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神経系に対するHGFの機能とその作用分子機構の解析

神経難病への治療法開発は、21世紀医学の最大目標の1つである。神経変性疾患をはじめ原因遺伝子の同定が相次ぐものの、治療法開発には直結していない現実がある。我々は、HGFが神経細胞に対し強力な神経栄養作用(神経細胞生存・神経突起伸張の促進効果)に加え、血管新生促進作用を含む多彩な機能をもつことに注目し、HGFの神経疾患への機能解析を行ってきた。その結果以下の点が明らかとなった。(1)HGFが筋萎縮性側索硬化症(ALS)を含む複数の神経変性疾患の神経細胞変性をよく抑制し、運動機能を改善すること(2)虚血性神経疾患(各種脳虚血モデル)に加えて外傷性神経疾患(脊髄損傷や神経引き抜き損傷)にも治療効果を示すことを明らかとした。(3)HGFの神経疾患モデル動物治療効果は、神経細胞への直接作用に加えて1部はグリア細胞への機能を介していることを明らかとした。本年、東北大学神経内科糸山教授との共同研究の結果、リコンビナントHGF蛋白質の発症時期に於ける髄腔内投与がALSモデルトランスジェニックラットの病態を改善し、寿命延長効果を持つことを示した。このことは孤発例が90%を占めるALSの治療に実用性の高い方法の発見である。本研究プロジェクトにおいて、私達はHGFの多彩な機能の中で特にHGFの神経系における機能に焦点をあて研究を施行した。本年度は、まずHGFの示す強力な神経栄養活性に基づく多彩な神経疾患への治療効果の解析を行なった。次いで、HGFの神経栄養活性の作用分子機序について解析を施行した。その結果、HGFは、これまでに報告のある脳虚血や筋萎縮性側索硬化症(ALS)に加えて、神経引き抜き損傷(Hayashi et al., 1996)や、他の神経変性疾患モデル動物に対しても治療効果をもつことを明らかとした。HGFの神経栄養活性を示す分子機構としては、従来明らかとなっているカスパーゼを介したアポトーシスを抑制する機構に加えて、カスパーゼを介さないアポトーシスを調節する際重要とされるアポトーシス誘導因子(Apoptosis-inducing factor : AIF)の核内移行を抑制する機構も介することを明らかにした(Nishimura et al., 2006)。HGFは脳虚血で惹起されるpoly(ADP-ribose)polymerase(PARP)とp53の誘導を抑制することから、HGFはPARP/p53/AIFカスケードの抑制を介して脳虚血時の酸化ストレスを軽減し神経細胞保護に機能する分子機構があることを初めて明らかとした。このようにHGFの神経栄養活性に関する機能解析が進む一方で、HGFの神経細胞以外の神経系細胞における機能、例えばグリア細胞のなかでもオリゴデンドロサイトやその前駆細胞(OPC)に対するHGFの機能はほとんど明ちかとされていない。本研究において、HGFとその受容体の発生過程に於ける発現、機能解析を施行した結果、HGFは発生過程でOPCとオリゴデンドロサイトの両細胞にシグナルを入れ、OPCの増殖をうながす一方、その分化を調節することが初めて明らかとなった。この結果は、HGF蛋白質投与と、その機能中和抗体の脳定位投与で詳細に解析した(Ohya et al., 2007, in press)。

本年、東北大学神経内科糸山教授との共同研究の結果、リコンビナントHGF蛋白質の発症時期に於ける髄腔内投与がALSモデルトランスジェニックラットの病態を改善し、寿命延長効果を持つことを示した。このことは孤発例が90%を占めるALSの治療に実用性の高い方法の発見である。
ジョセフソン接合超格子を用いた位相制御型磁束量子ソリトンデバイスの開発

本研究は、Bi_2Sr_2CaCu_2O_y単結晶に内在する自然超格子ジョセフソントンネル接合における磁束量子ソリトンの基本性質を明らかにするとともに、磁束量子ソリトン運動に基づく位相制御型磁束量子ソリトンデバイスの開発を目的としており、本年度は磁束量子ソリトンの基本性質の解明並びにその制御方法を検討し、以下の成果を得た。(1)同単結晶のデバイス加工自己フラックス法により成長した同単結晶をフォトリソグラフィ技術とArイオンエッチング技術を用いて、大きさ(160,300)μm×40μm×(10-150)nmのメサを精度良く作製する技術を確立した。(2)ボルテックスフロー特性の観測作製したメサに磁場を印加することにより電流ー電圧特性上において明瞭なボルテックスフロー特性を観測した。また、その磁場依存性から磁束量子は同超格子内を約3×10^6m/sの高速度で伝搬することがわかった。(3)シミュレーション多積層ジョセフソン接合の電流ー電圧特性の磁場依存性をシミュレーションした結果、実験結果と同様なボルテックスフロー特性が得られた。更に、積層接合内の全接合がフロー状態でない場合は各接合における磁束量子は同相モードが、全接合がフロー状態の場合は逆相モードが安定に現れ、磁場の大きさによりそれらを制御できることがわかった。本研究で選られた成果は、Bi_2Sr_2CaCu_2O_y単結晶自身を用いた新規な磁束量子ソリトンデバイス応用への可能性を示すものであり、本分野の今後の進展が期待される。本研究は、Bi_2Sr_2CaCU_2O_y単結晶に内在する自然超格子ジョセフソントンネル接合における磁束量子ソリトンの基本性質を明らかにするとともに、磁束量子ソリトン運動に基づく位相制御型磁束量子ソリトンデバイスの開発を目的としており、本年度は主に磁束量子ソリトンの基本性質を調べ以下の成果を得た。(1)フォトリソグラフィ技術を用いた同単結晶のデバイス加工自己フラックス法により成長した同単結晶をフォトリソグラフィ技術を用いて、大きさ(160,320)μm×40μm×(10-150)nmのメサを精度よく作製する技術を確立した。これにより再現性のある電流-電圧特性を得ることができるようになった。(2)同単結晶に内在する自然超格子ジョセフソントンネル接合の磁場依存性(1)で得られた成果をもとに接合数が100までのメサを作製し、その臨界電流の磁場依存性から、接合の下部臨界磁場は接合数に強く依存することがわかった。この依存性は本研究により初めて観測されたものであり、メサ内の接合間に強い磁気的結合が存在することを示している。(3)自然超格子ジョセフソントンネル接合における磁束量子ソリトンの基本特性の解明自然超格子ジョセフソントンネル接合に磁場を印加することにより、電流-電圧特性上に観測される磁束量子ソリトン運動に基づくボルテックスフローブランチの磁場依存性から、同接合における、磁束量子ソリトンの伝搬特性を評価した。これにより、磁束量子ソリトンは4.2Kにおいて約3×10^6m/sの高速度で同接合内を伝搬することがわかった。また、この伝搬速度はバイアス電流には依存するが、接合長、接合数にはあまり依存せずほぼ一定であることがわかった。本研究で得られた成果は、Bi_2Sr_2CaCU_2O_y単結晶自身を用いた新規な磁束量子ソリトンデバイス応用への可能性を示すものであり、本分野の今後の進展が期待される。
核スピンが1以上の核における新しい固体NMR測定法の開発

