hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
介護予防と在宅生活の継続を支援するケアマネジメント指針の開発

本研究の目的は、要介護状態にある在宅高齢者の視点に立った「在宅生活の継続」と「介護予防」に有効なケアマネジメント技術を明らかにすることにより、在宅生活の継続と介護予防を支援するケアマネジメントに関するガイドラインを開発し、そのガイドライン活用によりケア提供者の能力開発に寄与することである。2年間で要介護状態にある高齢者のなかで在宅生活の継続と介護予防に至った事例について、在宅生活の継続と介護予防に至った要因について検討し、その結果より、「在宅生活の継続」と「介護予防」を支援するため、ケアマネジャーが展開した援助技術であるアセスメントの項目をICFの枠組みに整理したアセスメント表を作成した。アセスメント表は、健康状態13項目、心身機能26項目、活動31項目、参加10項目、環境6項目、個人因子6項目、そしてアセスメント、ケアプラン作成のプロセスとして、8段階のステップから構成されている。また、アセスメント表を活用した、ケアマネジメントにおけるアセスメントのガイドラインとして「ICFを活用したアセスメントの手引き書」を作成した。その手引き書について、エキスパートであるケアマネジャーと協働関係にある、リハビリテーションの専門である医師、理学療法士のエキスパート、およびエキスパートであるケアマネジャーに、配布し、その評価を得、その結果より、「ICFを活用したアセスメントの手引き書」をさらに洗練化した。ケアマネジメント指針の開発に向け、ICF(国際生活機能分類)の枠組みを用いて在宅生活の継続と介護予防に至った事例について、アセスメント(情報収集の内容、分析の視点)の特徴について明らかにするために、アセスメント項目並びにプロセスについて検討した。分析に用いた事例は、エキスパートのケアマネジャー(看護職、介護職、福祉職)が担当し、研究に対し事例並びに家族の同意が得られた、独居高齢者2事例、医療依存度の高い要介護5の療養者2事例、認知症のある要介護高齢者2事例の計6事例である。事例分析にあたり、まず研究者が作ICFを活用したアセスメントシートを作成した。このアセスメントシートは、介護保険制度で活用されている課題分析表や認定審査調査項目、主治医意見書等介護保険制度で使用する書類の項目を全て取り出し、ICFの枠組みに分類し、研究者らで項目を検討し作成した者である。事例分析にあたっては、担当のケアマネジャー、ケア提供者、その他担当外のエキスパートのケアマネジャー、在宅ケアを専門とする研究者など6-8名の参加の下、在宅生活継続と介護予防に至った要因に関する抽出した。これらの結果より、在宅生活継続、介護度維持、改善に向け必要となるアセスメント項目である、健康状態13項目、心身機能26項目、活動31項目、参加10項目、環境6項目、個人因子6項目が明らかとなり、アセスメント、ケアプラン作成のプロセスとして、8段階のステップが必要であることが明らかとなった。ケアマネジメント指針の開発に向け、ケアマネジャーが「在宅生活の継続」と「自立支援」を目的として実施した援助技術を抽出するために、ケアマネジャーの記録の分析とともに半構成的インタビューを実施した。その結果、『利用者を支える』で「本人の意欲を支える」「本人に安心感を提供する」「本人の意向を尊重する」の3カテゴリーが『家族を支える』で「家族に安心感を提供する」「家族の意欲を支える」「家族員の健康状態を維持する」「家族の気持ちに添う」の4カテゴリーが、『健康状態の維持を支える』で「健康状態の維持を支える」の1カテゴリーが、『新たな出来事を受け入れることを支援する』で「新たな環境への適応を支える」「喪失感を和らげ現実を受け入れることを支援する」の2カテゴリーが『安全と自立のバランスを整える』で「自立動作の維持を支える」「加齢に伴う身体機能の変化を把握する」の2カテゴリが、『限界を見極める』で「在宅生活の限界を見極める」の1カテゴリーが『サービス提供者と上手く連携する』で「サービス提供者の理解を深める」「サービス提供者のケアへの熱意を高める」の2カテゴリーと、7つの大カテゴリーと15の中カテゴリーが明らかになった。

各2年間で要介護状態にある高齢者のなかで在宅生活の継続と介護予防に至った事例について、在宅生活の継続と介護予防に至った要因について検討し、その結果より、「在宅生活の継続」と「介護予防」を支援するため、ケアマネジャーが展開した援助技術であるアセスメントの項目をICFの枠組みに整理したアセスメント表を基に、ケアマネジメントにおけるアセスメントのガイドラインとして「ICFを活用したアセスメントの手引き書」を作成した。その手引き書について、エキスパートであるケアマネジャーと協働関係にある、リハビリテーションの専門である医師、理学療法士により、アセスメント項目についてや各職種のエキスパート、およびエキスパートであるケアマネジャーに、配布し、その評価を得、その結果より、「ICFを活用したアセスメントの手引き書」を洗練化した。
医療保険に新医薬品を採用するための増分費用効果比に基づく判断基準の作成

