hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ZnO系ナノ粒子を用いた塗布型トランジスタ実現のための基礎的検討

ガス中蒸発法で作製したZnOナノ粒子をガラス基板上に塗布し,n型およびp型のZnO薄膜の形成に成功した。またこの塗布膜のみを用いてpn接合ダイオードや,n-チャネルおよびp-チャネル薄膜トランジスタ(TFT)を作製した。これは世界で初めての試みである。これにより,従来の集積回路技術を活かしたまま,より幅広い基板材料や表面形状など,粒子層が形成可能なあらゆる場所へ電子回路を作り込めることを示した。また今回用いた粒子層の形成法は,滴下法,スプレー法,沈殿堆積乾燥法である。これらは設備投資や製造コストが極めて低い手法であり,全国に多数ある中小企業も参画できる技術である。簡便かつ低コストな「塗布法」を用いて,ガラス基板上に酸化亜鉛(ZnO)ナノ粒子層を形成し,その電気伝導特性を評価した。H25年度は,粒径約200nm程度のn型粒子について,スプレー法,沈殿堆積法およびこれらの中間的な特徴を持つ滴下法の3つの手法による成膜を試みた。その結果,光学顕微鏡およびSEM観察より,これら3つの方法によりZnOナノ粒子層が形成されていることを確認できた。またスプレー法と滴下法については,PLおよびXPS測定より,塗布プロセスによる粒子層表面および内部の欠陥の著しい増加は観測されず,構造的には良好な成膜が達成されたと言える。一方,沈殿乾燥法は均一性の劣る膜となった。これは,成膜(乾燥)に時間がかかり,ZnO分散液中にガラス基板を浸漬している間に空気中のゴミなどが混入したためと思われ,今後検討が必要である。電気伝導特性については,当初はGΩ/□台だったシート抵抗も,成膜時の基板温度・塗布間隔・分散液濃度・塗布量などを最適化することにより,MΩ/□台にまで低減でき,さらに成膜後に熱プレスを加えることでkΩ/□台まで低減可能なことを示した。熱プレスにより粒子同士の密着性が向上していることをSEM観察により確認した。尚,TFTなどへ応用するに当たって,現在主流のpoly-Si層のシート抵抗値である百Ω/□台まで後一歩に迫っている。また,移動度は0.3 cm^2/Vsを得,これはかつてのアモルファスSi層の移動度に匹敵する値である。昨年度に引き続き,酸化亜鉛(ZnO)ナノ粒子分散液を「塗布」することで粒子層を形成し,電気伝導特性を評価した。粒子層の作製には,昨年同様,「滴下法」「スプレー法」「沈殿乾燥法」を検討した。「滴下法」で作製した粒子層については,トランジスタのチャネル層への応用を実施し,実際にガラス基板上に滴下法により形成した粒子層にMES-FET(MEtal Semiconductor-Field Effect Transistor)を形成したところ,トランジスタ動作を確認でき,ZnOナノ粒子層へのトランジスタの作製に成功した。「スプレー法」ではn型粒子層のみならずp型粒子層も実現し,ZnO粒子層によるpn接合の形成と整流特性を達成した。一方,「沈殿乾燥法」では,新たに減圧環境下で乾燥させる手法を取り入れることでプロセスの清浄化と時間の大幅な短縮を実現したが,粒子層の不均一性を改善するには至らず,今後も検討が必要である。また,粒子層表面のN2ラジカル処理を試みたが,現状では特筆すべき結果は得られていない。当研究室の独自技術であるガス中蒸発法により生成した窒素ドープZnOナノ粒子を,ガラス基板上に塗布し,n-型およびp-型の伝導特性を持つZnOナノ粒子層を再現性良く形成することに成功した。またこれらZnOナノ粒子層をチャネルとする薄膜トランジスタ(TFT)の試作にも成功した。特にZnOナノ粒子層におけるp型伝導やp-チャネルTFTの実現は世界で初めてである。ガラス基板上へのZnOナノ粒子層の形成は主に滴下法,スプレー法,沈殿堆積乾燥法を用いた。「滴下法」では,形成直後の粒子層は極めて高抵抗(GΩ台)を示したが,熱プレス法により実用に近い抵抗(kΩ台)まで低減させることに成功し,粒子層状に形成した薄膜トランジスタ(TFT)の特性も熱プレスにより飛躍的に向上することを見出した。「スプレー法」では,熱プレスを加えなくても比較的低抵抗な粒子層が得られた。また粒子生成条件を制御することで窒素ドープ量を変え,n型およびp型の伝導特性を持つZnOナノ粒子層を得,さらにn-チャネルおよびp-チャネルTFTを実現するに至った。これは世界で初めてのことである。ZnOナノ粒子層のみによるpn接合も作製した。「沈殿体積乾燥法」では,当初は乾燥に要する時間が長く,大気中で行っていた為もあり不純物の混入が問題であったが,減圧環境下で行うことで短時間化でき,清浄なZnOナノ粒子層を得ることが出来た。さらに滴下法やスプレー法と比べて抵抗にして1桁2桁低い層を得られる可能性が示唆された。本手法はまだ取り組みはじめたところであり,今後の成果が期待される。※上記実績の中で最終年度の実績は,スプレー法によるp-チャネルおよびn-チャネルTFTの作製と,沈殿体積乾燥法による粒子層の作製である。以上より,ZnOナノ粒子層を用いた塗布型トランジスタ実現に向けた基礎的な検討を行い,実現の可能性とその有益性を示した。

