hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
膵β細胞で発現するイオンチャネルの分子生物学、分子遺伝学的研究-糖尿病における役割-

(目的)インスリン分泌は種々のイオンチャネルにより制御されている。中でも、電位依存性Ca^<2+>チャネル(VDCC)はβ細胞へのCa^<2+>流入の調節に、ATP感受性K^+チャネル(K_<ATP>チャネル)はβ細胞におけるグルコース代謝による膜電位の調節に重要な役割を演じている。従って、これらのチャネル遺伝子の構造異常や発現異常は、インスリン分泌障害をきたし、糖尿病を発症する可能性がある。そこで我々は、膵β細胞で発現するVDCCとK_<ATP>チャネルの分子的基盤を明らかにすると同時にそれの遺伝子構造を決定し、インスリン非依存性糖尿病(NIDDM)における役割を検討した。(結果)<VDCC>膵β細胞における電位依存性Ca^<2+>チャネルのα1サブユニットとβサブユニット(β1β3)の全長を単離し、発現系で機能解析を行ったところα1サブユニット単独ではチャネル活性が認められずβサブユニットと同時に発現した時のみ典型的なL型Ca^<2+>チャネル活性が認められ、βサブユニットが機能発現に重要であることが示された。次にα1サブユニット(CACN4)とβ(β3)サブユニットの遺伝子構造を決定した。α1サブユニット遺伝子は全長が約155kpbにおよび49のエクソンから構成されていた。一方、β3サブユニットは約8kbにおよび13のexonから構成されていた。CACN4遺伝子変異を検索したところ、89例のNIDDM患者(178 alleles)中1例(1 allele)にexon1におけるATGのinsertionよるmethionineのinsertionがN端に認められた。さらに別の1例ではexon42のGAAのdeletionによるGluのdeletionがC端領域に認められた。これらの変異は48例の正常者(96 alleles)には認められなかった。絶食状態では膵β細胞で発現する電位依存性Ca^<2+>チャネルα1サブユニット遺伝子の低下が認められた。<K_<ATP>チャネル>膵β細胞で発現する新たな内向き整流性K^+チャネル(BIR βcell inward rectificr)をクローニングした。BIRは390個のアミン酸から構成され、他の内向き整流性K^+チャネルと同様2回の膜貫通領域を有していた。組織発現を検討したところ、BIRは膵ランゲルハンス島及びグルコース反応性のインスリン分泌細胞株であるMIN6、HIT細胞で高レベルの発現が認められた。一方、スルホニール尿素剤の受容体であるSURも膵ラ氏島、MIN6、HIT細胞で高レベルの発現が認められた。BIRとSURが膵ラ氏島やβ細胞株で共発現することより、BIRとSURは機能共役する可能性が示唆された。そこで両者をCOS-1細胞に発現させ、機能解析を行った。電流-電圧曲線の解析によりこのチャネルは内向き整流性を示した。単一チャネルの解析を行ったところ、ATP濃度依存性にK^+チャネル活性が抑制された。スルホニール尿素剤であるグリベンクラミドによってチャネル活性は抑制されたが、diazoxideによりこのチャネルは活性化された。これらのK^+チャネルの特性はすべて膵β細胞で認められるATP感受性K^+チャネルの特性をみたすものである。一方、BIR単独あるいはSUR単独の発現ではATP感受性K^+チャネル活性は全く認められなかった。ヒトBIR遺伝子は第11染色体p15.1に位置し、SUR遺伝子と隣接することが証明された。日本人の正常者(74名)とNIDDM(103名)でBIR遺伝子の変異を検索したところ、2種類のBIR遺伝子の存在が確認された。即ちallele AではBIR遺伝子の23番目と337番目のコドンはそれぞれGlu,Ile (Glu^<23>,Ile^<337>)をコードし、allele BではそれぞれLys,Valをコード(Lys^<23>,Val^<337>)していた。(結論)膵β細胞で発現する電位依存性Ca^<2+>チャネル(VDCC)の遺伝子構造を決定した。さらに、グルコースによるインスリン分泌の調節の鍵となる因子である膵β細胞のATP感受性K^+チャネル(K_<ATP>チャネル)の分子構造を解明し、その特性を明らかにした。膵β細胞で発現するVDCCとK_<ATP>チャネルの分子的基盤や遺伝子構造を明らかにしたことは、NIDDMの成因の解明や新たな治療薬の開発に向けて極めて有力な情報を与えるものである。(結果)<VDCC>膵β細胞における電位依存性Ca^<2+>チャネルのα1サブユニットとβサブユニット(β1β3)の全長を単離し、発現系で機能解析を行ったところα

1サブユニット単独ではチャネル活性が認められずβサブユニットと同時に発現した時のみ典型的なL型Ca^<2+>チャネル活性が認められ、βサブユニットが機能発現に重要であることが示された。次にα1サブユニット(CACN4)とβ(β3)サブユニットの遺伝子構造を決定した。α1サブユニット遺伝子は全長が約155kpbにおよび49のエクソンから構成されていた。一方、β3サブユニットは約8kbにおよび13のexonから構成されていた。CACN4遺伝子変異を検索したところ、89例のNIDDM患者(178 alleles)中1例(1 allele)にexon1におけるATGのinsertionよるmethionineのinsertionがN端に認められた。さらに別の1例ではexon42のGAAのdeletionによるGluのdeletionがC端領域に認められた。これらの変異は48例の正常者(96 alleles)には認められなかった。絶食状態では膵β細胞で発現する電位依存性Ca^<2+>チャネルα1サブユニット遺伝子の低下が認められた。<K_<ATP>チャネル>膵β細胞で発現する新たな内向き整流性K^+チャネル(BIR βcell inward rectificr)をクローニングした。BIRは390個のアミン酸から構成され、他の内向き整流性K^+チャネルと同様2回の膜貫通領域を有していた。組織発現を検討したところ、BIRは膵ランゲルハンス島及びグルコース反応性のインスリン分泌細胞株であるMIN6、HIT細胞で高レベルの発現が認められた。一方、スルホニール尿素剤の受容体であるSURも膵ラ氏島、MIN6、HIT細胞で高レベルの発現が認められた。BIRとSURが膵ラ氏島やβ細胞株で共発現することより、BIRとSURは機能共役する可能性が示唆された。そこで両者をCOS-1細胞に発現させ、機能解析を行った。電流-電圧曲線の解析によりこのチャネルは内向き整流性を示した。単一チャネルの解析を行ったところ、ATP濃度依存性にK^+チャネル活性が抑制された。スルホニール尿素剤であるグリベンクラミドによってチャネル活性は抑制されたが、diazoxideによりこのチャネルは活性化された。これらのK^+チャネルの特性はすべて膵β細胞で認められるATP感受性K^+チャネルの特性をみたすものである。一方、BIR単独あるいはSUR単独の発現ではATP感受性K^+チャネル活性は全く認められなかった。ヒトBIR遺伝子は第11染色体p15.1に位置し、SUR遺伝子と隣接することが証明された。日本人の正常者(74名)とNIDDM(103名)でBIR遺伝子の変異を検索したところ、2種類のBIR遺伝子の存在が確認された。即ちallele AではBIR遺伝子の23番目と337番目のコドンはそれぞれGlu,Ile (Glu^<23>,Ile^<337>)をコードし、allele BではそれぞれLys,Valをコード(Lys^<23>,Val^<337>)していた。(結論)膵β細胞で発現する電位依存性Ca^<2+>チャネル(VDCC)の遺伝子構造を決定した。
プロテオミクスを用いたD-アロースによる癌細胞増殖抑制機構の解明

