hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
神経細胞構能における脂質性情報伝達機構の多様性の意義

1)抗体の作成:各々のDGKアイソザイムに特異的な領域を選択しグルタチオンSトランスフェラーゼ(GST)との融合蛋白質として大腸菌にて大量培養発現を行った。グルタチオンカラムによる精製後、家兎に免疫を行い現在血清から抗体を精製中である。2)細胞内局在の変化の検討:抗体作成の成功したDGKzetaに関して、その機能的役割を検討する目的で、発達課程および脳虚血状態における局在を精査した。DGKzetaの免疫反応は、大脳皮質、海馬、および小脳の大部分の神経細胞内において核内に局在するが、生後14日齢の小脳プルキンエ細胞においては、核内には認められず、細胞質にのみ検出された。また一過性脳虚血モデルを用いた実験では、虚血に脆弱性を示す海馬CA1錐体細胞においてのみ、核から細胞質への迅速なDGKzetaの移行が認められることを見い出した。これらの所見は、DGKzetaが種々の条件下において、核と細胞質間を移行する可能性を示し、このアイソザイムの機能解析を行う重要なヒントになると考えられる。さらに脳スライスを用いた追試実験の平行して行っている。ジアシルグリセロールキナーゼ(DGK)は、プロテインキナーゼCの生理的活性化因子であるジアシルグリセロール(DG)をリン酸化する酵素である。我々はこれまでに数種類のDGKアイソザイムをクローニングし、これらアイソザイムが中枢神経系や呼吸器などで多様な発現様式を示すことを、また核移行シグナルを有するゼータ型DGK(DGKζ)は特異抗体を用いた免疫組織染色により正常ラット大脳皮質や海馬の神経細胞の核内に強く発現することを報告してきた。今回我々は脳梗塞モデルにおいて、神経細胞及びその他の細胞におけるDGKζの発現を検討した。成体ラットの左中大脳動脈を90分間閉塞し、直ちに固定(post operation day 0; Po0)、あるいは再灌流後7日目(Po7)に固定した脳組織を使用した。固定操作は前灌流なしにPLP液にて固定後、組織を摘出し同固定液で浸漬固定した。40μm厚の凍結切片に対して、ウサギ抗DGKζ抗体及び食作用をもつ細胞のマーカーであるED1マウス単クローン抗体を用いて免疫組織化学法を行った。Po0において、非閉塞側では正常と同様に大脳皮質全層の神経細胞の核内にDGKζ免疫反応が認められたが、閉塞側では組織学的に明らかな梗塞巣は形成されていないにもかかわらず、左中大脳動脈支配の大脳皮質領域では神経細胞のDGKζ免疫反応性は全体的に減弱していた。Po7では閉塞側の大脳皮質に広範な梗塞巣が形成され、この部位では変性神経細胞におけるDGKζ免疫陽性反応は消失していたが、新たに血管周囲の小型の細胞に免疫反応が認められた。penumbra領域では比較的大型の細胞に強いDGKζ免疫陽性反応が検出され、ED1抗体との二重染色の結果、多くのDGKζ免疫陽性細胞はED1免疫陽性を示したが、ED1陰性のDGKζ陽性細胞も存在していた。さらに共焦点レーザー顕微鏡を用いて観察を行うと、DGKζ免疫反応はED1陽性のリソソームに局在していることが示された。以上の結果より、神経細胞核内のDGKζ免疫反応は、虚血後早期から減弱することが明らかとなった。このことは、大脳皮質の神経細胞においてDGKζが虚血に対し、光学顕微鏡的な細胞死の変化に先駆けて発現低下をおこすことを示唆する。また、penumbra領域でのED1免疫陽性細胞のリソソームにおけるDGKζの発現は、DGKζが活発な細胞内消化機構に関与することを示唆する。我々は、神経情報伝達機構における脂質性二次伝達物質ジアシルグリセロールのリン酸化酵素DGキナーゼ(DGK)に注目し、ラットから5種のDGKアイソザイム(α,-β,-γ,-ζ,-ι)を単離し、その分子多様性を明らかにしてきた。
論理式による実数の近似表現を用いた数値データからの機械学習手法

大量データに潜む有用な知識を効率的に発見する手法(知識発見手法)の重要性が増す今日において,離散データと連続データが混在したデータからの知識発見手法の基盤を構築することが本研究の目標である.実数値データの計算論的な性質と機械学習の関係について解明することにより,実数値データからの知識発見と離散データからの知識発見と統一的な形で与えるこを目標としてきた.昨年度の成果として,実数を,近似値と誤差が測定の繰返しによって精度が増すデータと捉え,機械学習の対象を「関数」よりも一般的な「図形(数学的には閉集合)」に設定することとした.さらに,近似値と誤差を有理数を端点とする閉区間で表現し,さらにそれを論理項で表することにより,図形の近似表現を論理式で表現すした上で,学習対象とその近似表現の間の距離を導入し,学習のアルゴリズムと評価に用いるという基本的な成果を得た.この成果を発展させ,計算論的学習理論でしばしば行われるような,学習可能性の階層分析を行って論文としてまとめた上で,国際会議および国内会議での発表を行った.さらに,この理論を少し変形させると,統計学における仮説検定の代替手法として機能することに気づき,萌芽的な理論をまとめた.一方で,図形に制限しない一般的な対象め族に位相を導入して,計算論的学習の手法を位相の面から分析する研究を進展させ,Σ0α許容表現という表現クラスが,計算可能性解析学と密接に関係することを明らかにし,論文としてまとめて国際会議および国内会議での発表を行った.本研究は,京都大学・人間・環境学研究科立木秀樹准教授,北九州大学・基盤教育センター・廣渡栄寿教授を連携研究者として,京都大学・情報学研究科・博士後期課程Matthew de Brecht君,杉山麿人君を研究協力者として遂行した.本研究の目的は,論理式を用いた計算論的機械学習システムを利用し,グレイコードに基く実数値と実数値関数の論理式表現を用いて,実数値データから機械学習方式を実装するとともに,その理論的な裏付けを行う.実数値データからの機械学習に対しては,統計学からアプローチが主であったが,本研究は計算論的学習からアプローチにより形式言語等の学習との接点を見出す.さらに機械学習を通じて,構成的な実解析学に対して新たな理論展開を探る.本年度は,機械学習システムとして,論理式を用いた計算論的学習において既に開発されているモデル推論システム(MIS)を利用してプロトタイプシステムを稼動可能とした.グレイコードを用いると,実数の近似値と誤差からなる組を一つの論理項で表現することが可能であるが,現実の「連続値データ」とは無限桁の小数ではなく,実験・観測によって得られる近似値と誤差の組であり,それは実験・観測が繰り返されることにより精度が増す.そこで,MISが用いている演繹的推論を「公理を,演繹したい定理に向かって精密にする」という行為と捉えた上で,精度の増加を演繹的推論に還元している.また,精密化と機械学習の関係について分析を進めた。MISは精密化を利用しているが,基礎としている機械学習のモデルが質問を許す学習であるが,実際の実数値データからの機械学習は正データまたは正負データからの一方向的な学習である.そこで,正データからの学習が可能であるために十分であるような精密化のもつ条件を,領域にによらない一般的な手続きを構成することで示した.この結果に基いて,上述のプロトタイプシステムを質問学習から一方向的な学習へ変更することを検討する.本研究の目的は,論理式を用いた計算論的機械学習システムを利用し,グレイコードに基く実数値と実数値関数の論理式表現を用いて,実数値データから機械学習方式を実装するとともに,その理論的な裏付けを行う.実数値データからの機械学習に対しては,統計学からアプローチが主であったが,本研究は計算論的学習からアプローチにより形式言語等の学習との接点を見出す.さらに機械学習を通じて,構成的な実解析学に対して新たな理論展開を探る.[連携研究者]京都大学・人間・環境学研究科・准教授立木秀樹北九州大学・基盤教育センター・准教授廣渡栄寿昨年度考察した機械学習の手法は次の通りである:実数の近似値と誤差からなる組を論理項で表現し,それを用いて学習対象の関数の近似である公理(仮説)を演繹したい定理に向かって精密にする.本年度はこの手法を詳細に検討し,以下の設定のもとで基礎理論の構築を行った.1.実数を,測定原理,すなわち近似値と誤差が測定の繰返しによって精度が増すデータと捉える.2.機械学習の対象を「関数」よりも一般的な「図形(数学的には閉集合)」に設定する.3.近似値と誤差を有理数を端点とする閉区間で表現し,さらにそれを論理項で表現する.4.図形の近似表現をフラクタルアトラクターとし,さらに論理式で表現する.5.学習対象とその近似表現の間の距離を導入し,学習のアルゴリズムと評価に用いる.この設定のもとで,自然数の帰納的関数の計算論的学習において提唱されている基本的な学習手続きと対照させながら,図形の学習手続きを構成し,分析を行った.一方で,図形に制限しない一般的な対象の族に位相を導入して,計算論的学習の手法を位相の面から分析する研究も行った.大量データに潜む有用な知識を効率的に発見する手法(知識発見手法)の重要性が増す今日において,離散データと連続データが混在したデータからの知識発見手法の基盤を構築することが本研究の目標である.

