hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
細胞発達定量評価のための三次元細胞位置制御技術の確立

従来の細胞培養においては細胞培養時の初期位置が制御できていないため、細胞発達時に行われいる細胞間コミュニケーションの定量評価ができない問題がある。そこで本研究では、培養空間における細胞の初期位置を制御することにより、細胞発達の定量評価を行うことを目的とし、二次元および三次元空間における細胞の位置制御手法の開発と肺気管支上皮細胞を用いた発達評価を行った。本技術を用いて細胞を一列に並べた状態から気管支上皮細胞の分岐形成を計測したところ,分岐は全て初期細胞群と直交方向に伸びていることが新たに確認できた。細胞は自ら形態形成因子を放出し,空間的に濃度勾配を生成することで他の細胞とコミュニケーションを取り,自らの位置情報を得ていることが知られている.しかしながら従来の細胞培養においては細胞位置が制御できていないため、細胞間コミュニケーションの定量評価ができない問題がある。(1)細胞二次元空間位置制御による気管支上皮細胞の発達評価ガラス基板上における細胞の接着性を、フィブロネクチンをフォトリソグラフィーにより選択的にパターニングを行うことで培養初期における細胞の二次元位置制御を達成した。この状態から気管支上皮細胞がどのように分岐形成するかを実験および反応拡散系モデルを用いたシミュレーションにより発達の評価を達成した。(2)ゲルシートを用いた細胞三次元制御シリコン基盤にDRIEを用いて作製したフレームにゲル薄膜を作製し、パターニングしたアライメントマークに併せて積層化することを達成した。本手法を用いることにより、各ゲルシート上に二次元細胞位置制御を行うことで、三次元空間における細胞位置制御を達成することが可能となる。26年度が最終年度であるため、記入しない。細胞発達制御26年度が最終年度であるため、記入しない。
表面・界面領域に拘束された高分子鎖の分子運動特性解析法の確立

高度に機能化された高分子表面を創成するためには、表面構造および物性を正確に理解し、精密に設計・制御する必要がある。本研究では、表面や界面などに束縛された高分子鎖の分子鎖熱運動性の解析法を確立すべく研究を展開してきた。以下に得られた成果を要約する。本研究グループで提案してきた高分子表面・界面の解析法をより精度の高いものに仕上げ、種々の高分子系、さらには高分子混合物系へと展開した。具体的には、走査粘弾性顕微鏡の測定周波数の拡大、S/N比の向上、液中測定等を実現し、高分子表面・界面におけるレオロジー特性の解析法をより確実なものにした。また、従来より用いられてきたバルク試料用の動的粘弾性測定装置を用いて、膜厚数10ナノメートル程度の高分子超薄膜の分子運動性を正確に、かつ、詳細に解析することに成功した。本研究での成果、すなわち、ナノレベルでの分子運動性の解析法が確立できたことで、高分子表面および界面で発現される特異な分子鎖熱運動性の検出、さらには、その発現機構の解明へとつながった。今後は、本研究で提案、確立した手法によって高分子ナノ物性の解明が飛躍的に進行し、ナノ組織体の構築等のナノテクノロジー分野がさらに発展することを期待している。これまで、単分散ポリスチレン(PS)膜の表面分子遅動特性はバルクと比較して著しく活性化していることを明らかにしている。今年度は、SVM測定における試料表面への探針の侵入深さが表面ガラス転移温度、Tgsに及ぼす影響について検討した。試料として、数平均分子量、Mnが140kの単分散PSを用いた。示差走査熱量測定より評価したバルクのガラス転移温度、Tgbは382Kであった。PS膜はスピンコーティング法によりシリコン基板上に製膜した後、真空下、423Kで24h熱処理を行った。偏光解析測定に基づき評価したPS膜の膜厚は約200nmであった。走査粘弾性顕微鏡(SVM)測定は真空下、周波数4kHzで行い、ノーマルフォース及び探針先端径を変化させて探針先端の侵入深さを制御した。探針の侵入深さを変化させてPS膜におけるTgsを測定した。侵入深さはHertzの弾性理論に基づき計算し、TgsはSVM測定における表面位相差が増加し始める温度で定義した。線形粘弾性領域では、TgsはTgbより著しく低く、侵入深さとともに上昇した.また、侵入深さが同じ場合には、Tgsは探針径の増加にともない低下した。Tgsを探針-試料表面間に生じる圧力の円数で整理しなおすと、Tgsは圧力とともに上昇した.圧力を0Paに外挿して得られるTgsは、探針が表面と接触していない状態、すなわち理想的な膜最表面のTgと考えてよい。Mn=140kのPS膜の場合この値は305Kであった高分子表面・界面に束縛された分子鎖の熱運動特性は内部と比較して著しく異なっている。本研究では、走査粘弾性顕微鏡(SVM)更なる改良を行い、温度変化にともなう高分子膜表面の弾性率変化を直接観察した。試料としてMn=1.03Mの単分散ポリスチレン(PS)を用いた。示差走査熱量測定に基づき評価したバルク試料のガラス転移温度(Tgb)は378Kであった。PS固体膜はスピンコーティング法によりシリコン(Si)基板上に調製し、十分に熱処理を施した。膜厚は100nmとした。PS膜表面の分子鎖熱運動性はSVM測定に基づき評価した。温度上昇にともなう弾性率の変化を可視化するため、PSの一部をナイフで削り取り基板のSiを露出させ、SVM測定を行った。SVM像中、弾性率の高い領域は明るい領域として観察される。測定温度上昇に伴いPS膜の存在する領域としない領域でコントラストが明確になった。より定量的に評価するため、PSと基板の弾性率の差、ΔEの温度依存性を温度の関数としてプロットした。測定温度範囲でSiの弾性率は変化しない。ΔEの減少率は340K付近で変化したことから、PS膜表面の弾性率はこの温度を境に急激に変化したと考えられる。

この温度はこれまで報告してきたPS膜表面のTgと良く対応しており、この結果からも、高分子膜表面の分子鎖熱運動性は内部と比較して活性化していると結論できる。SVMを用いて表面分子運動特性を視覚的に評価することができた。今年度は、走査粘弾性顕微鏡(SVM)を用いて、表面ナノレオロジー特性に及ぼす分子構造因子の解明とその制御を目的に研究を行った。特に、高分子表面の粘弾特性に及ぼす分子鎖末端基濃度と結晶性の効果について定量的に議論した。高分子表面の分子運動特性と分子鎖末端基濃度の関係を明らかにするため、分子鎖両末端にフルオロアルキルシリル基(R_f)を有するPS[α,ω-PS(R_f)_2]を合成し、固体膜を調製した。膜表面での分子鎖末端基濃度はX線光電子分光測定ならびに中性子反射率測定、分子運動特性は水平力顕微鏡測定に基づき評価した。表面での分子鎖末端基濃度は膜内部と比較して約20倍近く高くなっており、この末端の表面濃縮によって過剰な自由体積が誘起され、表面での分子鎖熱運動性が活性化されることを定量的に議論した。代表的な結晶性高分子として、アイソタクチックポリプロピレンを選択し、その表面分子運動特性を評価した。その結果、結晶性高分子においてさえも膜表面でのガラス転移温度は内部と比較して著しく低下していた。また、表面セグメント運動の活性化エネルギーに関してもバルク値と比較して小さな値であることを初めて明らかにした。研究を総括した。
気管支腔内超音波断層法における後方散乱波解析による組織性状診断のプログラムの開発

