hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
MIRAGE症候群の疾患モデル細胞および動物の作成と変異遺伝子の機能解明

第1に世界初のMIRAGE症候群モデル細胞を樹立し、野生型SAMD9遺伝子は細胞増殖を抑制すること、および変異型SAMD9遺伝子は野生型SAMD9遺伝子の作用を強く増強する“機能獲得型変異"であることを示した(Nat Genet 2016)。第2に野生型ヒトSAMD9遺伝子を有する遺伝子改変マウス、すなわちROSA26遺伝子プロモーターの制御下でloxP-終止コドン-loxPの3'側にRFP-野生型SAMD9をホモ接合性に有するマウスの作成に成功した。第3に野生型ヒトSAMD9遺伝子を有する遺伝子改変メダカ、および変異SAMD9遺伝子を有する遺伝子改変メダカの作成を試みている。本研究の目的は成長障害を主症状の1つとするMIRAGE症候群(以下本症候群)の疾患モデル細胞およびモデル動物を作成し、変異SAMD9の機能をin vitroおよびin vivoで解明することである。平成27年度、第1に本症候群疾患モデル細胞を樹立し、その増殖能を解析した。具体的には哺乳動物細胞のゲノムへの安定型遺伝子組み込みを利用し、ヒト胎児腎由来HEK293細胞に野生型遺伝子SAMD9を導入した細胞(野生型SAMD9細胞)、および本症候群患者で同定した8つの変異型遺伝子SAMD9を各々導入した細胞(疾患モデル細胞)を作成した。遺伝子非導入HEK293細胞、野生型SAMD9細胞および疾患モデル細胞を培養し、タイムラプス顕微鏡で、3時間毎に120時間コンフルエンスを計測した。野生型SAMD9細胞は遺伝子非導入HEK293細胞に比し細胞増殖はやや不良であった。すなわちほぼコンフルエントになった時間は、遺伝子非導入HEK293細胞で60時間であったのに比し、野生型SAMD9細胞で80時間であった。さらに8種類の疾患モデル細胞は野生型SAMD9細胞に比し、細胞増殖は明らかに不良であった。すなわち、8つの疾患モデル細胞すべての120時間後のコンフルエンスは2040%であった。第2に本症候群モデル動物である遺伝子改変メダカを作成中である。はじめにCreリコンビナーゼ誘導下に高感度緑色蛍光たんぱく質(以下EGFP)および野生型(あるいは変異型)SAMD9遺伝子を発現するベクターを作成した。このベクターを受精卵1細胞期にマイクロインジェクションした。飼育中の受精卵においてEGFPの誘導発現を確認した。平成27年度には2つの研究計画を実施予定であった。第1に予定していた「本症候群疾患モデル細胞の樹立と細胞増殖能の解析」については予定通り研究が進行し、終了した。すなわち、8種類の本症候群疾患モデル細胞の樹立に成功し、その細胞増殖能を定量評価することに成功した。全ての本症候群疾患モデル細胞の増殖は極めて不良であった。第2に予定していた「変異SAMD9を有する本症候群モデル動物である遺伝子改変メダカの作成」については、当初の実験計画を修正し、結果的にほぼ予定通りに研究が進行した。当初、heat-inducibleプロモーターに赤色蛍光たんぱく質タグつき野生型SAMD9遺伝子を連結したベクターを構築した。このベクターを受精卵の1細胞期にマイクロインジェクションしたところ、受精卵が分化増殖することはなかった。野生型SAMD9遺伝子が漏出発現し、その細胞増殖抑制作用のために受精卵が育たなかったと考え、コンストラクトを作り直した。すなわち、Creリコンビナーゼ誘導下に高感度緑色蛍光たんぱく質(以下EGFP)および野生型(あるいは変異型)SAMD9遺伝子を発現するベクターを作成した。具体的には、マウスアクチンプロモーター制御下に、loxPー終始コドンーlopP、EGFP、野生型SAMD9遺伝子を連結した。このベクターを受精卵の1細胞期にマイクロインジェクションし、Creリコンビナーゼ誘導下の受精卵にEGFPの発現を確認した。平成27年度に本症候群疾患モデル細胞を樹立し、その増殖能は不良であることを示した。平成28年度、第1に本症候群モデル動物である遺伝子改変メダカを作成中である。すなわちCreリコンビナーゼ非誘導化には赤色蛍光たんぱく質(以下DsRED)のみを発現し、Creリコンビナーゼ誘導下には、DsREDは発現せず、EGFPおよび野生型(あるいは変異型)SAMD9遺伝子を発現するベクターを作成した。DsREDの蛍光観察により、このベクターの導入に成功した受精卵のみを杯の段階で選択することが可能であった。導入に成功した受精卵に対し、Creリコンビナーゼによる発現誘導を行う。第2に本症候群モデル動物である遺伝子改変マウスを作成中である。すなわち、ROSA26マウスES細胞株での相同組み替えにより、ROSA26遺伝子プロモータの制御下でloxP-終止コドン-loxPの3'側に野生型SAMD9遺伝子を連結したROSA26/Sノックインマウス(以下終止コドン付き野生型SAMD9ノックインマウス)を作製することに成功した。

一方、ROSA26遺伝子プロモータの制御下でloxP-終止コドン-loxPの3'側に変異型SAMD9遺伝子を連結したROSA26/Sノックインマウス(以下終止コドン付き変異型SAMD9ノックインマウス)の作成には成功しなかった。現在終止コドン付き野生型SAMD9ノックインマウスに対するゲノム編集により、終止コドン付き変異型SAMD9ノックインマウスの作成中である。第1に予定していた「変異SAMD9を有する本症候群モデル動物である遺伝子改変メダカの作成」については、当初の実験計画を修正した。昨年Creリコンビナーゼ誘導下に高感度緑色蛍光たんぱく質(以下EGFP)および野生型(あるいは変異型)SAMD9遺伝子を発現するベクターを作成した。しかし、このベクターを受精卵にインジェクションした際には、トランスジェニック個体かどうかの判別がつかない状態でEGFP-SAMD9の発現を誘導せねばならないという問題点を有した。そこで新たにCreリコンビナーゼ非誘導化には赤色蛍光たんぱく質(以下DsRED)のみを発現し、Creリコンビナーゼ誘導下には、DsREDは発現せず、EGFPおよび野生型(あるいは変異型)SAMD9遺伝子を発現するベクターを作成した。全長12kbpという巨大ベクターであり、大きなベクターの形質転換効率に適した大腸菌(NEB10β)を使用した。DsREDの蛍光観察により、このベクターの導入に成功した受精卵のみを杯の段階で選択することが可能であった。現在、導入に成功した受精卵に対しCreリコンビナーゼによる発現誘導を行っている。第2に「変異SAMD9を有する本症候群モデル動物である遺伝子改変マウスの作成」に着手した。すなわち、ROSA26マウスES細胞株での相同組み替えにより、ROSA26遺伝子プロモータの制御下でloxP-終止コドン-loxPの3'側に野生型SAMD9遺伝子を連結したノックインマウス(以下終止コドン付き野生型SAMD9ノックインマウス)を作出することに成功した。一方、原因は不明であるが、ROSA26遺伝子プロモータの制御下でloxP-終止コドン-loxPの3'側に変異型SAMD9遺伝子を連結したノックインマウス(以下終止コドン付き変異型SAMD9ノックインマウス)の作出には成功しなかった。本研究の目的はMIRAGE症候群の疾患モデル細胞およびモデル動物を作成し、変異SAMD9の機能をin vitroおよびin vivoで解明することである。1.疾患モデル細胞(平成27年度):野生型S AMD9を導入した細胞増殖は非導入HEK293細胞に比しやや不良であった。変異型SAMD9を導入した疾患モデル細胞を8種類の増殖はいずれも明らかに不良であった(Nat Genet報告済)。2.遺伝子改変メダカ(平成28および29年度):はじめにマウスアクチンプロモーター制御下に、loxP-終始コドン-lopPの3'側にEGFPおよび野生型SAMD9遺伝子を連結した。
認識行動する知的人工生命ロボットの創成―高度情報化社会の人口環境と人間の新しい関係―

