hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
指導と評価の相互作用プロセスに着目した、自己学習力を育成する教育プログラムの開発

昨年度まで,学習評価のあり方が学習者の方略使用に影響を与えていることを明らかにした.本年度は,さらにその問いを深め,学習評価が学習方略に影響を与えている際に,どのようなメカニズムが働いているのかを検討することとした.大学生を対象としたいくつかの実験研究を通して,学習者の方略変容には"空所補充型テストには暗記が有効である"といった,テストに対する信念(テスト形式スキーマ)が関与していることが明らかになった.そこで,中学生を対象にした授業実験を実施し,テスト形式スキーマへの介入を行った.その結果,テスト形式スキーマへの介入によって,"空所補充型テストが暗記を促進する"というネガティブな効果を抑制することが示された.こうした"テスト形式スキーマ"へ介入することの有効性は,先行研究の文献展望を通しても明らかになった.このような知見を踏まえ,学習者に評価の意図や目的をしっかりと伝えるような学習評価のあり方を"インフォームドアセスメント"と名づけ,その有用性を展望論文を通して提唱した.特に,近年の新しい評価(alternative assessment)が成果をあげるためには,このインフォームドアセスメントという視点が不可欠であることを主張した.次に,指導と評価の相互作用をより詳細に検討するため,高校生の総合学習に関する探索的な研究を行った.定量的な調査と,質的なインタビューデータを通す中で,学習者のパフォーマンスを促進するためには,一方向的な評価だけでなく,双方向的なサポート(支援)のあり方が重要であることを示した.本年度の目標は,テストといった教育評価が,(1)学習者の自己制御学習に与える影響プロセスを検討し,(2)そこから学習指導への示唆を明らかにすることであった.また,このような検討を通して,(3)有効な自己制御のあり方について検討を行うことも3点目の目標として加えた.この3つの目標に関して,次のことが明らかになった.(1)に関しては,テストが学習者の自己制御方略に影響を与える際に,"テスト形式スキーマ"という,テストに関する暗黙の知識・信念が作用していることが明らかになった.この点は文章読解に関する個別実験を実施する中で,見出された.(2)に関しては,(1)で明らかになったような"テスト形式スキーマ"に対して,直接学習指導を行うことによって,テストが自己制御学習に与える影響を変えることができるということが明らかになった.これは,中学2年生に対して実際に授業を行う授業実験を行い,仮説を検証した.この(1),(2)の研究を通して,テストといった教育評価が学習者に与える影響に関してのプロセスモデルが提唱された.(3)に関しては,自己制御学習の重要な構成要素の1つである"回避方略"が,定義としても非常に複雑な概念であり,その有効性も状況による影響を大きく受けてしまうということが明らかになった.この点に関しては,先行研究を総合し,調査研究を行う中で明らかになった.(1),(2),(3)を総合して,指導と評価の相互作用プロセスに関して,教育実践的に有効だと思われる部分の解明が進んだ.以上の実績は,すべて学会誌として投稿した.昨年度まで,学習評価のあり方が学習者の方略使用に影響を与えていることを明らかにした.本年度は,さらにその問いを深め,学習評価が学習方略に影響を与えている際に,どのようなメカニズムが働いているのかを検討することとした.大学生を対象としたいくつかの実験研究を通して,学習者の方略変容には"空所補充型テストには暗記が有効である"といった,テストに対する信念(テスト形式スキーマ)が関与していることが明らかになった.そこで,中学生を対象にした授業実験を実施し,テスト形式スキーマへの介入を行った.その結果,テスト形式スキーマへの介入によって,"空所補充型テストが暗記を促進する"というネガティブな効果を抑制することが示された.こうした"テスト形式スキーマ"へ介入することの有効性は,先行研究の文献展望を通しても明らかになった.このような知見を踏まえ,学習者に評価の意図や目的をしっかりと伝えるような学習評価のあり方を"インフォームドアセスメント"と名づけ,その有用性を展望論文を通して提唱した.特に,近年の新しい評価(alternative assessment)が成果をあげるためには,このインフォームドアセスメントという視点が不可欠であることを主張した.次に,指導と評価の相互作用をより詳細に検討するため,高校生の総合学習に関する探索的な研究を行った.定量的な調査と,質的なインタビューデータを通す中で,学習者のパフォーマンスを促進するためには,一方向的な評価だけでなく,双方向的なサポート(支援)のあり方が重要であることを示した.
カンボジアにおける電力化と女性労働者の雇用、及び家計の厚生に関する実証研究

本研究の目的は、雇用のフォーマル化(政府の監督や国家の登録内で行われる公式経済における雇用)を促す外生ショックとして「電化(公的な電力にアクセス可能となること)」に着目し、電化が1フォーマル雇用の促進、及び2家計の厚生(家計所得、子供の人的資本投資支出、及び出生率)に与える影響について分析することである。対象国は、2004年から2014年にかけて電化が急速に進み、またインフォーマル雇用の割合、及び貧困率が減少しているカンボジアとする。方法としては、全国規模の家計調査データ、及び企業調査データを用い、労働供給側、及び労働需要側双方の視点からの包括的な分析を行う。
膵外分泌機能の修復と再生をめざした研究

