hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
不確定性を考慮した宇宙スマート構造の形態創成設計に関する研究

大型アンテナのような宇宙構造システムは,ますます高精度化が求められている.その要求に応える構造様式として,センサやアクチュエータを統合した宇宙スマート構造がある.そのような高精度構造を設計するにあたっては,荷重などの環境条件や材料物性の不確定性,特に不確定性の空間分布を考えることが不可欠である.そこで,本研究では,そのような不確定性の影響を考慮した形態創成設計法として,確率過程を利用するロバストトポロジー最適設計法を開発した.これにより,少ない確率変数で空間変動を含む不確定性を表現できるため,ロバスト設計法として高い計算効率を実現することができる.大型アンテナのような宇宙構造システムは,ますます高精度化が求められている.その要求に応える構造様式として,センサやアクチュエータを統合した宇宙スマート構造がある.そのような高精度構造を設計するにあたっては,荷重などの環境条件や材料物性の不確定性,特に不確定性の空間分布を考えることが不可欠である.そこで,本研究では,そのような不確定性の影響を考慮した形態創成設計法として,確率過程を利用するロバストトポロジー最適設計法を開発した.これにより,少ない確率変数で空間変動を含む不確定性を表現できるため,ロバスト設計法として高い計算効率を実現することができる.高精度宇宙スマート構造の新しい構造形態を提案するために,荷重などの設計条件の不確定性に着目した設計法を開発することが本研究の目的である.そこで,不確定性のもとでの性能の変動を抑える構造形態を求めるためのロバストトポロジー最適設計法を提案する.今年度は,特に,荷重などの変動が空間的に変動する場合に着目し,不確定性を確率過程でモデル化したロバストトポロジー最適設計を開発した.確率過程は,現実に近い空間的な不規則な変動を少ない変数で表現できる利点がある.これを用いて,ロバスト設計を定式化した,その際,ロバスト設計における性能変動を一次近似を用いて定式化するために,確率過程を特徴づける確率変数の感度解析の定式化において,計算効率を確保することで,大規模設計問題への適用を可能とした.そして,構造境界が明瞭に表現できる特徴をもつレベルセット法に基づくトポロジー最適設計法に導入することで,ロバストトポロジー最適設計を定式化した.数値計算例として,分布荷重の空間的変動を仮定した2次元設計問題に適用し,確定的な最適形態とロバスト最適形態を比較し,提案手法の妥当性を検証した.そして,空間的な変動の特徴量であるパワースペクトルの違いによって,ロバスト最適形態が異なることを明らかにした.そして,その最適形態が力学的な洞察と一致していることから,本研究で開発した手法の妥当性を検証した.今後は,より現実に近い三次元形態に対する設計問題へと適用することが必要である.なお,伝熱特性,温度環境の不確定性についても確率過程によるモデル化を進める予定であったが,そちらは十分な検討ができなかった.荷重については確率過程によるモデル化の妥当性が検証できたことから,次年度の課題として取り組む予定である.材料特性や荷重などが空間的に変動する場合の不確定性を定常確率過程でモデル化する手法とロバストトポロジー最適設計の少ない確率変数でモデル化する手法を確立した.これに加えて,得られた設計解のロバスト性を可視化する手法として,確率過程を利用する手法を構築した.これは,空間変動を有する荷重に対する構造応答の空間変動成分を確率過程によって波数領域で表すことで,支配的な変動を有する波数成分を明確化する.具体的には,応答のパワースペクトルを利用する.これまでは力学的な洞察によってロバスト最適形態の妥当性を定性的に判断してきたが,パワースペクトルを利用して定量的に判断することが可能となり,空間変動特性とロバスト最適形態との関係を明示的に示すことができる.さらに,本手法の計算効率を高めることで,空間変動が一次元の場合から二次元の場合へと拡張し,三次元構造のロバスト設計問題に取り組むことができた.なお,本研究のロバストトポロジー最適設計法は,レベルセット法に基づくトポロジー最適設計法とロバスト設計法の組合せであり,目的関数に利用する二つのパラメータが最適形態におよぼす影響が定量的に判断できていない問題があった.そこで,これらのパラメータの組合せを変化させて詳細に調べることにより,これらのパラメータの影響を明確にするとともに,具体的な設計問題へ適用する際のパラメータ設定の指針を得た.上記の空間変動と合わせて,得られた最適形態のロバスト性の妥当性を明確化することができるようになった.構造と熱のマルチフィジックス解析ツールの整備を進めることができた一方で,熱特性に対する不確定性モデルの構築が遅れている.これは,次年度の課題として取り組む予定である.本研究では,材料特性や荷重などが空間的に変動する場合の不確定性を定常確率過程でモデル化する手法とロバストトポロジー最適設計の少ない確率変数でモデル化する手法を確立した.これに加えて,得られた設計解のロバスト性を可視化する手法として,確率過程を利用する手法を構築した.これは,空間変動を有する荷重に対する構造応答の空間変動成分を確率過程によって波数領域で表すことで,支配的な変動を有する波数成分を明確化する.具体的には,応答のパワースペクトルを利用する.これまでは力学的な洞察によってロバスト最適形態の妥当性を定性的に判断してきたが,パワースペクトルを利用して定量的に判断することが可能となり,空間変動特性とロバスト最適形態との関係を明示的に示すことができた.

さらに,本手法の計算効率を高めることで,空間変動が一次元の場合から二次元の場合へと拡張し,三次元構造のロバスト設計問題に取り組んだ.なお,本研究のロバストトポロジー最適設計法は,レベルセット法に基づくトポロジー最適設計法とロバスト設計法の組合せであり,目的関数に利用する二つのパラメータが最適形態におよぼす影響が定量的に判断できていない問題があった.そこで,これらのパラメータの組合せを変化させて詳細に調べることにより,これらのパラメータの影響を明確にするとともに,具体的な設計問題へ適用する際のパラメータ設定の指針を得た.上記の空間変動と合わせて,得られた最適形態のロバスト性の妥当性を明確化することができるようになった.これにより,スマート構造への適用可能性を明らかにすることができた.なお,マルチフィジックス問題としての熱と構造の連成問題への適用は,期間内にすべてを明らかにすることはできなかったが,適用可能性を示すことができた.当初の研究計画にはなかった最適設計に用いる二つの異なるパラメータの影響を調べるために時間を割いたために,やや遅れることとなった.現状では,構造と熱との不確定性を考慮するロバストトポロジー設計の開発への取組みが途中となっている.24年度が最終年度であるため、記入しない。最終年度として本研究をまとめるとともに,本研究をより発展させ,実用化へと進めるための研究計画を構築する.そのために,構造と熱などのマルチフィジックス環境における空間変動モデルの構築を早急に進めることとする.24年度が最終年度であるため、記入しない。
ポストペタスケール計算機環境に向けた高可用分散協調スケジューリングの研究

