hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
高血圧、活性習慣及び脂質代謝異常の関連に関する研究

近年、動脈硬化、特にアテローム硬化の発症機構に過酸化脂質の関与が報告されており、循環器疾患と過酸化脂質の関係が注目されている。そこで従業員7000人の某企業から無作為に抽出した男女352人を対象に過酸化脂質を測定し、食生活、飲酒、喫煙等の生活習慣や健診成績との関連を検討した。1)血清過酸化脂質(TBARS)や八木法を改良して、過酸化脂質生成の過程で生じるアルデヒドの一種であるアルケナ-ルを高速液体クロマトグラフ法で測定した。血清TBARSの平均値は男4.8±2.1、女5.3±2.9nmol/mlであり、血清アルケナ-ルの平均値はプロパノールが男1.17±0.66、女0.99±0.47μg/ml、ブタノールが男0.10±0.01、女0.08±0.04μg/mlであった。2)血清TBARSやアルケナ-ルは体格(BMI)、血圧、血清脂質、肝機能と強く関連が見られた。また栄養調査成績との関連は、血清TBARSやアルケナ-ル値は栄養素等摂取量と相関が見られた。血清TBARSは中等度以上の飲酒習慣で高値を示したが、喫煙習慣と関連は認められなかった。3)Pagliaらの変法によって、血清および赤血球中GPX活性の測定を男性について行った。血清GPX活性の平均値は、389±42U/mlであった。蛋白1mg当たりの活性値では、5.24±0.59U/mg・proteinであった。また、赤血球GPX活性の平均値は、59.3±6.2U/mg・Hbであった。4)喫煙習慣によって、赤血球GPX活性は変わらなかったが、血清GPX活性は低値を示した。中等度以上の飲酒習慣によって、血清GPX活性はかわらなかったが、赤血球GPX活性は高値を示した。GPXと健診成績との関連では赤血球GPXは関連が認められなかったが、血清GPX活性は喫煙習慣によって低値を示す血清HDL-コレステロールとの間に正に相関がみられた。食生活を中心とした生活習慣と高血圧、脂質代謝異常の関連を検討するために、富山県内にある従業員約7,000人のアルミサッシ及びファスナ-製造工業を対象にして調査を行った。初年度としてまず健康管理センターの周辺に勤務地がある建材部、ファスナ-事業部、管理部の従業員約2,000人の中から、20から59歳までの従業員を10歳年齢階級、性別に各群50人づつ無作為に層化抽出を行い、抽出順に各群40人を目標に循環器検診と生活習慣調査を実施した。抽出の際50-59の女は従業員数が少なく、40人しか抽出できなかった。受診者総数は325人で男は20歳代、30歳代、40歳代、50歳代の各群それぞれ44人、42人、40人、37人の計163人で、女は各年齢群それぞれ44、41、46、31人の計162人であり、50歳代の男女で40人の目標を達成できなかった。生活習慣調査は問診により運動や精神ストレス、嗜好(飲酒、喫煙)を行った。

さらに栄養調査を24時間思い出し法および配票自己記入方式で2日間実施し、栄養士による聞き取り確認を行った。摂取栄養素及びその充足率の計算は栄養計算ソフト「NUTUS」により実施した。循環器検診は血圧測定、血液検査、尿検査を実施した。血圧測定は30分安静後、ランダムゼロ血圧計により2回測定した。血液検査は血清電解質(Na、K、Ca、Mg)、血清脂質(総コレステロール、中性脂肪、HDL-コレステロール、リポ蛋白分画、Lipo(a)、RLP-コレステロール、アポ蛋白(Al、B、E)及びその他であり、次年度過酸化脂質、アルケナ-ル測定用に血清の一部は-80°Cで保存した。尿検査は24時間蓄尿検査を実施し、尿中Na、K、Ca、Mg、クレアチニンの測定を行った。次年度過酸化脂質、アルケナ-ルの測定を行い、今年度結果と併せて総合的に検討する予定である。近年動脈硬化、特にアテローム性硬化の発症機構に過酸化脂質の関与が報告され、循環器疾患と過酸化脂質の関係が注目されている。そこで従業員7000人の企業から性・年齢層化により無作為に抽出した325人について、血清過酸化脂質の測定とともに、血圧測定、血清脂質検査(総コレストロール、中性脂肪、HDLコレステロール,LDL、VLDL、Lipo(a)、アポ蛋白、RLPコレステロール)、栄養調査、生活習慣調査を実施し、その関連を検討した。従来の過酸化脂質物質の測定法では多くの前駆物質、誘導体、分解産物を含んでいるので、その測定は八木らのTBA法以外に過酸化脂質生成過程で生じるMDA以外のアルデヒドである4種のアルケナ-ル(プロパナ-ル、ブタナ-ル、ペンタナ-ル、ヘキサナ-ル)を測定した。さらに男について生成した過酸化脂質の消去に関連があるとされているグルタチオン・ペルオキシダーゼ活性(GPX)を測定した。その結果TBA法による過酸化脂質は男女とも血圧、血清総コレステロール、中性脂肪、LDL、VLDL、アポ蛋白(A、B、E)と、女でRLPコレステロールと正の関連が見られたが、HDLコレストロールやLipo(a)とは関連が認められなかった。プロパノールは男で血圧と正相関、女でHDLコレステロール、RLPコレステロール、アポ蛋白A、Eと負の相関を示した。ブタノールは男でLDL、VLDLと正の相関、女でHDLコレステロール、RLPコレステロール、アポ蛋白A、Eと負の関連が見られた。ペンタノール,ヘキサノールは女でアポ蛋白の一部と関連が示唆されたのみであった。GPXもHDLコレストロールと正の関連が見られたのみであった。これらの結果は飲酒や喫煙の影響を補正する必要があるが、血清過酸化脂質と循環器疾患は何らかの関わりがあることを示している。今後栄養調査の結果や生活習慣との関連を含めた解析を行う予定である。
口腔癌悪性度を決定するスーパーエンハンサーによる系統的転写制御機構の解明

スーパーエンハンサー(SE)は強力なエンハンサー領域であり、幹細胞をはじめ各組織の細胞系統を特徴付けるような遺伝子発現を制御する。癌に関して発生、進展・悪性化・治療抵抗性などに大きく関与していると考えられ、世界的にSEの検索・同定とその制御薬の開発競争が開始されたところである。本研究では、全ゲノムワイドな解析により、口腔扁平上皮癌に特異的なSE、癌の発生、進展・悪性化(増殖・浸潤・転移等)に特異的なSE、そのターゲットであるmiRNA、long non coding RNA、遺伝子等を検索・同定し、口腔扁平上皮癌特異的な発生メカニズムを検討すると共に、各SEを制御する薬剤や治療法を検討する。
精神分裂病の継時的認知統合機能の研究

