に係わる因子や機構を解明する。1キメラ形成能の検討:CAG-EGFP遺伝子を導入したCes1ノックアウトES細胞を作成し、これを胚盤胞に注入し、キメラ胚の作製を行った。発生途中で胚を取り出し、ラベルされた細胞の分布を解析したところ、全身に分布することが示された。さらに、キメラマウスが誕生し、生殖系列へ伝達が起きることも確認された。これにより、Ces1ノックアウトES細胞が全能性を維持していることが確認された。2Ces1ノックアウトES細胞の増殖能の検討:MTTアッセイにより、ノックアウトES細胞、野生型ES細胞、rescue ES細胞の間で、増殖能を検討したところ、Ces1発現により増殖が低下することが示された。3Ces1発現のRT-PCRによる解析:受精卵から胚盤胞までの胚を採取し、RNA抽出し、RT-PCRによりCes1遺伝子の発現を解析した結果、強い発現が確認された。4Dppa3/Stella遺伝子の発現制御領域におけるCGのメチル化の解析:Dppa3/Stella遺伝子の発現制御領域について、CGのメチル化をノックアウトES細胞、野生型ES細胞、rescue ES細胞の間でbisulfite sequencingにより解析した。その結果、Ces1発現により、Dppa3/Stella遺伝子の発現制御領域のメチル化が解除されることが示された。本研究では、Ces1ノックアウトES細胞を用いてCes1遺伝子の機能を明らかにすることにより、細胞の未分化性維持に係わる因子や機構を解明することを目的とする。今年度は、ChIP-sequenceにより染色体上のCES1結合部位の同定を行った。Zinc finger motifを有する蛋白質であるCES1は転写因子として機能していると考えられ、ChIP-seqにより染色体上のCES1結合部位を明らかにできると想定された。Ces1ノックアウトES細胞にTy1-tagを結合したCES1蛋白を発現するプラスミドベクターを導入し、その細胞の核からTy1抗体を用いて、ChIP-seqを行った。同定された結合部位のピークは転写開始点の近傍に位置するものが多く、CES1が転写制御に関わることが強く示唆された。DNA microarray解析により発現の変動した遺伝子の近傍について調べたところ、CES1で発現が抑制される遺伝子の近傍にChIP-seqのピークが多く見出されるのに比し、CES1で発現が活性化する遺伝子の近傍にはほとんどピークが見出されなかった。この結果から、CES1は転写抑制に働いていると推定された。そこで、GST-CES1融合蛋白を作製し、ES細胞に対しプルダウンアッセイを行い、結合した蛋白を質量分析によるShotgun解析したところ、染色体のエピジェネティック制御に関わる蛋白が数多く検出された。これらの結果から、CES1は遺伝子の制御領域に結合し、エピジェネティックな修飾を引き起こすことにより、その遺伝子の活性を抑制しているものと考えられた。以上の結果は、ES細胞における遺伝子発現制御における新たな機構を提示するとともに、その異常により、ES細胞の未分化状態が大きく影響を受けることが示された。

ノックアウト細胞はキメラ形成能を維持していたが、テラトーマ形成能を喪失していた。ノックアウト細胞から胚様体を形成しin vitro分化能を検討したところ、野生型ES細胞と違いは見られなかった。Zinc finger蛋白であるCES1は転写因子として機能していると考えられ、ChIP sequence法により解析した結果、特に遺伝子の転写開始点近傍に多くの結合が確認された。Ces1蛋白により発現抑制される遺伝子の転写開始点近傍に結合が多く見出され、CES1はrepressorとして機能していると推定された。これまでの研究により、Ces1ノックアウトES細胞の基本的な性質の解析がほぼ終了し、CES1の結合部位や他の蛋白性因子との結合を解析するところまで進んでいる。