hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
エイズ患者に合併する日和見真菌感染症の分子病態に関する研究

その中でNKT細胞の役割について遺伝子欠損(Vα14+NKT-KO)マウスを用いて詳細に検討したところ、Vα14+NKT-Kマウスでは肺内におけるTh1細胞の分化誘導、遅延型過敏反応、そしてCnに対する感染防御反応の有意な低下が見られた。このことは、Vα14+NKT細胞がTh1型の獲得免疫誘導に重要な役割を果たしていることを意味しており、ただ単に獲得免疫が成立するまでの「繋ぎ」ではないことを示している。また、感染後のVα14+NKT細胞の増加はMCP-1遺伝子欠損マウスにおいて明らかに障害されており、MCP-1がVα14+NKT細胞の集積に重要であると考えられた。この結果に一致して、Cn感染後局所においてMCP-1の経時的な産生増加がmRNA及び蛋白レベルで認められ、さらにVα14+NKT細胞の集積より先行していた。逆に、Vα14+NKT細胞の特異的活性化物質である、α-galactosylceramide(α-GalCer)投与によってIFN-_γ産生が著明に誘導され、Cn感染の排除が促進された。また、α-GalCerによるIFN-_γ産生誘導にはIL-12が必須であり、IL-18は重要でなかった。最終年度は、宿主細胞による真菌認識からNK細胞、NKT細胞、γδT細胞による自然免疫、そして獲得免疫成立に至るプロセスを立体的に解明していきたい。本研究では、動物モデルを用いてエイズに合併する日和見感染真菌として重要なCryptococcus neoformans (Cn)に対する感染防御機構について検討を行ってきた。各種遺伝子欠損マウスを用いることで、Cn感染防御におけるTh1関連サイトカイン(IFN-γ、IL-12、IL-18)の重要性について明らかにし、報告してきた。さらに前年度からは、Cn感染防御におけるNK、NKT、γδT細胞といった自然免疫リンパ球の役割について詳細な解析を行っている。Cn感染後肺内及び所属リンパ節にこれらの細胞が集積すること、またその集積にはNK、NKT細胞がMCP-1を必要とすること、γδT細胞はMCP-1非依存的であることを明らかにした。NKT細胞の役割として、この細胞を遺伝的に欠損したマウスを用いて、Cnに対するTh1反応及び感染防御の成立にNKT細胞が重要であることを見出した。一方、γδT細胞についてはマウスに抗体を投与することでこの細胞を除去してその影響を検討したところ、NKT細胞によるTh1反応の誘導を抑制的に制御している可能性を示す結果を得ており、さらに詳細な解析を行っているところである。また、東南アジアにおいてエイズに合併する重要な日和見感染真菌であるペニシリウム・マルネッフェイによるTh1反応誘導過程におけるオステオポンチンの役割についてヒトの末梢血単核球を用いて明らかにしてきた。本年度はプロジェクトの最終年度になるが、この3年間で真菌に対する自然免疫から獲得免疫に至るプロセスを明らかにすることができ、今後のエイズ合併真菌感染症に対する対策を構築する上で基礎的研究を通した貢献ができたと考えている。
先天性橈尺骨癒合症の原因遺伝子同定とその機能解析

本研究の目的は先天性橈尺骨癒合症孤発例に対して全エクソン解析を行い原因遺伝子を同定することと、そこで見つかった遺伝子変異をゼブラフィッシュを用いて機能解析することである。これまで、12家系から採血を行い、そのうち4家系の全エクソン解析を行い、8つの遺伝子に頻度1%以下の変異を同定した。そのうち1つの候補遺伝子である遺伝子Aのゼブラフィッシュにおける発現部位、組織について、脳、眼、胸鰭の一部に同遺伝子の強い発現をみとめた。またゼブラフィッシュモデルにおいて、遺伝子Aの過剰発現に伴いBMPシグナルを制御する点を見出した。研究最終年度である昨年度は、Crispr/Cas9システムを用いて遺伝子Aノックアウトゼブラフィッシュを作製、解析を行い、ヒト橈尺骨癒合症に相当する器官であるゼブラフィッシュの胸鰭の成長障害を見出した。これまで、12家系から採血を行い、そのうち4家系の全エクソン解析を行い、8つの遺伝子に頻度1%以下の変位が発見された。そのうち1つの候補遺伝子である遺伝子Aの生体内における発現部位、組織は不明であったのでゼブラフィッシュで検討した。はじめに、生後数時間、1日、2日の稚魚を用いて、whole-mount in situ hybridizationを行い、mRNAの発現解析を行った。結果、脳、眼、胸ひれの一部に同遺伝子の発現を認めた。以上より、遺伝子Aはこれら発現部位において何らかの機能を発揮していると予想された。次に、遺伝子特異的ノックダウンオリゴを新規に3つ作製し、ゼブラフィッシュ胚を用いて、ノックダウンを行った。結果、大きな表現型を認めなかった。そこで、遺伝子Aの全長遺伝子をクローニングし、CMVプロモーターを有するpCS2+ベクターに組み込み、遺伝子Aの過剰発現を行った。結果、背側化促進現象を認めた。従って骨形成タンパク質であるBMPシグナルを制御している遺伝子という仮説を立て、検証を行った。次にbmp2bを過剰発現し(腹側化促進現象)、遺伝子Aと共に共発現を行った。結果、bmp2b過剰発現に伴う腹側化促進現象が遺伝子A過剰発現に伴う背側化促進現象がレスキューできた。以上より、遺伝子AがBMPシグナルを制御している可能性が示唆された。次年度は、遺伝子Aノックアウトゼブラフィッシュを作成し、上記の詳細を検討予定である。またヒト橈尺骨癒合症に相当する器官であるゼブラフィッシュの胸鰭に特に着目し検証予定である。遺伝子Aに対して、ゼブラフィッシュの全長遺伝子をクローニングを行い、発現ベクターであるpCS2+ベクターに組み入れた。また遺伝子A特異的なノックダウンアンチセンスオリゴであるモルフォリノを3つ作成しノックダウンを行った。結果、全長遺伝子の過剰発現において骨形成タンパク質であるBMPを制御しているという予備的データを得ている。一方でノックダウンにおいては明らかな表現型を認めていない。H28年度以前まで、12家系から採血を行い、そのうち4家系の全エクソン解析を行い、8つの遺伝子に頻度1%以下の変位が発見された。そのうち1つの候補遺伝子である遺伝子Aのゼブラフィッシュにおける発現部位、組織について、脳、眼、胸ひれの一部に同遺伝子の強い発現をみとめた。また遺伝子Aはゼブラフィッシュモデルにおいて、遺伝子Aの過剰発現に伴いBMPシグナルを制御する可能性について、昨年度報告した。H29年度は、遺伝子Aが蛋白レベルで発現するかどうかを細胞株、ウェスタンブロットを用いて確認、Crispr/Cas9システムを用いて遺伝子Aノックアウトゼブラフィッシュを作製した。しかしながら、遺伝子ノックアウトゼブラフィッシュの作製過程で、多くの胚が死亡するなど困難を極めた。10種類以上のオリゴを試し、最終的に2つのライン化に成功した。しかしながら成長が遅い、など課題が残っている。今後、遺伝子Aノックアウトゼブラフィッシュの解析を行い、ヒト橈尺骨癒合症に相当する器官であるゼブラフィッシュの胸鰭に特に着目し、骨格発生・成長に関して検証予定である。遺伝子Aノックアウトゼブラフィッシュの作製が困難を極め、予定していた遺伝子Aノックアウトゼブラフィッシュを用いた骨格解析などが実施できなかったため。上記11.知見により、遺伝子Aが過剰発現状態においてBMPを制御している点の再現性を確認したい。

