hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
勤労者の生活習慣、血中ビタミン値と上下肢血圧比、容積脈波の関連についての疫学研究

PVWと有意な関連を示したのは、収縮期血圧値(偏回帰係数8.1,95% C.I. 5.3-10.9)、喫煙(101.9,95% C.I. 1.8-201)、CRP(4.4,95% C.I. 0.4-8.5)であった。CRPの代わりに葉酸またはビタミンB12を独立変数として解析を行ったが、これらはPWVと関連を認めなかった。喫煙は血中葉酸濃度と強い負の関連を示したが、ビタミンB12と関連する生活習慣は明らかではなかった。次年度は残りの50歳代男性のPWVを測定すると同時に、葉酸、ビタミンB12によって規定される動脈硬化促進要因である血中ホモシステイン濃度の測定を計画している。前年度の検討により、他の危険因子を調整しても、血清高感度C反応性蛋白(hs-CRP)と動脈硬化の指標である容積脈波(PWV)の間に有意な正の関連を認めた。今年度は同じ事業所の男性528人を対象として、ホモシステイン濃度の低下を介して抗酸化作用を有する血清葉酸、ビタミンB12濃度を測定しhs-CRPとの関連を見ると同時に、葉酸、ビタミンB12濃度を規定する生活習慣要因についても検討した(対象者の平均年齢46.4歳)。血中葉酸平均値は15.4nmol/L、ビタミンB12は295pmol/L、CRPは0.46mg/Lであった(葉酸以外はgeometric mean)。このうち3名は採血時に急性感染症を有しており分析から除外した。大豆製品、淡色野菜、緑黄色野菜、海藻、果物の摂取は葉酸と有意な関連を示し、これらの総合的な食品摂取頻度を05点でスコア化した指数と血中葉酸濃度の関連を見ると、それぞれ13.6、14.7、15.2、15.5、17.9、21.7nmo1/Lであり段階的に上昇していた。また種実類と牛乳の摂取はビタミンB12と有意な正の関連を示した。いずれのビタミンとも、喫煙は負の、ビタミンサプリメントの摂取は正の関連を示した。線形重回帰分析で血中葉酸の有意な規定要因と考えられたのは、ビタミンサプリメント(偏回帰係数2.4)・タバコ1箱(-1.5)、食品スコア(0.88)、飲酒1合(0.55)であった。hs-CRPの有意な規定要因は、年齢以外に、BMI(偏回帰係数0.29)、タバコ1箱(0.23)、葉酸濃度(1SD;-0.11)であり、B12は特に関連を認めなかった。以上の結果から、働き盛り男性の動脈硬化のリスクファクターとして、喫煙や肥満に加えて低葉酸血症の重要性が明らかとなり、その原因となる野菜や果物等の摂取不足に注意する必要があると考えられた。
動物細胞を用いた新規完全ヒト抗体ディスプレイ法の開発

前年度において、動物細胞ディスプレイ法の基盤を構築した。本年度においては構築した新しい手法を用いる事でヒトモノクローナル抗体を取得が可能であるかということを試験した。そこでヒトモノクローナル抗体の親和性成熟試験を行った。所属機関において作製された抗ヒト高親和性IgE受容体(FcεRIα)のモノクローナル抗体の遺伝子を用い、H鎖CDR3にPCR法でランダムに変異を導入した。その後構築された動物細胞ディスプレイ用ベクターにライゲーションを行った。このベクターをCHO FlpIn細胞にFlpInシステムを用いてトランスフェクションをする事で、10の6乗の独立したクローンからなる動物細胞ディスプレイライブラリーを作製した。このライブラリーにFITC標識をしたFcεRIαを反応させ、結合性の高いクローンに関してセルソーティングによって分離を行った。ソートした細胞は、その発現する抗体の抗原への結合親和性をELISAによって測定した結果、変異を導入する前の親抗体よりも抗原に対する反応性が高くなったクローンが多数取得された。取得された細胞にCre/loxP組換えを起こさせる事で抗体を膜型から分泌型へ変換し、モノクローナル抗体を取得した。取得された抗体は特異性をEHSAにて試験を行った。その結果FcεRIαに対しては反応性を示したものの、他の抗原(IgE,BSA)に関しては反応を示さなかった。これらの結果から新たに開発された動物細胞ディスプレイ法を用いてヒトモノクローナル抗体を単離することが可能である事が示された。動物細胞ディスプレイ法を構築する上でまずプラスミドベクターの作製を行った。pcDNA5FRTをバックボーンとして、抗体重鎖および軽鎖2つの遺伝子を組み込んだ。この二つの構造遺伝子の間には内部リボソーム進入部のエレメントを介在させ、これらの遺伝子を一つのプラスミドからバイシストロニックに発現させ得るように設計を行った。抗体重鎖遺伝子の下流にはトランスメンブレンドメイン(TM)の遺伝子を配置することによって動物細胞膜表面へのIgGの提示を可能とした。TMは2カ所のloxP配列で挟み、提示したIgGを分泌型に切り換えられるよう設計を行った。loxP配列に関しては、抗体重鎖定常領域に余剰なアミノ酸配列を付加しないようイントロン内部に隠し、通常はスプライスアウトされるよう設計を行った。作製したプラスミドはFlp-Inシステムを用いたトランスフェクションで動物細胞に導入を行った後、動物細胞膜表面へのIgGの提示および提示されたIgGの抗原認識能はフローサイトメトリーによって確認された。提示された抗体はCreリコンビナーゼのトランスフェクションにより膜型から分泌型へ切り換えられ、その遺伝子の組換えはPCRによって、組換えによって分泌されたIgGはELISA法によってそれぞれ確認された。抗体重鎖定常領域下流のloxP配列はスプライシングで除去されている事がPCRにより確認された。これらよりIgGが適切な形で動物細胞表面に提示されている事、提示した抗体を分泌型に非常に簡単な方法で切り換える事が可能である事から、抗原特異的抗体のスクリーニングから産生まで一貫して動物細胞で行える事がこの研究によって示された。
筋収縮 初期の分子変化から張力上昇までの遅れの生理学的意義