新医薬品の既存薬からの増分費用効果比(ICER)が一定額以下でなければ医療保険の対象としないという欧米の考え方を踏まえ、73成分の新医薬品のわが国での薬価算定額を基に一定額の算出を試みた。ICERは120円1900万円と大きくばらつき、現行の薬価算定方式では新医薬品の費用対効果を反映できていないことが示された。疾患に対する薬剤の治療充足度とICERとの間で逆相関の傾向がみられ、現行の薬価制度下での一定額設定の可能性が示唆された。新医薬品の従来の治療法に対する増分費用効果比を求め、その額が一定額以下であれば、その新医薬品を医療保険制度の対象として認めてもよいとする考え方が欧米では広く取り入れられているが、問題は、「一定額」をどのように決めるかである。この一定額を決める試みとして、我が国特有の薬価制度の下での類似薬効比較方式における加算額に注目した。平成9年6月から平成19年3月までの間に薬価基準に新たに収載され、薬価算定された新医薬品、330成分551品目(規格)について検討を行った。まずこれらのうち、比較臨床試験結果が入手でき、かつ類似薬効比較方式で算定され有効性に基づく加算が行われた19成分21薬効について増分費用効果比を求めた。その結果、1日当たりの増分費用効果比は5円から56607円と大きくばらついていた。この違いは、適応症による違いというよりも、経口剤、注射剤、外用塗布剤という剤形による違いや、薬価算定方法の違いを反映した算定時期による違いが大きいものと思われた。具体的には、外用塗布剤は2成分で5円及び6円であるのに対して、14年8月以降に算定された注射剤は3成分で6118円から56607円であり、算定時期については、18年以降の経口剤が229円から604円であるのに対して、15年9月以前は29円から118円であった。一方、5成分が市場に導入されているスタチン製剤では、最初に導入されたプラバスタチンからの1日当たりの増分費用効果比をみると、0円、18円、36円、36円となり、0円となったフルバスタチンの増分効果を差し引いたネットの増分効果について再計算すると、22円、48円、52円と比較的近い値が得られた。今後、さらに事例を追加することにより詳細な分析が可能になると思われる。新薬の現治療法からの増分費用効果比が一定額以下であれば医療保険の対象として認めるという考え方が欧米ではあるが、「一定額」をどのように決めるかが問題である。この一定額を決める試みとして、我が国の薬価制度の下での新薬の薬価算定額に注目した。平成9年6月から平成20年9月までの間に薬価算定された新薬、401成分のうち、比較臨床試験が行われた248成分を検討の対象とした。これらについて、PMDAのHP上に公表されている審査報告書及び申請資料概要、臨床試験の公表論文、添付文書、インタビューフォーム等を収集し分析に用いた。治療目標に到達した患者の割合を臨床効果とすることとし、それを表していると思われる最終全般改善度、治療成功割合、目標達成率、奏効率、HIVウイルス量等を用いた。臨床検査値の変動を評価指標としているものについては、治療ガイドラインに示された治療目標値に到達した人の割合を算出し、それを用いた。対照薬との臨床効果の差を増分効果とした。新薬の薬価は薬価収載時のもの、対照薬の薬価は新薬が薬価基準に収載された時点のものを使用し、プラセボの薬価は0円した。臨床効果判定日までの日数を投与日数として対照薬との薬価差を求め増分費用とし、増分費用効果比を算出した。これを臨床効果に有意差があるもの、投与経路別、薬効分類別、疾患領域別等で分類したが、増分費用効果比に関連性は見られなかった。次に、さまざまな論文からそれぞれの疾患に対する効用値を収集し、これを効果として増分費用効果比を求めた。増分費用効果比は、効用値0.40.59の疾患で1000万円、0.60.79で620万円、0.81.0で110万円を最大値としてそれぞれの分類である程度の範囲内に収まり、新薬の効能効果を領域を考慮せず効用値で分類し、それぞれについて判断基準となる「一定値」を求めることが妥当なのではないかと考えられた。この一定額=閾値を決める試みとして、我が国の薬価制度の下での新薬の薬価算定額に注目した。

平成9年6月平成21年3月に薬価基準に収載された新医薬品423成分のうち類似薬効比較方式で算定され、比較試験で対照薬に対し有意に有効であり、薬価が増額されている73成分を対象とした。これらについて、審査報告書、臨床試験の論文等から臨床効果等の情報を集めた。新薬の薬価収載時の薬価と、比較試験を行った薬剤のその時の薬価を用いた。比較試験の投与日数での薬価差を求め、これと臨床効果の差から増分費用効果比を求めた。また、新医薬品の薬価の妥当性に対する一般消費者の評価を得るため、一般消費者600名を対象にインターネット調査を行った。増分費用効果比は120円1900万円と大きくばらついた。閾値の設定は疾患をある程度グループ化しなければ実用には適さないことから、疾患領域別、治療充足度別、効用値別に分類を試みた。9つに分けた疾患領域別では、閾値は、感覚器疾患の11000円から、感染症の120万円まで大きく異なった。最も可能性があるのは、薬剤の治療充足度別の分類であり、充足度が小さくなるほど増分費用効果比は高くなる傾向にあり現行の薬価算定制度下で使用しても大きな矛盾は生じないと考えられた。今回の調査により、増分費用効果比に非常に大きなバラツキがあることが明らかとなった。現行の薬価算定方式では費用対効果は必ずしも反映されていないことが示された。次に薬価の妥当性については、一部の疾患を除き現行の薬価は半数以上の一般消費者に受け入れられていた。消費者が効果は高いが価格が高いと考える統合失調症、アレルギー性鼻炎に関しては価格の見直しが必要であると思われた。
アフリカにおけるエイズ患者の神経病変に関する社会医学的調査研究

1.タンザニア連合共和国ダルエスサラーム市における法医解剖について、HIV感染の疑いのある症例から感染者とエイズ患者を抽出し、神経病変の種類と頻度の調査並びにエイズ脳炎の発症機序に関する研究を行った。2.法医解剖218例中78例(35.8%)でHIV感染を確認した。感染経路の多くは異性間性交渉であり、女性の感染者が比較的多く、タンザニアでは異性間性交渉による女性の感染者が多いことを認識した。また、HIV感染者は非感染者と比較して臨床的に肺結核を高頻度に合併していた。3.HIV感染者の神経病変としてリンパ球性髄膜炎が高頻度に認められた。しかし、HIVの脳内侵入を示すHIV脳炎は認められなかった。タンザニアでは感染者は肺結核等でHIV感染後早期に死亡する例が多いため、キャリアに認められるリンパ球性髄膜炎が高頻度であり、感染後期に生じるとされているHIVの脳内侵入は無かったものと考えられた。なお、脳病変周辺部にHIVは確認されなく、HIVの脳内侵入には脳局所状態よりも全身状態が関係していると考えられた。4.感染者の神経病変の特徴として結核菌と一般細菌による髄膜脳炎が多いことが明らかになった。また、脳の日和見感染症として脳結核、クリプトコッカス脳炎、トキソプラズマ脳炎が認められた。さらに、全身の日和見感染症として肺結核、粟粒結核、全身性クリプトコッカス症が認められた。本研究によって現地での感染者の神経病変の種類と頻度が明らかとなり、本研究の結果は現地でのエイズ患者の臨床に役立つものと期待される。本研究はタンザニア連合共和国ダルエスサラーム市のムヒンビリ大学医学部病理学講座との国際共同研究であり、当地における後天性免疫不全症候群(エイズ)患者の神経病変の種類と頻度を調査し、その結果を臨床医学に還元し、アフリカのエイズ患者を救済することを目的とする。研究分担者の米満孝聖がムヒンビリ大学医学部病理学講座に1ヶ月間出張し、海外共同研究者のJames N.KitinyaとMartin P.Mbondeと共に、タンザニア連合共和国ダルエスサラーム市において、法医解剖例の抗体スクリーニング検査をELISA法とウェスタンブロット法を用いて行い、HIV感染10症例を抽出し、臨床経過を調査し、病理組織標本を作成した。また、海外共同研究者のJames N.Kitinyaを佐賀医科大学医学部法医学講座に1ケ月間招聘し、研究代表者の木林和彦並びに研究分担者の恒成茂行・狸々英紀と共に神経病理学的検討を行い、脳のホルマリン固定パラフィン切片について、HIVのp24抗原に対する抗体を用いた免疫組織化学を行った。その結果、HIV感染者には、高頻度にリンパ球性髄膜炎が認められ、脳内にHIVの侵入は認められなかった。タンザニアの感染者は肺結核等でHIV感染後早期に死亡する例が多いため、一般にキャリアに認められるリンパ球性髄膜炎が高頻度であり、HIVの脳内侵入が認められなかったものと考えられた。現在までに感染者62例の神経病理学的検査を終了し、タンザニアにおける感染者の神経病変の特徴としては結核菌と一般細菌による髄膜脳炎が多いことが明らかとなり、トキソプラズマ脳炎の症例を始めて確認できた。結果を取りまとめた論文を投稿中であるが、研究成果は当地でのエイズ患者の診断と治療に活かされるものと期待される。また、本研究を通じて、当地の法医解剖には抗マラリア薬クロロキン服用による自殺例が多いことに着目し、現在、クロロキンの法中毒学的研究も行っている。本研究はタンザニア連合共和国ダルエスサラーム市のムヒンビリ大学医学部病理学講座との国際共同研究であり、当地における後天性免疫不全症侯群(エイズ)患者の神経病変の種類と頻度を調査し、その結果を臨床医学に還元し、アフリカのエイズ患者を救済することを目的とする。

