hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
環境応答性を示すリン酸カルシウム系ハイブリッド材料の創成

その結果、ヒドロキシアパタイトへの転化反応は、ALPによるリン酸エステルの加水分解速度に主に支配されており、有機鎖の短いリン酸エステル化合物ほどALPの加水分解を受けやすく、ヒドロキシアパタイトの生成もALPの共存により顕著に現れることを明らかにした。これらの成果は概ね計画どおりに進捗している。工学本年度の研究成果により、体液を模倣した水溶液(擬似体液、SBF)を用いた条件でも周囲のALPの存在によって、ヒドロキシアパタイトへの生成反応が異なることが明らかになってきた。さらにその生成速度がリン酸エステル化合物の有機鎖の違いによっても異なることが明らかになった。今後は、異なるグリセロリン酸カルシウム、ラクトホスホン酸カルシウム等のリン酸エステルのカルシウム化合物についても挙動の違いを明らかにするともとに、リン酸エステルのカルシウム化合物を溶解性の高いリン酸カルシウム化合物の表面に複合化する条件を探究する。複合化を行う化合物として、α型リン酸三カルシウム(α-TCP)を主体に合成条件を検討することによって、研究を推進する。得られた化合物の複合構造の解析とともに、ALPを含有した擬似体液中での反応を調べ、酵素応答性を示すリン酸カルシウム系材料の合成条件を明らかにする。
歯胚発生プログラムの解明・応用に基づく歯の再生技術の開発

歯の喪失に対して,生理的活性を有した完全な歯を再生することに大きな期待が寄せられている.近年我々は,細胞を三次元に配置することで器官の原基を再生することが可能な器官原基法の開発に成功した.しかし,未だ歯の発生に関わる遺伝子の解明にはつながっていない.そこで,我々は,歯の発生に関わる遺伝子の探索を目的に解析を行った.その結果,いくつかの歯の発生および発生の時間軸に関わる候補遺伝子を絞り込むことに成功した.今後,これらの遺伝子の機能解析を行っていく予定である.本研究課題は「歯の再生治療」の開発に向けた技術開発として,未分化な歯原性上皮細胞や間葉細胞を得るために,(1)歯原性組織幹細胞のReprograming方法,(2)ES細胞やiPS細胞のような多能性幹細胞を歯原性上皮細胞や間葉細胞に分化させる方法,(3)再生歯の発生期間の短縮化のための乳歯と永久歯の発生・成熟期間の差を生物学的に解析するものである.平成26年度の研究実施項目に従って進捗し、下記の研究成果を得た.研究項目(1);cDNAマイクロアレイ,Laser micro-dissection法による包括的および限局的な歯胚発生関連遺伝子を抽出するために,マウス帽状期前後の歯胚を摘出する手技を確立した.研究項目(3);本研究項目は平成27年度以降の実施事項であるが,計画を先行して開始している.乳歯・永久歯歯胚を胎齢イヌから取得し,cDNAマイクロアレイの実施・歯の発生・成熟に関わる候補遺伝子の抽出を行った.胎齢55日ビーグル犬から摘出した上顎顎骨内に存在する乳歯・永久歯歯胚(第1乳臼歯,第3乳臼歯,第1臼歯,第2臼歯)を解析対象とし,cDNAマイクロアレイ解析を行った。Total 43,603個の遺伝子群の中から,発現比が有意に高い遺伝子(未解明遺伝子を含む)を抽出し,乳歯に高発現している遺伝子201個,永久歯に高発現する遺伝子84個を見出した.本解析により,これまで知られていなかった乳歯・永久歯間における発現遺伝子の差異が明らかとなり,今後,歯の発生・成熟期間の生物学的な相違を解析することが可能となった.本研究課題は「歯の再生治療」の開発に向けた技術開発として,未分化な歯原性上皮細胞や間葉細胞を得るために,(1)歯原性組織幹細胞のReprograming方法,(2)ES細胞やiPS細胞のような多能性幹細胞を歯原性上皮細胞や間葉細胞に分化させる方法,(3)再生歯の発生期間の短縮化のための乳歯と永久歯の発生・成熟期間の差を生物学的に解析するものである.平成27年度の研究実施項目に従って進捗し、下記の研究成果を得た.研究項目(1);cDNAマイクロアレイ,Laser micro-dissection法による歯胚発生関連遺伝子を抽出するために,様々な歯胚発生ステージに該当する各胎齢のマウス歯胚摘出技術,さらには上皮/間葉組織の分離技術を確立した.研究項目(2);研究項目(1)の歯胚発生遺伝子の同定を進めており,現在のところ,direct reprogramming/differentiationを可能とする候補遺伝子の抽出中である.研究項目(3);胎齢55日イヌ乳歯・永久歯歯胚を取得して,cDNAマイクロアレイの群間比較により,乳歯に高発現している遺伝子201個,永久歯に高発現する遺伝子84個を見出した.その中から,未分化性維持を基礎とする器官発生時間軸制御に関与する遺伝子を抽出するために,永久歯に高発現する上位2遺伝子を対象に,in situ hybridizationにてイヌ永久歯歯胚組織内における発現局在を解析している.研究項目1, 2に該当する歯胚発生を制御する候補遺伝子同定に関する内容は、研究計画よりもやや遅れが生じている.これはLaser micro-dissection法の構築(サンプル採取部位の選定)が技術的に高度であり,その点で難航しているためである.その一方で,研究項目(3)においては計画に沿って順調に進んでおり,研究プロジェクト全体としての進捗に関しては大きな遅れはない.本研究課題は、補綴治療の究極の目的である「再生臓器としての歯・歯根膜・歯槽骨複合体」による歯の再生治療に向けて、再生器官原基を創出可能な未分化な上皮細胞・間葉細胞を開発し、再生器官の発生や形態を制御するための基盤技術を構築することを目的とする。そのために、(1)歯胚発生に関わるマスター遺伝子の探索、(2)歯胚上皮前駆細胞・歯胚間葉前駆細胞への誘導因子の同定、(3)歯胚発生の時間軸制御に関わる因子の探索を行う。平成28年度の研究実施項目に従って進捗し、下記の研究成果を得た。研究項目(1):歯胚発生に不可欠な上皮間葉相互作用の境界面となる基底膜にて、どのような遺伝子発現変動が生じているかを解析するために、生後30日のイヌ顎骨から永久歯歯胚を摘出し、これらの歯胚の基底膜をレーザーマイクロダイセクション法により抽出することにより、歯胚発生関連遺伝子を抽出する技術を構築している。研究項目(2):研究項目(1)の歯胚発生遺伝子の同定を進めているとともに、direct reprogramming/differentiationを可能とする候補遺伝子の抽出中である。また、マウス歯胚への遺伝子導入の技術確立を検討中である。