膵臓の幹細胞から膵外分泌細胞を再生させることではなく、残存しているわずかな膵外分泌細胞の機能をよみがえらせて、膵外分泌機能の回復と改善を望むための基礎的手段を探索した。手がかりとして、マウスおよびヒトに共通して存在するラス蛋白関連蛋白(KRAP)を選択し、マウスでは、KRAPの発現低下は膵外分泌細胞を肥大させることを明らかにした。一方、ヒト膵胆道系悪性腫瘍におけるKRAPの発現は変動がなく、悪性腫瘍発現とKRAP発現量は関係がないことがわかった。(1)ラス遺伝子変異に伴って増加する新規蛋白(KRAP)が外分泌腺の機能再生に有用と想定された。そこで、KRAP遺伝子ノックアウト(KO)マウスの膵機能を検索する。(2)インスリン代謝に関与するSHIP2遺伝子をtransgene(tg)したマウスでKRAP蛋白の遺伝子発現をしらべる。(3)CCK受容体遺伝子欠損マウスでKRAP蛋白の遺伝子発現をしらべる。(4)ヒト悪性腫瘍でのKRAP発現の有無を調べる。膵外分泌腺再生の試みはあまり行われていない。本研究では、膵臓の幹細胞から膵外分泌細胞を再生させることではなく、残存しているわずかな膵外分泌細胞の機能をよみがえらせて、膵外分泌機能の回復と改善を望むための手段を探索することを計画した。基礎実験ではラスシグナルに関係する分子の発現を調節することにより目的を達成できる可能性が示唆された。ヒトとげっ歯類の膵臓の決定的な相違はCCK-A(1)受容体(R)の存否である。げっ歯類の膵外分泌腺はCCKの持続投与によって効率的に肥大、増殖するが、ヒトではそれがみられない。ヒト膵臓にはCCK-BRが発現している。KRAP遺伝子欠損マウスでは、膵腺房細胞の消化酵素含有量と分泌量が増加していることから、CCK-AR,BR,ARBR-KO(homo-/-)および野生型(wild+/+)マウス(♂10週令)の白色脂肪、膵臓、肝臓の盟遺伝子発現をリアルタイムPCRで測定した。結果は、脂肪組織ではwild<ARKO,BRKO<ARBRKO、膵臓では、ARKO<wild<BRKO,ARBRKO、肝臓ではwild,BRKO<ARKO,ARBRKOであり、臓器によって発現パターンが異なっていた。平成20年度以降に検討する計画であったSHIP2 transgenic miceの繁殖と飼育をおこない、KRAP遺伝子発現の検索を施行中であるが、野性型と比較して差がなさそうである。ラスシグナルに関係する分子をノックアウトしたマウスは、膵外分泌亢進、膵臓内酵素含有量増加、胆汁酸分泌増加、エネルギー代謝亢進、インスリン感受性亢進、耐糖能、食事誘導性肥満に抵抗性を示した。分子機序として、脂質代謝酵素の変化が関与している可能性が考えられた。一方、我々は、インスリンの細胞内情報伝達を抑制するSHIP2タンパクを過発現させたトランスジェニックマウスを作成した。このマウスは、高脂肪食の投与によって、むしろ、インスリン感受性が改善するという、予測に反した表現形を呈した。分子機序は、やはり脂質代謝酵素の遺伝子発現レベルの変化が関与していると考えられたが、確定するには至らなかった。高脂肪食による肥満誘導に抵抗性を示す点で、ラスシグナルに関係する分子をノックアウトしたマウスとSHIP2過発現マウスは共通していたことから、SHIP2過発現マウスで、ラスシグナルに関係する分子の遺伝子発現を調べた。結果は、肝臓、脂肪組織、膵臓において、遺伝子発現はわずかに上昇傾向を示したが、有意差をえるには至らなかった。ヒト膵癌細胞株(n=46)、膵臓癌の手術例における膵臓癌組織および正常組織におけるKRAP遺伝子発現を定量的リアルタイムPCR法でヒト定量をした。KRAP測定値およびサンプル間補正にはβ-アクチンを用いた。その結果、この3群間でKRAP遺伝子発現には差がみられなかった。以上の結果はKRAP遺伝子は癌化そのものには関与していないと解釈された。ki-ras遺伝子のcodon13変異のあるCell line (colon cancer由来)で、KRAPタンパクが同時に増加していることが報告されていることから(Shirasawa et al.Science 1993, Inokuchi et al.J Hum Genet 2004)、膵癌細胞及び組織でのki-ras遺伝子のシーケンスを行い、codon13変異の確認を行った。プライマーの設計は、イントロンを含む領域を増幅するよう設計したものと、cDNA用の2種類のプライマーを用いた。

しかし、すでに10例ほどの膵臓癌組織をもちいて解析をしたが、codon13変異の存在はみつからなかった。ヒトのがん組織(膵臓癌、胆道系のがん)組織における、Kras codon12, 13の変異の有無を検討した。膵癌細胞及び組織でのki-ras遺伝子のシーケンスを行い、codon13変異の確認を行った。プライマーの設計は、イントロンを含む領域を増幅するよう設計したものと、cDNA用の2種類のプライマーを用いた(以下に示した)。結果は、これらのがん組織において、Kras codon12の変異は高頻度に観察されたが,codon13の変異は全く見られなかった。KRAPタンパクの増加は、特殊な大腸癌由来のcell lineで認められている(Shirasawa et al. Science 1993)ことから、大腸癌組織におけるcodon13の変異の有無も解析したが、変異は発見できなかった。同時に遺伝子発現量の測定を以下のプライマーを用いた定量的リアルタイムPCR法で行った。KRAP測定値おサンプル間補正にはβ-アクチン、およびGAPDHの値を用いた。結果は、有意の変化が認められなかった。
悪性脳腫瘍に対する新規光感受性物質を用いた光線免疫療法の開発

