hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
環オホーツク海・環ベーリング海地域における海獣狩猟文化の成立・変容過程の研究

本研究では標記の目的を達成するために、代表的な海獣狩猟具である骨角製銛頭に注目して研究を行なった。単に表面的な形態を比較するだけに留まらず、遺物の徹底的な観察に基づいて、製作から廃棄に至るプロセスを具体的に復元することを目指した。また銛頭の機能的側面を考察するためのバックデータを得るために、礼文島における現代のトド猟に関する聞き取り調査と銛頭の製作・使用実験を行なった。本研究では、環オホーツク海および環ベーリング海地域を対象として、技術形態学的な分析に、実験考古学的な研究と民族考古学的な調査を組み合わせることによって、先史時代以降展開した海獣狩猟文化の成立・変容のプロセスを解明することを目指している。2007年度は、オホーツク海沿岸では北海道と北千島、ベーリング海沿岸ではアラスカのセント・ローレンス島を主たる対象として資料調査を行なった。北海道内では、道東部(網走・知床・根室地方)と道南部で資料調査を行なった。11月および12月には東京大学において考古学研究室所蔵のアラスカ出土資料および総合研究博物館所蔵の千島出土資料の整理作業を行なった。前者はセント・ローレンス島ククリック遺跡出土資料、後者は明治32年の鳥居龍蔵による千島調査の際の採集・発掘資料が主体を占める。23月には、アラスカ大学博物館においてプヌーク島オクヴィク遺跡出土資料を中心に資料調査を行なった。以上の調査により、筆者がこれまで北海道を中心に行ってきた技術形態学的な研究成果と比較可能な観察データを収集することができた。またアラスカ人類学会において銛頭の破損・再加工プロセスについての研究発表を行い、現地研究者と意見交換を行なった。実験考古学的研究としては、銛頭のレプリカを製作して使用時の運動について基礎的な実験を行なった。トド猟の民族考古学的調査については、2008年秋に実地調査に行なうこととで現地インフォーマントとの調整を進めている。本研究では環オホーツク海および環ベーリング海地域を対象として先史時代以降展開した海獣狩猟文化の成立・変容のプロセスを解明することを目的とし、特に骨角製狩猟具である銛頭に注目して、オホーツク海沿岸(北海道と千島列島)とベーリング海沿岸(セント・ローレンス島)における資料調査を行なった。従来の骨角器研究にみられた方法論的な限界を克服するために、表面的な形態を比較するだけに留まらず、遺物の徹底的な観察によって残された痕跡を読み取り、製作から廃棄に至るプロセスを復元することを目指した。また銛頭の機能的側面を考察するためのバックデータを得るために、礼文島におけるトド撃ち猟師への聞き取り調査と銛頭の製作・使用実験を行なった。北海道では、道東部のトコロチャシ跡遺跡とモヨロ貝塚、道北部の利尻・礼文島の資料について調査を行なった。千島列島の資料については、前年度に引き続いて東京大学総合研究博物館所蔵資料の整理作業を行ない、資料の図化をほぼ完了した。19世紀末に鳥居龍蔵によって収集されたものが中心であるが、北千島は対象地域の中でも資料が著しく乏しいため、今日でも資料的価値が高いものである。アメリカ合衆国の国立自然史博物館では、ベーリング海沿岸地域における編年の基礎資料としても重要な1930年代のセント・ローレンス島出土資料の調査を行なった。前年度までに行なったアラスカ大学所蔵の同島出土資料の調査成果と合わせると、当該地域における銛頭の製作・再加工プロセスには時期的な変化がみられる可能性が高い。これまでの日本列島の資料を扱った研究で蓄積してきた技術形態学的な分析成果と比較することにより、それぞれの地域における骨角製狩猟具の運用システムの特徴をとらえることが可能になった。
不法移民と財貿易に関する一般均衡モデルの構築

Alan Woodland教授(シドニー大学、オーストラリア)と共に、2国(自国、外国)、1財、2生産要素(資本、労働)モデルを用いて、資本希少国である外国から資本豊富国である自国へ不法入国する移民、すなわち不法移民の不法入国に関する意思決定並びに不法移民を故意に雇い入れる自国企業の意思決定を、不確実性に関する経済理論を駆使して一般化した。その上で、均衡解の存在の有無並びに自国政府による移民政策(国境検問、雇主処罰)が自国と外国経済に及ぼす効果を、両国の間で資本移動が存在しない場合と存在する場合に分けた上でそれぞれ分析した。その結果、不法移民が(国境検問という)危険に関して回避的である場合に、複数均衡が存在すること、また、不法移民が危険に関して中立的かもしくは愛好的である場合に、安定的な均衡解が一意的に:存在することが発見された。また、国境検問の強化によって、自国の賃金水準は必ず上昇するが、雇主処罰の強化が自国の賃金に及ぼす効果は、不法移民の危険に対する選好と移民政策の施行水準(不法移民の逮捕率)に因って変化することが確認された。実際に、Papademetriou D. G, B, Lindsay Lowell and D. A Cobb-Clark(1991)の研究では、国境検問による逮捕率は25-75%であるという実証的データが得られた。したがって、不法移民の逮捕率の(広範囲に存在する)其々の水準によって、移民政策が自国の賃金に及ぼす効果を分析することに意義を見出した。これらの分析結果は、国境検問の自国賃金に及ぼす効果を除いて、いずれも不法移民に関する先行研究では得られなかった新しい結果である。参考文献:Alan Woodland教授(シドニー大学、オーストラリア)と共に、2国(自国、外国)、1財、2生産要素(資本、労働)モデルを用いて、資本希少国である外国から資本豊富国である自国へ不法入国する移民、すなわち不法移民の不法入国に関する意思決定並びに不法移民を故意に雇い入れる自国企業の意思決定を、不確実性に関する経済理論を駆使して一般化した。参考文献:さらに、これらの検証結果を基に、先進国と発展途上国との間の財貿易と不法移民問題を同時に取り扱う一般均衡モデルの構築をした。先進国政府による不法移民に対する査察政策の強化が、不法移民の数並びに財貿易にいかなる影響を及ぼすのかを数理的に分析しているところである。次年度も引き続きこの分析を進めていく予定である。16年度に構築された、不法移民に関する「静学的一般均衡モデル」を検証した。当モデルの構造に理論的に矛盾した点がないかどうかを入念にチェックした。さらに、当モデルを構築する意義、当モデルを用いて分析を行うポイント、また、なぜ分析を行う必要があるのかについて考察を行った。つまり、社会的な観点から判断して、当分析を行うことが望まれることなのかどうかについて熟考した。日本は2002年にシンガポールとFTAを締結した。さらに、2005年4月にメキシコと経済連携協定(EPA)を締結し、同年5月にマレーシアとEPA締結で大筋合意した。現在、インドネシア、タイ等と交渉と続けている。このように、今後の日本においては、国際貿易のみならずヒト、サービス、投資の国際間の移動が促進されることは言うまでもない。したがって、上記のモデルを構築することの社会的な意義は大いにあると確信するに至った。