またこの塗布膜のみを用いてpn接合ダイオードや,n-チャネルおよびp-チャネル薄膜トランジスタ(TFT)を作製した。これは世界で初めての試みである。これにより,従来の集積回路技術を活かしたまま,より幅広い基板材料や表面形状など,粒子層が形成可能なあらゆる場所へ電子回路を作り込めることを示した。また今回用いた粒子層の形成法は,滴下法,スプレー法,沈殿堆積乾燥法である。これらは設備投資や製造コストが極めて低い手法であり,全国に多数ある中小企業も参画できる技術である。研究計画調書で掲げた5項目の目的に対して,3項目分の成果が出始めているため,概ね順調と判断した。半導体デバイス現在,「滴下法」でトランジスタ動作が確認できているが,量産性を考慮した場合,「スプレー法」または「沈殿乾燥法」の方が有利であるため,そちらの手法で作製した粒子層に対してもトランジスタ応用を進める。その際,MESゲートでは特性が不安定で歩留まりも悪いため,MISゲート型の構造を検討する。また,引き続きN2/N2Oラジカル処理による表面近傍粒子のp型化の検討を進める予定である。交付申請書の「研究目的」中の【2研究期間内に明らかにする点】で挙げた5項目に対して,まだ始めの1項目に留まっている状況である。ただし,塗布技術がある程度確立されれば,以降のステップは早急に達成可能であると考えられるため,腰を据えている状況である。「研究実績の概要」にも記したとおり,移動度やシート抵抗値としてある程度実用的な結果を得始めているため,H26年度以降はペースアップが図れ,研究期間内に5項目全てについて検証可能と判断し,「(3)やや遅れている」という評価とした。論文投稿を計画していたが,解析が間に合わず次年度に繰り越すこととした。その分,次年度購入予定の消耗品などを繰り上げて購入するなどし,残りが次年度使用額となった。概ね交付申請書に記載した流れに沿って進める予定であるが,H25年度の結果を基に以下の2点について若干の修正を加える。(1)熱プレスは当初の申請書には記載していない手法であるが,効果が期待できるため,引き続き検討する。具体的にはより高いプレス圧に耐える厚めのガラス基板を用意し,圧力依存性をより広範囲に検証する。現状では300 kg/cm2を超えると基板が割れてしまう。(2)沈殿乾燥法において,プロセスの清浄化と時間短縮を目的として,大気中から減圧雰囲気中での成膜に切り替える。また,連携研究機関である北海道大学との連携を強化し,「研究目的」で挙げているN2/N2Oラジカル処理装置の利用,MIS構造の作製のためのALD装置の利用やトランジスタ構造作製のための描画装置の利用に備える。データ解析ができ次第,学術論文として投稿予定である。それ以外の計画に大きな変更は無い。交付申請書で挙げていた設備備品「2chシステムソースメータ」と同等以上の性能の装置を他の研究室より貸与を受けることができ,新規の購入が不要となったためである。その分は,消耗品や旅費(北海道大学設備利用)に当てており,残りを次年度に繰り越すこととした。尚,貸与を受けた装置は当研究機関の間は利用可能であるため,研究遂行上の問題は無い。主に消耗品の購入に充てる予定である。少額であるため,これによるH26年度の計画に大きな変更は無い。
結晶設計の概念に基づく超分子有機伝導体の創製と物性開拓

1.含セレンドナー分子を用いたAu(CN)_4塩の構造と物性超伝導体を与えるドナー分子DIETS(=diiodo(ethylenedithio)diselenadithiafulavalene)を基本骨格とする、種々のセレン置換体のAu(CN)_4塩について合成と物性測定を行った。ヨウ素置換側がジセレノール骨格のドナーでは、Au(CN)_4塩が全て同型で強いI...Nヨウ素結合を形成している。これらの塩の伝導性はセレン原子の数に依存し、DIEDSSe塩は4.2Kまで金属的性質を保持する。一方ヨウ素置換側がジチオール骨格のドナーDIEDSSは螺旋状の超分子ネットワークを形成することが分かった。2.異種ハロゲン化TTF誘導体の合成および性質分子内にヨウ素原子と臭素原子を併せ持つ新規なBrI誘導体について検討した。クロスカップリング法によりBrIETSを56%の収率で得た。電解法により作成したλ-(BrIETS)_2〔Au(CN)_2](PhCl)_<0.5>の室温伝導度は18Scm^<-1>で、100K付近まで金属的挙動を示した。