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血管内皮の抗血栓性に関わる細胞膜受容体の構造・機能相関の研究

血管内皮細胞には血液の流動性維持のための抗血栓性機能が存在する。しかし、感染性因子やトロンビンなどの凝固因子で刺激された内皮細胞では、トロンボモジュリン(TM)やプロテインC受容体(EPCR)の発現低下により抗血栓性機能が低下するとともに組織因子(TF)やMCP-1などのケモカイン、細胞接着因子などが産生され、炎症と凝固反応が亢進し、血栓形成傾向をきたす。一方、これまでに我々は、トロンビンによる血管内皮細胞でのTFの発現をアデノシン(Ado)トランスポーターの阻害剤である塩酸ジラゼプが強く抑制することを報告してきたが、本研究では、Adoがその受容体を介して、血管内皮細胞でのTFの発現や細胞接着因子の産生を抑制し、線溶系機能を亢進することを明らかにした。更に、非ステロイド性抗炎症薬として知られるアスピリンおよびその代謝産物であるサリチル酸(Sal)がトロンビン刺激内皮細胞でのTFの発現をAdo受容体を介して抑制することを見いだした。Salは細胞内でのNF-κBの活性化を阻害することが示唆されており、現在、このAdo受容体を介するNF-κBの活性化制御の分子機構を解析している。他方、血管内皮の抗血栓性に関わる細胞膜受容体の構造・機能相関の解析研究の一環として、欧米白人で血栓症の一因になることが示唆されているTM異常症やEPCR異常症について、日本人の冠動脈疾患患者におけるTM分子上のAla(GGC)25Thr(AGC)変異およびEPCR分子上めGly(GGC)219Ser(AGC)変異の有無を解析した。その結果、これらの変異は日本人では健常人でも冠動脈疾患患者と同程度にみられることが明らかになった。この結果は、これらの変異が両蛋白質の機能発現には影響を及ぼさないこと、また血栓症発症の主要な原因にはならないことを示唆しているが、この点を確認するため、現在、小麦胚芽抽出液を用いたin vitro転写・翻訳系により異なる分子構造の組換え蛋白質を作製し、その生物活性を解析し、両分子の構造・機能相関を解析する準備を行っている。正常な血管内皮細胞の有する抗血栓性機能はトロンビンやTNF-α等の刺激によって低下し、障害内皮細胞上は向血栓状態に陥る。すなわち、培養血管内皮細胞(HUVEC)をトロンビン、TNF-α等で刺激すると凝固惹起因子の組織因子(TF)や細胞接着因子のVCAM-1等の発現が惹起され、障害内皮細胞上は炎症と血液凝固の反応の場となる。我々はこれまで、核酸代謝産物のアデノシンが、トロンビンやTNF-αで刺激されたHUVECでのTF、VCAM-1等の発現を阻止することを見い出した。今回、血管内皮の抗血栓性に関わる細胞膜受容体に関する研究の一環として、アデノシン受容体を介する障害内皮の保護機構に関する分子細胞学的検討を行い、次の結果を得た。アデノシン受容体特異的アゴニストを用いた検討から、アデノシンによるHUVEC上のTF活性の抑制作用は、主にアデノシン受容体サブタイプのA3受容体を介することが示唆された。一方この作用は、carboxy-PT 10、L-NMMA、L-NAMEのいずれでも濃度依存性に阻害された。アデノシン存在下の培養HUVEC

上清中のnitrite及びcGMPの濃度はアデノシン非存在下の濃度に比べ有意に高値を示した。しかし、8-SPT、L-NMMA、L-NAMEの存在下のnitrite、cGMP及びcAMPの濃度はアデノシン存在下での濃度に比べ有意に低値を示した。以上の結果から、トロンビン刺激による障害内皮細胞に対するアデノシンの保護作用の少なくとも一部はアデノシンが内皮細胞上のアデノシン受容体サブタイプA3受容体を介して、内皮細胞のNO産生酵素(eNOS)を活性化し、産生されたNOが可溶性guanylate cyclase及びadenylate cyclaseを活性化してcGMPとcAMPを産生させ、これらが内皮細胞を障害から保護することが示唆された。血管内皮細胞には血液の流動性維持のための抗血栓性機能が存在する。しかし、感染性因子やトロンビンなどの凝固因子で刺激された内皮細胞では、トロンボモジュリン(TM)やプロテインC受容体(EPCR)の発現低下により抗血栓性機能が低下するとともに組織因子(TF)やMCP-1などのケモカイン、細胞接着因子などが産生され、炎症と凝固反応が亢進し、血栓形成傾向をきたす。一方、これまでに我々は、トロンビンによる血管内皮細胞でのTFの発現をアデノシン(Ado)トランスポーターの阻害剤である塩酸ジラゼプが強く抑制することを報告してきたが、本研究では、Adoがその受容体を介して、血管内皮細胞でのTFの発現や細胞接着因子の産生を抑制し、線溶系機能を亢進することを明らかにした。更に、非ステロイド性抗炎症薬として知られるアスピリンおよびその代謝産物であるサリチル酸(Sal)がトロンビン刺激内皮細胞でのTFの発現をAdo受容体を介して抑制することを見いだした。Salは細胞内でのNF-κBの活性化を阻害することが示唆されており、現在、このAdo受容体を介するNF-κBの活性化制御の分子機構を解析している。他方、血管内皮の抗血栓性に関わる細胞膜受容体の構造・機能相関の解析研究の一環として、欧米白人で血栓症の一因になることが示唆されているTM異常症やEPCR異常症について、日本人の冠動脈疾患患者におけるTM分子上のAla(G__-GC)25Thr(A__-GC)変異およびEPCR分子上のGly(G__-GC)219Ser(A__-GC)変異の有無を解析した。その結果、これらの変異は日本人では健常人でも冠動脈疾患患者と同程度にみられることが明らかになった。この結果は、これらの変異が両蛋白質の機能発現には影響を及ぼさないこと、また血栓症発症の主要な原因にはならないことを示唆しているが、この点を確認するため、現在、小麦胚芽抽出液を用いたin vitro転写・翻訳系により異なる分子構造の組換え蛋白質を作製し、その生物活性を解析し、両分子の構造・機能相関を解析する準備を行っている。
表皮増殖性皮膚疾患の病態における核移行シグナルの役割解明