ヒト肝細胞株Huh 7は、自然界にあまり存在しない希少糖であるD-アロースにより、細胞の増殖抑制効果が見られ、G1期での細胞周期停止の可能性が示唆されている。細胞周期制御には様々なタンパク質のリン酸化関与していることはよく知られており、リン酸化が大きく変動するタンパク質の決定を試みた。D-アロース投与前後の細胞抽出物から、リン酸化タンパク質をphos-tagで精製し、SDS-PAGEで展開した後、LC-MS/MS法でそのタンパク質同定を行った。その結果、PDIR5 (protein disulfide isomerase-related protein 5)やtumor protein D52-like 2を含む12種のタンパク質にリン酸化亢進の可能性が認められ、これらが細胞増殖抑制に関与していることが示唆された。また、TXNIP (thioredoxin interacting protein)のリン酸化部位の解析を行った。この遺伝子は、当機関の医学部・細胞情報生理学講座において、マイクロアレイを用いた実験により、D-allose投与48後に約10倍上昇することが知られている。TXNIPは、p38 MAPKとCaMKIVによるTXNIPのリン酸化の完進が見られたので、どの部位がリン酸化されているかをLC-MS/MS法で調べたところ、リン酸化部位の候補として、p38 MAPKではT348あるいはT349、CaMKIVではS236とS315が挙げられた。これらのリン酸化が、D-アロースによる培養細胞の増殖抑制効果に関わっているかもしれない。本研究では、当研究室で確認された、希少糖D-アロース(D-allose)の白血病細胞における癌細胞増殖抑制の分子レベルでのメカニズムを解明するため、SILAC法(Stable Isotopic Labeling using Amino Acids in Cell Culture)を用い、網羅的なタンパク量比較解析を行った。細胞培地に加える安定同位体ラベルしたアミノ酸に重水素ロイシン(deuterated leucine)を用いたところ、細胞増殖に対する影響は見られなかった。今回は、D-アロースを加えて5日間培養した後に細胞を回収して実験を行った。この時D-アロースを加えた細胞では約2倍程度の増殖抑制が見られる。四重極-飛行時間型ハイブリッド型質量分析装置(Q-tof2)を使ったLC-MS/MSによるタンパク質同定とLC-MSによる比較定量を行った結果、1273のペプチドについて比較可能であった。これにより、343種類のタンパク質の発現レベルの比較に成功した。SILAC法で得られた結果ウエスタンブロッティングと比較したところ、これを支持する結果が得られ、この方法の信頼性が確認された。D-アロース投与により、発現量に大きく差が見られた遺伝子を、シグナル伝達パスウェイデータベース上に反映させたところ、発現量が40%以上上昇した10個の遺伝子のうち2つが、DNA複製開始に関連する遺伝子であり、これらの遺伝子の関与が示唆された。
動物におけるAIDS関連ウイルス疫学と比較ウイルス学