本研究では、四重極相互作用により線幅が非常に広いスピン1の^2Dの線形観測や^<14>Nに対して提案されているオーバートーンNMR法などが簡便に行えるNMR測定システムを構築し、更に、種々の試料にこれらの方法を単独で、または、他の方法と組み合わせて応用し、その性能、限界を検討することを目的とした。まず、現有の装置の改造をおこなった。固体における多量子遷移の観測や多重パルス法を精度よく行うために、パルス位相微調整器を現有のNMR装置に組み入れる作業をおこなった。さらに、高速アナログ/デジタル変換器を導入し、線幅の広いスペクトルの測定を可能にした。改造された装置を用い、アミノ酸の^<14>N核等の粉末試料スペクトルの試料回転による高分解能化の可能性の検討、および、単結晶試料の磁場にたいする角度依存性の解析による四重極相互作用の異方性の解析などを行った。また、重水素のNMRスペクトルの測定および線形の解析を行った。試料は主鎖のみを選択的に重水素化したポリスチレンをポリメチルビニルエーテルと混合したものを用いた。得られた重水素のNMRスペクトルを線形解析し、分子運動に関する詳細な情報を得られた。平成2年-4年度の3年間で、成果が得られたが、研究を終了するにあったて、まだ多くの問題が残されおこされている。ことに、粉末試料のオーバートーンNMRでは感度の点で問題があった。これは現有装置がnarrow boreの^1H270MHzのマグネットで、プローブ試料容積が小さいことによると考えている。本年度はおもに現有の日本電子社製の核磁気共鳴装置(JMN GX270)の改造を行った。まず市販の高速アナログ/デジタル変換器(オ-トニクス社製APC204)をGX270の受信機のオ-ディオ出力部位に自作の前置増幅器(F_02000kHz、2050倍増幅)を通して結合した。また照射パルスと信号の積算を同期するためにGX270の元来のパルス発生器をはずして、GX270とAPC204を自作のパルス発生器で制御できるように改造した。パルス発生器とAPC204を制御するためのプログラムを作成し、両機器ともいわゆるパソコンで制御できるようにインタ-フエ-ス等を自作した。またパソコン上でフ-リエ変換、線形分析等のデ-タ処理が出来るようにプログラムの整備を行った。これらのプログラムは移植性の高さや可読性を考えてPASCALで作成した。さらにパルス位相の微調整器も自作のパルス発生器により制御できるようにした。このようにして実験の自由度が格段に増し、また精度のよい実験が可能になった。そこで^<14>NのOver Tone NMRを検討した。プロ-ブとして現有の高速試料回転用プロ-ブを多少改造したものを用い、S/Nをよくし出力ロスを押さえるためにduplexerと呼ばれる機器を^<14>Nのover tone周波数に正確に同調した。その結果300Wの入力で約100μsの90度パルスが得られ単結晶試料においては良好な信号が得られたが粉末試料においては入力不足のためによい信号は得られなかった。さらに入力を増すことなどを検討している。本年度は前年度改造した日本電子社製の核磁気共鳴装置(JMNGX270)を用いて、^<14>NのOvertone NMRの磁場に対する角度依存性の測定を試みた。Overtone周波数の角度依存性を解析することにより、^<14>Nの四重極相互作用の主軸の分子座標系における配向が決定できる。^<14>NのOvertone周波数と^1Hのラ-モア周波数に二重共鳴し、さらに結晶を磁場にたいして直角の軸まわりに回転できるゴニオメ-タが組み込まれたプロ-ブを購入し、L-アラニン単結晶において良好な信号を得た。しかし、結晶の磁場に対する角度によってはOvertone共鳴の遷移確率が非常に小さくなり、よい信号が得られない場合があることが分かった。

^<14>Nの四重極相互作用の主軸をどの程度正確に決定できるかどうかを現在検討中です。また重水素のNMRスペクトルの測定および線形の解析を行った。試料は主鎖のみを選択的に重水素化したポリスチレンをポリメチルビニルエ-テルと混合したものを用いた。粉末試料の重水素のNMRスペクトルは四重極相互作用のために幅が広くなっている(250kHz)。全体を均一に測定するためには、90度パルスとして3μs以下の強いラジオ波パルスを照射する必要がある。そこで、コイルの内径が5mmのプロ-ブを購入し、450Wの入力で約2.2μsの90度パルスを得た。重水素のNMRスペクトルを解析することで分子運動に関する詳細な情報が得られる。そこで、重水素のNMRスペクトル解析プログラムをPASCALで作成した。本年度は、前年度に測定した1-アラニン単結晶の^<14>NのOvertone周波数の角度依存性を理論的に検討した。周波数の角度依存性を解析することにより、1-アラニンの^<14>Nの四重極モーメントの主値と方向を決定できた。得られた四重極モーメントの主値は1.148Mhzで非対称パラメータは0.276であった。これらの値は、NQRで77Kで得られた1.205MHz、0.261によく一致している。また結晶のab面において、得られた四重極テンソルより、オーバートーン共鳴吸収強度(遷移確率の二乗)を計算し、実際の強度と比較したところ、測定結果をわりとよく再現していることがわかった。以上の実際の解析により、オーバートーン法においては、簡便に四重極モーメントが得られるが、一つ欠点があることがわかった。それは、化学シフトの項が除けないという点である。この化学シフトを無視したことが、理論値と実験のずれの主要な原因だと考えられる。化学シフトの効果は、低磁場で小さくなるため、この実験は低磁場で行うことが望ましいことが示された。また、ポリスチレン/ポリビニルメチルエーテル高分子混合体の粉末試料の重水素NMRスペクトルの線形解析を行った。ポリスチレン主鎖の運動に対する混合の効果が検討された。さらに、ガラス転移温度以下の領域での遅い運動を詳細に検討するために、二次元交換NMR測定を行った。重水素NMR法の結果については、測定結果を現在検討中である。以上のように、既存のNMR装置を改良して、核スピンが1以上の核の固体NMRを可能にすることが出来た。検討した手法は、いずれも簡便に固体試料の物性研究の適用できることが示された。
生体分子シミュレーションの最適な条件探索

