hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
レーザーとクラスターの相互作用を用いたテーブルトップパルス中性子源に関する研究

本年度は、特に中性子発生と密接な関係のある、レーザークラスター相互作用による高速プロトン発生について研究を進めた。プロトンを含む被加速イオンのエネルギーは阪大の西原らのモデル(クーロン爆発モデル)から、クラスター径の2乗に比例し、ピーク出力100TW級のレーザーシステムと組み合わせることでMeV級の高速イオンが発生可能であることが示されている。当然、このMeV級の重水素イオンを発生させる事ができれば、現状のイオン温度(8keV)から2桁程度核融合反応レートを向上させることができ、その結果中性子の高輝度や、さらに核変換等の旧来のテーブルトップレーザーを用いた放射線発生からさらに踏み込んだ研究が期待できると考えられる。しかし、特に水素において巨大クラスターの生成は、技術的に難しい問題がある。これは、クラスター形成に気体の断熱膨張を用いる為で、沸点・凝固点が非常に低い水素では液体窒素等でガスを予備冷却した場合でも高々10nmのクラスターしか生成できない技術的な問題を有している。本年度の研究は、水素化合物を用いることでこの沸点・凝固点が低い問題をクリアし、100ナノメートル級の巨大クラスターを生成させ、高輝度中性子源の開発に向けた高速プロトン発生についてその実証と物理機構の解明に向けて研究を進めた。その結果、100TWレーザー照射実験を通じ、最大100keVを越える高速プロトンを検出し、水素化合物を用いる有用性を明らかにするとともに、さらに平均プラズマ密度を高めることでさらに高いエネルギーが期待できる事を明らかにした。本年度は、レーザー装置の開発とさらにレーザー装置の完成度の確認及び中性子発生の新方法である(γ、n)反応による中性子発生を検証する目的にレーザープラズマ相互作用による高速電子線発生の実験研究をおこなった。まず前者では特に高ピーク出力レーザーにおいてレーザークラスター相互作用で技術的にネックとなるプリパルスの抑制とレーザー本体の信頼性に重点を置いた10TWレーザーの開発を進め、さらにプリパルス発生を原理的に抑制する試みとして光パラメトリックチャープドパルス増幅(OPCPA)法による光パルス増幅実験を行った。この結果、プリパルス10^<-6>の10TWレーザーを開発し、さらにOPCPA実験ではプレパルスが効果的に抑制されていることを実験的に明らかにした。その一方レーザー照射実験では、仏・独等で報告されている結果に近い約3×10^<19>cm<-3>の平均電子密度で0.62MeVの有効温度を持った0.2nC/shotの指向性のある電子線の発生を観測した。しかし発生した電子線を使いSiO2 5mmをコンバーターに(γ、n)反応による中性子の発生を試みたが、明らかな中性子の検出は認められなかった。この原因として(γ、n)反応を効率よく発生させるには10meV以上のγ線のエネルギーが必要なのに対して、発生した電子線の有効電子温度が低い事が考えられる。今回の研究ではパルスガスジェットの性能の限界によって高密度プラズマが生成できなかったために実験が出来なかったが、独仏の結果によると更に高い10^<20>cm^<-3>の密度領域では、有効温度が58MeVに至る事が明らかになっている。次年度(平成15年度)では本研究のメインであるレーザークラスター相互作用による中性子発生について進めると同時に、パルスガスジェットの改良(つまり高密度プラズマが生成可能なガスジェットの開発)を中心に研究を展開する予定である。
転写異常に繋がるゲノム変異の網羅的探索法の開発とゲノム医療への応用

シークエンス技術の革新により、ゲノム変異の網羅的な可能になり、数多くの疾患関連遺伝子変異が発見された。一方で、機能の推測が未知の遺伝子変異も数多く、大量に蓄積されているゲノム変異データを十分に活用できているとは言い難い状況が続いている。機能の未知の遺伝子変異の中で重要なクラスを締めるのは、転写の異常、特にスプライシング異常を引き起こす変異である。しかし、どのような変異がスプライシング異常を引き起こすのかについてのメカニズムについては未だに理解が進んでいない。申請者は、ゲノム・トランスクリプトームシークエンスデータを統合的に用いて、転写異常につながる後天的変異を網羅的に検出する方法論(SAVNet, https://github.com/friend1ws/SAVNet)を開発し、大規模ゲノムデータに適用を通じて、スプライシング異常のカタログ化を行い、全体像の解明に努め、ゲノム医療の発展に寄与することを目指してきた。本研究課題を通じては、構造異常などの様々な形式のゲノム変異において、スプライシング異常を引き起こすものを解明できるように方法論の改良を行い、大規模データへの適用を行っている。また、特に理解が進んでいない、deep intron上でのスプライシング異常を引き起こす変異の検出・予測方法について、機械学習の手法を用いつつ開発を進めている。SAVNetをTCGAの9,000検体のゲノム・エキソームに適用して、スプライシング変異の全体像を解明した研究について、さらなる解析を行い、結果をまとめ、国際学術誌において受理・出版された(Shiraishi et al., Genome Research, 2018)。また、ICGC PCAWG (PanCancer Analysis of Whole Genomes)において、国際共同研究グループと協調して約1,200検体の全ゲノムにSAVNetに適用し、deep intronにおけるスプライシング変異のメカニズムの解明を行うなどの貢献をしており(https://www.biorxiv.org/content/10.1101/183889v2)、こちらは現在投稿中である。2018年度は、SAVNetを改良して、遺伝子内の構造異常について、スプライシング異常を引き起こすものの同定を可能にした。さらに、この方法をICGC, TCGAの全ゲノムデータ、エキソームデータに適用して、構造異常とスプライシング異常の関係性の全体像の解明を試みた。2019年度においては、これまでに大規模ゲノムデータに適用して得られた構造異常とスプライシング異常の関連性の結果について、さらにゲノム構造異常の検出手法のチューニングを行い、精緻化を行ったのちに、様々な観点から生物・医学的な意義付けを行い、ゲノム医療に示唆を与えることを目指す。また、deep intronの変異で、転写異常を引き起こすものを検出する方法論についても、機械学習の手法を首尾よく組み合わせつつ、感度・正答率の両面から優れた方法論の開発に着手する。さらに、開発手法をTCGA、GTEx、NCBI SRAなどから収集される大規模トランスクリプトームのデータベースを利用した解析を行い、変異のカタログ化、生物・医学的な意義付けを行うことを目指す。

