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「ヒトパピローマウィルスの病理学」に基づいたヒト体性幹細胞の寿命制御

ヒト体細胞を用いた再生医療において、十分量の細胞数を得るのは困難である。本研究により、種々の組織由来の間葉系幹細胞を用いて細胞寿命延長の機構の明らかにし、再生医療に用いる細胞の確保に向けた、要素技術の礎を確立できた。臨床応用へ向けて細胞にダメージを伴わない遺伝子導入法による細胞延命増殖の方法を確立し、細胞を正常なまま寿命延長する方法を開発した。また、多分化能を有するヒト由来間葉系幹細胞(骨髄、臍帯血、月経血、末梢血など)については、寿命延長ならびに目的とする組織への最終分化させる手段を開発した。本研究は、細胞治療に用いる臨床応用可能な細胞のソースの開発を目的としている。再生医療を取り巻く法体系が整備されつつあり、これらの法律・指針の要求事項を満たす、安全で有効性の高い、細胞ソースの確立は大変重要である。正常な細胞が正常なまま機能を損なうことなく、安定で安全な細胞を医療の現場に必要十分量が供給されるシステム構築を目指す。増殖の機能を失った組織あるいは器官を細胞移植によって修復しようとする再生医学にとって細胞数の確保は必要不可欠である。比較的細胞を増やすことが容易とされている骨髄間質細胞や神経幹細胞においても、ある分裂回数の後に増殖を止めてしまうため、将来における移植医療でのドナーの細胞数不足が危惧されている。その細胞不足の解消にあたり、細胞の寿命をコントロールすることで延長させ、さらに腫瘍化せず、より正常に近い状態、かつ安全な細胞を臨床の場に提供できる細胞の数を確保することを目的とした研究である。本研究においては、ヒトパピローマウイルスの部分構造遺伝子であるE6を用いて、テロメラーゼを活性化し、p53を分解誘導することによりアポトーシス、G1 arrestを回避した。また、ヒトパピローマウイルスのE7を用いてRBファミリー(RB, p107, p130)と結合して、p16Ink4a増加に伴ってリン酸化が阻害されたRbをリン酸化してE2F放出を可能にし細胞を不死化した。同様の手法をもちいて、種々の組織由来の間葉系幹細胞を用いて細胞寿命延長の機構の詳細を明らかにしていくが、その中で臨床応用、細胞治療に十分な量の安全で品質の均質な細胞提供に向けてRNA干渉法、PTDタンパクによる細胞延命増殖の方法、さらに細胞をできるだけ正常なまま寿命延長する方法を開発する。バイオリソースの蓄積や、寿命延長による不死化は、順調に進展している。正常な細胞が正常なまま機能を損なうことなく、安定で安全な細胞を医療の現場に必要十分量が供給されることを意味している。現在、臍帯血からの間葉系細胞のstrainの樹立さらに寿命延長にも成功しており、細胞の特徴性格づけも明らかにされている(Terai M, Uyama T, et al. Mol Bio Cell)。さらに最近の成果として月経血由来間葉系細胞の骨格筋への高率な分化誘導に成功している(Cui C, Uyama T et al. Mol Biol Cell)。この技術を応用して、ヒト正常体細胞を用いた細胞移植治療の際に必要十分な量の分化可能な細胞数を確保することは医療の現場に於いては大きな利益をもたらすと確信している。さらに分化後移植された細胞が生体内でうまく機能するかどうか、腫瘍化しないかどうかの安全性、有効性を詳細に検討する。具体的にはヒト骨髄間葉系幹細胞にヒトパピローマウイルスのE6、E7、ポリコウム遺伝子群のBmi-1およびhTERTのコンストラクトをレトロウイルスにより遺伝子導入し、寿命を延長させることを考えている。ヒト体細胞を用いた再生医療の研究においても、必要な十分量の細胞数を得るのは困難であり、再現性を確認するのも一般に困難である。本研究は種々の組織由来の間葉系幹細胞を用いて細胞寿命延長の機構の詳細を明らかにし、さらに臨床応用へ向けて細胞にダメージを伴わない遺伝子導入法による細胞延命増殖の方法を確立し、細胞をできるだけ正常なまま寿命延長する方法を開発する。本研究においてはヒト骨髄間葉系幹細胞の寿命を腫瘍化させずに延長させる実験系を用いた。具体的にはヒトパピローマウイルスの系である。ヒトパピローマウイルスの部分構造遺伝子であるE6はテロメラーゼを活性化し、p53を分解誘導することによりアポトーシス、G1 arrestを回避することができる。ヒトパピローマウイルスのE7はRBファミリー(RB, p107, p130)と結合して、p16 Ink4a増加に伴ってリン酸化が阻害されたRbをリン酸化してE2F放出を可能にして細胞を不死化する。

具体的にはヒト骨髄間葉系幹細胞にヒトパピローマウイルスのE6、E7、ポリコウム遺伝子群のBmi-1およびhTERTのコンストラクトをレトロウイルスにより遺伝子導入し、寿命を延長を試みた。さらに、細胞治療の応用に関して動物実験を行った。その中で寿命制御された細胞による細胞治療の効果の病理学的解析および評価システムの開発に関しても実験を進めた。細胞数の確保に際し、腫瘍化や染色体異常等を伴わないこと、さらに現在実験段階において行なっているウイルスを用いた遺伝子導入に変わる手段を開発することで細胞移植による再生医療の安全性を保証し、多くの患者に再生医療を臨床応用可能な段階へ医療全体、社会全体を導いていく。ヒト体細胞を用いた再生医療において、十分量の細胞数を得るのは困難である。本研究により、種々の組織由来の間葉系幹細胞を用いて細胞寿命延長の機構の明らかにし、再生医療に用いる細胞の確保に向けた、要素技術の礎を確立できた。臨床応用へ向けて細胞にダメージを伴わない遺伝子導入法による細胞延命増殖の方法を確立し、細胞を正常なまま寿命延長する方法を開発した。また、多分化能を有するヒト由来間葉系幹細胞(骨髄、臍帯血、月経血、末梢血など)については、寿命延長ならびに目的とする組織への最終分化させる手段を開発した。種々の組織由来の間葉系幹細胞を用いて細胞寿命延長の機構の詳細を明らかにしていく。その中で臨床応用、細胞治療に十分な量の安全で品質の均質な細胞提供に向けてRNA干渉法、PTDタンパクによる細胞延命増殖の方法、さらに細胞をできるだけ正常なまま寿命延長する方法を開発する。将来的には遺伝子導入を伴わない方法の確立も視野に入れている。これは細胞を培養というストレスに打ち勝って、細胞が定常状態すなわちDNA複製時においてもテロメアの長さを維持し、かつ遺伝子発現も定常化したままで細胞分裂を続けさせることを意味している。そのためにはテロメア短縮を除いたストレスの本態を解明し、ストレスフリーの状態を作り出すことも本研究計画に含まれる。すなわちその目標達成のため細胞培養時に用いる培養液の検討も計画に含めている。細胞の寿命制御機構の詳細を分子生物学的に解明し、さらにその機構を制御するためには分子生物学的なアプローチがメインであるが、細胞にとって培養ストレスの軽減による細胞の寿命制御は、臨床応用の段階においても一番安全で均質で効果的で経済的である。<ヒト体性幹細胞の寿命延長のための遺伝子導入手段、培地の研究>種々の組織由来の間葉系幹細胞を用いて細胞寿命延長の機構の詳細を明らかにしていくが、その中で臨床応用、細胞治療に十分な量の安全で品質の均質な細胞提供に向けてRNA干渉法、PTDタンパクによる細胞延命増殖の方法、さらに細胞をできるだけ正常なまま寿命延長する方法を開発する。
老年者の高血圧および起立性低血圧の発生機序における交感神経活動の役割