その結果、不法移民が(国境検問という)危険に関して回避的である場合に、複数均衡が存在すること、また、不法移民が危険に関して中立的かもしくは愛好的である場合に、安定的な均衡解が一意的に存在することが発見された。また、国境検問の強化によって、自国の賃金水準は必ず上昇するが、雇主処罰の強化が自国の賃金に及ぼす効果は、不法移民の危険に対する選好と移民政策の施行水準(不法移民の逮捕率)に因って変化することが確認された。実際に、Papademetriou D.G, B.Lindsay Lowell and D.A.Cobb-Clark(1991)の研究では、国境検問による逮捕率は25-75%であるという実証的データが得られた。したがって、不法移民の逮捕率の(広範囲に存在する)其々の水準によって、移民政策が自国の賃金に及ぼす効果を分析することに意義を見出した。これらの分析結果は、国境検問の自国賃金に及ぼす効果を除いて、いずれも不法移民に関する先行研究では得られなかった新しい結果である。参考文献:
伝達物質放出の制御によるシナプス伝達の可塑性

シナプスにおける伝達物質放出量は神経回路のオン・オフを決定する重要な因子であり、シナプス伝達の可塑性にも深く関わっているものと考えられる。過去9年程の研究の急速な進展によって伝達物質放出の分子機序が解明され始めている。本研究においては伝達物質放出制御によるシナプス伝達の可塑性機構の解明に向けて、研究分担者間での議論、研究発表会を頻繁に行うとともに、共同研究を実施した。また、本研究の終了後もこの分野の今後の発展を促進するため、学会、シンポジウム等を通じて尽力することとなった。本研究の成果を基にして特定領域研究(B)を申請した。本研究の期間は1年間であったが、伝達物質放出機構に関して、SNAREに結合する細胞質蛋白質シナーフィン/コンプレキシンが放出に必須であり、それがSNARE複合体のオリゴマーを形成することによって作用すること、シナプス小胞膜蛋白質シナプトタグミンのシナプス小胞のドッキングと膜融合における役割とその機能を担うドメインの同定、SNARE蛋白質と細胞骨格系の相互作用等の重要な新知見がもたらされた。また、神経終末のシナプス小胞はいくつかのプールに分かれているが、それらのプール間の移動におけるcAMPの関与もショジョウバエを用いて明らかにされた。さらに海馬や視覚皮質の神経回路およびその発達過程における伝達物質放出の制御とその生理的意義についての研究成果もシナプス伝達の可塑性機構に多くの示唆を与えるものと思われる。
食道癌の新規治療法開発を目指したmicrobiomeとエピジェネティクス解析

本研究の目的は、食道癌データバンクを用いて、食道癌におけるMicrobiome(ヒト微生物叢)とエピジェネティック変化(LINE-1≒ゲノム全体のメチル化)の関連を網羅的に解析し、革新的なbiomarkerを開発することである。Fusobacteriumは主に口腔内に生息するmicrobiomeの一種で、一般的には歯周病の原因菌として知られている。これまで、Fusobacterium nucleatum陽性食道癌症例は有意に予後不良であり、Fusobacterium nucleatumが食道癌の進展・浸潤に関与していることを報告している。今回、300例以上のデータバンクを用いた追加解析によってFusobacterium nucleatum陽性食道癌症例はLINE-1メチル化レベルが有意に低いことが明らかになった。次に、そのメカニズム解析を行うために、まずはLINE-1メチル化とLINE-1増幅・転位との関係を評価した。消化器癌300例以上を解析したところ、LINE-1低メチル化症例では有意にLINE-1増幅が認められた。今後は、癌特異的なLINE-1転位部位の検索を次世代シーケンサーを用いて行っていく。また、Fusobacterium nucleatumが癌細胞のAutophagyを誘導することも明らかになっており、今後はLINE-1メチル化・増幅との関連も検証していく。また、腫瘍免疫との関連についても検証を進めており、腫瘍浸潤リンパ球、PD-L1発現、IDO1発現などについても網羅的に検討している。消化器癌300例以上を解析したところ、LINE-1低メチル化症例では有意にLINE-1増幅が認められることが明らかになった。このように、研究はおおむね順調に進捗している。今後は、LINE-1増幅に関しては、“癌特異的なLINE-1転位部位の検索"を次世代シーケンサーを用いて行っていく予定としている。その条件設定等は順調に進んでおり、継続して研究を推進する。また、腸内細菌Fusobacterium nucleatumが癌細胞のAutophagyを誘導することも明らかになっており、今後はLINE-1メチル化・増幅との関連も検証していく。腫瘍免疫に関する予備実験(免疫染色、FACSなど)も順調に進んでおり、それらの統合解析を随時行っていく方針である。引き続きメカニズム解析を行っていく。また、Fusobacterium nucleatumが癌細胞のAutophagy (ATG-7及びULK-1)と関連することも明らかになっており、今後は抗がん剤感受性との関連も検証していく。また、microbiomeと腫瘍免疫の関連にも着目しており、食道癌におけるPD-L1発現、腫瘍浸潤リンパ球に関する検証を行った。PD-L1高発現、腫瘍浸潤リンパ球が少ない症例は予後不良であることが明らかになり、Ann Surg誌に投稿し採択された。Fusobacterium nucleatumとautophagyの興味深い知見が得られており、今後抗がん剤感受性への影響などを更なる研究の基盤となるデータとなりうる。これまでの結果は米国癌学会American Association for Cancer Research 2018で「The relationship between Microbiome Fusobacterium Nucleatum and autophagy in esophageal cancer」として発表する予定である。さらには、Fusobacterium nucleatum感染とLINE-1メチル化レベルの関連も示されており、今後メカニズム解析を行う予定である。今回、300例以上のデータバンクを用いた追加解析によってFusobacterium nucleatum陽性食道癌症例はLINE-

1メチル化レベルが有意に低いことが明らかになった。次に、そのメカニズム解析を行うために、まずはLINE-1メチル化とLINE-1増幅・転位との関係を評価した。消化器癌300例以上を解析したところ、LINE-1低メチル化症例では有意にLINE-1増幅が認められた。今後は、癌特異的なLINE-1転位部位の検索を次世代シーケンサーを用いて行っていく。また、Fusobacterium nucleatumが癌細胞のAutophagyを誘導することも明らかになっており、今後はLINE-1メチル化・増幅との関連も検証していく。また、腫瘍免疫との関連についても検証を進めており、腫瘍浸潤リンパ球、PD-L1発現、IDO1発現などについても網羅的に検討している。本研究の目的は、食道癌データバンクを用いて、食道癌におけるMicrobiome(ヒト微生物叢)とエピジェネティック変化(LINE-1≒ゲノム全体のメチル化)の関連を網羅的に解析し、革新的なbiomarkerを開発することである。今回、300例以上のデータバンクを用いた追加解析によってFusobacterium nucleatum陽性食道癌症例はLINE-1メチル化レベルが有意に低いことが明らかになった。消化器癌300例以上を解析したところ、LINE-1低メチル化症例では有意にLINE-1増幅が認められることが明らかになった。このように、研究はおおむね順調に進捗している。今後は、(1)Fusobacterium nucleatumとAutophagy,抗がん剤感受性の関連、(2)Fusobacterium nucleatum感染によりLINE-1低メチル化が引き起こされるメカニズム解析に焦点を絞り、研究推進していく。さらには、LINE-1メチル化レベルを制御する候補microbiomeを同定するために16S rRNAシークエンスで解析する症例選択を行っており、順次解析する予定である。腫瘍部からのPowerMag Microbiome RNA / DNA Isolation Kit (MO BIO Laboratories, Inc.)を用いてDNAの抽出を行う。
社会変動期における思想転向の意味―楊度の思想遍歴を通して

