hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
核酸系旨味物質によるＡＭＰＫ活性化は炎症性腸疾患の病状を緩和するか

本研究は核酸系旨味物質であるアデノシン-5'-一リン酸(AMP)の投与がデキストラン硫酸ナトリウム誘導慢性大腸炎マウスにおいて病状が緩和されるかを調べた。AMPの投与は下痢及び血便などIBDマウスの臨床症状を軽減し、大腸組織の潰瘍病変の程度も改善した。さらに大腸組織のAMP-activated protein kinase(AMPK)の活性化及び炎症性サイトカインベルの減少が確認された。AMPは慢性大腸炎マウスの症状改善に有効であることがわかった。その症状改善にAMPKの活性化が関与する可能性が示唆された。また、これらの結果の一部はイノシン-5'-一リン酸投与においても確認された。細胞内のエネルギーセンサーであるAMP-Activated protein kinase (AMPK)の活性化が、エネルギー代謝の調節のみならず免疫機能の調節にも関与することが明らかになり、免疫異常を主徴とする疾患の治療に注目されつつある。潰瘍性大腸炎マウスにおいてAMPK賦活剤投与により大腸組織炎症性サイトカインの産生抑制を介して大腸炎が軽減されることが確認されている。そこで本研究は、デキストラン硫酸ナトリウム(DSS)誘導性慢性大腸炎(IBD)マウスにおいて核酸系旨味物質であるアデノシン一リン酸(AMP)の投与が大腸組織のAMPKを活性化し、病状の改善に有効であるかを調べた。さらにAMPの構造類縁体の核酸系旨味物質、イノシン酸及びグアニル酸の有効性についても調べた。マウスにDSSを3%含む飲料水を05日目、1315日目、20及び21日目に与えてIBDを惹起した。AMPは精製粉末飼料に0.3%混合し自由摂取させた。対照IBDマウスには精製粉末飼料を与えた。AMPは、IBDマウスの下痢及び血便の程度を軽減した。また大腸病理組織検査では、AMP投与により大腸粘膜の炎症の程度が抑制された。さらにそのときの大腸組織AMPKの活性化をイムノブロット法にて確かめたところ、AMPはAMPKを活性化した。このようにAMPは、大腸組織AMPKを活性化し、大腸炎の症状を緩和することがわかった。また、イノシン酸にも作用の程度はAMPに比べやや劣るが、AMP投与と同様に大腸組織AMPKを活性化して大腸炎の症状を軽減した。一方、グアニル酸にはAMP及びイノシン酸投与で認められた大腸組織AMPKの活性化と大腸炎の症状を緩和する作用は認められなかった。以上ように一部の核酸系旨味物質に大腸組織のAMPK活性化を介して、抗炎症作用を有する可能性が示された。細胞のエネルギーセンサーであるAMP-activated protein kinase(AMPK)活性化による抗炎症作用が免疫異常により生じる炎症性疾患の治療に応用できないかと注目されている。本研究ではこれまでにアデノシン一リン酸(AMP)及びイノシン一リン酸(IMP)を潰瘍性大腸炎マウスに投与したとき大腸組織のAMPKが活性化され、下痢・血便などの大腸炎の症状が緩和すること及び病理組織学検査においても潰瘍の程度が軽減されることを確認している。平成27年度は、大腸炎の症状の緩和作用が強かったAMPを被検物として潰瘍性大腸炎マウスに与え、先に行った実験結果の再現性を確認するとともに、潰瘍性大腸炎抑制作用のメカニズム解明の一端として潰瘍性大腸炎で増加することが報告されている大腸組織炎症性マーカーのTNF-α、さらにTh1型及びTh17型炎症性サイトカインレベル(INF-γ及びIL-17)に変化があるか否かを調べた。その結果、AMPの投与は潰瘍性大腸炎マウスの症状を緩和し、AMPによる抗炎症作用の再現性を確認することができた。さらにAMPの投与は、大腸組織においてマクロファージ由来とされるTNF-α、Th1型サイトカインのINF-γ及びTh17型サイトカインのIL-17レベルを減少させた。このことからAMPによる抗炎症作用には大腸組織に浸潤した炎症性細胞における炎症性サイトカイン産生に関するシグナル伝達系抑制の関与が示唆された。本研究は、研究計画に基づいておおむね順調に進行しており、現時点での研究目的をほぼ達成していると考えている。本研究では潰瘍性大腸炎マウスへのAMP及びIMPの投与が大腸組織AMPKの活性化を介して大腸の炎症を軽減し、潰瘍の発生を抑制することを明らかにしてきた。平成27年度は、さらにAMPを用いて前述の実験結果の再現性を確認するとともにAMPの抗炎症作用のメカニズムを明らかにする一端として潰瘍性大腸炎において大腸組織で増加することが知られている炎症性マーカーのサイトカインレベルを調べた。AMPの投与は、大腸組織においてマクロファージ由来とされるTNF-α、Th1型サイトカインのINF-γ及びTh17型サイトカインのIL-17レベルを減少させた。このようにAMPによる抗炎症作用にはAMPK活性化を介して大腸組織に浸潤した炎症性細胞における炎症性サイトカイン産生に関連するシグナル伝達系抑制の関与が示された。今後は、AMPによるAMPK活性化を介した抗炎症作用のメカニズム解明のため大腸組織に浸潤したマクロファージ、Th1ヘルパーT細胞及びTh17ヘルパーT細胞を分離してそれら細胞内のAMPK活性化の状態及び前述の炎症性サイトカインレベルを測定して炎症性細胞においてAMPK活性化と炎症性サイトカイン産生に関連があるか否かを明らかにする予定である。細胞のエネルギーセンサーであるAMP-activated protein kinase(AMPK)の活性化による抗炎症作用が、免疫異常により生じる炎症性疾患の治療への応用に注目されている。

