hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
がん微小環境における芳香族炭化水素受容体AhRの意義解明と治療標的としての評価

芳香族炭化水素受容体(Aryl hydrocarbon receptor; AhR)はがん微小環境の中でがん細胞や様々な免疫細胞で活性化が認められる。IDOやTDOにより産生されるKynurenine (Kyn)ががん細胞でのAhR活性化に働く。我々はがん細胞内で活性化されたAhRによる免疫抑制分子の産生誘導という新たな免疫抑制機構を明らかにし、その免疫抑制に関わる分子を幾つか同定した。また、IDOはヒトがん細胞でリン酸化されることを示し、そのシグナルの一部を明らかにすることができた。我々の結果から、AhRを標的にした治療が、免疫抑制を解除する有効な治療法となりうることが示唆された。これまでにIDOによるTrp代謝物であるKynurenine(Kyn)ががん細胞内での芳香族炭化水素受容体AhRの内在性リガンドの一つであることが明らかになってきた。AhRのがん微小環境での役割を解明するため、マウスの様々ながん細胞株にIDOあるいは恒常的活性化型AhR(actAhR)を過剰発現させ、同系マウスに移植したところ、がん組織でのCD8 T細胞の減少、制御性T細胞Tregと骨髄由来抑制細胞MDSCの増加が見られた。IDOによる免疫抑制の機構として、1) Trp枯渇による免疫細胞の機能抑制、2)がん細胞からのKynによる抑制性免疫細胞の誘導、3)がん細胞内のAhRが誘導する因子による抑制性免疫細胞の誘導が考えられた。TregとMDSCのin vitro誘導においてKyn添加はほとんど誘導を増強しなかったことから、がん細胞内のAhR活性化で誘導される遺伝子産物が抑制性免疫細胞の誘導に重要であることが示唆された。マウス大腸がん細胞のIDO/actAhR過剰発現株のDNAチップ解析から、複数のケモカインがAhR依存的に誘導されることが明らかになった。これらのケモカインを過剰発現した大腸がん細胞を移植したマウスでTregとMDSCががん組織で増加した。これらケモカインはマウスの大腸がんとグリオーマで増加したが、マウス乳がんでは増加せず、乳がんでは別の遺伝子が免疫抑制を担っていることが示唆された。また、最近、IDOがTrp代謝酵素としての機能の他に、ITIMを介したシグナル伝達を担うことが報告された。そこで、Trp代謝とITIM機能のそれぞれを喪失させたIDO変異体をヒトがん細胞株に導入したところ、野生型IDOの発現で誘導される遺伝子変化の一部がTrp代謝あるいはITIM機能の一方の変異体で同様に失われることが示され、これらの経路にクロストークがあることが示唆された。AhRのがん微小環境での役割を解明するため、マウスの様々ながん細胞株にIDOあるいは恒常的活性化型AhR(actAhR)を過剰発現させ、同系マウスに移植したところ、がん組織でのCD8 T細胞におけるCD3発現低下、骨髄由来抑制細胞MDSCとマクロファージの増加が見られた。IDOによる免疫抑制の機構として、1) Trp枯渇による免疫細胞の機能抑制、2)がん細胞からのKynによる抑制性免疫細胞の誘導、3)がん細胞内のAhRが誘導する因子による抑制性免疫細胞の誘導が考えられたが、IDOとactAhRで同様の免疫抑制を誘導していることから、がん細胞内のAhR活性化で誘導される遺伝子産物が抑制性免疫細胞の誘導に重要であることが示唆された。マウス大腸がん細胞のIDO/actAhR過剰発現株の網羅的遺伝子発現解析から、これらの細胞で発現が亢進し免疫抑制に関わる可能性のある遺伝子を複数同定し、それらを過剰発現したがん細胞を同系マウスに移植した結果、ある遺伝子においてIDO/actAhRと同様の免疫抑制が見られるとともに、actAhRによるin vivoでの腫瘍増殖亢進が、その遺伝子ノックダウンにより顕著に低下したことから、この遺伝子はAhRの下流で免疫抑制を担うことが示唆された。また樹状細胞のIDOはTrp代謝酵素としての機能の他に、ITIMを介したシグナル伝達を担うことが報告されたが、我々はリン酸化ITIMに対する抗体を作成しヒトがん組織の免疫染色を行った結果、がん細胞でもIDOのITIMリン酸化が認められた。さらにヒトがん組織でのIDO ITIMリン酸化と同じ部位で発現亢進が認められるがん悪性因子を同定した。

我々は、がん細胞で高発現するIDOによる代謝産物Kynurenine(Kyn)が、がん細胞のAhR内在性リガンドの一つであり、IDOによる免疫抑制には、(1) IDOによるTrp枯渇、(2)がん細胞で産生されるKynによる免疫抑制細胞の誘導、(3)がん細胞内で活性化されたAhRによる免疫抑制分子の産生誘導、という3つの免疫抑制経路が存在することを示してきた。担がんマウスでの解析から、活性化AhRの下流で誘導される免疫抑制物質の一つとして、腫瘍内の骨髄由来免疫抑制細胞や免疫抑制型マクロファージの増加を担う分子を同定した。ヒトで同じ現象が見られるか検証するため、ヒトがん細胞株に恒常的活性化型AhRを過剰発現したところ、この遺伝子が誘導される株とされない株が存在した。これは、がん微小環境でのAhRを介した免疫抑制に不均一性を与える可能性を示唆した。また、IDOにはKynを生成する酵素活性に加えて、IDO分子内にITIMが存在しプラズマ細胞様樹状細胞でリン酸化されることが報告された。そこで、ヒトがん組織でIDOがITIMリン酸化されているか調べるため、IDOのリン酸化ITIMに対する抗体を作成し、ヒト大腸がん組織を染色したところ、一部のがん細胞でITIMリン酸化が観察された。さらにリン酸化陽性がん細胞の分布はがん悪性因子の一つの発現分布と良い一致を示した。ITIMリン酸化を担うキナーゼを同定するため、in silicoで候補キナーゼを予測し、ヒト大腸がん組織の免疫染色でITIMリン酸化部位に発現するキナーゼを絞り込み、in vitroでIDO ITIMリン酸化を亢進するキナーゼを同定した。さらにヒト大腸がん組織の免疫染色とITIM機能を喪失させたIDO変異体の解析からがん組織におけるIDO ITIMリン酸化の意義を示唆する知見を得た。がん細胞におけるIDO-AhR経路の活性化の免疫抑制への関与について、担がんマウスでの解析から、どのような免疫細胞の変化が起こり、それがどのような分子機構によるのか明らかになりつつある。がん種によるAhRの作用の差異、IDO機能でのTrp代謝とITIMシグナルの関係も次第に明らかになっている。腫瘍免疫学マウス大腸癌で同定できた活性化AhRの下流で免疫抑制を担う遺伝子について大腸がん患者の病理組織切片での免疫染色を進め、AhR活性化との関係を明らかにするとともに臨床病理学的因子との相関解析を進める。ヒトがん組織でのIDO ITIMリン酸化と同じ部位で発現亢進が認められるがん悪性因子について、発現亢進にIDOのTrp代謝とITIMシグナルがどのように関与するか明らかにし、免疫抑制に関与する可能性を検討する。また、がん種によるAhRの作用の差異についてAhR複合体の差異から説明できるかについて解析を進める。Kyn以外のAhRリガンドの探索についてもライブラリー構築とスクリーニングを行う。さらに、IDO陽性の癌細胞を移植したマウスでAhR阻害剤を投与して治療効果を評価する。がん種によるAhRの作用の差異、IDO機能にTrp代謝とITIMシグナルの関係も次第に明らかになっている。活性化AhRによるTreg, MDSC増加が同定したケモカインに依存するかはこれら遺伝子のノックダウンにより検証を進める。CD8 T細胞の減少の機構を解明するとともに、乳がんにおいてAhRが免疫抑制を誘導する責任分子について明らかにする。
低次元電子系における量子輸送現象、完全計数統計と量子絡み合いの理論的研究

