hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ジャック・ベルタンの地図学理論の発展段階とその位置づけに関する研究

この結果を、7月にパリにおいて開催された国際地図学会議において発表すると同時に、英国の地図学会誌に論文として公表した。次にこの成果をもとに、9月にパリにおいて本研究のテーマの中心人物であるベルタン教授の未亡人にインタビューを行い、資料の提供を受けた。さらに理論地図学を専門とするドイツのドレスデン工科大学のウォロチェンコ教授に、地図学理論におけるベルタン教授の位置づけについて意見交換を行った。さらにイタリアに廻り、地図記号論を専門とするベルガモ大学のカスティ教授の紹介により、地図学理論のなかでも基本要素となる地図記号の発生を考察する上で重要な紀元前3000年に作られた岩絵地図について、カポディポンテのベドリーナ岩絵公園を訪れガイドの案内のもと現地を視察し写真撮影を行うとともに、併せて現地の岩絵発掘センターにおいて関連文献を収集した。本研究は国際地図学協会から金メダルを受賞している地図学分野に大きな影響を与えてきたフランスの地図学者ジャック・ベルタン氏(2010年没)の地図学理論を、残された著作・主題図類などを系統的に整理することを通して、デジタル化による地図制作という今日的なコンテクストの中で再評価しようとするものである。全体は、(1)資料の発掘、(2)整理、(3)体系化、(4)再評価、(5)総括、の流れにより実施した。資料の発掘・整理については、文献検索を行い結果を時系列的に整理した。その結果を体系化し、国際地図学会議パリ大会(2011)において発表すると同時に英国の地図学会誌に論文が掲載された。また、パリ在住のロベルト・ジメノ氏より、ベルタン氏が所長であった国立高等研究院および改組された国立社会科学高等研究院の地図学研究所およびグラフィックス研究所の年次活動報告書の提供を受けた。これにより彼の研究全体の流れをチェックした。再評価については、ベルタン氏が強調する地図記号の基本的性質である一義性・多義性について、紀元前3000年に作られた岩絵地図をイタリアのカモニカ渓谷において観察することにより、地図記号に託した意味が一義性を帯びやすいことを周辺の地図的ではない記号群と比較して考察した。また、ベルタン理論を実装化したデジタル作図ソフトを、上記グラフィックス研究所の流れをくむパリ政治学院地図アトリエのパトリス・ミトラノ氏より提供および操作解説を受け、その機能および効果について確認し、今後の展開の可能性について議論した。総括としては、フランスにおけるベルタン理論の教育研究の拠点はパリ政治学院地図アトリエへと引き継がれており、利用ソフトの開発も続けられている。また、近年、インフォグラフィックスの分野でも応用が進んでおり、ベルタン理論は地図を含む情報の視覚処理・表現の方法として一般化が展開している。地図学ヒアリングや出版資料のリスト化については順調に進展しているが、フランス国立図書館地図部門へ寄贈されたベルタン教授の作図を含む遺稿については、図書館としてまだ未整理であることが判明し、この資料の全貌を早急に明らかにすることが本研究のためには重要である。予定していたベルタンの遺稿調査が実施できなかったため。計画通りで順調であるが、一部現地調査未了の部分が存在している。ベルタン教授の作図を含む遺稿資料の整理を行うことを通して未発表の資料の発掘に努め、最終的なベルタン理論の体系化、再評価において、それらの新たな資料を加えながら展開することを目指す。
赤色・青色光刺激による家兎対光反射とメラノプシンの関与

家兎の光受容器と対光反射に関して評価を行った。家兎の対光反射は635nmの赤色光刺激に比較し470nmの青色光刺激にて持続的で大きな縮瞳を示した。硝子体内薬物注入家兎、もしくは変異型ロドプシン遺伝子トランスジェニック(Tg)家兎にて視細胞が委縮した後でも青色光刺激による対光反射のみ残存した。組織学的に家兎は視細胞の約95%は杆体で、網膜神経節細胞(RGC)中の超大型、多角で樹状突起が豊富なRGCは、メラノプシン含有RGCと考えられ、視細胞萎縮後も組織学的特徴を維持していた。以上の結果より家兎の対光反射は大部分が視細胞由来であるものの青色光刺激による反応の一部はmRGC由来であると結論した。平成22年度には、我々は正常有色家兎硝子体内へ神経伝達阻害薬を注射し、網膜電図(ERG)、対光反射を測定し、最終的に眼球を摘出、網膜組織を観察した。その結果、ERGは平坦化し、かつ組織学的に視細胞の破滅が確認された家兎でも強い(250cd/m2)青色光刺激(470nm)によって対光反射が生じた。平成23年度では、薬剤投与家兎に加え、変異型ロドプシン遺伝子トランスジェニック(TG)家兎(Kondo M et al . Invest Ophthalmol Vis Sci 50, 2009)を用い、経時的にERG、対光反射を測定したのち眼球を摘出、網膜組織を観察した。組織はHRPを家兎中脳へ注射し、逆行性に網膜神経節細胞(RGC)を染色、さらに免疫組織染色(抗TUJ-1抗体)を施しRGCを確認した。ERGは経時的にa波、b波ともに減弱し、最終的には平坦化した。さらに赤色光刺激による瞳孔反応は19週ではすでに消失、青色光刺激による瞳孔反応も徐々に縮瞳率は低下し、かつ不安定となり19週では18%、40週で13.2%、56週では9.2%へ縮瞳率が減弱した。瞳孔反応のパターンも変化し、刺激によりゆっくりと縮瞳し、かつその縮瞳が光刺激消失後も持続する波形となった。組織学的には,視細胞層は完全に萎縮していた。さらに網膜神経節細胞は形態学的に3種類(円形大型、円形小型、多角大型)が確認され、一部変性が始まっていたが視細胞と比較し温存されていた。家兎の対光反射は杆体が主な起源であり、一部錐体が関与すると考えられてきた。しかし、以上の結果から視細胞が障害された家兎でも470nmの強い青色光刺激にて対光反射は維持された。すなわち家兎においても470nmで強い青色光刺激にてメラノプシン含有網膜神経節細胞(mRGC)が存在し、mRGCの刺激にて対光反射が誘発されたことが機能的にも形態学的にも証明された。平成23年度正常家兎(WT)、家兎硝子体中へ薬物を注入し視細胞からの伝達を薬理学的に遮断した家兎を作成し、対光反射測定、網膜組織確認を行った。さらに24年度は変異型ロドプシン遺伝子トランスジェニック(Tg)家兎を用い同様に対光反射、網膜電図(ERG)、組織標本を観察した。Tg家兎では週齢と共に対光反射は減弱し、個体差もあるが50週近くになると赤色光刺激では対光反射はほぼ消失した。一方、青色光刺激の縮瞳率は約15%と僅かながらゆっくりとした縮瞳が残存した。ERGは振幅がほぼ消失した。同時点で組織学的に視細胞は完全に萎縮したものの、多角大型の網膜神経節細胞の一部は残存した。昨年度までの結果をさらに確認し、対光反射の起源解明を確実なものとするため、25年度は組織学的変化が初期(軽度)であるTg家兎30週齢前で対光反射測定、組織検査を行った。ERGのa波はWTの約5割へ減弱、さらに対光反射も赤色光刺激による反応はWTの約5割へ減弱、しかし青色光刺激では依然として縮瞳率は50%とほぼWTと同値が残存した。この時点での網膜組織所見は視細胞中に核濃縮(pyknosis)が観察された。すなわち視細胞へ初期変化が生じる時期にはすでに視細胞由来である赤色光刺激の縮瞳は減弱していた。以上、3年間の『赤色・青色光刺激による家兎対光反射とメラノプシンの関与』に関する生理学的、組織学的実験の結果をまとめると、家兎の視細胞は約95%が杆体で、5%の錐体が存在し対光反射を形成している。また網膜神経節細胞(RGC)には少なくとも3種類(小型円形、大型円形、超大型多角)が存在し、その大きさ、樹状突起の豊富さから超大型多角のRGCはメラノプシン含有RGCと考えられた。対光反射は視細胞が変性、さらに消失後も青色光刺激による反応は残存し、対光反射の起源の一部はmRGC由来であると結論した。

