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脳腸軸を介し脳を活性化するポリフェノールの探索

疫学調査により、ポリフェノールには老化やそれに伴う疾病を予防する効果が数多く報告されているが、詳細な機作が明らかにされているものあまり存在しない。ポリフェノールはバイオアベイラビリティが低いにもかかわらず、摂食後全身で作用するものが多く、標的組織や細胞内に吸収されて効果を発揮するといったこれまでの定説では説明がつかない。本研究は、体内に吸収されずとも効果を発揮するポリフェノールの新たな作用機作の1つとして、ポリフェノール摂食刺激による脳機能の活性化機構に着目し、その効果が期待できる新規素材としてのポリフェノールを探索・同定すると共に、その活性化機構を探る。
低酸素血症と急性胃粘膜障害-脂質過酸化はどのように関与するか

1.CL-HPLC法による脂質過酸化物(PCOOH)の測定:宮澤らの方法による化学発光高速液体クロマトグラフィー法により小腸粘膜内PCOOH測定を試み,ピコモルレベルでの測定に成功した.実験にはラット小腸虚血再灌流モデルを用いた.虚血時間を30分とし,虚血のみの群,再灌流30分,60分,120分,180分,360分後に小腸を摘出した群,および無処置の群で粘膜内チオバルビタール反応物質(TBARS)とPCOOHを測定比較した.また各群の粘膜障害の程度,多核白血球浸潤の程度を組織学的に検討した.その結果,粘膜障害は再灌流後30分から120分で虚血のみの群より高度であった.白血球浸潤も再灌流後30から180分で顕著nであった.しかしTBARSは全経過を通じて有意な変化が見られなかった.一方PCOOHは再灌流後30分で,無処置群,虚血のみの群に比べ有意に増加していた.これらの結果からTBARSの変化としてとらえられない軽微な粘膜障害でも脂質が過酸化されていることが明らかとなり,かつCL-HPLC法によるPCOOH測定が高感度の測定系であることが明らかとなった.2.低酸素血症による急性胃粘膜障害モデルの作成:任意の低酸素環境を設定できる低酸素チェンバーを作製し、ラットを酸素濃度10%の環境に拘束し急性胃粘膜障害モデルを作製した.この方法で胃粘膜に線状の潰瘍が発生することを確認し,さらにCL-HPLC法にて胃粘膜内PCOOHを測定した.その結果,通常の酸素濃度環境で拘束した群に比べ,低酸素環境下では胃粘膜内PCOOHが増加する傾向が認められた.1.低酸素血症による急性胃粘膜障害発生モデルの作成:任意の低酸素環境を設定できる低酸素チェンバーを作成し,ラットに低酸素を負荷し潰瘍発生の有無を検討した.その結果,10%の低酸素負荷にて胃体部に線状の潰瘍発生を認めた.以前より我々はTBA反応物質が急性胃粘膜障害発生時には上昇することを明らかにしてきたが,後述するCL-HPLC法により測定したPCOOHも低酸素条件下で発生した急性胃粘膜病変では有意に増加していた.2.CL-HPLC法による過酸化脂質物質(PCOOH)の測定:宮沢らの方法による蛍光高速液体クロマトグラフィーにより小腸粘膜より抽出した過酸化脂質をピコモルレベルで測定することに成功した.実験に用いたのは小腸虚血再潅流障害モデルである.虚血時間を30分とし虚血のみ及び再潅流後の30分小腸粘膜内TBA反応物質を測定したところ正常無処置対照群,虚血群,再潅流群で有意な変化はみられなかった.一方,PCOOHは再潅流群で,正常対照群,虚血群いずれに対しても有意に増加した.正常対照群と虚血群では有為な差は認めなかった.このことより,TBA反応物質が動かない軽度の病変で,すでにPCOOHが有意に変化していることが明らかにされ,あわせてPCOOH測定が鋭敏かつ高感度な測定系であることが明らかになった.1.CL-HPLC法による脂質過酸化物(PCOOH)の測定:宮澤らの方法による化学発光高速液体クロマトグラフィー法により小腸粘膜内PCOOH測定を試み,ピコモルレベルでの測定に成功した.実験にはラット小腸虚血再灌流モデルを用いた.虚血時間を30分とし,虚血のみの群,再灌流30分,60分,120分,180分,360分後に小腸を摘出した群,および無処置の群で粘膜内チオバルビタール反応物質(TBARS)とPCOOHを測定比較した.また各群の粘膜障害の程度,多核白血球浸潤の程度を組織学的に検討した.その結果,粘膜障害は再灌流後30分から120分で虚血のみの群より高度であった.白血球浸潤も再灌流後30から180分で顕著nであった.しかしTBARSは全経過を通じて有意な変化が見られなかった.一方PCOOHは再灌流後30分で,無処置群,虚血のみの群に比べ有意に増加していた.これらの結果からTBARSの変化としてとらえられない軽微な粘膜障害でも脂質が過酸化されていることが明らかとなり,かつCL-HPLC法によるPCOOH測定が高感度の測定系であることが明らかとなった.2.低酸素血症による急性胃粘膜障害モデルの作成:任意の低酸素環境を設定できる低酸素チェンバーを作製し、ラットを酸素濃度10%の環境に拘束し急性胃粘膜障害モデルを作製した.この方法で胃粘膜に線状の潰瘍が発生することを確認し,さらにCL-HPLC法にて胃粘膜内PCOOHを測定した.その結果,通常の酸素濃度環境で拘束した群に比べ,低酸素環境下では胃粘膜内PCOOHが増加する傾向が認められた.1.CL-HPLC法による脂質過酸化物(PCOOH)の測定:宮澤らの方法による化学発光高速液体クロマトグラフィー法により小腸粘膜内PCOOH測定を試み,ピコモルレベルでの測定に成功した.

実験にはラット小腸虚血再灌流モデルを用いた.虚血時間を30分とし,虚血のみの群,再灌流30分,60分,120分,180分,360分後に小腸を摘出した群,および無処置の群で粘膜内チオバルビタール反応物質(TBARS)をPCOOHを測定比較した.また各群の粘膜障害の程度,多核白血球浸潤の程度を組織学的に検討した.その結果,粘膜障害は再灌流後30から120分で虚血のみの群より高度であった.白血球浸潤も再灌流後30から180分で顕著nであった.しかしTBARSは全経過を通じて有意な変化が見られなかった.一方PCOOHは再灌流後30分で,無処置群,虚血のみの群に比べ有意に増加していた.これらの結果からTBARSの変化としてとらえられない軽徴な粘膜障害でも脂質が過酸化されていることが明らかとなり,かつCL-HPLC法によるPCOOH測定が高感度の測定系であることが明らかとなった.低酸素血症による急性胃粘膜障害モデルの作成:任意の低酸素環境を設定できる低酸素チェンバーを作製し,ラットを酸素濃度10%の環境に拘束し急性胃粘膜障害モデルを作製した.この方法で胃粘膜に線状の潰瘍が発生することを確認し,さらにCL-HPLC法にて胃粘膜内PCOOHを測定した.その結果、通常の酸素濃度環境で拘束した群に比べ,低酸素環境下では胃粘膜内PCOOHが増加する傾向が認められた.
超高磁場MRIによる脳アミロイドイメージングの開発