研究項目(3):発生時間軸制御に関わる候補遺伝子の発現解析として、H27年度の乳歯歯胚・永久歯歯胚におけるcDNAマイクロアレイの研究結果から抽出された因子の中で、永久歯歯胚にて高発現するFGF14遺伝子と、乳歯歯胚に高発現するFEZF2遺伝子を見出した。これらの分子を用いてin situ hybridizationにて発現局在の解析を行ったところ、FGF14は歯胚上皮幹細胞のニッチであるサービカルループ領域の上皮細胞に遺伝子発現が集積しており、その一方でFEZF2遺伝子は歯冠部のエナメル芽細胞の領域にて発現集積が認められた。これらの結果より、抽出された2つの候補遺伝子は歯胚上皮細胞の未分化性維持や分化促進に影響している可能性が示唆された。昨年度より、研究項目1・2における歯胚発生を制御する候補遺伝子の同定に関しては、研究計画よりもやや遅れが生じている。その理由として、マウス歯胚におけるレーザーマイクロダイセクションの構築(サンプル採取部位の選定)や遺伝子導入が技術的に困難であったためである。そこで今年度においては、レーザーマイクロダイセクションの解析サンプルをイヌ歯胚に変更するとともに、エレクトロポレーションやアデノ随伴ウイルス導入系利用した遺伝子導入を試みている。その一方で,研究項目(3)においては計画に沿って順調に進んでおり、研究プロジェクト全体としての進捗に関しては、大きな遅れは生じていない。本研究課題は、補綴治療の究極の目的である「再生臓器としての歯・歯根膜・歯槽骨複合体」による歯の再生治療に向けて、再生器官原基を創出可能な未分化な上皮細胞・間葉細胞を開発し、再生器官の発生や形態を制御するための基盤技術を構築することを目的とする。そのために、(1)歯胚発生に関わるマスター遺伝子の探索、(2)歯胚上皮前駆細胞・歯胚間葉前駆細胞への誘導因子の同定、(3)歯胚発生の時間軸制御に関わる因子の探索を行う。平成29年度の研究実施項目に従って進捗し、下記の研究成果を得た。研究項目(1):歯胚発生に不可欠な上皮間葉相互作用の境界面となる基底膜にて、どのような遺伝子発現変動が生じているかを解析するために、生後30日のイヌ顎骨から永久歯歯胚を摘出し、これらの歯胚の基底膜をレーザーマイクロダイセクション法によりRNAを抽出し,RNA-seqを行い、歯胚発生に深く関わる遺伝子の抽出を行った。研究項目(2):研究項目(1)の歯胚発生遺伝子の同定を進めているとともに、direct reprogramming/differentiationを可能とする候補遺伝子の絞り込みを行った。また、マウス歯胚への遺伝子導入の技術確立を検討し、マイクロインジェクターにて、歯胚に直接遺伝子導入する方法が最も効率が良いことが明らかとなった。研究項目(3):発生時間軸制御に関わる候補遺伝子の発現解析として、乳歯歯胚・永久歯歯胚におけるcDNAマイクロアレイの研究結果から抽出された因子の中で、永久歯歯胚にて高発現する遺伝子Xと、乳歯歯胚に高発現する遺伝子Yを見出した。2つの候補遺伝子の機能解析を行い、歯胚上皮細胞の未分化性維持や分化促進に関与していることを明らかにした。歯の喪失に対して,生理的活性を有した完全な歯を再生することに大きな期待が寄せられている.近年我々は,細胞を三次元に配置することで器官の原基を再生することが可能な器官原基法の開発に成功した.しかし,未だ歯の発生に関わる遺伝子の解明にはつながっていない.そこで,我々は,歯の発生に関わる遺伝子の探索を目的に解析を行った.
モデリングと制御器設計の協調を可能とするリアルタイム制御系CADの開発

制御対象のモデリングと制御器設計の協調を可能とするには,モデリングのために実際に実験を行なう必要があり,制御系CADにリアルタイム制御機能を持たせなければならない。リアルタイム制御は一定時間毎に行なわれる処理(測定入力-制御則計算-制御出力)の時間的要求が絶対的であり高速処理が求められるので,コードの最適化および高速なメモリ管理機構を導入する必要がある。本研究では,制御系の解析,制御器の設計,モデリングの繰り返しによって仕様を満足させる作業を制御系設計と考え,これらの作業を総合的にサポートできるソフトウェアを開発した。具体的には,1.リアルタイム制御のためのメモリ管理機構,リアルタイム制御を行ないながら制御器などのパラメータを変更できるパラメータ更新機構,制御器設計とモデリングの繰り返しを効率的に行なえる機構を設計した。2.申請者が開発したワークステーションのUNIX上で動作する制御系CADを申請した開発ソフトウェアを用いて申請したパーソナルコンピュータに移植し,本研究で提案したリアルタイム制御機構を組み込んで,リアルタイム制御系CADを開発した。そして,申請したパーソナルコンピュータを用いて,倒立振子装置やロボットアームと接続した実験システムを構築し,実際にリアルタイム制御実験を行った.その結果,開発したリアルタイム制御系CADが制御系のモデリングおよび設計に有効性であることが分かった。また,開発した制御系CADでモデリングと制御器設計の繰り返しにより制御性能を改善できることを確認した。
光活性機能アモルファスTiO2薄膜の創成と環境センサーへの応用