「研究目的・研究実施計画」1.研究目的少子高齢化社会における高齢者障害者を支援する社会基盤をいかに形成するかは多くの議論を必要とするところである。高齢者障害者が住みやすい社会基盤づくりに大きな役割を演ずる技術として、知的機械やロボット、用具等の利用が考えられ、その開発に対する要望は日増しに高まっているにもかかわらず、それに対し研究機関が連携し研究プロゼクトとを組み、その要望に応えるべく、特定領域を設定し研究を進めるまでに至っていない。特に、この分野の研究開発は未来の社会生活に大きな影響を与え、社会文化宗教面における大きな変革をもたらすものと考えられる。本企画調査は,少子高齢化社会をいかに乗り切るかという問題に対し、新しい技術並びに新しい思想をも提供するために行うものである。人間を対象とした人に優しいしなやかな人工社会基盤を構築するため、従来の研究領域とは異なった新しい特定領域「認識行動する知的人工生命ロボットの創成-高度情報化社会の人工環境と人間の新しい関係-」を設定し、高齢者障害者を支援できる技術開発をおこなう目的で本研究を平成14年度から開始するための研究グループを組織し事前調査研究を実施した。2.研究実施計画本特定領域研究において、何をどこまで明らかにするのか、また研究目的を3年の研究期間内で研究代表者、研究分担者がいかに連携して達成するかについて4回の研究企画会議で議論し、提案する特定領域研究が今後の新しい科学技術として認知され実施されるための措置を講じた。又本研究が実施された後、研究終了時にどのようなアウトプットをだすか明確に議論しその目的を達成するための各研究者の役割を明らかにした。
原虫感染におけるスカベンジャー受容体の機能

これまでに用いられてきた遺伝子欠損マウスは、複数のマウス系統の遺伝的背景を持つものであったことから、C57BL/6Jを遺伝的背景とするSR-AI/IIおよびLox-1遺伝子欠損マウスとして利用可能とし、より再現性の高い実験成績を得る材料を準備するとともに、これら2つの遺伝子についてのダブルノックアウトマウスを樹立した。SR-AI/II欠損マウスに対するTrypanosoma congolense (5000 cells)の腹腔内投与による生存率には、野生型マウスとの差異は観察されなかった。また、Lox-1欠損マウスに対するBabesia rodhaini (10,000 IRBC)感染後の生存率には野生型マウスとの間に差は認められなかったが、パラシテミアのより早期かつ急速に上昇する傾向およびヘマトクリット値の有意な減少が観察された。また、Lox-1欠損マウスに対するBabesia microti (1x10^7 IRBC)の感染においては、野生型マウスでは2峰性のパラシテミアのピークを示すのに対し、Lox-1欠損マウスでは3峰性に推移することが観察さた。尚、ヘマトクリット値の推移には野生型マウスとの差を認められなかった。また、トキソプラズマの感染動態をより詳細に観察することを可能とするために、Toxoplasma gondii PLKにGFP遺伝子を導入したトランスジェニック原虫を樹立し、このT.gondii PLK-GFPが、野生型と同等な病原性を有することを確認すると共に、感染動物由来のタキゾイトおよび脳シスト由来のブラディゾイトにおいてGFP蛋白を発現していることを確認した。今回、マラリアと同様に赤血球に寄生するバベシア原虫の感染実験において、Lox-1のこの原虫感染症への関与を示唆する成績が得られた。
骨髄間葉系幹細胞療法による糖尿病合併症の新規治療戦略