悪性神経膠腫を主とする原発性悪性脳腫瘍における腫瘍関連マクロファージ( Tumor associated macrophage: TAM )には、宿主の単球が遊走して腫瘍組織を攻撃するM1マクロファージと、腫瘍組織から分泌されるサイトカインによって腫瘍細胞の不死化や増殖、血管新生促進に関わるM2マクロファージが存在することが知られている。悪性神経膠腫は全ての癌腫の中でもTAMが多い腫瘍であり、中でもM2の分布が目立つ腫瘍であることが近年の研究で明らかとなった。研究代表者は、M2マクロファージの組織内分布度を100例以上の悪性神経膠腫症例で調査し、実際にPDTを行った症例群におけるPDT効果の差と、M2マクロファージ浸潤度に関連性があるか否かを検討した。100例超の原発性悪性神経膠腫手術例の切片を作成し、CD68、CD163、CD204、CD205といったマクロファージ抗体を用いた免役組織化学的解析を行った。結果は近日中に脳腫瘍関連学会で公表する予定としている。又、M2マクロファージに特異的に発現しているmannose receptorに注目、mannnoseを結合した光感受性物質を入手、まずin vitro studyによって、従来用いてきた光感受性物質(talaporfin sodium)と同様の腫瘍細胞殺細胞効果があるか否かを検討した。その結果では、7種類の脳腫瘍関連細胞株において、感度の差はあるものの、talaporifn sodiumよリも有意に殺細胞効果が高かった。すでに論文化に至っている。今後はマウス脳内グリオーマモデルや皮下グリオーマ移植モデルなどを用いたin vivo実験系で、実際にM2をターゲットとしたPhotoimmunotherapyの可能性を探索してゆきたいと考えている。光感受性物質であるtalaporfinsodiumと半導体レーザを用いる光線力学的療法(Photodynamic therapy: PDT)は原発性悪性脳腫瘍を対象とした術中補助療法として保険承認を得ている。PDTの機序としては、腫瘍細胞内に選択的に取り込まれた光感受性物質がレーザ光照射によって励起状態に移行、その後、基底状態に復する際に生ずるエネルギー格差によって、組織内溶存酸素を毒性の強い一重項酸素に変換し、腫瘍細胞にアポトーシスを誘導、腫瘍新生血管を閉塞することによって、腫瘍細胞制御を図るものである。近年の研究により、PDTのもう一つの機序として局所における宿主免疫反応の誘導が示されている。研究者は腫瘍内浸潤マクロファージの役割に注目している。悪性脳腫瘍に浸潤するマクロファージの大半はM2と呼ばれる、腫瘍増殖を促進するサイトカインを分泌するものであり、腫瘍細胞のみならずM2を傷害することは、PDTの効果をより高められる可能性を示唆するものと考える。M2マクロファージはその表面に糖鎖の一つであるマンノースのレセプターを有している。本研究ではマンノースを結合させた光感受性物資を用いたPDTを行うことにより、M2の制御も同時に行える、光線免疫療法(Photoimmunotherapy:PIT)の可能性を検討する。研究者はマンノース結合光感受性物質、マンノースクロリンを山形大学鳴海博士より譲り受けることができた。そこで、数種の確立されたラットおよび人の悪性脳腫瘍細胞株に対して、同薬剤を用いたin vitro studyを行い、腫瘍殺細胞効果が得られるかを検討した。比較対象として、従来実験にて行ってきたtalaporfinsodiumによるPDTの殺細胞効果を用いている。結果として、人由来の悪性脳腫瘍株に対しては、PDTの方が殺細胞効果が高かったが、ラット由来の悪性脳腫瘍株に対してはPITの方が殺細胞効果が高かった。In vitro studyにおいては、免疫系の関与が乏しいため、純粋にマンノースクロリンを用いても光化学反応による悪性脳腫瘍細胞株の殺細胞効果が得られるという結果を示したに過ぎないが、これらの知見は悪性脳腫瘍研究における世界初の知見であり、論文として公表することができている。

今後はマウス脳内グリオーマモデルや皮下グリオーマ移植モデルなどを用いたin vivo実験系で、実際にM2をターゲットとしたPhotoimmunotherapyの可能性を探索してゆきたいと考えている。Mannose-conjugatedchlorineを用いたPITの殺細胞効果をin vivo modelで検証する実験系をすでに確立している。Balb C nude mouse、およびBalb c mouseの下肢皮下に、ラット由来の悪性髄膜腫細胞株KMJ-Y cellを1x106個移植し、腫瘍増殖曲線をすでに確立している。移植後2週間において5x5mm径の皮下腫瘍が形成され、漸次増大し、移植後6週の時点でマウス腫瘍volumeは20x20mmを超えることとなった。Sacrificeしたマウスから得られた腫瘍組織は、著明な壊死や血管増殖を伴う悪性髄膜腫組織であり、Balb Cに移植した腫瘍には多数のマクロファージが浸潤していることを抗CD68抗体を用いた免疫染色で確認している。今後は両マウスに対する皮下移植モデルに対し、移植2週間の時点で、一定量のtalaporfinsodium、およびmannose-conjugate chlorineを投与し、局所に一定エネルギーのレーザ照射を行うことによるin vitroでの腫瘍制御効果を比較研究する。解析方法は一般的な病理形態的解析に加え、免疫組織化学的検討、flow cytometerを用いた増殖相解析、apoptosis解析を行う。さらにレーザ照射後の経時的な凍結組織からDNAを抽出し、腫瘍増殖制御の過程で変化している遺伝子発現を同定し、PDTおよびPITの作用機序の解明を図りたい。次年度に行う動物実験の経費として用いる予定である。具体的にはBalb Cマウス購入費用、各種病理組織検体検索に用いる、薬剤や抗体などに使用する。
新手法を用いた、C型肝炎ウイルスの構造蛋白の抗原構造解析

C型肝炎ウイルス(HCV)は、構造蛋白として一つのコア蛋白と二つのエンベロープ糖蛋白を有している。コア蛋白のアミノ酸配列はHCV変異株間でよく保存されており、その高次構造および抗原構造の解析は、HCVの生態や肝炎の病態、防御免疫の解明に重要であると考えられる。そこで本研究では、オ-センティックなコア蛋白の抗原構造を解析した。大腸菌発現コア蛋白をマウスに免疫して数十種類の抗コア単クローン抗体を作製し、このうちHCV感染者の検体中のオ-センティックなコア蛋白を認識できるもの39種類を、患者肝組織破砕物を用いたキャプチャーPCR、および患者血清を用いた競合的結合阻止試験によって選択し、これらを以後の解析に供した。各抗体間でのコア蛋白に対する競合的結合阻止試験を、表面プラズモン共鳴現象を利用した抗原抗体反応解析システム(ファルマシア社、ビアコアシステム)を用いて行ない、この結果から、これらの抗体が認識しているコア蛋白上のエピトープはAGの7群に分類することができ、さらにA,D,F群、C,E,G群およびB群がそれぞれ一つずつの抗原ドメインを形勢していることが明らかになった。またコア蛋白の予測される一次構造に従って全体をカバーするように多数の合成ペプチドを作製し、マルチスキャンニング法により解析した結果、A,F,G,E群のエピトープは、それぞれコア蛋白のN末端から2837、4348、7177、104111残基の付近に位置するリニアエピトープであることが判明した。一方、D,C,B群はコンフォーメ-ショナル(アセンブルド)エピトープである可能性が示唆され、合成ペプチドライブラリーを用いて解析を進めている。本研究では、単クローン抗体が認識するエピトープのグル-ピングを通じて、オ-センティックなコア蛋白の抗源ドメイン構造を解析することができた。以上の研究成果の一部は、第43回日本ウイルス学会総会(平成7年10月)にて発表した(現在、英文学術誌投稿準備中)。
アフリカツメガエルをモデル系とした体軸形成に重要な遺伝子群の網羅的解析