実数値データの計算論的な性質と機械学習の関係について解明することにより,実数値データからの知識発見と離散データからの知識発見と統一的な形で与えるこを目標としてきた.昨年度の成果として,実数を,近似値と誤差が測定の繰返しによって精度が増すデータと捉え,機械学習の対象を「関数」よりも一般的な「図形(数学的には閉集合)」に設定することとした.さらに,近似値と誤差を有理数を端点とする閉区間で表現し,さらにそれを論理項で表することにより,図形の近似表現を論理式で表現すした上で,学習対象とその近似表現の間の距離を導入し,学習のアルゴリズムと評価に用いるという基本的な成果を得た.この成果を発展させ,計算論的学習理論でしばしば行われるような,学習可能性の階層分析を行って論文としてまとめた上で,国際会議および国内会議での発表を行った.さらに,この理論を少し変形させると,統計学における仮説検定の代替手法として機能することに気づき,萌芽的な理論をまとめた.一方で,図形に制限しない一般的な対象め族に位相を導入して,計算論的学習の手法を位相の面から分析する研究を進展させ,Σ0α許容表現という表現クラスが,計算可能性解析学と密接に関係することを明らかにし,論文としてまとめて国際会議および国内会議での発表を行った.本研究は,京都大学・人間・環境学研究科立木秀樹准教授,北九州大学・基盤教育センター・廣渡栄寿教授を連携研究者として,京都大学・情報学研究科・博士後期課程Matthew de Brecht君,杉山麿人君を研究協力者として遂行した.
製造ばらつきを利用したCMOSセンサ回路の低消費電力設計に関する研究

本研究は、微細トランジスタ間に発生する特性ばらつきを積極的に利用した新たな回路設計方法を確立する。提案技術はデバイス間の特性ばらつきをオンチップのセンシング技術及び再構成により最適なデバイス組を動的に接続技術の2つから成り立つものである。提案手法の応用として(1)基準電圧生成回路、(2)温度センサ回路、及び(3)アナログーディジタル変換回路の3種類の回路を設計し、実シリコンの評価により最適な設計手法を明らかにする。
末端酸化酵素の基質酸化特異性とプロトン輸送能の研究

bo_3型シトクロムオキシダーゼこの酵素はヘムBとOのほか少量のヘムAを含みこの菌のシトクロムc-551を高い親和性で速く酸化することができるので(Km=0.2uM,Vmax=190s^<-1>)、この酵素は2つのサブユニット(56と20kDa)からなるが、その一次構造から見ても、グラム陰性非プロテオバクテリアのThermus thermophilusのba_3型酸化酵素と類似している。これら2つのb(o/a)_3型酸化酵素のサブユニットIIには、古細菌Sulfolobus acidocaldariusで同定されたSoxABCDキノール酸化酵素のそれとともに膜貫通a-ヘリックスが1本しかない(他のほとんどのヘム銅オキシダーゼは2本)。この好熱性バシラスのシトクロムbo_3をふくむsoxBグループは系統樹の上で,おおくのaa_3型のオキシダーゼがふくまれるsoxM型やNO還元酵素との類似性をしめすfixN型とは異なる独自のサブグループを形成する。.B.stear other mophilus野生株K-1041に酵素のオペロンを持つプラスミドを形質転換したところ1-2nmol/mg proteinの本酵素が発現された。また同様のオペロンを持つ大腸菌プラスミドを大腸菌で発現させたところ、12nmol/mg proteinの酵素が発現された。前者にはシトクロムcオキシダーゼ活性があったが後者にはなかったので、前者から精製をすすめ、DEAEセルロースとハイドロキシアパタイトカラムによりほぼ純粋にした。このbo_3型オキシダーゼは2個の基質結合部位を持ち、その高親和性部位にシトクロムc-551を特異的に結合する。一方、低親和性部位の基質特異性は低い。また、低いながらもH^+ポンプ活性を検出することができた。変異シトクロムc-551このbo_3型オキシダーゼの本来の基質であるシトクロムc-551部位特異性変異を導入し、5種の変異シトクロムc-551を発現し、これらを精製した。ctaA遺伝子B.stear other mophilusのcaa_3型オキシダーゼの構造遺伝子の上流反対ストランドにあるctaAを大腸菌で発現、ヘムOオキシゲナーゼであることを示した。cb型オキシダーゼ第三のヘムー銅オキシダーゼであるcb型オキシダーゼをHelicobacter pyloriから精製しその性質を調べた。
インド亜大陸におけるコレラ関連細菌の生態学的および分子疫学的研究

