hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
車両通信における条件ベース情報収集・分配手法とシミュレーション評価基盤

本研究課題では、ITSのための車両アドホックネットワーク(VANET)の通信方式として、各車両が条件に基づいて自律的に情報転送や情報交換を行う条件ベースの情報収集・分配手法を検討し、道路の連結構造を考慮した条件ベースの情報分配手法BRNT、道路網構造と通信コネクティビティを考慮した条件ベース情報収集・分配手法RO-CBRなどを提案し、評価した。また、BRNTを用いたインフラレス動的走行経路案内を提案し、ネットワークシミュレーションと交通シミュレーションの統合シミュレーション基盤を構築し、通信と交通が相互に影響する環境でアプリケーション性能と通信性能の両面から評価した。平成25年度は、道路網構造に着目した条件ベース情報分配手法と経路制御手法、高速道路におけるショックウェーブ抑制手法を提案し,比較的単純な道路網における通信性能を中心に評価実験を行った。また、交通流シミュレーションの結果をネットワークシミュレーションに取り込む片方向シミュレーションを実現し、性能評価に導入した。文献調査等を通じて、車車間通信手法、協調走行等のITSアプリケーションについて研究動向を調査し、高速道路を想定環境として、道路モデル、交通モデル、通信モデルについてまとめた。分析や性能評価で使用する道路地図データを準備した。これらのデータを使用して、交通流シミュレータからネットワークシミュレータへの車両交通情報の受け渡す片方向シミュレーション手法を検討し、性能評価の一部で導入した。道路地図データをもとに道路網構造を分析し、道路の連結構造を利用してパケット転送の効率化をはかる条件ベースの情報分配手法を提案した。提案手法をシミュレーション・プログラムとして実装し、比較的単純な道路構造を対象として評価し、平均パケット中継回数やパケット到達率等の観点から提案手法の有効性を示した。また、道路網構造を基づいてパケットの転送経路を決定するソースルーティング手法についても提案し、道路地図データを用いた片方向シミュレーションによる評価を行った。道路網構造の違いが通信性能に影響することを示すとともに、パケット到着率や総通信量の観点から提案手法の有効性を示した。加えて、車車間通信アプリケーションとして、高速道路における渋滞原因であるショックウェーブの抑制方式を提案した。本方式では、通信周期制御を導入し、早期速度調整ならびに車間距離制御方式を効果的に併用する。シミュレーション評価から、通信性能に加え、平均ショックウェーブ伝播速度、平均渋滞時間等の観点からも有効であることを示した。平成27年度は、初年度の道路網構造を考慮した車両間での情報分配手法に関する成果を踏まえ、車両交通状況に着目し、道路網構造と通信コネクティビティを考慮した条件ベース情報収集・分配手法を提案した。都市部の道路網における通信性能についてシミュレーション実験により、提案の有効性を評価した。また、交通流シミュレーションとネットワークシミュレーションを統合的に実施する双方向シミュレーション環境の実現方法について検討した。文献調査等を通じて、都市部を想定した道路網と交通モデル、VANETをベースとした動的走行経路制御手法、情報収集・分配のための地理ベースのVANET経路制御・転送手法手法について調査した。都市部の道路網を対象としたシミュレーション・モデルを検討し、道路網モデル、建物等を考慮した無線伝播モデルについてまとめた。分析や性能評価のために世界10都市の道路地図データを整備し、シミュレーション評価に導入した。初年度に構築した片方向シミュレーション環境を基本として双方向シミュレーション環境を構築するための実現方法を検討した。都市部の複雑な環境において、車両交通状況よっては車両密度が低下して通信コネクティビティが失われる問題に着目し、道路網構造と通信コネクティビティを考慮した条件ベース情報収集・分配手法を提案した。都市部の道路地図データ、建物を考慮した電波伝搬モデル(ITU-R P.1411)を含むシナリオを用いたシミュレーション評価を実施し、通信到達性、総中継量、通信遅延の観点から既存方式と比較評価を行い、提案方式の有効性を示した。加えて、交差点分布の分散に着目した道路網構造の複雑度分析手法を提案し、車両間ブロードキャストへの影響をシミュレーションにより評価した。また、アドホックネットワークにおけるノード信頼度の評価手法とセキュア経路制御への応用についても検討した。平成27年度は、これまでの条件ベース情報収集・分配手法や双方向シミュレーション環境の実現方法の検討を踏まえ、車両間協調アプリケーションとしてインフラレス動的走行経路案内アプリケーションを設計し、それを双方向シミュレーションとして実装し、通信性能とアプリケーション性能の両面から評価した。文献調査と学術会議等での意見交換を通じて、車車間通信ネットワーク、車両通信を用いた動的経路制御手法、ITSアプリケーションの評価等に関する研究動向を調査した。車両間協調アプリケーション向けに条件ベースの情報収集・分配方式の評価を進めるとともに、車両間協調アプリケーションとしてVANETを用いたインフラレス動的走行経路案内アプリケーションを設計した。本アプリケーションでは、各車両はVANET通信によって取得した他車両の走行情報もとに、各道路セグメントの通過所要時間をGreenshieldsモデルにより推定し、最短時間経路を案内する。設計したインフラレス動的走行経路案内アプリケーションを、過年度に提案した散布型の情報共有方式とともに双方向シミュレーションに実装した。本シミュレーションではネットワークシミュレーションと交通シミュレーションを統合し、通信と交通が相互に影響する環境における評価を実現した。マンハッタンの道路地図データ、建物を考慮した電波伝搬モデル(ITU-R P.1411)を想定したシミュレーションにより、通信性能とアプリケーション性能の両面にからインフラレス動的走行経路案内を評価し、所用交通時間の短縮の観点からその有効性を示した。また、通信性能(パケット到着率、パケット配送遅延)、経路更新間隔の動的走行経路案内のアプリケーション性能への影響についても評価した。本研究課題では、ITSのための車両アドホックネットワーク(VANET)の通信方式として、各車両が条件に基づいて自律的に情報転送や情報交換を行う条件ベースの情報収集・分配手法を検討し、道路の連結構造を考慮した条件ベースの情報分配手法