アフリカツメガエル初期胚は背側決定因子beta-cateninの局在から体軸の形成が始まる。我々はbeta-cateninが直接誘導する遺伝子群を同定することで、体軸形成に重要な遺伝子の網羅的なスクリーニングを試みた。具体的には、816細胞期のアフリカツメガエル初期胚の腹側帯域(ventral marginal-zone)に野生型beta-catenin mRNA及び機能喪失型beta-catenin mRNAをそれぞれマイクロインジェクションし、zygoticな転写が始まってすぐのステージ(stage 8.5)までインキュベーションする。Stage8.5胚に達した後、インジェクションした領域を切り出しtotal RNAを回収した。その後total RNAからcDNAプールを作製、プローブ化した後、サブトラクティブスクリーニングを行なった。予備段階の実験からbeta-cateninによって誘導される事が知られている既知の遺伝子Siamois、Chordinなどが単離され、スクリーニングがうまく機能していることが明かとなった。6000クローンのcDNAライブラリーをスクリーニングした結果、オーガナイザー形成に重要である事が知られている遺伝子がいくつか同定され、それとともに機能の明らかで無い遺伝子もいくつか同定できた。それらの中にはショウジョウバエの初期発生に重要であると考えられている転写因子なども含まれており、現在アフリカツメガエル初期胚を用いて機能を解析中である。これまでXenopusではゲノム解読が遅れていたせいもあり、網羅的にスクリーニングする手段(cDNAマイクロアレイなど)に制約があった。しかし最近cDNAマイクロアレイに強い実績を持つアフィメトリクス社が一万以上のcDNAが搭載されたXenopus Gene Chipを商品化し、ようやく他の種同様網羅的な解析が簡便にできるようになった。現在、cDNAマイクロアレイを利用したより広範なスクリーニグを行なっているところである。
食欲調節作用を有する低分子ペプチドの探索と作用機構の解析

食欲調節におけるプロスタグランジン(PG)類の役割を明らかにするため、飢餓状態における視床下部PG合成酵素の発現量の変化を測定し、リポカリン型PGD2合成酵素の発現量が上昇することを見出した。PGD2がDP1受容体を介して摂食促進作用を示すとともに、DP1受容体を阻害することにより摂食量、体重、脂肪量が著しく低下することから、PGD2はエネルギー不足状態で活性化される新しい摂食促進因子であり、食欲調節に重要な役割を演じていることがわかった。一方、PGD2の構造異性体であるPGE2はEP4受容体を介して摂食抑制作用を示すが、angiotensin AT2アゴニストのnovokininが、本経路を活性化する経口投与で有効な摂食抑制ペプチドであることを明らかにした。また、中枢神経系にも存在するangiotensin IIがAT2受容体の下流でPGE2-EP4経路を活性化し、摂食抑制作用を示すことも明らかにした。菜種タンパク質由来の摂食抑制ペプチドArg-Ile-TyrがCCK分泌能を有することをSTC-1細胞を用いて明らかにした。また、本ペプチドは動脈弛緩作用ならびに血圧降下作用を有するが、動脈弛緩作用がコレシストキニン(CCK)放出を介することを明らかにした。これはCCK自身が動脈弛緩・血圧降下作用を有することを示唆する重要な実験結果である。なお、大豆タンパク質由来のグレリンアゴニストペプチドを探索したが、新規ペプチドの同定には至っていない。現在検討中である。米アルブミン由来の生理活性ペプチドoryzatensin(GYPMYPLPR)のC末端側5残基のアミノ酸配列をもとに設計した補体C3aアゴニストペプチドのWPLPRが、経口投与により食欲抑制作用を示すことを見出した。WPLPRの食欲抑制作用はプロスタグランジンE2の4種類の受容体サブタイプのうち、EP4受容体のアンタゴニストで阻害されることから、WPLPRはEP4受容体を活性化することにより、食欲抑制作用を示すことを明らかにした。さらに、プロスタグランジン(PG)E2自身が、EP4受容体を介して食欲抑制作用を示すことを初めて見出した。また、ナタネ蛋白質由来の3残基の血圧降下ペプチドであるRIYをマウスに経口投与したところ、食欲抑制作用を示すことを報告した。RIYは、コレシストキニン(CCK)受容体に親和性を示さないが、RIYの食欲抑制作用がCCK受容体アンタゴニストによって阻害されることから、RIYは、CCK分泌を促進することにより、食欲抑制作用を示すことが判明した。なお、食欲調節に重要なグレリン受容体に親和性を示す低分子ペプチドを設計し、本ペプチドが食欲促進作用と成長ホルモン分泌促進作用を有することを明らかにした。現在検討中である。
補修用部品の経済的生産・保管・供給の研究

すでに生産が打ち切られた製品の補修用部品について、その確実な供給を経済的に実現するには、「いつ、どれだけの量を生産し、保管するか」が重要な問題である。本研究においては、この点について耐久財生産企業での実態調査を行い、これをもとに問題を定式化し、企業にとっての適切な生産・在庫・供給計画方法の提案を試みた。結果は以下のとおりである。1)長期間の在庫保持によって発生する保管コストならびに資本のコストと、長期間の生産設備および生産技術を維持するためのコストに着目し、将来の需要が既知との条件のもとで、これらのコスト全体を最小化する計画方法を導出し、さらに法人税等所得関連税の影響も考慮した計画方法を導出した。2)製品本体ならびに当該部品の寿命がそれらの物理的劣化によってのみ決定される場合を取り上げ、将来の補修用部品の需要の予測を行ったうえでの、前出のコストに死蔵品の保管ならびに廃棄のコストを加えた総コストの期待値を最小とする計画の策定方法を導出した。3)製品本体の寿命が経済的要因など非物理的要因によっても左右される場合は、補修用部品の需要の予測が困難であることが多い。このような場合、将来における多数の可能なケースを想定して計画を作成することになるが、これに多目標計画法を導入することを考え、定式化を行い、シミュレーションにより有効性を検証し、有効であるとの結論を得た。以上の3つの結果について現在は未発表であるが、1)および2)に関しては論文投稿準備中であり、3)についても追って発表予定である。なおこれらは、部品を1品目にしぼった場合の方法であり、他の部品の生産・保管・供給とは独立に計画を策定できることを前提としている。相互に関係を持つ複数の部品を対象とした計画の策定方法を提案することが、今後の課題として残った。
インピーダンス変化に基づくワイヤレス充電状況推定システムの開発