リモートプラズマ法で作製された、アモルファスTiO2薄膜は膜中にOH基を含み、紫外線照射に対して、強い光活性機能を示し、超親水性機能と光触媒機能を示すことが確かめられた。これは、アモルファスTiO2中に含まれるダングリングボンドがOH基によって終端されることによって、欠陥準位が電気的に不活性化され、紫外線励起されたキャリヤーの寿命時間が長くなったために生じた光機能性と考えられる。アモルファスTiO2のバンドギャップ中の欠陥準位密度がどのようなもので、どのように変化が起こったのかについては、まったく未知の事柄である。本研究では、電気伝導特性において暗電流の温度依存特性から、活性化エネルギーを求めると、0.40.5eVの値が求まった。さらに、1mW/cm2の強度の紫外線照射を行った場合、真空中またはアルゴン雰囲気中において、6桁から7桁の電気伝導率の上昇が見られ、光を遮断した後も光電流の減少は少なく数時間にもわたって流れ続けた。このとき、光電流の温度依存特性から活性化エネルギーを求めると、0.35eであり、光で励起されたキャリヤーは0.35eVの準位に捕獲され、また放出されることを繰り返して電流が流れ続けるものと考えられる。酸素ガスを含む雰囲気において、光電流は顕著な変化をした。光電流量は酸素ガス分圧に反比例し、光電流の光遮断後の電流減衰時定数は、酸素ガス分圧に反比例する結果が得られた。これらの実験結果は酸素ガスが光励起キャリヤーを再結合させる役割を演じているものと、考えられる。さらに、光触媒効果の本質的な原因が、光励起キャリヤの捕獲準位と酸素ガスへの電子の授受の関係から発生しているものと考えられ、本現象の更なる究明により、アモルファスTiO2コーティングの光触媒応用への知見が得られる目途がついた。マイクロ波リモートプラズマ法を用いて酸素水素の混合ガスプラズマによって生成された励起種、主として中性ラジカルを作用させて有機チタン(チタニウムテトライソプロポキシド(TTIP))から酸化チタン薄膜を堆積する反応過程が前年度に引き続いて研究された。TTIPの分解膜化プロセスに水素の原子ラジカルは反応を加速させること、OHラジカルは反応を抑制させることがわかった。得られた薄膜はアモルファス状態であり、膜中には多くのOH基を含むことが、FTIRの解析から明確に示された。これをa-TiOx : OHと呼ぶこととした。得られた薄膜は紫外線の照射により極めて高い光伝導電流が観測され、再結合中心が大きく減少していることがわかった。しかしながら、光照射時の電流変化は時間的に緩やかな変化であり定常状態、即ち飽和値に達するのに10分程度の時定数を持つものであることもわかった。飽和値に達した後、光照射を遮断すると電流値は減少するが、その減少する時定数は雰囲気ガスの影響を強く受け、真空中では数時間に及ぶものが、酸素ガス中では瞬時に暗値にまで減少する。この減少の早さは酸素圧力に反比例することがわかった。アモルファス酸化チタン薄膜を活性層としたTFTを作製した。即ち、シリコンを酸化し酸化膜上にa-TiOx : OH膜を付け、その上にドレイン-ソース電極をつけた。ゲート電極にプラス電圧を印加したとき、ドレイン電流の変化は極めて少なく、かつ、その変化は時間的にも緩慢なものであった。

これらのことを総合的に判断すると、プラズマにより生成されたa-TiOx:OH薄膜はOH基がアモルファス薄膜中の欠陥に対応した不対電子を終端することにより再結合欠陥を不活性化していることにより、高い光伝導率を示す。この欠陥準位はバンドギャップの中央近傍にあるもので、中央から離れた深い準位の欠陥は捕獲中心として働き、励起されたキャリヤーは捕獲中心と伝導帯もしくは価電子帯間をジャンプしながら存在し、長い時定数を持つものと思われる。酸素が表面に衝突すると、電子が酸素に移り、急激に電流が減少するものと思われる。リモートプラズマ法で作製された、アモルファスTiO2薄膜は膜中にOH基を含み、紫外線照射に対して、強い光活性機能を示し、超親水性機能と光触媒機能を示すことが確かめられた。これは、アモルファスTiO2中に含まれるダングリングボンドがOH基によって終端されることによって、欠陥準位が電気的に不活性化され、紫外線励起されたキャリヤーの寿命時間が長くなったために生じた光機能性と考えられる。アモルファスTiO2のバンドギャップ中の欠陥準位密度がどのようなもので、どのように変化が起こったのかについては、まったく未知の事柄である。本研究では、電気伝導特性において暗電流の温度依存特性から、活性化エネルギーを求めると、0.40.5eVの値が求まった。さらに、1mW/cm2の強度の紫外線照射を行った場合、真空中またはアルゴン雰囲気中において、6桁から7桁の電気伝導率の上昇が見られ、光を遮断した後も光電流の減少は少なく数時間にもわたって流れ続けた。このとき、光電流の温度依存特性から活性化エネルギーを求めると、0.35eVであり、光で励起されたキャリヤーは0.35eVの準位に捕獲され、また放出されることを繰り返して電流が流れ続けるものと考えられる。酸素ガスを含む雰囲気において、光電流は顕著な変化をした。光電流量は酸素ガス分圧に反比例し、光電流の光遮断後の電流減衰時定数は、酸素ガス分圧に反比例する結果が得られた。これらの実験結果は酸素ガスが光励起キャリヤーを再結合させる役割を演じているものと、考えられる。さらに、光触媒効果の本質的な原因が、光励起キャリヤの捕獲準位と酸素ガスへの電子の授受の関係から発生しているものと考えられ、本現象の更なる究明により、アモルファスTiO2コーティングの光触媒応用への知見が得られる目途がついた。
熱安定性の高いRNAとタンパク質の複合体の創製

本研究では複合体の結晶構造及びRNAとの相互作用形式が解明されており、尚かつ80°C以上で生育可能な超好熱菌内において機能するH/ACA Box RNPを基に設計した基本骨格を用いて、望みの機能を有し熱安定性の高い機能性RNPを構築する方法論の開発を試みている。本年度は、(1)基本骨格として用いるRNA部位及びタンパク質部位の決定と、(2)超好熱菌のタンパク質の発現、精製法及び分子設計によるapADHの機能改変について学ぶ事を目的に研究を行った。(1)RNA部位及びタンパク質部位の決定H/ACA Box RNPを構成している1つのRNA(guide RNA)及び4つのタンパク質サブユニット(Cbf5,Nop10,L7Ae,Gar1)の内から基本骨格として用いる部位の選択を行った。タンパク質サブユニットに関しては、論文及び結晶構造を基にRNAと最も相互作用面が大きいCbf5及び最もアミノ酸数が少なくH/ACA Box RNPの構造変化に寄与すると考えられるNop10をタンパク質サブユニットとして選択した。guide RNAに関しては、論文を基にCbf5及びNop10との相互作用部位の確認を行いCbf5及びNop10との相互作用を保持した最小限のRNA単位及びランダム領域の導入箇所を決定した。(2)超好熱菌由来のタンパク質の発現、精製法及び機能改変について超好熱菌由来のタンパク質の発現、精製法及び機能改変について学ぶ為に超好熱菌由来のアルコールデヒドロゲナーゼ(apADH)を用いて超好熱菌由来タンパク質の発現及び精製を行い、更にモデリングソフトを用いた分子設計によりapADHを熱安定性の高いホルムアルデヒドジスムターゼ(FDM)に機能改変する事を試みた。超高熱菌の精製法の習得、8種類のapADH変異体の作製及び熱安定性の評価を行った。
生細胞分光イメージングと多変量解析法による多重蛍光の定量的分離解析システムの開発