ポストペタスケール計算環境でアプリケーションの実効性能を維持しつつプログラムの継続実行を支援する高可用分散協調スケジューラの実証を目的とし、高可用分散協調スケジューラのプロトタイプシステムを設計,開発,評価した。本研究は,ポストペタスケール計算機環境でアプリケーションの実効性能を維持しつつプログラムの継続実行を支援する高可用分散協調スケジューラを実証することを目的としている.ポストペタスケール計算機環境では,階層型タスク並列が計算効率を高めるための有望なプログラミングモデルの1つと考えられているが,アプリケーションプログラムには障害が発生しても継続実行できる耐障害性が求められる.よって,階層型タスク並列アプリケーションプログラムの耐障害性を支援する高可用分散協調スケジューラのプロトタイプシステムを開発し,ポストペタスケール計算機環境における性能特性を調査する.H25年度は,高可用分散協調スケジューラのプロトタイプシステムを開発した.高可用分散協調スケジューラでは,計算に必要となるデータを障害から保全するデータストア機構と,計算ノードの健全性を監視しつつ適切に計算を実行する資源管理機構が必要となる.これらを,ポストペタスケール計算機環境においてスケーラブルでかつ,それら自体が耐障害性を持つように設計・実装する必要がある.よって,資源管理機構とデータストア機構からなる高可用分散協調スケジューラのプロトタイプを設計し,分散協調処理ライブラリApache ZooKeeperと分散キーバリューストア(KVS) Apache Cassandraを用いて開発した.資源管理機構にはタスクの管理,計算ノードの死活監視,障害発生時のタスク再実行/削除機能を実装し,データストア機構には結果整合性を保証するKVSを用いた.本スケジューラを用いた予備実験から,処理中に計算ノードが落ちてしまった場合も自動的にタスクが再実行され,アプリケーションプログラムが継続実行できることが確認できた.本研究は、ポストペタスケール計算環境でアプリケーションの実効性能を維持しつつプログラムの継続実行を支援する高可用分散協調スケジューラを実証することを目的としている。ポストペタスケール環境では、階層型タスク並列が計算効率を高めるための有望なプログラミングモデルの1つと考えられているが、アプリケーションプログラムには障害が発生しても継続実行できる耐障害性が求められ、そのプログラミングコストが大きくなってしまう。よって、階層型タスク並列アプリケーションプログラムの耐障害性を支援する高可用分散協調スケジューラのプロトタイプシステムを設計・開発し、ポストペタスケール計算機環境における性能特性を調査する。H26年度は、Javaで実装したプロトタイプシステムに加え、User Level Fault Mitigation (ULFM) MPIをもちいてCで実装しているFalanxミドルウェアに提案する高可用分散協調スケジューラを実装した。評価実験から、資源管理情報を適切に管理することにより、分散協調スケジューラのオーバヘッドを低減できることを確認した。また、実アプリケーションであるOpenFMOを用いた評価では、分散強調スケジューラの有無による顕著な性能差は確認されず、大規模環境での実現可能性を示した。並列・分散処理高可用分散協調スケジューラを実証するため,(1)高可用分散協調スケジューラのプロトタイプシステムの開発,(2)ポストペタスケール計算機環境を模擬した評価環境の構築、(3)様々な条件を考慮した高可用分散協調スケジューラの評価の研究開発を進めている.H25年度は,(1)プロトタイプシステムの開発と,(2)評価実験環境の構築の研究開発を予定していた.(1)プロトタイプシステムの開発は,資源管理機構とデータストア機構からなる高可用分散協調スケジューラのプロトタイプを設計・開発した.(2)評価実験環境の構築は,8コアCPUを搭載した実験用計算機を購入し,仮想計算機を用いた実験環境の整備を進めることができた.H26年度は,(1)高可用分散協調スケジューラのプロトタイプシステムを改良しつつ,構築した(2)ポストペタスケール計算機環境を模擬した評価実験環境において(3)プロトタイプシステムを用いた評価を行い,高可用分散協調スケジューラの設計指針を示す.(1)で開発したスケジューラを実高性能計算環境に対応させるため,産総研で開発している耐障害性ミドルウェアfalanxへの移植を行う.また,(2)の評価環境や実環境に(1)のスケジューラを分散配備し,障害の発生状況や共有するデータ量,スケジューラプロセスの冗長度,適用する計算機システムのスケール等を変化させて,本スケジューラの基本性能を調査する.また,アプリケーションプログラムおよびスケジューラの振る舞いの検証,ボトルネックの検出等を行い,ポストペタスケール計算機環境に向けたスケジューラの設計指針を示す.海外での研究成果発表を予定していたが年度内に発表することができなかった。H26年度前半にH25年度予定していた海外での研究成果発表を行う。
物体情報を必要としないロボットハンドの摘み動作の制御法

本研究は物体のセンサレスマニピュレーションに関するものであり、把持物体の掴みや操りといった制御を物体の事前情報や外界センサをいかに少なく抑えながら行うかの研究を行っている。昨年度は水平面における円形物体と多角形物体に対して2本指ロボットを用いて転がり接触による安定把持およびマニピュレーションの方法を理論的・実験的側面を検証したが、今年度は、このマニピュレーションの適用可能なクラスを拡張することを目指した。1、水平面内にある物体に対して、指先と物体の接触位置が既知である場合、指先と物体の形状が局所的に滑らかであれば物体の形状によらず安定に把持できることを理論的に示し、シミュレーションにより検証した.実際のマニピュレーションでは、接触点が検出可能な触覚センサを備えていることより実現できるが、近年開発されている触覚センサの多くが、位置だけでなく接触力も検出する機能を備えており、現実的な要請と考えることができる。2、これまでの安定把持の議論は2本指に限定されていたが、指が複数あっても同様に安定に把持できることを理論とシミュレーションにより示した。3、通常、ロボットと物体の接触形態は転がり接触のみだけでなく、固定した点接触も取り扱われる。そこで、指先の局率がゼロとなる完全な固定された点接触の場合と指先の局率がある転がり点接触の間の関係とこれらのマニピュレーション法が統一的な観点から設計可能であることを理論とシミュレーションにより検証した。これにより、固定点接触の場合、転がり接触の場合、両方が混在している場合についても同じマニピュレーション法で操作可能であることが分かった。本研究は物体のセンサレスマニピュレーションに関するものであり、把持物体の掴みや操りといった制御方法を物体の事前情報や外界センサをいかに少なく抑えながら行うかの研究を行っている。まず2次元水平面内にある直方体物体に関する安定把持・相対的な姿勢制御・相対的な位置制御に関する研究をまとめた。ここでは、直方体をつまむ場合はどのような安定把持集合に陥るのか、さらに物体情報無しで姿勢角を制御するには相対的な方法しかなく、さらに近似的な方法なら位置も制御可能であることを理論的に示し、シミュレーションおよび実験により検証した。また水平面内にある円形物体に対して物体情報を用いなくても制御を行えることを示した。円形物体は直方体で用いられた制御方法に加え、指先に生じる回転モーメントを打ち消すための付加項が必要となるが、この付加項はリグレッサを用いることにより物体情報を用いずとも安定把持できることを理論的に示した。また円形物体の姿勢制御は把持物体の直径に依存して転がり距離が変わるためにセンサレスマニピュレーションでは、近似的な姿勢制御しか行えないことを示した。これらの結果をシミュレーションおよび、実験にて検証した。次に2次元重力下でも多面体は把持できることを理論的に検証した。重力下では指の重力補償が必要となるため、指の質量情報を新たに必要とするが、物体のほうはリグレッサにより推定可能であることが分かった。またこれらの結果をシミュレーションおよび実験にて検証した。
光合成生物への高塩環境適応性の導入