本研究は非接触充電時における2次側でインピーダンスの変化(すなわち充電状況)に注目し、その変化から充電状態を推定するシステムを確立するものである。23年度前期は震災影響により破損した非接触電力伝送に関わる研究資料(コイル)の再作製および研究室の実験環境整備に注力した。これに並行して、非接触電力伝送回路をT型簡易等価回路で表現し、2次側のインピーダンス(負荷抵抗)を1次側パラメータ(インピーダンス、力率)から推定する充電状況推定式の導出を進めた。23年度中期には、上述の推定式の妥当性を確認するために、金属ケースを有しない一般的な非接触電力伝送でバッテリーを充電し、充電状況推定の評価を行った。また、2次側負荷をバッテリーではなく,抵抗とL成分をC成分を有した負荷を接続した場合にインピーダンスの推定にどのような影響を及ぼすか、その挙動を把握した。その結果、位置ずれのない場合には1次側から体内の充電状態を十分に推定可能であることが確認できた。これより基本的な非接触電力伝送システムに本充電状況推定方法が適用可能である良好な結果が得られた。23年度後期には、本研究が目標としている心臓ペースメーカへの適用に向って、2次側コイルをチタンケースに封入した実装状態において同様の非接触電力伝送を行った。その結果、実測値と推定値に大きな差異が認められ、実際よりもインピーダンスの変化が少なくなる(満充電に見えない)推定結果を示すことが初めて判明した。この差異は伝送コイル間にチタンケース(金属)が介在したことによるものと考えられる。今後は、チタンケースの影響(鉄損)を考慮した新たな推定式を検討していく予定である。また、本推定式にはコイルの結合係数(結合度合)が式中に含まれるため、コイル位置ずれにより推定結果が変化する特性を必然的に持つため、この影響を受けない、または補正可能な推定式についても検討する。
治療抵抗性関節リウマチ患者におけるタクロリムスの薬効・副作用の変動予測法の構築

関節リウマチ患者におけるタクロリムスの遺伝子多型の影響を検討した。その結果、タクロリムスの代謝に関与するCYP3A5において、*1アレルを有する患者はタクロリムスの血中濃度が低下しその結果、タクロリムスによる治療の中断率に影響を及ぼしている可能性が示唆された。また、タクロリムスによる治療で懸念される重度の腎機能障害などの副作用は今回の患者群ではみられなかったが、もともと低用量による治療であったため代謝酵素や薬物輸送担体の遺伝子多型の影響をほとんど受けなかったと考えられた。平成24年度は患者登録を進め、昨年度確立したLC/MS/MS法を用いて関節リウマチ患者におけるタクロリムスの血中濃度の測定を行うとともに、タクロリムスの代謝に関与するCYP3A5と薬物輸送担体のABVB1の遺伝子多型の解析を進めてきた。CYP3A4およびABCB1の遺伝子多型の解析には、PCR-RFLP法を用いて行った。また、CYP3A5やABCB1以外にも、タクロリムスの薬物動態に関与する可能性のある、CYP2C19、CYP3A4、CYP3AP1およびCYP3A7においても同様の方法を用いて解析を行った。患者登録は現在の時点において40名を超えている。そして、現時点において各遺伝子多型の頻度は過去に報告されているものとほぼ同様であり、登録された患者群は偏ったものではないことを確認している。LC/MS/MS法によって測定されたタクロリムスの未変化体と活性代謝物の血中濃度と、各代謝酵素および輸送担体の発現群および非発現群に層別化し、現在解析を行っている。CYP3A4*18やCYP3A7*1Cのアレル頻度は日本人において約数%程度であることが報告されており、実際本研究においても解析できる症例数を確保するには至っていない。しかし、CYP3A5*1のアレル頻度は20%程度であることが報告されており、本研究においてもほぼ同様のアレル頻度がみられており、解析可能な症例数を確保できたと考えている。またABCB1のC1236Tにおいては、それぞれの群において解析可能な症例数を確保しつつあると考えている。平成25年度は昨年度に引き続き、タクロリムスおよびその代謝物の血中濃度の測定およびCYP3A5、ABCB1、CYP2C19、CYP3A4、CYP3AP1およびCYP3A7の遺伝子解析を行い、症例数の増加をはかり解析の精度を高めた。平成24年度までに40症例を集積したが、平成25年度はさらに15症例の追加を行った。その結果、ABCBのC1236Tに加えて、C3435Tの解析が可能な症例数を確保した。また、各それぞれの遺伝子多型のアレル頻度に偏りがないことを確認している。得られた薬物代謝酵素や薬物輸送担体における各遺伝的背景の違いにより、タクロリムスの代謝物と未変化体の比に統計学的な違いがあるか解析を進めている。タクロリムスはTDMを行って投与量を決定するが、通常の投与量では血中濃度が確保できない患者が存在することから、こうした遺伝的背景が影響を及ぼしていることが予想され、本仮説を検証するために本研究を遂行している。本結果は、目標とするタクロリムスの血中濃度が確保できない患者における遺伝的背景を明らかにすることにより、初期投与量の設定のみならず適切なタクロリムスの増量や生物学的製剤への治療方針変更などを考慮が可能となり、迅速に治療の最適化に貢献できるものと期待される。さらに、タクロリムスは従来の適応に加えて多発性筋炎・皮膚筋炎に合併する間質性肺炎の適応が追加されたことから、本研究結果は関節リウマチ患者による結果であるが関節リウマチ患者以外の患者についても応用が期待でき、本研究結果の重要性が増して規きている。平成23年度は、LC-MS/MS法を用いたタクロリムス血中濃度測定法を確立した。本測定法は、LC条件として、移動相には酢酸アンモニウムを含むアセトニトリル溶液を、内部標準物質にはリトナビルを用いた。MS条件として、TSQ7000を用いたESI法にてイオン化を行った。キャピラリー温度は300°C、ポジティブイオンモードで測定を行い、モニターイオンサイズはタクロリムスでm/z=616.2、リトナビルでm/z=573.0/743.1とし、衝突エネルギーは-29eVとした。ピーク面積を用いた内部標準法により作成した検量線では、標準溶液および血液にタクロリムスを添加したサンプルの両方において、0.1から20ng/mLの濃度域において直線性を示した。また分析バリデーションを実施し、0.5から20ng/mLの濃度域において測定間および測定内の真度と精度は、FDAのガイダンスに適合していることを確認した。

