hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
眼内増殖疾患の病態解析および抑制

増殖硝子体網膜症の増殖膜の構成細胞の一つであるミュラー細胞の関与をin vitroしたで確認した。豚培養muller細胞を25%硝子体液を含有した培養液で継代したところ、線維芽細胞および筋線維芽細胞様に形質変化を来し、in vitro collagen matrixcontraction assayで収縮を来すことを確認した。また、チロシンキナーゼ阻害薬であるDasatinibで増殖硝子体網膜症の病態の中心である細胞の遊走、増殖、収縮をミュラー細胞においても抑制を来すことを確認した。1豚眼からのミューラー細胞培養芝浦臓器より購入した豚眼より網膜を摘出し、Guidryらの報告と同様の方法でpapain kitを使用しミューラー細胞培養を施行した。培養ミューラー細胞は、3 4回継代している。細胞の培養に関しては、既報通りに成功しており実験を遂行する状態にある。2で記載する項目が問題ないことを確認した上で、遊走能および増殖能分析を予定している。2増殖膜収縮分析について当初は、bovine collagenIを使用し増殖膜収縮分析を行う予定であったが、BSEの問題より米国からの入手が困難になってしまった。そのためにまずヒトコラーゲンを購入しbovineと同条件でゲルの作成を行った。しかしながら、ゲルのwell状への接着が不良であり、かつ固形状態にもならなかった。そこで豚コラーゲンを新田ゼラチン株式会社より購入し代用した。その結果、bovine collagenIと同様の状態を作成することを確認した。次に豚コラーゲンを用いた増殖膜収縮分析が同様の結果が得られるのかを確認するために申請者らが以前より使用していた豚網膜色素上皮細胞にて本分析を施行した。計5回同様の実験を行い、50%近くの収縮能を持つ増殖膜の作成を確認した。そのことより次年度より当初の予定通りミューラー細胞を用いた収縮解析を行う予定である。平成27年度予定当初の予定ではin vitroの実験を終了している予定であったが、前記の如くコラーゲン購入に時間を要してしまったために平成27年度に持ち越してミューラー細胞を用いたDasatinib抑制実験を行うこととする。我々はこれまでにin vivoとin vitroにおける増殖硝子体網膜症(PVR)モデルを用いて、ダサチニブによる増殖性変化の抑制効果について報告してきた(Umazume K, et al. IOVS 2013 54, 1150-9)。ダサチニブは広汎にチロシンキナーゼを阻害し、主にBCR-ABLを標的とするが、FAK(focal adhesion kinase)も阻害することが知られている。今回、培養豚ミューラー細胞を用いた実験的PVRモデルで、FAKを特異的に阻害することによる増殖膜への影響を研究目的とした。具体的にはFAK阻害薬であるPF573228(選択的FAK阻害薬)とPF431396(pyk2/FAK阻害薬)を使用して、豚コラーゲンIを用いた増殖膜収縮解析によるコラーゲンゲルの収縮率を比較検討した。また、筋線維芽細胞のマーカーである平滑筋アクチンをファロイジン染色することで増殖膜のアクチンストレスファイバーを可視化して比較検討した。結果はPF431396使用群と比較してPF573228使用群では増殖膜の収縮が有意に抑制されていた。PF573228使用群ではアクチン-ファロイジン染色は減弱しており、細胞内のアクチンストレスファイバーの形成が抑制されていた。PF573228をDay0とDay2に投与した群で増殖膜収縮を比較すると、Day0群では有意に収縮が抑制されていた。つまり、FAKは主に増殖膜形成の初期に作用し、収縮に関与することが明らかになった。in vitroの実験に時間を要し、in vivoの実験までに至らなかったが、PVRモデルにミュラー細胞を用いてDasatinibの作用機序の一端を解明できた。これまでに我々は豚培養網膜色素上皮細胞を用いてin vitro in vivoの増殖硝子体網膜症モデルを用いてチロシンキナーゼ阻害薬の阻害薬であり、既に慢性骨髄性白血病の治療薬のDasatinibで一定の抑制効果を確認した。しかしながら、増殖硝子体網膜症の構成細胞であるミュラー細胞の関与は確認されず、ヒト増殖硝子体網膜症においてDasatinibの効果を今後検討するには不十分な状態であった。本年度の追加実験として豚培養ミュラー細胞をチェンバースライドに播種し、Dasatinibを添加し、一定時間ごとに形態の変化を確認した。細胞死を起こすことなくDasatinibの付加によりアクチンストレスファイバー構造変化とαSMAの発現低下を確認した。また、ウエスタンブロット法でFAKのリン酸化を確認したところ、リン酸化の抑制が確認されたことより、FAKが殊に初期増殖硝子体網膜症の病態に関与していることが示唆された。Dasatinibの増殖硝子体網膜症の構成細胞の一つであるミュラー細胞から筋線維芽細胞への変化を来した増殖膜においてDasatinibの一定の抑制効果が期待できると考えられた。

また、チロシンキナーゼ阻害薬であるDasatinibで増殖硝子体網膜症の病態の中心である細胞の遊走、増殖、収縮をミュラー細胞においても抑制を来すことを確認した。当初予定していたミューラー細胞を用いたDasatinbの抑制実験がbovine collagenの米国からの入手がBSEの問題により困難になってしまった。それにより豚コラーゲンで以前用いた網膜色素上皮細胞の実験と同様の結果が得られるか確認する必要があったため。今年度で遂行できなかったin vivoモデルでのミュラー細胞を用いた実験を行う予定である。また、ダサチニブの臨床での適切な使用時期を図りたいと考えている。眼科網膜疾患当初の予定ではin vitroの実験を終了している予定であったが、コラーゲン購入に時間を要してしまったために平成27年度に持ち越してミューラー細胞を用いたDasatinib抑制実験を行うこととする。一部注文した抗体が届いていないためと投稿中の論文があるため。bovineのコラーゲンが使用できなかったために条件設定に時間を要して研究の進捗がやや遅れているため論文校正代として使用予定。収縮能分析の条件設定が完了したためにin vitroの研究を中心に遂行していく予定である。
永久磁石を用いたMPDアーク推進機に関する研究