本研究は、楊度(18741932)の思想的変遷を解明し、所謂思想的「変節」や「転向」が個人において如何なる事態を引き起こすことになるのか、そのようにして得られる実践的「正義」が、個人的にも、社会的にも、如何なる意義を持ち得るのかという視点に立って、対話や合意によって共通の実践的価値である文脈的正義を獲得するという今日の哲学思想状況における最前線の課題に取り組むことを目的とした。先ず、対語や合意の場面における感情の役割や機能をめぐって、意思決定におけるそのコミットメント機能を明らかにし、論文「ディベート論」の中に提示した。又、その具体的特殊的展開として、司法の場における感情のコミットメント機能については、廈門における2001年中国法律史学会で「司法と感情」という口頭報告を行い、明らかにした。我々の意思決定は、常に不確定な事態の中で為されるし、そのような事態の中での意思決定を評価する基準を如何に求めてゆくのかというテーマはすぐれて今日的課題でもある。従って、自分自身と国家との間で葛藤を続けた楊度の人生のそれぞれの時点でなされた彼自身の意思決定の評価は、後知惠でしかない。しかし、本研究において、楊度が変わることを畏れなかったことを、私は評価した。楊度の思想的変遷を解明することを通じて、対話や合意によって共通の実践的価値である文脈的正義を獲得するということは、正に「変化を畏れない」ということであることが明らかになったと、私は考えている。今後、楊度の思想遍歴に関しての具体的研究内容については論文等の形で発表してゆく予定であるし、不確定な事態の中で為される意思決定を如何に評価するかの基準についても、追求してゆくつもりである。本研究は、楊度(18741932)の思想的変遷を解明し、所謂思想的「変節」や「転向」が個人において如何なる事態を引き起こすことになるのか、そのようにして得られる実践的「正義」が、個人的にも、社会的にも、如何なる意義を持ち得るのかという視点に立って、対話や合意によって共通の実践的価値である文脈的正義を獲得するという今日の哲学思想状況における最前線の課題に取り組むことを目的としている。本年度当初、本研究は、楊度の経歴に関する資料の発掘、蒐集を行うことを主として、その際中国の研究者との交流を行い情報の交換をすること、次いで、対話や合意という場面における感情の役割や機能をめぐる基礎的文献を蒐集することを、年度課題として設定した。先ず、1906年に楊度によって編集された『中国新報』の蒐集については、清末民初期刊彙編の購入により果たされた。清の憲政編査館関連の資料を探索することについては、国内(主として東京及び京都)への出張調査を行った。しかし、北京大学へ出張を行い、中国研究者と直接の情報交換を行うことについては、双方の調整が成立せず、従って次年度に延期して行うことにした。次に、資料の整理を通じて、楊度に関する簡単な経歴表を作成した。さらに、対話や合意の場面における感情の役割や機能をめぐる基礎的文献を蒐集した。それらの文献の知見によって、この面については或る程度見通しの立った理解が得られた。その研究成果は、本研究とは別の、従って本研究にとっては副次的という位置づけにはなるが、コミュニケーションをめぐる共同研究の報告書に収められた拙論「ディベート論」の中に提示されている。

本研究は、楊度(18741932)の思想的変遷を解明し、所謂思想的「変節」や「転向」が個人において如何なる事態を引き起こすことになるのか、そのようにして得られる実残的「正義」が、個人的にも、社会的にも、如何なる意義を持ち得るのかという視点に立って、対話や合意によって共通の実践的価値である文脈的正義を獲得するという今日の哲学思想状況における最前線の課題に取り組むことを目的としている。本年度当初、本研究は、前年に蒐集できなかった楊度の経歴に関する資料の調査・蒐集を行う。この為、東京・京都等への出張を行う。さらに北京大学他への出張を行い、中国の研究者と直接交流し、現地研究者との情報交換を行う。蒐集資料の読解を通じて、楊度の思想遍歴に関して具体的にその内容を整理する。以上のことを、年度課題として設定した。先ず、前年に蒐集できなかった楊度の経歴に関する資料については、数度の東京出張において、重要な中国語文献を見つけることが出来た。しかし、北京大学へ出張を行い、中国研究者と直接の情報交換を行うことについては、当方の事情で調整が成立せず、従ってさらに次年度に延期して行うことにした。楊度の思想遍歴に関して具体的にその内容を整理することについては、資料の発見に手間取ったため十分に果たすことは出来なかった。これについては次年度の最重点課題として、果たして行きたい。本研究は、楊度(18741932)の思想的変遷を解明し、所謂思想的「変節」や「転向」が個人において如何なる事態を引き起こすことになるのか、そのようにして得られる実践的「正義」が、個人的にも、社会的にも、如何なる意義を持ち得るのかという視点に立って、対話や合意によって共通の実践的価値である文脈的正義を獲得するという今日の哲学思想状況における最前線の課題に取り組むことを目的とした。本年度の研究は、前年に蒐集できなかった楊度の経歴等に関する資料の調査・蒐集の為東京・京都への出張を行い、若干の邦語文献を蒐集することができた。さらに中国の研究者と直接交流し、現地研究者との情報交換を行うことについては、平成13年11月1日より8日まで中国に渡り、まず上海の華東政法学院にて現地研究者との情報交換を行うと共に、中国語文献資料の蒐集を行った。さらに、廈門における2001年中国法律史学会に参加して、多くの中国研究者と直接の情報交換を行った。中国法律史学会では、さらに、対話や合意の場面における感情の役割や機能をめぐる研究の一環として、「司法と感情」という論題で研究報告を行った。この報告は中国で出版される当学会報告集に掲載される予定である(発行年は未定)。この研究報告は、本研究にとっては副次的成果という位置づけになる。楊度の思想遍歴に関して具体的にその内容を整理することについては、資料の発見に手間取ったため論文等の形で発表することは出来なかったが、本年度の報告書にまとめたものを敷衍して、今後発表してゆく予定である。
大気圏再突入カプセルに関する大規模流体シミュレーションデータの疎性モデリング解析

