hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
半導体レ-ザ-を用いたカルマン渦流速計の開発

40Hzまでの測定が可能であった。以上のように市販の渦流量計に比べ非常に細い管路の流量を測定可能で応答性の高い流量計が得られた。半導体レ-ザ-を用い細い径の渦発生体の後流に生じるカルマン渦の周波数を測定することによる流速・流量計を開発した。1流速計について渦発生体の径を0.3mmから2mmのものを用い、渦発生体に電流を流し加熱し、レ-ザ-光により渦周波数を検出し、FFTにより周波数を測定した。流速が速くなるほど渦の検出は容易になり、高速流では加熱の必要がない。また渦発生体が細くなるほど良い波形の信号が得られた。流速は約3m/sから200m/sの範囲で測定可能であることが確かめられたが、さらに高速でも測定可能である。流速分布の測定は渦発生体を固定しレ-ザ-光を渦発生体に沿って移動するものとレ-ザ-光を固定し渦発生体を移動する2方法で行った。後者はピト-管による結果と良い一致を示したが前者は壁近傍で(速度勾配の大きい所)で差がでた。これは渦発生体後部での二次流れによることが可視化により確かめられ、遮蔽板を設けることにより、差をなくすことができた。また複数の渦発生体を用いることにより、単一のレ-ザ-光により、同時に多点の流速が測定可能であった。測定誤差は1%未満である。2.流量計について内径5mmの円管と3x3mmから5x5mmの矩径管を用い、0.1mmから0.5mmの径の渦発生体を設け、水を用いて実験を行った。測定はFFTばかりでなく自作したF/Vコンバ-タにより行った。F/Vコンバ-タは応答性が良いことにより、変動流の測定も行った。変動流はロ-タリ-弁を回転させ発生させた。この場合40Hzまでの測定が可能であった。以上のように、市販の渦流量計に比べ非常に細い管知の流量を測定可能で応答性の高い流量計が得られた。
聴覚障害者の生活困難問題への教育的・福祉的対処の類型とその地域的基盤

1.「聾学校主導・社会事業団体補完型」の対処事例に関する検討聾唖学校は、大正末期以降学校教育の枠組みのなかに定着していく過程で、それまで附設されていた卒業生のための授産施設を分離させる。本課題では、この授産施設が昭和期以降社会事業の枠組みのなかで存続する福岡県を事例として、その存続を可能にした地域的基盤の検討をおこなった。私立福岡盲唖学校はその創設から県費獲得までの過程で、福岡県教育会、博多演芸界、炭坑財閥からの援助を受けてきた。授産施設が設立される経緯では、それまでの支持基盤に加え、比較的裕福な在校生・卒業生の保護者の設立にむけた働きかけが重要な意味をもった。福岡校の授産施設が、大正12年の盲学校及聾唖学校令を境として聾唖学校から分離されて後、社会事業の枠組みのなかで維持されていった要因は、福岡校が比較的経済的に潤沢で、なおかつ重層的な支持基盤を有していたことであった。2.「聾学校主導・当事者団体補完型」の対処事例に関する検討和歌山県立盲唖学校附設の授産施設の保護機能、及び卒業生の有する教育・保護機能が学校から分離される経緯を、初代校長辻本與次郎の教育理念の変遷及び同校の教育体制と教育方法の整備の点から検討した。和歌山校は、盲学校及聾唖学校令制定後、盲・聾唖各部の専任教員と職業科専任教員の確保、和歌山県師範学校出身の教員の補充により、口話法に基づく教育体制を確立させ、教育機能を強化させていった。辻本校長は、授産施設設立の担い手であった一方で、「教育の下延長」によって社会規範を備えた有用な存在を育成するという理念に基づき、口話法教育を推進していった。この教育機能の強化の過程で、学校令制定前には必要とされた卒業生に対する保護機能は、同校附設の授産施設から分離されていった。今後、生活困難問題への対処における京阪地域の当事者団体との関係が果たした役割が解明される必要がある。本研究は、大正期から昭和戦前期の聴覚障害者の教育後の生活困難問題の具体相と、それへの対処の類型を、当該地域の社会的諸条件との関係から究明しようとするものである。この対処の類型には、(1)聾学校主導型、(2)聾学校主導・社会事業団体補完型、(3)聾学校主導・当事者団体補完型があったと考えられる。すでに、類型(1)については和歌山聾唖興業会(和歌山市、大正11年設立)を、類型(2)については株式会社聾唖工芸品製作所(福岡市、大正8年設立)を対象に、事例研究を実施してきた。そこで本年度は、聾学校主導・当事者団体補完型の一事例であり、官立東京盲唖学校卒業生によって設立された東京楽善合資会社(東京市、大正10年設立)に焦点を当て、その設立の経緯と理念を分析した。また、福岡市の事例との類似性が予測される、札幌市の大日本聾唖実業杜(大正14年設立)に関して、現地での資料収集を実施した。東京楽善合資会社は、和歌山聾唖興業会、株式会社聾唖工芸品製作所と比較すると、聾唖者の社会的地位向上という設立理念、営利的性格と慈善的性格が併存する経営基盤、卒業生への保護機能という面で共通する要素があった。一方、同会社は、設立・運営の主体が聾唖者であり、設立過程で聾唖学校の財政難、教育力不足が関与していなかった点が、前二者とは異なっていた。これらの相違は、官立東京盲唖学校と地方聾唖学校とのあいだで、教育を支える人的・財政的基盤、および教育実践の歴史的蓄積が大きく異なる点に帰されると推察された。聾唖者主体での設立・運営は、昭和期以降に当事者団体がより明確な位置づけを獲得する過程においても重要な要素となることが示唆された。次年度は、人的・財政的基盤、教育実績の脆弱な地方聾唖学校において、生活困難問題への対処が可能となるための条件が何であったのかを、札幌市等の新たな事例を補充して総合的に分析・考察したい。2.「聾学校主導・当事者団体補完型」の対処事例に関する検討

和歌山県立盲唖学校附設の授産施設の保護機能、及び卒業生の有する教育・保護機能が学校から分離される経緯を、初代校長辻本與次郎の教育理念の変遷及び同校の教育体制と教育方法の整備の点から検討した。和歌山校は、盲学校及聾唖学校令制定後、盲・聾唖各部の専任教員と職業科専任教員の確保、和歌山県師範学校出身の教員の補充により、口話法に基づく教育体制を確立させ、教育機能を強化させていった。辻本校長は、授産施設設立の担い手であった一方で、「教育の下延長」によって社会規範を備えた有用な存在を育成するという理念に基づき、口話法教育を推進していった。この教育機能の強化の過程で、学校令制定前には必要とされた卒業生に対する保護機能は、同校附設の授産施設から分離されていった。今後、生活困難問題への対処における京阪地域の当事者団体との関係が果たした役割が解明される必要がある。
非クラマース縮退を持つプラセオジム化合物における多極子揺らぎと超伝導対形成の相関