筋収縮の初期におけるミオシンとアクチンの反応機構を検討するために,ニワトリ遅筋(anterior latissimus dorsi,ALD)と速筋(posterior latissimus dorsi,PLD)におけるクロスブリッジ形成の時間経過を,X線赤道反射の強度変化から計算される太いフィラメント周辺から細いフィラメント周辺への質量の移動を指標として測定し,張力と比較した。遅筋,速筋いずれにおいても,筋収縮初期においてはクロスブリッジの形成量は張力に先行して増加した。その時間経過の違いはクロスブリッジ形成と張力発生が遅いほど顕著であり,20°CにおけるALDに収縮においては,質量移動は張力に140ミリ秒も先行した。X線回折法によるフィラメント格子間隔の測定から,この遅れが収縮初期の筋の内部短縮に起因するものではないことも明らかとなった。以上の実験結果は,収縮初期のクロスブリッジとアクチンの結合状態に「弱い結合」と「強い結合」の二種類があり,「弱い結合」においては張力発生が少ないと仮定すると,定量的に説明することが可能である。モデル計算の結果は,遅筋と速筋の張力発生の速度の違いは,主としてクロスブリッジの「弱い結合」から「強い結合」への移行の速度の違いであることを示唆する。温度を変化した場合には,「弱い結合」の形成速度も「弱い結合」から「強い結合」への移行の速度も,共に影響を受けて変化する。収縮初期に急速凍結したALDとPLDの電子顕微鏡を用いた観察では,クロスブリッジ等の微細構造が認められ,凍結方法の更なる改良によって「弱い結合」と「強い結合」を電子顕微鏡を用いて識別できると考えられる。ニワトリの速筋(PLD)と遅筋(ALD)を31°Cの生理的食塩水に浸し、X線ビームを当てて、筋の長軸と直角な方向に生じる二つの回折ピーク(10反射と11反射)を記録した。従来の研究から、ミオシン分子頭部がアクチンと結合すると、10反射の強度が減り、11反射の強度が増えて、二つの反射の強度比(I_<11>/I_<10>)が増加することが知られている。この知見に基づき、筋収縮時の強度比の増加を、ミオシンとアクチンの結合反応の指標にした。速筋を電気刺激して等尺的強縮を起こしたところ、強度比は刺激開始後80ミリ秒で最大に達した。張力の増加はこれよりも遅れて進み、120ミリ秒で最大に達した。張力増加の遅れの程度を定量化するために、強度比増加のハーフ・タイム(t_<1/2>)から張力増加のt_<1/2>までの時間を測ったところ、17ミリ秒であった。遅筋を同じ生理的条件で電気刺激し、強縮を起こした。強度比は刺激開始後200ミリ秒で最大に達した。いっぽう張力の上昇は著しく遅く、1700ミリ秒でようやく最大になった。強度化増加のt_<1/2>から張力増加のt_<1/2>までの時間は160ミル秒で、速筋の約9倍であった。従来の生化学的研究から、いっぱんにミオシンとアクチンが反応するとき、先ず結合反応が起き、次にこの結合体が張力発生反応を起こすと考えられている。結合反応も張力発生反応も、ミオシンとアクチンの反応サイクルの一部分を構成している。いっぽう、強縮時の維持熱発生率に基づいて、遅筋における反応サイクルが速筋の反応サイクルより715倍も遅く回ることが知られている。今回の研究結果は、この遅れの主な原因が、ミオシンとアクチンの結合反応ではなく、いったん形成された結合体の張力発生反応の遅れにあることを示している。ニワトリ速筋(PLD)と遅筋(ALD)を用いて、張力発生の初期においてミオシンクロスブリッジとアクチンの間の弱い結合と強い結合の形成過程の比較を行った。

弱い結合の形成の指標としては、X線赤道反射の主な二つの反射の強度比(I_<10>/I_<11>)から計算されるクロスブリッジの細いフィラメント近傍への移動率を用い、強い結合の指標としては発生張力を用いた。実験は筑波高エネルギ-研究所の放射光実験施設で行なった。標本は50Hzの矩形波で1秒間刺激して収縮させた。今年度は実験温度を20°Cに下げて、クロスブリッジとマクチンの反能を遅くしたところ、二種類の結合の形成の時間経過の違いがはっきりと観測された。すなわちALDでは張力は250ミリ秒かかって最大の半分に達したが、クロスブリッジ移動率は100ミリ秒で既に最大変化の半分に達した。PLDにおいても張力は70ミリ秒、クロスブリッジ移動率は40ミリ秒で最大変化の半分に達した。これらの、張力発生とクロスブリッジ移動率の増加の時間経過の違いは、クロスブリッジとPクチンとの弱い結合が強い結合へと変化する過程の時間経過を反映していると考えられる。温度が低い場合には、弱い結合の形成も遅くなり、その強い結合への変化の過程も遅くなっている。このほか、収縮中に急速凍結したALDとPLDの電子顕微鏡による観察も試みた。この実験のために特に急速凍結装置を改良し、電気刺激と張力測定を行いながら標本を銅ブロックに接触させて凍結することが可能となった。予備実験の結果では試料の凍結状態は良好であり、クロスブリッジの観察に適するものと判断される。筋収縮の初期におけるミオシンとアクチンの反応機構を検討するために,ニワトリ遅筋(anterior latissimus dorsi,ALD)と速筋(posterior latissimus dorsi,PLD)におけるクロスブリッジ形成の時間経過を,X線赤道反射の強度変化から計算される太いフィラメント周辺から細いフィラメント周辺への質量の移動を指標として測定し,張力と比較した。遅筋,速筋いずれにおいても,筋収縮初期においてはクロスブリッジの形成は張力に先行して増加した。その時間経過の違いはクロスブリッジ形成と張力発生が遅いほど顕著であり,20°CにおけるALDの収縮においては,質量移動は張力に140ミリ秒も先行した。X線回折法によるフィラメント格子間隔の測定から,この遅れが収縮初期の筋の内部短縮に起因するものではないことも明らかとなった。以上の実験結果は,収縮初期のクロスブリッジとアクチンの結合状態に「弱い結合」と「強い結合」の二種類があり,「弱い結合」においては張力発生が少ないと仮定すると,定量的に説明することが可能である。モデル計算の結果は,遅筋と速筋の張力発生の速度の違いは,主としてクロスブリッジの「弱い結合」から「強い結合」への移行の速度の違いであることを示唆する。温度を変化した場合には,「弱い結合」の形成速度も「弱い結合」から「強い結合」への移行の速度も,共に影響を受けて変化する。収縮初期に急速凍結したALDとPLDの電子顕微鏡を用いた観察では,クロスブリッジ等の微細構造が認められ,凍結方法の更なる改良によって「弱い結合」と「強い結合」を電子顕微鏡を用いて識別できると考えられる。
サイトカインmRNA発現レベルに呼応するラットIgE産生調節機構の解析