BRNT、道路網構造と通信コネクティビティを考慮した条件ベース情報収集・分配手法RO-CBRなどを提案し、評価した。また、BRNTを用いたインフラレス動的走行経路案内を提案し、ネットワークシミュレーションと交通シミュレーションの統合シミュレーション基盤を構築し、通信と交通が相互に影響する環境でアプリケーション性能と通信性能の両面から評価した。道路網構造と通信コネクティビティを考慮した条件ベース情報収集・分配手法を提案し、シミュレーションにより評価した。また、10都市以上についての道路地図を整備し、都市部の建物の影響を考慮した電波伝搬モデルを導入したシミュレーションを実現している。双方向シミュレーションを実現手法について検討を進め、試験的な実装ができつつある。したがって、全般として概ね順調に進展している。27年度が最終年度であるため、記入しない。情報ネットワーク本年度の成果を踏まえ、研究計画に基づき推進する。道路網構造を考慮した条件ベースの車車間通信情報分配手法や経路制御手法を提案し、シミュレーションによって評価した。また、道路地図や車両交通情報を用いた片方向シミュレーションを実現している。購入したシミュレーション用データサーバとシミュレーション開発マシンについて、計画時から機種変更をした結果、単価が低くなったため。本年度の成果を踏まえ、研究計画に基づき推進する。次年度は主として、国際会議等での発表のための費用、あるいは,研究協力者への謝金として使用する予定である。本年度は、道路地図データや交通データを含むシミュレーションデータが、当初想定していたよりも小規模であったため、購入予定のシミュレーション用データサーバを導入しなかった。次年度以降、シミュレーション用データサーバを購入する予定である。
帝国大学における研究者の知的基盤に関する研究

最終年度である今年度(平成30年度)は、これまでの研究成果をとりまとめて広く公開することに主眼をおいて活動を展開した。【シンポジウムの開催】5月に開催された日本科学史学会において、シンポジウム「帝国大学における研究者の知的基盤に関する研究」を企画し、代表者・分担者全員が研究成果を報告した。個別の研究者に関する報告では、成瀬政男(東北帝国大学工学部)、村岡典嗣(東北帝国大学法文学部)、畑井新喜司(東北帝国大学理学部)、熊谷岱蔵(東北帝国大学医学部)、佐藤丑次郎(東北帝国大学法文学部)といった研究対象者の知的基盤の解明を試みた研究成果の報告を行った。また知的基盤としての帝国大学の研究環境整備に関する報告として、京都帝国大学と東北帝国大学の附置研究所設置を構想する経緯について比較検討する研究の成果を報告した。さらに帝国大学の研究者の多くがその知的基盤を形成したと考えられる旧制高等学校の教育過程について、第二高校学校校長である阿刀田令造、第四高等学校校長である溝淵進馬を事例として、知的基盤形成過程の解明を試みる研究報告を行った。コメンテーターを含め、会場より有用な意見を得ることができた。【論文集の刊行】5月に第4回研究会を開催し、シンポジウムにおいて報告した研究成果を基盤とする論文を取りまとめた論文集の刊行を目指すことを確認した。その後、分担者らは論文執筆に取りかかりつつ、7月(第5回)、9月(第6回)の研究会において論文内容の検討を重ねてきた。平成30年度内に草稿は出揃い、刊行する出版社も決定し、令和元年中に刊行される予定である。そのほか、研究成果の一部は別記のように論文として『東北大学史料館紀要』においても報告されている。本年度(平成28年度)は、予定通りに第1回研究会(11月5日、於東京大学文書館)を開催し、調査・研究方針の確認と各分担者の研究の進捗状況の報告が行われた。この研究会においては、成瀬政男ー東北帝国大学工学部、富塚清ー東京帝国大学工学部、橘覚勝ー大阪大、村岡典嗣ー東北帝大法文学部、畑井新喜司ー東北帝国大学理学部といった個別の研究者の事例について、それぞれの研究者自身が記した著作物の分析を通して知的基盤を明らかにしようとする旨の報告がなされた。その一方で、旧制高等学校史研究の立場からは知的基盤の一要素としての教養が涵養される高等学校における教育を研究対象とすべきであるとの指摘がなされた。また知的基盤形成のための枠組みの一部をなす帝国大学の組織や体制について分析する必要性が指摘された。つまり、知的基盤の定義を巡り、研究者の内面からその知的基盤にアプローチするのみならず、研究者が教養を学んできた教育機関としての高等学校や帝国大学、また知的生産を実践する場としての帝国大学の教育・研究環境についても研究対象として捉えるべきという重要な指摘がなされたのである。今後はこのことを念頭に入れ、研究を進めることを確認した。また各自が示した研究方針に基づいて研究を進め、次年度の平成29年9月に開催する第2回研究会において、成果の中間報告を行う旨を確認した。別記したように、初年度にもかかわらず、研究成果の一部が学会等で口頭報告され、論文として『東京大学史紀要』や『東北大学史料館紀要』等の雑誌において公開されている。当初予定していた通りに研究会を開催し、各分担者からの報告もなされている。予定通りの進捗であるといえる。本年度(平成29年度)は、研究がほぼ予定通りに進捗した。第2回研究会(9月16日、秋田高専)、第3回研究会(3月10日、秋田高専)を開催し、各分担者が調査・研究の成果および進捗状況の報告を行った。これらの研究会においては、成瀬政男(東北帝国大学工学部)、村岡典嗣(東北帝国大学法文学部)、畑井新喜司(東北帝国大学理学部)、熊谷岱蔵(東北帝国大学医学部)、佐藤丑次郎(東北帝国大学法文学部)といった研究対象者の知的基盤の解明を試みる報告や知的基盤としての帝国大学の研究環境整備に関する報告がなされた。またこうした帝国大学の研究者の多くがその知的基盤を形成したと考えられる旧制高等学校の教育過程について、旧制ナンバースクールを対象として解明を試みる研究報告がなされた。同時に「知的基盤」の概念についても整理する作業も進められた。これらの研究会を契機として新たに若手の研究協力者3名の参加を見ることができ、研究の対象や範囲が広がりつつあり、戦時下の帝国大学における研究者の知的基盤の解明をめざしての今後の展開が期待される。そして各自が示した研究方針に基づいて研究を進めることが確認された。これまでの研究成果の一部は別記のように学会等で口頭報告され、論文として『東北大学史料館紀要』や『東北学院史資料センター年報』等の学術雑誌、著書『学都金沢形成の様相ー近代日本官立高等教育機関の設置過程ー』(該当箇所は91-120頁)において報告されている。また第3回研究会において、最終年度である平成30年度の5月に開催される日本科学史学会の個別報告・シンポジウムにおいて研究成果を報告し、書籍として刊行することを目指すことを決定した。くわえて海外に発信することも視野に入れることを確認した。当初予定していた通りに研究会を開催し、各分担者からの報告も受けている。予定通りの進捗である。