再生医学、糖尿病学これまでの検討から、Ces1遺伝子がどのようなターゲット遺伝子に作用しているかを明らかにすることが重要と考えられる。Zinc finger motifを有する蛋白質であるCES1はDNAに結合して機能していると考えられ、そのターゲット遺伝子をChiP sequencingにより解析する予定である。また、CES1蛋白は他のヒストン修飾、DNAメチル化制御蛋白とも相互作用している可能性が考えられ、その観点からの検討も進める予定である。現在までの研究により、CES1蛋白に対する特異的な抗体の作成に成功した。また、Ces1ノックアウトES細胞の解析も順調に進展しており、遺伝子発現の変化、in vitro分化、テラトーマ形成についてのデータが得られた。特に興味深いことに、Ces1ノックアウトES細胞はin vitro分化能を維持しているにもかかわらず、テラトーマ形成能を失っていることが判明した。予定していた実験計画は順調に進展しており、次年度の計画に進む予定である。本研究により得られる知見は、生命科学の重要な課題の1つとなっているES細胞の未分化状態維持機構の解明に有用な情報をもたらすと期待される。(1) ChiP-qPCRによる解析:DNAマイクロアレイ解析により、Ces1欠損により大きく発現の低下する遺伝子が見出された。これらの遺伝子について、各発現制御領域へのCES1蛋白の結合をChiP-qPCRにより検討する。さらにこれら領域のCGメチル化をノックアウトES細胞、野生型ES細胞、rescue ES細胞の間でbisulfite sequencingにより検討する。(2)免疫沈降と質量分析によるCES1結合蛋白の同定:CES1は核蛋白であり、クロマチンに結合している可能性が高いと考えられる。核分画からCES1を免疫沈降し、共沈する蛋白をSDSポリアクリルアミド電気泳動、質量分析により解析する。(3)キメラ形成能の検討:Ces1遺伝子ノックアウトES細胞をblastocyst injectionすることにより、キメラマウス作成を試みる。
細胞間相互作用を有する精巣細胞システムの開発

TTE3セルトリ細胞とTTE1ライディヒ細胞を共培養した時,セルトリ細胞において数多くの遺伝子の発現が変動した.本細胞システムにおいて,セルトリ細胞の細胞分化の指標であるトランスフェリンの発現が上昇し,細胞周期関連遺伝子であるサイクリンD1の発現が減少した.さらに,コンピューターを用いた遺伝子発現解析により,細胞間相互作用に関連するユニークな遺伝子ネットワークを明らかにした.TTE3セルトリ細胞とTTE1ライディヒ細胞を共培養した時,セルトリ細胞において数多くの遺伝子の発現が変動した.本細胞システムにおいて,セルトリ細胞の細胞分化の指標であるトランスフェリンの発現が上昇し,細胞周期関連遺伝子であるサイクリンD1の発現が減少した.さらに,コンピューターを用いた遺伝子発現解析により,細胞間相互作用に関連するユニークな遺伝子ネットワークを明らかにした.細胞間相互作用を有する精巣細胞システムの開発を目指し,今年度は本システムに使用する不死化セルトリTTE3細胞の性質を詳細に解析した. TTE3細胞は,許容温度で増殖し,非許容温度では細胞が分化する.網羅的遺伝子発現解析と解析ソフトウエアーを用いて,この分化の過程に関与する遺伝子を詳細に調べた結果,約900遺伝子が発現変動し,これらは階層解析により6遺伝子グループに分けることができた.遺伝子発現が上昇する遺伝子クラスターIVから, CDKN1A, RB1, KIT, STAT1等を含む遺伝子ネットワークが明らかになった.また,遺伝子発現が減少する遺伝子クラスターIから,FOSL1,PLAUR, FN1等の遺伝子を含む遺伝子ネットワークも明らかになった.