Brown norway(BN)およびFischer-344(F344)近交系ラットにNippostrongylus brasiliensis(Nb)感染幼虫を感染させ,継時的(06週)に腸管膜リンパ節を摘出した後,全RNAを抽出しオリゴdTプライマーと逆転写酵素によってcDNAを合成した.次いで塩基配列をもとに設計したIL-4,IFN-γのオリゴプライマーを用い,cDNAを鋳型としてPCRを行なった.同時に内部対照としてラットβ-アクチンの増幅も行なった.PCRの過程で[α-^<32>P]dCTPを取り込ませることにより各増幅産物をラベルし,電気泳動,オートラジオグラフィーの後,^<32>P量を測定した.結果はβ-アクチンの増幅量で標準化することにより,日ごとの比較を行った.感染前ではBNの方がF-344よりもIL-4mRNAのレベルは高かった.感染後どちらにおいてもIL-4mRNAは速やかに増加し,14日目にピークに達した後徐々に減少していったが,6週を過ぎても感染前のレベルより高い価にとどまっていた.一方,IFN-γmRNAはどちらのラットにおいても,IL-4の変動よりはるかに小さく,BNでは僅かながらも抑制傾向がみられたが,F-344ではむしろ感染前のレベルを中心に小さな振れを示すにとどまっていた.ELISAで総IgE抗体の変動をみると,感染前BNでは30ng/ml前後でありF-344では検出できなかったのが,感染後両者とも速やかに上昇し,14日目にピークに達した後徐々に減少していった.腸管寄生線虫による感染で,ラットではTh2系のサイトカインであるIL-4のmRNAが強く誘導され,それに応じてIgE抗体産性が上昇するが,IFN-γのmRNA発現の変動は小さいということと,IgE高応答性のBNでも低応答性のF-344でも感染によってIL-4mRNAとIgE抗体産性は同じように誘導されるということが判明した.Brown norway(BN)およびFischer-344(F344)近交系ラットにNippostrongylus brasiliensis(Nb)感染幼虫を感染させ,継時的(06週)に腸管膜リンパ節を摘出した後,全RNAを抽出しオリゴdTプライマーと逆転写酵素によってcDNAを合成した.次いで塩基配列をもとに設計したIL-4,IFN-γのオリゴプライマーを用い,cDNAを鋳型としてPCRを行なった.同時に内部対照としてラットβ-アクチンの増幅も行なった.PCRの過程で[α-^<32>P]dCTPを取り込ませることにより各増幅産物をラベルし,電気泳動,オートラジオグラフィーの後,^<32>P量を測定した.結果はβ-アクチンの増幅量で標準化することにより,日ごとの比較を行った.感染前ではBNの方がF-344よりもIL-4mRNAのレベルは高かった.感染後どちらにおいてもIL-4mRNAは速やかに増加し,14日目にピークに達した後徐々に減少していったが,6週を過ぎても感染前のレベルより高い価にとどまっていた.一方,IFN-γmRNAはどちらのラットにおいても,IL-4の変動よりはるかに小さく,BNでは僅かながらも抑制傾向がみられたが,F-344ではむしろ感染前のレベルを中心に小さな振れを示すにとどまっていた.ELISAで総IgE抗体の変動をみると,感染前BNでは30ng/ml前後でありF-344では検出できなかったのが,感染後両者とも速やかに上昇し,14日目にピークに達した後徐々に減少していった.腸管寄生線虫による感染で,ラットではTh2系のサイトカインであるIL-4のmRNAが強く誘導され,それに応じてIgE抗体産性が上昇するが,IFN-γのmRNA発現の変動は小さいということと,IgE高応答性のBNでも低応答性のF-344でも感染によってIL-4mRNAとIgE抗体産性は同じように誘導されるということが判明した.
高性能なスペクトル拡散型電子透かしを防災サイレンに応用した防災無線システムの開発

本研究では,完全相補系列系を用いた音声データハイディング方式を防災サイレンに応用した新しい防災無線システムを提案した。主な研究成果は,情報埋め込み方式の考案と実装,各種パラメータの設定方式の検討,誤り訂正方式の検討および受信アプリケーションの開発である。提案方式の特性評価として,計算機シミュレーションに加え,災害情報を埋め込んだサイレン音を実際にスピーカから鳴動させ,屋内における情報通信実験を行なった。その結果,スピーカから受信機までの距離が離れるほど,受信ビット誤り率は低下するものの,適切なパラメータ設定のもとでは誤り率を低く抑えた情報通信を実現できることが判明した。平成24年度に行なった検証結果に基づき,完全相補系列に基づく音声信号向け電子透かし方式の改良を行なった。特に,サイレン音に災害情報を埋め込み,スピーカから鳴動させた状況で正確に情報の抽出ができるよう,信号の同期方式の検討を行なった。検討の結果,音声信号の前にM系列を用いた同期用信号を繰り返し挿入し,相関関数のピークを検出することで同期捕そくを行なう方法を採用した。また,緊急音声放送に情報量の大きなメッセージを埋め込む,いわゆるステガノグラフィ技術を用いた場合の伝送特性についても,実際のスピーカを用いた環境下での検証を行なった。結果として,12Kビットの情報を同時に埋め込んでも,ビット誤り率をある程度低く保つことができることが示された。これらのビット誤りは適当な誤り訂正符号を用いて訂正することが可能であると考えられるが,これについては次年度の課題とする。アンドロイド端末上で動作する受信用プログラムを開発し,実際にスピーカから鳴動させたステゴ音声から携帯端末を用いて埋め込まれた情報を抽出できることを示した。ただし,信号の同期に時間を要しているため,この点が次年度の課題として残された。災害用ポータルサイトの作成とそこへ誘導するための埋め込み情報の作成,リモコンを改良した受信機の開発については,次年度への継続課題とすることとした。東北地方の自治体の防災担当者などと打ち合わせを行ない,開発しているシステムを実用化する場合のシナリオについて検討を行なった。その結果,最終年度である次年度においては,体育館のような避難所や仮設住宅などで,災害やライフラインの復旧などに関する連絡を一斉に放送できるようなシステムとして実現することが重要であることが確認された。次年度は上記の継続課題を実現するとともに,自治体の求めに応じたシステム開発と検証を行なうことをめざすこととなった。研究を開始するにあたり,東日本大震災で被災した自治体である仙台市や岩手県矢巾町,および所属機関が位置する八王子市を訪問し,防災担当者から現行の防災無線システムについてヒアリングを行ない,本研究で開発を行なうシステムの方向性を確認した。完全相補系列を用いた電子透かし方式を音声信号に応用し,その特性を計算機実験により評価した。具体的には,サイレン音に対して,電子透かし技術により災害の規模や内容に対応した固有のID番号を埋め込む方法と,ステガノグラフィ技術により,災害に関する詳細な情報を文字データとして埋め込む方法について特性を評価し,比較を行なった。また,埋め込み方式については,電子透かしとステガノグラフィの双方において,高速フーリエ変換などを用いて周波数領域へ埋め込む方式と,音圧データに直接埋め込む方式の両方を実装し,評価した。計算機による数値実験の結果,電子透かし,ステガノグラフィの双方において,高速フーリエ変換により周波数領域へ埋め込む方式の優位性が確かめられた。また,ステガノグラフィで大量のデータを埋め込む場合でも,埋め込んだ情報の抽出特性において大きな問題が検出されなかったため,本研究においては,ステガノグラフィ技術を用いて,音声信号の周波数領域へ災害情報を埋め込む方式を最優先で採択することとした。実環境でスピーカから出力した透かし音声をマイクで採取し,情報の抽出を行う実験もについては,準備にとどまり.詳細な特性検証までは至らなかった。また,携帯端末上で情報を抽出し表示する機能の開発も準備段階に終わった。この2点については,次年度以降の最優先課題として取り組む予定である。実音声での実験を踏まえ,提案方式と相性の良いサイレン音に関する調査も行なう予定であったが,これも今後の課題とする。計算機実験の特性評価結果については,研究会での口頭発表を行なった。提案システムに必要なソフトウェアを開発し,実際に屋内環境において情報受信実験を行ない性能を評価した。要素技術として,誤り訂正符号の導入と受信アプリケーションの改良を行なった。誤り訂正符号としてはRS符号とBCH符号を実装し,実験を通してその性能を評価した。受信アプリケーションにおいては,従来のものは同期捕そく処理などに長い時間を要していたが,冗長な処理を省くことなどにより,全体として受信してから情報を表示するまでに要する時間を1/3以下に短縮することに成功した。さらに,情報を埋め込む方式として,従来通り原信号の周波数領域に埋め込む方式に加え,サイレン音を用いず,埋め込む情報のみを特定の周波数領域に配置することにより,擬似的なサイレン音を作成する方式について検討した。

