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ＬＥＤを活用した骨格筋再建法の開発　―『光』は骨格筋を変えるのか？―

骨格筋のミトコンドリアは、骨格筋のみならず全身の健康を司る細胞小器官である。この生物学的特徴から、骨格筋ミトコンドリアの機能を向上させる手段の開発は、学術のみならず臨床においても高い意義がある。例えば、近年では、骨格筋ミトコンドリアの恒常性の改善が骨格筋再建を促進する可能性が考えられている。培養細胞を対象とした先行研究から着想を得て、本研究では、マウスの骨格筋のミトコンドリア機能を高める新たな手段として、LED照射が有効であるか否かを明らかにすることを目指して検討を重ねてきた。平成28年度はLEDを照射装置の開発を中心に検討を行い、プロトコールを確立した。平成29年度は、確立したプロトコールを用いて、実際にミトコンドリアの適応を検討した。平成29年度は、赤色LEDの照射が骨格筋のミトコンドリア生合成を誘導するか否かを評価した。2週間のマウスの腓腹筋に2週間にわたってLEDを照射し(650 nm, 1 mW, 30 min/day)、最終のLED照射から24時間後に組織を摘出した。生化学解析として、ミトコンドリア量を評価した。LEDの照射を行ったとしても、ミトコンドリア量の指標となるCS最大活性、COX最大活性、OXPHOSタンパク質量の上昇は認められなかった。これらの知見は、本研究の仮説を支持するものではなく、現時点では、LED書ウッ者によってミトコンドリア生合成の促進効果は認められないことが暫定的な結論である。一方で、一過性のLED照射によって、エネルギー代謝やタンパク質代謝を制御する分子群が活性化したことを認めており、特に糖・脂質代謝を制御する酵素の遺伝子発現が上昇することも観察されている。したがって、現在得られている知見を踏まえると、一過性のLED書照射による骨格筋の細胞応答(特に一過性にエネルギー代謝が変化する可能性)をより詳細に解析し、ミトコンドリア以外の応答・適応の可能性を探ることが、今後の研究展開の方向となりうる。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。この特徴から骨格筋ミトコンドリアの機能を向上させる手段の開発は学術のみならず臨床においても高い意義がある。培養細胞を対象とした基礎研究から着想を得て、本研究ではマウスの骨格筋ミトコンドリアの機能を高める新たな手段として、赤色LEDの照射が有効であるか否かを明らかにすることを目指し検討を重ねてきた。今年度は、マウスを対象としたLED照射装置の開発を中心に検討を行った。複数のタイプのLED照射装置を試作を重ねた。検討項目は、照射強度および照射波長、照射時間等である。また、LED照射による発熱の影響がマウスの骨格筋に伝達しないことを確認するなど妥当性の検証も併せて実施した。現在までのところ、フォトダイオードを用いた測定結果から、5-20mWのLEDを15-30分照射することが好ましいと考えられる。また、当初の仮説に加えて、赤色光および近赤外光を採用することが妥当であることを示唆する結果が得られている。今後は、LED照射装置の完成度を高めることを最優先課題とする。その後、単回・頻回の介入実験を実施することで、実際にマウスの骨格筋に生理応答・代謝的適応が生じるか否かを検討する。具体的にはミトコンドリア生合成に関与する細胞内情報伝達経路および転写因子群が活性化するか否かを検討し、本研究の最終目標である「伸張性収縮に伴う骨格筋損傷への新規治療法の開発」に向けた基礎的知見を蓄積する。LED照射装置の開発は、本研究を遂行する上で最も重要な検討課題であった。今後、検証する仮説に応じて、照射パラメータを調整する余地はあるものの、LED照射装置の試作・妥当性検証に関して概ね予定通りに遂行された。

一方で、一過性のLED照射によって、エネルギー代謝やタンパク質代謝を制御する分子群が活性化したことを認めており、特に糖・脂質代謝を制御する酵素の遺伝子発現が上昇することも観察されている。したがって、現在得られている知見を踏まえると、一過性のLED書照射による骨格筋の細胞応答(特に一過性にエネルギー代謝が変化する可能性)をより詳細に解析し、ミトコンドリア以外の応答・適応の可能性を探ることが、今後の研究展開の方向となりうる。LED照射装置の完成度を高める。その後、単回・頻回の介入実験を実施することで、実際にマウスの骨格筋に生理応答・代謝的適応が生じるか否かを検討する。具体的にはミトコンドリア生合成に関与する細胞内情報伝達経路および転写因子群が活性化するか否かを検討し、本研究の最終目標である「伸張性収縮に伴う骨格筋損傷への新規治療法の開発」に向けた基礎的知見を蓄積する。必要に応じて、生体のみならず、培養細胞を対象とした実験系も動員し、あらゆる角度からLED照射による骨格筋適応を検討することで、より堅実な科学的根拠の獲得を目指す。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。
共蒸発分子誘起結晶化法の異種材料展開と原理探求

