hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
分裂酵母におけるカドミウム誘導ペプチドの合成機構

PC合成のアッセイは酵素溶液にグルタチオンとカドミウムを加え生成物であるPCを分析するシステムで行った.分析は,逆相系のカラムでPCを分離した後,5,5'(2ージチオビスニトロ安息香酸)で発色させて行った.それぞれにおいて,分離分析の最適条件を求めた.PC合成酵素の効率的な抽出を目的として,酵母細胞のスフェロプラスト化を試みた.各種セルラ-ゼ(Novozym234,Zymolyase,Funcelase)及びその混合物について,処理溶液のpH,処理時間,酵母細胞の生育時期などについて検討した.しかし,いずれの場合にも,調製途中において細胞の融解が生じ,スフェロプラスト細胞は得られなかった.一方,細胞を石英砂を加え乳鉢で粉砕することにより大部分の細胞が破砕されることが明らかになり,現在この方法を細胞の破砕法として採用している.3.カドミウムを加えないで培養した酵母細胞を上記した方法で粉砕し粗酵素液を調製した.これを硫安分画,疎水クロマトグラフィ-により精製を進めた.この後ハイドロキシアパタイトカラムによる分離を試みたが,活性のある画分が得られなかった.また,酵素自身が非常に不安定であることが判明したので,活性の損失をできる限り妨げ得る保存法についても検討を重ねている.
ウイルスの病原関連分子パターン認識を介した免疫誘導機構の解明

タバコのカルモジュリン様タンパク質rgs-CaMが免疫受容体として多くのウイルスが持つ毒性因子であるRNAサイレンシング抑制タンパク質とカルシウム流入を感知してサリチル酸シグナリングを誘導することを新たに明らかにした。また、以前の研究で見出したrgs-CaMがウイルスのRNAサイレンシング抑制タンパク質をオートファジーによる分解に導く機能が、サリチル酸シグナリングにより活性化することも明らかにできた。そしてこれらの機能が、全身獲得抵抗性と呼ばれる植物のワクチン効果様の現象におけるウイルスに対する抵抗性増強の一翼を担っていることを示した。本研究は、植物が植物ウイルスの感染を如何にして認識し、防御反応を誘導しているのか明らかにするのが目的である。植物ウイルスの多くはタンパクとRNAから成り、それらは植物の成分でもあるため、植物が自身とウイルスを区別することは難しいと思われる。申請は、これまでの研究から植物が複数のウイルス感染に伴うしるしを同時に感知することで、特異的にウイルス感染を感知していることを見出し、本年度は、その感染のしるしが何なのか探索した。その結果、当初予想していたウイルスの外皮タンパクに比べて、RNAサイレンシング抑制タンパク(RSS)を感染のしるしとしてより強く認識して防御反応を誘導することが明らかになった。多くのウイルスはRSSを持っていることから、植物がウイルスのRSSをウイルス感染に共通するしるし(病原関連分子パターンPAMPs)として認識しても不思議ではない。次に、RSSを認識する受容体がタバコのカルモジュリン様タンパクrgs-CaMである可能性について検討した。RNAサイレンシングによりrgs-CaMの発現を抑制した場合にウイルスRSSに対する防御応答が弱くなったことから、この防御応答がrgs-CaMに依存していることが示唆された。rgs-CaMが多様なRSSと結合することは既に分かっていることから、rgs-CaMがRSSをウイルスPAMPsとして認識する受容体であると結論した。さらに、rgs-CaMがRSSを認識後、どのようなメカニズムで防御応答を誘導するのか解明するために防御応答時にrgs-CaMと相互作用する宿主植物因子の探索をrgs-CaMに対する抗体を用いた免疫沈降法とSDS-PAGEにより解析したところ、候補タンパクと考えられる3本のバンドが検出され、次年度にその同定を目指すつもりである。昨年までの研究でrgs-CaMがウイルス感染時にウイルスのRNAサイレンシング抑制タンパク質(RSS)を認識してサリチル酸シグナルを誘導する免疫受容体として働くことが示唆された。また、一方で申請者はrgs-CaMはウイルスRSSに結合し、オートファジーによる分解に導きウイルス感染防御に貢献していることを報告した。そこで、本年度は、サリチル酸シグナルとrgs-CaM-オートファジーによるRSSの分解の関連について検討した結果、オートファジーによるRSSの分解はサリチル酸シグナルが誘導されたタバコ植物ないで活性化することが示唆された。これらの結果は、rgs-CaMがウイルス感染時にRSSを認識して誘導するサリチル酸シグナルにより、rgs-CaM自身によるRSSをオートファジーによる分解に導く働きを自己活性化している可能性を示していると考えられた。また、これらのrgs-CaMによるウイルス防御の分子機構を明らかにするために、二つの解析を進めた。一つはウイルス感染時などでrgs-CaMに結合する宿主因子を探索するために、rgs-CaMに対する抗体を用いた免疫沈降によりrgs-CaMに結合する宿主因子を分画し、質量分析により同定を試み、これまでに40を超える候補遺伝子を得ることができた。また、モデル植物であるシロイヌナズナのrgs-CaMに相当するカルモジュリン様タンパク質CML37とCML38、CML39のノックアウト変異体を分与してもらい、サリチル酸シグナル誘導やウイルス防御に対する貢献について検討をはじめた。昨年までに、カルモジュリン様タンパク質rgs-CaMがウイルスのRNAサイレンシング抑制タンパク質RSSをウイルスの共通分子パターンPAMPsとして認識し、サリチル酸シグナルを介した防御反応を誘導する受容体として働くこと、さらに、そのサリチル酸シグナルにより、rgs-CaM自身の持つウイルス防御機能、すなわちウイルスRSSをオートファジーによると思われる分解に導く機能が活性化すること(自己活性化)が示唆された。rgs-CaMのこれらの機能は、rgs-CaMがサリチル酸を介したウイルス防御機構、特に、プライミングと呼ばれる現象に含まれる全身獲得抵抗性に関わっている可能性が考えられたことから、本年はそれを検証した。全身獲得抵抗性とは、病原体の一次感染により植物の免疫機構が活性化(プライミング)された状態になり、病原体が二次的に感染した時、より耐性を示す現象で、現象が見つかって100年を経て、そのメカニズムは未だに良く分かっていないがサリチル酸シグナルが深く関与していること示されている。野生タバコとrgs-CaMをノックダウンした形質転換タバコに二種のウイルス(キュウリモザイクウイルスとジャガイモXウイルス)を接種した。この時、全身獲得抵抗性を誘導した場合としない場合にウイルスを接種して、接種タバコにおけるウイルスの蓄積量を比較した結果、予想通り、野生タバコでは全身獲得抵抗性誘導後にウイルス感染が阻害されたが、その阻害効果はrgs-CaMノックダウンタバコでは著しく失われた。これまでの一連の研究結果により、rgs-CaMがウイルス感染を感知する受容体およびウイルス感染を直接阻害するエフェクターの両方の機能を備え、それらがウイルスに対する全身獲得抵抗性において中心的な役割を果たしていると結論した。