本研究では、2014年度より2017年度までの間に、生体分子のシミュレーションにとって重要なレプリカ交換分子動力学法及び、焼き戻し法に関するパラメータの最適な選択法を調べた。両手法では、実際に調べたい温度よりも高い温度で分子動力学シミュレーションを行う必要がある。しかしながらこのような高温の分子動力学シミュレーションは不安定である。この問題を払拭する手法として、質量スケールの方法を開発した。2014年度は、質量に着目し研究を遂行した。レプリカ交換分子動力学法のようなシミュレーションでは、対象とする系を本来調べたい温度より高い温度でも分子動力学シミュレーションを実行する必要がある。しかしながら、温度の高いところでは、粒子の速度が大きくなり、分子動力学シミュレーションは不安定となり、シミュレーションが途中で失敗してしまうことがある。この問題点を払拭する方法として、温度に合わせて質量を適切にスケールすることを提案し、具体的な数値実験による検証も行った。またこの方法により、レプリカ交換分子動力学シミュレーションのアルゴリズムが簡単となる場合があることを併せて指摘した。さらに、レプリカ交換分子動力学シミュレーションにおいて、質量を任意にスケールした際に必要となる補正についても理論的な検討を行い発表した。過去に提案された手法に原理的な間違いがあることも同時に指摘し、改善策を提案した。これに関する具体的な数値計算による確認は今後の課題である。本研究では、生体分子のシミュレーションにとって重要なレプリカ交換分子動力学法(replica-exchange molecular dynamis: REMD)及び、焼き戻し法(simulated tempering: ST)に関するパラメータの最適な選択法について研究している。2015年度は質量に着目して焼き戻し法を改良した。焼き戻し法によるシミュレーションでは、実際に調べたい温度よりも高い温度でシミュレーションを行う必要がある。このような高温では原子分子の衝突がより高いエネルギーで生じる。そのため分子動力学シミュレーションが不安定となることが懸念される。この問題点を解決するために、温度に比例した質量スケーリングを焼き戻し法に対して応用し、質量スケールを用いた焼き戻し法を定式化した。この方法を幾つかのモデル系に応用し、本手法の有用性を確かめた。加えて、より一般的な定式化を行い実際にタンパク質に応用した。本手法により不安定性を払拭しつつ優れた効率が得られる事を示唆する結果を得た。これらの結果は現在論文として投稿準備中である。さらに、2014年度に行ったよりレプリカ交換分子動力学シミュレーションにおける質量スケールの定式化の理論的な検討に対して、実際にシミュレーションによる予備実験を行い有用性を確認をしている。翌年はこの予備実験を元にして、より意義のある系に応用し論文としてとりまとる所存である。本年度は焼き戻し法に関して質量スケールに着目した研究を行い現在論文投稿中となっているため。本研究では、生体分子のシミュレーションにとって重要なレプリカ交換分子動力学法(replica-exchange molecular dynamics: REMD)及び、焼き戻し法(simulated tempering: ST)に関するパラメータの最適な選択法について研究を行っている。2016年度は、2015年度より引き続き、焼き戻し法によるシミュレーションの改良を行ってきた。焼き戻し法とレプリカ交換分子動力学法の間には、幾つかの共通点があるが、焼き戻し法には一度に大量のCPUを使う必要がないという利点が有り、レプリカ交換分子動力学法と同様に重要な手法である。焼き戻し法ではレプリカ交換分子動力学法と同様に、実際に調べたい温度よりも高い温度で分子動力学シミュレーションを行う必要がある。このような高温の分子動力学シミュレーションでは原子や分子の衝突がより高いエネルギーで生じ、分子動力学シミュレーションが不安定となることが懸念される。この問題点を払拭する手法として、焼き戻し法においても質量のスケールが有用であることを示し、また、本手法により焼き戻し法のアルゴリズムがより簡便できることを示した。さらに、提案した手法をタンパク質の折りたたみシミュレーションに応用し、本手法が有望であることを示し、論文として出版された。さらに、レプリカ交換分子動力学法において、より一般的な質量のスケールを行うための定式化を完成させた。本定式化を利用して、先行研究をより精度の良い手法にする提案を行っている。昨年度より引き続き行ってきた焼き戻し法に関して、追加実験を遂行し投稿論文として受理された。また、質量をスケールする手法について、より一般的な定式化を完了したため。本研究では、2014年度より2017年度までの間に、生体分子のシミュレーションにとって重要なレプリカ交換分子動力学法(replica-exchange molecular dynamics: REMD )及び、焼き戻し法(simulated tempering: ST)に関するパラメータの最適な選択法について研究を行ってきた。焼き戻し法とレプリカ交換分子動力学法の間には、いくかの共通点があるが、焼き戻し法には一度に大量のCPUを使う必要がないという利点があり、レプリカ交換分子動力学法には重みの決定が不要という利点があり、両者ともに重要な手法である。両手法ではともに、実際に調べたい温度よりも高い温度で分子動力学シミュレーションを行う必要がある。このことによりポテンシャルエネルギーの障壁を乗り越え正しいシミュレーションが行うことができる.しかしながらこのような高温の分子動力学シミュレーションでは原子や分子の衝突がより高いエネルギーで生じ、分子動力学シミュレーションが不安定となることが懸念される。この問題点を払拭する手法として、質量スケールの方法を開発してきた。プロジェクトを通じ両手法において質量のスケールが有用であることを示しアルゴリズムがより簡便できることを示した。

また、質量スケールの方法についてより一般的な手法を検討し過去に提案されていた手法をより厳密で頑強なアルゴリズムになるような提案も行った。本研究では、2014年度より2017年度までの間に、生体分子のシミュレーションにとって重要なレプリカ交換分子動力学法及び、焼き戻し法に関するパラメータの最適な選択法を調べた。両手法では、実際に調べたい温度よりも高い温度で分子動力学シミュレーションを行う必要がある。しかしながらこのような高温の分子動力学シミュレーションは不安定である。この問題を払拭する手法として、質量スケールの方法を開発した。当初の計画では、まず交換頻度とレプリカ数に着目する予定であったが、質量に着目したことで、一定の進捗が得られ、過去に提案された手法に存在する理論的な間違いについても指摘することが出来た。当初計画における対象であった交換頻度とレプリカ数に対してもいくつかの予備実験による結果を得ることが出来ている。また、論文等に直接結び付くわけではないが、広く使われているソフトウェアに存在するバグを指摘できたことは、当該分野の多くのユーザに対するメリットがあったと考えられる。現在は、質量スケールを用いた焼き戻し法やレプリカ交換分子動力学シミュレーションの一般的な場合における手法論の理論的検討が終了したので、一般的な場合に関しての数値的な結果をまとめる。また当初計画のレプリカ数と交換頻度に関しても予備実験を進める。現在は、質量スケールを用いた焼き戻し法やレプリカ交換分子動力学シミュレーションに対する理論的検討が終了し、一定の数値的検証が完了したため、当初計画のレプリカ数と交換頻度に関しても研究をさらに進める所存である。生物物理当初の計画では、まず交換頻度とレプリカ数に着目する予定であったが、質量に関する最適化で進捗が得られたので、2015年度も質量に関する最適化を当面すすめる。特に、レプリカ交換分子動力学シミュレーション法で有用であった方法が焼き戻し法でも有用であるかを確かめる。研究実績の概要で述べたように、過去に提案された手法において、原理的な間違いがあることを理論的に検討したので、その数値実験による確認も合わせて行う。また、当初の計画であった交換頻度とレプリカ数に関しても予備実験を進める。人事異動による研究環境の変化に伴い、物品の購入計画を変更したため物品の購入の際に価格を抑えることができたため。当初計画と異なる部分に注目したため、2014年度に当初必要とした計算資源を必要としなくなったため、計算機の購入を一時見送ったため。
細胞外マトリックスの自然修復機転の分子機構―腎再生を探る新しい視点―