平成18年度には、従来型の蛍光顕微鏡をべースにして、励起波長と蛍光波長を数種類のバンドパスフィルターで切り換えて高感度ビデオカメラで記録する光学系を構築した。また、多チャンネル分光センサを搭載した共焦点顕微鏡をベースにしたシステムも併せて検討した。これらの測定系で得られたEEM画像について励起光強度やフィルタ透過率についての補正を行った後、昨年度までに開発したPARAFACに基づくスペクトル分離アルゴリズムを画像データ用に改変したものを用いて、各蛍光成分画像の分離を行った。マウス卵細胞に各種蛍光色素や蛍光タンパク質を導入したものを対象にして、上述のシステムで単一細胞レベルでのEEM画像を経時的に記録・解析した結果、いずれの系においても導入した複数の蛍光成分と内因性蛍光成分のそれぞれが正確に分離できることが確認できた。具体的には例えば、IP_3産生酵素であるPLC、細胞内カルシウムイオン、およびミトコンドリアの細胞内動態を、それぞれGFP、カルシウムプローブ、フラビン由来の自家蛍光により、同時に測定することが出来た。また、従来のLinear unmixingによる成分分離法より分離結果が正確であることも確かめられた。各成分スペクトルに関する先見情報が不要な方法なので、特に未知の成分を含む試料に関して有用なシステムであると考えられるが、現時点では分離可能な蛍光成分数が3から4個と少なく、今後更なる改良が必要である。
社会に生きる学力形成をめざしたカリキュラム・イノベーションの理論的・実践的研究

従来のカリキュラムは,大学における学問体系を高校・中学・小学校へとおろしていくように構成されていた。こうしたカリキュラムは,市民社会生活との関連(社会的レリバンス)を欠くという問題点をはらんでいた。そこで本研究では,戦後型社会の構造転換を踏まえた公教育の新しい方向性を探り,理論面と実践面から検討を加え、次の学習指導要を視野に入れたカリキュラム・イノベーションの可能性と条件を探った。こうした目的を達成するために,「基幹学習ユニット」「生き方の学習ユニット」「社会参加の学習ユニット」の3つのユニットを設け,さらに,東京大学教育学部附属中等教育学校との連携を可能にするために「総括ユニット」を設けた。本研究では、戦後型社会の構造転換をふまえた公教育の新しい方向性を探り、理論面と実践面から、次の学習指導要領改訂およびその後を視野に入れたカリキュラム・イノベーション(革新)の条件を探ることを目的とする。さらに、実現可能なカリキュラムを開発することもめざす。その際特に、教科学習に閉じることなく、社会生活を視野に入れた、社会的レリバンスを有する学力の形成を重視する。本年度は、研究組織を立ち上げると同時に、附属中等教育学校との協働研究を可能にするプラットフォームづくりを行った。具体的には、第一に、基幹学習ユニット(言語力育成プロジェクト:秋田喜代美、数理能力の育成プロジェクト:藤村宣之、学び方の学習プロジェクト:市川伸一、探究型学習プロジェクト:根本彰)、第二に、生き方の学習ユニット(哲学教育プロジェクト:今井康雄、金森修、田中智志、心理教育プロジェクト:下山晴彦、中釜洋子、キャリア教育プロジェクト:高橋美保)、第三に、社会参加の学習ユニット(市民性教育プロジェクトA:川本隆史、小玉重夫、市民性教育プロジェクトB:牧野篤、バリアフリー教育プロジェクト:白石さや、星加良司、職業教育プロジェクト:本田由紀)、第四に、総括ユニット(カリキュラムの基礎概念の検討:佐藤学、高等教育との接続の観点からの初等中等カリキュラムの検討:両角亜希子、カリキュラム・イノベーションに向けた行政の役割の分析:大桃敏行、附属学校との協働を可能にするプラットフォームづくり:小玉重夫、南風原朝和、河野麻沙美、植阪友理、今井康雄、大桃敏行)を発足させ、稼働させることができた。また、これらのユニットを結集して、研究全体の理念と方向性を明らかにするための公開シンポジウム「社会に生きる学力形成をめざしたカリキュラム・イノベーション-理念と方向性-」を2011年12月10日に開催し、成功させた。科研の研究組織としては「基幹学習ユニット」「生き方の学習ユニット」「社会参加の学習ユニット」の3つのユニットを設け、さらに、東京大学教育学部附属中等教育学校との連携を可能にするための組織として「総括ユニット」を設けて大学と附属学校等とを架橋するプラットフォーム的役割を持たせている。また、附属学校との連携に関しては、附属学校と研究科の教員が協働して、イノベーション科研に取り組む13の研究プロジェクトを立ち上げ、共同研究を進めてきた。最終年度である本年度は、具体的なカリキュラムの提案を含む研究の成果をとりまとめる方向で、研究を進めた。そして、12月8日(日曜日)の午後1時から5時まで、東京大学本郷キャンパス内の福武ホール・ラーニングシアターで、公開シンポジウムを開催し、研究成果の公表とカリキュラムの提案を行った。シンポジウムのテーマは、「社会に生きる学力形成をめざしたカリキュラム・イノベーション-新たなカリキュラム像の提案に向けて-」と題し、イノベーション科研の最終成果発表へ向けて、各ユニットの進捗状況とそこで検討されているカリキュラム像の中身を公表し、議論を行った。当日は、130名を超える参加者があった。本年度は、附属学校と研究分担者が協働して、イノベーション科研に取り組む13の研究プロジェクトを立ち上げ、共同研究を進めた。それを各ユニットの研究と連動させつつ行った。その結果、附属との連携による研究は、具体的な実践の提案を視野に入れながら進展した。

具体的には、第一に、基幹学習ユニット(言語力育成プロジェクト:秋田喜代美、数理能力の育成プロジェクト:藤村宣之、学び方の学習プロジェクト:市川伸一、探究型学習プロジェクト:根本彰)、第二に、生き方の学習ユニット(哲学教育プロジェクト:今井康雄、金森修、田中智志、心理教育プロジェクト:下山晴彦、中釜洋子:年度途中逝去により辞退、キャリア教育プロジェクト:高橋美保)、第三に、社会参加の学習ユニット(市民性教育プロジェクトA:川本隆史、小玉重夫、市民性教育プロジェクトB:牧野篤、バリアフリー教育プロジェクト:白石さや、星加良司、職業教育プロジェクト:本田由紀)、第四に、総括ユニット(カリキュラムの基礎概念の検討:佐藤学、高等教育との接続の観点からの初等中等カリキュラムの検討:両角亜希子、カリキュラム・イノベーションに向けた行政の役割の分析:大桃敏行、附属学校との協働を可能にするプラットフォームづくり:小玉重夫、南風原朝和、河野麻沙美、植阪友理、今井康雄、大桃敏行)が活動を行い、その成果を9月29日(土曜日)開催のシンポジウム「社会に生きる学力形成をめざしたカリキュラム・イノベーション-具体的な実践の提案-」において発表した。当初の計画では各ユニットの研究実施に着手することを初年度の課題としていたが、実際には、研究実施にとどまらず、各ユニットの研究組織を附属学校との協働のプラットフォームに位置づけ、公開シンポジウムでその成果を公表するところまで進めることができた。25年度が最終年度であるため、記入しない。当初の計画では各ユニットごとに、附属学校との連携プロジェクトを立ち上げ、実践の成果を検証するところまでを課題としていた。しかし実際には、成果の検証にとどまらず、成果の検証をふまえた具体的な実践の提案へ向けての端緒をつかむことができ、その一端は、研究実績の概要において上述したシンポジウム「社会に生きる学力形成をめざしたカリキュラム・イノベーション-具体的な実践の提案-」で公表することができた。特に、シンポジウム当日は、150名を超える参加者があるなどその反響はきわめて大きく、社会へ向けての研究成果の発信という意味においても、当初の計画以上の成果を上げることができた。初年度の成果に立脚して、カリキュラムの具体像を構築する作業に着手する。そのために、7月に研究プロジェクト内部での全体会を持ち、さらに、9月には公開シンポジウムで成果を公表することを計画している。これまでの2年間の成果に立脚して、カリキュラムの具体像と実践の提案を伴ったカリキュラム開発を構築する作業に着手する。そのために、7月に研究プロジェクト内部での全体会を持ち、さらに、12月には公開シンポジウムで成果を公表することを計画している。
牛卵子成熟および胚発生に関わるオートファジー・リソソーム系のストレス応答機構

