hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
時間分解蛍光スペクトル測定による不規則系ダイナシクスに関する研究

一方、信号に対するバックグラウンド光比が微弱蛍光を測定する上で決定的であるが、バックグラウンド光はカー媒質の二光子励起蛍光がその主な起源であり、この点でも、従来に比べて性能の良い媒質を見出した。さらに、現在、能動的な二光子蛍光低減化を追求している。光反応性蛋白質Photoactive Yellow Proteinについて、時間分解蛍光スペクトル測定を行い、緩和の初期に、非常に速い減衰を見せる成分が存在するが、そのスペクトルは幅が広く、緩和に伴い幅が狭くなる奇妙な振る舞いを直接観測することができた。その起源に関して現在詳細な研究を続行中である。このようにして、光カーシャッターに基づく時間分解蛍光スペクトル測定は、超短時間域におけるスペクトルのスナップショット測定に適用できる簡便かつ有効な方法であり、さらなる改良により次世代標準となる測定法であることを示す事ができた。
世界の全ての大陸に400種以上が存在し,様々な有用植物を含むカキ属植物の用途は広く,さらに系統分類や進化学的にも興味が持たれてきた.本研究は,1)ゲノム情報と発現遺伝子情報の整備,2)機械計測と機械学習による形質評価法の開発,3)遺伝子機能評価系の開発,4)遺伝資源の調査収集の4種類のサブテーマの成果に支えられたカキ属植物の研究加速化のためのコモンプラットフォームを整備し,モデル植物の研究からは期待出来ない新発見や技術革新をもたらすために遂行するものである.これにより研究材料として最も扱いにくい木本性作物を研究対象にする果樹園芸学から基礎植物科学への貢献というパラダイムシフトの実例を示す.世界の全ての大陸に400種以上が存在し,様々な有用植物を含むカキ属植物の用途は広く,さらに系統分類や進化学的にも興味が持たれてきた.本研究は,1)ゲノム情報と発現遺伝子情報の整備,2)機械計測と機械学習による形質評価法の開発,3)遺伝子機能評価系の開発,4)遺伝資源の調査収集の4種類のサブテーマの成果に支えられたカキ属植物の研究加速化のためのコモンプラットフォームを整備し,モデル植物の研究からは期待出来ない新発見や技術革新をもたらすために遂行するものである.これにより研究材料として最も扱いにくい木本性作物を研究対象にする果樹園芸学から基礎植物科学への貢献というパラダイムシフトの実例を示す.
完新世後半における泥炭の堆積速度の増加期とそれをもたらす要因-西日本の山地を例として-

尾瀬ヶ原に代表される中部地方以北の多雪山地の泥炭地では,完新世後半(34000年前以降)の沼沢化にともない,泥炭地が山地側の緩斜面へ拡大していることが多い.中部地方以北の多雪山地に比べて,標高が低く,降雪量も少ない中国山地において,同様な傾向が認められるかについて検討し,以下のような結果が得られた.1.広島県北部の八幡湿原(標高800m)は,緩傾斜な谷底平野の源頭部付近に存在する.堆積速度は,約9000年前から約6000年前までが0.17mm/yr,約6000前以降現在まで0.95mm/yrとなり,大まかには,完新世後半の方が前半に比べて小さい.しかし,二葉マツ型花粉がやや深い層準から増加することから,34000年前よりもかなり遅れて,堆積速度が増加した可能性が推定される.いずれにしても,耕地化などの人工改変の影響も考慮して,さらに検討が必要である.2.島根県西部に沼原湿原(標高500m)は,単成火山である青野山に堰止められた,谷底平野の最上流部に分布する.泥炭地の拡大が可能な緩斜面が山脈の縁に存在するものの,ここでも,耕地化のため,泥炭地の拡大を確認することができなかった.3.岡山県北部の細池湿原では,ケルミ-シュレンケ状の微地形が分布する縁辺部分では,15002000年前以降,泥炭の堆積速度が急増している.4.現段階においては,中国山地では,34000年前頃より大きく遅れて,泥炭堆積が活発化した可能性が示唆される.この点は,中部地方以北の多雪山地における,34000年前以降の堆積速度の変動との関わりを含めてさらに検討することが必要であろう.尾瀬ヶ原に代表される中部地方以北の多雪山地の泥炭地では,完新世後半(34000年前以降)の沼沢化にともない,泥炭地が山地側の緩斜面へ拡大していることが多い.中部地方以北の多雪山地に比べて,標高が低く,降雪量も少ない中国山地において,同様な傾向が認められるかについて検討し,以下のような結果が得られた.1.広島県北部の八幡湿原(標高800m)は,緩傾斜な谷底平野の源頭部付近に存在する.堆積速度は,約9000年前から約6000年前までが0.17mm/yr,約6000前以降現在まで0.95mm/yrとなり,大まかには,完新世後半の方が前半に比べて小さい.しかし,二葉マツ型花粉がやや深い層準から増加することから,34000年前よりもかなり遅れて,堆積速度が増加した可能性が推定される.いずれにしても,耕地化などの人工改変の影響も考慮して,さらに検討が必要である.2.島根県西部に沼原湿原(標高500m)は,単成火山である青野山に堰止められた,谷底平野の最上流部に分布する.泥炭地の拡大が可能な緩斜面が山脈の縁に存在するものの,ここでも,耕地化のため,泥炭地の拡大を確認することができなかった.3.岡山県北部の細池湿原では,ケルミ-シュレンケ状の微地形が分布する縁辺部分では,15002000年前以降,泥炭の堆積速度が急増している.4.現段階においては,中国山地では,34000年前頃より大きく遅れて,泥炭堆積が活発化した可能性が示唆される.この点は,中部地方以北の多雪山地における,34000年前以降の堆積速度の変動との関わりを含めてさらに検討することが必要であろう.典型的な多雪山地である北アルプスに比べて,中国山地をはじめとする西日本の各多雪山地は標高が低い,このため,降雪量の変化などの環境変化に対して,泥炭地がどのように反応するかを明らかにすることが本研究の目的である.まず,米軍撮影の4万分1の空中写真判読を行い,西日本の主な泥炭地の地形判読を実施した.その結果,広島県北部県境付近の八幡原湿原(標高約800m)と島根県西部の沼原湿原(標高約500m)をまず主な調査地として決定した.前者は,幅広い沖積低地の谷頭部分に発達した泥炭地であり,泥炭質堆積物の層厚は1mをわずかに越える程度である.3つの地点から資料を採取し,その物理的分析(深さ5cmごとに,椀がけ法による混入無機物の抽出と重量比の算出,洗泥法による泥炭層の分解度の測定等)を実施した.その結果,深さ60cm付近を境として泥炭層の分解度が変化することが判明した.さらに,この付近の層準および泥炭質堆積物の基底部分の^<14>C年代測定を依頼した.沼原湿原は,谷の途中に単成火山が噴出したため,その上流部分が堰止められた泥炭地である.現在カラー空中写真による微地形の判読を実施している.丹後半島の大フケ湿原は地滑りの頂部凹地に起源をもつ泥炭地であり,前年度から調査を実施している。泥炭層の物理的分析を実施中である.