2019年度においては、これまでに大規模ゲノムデータに適用して得られた構造異常とスプライシング異常の関連性の結果について、さらにゲノム構造異常の検出手法のチューニングを行い、精緻化を行ったのちに、様々な観点から生物・医学的な意義付けを行い、ゲノム医療に示唆を与えることを目指す。また、deep intronの変異で、転写異常を引き起こすものを検出する方法論についても、機械学習の手法を首尾よく組み合わせつつ、感度・正答率の両面から優れた方法論の開発に着手する。さらに、開発手法をTCGA、GTEx、NCBI SRAなどから収集される大規模トランスクリプトームのデータベースを利用した解析を行い、変異のカタログ化、生物・医学的な意義付けを行うことを目指す。
Drug Delivery Systemを用いた新規徐放化鎮痛薬の臨床応用

医用工学的手法であるDrug Delivery Systemを応用して、生体内分解材料を用いて長時間作用型鎮痛薬を作成し、安全かつ手技によらない強力な鎮痛方法を臨床応用できることを目的として研究を開始した。10年来長時間作用型リドカイン徐放シートを作成しており、数日間放出し続ける徐放薬開発に成功し、動物実験からヒトボランティア試験を経て、実際の患者に投与する医師主導型臨床試験(術後痛に対するリドカイン徐放シートのI/II相臨床試験:UMINID000011945)で100症例の試験を終えたが、2018年度にその研究を論文化することができた。最新の徐放手法を用いて、リドカイン徐放薬を注射可能な製剤化を目指す。リドカイン以外にもレボブピバカイン、ロピバカインについての作成も検討することを徐々にではあるが基礎研究として開始できている。徐放手法としては、新たな研究提携先に何度か訪問し、温度応答性の新たなポリマーを用いて放出を制御する試みに着手している。既にリドカインを用いての試験的な徐放薬は作成できており、それらをラットで作用時間を検討する実験を開始した。別にレボブピバカインの原末を製薬会社から提供していただき、レボブピバカインと新たな徐放手法での徐放薬作成にも着手している。臨床研究法が変わり、作成した薬剤を人に用いるハードルは著しく上がったため、工学部や製薬会社などとも連携しつつ薬剤作成と研究成果を上げることを目標としている。ある程度の動物実験データが揃ったところで臨床研究として立案するに必要な製剤作成ラインについて検討を始める予定である。数年来続けているリドカインを用いた徐放性局所麻酔薬に関して、患者を対象とした臨床試験へと展開中である。試験概要は、抜歯後のスペースにリドカイン徐放薬を包埋することで、抜歯術後の痛みをコントロールする目的である。試験は患者を対象として、ランダムに投与量を振り分けてその効果と有害事象を調べるものであり、第II相医師主導臨床試験に位置づけられる。現在100症例を目標に行っているところであるが、8割以上を終え、あと半年程度で試験を終えることが想定されている。試験終了後は直ちに解析し論文化を試みる予定である。中間解析等は行う予定となっていないため、試験終了後の解析となる。リドカイン徐放薬研究は臨床まで到達したが、リドカイン以外の局所麻酔薬を用いた徐放薬作成に関しても着手している。現在までレボブピバカインなどの有力な薬剤候補は挙げられるものの、いまだ適切な徐放製剤は作成に至っていない。ポリマーや局所麻酔薬濃度などを調整して、今後も作成を続けていくことになる。さらに今後は新たな適応を目的としたリドカイン徐放薬を用いた臨床試験を行っていく予定である。それと並行してリドカイン以外の局所麻酔薬徐放化や局所麻酔薬以外の徐放性鎮痛剤開発を狙って研究を進めていきたい。現在、局所麻酔薬以外の徐放薬の候補薬としては、α2アゴニストであるデクスメデトミジンやクロニジンの徐放化で、これらは局所麻酔薬との相互作用にも期待できると思われる。臨床試験は、対象患者があってのものなのでその進捗に関しては、なかなか予定通りに進まない部分もあるが、概ね試験は終了できそうである。新たな製剤作成に関して、いまだ見出せていないのは残念ではあるが、継続的に開発を行っていきたい。局所麻酔薬リドカインを徐放化して、周術期疼痛を制御することを目的として研究を継続している。今までに、薬剤作成、動物実験、ヒトボランティアを用いた試験を終えていて、一定の効果と目立った副作用のないことが確認できている。2016年度までに、リドカイン徐放薬を下顎埋伏歯抜歯術患者を対象に臨床試験を行った。予定された抜歯術に対して、抜歯部位にリドカイン徐放薬を適応し、術後の痛みの程度や鎮痛薬の使用頻度を比較する試験とした。5群設定して、従来治療群、リドカインなしのポリマーのみ、リドカイン徐放薬投与群をdoseで分けて3群設定して行った。結果に関しては現在解析中で、解析後論文作成する予定である。また試験中に目立った副作用等は認めなかった。また現在行っているリドカイン徐放薬に関してはその作成は10年以上前に作成方法を検討してそのまま継続しているが、最近の徐放技術でもっと投与しやすい形状のものができないか併せて検討を行っている。作用持続時間は多少短くなったとしても、ゲル状のような形態で注射できるようなタイプの徐放薬の作成ができると臨床上非常に応用範囲が広がると考えていて、そちらの作成方法の検討にも着手している。注射可能な局所麻酔徐放薬ができると、近年解像度の良くなった超音波装置を用いての神経ブロックなどの際に、より長時間の鎮痛効果を期待して、局所麻酔徐放薬を超音波ガイド下に投与することが可能になると思われ、臨床上非常に有効な術後鎮痛法の開発へと繋がると思われる。臨床研究においては、昨年度まで行っていた患者を対象とした試験の解析を行い、それを論文化するところであるが、概ね順調に進められているものと思う。基礎研究としてやる予定の新たな薬剤開発においては、現在いくつかの手法および薬剤の選定作業を行っているが、現時点で有効な新しい局所麻酔薬の開発には至っていない。もともと薬剤作成には非常に時間がかかる可能性もあり、また時間をかけても意図した徐放化が得られるとも限らない。継続的に薬剤開発は行っていく予定である。