Vibrio choleraeはインド亜大陸、特にガンジス河流域の水環境に定着して、コレラの流行を繰り返しているが、自然界での消長に関してなお不明の点が多い。本菌は、その206の血清型のうち01と0139が流行性のコレラを起こすが、non-01/non-0139血清型株にも単発性ではあるが、激しい腸疾患を起すものがある。01/0139両血清型の菌は人に病原性を示すために必要な病原遺伝子、すなわちコレラ毒素(CT)遺伝子、定着に必要なtoxin co-regulated pilus(TCP)遺伝子、およびその制御にかかわるToxR遺伝子を保有していることが知られている。近年の研究は、これらの遺伝子が多くの血清型にも分布していることを示しているが、後者の血清型でこれらの病原遺伝子を保有しているものは稀である。そこで、本研究ではインドおよびバングラデシュでの分離株について分子遺伝学的に解析を行ない、環境分離V. cholerae 01,0139と臨床分離V. cholerae 01,0139がすべて上記の3病原遺伝子が陽性であり、同一クローンまたは非常に近い関係にある株であることを明らかにした。すなわち、この地域の環境水中に住み着いているV. cholerae 01,0139は、あるクローンが大部分を占めており、それがヒトにコレラを引き起こすと考えられる。一方、non-01/non-0139の分離株のほとんどは、患者から分離した株を含んでいるにもかかわらず、1株を除いてctxAとtcpAは陰性であった。しかし、これらの株はtoxRおよびV. cholerae hemolysin (VCH)をコードするhlyAを保有していた。また、NAG-STやNAG-TDHなどの他の腸管毒素遺伝子も一部の株しか保有していなかった。これらの結果は、non-01/non-0139分離株におけるVCHの腸管毒性因子としての関与を示唆している。例外的なnon-01/non-0139株としてctxAとtcpAを保有するものが1株得られ、しかもこの株のtcpAとhlyAは、いずれもクラシカル型であり、かつ活性なVCHを産生する稀な性状の株であることが明らかになった。すなわち、流行性株の生じるリザーバーとしてのnon-01/non-0139の意義が確認されたものであり、流行現象解明への有益な情報を提供し得ると思われる。コレラ菌および類縁のビブリオはインド亜大陸、特にガンジス河流域の水環境に定着して流行期には高率に検出されるが,非流行期には検出されず,自然界での消長に関してなお不明の点が多い。また,腸炎ビブリオに関しても,従来とは異なった03:K6による事例が頻発しており,環境中の病原ビブリオが,抑圧に対抗する手段を獲得して流行の輪を広げようとしている感がある。さらに,ビブリオ関連細菌であるエロモナスの下痢症も頻発している。

従って,下痢症制圧にはビブリオ関連下痢原因細菌の性状,特に環境中での生態,病原遺伝子の伝達などを分子生物学的に明らかにしておく必要がある。本研究ではガンジス河口デルタ地帯で,患者あるいは環境由来のコレラ関連ビブリオの生態および分子疫学的検討を行って,インド亜大陸を中心にした地域での流行予測さらには下痢症制圧に寄与することを目的としており、本年はその予備段階の調査を行った。ダッカ、カルカッタにおいて環境水からV.choleraeを分離し、それら33株とそれぞれの地域の患者分離株50株と共にPCRにより病原性関連遺伝子の保有状況を調べた。また、NotIを使用したPFGE(pulsed-field gel electrophoresis)を行い、環境分離株・臨床分離株のgenetic fingerprintの比較から病原株の由来を探った。コレラ毒素CT(ctxA)、腸管付着因子であるとともにCTXΦの受容体として働くTCP(tcpA)、CTおよびTCPの発現調節因子であるToxR(toxR)の存在をPCRで調べた結果、ctxAは、環境分離および臨床分離の全てのO1/O139株から検出されたものの、nonO1/O139株からは検出されなかった。toxRは、O1/O139株、nonO1/O139株共に多くの株から検出された。本年は初年度であり、結論を得るに至っていないが、以上の病原性関連遺伝子の保有状況と合わせて、各株のPFGEによるgenetic fingerprintの比較を行ない解析を行っている。コレラ菌および類縁のビブリオはインド亜大陸、特にガンジス河流域の水環境に定着して流行期には高率に検出されるが,非流行期には検出されず,自然界での消長に関してなお不明の点が多い。また,ビブリオ関連細菌であるエロモナスの下痢症も類発している。本研究ではガンジス河口デルタ地帯で,患者あるいは環境由来のコレラ関連ビブリオの生態および分子疫学的検討を行って,インド亜大陸を中心にした地域での流行予測さらには下痢症制圧に寄与することを目的としており、前年度に続いて、ダッカ、カルカッタにおいて環境水からVibrio choleraeを分離し、また、患者分離株を得て、PCRによる病原因子の検出、Not 1を使用したPFGE(pulsed-field gel electrophoresis)によるGenetic Fingerprintの比較、薬剤耐性試験等を行った。その結果、環境分離V.cholerae 01,0139と臨床分離V.cholerae 01,0139が同一クローンまたは非常に近い関係にある株であることが示された。すなわち、ベンガル地域の環境水中に住み着いているV.cholerae 01,0139は、あるクローンが大部分を占めており、それがヒトにコレラを引き起こすと考えられる。そして、それは、年月と共に徐々に遺伝子の変化を受けているが、何らかの環境因子が働き、淘汰を受けているのではないかと考える。従って、引き続きベンガル地域における分子疫学的解析を継続することが重要であり、さらなる研究成果につながると考える。V.cholerae non-01/non-0139についてもCTX・による新たなCT産生株が出現する可能性も踏まえ、その病原性についてさらに解析を進める必要性がある。
プロリルエンドペプチダ-ゼ阻害剤が示す抗痴呆作用の機構解明

