hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
安全に着目した英・豪小学校空間の計画手法

小学校施設に求められる機能の変化への対応、児童を取り巻く治安環境の悪化等が課題となっている。本研究では英・豪における小学校施設を対象として、児童の安全に対する責任範囲、ハード・ソフト面での安全確保の手法、及び、地域への利用の開放のルール・実態等を明らかにし、研究成果の日本への適用について検討を行った。調査方法は、政府・学校長へのインタビュー調査、事例校実地調査、児童へのアンケート調査、文献調査である。本研究の初年度である平成19年度は、小学校の安全に関する近隣住民へのアンケート調査(海外との比較対象として、19年度は日本で実施。2007年8月。)及び分析作業、2007年12月のオーストラリア実地調査により、以下の研究実績を得た。●主体関与の状況:各主体へのインタビュー調査を行い、主体毎の安全に対する責任範囲を明らかにし、安全確保の手法を抽出した。また、教育省の施設の安全確保に関する指針資料を得た。インタビューの対象は、カールトン小学校(ニュータウン)副校長:Gail Sadleir氏、アルティモ小学校(都心部)校長:Stephanie Searle氏、また、教育省設計局:Stewart Morgan氏である。●安全への要望レベル(「児童の安全」に対する意識の抽出)及び地域住民の小学校施設に期待する機能の抽出:海外との比較対象とするために、平成19年度は日本(岐阜県多治見市)において、近隣住民へのアンケート調査を実施した(500件配布、156件回収)。児童の安全の為に実行している内容、責任範囲について、小学校施設の利用実績等の分析を行なった。現在、カールトン小学校、アルティモ小学校において、同内容のアンケート調査を実施するための調整を行なっている。●境界の状態等について、インタビュー対象校において実地調査を行なった。対象校のうち、アルティモ小学校は、2002年に大規模改修を行なっている。その際の工事内容等について、インタビュー及び図面等の資料を得た。本申請研究の第1の目的は、豪英における小学校空間の安全確保に関する諸課題について整理することである。平成20年度は、主として以下の内容を達成するために豪・英での調査を実施し、必要なデータの収集を行った。(1)安全の概念の整理:各主体が責任を負うべき安全の範囲、守るべき安全について整理する。(2)安全確保の手法の抽出:人と空間の関係・安全のレベル・危険の種類と対処方法について抽出する。(3)安全確保の為の諸条件の整理:事例調査により、各国の小学校施設の建築的条件の整理を行なう。(4)小学校施設に対する児童の印象評価の抽出:地域開放・安全確保の前提として、児童が小学校空間をどのように評価しているのかを明らかにする。●オーストラリア調査【2008.8.7.-12.】インタビュー実施先:●イギリス調査【2009.3.16.-3.22.】インタビュー実施先:本申請研究の第1の目的は、豪英における小学校空間の安全確保に関する諸課題について整理することであり、平成19-20年度に調査・データ収集はほぼ完了した。平成21年度はこれらの成果のまとめ、及び、豪英の安全確保手法を日本へ適用することを検討した。●平成21年度実施内容:(1)オーストラリアでの実地調査、(2)日本の小学校(名古屋市全小学校)のデータ収集・分析、(3)名古屋市教育委員会・事例校へのインタビュー調査、実地調査を行った。(1)オーストラリア調査【平成21年8月8日8月16日】インタビュー及び実地調査Ultimo Public School、シドニー日本人学校他(2)日本の小学校データ収集・分析:名古屋市立小学校全校の平面図を収集し、校舎配置・出入り口等のデータを入力し、類型を行った。(型毎の安全確保手法の検討の為の基礎資料)(3)インタビュー調査・事例調査(5校)【平成21年11月9日12月1日】主として上記(1)(3)の項目について実施した。豪英との主体の責任範囲の違い、ハード・ソフト面での課題が明らかとなった。
潤滑油分解による鋼への水素侵入挙動の解明およびDLCの水素侵入抑制効果の検討

本研究では,摩擦による潤滑油のトライボ化学分解で生成した水素が鋼への侵入過程の可視化方法を確立するとともに,DLCコーティングによる水素侵入の抑制効果を検討することを目的とした。2018年度には,低摩擦発見のためにDLCにおける潤滑油の仕組みを調べ,DLCコーティングにおける潤滑油のトライボ化学分解を解明することを計画した。本研究では,炭素のみから成る膜(ta-C),ダイヤモンド構造に対応するsp3とグラファイト構造に対応するsp2の比率が高い(69%)水素含有DLC(ta-C:H-a),sp3とsp2の比率が低い(53%)水素含有DLC(ta-C:H-b)を用い,潤滑油と組み合わせ,低摩擦と耐摩耗性の持つ仕組みを見出した。いずれの摩擦実験においても,DLCコーティングした場合では低摩擦・耐摩耗性が示された。特に,重水素ヘキサンデカンを潤滑油とした場合は,DLCコーティングなしの0.2の高い摩擦係数に対し,ta-C:H-bが0.03の超低摩擦係数を得た。摩耗痕幅もDLCコーティングなしの0.76mmに対し,ta-C:H-bが0.17 mmまでに減ったことが分かった。一方,ta-C:H-bをコーティングした軸受を用い,摩擦実験を行うと,軸受鋼への水素侵入量が大幅に減少し,水素侵入抑制効果が確認された。そのメカニズムを解明するために,真空中に設置する摩擦試験機に質量計を組み込み,潤滑油トライボ化学分解のその場観察システムを開発した。本装置は摩擦面での反応により発生する気体を,質量分析計で成分ごとの圧力変化をモニター可能となり,特に水素発生の定量化の評価が実現できた。ta-C:H-bの表面における潤滑油の分解による生成された水素の量はSUJと比べ,約19%までに下がったことが分かった。ta-C:H-bの水素侵入抑制効果はDLCの潤滑油のトライボ化学分解を抑制できたと考えられる。2018年度に,まずは,2017年度に残った軸受鋼への水素侵入量に及ぼす温度の影響を調べた。重水素化ヘキサンデカンを用い,80°Cで30h摩擦実験を行い,水素侵入量が室温時より減少したことが分かった。2018年度では,低摩擦を発見するためにDLCにおける潤滑油の仕組みを調べ,DLCコーティングにおける潤滑油のトライボ化学分解を解明することを計画した。計画通り,水素含有の有無,sp3とsp2比率が異なるDLCと潤滑油の組合せ,低摩擦・耐摩耗性の持つ仕組みを見出した。具体的に,いずれの摩擦実験においても,DLCコーティングした場合は低摩擦・耐摩耗性が示された。特に,重水素ヘキサンデカンを潤滑油とした場合は,DLCコーティングなしの0.2の高い摩擦係数に対し,ta-C:H-bが0.03の超低摩擦係数が示された。また,DLCコーティングにおける潤滑油のトライボ化学分解特性も計画とおりで検討した。ta-C:H-bをコーティングした軸受を用い,摩擦実験を行うと,軸受鋼への水素侵入量が大幅に減少し,水素侵入抑制効果が確認された。DLC膜は,ダイヤモンド構造に対応するsp3混成軌道で結合した炭素と,グラファイト構造に対応するsp2混成軌道で結合した炭素が不規則に混じり合ったアモルファスな被膜である。2019年度では,水素含有の有無,sp3とsp2比率が異なるDLCの水素侵入抑制効果の有効性を検証する予定である。1水素侵入抑制効果に及ぼすDLC種類の影響重水素化モデル潤滑油を用い,異なるDLCコーティングされたテストピースで,摩擦疲労実験を行う。その後,TOF-SIMSによって,DLC膜および下地の鋼に侵入した重水素の量と分布を調べ,水素侵入の抑制効果の有効性を証明する。具体的に,水素含有の有無,sp3とsp2比率の影響,DLC膜厚の影響を調べる。さらに,DLCコーティングに水素拡散速度の解析を行う。2異なるDLCコーティングにおける潤滑油のトライボ化学分解開発した潤滑油トライボ化学分解その場観察システムを用い,異なるDLCコーティングにおける潤滑油のトライボ化学分解挙動を調べ,水素侵入抑制メカニズムを解明する。さらに,水素侵入の抑制だけではなく,十分な低摩擦係数と耐摩耗性を発現するコーティング膜を付与した摺動面の改質表面も確立する。本研究では,摩擦による潤滑油のトライボケミカル分解で生成した水素が鋼への侵入過程の可視化方法を確立するとともに,DLCコーティングによる水素侵入の抑制方法を検討することを目的とした。H29年度内には,水素侵入過程の可視化と定量方法を確立するとともに,水素侵入量に及ぼす摩擦条件などの影響因子を明らかにすることを計画した。