発現変動する遺伝子やこれらの遺伝子ネットワークがTTE3セルトリ細胞の細胞分化に関与している可能性が示された(Cell Biol. Int. 31,1231-1236,2007).現在,不死化ライデイヒTTE1細胞の遺伝子発現プロファイルと検討している.また,TTE1細胞を用いて,外因性エストロゲン様化学物質がLeydig細胞株TTE1のステロイドホルモン産生系遺伝子発現に与える影響とヒストンアセチル化解析を行なった(環境ホルモン学会第10回研究発表会).その他,バイオインフォマティクスの手法を用いて,化合物や細胞分化に関係する遺伝子ネットワークを明らかにした(Int. J. Hyperthemia 23,529-537,2007; J. Cell.Biochem. 102, 1472-1485, 2007).細胞間相互作用を有する精巣細胞システムの開発を目指し,今年度は本システムに使用する不死化Sertoli TTE3細胞と不死化Leydig TTE1細胞の共培養系における細胞間の相互作用を検討した.膜フィルターを用いてTTE3細胞とTTE1細胞を共培養し,TTE3細胞の遺伝子発現変化を網羅的に調べた.その結果,数多くの遺伝子の発現が変動することが明らかとなった.発現が上昇する遺伝子には,VEGF, CAT, E2F1, TFが含まれた.TF (transferrin)は,Sertoli細胞の細胞分化の指標であり,Leydig細胞との共培養によりSertoli細胞が分化することが示された.発現が減少する遺伝子には,CCND1, CASP9, MET, TFRCが含まれた.CCND1 (cyclin D1)は,細胞増殖に関与する遺伝子で,この遺伝子の減少が,細胞増殖抑制に関与する可能性が考えられる.現在,発現変動する遺伝子の機能を解析している.その他,バイオインフォマティクスの手法を用いて,物理化学的なストレスに応答する遺伝子ネットワークを明らかにした(Int. J. Hyperthermia 24, 613-622, 2008; Cancer Lett. 270, 286-294, 2008).さらに,温度感受性SV40大型T抗原遺伝子導入トランスジェニックラットから新規に種々の機能を有した気道上皮細胞モデルの構築を行った(Cell Biol. Int. 32, 1344-1352, 2008).コラーゲンタイプI処理膜フィルターを用いてTTE3 Sertoli細胞とTTE1 Leydig細胞を共培養した時,お互いの相互作用により数多くの遺伝子の発現が変動することを明らかにした.特に,Sertoli細胞の細胞分化の指標であるtransferrinがLeydig細胞との共培養により発現が上昇することを確認した.これらの結果から,細胞間相互作用を有する精巣細胞システムが構築できたと考えられる.さらに,本システムが血液ー精巣関門のモデルとなり得るか否かを調べた.本条件下,細胞間の有意な膜電気抵抗が形成されなかったので,TTE3細胞間には完全な密着結合が形成されていないことが示された.これは,網羅的な遺伝子発現解析により,密着結合の構成タンパク質である,occludinやclaudin 11が発現していないことからも示された.一方,密着結合の構成タンパク質であるZo-1は発現していた.現在,密着結合が形成され,血液ー精巣関門を完全なものにするために,細胞外マトリックスの効果を検討している.内分泌かく乱物質bisphenol AによりSertoli細胞に小胞体ストレスが誘導される.Sertoli細胞において,小胞体ストレスを伴う細胞障害に抗酸化タンパク質DJ-1がどのように機能しているのか調べた.Thapsigarginによる小胞体ストレスを伴う細胞障害に対してDJ-1は細胞保護的に機能していることが明らかとなった.その他,温度感受性simian virus 40大型T抗原遺伝子導入トランスジェニックラットから新規に種々の機能を有した口腔や皮膚の細胞モデルの構築を行った.
