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鼻副鼻腔内反性乳頭腫の診断・再発・悪性化マーカーの探索

内反性乳頭腫(IP)では炎症疾患と比較して血中SCCA値は有意に高く(p<0.001)、またIPの血中SCCA値と腫瘍容量にはかなり相関(r=0.522)があり、IPに対する血中SCCA値(異常値;>1.5ng/ml)測定は感度83.3%、特異度94.7%であった。IPのヒト乳頭腫ウイルス(HPV)陽性率は29.4%であり、SCC、IP+SCCも炎症群に比較してHPV感染が多いことが判明した。癌病変ではウイルス量は良性IPに比較して有意に高く、integrationしていた。研究1:扁平上皮癌抗原(SCCA)による内反性乳頭腫の診断:30例の内反性乳頭腫と57例の炎症性疾患についてレトロスペクティブにSCCA値を調べた。この結果,内反性乳頭腫では83.3%の症例でSCCA値が上昇していたのに対し,炎症性疾患では5.3%でしか上昇していなかった。SCCAを用いた内反性乳頭腫の診断は感度83.3%,特異度94.7%と極めて良好であった。術後のフォローアップでは皮膚病変との関連は認められなかったが,喫煙者では高く出るため,非喫煙者と喫煙者の間で異なる値を設定することでより正診率を高めることができることが判明した。この結果は国際誌に発表した。研究2:HPV integrationと悪性化:内反性乳頭腫17例,内反性乳頭腫+扁平上皮癌5例,扁平上皮癌16例,慢性副鼻腔炎32例を用いて,pRb, p53, p16, HPV感染状態を調査した。HPV DNAはそれぞれ29.4%,40%,25%,6.3%で検出され,主たるHPV型は16であった(76.9%)。ウイルス量は扁平上皮癌,内反性乳頭腫+扁平上皮癌例では,内反性乳頭腫単独,炎症性疾患よりも高値を示した。内反性乳頭腫ではp16発現がHPV感染と関係なく亢進しており,HPV感染のサロゲートマーカーにはならないことが判明した。セルサイクル蛋白のなかで,pRbの発現低下がHPV感染と有意に関連していることが判明した。本結果は国際誌に発表した。初年度で目標の2/3程度の研究成果が得られた。27年度は研究で使用する純水製造装置が壊れ,修理不能であったため新規購入した。鼻副鼻腔内反性乳頭腫は良性腫瘍であるが,治療に関して臨床的に2つの問題点,1.易再発性(手術切除による再発率:12%),2.悪性病変の合併(同時性,異時性:10%)を持っている。内視鏡下切除が行なわれる場合が多いが,内視鏡下切除では一般に分割切除されるため,腫瘍播種,再発リスクが高まるとの報告も散見される。腫瘍の播種,再発リスク,悪性病変合併・転化を術前に予測することができれば,en bloc切除可能な手術アプローチを選択することができる。本研究は手術アプローチ決定に有用な易再発性,悪性病変合併・転化に関するマーカーを見いだすことを最終的な目標とする。今年度は扁平上皮癌抗原(SCCA)について引き続き症例を蓄積するとともに、過去の手術例のパラフィンブロックを取り出しここからゲノム抽出を行う手技を確立した。現在のところ、パラフィンブロックの状態にもよるが、PCRでゲノム解析ができるものは約60%である。インテグレーションの状態やin situ hybridization法を用いたHPV検出法も条件設定を行っている。また昨年度の研究で内反性乳頭腫がヒト乳頭腫ウイルス感染とは関係なくセルサイクルプロテインp16を発現していることが判明したが、この現象はこれまでの国内外の研究で全く不明なまま残されている。昨年度研究が進行したため、さらに研究を前進させるため、p16の発現について解析を実施している。細胞老化にともなうアポトーシスが関係している所見が得られたが、さらに検証を進めている。これまで蓄積したサンプルを解析することにより、比較的良好な結果が得られた。国際誌でも高い評価を得ることができた。鼻副鼻腔内反性乳頭腫(IP)は良性腫瘍であるが臨床的に1.治療前診断が困難、2.易再発性(手術切除による再発率:10-20%)、3.悪性転化(扁平上皮癌:SCCへの悪性転化:10%)の3つの問題点がある。本研究「鼻副鼻腔内反性乳頭腫の診断・再発・悪性化マーカーの探索」では3年間の間に下記の結果を得た。IP30例の血中SCCA値(異常値;>1.5ng/ml)の中央値は2.4ng/ml、慢性副鼻腔炎や好酸性副鼻腔炎などの炎症群(以下炎症群とする)57例の中央値は0.9ng/mlでIPの血中SCCA値は有意に高く(p<0.001)、また、IPの血中SCCA値とIPの腫瘍容量にはかなり相関(r=0.522)があり、IPに対する血中SCCA値(異常値;>1.5ng/ml)の感度83.3%、特異度94.7%であることがわかった。

IPのHPV陽性率は29.4%であり、炎症群のHPV陽性率6.3%に比較し有意に高く、SCC群は25.0%、IP+SCCは40.0%がHPV陽性であり、SCC、IP+SCCも炎症群に比較してHPV陽性が多いことがわかった。また、HPV陽性のSCC、IP+SCCのウイルス量はHPV陽性のIPに比較して有意に高く、HPVはSCC、IP+SCCではintegrationしていたが、IPにおいてはepisomalであることがわかった。中咽頭癌ではHPV感染の重要なサロゲートマーカーであるp16は、IPではp16陽性率が82.4%、SCCでは12.5%、IP+SCCでは40%、炎症群では0%で過剰発現していた。IPはp16陽性のものが多いが、HPV陽性の有無と関連なくp16陽性を示すことから、IPにおいてp16はHPV感染のサロゲートマーカーとはならないことが判明した。内反性乳頭腫(IP)では炎症疾患と比較して血中SCCA値は有意に高く(p<0.001)、またIPの血中SCCA値と腫瘍容量にはかなり相関(r=0.522)があり、IPに対する血中SCCA値(異常値;>1.5ng/ml)測定は感度83.3%、特異度94.7%であった。IPのヒト乳頭腫ウイルス(HPV)陽性率は29.4%であり、SCC、IP+SCCも炎症群に比較してHPV感染が多いことが判明した。癌病変ではウイルス量は良性IPに比較して有意に高く、integrationしていた。扁平上皮癌抗原が内反性乳頭腫診断に極めて有用であることが判明したため,前向き臨床試験で確認する予定である。平成28年度は臨床試験の準備を行う。前年度の研究でp16がHPV感染と無関係に内反性乳頭腫で著明亢進していることが明らかになった。本メカニズムは,内反性乳頭腫の発生や癌化に密接に関連していると思われるため,引き続きそのメカニズムを解明してゆく。症例数を増やし、ヒト乳頭腫ウイルスのインテグレーションが悪性化に関係していることを明らかにする。さらに内反性乳頭腫でのp16過剰発現メカニズムを明らかにすることにより悪性化につながるステップを検証してゆく。耳鼻咽喉科少額の残がでたため,次年度の研究費を合わせ使用する。物品購入の加減で少額の執行残が生じた。物品費に充当する。次年度の消耗品購入に充てる予定。
生体心におけるカルシウム誘導性ネクローシス様細胞死の転写因子による制御