本研究は動脈圧受容器-交感神経反射機能に及ぼす加齢の影響およびその安静時交感神経活動との関係を明らかにすることを目的とした.1680歳の異なる年齢層の健常人を対象とした.1)マイクロニューログラフィを用いて筋交感神経活動を測定し,血圧上昇作用あるいは下降作用を有する薬物負荷により血圧を上昇または下降させた時の心拍数および筋交感神経活動の反応を観察した.その結果,動脈圧受容器-心拍数反射機能は血圧上昇時,降圧時とも加齢によって減弱した.一方,動脈圧受容器-筋交感神経反射機能は血圧上昇時,降圧時とも年齢との間に有意な相関を示さなかった.安静時交感神経活動は加齢とともに亢進したが,動脈圧受容器-交感神経反射機能との間に相関を示さなかった.本研究により動脈圧受容器-心拍数反射機能は加齢により減弱するが,70歳以上の老年者でも動脈圧受容器-交感神経反射機能が比較的よく保たれていることが明らかとなった.また,動脈圧受容器反射機能のsteady-state responseとdynamic responseを若年者と老年者で比較すると,老年者では圧受容器反射機能のdynamic responseは心拍数反射および筋交感神経反射においてもよく保たれていることがわかった.本研究は動脈圧受容器-交感神経反射機能に及ぼす加齢の影響およびその安静時交感神経活動との関係を明らかにすることを目的とした.1680歳の異なる年齢層の健常人を対象とした.1)マイクロニューログラフィを用いて筋交感神経活動を測定し,血圧上昇作用あるいは下降作用を有する薬物負荷により血圧を上昇または下降させた時の心拍数および筋交感神経活動の反応を観察した.その結果,動脈圧受容器-心拍数反射機能は血圧上昇時,降圧時とも加齢によって減弱した.一方,動脈圧受容器-筋交感神経反射機能は血圧上昇時,降圧時とも年齢との間に有意な相関を示さなかった.安静時交感神経活動は加齢とともに亢進したが,動脈圧受容器-交感神経反射機能との間に相関を示さなかった.本研究により動脈圧受容器-心拍数反射機能は加齢により減弱するが,70歳以上の老年者でも動脈圧受容器-交感神経反射機能が比較的よく保たれていることが明らかとなった.また,動脈圧受容器反射機能のsteady-state responseとdynamic responseを若年者と老年者で比較すると,老年者では圧受容器反射機能のdynamic responseは心拍数反射および筋交感神経反射においてもよく保たれていることがわかった.
植物の生存戦略としての細胞内膜系の分化機構の解明

植物は、病原体の感染や外環境変化に対処するために細胞内膜系を巧みに使い分けている.本研究では,細胞内膜系動態から植物の生存戦略の理解を深めることを目指した.虫害応答研究では,小胞体由来のオルガネラERボディを使った新規の防御系の実態を解明した.一方,外環境応答研究では,小胞体流動を駆動するAnti-Myosin XI細胞骨格系が器官屈曲のブレーキとして働いていることを見いだし,「植物の器官が真直ぐに伸びる」という基本的な成長原理に関わる仕組みの存在を明らかにした.免疫細胞を持たない植物は,全身の細胞が外敵から個体を守るための仕組みをもつ必要がある.このために植物は,全ての細胞が備えもっている液胞や小胞体を,外敵の種類に応じて巧みに使い分けているという新しい概念が生まれてきた。本研究課題の一つとして,感染ストレス下での小胞体のダイナミックな動態を把握することを目的として,傷害ストレス依存的に小胞体から誘導される構造体(ERボディと命名)の形成機構と生体防御系としての実体解明の研究を行っている.ERボディは内部にβ-glucosidase(PYK10)を大量に蓄積している.昨年度までの研究から,PYK10がミロシナーゼとしての機能を持つことが分かった.従って,ERボディ系が,植物の地下部(根)における生体防御(ミロシナーゼーグルコシノレート系)のkey playerである可能性が浮上した.この成果を受けて,様々な病原菌や共生菌感染に対する効果を調べた、その中に今回遅れてドイツより入手した2種類の菌(糸状菌Pythium sylvaticumstrain DSM2322と共生菌Piriformospora indica)が含まれる.その結果,P.indicaにより,シロイヌナズナのERボディが消失することが確認でき,ERボディの感染応答の実験系の確立を行った.一方,P.sylvaticumstrainは感染力が強いことが原因で5現時点で実験系の確立まで至っていない.この他にも入手可能な菌感染の実験系の確立を行った.植物の生体防御研究の多くは,地上部(葉や果実)で行われてさており,地下部での防御機構に関する知見は乏しい.上記の実験系の確立により,ERボディによって駆動される根の感染防御系の解明に貢献できた.本研究は,細胞内膜系の動態という新しい視点から「植物の生存戦略」の理解を目指すことを目的としている.感染および環境ストレスに応じた細胞内膜系の動態に着目し下記の成果を得た.1.感染ストレス応答:「液胞系」と「小胞体系」に注目して研究を実施した.独自に開発した小胞輸送変異体ライブラリー(GFS)から,菌感染応答異常を示す変異体を複数選抜・解析した.その結果,GFS11は,非病原性菌感染におけるサリチル酸シグナル伝達に関わること(論文準備中),GFS4,GFS5,GFS6は複合体を形成して感染応答に関わること,GFS12はkinaseドメインをもつ機能未知のタンパク質で基礎的抵抗性に関わることが分かった.また,非病原性菌感染直後の膜融合過程を解析するために,エフェクターを誘導性プロモータ依存的に発現する形質転換植物に各種可視化マーカーを導入し,過敏感反応による細胞内膜系および細胞骨格系動態をリアルタイムで観察することに成功した.一方,小胞体から派生する構造体の解析からは,新規の抗カビ物質の生産系の発見(論文投稿中)およびERボディ依存的な根圏微生物に対する防御機構の発見があった.2.環境ストレス応答:「細胞骨格」と「細胞間シグナルの分泌系」に注目して研究を実施した.ミオシンXIK依存的な小胞体流動(昨年の成果)と他のオルガネラの運動解析から,仮説「原形質流動の駆動力が小胞体上のミオシンである」を裏付けることができた.ミオシンXIの多重欠損変異体の解析から,重力および光に対する屈性反応に,ミオシンXIがアクチンと協調してブレーキとして働き,植物の屈性反応の微調整を担っているという興味深い発見があった.また,昨年に発見した分泌性シグナルstomagenが,光に応答して光合成組織で合成・分泌され,原表皮細胞の運命決定を担っているという機構が見えてきた.本研究の目的は,小胞輸送系を含む細胞内膜系の動態という視点から,植物の感染防御応答や環境ストレス応答を解析し,細胞から個体レベルでの「植物の生存戦略」の理解を目指すことである.当該年度の具体的な成果は下記の通りである.(2)葉のオイルボディが,真菌感染時に抗菌物質生産工場として働く事を初めて明らかにした(Shimada et al., 2013 ; F1000Primeに選抜).また,種子の感染防御であるムシレージの放出機構を解明した(Kunieda et al., 2013).外敵に対する忌避物質生産系としてのミロシン細胞の分化機構を解明した(論文準備中).また,小胞体由来ERボディの酵素がミロシナーゼとして機能することを証明するとともに, ERボディ系の獲得について進化的側面から解析した(論文準備中).(3)小胞体ネットワーク形成にモータタンパク質ミオシンXI-kが必要である事および小胞体膜タンパク質のリン酸化が膜融合を促進する事を明らかにするとともに,同じfamilyに属するミオシンXIが植物の屈性運動を調整している事を見いだした.また,ミオシンXI-iが,核外膜タンパク質と結合し,核の暗定位運動に寄与する事を初めて証明した(Tamura et al., 2013).免疫細胞を持たない植物は,全身の細胞が外敵や環境ストレスから個体を守るための仕組みをもつ必要がある.