局所麻酔薬を医用工学的な手法で放出速度を制御するような製剤化し、長時間作用型鎮痛薬を作成することを目指しているが、ポリ乳酸とポリグリコール酸を基材に用いたリドカイン徐放シートは、動物実験を終えて、ヒトボランティア試験を行い、実際の患者に使用する医師主導型臨床試験を行うところまで到達した。下顎埋伏歯の抜歯術の術後痛に対して、抜歯したスペースにリドカイン徐放薬を包埋する方法でドーズレスポンスも含めて100症例を目標に試験プランを立案し、現在その試験を終了して論文投稿準備中である。その試験の中ではまずは何より安全性の確認が主体であったが、今後はさらに効果の違いを明確に出せるような対象に行うことができると良いと思う。臨床研究を取り巻く環境が変わってきており、薬剤作成のシステムから考え直す必要が出てきそうである。そうなるとなかなか一研究室として継続するのは困難になるので、さらに他大学多職種との連携が必要となってくることが予想される。次の局所麻酔薬徐放薬としては、やはり注射可能な製剤化を行った方が、用途が増えるため、現在薬剤作成に関して、いくつかの工学系学部との共同研究を画策しているところである。局所麻酔薬以外にも徐放薬作成の試みを継続しており、次のターゲットはα2アドレナリン受容体アゴニストの徐放薬が脊髄での鎮痛に関与していたり、局所麻酔薬との相乗作用もある点から優位性がありそうで検討を進めているところである。クロニジン徐放薬を作成し、動物実験レベルでの効果を確認しているところである。研究の進捗とするとおおむね順調といったところであるが、実験手法などがある程度確立してきているので、今後の展開に関しては薬剤作成・動物実験というところはさらにスピードアップできるものと思われる。リドカイン徐放シート研究は、10年ほどかかったが実際に患者に投与する試験を終えることができ、安全性の観点からはほぼ問題ないことが確認された。ただ、臨床試験を取り巻く環境が変わってくるため、今後の展開は薬剤作成を含めて検討することが多くなりそうである。医用工学的手法であるDrug Delivery Systemを応用して、生体内分解材料を用いて長時間作用型鎮痛薬を作成し、安全かつ手技によらない強力な鎮痛方法を臨床応用できることを目的として研究を開始した。10年来長時間作用型リドカイン徐放シートを作成しており、数日間放出し続ける徐放薬開発に成功し、動物実験からヒトボランティア試験を経て、実際の患者に投与する医師主導型臨床試験(術後痛に対するリドカイン徐放シートのI/II相臨床試験:UMINID000011945)で100症例の試験を終えたが、2018年度にその研究を論文化することができた。最新の徐放手法を用いて、リドカイン徐放薬を注射可能な製剤化を目指す。リドカイン以外にもレボブピバカイン、ロピバカインについての作成も検討することを徐々にではあるが基礎研究として開始できている。徐放手法としては、新たな研究提携先に何度か訪問し、温度応答性の新たなポリマーを用いて放出を制御する試みに着手している。既にリドカインを用いての試験的な徐放薬は作成できており、それらをラットで作用時間を検討する実験を開始した。別にレボブピバカインの原末を製薬会社から提供していただき、レボブピバカインと新たな徐放手法での徐放薬作成にも着手している。
沖縄県における外来魚の侵入と生態系の撹乱に関する研究

沖縄県島の河川調査に加え,西表島,沖永良部島,徳之島,奄美大島,種子島で外来魚を採集した。採集物は10%ホルマリンで固定後,研究室に持ち帰り,同定した。また,南風原ダムで毎月,ジルテラピアを採集し,体長と体重を計測後,生殖腺と耳石を摘出し,産卵期の推定と年齢査定を行った。また,ジルテラピアの仔稚魚の形態を記載した。離島の外来魚分布調査西表島:グッピーが新たに確認された。沖永良部島:カワスズメの生息が確認された。徳之島:カワスズメ,ジルテラピア,オイカワの生息が確認された。奄美大島:ジルテラピアが新たに確認された。種子島:カダヤシとプラティの生息を確認した。今年度までの調査で,琉球列島の外来魚の島ごとの分布地図がほぼ完成した。ジルテラピアの生活史合計2,642個体のジルテラピアを解析した結果,本種の産卵期は,4月をピークとする28月であり,孕卵数(F)はF=1.5615x体長^<1.4637>で示された。耳石輪紋による年齢査定の結果,本種の成長曲線は,雄:SL=214.4{1-exp[-0.16(t+1.45)]},雌:SL=97.5{1-exp[-0.61(t+0.08)]}で近似された。雌雄ともに最高齢は6歳であった。本種の孵化仔魚は,脊索長3.4mmで大きな卵黄をもち,頭部に付着器を有していた。日齢15(4.2mm)で眼が黒化し,日齢15(標準体長6.2mm)で卵黄を完全に吸収し,日齢20(6.7mm)ですべての鰭条が定数に達した。沖縄島,南大東島,渡嘉敷島,伊平屋島,伊是名島,石垣島,西表島,与那国島で外来魚の調査を行った。以下に島ごとの結果を述べる。(1)沖縄島:従来,記録のなかったアカヒレTanichthys albonubesとレオパードダニオBrachydanio frankei,レッドフィンボーシャBotia modestaが確認された。また,パールダニオB.albolineatus,ゼブラダニオB.rerio,グッピーPoecilia reticulata,カダヤシGambusia affinis,カワスズメOreochromis mossambiscus,マダラロリカリアLiposarcus disjunctivus,ヒレナマズClarias fuscus,コンビクトシクリッドCichlasoma nigrofasciatusの分布の拡大が懸念された。(2)南大東島:外来種は6種(グッピー,ドジョウMisgurnus anguillicaudatus,カワスズメ,ギンブナCarassius auratus langsdorfii,タイワンキンギョMacropodus opercularis,コイCyprinus carpio)であった。(3)渡嘉敷島:外来種は4種(カワスズメ,ナイルテラピアOreochromis niloticus,グッピー,カダヤシ)であった。(4)伊平屋島:外来種は4種(コイ科の1種Triborodon sp. ?,コイ,カワスズメ,カダヤシ)であった。沖縄県下から初めてウグイ属と考えられる魚類が採集された。(5)伊是名島:外来種は5種(カダヤシ,コイ,ナイルテラピア,カワスズメ,オオクチバスMicropterus salmoides)であった。