タンザニア連合共和国ダルエスサラーム市において、本年度、法医解剖例50症例についてELISA法を用いた抗体スクリーニング検査を行い、HIV感染10症例を抽出し、臨床経過を調査し、病理組織標本を作成した。また、ムヒンビリ大学医学部病理学講座から研究協力者としてAmos R. MwakigonjaとEdda A.M. Vuhahulaを各約3週間1ヶ月間招聘し、エイズ病変の病理学的診断を行い、一般的な神経病理学的検査方法を修得させた。その結果、現地のエイズ患者はトキソプラズマや結核などの脳病変を高頻度に合併することが確認され、カリニ肺炎や寄生虫症などの現地では希な合併症を見出すことができた。現在までに法医解剖223例の抗体スクリーニングを行い、80例の感染者・患者の病理診断を実施し、さらなる症例の抽出と神経病理学的検索を行っている。研究者招聘は、本研究だけでなく、現地での様々な疾患の神経病理診断の向上に寄与するものと考えられる。研究代表者の木林和彦はフランス・モンペリエにおいて法医神経病理学のワークショップを主催し、本科学研究費による研究を主題の一つとし、京都府立医科大学の安原正博教授を派遣して諸外国の研究者と活発な議論を行った。また、本研究を通じて、当地での抗マラリア薬クロロキン服用による自殺例の病理・中毒学的研究も実施し、国際学会において発表した。本研究はタンザニア連合共和国ダルエスサラーム市のムヒンビリ大学医学部病理学講座との国際共同研究であり、当地におけるエイズ患者の神経病変の種類と頻度を調査し、その結果を臨床医学に還元し、アフリカのエイズ患者を救済することを目的とする。1.研究分担者の狸々英紀が平成16年2月1422日にダルエスサラーム市に出張し、海外共同研究者のPaul M.Ng' walali、Martin P.Mbondeと共に法医解剖例についてELISA法によるHIV感染のスクリーニング検査を実施した。2.研究代表者の木林和彦が平成16年2月283月7日にダルエスサラーム市に出張し、海外共同研究者のPaul M.Ng' walali、Martin P.Mbondeと共に法医解剖例についてELISA法によるHIV感染のスクリーニング検査を実施した。また、本研究の継続のために、ムヒンビリ大学医学部の医師・技術者と今後の研究計画について議論した。3.現在までにHIV感染が強く示唆される法医解剖231例についてELISA法によるHIV1/2のスクリーニング検査とウエスタンブロットによる確定診断を行ったところ74例(32%)でHIV-1の感染が確認された。年度別では、平成15年度は平成13・14年度よりも感染率が低い傾向にあり、現地での献血者と病院受診者の感染率の低下との関係が示唆された。また、感染原因は殆どの例で異性間性交渉であった。感染者は非感染者と比較して脳の日和見感染症を高頻度に合併しており、脳結核が最も多い合併症であり、クリプトコッカス脳炎、トキソプラズマ脳炎も認められた。4.剖検時の術者のHIV感染防止は感染者の多い国では急務の対策課題である。HIV暴露時には抗レトロウイルス薬服用による感染防止が必要であるが、アフリカ諸国では薬の入手が困難である。また、感染者は結核を高頻度に合併しており、結核感染防止のためにN95マスクなどの消耗品も揃える必要がある。
ベンボ『俗語論』とイタリア文学語の形成

ベンボ『俗語論』第三巻の草稿Vaticano Latino 3210から初版(Tacuino, 1525)、第二版(Marcolini, 1538)、そして決定版たる第三版(Torrentino, 1549)について、その推敲および刊行後の異同をフォントの色分けにより示したテキストを作成した上で、記述内容の正確な和訳を行ない、いわゆるFascicolo Bの分析と併せて、《規範》意識の顕在化とその後の強化の様子を跡付けた。本年度の目標はピエトロ・ベンボの『俗語論』Proseに見られる《規範》の成立過程の全貌を微視的に追跡することであり、そのためにまず資料の整備に多くの時間と予算を費やした。具体的には『俗語論』のテキストに関して、初版Tacuino版(1525)、Marcolini版(1538)、決定版とされるTorrentino版(1549)、そして手稿Vaticano Latino3210のマイクロフィルムを入手して、これらをデジタル化し、レイヤーを使って章番号を付した上、これらに基いて4つの段階がフォントの色分けにより示される文字情報版のテキストを作製した。完成したのは第3巻のみであるが、他の巻についても順次作業を続ける予定である。また、当初の研究計画には含まれていなかった『俗語論』第3巻の翻訳に着手した。これはイタリア語を解さない人の用に供するものではなく、テキストが、その内容の複雑さに加えて叙述の極端な錯綜ぶりを特徴とすることが判明し、正確な解釈のためには何らかの形でより平易で分かりやすい文章表現に改める必要が痛感されたがゆえに行なうものである。叙述が錯綜していると言っても、ベンボの思惟が混乱しているわけではさらさらなく、ひとつには当時このような内容をイタリア語で書き記す伝統が未だ確立していなかったこと、そしていまひとつには著者がまさに当該作品で主張しているようにボッカッチョ風の文体にこだわったために生じた現象であり、翻訳によって解釈は飛躍的に正確なものとなる。わが国における後の研究のためにも非常に有益である。さらに本年度の研究成果として、イタリア詩の韻律に関する著書(共著)を刊行したことも挙げておきたい。これは必ずしもアカデミックな研究成果の範疇に入るものではないが、イタリア語を母語としない人間を明確に意識しており、わが国においては前例のないイタリア語の詩作法を解説する書物であるだけに、その執筆に当たっては本研究によって得られた知見が間接的に大きな役割を果たしている。本研究はルネサンス期のイタリア詩作法に関する包括的研究の第一段階として計画されたものであり、当面の目標はイタリア文学語の方向を決定付けたピエトロ・ベンボ『俗語論』Prose della volgarlinguaの成立過程を明らかにすることである。それは抽象的な言語論争のレベルにとどまることなく、通常《ベンボ規範》と呼ばれる、後のイタリア語のあり方を決定づけた文学用文法の形成過程を可能な限り具体的かつ微視的に明らかにすることを目指すものであり、ベンボによってそれぞれ詩と散文のモデルと位置づけられたペトラルカ『カンツォニエーレ』とポッカッチョ『デカメロン』からの豊富な引用によって、実際の用例・用法が示された第3巻に的を絞って調査のベースとなる資料整備を行なうのが平成23年度の主たる目標であった。具体的には、年代の異なる3つの版と初版直前の手稿という計4種のテキスト、すなわち(1)Tacuino版1525、(2)Marcolini版1538、(3)Torrentino版1549、(4)Vaticano Latino 3210をデジタル情報化するとともに、それらテキスト間に見られる異同の情報を、フォントの色を違えることによってその中に盛り込む作業、および本文の翻訳作業を行なったものである。翻訳は日本語へのものであるが、14世紀のイタリア文学語を解する専門研究者のみを対象とする特殊なものであり、当初はとりわけ動詞の活用形に関する論述の難解さを整理・克服することを主たる目的として始めたものの、補語人称代名詞に関しても極めて有効であることが判明し、実際にはこうした方法をとることなくベンボの意図するところを正確に理解・記述することは不可能であることが明らかとなった。なお、この翻訳にはペトラルカ、ポッカッチョを中心とする引用の出典情報を脚注としてではなく本文中に記載してあり、既にデジタル化の完了したテキスト間の異同情報をも織り込むことによって、今後に予定している調査活動のための有効なツールとなるはずである。本研究はルネサンス期イタリアの詩作法に関する包括的研究の第一段階として計画され、ピエトロ・ベンボの『俗語論』Prose della volgarlinguaの成立過程を詳らかにすることを当面の目標とする。