プロリルエンドペプチダ-ゼに特異的なインヒビタ-が実験的に動物に起こした記憶喪失を予防する効果を見いだしてきた。この機講を解明するため、酵素の構造と触媒機能を明らかにする必要があると考え、新規インヒビタ-を開発し活性部位の構造を検討した。1、プロリルエンドペプチダ-ゼの活性部位の検討:本研究者は酵素に特異的なインヒビタ-として、ZーThioproーthioprolinalが強力な阻害力を示した(J.Biochem.,104.580)。更に詳細に検討するため、各部位の光学的特異性についての検討、硫黄原子の置換や保護基の検討を行った。その結果、L型のプロリンをD型に変えると阻害作用が激減した。prolineにSを持つthioprolineにすると阻害力は増すが、Oに変えると減少した。保護基は疎水性の強い方がよく、benzyloxycarbonyl基が一番強い阻害効果が現れることが判った。2、プロリルエンドペプチダ-ゼのクロ-ニング:酵素を蛋白分解酵素で分解後、HPLCでペプチド断片を分離し、アミノ酸配列を明らかにした。得られた配列をもとにDNAを合成し、これをプロ-ブとした。Flavobacterium染色体DNA遺伝子バンクより酵素遺伝子を得、酵素遺伝子の全塩基配列を明らかにした。塩基配列から推定されるアミノ酸配列の548番目から552番目にセリン酵素としての共通配列GlyーXーSerーXーGlyが見られ、550番目のセリン残基が触媒に関与すると推定された。酵素遺伝子を持つプラスミドpFPH5K50で形質転換した大腸菌DH1株は高いプロリルエンドペプチダ-ゼ活性を示した。現在牛脳のプロリルエンドペプチダ-ゼについてクロ-ニングを行っている。本研究により、プロリルエンドペプチダ-ゼの活性部位構造と、酵素遺伝子の全構造を明らかにすることが出来た。本年度はラット脳よりプロリルエンドペプチダ-ゼを精製すること、新規インヒビタ-の開発およびバソプレシン誘導体への酵素の作用とインヒビタ-による分解阻止を調べた。酵素の精製:ラット脳のホモジェネ-トよりDEAE-Toyopearl、hydroxyapatite、Sephadex G-150の各クロマトグラフィ-を用いプロリルエンドペプチダ-ゼの精製をおこなった。酵素はこれまで仔羊や牛の脳から得られた酵素と非常によく似た性質を示し、酵素抗体で調べたところ、共通抗原をもつことがわかった。新規インヒビタ-の合成:Z-Pro-prolinalを基本骨格とし、プロリンの誘導体や保護基を変え、阻害力を調べた。その結果、Z-Thiopro-thioprolineが強い活性を示し、酵素のサブサイト1に結合すると思えるthioproline部分をD型に変えると阻害力が失われた。ラットへ経口投与した後、脳内の活性の変動をZ-Pro-prolinal及びZ-Thioproーthioprolinalを経口投与後、経時的に調べた結果、1時間後に60%阻害され徐々に酵素活性が回復した。バソプレシンの誘導体への酵素の作用とインヒビタ-による分解阻止:デ・ウイ-ドにより真の記憶に関与する物質として報告されているバソプレシンの分解物Pyr^4-Asn^5-Cys^6(Cys^1)-Pro^7-Arg^8-Gly^9-NH_2[AVP(4-9)と略す]を合成した。これに、ラット脳由来プロリルエンドペプチダ-ゼを作用させ、Pro^7-Arg^8を切断することを確認した。更に、種々の酵素特異的インヒビタ-がこの切断を阻害することを明らかにした。

一方、キノコにプロリルエンドペプチダ-ゼに特異的なインヒビタ-が存在することも見いだした。このインヒビタ-が実験的健忘症にどのような効果を示すかを調べる予定である。本年度はプロリルエンドペプチダ-ゼの構造を調べるため,その遺伝子構造を明らかにすることを計画した。牛脳およびFlavobacteriumの酵素を精製し,その内Flarobacteriumの酵素標品についてまずエンドペプチダ-ゼAsnーNで水解し,HPLCでペプチド断片を得た。その中20断片についてアミノ酸配列決定を行った。この配列をもとに比較的コドン使用の少ない部分を選びDNAを合成し、これをプロ-ブとした。一方,Flavobacterium染色体を用いバンクを作り,このバンクからコロニ-ハイブリダイゼ-ションで5個のポジティブなクロ-ンを得た。いずれの菌からも3.6Kbpの挿入断片を持つプラスミドが得られたので、その1つを選びpFPH1と名づけた。この制限酵素地図を作製し、この制限酵素部位を利用し断片化したり、両端からデリ-ションをおこない種々のプラスミドを作成した。これらにより形質転換した大腸菌についてプロリルエンドペプチダ-ゼ活性を比較した結果、約2.5Kdpの挿入断片を持つプラスミドpFPH5KD7によって10倍の酵素活性の上昇がみられた。このプラスミドを用い、酵素遺伝子の全塩基配列の決定をおこなった。配列から推定されるアミノ酸配列から求めた分子量は76,200で天然の酵素についてSDSーPAGEや超遠心分離法で得た値とよく合う。本酵素はセリン酵素であるが、一般にセリン酵素の活性セリン残基周辺の共通配列としてGlyーXーSerーXーGlyが知られている。アミノ酸配列中556から560番目に類似配列がみられ、活性セリン残基と推定される。現在,酵素を[ ^3H]DFPで化学修飾後,蛋白質のアミノ酸配列からの位置の確認をおこなっている。牛脳酵素については現在アミノ酸配列の検討中である。
自閉症スペクトラム障害における社会的相互作用の神経基盤