沖縄県下で沖縄島以外の離島からオオクチバスが確認されたのは初めてである。(6)石垣島:外来種は4種(カワスズメ,ナイルテラピア,グッピー,カダヤシ)であった。従来,記録のあったタイワンドジョウChanna maculata,コウタイC.asiatica,ヒレナマズは,確認されなかった。(7)西表島:外来種は,カダヤシのみであった。(8)与那国島:外来種は,ナイルテラピアのみであった。沖縄県島の88河川と久米島および与那国島で魚類を採集した。採集物は10%ホルマリンで固定後,研究室に持ち帰り,同定した。また,南風原ダムで毎月、ジルテラピアを採集し、体長と体重を計測後,耳石を摘出し、年齢を査定した。沖縄島:従来記録されていなかった移入魚2種が新たに確認された。レッドドラムは近年,沖縄島で海面養殖が試みられており,網生簀から逃亡したものであると推察された。ヘミクロミスは,那覇市の貯水池で採集され,この水域で再生産していると考えられた。同水域からは,シルバーアロワナも複数確認された。88河川の魚類調査の結果,魚種が10以下の場合には,移入魚が全体の50%以上を占める場合があった,種数が増加するに従い,移入魚が占める割合が減少し,30種以上の魚類が生息している河川では,移入魚が占める割合は10%以下となった。今年度の調査で,南風原ダムから805個体のジルテラピアが採集された。そのうち84個体の耳石薄片を顕微鏡下で観察した結果,最大4本の輪紋が確認された。これを年輪であるとすると,本種は4年で、136.0mmに達すると考えられた。久米島:久米島からは,11目21科48種の魚類が採集された。そのうち移入種は4種そのうちソードテールは,島内のあらゆる水域に侵入していることが明らかとなった。与那国島:与那国島から新たにカダヤシが採集された。また,島内で最も大きい河川である田原川下流域の水質が著しく悪化していた。沖縄県島の河川調査に加え,西表島,沖永良部島,徳之島,奄美大島,種子島で外来魚を採集した。また,南風原ダムで毎月,ジルテラピアを採集し,体長と体重を計測後,生殖腺と耳石を摘出し,産卵期の推定と年齢査定を行った。また,ジルテラピアの仔稚魚の形態を記載した。離島の外来魚分布調査西表島:グッピーが新たに確認された。沖永良部島:カワスズメの生息が確認された。徳之島:カワスズメ,ジルテラピア,オイカワの生息が確認された。奄美大島:ジルテラピアが新たに確認された。種子島:カダヤシとプラティの生息を確認した。今年度までの調査で,琉球列島の外来魚の島ごとの分布地図がほぼ完成した。ジルテラピアの生活史合計2,642個体のジルテラピアを解析した結果,本種の産卵期は,4月をピークとする28月であり,孕卵数(F)はF=1.5615x体長^<1.4637>で示された。耳石輪紋による年齢査定の結果,本種の成長曲線は,雄:SL=214.4{1-exp[-0.16(t+1.45)]},雌:SL=97.5{1-exp[-0.61(t+0.08)]}で近似された。雌雄ともに最高齢は6歳であった。本種の艀化仔魚は,脊索長3.4mmで大きな卵黄をもち,頭部に付着器を有していた。日齢2(4.2mm)で眼が黒化し,日齢15(標準体長6.2mm)で卵黄を完全に吸収し,日齢20(6.7mm)ですべての鰭条が定数に達した。
量子揺らぎに関する原理的問題の検証を通した初期宇宙進化モデルの特定

高エネルギー領域での時空構造をLorentz対称性の破れという観点より検証した。Horava-Lifshitz(HL)重力理論に基づき、時空に重力の量子効果が効く場合のブラックホール解の構成を行った。その結果、繰り込み群による結合定数のrunningによってはLorentz対称性を持たない粒子に対しての事象の地平線が常に特異的になることを示した。これは1+1次元の量子重力に見られるthuderbolt特異点と類似しており興味深い。また、HL重力理論の低エネルギー極限であるEinstein-aether理論に基づき、Maxwell場を伴うブラックホールの解析解を導出、解析を行った。26年度が最終年度であるため、記入しない。本研究は、有力な初期宇宙進化モデルであるインフレーション理論に付随する未解決問題の検証を通して、高エネルギー領域での宇宙の姿と、その進化を支配するより基礎的な物理法則を解き明かすことを目的としている。これまでに量子重力理論の候補と目されるHorava-Lifshitz (HL)重力理論に基づく宇宙初期特異点回避を議論し、非特異的な解を発見するなど一定の成果を得ている。但し、HL重力は時空に於ける時間と空間の等価性(Lorentz対称性)を喪失しており、特異点自体の定義や、その発生条件といった時空構造に関しての理解は進んでいない。このような事情により、解の特異性に関して更なる研究の余地が残されている。そこで、Ricci flow方程式を用いたEinstein方程式の数値解法の開発を進め、HL重力理論に於ける特異点の発生を始めとする時空の構造に関する知見を得るべく研究を推進している。この方法は、ゲージの選び方に依らず、Einstein方程式を解法のよく知られたPoisson方程式に帰着させることが出来る。そのため従来の数値解法と比較して、より複雑な解を得られやすい利点がある。本年度の進展としては、まずHL重力の低エネルギー有効理論であるEinstein-aether (ae)理論に於いて、あらかじめゲージ固定を行い簡略化した方程式を用いて定常・軸対称解が得られたことである。更に、より複雑な系へと適用するためゲージ固定に依らない定式化についても研究を進めている過程であり、一定の目処が付いている。また、インフレーションを引き起こすスカラー場について、その量子補正が赤外領域での発散を含むなど、予測される観測データに影響し得る問題が存在する。現在、量子補正の正則化や場の相関関数の保存則の検証を通して、宇宙初期の量子状態に対しての制限を得るべく研究を遂行している段階である。今年度は体調不良により一時的に研究が滞った。研究は既に再開しており、その間に進めていた準備によって成果が生まれつつある段階である。Ricci flow方程式を用いたae理論の数値解の構成については加えるべきゲージ固定項を既に特定しており、今後は境界条件の解析に移る。またae理論はHL重力理論の低エネルギー有効理論であるので、特異点付近の解析ではHL重力理論への拡張を考慮しなければならない。これに対しては、HL重力理論の作用を適当な形で書き換えることにより上記の方法を応用できる見通しを持っている。これにより、高エネルギー領域での時空構造の変更を精査し、引き続き解析を進めていく。
E型肝炎ウイルスの複製機構に関与する5'非翻訳領域の構造と機能に関する研究