この泥炭地では,約16000年前頃から泥炭層の堆積が開始し,12000年前頃から9000年前頃にかけて堆積速度が大きく,その後低下し,約4000前頃から再び速度が増加したことが判明した.1.泥炭層の堆積速度八幡湿原では,黒色有機質粘土層の基底(120cm)付近の深さ100-110cmから8810±70年BP,そして,植物遺体の分解度がそれより上部でやや低下する深さ50-60cmから5800±70年BPの^<14>C年代測定値がそれぞれ得られた.後者の年代値は,当初予想していた34000年前に比べて,かなり古いものであった.現在の地表面が削剥を受けていないものとすると,堆積速度は,約9000年前から約6000年前までが0.17mm/yr、約6000前以降現在までが0.95mm/yrとなる.今回の年代値では,大まかには,完新世後半は,前半に比べて,泥炭層の堆積速度が遅いことになる.しかし,この点に関しては,現在の地表面が人為的的な影響も含めて削剥されている可能性もあることから,今後さらに検討を要する.2.泥炭地周辺の緩斜面尾瀬ヶ原に代表される中部地方以北の多雪山地の泥炭地では,完新世後半の沼沢化に伴い,泥炭地が山地側の緩斜面へ拡大していることが多い.そこで,泥炭地が拡大中,あるいは,拡大できるような緩斜面が山地斜面側縁辺に存在するかなどについて,沼原湿原,八幡湿原,細池湿原などにおいて検討した.その結果,、前二者では耕地化などの人為的な改変を受けており,泥炭地の拡大の有無については明確することができなかったものの,細池湿原では緩斜面にケルミ-シュレンケ複合体状の微地形が存在し,完新世後半における拡大が堆積された.3.火山灰,積雪量などについての調査も実施した.
自然言語における移動現象を誘発するメカニズムの解明

【研究目的】移動現象の詳細な研究を通して、自然言語の普遍性や個別言語の多様性を生み出す言語能力の本質を探ることを目指し、今年度は、「叙述の形成」という観点から、日英語における移動現象、とりわけA移動に関しての考察を行い、両言語の移動現象の間で確認された非対称性を、「叙述のタイプの違い」というパラメータを設定することで、統一的に説明することができる理論を構築することを試みた。【研究方法】1.昨年度行った英語の移動現象(LIC・PAB・ExNP)と日本語の移動現象(存在文・所有文)に関する自身の研究を基に、A移動が関与すると考えられる英語のHNPSと日本語の長距離スクランブリングに関して考察を行った。2.それぞれ考察した日英語の移動現象を「叙述の形成」と「叙述のタイプの違い」という観点から統一的に捉えることで、本研究が主張する移動理論の経験的妥当性を立証した。【研究成果】今年度行ってきた一連の研究により、主語卓越言語である英語において、非規範的な語順を示すHNPSもまた、LICやExNP等のいわゆる「文体的倒置構文」と同様に、顕在的統語部門において主語卓越言語に特有であるタイプのA移動が起こるということを明らかにした。そして、この特性が「主語-述語」というタイプの叙述を形成させる主語卓越言語におけるTのEPP素性の特性から生じるものであるということを示した。また、話題卓越言語としての日本語において、AとA'の両方の特性を示すとされる中距離スクランブリングだけでなく、A'特性のみを示すとされてきた長距離スクランブリングにおいても、A特性を示す場合があると指摘した上で、このスクランブリングの示す特異性が、「主題-題述」というタイプの叙述を形成させる話題卓越言語におけるTのEPP素性の特性から生じるということも明らかにした。【研究目的】移動現象を誘発するメカニズムを新たな観点から解明することを目指し、本年度は、「叙述の形成」という観点から日英語における移動現象、とりわけA移動の本質を捉え、両言語の移動現象で確認された非対称性を、「叙述のタイプの違い」というパラメータを設定することで統一的に説明することができる理論の構築を主な目的とした。【研究方法】1.昨年度から引き続き行ってきた英語の場所句倒置構文(LIC)と日本語の存在文の研究を基に、動詞句内移動及び動詞句外移動が関与すると考えられる日英語における個別の言語現象(英語における名詞句からの外置(ExNP)・重名詞句転移(HNPS)、日本語における所有文・二重目的語構文等)に関して考察した。2.それぞれ考察した日英語の個別現象を「叙述の形成」と「叙述のタイプの違い」という観点から統一的に捉え、本研究が主張する移動理論の妥当性を検証した。【研究成果】本年度行った一連の研究により、主語卓越言語である英語では、LICやExNP、HNPS等のいわゆる「文体的倒置構文」においても、subject-predicate型の叙述を形成するために、一致を起こしている要素が顕在的統語部門においてA移動を起こすことが明らかになった。また、話題卓越型言語の日本語では、一致現象とは独立した形で、topic-comment型の叙述を形成するために何らかの要素がA移動を起こすということが示された。
水平力を受けるト形部分架構を有するパイルキャップの力学特性の明確化

既往の研究においてパイルキャップ内の帯筋量を増加することで耐力や変形性能の向上が確認できた。そこで,本研究ではパイルキャップ内部の2種類の帯筋に着目し,パイルキャップ帯筋と柱帯筋の比率の違いが耐力や変形性能に対しどのような影響を与えるのかを確認する。試験体は8階建ての中層建築物の側柱下におけるト形部分架構を参考に約1/3スケールモデルの試験体を設計した。パイルキャップ配筋については,縦筋・帯筋によるかご筋型を用いた。試験体A-7aはパイルキャップ帯筋量を2.5倍,試験体A-7bは柱帯筋量(パイルキャップ内)を2.5倍とした。試験体A-7aは最大耐力時に下端基礎梁主筋に沿った位置におけるパイルキャップ横ひび割れ幅の増大が顕著であった。柱脚部コンクリートの剥落も確認されたが最大耐力後であること,またパイルキャップ内の鉄筋の降伏状況からパイルキャップで破壊したと考えられる。試験体A-7bに関しては最大耐力時にパイルキャップせん断ひび割れ幅の増大が顕著であった。試験体A-7aと同様に最大耐力後に柱脚部コンクリートの剥落も確認されたがパイルキャップ内の鉄筋の降伏状況からパイルキャップせん断破壊と判断した。パイルキャップ内のパイルキャップおよび柱帯筋の比率を変化させた試験体A-7aとA-7bについて,鉄筋の降伏状況は似通っているが,パイルキャップに入ったひび割れの傾向が異なるから,パイルキャップ帯筋と柱帯筋がパイルキャップの構造性能に与える影響は異なると考えられる。パイルキャップ内のパイルキャップ帯筋および柱帯筋の比率を変化させると,パイルキャップ帯筋量が多い方が最大耐力は大きく,体力低下率は小さくなり,ひび割れ状況から2種類の帯筋がパイルキャップの構造性能に与える影響は異なると考えられる。当初の計画通り,試験体を2体製作し,加力も終了している。データの整理が若干遅れてはいるが,実験に対する論文も内容は実験結果の報告程度となっているが,一応,達成できた。現在,実験結果の考察をさらに進めており,今年度の実験計画を進める予定である。本年度は,場所打ち杭におけるパイルキャップの破壊性状および耐力の確認を行う。既製杭を使用した場合のパイルキャップ内の力の伝達機構および基礎梁主筋の定着性能を把握することは,昨年度までの試験体で確認できる。既往の実験結果や今回の実験データを再考察することで,パイルキャップ内の鉄筋を合理的に設計でき,パイルキャップの縮小化が可能となる。場所打ち杭の場合に関しては,RC基礎指針で提唱されている破壊機構の確認を行い,大口径杭の場合のパイルキャップ耐力の整合性も確認する。実験では,実物大の約1/4に縮小した試験体を設計し,せん断破壊型と曲げ破壊型の試験体を作製し,最終破壊時強度および変形性能を把握する。さらに,曲げ破壊型に関しては,杭頭部の抜け出しによる杭の回転変形量と軸方向変位も定量的に評価する。