また遺伝子Aのノックダウンオリゴでは明らかな表現型を認めなかったが、今後Crispr/Cas9システムを導入しノックアウトゼブラフィッシュを作成する。ノックアウトではヒト橈尺骨に相当する胸鰭に表現型をみとめると強く期待する。遺伝子Aが過剰発現状態においてBMPを制御している点の再現性を蛋白レベルで確認したい。遺伝子Aノックアウトゼブラフィッシュの解析を行い、ヒト橈尺骨癒合症に相当する器官であるゼブラフィッシュの胸鰭に特に着目し検証したい。当初予定していた実験のうち、ノックアウト条件での実験が行えなかったため次年度使用額が生じた。次年度使用額は平成30年度請求額と合わせて遺伝子Aの蛋白レベルの実験、ノックアウト実験及び得られた成果の学会発表、論文発表に使用する計画である。次年度使用額は平成29年度請求額と合わせてノックアウト条件での実験の実施に使用するとともに、ノックアウト実験及び得られた成果の学会発表、論文発表に使用する計画である。
溶解性改善を目的とした非溶媒添加晶析による革新的共結晶創製法の開発

本研究は、結晶化工学の概念を用いた、品質制御された共結晶粒子群の製造手法を提案することを目的としている。平成25年度は、実験系を決定して4成分相図の作成に取りかかる計画であった。4成分相図の作成のために計画通り、対象系として30°C大気圧でのカルバマゼピン(CBZ)-サッカリン(SAC)-メタノール(MeOH)-水系を選択した。相図の作成にあたって、まず高速液体クロマトグラフィー(HPLC)によるCBZおよびSACの濃度定量のための測定条件を検討し、それから相図作成に取り組んだ。相図作成の状況として、良溶媒100wt%の溶媒とCBZおよびSACの3成分相図が作成され、4成分相図としては溶媒組成で非溶媒組成0wt%から40wt%の領域まで相図を作成することができた。作成した相図の範囲内で、非溶媒添加晶析操作が可能な領域が想定通りに存在することが確認された。当初の計画では、25年度は系の選択および相図作成に時間を要することを想定して、系の選択および相図作成に集中してする予定であった。しかし、系の選択および相図の作成に目途が立ったので、4成分相図が完成されてからの非溶媒添加晶析の操作設計の検討にも備えた。結果として、4成分相図の作成途中で得られたCBZ-SAC-MeOH系の3成分相図に基づいて、溶液から共結晶粒子群を創製する新規晶析法を提案するに至った。この新規晶析法は、非溶媒添加晶析法と同様の二液を混合する晶析法であり、非溶媒添加晶析への展開が可能である。また、相図を利用した共結晶の過飽和度の定義・算出法の考案にも取り組み、物質収支に基づく定義・算出方法を提案することができた。共結晶粒子群の品質制御の検討に際して、過飽和度と結晶粒子群品質との関係の整理は必須の重要課題である。したがって、共結晶の過飽和度の定義・算出方法を提案できたことは、大きな意義がある。当初の計画では4成分相図が完成してから非溶媒晶析操作法の検討に取り組むこととしていた。しかし、4成分相図作成の途中で得られた3成分相図を利用して、非溶媒添加晶析のような新規晶析操作法を提案できる可能性を見出した。そこで、4成分相図作成と同時に3成分相図に基づく新規晶析操作法の提案にも取り組んだ。非溶媒添加晶析へと展開可能な3成分相図に基づく新規晶析操作法の提案することができた一方で、4成分相図作成が遅れているため、上記の区分であると評価した。提案した3成分相図に基づく新規晶析操作法は非溶媒添加晶析へ展開することが可能であり、4成分相図が完成した時点で非溶媒添加晶析を実施することができる。したがって、今後の研究の推進のための方策として、4成分相図の作成に専念する。また、4成分相図が完成してからの非溶媒添加晶析で条件と結晶粒子群品質の関係を整理する段階では、3成分相図に基づく新規晶析操作法の提案に際して得られた知見を活用することで研究の推進を図る。

そこで、4成分相図作成と同時に3成分相図に基づく新規晶析操作法の提案にも取り組んだ。非溶媒添加晶析へと展開可能な3成分相図に基づく新規晶析操作法の提案することができた一方で、4成分相図作成が遅れているため、上記の区分であると評価した。提案した3成分相図に基づく新規晶析操作法は非溶媒添加晶析へ展開することが可能であり、4成分相図が完成した時点で非溶媒添加晶析を実施することができる。したがって、今後の研究の推進のための方策として、4成分相図の作成に専念する。また、4成分相図が完成してからの非溶媒添加晶析で条件と結晶粒子群品質の関係を整理する段階では、3成分相図に基づく新規晶析操作法の提案に際して得られた知見を活用することで研究の推進を図る。
分析電子顕微鏡による低温域拡散係数の測定

材料の相変態や変形の解析には広い温度域にわたる拡散係数の値を知ることが必須である。X線検出器を備えた分析電子顕微鏡(AEM-EDS)は直径数nmの極微小領域の定量分析が可能で、従来のセクショ二ング法やX線マイクロアナライザー(EPMA)による分析法に比べて空間分解能が二桁ほど高いため、低温度域の拡散係数測定に適用できることになる。本研究では、この分析法を拡散係数測定に有効に活用できるようにするため、拡散対薄膜試料の作製法やX線吸収補正法に改良を加え、Ni-Al系において相互拡散係数の測定を行った。得られた成果を以下に要約する。1.ブロック状の拡散熱処理試料から薄膜試料を作製する際、加工手順を変えたりメッキで拡散対試料を補強したりすることにより、薄膜化過程で発生し易い拡散対界面からの割れを高い確率で防ぐことができるようになった。2.試料中での吸収が大きいAl特性X線の吸収補正に対し、申請者らはX線吸収差法に改良を加えることにより、吸収補正が分析箇所の膜厚測定なしで精度よく効率的に行うことができることを示した。3.AEM-EDS法とEPMA法を用いて相互拡散係数を測定した結果、両者とも同様な値を得ることができた。このことから、空間分解能が低いためにEPMA法では測定できない低温度域の拡散係数もAEM-EDS法では測定できることが示された。4.本実験で求めたNi-Al系相互拡散係数はJanssen(1973)の結果を除いて他の報告値と一致した。また、Ni中のAlの不純物拡散係数と一致したが、Ni中のNiの自己拡散係数に比べれば一桁ほど大きいことが分かった。
拡張型反応性分子を用いる高次アセンの迅速合成法の開発と機能評価