高出力の定常作動型MPDアーク推進機の比推力、推進効率の向上を目的とした実験を行った。パルス作動型推進機の場合は、放電々流が10KA以上と大きいため電磁加速が有効に働き、比推力、推進効率共高い。これに対して定常作動型では放電々流23KA以下と低く、自己誘起磁場による電磁加速が期待できないため、外部磁界が必要であり、これまでは電磁コイルを用いてきた。しかしながら電磁コイルに加える励磁エネルギーは推進機全体に加えるエネルギーに対しても相当な割合を占め、また電磁コイルの装着が推進機の重量増加につながっている。電磁コイルに代って永久磁石を用いると推進機の大巾な重量減と共に励磁エネルギーを必要としないため、推進機の性能向上が期待できる。本研究では永久磁石がつくる磁場形状と位置関係の最適化をはかりながら、推力測定を中心とした実験を行った。本研究で行った永久磁石を用いたMPD推進機の推進性能をまとめると以下のようになる。1.円錐形状をなす永久磁石を用いることによって、放電室内に末広がり形状の磁気ノズルを実現することができた。この際、永久磁石による推進機重量の増加は推進機全体の7%程度とソレノイドコイルを用いた場合に比べて十分小さくすることができ、当然のことながら励磁電力も不要となった。2.推進剤にアルゴンを用いた場合は、比推力1000秒で推進効率4.5%という低い推進性能しか得られなかったが、水素を用いた場合には、比推力7700秒で推進効率25%という比較的良好な性能が得られた。3.永久磁石による外部磁場を印加することによって、比較的推進剤流量が少ない場合でも安定した作動を得ることができた。
錐体機能不全の病態解明に向けた臨床的、遺伝学的研究

2015年に難病認定された広義黄斑ジストロフィは、一種の症候群で、杆体1色覚、青錐体1色覚、錐体ジストロフィ、錐体機能不全などが含まれ、その原因は多岐にわたり、原因となる遺伝子変異を特定することは困難であった。本研究は、錐体機能不全をきたす遺伝子網膜疾患に対し、次世代シークエンサを用いた全エクソーム法により、原因となる遺伝子変異を特定し、疾患表現型との関連性、ハプロタイプについて明らかにすることを目的とした。平成30年度は、以下の研究成果が得られた。1. X連鎖若年網膜分離症は、男児の視力障害の原因として重要な疾患である。原因としてRS1遺伝子変異が主たる原因であり、米国では遺伝子治療の試みが行われている。今回、全国多施設共同研究で、56家系67症例に対してRS1遺伝子解析を行い、12の新規遺伝子を同定した。将来の遺伝子治療へ向けた重要な日本人コホートの報告となった。2.眼底異常を伴わない錐体ジストロフィに対して、全エクソーム法によりPOC1B遺伝子変異を同定した。今回、多数例での解析を行い、新規遺伝子変異を同定した。POC1B遺伝子変異による錐体ジストロフィの臨床的特徴についても検討し、一部の周辺型錐体ジストロフィの原因になり得ることを明らかにした。遺伝子型と表現型の関連性について現在論文投稿中である。錐体機能不全を来す疾患、その原因遺伝子は多岐にわたる。臨床像と遺伝子型との関連性を明らかにすることは、疾患の自然経過、進行度、視機能予後予測など、将来の介入研究にむけ有意義な研究成果であると考えられる。本研究は、杆体1色覚、青錐体1色覚、錐体ジストロフィを来す錐体機能不全に対し、候補遺伝子の分子遺伝学的アプローチもしくは次世代シークエンサを用いた全エクソン解析により、原因となる遺伝子変異を特定し、表現型との関連性、ハプロタイプについて明らかにすることを目的としている。現在15家系以上の錐体機能不全の家系に対して遺伝子解析を行い、5-6家系でその原因を突き止めた。また、遺伝子治療対象疾患であるコロイデレミアの遺伝子解析を継続している。その原因遺伝子CHM異常によるコロイデレミアに対する遺伝子治療は、間もなく日本でも治験が行われる可能性がある。本研究は、その前段階としてまず、女性保因者の臨床像の特徴を検討した。その結果、CHM変異を有する保因者は特徴的な眼底所見を示すものの補償光学装置をもちいた解析で錐体細胞数・密度は健常者とどうように保たれていることを明らかにした。今後は、コロイデレミア(男性罹患者)のコホート研究を行い、将来の遺伝子治療に向け臨床的特徴を明らかにしていく予定である。青錐体一色覚の4家系・4症例で、その原因を特定しつつある状況である。青錐体一色覚の原因も過去の欧米での報告とはことなる疾患メカニズムが存在することが明らかになりつつある。今後も引き続き、杆体1色覚、青錐体1色覚、錐体ジストロフィ(黄斑ジストロフィ含む)を来す錐体機能不全に対し、候補遺伝子の分子遺伝学的アプローチもしくは次世代シークエンサを用いた全エクソーム解析を行い、遺伝子変異の同定、臨床像との関連性を明らかにし、その病態解明の成果を、発表論文としてまとめていく予定である。将来の遺伝子治療研究へ向けた基盤研究と確信する。2015年に難病認定された広義黄斑ジストロフィは、一種の症候群で、杆体一色覚、青錐体一色覚、錐体ジストロフィ、錐体機能不全などが含まれ、その原因は多岐にわたり、原因となる遺伝子変異を特定することは困難であった。平成29年度は、以下の研究成果が得られた。1.眼底異常を伴わない杆体一色覚症例で、日本人症例では最初となるGNAT2遺伝子変異を報告した。補償光学装置を用いた錐体細胞の可視化に成功し、錐体密度および錐体構造が比較的保たれていることを明らかにした。2.まれな眼底異常を伴わない錐体ジストロフィに対して、全エクソーム法により遺伝子変異の同定を試みた。その結果、1症例で日本では最初となるPOC1B遺伝子に両アレル変異を同定した。臨床像が同様な他の症例でもPOC1B遺伝子異常が示唆され、今後多数例での解析を予定している。3.女性のみが発症する錐体杆体ジストロフィの日本人1家系に対し、全エクソーム法により遺伝子解析を施行した。その結果、X染色体に存在するPRPS1に異常があることを捉えた。PRPS1変異はまた、難聴や視神経萎縮も合併する症例も存在し、症候性錐体杆体ジストロフィの原因である可能性が示唆された。日本で最初に発見された遺伝子異常であると同時に、その詳細な臨床像を明らかにした。