本研究では,潤滑剤成分に安定同位体である重水素を用いてラベル化し,飛行時間二次イオン質量分析法(TOF-SIMS)でその存在を確認するトレーサー法を利用した。具体的に,ポリプロピレングリコールと重水を質量比2:1で混合したものを潤滑油とし,スラスト玉軸受を用い,摩擦疲労実験を行った。摩擦試験後軸受の一部を切断し,その断面をTOF-SIMSで転走面から300μmまでの深さ方向分析を行った。鋼中への重水素侵入量を定量的に評価するために重水素の存在率をD/Hとして求めた。TOF-SIMS分析によって本研究で用いた軸受鋼内の重水素自然存在率は0.009%0.01%となった。いずれの摩擦実験においても,表面近傍では重水素が自然存在率よりも多く検出され,潤滑油の分解により生成した重水素は軸受鋼内部に侵入したことが確認された。また,断面の深さ方向分析では,表面近傍よりも内部の重水素の相対強度が低下していることから,重水素は表面から内部に拡散していることが分かり,その侵入深さは200250μm程度が限度だと考えられる。さらに,重水素の侵入量は摩擦時間を延ばすことで増加することが分かった。一方,新生面(トライボケミカル分解に起因する活性点)の生成速度は摩擦速度・荷重・材料の硬さに依存するため,生成した水素量の摩擦速度・接触荷重・軸受硬さの依存性を調べた。結果として,速度が速いほど,荷重が高いほど,軸受鋼が軟らかいものほど,より多くの重水素が検出された。前述のとおり,本研究では,摩擦による潤滑油のトライボケミカル分解で生成した水素が鋼への侵入過程の可視化方法を確立するとともに,DLCコーティングによる水素侵入の抑制方法を検討することを目的とした。H29年度内には水素侵入過程の可視化と定量の方法を確立するとともに,水素侵入量に及ぼす摩擦条件などの影響因子を明らかにすることを計画した。計画通り,水素侵入過程の可視化と定量の方法を確立した。具体的には,重水素化潤滑剤を用い,レーサーとして飛行時間二次イオン質量分析法(TOF-SIMS)でその存在と分布の分析方法を確立した。重水素は自然界にも存在し,その自然存在率(D/H)は0.0026%0.0186%などと言われているが,本研究で用いた軸受鋼内の自然存在率は実測で0.009%0.01%となった。この値を基準とし重水素の軸受鋼への侵入の有無を評価するものとした。結果としては,いずれの摩擦実験においても,表面近傍では重水素が自然存在率よりも多く検出され,潤滑油の分解により生成した重水素は軸受鋼内部に侵入したことが確認された。また,水素侵入量に及ぼす摩擦速度,荷重,材料の硬さ,摩擦時間など摩擦条件の影響も計画通りで検討した。速度が速いほど,荷重が高いほど,軸受鋼が軟らかいものほど,より多く重水素が検出された。一方,温度による影響の検討を計画したが,実験中で加熱すると,潤滑油の蒸発で,実験が順調に進まなかった。今後は耐温性の高い重水化潤滑油を検討予定である。本研究では,摩擦による潤滑油のトライボ化学分解で生成した水素が鋼への侵入過程の可視化方法を確立するとともに,DLCコーティングによる水素侵入の抑制効果を検討することを目的とした。2018年度には,低摩擦発見のためにDLCにおける潤滑油の仕組みを調べ,DLCコーティングにおける潤滑油のトライボ化学分解を解明することを計画した。
多様化する中華学校における音楽教育の民族音楽学的研究

全国の中華学校五校のうち二校について小学部の音楽教育の実地調査を行なった。それぞれ使用している教科書の提供を受け、取り上げられている歌曲・器楽曲について以下5つの項目を調べた:(1)曲名、(2)作詞者・作曲者、(3)作曲年代、(4)その他、作曲の背景等。更に、楽器の紹介や楽典の他、特定の作曲家のバイオグラフィー等の項目も加えて、全体のデータベース化を行なった。これらをもとに各校で用いられている教材の大まかな特徴や相違を把握すると共に、1学年から6学年までに扱われる教材内容の変化についても詳細に検証した。具体的な項目としては、日本と中国の歌曲や器楽曲のそれぞれの分量、曲のテーマ(自然描写、愛国心、愛郷心、勤勉の奨励、生活関連、民謡や伝統楽器、少数民族の音楽、その他)などについて考察を行なった。教員からの聞き取りでは、現職の教員に加えて過去に音楽を担当していた教員にも聞き取りを行った。現職教員からは現在の学校における教育方針の概要に加えて音楽教育の目的及び教材選択の背景、更には授業の実践方法や問題点について聞いた。特に児童の国籍や経歴の相違により授業運営にどのような影響が出ているか、また保護者は学校の音楽教育の内容に対してどのような意見を持っているのかということ等を詳しく聞いた。過去の担当教員への聞き取り調査では、中華人民共和国成立時における日本の中華学校の音楽教育への影響や、文化大革命から改革開放に至る時期に用いられた教材の変化などを聞き、今日の音楽教育に至る教育目的や教材内容の変遷について検証を行なった。初年度はデータベース化を中心に進めた。他の学校の教材を入手し内容をデータベース化すると共に、各学校における音楽教育の方針について比較考察を行なう。また授業を観察し使用言語や構成、児童生徒と教師との関わり方について考察を行なう。さらに各教材(歌や楽曲)が、実際の授業の中で、どのような意味合いをもって伝達されているのかを見ていく。授業の観察に加えて、担当教師からの聞き取りを更に進め、教材で取り上げられている曲を選択した背景、それぞれの歌・楽曲で児童生徒に感じてほしいこと・理解してほしいこと・学んでほしいことは何かを検証していく。初年度はデータベース化を中心に進めたため次年度使用額が生じた。差引額24,892円は次年度旅費等に使用する。
飛沫・喀痰の粘性研究を基盤としたインフルエンザウイルス伝播機構解明