14世紀のトスカーナ語をモデルとすべしというベンボの理論は従来からよく知られているが、同時代の諸作品を通じて実際に大きな影響力を行使したのは、第三巻において多くの用例とともに為された具体的な指示である。そこで、草稿Vaticano Latino 3210から決定版たるTorrentino版(1549)に至る計4種のテキストを厳密に比較することによって、いわゆる《ベンボ規範》の形成プロセスを微視的に追跡することを目指した。平成24年度においては、実施計画に沿ってまず第三巻の和訳を完成させるとともに、通称Fascicolo Bの分析により《規範》形成の開始時点を絞り込んだ。続いて、整備を終えた資料に基いてその後の《規範》形成過程を跡付けるべく作業を進めた結果、次の二点が判明した。すなわち、1段階を追って《規範》確立の流れが明確に浮かび上がるのは《前置詞+定冠詞》の結合に関する部分に限られること、2一定の重要性を持つ他のマイナーな修正点が1549年版に集中していること。この版は著者の没後にコジモ1世の臣下であったベネデット・ヴァルキの手になるものであり、従って修正点がどこまで著者の遺志に基くものであるかに疑問が残ることから、次に、同時代人であるルドヴィーコ・カステルヴェトロによるポレミックな注釈を検討することによって最終段階におけるベンボの真の意図の洗い出しを試みる作業を進めた。これは第三巻の和訳とともに当初の研究計画には含まれていなかった作業であり、現在も継続中である。一方、第三巻の和訳は、フォントの色分けや詳細な注により、これを有用な研究資料と為すことができた。第一に『俗語論』第3巻の翻訳を完成させることができなかった。Dionisotti版の章区分の全79章中、12章分が未完成であり、これはおよそ85%の達成度を意味する。第二に、ベンボの校訂になる1501年のアルドゥス版『カンツォニエーレ』に付されたあとがき(通称Fascicolo B)の詳細な分析によって、この段階におけるベンボの《規範》意識がどの程度までその形を採っていたのかを検証する作業を行なう予定であったが、時間的な問題から思ったように進めることができず、成果の発表にも至らなかった。24年度が最終年度であるため、記入しない。主として時間的な制約から研究の進捗に若干の遅れが出ているものの、その内容や作業の方法には修正の必要を感じていない。とりわけ、資料整備に関してはほぼ予定した段階にまで到達しており、これまでの作業の遅れが今後の研究に悪影響を及ぼす可能性が低いからである。従って、当初平成23年度に済ませる予定であった作業の一部を次年度に行なうことになり、計画全体が後にずれ込む結果になるとしても、それ以外の質的ダメージは生じないものと予想される。
心不全進展における情報伝達制御

各群左心室よりtotal RNAを抽出しreverse transcriptaseによりcDNAを作成した。PCRのprimerはfull sequence増幅用にヌクレオチド1-24、1564-1590に相応して作成した。truncated formのRGS3検出用にヌクレオチド937-965に対するprimerを作成し先のprimer(1564-1590)と組み合わせて3'側の増幅を行った。ラット左室心筋ではtruncated formのRGS3の発現が著明で、それに比べfull sequence RGS3の発現は乏しかった。control群、isoproterenol群間で、RGS3各formの発現に明らかな差はみられなかった。同様の検討をRGS4について行っているが、一定した結果はまだ得られていない。
生体イメージングと特異的細胞除去による再生骨成熟過程の解明と体外成熟法の確立