MR感受性高血圧の分子メカニズムにおける新規転写共役因子C14orf43の役割

MRは核内受容体に属する蛋白であり、アルドステロン依存性にENaCやSGK1などの標的遺伝子の発現を促進し、腎遠位尿細管においてナトリウムの再吸収を通じ血圧を上昇させる機能を持つ。しかしながら、MR活性化に関わる分子メカニズムは未だ詳細が不明のままである。我々はFLAGタグ付きMR安定発現HEK293細胞を樹立し、その細胞から核抽出液を取得し、FLAG抗体によるアフィニティ精製を行い、LC-MS/MSによる同定を行うことで、C14orf43という機能未知因子をMR相互作用因子候補として同定した。そこでマウス腎臓組織の免疫染色を通じてMRとの共局在を確認するとともに、qPCR法でアルドステロン依存性のMR標的遺伝子の定量化測定を行い、C14orf43がMRの新規co-repressorであることを示す結果を得た。またC14orf43のMR転写抑制機能をさらに詳細に検討するために、C14orf43と相互作用する蛋白質の網羅的同定を、安定発現細胞株の樹立→大量培養→FLAG抗体による精製→LS-MS/MSを用いた方法でより精度を高めて試みたところHDAC1やHDAC2、RPD3、SENP3、TdIF1、CHD4、RBBP4、MTA2、MBD4などのエピゲノム制御因子蛋白を同定できた。以上の結果からC14orf43がヒストン脱アセチル化やユビキチン化、DNAメチル化などを介してMRの転写を負に制御していることが考えられた。C14orf43ノックアウトマウスの作成については、従来からのアプローチによるキメラマウスからのC14orf43 floxマウスの作出は困難であったため、現在新たにゲノム編集技術を用いて作出を進めている。vitroの実験系については、おおむね計画通り進行している。これまでのvivoの実験については、作出できたキメラマウス2匹のうち、キメラ率が低いオス個体では、野生型マウスとの交配で出生するマウスが全て野生型マウスであり、このキメラマウスからのC14orf43 floxマウスの作出は困難であった。また、キメラ率が高いキメラマウスのオス個体では、野生型メスとの交配で不妊を呈した。そこで、動物実験センターにお願いし、オスキメラマウスの精巣上体から精子を取得する体外受精を試みたが、開腹したところオスキメラマウスの精巣上体がないことが判明し、本個体からもヘテロマウスの作出が不可能であることが判明した。以上の結果から、得られたES細胞の質の低下が考えられた。そこで現在は、別のアプローチからのノックアウトマウス作出を試みている。すなわち、C57BL/6マウスの受精卵にCAS9蛋白、crRNA、tracrRNAを導入することにより、C14orf43のexon2のゲノムDNA切断場所にindelsを挿入し、遺伝子機能が失われることによりノックアウトマウスを作出する方法である。すでにcrRNA1の設計として3か所に絞り込みを行っており、その中から1つの配列に絞り込んだのち、マウス受精卵に遺伝子を導入予定となっている。得られるマウスはヘテロノックアウトマウスおよびホモノックアウトマウスの両者であり、これらのマウスの表現型解析を行う予定である。上記のマウス受精卵をマウス子宮に戻し、個体を誕生させたうえでC14orf43ホモ、ヘテロノックアウトマウスの存在をジェノタイピングから確認する。この得られたC14orf43ノックアウトマウスについては、妊娠能力、体格、体長の変化などをまず観察する。そして内分泌領域に変化がみられた場合、本研究室において解析手法が確立しているため、系統的な解析を行う。それ以外の場合は、適宜その分野の専門的研究者と共同研究を行う。特に血圧や前回質調節で変化がみられた場合には、8週齢になった時点でコントロール群とともに代謝ゲージ内で10日間飼育し、毎日体重を測定し、飲水量および蓄尿にて尿量も測定する。また、毎日非観血血圧測定計にてこれらマウスの血圧を測定する。またorbital venous plexusから血液を採取し、血液および尿サンプルから血中尿中電解質、各種ホルモン、浸透圧など様々な生理学的パラメータを測定し、GFRや尿中ナトリウム排泄率、TTKGなどを算出する。