バイオエアロゾルの粒度動態分析:エアロゾルの粒度分布について、レーザー回折式測定およびパーティクルカウンターを用い、エアロゾル(人工粘液を含む)発生装置と組み合わせることにより、飛沫などバイオエアロゾルの粒径(粒度)分布を測定するシステムを確立した。バイオエアロゾル感染モデル:加圧ポンプを止めて建物内圧縮空気配管に直結する工事を行ったことにより、より安定的な吸気システムを設置することができた。このシステムを用いてGFP発現パラミクソウイルスをモデルウイルスとして用いることにより、in vitro感染実験系の評価がより迅速に行えるようになった。これまでにウイルス濃度とエアロゾルの感染(暴露)時間をパラメーターとして各条件下での感染実験を行った結果、当初想定した30分間の噴霧時間を大幅に短縮した3分間の暴露で効率に細胞に感染することを明らかにした。この“閉鎖空間中の感染実験系"を用いて2019年度も引き続き、分化誘導したヒト呼吸器上皮細胞の感染試験を行うことに加え、マウスを用いた感染実験を行うことを計画している。粘液中のウイルスに対する手指消毒の効果判定:粘性を帯びた体液中の病原体の消毒液による殺菌・不活化効果を評価する。粘性体液を再現するため、急性上気道患者から採取した臨床検体(喀痰)および人工粘液を各々PBSに溶解し、粘度:10000mPa・sに調整)を用いる。2019年度も引き続き判定試験を行うことを考えており、得られた成果を投稿論文として発表することを計画している。これまでにウイルス濃度とエアロゾルの感染(暴露)時間をパラメーターとして各条件下での感染実験を行った結果、当初想定した30分間の噴霧時間を大幅に短縮した3分間の暴露で効率に細胞に感染することが明らかとなった。バイオエアロゾルの粒度動態分析:飛沫などバイオエアロゾルの粒径(粒度)分布を測定するシステムを用いて今年度も引き続き、粘(弾)性を付加することによる粒度分布の経時的変化を測定し、人工粘液の粒度分布の動態を評価する。バイオエアロゾル感染モデル:ヒト呼吸器の初代上皮細胞由来の不死化細胞株を樹立し、培養液を細胞表面ぎりぎりまで減らす「気相液相界面培養」により、細胞の分化誘導を行い、細胞表面にムチンが産生されることを確認している。上記の“閉鎖空間中の感染実験系"を用いて2019年度も引き続き、分化誘導したヒト呼吸器上皮細胞の感染試験を行う。さらに、マウスを用いた感染実験を行う。2019年度も引き続き判定試験を行う。

これまでにウイルス濃度とエアロゾルの感染(暴露)時間をパラメーターとして各条件下での感染実験を行った結果、当初想定した30分間の噴霧時間を大幅に短縮した3分間の暴露で効率に細胞に感染することが明らかとなった。バイオエアロゾルの粒度動態分析:飛沫などバイオエアロゾルの粒径(粒度)分布を測定するシステムを用いて今年度も引き続き、粘(弾)性を付加することによる粒度分布の経時的変化を測定し、人工粘液の粒度分布の動態を評価する。バイオエアロゾル感染モデル:ヒト呼吸器の初代上皮細胞由来の不死化細胞株を樹立し、培養液を細胞表面ぎりぎりまで減らす「気相液相界面培養」により、細胞の分化誘導を行い、細胞表面にムチンが産生されることを確認している。上記の“閉鎖空間中の感染実験系"を用いて2019年度も引き続き、分化誘導したヒト呼吸器上皮細胞の感染試験を行う。さらに、マウスを用いた感染実験を行う。粘液中のウイルスに対する手指消毒の効果判定:粘性を帯びた体液中の病原体の消毒液による殺菌・不活化効果を評価する。粘性体液を再現するため、急性上気道患者から採取した臨床検体(喀痰)および人工粘液を各々PBSに溶解し、粘度:10000mPa・sに調整)を用いる。2019年度も引き続き判定試験を行う。
ウマヘルペスウイルス1型野外分離変異株の変異遺伝子の同定と機能解析

ウマヘルペスウイルス1型(EHV-1)は妊娠馬が感染すると死流産や新生子の生後直死を起こす。2000年に生後直死した子馬の肺から分離したEHV-1の5089株は、従来の株とは異なり培養細胞で増殖させると主に細胞介在性でウイルスは伝播した。2002年には細胞遊離性ウイルスをほとんど産生しない5586株を馬流産胎子から分離した。両ウイルスの変異メカニズムの解明を目的に遺伝子レベルでの解析を進めた。両ウイルスの全塩基配列を決定したところ、複数のウイルス構成蛋白や転写調節因子をコードする遺伝子に変異を認めた。5089株では76種類の遺伝子中53種類、5586株では67種類の遺伝子にアミノ酸変異を伴う塩基の変異を認めた。EHV-1がコードする76種類のmRNA発現量を5089株、5586株と標準株とで比較したところ、5089株ではORF13(テグメント)、14(機能不明)、15(構成蛋白)、16(糖蛋白gC)、53(オリジン結合蛋白)、54(DNAヘリカーゼ/プライマーゼ)、55(機能不明)、56(構成蛋白)、57(DNAヘリカーゼ/プライマーゼ)、58(機能不明)ならびに71(gp2)の発現量が標準株に比べて顕著に低下していた。5586株でも同様であった。塩基配列の変異によりストップコドンの位置が移動し、発現蛋白の分子量が顕著に低下しているものが両ウイルスで複数認められ、特に5586株では糖蛋白のgDの分子量が標準株の約1/10となっていた。gDはEHV-1の感染性に必須である。ウェスタンブロット解析の結果、両ウイルスともgCの発現を認めなかった。gCは細胞へのEHV-1吸着効率を高める作用がある。以上の成績より、5089株と5586株で認められたウイルス性状の変化は、少なくとも、それぞれgC、gCとgDの発現異常によるものと推察された。ウマヘルペスウイルス1型(EHV-1)は妊娠馬が感染すると死流産や生後直死を起こす。2002年に当教室で馬流産胎子の肺から分離したEHV-1の5586株は、従来の株とは異なり培養細胞で増殖させると細胞遊離性ウイルスを産生せず、細胞介在性でウイルスは伝播した。今回、この原因を明らかにすることを目的に、ウイルス性状の詳細な解析とウイルス遺伝子のシークエンス解析を行った。【材料と方法】EHV-1の野外株5586と標準株HH1を用いた。培養細胞には馬皮膚株化細胞を用いた。感染細胞から抽出した5586株のウイルスDNAはBamHIで切断し、pUC18にクローニングしてシークエンス解析に用いた。【成績と考察】5586株ウイルスDNAのBamHIプロファイルは変異型1BをもとにさらにHとM断片間の切断点が欠損した新しい型を示した。ウイルス蛋白をウェスタンブロット法で解析したところ、gC蛋白とgp2の発現が認められなかった。5586株の77種類のmRNAの発現量をリアルタイムPCRで調べたところ、gCとgp2を含む12種類でHH1株の半分以下に減少していた。