心不全における転写因子Runx2の役割を明らかにするために、心筋特異的Runx2過剰発現マウスを作製した。Runx2の発現は、心筋梗塞及び圧負荷心肥大において上昇を認め、過剰発現マウスは心肥大と心収縮力の低下をきたした。しかしながら、同モデルにおいて明らかなカルシウム誘導性ネクローシス様細胞死の像を認めなかった。一方、Runx2の心筋特異的欠損マウスを作製すべくRunx2のfloxマウスの作製を施行しヘテロ変異マウスのラインを確立した。生体心においてL型カルシウムチャネルを介するCa2+流入増大モデルにβアドレナリン受容体刺激を加えるとカルシウム塩の沈着を伴うユニークな組織像をとる非アポトーシス性細胞死(以下von Kossa染色陽性細胞死)が観察される。このような細胞死像を呈する心臓において骨形成主要転写因子であるRunx2の発現上昇が認められる。本研究において、かかるvon Kossa染色陽性像を呈する細胞死が転写因子Runx2により制御されているという仮説を検証するべくCre-loxPシステムを用いた心筋特異的Runx2欠損マウスの作製を試みた。ターゲティングベクターを作成した後、ES細胞に遺伝子導入し陽性細胞をスクリーニングした後にキメラマウスを作製した。得られた9匹のキメラマウスと野生型マウスの交配により3ラインにおいて生殖細胞系伝達を確認しヘテロのRunx2 floxマウス(以下Runx2 f/+)のラインを確立した。次にRunx2 f/+マウス同士の交配によりホモのfloxマウスの作製を試みた。また胎生期に心筋特異的にCreを発現するbeta MHC Creとfloxマウスの交配によりbeta MHC Cre(+) Runx2 f/+を得た。beta MHC Cre(+) Runx2 f/+とRunx2 f/+にて得られたbeta MHC Cre(+) Runx2 f/fマウスは現在のところ生後2日以内に死亡している。これらの結果は、Runx2が胎生期の心臓の発生にいて関与している可能性を示唆している。現在かかる表現型の詳細な解析を施行するとともに、タモキシフェン誘導型Creを用いた解析のためのマウスを交配中である。本研究において、かかるvon Kossa染色陽性像を呈する細胞死が転写因子Runx2により制御されているという仮説を検証した。まずRunx2心筋過剰発現マウスを作成し、解析を試みた。2ラインの過剰発現マウスが得られ、高発現のラインにおいて心肥大と心機能の低下及び早期の死亡率の増加が認められた。しかしながら、組織学的な解析においてはvon Kossa染色陽性の細胞死像は認められなかった。次に圧負荷モデルを用いてストレスによる心病型とvon Kossa陽性細胞死像の有無を観察した。この検討には、生理学的条件下では異常を認めなかった低発現ラインを使用した。その結果、圧負荷により過剰発現マウスは心機能低下をきたし、また一部のマウスにおいてvon Kossa陽性細胞死像が観察された。この結果は、von Kossa染色陽性像を呈する細胞死形成の機序にRunx2が関与している事を示唆していると考えられる。さらに、心不全の病態形成におけるRunx2の役割を検討するために、Runx2の臓器特異的なノックアウトマウスを作製した。今後同マウスの解析により、心筋におけるRunx2の意義を明らかにしていく。研究計画1-1に従い、Responder TGとtTAの交配による蛋白質発現の確認と実験に使用する至適ラインの決定、テトラサイクリンによるtransgeneの発現抑制の確認、生理条件下におけるvon Kossa染色を含む病理組織学的解析、持続イソプロテレノール刺激によるvon Kossa染色陽性細胞死誘導の同定及び心筋の骨様変化(osteogenic conversion)の骨形成関連遺伝子の発現解析による評価を完了した。さらに研究計画に加えて、圧負荷における病態解析・マイクロアレイによる解析・テレメトリーによる心電図解析を施行した。研究計画1-2.に従いラット新生児心筋細胞を用いてアデノウィルスによるRunx2過剰発現下におけるβ受容体刺激誘導性細胞死を評価した。また各種阻害剤を用いてアポトーシスの有無を確認した。さらにRunx2の非リン酸化変異体を作成し細胞死の転写活性化依存性を検討した。また研究計画2に従い、Runx2 floxマウスの作成を施行し、キメラマウスの作製が完了し、遺伝子の世代間伝達も確認された。以上より計画により多少の予定外の進展・遅延している部分があるものの概ね計画どおりと考える。今後は心筋特異的Runx2欠損マウスの解析を中心に展開する。以下各々の研究計画を述べる。研究計画1. Runx

2過剰発現による心病態形成機序をマイクロアレイ解析にて得られた知見をもとに、その下流の候補分子であるオステオポンチンに焦点をあてて解析していく。研究計画2.心筋特異的Cre recombinase発現マウスとの交配による心筋特異的Runx2欠損マウスの作成。Runx2floxマウスにおいて心筋特異的Runx2欠失を確認するためのマウスの交配を行う。生理条件下における表現型解析を、心エコーを用いた心機能の解析及びvon Kossa染色等を用いた病理組織学的解析を施行する。また心筋梗塞モデル・ベータ受容体持続刺激モデル・カルシウムチャネル高活性モデルを用いて表現型解析を施行していく。次年度は動物代(動物飼育費・動物購入費・特殊食餌及び薬剤)の消耗品費にて50万円及び細胞実験関連(細胞培養器具・細胞培養試薬)、分子生物学的試薬等の消耗品費にて50万円、論文掲載費用等10万円を使用する計画である。
右および左円偏光を用いるキラル化合物の高エナンチオ選択的な絶対不斉合成