共蒸発分子誘起結晶化法は、有機薄膜太陽電池への応用を意図して考案した、真空蒸着中に液体を導入することで有機混合膜の結晶化を促進する手法である。しかし、研究を進めるうちに、この手法は有機混合膜結晶化に限らない真空蒸着法の本質的な拡張法であることが明らかになってきた。本研究ではこの方法の適用範囲を結晶性有機半導体のみから、アモルファス性の有機半導体や無機材料などの異種材料へ拡張することを目的として、研究をおこなったところ、試した全ての有機半導体で結晶粒子の大きさを変化させることに成功した。一方、有機材料と無機材料とのハイブリッド系では、明確な変化がみられる系と見られない系に分かれる結果となった。共蒸発分子誘起結晶化法は、研究代表者らが最近、有機薄膜太陽電池への応用を意図して考案した、真空蒸着中に液体を導入することで有機混合膜の結晶化を促進する手法である。本研究ではこの共蒸発分子誘起結晶化法の適用範囲を結晶性有機半導体のみならず、アモルファス性の有機半導体材料・無機金属材料・無機金属酸化物材料・アルカリハライド材料などの異種材料へ拡張することを目的とする。今年度は上記の目的のため、蒸着装置における成長制御法の精密化を進めるとともに、結晶性有機半導体としてC60・H2Pc・ルブレン、アモルファス性有機半導体としてAlq3を用いて、共蒸発分子誘起結晶化法により薄膜を作製した。その結果、上記のどの有機半導体を用いても共蒸発分子誘起結晶化法を用いた場合に、用いない場合と比べて大幅に薄膜形態が変化することが確認された。その一方で、C60以外の分子においては、基板温度が70°Cの時、基板温度の影響による薄膜中の結晶核の3次元成長を抑えられないために、成膜後の定量的な評価が難しくなる問題も露呈した。この解決策として、特にH2Pcにおいて、基板温度40°Cでの薄膜成長をおこなったところ、3次元成長を抑制しながら、共蒸発分子誘起結晶化法により結晶粒子の大きさを変化させることに成功した。しかし、研究を進めるうちに、この手法は有機混合膜の結晶化に限らない、真空蒸着法の本質的な拡張法であることが明らかになってきた。本研究では、この共蒸発分子誘起結晶化法の適用範囲を結晶性有機半導体のみならず、アモルファス性の有機半導体材料・無機金属材料・無機金属酸化物材料・アルカリハライド材料などの異種材料へ拡張することを目的としている。前年度から今年度にかけて、まず、結晶性半導体としてC60・H2Pc他フタロシアニン類、ルブレンなど、アモルファス性有機半導体材料としてAlq3などを用いて共蒸発分子誘起結晶化法による薄膜成長をおこなってきている。また、蒸着装置を改造して、共蒸発分子誘起結晶化法による薄膜成長制御の精密化も引き続き進めており、様々な条件において、共蒸発分子誘起結晶化法が再現性よくおこなえることを確認した。また、今年度は上記に加えて、蒸発速度と粒子サイズの関係を材料系を拡張して解析するとともに、その結果を学会・論文発表する予定であったが、年度途中に研究代表者の所属研究機関の変更により、研究設備の移設や整備、設備変更に伴う実験条件の変化が生じた。そのため、計画を変更し、既知材料による実験条件の再現性の確認を優先しておこなった。本研究ではこの共蒸発分子誘起結晶化法の適用範囲を結晶性有機半導体のみから、アモルファス性の有機半導体材料や無機材料などの異種材料へ拡張することを目的として、研究をおこなった。まず上記目的のため、蒸着装置における成長制御法の精密化を進めるとともに、結晶性有機半導体として、C60・H2Pc・ルブレン、アモルファス性有機半導体としてAlq3を用いて、共蒸発分子誘起結晶化法により薄膜を作製した。その結果、上記のどの有機半導体を用いても、共蒸発分子誘起結晶化法を用いた場合に、用いない場合と比べて大幅に薄膜形態が変化することが確認された。次に有機材料と無機材料とのハイブリッド系に材料系を拡張するため、既に精密制御可能なC60と、無機アルカリハライド材料であるLiFとの混合膜を作製したところ、共蒸発分子誘起結晶化法の有無による明確な変化は見られなかった。一方、ヨウ化金属化合物とヨウ化水素酸有機化合物との混合膜を作製すると、共蒸発分子誘起結晶化法により結晶粒子の大きさを変化させることに成功した。

この変化の詳細については、今後の更なる研究が必要である。共蒸発分子誘起結晶化法は、有機薄膜太陽電池への応用を意図して考案した、真空蒸着中に液体を導入することで有機混合膜の結晶化を促進する手法である。しかし、研究を進めるうちに、この手法は有機混合膜結晶化に限らない真空蒸着法の本質的な拡張法であることが明らかになってきた。本研究ではこの方法の適用範囲を結晶性有機半導体のみから、アモルファス性の有機半導体や無機材料などの異種材料へ拡張することを目的として、研究をおこなったところ、試した全ての有機半導体で結晶粒子の大きさを変化させることに成功した。一方、有機材料と無機材料とのハイブリッド系では、明確な変化がみられる系と見られない系に分かれる結果となった。蒸発速度と粒子サイズの関係を材料系を拡張して解析するとともに、その結果を学会・論文発表する予定であったが、研究代表者の所属研究機関の変更により、研究設備の移設や整備、設備変更に伴う実験条件の変化が生じた。そのため、計画を変更し、既知材料によおる実験条件の再現性を確認することとしたため、やや遅れている。有機半導体エレクトロニクス材料系の拡張による解析を引き続きおこなう。実験装置の移設の必要が生じたため、および、蒸着条件の精密化に想定よりも多くの時間がかかったため。今年度は、蒸発速度と粒子サイズの関係を材料系を拡張して解析するとともに、その結果を学会・論文発表する予定であったが、研究代表者の所属研究機関の変更により、研究設備の移設や整備、設備変更に伴う実験条件の変化が生じた。そのため、計画を変更し、既知材料によおる実験条件の再現性を確認することとしたため、次年度使用額が生じた。今後、引き続き、異なる材料に対して共蒸発分子誘起結晶化法を適用して薄膜を作製していく。研究計画時に明らかでなかった課題は、成膜後の薄膜の定量評価のためには薄膜の3次元成長を抑える必要があることである。そのため、材料ごとに適した基板温度を検討しながら、研究を進めていく。このため、材料系の拡張による解析と学会・論文発表を次年度に行うこととし、次年度使用額はその経費に充てることとしたい。消耗品の購入において端数が生じたため。薄膜成長のための材料や、真空機器、旅費などに使用予定である。
生殖のライフサイクルにおける脳の機能構造の変化と性特異性に関する研究

ほ乳類の生殖中枢である視床下部には前腹側脳室周囲核(AVPV)と呼ばれる性的二型核が存在する。ラットのAVPVの大きさや細胞数は雄よりも雌に優位であり、雌のAVPVは排卵誘起に重要な黄体形成ホルモン(LH)のサージ状分泌の制御に関与している。前年度研究では、成熟期のラットのAVPVの機能の性特異性に関する解析をおこなった。その結果、雌AVPVではLHサージが生じる期間においてニューロンの活性上昇がみとめられたが、雄AVPVのニューロン活性は上昇しなかった。また、AVPVの構造性差の形成メカニズムを探るため、発達期のアポトーシスを制御するBcl-2ファミリー分子の発現を検証した。その結果、発達期のAVPVにおけるBcl-2(雌>雄)およびBax(雌<雄)発現の性差が明らかになった。このように、成熟期のAVPVの機能の性差は発達期において形成されるAVPVの構造の性差によるものと考えられた。そこで本年度研究では、発達期におけるAVPV構造の性差形成のメカニズムについてさらに検討するため、脳の性分化の方向性を決定するエストロゲンによるBcl-2およびBax発現への影響を調べた。出生1日目にエストロゲンを投与し、出生2日目に採取された雌ラットのAVPV組織片では、Bcl-2タンパク質発現量は溶媒を投与した対照群雌より少なくなった。しかし、出生5日目にエストロゲンを投与して出生6日に採取した雌AVPVのBcl-2発現量は対照群雌よりも多くなった。Baxタンパク質発現に対するエストロゲンの顕著な影響は見られなかった。以上の結果から、発達期のAVPVにおけるBcl-2発現へのエストロゲンの影響は二相性を示し、その作用は時期によって異なることが示唆された。ほ乳類の生殖中枢である視床下部には視索前野の前腹側脳室周囲核(AVPV)と呼ばれる形態学的に雌に優位な性差がみられる神経核(性的二型核)が存在する。AVPVの性差形成は発達期における脳の性分化によって生じ、雌ラットのAVPVは排卵誘起に重要な黄体形成ホルモン(LH)のサージ状分泌制御に関与している。従って、性分化したAVPVの構造の性差によって生殖内分泌機能の性差が引き起こされると考えられる。また、生殖機能は加齢により著しく衰退する機能であり、生殖中枢の構造と機能は加齢影響を受けると考えられる。そこで生殖のライフサイクルにおけるAVPVの機能構造の変化とその性差を明らかにすることを目的として、本年度研究では、初期応答遺伝子であるFosの発現を指標として、成熟期の排卵制御におけるAVPVの神経活動の変化と性差を定量免疫組織学的に解析した。その結果、成熟雌ラットのAVPVのFos発現はLHサージの発生期間において他の時間帯よりも有意に増加していた。雌のLHサージの発生する時間帯においてAVPVのFos発現を雌雄で比較したところ、雄ラットのAVPVでは有意なFos発現の増加はみとめられなかった。さらに、雌AVPVのFos発現の増加はエストロゲン処置卵巣除去ラットでは引き起こされるが、卵巣除去ラットでは増加しなかった。以上のことから、成熟ラットAVPVの神経活性には性差があり、雌AVPVではLHサージ期間において活性上昇がエストロゲン作用によって生じることが示唆された。また、AVPVの性的二型核形成のメカニズムを探るため、発達期のアポトーシス細胞死を制御するBcl-2ファミリー分子の発現性差を検証した。その結果、発達期のAVPV形成にはBc1-2およびBaxによって制御されるアポトーシスが関与することが示唆された。
α-1-アンチキモトリプシンによるT-細胞幼若化の特異的抑制