組織学的に家兎は視細胞の約95%は杆体で、網膜神経節細胞(RGC)中の超大型、多角で樹状突起が豊富なRGCは、メラノプシン含有RGCと考えられ、視細胞萎縮後も組織学的特徴を維持していた。以上の結果より家兎の対光反射は大部分が視細胞由来であるものの青色光刺激による反応の一部はmRGC由来であると結論した。有色家兎の対光反射とメラノプシン含有網膜神経節細胞(melanopsin containing retinal ganglion cells: mRGC)の関係を生理学的、組織学的方法を用い検討した。家兎の対光反射は1時間の暗順応後、赤外線電子瞳孔計(浜松ホトニクス)を用い測定した。赤色刺激(670nm, 250cd/m2)にて20±5%の縮瞳を、一方、同様の強さの青色刺激(470nm)では67±4%と有意に大きく縮瞳した。その後、硝子体内に神経伝達阻害物質を注射(薬物投与群)し対光反射を測定すると、赤色刺激による対光反射は無反応となった。さらに薬物投与群の網膜電図(electroretinogram:ERG)は平坦化し(non-recordable)、視細胞の破壊が示唆された。しかし青色刺激では23.7±6.8%の縮瞳が残存した。組織学的に両群の網膜を比較するとコントロール群では視細胞、双極細胞、神経節細胞さらに神経線維の配列が規則的であり、網膜神経節細胞は大型(円形、多角形)、小型の全3種類の細胞が観察された。電顕水平断にて5%程度の錐体も観察され、赤色刺激の起源と考えられた。一方、薬物投与群では視細胞層の萎縮が著しく内顆粒層が色素上皮へ向かって落ち込む像が認められたが網膜内層の神経節細胞は比較的保たれており青色刺激による反応の残存との関連が示された。家兎の対光反射の起源は杆体が主であり、一部錐体が関与すると考えられてきた。しかし視細胞が障害された薬物投与家兎でも470nmの強い青色光刺激にて対光反射が維持された。組織学的には一部の網膜神経節細胞は残存していた。網膜神経節細胞のうち大型、多角形のものは、近年発見されたmRGCであることが報告されている。今回の実験から家兎においても470nmで強い青色光刺激にてmRGCが刺激され、対光反射が誘発されたことが強く示された。24年度はコントロール家兎(Wild type)の硝子体内に神経伝達阻害薬を注射し視細胞の伝達を遮断した家兎、さらに変異型ロドプシン遺伝子トランスジェニック(TG)家兎の対光反射、網膜電図を記録した。さらに組織学的には視細胞は通常の染色後、光顕、電顕両者にて観察。また特に網膜神経節細胞はHRPを用いた染色、さらに免疫組織染色(TUJ-1)による方法を行い、とも成果が得られ、3種類の細胞(小型円形、大型円形、大型多角)が確認された。生理学的実験の結果と組織実験の結果を比較し、所見が一致する事が確認された。23年度は家兎視覚機能の基本部分、すなわち対光反射測定の為の暗順応時間や刺激の最適波長等を測定する計画であった。実験は非常にスムーズに進み現在、コントロール家兎(Wild type)以外、硝子体内に神経伝達物質阻害薬を注射した家兎のデータも集まりつつある。結果は赤外線電子瞳孔計を用いる以外、網膜電図の結果、さらに光顕、電顕両者の組織結果も揃い、生理学的実験の結果と組織実験の結果を比較する事まで可能となった。23年度、変異型ロドプシン遺伝子トランスジェニック(TG)家兎は56週まで生育し、その間、対光反射、ERG測定を経時的に行い、最終的に組織観察を行った。56週でのTG家兎の視細胞層は完全に萎縮し、網膜神経節細胞も一部、核の変性、軸索は退縮していた。22年度の薬物投与家兎に関しても同様であった。次年度、早期段階(early stage)での組織変性と機能的結果の比較を行う。
蛍光バイオセンサーを用いたミトコンドリア分岐鎖アミノ酸輸送体の同定およびその解析