本研究課題では、大規模流体シミュレーションデータに対するスパースモデリング解析の有効性を実証する。また、スパースモデリングを用いて、大気突入カプセル背後に生じる非定常な流れの支配的な空間構造及びその動的な構造・メカニズムを明らかにする。採用2年目である平成29年度には、当初計画の通り、大気突入カプセル周りの流れ場の動的モード分解(DMD)解析および圧縮センシング解析を行った。その結果、カプセル背後の複雑な流れ場から4つの特徴的な空間構造を明らかにした。特に、大気突入カプセルの動不安定現象との関係性が示唆される長い時間スケールを持つ新たな流体現象を発見した。また、本研究課題で提案したスパースモデリング解析法を後退翼上の3次元バフェット現象に適用し、後退翼上のバフェット現象に特有の空間構造(バフェットセル)とその振る舞いを明らかにした。本研究課題の研究成果は査読付論文としてまとめているところである。29年度が最終年度であるため、記入しない。採用初年度である平成28年度には、当初計画の通り、大気突入カプセル周りの流れ場の数値シミュレーション及び固有直交分解(POD)のプログラムを整備し、解析をおこなった。その結果、カプセル背後の一見複雑な流れ場から渦輪状の形状をもつ特徴的な組織構造を抽出することに成功した。また、より低周波数の変動をもつ組織構造も新たに明らかになった。この低周波数変動は、大気突入カプセルの問題点である飛行時の動不安定をもたらす流体現象と関係が深い可能性があるため、今後さらなる検討を進める予定である。また、メモリ消費量の観点から大規模流体シミュレーションデータを取り扱うには、オンライン型の特徴抽出アルゴリズムが有効であることを見出した。そこで、オンライン型の固有直交分解を前処理として用いることで、大規模流体データの固有直交分解解析、動的モード分解解析、およびモデル選択を効率的に実施する枠組みを提案した。提案した枠組みを用いることで、これまで困難であった大規模なデータの動的モード分解およびそのモデル選択が可能となる。実際に提案手法を数千万セルオーダの大規模流体データに適用し、その有効性を確認した。以上の研究成果はアメリカ航空宇宙学会(AIAA)による国際学会等で発表を行ったほか、査読付論文としても成果をまとめているところである。初年度は当初計画の通り、大気突入カプセル周りの流れ場の数値シミュレーション及び、固有直交分解(POD)のプログラムの整備・解析を終了した。また、当初計画では2年度目の計画の一部として予定していた大規模データを効率的に扱う手法やモデル選択の手法のアルゴリズム開発もほぼ終了させることができた。初年度の研究成果である、省メモリ型の固有直交分解解析、動的モード分解解析、およびモデル選択アルゴリズムを用いて、大気突入カプセル周り流れのより詳細な解析を進める。特に、初年度の固有直交分解による解析によって明らかとなった低周波数モードは、大気突入カプセルの動不安定現象に関わる重要なモードである可能性があるため、本モードを重点的に調べる計画である。同時に、得られた研究成果は査読付論文としてまとめて発表する。
早期肝細胞癌における細胞外マトリックスの分解に関する研究

早期の肝細胞癌が線維性隔壁・被膜に浸潤する像(間質浸潤)が,肝細胞癌の病理診断や,癌の進展過程解明に有用であると明らかになった。今回は,その間質浸潤のメカニズムを細胞外マトリックス分解酵素matrix matalloproteinase(MMP)の発現の面から,明らかにした.まず,肝細胞癌の間質浸潤の形態的評価の確実な切除例と培検例を用いた。この凍結標本を-30°C(クリオスタット内)で細切,CO_2incubatorで3時間モネンシン処理。その後,peridate-lysine-parapholmaldehyde(PLP)固定液で4°Cで一晩固定。通常の方法でパラフィン包埋。そして,MMPのモノクローナル抗体各種を用いて免疫染色を行った。また,各種コラーゲンも染色した。その結果:MMPは一部の腫瘍細胞内に陽性に染色された。MMP陽性細胞は,癌胞巣内部よりも,線維組織内,線維と癌組織との境界部により高頻度にみられた。これは癌浸潤の合目的的結果と考えられた。現在,染色性の感度・特異性向上のためさらに条件設定を工夫している。以上の結果は,これまで不明であった間質浸潤のメカニズム解明の第一歩となりうるものであり,また従来から鑑別の難しかった"肝細胞癌の間質浸潤"と"間質内の残存良性肝組織"とを鑑別する一助となる可能性を示唆した。今後生検例にも応用し,良・悪性の判定の困難な症例の確定診断という実用的目的にも役立てたい。
エンバク冠さび病における品種特異的抵抗性遺伝子発現の分子機構に関する研究

エンバク冠さび病抵抗性遺伝子Pc-2は冠さび菌に抵抗性を示すばかりでなく、宿主特異的毒素ビクトリンに感受性を示す。また、低分子で化学構造も明らなビクトリンはエンバクのフィトアレキシン・アベナルミンの生成誘導をする特異的エリシターとしての作用を持つ。したがって、エリシター・ビクトリンによるアベナルミンの生成誘導はエンバク冠さび病の抵抗性発現機構の分子レベルでの解明のモデルシステムとして有効である。本研究では、ビクトリンによるアベナルミン生成を伴うPc-2遺伝子の発現制御機構を分子生物学的手法を用いて解明するものである。はじめに、Pc-2遺伝子保有エンバクIowa x469品種のゲノミックライブラリーを調製した。また、ビクトリン処理葉よりえたm-RNAのcDNAを調製した。一方、既知のダイズ由来、フェニールアラニン・アンモニアリアーゼ(PAL)、カルコンシンターゼ(CHS)およびカルコンイソメラーゼ(CHI)のcDNAとビクトリン処理時のpoly-mRNAとハイブリダイゼーションしたところ、PALcDNAと結合する遺伝子がアベナルミンの蓄積と呼応して認められ、エンバクのPALが活性化していることが示唆された。しかし、アベナルミンの生合成系の関与しない、CHSとCHIのcDNAと結合するスポットは認められなかった。このことは、アベナルミンの生合成に関与する酵素のみに反応するものであり、フラボノイド系化合物の合成の活性化はないことを示すものである。また、ビクトリン処理葉より得たmRNAのcDNAに対してPALcDNAとハイブリさせたところビクトリン処理のより活性化されるPAL遺伝子を確認した。現在、ビクトリン処理後の経時的な変動を追認している。また、イネのキチナーゼcDNAとエリシター・ビクトリンにより活性化されるmRNAのcDNAとのハイブリを行いエンバクのキチナーゼが活性化すことが明らかになった。これはキチナーゼ酵素活性が増高することとも一致した。今後、これらエンバクの遺伝子のクローニングを進める計画である。エンバク冠さび病抵抗性遺伝子Pcー2は冠さび菌に抵抗性を示すばかりでなく,宿主特異的毒素ビクトリンに感受性を示す。また,低分子で化学構造も明らかなビクトリンはエンバクのファイトアレキシン・アベナルミンの生成誘導をする特異的エリシタ-としての作用をもつ。したがって,エリシタ-・ビクトリンによるアベナルミンの生成誘導はエンバク冠さび病の抵抗性発現機構の分子レベルでの解明のモデルシステムとして有効である。本研究では,ビクトリンによるアベナルミン生成を伴うPcー2遺伝子の発現制御機構を遺伝子工学的技術を用いて解明するものである。本年度は,まず,Pcー2遺伝子保有エンバクIowa×469品種のゲノミックライブラリ-をλEML3で作成し,5.2×107ヶの組換え率を示すファ-ジを確認した。このゲノミックDNAとビクトリン処理時のpolyーA RNAとハイブリダイゼ-ションしたところ,70回以上くり返りしが,特異的RNAは検出できなかった。本年度は引き続いてpolyーA RNAよりCーDNAを作成し,それをdiffernfical Sereening法に用い活性化されるnRNAを検出する予定である。