4f2配位系の立方晶PrT2Zn20 (T=Ru, Rh, Ir)に着目し、超伝導や非フェルミ液体(NFL)状態におけるPr3+イオンの電気四極子の役割について調べた。この系のPr3+の結晶場基底状態は,四極子と八極子の自由度を有する非磁性二重項である。これまでに,T=Irの系において,反強四極子(AFQ)秩序温度TQ=0.11K以下で超伝導転移(Tc=0.05K)を示すことを見出し,超伝導対形成に四極子揺らぎが関与している可能性を指摘した。一方,非磁性のLaIr2Zn20はTc=0.6 KのBCS超伝導体である。本年度は以下の実験を行った。(1)昨年度までに作製したPr1-xLaxIr2Zn20 (0<x<1)を用いて,電気抵抗率、交流磁化率、比熱を測定した。TQはx<0.09で消失することを明らかにした。一方,Tcはx<0.5で殆ど上昇せず,x>0.5で大きく上昇する。La置換に対するTcとTQのx依存性から,両者の相関は弱いことが示唆される。これらの研究成果をまとめてJournal of the Physical Society of Japanに投稿し,2015年5月に出版された。さらに,これまでにRT2Zn20 (R=La, Pr, T=Ru, Rh, Os, Ir)の系で見出した超伝導や四極子秩序、構造相転移に関する成果と今後の展望について,2015年9月の日本物理学会秋季大会で招待講演を行った。(2)T>TQの比較的広い温度範囲で電気抵抗率と比熱はNFL的挙動を示し,AFQ秩序が消失する磁場5テスラ近傍でフェルミ液体(FL)状態が現れる。このNFLからNLへのクロスオーバーの原因は明らかではないが,四極子自由度と伝導電子の混成効果に起因していると考えられる。これらの特異な物性についての知見を得るために,Znアイソトープで作製した試料を用いたNMRが不可欠である。これまでに,NMRに必要な0.5グラム以上の単結晶を作製するための試料育成条件を確立した。27年度が最終年度であるため、記入しない。近年,カゴ状結晶構造をもつ化合物の多彩な物性が注目を集めている。申請者は, 4f電子を2個持つPr3+イオンがカゴに内包されたPrT2Zn20に着目した。この系の結晶場基底状態は,磁気双極子の自由度を持たず,四極子と八極子の自由度のみを有する非磁性G3二重項である。そのため,これら高次の多極子が絡んだ物性の発現が期待される。申請者は, T=lrの系において,四極子秩序(TQ=0.11K)と超伝導(Tc=0.05K)が共存することを見出し,超伝導対形成に四極子揺らぎが関与している可能性を指摘した。一方,非磁性のLalr2Zn20はTc=0.6KのBCS超伝導体である。本年度は, Pr1-xLaxIr2Zn20の超伝導特性のLa置換による変化を調べることを計画した。・Prl-xLaxlr2Zn20の試料を,シリコニット炉を用いたブリッジマン法により作製したところ,融液固化法で作製した試料よりも純良な試料が得られた。・磁化率の温度依存性は0≤x<1において, 10K以下で一定値に近づくヴァンヴレック常磁性的振舞いを示すことから,結晶場基底状態は非磁性であることが判った。・磁気比熱を温度で割ったCm/Tの温度依存性は, 10K付近にブロードなピークを示す。このピークは結晶場基底状態を二重項,第一励起状態を三重項,その間の分裂幅を30Kとするモデルで再現できる。このことから, Laで置換した系でも, Pr3+の結晶場基底状態はG3二重項に留まることが判った。・0≦x≦1の電気抵抗率と交流磁化率は超伝導転移を示し,そのTcはx≤0.5で殆ど上昇せず, x>0,5で大きく上昇する。Tcがxに対して線形に変化しないことから, Prlr2Zn20とLalr2Zn20の超伝導対形成機構が異なっている可能性がある。・電気抵抗率測定では, x=0でのみ四極子秩序による異常を観測した。・磁場中での電気抵抗率測定から超伝導転移の磁場-温度相図を作成した。上部臨界磁場の初期勾配から見積もった有効質量は, Prlr2Zn20で6.3meであり, Lalr2Zn20の1.7倍である。また, x>0.5において, m*が半減するとともにTcが上昇することから, Tcとm*の相関が示唆された。私は,4f電子を2個持つPrイオンがカゴに内包されたPrT2Zn20 (T:遷移金属)に着目した。

私は,T=Irの系において,反強四極子(AFQ)秩序(TQ=0.11K)と超伝導(Tc=0.05K)が共存することを見出し,超伝導対形成に四極子揺らぎが関与している可能性を指摘した。一方,非磁性のLaIr2Zn20はTc=0.6KのBCS超伝導体である。本年度は以下の実験を行った。(1)昨年度までにPr1-xLaxIr2Zn20 (0<x<1)の試料を作製し,電気抵抗率と交流磁化率を測定した。Tcはx<0.5で殆ど上昇せず,x>0.5で上昇する。一方,電気抵抗測定では,TQでの異常をx=0でしか観測できていなかった。そこで,0.06 Kまでの比熱測定装置を立ち上げ,Pr1-xLaxIr2Zn20 (x>0)におけるTcとTQの関係を調べた。比熱測定から,TQはx<0.09で消失することが明らかになった。Tcはx<0.5で変化しないことから,TQとTcの相関は弱いことが示唆される。これらの内容について,国内外の学会で発表し,原著論文として投稿した。(2)PrIr2Zn20の比熱や弾性定数の測定から,TQでAFQ秩序が起こっていることはわかっていたが,その秩序変数についてはまだ明らかになっていなかった.そこで,四極子秩序構造と秩序変数について調べるために,フランス・レオンブリュアン研究所(LLB)において磁場中の中性子回折実験を行った.禁制反射の指数の磁場誘起反強磁性モーメントを観測し,AFQ秩序であることを微視的手法ではじめた確認した。なお,ビームタイムの申請を自ら代表者として行い,7日間のビームタイムを確保した。4f2配位系の立方晶PrT2Zn20 (T=Ru, Rh, Ir)に着目し、超伝導や非フェルミ液体(NFL)状態におけるPr3+イオンの電気四極子の役割について調べた。この系のPr3+の結晶場基底状態は,四極子と八極子の自由度を有する非磁性二重項である。これまでに,T=Irの系において,反強四極子(AFQ)秩序温度TQ=0.11K以下で超伝導転移(Tc=0.05K)を示すことを見出し,超伝導対形成に四極子揺らぎが関与している可能性を指摘した。一方,非磁性のLaIr2Zn20はTc=0.6 KのBCS超伝導体である。(1)昨年度までに作製したPr1-xLaxIr2Zn20 (0<x<1)を用いて,電気抵抗率、交流磁化率、比熱を測定した。TQはx<0.09で消失することを明らかにした。一方,Tcはx<0.5で殆ど上昇せず,x>0.5で大きく上昇する。La置換に対するTcとTQのx依存性から,両者の相関は弱いことが示唆される。これらの研究成果をまとめてJournal of the Physical Society of Japanに投稿し,2015年5月に出版された。さらに,これまでにRT2Zn20 (R=La, Pr, T=Ru, Rh, Os, Ir)の系で見出した超伝導や四極子秩序、構造相転移に関する成果と今後の展望について,2015年9月の日本物理学会秋季大会で招待講演を行った。(2)T>TQの比較的広い温度範囲で電気抵抗率と比熱はNFL的挙動を示し,AFQ秩序が消失する磁場5テスラ近傍でフェルミ液体(FL)状態が現れる。このNFLからNLへのクロスオーバーの原因は明らかではないが,四極子自由度と伝導電子の混成効果に起因していると考えられる。これらの特異な物性についての知見を得るために,Znアイソトープで作製した試料を用いたNMRが不可欠である。これまでに,NMRに必要な0.5グラム以上の単結晶を作製するための試料育成条件を確立した。Pr1-xLaxIr2Zn20におけるTcとTQのx依存性について明らかにした。電気抵抗測定では,TQでの異常をx=0でしか観測できていなかった。
真核生物染色体のS期に於ける動態の全て―出芽酵母第六染色体をモデルとして