既往の実験結果や今回の実験データを再考察することで,パイルキャップ内の鉄筋を合理的に設計でき,パイルキャップの縮小化が可能となる。場所打ち杭の場合に関しては,RC基礎指針で提唱されている破壊機構の確認を行い,大口径杭の場合のパイルキャップ耐力の整合性も確認する。実験では,実物大の約1/4に縮小した試験体を設計し,せん断破壊型と曲げ破壊型の試験体を作製し,最終破壊時強度および変形性能を把握する。さらに,曲げ破壊型に関しては,杭頭部の抜け出しによる杭の回転変形量と軸方向変位も定量的に評価する。試験体の作製費用が予定額より低く抑えられたために差額が生じた。この差額分で新しい変位計を一台購入できればと考えている。今年度は場所打ち杭を対象としたパイルキャップ試験体を作成する。既製杭の場合の埋め込み深さのない場合を場所打ち杭と捉え,パイルキャップの設計としては場所打ち杭も既製杭も区別せず,連続的に設計できると考える。試験体の寸法,測定項目等は前年度と同様である。
老年期痴呆における尿失禁の研究

前頭葉は知能にも関与すると共に排尿機能にも重要な役割を有し、その病変で種々の排尿障害が起こることが知られている。しかし、その具体的内容についてはあまり明らかでなかったので、尿流動態検査を行なって検討した。その結果、排尿障害には排出障害を主徴とするものと、蓄尿・排出の両障害を主徴とするものの2者がみられ、責任病巣として前者では前頭葉内側上部病変が、後者では内側下部病変が考えられた。血管性痴呆患者の排尿障害の内容を検討した結果、高度な排出障害を有するものより、高度な蓄尿障害を有するものの方が多く、痴呆の程度と排尿障害の程度とに明らかな関連はなかった。また無抑制収縮が高頻度にみられ、排尿障害の主な病態機序は骨盤神経の核上性障害によると考えられた。無作為に選択した脳幹梗塞30名中で8名に排尿症状があり、尿失禁は4名、尿閉は3名にみられた。責任病巣として橋被蓋排尿中枢およびその下行路が考えられた。進行性核上性麻痺の排尿障害について検討してみると、約90%に排尿障害があり、尿失禁や残尿の多いものも少なくないことが分かった、また、Parkinson病でも詳細に検討してみると、約60%に排尿症状があり、尿失禁は約30%にみられた。下部尿路に作用する薬物が排尿障害の治療薬として良く使用されるが、痴呆老人に対する有効性はほとんど検討されてない。そこで切迫性尿失禁を有する15名の痴呆患者に使用したところ、約2/3の症例に有効であった。対象を選択するとかなりの効果が期待できることが分かった。脳循環改善薬である塩酸moxisylyteやbifemelane hydrochlorideの排尿障害についての有効性を検討した結果、両薬物は刺激症状にも閉塞症状にも有効なことが分かった。副作用の少ないこれらの薬物は脳血管障害後遺症の排尿障害の第一選択薬になり得ると思われる。特別養護老人ホ-ムに入所中の痴呆老人に対し,看護婦や寮母の協力のもとに排尿障害の実態調査を施行し,ついで尿失禁に対する薬物療法を試みた。排尿障害の実態調査の結果,対象患者68名中排尿行為が自立しているのは19名,半自位が18名,合介助が31名であり,痴呆や歩行障害が高度なもの程,またアルツハイマ-型痴呆よりも脳血管性痴呆の方が全介助者が多かった。尿失禁は58名(85%)にみられ,夜間遺尿,腹圧性尿失禁,切迫性尿失禁が多く,尿失禁の回数と痴呆の重症度との間には明らかな関係がみられなかった。薬物療法は切迫性尿失禁と考えられる15名(男1名,女14名)に対し抗コリン薬であるterodilineとoxybutyninを使用した。薬物は少量から漸増し,最大量の達した48週の時点で,尿天禁の回数および失禁量から治療効果を着明改善,改善,軽度改善,不変,悪化に判定した。結果は着明改善6名,改善3名,軽度改善1名,不変5名で,悪化例はなく,改善の程度は血管性痴呆とアルツハイマ-型痴呆とで明らかな差はなく,痴呆の程やおむ一着用の有無とも無関係であった。以上の結果から,痴呆の原因や程度にかかわらず,切迫性尿失禁に対して薬物療法を試みる価値があるものと考えた。