トポロジカル絶縁体はバルクでは絶縁体なのに表面では金属的という一見矛盾した性質によって特徴づけられる。その中でもとりわけZ2トポロジカル絶縁体は時間反転対称性を破らず、量子ホール効果と同様の状況を磁場なしで実現できる。Z2トポロジカル絶縁体を題材として、Z2秩序の不純物に対するrobustnessやドープした状況下での局在の性質、トポロジカル絶縁体の接合面における輸送特性、また端状態のスペクトルと波動関数の局在度による特徴付け等の研究を行った。メゾスコピック系と強相関系の物理学の境界領域において、とりわけ解析的なアプローチが有用と思われる現象に焦点を当て、非自明な未知の物理的機構を解明する。単一分子伝導の物理のひとつの方向性に分子の持つ固有のスピンに着目した単一分子スピントロニクスがある。我々は、このような分子を介した伝導における揺らぎの問題、とりわけ揺らぎの完全計数統計について、トンネル現象がインコヒーレントに起こる領域を考える。このような領域で、Bagrets-Nazarovの方法[1]を拡張し、電流と電荷、あるいは、スピンまで含めた同時確率分布を扱えるように一般化した。さらに、電流と電荷の同時確率分布に関しては、角運動量の合成則を援用して、解析的な結果を得た。[2]次に問題になるのは、単一分子量子ドットの左右につけるリード線が強磁性的な場合である。我々は最近、左右の強磁性的なリード線の磁化方向が平行、あるいは、反平行の場合は、電流や電荷の揺らぎだけでなく、スピンの揺らぎもKorotkovの確率過程を解析する手法[3]と計数場の方法の両方で、任意のスピン偏極Pの値に対して、解析的に計算できることに気づいた。しかも、驚いたことに、スピンの揺らぎだけは、分子のスピンによって、非常に大きく増幅される(例えば、揺らぎの大きさを表す特徴的な係数を列挙してみると、分子のスピンのない場合(s=0)に1/3、s=1/2の時22/5、s=1では138/7というように急激に増え、例えばs=10というような比較的大きなスピンを持った分子に対しては、巨大な数になる。)ことが分かり、この結果を論文にまとめた[4]Z2トポロジカル絶縁体を特徴づけるため、境界のないバルクの系で、不純物散乱によってZ2秩序が壊れていく様子に注目する。具体的なモデルとしては、Z2トポロジカル絶縁体の原型であるKane-Mele模型を採用し、またトポロジカル絶縁相を直接見に行くのではなく、むしろドープした系における局在の性質に焦点を絞る。とりわけ格子間隔程度の短距離の散乱に注目し、K点とK'点の間を行き来するような(バレー間)散乱過程が、弱局在の相図に及ぼす影響を調べる。2次元系において、金属相近傍における最低次のスケーリングは、通常、局在に向かういわゆる「弱局在」であるが、時間反転対称性の破れがあると、最低次ではスケールしない「ユニタリーなふるまい」が見られる。一方、スピン軌道相互作用による散乱では、逆にサイズとともに伝導率が上昇する「反局在」が現れる。グラフェンにおいては、バレー間散乱が無視できるとき、不純物が通常の散乱体であっても、特徴的にこの反局在が起こる。一方、我々は、ドープされたZ2トポロジカル絶縁体の場合、モデル全体としては、時間反転対称性を破っていないのに、トポロジカルな質量項の指紋として、ユニタリーなふるまいが見られることを解析的に見出した(通常の質量項では、弱局在になる)。次に、試料が基盤の上にある場合、一般には、2次元面と垂直な方向の反転対称性は破れており、ラシュバ項が存在する。ラシュバ項は、これまで不活性だった実スピンの自由度を活性化するとともに、時間反転対称性を回復するという「二重の役割」を担う。その結果、グラフェンのときとは反対に、Z2トポロジカル絶縁体では、「バレー間散乱により」系は反局在を示す。Z_2トポロジカル絶縁体-この新しいタイプのバンド絶縁体の具体的な実装として最初に考えられたのは、グラフェン系、特にグラフェン・ナノリボンである(Kane-Mele模型)。グラフェン系はそれ自体、大変興味深い研究対象であり、実際、実験・理論の両側面から爆発的に研究が行われている。我々もグランフェン系の物理の延長として、Z_2トポロジカル絶縁体の研究を行った。現在までに得られた主な成果は、1)弱局在の相図-バルクの性質、2)接合の問題-「クライン・トンネル」に関してである。1)我々は、ドープしたKane-Mele模型が不純物散乱の存在下で特徴的な弱局在の相図を呈すこと見出した。とりわけ、局在のクラスは、活性化された有効スピンの数N_sを数えることでわかることを指摘した。Kane-Mele模型には、副格子、バレー、実スピンの3つがあるので、N_s=1,2,3(副格子スピンは常に活性)。