1、バルーン付きカテーテルの作成循環器領域で使用している血管内超音波カテーテルをそのまま気管支鏡に使用するために、特別な外筒の制作を開始した。血管内超音波カテーテルが血液などの液体で周囲が満たされるのを前提として作成されている一方、気管支内は気体で満たされており超音波による解析は気体中では不可能なため、カテーテルの先端に生理食塩水をためるためのバルーンを取り付け、超音波プローブの先端がそのバルーンの中心に位置するようカテーテルの長さを調節した。バルーンの大きさを気管支のサイズに調節するとともに、気管支内を損傷させないことに注意を払った。2、解析プログラム初期設定の検討気管支から収集された超音波後方散乱波を冠動脈内超音波解析で使用している装置で解析できるよう初期設定(減衰や解析周波数の設定など)を調節するために、パーソナルコンピューターに解析プログラムをインストールし初期設定の検討を始めた。3、超音波後方散乱波と気管支組織の比較気管支病変部位からの超音波後方散乱波のIntegrated backscatter(IB)値を生検あるいは手術後標本から得られた画像と比較検討し、各IB値がどのような気管支組織に対応するかの検討を始めた。1,バルーン付きカテーテルの作成循環器領域で使用している血管内超音波カテーテルをそのまま気管支鏡に使用するために、特別な外筒の制作を開始した。2,解析プログラム初期設定の検討気管支から収集された超音波後方散乱波を冠動脈内超音波解析で使用している装置で解析できるよう初期設定(減衰や解析周波数の設定など)を調節するために、パーソナルコンピューターに解析プログラムをインストールし初期設定の検討を始めた。3,超音波後方散乱波と気管支組織の比較気管支病変部位からの超音波後方散乱波のIntegrated backscatter(IB)値を生検あるいは手術後標本から得られた画像と比較検討し、各IB値がどのような気管支組織に対応するかの検討を始めた。
サリチル酸の外有毛細胞の運動能抑制に対する作用機序の解明

哺乳動物の外有毛細胞は、基底板と網状膜を連結する重要な位置にあり、細胞膜電位の変化に伴ってその円柱形の細胞体を伸縮させる。この運動性は、少なくとも20kHzの周波数まで追随することが出来る。このことから、外有毛細胞は蝸牛のactive mechanismにおける中心的な作用体として働いていると考えられている。この外有毛細胞についての運動メカニズムとその生物学的役割は、これまでにも非常に注目されてきた。形質膜に蓄えられた電気エネルギーを使う外有毛細胞の運動性は、形質膜に存在するモーターが作用していると考えられている。外有毛細胞の形質膜は膜を横断する電荷を蓄えているので、この電荷の移動に伴い外有毛細胞は電気的エネルギーを保持している。高周波領域で働くためには、セカンド・メッセンジャーを介しない電気的エネルギーから機械的エネルギーへの直接的な変換機構が理想である。形質膜における運動メカニズムの特徴を明らかにするために、外有毛細胞の細胞骨格をトリプシンで融解させる実験を行った。その結果、細胞は内圧の上昇に伴って球形に変化し、細胞内圧を一定以上に加える事により表面積を制約することができる。電荷の移動と表面積変化が直接カップリングしているならば、表面積変化が制約されると膜の電荷移動量は減少するはずである。また、膜電位の変化に対応する電荷の移動は膜容量として現れるため、表面積を制約した効果は膜容量の計測によって観察されるはずである。以上のことから外有毛細胞を球形にして、膜容量と細胞の半径の電位依存に対する変化について調べた。その結果、表面積を制約すると電荷移動が減少することより、トリプシンで細胞骨格を破壊させた細胞では、面積変化と電荷の移動がカップリングしている事が分かった。この結果は外有毛細胞の形質膜に存在するモーターを分子レベルで解明する手がかりになると考えられる。
デジタルペンを用いた野外調査支援システムの開発と評価

近年,地域研究などで実施される野外調査では,様々なモバイル機器を使ったデータを収集が行われる.さらに研究者の多くは,野外でのデータ収集にあわせて手書きメモを作成する.このように収集されたデータや手書きメモは,大量である上に書式が不統一であるため,研究者はそれらの分類や分析に必要な関連付けを効率的にできない.そこで本研究では,野外調査で収集したデータを関連付けて蓄積し地理情報として公開することを支援する野外調査支援システムを開発した.さらに,地域研究者による実際の野外調査で提案システムを評価し,その有効性を確認した.近年,地域研究などで実施される野外調査では,様々なモバイル機器を使ったデータを収集が行われる.さらに研究者の多くは,野外でのデータ収集にあわせて手書きメモを作成する.このように収集されたデータや手書きメモは,大量である上に書式が不統一であるため,研究者はそれらの分類や分析に必要な関連付けを効率的にできない.そこで本研究では,野外調査で収集したデータを関連付けて蓄積し地理情報として公開することを支援する野外調査支援システムを開発した.さらに,地域研究者による実際の野外調査で提案システムを評価し,その有効性を確認した.本年度は,地域研究者と共同し,以下のような野外調査支援システム等の開発と評価を実施した.1.地域研究者によるデジタルペンを用いた地図への注釈や,GPSデータとデジタルペンを用いて作成したテキストデータから地理情報を作成するプロトタイプシステムの評価実験をインドネシアで実施した.実験の結果,地提案システムは,地位研究者の要求を満たし,有益であることが確認された.特に,フィールドノートからのデータ整理や分析のために,GPSデータとデジタルペンによるテキストデータから地理情報を効率的に作成することへの評価が高いことが示された.2.地域研究者は,野外調査において多様な機器を用いてデータを収集する.しかし,収集データの分析のためのデータ統合は,機器ごとのデータ形式が異なるため,効率的にできない.そこで,本研究では,GPSデータと加速度計データを例に時間に基づいて効率的にデータ統合をするシステムを開発した.提案システムは,バングラデシュや上海での野外調査において,地域研究者によって実際に使用され,効率的なデータ統合が実現でき高い評価を得た.3.語彙学習で発音の学習は,綴りの学習と同様に重要である.しかし,学習者自信の教材作成を許すシステムで,学習者が発音データを用意することは困難である.そこで,本研究では,学習対象の語を母国語とする利用者が,発音を録音と学習者へのデータ提供を容易にするためのシステムを開発した.地域研究において,写真やメモ以外にも音声も重要な収集対象である.従って,提案システムは,地域研究者による野外帳支援にも役立つと考えられる.4.モバイル機器を用いた学習支援を目的に,携帯電話向け小テストの管理や実施を支援するシステムを開発した.世界的に携帯電話普及は進んでおり,海外における野外調査でのアンケート収集などへの応用が期待できる.本年度は,地域研究者による野外調査支援としてデジタルペンを用いたフィールドデータ収集支援システムの開発を引き続き行った.さらに研究者による提案システムの評価実験から問題点を明らかにし,機能追加と改善を行った.提案システムの基本機能は,デジタルペンで記録した手書きデータと,位置データおよびデジタル写真をタイムスタンプに基づいて統合し,KMLもしくはCSV形式のファイルを出力することによって,収集したフィールドデータの分析や共有を支援する.さらに,本年度は基本機能に加えて,各データの編集機能と統合した地域情報の出力範囲の指定するためのフィルタリング機能を実現した.これにより,研究者はより効率的に,収集データの分類や共有が可能になった.さらに提案システムを京都大学,東京成徳大学,タイ,東京大学で研究者および大学院生を対象に評価実験を行い,ユーザインタフェースに関する問題点を明らかにするとともに実現した機能の有効性を確認した.
希少疾患セッケル症候群特異的ｉＰＳ細胞を用いた病態解明

