hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
胸腺プロテアソームによるＴ細胞の正の選択機構の解明

細胞(MEF)と胸腺プロテアソーム発現MEFを用いて胸腺プロテアソームがもつタンパク質切断活性の評価および胸腺プロテアソームが作り出すMHCクラスI結合ペプチドレパトアを解析することで、胸腺プロテアソームがTCRと弱い相互作用を有するペプチドレパトアを産生することでT細胞の正の選択を正常に誘導することを示唆した。実際にマウスの胸腺から精製したcTECからMHCクラスI結合ペプチドを精製し、質量分析を用いてペプチドのアミノ酸配列を同定することで、野生型マウスおよびβ5tノックアウトマウス間で抗原提示されているペプチドの違いに迫ることを試みた。この実験は実際にマウスの生体内でT細胞の正の選択に関わるペプチドを直接同定することを目的としており、本研究課題の最終目的であるT細胞の正の選択の分子メカニズムの解明に大きく寄与する。現在、解析に用いるcTECの精製、MHCクラスI結合ペプチド精製の条件検討を終え、最終的な解析に向けてcTECを回収している段階である。また条件検討の段階で野生型マウスおよび胸腺プロテアソーム欠損マウスのcTEC上のMHCクラスI結合ペプチドを高い精度で100本程度同定している。一方で上記のMEFより精製したMHCクラスI結合ペプチドに関して定量を行い、両MEF間において定量値として5倍以上の差が見られる胸腺プロテアソーム発現細胞特異的および免疫プロテアソーム発現細胞特異的MHCクラスI結合ペプチドを同定している。今後、これらのペプチドに蛍光基質を付加した合成ペプチドの作製や化学的な修飾の付加により胸腺プロテアソーム特異的活性測定用基質および阻害剤の作出を試みる。最終的な目標であるcTEC上のMHCクラスI結合ペプチドの解析はcTECの回収率、質量分析装置の感度から当初は不可能かと思われていたが、高感度のorbitrap型の質量分析装置を利用することにより現実に可能となりつつあるため。MEFを用いたMHCクラスI結合ペプチドの解析においては1x109個の細胞をサンプルとして従来型の質量分析装置を用いてMHC class I結合ペプチドとして100本程度のペプチドを同定し、そのペプチドの配列の確からしさを表すFalse positive rate(FDR)10%以下のペプチドを40本程度同定した。本課題を達成するためには最終的にマウスの胸腺よりcTECを精製し、実際にその細胞表面上のMHC class I結合ペプチドを野生型マウスとβ5t欠損マウスで比較を行うことが必須であるが、1匹のマウスよりcTECは10000個程度しか得られず、従来型の質量分析装置では解析が実現しなかった。しかし、今年度は近年飛躍的に性能が向上したorbitrap型の高感度な質量分析装置を用いた解析を用いて野生型マウスおよび胸腺プロテアソーム欠損マウスのcTEC上のMHCクラスI結合ペプチドをFDR1%以下の精度で100本程度同定することができた。現在は解析に用いるcTECの精製ステップ、MHCクラスI結合ペプチドの精製などの条件検討を行っている。この実験で実際にcTEC上のMHCクラスIに結合し、正の選択を促進していると考えられるペプチドに関しては、このペプチドを結合したMHCクラスIを発現するマウスを作製し、これがβ5t欠損マウスのCD8+T細胞の減少という表現型を回復させるか否かを確認する。28年度が最終年度であるため、記入しない。
ヒト肝サイトゾールY′胆汁酸結合蛋白の酵素学的検討

剖検肝のサイトゾール画分から、ゲル3過によりY′分画(MW34万)を得、これをクロマトフォーカシングで分画した。クロマトグラム上、^<14>Cーリトコール酸を用いた平衡透析法による胆汁酸結合のピークはPI7.2にみられ、3β-hydroxysteroid dehydrogenase(3β-HSD)およびdihydrodiol dehydrogenase(DDH)活性とともに溶出された。このピークとは別に。PI5.2で3αーhydroxysteroid dehydrogenase(3α-HSD)活性のピークが溶出された。また、^<14>Cー3ケト-コール酸よりの生成物をTLCで検討したところ、前者のピークではイソコール酸、後者のピークではコール酸であり、各々のHSD活性に対応した反応がおこっていることを確認した。家兎で作製した抗ヒトY′胆汁酸結合蛋白抗体を用いたWestern blot法では、クロマトフォーカシング上の胆汁酸結合ピークのみで36kDのバンドが検出された。SDS-PAGE上、胆汁酸結合ピークは36kDのバンドの他にもう1本の低分子量のバンドがかすかに認められたが、FPLCによるゲル3過により36kDの単一バンドになるとともに、酵素活性はDDH活性のみが保持され、3β-HSD活性は消失した。このDDH活性は胆汁酸により非競合阻害をうけることから、同蛋白上のDDH基質を胆汁酸の結合部位は異なるものと予想された。3α-HSDの見かけ上のKmは、リトコール酸、コール酸でそれぞれ、2.6μM、37μMであったが、3β-HSDのKmはイソコール酸で570μMと高値であった。ラット肝の主たる胆汁酸結合蛋白であるY′binder(MW3.3万)は3α-HSDと同一であったのに対し、さらに強い胆汁酸結合能をもつヒト肝のY′binderは3α-HSDとは異なりDDH活性のみを有し、胆汁酸関連のHSD活性を持たないことが判明した。また、ヒト肝のY′binderはDDHの基質とならない胆汁酸と強く結合し、ヒト肝内での胆汁酸輸送に重要な役割を持つものと考えられた。このピークとは別に。
アフリカにおける金融のグローバル化と経済成長