質量項がない場合、N_sが偶数なら系は弱局在(WL)、奇数なら反局在(AL)である。質量項が実効的な時間反転対称性を破ると、系はユニタリー(弱局在補正なし)にたる。我々の提唱するこの新しいアプローチは、弱局在理論の枠組みに現代的な視点を与えるものと言える。2)相対論的な量子力学において、ポテンシャル障壁が静止質量を超えて大きいと、逆に古典的には不可能な領域に粒子がトンネルしていく(クライン・パラドックス)。グラフェン系では、これが普通に起こり、しかも、界面に粒子が垂直入射した場合、障壁の高さに依らず完全透過が起こる。背後にある事情は、先の弱局在の場合と同様、副格子の自由度が実効的にスピンの役割をしているため、いわゆる「後方散乱の消失」が起こる。Z_2絶縁体の場合、ラシュバ相互作用により実スピンを活性化してやると、これが完全反射に変わる。一方、トポロジカル質量項とラシュバ相互作用がうまくバランスした場合には、再び完全透過が可能になる。Z2絶縁体は第一義的にはバンド絶縁体だが、Anderson絶縁体やMott絶縁体もトポロジカルになることが最近の研究で分かってきた。我々は水銀テルル量子井戸(2次元Z2絶縁体)に対するBernevig-Hugues-Zhang (BHZ)模型を用いてドープしたZ2絶縁体の相図を詳細に解析にし、「Z2 Anderson絶縁体相」が存在することが明らかにした。[1]BHZ模型はKane-Mele模型と対照的に連続極限において単一谷(single-valley)の模型で、Γ点近傍における低エネルギー電子の実効的な振る舞いを記述する。場の理論的にはDirac電子はペアで出てきてほしい(fermion doubling)ので二重谷の方が目然な気がするが、元の正方格子に戻るとBHZ模型にも4つのDirac点があり問題はない[2]。これらの4つのDirac点は異なる変数(有効Hamiltonianを特徴づける)の値で現れ、BHZ模型の相図/Z2自明と非自明の境界を決める。我々は転送行列法で局在長のスケーリングを調べることにより、ドープしたBHZ模型の相図を決めた。同様の研究は過去にQSH絶縁体で行われたが、Anderson局在がZ2絶縁体の形成に寄与しているかについてはむしろ否定的な方に決着している[3]。局在の性質は系の対称性に本質的に依存しており、ランダム行列の分類から決まる3つのクラスがある。先行研究で扱われたQSH絶縁体の場合はunitaryクラスに対応するが、我々のデータはsymplecticクラスに属する状況でAnderson局在がZ2絶縁体の形成に本質的に寄与していることを示唆する。つまり、clean limitではZ2自明相にあたる変数の値でも局在の効果でZ2非自明になり得る。
実験的サル・パーキンソニズムを用いた視床下核の病態生理学的研究

1.パーキンソン病誘起物質である1-methy1-4pheny1-1,2,3.6-tetrahydropyridine(MPTP)を,われわれの開発した方法,すなわち,L字型金属カニューレの先端をサルの一側尾状核または被殻内に留置し,MPTPを満たした浸透圧ポンプに接続する方法で2週間かけて直接注入し,片側パーキンソニズムを作製した.今回は,パーキンソン病で線条体内dopamine低下の最も著明な部位である被殻の尾側に塩酸MPTP1mgを注入し,尾状核は無傷のまま反対側上下肢の寡動(hypokinesia)と屈曲位の生ずることを見出だした.この状態で興味深いことに,予想に反して筋固縮は明らかでなかった.尾状核頭部に塩酸MPTP1mgを注入したサルで著明に認められるapomorphine 0.4mg/kg筋注による回転運動(MPTP注入側と反対方向への)はこのサルでは認められなかった.この事実は,片側パーキンソニズムの臨床・病理学的対応ー尾状核頭部ーorientingの障害,被殻ーhypokinesiaーを強く示唆するものである.2.大脳基底核内の諸構造,特に視床下核,淡蒼球外節・内節の神経細胞の活動を選択的にブロックするため,カイニン酸ないしイボテン酸を当該部位に微量注入する装置を作製した.すなわち,Hamada & DeLong(1992)の方法に準じ,タングステン微小電極を用いマルチユニット活動の記録と薬液注入を併せて行えるようにした.サルを麻酔下で脳定位装置に固定し,脳室造影とマルチユニット活動の記録から視床下核,淡蒼球外節・内節の位置を同定することができた.そして,被殻の尾側にMPTP1mgを注入され既に片側パーキンソニズムを呈しているサルの同側視床下核内にカイニン酸(6μg/2μ1)を注入した.その結果,片側パーキンソニズムは消失した.病理組織学的検討を予定している.3.上記1と2の方法を組み合わせて,大脳基底核の機能局在の病態生理学研究をさらに推進してゆく所存である.1.パーキンソン病誘起物質である1-methy1-4pheny1-1,2,3.6-tetrahydropyridine(MPTP)を,われわれの開発した方法,すなわち,L字型金属カニューレの先端をサルの一側尾状核または被殻内に留置し,MPTPを満たした浸透圧ポンプに接続する方法で2週間かけて直接注入し,片側パーキンソニズムを作製した.今回は,パーキンソン病で線条体内dopamine低下の最も著明な部位である被殻の尾側に塩酸MPTP1mgを注入し,尾状核は無傷のまま反対側上下肢の寡動(hypokinesia)と屈曲位の生ずることを見出だした.この状態で興味深いことに,予想に反して筋固縮は明らかでなかった.尾状核頭部に塩酸MPTP1mgを注入したサルで著明に認められるapomorphine 0.4mg/kg筋注による回転運動(MPTP注入側と反対方向への)はこのサルでは認められなかった.この事実は,片側パーキンソニズムの臨床・病理学的対応ー尾状核頭部ーorientingの障害,被殻ーhypokinesiaーを強く示唆するものである.2.大脳基底核内の諸構造,特に視床下核,淡蒼球外節・内節の神経細胞の活動を選択的にブロックするため,カイニン酸ないしイボテン酸を当該部位に微量注入する装置を作製した.すなわち,Hamada & DeLong(1992)の方法に準じ,タングステン微小電極を用いマルチユニット活動の記録と薬液注入を併せて行えるようにした.サルを麻酔下で脳定位装置に固定し,脳室造影とマルチユニット活動の記録から視床下核,淡蒼球外節・内節の位置を同定することができた.そして,被殻の尾側にMPTP1mgを注入され既に片側パーキンソニズムを呈しているサルの同側視床下核内にカイニン酸(6μg/2μ1)を注入した.その結果,片側パーキンソニズムは消失した.病理組織学的検討を予定している.3.上記1と2の方法を組み合わせて,大脳基底核の機能局在の病態生理学研究をさらに推進してゆく所存である.
リズミカルに繰り返される発声運動が心身に及ぼす影響