研究の目的は痴呆患者における尿失禁を中心とした排尿障害の病態機序の解明と、病態機序に応じた治療法の開発である。本年度は脳血管性痴呆患者を対象として検討した。脳血管性痴呆は本邦における痴呆の最も多い原因といわれ、患者は高率に尿失禁を含めた排尿障害を有していると想定されるが、その詳細な内容はほとんど明らかにされていない。そこで、我々は千葉大学病院を受診した脳血管性痴呆患者19名に対して排尿障害についての問診と尿流動態検査を施行して、その病態機序を検討し、次いで病態機序に応じた治療を試みた。詳細な問診の結果、頻尿、尿意切迫等の刺激症状が全例に、排尿開始遅延、排尿時間延長等の閉塞症状が約6割にみられた。尿失禁は約7割にみられ、その内容は切迫性および腹圧性のものが多く、いわゆる機能性のものは少なかった。尿失禁の頻度は痴呆の程度と明らかな関係はなかった。尿流動態検査の結果、無抑制収縮が約7割に、自律性収縮が約1割に、排尿筋括約筋協調不全が約2割にみられ、排尿障害の病態機序は主に骨盤神経の核上性障害によるものと考えられた。100ml以上の残尿や尿閉を高度な排出障害とし、尿失禁を高度な蓄尿障害とすると、高度な蓄尿障害の頻度が高度な排出障害のよりも多く、痴呆の程度と排尿障害の程度とは明らかな関連はなかった。尿失禁を有するものに各種薬物や点鼻薬を使用したところ全体として約7割の症例に改善がみられ、高度な排出障害を有するものに対して薬物、経尿道的膀胱頸部切除術を使用したところ半数に改善がみられた。治療成績を総合すると、15名中9名で改善し、高度痴呆群より軽度痴呆群において治療効果は高かった。以上の治療結果は痴呆以外の疾患の排尿障害の治療結果と比較すると決して高いとはいえないが、患者の協力が十分期待できない痴呆患者の成績としてはほぼ満足すべきものと考えられる。前頭葉は知能にも関与すると同時に排尿機能にも重要な役割を有しており、排尿中枢の存在する場所とされている。しかし、排尿機能に前頭葉のどの部位が関与するのか、排尿障害が起こるとすると蓄尿障害なのか、排出障害なのか、あるいは両障害なのかという点については不明であり、尿流動態検査を用いての検討はほとんどなされてなかった。そこで、前頭葉に限局する病変を有する6名について詳細な問診と尿流動態検査を施行して検討した。その結果、尿閉、溢流性尿失禁などの排出障害を主体とするものと、頻尿、切迫性尿失禁などの蓄尿障害に加えて排出障害を有する群とに分けることができた。前者は前頭葉内側上部病変で、排尿障害の病態機序として膀胱の無緊張性収縮が認められ、後者は内側下部病変で、膀胱容量の減少、無抑制収縮、排尿筋括約筋協調不全が認められた。無緊張性収縮や排尿筋括約筋協調不全が前頭葉病変で起こることは従来知られてないことで新知見と考えた。排尿障害の治療は通常下部尿路に直接作用する薬物が使用されるが、副作用が少なくなく、高齢者では使用しにくいことが多い。そこで、脳血管障害患者における種々の精神症状に有効とされる脳代謝改善薬が排尿障害にも有効かどうかを検討した。使用した薬物はbifemelane hydrochlorideであり、対象は頻尿・尿失禁を有する40名の脳血管障害患者である。8週間経口投与した結果、頻尿・尿失禁の全般改善度は改善以上が25%、やや改善以上が67.5%であった。これらの薬物は認知機能、意欲、積極性を改善することが知られており、排尿障害もこれらの精神機能の改善によることが考えられ、副作用がほとんどないことから、脳血管障害患者の排尿障害の第一選択薬と思われた。
走査型電子スピン共鳴顕微鏡によるダイヤモンド薄膜製作法の評価と改良

電子スピン共鳴(ESR)画像計測(イメージング)を高分機能で行う「ESR顕微鏡」を用いて、ダイヤモンド結晶と薄膜内に常磁性中心の濃度分布を明らかにした。特に、このための「ESR顕微鏡用キャビテイ」を開発し、新方式のESR顕微鏡とその応用例について、著書(共著)にまとめ、シュプリンガー東京から出版した。また、これまでのESR応用を一冊の英文著書にまとめ、ワールドサイエンテイフィック社から近く出版予定である。ダイヤモンド及びSi基板上の薄膜に関連したESR顕微鏡の成果は下記の通りである。(1)高圧合成ダイヤモンド単結晶(住友電工)内の常磁性不純物である窒素(N)中心とNi中心の濃度分布を画像化して、結晶成長のセクター依存生を明らかにした。特にNi中心については、77Kで測定できるように工夫した。(2)ダイヤモンド薄膜の常磁性中心分布測定では、顕著な分布画像を得ることができなかったが、各種不純物をドープした薄膜では、分布画像を得ることができる。(3)半導体基盤上の常磁性分布を測ることができ、工学上役立つことが明らかになった。特に、「マイクロ波走査型ESR顕微鏡」は、工学的応用が盛んになると考えられる。本研究に問題点として、ESR基是の小型化と感度向上について検討した。ダイヤモンドは次世代の高温動作デバイスとしてまた短波長光学デバイスとして有望視され、開発が進められつつある。本研究は、「マイクロ波走査型ESR顕微鏡」を開発し、これを用いてダイヤモンド薄膜を画像観察した。また、原子一個を検出する磁気共鳴の実現という野心てきな「走査型トンネル顕微鏡(STM)」にも取り組み、マイクロ波周波数でトンネル電流を観測した。ダイヤモンド薄膜評価用ESR顕微鏡が開発が進んだので、次の段階で、分担者の馬が担当して、合成したCVD及び・ECRダイヤモンド薄膜を測定した。これらのデ-タを基に合成法の改良を図り、そこで製作した試料について測定を繰り返し、さらに改良を図った。また、FeーNi溶媒法による高圧合成ダイヤモンド単結晶についてもESR顕微画像計測を行った。これらの成果は数々の論文を発表したほか、1992年にシュプリンガ-東京社から申請者らにより「電子スピン共鳴(ESR)顕微鏡」の著書が公表された。「走査型ESR顕微鏡」は、申請者らが物性研究のために開発した装置であり、これまで、化石、天然結晶などの不純物分布の測定に用いていた装置を、高周波ESR用に製作しなおして、CVD及びECRによるダイヤモンド合成方法評価に用いるように改善した。電子スピン共鳴(ESR)画像計測(イメージング)を高分解能で行う「ESR顕微鏡」を用いて、ダイヤモンド結晶と薄膜内の常磁性中心の濃度分布を明らかにした。本研究の問題点として、ESR基是の小型化と感度向上について検討した。
小腸フルクトース代謝に注目した新規代謝症候群治療法の開発