複製チェックポイント制御機構が欠損すると、DNA損傷を修復しないまま、あるいは未複製の染色体を持ったまま、細胞は分裂してしまうため、細胞は死滅あるいは、異常染色体を持ったまま増殖を続けることになる。我々は、チェックポイント制御と複製過程の連携を明らかにするためには一本の染色体のレベルで詳細に複製中の染色体の動態を解析しなくてはならないと考え、出芽酵母第六染色体を解析対象とし、六番染色体全体(280kb)を約13000個の25塩基長の単鎖DNAで余すところなくカバーするカスタムDNAチップを作成した。このDNAチップを用い、いくつかのタンパクの結合領域についてChIP-chip法(Chromatin Immuno-precipitationにより得られたDNAをDNAchip上で検出する方法)により解析を行ったところ1解像度300塩基対でタンパクの結合プロファイルを解析可能であった。同時に我々は複製領域をBrdUでラベルし、抗BrdU抗体で免疫沈降することで検出することにも成功した。この方法により、チェックポイント非活性化時、HU(ヒドロキシウレア)添加による複製異常時(チェックポイント活性化時)のチェック因子及び複製因子の配置を解析した。その結果、MRC1、及びTOF1という二つのチェックポイント因子のみは異常の有無に関係なく、複製伸長複合体の一部として機能していることが明らかになった。さらに、MRC1とTOF1、それぞれの因子の欠失酵母を用い、HU添加時の複製領域と複製伸長因子の相対的配置を解析した。その結果、変異株中では複製伸長因子が複製領域より新鎖合成を行うことなく2-3kb先行して停止することが判明した。このことは、複製の停止はチェックポイント活性化を必要とせず、複製伸長複合体に組込まれたチェック因子により誘導されることを示している。真核生物染色体は多数の複製開始点より構成されるマルチレプリコン構造をとっており、それぞれの複製開始点はS期の異なる時期に秩序正しく複製を開始する。我々は出芽酵母の第六染色体を用い、かかる制御機構について解析してきた結果、複製開始の時間的制御機構が染色体を様々な傷害から守るために機能するDNA傷害、複製チェックポイント制御機構と密接に連携することを明らかにしている。この発見からチェックポイントキナーゼであるRAD53と複製開始点結合蛋白であるORC2が共に複製開始点の開始の順番を決定する時間的な制御因子として明らかにされたが、その分子的作用機序については今後の課題となった。今年度は1)S期初期に複製を開始する開始点、および後期に複製を開始する開始点についてその構造上の違い、特に染色体上でのヌクレオソーム構造の違いを明らかにすること、および2)RAD53キナーゼ自身のリン酸化が複製進行調節に於いて担っている役割を具体的に明らかにすること。の2点に絞って解析を行った。課題1)の成果;野生株中での初期及び後期開始点を含むそれぞれ5kbの領域でのヌクレオソームの配置をマイクロコッカルヌクレアーゼに対する感受性部位を指標に明らかにしたところ、ヌクレオソームの配置からは初期、および後期開始点それぞれの特異性は明らかに出来なかった。一方、我々はorc2-1株では初期、後期開始点が同時に複製を開始してしまい、さらには、マイクロアレイによる解析の結果、通常は制御されている開始点周辺(2-5kbの領域)の転写ユニットの活性が上昇してしまうことが明らかにしている。そこで、orc2-1株についても同様の解析を行った所、ヌクレオソームの配置そのものでは野生株と差異を見出せなかったが、変異株中では初期開始点を含む2kbにわたる領域のヌクレアーゼに対する感受性が変化していることが明らかとなった。このことは、orc2-1株中では所期開始点の染色体高次構造に変化が生じ、結果として、初期開始点特異的な高次構造が失われてしまった可能性を示唆している。現在、ヌクレオサーム構造の折り畳みにより作り出されるさらに上位のクロマチン高次構造の解析法を開発中である。課題2)の成果;RAD53蛋白にHAタグを付加することで蛋白の検出系を構築し、さらにはRAD53自身のリン酸化を検出する系を確立した。今後は大量培養系よりRAD53のリン酸化フォームを精製し、リン酸化部位を決定、その情報を元にリン酸化部位の変異をRAD53に導入し、リン酸化そのものの機能、さらには遺伝学によるRAD53の標的因子の同定を行おうと考えている。1.マイクロアレイを用いた複製開始点抑制にいたるチェックポイントシグナル伝達カスケードの研究昨年度、総括班で購入したマイクロアレイ解析装置を用い、蛋白の染色体上での配置を同定する技術を確立する事が出来た。酵母細胞をホルマリン固定し、蛋白-DNAをクロスリンクした後、蛋白特異的抗体により蛋白-DNA複合体を免疫沈降する。沈降産物をランダムPCRで増幅後、ビオチンで標識し、マイクロアレイにハイブリダイズさせる事で蛋白の結合領域の同定を行った。現在迄の所、複製開始点結合蛋白であるORC1について本方法を実施したところ、既知の開始点全てを優位に(Z値>4)免疫沈降画分に同定できた。逆に免疫沈降画分には開始点領域以外に由来する断片は全く含まれなかった。同様の方法でチェックポイントキナーゼであるRAD53蛋白について解析を行っている。その結果、明らかにRAD53はDNAに間接的、あるいは直接的に結合しており、いくつかの共通の性質を持った断片が免疫沈降分画に濃縮されている事が分かった。現在、このRAD53の結合が持つ異義について解析を進めている。