リズミカルに繰り返される発声運動が、セロトニン神経を活性化して中枢セロトニンレベルと前頭前野の活動を増大させ、心理面では不安が少なく活気のある状態を形成する、との仮説をヒトを対象に検討した。本研究では、声明、子守唄、歌曲および賛美歌を対象とし、それぞれの曲の熟練者に20分以上歌わせた。歌の最中には、近赤外分光法(Near-infrared spectroscopy ; NIRS)を用いて前頭前野の酸素化ヘモグロビン(oxy-Hb)レベルを測定して局所脳血流変動の解析を行い、同時に腹筋の筋電図を記録した。歌の前後では脳波記録を行い、心理テスト(POMS)を実施して気分の変化を測定し、採血と採尿を行って血中及び尿中セロトニンレベルを測定した。その結果、歌っている最中には発声に伴って腹筋の筋電図が出現し、歌の後には脳波のhigh-frequency α波帯域(1013Hz)のパワーが増加した。前頭前野のoxy-Hbレベルは歌の最中にゆっくりと増加した。この変化はこれまでの私の先行研究における坐禅の呼吸法や読経の最中のoxy-Hbレベルの変化と同様であった。さらに、oxy-Hbレベルは歌の内容に対して共感が深まる"さび"の部分でより急峻な増加となり、前頭前野腹内側部において他の領域より大きい傾向を示した。歌う前と比べて歌った後には緊張と不安が減少し活気が増大する傾向があった。尿と血液中セロトニンレベルは歌う前と比べて、歌った後に増加していた。以上の結果から、声明、子守唄、歌曲および讃美歌を歌うことによって前頭前野が活性化され、その活性化は、セロトニン神経の活性化を促し、セロトニン神経の活性化が脳波や心理状態の変化に影響したものと考えられた。リズミカルに繰り返される発声運動が、セロトニン神経を活性化して中枢のセロトニンレベルを増大させ、脳及び脊髄神経系の活動を適度に調節し、心理面では不安が少なく活気のある状態を形成する、との仮説をヒトを対象に検討した。この仮説は、ゆっくりとリズミカルに繰り返される呼吸運動の出現が特徴的な、私の先行研究である、座禅の呼吸法の研究に基づいている。そのため発声運動としては、座禅の呼吸法と類似した呼吸パターンが出現する、読経を採用した。被験者は僧侶であり、経典を約30分音読させた。読経前、読経中、読経後に、脳波記録、近赤外分光法(Near-infrared spectroscopy;NIRS)による前頭前野の局所脳血流測定を行った。また、読経前後に心理テスト(POMS)を実施して気分の変化を調べ、さらに、採尿と採血を行って尿中と血中のセロトニンレベルを定量した。その結果、読経中の発声に伴って、腹筋の筋電図がゆっくりと漸増した。この腹筋筋電図の出現パターンは、座禅やヨガの呼吸法において出現する腹筋筋電図のパターンと同様であった。脳波に関してはhigh-frequency α波帯域(HF-alpha:1013Hz)のパワーが読経の最中に増大した。NIRSによって測定された前頭前野の酸素化ヘモグロビンレベルは読経中に増大した。また、POMSによって読経前と比べて読経後に活気が増大することが明らかとなった。尿と血液中セロトニンレベルは読経前と比べて、読経後に増加していた。さらに、酸素化ヘモグロビンレベルの経時変化における変曲点(増加の起点)とHF-alphaパワーの経時変化における変曲点はほぼ一致した。以上のことから我々は読経により前頭前野が活性化され、その活性化は、セロトニン神経の活性化を促し、セロトニン神経の活性化が脳波や心理状態の変化に影響したものと考えた。

以上の結果から、声明、子守唄、歌曲および讃美歌を歌うことによって前頭前野が活性化され、その活性化は、セロトニン神経の活性化を促し、セロトニン神経の活性化が脳波や心理状態の変化に影響したものと考えられた。
浅海の生物生産性と温泉成分の関係解明を目指した海底温泉湧出探査手法の構築

森の栄養を海に運ぶ河川に次ぐ“水路"として海底地下水湧出(Submarine Groundwater Discharge,略してSGD)が注目を集めており,通常の地下水よりミネラル分に富み,かつ栄養塩のひとつであるケイ酸を豊富に含む温泉水もまた沿岸浅海域の生態系に大きく関わっていると予想している.本研究では,最新のSGD観測手法と伝統的な地球化学的調査方法等を組み合わせて海底温泉湧出探査法を構築し,別府湾奥部の別府温泉の沿岸域に散在すると予想される海底温泉湧出に適用して検出し,さらに陸域の熱水流動系との関係の解明や海底からの温泉流出量の推定などを行う.研究2年目の本年度は,採水器で汲みあげられる深層海水に溶けているガス(N2,Ar,O2など)の濃度測定を想定して初年度(H29年度)に構築した真空抜気による溶存ガス分析法の実用性の検証を陸域の湧水を用いて行ったが,理論的に予想された抜気率に到達できず,かつ抽出ガスの化学組成が抽出率に依存するという要検討の結果が得られた.その一方で,日出沖から別府温泉を経て大分市西部に至る別府湾奥部沿岸域における表層海水のラドン濃度/塩分/水温の曳航観測データならびに別府湾に流入する河川,自噴する地下水や温泉水のラドン濃度/水温等のデータを整備することができた.整備したデータを使い,ラドン濃度と塩分に着目した外洋水と陸水(河川水,地下水)の混合関係(ミキシング・ダイアグラム)に基づき,観測対象となった表層海水に占める地下水の混合率を導出したところ,海底地下水流出を指し示すエリアの存在が明らかとなり,さらに,それらのエリアについてラドン濃度と水温の関係を検討したところ,表層海水は高温でラドン濃度が低いものと,低温でラドン濃度が高いものに明確に2分され,前者が温泉水,後者が低温地下水の海底湧出に対応することが示唆された.初年度(H29年度)に構築した真空抜気による溶存ガス分析法の実用性(確度と精度)のチェックを,陸域の湧水を用いて行ったところ,理論的に予想された抜気率に到達できず,しかも抽出ガスの化学組成が抽出率に依存するという分析的に望ましくない結果となった.また,本年度までに,日出沖から大分市西部に至る別府温泉に接するエリアを含む別府湾沿岸域における表層海水のラドン濃度/塩分/水温の曳航観測データ(約570点)、ならびに陸域の調査によって入手した別府湾に流入する河川、自噴する地下水や温泉水のラドン濃度/水温等のデータを揃えることができた.ラドン濃度と塩分に着目した外洋水と陸水(河川水vs海水,地下水vs海水)の混合関係(ミキシング・ダイアグラム)に基づき,観測対象となった表層海水に占める地下水の混合率を導出したところ,海底地下水流出でしか説明できないエリアが別府北部,別府南部にそれぞれ2ヶ所ずつ存在することを明らかにした.さらに,それら4つのエリアについてラドン濃度と水温の関係を検討したところ,表層海水は高温でラドン濃度が低いものと,低温でラドン濃度が高いものに明確に2分され,それぞれが温泉水と低温の地下水の特徴と合致していることを見出し,このような曳航観測によるラドン濃度/塩分/水温の複合観測・解析法によって海底温泉湧出の検出が可能であることを示すことができた.明らかとなった真空抜気による溶存ガス分析法の不具合に対して,液性調整とガスパージを併用した改良法への検討と検証を行う.別府湾におけるラドン濃度/塩分/水温の複合観測・解析法によって推測された海底温泉湧出域において,ドローン等を利用した熱赤外観測を実施し,海底温泉湧出の存在を検証する.また,同じく曳航観測データを活用し,Sugimotoet al.(2016)等の方法にならい,別府温泉沿岸部におけるラドン・塩分収支モデルから海底への地下水の総流出量を推定する.別府湾における曳航観測に使用したラドン濃度観測装置にフロースルータイプのCO2ガス・プルーブを組み込んで全溶存炭酸(DIC)濃度も測定できるようにし,火山性CO2ガスの海底噴出が認められている大分県の姫島(大沢・三島,2017)において試験曳航を行う.テスト後,島周回曳航観測を実施し,沿岸域表層海水のCO2濃度/ラドン濃度等のマッピングを行い,新たな海底ガス流出域を探る.さらに,現有の土壌CO2フラックスメータを用いて陸域のCO2フラックス観測を実施し,姫島全島のCO2フラックス分布図を作成し,沿岸海域のCO2データと比較検討する.以上の研究成果を,随時,関連学会で発表する.森の栄養を海に運ぶ河川に次ぐ“水路"として海底地下水湧出(Submarine Groundwater Discharge,略してSGD)が注目を集めており,通常の地下水よりミネラル分に富み,栄養塩のひとつであるケイ酸を豊富に含む温泉水も沿岸浅海域の生態系に大きく関わっていると予想している.本研究では,最新のSGD観測手法と伝統的な地球化学的調査方法を組み合わせて海底温泉湧出探査法を構築し,別府湾奥部の別府温泉の沿岸域に散在すると予想される海底温泉湧出に適用して検出し,さらに陸域の熱水流動系との関係の解明や海底からの温泉流出量の推定などを行う.本研究で構築を目指す海底温泉湧出の探査法は,小型船舶を使った表層海水のラドン濃度

