hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
レビー小体の形成機序の解明

パーキンソン病(PD)は神経細胞内封入体であるレビー小体(LB)により病理学的に定義される。LBのできる機序は未解明であるが、その主要構成タンパクであるアルファシヌクレイン(AS)の挙動変化がLB形成において中核的役割を担っていると考えられている。ASは細胞膜脂質に結合し、またASの挙動は結合する細胞膜脂質組成により変化することから、PD脳では、神経細胞膜の脂質組成に変化が生じ、これがASの挙動を変化させ、ついにはLB形成に至るとする作業仮説を立てた。これに基づき本研究では,LBを呈する脂質代謝異常症の動物モデルにおいて脳の脂質組成変化を明らかにした。本研究の目的は、レビー小体病(LBD,パーキンソン病、認知症を伴うパーキンソン病、レビー小体型認知症)を病理学的に特徴づける神経細胞体内封入体であるレビー小体の形成機序を解明することである。本疾患では加齢がリスクファクターの一つであり、高齢化社会に伴い、LBDの有病率は増加すると考えられる。現行の治療は患者のQOLを保つのに十分ではなく、その病態解明が急務である。LBDの原因は明らかになっていないが、レビー小体がその発症および進行に関与することは確実であることから、その形成機序を解明することにより効果的な治療法の開発が期待できる。内在性SNCAの発現が知られているヒト由来の培養細胞(HeLa細胞)にヒトの野生型および変異型GBA, PLA2G6をリポフェクション法により過剰発現させ、toxic gain-of-functionのモデルを作製した。生化学的解析により、いずれの変異型もSNCAの可溶性、膜結合性に変化を及ぼすことが示された。今後は、CRISPRにてGBA, PLA2G6の安定発現系を作製し、長期的経過によるSNCAへの影響を解析する。ヒトの野生型および変異型GBA, PLA2G6のトランスジェニックショウジョウバエを作製し、ショウジョウバエでは内在性のSNCA発現がないことから、SNCAトランスジェニックショウジョウバエとかけ合わせを行った。現在、生体内におけるSNCAの挙動および脂質解析を進めている。ヒト剖検脳を用いたレビー小体形成機序のアプローチとして、LBDとコントロールの剖検脳を用いたimaging MSを計画している。これまでにヒト脳のimaging MSの報告はなく、H27年度はimaging MS法の条件検討を行い、最適条件を確立した。今後は、LBD脳およびコントロール脳の帯状回前部を用いたimaging MSによる解析を進める。レビー小体病(LBD)モデルを作製することにより、レビー小体形成機序を明らかにするという当初の計画は、おおむね順調に進展している。ヒト培養細胞とショウジョウバエにGBA遺伝子およびPLA2G6遺伝子を導入することは達成され、SNCAの挙動解析の準備は順調と考えられる。マーモセットへの上記遺伝子導入が達成できていないが、哺乳動物個体におけるこれら遺伝子導入によるSNCAへの影響を解析する必要からトランスジェニックマウスを用いることとした。現在、Jackson Laboratoriesよりcryospermの納入待機中である。ヒト脳のimaging MSの条件設定は順調に進んでおり、LBDとコントロールの比較解析を開始する段階に入っている。本研究の目的はレビー小体病を病理学的に特徴づける神経細胞体内封入体であるレビー小体の形成機序を解明することである。本疾患は加齢がリスクファクターであり高齢化社会に伴いレビー小体病の有病率は増加すると考えられる。レビー小体病の原因は明らかになっていないが、レビー小体がその発症および進行に関与することは確実であることから、その形成機序を解明することにより効果的な治療法が期待できる。遺伝性脂質代謝異常症であるゴーシェ病(GD)では、レビー小体が形成されパーキンソン病類似の表現型が知られていることからGDのモデルマウスを解析することにより封入体形成のヒントを得る。28年度はGBAヘテロノックアウトマウスに脂質組成の異なる餌を与え、リピドミクスによりその影響を観察した。GBAヘテロノックアウトマウスの脳では低分子量の脂質組成の変化が起こっている可能性が示唆された。GBAヘテロノックアウトマウスのリピドミクスは条件設定に時間を要したが、低分子脂質の変化を確認した。同時にGBAの病的変異であるL444Pノックインマウスの作製が進行している。本研究はレビー小体病の病態解明を主眼とし、レビー小体がその発症および進行に関与することは確実であることから、その形成機序を解明することにより効果的な治療法が期待できる。遺伝性脂質代謝異常症であるゴーシェ病(GD)はGBA遺伝子のホモ変異によって若年に発症する重篤な疾患であるが、GBA遺伝子のヘテロ変異はパーキンソン病類似の臨床像を呈し、レビー小体が形成される。そこでGBAヘテロ変異を有するモデルマウスを解析することにより封入体形成の影響を観察した。GBAヘテロノックアウトマウスにω3系脂質組成の異なる餌を与え長期の渡る表現型を観察した。GBA野生型マウスとヘテロ変異群についてそれぞれ通常の餌を与えた群と脂質組成の異なる群を準備しロタロッド試験により行動試験を1年半継続して行った。ロタロッド試験では回転ローターからマウスが落下するまでの潜時を測定した。しかしながら野生群と遺伝子変異群、あるいは脂質組成の異なる各群においても明らかな差は認められなかった。

さらにパーキンソン病の病態と関連のある糖脂質としてGM1に着目した。各マウス群の脳を取り出しGM1を抽出した後LCMSによる定量を行ったが明らかな変化は認められなかった。一方で、リソソーム関連遺伝子に遺伝性パーキンソン病の原因遺伝子候補を見出しており、それら遺伝子改変マウスのリピドミクスによりいくつかの脂質の変化を見出している。それらの候補脂質は本研究課題で同時に行っている患者脳での解析でも見られる変化でありパーキンソン病の病態に脂質組成の変化が関与していることが推測された。パーキンソン病(PD)は神経細胞内封入体であるレビー小体(LB)により病理学的に定義される。LBのできる機序は未解明であるが、その主要構成タンパクであるアルファシヌクレイン(AS)の挙動変化がLB形成において中核的役割を担っていると考えられている。ASは細胞膜脂質に結合し、またASの挙動は結合する細胞膜脂質組成により変化することから、PD脳では、神経細胞膜の脂質組成に変化が生じ、これがASの挙動を変化させ、ついにはLB形成に至るとする作業仮説を立てた。これに基づき本研究では,LBを呈する脂質代謝異常症の動物モデルにおいて脳の脂質組成変化を明らかにした。上記により確立したヒト培養細胞モデル、ショウジョウバエモデル、マウスモデルを用いて、細胞膜脂質の変化をimaging MSを含めたリピドミクスにより明らかにする。同時に、細胞膜脂質の変化がSNCAに及ぼす影響を解明する。この脂質変化が実際のヒト脳においても起きているかを同様のリピドミクスにより検討する。以上によりLBDモデルの確立を目指し、このモデルを用いることにより新たな治療法の開発を試みる。LBDモデルの摂取脂質の調整、LBDモデルを用いた薬物スクリーニングを想定している。ドーパミン細胞特異的オートファジー欠損マウスはレビー小体類似の凝集体を形成することを見出しているため、当該マウスについても脂質解析を追加し凝集体形成機構に迫る。脳神経内科上記のヒト培養細胞、ショウジョウバエ、マウスのLBDモデルへの摂取脂質の効果を解析する際に、当初計画より長期にわたりその効果を観察解析する必要があると考えられるため。マウスに期待される表現型が出現しなかったため経過観察に時間を要したため。脂質組成を調整した培養液、ショウジョウバエおよびマウスのエサの追加オーダーに使用する計画である。また、長期飼育管理のために飼育ケージ等の増設に使用する計画である。観察期間の延長にともない、生化学的解析、リピドミクスによる追加評価も必要となる。新たなモデルマウスと脂質の解析手法を導入する。
内視鏡・胃壁固定具補助下経皮的胃全層生検の有用性に関する研究