また、以前の研究で見出したrgs-CaMがウイルスのRNAサイレンシング抑制タンパク質をオートファジーによる分解に導く機能が、サリチル酸シグナリングにより活性化することも明らかにできた。そしてこれらの機能が、全身獲得抵抗性と呼ばれる植物のワクチン効果様の現象におけるウイルスに対する抵抗性増強の一翼を担っていることを示した。我々がこれまでに見つけたrgs-CaMを介した二つの機能ウイルスRNAサイレンシング抑制タンパク質(RSS)のオートファジーによる分解とRSSを認識して誘導するサリチル酸シグナルの間の因果関係を明らかにすることができたこと。さらに、それらの防御機構の分子機構を明らかにするため、未知の宿主因子の候補を抗rgs-CaM抗体を用いた免疫沈降により得ることができたこと、変異体を用いた分子遺伝学などにより、その分子機構のより詳細な解析が必要なシロイヌナズナのrgs-CaMに相当するCML遺伝子ノックアウト変異体を得て、実際に解析を開始できたから。植物ーウイルス相互作用・植物自然免疫これまで得られたrgs-CaMのウイルス防御に関連した機能、すなわちウイルス感染を認識してサリチル酸シグナルを誘導する免疫受容体としての機能とそのサリチル酸シグナルにより活性化されるウイルスのRNAサイレンシング抑制タンパク質をオートファジーによる分解に導く機能、が実際のウイルス感染場面でウイルス防御にどのように貢献しているのか解明を進める。申請者は上記のようなrgs-CaMの機能から、rgs-CaMが植物で100年の謎になっている全身獲得抵抗性と呼ばれる病原体の一次感染により誘導され、二次感染に広範囲の病原体により強い抵抗性を示す興味深い生体防御機構に関わっている可能性を示しているのではないかと考えており、これを証明するための解析を免疫沈降によるrgs-CaMと相互作用する宿主因子の探索とともに、タバコだけでなく、CML変異体を含むシロイヌナズナも用いて進めるつもりである。rgs-CaMにより誘導される免疫反応の詳細を解明するために次世代シーケンスRNA-seqを用いた解析も計画している。植物が自然免疫機構を介してウイルス感染を感知するしるしとして、当初予想していたウイルス外皮タンパクではなくRNAサイレンシング抑制タンパクであることを明らかにできたからである。植物ではRNAサイレンシングがウイルス防御の自然免疫機構として主要な働きをしていることは既に分かっており、本研究で解析するもう一つの自然免疫機構はウイルスのRNAサイレンシング抑制タンパクを認識することを介して、RNAサイレンシングの免疫機構と機能的に連携している可能性を新たに見出すことができた。次年度に、次世代シーケンスや論文投稿など、費用がかかることが予想され、できるだけ節約した結果、余りが生じた。
ルリキンバエの光周反応と神経分泌細胞の活動

まず、北海道、帯広市にてルリキンバエ成虫を採集した。次に、この成虫から得られた卵を元にして、ウシ肝臓を幼虫の餌、ウシ肝臓とショ糖を成虫の餌として、25°C・18時間明、6時間暗(18L-6D)の条件下で累代飼育を行う方法を確率した。さらに、17.530°Cの温度、12L-12D18L-6Dの光周期を組み合わせて飼育し、温度と光周期がこの虫の生殖に与える効果を調べた。その結果、高温と長日条件の組み合わせで速やな卵巣発達が誘導されたのに対し、低温と短日条件の組み合わせで卵黄蓄積の抑制された成虫休眠が誘導された。30°Cでは光周期にかかわりなく生殖が導かれたが、27.5°Cと25°Cでは光周期の影響が顕著であった。25°Cでは18L-6Dですべて非休眠となり、16L-8D、14L-10D、12L-12Dでは、ある程度休眠成虫が出現した。しかし、短日条件でも必ずいくらか非休眠が現れた。温度をさらに低く設定すると、休眠率は上昇し、22.5°C以下の温度と12L-12Dの組み合わせで、ほぼすべての成虫が休眠に入った。以上より、涼しい北海道でも、暑い夏には休眠に入らない成虫が現れ、年間複数世代が出現する可能性があることがわかった。最後に、ほぼ100%非休眠成虫の得られる25°C・18L-6Dと、ほぼ100%休眠成虫の得られる20°C・12L-12Dで飼育された成虫の脳をパラフィン切片とし、パラアルデヒドチオニン・フロキシン法で染色したところ、多数の神経分泌細胞が同定された。これらの神経分泌細胞の活動と休眠の関係について現在検討中である。
光触媒作用を利用した新しい型の化学センサ

半導体とガスとの光触媒作用により半導体表面の電気伝導度が変化する事を利用した「光触媒式ガスセンサ」において,原理的なメカニズムを明らかにする事とセンサ材料として光触媒能をもつ物質の検討を行なう事を目的として実験を行なった.1.ガス感応メカニズム本光触媒型ガスセンサをTiO_2薄膜で構成するとエタノールをはじめとするアルコール類に顕著な選択性を示す.この特異的な選択性を説明するために光触媒反応に特有な電流二倍効果のメカニズムを考えた.この考え方を証明するため,他の電流二倍効果を示すガス,即ちメタノール, n-プロピルアルコール, m-ブチルアルコール,蟻酸,酢酸でセンサ作用を調べたところ高い感度を示した.一方, 3級アルコールであるTert-ブタノールやアセトン,ベンゼンなど電流二倍効果を示さないガスについては感度が低かった.又,感度特性と分子のイオン化ポテンシャルとは関係せず,不可逆的に電流二倍効果で酸化され易い分子の方が高い感度を示すことがわかった.これらの結果により,ガス感度メカニズムは光触媒的電流二倍効果によると結論した.2.光触媒センサ材料光触媒的メカニズムを材料面からも示すため,代表的な熱反応型センサ材料でありTiO_2と同様なバンドギャップを持つ酸化亜鉛と光触媒作用の大きなCdSの膜でセンサを作り感度を調べた.その結果,酸化亜鉛では感度をほとんど示さず,又, CdSではエタノール,ギ酸に感度を示した.この様に材料面からも光触媒メカニズムが支持された.半導体とガスとの光触媒作用により半導体表面の電気伝導度が変化する事を利用した「光触媒式ガスセンサ」において,原理的なメカニズムを明らかにする事とセンサ材料として光触媒能をもつ物質の検討を行なう事を目的として実験を行なった.1.ガス感応メカニズム本光触媒型ガスセンサをTiO_2薄膜で構成するとエタノールをはじめとするアルコール類に顕著な選択性を示す.この特異的な選択性を説明するために光触媒反応に特有な電流二倍効果のメカニズムを考えた.この考え方を証明するため,他の電流二倍効果を示すガス,即ちメタノール, n-プロピルアルコール, m-ブチルアルコール,蟻酸,酢酸でセンサ作用を調べたところ高い感度を示した.一方, 3級アルコールであるTert-ブタノールやアセトン,ベンゼンなど電流二倍効果を示さないガスについては感度が低かった.又,感度特性と分子のイオン化ポテンシャルとは関係せず,不可逆的に電流二倍効果で酸化され易い分子の方が高い感度を示すことがわかった.これらの結果により,ガス感度メカニズムは光触媒的電流二倍効果によると結論した.2.光触媒センサ材料光触媒的メカニズムを材料面からも示すため,代表的な熱反応型センサ材料でありTiO_2と同様なバンドギャップを持つ酸化亜鉛と光触媒作用の大きなCdSの膜でセンサを作り感度を調べた.その結果,酸化亜鉛では感度をほとんど示さず,又, CdSではエタノール,ギ酸に感度を示した.この様に材料面からも光触媒メカニズムが支持された.
時間分解CARS法による強い衝撃波背後の振動・回転温度測定