インターリュウキン(以下IL-2)が関与する免疫反応に対するα-1-アンチキモトリプシン(ACT)の作用をヒト血中T-細胞を用い検索した。T-細胞は血中単核細胞からナイロンウールカラムを用い分離した。この細胞集団はPHAにより幼若化するがプロテインAでは幼若化しない。このことはこの細胞集団はT-細胞集団と判断された。この細胞をIL-2と共に5日間培養すると【^3H】-4ミジンの取り込みが増加し幼若化が認められた。この反応はIL-2濃度にある程度比例した。0.5mg/mlのACTは完全にIL-2によるT-細胞の反応を阻害し、阻害の程度はACTの濃度に比例した。〓にACTの生理活性であるキモトリプシンに対する阻害活性を熱処理により不活性化した場合でもIL-2によるT-細胞の反応を阻害した。ヒト血清急性期反応蛋白質の一つであるACTがIL-2関与の免疫反応を阻害することは上記の実験事実から明かとなった。そして酵素阻害活性をもたないACTがT-細胞反応性を阻害することは興味ある事実でACTの機能として新しく加えてもよいと考えられる。ACTのヒトにおける正常時での濃度は0.2mg/mlでありこの濃度は50%阻害を示す濃度でもある。このことはACTが常に免疫反応を阻害しIL-2が少量産生されたとしてもその作用を中和していると考えられる。そしてIL-2の濃度が一定以上となり、その上抗原の刺激があるときには免疫反応が進行する。免疫反応は従ってリンフォカインやモノカインのみならず血清タンパク質によっても調節をうける。これらの事実はACTが第一儀的には免疫反応の調節に関与しており二儀的に酵素阻害剤として組織を障害から保護することを考えさせる。
中堅助産師のキャリア開発と関連要因の探索

中堅助産師のキャリア開発に関する認識、それに関する影響要因を明らかにすることを目的とした。中堅助産師のキャリア開発の実態・認識とそれに対する影響要因を探索した結果、ワークライフバランスをふまえてキャリア開発を考え、就業機関、経験年数や私生活が影響している。またキャリア開発に向けた継続教育や研修に関する認識にも同様の傾向がみられ、総じてキャリア開発に必要な情報等が十分に認識されている状況とは言えない。中堅助産師がキャリア開発を考える時に、必要な情報を得たり、準備できるような環境・体制の整備が重要であることが考えられた。平成26年度は中堅助産師のキャリア開発の実態と課題を明確にすることを目的に、【中堅助産師】【キャリア】をキーワードに文献検討を行った。中堅助産師のキャリア開発に関する文献は十分にあるとは言えないが、中堅助産師に関する共通した用語の定義がないこと、助産師のキャリア開発全体の一部分として取り扱われていることなどが分かった。これらの内容を踏まえて、本研究の目的である「助産師経験510年目程度の中堅助産師が専門職としてのキャリア開発に関する認識やそれに影響を与える要因を明確にする」ための調査枠組み・質問紙(案)を検討した。平成27年度は、病院に従事する助産師及び教育機関に在籍する助産師を対象に本調査を行い、キャリア開発に関する認識と影響を与える要因について検証を行い、中堅助産師に必要な現任教育についての示唆を得る予定である。平成27年10月に分娩取扱い機関及び教育機関に助産師のキャリア開発に関する質問紙を配布・回収した。助産師経験(経験年数・分娩介助件数・病院内の役割等)、キャリアに関する志向など得られたデータを量的・質的に分析を行った。平成27年3月中旬に上記質問紙を回収した際に、フォーカスグループインタビュー協力に同意を得られた助産師を対象に、再度研究協力依頼を行い、フォーカスグループインタビュー開催日時への参加が可能であり、研究協力に同意を得られた助産師を対象にグループインタビューを行った。助産師のキャリア開発に関する思い、影響する要因、必要な支援等について把握した。研究データの分析に当初の予定より時間を要しているため昨年度までに実施した質問紙調査及びフォーカスグループインタビュー調査を踏まえて、調査対象施設について、関西圏にある分娩取扱い病院・教育機関及び助産所に拡大し、研究協力への同意を得られた施設を対象に、助産師の経験年数の制限を設けない方向で質問紙調査を行った。助産師は、様々な助産師になった動機をもち、助産師としての専門性に対する認識をもつ。そしてキャリアアンカー(キャリアの拠り所)をもち、このアンカーによってキャリア開発に対する認識や方向性が異なると考えられる。キャリア開発に向けた支援は、タイムリーに相談できるような体制であること、家族・職場の理解や金銭的な支援などを求めていることが示唆された。当初の予定より文献検討やその検討結果を踏まえた質問紙の作成に時間を要しているため。平成27年度に質問紙及びフォーカスグループインタビューを通して得られた研究データを更に分析し、中堅助産師のキャリア開発及び必要な支援について示唆を得る予定である。明らかになった内容について学会等を通して公表する予定である。母性看護学・助産学質問紙の枠組みを完成させ、平成27年度前期中の質問紙の配布・回収を行う予定である。当初より研究分析に時間を要し進捗が遅れ、必要物品の購入及び学会発表等につなげることができなかったため。当初予定していた質問紙の配布・回収を次年度に行うことになったため。研究結果の分析に必要な物品・備品等の購入や学会発表に必要な経費に使用する予定である。研究テーマに関する質問紙を配布・回収する際の送料やデータ入力(一部委託等)に使用する予定である。
量子ドットのサブバンド間遷移に基づく超高速面型光ゲートデバイスの実現