ヒトを含む動物には、他者の存在下で行動の頻度や速度が上がる「社会的促進」が広く見られる。本研究の目的は、ヒトにおける社会的促進の神経基盤とともに、「社会性の障害」とされる自閉スペクトラム症(ASD)の神経科学的背景を解明することであった。これを達成すべく、(1)ヒトで社会的促進がロバストに起こる行動課題の確立、(2)神経機構解明のためにfMRIを導入するにあたり、メインの行動課題からは独立した、賦活領域を比較するアンカーとしての「localizer課題」の確立、を試みた。(1)「社会採餌ゲーム」を開発し、一般人を対象に行動実験を行った。「餌」の奪い合いがなくても、他者存在下で「餌場」への滞在時間が短くなるnon-specificな社会的促進がみられた。聴覚の感覚偏奇が強いほど、社会的促進が抑制される傾向がみられた。餌場滞在時間には性差がみられた(男性>女性)。(2) “Monetary incentive delayタスク"(MIDタスク;報酬金額を予告したのち、ターゲットに合わせてうまくボタンを押すことができれば金銭報酬をプレイヤーに与える、というゲーム課題)をlocalizerとして確立した。外的な金銭報酬と「内的な報酬」、つまりゲームをうまくプレイすることそのものの効果とを分離するため、独自に改変したMIDタスクを用いて検討した。外的な報酬の予告期には先行研究と同様、腹側線条体を含む一連の「報酬系」領域の賦活を認めた。内的な報酬の予告中には運動前野が、結果呈示期には体性感覚野・感覚運動連合野が賦活していた。社会的促進の神経基盤の解明に必要な実験パラダイムを得るとともに、社会的促進がASDの特徴の一つである感覚偏奇と関連することを示唆する結果を得た。しかし、社会的促進がASDと直接に関連している証拠は得られなかった。神経機構の解明も今後の課題として残った。28年度が最終年度であるため、記入しない。(1)社会的相互作用を測る新規行動課題を確立し、自閉スペクトラム症(ASD)傾向との関連を示唆する結果を得た。ASDは「対人的相互交流の障害」(DSM-5)を特徴とするが、具体的にどのような社会的相互作用が障害されるかは議論の余地が多い。単純な身体運動による行動課題を新たに確立し、ASDと定型発達とで社会的相互作用がどのように異なるかを調べた。新規行動実験として、「ロープを左右に引く」という動作が、他者の同じ動作によって影響されるかを調べた。被験者2名(ペア)同時に実験を行い、ペア相手が見えない時(単独条件)と、見える時(ペア条件)とで行動を比較した。定型発達者12名(=6ペア)を対象に行動実験を行った。「単独条件→ペア条件→単独条件」のように進めた。運動量(ロープを引いた量)を測ったところ、実験終了時点で開始時に比べて両者の運動量の差分が有意に小さくなった。すなわち、運動量が相手に「引き込まれる」傾向がみられた。また、Autism-Spectrum Quotient(Baron-Cohen et al. 2001)の下位項目「社会的スキル」得点がペア相手に比べて相対的に高い人は、運動量の「引き込み」がより早い段階で生じている可能性が示唆された。(2)社会的相互作用に関連する脳部位を同定するために必要な、「localizer課題」を確立した。線条体は、新規課題に関連する可能性が高い脳部位である。線条体のlocalizerとして、「Monetary Incentive Delay課題」(MID課題; Knutson et al. 2000, 2008)の実験系確立に取り組んだ。定型発達者37名について、MID課題を行っている最中の脳活動をfMRIで測った。先行研究と同様、線条体の有意な賦活が認められた。MID課題は線条体のlocalizerとして有用であることが分かった。本研究の目的は、定型発達と自閉スペクトラム症(ASD)との比較の観点から、他者がいると意思決定及び行動がどのように変わるか検討することである。昨年度の行動課題ではデータが安定しなかったため、今年度は他者の影響に対してより鋭敏な行動課題を改めて開発・確立した。行動生態学の考え方に基づき、動物が餌場(パッチ)への滞在と離脱とを繰り返し、時間当たりの餌(報酬)量を最大化しようとする(Charnov 1974)状況を再現した。被験者はコンピューターゲーム内で餌パッチを探し、見つければ報酬を得た。報酬加算のペースは次第に鈍るので、「今のパッチに留まるか、次のパッチを探すか」の判断が求められた。同一被験者において、単独時とペア(2名で実験を行う)時とでパッチ滞在時間を比較した。行動生態学的には(Giraldeau & Caraco 2000)、ペア時は単独時に比べて滞在時間が短くなると予測された。被験者50名(男性24名、女性26名)において、ペア時は単独時に比べて有意に滞在時間が短かった。他方で、パッチをめぐる競争があるかないか、他者が自分のパッチを見つけられるか否か、といった他者との関係の違いは影響していなかった。滞在時間の短縮は行動生態学的背景よりもむしろ、non-specificな"社会的促進"(Allport 1924, Zajonc 1965)によるものと考えられる。

滞在時間短縮の大きさ(=社会的促進の強さ)と、ASDに関連した質問紙の点数とに、有意な相関は認められなかった。他方、感覚偏奇のアセスメントツールである青年・成人感覚プロファイル(Brown & Dunn 2002;辻井(監修)・萩原ら(作成) 2015)の「聴覚・低登録」点数が、1回目単独時のパッチ滞在時間と負に相関していた。パッチ滞在時間に関する意思決定は、感覚受容の様式から影響を受けているかもしれない。前年度に行った運動ベースの行動課題では安定したデータを得られず、新たに「パッチ採餌課題」を確立、実施する必要が生じた。定型発達者については十分な被験者数を確保し、予定の実験を終えることができた。行動データからはおおむね仮説通りの結論が得られ、昨年度は未実施であった質問紙(感覚プロファイルなど)調査も実施した。臨床患者を被験者とした行動実験および質問紙調査、および本行動課題をfMRIと組み合わせて実施するには至っておらず、今後進めていく必要がある。ヒトを含む動物には、他者の存在下で行動の頻度や速度が上がる「社会的促進」が広く見られる。本研究の目的は、ヒトにおける社会的促進の神経基盤とともに、「社会性の障害」とされる自閉スペクトラム症(ASD)の神経科学的背景を解明することであった。これを達成すべく、(1)ヒトで社会的促進がロバストに起こる行動課題の確立、(2)神経機構解明のためにfMRIを導入するにあたり、メインの行動課題からは独立した、賦活領域を比較するアンカーとしての「localizer課題」の確立、を試みた。(1)「社会採餌ゲーム」を開発し、一般人を対象に行動実験を行った。「餌」の奪い合いがなくても、他者存在下で「餌場」への滞在時間が短くなるnon-specificな社会的促進がみられた。聴覚の感覚偏奇が強いほど、社会的促進が抑制される傾向がみられた。餌場滞在時間には性差がみられた(男性>女性)。(2) “Monetary incentive delayタスク"(MIDタスク;報酬金額を予告したのち、ターゲットに合わせてうまくボタンを押すことができれば金銭報酬をプレイヤーに与える、というゲーム課題)をlocalizerとして確立した。外的な金銭報酬と「内的な報酬」、つまりゲームをうまくプレイすることそのものの効果とを分離するため、独自に改変したMIDタスクを用いて検討した。外的な報酬の予告期には先行研究と同様、腹側線条体を含む一連の「報酬系」領域の賦活を認めた。内的な報酬の予告中には運動前野が、結果呈示期には体性感覚野・感覚運動連合野が賦活していた。社会的促進の神経基盤の解明に必要な実験パラダイムを得るとともに、社会的促進がASDの特徴の一つである感覚偏奇と関連することを示唆する結果を得た。しかし、社会的促進がASDと直接に関連している証拠は得られなかった。神経機構の解明も今後の課題として残った。新規行動課題を用いた実験に関しては、実験装置・設備の確立に想定よりも時間を要し、少人数の結果を得るに留まった。他方、fMRI実験を行うための準備(localizer課題の確立)は、当初の予定以上に進めることができた。「パッチ採餌課題」の被験者を臨床患者(主にASDと診断されている人)に広げるとともに、課題を行っている間の脳活動をfMRIにて記録し、関連脳部位を同定する。
チュクチ語の形態論に関する記述的研究