1)まず初気圧約133Paの低圧空気、およびマッハ数10を越える強い衝撃波背後の流れに対し、CARS信号を得ることを目的として、システム全体のトリガー系とレーザーの励起光信号系に工夫を加え、狭帯域励起光で充分なCARS信号を得ることができた。次に広帯域色素レーザーを用い、窒素分子の振動・回転温度を求めるためのCARS信号を得ることを試み、測定部と光学系の形状と配置に工夫を加え、マッハ数15以上の強い衝撃波背後の高速流れからのCARS信号を得ることが可能となった。2)次に、得られたCARS信号に対して、スペクトルマッチング手法により強い衝撃波背後の高速輻射非平衡流れ中の窒素気体分子の振動温度と回転温度などの必要な情報を得るために、理論解析で、光学測定系のスリット幅や振動温度と回転温度をパラメトリックに変化させてCARSスペクトル分布を得る計算プログラムを開発した。その結果、理論計算スペクトルと、実観測CARSスペクトルを最小二乗近似によりマッチングさせることで、窒素気体分子の振動温度と回転温度を得ることができた。さらに、測定CARSスペクトルと計算スペクトルに高波数域で不一致となる部分があったため、さらに比較考察を加えて3次の非線形感受率の中の非共鳴項を考慮することを試み、両スペクトル比較の結果に良い一致を見ることができた。3)以上の研究開発により、低圧空気中でマッハ数15を越える強い衝撃波背後の輻射非平衡高速流れに対して、ゲート時間10nsという短時間の高時間分解・高空間分解のCARS信号を得ることができ、窒素気体分子の振動温度・回転温度を衝撃波面直後からの空間分布として得ることが世界で初めて可能となった。その成果は国内外の学会・国際会議において第一報として報告された。本年度は、CARS(Coherent Anti-Stokes Raman Spectroscopy)システムを構築するために、以前の科研費で購入したNd:YAGレーザー(HOYA Continuum社製Powerlite Precision 8010)を励起光として利用することのできるDyeレーザー(HOYA Continuum社製ND6000)を購入し、CARSシステム励起光源を構築した。CARS法による振動および回転温度測定の予備実験として、衝撃波速度10km/sの衝撃波背後の時間分解画像分光計測を行った。研究結果および実績をまとめると以下のようになる。1)以前の科研費によって、衝撃波管低圧部の改良が完了し、試験気体の高純度化が達成された。試験気体による相違を調査する目的で、雰囲気空気、乾燥空気および純窒素を用いて計測を行った。平衡領域における発光に着目したところ、純窒素の場合、他の試験気体の場合に比べて発光強度が半分程度となることが明らかになった。2)平衡領域における分光スペクトルからボルツマンプロット法により窒素分子の振動温度を算出した。その結果、画像分光器の回折格子の違い、すなわち、波長分解能の違いにより振動温度にばらつきがみられた。これは、時間分解画像分光計測システムに含まれるストリークカメラ、MCP(Micro Channel Plate)のゲインなどの影響によるS/N比の低下および分光スペクトルの時間(空間)積分範囲が原因であると考えられる。3)上記の3種類の試験気体において、窒素分子の振動温度にほとんど変化はみられなかった。さらに、試験気体の高純度化を目的として、観測窓の改良を行った。これまでの観測窓は石英ガラスを接着剤で固定していたたが、Oリングで固定する形に改良した。来年度以降、CARSシステムを完成させるとともに、これまでの分光計測で明らかになった問題点を改良し、振動および回転温度の測定を開始する。本年度は、CARS(Coherent Anti-Stokes Raman Spectroscopy)システムのための光学系一式を購入し、BOXCARSシステムを構築した。

励起光源として用いているNd : YAGレーザーとプローブ光源として用いているDyeレーザーの波長は、それぞれ532nm及び607nmであり、これに適したコーティングを施したレンズ・ミラー等を選定した。さらに、衝撃波生成時における衝撃波管の衝撃及び振動を軽減する目的で、衝撃波管の一部を改良・製作した。本研究の現況及び実績をまとめると以下のようになる。1)Nd : YAGレーザー(第二高調波532nm)及びDyeレーザー(R640+R610混合607nm)からの出力光の波長及び強度に最適化された光学系一式を選定・購入した。現在、その光学系を配置し、CARSシステムを構築中である。2)計測で得られるCARS信号から振動・回転温度を算出するために、スペクトルマッチングするためのスペクトル計算プログラムを作成した。分光器のスリット関数など装置固有の定数を導入し、温度の関数として理論式からCARSスペクトルを計算しておき、その計算結果と計測結果をマッチングするためのデータファイルを構築した。3)本研究で衝撃波の発生に用いる衝撃波管は、自由ピストンの衝突による衝撃及び振動が衝撃波管内を伝わり、観測位置がばらついてしまうことが確認されていた。CARS計測は微小領域で、かつ定点で行われるため、計測対象位置の高精度な同定が重要となる。したがって、本年度は衝撃波管の一部(中圧管)に緩衝部を設けることによってその衝撃を軽減することを目的に改良を行った。4)なお、上記の計測システムに加えて流れ場全体の可視化用YAGレーザーの購入を計画している。本年度は衝撃波管中圧管に予想以上の予算がかかったためにレーザー発振部を購入し、電源・制御装置は次年度以降に購入する予定となった。これらの実績については、学会・シンポジウム等で成果発表するには至っていないが、並列して行われている分光測定による振動温度計測は、第23回宇宙技術と科学の国際シンポジウム(島根県松江市、2002年5月)と平成14年度衝撃波シンポジウム(群馬県桐生市、2003年3月)において成果発表を行った。このようにCARS計測のための準備はほぼ整い、来年度初めより、強い衝撃波背後の振動・回転温度の計測を開始する。本年度は、昨年度に設計をし、発注をした緩衝型中圧管を衝撃波発生装置に組み込み作動試験を行った。またCARS(Coherent Anti-Stokes Raman Spectroscopy)計測システムの構築を行うために、レーザー発振器内の光学系の改良を行い、その後CARS計測光学系を構築した。また、レーザーと衝撃波の同期をとるためのシステムを構築し、衝撃波の任意の位置にCARS計測用レーザーを照射することに成功した。その結果、色素レーザーの線幅を狭くした場合に、衝撃波背後からCARSスペクトルを取得する事に成功した。しかし、一度の測定で振動・回転温度を求めるにはこれよりも更に広い線幅を持ったCARSスペクトルを取得する必要があり、そのためには色素レーザーの線幅を広くする必要があることがわかった。本研究の現状および実績をまとめると以下のようになる。
ナノコンタクトの摩擦機構と超潤滑