糖尿病の主な死因は腎不全や脳心血管障害、肝障害などの主要臓器合併症である。骨髄間葉系幹細胞(Mesenchymal stem cell, MSC)は、免疫調節能や組織修復能を発揮する体性幹細胞で、細胞療法のソースとして注目される。本研究では、糖尿病合併症に対する新規根治的治療法として、MSCを用いた細胞治療の有効性について検討した。糖尿病モデル動物に対するMSC治療は、肝腎機能の増悪を抑制し、組織に集積する炎症細胞や肝脂肪の沈着を減少させ、組織の修復効果を示した。これらの有効性は主にMSCによって分泌される液性因子によることも判明した。糖尿病の臓器合併症に対するMSC治療の有用性が示唆された。平成24年度は、糖尿病における1骨髄幹細胞の異常性、および2末梢臓器障害、とくに腎障害について評価し、障害に関与する骨髄由来細胞および標的臓器細胞の形態学的、機能的異常を解明した。さらに3糖尿病性腎障害に対する骨髄間葉系幹細胞(MSC)治療の有効性を明らかにした。ストレプトゾトシン(STZ)150mg/kg腹腔内投与(STZモデル)、あるいはHigh Fat Diet給餌(HFDモデル)により、高血糖モデルマウスを作成した。両モデルにおいて、体重、血糖値の変化、および腎機能障害を血液尿生化学検査にて評価したところ、STZモデルでは疾患群で高血糖の持続と著明な体重減少を認め、HFDではHFD摂食開始から5か月後に、疾患群で空腹時血糖200以上の高血糖と、週齢一致コントロールマウスの約1.5倍の体重増加(肥満)を認めた。尿中アルブミン・クレアチニン比は、両モデルともに疾患群で著明な上昇(U-alb/Cr 15-50mg/g Cr)を認めた。GFP骨髄キメラマウスを用いた検討で、疾患群の腎組織では、近位尿細管および糸球体周囲にGFPで標識された骨髄由来細胞(Bone marrow derived cells, BMDCs)の著明な集積と組織学的障害を認めた。さらに平成25年度に予定していたratMSCを移植する治療を行った。治療群では、STZ, HFDモデルともにU-alb/Crの上昇が抑制され、腎組織に集積するGFP陽性BMDCsの数も著明に減少した。さらに、STZおよびHFDモデルにおける骨髄幹細胞の異常性について、造血幹細胞系については分化段階により分取し、疾患群とコントロール群のLT-HSCおよびMSCをFACSにて回収し、各細胞の異常性をDNAアレイを用いて網羅的に解析した。疾患群で発現が亢進あるいは低下している因子につき、現在発現確認を進行中である。平成25年度は、糖尿病マウスにおけるMSC移植治療の効果とその有効性機序について検討した。1移植したMSCの局在・生着率の検討;STZあるいはHFDで誘導した高血糖マウスに、CAG-GFPから単離培養したMSCを経静脈的に投与し、GFPを標識として骨髄および末梢臓器におけるMSCの局在・生着率を検討したところ、投与7日目において肝臓、腎臓、骨髄に各々約1%程度のGFP陽性細胞(MSC)が検出された。2MSCによる治療効果の検討;GFP骨髄キメラマウスをSTZあるいはHFDで高血糖状態にしたのち、ラットから単離培養したMSCを経静脈的に投与したところ、モデルマウスの肝腎機能の改善が得られた。またHFDマウスの脂肪肝やインスリン抵抗性が改善した。また、肝臓、腎臓の主に間質に集積したGFP陽性骨髄由来細胞の数が、MSC治療により減少し、細胞障害性サイトカインの発現が減少した。3骨髄および末梢臓器におけるMSCの作用機序の検討;骨髄あるいは末梢臓器に生着したMSCの、標的細胞に及ぼす作用を検討した。有効性に比較して、標的臓器に生着するMSCの数が少なかったことから、MSCが産生する液性因子(HGF, VEGF, bFGF, Ang, SDF-1, STC, TGF-β等)が関与するとの仮説のもと、MSCの培養上清のみを連日投与したところ、細胞治療と同様の効果が得られたことから、MSCが産生・分泌する多彩な生理活性物質によるパラクライン効果が、肝腎障害を改善したと考えられた。MSCの培養上清の含有成分を解析したところ、VEGFやMCP-1を初め多数の増殖因子やサイトカイン、ケモカインを含有した。これらは、高血糖や高脂血症で障害された臓器の、実質・間質の修復、リモデリングに関与する因子を多く含有した。MSC自身の明らかな標的細胞への分化転換による組織再生修復効果については、明らかではなかった。平成23年度は、糖尿病における臓器障害、とくに肝障害について詳細に評価し、障害に関与する骨髄由来細胞および標的臓器細胞の形態学的、機能的異常を解明した。さらに糖尿病性肝障害に対する骨髄間葉系幹細胞(MSC)治療の有効性を明らかにした。

ストレプトゾトシン腹腔内投与(STZモデル)、あるいはHigh Fat Diet給餌(HFDモデル)により高血糖モデルマウスを作成した。両モデルにおいて、体重、血糖値の変化、および肝障害を血液生化学検査にて評価したところ、STZモデルでは疾患群で高血糖の持続と著明な体重減少を認め、HFDではHFD摂食開始から5か月後に、疾患群で空腹時血糖200以上の高血糖と、週齢一致コントロールマウスの約1.5倍の体重増加(肥満)を認めた。AST/ALTは、両モデルともに疾患群で著明な上昇(AST 300-500 U/l, ALT 250-400 U/l)を認めた。疾患群の肝臓組織では、GFPで標識された骨髄由来細胞(Bone marrow derived cells, BMDCs)の著明な集積を認めた。疾患群の肝組織に集積したBMDCsは、免疫組織学的検索およびmRNAの発現解析から、M1マクロファージ形質を発現した。STZモデルでは、肝円索構造の障害を認め、HFDでは著明な大型の脂肪滴の沈着を伴う肝細胞の脂肪変性を認めた。肝実質細胞におけるTNF alpha, MCP-1, Toll like receptor 4の発現上昇を認め、類洞内皮細胞のICAM-1の発現も亢進していた。さらにこれらの糖尿病モデルに対し、平成25年度に予定していたratMSC移植治療を行った。治療群では、STZ, HFDモデルともにAST/ALTの上昇が抑制され、HFDモデルでは肝細胞に沈着する脂肪滴の小型化が見られた。MSC治療により糖尿病性の肝障害が抑制された。平成26年度は、糖尿病マウスにおけるMSC移植治療の効果とその有効性機序について、平成25年度に不十分となった追加実験を行った。1植したMSCの局在;STZあるいはHFDで誘導した高血糖マウスモデルにおいて、GFPを標識として骨髄および末梢臓器におけるMSCの局在・生着率を検討したところ、投与7日目において肝臓、腎臓、骨髄に各々投与した細胞の約1%程度のGFP陽性細胞(MSC)が検出された。2MSCによる治療効果の検討;STZあるいはHFDで高血糖状態にしたのち、正常ラットから単離培養したMSCを経静脈的に投与したところ、モデルマウスの肝腎機能の改善が得られ、脂肪肝や線維化、インスリン抵抗性が改善した。また、肝臓、腎臓の主に間質に集積する骨髄由来細胞の数がMSC治療により減少し、細胞障害性サイトカインの発現が減少した。3髄および末梢臓器におけるMSCの作用機序;MSC治療の有効性に比較して、標的臓器に生着するMSCの数が少なかったことから、MSCが産生する液性因子(HGF, VEGF, bFGF, Ang, SDF-1, STC, TGF-β等)が関与すると仮説し、MSCの培養上清のみを連日投与したところ、細胞治療と同様の効果が得られた。MSCが産生・分泌する多彩な生理活性物質によるパラクライン効果が、肝腎障害を改善したと考えられた。MSCの培養上清には、VEGFやMCP-1を初め多数の増殖因子やサイトカイン、ケモカイン、exosomeが含有されていた。これらは、障害された臓器の実質・間質の修復、リモデリングに関与する因子を多く含有した。
腸上皮細胞における圧力負荷時の細胞内シグナル伝達機構の解析