【シンポジウムの開催】5月に開催された日本科学史学会において、シンポジウム「帝国大学における研究者の知的基盤に関する研究」を企画し、代表者・分担者全員が研究成果を報告した。個別の研究者に関する報告では、成瀬政男(東北帝国大学工学部)、村岡典嗣(東北帝国大学法文学部)、畑井新喜司(東北帝国大学理学部)、熊谷岱蔵(東北帝国大学医学部)、佐藤丑次郎(東北帝国大学法文学部)といった研究対象者の知的基盤の解明を試みた研究成果の報告を行った。また知的基盤としての帝国大学の研究環境整備に関する報告として、京都帝国大学と東北帝国大学の附置研究所設置を構想する経緯について比較検討する研究の成果を報告した。さらに帝国大学の研究者の多くがその知的基盤を形成したと考えられる旧制高等学校の教育過程について、第二高校学校校長である阿刀田令造、第四高等学校校長である溝淵進馬を事例として、知的基盤形成過程の解明を試みる研究報告を行った。コメンテーターを含め、会場より有用な意見を得ることができた。【論文集の刊行】5月に第4回研究会を開催し、シンポジウムにおいて報告した研究成果を基盤とする論文を取りまとめた論文集の刊行を目指すことを確認した。その後、分担者らは論文執筆に取りかかりつつ、7月(第5回)、9月(第6回)の研究会において論文内容の検討を重ねてきた。平成30年度内に草稿は出揃い、刊行する出版社も決定し、令和元年中に刊行される予定である。そのほか、研究成果の一部は別記のように論文として『東北大学史料館紀要』においても報告されている。第1回研究会において各分担者が示した研究方針に基づいて、調査・研究を実施する予定通である。平成29年9月には中間報告のための第2回研究会を開催し、成果を共有する予定である。第3回研究会において確認されたように、平成30年5月25日26日に開催される日本科学史学会において、講演やシンポジウムを実施し研究成果を報告する予定である。またこれらの成果報告を踏まえ、成果公開のための書籍を刊行する計画を進めている。くわえて今年度後半には、研究成果を海外に発信することを検討している。当年度は、手持ち資料による研究が思いのほか進み、史料調査等の実施回数が少なかったため支出が少なかった。当年度は各分担者の所属大学に所蔵されている史料による研究が思いのほか進み史料調査等の実施回数が少なかったため支出が少なかったことから次年度使用が生じた。上記の「今後の研究の推進方策」で述べたように、次年度にあたる平成30年度には学会シンポジウムでの研究成果を報告し、その成果を踏まえ書籍を刊行する計画であるため、次年度使用分はそれらの費用に充てる予定である。また海外に向けた成果の発信のための経費に充てることも視野にいれている。平成29年度は、史料調査・収集・分析をさらに進め、その成果を学会報告、論文投稿という形で公開して行きたいと考えている。
自閉症者の身体近位空間の変容に基づく視触覚間の過剰な分離／統合メカニズムの解明

自閉スペクトラム症者では、障害物に頻繁に接触するといった特徴が見られる。こうした障害の背景には、脳内における身体近位空間の変容が関与すると考えた。Ide & Hidaka(2013)では、身体近位空間を変容させるような条件では、視覚と触覚の時間的な順序判断が難しくなることを報告した。本研究では、この視-触覚間の時間順序判断課題の成績の低下が、自閉症傾向が高い人では起こりづらいことを見出した。また、触覚と聴覚に関する時間処理精度が、定型発達者のおよそ10倍の自閉症の症例を見出した。以上の成果から、感覚刺激に対する過剰/過小な時間処理精度が、身体近位空間の変容の背景にあることが示唆された。我々は自分の身体だけでなく、自分と密接に関係する身体周辺の空間(身体近位空間)についても無意識に理解している。この身体近位空間に関する脳内表現には、視覚と触覚の統合が重要な役割を果たしている。一方、自閉症スペクトラム障害(autism-spectrum disorders: ASD)者では、異種感覚間統合の過剰と過少という多様性が報告されており、視触覚間統合に基づく身体近位空間の範囲は変容している可能性が考えられる。我々の先行研究では、手を模した対象を提示することが視触覚間統合を促し、それらに時間差がある時でさえ同時と知覚され易くなることを報告した。本研究では、この効果が生起する空間範囲に着目し、身体近位空間が自閉傾向に関連して変化するのかを検討する。本年度は、実際の手と手を模したラバーハンドを視覚的に提示することが視触覚間統合に及ぼす影響とその自閉傾向との関連性を検討した。実験参加者は、自分の手の指先に与えられた振動と、その真上に提示した光に関して時間順序判断を行った。その結果、自分の手が見える条件では、それが見えない条件と比べて、視触覚刺激を同時と知覚し易くなった。また、この効果は低自閉傾向者でのみ見られ、高自閉傾向者では低下した。更に、ラバーハンドを提示した条件でも、実際の手を提示した時と全く同様に、視触覚刺激を同時と知覚する傾向が低自閉傾向者でのみ見られた。以上の結果から、手周辺に提示した視覚刺激は指先への触覚刺激と強く統合されることに加え、ラバーハンドがあたかも実際の手であるかのように同様の効果を生じさせることが分かった。また、この効果は個々人の自閉傾向に伴って変化することから、ASD者の身体近位空間の変容と結びついている可能性を示唆する。本年度は、実際の手と手を模したラバーハンドを提示することによる視触覚間の統合促進を調べ、その自閉傾向との関連性を検討した。実験結果から、自分の手が見える条件では、それが見えない条件と比べて、視触覚刺激を同時と知覚し易くなる傾向が見られた。また、この効果は低自閉傾向者でのみ強く生じ、高自閉傾向では低下することも示唆された。全く同様の効果が、ラバーハンドを提示した条件でも低自閉傾向者でのみ見られた。以上の結果は、身体近位空間における視触覚間統合は、自閉傾向に伴って低下する可能性を示唆している。この知見に関して、既に国内外の学会で発表を行っており、現在は論文投稿の準備を進めている。我々が自己身体と関連し、それを取り巻く空間(身体近位空間)の脳内表現を形成するには、視覚と触覚の統合が重要な役割を果たしている。一方、自閉スペクトラム症者では、異なる感覚モダリティの刺激を連続提示した時、その順序を正確に判断することが困難である(時間分解能が低下している)ことが報告されている(Boer-Schellekens, 2013)。これは、自閉スペクトラム症者が異なる感覚を過剰に統合し易い傾向を反映していると考えられた。昨年度までに、視覚と触覚の時間順序判断課題について、定型発達者でも、質問紙(AQスコア)で評定される自閉傾向が高いほど、時間分解能が低下する傾向を見出した。高い自閉傾向者で見られる異種感覚間の時間分解能の低下を検証するためには、単一感覚の時間分解能と比較することが不可欠だと考えられる。本年度は、視覚、触覚、聴覚それぞれについて時間順序判断課題を実施した。また、聴覚と触覚の組み合わせで、同様の課題を実施した。その過程で、自閉スペクトラム症者の1症例が、極めて高い時間分解能を示すことを見出した。この当事者は、触覚と聴覚それぞれ、触覚と聴覚の組み合わせの時間順序判断課題で、それぞれ時間分解能は6.5ミリ秒、7.6ミリ秒、11.5ミリ秒の時間分解能を示し、これらは全て定型発達者の平均値の標準偏差の2倍を上回る値であった。しかし、視覚、視覚と触覚の組み合わせでは、それぞれ時間分解能は19ミリ秒、27.8ミリ秒であり、これは標準偏差の2倍の範囲内であった。これらの結果は、自閉スペクトラム症者では、各感覚モダリティで高い時間分解能を示していた場合、その組み合わせでも同様に高い時間分解能を維持することを示唆する。高い自閉傾向をもつ実験参加者では、視触覚間の時間分解能が低下するという発見に基づき、単一感覚での時間分解能との比較を行うため、視覚、触覚、聴覚それぞれで時間順序判断の課題を実施した。また、極めて高い時間分解能を示す1症例に着目し、全てに感覚について網羅的に時間分解能を検討した。