摩擦力顕微鏡(FFM)が開発されて原子スケールでの摩擦力の観測が可能となり、ナノスケールのコンタクトの摩擦に対して巨視的な接触面での摩擦則が成立しないことが明らかになっている。本研究の目的は、ナノスケールコンタクトの摩擦機構を明らかにし、摩擦が消滅する超潤滑の出現機構と出現条件を解明することである。FFMでの単針の運動をTomlinsonモデルを用いて調べ、以下のことがらを明らかにした。(1)FFMで観測される摩擦力のスキャン速度飽和について、新たな機構を提唱した。(2)単針先端が複数個の原子で構成される場合の摩擦機構を明らかにした。(3)FFM単針を振動させながらスキャンしたときに観測される摩擦消失(動的超潤滑)の機構を明らかにした。Riedo等により、摩擦力顕微鏡のティップ先端原子に働く摩擦力は、(1)高スキャン速度では飽和傾向を示し、(2)低スキャン速度では横方向の振動印加により共鳴減少することが示されている(Riedo et al., Phys.Rev.Lett.91(2003)84502)。有限温度の1次元Tomlinsonモデルの数値解析結果に基づいて、(1)、(2)の出現機構を調べた。(1)の摩擦力の速度飽和機構は、高スキャン速度では高次のスリップ運動が起こることにより説明された。(2)の外部振動印加による摩擦力の共鳴減少については、2種類の機構を提案した。一つはスキャン速度と基板の格子定数比の外部振動数で生じる同期共鳴減少であり、他の一つはスティック点での内部振動励起機構である。これらの共鳴周波数領域では、外部振動の振幅を基板格子定数の3倍程度大きくできれば、摩擦力消失の超潤滑が出現することを見出した。摩擦力顕微鏡(FFM)を用いて原子スケールの摩擦力が測定されている。FFMのティップ先端部のサイズと硬さが摩擦力にどのような影響を及ぼすかを、ティップのたわみと基板との格子不整合を考慮できる、有限サイズのFrenkel-Kontrova-Tomlinsonモデルを用いて調べた。ティップ先端原子の有限温度での運動を、Langevin方程式を数値的に解いて調べた。硬いティップでは、格子不整合の大きさに依存して特定のティップサイズ(マジックサイズ)で摩擦力が激減することを見出した。マジックサイズで、ティップー基板間の相互作用ポテンシャルの変調振幅が激減することによる。他方、軟らかいティップでは、温度効果により、ティップサイズが増大するにつれ、摩擦力が減少することを見出した。これは、ティップ先端原子のインコヒーレントなスリップ運動が熱的に誘起させることによる。本研究の目的は、(1)結晶表面上のナノコンタクトの有限温度での滑り摩擦機構を解明し、(2)ナノコンタクトの摩擦を消失させる「超潤滑」の物理的起源と出現条件を明らかにすることである。摩擦力件顕微鏡ティップ先端原子と基板間のナノコンタクトの、有限温度での摩擦機構を、1次元Tomlinsonモデルに基づいて調べた。本年度は、摩擦力件顕微鏡のティップを振動させながらスキャンするときに観測される「共鳴超潤滑」現象の微視的な機構の解明を目指し、ティップ先端原子の運動の有限温度での分子動力学シミュレーションを行った。外部振動として、振動方向が基板表面に垂直な場合を考え、臨界振幅以上の振動に対して「共鳴超潤滑」が現れることを示し、絶対零度と室温での出現機構を明らかにした。共鳴超潤滑の、粘性係数、スキャン速度、温度に対する依存性を調べ、出現条件を明らかにした。以上の結果は論文にまとめ、学術誌に投稿中である。
肝癌の増殖と肝再生におけるＡｐｇ－２の意義