実験を通して特性を検証したところ,両方式の間に大きな性能の差は認められなかったが,受信ビット誤り率(BER)は従来方式の方が高いという実験結果を得た。屋内環境において情報伝達特性を評価した。実際にスピーカから災害情報を埋め込んだサイレン音を放送し,パソコンや携帯端末で受信して抽出された情報のBER特性を評価した。屋内の実験室においてスピーカとマイクの距離を3m以下に設定し実験を行なったところ,4秒間のサイレン音に4kbit程度の情報を埋め込んだ場合でもBERは約10%に抑えられることがわかった。一方,避難所などを想定して体育館を用いて行った実験では,スピーカとマイクの距離は18m程度であったが,128bit程度で10%程度のBERとなった。埋め込み情報量が増加するとBERも増加する傾向が認められるが,これは反響の影響でマルチパスフェージングに似た状況が発生しているとわかった。最終的にそのまま実用化できるシステムとはならなかったが,通信環境に合わせたパラメータ設定を行なうことで,十分に実用に耐えうるシステムとなることを実験を通して示すことができた。情報理論,系列生成とその応用提案した方式の特性について実際の環境下で実音声を使って検証し,評価を行なった点は極めて順調に進んでいる。現状でも,最終的な目的を達成するに値する特性を有していると考えられるが,今後,改良を加え,信号の抽出精度などを向上させる予定である。また,アンドロイド端末上のアプリケーション開発も順調に進み,実地実験までを終えることができた。一方,災害のポータルサイトへの誘導や,災害情報を抽出したうえでテレビのスイッチを入れることができるよう,リモコンを改良する方式などについては,次年度への継続課題となっているが,十分実現可能であると考えている。以上のように,計画通りに進んでいる部分と計画よりも前倒しで進んでいる部分がある一方で,計画よりも遅れている要素もある。しかし,大きく研究計画を遅らせる必要があるほど,達成状況が遅れているわけではなく,おおむね順調に研究が遂行されているといえる。自治体などへの調査と,提案した方式の計算機実験による特性評価及び比較については,計画通りに達成することができた。また,災害情報を抽出したうえでテレビのスイッチを入れることができるよう,リモコンを改良する方式については,調査を行ない,次年度以降の開発につなげる準備を行なうことができた。また,当初の研究計画では,ステガノグラフィを用いた場合の特性評価については2年目以降の研究課題としていたが,計算機上の特性評価がすでに終了しており,これについては計画よりも前倒しで進めることができている。一方,実環境でスピーカから出力した透かし音声から災害情報を抽出した場合の特性評価,およびそれを踏まえての最適なサイレン音に関する調査は,実験環境の構築を行ない,実験の準備を整えるにとどまり,詳細な実験や特性評価は行なうことができなかった。
細菌感染治療の分子基盤を自然免疫機構と化学療法の協調的相互作用から理解する試み

リステリア感染のアンピシリン治療モデルにおいてインフラマソームが菌の排除を亢進する機序を明らかにする目的で、菌排除の亢進に関わるインフラマソーム下流のエフェクター分子の同定を試みた。インフラマソーム下流のエフェクターとしてサイトカインであるinterleukin (IL)-1b/IL-18およびパイロトーシスの誘導に関わるgasdermin D (GSDMD)が知られているが、これらのうちGSDMDがアンピシリン治療効果の亢進に必要であることがわかった。この結果から、パイロトーシスが同治療モデルにおける菌排除を亢進させることが示唆される。一方、リステリア感染マクロファージをアンピシリン処理するとパイロトーシスが促進されることが明らかになった。すなわち、同治療モデルにおいてアンピシリン処理は単にリステリアに作用するだけではなくインフラマソーム-パイロトーシス経路の活性化を増強することで自身の効果を亢進させることがわかった。その理由として、細胞内でリステリアがアンピシリンによって傷害されることで菌由来DNAが細胞質内に放出され、その結果、細胞内DNA受容体であるabsent in melanoma 2 (AIM2)がインフラマソームを形成し、カスパーゼ-1活性化とそれによるGSDMDの成熟化を介してパイロトーシスを誘導する可能性が考えられる。この推察と一致して、アンピシリンによる宿主マクロファージからのリステリアの排除にAIM2が重要な役割を果たす結果が得られている。リステリア感染のアンピシリン治療モデルにおいて菌の排除を亢進するインフラマソーム下流のエフェクター分子(GSDMD)を同定することができた。計画的ネクローシスであるパイロトーシスが菌排除の亢進に関与することが明らかになり、この現象の詳細な機序解明に向けて大きく前進した。インフラマソーム-パイロトーシス経路の不全はアンピシリン処理によるリステリア感染マクロファージ内からの菌排除を顕著に遅延させることから、この条件下において細胞内の一部の菌がアンピシリン処理に不応答性を示していると想定される。そこで、そのような菌の状態や細胞内局在を明らかにする。リステリアは細胞質内では増殖してF-アクチンを誘導するが、食胞内では増殖もF-アクチン誘導も起こさない。このような違いが菌のアンピシリンへの感受性を決定する可能性を考え、アンピシリン処理中にリステリアがどちらに局在するかを検討する。さらに、そのような菌の局在とパイロトーシスとの関係性を明らかにする。日本細菌学会総会は例年3月中に開催されるが、第92回日本細菌学会総会は北海道での開催のため2019年4月に変更になった。そのため、この学会への参加に係る旅費を2018年度ではなく次年度に使用することになった。