5-ブロモピリミジンにブチルリチウムを作用させてリチオ化し、イソブチルアルデヒドと反応させてラセミ体のピリミジルアルカノールを合成した。ラセミ体のピリミジルアルカノールをエタノールに溶解し円偏光を照射した。このとき溶液フィルタを用いて波長365nm付近の光が透過するように設定した。円偏光による不斉光分解を行い、残ったピリミジルアルカノールにわずかでも不斉が誘起されれば、その後の不斉自己触媒反応によりピリミジルアルカノールの鏡像体過剰率が著しく向上するものと期待した。室温で3日間ラセミ体に円偏光照射した場合、薄層クロマトグラフィーで分解生成物が確認されたが痕跡量にとどまった。さらに反応時間を長くしても光分解の収率の向上は見られなかった。また、フィルタなしで光源から直接光を照射すると比較的短時間で分解生成物が得られた。つぎに、円偏光を照射する温度を40°Cに設定して実験を行ったところ、室温での条件の実験のときよりも光分解速度が増大することを見出した。ラセミ体のピリミジルアルカノールの不斉光分解で残ったピリミジルアルカノールにピリミジンカルバルデヒドとジイソプロピル亜鉛とを順次加えて不斉自己触媒反応を行いピリミジルアルカノールを得た。本研究の芽は得られたものと考えられ、現在、本条件下で円偏光のキラリティーと不斉自己触媒反応により生成するピリミジルアルカノールの不斉との立体相関性の再現性の確認を行っている。ラセミ体のピリミジルアルカノールに円偏光を照射して不斉光分解を起こし,これにより誘起された極微小不斉のピリミジルアルカノールが,鏡像体過剰率の向上を伴う不斉自己触媒反応を行うことにより高い鏡像体過剰率のピリミジルアルカノールを得ることを目的として研究を行った.まず,ピリミジルアルカノールに超高圧水銀ランプで発生させた光をフィルターを通さず直接照射(ただし赤外線を吸収させるため水のフィルターを通した)したところ,良好な収率でピリミジルアルカノールの変換(または分解)反応が起こることを見出した.溶媒として,トルエン,ヘキサンなどを用いることができた.つぎに光を,水フィルター,313nmのUVフィルター,偏光版,および4分の1波長版の順に通過させて右または左円偏光とし,ラセミ体のピリミジルアルカノールに照射して変化を調べた.その結果,ラセミ体のピリミジルアルカノールの変化はフィルターを用いない場合よりもかなり遅いことが明らかになった.フィルターを用いない場合は,各種の波長の光が照射されるのでピリミジルアルカノールの変化が速かったものと解釈できる.そこで,不斉光反応(分解)を効率良く起こさせるためには,より適切な波長の円偏光を照射することが鍵となることを予測した.さらに,光増感剤を添加して光反応を助長することを試みた.また,ピリミジルアルカノールの亜鉛アルコキシドに同様に円偏光を照射して不斉誘起を試みた.5-ブロモピリミジンにブチルリチウムを作用させてリチオ化し、イソブチルアルデヒドと反応させてラセミ体のピリミジルアルカノールを合成した。
亜鉛フィンガータンパク質の細胞内活性酸素種に対するセンサー分子としての機能解明

本研究では、ヒト転写因子由来のSp1 ZFPを用い、各フィンガードメイン(Sp1-F1,F2およびF3)および3フィンガー体(Sp1-F123)の構造および酸化反応性や安定性、DNA結合能について検討を行った。過酸化水素を用いた酸化反応の結果、反応性がF1>>F2>F3となり、各フィンガーの酸化反応に対する非等価性が示された。また、酸化によりDNA結合能が失われることが明らかとなった。今年度は、種々のROSとCys2His2型Sp1ZFPとのレドックス反応メカニズムの解明について検討を行った。特に生体内で広く認められる活性酸素種であるH2O2を用いて酸化実験を行った。3つのフィンガードメインから成るSp1 ZFPの各フィンガードメインと(Sp1-F1,F2およびF3)とH2O2との反応について検討を行ったところ、H2O2の濃度が低い場合は、いずれのフィンガーにおいてもジスルフィド結合が形成され、酸化反応性はドメイン間で大きく異なりF1>>F2>F3の順となった。また、H2O2の濃度が高い場合、フィンガーによって酸化反応による生成物が異なり、F1ではジスルフィド結合のみが形成されるが、F2およびF3では更に酸化が進み酸素が1つ付加した不可逆的な酸化体まで反応が進行する興味深い結果が得られた。フィンガー間の酸化反応性の違いについて考察するために、各フィンガードメインと亜鉛イオンとの結合定数を決定したところ、結合定数の大きさが酸化反応性とは逆のF1<F2<F3となりF1は他のフィンガードメインよりも100倍程度結合定数が小さいことが明らかとなった。この結果から、恐らく酸化反応性はZn(II)との配位結合の安定性に大きく影響を受け、安定な配位結合が形成されることに反応に関与するCys残基のチオール基が保護れることにより酸化が受けにくくなると考えられる。酸素付加体については、これまでにジスルフィド部分にさらに酸素が付加したS-S=O型酸化体が形成されると報告されているが、今回フィンガーのZn(II)結合に関与するCys残基をAla残基に変えた変異体を用いて酸化反応を行ったところ、その場合でも1つ酸素原子が付加した生成物が得られたことから、現在のところS-S=O型酸化体でない別の生成物が酸化反応によりできていると考えている。今年度は、ヒト転写因子のDNA結合ドメインであるSp1亜鉛フィンガータンパク質とH2O2との酸化反応についてより詳細に検討を行った。これまでの検討から、酸化反応後の生成物の質量をMALDI-TOFマスにより測定すると、Sp1-F1では還元体から2マス減少するが、Sp1-F2,F3では14マス増加することが分かっている。14マス増加の理由は、以前の報告例を参考にすると、Sp1-F2,F3ではジスルフィドの他に、さらにその部分が酸化されてS-S=O酸化体が生成していると予想された。そこで、S-S=O酸化体をTCEPで再還元してマス測定を行うと、分子量が還元体と比較して16マス増加することが分かった。この結果から、O原子がペプチドに1つ付加していることが考えられ、S-S=O酸化体の構造ではこの現象の説明がつかないことが分かった。そこで、Cys残基をAla残基に置換した変異体を作製し酸化反応を行ったところ、SH基がなくても16マス増加が認められ、他のアミノ酸が酸化を受けていることが明らかとなった。Sp1-F2,F3の配列を見てみると配列中にMet残基があり、一般的には酸化反応を受けやすいアミノ酸残基として知られている。そこで、このMet残基をAlaに置換した変異体を作製し酸化反応を行うと、反応生成物が還元体より2マス減少したことから、Met残基がCysのSH基と同時に酸化されてS=Oが形成されていることが明らかとなった。次に、Sp1-F2,F3の各フィンガードメインの酸化体を再還元して得られるO付加体の構造をCDスペクトルにより検討を行ったところ、いずれの場合もMet残基にO原子が付加していても、CysのSH基が回復することによりZn(II)と結合し、二次構造を形成することが明らかとなった。また、金属置換体フィンガーの酸化についても検討い、金属イオンの重要性を明らかにしている。Sp1亜鉛フィンガーを用いて過酸化水素との反応性について詳細に検討を行った。これまでの報告例を一部異なる結果が得られたために、その理由を探索するのにやや時間がかかったが、その理由を明確にすることができた。また、構造解析についてもCD,NMRの検討を開始している。よって、ほぼ当初の計画通りに研究が進んでいると判断する。本研究では、3つのフィンガードメインを有し、レドックス応答性といわれているSp1 ZFPを用い、各フィンガードメイン(Sp1-F1,F2およびF3)および3フィンガー体(Sp1-F123)の構造および酸化反応性や安定性、DNA結合能について検討を行った。F1ではジスルフィド型酸化体のみ生成するが、F2およびF3ではジスルフィド体が生成し、さらにMet残基のSが酸化されスルホキシ型酸化体も生成することが明らかとなった。