ヒト肝癌に過剰発現することが報告されているHeat shock蛋白110ファミリーの一つであるApg-2は、マウス脂肪肝モデルにおいて脂肪化肝細胞での発現が上昇していた。そこでApg-2の脂肪肝における役割を検討するためにApg-2-/-マウスを作成し高脂肪食による脂肪肝を誘導したところ、肝脂肪化の抑制だけでなく、体重増加の抑制、脂肪組織の縮小が確認された。さらに肝癌でのApg-2発現の意義を検討すべく、Apg-2-/-マウスにおいてDEN誘発肝発癌モデルを作成したところ、肝癌個数の抑制、腫瘍径の縮小が確認された。以上からApg-2は肝脂肪化、肝発がんに促進的に働く可能性が示唆された。APG2-/-マウスの繁殖が動物舎スペースの増設により軌道に乗り、実験に必要な個体数が徐々に確保されてきている。まずはノックアウトマウスとコントロールマウスの各3匹のマウスを用いて部分肝切除、次に各6匹ずつで高脂肪食負荷、さらに各15匹ずつで発癌モデルの作成を行った。部分肝切除は6週令の個体を使用し、80%の肝切除を施行後48時間の検体を採取した。肝組織検体はcDNAマイクロアレイを行い、肝再生時におけるAPG2欠損の影響を解析している。次に8-10週令の20gを超えたマウスを各5匹ずつ用いて部分肝切除を行い、肝切除後の30および36時間後に検体を採取し、APG2-/-による肝再生への影響を検討している。次に20gの体重を目安に高脂肪食、高脂肪高コレステロール食を12週間投与開始し、脂肪肝炎モデルを作成した。肝内のインスリンシグナル、脂質代謝、糖代謝経路に及ぼすAPG2の関与を解析している。さらに、マウス肝細胞株(AML12)を用いて、APG2をsiRNAを用いてノックアウトし、脂肪酸負荷による影響を検討することで、マウス個体に見られた変化の機序を解析中である。最後に生後2週間のAPG2-/-マウスとコントロールマウスAPG2+/+マウスにジメチルニトロサミンを投与し8から10か月後における肝発癌の状況を検討中である。先の実験では、マウスの体重が20gになるまで待つことで、コントロールマウスとの体重差がない状況でモデルマウスを作製した。しかし、この発癌モデルは生後2週間の投与であり、APG2-/-マウスは生後数週間の発育が不良であることから、ジメチルニトロサミン投与の影響が響き、当初は投与後数週間の死亡が散見された。解析に必要な個体数の確保が困難であったが、ようやく数が揃い結果待ちの状況である。SPF化の終了したAPG-2+/-マウスの雄、雌それぞれ3匹が搬入され、早速繁殖にとりかかった。ゲノタイピング用のプライマーセットを設計し、マウスの尾から採取したgenomicDNAでノックアウトマウスの判別が可能であることを確認した上で、Apg-2ノックアウト(-/-)マウスがメンデルの法則に則って生まれることを確認した。性別もほぼ5分5分であった。しかし、4週令のApg-2-/-マウスの体重はApg-2+/-およびApg-2+/+マウスの70%以下にとどまり、8週令ではほぼ同等に達っするものの、APG2-/-マウスの生後から特に2,3週令の間は体重低下が目立つことで、その間に周囲(母マウスを含む)からの攻撃を受け易く生存競争に不利で、3割ほどは成長せず生命を落としていることが分かった。しかし、2,3週はどうしても母乳による飼育が必要であるため別離させることができず、なるべくストレスのかからないように繁殖用の特殊な仕切りなどを設けるなどして産後ストレス軽減に努めた。その結果として徐々にノックアウトマウスの繁殖が軌道に乗り始めるようになった。以上の理由から、雄のノックアウトマウスの数の準備に予定よりも長期間を要し、次のステップであるマウスモデル作成の開始が遅れることとなった。ようやく得られたマウスから、部分肝切除モデル、高脂肪食負荷モデル、発癌モデルの作成を開始したところである。Heat shock蛋白110ファミリーに属するApg-2はタイトジャンクション蛋白であるZO-1にZONAB(ZO-1-associated nuclear acid binding protein)と競合的に結合する。その結果、ZONABと複合体を形成するCyclinD1やCDK4複合体の核移行を促進することで細胞増殖正に制御することが報告されている。さらにヒト肝癌組織において高頻度に高発現することが報告された。そこで我々は肝癌の増殖や肝再生におけるApg-2の意義に関してマウスモデルを用いて検討を行った。

まずApg-2ノックアウト(-/-)マウスを作成しメンデルの法則に則って生まれることを確認した。しかし、4週令のApg-2-/-マウスの体重はApg-2+/+マウスの70%以下にとどまった。生後14日の雄性Apg-2+/+マウスとApg-2-/-マウスに0.01 ml/gのジエチルニトロサミン(DEN)を0.05μmol/gbody wtを腹腔内投与し肝発癌モデルを作成し、それぞれの肝病態またはその組み合わせにおけるZO-1、ZONAB、CyclinD1やCDK4などの動態を検討した。結果、Apg-2-/-マウスにおいてDEN投与40週後の解析で明らかに肝癌腫瘍個数の減少、腫瘍径の減少が見られた。この傾向はDEN投与後に高脂肪食を投与したマウスでも明らかであり、Apg-2蛋白の肝発がんへの促進効果が確認された。その機序として肝癌におけるアポトーシスの抑制、細胞周期の正の制御が示唆され、得られたマウス検体における、TUNEL染色、抗アポトーシス蛋白や細胞増殖マーカーの免疫組織学的検討を行った。さらにヒト肝癌細胞株においてApg-2蛋白をSiRNAを用いてサイレンシングを行い、Apg-2蛋白のアポトーシス、細胞周期に及ぼす影響を検討した。結果、Apg-2の減少はHuh7やPLC/PR5細胞株において細胞増殖の低下、アポトーシスの増加をもたらすことが確認され、Apg-2-/-マウスにおけるDEN誘発肝発がんの減少の結果と一致することが確認された。消化器内科昨年の段階でAPG2-/-マウスのSPF化を含む搬入手続き、実験に必要な個体数の確保に時間がかかったためにその分遅れが生じている。さらに、モデル作成にかかる時間として、部分肝切除は数日、高脂肪食負荷モデルは12-24週間であるが、肝細胞癌発癌モデルは10か月と長時間を要する。また、発癌モデルは生後2週間のマウスにジメチルニトロサミンを腹腔内投与するが、投与後に死亡するケースが散見された。APG2-/-マウスは生後数週間の体重増加率が低いという表現型があり、これが影響していると考えられた。とりあえずは、部分肝切除モデル、高脂肪食負荷モデルでのサンプリングが終了しており、現在解析中である。発癌モデルに関しては今年度中にサンプリングが終了する予定であるため、APG2-/-で肝細胞癌発癌に差がある場合は、その機序を解明するための検討を予定している。研究実績の概要にも記載した通り、APG-2-/-の雄マウスの数が揃わず動物モデルの作成開始が遅れている。先述した以外の理由としては、APG-2-/-マウスを得るために、APG-2-/-と+/-の掛け合わせを行っているが、親側の原因として、雄のAPG-2-/-マウスは生殖能力がやや低いこと、雌のAPG-2-/-マウスは保育能力がやや低い可能性が疑われている。また、生まれてくるAPG-2-/-マウスも2,3週令まではとにかく体が小さく+/-マウスとの生存競争にやや劣るようであり、これらが原因で必要数のマウスが得られなかったと考えられる。
Th1細胞活性化による細胞内寄生体に対する感染防御の検討

我々は今回の研究によりDNAワクチンと組換え型IL-12,IFN-γをマウスに接種することにより免疫反応が増強できるデータを得た。以下個条書きにする。。1)マウスにHIV-1 env DNAワクチンを接種し、同時にレコンビナントIL-12、IFN-γあるいは、IL-12、IFN-γあるいはB7-1、B7-2などの発現ベクターを接種されたマウスに、HIV-1特異的なCTLやDTH等の免疫反応が増強されることを見いだした。(Tsuji et al.,Immunology,1997,J.Immunol.、Eur.J.Immunol印刷中)しかしその程度は、レコンビナント蛋白では不十分で、IL-12、IFN-γ、B7-1、B7-2等の発現プラスミドの方が強力であった。我々はこの理由としてレコンビナントサイトカインは生体内で分解を受けて早期に消失すると考えられるが、プラスミドDNAの形で投与されると持続的で長期にわたるサイトカインの発現が得られるためと推察している。2)マウスではIL-12およびB7-1あるいはB7-2を過剰発現させることにより、IgG2a分画の上昇とINF-γ誘導が観察され、Th1由来細胞性免疫のの活性化を見た。(Okuda et al.,投稿中)3)最後にこれらのワクチンの投与によりTh1型免疫系を活性化したマウスに緑膿菌や、HIV/MuLVキメラウイルス等をChallengeした場合、その感染予防効果がみられた(Asakura et al.,投稿中)。以下個条書きにする。。
インプラントオーバーデンチャー用緩圧型磁性アタッチメントに関する研究