1.ミトコンドリア内バリン輸送へのグルタミン要求性の発見ミトコンドリア内に分岐鎖アミノ酸蛍光バイオセンサーを発現させた細胞のイメージングをおこないながら、培地を通常のDMEMからロイシン、イソロイシン、あるいはバリンのみを含む培地へ交換した。その結果、ロイシンやイソロイシンを含む培地に変換した場合はバイオセンサーのFRETシグナルに変化はほとんど見られなかった一方、バリンを含む培地に変換した場合は、FRETシグナルの低下が観察された。興味深いことに、バリンのほかにグルタミンが含まれている場合は、FRETシグナルの低下はほぼ抑制された。すなわち、細胞質からミトコンドリア内へのバリンの輸送にはグルタミンが必要であることが示唆された。2.ミトコンドリア内膜のバリン輸送体のスクリーニング上記1の実験結果より、バリン輸送体はロイシンやイソロイシンの輸送体とは異なりグルタミンを要求すると考えられたことから、分岐鎖アミノ酸蛍光バイオセンサーを恒常的にミトコンドリアに発現するHeLa細胞をsiRNAで処理し、バリンのみが含まれている培地とバリンとグルタミンが含まれている培地で、FRETシグナルを比較した。その結果、3種類の遺伝子のsiRNAで有意にFRETシグナルの低下が観察された。このことから、この3種類の遺伝子のいずれかあるいは全てがバリンのミトコンドリア内輸送に関与していることが示唆された。siRNAライブラリーを用いたスクリーニングにより、当初目標としていた分岐鎖アミノ酸輸送体の候補遺伝子の絞り込みをおこなうことができたため、本研究プロジェクトは概ね順調に進展していると考えられる。1.輸送体の生化学的解析RNAiスクリーニングによって同定された輸送体をHEK293細胞で大量発現させる。発現した輸送体をアフィニティークロマトグラフィーによって精製した上でリポソームに組み込む。放射性ラベルしたアミノ酸がリポソームの外から内に取り込まれる活性を指標に、RNAiスクリーニングで得られた輸送体が実際に分岐鎖アミノ酸を輸送するかどうかを確認する。また、分岐鎖アミノ酸以外のアミノ酸についての輸送活性を測定することで、輸送体の基質特異性を明らかにする。2.輸送体の分子細胞生物学的解析絞り込まれた輸送体に標識タグを付加して発現させ、タグ抗体を用いた免疫染色によって、その輸送体の細胞内局在を確認する。並行して、蛍光タンパク質と輸送体を融合させて細胞に発現させ、その局在を蛍光顕微鏡で解析する。次に、輸送体の細胞レベルでの機能を調べるため、ゲノム編集によって輸送体遺伝子をノックアウトした細胞を作製し、ミトコンドリア内アミノ酸濃度、呼吸活性、ミトコンドリアの数と形態、細胞内ATP濃度等に与える影響を解析する。1.ミトコンドリア内への分岐鎖アミノ酸流入速度を定量的に計測する系の確立培地中の各アミノ酸濃度を変化させ、分岐鎖アミノ酸蛍光バイオセンサーを細胞質に発現した細胞のイメージングをおこなうことによって、このバイオセンサーが細胞内においても分岐鎖アミノ酸に対して特異性を有していることを確認した。次に、cytochrome c oxidase subunit 8のミトコンドリアマトリックス局在化シグナルを直列に2つ繋いだ配列を分岐鎖アミノ酸蛍光バイオセンサーに付加することにより、分岐鎖アミノ酸蛍光バイオセンサーをミトコンドリア内に局在させることに成功した。アミノ酸を含まない培地に分岐鎖アミノ酸(ロイシン、イソロイシン、バリン)を加えると、ミトコンドリア内に局在させたバイオセンサーのFRET効率が上昇したことから、この測定系を用いることによってミトコンドリア内膜における分岐鎖アミノ酸流入速度を経時的に測定できると考えられた。2.分岐鎖アミノ酸流入速度を指標とした輸送体のスクリーニング主に質量分析を用いたミトコンドリア局在タンパク質の網羅的解析によって、ヒトでは機能未知遺伝子を含む計1158の遺伝子がミトコンドリアに局在するタンパク質をコードしていることが示されている。このうち、SLCファミリー輸送体およびABCファミリー輸送体をコードすることが予想されている約70の遺伝子に対するsiRNAライブラリーを作製した。

蛍光バイオセンサーをミトコンドリアに恒常発現する細胞をsiRNAで処理したのち、分岐鎖アミノ酸を培地中に加えた際のFRET効率の変化を測定した。輸送体の遺伝子がノックダウンされた場合は分岐鎖アミノ酸流入速度が低下すると予想されたが、有意に低下した遺伝子は見出されなかった。当該年度では、(1)ミトコンドリア内への分岐鎖アミノ酸流入を測定する系を確立し、その系を用いることで(2)ミトコンドリア内に分岐鎖アミノ酸を輸送する分子の候補遺伝子を同定する予定であった。(1)についてはほぼ計画通りに進んだものの、(2)については年度中に候補遺伝子を同定するところまで達成することができなかった。1.輸送体の生化学的解析RNAiスクリーニングによって同定された輸送体をHEK293細胞で大量発現させる。発現した輸送体をアフィニティークロマトグラフィーによって精製した上でリポソームに組み込む。放射性ラベルしたアミノ酸がリポソームの外から内に取り込まれる活性を指標に、RNAiスクリーニングで得られた輸送体が実際に分岐鎖アミノ酸を輸送するかどうかを確認する。また、分岐鎖アミノ酸以外のアミノ酸についての輸送活性を測定することで、輸送体の基質特異性を明らかにする。2.輸送体の分子細胞生物学的解析絞り込まれた輸送体に標識タグを付加して発現させ、タグ抗体を用いた免疫染色によって、その輸送体の細胞内局在を確認する。並行して、蛍光タンパク質と輸送体を融合させて細胞に発現させ、その局在を蛍光顕微鏡で解析する。次に、輸送体の細胞レベルでの機能を調べるため、ゲノム編集によって輸送体遺伝子をノックアウトした細胞を作製し、ミトコンドリア内アミノ酸濃度、呼吸活性、ミトコンドリアの数と形態、細胞内ATP濃度等に与える影響を解析する。前年度から引き続き、ミトコンドリア内膜の分岐鎖アミノ酸トランスポーター遺伝子の候補を絞り込む。前年度においては、3種類すべての分岐鎖アミノ酸を培地中に添加した際のミトコンドリア内分岐鎖アミノ酸濃度を測定していたが、3つの分岐鎖アミノ酸が別々のトランスポーターで輸送されている場合は、この測定方法で遺伝子を絞り込むことが困難である。そこで、今後はまずひとつひとつの分岐鎖アミノ酸に絞ってトランスポーターのRNAiスクリーニングをおこなう。
皮膚Langerhans細胞の分化における前駆細胞と表皮細胞の必要性に関する研究