将来の光信号処理に必要となる100Gb/sから1Tb/s級の超高速化に向けて、基本素子となる超高速全光学型ゲート機能デバイスの実現が必須である。特に,光実装が簡単で、超大容量・多チャネル化にも対応できる、面型構造光ゲートデバイスの実現が急務である。本研究は、量子ドットと1次元フォフォトニック結晶とを組み合わせて非線形性の増強を行って、高効率、かつ面型構造を有する光ゲートデバイスを実現することを目的とする。本年度は、最適化した量子ドット光スイッチ素子の製作と新しい非線形評価システムによる特性評価を進め、以下の成果を得た。(1)光スイッチの設計では、電子第1励起準位が1.3μm付近の長波長領域に対応する量子ドットを用い、また、この励起準位と基底準位との間のサブバンド間遷移に基づく超高速緩和を利用することとした。さらに、出力の最大化のために最適化を行った多層膜共振器構造(16/30周期)を採用した面型光スイッチを製作した。(2)このデバイスの応答特性をポンプ・プローブ法により測定し、1.24μmの波長で、20psの超高速応答と、2.5fJ/μm^2の低スイッチングエネルギーを観測した。(3)量子ドットの非線形性の評価を深めるために、マッハツェンダー干渉計配置を持つ位相変化測定系を構築し、デバイスの光励起時における位相変化量特性の詳細な評価を行った。その結果、励起エネルギー0.2fJ/μm^2における位相変化として18゚を観測した。これは面型光スイッチにおける充分大きい位相変化の検出に初めて成功したものであり、同時に量子ドット面型光スイッチが、さらなる超高速・低エネルギーの光ゲート動作に向けて有効なマッハツェンダー型光スイッチの製作に適用出来ることを実証したものである。以上により、量子ドット面型全光スイッチデバイスの基本動作を実証するとともに、さらなる超高速・低エネルギーの光ゲート動作の実現可能性を明らかにした。特に、光実装が簡単で、超大容量・多チャネル化にも対応できる、面型構造光ゲートデバイスの実現が急務である。平成21年度繰越課題として、面型光ゲートデバイスの高速化に向けたデバイス構造の最適化、および干渉計配置光ゲートデバイスの評価および素子化のために用いる集積化モジュールの基本設計を行った。平成21年度までに得た結果をもとにして製作した面型光ゲートデバイスの応答速度特性の入射光角度依存性について詳しい解析を行った結果、20psまでの高速光応答の実現性を明らかにすることができた。また、量子ドット/量子井戸近接配置構造による電子の高速移動を用いた高速緩和量子ドット構造の可能性を明らかにした。これらによって、面型ゲートデバイスに適用すべき量子ドット構造の基本設計を行った。一方、マッハツェンダー干渉計配置による光ゲートデバイスの位相変化量の精密測定の方法を検討し、また、これに使う集積化モジュール構造の基本設計を行った。これにより、面型ゲートデバイスの非線形特性の測定、および超高速光ゲート・モジュールの実現に向けた重要な準備を完了した。
リポジトリを用いた要求獲得と要求進化の支援技術の研究

1.メタモデル記述から版管理機構を持ったリポジトリの生成技術UMLなどのダイヤグラムで記述された仕様の版管理システムと変更履歴までも蓄積するリポジトリを,ダイヤグラムのメタモデルより生成する手法を開発し,実現した.メタモデルの構成要素を変更基本単位とみなし,これらの変更差分を抽出し,リポジトリに蓄積する.さらに,異なるメタモデルに従って開発された仕様片の無矛盾性を保った変更を行うための構成管理技術を開発した.この技術では,仕様間の無矛盾性を保つための制約条件をメタモデル上で記述し,メタモデルの版管理と併せて,操作的な変更差分から矛盾検出を行う機構を開発した.2.オントロジを用いた要求仕様の意味付け技術とそれを応用した要求獲得手法の開発変更履歴を解析するためには,仕様の意味的な解析が必要である.本研究ではオントロジを用いて仕様の意味解析を行う手法をとっている.そのため,要求獲得段階から要求とオントロジと対応付けながら要求獲得を行う方法論とその支援ツールを開発し,その評価を行った.3.要求仕様の差分抽出,解析,パターン化技術と支援ツールの開発上記1,2の手法を用いて,オントロジの概念と対応付けられた要求の変更を差分として抽出し,差分の意味的な分類を行うシステムの開発を行った.同じ分類の差分の頻度により,パターン化する技術も導入した.変更履歴を収集し,この手法を適用し,意味的にどのような変更がなされることが多いかを分析した.変更過程の初期段階では,機能要求が主に変更され,後段で変更された機能の品質要求が変更されていくというパターンが頻出していることが判明し,これらの傾向をパターン化し,変更予測が行えるようにした.さらに,矛盾や要求欠落を引き起こす可能性のある差分を分類することにより,分析者に問題個所を指摘する技術も開発した.1.メタモデル記述から版管理機構を持ったリポジトリの生成技術UMLなどのダイヤグラムで記述された仕様の版管理システムと変更履歴までも蓄積するリポジトリを,ダイヤグラムのメタモデルより生成する手法を開発し,実現した.メタモデルの構成要素を変更基本単位とみなし,これらの変更差分を抽出し,リポジトリに蓄積する.さらに,異なるメタモデルに従って開発された仕様片の無矛盾性を保った変更を行うための構成管理技術を開発した.この技術では,仕様間の無矛盾性を保つための制約条件をメタモデル上で記述し,メタモデルの版管理と併せて,操作的な変更差分から矛盾検出を行う機構を開発した.2.オントロジを用いた要求仕様の意味付け技術とそれを応用した要求獲得手法の開発変更履歴を解析するためには,仕様の意味的な解析が必要である.本研究ではオントロジを用いて仕様の意味解析を行う手法をとっている.そのため,要求獲得段階から要求とオントロジと対応付けながら要求獲得を行う方法論とその支援ツールを開発し,その評価を行った.3.要求仕様の差分抽出,解析,パターン化技術と支援ツールの開発上記1,2の手法を用いて,オントロジの概念と対応付けられた要求の変更を差分として抽出し,差分の意味的な分類を行うシステムの開発を行った.同じ分類の差分の頻度により,パターン化する技術も導入した.変更履歴を収集し,この手法を適用し,意味的にどのような変更がなされることが多いかを分析した.変更過程の初期段階では,機能要求が主に変更され,後段で変更された機能の品質要求が変更されていくというパターンが頻出していることが判明し,これらの傾向をパターン化し,変更予測が行えるようにした.さらに,矛盾や要求欠落を引き起こす可能性のある差分を分類することにより,分析者に問題個所を指摘する技術も開発した.本年度は,要求仕様を格納するリポジトリの構成法,要求の変化のパターン化とその意味付けを行うためのオントロジの開発を行った.具体的な成果は以下のとおりである.1.メタモデル記述から版管理機構を持ったリポジトリの生成技術UMLなどのダイヤグラムで記述された仕様の版管理システムと変更履歴までも蓄積するリポジトリを,ダイヤグラムのメタモデルより生成する手法を開発し,実現した.メタモデルの構成要素が変更基本単位とみなし,これらの変更差分を抽出し,リポジトリに蓄積する.変更がメタモデル上のどの要素でなされたかを追跡できるような機構も導入している.2.要求仕様の変更履歴を収集し,変更内容をドメインオントロジと対応付けることにより,意味的にどのような変更がなされることが多いかを分析した.変更過程の初期段階では,機能要求が主に変更され,後段で変更された機能の品質要求が変更されていくというパターンが頻出していることが判明し,これらの傾向をパターン化し,変更予測が行えるようにした.3.ある要求に対するステークホルダ間での対立を分析し,その原因に基づいて分類を行った.さらにステークホルダ自身の採点を用いて対立を検出する手法を開発し,要求の代替案の獲得,選択や変更による対立の解消法を分析した.この結果を,対立解消のために要求の進化としてパターン化することを考察した.4.要求仕様の変更差分を抽出し,変更差分を解析することにより,矛盾のない要求変更が行われたかどうかを解析する手法を開発し,要求仕様変更管理システムの実現を行った.本年度は,要求の意味的な検索や検査を行うためのオントロジ技術の研究,仕様を格納するリポジトリでの版管理,構成管理技術の開発と支援ツールの開発,要求変化のパターン抽出と抽出支援ツールの開発を行った.具体的な成果は以下のとおりである.