1.精神分裂病の基本的病態として、臨床精神病理学的には「知覚の時間的、空間的な連続性の喪失」「知覚の断片化」など、継時的に繋がりを持った知覚ができなくなるという考察がある。しかし現在までのところ精神分裂病の情報処理障害論のなかでは、比較的短時間に提示される纏まりをもった知覚刺激を処理し、反応する過程の異常を問題にするものが多く、一方、いわば断片的な知覚情報を継時的に統合し、纏まった認知を形成する過程の異常を研究したものは少ない。そこでわれわれは新しい検査システムを開発し、継時的認知統合機能の異常の有無を実験的検討した。2.新しく開発した検査システムは、プログラム言語Quick BASICを用いてPC98上で作動する以下のようなものである。カラーモニター画面上に刺激図形を提示するが、その上から黒色の遮蔽で図形は隠されている。その遮蔽に直径30mmの覗き穴をあけて裏側の刺激図形を部分的に見えるようにする。マウスを動かすことにより、被検者はその覗き穴を自由に連続的に画面上で動かすことができる。覗き穴を動かして図形をトレースし、刺激図形の部分を統合することで刺激図形の全体を認知できる。3.慢性の精神分裂病患者25名を対象に以上の検査システムを使い、12の刺激図形を順次提示し、各刺激図形の描写による再生、及び6つの図形から正解の刺激図形を選択する再認を行わせた。また患者の症状評価をSAPS及びSANSを用いて行い、再生、再認の誤答数と、症状との関係を調べた。4.精神分裂病患者で、この課題で再生、および再認のいずれにも障害が認められた。5.以上の結果から、精神分裂病には継時的認知統合機能に障害があることが図形認知のレベルで実験的に確認された。またこの障害は思考障害と関係することが示唆された。
高極性官能基の不斉水素化によるキラル化合物の効率的創出

長年,高温高圧下でのみ進行することが知られていた様々なカルボン酸誘導体の直接水素化反応を,極めて穏和な条件下に進行させうる新たな触媒を開発した.さらにこの触媒が分子性である利点を生かし,高度なキラル修飾を通じて新規な不斉水素化反応を実現した.その結果,他法では得難いキラル化合物の効率的創出が可能となった.また本水素化反応の触媒活性が,反応系に共存する塩基の効果によって劇的に向上することについて詳しく調べた.長年,高温高圧下でのみ進行することが知られていた様々なカルボン酸誘導体の直接水素化反応を,極めて穏和な条件下に進行させうる新たな触媒を開発した.さらにこの触媒が分子性である利点を生かし,高度なキラル修飾を通じて新規な不斉水素化反応を実現した.その結果,他法では得難いキラル化合物の効率的創出が可能となった.また本水素化反応の触媒活性が,反応系に共存する塩基の効果によって劇的に向上することについて詳しく調べた.独自に見いだした2-オキサゾリジノンを出発とする1, 2-アミノホスフィン化合物合成法を利用してさまざまなキラル1, 2-アミノホスフィン化合物を合成し、これをCp^*Ru(II)フラグメントに導入して新たなキラルCp^*Ru(PN)錯体の触媒ライブラリを構築した.さらにこれらを利用してさまざまな双環性対称イミド類の非対称化を伴うエナンチオ選択的水素化反応を開発し,他法では得がたい多官能基化された環状キラル化合物を迅速簡便に供給する方法を開発した.さらにイミド類よりも還元の難しいエステルやラクトン類の水素化反応に有効な分子触媒系をあらたに見いだすすとともに,触媒分子をキラル修飾することによりラセミ体エステルの動的速度論的分割を伴うエナンチオ選択的水素化反応を開発し,光学活性アルコールを得る新たな方法を案出した.この二つの方法はこれまでにまったく類例を見ない触媒的水素化反応でありながら,省力的な方法で高付加価値化合物を得る魅力的な手法を提供するものである.またハーフサンドイッチ構造をもつ新たな分子触媒として,キラルSN配位子を導入したルテニウム錯体やテザー型のアミン配位子をもつロジウム錯体などをあらたに合成しそれらの構造と反応性を明らかにした.特に前者は不斉水素移動型還元反応の触媒として有効であることを明らかにし,広範なカルボニル化合物から二級アルコールを高エナンチオ選択的に得る簡便な新手法を提供し得ることを明らかとした.これまでに開発したCp^*Ru(PN)錯体触媒に関連し,等電子構造をもつテザー型構造を持つロジウムやイリジウム錯体をあらたに創製し,これらがケトン類の不斉水素化反応触媒として機能して光学活性2級アルコール類を効率よく与えることを見いだした.またCp^*Ru(PN)錯体触媒と構造類似のアレーンルテニウム錯体と2-アミノエタンチオール配位子からなる触媒系がケトン類の不斉水素移動型還元反応に有効であることはにすでに報告していたがその作用機構と触媒分子の設計指針が不明瞭であったので,そのメカニズム解明にとりくみ,単核ハーフサンドイッチ構造をもつ配位不飽和ルテニウム中間体がプロトン移動に対して重要な役割を担っていることを明らかにした.この結果,光学活性2-アミノエタンチオール類を活用する自在なキラル触媒デザインが可能となった.さらにアルコール類の可逆的な水素移動に対して有効であったCp^*Ru(PN)錯体の配位子部分の構造修飾を通じて,非対称ジオール類の酸化的ラクトン化における位置選択性制御に成功し,リグナン類の合成プロセスの鍵反応として利用可能であることを示したまた容易に調製可能な面不斉9員環不飽和分子に着目し,不飽和部位と遷移金属フラグメントとの反応によって得られる錯体の構造を精査することを通じて,不飽和結合上の特異な混成軌道とこれに起因する制限された分子運動との関係を明らかとした.さらに反応性に富む不飽和結合が金属錯体形成を通じて化学的に保護されることを利用して他法では困難な分子変換を開発した.またこの面不斉9員環不飽和分子の触媒的不斉合成法の開発に新たに成功し,より自在な類縁体合成とその立体化学挙動の解明に新たな道を開いたこれまでに開発したCp^*Ru錯体(Cp^*:ペンタメチルシクロペンタジエニル)のカルボン酸誘導体の水素化反応に対する触媒活性を詳細に調査した結果,モレキュラーシーブスを反応系に共存させ水を厳密に除去すると触媒寿命が向上し基質適用範囲が拡大することが分かった.その結果,これまで高い化学選択性が得られなかった鎖状エステルやカルボキサミドから対応するアルコールが効率よく得られることが明らかとなった.またキラルジアミンやアミノホスフィン類を配位子とするCp^*Ru錯体を新規に合成して,その立体構造を明らかにするとともに不斉水素化反応に対する触媒機能を精査した.その結果N,N'-ジメチルシクロヘキサンジアミンをキラル配位子とするCp^*Ru錯体がα-アリールあるいはα-ベンジル-γ-ブチロラクトン類の動的速度論的分割を伴う不斉水素化の触媒として有効であり,リグナン類の合成中間体として有用なジオール類をエナンチオ選択的に与えることが明らかとなった.