平成11年度では、表皮細胞あるいは線維芽細胞がGM-CSF供給している可能性を検討するため、形成された皮膚組織、線維芽細胞、表皮細胞におけるGM-CSF産生を(1)ヒト培養表皮細胞とヒト培養真皮線維芽細胞、(2)ヒト培養表皮細胞のみ、(3)ヒト培養真皮線維芽細胞のみ、の三つの組み合わせで培養し、培養上清中のGM-CSFをELISA法にて測定した。さらに、ヒト型GM-CSFが常に分泌されているヒトGM-CSF遺伝子導入免疫不全マウス(C57BL/6J背景)への(1)血液前駆細胞(CD34^+CD33^-)単独、(2)血液前駆細胞とヒト培養真皮線維芽細胞、ヒト培養表皮細胞の移植を試み、以下の結果を得た。(1)GM-CSF産生細胞の同定:(1)表皮細胞と真皮線維芽細胞の組み合わせでの培養上清中のGM-CSFは、291.4pg/ml(24時間培養)、616.6pg/ml(48時間培養)、438.7pg/ml(72時間培養)と高値であった。(2)表皮細胞単独の培養上清中にも、150.7pg/ml(72時間培養)のGM-CSFの産生を認めたが、(3)真皮線維芽細胞のみの培養上清中には、GM-CSFの産生は認められなかった。(2)GM-CSF遺伝子導入マウスへの移植:(1)血液前駆細胞単独、(2)血液前駆細胞と真皮線維芽細胞、表皮細胞を移植した群ともに、ヒト皮膚組織は形成されなかった。BALB/c背景のNu-SCIDに血液前駆細胞と真皮線維芽細胞と表皮細胞を移植したコントロール群ではLangerhans細胞を有するヒト皮膚組織が形成されていたことから、マウスの系統の違いに原因があると思われた。平成10年度は、まず、磁気ビーズ法により正常ヒト末梢血より末梢血単球(CD14^+/CD34^-)および血液前駆細胞(CD34^+/CD33^+)を分離し、フローサイトメトリー法にて陽性細胞を確認後、培養ヒト表皮細胞、皮膚線維芽細胞と共に、重症免疫不全(SCID)マウス皮下に移植、21日間継代後、マウス皮下にヒト皮膚組織が形成されることを確認した。次に、マウス皮下に形成された皮膚組織内のヒトLangerhans細胞の存在の有無を確認するため、10%ホルマリン固定パラフィン切片を作成、ヒトLangerhans細胞のマーカーである抗S-100、抗HLA-DRモノクローナル抗体を用いた免疫組織染色および、グルタールアルデヒド並びに4%パラフォルム固定電顕試料を作成し、通常電顕、抗HLA-DRモノクローナル抗体を用いた免疫電顕法を行い、超微形態観察を行い、以下の結果を得た。1. SCIDマウスへの移植:培養ヒト表皮細胞、皮膚線維芽細胞と共に、末梢血単球(CD14^+/CD34^-)を移植した群、血液前駆細胞(CD34^+/CD33^+)を移植した群ともに、マウス皮下にヒト皮膚組織が形成された。2.免疫組織染色:培養ヒト表皮細胞、皮膚線維芽細胞と共に血液前駆細胞(CD34^+/CD33^+)を移植した群では、形成されたヒト皮膚表皮組織内に、抗S-100、抗HLA-DRモノクローナル抗体陽性となるLangerhans細胞が認められた。しかし、末梢血単球(CD14^+/CD34^-)を移植した群では、形成された表皮組織内にLangerhans細胞は認められなかった。3.超微形態観察:培養ヒト表皮細胞、皮膚線維芽細胞と共に血液前駆細胞(CD34^+/CD33^+)を移植した群では、抗HLA-DRモノクローナル抗体陽性となるLangerhans細胞質内にBirbeck顆粒を認めた。(2)GM-CSF遺伝子導入マウスへの移植:(1)血液前駆細胞単独、

(2)血液前駆細胞と真皮線維芽細胞、表皮細胞を移植した群ともに、ヒト皮膚組織は形成されなかった。BALB/c背景のNu-SCIDに血液前駆細胞と真皮線維芽細胞と表皮細胞を移植したコントロール群ではLangerhans細胞を有するヒト皮膚組織が形成されていたことから、マウスの系統の違いに原因があると思われた。
自己形成量子ドット構造の形成機構の解明と制御

基板結晶表面に形成した人工的な歪または表面エネルギー分布が、自然形成型量子ドット形成に与える影響を調べることにより、量子ドット形成機構を解明し、量子ドットの形成位置、寸法を制御するための基礎データを得る事を目的とし、以下のような成果を得た。1)Valence-force-field法を用い、自己形成量子ドットの垂直配列が生じているInAs/GaAs系の歪場の解析を行い、垂直配列が生じるために必要な成長層表面での面内歪差を求めた。2)AlAs/GaAsおよびAlP/GaP分数超格子を用いることにより、InAs/GaAsにおいて自己形成量子ドットの垂直配列を生じさせ得る面内歪差以上の面内歪差を与えられることを示した。3)InP/GaPヘテロエピタキシャル成長の成長モードについて検討し、1.1MLから3次元成長に変化するStranski-Krastanovモードであることを、理論的、実験的に示した。4)InP/AlPヘテロエピタキシャル成長の成長モードについて検討し、0.7MLから3次元成長に変化するVolmer-Weberモードであることを、理論的、実験的に示した。以上の結果を基に、自己形成量子ドットを特定の領域内に形成可能であることを示した。今後は、実際に分数超格子を作製し、量子ドットの形成位置の制御を実現していく予定である。
小型化抗体による植物二次代謝産物生合成制御メカニズムの解明と育種への応用

本研究では、抗plumbagin(PL)小型化抗体(PL-scFv)遺伝子を用いたセイロンマツリのイムノモジュレーションを実施し、更にscFvによるPL生合成制御メカニズムを解明する知見を得ることを目的としている。最終年度は、前年度、PL-scFv遺伝子の導入したセイロンマツリの毛状根に関してPL-scFv遺伝子の発現及びPL含有量を詳細に検討した。1)セイロンマツリにおけるPL-scFvの発現検討;アグロバクテリウム法を用いて発現誘導を行った毛状根を1/2MS培地で適宜継代培養し、三週間後の毛状根を材料としてDNA及びタンパクを抽出し、PCR及びウェスタン解析によりPL-scFvの発現を検討した。その結果、9株の毛状根においてPL-scFvの発現が認められた。また、野生種のアグロバクテリウムリゾジェネス(ATCC15834)を用いて誘導した毛状根12株をWild typeとした。2)毛状根に含有するPLの定量;PL-scFvを発現したセイロンマツリ毛状根に含有するPLの定量は、抗PLモノクローナル抗体を用いたELISAにより行った。定量の結果、PL-scFv遺伝子を発現した毛状根におけるPL含有量は、wild typeと比較して2.2倍高いことが判明した。また、最もPL含有量の高い株では、約6倍もの含量を有する高品質な株を作出することに成功した。また、PL-scFvの発現量とPL含有量との間に正の相関が得られたことからPL-scFvがPLの生合成に関与することが示唆された。本研究により、PL-scFvとPLとの複合体がPL生合成経路を促進したかPL代謝経路を阻害することによりPLの含有量が増加するといった知見が得られた。本研究は、更なるイムノモジュレーション研究の技術的進歩をもたらす可能性を秘めており、今後の進展が期待される。本研究では、抗Plumbagin(PL)小型化抗体(PL-scFv)遺伝子を用いたセイロンマツリのイムノモジュレーションを実施し、さらに組換え体中のPL代謝産物を精査することで、scFvによるPL生合成制御メカニズムを解明することを目的とし、第一年度は、1)植物発現用バイナリーベクターの構築、及び2)アグロバクテリウム法を用いた形質転換セイロンマツリの作出に取り組んだ。2)アグロバクテリウム法を用いた形質転換セイロンマツリの作出構築したバイナリーベクター上のcDNA領域は、helper plasmidを介したTri-parental mating法によりA.rhizogenes(ATCC15834)及びA.tumefaciens(LBA4404)に導入し、これらをセイロンマツリに感染させることでPL-scFv遺伝子及びAcGFP-PLscFv遺伝子の発現を検討した。A.rhizogenesを介して感染させた茎部は、感染後4-6週目において20程の毛状根が観察できたが、その毛状根を用いてdirect PCRを行った結果、1株においてのみPL-scFv遺伝子を確認した。また、A.tumefaciensを介して感染させた茎部においては、まず培地条件の検討を行った。その結果、合成オーキシンであるナフタレン酢酸(NAA)とカイネチン様植物ホルモンのベンジルアミノプリン(BA)の組み合わせがカルス・シュート形成に適していることが判明した。現在、最適化された培地で培養中である。
食物アレルギーにおけるHRF増幅機序の解明