その結果、NF-kappa B、NF-IL6の活性化は圧力負荷1時間後より認められ、また、同様に圧力負荷1時間後よりI kappaBのリン酸化が亢進していた。IL-6の産生は圧力負荷24時間後より増加していた。このことから圧力負荷に伴うIL-6の産生の増加に、I kappaBのリン酸化と分解、NF-kappaB、NF-IL6の核内への移行と転写活性化が関与している可能性が示唆された。申請者らは、これまでに小腸粘膜細胞上皮(IEC-18)の増殖因子として物理的圧力負荷に注目し、生理的にも生じうる80mmHgをピークとして細胞増殖能が促進されること、及びこの細胞増殖がフォスフォリパーゼC、プロテインキナーゼCを介して行われていることを明らかにしてきた。今回、in vitroの培養細胞を用いてどのような細胞内シグナル伝達機構がこれらの生理反応に関与しているか検討した。以下に現在までの結果を示す。(1) MAPキナーゼの活性を免疫沈降法およびWestern blottingにて検討した結果、圧力負荷後3時間後よりMAPキナーゼ活性が増強し、6時間後まで持続した。(2) RT-PCR法により早期発現遺伝子(c-fos、c-myc)の誘導を検討した結果、圧力負荷3時間後から活性の増強が認められ、12時間後まで持続した。(4)圧力負荷に伴う形態の変化を、actin stress fiberを染色するphalloidineを用いて検討した結果、圧力負荷後も特記すべき変化を認めなかった。今回の検討により圧力負荷に伴う小腸粘膜細胞上皮の細胞増殖においてもMAP kinaseを介して早期発現遺伝子が活性化し、さらにNFKB、AP-1などの転写因子の活性を促進して細胞増殖を亢進させるというシグナル伝達経路の存在が示唆された。
糸状菌エンドファイトの共生確立における分泌タンパク質の機能

Epichloe festucaeにおける共生確立に不可欠な転写制御因子ProAが直接発現制御する遺伝子群を明らかにするため、SELEX法を用いてターゲットプロモーター配列を特定した。E. festucaeの染色体DNAライブラリーからMBPタグとProAとの融合タンパク質を用いてターゲットプロモーター配列を含むと推定されるDNAを濃縮した。Mi-seqを用いて解析した濃縮DNA配列をリファレンスゲノムにマッピングしターゲットプロモーター配列を特定した。遺伝子破壊による機能解析によって新たな4遺伝子がProAの下流で機能する共生関連遺伝子であることが示された。1.共生時特異的転写制御因子の同定先に、Epichloёfestucaeにおいて宿主植物との共生確立に必須である転写制御因子をコードするProAを同定した。E. festucaeとペレにあるライグラスとの共生におけるProAの機能を明らかにするため、野生株およびproA変異株感染サンプル、野生株の培養時のRNA-seqを実施した。本年度は、E. festucaeゲノム上の全遺伝子群から、ProAと同様なZn(II)2Cys6タイプDNA結合ドメインをコードする遺伝子群を検出するプログラムを作成した。その結果、全9,350遺伝子のうち53遺伝子からZn(II)2Cys6タイプDNA結合ドメインが検出された。そこで、これら53遺伝子の培養時と共生時の発現レベルを比較解析したところ、宿主植物感染時に発現が顕著に上昇するProAを含む9遺伝子を特定した。解析済みのProAを除く8遺伝子について、相同組み換えによる遺伝子破壊法を用いて、各遺伝子の遺伝子破壊株を作成した。2.ProAに直接発現制御を受けるプロモーター配列の同定ProAタンパク質が直接結合するプロモーター配列を特定するため、SELEX法を用いプロモーター配列の回収を行った。SELEX法に必要なゲノムライブラリーを作成し、ProAタンパク質とタグとなるMBPとの融合タンパク質を用いて、ProA結合性プロモーター配列を回収した。先に同定しているProA結合プロモーター配列PesdC b5を定量PCRにより検出し、濃縮前のDNAと比較し1回濃縮DNAで約4倍、2回濃縮DNAでは約7倍量となった。そこでこれらの濃縮DNAをMiseqを用いて配列解析(SELEX-seq)を行った。濃縮前、1回濃縮、2回濃縮の各サンプルを75bp、ペアエンド、100万リード解析した。ChIP-seq用解析ソフトMACSを用いて配列解析を行い、2回の濃縮によって20倍以上濃縮された455のプロモーター配列を検出した。共生時に重要な分泌タンパク質の機能解析を目指し、共生に必須な転写制御因子のターゲット遺伝子群の特定を行った。今年度は、すでに同定済みのProAについては、ターゲット遺伝子群を絞り込むところまでできている。さらに、網羅的な解析を目指し、新たな共生時特異的な転写制御遺伝子を見出し、機能解析を進めることができた。ProAに直接発現制御を受けるプロモーター配列の同定先に、ProAタンパク質が直接結合するプロモーター配列をSELEX法を用いて回収し(SELEX DNA)、Miseqを用いて配列解析を行った。非濃縮DNAと比較し、濃縮DNAで特に高頻度で検出される配列について、モチーフ検索を行ったところ、先に同定したProA結合プロモーター配列と類似のモチーフが高頻度で検出された。さらにSELEX DNAに高濃縮で存在するDNA配列をChIP法により分離したDNA(ChIP DNA)を鋳型として増幅したところ、多くの配列がChIP DNAにおいても高頻度で検出され、Epichloe festucae細胞内でProAタンパク質がSELEX DNAの一部に直接結合することが示唆された。ProAに直接発現制御を受ける遺伝子群の機能解析SELEXDNAにおいて濃縮されてる配列でさらにChIP DNAにおいても濃縮が確認された配列についてその下流に存在する遺伝子群は、ProAと同様に共生に重要な機能を果たす可能性が考えられた。これらのN末端に分泌シグナルの有無を調査したところ一部の遺伝子群については分泌シグナルが見つかった。そこで、これらの遺伝子破壊ベクターを作成し、野生株の形質転換を行った。10遺伝子について遺伝子破壊株が得られ、それらを宿主ペレニアルライグラスに接種した。今後これら接種植物における破壊株の共生の有無、感染が確認された場合には、宿主の生育への影響、バイオマスについての調査を予定している。共生に不可欠な転写制御因子のターゲットとなる遺伝子群の機能解析を進めることができ、次年度中に表現形質の評価を完了するための材料を揃えることができた。これまでにEpichloёfestucaeの宿主植物との共生確立に必須である転写制御因子ProAを中心にその分子機構の解明に向け研究を進めてきた。ProA変異体は共生を維持できなくなるだけでなく細胞融合能を喪失していたことから、ProAは細胞融合に不可欠な遺伝子群の発現に関与すると推定された。1.ProAに直接発現制御を受けるプロモーター配列の同定2.ProAに直接発現制御を受ける遺伝子群の機能解析SELEX-seqによって特定されたプロモーター配列についてその下流に存在する遺伝子群は、ProAと同様に共生に重要な機能を果たす可能性が考えられた。10遺伝子について遺伝子破壊株が得られ、そのうち4遺伝子(PtpA、PtpB、PtpC、PtpD)の破壊株は細胞融合能が低下していた。さらに、それらを宿主ペレニアルライグラスに接種したところ、いずれの破壊株でも宿主の生育が低下し、4遺伝子がProAに制御を受け細胞融合時に必要な遺伝子であることが示された。