本研究では核酸系旨味物質のアデノシン一リン酸(AMP)及びイノシン一リン酸(IMP)をデキストラン硫酸ナトリウムで惹起した潰瘍性大腸炎(IBD)マウスに投与したときに大腸組織AMPKが活性化され、下痢・血便などの大腸炎の症状が軽減されること及び大腸病理組織検査においても潰瘍の程度が軽減されること確認している。次にIBDで上昇することが明らかになっている大腸組織に浸潤したTh 1及びTh17リンパ球それぞれに由来すると言われている炎症性サイトカインのINF-γ及びIL-17Aレベル、マクロファージ由来のTNF-αレベルをELISA法により測定した。その結果、AMPの投与は大腸組織INF-γ、IL-17A、TNF-αレベルを減少させ、AMPの抗炎症作用には大腸組織に浸潤したTh1及びTh17リンパ球、マクロファージなどの炎症性細胞における炎症性サイトカイン産生に関するシグナル伝達系抑制の関与が示唆された。そこで平成28年度は、AMPの抗炎症作用に対する大腸組織制御性Tリンパ球(Treg)の関与に焦点を当て、IBDマウスにAMPを投与し、抗炎症性サイトカインのIL-10の大腸組織濃度を測定した。その結果、AMPの投与は大腸組織のIL-10レベルを上昇させることがわかった。AMPの抗炎症作用のメカニズムとしてAMPK活性化を介したTregリンパ球の活性化の関与が示唆された。そこでさらに作用メカニズムを探索するため、現在は、大腸に浸潤した炎症性細胞のTh1・Th17リンパ球及びTregリンパ球を細胞分離装置にて分取して、それぞれの細胞に由来するサイトカインレベル(INF-γ、IL-17A、TNF-α及びIL-10)を測定し、それらリンパ球のAMPK活性との関連を調べるための準備を行っているところである。本研究は、本来なら平成28年度末をもって終了する予定であったが、予期しなかった事由(他の受託研究や私立大学戦略的研究基盤形成支援事業の研究分担者になった)で平成28年度に行う予定であった以下の実験がほとんど実施できなかった。1AMPを投与したIBDマウスの大腸組織から細胞分離装置により炎症性細胞(Th1及びTh17リンパ球)及び制御性Tリンパ球(Tregリンパ球)を分取して、それらのAMPK発現とそれぞれの免疫細胞が特異的に産生するサイトカイン(TNF-α、INF-γ、IL-17A及びIL-10)量との関連を調べること。2さらにTregリンパ球が活性化されているか否か、活性化されていた場合にAMPK活性化が関与するのかを調べること。したがって、補助期間延長を申請し、承認されたことから平成29年度に上記未実施分の実験を行う予定である。細胞のエネルギーセンサーであるAMP-activated protein kinase(AMPK)の活性化による抗炎症作用が、免疫異常により生じる炎症性疾患の治療への応用に注目されている。
機能性ルイス酸を活用するラジカル反応の新展開

研究計画に従い機能性ルイス酸の提供する反応場を活かしたラジカル的分子内環化反応を行うための基質として、ルイス酸の中心金属との酸塩基複合体形成の足掛りとなるエーテル酸素を有し、末端にそれぞれヨウ化アルキル基と炭素-炭素不飽和結合構造を持つ化合物を選び、合成を行った。反応形式としては、基質のトルエンあるいはジクロロメタン溶液に水酸化トリブチルスズに続いてラジカル開始剤を加え、炭素-ヨウ素結合の均一開裂によって発生した炭素ラジカルが分子内の不飽和結合に付加することによって環化するというものである。典型金属ルイス酸としてアリルビニルエーテルのクライゼン転位反応の有効な触媒となるアルミニウムトリス(2,6-ジフェニルフェノキシド)(ATPH)を用い、中心金属であるアルミニウムのまわりにフェノール配位子の三つのベンゼン環によって形造られる特異な反応場をラジカル反応のテンプレートとして活用することを試みた。ATPH存在下、触媒量のトリエチルホウ素をラジカル開始剤として基質である鎖上のエーテル化合物から六員環環状エーテルへの分子内ラジカル環化反応を行った結果、望ましい環化体のみがほぼ定量的に得られた。ATPHを用いることなく同様の条件で反応を行った場合、単にヨウ化アルキルが還元された化合物が主生成物として得られ、環化体の収率は著しく低下した。この事実はATPHが分子内ラジカル環化反応を促進するための極めて有効なテンプレートとして機能していることを示している。さらに、エーテル酸素のα位に置換基を有する基質のラジカル環化反応にATPHを適用することで、従来法では得られなかった立体選択性の獲得が可能となることも見い出しており、三次元構造の明確な反応場を持つルイス酸をデザインすることでラジカル反応の反応経路及び立体化学を制御し得ることを初めて明らかにすることができた。
フェリ磁性体/強誘電体エピタキシャル多層膜の作製と光導波デバイスへの応用

人工的にフェリ磁性体と強誘電体を数nm数μmの一定周期で層状に積み重ねた構造を持つ多層膜は、フェリ磁性と強誘電性を兼備した材料となる一方で、層界面での量子効果や異種金属イオン間の相互作用による偏光角の飛躍的増大も期待できる。本研究では二種の酸化物の極薄膜を組成ずれなしに交互堆積して層境界の乱れのない多層膜を作製できるスパッタ装置を開発し、異種酸化物多層膜作製技術を確立することを目的とした。異種酸化物多層膜スパッタ装置については、当初に計画した通り、膜形成用真空槽に新しく複合酸化物極薄膜堆積用に開発したスパッタ源を二対取り付けて、安定に同時グロー放電が維持できるようにし、両方の酸化物極薄層が交互に堆積できることを確認した。この装置で本研究の多層膜の構成酸化物であるBaFe_<12>O_<10>(BaM)一対をターゲットとしてスパッタ膜を熱酸化Siウェファー上に作製したところ、下地にアモルファス構造の酸化物を用いてもBaM結晶子がc軸配向し、良好な結晶成長が行なえることを確認した。この結晶子のc軸配向を完全にして垂直磁気異方性の大幅増大をはかるための下地層としてZnO薄膜やCoFe_2O_4(CoS)薄膜の作製を行なった。BaM,CoSそしてZnO各層作製時の動作ガス圧力、酸素分圧、基板温度等を変化させた種々の多層膜試料を作り、結晶構造などの微細構造と磁気特性を調ベた。その結果、良好なBaM薄膜およびCoS薄膜形成のための技術を確立することができた。従来のスパッタ技術では複合酸化物ターゲットを使用した場合、組成ずれが起こり易く、また層境界が乱れるので極薄層化が難しいが、本研究で開発した方法では異なる結晶系を有する酸化物薄膜でも数100Åの極薄膜領域から結晶成長が良好に行われることが分かった。このことより、BaMとBaTiO_3の異種酸化物薄膜の多層膜においてもそれぞれの結晶成長を保ちつつ積層化できる目処がついたとみなしている。新しい電子デバイスとして、人工的にフェリ磁性体と強誘電体を一定周期で層状に積み重ねた構造を持つ多層膜が期待されている。従来のスパッタ技術では、組成ずれが起こり易いなどの欠点があった。本研究では交互堆積膜を作製できる対向タ-ゲット式スパッタ装置を開発し多層膜作製技術の確立を試みた。酸化物磁性層としては、大きな磁気異方性と磁気光学効果、磁歪効果を有するために、強誘電材料との積層化されたデバイスにおいて、大きな信号変換性能が期待できるスピネル型立方晶コバルトフェライト(CoO・Fe_2O_3:CoS)を用いた。本研究費で購入したインピ-ダンスアナライザは主に磁歪と高周波透磁率の測定に使用した。強誘電材料としては電気機械結合係数が高いZnOを使用した。酸化物薄膜形成法は、負イオンの成長膜面への衝撃を抑制し、良質の酸化膜を形成できる対向タ-ゲット式スパッタ法を採用した。表面熱酸化したSi基板上に、第1層としてそのc軸配向の分散角Δθ_<50>が1度程度のZnO配向膜を堆積し、その上にCoSを連続的に堆積した。