AIDSの原因ウイルスであるHIVの起源については,現在アフリカではないかと疑われているが未だ明らかでない.ごく最近により,このHIVと類似のウイルスをアフリカのサルが保有していることが判り,このウイルスがサルからヒトへ伝播したのではないかと疑われている.そこで主としてアフリカにおけるヒト(及びサル)のHIV(及び類似ウイルス)の抗体保有状況を調査してウイルス分離を行い,これらのウイルスの起源を明らかにするとともに,ヒト間,サル間の感染経路を明らかにして,このウイルス侵入に対する防御の方策を考えたい.さらにまだこれらのウイルスに関して調査されていないインド亜大陸におけるヒト及びサルの調査を併せて行う.1.各種サル類の抗体保有状況の調査とウイルス分離(1)ケニア霊長類センター飼育ザル計59匹(サイクス28匹,ブルーサイクス2匹,グレイマンガバイ6匹,デブラザ4匹,パプーン7匹,コロブス1匹,アフリカミドリザル11匹)より採血し,今迄にアフリカミドリザル5匹からのSIV分離に成功しており,その他のサルについても現在実験中である.(2)ガボン・フランスヴィユ国際医学研究センターにおいてマンドリル5匹,チンパンジー10匹より採血を行ったところ,マンドリル2匹とチンパンジー3匹がSIV,STLVーI陽性であり,マンドリル2匹からウイルスが分離できた.今迄に分離したアフリカミドリザル由来株SIV.ナD2AGM.ニD2の抗原蛋白・遺伝子の解析により, SIV.ナD2AGM.ニD2は今迄に報告されたヒトにおけるHIVー1,HIVー2,アカゲザル由来のSIV.ナD2MAC.ニD2とは異なるウイルス群であり, HIVー1・HIVー2群内で認められている多様性があった.これらのことからHIV/SIV群は種属特異的であって,近年におけるウイルスのサルーヒト間の伝達はなかったものと考えられる.そのことを確認する為に現在SIV.ナD2MND.ニD2の解析を行っており,その他のサル種からのウイルス分離を行っている.特に類人猿のチンパンジーでSIV抗体陽性例がみつかったことは重要な知見で,そのウイルス分離が急がれる.2.ヒトの抗体保有状況の調査とウイルス分離ガーナのAIDS患者を含む計261例の血清のうち, HIVー1抗体陽性例は252例であった.そのうちリンパ球が得られた11例のうちHIVー1抗体陽性の9例からのウイルス分離を行なっている.今迄の調査からガーナ人においてはHIVー2感染者が多いことが判り,またHIVー2の1株を分離してその解析を行なっているが,今回の調査によってそれを裏付け,別のHIVー2株を分離できることを期待している.その解析によりHIVー2群の特性を明らかにできる.また第3のAIDSウイルス分離の可能性もある.AIDSの原因ウイルスであるHIVの起源については,現在アフリカではないかと疑われているが未だ明らかでない.ごく最近により,このHIVと類似のウイルスをアフリカのサルが保有していることが判り,このウイルスがサルからヒトへ伝播したのではないかと疑われている.そこで主としてアフリカにおけるヒト(及びサル)のHIV(及び類似ウイルス)の抗体保有状況を調査してウイルス分離を行い,これらのウイルスの起源を明らかにするとともに,ヒト間,サル間の感染経路を明らかにして,このウイルス侵入に対する防御の方策を考えたい.さらにまだこれらのウイルスに関して調査されていないインド亜大陸におけるヒト及びサルの調査を併せて行う.1.各種サル類の抗体保有状況の調査とウイルス分離(1)ケニア霊長類センター飼育ザル計59匹(サイクス28匹,ブルーサイクス2匹,グレイマンガバイ6匹,デブラザ4匹,パプーン7匹,コロブス1匹,アフリカミドリザル11匹)より採血し,今迄にアフリカミドリザル5匹からのSIV分離に成功しており,その他のサルについても現在実験中である.(2)ガボン・フランスヴィユ国際医学研究センターにおいてマンドリル5匹,チンパンジー10匹より採血を行ったところ,マンドリル2匹とチンパンジー3匹がSIV,STLVーI陽性であり,マンドリル2匹からウイルスが分離できた.今迄に分離したアフリカミドリザル由来株SIV.ナD2AGM.ニD2の抗原蛋白・遺伝子の解析により, SIV.ナD2AGM.ニD2は今迄に報告されたヒトにおけるHIVー1,HIVー2,アカゲザル由来のSIV.ナD2MAC.ニD2とは異なるウイルス群であり, HIVー1・HIVー2群内で認められている多様性があった.これらのことからHIV/SIV群は種属特異的であって,近年におけるウイルスのサルーヒト間の伝達はなかったものと考えられる.そのことを確認する為に現在SIV.ナD2MND.ニD2の解析を行っており,その他のサル種からのウイルス分離を行っている.特に類人猿のチンパンジーでSIV抗体陽性例がみつかったことは重要な知見で,そのウイルス分離が急がれる.2.ヒトの抗体保有状況の調査とウイルス分離ガーナのAIDS患者を含む計261例の血清のうち, HIVー1抗体陽性例は252例であった.そのうちリンパ球が得られた11例のうちHIVー1抗体陽性の9例からのウイルス分離を行なっている.今迄の調査からガーナ人においてはHIVー2感染者が多いことが判り,またHIVー2の1株を分離してその解析を行なっているが,今回の調査によってそれを裏付け,別のHIVー2株を分離できることを期待している.その解析によりHIVー2群の特性を明らかにできる.また第3のAIDSウイルス分離の可能性もある.
H.pylori細胞傷害毒素の精製、性状解析と胃十二指腸疾患発症機作に関する研究

Helicobacter pylori感染と胃十二指腸疾患発症との関連性を調べるために、胃十二指腸疾患患者より本菌の分離を試みた。胃潰瘍、十二指腸潰瘍、萎縮性胃炎患者からの本菌検出率は各々83、85、75%であり、急性表層性胃炎(25%)、粘膜下腫瘍(33%)患者のそれらに比べて高率であった。胃生検材料のウレアーゼテストの培養法に対する感度、特異性、陽性および陰性予知率は各々76、85、91、63%であり、本テストは迅速スクリーニングテストとして有用であることが判明した。定量培養の結果、1生検材料あたり5,000-1,000CFUのH.pyloriが存在するとウレアーゼテストが陽性となることが示唆された。H.pyloriの約半数の菌株は培養細胞の空胞化を引き起こす細胞障害毒素cytotoxin(CT)を産生する。CTは70°Cで易熱性な分子量2万以上の蛋白であることが明らかにされた。50%硫安塩析後、セファクリルS300ゲル濾過、フェニルスーパーロース疎水結合カラム、QセファロースFFおよびモノQ陰イオン交換カラム等によりCTの高度精製を試みたが成功に到らなかった。H.pylori 33菌株のCT産生性を検討した。ウサギ腎(RK13)、ヒト羊膜上皮(FL)、サル腎(Vero)、ハムスター腎(BHK-21)、ヒト子宮癌(HeLa)細胞を指示細胞とした場合のCT検出率は各々73、61、27、27、21%であり、CT検出細胞としてRK-13細胞が優れていることが明らかとなった。H.pylori 15菌株のMKN45、KATO III(いずれもヒト胃癌由来)およびInt-407(ヒト小腸上皮由来)細胞への付着性をフローサイトメーターにより解析した。被検15菌株のMKN45、KATO III、Int-407への平均付着率はそれぞれ76.6、42.7、15.1%であり、H.pyloriは、小腸由来細胞よりも胃上皮由来細胞に対して強い親和性を有し、特にMKN45細胞に対して強い付着性をもつことが示された。CT産生性と付着率の間に有意な相関は認められなかった。東海大学病院内視鏡センター受信患者の胃生検材料を用い、Helicobacter pylori分離率およびウレアーゼテスト陽性率を比較検討した。本菌の分離率は十二指腸潰瘍、胃潰瘍、萎縮性胃炎患者では各々85、83、75%と高率を示したが、粘膜下腫瘍、表層性胃炎患者では33、25%と低率であった。この結果は従来の報告と同様、本菌感染と胃炎および消化性潰瘍発症との関連性を示している。ウレアーゼテストは十二指腸潰瘍、胃潰瘍患者では70、61%の陽性率を示し、菌の分離率を類似した傾向を示した。