5586株の全塩基配列を決定した結果、77種類の遺伝子のうち68種類でアミノ酸置換が認められた。11種類の主要エンベロープ糖蛋白ではgLを除く10種類でアミノ酸配列の変異が認められた。転写活性化因子ではORF5(ICP27)、ORF63(ICP0)、ORF64(ICP4)とORF65(ICP22)でアミノ酸置換が認められた。以上の成績より、エンベロープ糖蛋白などのウイルス構成蛋白をコードする遺伝子の変異ならびに転写調節に関わる遺伝子の変異が5586株のウイルス増殖過程のあらゆる段階に影響しているものと考えられた。今後、変異の認められた遺伝子と5586株のウイルス性状との関連性を検討する予定である。ウマヘルペスウイルス1型(EHV-1)は妊娠馬が感染すると死流産や新生子の生後直死を起こす。2000年に当教室で生後直死した子馬の肺から分離したEHV-1の5089株は、従来の株とは異なり培養細胞で増殖させると主に細胞介在性でウイルスは伝播した。2002年には細胞遊離性ウイルスをほとんど産生しない5586株を馬流産胎子から分離した。両ウイルスの変異メカニズムの解明を目的に遺伝子レベルでの解析を進めた。両ウイルスの全塩基配列を決定した結果、複数のウイルス構成蛋白や転写調節因子をコードする遺伝子に変異を認めた。5089株では76種類の遺伝子中53種類、5586株では67種類の遺伝子にアミノ酸変異を伴う塩基の変異を認めた。EHV-1の76種類の遺伝子のmRNA発現量をリアルタイムPCRで測定し、5089株、5586株と標準株とで比較したところ、5089株ではORF13(テグメント)、14(機能不明)、15(ウイルス構成蛋白)、16(糖蛋白gC)、53(オリジン結合蛋白)、54(DNAヘリカーゼ/プライマーゼ)、55(機能不明)、56(ウイルス構成蛋白)、57(DNAヘリカーゼ/プライマーゼ)、58(機能不明)ならびに71(gp2)の発現量が標準株に比べて顕著に低下していた。5586株でも同様であった。塩基配列の変異によりストップコドンの位置が移動し、発現蛋白の分子量が顕著に低下しているものが両ウイルスで複数認められ、特に5586株ではエンベロープ糖蛋白のgDの分子量が標準株の約1/10となっていた。gDはEHV-1の感染性に必須であることが知られている。以上の成績より、5089株と5586株で認められた遺伝子変異は両ウイルスの増殖に大きな影響を与えているものと考えられた。5586株で細胞遊離性ウイルスの産生が認められないのはgDの発現異常によるものと推察された。
新規レドックス因子Prx4による蛋白質の酸化的折畳みとその生理的役割の解明

Prx4の生理的役割を解明するために、培養細胞およびPrx4欠損マウスを用いた解析を行い次の結果を得た。(1)Prx4と相互作用する蛋白質を同定した。(2)Prx4が血小板の膜上に局在することを確認した。(3)Prx4とSOD1の二重欠損マウスを作製した。その二重欠損マウスでは若齢期から著しい肝障害を認めた。(4)Prx4tと相互作用する蛋白質を同定した。Prx4tを培養細胞で過剰発現させると主に細胞質に局在し、抗酸化機能の亢進が認められた。分泌蛋白質や膜蛋白質が正常に機能するためには、小胞体における酸化的折畳みが重要である。酸化的折畳みに障害が生じると、異常蛋白質の蓄積等がひきおこされ、それは神経変性疾患や癌といった疾患の原因になる。Prxファミリー蛋白質はperoxidase活性を有する酸化還元酵素で、人を含む哺乳類では6種類のファミリーメンバーが知られている。それぞれ発現の組織特異性や細胞内局在などに違いがあるが、Prx4はファミリー内で唯一分泌シグナル配列を有するため、小胞体に局在することがこれまでに明らかになっている。小胞体での機能は長らく不明だったが、近年、Prx4が小胞体において蛋白質の酸化的折畳みに関与していることが明らかになった。しかしながら、その分子機構の詳細や、生理的意義に関してはほとんどわかっていない。そこで、Prx4が関わる酸化的折畳みの詳細を解明する目的で、我々が作成したPrx4ノックアウトマウスを解析した。これまので私達の解析から、Prx4ノックアウトマウスは通常飼育下では顕著な表現型を示さないことが明らかになっている。そこで、蛋白質の酸化的折畳みは酸化ストレスに脆弱であるとの考えから、全身性で酸化ストレスの亢進が観察されるSod1ノックアウトマウスをPrx4ノックアウトマウスと交配することによりPrx4;Sod1二重欠損マウスを作成し、現在解析を進めている。また、Prx4がどういった因子と相互作用して酸化的折畳みに関与しているのかを分子レベルで明らかにする目的で、Halo-tagを付加したPrx4発現ベクターを作製し、培養細胞を用いたPull-down assayを行った。その結果、小胞体に局在し、酸化的折畳みに関与することが以前から明らかにされているPDIファミリー蛋白質やシャペロン蛋白質を同定した。Peroxiredoxin 4 (Prx4)は小胞体でthiol oxidaseとして働き、ER oxidoreductin1 (Ero1)やProtein disulfide isomerase (PDI)と協調して蛋白質の酸化的折畳みに関与することが近年明らかとなった。しかしながら、その分子機構の詳細や生理的役割についてはほとんどわかっていない。これまでに、野生型および各シングルノックアウトマウスとの比較により、著しい臓器障害を観察しており、その分子機構の解明に取り組んでいる。分泌蛋白質や膜蛋白質が細胞外において正常に機能するためには、小胞体における酸化的折畳みが重要である。そこで、酸化的折畳みにおけるPrx4の生理的役割を解明する目的で、我々が作成したPrx4ノックアウトマウスを解析した。これまでの私達の解析から、Prx4ノックアウトマウスは通常飼育下では顕著な表現型を示さないことが明らかになっている。そこで、蛋白質の酸化的折畳みは酸化ストレスに脆弱であるとの考えから、内在的に酸化ストレスの亢進がみられるSOD1ノックアウトマウスをPrx4ノックアウトマウスと交配することによりPrx4;SOD1ダブルノックアウトマウスを作製し、現在解析を進めている。これまでに、野生型および各シングルノックアウトマウスとの比較により、著しい臓器障害を観察したが、さらにある条件によりダブルノックアウトマウスが脆弱性を示すことを見出した。また、Prx4には転写開始点が異なる2種の転写バリアントが存在するが、これまでに解析している全身性で発現しているフォームとは別に、精巣特異的に発現しているフォーム(Prx4t)に関しても相互作用する因子の検索を行い、候補因子を同定した。これら2種を比較検討することにより、Prx4の生理的役割解明をすすめる。

