hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
HIV感染による宿主側免疫機構の破綻とその制御

HIV感染によるサイトカインの動態は複雑であるが、AIDSに進展する病態ではTh1型反応の障害が関連すると考えられている。本年度はTh1型細胞に特異的に発現するTecファミリーのチロシンリン酸化蛋白Txkに着目し、Th1型細胞の活性化経路におけるTxkの役割を解析した。ウエスタンブロッティング法によりリンパ球サブセットにおけるTxkの発現を検討すると、リンパ球系腫瘍細胞株、末梢血リンパ球いずれにおいてもT細胞系にのみTxkの発現を認めた。末梢血リンパ球より樹立した抗原特異的T細胞株のTxkの発現は、Thl型細胞で陽性、Th2型細胞で陰性であった。Jurkat細胞にTxk発現ベクターpME18S-Txkをトランスフェクトすると、Txk蛋白の発現が著明に増加した。このトランスフェクタントをPHA+PMAで刺激すると、IFN-γ産生の著しい増加が観察されたが、IL-2,IL-4の産生には全く影響を与えなかった。さらにTxkアンチセンスのサイトカイン産生に及ぼす影響を検討した。末梢血T細胞にTxkアンチセンスを添加すると、48時間後にはTxk蛋白の発現は著明に減弱した。このアンチセンス存在下で、PHA刺激末梢血リンパ球によるIFN-γの産生は抑制されたが、IL-4の産生には影響がなかった。また、抗原特異的T細胞株に対してもTh1,Th0型によるIFN-γの産生は選択的に抑制されたが、Th0型によるIL-4産生には影響がなかった。これらの成績はTxkがTh1型サイトカインの産生機序に関与することを示している。次にT細胞でのTxk発現に対するサイトカインの影響を検討した。末梢血T細胞にIL-2を添加してもTxkの発現は変化しなかったが、Th1型細胞の分化を誘導するIL-12により増強し、Th2型細胞の分化を誘導するIL-4により抑制された。またJurkat細胞株をPHAで刺激すると、1時間後にTxkの細胞質内から核内への移行が確認された。Txkは核移行シグナルと考えられる構造をもつことを考え併せると、Txkはリン酸化蛋白としてだけでなく転写因子としても機能している可能性が考えられた。以上の成績より、TxkはTh1型細胞の分化と関連し、Th1型サイトカインの産生を誘導するチロシンキナーゼ活性を持つ転写因子として機能していると考えられた。今後、HIVにおける複雑なサイトカインネットワークをTxkを中心にした単純なネットワークに置き換え、Txk発現系修飾によるHIV感染症の治療に応用すべく検討を続ける予定である。
有価物生産のための複合微生物高度制御化と機能解析基盤技術の開発

本研究では,複合微生物系を用いた発酵(メタ発酵)による高効率乳酸生産プロセスの開発および複合微生物群集構造の網羅的解析・機能解析を目的としている.平成29年度に実施した主な研究内容は下記の通りである。1.分離微生物群を用いたメタ発酵プロセスの開発平成28年度に分離に成功した細菌株を用いて,未糖化の標準モデル生ゴミ培地を用いて,pH振動制御下,温度50°Cでメタ発酵におよぼす種菌の影響を検討した.主要乳酸生産細菌と予測されたBacillus coagulans分離細菌株をそれぞれ単一で純粋発酵しても既報よりも乳酸生産濃度が3分の1程度であった.ところが,他のBacillus種とメタ発酵を行った結果,乳酸生産濃度が向上し,既報と同等の乳酸を生産できる株を決定した.よって,糖化工程を省略した効率的なメタ発酵プロセスの構築に成功した.2.種々の複合微生物種菌を用いたメタ発酵と微生物群集構造解析平成28年度には,1種類の堆肥を複合種菌として用いたメタ発酵プロセスを開発したが,本項では,他2種類の堆肥をそれぞれ用いたメタ発酵を検討した.未殺菌の標準モデル生ゴミ培地を用いて,pH振動制御下,温度を30-65°Cでメタ発酵を行った.その結果,種菌によって最大乳酸生産濃度を示す最適温度が異なったが,いずれの場合も最適温度でL-乳酸光学純度100%を達成した.さらに,発酵中の細菌群集構造を解析したところ,Bacillus coagulans種が主要乳酸生産菌であると推測したが,他の菌種も乳酸生産に寄与している可能性が示唆された.平成29年度に実施して上記で述べた研究概要は、すでに学会発表を済ませ,現在,論文投稿準備中であり、学術面からも優れた研究成果である。申請した研究方針に従い、今後は1次世代シーケンサーによる種々のメタ発酵プロセスの細菌群集構造解析、2次世代シーケンサーによる種々のメタ発酵プロセスにおける機能解析、を行う。本研究では,複合微生物系を用いた発酵(メタ発酵)による高効率乳酸生産プロセスの開発および複合微生物群集構造の網羅的解析・機能解析を目的としている.平成28年度に実施した主な研究内容は下記の通りである。1.新規なpH制御法による生ゴミからの乳酸生産プロセスの効率化コンポストを種菌として,標準モデル生ゴミ培地を用いて,殺菌の有無,かくはん,pH制御法について温度50°Cでメタ発酵におよぼす影響を検討した.本メタ発酵では,非殺菌でも乳酸を生産することが可能であり,コストの削減が期待される.また,発酵中のかくはんにより発酵速度が向上した.さらに,単一微生物による発酵で効果的なpH一定制御法はメタ発酵では,有効ではなく,振動制御から一定制御へのpH切替法を初めて考案し,メタ発酵によるL-乳酸生産(光学純度100%)の高効率化に成功した.2.体系的フィードバック分離法の開発とメタ発酵中の主要細菌の分離標的細菌分離に関する元来の2つの課題(固体培地を用いた低コロニー形成率および多数のコロニーからの標的微生物選抜の長期化)を克服するために,体系的フィードバック分離法の開発に取り組んだ.すなわち,文献情報より標的細菌の培養条件を設定して,固体培地のコロニー形成率を向上した.さらに,分離コロニーをDirectコロニーMALDI-TOF MS法に供し,MSスペクトルを標的細菌類縁標準株と比較することにより,迅速に標的コロニーを選抜することができた.開発した体系的フィードバック分離法を用いて,メタ発酵中の主要細菌6種のうち,3種の標的細菌および3種の類縁菌を分離することに成功した.平成28年度に実施して上記で述べた研究概要は、すでに学会発表および論文発表を済ましており、学術面からも優れた研究成果である。