口腔外科領域における再生骨移植では、移植時における再生組織は未熟かつ脆弱で、十分な強度を有しておらず、移植後生体内ではじめて成熟する。また、未熟な再生骨を移植するため、効果も不安定である。これらの問題の解決には体外での再生組織成熟法の確立が必須である。これを実現するため、生体内における再生骨成熟過程について、2光子励起顕微鏡や各種蛍光プローブを用いた生体イメージング、特異的プロモーターを用いた任意の時期における特異的細胞除去、網羅的な遺伝子発現解析を行い、移植した間葉系幹細胞の増殖から分化への移行、ホスト側細胞および因子と基質形成との関連を時空間的に解明する。さらに生体内の再生組織成熟過程をin vitroで再現し、再生骨の体外成熟の実現を目指す。平成30年度は、骨再生イメージング系の確立を目指した検討を行った。全身に緑色蛍光タンパク質GFPを発現するGFPマウス新生仔頭蓋骨を採取し、細切、酵素処理後に培養を開始した。骨から萌出してきた細胞を採取して骨芽細胞を得た。骨芽細胞をカバーガラス上で培養し、マウス頭蓋骨に作製した骨孔に接着した。移植を受けるマウスとしては、C57BL/6J野生型あるいは、Rosa領域にて赤色蛍光タンパク質tdTomatoをコードする遺伝子とその直前にloxP配列に挟まれたstop配列をもつマウス(Ai14(RCL-tdT)-D)を、細胞種特異的にCreリコンビナーゼを発現するRANK-Creマウス(マクロファージ)などと掛け合わせ、細胞種特異的にtdTomatoで標識したマウスを使用した。マウスを麻酔し、専用の固定具を装着後、2光子励起顕微鏡による観察を行った。マウスの体動の影響を受けず、鮮明な画像を得ることができた。移植細胞のGFPシグナル、骨基質のSHGを検出することで、細胞形態や骨基質線維走行などの観察を行った。頭蓋骨に作製した骨孔に、細胞を播種したカバーガラスを接着し、専用の固定具を使用することで、細胞および骨基質の鮮明な画像が得られる骨再生イメージング系を確立できたため。また、平成31年度に使用予定であったAi14(RCL-tdT)-D x RANK-Creを前倒して導入したため。平成31年度は、in vivoにおける再生組織成熟過程の解析を行う。GFPあるいは細胞周期検出蛍光プローブFucciを発現したマウスよりMSCsあるいは骨芽細胞を採取し、作製した再生骨インプラントあるいは細胞を播種したカバーガラスをC57BL6Jマウスに移植する。細胞増殖活性の変化、細胞密度の変化と基質産生活性の時空間的関連を明らかにする。Fucci発現細胞を移植した場合には、細胞周期を表す蛍光のパターンとSHGで示される基質産生のパターンを数週に渡って1週毎に、同一部位を観察する。また、Ai14(RCL-tdT)-D x RANK-Creマウスに、GFPマウスまたはFucciマウス由来細胞を用いて作製した再生骨インプラントを移植し、2光子励起顕微鏡により観察する。ホスト側細胞の局在と、移植細胞の増殖活性、細胞密度、基質形成との関連を時空間的に評価し、時期毎のホスト側細胞の基質産生への影響を明らかにする。

GFPあるいは細胞周期検出蛍光プローブFucciを発現したマウスよりMSCsあるいは骨芽細胞を採取し、作製した再生骨インプラントあるいは細胞を播種したカバーガラスをC57BL6Jマウスに移植する。細胞増殖活性の変化、細胞密度の変化と基質産生活性の時空間的関連を明らかにする。Fucci発現細胞を移植した場合には、細胞周期を表す蛍光のパターンとSHGで示される基質産生のパターンを数週に渡って1週毎に、同一部位を観察する。また、Ai14(RCL-tdT)-D x RANK-Creマウスに、GFPマウスまたはFucciマウス由来細胞を用いて作製した再生骨インプラントを移植し、2光子励起顕微鏡により観察する。ホスト側細胞の局在と、移植細胞の増殖活性、細胞密度、基質形成との関連を時空間的に評価し、時期毎のホスト側細胞の基質産生への影響を明らかにする。当初の想定より順調にイメージング系の確立が進んだため。次年度使用額は、動物の購入や維持に使用する予定。
生命現象をグローバルに把握させるためのカリキュラムとその教授法の開発

中等教育段階の生徒達に、生命現象をグローバル(総合的あるいは巨視的)にとらえせさるには、現行の生物教育カリキュラムでは十分ではないことが、生徒および教員を対象とした今回の調査から明らかになった。そこで、我々は、(1)生徒に生命現象を環境とのかかわりでとらえさせることのできる教材や実験の開発、(2)細胞レベル以下の内容を個体またはそれ以上のレベルの内容と関連させ、総合的理解ができるような扱い、(3)開発した教材・実験・教授法の教育現場での試行とその教育効果の検討、の3点を考慮しつつ望ましい生物教育のカリキュラムおよび教授法の開発を行った。開発されたカリキュラムは、3つのアプローチから生命現象をとらえさせるようになっている。即ち、(1)空間的(環境的)アプローチ:これは生物の活動に対する環境の影響を重点的に調べようというもので、「ケイソウを使う水質判定ドライラボ」や「人工海水による海藻の培養とアクアリウムの作製」などのモジュールが開発されている。(2)時間的アプローチ:これは生命現象を継続的にあるいは時間的な変化という視点で調べようというもので、「モノアラガイを用いて初期発生・生長を観察する」や「プラナリアの再生実験」などのモジュールが開発されている。(3)多面的なアプローチ:生命現象を多面的にとらえようというもので、1種類の材料で色々な現象を調べたり、簡便な方法や装置を活用して生物の特性を明らかにしていこうということである。「シッフ試薬で神経を染色し、神経系の学習をする」「海藻のかたち・はたらき」などのモジュールが開発されている。今回開発された教材あるいは実験は、そのまま現行の中学校・高等学校の生物教育にも導入できるものであり、また、課題研究のテーマとしても最適のものである。今後も教育現場での試行により、さらに内容を改善・充実していく予定である。
植物根による有機物吸収機構の分子生物学的解析

従来、我々は、有機物吸収機構を明らかにするために、イネやオオムギを用いた実験では、水耕による植物の栽培を行ってきた。しかし、水耕では、無菌栽培が難しく、根圏微生物による有機物の分解が避けられなかった。そこで、材料植物として、シャーレ内の無菌栽培が可能なイロイヌナズナを用いることにより、無菌条件下での各種アミノ酸窒素源による栽培を検討し利用可能なシステムであることを明らかにした。既に単離されているイロイヌナズナのアミノ酸トランスポーターは、そのタンパク質が確かに細胞膜上に存在しているか否かが未解明である。そこでこの遺伝子のタンパク質を得て抗体を作成し、免疫細胞化学に手法により染色し、その存在部位の確定を試みた。cDNAが大腸菌では発現しなかったので、推定されるアミノ酸配列から特異的な部分を選び合成ペプチドを作製し、抗体を調整した。力価について現在検討中である。
最先端分析技術を用いたイカ塩辛の発酵機構の解明