1.オントロジを用いた要求獲得手法とその評価要求の検索や変更履歴を解析するためには,仕様の意味的な解析が必要である.本研究ではオントロジを用いて仕様の意味解析を行う手法をとっている.そのため,要求獲得段階から要求とオントロジと対応付けながら要求獲得を行う方法論とその支援ツールを開発し,その評価を行った.2.要求仕様・設計仕様の構成管理とリポジトリ技術前年度の成果である「メタモデル記述から版管理機構を持ったリポジトリとツールの生成技術」をさらに発展させ,異なるメタモデルに従って開発された仕様片の無矛盾性を保った変更を行うための構成管理技術を開発した.この技術では,仕様間の無矛盾性を保つための制約条件をメタモデル上で記述し,メタモデルの版管理と併せて,操作的な変更差分から矛盾検出を行う機構を開発した.3.要求仕様の差分抽出,解析,パターン化技術と支援ツールの開発1の手法で,オントロジの概念と対応付けられた要求の変更を差分として抽出し,差分の意味的な分類を行うシステムの開発を行った.同じ分類の差分の頻度により,パターン化する技術も導入した.さらに,矛盾や要求欠落を引き起こす可能性のある差分を分類することにより,分析者に問題個所を指摘する技術も開発した.
光誘起機能性材料のアドバンスドESRによるスピンダイナミクス研究

本申請課題では,蛍光部位(PPD, Fluo, Pyrene)と伝導部位(TTF)とを有する単分子型光誘起伝導性物質TTF誘導体(PPD-n, Fluo-n, Pyrene-n)の光誘起伝導性メカニズムを,パルス時間分解ESRを使用して電子スピンダイナミクスという観点からの解明をすることが目的である.前年度までに,高時間分解能を持ったTR-ESRシステムの開発,および孤立分子系における光励起状態の解明は完了している.本年度は,固体状態におけるCS状態の捕捉とそのスピンダイナミクスの解明をするため,PPD-nの粉末試料に対する時間分解ESR測定を行った.そして,10K,355nm励起の条件化で,PPD-n粉末試料でのTR-ESRスペクトルを観測することができた.このスペクトルは,(1)非常に狭いスペクトル全幅(25G程度),(2)すべて負側(Emission側)に現れるシグナルという2つの大きな特徴を示していた.スペクトル全幅はゼロ磁場分裂相互作用定数D(∝r^<-3>,ここでrはスピン間距離を示す.)に依存するので,スピン間距離の長い,TTF部からPPD側への分子内電子移動の結果生成したCS状態に帰属できた.また,シグナルがすべてEmission側であることから,CS状態は,何らかの励起三重項(T_2)状態から生成されると予測できた.T_2状態の寿命は装置限界より短いと予想され直接観測にはいたっておらず,T_1状態と同じか否かを特定することも出来ない.以上の結果から,孤立分子系では,基底状態(S_0)状態から,光(532nm)によりS_1状態に励起される.その後,系間交差によりT_1状態を経てS_0状態へと緩和するが,固体系では,光(355nm)によりS_0からS_2状態へと励起され,その後,T_2状態を経てCS状態となり,再結合して失活するプロセスを経ることを明らかにした.近年,光をトリガーとして新規な機能性を発する光誘起機能性材料が注目されている,その試みの一つとして,1分子に光吸収部位と伝導部位を持つ単分子型光誘起伝導性物質が開発されている.現在の大きな課題は機能の効率を向上させることである.これを根本的に解決するためには,そのメカニズムを解明することは不可欠であり,本課題ではアドバンスドESRを用いて,スピンダイナミクスという観点からメカニズムの解明を試み,新規光誘起機能性物質開発へとつなげていくことを目的としている.機能部分のスピンダイナミクスは孤立スピン系のスピンダイナミクスに比べて十分に速い.このダイナミクスを捉えるために,時間分解ESRシステムの時間分解能を向上させる必要がある.検出系を改良することで,従来の60nsから4ns程度まで向上させることに成功した.上記の新システムを利用して,光誘起伝導性を持つ単分子性TTF誘導体のスピンダイナミクスを調べた.蛍光部としてPPD基が,伝導部のTTFとリンカーにより接合されたTTF誘導体の凍結溶液による時間分解ESR測定を行った.レーザー照射により,ESRシグナルが増大することを見出した.そしてそれらをシミュレーションすることで,得られたシグナルが励起三重項に由来すること,およそ3Å程度のスピン間距離に対応するゼロ磁場分裂を明らかにした.そして,量子化学計算により,得られた励起三重項状態のスピン密度は,蛍光部PPDと伝導部TTFとのリンカー部にほとんど存在することを明らかにした.本申請課題では,蛍光部位(PPD, Fluo, Pyrene)と伝導部位(TTF)とを有する単分子型光誘起伝導性物質TTF誘導体(PPD-n, Fluo-n, Pyrene-n)の光誘起伝導性メカニズムを,パルス時間分解ESRを使用して電子スピンダイナミクスという観点からの解明をすることが目的である.前年度までに,高時間分解能を持ったTR-ESRシステムの開発,および孤立分子系における光励起状態の解明は完了している.本年度は,固体状態におけるCS状態の捕捉とそのスピンダイナミクスの解明をするため,PPD-nの粉末試料に対する時間分解ESR測定を行った.そして,10K,355nm励起の条件化で,PPD-n粉末試料でのTR-ESRスペクトルを観測することができた.このスペクトルは,(1)非常に狭いスペクトル全幅(25G程度),(2)すべて負側(Emission側)に現れるシグナルという2つの大きな特徴を示していた.スペクトル全幅はゼロ磁場分裂相互作用定数D(∝r^<-3>,ここでrはスピン間距離を示す.)に依存するので,スピン間距離の長い,TTF部からPPD側への分子内電子移動の結果生成したCS状態に帰属できた.また,シグナルがすべてEmission側であることから,CS状態は,何らかの励起三重項(T_2)状態から生成されると予測できた.T_2状態の寿命は装置限界より短いと予想され直接観測にはいたっておらず,T_1状態と同じか否かを特定することも出来ない.以上の結果から,孤立分子系では,基底状態(S_0)状態から,光(532nm)によりS_1状態に励起される.その後,系間交差によりT_1状態を経てS_0状態へと緩和するが,固体系では,光(355nm)によりS_0からS_2状態へと励起され,その後,T_2状態を経てCS状態となり,再結合して失活するプロセスを経ることを明らかにした.
自閉症モデル霊長類を用いた発達期大脳皮質シナプス形成・再編成異常の解析