消化管運動知覚神経や筋肉に器質的異常を有する疾患群は、診断のために消化管壁全層組織を得る必要があり、開腹または腹腔鏡手術による組織採取が通常行われる。本研究は内視鏡・胃壁固定具補助下に生検針を用いた経皮的胃壁全層組織採取の安全性と診断有用性を検証した。安全性に関して、観察期間に本手技に関連した有害事象は認めなかった。診断有用性に関して、神経筋疾患の病理組織学的診断に適切で十分な生検標本を得る事が出来なかった。生検針の改良や生検針サイズ選択が今後の課題に挙がった。消化管運動知覚神経や筋肉に器質的異常を有する疾患群は、通常の消化管内視鏡下粘膜生検では診断が不可能であり、消化管全層組織を得るために開腹または腹腔鏡手術による組織採取が現在行われている。本研究は、安全に、また十分に診断可能な胃全層組織を経皮的生検にて可能であるか検証する目的に計画された。平成25年度は、本研究の手技に関する安全性を最も重視して研究を実施した。具体的には胃モデルを用いて、組織の十分な採取を目的とした生検針の選択、刺入および生検法の工夫を複数回に渡って確認し、現時点での最良の手法を検討した。また本年度は胃瘻造設が予定された症例を対象として、本研究への参加を自己意志にて同意された2症例に内視鏡・胃壁固定具補助下経皮的胃全層生検を行った。2症例とも入院管理下で手技を行い、胃瘻造設時の手技のため胃瘻造設部位に限局されはしたが、内視鏡観察下に胃壁固定、引き続いて皮膚小切開の上、生検針を用いて胃漿膜側から胃粘膜側方向に向かって数回穿刺吸引胃全層生検を行った。生検時は内視鏡にて確実に胃内へ生検針が挿入されている事、また対側胃壁や多臓器への穿刺が行われていない事、穿刺時および穿刺後に出血や血腫形成がない事を内視鏡で確認しながら手技を終了した。穿刺に伴う偶発症は2症例ともに認めず、また穿刺後の入院経過中に本手技に伴う有害事象の発生は認めなかった。本研究開始である初年度に、2症例に経皮的胃全層生検を安全に行えた事は非常に重要で、今後に繋がる成果と考えている。今後は病理組織学的特徴が報告されている胃麻痺症例に実施する事で、本手法の妥当性を評価する必要があり、胃麻痺患者の抽出のため上腹部症状を訴える患者への内視鏡検査、また疑わしい症例には13C呼気試験を用いた胃排出検査を行い、3症例程の対象患者が抽出されたが、本手技実施までには現状至っていない。平成26年度は、これまで同様に手技の安全性の評価を継続するとともに、本手技における組織採取の妥当性を重視して研究を実施した。胃モデルを用いて選択された生検法を、本研究参加に同意した対象者に対して実際に行い、得られた組織を病理専門医に組織評価してもらい本手技の有用性を検討した。病理評価検体は患者疾患毎に層別化する事無く、得られた検体すべて評価対象とし、胃平滑筋の採取状況、筋層間神経叢等の認識の有無を第一の評価項目として検討した。結果は胃平滑筋が得られた症例も存在するが、多くの症例で十分な胃全層組織採取が得られておらず、皮下結合織や横紋筋が検体成分の多くを占めていた。すなわち実際の患者を対象とした体外からの胃生検は、胃モデルとは異なり我々が選択した方法では不十分である事が判明した。安全性に関しては、生検後に偶発症が発生した症例は経験されず、胃壁腹壁固定下・内視鏡観察下での体外からの生検針刺入は安全な方法と認識された。また、本研究への参加を促す患者のリクルートの一環として、当院に入院となった消化管運動機能異常の患者を対象として13C呼気試験を用いた胃排出能検査を行い、胃運動機能異常を呈する患者の抽出を行った。本研究の結果は、当教室の大学院生松浦瑞恵医師が第101回日本消化器病学会総会ワークショップ13:消化器疾患の機能検査法と機能に基づいた治療戦略において、演題名「消化管機能障害患者の胃排出能の検討ー13C呼気テストを用いてー」を発表報告した。平成27年度は、本研究参加に同意された対象者に対する経皮的胃全層生検の試みが、全ての症例において十分な組織採取を得られるものではない事がこれまでの経過から判明したため、生検に用いる生検針の種類やゲージ数、穿刺方法を再検討する作業を中心に研究を進めた。