核移行シグナルであるkaryopherinα2(KPNA2)が細胞増殖に関して果たす役割について、HaCaT細胞おいてTAP(tandem affinity purification) methodおよびmass spectrometryを行い、KPNA2が結合し核移行を行っているタンパク群を特定、解析。また、乾癬や有棘細胞癌をはじめとする皮膚悪性腫瘍でのKPNA2の発現を免疫染色にて確認し、表皮細胞の増殖との関連を検討。これまでの研究結果により、KPNA2が乾癬において基底層付近で発現が上昇しており、有棘細胞癌や悪性黒色腫などの皮膚悪性腫瘍においてもKPNA2の発現上昇が確認された。そこで細胞増殖に関して核移行シグナル(KPNA2)が何らかの役割を果たしている可能性があると考えられた。過去の報告では卵巣癌や食道癌などでもKPNA2は発現増加しているが、悪性腫瘍におけるKPNA2の役割はまだ不明であり、si KPNA2でノックダウンしてもその増殖は抑制されなかったとの報告がある。そこで、培養HaCaT細胞にsi KPNA2を導入してその細胞増殖に関してMTSアッセイを用いて行ったが、si controlと比較して増殖に有意な差が見られなかった。しかし、si KPNAの各サブユニットを複合して同時に導入し、また、低栄養や低酸素などの刺激を加えた条件で比較検討すると、MTSアッセイにて有意に増殖が抑制されることが明らかになった。現在この増殖抑制のメカニズムをさらに詳細に調べるため、FACSを用いて、各条件下での細胞周期の変化を検討している。また、細胞増殖が活性化している状態において、どのような転写因子がKPNA2の働きによって実際に核へ移行し増殖を維持させているのかについて、細胞内でのタンパク結合を解析することから明らかにするため、TAP(tandem affinity purification)methodを用いてHaCaT細胞内でKPNA2と結合するタンパクを分離・精製した。HaCaT細胞におけるstably expressing KPNA2 with a C-terminal TAP-epitope tag(KPNA2-TAP)の作成を行い、これらを細胞数1×10^8培養しTAP methodを用いてKPNA2と結合するタンパクを細胞質分画と核分画に分けて回収し、それぞれをSDS-PAGEで展開した後銀染色を行い、特異的結合と考えられるバンドを切り出し、mass spectrometryを行いターゲットタンパクを同定した。現在同定タンパクの解析をさらに追加して行っている。これらの結果を元に、皮膚科領域における乾癬や皮膚悪性腫瘍の増殖に関する詳細なメカニズムが明らかになっていくと考えられる。そこで細胞増殖に関して核移行シグナル(KPNA2)が何らかの役割を果たしている可能性があると考えた。この増殖抑制のメカニズムをさらに詳細に調べるため、FACSを用いて、各条件下での細胞周期の変化を検討した。同定タンパクの解析をさらに追加して行った。これらの結果を元に、皮膚科領域における乾癬や皮膚悪性腫瘍の増殖に関する詳細なメカニズムが明らかになっていくと考えた。
生体内酸化反応をモデルとした新規サレン錯体の合成と不斉酸化反応への応用

生体内酸化反応では、酸素分子から酸化反応の活性種であるメタル-オキソ種への変換がメタールヒドロペルオキシドを経て進行することが知られている。そこで生体内酸化反応をモデルとした新規サレン錯体合成の基礎的な知見を得るために、過酸化水素によるヒドロペルオキシドを経由する反応の可能性を検討した。この結果軸配位子としてN-メチルイミダゾールが存在すれば、過酸化水素の分解が生じるものの、目的のエポキシ化が進行することが分かった。更に過酸化水素を過剰に用いて気質濃度を高くすれば、エポキシドの収率が向上することが分かった。以上のように、生体内酸化反応と非常に似た反応機構で、サレン錯体触媒不斉酸化反応を行えることを明らかにすることができた。そこで次に、分子内に軸配位子および塩基を有するサレン錯体の合成を検討した。サレン錯体触媒の不斉誘起機構から、Cl"(2")位への軸配位子および塩基の導入は気質の触媒への接近を妨げることが予想されたので、当初の計画を変更してC8(8')位に導入することとした。これまでのところサレン錯体の合成には至っていないが、2-メトキシ-6-メチルアセトフェノンを鍵合成中間体とする新しい合成ルートを開発することができた。この合成法は、中間体のカルボニル基への付加反応を利用して様々な側鎖を導入することができ、非常に柔軟性の高い方法である。また最近、軸不斉ビナフチル骨格を有するサレン錯体が極めて高い不斉誘起能を示すことを見いだした。この錯体は2,2-ビナフトールから合成することができ、その一つの水酸基を手掛かりとして様々な置換基の導入が可能である。現在、このタイプのサレン錯体の合成も検討中である。今回サレン錯体を用いて生体類似の反応機構で不斉酸化を行えることを示すこたができたので、上で述べたようにより生体系により近いサレン錯体触媒の構築を更に検討中である。
枝分かれ構造を形成する時空パターンの数理解析