ヒスタミン遊離因子(HRF)はIgE依存性のアナフィラキシー反応や気管支喘息に関わる分泌性タンパク質である。本研究の目的は、食物アレルギーにおけるHRFの役割を解析することである。食物アレルギーマウスにHRF阻害剤を予防的に投与すると食物アレルギー症状が減弱することから、HRFの関与が証明された。食物アレルギー患者および下痢発症マウスでHRF反応性IgE及びIgG抗体価が上昇していること、急速経口免疫療法成功例でその抗体価が有意に低下することから、HRF反応性抗体価が食物アレルギーの診断や治療効果を判断する客観的指標となりうる可能性が示唆された。本年度は食物アレルギーマウスモデルを用いて、血中HRF/HRF反応性抗体価の変動およびHRF阻害剤による食物アレルギー反応の軽減の有無について検討した。1、Balb/cマウスをOVA+Alumで感作後、OVAを経口投与し下痢発症前後のHRF反応性抗体価を比較したところ、下痢発症マウスでは血中HRF反応性IgG量が有意に増加した。また血中HRF量に関しても上昇傾向が見られた。一方、食物アレルギー反応が見られなかったPBS感作/OVA経口投与マウスではこれらの値は上昇しなかった。この結果から、食物アレルギーにおいてHRFおよびHRF反応性抗体は何らかの作用があることが示唆された。さらに、HRFやHRF反応性抗体価を測定することは食物アレルギーの発症もしくは重症度を客観的に判断するための新たなマーカーになる可能性が考えられ、臨床的観点からも重要な結果である。2、我々が以前開発しマスト細胞依存性喘息症状に効果を示したHRF阻害剤GST-N19(以下N19)の食物アレルギーに対する影響を検討した。Balb/cマウスをOVA+Alumで感作し、OVAを経口投与すると下痢症状が発症するが、N19を全OVA経口投与の30分前に経口投与しOVA誘導性の下痢症状の変化を観察したところ、非投与群およびGSTコントロール群と比較してN19投与群では一部のマウスで食物アレルギー反応が抑制された。このことから我々が開発した阻害剤が食物アレルギーに対して予防的効果を示すことが示唆された。食物アレルギー発症機序におけるヒスタミン遊離因子(Histamine-releasing factor、以下HRF)の役割を本研究では検討した。最終年度では、1)食物アレルギー患者では血中HRF反応性IgEおよびIgG量が健常者と比較し有意に高いこと、2)血中HRF量に関しては2群間で差がないこと、3)食物アレルギー患者HRF反応性IgG、IgG1およびIgG4量は急速経口免疫療法施行後に有意に低下し、治療2ヶ月1年後まで有意な低下が持続されていたことを明らかにした。さらに本研究期間全体では1)食物アレルギーマウスでは血中HRF反応性IgG量が有意に高いこと、2)細胞外機能のみを抑制するHRF阻害剤を予防的に投与すると、下痢発症頻度の低下および発症期間の延長が観察されること、3)HRF阻害剤を予防的に投与した食物アレルギーマウスでは腸管粘膜マスト細胞数が非投与群および擬薬投与群と比較して有意に減少すること、4)予防的HRF阻害剤投与食物アレルギーマウスではマスト細胞の活性化指標の一つである血中Mcpt-1量が非投与群と比較して有意に減少すること、5)HRF阻害剤投与群の全IgEおよびIgG量は非投与群および偽薬投与群と同濃度であったことを明らかにした。以上の結果から、抗原/HRF/HRF反応性IgE/IgE受容体によるマスト細胞活性化機序が食物アレルギーの発症に重要であることが示された。さらに、HRF反応性抗体価の測定は食物アレルギーの診断や急速経口免疫療法の治療成果を判断するのに有用な新規マーカーと成りうることが示唆された。今後はマウスレベルでHRFおよびHRF反応性抗体価が急速経口免疫療法にどのように関わるか、HRF阻害剤が治療的投与で効果を示すかを検討する予定である。アレルギー本年度、当該研究申請書に記載した食物アレルギーマウスモデルにおけるHRF反応性抗体価の測定と臨床症状との関連および阻害剤の効果を検証することに成功し、研究計画通りに研究は遂行できている。食物アレルギー患者におけるHRFおよびHRF反応性抗体価に関しては共同研究先と連携して測定を行う予定である。
免疫グロブリンH鎖遺伝子の再構成に関与する核内因子のcDNAクロ-ニング

Abelsonウイルスの温度感受性変異株(ts mutant)を分離し、このウイルスでトランスフォ-ムしたマウス未熟B系細胞株を樹立し、35°Cでの培養では、モノクロ-ナルに増殖するが、39°Cで培養すると、免疫グロブリン遺伝子の再構成が誘発される系を確立し、この系を用いて、免疫グロブリンH鎖遺伝子の再構成機構に関与する遺伝子をクロ-ニングすることを、平成元年度の研究目的として来た。先ず、免疫グロブリン遺伝子の再構成をおこしている細胞よりcDNAを合成し、他方、全く再構成を起こさない細胞から作ったcDNA間で、differentical hybcidization法で、再構成に特異的なcDNAクロ-ンの単離を試みたが特異的なcDNAクロ-ンを単離することができなかった。そこで、手法を改め、現在、subtraction法を用いて、特異的クロ-ンの単離を試みている。一方、タンパクレベルからの解析も進めて来た。recombinaseが認識すると考えられているsignal配列を合成し、この合成signal配列を用いたAffinityカラムを用いて、現在、signal配列特異的結合タンパクの精製を現在すすめている。
ボルバキア因子TomOの宿主の性に与える影響の解析