全ガス圧は2mTorr、酸素分圧比は1%程度で作製した。ZnO配向膜が無い場合には、基板温度が500°C程度になってもX線回折強度は低く、ランダム配向の結晶子による薄膜が形成されるのみであったが、ZnO薄膜の下地層上に形成したCoS薄膜は完全に〈111〉配向膜が得られ、しかも基板温度がほぼ室温程度であっても結晶性を有する薄膜が形成でき、その結晶配向も〈111〉軸配向を示したままであった。これらのことから、ZnO薄膜のc面と各種フェライト薄膜の酸素の最密充填の面とのエピタキシ-効果により、相互の薄膜の結晶性の向上と、配向度の向上が見込めることが立証された。このことにより、将来の光波のスイッチング素子、モ-ド変換器などへの本多層膜の応用が期待される。人工的にフェリ磁性体と強誘電体を数nm数μmの一定周期で層状に積み重ねた構造を持つ多層膜は、フェリ磁性と強誘電性を兼備した材料となる一方で、層界面での量子効果や異種金属イオン間の相互作用による偏光角の飛躍的増大も期待できる。本研究では二種の酸化物の極薄膜を組成ずれなしに交互堆積して層境界の乱れのない多層膜を作製できるスパッタ装置を開発し、異種酸化物多層膜作製技術を確立することを目的とした。異種酸化物多層膜スパッタ装置については、当初に計画した通り、膜形成用真空槽に新しく複合酸化物極薄膜堆積用に開発したスパッタ源を二対取り付けて、安定に同時グロー放電が維持できるようにし、両方の酸化物極薄層が交互に堆積できることを確認した。この装置で本研究の多層膜の構成酸化物であるBaFe_<12>3_<19>(Bam)一対をターゲットとしてスパッタ膜を熱酸化Siウェファー上に作製したところ、下地にアモルファス構造の酸化物を用いてもBaM結晶子がc軸配向し、良好な結晶成長が行なえることを確認した。この結晶子のc軸配向を完全にして垂直磁気異方性の大幅増大をはかるための下地層としてZnO薄膜やCoFe_20_4(CoS)の薄膜の作製を行った。BaM、CosそしてZnO各層作製時の動作ガス圧力、酸素分圧、基板温度等を変化させた種々の多層膜試料を作り、結晶構造などの微細構造と磁気特性を調べた。その結果、良好なBaM薄膜およびCoS薄膜形成のための技術を確立することができた。従来のスパッタ技術では複合酸化物ターゲットを使用した場合、組成ずれが起こり易く、また層境界が乱れるので極薄層化が難しいが、本研究で開発した方法では異なる結晶系を有する酸化物薄膜でも数100A^^<>の極薄膜領域から結晶成長が良好に行われることが分かった。このことより、BaMとBaTiO_3の異種酸化物薄膜の多層膜においてもそれぞれの晶成長を保ちつつ積層化できる目処がついたとみなしている。
長波長紫外線による皮膚角化細胞のサイトカインの発現調節と免疫抑制

紫外線主に長波長紫外線(UVA)による表皮細胞への影響について検討して来た.中波長紫外線(UVB)の表皮細胞および生体に及ぼす影響についての知見は多いが,UVAの影響に関する知見は少ない.正常ケラチノサイトを培養し,紫外線(UVA=020kJ/m^2)を照射して,炎症性サイトカインの発現についてmRNAレベルと培養上清中に放出される蛋白量について検討した.その結果,IL-12の産生亢進を認め,IL-10の上昇は認められなかった.またUVAはUVBで誘導のかかるIL-6,IL-8,TNF-α,TGF-β1,GM-CSF,PGE_2のうち,IL-6,IL-8,PGE_2の上昇のみを惹起し,TNF-α,TGF-β1,GM-CSFは誘導しなかった.すなわち,UVAはUVBによって惹起される炎症反応を増強することが示された.一方紫外線照射後の表皮細胞のアポトーシスに関与しているとされているNGFはUVBで産生抑制がかかるが,UVAでは影響を認めなかった.具体的にはNGFのmRNAレベルと培養液中に放出されたNGF蛋白について検討した.その結果UVA照射24時間後では今回の照射量ではNGFのmRNAレベルの低下は認められず,12時間後にはむしろmRNAレベルの上昇を認めた.しかし培養上清中のNGF蛋白レベルには有意の変動を認めなかった.現在引き続き,感度を高めて検討中である.UVAがUVBによって惹起される免疫抑制に対して拮抗的に作用していることについて,表皮細胞由来のIL-10,IL-12産生に及ぼす影響についての検討から明らかにしてきた.表皮細胞由来NGFに対するUVAの影響もUVBによるものに拮抗的に作用している可能性があり,今後さらにUVA照射量を変動させ,またUVBとの混合照射などにより検討を進めて行く予定である.培養ヒト皮膚ケラチノサイト(HuSK)に20kJ/m^2までのUVAを照射し,照射後種々の時間に細胞と上清を回収し,細胞より全RNAを抽出し,RT-PCRを行なった.PCR産物は1.5%アガロースゲル上で電気泳動を行なった.回収した上清は遠沈で細胞成分を除去し,IL-12 immunoassay kit(BioSource International)を用いて,蛋白量を測定した.その結果IL-12のp35 mRNAは常に発現し,UVAの照射に無関係であったが,p40 mRNAは20 kJ/m^2までのUVA量依存性に誘導された.内部コントロールとして用いたG3PDHの発現は変化を認めなかった.UVA10 kJ/m^2照射後の種々の時間におけるIL-12のp40 mRNAの発現レベルでは,6時間で既にp40 mRNAは誘導され,12時間後にピークとなり,24時間から48時間後までその発現が確認された.10 kJ/m^2照射後の種々の時間におけるELISA法で検討したIL-12の量は,照射6時間後から72時間後まで時間依存性に誘導が認められた.またIL-12の生物活性を調べる目的で正常人由来のTリンパ球からのIFN-γ誘導効果を検討した.その結果,UVAを10 kJ/m^2照射されたHuSK培養上清には.IFN-γ誘導効果が認められことより,生物活性をもつIL-12が産生放出されていることが確認された.同時に行なったIL-10のmRNAおよび蛋白はいずれも検出されなかった.今回の結果より,太陽光線に含まれるUVAとUVBはサイトカイン誘導に及ぼす影響に相違が認められ,従ってその免疫に及ぼす作用は,異なっている可能性が示唆された.今後,更にUVAにより調節,誘導されるケラチノサイト由来のサイトカインについての検討,およびin vivoでの確認が必要である.紫外線主に長波長紫外線(UVA)による表皮細胞への影響について検討して来た.中波長紫外線(UVB)の表皮細胞および生体に及ぼす影響についての知見は多いが,UVAの影響に関する知見は少ない.正常ケラチノサイトを培養し,紫外線(UVA=020kJ/m^2)を照射して,炎症性サイトカインの発現についてmRNAレベルと培養上清中に放出される蛋白量について検討した.その結果,IL-12の産生亢進を認め,IL-10の上昇は認められなかった.またUVAはUVBで誘導のかかるIL-6,IL-8,TNF-α,TGF-β1,GM-CSF,PGE_2のうち,IL-6,IL-8,PGE_2の上昇のみを惹起し,TNF-α,TGF-β1,GM-CSFは誘導しなかった.すなわち,UVAはUVBによって惹起される炎症反応を増強することが示された.一方紫外線照射後の表皮細胞のアポトーシスに関与しているとされているNGFはUVBで産生抑制がかかるが,UVAでは影響を認めなかった.具体的にはNGFのmRNAレベルと培養液中に放出されたNGF蛋白について検討した.その結果UVA照射24時間後では今回の照射量ではNGFのmRNAレベルの低下は認められず,12時間後にはむしろmRNAレベルの上昇を認めた.しかし培養上清中のNGF蛋白レベルには有意の変動を認めなかった.現在引き続き,感度を高めて検討中である.UVAがUVBによって惹起される免疫抑制に対して拮抗的に作用していることについて,表皮細胞由来のIL-10,IL-12産生に及ぼす影響についての検討から明らかにしてきた.