興奮系反応拡散方程式系を一般的に扱い、パルス型の進行波解が持つ性質について調べた。進行波解に関する線形化固有値問題を扱うことで、拡散係数の大きさに応じて解が不安定化することを示した。次に燃焼モデルに現れる指状パターンの解析を行うため、数理モデルを単純化した。パルス型の進行波解は扱うのが難しいため、遷移層型の界面が現れるモデル方程式の構築を行った。このモデルのパラメータは実験的に測定可能である。枝分かれ構造の形成は様々な現象に見られる。リーゼガング現象に代表される微粒子沈殿帯の動的なパターン形成においては、同心円状に広がる沈殿パターンが安定的に観測される。一方、同様の実験で条件を変えると、同心円状のパターンがバンド方向に不安定化する場合もある。実はリーゼガング現象は反応拡散方程式系によってモデル化されているため、本研究の目標である界面の不安定性を示すことが、現象の解析にとって重要な役割を果たすのである。また、化学反応系の現象であるので、モデルにおけるパラメータを実験によって推定可能であり、モデルと現象の対応関係を詳細に調べることが可能である。このような背景から、リーゼガング現象における界面の安定性を調べることは、本研究において重要な役割を果たす。実は、これまでに先行研究で提唱された方程式では、バンドパターンに対応する解は安定的に表れることが知られている。そのため、バンドパターンの不安定性を考えるには新たなモデルが必要である。そこで、共同研究者である大阪大学の伴氏によって新たなモデルが提案された。2013年度の研究では、この新たなモデル方程式を考え、同心円のバンドパターンに対応する解や、バンドパターンに不安定化が起こることを、数値計算によって確かめることができた。バンドパターンの不安定性が表れる、新たなモデル方程式を提唱できたという点において、研究実施計画上重要な結果が得られたと言える。枝分かれ構造の形成過程における数理的なメカニズムを解明するため、まずは形成過程の初期段階にみられる、単純な構造から複雑な形状が生まれる機構を明らかにしたい。多くの現象が反応拡散方程式によってモデル化されており、枝分かれする時空間パターンの存在が数値計算により示唆される一方で、パラメータがパターンに与える影響の解明や厳密な解の構成は未だ十分に行われていない。先行研究によって、遷移層型の界面が不安定化することは既に知られている。そこで本研究では、まず、パルス型の界面が不安定化することを示した。パルス型の界面の安定性を厳密に調べるには、遷移層型の界面の場合より固有値問題が複雑なため、解析を行うことが難しい。よって、本研究によって得られた結果は、数学的に新しい結果を得たと言える。さらに、得られた結果は遷移層型の解に対して得られた結果と整合性があり、界面の安定性に関して、統一的な見方を与えるものである。また、本研究は自由境界問題を取り扱うことによって得られた結果であり、研究実施計画上必要な情報が得られた。この結果は論文としてまとめ、既に出版されている("Stability analysis fora planar travelingwave solution in anexcitablesystem", RIMS Kokyuroku Bessatsu, B35 (2012), 125-140)。例えば肺の上皮組織には、枝分かれ構造を伴った形態形成が観察される。この枝分かれ構造は、初期過程における一様状態が枝分かれした後にダイナミックな遷移過程を経て、自己組織的に形成される。この現象を数理的に理解するため、初期時刻で平面的な状態が不安定化することを確認する必要がある。この事実は既に、反応拡散方程式系における進行波解の線形安定性解析を通じて確認済みである。したがって、不安定解の近傍に厳密には平面的でない解が存在するはずである。この解を捉えるために、分岐パラメータによって解を摂動展開し、近似解を構成できることを確認した。近似解を求める際に最も重要なのは、帯状領域における線形楕円型方程式の解を求めることである。空間2次元の帯状領域でこの方程式を考えれば、等角写像を使うことで厳密な解を陽に書き下すことが出来る。この事実を用いて解を構成できることを確かめた。枝分かれ構造を伴う現象として知られるすす燃焼は、近年工学的な立場から実験と理論の両面から解析が進んでいる。この現象においても一様な界面の不安定化によって枝分かれ構造が現れる。ここで重要なのは、分岐点と物理的なパラメータの関係性を明らかにすることである。そこで共同研究を通じて、実験と理論の関係性を調べることにした。これによって、様々な条件下で実験を行うことができるので、理論的な結果の有効性を確かめたり、新たな現象の発見を行うことが出来ると期待している。現在実験を行っている最中である。さらにモデルの簡約化を考え、既にモデル構築は終わっている。例えば肺の上皮組織やすす燃焼において、枝分かれ構造を伴った形態形成が観察される。枝分かれ構造を伴う現象として知られるすす燃焼は、近年工学的な立場から実験と理論の両面から特に解析が進んでいる現象である。

そこで共同研究を通じて、実験と理論の関係性を調べることにした。これによって、様々な条件下で実験を行うことができるので、理論的な結果の有効性を確かめたり、新たな現象の発見を行うことが出来ると期待している。今年度は実験系の構築を行うことに成功した。実際に実験を行い、既存の研究で知られているように、2次元的な時空間パターンが出現することが確認できた。これによって、モデル方程式と実験の関係性を詳しく調べることができると期待する。興奮系反応拡散方程式系を一般的に扱い、パルス型の進行波解が持つ性質について調べた。進行波解に関する線形化固有値問題を扱うことで、拡散係数の大きさに応じて解が不安定化することを示した。次に燃焼モデルに現れる指状パターンの解析を行うため、数理モデルを単純化した。パルス型の進行波解は扱うのが難しいため、遷移層型の界面が現れるモデル方程式の構築を行った。このモデルのパラメータは実験的に測定可能である。目標となる枝分かれ構造を表す解の候補として、平面的な解の近傍に新たな解を構成した。実は、ここで構成した解は数値シミュレーション等で観測される解とは異なると考えている。少なくとも現在構成されている解は劣臨界的な分岐解として構成されているため、得られた解は不安定である。また、得られた解は平面的な解に三角関数的な摂動が加わっただけの単純な構造を持っているが、数値シミュレーション等で観察されている解は複雑な形状をしており、明確な差違が見られる。これまでに行って研究によって、より複雑な解を構成する必要があることが分かった。パターン形成の数理2次元における等角写像の理論を応用することで、様々な領域における解の構成を行う。2次元の帯状領域であれば解の構成を行うことが出来る。一方、等角写像は様々な領域で構成されているので、この理論を応用することでより広範囲の解の構成を行えるであろう。この解析を通じて、優臨界的な解の構成を行うことを目標とする。すす燃焼における新たなモデル構築を行う。界面の構成を行うには、できるだけ単純な反応拡散方程式系を扱う必要がある。ただし、非現実的なモデルにならないことも重要である。そこで、現在行っている共同研究を通じて新たなモデルを提案する。その上で、枝分かれ構造を表す解を数学的に行うことを目標とする。実験に対応する反応拡散モデルにおいて、界面不安定性が確認できたという点においては、研究の対象を絞ることにつながるため、研究の推進に重要な役割を果たすと言える。ただし、この方程式における詳細な解析は今後の課題として残されている。自由境界問題を数学的に取り扱い、重要な結果を得たという点では評価できる。特に、界面の安定性解析を行う上で重要な、非線形固有値問題を解析できたことは重要である。
ラットの脳損傷による補償作用に関する行動生理学的研究