実験腎炎における細胞外マトリックスと糸球体内皮細胞の動態【背景】(1)近年、血管新生の過程にアンジオテンシンIIが必要であることが明らかとなっている。(2)レニン・アンジオテンシン系の概念は、アルドステロンまで広がり、心臓や血管局所におけるアルドステロン産生が報告されている。今回我々は、アンジオテンシン阻害と糸球体修復過程における細胞外マトリックスと糸球体内皮細胞の動態を解析し、さらにヒト腎生検組織におけるアルドステロンの産生酵素であるCYP11B2の発現を検討した。【方法と結果】(1)アンジオテンシンII受容体欠損マウス(ARKO)にハブ毒腎炎を惹起し、マトリックスの変化を糸球体内皮細胞の動態に注目しながら検討した。その結果、ARKOでは野生型に比べ、糸球体係蹄の参復の遅れを伴いながらマトリックス拡大が残存した。さらにVEGF投与により糸球体係蹄の修復及びメサンギウム細胞増殖やマトリックス拡大が野生型と同様のレベルに復した。(2)CYP11B2 mRNAの発現をin situハイブリダイゼーション法により検討した結果、IgA腎症の糸球体と間質に、CYP11B2の発現が観察され、その発現の程度は組織障害度と正の相関を示した。【考察】拡大したマトリックス修復にアンジオテンシン・VEGF系を介した糸球体係蹄の修復が重要な役割を果たしていることが明らかとなった。これは、糸球体血管の再構築が細胞外マトリックスの動態と関係があることを示しており、糸球体の修復に対して血管新生と細胞外マトリックスに注目した新しい治療戦略が今後検討されるべきと思われる。また、ヒト腎組織におけるアルドステロン産生の事実は、レニン・アンジオテンシン・アルドステロン系へのパラダイムシフトが腎臓でも起こり、アルドステロン阻害が糸球体腎炎の有望な治療となりうる可能性が示された。腎組織の修復について1.ハブ毒腎炎の作成ハブ毒を静注し、メサンギウム融解後、メサンギウム細胞および基質の増生が21日目に最大となり、28日目にほぼ元の組織像に戻る可逆性のメサンギウム増殖性腎炎を惹起した。2.細胞外基質の産生と分解の変化・コラーゲンIVとHSP47の発現コラーゲンIVと、コラーゲン産生に必須のシャペロン分子であるHSP47(heat shock Protein 47)を免疫組織染色後に、コンピューターによる画像解析を行い、発現の程度を定量化した。コラーゲンIVとHSP47の発現は、メサンギウムの融解が起こる3日目において最小となり、21日目に最大となった。以後28日目には元のレベルに戻った。・コラーゲン分解系の変化コラーゲンなどの細胞外基質は、マトリックスメタロプロテナーゼ(matrix metalloproteinase ; MMP)により分解されるが、今回は、分解する基質の種類が多いMMP-3とその転写因子であるEts-1の発現を検討した。コラーゲンIV、HSP47と同様の方法により、その発現を調べた。MMP-3とEts-1の発現はハブ毒投与後徐々に増加し、コラーゲンIV、HSP47の発現が最大になる21日目を過ぎても発現は持続した。以上より、ハブ毒腎炎においては、細胞外マトリックスの増加する時期より同時に分解系の発現も増加しており、コラーゲン産生の低下と持続的な分解系の発現が組織の可逆性に関与していることが明らかとなった。3.組織障害、修復における骨髄由来細胞の関与骨髄由来の血管内皮細胞の関与を検討している。Tie-

2遺伝子の下流にLacZの遺伝子を組み込んだトランスジェニックマウスの骨髄移植を行い、その発現を腎組織上で検出することが可能となった。今後種々の腎障害を惹起し、この細胞の発現を検討予定である。実験腎炎におけるマトリックスの動態の解析・可逆性のメサンギウム増殖性腎炎であるハブ毒腎炎を作成:ハブ毒をラットに1回投与し、mesangiolysis後にメサンギウム細胞増殖とメサンギウム基質増生を生じ、正常に修復されるモデルを確立した。【結果】メサンギウム領域の拡大は最大約3倍であり、35日目に肉眼的にほぼ正常に戻った。・マトリックスの産生と分解に関係する因子の解析:マトリックス産生因子として、コラーゲン産生の際に必須とされているHSP47(heat shock protein47)とコラーゲンtypeIVを、分解系として、MMP-3(matrix metalloproteinase-3)とその転写因子であるEts-1の発現をした。【結果】コラーゲンIVの発現は21日目に最大6倍に、HSP47は14日目に7倍となり、それに対しマトリックス分解系のEts-1、MMP-3の発現は14日目より徐々に増加し、35日目では12倍となっていた。【考察・今後の方向性】マトリックス産生系は1421日目、分解系は35日目が最大となっており、産生系と分解系のバランスが、マトリックスの動態に重要であることが示され、分解系の持続した発現が組織修復に重要であることが示唆された。このモデルにおいては、産生系の持続的刺激が加わっていないため、組織修復には、産生系の抑制と分解系の活性化を起こさせるような治療戦略が重要であることが示唆された。現在、アンジオテンシン系がコラーゲン産生や分解に重要な役割をしていることが報告されており、その詳細なメカニズムの解析をアンジオテンシンのレセプターノックアウトマウスを用いた実験による進めている。実験腎炎における細胞外マトリックスと糸球体内皮細胞の動態【背景】(1)近年、血管新生の過程にアンジオテンシンIIが必要であることが明らかとなっている。(2)レニン・アンジオテンシン系の概念は、アルドステロンまで広がり、心臓や血管局所におけるアルドステロン産生が報告されている。今回我々は、アンジオテンシン阻害と糸球体修復過程における細胞外マトリックスと糸球体内皮細胞の動態を解析し、さらにヒト腎生検組織におけるアルドステロンの産生酵素であるCYP11B2の発現を検討した。【方法と結果】(1)アンジオテンシンII受容体欠損マウス(ARKO)にハブ毒腎炎を惹起し、マトリックスの変化を糸球体内皮細胞の動態に注目しながら検討した。その結果、ARKOでは野生型に比べ、糸球体係蹄の修復の遅れを伴いながらマトリックス拡大が残存した。さらにVEGF投与により糸球体係蹄の修復及びメサンギウム細胞増殖やマトリックス拡大が野生型と同様のレベルに復した。(2)CYP11B2 mRNAの発現をin situハイブリダイゼーション法により検討した結果、IgA腎症の糸球体と間質に、CYP11B2の発現が観察され、その発現の程度は組織障害度と正の相関を示した。【考察】拡大したマトリックス修復にアンジオテンシン・VEGF系を介した糸球体係蹄の修復が重要な役割を果たしていることが明らかとなった。
磁気感応運動マシナリーの構造機能相関