本研究では、牛卵子成熟および初期胚発生能に及ぼす細胞質内オートファジー・リソソーム系のストレス応答機構を解明することを目的とした。暑熱負荷によってリソソームとカテプシン(CTS)Bの活性化ならびにアポトーシス経路の活性化がおこり、胚発生低下との関連が見られた。これに対して、CTSB阻害剤であるE-64の添加によって、暑熱ストレス下の発生向上効果が認められた。本年度は、オートファジーとの関連が深いリソソームの機能に主眼を置いて、その局在の検出を行うこととともに、リソソーム内に貯蔵され、異化作用にかかわっているプロテアーゼであるカテプシンの遺伝子および蛋白質の発現を解析することを目的とした。【材料及び方法】食肉処理場より採取したウシ卵巣より卵子を採取し、体外成熟体外受精および体外培養によって得られた胚盤胞を主な材料として、1)リソソーム活性を可視的に検出する蛍光プローブを用いることで、初期胚におけるリソソームの機能を評価した。2)リソソームから漏出する可能性のあるカテプシンB、K,S, Zに焦点を当てその遺伝発現を定量PCRで解析した。またカテプシンBの特異抗体を用いて胚盤胞における局在を検出した。【結果】1)胚盤胞における活性リソソームを検出したところ、胚盤胞を構成する内部細胞塊(ICM)と栄養外胚葉(TE)にともに高い活性を示すスポットが散在することが観察された。2)カテプシンB、K,S, Zに焦点を当てその遺伝発現を定量PCRで解析したところ、BとZの高い発現が胚盤胞で見られた。また、胚盤胞を構成する内部細胞塊(ICM)と栄養外胚葉(TE)に分けてBとZの発現を見たところ、TEでの高い発現がみられ、蛋白質の局在についてもICMで高い局在がみられた。カテプシンBの蛋白質発現について免疫組織学的に検出したところ、ICMでの高い発現が観察された。本年度は、卵子成熟、胚発生時の細胞質内リソソーム機能不全によるカテプシン群の不必要時の漏出による細胞内機能への負の影響という仮説を立て、リソソームへのダメージを可視的に検出する蛍光プローブを用いることで、品質・発生能とリソソーム機能を評価する。加えて、リソソームから漏出する可能性のあるカテプシンBに焦点を当て、卵子・胚の品質とリソソーム損傷ならびに発現動態について解析した。【材料及び方法】ウシ卵子成熟時に41°C16時間の暑熱ストレスを付加し、1)胚盤胞形成率および細胞数に及ぼす影響、2)成熟後の卵子におけるカテプシン蛋白質の発現ならびにアポトーシス関連酵素であるカスパーゼ3の蛋白質発現を解析した。併せて、卵丘細胞でのアポトーシスを検出した。3)また、カテプシン活性阻害剤であるE-64を添加して暑熱ストレスを付加させた際の卵子でのカテプシン、カスパーゼ3タンパク質発現を検出した。【結果】1)体外成熟培養時の暑熱ストレス負荷によって体外受精後の胚盤胞発生率が有意に低下したが、カテプシン阻害剤の添加によってストレスによる阻害防止効果がみられた。2)暑熱負荷によって卵子卵丘細胞のTUNEL陽性細胞数が増加したが、カテプシン阻害剤の添加によって緩和された。3)体外成熟培養時の暑熱ストレス負荷によって卵子のカテプシンBおよびカスパーゼ3の発現が有意に増加した。カテプシン阻害剤の添加によってカスパーゼ3の発現が抑制され、アポトーシス誘導との関係が示唆された。カテプシン阻害剤の添加は、暑熱感作時のカテプシンB蛋白質増加の改善には影響しなかったが、活性に対する抑制効果としての関与が示唆された。本研究では、牛卵子成熟および初期胚発生能に及ぼす細胞質内オートファジー・リソソーム系のストレス応答機構を解明し、その制御による高品質な牛胚生産を目的として、以下の研究を実施した。具体的には、1)酸化、暑熱等のストレス因子がリソソームへの傷害に及ぼす影響の評価解析と成熟・初期発生への影響、2)リソソームが関与する蛋白質分解・代謝に関わるオートファジー動態並びに、システインプロテアーゼであるカテプシン類のストレス応答とアポトーシス誘導に及ぼす影響、3)カテプシン類の活性制御によるストレス負荷下での卵子成熟・胚発生への影響解析、について、受胎率向上が望める高品質の胚生産につながる基盤的な研究を推進することを目的として研究に取り組んだ。二年目までに、1)体外成熟培養時の暑熱ストレス負荷によりみられた体外受精後の胚盤胞発生率の低下は、カテプシン阻害剤の添加によって改善効果がみられた。2)体外成熟培養時の暑熱ストレス負荷によって卵子のカテプシンBおよびカスパーゼ3の発現が有意に増加したが、カテプシン阻害剤の添加によってそれらの発現が抑制され、アポトーシス誘導との関係が示唆された。併せて、暑熱により増加した卵子卵丘細胞のTUNEL陽性細胞数は、カテプシン阻害によって改善された。