2.前減数分裂期複製における複製開始点の使用頻度、時期の解析クロマチン構造、および染色体の転写状況が大きく変換すると考えられる減数分裂時の染色体複製について、同調度の高いサンプルの調製法を太田らより習得し、まず、開始点活性について解析を行った。その結果、ARS605(左腕、セントロメアより5kbの距離にある開始点)の活性が有糸分裂時(80%)と比べ大きく低下した(4%以下)。605は減数分裂期に特異的に転写活性が上がるMSH4遺伝子のORF中に存在しており、転写活性により複製開始点活性が阻害されている可能性が考えられる。現在、MSH4遺伝子の活性に影響を与える様々な変異株を用い、何が、605の活性に影響するのかを明らかにしようとしている。真核生物の一本の染色体のS期におけるダイナミクスを解析する目的で出芽酵母の第六染色体を用い解析を行っている。昨年度までにDNAチップを用いた蛋白結合位置の網羅的解析法(ChIP on chip法)を技術的に確立することに成功し、今年度は主として、1)チェックポイント因子RAD53の染色体上での結合位置の解析、及び、2)複製領域のChipを用いた同定法の確立、の二項目を中心に研究を進めた。以下、項目ごとに成果をまとめた。1)ChIP on chip法により、チェックポイント活性化時、非活性化時それぞれに於けるRAD53の染色体上の配置を検索したところ、G1期にはRAD53がS期の超初期に複製を開始する開始点である二つ開始点の上に配置されており、その配置が完全にRAD53の上流で機能するキナーゼであるMEC1キナーゼに依存することが明らかとなった。さらに、S期チェックポイント活性化時にはRAD53は複製フォークの近傍に位置することが示された。このことは、RAD53自身が複製開始-伸長を制御する因子として、MEC1依存的に開始点へロードされ、複製フォークと一緒に染色体上を移動する、或いは、チェックポイント活性化時に複製フォークにリクルートされる可能性を示している。現在、この両者の可能性を見分けるべく実験系を組んでいる。2)出芽酵母では複製新鎖をBrdUによりラベルし、複製プロファイル等の解析に用いることは出来ない。これは、出芽酵母がチミジンキナーゼを持たないためである。我々はヘルペスウィルスのチミジンキナーゼを大量発現する酵母を用い複製新鎖にBrdUを取り込ませ、DNAチップ上で既報の複製開始点、全てを含む計144個の複製開始点を同定出来た。さらに、この方法を用いS期進行に伴う複製領域の網羅的同定と、様々な変異株に於ける複製プロファイルの測定を行っている。以上の二つの結果を盛り込み、現在、論文作成中である。Affymetrix社によるDNAチップ解析装置により真核生物染色体のS期に於けるダイナミクスを解析すべく出芽酵母第六染色体を対象とした高解像度チップ(第六染色体270kbを14000本のオリゴプローブで検出)を作成した。
味蕾における選択的神経回路形成機構の解明

常に味細胞が更新される味蕾において、味の識別が常に正しく行われるためには、味細胞の更新が正確に行われ、かつ味情報を伝達する味神経がその味刺激に対する受容体を発現する味細胞を正確に認識して、シナプスを形成しなければならない。本研究では、味細胞の分化制御機構の解明と、味細胞と味神経との間で行われている選択的なシナプス形成機序の解明を目的として、転写因子Mashlの味細胞分化における機能と、さらに味蕾における細胞膜表面分子の発現を検索した。Mashlノックアウトマウスの味蕾を検索すると3型細胞のマーカーのAADC, GAD67の発現が消失し、Mashlが3型細胞の分化に関与していることが推測された。味蕾細胞の細胞型には、細胞型特有の膜表面分子が発現し、味神経が特定の味細胞を認識するために、味細胞の膜表面分子を認識している可能性が示唆された。本年度は、味細胞と味神経との間で行われている選択的なシナプス形成機序の解明を目的として、味細胞の細胞膜に発現しているカドヘリンスーパーファミリーをはじめとした接着分子の探索を行った。味蕾を含まない舌上皮と味蕾を含む有郭乳頭上皮間で、カドヘリンファミリーの発現の違いを検索してきた。その結果有郭乳頭上皮には舌上皮に発現が認められるP-,E-カドヘリンに加えて、N-,R-,OB-カドヘリンの発現が認められた。これらのカドヘリンの味蕾における発現をin situ Hybridizationで検索すると、それぞれのカドヘリンは味蕾の中で1部の細胞にのみに発現が認められた。特にN-カドヘリンは、味蕾細胞のマーカーとの2重染色から、II型細胞のマーカーと局在が一致していて、味蕾内で甘味・うま味・苦味の受容に関連している細胞での発現が示唆された。また、カドヘリンファミリー以外の膜表面分子ではニューレキシン1の発現がRT-PCRより味蕾での発現が認められた。in situ Hybridizationを用いて味蕾でのニューレキシン1の発現を検索すると、味蕾の1部の細胞での発現が確認され、マーカーとの2重染色でAADCなどのIII型細胞のマーカーとニューレキシン1との局在が一致した。III型細胞は酸味・塩味の受容に関係する細胞で、これらの味物質に応答する味細胞の膜表面分子としてニューレキシン1が発現していることがわかった。その結果有郭乳頭上皮には舌上皮に発現が認められるP-, E-カドヘリンに加えて、N-, R-, OB-カドヘリンの発現が認められた。特にN-カドヘリンは、味蕾細胞のマーカーとの2重染色から、II型細胞のマーカーのgustducinとと局在が一致していて、味蕾内で甘味・うま味・苦味の受容に関連している細胞での発現が示唆された。また、カドヘリンファミリー以外の膜表面分子ではシナプス形成に関与しているニューレキシン1の発現がRT-PCRより味蕾での発現が認められた。

その結果有郭乳頭上皮には舌上皮に発現が認められるP-,E-カドヘリンに加えて、N-,R-,OB-カドヘリンの発現が認められた。これらのカドヘリンの味蕾における発現をin situ Hybridizationで検索すると、それぞれのカドヘリンは味蕾の中で1部の細胞にのみに発現が認められた。特にN-カドヘリンは、味蕾細胞のマーカーとの2重染色から、II型細胞のマーカーのgustducinとと局在が一致していて、味蕾内で甘味・うま味・苦味の受容に関連している細胞での発現が示唆された。さらにSAGE法により有郭乳頭味蕾においてカドヘリン24(CDH24)の発現が認められ、CDH24はIII型細胞のマーカーのマーカーのAADC,GAD67との局在が一致していた。また、カドヘリンファミリー以外の膜表面分子ではシナプス形成に関与しているニューレキシン1の発現がRT-PCRより味蕾での発現が認められた。in situ Hybridizationを用いて味蕾でのニューレキシン1の発現を検索すると、味蕾の1部の細胞での発現が確認され、マーカーとの2重染色でAADCなどのIII型細胞のマーカーとニューレキシン1との局在が一致した。III型細胞は酸味・塩味の受容に関係する細胞で、これらの味物質に応答する味細胞の膜表面分子としてニューレキシン1が発現していることがわかった。現在、初代培養舌上皮細胞にN-カドヘリン、CDH24を強制発現させて、舌咽神経細胞との共培養により、神経細胞と舌上皮との間に神経回路が形成されるどうかを検索中である。
精巣上体管内腔酸性化が精子成熟におよぼす影響