自然界に少ない炭素13をアミロイドプラークに結合する物質に組み込むことで、特異的な炭素13MRアミロイドイメージングが得られるのではないかという仮説で実験を行った。その結果、炭素13含有化合物の合成には成功したが、その溶解性が低かった。さまざまな工夫である程度溶解し、アルツハイマー病のトランスジェニックマウスに投与を行い、7T MRI装置でマウス脳の炭素13MRI画像を取得した。そのMRI画像で脳内に炭素13化合物の存在が確認されたが、組織学的な検討と解離がみられた。今後更なる検討が必要と思われる。アミロイドの分子イメージングは主にPETが用いられているが、サイクロトロンが必要で経済的負担が大きく、患者や医療従事者への被曝、撮像における時間的制限があり、施設が限られている。またPETによる画像は空間分解能が必ずしも高いとは言えない。我々の研究の目的はアルツハイマー病の脳アミロイドβペプチドに特異的に結合するC-13フラボン誘導体を合成し、アルツハイマー病のトランスジェニックマウスに投与することで、超高磁場MRIを用いin vivoにて脳アミロイドの画像化を開発することである。このアミロイドイメージングが実現すれば経済的負担が少なく、患者や医療従事者への被曝もなく、多くの施設で撮像可能と思われる。我々の研究チームでは、アミロイドβペプチドに特異的に結合するC-13安定同位体を含むフラボン誘導体の合成に成功した。また、アルツハイマー病のトランスジェニックマウスも入手できている。現在の課題は、アミロイドβペプチドに特異的に結合するフラボン誘導体が水に溶けにくいため、静脈内投与が難しいことである。腹腔内投与や経口投与に変更できるかどうかを現在検討中である。血中に薬剤が移行することを確認できた段階で、アルツハイマー病のトランスジェニックマウスに薬剤を投与し、動物実験用7T MRI装置を用いC-13用コイルでそのマウスの脳を撮像する予定である。その後、マウス脳のMR画像と病理組織像を詳細に比較検討する。平成22年度の途中で当機関の工学部で稼働していた動物実験用の7T MRI装置が諸事情により使用できなくなった。そのため、急遽当機関の薬学部構造機能物理化学分野で運営されているブルッカー社の動物実験用7T MRI装置を使用することに変更した。同機器で炭素13MRI画像および炭素13MRスペクトロスコピーを取得する準備を進め、画像取得に成功した。また、本実験で使用予定であったフラボン誘導体(ピッツバーグ化合物Bよりもアミロイドβに親和性が高いと報告されている物質)に対する炭素13の組み込み合成に成功したが、種々の実験から水溶性が極めて低いことが判明した。また、実際に動物に対し同物質を投与し、どのくらい血液に溶けるかを採血してマスクロマトグラフィー分析を行ったが、全く血液中に検出されなかった。そのため、炭素13を組み込む薬剤を臨床で応用されているピッツバーグ化合物Bに変更し、実験を再構築してきた。アルツハイマー病のトランスジェニックマウスは完成し、アミロイドβに親和性が高い炭素13含有薬剤を投与予定の動物は整っている。我々は超高磁場MRIを用いたグリオーマ細胞を移植したマウスにて炭素13メチオニンがグリオーマに集積したMR画像化に成功し、その成果はMagnetic Resonance in Medical Sciences誌に採択され、2011年6月号に掲載予定である。実験計画の変更を余儀なくされたが、実験の新たな体制や準備はすでに整ってきており、in vivoでの脳アミロイドの炭素13MRI画像化を目指して取り組む予定である。炭素13をピッツバーグ化合物Bに組み込む合成を行い、水溶性の程度の確認を行った。その結果、炭素13含有ピッツバーグ化合物Bは水溶性が低いことが判明し、さまざまな溶剤で可溶化を試み、溶解することができた。アルツハイマー病のトランスジェニックマウスの心臓から直接炭素13含有ピッツバーグ化合物B溶液を注入し、その後、当機関の薬学部構造機能物理化学分野で運営されているブルッカー社の動物実験用7T MRI装置を使用し、マウスの脳に対してケミカルシフトイメージングによる炭素13MRスペクトロスコピーおよび炭素13MRI画像を約12時間かけて取得した。炭素13MRスペクトロスコピーにて脳内に局所的に炭素13のピークがみられ、マウスの脳に炭素13が集積していることが認められた。また、炭素13MRI画像とプロトン強調画像の融合画像にて視床に強い信号上昇域がみられた。2匹のマウスで7TMRI撮像を行い同様の所見が観察された。PETによるアミロイドイメージングはアルツハイマー病の早期診断に有用性が高いが、施設が限られているのが現状である。

MRIでは最近3Tや7Tなどの超高磁場装置が臨床に応用されているが、炭素13MRスペクトロスコピーや炭素13MRI画像化が進めば、PETのようにアミロイドイメージングが可能ではないかと考えられる。今回の検討で、フラボン誘導体に炭素13.を組み込むことが可能で、7T MRIを用いin vitroにて炭素13の画像化を得ることができた。炭素13MRI画像によるアミロイドイメージングの可能性を示す研究成果と思われ、今後の研究に期待される。
中国人の国際移動の地域構造に関する研究