本研究は、杆体一色覚、青錐体一色覚、錐体ジストロフィを来す錐体機能不全に対し、候補遺伝子の分子遺伝学的アプローチもしくは次世代シークエンサを用いた全エクソン解析により、原因となる遺伝子変異を特定し、表現型との関連性、ハプロタイプについて明らかにすることを目的としている。現在15家系以上の錐体機能不全の家系に対して遺伝子解析を行い、5-6家系でその原因を突き止めた。また、RPPH2遺伝子変異(p.C250G)を有する常染色体優性網膜色素変性の4家系におけるハプロタイプ解析では、その変異が欧米と異なる日本固有の創始者変異である可能性を突き止めた。現在、青錐体一色覚の4家系・4症例で、その原因を特定しつつある状況である。青錐体一色覚の原因も過去の欧米での報告とはことなる疾患メカニズムが存在することが明らかになりつつある。2015年に難病認定された広義黄斑ジストロフィは、一種の症候群で、杆体1色覚、青錐体1色覚、錐体ジストロフィ、錐体機能不全などが含まれ、その原因は多岐にわたり、原因となる遺伝子変異を特定することは困難であった。本研究は、錐体機能不全をきたす遺伝子網膜疾患に対し、次世代シークエンサを用いた全エクソーム法により、原因となる遺伝子変異を特定し、疾患表現型との関連性、ハプロタイプについて明らかにすることを目的とした。平成30年度は、以下の研究成果が得られた。1. X連鎖若年網膜分離症は、男児の視力障害の原因として重要な疾患である。原因としてRS1遺伝子変異が主たる原因であり、米国では遺伝子治療の試みが行われている。今回、全国多施設共同研究で、56家系67症例に対してRS1遺伝子解析を行い、12の新規遺伝子を同定した。将来の遺伝子治療へ向けた重要な日本人コホートの報告となった。2.眼底異常を伴わない錐体ジストロフィに対して、全エクソーム法によりPOC1B遺伝子変異を同定した。今回、多数例での解析を行い、新規遺伝子変異を同定した。POC1B遺伝子変異による錐体ジストロフィの臨床的特徴についても検討し、一部の周辺型錐体ジストロフィの原因になり得ることを明らかにした。遺伝子型と表現型の関連性について現在論文投稿中である。錐体機能不全を来す疾患、その原因遺伝子は多岐にわたる。臨床像と遺伝子型との関連性を明らかにすることは、疾患の自然経過、進行度、視機能予後予測など、将来の介入研究にむけ有意義な研究成果であると考えられる。本研究は、杆体1色覚、青錐体1色覚、錐体ジストロフィを来す錐体機能不全に対し、候補遺伝子の分子遺伝学的アプローチもしくは次世代シークエンサを用いた全エクソン解析により、原因となる遺伝子変異を特定し、表現型との関連性、ハプロタイプについて明らかにすることを目的としている。また、遺伝子治療対象疾患であるコロイデレミアの遺伝子解析を継続している。その原因遺伝子CHM異常によるコロイデレミアに対する遺伝子治療は、間もなく日本でも治験が行われる可能性がある。本研究は、その前段階としてまず、女性保因者の臨床像の特徴を検討した。その結果、CHM変異を有する保因者は特徴的な眼底所見を示すものの補償光学装置をもちいた解析で錐体細胞数・密度は健常者とどうように保たれていることを明らかにした。今後は、コロイデレミア(男性罹患者)のコホート研究を行い、将来の遺伝子治療に向け臨床的特徴を明らかにしていく予定である。青錐体一色覚の4家系・4症例で、その原因を特定しつつある状況である。
塩基配列に依存した溶液中のDNA構造と制限酵素による識別

1.塩基配列に依存した溶液中のDNA構造前年度までのラマン分光の実験により,塩基配列に依存したDNA構造の規則をある程度求める事ができた.その場合我々がラマン分光より求めたものは, DNA高次構中の各残基の局所構造(塩基の配向がシンであるかアンチであるかおよび骨格の構造の内O_51-C_51-C_41-C_31の局所構造)である.これらの局所構造は塩基配列に依存して変化していたが,それらの局所構造がDNA全体の中にどのようにあてはめられているのかは不明であった.今回コンピュータ・グラフィックスにより,ラマン分光で求まった局所構造の実験値の下で全体構造を得る事を試みた結果,ポリ(dG-dC),ポリ(dA-dT),ポリ(dG)・ポリ(dC),ポリ(dA)・ポリ(dT),ポリ(dA-dC)・ポリ(dG-dT),ポリ(dA-dG)・ポリ(dC-dT)に関しては十分満足できる構造(エネルギー的に安定な構造)を得る事ができ,我々の求めた局所構造は納得いくものであった.更にこの事を発展させるためDNAオリゴマーに関してもラマン分光とNMR分光の実験を行い水溶液中のDNA構造の完全解析を分光法のみで行う事を試みて, CCTTAAGGに関してはうまくいった.2.制限酵素の切断部位前年度の研究を発展させ,消化部位とDNAの構造を考えるさいに,配列に依存したDNAの構造ユニットを考えるとうまくいく事が分った.特に水溶液中のDNA構造に関してはB形構造の安定化ユニットというものを考えることができ,制限酵素はこれらのユニットのつなぎ目を切断すると考えると今までの結果が説明できる事がわかった.3.ベンドDNA最近DNAは配列に依存してベンドする事が分ってきているが,その理由をB形構造の安定化ユニットの考えで説明できる事,および今まで報告されているベンドDNAのゲル電気泳動の異常度を計算で再現できる事を示した.1塩基配列に依存した溶液中のDNA構造塩基配列が一定のDNAの水溶液中の構造を、レーザーラマン分光で調べ次の事が判った。(b)poly(dG)・poly(dC)は低イオン強度中でB形の亜種Bh形をとり、高イオン強度中で右巻きのA形に構造変化をする。上記4種類の合成DNAテトラマーの内、、高イオン強度で、CCGGのみが若干A形構造をとる。2制限酵素の消化部位合成DNAテトラマーおよびポリマーの構造を比べる事により、poly(dG-dC)・poly(dG-dC)は、二塩基配列の基本としては(G-C)nと書くよりも(C-G)nと書いた方が良い事が分る。すなわちC-Gの基本的な構造が単位となっていてG-C部はその接合点であると考えられた。現在までに知られているテトラマーおよびヘキサマーを認識する制限酵素の内、poly(dG-dC)・poly(dG-dC)を切断するものは全て(種類)G-C部を切断し、C-G部を切断しない。これはC-Gが構造の基本単位でありG-Cがその接合部という考え方からすると、接合部のコンホメーションが制限酵素で切断され易くなっているといえる。同様に他の配列でも消化部位と構造の間に相関がある事が分った。1.塩基配列に依存した溶液中のDNA構造前年度までのラマン分光の実験により,塩基配列に依存したDNA構造の規則をある程度求める事ができた.その場合我々がラマン分光より求めたものは, DNA高次構中の各残基の局所構造(塩基の配向がシンであるかアンチであるかおよび骨格の構造の内O_51-C_51-C_41-C_31の局所構造)である.これらの局所構造は塩基配列に依存して変化していたが,それらの局所構造がDNA全体の中にどのようにあてはめられているのかは不明であった.今回コンピュータ・グラフィックスにより,ラマン分光で求まった局所構造の実験値の下で全体構造を得る事を試みた結果,ポリ(dG-dC),ポリ(dA-dT),ポリ(dG)・ポリ(dC),ポリ(dA)・ポリ(dT),ポリ(dA-dC)・ポリ(dG-dT),ポリ(dA-dG)・ポリ(dC-dT)に関しては十分満足できる構造(エネルギー的に安定な構造)を得る事ができ,我々の求めた局所構造は納得いくものであった.更にこの事を発展させるためDNAオリゴマーに関してもラマン分光とNMR分光の実験を行い水溶液中のDNA構造の完全解析を分光法のみで行う事を試みて, CCTTAAGGに関してはうまくいった.2.制限酵素の切断部位前年度の研究を発展させ,消化部位とDNAの構造を考えるさいに,配列に依存したDNAの構造ユニットを考えるとうまくいく事が分った.特に水溶液中のDNA構造に関してはB形構造の安定化ユニットというものを考えることができ,制限酵素はこれらのユニットのつなぎ目を切断すると考えると今までの結果が説明できる事がわかった.3.ベンドDNA最近DNAは配列に依存してベンドする事が分ってきているが,その理由をB形構造の安定化ユニットの考えで説明できる事,および今まで報告されているベンドDNAのゲル電気泳動の異常度を計算で再現できる事を示した.
統合失調症治療薬によるD-セリンの有効性向上効果の検討