ウレアーゼテストの分離培養法に対する陽性予知率は91%と高く、本テストは本菌のスクリーニングに有用な迅速診断法であることが確認された。また1生検材料あたり5×10^3-1×10^4cfu以上の本菌が存在することによりウレアーゼテストが陽性となることが初めて明らかにされた。H.pylori標準株(NCTC11638株)および東海大学で分離された菌株(TK株)計33菌株の細胞傷害毒素(CT)産生性を検討した。ウサギ腎(RK-13)、ヒト羊膜上皮(FL)、サル腎(Vero)、ハムスター腎(BHK-21)、ヒト子宮癌(HeLa)細胞を指示細胞とした場合のCT検出率は各々73、61、27、27、21%であり、CT検出細胞としてRK-13細胞が優れていることが明らかにされた。CTは分子量2万の限外濾過膜を通過しないこと、70°C10分加熱又はプロテアーゼ処理により失活すること等より、本毒素は分子量2万以上の70°Cで易熱性の蛋白であることがわかった。培養濾液を50%硫安塩析後フェニールスーパーロース疎水結合カラム、モノQ陰イオン交換カラムにより分離されたCT陽性画分には86、56、42、30kDaの4種の蛋白が検出され、今後CTの高度精製が必要とされる。Helicobacter pyloriサイトトキシン(CT)産生株TK1029を用いて、大量培養後の培養上清よりCTの精製を試みた。50%硫安塩析後、セファクリルS300ゲル濾過、フェニルスーパーロース疎水結合カラム、QセファロースFFおよびモノQ陰イオン交換カラム等により高力価の精製CTを得ることは、出来なかった。無血清培地の考案、透析膜培養、高力価CT産生菌株の検索等試みてきたが、現在のところ有効な方法が確立されていない。H.pylori15菌株を用いて細胞への付着性をフローサイトメーターにより解析した。被検15菌株のMKN45、KATO III(いずれもヒト胃癌由来)およびInt-407(ヒト小腸上皮由来)への平均付着率はそれぞれ76.6、42.7、15.1%であり、H.pyloriはMKN45細胞に対して最も高い付着性を有することが示された。またH.pyloriは小腸由来細胞よりも胃上皮由来細胞に対して強い親和性を持つことも明らかにされた。fetuinのH.pyloriの付着性に対する抑制効果は全く認められなかった。赤血球凝集(HA)試験の結果、被検55菌株のうちモルモット、ウサギ、ヒトO型、ヒツジ、ニワトリ、ウマ、ウシ赤血球を凝集させる菌株数は各々53(96%)、52(95%)、47(85%)、47(85%)、33(60%)、28(51%)、25(45%)株であった。また平均HA価は、モルモット赤血球を用いた場合2^<5.6>の最高値を示した。15菌株の細胞付着性とHA活性を比較した結果、MKN45細胞への高い付着性を示す菌株のHA活性は高値を示す傾向(ヒツジおよびヒト赤血球)が認められた。一方、毒素産生性と細胞付着性およびHA活性との間に明確な関連性は認められなかった。
温帯から亜寒帯に分布するタイレリア原虫の分子レベルでの比較調査

今年度は韓国・中国・台湾からタイレリア原虫(Theileria sergenti)を採集し解析を行った。解析には以下に述べるDNA型別PCR法を用い原虫の型別を行った。日本各地より分離したT・sergenti分離株の主要表面抗原(P32)遺伝子の塩基配列より設計した特異プライマーを用いたPCR法で、日本各地の分離株はI型、C型およびB型の少くとも3型に分けられることが明らかとなった。本法により日本各地からの分離株15例のうち11例はCとI型の混合感染であった。他の4例はCかI型の単独感染であった。またB型は2株から分離された.このDNA型PCR法を用い東アジアの国々に分布するT・sergentiの型別を行った。韓国からは6地方のウシから37材料ならびに済州島のウシからの10材料の計47材料を得た。2地方の8材料と済州島3材料からはT・sergenti DNAは検出されなかった。残りの36材料からはT・sergentiの感染が確認され、そのDNA型別を行ったところ、地域により差はあるもののI、C、B3型の混合感染しているものが多数認められた。特にI型は全例で認められ日本の分離株に比較しI型が多いことが注目される。中国からはT・sergenti陽性と確認された5株について検討した。その結果1例ではI、C、Bの3型の混合感染であり、他の4例からはC型のみが検出された。台湾からは台北周辺の牧場から得られた22材料と南部の牧場から得られた89材料について検討した。台北周辺の22材料のうち15材料でT・sergenti感染が確認され、そのうち4例がCとB型の混合感染であり他の11例からはC型のみが検出された。南部の89材料はすべてT・sergentiが検出されなかった。この結果、台湾のT・sergentiからはI型は全く検出されなかった。T・sergentiはシベリアのウラジオストックで最初に分離された。そこで今年度ソ連でのタイレリア原虫の分布を知る目的でソ連を訪問し、ロシア科学アカデミーの原虫学者から情報を得た。それによると旧ソ連のカザフスタンやトルクメンスタン等の南部ではT・annulataが分布しており生ワクチンによりコントロールしているとの事である。T・sergentiについては現在研究している研究者はおらず、ほとんど不明であるとの事である。シベリア地区については交通や通信の不便さからT・sergentiが分布していると考えられるがほとんど情報がないとの事である。そこでロシアの研究者によりシベリアを中心にタイレリア原虫を採集してもらい日本で解析する事とした。T・sergentiと抗原的に交差するT・buffeliやT・crientisが南アジアに分布している。そこでイスラエルのkimron獣医研究所の原虫研究者の協力を得てイスラエルに分布するタイレリア原虫を採集した。イスラエルでのタイレリア原虫はT・annulataが主であり、T・buffeliやT・orientalisには注意に払われていない。今回野外材料を採集し、検討したが4株はすべてT・annulataであった。T・annulataにおいてもT・sergentiと同様に株間での抗原性やDNAレベルでの相異が知られている。今後、イスラエルの共同研究者により多くのT・orientalisを採集してもらい解析することとした。今年度、東アジアを中心にT・sergentiを採集し、その遺伝子型別を実施した。その結果、日本と同様に中国・韓国においてもI・C・Bの3型の原虫が検出されている。いっぽう台湾からはI型は全く検出されなかった。各DNA型と病原性については十分なデーターはないが、I型は病原性がもっとも強く次いでC型であり、B型は非病原性である。韓国ではI型が全株に認められT・sergentiによる被害が大きい。逆に台湾ではC型とB型が検出されI型は検出されず、本原虫感染がほとんど問題にされていない事と考え合わせると興味深い。