磁性細菌は、ナノサイズの磁気オルガネラ「マグネトソーム」を用いて地磁気を感知し、地磁気に沿って遊泳する走磁性を示す。このような磁気感応細菌は、世界中の水環境中に広く分布しているが、その磁気感応機構の詳細は不明であった。本研究では、走磁性運動の定量化、生細胞イメージングによるマグネトソーム動態とべん毛回転運動の可視化と解析、高速原子間力顕微鏡による生細胞分子イメージングにより、MamK細胞骨格の機能解明を中心として、磁性細菌の磁気感応運動の分子機構を解析した。平成25年度は、広宿主域プラスミドを用いて、M. magneticum AMB-1においてMamC-GFPの融合タンパク質の発現系を構築した。MamC-GFPを発現させた細胞を、ポリ-L-リジンでコートしたカバーグラスに付着させ、長時間観察による細胞の遊離を防ぐためジェランガムゲルにより細胞を固定した。液体培地で満たしたチャンバー内で、微好気的に磁性細菌の培養を行いつつ24-48時間に渡って長時間蛍光タイムラプス観察を行った。観察には、斜光照明(HILO照明)法を用いた。蛍光顕微鏡観察の結果、MamC-GFPは、細胞の長軸方向に沿ってスポット状に観察され、マグネトソームの局在部位と一致していた。細胞はタイムラプス観察中に複数回分裂し、細胞周期を通してマグネトソームの動態を観察することができた。細胞の伸長とともに、細胞内の蛍光スポット間の距離が増加したが、細胞長軸における相対的な位置は変化せず、その後に起った細胞分裂により、蛍光スポットが娘細胞へ安定して分配される様子が観察された。また、娘細胞では細胞の成長とともに、新規にマグネトソームが形成される様子を観察することができた。また、同様の実験をMamK欠損株を用いて行った。MamKはアクチン様細胞骨格タンパク質であり、マグネトソームの鎖状構造形成や安定伝搬に寄与することが示唆されている。mamK欠損株において、MamC-GFPの蛍光スポットは、野生株のように細胞の長軸方向に沿って分布せず、野生株と比べて細胞内をランダムに移動し、結果として娘細胞に不均等に受け渡されていた。1.マグネトソームとMamK細胞骨格の細胞内動態解析:マグネトソーム局在蛋白質MamC及びMamIとGFPの融合蛋白質をM. magneticum AMB-1に発現させ、斜光照明法を用いた蛍光顕微鏡観察することにより、細胞周期を通じたマグネトソームの生細胞観察に初めて成功した。野生株では、マグネトソームは細胞周期を通じて細胞長軸に沿った直鎖状に配置され、細胞分裂の際には娘細胞へ均等に分配される様子が観察された。一方、mamK欠損株では、マグネトソームは細胞内に分散しランダムに移動あるいは凝集体を形成していた。これらの結果から、「MamK細胞骨格」は「マグネトソーム」と相互作用し、マグネトソームを直鎖状に細胞内配置させることで、効率的な磁気センサーとして機能させると共に、娘細胞への安定伝搬にも貢献することが示された。2.マグネトソーム形成蛋白質の機能解析:「マグネトソーム」の形成機構を明らかにするため、MamPと呼ばれるマグネトソーム蛋白質に着目し、その機能解析を行った。その結果、MamPはマグネトソームの磁鉄鉱結晶の成長に必須であること、その機能にはMamPへのヘムcの結合が必要であることが示され、MamPは磁性鉱物合成に関わる新奇のヘム蛋白質であることが明らかになった。3.高速AFMによる生細胞分子構造観察:微小な細菌の運動マシナリーの解析には、生細胞の分子マシナリーを直接観察する技術が必要である。そこで、高速AFMによる生細胞観察法の開発を目的として、大腸菌や光合成細菌の表面構造を観察した。その結果、外膜表面にポーリン分子により構成されるナノサイズの網目構造の観察に成功し、この構造がグラム陰性細菌に普遍的であることを示唆した。高速AFMによる生細胞観察法は、多様な細菌種に適用可能であり、微生物学における新しい解析手法となることが期待できる。1、MamK細胞骨格の機能解析MamKは磁性細菌に保存されたアクチン様細胞骨格蛋白質であり、磁気感知センサーオルガネラであるマグネトソームの細胞内配置に関わることが電子顕微鏡解析から示唆されているが、生細胞での機能解析は行われていない。そこで、全反射蛍光顕微鏡(HILO照明法)を用いた生細胞蛍光イメージングにより、Magnetospirillum magneticum AMB-1細胞内のマグネトソーム動態を、細胞成長期、分裂期を通した細胞周期全体にわたって可視化し、MamKの役割を調べた。野生株、mamK遺伝子破壊株、変異型MamK蛋白質(ATPase活性を喪失)発現株において、マグネトソームの細胞内動態を解析した。その結果、MamK細胞骨格は、マグネトソームを細胞周期を通じて静止した直鎖状に配置し、棒磁石状の構造に固定することで、効率的な磁気センサーを形成していた。さらに、それと同時に娘細胞への安定伝搬をも担うことが明らかになった。また、ATPase活性を介したMamK細胞骨格繊維の動態がマグネトソームの細胞内配置に必要であることが示唆された(論文投稿中)。