本年度は、細菌数の測定方法および代謝産物の定量系の確立を試みた。また、イカ塩辛の官能検査系を確立するため、市販の様々なイカ塩辛製品を対象とし官能検査を行い、遊離アミノ酸含量との比較を行った。その後、スルメイカを原材料にして、低塩分・低温貯蔵塩辛(塩分5%、温度5°C、製造期間7日間)と、糀を添加し高塩分・常温熟成した伝統的塩辛(塩分12%、温度24°C、製造期間4日間)を作製し、メタゲノム解析と遊離アミノ酸分析を行った。製造に伴う細菌数の測定を行うため、DAPIを用いた染色と市販の定量PCRキットを用いた細菌数の定量を試みたが、本年度は定量系の確立には至らなかった。LC-Q-TOF-MSを用いて呈味および香気に関連する低分子有機化合物の定量系の確立を試みた。リンゴ酸、コハク酸、プロビオン酸、αケトグルタル酸、ピログルタミン酸などについては定量法を確立できたが、乳酸、酢酸およびオキサロ酢酸については検出できなかった。官能検査では、5味試験に合格した20歳代の男女15名のパネルを選定し、市販の様々なイカ塩辛製品について官能検査で評価した。その結果、アミノ酸調味料無添加製品では各社の製造方法による違いがあり、これらの製品では呈味とアミノ酸含量に相関があることを見出した。作製した塩辛のメタゲノム解析の結果、低塩分・低温貯蔵イカ塩辛においては原料のイカ肉および製造期間の各試料でVibrio属が優先した。一方、糀添加常温熟成イカ塩辛については、製造ごとに原料の塩漬けイカ肉および製造期間の試料で細菌叢が異なった。HPLCを用いて分析した遊離アミノ酸の総量およびタウリンの総量では、低塩分・低温貯蔵イカ塩辛の液状部では製造初日と製造期間中で大きな変化は認められなかった。一方、糀添加常温熟成イカ塩辛においては、とくにアミノ酸総量は製造期間中に大きく増加した。また、塩辛の官能検査系を確立するため、市販の様々なイカ塩辛製品を対象として官能検査を行い、遊離アミノ酸含量との比較を行った。その後、低塩分・低温貯蔵イカ塩辛と糀添加常温熟成イカ塩辛を作製し、それぞれの製造過程における細菌叢と遊離アミノ酸解析を行った。細菌数の測定系については本年度は確立に至らなかった。また、LC-Q-TOF-MSによるメタボローム解析では、リンゴ酸、コハク酸、プロビオン酸、αケトグルタル酸、ピログルタミン酸などの有機酸は定量系を確立できたが、乳酸、酢酸およびオキサロ酢酸については検出が難しかった。一方、官能検査により、市販イカ塩辛製品のうちアミノ酸調味料無添加製品では各社の製造方法により呈味に違いがあることが明らかとなり、この呈味とアミノ酸含量に相関があることを見出した。作製したイカ塩辛を用いた分析では、低塩分・低温貯蔵イカ塩辛では細菌叢および代謝産物の製造期間の経過に伴う変化はほとんど認められなかったのに対し,糀添加常温熟成イカ塩辛については、製造ごとおよび製造期間の経過に伴い細菌叢が大きく変化することを見出した。以上のように、本年度は、遊離アミノ酸等の代謝産物がイカ塩辛の呈味に影響を与えることを見出した。また、一般に流通している低塩分低温貯蔵イカ塩辛と伝統的な製造方法のひとつである糀添加常温熟成で製造したイカ塩辛について検討を行い、製造方法により細菌叢および代謝産物量が大きく異なることを明らかにしたことから、おおむね順調であると考えられる。平成30年度は、細菌数の定量およびLC-Q-TOF-MSによる代謝産物の網羅的解析法の確立には至らなかったことから、引き続きこれらの方法の確立を試みる。また、低塩分・低温貯蔵イカ塩辛と、糀添加高塩分常温熟成イカ塩辛の比較において、糀添加高塩分常温熟成イカ塩辛については、作製回ごとに大きく細菌叢が異なっていたことから、令和元年度においても引き続き糀添加高塩分常温熟成イカ塩辛を作製し、製造過程における細菌叢、アミノ酸等の代謝産物の変化と、完成品の官能検査を行い、これらの結果を統合することにより発酵に伴う変化を明らかにすることを試みる。また、糀を添加していない高塩分常温熟成イカ塩辛を作製し、同様に解析することにより、製造方法および製造期間による違いを明らかにすることを試みる。

官能検査では、5味試験に合格した20歳代の男女15名のパネルを選定し、市販の様々なイカ塩辛製品について官能検査で評価した。その結果、アミノ酸調味料無添加製品では各社の製造方法による違いがあり、これらの製品では呈味とアミノ酸含量に相関があることを見出した。作製した塩辛のメタゲノム解析の結果、低塩分・低温貯蔵イカ塩辛においては原料のイカ肉および製造期間の各試料でVibrio属が優先した。一方、糀添加常温熟成イカ塩辛については、製造ごとに原料の塩漬けイカ肉および製造期間の試料で細菌叢が異なった。HPLCを用いて分析した遊離アミノ酸の総量およびタウリンの総量では、低塩分・低温貯蔵イカ塩辛の液状部では製造初日と製造期間中で大きな変化は認められなかった。一方、糀添加常温熟成イカ塩辛においては、とくにアミノ酸総量は製造期間中に大きく増加した。本年度は、細菌数の測定方法および代謝産物の定量系の確立を試みた。また、塩辛の官能検査系を確立するため、市販の様々なイカ塩辛製品を対象として官能検査を行い、遊離アミノ酸含量との比較を行った。その後、低塩分・低温貯蔵イカ塩辛と糀添加常温熟成イカ塩辛を作製し、それぞれの製造過程における細菌叢と遊離アミノ酸解析を行った。細菌数の測定系については本年度は確立に至らなかった。また、LC-Q-TOF-MSによるメタボローム解析では、リンゴ酸、コハク酸、プロビオン酸、αケトグルタル酸、ピログルタミン酸などの有機酸は定量系を確立できたが、乳酸、酢酸およびオキサロ酢酸については検出が難しかった。一方、官能検査により、市販イカ塩辛製品のうちアミノ酸調味料無添加製品では各社の製造方法により呈味に違いがあることが明らかとなり、この呈味とアミノ酸含量に相関があることを見出した。作製したイカ塩辛を用いた分析では、低塩分・低温貯蔵イカ塩辛では細菌叢および代謝産物の製造期間の経過に伴う変化はほとんど認められなかったのに対し,糀添加常温熟成イカ塩辛については、製造ごとおよび製造期間の経過に伴い細菌叢が大きく変化することを見出した。以上のように、本年度は、遊離アミノ酸等の代謝産物がイカ塩辛の呈味に影響を与えることを見出した。また、一般に流通している低塩分低温貯蔵イカ塩辛と伝統的な製造方法のひとつである糀添加常温熟成で製造したイカ塩辛について検討を行い、製造方法により細菌叢および代謝産物量が大きく異なることを明らかにしたことから、おおむね順調であると考えられる。平成30年度は、細菌数の定量およびLC-Q-TOF-MSによる代謝産物の網羅的解析法の確立には至らなかったことから、引き続きこれらの方法の確立を試みる。また、低塩分・低温貯蔵イカ塩辛と、糀添加高塩分常温熟成イカ塩辛の比較において、糀添加高塩分常温熟成イカ塩辛については、作製回ごとに大きく細菌叢が異なっていたことから、令和元年度においても引き続き糀添加高塩分常温熟成イカ塩辛を作製し、製造過程における細菌叢、アミノ酸等の代謝産物の変化と、完成品の官能検査を行い、これらの結果を統合することにより発酵に伴う変化を明らかにすることを試みる。また、糀を添加していない高塩分常温熟成イカ塩辛を作製し、同様に解析することにより、製造方法および製造期間による違いを明らかにすることを試みる。
植物においてアルミニウムが液胞を介して誘発するプログラム細胞死の分子機構