平成14年度において、本研究代表者は、平成13年度の研究に続き、更なる調査・分析を行った。中国における出入国統計は全く整備されていないため、平成13年度は、まず米国・欧州・日本など主な移動先での現地調査を含めて関係諸国の多時点(1980年・1990年・2000年など)人口センサスデータ・出入国統計データなどの大量な資料を収集した。また、これらの資料に基づいて、19802000年の中国から海外への人口移動の規模及びその地域構造を大体推定した。平成14年度には、主要関係国における中国人移動者の年齢・性別・職業状況・転出地(省)などについてより詳しい資料を収集し、移動要因に関する関連分析を行った。集計分析結果を見ると、19802000年の間に、中国本土から海外への「新華僑」の人口移動規模は250万人を超えており、「老華僑」の故郷である福建省と広東省からの転出も多いが、平均所得水準が相対的に高く、主要大学・研究機構が集中している北京市・上海市およびその周辺地域からの転出が最も目立っている。また、香港への移住者を除けば、「新華僑」のほとんどは、欧米・日本など先進諸国に移入している。「新華僑」のこのような転出地・転入地構造は、主に東南アジアに分布している「老華僑」のそれと明らかに違う。一方、移動時期や移動先によって「新華僑」の移動目的、学歴構造、出身地構造などにはかなりの差異と変化があると見られる。本研究の成果は、一部を英文・日本語学術誌に投稿していると同時に、その中国語版は2003年中に上海社会科学院出版社より出版される予定である。中国における出入国統計は整備されていないため、本年度は、まず資料収集から着手して、1970年代末以降中国から海外への人口移動の規模及びその地域構造の解明を進めている。中国国内の関連資料および主要関係国の最新人口センサス。出入国統計データから整理した結果、近年の中国から海外への人口移動には、次の特徴があると判明している。1.「改革開放」以降の約20年間に、中国本土から海外への人口移動規模は250万人を超えている。先進国及び近隣諸国(地域)は主な移動先となっており、香港・アメリカ・日本・カナダ・オーストラリア・EU・ロシア・韓国が中国からの転出者の約9割を受け入れている。2.主な転出地は、所得および教育水準が相対的に高い沿海地域である。特に主要大学。研究機構やその他分野のエリートが集中している北京市と上海市、および海外の華人ネットワークとのつながりが強い福建省と広東省からの転出が目立つ。また、東北3省から日本・韓国・ロシアへの移動も急増している。3.移動者の転入先国における職業は二極分化になっている。研究者。技術者。経営者になるものも少なくないが、伝統製造業や飲食業の底辺労働者として生計を維持しているものも多い。4.当初、「頭脳流出」への懸念が強かったが、近年ハイテク技術者。研究者。経営管理者など専門人材の北京・上海など地域への回流は始まっており、中国のIT産業などの発展や國際社会との融合に大きく促進している。一方、個別省から海外への不法入国の増加は新たな問題となっている。上述した移動動向を大体判明したとともに、人口移動と経済グローバル化との関係、人口移動の転入先の労働市場・所得分配の影響などについての分析も始めている。その内、一部の内容は國際研究会(University of Oxford)で報告されており、一部の内容は公表される(予定)論文の中に反映されている。
アリ類の腹柄節構造の解析と系統進化の解明

アリ類(Formicidae)の系統進化とアリ類を含む膜翅目有剣類(Aculeata)の腹部の関節構造の進化的蛍光を明らかにするため、有剣類の腹部関節構造と筋肉系の解析を行った。その結果、1)有剣類において、その腹部の構造と筋肉系の進化的な改変様式には3つのグレードが見られた。2)最初の、そして最も単純な改変はTipiidae,Scoliidaeで見られた様式で、これらの有剣類では腹部第3節のPrecsleritesは伸張して、前節である腹部第2節に緊密に差し込まれる突出部を形成していた。3)次のグレードはVespidae,Eumenidae,Masaridae,Formicidaeで見られた様式で、これらの有剣類では腹部第3節Prescleritesが突出部を形成するだけでなく、腹部第2節の後腹端に腹部第3節Pretergiteの前下端を受ける特異な関節溝が形成され、より強く下方へ腹部を曲げることができる構造となっていた。4)最後のグレドはFormicidaeの一部で見られる改変で、関節溝はなくなり、そのかわりに腹部第3節のPrescleritesが下方に膨張して、腹部第3節の突出部はボール状となり、関節部の運動性能をより高いものとしていた。5)これらの3つのグレードが見られた有剣類では、腹部の背節筋肉系に改変が生じ、本来腹部背節のretractorとprotractorの役割を有する筋肉が、腹部全体のlevatorとdepressorに役割を改変していることがわかった。6)FormicidaeとVespidaeの仲間が、有剣類のなかで唯一同様の腹部関節構造を有していることがわかり、これまでポジティブな証拠がなく不明であったアリ類の姉妹群として、Vespidaeの仲間が有力であることが示された。7)外観的にはTipiidae様の明確にくびれない腹部第3節を有するため、ノコギリハリアリ族(Amblyoponini)はこれまで最も祖先的なアリ類であると見なされてきた。しかし、その腹部関節構造と筋肉系は他の高等なアリ類と同様であるとわかり、その外観が筋肉系の改変にともなう二次的な改変であることが示唆された。8)腹部の外観的な類似から、フタフシアリ亜科(Myrmicinae)の姉妹群として、フシナガアリ亜科(Pseudomyrmicinae)が認められてきたが、その関節構造と筋肉系の解析からこの両亜科間にポジティブな類似点はなく、むしろハリアリ亜科(Ponerinae)のEctatomminiとフタフシアリ亜科の間にポジティブな類似点が見られた。このことから、フタフシアリ亜科の姉妹群としてはハリアリ亜科の一部が有力であると示唆され、かつこのことからハリアリ亜科の単系統性も疑問視された。これら本研究から得た新知見は、"Skeletomuscular modifications associated with additional petiolar-fornation on anterior abdominalsegments in aculeate Hymenoptera"に取りまとめ、Systematic Entomology誌に投稿した(投稿中9)。

このことから、フタフシアリ亜科の姉妹群としてはハリアリ亜科の一部が有力であると示唆され、かつこのことからハリアリ亜科の単系統性も疑問視された。これら本研究から得た新知見は、"Skeletomuscular modifications associated with additional petiolar-fornation on anterior abdominalsegments in aculeate Hymenoptera"に取りまとめ、Systematic Entomology誌に投稿した(投稿中9)。
慢性炎症が引き起こす糖尿病性血管内皮由来因子シグナル破綻と性差の分子基盤