申請した研究方針に従い、今後は1様々な複合微生物種菌を用いたメタ発酵プロセスの開発、2種々のメタ発酵プロセスにおける細菌群集構造解析、3分離主要菌を用いたメタ発酵プロセスの再構成、を行う。申請した研究方針に従い、今後は1次世代シーケンサーによる種々のメタ発酵プロセスの細菌群集構造解析、2次世代シーケンサーによる種々のメタ発酵プロセスにおける機能解析、を行う。
細胞核内アクチンの人為的操作に基づく遺伝子初期化機構の理解と制御技術基盤の創出

本研究では、人為的に形成した核内アクチン繊維がクロマチンと相互作用すること、また核内アクチン繊維の形成によって、Wnt/beta-cateninシグナルにも影響を及ぼすことを見出した。Wnt/beta-cateninシグナルは遺伝子初期化や細胞分化にも重要な役割を果たすことが知られているが、本研究において、遺伝子初期化に重要なOCT4遺伝子の発現が核内アクチン繊維によって制御されていることが示された。さらにG-アクチンあるいはF-アクチンに結合するbicyclic peptideをスクリーニングによって得て、これらが細胞核のアクチンフィラメントの人為制御に利用できる可能性を示した。エピジェネティック制御による遺伝子発現の分子基盤として、クロマチンの構造とクロマチン核内空間配置が知られている。たとえば、遺伝子初期化による分化多能性獲得には、核内のアクチン繊維の形成が必要であることも報告されている。これまでに我々は、核内にアクチン繊維を人為的に誘導することができることを見出した。さらに、OCT4などの転写因子の発現に、核内のアクチン繊維形成が関与していることを見いたしている。これらの結果は、核内アクチンの人為的な形成が、遺伝子初期化機構の理解に有用であると同時に、核内アクチン形成を制御することによってその機構を人為的に制御できる可能性を示唆している。当該年度は、まず、核内のアクチン繊維を人為的に操作する方法の確立を目指した。その結果、変異型アクチンを利用することにより、異なった程度の核内アクチン繊維を人為的に形成することに成功した。さらに、この実験系を用いて、核内アクチン繊維が、遺伝子発現やシグナル伝達に及ぼす影響について解析を行った。その結果、核内のアクチン繊維がクロマチンと相互作用すること、また核内アクチン繊維の形成によって、Wnt/beta-cateninシグナル伝達にも影響を及ぼすことが見出された。Wnt/beta-cateninシグナルは、遺伝子初期化や細胞分化にも重要な役割を果たすことが知られている。本研究の結果は、遺伝子初期化機構の新しいメカニズムの解明につながると共に、その操作についても新しい知見を与えるものである。細胞核内に人為的にアクチン繊維を形成する実験系を確立した。さらに、この実験系を用いて、核内アクチン繊維が、クロマチン構造形成のみでなく、シグナル伝達にも関与することを示すことができた。クロマチンの構造と核内空間配置により、真核生物の遺伝子発現はエピジェネティック制御を受けている。これまでの申請者の研究から、核内に形成されるアクチンフィラメントが、クロマチンの細胞核内空間配置に関与することが示されている。またこれまでに、細胞の遺伝子初期化による分化多能性獲得の過程で、核内にアクチンフィラメントが形成されることも観察されている。そこで本研究では、核内のアクチンフィラメント形成を人為的に奏さすある方法の確立を目指し、またこのアクチンフィラメントによる遺伝子発現や遺伝子初期化への影響を解析した。G-アクチンあるいはF-アクチンに結合して、核内のアクチンフィラメント形成を制御できる可能性のあるbicyclic peptideをスクリーニングしたところ、多くの候補配列を得ることができた。これらの候補について順次解析を行なっているが、少なくとも複数のbicyclic peptideが、細胞核のアクチンフィラメントの形成や機能に影響を及ぼす可能性が示唆されている。また、細胞核内にアクチンフィラメントが遺伝子発現に与える影響を解析したところ、Wntシグナルのco-factorであるbeta-cateninの細胞内局在性やクロマチン結合において、核内アクチンフィラメントが大きな影響を与えることが示された。さらに、核内のアクチンフィラメントとクロマチンの相互作用が、クロマチン免疫沈降法によって示された。今後は、得られたbicyclic peptideを細胞に導入することで、同様の解析を進める。核内にアクチン繊維を形成することにより、遺伝子初期化に関わる遺伝子の発現を制御できる可能性が示されている。真核生物の遺伝子の機能は、クロマチンの構造およびその核内での空間配置によって制御されている。これまでに、細胞の遺伝子初期化による分化多能性獲得の過程で、核内にアクチン繊維(F-アクチン)が形成されることが観察されている。我々は、核内アクチン繊維を人為的に形成することによって、核内アクチン繊維がエピジェネティクスの制御に関与することを見出した。また、核内のアクチン繊維が、OCT4などの初期化因子の発現制御に関与することも示している。本研究では、核内アクチン繊維の形成を、アクチン結合タンパク質やアクチン結合ペプチドの用いて調節することで、エピジェネティクスを人為的に制御することを目的とした。目的タンパク質に高親和結合する二重環状ペプチド(bicyclic peptide)に注目し、G-actinおよびF-actinに特異的に結合するペプチドのスクリーニングを行った。その結果、性質の異なる複数の二重環状ペプチドを得ることができた。これらの二重環状ペプチドの結合特性をin vitroの実験系で検証すると共に、これらを生細胞内に導入することでアクチン機能への影響を解析した。その結果、これらの二重環状ペプチドのうちのいくつかが、細胞質および細胞核においてアクチン機能を阻害することが示された。この結果は、二重環状ペプチドを用いて、細胞内および細胞核内のアクチン機能を制御できる可能性を示すものであり、今後さらにこの二重環状ペプチドによるエピジェネティクスの人為制御に向けた解析を続ける予定である。Wnt/beta-

cateninシグナルは遺伝子初期化や細胞分化にも重要な役割を果たすことが知られているが、本研究において、遺伝子初期化に重要なOCT4遺伝子の発現が核内アクチン繊維によって制御されていることが示された。さらにG-アクチンあるいはF-アクチンに結合するbicyclic peptideをスクリーニングによって得て、これらが細胞核のアクチンフィラメントの人為制御に利用できる可能性を示した。本研究によって確立した、細胞核内に人為的にアクチン繊維を形成する実験系を用いて、遺伝子初期化機構の一端を明らかにすることを目指すと共に、この実験系を、再生医療などに応用する基盤の確立を目指す。細胞核内のアクチン繊維形成を制御できる可能性のある複数のbicyclic peptideがスクリーニングされており、これらの特性や有用性などについてもさらに解析を進める。分子細胞生物学細胞核内のアクチンフィラメントがシグナル伝達に関与するという新たな発見があった。そのため、遺伝子発現解析の一部を翌年に実施することとし、その経費が未使用となった。細胞核内のアクチン繊維形成に利用できる可能性のある多くのbicyclic peptideが得られた。予想よりも多様な性質を示すbicyclic peptideが得られ、その条件検討などに時間を要し、bicyclic peptideの解析するための期間が延長されたため。当該年度の未使用額については、すべて物品費として使用し、翌年に実施することとなった遺伝子発現解析を行う。次年度使用額の全額を、物品費(酵素試薬類、および細胞培養試薬類)に用いる。
精子形成の品質保証とluminal flowによる精上皮クリアランス機構