通常飼育下では顕著な表現型が観察されないPrx4ノックアウトマウスを、内在的に酸化ストレスが亢進しているSOD1ノックアウトマウスと掛け合わせて酸化ストレスを負荷することにより、シングルノックアウトでは観察されない表現型を観察した。その結果、ある条件に対してダブルノックアウトマウスが脆弱であることを見出した。また、Prx4は転写開始点が異なる2種の転写バリアントが存在するが、これまでに、精巣特異的に発現しているバリアントであるPrx4tに関しても、質量分析器を用いた相互作用因子の検索を行い、相互作用する可能性のある因子の同定に成功した。分泌蛋白質や膜蛋白質が細胞外において正常に機能するためには、小胞体における酸化的折畳みが重要である。酸化的折畳みに障害が生じると、異常蛋白質の蓄積等がひきおこされ、それは神経変性疾患や癌といった疾患の原因になる。Peroxiredoxin 4 (Prx4)は小胞体でthiol oxidaseとして働き、蛋白質の酸化的折畳みに関与することが近年明らかとなった。しかしながら、その分子機構の詳細や生理的役割についてはほとんどわかっていない。そこで、酸化的折畳みにおけるPrx4の生理的役割を解明する目的で、我々が作製したPrx4ノックアウト(KO)マウスを解析した。これまでの私達の解析から、Prx4KOマウスは通常飼育下では顕著な表現型を示さないことが明らかになっている。そこで、蛋白質の酸化的折畳みは酸化ストレスに脆弱であるとの考えから、内在的に酸化ストレスの亢進がみられるSOD1KOマウスをPrx4KOマウスと交配することによりPrx4;SOD1ダブルKOマウスを作製し、解析に供した。その結果、野生型および各シングルKOマウスとの比較により、著しい臓器障害を観察した。また、Prx4には転写開始点が異なる2種の転写バリアントが存在するが、これまでに解析している全身性で発現しているフォームとは別に、精巣特異的に発現しているフォーム(Prx4t)に関しても相互作用する因子の検索を行い、候補因子を同定した。また、GFP蛍光タンパク質を付加した発現プラスミドを作製し、培養細胞での細胞内局在をしらべたところ、過去の精巣における細胞内局在の結果と一致して、Prx4tは主に細胞質に局在した。Prx4tを過剰発現させた細胞において抗酸化機能の亢進がみられたことから、Prx4tも全身性で発現しているフォームと同様に抗酸化機能を有することが示唆された。Prx4の生理的役割を解明するために、培養細胞およびPrx4欠損マウスを用いた解析を行い次の結果を得た。(1)Prx4と相互作用する蛋白質を同定した。(2)Prx4が血小板の膜上に局在することを確認した。(3)Prx4とSOD1の二重欠損マウスを作製した。その二重欠損マウスでは若齢期から著しい肝障害を認めた。(4)Prx4tと相互作用する蛋白質を同定した。Prx4tを培養細胞で過剰発現させると主に細胞質に局在し、抗酸化機能の亢進が認められた。これまでに、Prx4-KOマウスにストレスを加えることにより顕著な表現型が観察されており、現在解析中である。
高等植物の葉における異型細胞の分化誘導メカニズムの解明

ミロシン細胞はアブラナ科特有の異型細胞であるが,分化メカニズムなどは全く未知である.シロイヌナズナの葉のミロシン細胞は,維管束周辺に点在することが知られていた.われわれは葉全体におけるミロシン細胞の可視化法を確立することによって,ミロシン細胞が維管束の分岐に沿って分枝する,あるいは発達中の維管束の先端部分に分布する傾向を見出した.前年度は維管束とオーキシンがミロシン細胞分化と密接に関わる可能性を示したが,さらにミロシン細胞の分化メカニズムを明らかにすることを目的として,ミロシン細胞数が増加して分布パターンに異常を示すatvam3変異体の解析を中心として,下記に示す新規知見を得た.1.維管束分化とミロシン細胞分化の関わりの解析維管束形成不全変異体の中から,小胞輸送に関わる因子の変異体4種についてミロシン細胞を観察した.その結果,変異体因子とAtVAM3の小胞輸送経路における作用点の相違によって,ミロシン細胞の分布パターンが異なることを明らかにした.(1)AtVAM3と作用点が同じ因子の変異体:atvam3変異体と同様にミロシン細胞数が増加し,維管束周辺のみならずミロシン細胞のネットワークが形成されていた.(2)AtVAM3と作用点が異なる因子の変異体:維管束が不連続に点在していても,基本的にその維管束に沿ってミロシン細胞が形成されていた.以上の結果から,小胞輸送経路上のある特定地点における輸送が,ミロシン細胞の分化に重要であることが示唆された.2.ミロシン細胞分化に関わる債伝子の探索野生型シロイヌナズナとatvam3変異体でマイクロアレイを行い,発現量の差が大きい機能未知分子M1M31を選抜した.その中でM13およびM31の過剰発現体,およびノックダウン変異体で維管束とミロシン細胞に異常が観察されたことから,これらの因子がミロシン細胞分化に関与する可能性が考えられた。ミロシン細胞は,アブラナ科特有の異型細胞である.シロイヌナズナの葉では維管束周辺に点在することが知られていたが,ミロシン細胞が維管束の分岐に沿って分枝する,あるいは発達中の維管束の先端部分に分布する傾向を新たに見出した.維管束の分化には,植物ホルモンであるオーキシンの関与が報告されている.そこで本研究では,ミロシン細胞の分化と維管束ならびにオーキシンの関わりに着目した.野生型シロイヌナズナと,ミロシン細胞数が増加するatvam3変異体とを比較しながら解析を行い,下記に示す新規知見を得た.1.ミロシン細胞と維管束の関わり葉における維管束パターンを比較した結果,atvam3変異体では高次脈が顕著に減少し,野生型には形成されない2次脈の不連続点が観察された.このことから,atvam3変異体では,ミロシン細胞が葉全体にわたってネットワークを形成している一方で,維管束は未発達であることが明らかとなった.2.ミロシン細胞とオーキシンの関わりオーキシン応答マーカーを導入したシロイヌナズナを用いて,葉におけるオーキシンの分布を比較した結果,atvam3変異体ではマーカーの発現が顕著に低下し,野生型で観察される維管束予定領域を示す網目状パターンがほとんど観察されなかった.オーキシン処理したatvam3変異体の葉では,野生型と同程度にマーカーが発現したことから,オーキシン応答性は正常であることが示された.一方,オーキシン輸送阻害剤を添加した培地で植物を生育したところ,ミロシン細胞の分布パターンは維管束パターンと同様に影響を受けた.以上の結果から,ミロシン細胞の分化は,維管束ならびにオーキシンと密接に関わることが示唆された.また,atvam3変異体では,葉におけるオーキシン蓄積パターンが異常になることによってミロシン細胞の数と分布に異常が起こっている可能性が考えられた.ミロシン細胞はアブラナ科特有の異型細胞であるが,分化メカニズムなどは全く未知である.シロイヌナズナの葉のミロシン細胞は,維管束周辺に点在することが知られていた.われわれは葉全体におけるミロシン細胞の可視化法を確立することによって,ミロシン細胞が維管束の分岐に沿って分枝する,あるいは発達中の維管束の先端部分に分布する傾向を見出した.前年度は維管束とオーキシンがミロシン細胞分化と密接に関わる可能性を示したが,さらにミロシン細胞の分化メカニズムを明らかにすることを目的として,ミロシン細胞数が増加して分布パターンに異常を示すatvam3変異体の解析を中心として,下記に示す新規知見を得た.1.維管束分化とミロシン細胞分化の関わりの解析維管束形成不全変異体の中から,小胞輸送に関わる因子の変異体4種についてミロシン細胞を観察した.その結果,変異体因子とAtVAM3の小胞輸送経路における作用点の相違によって,ミロシン細胞の分布パターンが異なることを明らかにした.(1)AtVAM3と作用点が同じ因子の変異体:atvam3変異体と同様にミロシン細胞数が増加し,維管束周辺のみならずミロシン細胞のネットワークが形成されていた.