アルミニウムイオン(Al)による細胞毒性は、増殖の盛んな細胞にみられ、根においては先端の分裂・伸長域において細胞死を誘発する。Alによる細胞死誘発機構の解明を目的に、3つの遺伝子、VPE(液胞プロセシング酵素)遺伝子、N(ウイルス抵抗性)遺伝子、NtSUT1(スクロース輸送体)遺伝子に着目し、タバコ植物体ならびに培養細胞を用いて解析した。タバコ培養細胞を用いて作出したVPE遺伝子の発現抑制(RNAi)系統と野生系統との比較解析から、VPE1遺伝子がAlによる細胞死の実行因子であることを見いだした。N遺伝子は、タバコがタバコモザイクウイルスに感染した際にVPE遺伝子に依存した過敏感細胞死の誘発に必要であることから、Alによる細胞死誘発における関与について、N遺伝子を持つタバコ系統と持たない系統を用いて比較解析をしたが、Alによる細胞死の誘発ならびにVPE遺伝子の発現誘導の程度に差はみられず、N遺伝子の関与は否定された。細胞の増殖に必要な炭素源のスクロースは、細胞膜に局在するNtSUT1を介して取り込まれ、液胞に蓄積されて浸透圧調節物質として細胞伸長にも寄与することから、タバコ植物体を用いてNtSUT1遺伝子の過剰発現系統ならびに発現抑制系統を作出し野生系統とともに根伸長への影響を比較した。通常の栽培条件では、根端で発現するNtSUT1遺伝子の発現量が多いほど根端の遊離糖含量が増加し根伸長が促進された。同様に、Al処理においても、NtSUT1遺伝子の発現量が多いほどAlによる根の伸長阻害ならびに細胞死が緩和された。以上の結果より、液胞に局在するプロテアーゼVPE1が、Alによる細胞死の実行因子であること、根端で発現する細胞膜局在のNtSUT1が、細胞伸長を正に調節する因子であるとともに、Alによる細胞死や細胞伸長阻害に対する抑制因子でもあることを初めて明らかにした。
マクロファージ活性化症候群の新規治療を目指した網羅的免疫学的解析

マクロファージ活性化症候群(Macrophage activation syndrome:MAS)の病態には、免疫細胞の異常活性化とサイトカインの過剰産生が深く関与している。本研究では、末梢血細胞亜群解析、サイトカインアレイ解析、末梢血単核球mRNAに対するmicroarray解析を組み合わせた網羅的な免疫学的解析を行い、MASの基礎病態を理解するとともに、基礎疾患によるMASの免疫学的異常の異同を明らかにし、MAS病態に深く関与する共通の分子に対する特異的治療法の開発を目指す。
Radiosurgery後のオリゴデンドログリアのアポトーシスと脱髄性放射線障害

定位的手法を用いて病変に限局した一回大量照射を行うRadiosurgery(定位的放射線治療)は近年脳神経外科領域で急速に普及し、治療件数も飛躍的に増加しているが、その作用機序に関しては未だ解明されておらず、一回大量照射が正常脳に与える影響に関する知識は乏しい。本研究は、radiorurgery後のoligodendrogliaのapoptosisを定量化し、この現象が遅発性の脱髄性放射線障害にどのように関与しているか、また脳の血管内皮細胞にどのような影響を与えるかを解明する事を目的とし、4年間の研究で以下のような点を明らかにする事ができた。(1)大脳深部白質で発見された照射数時間以内のOligodendrogliaのapoptosisによる選択的な細胞死を脳神経(視神経)においても生じている。(2)この細胞死はaminosteroidやcorticosteroidなどの臨床で用いられている放射線保護剤ではブロック不可能である。(3)遅発性脱髄性障害は照射3ヶ月後に始まり6ヶ月後まで進行、拡大し、脱髄の範囲は照射線量に比例して増加する。(4)遅発性脱髄性障害は超急性期のoligodendrogliaのapoptosisの程度と相関する。(5)臨床上で認められる照射野近傍のcystや慢性被膜化血腫の原因は限局した白質の微小血管障害によるvasculopathyであり、radiosurgeryに特有な放射線壊死である。(6)臨床上散見される脳動静脈奇形がradiosurgery後に消失・治癒したあとの頭蓋内出血は限局した放射線壊死巣に基因するradiosurgeryのadverse effectである。平成15年度はラットを、ネンブタール麻酔下にラット用のstereotactic deviceに頭部を固定し、直腸温をモニター下に左側頭葉、並び左大脳半球に0,5,10,20,30,50Gyの照射をそれぞれ36体づつ行って3,6,12,24時間後にラットを6体づつsacrificeして灌流固定し、脳梁,及び視交叉におけるグリア細胞数を算出し、照射後の単位面積当たりのGliaの各時点におけるglialcell lossを算出,またTUNEL法を用いてapoptotic cellを染色し、各時点におけるapoptotic rate(apoptotic cell/total glial cell)を算出し,同時にTUNEL法とGFAP(astrocyteのマーカー)、CNP(oligodendrogliaのマーカー)の2重染色を行い、apoptotic cellがoligodendrogliaである事を確認した。その結果,視交叉においては大脳白質に比して有意にapoptotic rateが低い事を明らかにできた。ここまでの研究で脳神経において初めて超急性期の放射線障害が確認され,この結果を現在第1報として英文雑誌に投稿中である。次年度は同様の照射及び染色をP53ノックアウトマウス、通常マウスでも行い、P53の急性期のglialcell lossへの関与を確認する予定である。平成16年度は、平成15年度に作成したラットのRadiosurgeryモデルを3,6,12ヶ月後にsacrificeして還流固定し、遅発性の放射線障害、脱髄性白質障害を鍍銀染色を用いて検出した。さらに各スライスをコンピュータに取り込んで画像解析ソフトを用いて病変の広がりを定量化した。その結果、脱髄性白質障害は照射3ヶ月後に始まり6ヶ月後まで進行・拡大し、12ヶ月後まで遷延する事、また脱髄の範囲は照射線量に比例して増加する事が明らかとなった。また、同時に進行させたマウスのRadiosurgeryモデルでは、このような遅発性障害はP53ノックアウトマウスで野生型と比べて有意に発症率が少ない事も明らかにする事ができた。今後は、平成15年度に定量化した照射24時間以内のoligodendrogliaのapoptosisと、1年以内に生じた脱髄性障害との相関を定量化して検討する予定である。