ヒトの内皮細胞は全身に分布し、刺激に応じて様々な物質を放出することで生体の恒常性を維持している。生活習慣病である糖尿病や高血圧は持続的な慢性炎症が病態形成に関与するが血管内皮細胞や平滑筋細胞におけるシグナルは体系化されていない。本研究は慢性炎症病態における血管内皮細胞・平滑筋細胞のクロストークに着目して検討を行い、セロトニン収縮における性差、情報伝達、糖尿病罹患期間における収縮弛緩異常、細胞内イベントと血管反応、血管異常に対するポリフェノールの影響などについての最新の知見を得た。糖尿病を含む生活習慣病においては、血管機能障害(内皮機能障害や平滑筋機能障害)がこれら疾病の合併症発症、進展に重要な役割を果たしている。また一方で、生活習慣病病態形成に慢性炎症が関与していることが近年注目されている。そこで、まず、慢性炎症が既に起こっていると考えられる2型糖尿病長期罹患モデルであるGoto-Kakizaki (GK)ラット摘出頸動脈を用いて、未だ病態下において収縮異常機序が明らかではないセロトニン(5-HT)による収縮反応に関して我々は以前GKラットにおいて増強することを明らかとしたが、更なる分子メカニズムの検討を行った。対照群と比較してGK群にて頸動脈における5-HT収縮増大が観察され、内皮除去標本においても依然として、GK群における収縮反応が増大していることから、5-HT収縮増大には内皮よりも平滑筋シグナルの異常が大きく関与していることを明かとした。更に、薬理学的検討から、頸動脈におけるセロトニントランスポーターがこの異常に一部関与している可能性や、p38MAPK, PI3K, Rho kinaseといったキナーゼもこの異常に関与することを明らかとした。エピガロカテキンガレート(EGCG)は、主に緑茶に含まれる成分であり、抗炎症作用など多彩な有益効果が報告されているが、2型糖尿病を長期罹患した状態におけるEGCG慢性投与が頸動脈における血管反応に有効かどうかは明らかではないため検討を行った。2型糖尿病ラット(OLETF)摘出頸動脈において、エンドセリン-1(ET-1)収縮がEGCG慢性投与によって抑制されることを明らかとした。この効果は、内皮除去で消失すること、さらにアセチルコリン誘発内皮依存性弛緩反応がEGCGで増強することから、EGCGのET-1収縮抑制には、内皮機能の改善が関与していることを明らかとした。本研究によって、持続的な慢性炎症モデルにおける血管反応異常のメカニズムの一部が明らかとなった。慢性炎症は生活習慣病の合併症発症・進展に重要であり、合併症形成に血管機能異常が関与しているので、慢性炎症が生じているモデルを用い多角的に検討した。自然発症高血圧ラット(SHR)において、頸動脈のatrial natriuretic peptide (ANP)弛緩は対照群と比較して減弱し、内皮機能でなく平滑筋のlarge-conductance calcium-activated potassium channel異常が関与すること、大腿動脈にてnoradrenaline (NAd)収縮が増強し、内皮機能障害、特に内皮由来過分極因子(EDHF)障害やcyclooxygenase由来収縮性プロスタノイド増大が関与することを見いだした。ポリフェノールのレスベラトロールがAkt/eNOS経路を介し慢性2型糖尿病の内皮依存性弛緩を改善すること、モリンも、糖尿病マウス胸部大動脈の内皮機能障害をAkt/eNOSシグナル増加により改善する新規メカニズムを明らかとした。糖尿病ラットにて、マイクロパーティクル(MPs)の循環レベルの増大と、糖尿病ラット由来MPsは、正常ラット頸動脈の内皮依存性弛緩反応を減弱させることを明らかとした。若・老齢2型糖尿病ラットを用い腎動脈機能と小胞体ストレスとの関連を検討した。2型糖尿病ラットにて、agingにより、小胞体ストレスマーカーのCHOP増加、内皮由来収縮因子のUp4A収縮増大、アセチルコリンによる弛緩反応減弱・収縮反応増大を見出した。また、対照群と比較し、糖尿病群で、初期ステージではUp4A収縮が低下し、後期では増強すること、小胞体ストレスマーカーであるPDIやアポトーシスマーカーであるBaxが初期ステージからすでに増加することを見出した。本研究によって、慢性炎症モデルにおける内皮由来因子シグナルの異常メカニズムの一部が明らかとなった。様々な慢性炎症モデル動物を用いて、内皮由来因子シグナルの異常による血管機能異常の動脈部位による違いやそのメカニズムの一端を見いだすことが出来た。慢性炎症は生活習慣病の合併症発症・進展に関与し、血管機能異常が合併症形成に関与しているので、慢性炎症が生じているモデルや、擬似的病態条件を構築したモデルを用い多角的に検討した。自然発症2型糖尿病ラット頸動脈において、5-HT収縮にPDK1の活性化経路が関与すること、および、この活性亢進は、高インスリンによって誘発されることを見出した。さらにウロテンシンIIの血管収縮反応はagingによって正常ラットでは減弱していくが、2型糖尿病ラットでは維持されていることを見出し、持続的な病態が血管収縮物質の反応性を変化させること、それを規定する分子の一部を明らかとした。頸動脈の5-HT収縮は、慢性1型糖尿病においては雄より雌の方が増大していることを見出した。また、雌性肥満ラット(OLETF)の血管機能に関する報告は全くなかったが、本研究によって、内皮由来過分極による弛緩反応が減弱していることを見出した。自然発症高血圧ラットにおいて、上腸間膜動脈におけるATPおよびその代謝物による弛緩反応性が内皮由来成分の寄与の違いによることを明らかとし、頸動脈においては、5-HT収縮亢進及びさまざまなキナーゼを介するシグナル異常が関与していることを見出した。

小胞体ストレス誘導薬を正常血管に暴露すると、内皮依存性弛緩反応、cAMPを介する弛緩反応、KATPチャネル誘発弛緩反応が減弱することを明らかとした。慢性炎症惹起因子として重要な高グルコースや、アンギオテンシンIIを血管に暴露すると、内皮細胞から小胞が分泌され、この小胞が直接内皮機能障害を誘発することを見出した。本研究によって、慢性炎症状態あるいは、それを惹起する物質における内皮由来因子シグナルの異常メカニズムの一部が明らかとなり、さらに、糖尿病時の幾つかの血管反応の雌雄による違いを明らかとした。ヒトの内皮細胞は全身に分布し、刺激に応じて様々な物質を放出することで生体の恒常性を維持している。生活習慣病である糖尿病や高血圧は持続的な慢性炎症が病態形成に関与するが血管内皮細胞や平滑筋細胞におけるシグナルは体系化されていない。本研究は慢性炎症病態における血管内皮細胞・平滑筋細胞のクロストークに着目して検討を行い、セロトニン収縮における性差、情報伝達、糖尿病罹患期間における収縮弛緩異常、細胞内イベントと血管反応、血管異常に対するポリフェノールの影響などについての最新の知見を得た。本プロジェクトは、慢性炎症が引き起こす血管機能障害特に内皮機能障害、平滑筋機能障害の分子メカニズムの解明及び性差について研究であるが、長期慢性炎症モデルの形成に時間がかかっていることと、雄モデルの研究が先行していて、雌モデルの研究が滞っている。今後は、雌の病態モデルを用いて、血管機能を内皮機能を中心に検討し、性ホルモンや、炎症惹起因子の血管機能に対する影響を詳細に検討すること、さらには、引き続き雄モデルにおける血管機能異常メカニズムを検討することで、性差を明らかとし、本研究の更なる推進を目指す。病態生理学今後は、雌の病態モデルを用いて、血管機能を測定し、更に性ホルモンと炎症惹起因子の血管機能に対する影響を詳細に検討していくことで本研究課題の推進を目指す。研究遂行のための消耗品が差額より高額であったために、次年度に持ち越すこととした。引き続き研究を遂行するために、実験動物、薬理学および生理学的試薬、抗体、ELISAキットなど消耗品に研究費を使用する予定である。引き続き研究を遂行するために、実験動物、薬理学/生理学的試薬、抗体、ELISAキットなど消耗品に研究費を使用する予定である。
両眼立体視における相関計算と対応計算の適応的制御