本研究の目的は,小胞輸送系を含む細胞内膜系の動態という視点から,植物の感染防御応答や環境ストレス応答を解析し,細胞から個体レベルでの「植物の生存戦略」の理解を目指すことである.当該年度の具体的な成果は下記の通りである.(1)病害虫応答制御系では,地上部での食植生昆虫からの防御系を担うミロシン細胞が,葉の維管束に沿って配備されることを証明した.植物のライフラインというべき組織を重点的に防御する戦略と位置づけられる.予想外の成果としては,ミロシン細胞の分化が,表皮組織の気孔(孔辺細胞)の分化マスター遺伝子として知られているFAMAによって制御されていることが分かった.両細胞は,形態も機能も分布域も全く異なるにも関わらず,葉の原基からの分化の段階で共通の経路を辿ることは興味深い現象と言える.(2)これまで細胞内膜系の動態の駆動力となっているミオシンモーターに注目して研究を推進し,小胞体流動や細胞核の運動の分子機構を明らかにしてきた.シロイヌナズナのMyosin XI classには13メンバーが存在する.これらのメンバーの多重欠損変異体の表現型の解析から,今年度は,植物の基本的な成長原理に迫る発見があった.Myosin XIが欠損すると植物体は真直ぐに成長できない.また, Myosin XI欠損変異体の様々な器官は光や重力等の刺激に対して過剰に応答することが分かった.植物が光や重力等の環境刺激に応答して屈性反応を起こすことは良く知られている.この屈性は器官の屈曲を伴うが, Myosin XIはこの屈曲のブレーキとして働いていることが分かった.本成果はNature Plants誌の2015年4月号の表紙を飾るとともにウエブサイトのトップページで「Reach for the sky」のタイトルで紹介された.本研究では,小胞輸送系を含む細胞内膜系の動態という視点から,植物の感染防御応答や環境ストレス応答を解析し,細胞から個体レベルでの植物の生存戦略の理解を目指している.植物細胞内膜系による感染防御応答及び環境ストレス応答の制御に関する当該年度の成果は下記の通りである.1.感染ストレス応答(1)小胞輸送不全変異体プールから選抜した非病原性菌の感染抵抗性不全変異体6種類について,それぞれの原因遺伝子を同定し,各変異体の感染シグナルの受容から過敏感細胞死に至る素過程における表現型解析を行った.次年度も解析を継続する.(2)真菌が感染した葉では,小胞体由来のオイルボディに抗菌物質2-hydroxy-octadecatrienoic acid (2-HOT)を合成するための2つの酵素が誘導・局在化することを見いだした.新規のオイルボディ依存的な真菌感染防衛系を提唱するために,次年度も解析を継続する.(3)私たちが見いだした植物生体防御系ERボディに注目して,特異的膜タンパク質の機能解明(Yamada et al., 2013)とERボディを含む小胞体の形態形成に関わる因子ERMO3の機能解明(Nakano et al., 2012)を行った.2.環境ストレス応答(1)気孔分化を促進するSTOMAGENの過剰発現体を用いて,気孔密度の人為的な上昇により光合成速度を30%まで上昇できる事を証明した(Tanaka et al., 2013).
多様な細胞機能を制御する細胞間信号伝達システムCD47-SHPS-1系の生理機能

私共は、これまで蛋白質チロシンリン酸化を介する細胞内シグナル伝達系に関する研究を継続してきているが、その過程において、全く新たな細胞間シグナル伝達システムであるCD47-SHPS-1系を見出している。本研究では、このCD47-SHPS-1系の生理機能と作用機構に関し検討を行った。その成果を、以下に列記する。(1)CD47はSHPS-lと協調的に作用することにより、神経突起伸長を促進して神経回路網形成に寄与することを明らかにした。(2)SHPS-lのマクロファージ貪食抑制作用にはSHP-lチロシンホスファターゼとの結合に重要なSHPS-lのチロシンリン酸化部位に加えて細胞内領域全体が必要であり、また、マクロファージ上のSHPS-l貪食標的細胞との結合をも制御する可能性が示唆された。(3)CD47が別の細胞に発現するSHPS-lにtransに結合した後、SHPS-l発現細胞内にSHPS-lと共にendocytosisされること(trans-endocytosis)を明らかにした。このCD47のtrans-endocytosisには、クラスリンやダイナミンが重要であると共に、Rac,Cdo42により制御を受ける。(4)SHPS-lは樹状細胞に強く発現するが、SHPS-lは樹状細胞によるCD4陽性T細胞のThl7あるいはThlへの分化促進の作用、およびNKT細胞の活性化に重要である可能性が示唆された。(1)海馬神経細胞において、CD47はSHPS-1と協調的に作用することにより、神経突起伸長を促進して神経回路網形成に寄与することを明らかにした。また、CD47による神経突起伸長作用は、Srcおよびそれによりリン酸化され活性化されるVav2、FRGなどのGEFを介していることを明らかにした。(2)昨年度までに赤血球上のCD47分子がマクロファージ上のSHPS-1分子と相互作用しマクロファージによる赤血球の貪食を抑制することを明らかにしていた。今年度、SHPS-1の細胞内チロシンリン酸化部位を改変、あるいは細胞内領域を完全に欠失させた変異型SHPS-1を強制発現するRAWマクロファージ様細胞を作成し、検討を行った。その結果、SHPS-1の貪食抑制作用にはSHP-1チロシンホスファターゼとの結合に重要なSHPS-1のチロシンリン酸化部位に加えて細胞内領域全体が必要であることが示唆された。また、マクロファージ上のSHPS-1は貪食標的細胞との結合をも制御する可能性が示唆された。私共は,これまで蛋白質チロシンリン酸化を介する細胞内シグナル伝達系に関する研究を継続してきているが,その過程において,全く新たな細胞間シグナル伝達システムであるCD47-SHPS-1系を見出している。本研究では,このCD47-SHPS-1系の生理機能と作用機構に関し検討を行った。その成果を,以下に列記する。(1)膜型分子であるCD47がどのような機構で別の細胞に発現するSHPS-1にtransに結合した後,乖離するかが不明であったが,CD47が別の細胞に発現するSHPS-1にtransに結合した後,SHPS-1発現細胞内にSHPS-1と共にendocytosisされること(trans-endocytosis)を明らかにした。このCD47のtrans-endocytosisには,クラスリンやダイナミンが重要であると共に,Rac,Cdc42により制御を受ける。(2)SHPS-1は,獲得免疫系の活性化に重要である樹状細胞に強く発現する。