一方,既知のダイズ由来,フェン-ルアラニン、アンモニアリア-ゼ(PAC),カルコンシンタ-ゼ(CHS),およびカルコンイソメラ-ゼ(CMZ)のcDNAとビクトリン処理時のpolyーAmRNAとハイブリダイゼ-ションしたところ,PALcDNAと結合するスポットがアベナルミンの蓄積と呼応して認められ,エンバクのPALが活性化されていることが示唆された。しかし,アベナルミンの生合成系に関与しない,CHSとCHIのcDNAとは結合するスポットは認められなかった。このことは,アベナルミンの生合成系に関与する酵素とも一致する結果であり,エンバクのストレス化合物としてアベナルミンが主要するものであることが確認された。エンバク冠さび病抵抗性遺伝子Pc-2は冠さび病抵抗性であるばかりでなく、宿主特異的毒素ビクトリンに感受性を示す。また、ビクトリンはファイトアレキシン・アベナルミンを生成誘導する特異的エリシターとして作用する。本研究はビクトリンによるアベナルミン生成を伴うPc-2遺伝子の発現制御機構を分子生物的技術を用いて解明するものである。昨年度は作成したゲノミックDNAとビクトリン処理時に誘導されるPoly-A・m・RNAとのハイブリダイゼーションをしたが、特異的RNAを検出できなかったので、本年度に入り、抵抗性遺伝子発現時のPoly-AmRNAを調製後C-DNAを作成した。C-DNAに対してmRNAのdifferential screeningを行い複数のスポットを確認した。一方、ダイズおよびイネのPAL-CDNAとのハイブリダイゼーションを行い、オートのPALと思われるスポットを得た。現在これらmRNAの抵抗性発現との関係について明らかにするTime courseの研究を行っている。従って、抵抗性特異的な活性化遺伝子と思われるスポットを得たが、クローニングまで至らなかった。引き続い研究していたので必ずや成果を出せるものと思っている。また、現在、オオムギおよびイネのキチナーゼCDNAを農林水産省より得たのでこれら遺伝子とハイブリダイゼーションからキチナーゼ遺伝子のクローニングも試みている。すでに、キチナーゼ活性の抵抗性発現に伴う増高を認めており、電気泳動ゲル上での活性バイドも確認しており、蛋白の単離も可能な条件が整っている。キチナーゼ活性増高については、平成5年度日本植物病規学会大会において発表予定である。
損傷脊髄モデルに対する損傷脊髄環境の制御と幹細胞移植を用いた軸索再生と機能回復

今年度は、前回報告した移植細胞となる胎児海馬由来神経幹細胞(神経幹細胞)と骨髄由来幹細胞(骨髄細胞)のRT-PCR法による神経栄養因子発現の比較から1)NGF・CNTF・GDNF遺伝子およびそれぞれのレセプター遺伝子ベクターを培養神経幹細胞に導入しその分化傾向を確認した。in vivo実験では2)脊髄損傷モデルに移植した細胞の生存期間を改善するような遺伝子導入を行った。1)NGF・CNTF・GDNFおよびそれぞれの受容体遺伝子を培養神経幹細胞にさまざまな組み合わせで導入実験を行った。その結果、GDNFとそのレセプターGFRα1の組み合わせでもっと高い神経細胞へ分化が認められた。本結果から骨髄細胞が脊髄損傷部に移植された場合、損傷後の機能回復を促進する一因としてGDNFの関与が示唆される。今後は、脊髄損傷後にGDNFを持続的に発現させるモデルを作製し、損傷急性期の炎症の抑制と組み合わせて研究を行っていく予定である。2)前回、培養神経幹細胞を脊髄損傷1週後に移植した結果、ホスト脊髄内で細胞の生着は確認されたもの正常脊髄に移植したものの約半数しか生着できなかったことを報告した。今回、細胞骨格とアポトーシスに関与するRhoファミリー遺伝子に注目し、神経幹細胞に導入し移植実験を行った。その結果、RacおよびRho遺伝子のdominant negative typeを感染させた場合、対照群と比較して2.5倍の生着細胞が観察された。これら遺伝子は、移植後の細胞死を抑制するための有効な手段と考えられた。1)2)では損傷脊髄に移植する神経幹細胞、骨髄幹細胞についてその神経栄養因子的な働きと細胞死の抑制方法について明らかにした。骨髄幹細胞の脊髄損傷に対する働きはいまだ不明であり、移植細胞の多くが細胞死を受け十分に生着せず、一過性の働きしか得られないという報告もあることから本研究で明らかにしたことは意義が大きい。いずれの実験結果も論文への投稿準備中である。研究計画にあるような抗炎症作用とダリア瘢痕の抑制環境の作製には時間が必要であるが、本研究で明らかにした手法を組み合わせることで脊髄損傷のメカニズムおよび治療の解明に役立つと思われる。平成16年度報告書損傷脊髄環境の制御今年度は、移植細胞となる胎児海馬由来神経幹細胞と骨髄由来幹細胞についてin vitroおよびin vivoの評価を行った。1)移植細胞としての胎児海馬由来神経幹細胞(神経幹細胞)と骨髄由来幹細胞(骨髄細胞)の共培養を行いそれぞれの形態変化および遺伝子発現を検討した。2)移植した骨髄細胞の正常脊髄内での分布・分化について組織学的評価を行った。1)神経幹細胞は、ラット胎児海馬から単離分散し、骨髄細胞は、成ラット大腿骨から単離培養し、それぞれ2-3代継代し、幹細胞を培養皿上にまき、共培養用のメッシュ上に骨髄細胞を培養した。その結果、骨髄細胞と共培養していない群と比較すると神経幹細胞の多くがアストロサイトに分化していることがわかった。さらにRT-PCR法を用いて骨髄細胞の神経栄養因子の発現を比較するとニューロン維持に必要なNT3やBDNFの発現が欠けていた。2)生後7日ラット正常脊髄内に骨髄由来幹細胞を移植し、細胞生着・分布を検討した。移植細胞はGFP導入アデノウイルスで標識した。移植1週で灌流固定し、免疫染色によって移植細胞の分布形態を検討した。生着細胞数は、1切片あたり平均10個ほどであり、注入部白質に分布し生着不良であった。いずれの細胞も神経系細胞へ分化を認めなかった。神経幹細胞移植時には、平均約400個の細胞が生着しており生着率の低さが際立った。さらに幼若脊髄内という生着しやすい環境にありながら、移植細胞の生存は不十分である。文献的には、脊髄損傷モデルに対する骨髄細胞移植が機能改善に有効であり、骨髄細胞が有効な細胞種であることが知られている。今年度のin vitroの結果から骨髄細胞は、グリア細胞への作用が強く働いている可能性が示唆され、in vivo実験からは、組織学的に骨髄細胞単独では不十分であり神経幹細胞との組み合わせも有効な手段であることが示唆された。今後、脊髄環境制御についてさらにin vivo実験を進めていく予定である。今年度は、昨年度行った移植細胞となる胎児海馬由来神経幹細胞(神経幹細胞)と骨髄由来幹細胞(骨髄細胞)のRT-PCR法による神経栄養因子発現の比較から1)同遺伝子を過剰発現するような遺伝子ベクターを作製した。さらに2)脊髄損傷モデルを作製して細胞移植実験を行い、移植細胞の生存について検討した。1)骨髄細胞での神経栄養因子発現の解析から神経細胞を保護するようなNT3・BDNFを認めず、神経軸索伸展作用などを持つNGF・CNTF・GDNFの発現がみられた。骨髄細胞が損傷脊髄に対し有効に働く理由としてこれら神経栄養因子の分泌による影響が考えられた。よってこれら栄養因子を過剰発現させることにより、損傷軸索に対する伸展効果が見込まれる。NGF・CNTF・GDNF遺伝子をベクターに組み込みレンチウイルスを作製している。現在、ウイルス濃度とタンパク発現量を確認中であり、今後さらにin vitroの効果およびin vivoでの移植実験と組み合わせていく予定である。2)昨年度、生後7日ラット正常脊髄内に骨髄由来幹細胞を移植した結果、生着しやすい環境にもかかわらず生存が不良であることを報告した。今年度は、アデノウイルスでGFP標識した神経幹細胞を生後7日ラット脊髄切断モデルの脊髄近位端に移植した。切断直後に移植した場合、1週後にGFP細胞は観察されなかったが、切断1週間後に移植するとGFP細胞が観察された。