当院におけるTDMの結果から、ヒトにおけるタクロリムス内服12時間後のタクロリムス血中濃度は、0.5から20ng/mLにほぼ収まることを確認しているので、本研究によって確立されたLC-MS/MSを用いたタクロリムス測定法は、関節リウマチ患者におけるタクロリムス血中濃度測定に有用であることが示唆された。本研究は、タクロリムスの薬効の指標としてタクロリムスによる炎症性マーカーの抑制を用い、薬効とタクロリムス血中濃度の関係を明らかにすることを一つの目的としているため、本測定法の確立は目的達成のため重要性が高い成果である。平成26年度は、症例の増加を見込んで引き続きタクロリムスと代謝物の血中濃度の測定と代謝酵素および排泄に関与するトランスポーターの遺伝子多型(CYP3A5、ABCB1、CYP2C19、CYP3AP1およびCYP3A7)についての測定を試みた。当院における関節リウマチの薬物治療が、内服薬による治療から生物学的製剤を用いた治療にシフトしており、すべての遺伝子多型に対して統計解析を行いうる十分な対象症例の症例数の増加を図ることができなかった。結果、現在までに集まった70例の症例数で統計解析を行った。その結果、CYP3A5、ABCBのC1236TとC3435Tの3つの遺伝子多型について、過去に報告されているアジア人のアレル発現頻度に対して偏りなく症例数を確保することができたことは、昨年度までと同様であった。それぞれの遺伝子多型において、タクロリムスとその代謝物の一つである13-O-脱メチル体の濃度比について統計解析を行った。さらにCYP3A5において、*1アレルをもつ患者は、治療中断率が高い結果が得られた。ただし、タクロリムスの中止理由はタクロリムスの血中濃度の変動よりもこれらの患者においてタクロリムスによる治療抵抗性がみられたことが主要因であった。なお、本治療は低用量による治療であることから、血中濃度比とeGFRの値に弱い相関がみられているものの、重度の腎機能低下などの副作用は全例においてみられなかった。医療薬学昨年度までは研究着手の遅れから患者登録ができなかったが、本年度は患者登録を進め、ほぼ予定通りの症例数をえることができている。遺伝子多型の解析においては、CYP3A5に加えて他の代謝酵素および薬物輸送担体についても実施することができている。にまたタクロリムスの未変化体および活性代謝物の血中濃度の測定および代謝酵素および薬物輸送担体の遺伝子多型も解析を行うことができており、ほぼ当初の予定通り研究が進捗しているものと考える。予定していた症例数はほぼ確保しており、それに伴い未変化体と代謝物の血中濃度比と各薬物代謝酵素や薬物輸送担体の遺伝子背景の関係については解析が進行できている為、症例の集積については進行状況はほぼ順調と考える。ただし、CYP3A5*1、CYP3AP1*1、CYP3A4*18およびCYP3A7*1Cの遺伝子多型はアレル頻度が少ない為、ホモ単独で解析できる状況ではないことから、遺伝背景に基づく初期投与量設定を算出するには至っていない為、さらなる症例数の追加が必要と考える。震災による医薬品の供給困難に対応していたため、研究の着手に大幅な遅れが生じたことと、一部の生物学的製剤の安定供給が確認されるまでは患者登録を進めることができなかったことが主な原因である。引き続き可能な限り患者登録を進めて、タクロリムスおよび代謝物の血中濃度の測定と薬物代謝酵素および薬物輸送担体の遺伝子多型の解析を行う。
転写因子導入による蝸牛有毛細胞の分化誘導

○tet-onマウス蝸牛のotosphere作成:iPS干渉法ではotosphereに転写因子とSox2、Oct3/4、Klf4、c-Mycの初期化4因子を導入する。この際、導入効率のばらつきを最小限にするため、初期化4因子をendogeneousに発現するdoxycycline(Dox)投与によるtet-on発現マウスを用いる。H28のICRマウスでのプロトコールに従ったところ、得られたotosphereは1回の継代をはさみ8日間の維持培養が可能であった。○otosphereからiPS細胞樹立:所属研究室にて既に確立していたDoxマウスのMEF(マウス胎仔繊線維芽細胞)からのiPS細胞樹立プロトコールをもとに検討を進めた。MEF由来では2週間でコロニー形成が確認されたが、Otosphere由来では1ヶ月以上を要した。得られたコロニーにつき、幹細胞マーカー(SSEA-1、ALP)で染色した結果、強陽性コロニーは5-10%であった。そこでiPS細胞樹立を促進する目的で、様々な誘導剤の併用を試みたが、顕著な効果は見られなかった。○昨年度の研究成果「Otosphereのマイクロアレイ解析による内耳幹・前駆細胞の維持に関わる転写因子の同定(Iki T, et al., PLOS One)」から、蝸牛感覚上皮に比べotosphereで有意な発現上昇を認めた遺伝子の中からCD14に注目し、検討を進めた。まず、qPCRならびにフローサイトメトリーにより、otosphereでの発現上昇を再確認した。また免疫染色像では、マウス蝸牛感覚上皮において、CD31陽性血管内皮細胞やIba1陽性マクロファージ細胞とは独立して局在するCD14陽性細胞が確認された。〇適切なotosphereの作成、回収ICRマウスの蝸牛細胞を単離培養し、otosphereを作成した。otosphereのうち、solid typeは前駆/幹細胞を含有するが、培養中前駆/幹細胞を喪失したhollow typeに形態変化することがある。マイクロアレイ解析を行うにあたり、hollow typeを混入防止のため、hollow typeが増殖しない培養条件および除去する方法を検討したところ、1回の継代を挟み8日間の維持培養が妥当であった。また培養するに従い、両者のサイズの違いが鮮明となり、セルストレイナーで分離可能であった。その結果、90%以上の純度でsolid typeのotosphereを回収することが可能となった。〇蝸牛由来の前駆/幹細胞における遺伝子発現の網羅的解析otosphereサンプルを6回にわたり回収し、ES細胞、コルチ器、MEFを比較サンプルとして、RNAを抽出しマイクロアレイを行った。マイクロアレイより得られた結果は研究協力者である田中が解析した。クラスタリング解析でotosphereサンプル同士の異質性が少ないことが確認された。マイクロアレイ解析の妥当性を検討するために、代表となる約50の遺伝子に対し、qPCRで遺伝子発現を調べ、いずれもマイクロアレイ解析の結果と矛盾しなかった。〇候補転写因子の抽出GO解析で"transcription, DNA-binding, DNA-dependent"のannotationを有する遺伝子を転写因子と考えて、候補転写因子の抽出を行った。発現量においてotosphere>ES細胞、otosphere>コルチ器、otosphere>MEFをそれぞれ満たす転写因子をotosphereでの発現量が高い順に順位をつけ、3つのグループでつけられた順位を転写因子ごとに平均化する。平均化された順位を良いものから100個選択して、これらを候補転写因子とした。可及的にsolid typeのotosphereのみを回収する必要があり、成長因子の種類、濃度といった培地の検討、培養日数の検討を要した。それでもhollow typeのotosphereは混在してくるため、分離法についての検討にも時間を要した。マイクロアレイ解析の妥当性についてqPCRで検討を行ったが、約50の遺伝子に対するプライマー作成において、増幅効率が悪いなどの原因で数回配列の変更を余儀なくされたプライマーがあった。これによりqPCR施行回数の増大、特にotosphereサンプルの不足を招き、数ヶ月時間を割く必要があった。iPS干渉法を用いて、otosphereへの分化転換に必要な転写因子を選定していくため、otosphereにレトロウイルスでの転写因子の導入を行うこととした。前年のマイクロアレイ解析の結果から得られた100個の候補転写因子うち95個について、個々の転写因子のオープンリーディングフレーム(ORF)をクローニングした後、pMXをバックボーンとするプラスミドベクターにサブクローニングした。〇otosphereのcharacterの調査マイクロアレイ解析により得られた遺伝子発現において、幹細胞としての性質を調べるため、ES細胞と蝸牛感覚上皮細胞との比較解析によりotosphereとES細胞で発現の高い遺伝子を抽出した。これらの遺伝子について、遺伝子オントロジーエンリッチメント解析を行ったところ、「幹細胞らしさ」という単語を含む遺伝子オントロジーは認めなかったが、「細胞周期」にかかわる遺伝子を複数同定した。いくつかは細胞周期を抑制する働きを持つ遺伝子であり、培養の影響が関わっている可能性が示唆された。さらに転写因子の抽出を行ったところ、Trib3、Klf5、Hmga2といった多能性に関連する転写因子を同定した。この結果については、論文化し、PLOS ONEに投稿発表した。また、otosphereのみに高発現する転写因子も抽出し、qPCRを行って、確かに発現が高いことを確認した。otosphereに特異的に発現する遺伝子については表面マーカーを同定し、qPCRでも高発現であることが示された。