フルクトースの過剰摂取は"メタボ"を引き起こすが知られる。グルコース活性化転写因子ChREBPはフルクトース代謝に関与する遺伝子を誘導し、小腸ではフルクトースの取り込みと分解を、肝臓でフルクトースから他の代謝産物への変換を促進することを明らかにした。フルクトース(果糖)は蛋白の糖化能が高く、細胞障害を引き起こす。したがって、フルクトースの毒性から身体を守る上で小腸および肝のChREBP機能が重要であることが明らかとなった。"甘い食べ物を食べると小腸からの糖の取り込みが増え、より太りやすくなる"という仮説を検証することが、本研究の主目的である。申請した研究計画に基づき、本年度は以下を行なった。(1)マウスモデルを用いた検討通常食および高脂肪/高ショ糖/高コレステロール食(HSHFHC食)を5ヶ月間負荷した野生型およびChREBP-/-マウスの小腸でのグルコースおよびフルクトーストランスポーター(SGLT1, GLUT2, GLUT5)の遺伝子発現を調べた。まず、小腸上部>中部>>下部の順に、上記トランスポーター発現が見られた。さらに、野生型にくらべChREBP-/-マウスでは、上記トランスポーターの発現が低下していた。次に、小腸上部での糖取り込みを抑制するミグリトールを含むと含まないHSHFHC食(ミグリトール添加群vs非添加群)での小腸のグルコースおよびフルクトーストランスポーター(SGLT1, GLUT2, GLUT5)の遺伝子発現を比較した。ミグリトール群では小腸上部でのSGLT1, GLUT2, GLUT5が低下し、小腸下部でのSGLT1, GLUT2, GLUT5が増加した。ChREBPおよび標的遺伝子であるPKLRも同様の挙動を示した。上記は、糖質の取り込みの主な部位が小腸上部であること、ChREBPによる糖質トランスポーター発現調節の可能性を示唆する。(2)腸管培養細胞を用いた検討腸管培養細胞であるCACO2細胞を用いて、グルコース、フルクトース、スクロース、メチルグルコース、2ーデオキシグルコースによる発現誘導を検討した。結果としてグルコース、フルクトース、スクロースによるGLUT5発現誘導が観察された。上記はグルコースもしくはフルクトースの代謝産物によりGLUT5の発現が誘導されることを示唆することから、ChREBPの関与が推察された。フルクトースはフルクトーストランスポーターであるGLUT5により小腸上部で吸収される。一部はフルクトキナーゼ(KHK-A及びKHK-C)を介して小腸で代謝され、一部は門脈中へそのまま吸収され肝臓で代謝される。本計画は小腸におけるフルクトース代謝調節機構をグルコース活性化転写因子(ChREBP)の役割に注目し明らかにすることを目的としている。平成27年度は、野生型マウス(WT)とChREBPホモノックアウトマウス(ChREBP-/-)にフルクトースを負荷した際の血糖、血中トリグリセリド濃度、小腸(上部)でのフルクトース代謝関連遺伝子発現を経時的に測定した。フルクトース負荷によりWTでは20 mg/dL程度の血糖上昇が見られたが、ChREBP-/-では不変であった。血中トリグリセリド値についてもWTに比べ、ChREBP-/-では低値であった。さらにWTでは、Glut5やChREBPの標的遺伝子である解糖系の肝型ピルビン酸キナーゼ(Pklr)の発現が誘導され、遅れてKhk-A及びKhk-CのmRNA発現が誘導されたが、ChREBP-/-マウスでは、GlutT5, Pklr, Khk-A及びKhk-CのいずれもフルクトースによるmRNA発現誘導は見られなかった。すなわち、ChREBP-/-マウスでは、小腸でのフルクトースの取り込みと細胞内代謝が障害されていると考えられた。以上から、ChREBPは小腸フルクトキナーゼ代謝関連遺伝子の発現調節を介して小腸フルクトース代謝を調節していると考えられた。フルクトース自体がChREBPを活性化し、フルクトース代謝酵素の発現を調節していることが平成27年度の検討で明らかとなった。ChREBP-/-マウスではフルクトース代謝酵素の発現誘導が全く生じないことから、フルクトースの小腸の取り込み自体がChREBP-/-マウスで著しく低下している可能性を示唆する。ChREBPの小腸フルクトース代謝調節への寄与を表す重要な結果が平成27年度の研究で得られたことから、本計画は順調に経過していると考えられる。平成28年度は、フルクトースの投与経路(経口vs腹腔内投与)の違いに注目し、フルクトース腹腔内投与の際の血糖変化、肝臓内フルクトース含量および小腸および肝のChREBP標的遺伝子発現変化を検討した。フルクトース腹腔内投与の場合は直接門脈内へ流入するため、小腸を介さない経路のフルクトース代謝を直接評価できる利点がある。フルクトース腹腔内投与の場合、両群マウスで血糖の上昇が見られたが、野生型に比しChREBPノックアウトマウスで遅れて血糖が上昇した。さらに、肝臓内のフルクトース含量は経口投与と異なり、両者で増加するが、野生型マウスに比べ、ChREBPノックアウトマウスで4倍程度高値であった。さらに野生型マウスの小腸におけるChREBPの標的遺伝子(GLUT5,PKLR, KHK-C, GLUT2)発現は、経口投与と異なり腹腔内投与ではごく軽度の増加にとどまった。

一方、野生型マウスの肝臓におけるChREBPの標的遺伝子(GLUT5, PKLR, KHK-C, GLUT2)発現は、経口投与と異なり腹腔内投与では経時的な増加が見られた。ChREBPノックアウトマウスの肝臓ではフルクトース腹腔内投与によるChREBP標的遺伝子の誘導は見られなかった。すなわち、フルクトース腹腔内投与により小腸をバイパスするとフルクトースは肝で(グルコースなどに)代謝されるが、ChREBPノックアウトマウスではKHK-C遺伝子発現の低下により障害されることが示唆された。平成26ー28年度の研究結果から、小腸と肝臓はフルクトースの吸収および代謝に対するバリア臓器として重要であり、小腸と肝臓のChREBPはフルクトースの吸収代謝の両面で重要な役割を果たすことが明らかとなった。フルクトースの過剰摂取は"メタボ"を引き起こすが知られる。グルコース活性化転写因子ChREBPはフルクトース代謝に関与する遺伝子を誘導し、小腸ではフルクトースの取り込みと分解を、肝臓でフルクトースから他の代謝産物への変換を促進することを明らかにした。フルクトース(果糖)は蛋白の糖化能が高く、細胞障害を引き起こす。したがって、フルクトースの毒性から身体を守る上で小腸および肝のChREBP機能が重要であることが明らかとなった。初年度として、まずは研究計画の基礎にあたる部分である仮説を支持する研究結果が得られている。従って、概ね順調に経過していると考える。(1)マウス実験について本年度はまず、マウス生体で実際にChREBPが糖質トランスポーターの発現に影響を与えることを目標としたので、まずその目標はクリアできた。また、ミグリトール添加によるマウス実験でも小腸の部位ごとに解析を行い、ミグリトール添加により下部小腸においてChREBPの発現増加とともに糖質トランスポーターの発現が増加していることを明らかにできた。(2)培養細胞実験についてグルコース応答性のみられる条件について、糖質トランスポーターの発現変化を指標として培養条件が決定できた。次年度に使用するGLUT5プロモーター領域を含むリポーターベクター(合計6種)についても作成が完了した。従って、培養細胞を用いた実験についても、順調に経過している。今後は、ChREBP-/-マウスにおける(フルクトース負荷時の)血中のフルクトースや乳酸濃度の変化からフルクトース取り込みへの影響を明らかにしたい。また、小腸を通り抜けた後フルクトースは主に肝臓で代謝されることから、肝臓でのフルクトース代謝関連遺伝子発現変化や肝臓内フルクトース含量、肝内乳酸含量、肝内トリグリセリド含量をWT及びChREBP-/-マウスを用いて明らかにする。さらに、平成27年度に使用したCACO2細胞の系を利用して、フルクトキナーゼやGlut5プロモーター内のChREBP結合領域の同定を並行して進める。代謝学、栄養学、糖尿病学、内分泌代謝学本年度の研究結果により、ChREBPによる糖質トランスポーター発現調節への関与が明らかになった。次年度は以下の実験を進める。(1)マウス実験についてChREBP-/-
周産期の鉄欠乏による神経幹細胞の発生異常と生後の行動特性との関連の解析