さらにルテニウム触媒と共に用いる塩基が,反応速度とエナンチオ選択性に及ぼす影響について調べた結果,ルテニウム触媒の量を塩基に対して相対的に増大させると反応速度のみならずエナンチオ選択性も向上するという興味深い知見が得られた.さらにシクロペンタジエニル配位子をプロティック官能基化したRu錯体を導く一般的な手法を新たに開発するとともに,錯体分子に組み込まれた新たなプロティック官能基が触媒機能に与える影響を調べた.その結果,ケトン類の触媒的水素化反応には大きな影響を与えないのに対して,その逆反応であるアルコール類の脱水素化反応を効果的に阻害することを見いだした.
食塩感受性高血圧の腎障害に対するリハビリ運動療法の治療的・予防的効果と機序の解明

食塩感受性高血圧とそれに伴う腎障害に対する長期的運動の治療的効果とその機序を明らかにするために、Dahl食塩感受性(Dahl-S)ラットに食塩負荷と同時に長期的運動を行い、血圧や腎障害の進展について検討した。その結果、長期的運動は食塩負荷により生じたタンパク尿や糸球体硬化の進展を有意に抑制した一方で、長期的運動は高血圧や腎間質の線維化の進展は抑制しなかった。これらの結果から、食塩感受性高血圧に伴う腎障害に対する長期的運動の治療的効果は血圧とは独立した機序によるものである可能性と、主に糸球体病変に対するものであることが示唆された。また、食塩感受性高血圧とそれに伴う腎障害に対する長期的運動の予防的効果とその機序を明らかにするために、Dahl-Sラットに対して食塩負荷の2週間前から長期的運動を行ったところ、食塩負荷後の高血圧と腎障害の進展が有意に抑制された。これらの結果は長期的運動には食塩感受性高血圧とそれに伴う腎障害に対して予防的効果を有することが明らかとなった。さらに、長期的運動の食塩感受性高血圧とそれに伴う腎障害に対する治療的・予防的効果の機序について検討した。長期的運動の腎保護作用には、腎臓の酸化ストレスや一酸化窒素(NO)系が関与していることがいくつかの疾患動物モデルで報告されていることからこれらに着目した。前年度までに、治療的・予防的介入のいずれにおいても、長期的運動により腎臓の酸化ストレスが有意に軽減し、腎保護作用に対する酸化ストレス軽減の影響が示唆されていたので、最終年度はNO系についての検討を実施した。食塩を負荷したDahl-Sラットでは腎臓でのNO合成系の異常が認められ、長期的運動により腎臓でのNO合成酵素のタンパク発現は改善がみられたもののNO合成やNO活性には有意な変化は認められなかった。食塩感受性高血圧とそれに伴う腎障害に対する長期的運動の治療的効果とその機序を明らかにするために、食塩負荷と同時に長期的な運動を行ったDahl食塩感受性(Dahl-S)ラットにおいて検討を行った。雄性Dahl-Sラットを、通常食塩食群(コントロール群)、通常食塩食+長期的運動群、高食塩食群、高食塩食+長期的運動群の4群に分け、長期的運動群には中等度の強度のトレッドミル運動を高食塩食の開始と同時に開始し8週間にわたり実施した。高食塩食負荷により高食塩食負荷により著しい高血圧と蛋白尿を生じ、血漿クレアチニン値の増加やクレアチニンクリアランスの低下を認めた。長期的運動は血圧の上昇は抑制しなかったが、尿蛋白排泄量の増加は有意に抑制し血漿クレアチニン値を低下しクレアチニンクリアランスを改善する傾向が見られた。また、腎の組織学的検討では、高食塩食負荷は糸球体の硬化を生じたが、長期的運動はこれを抑制する傾向が認められた。さらに、高食塩食負荷は酸化ストレスマーカーである過酸化水素やチオバルビツール酸反応物質の尿中排泄量を著明に増加させたが、長期的運動はこれらの排泄を抑制した。また、長期的運動は一酸化窒素(NO)産生のマーカーである窒素酸化物の尿中排泄も増加させた。以上の結果より、長期的運動はDahl-Sラットにおいて食塩負荷により生じた腎障害の進展を抑制することが明らかとなった。さらに、この長期的運動の腎保護作用は血圧とは独立した機序によるものであり、酸化ストレスやNO産生系が関与している可能性が示唆された。高食塩食負荷や運動プロトコルなどの介入条件の設定に時間を要したため、解析の開始が予定よりやや遅れたが、長期的運動がDahl-Sラットにおいて腎保護作用を持ち、その作用機序は血圧とは独立した機序であり、酸化ストレスやNO系が関与している可能性を明らかにできた。現在は、長期的運動の腎保護作用の機序の詳細については検討を続けている。食塩感受性高血圧とそれに伴う腎障害に対する長期的運動の治療的効果の機序を明らかにするために、食塩負荷と同時に長期的な運動を行ったDahl食塩感受性(Dahl-S)ラットにおいての検討を行った。前年度の検討にてDahl-Sラットにおける長期的運動の腎保護作用には酸化ストレスや一酸化窒素(NO)産生系の関与が示唆されたので、これらについて詳細な検討を行った。その結果、食塩負荷はスーパーオキサイドの主な発生源である腎NADPHオキシダーゼとキサンチン酸化還元酵素の活性を著明に増加させ、長期的運動はNADPHオキシダーゼ活性には影響を与えなかったが、腎キサンチン酸化還元酵素活性は有意に低下させた。また、食塩負荷により腎の内皮型NO合成酵素(eNOS)活性は低下しているにも関わらず蛋白発現の著明な増加が見られたが、長期的運動は腎eNOS蛋白発現を低下させた。以上の結果から、Dahl-Sラットにおける長期的運動の腎保護作用は腎臓におけるキサンチン酸化還元酵素活性の減弱やeNOS蛋白発現の正常化を介したものであることが示唆された。また、食塩感受性高血圧と腎障害に対する長期的運動の予防的効果とその機序を明らかにするために、食塩負荷に先行して長期的運動を行ったDahl-Sラットにおいての検討も行った。6週齢の雄性Dahl食塩感受性ラットを通常食塩食群、高食塩食群、高食塩食負荷と同時に運動を開始する群、高食塩食負荷に2週間先行して運動を開始する群に分け、中等強度のトレッドミル運動を8週間または10週間実施した。その結果、食塩負荷に伴う高血圧、蛋白尿、腎機能低下に関して、食塩負荷と同時に運動を開始した群では蛋白尿の進展のみ抑制されたが、食塩負荷に先行して運動を開始した群では、これらすべての進展が抑制された。

