hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
脳卒中後遺症としての尿失禁における橋排尿中枢シグナル伝達機構と遺伝子治療について

これまでの研究により、脳血管障害に伴い生ずる頻尿・尿失禁は記憶/学習に関与すると推測されている海馬の長期増強(long-term potentiation, LTP)に類似していることが解明された。すなわち脳梗塞時橋排尿中枢では、興奮性神経伝達物質であるglutamateのN-methyl-D-aspartate(NMDA)受容体開口に始まる一連のシグナル伝達と最終的には新たなmRNAと蛋白質の合成が必要と推測された。本研究ではprotein kinase A inhibitorによるシグナル伝達や核内遺伝子の転写が、どのように排尿反射亢進に関与し、c-fosやzif268などの神経可塑性関連遺伝子の発現がNMDA受容体とどのようにリンクしているのかを検討した.また転写因子としてのc-fosやzif268で制御される下流遺伝子、COX-2/nNOSが尿失禁遺伝子である可能性についても検討した。2)actinomycin Dを背外側被蓋野にmicroinjetionしてDNAからRNAへの転写を阻害すると排尿反射の亢進は抑制されるという結果、さらに神経可塑性関連遺伝子の発現が抑制されるという結果は、排尿反射亢進に本質的な脳部位は吻側部橋の背外側被蓋野で、ここに頻尿/尿失禁遺伝子ともいうべき遺伝子が存在することを意味している。3)その候補の1つとしてCOX-2が挙げられると思われるが、COX-2 inhibitorが脳梗塞作成後でも排尿反射の抑制に有効か、あるいはCOX-2の下流に存在する遣伝子は何か、など今後検討すべき課題は多いと考えられる。頻尿・尿失禁モデルとしてこれまでに、中大脳動脈領域の梗塞を作成したラットモデルを報告してきた。このラットの橋排尿中枢に起こる可塑性は記憶・学習に関与すると推測されている海馬の長期増強(long-term potentiation、LTP)によく類似していることが解明された。もし、脳梗塞後の排尿反射亢進がLTPと同様の機序で生じているのならば、橋排尿中枢では新たなmRNAと蛋白質の合成が必要となる。DNAの転写反応を抑制する効果のあるActinomycin D(ACD)を用いてこの転写を阻害すると排尿反射の亢進は抑制されることが解明されたが、この結果は排尿反射の亢進に遺伝子が関与していることを意味する。ではこれをコントロールしている遺伝子は何か。われわれは転写因子としてのc-fos、c-jun、zif268に注目し、SYBR GreenIを用いたLightCycler^<TM> Systemによるreal-time PCRを行って、mRNAの定量を行った。その結果、脳梗塞による排尿反射の亢進には橋背外側被蓋におけるc-fosやzif268などのシナプス可塑性遺伝子が関与していることが解明された。これらの遺伝子は排尿反射の亢進とともに発現が増加し、NMDA受容体遮断やACD投与によりその発現は抑制された。また、排尿反射の亢進も抑制された。脳梗塞後、一酸化窒素(NO)合成酵素(NOS)の阻害剤を側脳室に投与すると排尿反射亢進は持続的に抑制された。したがってNOは脳梗塞による排尿反射亢進においても重要な役割を果たしていると考えられる。LTPにおいてNOは、後シナプスより前シナプスへの逆向性メッセンジャーとして働き、cGMPを介した蛋白リン酸化により前シナプスからの神経伝達物質の放出を増大させると言われている。NOS阻害剤により亢進した排尿反射が抑制されたのは、同様のメカニズムが存在するためだろうか。今後検討する予定である。脳梗塞作成直前にactinomycin D(ACD)を吻側部橋の背外側被蓋野にmicroinjectionしてDNAからmRNAへの転写を阻害すると脳梗塞作成4時間後より排尿反射の亢進は抑制された。

この結果は排尿反射亢進に本質的な、頻尿/尿失禁遺伝子ともいうべき遺伝子が橋背外側被蓋に存在することを示唆している。次ぎにACDによる神経可塑性関連遺伝子の発現の変化について脳梗塞作成前後で検討した。その結果、c-fosやzif268といった神経可塑性関連遺伝子は吻側部橋の背外側被蓋において脳梗塞に伴い発現が増加するが、脳梗塞作成前にACDを背外側被蓋に注入しておくと発現の増加はみられないことが判明した。さらに近年、神経可塑性との関係で注目されているCOX-2に注目した。脳梗塞作成1時間後より橋背外側被蓋におけるCOX-2発現は有意に増加し、5時間後まで持続していた。12時間、24時間後にはコントロールレベルにまで低下していた。さらに脳梗塞前COX-2 inhibitor投与の排尿反射に対する影響についても検討した。COX-2 inhibitorであるNS398を脳梗塞作成前に静脈内投与しておくと脳梗塞作成して排尿反射は亢進しなかった。NS398による効果には用量依存生が認められた。以上より、ACDを背外側被蓋野にmicroinjectionしてDNAからRNAへの転写を阻害すると排尿反射の亢進は抑制されるという結果、さらに神経可塑性関連遺伝子の発現が抑制されるという結果は、排尿反射亢進に本質的な脳部位は吻側部橋の背外側被蓋野で、ここに頻尿/尿失禁遺伝子ともいうべき遺伝子が存在することを意味している。その候補の1つとしてCOX-2が挙げられると思われるが、COX-2 inhibitorが脳梗塞作成後でも排尿反射の抑制に有効か、あるいはCOX-2の下流に存在する遺伝子は何か、など今後検討すべき課題は多いと考えられる。
自発的発展可能な新量子化学文献データーベースシステムの構築