表皮細胞由来NGFに対するUVAの影響もUVBによるものに拮抗的に作用している可能性があり,今後さらにUVA照射量を変動させ,またUVBとの混合照射などにより検討を進めて行く予定である.前年度(平成10年度)に引き続き,紫外線による表皮細胞への影響について検討してきた.正常ヒトケラチノサイトを培養し,紫外線(UVB=30mJ/cm^2,UVA=10kJ/m^2の両者を同時または単独で)を照射して,培養液中に産生放出されたサイトカインの測定と,mRNAレベルを検討した.その結果,ヒト正常ケラチノサイトにおいて,長波長紫外線と中波長紫外線は炎症惹起に働くサイトカイン(IL-1α,IL-6,IL-8)を相加的に誘導するが,免疫抑制性サイトカイン(IL-10,IL-12,TNF-α)の誘導に関しては差異のあること,したがって,免疫に及ぼす影響にも差異の認められ可能性のあることについて明らかにした(Jpn Inflamm,1999,in press).さらに紫外線照射により,ケラチノサイトの増殖および炎症・免疫に関与するサイトカインの特異的レセプターの発現が抑制されることについても明らかにした(J Invest Dermatol 112:656,1999;J Cell Physiol,182,2000,in press).具体的にはケモカインレセプターの一つであるCXCR-2の皮膚ケラチノサイトでの発現は紫外線照射によりその発現が著明に抑制されるが,同様の処理にて,CXCR-1の発現は変化しないことを確認した.ケモカインはケラチノサイトの増殖,分化のみならず,炎症細胞の浸潤動態を調節することにより皮膚のサイトカイン環境に影響している.すなわち,紫外線には生体の恒常性の維持に必要な因子を調節し,自己防衛能力を亢進させる作用のあることについても明かにした(J Invest Dermatol Sym Proc,4(2):177,1999;J Dermatol Sci,2000,in press).前年度(平成11年度)に引き続き,紫外線による表皮細胞への影響について検討して来た.紫外線照射により表皮細胞がアポトーシスに陥いることはすでに知られた事実であり,アポトーシスに陥った細胞は表皮内にサンバーン細胞として認められる.これは紫外線の中波長(UVB)により誘導されることが証明されているが,長波長紫外線(UVA)による影響についての検討は成されていない.またアポトーシス誘導の一因として表皮細胞由来のnerve growthfactor(NGF)のUVBによる産生抑制が推測されている.したがった今回われわれはUVAにより表皮細胞由来のNGFの産生がどのように影響されるかについて検討した.正常ケラチノサイトを培養し,紫外線(UVA=1020kJ/m^2)を照射して,NGFのmRNAレベルと培養液中に放出されたNGF蛋白について検討した.その結果UVA照射24時間後では今回の照射量ではNGFのmRNAレベルの低下は認められず,12時間後にはむしろmRNAレベルの上昇を認めた.しかし培養上清中のNGF蛋白レベルには有意の変動を認めなかった.現在引き続き,感度を高めて検討中である.UVAがUVBによって惹起される免疫抑制に対して拮抗的に作用していることについて,表皮細胞由来のIL-10,IL-12産生に及ぼす影響についての検討から明らかにしてきた.今回の表皮細胞由来NGFに対するUVAの影響もUVBによるものに拮抗的に作用している可能性があり,今後さらにUVA照射量を変動させ,またUVBとの混合照射などにより検討を進めて行く予定である.
蛍光変調検出法によるがんの高感度センチネルリンパ節生検法

超音波蛍光変調検出法の実用化を目的として、模擬生体における有用性の評価並びに装置の最適化を進めた。模擬生体、食肉を用いた検討である程度の深度にある蛍光色素の検出に成功し、我々が開発した蛍光断層画像計測装置を生体に応用すべく素子をリニアアレイ化したプロ-ブを用い、模擬生体の20-30mmの深さにある蛍光色素を検出することに成功した。この結果から、生体においても従来の検出法を上回る深度の蛍光色素を検出できる可能性が強く示唆された。リニアアレイ型トランスデュ-サの各素子への信号の位相制御による集束化および走査の検討を行い液体散乱媒質中に蛍光体検出にも成功した。以上により装置開発における新たな課題が出てきたが、本研究は実用化に向けて着実に前進した。がん手術におけるセンチネルリンパ節生検法は個々の患者の病期に合わせたテイラーメイドメディスンとして広く受け入れられつつあり、無駄なリンパ節郭清を省略できることから、今後がん手術の主流になると考えられる。現在センチネルリンパ節生検はRI法、色素法が主に行われている。RI法は体外診断が可能であるが使用施設が放射線障害防止法で規制され、すべての施設では行い得ない。また、色素法は簡便で直視下に観察できるが体外診断できないなど、それぞれ欠点がある。がん手術は多くの病院で行われており、すべての施設で使用可能な、高感度なセンチネルリンパ節生検法が求められている。今回我々はRIを用いない、しかも色素法に比べて高感度かつ体外からのセンチネルリンパ節生検を可能とした、高感度な蛍光計測法の開発を目標とした研究を行った。従来の蛍光計測法では深さ1cmに存在する蛍光色素の検出が技術的限界であった。今回我々は、こうした限界を打破すべく、超音波蛍光変調検出法(以下、本方法)の実用化を目的として、模擬生体における本方法の有用性を評価した。本年は我々が開発した蛍光断層画像計測装置を用い、生体に近い光散乱特性を持つ媒体を模擬生体として用い、その深部にある蛍光色素の検出を試みた。その結果、20-30mmの深さにある蛍光色素を検出することに成功した。この結果から、生体においても従来の検出法を上回る深度の蛍光色素を検出できる可能性が示唆された。RI法は体外診断が可能であるが使用施設が放射線障害防止法で規制され、すべての施設では行い得ない、色素法は簡便で直視下に観察できるが体外診断できないなど、それぞれ欠点がある。今回我々はRIを用いない、しかも色素法に比べて高感度かつ体外からのセンチネルリンパ節生検を可能とした、高感度な蛍光計測法の開発を目標として研究を行っている。今回我々は、こうした限界を打破すべく、超音波蛍光変調検出法(以下、本方法)の実用化を目的として、模擬生体における本方法の有用性を評価を進めている。本年は我々が開発した蛍光断層画像計測装置を用い、市販の食肉を模擬生体として用い、その深部にある蛍光色素の検出を試みた。また、実用的な装置の開発を目的として超音波素子のアレイ化など装置の改良も並行して進め、超音波収束のシミュレーションに成功した。今回我々はRIを用いない、しかも色素法に比べて高感度かっ体外からのセンチネルリンパ節生検を可能とした、高感度な蛍光計測法の開発を目標として研究を行っている。