転写因子のORFを作成し、クローニングする過程に大幅な期間を要してしまった。サブクローニングに関しては同一の制限酵素で切り出しができるよう、塩基配列を工夫した結果、順調に進んだ。○tet-onマウス蝸牛のotosphere作成:iPS干渉法ではotosphereに転写因子とSox2、Oct3/4、Klf4、c-Mycの初期化4因子を導入する。この際、導入効率のばらつきを最小限にするため、初期化4因子をendogeneousに発現するdoxycycline(Dox)投与によるtet-on発現マウスを用いる。H28のICRマウスでのプロトコールに従ったところ、得られたotosphereは1回の継代をはさみ8日間の維持培養が可能であった。○otosphereからiPS細胞樹立:所属研究室にて既に確立していたDoxマウスのMEF(マウス胎仔繊線維芽細胞)からのiPS細胞樹立プロトコールをもとに検討を進めた。MEF由来では2週間でコロニー形成が確認されたが、Otosphere由来では1ヶ月以上を要した。得られたコロニーにつき、幹細胞マーカー(SSEA-1、ALP)で染色した結果、強陽性コロニーは5-10%であった。そこでiPS細胞樹立を促進する目的で、様々な誘導剤の併用を試みたが、顕著な効果は見られなかった。○昨年度の研究成果「Otosphereのマイクロアレイ解析による内耳幹・前駆細胞の維持に関わる転写因子の同定(Iki T, et al., PLOS One)」から、蝸牛感覚上皮に比べotosphereで有意な発現上昇を認めた遺伝子の中からCD14に注目し、検討を進めた。まず、qPCRならびにフローサイトメトリーにより、otosphereでの発現上昇を再確認した。また免疫染色像では、マウス蝸牛感覚上皮において、CD31陽性血管内皮細胞やIba1陽性マクロファージ細胞とは独立して局在するCD14陽性細胞が確認された。候補となる転写因子を用いてiPS干渉法を行うため、iPS細胞にレトロウイルスでの転写因子の導入を試みる。pMXをバックボーンとするプラスミドベクターに個々の転写因子のORFをクローニングする予定である。iPS干渉法ではotosphereに転写因子とSox2、Oct3/4、Klf4、c-Mycの初期化4因子を導入する予定であるが、導入効率のばらつきを極力抑えるため、初期化4因子はendogeneousに発現するように工夫する。すなわちdoxycycline (Dox)投与で4因子を発現するtet-onマウスの蝸牛からotosphereを作成して、転写因子を導入後、Doxを添加して、培養を行い、iPS細胞へと変化するか観察する。まずはマウスが手に入り次第、転写因子を導入しない場合のotosphereの初期化効率について確認する。
国際化と地域化の下での国家の役割変化とその市民生活への影響に関する国際比較研究