十分成熟した3ケ月齢の片眼が摘出されたアルビノラットに白黒弁別学習課題を与え、獲得後、残存眼と反対側の皮質視覚野を破壊して、再び同じ課題で訓練すると、出生直後に片眼を摘出されたラット(OEB)は、3ケ月齢で片眼を摘出されたラット(OET)より速く再学習することができた。これは出生直後の片眼摘出によって残存眼と同側の視覚神経路系(UXVP)が補償的に再編成したためであると考えられた。このようなこれまでにわれわれが確認した成果にもとづいて本研究を進めた。まず、このような視覚の機能高進には解像度の向上が考えられたので、平成6年度、平成7年度にかけては、縦縞、横縞の弁別を行ってその点を調べた。われわれはこれまでアルビノラットを用いて研究を行ってきたが、この研究には視覚能力が高い有色系ラットを被験体として用いた。その結果、30mmの縞の弁別の再成立にはOEB、OETの差はなかった。しかし、反対側皮質視覚野破壊後にはじめて課題を与えると、OEB、OETとも弁別学習が成立しなかった。いったん学習した後、UXVPを用いて再学習するとかなり狭い幅の縞模様を弁別できたが、OEB、OETの弁別可能な縞幅の差は、初めに考えられたほどの大きなものではなかった。このようなことから、OEBの視覚能力の高進は、最初に仮定された解像度の向上によるのではなく、別の機能によることが考えられた。これまでわれわれは片眼摘出による補償作用を見てきたが、解像度では説明できない点が出てきたので、視覚の中でもより高度な認知能力という点から考えることにした。それには皮質の機能が大きく関与すると考えられたので、皮質そのものの補償機能を調べることとした。そのため幼若時に残存眼と反対側の皮質視覚野を破壊して、その補償効果を見たが、OEB、OETとも大きな効果が現れた。現在はこの点を研究中である。出生直後の片眼を摘出されたラットにおいては、残存眼に関係する視覚経路が補償的に増大し、視覚情報量が正常なラットのそれより多くなることが、これまでの実験から明らかにされている。特に残存眼と同側の視覚経路系の増大、その中でも、上丘-視床の後外側核-皮質視覚野の経路系の増大が顕著であった。この出生直後の片眼摘出に加えて、幼若時に残存眼と反対側の皮質視覚野を破壊することにより、さらに残存眼と同側経路の機能高進生じるかどうかを調べようとしたのが本年度の研究であった。片眼の皮質視覚野破壊は、出生直後ではなく3週齢とした。それはこれまでの研究で脳梁を3週齢で切断したことに合わせるためであった。この時期はまだ皮質の神経構造が未発達なので、十分可塑性が生じる可能性があるからである。出生直後に片眼を摘出し、3週齢で残存眼と反対側の大脳皮質視覚野を破壊し、十分成熟する3ケ月齢で白黒弁別獲得訓練を行った。その結果、このような処置を受けたラットは、正常な動物とほとんど変わりない速度で学習することができた。ちなみに、出生後に片眼を摘出され、3ケ月齢で残存眼と反対側の皮質視覚野を破壊されたラットは白黒弁別を獲得することができない。また、3週齢で視覚野破壊後、3ケ月齢での訓練直前に片眼を摘出されたラットは、弁別を獲得でき、出生時片眼摘出及び3週齢反対側皮質破壊ラットと比べて、獲得速度に有意な差はなかった。

3ケ月齢で片眼摘出、反対側視覚野破壊を同時に受けたラットは、弁別を獲得することができないので、ここで表れた効果は、出生時片眼摘出よりも、3週齢皮質視覚野破壊によってもたらされた補償的効果であると考えられることが示唆された。次年度はこのような補償的効果に係わる上丘-視床後外側核の経路系の役割を調べる。十分成熟した3ケ月齢の片眼が摘出されたアルビノラットに白黒弁別学習課題を与え、獲得後、残存眼と反対側の皮質視覚野を破壊して、再び同じ課題で訓練すると、出生直後に片眼を摘出されたラット(OEB)は、3ケ月齢で片眼を摘出されたラット(OET)より速く再学習することができた。これは出生直後の片眼摘出によって残存眼と同側の視覚神経路系(UXVP)が補償的に再編成したためであると考えられた。この機能高進には解像度の向上が考えられたので、縦縞、横縞の弁別を行うことにした。この研究には視覚能力が高い有色系ラットを被験体として用いた。縞の幅を20mmから5mmへと段階的に下げてゆき、解像能力を調べた。まず、30mmの縞の縦縞と横縞を弁別させ、その後残存眼と反対側の皮質視覚野を破壊して再学習を課した。30mmの縞の弁別の再成立にはOEB、OETの差はなかった。段階的に縞の幅を狭くすると、OETは10mm、OEBは7.5mmの幅まで弁別することができた。しかし、反対側皮質視覚野破壊後にはじめて課題を与えると、OEB、OETとも弁別学習が成立しなかった。いったん学習した後、UXVPを用いて再学習するとかなり狭い幅の縞模様を弁別できた。そして、OEB、OETの弁別可能な縞幅の差は、初めに考えられたほどの大きなものではなかった。このようなことから、OEBの視覚能力の高進は、最初に仮定された解像度の向上によるのではなく、別の機能によることが考えられた。OEBがOETより視覚野の誘発電位記録可能部位が広いことから、OEBの視野の広がりが、手がかりに対する認知能力を高めているということが、ひとつの可能性として考えられた。現在、この問題を明らかにするため、研究を進めている。この機能高進には解像度の向上が考えられたので、昨年度、縦縞、横縞の弁別を行ってその点を調べた。その研究には視覚能力が高い有色系ラットを被験体として用いた。いったん学習した後、UXVPを用いて再学習するとかなり狭い幅の縞模様を弁別できたが、OEB、OETの弁別可能な縞幅の差は、初めに考えられたほどの大きなものではなかった。3週齢で残存眼と反対側の皮質視覚野を破壊して、13週齢にアルビノラットの白黒弁別獲得訓練を行うと、OEB、OETとも弁別することができた。これまでの研究から、出生後片眼摘出の効果が生じるのは10週齢ほどと考えられている。
「音環境をいかした保育」のカリキュラム開発