本プロジェクトでは、20年以上に渡って構築され続けてきた量子化学文献データベース(QCLDB)システムのデーター収集作業を実施するとともに、このデータベースシステムが継続的に発展を続けることが可能となるような施策を検討することを目的としている。本プロジェクトの最大の特徴は、データベースの収集活動が量子化学者の日々の研究活動の一環として実施されることにあり、研究活動とデータ収集活動の調和を重視しつつ収集雑誌の選択や収集ソフトウェアの改良を行っている。具体的には以下の項目を実施した。(1)2006,2007,2008年の量子化学文献データの収集・精製作業を実施した。2007年版までを公開した。(2)QCLDBの収集作業に協力する研究者への説明会を年1回実施した。(3)収集作業をサーバー・クライアント方式のソフトウェアーに変更し、その改良作業を行った。本年度当初の研究計画に基づき以下のように研究活動を実施した。(1)文献収集活動の継続:本課題の中心となる量子化学計算に関連する文献収集を実施した。2006年に発表された8,000件の文献を収録した。この収集された素データの精製作業を3月20日24日に岡崎市の自然科学研究機構分子科学研究所にて実施した。精製された文献データ2006年分は日本コンピューター化学会の特別号として出版する予定である。(2)文献収集システムの改良:H18年度に収集システムの大幅な改良を実施した。文献収集結果をテキストベースのデーターとして通常のエディターで入力する方式からコンピューターネットワークを使ったサーバー・クライアント方式の入力システムに変更した。収集者に公開された初期バージョンは必ずしも使い勝手の良いものではなかった。本年度は、多くの試行錯誤や利用者の意見や苦情を考慮して改良を加えたバージョンを開発して収集作業に利用した。細かな点で未だ十分なシステムとはなっていないが使い勝手が大幅に改善された。また、収集者-査読者-精製作業間のデーターの移行や、収集・査読者の管理などの面でも幾つかの改良を施した。(3)文献収集支援体制の確立:本年度も分子科学討論会の時期に合わせて、QCLDBの説明会を開催した。70名を超える教官・大学院生が参加した。QCLDBの重要性を説明して新たな参加者を募るとともに。新しいQCLDBの収集システムについての説明を行った。(4)収集文献の厳選:分子の個性を重要視するQCDLBの基本方針に基づき収集する雑誌の選定を行った。収集に必要な予算や人材の不足から、必ずしも全く不必要とは言えない雑誌も不採用にせざるを得なかった。計算化学に関する豊富な情報を備えるQCLDBの従来の活動及びその成果を地道に継続させることが必須である。同時に、組織的改良を含めて活動を継続的に進行させるための安定なシステムを構築する必要がある。これらの観点から本年度は以下の活動を実施した。(1)量子化学文献データーの収集・査読:昨年度の方針を踏襲して全国の大学の教官・大学院生の協力の下に収集・査読を実施した。データー件数は4000件以上。新収集システムは安定に稼動するようになっており、収集の自動化への道を一歩進むことができた。(2)データー精製作業:今年度8月と3月にQCDBメンバーが集まってデーターの精製作業を実施した。この作業を年2回として1回の作業量を減らしたことは有効であった。(3)データー公開:新収集システムになって以来、データーの公開が遅れていたが、今回の作業で2005年度、2006年度を公開し、2007年度の公開の目途が立ったことは今年度の大きな成果であった。(4)講習会の開催:分子科学討論会の開催に合わせて、QCLDBの講習会を実施した。(5)自動検索システムの試作:データの自動収集は懸案であったが、本年度にそのためのソフトの試作品が完成した。次回の収集においてテストを実施する予定である。著作権を尊重し、電子データの不法アクセスにならぬように留意する必要がある。量子化学文献データベース(Quantum Chemistry Literature Data Base ; QCLDB)は国内外の主要な学術雑誌に発表された非経験的量子化学計算及び計算方法に関する文献を収録した文献データベースである。1976年にデータベースの構築が立案されて以来、多数の研究者の地道な文献調査活動に支えられて、25年以上にわたって文献収録が続けられ、現在の文献収録論文数は7万件に達している。一方、QCLDB発足以来25年以上の歴史の間に量子化学計算自体も質的な変化を遂げた。

即ち、非経験的量子化学計算は精密な実験と対等な立場で分子科学の発展を相補的に支えるまでに大きく成長し、実験化学者の重要な道具へと進化した。その結果、QCLDBに採録する論文は多様化し、その数も激的に増加した。これらの状況の変化に対応するため、われわれはデータベース作成のポリシーと細かな仕様の変化を絶えず行ってきた。しかし、システム全体を早急に見直さなければ、質の高いデータベースを恒常的に提供できない危機的な状況が予測されたため、蓄積されたデータとの継続性を保ちつつ、今後の計算化学の研究方法の浸透と対象文献の増加に対応できる新しいデータベースのあり方を検討し、新しいデータベース(QCLDB II)の活動指針を実施した。具体的な成果は以下の通りである。(1)2006, 2007, 2008年の量子化学文献データの収集・精製作業を実施した。2007年版までを公開した。(2)QCLDBの収集作業に協力する研究者への説明会を毎年1回実施した。(3)コアージャーナルの取捨選択を実施した。(4)収集作業をサーバー・クライアント方式のソフトウェアーの改良作業を行った。
胃ガン腹腔細胞診における腫瘍関連遺伝子定量法の構築とその意羲に関する研究

1.研究目的2.方法3.研究成果基礎実験として胃癌細胞株(MKN28,MKN45,MKN74,KATOIII,AZ521)を用いて,Real time-PCRによる遺伝子定量的検出法(CEA,SCC,CK19,CK20mRNA)の構築を行った。続いて,日常臨床検査として腫瘍関連遺伝子検査が実施された胃ガン症例の腹腔内洗浄液および腹水を対象に各症例の臨床経過と当遺伝子発現定量値の感度・特異度を検証した。(2)腹膜播種再発症例においてRT-nested-PCR法による定性的検出法の感度は97%・特異度57%であった。以上,胃癌の腹腔細胞診において,本研究の腫瘍関連遺伝子の病態生理学的意義,癌の転移に関与するその発現を解析することは有用と考えられた。本研究の成果は臨床検査への応用に向けた基礎データとして評価できる。
鼻粘膜局所免疫応答におけるマウス鼻腔関連リンパ装置（NALT）の役割に関する研究

実験動物として雄性C57BL/6マウスを用い実験を行った。Hoarseradish peroxidaseを蛋白抗原としcholeratoxinをアジュバントとして2週間隔日点鼻の後、経時的に鼻腔内抗原特異的IgAの測定を行った結果、感作終了より2週間目で最も高い値を示すことが示された。この実験結果をふまえ感作後2週間目のマウス鼻腔リンパ球の解析を試みた。マウスを全血脱血にて屠殺し、生理食塩水にて全身貫流した後、鼻腔を摘出し顕微鏡下に鼻腔粘膜を剥離採取した。パーコール濃度勾配を用い単核球を分離し、細胞表面マーカーの解析およびRT-PCR法を用いたm-RNAレベルでのサイトカインの発現を解析した。細胞表面マーカーの解析結果:感作マウスと非感作マウスで特にT細胞マーカーについて比較検討した結果、αβTCR陽性細胞の割合が感作マウスで増加することが認められた。γδTCR陽性細胞は2群間で差を認めなかったものの、ともに10-15%と高い割合で認められた。サイトカイン発現の比較:感作マウスと非感作マウスでRT-PCR法を用いIFN-γ、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、TGF-βについて解析を行った結果、IL-4、IL5はともに発現を認めなかったのに対し、IFN-γ、IL-2、IL-6、TGF-βは発現が認められた。β-actinを指標とし定量を行った結果、いずれのサイトカインも非感作マウスに比べ感作マウスにおいて強い発現を示すことが認められた。これらの実験結果より蛋白抗原を用いて点鼻感作による抗原特異的IgA産生においてはT細胞、特にαβTCR陽性細胞が重要な役割を有し、サイトカインとしてはTh1由来のIFN-γ、IL-2、Th2由来のIL-5、IL-6、さらにTGF-βが重要な役割を有する可能性が示された。
レーザー走査型生体生理情報センシング顕微鏡の開発