SHPS-1 KOマウスでは,実験的自己免疫性脳脊髄炎の発症が著しく抑制されると共に,皮膚の接触性過敏反応も減弱することを見出した。さらに,SHPS-1 KOマウス由来樹状細胞によるCD4陽性T細胞のTh17あるいはTh1への分化が障害されていることも明らかにした。また,α-GalCer刺激によるNKT細胞の腫瘍転移抑制効果を検討したところ,SHPS-1 KOマウスにおいて腫瘍転移抑制効果の有意な減弱が認められた。これは,SHPS-1 KOマウスにおいて樹状細胞によるNKT細胞の活性化が障害されているためと推察された。
変化するオーストラレイシア立憲主義

「オーストラレイシア」共通の特色はそう多くなく、オーストラリアの連邦の硬性憲法とニュージーランドの軟性憲法の差とともに、後者は最高裁が少人数で機動的に判断を行っている点むしろ立憲主義の点から評価される。オーストラリアは、2011年人権議会審査法(連邦法)によって国際人権条約の「人権」基準が徐々に国内法に浸透し、議会主権と連邦最高裁による違憲審査を調和させた独自の「立憲主義」を発展させつつある。ただし研究最終年度における調査で、日本と共通するポピュリズム的傾向が連邦憲法における議員の二重国籍禁止条項との関係で継続的な問題を惹起し、この点、さらに他のコモンウェルス諸国との比較が必要である。平成25年度は,5月に新潟において研究会を開催した。JR新潟駅近くの会議室において,分担者松井がニュージーランドの憲法状況について報告を受け,また代表者佐藤が今後の研究の進め方について問題提起をした。さらに,この方向性に基づいて研究を各自で進め,10月には,京都において,京都ガーデンパレスにおいて研究会を開催した。10月の研究会においては,分担者柳井がコモンウェルス諸国における立憲主義について報告を行い,また代表者佐藤がオーストラリアにおける最近の人権条約の実施状況について報告をした。その後,各自で購入した文献を精読するに努めた。代表者佐藤は,本科研獲得以前の研究成果とも関わるものであるが,研究成果として,「オーストラリアにおける差別表現規制ー差別禁止法と国内人権機関の役割」『国際人権』第24号(2013年10月30日)5362頁を公表した。なお,分担者松井及び柳井は,平成26年2月にニュージーランドに基礎調査を行った。詳細な報告について,平成26年度中に開催予定の研究会において行う予定である。研究代表者佐藤は次の報告を行った。6月22日のヨーロッパ人権条約研究会において,オーストラリアにおける人権保障関連法制の変動状況について報告した。11月23日のヨーロッパ人権条約研究会において,オーストラリアおよびニュージーランドにおける保障状況も含む「文化的権利」について報告した。また,平成26年8月2日実施されたイギリス憲法研究会に「オーストラリア憲法とイギリス憲法」について報告文書を提出し,同9月30日にイギリス憲法研究会に同題目の論文を提出した。本科研関連業績として本報告に記入した分担者の研究とともに2015年度中に書籍として刊行予定であるなお,分担者松井はニュージーランドにおける憲法状況と選挙についての実地調査を行った。2015年2月22日2月27日,ウェリントン・ビクトリア大学ロースクールのTony Angelo教授及びAmeha Wondirad研究員と面談し、近年の、とりわけ2014年9月総選挙以降のニュージーランド憲法の動向について情報と資料を収集した。併せて、ニュージーランド国会と最高裁判所を訪問して情報を収集するとともに、審議・審理を見学した。2011年の選挙制度改革についてのレファレンダム(失敗)以降の、とくに昨年9月総選挙以降のニュージーランド憲法改革の動向について最新の情報・資料を得るとともに、近年の日本の憲法動向についても意見を交流することができた。昨年9月、比例選挙の下で国民党は勝利したものの過半数には1議席不足し、連立を余儀なくされている状況の中での憲法改革の停滞、現在の憲法的課題について最新の情報と資料(主に国会改革に関する)を入手し得た。平成27年3月1日には大阪産業大学梅田サテライトキャンパスにおいて研究報告会と総括を行うことができた。代表者佐藤は次年度に繋げたい研究としてオーストラリアにおける人権教育について取り上げた。論文等の成果は,共著として発表した『憲法の「現代化」ーウェストミンスター型憲法の変動ー』(敬文堂・2016年2月)第2章「イギリス憲法の「現代化」と「法の支配」論の現状ービンガムの論説を手がかりに」(松原),第3章「貴族院改革とウェストミンスター型憲法の「現代化」(柳井),第9章の「オーストラリア憲法とイギリス憲法」(佐藤),「ニュージーランド憲法とイギリス憲法」(松井)である。昨年度発刊予定実績として掲載したが元々2015年度発刊予定のものであった。この他代表者佐藤による発表実績として,主としてニュージーランド憲法にかかる人権保障状況について発表した(ニュージーランドにおける人権保障(2015/6/20);ニュージーランドにおける人権保障ー「オーストラレイシア立憲主義研究」の視点から(2015/11/1);コモンウェルス憲法との「比較」が持つ意義と限界(2015/12/13);ニュージーランド憲法と立憲主義(2016/2/27)なお,佐藤・柳井・松井でニュージーランド現地調査を2016年3月に実施した。ニュージーランドのヴィクトリア・ユニバーシティ・オブ・ウェリントンにおいて,トニー・アンジェロ教授にニュージーランドにおける立憲主義状況をインタビューしたほか,ニュージーランド最高裁判所,ニュージーランド議会の現況についても視察し,短期間ながら充実した視察となった。また,柳井・松井・松原は,本研究と密接にかかわるイギリス法制研究について,『憲法のいまー日本・イギリスー』(敬文堂・倉持孝司,小松浩編著)に論考・翻訳を掲載した。論文成果は限られたものであるが,ニュージーランド現地調査を実施し,オーストラリア憲法との比較の持つ意義と限界について一定の研究の進展があったため。代表者佐藤が4件の報告を行ったほか,分担者松原がオーストラリア・ニュージーランドの人権保障状況との比較法的考察の前提的考察に当たる,イギリスの緊急事態について若干の論考を著した(公表は2017年5月予定であるが)。代表者佐藤は具体的には(1)「ニュージーランド憲法における人権保障とイギリス・日本」(ヨーロッパ人権条約研究会・2016年4月9日発表),(2)「イギリス国籍法の移民法による変容」(宮内紀子九州産業大学講師発表へのコメント