左右網膜における像の位置ずれ(両眼視差)に基づき奥行きを知覚する。立体視の実現には視覚連合野が必要である。この過程において、左右網膜像の相互相関の計算(相関計算)と左右網膜像の対応をとる計算(対応計算)の両方が機能する。本研究では、1細かい立体視では対応計算が、粗い立体視では相関計算と対応計算の両方が働く、2時間変動の速い刺激では相関計算が、遅い刺激あるいは静止刺激では対応計算が立体視により強く貢献する、3細かい奥行き知覚にはV4野の活動が直接貢献していることを明らかにするとともに、4立体視情報の伝播経路を明らかにする目的で、2光子イメージング法を霊長類大脳皮質に適用することに成功した。二つの目は異なる角度から世界を見ており、左右の網膜像はわずかに異なる。しかし、我々は二つのずれた視野像を感じるのではなく、一つの立体世界を知覚する。左右網膜像の水平方向の位置ずれ(両眼視差)に基づき奥行きを知覚する能力は両眼立体視と呼ばれる。両眼視差の検出はV1で行われるが、V1細胞の活動は奥行き知覚の形成に直接貢献せず、その実現には視覚連合野が必要である。本研究では、(1)奥行きの弁別のために、両眼視差検出以後になされる情報処理内容を解明し、(2)高次視覚野(V4とMT)がこれらの計算過程へどう関与するかを検討する。この解析を通して、「奥行き知覚の成立に両眼相関計算と両眼対応計算の2つの過程が直接的に貢献することができ、両者り相対的貢献度は、視覚刺激条件に依存して計算に関与する脳部位が変わることにより、適応的に変化する」という仮説を検証する。本年度は、V4細胞の両眼立体視への因果的関与を検証するため、V4に局所電気刺激を与え、刺激部位の両眼視差選択性に従って、奥行き判断が左右されるかを検討した。V4細胞は相対視差を算出することから、相対視差の検出が必要とされる「細かい奥行き弁別」に対する影響を検討する。局所電気刺激が効果を持つためには、似た性質を持つ細胞が局所的に集まっていなくてはならないが、V4細胞が両眼視差選択性に従って分布していることを申請者らはすでに明らかにしている。実験の結果、「細かい奥行き弁別」にV4野の活動が直接的に貢献していることを証明した。ヒトやサルなど霊長類は、両眼視差に基づいて視覚対象の奥行き・世界の3次元構造を知覚する両眼立体視機能を持つ。両眼視差の検出は一次視覚野(V1)で行われるが、奥行き知覚の成立には、V1以後の視覚領野が必要である。本研究では、1奥行きの弁別のために、両眼視差検出以後になされる情報処理内容を解明し、2高次視覚野(V4とMT)がこれらの計算過程へどう関与するかを検討する。この解析を通して、「奥行き知覚の成立に両眼相関計算と両眼対応計算の2つの過程が直接的に貢献することができ、両者の相対的貢献度は、視覚刺激条件に依存して計算に関与する脳部位が変わることにより、適応的に変化する」という仮説を検証する。(1)両眼相関計算と両眼対応計算の機能分担の解明視覚刺激のパラメータが両眼相関計算と両眼対応計算の奥行き弁別への貢献度へ与える影響を調べた。RDSのドットの更新速度が速い場合には両眼相関計算の出力が奥行き判断に反映され、遅い場合には、両眼相関計算に加えて両眼対応計算の出力も奥行き判断に貢献することが明らかになった。このように刺激の時間特性によって、両眼相関計算と両眼対応計算の相対的貢献度が変化する。前者の貢献はMT野によりなされていることを示す予備的結果も得られた。(2)側頭葉経路への両眼視差情報入力経路の特定:2光子励起イメージング法による解析様々な領野で見つかる両眼視差選択性細胞への入力経路は多くの場合不明である。本実験では、V4の両眼視差情報が側頭葉経路に沿って到達しているのか、それとも頭頂葉経路から転送されたものなのかを検討する。V4に逆行性軸索トレーサー(CTB-Alexa)を注入し、標識されたV2細胞の両眼視差選択性を、2光子励起イメージング法と単一神経細胞外記録により調べる手法をサルに適用する技術を開発した。また、V1野の機能構築を2光子イメージングにて解明した。

両眼視差の検出はV1で行われるが、V1細胞の活動は奥行き知覚の形成に直接貢献せず、その実現には視覚連合野が必要である。本研究では、1奥行きの弁別のために、両眼視差検出以後になされる情報処理内容を解明し、2高次視覚野(V4とMT)がこれらの計算過程へどう関与するかを検討する。この解析を通して、「奥行き知覚の成立に両眼相関計算と両眼対応計算の2つの過程が直接的に貢献することができ、両者の相対的貢献度は、視覚刺激条件に依存して計算に関与する脳部位が変わることにより、適応的に変化する」という仮説を検証する。本年度は、1両眼対応計算過程が、V1,V2,V3,V4と側頭葉視覚経路をのぼるにつれて徐々に進行していること、2輝度反転ランダムドットステレオグラムにおける奥行き知覚の反転が、脳内において相対視差を伝えている場所でのできごとであること、3V4単一細胞の活動では説明できない奥行き知覚の性質が、V4細胞集団の活動プーリングにより説明できることの3つの知見を得た。明年度に向け、成果のとりまとめを進めている。さらに、本年度、V4野の神経活動の2光子カルシウムイメージングのデータ取得が進んだ。さらに、昨年度より進めていた、視覚刺激のリフレッシュ速度が高いときには両眼相関計算過程が奥行き知覚に反映され、リフレッシュ速度が低いときには両眼対応計算過程の出力が奥行き知覚に反映されることを示す結果をまとめ、論文を投稿した。本研究計画において、もっとも難関であると思われて、微小電気刺激実験が成功し、V4野が細かい奥行き知覚に因果的に関わっていることが証明できた。本成果を、Joumal of Neumscience誌に公表した。25年度が最終年度であるため、記入しない。当初計画のデータ取得はほぼ完了した。これから一年をかけて成果のとりまとめ、論文作成を行う段階に来ている。研究計画にほぼ沿ってこのまま研究を推進していく。研究実績の概要で記した3つの成果(1-3)について、論文を完成させ、投稿する。
チタンイオンがインプラント周囲の骨、歯肉に与える影響