フランスAix Marseille UniversityのGilles Dufrenot教授と共同研究の形で、アフリカにおける金融グローバル化は技術生産性を押し上げているのか、実現可能な産出量水準そのものを上げることでアフリカ諸国の生活水準を向上させ、貧困削減に貢献しうるかを検証した。アフリカ諸国は発展段階が異なるだけでなく、投資家が注目する保有資源も異なるため、援助、送金から外資系金融機関による貸付、直接投資、間接投資まで、資金流入の形と行先は様々である。そこでこうした事情を考慮可能な確率フロンティアモデルとパネル分位点回帰モデルを用いて分析した。この論文はInternational Atlantic Economic Societyのアテネ年次学会やアジア経済研究所(申請者が発表)、神戸大学や大阪学院大学のワークショップ(共著者が発表)などで発表させていただき、現在論文投稿の準備段階にある。次に2018年12月に共同研究者を日本に招聘した際、甲南大学の学生に開発経済学の講義の一環として人口問題に関して講演していただき、アフリカの人口問題に関する共同論文の執筆可能性も検討した。また当該共同研究の主題、アフリカにおける金融グローバル化の実態をより詳細に把握するため、一次産品価格の変動と資本流入の因果関係を明らかにする論文執筆にむけて話し合いを実施し、現在、データの整備と実証段階にある。同時に大阪学院大学の松木隆教授を含めた共同研究の形で、Dynamic Modelling and Econometrics in Economics and Finance(2020年3月Springer社から出版予定)の1章(Quantile and copula spectrum:先述の共同論文の推計手法を高度化するため、計量手法に関するサーベイと実証結果を含む)を執筆予定である。2018年12月に共同研究者のGilles Dufrenot教授を2週間招聘できたことで、2020年3月からフランスで始まる半年間の共同研究の下準備を大きく進めることができたと考えている。(なお、この招聘は、申請者の[2016-18年度基盤研究(C)_16K03763_アフリカにおける金融深化と経済成長:金融統合が果たす役割]で往復交通費を、共同研究者所属機関より宿泊費を充当するという形で実施していることから、本研究基金の経費とはなっていない)共同研究者であるフランスAix Marseille UniversityのGilles Dufrenot教授が、在日フランス大使館が提供している第4回「エクスプロラシオン・ジャポン」(フランスの研究機関の研究者を対象とした渡航費助成プログラム)に採択されたことから、2019年12月に2週間ほど再来日される予定となっている。そこで、現在進めている論文を、横浜国立大学、大阪学院大学などのWorkshopで発表できるよう、受け入れ側として計画を進めている。また同時に、共同研究の論文についての打ち合わせを滞在期間中に進めていく予定である。内定年度:2017フランスAix Marseille UniversityのGilles Dufrenot教授と共同研究の形で、アフリカにおける金融グローバル化は技術生産性を押し上げているのか、実現可能な産出量水準そのものを上げることでアフリカ諸国の生活水準を向上させ、貧困削減に貢献しうるかを検証した。
高圧で噴出する可燃性ガスの自己着火危険性の科学的解明

高圧の可燃性ガス,特に水素ガスが瞬間的に空気中に放出されると,自発的に着火する場合がある.この現象について多くの研究が行われているが,本研究では70MPaの水素ガス噴出したときの挙動について,実験室レベルで調べられるように,一般的な14.7MPaのボンベを利用した模擬的な実験手法により調べた.その結果,低圧側が0.07MPaまでは現象を再現できることがわかった.さらに,自己着火の発生には,放出された高圧水素と空気との混合が重要であり,直管よりも曲がり管や乱れが発生しやすいような配管の方が,より着火しやすいことがわかった.また,自己着火が起こる最小圧力を簡易に予測する手法を提案した.高圧可燃性ガスが空気中に瞬間的に放出された際の着火危険性について、着火に及ぼす要因およびこれまでに明らかにされていない高圧条件における着火危険性を実験的および解析的に検討した。高圧水素ガス噴出時の自己着火現象において着火限界に及ぼす配管形状の影響について調べた。配管壁面に乱れが発生するような構造や、オリフィスのような配管出口で乱れが発生するような条件の場合、着火するときの放出圧力が低下することがわかった。さらに、高圧条件における着火現象の計測では、低圧側の酸素濃度と大気圧下と同じ濃度にすることにより、高圧条件を模擬した実験を行うことが可能となった。さらに、化学平衡計算で求めた着火誘導時間と一次元衝撃波理論から求めた加熱時間の大小から最低着火初期圧力比を予測する手法を提案し、実験値と比較することで、その有用性を示した。また、着火現象の詳細な計測を行った結果、衝撃波面と空気と水素の接触面の間で燃焼反応が開始されていることが実験的に明らかになった。すなわち、高圧水素ガス噴出時の着火現象には、水素と空気の混合が重要であることが示唆された。数値シミュレーションでは、配管内での混合と着火の現象を再現できるようになり、実験結果を再現できるようなシミュレーションが行えるようになった。また、自己着火は配管との境界層ではなく、空気と水素の接触面で着火することがシミュレーションでも示され、前述の着火過程の説明をより明確に行えるようになった。高圧の可燃性ガス,特に水素ガスが瞬間的に空気中に放出されると,自発的に着火する場合がある.この現象について多くの研究が行われているが,本研究では70MPaの水素ガス噴出したときの挙動について,実験室レベルで調べられるように,一般的な14.7MPaのボンベを利用した模擬的な実験手法により調べた.その結果,低圧側が0.07MPaまでは現象を再現できることがわかった.さらに,自己着火の発生には,放出された高圧水素と空気との混合が重要であり,直管よりも曲がり管や乱れが発生しやすいような配管の方が,より着火しやすいことがわかった.また,自己着火が起こる最小圧力を簡易に予測する手法を提案した.(1)瞬間放出装置および高圧模擬実験装置の開発従来の実験装置では、隔膜の強度限界に依存して破膜して放出していたため、隔膜の厚さや取り付け方法による放出圧力のばらつきが着火条件に大きく影響した。そこで、針を用いて破膜する機構を持つ瞬間放出装置を開発した。これにより、任意の貯気圧に設定して針で隔膜を破膜することができるようになり、放出圧力を正確に制御することが可能になった。また、設計・製作したバッファタンクを用いた実験により、大気圧下に高圧可燃性ガスを放出し着火した場合にも、安全に現象を計測できるようになった。さらに、バッファタンク内を減圧することにより、高圧状態を模擬できる実験の実施も可能になった。(2)自己着火現象の精密計測新たに開発した瞬間放出装置を用いて、通常の配管から放出される可燃性ガスの着火現象について、配管の長さや放出圧力等の着火条件を計測した。申請者や他の研究グループが行なってきた研究結果では、着火条件にばらつきが多く見られ定性的な結果しか得られていなかったが、これにより着火条件に対して定量的な考察を行えるようになった。(3)熱流体計算による現象の解析現象を理論的に把握するため、熱流体計算によるシミュレーションの準備を行った。高圧と低圧を隔膜で仕切った直管内のような単純な系におけるシミュレーションについて実験結果と比較することにより再現性を確認することができた。実験については、予定にしたがって瞬間放出装置および高圧模擬実験装置を設計、製作し、さらに予備的に単純な条件での実験を実施できるようになった。シミュレーションについても境界条件の設定、メッシュの作成など、適切に実施できるような結果を得られるようになったため、おおむね順調に進展していると判断される。高圧を模擬した実験を実施し、高圧条件での着火条件を明らかにするとともに、実際の事故を想定した噴出(障害物等に衝突して噴出)における着火危険性について、明らかにすることを試みる。これまでの研究成果をまとめ、産業爆発に関する国際シンポジウムにて発表を行うため、旅費として使用する。実際の事故を想定した着火危険性について調べるため、放出ノズルを製作するとともに、可燃性ガスおよび消耗品(継手、圧力センサー等)を購入する。
膜タンパク質機能を組込んだ人工細胞の創製と応用