・日本臨床政治学会・2016年4月23日),(3)「比較憲法の意味と無意味」(ヨーロッパ人権条約研究会・2016年11月20日),(4)基調報告「大阪府における『外国人の人権』の現状と課題」(第43回大阪府在日外国人施策有識者会議・2016年12月22日)の報告を行い,研究課題の総括に努めたが,論文を公表するには至らなかった。ただし,(4)の報告を引き受けることによって,オーストラレイシア立憲主義研究の,日本における具体的課題解決への示唆について公表することができた。また,報告は非専門家が多く出席し,大阪府の実務的課題(ヘイトスピーチ救済の制度)設計に関する立法学的知見を公表することができたことは,一つの成果といえる。平成28年度は,代表者分担者ともに行政職等で多忙であったため,進捗は遅れている。特に最終年度としてニュージーランドの研究者と意見交換を行う予定であったが果たせなかった。延長を申請したのはそれが主たる理由である。2.2016年度に実施できなかった海外調査を実施した(於:オーストラリア・クイーンズランド大学・2018年1月15日21日)。クイーンズランド大学のスリ・ラトナパーラ(Suri Ratnapala)名誉教授(憲法学)、グレイム・オー(Graeme Orr)教授(政治学)、アンソニー・カシマティス(Anthony E Cassimatis)教授(国際法)、フランク・モルス(Dr Frank Mols)講師と代表者佐藤及び分担者柳井が意見交換を行い、ポピュリズム的な政治状況についての日豪比較の可能性について有意義な成果を得た。特にモルス講師からは追加で論文を提供いただき、今後の共同研究の可能性についても確認した。また憲法状況について、憲法上の規定を有するオーストラリアにおける議員の二重国籍問題それ自体、アカデミズムでは問題視されているものの、憲法改正は現実的ではないとのことであった。3.これらの成果を踏まえ、代表者佐藤は本科研の成果として、「『憲法』の比較の意味と無意味」『大阪産業大学論集人文・社会科学編』32号(2018年3月)7198頁を公表した。「オーストラレイシア」共通の特色はそう多くなく、オーストラリアの連邦の硬性憲法とニュージーランドの軟性憲法の差とともに、後者は最高裁が少人数で機動的に判断を行っている点むしろ立憲主義の点から評価される。オーストラリアは、2011年人権議会審査法(連邦法)によって国際人権条約の「人権」基準が徐々に国内法に浸透し、議会主権と連邦最高裁による違憲審査を調和させた独自の「立憲主義」を発展させつつある。ただし研究最終年度における調査で、日本と共通するポピュリズム的傾向が連邦憲法における議員の二重国籍禁止条項との関係で継続的な問題を惹起し、この点、さらに他のコモンウェルス諸国との比較が必要である。
アミノ酸配列の置換を生じるRNA編集の生理的意義の解明

本研究は、アミノ酸配列置換型RNA編集の更なる重要性を解明するため、ホルモン分泌に必須のCAPS1に生じるRNA編集をモデルとして選択し、生理的意義を解明することを目的として研究をスタートさせた。前年度に、CAPSI RNA編集に必要な相補鎖配列と責任酵素を決定した。本年度は、以下の解析を行った。1)CAPS1細胞内局在部位へRNA編集が与える効果を解析するため、GFPなどのタグを結合させたCAPS1発現ベクターを作製した。この際未縦集型と編集型を用意し、PC12細胞とMIN6細胞へ導入した。共焦点顕微鏡で観察したところ、CAPS1は細胞質に局在し、非刺激下においても、Latrotoxinによる脱分極刺激を加えても、特に両者の局在に差異を認めないことを確認した。2)CAPS1によるカテコラミン分泌へRNA編集が与える効果を解析するため、PC12細胞中の内在性CAPS1の発現を抑制する必要がある。このため、CAPS1に対するshRNAを導入し、これを安定発現する細胞株を樹立した。現在、この細胞株へ未編集型と編集型CAPS1を導入し、二重安定発現細胞株の樹立を目指している。3)ホルモン分泌におけるRNA編集の重要性を明らかにするため、ADAR1をノックアウトしたMIN6細胞を樹立した。すなわち、Flox-ADAR1 mutantマウスをIT6マウスと交配し、インスリン分泌腫瘍を摘出、ここからMIN6細胞を樹立した。グルコース負荷に良好なインスリン分泌を呈することを確認した後、Cre rccommbinを組み込んだアデノウイルスベクターを感染させ、ADAR1をMIN6細胞からノックアウトした。90%程度のADAR1がノックアウトされたことを確認した。ノックアウトによる有意な細胞死や形態の変化は認めなかった。現在インスリン分泌能やRNA編集効率の変化などを解析中である。1) CAPS1 RNA編集に必要な相補鎖を決定するため、下流イントロン中の2箇所に候補領域を絞った。これらの候補領域のRNAと組み換え編集酵素を用いてRNA編集アッセイを行い、編集部位から約1.5kb下流の領域がRNA編集に必須であることを決定した。また野生型マウスと編集酵素ADAR2ノックアウトマウスの各臓器における編集効率を比較し、脳ではADAR1とADAR2が協調して編集を触媒し、膵臓ではADAR1が責任酵素であることを決定した。2) CAPS1細胞内局在部位へRNA編集が与える効果を解析するため、GFPなどのタグを結合させたCAPS1発現ベクターを作製した。この際未編集型と編集型を用意し、PC12細胞とMIN6細胞へ導入した。非刺激下では、両者の局在に差異がないことを確認した。今後、ホルモン分泌刺激を加えた後にCAPS1の局在がRNA編集によってどのように変化するのかを観察する。3) CAPS1によるカテコラミン分泌へRNA編集が与える効果を解析すうため、PC12細胞中の内在性CAPS1の発現を抑制する必要がある。今後、この細胞株へ未編集型と編集型CAPS1を導入し、カテコラミン分泌へRNA編集が与える効果の解析を行う。4)ホルモン分泌におけるRNA編集の重要性を明らかにするため、ADAR1をノックアウトしたMIN6細胞の樹立を行うこととした。このため、Flox-ADAR1 mutantマウスをIT6マウスと交配中であり、樹立後インスリン分泌能を解析する予定。
複合物質系開拓による分子性伝導体の新しい物性制御