その結果1例ではI、C、Bの3型の混合感染であり、他の4例からはC型のみが検出された。台湾からは台北周辺の牧場から得られた22材料と南部の牧場から得られた89材料について検討した。台北周辺の22材料のうち15材料でT・sergenti感染が確認され、そのうち4例がCとB型の混合感染であり他の11例からはC型のみが検出された。南部の89材料はすべてT・sergentiが検出されなかった。この結果、台湾のT・sergentiからはI型は全く検出されなかった。T・sergentiはシベリアのウラジオストックで最初に分離された。そこで今年度ソ連でのタイレリア原虫の分布を知る目的でソ連を訪問し、ロシア科学アカデミーの原虫学者から情報を得た。それによると旧ソ連のカザフスタンやトルクメンスタン等の南部ではT・annulataが分布しており生ワクチンによりコントロールしているとの事である。T・sergentiについては現在研究している研究者はおらず、ほとんど不明であるとの事である。シベリア地区については交通や通信の不便さからT・sergentiが分布していると考えられるがほとんど情報がないとの事である。そこでロシアの研究者によりシベリアを中心にタイレリア原虫を採集してもらい日本で解析する事とした。T・sergentiと抗原的に交差するT・buffeliやT・crientisが南アジアに分布している。そこでイスラエルのkimron獣医研究所の原虫研究者の協力を得てイスラエルに分布するタイレリア原虫を採集した。イスラエルでのタイレリア原虫はT・annulataが主であり、T・buffeliやT・orientalisには注意に払われていない。今回野外材料を採集し、検討したが4株はすべてT・annulataであった。T・annulataにおいてもT・sergentiと同様に株間での抗原性やDNAレベルでの相異が知られている。今後、イスラエルの共同研究者により多くのT・orientalisを採集してもらい解析することとした。今年度、東アジアを中心にT・sergentiを採集し、その遺伝子型別を実施した。その結果、日本と同様に中国・韓国においてもI・C・Bの3型の原虫が検出されている。いっぽう台湾からはI型は全く検出されなかった。各DNA型と病原性については十分なデーターはないが、I型は病原性がもっとも強く次いでC型であり、B型は非病原性である。韓国ではI型が全株に認められT・sergentiによる被害が大きい。逆に台湾ではC型とB型が検出されI型は検出されず、本原虫感染がほとんど問題にされていない事と考え合わせると興味深い。韓国からは5株採集した。このうち済州島、全羅北道(全州)、忠清南道(唐津)からの3株は原虫材料が十分にあり解析に用いた。中国については2株採集したが1株は寄生率が低く、甘粛省の1株しか解析できなかった。韓国の3株と中国の1株を日本の株と抗原性ならびにDNAレベルで比較を行った。その結果以下の事が明らかになった。2)二次元電気泳動像では32KDaタンパク質(p32)を中心に周囲のスポットのパターンが日本の株間でも相違が認められるが、韓国と中国株では日本株間の相違以上の差異が認められた。
非線形拡散方程式における進行波と界面ダイナミクスの研究

非線形の拡散現象を記述する放物型方程式に関して、進行波と界面のダイナミクスについて研究を行った。非線形系の拡散現象は、物理学、化学、生物学、さらに近年は金融工学上のモデル等、多くの分野で現れる。それらの中には、急激な状態変化が狭い領域に集中する界面と呼ばれる局在構造が出現して、この界面の示す振る舞いを理解することが非線形現象を解明する上での鍵になることが数多くある。単独、あるいは連立の非線形拡散方程式で記述される拡散現象では、界面の動力学を支配する方程式が、形式的な漸近展開によって、空間内の曲面の発展方程式として導かれている。これらの曲面の発展方程式は、微分幾何学的には広い意味で平均曲率流方程式と呼ばれるものとなる。拡散現象が単独方程式で記述されている場合には、導出の数学的正当化がすでに多くの研究者の努力の結果、ほぼ満足のいく形で成功している。しかしながら、この種の`数学上の良い構造'を持たない一般の連立系に関しては数学的正当化は得られていない。本研究では、進行波のダイナミクスについては、FitzHugh-南雲方程式、あるいは、類似の方程式の進行波の衝突消滅を数学的に厳密に示すことを目指している。また、界面のダイナミクスについて、比較定理や変分構造を有さない一般の連立系に対して、界面のダイナミクスの縮約系として平均曲率流が現れることを数学的に厳密に示すことを目指している。一方、進行波や曲線の状態達の住む空間は、無限次元の空間と捉えることが自然である。そのような無限次元の空間を研究することは基礎的な問題である。そのような無限次元の空間は深い構造を持っていることが近年、明らかになってきたのだが、その構造の解析は容易でないことも分かってきた。そこで、当該年度は、有限次元の同種の構造を持った空間についての考察を行った。当初の研究計画からの多少の相違はあるが、全体としては、新たな予想が得られるなどの進展を得ている。有限次元の空間においても非自明な問題があることが分かってきたので、今後は、まずは、有限次元の場合についての詳細な解析を与えることを目指す。順次、無限次元については、どうなるか、などについても考えていきたい。非線形の拡散現象を記述する放物型方程式に関して、界面と進行波のダイナミクスについて研究を行った。この研究では、界面のダイナミクスについては、比較定理や変分構造を有さない一般の連立系に対して、界面ダイナミクスの縮約系として平均曲率流が現れることを数学的に厳密に示すことを目指している。また、進行波のダイナミクスについて、FitzHugh-南雲方程式、あるいは、類似の方程式の進行波の衝突消滅を数学的に厳密に示すことを目指している。それらの中には、急激な状態変化が狭い領域に集中する界面と呼ばれる局在構造が現れて、この界面の示す振る舞いを理解することが非線形現象を解明する上での鍵になることが数多くある。これらの方程式は、微分幾何学的には広い意味で平均曲率流方程式と呼ばれるものとなる。当該年度は特に、良い数理構造を必ずしも持たない一般の連立系に関し界面運動の支配方程式として、平均曲率流方程式の数学的導出に関するスペクトルの研究を行った。良い数理構造を必ずしも持たない一般の連立系に関して界面運動の支配方程式として、平均曲率流方程式の数学的な導出について研究をし、線形化作用素のスペクトルについての具体的な情報を引き出すための目ぼしい手法の開発に目途が立った。