本研究では、細胞膜表面で物質の認識、透過、情報伝達に関わる膜タンパク質を人工胞モデルとしてのリポソーム系に効率よく組み込む新規シャペロン技術を確立し、膜タンパク質研究やバイオテクノロジー・医学への応用を図ることを目的とする。膜タンパク質の分子レベルでの機能解析は、水溶性タンパク質ほど進んではいない。その最大の理由は、正しいフォールディングや単離精製が困難な点にある。本研究では、膜タンパク質をリポソームに再構成する新規な手法(膜タンパク質シャペロン)として、1)リポソーム存在下での無細胞膜タンパク質合成による一段階膜タンパク質再構成法および2)新規酵素応答性界面活性剤を利用する法について検討を行った。リポソームシャペロン法により細胞間にギャップジャンクション(GJ)を形成するチャネル膜タンパク質であるコネキシン(Cx43)をリポソームに直接組み込むことに成功している。本年度は、コネキシン組み込みリポソームと細胞との相互作用を詳細に検討し、リポソーム内に導入した水溶性生理活性ペプチドの細胞内への直接移行による細胞機能制御が可能であることが明らかになった。さらに、GJのインヒビターによる阻害や同種のコネキシン間のみでの選択的な相互作用が確認され、リポソームと細胞間でのGJ形成による物質輸送の可能性が示唆された。従来にない新規なリポソームデリバリーシステムの開発に成功した。ホスホリラーゼ酵素による糖鎖伸長反応が可能な新規酵素応答型界面活性剤(ドデシルマルトペンタオース,C12MP)を合成し、膜タンパク質再構成リポソームの新規調製法を開発した。本年度は、C12MPとリン脂質の混合ミセル系のミセルーベシクル転移挙動を詳細に検討した。その結果、ベシクル形成速度や形成されるベシクルのサイズが、リン脂質濃度、酵素濃度により制御しえることを明らかにした。従来にない新規な膜タンパク質再構成リポソーム構築技術を確立した。本研究では、細胞膜表面で物質の認識、透過、情報伝達に関わる膜タンパク質を人工細胞モデルとしてのリポソーム系に効率よく組み込む新規シャペロン技術を確立し、膜タンパク質研究やバイオテクノロジー・医学への応用を図ることを目的とする。このために本年度においては2つの新規な手法を用いて膜タンパク質のリポソーム膜への組込みを試みた。まず、無細胞タンパク質合成系にリポソームを共存させることで、ある種の膜タンパク質の発現と同時にリポソームヘの再構成、さらにリポソームを集めることで発現した膜タンパク質のみからなるリポソームが調製(精製)しえるシステムの開発に成功している。今年度は膜タンパク質としてコネキシン用い、無細胞タンパク質合成系での人工細胞リポソームヘの膜タンパク質の組込み挙動とコネキシンの機能発現について検討した。コネキシンの発現をSDSゲル電気泳動およびコネキシン抗体を用いてウエスタンプロット法により確認することができた。現在、発現条件やリポソームの組成を変えて条件の最適化を図っている。次にコネキシンを発現させた生細胞と蛍光プローブを内包したコネキシン組込みリポソームとを相互作用させ、蛍光プローブの細胞内への移行を蛍光顕微鏡で直接観察を行ったところ、細胞への物質移行が起こることを確認できた。一方で、ホスホリラーゼにより酵素重合可能な界面活性剤を用いてリン脂質との混合ミセルを形成させ、ここにこの界面活性剤により可溶化したバクテリオロドプシンを添加して酵素重合を行うことで、バクテリオロドプシンを有したりポソーム膜(150nm)の再構成に成功し、さらにそのプロトンポンプ活性を確認した。これら2つの手法はいずれも膜タンパク質の再構成・機能解析に有用なツールとなり得るであろう。
成人T細胞白血病における副甲状腺ホルモン関連ペプチド遺伝子の活性化機構

レトロウイルスであるHTLV-I感染に引き続いて起こる成人T細胞白血病(ATL)はしばしば副甲状腺ホルモン関連ペプチド(PTHRP)を過剰産生し、高カルシウム血症を合併する。私は、ATL細胞におけるPTHRP遺伝子の活性化機構について研究し、HTLV-Iの産物であるTax蛋白によって活性化されるIL-2/IL-2受容体システムが、PTHRPの産生・分泌を高めること(Endocrinology 1993)、細胞内cAMPセカンドメッセンジャーがPTHRP遺伝子の転写を活性化することを明らかにした(J Biol Chem 1993)。さらにHTLV-I感染によるT細胞の活性化・腫瘍化に伴ってビタミンD受容体が恒常的に過剰発見されること、この受容体との結合を介して活性化ビタミンDである1,25(OH)_2D_3あるいはそのアナログである22-oxa-1,25(OH)_2D_3(OCT)がHTLV-I感染T細胞の増殖およびPTHRP遺伝子転写を抑制することにより、PTHRPの分泌を強力に抑制することを明らかにしてきた(J Biol Chem 1993)。本年度は、ヒトPTHRP遺伝子の調節領域について分子生物学的検討を加え、下流プロモーター領域にcAMPに対する転写の促進に関わるDNAエレメントが存在すること、さらにその上流には転写を抑える負のDNAエレメント(silencer)が存在することを見いだした(manuscript in preparation)。以上の成績は、PTHRP遺伝子が正および負のDNAエレメントによって複雑な転写制御を受けていることを示唆する。
光周波数同期網のためのＣＥＰ制御光周波数コム高コヒーレンス化の研究