昨年度までに本研究で開発した半導体化学イメージセンサにより、試料中のpH値や分子・イオン濃度の2次元分布を画像化できることがわかった。現在までに、空間分解能100mm、pHに換算した測定精度0.01、測定速度毎秒100ピクセルを達成している。また、センサ面上で微生物や神経細胞・組織などの生体試料を培養することができ、代謝や神経活動などの生理現象の観察に用いることができることを示した。本年度はまずセンサ面である窒化物表面が試料溶液の酸化還元電位に対してどのように応答するかを調べた。その結果、金属電極に比べてやや感度が低いものの酸化還元電位の変化に対して直線的な応答を示すことがわかった。また、試料中の酸化還元電位の2次元分布を画像化することにも成功した。これにより、酸化還元反応を伴う空間的に不均一な系の解析が可能となった。その応用として、自発的振動現象や空間的パターン形成現象で知られるベロ-ゾフ・ジャボチンスキー反応を取り上げ、化学イメージセンサを用いてこの溶液中の化学波の伝搬をとらえることに成功した。以上のように酸化還元電位の空間的時間的解析が可能になったことにより、化学イメージセンサの応用範囲は非常に広くなるものと期待される。特にセンサ面と生体との親和性が高いことから、生体中におけるさまざまな化学反応に伴う物質の生成・移動や反応の伝搬を観測する新しい手段になり得るものと期待される。レーザー走査型生体生理情報センシング顕微鏡を設計・製作し、基本的な動作を確認した。検出面には生体の代謝にともなうpH変化を検出するSiN薄膜を用い、レーザー走査によってpH値の2次元的な分布を画像化できることを実証した。さらに、検出面と接する電解質として生体用の寒天培地を用いることにより、寒天培地上で培養したイースト菌や大腸菌の代謝活動にともなうpH変化を検出し、これらのコロニーをpH像として観察することに成功した。この技術は、生物学的研究のツールとしてはもとより、食品衛生管理の分野でも短時間で生菌を検出する手段として応用できると期待される。次に、同顕微鏡の空間分解能や測定感度などの基本性能を向上させるための研究を行なった。キャリア拡散モデルによるシミュレーションを行い、分解能や感度等がセンサの構造や物性定数、レーザー光の波長などによってどのように変化するかの性能予測を行なった。シミュレーションの結果を実際の性能と比較したところ良い一致を示し、キャリア拡散を考慮したモデルが妥当であることが分かった。実際に半導体層の最適化を行ない、50μm以下のパターンが解像できるようになった。また、レーザー光の波長に関しては、赤外線レーザーを用いることにより分解能、感度ともに向上できることが分かった。そのほか、測定電流を高速A/D変換してデジタル信号処理するシステムを使うことにより、一画面の測定に要する時間が数分程度にまで短縮された。また、より実用化に近い簡易型の装置を試作し、基本性能を確認した。レーザービーム走査型生体生理情報センシング顕微鏡に関して、キャリア拡散モデルに基づく性能予測のシミュレーションを行ない、デバイス構造等の最適化を行なった。半導体層の薄層化・赤外励起光源の使用による高分解能化、16ビット高速デジタルサンプリングによる測定の高速化・高精度化などにより、現時点で空間分解能10ミクロン、pH換算検出感度0.01、測定速度毎秒50点を達成している。これによって、たとえば大腸菌の検出は培養開始後約8時間で可能となった。さらに、センシング表面を化学的に修飾することによって分子・イオン識別機能を持たせ、同顕微鏡によって得られる情報を、従来のpH画像だけではなく種々の化学物質の分布画像にまで拡げる実験を開始した。具体的には、センシング表面に酵素であるウレアーゼを固定化することにより尿素に対して選択的に酵素を作用させ、尿素の濃度分布画像が得られることを確認した。同様の手法を用いれば、生体が排出する特定の物質の分布画像が得られることになり、菌種の同定等にも応用できると期待される。また、神経活動のような高速の現象を高時間分解能で記録できるよう、デジタルサンプリングされた信号波形データを全量収録し解析するためのシステムとソフトウエアを準備した。

さらに、生菌や神経組織等を同顕微鏡システム内で継続的に培養し、成長や代謝の様子を連続的にモニターできるようにするため、組み込みの炭酸ガス恒温培養装置を設計・製作し、実際に継続培養ができることを確認した。これらのシステムにより、次年度はさまざまな試料に対して複合的な生体生理情報の画像収録実験を行なう準備が整ったことになる。昨年度までに本研究で開発した半導体化学イメージセンサにより、試料中のpH値や分子・イオン濃度の2次元分布を画像化できることがわかった。現在までに、空間分解能100mm、pHに換算した測定精度0.01、測定速度毎秒100ピクセルを達成している。また、センサ面上で微生物や神経細胞・組織などの生体試料を培養することができ、代謝や神経活動などの生理現象の観察に用いることができることを示した。本年度はまずセンサ面である窒化物表面が試料溶液の酸化還元電位に対してどのように応答するかを調べた。その結果、金属電極に比べてやや感度が低いものの酸化還元電位の変化に対して直線的な応答を示すことがわかった。また、試料中の酸化還元電位の2次元分布を画像化することにも成功した。これにより、酸化還元反応を伴う空間的に不均一な系の解析が可能となった。その応用として、自発的振動現象や空間的パターン形成現象で知られるベロ-ゾフ・ジャボチンスキー反応を取り上げ、化学イメージセンサを用いてこの溶液中の化学波の伝搬をとらえることに成功した。以上のように酸化還元電位の空間的時間的解析が可能になったことにより、化学イメージセンサの応用範囲は非常に広くなるものと期待される。特にセンサ面と生体との親和性が高いことから、生体中におけるさまざまな化学反応に伴う物質の生成・移動や反応の伝搬を観測する新しい手段になり得るものと期待される。
ヒトノロウイルス感受性細胞の樹立とレセプター探索