乳児期早期(日齢21ー39)に鉄制限(1/10量)をラットに行い、8および12週齢に行動実験を実施し9および13週齢に材料採取を行った。行動実験ではオープンフィールド試験おいて、交互作用に有意差を認めた。コントロール(CN)群に比べ、鉄欠乏(FD)群では総移動距離および辺縁部移動距離の減少率が低い結果となりFD群は成獣となってからも多動が残った。モノアミン測定では13週齢で側座核においてドーパミン(DA)の取り込み増加を認めた。13週齢の前頭皮質(PFC)および側坐核(NACC)の2領域において次世代シークエンサー用いた転写産物(mRNA)の解析をRNA-seq法を用いて施行した。結果はNACCにおいてFD群でReelin遺伝子の転写産物が有意に減少していた。Reelin遺伝子はシナプスの可塑性に関わる重要な遺伝子であり、生後鉄欠乏の行動特性に関連している考えた。組織形態異常解析についてはsynaptophysinを用いてシナプスの免疫染色を行い、シナプス密度がPFCでは有意差はなかったが、NACCにおいてはCN群に比してFD群で増加していた。近年、神経発達症は増加していることが報告されており、胎児期や幼児期の栄養環境がその発症に関連しているとの報告はあるものの、機序が不明である。統合失調症や双極性障害、自閉スペクトラム症などの神経疾患ではReelin遺伝子の発現の低下、また、注意欠如多動症では神経伝達物質(DA)の変化、シナプス密度についても統合失調症では低下、自閉スペクトラム症では増加が認められると報告されてる。神経発達症は症状の出現に応じたスペクトラムな症候群であり、ヘテロジーニアスな集団である。乳児期の鉄欠乏によりReelin遺伝子の発現量がエピジェネティックな変化により減少することで不可逆的な変化をもたらし、成人期にも行動特性が残る一因となることを明らかにしたのではないかと考えている。概ね研究内容は計画通り遂行でき、新たな知見を発見することができたが、その成果の発表に際して、演題登録している学会が本年5月に実施されること、および、論文投稿については現在投稿中であるため。学会にて発表後、論文が今年度中に受理されるようすすめていく。昨年度に続き1群15匹に増加させ、乳児期早期(日齢21ー39)に鉄制限(1/10量)をラットに行い、8および12週齢に行動実験を実施し13週齢に材料採取を行った。高架式十字迷路試験では有意な差は認めなかったが、オープンフィールド試験では、交互作用に有意差を認めた。コントロール(CN)群に比べ、鉄欠乏(FD)群では総移動距離および辺縁部移動距離の減少率が低い結果となりFD群は成獣となってからも多動が残ることが分かった。次に、13週齢の成獣ラットの前頭皮質・側坐核・被殻・中脳背側・中脳腹側・橋においてHPLC法を用いて脳内モノアミン測定を行った。FD群の側坐核においては5HIAA・HVA・DOPACが高く、中脳背側では5HIAAのみ高いという結果であり行動異常に関連した神経機能不全を認めた。また、13週齢の前頭皮質および側坐核の2領域において次世代シークエンサー用いた転写産物(mRNA)の解析をRNA-seq法を用いて施行した。

結果は側坐核においてFD群でReelinの転写産物が有意に減少していた。Reelinはシナプスの可塑性に関わる重要な遺伝子であり、生後鉄欠乏の行動特性に関連している考えている。人間において2歳以上に発症した鉄欠乏性貧血は鉄剤投与において貧血は改善するが成人期の認知機能の改善は乏しいとの報告がある。その機序の一つとしてReelin遺伝子の発現量がエピジェネティックな変化により減少することで不可逆的な変化をもたらし鉄剤治療にはクリティカルピリオドが存在する可能性があることを明らかにしたのではないかと考えている。当初より計画していた行動解析・脳内モノアミン定量および遺伝子発現の解析については終了することができているため。鉄欠乏の影響を明らかにするために妊娠初期(受精後5日)から生後6日まで鉄を1/10量に制限した胎児鉄欠乏群7匹および生後21から39日まで同様に鉄を1/10量と制限した乳児鉄欠乏群4匹、食事制限のないコントロール群5匹の3群の実験動物(ラット)において行動異常と脳内生理異常との関連を解析した。行動解析ではオープンフィールド試験(OP)・高架式十字迷路試験(PM)を8週齢と12週齢に行った。8週齢ではOP/PMともに有意な差は認めなかったが、12週齢ではOP・PMとも有意な差を認めた。OPでは、交互作用において有意な差を認め、コントロール群に比べ、胎生期鉄欠乏群においては総距離の減少および辺縁部滞在時間の増加があり、一方乳児期早期鉄欠乏群では総距離の増加および中心部滞在時間の増加を認めた。乳児鉄欠乏は成獣となってからも多動が残り、乳児鉄欠乏群では不安が高い状態であると考えられた。日齢94に脳内モノアミン定量を前頭前皮質、側座核、尾状被殻、中脳背側、中脳腹側、橋において行った。胎児鉄欠群において、前頭皮質で5HT、側座核でDAと3MT上昇を認め、乳児鉄欠群は側座核で5HTと5-HIAAの上昇を認めた。異なる時期での鉄欠乏は産仔の神経心理学的な発達特性とその脳内生理(脳内モノアミン系の動態)に違った変化をもたらしていることが明らかとなった。同様の鉄欠乏の実験計画において、どの程度貧血が存在しているかを明らかにするために血算測定を行い確認した。初年度の行動解析およびモノアミン定量の結果を踏まえて、胎児鉄欠乏の影響は行動解析およびモノアミン定量の結果とも既存のものに合致するものであった。臨床的によく経験する2歳までの乳児鉄欠乏の影響を明らかにするためには乳児鉄欠乏群にしぼって研究を継続する方向が見い出せた。学会にて発表後、論文が今年度中に受理されるようすすめていく。組織形態異常解析についてはまだ未施行である。昨年度までの実験により側坐核においてmRNA Reelinが有意に減少していることが明らかにされ、今年度は機能発現を評価するためにシナプスの免疫染色法を用いての確認を行っていく予定である。乳児鉄欠群とコントロール群の二群に絞り、ラットの個体数を増やして研究を進めたいと考えている。行動実験の結果において有意な差が得られれば、凍結保存している片側脳を用い遺伝子発現の解析(RNAマイクロアレイにより行動異常に関連した遺伝子発現変化を解析する)、やエピジェネティクスの解析(成獣のミクログリア、神経幹細胞において、ヒストン修飾やDNAメチル化などの変化を解析し鉄欠乏によるエピジェネティクスの変化を検討する)を進めていきたい。
頭頸部癌の超選択的動注施行例における分子生物学的予後因子の検索