セッケル症候群(SS)は小頭症、低身長などの症候を示す希少疾患である。SSの遺伝子変異として複製ストレス応答を制御するATR遺伝子の変異(ATR-Seckel変異)が同定されている。ATR-Seckel変異の影響として、患者さんの線維芽細胞においてATR遺伝子のエキソン9のスプライシング異常を起こすことが知られている。しかしながら、この変異を持つiPS細胞(SS-iPS細胞)を樹立したところ、iPS細胞ではスプライシング異常が軽減され、神経前駆細胞(NPCs)ではスプライシング異常が生じていた。NPCsにおけるATR-Seckel変異の影響を調べるために、ATR活性及び分裂紡錘体の形態を検証した。SS-NPCsにおいて複製ストレスに対するATR活性の低下と異常な紡錘体形成の割合が上昇した。化合物を用いたスプライシング異常の回復実験も行った。CLK1阻害剤であるTG003がSS-NPCsおいてスプライシング異常を抑制し、ATRの応答が上昇し、紡錘体形成異常の頻度も低下した。次に細胞種特異的の機構解明に取り組んだ。ATR-Seckel変異が入ることで結合能が変動するRNA結合タンパク質をin silico予測し、二つの因子を特定した。RNAプルダウンを行ったところ、変異型とWT型のATRエキソン9 RNAに対するこれらの因子の結合能が異なった。さらに、二つの因子の発現抑制実験を行った結果、一種類のみiPS細胞でATRエキソン9のスキッピングを促進した。細胞種によってこの候補因子の発現量の差を確認したが、SS-iPS細胞とSS-NPCsにおいて差がみられなかった。RIP-qPCRを行うことで、候補因子がNPCsの状態と比較してiPS細胞の状態で変異型ATRエキソン9への結合能が強くなっていた。iPS細胞における候補因子のスプライシングへの影響を示唆する結果が得られた。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。神経発達障害であるセッケル症候群(Seckel syndrome: SS)の病態解明を目指し、本研究を開始した。SSは重度の小頭症、脳回形成異常、低身長などの症候を呈する先天性疾患である。小頭症の原因は脳を構成する神経細胞になる神経前駆細胞集団の枯渇によるところが大きいとされる。SSの原因遺伝子として最初に同定されたATR遺伝子変異を有する患者(ATR-SS)の細胞を本研究で用いる。ATR遺伝子は複製ストレスを調節するキナーゼとして広く知られている。しかし既知の機能だけでは神経特異的な症候を引き起こす理由を十分に説明できない。本研究でATRに神経特異的な機能の存在を考慮しながら、SSの病態解析を介してATR遺伝子変異が神経前駆細胞へ及ぼす影響を調べる。具体的にはATR-SS患者由来iPS細胞を樹立し、さらにゲノム編集技術をもちいて遺伝子修復株を作製する。病態を再現するために脳オルガノイド形成法を採用する。患者株と遺伝子修復株の脳オルガノイドを作製し、その内部構造を比較し、小頭症に繋がりうる表現型を探す。皮質形成期におけるATRの新規機能を推測する。また本研究で用いているATR遺伝子変異に見られるスプライシング異常の機構解明を目指す。iPS細胞、神経前駆細胞といった細胞種ごとにおけるスプライシングパターンを比べ、そのパターンの差異を生み出すスプライシング因子の探索を実施する。特定したスプライシング因子のATR転写物への結合能を確認し、他のスプライシングイベントに与える影響をトランスクリプトーム解析で網羅的に確認する。本研究により、ATRの新規機能が明らかになり、疾患解析モデルを用いて小頭症の発症メカニズムの解明に繋がると考えられる。また細胞種特異的スプライシング機構が明らかになることで神経分化段階でのスプライシング因子の転写物調節に関する知見を広げる可能性がある。当該年度の初めよりセッケル症候群の病態再現に進展が見られた。大脳皮質形成期の再現を効率よく実現できる脳オルガノイド技術の取得に成功した。疾患株と遺伝子修復株を用いてオルガノイド内部の神経前駆細胞の障害を確認した。この結果を基にATR遺伝子の神経分化過程における新規機能の推測することが可能である。またATR遺伝子変異で見られる細胞種特異的スプライシングパターンのメカニズム解明をすべく、RNA結合タンパク質の結合モチーフのデータベースに着目した。ATR遺伝子変異が導入されることで引き起こされる結合モチーフの変動を調べた。結合モチーフが変動したRNA結合タンパク質の発現制御実験を実施中である。