従来の蛍光計測法では深さ1cmに存在する蛍光色素の検出が技術的限界であった。超音波蛍光変調検出法の実用化を目的として、模擬生体における本方法の有用性の評価並びに装置の最適化を進めている。まず模擬生体、食肉を用いた検討である程度の深度にある蛍光色素の検出に成功した。しかし生体に用いるにはより簡便に使用できるプローブの開発が必要であり、我々が開発した蛍光断層画像計測装置を生体に応用すべくリニアアレイ型トランスデューサを試作し、各素子への信号の位相制御による集束化および走査のシミュレーションを行い、リニアアレイ型プローブを用いて、模擬生体の深部にある蛍光色素の検出を試みた。その結果、シングルプローブ機械式スキャンと同様、20-30mmの深さにある蛍光色素を検出することに成功した。
量子包絡代数,量子包絡超代数,q-ワイル群とその応用

アフィンリー超代数のセールの定理すなわちgのシュバレー生成元のみたす定義関係式について考察した。その結果カッツムーディーリー代数のセールの定理の場合とは異なり有限個の定義関数式ではとらえられないアフィンリー超代数があることがわかった。それらはsl(m/m)^<(1)>,sl(m/m)^<(2)>,sl(m/m)^<(4)>である。これらは無限個のヌルルートベクトルに独立な関係式が現れる。これらの関係式の具体的な形はこれらのリー超代数の行列による具体形をみればわかる。一方これらの量子群を考え様とするとこの特別は関係式の量子化を考えるのはまだうまくいっていないsl(m/m)^<(1)>のときのみベックのドリンフェルド具体形と同一視するのに使った拡大アフィンワイル群型の自己同型郡を使う方法で解決できそうである。アフィンリー超代数を使った理論でアフィンリー代数の時とかけはなれた結果がでるのはこの3つのリー超代数の場合が可能性が高いと思えるのでこれの量子群の存在性や具体形を知りたい。その為には関係式を求めてしまうのが一番よいと思われる。ベックの方法をsl(m/m)^<(4)>の量子群についても試みたがその場合sl(3/1)^<(4)>の量子群のポアンカレ・バーユフ・ヴィット定理がきれいでないことが分った。どうやらこの場合コーロシュキン・トルストイの正規順序基底の原理は成立しない様である。sl(2)_<(1)>の量子群の一の巾根の場合の制限量子群の定義関係式についても考えた。この場合有限型の場合とは異なり一の奇数乗根のみより定義関係式がある様である。またそのC=2のときの中心についても考えた。それらを使ってC=2のヴァーマカロ群の特異ベクトルの具体形を与えた。
紫外線・真空紫外線を用いた光電子・逆光電子分光法による強相関物質の電子状態

金属絶縁体転移を示す欠損ペロブスカイトRBaCo_2O_<6-δ>(R=Tb, Nd;δ=0.5, 1.0)、低温で重い電子的挙動を示すペロブスカイトCaCu_3Ru_4O_<12>、特異なスピン軌道秩序を示すスピネルAV_2O_4(A=Li, Zn, Cd)の電子状態を表面敏感な真空紫外線光電子分光およびパルク敏感なX線光電子分光によって研究した。特に、RBaCo_2O_<6-δ>では金属絶縁体転移に伴うe_gバンドの形状変化が観測された。CaCu_3Ru_4O_<12>では、Cuは2価であり局在したCu 3d電子が重い電子的挙動に重要であることを明らかにした。さらに、ワイドギャップ希薄磁性半導体Ti_<1-Σ>Co_xO_2、光誘起金属絶縁体転移を示すペロブスカイトPr_<0.55>(Ca_<1-y>Sr_y)_<0.45>MnO_3とスピネルCuIr_2S_4についても、光照射下においてバルク敏感なX線光電子分光と表面敏感な真空紫外線光電子分光を行い、光誘起の電子状態変化を観測した。バルク敏感な紫外線光電子分光については、Nd : YAGレーザーの第5高調波は大気による吸収を受けないエネルギー領域にあり、かつ、仕事関数を超えて光電子を放出させるのに十分なエネルギーを持つことに注目し、Nd : YAGレーザーの第5高調波によるバルク敏感な紫外線光電子分光装置を完成させて測定を行った。紫外線によるバルク敏感なエネルギー領域での逆光電子分光については、銅酸化物高温超伝導体の測定を行い、非占有状態を観測した。真空紫外線による表面敏感なエネルギー領域での逆光電子分光については、真空紫外線の検出が不十分であり有効なデータを得ることはできなかったが、電子源や光子検出について技術開発を行い、今後の発展の基礎となる成果が得られた。光電子分光装置については、エネルギー分析器が納入され、3-5meVのエネルギー分解能が達成されていることを確認した。低温で巨大光伝導を示すSrTiO_3,室温強磁性を示すTi_<1-x>Co_xO_2,金属絶縁体転移を示すCuIr_2S_4,高温超伝導体薄膜YBa_2Cu_3O_y/SrTiO_3,光照射によって価数が変化するCsAuBr_3,電荷秩序を示すLa_<1+x>Sr_<2-x>Mn_2O_7等の強相関物質の光電子分光測定を精力的に進めている。特に、Nd:YAGレーザーからの355nmのパルス光励起下でのX線光電子分光実験を行い、YBa_2Cu_3O_y/SrTiO_3:Nbヘテロ接合での光起電力を非接触で測定できることを示した。さらに、光起電力による光電子スペクトルのエネルギーシフトが励起光の周波数に依存することから、注入されたキャリアーの寿命について情報が得られた。また、Cs_2Au_2Cl_6,Cs_2Au_2Br_6,Cs_2Au_2I_6において、Au^+とAu^<3+>への電荷不均化によってAu 4f内殻準位が分裂する様子を系統的に計測し、さらにCs_2Au_2Br_6については、Au^+とAu^<3+>の2つの成分が光照射によってAu^<2+>に変化する様子を観測することに成功した。分散マッチングを利用した高エネルギー分解能逆光電子分光装置の開発については、平成16年7月にオーストラリアで開催された国際会議VUV14において、その進展状況を発表し、注目を集めた。当国際会議に投稿した論文は審査員によって受理され、出版される予定である。高エネルギー分解能逆光電子分光が稼動すれば、種々の強相関物質において非占有状態の測定を開始する予定である。光電子分光装置については、Nd : YAGレーザーの第5高調波が発振可能となり、初年度に立ち上げた電子線エネルギー分析器と組み合わせて、バルク敏感な紫外線光電子分光の測定を開始した。これまでの光電子分光による研究を進展させて、室温強磁性を示すTi_<1-x>Co_xO_2,金属絶縁体転移を示すCuIr_2S_4,光照射によって価数が変化するCsAuBr_3についてインパクトのある成果を挙げることができた。特に、Cs_2Au_2Br_6の表面において、Au^+とAu^<3+>の2つの成分が可視光照射によってAu^<2+>に変化することを室温で観測し、この室温光誘起原子価転移を利用する光記録材料を提案した。また、ペロブスカイト型マンガン酸化物薄膜の測定を行い、金属絶縁体転移に伴い光電子スペクトルの変化する様子を観測し、光誘起金属絶縁体転移に伴う電子状態の変化を調べた。一方、分散マッチングによる高エネルギー分解能逆光電子分光装置の開発については、実験装置が完成して標準試料による性能評価を行った。エネルギー分解能が不十分であったため電子源と紫外線検出系について改良を進めているが、目標とする分解能には到達していない。