3)加えて、卵子形成の場である卵巣の退行時黄体組織ではオートファジー、リソソーム並びにカテプシン活性が劇的に増加しており、卵子発育につながる周期調節に大きく関わっていることが明らかになった。家畜繁殖24年度の報告で当初計画であったストレスによるウシ卵子、胚でのカテプシンB遺伝子・蛋白質発現ならびに酵素活性の増加とアポトーシス誘導を明らかにしたとともに、カテプシンB活性を阻害剤で抑えることで、ストレス下での胚の発生率向上が可能であることを年次計画に先行して明らかにした(Reproduction 2013)。本年度は正常な胚発生の過程でみられるカテプシンの役割とカテプシンが不活性化され収納されている微小器官であるリソソームの動態についてを当初計画に従って解析を行った。本課題の主要な研究テーマである「細胞質内タンパク質の分解ー再利用に関わる機構としてのオートファジー・リソソームの観点から、酸化、暑熱が関わる化学的要因並びに物理的な外部ストレス要因が牛卵子成熟、初期胚発生並びに凍結保存に及ぼす影響」を明らかにするために3つの目的を設定し、当初年度の目標である「酸化、暑熱等のストレス因子がリソソームへの傷害に及ぼす影響の評価解析と成熟・初期発生への影響」に取り組んだ。その結果、暑熱ストレスを付加させて体外成熟を行った卵子の卵丘細胞および卵子自身でカテプシンの活性が増大し、それと合わせてリソソームの凝集・拡大がみられた。このことは、細胞内微小器官であり、蛋白質の異化にかかわるリソソーム内のプロテアーゼがストレスによって必要時以外に漏出することで、適正な細胞質内環境を悪化させているということが明らかとなった。加えて、アポトーシスシグナルの誘導とDNA断片化の増加が認められ、胚発生への影響としてのアポトーシスの関与が示唆された。また、興味深いことに、リソソームがダメージを受けて漏出し、細胞質内での活性が高まったカテプシンの活性阻害剤で卵子を処理することで、ストレス付加下にもかかわらず、発生が改善され、アポトーシスの抑制効果もあるという結果が得られた。このことから、本研究目的で想定していたストレス→リソソーム損傷→プロテアーゼ漏出→アポトーシスの流れの解明への一端が実証できたと考えられる。本年度は、不要蛋白質、細胞器官の異化作用にカテプシン、リソソーム機能との深い関係が明らかにされているオートファジーに関連する遺伝子発現および蛋白質発現をウシ胚発生での動態を明らかにすることに主眼を置く。また、オートファジーの阻害としては当初計画していたRNA干渉法よりも特異的な蛋白質機能阻害剤に重点を置いての解析を行い、正常胚およびストレス暴露胚の発生に及ぼすそれらの役割を明らかにすることに主眼を置く。今後の方針としては、当初計画通りに、「リソソームが関与する蛋白質分解・代謝に関わるオートファジー動態並びに、システイン・アスパラギン酸プロテアーゼであるカテプシン類のストレス応答とアポトーシス誘導に及ぼす影響」についての研究を進める。平成24年度は、年度途中で研究代表者の所属が(独)農業・食品産業技術総合研究機構から北海道大学に変わり、研究実施体制に変更が生じたため、当初研究経費として予定していた分(30万円)が未使用となった。平成25年度では、24年度未使用分を遺伝子、蛋白質解析にかかわる解析対象因子を増やし、その抗体購入費等に使用する予定である。
唾液分泌におけるNa/K/2Cl共輸送体活性化機構

アンモニウム-パルス法によりNa/K/2Cl共輸送体を介し細胞内へNH_4^+が流入することをTurnerらは細胞内pH測定により見いだしたが、我々はN-14NMRにより細胞内NH_4^+量増加を直接測定し、さらにInversion recovery NMR法にて細胞内K^+の脱出を測定した。本年度はこのKイオン流出経路と共輸送体活性化の関係を分析することにあった。ラット顎下唾液腺を血管灌流し、静脈よりの流出液を30秒毎に採取、Kを炎光光度計にて測定した。結果:1)NH_4Cl20mMを灌流すると、流出液のK濃度は急速に上昇し初期1-2分でピーク値(5mM)を示した。その後低下し、約4-5分でプラトー(4.6mM)となり、15-20分でさらに低下し30分でほぼ流出は停止した(4.4mM)。これは、K流出経路に最低2種類あることを示している。2)ouabain 1 mMは、初期ピーク値、プラトー値共に増加させ(peak5.5mM,plateau 4.8mM)、Na/K ATPaseが細胞内のアンモニウム増加時にもK取込み活性を持つことを示した。3)bumetanide 50 μMは、K流出に対し有意な変化を起こさなかった(peak 5mM,plateau 4.6mM)が、アンモニウム除去後のK取込みの一部はbumetanide感受性であり、Na/K/2Cl共輸送によると結論された。4)K流出経路のCa依存性を調べた。細胞外のCaを除去し、さらに細胞内Caストアを枯渇させるために、acetylcholine 1 μMで刺激した。その上でouabain 1 mMを添加し、NH_4Cl20mMを灌流した。Ca=0ではK流出の初期ピークは抑制された(4.7mM)が、plateau値は抑制されなかった(4.7-4.8mM)。この結果は初期K流出はCa依存性の輸送経路によるものと結論される。今回、細胞内アンモニウム増加時に、Ca依存性のK流出が細胞内の陽イオン-ホメオスタシスに重要な役割を果たすことが明かになった。
ウイルス性肝炎での集団予防接種の寄与と輸入型Ｂ型肝炎ウイルスキャリアの将来予測