アセンは複数のベンゼン環が直線状に縮環した構造を持ち,これをモチーフとするπ電子系分子は,構造化学ならびに物性化学をはじめ多くの分野から高い関心を集めている。本研究は,有機デバイス作製を指向したアセン系置換誘導体の量的供給を図り,キノイド型反応性分子を用いる多環構造構築法の開発を目指すものである。これまで,イソベンゾフランの利用を中心とする多環芳香族化合物の合成を行ってきたが,今年度は縮環数の伸長したイソアセノフランを新規合成ブロックとして活用することを念頭に,まずはイソナフトフランの発生法を検討した。その結果,置換ナフタレン誘導体への二つのアルキニル基の導入を経て得られるヒドロキシケトンに対して,トリフルオロ酢酸を作用させると,脱水環化反応が進行しイソナフトフランが生成した。これが系内に共存するキノンと環化付加反応を起こし,アセン構造の骨格構築を可能とした。続く官能基化と酸素架橋部位の芳香族化により,置換ペンタセンおよび置換ヘキサセンを系統的に合成することに成功した。このように,高い反応性を持つイソアセノフランを系内で発生する新規手法を見出し,キノン類との環化付加反応により得られる置換ポリアセンの迅速構築法の開発に成功した。当初の計画通り,イソナフトフランの系内発生法を見出し,これを反応性分子として用いる多置換ペンタセンへの誘導に成功した。なお,この化合物における多重アルキンの置換基効果により,π共役系の効果的な拡張に加え,有機溶媒中での安定性が向上した。また,求ジエン体として1,4-アントラキノンを用いることで,同様の手法により四つのアルキニル基を持つ置換ヘキサセン誘導体の合成にも成功した。これらの化合物について,X線結晶構造解析とNMRによる構造決定を行い,さらに分光測定および電気化学測定により基本物性を明らかとした。今年度の知見を踏まえ,より縮環構造の伸長したイソアセノフランの発生方法を検討し,これを反応性分子として用いる種々のキノンとの反応と官能基化により,多様な置換形式を持つポリアセン誘導体への展開を試みる。また,これまで系内発生により用いてきたイソナフトフランの単離精製法を検討し,その合成的利用の拡大を図る。
脳腫瘍の遺伝子診断とアポトーシス誘導療法に関する研究

1.脳腫瘍の手術時生検組織を対象とし、(1)アポトーシス情報の受容と伝達に関与するFas ligand/Fas系、(2)アポトーシスの決定に関与するBcl-2 family、(3)アポトーシスの実行に関与するICEfamilyについて、それらの発現を免疫組織化学的に検索した。さらにTUNEL法によりアポトーシス細胞の同定を行いその割合をapoptotic index(Al)として算出した。その結果脳腫瘍の組織型によってアポトーシス関連遺伝子産物の発現パターンは異なっており、各脳腫瘍の発生或いは存続へのアポトーシスの関与が一様ではないことが判明した。2.Fas ligand/Fas系を介して培養グリオーマ細胞にアポトーシスを誘導できるか否かを検討した。FlowcytometryおよびRT-PCR法にてFasの発現を確認した3種のヒト培養グリオーマ細胞株(T98G,U251およびA172)に対してIgM型抗Fas抗体を作用させると、T98Gにのみアポトーシスが誘導された。このアポトーシスはICE inhibitor(YVAD-CMK)にて抑制された。4.以上の研究から、ヒト脳腫瘍におけるアポトーシス機構を詳細に解析することにより、アポトーシスの機序を応用したより効果的な治療法の開発が可能になると思われる。またOK-MC養子免疫療法の機序にFas ligand/Fas系が関与していることから、将来、精製Fas ligandを用いたアポトーシス誘導療法の実現の可能性が示唆された。1)グリオーマ手術時生検組織を材料としてp16およびp21遺伝子産物の発現を免疫組織化学的に検討した。p21の陽性率は増殖能の指標であるMlB-1 indexと相関した。p16陽性率はグリオーマの悪性度が高くなるに伴って低下した。p16は核内蛋白質であるにも拘わらず、神経膠芽腫の一部の症例では細胞質にのみ強く染色され、p16蛋白質の構造異常により核内輸送が障害されている可能性が示唆された。p16蛋白質の発現がみられない例ではp16遺伝子の欠失が原因であることが確認された。3)グリオーマ組織におけるアポトーシス関連遺伝子産物であるFas,Bcl-2,Bcl-x及びBaxの発現を免疫組織化学的に検討した。病理組織学的悪性度が高いほどFasの発現が強くなる傾向にあった。すべてのグリオーマ組織でBcl-2の発現があり、Bcl-2が腫瘍細胞の生存延長に深く関与しているものと思われた。膠芽腫ではBcl-2の陽性率は低い傾向にあったが反対にBcl-xは高く、このことから膠芽腫においてはBcl-2とBcl-xとが相補的にアポトーシスを抑制している可能性が考えられた。Baxはその発現に変化が認められなかった。グリオーマにおけるアポトーシスはアポトーシス促進因子と抑制因子とにより複雑かつ精妙に制御されているものと推察された。FlowcytometryおよびRT-PCR方にてFasの発現を確認した3種のヒト培養グチオ-マ細胞株(T98G,U251およびA172)に対して1gM型抗Fas抗体を作用させると、T98にのみアポトーシスが誘導された。このアポトーシスはICEinhibitor(YVAD-CMK)にて抑制された。OK-MC療法が劇的に奏功した大腸癌脳転移症例では腫瘍細胞におけるFasの発現は強く、しかも同患者から作製したOK-MCはFas ligandを強く発現していることが判明している。今回の研究より精製Fas ligandを用いるアポトーシス誘導療法の可能性が示唆された。
C末欠損セロトニントランスポーターをセンサーとした新規シャペロン機構の同定と応用