現代社会において、国際化と地域化が、経済のみならず政治の領域においても進展する中で、近代市民革命以来確立されてきた近代立憲主義、民主主義、基本的人権、国家および地方制度などの理念および制度が変貌を迫られている。これらの日欧における変化について、国際共同研究および国際シンポジウムの場を組織・研究を行い、成果を公表することができた現代社会において、国際化と地域化が、経済のみならず政治の領域においても進展する中で、近代市民革命以来確立されてきた近代立憲主義、民主主義、基本的人権、国家および地方制度などの理念および制度が変貌を迫られている。これらの日欧における変化について、国際共同研究および国際シンポジウムの場を組織・研究を行い、成果を公表することができた平成19年度は、国家の役割変化とその市民生活への影響に関する研究を以下の分野で継続した。今年度はとりわけ基本的人権の現代的変容の問題に関して、目仏共同で研究を進めた。具体的には基本的人権に関する一般理論の変容に関する論点として、人権の担い手としての個人に関する論点、公的自由の概念から基本権概念への変容に関する論点、および人間の尊厳に関する論点に関して研究を進め、また行政および司法と基本的人権に関する論点として、憲法訴訟、対テロと司法、地方制度と司法に関して、さらに基本的人権の今日的変容に関する論点として、科学と人権、人権擁護の指標・目標に関して、研究が進められた。本研究の意義および重要性は、ヨーロッパとアジアにおいて進行している国家の役割の変容現象に関して、日仏を中心とした研究者が、対等に分析し、相互討論を行い、これらの変容現象の異同を検討することに有る。本研究は、平成20年3月12目から14日の日程で、福岡大学および九州大学にて国際シンポジウム・第8回日仏公法セミナーを開催し、成果を公表した。同シンポジウムの開催により日本からの情報発信が弱いフランス語圏の研究者に情報発信を行う事が出来る点でも本研究の成果公表の重要な意義がある。同シンポジウムの成果は、日仏双方で刊行するように準備がなされている。なお18年度にフランス・モンプリエ大学で開催した国際シンポジウムの成果は、フランス語出版物『Les mutations contemporaines de la democratie』(ISBN:978-2-7518-0058-0)として刊行した。平成20年度は、関西学院大学(5月)、國學院大學(10月)、慶応大学(1月)、工学院大学(1月)、立命館大学(2月)において研究会を開催するとともに、最終年度として、過去2年度のまとめを行った。とりわけ、20062008年度にかけて実施した国際シンポジウム(2005年9月ストラスブール第3大学(国家論の諸問題)、2006年9月20-22日モンプリエ第3大学(Les Mutations contemporaines de la Democratie)、2008年3月12-14日九州大学・福岡大学(Les mutations contemporaines des Droits Fondsmentaux))で扱われた国家論、民主主義論、基本権論に関する論点を整理し、出版の準備を行うとともに、これまでの研究成果を統合するためにLa science du droit constitutionnelを主テーマとして、2009年度にフランス・リール大学において国際シンポジウムを開催すべく準備を行った。主として扱われた論点は、国際化と地域化が進行する中で、多様化する国民のあり方と地域的に混住する諸民族の間で問題となる国家制度と地域制度の関係と整備の在り方であり、民主主義の概念を議論するとともに、選挙制度・市民自治・住民参加制度・セーフティネット・ジェンダーなど個別の論点を整理した。福岡シンポジウムの成果は、近目中に、日仏で出版すべく交渉を行っている。
非線形微分方程式の解の構造の研究

研究の内容は大きくわけて、2つある。一方は自由境界を伴う汎関数に対する変分問題に関するものであり、もう一方は非線形熱方程式の解の構造に関するものである。1.自由境界を伴う汎関数に対する変分問題に、離散的勾配流という概念を導入し、停留点の存在問題に適用してみた。離散的勾配流とは、勾配流を時間方向に差分化したもので、それ自身変分法を用いて定義される。ここでは、必ずしも最小点とは限らない停留点に収束する離散的勾配流の存在が示された。また、離散的パラメーターを0に近づけたときの勾配流の漸近挙動について論じ、それが部分例に沿って収束する事を示した。2.熱方程式の初期値問題の解の一意性について、従来から知らているTychonoff,Widder,Li,Dodziuk,Li-Karpらの諸結果を、特別な場合として含む結果を得た。応用として、調和写像に対する勾配流の一意性を示す事ができる。また、非線形境界条件を伴った熱方程式の初期値境界値問題の解の爆発について、従来から知られている結果よりも、仮定をゆるめた定理を示した。またその証明も、これまでのものよりもはるかに容易で、なおかつ爆発時刻の上からの評価も得られる。更に、解の一意性の無いある半線形熱方程式の解の集合の構造を調べた。これまでに、解の集合が連結であるという、常微分方程式論のKneserの定理に相当するものが知られていた。ここでは、与えられた熱方程式の解は、ある常微分方程式の解でもある事を示し、議論を容易にした。
幕末から明治にかけて開発された鉱山の鉱石に関する調査・研究

本年は、以下の鉱山などで資料調査をおこなった。富山県大山町亀谷鉱山、兵庫県和田山町朝日鉱山、島根県大田市石見鉱山、島根県協和町津和野笹ヶ谷鉱山、静岡県河津町縄地鉱山、静岡県下田市河津鉱山、鹿児島県大口市山ヶ野鉱山、鹿児島県入来町入来鉱山、鹿児島県吹上町平鹿倉鉱山、同町豊城鉱山。これらの施設のうち、鉱山の古い廃石堆積場所では、低品位の鉱石ならびに母岩の収集をおこない、鉱石を構成する鉱物の種類などを調べた。詳しいX線回折実験や化学分析などは現在進行中である。また、「江戸のモノづくり」A03班で行なわれたシンポジウム「生産遺跡から探る「モノづくり」の歴史」(第1回金山・銀山の技術)に出席し、貴重な情報を得ることができた。また、戦国時代から江戸時代まで採掘されていた湯之奥金山遺跡のことを展示する湯之奥金山博物館を見学し、考古学的見地での解析と鉱物学的な解析とでかなりの差があることもわかった。特に、古い時代の鉱石そのものは、ほとんど分析がされていない上に、製品となった金銀貨幣類の精密な分析もされていないことが判明した。古い金銀鉱山では、鉱石を粉にし、水による選鉱をした残りのカス(ゆりかす)が廃棄されているが、この中にかなり金銀が残されているようで、今後はこれらの精密な化学分析などが必要であることがわかった。本年は、以下の鉱山、資料館、博物館などで資料調査をおこなった。石川県小松市尾小屋鉱山、石川県立鉱山資料館、秋田県比内町立又鉱山、秋田県鷹巣町明利又鉱山、秋田県協和町亀山盛鉱山、秋田県角館町日三市鉱山、岩手県湯田町和賀仙人鉱山、岩手県湯田町鷲の巣鉱山、東北大学理学部自然史標本館、秋田県鹿角市尾去沢鉱山、鹿角市鉱山歴史館、小坂町立総合博物館郷土館、重要文化財小坂鉱山事務所、秋田大学附属鉱業博物館。詳しい化学分析などは現在進行中である。また、各資料館や博物館に保管されている鉱石を調べたので、化学分析などができる〓片が提供していただけるかどうかを打診しつつある。なお、確実に古い時代とわかる精錬カス(カラミ)を収集することはかなり困難であることがわかった。初期の鉱山の多くは、金銀鉱石を採掘対象にしていたが、後に金銀鉱石の枯渇や精錬技術の向上によって銅、鉛、亜鉛などに対象を移していっている。初期の鉱石を得るためには、かなり古い坑道あるいは廃石堆積場所を見つけなければならない。今後の問題点である。このような点からも、今後は古い時代を特定できる鉱石やカラミが発見されれば、きわめて貴重な資料となることは確実である。