本研究はE型肝炎ウイルス(HEV)の増殖におけるゲノムRNAの5'非翻訳領域の機能を明らかにすることを目的とした。5'非翻訳領域に様々な変異を組み込んだ全長RNAをPLC/PRF/5細胞に導入し、培養上清中のHEV RNAをリアルタイムRT-PCR法で定量測定し増殖効率への影響を検討した。その結果、5'非翻訳領域の2次構造が欠けるとHEVの増殖が抑制されたことから、5'非翻訳領域の2次構造がHEVの増殖に重要な役割を果たしていることが明らかとなった。また、構造だけではなく塩基配列の一部も増殖効率に影響していることが示された。E型肝炎ウイルス(HEV)の増殖機構は未だ十分に分かっていない。そこで、研究代表者が所属する研究室で世界に先駆けて開発されたHEVの細胞培養系とreverse genetics system、及び研究代表者が自ら開発したHEVのcell-free蛋白翻訳系を駆使し、感染性cDNAクローン(pJE03-1760F)に種々の変異を導入し、5'非翻訳領域(5'UTR)の構造と機能について検討した。先ず、種々の変異を導入したcDNAクローンに由来する完全長RNAをPLC/PRF/5細胞にtransfectし、増殖効率への影響を検討した。その結果、5'UTRのほぼ全長(nt 1-22)を欠く変異体は増殖しないことが分かった。そこで、6塩基対からなるステム構造の配列をそれぞれ相補的な配列に置換し、塩基対を保持した変異体を作製したところ、野生型と同等の増殖効率を示した。一方、ステム構造の6塩基対のペアをすべて壊した変異体は増殖しなかった。また、構造を維持したまま塩基配列を置換すると、興味深いことにGCペア数依存性に高い増殖効率を示した。ループ構造では、塩基配列を置換しただけの変異体は野生型と同等の増殖効率を示したが、構成する4塩基をすべて欠損させた変異体は増殖効率が1/1001/500に減少した。バルジ構造の2塩基を欠損させた変異体は増殖しなかった。次にA549細胞に接種し、progeny virusの感染性について検討した。増殖が確認された変異体はいずれも感染性を有し、上記実験で得られたウイルス増殖効率についても再現性が認められた。また、5'UTRのほぼ全長(nt 1-22)を欠く変異体を除き、それぞれの変異体においてウイルス蛋白質の発現を確認した。それぞれの変異体5'UTRのステム構造、バルジ構造のいずれかの構造が欠けてもHEVの増殖が抑制されたことから、5'UTRの2次構造がHEVの増殖に重要な役割を果たしていることが明らかとなった。また、構造だけではなく塩基配列も増殖の効率に影響していることが示唆された。E型肝炎ウイルス(HEV)はE型肝炎の原因となる1本鎖(+鎖)RNAウイルスである。昨年度の研究により5'UTRの二次構造がHEVの増殖に重要な役割を果たしていることが明らかになった。本年度は6塩基対のステム構造(nt 4-9:nt 14-19)の種々の変異体を構築し、HEV増殖におけるステム構造の機能をより詳細に検討した。HEV感染性cDNAクローン(pJE03-1760F)を用いて、5'UTRの6塩基対のステム構造の二次構造を維持させたまま塩基を置換してGCペア数を変えた変異体と、2塩基ずつ置換して塩基対や二次構造を壊した変異体を構築し、それぞれの変異体に対応する全長RNAをPLC/PRF/5細胞にtransfectして増殖効率への影響を検討した。ステム構造のGCペアが4つの野生型と比較すると、GCペアが3つの変異体は増殖効率が1/6に、GCペアが2つの変異体は1/20に低下した。6塩基対を全てGCペアにした変異体は予想に反し、野生株以上の増殖効率を示すことはなかった。次に、2塩基ずつ変えて塩基対を形成できないようにした変異体を6種類構築して検討した結果、中央の2塩基対を置換した変異体では増殖は認められず、他の変異体でも増殖効率は明らかに低下した。変異体のウイルスタンパク質(ORF2, ORF3)の細胞内発現レベルをIFA法により定量的に検討した結果、培養上清中のHEV RNA titerとほぼパラレルな関係にあることが分かった。以上のように、5'UTRのステム構造を維持したままGCペア数を変化させるとHEVの増殖効率が低下したことから、野生株が保有している5'UTRの構造及び塩基配列がHEVにとって最も適しているものと考えられた。また、ステム構造の中でも中央の2つのGCペアがウイルスの複製において特に重要な役割を果たしていることが示唆された。

ウイルス学H25年度の目的は15'非翻訳領域に変異を導入した様々なHEV変異クローンの構築とHEV産生への影響の解析、2ウイルスタンパク質の翻訳に関与する5'非翻訳領域の配列と2次構造の解明である。HEV変異クローンの構築とHEV産生への影響は研究実績の概要に記したように、当初の計画通り進展しており、各変異体において解析を終え、5'UTRの2次構造がウイルスの複製に重要な役割を果たしており、塩基配列もウイルスの増殖効率に関与していることを明らかにした。さらに、5'UTRはウイルス蛋白質の翻訳に必要であるが、5'UTR内の2次構造や塩基配列の変異は、翻訳に顕著な影響はないことを明らかにした。H26年度の計画はゲノムRNA・サブゲノムRNAの複製に関与する5'非翻訳領域の配列と2次構造の解明である。RNAの検出については、ノーザンブロット法を用いて感染細胞内で複製したHEVのゲノムRNA、サブゲノムRNA、および複製中間体である2本鎖RNAを検出する方法を確立できている。それぞれの変異体RNAを導入した細胞からRNAを抽出し、2本鎖RNAを検出することにより、ウイルスRNAの複製(特にー鎖から+鎖の複製)に関与する5'UTRの配列と2次構造を明らかにする。また、増殖した変異体の蛋白発現効率及び細胞内局在が野生型と同等であるか否かを確認するために、ウエスタンブロット法や蛍光抗体法により検討する予定である。
Ｃｒｙトキシンのクリスタル形成機構を利用する画期的なタンパク質生産技術の開発