希土類の4f電子と有機分子のπ電子の複合物質系を開発して、両者の相関による新規な磁性や伝導性を実現するための基礎研究をおこなった。これまですでに低温まで金属伝導を示す化合物を数種類開発したが、構造に乱れが入りやすい、4f電子と周囲の相互作用が小さすぎる、といった点が課題であった。そこで、用いる希土類陰イオン錯体の電荷と寸法を低く抑えるように配位子を選択して、β"-(BO)_2[YbCl_4(H_2O)_2]という化合物を得た。この物質は構造の乱れを含まず、低温まで金属伝導を示す。また陰イオン間に水素結合ができて架橋された結果、希土類を含むこの種の化合物としては初めて陰イオンが鎖状構造をもつものが得られた。しかしこの架橋構造も4f電子間の相互作用を媒介するにはまだ不十分で、磁気秩序などは生じていない。またこの結晶自体も準安定状態にあり、常温で徐々に、210K以下で絶縁化するα相に変化する。これ以外に、希土類イオンの磁性(特に磁気異方性とその温度変化)を具体的な構造に基づいて予測・解釈するために、等価演算子法を用いて結晶場分裂を求め、任意の配位構造・温度・磁場方向に対する磁化率を計算するプログラムを作成して、これまでにこの研究課題で得た化合物などの磁性の温度依存性データと結晶場分裂を考慮した計算結果を比較して、実際に結晶場効果がこれらの化合物の磁性を支配していることを示した。これは含希土類有機導体の磁性の構造による制御・設計をおこなううえで必要な基礎研究成果である。希土類系とは別に、数MHz帯の高周波磁化率を測定する装置を設計・製作し、低温・高圧条件下で超伝導性が報告されている数種の[Pd(dmit)_2]塩に適用した。その結果、これらの超伝導は通常のバルク超伝導とはいえないと結論した。本研究の目的は、有機π伝導電子系にそれとは異質な電子系を複合させて、有機分子だけでは得にくい複合物性の発現が期待される物質の、設計と開発をおこなうことである。本研究の開始直前に、研究代表者は、特定領域研究(A)「集積型金属錯体」の公募研究の結果として、安定な含希土類有機伝導体の結晶を世界で初めて得た。そこで、希土類錯体-有機分子の新規複合系を引き続いて開発するとともに、得られた新物質の物理的性質の解明を主眼として研究を進めた。最初に得た含希土類有機伝導体安定結晶である(BO)_x[Ln(NCS)_6]は、極低温1Kまで金属伝導を示す。X線回折実験からは、有機πドナー分子BOの配列がβ"構造と呼ばれる型であることと、希土類錯イオンの構造は不明であるが、ドナー分子配列に対して不整合超周期配列をとっていることがわかった。磁化率測定と元素分析の結果とあわせて、組成式のxは約8と見積もられた。平成11年度に新しく開発した(DIEDO)_6[Ln(NCS)_6]は、約70K以上で半金属的伝導性を示し、低温では絶縁化する。DIEDO分子は末端に2つのヨウ素原子をもち、これが希土類錯体の配位子NCS^-と結合して相互作用することが予想されたが、実際にX線結晶構造解析からヨウ素-配位子間に短い原子間距離が見出され、予想が裏付けられた。しかし、磁性と伝導性の測定からは希土類4f電子と有機π伝導電子の相互作用は無視できるほど弱いと考えられた。この点は最初のBO塩でも同様である。一方、DIEDO塩のπ電子の磁性は、絶縁化前後で変化せず、伝導電子系がやや特殊な状態にあることが示唆された。以上の希土類-有機複合系の研究と並行して、接合・界面を利用した複合系作成のための真空蒸着装置の仕様を決め、備品として導入し基本性能を試験した。平成11年度に引き続いて、異質物質系複合化による新しい電子系創出のため、希土類4f電子系-有機π伝導電子系の複合系開発研究をおこなった。平成11年度までに、自己集合機能をもつπドナーを使って3系列の高伝導性物質が実際に得たが、次の問題が出てきた。・πドナーの自己集合機能が高いと、結晶内で陰イオンの構造が乱れてしまう。・これまで用いてきた陰イオン[Ln(NCS)_6]^<3->は、安定性と取扱いの容易さの点では非常に優れていたが、陰イオンどうしは隔離され、4f電子間の相互作用は働かない。・πドナーと配位子NCS^-の間の相互作用が、π電子-4f電子間の相互作用にはならない。以上の問題を克服するためには、希土類4f電子と周囲との相互作用を可能にするさらに優れた配位子の選択が決め手になる。平成12年度はNCS^-以外の配位子を使った新物質探索研究を進め、希土類イオン間を架橋させた構造を得ることを目標とした。希土類イオン間に相互作用をもたせて4f電子が磁気秩序化する可能性を追求することと、陰イオン側にも適切な自己集合機能をもたせることが目的である。これまでに結晶として得られた新規物質は2種類で、本研究の中でははじめて軽希土類イオン(Ce^<3+>,Sm^<3+>)を含むものを得た。

そのうち、(DIEDO)_x[Ce(NO_3)_y]は準金属的な電気伝導を示す。(ET)_n{Sm(NO_3)_x[N(CN)_2]_y(H_2O)_z}は半導体であるが、その結晶構造にはN(CN)_2^-による架橋構造が見られ、4f電子間に相互作用が働いている可能性がある。希土類の4f電子と有機分子のπ電子の複合物質系を開発して、両者の相関による新規な磁性や伝導性を実現するための基礎研究をおこなった。これまですでに低温まで金属伝導を示す化合物を数種類開発したが、構造に乱れが入りやすい、4f電子と周囲の相互作用が小さすぎる、といった点が課題であった。そこで、用いる希土類陰イオン錯体の電荷と寸法を低く抑えるように配位子を選択して、β"-(BO)_2[YbCl_4(H_2O)_2]という化合物を得た。この物質は構造の乱れを含まず、低温まで金属伝導を示す。また陰イオン間に水素結合ができて架橋された結果、希土類を含むこの種の化合物としては初めて陰イオンが鎖状構造をもつものが得られた。しかしこの架橋構造も4f電子間の相互作用を媒介するにはまだ不十分で、磁気秩序などは生じていない。またこの結晶自体も準安定状態にあり、常温で徐々に、210K以下で絶縁化するα相に変化する。これ以外に、希土類イオンの磁性(特に磁気異方性とその温度変化)を具体的な構造に基づいて予測・解釈するために、等価演算子法を用いて結晶場分裂を求め、任意の配位構造・温度・磁場方向に対する磁化率を計算するプログラムを作成して、これまでにこの研究課題で得た化合物などの磁性の温度依存性データと結晶場分裂を考慮した計算結果を比較して、実際に結晶場効果がこれらの化合物の磁性を支配していることを示した。これは含希土類有機導体の磁性の構造による制御・設計をおこなううえで必要な基礎研究成果である。希土類系とは別に、数MHz帯の高周波磁化率を測定する装置を設計・製作し、低温・高圧条件下で超伝導性が報告されている数種の[Pd(dmit)_2]塩に適用した。その結果、これらの超伝導は通常のバルク超伝導とはいえないと結論した。
がんで異常亢進するシアリダーゼ遺伝子ノックダウンによるアポトーシス誘導機構