従来と比較してゲージ数を太くする事で組織採取量は増加し、病理組織評価が可能な検体が得られる可能性が得られたが、胃モデル(豚)を用いた検証であり、実際のヒトを対象とした検討では手技の妥当性が得られるか検討が必要である。特にこれまでの手法では腹壁穿刺による腹壁横紋筋や皮下組織の混入が胃平滑筋採取に対する支障となっている印象であり、改良した処置具での手技時には安全性も加味して腹壁固定を増やす、組織剥離を十分行う、複数回の穿刺生検等、検証必要な事項が課題として挙がった。本年は抜本的な手法に関する見直しが必要であったため、実際の本研究へのリクルートは積極的に行う事が出来なかった。参加を促す患者リクルートの一環として、当院に入院となった消化管運動機能異常の患者を対象として13C呼気試験を用いた胃排出能検査を行い、胃運動機能異常を呈する患者の抽出を行っていく。胃運動研究に関する結果は、当研究室の川名憲一医師が第101回日本消化器病学会総会にて、演題名「ルビプロストン内服における悪心と上部消化管の通過時間に関する検討13C呼気試験法を用いて」を発表報告した。従来の手法では評価に十分な胃全層組織が得られ難い事が病理学的に判明し、本手技の方法を抜本的に見直す必要性が生じている。本年度は手法の再検等を行うなど実際の症例集積が進まず予定していた研究計画に遅れが生じている。消化管運動知覚神経や筋肉に器質的異常を有する疾患群は、通常の消化管内視鏡下粘膜生検では診断が不可能であり、消化管全層組織を得るために開腹または腹腔鏡手術による組織採取が現在行われている。本研究は、安全に、また十分に診断可能な胃全層組織を経皮的生検にて可能であるか検証する目的に計画された。これまでの研究経過から我々が当初設定したプロトコールに従った経皮的胃全層生検の試みでは、筋層間神経叢を評価するための十分な組織採取を得る事が困難であることが判明したため、生検に用いる生検針の種類やゲージ数、穿刺方法を再検討する手技的側面の抜本的見直しを行う事を中心に研究を進めた。胃モデル(豚)を用いた検証で生検針の種類や穿刺法は組織採取量に影響しなかったが、穿刺針のゲージ数を太くする事(18G→15G)で組織採取量の増加が得られ病理組織評価が可能な検体が得られた。しかし胃モデルを用いた検証であり、実際のヒトを対象とした検討を行う前に穿刺針の径を太くする事による本手技の侵襲性を再度慎重に考慮する必要性が生じた。特にこれまでの手法では腹壁穿刺による腹壁横紋筋や皮下組織の混入が胃平滑筋採取の支障となっており、穿刺部位の皮膚・皮下組織の剥離を十分行い、複数回の穿刺生検が必要と考えられ、出血の危険性が従来プロトコールより増加する可能性も推察された。また本研究の対象としてGastrointestinal neuromuscular diseasesを有する患者以外に、咽喉頭・食道癌や脳血管障害を病態とする嚥下障害に対する胃瘻造設を要する患者を対象としており、合併症発生は厳に慎まなければならず、倫理面および患者へのInformed consentの点で新たな処置具による経皮的胃全層生検は行う事が出来なかった。消化管運動知覚神経や筋肉に器質的異常を有する疾患群は、診断のために消化管壁全層組織を得る必要があり、開腹または腹腔鏡手術による組織採取が通常行われる。本研究は内視鏡・胃壁固定具補助下に生検針を用いた経皮的胃壁全層組織採取の安全性と診断有用性を検証した。安全性に関して、観察期間に本手技に関連した有害事象は認めなかった。診断有用性に関して、神経筋疾患の病理組織学的診断に適切で十分な生検標本を得る事が出来なかった。生検針の改良や生検針サイズ選択が今後の課題に挙がった。本手法の安全性が確立される事が本研究を継続していく上で研究前半の最重要事項であるため本年度も重要な評価項目として研究を継続した。
サイトメガロウイルス胎内感染による脳の神経細胞死の発生機序に関する実験的研究

サイトメガロウイルス(CMV)は胎生期に感染によって脳障害の生ずる最も頻度の高い病原微生物である。私達はマウスCMV(MCMV)を胎生期のマウス脳に感染させて生後における脳障害を組織学的に解析する実験モデルを作成した。このモデルにおいて、MCMVの感染によって新生マウス脳にアポトーシスが誘導されることを明らかにした。アポトーシスが誘導される細胞は、神経細胞、グリア系細胞は数パーセントと少なく、ミクログリアに多かったが、これはミクログリアがアポトーシスに陥っているというより、アポトーシスに陥った細胞を貪食している可能性が高かった。MCMV感染によって神経細胞が脱落、消失しやすいことから神経細胞にアポトーシスが誘導される可能性が高い。TUNEL法と免疫染色の二重染色によりウイルス感染細胞がアポトーシスに陥る可能性少ないことより、神経細胞死はMCMV感染による間接的作用と考えた。初代培養神経細胞にグルタミン酸添加または、血清除去法でアポトーシスを誘導する系にMCMVを感染させるとアポトーシスが抑制される傾向を示した。CMVによる神経細胞のアポトーシスの誘導はサイトカインなどによる間接作用の可能性がある。この点に関しては大脳スライス培養にMCMV感染させ各種サイトカインを添加する実験系で解析している。CMVの前初期(IE)遺伝子発現がアポトーシスの誘導を抑制するという論文があり、MCMVのどの遺伝子がアポトーシスを促進あるいは抑制するかを知るためにマウス神経芽細胞培養株(N18TG2)にIE遺伝子および早期遺伝子を導入したトランスフォーマント(変異株)を作成した。これらのアポトーシスの誘導はIE発現株では促進されたが、早期抗原発現株では変わらなかった。さらにIEのうち、ie1,ie2,ie3の3種類の遺伝子を導入した変異株を作って検討している。1.マウスサイトメガロウイルス(MCMV)による発育期脳のアポトーシスの誘導:胎生後期マウス脳にMCMVを感染させ、新生児マウス脳を取り出しTUNEL法によって大脳皮質および海馬の領域にアポトーシスが誘導されることを明らかにした。TUNEL法と神経特異抗原であるneuron-specific enoiase(NSE)、グリア細胞特異抗原であるGFAP、ミクログリアの特異抗原(F4/80)に対する抗体を用いた二重染色を行なった。NSE、GFAPと二重染色される細胞は数パーセント以下であったが、F4/80と二重染色される細胞は30%であった。またウイルス抗原と二重染色されるTUNEL陽性細胞も数パーセント以下で、MCMV感染脳においてこれらの領域の神経細胞が有意に減少した。これらの結果よりアポトーシスの誘導される細胞はMCMVに直接感染した細胞でなく、MCMV感染によって間接的に生じ、ミクログリアによって責食される可能性を示した。初代培養神経細胞にMCMVを感染させると、血清除去あるいはグルタミン酸によって誘導されるアポトーシスが抑制されることを示した。2. MCMV遺伝子前初期および早期遺伝子発現と神経系細胞株のアポトーシス誘導との関係:マウス神経芽細胞腫由来のN18/TG2細胞にMCMV前初期遺伝子、早期遺伝子またはその発現ベクターを導入した細胞株を作成し、これらの細胞株に血清除去法でアポトーシスを誘導したところ、前初期遺伝子導入株においてアポトーシスが促進された。早期遺伝子導入細胞株においては影響を認めなかった。私達はマウスCMV (MCMV)を胎生期のマウス脳に感染させて生後における脳障害を組織学的に解析する実験モデルを作成した。