統合失調症にD-アミノ酸の1つであるD-セリンの投与が有効である知見に基づき、本研究では統合失調症患者に処方されている抗精神病薬、気分安定薬などについて、生体内でD-セリンを分解するD-アミノ酸酸化酵素(DAO)の活性阻害作用を調べた結果、第二世代抗精神病薬リスペリドン(Ris)やブロナンセリンにDAO活性阻害作用が確認された。次に、ラットにD-セリンとRisを併用投与した結果、D-セリン単独投与時に比べ、Risを併用投与することで、ラット血漿および脳でのD-セリン濃度が有意に高くなることを発見した。D-セリンは、内在性D-アミノ酸であり、NMDA受容体のコ・アゴニストとして機能する。一方、統合失調症の発症仮説の一つとして、NMDA受容体の機能低下が示唆されている。D-セリン投与が同症の治療に有効であると推察されるが、D-セリンは、古くからラットに腎毒性を誘発する物質として知られ、患者へのD-セリン投与は難しい。そこで、生体内D-セリン濃度の減少を防ぐため、その代謝酵素であるD-アミノ酸酸化酵素(DAO)の活性を阻害する物質の探索研究が現在、製薬企業で行われている。画期的な新薬の登場が期待されるが、しかし、その新薬が実際、患者に処方されるまでにかなりの年月がかかるのも事実である。このような現状から、統合失調症患者に処方される治療薬に、生体内DAO活性の阻害作用が有るかどうかを検討することにした。平成25年度は、当研究室で開発したDAO活性阻害のin vitroアッセイ法(Yakugaku Zasshi 131:111-1116, 2011)により、統合失調症患者に処方されている治療薬のDAO活性阻害能を評価した。ヒトDAOを用いて、その治療薬のDAO活性阻害作用を調べた結果、第一世代抗精神病薬であるクロルプロマジン、ハロペリドール、スルピリド、第二世代抗精神病薬であるアリピプラゾール、クエチアピン、リスペリドンおよびブロナンセリンにヒトDAO活性阻害作用が認められ、特にリスペリドンおよびブロナンセリンに強いヒトDAO活性阻害作用が確認された(IC50値:約45 microM)。一方、同患者に処方される抗パーキンソン病薬(トリヘキシフェニジル、ビベリデン)、抗うつ薬(セルトラリン、エスシタロプラム、デュロキセチン)、気分安定薬(バルプロ酸ナトリウム)のIC50値は50 microM以上であり、これらの薬物のDAO活性阻害は弱いと考えられた。昨年度(25年度)の検討では、統合失調症患者の治療に有効とされるD-セリン(D-Ser)と、現在、同症患者に実際に投与されている統合失調症治療薬について、試験管内での実験(in vitro実験)を中心に行い、幾つかの統合失調症治療薬には、D-Serの代謝分解を抑える作用を有する可能性が示された。26年度は、主にラットを用いた動物実験(in vivo実験)(1)および(2)を行い、下記の成果が得られた。(1)統合失調症治療薬リスペリドン(RIS)を腹腔内投与(i.p.)し、その30分後にD-Serを投与することで、RISによる血漿中D-Ser濃度の変動作用を調べた。その結果、投与されたD-Serの血漿中濃度およびその濃度曲線下面積の上昇が見られた。また、この効果は、RISの代わりにD-Serの代謝酵素であるD-アミノ酸酸化酵素の阻害薬であるMPCの投与(i.p.)によっても、同様の傾向が見られた。以上より、RISは生体内においても、D-Serの代謝分解を抑える可能性が示唆された。(2)D-Serの血液から脳組織への分布、移行への変動を調べるために、実験動物(ラット)が生きている状態での脳組織への物質変動を調べられる、ラット脳マイクロダイアリシス(MD)実験を行った。RISによる脳内D-Ser濃度の変動を調べた結果、D-Serの投与直後の時点において、RIS投与群の方がD-Serの脳への移行(脳内D-Ser濃度)に有意な増加が見られた。今後、RISの投与量変化、D-Serの脳内への移行に関与する幾つかの生体分子について、次年度検討する予定である。統合失調症患者にD型アミノ酸の1つであり、脳内NMDA受容体コ・アゴニストであるD-セリンを統合失調症の治療薬(抗精神病薬)とともに投与することで、陰性症状が改善された報告がある。そこで本研究では、同患者に処方される抗精神病薬にD-セリンの有効性(生体内濃度)を高める作用の有無を実験動物(ラット)を用いて検討した。第2世代抗精神病薬リスペリドン(Ris)とD-セリンをラットに併用投与し、ラット血漿中D-セリン濃度推移をHPLC-蛍光検出法を用いて調べた。RisおよびD-セリンを併用投与した結果、D-セリン単独投与時に比べ、D-セリンの血漿中濃度の有意な上昇が見られ、Risの投与量に依存して、血漿中D-セリン濃度-時間曲線下面積が上昇した。また、ラットが生きている状態で脳組織内での物質変化を追跡できる脳マイクロダイアリシス実験により、ラット脳組織においても、Risの併用投与によりD-セリン濃度が上昇した。RisがD-セリンの生体内分解を抑える可能性を調べるため、生体内でD-セリンを代謝分解するD-アミノ酸酸化酵素(DAO)の活性を評価する測定系を試験管内に構築した。