また、2018年度中の発表を目指していた論文について、実際の発表時期が追加実験の実施などの原因で予定よりも遅れたため、publication fee(約60万円)の支払いが2018年度ではなく次年度にずれ込んでしまった。従って、繰越分はこれらの支払いに当てる予定である。
三次元離散渦法を適用した斜航船体に作用する流体力推定法の開発に関する研究

船体から流出する渦要素を渦シートおよび渦ブロブによって表現する三次元離散渦法を適用し,斜航する船体に作用する流体力を推定する手法の開発を行った。船体周りに設定する渦層の高さや流れ場に導入する渦ブロブの初期渦核半径,ならびに渦シートの最大循環等の計算パラメータが流体力の推定精度に及ぼす影響を明らかにするとともに,斜航角の変化に対する流体力の変化の定性的な傾向を推定可能であることを確認した。三次元離散渦法に基づく流場推定においては,物体から流出する渦要素の導入方法が推定精度に大きな影響を与えることから,渦要素の導入時における渦層の高さや渦核半径が流体力の推定結果に及ぼす影響について検討を行った。その結果,渦層高さを高く設定した場合には,抗力係数・揚力係数ともに小さな値となり,計算精度が悪化することが分かった。また,初期渦核半径については,その値が小さくなるほど計算精度は良くなるが,小さくとり過ぎると計算が発散することが分かった。従って,解析するレイノルズ数,渦層高さ,導入される渦度により,適切な初期渦核半径の値を設定する必要がある。続いて,乱流場を精度良く表現することを目的として,流場に存在する渦度を離散化するために導入している渦blobに代えて,境界層域の計算に対して渦blockを用いるモデル,ならびに渦sheetを用いるモデルについて検討を行った。三次元円柱を対象として流場ならびに流体力の推定を行ったが,両モデルとも乱流域の推定精度を向上させるには至らなかったため,さらなる検討を継続して行う必要がある。また,船体を周りの流場ならびに圧力計算のために,数値計算プログラムの拡張に着手した。次年度も引き続き開発を継続する。一方,船体流体力の推定精度の系統的な検証を行うためのデータの蓄積を目的として,九州大学船舶運動性能試験水槽において,大斜航角運動時に船体に作用する流体力の計測実験を実施した。本実験によって得られた計測データは,来年度以降の船体を対象とした流体力の推定結果の精度確認のために利用する予定である。三次元離散渦法に基づく流場推定においては,物体から流出する渦要素の導入方法が推定精度に大きな影響を与えることから,昨年度は渦要素の導入時における渦層の高さや渦核半径について検討を行い,流体力の推定結果に及ぼす影響を明らかにした。また,乱流場を精度良く表現することを目的として,流場に存在する渦度を離散化するために導入している渦blobに代えて,境界層域の計算に対して渦ブロックを用いるモデル,ならびに渦シートを用いるモデルについて検討を行ったが,両モデルとも乱流域の推定精度を向上させるには至らなかったそこで本年度は,高レイノルズ数の流れ場をさらに精度良く解析することを目的として,渦シートを用いるモデル(Hybrid Vortex Method)の適用について検討を行った。Hybrid Vortex Methodとは,境界層内の渦度分布を渦シートで表現し,渦シートが境界層内よりも高い位置に移動した時点で渦blobに変換する手法であり,渦層高さ,渦blobの初期半径,生成する渦シートの最大渦度が計算パラメータとなる。Hybrid Vortex Methodを適用して高レイノルズ数の一様流れ中における円柱,球ならびに翼型周りの流れ場の解析を行った結果,円柱および球周りの流れ場については,渦層高さ,渦blobの初期半径,生成する渦シートの最大渦度を適切に設定することにより,揚力係数・抗力係数ともに実験結果と近い値が得られ,流体力を定量的に精度良く推定可能であることを示した。一方,翼型周りの流れ場については,迎角が小さい範囲においては実験結果と近い値が得られるものの,迎角が大きくなるにつれて誤差が拡大する結果となったため,船型への適用を考慮しながら計算法の改良・拡張を実施する必要がある。三次元離散渦法に基づく流場の推定においては,物体から流出する渦要素の導入方法が推定精度に大きな影響を与える。昨年度までに船体から流出する渦要素を渦blobによって表現するモデルを用いて斜航船体まわりの流れ場の計算を行い,船体に作用する流体力を推定した結果,斜航角の変化に対する定性的な傾向は捉えることができたものの,定量的には実験値と差が生じる結果となった。そこで,渦要素の導入方法が計算結果に及ぼす影響をより明確に把握することを目的として,昨年度に引き続き三次元翼型周りの流れ場を解析対象として,渦モデルの検討を行った。渦モデルとしては,境界層内の渦度分布を渦シートで表現し,渦シートが境界層内よりも高い位置に移動した時点で渦blobに変換する手法(Hybrid Vortex Method)を適用した。また,翼端まわりの渦シートの移動方法についても併せて検討を行い,渦シートの動きをより現実的に表現できるようにモデル化を行った。渦層高さや渦blobの初期半径,渦シートの最大循環等の計算パラメータを変化させながら流体力の計算を行った結果,渦層高さの設定が流体力の推定結果に及ぼす影響が大きいことが分かった。