ボルバキアによる宿主操作の分子機構を明らかにするため、キイロショウジョウバエ培養細胞を用いたボルバキア遺伝子のスクリーニングを行った結果、TomOを同定した。TomOは、ボルバキアによるSxl変異の回復を一部再現した。また、強制発現したTomOはRNA結合タンパク質複合体と共局在することから、TomOが宿主RNAを標的にしている可能性について検証したところ、nanos mRNAと複合体を形成していた。TomOはNanosタンパク質を増加させることによりSxl変異体表現型を回復させていることが明らかとなった。共生細菌ボルバキアはキイロショウジョウバエ性決定因子Sxl変異体の雌生殖幹細胞の異常を回復することを明らかにしていたが、同様の効果を持つ申請者らが同定したボルバキア因子TomOの、その詳しい作用機構の解明を目指した。(1)TomO強制発現によりSxl変異体での生殖幹細胞の減少が阻止されるが、TomOを複数ある生殖幹細胞の1つのみで発現させるモザイク解析を行ったところ、幹細胞の未分化状態の維持に働くpMadが6倍に増加していた。(2)nanos変異体ではボルバキアによる生殖幹細胞の増加が起こらないことから、ボルバキアの作用にはnanosが必要であることがわかった。(3)ボルバキア感染生殖細胞では非感染細胞と比較してNanosの量が増えていた。(4) C末端側の疎水性領域を欠くTomOの強制発現でもNanosが増加するが、この時、翻訳抑制因子Cupとnanos mRNAの結合が阻害されていた。(5)抗TomO抗体を作製し、ボルバキアが発現する内在性TomOの発現パターンを観察した。ボルバキアに感染した胚に抗TomO抗体をインジェクションした後、抗体の分布を調べたところ、ボルバキア細胞の表面に検出された。このことから、TomOはボルバキアにより分泌され、ボルバキア細胞上に局在することがわかった。また、内在性TomOはRNA結合タンパク質複合体P bodyに隣接することがわかり、強制発現したC末端側の疎水性領域を欠くTomOの発現パターンと類似していた。(6)ショウジョウバ初期胚においてボルバキアwMelは後極に集積し、nanos mRNAに近接していた。この時、TomOとnanos mRNAは共局在した。抗TomO抗体とDIGラベルnanosアンチセンスプローブに対する抗DIG抗体を使ったPLAによって、TomOとnanos mRNAが相互作用していることが明らかとなった。ボルバキアタンパク質TomOが宿主生殖幹細胞の異常を回復する仕組みについての詳細を明らかにした。特に、TomOが標的であるnanos mRNAを制御するメカニズムを解明した。また、抗TomO抗体を作成しボルバキアが発現する内在性TomOの検出に成功した。内在性TomOとnanos mRNAの相互作用も確認できた。ボルバキアは雌生殖細胞から子へと伝達される母性Ribonucleoprotein (RNP)と共局在することが知られていたが、それらの相互作用の鍵となる可能性があるTomOを同定し、機能解析を進めてきた。共生細菌ボルバキアはキイロショウジョウバエ性決定因子Sxl変異体の雌生殖幹細胞の異常を回復するが、これはボルバキアの持つエフェクタータンパク質TomOの働きによる。TomOは、宿主nanos mRNAと相互作用し、Nanosタンパク質を増加させる。キイロショウジョウバエに感染するボルバキアwMelに近縁の、イエカに感染するボルバキアwPipのゲノム上では、TomO周辺の遺伝子の並びは保存されているが、TomO相同遺伝子は重複している。一つ(TomOwPip1)はwMelのTomO(TomOwMel)と比較的相同性の高い領域と、Ankyrinリピート、TomOと同様にC末に2つの疎水性領域を持つ。もう一つにはストップコドンが見られ、N末部位(TomOwPip2)にはAnkyrinリピート、C末部位(TomOwPip3)にはwMelのTomOと同様2つの疎水性領域がある。コドンを最適化したそれぞれの人工遺伝子をキイロショウジョウバエ発現用UASpベクターにクローニングして遺伝子組換え系統を作出した。Sxl変異体にてnanos-GAL4を用いて雌生殖細胞で強制発現したところ、疎水性領域を欠くTomOwPip1がnanos mRNAと相互作用しSxl変異体の異常を回復した。このことは、TomOとSxlとの相互作用がボルバキア系統間で保存されていることを示している。また、TomOwMelのドメイン解析から、RNAとの相互作用活性のみではSxlの異常を回復することができないことが明らかとなった。以上のことから、TomOは異なる働きを持つ複数の領域から構成されていることが示唆された。ボルバキアはRNA結合タンパク質複合体P bodyと共局在することが知られていたが、それらの相互作用の鍵となる可能性があるTomOを同定し、機能解析を進めてきた。今後は、ボルバキアと、宿主のRNA結合タンパク質、RNAの相互作用の分子的な仕組みを明らかにすることを目指す。

主に、ボルバキアによって引き起こされる現象がRNAの制御に起因する可能性について検討する。自然界でキイロショウジョウバエに感染するボルバキア系統wMelを別種のオナジショウジョウバエに移植した系統では、ボルバキアが異常増殖し、卵のDorsal appendageに奇形が見られる。我々は、同系統では卵母細胞の形成異常(DNAの形態、Egg chamber内での位置、分化の異常)を確認しているが、TomOの強制発現でも同様の現象が誘発される。そこで、このボルバキアによって誘導される異常がRNAの制御不全による可能性について検討する。卵母細胞は哺育細胞から輸送されるRNAによって分化、成長するが、これらRNAの局在、翻訳制御がボルバキアによって撹乱されてるか否かを調べる。特に、卵母細胞の分化、成長に関与するorb, grk RNAに注目する。ボルバキア感染細胞ではRNAウイルスの増殖が抑制されていることが知られているが、その詳しい仕組みは明らかとなっていない。我々は、ボルバキアがRNAとタンパク質の結合を阻害することを示したが、同様の仕組みでウイルスRNAが制御されている可能性について検討する。ウイルスRNAと結合する宿主タンパク質には、ボルバキアと共局在することがわかっているものも存在する。そこで、それらRNA結合タンパク質をウイルスRNAの相互作用が撹乱されている可能性について、ヒトスジシマカ培養細胞と単回感染性デングウイルスを用いた実験により検討する。昆虫学
最終氷期以降の地球規模の気候変動事変に伴う古代遺跡周辺の水文環境の変動