次に細胞種特異的の機構解明に取り組んだ。ATR-Seckel変異が入ることで結合能が変動するRNA結合タンパク質をin silico予測し、二つの因子を特定した。RNAプルダウンを行ったところ、変異型とWT型のATRエキソン9 RNAに対するこれらの因子の結合能が異なった。さらに、二つの因子の発現抑制実験を行った結果、一種類のみiPS細胞でATRエキソン9のスキッピングを促進した。細胞種によってこの候補因子の発現量の差を確認したが、SS-iPS細胞とSS-NPCsにおいて差がみられなかった。RIP-qPCRを行うことで、候補因子がNPCsの状態と比較してiPS細胞の状態で変異型ATRエキソン9への結合能が強くなっていた。iPS細胞における候補因子のスプライシングへの影響を示唆する結果が得られた。これまでの実験結果を踏まえて、霊長類特有で大脳皮質の拡大に大きく寄与しているouter radial glialcells (oRGCs)を脳オルガノイドで観察できることから、oRGCsの挙動を評価し、SSにおけるoRGCsの障害の有無を確認する。さらにATRの神経特異的な病態メカニズムを解明すべく、網羅的解析を用いてATRタンパク質の新規標的探索を行う予定である。ATR遺伝子変異が誘発するスプライシング異常の機構を解明すべく候補因子を絞り込んでいる最中である。発現制御実験をもちいて、ATRのスプライシングへの影響を確認する。さらに候補因子のATR転写物への直接的な結合をCLIP解析で調べる。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
熱変成性生分解化合物を用いたステントレス胆管吻合法の開発

ラット胆管へのpoloxamer注入を試みたが、ラットの胆管径は1mmにも満たない個体もありpoloxamer注入に難渋した。そのため、導入手技としてラット門脈を用いた吻合を行った。門脈内にpoloxamerを注入、加温しゲル化した状態で吻合を行った。poloxamer注入は可能であったが、ゲル化した状態は内腔を確保するガイドとして安定性はなく吻合は困難であった。吻合後は出血、閉塞で生存例は得られなかった。加温によりゲル化するpoloxamerであるが、細径の管腔に注入した際は、細径ゆえに強度不足となり、内腔を確保するガイドとして不十分であることと考えられた。本研究は熱変成性生分解化合物であるpoloxamerを用いたステントレス胆管吻合の手技を確立することを目的とした。熱変成性生分解化合物としてのpoloxamerの調整、確認を行った。poloxamerは常温で粉末の状態であり、それを緩衝液に融解させ試験管内にて温度変化により可逆的にゲル状→液体に変化するかを観察した。18%wt/vol常温で融解させたときは、無色透明な液体であり、加温により40度程度でゲル化し、再び冷却すると液体に戻る可逆的変化を観察できた。poloxamerの安全性を検証するため、ラット胆管への注入を試みたが、ラットの胆管径は1mmにも満たない個体もあり、サーフロでのカニュレーションも困難であり、poloxamer注入に難渋した。より安定した吻合にためには細径でも十分な形状保持が可能かつ、生体への低刺激性な熱変成性生分解化合物が必要と思われた。新たな吻合手技に開発の試みを継続している。本研究は熱変成性生分解化合物であるpoloxamerを用いたステントレス胆管吻合の手技を確立することを目的としている。平成24年度は熱変成性生分解化合物としてのpoloxamerの調整、確認を行った。しかし融解の際に融解しきれない粉末状のいわゆる「だま」が残存した。撹拌方法やして溶解液の加温(60度)などの工夫を要した。次いでpoloxamerの安全性を検証するため、ラット胆管への注入を行った。ラットを麻酔下に開腹し、胆管を露出、サーフロにてカニュレーションを試みた。しかしラットの胆管径は1mmにも満たない個体もあり、サーフロでのカニュレーションも困難であり、poloxamer注入に難渋した。そのため、導入手技としてラット門脈(径約2-5mm)を用いたモデルの作成を行っている。熱変性生分解化合物としてのpoloxamerの調整に長時間を要したことが実験が遅れている原因である。また、胆管が細いためpoloxamerの注入が困難であることも、実験が遅れている原因である。細径胆管へのPoloxamer注入に関しては溶解時の「だま」が問題となる。引き続き攪拌・溶解方法を検討していく。実際の吻合手技に関しては、胆管径が細く胆管へのカニュレーション、poloxamerの注入が困難であることから、現在、門脈を代用としてこれらの手技を確立する。その後、poloxamerを用いたステントレス門脈吻合を導入手技として、ステントレス胆管吻合手技の確立を目指す予定である。実験用動物はWisterラット1匹2,500円程度と考え、年間100匹程度は必要と考えた。飼育費などと併せて1年間で35万円を計上する。Poloxamerなどの試薬、検査費用として30万円を計上する。また、研究成果の発表のための旅費、投稿料などに25万円を計上する。
造血幹細胞におけるTieシグナルの解析とTie1のリガンド同定

造血幹細胞は血液系の幹細胞であり、血液システムの維持にとって極めて重要であるが、その機能を制御する分子機構についてはあまり理解が進んでいない。本研究では、造血幹細胞に高く発現しているオーファン受容体Tie1に着目し、Tie1恒常発現細胞を作製した。Tie1のキナーゼ活性は細胞増殖やリガンド候補分子の発現に影響を与えなかったものの、リガンド候補分子の添加によってTie1がトランス活性化される可能性が示唆された。造血幹細胞は未分化性と多分化能を兼ね備えた血球系の幹細胞であり、その機能を維持する分子の一つとして受容体型チロシンキナーゼTie2が同定されている。同じTieファミリーに属するTie1も同様の機能を持つと考えられているが、ノックアウトマウスの表現型の違い等から独自の機能を有している可能性が示唆される。本研究課題では、オーファン受容体であるTie1のリガンド同定も含めたTie1の機能解析を行うことを目的としている。平成25年度は、SST-REX法により見出された候補分子がTie1リガンドとして機能するかどうかの検討を行った。スクリーニングにはヒト細胞のcDNAライブラリーを用いていたこと、マウスTie1-Fcではリコンビナントたん白質の安定性に問題があったことから、ヒトTie1-Fcをツールとして用いた。候補分子は市販のリコンビナントたん白質等を用い、ヒトTie1-Fcによるファーウェスタンブロッティング、および免疫沈降実験を行ったが、いずれも相互作用は検出されなかった。リガンド候補分子は、Tie1-Fcと安定な複合体を形成できなくても、Tie1の活性化状態に影響を及ぼす可能性が考えられるため、Tie1発現細胞への添加効果を検討することとした。細胞は、抗体等の解析ツールが充実していることから、当初予定していたマウス由来細胞ではなくヒト由来細胞に変更した。リアルタイムPCR法、およびウェスタンブロット法で内在性Tie1の発現が検出できる血球細胞を探索し用いた。コントロールとしてTie2の発現確認も行い、よりTie2の発現が低いものを選択した。現在、リガンド候補分子の添加効果を検討中である。平成26年度は、SST-REX法により見出された候補分子がTie1リガンドとして機能するかどうかの検討を平成25年度に引き続き行った。平成26年度は、リガンドの候補となりうる分子を文献上からも探索し、候補分子に追加した。候補分子を用いてTie1発現細胞への添加効果を検討したが、操作中にTie1の発現が著しく低下し解析不能となったため、Tie1を恒常的に発現する血液細胞株を作製し、リガンド候補分子の添加効果を検討した。しかしながら、恒常的発現株においても操作中にTie1の発現が低下し、解析困難となった。血管内皮細胞同様に細胞外ドメインの切断が起こっている可能性を検討したが、細胞外ドメイン切断という現象は血液細胞においては確認されなかった。Tie1、および下流シグナルの解析を行うため、Tie1のconstitutively active体(推定)、dominant negative体を発現する血液細胞株を構築した。野生型、constitutively active体について定常状態ではチロシンリン酸化の亢進は確認できなかったが、Tie1の活性化(リン酸化)については研究者によって見解が分かれるところである。これら細胞株においてリガンド候補分子のmRNA量を検討したが、リガンド候補分子の発現に影響は及ぼさないことが明らかとなった。本研究課題では、オーファン受容体であるTie1のリガンド同定も含めたTie1の機能解析を行うことを目的とした。当初はマウスの細胞等を用いて解析を行う予定であったが、細胞や解析ツールの充実性等を鑑み、ヒトの系を用いて解析を進めた。ヒトの系においてもTie1の発現が安定せず解析が困難であったが、Tie1恒常発現細胞株の作製により比較的安定したデータが取得できるようになった。最終年度は、これまでスクリーニングしてきたリガンド候補分子、および文献上から探索したリガンド候補分子を用い、これらがTie1リガンドとして機能するかどうかの検討を行った。その結果、キナーゼ活性を欠失したTie1変異体においてチロシンリン酸化の亢進が検出されるものが認められた。コントロール処理ではTie1のチロシンリン酸化の亢進は認められなかったことから、Tie1の生理的リガンドではないものの、何らかの因子を介してTie1をトランス活性化できる因子であると考えられた。