頭頸部癌進行例44例に対して大量のシスプラチンの超選択的動注と照射との併用療法を行った。性別は男性33例、女性11例で、年齢2573歳(中央値55歳)である。症例の内訳はT2b:1例、T3:14例、T4a:H例、T4b:15例、ステージII:1例、III:4例、IVA:22例、IVB:17例で、そのうち臨床的に手術不能と考えられたのが24例(54.5%)、手術拒否例が20例(45.5%)であった。病理組織は扁平上皮癌37例、腺様嚢胞癌3例、未分化癌4例で、原発部位は鼻副鼻腔19例、下咽頭8例、中咽頭9例、口腔5例、耳下腺1例、上咽頭1例、聴器1例であった。現在までの生存例の観察期間は9ヶ月4年2ヶ月(平均20ヶ月)であるが、Kaplan-Meier法による2年の原発巣のprogression free survivalは全体で66.9%で、T4b症例では57.1%、T4b未満では72.8%であった。2年粗生存率(図5)は52.4%であった。切除不能例が多く含まれており、この治療成績は十分評価されべきものと考えている。cDNAマイクロアレイを用い既知遺伝子約1000種類から、RADPLATを行なった鼻副鼻腔癌患者における正常鼻粘膜組織、異形成上皮、癌組織の遺伝子発現の変異を解析した。異形成上皮では正常組織細胞に比べ4倍以上発現が亢進したものが8種類、抑制されたものが27種類であった。癌組織では亢進が7種類、抑制が25種類であり、うち3種の遺伝子(Humig, diubiquitin, transcription factor ISGF-3)の発現が癌組織において特異的に亢進しており、RT-PCR法を用いてその発現の差異を確認した。これらの遺伝子の頭頸部癌における発現の報告は少なく、今回の結果の意義を検討するとともに、さらに症例を積み重ね検証し考察を進めていく予定である。頭頸部癌進行例35例に対して大量のシスプラチンの超選択的動注と照射との併用療法(以下RADPLAT)を行った。性別は男性26例、女性9例で、年齢3371歳(中央値54歳)である。症例の内訳はT2b:1例、T3:16例、T4:18例、ステージII:1例、III:7例、IV:27例で、そのうち臨床的に手術不能と考えられたのが15例(42.8%)、手術拒否例が20例(57.1%)であった。病理組織は扁平上皮癌31例、腺様嚢胞癌2例、未分化癌2例であった。原発部位は鼻副鼻腔14例、下咽頭7例、中咽頭7例、口腔4例、耳下腺1例、上咽頭1例、聴器1例で、動注は35例に対して117回(平均3.3回)行った。現在までの生存例の観察期間は4ヶ月41ヶ月(平均18ヶ月)であるが、非担癌生存20例(57.1%)、原病死11例(31.4%)、担癌生存3例(8.6%)、他病死1例(2.9%)であった。Kaplan-Meier法による2年生存率は53.3%であった。RADPLATによって原発巣が制御されたのは27例(77.1%)であった。リンパ節転移については3cm以上のリンパ節に対しては動注を行っているが、RADPLATで制御されたのがN(+)例18例中11例(61.1%)、手術で制御されたのが3例(16.7%)あった。異形成上皮では正常組識細胞に比べ4倍以上発現が亢進したものが8種類、抑制されたものが27種類であった。

現在までの生存例の観察期間は9ヶ月4年2ヶ月(平均20ヶ月)であるが、Kaplan-Meier法による2年の原発巣のprogression free survivalは全体で66.9%で、T4b症例では57.1%、T4b未満では72.8%であった。2年粗生存率(図5)は52.4%であった。切除不能例が多く含まれており、この治療成績は十分評価されべきものと考えている。cDNAマイクロアレイを用い既知遺伝子約1000種類から、RADPLATを行なった鼻副鼻腔癌患者における正常鼻粘膜組織、異形成上皮、癌組織の遺伝子発現の変異を解析した。異形成上皮では正常組織細胞に比べ4倍以上発現が亢進したものが8種類、抑制されたものが27種類であった。癌組織では亢進が7種類、抑制が25種類であり、うち3種の遺伝子(Humig, diubiquitin, transcription factor ISGF-3)の発現が癌組織において特異的に亢進しており、RT-PCR法を用いてその発現の差異を確認した。これらの遺伝子の頭頸部癌における発現の報告は少なく、今回の結果の意義を検討するとともに、さらに症例を積み重ね検証し考察を進めていく予定である。
在宅認知症高齢者に対するテレビ電話を用いたコミュニケーションに関する研究

安価な既存のInformation Communication technology(ICT)を用いたコミュニケーションが、在宅認知症高齢者とその介護者に与える影響を明らかにする為に、以下の二つのテーマで検証した。(1)「テレビ電話を用いた介入が在宅認知症高齢者とその家族介護者に与える影響」(2)「ICTツールの活用が在宅認知症高齢者の介護者に与える介護ストレス軽減効果」(1)では介入群家族の睡眠時間が、介入直前に比して有意に改善されたことが明らかになった。(2)では39名の介護ブロガーにアンケート調査を行い、質的分析を行ったところ、ブログ開設により(1)ソーシャルサポート、(2)対処機制、(3)出来事の知覚、という三つのカテゴリに分類される対処を行っていることが明らかになった。【研究概要】在宅で療養生活をおくる認知症高齢者とその家族介護者に対し、安価で簡便なICT(Information Communication Technology)ツールを利用した交信を行い、認知症の進行予防や介護者のストレス軽減を目指すことを本研究の目的とする。研究代表者が行った先行研究では、パソコンの無料テレビ電話ソフトを用いた交信を行ってきた。本研究では先行研究をさらに発展させるものとする。【具体的実施内容】1.「先行研究に準じた条件の対象者をさらに増やし、検証を行う」対照群患者1名を追加し、データ収集を行った。テレビ電話の介入による効果を検証する際に、きわめて重要な対照群を設定しており、今後さらに件数を増やし、検証していくこととなった。2.「先行研究での介入群に再度介入を行い、効果の継続の有無や再介入効果を検証する」先行研究での介入群1家庭に再度の交信を行った結果、先行研究の継続効果はなく、認知テストの結果は前回の介入前より低下していた。しかし、再介入後は前回の介入後と同程度まで認知テストの値が上昇した。これにより、介入の継続の必要性と、再介入により再び効果が期待できることが示唆された。3.「テレビ電話以外のツールとしてブログの有用性を明らかにする」在宅で認知症高齢者を介護している介護ブログ開設者にアンケート調査を行い、37名の回答が得られたものを量・質的に検証した。ブログ開設者は比較的介護度の高い患者(平均要介護度3.57)を介護しているが、約90%以上がインターネット上の相談で気持ちが晴れると答え、他者との共感を得る場としてブログの書き込みが日常生活で不可欠になっている姿が明らかになった。本研究の目的は、安価な既存のInformation Communication technology (ICT)を用いることが、在宅認知症高齢者とその介護者にどのような影響を与えるのかを明らかにするものであり、大きく二つの柱でその計画を立案した。一つ目はテレビ電話を用いた介入が在宅認知症高齢者とその家族介護者に与える影響を明らかにすることであり、もうひとつは既存のICTツールを活用している在宅認知症高齢者の介護者が、ICTツールを用いていない介護者と比較して、その介護ストレス軽減に影響を及ぼしているのかを明らかにすることである。テレビ電話による介入では、介入群家族の睡眠時間が、介入直前に比して有意に改善されていることが明らかになった(2011年学会発表予定)。もうひとつの、既存のICTツールを用いている介護者の比較という点では、ブログ開設の有無に注目し、39名のブログを開設している介護者にアンケート調査を行い、質的分析を行ったところ、ブログ開設により(1)ソーシャルサポート、(2)対処機制、(3)出来事の知覚、という三つのカテゴリに分類される対処を行っていることが明らかになった。何れの研究成果においても、ICTの活用が在宅認知症高齢者の介護者のストレス軽減効果において有効性が伺えるものであり、今後ますます在宅介護者数が増加すると考えられる本邦において、本研究は安価なICTツールの活用により、効率的なケアを推進していくことの可能性が示され、意義があるといえる。
アデノウィルスベクターを用いた断裂靭帯修復に関する研究