哺乳類の精巣の曲精細管(精子形成の場)では管腔液の流れ「luminal flow」により微細環境が維持されていると想定される。本研究は、このluminal flowに焦点を当て、人為的に破壊、再構築したluminal flow変異マウスを作出し、高品質な精巣の精子形成を支える微細環境での組織液の流れの重要性とそのによるクリアランス能の実態を解明する。
完全埋め込み型人工心臓の駆動を目的とした骨格筋リニアー型アクチュエーターの開発

本研究は人工心臓駆動を目的とした骨格筋リニアー型アクチュエーターの試作開発および模擬循環回路内や動物の胸壁装着下での駆動性能を耐疲労性誘導筋で評価した。既に基礎実験で用いたプレート型筋力変換装置をベローズ型筋力変換措置(I型)に改良して、直線牽引力による人工心臓駆動を行った。I型は直径7cmのベローズを10cmX10cmの平板に固定して雑種成犬の広背筋と胸壁から15cm離して設置した。I型装置はヒト用人工心臓(1回拍出量70ml)と連結させた。ついで胸壁固定可能な大きさで1回拍出量が30mlの犬用人工心臓を駆動すべくベローズ型筋力変換装置(II型)を試作した。大きさは体重20Kg前後の成犬での胸壁固定を目的に紡錐形(完全埋め込み式ではない)の装置とし、広背筋は上腕骨起始側を剥離して胸背動静脈、神経を温存、さらに肋間動脈からの側副血行を完全に温存した。広背筋の直線牽引力が最大に得られるようにII型装置は第一肋骨にワイヤーで固定した。模擬循環回路内での駆動実験ではI型装置は後負荷80mmHgに対して1回拍出量(SV)58ml(83% stroke)、人工心臓拍出量(PF)3.8L/min、1回拍出仕事量(SW)8.5X10^6ergが得られた。しかし、100mmHgの後負荷では1回拍出量や総ポンプ流量は20%以下に減少した。II型装置は後負荷80mmHgでSV23ml(75% stroke)、PF1.81/minが得られた。ポンプ拍出出力は後負荷80mmHgでは骨格筋重量に換算するとI型装置2W/kg、II型装置0.9W/kgであった。これらの実験結果から出力不足のため当初予定していた左心補助実験を中止し右心補助実験のみ行った。耐疲労性を誘導しなかった広背筋を用いて胸壁固定したII型装置で30mlの人工心臓(右房脱血、肺動脈送血)を駆動したところ、肺動脈圧は60%上昇しポンプ流量は1.75l/minが得られ、成犬の広背筋によるII型装置を介した人工心臓駆動右心補助に成功した。本研究により人工心臓駆動に骨格筋の利用は可能であったが、左心補助には更に研究が必要である。
貿易協定における労働条項の労働条件への効果と貿易への影響に関する研究