半導体レーザ(LD)を種光として25GHz間隔を有するCEP(Carrier-envelope phase offset)制御光コム(Comb)発生を目指している。光コムにおいて25GHzなるコム間隔は、光通信領域では周波数グリッド基準発生として有用であるとともに、様々な信号処理のためのニーズが高まりつつあるが、固体レーザやファイバレーザでは実現が現状困難な領域でもある。このような背景の中で我々が提案してきたLDを種光とする変調側波帯方式によるオクターブ光発生まで成功し、自己参照干渉によってCEP制御を行っているところである。干渉に際して大きな雑音が発生しており、その解明中である。LDを種光として生成した25GHz繰返しパルスに対してCEP制御を施し、光周波数確度・安定性を高め、光ファイバー通信網への適用性を検証すること目的として、2011年度SC光のSNR向上を目指した。その結果、1高出力光増幅過程における光ファイバ非線形圧縮を活用することにより、パルス圧縮が進展し100fsec以下まで短パルス化を図ることができた。その結果には、大変関心が持たれ、応用物理学会では招待講演として講演することとなり、OpticsExpressに採用されることとなった。2 30ps特注開発マイクロ波インパルス発生器の採用による光ゲート機能強化を実施した結果、半導体レーザを種とするSC光では最も広くかつSNRの良好なコムが得られた。SNRの良好なSC光が得られたので、f-to-2f干渉光も得られた。ただし、SNRは十分ではなく、原因究明が必要である。パルスオフ時の残留背景光抑圧が、位相情報を維持した真のSC光を得るのに重要な役割を果たすという知見は、LDを種としてコムを発生させて信号処理を目指す上で重要な役割を果たすであろう。ただし、残留背景光(ASEを含む)の抑圧は未だ十分ではなく、次年度以降、さらに周期性の光ファイバ型ファブリペロー共振器(FPI)の導入による一層の抑圧を試みる。3次世代フォトニクネットワークへの展開を見据えて、学会の場にて光周波数同期網なる概念を発表した。十分な理解を得られたとは言い難いが、今後実績を持って提案を進めてゆく。4レーザ光の狭線幅化を目的として、光周波数弁別器としてファイバ型FPIを用いる方式を検討した。(ファイバ型FPIは、従来光周波数弁別器として用いられているバルク型FPIと比較して、FM/AM変換効率が大幅に向上できる反面、安定性が小さい。)安定性を向上するため、FPIの共振光周波数を光周波数基準となる安定化レーザにロックする方式について、方式検討を進め光周波数基準への同期誤差抑圧、ファイバ内部の音響振動抑圧等の課題を抽出した。来年度は、これら狭線幅化に対する劣化抑圧法を方式化し、本方式により得られる線幅について定量的に把握する。昨年度来、オクターブ光発生までは成功したが、自己参照干渉時にビート信号が観測できず、雑音の増加が認められた。その原因を明らかにすべく、種とする光周波数コムにおけるコヒーレンス性を確認する手法をとった。光コムモード次数が高まるにつれて、位相雑音が増加し、コヒーレンス性が失われているのではないか、という仮説の元に以下の実験を行ったものである。スペクトル線幅が50kHz程度の可変波長光源と光コム輝線スペクトルとのビート信号を観測し、光コムモード次数に対する位相雑音の変化を測定した。25GHzモード間隔光周波数コムと50kHzスペクトル線幅波長可変レーザーとの干渉信号におけるコムの位相雑音を測定し、コムモード次数に対してプロットした。変調サイドバンド理論は、モード次数に比例して位相雑音も増加することを示している。実験結果は、光ファイバ非線形現象による拡がりまでは、理論とおり線形に増加していることが実証できた。この観測は世界的に見ても初めての実証である。光ファイバ非線形現象による光コムの帯域拡大後、位相雑音の増加は観測されるが、傾向を特定できるまで可変波長光源帯域が伸びておらず、メカニズムの解明までは至っていない。ただし、CEP光発生を可能とするファイバレーザが有する位相雑音に比べて小さく、f-2f自己参照干渉計を用いることでCEO信号を検出できる可能性があるという知見を得た。半導体レーザを種光源として1000から2000nmに至るオクターブ光の発生に成功した。次のステップとして、自己参照干渉を行うことになるが、パルスの干渉時に雑音が増強し干渉に伴うビート信号が埋もれてしまう現象が観測された。雑音増強のメカニズム解析とその除去が必要である。一般的に、マイクロ波を使って変調サイドバンド光として光コムを発生させると、モード次数が高まるにつれてマイクロ波が有する位相雑音も線形に増加する。マイクロ波による位相雑音が理論通りに増加するのか否かについて、実験的に検証を行った。

変調サイドバンドによる拡がりの範囲では、理論通り、線形に位相雑音も増加しており、採用している25GHzマイクロ波発振源の性能から推測すると、オクターブ光の拡がりでもコヒーレンスは維持されていることが分かった.雑音増強の原因は、今のところ不明であるが、フロア雑音等の抑圧を翌年度に行う予定である。LDを種とするSC光発生では、理論的予測では表に現れない現象が多く観測される。パルスオフ時の背景光が関与したと思われるf-to-2f干渉信号がその一つである。我々が知る限り、過去に報告例も無く、現象解明に時間を要しており、昨年度目標であったCEP制御まで到達できず、やや遅れている状況で絵ある。遅れを取り戻すべく、動作解明を急ぎたい。25年度が最終年度であるため、記入しない。自己参照干渉時に発生する雑音は、これまでに報告例もなく、予想していない現象であり、現状原因が不明である.この原因解明為にやや遅れ気味となっている.1.f-to-2f干渉光SNRを高め、CEP制御を成功させるために、ファイバFPIの導入、ならびに光ゲートの高機能化を図り、背景光抑圧を進める。SNRの向上による周波数高確度化、ならびに安定性の向上を目指す。2.CEP帰還制御では、分散圧縮用に光ファイバを用いるとループ長が長くなり、ループ制御帯域が十分に確保できなくなる恐れがあるので、回折格子型分散圧縮器を導入し、ループ制御帯域の十分な確保を図る。3.併行して、1kHz以下を目標にファイバFPIによるレーザスペクトル線幅の観測と、同時に狭線化を図る。自己参照干渉時雑音の原因解明と雑音低減を目指す.
慢性疾患の重症化予防を目指した先進的疾病管理システムの有効性に関する研究

北里大学東病院心臓二次予防センター(以下二次予防センター)を主たる研究フィールドとし、先進的な疾病管理システムの臨床的アウトカムについて、その有効性を実証するために前向きコホート研究を計画した。平成24年度は各種のデータベースの作成とマニュアル作成を行った。平成25年度には、バイアスへの配慮について検討を重ね、この間にも二次予防センターへの新規登録患者数は継続して増え続け、倫理委員会への申請や心臓二次予防医師の会で逆紹介先医療機関に対して研究計画説明を行い患者登録の環境を整備した。一方で、研究代表者の町田は平成24年度から研究フィールドを離れて外部からの研究統括を行い、研究分担者が実働して研究遂行していた。しかし、その研究分担者二名の勤務形態に変更が生じ診療業務にかかる負担が当初想定した以上に増加した結果、本研究の継続実施が不可能な環境に陥った。また、本研究を継続していくための代替研究者も得られない状況となった。以上の研究経過から平成26年度から本研究は頓挫し研究継続が不可能であると判断し、科学研究費助成事業の廃止申請を行うに至った。本研究は北里大学東病院心臓二次予防センターを主たる研究フィールドとし、先進的疾病管理システムの臨床的アウトカムについての有効性を実証するため前向きコホート研究を計画した。研究計画調書にある研究計画に則り、平成24年度は1調査に必要な質問票の作成、2データベース入力画面の作成、3評価マニュアルの作成を開始した。本研究を開始するに当たって、まず当初より指摘されているバイアスへの配慮について検討が加えられた。本研究は臨床試験とは異なり操作的・意図的に実施されるものではなく、通常診療行為の範囲における担当医の裁量によって登録されるため、登録自体が予後と関連しているように見えるバイアスが生じてしまう可能性がある。そこで、このバイアスを排除するための方策について研究分担者との協議を慎重に行った。そこで、詳細な登録理由の把握だけでなく、担当医別の登録患者数や逆紹介先施設の機能分類(規模、専門科、北里大学関係機関、ほか)を追加することとなった。次に倫理的配慮について北里大学医学部倫理審査委員会への申請を行っている。研究計画調書にあるとおり、本研究は通常診療の臨床現場に基づいた観察研究であり、人体から採取された試料を用いず、既存資料等のみを用いるものである。追跡調査を主体とした前向きコホート研究であるため文部科学省「疫学研究に関する倫理指針」に従って倫理審査委員会を経て、インフォームド・コンセントや個人情報保護について適切な処置を講じることとした。逆紹介先医療機関への研究計画説明を、毎年定例会として開催されている「心臓二次予防医師の会」を利用して、登録患者数の多い施設の責任医師に対して行った。本研究を遂行するためのフィールドや環境は既に完全に整っていて研究者調整も完了していたが、研究を開始するにあたりコホート研究としてのバイアスへの配慮や倫理的配慮を解決する必要があり、そのための協議を重ねる必要があり、その手続きに時間を要した。また、個人情報管理のためのIT環境整備にも手間を要した。平成25年度は研究計画調書に則り、スピード感をもって推進する。今後もCRCナースのトレーニングを継続し、症例の登録・追跡を行う。そのためのIT環境整備をハード面・ソフト面で充実化させる。また、スピード感を持たせるためにCRCナースだけでなく、通常診療体制へのサポート体制充実化や心臓二次予防センター業務の効率化を図っていく。具体的には、日常診療を担当する循環器内科医や逆紹介先医療機関への心臓二次予防センター活動を啓蒙強化する。研究計画調書に則り、情報管理環境や登録作業環境の整備や統計解析作業を本格化させる。また、ホームページの作成整備を前年度から引き続き推進していき、逆紹介先医療機関を交えた会議の開催や各学会での情報収集を行う。
メタボリックエラーを標的とした肉腫の新規治療開発