すなわち,Hybrid Vortex Methodでは物体表面に垂直な方向の渦シートの移動は乱数に基づいて決定されるため,渦層高さが同じであれば,物体表面の接線方向の流速の大小に関わらず,物体表面からの渦の剥離(渦シートから渦blobへの変換)は渦層高さのみに支配されることになる。従って,迎角によって変化する渦の剥離を表現するために,迎角に基づいて渦層高さを変化させるモデルを設定した結果,流体力を定性的かつ定量的に推定可能であることを確認した。
最尤法による分子系統樹推定法の研究

木村資生の中立説に代表されるように、進化におけるDNAやたんぱく質の変化の大部分は中立的なものであると考えられているが、なかには正の自然選択による変異も含まれており、そのような変異を検出することは進化生物学にとって重要な問題である。正の自然選択を分子進化的データから検出するのに、最大節約法が用いられることが多いが、この方法による推定には偏りがあることが知られており、最尤法による解析が望ましい。そこでわれわれは、最尤法によって祖先配列を推定するためのアルゴリズムを開発した。また、われわれの開発した独自の方法を、ロドプシン、反芻類とコロブス亜科霊長類のリゾチームなどの配列データに適用して生物学的に興味深い結果を得た。生物の系統関係を明らかにするために、DNAやたんぱく質の配列データをもとに推定された分子系統樹を用いることが一般的になってきたが、個々の遺伝子データのもつ系統に関する情報は限られており、一つの遺伝子だけからははっきりした結論を下せないことが多い。そのため、多くの遺伝子データの解析結果について総合的な評価を行うことが大切である。最尤法による解析は、そのためにも優れている。本研究では、多くの遺伝子データを扱うのに適した最尤法の開発とそれを実装したプログラムの開発を行った。この方法を、真獣類のミトコンドリアにコードされたたんぱく質データに適用し、真獣類の目間レベルの系統関係について多くの新しい知見を得た。
B細胞の分化、活性化、細胞死を制御する細胞内分子機構の解明

自己赤血球に対する自己抗体をコードするH鎖遺伝子、L鎖遺伝子を導入した抗自己赤血抗体産生性トランスジェニックマウスでは、自己赤血球反応性B1細胞は体内に存在するが、無反応状態(アナジー)にある。このマウスをLyn欠損マウスと掛け合わせて、Lyn欠損抗自己赤血球抗体産生性トランスジェニックマウスを作成した。このような動物において、B1細胞における無反応性(または自己寛容)は破れて強力な自己抗体産生が引き起こされ、動物は重症の自己免疫性溶血性貧血に陥った。以上の結果は、LynキナーゼがBCRからのシグナル伝達において強い負の制御を行っており、Lynキナーゼによる抗原に対する閾値の制御は自己反応性B細胞の自己寛容維持に重要な役割を果たしている事が示唆された。マウスB細胞株WEHI-231を抗IgM抗体で架橋すると24時間以降にアポトーシスに陥る。この場合、カスパーゼの活性化とDNAの切断が誘導及び細胞膜透過性の亢進を引き起こす。カスパーゼ阻害剤Z-VADは核の分画化、DNA切断を完全に阻止するが、細胞膜透過性の亢進は阻止しない。WEHI-231細胞ではBCR刺激後、膜透過性の亢進に先立って、ミトコンドリア膜電位の変化および活性酸素の増加が生ずることを見出した。即ち、BCRからのDeath signalはまずミトコンドリアに伝達され、その後にカスパーゼの活性化とDNA切断及び膜透過性の亢進が生ずると考えられた。即ち、自己反応性未熟B細胞では、抗原受容体からのシグナルはまずミトコンドリアを標的して伝達され、その後にアポトーシス及びネクローシスの反応が引き起こされると考えられた。免疫細胞の分化、増殖、活性化あるいは不活化、あるいは細胞死は、多くの場合、細胞表面受容体とそれに特異的なリガンドとの結合によって生ずる受容体からのシグナルによって高度に制御されている。B細胞の場合、膜免疫グロブリン(sIg)およびそれに会合している分子(Igαβ)から構成されている受容体複合体からのシグナルは抗原受容体依存性の細胞分化、増殖、活性あるいは不活化に重要である。特にIgαβ複合体からのシグナルは、プロB細胞からのプレB細胞を経て、成熟B細胞にいたる分化過程に必須である。我々はプレB細胞のcDNAライブラリーを作成し、Yeast Two Hybrid Systemにより、Igβに会合している新たなタンパクIBAP-1、IBAP-2を単離した。現在、これらの分子のIgβからのシグナル伝達における機能を解析中である。これまでに我々はLynキナーゼ欠損マウスを確立し、Lynキナーゼ欠損マウスが高IgM値と自己抗体を産生し、自己免疫病を発症することを報告したが、このLyn^<-/->マウスとBtkキナーゼ欠損のあるxidマウスを掛け合わせ、Lyn^<-/->Btk^<-/->マウスを作成したところ、高IgM、自己抗体の産生がともに消失し、Lyn欠損マウスで見られる脾腫も消失した。これらの解析から、Lyn^<-/->マウスにおいては、B1細胞の異常な活性化が生じていることが示唆され、B1細胞においてはLynキナーゼは抗原受容体からのシグナルを抑制的に制御していることが示唆された。さらに、Lynキナーゼの主要な基質HS1タンパクに会合する新たなタンパク(HAX-1)を同定した。HAX-1は免疫細胞の細胞死に抑制的に働く機能を有するタンパクであることが示唆され、免疫細胞のアポトーシスに関与するHS1とは相反的に作用すると考えられた。