本研究は、貿易協定における労働条項の協定締約国における労働基準・労働条件の維持・改善効果ならびに貿易協定に期待される貿易促進効果への影響の有無について理論および実証の両面から経済学的分析を行うことを目的として実施されている。研究の2年目となる平成30年度においては、研究代表者であるわたしは、前年度から予備的分析を進めてきた労働条項が協定締約国の国内労働基準や労働条件にもたらす効果に関する実証分析につき、現時点での成果を国際学会や海外研究機関でのセミナーを含む計4件の学会・研究会で発表するとともに、中間成果を論文にまとめジェトロ・アジア経済研究所のディスカッションペーパーとして公表した。また、本分析のために独自に作成している地域貿易協定の労働条項に関するデータベースを拡充すべく近年新たに締結された地域貿易協定の労働条項に関する追加調査を行うとともに、学会報告等を通じて得たフィードバックをもとに分析手法改善方策の検討を進め、分析の精緻化の準備を進めた。また、労働条項の有無が地域貿易協定の貿易促進効果に及ぼす影響に関する実証分析については、研究分担者である神事が中心となり、マクロレベル・データによる推定を行うべく分析に用いるデータの整備と推定方法の検討および関連する先行研究の調査を行い、これらを踏まえて予備的分析を実施した。さらに、本研究の理論分析に関しては、研究分担者である佐藤が中心となり、貿易協定に労働条項を含めることが協定の成立可能性や関税に与える影響という観点からモデル構築を進めた。また、佐藤が客員研究員として滞在した米国スタンフォード大学アジア太平洋研究センターにおいて、関連する研究の成果についての講演も実施した。まず、貿易協定の労働条項の協定締約国国内労働基準・労働条件への効果に関するマクロレベル・データ実証分析については、前年度の予備的分析および中間成果の学会等での対外報告の進捗を活かして、当平成30年度には、独自作成している地域貿易協定の労働条項データベースの拡充・更新の実施や(これについてはリサーチ・アシスタントの雇用を通じ効率的な作業ができた)、分析手法における課題の洗い出しと改善方策の検討を進めることで、分析の精緻化に向けて準備を整えることができた。また、中間段階ではあるが現時点での成果については論文にとりまとめ、ディスカッションペーパーとして公表することができた。次に、労働条項の存在が貿易協定の貿易促進効果に及ぼす影響に関する実証分析については、世界各国の2国間貿易および貿易協定の締結状況と性質分類に関する大量のデータの効率的な収集とデータセット化を通じて、予備的分析に着手するとともにその結果に関する担当研究者間での検討・議論も進めることができた。加えて、理論分析に関しては、労働条項の存在が貿易協定の交渉にもたらす影響(協定成立可能性)および協定内容に及ぼす影響(関税)の2側面からの分析という当初計画における方針を維持しつつ、具体的な理論モデル構築に着手し、モデル内容に関する議論と検討を進めることができた。なお、実証分析の1つとして計画した事例研究アプローチについては、当年度は事例割り出しのための予備調査を行ったが、その結果ケーススタディに耐え得るような貿易協定の労働条項発動事例およびそれに関する入手可能な情報が十分でないことが判明したため、今後の分析アプローチの調整を図る考えである。本研究の実証分析については、貿易協定の労働条項の国内労働条件への影響に関する分析については当平成30年度に実施した準備作業(データベース拡張・更新と分析手法改善策検討)を踏まえ分析の精緻化を試みるとともに、労働条項による協定の貿易促進効果への影響に関する分析については当年度に行った予備的分析を踏まえてマクロレベル・データによる推定と結果の分析を進める。本研究の理論分析については、当年度に構築したモデルをもとに、労働条項による貿易協定の成立可能性への影響に加え、労働条項が貿易自由化スケジュール(対象範囲や譲許程度)に影響する可能性について理論的な検討を試みる。また、それぞれの成果についての論文執筆を進めていきたい。本研究では研究代表者と2名の研究分担者のチームによる取組みとなるところ、前年度と同様に3者が互いに遠隔地を拠点としているため、研究者間の連携・共働を密にすることが重要である。当平成30年度には研究者間の対面打合せやミーティングを頻繁に設けたことが研究の推進に繋がったと考えており、今後も積極的にミーティングの機会を設けていきたい。また、本研究の理論分析および実証分析(特に貿易促進効果への影響推定)については、論文執筆のためのタイムリーなフィードバックを得るべく、次年度の前半あるいは可能な限り早い時期に学会等での報告を積極的に行っていく。加えて、本研究全体としての活動や成果の発表の場を設けるべく、学会における企画セッション等による報告を検討したい。なお、上記8.で述べた事例研究に対する情報制約への対応としては、分析アプローチを調整し、貿易協定における労働条項の内容に関する先行研究のサーベイを通じた比較分析として行うこととしたい。本研究は貿易協定における労働条項の協定締約国における労働基準・労働条件の維持・改善効果ならびに貿易協定に期待される貿易促進効果への影響の有無について理論および実証の両面から経済学的分析を行うことを目的として実施されている。研究の初年度となる平成29年度においては、まず実証分析について、研究代表者であるわたしは、自身が漸次整備を進めている地域貿易協定の労働条項に関するデータベースとともに当年度中に100か国超について入手・整備することができた各国の法定最低賃金とその時系列変化に関するデータを中心に用いつつ、労働条項の協定締約国内労働基準・労働条件への効果に関する計量経済学的分析の予備的分析を実施することができた。同分析においては従来の研究では指摘されてこなかった労働条項の効果を示唆する興味深い結果が得られたことを特記しておきたい。

また、同予備的分析とその結果について3件の国際学会を含む5つの学会・研究会で報告するとともに、これらを通じて内外の研究者から分析手法等に関して今後の改善に繋がる有益なフィードバックを得ることができた。さらに、同分析とその結果についての論文執筆も行うことができたが、これについては次年度半ば頃までに本研究の研究分担者が所属する研究機関のディスカッションペーパーとして発表される予定である。また、本研究の理論分析に関しては、2名の研究分担者とともに貿易協定とその交渉における労働条項の意義と影響に関する政治経済学的モデル構築のための先行研究調査に着手することができた。同調査の当年度時点での成果については、研究分担者である佐藤がシンガポールの研究機関におけるセミナー報告として発表することができた。当初計画において当年度の重点項目とした貿易協定の労働条項の協定締約国における国内労働基準・労働条件に対する効果に関するマクロレベル・データを用いた計量経済学による予備的実証分析について、100超の国について法定最低賃金とその時系列変化のデータを入手・整備し分析に用いることができたと同時に、計画初年度の予備的分析の段階で本研究の意義を強く裏づける結果を得ることができた。また同分析の国内および国際学会での発表・報告を通じて内外の研究者の意見や助言を得られたことで、分析の現状における課題と今後の改善および進展の具体的方向性について明確にすることができた。また理論分析の面については、(ア)労働条項と貿易制裁の厚生効果に関する分析および(イ)労働条項の貿易協定とその交渉に対する影響の政治経済学的分析の2側面からの分析を目指しているところ、当初計画での重点が(ア)であったのに対し実績では(イ)からの着手となった違いはあるものの、研究分担者とともに理論モデルの構築を目指した先行研究調査に着手することができた。なお、理論モデル構築のための知見を得るためこの分野の第一線の研究者と意見交換すべく平成30年1月にアメリカ経済学会に参加したが、会期中の寒波による交通混乱により出席予定者の欠席が相次ぎ、予定していた主要な面談のいくつかは果たせなかった。しかしながらそのかわり、同学会にて国際労働機関(ILO)のスタッフから同機関がごく最近まとめた貿易・投資協定と労働条項についての報告書を入手するとともに、同報告に携わったILO研究者に我々の研究を紹介し今後の意見交換を図りたい旨伝え、先方の主たる研究者のコンタクト情報を得ることができた。本研究は、貿易協定における労働条項の協定締約国における労働基準・労働条件の維持・改善効果ならびに貿易協定に期待される貿易促進効果への影響の有無について理論および実証の両面から経済学的分析を行うことを目的として実施されている。
臨床応用を目的とした膵癌におけるＬｉｐｏｃａｌｉｎ－２の分子生物学的役割の検討