また、酸化反応後の生成物をTCEPによる還元反応を行ったところ、F1ではジスルフィド部分は還元されたが、F2およびF3の場合、ジスルフィド部分はF1同様にTCEPにより還元されSH基に戻ったが、Met残基のスルホキシ部分はTCEPにより還元されず、不可逆的な酸化反応が起こっていることが明らかとなった。酸化型の各フィンガードメインは、CysのSH基がS-S結合を形成しているためにZn(II)と配位できず、適切な二次構造が形成できないことが分かった。また、再還元型の各フィンガードメインは、Met残基の酸化によるO原子付加の位置により、フィンガードメインの二次構造誘起のされ方が異なることが明らかとなった。3フィンガー体であるSp1-F123の酸化反応後は、1および2つのジスルフィド結合を含む酸化体、さらにすべてのSH基が酸化されて3つのジスルフィド結合をもちかつ1あるいは2つの酸素をMet残基の部分に有する酸化体が生成していることが明らかとなった。さらに、酸素付加体の酸化体に対してゲルシフトアッセイを行ったところ、すべての酸化体ではDNA結合能は失われており、TCEP還元反応により得られた再還元体では1酸素付加体ではDNA結合能が回復したが、2酸素付加体ではDNA結合能が回復しないことが明らかとなった。本研究では、ヒト転写因子由来のSp1 ZFPを用い、各フィンガードメイン(Sp1-F1,F2およびF3)および3フィンガー体(Sp1-F123)の構造および酸化反応性や安定性、DNA結合能について検討を行った。過酸化水素を用いた酸化反応の結果、反応性がF1>>F2>F3となり、各フィンガーの酸化反応に対する非等価性が示された。また、酸化によりDNA結合能が失われることが明らかとなった。今年度の計画では(a)Zn(II)との配位結合の安定性、(b)ドメイン構造の安定化に寄与している疎水性コアの構造、(c) Cys残基(SH基)の近傍に位置するアミノ酸残基の影響、の3つの項目を種々の酸化剤を用いて検討することを考えていた。(a)の部分についてはほぼ達成できたと考えている。(b)のドメインの安定性についても現在NMRを用いて温度可変測定することにより検討を進めている。(c)についてはまだ着手されていないが、次年度に検討したいと考えている。概ね研究計画は順調に進行していると考えられる。最終年度は残りの細胞内でのレドックスに関する研究計画を実行することともに、現在得られているデータをブラッシュアップし、学会、論文に発表することを目標とする。複合新領域生物分子化学概ね研究計画は順調に進行していると考えている。次年度後以降は、上述の検討が十分になされていなかった部分を補完するとともに、申請時の研究計画に記載した、配位子パターンの異なるZFPのレドックス挙動の検討、ならびに酸化型ZFPを用いた細胞内レドックス探索プローブの開発につても研究を開始したい。今年度の計画で一部遂行が不十分な部分があり、その部分を次年度に実験を行うため。次年度に計画遂行の不十分な部分の実験を行うための物品費(主に試薬)に使用する予定である。
ショウジョウバエにおけるヒト前立腺相同器官＝附属腺の発生メカニズム

昆虫のオスの内部生殖器官=附属腺は多種のペプチドを産生し、それらは交尾の際に精子と共にメスに送られ、食欲増進・産卵促進・交尾拒否をもたらす点で、オスの繁殖戦略上、重要である。ショウジョウバエ附属腺では、特有の二核細胞集団が形成され、精液貯蔵量に可塑性を与えることがわかった(Taniguchi et al. 2012)。また、附属腺の原基の細胞群は、蛹期に細胞周期を斉一化させ、同調的に二核化を行うことがわかった。二核状態を変化させる突然変異体またはRNAi系統を検索した結果、微小管結合タンパク質の1つMud/NuMAのうち、特定のスプライシングバリアントが中心的役割を果たすことが解明された。本研究では、ヒト前立腺に類似するショウジョウバエ附属腺における、特異な二核細胞集団の発生機構解明に焦点をあてる。研究代表者らは、この二核細胞集団が、一核細胞集団の同調化した細胞周期制御と最終細胞周期における細胞質分裂の放棄によって一斉に起きることを明らかにしてきた。本研究ではさらに、(1)二核化がどのような因子の働きによって生じてくるのか?(2)二核細胞集団の存在意義が何か?を明らかにすることを目的とする。リンシグナルと二核化との関係を解析する。本研究では、ヒト前立腺と同様な役割を果たす器官と考えられている、ショウジョウバエ附属腺(accessory gland)における、特異な二核細胞集団の発生機構解明に焦点をあてる。研究代表者らは、ショウジョウバエ附属腺の二核細胞集団が、少数の二核細胞からの増殖により生まれるのではなく、最終細胞周期の細胞質分裂の放棄によって、一斉に起きることを明らかにした。本研究では、この二核化がどのような因子の働きによって生じてくるのか、及び二核細胞集団の存在意義が何であるのかを明らかにすることを目的としている。本年度は以下のような実験を計画し、行った。1.附属腺の発生には、初めにFGFシグナルによる中胚葉細胞のリクルート、続いて転写因子Pairedの関与が知られている。二核化の起きる発生ステージを明かにすると共に、これらの因子が如何に関与するのかを探究した。その結果、二核化の起きる発生ステージは蛹中期の一時期であり、転写因子Pairedの関与は細胞種特異的であることが明かとなった。2.附属腺の二核細胞集団の中には、細胞が委縮して貪食されるような、特殊な姿を見せる像が存在することがある。研究代表者らはこれをアポトーシスに代わる細胞の消化と予想しているが、通常のアポトーシスの際にも良く見られる、細胞層からの離脱も伴うことが明らかとなった。また、各種のファゴソーム/リソゾーム・マーカーは検出されにかったが、これは固定後の細胞の性質によるものかも知れず、今後の検討を要する。3.すでに同定済みの細胞種特異的な二核形成不全を見せるトランスポゾン・タギング変異体の遺伝子座マッピングを進めた。本研究は、ヒトの前立腺と同様な役割を果たす器官と考えられている、ショウジョウバエの附属腺(accessory gland)における、特異な二核細胞集団の発生機構解明に焦点をあてたものである。昨年度までの研究において、附属腺の二核細胞集団が、少数の二核細胞の増殖により生まれるのでなく、通常存在する一核の増殖細胞集団が、最終細胞周期における細胞質分裂を放棄することによって生じることが明らかとなっていた。今年度は、発生ステージを追ったM期およびS期細胞の検出により、この最終ステップの細胞質分裂放棄(2核花)が、通常の細胞周期制御では認められない明確な同調性をもって一斉に生じることが明らかとなった。しかしながら一方でこの同調性には局所的な傾向も認められ、まず、附属腺上皮を構成するmain cellと2ndary cellとの間での同調性のずれ、そしてmaincell集団のPD軸に沿った位置における同調性のずれなどが再現性良く認められた。次に、この細胞質分裂放棄がどのようなしくみによって生じてくるのかを知るために、核分裂の極性や紡錘体の様々な部位を可視化する実験を行った。その結果、2核化を起こす際の核分裂は通常の細胞分裂の際の核分裂とは極性が90°異なることがわかった。また、分裂後期(Anaphase)に分配されつつある染色体群の間に生じるべき中央紡錘体(central spindle)の形成が不全であることがわかった。極性転換の実験や、中央紡錘体強化の実験により、細胞質分裂放棄においてこれらの特徴が果たす役割を解析中である。