・水温・塩分の広域稠密曳航観測に加え,有望エリアにおいて採取した底層海水のラドン,溶存ガス(He/Ar/N2など)および温泉由来成分(ケイ酸,全溶存炭酸,ヒ素)の分析を組み合わせたものである.溶存ガスの分析法以外の方法はすでに実用の段階にあったので,初年度は,溶存ガスの採取・分析手法の確立を行った.市販の真空採気びんを活用し,真空抜気によって水試料から抽出されたガスを現有のガスクロマトグラフィーによって分析し,全ての溶存ガス成分(He, H2, Ar, N2, CH4, O2およびCO2)の分析値を得ることができるようになった.また,ラドン濃度・水温・塩分の曳航観測を別府湾奥部沿岸域で実施し,水温と塩分では認知できない高ラドン高濃度域を複数検出することに成功した.その中には流入河川由来のラドンでは説明できない高濃度域があり,いくつかは別府湾の最奥部に位置する別府温泉の地下を流動する熱水の流動経路の終端に対応し,また,いくつかは活断層沿いの海底や沖合の断層帯に対応する場所であることが分かった.また,水深20m以上ではラドンの検出が難しくなることもつかんだ.目標にしていた溶存ガスの分析法の確立では,分析手順を構築し,操作マニュアルを作成できた.当初の予定では,作り上げた溶存ガス分析法の実用性(確度や精度)のチェックまで行うことにしていたが,研究協力者とのスケジュールが合わず,次年度(H30年度)に行うことにした.別府湾での曳航観測の結果は,予想していたことを含み,満足のいくものであった.満足できる結果としては,例えば,別府温泉の南部地域の地下に推定されている熱水の流動経路の終端域の沿岸部海域にラドンの高濃度域が期待されていたが,別府湾でも最高レベルの高濃度域を検出したことである.また,かつて気泡の噴出が認められた活断層沿いの沿岸域もラドン高濃度域であることも判明した.一方,別府温泉の北部地域の地下に推定されている熱水の流動経路の終端域の沿岸部海域にはラドンの高濃度域は検出されず,【研究実績の概要】に著したラドン濃度検出限界の水深依存によるものと考えられるので,【今後の研究の推進方策】に著した底層海水(海底付近の海水)の採取と分析を特別に濃度異常のないエリアにまで拡張し,海底温泉湧出を捉えたい.当初の予定では,なお,得られた研究成果を随時関連学会で口頭発表することにしていたが,研究集会での発表にとどまった.森の栄養を海に運ぶ河川に次ぐ“水路"として海底地下水湧出(Submarine Groundwater Discharge,略してSGD)が注目を集めており,通常の地下水よりミネラル分に富み,かつ栄養塩のひとつであるケイ酸を豊富に含む温泉水もまた沿岸浅海域の生態系に大きく関わっていると予想している.本研究では,最新のSGD観測手法と伝統的な地球化学的調査方法等を組み合わせて海底温泉湧出探査法を構築し,別府湾奥部の別府温泉の沿岸域に散在すると予想される海底温泉湧出に適用して検出し,さらに陸域の熱水流動系との関係の解明や海底からの温泉流出量の推定などを行う.研究2年目の本年度は,採水器で汲みあげられる深層海水に溶けているガス(N2,Ar,O2など)の濃度測定を想定して初年度(H29年度)に構築した真空抜気による溶存ガス分析法の実用性の検証を陸域の湧水を用いて行ったが,理論的に予想された抜気率に到達できず,かつ抽出ガスの化学組成が抽出率に依存するという要検討の結果が得られた.その一方で,日出沖から別府温泉を経て大分市西部に至る別府湾奥部沿岸域における表層海水のラドン濃度/塩分/水温の曳航観測データならびに別府湾に流入する河川,自噴する地下水や温泉水のラドン濃度/水温等のデータを整備することができた.
樹状細胞の活性化、抑制化状態におけるT細胞活性化能の検討