アポトーシスが誘導される細胞は、神経細胞、グリア系細胞は数パーセントと少なく、ミクログリアに多かったが、これはミクログリアがアポートシスに陥っているというより、アポトーシスに陥った細胞を貧食している可能性が高かった。MCMV感染によって神経細胞が脱落、消失しやすいことから神経細胞にアポトーシスが誘導される可能性が高い。TUNEL法と免疫染色の二重染色によりウイルス感染細胞がアポトーシスに陥る可能性が少ないことより、神経細胞死はMCMV感染による間接的作用と考えた。初代培養神経細胞にグルタミン酸添加または、血清除去法でアポトーシスを誘導する系にMCMVを感染させるとアポトーシスが抑制される傾向を示した。CMVによる神経細胞のアポトーシスの誘導はサイトカインなどによる間接作用の可能性がある。この点に関しては大脳スライス培養にMCMV感染させ各種サイトカインを添加する実験系で解析している。CMVの前初期(IE)遺伝子発現がアポトーシスの誘導を抑制するという論文があり、MCMVのどの遺伝子がアポトーシスを促進あるいは抑制するかを知るためにマウス神経芽細胞培養株(N18TG2)にIE遺伝子および早期遺伝子を導入したトランスフォーマント(変異株)を作成した。これらのアポトーシスの誘導はIE発現株では促進されたが、早期抗原発現株では変わらなかった。さらにIEのうち、ie1,ie2,ie3の3種類の遺伝子を導入した変異株を作って検討している。
コラーゲンに着目した超音波骨質評価法の開発

AGEs架橋を生成した骨試料中の音速評価から、架橋が骨の弾性的性質に及ぼす影響を実験的に検討した.大型動物の皮質骨試料では架橋生成により音速の低下が確認された.今回用いた光散乱法によるGHz域の音速測定は,8μm径程度の局所領域の測定であり,骨マトリクスの評価が可能となる.得られた結果から,骨のマトリクスの弾性がAGEs架橋生成により低下した可能性が見いだされた.板状試料全体の平均音速を評価するMHz域の音速測定では,音速の精密な測定が困難であった。しかし,培養後の試料の強度を三点曲げ試験で評価したところ,AGEs生成試料は明らかに低強度を示した.骨組織の粘弾性を定量的に測定し、疾病などにより劣化したコラーゲンなどの「骨質」を安全に評価する超音波技術を開発するため、下記の研究を行った。ウシなどの大型動物の皮質骨を用いて、樹脂包理なしに研磨により厚さ100μm以下の薄片試料を作成した。これらの試料中に人工的にAGEs(Advanced Glycation End Products)による架橋を生成した。14日程度の糖化により通常の2-3倍の架橋の生成を液体クロマトグラフ(HPLC)アミノ酸分析システムを用いて確認した。このAGEsによる骨の弾性変化を骨基質マトリクス中の音速変化として観測するため、顕微Brillouin光散乱計測システムを改良し、スポット径10μm程度の領域のGHz域の縦波音速測定に成功した。この程度の空間分解能があれば、骨のマクロな構造の影響を回避して音速測定が可能となる。生理食塩水のみに浸漬した参照試料と糖化を行った試料のそれぞれを複数作成し、糖化による音速変化を検討したところ、糖化試料では浸漬開始後3-4日で音速がわずかに増加した後、低下に転じ、最終的には音速低下が初期音速の5-6%に達した。しかし、参照試料ではこのような変化が観測されなかった。試料の質量は大きく変化しなかったことから、この結果は架橋の進捗に伴う弾性の低下を示唆している。同様な検討を、I型コラーゲンフィルムを用いて行ったところ、やはり糖化した試料のみ音速(弾性)低下が観測された。これらの結果より、糖化が骨質に影響し、特に糖化が著しい場合には力学的性質に大きく影響することが確認された。コラーゲンなどの「骨質」を非侵襲かつ安全に評価する超音波技術を開発するため下記の研究を進めた。Brillouin光散乱法では、集光により薄片試料中の10μm径程度の微小領域の音速測定ができ、骨微細構造の影響なしに骨質測定が可能となる。本研究では樹脂包埋せずに100μm厚程度の薄片試料を作成し、糖化培養により試料中にAGEs架橋を生成した。液体クロマトグラフのアミノ酸分析システムにより、14日の糖化培養では無糖化参照試料の2-3倍の架橋生成を確認した。この試料の糖化培養過程で音速を計測したところ、培養開始後3-4日で音速がわずかに増加した後低下に転じ、最終的には全試料で5-6%の音速低下を認めた。無糖化試料ではこのような音速変化はなかった。この結果は糖化による力学的性質の変化を示している。MHz域の超音波測定においても糖化の影響を確認した。厚さ0.51.0mmの板状試料を作成し、糖化培養過程で音速を観測した。波長に比べて板厚が小さいため音速の精密測定が困難であったが、すべての糖化試料、無糖化試料で音速が低下し、音速低下は無糖化試料で著しかった。また糖化の1試料において、光散乱計測と同様に初期の音速上昇とその後の低下が観測された。なお培養後の糖化試料の強度を3点曲げ試験で評価したところ、糖化試料がより低負荷で降伏に至った。MHz域の測定では、全試料中を伝搬する音波の平均音速を計測する。試料中の微細構造の変化や微小クラックの影響を受けて音速が低下した可能性がある。しかし,培養後の試料の強度を三点曲げ試験で評価したところ,AGEs生成試料は明らかに低強度を示した.当初困難と考えていた薄片試料の作製に成功するとともに、骨中の微小領域の音速測定が可能となった。骨のような不透明材料の光散乱測定は信号が微弱であるため困難であったが、研磨の工夫により可能となった。今回の研究では、AGEsが生成された試料中の音速が低下した。AGEsが生成された骨の強度低下はすでに力学的手法などを用いて報告されているが、音速や弾性的性質の変化についてはまだ報告されていない。架橋が生成されると、その程度によっては弾性の増加も予測される。本研究結果は、AGEsによる骨質の変化についてこれまでにない内容であり、当初予定していた研究計画以上に進展している。

この成果をうけて、一般の超音波診断装置と同程度のMHzの周波数で、in vivoに近いサイズの骨の糖化と音速の関連を測定するシステムの構築も始めており、27年度の研究遂行に向けて準備も整いつつある。電気電子計測26年度の研究内容をもとに、市販の超音波骨診断装置と同程度の音速測定システムを構築し、in vivoの骨程度のサイズ(厚さ1-数mm)の試料を用いて、糖化と音速の関係について検討する。実際の糖尿病患者のAGEs生成についても、文献調査を進め、疾患による骨の変化が音速変化として評価可能であるかどうかを検討する。架橋量の測定については26年度と同様に液体クロマトグラフ法を用いる。Brillouin光散乱による骨評価も継続し、電子顕微鏡なども利用して、糖化した骨の構造変化や物性変化がどのように音速変化に寄与しているか検討を進め、骨の音波物性の理解に努める。実際の研究遂行に際し、物品費や人件費等の運用上714円の次年度使用額が生じた。26年度の残額は27年度の物品費や人件費などの運用に使用する。
複数日にわたるデポジット・返金制度を考慮した新たな混雑課金政策の分析技術の開発