検討の結果、電子線のエネルギーを小さくすること、検出器からのノイズを抑えて位置分解能を改善することの2点が必要であることが分かった。分解能は不十分であるが、比較的バルク敏感な紫外線領域において銅酸化物高温超伝導体の非占有状態の観測を行った。金属絶縁体転移を示す欠損ペロブスカイトRBaCo_2O_<6-δ>(R=Tb, Nd;δ=0.5, 1.0)、低温で重い電子的挙動を示すペロブスカイトCaCu_3Ru_4O_<12>、特異なスピン軌道秩序を示すスピネルAV_2O_4(A=Li, Zn, Cd)の電子状態を表面敏感な真空紫外線光電子分光およびパルク敏感なX線光電子分光によって研究した。特に、RBaCo_2O_<6-δ>では金属絶縁体転移に伴うe_gバンドの形状変化が観測された。CaCu_3Ru_4O_<12>では、Cuは2価であり局在したCu 3d電子が重い電子的挙動に重要であることを明らかにした。さらに、ワイドギャップ希薄磁性半導体Ti_<1-Σ>Co_xO_2、光誘起金属絶縁体転移を示すペロブスカイトPr_<0.55>(Ca_<1-y>Sr_y)_<0.45>MnO_3とスピネルCuIr_2S_4についても、光照射下においてバルク敏感なX線光電子分光と表面敏感な真空紫外線光電子分光を行い、光誘起の電子状態変化を観測した。バルク敏感な紫外線光電子分光については、Nd : YAGレーザーの第5高調波は大気による吸収を受けないエネルギー領域にあり、かつ、仕事関数を超えて光電子を放出させるのに十分なエネルギーを持つことに注目し、Nd : YAGレーザーの第5高調波によるバルク敏感な紫外線光電子分光装置を完成させて測定を行った。紫外線によるバルク敏感なエネルギー領域での逆光電子分光については、銅酸化物高温超伝導体の測定を行い、非占有状態を観測した。真空紫外線による表面敏感なエネルギー領域での逆光電子分光については、真空紫外線の検出が不十分であり有効なデータを得ることはできなかったが、電子源や光子検出について技術開発を行い、今後の発展の基礎となる成果が得られた。
低温プロセスによる酸化物半導体の欠陥制御技術の開発とフレキシブルデバイス応用

本研究の目的は、フレキシブルデバイス応用を目指した低温プロセスによる高性能・高信頼性酸化物半導体薄膜トランジスタ(TFT)の実現である。当該年度は、ゲート絶縁膜として低温形成可能なポリマー絶縁膜を用いることにより、最高プロセス温度150°CでのInGaZnO(IGZO)TFTの作製に取り組んだ。その際TFT構造として、寄生容量を最小化することにより、ゲート遅延を低減し回路動作速度の高速化が可能な自己整合型構造を採用した。良好なTFT特性を得る為に、IGZOチャネルとポリマー絶縁膜とのより良い界面形成を目指したプロセス開発に取り組んだ。その結果、チャネル保護層を導入することにより、チャネルのパターニングに伴う汚染・ダメージのない界面形成を行うことが有効であることを明らかにした。また、自己整合型TFT作製における要素技術開発として、低温プロセスかつチャネル長制御性に優れるドーピング技術の開発に取り組んだ。これらの研究成果により、プラスチック基板が使用可能な150°Cという温度制約のもと、良好な特性を有する自己整合型IGZO TFTの作製を達成した。さらに信頼性評価及び素子劣化メカニズムに関する考察と、本研究で得られた知見を総括することにより、低温プロセスにより良好な特性・信頼性を有する酸化物半導体TFTを作製する為の指針についてまとめた。本研究成果は、酸化物半導体TFTを用いたフレキシブルデバイスの実用化及び発展に寄与することが期待される。27年度が最終年度であるため、記入しない。本研究は、低温プロセスによる高性能・高信頼性酸化物半導体薄膜トランジスタ(TFT)の実現を目的に行っている。研究目的達成の為に、本年度はInGaZnO(IGZO)上にプラズマ支援化学堆積(PE-CVD)法によりSiOxチャネル保護膜を成膜する際、IGZO膜中へ拡散した水素がTFT特性・信頼性に与える影響を調べた。IGZOの電子物性に関する水素の影響に関して議論の途上にある中で、本研究によりチャネル保護膜からの拡散水素がTFT特性・信頼性に与える影響について一定の結論を得る事ができた。また水素によるIGZO膜内・絶縁膜界面欠陥の不活性化は、低温プロセスによる高性能・高信頼性酸化物半導体薄膜トランジスタ(TFT)の実現においても有用であると考え、今後も応用的研究を行っていく予定である。IGZOTFT特性・信頼性に対するSiOxチャネル保護膜からIGZOチャネル中への拡散水素の影響に関して研究を行った結果、水素によるIGZO膜内・及び絶縁膜界面欠陥の不活性化という、当初研究目的である低温プロセスによる高性能・高信頼性酸化物半導体TFTの実現に向けた技術的方針となる研究成果を得る事ができ、WOS-Q1ランクの論文誌(IEEE Transaction on Electron Devices)への論文掲載に至った。また約2ヶ月にわたり独Stuttgart大学、Norbert Fruehauf教授の研究室(Institute for Large Area Microelectronics)に滞在し、有機ゲート絶縁膜を用いたIGZO TFTの低温形成に関する研究を行い、帰国後も習得した技術・知見を活かして、要素技術開発を含めた研究に引き続き取り組んだ。その結果、現状として200 °C以下の低温プロセスによるIGZO TFTの作製・動作を実現しており、次年度における研究目的達成が期待できる。現状として有機ゲート絶縁膜を用いることで、200 °C以下の低温プロセスによるIGZO TFTの作製・動作は実現したが、特性・信頼性に関しては更なる向上が望まれる。そこで今後は低温プロセスにおけるIGZO TFTの特性・信頼性向上を目的に、下記1,2に示す研究課題に取り組み、研究成果の統合により、最高プロセス温度150 °Cで、ポリエチレンナフタレート(PEN)上へ直接形成したIGZO TFTにおいて、移動度10 cm2/V/s以上、S値0.2 V/dec.以下、閾値電圧0 V以上、ストレス試験後の閾値電圧シフト量1 V以下の特性・信頼性を実現することを目標とする。1有機ゲート絶縁膜を用いた自己整合型IGZOTFTの特性・信頼性向上低温形成可能なスピンコート法による有機ゲート絶縁膜を用いた、IGZO TFTの特性・信頼性向上に取り組む。

その際TFT構造として、スパッタ法によるIGZO成膜に伴う有機ゲート絶縁膜へのダメージが無く、寄生容量最小化により回路動作速度の高速化が可能なトップゲート・セルフアライン構造を採用する。また特性・信頼性向上を目的に、適切な有機ゲート絶縁膜材料の選択・高品質化や、無機材料であるIGZOと有機絶縁膜の良好な界面形成を目指した研究に取り組む。2水素による欠陥補償効果の検証水素によるIGZO膜内・及び絶縁膜界面の欠陥補償効果に着目し、低温プロセスにおけるより効果的な欠陥補償手法として、成膜ガス中に水素を導入したスパッタ法によるIGZOの成膜を試みる。成膜中に取り込まれた水素がIGZOの電子物性に与える影響の評価、及びアニール温度の違いによる水素の挙動の変化を焦点に研究に取り組む。27年度が最終年度であるため、記入しない。再投稿予定論文
滑膜肉腫特異的融合遺伝子のin vivo機能解析及び創薬ターゲットの探索