介在因子としてはTie2が考えられるが、内在性Tie2の発現量は過剰発現したTie1の発現量の1%未満であることから、Tie2以外の因子によってTie1がリン酸化される新規Tie1活性化機構の可能性が示唆された。造血幹細胞は血液系の幹細胞であり、血液システムの維持にとって極めて重要であるが、その機能を制御する分子機構についてはあまり理解が進んでいない。本研究では、造血幹細胞に高く発現しているオーファン受容体Tie1に着目し、Tie1恒常発現細胞を作製した。Tie1のキナーゼ活性は細胞増殖やリガンド候補分子の発現に影響を与えなかったものの、リガンド候補分子の添加によってTie1がトランス活性化される可能性が示唆された。Tie1の発現量コントロールが困難であるため、平成26年度は当初の計画よりやや遅れ気味である。平成26年度に構築したTie1の強制発現株を活用することにより、ある程度の問題解決が見込まれる。平成27年度も引き続き当該研究の遂行に努めたい。血液学現在リガンド候補分子の添加効果を検討中であるが、操作中に著しいTie1の発現低下が認められるため、明確な結果が得られていない。Tie1の発現低下の原因として分解促進の可能性を考え、Tie1のN末端、またはC末端を認識する抗体によって分解産物の検討を行ったが、分解の現象は検出されていない。また、血管内皮細胞のような細胞外ドメイン切断も見られておらず、Tie1の発現低下の原因は不明である。今後はプロテアソーム阻害剤等を用いることも検討している。不溶化画分への移行によってもTie1の発現低下は起こると考えられたため、刺激後の細胞を分画し、各分画におけるTie1量をウェスタンブロット法で検討したが、内在性Tie1の発現量が低いため検出限界以下となった。免疫染色による検討も細胞が非常に脆いため困難であったが、Tie1恒常発現株において同様の検討を再度試みる予定である。同じ画分に候補分子が共局在するかも検討したい。Tie1の発現変動ついては細胞の状態との関連を示唆するデータが得られていることから、阻害剤やノックダウンの手法等を用いてTie1の発現調節に関する分子基盤について解析を進めて行きたい。平成25年度は所定の業務に加えて予定していなかった依頼業務が多数あり、まとまった時間を確保することが困難であったために当初の計画よりやや遅れ気味である。平成26年度は、これまで担ってきた業務の一部振り分けが期待されるため、当該研究の遂行に努めたい。年度末納品等にかかる支払いが平成27年4月1日以降となったため、当該支出分については次年度の実支出額に計上予定。平成26年度分についてはほぼ使用済みである。現在リガンド候補分子の添加効果を検討中であるが、リガンド添加・インキュベーション操作によりTie1の発現低下が認められ、明確な結果が得られていない。Tie1の発現低下の原因としては、分解促進、不溶化画分への移行等が考えられる。今後はTie1のN末端、またはC末端を認識する抗体によって分解産物の検討を行い、分解が検出された場合は、より分解されにくい条件でのリガンド添加実験を検討する。不溶化画分への移行については、刺激後の細胞を分画し、各画分におけるTie1量、リン酸化状態をウェスタンブロット法で確認する。同様に、同じ画分に候補分子が共局在するかも検討したい。
VR1及びCMR1受容体刺激を利用した誤嚥性肺炎予防法の確立とその臨床応用の研究

平成15年度の研究より、高齢者の嚥下反射はたとえ障害されたとしても温度依存性であり、温度感受性受容体の一つであるTRPV1刺激により効率的に改善されることが判明した。そこでTRPV1を持続的に刺激することにより嚥下反射が改善されるかどうか、TRPV1アゴニストであるカプサイシンの含有トローチを作成してそれを嚥下反射が遅延した高齢者に投与し、その効果を調べることを目的とする。『方法』カプサイシントローチ及びそのプラセボを、施設入所中の高齢者をランダムに2群に分け投与し、一ヶ月の中期投与の効果をみる。アウトカムとしては気道防御能としての嚥下反射、咳反射それとADL、認知機能、血中サブスタンスP量などを測定。嚥下反射は鼻腔より挿入した細いカテーテルから1ccの蒸留水により誘発し、その潜時を測定。また、咳反射は段階的に希釈したクエン酸の最小誘発濃度により評価する。『結果』一ヶ月の毎食前のカプサイシン投与により、カプサイシン含有トローチ群においてプラセボ群と比べ、有意に嚥下反射および咳反射が改善した。高齢者の食事は得てして、単調な味付けになりがちである。また、温度なども作りおきの室温になりがちである。『考察と結論』この研究を通して口腔および咽頭部のTRPV1の慢性刺激が嚥下反射を改善することが証明された。高齢者の障害された嚥下反射はカプサイシントローチにより改善されることが判明した。本トローチの投与は高齢者の誤嚥性肺炎の予防につながるものと思われる。さらに今後はその他の温度感受性受容体刺激についても調べる。まず今年度は高齢脳梗塞後遺症患者の遅延した嚥下反射及び咳反射に対する口腔侵害刺激の作用の研究をおこなった。施設入所の高齢脳梗塞後遺症患者において、一ヶ月間毎食後、口腔侵害刺激(口腔ケア)を行い嚥下反射、咳反射の潜時の変化を調べる。嚥下反射は従来我々が行ってきた、口蓋垂の高さまで挿入したチューブより1ccの蒸留水を注入する方法による。咳反射は様々な濃度のクエン酸を希釈したのをウルトラネブライザーにて吸入させ咳が誘発される閾値を調べることによる。すると一ヶ月の口腔侵害刺激により、嚥下反射のみならず咳反射が改善することがわかった。その2つの気道防御反射の改善が肺炎の予防に大きく寄与することが判明した。またこれまで咳反射を改善する方法は限られていたのでこのことは咳反射が低下している患者(高齢者やパーキンソン病患者)にとって朗報である。この結果はアメリカの専門誌に投稿中である。次に高齢者嚥下困難患者におけるカプサイシントローチの効果の検討した。高齢者収容施設にて嚥下困難患者に、慢性的にVR1レセプターを刺激する方法として開発したカプサイシントローチを毎食前、1錠嘗めて頂く。それを1月後、6ヵ月後の嚥下反射を測定した。さらに半年間の肺炎の発症、認知機能、Activity of Daily Living (ADL)、Instrumental IADL、Geriatric Depression Scale、血中または唾液中サブスタンスPの濃度の変化を調べた。するとカプサイシントローチは一ヶ月後に嚥下反射を改善することが判明した。このことは嚥下反射が低下した患者(高齢者やパーキンソン病患者)にとって朗報である。この結果はアメリカの専門誌に投稿準備中である。平成16年度は高齢者遅延した嚥下反射が温度依存性に改善することを世界で初めて示した。