ヒトの大脳皮質では、出生直後から興奮性シナプスが急速に増え、児童期に最大値に達した後減少する。自閉症脳ではシナプス数の増加率が大きく、その後の刈り込みが少ないと考えられている。げっ歯類ではシナプス刈り込み現象が観察されないため、自閉症の研究を推進するためには霊長類モデルが必要不可欠である。自閉症患者では頭周囲長が増加し、灰白質組織が厚くなっていることが報告されている。これは自閉症患者のシナプス刈り込み不全を反映しているものと考えられる。胎生期バルプロ酸(VPA)曝露マーモセット(自閉症様行動を示すことがわかっている)では、生後6か月齢・成体で顕著な脳重量の増加が認められた。前頭前皮質のニューロンの細胞体の大きさは変化がなく、密度は減少していた。灰白質組織の体積の過半をニューロン突起(樹状突起・軸索)が占めていることから、本モデル動物では樹状突起スパイン・軸索が増加していることが示唆された。本研究では、VPAマーモセットの大脳皮質シナプス形成過程を調査した。生後0, 2,3, 6ヶ月齢,成体のVPAマーモセットの前頭前皮質(12野)と一次視覚野(V1)の第3層錐体細胞に蛍光色素を注入して基底樹状突起全体を可視化した。VPAマーモセットは、定型発達個体と比較して生後2か月齢以降大きな樹状突起展開面積を持ち、どの発達段階においても長い樹状突起をもっていた。また、VPAマーモセットのスパイン密度は生後2ヶ月齢以降、顕著に上昇していた。定型発達個体では、生後3か月齢から成体にかけて50%以上スパイン密度が低下するのに対して、VPAマーモセットでは有意な変化は観察されず、この霊長類モデルで自閉症患者のシナプス過形成と刈り込み不全を再現できていることが分かった。スパインは、ヘッド・ネックともに直径が細くなっており、形態的なバリエーションが小さくなっていた。げっ歯類の胎生期バルプロ酸曝露自閉症様モデルと異なり、VPAマーモセットは自閉症脳の解剖学的特徴を反映する(灰白質の肥厚、スパインの過形成と刈り込み不全など)ことが明らかになった。また解剖学的変化を引き起こす遺伝子発現にも変化が起きていることが示されつつある。今後、新たな自閉症病態モデル動物として治療法の開発に貢献することが期待できる。これまで前頭前皮質area12と一次視覚野V1の樹状突起構造を優先して解析し、自閉症脳の特徴を反映する解剖学的変化が起きていることを示すことができた。今後は、自閉症や統合失調症に強く関与している内側前頭前皮質領野の解析を進める。また「シナプス刈り込み」によって除去される回路の実態について解析を行う予定である。胎生期に投与されたバルプロ酸がどのようなエピジェネティックな変化を起こしているのか検討するため、ChiP-seqを行うことを計画している。

また「シナプス刈り込み」によって除去される回路の実態について解析を行う予定である。胎生期に投与されたバルプロ酸がどのようなエピジェネティックな変化を起こしているのか検討するため、ChiP-seqを行うことを計画している。樹状突起スパインの可視化実験に使用する対物レンズとマニピュレーターを貸与してもらうことができた。また解析ソフトウェアを他研究者と共用することで、ライセンス更新費用を抑制することができたため支出が減少した。持ち越した研究費は今年度の研究費と合わせて、分子生物学実験試薬類、組織学的解析に係る試薬類の購入に充てる予定である。国際学会および国内学会に参加し、成果発表や情報の収集に努めたい。また本研究で得られた成果を論文として発表する際の投稿費用の支出を見込んでいる。
抗酸菌の65KD熱ショック蛋白とアジュバント関節炎発症機序に関する基礎的研究

昨年度に引き続き結核菌65KD蛋白の前投与によるBCG誘発関節炎およびMDP誘発関節炎の発生に対する効果を調べた。いずれの関節炎発症系においても熱ショック蛋白質に対して有意の発症抑制効果を示さなかった。熱ショック蛋白質に対するモノクローナル抗体を用いて、熱ショック蛋白質前投与群とアジュバント投与後の関節炎発症ラットと、発症していないラット関節部位において、いずれも有意の差をもった熱ショック蛋白質の反応は見られなかった。従って自己免疫アジュバント関節炎は外来性の熱ショック蛋白質に向けられた免疫応答が、自己の組織に誘導された熱ショック蛋白質との交差反応によって誘発されたとする仮説は確認できなかった。このことは熱ショック蛋白質以外にまだ何か重要な自己抗原があることを強く示唆している。そこで関節炎の炎症部位におけるマクロファージMφが関節炎局所の反応にどのような影響を及ぼしているのか、特に炎症の強い部位に骨破壊と骨形成が同時に観察されることから推測して破骨細胞誘導に及ぼす効果を中心に検討した。この検討のために教室で確立されたMφ細胞株を使用した。Mφの活性化にはペプチドグリカン以外にLPSを用いて行った。活性化Mφからは確かに破骨細胞誘導活性が認められ現在その因子の精製を鋭意に行っている。関節炎局所におけるMφの活性化と破骨細胞の誘導にかかわる因子、炎症の初期および炎症の再燃の時に多数出現する多形核白血球のリソゾーム顆粒に最もたくさん含まれるDefensinsが炎症局所で、ホルモン活性やその他の反応に影響している可能性がでてきたのでこれらを今後とも追求していく。(1)BCG誘発関節炎ラットを作成し、末梢血液より継時的にリンパ球を分離し、M.leprae由来の65KD蛋白に対する反応性を^3Hーthymidineの取り込みで調べた。次に、65KD蛋白を含まないアジュバンド活性物質、MDP、ploy I:C、アルキルジアミン投与によるアジュバント関節炎ラットを作成し、同様にして末梢リンパ球の65KD蛋白に対する反応性を調べた。関節炎発症ラットはアルブミン蛋白質に対する^3Hーthymidineの取り込みに比較して有意に高い反応を示し、ツベルクリン蛋白質に対する取り込みとほぼ同程度の^3Hーthymidineの取り込みを示した。以上の成績は、関節炎発症ラットでは、誘起物質の如何にかかわらず、65KD蛋白質に対する免疫応答が起こっていることを示唆している。(2)次に関節炎発症局所で65KD蛋白質の発現がどのようになっているかを組織学的に検討した。ウサギに65KD蛋白質を免疫し、やく6000倍のポリクロ-ナル抗体を作り、関節炎組織における免疫組織学的証明を試みた。組織の切り出し、脱灰、固定等の点に問題があり、まだ十分な成績は得られていない。一方、BCG培養上清からの65KD蛋白質精製では、十分量がとれなかった。方法を変更して、65KD蛋白質に対するcDNAを作成し、これをベクタ-につなぎ、大腸菌に発現させて65KD蛋白質大量に産生させる方法による精製を始めている。また、培養細胞を用いて65KD蛋白質に対する反応を調べる目的で、関節部位から得られる骨芽細胞や破骨細胞を培養し、種々の刺激を与えたときの熱ショック蛋白質の産生、発現に関する検討を始めた。関節炎発症ラットにおける骨芽細胞や破骨細胞と熱ショック蛋白質とのかかわりについて検討する予定である(共同研究者に加わった久木田明子が担当する)。いずれの関節炎発症系においても熱ショック蛋白質にたいして有意の発症抑制効果を示さなかった。