先行研究では、自閉スペクトラム症者では異種感覚刺激の時間分解能が低下すると言われてきたが、こうした状況でも、自閉スペクトラム症者が必ずしも時間分解能の低下を示すわけではないことを示した。この結果から、当事者を一括りにするのではなく、個人特性に着目し、単一感覚・異種感覚の処理の特徴を検討する必要性を示した。自閉スペクトラム症(Autism spectrum disorders: ASD)者は、自己身体の位置を正確に把握することの困難など、身体表象に関する障害が見られる。身体表象には、視覚と触覚(視触覚)の間の統合が極めて重要な役割を果たすことが知られている。視触覚間統合によって引き起こされるラバーハンド錯覚という身体表象の錯覚が、ASD者および高い自閉症傾向をもつ定型発達者では生じにくいことが報告されている(Cascio et al., 2012)。しかし、この特徴が、視触覚間の統合を制約する刺激間の時間的な一致の程度に起因するのかは明らかではない。本研究では、高自閉症傾向者とASD者を対象に、視触覚間の統合に基づく身体表象の変容の背景にある知覚・認知処理特性を検討した。時間順序判断(Temporal order judgment: TOJ)課題を用い、どの程度の時間差で、刺激の時間差を正確に答えることができるかを調べた。その結果、高自閉症傾向群、低自閉症傾向群それぞれの時間分解能は、74 ms、61 msであった。また、自閉症傾向が高いほど視触覚間の時間分解能が低下する傾向が見られた。しかし、この傾向は、参加者が自分自身の手、もしくはマネキンの手を観察しながら課題を遂行する条件では見られなかった。以上のことから、身体表象の参照を要する状況では、個々人の自閉症傾向が、視触覚間の統合に対して媒介効果をもつことが示唆された。また、実験の過程で、1名の極めて高い時間処理精度をもASDの症例を見出した。特に、触覚、聴覚に関しては、6 ms、7 msの時間分解能を有し、定型発達者の平均の10倍程度であった。以上の結果は、自閉症に関連して現れる身体表象の障害は、異種感覚間の統合における時間分解能の低下、逆に、単感覚における、時に極端なそのばらつきに起因する可能性を示唆する。自閉スペクトラム症者では、障害物に頻繁に接触するといった特徴が見られる。こうした障害の背景には、脳内における身体近位空間の変容が関与すると考えた。Ide & Hidaka(2013)では、身体近位空間を変容させるような条件では、視覚と触覚の時間的な順序判断が難しくなることを報告した。本研究では、この視-触覚間の時間順序判断課題の成績の低下が、自閉症傾向が高い人では起こりづらいことを見出した。また、触覚と聴覚に関する時間処理精度が、定型発達者のおよそ10倍の自閉症の症例を見出した。以上の成果から、感覚刺激に対する過剰/過小な時間処理精度が、身体近位空間の変容の背景にあることが示唆された。これまでの研究から、実際の手と手を模したラバーハンドを提示した状況では視触覚間統合が促進され、両刺激に時間差がある時でさえ同時と知覚し易いことが分かった。また、この効果は高自閉傾向者では生じず、身体近位空間の変容と結びつく可能性を示唆する。したがって、今後は視触覚間統合が促進される空間範囲と自閉傾向との関連性を検討していき、ASD者の身体近位空間の特徴を明らかにしていく。単一感覚刺激に関する時間分解能と異種感覚間のそれとを比較する。
高等動物におけるビタミンB_<12>補酵素合成機構の解明

ラット肝臓ミトコンドリア膜画分からビタミンB_<12>補酵素の合成に関与するNADH型およびNADPH型アクアコバラミンレダクターゼを精製し、その酵素化学的物質を解明した。NADPH型酵素はミトコンドリア膜より1%Triton X-100/1%デオキシコール酸で完全に可溶化され、各種クロマトグラフィーを用いて電気泳動的に均一にまで精製した。本酵素は分子量65000の単一のポリペプチドからなるフラボプロテインであった。酵素1モルあたり1モルのFADとFMNを含有していた。また、本酵素はミクロソームのシンクロムP450レダクターゼ(ミクロソームのNADPH型アクアコバラミンレダクターゼ)抗体と反応したが、ペプチドマッピングやフェノバルビタール誘導の挙動の相違から両酵素は異なるタンパク質であることが明らかとなった。一方、NADH型アクアコバラミンレダクターゼは1%TritonX-100で完全に可溶化されたが、DEAE-セファロースカラムクロマトグラフィーにより活性が顕著に消失したが、NADH-シトクロムcレダクターゼ(b-タイプシトクロムとシトクロムb5レダクターゼ複合体)活性とアクアコバラミンレダクターゼ活性は同一の挙動を示した。また、ミトコンドリア膜画分よりb-タイプシトクロムとシトクロムb5レダクターゼをそれぞれ精製し、再構成実験を行った結果、非常に高いアクアコバラミンレダクターゼ活性が検出された。これらの結果よりミトコンドリアのNADH型アクアコバラミンレダクターゼはb-タイプシトクロムとシトクロムb5レダクターゼ複合体であると結論した。
人流動複雑系の知能流体力学・運動論的展開によるアプローチ

本年度は,人の動きを各地で取材して,動きのパターンを区分し,最適な解析手法について検討した.取材は,大宮駅改札前,および東京都,新宿交差点付近を対象にしている.取材の結果は,個別の対象物体の動きに変化が大きく,動画像解析においては,集団運動の解析は,非常に困難で,物体個別の解析が必要であることが明らかとなった.これとは,並行して,人の流れのモデル化をより一般的に調べるため,魚の動きを捉えて,その座標位置の時間的変化から,数密度,速度の時間的変動を調べた.魚としてはメダカを取り上げ,メダカの光に対する逆光性と個々のメダカの位置取りが平面的であることを利用して,二次元の生物流の観察を行なった.実験に際しては,既存の大型水槽を改良して,中央流路が狭くなっている流路を用い,一方から,他方へ移動する群れの様子を,ビデオカメラで撮影し,これをPC上で解析した.運動解析は,各時刻のメダカの重心位置をトレースする方法を用いた.解析の結果,メダカの運動は,かなり変動が大きいものの,流路が狭まると,速度が減少し,密度が増加する傾向が見られた.これは,通常,言われているように,生物の流れが基本的には超音速流れに類似していることを示している.しかしながら,狭まり部から先の運動に関しては,必ずしも超音速流れとの類似点は見られなかった.