ヒトに感染するノロウイルス(HuNoV)は、冬型の急性胃腸炎、食中毒の原因ウイルスとして知られている。HuNoVのレセプター分子が同定できれば、感受性細胞の樹立が可能となり、研究の障壁を取り払うことができる。4年間の研究において、HuNoVの近縁なウイルスであるネズミノロウイルスのレセプター分子CD300lf, CD300ldの同定に成功した(PNAS 113(41):E6248-E6255, 2016)。CD300lf, ldのヒトホモログがHuNoVのレセプターである可能性を調べたが、その機能は有さなかった。HuNoVレセプター分子を検索するため、慶応大学の佐藤らより、ヒト腸管オルガノイド(HEO)の供与を受け、HEOを用いたHuNoVの増殖培養増殖系の開発に成功した(特願2016-163711)。2018年度は、特殊な蛍光標識ウイルス様中空粒子(VLP)を用いてHEOに含まれるHuNoV感受性細胞をラベルして分取することに成功した。感受性細胞と非感受性細胞のmRNAトランスクリプトームサブトラクション解析を実施し、転写変動2倍以上を示した遺伝子の内、膜タンパク質もしくはそれに関与する18遺伝子を、HuNoVレセプター候補遺伝子としてピックアップした。これらの遺伝子のクローニング、ノックアウト用のgRNAの準備を進行させた。上位4候補遺伝子のノックアウトを順次試行しHuNoV増殖阻害効率を測定したが、有意に増殖効率に変化を与える遺伝子は見出せなかった。一方、感受性細胞のcDNAライブラリーを作製し、株化培養細胞に導入して特殊な蛍光標識VLPを取り込み、蛍光を発する細胞に導入されたcDNA配列を解析したところ、細胞膜の変形に関わる2種類の遺伝子が同定された。しかし、HuNoVのレセプター同定には至らなかった。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。HuNoVは、感受性を示す培養細胞が無いため、基礎的研究に困難を極めている。申請者が科学研究費(基盤C)を受けて成功させた世界初のHuNoVとネズミノロウイルス(MNV)のリバースジェネティックスシステム(RGS)は、細胞内でのノロウイルス(NoV)の複製、感染性粒子作出を実現するとともに、GFPやルシフェラーゼ遺伝子でのウイルスゲノムラベルにより、NoV複製阻害剤の探索や、感受性細胞の探索を可能とした(PNAS 2014 Sep 23;111(38):E4043-52, Epub 2014 Sept 5.)。本研究では、このRGSを基盤技術として用い、HuNoV感染感受性細胞株の樹立、NoVレセプター分子の同定を目指す。さらに、小動物感染モデルの確立も目指す。今年度は、CRISPR/Cas9遺伝子ランダムノックアウトシステムによりMNV感受生細胞であるRAW264.7細胞のレセプター遺伝子をノックアウトすることで、MNV非感受性RAW細胞を作出し、その細胞で共通してノックアウトされている遺伝子を同定した。その遺伝子は、ヒト、サル、ネコ、ネズミの宿主の細胞をMNV感受生細胞に変化させるMNVのタンパク質性のレセプター分子である事が明らかになった。HuNoVのレセプターを検索するため、HuNoV感受生細胞の樹立を目指し、ヒト小腸バイオプシよりオルガンカルチャーを実施した。オルガンカルチャーの技術並びにヒト小腸細胞は、慶応大学医学部佐藤俊朗准教授より提供を受けた。MNVのRGSは、非感受生細胞であっても、また、ネズミ以外の動物種の細胞であっても、MNVゲノムを細胞内に送り込めば感染性粒子を算出可能であることを明らかにした。つまり、MNV感受生細胞と非感受生細胞の差は、MNVの細胞内部への侵入に関わるレセプター分子の有無である可能性を示唆する。そこで、MNVレセプター分子の検索をRGSで作出した遺伝的に均一なMNVと感受生細胞RAW264.7(RAW)細胞を用いて行った。CRISPR/Cas9でRAW細胞の遺伝子をランダムにノックアウトし、MNVを感染させた。MNVが感染したRAW細胞は死滅するが、レセプター分子がノックアウトされたRAW細胞は、生き残る。この原理を利用して、生き残った細胞に導入されたガイドRNA分子の配列を決定することで、レセプター分子をコードする遺伝子を同定した。同定したレセプター遺伝子を非感受性細胞に導入し、発現させると、非感受生細胞はMNV感受生細胞へと変化した。さらにMNVレセプター分子導入細胞の株化を行った。我々は、MNVレセプター分子を同定した。現在、同定されたレセプター分子のヒトホモログがHuNoVのレセプターとして機能するか否か研究を継続している。また、我々の同定したMNVレセプター分子に関して、特許申請を行った。現在、論文投稿が進行中である。HuNoVは、感受性を示す培養細胞が無く、基礎的研究に困難を極めている。我々が開発したノロウイルス(NoV)のリバースジェネティックスシステム(RGS)は、NoVの宿主特異性がレセプター依存的であることを示した(PNAS Sep 23;111(38):E4043-52, 2014.)。

MNVを増殖培養可能なRAW細胞の遺伝子を、CRISPR/Cas9システムでランダムにノックアウトした後、MNVを感染させ、生き残った細胞でノックアウトされている遺伝子の配列を調べ、MNVのレセプター分子CD300lf, CD300ldを同定した(PNAS Oct 11;113(41):E6248-E6255, 2016.)。CD300lf又は、CD300ldを強制発現させたヒト、サル、ネコの細胞株を構築し、MNVを感染させたところ、細胞は全てMNV感受性となった(特願2016-19315)。CD300lf, ld分子のヒトホモログがHuNoVのレセプターである可能性をしらべたが、HuNoVレセプターとしての機能は有さなかった。HuNoVレセプター分子を検索するため、慶応大学の佐藤らより、ヒト腸管オルガノイドの供与を受け、ヒト腸管オルガノイドを用いたHuNoVの増殖培養を試み、これに成功した(特願2016-163711)。現在、ヒト腸管オルガノイドに含まれる感受生細胞のラベル、単離を実施している。感受生細胞のラベルには、感染性ウイルスを用いるほか、VLPを特殊な蛍光物質でラベルする手法、GFP等の発現ベクターを内包させたVLPを使用する方法など多角的な方法を用いて、HuNoVのレセプター分子検索を実施する予定である。平成27年度に得られた成果、MNVのレセプター分子CD300lf, CD300ldの同定と株化細胞の作出を特許出願(特願2016-19315)し、論文投稿を行い(PNAS Oct 11;113(41):E6248-E6255, 2016.)パブリッシュした。HuNoVレセプター検索を実施するため、CD300lf, ld分子のヒトホモログがHuNoVのレセプターである可能性をしらべたが、HuNoVレセプターとしての機能は有さなかった。しかし、MNVレセプターがタンパク質性のレセプターであったこと、NoVの宿主特異性がレセプター依存的であることが強く示唆されたため、HuNoVレセプター分子を検索するため、HuNoV感受生細胞の検索を実施した。慶応大学との共同研究により、ヒト腸管オルガノイドを用いたHuNoVの増殖培養を試み、これに成功した(特願2016-163711)。ヒト腸管オルガノイドによるHuNoV培養の成功は、ヒト腸管オルガノイドの中にHuNoV感受性細胞が存在することを示している。ヒト腸管オルガノイドの中の感受生細胞とそれ以外の細胞を分取し、それぞれの遺伝子サブトラクションによってレセプター分子を発見できることを示唆している。ヒトに感染するノロウイルス(HuNoV)は、冬型の急性胃腸炎、食中毒の原因ウイルスとして知られている。HuNoVは、感受性を示す培養細胞が無く、基礎的研究に困難を極めている。我々が開発したノロウイルスのリバースジェネティックスシステム(RGS)は、NoVの宿主特異性がレセプター依存的であることを示した(PNAS 111(38):E4043-52, 2014.)。HuNoVのレセプター分子が同定できれば、感受性細胞の樹立が可能となり、研究の障壁を取り払うことができる。2016年度の本研究において、HuNoVの近縁なウイルスであるネズミノロウイルスのレセプター分子CD300lf, CD300ldの同定に成功した(PNAS 113(41):E6248-E6255, 2016)。
入国管理法政パラダイム研究―グローバル人材育成施策推進のインパクトと可能―