高濃度塩水中で生育しうる単細胞緑藻Dunaliellabardawilの耐塩性の機構を解明して、不毛な高塩環境で生育しうる生産性の高い植物種を創製することを究極の目的とし、具体的には、この緑藻に特異なグリセロール代謝系を等御する機構、特に全く未知である、浸透圧情報の感知・伝達系の解明を目指して、浸透圧の階段状下降・上昇時の藻の応答を、種々のパラメーターについて観測した。その結果480nm励起光による藻体からの686nm蛍光が、浸透圧の階段状昇降に対応して正負の過渡的4相の変化を示し、変化量は浸透圧変化の落差に比例した。階段状の降圧で起きる第1相の正の過渡的変化は5分以内に終了し、今までに報告されているパラメーター変化の中で最も早く出現し、完了するものであった。この第1相の正の応答はプロトノフォアcarbonylcyanide-m-chlorophenylhydrazone(CCCP)の添加によって選択的に、かつCCCP濃度に比例して増強された。他の諸種の結果を総合すると、このCCCPで増強される第1相の早い応答は、この時間帯で起きた何らかの独立事象を反映するものであることが示唆された。他の脱共役剤、阻効剤等は無効、あるいは非選択的であった。藻からの蛍光の4相が浸透圧変化の正負、大小に対応して変化すること、CCCPが第1相のみに選択的且つ濃度依存的に効くこと、しかも、このCCCP感受性応答は知られる限りで最も初期に完結するものであることなどから、当初の目的であるグリセロール生合成系を統御する初期浸透圧信号受容・伝達機構の解明に有望な緒を得たと考える。
脊髄反射に関与する二次神経細胞と三次神経細胞との結合様式の解析

頸筋を含む体幹筋は系統発生的に最も古く,頸と体幹の運動は一般の運動の基本と考えられる.本研究では体幹運動のうち特に頸の指向運動に着目してこれに関与する神経経路を調べ,以下の諸点を明らかにした.それぞれ随意性,反射性指向運動の中枢と考えられる大脳皮質,上丘より頸運動ニューロンはコシナプス性EPSPを受けた.この中継細胞は橋,延髄のnucleus rcticularis pontis caudalis(NRPC)とnucleus rcticularis gigantocellularis(NRG)にある網様体脊髄路細胞(RSN)であった.NRPCをNRGのRSNから細胞内記録を行い,大脳脚,上丘から誘発されるEPSPの大きさを比較すると, NRPCのRSNでは上丘からのEPSPが大脳脚からのEPSPに比して大きく, NRGのRSNでは逆の関係であった.上部頸髄では, NRPCのRSNは前索内側部を下行し, NRGのRSNは前索外側部,側索,一部は対側脊髄を下行した. RSNは脊髄投射レベルにより,腰髄,下部頸髄,上部頸髄まで投射するL-, C-, N-RSNに分類された.頸筋運動ニューロンに投射するものはNRPCとNRGのC-RSNであった.各C-RSNと頸筋運動ニューロンとの結合は筋特異性が高く,頭の挙上筋(BCC)又は側方屈曲筋(SPL)いずれかの運動ニューロンと結合していた.NRPCのRSNは脳幹で外転神経核, NRGに多数の分枝を派生したが, NRGのRSNは脳幹ではほとんど側枝を派生しなかった.上部頸髄では両者とも頸筋運動核, VI-VIII層に終末を派生した.下部頸髄前肢域では終末は主にVII-VIII層に分布し,前肢運動核への分布は非常に少なかった.NRPCへの大脳皮質入力はネコの前頭眼野である6野と4野の内側1/3から起始し,一方NRGは皮質頸・体幹領域と謂れる4野内側2/3から強い入力を受けていた.以上の結果より, NRPCは主にeyehead coordinationに, NRGは主に頸運動の制御に関与することが示唆された.頸筋を含む体幹筋は系統発生的に最も古く,頸と体幹の運動は一般の運動の基本と考えられる.本研究では体幹運動のうち特に頸の指向運動に着目してこれに関与する神経経路を調べ,以下の諸点を明らかにした.それぞれ随意性,反射性指向運動の中枢と考えられる大脳皮質,上丘より頸運動ニューロンはコシナプス性EPSPを受けた.この中継細胞は橋,延髄のnucleus rcticularis pontis caudalis(NRPC)とnucleus rcticularis gigantocellularis(NRG)にある網様体脊髄路細胞(RSN)であった.NRPCをNRGのRSNから細胞内記録を行い,大脳脚,上丘から誘発されるEPSPの大きさを比較すると, NRPCのRSNでは上丘からのEPSPが大脳脚からのEPSPに比して大きく, NRGのRSNでは逆の関係であった.上部頸髄では, NRPCのRSNは前索内側部を下行し, NRGのRSNは前索外側部,側索,一部は対側脊髄を下行した. RSNは脊髄投射レベルにより,腰髄,下部頸髄,上部頸髄まで投射するL-, C-, N-RSNに分類された.頸筋運動ニューロンに投射するものはNRPCとNRGのC-RSNであった.各C-RSNと頸筋運動ニューロンとの結合は筋特異性が高く,頭の挙上筋(BCC)又は側方屈曲筋(SPL)いずれかの運動ニューロンと結合していた.NRPCのRSNは脳幹で外転神経核, NRGに多数の分枝を派生したが, NRGのRSNは脳幹ではほとんど側枝を派生しなかった.上部頸髄では両者とも頸筋運動核, VI-VIII層に終末を派生した.下部頸髄前肢域では終末は主にVII-VIII層に分布し,前肢運動核への分布は非常に少なかった.NRPCへの大脳皮質入力はネコの前頭眼野である6野と4野の内側1/3から起始し,一方NRGは皮質頸・体幹領域と謂れる4野内側2/3から強い入力を受けていた.以上の結果より, NRPCは主にeyehead coordinationに, NRGは主に頸運動の制御に関与することが示唆された.頸運動は動物が対象に働きかけるとき、まず眼球,頭,体幹を対象に向ける定位運動において重要な位置を占めている。申請者はこれまでこの定位運動に関与する大脳及び上丘から頸運動ニューロンへの下行性コマンド、橋,延髄網様体に存在し、かつその軸索側枝を下部頸髄まで投射する網様体脊髄路(C-RST)細胞により介在されることを明らかにしてきた。そこで本研究では、橋,延髄由来のC-RST細胞の軸索に脳幹,脊髄の種々のレベルでHRPを注入し、終末まで染め出し、その形態を脳幹から脊髄まで全長にわたって詳しく解析した。その結果、橋,延髄由来のC-RST細胞には形態学的相違があることが明らかになった。橋由来のC-RST細胞は脳幹ではMLF又はその近傍を下行し、途中外転神経核,舌下神経前位核,延髄網様体,前庭神経核に多数の側枝及び終末を派生した。