1 SERTΔCTの取り込み活性を上昇させる膜輸送活性化薬物のスクリーニング法の開発と薬物の同定:シグマ受容体作用薬のSKF-10047(以下SKF)がSERTΔCTの取り込み活性を著明に上昇させることを見出した。さらにシグマ受容体のノックダウンの検討から、SKFのSERTΔCTに対する効果は、シグマ受容体を介さないことが明らかとなった。SKFのSERTΔCTに対する効果発現のメカニズムを明らかにする目的で、SKFの48時間処置により変動する遺伝子群の検索の結果から、膜輸送に関係するSNARE受容体のsyntaxin3に注目した。syntaxin3は実際にSKFのSERTΔCTの効果発現に関与していることが明らかとなった。今後、syntaxin3とSERTとの相互作用について検討を続ける予定である。3 SERTの膜輸送機構とパルミトイル化の関与:SERTがパルミトイル化される膜タンパク質であることを明らかにした。今後、パルミトイル化を介したSERTの機能調節機構、膜輸送機能調節機構を明らかにする予定である。4小胞体機能修飾する薬物としての麻酔薬プロポフォールの働き:麻酔薬プロポフォールがPKCの局在を種依存的に多彩に変化させることを明らかにした。また、この機序として、プロポフォールが小胞体に直接働きその形態を変化させることが関与していることが明らかとなった1SERTΔCTの取り込み活性を上昇させる膜輸送活性化薬物のスクリーニング法の開発2)SERTΔCTの凝集体形成を指標にした膜輸送活性化薬のスクリーニング法の開発:ハイコンテント顕微鏡OperaPhenixを用いてSERTΔCTの凝集対形成を認識させ、各種薬物の凝集体形成に対する効果を判定する実験手法を確立した。ケミカルシャペロンの4-PBA処置により、凝集体形成の抑制効果が見られた。2薬物により変動する遺伝子群のcDNAアレイによる網羅的解析:シグマ受容体アゴニストのSKF-10047処置による遺伝子変動を解析し複数の有力な幻想遺伝子を同定した。蛍光標識SERT基質用いた計測方法、SERTΔCTの凝集体形成を指標にした計測方法、ともに確立することができた。薬物により変動する遺伝子群のcDNAアレイによる網羅的解析に着手することができた。1SERTΔCTの取り込み活性を上昇させる膜輸送活性化薬物のスクリーニング法の開発1)蛍光標識SERT基質用いたハイスループットスクリーニング法開発への取り組み:非ステロイド系抗炎症薬のFlurbiprofenが本スクリーニング法にてSERTの膜輸送を活性化して取り込み活性を上昇させることがわかった。Flurbiprofenは自身の持つケミカルシャペロン活性を発揮してこのような効果を持つものと考えられた。また、HSP誘導剤である潰瘍薬を効果を本検索法で検討したところ、Carbenoxoloneが同様な機序でSERT取り込み活性を上昇させることがわかった。2)SERTΔCTの凝集体形成を指標にした膜輸送活性化薬のスクリーニング法の開発:ハイコンテント顕微鏡OperaPhenixを用いてSERTΔCTの凝集対形成を認識させ、各種薬物の凝集体形成に対する効果を判定する実験手法を確立した。前述のFlurbiprofen、CarbenoxoloneはともにSERTΔCTの凝集体形成を抑制することが本検索法で明らかになった。このように、ERストレス緩和作用を持つ薬物の候補が見つけることができた。2薬物により変動する遺伝子群のcDNAアレイによる網羅的解析:シグマ受容体アゴニストのSKF-10047処置による遺伝子変動を解析し複数の有力なSKF-10047のターゲットと思われる遺伝子を同定した。その中でも、膜輸送に関与する蛋白としてSNARE蛋白の一つであるsyntaxin 3が実際にSKF-10047処置により発現が増強することがわかった3麻酔薬プロポフォールがタンパク質リン酸化酵素Cに対して多彩なトランスロケーションを誘発することを明らかにした。蛍光標識SERT基質用いた計測方法、SERTΔCTの凝集体形成を指標にした計測方法、を確立し、その検索法を用いることにより、複数のERストレス緩和作用を持つと考えられる薬物を同定した。薬物により変動する遺伝子群のcDNAアレイによる網羅的解析に着手し、膜輸送活性化作用を持つSKF-10047の標的と考えられるタンパクを同定することができた。麻酔薬プロポフォールの新たな作用機序に迫ることができる結果が得られた。

また、この機序として、プロポフォールが小胞体に直接働きその形態を変化させることが関与していることが明らかとなった確立されたスクリーニング法を用いて、薬物検索を進めていく。蛍光基質を用いてSERTΔCTの活性が測定できなかった原因を探り、さらなる改善方法がないか、検討する。cDNAアレイによる網羅的解析の結果を検証する。確立されたスクリーニング法を用いて、さらに薬物検索を進めていく。新たなSERTΔCTの活性を評価する方法として、SERTΔCTの発現細胞に取り込まれたセロトニンをセロトニン抗体で認識させて評価することを試みる。cDNAアレイによる網羅的解析、薬物結合タンパク質の検索をさらに進める。1.C末欠損セロトニントランスポーターの取り込み活性が、当初予定していたNeurotransmiter Transporter Uptake Assay Kitでは測定できないことがわかり、他の方法による活性測定方法を開発するのに時間を要した。セロトニンを取り込ませた細胞を抗セロトニン抗体で免疫組織学的手法で解析する方法に変更したことで解析するのに時間を要した2.cDNAアレイの結果を検証することに時間を要した。1.2の理由から30年度においては、新たな解析手法による、C末欠損セロトニントランスポーターの取り込み活性を上昇させる薬物の検索を行う。また、cDNAアレイ解析で見いだされた発現変動遺伝子のノックダウン細胞や過剰発現細胞を用いて、SKF-10047の新規標的蛋白の同定を試みる。これら2つの実験計画の遂行に次年度使用額である500,000円を用いる。
大脳前頭前野における記憶検索の神経回路-ニューロン活動と認知行動の統合的研究

本プロジェクトでは、大脳前頭前野からのトップダウン的な認知情報処理に携わる神経回路(Hasegawa et al. 1998)の実体についてニューロン活動から行動レベルにいたる一貢した理解を目標とする。このために、ニホンザルに認知記憶課題を遂行させ、機能的、磁気共鳴画像(fMRI)法による活性化実験、fMRIの活性化地図を参照してGABAアゴニスト微量注入をおこなう可逆的不活化実験および微小電極法による単一神経活動記録実験、を並行して進めている。側頭葉からの単一神経活動記録により、視覚入力を受けない大脳半球から記憶検索するときに下部側頭葉連合野の単一神経活動が前頭前野からのトップダウン的信号によって誘導されることが判った(Tomita et al. 1999)。また、眼球運動課題遂行中に前頭前野から単一神経細胞の活動を記録した。遅延期間中に眼球運動目標の転換を指示することにより、前頭葉の神経細胞は直接的な視覚入力がなくとも、認知行動的に必要な記憶情報を保持し得ることがわかった(Fukushima et al. 2000)。また、1.5Tおよび4.7T超伝導磁石を用い、サルのfMRI実験を行った。1.5Tでは、触覚刺激で一次・二次体性感覚野に体部位局在を反映した活性化地図が同定された(Hayashi et al. 1999)。さらに4.7Tのシステムを構築し、覚醒下のニホンザルにおいて眼球運動記憶課題遂行中の脳活動を計測した。両側前頭葉の前頭眼野および背側運動前野周辺領域、補足眼野、視覚関連領野において賦活領域が検出された(Hasegawa et al. 2001)。今後さらに連想記憶課題等の認知課題における賦活化実験を行い、不活性化実験・電気生理学的実験を進めてゆく予定である。本プロジェクトでは、ニホンザルの脳梁後半部離断標本(Hasegawa et al.Science 281,814-818,1998)を用いて、1.GABAアゴニスト微量注入による可逆的不活化実験と、2.微小電極法による側頭葉連合野からの単一神経活動記録実験を進め、前頭前野からのトップダウン的な記憶検索の神経回路の実体について単一ニューロン活動のレベルから認知行動レベルにいたる一貫した理解を目標とする。1で前頭前野内におけるGABAアゴニスト注入部位を決定する際に、機能的磁気共鳴画像(fMR1)法による活性化地図を参照するという新しい方略を試みる。当該年度には、1.二頭のニホンザルの前交連と脳梁後半部を選択的に切除して脳梁後半部離断標本をつくった。手術後、片側の大脳半球に提示した図形刺激をてがかりとして、対をなす図形を反対側の半球に選ばせる視覚性連想記憶課題の訓練を開始した。並行して、マカクザルfMRlの予備実験を行った。その結果、触覚刺激で一次・二次体性感覚野に体部位局在を反映した活性化地図が同定できることがわかった(Eur.J.Neurosci.11,4451-4456,1999)。2.別の二頭の部分的スプリットブレイン標本に視覚性連想記憶課題を行わせながら、側頭葉から微小電極法により単一神経活動を記録した。ボトムアップ的な視覚入力を受けない側の大脳半球から記憶検索する必要のあるときに、下部側頭葉連合野の単一ニューロンの活動が前頭前野からのトップダウン的信号によって誘導されることが実験的に検証された(Nature 401,699-703,1999)。