近年、関係省や有力な団体が、一貫して、外国高度人材受け入れ政策を主張し続けてきたが、それに並行して、日本の出入国管理法政策のもう一つの特徴は人座育成政策に推進と言える。本研究は、1)外国人留学生、2)外国人技能実習生、そして、3)経済連携協定(EPA)に基づいた外国人看護師・介護士等の受入れ制度を対象に、日本の入国管理法政における国際自在育成施策推進のインパクトと可能性を明らかすることが目的であった。また、ドイツとオーストラリアの外国人育成プログラムとの比較研究を行いながら、移民政策における国際的キャパシティー・ビルヂングの役割を分析しました。本研究の目的は、1)外国人技能実習生、2)経済連携協定(EPA)に基づいた外国人看護士・介護士、そして、3)外国人留学生等の受け入れ制度を対象に、日本の入国管理法政における人材育成施策推進のインパクトと可能を明らかにすることである。また、ドイツとオーストラリアの外国人材育成プログラムとの比較を行いながら、移民政策における外交、ソフト・パワーおよび国際的キャパシティー・ビルディングの役割を分析することである。上記の目的の達成に向けて、平成24年度に関して、執筆者が主に次の活動に取り組んだ:1.文献・資料の調査、収集および分析(特に、政府開発援助および国際的経済ネットワークの構築に関する図書に基づいて、外国人材育成施策推進制度の実態を明確するため。)なお、平成24年4月末に研究代表者は腫瘍を伴う潜在性甲状腺機能低下が認められ、病因における精密検査の繰り返いし及び同時に生じた精神的な不安により、平成24年度に予定していた第二次現地調査(海外)、そして学会における中間報告等を行うことができなかった。科学研究費助成事業(学術研究助成基金助成金)補助事業期間延長に申請し、承認が得られた。上記の目的の達成に向けて、平成23年度に関して、執筆者が主に次の活動に取り組んだ:1.文献・資料の調査、収集および分析(特に、政府開発援助および国際的経済ネットワークの構築に関する図書に基づいて、外国人材育成施策推進制度の実態を明確するため。)2.研究テーマに関連のある「移民政策学会」への出席、資料収集と意見交換3.海外調査研究を行うため、アンケート調査作成および該当する機関(調査先)への連絡4.海外研究出張・打ち合わせの実施(実施期間:2012年2月27日(月)3月3日(土))出張先:ドイツ労働市場・職業研究所(IAB)<ニュルンベルク>、ドイツ統合・移民財団専門評議会<ベルリン>、ライン・ヴェストファーレン経済研究所<エッセン>。ドイツの移民政策における外国人材育成政策の実態や動きを把握するために、海外出張の企画・実施が必要との判断であった。平成24年度に行う予定の研究活動の参考になる専門的知識提供が得られたかと考えている。)「研究実績」にあるように、平成24年4月末に研究代表者は腫瘍を伴う潜在性甲状腺機能低下が認められ、病因における精密検査の繰り返いし及び同時に生じた精神的な不安により、平成24年度に予定していた第二次現地調査(海外)、そして学会における中間報告等を行うことができなかった。なお、治療中との実態が続いている中、病状が安定してきたので、平成24年9月以降は資料収集・分析及び国内出張で少しずつ研究活動を進め始めている。文献・資料の調査および分析、また海外調査研究の実施ができたものの、予定された国内調査研究の調整が遅れている。平成23年度に執筆者は留学生センター短期交換留学プログラム・コーディネーターとして多忙であった。特に、1)震災のプログラムへの影響が相当なものであり、その対応に追いまくられたことがあった。そして、2)本大学の交換留学プログラムの15周年記念シンポジウムおよび同窓会を企画、実施した結果、研究に十分に専念できる環境がそろっていなかった。平成24年度に大きなエベント等の開催が特に企画されていないので、研究を十分に発展させることができると考えている。今後は、交付申請書に記載した「研究の目的」、「研究実施計画」のとおりに本研究を推進したいと考えている。具体的な方策は:1.平成24年度に行えなかった国内調査研究の実施2.7月8月:海外調査研究の実施(オーストラリア:移民市民権省教育・雇用・労働省、オーストラリア国立大学、メルボルン大学)

3.資料調査および国内外研究打ち合わせから得た情報を分析・整理し、その結果を取りまとめた上に、成果の発表を行う。(8月12月:最終報告の下書き、校閲;平成25年1月3月:最終報告のまとめ、印刷、ホームページでの公開、国際イミグレーション・ジャーナルへの投稿;5月:移民政策学会大会での調査研究報告、「移民政策研究」への投稿(予定))今後は、交付申請書に記載した「研究の目的」、「研究実施計画」のとおりに本研究を推進したいと考えている。具体的な方策は: 1.23年度に行えなかった国内調査研究の実施(法務省出入庫管理局等) 2.5月6月:海外調査研究の実施(豪州:移民市民権省教育・雇用・労働省、オーストラリア国立大学、メルボルン大学)3.資料調査および国内外研究打ち合わせから得た情報を分析・整理し、その結果を取りまとめた上に、成果の発表を行う。(7月11月:最終報告の下書き、校閲;12月:移民政策学会大会での調査研究報告;1月3月:最終報告のまとめ、印刷、ホームページでの公開;平成25年度5月:学会雑誌への投稿(予定))次年度に残された助成金(564,564円)については、具体的な使用計画が下記のとおりである:1.旅費(およそ333,000円):国内外研究調査・打ち合わせの実施(主に上記に記載したオーストラリア出張)2.人件費・謝金(およそ100,000円)専門的知識および資料提供への謝金、研究報告の校閲、また研究成果のホームページへのアップロード援助への謝金3.その他(およそ90,000円):研究報告の印刷、発行繰り越された金額(69、700円)は、平成23年度に行えなかった国内調査研究(主に東京への出張)に使用したいと考えている。依然として交付される予定の助成金(700,000円)については、具体的な使用計画が下記のとおりである:1.物品費(およそ100,000円):入国管理体制・政策に関する図書、OCRソフトと文房具等の購入2.旅費(およそ400,000円):国内外研究調査・打ち合わせの実施(主に上記に記載したオーストラリア主張および国内政府機関と大学の関係者との打ち合わせ)3.人件費・謝金(およそ100,000円)専門的知識および資料提供への謝金、研究報告の校閲、また研究成果のホームページへのアップロード援助への謝金4.その他(およそ100,000円):研究報告の印刷、発行
第一壁のプラズマ駆動水素透過への壁材料表面状態の影響