肉腫のキードラッグであるドキソルビシン(DOX)抵抗性である類上皮肉腫と胞巣状軟部肉腫及びDOX耐性骨肉腫の細胞株を用いて、非必須アミノ酸であるアルギニン(Arg)生成に不可欠なアルギノコハク酸合成酵素(ASS1)欠損を標的とする新規治療の有用性を検討した。DOX抵抗性肉腫においてASS1の発現低下を認め、Arg枯渇療法が有用であることを明らかにした。また、誘導されるオートファジーを阻害する事でArg枯渇療法に併用できる新規治療法の可能性を見出した。また、新規にASS1がDox耐性に関連する可能性を示唆し、今後のアルギニン代謝を標的とした治療に対して非常に有意義であると考えられた。現在複数の臨床検体を利用して細胞株の樹立を試みているが、現在までにドキソルビシン耐性と臨床的に判断されている骨軟部肉腫においては細胞株は樹立されなかった。一般的に樹立の成功率は数パーセントであり、今後もゼノグラフト作成を含めて継続している。そこでドキソルビシン耐性肉腫として胞巣状軟部肉腫、類上皮肉腫およびドキソルビシン耐性骨肉腫細胞株入手し、それらを用いて、ASS1のたんぱく質レベルでの発現解析を行った。その結果で複数の細胞株でのASS1の発現低下を確認できた。またアルギニン欠乏培地を作製し、ASS1低発現細胞株およびコントロールとしてASS1高発現株MCF7を用いてアルギニンの有無で細胞の成長を確認した。その結果、ASS1低発現の細胞株ではアルギニンを枯渇させるだけで著明な増殖抑制を生じることが分かった。さらにはフローサイトメトリー用いて、アルギニンの有無で成長を調べたところ、増殖抑制を生じる細胞株ではG1 arrestを生じることで細胞増殖が抑制されていることを確認した。現在は希少肉腫においてTMAを作製しており、臨床検体レベルでのASS1の発現を免疫染色を用いて確認している。ただし以前の論文で多く用いられていた感度の良い抗体の販売が終了していたことから、現在種々の抗体を用いながら、その精度を調べている状況である。現在までの状況は骨軟部腫瘍基礎を語る会および日本整形外科学会でも口演を行っている。今回、臨床学的に肉腫のkey drugであるDoxorubicin(Dox)抵抗性である類上皮肉腫(ES-X, VAESBJ)と胞巣状軟部肉腫(ASPS-KY)の細胞株及びDox抵抗性骨肉腫(KHOSR2)の細胞株を用いて、ASS1を標的とした新規治療法を探索した。Dox抵抗性細胞株であるVAESBJ, ES-X, APSS-KY, KHOSR2では、Dox感受性のある細胞株に比してDoxのIC50が優位に高値であった。P-gpが有意に高発現であった。次にASS1の発現解析を行ったところ、Dox抵抗性肉腫では低発現であり、P-gp発現とは逆相関の傾向を示した。またASS1低発現であるDOX抵抗性肉腫細胞株においては、Arg枯渇環境下での細胞増殖が、有意に抑制された。細胞周期解析ではArg枯渇培地ではG1期停止が誘導され、細胞増殖抑制が起こっている事が確認された。さらにArg枯渇培地におけるオートファジー解析を行ったところ、オートファジー関連タンパクであるp62の時間依存性の消費及びLC3IからIIへの変換がみられ、オートファジー誘導が確認された。またDox抵抗性肉腫細胞株において、アルギニン枯渇培地にオートファジー阻害剤であるクロロキンを投与すると、アルギニン枯渇単独療法よりも有意に細胞増殖抑制を認めた。siRNAを用いてASS1発現を抑制し、P-gpの発現解析を行ったところ、P-gp発現が上昇したことより、ASS1はP-gp関連薬剤耐性との関連が示唆された。本研究では、臨床的にDox耐性肉腫と言われている骨状軟部肉腫において、ASS1の発現低下を認め、Dox抵抗性肉腫においてもArg枯渇療法が新規治療法になりうることを明らかにした。肉腫領域において初めて、アルギニン枯渇によりオートファジー誘導を証明し、アルギニン枯渇療法と阻害剤の併用による新規治療法の可能性を見出した。平成26年度の研究計画で述べたin vitroの研究に関してはおおむねドキソルビシン耐性肉腫細胞株でのASS1のメタボリックエラーを確認でき、その細胞増殖阻害を非必須アミノ酸欠乏培地作成によって確認できたことから達成できていると思われる。ただし以前から使用されていた感度のよい抗体の販売が中止されており、そのタイトレーションがうまくゆかず、時間がかかっている部分がある。整形外科骨軟部腫瘍次年度は悪性化や化学療法抵抗性のメカ二ズムを解明していく予定であり、臨床応用に向けて精進していく次第である。

現在までの問題点はASS1の抗体販売修了に伴って免疫染色やたんぱく質発現解析が予定通りに進まないことであり、本年度はRT-PCRで発現を検索することも考えている。またアルギニン分解酵素が治療薬として臨床試験が他の癌種で行われ始めたことから、薬剤を入手することで、さらに臨床応用実現に向けて実験を進めていきたい。さらには、そもそも希少がんであることから、何とか新たな細胞株やゼノグラフトモデルを樹立したうえで実験を進めていきたい。今年度の実験で新たな薬剤耐性機構におけるASS1の悪性化メカニズムに着目しており、ここに関しても研究をすすめていきたいと考えている。年度をまたく国際学会での発表があったために、次年度使用額が生じました。繰り越した部分は旅費の一部として、また研究計画の予定通りに臨床検体での免疫染色や各種バイオマーカーとしての有効性の評価、および悪性化メカニズム解明のために次年度使用してい区予定です。
電気抵抗率の超精密測定による格子欠陥の静的・動的評価