昨年度までの研究において、附属腺の二核細胞集団が、少数の二核細胞の増殖により生まれるのでなく、通常存在する一核の増殖細胞集団が、最終細胞周期における細胞質分裂を放棄することによって生じること、およびそれが明確な同調性をもって一斉に生じることが明らかとなっていた。また、一方でこの同調性には局所的な傾向があり、まず、附属腺上皮を構成するmain cellと2ndary cellとの間で同調性がずれ、そしてmain cell集団のPD軸に沿った位置における同調性がずれることなども認められていた。さらに、2核化を起こす際の核分裂は通常の細胞分裂の際の核分裂とは極性が90°異なること、また、分裂後期(Anaphase)に分配されつつある染色体群の間に生じるべき中央紡錘体(central spindle)の形成が不全であることも判明していた。当該年度は、これらの特徴をさらに検証し、核分裂の極性転換については、2核化の主要な要因を担っているものではなく単なる付随現象であること、中央紡錘体の形成についてはそれの強化によって細胞質分裂の特徴が増強されることから、主要な良い員であることが明らかとなった。さらに、この中央紡錘体形成不全を導く因子の探索を行ったところ、従来知られていなかった微小管結合因子のひとつが、その役割を果たす可能性について検証することができた。この因子を除去すると、野生型よりも細胞質分裂の特徴が明確化され、またこの因子を異所的に強制発現すると、2核化を導くことができることなどが明らかとなった。本研究では、ヒトの前立腺と同様な役割を果たす器官と考えられている、ショウジョウバエの附属腺(accessory gland)における、特異な二核細胞集団の発生機構解明に焦点をあてている。応募者らは、ショウジョウバエ附属腺の二核細胞集団が、少数の二核細胞からの増殖により生まれるのではなく、通常認められる一核細胞集団が、同調化した細胞周期制御と、最終細胞周期の細胞質分裂の放棄を見せることによって一斉に起きることを明らかにしてきた。本研究ではさらに、この二核化がどのような因子の働きによって生じてくるのか、及び二核細胞集団の存在意義が何かを明らかにすることを目的としている。本年度の研究実施計画としては、ショウジョウバエ附属腺における二核化のメカニズムを探るために、以下の研究を行った。1.附属腺の細胞質分裂停止に影響する因子として昨年度までに同定したものの機能解析を更に進めた。その結果、Mud/NuMAに関連する新規因子が中央紡錘体の不安定化を介して二核化を進めていることがわかった。2.附属腺の二核細胞集団の中では、特定の細胞が萎縮して貪食されたり、上皮の頂端側に追い出されたりする特殊な姿を見せる時がある。これはアポトーシスに代わる異常/老化細胞の消化機構と予想され、それらを調節する細胞間シグナル、およびそれらの目的について、昨年度に引き続いて研究を進めた。その結果、NotchやJAK-STATなどのシグナルが複合的に介在していることがわかった。3.附属腺細胞における二核化の意義を知るために、インスリン依存的な細胞成長と二核化との関係を昨年度に引き続いて研究した。その結果、附属腺細胞は、他の細胞種と比べてもより効果的にインシュリンの影響を受けて成長することがわかったが、それと二核化との間には因果関係はないことが明らかとなった。
ラパマイシン標的分子をターゲットとした高齢者の心不全治療法の開発

心不全は高齢者に多く見られる加齢関連疾患である。一度心不全を発症すると入退院を繰り返し患者のみならず家族と社会へ多大な負担を強いることから、その適切な管理は健康政上の大きな問題である。一方で加齢にともない壮年期から心機能が低下することも知られている。加齢は心不全の危険因子であり、加齢に伴う心臓の変化(心臓老化)は加齢関連疾患である心不全の発症基盤となっている可能性があるが、心臓老化の機序解明への取り組みは十分でない。本研究ではモデル動物の研究により寿命の調節に大切であることが明らかとなったインスリン・シグナル伝達経路の心不全と心臓老化における役割を検討した。本研究において以下の結果が得られた。1.ラパマイシンが拡張型心筋症モデル動物の心機能を改善した。2.レスベラトロールが自己免疫性心筋炎モデル動物の心筋障害と心不全を改善した。3.インスリン・シグナル伝達経路の活性調節が心臓老化が予防した。4.解凍系の活性調節がラット高血圧性心不全モデルの病態を改善した。インスリン・シグナル伝達経路が心臓老化と、心不全の発症および進展に関与していることが示された。インスリン・シグナル伝達経路への介入により、高齢者心不全患者に対する新しい予防法と治療法が開発されるものと期待される。1.拡張型心筋症モデルに対するラパマイシンの効果これまでの我々は、ラパマイシンが圧負荷による心肥大を予防し、また圧負荷によって生じた心肥大を退縮させることを報告した。また、ラパマイシンは自己免疫性心筋炎モデルにおいて炎症を減少させ心不全を軽減した。ラパマイシンが心拡張を主体とする心不全においても心臓を小さくする働きがあるかを検討するため、心筋症ハムスターにラパマイシンを1ヶ月間投与した。ラパマイシンは心重量の増加を有意に抑制した。ポリ乳酸製剤にラパマイシンを結合させたものをラット自己免疫性心筋炎モデルに静脈注射した。対照として通常の溶解法にて溶解されたラパマイシンをラット自己免疫性心筋炎モデルに静脈注射した。現在までに2種類の直径のポリ乳酸製剤を使用したが、対照と同等の心筋炎が観察された。経静脈投与では肝臓によりポリ乳酸製剤製剤が捕捉される可能性があるものと考えられた。3.心臓におけるTOR関連老化シグナル分子SIRT1の機能ラットの自己免疫性心筋炎による心不全モデルの心臓組織で、酵母、線虫、ショウジョウバエなどのモデル動物で長寿遺伝子であることが知られているSIRT1のmRNA量と蛋白量が増加していた。SIRT1増加の意義を検討するため、自己免疫性心筋炎ラットにSIRT1の活性化剤であるレスベラトロールを投与した。レスベラトロールは炎症を抑制し心筋障害を軽減した。また、ラバマイシンは自己免疫性心筋炎モデルにおいて炎症を減少させ心不全を軽減した。ラバマイシンが心拡張を主体とする心不全においても心臓を小さくする働きがあるかを検討するため、心筋症ハムスターにラバマイシンを1ヶ月間投与した。ラバマイシンは心重量の増加を有意に抑制した。心臓カテーテル検査による血行動態の評価をおこなったところラバマイシンは心筋症ハムスターの心機能を改善していた。2.実験的自己免疫性心筋炎ラットに対するレスベラトロールの効果ラットの自己免疫性心筋炎による心不全モデルの心臓組織で、酵母、線虫、ショウジョウバエなどのモデル動物で長寿遺伝子であることが知られているSIRT1のmRNA量と蛋白量が増加していた。レスベラトロールは炎症を抑制、心筋障害を軽減し、心筋炎動物の心機能を改善した。心筋炎により抗酸化酵素(Mn-SOD, Cu/Zn-SOD)のmRNA量は増加したが、レスベラトロールは抗酸化酵素mRNAの増加を抑制した。レスベラトロールは心臓での酸化ストレスを軽減することにより心筋障害を軽減した可能性が示唆された。3.インスリン・シグナルの心臓老化における役割の検討