本研究では,保育実践における音環境を保育者がどのように構築すべきかを明らかにするため,保育者のための「音環境チェックリスト」を活用したワークショップ・プログラムの開発を行った。このプログラムは,チェックリストへの回答,グループディスカッション,発表,そして1週間音日記をつけた後に,最終的な振り返りを行うというものである。研修を終えた後,保育者は音環境に対する意識が改善されたという結果が得られた。本研究では,保育現場で実践モデルとなり得る「音環境をいかした保育」のカリキュラム開発と,この実践モデルを現場に対して啓蒙していくことを目的としている。21年度は申請者らが作成した「音環境をいかした保育実践のためのチェックリスト」試行版を用いた保育者への調査結果を精査し,「1.保育者が把握している物理的・空間的環境」「2.保育者が行う物理的・空間的環境構成」「3.人的環境としての保育者のあり方」「4.音や音楽に関わる保育活動」「5.子どもの様子」の5群40項目からなる改定版「保育における音環境チェックリスト」を作成した^i。そしてこの改訂版チェックリストを用いて,再度保育者らを対象とした調査を実施し,指標となる音環境の要因として,「(1)音楽活動への接触」,「(2)音への関わり」,「(3)音環境の構成」,「(4)環境音への気づき」の4因子を抽出し,それぞれの因子についての考察を行った。その結果,保育者は物理的・空間的環境及び人的環境といった具体的な音の環境については意識を向けやすいが,保育内容・方法・援助や子どもの様子から音環境をとらえ直すという点については意識が向きにくいという結果が得られ,さらに,チェックリストを用いることにより,保育者の音環境に対する意識を高め,保育のふりかえりや様々な気づき・工夫を促す可能性が示唆された。また,保育者が音環境を意識しながら具体的な保育内容・方法・援助を導くための手立てとして,「音環境マップ」の活用を提案し,日々の保育実践の中でどのように音環境をいかすことができるかについての検討を行った。その結果,「音環境マップ」を作成することで,遊びと場の音環境特性との関係が分かる,意識的に必要な音環境を作り出すことができる,音環境に配慮しながらそれぞれの遊びや場をどのように繋ぐ(あるいは切り離す)かの工夫が可能となるなど,園の音環境を俯瞰的に見つつ,具体的な保育内容・方法・援助にいかすことが可能となることが示唆された。22年度は申請者らが作成した「音環境をいかした保育実践のためのチェックリスト」試行版を用いた保育者への調査結果を元に作成した改訂版での再調査を実施し,子どもにとって望ましい音環境を構成しそれらを保育にいかしていくために,音環境を構成する要素を明らかにし,さらに,保育者の経験年数と音環境の意識要因との関連を明らかにすることを目的とした。その結果,音環境の構成要因としては,〈音への関わり〉〈音楽活動への接触〉〈音環境の構成〉〈環境音への気づき〉の4つの要因が見いだされた。また保育者の経験年数と音環境の意識要因との関連については,子どもの直接的な音への関わりに関する要因については,保育経験年数に関わらず意識は高いが子どもが行う音楽活動についての意識や保育者が行う環境構成についての意識については,経験年数との関連が見られた。本研究では,保育における「望ましい音環境」について検討し,保育者が意識的に環境を構成し配慮すべき要因を明らかにした。また,保育者自身が音環境を意識することを通して自らの保育実践をふりかえり評価するための「音環境チェックリスト」を作成し,実際にこのチェックリストを用いた調査を行ってきた。チェックリストは試行版,改訂版,再改訂版を作成し,それぞれ調査結果を分析して改訂を重ねてきたが,23年度は,再改訂版チェックリストを用いて行った保育者を対象としたワークショップの結果を通して,保育者の音環境に対する意識がどのように変容していったか,そのプロセスについて明らかにした。ワークショップで使用した再改訂版チェックリストは,音や音楽に関わる子どもの様子や,保育者の音や音環境に対する意識について,「よくあてはまる」から「全くあてはまらない」までの4段階で回答する項目(19項目)と,記述式で回答する項目(8項目)からなる。ワークショップを行った結果,保育者は,チェックリストを記入することにより,自身の音や音環境に対する意識の程度を確認し,次にグループディスカッションを通して,自分では気づかなかった視点やとらえ方があることを知ることができた。さらにワークショップ後に行う音日記では,日々の生活や保育の中で音に対する意識を明確にもつことの必要性や,それを保育にいかす工夫の必要性に気づくなど,チェックリスト,グループワーク,音日記が,保育者らの音や音環境に対する意識の変化に有効に働くことが示唆された。
"準ソフト系"コロイド結晶における構造固体化技術の開発

準ソフト系コロイド結晶の構成因子である濃厚ポリマーブラシ層の構造設計を行うことで、コロイド結晶の構造固定化を行った。具体的にはブロック共重合による複合微粒子の最外郭への光架橋性側鎖を導入し、この複合微粒子を用いてコロイド結晶を作成した。結晶化前後の構造を共焦点顕微鏡により直接観察し、光架橋の前後で結晶化構造が維持されていることを確認した。この技術を重合性イオン液体に拡張し、新規なイオン伝導経路を有する固体電解質を創製した。シリカ微粒子(Sip)表面からのリビングラジカル重合を経て合成された濃厚ポリマーブラシ/Sip複合体の、濃厚ポリマーブラシ層を構成するグラフト鎖の末端を開始基として、反応性の官能基を有するモノマーのブロック共重合を行い、最外郭に化学修飾が可能な反応性の側鎖を含有する濃厚ポリマーブラシ/Sip複合体の合成を行った。続いて、導入した反応性の側鎖を光ラジカル重合によって架橋が進行すると期待されるビニル基に変換することで、最外郭に架橋性側鎖を有する濃厚ポリマーブラシ/Sip複合体の合成に成功した。上記で合成した、最外郭に架橋性側鎖を有する濃厚ポリマーブラシ/Sip複合体を用いて、準ソフト系コロイド結晶を作成した。調製したコロイド結晶に紫外光を照射して光架橋を試みたが、系全体のゲル化には至らなかった。これは、アルダー転移を経てコロイド結晶を形成する際に、結晶化に必要な自由体積が存在し粒子間の架橋を妨げていることに起因すると考えられる。そこで、架橋性側鎖を有する遊離ポリマー鎖の系中への添加を行った。膨潤した濃厚ポリマーブラシ層はサイズ排除効果を有するため、流体力学的半径が大きい遊離ポリマー鎖は濃厚ポリマーブラシ層の内部には進入できず、粒子間の自由体積部のみに局在することになる。数wt%の遊離ポリマーを添加した系においてもコロイド結晶化が確認され、光照射により系全体がゲル化したが、結晶構造に由来する構造色の消失し、結晶構造の崩壊が示唆された。さらに、照射光強度を最適化することで、結晶構造を保持しつつ、約1時間程度の照射時間で系全体が均一にゲル化する条件を確立した。準ソフト系コロイド結晶における結晶構造の固定化方法を確立は、コロイド結晶の実用化に向けて大きな前進をもたらすものである。リビングラジカル重合に適応可能な四級アンモニウム塩型イオン液体モノマーを用いて、重合条件の最適化を行った。重合溶媒としてアセトニトリル、銅/ビピリジン錯体を用いた原子移動ラジカル重合(ATRP)により、重合度102000の範囲で狭い分子量分布(1.3以下)を保ちつつ自在に分子量を制御する手法を確立した。さらに、上記で確立したイオン液体モノマーのATRPを単分散シリカ微粒子上での表面開始重合に適用することにより、シリカ微粒子上に分子鎖長の揃ったイオン液体濃厚ポリマーブラシの導入を行ったところ、合成過程で粒子間凝集を伴うことなく、1nm^2あたり0.15本という濃厚ブラシ領域に達する高いグラフト密度を達成した。続いて、合成されたイオン液体ポリマーブラシ/シリカ複合微粒子(PSiP)を用いて、微粒子積層型固体電解質の創製を試みたところ、アセトニトリルを溶媒とするキャスト製膜法による自立性の固体膜を得るることができた。電子顕微鏡ならびに原子間力顕微鏡測定よりこの固体膜中ではPSiPが三次元的に規則配列した構造を有していることが明らかとなった。この固体膜のイオン伝導性を評価した結果、ポリマー成分のみの場合と比較して、100倍以上も高いイオン伝導性を示した。磁場勾配NMR測定により各成分の移動速度を測定した結果、固体中あるにもかかわらず同組成のイオン液体のそれに匹敵する値を示していることから、ブラシ末端は高い分子運動性を有すると予想され、PSiPの集積膜は粒子間隙に連続したイオン伝導ネットワークチャネルを形成していると考えられる。
イソシアヌレート・ポリペプチド新高分子組織体の設計とその不斉認識能