ナノボルトメータと精密電流源を用い,電気抵抗率の精密測定システムを構築した。このシステムでは,自動で極性変換を行い,浮遊熱起電力を除去する。さらに,従来,風防ボックス中で行っていた室温近傍での静的な測定を,300.0 Kに保持したシリコーンオイル中で行い,測定温度の精度を向上させた。また,万能試験機において,電気的絶縁した引張試験の冶具を設計・作製した。このような測定系・装置を使用し,次の検討を行った。工業用純チタン板(JIS2種相当)を室温にて最大80 %まで冷間圧延し,圧延方向からθ= 0, 45, 90°方向に沿った電気抵抗率を精密に測定した。電気抵抗率は,全体として加工率と共に増加した。圧延方向に沿った(θ= 0°)300Kにおける電気抵抗率は,真ひずみ0.8付近で一旦減少した後,増加に転じるなど,電気抵抗率に異方性が現れた。繰り返し重ね接合圧延(ARB)した純Ti板においても,電気抵抗率の面内異方性を確認しており,θ= 0°よりθ= 90°の方が高い電気抵抗率を示した。この傾向は冷間圧延の加工度レベルから生じていることが明らかとなった。また,引張変形している純Tiの電気抵抗率を推定する手法を確立した。引張変形中,電気抵抗のその場測定を行ったところ,弾性変形初期にわずかに低下し,その後,単調に増加した。所定のひずみ量まで引張変形し,除荷後,300 K(シリコーンオイル中),77 K(液体窒素中)で測定し,マティーセン経験式を利用することで,試料サイズを測定することなく電気抵抗率を推定した。降伏直後は,電気抵抗率にplateauな領域が現れた。その後,単調に増加し,破断直前には,急激に増加した。24年度が最終年度であるため、記入しない。本研究は,従来の電気抵抗率測定で用いられていたCd標準電池や直流電位差計を使用せず,金属材料の電気抵抗率を超精密に測定できるシステムを構築すること,ならびに,その測定により,巨大ひずみ加工された材料中の格子欠陥や集合組織を評価することを目的とした。高精度のデジタルマルチメータ(YOKOGAWA 1281),電流源(YOKOGAWA 2561),標準抵抗(YOKOGAWA 2192,10mΩ)を用い,手動で極性変換を行うことで電気抵抗率の精密測定を行った。室温での測定は,従来,風防ボックス中で行っていたが,300Kに保持したポリジメチルシロキサン構造のシリコーンオイル中で行うよう方法を改良した。従来法では最大1.2Kの温度変動があり,それに起因する電気抵抗率の変動があったが,それらを除去することができた。このような測定系を使用し,以下のTi,Ti合金の電気抵抗率を測定した。Ti-13Cr-1Fe-3Al合金に圧力5GPa,回転速度0.2rpm,回転数1,5,10の条件でHPT加工を行い,液体窒素温度と室温で電気抵抗率を測定した。HPT加工に伴う転位密度,非熱的ωの最大体積率,生成開始・終了温度の変化を分離して捉えることができた。(2)冷間圧延された工業用純チタン70%までの冷間圧延(CR)と6サイクルまでの繰り返し接合圧延(ARB)を行い,77Kと300Kで電気抵抗率を測定した。マティーセンプロットを作成すると,CRとARBでそれぞれ良い直線性を示した。ARBのその関係はCRの関係の延長線上にこないことが明らかになった。また,次年度に行う電気抵抗率の動的測定に向け,装置(AC&DC電源+ナノボルトメータ:6221/2182A/J)の選定と測定条件の絞り込みも行った。

所定のひずみ量まで引張変形し,除荷後,300 K(シリコーンオイル中),77 K(液体窒素中)で測定し,マティーセン経験式を利用することで,試料サイズを測定することなく電気抵抗率を推定した。降伏直後は,電気抵抗率にplateauな領域が現れた。その後,単調に増加し,破断直前には,急激に増加した。24年度が最終年度であるため、記入しない。すべて計画通りに研究を遂行できている。次年度は,まず,電気抵抗率の動的測定も可能な新たな装置を構築する。その装置を用い,静的条件下で従来と同等,もしくはそれ以上の精度を得る方法を見出す。引張変形中の電気抵抗率測定を行うため,試験機本体と試料を完全に電気的絶縁されたつかみ部を設計・作製する。本年度に作成したマティーセンプロットの信頼性を向上させると共に,このデータを利用し,引張変形中の電気抵抗率変化を可能な限り正確に推定し,格子欠陥の振る舞いをその場観察する。
部位特異的組換え酵素の細胞内直接導入メカニズムの解明と人工ヌクレアーゼへの応用