従来報告されているように亜急性期に移植したほうが移植細胞の生存率は高かった。しかし、その数は正常脊髄と比較すると約半数であり、移植細胞の生存効果を高める手法の開発と損傷脊髄環境の制御の必要性を認めた。今後、移植細胞に対しては、神経幹細胞と骨髄細胞の組み合わせや神経栄養因子などの遺伝子導入の検討を行う予定である。さらに環境制御については脊髄切断モデルと脊髄圧挫モデルの2種類を作製中であり、これら損傷後に起こる環境変化の解析を行っていく予定である。今年度は、前回報告した移植細胞となる胎児海馬由来神経幹細胞(神経幹細胞)と骨髄由来幹細胞(骨髄細胞)のRT-PCR法による神経栄養因子発現の比較から1)NGF・CNTF・GDNF遺伝子およびそれぞれのレセプター遺伝子ベクターを培養神経幹細胞に導入しその分化傾向を確認した。in vivo実験では2)脊髄損傷モデルに移植した細胞の生存期間を改善するような遺伝子導入を行った。1)NGF・CNTF・GDNFおよびそれぞれの受容体遺伝子を培養神経幹細胞にさまざまな組み合わせで導入実験を行った。その結果、GDNFとそのレセプターGFRα1の組み合わせでもっと高い神経細胞へ分化が認められた。本結果から骨髄細胞が脊髄損傷部に移植された場合、損傷後の機能回復を促進する一因としてGDNFの関与が示唆される。今後は、脊髄損傷後にGDNFを持続的に発現させるモデルを作製し、損傷急性期の炎症の抑制と組み合わせて研究を行っていく予定である。2)前回、培養神経幹細胞を脊髄損傷1週後に移植した結果、ホスト脊髄内で細胞の生着は確認されたもの正常脊髄に移植したものの約半数しか生着できなかったことを報告した。今回、細胞骨格とアポトーシスに関与するRhoファミリー遺伝子に注目し、神経幹細胞に導入し移植実験を行った。その結果、RacおよびRho遺伝子のdominant negative typeを感染させた場合、対照群と比較して2.5倍の生着細胞が観察された。これら遺伝子は、移植後の細胞死を抑制するための有効な手段と考えられた。1)2)では損傷脊髄に移植する神経幹細胞、骨髄幹細胞についてその神経栄養因子的な働きと細胞死の抑制方法について明らかにした。骨髄幹細胞の脊髄損傷に対する働きはいまだ不明であり、移植細胞の多くが細胞死を受け十分に生着せず、一過性の働きしか得られないという報告もあることから本研究で明らかにしたことは意義が大きい。いずれの実験結果も論文への投稿準備中である。研究計画にあるような抗炎症作用とダリア瘢痕の抑制環境の作製には時間が必要であるが、本研究で明らかにした手法を組み合わせることで脊髄損傷のメカニズムおよび治療の解明に役立つと思われる。
超低被曝と高画質を両立する新方式の心臓用CTイメージング