上部頸髄(【C_1】-【C_3】)では軸索は前索を下行し、頸運動核に多数の終末を派生する以外に、Rexedの【VIII】-【VI】層にも少数の終末を分布した。これに対し延髄由来のC-RST細胞は脳幹では、ほとんど側枝を派生せず脳幹網様体内側部を下行した。上部頸髄では、前索外側部又は側索を下行した。前索外側部又は側索腹側を下行したC-RST細胞は頸運動核,副神経核のいずれかに多数の側枝,終末を派生した。終末の一部は【VIII】-【VI】層にも分布した。側索中央部を下行したC-RST細胞は頸運動核にはほとんど終未を派生せず、主に【VIII】-【VI】層外側部に終未を派生した。前肢運動ニューロンの存在する下部頸髄(【C_6】-【C_8】)では、橋,延髄由来の両C-RST細胞とも終未を主に【VIII】-【VI】層に派生し、前肢運動核にはほとんど派生しなかった。以上の結果より橋由来のC-RST細胞は、眼球と共同した指向運動に、延髄由来のC-RST細胞は、主に頸運動に関与し、両者の下部頸髄への軸索側枝は、頸運動に伴う肢による姿勢調節に関与していることが示唆された。
自己免疫疾患臓器特異性を決定する腸内細菌特異抗原の同定と慢性大腸炎モデルの開発

第1に、腸内細菌のいかなる特異的抗原が慢性大腸炎発症を制御するのかを明らかにする目的にて、我々はSingle Pathogenic Colitic T Cell Transfer Colitisモデルを樹立した。すなわち、慢性大腸炎発症マウス腸炎炎症局所より単離した1個の細胞を、in vitroでモノクローナルに増殖させるシステムを開発し、再度、T細胞クローンを免疫不全マウスに移入するシステムである。これにより発症した慢性大腸炎は単抗原を認識するT細胞により惹起したモデルであり、炎症局所よりT細胞を分離し、T細胞受容体遺伝子クローニングを進行中である。さらに、同定された腸内細菌抗原特異的T細胞受容体遺伝子を導入したトランスジェニックマウスを作製し、慢性大腸炎を誘導する腸内細菌の特定抗原の同定、新しい抗原特異的慢性大腸炎モデルの作製を行う予定である。第2に、最近、我々は従来から広く用いられているCD4^+CD45RB^<high>T細胞移入慢性大腸炎モデルを改変し、極めてユニークなシステムを確立した。最後に、これらの研究のもっとも重要な点は発展的に臨床応用も視野に入れ、上述の如く、どのような状況下によって、腸内粘膜免疫、さらには全身免疫へも作用制御する調節性T細胞をプロバイオテスク、プレバイオテスクなど腸内細菌のスクリーニングに基づき開発し、炎症性腸疾患治療の現在の主流をなす治療の対局、すなわち、副作用の少ない臓器特異的な治療法の開発を展開中である。1)自然免疫系障害は粘膜免疫組織に存在する調節性T細胞に影響を及ぼすか否か(1)腸内細菌に共通の自然免疫系認識機構であるMyD88-Toll-like受容体分子の欠損マウス(MyD88欠損マウス、TLR2、TLR4、TLR9欠損マウス)における脾臓、大腸粘膜内リンパ球より、CD4+CD25+T細胞は正常マウス同様にin vitroで調節性T細胞機能を有した。(2)(1)より分離した調節性T細胞を、CD4+CD45RBhigh移入大腸炎モデルにおいて、共移入したところ、正常マウスCD4+CD25+T細胞に比較して、MyD88欠損CP4十CD25+T細胞の腸炎発症抑制能は有意に低下し、腸炎を発症した。BALB/cマウスCD4+CD45RBhigh移入大腸炎炎症局所よりCD4陽性T細胞を単離し、1×10^4個を再びSCIDマウスに移入し大腸炎を作成した。同様の操作を繰り返し、病的CD4陽性T細胞のin vivoでの継代を行った。さらに、継代に際し、正常BALB/cマウス脾臓樹状細胞にCD4+CD45RBhigh移入大腸炎発症マウス大腸内糞便ホモジェネートし腸内細菌抗原をパルスし、病的CD4陽性T細胞のセレクションをおこなった。継代に際し、より早く激しく腸炎を発症するマウスを選択した。6代継代後、得られたT細胞クローンのVb領域のPCRを施行し、3匹にClonalityを確認した。種々得られたT細胞クローンを再度、BALB/c Rag-2欠損マウスに移入し継代中である。さらに、SPTC Colitisは正常マウスCD4+CD25+T細胞の共移入により腸炎発症抑制制御されることを確認した。得られた、腸炎発症病的CD4+T細胞は腸内細菌抗原パルス樹状細胞とIL-2とIL-7添加培養液にてin vitroでのT細胞クローンを2クローン樹立し、in vitroにおける単クローンメモリー細胞のCD4+CD25+T細胞での制御を検討中である。現在、腸炎を発症した個体より、炎症局所、脾臓、リンパ節よりT細胞を単離、T細胞受容体遺伝子のクローニングを行っている。1)腸内細菌抗原特異的調節性T細胞の同定とトランスジェニックマウスの作製腸炎誘導CD4陽性T細胞受容体遺伝子を用いた、T細胞受容体遺伝子導入トランスジェニックマウスを作製中である。

マウス、胸腺、脾臓、腸間膜リンパ節、パイエル板、大腸粘膜内リンパ球、大腸上皮間リンパ球について調節性T細胞の存在と機能を明らかとした。特に、ヒト腸粘膜内CD4+CD25+細胞の調節性T細胞の存在と機能の報告(Makita S, et al.J.Immunol.2004)に引き続き、マウス腸粘膜内CD4+CD25+細胞のin vivoにおける調節生T細胞機能を有することを証明した。(A)BALB/cマウスよりCD4+CD45RBhighT細胞をFACSVantageにて単離し、BALB/c nude/nude腹腔内に移入したところ、BALB/c scid/scidへの移入同様に慢性大腸炎を引き起こし、さらに、この新しいモデルにはヒト炎症性腸疾患により類似した免疫病態が関与することを示した。以上の検討で、異なるレシピエントで異なる自己免疫現象が出現することを検証し、その特性、特に臓器特異的な調節性T細胞の特性を明らかとする。4)CD4+CD25-レギュラトリーT細胞は胸腺外分化した細胞なのか
炭素－炭素結合の切断を伴う極性官能基導入法の開発と機能性有機材料合成への応用