都心部流入時課金の最適設計においては,課金レベルと課金区域の2つの考慮すべき要素がある.既存研究では,所与の課金区域に対して,課金レベルのみを最適化していることが多かった.本研究では,エリア課金の課金レベルと課金区域の同時最適化の計算法を新たに開発し,実都市圏に適用して,その実用性・有用性を明らかにした.このほか,ピーク・ロード・デポジットと呼んでいる複数日でのポジット・返金制度を考慮した新たな混雑課金政策について,一週間単位での時空間パスを考慮したネットワーク均衡モデルを提案して,その政策の特性の基礎を明らかにした.都心部流入時課金の最適設計においては,課金レベルと課金区域の2つの考慮すべき要素がある.既存研究では,所与の課金区域に対して,課金レベルのみを最適化していることが多かった.本研究では,エリア課金の課金レベルと課金区域の同時最適化の計算法を新たに開発し,実都市圏に適用して,その実用性・有用性を明らかにした.このほか,ピーク・ロード・デポジットと呼んでいる複数日でのポジット・返金制度を考慮した新たな混雑課金政策について,一週間単位での時空間パスを考慮したネットワーク均衡モデルを提案して,その政策の特性の基礎を明らかにした.1.本研究の基礎となる混雑課金政策に関する分析技術の最新の研究動向をレビュー論文として取りまとめた。次善課金の分類整理・課金収入の返金法に着目した新政策について重点的に紹介し、既存の研究成果の体系化、今後の研究展望も試みた。2.現実的な次善課金には、流入時コードン、流出入時コードン、エリア課金、上限付コードン、到着地別デポジット付課金など、さまざまな種類がありうることを指摘し、それらの特徴の違いを、研究代表者らが既存研究で構築しているモデルを改良して分析した。最適課金レベル、最適課金時の収入などに違いが生じることを現実都市圏を対象に実証的に明らかにした。3.都心部流入時課金の最適設計においては、課金レベルと課金区域の2つの考慮すべき要素がある。既存研究では、所与の課金区域に対して、課金レベルのみを最適化していることが多かった。本研究では、エリア課金の課金レベルと課金区域の同時最適化の計算法を新たに開発し、実都市圏に適用して、その実用性・有用性を明らかにした。この計算法の開発・適用により、エリア課金とコードン課金の違いについて、新たな知見が得られており、実政策上の有用性も高い。具体的には、最適エリア課金領域と最適コードン課金領域の形状は大幅に異なり、その最適値において、社会的余剰値は、コードン課金のほうが高いこと、領域の形状・大きさの変化に対しての安定性はエリア課金のほうが高いことなどである。さらに、本計算法は、複数目でのデポジット・返金制度を考慮した本研究の主題の新制度の最適設計への応用が次年度以降期待できる。平成21年度までに構築していた道路混雑課金(ロード・プライシング)政策の最適設計アルゴリズムを複数の実都市圏に適用し政策の特性についての考察を深めた。具体的には、エリア課金の課金レベルと課金領域を同時に決定するアルゴリズムを、熊本都市圏道路ネットワークに適用し、課金区域内の交通量が減少すること、都心部を横断する国道3号と県北東部を結ぶバイパスの交通量が減少すること、最適課金額は、100円となることを明らかにした。コードン課金についても同様に分析したところ、課金領域の形状は、国道3号と南方のバイパスに沿った細長い形状になり、最適エリア課金の形状と異なることが示された。最適コードン課金額は25円で、最適エリア課金額の値よりも低いことが分かった。昨年度適用した宇都宮都市圏における計算結果と比較すると、宇都宮では最適コードン課金が最適エリア課金よりも社会的余剰は高いが,熊本では逆の結果となっている。最適課金領域の大きさについてのエリアとコードンの比較についても宇都宮と熊本では逆の関係であり、これらの点についての一般的/普遍的な関係は導けないと考えられることなどが確認された。このほか、ピーク・ロード・デポジットと呼んでいる複数日でのポジット・返金制度を考慮した新たな混雑課金政策について、一週間単位での時空間パスを考慮したネットワーク均衡モデルを提案して、単純なネットワークに適用し、その政策の特性の基礎を明らかにした。
GPSとInSARを統合した地盤変位計測による時空間切れ目のない安全監視技術開発