以上の結果から、長期的運動は高血圧と腎障害に対して予防的効果を持つことが示唆された。平成28年4月に研究代表者の異動(所属研究機関の変更)があり、新しい所属研究機関での研究実施体制の整備に時間がかかったため。食塩感受性高血圧とそれに伴う腎障害に対する長期的運動の治療的効果の機序を明らかにするために、食塩負荷と同時に長期的な運動を行ったDahl食塩感受性(Dahl-S)ラットにおいての検討を行った。前年度までに長期的運動が食塩負荷により生じた蛋白尿や糸球体硬化の進展を抑制することが明らかになっていたので、本年度は腎間質病変に対する長期的運動の効果を検証した。腎間質病変の指標としてマッソントリクローム(MT)染色陽性領域について計測を行ったところ、食塩負荷により著明な線維化が見られ、染色陽性領域は有意に増加し、このMT染色陽性領域の増加は食塩負荷と同時に長期的運動を実施した群においても運動非実施群との間に有意差はなかった。したがって、食塩感受性高血圧に伴う腎障害に対する長期的運動の治療的効果は主に糸球体に対するものであり、間質の線維化に対しては保護作用を示さないことが明らかとなった。また、食塩感受性高血圧と腎障害に対する長期的運動の予防的効果とその機序を明らかにするために、食塩負荷に2週間先行して長期的運動を行ったDahl-Sラットについての検討も行った。前年度までに長期的運動が高血圧および腎障害に対して予防的効果を持つことが示唆されていたので、その機序に関しての検討を行った。その結果、食塩負荷により生じた酸化ストレスが食塩負荷に先行して運動を開始した群にて食塩負荷と同時に運動を開始した群よりも有意に低く、長期的運動の予防的効果についても酸化ストレスの減弱を介したものであることが示唆された。本課題は本年度で終了の予定であったが、平成28年4月に研究代表者の異動(所属研究機関の変更)があり、新しい所属研究機関での研究実施体制の整備に時間がかかったため、進捗が遅れてしまった。食塩感受性高血圧とそれに伴う腎障害に対する長期的運動の治療的効果とその機序を明らかにするために、Dahl食塩感受性(Dahl-S)ラットに食塩負荷と同時に長期的運動を行い、血圧や腎障害の進展について検討した。その結果、長期的運動は食塩負荷により生じたタンパク尿や糸球体硬化の進展を有意に抑制した一方で、長期的運動は高血圧や腎間質の線維化の進展は抑制しなかった。これらの結果から、食塩感受性高血圧に伴う腎障害に対する長期的運動の治療的効果は血圧とは独立した機序によるものである可能性と、主に糸球体病変に対するものであることが示唆された。また、食塩感受性高血圧とそれに伴う腎障害に対する長期的運動の予防的効果とその機序を明らかにするために、Dahl-Sラットに対して食塩負荷の2週間前から長期的運動を行ったところ、食塩負荷後の高血圧と腎障害の進展が有意に抑制された。これらの結果は長期的運動には食塩感受性高血圧とそれに伴う腎障害に対して予防的効果を有することが明らかとなった。さらに、長期的運動の食塩感受性高血圧とそれに伴う腎障害に対する治療的・予防的効果の機序について検討した。
家庭科教員向けのロール・プレイング(アクティブ・ラーニング)研修プログラムの開発

本研究の目的は、家庭科におけるロール・プレイングの教育的効果に関する研究知見を基に、家庭科教員をためのロール・プレイングの研修プログラムを開発すること、さらに家庭科教員のためのロール・プレイングのガイドブックを作成することである。以下、具体的な研究の方法と内容、その成果についての概要を報告する。まず、ロール・プレイングの実施は、2016年8月である。対象者は千葉市の家庭科の教員35名で、研修時間は休憩10分を含んだ120分間である。具体的には講義が30分、DVDの視聴が10分、ロール・プレイングについての講義と実践を60分、まとめと振り返りで20分であった。質問紙の内容は、基本調査として学校名、年齢、ロール・プレイングへのイメージ、取り組み状況、研修への興味・関心を聞いた。また、研修の効果を測る尺度として、価値観、認知、技能という視点をもち、質問紙を作成し、研修の前後に実施した。家庭科の教師が、理論と実践がつながるような研修を開発し、研修は3つのステップで構成した。最初に人間関係学の理論を学び、次にロール・プレイングを体験し、その学びをどのように評価するのかという3段階の内容とした。家庭科の教員向けのロール・プレイングの研修は、以下のような分析結果が得られた。・家族関係を学習することへの価値観を有意に高める。・学習において必要となる知識の認識、授業作りのスキルも有意に高める。二つ目のロール・プレイングのガイドブックの作成については、松村康平の創始した人間関係学を理論とロール・プレイングの実践が結びつくような構成とした。全部で18頁からなり、第1章:家庭科におけるロール・プレイングとは第2章:家族学習の内容第3章:ロール・プレイングを始める準備から評価までで構成した。
アドレノメデュリンの臨床応用を目指した研究-ゲノム・プロテオーム解析を含めて-

我々は血漿アドレノメデュリン(AM)濃度が種々の循環器疾患の重症度の指標となることを明らかにしてきた。本研究では種々の循環器疾患580名において血漿AM濃度ならびにほかの神経体液性因子や臨床指標を測定し、約10年間の年間追跡調査を行い、死亡率の予測因子となるか否かを検討した。90名が死亡し、死亡群ではAM濃度が生存群に比較して明らかに高かった。またAMが高いほど死亡率が高く、単変量解析ではAMや他の神経体液性因子(BNP、ノルエピネフリンなど)、腎機能、危険因子の存在が死亡と関係していたが、重回帰分析ではAMとBNPのみが有意に死亡率の増加と関係していた。このことは循環器疾患における血漿AM濃度測定の有用性を示すものと考えられた。我々はAMの投与は急性投与、慢性投与ともに動物の心不全モデルで有用なことを示してきた。またヒト心不全においてもAMの30分の投与は血行動態を改善した。本研究では、急性心不全症例(n=7)においてAM(0.02μg/kg/min)+ANP(0.05μg/kg/min)を12時間併用投与し、その後のANP単独治療(12時間)と比較した。AM+ANP併用投与で血圧、肺動脈圧、全身血管抵抗、肺血管抵抗をより低下させ、心拍出量をより増加させた。ほかにも併用投与でアルドステロン、BNP、酸化ストレスマーカーをANP単独治療より低下させた。腎作用については両群に有意な差はなかった。また副作用を認めなかった。以上の結果からAM+ANP併用は血管抵抗の減少、心拍出量の増加と神経体液性因子や酸化ストレスの抑制機序が考えられ、AMの急性心不全治療薬としての有用性が示唆された。
仮想版画における画像創成技法の向上およびユーザインタフェースの改良に関する研究