緩圧型磁性アタッチメントはキーパー,磁石構造体および磁石構造体を保持するハウジング部から構成され,キーパーおよび磁石構造体にはハイパースリム3513を使用している.ハウジング部はCAD/CAMシステムにて設計しシリンダー様に上下にスライドすることにより顎堤粘膜とインプラント間の被圧変位量を0.35 mm補正することが可能である.緩圧型磁性アタッチメントの維持力,耐久性を検討するため,繰り返し荷重後の維持力,被圧変位量について実験的検討を行った結果,維持力は約25Nと他の磁性アタッチメントと同程度の値を示し,繰り返し荷重後の維持力,変位量とも大きな低下は認められなかった.緩圧性磁性アタッチメントはマグネットの持つ水平応力へのスライディングエフェクトとスプリングによる垂直応力の緩圧効果を兼ね備えることで,インプラントにかかる応力を減少させることが可能となり,インプラント生存率の向上が予想される.また,骨量の不足している部位への骨造成を伴わないショートインプラント,ミニインプラントを用いたインプラントオーバーデンチャーの適応を可能にすると推察される.アタッチメントの基本構造はインナーハウジングとアウターハウジングから成りチタン合金をミリング加工して製作する.緩圧機構はハウジング部がスライドすることにより可動性を持たせ,インナーハウジングとアウターハウジングの間隙にスプリングを挿入することで緩圧性を持たせる.本年度は,スライドすることにより可動性を持つインナーハウジングとアウターハウジングをCAD/CAMシステムにて設計し,チタン合金をミリング加工し作成した.垂直的緩圧効果を発揮するスプリングはインコネルX750(板厚0.3x外径φ5x内径φ2.1x高さ0.40cm)を用いて試作した.試作品の被圧変位量の測定は,微小変位量計DT-A30を組み込んだ定荷重圧縮試験機を用い,5kgのロードセルを介し,ひずみゲージからの出力電圧をダイナミックデータ集録ソフト(DCS-100A)で解析後,パーソナルコンピュータ(DICOM server:PD-Vl-GW TYPE-H)にて演算処理を行った.アタッチメントの被圧変位量を測定した結果,被圧変位量は0.25mmを示し,咬合圧に対して十分な緩圧効果を期待できると考えられる.本研究において開発を行っている緩圧性マグネットアタッチメント(以下SBMアタッチメント)は,インナーハウジングとアウターハウジングをチタン合金からミリングすることにより製作されている.ハウジング部がスライドすることにより可動性を持ち,インナーハウジングとアウターハウジング間の間隙にスプリングを挿入することで緩圧性を持たせている.インプラントへの側方力や,咬合力を顎堤粘膜とインプラントに適正に配分することが可能で,インプラントオーバーデンチャー装着後の長期にわたる良好な経過が期待できる.昨年度においては,研究の基幹となる試作型SBMアタッチメント1号の設計,製作を行った.本年度は試作したアタッチメントを用い,繰り返し荷重後の維持力,被圧変位量について実験的検討を行った.その結果,被圧変位量は顎堤粘膜の被圧変位量と近似し,咬合圧がかかった際に十分な緩圧効果を得ることができることが確認された.繰り返し試験の結果からも,耐久性に関しても十分であると確認された.この結果は第24回日本磁気歯科学会にて口演発表,平成26年度日本補綴歯科学会西関東支部学術大会にて,ポスター発表という形で報告を行った.また,試作1号のサイズが大きく,デンチャースペースの少ない症例では使用が難しいという問題点があったため,その点を改良した試作2号の設計,製作を行い,再度同様の検討を行ったが,試作1号と比較しても遜色のない結果となった.この検討に関しては第45回日本口腔インプラント学会での報告を予定している.今回試作した緩圧型磁性アタッチメントはキーパー,磁石構造体および磁石構造体を保持するハウジング部から構成され,キーパーおよび磁石構造体にはハイパースリム3513を使用している.ハウジング部はCAD/CAMシステムにて設計し磁石構造体を保持するトップカバーとアウターハウジングから成り,その間隙には直径4mm,高さ1.2mmのSUS304製スプリングが挿入されている.ハウジング部がシリンダー様に上下にスライドすることにより顎堤粘膜とインプラント間の被圧変位量を0.35 mm補正することが可能である.前年度に試作した緩圧型磁性アタッチメントをさらに小型化し口腔内で使用可能な大きさに改良した.小型緩圧型磁性アタッチメントの維持力,耐久性を検討するため, 7種類のインプラントオーバーデンチャー用可撤性支台装置(Locatorアタッチメントブルー,3種の緩圧型ボールアタッチメント,2種の磁性アタッチメント,小型緩圧型磁性アタッチメント)を選択し,繰り返し荷重後の維持力,被圧変位量について実験的検討を行った.小型緩圧型磁性アタッチメントの維持力は約25Nと他の磁性アタッチメントと同程度の値を示し,繰り返し荷重後の維持力,変位量とも大きな低下は認められず,顎堤粘膜とインプラントの被圧変位量を補正することが可能であった。また機能時の負担圧配分を両側性遊離端欠損部後方にインプラントによる咬合支持を求めたシミュレーション模型上で通常の遊離端義歯およびインプラント強支持型義歯,インプラント緩圧支持型義歯を用いた時の顎堤粘膜とインプラントの負担圧配分について検討した結果,小型緩圧型磁性アタッチメントは緩圧型ボールアタッチメントと同様に,強支持型義歯に比較して垂直方向の荷重に対し大きな緩圧効果を示し,インプラント体に過大な負担圧を与えることなく欠損部遠心の顎堤粘膜の負担圧を抑制することが示唆された.緩圧型磁性アタッチメントはキーパー,磁石構造体および磁石構造体を保持するハウジング部から構成され,キーパーおよび磁石構造体にはハイパースリム3513を使用している.