X線単結晶構造解析の結果から、BrIETSドナー分子は4分子周期で積み重なったλ型構造をとっており、ヨウ素結合に基づく特徴的な超分子構造を構築している。TB近似のバンド計算から2種類の閉じたフェルミ面が存在することがわかった。3.嵩高い置換基を導入した新規ドナー分子の合成結晶設計における分子間相互作用と立体障害の相補性について検討を行った。具体的にTTF骨格に剛直な立体障害を導入した際に結晶構造と電子物性に与える効果を検証するために、アダマンチリデン骨格を含む種々のTTF誘導体を合成し、X線構造解析により分子間でアダマンチリデン部位同士が接近する特異な性質を明らかにした。今年度は、主に新規含ヨウ素ドナー分子の合成研究に集中し、中心骨格に1,3-diselenole環を含むテトラセレナフルバレン(TseF)およびジセレナジチアフルバレン(DSDTF)誘導体合成の基礎ユニットとなる、1,3-diselenole-2-thioneの新規合成法の開発に成功した。1,3-diselenole-2-thioneの従来の合成ルートでは非常に毒性が高く、しかも非常に強い悪臭を放つH_2Se(セレン化水素)ガスあるいはCSe2(二セレン化炭素、市販品無、室温で徐々に分解)を出発原料として用いる必要があった。しかし、1990年代以降の環境保護運動の急速な高まりを受けて、通常の実験研究施設においては実質上その合成が不可能となっており、より安全で一般的な合成法の開発が切望されてきた。今回我々は、セレン試薬の中で最も安全に取り扱いが出来、無臭の固体試薬である単体セレンの粉末のみをセレン導入試剤として用いる新規合成法の開発に成功した。合成は、鍵中間体としてsulfonium iodide誘導体を経由する6段階の反応により行い、同法によりグラムスケールの安全な合成法が確立された。また、従来懸案であった置換基導入に際しての硫黄-セレン交換反応についても、反応条件を検討することにより1,3-diselenole骨格を完全に保持したままヨウ素原子を導入した1,3-diselenoleユニットの合成にも成功し、各種TseFおよびDSDTF誘導体への展開を図った。
ラットクローン上皮性Na^+チャネルのヌクレオチド結合ドメインを介する機能調節機構

ラットクローン化上皮性Na^+チャネル(rENaC)を構成するα、β、γサブユニットを安定型発現しているNIH-3T3細胞を用いて以下の研究成果を得た。ホールセルパッチクランプ法を用いることにより、この発現系におけるrENaC活性に起因するホールセル内向き電流を抽出することに成功し、この電流のアミロライド感受性、膜電位依存性ゲート開閉調節、イオン選択性を電気生理学的特徴を明らかにした。さらに単一電流記録法を用いることにより、この発現系におけるrENaCを機能的に単一チャネルレべルで同定し、その単一チャネルコンダクタンス、イオン選択性、アミロライド感受性、膜電位依存性ゲート開閉調節を明らかにした。ホールセル電流測定実験で、(1)Cs-gltamateを基本にしたピペット内液を用いると、rENaC活性に依存する内向き電流のrun-downが起きること、(2)10mMEGTAを用いてピぺット内液の遊離Ca^<2+>濃度を低くしてもこのrun-downは影響されないが、ATPをピぺット内液に加えるとrun-downがATP濃度依存性に抑制され、そのKmt値は0.3mMであること、(3)run-downの抑制作用はATP>ADP=GTP=UTP=AMPの順であること、(4)EDTA (10mM)をMgを含まないピぺット内液を加えてもATPのrun-downの抑制効果に変化がないこと、(5)ATPの代わにATP-γSやAMP-PNPを用いてもATPの時と同様にrun-downの抑制効果が見られることがわかった。さらにoutside-outパッチを用いた単一チャネル電流測定実験により、(1)上記ホールセル実験で用いたさまざまな細胞内液条件下(ヌクレオチドなし、ATP(10mM), ATP(10mM)+EDTA(10mM), ADP(2mM),ATPgS(2mM),AMP-PNP(2mM),UTP(2mM),GTP(2mM))でrENaC単一チャネルコンダクタンスが変化しないこと、(2)ピぺット内液(この場合細胞膜の細胞内側を潅流していることになる)中にATPを含まないとNPoで定義されるチャネル活性の時間依存性のrun-downが見られ、このrun-downはATPの濃度依存性に抑制されること、(3)ADPではrun-downが抑制されないことがわかった。従って上記ホールセル実験で見らられたrun-downはチャネル活性のrun-downとして理解され、rENaCが細胞内ATP濃度により機能調節される可能性が示唆された。