(2)AtVAM3と作用点が異なる因子の変異体:維管束が不連続に点在していても,基本的にその維管束に沿ってミロシン細胞が形成されていた.以上の結果から,小胞輸送経路上のある特定地点における輸送が,ミロシン細胞の分化に重要であることが示唆された.2.ミロシン細胞分化に関わる債伝子の探索野生型シロイヌナズナとatvam3変異体でマイクロアレイを行い,発現量の差が大きい機能未知分子M1M31を選抜した.その中でM13およびM31の過剰発現体,およびノックダウン変異体で維管束とミロシン細胞に異常が観察されたことから,これらの因子がミロシン細胞分化に関与する可能性が考えられた。
咀嚼による全身的効果のメカニズム解明

咀嚼は、単に消化作用のみではなく、生命の維持に極めて重要で広範な作用を持つ。しかしその効果は現象論的な議論にとどまっており、メカニズムの解明には至っていない。そこで申請者らは、これまでに粉末飼料または固形飼料をラットに与え、DNAマイクロアレイにより脳内発現遺伝子を網羅的に解析した。その結果、視床においては咀嚼による離乳直後の神経ネットワーク形成の制御、視床下部においては視床下部ー下垂体ー副腎(HPA)系や交感神経系による血圧制御が示唆された。しかし、全身的な効果のメカニズムは、未だ不明である。本研究では、咀嚼の脳にとどまらない全身的な効果のメカニズムを解明する。すなわち、1咀嚼による血圧降下作用の制御因子を同定し、その関与を動物実験で証明する。さらに、2小脳マイクロアレイを基に分子論から咀嚼の運動機能に対する効果を予測し、動物実験でそれを検証する。当該年度では、1について、HPA系に関与するマイクロアレイ解析で見出された分子が、タンパク質レベルでも有意に変動していることを生化学的な解析で検証した。2については、小脳マイクロアレイ解析から神経形態形成・神経新生・長期増強に関わる遺伝子群が、咀嚼によって有意に発現変動することを見いだした。今後、1の「咀嚼による血圧降下作用の制御因子同定」では、見出した因子に関連する分子・血中成分・臓器について、さらに詳細な解析を分子レベルで行う。2の「咀嚼の運動機能に対する効果」では、小脳で引き起こされたと予測される機能変化が全身的な運動機能の変化として表れているかを検証する。1の「咀嚼による血圧降下作用の制御因子同定」では、当初、視床下部マイクロアレイ結果を詳細に解析し、血圧制御因子候補を抽出することを計画していた。マイクロアレイ解析を詳細に行った結果、注目すべき因子を見いだし、その発現がタンパク質レベルで変動することを明らかにした。因子の推測までが計画であったところ、そのタンパク質レベルでの検証まで至ることができ、大きく進捗した。2の「咀嚼の運動機能に対する効果」では、当初、マイクロアレイ解析から小脳がどのように機能変化したかを推測する計画であった。その計画通り、発現変動遺伝子から神経形態形成・神経新生・長期増強という機能変化を予測することができた。1の「咀嚼による血圧降下作用の制御因子同定」では、見出した因子に関連する分子・血中成分・臓器について、さらに詳細な解析を行う。具体的には、遺伝子の発現解析・生化学的解析・組織学的解析を計画している。運動機能、特に強調運動機能を測定可能な機器が既に使用可能であり、これを用いて動物行動学的に解析する。

具体的には、遺伝子の発現解析・生化学的解析・組織学的解析を計画している。2の「咀嚼の運動機能に対する効果」では、小脳で引き起こされたと予測される機能変化が全身的な運動機能の変化として表れているかを検証する。運動機能、特に強調運動機能を測定可能な機器が既に使用可能であり、これを用いて動物行動学的に解析する。キャンペーン価格の利用により、当初予定よりも安く購入できた。翌年度のプラスチック消耗品購入費に充て、研究体制を強化する。
多臓器不全におけるホスホリパーゼA_2の解析