Epichloe festucaeにおける共生確立に不可欠な転写制御因子ProAが直接発現制御する遺伝子群を明らかにするため、SELEX法を用いてターゲットプロモーター配列を特定した。E. festucaeの染色体DNAライブラリーからMBPタグとProAとの融合タンパク質を用いてターゲットプロモーター配列を含むと推定されるDNAを濃縮した。Mi-seqを用いて解析した濃縮DNA配列をリファレンスゲノムにマッピングしターゲットプロモーター配列を特定した。遺伝子破壊による機能解析によって新たな4遺伝子がProAの下流で機能する共生関連遺伝子であることが示された。RNA-seqデータとSELEX-seqデータの比較により、ProAターゲット遺伝子群より特に重要だと考えられる遺伝子群を絞り込み、その中から分泌タンパク質のシグナル配列をN末端に有するものを同定し、機能解析を進める。また、新たな共生時特異的転写制御因子が見いだせれば、ProAとの関係性についても調査し、E. fesutucae共生時における転写制御ネットワークを明らかにする。共生に不可欠な転写制御因子のターゲットとなる遺伝子群のうち共生に重要な役割を持つものを接種実験によって特定する。それらのうち、N末端に分泌シグナルを持つものを同定し、宿主植物中での発現部位および分布を明らかにし、E. festucaeと宿主植物との共生を支える分子機構を解明する。農学予定していた試薬が実験の進行の都合上必要なくなったため。次年度の研究計画の中で使用を予定している。
自然電位観測にする地震予知の基礎研究

VANの達成のためには,いかに困難であっても,短基線観測の併用が不可欠であるとの認識のもとに,本研究では地の利を得た北陸地域と,前回研究での発展的継続をめざす伊豆大島での観測に主力を投入した.前者では各機関の協力により,VANシステムにほぼ同等の低ノイズ観測網が確率され,現在はいわば"地震待ち"の状態にある.しかし,設置された観測点が"sensitive station"であるという確率は高くはないので,今後努力を続けて"ツボ捜し"を行う必要がある.後者では伊豆大島に多数の測線を設置し,観測を続行しているが,期間中に出現した矩形状変化はその空間分布から判断して,NTT岡田局近辺での局地的変化(原因未不明)と思われるが,群発地震の前に出現頻度の増大した変化そのものについては今後もう一度および現象が起きるまでは検証不可能であり,これも,"地震待ち"の状況である.また本研究ではNTTのア-スと回線を全面的に利用して,世界でも初めてのNETWORK MT法を開発し,北海道東部において詳しい地下電気伝導度分布の推定に大きな成果をあげた.これはVAN法の基礎研究としてのみではなく,地球物理学一般にとっても画期的な貢献であった.VAN法成否の鍵が"sensitive station"の発見にかかっていることは明らかである.このためには,一見まわりくどいが事前にその地点の"sensitivity"を推定する方法を開発することが重要であろう.具体的にはすでにsensitiveとinsensitiveな場所の知られているギリシャにおいてVANグル-プと協力して総合的な地球物理,地質調査を行い,それらになんらかの地学的相違を見いだすための国際共同研究も進めたい.VANの達成のためには,いかに困難であっても,短基線観測の併用が不可欠であるとの認識のもとに,本研究では地の利を得た北陸地域と,前回研究での発展的継続をめざす伊豆大島での観測に主力を投入した.前者では各機関の協力により,VANシステムにほぼ同等の低ノイズ観測網が確率され,現在はいわば"地震待ち"の状態にある.しかし,設置された観測点が"sensitive station"であるという確率は高くはないので,今後努力を続けて"ツボ捜し"を行う必要がある.後者では伊豆大島に多数の測線を設置し,観測を続行しているが,期間中に出現した矩形状変化はその空間分布から判断して,NTT岡田局近辺での局地的変化(原因未不明)と思われるが,群発地震の前に出現頻度の増大した変化そのものについては今後もう一度および現象が起きるまでは検証不可能であり,これも,"地震待ち"の状況である.また本研究ではNTTのア-スと回線を全面的に利用して,世界でも初めてのNETWORK MT法を開発し,北海道東部において詳しい地下電気伝導度分布の推定に大きな成果をあげた.これはVAN法の基礎研究としてのみではなく,地球物理学一般にとっても画期的な貢献であった.VAN法成否の鍵が"sensitive station"の発見にかかっていることは明らかである.このためには,一見まわりくどいが事前にその地点の"sensitivity"を推定する方法を開発することが重要であろう.具体的にはすでにsensitiveとinsensitiveな場所の知られているギリシャにおいてVANグル-プと協力して総合的な地球物理,地質調査を行い,それらになんらかの地学的相違を見いだすための国際共同研究も進めたい.1.東大地震研および東海大のグル-プにおいて、従来より行われているNTTの電話回線を利用した長基線地電位差連続観測を継続し、地震活動との対応について調査を続行した。伊豆大島では、新たに基線長1km以下の短基線をいくつか設置し、これまで注目されていた伊豆東方沖地震とよく対応しているとされる地電位差異常変化の地域分布を詳細に求めた。一方地電位差デ-タから地磁気変動による誘導成分を確率差分方程式を用いて除去し、上述の異常変化を明瞭に識別できるようにした。伊豆東方沖では、本年度は特に目だった地震活動がみられず、地電位差異常変化との対応をつけることができなかった。2.金沢大では、石川県の3箇所(能美郡辰口町・小松市小松高校・小松市尾小屋)に1方向あたり複数基線を持つ自然電位観測点を設置した。富山大では、従来からの観測点に加え跡津川断層沿いに1箇所、1方向短基線の観測点を設置した。さらに、NTTの電話回線を用いた長基線観測も石川県小松市周辺・富山県南西部で平成3年2月より開始した。ノイズレベルは、辰口・尾小屋観測点でそれぞれ0.2mV/100m以下・0.5mV/100m程度である。どちらも昼夜間のノイズレベルの差がほとんどないことから、人工ノイズの影響はきわめて少ないといえる。ギリシャにおけるノイズレベルは0.10.2mV/100mであることから、特に辰口観測点はノイズレベルの点からはVAN法の必要条件を満たしていると思われる。一方地震と相関のある自然電位変化の有無については、観測点からの震央距離300km以内でM>5の地震が未だ発生していないため、不明である。3.8月と12月に、金沢大学において本研究の代表・分担者、および気象庁より森俊雄氏(松代地震観測所)・小嶋美都子氏(柿岡地磁気観測所)を招き、本研究に関する会議を開催した。VANの達成のためには,いかに困難であっても,短基線観測の併用が不可欠であるとの認識のもとに,本研究では地の利を得た北陸地域と,前回研究での発展的継続をめざす伊豆大島での観測に主力を投入した。前者では各機関の協力により,VANシステムにほぼ同等の低ノイズ観測網が確率され,現在はいわば"地震持ち"の状態にある。