2、磁性細菌のべん毛運動の可視化と走磁性運動解析中根班(公募班A03)の技術支援により、AMB-1のべん毛運動の可視化に成功した。べん毛をQdotにより蛍光標識し、マイクロスライドチャンバー内で遊泳するAMB-1細胞を蛍光顕微鏡観察した。その結果、遊泳中の細胞の両極に存在するべん毛の運動を観察することができた。今後、回転運動の定量的解析の他、磁気強度や方位を制御した環境で、磁気感知運動中の磁性細菌のべん毛運動を解析する。また、西坂班(総括班)との共同研究により、磁気ピンセットにより外部磁場の方位と強度を制御し、外部磁場が磁性細菌の磁気感知運動や細胞内の磁気極性に与える影響を解析した(論文投稿準備中)。年度当初に予定していた2つの課題、1、MamK細胞骨格の機能解析と2、磁性細菌のべん毛運動の可視化と走磁性運動解析について、「研究実績の概要」に記載のとおり、1については、論文投稿中であり、2つについては論文投稿準備中の段階であることから、上記の「おおむね順調に進展している。」と自己評価とした。1、MamK細胞骨格の機能解析MamKは、磁性細菌の磁気オルガネラであるマグネトソームに結合する細胞骨格繊維を構成するアクチン様蛋白質である。本研究では、蛍光イメージングによりMamKの生細胞内での機能解析を行った。全反射蛍光顕微鏡を用いて、細胞周期全体にわたるマグネトソームの細胞内動態を、高い時間分解能で動画観察することに成功した。野生株とmamK欠損株のマグネトソーム動態を比較解析したところ、mamK欠損株細胞内のマグネトソームの拡散定数は、リボソームなどの細胞内を単純拡散する分子と同等であった。このことから、MamK細胞骨格は、マグネトソームを細胞中央に直鎖状につなぎとめることで、マグネトソームが細胞内に動的に分散することを防ぎ、安定な構造をもつ効率的な磁気センサーとして機能させていることが明らかになった(論文投稿中)。さらに、高速AFMを用いて、MamK繊維の重合過程をin vitroで観察したところ、MamK繊維の重合に極性があること、MamK繊維がトレッドミル運動することを明らかにした。MamK繊維のトレッドミル運動がマグネトソームの安定な細胞内配置に必要であることを示唆した。2、マグネトソーム局在蛋白質間の相互作用磁鉄鉱結晶の形成に必要なMms6蛋白質がマグネトソームの細胞質側表面を覆うTPR蛋白質MamAと結合することを見出し、MamAの新しい機能を提案した(Biochem Biophy Rep 7:39-44)。3、磁性細菌のべん毛運動の可視化西坂教授(学習院大・総括班)、中根助教(学習院大・公募班)の技術支援により、Magnetospirillum magneticum AMB-1の細胞両極にあるべん毛の回転運動を解析した。その結果、べん毛の回転方向の同定に成功し、本細菌が前進する際は前後の2本のべん毛が協調して働いていることを明らかにした。磁性細菌の走磁性は、磁気情報の“Input"を担当するセンサーマシナリー「マグネトソーム」と、運動装置として“Output"を担当する運動マシナリー「べん毛」という2つの超分子複合体の連動によって可能となっている。本年度の研究計画は「全反射蛍光顕微鏡(24年度10月購入費計上)を用いて、磁性細菌の生細胞内での分子の動態を可視化するための実験系(遺伝子組み換え実験)を構築する。」ことである。
古代ギリシアの散文の文体-とくに演説と演説以外の散文の間の異同

Thucydides(以下Thuc)の文は演説家Antiphon(以下Ant)の文と非常に似ていて、Antの文は聞いただけで分かったはずだから、Thucの文もさしたる困難なしに分かったと考えられるという説に対して、Antの文はThucの文にそれほど似ていないと証明するために、昨年度は両者のペリオドスの構造が全く違うことを示したあとを受けて、今年度は両者の語彙とその用法を調査研究することにより、昨年度の結論をさらに裏付けした。比較の対象とした語彙は(1)-sis名詞、(2)冠詞+中性形容詞(または分詞)、(3)冠詞+動詞の不定法であり、調査の結果、a)これらの使用頻度において、AntはThucよりかなり少ないが、他の著者・演説家に比べればかなり多い。すなわち彼の文はこの点ではThucに多少は似ていると言える。b)しかしそれらの語彙の用法においては、両者に共通する点は皆無で、とくにAntのは単純明快だが、Thucのは解説をしてもらわなければ分からない点を多く含んでいる。ゆえにThucの文はAntに非常に似ているとは言えまい。ゆえにAntを論拠にして、Thucの文も聞いただけで分かったはずだとは言えない。一方この当時、著作の最初の発表の仕方は、読んで聞かせるという方法にのみよっていたということは、否定しえない一般情勢である。とすれば上記の状況から、Thucの読者はかなり限られた数の、Thucになじんでいた人々であった、というのがここから引き出せる唯一の結論である。かつてすべての著作は、最初に発表されるときは聴衆に聞かせるという方法によっていたが、ある時からそうでなくなった。これは読みのあり方がまったく変わったことを意味するが、それは文体の変化としても表れているはずだと期待した。そしてその変化を、聞いただけで分かる文章から、聞いただけでは分からない文章への変化としてとらえようと試みた。この変化にもいくつかの要因があるが、今年度は、古典期のギリシア語の慣用に反する語法(慣用に反しているゆえに聞いただけでは分かりにくい)のうち、主語となる語(句)の種類、および-sis名詞(ただし学術用語として新造された-sis名詞を省く)の用例を検討した。比較の対象としては、トゥキュディデスと、彼らに劣らず複雑な構文の文章を書いた弁論家、とくにアンティポンとデモステネスを選んだ。なぜなら、弁論家の文章はまず聞かれたのであるから、ただ構文が複雑なだけなら聞いただけで分かるには何の支障もなかったと言えるとともに、これらの弁論家の文章にはなくてトゥキュディデスの文章にはある特性を見いだせば、それが、聞いただけでは分からず、繰り返し読むことによってはじめて、著者の意図や思考を読み取ることができる文章の要因と考えることができるはずだからである。その結果、-sis名詞を主語にする文章は、弁論家では、多い時でもトゥキュディデスの半分以下、しかも次第に減少する傾向があること、動詞の不定法に定冠詞をつけて主語にするのも、弁論家ではほとんどその用例がないのに、トゥキュディデスではかなり頻繁であることが分かった(この点は、哲学者の文章にも用例が多い。彼らの場合は、不定法どころか副詞(句)に冠詞をつけて主語にしている例も少なくない)。ゆえに、トゥキュディデスは聴衆ではなく個人の読者を想定して文を書いた可能性があると論じた。比較の対象とした語彙は(1)-sis名詞、(2)冠詞+中性形容詞(または分詞)、(3)冠詞+動詞の不定法であり、調査の結果

a)これらの使用頻度において、AntはThucよりかなり少ないが、他の著者・演説家に比べればかなり多い、すなわち彼の文はこの点でThucに多少は似ていると言える。b)しかしそれらの語彙の用法においては、両者に共通する点は皆無で、とくにAntのは単純明快だが、Thucのは解説をしてもらわなければ分からない点を多く含んである。ゆえにThucの文はAntに非常に似ているとは言えない。ゆえにAntを論拠にして、Thucの文も聞いただけで分かったはずだとは言えない。一方この当時、著作の最初の発表の仕方は、読んで聞かせるという方法にのみよっていたということは、否定し得ない一般情勢である。とすれば上記の状況から、Thucの読者はかなり限られた数の、Thucになじんでいた人々であった、というのがここから引き出せる唯一の結論である。
心血管イベントの予測因子としての脂質代謝酵素動態の解明