本研究は実際に生体内(骨内、歯肉貫通部)でチタンイオンが溶出した際、チタンイオンがインプラント周囲の骨、歯肉にどのような影響を与えるかを、動物実験を用いて明らかにしていく。平成24年度はラットの顎骨に埋入したミニインプラントにNaFを塗布したのちインプラント周囲の歯肉、骨組織を回収した。平成25年度は、この平成24年度に回収した歯肉、骨組織中の金属イオンを測定した。その結果、歯肉中から有意に多くの量のチタンが検出された。平成26年度は、平成25年度に得たデータを参考にチタンイオンがインプラント周囲に与える影響について分子生物学的手法を用いて詳細に検討し、欧文誌に報告した。本研究は実際に生体内(骨内、歯肉貫通部)でチタンイオンが溶出した際、チタンイオンがインプラント周囲の骨、歯肉にどのような影響を与えるかを、動物実験(九州大学動物倫理委員会承認承認番号A23-172-3)を用いて明らかにしていく。動物実験計画書であるインプラント周囲炎モデルラットの作製とその診断、予防、治療法の開発(九州大学動物倫理委員会承認承認番号A23-172-3)が承認され、本研究はその動物倫理を遵守し開始した。平成25年度は、この平成24年度に回収した歯肉、骨組織中の金属イオンを高周波プラズマ発光分光分析装置によって測定した。その結果、NaFを塗布したインプラント周囲から回収した歯肉中からコントロール歯肉中より多くの量のチタンを検出した。次年度は、高耐食性チタン合金に対するNaFの影響をICP法にて検討する予定である。初年度はラットの脛骨に骨欠損を形成しチタン試料を埋入し、0.2%NaFを注入することによってイオンの溶出を促す予定であった。しかしながらチタン試料の準備に予定より時間を有したがミニインプラントはすでに所有していたため、2年目以降に用いる動物実験系で行うこととした。これはミニインプラントを上顎骨に埋入する系である。本系の方がより口腔内のインプラントの状態をシミュレートしている。本年度、高周波プラズマ発光分光分析装置(ICP;現有施設)を使用した金属の量の測定のための組織を回収した。その結果、NaFを塗布したインプラント周囲より回収した歯肉中からコントロール歯肉中のそれと比較して有意に多くの量のチタンが検出された。平成25年度は、高耐食性チタン合金に対するNaFの影響をICP法にて検討する予定であったが、製作した高耐食性チタン合金を動物に移植するまでには至らなかった。しかしながら、平成26年度は、平成25年度に得たデータを参考にチタンイオンがインプラント周囲に与える影響について分子生物学的手法を用いて詳細に検討し、欧文誌に報告した。歯科補綴学本年度は規格のチタン試料の準備に時間がかかったが、2年目以降の動物実験の系でほぼ研究の目的を果たすことができるため、その実験を中心に行った。そのため当初の計画実施は若干遅れ気味ではあるが問題ないと考えている。本年度は規格のチタン試料の準備に時間がかかったが、2年目以降の動物実験の系でほぼ研究の目的を果たすことができるため、その実験を中心に行った。平成25年度は、平成24年度に回収した歯肉、骨組織中の金属イオンの高周波プラズマ発光分光分析装置(ICP;現有施設)を使用して行う。また、各組織から切片を作製し、タンパク質レベルで組織の変化を詳細に観察する。平成24年度より研究補助者を増員することによって実験の効率化をはかり、研究を遂行する予定である。

初年は成果発表をするデータを取得できなかったが、今後2年間で得られた結果をとりまとめ、成果発表を関連学会で積極的に行う。また、成果発表でインプラント関連の研究者との討論を積極的に行い今後の研究に生かし、最終年度の論文作成へと展開していく予定である。平成25年度は、平成24年度に回収した歯肉、骨組織中の金属イオンの高周波プラズマ発光分光分析装置(ICP;現有施設)を使用して行う。また、各組織から切片を作製し、タンパク質レベルで組織の変化を詳細に観察する。平成24年度より研究補助者を増員することによって実験の効率化をはかり、研究を遂行する予定である。チタンイオン溶出の検出に少し時間を擁してしまったため。高耐食性チタン合金の作製が遅れた。高耐食性チタン合金の作製が遅れたため平成25年度の経費の一部を作製費に充当する。チタン試料の作製が遅れたため平成25年度の経費で作製する。このため、平成24年度の経費の一部を繰り越すこととする。このチタン試料を脛骨の骨欠損へ埋入して行う系について研究を開始する。さらに、平成25年度は、平成24年度に回収した歯肉、骨組織中の金属イオンの高周波プラズマ発光分光分析装置(ICP;現有施設)を使用して行う。また再現性の確認も行う。
マラッセ上皮遺残形成における新規仮説の提唱

Hertwig上皮鞘(HERS)からMalassezの上皮遺残(ERM)が形成されるメカニズムの解析を目的に研究を継続しているが、より効果的にERMを観察するために、HERSからERMへ移行する過程を促進する因子と、その作用についての解析を行った。これまでの我々の研究によってHERSが形成されるタイミングでinsulin like growthfactor-I (IGF-I)受容体がHERS細胞に発現する事を報告しており、オリジナルの器官培養系を用いて、生後20日齡のマウス下顎臼歯歯胚に外因的にIGF-Iを添加して培養した。IGF-Iの添加によりHERS形成初期でみられたHERS内層と外層の細胞増殖は本実験系において共にダウンレギュレートされ一方で、有細胞セメント質基質の形成を促進する事が分かった。有細胞セメント質形成には歯根膜のセメント芽細胞が歯根象牙質に接触する必要があるが、この接触を促進するためにはHERSの断裂も促進する必要がある事から、連続切片を作成し詳細な検討を行った結果、IGF-Iは歯頸側のHERSにおける断裂、すなわちERM形成を促進する事が明らかとなった。また形成されたERMは対照群のみならず、intactな生後24日齡の臼歯に比べても約3倍に増加していた他、より大きな細胞集団のERMが多数観察された。この事は今後の観察において、IGF-Iを添加した培養下で実験を行う事で、周囲の歯根膜細胞からERMを判別することも容易になると言う利点を持った実験系を確立できたと考えられる。一方、アレイトモグラフィー法による観察において、cytokeratin-Tomato陽性細胞による検出より免疫染色の方がより鮮明にERMを判別できる事が明らかとなり、今後これらの実験系を合わせて解析を勧める予定である。器官培養下で、標的細胞であるMalassezの上皮遺残(ERM)を増加させ、サイズも大きくする事で、これまでよりERMが捉えやすい実験系が確立できた。これは予定された実験計画書には記載されていない事であったが、別の実験系からの結果を応用したものである。当初の予定ではk14cre/Rosa26R tdTomatoマウスの歯胚を用いてアレイトモグラフィー法を実施する予定であった。しかし、このマウスからの細胞はリアルタイムイメージングでの観察には有効であったが、解析のためのアレイトモグラフィー法には適さない事が判明した。今回の実験結果はこれを補い、別のアプローチで当初の計画に類似した実験系の構築に貢献できる結果である。このことから、計画変更はあったものの、研究は順調に進捗していると判断している。初年度に明らかとなった当初計画の実験系の不具合を、オリジナル器官培養法に外因性のIGF-Iを添加する事で、ほぼ克服できる事を示す事ができた。さらに、IGF-Iの添加はMalassezの上皮遺残(ERM)をより形態学的に判別しやすくできる事も明らかとなり、ERMをアレイトモグラフィー法で効果的に捉えることができる実験系を確立できたと考える。そのため、多少検出方法の違いはあるものの、今後予定した実験計画に近い形で、ERMの細胞を形態学的に確認しつつ、細胞特性を検索する研究を進めていく予定である。Hertwig上皮鞘(HERS)からMalassezの上皮遺残(ERM)が形成されるメカニズムを解明するために、歯根成長過程におけるHERS細胞の動態について観察した。生後14日齡のk14cre/Rosa26R tdTomatoマウスから下顎を摘出し、固定・脱灰後、組織を透明化し、蛍光実体顕微鏡で観察した。根尖には赤色蛍光を持つHERSが維持されている一方で、歯頸側ではHERSの断裂が観察されERM形成過程にあることが確認されたが、教科書に記載されているような網目状のERMは観察できなかった。そこで器官培養下リアルタイムイメージング技術を用いて観察を行ったその結果、HERSから一部の細胞が離脱し、周囲にある歯根膜組織へ活発に移動する遊走パターンが捉えられた。細胞の動きをより詳細に検討するため、このマウス由来のHERS細胞株(HERS02-T)と歯根膜細胞との共培養によるライブイメージング撮影を行った。HERSの細胞集団から周囲の歯根膜組織の中に遊走するHERS由来細胞(Tomato陽性細胞)移動パターンを詳細に検討した結果、1)細胞はコロニーから遊走する方向へゆっくりと伸長し、その先端に複数の細胞質突起を形成しながら移動を開始する。2)細胞集団から離れるとすぐに細胞は素早く移動する。3)その遊走細胞が近傍の細胞へ接触すると移動を停止して、細胞形態を球形に変化させる。4)再度、接触面と反対側に細胞が伸長し、他の細胞との接触がなくなると再び速い速度で移動する、というパターンを繰り返していた。この結果は、少なくともHERS細胞の一部がcontact inhibition of locomotionと考えられる細胞動態を示しながら、歯根膜中へ遊走し、ERMの形成に関わることを示唆すると考えられた。現在さらにアレイトモグラフィー法を用いて、遊走細胞の解析を進めている。器官培養によるリアルタイムイメージングで遊走するHERSを捉え、さらにHERS細胞と歯根膜細胞の共培養による細胞培養系で、HERSから離脱した細胞がcontact inhibition of locomotionと考えられる遊走パターンを示しながらMalassezの上皮遺残形成に関わることを示唆する結果を得るところまで、実験は進んでいる。