本研究では、パラジウム触媒によるアライン、イソシアニドおよびシアノギ酸エステルの3成分カップリングによってイミノイソベンゾフランおよびαーイミノニトリルが生成することを見出した。また、単離したイミノイソベンゾフランに水素化ジイソブチルアルミニウムを作用させると、期待したアルデヒドではなく、αーイミノニトリルが選択的に生成することを明らかにした。一方、単離したシアノ基を有するイミノイソベンゾフランに対して触媒量のトリス(ペンタフルオロフェニル)ボランを作用させると、2-シアノ安息香酸エステルを与えることが分かった。以前、研究代表者は、パラジウム触媒によるノルボルネンおよびノルボルナジエンに対するシアノエステル化を報告している。この反応では、シアノギ酸エステルの炭素ー炭素結合をパラジウムにより活性化し、ノルボルネン誘導体に付加させることで極性官能基であるシアノ基とエステル基を同時にしかも何の副生物も生じることなく導入することができる。しかし、この反応の欠点は、基質の適応範囲がノルボルネン類に限られることである。そこで、平成25年度は、このシアノエステル化の反応機構を明らかにする目的でシアノギ酸エステルと化学量論量のロジウム(I)錯体を用いて反応をおこなった。具体的には、ロジウム(I)錯体に対して、等モル量のシアノギ酸エチル、リン配位子を入れ、重トルエン溶媒中60度で24時間加熱したのち、1H NMRによりシアノギ酸エチルの転換率を概算した。その結果、トリメチルホスフィンを用いたところ、等モル量では22%の転換率で目的の錯体が生成し、3倍モル量用いた時では、高収率で酸化的付加体であるmer-エトキシカルボニル(シアノ)ロジウム(III)錯体が生成することがわかった。シアノギ酸エステルのエステル上の置換基としては、R = Me、Et、nPr、iPr、nBu、Bnが適応可能であった。さらに、錯体のX線結晶構造解析をおこない、クロロ基とエステル基がパラジウムに対してトランス配座で結合していることがわかった。錯体の生成に関する実験として、1H NMRにより反応を追跡すると、反応の初期には、速度論的に安定な錯体が生成し、その後、少しずつ熱力学的に安定な錯体へ異性化することを明らかにした。さらに、密度汎関数法(DFT)計算により、シアノギ酸エチルの炭素ー炭素結合活性化を経由したロジウム(III)錯体の熱力学的な安定性の比較をおこなった結果も、実験によって得られた錯体の構造が最も安定であると支持された。以前,パラジウム触媒によるノルボルネンおよびノルボルナジエンに対するシアノエステル化を報告している。この反応では、シアノギ酸エステルの炭素ー炭素結合をパラジウムにより活性化し、ノルボルネン誘導体に付加させることで極性官能基であるシアノ基とエステル基を同時にしかも何の副生物も生じることなく導入することができる・平成24年度は、この反応を芳香族化合物へのシアノ基とエステル基の導入を目的として、アラインに対するシアノエステル化に適用することを試みたが,対応する生成物を得ることはできなかった。しかし,興味深いことに,パラジウム触媒の配位子としてイソシアニドを用いた際に,アライン前駆体,イソニトリル,シアノギ酸エステルの三成分カップリングが進行し,対応するシアノ基を有するイソベンゾフランとその異性体であるαーイミノニトリル誘導体が生成することを見出した。具体的には、パラジウム触媒下,基質としてアライン前駆体,tert-オクチルイソニトリル,シアノギ酸エチルを用い,THF中,50 °C,18時間反応させることにより対応するシアノ基を有するイソベンゾフランを収率44%で得た。さらに,この反応において,異性体であるαーイミノニトリル誘導体が25%の収率で生成していることを確認した。これら2種類の化合物の構造は,X線結晶構造解析により決定した。アラインを用いる多成分カップリング反応は,アラインの高い反応性を利用し,様々な求核剤,求電子剤との組み合わせが可能性であることから多置換アレーンを合成する重要な手段となりうる。アラインを用いる多成分カップリング反応は、アラインの高い反応性を利用し、様々な求核剤、求電子剤との組み合わせが可能性であることから多置換アレーンを合成する重要な手段である。研究代表者は、平成24年度にパラジウム触媒によるアライン、イソシアニドおよびシアノギ酸エステルの3成分カップリングによってイミノイソベンゾフランが合成できることを報告している。その後、この反応では、同時にαーイミノニトリルが副生することも同時に見出した。さらに、ボラン触媒を用いるイミノイソベンゾフランの選択的な2-シアノ安息香酸エステルへの変換反応を開発した。

単離したシアノ基を有するイミノイソベンゾフランに対して触媒量のトリス(ペンタフルオロフェニル)ボランを作用させると、αーイミノニトリルを経由して2-シアノ安息香酸エステルを与えることが分かった。さらに、速度論的研究および計算科学を駆使しながら、反応機構に関して詳細に研究をおこない、イソシアニドの置換基に由来するカチオンの安定性がこの変換反応の鍵であることを突き止めた。化学量論反応において、ベンザイン前駆体と化学量論量のエトキシカルボニル(シアノ)パラジウム(II)錯体の量論反応においても対応するエチル2-シアノ安息香酸エステルが生成することも見出した。以上のように、研究代表者はパラジウム触媒と反応活性な反応剤であるアラインを巧みに用い、イソシアニドとギ酸エステルを組み合わせて、様々な含窒素化合物の合成に成功した。これらの反応の開発により、従来の合成法では達成できなかったギ酸エステルの新たな炭素ー炭素結合の切断を伴う新規有機分子合成への応用が期待できる。化学平成25年度は、パラジウム以外の遷移金属を用いて、シアノギ酸エステルの炭素ー炭素結合を活性化を検討した。具体的には、他の遷移金属としてロジウムに着目した。ロジウムは9族の遷移金属であるため,同様の触媒反応においても,10族の遷移金属であるパラジウムやニッケルとは異なる挙動を示すことが期待できる。また,ロジウム(I)からロジウム(III)の錯体に変化する際には,通常,6配位までとることができるため,平面4配位しか取れないパラジウムやニッケルと比較しても,配位座が二つ多い分,反応性の多様性が期待できる。ロジウム(I)錯体に3倍モル量のトリメチルホスフィンを作用させると、シアノギ酸エステルの炭素ー炭素結合が切断され、mer-アルコキシカルボニル(シアノ)ロジウム(III)錯体が生成することを明らかにできた。これらの実験結果から、シアノギ酸エステルの炭素ー炭素結合の切断を伴う酸化的付加段階における重要な知見を得ることができたと考えている。平成24年度は、炭素ー炭素結合の形成による触媒反応の開発を目的として研究を遂行した。当初の目的であったアラインに対するシアノエステル化反応は達成できなかったが、予想しなかった新規反応であるアライン前駆体,イソニトリル,シアノギ酸エステルの三成分カップリング反応を発見することができた。(今後の推進方策)平成26年度は、今後,ロジウム触媒によるシアノエステル化反応について検討し,パラジウムやニッケル触媒反応とは異なる新規の反応性,選択性を得ることを目指す。本触媒反応の達成のために,詳細な反応条件の検討,反応機構を精査する。さらに、当初の目的であった遷移金属錯体触媒を用いるベンザインへのシアノエステル化を達成したい。触媒反応が予定通り進行しない時には、化学量論量の遷移金属錯体を用いて反応機構を詳細に検討する。次年度の研究費の使用計画)平成26年度は、1,200千円の研究費に対して、その大半を薬品や実験器具類などの消耗品費に充てる予定である。平成25年度は、炭素ー炭素結合を活性化できる他の遷移金属としてロジウムに着目して研究を開始する。パラジウムは通常、四つの配位子としか結合できないが、ロジウムは最高六つの配位子と結合可能であるため、これまで達成できなかった有機不飽和化合物に対するシアノアステル化反応が開発できる。
脳関門におけるABCG2の生理的役割と活性制御機構の解明