心臓老化におけるインスリン・シグナルの役割を検討するため、3ヶ月齢および20ヶ月齢の野生型マウス(NTg)、活性型PI3K (constitutively active PI3K、caPI3K)トランスジェニックマウス、抑制型PI3K(dominant-negative PI3K、dnPI3K)トランスジェニックマウスの心臓組織を用いてmRNAマイクロ・アレー解析による遺伝子発現の網羅的解析を行った。3ヶ月齢のNTgと20ヶ月齢のNTgの間で遺伝子発現パターンに有意な差がみられ、そのパターンの変化はPI3Kトランスジェニックマウスにおいて修飾されていた。よってインスリン・シグナルが心臓の老化過程に影響を与えている可能性が示唆された。1.心臓老化におけるインスリン・シグナルの役割を検討した:加齢は心不全の大きな危険因子である。心臓老化におけるインスリン・シグナルの役割を検討した。若齢(3ケ月齢)および老齢(18-22ケ月年)の、野生型マウスおよび、心臓特異的にphosphoinositide-3-kinase (PI3K)を抑制したマウス(dnPI3Kマウス)の心機能を測定し、病理学的解析を行った。dnPI3Kマウスでは老化に伴う心機能低下が抑制されていた。また、老化による炎症性サイトカイン、線維化、酸化ストレスマーカーの増加がdnPI3Kマウス群では抑制された。マイクロアレイを使用した網羅的遺伝子発現解析により、野生型マウス群の老化により発現量が変化する遺伝子が同定され、それらの遺伝子発現は老化dnPI3Kマウス群において抑制された。インスリン・シグナル経路は心臓老化を制御する重要なシステムであり、その抑制により加齢に伴う心機能の低下を予防しうることが示唆された。2.心不全における解糖系の役割を検討した:心不全の発症と進展には心筋代謝の変化を伴う。心肥大期から解糖系を促進する薬剤を慢性投与し心機能と心筋代謝に与える影響を検討した。ダールラットに、6週齢から高食塩餌を投与すると、高血圧を発症し11週齢で心肥大をきたし17週齢から19週齢で心不全にて死亡する。Dichloroacetate (DCA)は、pyruvate dehydrogenaseを活性化し解糖系を促進する薬剤であるが、11週齢の心肥大期から、DCAを経口投与した。DCAは、心不全期のラットの血圧・左室重量に影響せず、エコー上の心機能を改善し、生存率を改善した。解糖系は心不全の発症において保護因子として働いている可能性が示唆された。
モノクローナル抗体を機軸とした天然活性化合物研究

1)モノクローナル抗体を用いた研究2003年正山等により開発された新規染色法であるイースタンブロットによりアメリカ人参の粗エキスを2重染色したところ、未知化合物と推察されるスポットを見出したので、各種カラムクロマトを繰り返し精製し、2種の人参サポニンを単離構造決定を行ない、quinquenoside Ja,quinquenoside Jbと命名した。2)タイ産植物の活性成分探索研究タイ産のMammea siamensisの花のエキスがヒトがん細胞の増殖阻害とアポトーシスを惹起することを発見した。細胞増殖阻害作用を指標として活性画分を濃縮し、活性成分を単離構造決定を行なった。単離した化合物群の中で、イソプレン側鎖を持つクマリン類が強い細胞増殖阻害とアポトーシスを引き起こした3)サフランに関する研究サフランの活性成分探索は長年継続しており、記憶学習改善作用、長期増強(LTP)の改善作用、抗皮膚がん活性等を明らかにし、その活性成分がクロシンであることを特定した。現在4人に1人が睡眠傷害を持つと言われており副作用の無い薬物が望まれている。そこでクロシンの睡眠作用を調査した。クロシンを投与したマウスの脳波解析から、ノンレム睡眠を惹起することを突き止めた。クロシンには運動抑制は若干見られるもののレム睡眠は起こらないことを明らかにした。漢方薬の中には睡眠傷害を改善するものも有るので、サフランと漢方薬の併用効果等を明らかにする予定である。先にヒト大腸がん細胞を用いて、サフラン及びクロシンが強い阻害活性を持つことを明らかにしているので、大腸ガン誘引化合物を投与し、担ガンモデルマウスを作成しクロシンを投与したところ、抗ガン作用が明らかになり、その作用メカニズムとして免疫関連因子の抑制によることを明らかにした。当研究室において推進しているモノクローナル抗体を用いた研究と癌細胞系を用いた活性成分の探索研究と当該博士研究員の有機化学的研究能力が相まって、新しい活性成分の単離構造決定を遂行する事が出来、論文発表も行なった。当該博士研究員の2年間の研究期間は24年10月で終了したが、研究能力に鑑み得難い人材と判断し、24年11月から1年間の雇用契約を結び現在研究を継続しており、コンスタントな研究成果が出ている。(1)抗HIV,抗トリパノソーマ活性成分の探索抗HIV活性が認められたプロシアニジン類の2両体と3両体の一部を単離構造決定した。それら純粋な化合物については現在その活性を調査中。抗トリパノソーマ活性が予想される紫根、アルカンナ根、ザクロ皮、ムベ等の生薬を抽出し現在抗トリパノソーマ活性を評価中である。(2)イースタンブロットによる生薬研究:アメリカ人参をメタノール抽出後、クロロフォルム、酢酸エチル、ブタノールの順に水と分配し、それぞれの可溶性画分を得た。ブタノール画分を各種カラムクロマにより化合物を単離した。NMR,MS等のスペクトル解析により現在までにモノテルペン配糖体を新化合物を含み数種単離構造決定した。引き続き新規化合物の探索とそれらの生物活性を検討中。現在イースタンブロットにより新ギンセノシドと考えられる成分を確認中であるので、引き続きイムノアフィニティーカラムを含めた各種カラムクロマトにより成分を精製単離し構造解明を行う。(3)ノックアウトエキスの作成と活性成分の確定:本プロジェクトでは甘草エキスから抗グリチルリチンモノクローナル抗体を装着したカラムによりグリチルリチンをワンステップで単離した。一方洗浄フラクションには粗甘草エキスからグリチルリチンのみが除かれたノックアウトエキスである。本ノックアウトエキスをマウスマクロファージ細胞系を用いて、NO産生能を評価した結果、NO産生阻害作用はグリチルリチンと他の成分の相互作用によるものと推察した。(4)サフランの活性成分の探索:サフランの粗抽出エキスをセファデックスカラムで精製し、新しいクロセチン配糖体を単離構造決定した。本化合物はクロシンをコントロールとしてノンレム睡眠等、クロシンにより明らかとなった活性を調査する予定にしている。1)モノクローナル抗体を用いたイースタンブロットによる活性成分の探索研究:イースタンブロッテイングの手法はノーザン、サザン、ウエスタンブロってイングに次ぐ4番目の染色法として、正山等が世界に先駆けて開発したもので、本法を応用して活性成分の探索研究を展開している。(1)アメリカ人参のイースタンブロットを基にメタノールエキスを各種クロマトにより精製し、ジンセノシドRb1,Rc,Re,Rg1等メジャーな人参サポニンの他に、quequenoside Ja,Jbと命名したジンセノシド類を単離構造決定した。それぞれプロトパナクサトリオール、プロトパナクサジオールをアグリコンとし、糖をそれぞれ4個、5個結合した新ジンセノシド類である。今後バイオアッセイを検討する予定である。(2)人参と同じウコギ科に属するエゾウコキ(Acantopanax)には人参に含まれるジンセノシド類は含まれないとの見解があるが、我々は同じウコギ科に属するハリギリから、イースタンブロットを応用することにより、微量のギンセノシドRb1を単離した経験があるので、本研究ではエゾウコギの葉のメタノールエキスを探索した。粗エキスを水と各種有機溶媒によりパーティション分画をおこなった。ブタノール分画を各種クロマとにより精製し、ギンセノシドRb1の発色とELISAによる確認を行い、エゾウコギにギンセノシドRb1の含有を確認した。2)抗トリパノソーマ活性成分の探索