本プロジェクトでは、ニホンザルに認知記憶課題を遂行させ、1.機能的磁気共鳴画像(fMRI)法による活性化実験、2.fMRIの活性化地図を参照してGABAアゴニスト微量注入をおこなう可逆的不活化実験、3.微小電極法による単一神経活動記録実験、を並行しておこなう。これにより、前頭葉連合野からトップダウン的に記憶情報を操作する神経回路(Hasegawa et al.Science 281,814-818,1998)の実体について単一ニューロン活動のレベルから認知行動レベルにいたる一貫した理解を目標とする。当該年度には、●前年度につくったニホンザル脳梁後半部離断標本において、視覚性連想記憶課題の訓練を完成した。また、1.5TのMRI撮影室内で動作する、サルの頭部固定システム、視覚刺激提示と同時にサル眼球運動を測定するためのシステム、液体報酬(ジュース)投与システムを開発した。これらを利用して覚醒下でfMRI実験をおこない、大脳の視覚関連領野、眼球運動関連領野、および記憶関連領野の活性化地図の作成を進めている。●別のニホンザルに眼球運動記憶課題を遂行させ、前頭葉連合野から微小電極法により単一神経細胞の活動を記録した。遅延記憶期間中に眼球運動目標の転換を指示することにより、前頭葉の神経細胞は直接的な視覚入力がなくとも、認知行動的に必要な記憶情報を保持し得ることがわかった(Fukushima et al.Soc.Neurosci.Abstr.26,404.2,2000)。本プロジェクトでは、大脳前頭葉連合野からトップダウン的に記憶情報を操作する神経回路(Hasegawa et al. Science 281, 814-818, 1998)の実体について単一ニューロン活動のレベルから認知行動レベルにいたる一貫した理解を目標とする。この目的のために、前年度までにオペラント条件付けによりニホンザルに認知課題を遂行するよう訓練し、1.機能的磁気共鳴画像(fMRI)法を用いた非侵襲的イメージング実験による大脳の活性化地図作成、2. 1で作成した大脳の機能地図を参照しながら抑制性神経伝達物質GABAのアゴニストであるムシモルを微量注入する不活化実験の準備ならびに微小電極法による単一神経活動記録実験を並行して進めてきた。前年度から推進していた1.5テスラのMRI実験において、信号雑音比・空間分解能等の技術的問題から脳梁後半部離断標本における大脳記憶関連領野の活性化地図の作成が困難であることが判明したため、当該年度には高磁場MRIシステムの開発を行った。静磁場コイルとして4.7テスラ超伝導磁石を用い、立ち上がり時間200マイクロ秒で高速に傾斜磁場の切り替えが可能な傾斜磁場コイルを装備した。このシステムを用いて、予備実験として覚醒下のニホンザルにおいて眼球運動記憶課題遂行中の脳活動を計測した。両側前頭葉の前頭眼野および背側運動前野、補足眼野、視覚関連領野において賦活領域が検出された。今後さらに視覚性連想記憶課題等の認知課題における賦活化実験を行い、不活性化実験・電気生理学的実験を進めてゆく予定である。
HTLV-I感染特異的神経障害機構に基づくHTLV-I関連脊髄症発症機構の解明

昨年度までに、HTLV-Iエンベロープタンパク質がヒトおよびマウス神経細胞において、小胞体およびミトコンドリア依存性の細胞死カスケードのクロストークを介して、神経細胞にアポトーシスを誘導することを明らかにした。本年度はHTLV-Iエンベロープタンパク質の神経細胞上の受容体の探索を試みた。グルコース輸送体の一つであるGLUT-1がHTLV-Iの受容体であると報告されたため、GLUT-1の阻害剤であるCytochalasin BおよびPhroletinの、HTLV-Iエンベロープタンパク質による神経細胞死への影響を調べた。しかし、両者ともHTLV-Iエンベロープタンパク質による神経細胞死を抑制することはできなかった。これらの結果から、HTLV-Iエンベロープタンパク質による神経細胞死はGLUT-1を介して引き起こされるものではないと考えられた。次に、Viral Overlay Protein Binding Assay(VOPBA)法を用いて、マウス初代培養中枢神経細胞より取得した細胞膜タンパク質における、リコンビナントHTLV-Iエンベロープ蛋白質と反応するタンパク質の検出を行った。その結果、陰性コントロールと比較して、215kD付近にバンドが認められた。また、マウス初代培養中枢神経細胞より取得した細胞膜タンパク質を、HTLV-Iエンベロープ蛋白質と反応させ、抗HTLV-Iエンベロープ蛋白質抗体を用いて免疫沈降を行った。その結果、同様の位置にバンドが認められた。今後、そのタンパク質の解析を、質量分析法を用いて行う予定である。我々はこれまでに、HTLV-Iエンベロープ蛋白質がヒトおよびマウス神経細胞においてアポトーシスを誘導することを明らかにした。そこで、今年度の研究では、HTLV-Iエンベロープ蛋白質による神経細胞アポトーシス誘導のメカニズムについて検討した。C57BL/6胎仔マウスの大脳皮質より得られた中枢神経細胞にリコンビナントHTLV-Iエンベロープ蛋白質を作用させ、化学発光測定システムを用いて、各サンプルの生細胞率、各種カスパーゼ活性を測定した。その結果、HTLV-Iエンベロープ蛋白質で処理された神経細胞において、非処理細胞と比較して、それぞれの特異的阻害剤感受性である、有意なカスパーゼ3および9活性の上昇が認められた。HTLV-Iエンベロープ蛋白質による神経細胞でのカスパーゼ3の有意な活性化は、神経マーカーであるMAP2と活性化カスパーゼ3に対するそれぞれの抗体を用いた二重組織染色により確認された。一方、カスパーゼ8の活性化は認められなかった。さらに。HTLV-Iエンベロープ蛋白質で処理された神経細胞から抽出された細胞質画分をウェスタンブロット法で解析した結果、チトクロームc、また、Smac/DIABLOのレベルの上昇が認められた。さらに、カスパーゼ12の断片化も認められた。以上のことから、HTLV-Iエンベロープ蛋白質は神経細胞において、チトクロームcやSmac/DIABLOのミトコンドリアからの流出を引き起こし、それらによるカスパーゼ9の活性化、引き続いてカスパーゼ3の活性化を引き起こす。また、カスパーゼ12の断片化を引き起こし、それによってもカスパーゼ3の活性化を引き起こすと考えられた。これらのことから、HTLV-Iエンベロープ蛋白質は小胞体およびミトコンドリア依存性の細胞死カスケードのクロストークを介しで神経細胞にアポトーシスを誘導すると示唆された。
言語の機械処理の前提となる理論言語学の研究