申請者は昨年度までに、血液脳関門(BBB)の血液側膜に発現している薬物排出輸送担体ABCG2の発現・活性が、星状膠細胞培養上清やbFGF、ホルモンによって誘導されること、およびそのシグナル経路の一部を明らかにした。本年度は、BBBにおけるABCG2の生理機能をより詳細に明らかにすることを目的として、ABCG2ノックアウトマウス(in vivo)及びRNAi法(in vitro)を用いて、ABCG2機能および寄与の検討を行った。ABCG2ノックアウトマウスを用いて、各種放射性ラベル化合物の脳内移行性を比較検討した。検討した化合物のうち、ドパミンの最終代謝産物である[^3H]ホモバニリン酸の脳内移行がABCG2(-/-)マウスにおいて、ABCG2(+/+)マウスと比較して有意に低下していた。さらに、ABCG2過剰発現細胞株を用いた輸送実験から、ホモバニリン酸がAECG2の基質となることが見いだされた。以上から、BBBを介した脳からのホモバニリン酸の排出にABCG2が関わっている可能性が示された。さらに、作成したABCG2 siRNAによって、基質スペクトルが類似しているABCB1やAECC1、同じサブファミリーに属するABCG1に影響を及ぼさず、選択的にBCECにおけるABCG2の発現を抑制することに成功した。これらの輸送担体は、BBBに発現していることから、本手法によってABCG2のBBB排出輸送における機能を特異的に評価し、ABCG2の寄与解明に応用できる可能性が考えられた。本研究成果の一部は本年度の日本神経科学大会において発表した。以上、本研究から、BBBの血液側膜に発現しているAECG2は、脳内の内因性物質の排出に関与しており、その発現・活性は、血液中及び脳内の各種環境因子によって制御されていることが示唆された。申請者はこれまでに、薬物排出輸送担体であるABCG2がラット血液脳関門(BBB)の血液側膜に発現していることを見いだした。しかし、BBBにおけるABCG2の機能、および制御機構は不明である。そこで、本研究はBBBにおけるABCG2の生理的役割と活性制御機構の解明を目的とした。星状膠細胞培養上清およびbFGFによって脳毛細血管内皮細胞(BCEC)におけるAktキナーゼのリン酸化が誘導されることが明らかになった。Aktキナーゼ活性化はABCG2の細胞膜局在量を増大させる。従って、bFGFをはじめとする星状膠細胞由来のAktキナーゼ活性化因子は、ABCG2タンパクの細胞膜移行量の増加を介してABCG2輸送活性を誘導していることが示唆された。さらに、BCECにおけるABCG2の発現は女性ホルモンである17β-estradiol処理によって誘導された。以上から、BBBにおけるABCG2の発現は脳内環境(星状膠細胞分泌因子)だけでなく、血中の内因性化合物によっても制御されることが示唆された。さらに、BBBから単離したラットABCG2遺伝子導入発現株を用いて、非ステロイド性抗炎症薬(NSAIDs)がABCG2の阻害剤となることを見いだした。これらの薬物は、脳移行性が低いことから、ABCG2がBBBにおいてNSAIDsの脳移行を制限している可能性が考えられる。本研究成果の一部はドイツで開催されたBBBシンポジウムにて発表し、「The best poster presentation award」を受賞した。
第Ｖ因子の抗凝固機能と小児血栓性疾患との関連についての基礎的研究

1.被検血漿解析:患者34名から採血し、内訳は血栓性疾患群(A群)8名、出血性疾患群(B群)22名、その他4名であった。(1)PC経路異常のスクリーニング検査:A群ではトロンビン生成能は正常であったがPC活性化刺激に対する感受性が有意に低下していた。半数(4例)でPC経路異常を示したが、うち3例はPC、PSおよびFV活性は正常で、FVIII活性高値が要因であった。一方B群ではPC経路機能は健常成人群と有意差を認めなかった。(2)FVのAPC抵抗性試験:全患者中4例が異常値でAPC抵抗性FVの可能性を示したが、3例では抗FVIIIインヒビターの影響が疑われた。残り1例はA群の脳梗塞既往小児例であり、(1)の検査も異常値でFV活性低値を示した。FV分子異常症が疑われたが確定診断に至らず他疾患のため死亡された。FV低値を示したのはこの1例のみであり、この他にFVNara類似症例は認められなかった。B群の出血症状の重篤度と(1)、(2)の関連はなかった。2.遺伝子組換えFVを用いたFVNara(FV-W1920R)の蛋白解析:遺伝子組換えFVとAPCの結合実験をELISAと表面プラズモン共鳴測定法を用いて実施し、FVとAPCの特異的結合を確認できたが、FV-wild typeに比したFV-W1920RのAPC結合能の有意差の有無の同定には至らなかった。3.総括と今後の展望: FVの抗凝固機能とその阻害(APC抵抗性)について、患者血漿および遺伝子組換えFVを用いて解析した。新たなAPC抵抗性FV症例は見出せなかったが、PC経路異常スクリーニング検査が本邦血栓性疾患においても有用であることが示唆された。近年、国内他施設からもFVNara類似症例が報告されており、本テーマの意義は大きい。より大規模なAPC抵抗性FVの関連調査が望まれる。まず本研究を実施するにあたり、研究実施審査申請書、研究計画書、同意書等を本学の医の倫理委員会に提出して、平成24年6月26日に承認を得た。その後、患者25名から同意書に署名の上、採血・検体保存を実施した。患者検体での検討実施を前に、FV欠乏血漿およびFVIII欠乏血漿、精製FV、FVIII等を用いて平成24年度実験計画にある(1)(5)の検討の予備実験を行い、それぞれの検査が問題なく実施できることを確認した。患者25名のうち、血栓症患者は4名あり、そのうち2例は不育症、1例は小児脳梗塞、1例は深部静脈血栓症から肺塞栓症をきたした小児例であった。これら4例の精査は緊急性もあり、優先的に実施した。その結果、このうち2例で(2)PC経路異常のスクリーニング検査で異常を示し、そのうちの1例はさらに(1)FVのAPC抵抗性試験においても陽性であった。この1例のFVについて遺伝子検査も含めさらに精査予定であったが、非出血/血栓性基礎疾患のため死亡され、以降の検体採取の同意が困難となった。健常ボランティア検体と残り21名の検討を一括して実施予定であったが、(2)の検査キット「トロンボパス」の欠品から納品が大幅に遅れた。