その結果、RisにDAO活性阻害作用が弱いながらも認められ、また、Risの主代謝物である9-ヒドロキシRisにもRisと同程度であったが、DAO活性阻害作用が見られた。Risを投与後のラット血漿中Risおよび9-ヒドロキシRis濃度をLC-MS/MS法を用いて調べた結果、Ris、9-ヒドロキシRisともに血漿中に長い時間、存在することがわかり、Risおよび9-ヒドロキシRisがDAO活性を阻害し、D-セリン濃度が高く維持されることが推測された。一方、Risの投与後、腎臓及び小脳のDAOmRNAの発現減少はなかった。本研究により、RisとD-セリンを統合失調症患者へ併用処方する上で臨床上重要な知見が得られた。統合失調症にD-アミノ酸の1つであるD-セリンの投与が有効である知見に基づき、本研究では統合失調症患者に処方されている抗精神病薬、気分安定薬などについて、生体内でD-セリンを分解するD-アミノ酸酸化酵素(DAO)の活性阻害作用を調べた結果、第二世代抗精神病薬リスペリドン(Ris)やブロナンセリンにDAO活性阻害作用が確認された。次に、ラットにD-セリンとRisを併用投与した結果、D-セリン単独投与時に比べ、Risを併用投与することで、ラット血漿および脳でのD-セリン濃度が有意に高くなることを発見した。研究協力者(卒業研究学生)とともに、動物実験の日程調整を行い、各実験が効率的に進められている。しかし、飼育期間が必要な動物(ラット)を用いる一連の実験が年度内に行うことができなかったため、次年度へ延長することにした。東邦大学薬学部薬品分析学教室ホームページ分析化学平成27年度については、平成25年度および26年度の研究成果を踏まえ、更に進展させていく予定である。平成25年度では、統合失調症治療薬のD-アミノ酸酸化酵素活性阻害の評価(in vitro実験)を中心に進めたところ、興味深い結果を得られ、学会での発表(3件)を行うことができた。また、その成果をまとめた論文を投稿し、現在、審査中である。一方で、ラットを用いる幾つかの動物実験が、平成26年度以降の課題として残されている。今後、ペースを速める必要があり、区分をやや遅れているとした。平成26年度は、動物実験を中心に進め、順調に成果を得てきたが、飼育期間が必要な動物(ラット)を用いる一連の実験が、年度内に行うことができなかったため、その動物実験を次年度へ延長することにした。当初の計画に従い、研究を進める。平成26年度からは、in vivo実験を中心に行う。平成27年度は、追加検討が必要な動物実験を行うために、主として動物およびその実験機材の購入費に助成金を使用する。動物実験を、平成26年度以降に行うことになったため、使用額に多少ではあるが変更があった。平成26年度は、主として動物実験に関係する消耗品に、助成金を使用する予定である。
コルゲーションの発生・成長現象の解明

表面に弾塑性変形や摩耗が生じる物体が転がり接触をすると、接触表面の振動に起因して、コルゲーションと呼ばれる周期的な変形が接触表面上に発生することがしばしば見られる。例を挙げると、鉄道レールに発生する波状摩耗、圧延機、製紙機などの転がり接触を伴うローラーの変形などである。一度コルゲーションが発生すると、振動・騒音問題を引起こすだけでなく、装置の本来の機能をも損なうという重大な問題を引起こすが、従来詳細なメカニズムは明らかにされて来なかった。本研究の目的は、このようなコルゲーションの発生・成長メカニズムを解明し、防止のための手法を探究することである。2つの円盤が転がり接触する実験装置を用いて、接触面内の縦・横すべりを伴うコルゲーションの発生・成長を実現した。コルゲーションの発生・成長状況、車輪・軌条輪の上下・左右・前後・回転方向の振動及び滑りの状態をリアルタイムに計測し、上下振動と滑り振動の関係、さらに摩耗率との関係を実験的に明らかにした。実験結果から得た知見は以下の通りである。すべりを伴うコルゲーションの発生メカニズムは、すべり振動と上下振動が連成し、繰り返し接触により、フィードバック系を構成するためと考えられる。よって、コルゲーションの防止策は、接触面内の振動防止、定常すべりの排除、すべり振動と上下振動の連成防止、および摩耗などの変形防止が有効と考えられる。具体的には、接触面の潤滑(塗油)が方策の一つである。実験では二つの円盤が円筒接触する系を想定したが、レールと車輪が接触する場合を想定した弾性支持梁上を接触剛性を伴いながら荷重が移動する振動問題についてのモデル化も検討した。固有振動数が接触位置により変化することが分かり、コルゲーションの問題について検討するためには、この点を考慮する必要があることが分かった。表面に弾塑性変形や摩耗が生じる物体が、転がり接触あるいは滑り接触をすると、鉄道レールに発生する波状摩耗のように、接触表面の振動に起因してコルゲーションと呼ばれる周期的な変形が接触表面上に発生する。この現象を解明するための基礎的な研究を行った。本年度の研究では、従来の実験装置を参考に、2つの車輪が転がり接触する実験装置を新たに製作した。この装置は、接触面内の滑り特性を管理、計測できること、上下振動に加えて、回転方向の振動も計測できること、という2つの特徴をもっている。このような滑りと回転振動系を管理した実験の試みは未だ行われていなかった。具体的には、滑りに関しては、2つの車輪間のアタックアングルが管理可能であり、さらに、2つの車輪の回転を独立のサーボモーターで駆動することにより、0.05%の精度でスリップ率を管理できる。また、エンコーダーとF/Vコンバータを用いて10kHzでの高速サンプリングを行うことにより、1kHzまでのコルゲーションについて計測可能である。また、上下振動系に加えて回転振動系の特性を調べるために、ねじり剛性を変えられる。実験は開始したばかりで、詳細な結果は得られていないが、現在までのところ、接触面内に縦滑りを与えると、回転振動系に関連するコルゲーションの発生が見られ、従来十分解明が行われていなかったコルゲーション現象が再現された可能性が強い。一方、鉄道レールのような一方の接触体が円盤ではない場合に対処するため、弾性支持梁上を接触剛性を伴いながら荷重が移動するモデルによる計算も平行して行っており、本年度はモデル化が終了した。