いわゆる自然言語の機械処理の基礎となる言語理論は形式化されている必要があるが、これに加え、高度の処理を目指すなら、既成理論の形式化にとゞまらない先行的研究も必要である。この二つの観点から当研究を行った。1.構文論を中心とする分野ーまず日本語を扱う形式文法GPSGの立場から、前二年の成果を受け補語構造の文法論・意味論的考究をし、単一化を利用した実験的システムを作った。他に、束縛経路理論の立場からwh疑問文などの新しい扱い方を研究し、理論の拡張を行うと共に機械処理への応用上の問題を検討した。また、パラメータの理論に基づいて、日本語と英語とをそれぞれの典型とするwh句の文法的性質を調べ、両者の違いを生ずるパラメータを追究し一つの仮説を立てた。2.意味論を中心とする分野ーNBGクラス論理を背景とする意味記述体系を構築しつゝ、本年度は特に、真偽が直接には問われない感動文や命令文・疑問文の釈義、アナロジに立つ表現の意味の記述法を考察した。別の体系として、従来の引き項・述項の別に立つのではない《タプル論理》の考案に基づき、その形式体系化をすると共にこれを日本語によるQAシステムに応用した。モンタギュー意味論的研究として、日本語の名詞句の特色を明らかにしその明示的意味論を展開した。3.運用論を中心とする分野ー潜在文脈の理解を成り立たせる推論の種類を整理し、純粋に意味的な含意、慣習による含意、文脈に依存する含意の、言語学的位置づけを明らかにした。他に、まとまった文章について、知的伝達を目的とする(広義の)論説文の一類の望ましい文章構造を実例から抽出し、その知見に立って、この種の文章を生成するための支援システムをパーソナルコンピュータ上に実現した。
乳癌の内分泌療法耐性獲得の分子機構の解明とその克服：癌幹細胞の役割を中心に

昨年度からエストロゲン感受性乳癌細胞株MCF-7を6カ月間以上の長期にわたり1)低酸素培養下、2)エストロゲン枯渇下、3)抗エストロゲン薬(4-OH-tamoxifen [4-OHT], fulvestrant [FUL])曝露下、4)これらの組み合わせ処理下、合計8条件で細胞培養を行なった。培養開始後2カ月毎に、エストロゲン・抗エストロゲン薬に対する増殖反応性、ERシグナル伝達経路、癌幹細胞(CSC)比率、CSC制御因子であるヘッジホッグシグナル伝達の関連因子のmRNA発現を経時的に検討した。その結果、すべて条件下で経時的にエストロゲンや抗エストロゲン薬に対する反応性の低下が観察された。興味深い所見としては、1)エストロゲン枯渇下処理により樹立された内分泌療法耐性乳癌細胞株と親株を比較したところ、エストロゲンに対するhypersensitivityとER-αの発現亢進、エストロゲン非依存的なER-αの活性化やCSC比率の増加がみられた。2)抗エストロゲン薬FUL曝露下で樹立された内分泌療法耐性乳癌細胞株と親株を比較したところ、ヘッジホッグシグナル伝達の関連因子のmRNA発現の増加が認められた。これらの研究結果は、論文にまとめられた。さらに、エストロゲン枯渇下で樹立されたlong-term estrogen deprived (LETD)細胞やFUL耐性細胞が樹立され、親細胞とのmRNA発現をマイクロアレイで比較検討し、共通した遺伝子変化として、CXCR4, HER4の発現亢進が抽出された。現在、これらの因子の拮抗薬を用い、内分泌療法耐性の克服が可能かどうかを検討中である。8種類の条件下の長期培養実験により、複数の内分泌療法耐性乳癌細胞株が樹立され、異なるシグナル伝達の変化が観察された。さらに、LETD細胞やFUL耐性細胞が樹立され、親細胞とのmRNA発現をマイクロアレイで比較検討し、共通した遺伝子変化として、CXCR4, HER4の発現亢進が抽出された。ほぼ予定通り研究は進展している。本年度は、エストロゲン感受性乳癌細胞株MCF-7を6カ月間の長期にわたり1)低酸素培養下、2)エストロゲン枯渇下、3)抗エストロゲン薬(4-OH-tamoxifen [4-OHT], fulvestrant [FUL])曝露下、4)これらの組み合わせ処理下、合計8条件で細胞培養を行なった。培養開始後2カ月毎に、エストロゲン・抗エストロゲン薬に対する増殖反応性(エストラジオールや4-OHT, FULの細胞増殖に与える影響)、ERシグナル伝達経路(ER-α, PgR, TFF-1のmRNA発現量)、CSC比率(CD44/CD24アッセイ、マンモスフェアアッセイ)、CSC制御因子であるヘッジホッグシグナル伝達の関連因子(SHH, Gli1, Gli2)のmRNA発現を経時的に検討した。しかし、CSC比率の変化は一定の傾向は認められなかった。興味深い所見としては、1)エストロゲン枯渇下処理により樹立された内分泌療法耐性乳癌細胞株と親株を比較したところ、ER-αの発現亢進とエストロゲン非依存的なER-αの活性化(PgR, TFF-1の転写促進)がみられた。2)抗エストロゲン薬(FUL)曝露下で樹立された内分泌療法耐性乳癌細胞株と親株を比較したところ、ヘッジホッグシグナル伝達の関連因子(SHH, Gli1, Gli2)のmRNA発現の増加が認められた。今後さらに、EMT関連因子やヌードマウス移植能の変化についても検討する予定である。また、次年度は、予定通り内分泌療法耐性乳癌細胞株と親株を比較するmRNA expression microarrayを行い、網羅的に遺伝子発現の変化を検討する予定である。しかし、それらの耐性細胞においてCSC比率の変化には一定の傾向が認められなかった。今後は、網羅的な遺伝子解析を用いて、CSCやEMT制御に係る様々なシグナルの変化を確認し、内分泌療法耐性を誘導する要となるシグナルを同定したい。