以上より,運動力学上の重要なデータが得られた.更に,数値シミュレーションでは,単純な粒子運動モデルを作成し,粒子分子ポテンシャルと,運動ポテンシャルを与えて,シミュレーションを行ない,単一流路幅での運動で,ランダムウォークを示すシミュレーション結果が得られ,シミュレーションの基本スキームを確立した.本年度は,人の流れの解析を行なうに当たって解析対象を絞り込む作業を行なった.はじめに駅構内の複雑な人の流れを対象にして、ビデオカメラによる取材を行ない,人の流れとして特徴のある地域,場所の特定を行なった.駅の構内における人の流れを長時間ビデオで撮影し、これを解析し,流体粒子としての人の粒子モデルを考える材料を得た.得られた画像を、研究室でデータ収集し、流体粒子としての一人一人の動きの特徴抽出を行う。この作業は、統計的に処理する必要があるために、より多くのデータ収集を行い、データベース化を図っている.また,得られたビデオの画像を解析して,人が移動した跡(人の流跡と呼ぶ)のコンピュータによるトレース法について検討し,その計測方法の確立を図った.ビデオカメラで捉えた人の流跡は,実際には3次元的な移動となるため,人の流跡を決定するのは単純ではない.そのため,擬似2次元を仮定して,人の流跡を追跡する方法について検討し,試験的解析を行なっている.一方,古典的流体力学による理論と単純化した人の流れとを対応づけて相似則を確立し,単純な相似シミュレーションを行なった.その結果,人の流れを超音速流れと対応づけて,速度,温度,圧力をそれぞれ人の行動パターンといかに結び付けるかについて一定の見解を得た.また,人の流れを独立した粒子の群れが流れる動きと捉えて,単純な流れの数学モデルを構築した。これは,先にビデオ取材によって求めた人の動きの特徴をもとに,粒子の運動の決定要素に,種々の条件や特性を付加し,はじめに,非常に単純な人の動きを計算機によりシミュレーションした.単純な動きにおいては,ある程度妥当な結果を得ることができたが,運動力学的要素と人の行動とを対応づけ,さらに改良を行なう必要がある.本年度は,人の動きを各地で取材して,動きのパターンを区分し,最適な解析手法について検討した.取材は,大宮駅改札前,および東京都,新宿交差点付近を対象にしている.取材の結果は,個別の対象物体の動きに変化が大きく,動画像解析においては,集団運動の解析は,非常に困難で,物体個別の解析が必要であることが明らかとなった.これとは,並行して,人の流れのモデル化をより一般的に調べるため,魚の動きを捉えて,その座標位置の時間的変化から,数密度,速度の時間的変動を調べた.魚としてはメダカを取り上げ,メダカの光に対する逆光性と個々のメダカの位置取りが平面的であることを利用して,二次元の生物流の観察を行なった.実験に際しては,既存の大型水槽を改良して,中央流路が狭くなっている流路を用い,一方から,他方へ移動する群れの様子を,ビデオカメラで撮影し,これをPC上で解析した.運動解析は,各時刻のメダカの重心位置をトレースする方法を用いた.解析の結果,メダカの運動は,かなり変動が大きいものの,流路が狭まると,速度が減少し,密度が増加する傾向が見られた.これは,通常,言われているように,生物の流れが基本的には超音速流れに類似していることを示している.しかしながら,狭まり部から先の運動に関しては,必ずしも超音速流れとの類似点は見られなかった.以上より,運動力学上の重要なデータが得られた.更に,数値シミュレーションでは,単純な粒子運動モデルを作成し,粒子分子ポテンシャルと,運動ポテンシャルを与えて,シミュレーションを行ない,単一流路幅での運動で,ランダムウォークを示すシミュレーション結果が得られ,シミュレーションの基本スキームを確立した.
α-ジストログリカノパチーによる筋ジストロフィーに対する糖転移酵素補充療法の開発

α-ジストログリカン(α-DG)は糖鎖を介して細胞外のラミニンと結合することで細胞膜を安定化している。α-DGの糖鎖修飾に関わる糖転移酵素の遺伝子異常は筋ジストロフィー、脳奇形、眼球異常など多彩な症状を呈しこれらはα-ジストログリカノパチーと呼ばれる。本研究ではこの原因となる糖転移酵素の投与によりα-DGの糖鎖修飾を回復させて疾患治療を目指す糖転移酵素補充療法の開発に向けての基礎的な研究を行った。そしてCRISPR/Cas9のゲノム編集技術により培養細胞を用いた糖転移酵素補充療法のアッセイ系を確立するとともに、糖転移酵素を小胞体へ運搬するための担体としてリシンBサブユニットの利用を提唱した。α-ジストログリカン(α-DG)はジストロフィン糖蛋白複合体の構成蛋白質であり、糖鎖を介して細胞外のラミニンと結合することで細胞膜を安定化している。近年α-DGの糖鎖修飾の異常により筋ジストロフィー、脳奇形、心筋症など多彩な疾患が発症することが明らかとなりこれらはα-ジストログリカノパチーと総称されている。本疾患群では糖転移酵素をコードする遺伝子の変異によりα-DGの糖鎖修飾が未熟な状態にとどまり、この結果α-DGとラミニンとの結合が断たれることが原因と考えられている。本研究はα-ジストログリカノパチーの原因となっている糖転移酵素を体外から投与することによりα-DGとラミニンとの結合性を回復させて疾患の治療を目指す、すなわち糖転移酵素補充療法の実現に向けての基礎的な研究を行うことを目的としている。本年度は福山型先天性筋ジストロフィーで欠損しているfukutinと、小胞体への運搬体として利用するコレラトキシンBサブユニットあるいはリシンBサブユニットとの融合蛋白のコンストラクトを作製した。そしれこれらを細胞に遺伝子同導入してα-DGの糖鎖修飾が正常化するかどうかをfukutin欠損マウスES細胞を用いて検討した。しかしリポフェクション法、エレクトロポレーション法などを試みたものの遺伝子導入効率が低く、十分な量の蛋白質の発現が得られなかった。そこで細胞の系を遺伝子導入効率の高いHEK293に変更して、現在これにCRISPR/Cas9を用いてfukutinノックアウト細胞株の作製に取りかかっている。近年α-DGの糖鎖修飾を司る糖転移酵素群の遺伝子異常により筋ジストロフィー、脳奇形、心筋症など多彩な疾患が発症することが明らかとなりこれらはα-ジストログリカノパチーと総称されている。本研究はα-ジストログリカノパチーの原因となっている糖転移酵素を体外から投与することによりα-DG糖鎖修飾を回復させて疾患の治療を目指す、すなわち糖転移酵素補充療法の実現に向けての基礎的な研究を行うことを目的としている。昨年度我々は福山型先天性筋ジストロフィーで欠損しているfukutinと、小胞体への運搬体として利用するリシンBサブユニットとの融合蛋白のコンストラクトを作製しfukutin欠損マウスES細胞を用いた蛋白質発現を試みた。しかしES細胞の遺伝子導入効率が低いための十分な量の発現が得られなかった。