咽頭内の食物が体温付近で一番嚥下反射が遅延し、食物がその温度から離れれば離れるほど嚥下反射の反射時間は早くなるのである(J Am Geritr Soc 52(12):2143,2004)。このことより、43°C以上で活性化されるTRPV1(VR1)、52°C以上で活性化されるTRPV2(VRL-1)、25°C以下で活性化されるTRPM8(CMR1)、17°C以下で活性化されるTRPA1(ANKTM1)が関与し、それらを活性化することが嚥下反射の改善につながることが示唆された。このことは非常に示唆に富む発見である。通常介護食は介護者の都合上、つくりおきが多い。そうなると介護食は口にするときは室温になり、口に入れて咽頭に達するときは体温と同じ温度になってしまい、食物は非常に誤嚥しやすいということになる。そこでこの研究により介護食は常に作りたてがいいことを提示できたのである。さらに、TRPV1は侵害刺激でも活性化されることより、口腔ケアによる歯茎の慢性的な侵害刺激が咳反射を改善するかどうか調べた。一ヶ月間の積極的な口腔ケアを施した群としなかったコントロール群の一ヶ月後のクエン酸法による咳反射の感受性を測定したところ、ベースラインでは有意差がなかったのに、一ヵ月後は口腔ケア群で有意にベースラインと比べてもまた、コントロール群と比べても改善していた。このことは、口腔ケアは口腔内細菌を除去するのみならず、咳反射、嚥下反射を改善することにより、誤嚥性肺炎を予防することが示された(Chest 126:1066,2004)。さらに、テオフィリン投与群の高齢者の嚥下反射、プラセボ投与群と比べて有意に一ヵ月後に嚥下反射が改善することを発見した(J Am Geritr Soc 52:1787,2004)。[緒言]平成16年度までの研究より、高齢者の嚥下反射はたとえ障害されたとしても温度依存性であり、温度感受性受容体の一つであるTRPV1刺激により効率的に改善されることが判明した。そこでTRPV1を持続的に刺激することにより嚥下反射が改善されるかどうか、TRPV1アゴニストであるカプサイシンの含有トローチを作成してそれを嚥下反射が遅延した高齢者に投与し、その効果を調べることを目的とする。[方法]カプサイシントローチ及びそのプラセボを、施設入所中の高齢者をランダムに2群に分け投与し、一ヶ月の中期投与の効果をみる。アウトカムとしては気道防御能としての嚥下反射、咳反射それとADL、認知機能、血中サブスタンスP量などを測定。嚥下反射は鼻腔より挿入した細いカテーテルから1ccの蒸留水により誘発し、その潜時を測定。また、咳反射は段階的に希釈したクエン酸の最小誘発濃度により評価する。[結果]一ヶ月の毎食前のカプサイシン投与により、カプサイシン含有トローチ群においてプラセボ群と比べ、有意に嚥下反射および咳反射が改善した。高齢者の食事は得てして、単調な味付けになりがちである。また、温度なども作りおきの室温になりがちである。[考察]この研究を通して口腔および咽頭部のTRPV1の慢性刺激が嚥下反射を改善することが証明された。[結論]高齢者の障害された嚥下反射はカプサイシントローチにより改善されることが判明した。本トローチの投与は高齢者の誤嚥性肺炎の予防につながるものと思われる。さらに平成16年度の研究より低温のTRPM8受容体刺激に手も嚥下反射が改善されることが示されたのでそれについて現在検討中である。
ゲノムのリプログラミングと染色体構築原理