性成熟齢にあるラット雄の精巣上体における液胞型プロントATPaseの局在について、免疫組織学的に観察、検討した。精巣上体上皮を構成する細胞のうち、mitochondria rich cellと呼ばれる細胞に特異的に、しかも高度に発現しているのが観察された。また、その細胞内局在は、管内側膜上およびその直下であることが観察された。これらの結果から、精巣上体管内腔は、mitochondria rich cellの液胞型プロトンATPaseにより酸性化が行われているものと考えられた。また、mitochondria rich cellは、精巣上体尾部に進むに従い、他の上皮細胞に較べてその数的割合を増すことから、頭部、体部、尾部へと進むにつれ、活発に内腔酸性化が行われているものと推察される。精子の運動能は、酸性環境で低下するとの報告がなされており、液胞型プロトンATPaseによる精巣上体内腔の酸性化は、射精までの精子の不動性の保持にあるものと考えられた。液胞型プロトンATPaseの特異的阻害剤であるバフィロマイシンA1の投与による精子成熟に及ぼす影響については、現在至適投与量についての検討を行っている。
日本に蔓延する非病原性とされてきた豚アメーバの病態発現機序の解明と診断技術の開発

Entamoeba(E)histolyticaはヒトに感染した場合、アメーバ性大腸炎や肝膿瘍を形成し、重篤例では死に至る。これら豚に寄生するEntamoeba種の病態を詳細に明らかにすべく以下の解析を実し、4つあるサブタイプの型別方法を構築した。さらに、国内の難治性下痢症を呈する豚において、E. poleckiサブタイプ1と3を検出した。以上より、国内には、3種(サブタイプ)のEntamoebaが存在し、E. poleckiがより広く分布している可能性が示唆された。Entamoeba属の原虫には多くの種が含まれるが、病原性を有するものはE. histolyticaであり、人に感染した場合、アメーバ性大腸炎や肝膿瘍を形成し、重篤例では死に至る。家畜においては数多くのEntamoeba種が報告されているが、いずれも病原性はないと認識されている。しかし、近年、我が国において致死性の消化器症状を呈する豚で、アメーバ様原虫の寄生が確認されている。しかし、人獣共通に寄生するE. histolyticaは否定され、長年の間、その種は明らかにされなかった。申請者らは、これまでに難治性・致死性の下痢症を呈する豚から、E. suisおよびE. poleckiを同定することに成功している。しかし、これらの原虫の検出は、いくつかの都道府県に限られ、国内での分布状況は不明であった。本研究では、これら豚に寄生するEntamoeba種の病態を詳細に明らかにすべく以下の解析を実施した。国内での調査を実施した結果、新たに4つの県で豚寄生Entamoebaを同定した。また、E. poleckiについては4つの遺伝子型が報告されているが、この遺伝子型を決定できるPCRの系の構築に成功した。養豚農家での環境調査では、土壌中から本原虫の遺伝子が検出され、また下痢症状を呈さない豚からも本原虫を検出した。Entamoeba. histolytica(EH)は家畜においても、複数種のEntamoeba(E)種が報告されているが、いずれも病原性はないと報告されている。しかし、近年、我が国で致死性の消化器症状を呈する豚において、その組織病理学的解析によりアメーバ様原虫の寄生が確認されている。しかし、人獣共通に寄生するEHによるPCRでは鑑定できず、その種は明らかにされなかった。申請者らは、これまでに難治性・致死性の下痢症を呈する豚から、E. suisおよびE. polecki(EP)を同定することに成功している。本研究課題では、これら豚に寄生するE種の病態を詳細に明らかにすべく以下の解析を実した。昨年度は、特にEPについて、PCRおよびシークエンス解析により、4つあるサブタイプの型別方法を構築した。本年度は、国内においてさらに調査を実施し、複数の県において、難治性下痢症を呈する豚において、EPサブタイプ1と3を検出した。また、糞便検体、水や土壌検体からのPCRによるEの検出に加え、病理組織解析によりアメーバ様原虫が検出された場合でも、パラフィン切片からDNAを抽出し、遺伝子型を同定する事も可能であることが分かった。これにより、アメーバのシストおよび栄養型においても、解析は可能であることが分かった。いずれの検体も、可能な範囲で細菌学的およびウイルス学的解析を行ったが、他の病原体の関与の可能性は低く、その誘発因子は不明であるが、豚に寄生するEntamoebaは病原性を有することが示された。これまでの結果から、国内には、3種(サブタイプ)のEが存在し、EPがより広く分布している可能性が示唆された。また、EHで用いられる培地を用いて、豚のE感染便から豚Eの培養を試みたが、成功しなかった。今後は培地成分や培養条件等の検討が必要と考えられた。次年度以降は、本原虫の分布を明らかにするため、我々が構築した遺伝子型が鑑別できるPCRの系を用いて、さらに調査を実施する。また、病態を詳細に解析するために、Entamoebaが検出された豚について、細菌学的およびウイルス学的解析を行い、これらの他の病原体による病態発現への関与を精査する。また、感染豚の消化管について、詳細に病理組織学的、電子顕微鏡学的に解析を行う。さらに、豚Entamoebaの原虫単離方法の構築を目指す。獣医内科学
導電性高分子のスッイチングによる動的な導電層分布を利用したイオン分離の基礎

電極上に電解合成した導電性高分子膜は、電気化学的なスイッチングにより、導電体(酸化体)と絶縁体(還元体)との間で相変化を起こす。イオン性溶液中で還元膜を電気化学的に酸化すると、電極に接した部分はイオンの放出または取り込みを伴って電子導電体になり、それ自身が電極として作用する。その結果、導電層が電極表面から溶液/膜界面へ向かって成長すると考えられ、本研究室では、この成長を導電層伝播機構と名付けて理論的に取り扱い、成長速度を測定してきた。導電膜を還元すると、膜全体にわたって均一に絶縁体化することがわかった。それ故、膜の酸化還元を繰り返すと、膜の電極近傍では酸化状態、溶液に近い側では還元状態をとる。すなわち、イオンの膜への取り込み量に動的分布を作ることができる。この分布をマクロ的に拡大するため、電極から引き剥した膜の一端に別の電極を取り付けてスイッチングを行うと、膜の長さ方向に酸化と還元体の分布が形成できた。ポリアニリン膜における電位と導電種の濃度との関係をスペクトロメトリーにより測定したところ、大きなヒステリシスのために、不可逆性が重要な問題になった。酸化方向の膜の変化では、電位の変化速度に依存しなかったため、平衡に近い状態が得られた。電位と導電種の対数濃度との関係はネルンスト式で表される直線からはずれ、ある電位で急激に折れ曲がることが分かった。この電位はパーコレーション閾値電位と考えられ、電極と電子的につながった酸化体と電子的につながらない酸化体との線形結合によってネルンストプロットを説明した。また、誘導電流を利用した抵抗測定に成功した。現在、そのpH依存性について実験が進行中である。ポリアニリン膜の導電層の成長に関する基礎的性質の解明に、研究の主眼点を置いた。従来、導電層の成長を視覚的に見る膜として、インジウム・酸化チタン電極を用いていたが、硫酸中では電極そのものが不安定であるため、1時間以内の測定しか出来なかった。今年度では、電極処理法を開発したところ、長時間にわたる安定したデータが得られた。その結果、導電層の成長が始まる閾値電位の決定に曖昧さがなくなった。そこで、測定器の精度を上げる努力をすると同時に、外部からのノイズ、特に電力線からのノイズを抑える工夫をしたところ、電気化学セルの回りに交流電場に応答するシグナルが出ていることが分かった。そのノイズレベルは膜の厚さ・外部交流電場・外部交流磁場の振幅に一次であった。直流電位の依存性を検討したところ、膜が電子導電体であるときのみ、このような現象が起きた。すなわち、電子導電体部は外部電場と磁場に応答し、導電性の評価に使えそうである。一方、膜に導電分布を持たせるための閾値電位を決定するために対電極法を開発し、ポリアニリンは熱力学的には0.186V/vsSCEの閾値電位を持つことが分かった。現在、論文を草稿中である。計画とは幾分異なって研究が進行した。以下に述べる二点が新たに見つかった。ポリアニリン膜における電位と導電種の濃度との関係をスペクトロメトリーにより測定したところ、大きなヒステリシスの変化速度に依存しなかったために、不可逆性が重要な問題になった。