そこで本年度はCRISPR/Cas9によるゲノム編集技術を用いて、発現効率の高いHEK293細胞のfukutinノックアウト株を作製した。この結果fukutin遺伝子のexon 5に1塩基挿入をホモで有する変異体を得る事ができた。この変異(c.439dupC)により下流に終止コドンが導入されるため(p.Leu147ProX10)不完全なfukutin蛋白質が産生されるものと考えられる。実際にウエスタンブロットにより本変異株ではfukutinの機能不全によりα-DGの糖鎖修飾が未成熟な状態に留まっていることが明らかとなった。今後本変異株をアッセイ系として用いることにより、糖転移酵素補充療法に用いるコンストラクトを検討・選定することが可能となった。CRISPR/Cas9によりfukutinノックアウトHEK293細胞株のアッセイ系を確立できた点は大きな前進であったと考える。しかし当初の計画では本年度のうちにコンストラクトの選定からfukutin融合蛋白質のスモールスケールでの精製、そして培養細胞への添加実験までを目指していたので、達成度としてはやや遅れていると判断した。α-ジストログリカン(α-DG)は各種筋ジストロフィーの原因となるジストロフィン糖蛋白複合体の主要な構成蛋白質である。α-DGは糖鎖を介して細胞外のラミニンと結合することで細胞膜を安定化し、細胞内外のシグナル伝達に寄与している。近年α-DGの糖鎖修飾を司る糖転移酵素群の遺伝子異常により筋ジストロフィー、脳奇形、眼球の異常など多彩な疾患が発症することが明らかとなりこれらはα-ジストログリカノパチーと総称されている。本研究はα-ジストログリカノパチーの原因となっている糖転移酵素を投与することでα-DGの糖鎖修飾を回復させて疾患治療を目指す、すなわち糖転移酵素補充療法の実現に向けての基礎的な研究を行うことを目的として行われ、以下の結論を得た。1)CRISPR/Cas9のゲノム編集技術により、培養細胞を用いた糖転移酵素補充療法のアッセイ系を確立した。すなわちHEK293細胞を用いて、α-ジストログリカノパチーの代表的疾患である福山型先天性筋ジストロフィーの原因遺伝子fukutinに対するゲノム編集を行った。

この結果fukutin遺伝子のexon 5に1塩基挿入を有する変異体を得る事ができた。この変異はフレームシフトを引き起こすためfukutinが機能せず、α-DGの糖鎖修飾不全が生じていた。2)糖転移酵素補充療法では目的とする酵素が小胞体まで運ばれなくては糖鎖修飾は正常に行われない。そこでfukutinを小胞体へ運搬するための担体としてリシンBサブユニットを利用した。すなわちfukutinとリシンBサブユニットとの融合蛋白質を発現し、上述のfukutin機能欠損HEK293細胞におけるα-DGの糖鎖修飾を検討した。その結果本細胞株におけるα-DGの糖鎖修飾が回復することが示された。以上より本研究により将来的な糖転移酵素補充療法の開発に向けての端緒が開けたものと考えられる。α-ジストログリカン(α-DG)は糖鎖を介して細胞外のラミニンと結合することで細胞膜を安定化している。α-DGの糖鎖修飾に関わる糖転移酵素の遺伝子異常は筋ジストロフィー、脳奇形、眼球異常など多彩な症状を呈しこれらはα-ジストログリカノパチーと呼ばれる。本研究ではこの原因となる糖転移酵素の投与によりα-DGの糖鎖修飾を回復させて疾患治療を目指す糖転移酵素補充療法の開発に向けての基礎的な研究を行った。そしてCRISPR/Cas9のゲノム編集技術により培養細胞を用いた糖転移酵素補充療法のアッセイ系を確立するとともに、糖転移酵素を小胞体へ運搬するための担体としてリシンBサブユニットの利用を提唱した。上述のようにfukutin欠損マウスES細胞へfukutin融合蛋白質の遺伝子導入を行い、コンストラクトが有効に機能するかどうかを検討する予定であった。しかしES細胞の遺伝子導入効率が予想外に低かったため、代替の方法としてHEK293細胞にCRISPR/Cas9を用いてfukutinノックアウト細胞を作製しているところである。本来ならば今年度中にこれらコンストラクトのチェックに加えてfukutin融合蛋白質のスモールスケールでの作製までを目指していたことから、現在までの達成度としては遅れていると判断した。以下のように培養細胞を用いたin vivoの系における酵素補充療法の検討から、さらに疾患モデルマウスを用いた検討へと順次実験を進めていく。1)培養細胞に対する糖転移酵素の補充によるα-DGの機能回復各種fukutinコンストラクトを今回作製したfukutinノックアウトHEK293細胞株に遺伝子導入し、α-DGの糖鎖修飾が正常化するか否かを検討する。α-DGの糖鎖が正常化してラミニン結合能が回復したらそれらのコンストラクトを用いてHEK293細胞へ再度遺伝子導入を行い、fukutin融合蛋白質のスモールスケールでの精製を行う。得られた融合蛋白質をfukutinノックアウトHEK293細胞の培養細胞上清に添加し、これら蛋白質が細胞内へ取り込まれて小胞体からゴルジ体へ局在するかどうか、その結果としてα-DGの糖鎖修飾やラミニン結合能が回復するかどうかを検討する。2)筋ジストロフィーモデルマウスに対する糖転移酵素補充療法の試みマウスへの投与実験に備えてfukutin融合蛋白質をラージスケールで精製する。
積雪空隙内に存在する化学成分の存在形態とその挙動に関する研究

大気エアロゾルから積雪中の化学シグナルが形成される過程には、(1)降雪へのエアロゾルの取り込み過程、(2)積雪内での化学成分の移動と大気への放出、(3)積雪内での化学反応、(4)融雪をともなう化学成分の溶出と移動、(5)氷河流動による層序の擾乱、が挙げられる。本研究の目的は、これらの諸過程の中で(2)と(3)の過程と機構に着目し、積雪内での化学成分の挙動、存在形態を明らかにすることである。北海道幌加内町母子里にある当研究所融雪観測室において積雪の空隙内の存在する化学成分の挙動を調べた。積雪内に金属パイプを陥入しポンプによって空隙内の空気を吸引し,空隙内のエアロゾル成分とガス成分をフィルター上に捕集した。また同時に積雪直上の大気中のエアロゾルとガス成分をフィルター上に捕集した。捕集した成分は、イオンクロマトグラフィーで化学成分の定量を行った。その結果、昨年と同じように空隙内での存在が肯定的ではなかったエアロゾルが検出された。空隙内のエアロゾル濃度と大気中のエアロゾル濃度の変動は全く異なった挙動を示した。また、大気中のナトリウム濃度は10倍以上の変化を示したのに対し、空隙内のエアロゾルはほぼ一定の値を示した。このことから、空隙内から採取されたエアロゾルは、大気の影響を直接うけたものではなく、大気の変化とは独立して空隙内にエアロゾルが存在することが示唆された。また空隙内のエアロゾルは化学成分によっても挙動が異なった。これは温度や温度勾配の違いが化学成分の挙動の違いに現れたのではないかと推測される。以上の結果から、積雪内の化学成分挙動を明らかにする重要性が確認され、今後のアイスコアの解釈のための研究の発展が大いに期待される。