本研究は、イソシアヌレート環が剛直な平面六角形構造を有することに着目し、これを基にイソシアヌレート環の周囲に複数のポリペプチド鎖が結合した高分子ナノ組織体を合成し、ポリベプチド鎖の螺旋コンホメーションに起因する三次元不斉認識空間を構築することを目的とした。剛直なコア分子の周囲に複数のポリペプチド鎖を有する高分子は、ポリペプチド螺旋の非共有結合的な相互作用により自己組織化し、互いの位遣関係が3次元的に固定されると考えられる。さらに、これらが協奏的に機能する場合には、それぞれのポリペブチド鎖が単独で存在する場合と比べてより高い不斉認識能を発現すると期待される高分子組織体の一つである。これまでに、コアにホスファゼン環状3量体やポルフィリン環を利用したポリペプチド組織体などが合成されているが、それらを光学活性低分子の不斉認識に用いた研究はなかった。本年度は、ポリペプチド鎖を有するイソシアヌレートを用いた不斉認識能の検討に先立ち、種々のアミノ酸ユニットを有する光学活性な新規イソシアヌレートを合成した。また得られた新規光学活性イソシアヌレートが溶液中でビナフトールの鏡像体を識別できることを見いだし、されにその認識能が複数のアミノ酸を1分子中に組織化したことに起因することを明らかにした。
肝移植後合併症における非造影ＭＲ血流画像、肝線維化画像の確立と臨床的有用性の検討

Time-SLIP法を併用しないMPRAGEシークエンスをT1時間450msec.にて撮像することにより、良好な非造影肝静脈画像を得ることができた。健常ボランティアでの検討から、造影剤を用いなくても肝静脈の描出と血流のみを反映したMR画像が得られることがわかった。今後、肝移植後合併症の一つである静脈うっ血を評価する方法として、造影剤を用いないMR静脈血流画像の有用性が期待される。。本年度より3 T MR装置で、肝臓における非造影MR肝静脈血流washout画像の至適撮像条件の検討することとなった。まず男女健常ボランティアにおいて、非造影MR肝静脈血流washout画像をいくつかの条件で撮像、その画質を評価した。またinversion時間を変化させた非造影MR肝静脈血流washout画像も撮像し、各inversion時間で撮像された画像を組み合わせて差分inversion時間を変化させた非造影MR肝静脈血流washout画像も撮像し、各inversion時間で撮像された画像を組み合わせて差分画像も作成し、肝静脈血流のみを反映した肝血流情報が得るのに最適なinversion時間と差分画像の方法も検討した。その結果、3 T MR装置では、(1)肝辺縁領域における肝実質の血流情報を得るには、Flip Angle120度での撮像が適しており、1600mesec.以上のinversion時間が必要であること、(2) 1.5 TMR装置と比較して、信号雑音比が高く、肝静脈自体の描出は概ね良好であるものの、横隔膜近傍では良好な画質が得られないこと、(3) 1600mesec.の以上の長いinversion時間による撮像ではあるが、1.5 T MR装置と比較して、肝実質の信号回復は弱いこと、(4)単なる差分画像では、アーチファクトが目立つことが判明した。3 T MR装置における非造影MR肝静脈血流washout画像の至適撮像条件が固まってきたので、本年度より、生体部分肝移植術後に肝障害を生じた患者におけるMRIによる非造影のperfusion画像、washout画像及びIVIMを用いたMR線維化画像と各臨床データ、造影CT像、ドップラー超音波検査所見、門脈及び肝静脈の直接造影・圧測定、肝生検の病理学的所見との比較検討を重ねる。。まず男女健常ボランティアにおいて、肝静脈を選択的に描出できるようなTagパルスを設定した非造影MR肝静脈血流washout画像をいくつかの条件で撮像、その画質を評価した。またinversion時間を変化させた非造影MR肝静脈血流washout画像も撮像し、各inversion時間で撮像された画像を組み合わせて差分画像も作成し、肝静脈血流のみを反映した肝血流情報が得るのに最適なinversion時間と差分画像の方法も検討した。その結果、(1)肝辺縁領域における肝実質の血流情報を得るには、最短のTR時間・TE時間・90度以上のFlip Angleでの撮像が適しており、1200mesec.以上のinversion時間が必要であること、(2) 1.5 TMR装置では信号雑音比が低いため、肝静脈自体の描出は良好であるものの、肝実質の信号変化は十分ではないので、薄い撮像スライスでは良好な画質が得られないこと、(3) 1200mesec.の以上の長いinversion時間による撮像では、肝実質の信号が回復してしまうので、肝静脈血流のwashoutによる信号低下と肝実質の信号回復による信号上昇とが相殺され両者の区別が困難であること、(4)単なる差分画像では、アーチファクトが目立つことが判明した。1.5 T MR装置で非造影MR肝静脈血流washout画像を得るにはいくつかの問題点をクリアする必要があると考えられた。そこで本年度より3 T MR装置で、再度肝臓における非造影MR肝静脈血流washout画像の至適撮像条件の検討することとなった。3 T MR装置は、信号雑音比が高く、T1時間も延長し肝実質の信号回復も小さいので、1.5 T MR装置での非造影MR肝静脈血流washout画像撮像で問題となった点を解決できる可能性があると思われる。本年度は生体部分肝移植術後に肝障害を生じた患者におけるMRIによる非造影のperfusion画像、washout画像及びIVIMを用いたMR線維化画像と各臨床データ、造影CT像、ドップラー超音波検査所見、門脈及び肝静脈の直接造影・圧測定、肝生検の病理学的所見との比較検討を行った。Time-SLIP法を併用した非造影肝静脈血流washout画像における至適撮像条件が確立されつつあったが、特定の門脈血流速度、血流方向を反映させた非造影MR perfusion門脈画像や特定の領域における肝静脈うっ滞に関しては、良好な結果が得られず、Tagパルスの設定部位や最適なinversion時間を含めた至適撮像条件が確立できていないことが症例を重ねることで明らかになった。そこで非造影肝静脈