しかし,設置された観測点が"sensitive station"であるという確率は高くはないので,今後努力を続けて"ツボ捜し"を行う必要がある。後者では伊豆大島に多数の測線を設置し,観測を続行しているが,期間中に出現した矩形状変化はその空間分布から判断して,NTT岡田局近辺での局地的変化(原因末不明)と思われるが,群発地震の前に出現頻度の増大した変化そのものについては今後もう一度おなじ現象が起きるまでは検証不可能であり,これも,"地震待ち"の状況である。また本研究ではNTTのア-スと回線を全面的に利用して,世界でも初めてのNETWORK MT法を開発し,北海道東部において詳しい地下電気伝導度分布の推定に大きな成果をあげた。これはVAN法の基礎研究としてのみではなく,地球物理学一般にとっても画期的な貢献であった。VAN法成否の鍵が"sensitive station"の発見にかかっていることは明らかである。このためには,一見まわりくどいが事前にその地点の"sensitivity"を推定する方法を開発することが重要であろう。具体的にはすでにsensitiveとinsensitiveな場所の知られているギリシャにおいてVANグル-プと協力して総合的な地球物理,地質調査を行い,それらになんらかの地学的相違を見いだすための国際共同研究も進めたい。
新規敗血症バイオマーカーendocanの統合的解析

敗血症では、従来のバイオマーカーのCRP、プロカルシトニン(PCT)は、診断の感度・特異度ともに不十分である。血管内皮細胞特異的分子であるendocanが敗血症のマーカーとして新たに認識されている。血清endocan濃度の経時変化、他のマーカーや臨床因子との関連性は不明である。本研究では、感染症症例のバイオマーカーの経時的な測定をした。血液培養陽性群と陰性群の比較で、入院時のendocanは血液培養陽性群で有意に高かったが、CRPとPCTでは両群とも有意差はなかった。ROC曲線下面積はendocanが0.662で最も高値であった。血清endocan濃度は菌血症と関連性が高いという特性を示した。内皮細胞特異的分子-1(endothelial cell specific molecule-1, endocan)はデルマタン硫酸のプロテオグリカンで、肺癌をはじめとする腫瘍細胞でも認められ、乳癌、肺癌などで転移、増殖の危険因子となり得る一方、敗血症、敗血症性ショックの症例を対象にした過去の研究で、endocanは上昇し、CRP、PCT、IL-6など他のバイオマーカーと比較しても、各群間で有意差を確認できたのはendocanのみで、10日以内の死亡例と生存例との比較でも、endocanのみで有意差を認めた。しかしながら、この研究では、敗血症の進行、もしくは治癒過程でendocanの血清濃度がどのように推移するのかは検討されていない。本研究では臨床症例での血清濃度の推移を継時的に解析した。非担癌症例であり菌血症合併の敗血症症例51例、非敗血症性の感染症症例25例を研究対象とした。血液培養(非敗血症では感染部位からの検体培養)陽性日を0日として、前向きに0、1-2、3-5、6-9日の血清を採取し、endocan濃度をELISA法にて測定した。また同時にCRP、プロカルシトニンを測定した。この解析によりendocanは感染症の経過において、0日から6-9日まで臨床経過に関係なく、持続的に高値を維持していることが明らかとなった。また敗血症症例と非敗血症症例の比較では、敗血症症例で全ての期間にわたって、有意に高値を示した。一方でCRPは発症後に上昇し、変動の大きい傾向があり、敗血症と非敗血症での優位差は認められなかった。以上より、endocanは従来のバイオマーカーと比較して、診断時期の限定されない、安定した敗血症の診断マーカーになり得るという特性が示された。内皮細胞特異的分子-1(endothelial cell specific molecule-1, endocan)はデルマタン硫酸のプロテオグリカンで、腫瘍細胞でも認められ、乳癌、肺癌などで転移、増殖の危険因子となり得る一方、敗血症、敗血症性ショックの症例を対象にした過去の研究で、endocanは上昇していた。本研究では、これまで検討されていなかった敗血症を含め感染症の経過とendocanの血清濃度がどのように推移するのかについて解析した。各バイオマーカーの推移と臨床因子の関連について解析した。この解析によりendocanは感染症の経過において、また血液培養陽性症例と陰性症例との比較では、血液培養陽性症例で発症初期に、有意に高値を示した。一方でCRP、プロカルシトニンでは発症初期の両群の値に有意差は認められなかった。Endocan 1.7ng/mlをカットオフとし、高値群と低値群に2分したところ、高値群で血液培養陽性の頻度が高く、多変量解析では有意差は認めなかったが、血液培養陽性とendocanの血清値に関連のある傾向が示された。以上より、endocanは従来のバイオマーカーと比較して、敗血症、特に血流感染症の初期において上昇するバイオマーカーであることが示唆された。この解析によりendocanは初期より上昇し、6-9日後にも高値を維持することが確認された。血液培養陽性症例と陰性症例との比較では、血液培養陽性症例で発症初期に、有意に高値を示した。Endocan 1.7