この間、急性期のoligodendrogliaのapoptosisはaminosteroidやcorticosteroidなどの放射線保護剤ではblockできない事、また視神経でも同様のoligodendrogliaのapoptosisが大脳白質と同様に生じる事を見出し、これを出版公表した(Nagayama K, Kurita H, et al. : Radiation-Induced apoptosis of oligodendrocyte in rat optic chiasm. Neurol Res (in press))。
絨毛細胞による母体らせん動脈の浸潤機構の解明ー母体血小板に着目してー

我々の研究の目的は、ヒト着床部位でおこる絨毛外トロホブラスト(EVT)による母体血管リモデリングの分子機構を明らかにすることである。今回、CD9およびCD59の発現が母体血管を浸潤するEVT(eEVT)に強発現していることが明らかとなり、EVT不死化細胞株であるSwan71、絨毛癌細胞株BeWoを用いて機能解析を行った。CD9については、ノックダウンによりSwan71細胞の管腔形成能が抑制されたことより、eEVTによる母体血管内皮置換に関与している可能性が示唆された。CD59については、Swan71細胞では強発現し、BeWoで発現していないこと以外、まだ有意な結果を得られていない。ヒト胎盤において、絨毛の一部は母体面と接着する。絨毛の母体面付着部ではtrophoblastの幹細胞であるcytotrophoblast (CTB)は重層化し、cell columnを形成する。Cell column内でCTBは浸潤能をもつextravillous trophoblast(EVT)へと分化し、母体脱落膜(interstitial trophoblast (iEVT))およびらせん動脈(endovascular trophoblast (eEVT))へと浸潤していく。eEVTの浸潤によりらせん動脈は再構築(リモデリング)され、血管径が増大し、種々の血管作動物質への反応性を失う。広範ならせん動脈リモデリングは霊長類に特異的な現象であり、正常な胎児発育に必要な絨毛間腔への血流確保に不可欠とされる。我々の研究の目的は、その分子機構を明らかにすることである。平成21-23年度基盤研究(C)「母体血小板と絨毛細胞の相互作用:PIH、IUGRの病因解明をめざして」の中で、CD9、TGFβ受容体、インテグリンα5、MCAMなどの細胞表面分子がeEVTで高発現していることを明らかにした。今回はCD9に着目し、平成24年度はEVTを不死化したSwan71細胞を用いてその機能解析を行い、CD9が浸潤抑制に働いている可能性が明らかとなった。平成25年度はSwan71細胞を低酸素下で培養するとCD9の発現が減少することを確認した。ヒト臍帯静脈内皮細胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells(HUVEC))とSwan71細胞を共培養することで、Swan71細胞のCD9の発現が増加した。レンチウイルスを用いたshRNA導入によりCD9がノックダウンされたSwan71細胞とHUVECとを共培養し、それぞれの細胞動態を観察することに成功した。CD9をノックダウンされたSwan71細胞では明らかな形態変化は認めなかったが、CTR shRNAを導入したSwan71細胞もしくはshRNAを導入していないSwan71細胞とHUVECを共培養した場合、Swan71細胞は管状構造を形成することを確認した。CD9が血管再構築に関わっている可能性が示唆される結果であった。今回はCD9に着目し、EVTを不死化したSwan71細胞を用いて、その機能解析を行った。まず、Swan71細胞にCD9が発現していることを確認した。次に、レンチウイルスを用いてCD9特異的shRNAをSwan71細胞に導入することでSwan71細胞におけるCD9発現を約50%減弱させることに成功した。さらに、マトリゲル浸潤実験により、CD9発現を減弱させたSwan71細胞の浸潤が増強することを明らかとした。細胞増殖実験では、CD9発現減弱がSwan71細胞の増殖に影響を与えなかったことより、Swan71細胞においてCD9が浸潤抑制に働いている可能性が明らかとなった。

平成25年度はCD9分子がeEVTに高発現しており、母体血管リモデリングに関与している可能性を示した。平成26年度は補体関連分子であるCD59に着目した。補体は母体の自然免疫機構の一つである。補体は、古典経路・副経路・レクチン経路により活性化され、最終的に細胞表面に膜侵襲複合体を形成し、細胞溶解により細胞死をもたらす。ヒト着床部位におけるCD59の発現を免疫組織染色で調べたところ、CTB、cell columnおよびiEVTにはほとんど発現していなかったが、STBおよびeEVTに強い発現を認めた。分離EVT、Swan71細胞および絨毛癌細胞株BeWoにおけるCD59の発現を調べたところ、分離EVTおよびSwan71細胞にはCD59の発現が確認されたが、BeWoではCD59の発現をほとんど認めなかった。分離EVT、Swan71細胞、BeWo細胞をそれぞれ、ヒト血清加熱群(補体なし)あるいは非加熱群(補体有り)の存在下に培養し、生細胞数のWST assayで評価したが、すべての細胞において生細胞数に有意差を認めなかった。今後は、生細胞数には細胞死だけでなく、細胞増殖も影響するため、補体の影響を直接評価するためにアポトーシス解析を行う予定としている。加えて、実際に膜侵襲複合体が細胞表面に生じているかどうかを評価するべく、抗C9による免疫染色を予定している。さらに平成26年度には、プロテオミクス法によるcell column内のEVTとeEVTの蛋白発現プロファイルの比較をおこなうことにも着手した。現在、共同研究者である京都大学総合解剖センター 鶴山竜昭先生の協力のもとホルマリン固定された妊娠初期ヒト着床部位の組織標本の連続切片を顕微鏡で観察し、cell column内のEVTとeEVTの細胞集塊をレーザー・マイクロダイセクションにて切り出す作業を行っている。生殖医学レンチウイルスによるEVTへのshRNA導入の条件設定が難しく、満足のいくノックダウン効率を達成できていない。また、Swan71細胞とHUVEC細胞との共培養実験の条件設定にも時間を要した。レンチウイルスによるshRNA導入の条件設定が難しく、満足のいくノックダウン効率を達成するのに時間を要した。今回の研究計画に記載しているように、eEVTによる血管浸潤のin vitroモデルを確立することが重要であると考えている。HUVECとの共培養により管状構造をとるSwan71細胞が血管内皮への分化を示しているか解析を行う。不死化していない初回培養の分離EVTについてもレンチウイルスを用いた方法でCD9をノックダウンし、マトリゲル浸潤実験、細胞増殖実験、HUVEC共培養実験によりCD9の機能を解析する。またSwan71細胞同様にHUVEC共培養実験によりEVTが管状構造をとることは確認できているので、管状構造をとったEVTで他の分子の変化を解析する。さらに、他のeEVTマーカー(TGFβ受容体、インテグリンα5、MCAMなど)についても同様の手順で機能解析を行う。今回の研究計画に記載しているように、eEVTによる母体らせん動脈浸潤のin vitroモデルを確立することが重要であると考えている。