仮想版画は,実世界での版画作成過程をコンピュータで構築した仮想空間内でシミュレーションすることによって,容易に手作りの雰囲気を持つCG木版画画像を合成する手法である.その中で本研究では仮想版画の物理的検討やユーザインタフェースの改良を行うことによって,より現実の版画に近い画像合成を実現することを目的とする.多くの人に使いやすいシステムを実現するだけでなく,将来的には日本固有の木版画である浮世絵の電子保存(デジタルアーカイブ)も視野に入れている.そこで昨年度に検討した仮想インクの物理モデルの仮想版画システムへの実装を行った.その結果,仮想インクの振る舞いや摺り上がりのシミュレーション精度が向上し,従来の仮想版画では困難であったぼかし摺りや重ね摺りなどの実際の版画で用いられる様々な摺り技法を実現した.これにより多色多版木版画である浮世絵を仮想版画で合成することが可能となった.また,彫刻操作を筆圧感知式ペンタブレットで行うことができる新しいユーザインタフェースを開発した.これにより切削の深さや面に対する角度をペン操作圧力の強弱によって直接的に制御できるようになり,現実の彫刻に近い操作感覚で仮想彫刻や版木の作成が可能となった.これはコンピュータ操作に不慣れなCG初心者のみならず彫刻・版画の熟練者にも有用である.今後,摺り操作にも感圧式のユーザインタフェースを採用することにより,版木作成から摺り操作までの作成過程に基づく浮世絵の電子保存が実現できると思われる.版木・紙・インク・ばれんを用いた版画操作の再現により版画画像を合成する仮想版画において,仮想空間内でのインク付着の物理モデルの検討と実装を行った.まず実際の版画において,インク濃度・摺り(ばれん操作)の圧力・インク付着量の間の関係の実験・観察を行った.実験結果からこれらの関係を示す偏微分方程式を構築し,この解を求めることで実験に基づく新たなインク付着物理モデルを提案した.これは多版多色摺りでの版画画像の品質向上や,より現実に近いばれん操作感覚を実現し,従来のインク付着モデルでは困難であった仮想版画における浮世絵の再現を可能にした.この結果を得て,近年注目を浴びている文化財のデジタル保存の一つとして,浮世絵のデジタル保存に関する基礎検討を行った.ここでは浮世絵を単に画像としてデジタル化するのではなく,仮想版画手法に基づいて絵師による画工,彫師による彫工(版木作成),摺師による摺工という日本の伝統文化である浮世絵製作過程全体をデジタル保存することを提案した.また筆圧ペンに基づくユーザインタフェースに関する基礎的検討も行った.なお本年度の研究実績に関して,国際会議で3件,国内会議で2件の報告を行った.仮想版画は,実世界での版画作成過程をコンピュータで構築した仮想空間内でシミュレーションすることによって,容易に手作りの雰囲気を持つCG木版画画像を合成する手法である.その中で本研究では仮想版画の物理的検討やユーザインタフェースの改良を行うことによって,より現実の版画に近い画像合成を実現することを目的とする.多くの人に使いやすいシステムを実現するだけでなく,将来的には日本固有の木版画である浮世絵の電子保存(デジタルアーカイブ)も視野に入れている.そこで昨年度に検討した仮想インクの物理モデルの仮想版画システムへの実装を行った.その結果,仮想インクの振る舞いや摺り上がりのシミュレーション精度が向上し,従来の仮想版画では困難であったぼかし摺りや重ね摺りなどの実際の版画で用いられる様々な摺り技法を実現した.これにより多色多版木版画である浮世絵を仮想版画で合成することが可能となった.また,彫刻操作を筆圧感知式ペンタブレットで行うことができる新しいユーザインタフェースを開発した.これにより切削の深さや面に対する角度をペン操作圧力の強弱によって直接的に制御できるようになり,現実の彫刻に近い操作感覚で仮想彫刻や版木の作成が可能となった.これはコンピュータ操作に不慣れなCG初心者のみならず彫刻・版画の熟練者にも有用である.今後,摺り操作にも感圧式のユーザインタフェースを採用することにより,版木作成から摺り操作までの作成過程に基づく浮世絵の電子保存が実現できると思われる.
日中戦争期の中国で発掘した考古資料の再検討

京都大学人文科学研究所の前身である東方文化学院京都研究所は、1938年から1944年にかけて山西省大同市に所在する雲岡石窟とその周辺遺址の調査を実施した。その報告書は水野清一・長廣敏雄『雲岡石窟』全16巻32冊として公刊されたが、残念なことに、出土遺物についてはほとんど未整理・未報告のまま人文科学研究所に保管されてきた。今年度は第1に、雲岡石窟の対岸にある八蘇木地遺址の出土遺物を整理し、実測図と報告文を完成させた。とりわけ紀元前3千年紀の土器や陶環の数は多く、不明な点の多い当該地域の仰韶文化後期から龍山文化を解明する上で重要な資料と考えられる。第2に、雲岡石窟前や台上寺院址の発掘で出土した北魏から遼金代の土器・陶磁器について整理を進めた。とくに第8・第9洞前から出土した一括の白磁椀は遼代の陶磁器編年に大いに寄与するものであり、第20洞前から出土した遼金代の「通楽館置」白磁壺の発見は、積年の問題であった曇曜の通楽寺の所在地論争に決着をつける成果であった。また、西部台上寺院址や大同市内の平城宮遺址で発見された5世紀後半の土器にはローラー状の道具を回転させながら文様をほどこしたことを明らかにした。さらに、これらの遺物が出土した遺跡を踏査した。とりわけ大同市の東南45kmにある西冊田遺址は、中国側の遺址台帳に記載されていない未知の遺址であるが、5世紀前半の平城宮に使用した瓦の窯址であることが判明したのは、特記すべき発見である。また、応県東張寨遺址の漢代城壁を調査し、GPSを用いてその規模を測定した。
核内アクチンファミリーのゲノム安定性維持への寄与解明と結合ペプチドによる機能操作