血漿検体は凍結再融解すると検体が劣化するため、検査キットの到着を待って実施することとした。検査キットは平成25年5月中に納品予定である。そこで、当初は平成25年度に実施予定であった、遺伝子組み換えFVを用いた蛋白解析を早めに実施した。FV-wild type、FV-R506Q、FV-W1920Rの3種を、EGRあるいはビオチン化PPACKでactive siteをブロックしたAPCとの結合実験をELISAとBIAcore(表面プラズモン共鳴測定法)を用いて実施中である。また、発端となったFV分子異常症患者の経過と病態解析について学会発表を行った。初年度に4名の血栓症患者を含む25名の患者検体を得ることができた。凍結保存血漿を用いた検査は血漿を融解した際に一括して行い、再凍結を避けることが望ましいが、重要なスクリーニング検査と位置付けているトロンボパスの欠品が発生し、緊急性のある4名の血栓症患者以外の検体の検討はトロンボパスの納品を待たざるを得なかった(平成25年5月納品予定)。平成25年5月に検査キットが揃う予定であり、到着次第、血漿検体の解析に取り掛かる。これらの結果とすでに実施している全血検査や外来診療データを総合的に解析し、血栓性疾患および出血性疾患における、FVの抗凝固機能の関与の可能性を検討する。また、すでに先行して検討を開始した平成25年度の課題である、遺伝子組み換えFVを用いた蛋白解析も引き続き実施する。平成25年度の成果をふまえ、不足する試薬や検査キットの購入に充てる。
非線形問題に関する数理力学的総合研究

この研究課題は非線形現象を記述する非線形の常微分方程式あるいは偏微分方程式また確率微分方程式等の多数の未解決問題を解明するために,解析学的のみならず代数学的・幾何学的などの観点から非線形問題およびそれと関連する諸問題を研究することを目的とするものであった。研究代表者および分担者は解析学の分野から4名,幾何学の分野から4名,代数学の分野から2名の計10名で構成されていた。具体的な研究テーマとしては,非線形偏微分方程式に関する研究,ループ群束の非可換接続についての研究,非アーベル的コホモロジーと場の理論とに関する研究,C^nの単位多重円板上のあるハーディ空間の上の等距離写像に関する研究,C^nの単位球上のあるバナッハ空間の上の等距離写像に関する研究,多重円板上のH^∞+Cのmultiplierとブルゲイン代数に関する研究,フレッドホルムの荷重合成作用素に関する研究,有限半順序集合Pと環のP-ガロア拡大に関する研究,およびPI多元環の中心商標に関する研究であった。また,研究業積の観点から云えば,関数方程式論的にはドリフト項をもつ非線形放物型方程式の時間的大局解の存在証明,大域的解析学的分野ではループ群束やカレント群束等を含むGLp束における非可換接続に関する探求等,多変数関数論の面ではハーディ空間上の線形等距離写像の特徴ずけなどの一連の仕事,関数解析学の面では荷重合成作用素がフレッドホルム作用素であるための必要十分条件の発見,代数学的分野では有限半順序集合Pが働く環の不変環の構造の解明などこれらが主要な成果である。これらは各種の刊行物ならびに種々な所で発表されたり講演されたりした。尚,以上の成果は非線形問題全般に対して直接的・間接的に,また純理論的にあるいは応用面において多々寄与する所があると考えられる。今後ともこの問題の一層の解明のために努力したいと思う。
インターフェロン誘発物質ポリI:Cのレセプター単離に関する研究

インターフェロン(以下IFN)誘発に関与するポリI:Cレセプターの精製とその性状を解析する事を目的として実験を行ない、以下の結果を得た。1.ポリI:Cレセプターに対する単クロン抗体の作製:RK-13細胞及びその細胞膜から分離したポリI:Cレセプター画分(昭和60年度研究実績)を抗原として、BALB/Cマウスを免疫し、細胞融合法により抗体産生ハイブリドーマを作製した。単クロン抗体のスクリーニングは、RK-13細胞を抗原として、酵素抗体法(ELISA)により行ない、又、抗体価測定は、【^(125)I】標識2次抗体を用いるRIA法により行なった。2.単クロン抗体による細胞レベルでのポリI:Cレセプターの解析:RK-13細胞を単クロン抗体で前処理して、ポリI:C誘発によるIFN産生に対する効果を調べた所、(1)IFN産生を抑制する抗体、及び(2)IFN産生を増強する抗体が見出された。(1)の抗体は、レセプター分子のポリI:C結合部位を認識しポリI:Cのレセプターへの結合を阻害する事によりIFN産生を抑制すると推定される。一方、(2)の抗体については、そのIFN産生増強の機序は、現在の所不明である。3.単クロン抗体による分子レベルでのポリI:Cレセプターの解析:RK-13細胞の細胞膜から部分精製したポリI:Cレセプター画分を、SDS-PAGE及び銀染色法で解析した所、分子量95K25Kの5種類のポリペプチドが検出された。これを更にウエスタンブロッティング法で解析した所、分子量59Kの成分が、ポリI:Cによるインターフェロン誘発を抑制する単クロン抗体によって認識された。従って、この分子量59Kの成分が、ポリI:Cレセプター分子上のポリI:C結合部位を構成していると推定される。4.ポリI:CレセプターのRNA特異性:RK-13細胞及びPR-RK細胞を用いた細胞レベルの実験から、ポリI:CとポリA:Uとではレセプターが異なる事(RNA特異性)が示唆された。現在、【^(32)P】によるポリI:Cの標識を試みており、これをプローブとして、ポリI:Cの性状の解析を更に進める予定である。
超高エネルギー物質を利用する細胞破壊型殺癌剤の開発