DInSARによる変位計測における数値標高モデルの精度の影響を29年度に続き調査した.特に,計測期間中に掘削によって地形(高さ)が変化するような鉱山斜面の場合,最新の標高モデルを用いること,最新の標高モデルはInSARによって求めることができること,数cm精度の計測をするためには干渉させる衛星間距離を150m以下とすることが望ましい,などを明らかにした.また,年間を通じて精度の良い計測を行うためにマイクロ波の対流圏遅延の影響は大きな課題であり,30年度,高度な解析を必要としない簡易な補正法を考案し, 30年度は阿蘇山に調査に行き,新たに提供を受けたGPS計測結果と本法によるDInSAR結果を用いて妥当性を検証した.基礎研究とともに,本研究成果の実課題への適用性の検証と課題の解決が重要である.まず,インドネシアのスマラン市における広域地盤沈下の長期観測に対し29年度提案した欠測期間も含め挙動を接続する新しいデータ処理法を用い,時間-空間切れ目のない計測を実施した.このテーマはインドネシア地理情報庁とバンドン工科大学との国際共同研究として継続している.また,ボスニア・ヘルツェゴビナのトゥズラ市の地下岩塩採掘による地盤沈下の観測も継続し,現地と連携し過去の観測結果との整合性とともに,最新のGPS計測結果を入手し本研究の妥当性を検証した.これは,トゥズラ大学等との国際共同研究である.さらに,これに加えて,スロベニアの南西部の広域地すべり地帯,ブルガリア黒海沿岸の地すべり地域,への本研究成果の適用を新たに開始し,それぞれ国際共同研究として進めている.GPSについては,低コストセンサーの有効性の基礎および現場計測実験を行い,精度が多少劣っても連続計測により従来のスタティック法とそん色ない結果が得られること,数Hz程度の動的計測が可能なことを明らかにした.地盤変位の時空間連続の切れ目のない計測体制の確立に向けて,GPS変位計測の汎用化と高度化(低コストセンサー利用と動的計測),DInSAR変位計測の実用化への課題解決(誤差低減,時系列解析,悪受信条件における対応),および,研究成果に基づく国際共同研究の推進,の進捗を図っている.研究実績の概要に示すようにすべて順調に進んでいる.31年度は研究最終年度となるために,それぞれの課題について,(1)低コストGPSセンサーによる変位法の確立(汎用化と動的計測),(2)DInSARによる実用的な地盤変位計測法の確立(誤差低減,時系列解析,悪干渉条件下の処理,結果の解釈),(3)国際共同研究の推進,を図る.具体的には,これまで提案し検証してきた方法,国内外から入手した様々なデータを用いて実施する.そして最終的には,研究目的であるGPSとDInSARを統合した時空間切れ目のない地盤変位計測法として取りまとめる.28年度の研究は大きく2つに分けられる.1.新しいGPSセンサーの性能調査空間高密度の計測を実現するために低コストセンサーによって従来と同程度のmm精度の計測が可能であることが示された.さらにより低コストとするためにナビゲーション用のアンテナを用いて性能調査を行った.電波の反射を防ぐ電波吸収グランドプレーン(GP)を用いることで,従来の高性能アンテナに比べて20%程度の精度低下はあるものの数mm単位の変位計測が可能であることが示された.次に時間高密度(短周期)の計測を実現するためにキネマティック方式と平均化手法を組み合わせる方法を用いた.30秒周期の計測結果を10分平均することで,1時間周期のスタティック方式と同程度のmm精度の計測が可能であることが分かった.この方法を30秒周期で実施すると30秒周期でmm計測が可能となる.実験はGP付きナビゲーションアンテナでも実施し,20%程度の精度低下はあるものの実用性に耐えることが分かった.2.InSARの変位計測適用のための課題抽出と解決InSARの適用対象として,広域地盤沈下,長大斜面,火山,地震後の地盤変動を対象に適用性と課題を調べた.広域地盤沈下では時系列解析を,長大斜面では地形解析を含めた計測精度の限界を調べた.いずれもGPS計測結果との比較を行い,一次元的な変位をcm程度の精度で計測できることが示された.ただし,適切なフィルターのウィンドウサイズ,アンラップ法など問題によって異なるため,対象と目的精度にあわせた選択が必要である.次に,熊本地震による地盤変位計測と被害との対応について調査した.変位は領域平均値となり,現時点では直接被害を検出することは困難である.一方,干渉性を調べることにより液状化領域や被害家屋などが検出できる可能性が示された.火山については,水蒸気爆発の前兆の山体膨張が顕著に見てとれた.前年度の計画どおりに,センサーの基本性能調査を実施し明確な成果を得た.成果としては,新しい低コストのセンサーでも従来と同精度の計測が実施できる,より安価なアンテナを用いた場合,20%程度の程度低下はあるが,これを許容できる場合,十分実計測に適用できる.一方,InSARによる地盤変位計測では,広域地盤沈下,長大斜面監視,地震後地盤変位検出,火山動態観測への適用性が示された.29年度の研究成果を列挙する.1.DInSARの精度検証:数km2におけるDInSARによる変位計測について,標高モデルによる精度を調査し,衛星基線長が大きいと標高の精度(数m程度)が変位の計測精度(cm程度)に影響があることを明らかにした.

標高モデルの作成から変位計測結果を得るまでの手順を整備し,鉱山斜面に適用しGPS変位計測結果と比較して妥当性を検証した.2.DInSARの補正法(対流圏遅延):DInSARにおいてはデータ取得の季節差とともに標高差によっても対流圏遅延の影響を受ける.補正方法をすでに提案されているが,その方法の適用は研究者以外の一般技術者には困難である.そこで,対流圏遅延誤差が標高に比例することをGPS計測によって明らかにしたので,その性質を活用した簡易な対流圏遅延誤差の低減法を提案し,阿蘇山の火山活動にDInSAR解析を適用し妥当性を検証した.3.実課題への適用:インドネシアのスマラン市における広域地盤沈下の長期観測に時系列DInSAR解析を適用し,欠測期間も含め挙動を連続的に接続する新しい方法を提案した.その結果,空間的な地盤沈下だけでなく,時系列的に切れ目のない計測ができることになった.さらに,ボスニア・ヘルツェゴビナのトゥズラ市の岩塩採掘による地盤沈下の観測に適用した.同市では,過去にGPSによる広域観測が実施されているが,その後,広域観測が行われていない.本研究の結果は過去の観測と整合するだけでなく新たな情報も把握できたため,今後継続し安定評価を実施する予定である.4.GPS新センサーの改善:昨年度までのセンサーにさらに改良を加え,無線でリアルタイム計測ができるようになった.精度や適用性について調査中である.時空間連続計測の確立に向けて,手法の提案,整備,また,センサーの開発は順調に進んでいる.また,研究成果の実証のための現場適用事例も深化,拡大し,成果を紹介する先々で研究連携の申し出を受けている.DInSARによる変位計測における数値標高モデルの精度の影響を29年度に続き調査した.特に,計測期間中に掘削によって地形(高さ)が変化するような鉱山斜面の場合,最新の標高モデルを用いること,最新の標高モデルはInSARによって求めることができること,数cm精度の計測をするためには干渉させる衛星間距離を150m以下とすることが望ましい,などを明らかにした.また,年間を通じて精度の良い計測を行うためにマイクロ波の対流圏遅延の影響は大きな課題であり,30年度,高度な解析を必要としない簡易な補正法を考案し, 30年度は阿蘇山に調査に行き,新たに提供を受けたGPS計測結果と本法によるDInSAR結果を用いて妥当性を検証した.基礎研究とともに,本研究成果の実課題への適用性の検証と課題の解決が重要である.まず,インドネシアのスマラン市における広域地盤沈下の長期観測に対し29年度提案した欠測期間も含め挙動を接続する新しいデータ処理法を用い,時間-空間切れ目のない計測を実施した.このテーマはインドネシア地理情報庁とバンドン工科大学との国際共同研究として継続している.また,ボスニア・ヘルツェゴビナのトゥズラ市の地下岩塩採掘による地盤沈下の観測も継続し,現地と連携し過去の観測結果との整合性とともに,最新のGPS計測結果を入手し本研究の妥当性を検証した.これは,トゥズラ大学等との国際共同研究である.さらに,これに加えて,スロベニアの南西部の広域地すべり地帯,ブルガリア黒海沿岸の地すべり地域,への本研究成果の適用を新たに開始し,それぞれ国際共同研究として進めている.GPSについては,低コストセンサーの有効性の基礎および現場計測実験を行い,精度が多少劣っても連続計測により従来のスタティック法とそん色ない結果が得られること,数Hz程度の動的計測が可能なことを明らかにした.
アメリカの「文化戦争」における「信教の自由」をめぐる新たな問題状況に関する研究

近年、アメリカでは、いわゆる「文化戦争」を背景に、保守的な信仰を有する企業経営者等の経済的主体が信教の自由に対する侵害を理由に人工妊娠中絶の権利や同性愛者の権利の保護を目的とする法律の適用を争うという新たな問題状況が生じている。これに伴い、宗教に対する法適用免除をめぐるリベラル派と保守派の対立構図にも一定の「変容」が見られ、経済的主体による信教の自由の主張を広く認めようとする保守派の議論に対抗すべく、経済的主体と信教の自由との関係性を根源的に問う議論がリベラル派から示されている。本研究は、かかるアメリカにおける信教の自由をめぐる新たな問題状況について、判例の動向と学説の議論を中心に分析する。
C型肝炎ウイルス感染性粒子産生に関与する細胞性因子の同定とその機能解析