部位特異的組換え酵素(Cre酵素)を、核酸(DNA)を酵素キャリアとして麹菌核内に直接導入し、高効率でゲノム上のマーカー遺伝子を除去する技術を開発した。このメカニズムを解明することで、ゲノム編集に関わる酵素(TALEN)に応用できないか取り組んだ。酵素キャリアに関しては、DNAだけでなくRNAやヘパリンでも代替が可能であった。また、導入酵素の電荷を上げる事や酵素濃度を上げる事で酵素キャリアを利用せずに直接導入が可能であることを示した。一方、TALENでは、麹菌で一過性発現によりゲノム編集が可能であることを確認し、精製酵素の準備を行った。今後、精製酵素を用いて麹菌に直接導入を試みる。現在までに部位特異的組換え酵素(Cre)を、核酸(DNA)を酵素キャリアとする事で麹菌細胞内に直接導入することに成功し、ターゲット配列(loxP)間に挟まれた遺伝子を、従来より簡便に除去できる方法を開発している。本研究では、Cre酵素を麹菌細胞内に直接導入し機能させるために、核酸が酵素キャリアとしてなぜ必要なのかを明らかにしようとしている。Cre酵素の細胞内への取り込みは、キャリアである核酸との相互作用を介し、更に細胞膜と核酸の相互作用によりエンドサイトーシスにて取り込まれていると予想している。そこで、Cre酵素に対して、キャリアである核酸がどのような効果をもたらしているかを調べた。しかしながら、明確な結合作用等確認することが出来なかった。今後、より詳細な解析を行うとともに、Cre酵素抗体等を利用し、蛍光顕微鏡を用いて視覚的にCre酵素の取り込みの様子を観察する予定である。また、酵素キャリアの種類について検討を行ったところ、二本鎖又は一本鎖DNAだけでなくrRNAでもキャリアとなりうることを明らかとした。今後は、他にも酵素キャリアとなりうる物質の探索を行うとともにCre酵素単独でも細胞内に導入出来る変異体の作製を検討する。さらに本研究では導入酵素をCreだけでなく、人工ヌクレアーゼ(TALEN)でも応用が可能かに挑戦し、遺伝子組換え体でない有用菌株の造成技術の開発を目指している。そこで最初の取り掛かりとして、ターゲットを麹菌の硫酸塩資化に必要なATP sulfurylase (sC)遺伝子に決定し、その標的配列の決定とTALEリピート配列の設計を行った。現在までに部位特異的組換え酵素(Cre)を、核酸を酵素キャリアとする事で麹菌細胞内に直接導入することに成功し、ターゲット配列(loxP)間に挟まれたマーカー遺伝子等を、従来より簡便に除去できる方法を開発している。本研究では、Cre酵素を麹菌細胞内に直接導入し、機能させるために核酸が酵素キャリアとしてなぜ必要なのかを明らかにし、導入酵素をCreだけでなく、人工ヌクレアーゼ(TALEN)でも応用が可能かに挑戦することで、有用菌株の造成技術の開発を目指している。Cre酵素の酵素キャリアを検討する実験において、酵素キャリアを用いた時と比べて効率は低くなるが、Cre酵素単独でもマーカー遺伝子の回収が可能であることが明らかとなった。これは、Cre酵素の供給元が変わり、N末端にオリゴペプチドが付加されている事が示唆された。そこで、大腸菌を用いてHisタグ体付Creを発現・精製を行い、麹菌細胞内に直接導入出来るかを検討した。その結果、やはり酵素キャリアを用いた時と比べると効率は落ちるが、市販Cre酵素より約20 %程効率良くマーカー遺伝子の回収が確認された。現在、この現象がタグの効果によるものなのかを調べるために、タグ体なしのCre酵素の精製を行っている。一方、人工ヌクレアーゼ、TALENでも細胞内直接導入が応用可能かを検討する最初の取りかかりとして、糸状菌用TALEN発現プラスミドを構築し、一過的発現により、麹菌においてもTALENが機能するかを調べた。ターゲット遺伝子にはカウンターセレクションが出来るATP sulfurylaseをコードするsC遺伝子を選択し、Non-homologous end joiningによる修復エラーを起こすコンストラクトで行った。その結果、得られた株の90%以上で切断活性が認められた。本研究では、Creを麹菌細胞内に直接導入し、機能させるために核酸が酵素キャリアとしてなぜ必要なのかを明らかにし、導入酵素をCreだけでなく、人工ヌクレアーゼ(TALEN)でも応用が可能かに挑戦することで、有用菌株造成技術の開発を目指している。酵素キャリアの種類について検討を行った結果、核酸(DNA)だけでなく、rRNAや核酸との親和性が高いヘパリンも酵素キャリアとして機能することを見出した。Creの酵素キャリア検討時に、酵素キャリアを用いた時と比べて効率はかなり低くなるが、Cre単独でもマーカー遺伝子の回収が可能であることが明らかとなった。そこでCre単独で、より効率よく導入できる方法を探索した結果、Hisタグ付きのCreにおいて、市販Creやタグ無しのCreより若干効率が良くなること、また、酵素濃度を高く(16倍以上)することで、高効率で導入されることが明らかとなった。一方、人工ヌクレアーゼ、TALENでの検討も行った。最初に、糸状菌用TALEN発現プラスミドを構築し、一過的発現により、麹菌においてもTALENによるゲノム編集が可能である事を確認した。続いて、大腸菌を用いてTALENの発現及び精製を試みた。その結果、微量であるが、精製TALENsを得ることが出来た。そこで、精製TALEN

単独及び核酸等のキャリアを用いて、麹菌に直接導入実験を行った所、残念ながらゲノム編集株を見出すことが出来なかった。今後は、Creで得られたデータを元に、精製TALEN量を増加させる、または、市販Cas9を用いて直接導入によるゲノム編集が行えるかを検討していきたい。部位特異的組換え酵素(Cre酵素)を、核酸(DNA)を酵素キャリアとして麹菌核内に直接導入し、高効率でゲノム上のマーカー遺伝子を除去する技術を開発した。このメカニズムを解明することで、ゲノム編集に関わる酵素(TALEN)に応用できないか取り組んだ。酵素キャリアに関しては、DNAだけでなくRNAやヘパリンでも代替が可能であった。また、導入酵素の電荷を上げる事や酵素濃度を上げる事で酵素キャリアを利用せずに直接導入が可能であることを示した。一方、TALENでは、麹菌で一過性発現によりゲノム編集が可能であることを確認し、精製酵素の準備を行った。今後、精製酵素を用いて麹菌に直接導入を試みる。TALENに関しては概ね順調に進んでいる。一方、麹菌細胞内にCre酵素を導入するために必要であった酵素キャリアが存在しなくても、細胞内に導入が可能な条件を見出せつつあるが、そのコントロールとなるタグ体なしのCre酵素の精製に遅れが生じているため、"やや遅れている"とした。農学当初の予想に反してタグ付のCre酵素において、単独でも細胞内に直接導入させられることが示唆されつつある。今後は、この理由を調べることで、どのような仕組みでCre酵素が麹菌細胞内に導入されているのかを考察していく。また、糸状菌用に作成したTALENが麹菌で機能することが明らかとなったので、細胞導入に必要な条件を付加したTALENを作成し、大腸菌等により発現、精製を試み、TALENを麹菌細胞内に直接導入できるか検討する。酵素キャリアの検討やTALENに関しては進んでいるが、麹菌細胞内にCre酵素を導入するために、核酸が酵素キャリアとしてなぜ必要なのかに関する研究において、考察出来る結果が得られていないため、"やや遅れている"とした。TALENプラスミド作製サービスが当初の予定より安く利用出来た結果と考えられる。概ね当初の実験計画に従って研究を進めていく予定。しかしながら、Cre酵素の直接同入に関する研究が遅れているため、重点的に行うとともに、うまくいかない場合は、麹菌より扱いが簡便な酵母等の微生物でも研究を進めていく。また、TALENの作製を行い、まず麹菌で正常に機能するかを確認するとともに大腸菌等により発現、精製を試み、TALENを麹菌細胞内に直接導入出来るかの準備を進める。本繰越額は次年度の研究費とあわせ、リコンビナントCre酵素やTALENの精製及び、それらを利用した麹菌への細胞内導入に関する実験に使用する予定である。
抗体遺伝子変異の変遷追跡による病原体感染歴予測