糖蛋白や糖脂質からシアル酸を脱離するシアリダーゼは、がんの悪性形質に大きく影響を与えていることが従来から指摘されてきた。しかし、その実体については明らかとなっていなかった。最近、われわれは哺乳動物シアリダーゼ遺伝子の同定と解析を通じて、がんにおけるシアル酸変化の機構と意義の解明を進めてきた。現在まで、4種のシアリダーゼ遺伝子が同定され、それぞれ酵素学的性状や細胞内局在が異なるシアリダーゼをコードしていることが明らかになっている。ヒトではNEU1,NEU3,NEU4シアリダーゼの発現が検出されるが、そのうち、我々がクローン化したNEU3についてはこれまで、ガングリオシドを特異的に脱シアリル化すること、形質膜ミクロドメインに局在すること、各種ヒトがん組織において発現が著しく亢進していること、高発現NEU3がアポトーシスを抑制していることを明らかにしてきた。本課題では特にNEU3ががん細胞のアポトーシスを抑制する分子機構を検討した。その結果、MEU3特異的siRNAを導入すると、がん細胞が特別の刺激もなく自ら細胞死に陥ること、Ras活性が低下することがわかった。一方、NEU3高発現はRasの活性化をもたらし、アポトーシスを抑制するだけでなく、がん細胞の接着や浸潤・運動をも亢進することが明らかになった。NEU3の特異的な基質であるガングリオシドの変化とこれらの細胞現象との関連を調べると、NEU3高発現細胞では、酵素反応産物であるラクトシルセラミドが蓄積し、それがEGFR等の増殖因子レセプターのリン酸化を亢進し、Rasを活性化していることが推察された。さらに、NEU3酵素蛋白がEGFR等と分子間相互作用を通じて、そのシグナルを活性化している可能性も示唆された。
嚥下機能維持増進プロジェクト-嚥下機能低下を予防する-

高齢者の口腔機能を維持・増進するために、介護予防事業の一つとして口腔機能の向上が取り入れらている。この口腔機能を評価する項目の一つとして、オーラル・ディアドコキネシスが用いられる事が多い。音節の/ta/の運動は、舌前方部を口蓋に接触させたり、離したりする運動の巧緻性が必要になる。そこで我々は、超音波診断装置を用いて、高齢者と若年者における、/ta/発音時の舌前方部上下運動距離と/ta/発音時最上部と安静時の距離の違いを検討した。目的:高齢者の口腔機能を維持・増進するために、介護予防事業の一つとして口腔機能の向上が取り入れらている。これは音節の交互反復運動を早く行わせて、口唇や舌の随意運動機能を評価するものである。音節としては、/pa/、/ta/、/ka/が用いられる事が多い。中でも/ta/の運動は、舌前方部を口蓋に接触させたり、離したりする運動の巧緻性が必要になる。方法:被験者は、健康女性若年者5名(平均年齢28.2歳)と要介護ではない女性高齢者8名(平均年齢74.5歳)とした。オーラル・ディアドコキネシスを用いて平均回数を音節反復速度として測定した。また超音波診断装置を用いて、/ta/の上下運動の平均距離を舌運動距離とした。また/ta/発音時の最上部と安静時舌背面の距離を測定した。結果:/ta/発音時の1秒あたりの回数は、若年者で平均7.16±0.8回、高齢者で平均6.2±0.61回であり、有意差が認められた。また上下運動距離は、若年者で平均0.31±0.05cm、高齢者で平均0.81±0.28cmであり、有意差が認められた。/ta/発音時の最上部と安静時舌背面の距離は、若年者で平均0.1±0.05cm、高齢者で平均0.38±0.28cmであり、有意差が認められた。考察:発音時の移動距離が長く、低位からの前方部の上下運動は、高齢者にかなりの負荷となっており、オーラル・ディアドコキネシスの回数に低下の原因の一つと考える。今後、舌運動と関係のある発音を増やし、更なる検討を行っていきたいと考える。そこで我々は、超音波診断装置を用いて、高齢者と若年者における舌前方部上下運動距離と安静時の距離の違いを検討した。方法:被験者は、健康女性若年者5名と要介護ではない女性高齢者8名とした。オーラル・ディアドコキネシス回数の測定として、1秒あたりの平均回数を音節反復速度として測定した。次に舌の運動距離の計測として、超音波診断装置GE社製LOGIQ Book XPを用いた。描出画像は、Bモード矢状断での舌背面とした。計測方法は、描出可能な範囲での最前方部の舌背部の上下運動動態を、Mモード上の波形として描出させた。このうち安定した波形3回を測定して、その平均距離を舌運動距離とした。考察:/ta/発音時、舌背面の上下の移動距離が若年者の方が短く、舌前方部の微細な運動が可能であるためと考えた。また/ta/発音は口蓋部に舌前方部を接触させることにより発声させる。このため舌背部が、口蓋相当部の最も高い位置にあると考える。一方安静時舌位は、通常では舌尖部が切歯乳頭付近に位置しているといわれている。このため舌前方部も安静時において口蓋部付近の高い位置にあると考える超音波診断装置を用いた研究についてはおおむね良好に進捗していると考えている。

また嚥下内視鏡を行うことで、舌根部の観察をおこなっており、これらの観察項目を統合させる作業を行っている。反復唾液嚥下テスト,改訂水飲みテスト,フードテストを至適基準として嚥下造影検査を実施している。これに若干の機能低下が明らかになるような基準を設定し、スクリーニング検査を開発しており、今後施行予定である。また軽度の障害が認められる場合は画像検査を用いて、画像情報との関係性について明らかにしたいと考える。この結果からグレード分類を行う予定である。最終的なデータの採取を行う予定である。このため携帯性に優れたデータ保管等できるものなどを購入する予定である。またそのデータから検討を行い、学会発表や最終的な打ち合わせ等に研究費を使用する予定である。
語の共起依存特性に基づく語彙連鎖を用いた連想的情報断片探索手法と応用に関する研究