脂質代謝酵素の動脈硬化症への影響は未だ明確ではない。本研究では、脂質代謝酵素あるいは制御蛋白であるリポ蛋白リパーゼ(LPL)、血管内皮リパーゼ(EL)、血管内皮細胞アンカー蛋白(GPIHBP1)、上述系で測定した血清HL蛋白量と動脈硬化度との相関性を家族性高コレステロール血症患者で明らかにした。その結果、ELとGPIHBP1は動脈硬化進展度予測因子であることが示唆された一方HTGLやLPLに関しては、頸動脈の動脈硬化重症度を必ずしも反映しないことが示唆された。LDL-R遺伝子変異で確定されたFH患者をエントリーし、脂質代謝酵素LPLとELの蛋白量測定を施行することが出来た。本年度は、課題研究達成のために、脂質代謝酵素の一つ肝性リパーゼ(HTGL)を簡便に測定できる系を確立した。従来HTGLはヘパリン静注後血漿(PHP)を試料として測定したが、血清中HTGLを測定できればはるかに多くの試料を採取しHTGLの臨床意義を明らかにできる。そこで血清中HTGLに反応する新しいモノクローナル抗体(MoAbマウス9A1、MoAbラット141A1)を開発し、血清HTGL蛋白量測定用ELISAシステムを確立した。方法:FLAG-epitope tagを3 '末端に付加した後、PCR産物をpcDNA3.1(+)発現ベクターに挿入した。HEK293をhHTGL plasmidでtransfectionし、安定な発現系を確立するためにG418で選択した。得られたHTGLをBALB / cマウスまたはWisterラットに皮下注射し免疫した。MoAbの特異性を確認するために免疫沈降-免疫ブロッティング分析を行った。臨床的意義を検討するため冠動脈疾患を有する42名の男性被験者の血清脂質、HTGL蛋白量測定を行い、それらの相関性を検討した。結果:MoAbマウス9A1およびMoAbラット141A1はいずれも、組換えHTGL、PHP-HTGL、血清HTGLを免疫沈降させた。このELISA法は、アッセイ内およびアッセイ間で変動係数が6%未満であり、リポ蛋白リパーゼまたは内皮リパーゼと交差反応しなかった。被験者の臨床分析では、血清HTGL濃度とPHP-HTGL濃度との間に強い正の相関があった(r = 0.727、p <0.01)。血清HTGL濃度は血清TG(r = 0.314、p <0.05)とALT(r = 0.406、p <0.01)との間に正相関を示し、LDL-C、small、dense LDLおよびγGTPと正の相関傾向を認めた。本課題研究を達成するためにHTGL酵素蛋白量測定の系を確立することは必須である。この系の確立により血清中のHTGL測定が可能となる。従来はHTGL測定試料としてヘパリン静注後血漿を用いたため検体採取がはるかに複雑であった。前年度課題研究達成のために肝性リパーゼ(HTGL)を簡便に測定できるELISA系を確立した。この測定系は従来法と異なり、試料採取の際にヘパリン静注を必要とせず血清を試料としてHTGL蛋白量を測定できる系である。今年度は、その測定系を用い、ヘテロ家族性高コレステロール血症(FH)患者(n=17;年齢64±9.7 y男性/女性=12名/5名)を対象に頸動脈超音波検査にて測定した頸動脈内膜中膜複合体厚(IMT)またはプラークスコア(PS)と血清HTGL蛋白量との相関性を検討した。同様に脂質代謝酵素あるいは制御蛋白であるリポ蛋白リパーゼ(LPL)蛋白量、血管内皮リパーゼ(EL)蛋白量、血管内皮細胞アンカー蛋白(GPIHBP1)との相関性を検討した。頸動脈IMT、PSと血清HTGLとの相関はそれぞれr=0.074 p=0.79; r= -0.089 p=0.74。頸動脈IMT、PSと血清LPLとの相関はそれぞれr= 0.323 p=0.223 ; r=-0.037 p=0.892。頸動脈IMT、PSと血清ELとの相関はそれぞれr=0.587 p=0.017; r=0.215 p=0.424。頸動脈IMT、頸動脈PSと血清GPIHBP1との相関はそれぞれr=0.587 p=0.017; r=0.432 p=0.095。以上から脂質代謝酵素の1つELとGPIHBP1はFH患者の動脈硬化予測因子であることが示唆された。HTGLやLPLに関しては、頸動脈の動脈硬化重症度を必ずしも反映しないことが示唆された。今後はFH患者検体を更に収集するとともに、動脈硬化症の指標である頸動脈エコー所見や冠動脈CTとの相関を明らかにしていく。

リポ蛋白リパーゼ(LPL)、血管内皮リパーゼ(EL)測定系はすでに確立、キット化されている、これに血清HTGL測定系が加わることになる。今後は家族性高コレステロール血症(FH)患者から血清を採取しその動脈硬化進展度とこれら3つの脂質代謝酵素との関係解析を更に進展していく。病態検査学LPLやEL酵素蛋白量測定のELISAキット(1キット約100,000円)の購入費用が、あらかじめ保管してあった使用期限内のものを使用したためキットの購入数を大幅に抑えることが出来た。そのことによる余剰金である。LPL測定キットを購入する際、当初予定していた個数購入よりも1個(100,000円相当)少なく研究を達成できたことが大きな理由である。本研究を推進していくために、ひきつづき、LPLやEL酵素蛋白量測定のための費用にあてていく。昨年度はELとLPLのみにつき検討したが、HTGLについても検討予定である。新年度開始後比較的早い時期にLPLキット購入を再開し、研究にとりかかる予定である。
超塑性材料における粒界拡散および格子拡散

Zr基多元系金属ガラスは100Kにも及ぶ広い温度範囲において超塑性を示す過冷却液体領域を有しており、その物性と応用の研究が盛んに行われている。ところで、このような超塑性現象は原子の拡散や粘性と密接に関係している。従って、拡散の知見はこのような金属ガラスにおいて生じる超塑性を理解する上で重要である。しかしながら、原子の拡散に関する知見はきわめて少ない。本研究では、Zr基金属ガラスのアモルファス相および過冷却液体相における自己拡散係数を測定し、その拡散機構を明らかにすることを目的とした。得られた実験結果を要約すると,Zr_<55>Al_<10>Ni_<10>Cu_<25>金属ガラスのアモルファス領域および過冷却液体領域における^<63>Niの拡散濃度分布はガウス分布によく従っている。このようにして測定された拡散係数Dはガラス遷移温度T_gを境にして大きく異なった温度依存性を示している。このガラス遷移温度T_gを境にして過冷却液体領域では粘性が急激に低下することが知られている。このような粘性の低下に伴い過冷却液体領域ではNi原子の最隣接および第2隣接原子がゆっくりとした原子の再配列を行っている。従って,原子が拡散ジャンプする際にはアモルファス相の場合よりも多くのconfigurationsを生じていて配置のエントロピーが大きくなっていると考えられる。
大量DNAシーケンシング体制の構築と支援