微生物感染といった外界環境あるいは自己抗原等の生体内環境に対する獲得免疫応答において、B細胞は抗体(Ig)遺伝子の再構成、クラススイッチ、および体細胞突然変異(SHM)といった遺伝子イベントを行うことが知られている。特に病原性細菌、ウイルス等の外来抗原に反応し繰り返しIg遺伝子変異を経過することによってそれらに対する反応性、結合親和性を高める。しかしながら抗原刺激によるIg遺伝子変異の速度、規則性については未だ明らかになっていない。本研究計画ではIg遺伝子変異変遷による環境適応メカニズムを明らかにする目的で、ヒトでの病原微生物感染過程における関連Ig遺伝子のSHM変遷過程と、抗体親和性を分子生物学的に解析した。ヒト末梢血単核球(PBMC)を単離しEBウイルス、およびTLR9リガンドによるPBMC内B細胞集団の形質転換株を樹立した。1x107個PBMCあたり、形質転換細胞株を約1000クローンの取得が可能であった。さらにヒトDPT3種混合ワクチンのコンポーネントである破傷風毒素(TeNT)に対して、ELISAを行った結果15クローンの抗TeNT IgG/IgAを得た。次世代シークエンサー(NGS)を用いてIg遺伝子配列を決定した結果ほとんどのクローンがIgGサブタイプであった。一方、サイトメガロウイルス(CMV)に対する抗体クローンのIg遺伝子解析を行うために先述と同様のスクリーニングを行った。CMV感染細胞に反応する抗体クローンは、TeNTに対して約4倍の陽性数が認められた。この結果は、CMVはヒト生体内において、常に再活性化することによってCMV抗原を供給し、液性免疫応答を誘導している可能性を強く示唆している。本研究計画において、高効率でヒト由来B細胞形質転換細胞株を取得する方法が確立できた。また、NGSによる包括的遺伝子解析により、短期間でのクローン同定が可能となった。外界の様々な環境変化に対する適応反応の中で、B細胞は、抗体(Ig)遺伝子における遺伝子再構成、クラススイッチ、そして体細胞突然変異(SHM)を経て、細菌、ウイルス等の病原体蛋白に反応し、遺伝子変異によって抗体の抗原への親和性を高める。しかしながら、抗原刺激に対するSHM導入の速度、及び規則性については未だ不明である。本研究計画では、Ig遺伝子変異変遷による環境適応メカニズムを明らかにする目的で、ヒトでのウイルス感染過程における関連Ig遺伝子のSHM変遷過程と、抗体親和性を分子生物学的に解析した。CMVUL83のリコンビナント蛋白を作製してCMVUL83反応性B細胞クローンの単離と抗UL83抗体遺伝子のクローニングを行い、塩基配列を決定することによって、抗体遺伝子レパートリーデータの集積を開始した。一方、健常人ボランティア血清中の抗UL83抗体の解析情報から、抗体遺伝子情報を類推することからもデータ集積を試みた。現在、そのデータ個数を蓄積中である。実際に、CMVUL83のリコンビナント蛋白をバキュロウイルスにて大量調製した。標識したリコンビナントCMVUL83をプローブとして用いて、ヒト末梢血中に存在するCMVUL83結合性メモリーB細胞、または抗体産生細胞である形質芽細胞や形質細胞を、フローサイトメトリーにより1細胞ずつ単離した。さらに、1)RT-PCRによる抗体遺伝子のクローニング、2)293細胞におけるCMVUL83に対するリコンビナント抗体の発現、さらに、3)ELISAによるCMVUL83反応性の同定を行った。最終的に抗体遺伝子の塩基配列により、抗体遺伝子レパートリーを決定した結果、そのSHM導入効率は約20塩基であることが明らかとなった。本研究計画の律速段階は、いかに健常人Igデータを集積し、そのベースラインを決定するかにかかっている。日本赤十字社による献血者由来末梢血単核球よりRNAを順次精製し、そのIgデータを集積することが可能となった。したがって、本研究計画の遂行に関して現時点では何ら障害は認められない。微生物感染といった外界環境、あるいは自己抗原等の生体内環境に対する獲得免疫応答において、B細胞は抗体(Ig)遺伝子の再構成、クラススイッチ、および体細胞突然変異(SHM)といった遺伝子イベントを行うことが知られている。特に病原性細菌、ウイルス等の外来抗原に反応し、繰り返しIg遺伝子変異を経過することによって、それらに対する反応性、結合親和性を高める。しかしながら、抗原刺激によるIg遺伝子変異の速度、規則性については未だ明らかになっていない。本研究計画では、Ig遺伝子変異変遷による環境適応メカニズムを明らかにする目的で、ヒトでの病原微生物感染過程における関連Ig遺伝子のSHM変遷過程と、抗体親和性を分子生物学的に解析した。ヒト末梢血単核球(PBMC)を単離し、EBウイルス、およびTLR9リガンドによるPBMC内B細胞集団の形質転換株を樹立した。1x107個PBMCあたり、形質転換細胞株を約3000クローンの取得が可能であった。さらにヒトDPT3種混合ワクチンのコンポーネントである破傷風毒素(TeNT)に対して、ELISAを行った結果、15クローンの抗TeNT IgG/IgAを得た。次世代シークエンサー(NGS)を用いてIg遺伝子配列を決定した結果、ほとんどのクローンがIgGサブタイプであり、現在その体細胞突然変異を検討中である。今回の研究計画において、高効率でヒト由来B細胞形質転換細胞株を取得する方法が確立できた。一方、サイトメガロウイルス(CMV)に対する抗体クローンのIg遺伝子解析を行うために、クローンスクリーニングを行うタンパクプローブが必要である。

したがって、CMVエンベロープタンパク複合体(gH/gL/UL128-131)を選択し、そのリコンビナント化を行った。健常人におけるIgシークエンスデータの集積は、概ね順調に進捗していると考えられる。また病原体タンパク特異的抗体クローンの取得について、H29年度における新規ヒト末梢血単核球形質転換法の確立によって、クローン数の飛躍的な増大が認められた。したがって、本研究計画の遂行に関して現時点では何ら障害はないと考えている。微生物感染といった外界環境あるいは自己抗原等の生体内環境に対する獲得免疫応答において、B細胞は抗体(Ig)遺伝子の再構成、クラススイッチ、および体細胞突然変異(SHM)といった遺伝子イベントを行うことが知られている。特に病原性細菌、ウイルス等の外来抗原に反応し繰り返しIg遺伝子変異を経過することによってそれらに対する反応性、結合親和性を高める。しかしながら抗原刺激によるIg遺伝子変異の速度、規則性については未だ明らかになっていない。本研究計画ではIg遺伝子変異変遷による環境適応メカニズムを明らかにする目的で、ヒトでの病原微生物感染過程における関連Ig遺伝子のSHM変遷過程と、抗体親和性を分子生物学的に解析した。ヒト末梢血単核球(PBMC)を単離しEBウイルス、およびTLR9リガンドによるPBMC内B細胞集団の形質転換株を樹立した。1x107個PBMCあたり、形質転換細胞株を約1000クローンの取得が可能であった。さらにヒトDPT3種混合ワクチンのコンポーネントである破傷風毒素(TeNT)に対して、ELISAを行った結果15クローンの抗TeNT IgG/IgAを得た。次世代シークエンサー(NGS)を用いてIg遺伝子配列を決定した結果ほとんどのクローンがIgGサブタイプであった。一方、サイトメガロウイルス(CMV)に対する抗体クローンのIg遺伝子解析を行うために先述と同様のスクリーニングを行った。CMV感染細胞に反応する抗体クローンは、TeNTに対して約4倍の陽性数が認められた。この結果は、CMVはヒト生体内において、常に再活性化することによってCMV抗原を供給し、液性免疫応答を誘導している可能性を強く示唆している。本研究計画において、高効率でヒト由来B細胞形質転換細胞株を取得する方法が確立できた。また、NGSによる包括的遺伝子解析により、短期間でのクローン同定が可能となった。健常人ボランティア血清中における抗CMVUL83抗体のレパートリーを解析するために、リコンビナントCMVUL83を固相化したカラムにて、血清中抗体を吸着させる。その後、限定分解したFab化抗体を質量分析装置に供し、抗CMVUL83抗体IgH鎖の一次構造配列を類推することによって、抗体レパートリーを決定する予定である。さらに健常人ボランティア末梢血単核球より相当するIgH遺伝子を単離し、塩基配列の決定を試みる。