本研究は、チュクチ語の形態論に関する記述研究を行なうことを目的としたものであり、その主な研究成果は以下の通りである。1)チュクチ語における語彙的接辞について網羅的に調べ、語彙的接辞の付加によって派生される出名動詞と名詞抱合との類似点、相違点を明らかにした。また、先行研究において、語彙的接辞を自立動詞と混同した点を指摘し、動詞の語形成の研究を一歩前進させた。ここで述べた内容を英語で論文として執筆し、学術雑誌に発表した。2)昨年度に続き、今年度も使役動詞の派生について詳しく調査し、チュクチ語に見られる様々な使役表現の実態を明らかにした。具体的に言えば、類型論の観点から、使役を「形態的使役」、「分析的使役」、「語彙的使役」に分け、このうち、生産的な使役である「形態的使役」と「分析的使役」を網羅的に記述した。チュクチ語では、動詞語幹に一つの接辞がつく「単純使役」以外に、二つの接辞がつく「二重使役」、さらに「逆使役」も存在していることが明らかになった。使役について論文を日本語で執筆、学術雑誌で発表した3)今年はまた、否定を表わす様々なパターンを整理・分析した。その結果、チュクチ語では、否定を表わすのに5種類の小詞と2種類の接辞が用いられるが、これらの使用には様々な制限があり、細かい使い分けがあることが明らかになった。本研究は、チュクチ語の形態論に関する記述を行なうものであるが、具体的には以下が今年度の研究成果として得られたものである。1)今までの現地調査で得られた資料に基づいて、チュクチ語の使役表現について、自動詞・他動詞との関わりを視野に入れながら、網羅的に記述した。とりわけ、使役接辞による「形態的使役」と助動詞を用いる「分析的使役」について詳しく調査した。その結果、チュクチ語の使役には「単純使役」「二重使役」の他に「逆受動使役」があることも分かった。従来の研究では、「単純使役」だけしか扱われておらず、使役の範囲が狭くとらえられてきた。この点では先行研究よりも一歩進んだ記述が可能になったと考えられる。現在はこれを論文化し、学術雑誌で発表する準備中である。2)今年度はまた、チュクチ語の多様な否定表現についての記述も行なった。チュクチ語では、否定を表わすのに四種類の小詞、二種類の接辞が用いられるが、これらは主語の人称、述語動詞がとる時制などによって細かく使い分けられていることが確認できた。さらに過去時制にかかわる二つの否定小詞にニュアンスの違いがあることも分かった。
トビイロウンカの相変異の誘導に関わる遺伝子の探索と機能解析

トビイロウンカを異なる翅型を誘導する2種類の密度条件で飼育し、翅型決定期である3、4齢の幼虫期にサンプリングを行った。トビイロウンカのすべてのステージからRNAを抽出し、網羅的な発現遺伝子情報を得て、マイクロアレイを設計した。このマイクロアレイを用いて、翅型決定期のサンプル問で発現量に差がある遺伝子を探索した。候補遺伝子についてRNAiによる発現抑制試験を行った。トビイロウンカHS系統の同じ親世代から生じた幼虫を、高密度と低密度に分けてイネ上で飼育し、異なる翅型を発現する幼虫を得た。3齢、4齢、5齢、成虫について雌雄別にサンプリングを行い、mRNAサンプルを得た。JH esterase等幼若ホルモン合成関連遺伝子について、定量PCRにより発現量の比較を行い、予定翅型とこれらの遺伝子の発現量の関係を調べた。幼若ホルモンと相変異の関連性は長い間研究されながら、なかなかはっきりした結果が得られておらず、貴重なデータが得られた。また、マイクロアレイ解析を効率よく行うためには、できるだけ多くの遺伝子をアレイに搭載する必要がある。このため、トビイロウンカにおいて、次世代シーケンサーを用いた大量cDNA解析を行った。まず、胚子から成虫まですべてのステージのすべての器官のサンプルからmRNAを抽出し、cDNAに逆転写した後、平均化作業を行い、EST数の遺伝子による偏りを軽減した。このサンプルについてロシュ社GS FLXを用いて塩基配列を決定し、91万個のESTを得た。MIRA3によるクラスタリングの結果、10万弱の遺伝子に分類された。得られたデータをもとにマイクロアレイを設計中である。トビイロウンカにおける次世代シーケンサーを用いた大量EST解析はこれが初めてであり、設計されたマイクロアレイは相変異の研究のみならず、トビイロウンカのさまざまな生理現象の解明に有効に使用できる。トビイロウンカの全組織、全ステージから抽出したRNAをシーケンサーロシュ454FLXで解析し、120万リードの塩基断片を得た。これを既知のトビイロウンカEST13万クローンと合わせてMIRA3でアセンブルを行い、約11万の転写産物のコンティグを作成した。このうち、信頼性の高い塩基配列からなるコンティグを58,000選び、アジレント社製マイクロアレイ解析用のプローブを設計した。翅型解析用に作製したトビイロウンカ系統の同一集団から由来する3齢脱皮後直後の幼虫を、異なる翅型を誘導する2つの環境条件に分けて飼育した。途中、3齢2日、4齢2日、5齢2日にサンプリングを行った。また成虫の翅型を記録し、確かに2種の条件下で異なる翅型が誘導されることを確認した。実験は2反復行い、それぞれ3齢、4齢由来のRNAについて8x60Kのマイクロアレイ1枚で遺伝子の発現量を網羅的に比較した。統計的に有意な発現量の変化を示した遺伝子について、上位から順にデータベース上の既知遺伝子と配列を比較して大まかな機能を推定した。結果、他の昆虫種で近年相変異に関与することが疑われる遺伝子の変動がトビイロウンカにおいても認められた。また、現在までに相変異との関連が一切報告されていないある代謝系に含まれる複数の遺伝子が大きく変動していることが明らかになった。現在、変動の見られた遺伝子と、この代謝系に含まれる他の遺伝子について、合成dsRNAを使用したRNAiによる機能破壊実験を行っている。昨年度までに得られたマイクロアレイの結果をもとに、トビイロウンカの異なる翅型を発現する飼育条件下で発現に差のある遺伝子の機能の検討を行った。マイクロアレイのデータから3倍以上発現量に差があり、またその差が統計的にであった6種類の遺伝子についてRNAiによる発現抑制の実験を行った。3齢幼虫2080個体に2本鎖RNAの溶液を注射し、そのまま飼育して成虫時の翅型を記録した。3反復の実験を行ったが、注射によって翅型が変化したと思われる遺伝子はなかった。配列と機能から特に有望と思われた1遺伝子についてはさらに97個体について注射し、コントロール48個体と翅型の出現率を比較したが、やはり翅型の出現率その他表現型に差はなかった。RNAiの実施に当たり、現在までに実績のある直接注射法以外に、2本鎖RNAの溶液をトビイロウンカに吸汁させて遺伝子発現を抑制させるfeeding RNAiを試した。Laccase2遺伝子の2本鎖RNAをさまざまな濃度に溶解した液を吸汁させたが、体色の着色が抑制された個体は現れなかった。2本鎖RNAの溶液にショ糖を混ぜても結果は同様であった。コントールとして用いた直接注射法は高い確率で体色の着色が抑制されたことから、feeding RNAiは本種では実用的ではないと考えられた。今後はマイクロアレイデータの再解析を行い、翅型制御に関わる可能性のある候補遺伝子をさらに検討する予定である。計画通りすすんでいる。マイクロアレイ解析においては、反復実験と統計処理の結果、信頼性の高い変動遺伝子群を同定できている。24年度が最終年度であるため、記入しない。