本研究では殺蚊トキシンCry4Aaに由来するペプチドタグ4AaCter及び4AaB7のタンパク質凝集体形成機構及びその利用に関する研究を進めた。様々な変異体の構築を通して4AaB7内の機能構造を解析した結果、保存されている疎水性アミノ酸の配置がタンパク質凝集体の形成に関与することを示唆した。またペプチドタグ4AaCterを利用して臨床検査薬資材(シスタチンC)や微生物殺虫剤(サソリトキシン)の生産を試み、これらが効率よく且つ安価に生産できることを実証した。殺蚊トキシンCry4AaのC末端領域に由来するポリペプチド、4AaCter(Ile696Pro851)及び4AaB7(F802E834)と連結したタンパク質は大腸菌で凝集体として発現・蓄積される。タンパク質を凝集体として生産する方法は、既存の方法で調製が難しいタンパク質を大量生産するのに利用できると期待される。ペプチドタグ4AaCter及び4AaB7を利用する画期的なタンパク質生産技術を開発するため、本年度は以下の2点について研究を進めた。4AaB7を用いた新規発現ベクターの構築:4AaB7融合タンパク質を発現させるための発現ベクター(pHB7, pHB7PP, pB7H, pB7PPH, pB7HN)を構築した。発現ベクターで用いたペプチドタグは、Hisタグ(H)及び4AaB7タグ(B7)、HRV3Cプロテアーゼ(PP)などを組み合わせて作製した。これらを用いてCys C、もしくはフェリチン(腫瘍マーカー)の生産を試みた結果、4AaB7との融合は発現量の上昇を促すことが示された。しかし4AaB7自体の再凝集性が強く、精製過程でのロスが非常に多くなった。現在、タグの改良及び、使用法について検討している。殺蚊トキシンCry4AaのC末端側領域に由来するペプチドタグ、4AaCter(I696P851)及び4AaB7(F802E834)は連結したタンパク質を凝集体として発現・蓄積させる。このようなペプチドタグは、その毒性等により既存の方法で調製が難しいタンパク質を大量生産するのに利用できる。本研究では4AaCter及び4AaB7による凝集体形成機構の解明及びその利用に関する研究を進めており、本年度は以下の2点について研究を進めた。4AaCterを用いたサソリトキシン(AaHIT及びBjαIT)の効率的生産:前年度行った抗原タンパク質以外の生産例として、本ペプチドタグを利用した殺虫トキシンの製剤化を試みた。具体的には昆虫特異的サソリトキシンAaHIT及びBjαITをコードする人工遺伝子(aaHIT-S1及びbjαIT-S1)を合成し、発現ベクター(p4AaCter)を利用して生産した。AaHIT及びBjαITは4AaCterを融合することでアルカリ可溶性の凝集体として生産された。バイオアッセイの結果、サソリトキシンはCry4Aaのアカイエカ幼虫に対する殺虫作用を助長することが示された(Matsumoto et al., 2014)。4AaB7による凝集体形成機構の解明:タンパク質凝集体形成に関与する機能構造を特定する目的で、4AaB7をC末端側から欠失させた様々な変異体を構築してGST融合タンパク質として発現させた。凝集体形成率は4AaB7(凝集体形成率=94.1%)から10及び15アミノ酸(aa)を欠失させると75.1%及び45.9%と順次減少し、その後25aa欠失させた変異体まで約50%の凝集体形成率を維持した。本実験で構築した最小の変異体はわずか8aa (F802PTYIFQK809)の短いポリペプチドであり、この中に必要最小限の機能構造が含まれることが示された。殺蚊トキシンCry4AaのC末端領域には、タンパク質の凝集体形成を促す因子が存在する。本研究ではCry4Aa由来のポリペプチド、4AaCter(Ile696Pro851)と連結したタンパク質が大腸菌でアルカリ可溶性の凝集体として発現・蓄積することを示し、発現用タグとしての利用を進めている。凝集体形成には4AaCter中に位置する保存配列、Block7(F802E834)が重要と考えられるものの、その原理に関しては全く明らかでない。本年度は凝集体形成に関与する機能構造を明らかにするため、Cry4Aa以外に14種類ある130 kDa型Cryトキシン(Cry1, 5, 7, 8, 9, 12, 14, 21, 26, 28, 32, 43, 47, 48)のblock7ポリペプチドをグルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)との融合タンパク質として発現させた。GST融合タンパク質は大腸菌で問題なく発現し、菌体内で凝集体の形成が観察された。

しかしその効率はCryトキシンの種類によって異なり、Cry4Aaと同様な高い凝集体形成率(95%)を示したBlock7ポリペプチドはCry5Baや32Aa、48Aa由来のものだけで、特にCry47Aaでは10%以下の低い形成率しか観察されなかった。Block7配列に変異を導入して解析した結果から、Block7配列中の疎水性アミノ酸が凝集体形成に重要であると示唆された。しかしBlock7の配列自体は一般的な可溶性タンパク質に特徴的であり、疎水性アミノ酸の量ではなく、その並び(配列)が重要であると示唆された。一般的にBlock7は4AaCterよりもかなり小さなポリペプチド(33アミノ酸)であり、発現用ペプチドタグとして適している。現在、Cry4Aa由来のBlock7ポリペプチドを利用した幾つかの発現用ペプチドタグを試作している。本年度はペプチドタグ4AaCterを利用してシスタチンC(腎機能マーカー)の効率的生産システムを構築した。これは梅毒菌表面抗原(TpN)の生産に次ぐ2例目の成功例であり、4AaCterタグを用いて臨床診断薬に用いる抗原タンパク質が効率的に生産できることが示されつつある。一方、4AaB7タグについても構造の異なる様々な発現ベクターを構築することができた。構築した発現ベクターを利用してシスタチンCやフェリチンなどの生産を試みた結果、4AaCterタグを利用した場合と同様に4AaB7との融合も抗原タンパク質の発現量を大幅な上昇させることが明らかになった。しかし4AaB7タグ自体が非常に高い凝集活性を示し、尿素を除去する透析の過程で、発現タンパク質が再凝集する問題が明らかになった。現在はペプチドタグ配列の改変による再凝集活性の抑制、及び4AaB7タグを別の利用法について検討を進めている。全体像には未だに不明な部分が多いものの、タンパク質の凝集体形成に必要なアミノ酸配列の特徴が明らかになりつつある。また130kDa型Cryトキシンの中で、凝集体形成率の高いBlock7配列が判明し、発現用タグとしての利用が容易となった。Cry4Aa由来のBlock7ポリペプチドを利用した発現用ペプチドタグについても幾つかの試作品が構築されている。本年度も継続して発現用ペプチドタグ(特に4AaB7タグを基にしたペプチドタグ)の試作とそれを利用した発現ベクターの構築を進める。ペプチドタグ4AaCter及び4AaB7を抗原以外のタンパク質生産で利用する方法を模索する。例えば、4AaCterを可溶性トキシンの製剤化に利用する方法の開発や4AaCterもしくは4AaB7で作られた凝集体の表面に抗原タンパク質を提示させる方法を開発する。表面に抗原タンパク質を提示させた粒子は効率的抗体作製のためのアジュバントとして利用することを考えている。発現用ペプチドタグの試作を継続する。Cry4Aa由来のBlock7ポリペプチドとHisタグ、プロテアーゼ(HRV 14-3C)の認識配列(LEVLFQGP)を組み合わせて、発現タンパク質をHisタグ融合タンパク質として、もしくはネイティブな状態で生産する新しいペプチドタグを構築する。またプロテアーゼ(HRV 14-3C)自体をペプチドタグに組み込むことも考える。実際にタンパク質の生産を行い、試作したペプチドタグの有用性を検証する。
新規鉄代謝指標・生体内不安定鉄ＮＴＢＩの革新的測定法開発・実用化研究及び臨床応用