本研究の目的は、B細胞の活性化、分化、細胞死を誘導する情報伝達経路に関わる分子群を同定すると共にその機能を分子レベル、個体レベルで明らかにし、それらの分子の異常がどのような免疫異常、特に自己寛容等の免疫機能の破綻にどのように関わっているかを解明する事である。本年度に得られた成果は(1)胚中心形成障害をもつLynキナーゼ欠損動物における抗体親和性の亢進。Srcファミリーチロンシンキナーゼの一つであるLynキナーゼ欠損マウスでは、胚中心形成が全く生じない。胚中心は、抗体のクラススイッチ、抗体親和性の亢進、記憶B細胞の形成などに重要な役割を果たすと考えられている。lyn遺伝子欠損マウスでは胚中心形成に障害があるにもかかわらず、抗原特異的なクラススイッチ及び抗体親和性の亢進(affinity maturation)、抗体可変部領域における体細胞超突然変異は正常に生ずる事が分かった。この結果は、これまでの定説と異なり、胚中心の構築そのものは、必ずしも抗体親和性の亢進に必須ではない可能性を示唆した。(2)Lynキナーゼ欠損マウスでは、血清IgMの上昇、加齢に伴う脾腫及び自己抗体産生性系球体腎炎などの異常が認められるが、Btkキナーゼ異常を持つxidマウスと掛け合わせると自己免疫病の発症が消失した。Lynキナーゼ異常によって起こる自己免疫病の発症にBtkキナーゼが関わっている事が分かった。(3)我々が単離したマウスリンパ組織特異的Formin関連遺伝子Frlは、リンパ組織に発現が認められた最初のFormin family遺伝子である。Frlタンパクは核に存在する。Frl遺伝子は11番染色体の遠位部に存在し、リンパ節形成不全マウスの原因とされるaly遺伝子座の1cM以内に位置することが分かった。現在、ノックアウトマウスの作成を行っている。自己赤血球に対する自己抗体をコードするH鎖遺伝子、L鎖遺伝子を導入した抗自己赤血抗体産生性トランスジェニックマウスでは、自己赤血球反応性B1細胞は体内に存在するが、無反応状態(アナジー)にある。このマウスをLyn欠損マウスと掛け合わせて、Lyn欠損抗自己赤血球抗体産生性トランスジェニックマウスを作成した。このような動物において、B1細胞における無反応性(または自己寛容)は破れて強力な自己抗体産生が引き起こされ、動物は重症の自己免疫性溶血性貧血に陥った。以上の結果は、LynキナーゼがBCRからのシグナル伝達において強い負の制御を行っており、Lynキナーゼによる抗原に対する閾値の制御は自己反応性B細胞の自己寛容維持に重要な役割を果たしている事が示唆された。マウスB細胞株WEHI-231を抗IgM抗体で架橋すると24時間以降にアポトーシスに陥る。この場合、カスパーゼの活性化とDNAの切断が誘導及び細胞膜透過性の亢進を引き起こす。カスパーゼ阻害剤Z-VADは核の分画化、DNA切断を完全に阻止するが、細胞膜透過性の亢進は阻止しない。WEHI-231細胞ではBCR刺激後、膜透過性の亢進に先立って、ミトコンドリア膜電位の変化および活性酸素の増加が生ずることを見出した。即ち、BCRからのDeath signalはまずミトコンドリアに伝達され、その後にカスパーゼの活性化とDNA切断及び膜透過性の亢進が生ずると考えられた。即ち、自己反応性未熟B細胞では、抗原受容体からのシグナルはまずミトコンドリアを標的して伝達され、その後にアポトーシス及びネクローシスの反応が引き起こされると考えられた。
蛍光性及び水熱劣化抑制能を有するマルチファンクションジルコニアセラミックスの開発

一般に市販の歯科用高透光性ジルコニアには蛍光性がなく、明るく白い歯を再現するのが困難である。さらに、高透光性ジルコニアは、透光性向上のため劣化抑制に有効なアルミナをほとんど含んでおらずフレーム用ジルコニアよりも口腔内で劣化しやすい性質を持っている。そこで、本研究は天然歯と同様の色調の蛍光性をもち、長期間使用しても劣化しにくいクラウンブリッジ用の高透光性ジルコニアを開発することを目的とした。29年度の実験から、Tmを添加したジルコニアが天然歯に近い青色の蛍光性を示すことがわかったので、より蛍光強度が高くなる条件を最適化するために、標準グレードのジルコニア(TZ-3Y-E)に加えて、2種類の歯科用高透光性ジルコニア(ZpexおよびZpex Smile)を用い、Tm2O3の混和率を変えて試料を作製し、蛍光性や物性を評価した。その結果、2種の高透光性ジルコニアでは、Tm2O3添加量が0.8 wt%で蛍光強度が最大となった。蛍光強度は、2種の高透光性ジルコニアで大きな違いはなかった。また、高透光性ジルコニアの透光性はTm2O3添加量が変化しても、大きく変わらないことが示された。ビッカース硬度は3種のジルコニアで大きな相違はないが、破壊靱性値(K1c)はZpex Smileが他の2種よりも小さくなった。これは、Zpex Smileはイットリアの添加量が多く、ジルコニア特有の応力誘起相転移強化機構が十分働かなかったことが原因と思われた。今回の実験から、イットリアを3mol%含んだ歯科用高透光性ジルコニアに、Tm2O3を0.8 wt%すると青色の蛍光が得られることが示された。しかしながら、この試料であっても、紫外線ライト下の蛍光は天然歯よりも暗い色調であった。そこで、より天然歯に近い蛍光を得るためには、蛍光色調を天然歯に近づける必要があるものと思われた。前年度の実験で、抜去歯の歯冠部を板状に切断して製作した試料に紫外線を照射すると、従来の報告と同様の青白色の蛍光が確認できた。光が届きにくい口腔内であっても、クラウンやブリッジに蛍光性があれば、明るく見えると言われている。歯科用のセラミックスやレジンでは、有機蛍光材料や蛍光ガラスによって蛍光が付与されている。しかしながら、ジルコニアは多結晶体であり、焼結温度が高いので、このような材料を使用することができない。前年度の実験でジルコニアにツリウム酸化物(Tm2O3)を微量添加すると青色の蛍光を得ることができたので、本年度は、ジルコニアの種類やTm2O3添加量を変化させて、蛍光性や物性を検討した。その結果、イットリアを3mol%含む歯科用の高透光性ジルコニアにTm2O3を適量添加すれば、物性に影響を与えることなく、青色の蛍光を発光させることができた。歯科用の高透光性ジルコニアは、標準グレードのイットリア安定型ジルコニアに比べると物性の低下が懸念されるが、イットリアを3mol%含む製品(Zpex)であれば、その透光性が蛍光強度の上昇にも効果的であることが明らかになり、以後の実験はこのジルコニア材料を使用して進めることとした。また、本年度の実験で得られた試料の透光性は、天然歯に比べると暗い色調であり、より色調を天然歯に近づけることが必要と思われた。蛍光性は材料の透光性にも影響を受けるといわれており、本年度の実験では、29年度に使用した市販の標準グレードジルコニアよりも透光性の高い市販のイットリア添加量の異なる2種の高透光性ジルコニア材料を使用した。その結果、イットリアを3mol%含んだ高透光性ジルコニア(Zpex)であれば、破壊靱性を低下させることなく、蛍光強度を上げることができたので、次年度も実験には、母材としてこのジルコニア材料を使用することとした。本年度の実験で得られた蛍光は、添加量をコントロールすることによりある程度その強度を上げることができた。しかしながら、天然歯に比べると暗い色調であった。これは、肉眼で観察できる蛍光は、単に蛍光強度だけでなく、その色調が影響を与えていることが考えられた。そこで31年度は、複数の蛍光の混色を使用することを試みる予定である。具体的な方法として、ツリウム(青色)に、エルビウム(緑色)を適量加えれば、より天然歯の蛍光色調に近づけられるかを色度図により判断し、両者の添加量を変化させて実験を行う必要がある。また、物性の評価も30年度のビッカース硬度や破壊靱性だけでなく、より臨床での有用性を判断するため、別の試料による3点曲げ試験も加えて行いたい。CAD/CAM技術が発達し、高透光性ジルコニアのみで製作するフルジルコニアのクラウンブリッジが多用されるようになった。従来のセラミックスやレジンは、天然歯がもつ蛍光性を付与することにより審美性の再現を行っている。ところが、一般に市販の歯科用高透光性ジルコニアには蛍光性がなく、患者の希望する明るく白い歯を再現するのが困難である。