また、次のステップであるアレイトモグラフィー法による解析の予備実験も進行中で、これまでのところ予定通り進捗していると考えている。Hertwig上皮鞘(HERS)からMalassezの上皮遺残(ERM)が形成されるメカニズムの解析を目的に研究を継続しているが、より効果的にERMを観察するために、HERSからERMへ移行する過程を促進する因子と、その作用についての解析を行った。これまでの我々の研究によってHERSが形成されるタイミングでinsulin like growthfactor-I (IGF-I)受容体がHERS細胞に発現する事を報告しており、オリジナルの器官培養系を用いて、生後20日齡のマウス下顎臼歯歯胚に外因的にIGF-Iを添加して培養した。IGF-Iの添加によりHERS形成初期でみられたHERS内層と外層の細胞増殖は本実験系において共にダウンレギュレートされ一方で、有細胞セメント質基質の形成を促進する事が分かった。有細胞セメント質形成には歯根膜のセメント芽細胞が歯根象牙質に接触する必要があるが、この接触を促進するためにはHERSの断裂も促進する必要がある事から、連続切片を作成し詳細な検討を行った結果、IGF-Iは歯頸側のHERSにおける断裂、すなわちERM形成を促進する事が明らかとなった。また形成されたERMは対照群のみならず、intactな生後24日齡の臼歯に比べても約3倍に増加していた他、より大きな細胞集団のERMが多数観察された。この事は今後の観察において、IGF-Iを添加した培養下で実験を行う事で、周囲の歯根膜細胞からERMを判別することも容易になると言う利点を持った実験系を確立できたと考えられる。一方、アレイトモグラフィー法による観察において、cytokeratin-Tomato陽性細胞による検出より免疫染色の方がより鮮明にERMを判別できる事が明らかとなり、今後これらの実験系を合わせて解析を勧める予定である。器官培養下で、標的細胞であるMalassezの上皮遺残(ERM)を増加させ、サイズも大きくする事で、これまでよりERMが捉えやすい実験系が確立できた。これは予定された実験計画書には記載されていない事であったが、別の実験系からの結果を応用したものである。当初の予定ではk14cre/Rosa26R tdTomatoマウスの歯胚を用いてアレイトモグラフィー法を実施する予定であった。しかし、このマウスからの細胞はリアルタイムイメージングでの観察には有効であったが、解析のためのアレイトモグラフィー法には適さない事が判明した。今回の実験結果はこれを補い、別のアプローチで当初の計画に類似した実験系の構築に貢献できる結果である。このことから、計画変更はあったものの、研究は順調に進捗していると判断している。予備実験としてk14cre/Rosa26RtdTomatoマウスから摘出した臼歯のHERSをアレイトモグラフィー法により解析したところ、薄切した際に、このマウスの細胞における赤色蛍光が弱く、アレイトモグラフィー法でうまく捉えられないことが判明したため、現在、免疫組織化学的手法を用いて蛍光強度を強め、HERSから遊走する細胞をアレイトモグラフィー法で捉えるために必要な条件検索を行っている。
インフルエンザウイルスの自己・非自己区別とその応用による新薬開発