本研究は、心臓CTイメージングの有効な撮影プロトコルと画像生成のデータ処理法(画像再構成法)を開発することを目的とする。本年度は、これを実現するために設定した小テーマの中で、1)動き補償を組み込んだ疎な投影データからの動画像再構成法の開発、2)心臓イメージングのための関心領域X線照射方式の開発、の2つの研究を行った。1)のテーマでは、前年度の研究で示した『心電同期を用いて投影データ収集を行った心臓CTにおける動画像の生成は少数方向投影データからの画像再構成に帰着する』という事実に基づき、以下の考え方に基づく新しい再構成法を開発した。提案手法では、前年度の研究で用いた対数ゆう度と(リファレンス画像やリファレンスヒストグラムなどの)事前情報の和からなる画像再構成の評価関数にオプティカルフローで表現した動きの影響を組み込み、交互最小化法により画像とオプティカルフローを同時に推定する。シミュレーション実験を行い、再構成画像の画質(動きアーティファクト・時間分解能・定量性)・被曝量低減効果・計算時間を評価した。2)のテーマでは、静止画像の撮影に対して有効性が示されている関心領域X線照射方式(X線を心臓など検査の関心領域のみに照射して画像再構成を行い被曝量を低減する新方式CT)を、少数方向投影データのみが測定される心臓イメージングの動画像撮影に拡張した。具体的には、関心領域X線照射方式により測定した心臓外部が欠損して方向数が少数に限定された不完全投影データからの画像再構成問題の解の一意性と安定性を考察して、被写体に関する上述の事前情報を用いてデータ欠損による画質劣化を抑制する再構成法を開発した。これを実現するために克服すべき3つの小テーマの中で、本年度は心臓CTイメージングを目的とした『疎な投影データからの画像再構成』について研究を行った。まず、心電同期や呼吸同期を用いて投影データ収集を行った場合の動画像の生成が、疎な投影データからの画像再構成に定式化できることを示した。次に、代表者らの先行研究である被写体に関する事前情報を用いてベイズ推定により疎な投影データから高品質の画像再構成を行う手法(Rashed, Kudo :『Intensity-based Bayesian framework for image reconstruction from sparse projection data』Medical Imaging Technology,Vol.27, pp.243-251, 2009)を、心臓CTイメージングの動画像に拡張した。具体的には、心臓の動画像は空間方向のみではなく時間方向にも強い相関を持つことに着目して測定データの情報不足を補う時空間リファレンス画像を構築して、これをコンプレストセンシングによる画像再構成の正則化に利用して疎な投影データから高画質な画像を生成する。そして、開発した画像再構成法のソフトウェア開発とシミュレーション実験を行った。心臓の動きを模擬した数値ファントムを準備して計算で擬似的に投影データを作成して、提案手法と本問題に対する代表的な先行研究であるトータルバリエーション(TV)を用いた再構成法で画像再構成を行い、統計雑音や動きアーティファクトなどの画質と被曝量の観点から性能評価を行った。その結果、提案手法によりTVと比較してはるかに少ない計算量で、ほぼ同等の画質の動画像が得られることが示された。
学生支援体制の改善に向けた要支援学生の早期発見と実務者情報共有システムの開発

本研究では,要支援学生の早期発見を目的とするスクリーニングシステムを開発し,学生生活への適応を促すための実務者間の情報共有体制を構築することを目的としている。初年度は,スクリーニングシステムに活用するためのデータの整理とその分析を実施した。スクリーニングシステムとして精度を上げるために,大学生の精神的な健康状態の尺度として用いられているUniversity Personality Inventory(UPI)のデータを活用し,2つの分析方法を用い,予測モデルの構築を試みた。1つめは,ロジスティック回帰分析による不適応リスク予測モデルである。4つの健康的主訴(A1_心気的,A2_抑うつ,A3_劣等感,A4_強迫・被害的)に関する各チェック項目の合計を説明変数とし,精神的な訴えで学生相談室利用した学生を目的変数とするロジスティック回帰分析を実施した。2つめは,ニューラルネットワーク(NN)による不適応リスク予測モデルである。UPIの60項目の得点を入力とし,学生相談室利用の有無を出力とするNNを構築し,すべてのUPIデータを用いて学習モデルを構築した。分析精度の低さから,初年度に引き続き,本年度もこの分析を続けている。本年度は発達障害を抱えた学生の早期発見に繋がっていないことが考えられたため,発達障害傾向をスクリーニングする項目を加えており,発達障害傾向による支援の必要性に関しても検討をしているところである。今後の研究では,大学内でどのように情報共有をするのか,その体制についても検討していく予定である。情報を必要としている部局は学科に留まらないが,方法によっては学生に対する先入観や偏見を与えることにも繋がってしまうことが懸念されるため,学生相談の教職員とも連携し,丁寧に検討していきたい。予測の精度が不十分だと考えられたため,データの項目数を増やし整理が必要だったこと,さらに分析を加えることに時間を要したため。今後は,発達障害傾向の学生をスクリーニングできるよう精度を上げていきたい。情報共有する教職員は,発達障害に詳しくない人もいるため,どのような表現で教職員間で情報共有するのか,学生に対する偏見や誤解のないように丁寧に検討を進めていきたい。その際に,他の事例も参考にしていく予定である。スクリーニングシステムとして精度を上げるために,University Personality Inventory(UPI)のデータを活用することとした。UPIは,1960年代に確立されたスクリーニングのための尺度であり,現在においても大学生の精神的な健康状態の尺度として用いられている。本学においても,全入学生に対してUPIを実施しているため,このデータを活用することとし,2つの分析方法を用い,予測モデルの構築を試みた。分類精度の低さなどから,発達障害を抱えた学生の早期発見に繋がっていないことが考えられたため,今後は,発達障害傾向をスクリーニングする項目を加えることも検討に加える。なお,1つめの結果については国際学会にて発表し,2の結果については,平成30年度の学会で報告する予定であり,その後論文にまとめる予定である。今後の研究では,面談で得られた情報とUPIデータの両方を使った分析を進めていく。さらに,情報共有体制について検討していく予定である。UPIデータを使用し,さらにデータの数を増やすことでスクリーニングシステムの精度を上げたいと考えたため,これまでのデータの整理や,新たな項目の調整に時間を要した。

今後の研究では,大学内でどのように情報共有をするのか,その体制についても検討していく予定である。情報を必要としている部局は学科に留まらないが,方法によっては学生に対する先入観や偏見を与えることにも繋がってしまうことが懸念されるため,学生相談の教職員とも連携し,丁寧に検討していきたい。予測の精度が不十分だと考えられたため,データの項目数を増やし整理が必要だったこと,さらに分析を加えることに時間を要したため。次年度には,発達障害の傾向をもつ学生をスクリーニングできるよう,これまでのデータに新たな項目を加えたスクリーニングシステムの開発と分析を進める。さらに,面談で得られた学生のテキストデータを用いて,テキストマイニングによる傾向の分析を進めていきたい。その結果の精度や数値をもとに,情報共有体制について検討する予定である。今後は,発達障害傾向の学生をスクリーニングできるよう精度を上げていきたい。情報共有する教職員は,発達障害に詳しくない人もいるため,どのような表現で教職員間で情報共有するのか,学生に対する偏見や誤解のないように丁寧に検討を進めていきたい。その際に,他の事例も参考にしていく予定である。データ処理と分析が遅れたことにより,未使用額が生じた。今年度,引き続きデータ処理にかかるアルバイト謝金や,出張旅費に使用する予定である。分析の遅れと国際学会への参加が叶わなかったため,未使用額が生じた。
気道上皮細胞の分化誘導法の確立