そこで、本研究は天然歯と同様の色調の蛍光性をもち、長期間使用しても劣化しにくいクラウンブリッジ用の高透光性ジルコニアを開発することを目的とした。まず天然歯の蛍光性を検討した。抜去したヒト第三大臼歯を歯冠部で板状に切断・研磨し、蛍光分光光度計を用いて蛍光性と色調を評価した。その結果、天然歯は波長365 nmの紫外線に対してピーク波長446 nmの青白色の蛍光を示すことがわかった。次に、天然歯に近い色調の蛍光性を発揮させるため、アルミナをほとんど含まない歯科用の高透光性ジルコニア粉末に各種の希土類(Pr, Nd, Sm, Eu, Gd, Tb, Dy, Ho, Er, Tm)を微量添加し、混合、成形後に焼結・研磨して試料を製作した。ブラックライトを照射し、蛍光性を示さないものを除外した(スクリーニング)。蛍光の評価には蛍光分光光度計を用いた。その結果、Pr、Sm、Euは赤色、Tb,Ho,Erは緑色、Dyを添加した試料は黄色の蛍光を示し、Tmを添加した試料は青色の蛍光を示した.歯質に近い青色を示したTmを添加した試料は、蛍光分光光度計により、波長365 nmの紫外線に対して波長460 nmの蛍光を示すことが明らかとなった。今後は、蛍光強度がより強くなる条件を模索し、物性への影響も調査する予定である。以前から、天然歯は紫外線の照射により、青白色の蛍光を発することが知られている。本実験でも、抜去歯の歯冠部を板状に切断して製作した試料に紫外線を照射すると、従来の報告と同様の青白色の蛍光が確認できた。歯科用のセラミックスやレジンでは、有機蛍光材料や蛍光ガラスによって蛍光が付与されている。しかしながら、ジルコニアは多結晶体であり、焼結温度が高いので、このような材料を使用することができない。本実験では、歯科用ジルコニア粉末に各種の希土類酸化物の粉末を微量添加し、焼結させることでジルコニアに蛍光性を付与する方法をこころみた。その結果、紫外線照射により蛍光がみられない希土類もあったが、いくつかの希土類では明らかな蛍光が確認できた。その色調も、Tb,Ho,Er添加では緑色、Dy添加では黄色、Tmを添加では青色の蛍光が観察された。天然歯が青白色の蛍光を示したので、Tmを添加したジルコニアの青色蛍光は、天然歯に比較的近い色調を示すものとして、以後の実験にはTmの酸化物を使用して進めていくこととした。一般に市販の歯科用高透光性ジルコニアには蛍光性がなく、明るく白い歯を再現するのが困難である。さらに、高透光性ジルコニアは、透光性向上のため劣化抑制に有効なアルミナをほとんど含んでおらずフレーム用ジルコニアよりも口腔内で劣化しやすい性質を持っている。29年度の実験から、Tmを添加したジルコニアが天然歯に近い青色の蛍光性を示すことがわかったので、より蛍光強度が高くなる条件を最適化するために、標準グレードのジルコニア(TZ-3Y-E)に加えて、2種類の歯科用高透光性ジルコニア(ZpexおよびZpex Smile)を用い、Tm2O3の混和率を変えて試料を作製し、蛍光性や物性を評価した。その結果、2種の高透光性ジルコニアでは、Tm2O3添加量が0.8 wt%で蛍光強度が最大となった。蛍光強度は、2種の高透光性ジルコニアで大きな違いはなかった。また、高透光性ジルコニアの透光性はTm2O3添加量が変化しても、大きく変わらないことが示された。ビッカース硬度は3種のジルコニアで大きな相違はないが、破壊靱性値(K1c)はZpex Smileが他の2種よりも小さくなった。
多環芳香族系抗生物質の合成研究

FD-594は、Streptomyces sp.TA-0256より単離された多環芳香族系抗生物質であり、グラム陽性菌や腫瘍細胞に対して活性を示す。その構造は、ピラノナフトキサントン骨格を母核として、それに糖が結合している。本研究では、FD-594の全合成研究を行った。FD-594の合成上の課題は、1)多くの官能基を持つ六環式アグリコン部分の合成、2)C3、C6、C7位に存在する不斉中心の立体選択的構築、3)高度にデオキシ化された三糖の立体選択的導入、の3点である。今年度の研究では、このうちの一つ目の課題について詳細な検討を行った結果、重要な鍵中間体であるAB環に相当するヨードフェノールの合成とDEF環に相当するキサントン骨格を持つカルボン酸の合成に成功した。すなわち、AB環に相当するヨードフェノールは、容易に調製可能な4-メチルサリチル酸誘導体を原料として用い、数工程を経てアミドへと誘導後、オルト位の位置選択的なリチオ化、それに引き続くプロピルオキシランとの反応を経ることによって合成した。一方、DEF環に相当するキサントン骨格を持つカルボン酸は、セサモール誘導体のリチオ化体とジメチルスクシニルスクシネートから誘導したベンズアルデヒドを結合させた後、分子内芳香族求核置換反応を経ることによって合成した。さらに、これらの両部分を縮合させ、得られたエステルのパラジウム環化反応を試みた結果、FD-594のアグリコン前駆体に相当するオルト四置換のビアリールラクトンを得ることができた。