本研究においては、情報アクセス空間における「発想支援」に焦点を当てて、情報にアクセスすることで、ユーザの独創的な発想・ひらめき・着想を引き出すきっかけを得ることのできる、連想的情報アクセス手法の確立、および、インタフェースの開発を目指した。近年、様々な分野において、電子化された膨大な情報が蓄積されており、これらの有効利用の具体的手法が求められている。様々な組織において、保存されているデータや記録に対する、多様な視点、柔軟なものの見方の必要性・重要性は認知されているが、具体的な利用方法の研究は充分とはいえない。膨大な記録や資料を有効に利用するためには、利用する際の文脈に沿った情報提示が必要であるが、情報を記録した時の文脈と、情報を利用する時の文脈は同じとは限らない。また、特定の情報を含みうる文脈を事前にすべて想定しておくことは不可能である。そこで、利用時の文脈に基づき、動的に情報を再構成して提示する技術の研究を行った。文書には、作成時の文脈に沿い複数のトピックが含まれている。新しい文脈にあわせて情報を再構成するためには、元の情報を適当な粒度に分割するための文書分割技術が必要である。また、文書の内容を簡易提示するための視覚化技術は、文書の内容を俯瞰するとともに、関連情報をたどるための文脈を示唆する必要がある。そこで、新しい文脈にあわせて情報を再構成するために、元の情報を適当な粒度に分割するための文書分割手法の開発を行い、昨年度開発した文書内容視覚化ツールWordColonyと組み合わせることにより、文書の内容を俯瞰するとともに、関連情報をたどるための文脈を示唆する機能を実現した。本研究では、語彙連鎖に基づく文書主題の視覚化手法に関して研究を行い、文書中の語の共起関係の方向性に着目して、語群クラスターを形成し、これを視覚化するツールWord Colonyを開発した。各語の出現頻度を考慮した共起依存度を指標として用いることにより、(i)双方向に強い共起依存度を持つ語群・(ii)一方向にのみ強い共起依存度をもち共起に主従関係を生じる語群、(iii)互いに共起関係にない語群に分けられる。この共起依存度に基づく語彙クラスターの連鎖を用いて情報断片を連結し、語彙的連鎖の関係を視覚化する。つまり、語の共起依存の方向性に基づき、文書中の主要な語群と、互いに直接共起関係にないが、主要語群に共起依存する語群を抽出し、共起依存関係を表す語のコロニーを視覚化し、文書の内容を語と語の関係として表現するツールである。与えられたテキストをWord Colonyで視覚化し、文書の内容を俯瞰するグラフとして示すことにより、ユーザに、語彙連鎖に基づく想起を促し、得られた結果を体系的、構造的に捉え直し、比較対照を可能とするインタフェースを提供した。また、本年度は、語彙連鎖に基づく文書の物語構造解析手法の研究も行い、非構造化文書を主題に基づき分割する手法の研究・開発に着手した。これにより、複数の文書の関連部分を横断的に探索し、多様な視点で情報を捉えるための連想的情報アクセス手法の外郭を具体化した。
シロイヌナズナ品種間差を利用する根の重金属耐性機構の研究

重金属耐性は複数の遺伝子により支配される形質である。申請者らは、これまでに銅やカドミウムに対する応答遺伝子や、集団遺伝学的構造に関して研究を進めてきた。本研究は、特にシロイヌナズナをモデルとして銅・カドミウムを中心とする、遺伝子発現の品種間差解析や、F2(交配集団)の遺伝解析を通じて、未知の重金属耐性を解明することを目的とした。先ず比較マイクロアレイ解析を行い、銅やカドミウム処理で誘導される遺伝子の多くは、ストレスの強度によらず類似性が高いことを見出した。この遺伝子はカドミウムの場合、過酸化水素応答遺伝子と極めて類似性が高く、カドミニウムが活性酸素代謝の撹乱をターゲットにすることが明確となった。一方、銅に関しては、銅過剰で誘導される鉄欠乏クロロシスに明らかな品種間差が存在することを見出した。これは、銅の吸収・転流システムが、鉄の輸送・転流と共制御を受けているためと考えられ、実際に鉄吸収に関わる重要遺伝子の転写レベルが、銅過剰では抑制されることが明らかとなった。これらの知見を基に、ゲノム配列が解読されているいくつかの系統の応答を解析すると、クロロシスの発生程度や銅耐性程度が、遺伝子発現との関係で説明できる可能性が高いことが明らかとなった。逆遺伝学的な解析など、遺伝子を特定するために必要な項目を終了することができなかったため、今後も継続して研究を進める必要があるが、重要な栄養元素間の拮抗作用を分子レベルで理解するための基盤を構築することができたと考えている。申請者は、シロイヌナズナの生態型に存在する耐性差を利用して、耐性に関する遺伝子を特定することを目的とし、(1)品種間差を遺伝学的に解析するために、アソシエーションマッピングとQTL解析を受け入れ研究者と共同して実施する(2009年度)、(2)マイクロアレイから特定された応答遺伝子の効果を逆遺伝学(ノックアウトラインを用いる)で解析する(2010年度まで)、(3)耐性差に関与する遺伝子の過剰発現体を作成して、品種間差の遺伝子多型とあわせて解析し、原因遺伝子を特定する(2011年度帰国まで)を計画している。本年は、来日からの半年間で、銅耐性、カドミウム耐性、およびリファレンスとしての耐塩性に関するQTL解析を実施するとともに、マイクロアレイのデータ解析を行った。マイクロアレイに関しては、根をイオン処理したサンプルにおける地上部の遺伝子発現を中心に解析し、共通して誘導される遺伝子及び特異的に誘導される遺伝子が存在することを確認している。これらに関しては遺伝子破壊系統を入手して、ホモ接合体解析の準備を進めている。ところで、抑制される遺伝子の中には、あるイオン処理を行うと、特定のほかのイオンの輸送体遺伝子が抑制されることなど、イオン間の相互作用を分子レベルで理解する端緒となる現象を見出した。元素分析などを組み合わせることにより、いわゆるcombined effectの分子機構が解明につながると考えられる。カドミウムや鉛などの有害重金属以外でも、銅などの重金属は、鉄及び亜鉛などと同様に必須元素であるが過剰な場合には毒性を示す。これは、銅ホメオスタシスなどと呼ばれる機構で毒性が生じないように制御されているが、これは複数の遺伝子産物(物質輸送に関わるトランスポーターや、金属結合タンパク質など)が関与する機構で、精密に制御されている。本研究では、これを明らかにするために、ゲノム全体の遺伝子発現状態を解析する手法であるマイクロアレイを用いて、銅、カドミウム、塩化ナトリウム、アルミニウム処理を比較して、特に重金属障害で生じる機構に関して解析を加えた。シロイヌナズナの根の生育を100%及び50%阻害する条件で、24時間処理した後に、誘導される遺伝子に関して比較した。その結果、銅、カドミウム及びアルミニウムでは、処理によらず類似の遺伝子発現が増加するのに対して、塩化ナトリウム処理では異なる遺伝子群が増加することが確認された。これは、遺伝子発現による制御(耐性遺伝子や適応遺伝子の発現)による制御が、重金属耐性では一般的であるのに対して、塩化ナトリウムへの適応でタンパク質の活性化調節などの他の機構で制御されていることを意味する結果であった。さらに重金属耐性に関わる遺伝子の内、誘導レベルを耐性及び感受性系統間で比較すると、感受性系統で発現が高いストレス応答遺伝子と、耐性系統との間に明確な差が認められないストレス耐性に関わると考えられる遺伝子に区別できることが明らかとなった。

これらの知見を基に、ゲノム配列が解読されているいくつかの系統の応答を解析すると、クロロシスの発生程度や銅耐性程度が、遺伝子発現との関係で説明できる可能性が高いことが明らかとなった。逆遺伝学的な解析など、遺伝子を特定するために必要な項目を終了することができなかったため、今後も継続して研究を進める必要があるが、重要な栄養元素間の拮抗作用を分子レベルで理解するための基盤を構築することができたと考えている。