一度コルゲーションが発生すると、振動・騒音問題を引起こすだけでなく、装置の本来の機能をも損なうという重大な問題を引起こすが、従来詳細なメカニズムは明らかにされて来なかった。本研究の目的は、このようなコルゲーションの発生・成長メカニズムを解明し、防止のための手法を探究することである。2つの円盤が転がり接触する実験装置を用いて、接触面内の縦・横すべりを伴うコルゲーションの発生・成長を実現した。コルゲーションの発生・成長状況、車輪・軌条輪の上下・左右・前後・回転方向の振動及び滑りの状態をリアルタイムに計測し、上下振動と滑り振動の関係、さらに摩耗率との関係を実験的に明らかにした。実験結果から得た知見は以下の通りである。すべりを伴うコルゲーションの発生メカニズムは、すべり振動と上下振動が連成し、繰り返し接触により、フイ-ドバック系を構成するためと考えられる。よって、コルゲーションの防止策は、接触面内の振動防止、定常すべりの排除、すべり振動と上下振動の連成防止、および摩耗などの変形防止が有効と考えられる。具体的には、接触面の潤滑(塗油)が方策の一つである。実験では二つの円盤が円筒接触する系を想定したが、レールと車輪が接触する場合を想定した弾性支持梁上を接触剛性を伴いながら荷重が移動する振動問題についてのモデル化も検討した。固有振動数が接触位置により変化することが分かり、コルゲーションの問題について検討するためには、この点を考慮する必要があることが分かった。
高速2光子軸索機能イメージングで読み解く軸索神経活動の発振現象と行動連関

本研究課題の目的は軸索神経活動の発振状態や同期化と行動との関連を調べ、文脈依存的な同期化などを探索することである。本年度は、まず軸索活動と行動の関連を調べる手法を確立した。動物の行動として、レバー引き課題の成功率とレバー軌道から抽出された運動の様々なパラメーターを用意し、これらを軸索の神経活動から説明するという統計モデルを立てた。モデル化においては柔軟な入出力関係を得ることができる一般化線形モデルを用いて、成功率については二項分布を用いるなどにより、線形モデルを用いた場合よりデータに即したモデル化を実現した。このモデル化により、大脳皮質の層の違いによって、軸索の神経活動とこれらの行動に関する変数との関連性が異なることを見出した。また、皮質での軸索イメージングを行いながら、皮質下で光刺激を行い、光刺激に誘導される軸索活動を観察した。動物の行動をレバー引きに限らず、より多様な運動をさせた場合の運動情報を抽出することは今後、軸索神経活動の発振と運動との関連を解析するうえで非常に重要である。3台のカメラを用いて、口元、両手の運動、レバーを引く右手の拡大図について200 Hz程度で記録し、これらの動画から、深層学習を利用したプログラムを用いて動物の手や舌などの任意の部位について、座標を連続的に自動取得する記録・観察系を実現した。同じ深層学習を利用した手法を用いて、脳部位の一部を損傷した動物の行動を解析し、抽出した行動から損傷部位をある程度推定できることを確認した。本年度は軸索神経活動の新規のイメージングよりも、動物行動との関連を調べるための手法の開発・適用にエフォートを割いた。すなわち、動物行動を画像から深層学習を用いて自動取得する系、および、動物行動と神経活動を関連付けるための統計的手法の確立といった面を先行しておこなった。これらの手法は行動時の軸索活動と行動を関連付けていく際に必須となる手法である。実験面での遅れがあるものの、解析面での進展があったため、おおむね順調に進展しているものと考える。本年度は実験面で軸索神経活動の新規のイメージングが行えなかったため、来年度は実験面に注力して研究を進展させる。生体での電気生理的手法を導入し、イメージング技術との組み合わせによって発振現象を明らかにしたうえで、それを本年度確立した、動物行動の自動取得系と組み合わせることで、本研究課題の目的である、軸索神経活動の発振状態と行動との関係の解明につなげる。
発語のない重度言語発達遅滞児の実用的伝達スキルの開発-図形シンボルと会話エイドの応用-

本研究は,養護学校に在籍する発語のない重度言語発達遅滞児を対象に,図形シンボルと会話エイドを利用して学内日常環境における実用的伝達スキルを開発するとともに,その効果的指導方法について実験的に検討することを目的としている。今年度は,昨年度までの研究の継続として以下の2点について研究を行い成果を得た。1.図形シンボル用会話エイドの開発昨年度までの研究でプロトタイプの開発を終了し下記の事例研究にも導入している図形シンボル用会話エイドの開発を終了した。この会話エイドは(PICOT),市販のパソコン(Macintosh)の画面上で自由にシンボルを作成し,必要な音声フィードバック用データを録音・登録することが可能なソフトウェアである。この成果は「聴能言語学研究」誌へ論文として投稿中である。2.図形シンボル用システムのインストールと事例研究対象児2名の図形シンボル用システムとして会話エイド(PICOTを搭載したパソコン)と会話ボードを学校内へインストールし、同システムを利用して行う会話訓練を中心とした事例研究を開始した。会話訓練はこれまでに約3ケ月間行われた。現在,各訓練セッションのビデオ映像記録をスクリプト化する作業を行っており、図形シンボルによる伝達スキルの獲得過程,既・未得伝達スキルへの影響,図形シンボルによる伝達スキルの般化,等について分析を進める予定である。
三次元微細単結晶シリコンプローブを集積化した高機能スマートセンシングチップ