クロマチンドメインの形成に極めて重要である以下の二点について解析し成果のとりまとめを行った。DNA複製における核マトリックスの関与:まず修飾ヌクレオチドをパルスで複製時に取り込ませて核ハロー標本上で検出した結果、複製直後は取り込まれたヌクレオチドは核内にとどまっているが、チェイス30分後にはDNAループ上にも広がって検出され、DNA複製が核マトリックス上で起こっていることを示唆した。さらに複製タイミングがS期初期、中期、後期の特定のゲノム領域について解析した結果、それぞれの遺伝子領域に存在するMARはS期を通して核マトリックスに結合しているが、MAR以外のDNA配列は、それぞれの複製タイミングの時期にのみ核マトリックスと結合していることを明らかにした。また各種preRC複合体タンパク、複製ファクトリータンパクについても核マトリックスとの関係を明らかにし、これまでの成果とあわせて、複製・転写ファクトリーが核マトリックス上で機能しているモデルを提示した。セントロメアヘテロクロマチン領域におけるエピジェネティックな制御:DNAメチル化阻害時のヘテロクロマチン領域における複製フォークの進行と複製タイミング、ヒストンのエピジェネティックな動態との相関関係について解析した。triMeK4H3,diMeK4H3はDNAメチル化阻害で、セントロメア周辺ヘテロクロマチン領域に局在する一方、triMeK9H3はこの領域では少し減少した。また、24時間の5azadC処理によって、セントロメア周辺ヘテロクロマチンにおける修飾ヒストンの変換が起きた核はS期初期では少なく、この領域が複製するS期中期以降の核で多く見られた。これらの結果から、5-azadC処理により、セントロメア周辺ヘテロクロマチン領域のDNAのメチル化が減少することで、複製タイミングが早くなり、さらに複製フォークの進行が促進されるに伴って、その後のクロマチンアッセンブリーの際、ヒストン修飾の構成に大きな変化が起こると示唆された。さらに成果のまとめとして論文作成中である。(1)ヒト15番染色体近位部、およびマウス7番染色体遠位部のインプリント領域を解析し、この領域が数百kbから1Mb程度のラージスケールの複製タイミングドメインからなり、しかもアリル特異的なゲノムの伸縮構造を示すドメインとなっていること、このアリル特異性はヒストン脱アセチル化阻害処理によって解除されることを見出した。(2)S期の進行に伴う複製の進行過程を解析し、複製フォークの進行速度がS期の初期から中期にかけて一端減速し、後期に最も速くなることを、独自に開発したDNAファイバー上で複製フォークの進行速度を測定する方法により見出した。また、マウス・セントロメア周辺領域の複製起点の活性化と複製フォークの進行速度はヒストンのアセチル化により制御されることを明らかにした。さらに、カンプトテシン処理によるDNA損傷時に作動するチェックポイント制御についても検討し、各種特異的阻害剤存在下での複製フォーク速度やDNA合成量を調べる実験から、DNA損傷時に、S期チェックポイント因子PI3KKが複製開始点の抑制と複製フォークの安定性に貢献することを見出した。また、この複製解析法に低張処理法を導入し、浮遊系細胞にも適用できるよう汎用化した。(3)複製・転写等の核内イベントへの核マトリックスの関与を明らかにするため、転写誘導される熱ショックタンパク質HSP70遺伝子領域の核マトリックスとの結合状態について転写ファクトリーを含めたモデルを提示し、クロマチンドメイン形成における核マトリックスの役割に関する知見を得ると共に、非転写領域が、複製前に核マトリックスに結合し、複製後に離れることを見出した。(4)分子コーミング技術を確立し、DNAファイバー上での複製解析へ応用する一方、インプリント遺伝子がアリル間で非同調的なタイミングで複製することをセミファイバー法を用いた独自の方法で証明した。本年度は、次世代への継承に必要なゲノム(クロマチン)・ドメインの形成に関してエピジェネティックな制御について解析した。マウスセントロメア領域はマイナーサテライトDNA(MS)およびメジャーサテライトDNA(MMS)で構成されておりMSがセントロメア機能を担う。マウスm5S胚性線維芽細胞株を5アザデオキシシチジン(azadC)処理した際のMS, MMS領域のヘテロクロマチン構造、修飾、複製タイミング、複製フォーク進行速度等について解析した。azadC処理によりMMS領域はヘテロクロマチン構造の崩壊が認められ、崩壊した領域が高アセチル化すること、ヘテロクロマチン結合タンパク質HP1αの結合が極めて少なくなることを見出した。MS領域は、セントロメア結合タンパク質CENPBの結合も変化なく、ヘテロクロマチン状態を維持していると推定した。次に核内複製フォーカスパターン(S期をIIVに分類)からそれぞれの複製タイミングを判定した。MMS領域はパターンII、MS領域はIIIの時期に複製するがazadC処理でヘテロクロマチン構造が崩壊した部分はパターンIに、MS領域はIIに複製する核の割合が増え、MS,MMS領域ともに複製タイミングが早まっていた。MS領域は、隣り合うMMS領域の複製タイミングの早まりに引きずられ早くなったものと推定した。さらに、複製フォークの進行速度を複製フォークの進行とMS,MMS領域をDNAファイバー上に同時検出するシステムを確立し、調べた結果、MMS領域のみ速くなっていた。これらの結果は、クロマチン構造と複製タイミング、複製フォークの進行速度が密接に関係することを示す。また、発生段階でクロマチンドメイン・複製ドメインがいかに確立するかを調べる手法として、ES細胞に修飾ヌクレオチドを取り込ませ複製解析するシステムを確立した。

DNA複製における核マトリックスの関与:まず修飾ヌクレオチドをパルスで複製時に取り込ませて核ハロー標本上で検出した結果、複製直後は取り込まれたヌクレオチドは核内にとどまっているが、チェイス30分後にはDNAループ上にも広がって検出され、DNA複製が核マトリックス上で起こっていることを示唆した。さらに複製タイミングがS期初期、中期、後期の特定のゲノム領域について解析した結果、それぞれの遺伝子領域に存在するMARはS期を通して核マトリックスに結合しているが、MAR以外のDNA配列は、それぞれの複製タイミングの時期にのみ核マトリックスと結合していることを明らかにした。また各種preRC複合体タンパク、複製ファクトリータンパクについても核マトリックスとの関係を明らかにし、これまでの成果とあわせて、複製・転写ファクトリーが核マトリックス上で機能しているモデルを提示した。セントロメアヘテロクロマチン領域におけるエピジェネティックな制御:DNAメチル化阻害時のヘテロクロマチン領域における複製フォークの進行と複製タイミング、ヒストンのエピジェネティックな動態との相関関係について解析した。triMeK4H3,diMeK4H3はDNAメチル化阻害で、セントロメア周辺ヘテロクロマチン領域に局在する一方、triMeK9H3はこの領域では少し減少した。また、24時間の5azadC処理によって、セントロメア周辺ヘテロクロマチンにおける修飾ヒストンの変換が起きた核はS期初期では少なく、この領域が複製するS期中期以降の核で多く見られた。これらの結果から、5-azadC処理により、セントロメア周辺ヘテロクロマチン領域のDNAのメチル化が減少することで、複製タイミングが早くなり、さらに複製フォークの進行が促進されるに伴って、その後のクロマチンアッセンブリーの際、ヒストン修飾の構成に大きな変化が起こると示唆された。さらに成果のまとめとして論文作成中である。
社会性と共生の共進化の数理的研究