血流washout画像の撮像方法をTime-SLIP法を併用したbSSFPから、Time-SLIP法を併用しないMPRAGE法に変更、撮像条件を再検討した。TI時間を肝実質が無信号となるように設定したTime-SLIP法を併用しないMPRAGE法が、非造影肝静脈血流washout画像として有用なことが確認された。本方法を用いて、生体部分肝移植術後に肝障害を生じた症例での評価を行い、MPRAGE法を併用した非造影のMR門脈perfusion画像、肝静脈血流washout画像及びIVIMを用いたMR線維化画像の臨床的有用性を示し、本法が侵襲性の高い門脈及び肝静脈の直接造影・圧測定、肝生検と同程度の情報をもつ検査となり得るかどうかを明らかにしたいと考えている。医歯薬学当初から非造影肝静脈血流washout画像における至適撮像条件は24年度だけでは確立できないのではないかと予測していた。特定の肝静脈血流速度、血流方向を反映させた非造影MR肝静脈血流washout画像や特定の領域における肝静脈うっ滞に関しては、Tagパルスの設定部位や最適なinversion時間を含めた至適撮像条件の設定が難しい。さらに1.5 T MR装置で、非造影MR肝静脈血流washout画像を得るにはいくつかの問題点があるため、25年度は3 T MR装置で、肝臓における非造影MR肝静脈血流washout画像の至適撮像条件の検討することとなったので、非造影MR肝静脈血流washout画像の至適撮像条件の確立が遅れた。その結果、生体部分肝移植術後に肝障害を生じた患者における検討が遅れたと考えている。当初から非造影肝静脈血流washout画像における至適撮像条件は24年度だけでは確立できないのではないかと予測していた。さらに1.5 T MR装置では信号雑音比が低いため、肝静脈自体の描出は良好であるものの、肝実質の信号変化は十分ではないので、薄い撮像スライスでは良好な画質が得られないこと、1200mesec.の以上の長いinversion時間による撮像では、肝実質の信号が回復してしまうので、肝静脈血流のwashoutによる信号低下と肝実質の信号回復による信号上昇とが相殺され両者の区別が困難であること、単なる差分画像では、アーチファクトが目立つことが判明した。1.5 T MR装置で非造影MR肝静脈血流washout画像を得るにはいくつかの問題点があるため、非造影MR肝静脈血流washout画像の至適撮像条件の確立が遅れていると考えている。まず優先してきた非造影MR肝静脈血流washout画像の至適撮像条件がほぼ固まってきたので、生体部分肝移植術後に肝障害を生じた患者での撮像を重ねることとする。
癌骨転移の成立・進展における骨微小環境および免疫系が果たす役割の検討

【目的】肝細胞増殖因子(HGF)は癌の増殖・浸潤・血管新生を促す。また骨芽細胞はHGFを産生するが、骨転移とHGFの関連は明らかではない。そこで我々はマウス乳癌細胞株、BALB/c-MC(BALB)を用いて骨転移へのHGF関与を検討した。【方法および成績】癌細胞のマウスにおける骨転移組織(左心室腔への癌細胞投与による転移系)を評価すると腫瘍周囲基質にHGF発現がみられ、その部位に一致して血管新生の指標となるCD31陽性血管が認められた。詳細を検討するためにBALB、骨髄細胞および骨芽細胞の培養上清中のHGF濃度を測定するとBALB、および骨髄細胞では感度(0.4ng/ml)以下であったが、骨芽細胞では3.13±0.25ng/mlであり、この濃度は既報より血管新生を促進しうる濃度であった。以前の検討ではBALBを骨髄細胞と共存培養したとき、培養上清中のPGE_2濃度が上昇したので、培養系にPGE_2を添加すると骨芽細胞からのHGF産生は増加した。それに対してBALBおよび骨髄細胞においては依然として測定感度以下であった。5ng/mlのHGFを添加するとBALBの増殖は亢進し、HGF受容体であるc-MetのBALBにおける発現もWestern blotで確認された。浸潤能を評価するためBALBを基底膜モデルであるマトリゲルコートインサート上に播種し、下層にHGFを添加してインサート通過数を計測するとHGF添加はBALBの通過を3倍に増加させた。また下層に骨芽細胞を培養すると、BALBの通過は増加し、その効果はHGF阻害剤NK4で抑制され、さらにc-Met中和抗体添加でも抑制された。【結論】骨芽細胞の産生するHGFはマウス乳癌細胞株、BALBの骨・骨髄への浸潤を促進し、さらに増殖を刺激すると考えられた。またHGFは転移巣での血管新生を誘導し癌の増殖・進展を促進すると考えられた。

浸潤能を評価するためBALBを基底膜モデルであるマトリゲルコートインサート上に播種し、下層にHGFを添加してインサート通過数を計測するとHGF添加はBALBの通過を3倍に増加させた。また下層に骨芽細胞を培養すると、BALBの通過は増加し、その効果はHGF阻害剤NK4で抑制され、さらにc-Met中和抗体添加でも抑制された。【結論】骨芽細胞の産生するHGFはマウス乳癌細胞株、BALBの骨・骨髄への浸潤を促進し、さらに増殖を刺激すると考えられた。またHGFは転移巣での血管新生を誘導し癌の増殖・進展を促進すると考えられた。
人為攪乱と水位管理による氾濫原植物の出現メカニズム解明