神経細胞活動計測において、生体組織内の空間的な電位分布を多点で同時に計測するための電極開発が必要とされている。本研究では、選択シリコン(Si)vapor-liquid-solid(VLS)成長を用いた神経電極を提案してきている。この技術により、Siプローブのサイズ、長さ、位置の制御、微細プローブ電極としてのアレイ化が可能となり、また標準的なCMOSプロセスを用いた同一基板上信号処理回路の一体化が可能となる。本研究期間では、VLS成長を用いた神経電極技術の実現に向けて、以下に示す知見を得た。・Si(111)基板上に製作したMOSFETのMOS界面特性に着目し、フッ素注入処理及び長時間の水素雰囲気での熱処理を用いることで、Si(100)基板上に製作したMOSFETと同等の電気的特性を確認した。・In-situドーピングVLS成長法の提案。Siガス(Si_2H_6)にPH_3ガスを混入し、成長温度700°C以下で10^19/cm^3の低抵抗Siプローブを実現。また、B_2H_6ガスを用いることで、10^17/cm^3のP型Siプローブを実現した。・バッファアンプとしてOn-chipインピーダンス変換回路を搭載。チップ被覆、実装までを行い生体同様の生理溶液中での電気的特性を検討した。増幅率の確認と細胞外電位100μV以下の電位取得を確認した。・ワイヤレスの基礎技術として、Si基板上にコイルなどを形成したワイヤレス信号伝搬システムの構築を行った。本結果より、300MHzでの信号の送受信が可能であることを確認している。・長さの異なる3次元プローブを既存のICプロセスにより配線チップ上に形成、またプローブの電気特性、機械的特性を評価し、実際の生理実験で試用できることを示した。・組織内薬液投与を目的とし、これまでの電極チップに薬液投与用のマイクロチューブアレイをICプロセスで集積化した。チューブ薬液吐出特性、機械的特性を考察し、実際の生理実験で使用できることを示した。このように本研究期間で得られた研究成果は非常に多く、また本提案電極デバイスのみでなく、多くの課題を残す神経電極の分野への貢献も多いと考える。このような神経電極デバイスは、脳内の解析、細胞レベルの電極ツール、更に近年ではブレインマシン・インタフェース(BMI)研究用の電極デバイスとして期待が大きい。神経細胞活動計測において、空間的な電位分布を多点で同時に計測するための電極開発が必要とされている。VLS結晶成長を用いたシリコンプローブは、センサー部となるプローブのサイズ、長さ、位置を制御可能であり、微細プローブ電極としてのアレイ化が可能となる。また、シリコン結晶成長を用いるため、標準的なCMOSプロセスの後にプローブ形成が可能であり、同一基板上に信号処理回路を一体化することができる。これらを集積化した高機能スマートセンシングチップは、脳神経科学における信号解析のための強力なツールとなることが期待されている。これまでの神経電位計測を通した研究で、シリコンプローブアレイ電極の評価を行ってきたが、今年度は、更に神経活動計測における強力なツールとするため、以下を実現した。

(1)これまで開発してきた電極は、計測点が同一平面状に二次元的に存在していたが、空間的な神経活動計測を可能とすることを目的とし、計測点を三次元で配置するためのプロセスを実現した。触媒金属となる合金の組成比を変化させることで、同一基板上に長さの異なるプローブの形成方法を確立した。(2)長期的な信号計測を考えた場合、生体適合性が重要となる。一般的に生体適合性が高いとされるパリレンを用いてプローブ側面の被膜を行ない、プローブ先端部の計測点のみ露出する方法を確立した。(3)プローブのインピーダンスが計測した信号に与える影響を検討し、開発したシリコンプローブアレイ電極の電気的特性評価を行った。電極としての高感度化を行うには、インピーダンスを低下させることが重要であることを確認した。(4)Si(111)上への信号処理回路をこれまでに実現してきたが、シリコンプローブアレイとの一体化を行なうための製作プロセス検討及び設計を行った。今後は、三次元プローブと信号処理回路とを一体化したスマートセンサの開発及び評価を行っていく。神経細胞活動計測において、空間的な電位分布を多点で同時に計測するための電極開発が必要とされている。VLS結晶成長を用いたシリコンプローブは、センサー部となるプローブのサイズ、長さ、位置を制御可能であり、微細プローブ電極としてのアレイ化が可能となる。また、シリコン結晶成長を用いるため、標準的なCMOSプロセスの後にプローブ形成が可能であり、同一基板上に信号処理回路を一体化することができる。これらを集積化した高機能スマートセンシングチップは、脳神経科学における信号解析のための強力なツールとなることが期待されている。これまでの神経電位計測を通した研究で、シリコンプローブアレイ電極の評価及び三次元空間的神経活動計測を可能とするプローブの三次元化のプロセスを実現してきた。さらに生体への長期埋め込みを視野にいれ、生体適合性に優れた材料且つ、三次元化に対応するプロセスの提案をし、実現してきた。今年度は、更に神経活動計測及びスマートチップ化における強力なツールとするため、以下を実現した。(1)これまで開発してきた電極は、電極インピーダンスが大きいため計測信号に対する信号の減衰・ノイズの影響が大きいことを理論的・実験的に示すことを実現した。そこで解決策として、本チップに適した集積回路形成方法を確立し、バッファアンプとして実際にインピーダンス変換回路との一体化及び回路動作を確認した。(2)生理実験及び人体への埋込みを考慮した際、信号記録用の配線などが一番問題となっていた。そこでワイヤレスの基礎技術として、Si基板上にコイルなどを形成したワイヤレス信号伝搬システムの構築を行った。本結果より、300MHzでの信号の送受信が可能であることを確認した。来年度も同様に神経電位計測を継続すると共に、本年度得られた技術の融合を目指し、神経電位記録用スマートデバイスの開発を行っていく。神経細胞活動計測において,生体組織内の空間的な電位分布を多点で同時に計測するための電極開発が必要とされている。
Ｓｉ含有ＤＬＣ膜の全構造因子による構造分析：次のＩＳＯ規格提案に向けて