C型肝炎ウイルス(HCV)複製を支持する細胞性因子であるシクロフィリン(CyP)のサブタイプのうち、CyP40が重要な役割を果たしていること、またCyP阻害剤の抗HCV活性に対する耐性がHCV NS5A遺伝子内の一アミノ酸置換により付与され、CyPA要求性の低下が生じることをCancer Science誌に報告した。さらにシクロオキシゲナーゼ阻害剤として知られるSC-560がHCVレプリコン細胞において抗ウイルス効果を示し、インターフェロンとの併用はより強い抗ウイルス効果を発揮したことをAntiviral Chemistry and Chemotherapy誌に報告した。加えて米国において、HCVレプリコン細胞を用いたRNAi-mediated genome-wide screenによりHCV複製への関与が示唆された細胞性因子候補の解析を新たに開始した。とりわけ有意な結果を示したリン(酸化酵素に着目した。Small interfering RNA (siRNA)による遺伝子発現抑制はレプリコン細胞、感染性粒子産生系においてウイルス複製を抑制したが、siRNAに標的されない配列を有する遺伝子の過剰発現はこの抑制効果を解除したことから、本酵素によるウイルス複製の支持は特異的なものであることが裏付けられた。さらに本酵素の機能を欠失した点変異体、機能ドメインを欠失した変異体を各種作製した。これらは今後本酵素のHCV複製促進様式を明らかにするものとなる。以上の情報はHCVの複製、増殖への細胞性因子による貢献メカニズムをさらに解明すると共に、より特異的かつ効果的な新奇抗HCV剤、抗HCV戦略の開発を導くと期待される。C型肝炎ウイルス(HCV)複製を支持する細胞性因子であるシクロフィリン(CyP)のサブタイプのうち、これまでに報告があるCyPA、CyPBに加えて、CyP40が重要な役割を果たしていることを新規に同定した。この情報はより特異的なシクロフィリン阻害剤の開発に寄与すると期待される。一方でHCV RNAレプリコン細胞をシクロスポリンもしくはインターフェロンαで処理し、レプリコンを排除した細胞においてmicroRNA(miRNA)の発現プロファイルをmiRNAアレイにより調べたところ、発現量が低下したmiRNAが同定された。本miRNAがHCVレプリコン細胞においてレプリコン複製を促進し、逆にmiRNAの働きを阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドがレプリコン複製を抑制したことから、本miRNAはウイルス複製を支持する新たな細胞性因子として働いている可能性が示唆された。また本miRNAによって制御される標的遺伝子を探索するために、配列情報から予測アルゴリズムを用いて標的遺伝子絞込みを行い、かつレプリコン排除によって発現が上昇したものをcDNAアレイにより探索した結果、いくつかの候補遺伝子が予測された。一方でレプリコン排除によって発現が低下した遺伝子を、HCV感染を支持する細胞性因子候補としてcDNAアレイにより探索した結果、複数の遺伝子が同定された。個々の遺伝子をノックダウンした結果ウイルスRNA複製抑制効果が観察された。これらの情報は新規抗HCV標的である細胞性因子とその作用メカニズムを明らかにする上で重要な知見となり抗HCV剤開発の突破口として期待される点で意義深い。
血管老化におけるレニン・アンジオテンシン系とmicroRNAの関連についての検討

In vitro、microRNA-21がターゲット分子の発現を抑制することにより、angiotensin II刺激したVSMCの老化に関与していることが認められたが、今回In vivoで同様な結果が得られなかった。将来、別の老化血管モデルマウスを用いて、さらにmicroRNA-21と血管老化の関係を検討する必要があると考えられる。今回microRNA-21のターゲット遺伝子Spry1の関与は認められなかったので、将来、別のターゲット遺伝子例えばSp-1の役割について調べる必要があると考えられる。[目的]近年、動脈硬化などの血管病には細胞老化が深く関与することが示唆されている。これまでに私たちは、レニン・アンジオテンシン・アルドステロン系(RAAS)が血管の老化に影響を与え、血管病の発症や進展に深く関与することを報告してきた。最近、microRNAは動脈硬化などの心血管疾患に深く関与していることが示唆される。microRNA-21がSpry1(Ras/MEK/ERKシグナルの抑制遺伝子)を抑制することにより、MAPKシグナルを活性化し、心臓の線維化細胞の増殖を促進することを報告した。さらに、microRNA-21、microRNA-10AがHmga2を抑制することにより、血管内皮前駆細胞の老化を促進することが示唆されている。我々もRas/MAPKシグナルが血管老化に与える影響を報告していることから、本研究ではmicroRNAとRAASの血管老化への関連について検討する。我々は血管平滑筋細胞の老化において、Ras/ERKシグナルパスウェイに関与するmicroRNA-21およびそのターゲット遺伝子であるSpry1などが、アンジオテンシンII (angiotensin II)が誘導した血管老化に関係する可能性について検討してきた。In vitro実験、C57BL/6Jマウスの胸部大動脈から血管平滑筋細胞を用いて、細胞老化を検討したところ、angiotensin II(10-7 M)で10日間連日刺激により時間依存性に老化細胞数やその割合が増強したことが認められた。angiotensin II(10-7 M)で10日間連日刺激した血管平滑筋細胞のmicroRNA発現量を調べたところ、microRNA-21の発現はangiotensin II刺激により時間依存性に増加したことが認められた。microRNA-21のターゲット遺伝子Spry1の抑制を検討したところ、Western blotting法でangiotensin II 10日間の連日刺激によりSpry1発現の変化は認められなかった。microRNA-21が血管平滑筋細胞の老化に関与するかを検討したところ、microRNA-21-siRNAトランスフェクションした細胞において、コントロール細胞に比較してangiotensin II刺激により老化細胞数は変化してなかった。In vivo実験、10 GyのX線をC57BL/6マウスに全身照射し、胸部大動脈血管の老化を誘導したが、血管microRNA-21の発現の増加が認められなかった。以上より、In vitro、microRNA-21がターゲット分子の発現を抑制することにより、angiotensin II刺激したVSMCの老化に関与していることが考えられたが、今回In vivoで同様な結果が得られなかった。血管平滑筋細胞からmicroRNAの抽出は不順調だった。方法はキット中の説明書に沿ってやっていた。抗マウスArgonaute2モノクローナル抗体を利用した免疫沈降法によりmicroRNA-Argonaute2複合体を回収し、Argonaute2に取り込まれたmicroRNAを取り出した。しかし、何回もやっでも、最後に得られたmicroRNAのpelletは非常に小さかった。実際にmicroRNAが取れたかどうかが不明だった。また、溶解後のRNA溶液に含まれるmicroRNA量の測定には、分光光度計(A260/A280)やバイオアナライザー(Agilent社)では測定できないということが言われている。microRNA量の測定には、Urea-PAGE後の核酸銀染色によって推定することが推奨されている。実際に、本研究室には核酸銀染色という実験技術が弱いので、microRNA量の測定は困難であった。以上技術の問題があるので、結局total RNAを取ってきて、microRNA-21とmicroRNA-212の発現をMystiCq microRNA cDNA Synthesis Mix Kitで測定し、in vitro実験の進展は遅くなってしまった。血管老化の制御機序、さらに、in vivo実験を行い、細胞の結果を証明する検討も進める:1)老化血管モデルマウスの作製: 10 GyのX線をC57BL/6マウスに全身照射する。または、C57BL/6マウスの大腿動脈にポリエチレンチューブをカフとして2週間巻き付けることによって内膜肥厚を起こす血管傷害モデルを作成する。2)血管microRNA-21の発現の量の測定:RAASの阻害剤(ARB)がmicroRNA-21の発現を抑制する可能性も検討する。