集団予防接種での注射器連続使用により感染したとしてB型肝炎特措法で救済が始まっている。これによるB型肝炎ウイルスキャリアの寄与推定を試みた。モデルによる推測では1950年1985年にかけて水平感染によるHBVキャリア率は男女全体で0.12%から0.07%へ推移していた。性交感染によると考えられるB型急性肝炎の増加がある。1994年から2010年までのB型急性肝炎のジェノタイプAの割合と、肝炎キャリアの多いアジアからの入国者数との間に有意な正の相関が認められ、モデルから肝炎キャリア流入率増加に伴い急性肝炎患者の増加を認めたが、肝炎キャリア流入率が小さい場合endemicとならなかった。本邦での集団予防接種等によるB型肝炎感染キャリア推定に関する報告が、2013年秋に相次いであった。平成25年度の研究として、これらの研究報告のメタ分析と「集団予防接種等によるB型肝炎感染拡大の検証及び再発防止に関する検討会」の報告を中心とした文献調査に留まった。Okamotoによる報告では、数理モデルにより1951年から1955年の出生コホートの推定で出生時のHBVキャリア率0.65%から1995年におけるキャリア率が1.4%と増加、1981年から1985年の出生コホートでは、その後のキャリア率は出生時のキャリア率より減少していた。一方、Satoらは、1950年から1985年のコホートを対象とした数理モデルからHBVキャリア率を推定した。水平感染の寄与によるキャリア率は男性で1.43%から0.1%、女性で0.95%から0.03%であった。水平感染によるキャリア率の垂直感染キャリア率に対する比の変化を経時的に分析すると、Okamotoの研究では1950年から1960年にかけて急激な減少を示していたのに対し、Satoらでは1950年から1985年にかけて線形的に減少していた(男性)。集団予防接種等によるB型肝炎感染拡大の検証及び再発防止に関する検討会の報告書から、昭和28年にWHOは血清肝炎が連続使用の皮下注射針又は注射筒によっても感染すること及び一斉予防接種に問題があることを警告。昭和34年1月「予防接種の実施方法について」で「接種液を吸入するには、そのつど滅菌した注射器を使用しなければならない」とした。推定結果との比較から昭和34年の通知による水平感染予防効果が大きいことが推測された。しかし、水平感染によるキャリア率比は、それ以降もなだらかな減少を認め、昭和63(1988)年1月の「予防接種等の接種器具の取扱いについて」までに、注射針、注射筒も取り換えの徹底が示唆された。平成26年度の研究としては、B型肝炎ウイルスによる垂直感染、水平感染について感受性のある者(S)、潜伏期(L)、増殖期(T)、キャリア(C)、回復期(R)からなるコンポーネントモデルによる感染モデルと、キャリアから慢性肝炎の病態進行を表したマルコフモデルとを結合したモデルにより、潜伏期、増殖期、キャリアへの進行と、慢性肝炎から代償性肝硬変、肝がん、肝がん死亡への予測を行った。本邦での集団予防接種等によるB型肝炎感染キャリアの推定に関する2014年の報告と比較すると。Okamotoによる報告では、数理モデルにより1951年から1955年の出生コホートに対する推定で出生時のHBVキャリア率0.65%から1995年におけるキャリア率が1.4%と増加、1981年から1985年の出生コホートに適応した場合には、その後のキャリア率は出生時のHBVキャリア率より減少を認めた。一方、1950年から1985年のコホートを対象とした数理モデルからHBVキャリア率を推定したSatoらの報告では、水平感染の寄与によるキャリア率は男性で1.43%から0.1%、女性で0.95%から0.03%であった。今回のモデルによる推測では男女全体でHBVキャリア率で0.12%から0.07%への推移が認められた。今年度は、海外からの輸入肝炎の可能性があるHBVジェノタイプAが増加していることから肝炎の輸入モデルについて検討を行った。SEACMコンパートメントモデルを作成し、肝炎キャリア流入による影響を評価した。肝炎キャリア流入率の増加に伴い、急性肝炎患者の増加を認めた。肝炎キャリア流入率が小さい場合、肝炎キャリアがendemicになることは認められなかった。実際には1994年から2010年までのB型急性肝炎のジェノタイプAの割合の変化と、肝炎キャリアの多いアジアからの入国者数との間に有意な正の相関が認められた。(相関係数0.894)。HIV患者報告数との相関は相関係数0.994と高く、本邦のB型急性肝炎の原因の割合はSTDが多いことに一致していた。社会的ハイリスク者については公費でB型肝炎ワクチンを進める等の検討も重要と考えられた。一方、厚生労働科学研究費による委託研究に関連して、肝炎検査未受診者に対する職域における肝炎検診について検討している。広島県での職域を対象とした肝炎検査ではHBVのキャリア率1.01%との報告もあり、他県で最近実施された職域の肝炎ウイルス検査でも、HCV,HBVキャリアを発見していることから、肝がん予防のため職場の壮年期を対象とした検診は新たなキャリアを発見法として有効と考え啓発を行っているが、同時に若年労働者に肝炎について関心を持ってもらう工夫の検討を継続したい。

これによるB型肝炎ウイルスキャリアの寄与推定を試みた。モデルによる推測では1950年1985年にかけて水平感染によるHBVキャリア率は男女全体で0.12%から0.07%へ推移していた。性交感染によると考えられるB型急性肝炎の増加がある。1994年から2010年までのB型急性肝炎のジェノタイプAの割合と、肝炎キャリアの多いアジアからの入国者数との間に有意な正の相関が認められ、モデルから肝炎キャリア流入率増加に伴い急性肝炎患者の増加を認めたが、肝炎キャリア流入率が小さい場合endemicとならなかった。これまでB型肝炎ウイルスの感染モデルと、B型肝炎ウイルスの慢性肝炎の病態進行モデルをそれぞれ別々に構築し報告している発表は多数認められる。それに比べ両方が連続したモデルから予測した報告は少ない。そのため、モデルの作成に時間を要した。新しいC型肝炎治療の導入に伴い、肝炎治療と就労の両立を支援する事業(厚生労働科学研究)の研究事業も加速する必要が生じたため、業務が輻輳しエフォートの調整が困難となった。公衆衛生学今年度のモデルでは、時間依存性マルコフモデルを使用したが、さらに各パラメータの確率分布を求め、それを適用することでstochastic modelに拡張予定である。研究計画当初、本邦での集団予防接種等によるB型肝炎感染キャリアの推定に関する報告は見られなかった。平成25年度は「集団予防接種等によるB型肝炎感染拡大の検証及び再発防止に関する検討会」の調査結果の分析を行ったが、モデル作成に必要なパラメータ抽出に参考となる情報に欠けていた。さらに、当時の集団での注射器の連続使用による感染確率を、個体での感受性確率、予防接種への曝露確率、注射後の肝炎ウイルスの感染確率からmass action modelを使用して推定する予定だったが、2013年秋に本邦での集団予防接種等によるB型肝炎感染キャリアの推定に関する2つの論文報告が相次いで発表された。この研究結果を比較検討し、数理モデルの見直しを要した。現在使用している統計ソフトの新しい版への更新を予定していたが、新しい版の発表が研究費の使用が出来ない3月にずれ込んだため更新が出来なかった。これまでの研究報告の結果から推定された当時の集団での注射器の連続使用状況をもとに、感受性のある者(S)、急性肝炎(A)、慢性肝炎(C)、回復(R)の4集団からなるコンパートメントを仮定した連立微分方程式によるモデルを作成する。国が予防接種を義務付けた1950年から、注射の使い回しを禁じた1988年までの期間を想定して、当時の集団予防接種(集団予防接種及び集団ツベルクリン反応検査)の接種率、注射針、注射筒の連続使用の頻度、注射筒の不適切な消毒頻度等の当時の実施状況からB型、C型肝炎ウイルスの感染者の推定を試みる。平成27年度の早期に統計ソフトの新しい版への更新を実施する。しかし、2013年秋に数理モデルにより集団予防接種等によるB型肝炎感染キャリアの推定に関して相次いで2件の報告があり、そのためそれぞれの報告結果について比較検討と本研究テーマとの関連性について分析し、分析結果を数理モデルの作り直しが必要となったため、当初の計画に遅れが生じた。
食物タンパク質誘発性胃腸炎における診断基準の作成および重要細胞群の同定