北海道幌加内町母子里にある、当研究所融雪観測室において空隙内の存在する化学成分の採取を行った。積雪内に金属パイプを陥入しポンプによって空隙内の空気を吸引する方法と、フィルターフォルダーを直接積雪内に設置しポンプで吸引する方法で、空隙内のエアロゾル成分とガス成分をフィルター上に捕集した。エアロゾル成分はテフロンフィルターに、ガス成分は炭酸ナトリウム2%+グリセリン2%溶液をしみ込ませた濾紙に捕集させた。捕集したエアロゾル中の化学成分はフィルター毎超純水に浸し超音波を照射して超純水中に抽出させた。ガス成分は、フィルターを2%の過酸化水素中に浸し超音波を照射して抽出させた。抽出液は0.45um孔径のフィルターで濾過し、イオンクロマトグラフィーで化学成分の定量を行った。その結果、ガス成分しか存在していないと考えられていた空隙内にエアロゾルがある程度の濃度で存在する可能性が見いだされた。当初予定していた札幌での観測は、例年にない暖冬のため札幌にある当研究所近傍の露場において乾いた積雪条件を得ることが不可能であり、行うことができなかった。上述の実験では、積雪深がせいぜい2m程度の国内にて観測を行う限り、地面と大気からの影響を無視した条件で観測を行うことが難しい。そのため、十分な積雪深を得られる海外の氷河においての観測を実施するための予備調査を行った。予備調査を行ったのは、カムチャツカイチンスキー氷河とグリーンランド北西部である。前者の調査では総合地球環境学研究所で実施されているプロジェクトと連携し行った。後者の調査は現地滞在者に協力を要請し観測を行った。現時点では、それぞれの観測地に長短所があり、来年度に行う観測地点を決定するには至っていない。
肝癌におけるキラ-T細胞に対する腫瘍特異的標的抗原の分子生物学的研究

私達は、細胞障害性T細胞株5B5が認識する腫瘍特異的抗原ATMー1を分子生物学的に研究する目的で、ヒト肝癌細胞株SKーHEPー1細胞からcDNAライブラリ-を作製し、免疫スクリ-ニングによりATMー1遺伝子のクロ-ニングを試みた。しかしながら、用いたモノクロ-ナル抗体では、ATMー1遺伝子のクロ-ニングは成功しなかった。そこで、ATMー1抗原を精製し、N端のアミノ酸配列を決定し、合成ペプチドに対する抗体を作製し、あるいは合成オリゴマ-を用いてATMー1遺伝子をクロ-ニングすることに計画を変更した。血清ATMー1値の高い肝癌患者血清からゲル濾過、抗ATMー1抗体アフィニティ-クロマトグラフィ-によりATMー1の精製を行ったが、使用した抗体の特異性が低いため、健常者血清も同様に処理し、得られた蛋白を電気泳動により比較することにより、ATMー1蛋白の同定を行い、N端のアミノ酸配列の決定を行った。その結果、2種類のアミノ酸の配列が得られ、一つは免疫グロブリン重鎖可変領域IIIのアミノ酸配列であり、これは、ATMー1と免疫複合体を形成し、一緒に精製されてきたものと考えられる。もう一つは、未知の蛋白のアミノ酸配列であり、今後この合成ペプチドを作製し、抗体を作りATMー1遺伝子の免疫スクリ-ニングを行うと共に、合成オリゴマ-を作製してのATMー1遺伝子のクロ-ニングも予定している。ATMー1測定の肝癌診断への応用に関しては、確立した測定系は、感度、特異性共に低く、実用的なレベルではなかった。今後は、ATMー1遺伝子クロ-ニングの後、遺伝子組換え技術によりATMー1を発見させ、これを用いて特異性、親和性の高いモノクロ-ナル抗体を作製し、新たな測定系を作る予定である。更に、抗ATMー1抗体の肝癌画像診断、ミサイル療法への応用も検討する予定である。本年度は、健常者末梢血リンパ球より樹立された細胞傷害性T細胞株が認識する腫瘍特異的標的抗原(ATM-1)の遺伝子クロ-ニングを行い。その肝癌組織における発現、肝細胞の癌化に伴う発現のon-offのメカニズムを明らかにすると共に、抗ATM-1の抗体の肝癌診断、治療への応用を検討するものである。当初ヒト肝癌細胞株の培養上清よりATM-1の精製を試みたが、培養上清中のATM-1量が非常に少ないことが判明し、ATM-1含量の多い肝癌患者血清より精製することに変更した。患者血清をゲル濾過したところ、分子量約70120万の分画にEIAにてATM-1活性が認められた。ATM-1活性のある分画を集め、抗ATM-1モノクロ-ナル抗体-セファロ-スビ-ズと反応させ、ATM-1を抗体に結合させ、よく洗浄後2Mグアニジンチオシアネ-トにより結合蛋白を溶出した。精製された蛋白を還元下にSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動したところ分子量3万と8万の位置に強い蛋白バンド、5万の位置に弱い蛋白バンドが認められた。これら蛋白のN端アミノ酸配列を分析したところ、分子量3万、8万、5万の蛋白は、それぞれIgMのκ鎖、μ鎖、αアンチトリプシンに相当することが判明し、免疫学的にも確認された。これは精製に使用したモノクロ-ナル抗体が認識するエピソ-ドがこれら蛋白分子にも存在することによることが考えられる。最近、ATM-1と抗体する結合は低イオン濃度では安定であるが、高イオン濃度では解離することが判明し、ATM-1と結合した抗体セファロ-スを高塩濃度で洗浄したため、ATM-1が失われた可能性が高く、再度ATM-1の精製を行っている。

抗ATM-1抗体によりATM-1抗原の組織中における存在を免疫組織学的に検索したところ、ATM-1は肝癌組織に強く発現していること。また、正常肝組織にも少量存在することが判明した。本研究は,健常者末梢血リンパ球より樹立された細胞傷害性T細胞株が認識する腫瘍特異的標的抗原(ATMー1)の遺伝子クロ-ニングを行い,その肝癌組織における発現,肝細胞の癌化に伴う発現のonーoffのメカニズムを明らかにすると共に,抗ATMー1抗体の肝癌の診断,治療への応用を検討するものである.ATMー1含量の多い肝癌患者血清をゲル濾過したところ,分子量約70120万の分画にEIAにてATMー1活性が認められた.ATMー1活性のある分画を集め,抗ATMー1モノクロ-ナル抗体ーゼファロ-スビ-ズと反応させ,ATMー1を抗体に結合させ,結合したATMー1を酸性溶出液にて溶出した.精製した蛋白は還元下では分子量約18万の蛋白であり,非還元下では多量体として存在することが判明した.この蛋白を臭化シアンで切断して得られた分子量約3.5万のペプチドのN端アミノ酸配列を分析したところ.ヒトα_2ーマクログロブリンのアミノ酸配列と一致した.精製したATMー1を免疫学的に検討したところ,ATMー1はα_2ーマクログロブリンに対する抗体及びATMー1に対する抗体の両者と反応するのに対し,精製したα_2ーマクログロブリンはATMー1に対する抗体とは反応せず,ATMー1は腫瘍特異的なα_2ーマクログロブリンであることが強く示唆される結果が得られた.現在,分子生物学的手法を用い,肝癌組織における腫瘍特異的なα_2ーマクログロブリンのmRNAの発現を検討中である.