テトラゾールとトリフルオロエトキシ化フタロシアニンから構成される全く新しい作用機序を持っと想定される超高エネルギー性細胞破壊型殺癌剤の設計を行い,目的通りにその合成を完成させた。さらに得られた合成化合物を用い細胞試験を行ったところ光照射時においてのみ高い活性を持っことがわかった。昨年度に合成したテトラゾール縮合型TEFOフタロシアニンを用いたin vitroの細胞試験を行った。2.0×104個のメラノーマ癌細胞B16F10に対し,本化合物のDMSO溶液を4時間曝露させ,続いて一定の波長の光を40分間照射することにより,癌細胞が死滅するかどうかを調べた。MTTアッセイによって細胞の生存率を調べたところ, 660 nmの光を当てた時に細胞数が大きく減少しており,強い細胞毒性を示すことが判明した。光照射時と非照射時の細胞生存率を比べたところ,光を当てた際,約8割の細胞が死滅する結果となったが,非照射時において細胞死滅数は0であり,高い選択性を示した。また本化合物の阻害率50は2.00 μMとなり高い活性を持つことが判明した。更なる知見を得るため,光照射によるテトラゾール分解実験を行った。本化合物を酢酸エチルに溶解し,四面平方石英セルにいれ,キセノンランプを用いて光を照射した。光照射30分で,緑色を呈していた溶液が退色し,完全に分解している様子が確認された。この実験から細胞内で光を当てることにより,窒素ガスが発生していることが示唆される。また本化合物の溶液中での物性を調べるため可視紫外吸収スペクトルと蛍光スペクトルを測定した。ジメチルスルホキシド溶媒中においてQ帯と呼ばれるシャープな吸収帯を示した。この吸収帯は配位性溶媒であるピリジンを添加しても,形状に変化がなかったことから。溶液中で会合状態を作っていないことが示唆される。650nmの光を当てて蛍光を測定したところ,720nmの光を発し,その蛍光量子収率は0.15となった。23年度は研究計画に従い,テトラゾールを結合させたトリフルオロエトキシ化フタロシアニン(TFEO-Pc)の合成を検討した。当初の計画では,アミノ基をもったTFEO-Pcを化学変換し,5-アミノテトラゾールへと誘導する予定であったが,反応は進行しなかった。そこで新たな合成ルートとしてTFEO-Pcに直接テトラゾールを導入することを考えた。アジド基を取り付けたテトラゾールと,エチニル基を持つTFEO-Pcをクリック反応により,トリアゾール結合を介したテトラゾール縮合型TFEO-Pcを合成した。本反応では,目的化合物一致する分子量を持つ2つの化合物が生成した。クリック反応時に,トリアゾールリンカーに結合する位置が異なる異性体が生成したものだと思われる。また当初の計画に従い,テトラゾールをトリフルオロエトキシ化サブフタロシアニン(TFEO-subPc)へ導入する検討も行った。TFEO-subPcの高い軸位置換活性を利用し,5-アミノテトラゾールのアミノ基を介してTFEO-subPcへと導入する予定であったが反応は進行しなかった。そこで予定を変更し,ヒドロキシ基を導入した5-アミノテトラゾールを用い,TFEO-subPcの軸位の置換反応によりエーテル結合を介したテトラゾール縮合型TFEO-subPcを合成した。合成したテトラゾール縮合型TFEO-Pcを用い抗癌活性を調査した。メラノーマ癌細胞B16F10に本化合物を曝露し,660 nmのLED光源により光を40分間照射した。結果,80%近くの癌細胞を死滅させることに成功した。しかし,本研究目的の爆発による細胞破壊は見受けられず,今後の研究課題である。23年度の研究では,当初の目的通り5-アミノテトラゾールをトリフルオロエトキシ化フタロシアニン,及びトリフルオロエトキシ化サブフタロシアニンに導入することに成功した。爆発による腫瘍破壊活性こそ出ていないものの,テトラゾールの導入形態は様々な形が考えられ,今後検討を行っていく余地は十分ある。またテトラゾール縮合トリフルオロエトキシ化フタロシアニンは,細胞試験の結果から癌細胞に取り込まれやすいことが判明しており,医薬品としての素質を備えている。トリフルオロエトキシ化フタロシアニンからテトラゾール環へのエネルギー伝達をスムーズに行うため,フタロシアニンユニットとテトラゾールユニットを繋ぐリンカーの検討を行う。フタロシアニンの置換基を化学変換させ,テトラゾール環を作ることは難しいと思われるため,テトラゾール誘導体とフタロシアニン誘導体を直接化学反応によって結合させる手法をとる。この際,両ユニット間には様々なリンカーを導入することができる。これによりエネルギー移動効率が高くなる化合物を探り出し,腫瘍破壊型殺癌剤の完成を目指す。化合物の合成が中心となるため薬品類の購入にあてる。また,ガラス器具などの実験器具の購入も計画している。研究成果を発表するための旅費も計上している。
転写調節因子NFκBの不活性化による放射線抵抗性がんの感受性化機構

本課題は種々の遺伝子発現に深く係わっていると考えられるNF-κBの機能を調節しているI-κBα遺伝子の導入により、分子レベルにおける細胞の内因性放射線感受性を支配している機構を解析しようとすることである。放射線抵抗性脳腫瘍細胞にNF-κBの阻害蛋白であるI-κBα遺伝子を変異型(非リン酸化型)として導入し、以下の知見を得た。1.IκB-α遺伝子のリン酸化部位(32および36番のセリン、42番のチロシン)のアミノ酸を塩基置換により変更し、このcDNAを発現ベクターpcDNA3に組み込んで、ヒト脳腫瘍由来細胞(MO54)に導入し、得られたクローンの放射線感受性化の程度を調べた結果、両セリンの置換(Sと略す)ならびにチロシンの置換(Yと略す)で放射線感受性化がさらに増し、これらすべてのリン酸化阻害によって、最も著しい放射線感受性化が認められた。3.放射線照射後の細胞周期分布については、親株やネガティブコントロールでG1期やG2期アレストが観察されたが、SY-IκB-αクローンではこれら休止期のアレストはわずかであった。4.リン酸化阻害剤herbimycin A(1μg/ml)を2時間処理すると、親株の放射線感受性は高まったが、SY-IκB-αクローンの放射線感受性に変化は認められなかった。5.放射線に加え、紫外線(UV)や制がん剤のアドリアマイシン(ADR)の感受性をそれぞれのクローンで調べた結果、S-IκB-αおよびY-IκB-αクローンで致死効果は増強した。両リン酸化阻害のSY-IκB-αクローンでは、放射線と同様、さらに著しいUVとADR感受性化が観察された。6.放射線誘発の突然変異について解析したところ、ネガティブコントロールに比較して放射線感受性化されたSY-IκB-αクローンでは著しくHPRT遺伝子の突然変異頻度が上昇した。