ハウジング部はCAD/CAMシステムにて設計しシリンダー様に上下にスライドすることにより顎堤粘膜とインプラント間の被圧変位量を0.35 mm補正することが可能である.緩圧型磁性アタッチメントの維持力,耐久性を検討するため,繰り返し荷重後の維持力,被圧変位量について実験的検討を行った結果,維持力は約25Nと他の磁性アタッチメントと同程度の値を示し,繰り返し荷重後の維持力,変位量とも大きな低下は認められなかった.本年度は試作したアタッチメントを用い,繰り返し荷重後の維持力,被圧変位量について実験的検討を行った.繰り返し荷重試験は繰り返し荷重試験機(JM100-T;日本メック,東京)を用いて5 kgf 0.8秒/回サイクルで5万回行い,各アタッチメントの維持力と被圧変位補正量の測定は繰り返し荷重10,000回毎に行った.被圧変位補正量は微小変位量計(DT-A30;共和電業社,東京)を組み込んだ定荷重圧縮試験機(東洋精機製作所,東京)を用い,5 kgf荷重時の被圧変位量を測定した.維持力の測定は,小型卓上試験機(EZ-S-200N;島津製作所,神奈川)に装着し、クロスヘッドスピード5 mm/minにて引張試験を行った.分離時に要した最大荷重量と規定し,15回の計測の平均を維持力とした.得られたデータは分散分析後,Tukeyの多重比較検定により有意水準5%で統計解析を行った.その結果,被圧変位量は530μmと顎堤粘膜の被圧変位量と近似し,咬合圧がかかった際に十分な緩圧効果を得ることができることが確認された.維持力については23Nであり,他の市販の磁性アタッチメントに比較し,劣らないものであった.繰り返し試験の結果からも,耐久性に関して十分であると確認された.また,試作1号のサイズが大きく,デンチャースペースの少ない症例では使用が難しいという問題点を改良した試作2号の設計,製作を行い,再度同様の検討を行ったが,試作1号と比較しても遜色のない結果となった.この計画ではシミュレーション解析までの予定であったことから,おおむね順調な進捗であると考える.有床義歯補綴学今後は試作型SBMアタッチメント2号を用い,実験を継続する.下顎無歯顎患者を想定し,顎堤部を単純化したシミュレーション模型を製作後,左右側第一小臼歯,大臼歯部の顎堤頂に超小型圧力センサーを設置し,欠損部にインプラントを植立,1本から4本支台のものまでシミュレーション試験を行う.実験の比較対象としてはボールアタッチメント,ロケーターアタッチメント,マグネットアタッチメントを用いる.実験義歯はインプラント支台オーバーデンチャーを設計したコバルトクロム金属床義歯を製作する.インプラント頸部には4枚のひずみゲージを貼付し
並列的かつ数値的な意味解釈推論モジュールを用いた音声対話システム

提案した意味解釈推論システムのプロトタイプを開発した。以上の意味解釈推論システムとすでに開発した音声言語システムを結合。ICSLP'94大学関係展示で「音声理解のための計量パ-ザ」を中心にデモした。これは音声理解システムと密に統合するために適切なパ-ザである。パ-ザへの入力は単語仮説のラテイスであり、出力は意味解釈に必要なスコア付けされた手がかりの集合である。さらに、出力はフイ-ドバックのためにも使われる。このパ-ザは、文法的に何がどこにあるべきかについての相互に独立で、スコア付け可能な“construction hypotheses"(構造仮説)を利用している。理解の正確率とフイ-ドバックの有効性を評価。パ-ザによりフイ-ドバックが可能になる。このことは、意味解釈を改善する情報を用いることが出来るように、単語仮説を再度スコア付けすることである。もう一度行なうことによって意味解釈を修正することになる。このことは、このシステムが意味情報を用いることが出来ることと意味し、シンタックスや単語仮説を再び推論することが出来る。数値的にも、意味論的知識に基づくフイ-ドバックは全般的にエラーを減らすことが出来る。音声言語の理解を発達するにはどんなコーパスが要求されているかを検討して、コーパスの具体案を作成した。
光ピンセット技術を用いた大径自由液滴の懸垂手法の開発

液滴燃焼は工業的に重要な噴霧燃焼の基礎として多くの研究が行われているが,多くの場合燃料液滴は細線を用いて懸垂されており,細線が液滴の蒸発や燃焼に及ぼす影響が少なからず存在する.本研究は細線の代わりに光ピンセット技術を利用した無接触での燃料液滴の懸垂技術の確立を目指して,その実証および基礎研究を行ったものである.懸垂技術の他,微粒化および観察手法に関して検討を行い,様々な燃料において光ピンセット技術を用いて燃料液滴が懸垂可能であることを実証した.本研究は光ピンセット技術を燃料液滴の懸垂に適用し、燃料液滴の蒸発,燃焼研究に適用可能な非接触の新しい液滴の懸垂方法を提案するために検討を行ったものである。平成23年度の実施内容においては光ピンセット光学系の開発、改良を通して大径の液滴を懸垂可能なシステムの構築を行い、観察系の開発を行うとともに微粒化機構の改良等によって様々な物性の燃料を懸垂を可能とし、燃料液滴の懸垂実証試験として一定の成果は得たが、システムの構成上、複数の液滴が同時に懸垂されてしまう場合があり、液滴径の計測を困難にしていることが問題点として抽出された。これを受けて平成24年度では、主として液滴径の定量的な見積もりについて継続的に検討を行った。平成23年度では干渉画像法を用いての液滴計測を行っていたが、平成24年度は液滴像の直接観察を目指し、観察系の刷新、観察倍率の調整、観察波長の調整、バックライトの方向性および光量調整、代替液滴を用いた模擬観察試験など様々な改良案を試みたが、液滴とほぼ同径のファイバーの観察はできるものの、現状においては光ピンセット技術で懸垂された液滴像を直接把握するには至っていない。このため液滴径の定量的な把握として液滴より観察される同心円状のエアリーディスクによる液滴径の解析を行い、解析の結果、液滴径を見積もることができることを示した。これにより例えば複数個の液滴が同時に懸垂されてといった懸垂液滴の状態を把握することが可能となり、干渉画像法と合わせて用いることで液滴の懸垂の状態とその液滴径を同時に把握することが可能となった。これに加えて微小重力環境下における液滴の懸垂についても試み、液滴の懸垂が可能であることを示した。液滴燃焼は工業的に重要な噴霧燃焼の基礎として多くの研究が行われているが,多くの場合燃料液滴は細線を用いて懸垂されており,細線が液滴の蒸発や燃焼に及ぼす影響が少なからず存在する.本研究は細線の代わりに光ピンセット技術を利用した無接触での燃料液滴の懸垂技術の確立を目指して,その実証および基礎研究を行ったものである.懸垂技術の他,微粒化および観察手法に関して検討を行い,様々な燃料において光ピンセット技術を用いて燃料液滴が懸垂可能であることを実証した.燃料液滴の蒸発,燃焼は噴霧燃焼の基礎として多くの研究が行われているが、多くの実験においては燃料液滴を空間的に固定して観察するために液滴を細線に懸垂して実験を行っており、得られた結果には細線の影響が少なからず存在する。このような背景から、研究代表者は生化学や半導体の分野で注目されている光ピンセット技術を燃料液滴の懸垂に適用し、非接触の新しい液滴の懸垂方法として提案するために検討を開始した。特に平成23年度においては光ピンセット光学系の開発、改良を通して大径の液滴を懸垂可能なシステムの構築を行った。主な進捗状況であるが、微粒化機構を改良することによって様々な物性の燃料を同様な手段で微粒化することが可能となり、正ペンタン,正ヘプタン,正オクタン,エタノール等の様々な種類の燃料液滴を本手法を用いて懸垂可能であることを示した。これは将来的に多様な燃料を用いる蒸発、燃焼試験を行うにあたり有意である。また各燃料において時間経過に伴う液滴径の減少、すなわち蒸発を確認することができた。すなわち本手法を用いての自由液滴の蒸発、燃焼試験への端緒が開けた。他方で、懸垂基礎試験を通して、懸垂および計測技術に関連する問題点を洗い出すとともに、それらの問題点の定量的な見積もりおよび可能なものについては実験装置および手法の改良を行った。具体的には特に周囲流動が液滴の懸垂に与える影響について、定量的な見積もりを行うともに、周囲流動の影響を最小限にとどめるための処置を行っている。また光学系の特性が燃料液滴の懸垂に与える影響について定性的に検討するとともに実験装置の改良を行った。なお液滴径の計測方法については議論の余地があり、液滴径の定量的な見積もりについては今後検討が必要である。今年度に実施した試験により、様々な燃料における液滴の懸垂および蒸発の観察の可能性について確認することができ、また実験手法および装置に関わる問題点を明確にすることができたことから、研究はおおむね順調に進捗していると言える。23年度においては本研究課題に関する具体的な開発項目の一つである、光源,光ピンセット光学系について順調に開発できたものと考えており、24年度においては液滴径の計測システムの高精度化および微粒化機構の改良を重点的に行っていく予定である。液滴径の計測システムの高精度化を行うにあたり、撮影系の光学系を改良する必要があり、研究費も多くは撮影系の改良に用いる予定である。なお微粒化機構および点火機構の改良も合わせて行っていく予定である。
『法華経』における「法師」の位置づけとその特色の解明