細胞核やクロマチンの構造が、ゲノム安定性維持に関与していることが知られているが、その詳細については不明な点が多い。特に、このような現象に関わる核内構造タンパク質についての情報はこれまで少なかったが、我々は、細胞核内のアクチンファミリー分子が核構造やクロマチン構造形成において重要な役割を果たしていること、またその変化がゲノム安定性維持に関与していることを示した。我々は核内のアクチンファミリーに結合するbicyclic peptideをスクリーニング・合成している。本研究では、核内アクチンファミリーのノックアウト細胞や、これらのbicyclic peptideを利用することにより、ゲノム安定性維持の機構を解析した。まず、アクチンファミリーに結合するbicyclic peptideを生細胞に導入し、細胞内でbicyclic peptideが細胞内でアクチンファミリーに結合することを免疫沈降によって明らかにした。さらに、これらのアクチンファミリーを含むINO80クロマチンリモデリング複合体の活性が、bicyclic ptptideによって抑制されることを示した。また、アクチンファミリーが関与する核内構造によるDNA損傷修復機構についての解析を行った。その結果、核内のアクチン繊維形成を人為的に抑制することにより、ゲノムの不安定化が誘導されることを見出した。これらの研究により、核内に存在するアクチンファミリーがゲノム安定性維持に関与する分子機構の一端を明らかにすることができた。平成29年度が最終年度であるため、記入しない。DNA損傷を正確・かつ速やかに修復することは、ゲノムの安定性維持において極めて重要であり、その破綻は細胞のがん化などにつながる。クロマチン構造および核構造を介したエピジェネティックな機構が、DNA損傷の制御に関わっている。これまでに我々は、細胞核内のアクチンファミリーがこのDNA損傷のエピジェネティック制御に関与することを見出してきた。これらは、クロマチンリモデリング複合体の構成因子として、また細胞核の骨格タンパク質として機能すると考えられる。そこで本研究では、次世代の人工抗体として注目されている二重環状ペプチドに注目し、核内アクチンファミリーに結合する二重環状ペプチドのスクリーニングおよび、それを用いた機能解析を行なった。単量体アクチン(G-actin)および重合アクチン(F-actin)をスクリーニングにより、これらのアクチンに対する二重環状ペプチドの候補が得られた。また、Arp5, Arp8などを用いたスクリーニングによって、これらのArpに結合する二重環状ペプチドの候補も取得できた。これらを生きた培養細胞中に導入することを試みた。試薬による導入、電気穿孔法などによる導入を検討し、後者を用いて効率的な導入が行なえることを明らかにした。これらの二重環状ペプチドを導入した細胞の表現形を観察することにより、これらの二重環状ペプチドが細胞の中においても、ターゲットタンパク質に結合すること、またターゲットタンパク質の機能を抑制している可能性があることが示された。今後、さらに二重環状ペプチドの評価を続ける。細胞核内のアクチン、およびアクチン関連タンパク質に結合する、多くの二重環状ペプチドがスクリーニングによって得られた。細胞核やクロマチンの構造が、ゲノム安定性に重要な役割を果たしていることが知られている。我々は、細胞核内のアクチンファミリーが、クロマチンリモデリング複合体の構成因子として、また細胞核構造を構築する分子として、DNA損傷修復のエピジェネティック制御に関与すると考えている。これを検証する目的で、二重環状ペプチド(bicyclic peptide)を用いた解析を行った。まず、アクチンファミリーに結合するbicyclic peptideをライブラリーからスクリーニングし、G-actinに結合するbicyclic peptideを得た。さらに、ATP結合部位に変異を導入したArp4を酵母細胞中で発現することにより、INO80クロマチンリモデリング複合体の機能に変化が生じることを示した。またこの細胞におけるINO80結合変化についても、クロマチン免疫沈降法で解析を行っている。また、核移行シグナルを付加したアクチンを培養細胞で発現させた際に、細胞核内にアクチン繊維が形成されると共に、DNA損傷修復能やgamma-H2AXの核内局在に変化が生じることを示した。これらの結果は、アクチンやArp4などの核内のアクチンファミリーが、クロマチン機能制御や細胞核の機能構造形成を介して、ゲノムの安定性に寄与することを示唆するものであり、今後さらにこの実験系を用いた解析を進める。さらに、bicyclic peptideを用いて、核内アクチンファミリーの機能や分子間相互作用の人為的操作を行うことにより、がんや疾病に対する創薬への応用展開を目指す。G-actinに結合するbicyclic peptideがスクリーニングによって得られ、今後このbicyclic peptideを評価や研究に用いることができる見込みである。また、核内のアクチンファミリーがゲノム安定性に関与する結果が得られ、今後その分子メカニズムの詳細を解析するための実験系も確立しつつある。

さらに、これらのアクチンファミリーを含むINO80クロマチンリモデリング複合体の活性が、bicyclic ptptideによって抑制されることを示した。また、アクチンファミリーが関与する核内構造によるDNA損傷修復機構についての解析を行った。その結果、核内のアクチン繊維形成を人為的に抑制することにより、ゲノムの不安定化が誘導されることを見出した。これらの研究により、核内に存在するアクチンファミリーがゲノム安定性維持に関与する分子機構の一端を明らかにすることができた。細胞核内のアクチン、およびアクチン関連タンパク質に結合する二重環状ペプチドの候補が多く取得されているので、これらの評価を継続すると共に、結合が強いものについては、細胞に導入して解析を続ける。スクリーニングによって得られたG-actinに結合するbicyclic peptideの生細胞における機能を評価すると共に、これをエピジェネティクスの人為制御の目的でも用いる。また、核内のアクチンファミリーの安定性への寄与に関する分子メカニズムを、詳細に解析する。平成29年度が最終年度であるため、記入しない。
バイオ素材としてのセリシンの新規機能性解析

セリシンの抗酸化作用の機構解析セリシンの抗酸化作用が銅依存性の作用であるのか否か検討を加えた。実験系として、銅イオンによってLDLの自動酸化を促進させる系で実験を行った。その結果、この実験系では、セリシンが顕著に酸化抑制作用を示すことが判明し、また鉄イオンによるLDLの酸化促進に対する抑制効果よりも顕著であった。これらの実験結果からセリシンの抗酸化作用の一部は鉄よりも銅とのキレーションによるものであることが推定された。セリシンの生体調節調節機能の検討(1)平成10年度の予備実験でセリシンが大腸がんの発現を抑制する可能性を示した。今年度では、実験動物の匹数を増やし飼育期間も延ばし、本実験を行った。その結果、セリシン添加食がジメチルヒドラジン誘発大腸がんの発現を抑制することが実証された。その機構解析も一部行った結果、その発がん抑制は大腸粘膜の細胞増殖の抑制によるものではないことが示された。(2)ジメチルベンズアンスラセン誘発ラット乳がんのモデル系でセリシン添加食が乳がんの発現を抑制するのか否か検討した。その結果、セリシン添加食は乳腺腫瘍の発生数を顕著に抑制することが明らかとなった。(3)セリシンがミネラルの小腸からの吸収を促進させるか否か、検討した。その結果、セリシン添加食がFe、Zn、Mg及びCaの見かけの吸収率を増加させることを明らかにした。(4)デキストラン硫酸誘発ラット大腸炎のモデル系でセリシン添加食が大腸炎を抑制するのか否か検討した。その結果、セリシン摂取が大腸炎を軽減させる可能性が示された。1.セリシンの抗酸化性の機構解明セリシンの抗酸化性がFeとのキレーションにより起こるのではないかと考え、セリシンとFeとのキレート形成能について検討したが、その結合能は弱いものであった。また、Feにより脂質過酸化が促進される条件でセリシンの効果を検討したが、やはりFe依存的な過酸化促進条件では、セリシンの抗酸化能は弱く、Feとのキレーションによる機構の可能性は否定された。一方、脂肪との親和性がある程度強力であることが確認され、セリシンの抗酸化性の一部の機構として、脂肪の周りをセリシンが取り囲み活性酸素の攻撃から防御しているのではないかと推定した。2.セリシンの抗菌性の検討28種類の大腸菌、かびなどの菌株を用いて抗菌性の試験を行ったが、一部の菌株のみ弱い抗菌性が確認された他は、全く抗菌性は確認されなかった。3.セリシンの生体調節機能の検討コレステロール添加食をラットに摂取させ、高コレステロール血症を誘起させる条件で、セリシン添加(35%)の影響を調べたところ、セリシンによる若干の血中コレステロールの低下傾向が確認された。1,2-ジメチルヒドラジン投与マウスでの大腸癌発現に及ぼす影響を調べた。その結果、短期の試験(5週間)では、食餌へのセリシン3%の添加で顕著な前癌病変のアベラントクリプト数の減少が見いだされ、大腸癌発現を抑制する可能性が示された。興味あることに、セリシン摂取によりマウスの脂肪組織重量の減少も見いだされ、セリシンは肥満にも有効である可能性が出てきた。
分子認識における蛋白質のエネルギー地形階層性と水和構造変化の役割