重症外傷・出血性ショック・重症感染症などに続発する成人型呼吸促迫症候群や多臓器不全の発生にホスホリパーゼA_2(PLA_2)の関与が推測されている。これらの症例の血中II型PLA_2値を調べると、より重傷例で高値を示すことが判明した。小腸の血行不全は局所および遠隔臓器に組織障害を引き起こし、外傷や大量出血に続発する多臓器不全の原因になると考えられているが、重傷外傷・出血性ショック・重傷感染症症例にパーテクネテイト急速静注によるRI検査を行うと、これらの病態では血圧がたとえ正常に維持・回復されても、腸管への低潅流状態は長期にわたり遷延することが観察された。次に小腸虚血・再潅流動物モデルを作製して腸管の低潅流が全身に及ぼす影響を検討した。ラットに上腸間膜動脈血行遮断と再潅流を行うと、PLA_2依存性に肺障害が出現した。45分の小腸虚血後の小腸ホモジェネートに存在するPLA_2サブタイプを調べると、ほとんど分泌型II型であることが明らかとなった。さらに分泌型II型PLA_2に対する阻害剤S-5920をラットに前投与して小腸虚血・再潅流を行うと、肺障害の出現は完全に予防された。これらの動物実験の結果と今までの臨床研究の結果を総合すると、重傷外傷・出血性ショック・重傷感染症の際に出現する高II型PLA_2血症は続発する成人型呼吸促迫症候群や多臓器不全の発生と深く関連していることが示唆された。今後臨床応用可能なII型PLA_2阻害剤が開発されれば、重傷救急患者に合併する成人型呼吸促迫症候群や多臓器不全の予防・治療に役立つ日も期待される。本研究の目的は多発外傷,重症感染症、による出血性ショック、敗血症性ショック、多臓器不全の患者における血中の各種メデイエーター、その他の指標を測定し、病態、血中PLA2との相関を検討することである。血中PLA2は今後一括測定する予定である。現時点での総合的な評価は不能なため、代表的な2症例の結果を報告する。腹部外傷により出血性ショックと小腸断裂による敗血症性ショックをおこした患者では、入院時の緊急手術直後より尿中Albumin/Creatinine比が上昇し(300以上;正常血18以下)、全身の組織における毛細血管の透過性が亢進していることが判明した。好中球エラスターセも340μg/L(正常値165以下)と上昇し、好中球の活性化が起こっていた。血中ヒスタミン値は全入院経過中正常値にとどまっていたため、肥満細胞の活性化はこの病態に関与していないように見えた。炎症性サイトカインIL-8は入院時1800pg/mL(正常値15以下)と上昇したが、その後急激に減少し、直ちに正常値に復した。IL-6は入院時7000pg/mL(正常値25以下)と上昇したが、その後急激に減少し、直ちに正常値に復した。下腸間膜壊死による汎発性腹膜炎、敗血症性ショックをおこし、その後多臓器不全をおこした患者では、多臓器不全発症直後より尿中Albumin/Creatinine比が290と上昇した。好中球エラスターゼは入院直後より860μg/Lと上昇し、その後徐々に低下した。血中ヒスタミン値は全入院経過中正常値にとどまった。IL-8は入院時320pg/mL(正常値15以下)と上昇、その後徐々に減少したものの正常値には復さなかった。IL-6は入院時1270pg/mLと上昇したが、その後徐々に減少した。現在、症例数も増加しており、今後、総合的な評価を行っていく予定である。

日本医科大学付属千葉北総病院集中治療室に平成7年7月1日から平成8年12月20日の期間の間に入院した21人の患者で、血中II型ホスホリパーゼA2値(正常値:1.6-2.6ng/mL)を測定した。症例の内訳は、1)出血性ショック4例、2)出血性ショック+感染症併発2例、3)中等度感染症3例、4)重症感染症3例、5)外傷6例、6)外傷+出血性ショック+感染症併発3例であった。検体採取は、入室後0-1日目、2-3日目、4-7日目、8日目以降に行った。1,2)出血性ショック単独症例では血中II型ホスホリパーゼA2値は全経過を通じて10ng/mL以下であったのに対し、出血性ショックに感染症を併発した症例では入室後0-1日目、2-3日目でそれぞれ250±70ng/mL、580±380ng/mLと高値を示した。2,3,4)中等度感染症では血中II型ホスホリパーゼA2値は全経過を通じて100ng/mL以下であったのに対し、重症感染症では入室後0-1日目で460±210ng/mL、2-3日目で500±140ng/mL、感染症に出血性ショックを併発した症例では入室後0-1日目、2-3日目でそれぞれ250±70ng/mL、580±380ng/mLと高値を示した。5,6)外傷単独症例では血中II型ホスホリパーゼA2値は全経過を通じて50ng/mL以下であったのに対し、外傷に出血性ショックと感染症を併発した症例では、入室後2-3日目、4-7日目、8日目以降でそれぞれ、480ng/mL、250±80ng/mL、340±160ng/mLと高値を示した。さらに、これらの症例の中で多臓器不全を合併した4例でのII型ホスホリパーゼA2の最高値は、1076ng/mL、959/mL、648/mL、277ng/mLと非常に高く、4例中3例が死亡した。多臓器不全が発生する頻度は危険因子(感染症、ショック、外傷など)が多くなるにつれて高くなることが知られているが、血中II型ホスホリパーゼA2値も危険因子の数とともに高くなる傾向を示した。血中II型ホスホリパーゼA2値の上昇は、多臓器不全が発生する以前に明らかとなった。小腸の血行不全は局所および遠隔臓器に組織障害を引き起こし、外傷や大量出血に続発する多臓器不全の原因になると考えられている。我々は、重症外傷・出血性ショック・重症感染症症例にPI検査(パーテクネテイト急速静注による腹部ファーストパス像の解析)を行い、これらの状態では血圧がたとえ正常に維持・回復されていても、腹腔内臓器(特に腸管)への血流不全状態は長期にわたり継続することを観察した。我々は腸管の低灌流が全身に及ぼす影響を調べるために、小腸虚血・再灌流動物モデルを作製した。ラットに上腸間膜動脈血行遮断と再灌流を行うと、ホスホリパーゼA_2(PLA_2)依存性に肺障害が出現する。上腸間膜動脈を45分間血行遮断し、小腸ホモジェネートに存在するPLA_2サブタイプを検討した結果、小腸PLA_2活性はほとんどが分泌型II型であることが明らかとなった。さらに分泌型II型PLA_2に対する阻害剤S-5920をラットに前投与してから小腸虚血・再灌流を行うと、肺障害の出現は完全に予防された。これらの動物実験の結果と今までの臨床研究の結果を総合すると、重症外傷・出血性ショック・重症感染症の際に出現する高II型PLA_2血症は続発する肺障害(成人型呼吸促迫症候群)の発生と深く関連している可能性が示唆された。今後臨床応用可能なII型PLA_2阻害剤が開発されれば、重症救急患者に合併する成人型呼吸促迫症候群や多臓器不全の予防・治療に役立つ日も期待される。
脊椎動物胚発生の進化発生学的理解を目指す