われわれは,樹状細胞がさまざまな刺激を受けることで,その活性化,分化度がどのように変化を受けるかに注目した。すなわち,樹状細胞が,T細胞からの(CD40L,LFA-1,CD28),周囲の環境からの刺激(各種サイトカイン,ケモカイン,Flt3L,LPS)などにより,その形態,accessory moleculeの発現性,液性因子の発現性がどのように影響を受けるかを解析することで,それらの変化がどのようにT細胞の活性化にフィードバックされるのかを検討することとした。また逆に免疫抑制を起こす刺激(cyclosporin,FK-506,ステロイド,IL-10,TGF-beta)により,樹状細胞がどのように影響を受けるかを検討することとした。昨年度までに,樹状細胞の収集法,刺激法,解析法について確立した。本年度はこれらの方法によって得られた結果を基に,in vitroでの樹状細胞のT細胞活性化能の増強効果あるいは抑制効果を解析した。解析方法としては,各種活性化刺激,抑制化刺激を受けた樹状細胞をallogenic MLRにて解析した。その結果,活性化刺激を受けた樹状細胞では,T細胞活性化能の増強効果が認められた。一方,抑制化刺激を受けた樹状細胞ではT細胞活性化能の増強効果が低下する傾向にあった。この際の細胞表面分子の解析において,各種の刺激により樹状細胞上の接着分子(特にCD82)がupregulateしており,T細胞活性化能においてこれの活性化が重要であることが示唆された。刺激後24時間ではCD82は細胞表面に均一に存在せず、部分的に局在するように存在していた。同様の結果は細胞をanti-CD40抗体で刺激した場合にも認められた。この結果はCD82の細胞表面における発現性と細胞外基質との接着性に相関が我々は樹状細胞の形態が分化の程度によって大きく異なることに注目した。すなわち、未分化の状態では樹状細胞は、他の血球系細胞と同様に球形であるが、分化するに従い細胞骨格が変化し多角形、樹状を呈するようになる。このことはまた、細胞表面上の接着分子の機能が変化していることを示唆している。一方樹状細胞と同様、抗原提示機能を有する単球表面上のCD82分子の発現量を能動的に亢進させると、細胞間接着が誘導されるようになる。またCD82分子は接着分子のひとつであるインテグリンの活性化を制御していることが明かとなっている。そこで我々は、まずヒト単球を活性化物質として知られるlipopolysaccaride(LPS:10ng/ml)にて刺激し、その形態とCD82分子の発現性をanti-CD82抗体による蛍光染色法により経時的に観察した。その結果、単球は刺激後4時間よりplateに強力に接着しはじめ16時間で多角形を呈するようになった。一方CD82の発現は安静時にはわずかに認められるにすぎないが、刺激後4時間より細胞表面の発現性が上昇しはじめ、24時間でピークを迎えた。この時のCD82の状態を観察するため、細胞をFITC-antiCD82抗体にて染色しconfocal microscopeにて解析したところ、安静時にはCD82は細胞表面に均一に存在しているのに対し、LPSあることを示唆させる。
アミロイド線維の形成と吸収のメカニズム:プロティンA・金コロイド法による検討

アミロイド-シス発症のメカニズムを解明する目的で以下の実験を行なった。マウスにアミロイドーシスを惹起させ、肝にアミロイドの微量沈着がみられる時期(惹起注射後4日目頃)に肝を生検し、アミロイド沈着を確認した後、そのまま放置して吸収させた。この沈着期と吸収期の超微形態的相違を抗マウスアミロイド抗血清を用いた免疫電顕法により検索し、Kupffer細胞がアミロイド線維形成に関与する役割を検討した。結果:アミロイド沈着期では、Kupffer細胞の胞体の弯入部に一致して細胞外に束状のアミロイド線維(amyloid bundle)が認められた。又、Kupffer細胞の胞体内で卵円形菱形のdense bodyに一致して金粒子のラベルが認められた。これらの小器官の形態は比較的整っており、アミロイド線維と考えられる細線維構造を有するものと、線維構造が認められない均一・細顆粒状の基質から成っているものが存在した。アミロイド吸収期では、少量のアミロイド沈着が細胞外に残存し、それらの多くはフェルト状を呈していた。Kupffer細胞の胞体内には金粒子にラベルされた不整形の小器官が多数認められたが、それらの中には、アミロイド線維と他の貧食された物質が混在していた。これらの所見より、この小器官はheterophagosomeでアミロイド線維も貧食、消化されている過程のものと考えられた。一方、アミロイド沈着期で金粒子にラベルされたelecteron denceな小器官は、その超微形態像より吸収期のものとは異なり、lysosomeないしはphagolysosomeと考えられ、その中で貧飲されたSAAがlysosomal enzymeの作用を受けアミロイド線維となったものと考えた。以上の結果は、我々が既に報告した(virchows Arch A 415:411419,1989)脾における網内系細胞の所見と一致しており、肝においてもKupffer細胞の胞体内でアミロイド線維は形成されることが確認された。本研究成果は、平成2年8月に第6回国際アミロイドーシスシンポジウム(オスロ)に参加、発表した。マウスにamyloid enhancingfactorとカゼインを投与してアミロイド-シスを短期間に惹起させ以下の実験を行った。投与後4日目で肝部分切除術を施行してアミロイドの微量沈着を確認した後、12週間放置し沈着したアミロイドを吸収させた。肝の部分切除組織および吸収期の肝組織を抗マウスアミロイド抗体を用いて免疫電顕法(プロテイン金・コロイド法)により、アミロイド線維の形成像と吸収像を比較検討した。アミロイド線維形成期では、Kupffer細胞の胞体の複雑な弯入部に一致して細胞外に束状のアミロイド線維が認められた。又、この時期では、Kupffer細胞の胞体内の円形菱形のライソゾ-ムあるいはファゴゾ-ムに一致して免疫電顕法で金粒子の付着が認められた。これらの小器官にはアミロイド線維と考えられる線維構造を有するもののみならず均一無構造なものも認められた。アミロイド吸収期では、細胞外に沈着したアミロイド線維の束状配列は減少し、多くはフェルト状を呈していた。この時期のKupffer細胞は相当数の不整形のファゴゾ-ムを有し、それらの中に貪食された他の物質に混じてアミロイド線維も認められた。又、一部では、線維構造を有さないファゴゾ-ム内にも金粒子の付着が認められた。

以上の結果より、アミロイド線維形成期と吸収期のKupffer細胞において、金粒子の付着したライソゾ-ムあるいはファゴゾ-ムに超微形態的に相違がみられ、前者はアミロイド線維形成像、後者はアミロイド線維の貪食・吸収像と考えられた。これらの所見は、脾のアミロイド形成期および吸収期におけるマクロファ-ジでみられたものとよく一致していた。今回の実験結果より、アミロイド線維の一部はKupffer細胞の胞体内でも前駆蛋白(SAA)より形成されることが確認された。実験的アミロイド-シスのマウス肝におけるアミロイド沈着期と吸収期像を比較して、アミロイド線維形成機序の解明を目的とした実験を前年度に行なった。そのによって得られた電顕ブロックを薄切し、抗マウスアミロイド抗体を用いたプロティンA・金コロイド法による免疫電顕法を行ない、アミロイド沈着期と吸収期のkupffer細胞とアミロイド線維との関係について詳細に検索することによって、kupffer細胞のamyloidogeーnisisに関する役割について検討した。結果:アミロイド沈着期の肝では、細胞外のアミロイド線維の大部分は束状(amyloid bundle)を呈し、一方、吸収期のそれはフェルト状を呈していた。又、沈着期のkupffer細胞の胞体内に金粒子でラベルされた小器官が稀に認められたが、これらの小器官は吸収期のものと比較して、卵円形菱形で比較的整った形態を呈し、アミロイド線維と考えられる細線維構造と細顆粒状の基質から成っていた。吸収期のものは、不整形を呈し、その中にはアミロイド線維と空胞状あるいは模様からミエリン様形態を呈した種々の貧食・消化された物質とが混在していた。生化学的にはアミロイドの前駆蛋白SAAはmonocgte等の細胞模表面で細胞からreleaseされたプロテア-ゼ系統の酵素の作用によりアミロイド蛋白と同一の分子量の蛋白にdegradeされるとの報告がある。これらの報告と本実験結果より、Kupffer細胞の胞体内でSAAがlysosomal enzymeの作用を受けアミロイド線維となる可能性が示唆された。以上の実験結果をまとめ、平成2年8月にノルウェ-のオスロで開催された第6回国際アミロイド-シスシンポジウムに参加し発表した。
長寿リスクの資本市場におけるヘッジに関する研究