従って自己免疫アジュバント関節炎は外来性の熱ショック蛋白質に向けられた免疫応答が、自己の組織に誘導された熱ショック蛋白質との交差反応によって誘発されたとする仮説は確認できなかった。このことは熱ショック蛋白質以外にまだなにか重要な自己抗原があることを強く示唆している。そこで関節炎の炎症部位におけるマクロファージMφが関節炎局所の反応にどのような影響を及ぼしているのか、特に炎症の強い部位に骨破壊と骨形成が同時に観察されることから推測して破骨細胞誘導に及ぼす効果を中心に検討した。この検討のために教室で確立されたMφ細胞株を使用した。Mφの活性化にはペプチドグリカン以外にLPSを用いて行なった。活性化Mφからは確かに破骨細胞誘導活性が認められ現在その因子の精製を鋭意行なっている。関節炎局所におけるMφの活性化と破骨細胞の誘導にかかわる因子、炎症の初期および炎症の再燃の時に多数出現する多形核白血球のリソゾーム顆粒にもっとも沢山含まれるDefensinsが炎症局所で、ホルモン活性やその他の反応に影響している可能性がでてきたのでこれらを今後とも追及していく。
インスリン遺伝子転写制御機構に関する研究

1.インスリン遺伝子転写制御因子(IEBP)の種々のミュータントを作製し、HeLa細胞とハムスターインスリノーマ細胞(HIT)に導入してその転写活性を調べた結果、以下の知見を得た。(1)IEBPのC末端近辺に存在する塩基性領域やヘリックス・ループ・ヘリックス構造に変異を導入すると、転写活性はほとんど消失するのでこれらの領域は転写活性に重要であることが示された。(2)IEBPの中央付近に存在するロイシン・ジッパー様配列に変異を導入しても転写活性の変化は認められなかった。(3)197270番目のアミノ酸を欠失させると、HeLa細胞における転写活性はあまり変化しないが、HIT細胞においては著しく転写活性が損なわれるので、特にこの領域がインスリン遺伝子転写を考える上で重要であると考えられた。2.IEBP蛋白質とヘテロダイマーを構成すると考えられる末知の蛋白質をクローニングするための系の確立をめざした。発現ライブラリーをビオチン化したIEBPをプローブとしてスクリーニングするもので、系が働くことが確認されたので、現在この方法で実際にスクリーニングを行なっている。3.ヒトのインスリン遺伝子転写制御領域の異常による糖尿病の有無を検討するため、正常人と糖尿病の患者各50人を対象に遺伝子変異の有無を調べたが、両群間で差は認められなかった。
衛生仮説における乳幼児RSV感染の意義の検討

衛生仮説とは、乳幼児期に多くの感染を経験することでType I helperT (Th1)細胞が増え、以降の過剰なTh2免疫応答であるアレルギーの発症を抑制するという概念である。我々は、Th2免疫応答を誘導する乳幼児期のrespiratory syncytialvirus (RSV)感染も衛生仮説の要素となり、後のアレルギー反応の制御に関与するという仮説を立て、検証した。結果、1週齢時にRSVを感染させたマウスではRSV非感染マウスと比較して、8週齢の時点でより強いイエダニ抗原誘導アレルギー反応がみられた。すなわち、乳児期のRSV感染が後のアレルギー反応に関与する可能性が示唆された。近年アレルギー患者数が増えている。いくつかの原因が挙げられるが、その中でも“衛生仮説"に注目が集まる。衛生仮説は、乳幼児期に多くの感染を経験することでType I helper T (Th1)細胞が増え、後の過剰なTh2免疫応答であるアレルギーの発症を抑制するという考え方である。これに対して我々は、Th2免疫応答を誘導する乳幼児期のrespiratory syncytial virus (RSV)感染も衛生仮説のひとつの要素となり、後のアレルギー体質を作る原因であるという仮説を立てた。本研究はこれを検証することを目的とした。まず、ダニ抗原(HDM)の反復経鼻投与により肺におけるインターロイキン(IL)-4、IL-5、IL-13といったTh2サイトカイン産生の促進と、それに伴う気道抵抗値(AHR)、好酸球浸潤を伴う炎症、粘液産生の亢進がみられるアレルギーモデルの作製に成功した。次に、1、2、3週齢マウスにRSVを経鼻投与により感染させ、死に至らないRSV量と容量を検討し、乳幼児期マウスのRSV感染モデルを確立した。そして、8週齢になったこれらRSV感染マウスを用いHDMアレルギーモデルを作製した。結果、2、3週齢時にRSVを感染させたマウスと感染させなかったマウスを比較すると、アレルギー応答に差はみられなかった。一方、1週齢時にRSVを感染させたマウスはコントロール群と比較してより強いHDMアレルギー反応がみられた。以上の結果より、RSV感染のタイミングが生後早いほど後のアレルギー反応に影響を与えることが示唆された。HDMアレルギーモデルの作製に成功した。また、RSV感染後のHDMアレルギーモデルを用いて乳児期のRSV感染が後のHDMアレルギー反応の程度に影響を与えることを示すことができた。まず、ダニ抗原(HDM)の反復経鼻投与により肺におけるTh2サイトカイン産生の促進と、それに伴う気道抵抗値(AHR)、好酸球浸潤を伴う炎症、粘液産生の亢進がみられるアレルギーモデルの作製に成功した。次に、1週齢マウスにRSVを経鼻投与により感染させ、RSV感染モデルを確立した。8週齢になったこれらRSV感染マウスを用いHDMアレルギーモデルを作製した。結果、1週齢時にRSVを感染させたマウスはコントロール群と比較してより強いHDMアレルギー反応がみられた。すなわち、乳児期のRSV感染はその後のアレルギー反応に影響を与えることが示唆された。一方、従来の衛生仮説を模倣するグループとして1週齢時にLPSを投与したマウスを用いてアレルギーモデルを作製したところ、予想に反しコントロールと比較してより強いアレルギー応答を示した。少なくとも、LPS以外の刺激では後のアレルギー応答にどのような影響を与えるのか、あるいはその他アレルギーモデルでの応答について調べる必要がある。再現性がみられた場合は、その免疫学的機構の解明が必要となる。この解明は、従来の衛生仮説に新たな知見を与えるだけではなく、新しい概念を提唱する可能性が期待される。これまではHDMアレルギーモデルを用いてきたが、乳児期のRSV感染が異なる抗原によるアレルギーモデルにも影響を与えるか、既に確立されているアスペルギルスアレルギーモデルを用いて検討する。また、Th1免疫応答を誘導するLPSを乳児期のマウスに投与した場合、アレルギーが軽減するか調べる。これと並行してLPS投与とRSV感染の両方を受けた場合、後のアレルギーにどのような影響を与えるか検討する。最後に、これらグループ間に差が生じた場合、そのメカニズムの一端を乳児期マウスのRSV感染に伴う免疫応答において見出すことを目標とする。