ng/mlをカットオフとし、高値群と低値群に2分したところ、高値群で血液培養陽性の頻度が高く、多変量解析では有意差は認めなかったが、血液培養陽性とendocanの血清値に関連のある傾向が示された。感染部位別でのendocanの上昇に有意差は確認されなかった。以上より、endocanは従来のバイオマーカーと比較して、感染部位に限定されない血流感染症の初期において上昇、経過中安定して高値を持続するバイオマーカーであることが示唆された。敗血症では、従来のバイオマーカーのCRP、プロカルシトニン(PCT)は、診断の感度・特異度ともに不十分である。血管内皮細胞特異的分子であるendocanが敗血症のマーカーとして新たに認識されている。血清endocan濃度の経時変化、他のマーカーや臨床因子との関連性は不明である。本研究では、感染症症例のバイオマーカーの経時的な測定をした。血液培養陽性群と陰性群の比較で、入院時のendocanは血液培養陽性群で有意に高かったが、CRPとPCTでは両群とも有意差はなかった。ROC曲線下面積はendocanが0.662で最も高値であった。血清endocan濃度は菌血症と関連性が高いという特性を示した。敗血症症例における血清endocan濃度と病態進行の関連性を解析する臨床研究は平成25年度内に症例の登録し、解析も施行された。一方で、内皮細胞におけるendocanの産生機構の解析については、平成27年以降に解析を行うこととなった。感染症学臨床研究では、血流感染症とendocanの上昇の可能性が示唆されたため、今後は血流感染症の持続性、治療効果とendocanの推移など、血流感染症に焦点をあてた観察研究を推進する予定である。基礎研究ではLPSがendocanの産生・分泌の誘導因子であると考えた場合、TNF-αを介する間接的な結果なのか、LPSを介した直接のシグナル伝達によるものか明らかとなっていない。まずTNF受容体での結合を阻害し、endocanの産生・分泌がどの程度抑制されるかを解析する。細胞は正常ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)を用いTNF-αの受容体に対する結合抑制にはTNFR1及びTNFR2の中和抗体を処理する。LPS刺激によりendocanの分泌が、中和抗体未処理の細胞と比較して相違があるのかをELISAを用いて定量する。この解析から、endocan産生・分泌の主たる原因が、PAMPsによる直接作用なのか、サイトカインストームと呼ばれるTNF-αなどの過剰産生がもたらしているかを推測できる。また、endocanがLPS以外のPAMPsでもendocanの産生能を有する可能性が推測されるが、誘導するPAMPsの特異性を検証した報告はない。本研究では黄色ブドウ球菌由来のペプチドグリカン、真菌由来のZymosan、ssRNAといった代表的PAMPsで刺激し、endocanが産生されるのかELISA法を用い研究協力者が解析する。この解析でendocanの産生が、特定のPAMPsのみ誘導されるのか、敗血症全般でおこる現象かを確認できる。敗血症症例における血清endocan濃度と病態進行の関連性を解析する臨床研究は平成27年度まで継続する予定であったが、平成25年度内に症例の登録が終了し、解析が可能な状況となった。一方で、内皮細胞におけるendocanの産生機構の解析については、平成26年以降に解析を行うこととなった。
筋緊張性ジストロフィー症の知能障害-遺伝子不安定領域、脳循環、海馬萎縮の検討-

対象および方法対象は,MD患者15例(平均年齢43歳,平均罹病期間15年)である.知能の評価にはWAIS-Rを用いた.MRI検査は海馬の萎縮および白質病変を評価した.海馬の断面積は3DFT Spoild GRASS法による再構成T1強調画像で,白質病変はMRIT2強調画像水平断で3段階(Grade0, 1, )に評価した.末梢血DNAのCTG repeatを測定し,それぞれの相関を検討した.結果1. DMの知能障害3. MRI所見(1)海馬断面積海馬頭部の断面積はMD例では正常例に比較して有意に小さかった.またMD例において海馬頭部の断面積とFSIQの間には正の相関関係が認められた(P<0.05).(1)白質病変15例中10例に白質病変を認め,白質病変が強い例ほどFSIQは有意に低下していた.結論MDの知能障害に海馬萎縮,白質病変が関与する可能性が示唆された.対象および方法対象は,MD患者15例(平均年齢43歳,平均罹病期間15年)である.知能の評価にはWAIS-Rを用いた.MRI検査は海馬の萎縮および白質病変を評価した.海馬の断面積は3DFT Spoild GRASS法による再構成T1強調画像で,白質病変はMRIT2強調画像水平断で3段階(Grade0, 1, )に評価した.末梢血DNAのCTG repeatを測定し,それぞれの相関を検討した.結果1. DMの知能障害3. MRI所見(1)海馬断面積海馬頭部の断面積はMD例では正常例に比較して有意に小さかった.またMD例において海馬頭部の断面積とFSIQの間には正の相関関係が認められた(P<0.05).(1)白質病変15例中10例に白質病変を認め,白質病変が強い例ほどFSIQは有意に低下していた.結論MDの知能障害に海馬萎縮,白質病変が関与する可能性が示唆された.
小脳全域のプルキンエ細胞特異的CRISPR/Cas9スクリーニング系の確立

本研究は、CRISPR/Cas9を用いてマウス小脳全域のプルキンエ細胞特異的に特定の遺伝子をノックアウトし、登上線維のシナプス刈り込みに関わる分子のスクリーニング系の確立を目的とした。条件検討の結果、胎生11日齢の両側小脳への2点電極を用いた子宮内エレクトロポレーション法が小脳全域への導入効率が良いと判明した。登上線維シナプスの刈り込みに必須な遺伝子をターゲットとして、小脳スライス標本を用いて電気生理学的にシナプス刈り込みへの影響を調べたが、SpCas9もeSpCas9も共に顕著なシナプス異常は見られなかった。今回の条件では遺伝子導入には成功したが、ゲノム編集の効率が低い可能性が示唆された。本研究は、CRISPR/Cas9を用いてマウス小脳全域のプルキンエ細胞特異的に特定の遺伝子をノックアウトし、登上線維のシナプス刈り込みに関わる分子のスクリーニング系の確立を目的とする。RNA干渉によるノックダウン法と比較して、ノックアウトによるより正確な表現型の解析や小脳全域の異常によって誘発される行動の解析を実現することを目指している。本年度は、マウス小脳全域のプルキンエ細胞にCRISPR/Cas9系を導入するために、子宮内ウイルスインジェクションまたは子宮内エレクトロポレーションを用いて、小脳全域への導入効率が高いウイルス・プラスミドコンストラクション・プラスミド導入時期・刺激条件等を検討した。ゲノム編集によるノックアウト効率を高めるため1遺伝子に対して3箇所をターゲットとしたレンチウイルス用・エレクトロポレーション用のベクターを構築した。従来のSpCas9に加えて、オフターゲットを抑えるためにeSpCas9(Slaymaker et al., 2016)を発現するベクターも作製した。プラスミド導入時期は胎生期E10, E11, E12を試験し、子宮内エレクトロポレーションは2点電極による小脳の左右両側導入と3点電極による両側導入を試みた。その結果、全般的に子宮内ウイルスインジェクションと比較して、子宮内エレクトロポレーションによるプラスミド導入効率が高く、現在のところ、2点電極により2種のプラスミドベクターをE11にエレクトロポレーションした条件が最も効率よく小脳全域にCRISPR/Cas9系を導入できることが判明した。当初、子宮内ウイルスインジェクション法を主体に実験系を確立しようと計画していたが、予想以上にプラスミド導入効率が低いことが判明し、子宮内エレクトロポレーションを追加で試験することになった。本年度は、この後者の手法によりマウス小脳全域のプルキンエ細胞にCRISPR/Cas9系を導入することに成功した。しかし、ゲノム編集効率や電気生理学的解析によって登上線維のシナプス刈り込みへの影響を調べることまでが目標であったため、やや遅れている状況にある。本研究は、CRISPR/Cas9系を用いてマウス小脳全域のプルキンエ細胞特異的に特定の遺伝子をノックアウトし、登上線維のシナプス刈り込みに関わる分子をスクリーニングする系の確立を目的とした。本年度は、子宮内エレクトロポレーションによりマウス小脳全域のプルキンエ細胞にCRISPR/Cas9系を導入したマウスでの電気生理学的解析を試みた。胎生11日および12日齢の小脳両側に対して2点電極または3点電極を用いた子宮内エレクトロポレーションによって遺伝子導入を行った。ゲノム編集によるノックアウト効率を高めるため1遺伝子に対して3箇所をガイドRNAのターゲットとして、従来のSpCas9またはオフターゲットを抑えるためにeSpCas9を発現するプラスミドベクターを導入した。登上線維シナプスの刈り込みに必要とされるP/Q型電位依存性カルシウムチャネルをターゲットとして、小脳スライス標本を用いて電気生理学的に登上線維のシナプス刈り込みへの影響を調べた。しかし、SpCas9もeSpCas9も共に、RNA干渉と比較しても、ノックアウトマウスで見られるほどのシナプス異常は見られなかった。小脳虫部を含めた両側の広範囲のプルキンエ細胞特異的にCRISPR/Cas9を導入することに成功したが、今回試験した条件ではゲノム編集の効率が低い可能性が示唆された。今後はさらなる条件検討を行うとともに、ゲノム編集を伴わないCRISPR干渉法に切り替えることも検討する。今後は、この手法においてゲノム編集効率を調べ、登上線維のシナプス刈り込みに関わる分子をノックアウトして電気生理学的解析を行い、従来行われていたRNAiノックダウン法と表現型を比較する。さらに、小脳における遺伝子変異によって運動異常もしくは精神疾患様行動が誘発されることが知られる既知の特定遺伝子をノックアウトして、この実験系によりそのような行動解析が可能かを検討する。神経科学
乱流燃焼場におけるレイノルズ応力の計測とそのデータベース化