本研究では、昨年度に引き続き「段階的分子認識モデル」が既に示されているアルコール脱水素酵素等を主なターゲットとして以下の3つのことを明らかにすることを目指している。すなわち、(1)分子認識過程のシミュレーション、(2)分子認識過程におけるエネルギー地形の変化、(3)分子認識における水和構造変化の役割、である。本年度は昨年度に引き続き(1)(2)の解明をまず重点に研究をおこなった。「開」構造で結合ドメインにリガンドが結合した状態(結合中間状態)をシミュレーションの初期構造としてモデリングし、分子動力学シミュレーションを行い、リガンドが存在することによって開閉ドメインが移動し「閉」構造が出現する過程をシミュレートした。このシミュレーションの詳しい解析により、2量体で機能するアルコール脱水素酵素はドメインの動きに相関が見られることが明らかになった。これは一種のアロステリックが効果と考えられる。この成果は現在投稿中である(Hayward and Kitao)。(3)に関しては、これらのドメイン運動と水和構造変化の関係を明らかにするため解析を進行中である。また、分子シミュレーションを用いて、構造ゆらぎのパターンと非干渉性中性子非弾性散乱実験データの関係を解析し、論文に発表した(Joti, Kitao, Go, J.Am.Chem.Soc, 2005)。これにより150K以下の低温で観測されるボゾンピークの起源は水和によるエネルギー面の微細構造であることを明らかにし、機能と密接に関与しているといわれているガラス転移との関係も示した本研究では、「段階的分子認識モデル」が既に示されているアルコール脱水素酵素等を主なターゲットとして以下の3つのことを明らかにすることを目指している。本年度はまず、(1)(2)の解明を重点に研究をおこなった。「開」構造で結合ドメインにリガンドが結合した状態(結合中間状態)をシミュレーションの初期構造としてモデリングし、分子動力学シミュレーションを開始した。その結果、リガンドが存在することによって開閉ドメインが移動し「閉」構造が出現する過程をシミュレートすることができた。これは一種のアロステリックが効果と考えられるので、現在これに注目した新しい解析を進めている。更に来年度は、これらのドメイン運動と水和構造変化の関係を明らかにする必要がある。また、分子シミュレーションを用いて、構造ゆらぎのパターンと非干渉性中性子非弾性散乱実験データの関係を解析した。これにより150K以下の低温で観測されるボゾンピークの起源は水和によるエネルギー面の微細構造であることを明らかにし、機能と密接に関与しているといわれているガラス転移との関係も示した
新しいキネシンスーパーファミリータンパク質ＫＩＦ２１Ｂの分子細胞生物学的研究

新規分子モーターKIF21ファミリーは、これまでにI型外眼筋線維症(CFEOMI)や多発性硬化症などの神経難病に関与することが報告されているが、その分子メカニズムはほとんど不明であり、個体レベル及び細胞レベルにおける機能欠失モデルの作出と解析が必須である。本研究ではこのKIF21ファミリーに焦点をあて、分子遺伝学的手法を用いて作成したノックアウトマウスを、その表現型を分子レベルから個体レベルを通して解析するが、この手法は高度に探索的であり、ノックアウトマウスの表現型については予想がつかないことが一般的である。しかし申請者ならびに他のグループのこれまでの結果から、結合タンパク質としてアクチン細胞骨格の制御因子が同定されており、KIF21ファミリーは、アクチン細胞骨格と微小管系細胞骨格を連携する制御を司る分子である可能性が高いと考えられた。そこで本研究ではKIF21ファミリーの神経細胞の形態形成および機能維持における役割を、主にアクチン細胞骨格の制御に光をあて、細胞生物学ならびに分子遺伝学的手法から明らかにするため、ノックアウトマウスの細胞・組織・個体レベルを通した統合的・集学的な表現型解析を行い、この新規分子モーターがかかわる未知の分子機序の解明を目指した。その結果、ノックアウトマウスの行動解析で検出された表現型の根底にある分子機構に、このKIF21ファミリーが分子モーターとして深く関与していることが示唆された。27年度が最終年度であるため、記入しない。新しいキネシン分子モーターKIF21ファミリーは、これまでにI型外眼筋線維症(CFEOMI)や多発性硬化症などの神経難病に関与することが報告されているが、その分子メカニズムはほとんど不明であり、個体レベルおよび細胞レベルにおける機能欠失モデルの作出と解析が必須である。しかし申請者ならびに他のグループのこれまでの結果から、結合タンパク質としてアクチン細胞骨格の制御因子が同定されており、KIF21ファミリーはアクチン細胞骨格と微小管系細胞骨格を連携する制御を司る分子である可能性が高い。そこで本研究では、KIF21ファミリーの神経細胞の形態形成および機能維持における役割を、主にアクチン細胞骨格の制御に光をあて、細胞生物学ならびに分子遺伝学的手法から明らかにすることを目的とする。現在までに、ノックアウトマウスの行動解析、ノックアウトマウスの組織や細胞における異常の解析、新規KIF21ファミリー結合タンパク質の探索とその解析を行い、KIF21ファミリーノックアウトマウスの細胞・組織・個体レベルを通した統合的・集学的な表現型解析により、この新規分子モーターがかかわる未知の分子機序の解明を行っている。本研究はKIF21ファミリーのノックアウトマウスを細胞・組織・個体レベルを通して統合的・集学的に表現型解析するものであるが、現在までに以下の実験を行った。1ノックアウトマウスの行動解析:KIF21ファミリーノックアウトマウスの運動能力や空間記憶・学習能力について、Rota-rod実験、Open-field実験、Elevated-plus-maze実験、恐怖記憶実験等の一連の行動実験を行い、このノックアウトマウスにおいて記憶学習の能力に異常があることを新規に発見した。2ノックアウトマウスの組織や細胞における異常の解析:Scale法(Hama et al., Nat Neuroscience 14:1481, 2011)やコンフォーカルレーザー顕微鏡を用いた、免疫細胞化学的な神経細胞の高精細形態計測を行った。また海馬一次培養系を樹立し、神経細胞の形態ならびに挙動について分子細胞生物学的手法を駆使して解析し、関連タンパク質と分子モーターとの共局在や結合解離についても観察を行った。3新規KIF21ファミリー結合タンパク質の探索とその解析:KIF21ファミリーのノックアウト細胞における結合タンパク質の機能・局在変化を分子細胞生物学的手法を用いて解析した。またそのノックダウンや強制発現法等による発現量の変化が、KIF21ファミリータンパク質欠損神経細胞の表現型を変化させるかどうかを確認した。以上のように、KIF21ファミリーノックアウトマウスの行動解析と組織・細胞レベルでの実験を通して、この新規分子モーターがかかわる

未知の分子機序を解明する目的に向かって統合的・集学的な表現型解析を行うことができた。27年度が最終年度であるため、記入しない。ノックアウトマウス海馬急性スライスを作成し、電気生理実験による海馬の回路網の解析を行なう。さらに、引き続きKIF21ファミリーのノックアウト細胞における結合タンパク質の機能・局在変化を詳細に観察していく。また、これまでの成果と上記の電気生理実験、新規KIF21ファミリー結合タンパク質の探索とその解析を通して、KIF21ファミリーの個体での機能と、細胞・分子レベルでの機能を関連させ、学術論文を作成し投稿する。
背地順応における魚類色素細胞のアポトーシスとその調節メカニズム