ヒトiPS細胞から肺上皮細胞への分化誘導を試みるため、阻害剤・増殖因子・ディッシュコーティングの条件検討を行った。TTF-1・TAZ・FOXA2遺伝子を発現するエピソーマルベクターを作成し、iPS細胞および皮膚線維芽細胞に対して、エレクトロポレーションによる遺伝子導入を行った。肺上皮細胞マーカーの発現上昇をqRT-PCRで確認し、さらに電子顕微鏡で細胞の形態観察も行った。前年度に引き続き、多能性幹細胞からの気道上皮細胞の分化誘導法の確立を目指し、培養条件の検討を行った。まずマウスES細胞株EB5を用いて実験を進めた。レトロウイルスによる遺伝子導入を試み、FACS解析により約30%の導入効率が得られたが、発現レベルは低かった。次に胚様体形成(hanging drop法あるいはペトリ皿上での浮遊培養)あるいは平面培養によって分化を促し、さらにactivin刺激による内胚葉系細胞の誘導を試みた。さらに気道上皮用の培養条件も組み合わせた。過去の文献を参考にして、TGF-beta阻害剤(LY364947)・BMP阻害剤(dorsomorphin)・BMP4・FGF2刺激などを組み合わせて、培養条件の最適化を試みた。内胚葉系細胞および気道上皮細胞のマーカーとしてFOXA2およびTTF-1を指標としたが、コントロールとして用いたマウス気道上皮細胞MLE12と比較して、その発現レベルは低いレベルにとどまった。これらの結果より、将来的な応用を考えるとヒトiPS細胞を用いた実験にシフトする方が有望と判断した。まずはヒト皮膚線維芽細胞株NR1RGBからのiPS細胞の作出を試みた。addgeneよりiPS細胞誘導因子を組み込んだプラスミドを入手した(Oct3/4、L-Myc、Lin28、shp53、KLF4、SOX2)。エレクトロポレーションによる遺伝子導入の最適化を行い、形態的にiPSに類似した細胞コロニーの作出に成功した。さらにアルカリフォスファターゼ染色や、未分化マーカーの発現確認(SSEA4、TRA60、TRA81)、免疫不全マウスへの移植による奇形腫形成によって未分化性・多分化能を確認し、iPS細胞であると判断した。奇形腫の中に気道上皮と思われる繊毛上皮組織を確認した。現在はヒトiPS細胞からの気道上皮細胞の誘導を目指して条件検討を行っている。1.CCDカメラを購入し、ウェスタンブロット・ゲルシフトアッセイ・サイトカインアレイに活用できた。2.統合的なトランスクリプトーム解析により、ヒト肺上皮細胞の上皮間葉転換を制御しうるmiRNA・遺伝子群を抽出した。パスウェイ解析・Gene Ontology解析・GSEA・クラスタリングなどのin silico解析も行った。3.アデノウイルス・レトロウイルス・レンチウイルスの発現ベクターを作成し、GFP発現をフローサイトメーターで検出して遺伝子導入効率の検定を行った。マウスES細胞・肺上皮細胞にはレトロウイルスが、ヒトiPS細胞・肺上皮細胞・線維芽細胞にはレンチウイルスが有効であることが確認できた。TGF-betaに対する人工的miRNAの発現システムを構築し、三次元共培養での効果を検証した。エレクトロポレーションの条件検討も行った。TTF-1、TAZ、FOXA2遺伝子のクローニングを行って発現ベクターを作成した。4.ヒト皮膚線維芽細胞からiPS細胞を作出した。Oct-4などの未分化マーカーの発現をqRT-PCRで確認し、SSEA4などの表面抗原を蛍光免疫染色で確認した。ゲノムPCRによりベクター配列が染色体に組み込まれていないことも確認した。多分化能の検定として、ヌードマウスでの奇形腫形成を行い、三胚葉系組織への分化を認めた。5.iPS細胞から肺上皮細胞への分化誘導を試みるため、阻害剤・増殖因子・ディッシュコーティングの条件検討を行い、さらにメチル化阻害剤、HDAC阻害剤の効果も検証した。ヒトiPS細胞およびヒト皮膚線維芽細胞に、エピソーマルベクターを用いてTTF-1・TAZ・FoxA2遺伝子を導入し、さらに肺上皮細胞用の培地で培養を行った。肺上皮細胞マーカーの発現上昇をqRT-PCRで確認でき、さらに電子顕微鏡で細胞の形態観察も行った。多能性幹細胞からの気道上皮細胞の分化誘導系の確立を目指し、その前段階として下記の予備実験を行った。(1)増殖因子・サイトカインによって惹起される気道上皮細胞の遺伝子発現の網羅的解析、(2)気道上皮細胞への遺伝子導入法の確立、(3)細胞分化・遺伝子発現プロファイルに影響を与えうるマイクロRNAの網羅的な発現解析、(4)マイクロRNAの導入法の確立、である。(1)に関しては、ヒト肺胞上皮細胞を用い、代表的な増殖因子・サイトカインであるTGF-betaおよびTNF-alpha刺激による網羅的な遺伝子発現解析(マイクロアレイ)を行った。この刺激により、増殖因子・ケモカイン・サイトカイン・細胞接着分子・細胞外器質・プロテアーゼ・プロテアーゼインヒビターの発現変化を確認した。さらにサイトカインアレイを用い、液性因子の蛋白レベルでの発現変化も確認した。

(2)に関して、マウス気道上皮細胞へのレトロウイルスを用いた遺伝子導入を行い、高効率での遺伝子導入をFACSによるGFP発色の検出により確認した。さらにヒト肺胞上皮細胞に対してレンチウイルスを用いた高効率での遺伝子導入法を確立した。(3)に関して、ヒト肺胞上皮細胞において、TGF-betaおよびTNF-alpha刺激による網羅的なマイクロRNA発現解析を行い、miR-23aをはじめとする複数の標的マイクロRNAを同定した。(4)に関して、レンチウイルスを用いたマイクロRNAの導入系を確立し、高い導入効率を、FACSを用いたGFP発色の検出により確認した。本研究費によりケミルミ撮影装置を購入した。これにより、ウエスタンブロット・サイトカインアレイ・ゲルシフトアッセイなどの実験系が確立された。さらに分化誘導法に役立つと考えている三次元共培養系の構築にも成功した。マウスES細胞株を用いた実験を繰り返し、期待通りの結果を得られなかった。ヒトiPS細胞の遺伝子導入の条件検討に多くの労力を必要とした。気道上皮細胞の細胞応答、特徴的な遺伝子発現プロファイル・マイクロRNA発現変化を捉えることができ、これらの知見は細胞の分化誘導法の樹立に役立つものと考えている。効率的な遺伝子導入手法を確立することができ、転写因子TTF-1など分化誘導に必須の遺伝子発現ベクターを調整することもできた。ヒトiPS細胞からの気道上皮細胞の分化誘導の条件検討を行う。iPS細胞および、分化誘導をさせた細胞への遺伝子導入手法が確立されつつあり、気道上皮細胞のマスター転写因子であるTTF-1を発現させる方法を検討している。多能性幹細胞(ヒトiPS細胞やマウスES細胞)を実験対象として、確立された遺伝子導入法を活用して分化誘導条件の検討を行っていく。この実験を進めていく過程で、気道上皮細胞の細胞応答に重要と考えられる遺伝子、増殖因子やサイトカイン、マイクロRNAなどの効果を検証していく。さらに確立された三次元共培養システムの効果も検討する。ヒトiPS細胞、よび分化細胞の細胞培養に必要となる細胞培養関連備品、培養液、増殖因子の購入に充てる。多能性幹細胞(ヒトiPS細胞やマウスES細胞)の細胞培養に必要となる細胞培養関連備品、培養液、増殖因子などの刺激因子の購入に充てる。