第一壁におけるプラズマ駆動水素透過に対する材料表面状態の影響を明らかにすることを目的とし、本年度は、Ni,sus304に対する重水素注入透過実験と、Vに対する分子状水素透過速度の温度・圧力依存性測定を行なった。いずれの場合も、その場的なオージェ電子分光法により試料上流表面組成を調べ、表面状態と透過挙動とを詳しく対応付けた。注入実験においては、500°Cに加熱した試料に3KVの加速電圧で【D(^+_2)】を打込んだ。この際、【Ar^+】によるスパッタ洗浄と試料のアニールとにより、あらかじめ試料表面組成を制御した。その結果、プラズマ駆動水素透過に特徴的なスパイクの発生機構は、イオン注入側表面の不純物付着による水素再結合定数の変化に帰し得ることがわかった。また、不純物による水素再結合放出挙動への影響は、表面分析の結果より、バルク材と不純物原子の組合せに強く依存することが確認された。即ち、Niの場合には硫黄が、sus304の場合には酸素の効果が支配的であると結論された。このように個々の富純物原子を特定し、その注入イオン駆動水素透過への影響をバルク材と関連付けて明らかにした研究はこれがはじめてであり、本研究の大きな成果と言えよう。一方、分子ガス状水素の透過に関しては、昨年度に引続き、バナジウム試料を用い、表面に偏した硫黄の効果を調べた。表面にはほとんど硫黄のない場合と、硫黄の飽和した場合の2種の表面状態で、温度および圧力依存性を測定した結果、いずれの状態においても、温度・圧力依存性にはほとんど差はなく、透過速度の絶対値のみが硫黄の偏析により低下することがわかった。この結果より、硫黄の効果は、表面上のサイト占有による水素吸脱着確率の減少にあると結論した。またこの観点から、硫黄の表面構造を考慮して、水素吸脱着阻害のモデル化を行ない実測データと比較したところ、このモデルにより実験結果を合理的に解釈できることがわかった。
破骨細胞骨吸収におけるミトコンドリア形態変化の機能解析

骨吸収のメカニズムとミトコンドリア形態変化の関係を明らかにするため、ミトコンドリアの分裂・融合に関与するGTPaseであるDrp1の活性をコントロールすることにより、破骨細胞性骨吸収におけるミトコンドリアの分裂・融合反応の意義を検討した。ミトコンドリア形態変化を制御する分子であるのDrp1の野生型およびドミナントネガティブ型変異体Drp1K38Aをアデノウイルス用いて破骨細胞に過剰発現させたところ、Drp1K38Aを過剰発現させた破骨細胞において、延命に明らかな変化はみられなかったものの、細胞骨格の変化が見られ、骨吸収機能が低下傾向となった。ミトコンドリアの分裂・融合のバランスが、破骨細胞骨吸収機能に影響を与えていると考えられた。破骨細胞を介した関節リウマチ(RA)骨破壊の制御により、RAによる日常生活活動度の低下を予防することを最終目的とする。我々はこれまで破骨細胞骨吸収におけるミトコンドリアの役割を解析してきた。最近、ミトコンドリアの形態変化によってアポトーシスが制御されること、そしてミトコンドリア形態形成遺伝子の変異が神経変性疾患の原因となることがわかってきた。本研究では、骨吸収のメカニズムとミトコンドリア形態変化の関係を明らかにするため、ミトコンドリアの分裂・融合に関与するGTPaseであるDrp1、Mfn1,Mfn2の活性をコントロールすることにより、破骨細胞性骨吸収におけるミトコンドリアの分裂・融合反応の意義を検討することにより、RA骨破壊制御への新たな筋道を見つけることを目的とする。本年度は、まずミトコンドリア形態変化を制御する分子であるのDrp1の野生型(wild type : WT)の遺伝子を非増殖型アデノウイルスに組み込んだ。さらにはポイントミューテーションでドミナントネガティブ型とした変異体Drp1^<K38A>もアデノウイルスに組み入れ、これらアデノウイルスを用いて破骨細胞に過剰発現させることに成功した。次年度は、これらの遺伝子を過剰発現させた破骨細胞の延命・機能解析を行っていく予定である。ミトコンドリア形態変化を制御する分子であるのDrp1の野生型(wild type:WT)の遺伝子を非増殖型アデノウイルスに組み込んだ。これらの遺伝子を過剰発現させた破骨細胞の延命・機能解析を行った。次年度は、これらの遺伝子を過剰発現させた破骨細胞のミトコンドリアの形態・ミトコンドリアの局在・ミトコンドリア機能・細胞内ATP濃度の測定などを行っていく予定である。本研究では、骨吸収のメカニズムとミトコンドリア形態変化の関係を明らかにするため、ミトコンドリアの分裂・融合に関与するGTPaseであるDrp1、Mfn1, Mfn2の活性をコントロールすることにより、破骨細胞性骨吸収におけるミトコンドリアの分裂・融合反応の意義を検討することにより、RA骨破壊制御への新たな筋道を見つけることを目的とする。ミトコンドリア形態変化を制御する分子であるのDrp1の野生型(wild type: WT)の遺伝子を非増殖型アデノウイルスに組み込んだ。さらにはポイントミューテーションでドミナントネガティブ型とした変異体Drp1K38Aもアデノウイルスに組み入れ、これらアデノウイルスを用いて破骨細胞に過剰発現させることに成功した。Drp1K38Aを過剰発現させた破骨細胞の延命に明らかな変化はみられなかった。

しかしながら、Drp1K38A過剰発現破骨細胞において、細胞骨格の変化が見られ、骨吸収機能が低下傾向となった。破骨細胞におけるミトコンドリア形態変化を制御する分子であるのDrp1の役割が明らかとなってきた。24年度が最終年度であるため、記入しない。ミトコンドリア形態変化を制御する分子であるのDrp1の変異型を過剰発現させた破骨細胞のミトコンドリアの形態・ミトコンドリアの局在・ミトコンドリア機能・細胞内ATP濃度の測定などを行っていく予定である。
海馬に特異的な遺伝子発現:αカムキナーゼII遺伝子の発現調節