免疫学本研究の基礎となるマウス実験モデルの作製に時間を費やすこととなり、それを用いた目的とする解析が遅れたため。平成27年度予定していた解析も含め、作製したモデルを用いた免疫学的解析のために使用する。
パルスラジオリシス法を用いた末端酸化酵素における電子駆動型プロトン輸送機構の解明

チトクロム酸化酵素は、ミトコンドリア内膜や細菌細胞膜に存在し、分子状酸素(O_2)を水に還元する反応と共役させて膜系の内側から外側に向けてプロトンをベクトル輸送するイオンポンプである。本研究ではアミノ酸置換変異の導入、大量精製などの長所を備えた大腸菌呼吸鎖電子伝達系の膜超分子複合体に着目し、キノール酸化酵素の一種であるチトクロムboがユビキノンの酸化還元を利用して、プロトンが細胞膜を横切ってベクトル輸送する仕組みをタンパク質の動態として解明することを目的として、その鍵となるアミノ酸残基の置換変異が分子内電子移動に及ぼす影響をパルスラジオリシス法で検討した。ヘムbからヘムoへの電子移動速度は用いた変異体により大きく変化することが分かった。Dチャネルの変異体D135NおよびE286Dは野生型とほぼ変わらない値を示した。Dチャネルはヘム鉄が分子状酸素を還元する際に生成するフェリル中間体の生成と崩壊の各過程で2個のポンププロトンに輸送されると報告されており、この結果はDチャネルがヘムb-o間の電子移動に直接関与していないという従来の報告と矛盾しない。それに対して、最も影響を受けたのはヘム周辺のHis333およびTyr288を置換した酵素であった。これらはCu_Bの欠失、ヘムoのヘムbへの置換、ヘムoの酸化還元電位の変化によると考えられる。しかし、ここで最も注目したいのはヘムから離れた位置にあるKチャネルの変異体であるK362Qでは一桁近く遅くなることが分かった。ヘム間の固有の電移動速度は、ほとんど変らないと考えられるが、この変異体K362Qの酸化還元電位も大きく変化することが分かった。このことはKチャネルを介するプロトンの取り込みが電子移動速度のみならず、その酸化還元平衡を支配していることを示している。大腸菌の好気的呼吸鎖のチトクロムbo型ユビキノール酸化酵素は、2種類のヘム(bとo)と1個の銅イオン(Cu_B)を結合し、電子はキノール酸化部位から結合型ユビキノン8とヘムbを経由して分子状酸素の還元場であるヘムo-Cu_B複核中心に伝達される。本酵素は、2分子の呼吸基質であるユビキノール8の酸化反応と1分子の酸素を水に還元する反応を細胞膜を介して異方的に触媒することにより、見かけ上合計8個のプロトンを輸送する酸化還元共役プロトンポンプとして働いている。本研究では、その鍵となるアミノ酸残基の置換変異が分子内電子移動に及ぼす影響をパルスラジオリシス法で検討した。野生型酵素では、水和電子との反応により生成したNMAラジカルによって還元され、ユビセミキノンアニオンラジカルが生じる。次に、キノンラジカルの酸化に伴って、ヘムbとヘムoの還元型が同時に現れた。さらにプロトン取り込みに関係すると思われるアミノ酸残基の置換変異がヘムb-o間の電子移動にどのような影響を与えるのか調べた。最も影響を受けたのはヘム周辺のHis333およびTyr288を置換した酵素であった。これらはCu_Bの欠失、ヘムOのヘムBへの置換、ヘムoの酸化還元電位の変化によると考えられる。一方Dチャネルの変異体D135NおよびE286Dは野生型とほぼ変わらない値を示した。この結果はDチャネルがヘムb-o間の電子移動に直接関与していないという従来の報告と矛盾しない。

一方、Kチャネルの変異体であるK362Qでは一桁近く遅くなっているのに対してK362より分子表面に存在するGlu540を置換した変異体であるE540Qでではほとんど変化せず、Glu540はプロトン取り込みに関与しないことを示しており、K362Qがヘムoの還元の際におこるプロトン取り込みに重要な役割を果たしていることが示された。チトクロム酸化酵素は、ミトコンドリア内膜や細菌細胞膜に存在し、分子状酸素(O_2)を水に還元する反応と共役させて膜系の内側から外側に向けてプロトンをベクトル輸送するイオンポンプである。本研究ではアミノ酸置換変異の導入、大量精製などの長所を備えた大腸菌呼吸鎖電子伝達系の膜超分子複合体に着目し、キノール酸化酵素の一種であるチトクロムboがユビキノンの酸化還元を利用して、プロトンが細胞膜を横切ってベクトル輸送する仕組みをタンパク質の動態として解明することを目的として、その鍵となるアミノ酸残基の置換変異が分子内電子移動に及ぼす影響をパルスラジオリシス法で検討した。ヘムbからヘムoへの電子移動速度は用いた変異体により大きく変化することが分かった。Dチャネルの変異体D135NおよびE286Dは野生型とほぼ変わらない値を示した。Dチャネルはヘム鉄が分子状酸素を還元する際に生成するフェリル中間体の生成と崩壊の各過程で2個のポンププロトンに輸送されると報告されており、この結果はDチャネルがヘムb-o間の電子移動に直接関与していないという従来の報告と矛盾しない。それに対して、最も影響を受けたのはヘム周辺のHis333およびTyr288を置換した酵素であった。これらはCu_Bの欠失、ヘムoのヘムbへの置換、ヘムoの酸化還元電位の変化によると考えられる。しかし、ここで最も注目したいのはヘムから離れた位置にあるKチャネルの変異体であるK362Qでは一桁近く遅くなることが分かった。ヘム間の固有の電移動速度は、ほとんど変らないと考えられるが、この変異体K362Qの酸化還元電位も大きく変化することが分かった。このことはKチャネルを介するプロトンの取り込みが電子移動速度のみならず、その酸化還元平衡を支配していることを示している。