研究:トリパノソーマは睡眠病を引き起こす原虫で世界的には多くの人が罹患しているにも関わらず、効果的な治療薬が無い状況である。本プロジェクトでは候補植物としてアルカンナ根とハンノキを避び、抗トリパノソーマ活性を指標として抽出・精製・単離を行い活性成分の特定を行う。(1)アルカンナ根をメタノール抽出し、各種溶媒で分画し、クロロフォルム層に活性が認められたので、各種クロマトを繰り返し、10個のalkanin関連化合物であるナフトキノン類を単離し構造決定を行なった。これらの内4種は新化合物である。これらの内6種の化合物に強い活性が認められた。(2)ハンノキ樹皮のエキスを溶媒によるパーティションを行い、抗トリパノソーマ活性の認められたクロロフォルム層を各種クロマトを繰り返し、10種の化合物を単離し構造決定を行なった。その内4種は新規化合物であった。6種に強い抗トリパノソーマ活性が認められたので、今後構造活性相関等を検討する予定である。1)モノクローナル抗体を用いた研究2003年正山等により開発された新規染色法であるイースタンブロットによりアメリカ人参の粗エキスを2重染色したところ、未知化合物と推察されるスポットを見出したので、各種カラムクロマトを繰り返し精製し、2種の人参サポニンを単離構造決定を行ない、quinquenoside Ja,quinquenoside Jbと命名した。2)タイ産植物の活性成分探索研究タイ産のMammea siamensisの花のエキスがヒトがん細胞の増殖阻害とアポトーシスを惹起することを発見した。細胞増殖阻害作用を指標として活性画分を濃縮し、活性成分を単離構造決定を行なった。単離した化合物群の中で、イソプレン側鎖を持つクマリン類が強い細胞増殖阻害とアポトーシスを引き起こした3)サフランに関する研究サフランの活性成分探索は長年継続しており、記憶学習改善作用、長期増強(LTP)の改善作用、抗皮膚がん活性等を明らかにし、その活性成分がクロシンであることを特定した。現在4人に1人が睡眠傷害を持つと言われており副作用の無い薬物が望まれている。そこでクロシンの睡眠作用を調査した。クロシンを投与したマウスの脳波解析から、ノンレム睡眠を惹起することを突き止めた。クロシンには運動抑制は若干見られるもののレム睡眠は起こらないことを明らかにした。漢方薬の中には睡眠傷害を改善するものも有るので、サフランと漢方薬の併用効果等を明らかにする予定である。先にヒト大腸がん細胞を用いて、サフラン及びクロシンが強い阻害活性を持つことを明らかにしているので、大腸ガン誘引化合物を投与し、担ガンモデルマウスを作成しクロシンを投与したところ、抗ガン作用が明らかになり、その作用メカニズムとして免疫関連因子の抑制によることを明らかにした。当該博士研究員は植物成分を精製単離し、構造決定を行う研究に長けており、本プロジェクトの主テーマである、モノクローナル抗体を応用することにより、成分の分画・精製が格段にス画ドアップされ、多くの化合物を単離し、構造決定を行なっている。
トマトの夜間における生育と窒素吸収

1.トマトは夜間に生長著しく,昼間の4倍の増体重を示しながら生長することが明らかとなった。しかし、根の伸長速度は2mm/hで昼夜間差は認められなかった。2.根から地上部への養分輸送濃度の日変化を知るため、株を1時間毎に24時間にわたって茎を切断し木部いっ泌液分析を行った。いつ液量は正午前に最高となり、リン濃度は午後10時頃にカリ濃度は午前10時頃に最高となった。硝酸態窒素、カルシウム、マグネシウムは夜間に僅かに濃度が高まる傾向にあった。自然光の30%に遮光すると、その日の午後6時および午前0時にリンを除いて、どの成分濃度も対照区より著しく低くなった。リン濃度は遮光区の方がはるかに高くなった。また,齢の進んだ株ほど成分濃度は低くなったが、カリ濃度だけは齢が進んでもほとんど変化しかった。3.夜間吸収窒素( ^<15>N)は、朝方にはその約50%が葉に、約10%が茎に、約40%が根に存在していた。昼間吸収窒素( ^<15>N)は、夕方にはその約70%が葉に、約10%が茎に、約20%が根に存在していた。夜間吸収窒素の葉ヘの流入量は昼間吸収窒素の1/81/12であり、果実への殆ど流入しなかった。しかし、ガクと果柄には流入していた。翌日の昼間に夜間吸収窒素は果実に流入した。4.人工光下(18Kルックス)でのトマトの生育は4時間暗期ー20時間明期で最も良く、連続照明下では20日目頃より葉のクロロシスが激しくなり下位節ではネクロシスとなる葉も出現した。葉のクロロフィル含有率は連続照明で著しく低く、1時間暗期挿入の約60%となった。1時間の暗期挿入で暗期8時間のそれと同程度にまで回復した。カルシウムは連続照明と1時間暗期で著しく低下し、48時間暗期の約70%となった。また、鉄は連続照明で14時間暗期と差が無かったが、亜鉛は低く18時間暗期の約60%となった。葉分析の結果、連続照明で低下する成分はカルシウムとマグネシウムであることが分かった。トマトの夜間(18:00ー6:00)の生体重増加は昼間のそれの45倍を示しながら推移していくことが分かった。夜間の増体は水と養分の取り込みと蒸散による放出ならびに呼吸による光合成産物の消費、それらの収支として理解される。根から地上部への養分輸送濃度は、Mg,Ca濃度が前夜半に若干高まり、リンが真夜中に著しく高まる。NO_3ーNは1日中大きな変化はない。これら成分の濃度パタ-ンとは異なり、カリは明け方から正午にかけて著しく上昇し、1日のうちリンとカリは全く逆の濃度パタ-ンで推移していることが分かった。光強度が低下すると、リンを除いてどの成分も濃度が低下し、この低下は午前0時になっても回復しなかった。リンは特異的で光強度が低下すると濃度が高くなった。また、カリを除いては苗齢が進むほど輸送成分濃度は低下することが分かった。