これらの研究結果は、論文にまとめられた。さらに、エストロゲン枯渇下で樹立されたlong-term estrogen deprived (LETD)細胞やFUL耐性細胞が樹立され、親細胞とのmRNA発現をマイクロアレイで比較検討し、共通した遺伝子変化として、CXCR4, HER4の発現亢進が抽出された。現在、これらの因子の拮抗薬を用い、内分泌療法耐性の克服が可能かどうかを検討中である。8種類の条件下の長期培養実験により、複数の内分泌療法耐性乳癌細胞株が樹立され、異なるシグナル伝達の変化が観察された。さらに、LETD細胞やFUL耐性細胞が樹立され、親細胞とのmRNA発現をマイクロアレイで比較検討し、共通した遺伝子変化として、CXCR4, HER4の発現亢進が抽出された。ほぼ予定通り研究は進展している。複数の内分泌療法耐性乳癌細胞株の親細胞株とのエストロゲン・抗エストロゲン薬に対する増殖反応性、ERシグナル伝達経路、CSC比率、ヘッジホッグシグナル伝達の関連因子の発現の違いを再確認し、さらに、網羅的な遺伝子解析を追加する。また、in vivoにおける造腫瘍能の変化も検討したい。その後は、構築されたin vitro, in vivo内分泌療法耐性乳癌細胞に対する治療実験を行い、内分泌療法耐性の克服を可能とする治療戦略を探索したい。具体的には、ヘッジホッグ阻害薬(GANT61など)、CDK4/6阻害薬を候補薬剤として使用する予定である。研究はほぼ順調に進展中である。次年度は、予定通り内分泌療法耐性乳癌細胞株と親株を比較するmRNA expressionmicroarrayを行い、網羅的に遺伝子発現の変化を検討する予定である。このマイクロアレイ実験には、予想以上の経費がかかると思われる。そのため、一部の研究費を次年度に持ち越した。mRNAマイクロアレイ解析への支出が大きかったがほぼ予定通り使用した。
女性の居住ニーズと居住環境整備の方策に関する研究

(1)現代女性のコレクティブハウスに対する居住ニーズ兵庫県営コレクティブハウスの居住者へのヒアリング調査ならびに民間コレクティブに関心をもつ女性グループへのヒアリング調査を実施し、コレクティブハウスが女性に支持される理由には、家事、育児、介護の協働化やコミュニティー形成による安心感への期待が大きいこと、また、居住歴、現在の居住形態、家族に対する考え方、近隣との付き合いの程度や付き合いにたいする考え方がコレクティブ居住へのニーズに反映されること、を見出した。(2)育児期の女性の居住ニーズ近年、供給されるようになった保育サービス付き共同住宅供給事例を収集し、その実体を調査した。保育サービス付き共同住宅とは、住宅供給主体が育児サービス運営主体と連携し、保育・託児プログラムを提供するサービス機能が付加された賃貸もしくは分譲の共同住宅で、通常、保育・託児のための共用空間が設けられている。調査から、現状では需要者のニーズとサービス提供形態や対価にズレが生じており、一部のサービスしか受容されていないこと、しかし、潜在的なニーズは大きく、居住者参加を組み入れるなど、運営形態に工夫の余地が残されていることが明らかになった。(3)居住地特性と居住ニーズ現代女性の居住ニーズは居住地特性によって異なる。都心部に住む女性は、職住近接という有利な条件を有していることから、家事・育児とフルタイム就労とを両立させようとしており、対価をともなっても、居住関連サービスを需要する傾向がみられる。一方、郊外部に住む女性はパートタイム就労による仕事の家庭の両立や共同保育等、近隣資源を活用した問題解決を指向している。アンケート調査結果は、女性の職業、就労形態、扶養子の数等の変数が居住地特性と相関しており、居住地特性に即した支援施策が要請されることを示唆している。欧米におけるジェンダー・パースペクティブをかかげた住宅研究をサーベイし、現代女性の居住ニーズについて検討した。既往文献から得られた知見は次のように整理される。(1)女性の社会参画がすすむにともない、これまで女性役割として位置づけられ、また実際に女性がそのほとんどを担ってきた家事、育児、介護の問題が顕在化している。(2)世帯形態の多様化やライフスタイルの変化にともない、住宅の立地、建てかた、間取り、所有関係にたいする指向性が変化している。選択肢を増やす住宅政策が求められている。(3)住まいとかかわってもっとも切実な問題として意識され、また取り組まれているテーマは育児である。働く女性は、保育空間、保育サービスの現状にたいする不満が高い。(4)一般に、男性世帯主世帯に比べ、女性世帯主世帯は所得水準が低く、社会サービスにたいする潜在ニーズが高い。(5)自家用車を保有・利用する女性は男性より少なく、女性の交通手段は徒歩や公共交通手段により依存している。歩きやすい街路の整備や公共交通手段へのアクセスの改善は、女性のモビリティーを高める効果が大きい。(6)女性の視点をとりいれた居住地整備をすすめるためには、政策決定機構に女性が参加することが不可欠であり、また、もっとも効果的であると認識されている。これらの知見にもとづく調査仮説を検討し、社会活動に参画している女性を対象に、家族観・住まい観と、住宅の形態や居住サービスにたいする指向性との関連性を調査した。その結果、家族や住まいのあり方にたいして、先鋭的な意識をもつ女性ほど、コレクティブハウス(一棟あるいは一住宅団地内に独立完備した住戸と、居住者が日常生活行為の一部を共同化するための共用空間や設備を有する集住形態)に代表される、新しい居住形態にたいする指向性が高いことがわかった。
蛋白質複合体結晶化による光非依存型プロトクロロフィリド還元酵素の動的構造解析