我々は、従来より成長因子やサイトカインなどの生理活性物質を局所投与して靭帯治癒を促進させる実験を続けてきたが、より効率よく組織にこれらの外因性因子を到達させるためにアデノウィルスベクターを用いた靭帯修復の研究を開始した。具体的には靭帯損傷モデルを作製し、その局所にマーカー遺伝子またはヒアルロン酸合成酵素をコードしたアデノウィルスを感染させ、遺伝子発現と靭帯修復能を検討した。また得られた知見を臨床応用可能なものとすべく新しい靭帯修復術を考案し有用性を確かめた。さらに、将来再建靭帯と骨との固着改善にもこの手法を応用すべく靭帯再建の動物モデルを作製し、FGF-2がその固着を改善することが可能かを検討した。結果として、(1)マーカー遺伝子であるLac-Z遺伝子は損傷靭帯周辺の瘢痕組織に効率よく発現することが、担体としてフィブリン糊を用いた場合でも確認された。しかし、ヒアルロン酸合成酵素をコードしたアデノウィルスでは明らかな修復組織の改善は認められなかった。(2)新しい術式を行った16例中13例を術後約1年の時点で、従来の保存療法を行った11例と比較し有意に膝安定性が得られた。(3)ゼラチンゲルを担体として局所投与されたFGF-2は、術後3週の早期に移植腱と骨孔との固着を、コントロール群と比べ有意に改善した。以上の結果から、局所にアデノウィルスベクターを用いて生理活性物質を投与することが可能であり、それは靭帯修復のみならず、靭帯と骨との固着にも応用可能であること、また臨床的にも応用は可能であることが示された。平成10年度にははじめに基礎的な研究としてアデノウィルス・ベクターが治癒過程にある靭帯の修復組織にどの程度の効率で導入されるかを検討した。実験動物として家兎を用い、損傷靭帯に関する治癒遅延のモデルとしてすでに確立されているChimichらのモデル(J Orthop Res,1991)を用い、靭帯実質中央に4mmの欠損部を作成し、ここに種々の方法でアデノウイルスを投与した。LacZをレポーター遺伝子として導入し、この導入効率を調べたところ、市販されているフィブリン製剤にベクターを混合して投与した場合に形成された修復組織に損傷後2週まではレポーター遺伝子の十分な発現があることが確認された。こののちにベクターおよび担体であるフィブリン製剤の投与が靭帯修復過程におよぼす影響を検討した。担体およびベクターのいずれも投与しない対照群、担体のみを投与した群、担体およびベクターをともに投与した群の3群について損傷後6週までの靭帯修復組織の形成を肉眼所見、組織学的所見、総コラーゲン量とI型およびIII型コラーゲンの比率に関する生化学的検討、引っ張り試験による生体力学的研究により評価した。この結果、担体の投与および担体とベクターの投与はいずれも靭帯の修復過程に有意の影響を及ぼさないと考えられることが分かった。従来の報告を再度詳細に検討したところ、現在までの時点では靭帯の修復過程が外因性の成長因子の投与により長期にわたって明確に改善されることは期待が困難であることがわかった。一方、皮膚などの組織修復に関して有利な作用があるとの報告が多いヒアルロン酸については最近この合成酵素をコードする遺伝子がクローニングされており、ヒアルロン酸の合成はこの酵素単独の作用によって可能であるとも報告されている。靭帯に関してもヒアルロン酸がその修復に有利に作用するという報告が散見される。このことが我々は当初予定していた成長因子の遺伝子導入に先立って、ヒアルロン酸合成酵素I型の遺伝子を導入し、これによる靭帯修復過程の変化を検討することとし、現在この遺伝子の導入によって実際に修復過程でヒアルロン酸が合成されているかを確認する作業に入っている。1.平成10年度より、我々はアデノウィルスベクターが治癒過程にある靱帯の修復組織に導入されうるのかを調べてきた。

昨年度報告したとおり、アデノウィルスベクターは2週の時点で治癒過程にある靱帯の修復組織に導入されうること、それが損傷後6週までの靱帯の修復過程には有意の影響を及ぼさないことがわかった。2.従来の報告を詳細に検討したところ、現在までの報告では靱帯修復が外因性の成長因子の投与により長期にわたって明確に改善されることは期待できない可能性が高いことがわかった。一方、ヒアルロン酸については、最近この合成酵素をコードする遺伝子がクローニングされ、ヒアルロン酸の合成はこの酸素単独の作用によって可能であるとの報告がなされている。靱帯修復に関してもヒアルロン酸がその修復に有利に作用するとの報告が散見される。このことより、我々はヒアルロン酸合成酵素I型の遺伝子導入を行い、これによる靱帯修復過程の変化を検討することにした。そこで、関節内においてもアデノウィルスにより遺伝子の導入が可能か、確認の実験を行う必要がある。そこでLacZ遺伝子を組み込んだアデノウィルスを経皮的に膝関節内に注射し1週後に染色した。その結果、滑膜細胞内にLacZの染色を確認し、アデノウィルスの経皮的関節内注により遺伝子導入が可能であることを確認した。3.ヒアルロン酸合成酵素(以下HAS)遺伝子を組み込んだアデノウィルスベクター(以下HASウィルス)を長寿医療研究センターの協力により提供を受け、現在HASウィルスを正常ウサギ膝関節内に注入し、ヒアルロン酸の合成促進が引き起こされているか否かを検討中である。合成促進されている場合には靱帯修復組織線維芽細胞や滑膜細胞にHASウィルスを導入し靱帯修復過程を調査する。また、TGF-βの活性型I型レセプターALK-5を発現するウィルスについても修復組織線維芽細胞に導入、検討するところである。昨年度までに家兎を用いた靭帯損傷モデルにおいて、アデノウィルスにより局所に比較的効率よく遺伝子発現させることが可能であることが明らかになったため、本年度はヒアルロン酸合成酵素をコードしたアデノウィルスを局所に感染させ、靭帯修復能を検討した。また得られた知見を臨床応用可能なものとすべく新しい靭帯修復術を考案し有用性を確かめた。さらに、将来再建靭帯と骨との固着改善にもこの手法を応用すべく靭帯再建の動物モデルを作製し、以前より強い骨形成作用の報告されている成長因子であるFGF-2の局所投与がその固着を改善することが可能かを検討した。結果として、(1)ヒアルロン酸合成酵素遺伝子をコードしたアデノウィルスでは明らかな修復組織の改善は認められなかった。(2)新しい前十字靭帯修復術を行った16例中13例を術後約1年の時点で、従来の保存療法を行った11例と比較したところ有意に膝安定性が得られていた。このことを日本整形外科学会学術集会他で発表し、論文発表も行った。(3)ゼラチンゲルを担体として局所投与されたFGF-2は、術後3週の早期に移植腱と骨孔との固着を、コントロール群と比べ有意に改善した。このことは日本整形外科学会基礎学術集会と米国整形外科基礎学会で発表し、現在論文作成中である。以上の結果から、靭帯損傷モデルにおいて局所にアデノウィルスベクターを用いて生理活性物質を投与することが可能であり、それは靭帯修復のみならず、靭帯と骨との固着にも応用可能であることがわかった。また本法は臨床的にも応用は可能であることが示された。