本研究は、これまで研究の遅れてきた中東および中央アジアにおける平野、盆地、湿地、湖沼などの陸地域における現地調査を行った。これらの地域では多数の遺跡が立地しており、それらを手がかりとして、最新の分析探査手法を用いながら、環境変動の実態を明らかとすることができた。そして地球環境が短期(10100年オーダー)で急激に変化してきたという事実とそれが遺跡立地に与えた影響を検証し、それらの結果から今後の地球環境の変動予測への応用を行った。最近の地球環境の変動に関する視点は、氷床におけるダンスガード・オシュガーサイクルの発見以来、大きく変わりつつある。地球環境が、短期(10102年オーダー)においても、急激に変化してきたという事実は、今後の地球環境の変動予測に大きな影響を与えてきた。特にこの数年で、完新世においても気候は安定的ではなく、8200年前に世界的な寒冷化イベントが発見されるなど、氷期と同様に、大規模気候変動事変が存在することが明らかとなった。一方、本研究の調査地域である西アジア・中央アジア地域においては、従来から、その遺跡の分布や立地環境の変動によって、新石器時代以降、大規模な気候変動、特に湿潤期と乾燥期が繰り返し出現することが推定されていた。これらの変動は、上記の地球規模の大規模気候変動事変との関わりが想定されるものである。しかし、これらの地域の社会情勢の悪化とも関わり、近年は継続的な現地調査の機会も少なく、その気候変動の詳細が検討されないまま残されてきた。特に、本研究の目的とする、気候、降水、地下水、植生、動物相など、遺跡を取り巻く自然環境変動に関する研究は、単発的に短期間の調査によるもの、これまでの概論をまとめたものを除くと、本研究における研究代表者および研究分担者による研究以外では、本格的な研究はイスラム原理主義革命以前の、1970年代以前までさかのぼらなければならないことが実情である(Butzer, 1995;Erol, 1978)。このように陸上における新しい資料が得られないため、同地域の古環壌変動については、主に、地中海東部、エーゲ海およびマルマラ海などにおける海洋掘削調査による研究で議論されてきた。これらは調査年度も新しく、その精度も高い。(Sperling, 2003)またが、内陸域では、バイカル湖など大湖沼における掘削調査が進んできた。本研究は、これらの研究動向を背景として、これまで研究の遅れてきた平野、盆地、湿地、小規模湖沼などの陸地域における調査を充実させることを目的とする。これらの地域では多数の遺跡が立地しており、それらを手がかりとして、最新の分析探査手法を用いながら、環壌変動の実態を明らかとするものである。最近の地球環境の変動に関する視点は、氷床におけるダンスガード・オシュガーサイクルの発見以来大きく変わりつつある。地球環境が、短期(10100年オーダー)においても、急激に変化してきたという事実は、今後の地球環境の変動予測に大きな影響を与えてきた。今回の調査においても、完新世においても気候は安定的ではなく、8200年前に世界的な寒冷化イベントが発見されたことなど、大規模気候変動事変が存在することが明らかとなった。具体的な現地調査は以下のように行った。(中国新疆ウイグル自治区平成20年9月15日間)新疆ウイグル自治区において現地調査を行う。調査項目は、地下水採取、湿原堆積物の採取などを行い、オアシスの立地および水文環境の変動について調査を行った。(エジプト平成21年3月30日間)エジプトにおいては、カイロ南東のカルーン湖において調査を行う。調査期間は20日間である。主に、湖の湖水位変動とナイル川の氾濫史の解明について、地形地質調査と考古歴史文書などの解析をあわせて実施した。(モンゴル平成20年7月15日間)ホブスグル湖周辺およびヒンティ産地における泥炭層において掘削調査を行った。(トルコ平成20年9月、30日)トルコ共和国ではアナトリア高原中部のアンカラ県、クルシェヒル県、コンヤ県、カイセリ県における遺跡の分布調査と古環境の復元のためのボーリング調査を行う。具体的には、地中レーダーおよび磁気探査を用いた地中物理探査で遺跡の未発掘地区の確定を進める。さらに、カイセリ県アジギョル湖、クルシェヒル県セイフェ湖で湖沼堆積物の掘削調査を行う。あわせて、トルコ東部のバン湖、および東南部のディアルバクール周辺で、予察調査を実施した。(モンゴル平成21年8月15日間)

ホブスグル湖周辺およびヒンティ産地における泥炭層において掘削調査を行った。(トルコ平成20年9月30日)トルコ共和国ではアナトリア高原中部のアンカラ県、クルシェヒル県、コンヤ県、カイセリ県における遺跡の分布調査と古環境の復元のためのボーリング調査を行う。具体的には、地中レーダーおよび磁気探査を用いた地中物理探査で遺跡の未発掘地区の確定を進める。さらに、カイセリ県アジギョル湖、クルシェヒル県セイフェ湖で湖沼堆積物の掘削調査を行った。あわせて、トルコ東部のバン湖、および東南部のディアルバクール周辺で、予察調査を実施した。(エジプト平成21年12月15日間)エジプトにおいては、カイロ南東のカルーン湖において調査を行う。調査期間は20日間である。主に、湖の湖水位変動とナイル川の氾濫史の解明について、地形地質調査と考古歴史文書などの解析をあわせて実施した。このほか、台湾国立大学において2回、合同セミナーを開催し、研究成果と分析手法に関する交流を行った。最近の地球環境の変動に関する視点は、氷床におけるダンスガード・オシュガーサイクルの発見以来大きく変わりつつある。地球環境が、短期(10100年オーダー)においても、急激に変化してきたという事実は、今後の地球環境の変動予測に大きな影響を与えてきた。今回の調査においても、完新世においても気候は安定的ではなく、8200年前に世界的な寒冷化イベントが発見されたことなど、大規模気候変動事変が存在することが明らかとなった。具体的な現地調査は以下のように行った。(モンゴル平成22年8月15日間)ボブスグル湖周辺およびヒンティ産地における泥炭層において掘削調査を行った。これによって、過去10000年間のモンゴルにおける降水分布変動を微化石と年代測定によって復元することができ、その成果を国際誌に投稿した。(トルコ平成22年9月、30日)トルコ共和国ではアナトリア高原中部のアンカラ県、クルシェヒル県、コンヤ県、カイセリ県における遺跡の分布調査と古環境の復元のためのボーリング調査を行った。(エジプト平成22年12月15日間)エジプトにおいては、カイロ南東のカルーン湖において調査を行う。このほか、九州大学において合同セミナーを開催し、研究成果と分析手法に関する交流を行った。研究資料収集実施国トルコ、エジプト、中国であった。実施日程と旅行経路(中国新疆ウイグル自治区平成23年10月15日間および24年8月)新疆ウイグル自治区において現地調査を行う。調査項目は、地下水採取、湿原堆積物の、オアシスの立地および水文環境の変動について調査資料収集を行った。(トルコ平成24年9月、延べ20日)
溶融塩を用いたダイヤモンド電解合成