RNAi法によって相変異に関する表現型に変化が現れるかどうかがカギになる。このためには複数の遺伝子を同時にノックダウンする必要があることも考えられ、検証には時間がかかる可能性がある。24年度が最終年度であるため、記入しない。
腸管免疫におけるマウスTL抗原の役割と炎症性腸疾患への関与の検索

TL抗原は主要組織適合抗原(MHC)クラスIb群に属し、すべてのマウスの腸上皮細胞に発現する。また正常胸腺においては、TL抗原を発現するマウス(A系等)と発現しないマウス(C3H等)がある。腸管に発現するTL抗原の生理的機能を明らかにするため、その抗原提示機能をTL抗原特異的CTL指標をして検索を行なった。TL抗原特異的CTLの抗原認識機構を明らかにするため、大腸菌由来のリコンビナント蛋白であるT3^b-TLとβ_2Mを用いて、抗原物質を添加せずにTLテトラマーを作成した。本テトラマーがTL抗原特異的CTLと反応性を示すことより、これらCTLはTL分子と抗原物質により形成されるエピトープではなく、Framework自身を認識していることが示された。本テトラマーが、Bulk CTL lineの大部分を染色したことから、TL抗原特異的CTLの大部分はTL分子に提示される抗原分子非依存性にTL抗原を認識していることが予想された。TL抗原はMHCクラスIa群に比べ多型性が少なく、抗原提示能を有するとすれば、通常のペプチド以外の物質(あるいは特殊なペプチド)を提示すると予想されていた。しかしながら、今回得られた知見は、TL抗原が抗原提示分子として機能している可能性が低いことを示唆している。TL分子のペプチド結合溝はMHCクラスIa群に比べ非常に狭く、抗原分子を提示している可能性が低いという、我々の予想を示唆する結晶解析の実験結果が最近報告された。今年度はTL抗原特異的CTLの認識機構に重点をおいで検索を行ない、以下の結果を得た。(1)大腸菌由来のリコンビナント蛋白であるT3^b-TLとβ_2Mを用いて、抗原物質を添加せずにTLテトラマーを作成した。(2)TL抗原特異的CTLのCD8依存性の解析:TL抗原特異的CTLはα3ドメインをH-2K^bに置換したキメラTL分子(TL/H-2K^b)を発現する遺伝子導入細胞株により刺激されINF-γを産生したが、α3ドメインをHLA-A2に置換したキメラTL分子(TL/A2)を発現する遺伝子導入細胞株では刺激されなかった。この実験結果よりH-2K^b分子のα3ドメインのCD8結合性はTLのα3ドメインに比して低いが、それでもCTLがα1/α2ドメインを認識する際には結合補助能力を保っているにとが示された。TL抗原特異的CTLがTL/A2発現細胞株で刺激されなかった理由は、マウスCD8に対するHLA-A2分子のα3ドメインの親和性が低いことに起因すると考えられた。この結果から、TL抗原特異的CTLに発現するTCRの親和性は比較的低く、CTLがTL抗原を認識して細胞傷害性を発揮するためにはCD8分子の結合補助能力が必須であるが、TL分子ほどの結合性の強さは必要ではなく、H-2K^bでも十分であることが示唆された。TL抗原特異的CTLの抗原認識

機構を明らかにするため、大腸菌由来のリコンビナント蛋白であるT3^b-TLとβ_2Mを用いて、抗原物質を添加せずにTLテトラマーを作成した。本テトラマーがTL抗原特異的CTLと反応性を示すことより、これらCTLはTL分子と抗原物質により形成されるエピトープではなく、Framework自身を認識していることが示された。本テトラマーが、Bulk CTL lineの大部分を染色したことから、TL抗原特異的CTLの大部分はTL分子に提示される抗原分子非依存性にTL抗原を認識していることが予想された。TL抗原はMHCクラスIa群に比べ多型性が少なく、抗原提示能を有するとすれば、通常のペプチド以外の物質(あるいは特殊なペプチド)を提示すると予想されていた。しかしながら、今回得られた知見は、TL抗原が抗原提示分子として機能している可能性が低いことを示唆している。TL分子のペプチド結合溝はMHCクラスIa群に比べ非常に狭く、抗原分子を提示している可能性が低いという、我々の予想を示唆する結晶解析の実験結果が最近報告された。
海洋細菌の活性を利用したアポトーシスの誘導によるノリ色落ち原因珪藻の防除技術開発