Ca^<2+>/カルモデュリン依存性プロテインキナーゼII(カムキナーゼII)は、生後の脳の発達過程において、神経回路形成が盛んになる時期に、神経特異的に発現が急速に高まることが知られている。カムキナーゼII遺伝子の転写調節領域の構造、および、転写調節因子の構造と作用などを調べることは、脳特異的、発達段階特異的な遺伝子発現の機構を分子レベルで明らかにし、脳の発達における神経回路の組織化を制御する分子機構の理解を深めるために重要である。本研究では、カムキナーゼII遺伝子の構造と転写調節領域を解析し、以下のことが明らかとなった。(1)本酵素の遺伝子構造の解明に成功し、哺乳類のカムキナーゼII遺伝子の全体構造が始めて明らかとなった。αカムキナーゼIIcDNAのコーディング領域は約1.4kbpであるが、遺伝子は全長50kbp以上におよぶ巨大なものであり、18個のエキソンに分断されるという複雑な構造をもつ。(2)αカムキナーゼII遺伝子の転写調節領域と考えられる部位をルシフェラーゼ遺伝子に接続し、レポーター遺伝子を構築した。これを、従来の神経芽細胞(Nb2a)、および、新しく株化したNF83細胞に導入し、ルシフェラーゼ活性を測定し転写に必要な領域を解析した。その結果、転写開始部位の上流約180bpに、神経細胞に特異的な強いプロモーター活性が存在することが明かになった。(3)さらに上流を含む場合にはプロモーター活性が抑制されサイレンサーエレメントの存在が予測された。
トンネル顕微鏡による有機物超伝導体の研究

有機物超伝導体の電子状態を調べるため、トンネル顕微鏡(STM)装置の開発及びトンネル分光測定を行った。まず、STM装置に超電導磁石を組み込み、磁場下での測定を行えるようにする装置の作製を行った。また、この装置を用いて有機物超伝導体(BEDT-TTF)_2Cu(NCS)_2の超伝導相においてトンネル分光測定を行った。装置の作製では、STMユニット部及び超伝導磁石を購入し、現有のSTM制御装置と組み合わせるとともに、トンネルユニット部の入る内挿の金属デュワ-を新たに作製した。これを用いて予備的な測定を行い、最高磁場7T、最低温度1.4KでのSTM測定が行えることを確認した。一方、有機物超伝導体(BEDT-TTF)_2Cu(NCS)_2のトンネル分光測定を、単結晶試料の面の方向を変えながら行い、超伝導ギャップの波数空間における異方性を調べた。得られたトンネル微分コンダクタンスは明確な超伝導ギャップ構造を示すもののその関数形は面の方向に依存して変化した。このことは、STM分光測定においても、トンネル探針の方向の波数を持つ電子からの寄与を選択的に観測するためであると理解され、同時に(BEDT-TTF)_2Cu(NCS)_2の超伝導ギャップは2次元面(b-c面)内において大きな異方性を持つことが明らかになった。トンネルスペクトルの角度依存の解析から、超伝導ギャップはフェルミ面の線上で消失しているd-波の対称性を持つことが示された。今後、さらに磁場中のSTM測定を進行させる予定である。有機物超伝導体の電子状態を調べるため、トンネル顕微鏡(STM)装置の整備を行うとともに、現有のSTM装置による測定も同時に行った。有機物超伝導体でのSTM測定では、特に低温領域が重要となるため、装置を低温で安定に動作させることが不可欠である。このため新たにSTMユニットを購入した。これをヘリウムクライオスタットに組み込むことにより、1.4Kまでの温度域での測定が可能になった。この装置を用いて、現在までに標準試料においての予備測定を開始している。さらに、この装置に超電導磁石を組み込み、磁場下でのSTM測定を可能にすることを計画している。磁場下の測定では、超伝導の渦糸状態の電子状態を微視的に調べることが可能となることから、極めて有力な測定手段として期待される。また、現有の装置を用いた測定では、有機物超伝導体(BEDT-TTF)_2Cu(NCS)_2の単結晶試料を用いたトンネル分光測定を行った。この結果、超伝導相の電子状態密度において明確な超伝導ギャップ構造を観測した。この超伝導ギャップ構造は相当に大きい異方性を示しており、この物質における超伝導が単純な等方的s波によるものではないことが明らかになった。一方で、測定の過程において単結晶試料の清浄な表面を得ることが極めて難しいことも明らかになった。今後、再現性のある精密なデータを得るためにには、大気に試料を直接さらさない状態での試料表面の処理等の工夫が必須である。有機物超伝導体の電子状態を調べるため、トンネル顕微鏡(STM)装置の整備及びトンネル分光測定を行った。まず、前年度に引き続きSTM装置に超電導磁石を組み込み、磁場下での測定を行えるようにする装置の改造を行った。また、実際の測定では有機物超伝導体(BEDT-TTF)_2Cu(NCS)_2の単結晶試料を用いたトンネル分光測定を行った。装置の改造では、超伝導磁石をSTM装置に組み込むため、外のデュワ-部分を含めた周辺の構造部を改造するとともに、トンネルユニット部の入る内挿の金属デュワ-を新たに作製した。これを用いて予備的な測定を行い、最高磁場7T、最低温度1.4KでのSTM測定を行えることを確認した。

一方、有機物超伝導体(BEDT-TTF)_2Cu(NCS)_2のトンネル分光測定を、単結晶試料の面の方向を変えながら行い、超伝導ギャップの波数空間における異方性を調べた。得られたトンネル微分コンダクタンスは明確な超伝導ギャップ構造を示すもののその関数形は面の方向に依存して変化した。このことは、STM分光測定においても、トンネル探針の方向の波数を持つ電子からの寄与を選択的に観測するためであると理解され、同時に(BEDT-TTF)_2Cu(NCS)_2の超伝導ギャップは2次元面(b-c面)内において大きな異方性を持つことが明らかになった。トンネルスペクトルの角度依存の解析から、超伝導ギャップはフェルミ面の線上で損失しているd-波の対称性を持つことが示された。今後、さらに磁場中のSTM測定を進行させる予定である。
人口動態を考慮した上での年金積立金のポートフォリオの見直しの影響

年金積立金の運用先として、人口動態の差の影響を考慮できる理論的なモデルを構築し、現実的な値のもと、投資先として外国の割合を高める影響を明示的に示すことを目的としている。また、学術的な独自性と創造性は、本多(2012)では捨象されている海外部門を考慮し年金制度の持続可能性の議論を深める点、そして、その際に人口動態の差、「老いている国」と「若い国」を考慮しつつ、年金方式の差にも注目して影響を明らかにしようとしている点にある。
自律分散原理の理論