そのような無限次元の空間を研究することは基礎的な問題である。当該年度は特に、そのような無限次元の空間について研究を行い、その結果として、深い構造を持った空間が、実は、有り触れた存在として、多数、存在するであろうことを予想ができた。当初の研究計画からの多少の相違はあるが、全体としては、新たな予想が得られるなどの進展を見ている。非線形の拡散現象を記述する放物型方程式に関して、進行波と界面のダイナミクスについて研究を行った。非線形系の拡散現象は、物理学、化学、生物学、さらに近年は金融工学上のモデル等、多くの分野で現れる。それらの中には、急激な状態変化が狭い領域に集中する界面と呼ばれる局在構造が出現して、この界面の示す振る舞いを理解することが非線形現象を解明する上での鍵になることが数多くある。単独、あるいは連立の非線形拡散方程式で記述される拡散現象では、界面の動力学を支配する方程式が、形式的な漸近展開によって、空間内の曲面の発展方程式として導かれている。これらの曲面の発展方程式は、微分幾何学的には広い意味で平均曲率流方程式と呼ばれるものとなる。拡散現象が単独方程式で記述されている場合には、導出の数学的正当化がすでに多くの研究者の努力の結果、ほぼ満足のいく形で成功している。しかしながら、この種の`数学上の良い構造'を持たない一般の連立系に関しては数学的正当化は得られていない。本研究では、進行波のダイナミクスについては、FitzHugh-南雲方程式、あるいは、類似の方程式の進行波の衝突消滅を数学的に厳密に示すことを目指している。また、界面のダイナミクスについて、比較定理や変分構造を有さない一般の連立系に対して、界面のダイナミクスの縮約系として平均曲率流が現れることを数学的に厳密に示すことを目指している。一方、進行波や曲線の状態達の住む空間は、無限次元の空間と捉えることが自然である。そのような無限次元の空間は深い構造を持っていることが近年、明らかになってきたのだが、その構造の解析は容易でないことも分かってきた。そこで、当該年度は、有限次元の同種の構造を持った空間についての考察を行った。当初の研究計画からの多少の相違はあるが、全体としては、新たな予想が得られるなどの進展を得ている。良い数理構造を必ずしも持たない一般の連立系に関して界面運動の支配方程式として、平均曲率流方程式の数学的な導出について研究をし、線形化作用素のスペクトルについての具体的情報を引き出し、それを元に実際に数学的正当化へと繋げる。新たな予想が得られたので、今後は、この予想の妥当性の程度を明らかにするなどの方向性を追求したい。有限次元の空間においても非自明な問題があることが分かってきたので、今後は、まずは、有限次元の場合についての詳細な解析を与えることを目指す。順次、無限次元については、どうなるか、などについても考えていきたい。
アナモックス反応と脱窒反応の共存による畜産廃水処理の研究

畜舎廃水の浄化処理において窒素除去の向上を図るために、硝酸還元・アナモックス反応による窒素除去を検討した。当該反応への電子供与体として、無機系電子供与体では水素が適することが明らかとなった。また、農業現場由来電子供与体として、イナワラ、オガクズ、モミガラを比較した結果、モミガラが効果的に利用できる可能性が示された。しかし、モミガラを用いて回分式リアクターの連続運転試験を行った結果は期待した効果が得られず、当該資材の利用には、リアクター形状や添加量などの検討が今後必要と考えられた。畜舎廃水の浄化処理において窒素除去の向上を図るために、硝酸還元反応およびアナモックス反応による窒素除去を検討し、硝酸還元反応のための電子供与体として、農業現場由来電子供与体の利用を試みる。本年度は、畜産、特に酪農現場で入手しやすいイナワラの利用を検討した。イナワラは、均一にするために粉砕し、0.4ー1.7 mmのサイズになったものを利用した。物理組成はDM 88 %、灰分15 %、C 41 (乾物中)%、N 0.5 (乾物中)%であった。また畜産排水の活性汚泥を植種汚泥としてイナワラのBODを測定したところ、110 mg/gであり、酢酸のBOD値が660 mg/gであったことから、比較的高い値であると言える。硝酸還元・アナモックス活性を持つ汚泥を供試汚泥とし、供試汚泥および硝酸・アンモニアを含む畜産排水の活性汚泥処理水にイナワラを加え、1ヶ月間培養した後、アナモックス活性を測定した。イナワラ無添加の系をコントロールとして比較をおこなった。培養中の硝酸の減少は、イナワラ添加区においてコントロール区の6倍の値が確認されたが、アンモニアの減少については差が見られなかった。また、イナワラ添加区においてはpHの4.8までの低下が観察された。培養の前後において、コントロールではアナモックス活性が約2倍に増加したが、イナワラ添加条件においてはアナモックス活性の消失が見られた。この理由として、イナワラは、比較的基質あたりのBODが高く、無酸素状態で酸発酵がおこり、それに伴うpHの急激な低下によりアナモックス菌が死滅したと考えられた。イナワラの利用においては、添加量の厳密な制御が必要であると予測され、硝酸還元のための電子供与体としての利用は困難であると考えられた。畜舎廃水の浄化処理において窒素除去の向上を図るために、硝酸還元反応およびアナモックス反応による窒素除去を検討する。本研究ではまず、既往研究により硝酸還元反応のための電子供与体として利用可能であることが示されている、無機系電子供与体の水素および鉄の、アンモニア・亜硝酸存在下でのアナモックス反応に対する影響について検討した。畜舎廃水処理施設の活性汚泥を種汚泥とし、硝酸還元・アナモックス活性を持つ汚泥を供試汚泥とした。水素および鉄の存在下でのアナモックス活性を、安定同位体を用いたバッチ培養試験により測定し、同時に測定した無添加のコントロール条件での活性に対する比率で評価した。水素の添加はアナモックス反応への阻害効果が無かったが、鉄の存在はアナモックス活性の低下をもたらした。アナモックス活性への阻害効果が見られなかったことから硝酸還元・アナモックス反応の共存を可能とする電子供与体として水素が有望であると考えられたが、畜産現場における水素の取り扱いについてはさらなる検討を要する。次いで、硝酸還元反応のための電子供与体として、農業現場由来電子供与体であり強固な微生物保持担体になり得るおがくずを用いることを試みた。供試汚泥および硝酸・アンモニアを含む畜産排水の活性汚泥処理水におがくずを加え、1ヶ月間培養した後、アナモックス活性を測定した。おがくず無添加の系をコントロールとして比較をおこなった。培養の前後において、コントロールではアナモックス活性が約2倍に増加したが、おがくず添加条件においてはアナモックス活性の増加は見られず、何らかの阻害因子が存在すると考えられた。畜舎廃水の浄化処理において窒素除去の向上を図るために、硝酸還元・アナモックス反応による窒素除去を検討し、硝酸還元反応に必要な電子供与体として、農業現場由来電子供与体の利用を試みる。本年度は、モミガラの利用を検討した。硝酸還元・アナモックス活性を持つ汚泥を供試汚泥とし、供試汚泥および硝酸・アンモニアを含む畜産排水の活性汚泥処理水にモミガラを加え、培養瓶を用い、随時汚水を交換しながら無酸素条件で1ヶ月間培養した後、アナモックス活性を測定した。モミガラ無添加の系をコントロールとして比較をおこなった。培養後、モミガラ添加条件においてはコントロール区の約1.8倍の活性が見られ、モミガラは硝酸還元・アナモックス反応に効果的に利用できる可能性が示された。そこで、モミガラを用いた連続培養試験を試みた。