もう一点は、酸化電位が不十分であるとき、導電層の成長には時間的遅れの伴うことである。また、低電位では拡散的に導電層が成長し、高電位では伝播機構によって成長することが分かった。ポリアニリン膜の導電層の成長に関する動的性質の解明だけではなく、平衡の性質にも注意を払いながら測定を行なった。その結果、単純なネルンスト式では表せない結果が得られた。これまで成長速度の変化のみから見積もってきたパーコレーションの性質を、静的測定であるネルンストプロットの急激な変化に結びつけることができたのは、横道に逸れた故の宝である。従来、導電性高分子膜のネルンストプロットから得られた電子数が1より小さいのは、数個の活性点のうちの一個が電極反応に関与すると解釈されていた。これは、多核錯体の相互作用の理論的予測と矛盾する。パーコレーションの考え方はこの矛盾を解決している。電極上に電解合成した導電性高分子膜は、電気化学的なスイッチングにより、導電体(酸化体)と絶縁体(還元体)との間で相変化を起こす。イオン性溶液中で還元膜を電気化学的に酸化すると、電極に接した部分はイオンの放出または取り込みを伴って電子導電体になり、それ自身が電極として作用する。その結果、導電層が電極表面から溶液/膜界面へ向かって成長すると考えられ、本研究室では、この成長を導電層伝播機構と名付けて理論的に取り扱い、成長速度を測定してきた。導電膜を還元すると、膜全体にわたって均一に絶縁体化することがわかった。それ故、膜の酸化還元を繰り返すと、膜の電極近傍では酸化状態、溶液に近い側では還元状態をとる。すなわち、イオンの膜への取り込み量に動的分布を作ることができる。この分布をマクロ的に拡大するため、電極から引き剥した膜の一端に別の電極を取り付けてスイッチングを行うと、膜の長さ方向に酸化と還元体の分布が形成できた。ポリアニリン膜における電位と導電種の濃度との関係をスペクトロメトリーにより測定したところ、大きなヒステリシスのために、不可逆性が重要な問題になった。酸化方向の膜の変化では、電位の変化速度に依存しなかったため、平衡に近い状態が得られた。電位と導電種の対数濃度との関係はネルンスト式で表される直線からはずれ、ある電位で急激に折れ曲がることが分かった。この電位はパーコレーション閾値電位と考えられ、電極と電子的につながった酸化体と電子的につながらない酸化体との線形結合によってネルンストプロットを説明した。また、誘導電流を利用した抵抗測定に成功した。現在、そのpH依存性について実験が進行中である。
ニューラルネットワークを用いた切削異状検知システムの開発

本研究は旋盤加工での切削工具の振動から得られる振動スペクトルをパターンとしてニューラルネットで学習および認識することにより切削中の異状を検知するシステムの開発を目的とした。平成5年度は検知システムの設計と構築をし,振動スペクトルから得られる特徴量(スペクトルのピーク値とその振動数)で再生びびり振動の発生を検知する方法の提案,および振動スペクトルをパターンとしてニューラルネットで学習し,びびり振動を検知する方法の提案を行った。実験は二次元切削で,切削幅は1.04.0mm,切削速度は10140m/minの範囲で行い,各切削速度ごとに,びびり振動が発生する切削条件からまったく発生しない切削条件まで段階的に切削幅を変えて被削材の振動(変位),動的切削力,工具の振動(加速度)を同時に測定した。振動スペクトルの特徴量で検知する方法では,信号のノイズ成分が少ない被削材の振動で検知をした場合,実験を行った範囲内では認識率(成功率)は100%であったが,信号のノイズ成分が多い動的背分力では認識率は71%と大きく低下した。一方,振動スペクトルからニューラルネットで検知する方法では,被削材の振動で検知した場合は88%と特徴量で検知する方法よりも認識率は低下したが,動的背分力で検知した場合は83%と逆に向上し,信号のノイズ成分の多少にかかわらず約80%以上の安定した認識率で検知ができた。平成6年度は振動スペクトルからニューラルネットで工具逃げ面の摩耗量を同定するシステムを提案した。実験は人工的に工具の逃げ面を削り,異なる摩耗幅を付けた4つの突切りバイトで行った。その結果,振動スペクトルを学習した切削条件(工具の摩耗量を含む)と同じ切削条件では,摩耗幅の検知率(同定の成功率)は約80%で従来の方法と同程度であった。しかし,未学習の切削条件では約30%と極端に低下するため,検知方法をさらに検討する必要があると結論される。本年度はびびり振動の検知システムの設計と構築をし,スペクトル解析のみ,およびスペクトル解析とニューラルネットワークの併用によるびびり振動の検知をオフラインで行った。実験では,激しいびびり振動が発生する切削条件からまったく発生しない条件まで段階的に変化させて二次元切削を行い、被削材の振動変位,動的背分力,および工具の振動加速度を同時に計測した。実験で得られた被削材の振動変位のデータを従来の研究で提案された検知の方法で判定したところ,びびり振動が発生していないにも関わらず,発生したと判定してしまう誤判定が多発した。本研究では現場で行われる切削作業を想定し,被削材に外部から衝撃力を加えないで実験したため,衝撃力を加えることを前提とした従来の判定方法は適当でなく,このような誤判定を生じた。そこで,振動スペクトルのピーク値だけでなく,ピークになる振動数にも着目した検知方法を提案し,実験を行った範囲で,目視による判定結果と98%一致するアルゴリズムを得た。しかし,この方法でも動的背分力での成功率は72%,工具の振動加速度では81%であった。スペクトル解析とニューラルネットを併用する検知では,切削速度40m/minでのびびり振動が発生していない場合と発生している場合について,それぞれ連続した6回転分を一組とするスペクトルを教師信号として学習させ,他の切削速度でのびびり振動の発生を判定した。