3)microRNA-21-siRNAをマウスにトランスフェクションして、血管の老化に関与するかの証明。4)microRNA-21-ノックアウトマウスの作成も考慮する。通常のC57BL/6マウスと比較して、以上の方法にて血管の老化が抑制されるのか、microRNA-21やターゲット遺伝子Spry1の発現や作用がどのように変化しているかについて検討する。以上の実験結果をまとめて、学会発表ならびに論文報告する。
イネmutator活性化遺伝子座近傍の細密分子遺伝学的地図の作成

イネmutatorの活性化遺伝子座(slg座)に関する細密遺伝子地図を作成するために、slg座近傍のYACライブラリーの構築を試みるとともに、slg座に密接に連鎖するRFLP部位およびRLGS法(Restriction Landmark Genomic Scanning)によるDNA多型部位を探索した。また、slg座内にレトロトランスポゾン様因子が内在する可能性を検証するため、数種類のイネ・レトロトランスポゾンをプローブとしてサザン解析を実施した。その結果、slg座と連鎖するRFLP部位G23(組換え値3%)を含むYACクローン(農林水産省イネ・ゲノムチームより供与)Y4270を選抜することができた。つぎに、Y4270に挿入されたDNAの末端領域をプライマーYA1とYA2およびプライマーYA4とYA5とを用いたインバースPCRによって増幅した。得られたPCR産物をプローブとしてサザン解析を実施した結果、両末端ともslg座と密接に連鎖しており、Y4270はキメラ・クローンではないことが確認できた。したがって、このYACクローンの末端部位から、slg座により近いDNAマーカーを探索することができる。次に、RLGS法によってDNA多型を探索した結果、原品種銀坊主とslgホモ型系統との間に3箇所の多型を認めることができた。しかし、検出された多型とslg座との関係が認められなかった。さらに、レトロトランスポゾンTos17をプローブとしたサザン解析の結果slg座との連鎖関係をもつ多型バンドが観察されたが、他のレトロトランスポゾンおよびRAc-1(イネのトウモロコシAc様因子)をプローブに用いたサザン解析では、多型とslg座との間に関係を認めることができなかった。今後は、slg座に関する分離集団のサイズを大きくして、各DNA部位とslg座との間の正確な位置関係を決定する必要がある。細粒遺伝子座近傍の細密遺伝子地図を作成するために、細粒遺伝子座近傍のコスミド・ライブラリーの構築を試みると共に、細粒遺伝子座に密接に連鎖するRAPD部位、RFLP部位を探索した。また、RLGS法(Restriction Landmark Genomic Scanning)によって、細粒系統と原品種銀坊主との間のゲノムの差異を探索した。現在までの段階では、細粒遺伝子座を含むコスミド・クローンを選抜するのに必要なDNAマーカーの発見には至っていない。また、RLGS法を実施して細粒系統と原品種とのゲノムを比較した結果、細粒遺伝子保有系統に特異的に欠失した2個のスポット、AおよびBが観察された。このスポットと細粒遺伝子との関係を調査するため、細粒系統と原品種との交雑F_2から、細粒個体8個体と非細粒個体7個体を供試して、RLGSを実施した。スポットBは近接したスポットと重なるように存在するため、分離集団においてはスポットの有無を判断するのが困難であった。存在の有無を判定することができたスポットAに関しては細粒個体で(有:無)=(1:7)、非細粒個体で(有:無)=(2:5)となった。したがって、スポットは細粒遺伝子座とは独立に遺伝すると考えられた。なお、スポットの消失がゲノムの欠失によるものであれば、スポットAをもつ個体の出現頻度は上記頻度よりかなり高くなるはずである。したがって、このスポットAをもつ個体の低出現頻度は、スポットAの消失がゲノムの欠失によるものではないことを示している。いずれにしても、細粒遺伝子保有系統と原品種銀坊主のRLGSパターンが酷似していたことから、RLGS多型の発見が細粒遺伝子のDNA部位の同定に直接結びつく可能性は高いと考えられた。

イネmutator活性化に関与する細粒遺伝子座(slg座)内にレトロランスポゾン様因子が内在する可能性を検証するため、数種類のイネ・レトロトランスオゾンをプローブとしてサザン解析を実施した。その結果、Tos17をプローブとした場合に、slg座との連鎖関係をもつ多型バンドが観察されたが、この多型バンドとslg座との連鎖値の推定には到っていない。また、slg座を含むYACクローンを選抜することを目的として、まずslg座に連鎖するRFLPマーカーG33およびG20を含むYACクローンを、YACライブラリー・フィルター(農林水産省イネ・ゲノムチームより供与)を用いて探索した。その結果、G33およびG20を含むと考えられるYACクローンがそれぞれ1個および3個検出された。これら4YACクローンをもつ酵母菌(農林水産省イネ・ゲノムチームより分譲)を培養・増殖した後、各菌系からYACインサートDNAを抽出し、RELPプローブG33およびG20とのハイブリダイゼーションの有無を調査した。その結果、クローンY4270はG33を含んでいたが、他の3つのクローンは無関係であることが判明した。つぎに、Y4270をもつ酵母菌系の全DNAをCTAB法によって抽出し、制限酵素AluI、HicIIおよびHindIIIで切断した後、セルフライゲーションを行い環状DNAを得た。得られた環状DNAをテンプレートとして、プライマーYA1とYA2およびプライマーYA4とYA5を用いたインバースPCRを実施し、YACに挿入されたDNAの両末端を増幅した。得られたPCR産物をプローブとしてサザン解析を実施した結果、両末端ともslg座と密接に連鎖しており、Y4270はキメラ・クローンではないことが確認できた。しかし、供試個体数が少ないためslg座に近い末端の決定には到っていない。