研究計画に沿って実験を行い、下記の成果を得た。1)蛍光収量法でSi K端X線吸収分光測定を行うために必要なSiを含まない基板上にシリコン含有ダイヤモンドライクカーボン(Si-DLC)膜を製膜した。2)製膜したSi-DLC膜を試料として、ニュースバル放射光実験施設BL05Aにおいて、Si-DLC膜のSi K端X線吸収分光(XAS)スペクトルを測定した。Si-DLC膜のSi原子の化学状態は、Siもしくはa-Si:Hと近い領域にあることを見出した。また、Si原子の含有率によりSi-DLC膜中のC原子の化学状態は大きく変化するが、Si原子の化学状態はそれほど大きく変化しないことを見出した。3)京都大学複合原子力研究所研究用実験炉(KUR)のB-1実験孔に設置された低速陽電子ビームシステムを用いて陽電子消滅(PAS)法により膜中の自由体積を反映するsパラメータの測定を行った。DLC膜にSiを含有させると大きくsパラメータが増加することを見出した。一方、Si原子の含有率によるsパラメータの違いは大きくないことを見出した。4)PAS法の測定から、軟X線の照射により水素化DLC膜およびSi含有水素化DLC膜のsパラメータが減少することを見出した。これは、軟X線照射によって水素化DLC膜およびSi含有水素化DLC膜中の自由体積が減少していると考えられる。5)XASの測定から、軟X線を照射することで水素化DLC膜、Si含有水素化DLC膜の炭素原子の局所構造が変化すること、一方、Si原子の局所構造はほとんど変化しないことを観測した。さらにX線反射率(XRR)測定の結果、軟X線照射により、水素化DLC膜・Si含有水素化DLC膜の密度が増加し、膜厚が減少することを見出した。また、Si含有水素化DLC膜ではこの変化に要する照射Dose量が多く、Siがこの過程を抑制していることを明らかにした。Si-DLC膜中のSi原子の局所構造を決定するためには蛍光収量法によるX線吸収分光の測定が必要だが、DLCの製膜基板として良く使われるシリコンウェハ上を用いるとウェハのSiの蛍光が試料信号に混ざるために精確な測定ができない。そこで、Siを含まないTi金属板上にプラズマエンハンスドCVD法を用いてSi-DLCを製膜した。原料ガスのアセチレンとテトラメチルシラン(TMS)の流量比を変えることでSi含有率の異なる4種類の膜を作成し、以下の実験に使用した。バルクの情報が得られる蛍光収量法と表層の情報が得られる全電子収量法でSi-K端X線吸収分光スペクトルの測定を行ったが、両者に差が無く、膜質の安定した製膜に成功したことを確認した。X線吸収分光スペクトルの測定結果から、Si-DLC膜中のSi原子のイオン化エネルギーは金属Siもしくはa-Si:Hに近いことが明らかとなった。また、Si-DLC膜の組成によりC原子の化学状態は大きく変化するのに対し、Si原子ではほとんど変化しないことを見出した。KURのB-1実験孔の低速陽電子ビームシステムにおいて昨年度に実証した測定条件で陽電子消滅(PAS)法を用いてドップラー拡がり(sパラメータ)の測定を行った。また、Si原子の含有率によるsパラメータの違いは大きくなく、自由体積は大きく変化しないことを見出した。さらに、軟X線照射により水素化DLC膜のsパラメータが減少することを突き止めた。XRRの測定からは、水素化DLC膜が軟X線照射によって密度が増加し、膜厚が減少することを見出した。これらの結果から軟X線の照射により水素化DLC膜から水素が脱離し、炭素ー炭素結合が構築され、その結果自由体積が減少し、密度の増加と体積の減少が起きることを明らかにした。研究計画に基づいて以下の実験を行う。1製膜したSi-DLC膜ではSi原子の化学状態の変化はほとんど観測されなかった。Si/C比の増加に対して化学状態の変化がどの領域で起きるかを調べるために、更にSi/Cの高い試料の製膜を行う。そのためには原料ガスにTMSよりもSi/C比の高いヘキサメチルジシランなどの使用を検討する。また、Si-DLC膜の組成比の精密決定は長岡科学技術大学所有の静電加速器を使用してラザフォード散乱/弾性反跳散乱分析から行う予定にしていたが、同装置の不調により実行できていない。精度では劣るがグロー放電発光分析装置を用いた組成分析を実施する。2本年度確立した手法を用いてニュースバルBL05Aにおいて1で製膜したSi-DLC膜のSi K端X線吸収分光の測定を蛍光収量法にて行う。また、BL09AにおいてC K端についても蛍光収量法を用いたX線吸収分光の測定を試みる。C K端は蛍光収率が低いために蛍光収量法でのX線吸収分光はほとんど行われていないが、11mのアンジュレータとC K端である300 eV近辺で高い収率を持つフォトダイオードの使用でグラファイトの測定に成功しており、DLC膜でも測定を試みる。3KURのB-1実験孔において、原子力規制委員会による原子炉運転再開の許可が遅れたため実施に至っていない陽電子消滅法の寿命測定を行ってDLC膜・Si-DLC膜中の自由空間を絶対値で観測する。4研究の過程で軟X線照射過程によってDLC膜に含まれるヘテロ元素によって、その改質過程が異なることが明らかになった。

DLC膜・Si-DLC膜・F-DLC膜を試料として昇温脱離スペクトルを測定し、X線照射過程と対比させる形でその自由体積・局所構造変化について検討する。研究計画に沿って実験を行い、下記の成果を得た。1)10004000eVのエネルギー範囲で高分解能分光測定のできるニュースバル放射光実験施設ビームライン05A(BL05A)において、シリコン含有ダイヤモンドライクカーボン(Si-DLC)膜のSi K端広域X線吸収微細構造(EXAFS)を測定するために広いエネルギー領域での光軸安定性とEXAFS測定用のプログラムの整備を行った。次年度以降、EXAFSの測定が可能である。2)Si-DLC膜のSi-K端およびSi-L端吸収端近傍微細構造(NEXAFS)の測定を行い、Si-DLC膜のSi原子のイオン化エネルギーが、半導体Siもしくはa-Si:HのSi原子と近い領域にあることを見出した。3)C K端NEXAFSの測定結果と比較することで、Si-DLC膜の組成の変化により、Si-DLC膜中のC原子の化学状態は大きく変化するが、Si原子の化学状態の変化はそれほど大きくないことを見出した。4)原子炉から放出される低速陽電子を用いた陽電子消滅法により、膜厚数百nmのDLC薄膜中の自由体積の違いを測定できることを確認し、実験条件の最適化の検討に必要な情報を入手した。5)陽電子消滅法の測定からDLC膜中の自由体積の大きさが密度に依存しないことがわかった。追試は必要であるが、これらは事前の予想と異なっており、DLC膜の自由体積における水素の役割について更なる考察が必要であることがわかった。6)軟X線照射により、DLC膜の元素組成・C原子の局所構造だけでなく、膜中の自由体積が変化することを明らかにした。7)DLC膜に含まれるヘテロ元素の種類により、軟X線照射による改質過程が異なることを見出した。シリコン含有ダイヤモンドライクカーボン(Si-DLC)膜中のSi原子の局所構造を決定するために必要な広域X線吸収微細構造(EXAFS)の測定には、広いエネルギー領域で光軸を安定する分光器の調整とエネルギー領域によってステップ刻みなどを変える測定プログラムの整備が必要であり、これを完了した。Si-DLC膜中のSi原子の化学環境に関してSi-K端およびSi-L端NEXAFS領域の測定を行った結果、Si-DLC膜中のSi原子のイオン化エネルギーはSiO2、SiCよりも低く、金属Siもしくはa-Si:Hに近いことを明らかにした。また、Si-DLC膜の組成によりC原子の化学状態は大きく変化するのに対し、Si原子ではほとんど変化しないことを見出した。京大原子炉の運転再開の許可が遅れたため、原子炉から放出される陽電子を用いた陽電子消滅測定は十分な実験時間を確保ができなかったために、装置準備が間に合わず陽電子寿命の絶対値測定はできなかったが、DLC膜を試料としてドップラー拡がりの測定から相対評価を行った。その結果、密度が少ないにも拘わらず水素含有量の多いDLC膜の方が、自由体積が小さいという観測結果を得た。また、平成30年度に予定していた軟X線照射によるDLC膜の自由空間の変化は前倒しで実施し、陽電子消滅法から軟X線照射によって自由空間が大きくなる結果を得た。