日本最大の水田単作地帯である越後平野は、かつて広大な氾濫原湿地帯であった。しかし、戦後の圃場整備によって、本来の氾濫原湿地としての環境は急速に失われた。本研究では、越後平野のあらゆる氾濫原環境における植物種組成とそれを規定する要因について広域的・横断的に調査し、平野全体の植物種多様性を保全していくための土地管理指針を構築することを目的としている。さらに、具体的な保全手段の一つとして、「休耕田の湿地化(再生湿地)」に着目し、越後平野の休耕田における野外実験を3年間継続した。この実験では、現在では激減している水湿生植物種の埋土種子の発芽を効果的に促すための休耕田の管理方法の特定を目指した。研究最終年度である今年度は、再生湿地の管理・調査を継続するとともに、越後平野の農業用水路網において野外調査を行った.今年度までの調査によって、越後平野の水田地帯における全ての氾濫原要素(耕作田・休耕田・農業用水路)において植物の出現パターンを評価できた。その結果、休耕田と土水路の環境の多様性が圃場ごとの植物種組成の多様性を生み、平野全体の植物種多様性を高めていることが明らかとなった。特に、管理が粗放な休耕田や、水が抜けにくい土水路では、かつて湿地帯だった頃に生育していたと考えられる水湿生種が出現した。さらに、水深11cm以上で管理した再生湿地では、上記のいずれの氾濫原環境にも生育が確認されなかった種が出現したことから、本取り組みが水湿生植物の保全に有効であることが示された。以上より、越後平野のような沖積平野の水田地帯における植物種多様性の保全を検討する際には、植物にとって過酷な攪乱体制である現代農業の耕作圧の緩和が必要であると言える。今後、人口の減少に伴って耕作田の面積が縮小していくと考えられることから、耕作放棄される土地を計画的にかつての湿地帯だった時代の環境に戻していくような土地利用計画を検討する必要があるだろう。日本最大級の沖積平野である越後平野は,戦後の圃場整備によって本来の氾濫原としての環境を失った.本研究の目的は,休耕田をかつての氾濫原に類似した環境(再生湿地)として管理することで,減少しつつある氾濫原生の植物種を保全する手法を考案することである.一年目である今年度は,休耕田を湿地として管理するための基礎的情報を得ることに重点を置いた.実施した調査内容と結果の概要を以下に示す.1.越後平野全面の70枚の休耕田における成立植生調査現在の越後平野における植物の分布特性の理解は,再生湿地として管理する休耕田の選定のために不可欠である.休耕田の植物分布は,地域的・物理的要因よりも植生遷移段階が影響している傾向が示された.植生遷移が初期段階の休耕田には多数の絶滅危惧種が確認された.2.河川域における植物種多様性のホットスポットの環境特性調査効果的な再生湿地の管理手法を考案する上で,現在も氾濫原である河川域においてどのような環境特性が植物種多様性を高める要因となるのかを明らかにすることは重要である.頻繁に冠水と乾燥を繰り返すような環境において高い植物種多様性が維持されていることが確認された.3.再生湿地における成立植生及び埋上種子組成来年度は,休耕田を再生湿地として管理するための操作実験を本格的に開始する.そのための予備調査として,昨年度から試験的に再生湿地として管理している3枚の休耕田における成立植生と埋土種子組成を調査した.その結果,土壌耕起の有無,湛水期間,水深によって人工的に出現植物を管理できる可能性が示された.日本最大の水田単作地帯である越後平野は,かつて広大な氾濫原湿地帯であった.しかし,戦後の圃場整備によって,本来の氾濫原湿地としての環境は急速に失われた.本研究の目的は,越後平野の水田地帯で近年増加しつつある休耕田を「再生湿地」として管理することで,地上では激減した氾濫原生植物種の埋土種子の発芽を促し,持続的に保全していく手法を提示することである.研究二年目である今年度は,再生湿地の管理・調査を継続するとともに,通常の稲作が行われている水田(慣行田)や湖沼において野外調査を行った.1.越後平野広域を対象とした水田地帯における植物分布とそれを規定する要因現在の越後平野における慣行田と休耕田の植物種組成の比較は,保全が急がれる植物種の選定のために不可欠である.昨年度調査した休耕田と比較して,慣行田では水田由来の絶滅危惧種が多く出現する一方,原野の氾濫社原環境を選好する種群はほとんど出現しなかった、このことから,休耕田でかろうじて存続している氾濫原生植物種を,再生湿地で効果的に保全していくことの必要性が明らかになった.2.越後平野に残存する3湖沼の沿岸における植物分布とそれを規定する要因圃場整備による埋め立てを免れた3湖沼の沿岸において,大規模な成立植生調査及び環境要因調査を実施した。その結果,(1)湖沼には他の氾濫原環境には出現しない種が多く存在すること,(2)それらの種の分布には冠水頻度や土壌表層のリター量などの要因が複合的に影響していることが明らかになった.3.再生湿地に成立する植物群落の特異性再生

湿地の創出が,水田地帯全体の植物種多様性の保全に貢献するか否かを評価するために,再生湿地周辺に存在する全ての環境要素(慣行田・休耕田・調整水田・ハス田)において植生調査を実施した.その結果,再生湿地では,他の環境要素では全く生育が確認されなかった多くの湿生種が出現していたことから,再生湿地の創出が水田地帯全体の植物種多様性を高めることが示唆された.これまでの研究によって,人為的に改変された沖積平野のかっての氾濫原環境における植物分布とそれを規定する要因を評価できた,研究3年目の来年度は,得られた豊富なデータを論文にまとめ,発表することに重点をおく.日本最大の水田単作地帯である越後平野は、かつて広大な氾濫原湿地帯であった。しかし、戦後の圃場整備によって、本来の氾濫原湿地としての環境は急速に失われた。本研究では、越後平野のあらゆる氾濫原環境における植物種組成とそれを規定する要因について広域的・横断的に調査し、平野全体の植物種多様性を保全していくための土地管理指針を構築することを目的としている。さらに、具体的な保全手段の一つとして、「休耕田の湿地化(再生湿地)」に着目し、越後平野の休耕田における野外実験を3年間継続した。この実験では、現在では激減している水湿生植物種の埋土種子の発芽を効果的に促すための休耕田の管理方法の特定を目指した。研究最終年度である今年度は、再生湿地の管理・調査を継続するとともに、越後平野の農業用水路網において野外調査を行った.今年度までの調査によって、越後平野の水田地帯における全ての氾濫原要素(耕作田・休耕田・農業用水路)において植物の出現パターンを評価できた。その結果、休耕田と土水路の環境の多様性が圃場ごとの植物種組成の多様性を生み、平野全体の植物種多様性を高めていることが明らかとなった。特に、管理が粗放な休耕田や、水が抜けにくい土水路では、かつて湿地帯だった頃に生育していたと考えられる水湿生種が出現した。さらに、水深11cm以上で管理した再生湿地では、上記のいずれの氾濫原環境にも生育が確認されなかった種が出現したことから、本取り組みが水湿生植物の保全に有効であることが示された。以上より、越後平野のような沖積平野の水田地帯における植物種多様性の保全を検討する際には、植物にとって過酷な攪乱体制である現代農業の耕作圧の緩和が必要であると言える。今後、人口の減少に伴って耕作田の面積が縮小していくと考えられることから、耕作放棄される土地を計画的にかつての湿地帯だった時代の環境に戻していくような土地利用計画を検討する必要があるだろう。
ミトコンドリアを介するポストコンディショニング成立機構の解明

虚血再灌流直後に短時間の可逆性虚血を繰り返すことで心筋保護作用を発揮するポストコンディショニング現象のメカニズムをPI3-kinaseとの関連で検討した。ウサギの心筋梗塞モデルを用いて30分の虚血直後にPI3-kinaseを活性化する薬物を10分間投与して心筋梗塞サイズの縮小効果が認められるかどうか調べた。アドレノメデュリンを投与すると梗塞サイズは有意に減少し,この効果はPI3-kinase阻害薬のLY294002で完全に消失した。同様に,糖尿病治療薬であるグリメピリドもPI3-kinaseのリン酸化をともなって梗塞サイズを縮小することが判明した。したがって薬理学的ポストコンディショニングに再灌流直後のPI3-kinaseの活性化が重要であることが示唆された。さらに,PI3-kinaseの下流にミトコンドリアK^+チャネルの活性化が関与するかどうかを,ウサギ心室筋細胞のフラボプロテイン酸化蛍光を指標に検討した。アドレノメデュリンはプロテインキナーゼAを介してミトコンドリアCa^2+活性化K^+(mitoK_ca)チャネルを活性化したが,アドレノメデュリンの梗塞巣縮小効果はmitoK_caチャネル遮断薬であるパキシリンでは抑制されなかった。すなわち,PI3-kinaseを介するアドレノメデュリンのポストコンディショニングにはmitoK_caチャネルの活性化が必ずしも必要でないことが示唆された。