有効容積200 mLのリアクターに、硝酸およびアンモニア含有畜産排水の活性汚泥処理水を流入させ、HRT1日、無酸素条件下で運転した。脱窒活性およびアナモックス活性を保持する種汚泥として添加し、同構成の2台のリアクターを同時に運転し、運転開始2週間後に一方にモミガラ50mLを添加した。運転期間中の窒素成分の変化およびアナモックス活性の変化を調べた。その結果、モミガラ添加以前の15日間の培養では、アナモックス活性は培養前の約二倍にまで増加した。しかし、その後一方にモミガラを添加し約45日間培養を行った結果、リアクター中MLVSS濃度が低下し、処理水中の亜硝酸濃度が上昇し、汚泥中アナモックス活性は低下した。モミガラの添加により、汚泥の細分化が起こり流出し、また同時に従属栄養細菌の増加により汚泥あたりのアナモックス活性も低下したと考えられた。モミガラの添加量およびリアクターの形状について今後検討する必要がある。畜産環境イナワラの基本的物性およびBODポテンシャルを明らかにし、硝酸還元・アナモックス反応における電子供与体としての効果を検討したが、当該反応での窒素除去に対する期待した結果は得られなかった。イナワラは単位重量あたりのBODが高すぎることから制御が困難であり、他の電子供与体を検討した方が良いと考えられた。無機系電子供与体のアナモックス反応への効果をまず確認する必要があると考えたため、そちらを先に取り組み、農業現場由来電子供与体についての検討の達成は十分ではなかった。しかし、無機系電子供与体については十分なデータが得られ、成果を公表することができた。本年度とは異なる農業現場由来電子供与体の影響をバッチ培養で検討を行う。基本的物性およびBODポテンシャルを確認した後、硝酸還元・アナモックス反応における影響を検討する。さらに見いだされた条件を用いて連続処理装置の運転を試みる。前年度十分に検討できなかった農業現場由来電子供与体の影響をバッチ培養で検討を行うとともに、見いだされた条件を用いて連続処理装置を運転する。次年度使用額の251,306円は、前年度研究費を効率的に使用して発生した残額であり、今年度に請求する研究費と合わせて研究計画遂行のために使用する。バッチ培養試験用の試薬、消耗品を購入する。連続処理装置の作成を行う。連続処理装置の作成をおこなう。次年度使用額の256,435円は、前年度研究費を効率的に使用して発生した残額であり、今年度に請求する研究費と合わせて研究計画遂行のために使用する。
網膜色素上皮細胞における貧食機構の解析

網膜色素上皮細胞(RPE)における貧食の初期過程をライソゾーム酵素を用いて免疫電顕的に、また貧食胞内腔の酸性化とライソゾームとの融合との関係をDAMP法を用いて検討した。貧食胞内腔の酸性化は、ライソゾームとの融合により液胞型H^+-ATPase(V-ATPase)が貧食胞膜に供給されることによると考えられる。そこでV-ATPaseの特異的阻害薬であるバフィロマイシンA_1を眼内に注入し、外節の貧食、消化過程にどのような影響が与えられるかを検討した。1.明期開始直後のRPEには、カテプシンDを含まない貧食胞とカテプシンDを含むライソゾームが融合している像が多く観察された。カテプシンDは、ごく初期の貧食胞には検出されないが、消化過程にある貧食胞には多数検出され、カテプシンDの増加に伴い、オプシンの反応が低下していく過程が観察された。2.ライソゾーム膜蛋白であるLGP107は、貧食胞膜に検出されたが、plasma membraneには検出されなかった。3.カテプシンDとDAMPの二重染色により、ライソゾーム融合後、貧食胞内腔のpHが著しく低下することが示された。4.バフィロマイシンA_1の硝子体内注入により、貧食胞内のpHが上昇し、貧食胞内の消化過程が顕著に抑制され、分解のほとんどみられない外節をふくむ貧食胞がRPE内に多数蓄積した。内容物の分解が進行していないことは、オプシンが貧食胞内に多数検出されることにより確認された。蓄積した貧食胞内には、カテプシンDが検出されたことから貧食胞とライソゾーム間の融合は、バフィロマイシンA_1存在下でも正常に行われていると思われた。又、注入後3-4時間でコントロールとの差が消失し、バフィロマイシンA_1の効果は、可逆的であった。
日本語学習者を対象とする文語文e-learning教材および文語文教授法の開発