これまでに,当量比0.80,1.10および1.40のプロパン火炎におけるレイノルズ応力の計測を行った.乱流火炎帯におけるガス流速の計測では,レーザー流速計で記録され得る速度信号が未燃焼混合気の流速なのか,あるいは燃焼ガスの流速なのかを判別する必要がある.ガス流速のバーナ半径方向成分は,火炎片の前後における発熱に起因する熱膨張のために,未燃焼混合気と燃焼ガスの二つのモードが観察される.したがって,ガス流速を未燃焼混合気の流速と燃焼ガスの流速に判別しない場合,平均流速は二つのモードの中間の価となり,この平均値に基づく速度変動は極めて大きくなり,大きな誤差を誘発する原因となる.従って,先ず,乱流火炎帯における平均流速の定義から改めなくてはならないことが明らかになった.すなわち,ガス流速を未燃焼混合気のそれと燃焼ガスのそれに判別し,未燃焼混合気の流速と燃焼ガスの流速に判別する.速度変動は,それぞれのモードの平均流速に基づき定義する発用がある.火炎が存在することにより,速度境界層の構造が大きく変化する.すなわち,非燃焼時には,ガス流速のバーナー軸方向成分はバーナ半径方向に減少するが,燃焼時には,火炎面の前後における発熱に起因する熱膨張のために,境界層内の流速が増加し,速度分布が平坦になる.そのために,速度勾配が減少し,レイノルズ応力は著しく減少する.プロパン火炎における実験結果から,層流燃焼速度が等しい燃料希薄側と燃料過濃側を比べると,燃料過濃側で,火炎面の前後における乱れの増加が著しいことが明らかとなった.これは,燃料分子と酸素分子の間の拡散速度の違いにより引き起こされる選択拡散効果であると考えられる.今後は更に,選択拡散が起きにくいメタン火炎における乱れの増加を明らかにしていく.レーザー流速計で計測している速度信号が未燃焼混合気の流速であるのか,あるいは燃焼ガスの流速であるのかを判別するために,レーザ流速計と発光分光計測システムとの同時計測を行っている.しかし,発光分光計測システムのI/Vアンプが老朽化により使用不能となったため,新たに製作し直したため,その製作期間分(約6ヶ月)送れている.プロパン火炎では,層流燃焼速度が等しい燃料希薄側と燃料過濃側を比べると,燃料過濃側で,火炎面の前後における乱れの増加が著しいことが明らかとなった.これは,燃料分子と酸素分子の間の拡散速度の違いにより引き起こされる選択拡散効果であると考えられる.今後は更に,選択拡散が起きにくいメタン火炎における乱れの増加を明らかにする.適切な乱流燃焼モデルを構築するためには,乱流燃焼場におけるレイノルズ応力に関する情報が必要である.ところが,乱流燃焼場におけるレイノルズ応力を計測する手法が確立されていないために,燃焼シミュレーションの予測精度は十分高いとは言い難い.本研究では,乱流燃焼場においてレイノルズ応力を計測する手法を確立するために,3次元のレーザ流速計を用いて,乱流予混合火炎における流れの様子を詳しく調べる.しかし,レーザー流速計単体では,計測される速度信号が未燃焼混合気の流速であるのか,あるいは,燃焼ガスの流速であるのか判別できないために,乱流予混合火炎の火炎片の前後でレイノルズ応力が変化する様子を明らかにすることができない.そこで,本研究では,レーザー流速計とカセグレン光学計との同時計測を行い,レーザー流速計により計測される速度信号が未燃焼混合気の流速であるのか,あるいは,燃焼ガスの流速であるのか判別することを予定している.本年度は,3本の光ファイバーを使用して,カセグレン光学計の計測点を3点とし,火炎面が燃焼ガス側から未燃焼混合気側に移動したのか,あるいは,未燃焼混合気側から燃焼ガス側に移動したのかを判別する手法を確立した.今後は,レーザー流速計とカセグレン光学計との同時計測を行い,レーザー流速計により計測される速度信号が未燃焼混合気の流速であるのか,あるいは,燃焼ガスの流速であるのか判別し,未燃焼混合気および燃焼ガスのレイノルズ応力を計測を試みる.カセグレン光学計の計測点を複数設置し,火炎面が燃焼ガス側から未燃焼混合気側に移動したのか,あるいは,未燃焼混合気側から燃焼ガス側に移動したのかを判別する手法を確立した.これまでの研究では,乱流火炎帯で記録されるガス流速のバーナ半径方向成分には低速のモードと高速のモードから成るbi-modalな確率分布が観察されること,低速のモードは未燃焼混合気の速度変動から成り,高速のモードは燃焼ガスの速度変動から成ることなどを明らかにした.これは,記録された速度信号を未燃焼混合気の速度信号と燃焼ガスの速度信号に分離することができることを示しており,レーザー流速計により同時計測(coincidence sampling)を行えば,乱流火炎帯におけるレイノルズ応力の計測が可能である.そこで本研究では,3波長・6ビームのレーザー流速計を使用して,乱流燃焼場におけるレイノルズ応力を計測することを試みた.