養分吸収濃度(成分吸収量/水吸収量)は夜間の方がどの成分も高くなる事は分かっているが、リンを除いてそれが輸送濃度に反映しないことは吸収と移行にかなりのTimeーlagがあるのではないかと考えられた。そこで、^<15>Nを用いてこの点を調べたところ、夜間吸収窒素の明け方における占有率は16.4%で時間の経過につれて徐々に低下し、12:00で7.05%,18:00で6.10%となった。1日後でも5.7%と吸収と移行のTimeーlagはかなり長いことが明らかとなった。夜間の吸水はわずかであるが窒素は昼間の5割も吸収される。人工育成器は8月納入で、照度17000lux、気温25°C、相対湿度70%で発芽段階からトマトを栽培したところ、12時間暗期(12時間明期)では1か月経過しても、よく生育するが、連続照明では10日後には既に葉の展開が異常を示し、葉色は薄くアントシアンの発現が著しく20日後には殆ど生育不能となった。しかし、根の生長は連続照明の方が良く、光合成産物の地上部と地下部への分配に偏りの生じる事が示唆された。人工気象器(1万8千ルックス)を用いて24時間を一サイクルとし,トマトの暗期に対する生育反応を調査した。1.トマトの生育は4時間暗期一20時間明期で最も良く,連続照明下では,既に10日目頃から葉の裏側にアントシアンが生成し紫色を呈するようになった。20日目頃より葉のクロロシスが激しくなり,下位節ではネクロシスとなる葉も出現した。単位新鮮重当りの葉のクロロフィル含量は連続照明で著しく低く,1時間暗期挿入の約60%となった。1時間の暗期が挿入されると,クロロフィル含量は暗期8時間のそれと同程度にまで回復した。2.茎葉の全炭素と全窒素の含有率は連続照明で若干高まり,リン,カリおよびマグネシウムは日長による一定の傾向は示さなかった。しかし,カルシウムは連続照明と1時間暗期で著しく低下し,48時間暗期の約70%となった。また,鉄は連続照明で14時間暗期と差がなかったが,亜鉛は低く18時間暗期の約60%となった。3.葉のクロロシス及びネクロシスが,どの成分の欠乏によって生じているかを知るため葉分析を行ったところ,連続照明で低下する成分はカルシウムとマグネシウムであった。特に,カルシウム含有率は8時間暗期の約40%と著しく低かった。鉄,亜鉛の含量には大きな差は認められなかった。以上の結果より,夜(暗期)がないとカルシウムとマグネシウムの葉での含有率が低下し,クロロシス及びネクロシスの発現に到るものと推察された。
勤労者の生活習慣、血中ビタミン値と上下肢血圧比、容積脈波の関連についての疫学研究

勤務者男性約250人の上下肢血圧比(ABI)、上腕-足首脈波伝播速度(baPWV)を測定した。同時に血中の直接的・間接的抗酸化ビタミンであるα-トコフェロール、葉酸、ビタミンB12、炎症反応指標であるCRP(C反応性蛋白)、喫煙や飲酒などの生活習慣を測定し、ABI、baPWVとの関連を検討した。各血液検査指標の平均値は、α-トコフェロール;38.9μmol/、葉酸;15.4nmol/L、ビタミンB12;295pmol/L、CRP(geometric mean);0.47mg/Lであった。下肢の動脈閉塞症が示唆されるABI0.9未満の者は3名に過ぎず統計学的な解析は不可能であった。baPWVは年齢によって大きな差があるため、対象者のうち50歳代で循環器疾患の既往歴がなく、ABIが正常かつCRPの上昇を伴う急性・慢性炎症を持つ者を除外した178名を解析対象とした。baPWVの平均値は1468cm/sec(標準偏差;221)であり、単変量解析では、年齢、CRP、収縮期と拡張期の血圧値、心拍数、空腹時血糖値がPWVと有意な正の関連を示し、逆に血清脂質、BMI、葉酸、ビタミンB12、α-トコフェロール、喫煙、飲酒は関連を示さなかった。線形重回帰分析で危険因子相互の関連を調整すると、年齢、血圧値(収縮期または拡張期)、心拍数、CRPのみがbaPWVと有意な正の関連を示した。共分散分析で他の危険因子を調整した場合、CRP四分位別のbaPWVは、1431、1436、1507、1508cm/secであった。baPWVの増加は大動脈の早期の動脈硬化性病変の存在を示唆していると考えられるため、CRPの測定は動脈硬化の早期発見に有用と考えられた。一方、抗酸化ビタミンはbaPWVとは関連せず、より進行した動脈硬化プラークの形成抑制等に関連している可能性がある。大阪市内の化学系会社を対象として、まずパイロット的に56人を対象として、上下肢血圧比(ABI)、容積脈波波(PWV)を測定した。その結果、勤労者集団ではABIの異常者が稀なこと(1名)、PWVは年齢、血圧と強い正の関連を示すため、幅広い年齢層を対象とした場合、他のリスクファクターの影響がマスクされてしまう可能性が示された。そこで同企業の50歳代男性に研究対象を絞り、主にPWVと血中ビタミン(葉酸、ビタミンB12)、C反応性蛋白(CRP、低域定量)との関連を検討することとした。50代男性の対象者は268名おり、このうち社員番号が奇数の117名をABI、PWVの測定対象者とした(平均年齢55.1歳)。血中葉酸平均値は14.2nmol/L、ビタミンB12平均値は382pmol/L、CRP平均値は11.1μmol/Lであった。このうち2名は採血時に明らかな急性感染症(感冒)を有しており、CRPの値が常態ではないと判断されたため分析から除外した。線形重回帰分析を用いて、年齢、飲酒量、肥満指数(BMI)、LDLコレステロール、HDLコレステロール、収縮期血圧値、空腹時血糖、喫煙、CRPとPWV(cm/sec)との関連を検討した。