1.試作版e-learning教材を科研メンバーの担当する古典入門の授業や古典を用いた文学の授業で試用し、開発教材をどのように授業に取り入れて活用することが有効かについて検討し、学習者に文語文を指導する授業のシラバス、教授法の開発を試みた。また、国内外の高等教育機関で文語文を学んでいる中・上級日本語学習者に依頼して教材を試用してもらった。2.前年度に実施した教材に関するアンケート調査の質問項目を柱として、上記1の授業の受講者を中心とする教材試用者にインタビュー調査を行った。素材セクションについては、1本文、2問題、3現代語訳のページごとに感想・提案を求め、参照セクションについても、項目ごとに意見を求めた。一部の試用者からは授業の期末レポートの形で試用結果についての詳細な報告を受けた。アンケート調査のみでは得られなかった細部についての有益なコメントを得ることができた。3.上記1の授業実践から得られた知見、上記2の調査結果をふまえて、本文ページの作り方を中心に既に作成した試作版教材(9課分、1課分は今後改編の予定)を改善するとともに、新たに8課分の教材(『伊勢物語』、『今昔物語集』、『平家物語』、『一寸法師』による)を作成し、プラットフォームに載せた。全体として作品のジャンル、文体、時代に関してヴァラエティに富む構成となるように配慮した。同時に、参照セクションについて、文法解説を補い、語彙リストを拡充した。4.試作版開発教材およびその試用結果に関する研究成果を関連の学会(第31回日本語教育連絡会議、9月7日、於プーラ大学(クロアチア)、第42回国際日本文学研究集会、11月18日、於国文学研究資料館)にて発表し、教材について国内外の関係者に広く周知し、教材開発や教授法についての意見や要望を収集した。また、文語文教育についての公開セミナーを開催した(8月9日、於東北大学)。平成30年度の研究計画としては、当初、1)教材の素材セクションの増設および参照セクションの拡充、2)サイトの一般公開、3)授業での教材試用と教材試用者からの意見集約による教授法開発、4)研究成果の国内外での公表を考えていた。このうち3)、4)については、ほぼ計画どおりに遂行することができた。3)については、インタビュー調査を実施し、また海外大学での試用結果についてのレポートも入手して、前年度のアンケート調査では得られなかった詳細かつ有益な情報を得て教材改善に活用することができた。一方、1)については、前年度までに作成した素材セクション10課分のうち1課の改編を含め、11課分を作成して20課とする予定であったが、既に作成した分の本文ページの改善や語彙リストの改訂に時間と労力をとられたため、新たに作成できたのは8課分であった。また、各課の問題ページの内容をプラットフォームに掲載できないという問題が生じており、最初に作成した5課分を除き、各課のテストについては未掲載である。素材セクションを増設した範囲での参照セクションの拡充については、文法解説と語彙リストの拡充は予定どおり行なうことができたが、資料集、作品解説などの拡充は今後の課題とせざるを得なかった。また、以上のように教材開発の遅れとプラットフォームの問題が生じていることから、2)のサイトの一般公開については、最終年度に持ち越しとなった。1.引き続き教材作成を行う。素材セクションについて、シリーズ1(全15課)およびシリーズ2の5課分を作成することを目標とし、現在できている17課分をさらに改善しつつ、残りの3課分(正岡子規『はて知らずの記』を予定)を作成する。問題(テスト)ページについては、プラットフォームの問題が解決されなければ、PDFファイルで問題を掲載することを検討する。参照セクションについては、文法解説および語彙リストのページをさらに充実させ、作品解説を付け、コラムを増設する。予定していた資料集の拡充については、予算と時間の関係で本研究の期間中には行なわない。教材全体の必要な部分に英語訳等外国語訳を付ける。2.教材の素材セクションの20課まで完成し、参照セクションの各ページも整った時点で、サイトを公開し、広く文語文学習あるいは文語文教育に関心を持つ国内外の学習者や日本語教師の利用に供する。ただし、サイトの管理が難しいことが予測されるため、国内外の関連学会等のMLを通じて利用者を募る形で公開する。3.本研究で開発した教授法、考案した学習法にもとづき、本教材を利用する日本語教師や日本語学習者(独習者)のガイドとなる手引き(教材の使い方の説明)を作成し、サイトに載せる。また、作成したガイドについて、英語版等外国語版も作成し、利用者の便宜を図る。4.日本語文語文学習や古典学習に関する関連サイトの制作者と連絡をとり、許可が得られればリンクを張り、本教材のサイトを文語文指導、文語文学習のベースとして使用できるようにして、利用者の便宜を図る。5.文語文e-learning教材開発および教授法開発についての研究成果を関連学会の大会、学術誌上で発表するとともに、研究成果の報告会を兼ねてパネルディスカッションもしくはセミナーを公開で開催し、本科研での研究成果を一般市民にも広く知らせる機会を設ける。1.既に作成した試作版e-learning教材(5課分)を科研メンバーの担当する古典入門の授業や古典を用いた文学の授業で試用し、開発教材をどのように授業に取り入れて活用するかについて検討した。また、受講者を中心とする中・上級日本語学習者に教材を試用してもらった。2.教材試用に関して、上記1の授業の受講者を中心に紙媒体およびウェブによるアンケート調査を行った。

素材セクションについては、1本文、2問題、3現代語訳のページごとに感想・提案の記述を求めるとともに、問題(小テスト)の難易度、取り上げてほしい素材について質問した。参照セクションについても項目ごとに記述を求めた。教材全体については、よい点、改善を要する点を記入してもらった。3.中・上級の外国人留学生を対象に、従来の古典入門の授業に加えて、古文入門の授業を新たに開講し、学習者に古典文法の基礎を教えるシラバス、教授法の開発を試みた。4.上記2の調査結果から得られた指針および3の授業実践から得られた知見にもとづき、既存の試作版教材を改善するとともに、新たに5課分の教材(『徒然草』、『一寸法師』、正岡子規『はて知らずの記』による)を作成した。全体として作品のジャンル、文体、時代に関してヴァラエティに富む構成となるように配慮した。同時に、参照セクションの文法解説を補い、語彙リストを拡充した。5.試作版開発教材およびその試用結果に関する研究成果を関連学会(2017年度日本語教育と日本学研究国際シンポジウム、5月13日、於同済大学、2017EAJS、9月2日、於Universidade Nova de Lisboa、日本文学協会第72回大会、於相模女子大学)にて発表し、教材について国内外の関係者に広く周知し、教材や教授法についての意見や要望を収集した。平成29年度の研究計画としては、当初、1)既存の試作版教材の試用、2)試作版教材についてのアンケート調査、3)試作版教材についてのインタビュー調査、4)調査結果を反映した教材の改善および増設、5)研究成果の国内外での公表を考えていた。このうち1)、2)、4)、5)については、ほぼ計画どおりに遂行することができた。3)のインタビュー調査は、2)のアンケート調査の結果から必要な情報が得られたと判断し、実施しなかった。その代りに、これまで実施していた外国人留学生向けの「古典入門」の授業に加えて、新しく「古文入門」の授業を開講し、日本語学習者を対象に文語文法の基礎を教授するシラバスおよび教授法の開発を試みた。この教育実践を通じて、開発教材の参照セクションにある文法解説ページを拡充していく上での様々なヒントが得られた。1.試作版e-learning教材を科研メンバーの担当する古典入門の授業や古典を用いた文学の授業で試用し、開発教材をどのように授業に取り入れて活用することが有効かについて検討し、学習者に文語文を指導する授業のシラバス、教授法の開発を試みた。また、国内外の高等教育機関で文語文を学んでいる中・上級日本語学習者に依頼して教材を試用してもらった。2.前年度に実施した教材に関するアンケート調査の質問項目を柱として、上記1の授業の受講者を中心とする教材試用者にインタビュー調査を行った。素材セクションについては、1本文、2問題、3現代語訳のページごとに感想・提案を求め、参照セクションについても、項目ごとに意見を求めた。一部の試用者からは授業の期末レポートの形で試用結果についての詳細な報告を受けた。アンケート調査のみでは得られなかった細部についての有益なコメントを得ることができた。