多くの硬骨魚類は、皮膚に存在する色素細胞の応答によって体色を背地の明度に順応させる(背地順応)。長期間にわたる順応では、色素細胞の細胞密度が増減する。メダカなどではこの細胞密度調節に、散発的なアポトーシスが関与していることがわかってきた。本研究は、色素細胞のアポトーシスを環境に順応しながらも恒常性を示す皮膚の組織恒常性メカニズムの一部として位置づけ、その調節メカニズムを明らかにすることを目的とした。まず、メダカの皮膚断片およびウロコ皮膚の初代培養系を用いた薬理および細胞生物学的実験から、明背地順応下の皮膚黒色素胞では生存シグナルであるcAMP-PKA系およびMAPK系シグナルが枯渇し、PI3K系シグナルなどにより形態が単純化し、それに続いてアポトーシスが生じる可能性を示唆する結果を得た。次に、長期間背地順応させた胚及び仔魚での黒色素胞密度の変化を調べ、成魚の黒色素胞と比較した。その結果、ある程度成長した仔魚や成魚ではアポトーシスが細胞密度調節に関わるが、胚及び初期の仔魚ではアポトーシスがみられず分化によってのみ細胞密度が調節されていることが示唆された。胚細胞の初代培養系で分化した黒色素胞のアポトーシス感受性が成魚由来の黒色素胞に比べて低いという結果も得た。分化直後の黒色素胞ではアポトーシスを誘導するメカニズムに差があると考えられる。さらに、メダカ皮膚から同定された新規RGSタンパク質(MeRGS3L)および脳下垂体中葉ホルモンであるソマトラクチンが色素細胞のアポトーシスに関わる因子である可能性が示唆された。また、ゼブラフィッシュを使用して、背側皮膚表層だけでなく、体側皮膚深部の色素細胞も背地順応により細胞密度を増減させることを見出し、黒色素胞および虹色素胞のアポトーシスが縦縞模様に影響することを示した。1生存シグナルの関与と単離細胞培養系の確立皮膚器官よりも構成が単純で、黒色素胞の形態の複維さが維持される鱗皮膚培養系を確立し、以下の結果を得た。ノルアドレナリン(NA)存在下で生じる黒色素胞のアポトーシスは、血清の添加により抑制される。この血清の効果を、MAPKK阻害剤PD98059は抑制した。しかし、PI3K阻害剤であるLY294002やwortmanninは逆に血清のアポトーシス抑制効果を増大させた。この効果は血清に依存するものではなく、NAによる黒色素胞のアポトーシスを直接抑制した。PI3KはAktを介して生存シグナルに関わる以外に、低分子G蛋白質の活性を制御してアクチン繊維の再構成に関わることが知られている。そこで、NA誘導アポトーシス過程における黒色素胞の形態および細胞骨格の変化と、それに対するLY294002の影響を調べた。黒色素胞は枝状突起数を減少させてサイズを縮小、形態を単純化させてアポトーシスへ向かう。このとき枝状突起に対応して微小管骨格の束は数を減らし、逆に検出できなかったアクチン繊維がみられるようになった。LY294002はこれらの過程を抑制した。これまでの研究とあわせて考えると、黒色素胞ではcAMP-PKA系およびMAPK系シグナルが生存を維持し、これが枯渇するとPI3K系シグナルなどにより形態の単純化とそれに続くアポトーシスが生じるという仮説がたてられる。形態の重要性追求の予備実験として、細胞骨格蛋白質の重合阻害剤などの影響を調べた。チューブリンの重合阻害剤は黒色素胞の形態を単純化させアポトーシスを誘導することがわかった。仮説の検証実験および単離細胞培養系の確立を継続中。2関連遺伝子のクローニングと発現皮膚

器官培養系でのNA誘導アポトーシスではmitfやtrp-2の発現変化はみられない。鱗皮膚培養系で検討中。I細胞骨格の重合・脱重合とアポトーシス細胞骨格阻害剤は、哺乳類の細胞株などでは細胞分裂を阻害し、P53またはJNKシグナル系を活性化してアポトーシスを誘導する。魚類の黒色素胞は分化した細胞で分裂することはなく、細胞骨格は形態の維持および細胞内輪送を主要な機能としている。鱗皮膚培養系を利用して、アクチンおよびチュウーブリンの重合阻害剤または安定化剤の影響を調べている。上記薬剤が黒色素胞の形態に影響を及ぼすこと、チューブリンの脱重合剤のみがアポトーシスを誘導することがわかった。また、鱗皮膚培養系では活性化した表皮細胞がアポトーシスを抑制している可能性が示唆された。そこで、初期胚の神経冠から分化させた黒色素胞培養系を確立し、表皮細胞のない状況での比較実験を行っている。2背地順応によるゼブラフィッシュ色素胞のアポトーシス近年、魚類のモデル動物としてメダカ同様ゼブラフィッシュの研究が発展している。ゼブラフイッシュは体表に縦縞模様をもち、単純な体色のメダカとは色素胞研究において相補的なデータを得る好材料となる。そこで、メダカの場合と同様にゼブラフィッシュを白または黒背地に長期間順応させ、色素胞のアポトーシスを調べた。白背地では早期に鱗皮膚の黒色素胞数がアポトーシスで減少し、その後真皮深部で縦縞を形成している黒色素胞も減少して模様も変化することがわかった。また、黒背地では虹色素胞数の減少とともに種類の変化がみられた。今後メダカでの結果と比較考察していく。3分化への影響マウスのチロシナーゼおよびTRP-2に対するポリクローナル抗体でメダカの黒色素胞の芽細胞の検出を試みたが明らかな結果は得られなかった。メダカtrp-2の全長クローニングが完了したので、これをプロープとして芽細胞の検出、アポトーシス時の発現変化を詳細に調べてゆく。1.細胞培養系における黒色素胞のアポトーシスメダカの黒色素胞出現前のstage2122(受精後約2日)胚の背部由来の細胞を20%FBS存在下で培養すると、培養24時間4日後には多くの黒色素胞が分化し、7日後までには枝状突起が発達し、形態の複雑性を増大させた。この培養系にコレラトキシンを添加すると分化数が増加し、さらにTPA存在下では形態の複雑化が早まることがわかった。これらの培養4日または7日後の黒色素胞を用いて、ノルエピネフリン添加培養3日間によるアポトーシス誘導を調べたが、ほとんどアポトーシスはみられなかった。成魚のメダカ皮膚から分散培養させた黒色素胞ではノルエピネフリン添加により3日後には約40%がアポトーシスを生じた。分化直後の黒色素胞ではアポトーシスを誘導するメカニズムに差があると考えられた。2.黒色素胞のアポトーシスに関連する遺伝子1での結果をふまえて、白背地順応下の仔魚および成魚皮膚で発現の変化する遺伝子を調べた。黒色素胞関連遺伝子では、成魚でアポトーシスに対応してtrp-2の発現が減少する。しかし、仔魚またはノルエピネフリン添加培養下の胚由来黒色素胞ではtrp-2の発現に明らかな差はみられなかった。また、メダカの体色明化変異体(ci)の