膵癌ではMoniaux N et al.が免疫染色により,早期膵癌でLcn2発現が増強され,進行膵癌では発現が減弱すること(early biomarker)を報告している.今回のわれわれの報告は, Lcn2の発現が減弱する進行癌では,血管新生が亢進することを示唆するものである.Lcn2は膵癌のearly biomarkerだけでなく,新たな膵癌血管新生抑制因子としての可能性が示唆された.1.臨床検体を用いたLipocaline-2(Lcn2)発現の検討.当科での手術症例の臨床検体を用いてLcn2の免疫染色を行った.予備実験では,膵癌患者と非膵癌患者との間で有意差をもってLcn2発現が膵癌患者に多い傾向であることを確認している.2.Lcn2の分子生物学的役割の検討.膵癌細胞株をLcn2強発現株(BxPC-3およびAsPC-1: well to moderatediff.)およびLcn2弱発現株(Panc-1およびMIA PaCa-2: poorly diff.)に分類し,それぞれに対してLcn2抑制株,Lcn2強発現株を樹立した.興味深いことに,高分化で発現が強く,低分化で発現が減弱する傾向にあった.これにより,癌化初期にLcn2のタンパク発現が生じ,進行と同時に減弱することが示唆された.3.Lcn2の導入または抑制によって,癌細胞が分泌するサイトカイン発現の差異をELISAで検討した.Lcn2の強発現によって,血管新生因子VEGF発現が増強することを認めている.4.分子生物学的特長の比較検討.Lcn2の導入または抑制によって生じる細胞特徴の変化の特徴を,増殖実験(WST-1 assay),接着実験,浸潤実験,で評価検討した. Lcn2弱発現株はLcn2強発現株に比べて,増殖,接着,および浸潤能が亢進している傾向を認めた.Lcn2弱発現株はLcn2強発現株に比べてVEGF発現が少なく,in vitroの血管新生実験でもLcn2弱発現株は血管新生能が亢進していた.以上により,膵癌初期にLcn2の発現が多く,これが膵癌血管新生に抑制的に作用しているが,Lcn2の発現が減弱する進行癌では,血管新生が亢進し,さらに腫瘍増殖が付随して亢進することが示唆された.今後はin vivoでの実験を行い,Lcn2と膵癌血管新生の関連を検討していく予定である.膵癌ではMoniaux N et al.が免疫染色により,早期膵癌でLcn2発現が増強すること(early biomarker)を報告している.膵癌の新しいbiomarkerとなりうるか,臨床検体(膵液)を採取して検討した.これは研究協力者であるMD Anderson CancerCenterのSushovan Guhaと協力して行った.正常膵(NL)21症例,慢性膵炎(CP)23症例,膵癌(PC)52症例の合計96症例の膵液中のLcn2とMMP-9/Lcn2 complexの濃度を測定した.Lcn2のレベルは、CP群とNL群(p values=0.0041)、PC群とNL群(p values=0.0035)で有意な差を認めた。CP群とPC群については、PC群でLcn2が高い傾向があった(p values=0.0816).MMP-9/Lcn2 Complexのレベルは、PC群とNL群で有意な差を認めたが(p values=0.0004)CP群とPC群の間には、有意差は得られなかった.Lcn2のレベルは、慢性膵炎および膵癌の存在を検出するのに役立つ可能性が示唆された.一方で,Lcn2は早期で発現が増強し,進行すると減弱すると報告されている(Moniaux N et al).われわれは以前から膵癌血管新生に着目しており,Lcn2の血管新生への関与を検討した. Lcn2の強制発現により膵癌からのVEGF分泌の低下を認めた.これは,膵癌では,進行とともにLcn2の発現が低下し,その結果腫瘍血管新生の亢進が起こり,腫瘍増殖を亢進する可能性が示唆された.以上より,膵癌においては,Lcn2はbiomarkerと抗血管新生作用の働きがあり,これらの解明が膵癌の診断,治療へと応用される可能性が示唆された.膵癌ではMoniaux N et al.が免疫染色により,早期膵癌でLcn2発現が増強され,進行膵癌では発現が減弱すること(early biomarker)を報告している.今回のわれわれの報告は, Lcn2の発現が減弱する進行癌では,血管新生が亢進することを示唆するものである.Lcn2は膵癌のearly biomarkerだけでなく,新たな膵癌血管新生抑制因子としての可能性が示唆された.(1)臨床検体を用いたLipocaline-2(Lcn2)発現の検討.当科での手術症例の臨床検体を用いてLcn2の免疫染色を行った.予備実験では,膵癌患者と非膵癌患者との間で有意差をもってLcn2発現が膵癌患者に多い傾向であることを確認している.今後,症例数を増やしてさらに検討する予定である.(2)Lcn2の分子生物学的役割の検討.膵癌細胞株をLcn2強発現株(BxPC-3およびAsPC-1: well to moderatediff.)およびLcn2弱発現株(Panc-1およびMIA PaCa-2: poorly diff.)に分類し,それぞれに対してLcn2抑制株,Lcn2強発現株を樹立した.

興味深いことに,高分化で発現が強く,低分化で発現が減弱する傾向にあった.(3)Lcn2の導入または抑制によって,癌細胞が分泌するサイトカイン発現の差異をELISAで検討した.Lcn2の強発現によって,血管新生因子VEGF発現が増強することを認めている.今後,DNA micro arrayおよびcytokine arrayによって他のサイトカイン発現の変化も検討する予定である.(4)分子生物学的特長の比較検討.Lcn2の導入または抑制によって生じる細胞特徴の変化の特徴を,増殖実験(WST-1 assay),接着実験,浸潤実験,で評価検討した.Lcn2強発現株は,Lcn2弱発現株に比べて,増殖,接着,および浸潤能が亢進している傾向を認めた.今後は,Lcn2の下流のシグナルを検討し,その分子生物学的特徴を解明していく予定である.また,血管新生実験を行い,続いてin vivo実験へと進めていく予定である.In vivoモデルは,膵癌同所移植モデルを用いる予定である.Lcn2の発現を膵癌細胞株および臨床検体で確認できており,その分子生物学的役割も解明しつつある.早期膵癌のマーカーとしてだけでなく,新規の抗血管新生薬としての働きも期待できる.Lipocaline-2が膵癌で発現している傾向が高いことを臨床検体を用いて確認できており,その分子生物学的役割も確認できつつある.今後はこれをin vivoに発展させていく予定である.in vivo実験で,Lcn-2の発現により腫瘍が大きくなることを確認する予定である.また,これらの組織を用いて免疫染色を行い,Lcn-2の腫瘍増大効果のメカニズムを検討する予定である.in vivo実験で,Lcn-2の発現により腫瘍が大きくなることを確認する予定である.また,これらの組織を用いて免疫染色を行い,Lcn-2の腫瘍増大効果のメカニズムを検討する予定である.3CD31染色(松尾洋一,高橋広城)同様にFFPE切片を抗CD31抗体で免疫染色し,micro vessel densityを計測する.これにより両群間で血管新生能を比較検討する.4Lcn2経口投与または腹腔内投与モデル(in vivo)(松尾洋一,竹山廣光)recombinant Lcn2を経口または腹腔内投与を作成する.これにより腫瘍抑制効果および抗血管新生効果の有無を検討する.
中耳真珠腫の成因と病態に関する研究