また、減塩食実験、DOCA-salt負荷実験、スピロノラクトン投与実験を同様に行い、採血、畜尿などの解析から、C14orf43のMR活性化、血圧調節に関わる機能を解明する。我々は、転写制御因子であるFLAGタグ付きMR安定発現HEK293細胞を樹立し、その細胞から核抽出液を取得し、FLAG抗体によるアフィニティ精製を行い、LC-MS/MSによる同定を行うことで、C14orf43という機能未知因子がMR相互作用因子候補として同定した。そこでマウス腎臓組織の免疫染色を通じてMRとの共局在を確認するとともに、ルシフェラーゼアッセイを行い、C14orf43がMRの新規co-repressorであることを示す結果を得た。またC14orf43のMR転写抑制機能をさらに詳細に検討するために、C14orf43と相互作用する蛋白質の網羅的同定を、安定発現細胞株の樹立→大量培養→FLAG

抗体による精製→LS-MS/MSを用いた方法でより精度を高めて試みたところ、HDAC1やHDAC2、RPD3、SENP3、TdIF1などの複数の蛋白質を同定できた。以上の結果から、C14orf43がヒストン脱アセチル化やユビキチン化、DNAメチル化などを介してMRの転写を負に制御していることが考えられた。C14orf43ノックアウトマウスの作成については、すでに相同組換えを起こしたES細胞を用いてオスキメラマウスの作製、野生型メスマウスとの交配によりヘテロマウスの作出を試みた。しかしながら、作出できたマウスでは、野生型マウスとの交配で出生するマウスが全て野生型マウスであり、このキメラマウスからのC14orf floxマウスの作出は困難であった。vitroの実験系については、おおむね計画通り進行している。一方、vivoの実験については、作出できたキメラマウス2匹のうち、キメラ率が低いオス個体では、野生型マウスとの交配で出生するマウスが全て野生型マウスであり、このキメラマウスからのC14orf43 floxマウスの作出は困難であった。また、キメラ率が高いキメラマウスのオス個体では、野生型メスとの交配で不妊を呈した。そこで、動物実験センターにお願いし、オスキメラマウスの精巣上体から精子を取得する体外受精を試みたが、開腹したところオスキメラマウスの精巣上体がないことが判明し、本個体からもヘテロマウスの作出が不可能であることが判明した。以上の結果から、得られたES細胞の質の低下が考えられた。そこで、理化学研究所と共同研究を締結のうえ、改めて別のlineでC14orf43 floxマウスの作出を行うことを検討している。現在、ターゲテイングベクターを作出しているところであり、近日中には、遺伝子組み換えES細胞の取得が終了し、続いてマイクロインジェクションによりC14orf43 floxマウスのヘテロマウスを取得する予定である。一方、本研究室ではすでに腎臓尿細管特異的CreマウスであるKSP1-Creマウスおよび全身性CreマウスであるCMV-Creマウスを所有している。従って、今後これらのCreマウスとC14orf43 floxマウスの交配を開始できると思われる。MRは核内受容体に属する蛋白であり、アルドステロン依存性にENaCやSGK1などの標的遺伝子の発現を促進し、腎遠位尿細管においてナトリウムの再吸収を通じ血圧を上昇させる機能を持つ。しかしながら、MR活性化に関わる分子メカニズムは未だ詳細が不明のままである。我々はFLAGタグ付きMR安定発現HEK293細胞を樹立し、その細胞から核抽出液を取得し、FLAG抗体によるアフィニティ精製を行い、LC-MS/MSによる同定を行うことで、C14orf43という機能未知因子をMR相互作用因子候補として同定した。そこでマウス腎臓組織の免疫染色を通じてMRとの共局在を確認するとともに、qPCR法でアルドステロン依存性のMR標的遺伝子の定量化測定を行い、C14orf43がMRの新規co-repressorであることを示す結果を得た。またC14orf43のMR転写抑制機能をさらに詳細に検討するために、C14orf43と相互作用する蛋白質の網羅的同定を、安定発現細胞株の樹立→大量培養→FLAG