脊椎動物は進化を通して驚くほどの形態的な多様性を獲得してきた。一方で、どの脊椎動物も基本的な解剖学的特徴(ボディプラン)は一致しており、その点に関しては非常に保守的である。この理由について本研究では遺伝子発現情報から解析した。本研究では、2種のカエルを用いて、保存された発生段階を探索、やはり脊椎動物の基本形を示す発生段階が保存されていることが判明した。依然として進化機構は不明だが、ボディプラン保存の謎解明に向けて重要な足がかりを得た。本研究は、X. tropicalisとX. leavisをモデル動物とし、脊椎動物発生過程の進化的多様性、並びに発生段階のヘテロクロニックなシフト(異時性)を分子レベルから記述・検証しようとするものである。昨年度までに我々はX.laevisとX. tropicalisの飼育・サンプリングを進め、初期胚(2細胞期)から後期胚までのRNAサンプルを得た。今年度は、これらサンプルをIllumina社のHiseqシステムを用いたRNAseqを行う事で、遺伝子発現プロファイルの包括的解析を行い、研究の中心となる基盤データを得た。本研究では、変態後の発生段階までカバーしており、本研究以外の研究でも活かされることが期待できる。本年度は、発生時系列遺伝子発現プロファイリングを行い、基礎的解析を行った。今後、さらなる解析を進めることで、進化的に同等な(共通祖先の同等の段階から派生したと考えられる)発生段階の同定などを進める予定である。また、解析終了後は公開データベースに登録し、広く一般に使用可能な基礎的データとする。本研究は、脊椎動物の発生過程の進化的多様性を分子データにより定量・解析するのみならず、発生段階のばらつき、そしてヘテロクロニックなシフトまでを視野に入れた研究である。特に既にデータとして取得済みのX. laevisの発生時系列遺伝子発現プロファイルと、本研究で得られるX. tropicalisの発生時系列遺伝子発現プロファイルの比較解析を行うことで、個体発生と系統発生の関係性解明において、重要な試金石となることが期待される。また今回の対象種は変態期が存在し、これが別種の四足動物の発生過程とどのように対応するかについても非常に興味深い。また、近縁種間での発生砂時計モデルの検証は重要な焦点である。本年度は、実験対象動物であるX. tropicalisの飼育システムを立ち上げ、交配、そして初期胚から後期胚、加えて変態後の発生段階の個体同定とサンプリングを行った。統計的母集団が一般的な野生型胚となるよう、親の異なる生物学的反復データの蓄積も進めており、上記研究のねらいと一致するデータ、そして結果を得るための工夫をしている。本年度は、さらに発生段階に応じた核酸(mRNA)の抽出と精製に成功、順次遺伝子発現プロファイルの測定を進めている。特に変態後の発生(発達)段階までサンプリング、ならびに解析を広げることにより、ネオテニー等、進化の重要な仮説を検証することも可能となることが期待される。本課題は、動物進化と個体発生の関係性の定式化を目指した研究である。これまで脊椎動物の発生過程と進化の関係に関しては発生砂時計モデルが妥当であることを示してきたが、今回、発生タイムテーブルの遺伝子発現情報による異種間対応付け、そしてボディプラン成立期とされる咽頭胚期に特徴的な遺伝子セットの同定などを目標とした。本課題では、進化的分岐後にゲノムの倍加を起こしたにも関わらず形態的に非常に似た状態を保存しているニシツメガエルとアフリカツメガエルを主な対象として研究を行った。実験としては発生期の全胚由来RNAseqデータによる遺伝子発現量の包括的推定をもとにした。カエル2種の発生段階ごとの遺伝子発現情報を比較解析した結果により、発生段階特異的な遺伝子発現情報を用いた場合、これまでの比較形態学的な発生タイムテーブルの対応付けから予想される発生段階の対応関係が検出できることが判明した。今回の異種間対応関係の検出は、検定できないなどの従来法の弱点を克服するものであり、異種間比較により適した情報であると期待される。進化を通してどのように発生過程が変更されてきたのかを追う上で、有用なツールとなることが期待される。また、脊椎動物分岐から考えると比較的近年に分岐した2種であるが、これら2種においても発生砂時計モデルが予測する通り、器官形成期(ファイロティピック段階)が保存されていることが判明した。脊椎動物全体で保存された胚段階を同定した時期と重なっており、ファイロテイィピック段階が進化的スケールによらない、いわば“しつこい保存"を示すことが明らかとなった。成体となってからの自然選択だけでなく、発生期のなんらかの要因にて、こうした保存が起こっている可能性も考えられる。また、こうした胚段階に保存されている遺伝子セットとして転写因子など遺伝子制御に関与する遺伝子が多い傾向にあることも掴んでいる。進化発生学研究の進捗は順調である。サンプリングしたtotal RNAのクオリティも高く、シーケンシング後のデータも十分に解析に耐える高い品質であった。

一方で、基礎解析を進めたところ、X. laevisのアノテーション(特に遺伝子予測)が十分に高いクオリティーとは言えないことが判明した。進化的に相同な遺伝子を定義し、正確な研究を進める上では必要な作業であるため、多少時間がかかっても行う予定である。また、ゲノムのアセンブルは難しいものの、取得したRNAデータによりアノテーションの精度を上げる作業を進めている。変態後の発生段階の胚を取得するまでに相当時間要することを見積もっていたが、そうした発生段階のサンプリングも無事終了しており、非常に順調に進展していると言える。今後は、得られた初期胚から後期胚までのX. tropicalisとX. laevisの全胚由来遺伝子発現プロファイルの解析を進めることとする。解析は、Xenopus2種の比較解析にとどまらず、すでに手元にある別種の四足動物の遺伝子発現プロファイルと比べることで、カエルのオタマジャクシに発生段階が四足動物のどの発生段階にもっとも対応すると言えるのか?進化的共通祖先の発生段階を仮想的におき、それと照らし合わせた場合にどのようなことが言えるのか。また、脊椎動物では発生砂時計モデルが成立すると言われているが、保存されたファイロティピック段階との対応関係などについても解析を進める。今後は、得られた各発生段階のmRNAサンプルより、遺伝子発現プロファイルの同定を行う。これには近年急速に高性能化・低価格化が進む超並列シーケンサーの利用も視野にいれて進める。また得られた遺伝子発現プロファイルを異種間のデータと比較したり、個体間でのばらつきを測定したりすることで、発生段階ごとにどういった遺伝子発現プロファイル上の差異が存在するのか、そしてそれが進化と発生の関係性を説明する発生砂時計モデルとどのような関係性にあるのかについて考察する。・研究実施場所の変更(代表者は2013年8月に東京大学に異動)により、一旦実験動物の飼育を止めて、再開するための時間が必要となったことで、本年度実施予定であった発生学的研究関連試薬を購入しなかったため。・今年度実施しなかった発生学的研究関連試薬を購入する予算に充てる。主に遺伝子発現プロファイルの同定のために、大部分の予算を使う予定である。マイクロアレイ、あるいは超並列シーケンサーによる遺伝子発現プロファイルの同定である。これに伴い、年次ごとに分けて遺伝子発現プロファイリングを進めるのではなく、2年目に一気に進めることとしたため、次年度使用額が発生している。