滑膜肉腫は特異的融合遺伝子SS18-SSXが発がん因子と考えられている難治性希少疾患です。我々はヒト滑膜肉腫細胞株を用いてSS18-SSXを制御することにより一度がん化した腫瘍を再度抑えることが出来るのかをドキシサイクリン誘導システムを用いて検討しました。この方法で検討した結果、SS18-SSXを制御することにより腫瘍化した細胞の増殖を抑えることができ、また腫瘍化することも抑えることが出来ました。この事はSS18-SSXが治療ターゲットとなりうることを示唆します。また現在、SS18-SSXが制御している遺伝子の解析を行い新たな治療ターゲットを探索しています。本研究の目的は申請者らが樹立したドキシサイクリン誘導SS18-SSX抑制滑膜肉腫細胞株を用いてin vitro, in vivoで滑膜肉腫細胞における融合遺伝子SS18-SSX抑制による抗腫瘍効果を時間制御下に厳密に評価し、融合遺伝子が創薬ターゲットとなり得るかを評価すること、更には融合遺伝子のin vitro, in vivoでの機能を評価することである。また、融合遺伝子抑制単独の抗腫瘍効果に加えて、融合遺伝子SS18-SSX抑制下での既存抗癌剤あるいは新規分子標的治療薬併用の抗腫瘍効果を評価することも可能である(Combined therapyの評価)。研究の進行は以下のように計画している。1)滑膜肉腫特異的融合遺伝子SS18-SSXの腫瘍原性の評価;ヌードマウスの動物実験モデルを用いてSS18-SSXが抑制された状態での腫瘍形成能を評価し、融合遺伝子SS18-SSXが腫瘍原性に与える影響を評価する。(微小転移に対する治療効果)。実際にはドキシサイクリンを投与した滑膜肉腫細胞をドキシサイクリン内服中のヌードマウスに摂取し、腫瘍の形成率を調査する。2)滑膜肉腫特異的融合遺伝子SS18-SSX抑制による抗腫瘍効果の評価;ヌードマウスの動物実験モデルを用いて実際に形成されている腫瘍に対するSS18-SSX抑制の抗腫瘍効果を評価する。(既存の腫瘍に対する治療効果)。実際には滑膜肉腫細胞を摂取し、腫瘍形成したヌードマウスにドキシサイクリンを内服させ、腫瘍体積を経時的に調査し滑膜肉腫特異的融合遺伝子SS18-SSXを標的とした治療法の効果を評価する。3)融合遺伝子標的治療と他治療薬との治療相乗効果評価;ドキシサイクリンによる滑膜肉腫の抗腫瘍効果が確認された後、他治療薬との併用効果を評価する。前年度までに申請者らが樹立したドキシサイクリン誘導SS18-SSX抑制滑膜肉腫細胞株(YSSi, ASSi)を用いてin vitro、in vivoで滑膜肉腫細胞における融合遺伝子SS18-SSX抑制による抗腫瘍効果を確認し、滑膜肉腫特異的融合遺伝子SS18-SSXが治療標的となり得ることを確認した。本年度は滑膜肉腫特異的融合遺伝子が、腫瘍原性に与える影響を評価した。1週間ドキシサイクリンを添加し培養したYSSiを同じく1週間ドキシサイクリンを内服させたヌードマウスに接種し、ドキシサイクリン内服を継続させ腫瘍形成能を評価下。コントロールはドキシサイクリンを添加せずに培養したYSSiをドキシサイクリン内服させていないヌードマウスに接種したものを用いた。造腫瘍能を詳細に検討するため接種細胞数を漸減させ同様の実験を複数回施行した。接種後1ヶ月の時点での腫瘍形成を比較したところ、ドキシサイクリン添加・内服群で有意に腫瘍形成が低下していた。滑膜肉腫

特異的融合遺伝子SS18-SSXが抑制されると腫瘍形成が抑制され、融合遺伝子は腫瘍原生に影響を与えることが確認できた。本研究の目的は申請者らが樹立したドキシサイクリン誘導SS18-SSX抑制滑膜肉腫細胞株を用いてin vitro, in vivoで滑膜肉腫細胞における融合遺伝子SS18-SSX抑制による抗腫瘍効果を評価し、融合遺伝子が創薬ターゲットとなり得るかを評価すること、融合遺伝子のin vitro, in vivoでの機能を評価することである。また、融合遺伝子抑制単独の抗腫瘍効果に加え、融合遺伝子SS18-SSX抑制下での既存抗癌剤あるいは新規分子標的治療薬併用の抗腫瘍効果を評価することである。研究の進行は以下のとおりである。1)滑膜肉腫特異的融合遺伝子SS18-SSXの腫瘍原性の評価;滑膜肉腫特異的融合遺伝子が、腫瘍原性に与える影響を評価した。In vivo実験系においてSS18-SSX抑制群で腫瘍形成が有意に抑制されていることが確認できた。SS18-SSXが腫瘍の発生に影響し新規転移抑制の治療ターゲットとなりうることを確認した。2)滑膜肉腫特異的融合遺伝子SS18-SSX抑制による抗腫瘍効果の評価;滑膜肉腫特異的融合遺伝子が、腫瘍増殖に与える影響を評価した。In vitro, in vivoの実験系においてSS18-SSX抑制群で腫瘍増大が有意に抑制されており、既存腫瘍に対する抗腫瘍効果が確認できた。SS18-SSXが既存腫瘍に対する治療ターゲットとなりうることが確認できた3)融合遺伝子標的治療と他治療薬との治療相乗効果評価;SS18-SSXは腫瘍の分化能に影響し腫瘍増殖に寄与することが報告されており、また分化誘導制御薬であるATRAも滑膜肉腫に対する抗腫瘍効果が報告されている。SS18-SSX抑制群におけるATRAの治療相乗効果を評価した。SS18-SSX抑制群、ATRA投与群ともに有意に腫瘍増殖が抑制されていたが、両薬剤の治療相乗効果は認められなかった。前年度までに申請者らが樹立したドキシサイクリン誘導SS18-SSX抑制滑膜肉腫細胞株を用いてin vitro、in vivoで滑膜肉腫細胞における融合遺伝子SS18-SSX抑制による既存腫瘍に対する抗腫瘍効果を確認し、滑膜肉腫特異的融合遺伝子SS18-SSXが治療標的となり得ることを確認した。また滑膜肉腫特異的融合遺伝子が、腫瘍原性に与えるかどうかを評価した。滑膜肉腫特異的融合遺伝子SS18-SSXが抑制されると腫瘍の発生が抑制され、融合遺伝子は腫瘍原生に影響を与えることが確認できた。本年度は他の抗腫瘍薬との相乗効果評価を行った。既存治療薬との併用という方法もあったが、SS18-SSXが起源細胞の分化誘導を偏向させ癌化させるという既報に基づき分化誘導薬として滑膜肉腫に対する抗腫瘍効果が報告されているATRAを使用することとした。ATRAは白血病の分子標的治療薬として使用されており、SS8-SSXによる分化誘導を抑制し、正常分化誘導を促すことを期待し使用した。しかしながら細胞刺激性が強くヌードマウスに対する投与方法、投与量の選定に時間がかかり計画よりも若干遅れることとなった。
多角的蛍光イメージングによる嗅覚神経回路の機能構築原理の解明