本研究では、高温溶融塩中においてダイヤモンドを常圧で電解合成することを目指し、実験を行った。溶融塩は、650°Cの溶融LiCl-KClに種々の濃度の水酸化カリウムおよび炭酸カリウムを添加した浴を用い、それぞれの添加濃度および電解電位が電析炭素の形態や結合状態に及ぼす影響を調査した。その結果、1.0 V (vs. Li+/Li)付近より卑な電位で炭素が析出し、1.3 V付近より卑な電位で水素が発生することが示唆された。また、0.8-1.2 Vの範囲において電解を行い、得られた試料を分析した結果、ダイヤモンドの形成は確認できなかったが、sp3混成軌道の炭素の割合が高くなる条件が明らかになった。従来のダイヤモンド合成は、高圧高温合成法または気相合成法のみであり、常圧液体からの合成例は知られていなかった。一方、炭酸イオンを含む溶融塩中において、炭素粉末や炭素膜、最近ではカーボンナノチューブなどが電析できることが知られていた。本研究は、これまで常圧の液相からは合成例のないダイヤモンドを、高温溶融塩中において常圧で電解合成することを目指し、以下の実験を行った。炭酸イオン濃度の低い系として、共晶組成LiCl-KCl(融点352°C)に炭酸カリウムを0.1-10 mol%添加した溶融塩を用いた。作用極にはニッケル板、単結晶シリコン板、グラッシーカーボン板、対極にはグラッシーカーボンロッド、参照極にはAg+/Ag電極を用いた。水素源として、水酸化カリウムを添加した。実験温度は400-600°Cとした。まず、サイクリックボルタンメトリーにより、炭酸イオンと水酸化物イオンの還元挙動を明らかにした。その結果、炭酸イオンと水酸化物イオンの両者ともに還元される電位領域が存在することが分かった。2.電析試料の分析定電位もしくは定電流電解により電析試料を作成した。基板材料としては、ニッケル板、単結晶シリコン板、グラッシーカーボン板を用いた。顕微ラマン分光、SEM、EDX、XRD、XPS等を用い分析した。その結果、ダイヤモンドの合成は確認できなかったが、sp3結合の割合が高くなる条件を見出すことができた。さらに、電解条件を最適化する必要があると思われる。本研究では、常圧下でダイヤモンドが合成できる可能性があり、装置の大型化やダイヤモンド膜の大面積化も容易であると考えられる、溶融塩電解法についての検討を行った。溶融塩としては、650°Cの溶融LiCl-KCl(58.5: 41.5 mol%)を用い、これに炭素源および水素源となる添加物を加えた。サイクリックボルタンメトリーの結果より、炭素の析出および水素の発生が示唆された。種々の添加物濃度および電解電位で電析サンプルを合成し、得られたサンプルを走査型電子顕微鏡、X線回折ならびに顕微ラマン分光により分析した。その結果、ダイヤモンドは確認できなかったが、ラマンスペクトルにおいてsp2炭素に対してsp3炭素の割合が高くなる条件を見出すことができた。今後、添加物濃度、温度および電解電位のさらなる最適化によりダイヤモンドが合成される条件を見出すことが期待できる。これまでにダイヤモンドは確認できていないが、sp2炭素に対してsp3炭素の割合が高くなる条件を見出すことができた。今後、添加物濃度、温度および電解電位のさらなる最適化を行えば、りダイヤモンドが合成される条件を見出すことが十分期待できる。上述のとおり、電析物に関して、sp2炭素に対してsp3炭素の割合が高くなる条件を見出すことができた。まず、これまでに得られたサンプル中でsp3炭素の割合が最も高かった条件付近で複数回の実験を行う。その後、温度を現在の650°Cから50°C刻みで上下させて、電析物を作成する。いずれのサンプルも、これまで同様に走査型電子顕微鏡、X線回折ならびに顕微ラマン分光により分析する。なお、電析においては適宜パルス電解も試みる。以上によりダイヤモンドが得られる条件を明らかにする。消耗品として、高純度試薬(LiCl、KCl、炭素源となる化合物、水素源となる化合物)と電極材料(高純度ニッケル板、単結晶シリコン板、グラッシーカーボン等)を購入予定である。さらに、溶融塩の真空乾燥、発生ガスのサンプリングに使用するガスラインの交換部品(バルブ、SUSチューブ、ガラスチューブ等)としても使用予定である。
遺伝性脊髄小脳***の分子病*-発生及び形態面からのアプローチ

本年度は、胎児及び新生児ratにMJD-1 radioactive cRNAprobeを用い、in situ hybridizationを適用する際凍結切片を用いたが、有効なシグナルが得られなかった。Machado-Joseph病(MJD)症例の病理学的所見とCAG repeatの長さとの関係について、本年は新たに2剖検例を加え、8例につき検討した。症例番号、死亡時年齢・性、MJD1遺伝子の正常及び異常alleleのCAG repeat数は、以下の通り:#1、77歳男、23/64;#2、78歳女、21/69;#3、44歳男、25/75;#4、62歳女、14/76;#5、46歳男、29/77;#6、49歳男、14/77;#7、44歳男、23/79;#8、32歳男、19/79。これらの症例に対し、免疫組織学的に抗ubiquitin抗体で全切片を染色し、核内封入体の有無を検討した。また、抗α-B-crystallin抗体で陽性に認識されるオリゴデンドログリアの密度を、視床下核で、コンピューター画像解析装置を用いて検討した。核内封入体は橋核に限局して極少量出現し、CAG repeat数との相関は認められなかった。また、抗α-B-crystallin抗体陽性オリゴデンドログリアの密度は、視床下核で明らかに増加が認められ、年齢で除した場合、CAG repeat数と相関傾向を認めた。これは、Huntington病の尾状核の神経細胞減少と同様の傾向であり、MJD病の本質の可能性がある。今後さらに、淡蒼球内節・橋底部尾側等の変性必発部位に対し、検討を加えていく予定である。これとは独立に、Machado-Joseph病(MJD)症例の病理学的所見とCAG repeatの長さとの関係を複数例で検討した。これまでの蓄積例は6例。症例1:死亡時77歳男性、経過20年、MJD1遺伝子の正常allele及び延長alleleのCAG repeat数は23/64。症例2:死亡時78歳女性、経過33年、CAG repeat数は21/69。症例3:死亡時44歳男性、経過17年、CAG repeat数25/75。症例4:死亡時46歳男性、経過23年、CAG repeat数29/77。症例5:死亡時44歳男性、経過18年、CAG repeat数23/79。症例6:死亡時32歳男性、経過13年、CAG repeat数19/79。これらの症例に恒常的に認められる所見を、顕微鏡画像をコンピューターに直接取り込み、MO diskに保存し、半定量的に解析することを併用して抽出を試みた。本年においては、胸髄の腹側部の萎縮と前側索の有髄線維の減少、クラーク柱の神経細胞減少、橋底部尾側の萎縮と神経細胞の減少の所見を全例で確認した。また、抗aB-crystallin抗体を用いた免疫染色で、陽性に認識されるオリゴデンドログリアが、これらの部位で増加していることを確認した。次年度は、さらに症例数並びに関心部位を増やし検討する予定である。本年度は、胎児及び新生児ratにMJD-1 radioactive cRNAprobeを用い、in situhybridizationを適用する際凍結切片を用いたが、有効なシグナルが得られなかった。

症例番号、死亡時年齢・性、MJDl遺伝子の正常及び異常alleleのCAG repeat数は、以下の通り:#1、77歳男、23/64;#2、78歳女、21/69;#3、44歳男、25/75;#4、62歳女、14/76;#5、46歳男、29/77;#6、49歳男、14/77;#7、44歳男、23/79;#8、32歳男、19/79。これらの症例に対し、免疫組織学的に抗ubiquitin抗体で全切片を染色し、核内封入体の有無を検討した。また、抗α-B-crystallin抗体で陽性に認識されるオリゴデンドログリアの密度を、視床下核で、コンピューター画像解析装置を用いて検討した。核内封入体は、橋核に限局して極少量出現し、CAG repeat数との相関は認められなかった。また、抗α-B-crystallin抗体陽性オリゴデンドログリアの密度は、視床下核で明らかに増加が認められ、年齢で除した場合、CAG repeat数と相関する傾向を認めた。これは、Huntington病の尾状核の神経細胞減少と同様の傾向をとっており、CAGrepeat病の本質の可能性がある。今後さらに、淡蒼球内節・橋底部尾側等の、変性必発部位に対し、検討を加えていく予定である。