全年齢層において世界中で患者数が増えつづけている好酸球性消化管疾患の中でも、特に新生児乳児における病態は他疾患との判別が難しく、ときに生命に関わる重大な合併症を引き起こすことがある。そこで本研究では、研究レベルで行われている抗原特異的リンパ球刺激試験が本疾患の診断に臨床応用できるか検討し、診断に有用であることが確認できた一方、IgE依存性の(通常の)食物アレルギーとの鑑別には弱さが残る結果となった。また、抗原特異的リンパ球試験の応用編としてサイトカインや増殖細胞群の検討も行い、IgE依存性の食物アレルギーと本疾患との差を見出すことができた。好酸球性消化管疾患の中でも、環境因子の影響の最も少ない新生児乳児が対象となる食物タンパク質誘発性胃腸炎を対象疾患として取り組んだ。まず初めに特に患者数の多い牛乳を原因食物とする患者群の抗原特異的細胞増殖試験の基準作成に取り組みはじめた。各種牛乳抗原に対する末梢血液由来リンパ球の細胞増殖を測定し、好酸球性消化管疾患患者群とIgE依存性牛乳アレルギー疾患患者群の比較を進めた。6種の牛乳抗原に対するそれぞれの細胞増殖指標のうち、最も高い反応性を示した指標を各ドナーから抽出し、比較検討を行った。その結果、好酸球性消化管疾患患者群において有意に高い値が検出された(p = 0.0299)。Receiver Operating Characteristic解析を行ったところ、AUCが0.715±0.088となり、moderate accuracyの判定を得た。本計算には2種の統計ソフトを用いたが、同一の値を算出したことから、現時点のデータとしては信用できる値であると思われる。また、鑑別に必要なカットオフ値も算出した。細胞刺激に使用している抗原のロット更新にあたり、外注業者でのトラブルが続き時間を要したたが、最終的には本実験系に適切な製品が納入され、現在に至っている。好酸球性消化管疾患の中でも、新生児乳児が対象となる食物タンパク質誘発性胃腸炎を対象疾患として取り組んだ。昨年度に引き続き、特に患者数の多い牛乳を原因食物とする患者群の抗原特異的細胞増殖試験の基準作成に取り組みはじめた。嘔吐、血便の有無によって4つの病型に分けられる本疾患について、血便の有無を中心に牛乳抗原に対するそれぞれの細胞増殖指標のうち、最も高い反応性を示した指標を各ドナーから抽出し、比較検討を行った。リンパ球の増殖具合やin vitroで産生されるサイトカイン量について検討を行った。その結果、細胞増殖や細胞増殖については血便観察群と非血便観察群において有意差が検出できるものの、必須のIL-2の産生量に有意差は観察できなかった。また、抗炎症性サイトカイン(TNF、IL-1β、IL-6)およびIFN-γ、IL-17Aについては牛乳抗原刺激により各産生量は有意に上昇するものの、両群間での差は認められなかった。一方、2型サイトカインであるIL-4、IL-5、IL-13については両群間で有意な差を認め、特にIL-5にいたっては中央値にして10倍以上の上昇を観察した。制御性サイトカインの一つとして考えられるIL-10は2型サイトカインと同様、両群間で有意な差を認めた。このIL-10が、2型サイトカインが顕著に上昇した結果、in vitro内での制御の目的で産生されたものか否かは、細胞内染色あるいうはELISpotを用いた実験を今後行うことで明らかになってくると思われる。これらの結果より、消化管アレルギーの亜型である血便の有無は両群ともに抗原特異的免疫応答においていくつかの特性を共有するが、明確に異なる抗原特異的細胞増殖やサイトカイン産生など、重要な特徴を有しており、この両群が独立した2つの病型であり、血便を呈する群が血便を呈さない群の重篤な形態ではないことが示唆された。また、名誉ある学会にて発表させていただく機会を頂戴し(著者クローズド、要旨内容のみの査読にて選定)自身の研究を国際的に有名な先生方に印象づけることができた。ただ、フローサイトメトリーのほうについては、使用していた複数の抗体がリコール対象となってしまったり、以前使用していた機器が故障(修理不可)してしまったために抗体セットを組み直したりというトラブルもあったが、それらの点を踏まえ、今後、解析を続けていきたいと思っている。これまで4群に分けられる牛乳を抗原とする乳幼児の食物タンパク質誘発性胃腸炎に加え、牛乳食物アレルギー群、非牛乳食物アレルギー群を集め、解析を行ってきた。各種抗原刺激後に1週間培養し、増殖した細胞画群について解析した結果、当初の予備検討に比して実際の病態は非常に複雑であることが判明した。有意差はついていないが、食物アレルギー群と食物タンパク質誘発性胃腸炎群の差について、傾向を認めはじめている。各患者群から採取したPBMCをIL-2存在下で1週間培養した際、食物タンパク質誘発性胃腸炎群においてはCD4+CCR4+分画が顕著に増殖していることが観察される一方、食物タンパク質誘発性胃腸炎群では顕著な増殖を認めない患者数が多いことが判ってきた。これは、食物タンパク質誘発性胃腸炎群の反応が激しいために1週間という培養期間の後では、増殖した細胞分画が確認できなかった可能性もある。そこで、別途実施しているリンパ球増殖試験の結果と照合してみると、培養条件が本実験とは完全に一致しないものの、やはり食物タンパク質誘発性胃腸炎群ではIL-2による細胞増殖が顕著ではないことが多いことが確認できた。この違いが食物タンパク質誘発性胃腸炎病態の複雑性を反映している可能性も考えられる。

クラスター分類別の傾向はいまだまとめられていないが、ターゲットとしてきた細胞群の増殖は確認できている。患者各々が反応する抗原の種類による刺激の強さの差異の影響も考え、各種マーカーの組み合わせ解析をさらに重ね、最終報告までに結論を導き出せるようにしたい。全年齢層において世界中で患者数が増えつづけている好酸球性消化管疾患の中でも、特に新生児乳児における病態は他疾患との判別が難しく、ときに生命に関わる重大な合併症を引き起こすことがある。そこで本研究では、研究レベルで行われている抗原特異的リンパ球刺激試験が本疾患の診断に臨床応用できるか検討し、診断に有用であることが確認できた一方、IgE依存性の(通常の)食物アレルギーとの鑑別には弱さが残る結果となった。また、抗原特異的リンパ球試験の応用編としてサイトカインや増殖細胞群の検討も行い、IgE依存性の食物アレルギーと本疾患との差を見出すことができた。健常群のリクルートが遅れているため、IgE依存性牛乳アレルギー群と別対照群として用いるこの群のN数確保を依頼する。また、各種抗原刺激後に増殖している細胞群の同定についても進めていく。トラブルが続いてしまっているフローサイトメトリーでの解析を中心に進めていく予定である。少なくとも、どの細胞群が抗原特異的反応によって増殖しているのかを推測していけるよう、拍車をかけていきたい。免疫学、アレルギー学、分子生物学、時間生物学本研究費からの旅費の支出が減り、研究室に既存の消耗品を使用したり、業者によるキャンペーンを利用したりしたため、当初の予定よりも少ない出費となった。機器トラブル等によりpendingなってしまった実験もあったが、ほかのプロジェクトの進行が順調であったため、総計としてはほぼ予定通りの支出金額に収めることができた。次年度の物品、消耗品として必要最小限の追加を行いたい。所属の異動がありはするものの、今後は、このプロジェクトのゴールを目指して着実に進めていく予定である。