嗅覚は動物にとって、食物の探索、危険の察知、社会性コミュニケーションや繁殖など、個体の生存と種の維持に関わる重要な感覚システムである。匂いの源から発せられた匂い分子は末梢感覚ニューロンによって受け取られ、その情報は匂い分子の化学構造を基にした匂い地図として脳の嗅球に投影される。また、動物が匂いの質に応じて様々な行動を出力するためには、高次中枢が嗅球の匂い地図を適切に読み取る必要がある。しかしながら、嗅球から高次中枢に至る二次嗅覚経路の神経接続様式および匂い情報処理様式はほとんど解明されていない。我々はこれまでに、蛍光タンパク質のモザイク発現により、ゼブラフィッシュ稚魚の嗅球ニューロンを単一細胞レベルで可視化することに成功している。本研究ではこの手法をさらに発展させ、多角的蛍光イメージングによりこの問題にアプローチした。成魚において単一の嗅球ニューロンを可視化することを目的として、Creリコンビナーゼ依存的に蛍光タンパク質の発現がRFPからGFPに変換されるトランスジェニック系統を樹立した。また、同一個体での多色標識を目的として、CFP, YFP, RFPのいずれか一つを嗅球ニューロンで確率論的に発現するBrainbowトランスジェニック系統を樹立した。神経接続様式の解明には、軸索軌跡の解析とともにシナプス結合特異性の解析が必須である。そこで、シナプス結合の可視化を目的として、膜局在型splitGFPの相補フラグメントをそれぞれtTA/TREおよびGal4/UASシステムを介して発現誘導する系を構築した。嗅球から高次中枢に至る神経配線図を機能的な側面から理解するために、嗅球の匂い地図の包括的解析を行った。神経活動レポーターGCaMPによるカルシウムイメージングと神経活動マーカー分子の免疫組織化学を組み合わせることで、匂い地図の全貌を明らかにした。24年度が最終年度であるため、記入しない。嗅覚は多くの動物にとって、食物の探索、危険の察知、社会性コミュニケーションや繁殖など、個体の生存と種の維持に関わる重要な感覚システムである。匂いの源から発せられた「匂い分子」は、鼻の奥にある感覚ニューロンによって受け取られ、その情報は匂い分子の化学構造を基にした「匂い地図」として脳の嗅球(一次嗅覚中枢)に投影される。また、動物が匂いの種類に応じて様々な行動を出力するためには、高次中枢が嗅球の匂い地図を適切に読み取る必要がある。本研究では、これまでに確立した神経回路の可視化技術をさらに発展させ、多角的蛍光イメージングによりこの問題にアプローチする。我々はこれまでに、蛍光タンパク質のモザイク発現により、稚魚の嗅球ニューロンを単一細胞レベルの解像度で可視化することに成功している。本研究ではこの手法をさらに発展させ、成魚において少数の嗅球ニューロン集団を蛍光タンパク質で多色刷りする系の構築を開始した。まず稚魚の一過性発現系において、Gal4/UASとCre/loxPシステムを組み合わせた蛍光タンパク質発現系(UAS : Brainbow)の有効性を確認した。さらに成魚での発現維持を目的として、UAS : Brainbowトランスジェニック系統を樹立した。また神経接続様式の解明には、シナプス結合特異性の解析も必須である。そこで、膜局在型splitGFPによるシナプス結合可視化システムの確立に向けて、splitGFP相補フラグメントを嗅覚系で発現させる導入遺伝子を構築した。一方、匂い情報伝達様式を機能的な側面から理解するために、神経活動レポーターGCaMPを発現するトランスジェニック系統を樹立し、各種匂い刺激に対する嗅球の応答性を確認した。

交付申請書の研究計画にほぼ沿って進展している。神経軸索の多色刷りや神経活動モニタリングのためのトランスジェニック系統を樹立し、次年度の詳細な解析の準備が整った。シナプス形成の可視化については、従来法の原理を基に大きな改良を加えているため、トランスジェニック系統の樹立には至っていない。しかしながら、系統樹立のための導入遺伝子構築がほぼ完了し、一過性発現によるシステム検証の段階に進んでいる。24年度が最終年度であるため、記入しない。今年度に得られたトランスジェニック系統を用いて、嗅球から高次中枢への包括的軸索マップの作製と、匂い刺激および嗅覚行動にリンクした神経活動マップを作製する。シナプス形成の可視化については、研究計画にある「嗅球-高次中枢」回路への適用に先立って、改良したシステムの妥当性の評価を行う。具体的には、ニューロンタイプとシナプス形成部位がすでによく知られている「嗅上皮-嗅球」回路での検証を行う。これらの多角的蛍光イメージングによる神経解剖学的・機能的解析を進め、嗅覚神経回路の機能構築原理の解明を目指す。
歯周病原菌モノクローナル抗体を用いた歯周病の臨床的診断および治療への基礎的研究

成人性歯周炎の病巣では、嫌気性グラム陰性菌群とスピロヘータが増加してくる。なかでもBacteroides gingivalisは、深い歯周ポケット内で優勢となっている。宿主は、一方的にB.gingivalisの歯周局所での増殖を許す訳でなく、本菌に対する抗体を産生し、防御作用を示すと考えられる。本研究では、B.gingivalisに対する単クローン抗体を作制し、その特異性および生物活性について種々検討を加えた。作製した単クローン抗体は、B.gingivalis菌種に特異的なことから、歯周病局所における本菌種の動態をとらえるための武器になることがわかった。得られた単クローン抗体は、本菌の莢膜抗原、LPSおよび付着因子(hemagglutinin)に対するものであることを免疫化学的に明らかにした。次にこれらの単クローン抗体を利用して、成人性歯周炎患者の血清中に本菌のどのような抗原に対する特異抗体があるかImmunoblot法を用いて調べた。多くの患者血清中には、本菌のhemaglutininに対する特異抗体をもつことを見い出した。また進行した歯周炎患者血清中には、本菌LPSに対する特異抗体をもつことを実証した。健康者の血清中には、本菌の表層抗原に対する特異抗体は、検出することができなかった。これらの所見から、歯周炎患者はB.gingivalisに感染すると的確に免疫応答が生じていることがわかる。作製した単クローン抗体を用いて、B.gingivalisの病原因子についてもその解析を行った。本菌のhemagglutininに対する単クローン抗体は、本菌と他のデンタルプラーク構成菌の共凝集を特異的に阻害した。またこの単クローン抗体は、本菌の赤血球凝集作用もある程度抑えることがわかった。しかし、個々の単クローン抗体および組み合せたものは、白血球の食菌・殺菌作用の亢進や補体媒介性殺菌能の亢進作用は見い出せなかった。