文献調査および社会性昆虫を専門とする研究者からの情報収集によって、社会性(特に社会性昆虫について)と共生関係の実態を把握した。社会関係については(a)ワーカーとソルジャーの分類群にわたる分布(b)巣あたりの個体数(c)生殖個体の数(d)分巣の方法である。(a)については単数倍数性の遺伝システムをもつものは主にワーカー、単為生殖と倍数性の遺伝システムをもつものはソルジャーという明確な傾向が認められた。他の項目については、とくに傾向はなかった。共生関係については、(a)寄生と共生者のサイズの差(b)体内共生か体外共生か(c)垂直感染の程度(d)相手の存在の必要度である。(c)については、垂直感染に依存する分類群と依存しない分類群の特徴の差を検出することができた。以上のデーターにもとづいて、社会性と共生の共進化がどのような要因によって起こるのかを明らかにするための数理モデルを作成し、投稿準備中である。また、共進化の部分モデルに貢献できる数理モデルを開発することができた。社会性については、繁殖個体の数と、繁殖個体間の繁殖量のひずみを説明するためのモデルを完成し(Tsuji and Tsuji,1996,1997)、令間分業がおきる条件についても解析できた(Wakano et al)。また、社会関係の構造を決定するための個体間の対立解消がどのようになされるのかのモデルも進展させた(Yamamura and Jormalainen,1996).共生関係については、垂直感染をともなう共生関係が進化するための条件を明らかにし(Yamamura,1996)、そのような共生者の獲得が進化的歴史においてどのような生物多様性を生みだしたかを展望することができた(Yamamura,1997)。文献調査および社会性昆虫を専門とする研究者からの情報収集によって,社会性(とくに社会性昆虫について)と共生関係の実態の把握に勤めた.現在進行中の調査項目は,社会関係については(a)ワーカーとソルジャーの分類群にわたる分布(b)巣あたりの個体数(c)生殖個体の数(c)分巣の方法である.(a)については,単数倍数性の遺伝システムをもつものは主にワーカー,単為生殖と倍数性の遺伝システムをもつものはソルジャーという明確な傾向が認められた.他の項目については解析中である.共生関係については,(a)寄主と共生者のサイズの差(b)体内共生か体外共生か(c)垂直感染の程度(d)相手の存在の必要度である.(c)については,垂直感染に依存する分類群と依存しない分類群の特徴の差を検出することができた.データが十分そろってきたので、社会性と共生の共進化がどのような要因によって起こるのかを明らかにするための数理モデルの骨子を作成した.また,共進化の部分モデルに貢献できる数理モデルを開発することができた.社会性については,繁殖個体の数と繁殖個体間の繁殖量のひずみを説明するためのモデルを完成した(Tsuji and Tsuji,1996,1997).また,社会関係の構造を決定するための個体間の対立解消がどのようになされるかのモデルも進展させた(Yamamura and Jormalainen,1996).共生関係については,垂直感染をともなう共生関係が進化するための条件を明らかにし(Yamamura 1996),そのような共生者の獲得が進化的歴史においてどのような生物多様性を生みだしたかを展望することができた(Yamamura,1997).文献調査および社会性昆虫を専門とする研究者からの情報収集によって、社会性(特に社会性昆虫について)と共生関係の実態を把握した。社会関係については(a)ワーカーとソルジャーの分類群にわたる分布

(b)巣あたりの個体数(c)生殖個体の数(d)分巣の方法である。(a)については単数倍数性の遺伝システムをもつものは主にワーカー、単為生殖と倍数性の遺伝システムをもつものはソルジャーという明確な傾向が認められた。他の項目については、とくに傾向はなかった。共生関係については、(a)寄生と共生者のサイズの差(b)体内共生か体外共生か(c)垂直感染の程度(d)相手の存在の必要度である。(c)については、垂直感染に依存する分類群と依存しない分類群の特徴の差を検出することができた。以上のデーターにもとづいて、社会性と共生の共進化がどのような要因によって起こるのかを明らかにするための数理モデルを作成し、投稿準備中である。また、共進化の部分モデルに貢献できる数理モデルを開発することができた。社会性については、繁殖個体の数と、繁殖個体間の繁殖量のひずみを説明するためのモデルを完成し(Tsuji and Tsuji,1996,1997)、令間分業がおきる条件についても解析できた(Wakano et al)。また、社会関係の構造を決定するための個体間の対立解消がどのようになされるのかのモデルも進展させた(Yamamura and Jormalainen,1996).共生関係については、垂直感染をともなう共生関係が進化するための条件を明らかにし(Yamamura,1996)、そのような共生者の獲得が進化的歴史においてどのような生物多様性を生みだしたかを展望することができた(Yamamura,1997)。
新奇ストレス環境における摂食抑制とケモカインシグナル

我々は、新奇ストレス環境下において、ケモカインCXCL14のノックアウト(CXCL14-KO)マウスの摂食が著しく抑制されるというユニークな表現型を明らかにした。そこで本研究では、新奇ストレス応答に関連がある海馬歯状回とCXCL14レセプターのCXCR4に着目して、新奇ストレス環境における摂食行動についての解析を進めている。本年度は、生化学的な解析で、CXCL14がCXCR4に結合し、これまで知られているCXCR4のリガンドであるCXCL12のケモタキシス活性を阻害するという活性に関して論文発表した。また、CXCR4の新奇ストレス応答に対する機能を明らかにするため、前年度までに繁殖させたCXCR4コンディショナルノックアウトマウスとEmx-Creマウスを掛け合わせることにより、前脳特異的なCXCR4ノックアウトマウスを作出した。このマウスの体重および新奇環境での摂食行動について解析を行ったが、現在のところ有意な差は見られていない。さらに、新奇環境下の摂食行動に関連があるとされる海馬歯状回のニューロン新生を、CXCL14ノックアウトマウスで調べたところ、コントロールに比べ減少する傾向が見られた。最近の研究で、海馬歯状回のニューロン新生がGABA産生ニューロンによっても制御されるという結果が発表された(Song et al.,2012 Nature 489,150-154)。CXCL14は発現するGABA産生ニューロンで強く発現するため、このニューロンにおけるCXCL14シグナルにも着目して研究を進める。24年度が最終年度であるため、記入しない。個体の恒常性を保つための摂食行動は、視床下部の機能との関連が詳細に研究されてきており、その分子メカニズムの解明も進みつつある。それに対して、過度のストレスも摂食行動に変調をきたすことが知られているが、ストレスがどのように摂食行動を変調させるのかに関しては、分子メカニズムに不明な点が多く残されている。今年度は、CXCR4レセプターとの関連を調べる生化学的な解析、CXCL14発現解析およびCXCL14ノックアウトマウスにおけるマーカー発現解析、さらにCXCR4コンディショナルノックアウトマウスのコロニー構築を行った。生化学的な解析ではCXCL14がCXCR4に結合し、これまで知られているCXCR4のリガンドであるCXCL12のケモタキシス活性を阻害することが明らかとなった。また、CXCL14発現解析ではCXCL14 mRNAが海馬の特定のニューロンに極めて限局して発現することが明らかとなり海馬での機能が示唆された。この機能については海馬細胞のマーカーでの抗体染色や遺伝子解析により詳細な解析を進めている。CXCR4コンディショナルノックアウトマウスは現在までに飼育施設へ導入し、前脳特異的なノックアウトに必要なEmx-Creマウスとともに繁殖を進めている。これらのマウスの掛け合わせにより前脳特異的なCXCR4ノックアウトマウスを作出し、行動解析などを行う予定である。CXCL14ノックアウトマウスの解析、行動解析用コンディショナルノックアウトマウスコロニーの構築などは概ね順調である。研究計画通り、CXCL14ノックアウトマウスおよび、CXCR4コンディショナルノックアウトマウスの解析を進める。