私達は、健常者末梢血リンパ球より樹立された細胞障害性T細胞株5B5の認識する腫瘍特異的抗原を(ATMー1)のN端のアミノ酸配列を決定するため、肝癌患者血清よりATMー1の精製を試みた。患者血清をセファロ-スCLー6Bカラムによりゲル濾過を行い、各分画のATMー1濃度を測定したところ、分子量約90万の分画にATMー1活性が認められた。ATMー1を含む分画を合わせ、濃縮後、抗ATMー1(N1977)抗体ーセファロ-スとインキュベ-トレ、ATMー1を抗体に結合させた後、酸性溶液でATMー1を抗体より解離させ溶出させた。溶出した分画にはATMー1活性を証明することはできなかったが、ATMー1分画と抗ATMー1抗体ーセファロ-スをインキュベ-トした後の上清には、ATMー1活性は認められず、ATMー1は抗体カラムに吸着されたと考えられることより、ATMー1活性は抗体カラムからの溶出条件で失われたものと考えられた。健常者血清も同様な手順により蛋白の溶出を行った。溶出した蛋白はSDSーポリアクリルアミト電気泳動を行い、フィルタ-にトランスファ-後、蛋白染色を行った。健常者血清からも蛋白が溶出されたため、健常者血清から精製された蛋白を対照としてSDSーポリアクリルアミド電気泳動を行ったところ、分子量約5.5万の位置に健常者血清では認められない蛋白バンドが認められ、この蛋白のN端のアミノ酸配列の解析を行った。アミノ酸配列の解析の結果、解析した蛋白バンドは約2種類の蛋白よりなることが判明した。
小細胞肺癌におけるネスチンの臨床的意義および治療標的としての研究

ネスチンは神経幹細胞に発現し中枢神経系発生に関わるVI型中間径フィラメント蛋白である。本研究では、ネスチンが小細胞肺癌の悪性形質や臨床転帰に及ぼす影響について検討した。ネスチンはin vivoにおける腫瘍増殖、さらに抗癌剤耐性にも関与していた。患者検体を用いてネスチン発現を免疫組織染色により検討したところ、二次治療における病勢制御率はネスチン陽性例でやや低い傾向にあった。さらに無増悪生存期間はネスチン陽性例で有意に短かった。本研究により、ネスチンは小細胞肺癌における抗癌剤耐性や臨床転帰へ影響を与える可能性が示唆された。小細胞肺癌におけるネスチンの臨床的意義を明らかにし、さらに新たな治療戦略の構築を目指して本研究を進めている。ネスチンを標的としたin vivoにおける抗腫瘍効果の評価のため、小細胞肺癌細胞株DMS53にshort-hairpin RNA発現ベクターを導入しネスチンをノックダウンした安定細胞株を樹立した。マウスへの皮下移植実験を行ったところ、ネスチンのノックダウンによる腫瘍形成能の抑制効果を認め、小細胞肺癌の増殖に対するネスチンの関与が示された。ネスチン発現調整メカニズムの解明に関しては、in vitroの検討を進めたところ、想定していたfibroblast growth factor receptor(FGFR)経路の関与は否定的との結果が得られつつある。そこで現在、新たな関連分子の発見をめざして網羅的な解析を開始している。小細胞肺癌の臨床検体におけるネスチン発現に関しては、まずは免疫染色の方法を確立した。そして現在までに目標症例数の半数となる約40例での検討を終えており、比較的高い頻度での陽性率を認めている。抗癌剤耐性化におけるネスチンの関与に関しては、複数の抗癌剤耐性肺癌細胞株およびその親株を用いて、ネスチンの蛋白発現を比較したところ、前者において発現亢進を認めた。ネスチンが抗癌剤感受性に関与する可能性が示唆されたため、現在DMS53およびそのネスチンノックダウン株を用いて抗癌剤暴露に伴うcell viabilityの差異につき評価を行っている。小細胞肺癌細胞株DMS53およびそのネスチンノックダウン株を用いて、それぞれマウスへ皮下移植したところ、後者で腫瘍形成能は有意に抑制された。ゆえにin vivoにおいても小細胞肺癌の増殖にネスチンが重要な役割を担うと考えられた。抗癌剤耐性化におけるネスチンの関連性を検討するため、上述の両細胞株における抗癌剤感受性をcell viabilityに基づき評価した。小細胞肺癌治療のkey drugであるSN38を用いて検討したところ、ネスチンノックダウン株では親株と比較してSN38に対する感受性の改善を認めた。一方、小細胞肺癌細胞株SK-LC-17にネスチン強制発現ベクターを導入してネスチン過剰発現安定細胞株を樹立することに成功したので、ネスチン過剰発現に伴う抗癌剤感受性の変化についても検討したい。ネスチンの発現調節メカニズムの解明については、当初想定していたfibroblast growth factor receptorの関与が否定的との結果を得たため、研究方法の変更を行った。即ち、DMS53とそのネスチンノックダウン株、さらにSK-LC-17とそのネスチン過剰発現株を用いて、網羅的な遺伝子発現解析を行った。前者間および後者間での差異を比較検討したところ、insulin-like growth factor 1 (IGF-1R)の関連性を示唆する結果を得た。現在、IGF-1Rによるネスチン発現調整に関する確認実験を進めている。小細胞肺癌の臨床検体におけるネスチン発現に関しては、現時点で名古屋市立大学病院44症例の解析を行った。ネスチン発現症例は40.9%で、陽性例と陰性例との間で年齢、性別、喫煙歴、病期などの患者背景の有意差は認めていないが、治療反応性や予後などの検討も進めている。研究協力者が平成27年度に転勤となったため、当初見込んでいた研究協力が得られなくなったことが主な理由である。また、小細胞肺癌の臨床検体におけるネスチン発現に関しては京都大学病院からの臨床検体の提供が遅れている。小細胞肺癌の病態形成におけるネスチンの重要性を基礎面および臨床面から明らかにし、新たな診療戦略の構築を目指して本研究を進めている。抗癌剤耐性化は小細胞肺癌患者における生存期間短縮へ直結するため、その分子機序を明らかにすることは新たな治療戦略の構築へ貢献しうる。そこで前年度に小細胞肺癌細胞株DMS53およびそのネスチンノックダウン株をもちいて、化学療法のkey drugであるSN-38の感受性を比較したところ、ネスチンノックダウン株において感受性の改善を認めた。そこで本年度は、小細胞肺癌細胞株SK-LC-17にネスチンを過剰発現させた株を樹立したため、SN-38の感受性を比較したところ、過剰発現株において有意な感受性低下を認めた。以上により、ネスチンは抗癌剤耐性化に関わる分子であることが示唆されたため、今後は他のkey drugであるCDDPやETPの感受性についても検討を行う予定である。小細胞肺癌の臨床検体におけるネスチン発現に関しては、免疫染色法による検討を行っている。本年度までに、名古屋市立大学病院の51症例の解析を行った。ネスチン発現陽性例は全体の41.2%を占めていたが、陽性群と陰性群との間で、年齢・性別・喫煙歴・進展型/限局型・血清ProGRP値などの患者背景に差を認めていない。