真珠腫上皮の中耳腔内進展メカニズムについて不明な点が多い。そのメカニズムを解明する為、細胞培養法を用て実験を行った。真珠腫由来の表皮細胞(CH-Ep)は、線維芽様細胞(CH-Fi)から得た使用済培養液(10%濃度)を添加する事により、CH-Epの分裂・増殖が促進された。この測定は【^3H】-tymidine、【^3H】-prolinの細胞内への取り込みを指標とした。さらにこの作用は胎児鼓膜の表皮細胞(F-Ep)の分裂・増殖にも効果がある。しかし逆に胎児鼓膜線維細胞(F-Fi)の使用済培養液は各々の表皮細胞には何ら作用しなかった。次に炎症下のモデル実験として、CH-Ep、F-EpにE-coliのendotoxin(LPS)を100μg/ml100pg/mlの各濃度で6時間培養液中に添加した。結果はCH-Ep、F-EpともにDNA、蛋白合成能は変化を示さなかった。さらにLPS1Mg/mlを172時間作用させてもDNA・蛋白合成能に変化は認めなかった。この事実からLPSは表皮細胞には作用しない事が判明した。一方CH-FiにLPS100μg/ml50pg/mlを216時間に渡って作用させると50μg/mlをピークに濃度匂配を示しつつDNA、蛋白合成が促進され、形態的にもmicrovilliの著しい形成、細胞小器官の発達が認められた。そこでCH-FiにLPS50μg/mlを添加し、CH-Fiを刺激して得られる使用剤培養液は、非添加例に比べより著しいCH-Epの分裂、増殖をもたらした。これは電顕的にも形態変化として観察された。しかし対照のF-FiにLPSを添加してもF-Epには何ら変化は認められない。次いでゲルマンフィルターを介してCH-FiとCH-Epを培養すると対照例には認めないCH-Epの分裂増殖が観察された。以上の結果から、真珠腫表皮細胞の増殖には上皮下結合組織が関与しており、CH-FiはLPSによってCH-Epを増殖させる物質をより多く分泌する事が示唆された。又、in vitroではCH-EpとCH-Fiの細胞間直接作用も関与する事が考えられた。
ヴィマラプラバーの翻訳研究によるインド密教教義の最終形態の解明

本年度は、『カーラチャクラ・タントラ』及び、『ウィマラフラバー』の翻訳研究と平行して、特に『カーラチャクラ・タントラ』の成立に重要な影響を与えたとされる『ナーマサンギーティ』の注釈書『アムリタカニカー』のテキスト再校訂及びコンピューター入力、そして翻訳研究を行った。再校訂作業が難航し、翻訳が進まなかったため、成果を外部に発表するまで至らなかった。しかし、従来指摘されてきた『カーラチャクラ・タントラ』と『ナーマサンギーティ』の関係について、特に本初仏に関する論議があまり行われていないなど、従来指摘されていた両教典の密接な関係性について、疑問を提示する箇所がいくつか見つかっており、この点に関しては、今後なるべく早い段階で発表したいと考えている。また、本年度は『ヴィマァプラバー』が、『カーラチャクラ・タントラ』の説かれた場所であると説明するインドのアマラヴァティーの遺跡を実際に調査し、許可を得て、博物館の収蔵物を写真撮影した。遺跡から発掘された遺品には、密教に関するもの非常に少なく、また、アマラヴァティーの遺跡自体も『ヴィマラプラバー』に説かれる仏塔のイメージとはかなり異なっていることから、なぜ『ヴィマラプラバー』に説かれるアマラバディーの異名とされるダーニヤタカタの仏塔が、現存するアマラバディーの仏塔と同一のものなのか、新たな疑問が浮かび上がった。『カーラチャクラ・タントラ』(以下KT)及びその注釈書『ヴィマラプラバー』(以下VP)の翻訳研究を中心に、特に第1章「世間品」に説かれるKT独自の終末観において語られる、異教徒との最終戦争で使われる武器について考察を行った。今までKTに説かれる最終戦争というテーマに関して、注釈書であるVPは仏教教典においてふさわしくないテーマであるとして、註釈において仏教教義の一つの象徴表現として内容をすり替えることによって、戦争というテーマを避けようとする傾向があると指摘されてきた。しかし今回の研究で、VPが武器に関して非常に詳細な解説を行っていることから、VPが、必ずしも戦争というトピックに対して否定的な態度では無かったのではないかということが、明らかになった。このことに関しては、2005年10月28日に真言宗豊山派宗務所で行われた、第38回日本密教学会学術大会において「Kalacakra-tantraに説かれる最終戦争の武器」というタイトルで発表を行った。また翻訳研究にあたって、ケンブリッジ大学所蔵仏教サンスクリット写本のマイクロフィルムのうち、KT及びVPの写本のPDF化を行った。これにより、コンピューター上で影像を簡単に拡大できることから、写本校訂の効率が飛躍的に向上した。さらに、翻訳該当個所のサンスクリットテキスト及びチベット訳テキストの対照電子テキストを作成した。作成されたデータは東京大学東洋文化研究所東洋学研究情報センターデータベース、「Tibetan-Sanskrit構文対照電子辞書eDic」のデータの一部として活用されている。研究代表者は、これまで『カーラチャクラ・タントラ』(以下KT)及び、注釈書である『ヴィマラプラバー』のサンスクリットテキストとチベット語訳テキストによる翻訳研究を行ってきた。本年度は特にKTの思想基盤とされる本初仏思想に注目しつつ、翻訳研究を行った。翻訳研究を進める中で、KTにおける本初仏思想が、先行研究において指摘されているほど重要な位置を占めていないのではないかという疑問が生まれた。この点を明らかにする為、本年度は本初仏思想の基本教典であり、KTの成立に大きな影響を与えたとされている『ナーマサンギーティ』(以下NS)にも注目し、この教典の多数の注釈書の内、特にKTの思想に基づいてNSを注釈しているとされる『アムリタカニカー』の翻訳研究を行うためにネパール国立公文書館を訪れ、写本の収集を行った。同時に、NSは現在のネパール仏教においても篤い信仰を集めていることから、ネパール現地において密教僧(ヴァジュラ・アーチャールヤ)から聞き取り調査を行った。その結果、ネパールに於いては、硲は盛んに信仰されているが、KTに関しては殆ど興味を持たれていないことが解った。今後、KTとNSの関係、そしてKTにおける本初仏思想の位置づけについては再考察が必要である。また昨年度同様、翻訳研究において作成した電子テキストデータは、東京大学東洋文化研究所東洋学情報センターデータベース「Tibetan-Sanskrit構文対照電子辞書eDic」のデータの一部として活用される予定である。遺跡から発掘された遺品には、密教に関するもの