本研究の目的は,日本における長寿リスクに関して,(1)先行研究での問題点を改善し,かつ現実的にも整合的なモデルを提案すること,(2)ベイズ予測分布の中立化による長寿リスクの評価を行うこと,(3)長寿リスクの証券化やリバースモーゲージ等,長寿リスクのヘッジの枠組みを提示し,その評価を行うこと,の3点である.その際,ベイズ法によるアプローチを用いてモデル推定,将来予測,長寿リスク評価,さらに証券化商品等長寿リスクをヘッジできる商品の評価を一貫した枠組みで行う.平成26年度の研究実施計画は, (a)前年度得られた結果を基に,日本における長寿リスクのヘッジの枠組みを提案し,ベイズ法によるアプローチを用い,リバースモーゲージ等の長寿リスクをヘッジできる商品の評価を行うこと,(b)ここまでで得られた長寿リスクに関するモデル,評価,ヘッジの枠組みについての見地に基づき,長寿リスクに関する制度面での調査を進め,日本で長寿リスクの証券化商品の普及が進まない要因や,リバースモーゲージが普及しない要因を探り,今後日本でこれらが普及するために必要な要因を提示すること,の2点であった.(a)について,平成25年度に引き続き,長寿リスクに関する研究動向の整理を行い,アメリカやヨーロッパにおける長寿リスクやリバースモーゲージの証券化に関する論文等,長寿リスクのヘッジの枠組みに関する論文を集中して読み込んだ.また,日本のデータを用いた住宅価格の予測を行い,リバースモーゲージ等の長寿リスクをヘッジできる商品の評価につなげた.(b)について,長寿リスクに関する制度面での調査として,まず過去日本において扱われたリバースモーゲージなどの長寿リスクに関する商品について調査した.また,これらの商品の背景となった要因を探るため,制度面に注目した論文やレポートを集中的に読み込んだ.26年度が最終年度であるため、記入しない。26年度が最終年度であるため、記入しない。本研究の目的は,日本における長寿リスクに関して, (1)先行研究での問題点を改善し,かつ現実的にも整合的なモデルを提案すること,(2)ベイズ予測分布の中立化による長寿リスクの評価を行うこと,(3)長寿リスクの証券化やリバースモーゲージ等,長寿リスクのヘッジの枠組みを提示し,その評価を行うこと,の3点である.その際,ベイズ法によるアプローチを用いてモデル推定,将来予測,長寿リスク評価,さらに証券化商品等長寿リスクをヘッジできる商品の評価を一貫した枠組みで行う.平成25年度の研究実施計画は, (a)2012年の国際学会で発表した結果を基に分析をより精緻なものにすること,(b)長寿リスクを資本市場でヘッジする枠組みを考察すること,(c)リバースモーゲージのリスクを評価するために,住宅価格の予測を行うこと,の3点であった.(a)について, 2013年7月の国際学会において, 2012年の国際学会で発表した研究をさらに発展させ,ベイズ法を適用し, 2つの因子に拡張したLee-Carterモデルを用いた日本の将来死亡率の予測と,長寿リスクの評価の具体例として日本のデータを用いたリバースモーゲージの評価について発表した. (b)について,長寿リスクに関する研究動向の整理を行い,アメリカやヨーロッパにおける長寿リスクやリバースモーゲージの証券化に関する論文等,長寿リスクのヘッジの枠組みに関する論文を集中して読み込んだ. (c)について,研究分野での国際動向が激しく, (b)における研究動向の整理に思いのほか手間取り,計画より若干進展が遅れてしまった.しかし,研究動向の整理と同時並行で取り組むことにより,本格的な分析に着手しており,着実な結果が得られた.本研究の目的は,日本における長寿リスクに関して,(1)先行研究での問題点を改善し,かつ現実的にも整合的なモデルを提案すること,(2)ベイズ予測分布の中立化による長寿リスクの評価を行うこと,(3)長寿リスクの証券化やリバースモーゲージ等,長寿リスクのヘッジの枠組みを提示し,その評価を行うこと,の3点である.その際,ベイズ法によるアプローチを用いてモデル推定,将来予測,長寿リスク評価,さらに証券化商品等長寿リスクをヘッジできる商品の評価を一貫した枠組みで行う.平成26年度の研究実施計画は, (a)前年度得られた結果を基に,日本における長寿リスクのヘッジの枠組みを提案し,ベイズ法によるアプローチを用い,リバースモーゲージ等の長寿リスクをヘッジできる商品の評価を行うこと,(b)ここまでで得られた長寿リスクに関するモデル,評価,ヘッジの枠組みについての見地に基づき,長寿リスクに関する制度面での調査を進め,日本で長寿リスクの証券化商品の普及が進まない要因や,リバースモーゲージが普及しない要因を探り,今後日本でこれらが普及するために必要な要因を提示すること,の2点であった.(a)について,平成25年度に引き続き,長寿リスクに関する研究動向の整理を行い,アメリカやヨーロッパにおける長寿リスクやリバースモーゲージの証券化に関する論文等,長寿リスクのヘッジの枠組みに関する論文を集中して読み込んだ.また,日本のデータを用いた住宅価格の予測を行い,リバースモーゲージ等の長寿リスクをヘッジできる商品の評価につなげた.(b)について,長寿リスクに関する制度面での調査として,まず過去日本において扱われたリバースモーゲージなどの長寿リスクに関する商品について調査した.また,これらの商品の背景となった要因を探るため,制度面に注目した論文やレポートを集中的に読み込んだ.26年度が最終年度であるため、記入しない。