インフルエンザウイルスは遺伝子複製酵素を有している。この酵素のPAサブユニットに独自の阻害活性(自身が自身を阻害する)を見つけ、阻害薬への応用を試みた。さらにPAを断片化することで阻害作用が高まり、188アミノ酸からなるPA断片が阻害活性を持つ最小断片であることを見出し、また断片の持つエンドヌクレアーゼ活性の関与が確認できた。インフルエンザに特異的な阻害であることから、自己と非自己を区別するメカニズムがあり、メカニズムの解明をさらなる主眼とした。メカニズム解明に向け、188アミノ酸からなる小断片の大量発現・精製系を構築した。大腸菌を用いた系では、発現量の確保はできたが精製度が低かった。組換バキュロを用いた系では、エンドヌクレアーゼ変異体については、十分な発現量と精製度を確保できたが、エンドヌクレアーゼ活性体は組換バキュロを得ることができなかった。断片の活性により、バキュロウイルスの増殖が阻害されていることが示唆された。このエンドヌクレアーゼに特異的な阻害薬存在下での組換バキュロウイルス作成の準備を進めている。またこのアイデアを元にRSウイルスでも同様の阻害作用を持つ断片の構築を行いさらなる応用へと進んでいる。一方で、インフルエンザウイルスは、自身の遺伝子を効率よく複製するために、RNA遺伝子の自己・非自己区別を、インフルエンザに特異的なプロモーター配列を介して行っている。そこで、PA断片によるウイルスの阻害とは別のアプローチとして、RNAiを用いたプロモーター配列の抑制による阻害効果を確認した。結果、PB2セグメントに存在するプロモーター配列に対するRNAiによりPB2タンパク質の発現を抑制できることが確認できた。現在は、PAやPB1セグメントのプロモーター配列に対するRNAiを検討すると共に、実際のウイルス形成にこのRNAiが阻害的に作用するか確認を行っている。インフルエンザウイルスはRNAを遺伝子に持ち、独自のRNAポリメラーゼを用いて遺伝子複製を行っている。このRNAポリメラーゼは抗インフルエンザウイルス薬のターゲットとなりうる。現在の抗インフルエンザ薬はNA阻害薬に分類され、作用機序が全く同じである。最近、このRNAポリメラーゼをターゲットとした薬剤も開発されたが、変異速度の速いウイルスに対しては、常に様々な視点から様々な作用機序を想定した抗ウイルス薬開発が必要である。我々はこれまでにインフルエンザウイルスのRNAポリメラーゼを構成する、PAおよびPB2サブユニットに自身の活性を制御する機能があり、さらにこれらの小断片には、遺伝子複製及び転写活性の阻害効果があることを示してきた。特にPAサブユニットの小断片には独特の阻害作用がある。興味深い事にこの阻害効果はRNAポリメラーゼの活性を阻害しているのではなく、RNAポリメラーゼそのものの発現を抑制することに由来していた。そこで我々はこのRNAポリメラーゼの発現の抑制作用にPA断片がどのように関わるっているのかそのメカニズムを解明することとした。まず、PA断片の高発現系を構築し、高純度な精製が行えるかの検討を行った。結果、大腸菌を用いた発現系によりPA断片の高発現を確認できた。また、高濃度の塩条件下によるHisタグ精製によってある程度の精製を行うことができた。この生成物を用いて、試験管内にてPAの小断片の生理的機能を確認したところ、エンドヌクレアーゼ活性が存在していた。また、このエンドヌクレアーゼの活性部位を変異した小断片にはRNAポリメラーゼの発現抑制活性が認められなかった。すなわち、PAの小断片によるRNAポリメラーゼの発言抑制効果にはエンドヌクレアーゼ活性が関与していることが示唆された。まず、PAの小断片による阻害メカニズムを探るために高発現かつ高純度な断片の精製系構築を目指した。高発現系に関しては、大腸菌を用い構築することができた。精製については当初、十分な量を確保することが困難であったが、様々な塩濃度条件を検討し、高濃度条件で試験管内で生理活性を測定するための必要最低限の量を確保する手段を得た。この生成物を用い断片の生理活性を測定したところ、エンドヌクレアーゼ活性を確認することができた。また、エンドヌクレアーゼ活性部位を変異したところ、阻害効果が失われた。このことからPAの小断片によるRNAポリメラーゼの発現抑制効果にエンドヌクレアーゼが関与していることが強く示唆された。しかし、これまでのメカニズムの検討で、RNAポリメラーゼの発現抑制に、エンドヌクレアーゼの本来のターゲットであろうDNAやmRNAは関わっていない事が確認された。これは、小断片にエンドヌクレアーゼ活性が見いだされたことと矛盾しており、当初の仮定を見直す必要ができたため研究にやや遅延が生じている。しかしながら、PAの小断片の発現系と最低限の精製系は得ており、試験管内でのエンドヌクレアーゼ活性の測定法も構築できた。今後の研究推進について大きな問題はないと考えている。インフルエンザウイルスはRNAを遺伝子として持ち、この遺伝子はインフルエンザウイルス独自のRNAポリメラーゼによって複製され、また転写されている。独自のRNAポリメラーゼを所有することから、抗インフルエンザウイルス薬のターゲットとして注目されている。最近、このRNAポリメラーゼをターゲットとした薬剤が2剤開発された。1つは、ファビピラビルでRNA合成を阻害する。さらに1つはバロキサビルで、インフルエンザウイルスのエンドヌクレアーゼ活性を阻害する。このエンドヌクレアーゼ活性の中心タンパク質がRNAポリメラーゼを構成するPAサブユニットである。我々は、このPAサブユニットの小断片に独自の阻害活性を見つけ、この阻害効果はインフルエンザウイルス自身のRNAポリメラーゼの発現そのものを阻害している事を見出した。そこで、我々はこの阻害活性のメカニズムを探求するためにPA小断片の高発現系を構築し、高純度な生成が行えるかの検討を行った。

これまでに、大腸菌を用いたPA小断片の高発現系を構築し、Hisタグ精製によってある程度の精製を行うことが可能となっている。この生成物を用いて、PAのエンドヌクレアーゼ活性と阻害効果の関係を検討したところ、強い相関がみられ、PAの小断片によるRNAポリメラーゼの阻害効果には小断片のエンドヌクレアーゼ活性が関与していることが示唆されていたが、さらにメカニズムを精査するだけの十分な高純度の小断片を大腸菌を用いた発現系では得ることができていなかった。そこで、これまでに多くの実績があるバキュロウイルスの発現系に切り替えて小断片の高発現系と高純度精製系の構築を目指すとともに、阻害効果にエンドヌクレアーゼ活性の関与が強く示唆されることから、ターゲットとなりうるRNA核酸の探索を行った。PAの小断片によるインフルエンザウイルスRNAポリメラーゼの発現抑制にエンドヌクレアーゼが関与している可能性は疑いようがないが、どのようにこの活性がインフルエンザウイルス自身のRNAポリメラーゼの発現抑制に関わっているのか不明な点が多い。この発現抑制メカニズムを解明するために、細胞内の様々な調整に関わっている宿主細胞内のSmall RNAに着目して、PA小断片の存在下でSmall RNAの量的・質的変化を観察した。しかしながらSmall RNAの量的および質的分布に変化が見られなかった。さらなる別の核酸がターゲットとなっている事が示唆され、未だに阻害メカニズムの全容解明には至っていない。PA断片の高発現、高純度の精製系については、大腸菌からバキュロウイルスへと変更し、Wildtypeに加えMutant断片の精製を試みたところ、Mutant断片については、大腸菌の発現よりも高発現、高純度の断片を得ることができた。一方でWildtypeの小断片については、大腸菌の発現系に劣っており、期待するだけの生成物を得るに至っていない。インフルエンザウイルスは遺伝子複製酵素を有している。この酵素のPAサブユニットに独自の阻害活性(自身が自身を阻害する)を見つけ、阻害薬への応用を試みた。さらにPAを断片化することで阻害作用が高まり、188アミノ酸からなるPA断片が阻害活性を持つ最小断片であることを見出し、また断片の持つエンドヌクレアーゼ活性の関与が確認できた。インフルエンザに特異的な阻害であることから、自己と非自己を区別するメカニズムがあり、メカニズムの解明をさらなる主眼とした。メカニズム解明に向け、188アミノ酸からなる小断片の大量発現・精製系を構築した。大腸菌を用いた系では、発現量の確保はできたが精製度が低かった。組換バキュロを用いた系では、エンドヌクレアーゼ変異体については、十分な発現量と精製度を確保できたが、エンドヌクレアーゼ活性体は組換バキュロを得ることができなかった。