生体にとって悪影響を及ぼす非トランスフェリン結合鉄(non-transferrin bound iron, NTBI)の血中レベルを正確に把握する目的で、臨床応用可能なワン・ステップ型同時多検体測定システムの開発を試みた。生体にとって重要なトランスフェリン結合鉄をほとんど奪いことなく、NTBIを補足することが可能な発色型キレート剤を自動分析装置に導入した新規プロトコールを開発した。鉄毒性モニタリング法として、NTBIの有用性を検討した結果、輸血後鉄過剰症の治療効果判定に加え、化学療法後の臓器傷害予測においてもNTBI測定の有用性が示された。鉄が生体に及ぼす影響をとらえる上で重要な形態として血中に存在する非トランスフェリン結合鉄(non-transferrin-bound iron:NTBI)が挙げられる。しかし、これまで日本国内でこのNTBIを測定するためのシステムを構築し、臨床検体を用いて測定した報告はない。そこで、NTBI測定方法のゴールド・スタンダードであるnon-metal HPLCシステムを導入し、種々改善を行い検出感度の向上と安定した測定システムの構築に取り組んできた。その結果、本計画の同時多検体測定を可能とする革新的NTBI測定法開発のための比較対象としてこの改良型non-metal HPLCシステムを適応することが可能であると判断することができる。もう一つの問題は、測定系に用いる既存のキレート剤はNTBIに加えて生体に有効なトランスフェリン結合鉄をも僅かではあるがスカベンジするためNTBI測定系での使用が問題視されてきた。そこでトランスフェリン結合鉄を奪取することなく、NTBIのみを選択的にキレート可能な反応基を選別し、その反応基を導入したクロマトグラフ用樹脂剤の開発を進めてきた。本来クロマトグラフ用樹脂剤は水親和性が高いが、その構造・利用目的から不溶性であり、鉄をキレートした後もその不溶性は変化することなく、鉄イオンをキレートしたクロマトグラフ用樹脂剤は、遠心操作などにより容易に分離することができる点は大きな特徴といえる。この利点は、今後の固相化剤、固相化方法の開発に繋がるものである。一方でハイスルプット測定システム開発の一環として、自動分析装置対応のNTBI測定試薬の開発と臨床検査試薬としての実用化を進めており、NTBI測定試薬としての基礎性能評価が終了した。【研究目的】生体にとって悪影響を及ぼす非トランスフェリン結合鉄(non-transferrin bound iron, NTBI)の血中レベルを正確に把握することは臨床上大変重要な要素である。そこで、NTBI測定方法のゴールドスタンダードであるHPLCを用いた測定システムを本邦で初めて導入・改良し、より安定した高感度測定システムを確立した。これを基に、臨床応用可能なワン・ステップ型同時多検体測定システムの開発を試みる。さらに、NTBIが新規鉄代謝マーカーおよびバイオマーカーとしての評価・検証を行う。【結果・考察】1.不溶性高分子鉄キレート担体として、多糖類系多孔質粒状キトサンゲル:トキパールを選択した。この担体にNTBIのみを選択的にキレート可能な反応基を導入した不溶性高分子化鉄キレート剤を作製した。本キレート剤を血清と混合し、室温、30分間反応させることで血中NTBIを55%除去することができた。さらに遠心操作により試料から本キレート剤を簡単に分離できる点は産業上極めて有用である。2.日立7700型自動分析装置対応のNTBI測定試薬を開発した。本測定系ではトランスフェリン結合鉄をほとんど奪うことなく、NTBIを0.34ー10μMの範囲で定量することができた。さらに、臨床使用の鉄キレート剤desferrioxamineおよびdeferasiroxによる影響を受けずにNTBIを測定することができた。これに関連して、輸血後鉄過剰症に対する鉄キレート療法の前後での血中NTBIの変動を追跡することができ、鉄キレート療法の効果判定においてNTBIが新たな指標となる可能性が示された。今回の自動化試薬は検体の前処理を必要としない点は臨床検査の現場での実用性の高い試薬として評価できる。3.鉄毒性モニタリング法として、NTBIの有用性を検討した結果、前出の輸血後鉄過剰症の治療効果判定に加え、化学療法後の臓器傷害予測においてもNTBI測定の有用性が示された。非トランスフェリン結合鉄(non-transferrin-bound iron:NTBI)の測定は、臨床的に鉄が生体に及ぼす影響をとらえる上で重要と考えられるが、その測定は極めて困難であり、これまで日本国内での測定報告はない。一方、海外において報告された健常人血中NTBI値はその測定方法により、検出感度未満であったり、マイナス表記されることが多く、信頼性に欠けていた。そこで、NTBI測定方法のゴールデン・スタンダードであるnon-metal HPLCシステムを導入し、これまで疑問視されていた低濃度領域の定量性に関してその問題点を改善し検出感度の向上と安定した測定システムの構築に取り組んだ。