申請者らはこれまでに、ニトロゲナーゼ様酵素である光非依存型プロトクロロフィリド還元酵素(DPOR)の触媒コンポーネント・NBタンパク質の構造解析に成功している.さらに,その構造から新規の鉄硫黄クラスターを見出し,基質結合に伴う構造変化に依存した活性発現機構を提唱した.本年度には,申請者らの成果であるNBタンパク質の構造・機能析の論文がNatureに載された.本研究はこの結果を踏まえて,DPORが複合体形成やレドックス状態に依存して構造変化する様を結晶構造解析で捉えることを目的としている.初年度はNBタンパク質と複合体を形成するLタンパク質の調製と結晶構造解析に取り組んだが,試料が非常に不安定であったため,結晶化には至らなかった.そこで,本年度は,嫌気性酵素の研究実績が豊富なドイツ・ルール大学ボーフムのHappe教授の研究室に滞在し,嫌気条件下における試料調製のノウハウを習得した.現在,Lタンパク質を安定に調製することができており,単体の結晶化を進めるとともに,Lタンパク質とNBタンパク質の複合体の構造解析も進めている.本年1月には,ニトロゲナーゼアッセンブリー酵素NifENの結晶構造がScienceに掲載されるなど,近年,ニトロゲナーゼ様酵素の構造研究に非常に注目が集まっている.今後,当該分野の研究の重要性はますます高まってくるものと思われる.申請者らはこれまで、光非依存型プロトクロロフィリド還元酵素(DPOR)の触媒コンポーネントであるNBタンパク質の構造解析に成功し、基質結合に伴ってヘリックスがほどけて、活性発現をもたらす機構を提唱してきた。本研究では、DPORが複合体構造の形成やレドックス状態に依存して構造変化する様を結晶構造解析で捉えることを目的としている。複合体結晶の作製に向けて、DPORの電子伝達コンポーネントであるLタンパク質の調製を進めている。Lタンパク質は酸素感受性の高い酵素であり、嫌気条件化での調製が必要とされる。Lタンパク質を安定に得るために、光合成細菌Rhodobacter capsulatusの培養系を立ち上げ、培養、精製、結晶化をルーチン的に行っている。すでに、単体の結晶は得られており、構造解析に向けた結晶化条件の最適化を進めている。これに並行して、申請者らはNBタンパク質の活性発現に関わるヘリックスにも注目した。ヘリックス上に位置するMet408を置換した改変酵素を調製し、構造解析を行った。Met408をAlaに変異した酵素では、基質が結合しているにも関わらずヘリックスはほどけていなかった。さらに、これまで確認できなかったC末端領域の50アミノ酸の構造を捉えることに成功した。このことから、C末端領域はヘリックスの動きに伴って動くと考えられる。複合体構造が解析されれば、これらC末端領域のダイナミックな動きを捉えることもできるかもしれない。申請者らはこれまでに、ニトロゲナーゼ様酵素である光非依存型プロトクロロフィリド還元酵素(DPOR)の触媒コンポーネント・NBタンパク質の構造解析に成功している.さらに,その構造から新規の鉄硫黄クラスターを見出し,基質結合に伴う構造変化に依存した活性発現機構を提唱した.本年度には,申請者らの成果であるNBタンパク質の構造・機能析の論文がNatureに載された.本研究はこの結果を踏まえて,DPORが複合体形成やレドックス状態に依存して構造変化する様を結晶構造解析で捉えることを目的としている.初年度はNBタンパク質と複合体を形成するLタンパク質の調製と結晶構造解析に取り組んだが,試料が非常に不安定であったため,結晶化には至らなかった.そこで,本年度は,嫌気性酵素の研究実績が豊富なドイツ・ルール大学ボーフムのHappe教授の研究室に滞在し,嫌気条件下における試料調製のノウハウを習得した.現在,Lタンパク質を安定に調製することができており,単体の結晶化を進めるとともに,Lタンパク質とNBタンパク質の複合体の構造解析も進めている.本年1月には,ニトロゲナーゼアッセンブリー酵素NifENの結晶構造がScienceに掲載されるなど,近年,ニトロゲナーゼ様酵素の構造研究に非常に注目が集まっている.今後,当該分野の研究の重要性はますます高まってくるものと思われる.
大衆教育時代におけるエリート中等学校の学校文化と人間形成に関する比較研究

英仏独米日におけるエリート中等学校の歴史的変容と現状に関して、とくに生徒の出身背景、学校生活(公式のカリキュラムと日常活動)、卒業後の進路を中心に分析を行なった。研究成果は、2001年9月の教育社会学会において共同発表し、2002年10月に報告書としてまとめ、刊行した。外国に関しては、イギリス(パブリック・スクール)、フランス(グランド・ゼコール準備級)、ドイツ(ギムナジウム)、アメリカ(プレップ・スクール)について、現地訪問して資料収集や関係者への聴き取りを行ない、各国のエリート中等教育をそれぞれの社会の構造、教育システムの中で位置づけ、どのような教育・選抜が行なわれているかを分析した。日本に関しては、戦前の旧制中学校と戦後の新制高等学校を対象として、3つの異なるアプローチを試みた。第一に、明治三十年代における旧制神戸中学の学籍簿・試験成績表・校友会誌を用いて、入学者・中途退学者の実態と進路分化の要因を分析した。第二に、戦前戦後の一高東大輩出校を調査分析して、地方公立"伝統校"(名門校パラダイム)が創出されていく過程を実証的に明らかにした。第三に、京都大学1回生調査を実施して、現代のエリート中等学校(受験エリート校)文化の類型分析を行ない、昭和四十年代以降の文化変容の分析枠組を提示した。また同じ京大生調査を用いて、学部および性別による文化的差異についても分析した。英仏独米日におけるエリート中等学校の歴史的変容と現状に関して、研究分担者がそれぞれ、各国のエリート中等学校生徒の出身背景、学校生活(公式のカリキュラムと日常活動)、卒業後の進路を中心に既存の資料と先行研究の整理をした。その上で、研究成果の検討会を2回行った。またイギリスとアメリカ合衆国に出張し、研究計画について専門家からのレビューを受けた。研究会においては、アメリカにおいて私立学校が存続する意味、フランスにおけるエリートと高等教育機関との関係ならびにその変化、日本の旧制中学の伝統が色濃い高校の同窓会活動などのテーマについて報告を受け、今後の研究方針を議論した。アメリカでは、東部白人流階級の特権的な教育機関であった私立寄宿学校が、1970年代以降、異なる人種の受け入れ、男女共学、カリキュラムの多様化などをはかりながらエリート養成という機能を維持し存続している。フランスでは、細分化された高等教育機関がエリート文化との根強い関係を持ちながらも、数学の成績がエリート選抜の基準となってきており、そこに出身階層の差が生じている。日本の伝統校では、同窓会がローカルエリート活動基盤の一つになっており、伝統校文化の維持に寄与している。イギリスとアメリカ合衆国の専門家からは、近年の変化について研究する必要性を指摘されている。アメリカでは、プレップ(prep)という語は用いず、独立学校(independent schools)という名称で全米組織が形成されている。各校の相互交流も活発化しており、エリート大学の入学選抜基準の多様化に対して、柔軟な選択が可能で、高水準の内容を持つカリキュラムを構成して生徒や父兄の関心を引き付けようとしている。次年度に実施する、日本のエリート高校の実証的な研究にとって、重視すべき視点が得られている。前年度に引き続き、英仏独米日におけるエリート中等学校の歴史的変容と現状に関して、研究分担者がそれぞれ、各国のエリート中等学校生徒の出身背景、学校生活(公式のカリキュラムと日常活動)、卒業後の進路を中心に既存の資料と先行研究の整理をした。日本に関しては、京都大学1回生を対象とする大規模な質問紙調査を実施して、出身高校を介して現代のエリート中等学校へのアプローチを試みた。現在の生活様式や価値観と出身高校との関連、母校や他校への意識、エリート中等学校内部(例えば「地方の公立伝統校/都市部の私立中高一貫校」)の分化状況などを中心に分析を進めている。さらに過去の旧制中学時代からの「継承」関係を考察するために、昭和3040年代、公立伝統校がいわゆる名門校として「復活」し一躍脚光を浴びて間もなく衰退していく過程(「名門校の55年体制」)を明らかにしていく。ドイツとフランスへの出張では、幾つかの代表的な中等学校を訪問して聴取調査と資料収集にあたるとともに、研究計画について専門家からレビューを受けた。