非常に少なく、また、アマラヴァティーの遺跡自体も『ヴィマラプラバー』に説かれる仏塔のイメージとはかなり異なっていることから、なぜ『ヴィマラプラバー』に説かれるアマラバディーの異名とされるダーニヤタカタの仏塔が、現存するアマラバディーの仏塔と同一のものなのか、新たな疑問が浮かび上がった。
歪みを内包する複核遷移金属フェノキシド錯体の設計と炭素―水素結合直截変換

我々は原子効率に優れた反応様式にこだわり、求核的な活性種を触媒的に系中で発生させ、単純な「水素原子の移動のみ」で新たなC-C結合を形成する直截的な分子変換プロセスの開発に取り組んでいる。その中で、2年間に渡る本研究において従前より取り組んできた複核シッフ塩基錯体の特徴を活かした各種反応開発、および、新たな求核的活性種の触媒的生成を可能にする系の探索に取り組んできた。本年度は、Rh触媒によるアリル位C-H活性化/異性化/交差アルドール反応、高原子価カチオン性コバルト錯体による求核的aryl-Co種の触媒的生成、低原子価コバルト-ヒドリド触媒による求核的alkyl-Co種の触媒的生成など様々な活性触媒種の創製に成功した。これらはそれぞれ直接的なアルドールプロセス、求電子剤との付加反応、ピリジンの直接修飾反応に適用可能であった。また、ピリジンのベンジル位のC-H官能基化についてもさらなる基質適用範囲の拡大に成功した。また、歪みを有する複核シッフ塩基錯体の反応性の拡張にも取り組み、特に第2族金属とメトキシ基を有する配位子から錯体調製を行うことで、金属と配位子がn:nの比率でオリゴマー化した活性種を生み出せることを見いだした。これを活用することで活性が低く、官能基化を触媒的に実現することが困難であったイソインドリノンのベンジル位C-H結合に関して触媒的な活性化と続くイミンとの不斉付加反応を実現することに成功した。24年度が最終年度であるため、記入しない。これまで酢酸パラジウムに代表される遷移金属カルボキシレートを活用したアリル位sp3炭素のC-H結合活性化が実現されているが、より困難なベンジル位sp3炭素のC-H結合活性化に向けて独自の「遷移金属フェノキシドの化学」に特化して研究を進めた。その際、単純な遷移金属フェノキシドではベンジル位C-H結合を活性化するための反応性が十分ではないため、「複核錯体化による歪みエネルギーの蓄積」を行い、歪みの解放をdriving forceとするベンジル位sp3炭素のC-H結合の活性化を目指すこととした。そのために、複核シッフ塩基錯体を系統的に調製し、結晶構造の決定、VCDスペクトル測定(IR領域の高感度、振動CDスペクトル)による動的挙動解明、計算化学による分析を通じて基礎情報を収集した。一方、遷移金属フェノキシドの系統的検証と並行して、ベンジル位sp3炭素のC-H結合の活性化を実現するべく、ルイス酸触媒条件下での各種、極性官能基への付加を検討した。検討の結果、エノン、α、β-不飽和N-アシルピロールへの1、4付加およびイミンへの1、2付加を効率的に促進する触媒系を見いだすことが出来た。また、複核シッフ塩基錯体をさらに発展させた第2族金属/シッフ塩基オリゴマー錯体が非常に活性が高いことを新たに見いだし、イソインドリノンのベンジル位C-H活性化とイミンへの付加が高いエナンチオ選択性にて進行することがわかった。本反応はイソインドリノンを求核剤的に触媒的活性化を行った初めての例である。当初はシッフ塩基の系統的検証を進め基礎的データを中心に集める予定であったが、それに加えてベンジル位のC-H活性化を達成し、不斉化に至るまで成功した点で当初の計画を超える成果が得られた。当初の想定以上の成果が得られてきているので、初年度の知見を踏まえ、さらに難しい不活性分子の直裁変換に取り組む。
Ｂ型肝炎症例への核酸アナログ製剤による薬剤耐性と新規治療薬の検討

B型慢性肝疾患症例に対して現在行われている核酸アナログ製剤(ラミブジン、アデホビル、エンテカビル)の効果が得られない原因にそれぞれの薬剤に対する耐性ウイルスが出現している可能性がある。そこで耐性ウイルスの頻度とタイプを調べる研究を行った。ラミブジン、アデホビルの併用療法では約6%に耐性ウイルスが認められた。(主にアデホビル耐性ウイルスであった。)また初回治療例のエンテカビルでは約1%に認められた。(エンテカビル耐性ウイルス)このような治療抵抗例にはテノホビルが効果的であり2年で87%の症例でウイルスが陰性化していた。ただしテノホビル治療でも少数例で効果が得られない症例もあった。ラミブジン治療抵抗例(耐性化例、不応例)406症例(ラミブジン治療中に血清HBV DNA量が最低値より1 logcopies/mL以上続けて上昇した症例、または、ラミブジン治療1年以降でDNA量が5 log copies/mL以上の症例)において、アデホビルとの併用療法を行った。併用療法開始時に多剤耐性ウイルス(ラミブジン+アデホビル耐性、エンテカビル耐性)を認めた症例は11例(2.7%)であった。また併用療法開始後12例(3%)でラミブジンとアデホビル両剤に対する耐性ウイルスの出現を認めた。RtA181S/Tの変異を11例に認め、rtT184IまたはrtM250Iの変異を4例に認め、rtA181TとN236Tのdouble mutationを2例に認めた。この12例中10例において併用療法開始時の血清を用いて、高感度の測定系である次世代シークエンサーにより耐性ウイルスの検討を行った。次世代シークエンサーはIon OneTouch Enrichment System (Life Technologies)を使用し、プラスミドからの検討で0.25%以上を有意と判断した。併用療法後rtA181T/V/Sの変異が出現した10例中7例で治療開始前にすでにrtA181TまたはrtA181Vの変異が検出された。検出量は7例中6例で1%以下であった。一方rtT184I, rtM236T, rtM250I/Lの変異は、治療開始時でも検出されなかった。ラミブジン治療に抵抗性を示した症例からの多剤耐性ウイルスの出現と治療効果について検討した。ラミブジン抵抗例406症例(ラミブジン治療中に血清HBV DNA量が最低値より1 logcopies/mL以上続けて上昇した症例、または、ラミブジン治療1年以降でDNA量が5 log copies/mL以上の症例)において、アデホビルとの併用療法を行った。ラミブジンとアデホビルの併用療法(観察期間中央値5.4年)では、HBV DNAの陰性化率(<2.6 log copies/mL)は1年目63%、3年目75%、5年目81%、7年目86%と良好であった。一方併用療法開始時に多剤耐性ウイルス(ラミブジン+アデホビル耐性、エンテカビル耐性)を認めた症例は11例(2.7%)であった。内訳はrtM204の変異を伴わないrtA181S/Tを認めた症例が4例、rtM204の変異を同じcloneに伴わないrtA181Tを認めた症例が3例、rtA181TとrtM204V/Iの変異を認めた症例が2例、エンテカビル耐性変異を認めた症例が2例であった。11例中4例のみが併用療法中に陰性化が得られたが、3例では十分な効果が得られずテノホビルの投与を必要とした。一方、併用療法開始後12例(3%)でラミブジンとアデホビル両剤に対する耐性ウイルスの出現を認めた。併用療法中5例でDNA量の再上昇を認めテノホビル等の他の治療に移行した。この5例中2例はrtA181TとN236Tのdouble mutationであり、残り3例では多彩な変異が出現した症例であった。多剤耐性ウイルスの出現は、ラミブジンとアデホビルの併用療法に抵抗性を示す可能性が高い。H2425年度では、ラミブジン治療抵抗例に対するアデホビルとの併用を行った406症例において、耐性ウイルスの検討を行った。