その結果、試薬等に混在している鉄を除去することで測定系のバックグラウンドを低値に抑えることができ、測定系の感度を高めることに成功した。本システムにより得られた健常人血中NTBI値が、男性(n=20)で0.206±0.091μM、女性(n=16)で0.212±0.095μMであることを世界で初めて明らかにした(Mol. Med. Reports, 2011, 4:913-918)。既存のキレート剤はNTBIに加えて生体に有効なトランスフェリン結合鉄をもスカベンジするためNTBI測定系での使用が問題視されてきた。そこでトランスフェリン結合鉄を奪取することなく、NTBIのみを結合するキレート剤に開発に取り組んできた。今回開発した低分子可溶型キレート剤はトランスフェリン結合鉄を奪取することなく、さらに鉄濃度依存的に着色したことから簡易診断にも利用可能であることが確認された。さらに新規キレート剤を高分子化し水不溶性の剤型とすることで、血中NTBIを吸着・除去することができ、新規キレート剤の新たな臨床応用の可能性が示唆された。不溶性高分子鉄キレート担体として、多糖類系多孔質粒状キトサンゲル:トキパールを選択した。このゲルは極めて理想的なマクロポーラス構造により強度と物質拡散性を兼ね備えており、キトサン由来の高親水性は試料からの鉄イオンのスカベンジに対して有意に働くものと考えられる。この担体にNTBIのみを選択的にキレート可能な反応基を導入し、室温、30分間反応させた条件において血清中のNTBIを吸収することが可能であることが確認できた。一方、生体にとって必要なトランスフェリン結合鉄はほとんど奪取しないことも確認された。さらに並行して、他の金属イオンが存在する血清のような試料に対して、NTBI由来鉄イオンのみを選択的に定量するハイスルプットな測定系の構築も望まれており、発色基質を選択することで自動分析装置対応が可能であることが確認された。NTBI測定試薬としての基礎性能評価が終了し、臨床検査試薬としての実用化を進めているところである。新規に開発した低分子可溶型鉄キレート剤はトランスフェリン結合鉄を奪取することなく、一方で鉄濃度依存的に着色したことから簡易診断にも利用可能であることが確認された点は、ワン・ステップ型同時多検体測定システムへの応用が可能な部材となり得ることを示唆しており、これまでのnon-metal HPLCシステムに替わる新しい測定システムの開発が可能となった。新規鉄キレート剤開発の過程で、低分子可溶型キレート剤を高分子化し水不溶性の剤型とすることで生体にとって悪影響を及ぼす血中NTBIを吸着・除去する効果を確認することができた点は、新規鉄キレート剤の新たな臨床応用の可能性を示唆するものである。この点は新しい発見であり、本申請内容の枠を超えた有用な結果である。NTBI測定における多検体同時測定システムの開発には、マルチプル測定用基材(マイクロ・プレートなど)への鉄キレート剤の確実な固定が重要な点となる。
アルツハイマ-病治療のための実験的・神経心理学的研究

本研究の目的は内科的治療の見通しが現在のところ立っていないアルツハイマ-病治療を脳外科的に模索することである。平成元年と2年度の研究成果を基礎にして,本年度は臨床応用のとき当然対象となる老齢ラットを実験動物に選び,神経自家移極と学習能テストを突き合わせた研究を行なった。1).マイネルト核を破壊したモデルラットを24月齢まで生かしておくことは非常に難かしかった。2).それらのラットに受動的回避反応条件づけ,8方向迷路学習をさせたが,それまでの結果(912ヶ月齢ラット)と差は認められなかった。ただ,自発活動量に関しては新奇場合に曝されても増加することはなかった。3).片側迷走神経節を切出し,大脳皮質に自家移植した結果はおおむね良好で,活着することと,神経繊維が発芽することが観察された。4).マイネルト核破壊により学習成績が低下したラットに迷走神経節を移植すると,受動的回避反応に改善が認められた。5).移植部位の選択などに問題を残しているが,以上の実験的事実は大動物での実験へと導びくものであると考えられる。6).実験成果は2つの国際神経外科学会と国内の神経科学会において口頭発表し,2篇の英文論文に纏められた。長寿社会を迎える我が国が確実に当面する困難な課題の一つに老年性痴呆の問題がある。本研究の目的は老年性痴呆の一つであるアルツハイマ-病(AD)の脳外科的治療の可能性を模索することである。ADは前脳基底部マイネルト核に存在するアセチルコリン含有細胞の欠落に起因するとする説が有力である。もし、欠落したアセチルコリン含有細胞を外科的に補えば、AD症状の改善がもたらされるのではないか。しかし、神経移植にはドナ-を何に求めるかという倫理上の問題がある。われわれはこの問題をまぬがれる方法として、グラフトを迷走神経節とし、これを自家移植することとした。本年は初年度でもあるので、技術上の問題を整理することに多くの労力がさかれ、被験動物は老年でないラットが主に使われた。本年度確認されたことは以下の4点であった。1.イボテン酸をマイネルト核に注入することにより、アセチルコリン含有細胞を欠落させることができた。2.前頭葉に迷走神経節を片側性に切出し、4つに細切し、移植したところ、アセチルコリン細胞が活着することが明らかになった。グラフトの細胞をアセチルコリン染色すると周囲に軸索を延ばしていることが観察された。3.マイネルト核を両側性に破壊されたラットは一試行回避訓練成績が正常ラットより有意に悪かった。またヘブ・ウィリアムス型迷路学習をさせると、誤走行が多く、目標までの走行時間が長かった。4.放射状迷路におけるエサ獲得方略を指標にして短期記憶の保持をテストしたが、マイネルト核破壊ラットは障害が認められなかった。5.今後はこれらの結果が老令ラットにおいても認められるか検討する。老齢ラット(2026月齢)のラットの基底前脳核(NBM)を両側性にイボテン酸注入により破壊し,アルツハイマ-病モデル動物を作った統制群のラットは同腹の無処置のものである。NBM破壊ラットのコリンアセチラ-ゼ活性を測定すると有意に低下しており,破壊の目的は達成されたと見倣された。八方向迷路学習,一試行回避学習を両群に課したが、NBM破壊ラットは統制群のラットに較べ,成績が有意に悪く,見当識障害,短期記憶障害を起こしていることが認められ、アルツハイマ-病モデルラットと見倣すことができると結論された。NBM破壊ラットの前頭葉皮質に迷走神経節を自家移植した。迷走神経節細胞はアセチルコリン含有細胞が多数存在する。NBM破壊によって欠落したアセチルコリン含有細胞を補なうことによって,障害が改善されるかを見ることが本研究の眼目である。前年度、老齢ラットでないものを用いて検討し,アセチルコリン含有細胞の活着に良好な結果を得たが,本年度,老齢ラットで再検討したが結果は活着の程度に個体差が大きく,群として行動実験の結果を結論することが出来ず、この点、来年度の実験に結論はゆだねられることになった。老齢ラットの脳が移植神経組織を受け入れる能力が欠けているのか、われわれの技法に問題点があるのか、次年度再検討すべき余地が残されてしまった。本年度の結果は2つの論文にまとめられ、現在投稿中である。

4).マイネルト核破壊により学習成績が低下したラットに迷走神経節を移植すると,受動的回避反応に改善が認められた。5).移植部位の選択などに問題を残しているが,以上の実験的事実は大動物での実験へと導びくものであると考えられる。6).実験成果は2つの国際神経外科学会と国内の神経科学会において口頭発表し,2篇の英文論文に纏められた。