本研究は、有明海でノリ養殖に被害を与えている珪藻赤潮を海洋細菌の殺藻活性を利用して抑制する技術の開発を目指して行い、以下の成果を得た。1)有明海から分離した細菌A25株を珪藻の無菌培養液に接種すると、珪藻細胞が細胞膜の剥離、核DNAの断片化、細胞の収縮という高等植物細胞のプログラム細胞死と同様の過程を経て死滅することを明らかにした。2) A25株を増粘多糖類のゲルで高密度で粒状に固定化して珪藻の培養液に添加すると珪藻細胞が1)で述べた過程を経て死滅することを示した。固定化により沿岸海域において局所的にA25株を高密度に保つことが可能となり、珪藻赤潮抑制技術の実用化に繋がると期待される。有明海から分離したシュードアルテロモナス属細菌A25株と無菌培養の珪藻スケレトネマ・コスタツムNIES-324株とを二者培養し、ニュートラルレッド及びDAPIでそれぞれ染色した珪藻細胞を無染色の細胞と併せて経時的に観察した。その結果珪藻細胞の変化として、まず殻から細胞膜が剥離する様子が見られ、その時点でニュートラルレッドで染色されなくなることが分かった。細胞膜の殻からの剥離が起きた時点で珪藻細胞は死に至っていることが示唆される。それからやや遅れてDAPIで染色された核の青色蛍光の退色が進み、DNAの分解が起きていることが示されたが、植物細胞のプログラム細胞死の場合と同様にクロマチンの凝縮は観察されなかった。また核DNAの分解と並行して珪藻細胞内の膜系の破壊が進行し、最終的には殻の内側に細胞内容物が凝縮した小さな残渣のみが見られる状態に至った。高等植物の細胞では、細菌やウイルスに感染すると液胞膜が内部から破られ、さまざまな分解酵素が細胞内に放出されて細胞内が破壊され内容物が凝縮されることが明らかにされているが、単細胞の植物である珪藻の細胞においてもA25株の攻撃により同様のプログラム細胞死が起きている可能性が示唆された。また、A25株とNIES-324株を膜で隔てて二者培養しても珪藻の細胞が同様の過程を経て死滅したことから、A25株が細胞外に放出する何らかの物質の作用により珪藻細胞の死滅が起きることが確かめられた。そこで、A25株の細胞を培養により集め、凍結・融解を繰り返すことによりペリプラズムタンパク質を溶出させ、粗酵素液を得た。この粗酵素液を無菌培養の珪藻スケレトネマ・コスタツムNIES-324株に作用させたところ、A25株の生菌をNIES-324株に作用させた際と同様に珪藻細胞内の膜系の破壊と核DNAの分解が進行し、細胞内容物が凝集することを確認できた。A25株細胞のペリプラズム画分を抽出して得られた粗酵素液を陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲルろ過等により精製しようと試みたが、珪藻スケレトネマ・コスタツムNIES-324株を死滅させる活性、およびその活性の指標として用いたプロテアーゼ活性が各クロマトグラフィーの段階において複数のピークに分かれて溶出した。また、最も活性の高いピークを追って精製を進めたところ、得られた部分精製酵素を珪藻(NIES-324株)細胞に作用させると、A25株の生菌をNIES-324株と二者培養した場合と比べて珪藻細胞の死滅の様子が異なっていた。このため、平成28年度には目的とした珪藻細胞のプログラム細胞死を誘導する酵素の精製達成には至らなかったとともに、単一の酵素のみではなく複数の酵素が連携して珪藻細胞のプログラム細胞死を誘導している可能性も考えられる状況となった。そこで完全精製を目指す実験を一旦中断し、精製酵素の代わりに粗酵素液をNIES-324株の細胞に作用させ、平成29年度に予定していたA25株が産生する酵素の作用による珪藻細胞の溶解過程の経時的な観察を実施することとし、上の項目で述べた知見を得ることができた。1)有明海から分離したシュードアルテロモナス属細菌A25株をノリ養殖に被害を及ぼす珪藻の1種であるスケレトネマ・マリノイードウルニイ(旧名スケルトネマ・コスタツム)NIES-324株の無菌培養液に接種すると、珪藻細胞が細胞膜の剥離、核DNAの分解、細胞の収縮という高等植物の細胞のプログラム細胞死と類似した過程を経て死滅することを明らかにした。2) A25株が産生する珪藻のプログラム細胞死を誘導する物質についてはプロテアーゼ活性をターゲットとして分離精製を試みたが、予備的に実施した各種カラムクロマトグラフィーにおいてプロテアーゼ活性が複数のピークに別れたため、精製を断念せざるをえなかった。一方、最終年度にA25株の細胞から抽出した粗酵素液を用いて各種のプロテアーゼ阻害剤の効果を検討したところ、用いた全ての阻害剤は粗酵素液の珪藻細胞の死滅を誘導する活性を阻害せず、分離精製の目的物質はプロテアーゼではない可能性も考えられた。今後分離精製を進めて行く際には、珪藻の生細胞を用いたバイオアッセイにより活性測定を行っていく必要があると考えられる。3)最終年度には細菌を粒状の高分子ゲル中に包み込んだいわゆる包括固定化担体に着目して検討を行った結果、グルコマンナン等の増粘多糖類はゲル中にA25株を生きたまま高密度で固定化することができ、このA25株固定化

担体を珪藻の培養液に添加することで、珪藻細胞を前述の過程を経て死滅させることが可能であることを明らかにした。細菌を生物農薬的に使用して「環境にやさしい」赤潮対策を実現するためには開放系である海洋において細菌を高密度に維持する手法の開発が不可欠であったが、A25株固定化担体は珪藻赤潮が頻発するノリ養殖海域において局所的にA25株を高密度に保つことを可能にするとともに、A25株を海域へ供給するシードとしても作用することが期待できる。本研究は、有明海でノリ養殖に被害を与えている珪藻赤潮を海洋細菌の殺藻活性を利用して抑制する技術の開発を目指して行い、以下の成果を得た。1)有明海から分離した細菌A25株を珪藻の無菌培養液に接種すると、珪藻細胞が細胞膜の剥離、核DNAの断片化、細胞の収縮という高等植物細胞のプログラム細胞死と同様の過程を経て死滅することを明らかにした。2) A25株を増粘多糖類のゲルで高密度で粒状に固定化して珪藻の培養液に添加すると珪藻細胞が1)で述べた過程を経て死滅することを示した。固定化により沿岸海域において局所的にA25株を高密度に保つことが可能となり、珪藻赤潮抑制技術の実用化に繋がると期待される。平成29年度には、引き続きA25株細胞のペリプラズム画分を抽出して得られた粗酵素液を用い、珪藻スケレトネマ・コスタツムNIES-324株の細胞の溶解過程について、細胞膜や核の細胞内小器官に起きる変化を詳細に検討し、珪藻細胞の死滅がプログラム細胞死であるかどうかについて検証を進める。また、平成28年度に達成できなかった目的酵素の精製を目指すが、こちらについては上の項目で述べたように活性が多数のピークに分散することから困難が予想されるだけでなく、複数の酵素が連携して珪藻細胞のプログラム細胞死を誘導している可能性も考えられ、その場合にはそれぞれのピークについて酵素の精製を達成し、それらの組み合わせを試験する必要などが生じ、研究時間を大幅に取られる事態も考えられる。そこで、目的酵素の完全精製だけにこだわらず、殺藻細菌を用いた珪藻赤潮防除技術の実用化に向けた研究を並行して進める。我々は、開放流動系である沿岸海域において殺藻細菌を赤潮防除に用いるためには、A25株を包括固定化した高分子担体を利用することが有効ではないかと考えている。包括固定化担体は殺藻細菌のシードとして作用するとともに、ノリ養殖海域において局所的に殺藻細菌の細胞密度を高く保つことにも効果的にはたらくことが期待できる。そのために、まず海洋環境で容易に溶解もしくは破壊されることなく、持続的に形態を維持することができる高分子担体を検討する。次に、その高分子担体にA25株を包括固定化し、スケレトネマ・コスタツムNIES-324株のプログラム細胞死誘導活性の確認を行ったのち、フラスコレベル、水槽レベルと段階的にスケールを上げて、珪藻赤潮防除シミュレーション実験を実施したい。環境微生物学平成28年度に予定していたA25株が産生する珪藻細胞のプログラム細胞死を誘導する酵素の完全精製を目指す実験を一旦中断し、A25株のペリプラズム空間から抽出した粗酵素液を作用させた場合の珪藻細胞の死滅過程を経時的に調べる実験を平成29年度から前倒しで実施したため、酵素の精製並びに精製酵素の性状を調べる実験に必要な試薬等の消耗品の購入を行わなかったことにより、物品費の支出が当初予定よりも若干少額となった。また、日本水産学会春季大会において本研究に関連する内容の発表が学会前半に集中していたため、同学会の聴講のための出張日数が当初の予定より短くなったことにより、旅費の支出額が予定より若干少額となった。