2つの自己組織システムと思われるモデルを構成して,自己組織化の可能性を考察した。複数の基本動作を試行錯誤的に組合せて合目的的行動を自己形成させるとき,構造の中にエネルギ-最小の平衡状態を“本能"として与えておくだけで,自己組織的に望ましい行動パタ-ンを獲得することが確かめられた。また,いろいろなロボットが構成できる部品群を用意し,部品のつながり方を指示する設計情報を部品に分散させておき,その情報をコントロ-ルする“システム記述"を与えることによってそれに応じたロボットができていくことが確かめられた。これらの考察から,自己組織システムがもつべき特質として,可塑性,継続的に変化する性質,安定状態または平衡状態があること,外のシステムとの干渉があること,などが抽出できた。大規模なシステムは分散型の制御をする方が,設計も容易で,またサブシステムの追加,削除も柔軟にできるし,複数の制御装置のうちの何台かが故障してもシステム全体は安定に動作するという耐故障性の向上にもつながる。線形系に対するこのような分散型制御系の安定化補償器の設計法,逐次サブシステムが追加される場合に追加すべき補償器の設計法,ロバストな分散型サ-ボ系の設計法などについて理論的結果を導いた。自律分散システムの機能と構造の関係を明らかにするのに先立って,“機能"という概念そのものを考察し,機能が“をする"という形式で表現されること,工学一般で考えたときその目的語には物質とエネルギ-と情報の3種が考えられること,他動詞には2点間あるいは2状態間をつないで,伝える,輸送する,移行させるというものと,2点間あるいは2状態間を遮断するというものとの2種が考えられること,したがって目的語3種に他動詞2種,組合せて6種の機能に分類整理できることを明らかにした。
コモンマーモセットで解き明かすブドウ球菌エンテロトキシン嘔吐メカニズム

本研究では、小型霊長類である顧問マーモセットを用いてブドウ球菌エンテロトキシン(SE)の嘔吐メカニズムの全容解明を目指し、SE受容体の探索と嘔吐シグナルの伝達機構、SEA内の嘔吐活性部位の同定を試みており、30年度は以下の研究を実施した。1.前年度に引き続き、SEAと高親和性を示す肥満細胞上の分子の検索を進めた。組織切片上において肥満細胞を各種酵素で処理したのちSEAとの相互作用を確認したところ、高親和性分子は糖タンパク質であることが示唆されたため、コモンマーモセット消化管から抽出したタンパク質から肥満細胞に存在する候補タンパク質のプルダウンを試みた。しかし、当該タンパク質の量がごく微量であるため分離には至らなかった。2.そこでコモンマーモセット消化管より細胞を分取し、肥満細胞のみを回収することを試みた。粘膜細胞を取り除き、粘膜下組織の細胞群よりセルソーターにより肥満細胞のみを分取することに成功した。この肥満細胞を用いてcDNAライブラリーを作製し、現在酵母ツーハイブリッドシステムにより、SEAと高親和性を示す糖タンパク質の同定を行っている。3.阻害剤を用いたin vivo, ex vivoでの実験により個体レベルの嘔吐メカニズムは明らかとなった。すなわち、SEAにより消化管肥満細胞が脱顆粒を起こし、放出されたヒスタミンが迷走神経を刺激することで嘔吐中枢へと伝わり、嘔吐反射を惹起する。また、この迷走神経での伝達にセロトニンも関与している。肥満細胞上のSEAと高親和性を示す分子の同定に難航している。本分子が同定されたのち、研究計画の最終段階に進むことができる。SEA高親和性分子については現在進めている酵母ツーハイブリッドシステムにより同定可能であると考えているが、より効率的に同定するために、マーモセットより粘膜型肥満細胞および粘膜下組織肥満細胞をそれぞれ分離し、RNAseqによりmRNAの発現状況を比較解析し、粘膜下組織肥満細胞に特異的に発現する分子の特定を計画している。本研究では、小型霊長類であるコモンマーモセットを用いてブドウ球菌エンテロトキシンの嘔吐メカニズムの全容解明を目指している。研究目標のうち、まず以下の2点を明らかにするために研究を実施した。1. SEsの嘔吐発現における腸管肥満細胞上の受容体を同定し、SEsと受容体との結合から脱顆粒に至るシグナル伝達機構を明らかにする。2.免疫組織染色およびタンパク質相互作用の解析により、作製したSEA変異体と肥満細胞における相互作用を精査し、SEAの嘔吐活性に必須な構造を明らかにする。平成28年度は、まず腸管組織から抽出したタンパク質を用いて免疫沈降法およびアフィニティクロマトグラフィを行い、SEAに強く結合する分子の探索を行った。SEA結合カラムで精製した組織抽出液をfarwestern blottingにより解析し、SEAと高親和性分子が存在するか確認した。現在複数のサイズの候補タンパク質が検出されており、LC-MSによる解析に向けて準備中である。また、SEA変異体の作出により、毒素分子内における活性部位を探索中である。作製したSEAの部位特異的変異体をマーモセット腸管の組織切片上にマウントし、免疫染色後に検出することで結合性の変化を検討している。これまでにSEA分子内において2箇所の肥満細胞への結合に関わる部位を見出しており、数アミノ酸残基レベルまで絞り込みを行っている。また予定を繰り上げて嘔吐シグナル伝達経路についても解析を行った。マーモセットにケミカルメディエーターの阻害剤を投与しセロトニンアンタゴニストの作用を明らかにした。平成28年度に実施予定であった研究項目について、1. SEsの嘔吐発現における腸管肥満細胞上の受容体を同定し、SEsと受容体との結合から脱顆粒に至るシグナル伝達機構を明らかにする。上記の2つに着手することができ、受容体の同定や活性部位の特定の最終段階には至っていないが、一定の結果が得られた。またin vivoにおける嘔吐シグナル伝達機構の解析実験を前倒しして実施することができたため、概ね順調に進展していると判断する。本研究では、小型霊長類である顧問マーモセットを用いてブドウ球菌エンテロトキシン(SE)の嘔吐メカニズムの全容解明を目指し、SE受容体の探索と嘔吐シグナルの伝達機構、SEA内の嘔吐活性部位の同定を試みており、29年度は以下の研究を実施した。1.前年度にSEに高親和性タンパク質を検出できたため、このタンパク質をLC-MS/MSで同定した。この候補タンパク質Aは、大腸菌発言系により発現・精製され、in vitroにおいてSEAと結合することが確認された。またこの分子を発現する培養細胞を用いてSEAの作用を解析し、細胞増殖に関与することが明らかになった。また、オートファジーとの関与も示唆された。現在この候補タンパク質Aと肥満細胞との関連を解析中である。また肥満細胞特異的な候補タンパク質をさらに発見するためにSEAと高親和性の分子を新規な方法を道いて探索中である。2.嘔吐シグナルの伝達について、マーモセットにセロトニン作動性神経の神経毒を用いて嘔吐実験を行ったところ嘔吐反射の消失が認められたことから他の嘔吐反射と同様にセロトニン作動性神経の重要性が明らかとなった。一方末梢では肥満細胞から放出されるヒスタミンの重要性が示されているため、マーモセットから迷走神経の神経節を回収した。今後、解析に供する予定である。