併用療法開始時に多剤耐性ウイルス(ラミブジン+アデホビル耐性、エンテカビル耐性)を認めた症例は11例(2.7%)、併用療法開始後12例(3%)でラミブジンとアデホビル両剤に対する耐性ウイルスの出現を認めた。耐性ウイルスは、RtA181S/Tの変異を11例、rtT184IまたはrtM250Iの変異を4例、rtA181T+N236Tの変異を2例に認めた。この12例中10例において併用療法開始時の血清を用いて、次世代シークエンサー(Ion OneTouch Enrichment System)により耐性ウイルスの検討を行った。併用療法後rtA181T/V/Sの変異が出現した10例中7例で治療開始前にすでにrtA181T/Vの変異が検出された。この検出量は7例中6例で1%以下であった。一方rtT184I, rtM236T, rtM250I/Lの変異は、治療開始時でも検出されなかった。H26年度は、エンテカビル初回治療例976例での耐性ウイルスのを検討を行った。5例でエンテカビル耐性を認め、さらに4例ではrtM204Iなどの耐性ウイルスを認めた。このような核酸アナログ製剤の耐性ウイルス出現例や不応例44例に対するテノホビルの成績を検討した。HBV DNAの陰性化率は、1年67%、2年87%であった。しかしrtA181T, rtS202Gの変異をもつ症例でviral breakthroughを認めた。以上のようにラミブジン、アデホビル併用療法では6%、エンテカビルでは1%に多剤耐性ウイルスを認めた。このような症例に対するテノホビルの効果は高いが、2例でviral breakthroughを認めrtA181T, rtS202Gの変異例を中心に注意が必要である。肝臓内科今回の研究では、1ラミブジン治療抵抗例および抵抗例に対するラミブジンとアデホビル併用療法施行例における多剤耐性ウイルスの出現頻度とその後の臨床経過についての検討。2エンテカビル耐性の頻度や耐性パターンと臨床経過についての検討。3多剤耐性ウイルスの出現例に対する次世代シークエンサーを用いた高感度の耐性ウイルスの検討。4多剤耐性ウイルスによる肝炎出現例に対するテノホビル治療の効果とテノホビル耐性についての検討。が目的である。今回の研究では、ラミブジン治療抵抗例および抵抗例に対するラミブジンとアデホビル併用療法施行例における多剤耐性ウイルスの出現頻度とその後の臨床経過についての検討。エンテカビル耐性の頻度や耐性パターンと臨床経過についての検討。多剤耐性ウイルスの出現例に対する次世代シークエンサーを用いた高感度の耐性ウイルスの検討。多剤耐性ウイルスによる肝炎出現例に対するテノホビル治療の効果。が目的である。現在1の研究は終了し、論文投稿中である。2と4の研究は現在解析中である。3の研究は、今年度中に解析を開始する予定である。今後の研究では、1エンテカビル耐性の頻度や耐性パターンと臨床経過についての検討を行う。耐性ウイルスの検討は、invader assay, direct-sequence法にてスクリーニングを行い、最終的にはcloning法にて各耐性変異がどのように関係しているか把握する予定である。2多剤耐性ウイルスによる肝炎出現例に対するテノホビル治療の効果。新規治療薬であるテノホビルの多剤耐性ウイルスに対する効果を臨床的、およびウイルス学的に検討する。テノホビル投与後のウイルス動態と耐性パターンとの関係やテノホビルでの効果不十分例(現在2例あり)のウイルス学的解析を行う。
植食性昆虫の遺伝構造にもとづくシイ型およびカシ型照葉樹林の分布変遷の比較

森林の歴史的変遷を考察するためには,そこに住む複数の動植物についてDNAレベルの遺伝的変異の地理的パターンを比較するといったアプローチが必要である。本研究では,日本の照葉樹林の中でも異なる分布変遷を経てきたと考えられるシイ林とカシ林の優占樹種およびそれに種特異的に寄生する複数の植食性昆虫に注目し,植物と昆虫両者を含めた系としてのシイ林およびカシ林の分布変遷の比較・解明を目標とする。平成21年度に行った研究および得られた成果は以下である。1.シイ林優占樹種シイのDNA多型の地理的分布パターンの解析日本のシイ林1地点から約20個体のシイの葉を採集し,ESTに由来するマイクロサテライト多型の地理的構造をみた結果,コジイ・スダジイともに遺伝的分化の境界は,琉球地域および中国・四国地域にみられた。2.シイに付く植食性昆虫類における種内のmtDNA多型の解析シイの新葉に潜葉するヒラセノミゾウムシのミトコンドリアDNA多型の集団解析を行った。その結果,シイの実に特異的に付くシイシギゾウムシと同様,中国・四国地域にハプロタイプの分布境界がみられた。このことからシイとそれに種特異的に付くゾウムシ2種は氷期の気候変動の影響を同じように受け,ある程度共通した分布変遷をたどってきた可能性が高いことが示唆された。カシ林優占樹種イチイガシ,ウラジロガシ,アカガシおよびその新葉に付く潜葉性昆虫について,日本のカシ林でサンプリングを行い,種内の遺伝的変異についてスクリーニングを行っているところである。