長寿リスクに関する研究動向の整理に思いのほか手間取ったものの,住宅価格の予測に関して本格的な分析に着手しており,加えて,国際学会においてこれまでの研究を発展させ,日本の将来死亡率の予測と,日本のデータを用いたリバースモーゲージの評価について発表できたため.平成26年度は,平成25年度に得られた結果を基に,日本における長寿リスクのヘッジの枠組みを検討し,ベイズ法によるアプローチを用いて,リバースモーゲージ等の長寿リスクをヘッジできる商品の評価を行う.また,これまでで得られた長寿リスクに関するモデル,評価,ヘッジの枠組みについての知見に基づき,長寿リスクに関する制度面での調査を進め,日本で長寿リスクの証券化商品の普及が進まない要因や,リバースモーゲージが普及しない要因を探り,今後日本でこれらが普及するために必要な要素を提示する.以上の研究成果を国際会議や国内学会で発表し,研究論文にまとめ学術雑誌に投稿する.
アンフォテリシンB会合体の解明を目指した固体NMRによる分子間相互作用解析

抗真菌剤であるアンフォテリシンB(AmB)は細胞膜中でステロール分子とイオン透過性チャネル複合体を形成することで薬理活性を発現すると考えられているが、その複合体構造の詳細は未だ不明である。そこでリン脂質膜中で形成されるイオン透過性チャネル複合体の構造を明らかにするため、固体NMRによる解析を試みている。これまでに^<13>Cおよび^<19>F標識体を用いた原子間距離測定に成功していたが、さらなる構造情報の取得には新たな方法を用いる必要がある。そこで、イギリスにあるオックスフォード大学のWatts先生の研究室に行き、固体NMRに関する測定技術の習得を行った。この研究室では、膜タンパク質の構造解明に向けた研究を行っており、アンフォテリシンへの応用も可能である。そこで、各種二次元測定、配向膜を用いた測定、バックグランドのシグナルを抑制する測定法など、多くの新たな手法を習得することができた。また距離測定に関しても、従来使用していたREDOR法に加えて、同核種間の距離測定が可能なRR法の習得し、今後のアンフォテリシンBの研究に応用する予定である。そこでリン脂質膜中で形成されるイオン透過性チャネル複合体の構造を明らかにするため、^<13>Cおよび^<19>Fで標識されたAmBもしくはエルゴステロールを用いて分子間REDOR測定を行った。まず、標識化AmBをリン脂質と混合し、膜中でのAmB分子間のREDOR測定を行った。その結果、エルゴステロール存在下ではAmBの分子間距離が増加することを見出し、AmB-エルゴステロールの直接的な相互作用が示唆された。また、AmB-リン脂質の相互作用も薬理活性の発現に重要であることが示唆された。次の段階として、標識化AmBと標識化エルゴステロールを用いたAmB-エルゴステロールの分子間REDOR測定を行った。その結果、初めて分子間REDOR測定に成功し、AmBとエルゴステロールが直接相互作用をしていることを明らかにした。さらに、AmB-エルゴステロール間の相互作用様式には、従来から想定されていた"head-to-head"タイプの他に"head-to-tail"タイプの相互作用も存在することが示唆された。これは、本研究により初めて得られた新たな知見である。さらに、AmB-エルゴステロール-リン脂質の相互作用を分子動力学計算を用いて再現し、薬理作用を発現する際の複合体のモデル構造を提唱した。
中性化合物の高感度分離同定用ミセル電動クロマトグラフィー・質量分析法の構築

ミセル電動クロマトグラフィー(MEKC)は中性化合物も分離可能としたキャピラリー電気泳動(CE)の分離モードの一つである。キャピラリーゾーン電気泳動(CZE)の泳動液にイオン性ミセルを擬似固定相として添加して,クロマトグラフイーの分離原理に基づいて行う分離法である。界面活性剤を用いるために通常のCZEとは異なる特性を有する。問題点としては,質量分析計(MS)を直接結合して検出器として用いる場合,エレクトロスプレーイオン化法(ESI)をインターフェースとすると界面活性剤がイオン化効率を低下させる。CZEの濃度感度を上昇させるために種々のオンライン試料濃縮法が開発されているが,それらはキャピラリー内での不連続な組成を持つ泳動液間での電気泳動速度の違いに基づいているが,中性化合物についてはこのような濃縮法もそのままでは利用できない。本研究ではMSをMEKCと直接結合することにより,高感度,同定可能な検出法として利用する方法の開発を目的とした。一方,MS検出に限らず,濃度検出感度を増強するために,MEKCのための種々のオンライン試料濃縮法を開発することも目的とした。前者に関しては界面活性剤の存在がイオン化効率を低下することのないイオン化法として特注の大気圧化学イオン化法(APCI)をインターフェースとする方法と,ESIをインターフェースとする市販MSの両方を利用し,MEKC-MSについて検討した。種々の工夫によりMEKC-MSは可能であるが,広く一般に利用されるためにはさらなる装置の改良が必要であると言える。一方,オンライン試料濃縮法については,スウィーピング法という濃縮原理を開発し,擬似固定相と親和性の強い疎水性の高い試料分子やイオン等については45桁の感度上昇が可能となった。今後はオンライン試料濃縮法とMS検出とを組み合わせた方法の開発を行う予定である。本年度は,主として3つの研究を平行して進めた。一つは本研究で新しく購入した質量分析計であるFinnigan LCQとキャピラリー電気泳動(CE)装置HP3DCEを用い,質量分析法(CE)-MSシステムを構築することである。質量分析計の設置までに時間がかかり,まだ稼動初めてからの時間が少なく,本格的な利用には至っていない。購入した装置は本来HPLC-MS用に設計されたものであり,CEと結合するためには,種々の操作条件の最適化が必要であった。エレクトロスプレーイオン化(ES)インターフェースを用いるCE-MSとしては期待通りの性能が得られることが判明したので,ESIを用いてミセル動電クロマトグラフィー(MEKC)とのオンライン結合を行っている。初期のデータでは期待通りの性能が得られているが,さらに検討が必要な部分もある。もう一つは昨年度まで基盤研究(A)で行っていた研究の継続で,以前から所有していたMS装置を用いて,大気圧イオン化(APCI)によるMEKC-MSの研究である。これまであまり知られていなかったAPCIを用いたCE-MSの基本的特性を多く明らかにできた。ESIによる噴霧の時のシース液の流量,ミセル濃度,緩衝液濃度は検出感度にあまり影響しないが,脱溶媒室温度とドリフト電圧は検出感度に大きく影響することが分かった。応用例として,フタル酸エステルのMEKC-MSを行った。3つ目の研究は,直接MEKC-MSを行うのでなく,稀薄溶液試料のMEKC-MSを行うための準備として,MEKCによる中性試料のオンライン濃縮法について検討した。疎水性の強い中性化合物であれば,100倍程度の濃縮が可能であることが明らかになった。本年度も主として3つの研究を平行して進めた。一つはMEKC-MSを行うための準備として,MEKCによる中性試料のオンライン濃縮法についてさらに検討した。