本年度は申請にあたって目標に掲げた課題に取り組むにあたり、インド仏教における『法華経』の受容と展開に注目し、昨年度の研究成果を整理しなおして国際学会で発表を行った。『維摩経』と『法華経』の両経典には共通した構造を持つ物語(「法供養」)が見られる。『法華経』「普門品」と『維摩経』「菩薩品」の梵文写本、蔵訳、漢訳に着目し、そこに見られる「法施」の概念が両経典で異なることを指摘した。また神変表現に着目し、両経典が共通のソースを基盤としている可能性を指摘した。『法華経』第14章「安楽行品」の冒頭散文部分、ya khalv esu dharmesvavicarana avikalpanaの解釈について取り上げ、梵文諸写本、蔵訳、漢文と比較しながら検討をした。梵語写本の解釈可能性は一通りではなく、様々な解釈可能性があるが、文脈を考慮すると「avicaraとavikalapana」と解釈するのが適切であると考えられる。また中国の注釈書の解釈も二通りに分かれる。「不分別を行ぜず」と「行ぜず分別せず」という解釈である。前者は慧思の『法華経安楽行義』や天台大師の『妙法蓮華経文句』に見られる。天台大師は慧思の解釈を踏襲し、中道を中心とした理論に当てはめ、「不分別」を「無相」「中道」と置き換え、それにさえも執着しないと解する。後者は吉蔵の『法華義疏』、法雲の『法華経義記』、基の『妙法蓮華経玄賛』にみられる。吉蔵は、「分別せず」の対象として「亦行」と「不行」と分けて解釈する。基は、「行ぜず」「分別せず」に分けて解釈し、その根拠を『般若経』の「無所住に住する=無諸行を行ずる」に求めている。「行ぜしところなし、分別せずところなし」というように、その目的語がないことを、「真際」であらわす。法雲は、両者を2つにわけ、その根拠を「空」に求め、法空を得た時、無分別であるが故に、行ぜざると解釈する。27年度が最終年度であるため、記入しない。本年度は申請にあたって目標に掲げた課題に本年度取り組むにあたり、中央アジアにおける『法華経』の受容と展開に注目した。中央アジア写本は、漢訳との近似性も指摘されており、種々ある梵文『法華経』写本の中でも注目されているからである。梵文の中央アジアの中でもコータンで出土した『法華経』梵文写本とコータン語で著された『法華経綱要』を取り上げた。『法華経綱要』はHarold Walter Baileyの英訳以後、国内外において先行研究がない。申請者は、Baileyの研究を参照しながら『法華経綱要』の試訳を提示し、『法華論』が直接的、或は間接的に影響しているという新知見を見いだした。『法華経綱要』には、梵文『法華経』にはなく、『法華論』にあるターム「七種成就」、「仏性」、「方便品」相当部で「二種甚深の秘要」というタームを用いている。また、法華七喩のうち五喩に言及している。カシュガル本の品の配列と類似している。とくに「陀羅尼品」を除く後半七品の配列と簡略された導入の仕方が『法華論』と等しい。『法華経』のインド撰述唯一の注釈書である『法華論』は、中央アジアに受容されたという事例が報告されていない。従って、『法華経綱要』に見られる『法華論』の影響を明らかにすることは、『法華論』研究にも資するものである。また、漢訳『法華論』が影響していると考えられる場合『法華論』に限定できず、「七種成就」「仏性」などのタームを用いて『法華論』を引用、援用する基の『法華玄賛』や吉蔵の『法華論疏』が参照されていた可能性についても論じた。本年度は申請にあたって目標に掲げた課題に本年度取り組むにあたり、前年度のコータン語『法華経綱要』に関する研究成果を国内外で発表をし、専門家と意見交換した上で、さらに論文の修正、加筆をして公表した。また、同時に、近年梵文写本が発見された『維摩経』を取り上げ『法華経』と比較した。初期大乗経典である『般若経』と『法華経』の関係に注目した研究はあるが、『維摩経』と同経との研究はあまりなされていない。申請者は、『法華経』「観世音菩薩普門品」(「普門品」)と『維摩経』「菩薩品」に見られる法施物語の比較検討を行い次の2点を指摘した。(1)『維摩経』では、果報を期待せず大いなる憐れみの心に基づいた喜捨行為が「法施」である。『法華経』では、観音菩薩による衆生の憐憫故に施物を受け取る行為が「法施」である。『法華経』「普門品」は観音菩薩に備わった徳や観音菩薩を供養することによって得られる衆生の果報について説かれていることから、このような文脈の中で「法施」の意味は理解される。