その結果,被削材の振動変位での成功率は93%,動的背分力では78%,工具の振動加速度では78%であった。成功率は予想よりも低かったが,本研究で提案した方法により,基本的にはびびり振動の検知が可能なことが確認できた。また,検知に失敗したスペクトルは,教師信号として用いたスペクトルに比べ,スペクトルの全体的なレベル,あるいはスペクトルがピークになる振動数が異なっており,スペクトルを正規化することにより,より正確な検知が可能になると期待される。本年度はスペクトル解析とニューラルネットワークの併用により,びびり振動の検知と工具の逃げ面の摩耗幅の同定を同時に行うニューラルネットワークを構築し,その有効性を実験により検証した.認知を行うニューラルネットワークには,びびり振動のみを検知する場合と同じ3層の階層型を用い,学習はバックプロパゲーションで行った.ただし出力層のユニットの数は2つとし,びびり振動と工具の逃げ面の摩耗幅にそれぞれ対応させた.実験には旋盤を用い,黄銅製の円盤の外周を突切りバイトで二次元切削した.切削速度は100m/minで一定とし,検知には切削工具の振動加速度を用いた.また,切削工具には人工的に工具の逃げ面を削り,異なる摩耗幅を付けた4つの突切りバイトを用いた.ニューラルネットワークの学習には,この内の3つの工具を使い,激しいびびり振動が発生する切削条件から,まったく発生しない条件まで切削幅を段階的に変化させて得られた振動スペクトルを用いた.ニューラルネットワークによる認知は,4つの工具による切削実験で得られた工具の振動データについて行った.その結果,学習を行った工具と切削条件では,びびり振動の検知と工具の摩耗幅の同定の成功率はそれぞれ8090%で,振動スペクトルをパターンとしてニューラルネットワークに学習させることにより,工具の摩耗幅の同定は可能なことが確認できた.しかし,学習を行っていない切削条件と工具では成功率は半分以下になり,ニューラルネットワークによる振動スペクトルのパターンの汎化能力は,当初の期待ほどにはないことがわかった.
損傷における体内時計とオートファジーのクロストーク解析-新規損傷診断指標の開発-

皮膚損傷組織では受傷後極めて早期にautophagyが抑制されることを見出し、法医実務に有用な創傷の生活反応となり得ることを報告した。逆に、皮膚損傷組織で時計遺伝子のRev-erb-alphaとROR-gammaがタンパクレベルで著しく増加することを見出した。3-Methyladenineによるautophagyの抑制によりROR-gammaは増加したことから、創傷組織でのautophagyの抑制がROR-gammaの増加を引き起こすと考えられた。創傷組織でのこれらの変化はKeap1/Nrf2システムに作用して抗酸化遺伝子の発現を誘導し創傷治癒の促進に寄与していることを明らかにした。創傷治癒過程における体内時計とオートファジーのクロストークを解析し,新規損傷診断指標を見出すことを目的として本研究を開始した.まず,27年度はマウス皮膚切除損傷モデルを作製し,体内時計およびオートファジーに関連した遺伝子及びタンパクの発現を解析した.これまでの研究で,受傷1日後の損傷組織では時計遺伝子の発現レベルが低下することを既に見出していたが,今回の研究において,受傷2時間までの短時間では寧ろ発現レベルが若干上昇することを見出した.また,時計遺伝子のRev-Erb-alphaおよびROR-gammaのタンパクレベルが受傷後損傷部位で著しく上昇することを明らかにした.一方,オートファジーについてはオートファジーに関連した分子の遺伝子発現は損傷により大きく変化しないことが示された.しかし,タンパクレベルにおいてオートファジーは受傷後著しく低下すること明らかにし,この現象が損傷の新規生活反応として有用であることを報告した.体内時計とオートファジーのクロストークについては損傷部位で時計遺伝子の遺伝子発現が低下するにも関わらず,Rev-Erb-alphaおよびROR-gammaのタンパクレベルが著しく上昇する原因がオートファジーの抑制にあると考えて,オートファジーのインヒビターである3MAを用いた実験を行い,オートファジーの抑制がRev-Erb-alphaおよびROR-gammaのタンパクレベルを上昇させることを確認した.受傷部位におけるRev-Erb-alphaおよびROR-gammaのタンパクレベル上昇も優れた新規生活反応となり得ると考えている.本研究の基となる最も重要な仮説「体内時計とオートファジーのクロストーク」を実験的に証明することに成功している.このことから,創傷治癒の初期におけるオートファジー抑制の意義解明に迫る研究が展開できる可能性が大きく広がった.創傷治癒過程における体内時計とオートファジーのクロストークを解析し,新規損傷診断指標を見出すことを目的として本研究を開始した.27年度の研究において、時計遺伝子のRev-Erb-alphaおよびROR-gammaのタンパクレベルが受傷後損傷部位で著しく上昇することを明らかにした.一方,オートファジーについてはオートファジーに関連した分子の遺伝子発現は損傷により大きく変化しないことが示された.しかし,タンパクレベルにおいてオートファジーは受傷後著しく低下すること明らかにし,この現象が損傷の新規生活反応として有用であることを報告した.28年度は、創傷部位におけるオートファジー抑制の分子機構について更に詳細に解析し、受傷後極めて早期に創傷部位でAktのリン酸化上昇が起きている事を明らかにした。Aktの活性化は下流のmTorの活性化を誘起し、これによりオートファジーが抑制されるものと考えられる。更に、オートファジーの抑制により蓄積したp62がNrf2/Keepの系に作用して、KeepからNrf2の遊離を促進してHO-1を始めとする抗酸化遺伝子の発現を上昇させることを明らかにした。創傷部位におけるこれら一連の反応は創傷治癒の極初期の生体の応答として、治癒を促進する様に機能していると思われる。時計遺伝子の一つであるRev-Erb-alphaがオートファジーの制御に関わることが示されており、創傷部位においてタンパクレベルでRev-Erb-alphaの発現が亢進することから、時計遺伝子とオートファジーの系は相互に作用して創傷治癒過程において機能することが示されたと考えている。28年度は創傷治癒の初期におけるオートファジーの抑制が及ぼす治癒への効果を,創傷治癒に関わる分子の発現との関連に着目して解析を進める.特にオートファジーの抑制により蓄積するp62とKeap1およびNrf2の関係を明らかにして,オートファジー抑制による創傷治癒促進効果の分子機構を解明する.また,損傷部位でタンパク発現が著しく増加するRev-Erb-alphaの創傷治癒における役割を明らかにする.法医学
滲出性中耳炎の炎症,感染防御機構の分子生物学的解析