大量DNAシーケンシング体制構築のために、シーケンシング全ステップを見直し、コストダウンを図り、年間600万リード(サンガー法)を可能にした。この結果、16の生物種の92種の組織・発生段階のcDNAライブラリーについて340万リードのEST解析を支援、野生由来マウス、ギボシムシ、クマムシ、立襟鞭毛虫、細胞性粘菌など7種の全ゲノムショットガンシーケンス1940万リードを支援、その他合計2400万リードを支援した。ゲノムfinishing用ワークベンチの開発、WGSリードより多型を探索するシステム、ビューアを構築した。次世代型シーケンサー解析システム構築を進め、情報セキュリティ体制の必要な個人ゲノム対応のためのシステムも含めたコンピュータシステムを整えて、様々な試行を行った。ショートリードより多型を探索するシステム・ビューア、SOLEXA multiplexingデータ解析システムの開発、cDNA全長シーケンスアセンブルシステムを開発した。本支援班は前特定領域「統合ゲノム」で設置されたDNAシーケンシング施設を活用し、より高効率のシーケンシング体制を構築し、他3領域特に「比較ゲノム」領域との連携のもとにそれぞれの課題におけるゲノム/ESTシーケンシングを集中的におこなうことを目的として、以下の成果をあげた。(1)大量シーケンシング体制の構築・改良Templiphiの導入、徹底した希釈によりコストダウンの目標をほぼ達成した。(2)大量シーケンシング支援:以下解析し、データ提供した。1.ゲノム1)日本産野生マウス系統の薄い(x1)WGSとマウス標準系統とのSNP検出リード数592万、高クオリティ配列総延長2.98Gb(マウスゲノムのカバー率1X)に達し、並行してシーケンスエラーも考慮してB6標準系統マウスゲノムとの間でSNPを検出・対応付けができるブラウザを開発した。結果、平均1%弱のSNPを検出しマップした。2)襟べん毛虫(200Mb前後):バクテリアのコンタミ問題がほぼ解決し、本格スタートした。3)カイコ:フォスミド両端シーケンシング12万クローン4)クワコ:フォスミド両端シーケンシング76800クローン1)ナメクジウオ:5ライブラリー計148000クローン2)無尾ボヤ(Molgula):2万クローン3)ユウレイボヤ:5ステージ96000クローン4)コムギ:25000クローン5)ヒメツリガネゴケ:SAGEライブラリー10万クローン、EST46000クローン6)クラミドモナス:5万クローン(3)リソース管理本課題で解析したホヤ、ナメクジウオのcDNAクローンについて内外からのリクエストに対応した。以下の大量シーケンシング支援をおこなった。1)日本産野生マウス系統の薄いWGSとマウス標準系統とのSNP検出:昨年度に引き続き全ゲノムショットガンシーケンスを行った。最終的にはマウスゲノムのカバー率1.4Xのリードを得た。シーケンスエラーも考慮してB6標準系統マウスゲノムとの間でSNPを検出・対応付けができるブラウザを開発した結果、平均1%弱のSNPを検出マップした。マウス間の比較をさらに進めるために、PCRダイレクトシーケンシング法を用いて3つの別系統JF1、PGN、HMIについて配列比較を行った。4)以下のEST等解析をおこなった:クラミドモナス(5ライブラリー、計96000クローン)、ギボシムシ(5ライブラリー、計96000クローン)、ヒメツリガネゴケ(3ライブラリー、計40000クローン;5'SAGEライブラリー、計57600クローン;3'SAGEライブラリー、11520クローン)、コムギ(61440クローン)、アピコンプレクサ原虫2種(各1ライブラリー、計23000クローン)、アゲハ2種(各1ライブラリー、計46000クローン)、アンドンクラゲ(1ライブラリー、23000クローン)1)ヒメギボシムシ(500-600Mb):昨年度に引き続きWGSシーケンスを行い、100万リードを終了し、総延長で550Mbの配列を決定した。2 )立襟鞭毛虫(100Mb):WGSシーケンス30万リードを終了し、これまでに総延長で700Mbの配列を決定した。RAMENアセンブラにより、約1万個のscaffold(総延長63Mb、最長1.7Mb)を得た。4)ヌクレオモルフ(合計450kb(直鎖状染色体3本):2万リードを終了し、総延長10Mbの配列を決定した。PCAPアセンブラによって得られた740個のscaffold(総延長1Mb、最長88kb)の提供を行った。

5)マウスMSM系統:すでに取得した全ゲノムショットガンデータをもとに標準B6系統との間の比較解析をおこなった。6)以上のゲノム解読に加え、以下のEST解析支援をおこなった。ヒメツリガネゴケ(5'SAGE5ライブラリー計73,000クローン)、ゼニゴケ(2ライブラリー、計115,000クローン)アピコンプレクサ原虫(3ライブラリー、計35,000クローン)、ギボシムシ(4ライブラリー、計54,000クローン)、細胞性粘菌(2ライブラリー、計12,000クローン)、コムギ(8ライブラリ、計61,000クローン)、タマーワラビー(3ライブラリ、計92,000クローン)、ショウジョウバエ(2ライブラリ、計34,000クローン)、線虫(8ライブラリ、計177,000クローン)1)大量シーケンシング体制の構築・改良については、「比較ゲノム」支援班の協力により、線虫及び近縁線虫を用いて次世代シーケンサSOLEXAによるショートリードのde novoアッセンブル解析の試行及び、サンガーリードと併用するハイブリッド法の検討を進めた。またショートリードのゲノム貼り付けのためのソフトウェアの比較、これらによる多型検出(SNP, In/Delなど)のためのビューアを構築した。de novoアッセンブルのためには間隔の大きいメイトペアリードが必要であることから、SOLiD3の導入に向けて検討をおこなった。ドラフト配列の完成に向けたフィニッシングプラットフォームを情報解析支援班の支援で構築し、近縁線虫Diploscapter coronatusの全ゲノム解読(サンガーリードとSOLEXAリード及びフォスミド配列などのハイブリッド)へ試用し、改良を進めた。2)大量シーケンシング支援については、全ゲノムショットガンでは、ヒメギボシムシ(500-600Mb)、立襟鞭毛虫(約100Mb)、細胞性粘菌Acytostelium subglobosum(40Mb)を支援し、また、クラミドモナスのフォスミド両端配列決定、近縁メダカ(インドメダカ、ルソンメダカ、ハブシメダカ)の23のフォスミド/BACクローンのドラフト配列決定を支援した。3) ESTでは、カイコ、ゼニゴケ、細胞性粘菌Acytostelium subglobosum、コムギ、ヒメミカヅキモを支援し、さらに全長cDNA配列のde novo決定のために、EST配列で分類し、代表クローンを混合し、EST配列をアンカーとしてSOEXA等ショートリードによるアッセンブルを行い内部全長配列決定する条件を設定・検討し、線虫cDNAで試行した。(1)大量シーケンシング体制の構築・改良については、「比較ゲノム」領域支援班と協同して引き続き次世代シーケンサI11uminaGAII、SOLiD3による解析システム構築を進めた。これには、SOLEXA等解析結果管理WWWサーバの整備、ショートリードより多型(SNP, In/Delなど)を探索するシステム・ビューアの構築、SOLEXA multiplexingデータ解析システムの開発、cDNA全長シーケンスアセンブルシステムの構築、などが含まれる。また、個人ゲノム解読対応のために入室管理や情報セキュリティ体制を強化したシーケンサー、コンピュータシステムを整備した。