この研究課題では,ラットを用いた実験的中耳炎モデルにて,中耳局所の接着分子の発現を経時的に観察した.炎症の初期に中耳粘膜上皮,粘膜内,貯留液中にも接着分子の発現が認められ,貯留液中には,好中球上のLFA-1発現を促進する作用が認められた.特にICAM-1は,炎症早期に出現し,好中球の浸潤に関与していることが中耳においても確認された.さらにVCAM-1の発現も経時的な観察から,皮膚における炎症過程と同様の経時的変化が観察された.ここでは,中耳腔における炎症の過程には接着分子が大きく関与していることが確認された.一方、中耳内における炎症の免疫学的過程を検討するため,グラム陽性および陰性桿菌の菌体成分を中耳内投与し,ケモカイン,サイトカインの中耳粘膜における産生およびmRNA発現を検討した.炎症早期に中耳粘膜よりケモカインの産生およびRNA発現が観察され,サイトカインの特性を中耳炎モデルにおいても確認された.この結果より,急性中耳炎に認められる好中球の浸潤にサイトカインが重要であることが,実験的に認められた.後者の実験結果より,グラム陽性および陰性桿菌の菌体成分は中耳局所の起炎物質として働き,炎症性メディエーターの誘導を起こすことを確認し,人における中耳炎の炎症過程,特に発症早期の中耳腔の免疫学的変化を明らかにすることができた.この研究課題では,ラットを用いた実験的中耳炎モデルにて,中耳局所の接着分子の発現を経時的に観察した.炎症の初期に中耳粘膜上皮,粘膜内,貯留液中にも接着分子の発現が認められ,貯留液中には,好中球上のLFA-1発現を促進する作用が認められた.特にICAM-1は,炎症早期に出現し,好中球の浸潤に関与していることが中耳においても確認された.さらにVCAM-1の発現も経時的な観察から,皮膚における炎症過程と同様の経時的変化が観察された.ここでは,中耳腔における炎症の過程には接着分子が大きく関与していることが確認された.一方、中耳内における炎症の免疫学的過程を検討するため,グラム陽性および陰性桿菌の菌体成分を中耳内投与し,ケモカイン,サイトカインの中耳粘膜における産生およびmRNA発現を検討した.炎症早期に中耳粘膜よりケモカインの産生およびRNA発現が観察され,サイトカインの特性を中耳炎モデルにおいても確認された.この結果より,急性中耳炎に認められる好中球の浸潤にサイトカインが重要であることが,実験的に認められた.後者の実験結果より,グラム陽性および陰性桿菌の菌体成分は中耳局所の起炎物質として働き,炎症性メディエーターの誘導を起こすことを確認し,人における中耳炎の炎症過程,特に発症早期の中耳腔の免疫学的変化を明らかにすることができた.ラットを用いた実験的中耳炎モデルにて,接着分子の発現を経時的に観察した.KLH全身感作後中耳腔内へ再投与することによって実験的中耳炎を作成した.炎症の初期に中耳粘膜上皮にICAM-1が発現し,粘膜の肥厚とともにLFA-1陽性細胞の浸潤が認められた.中耳貯留液も炎症数日後より認められ,貯留液中にもLFA-1陽性細胞の浸潤が認められた.貯留液中には,好中球上のLFA-1発現を促進する作用が認められ,リンパ球に対してはこの作用は認められなかった.ヒトにおいては,この貯留液の好中球に対する走化性促進作用は,LFA-1抗体およびMaC-1抗体により,阻害されることが認められた.このように,中耳腔における炎症の過程には接着分子が大きく関与していることが確認された.さらに,中耳貯留液に存在する因子が,炎症の遷延化に関与している可能性を示唆した.一方,中耳内における炎症の免疫学的過程をLPSを中耳内において潅流し,好中球走化因子であるIL-8ファミリー(GRO/CINC-1)の中耳粘膜における産生を検討した.LPS刺激により,時間および量依存性にGROの産生が認められ,2時間以内に産生の亢進が認められ,粘膜内のmRNA発現も認められた.急性中耳炎に認められる好中球の浸潤にこのサイトカインが重要であることが,実験的に認められた.現在,これらのサイトカイン,接着分子の制御のメカニズムについて検討中である.ヒト滲出性中耳炎浸潤細胞のサイトカインmRNA発現を検討した結果,高率に浸潤細胞はmRNAを発現していることが認められた.また,IL-8濃度は小児滲出性中耳炎貯留液に高濃度に存在し,成人症例に比し有意に高値を示した.小児では,病態形成にケモカインの関与があることが推察された.ラットを用いた実験的中耳炎モデルにて,さらにケモカインおよびサイトカインの病態への関与につき検討を行った.中耳内における炎症の免疫学的過程をLPSを中耳内において潅流し,好中球走化因子であるIL-8ファミリー(GRO/CINC-1)およびTNF-αの中耳粘膜における産生を検討した.LPS刺激により,時間および量依存性にGRO/CINC-1およびTNF-αの産生が認められた.2時間以内に産生の亢進が認められ,中耳粘膜内のmRNA発現も認められた.

小児粘液性貯留液を認める症例と類似の病態を検討するため,体温にて半固形ゲル状となる物質を中耳内へ投与し,この処置後のサイトカイン産生の変化を観察した.粘稠性物質の中耳貯留により,TNF-α産生に対する一次刺激効果が認められた.GRO/CINC-1およびTNF-αの産生はLPSの二次刺激により亢進することが認められた.これらの産生亢進はインドメタシンおよびコルチコステロイド局所投与により,サイトカイン産生の変化が,ラット実験的モデルから確認された.この研究課題では,ラットを用いた実験的中耳炎モデルにて,中耳局所の接着分子の発現を経時的に観察した.炎症の初期に中耳粘膜上皮,粘膜内,貯留液中にも接着分子の発現が認められ,貯留液中には,好中球上のLFA-1発現を促進する作用が認められた.特にICAM-1は,炎症早期に出現し,好中球の浸潤に関与していることが中耳においても確認された.さらにVCAM-1の発現も経時的な観察から,皮膚における炎症過程と同様の経時的変化が観察された.ここでは,中耳腔における炎症の過程には接着分子が大きく関与していることが確認された.一方,中耳内における炎症の免疫学的過程を検討するため,グラム陽性および陰性桿菌の菌体成分を中耳内投与し,ケモカイン,サイトカインの中耳粘膜における産生およびmRNA発現を検討した.炎症早期に中耳粘膜よりケモカインの産生およびRNA発現が観察され,サイトカインの特性を中耳炎モデルにおいても確認された.この結果より,急性中耳炎に認められる好中球の浸潤にサイトカインが重要であることが,実験的に認められた.後者の実験結果より,グラム陽性および陰性桿菌の菌体成分は中耳局所の起炎物質として働き,炎症性メディエーターの誘導を起こすことを確認し,人における中耳炎の炎症過程,特に発症早期の中耳腔の免疫学的変化を明らかにすることができた.