これらの機能実験の他にαサブユニットのC端およおびN端に存在するグリシンに富むヌクレオチド結合ドメインに注目し、まずそれそれN端またはC端ヌクレオチド結合ドメインのグリシンをすべてアラニンに変異させたαサブユニットを作成した.さらにこの変異体サブユニットを発現するNIH3T3細胞を作成するために、まず野性型βおよびγサブユニットを安定型発現する細胞株の作成を行い、現在そのスクリーニングをおこなっている,βおよびγサブユニットをともに発現する細胞を作成後、変異体α-サブユニットを遺伝子挿入法を用いて作成し、細胞内ヌクレオチドの効果を系統的に調べる予定である.ラットクローン化上皮性Na^+チャネル(rENaC)を構成するα、β、γサブユニットを安定型発現しているNIH-3T3細胞を用いて以下の研究成果を得た。

さらにoutside-outパッチを用いた単一チャネル電流測定実験により、(1)上記ホールセル実験で用いたさまざまな細胞内液条件下(ヌクレオチドなし、ATP(10mM), ATP(10mM)+EDTA(10mM), ADP(2mM),ATPgS(2mM),AMP-PNP(2mM),UTP(2mM),GTP(2mM))でrENaC単一チャネルコンダクタンスが変化しないこと、(2)ピぺット内液(この場合細胞膜の細胞内側を潅流していることになる)中にATPを含まないとNPoで定義されるチャネル活性の時間依存性のrun-downが見られ、このrun-downはATPの濃度依存性に抑制されること、(3)ADPではrun-downが抑制されないことがわかった。従って上記ホールセル実験で見らられたrun-downはチャネル活性のrun-downとして理解され、rENaCが細胞内ATP濃度により機能調節される可能性が示唆された。これらの機能実験の他にαサブユニットのC端およおびN端に存在するグリシンに富むヌクレオチド結合ドメインに注目し、まずそれそれN端またはC端ヌクレオチド結合ドメインのグリシンをすべてアラニンに変異させたαサブユニットを作成した.さらにこの変異体サブユニットを発現するNIH3T3細胞を作成するために、まず野性型βおよびγサブユニットを安定型発現する細胞株の作成を行い、現在そのスクリーニングをおこなっている,βおよびγサブユニットをともに発現する細胞を作成後、変異体α-サブユニットを遺伝子挿入法を用いて作成し、細胞内ヌクレオチドの効果を系統的に調べる予定である.ラットクローン化上皮性Na^+チャネル(rENaC)を構成するα、β、γサブユニットを安定型発現しているNIH-3T3細胞を用いて平成10年度計画予定に従い以下の研究成果を得た。ホールセルパッチクランプ法を用いることにより、この発現系におけるrENaC活性に起因するホールセル内向き電流を抽出することに成功し、この電流のアミロライド感受性、膜電位依存性ゲート開閉調節、イオン選択性を電気生理学的特徴を明らかにした。さらに単一電流記録法を用いることにより、この発現系におけるrENaCを機能的に単一チャネルレベルで同定し、その単一チャネルコンダクタンス、イオン選択性、アミロライド感受性、膜電位依存性ゲート開閉調節を明らかにした。ホールセル電流測定実験で、(1)Cs-gltamateを基本にしたピペット内液を用いると、rENaC活性に依存する内向き電流のrun-downが起きること、(2)10mMEGTAを用いてピペット内機の遊離Ca2+濃度を低くしてもこのrun-downは影響されないが、ATPをピペット内液に加えるとrun-downがATP濃度依存性に抑制されること、(3)ATP以外のヌクレオチドであるGTP,UTP(2mMで比較)を用いるとrun-downが観察されること、またADP,AMP,AdenosineではATPと比べrun-downの抑制が小さいこと、(4)10mMEDTAをMgを含まないピペット内液に加えてもATPのrun-down阻止効果に変化がないこと、(5)ATPの代わりにATP-γSやAMP-PNPを用いてもATPの効果run-down阻止効果が模倣出来ることがわかった。outside-outパッチを用いた単一チャネル電流測定実験により、(1)上記のホールセル実験で用いた各種条件下でrENaC単一チャネルコンダクタンスが変化しないこと、(2)ピペット内液(この場合細胞膜の細胞内側を潅流していることになる)中にATPを含まないとNPoで定義されるチャネル活性の時間依存性のrun-downが見られ、このrun-downはATPの濃度依存性に抑制されること、(3)ADPなどのヌクレオチドではこのrun-downは抑制されないことがわかった。従って上記ホールセル実験で見らられたrun-downはチャネル活性のrun-downとして理解され、rENaCが細胞内ATF濃度により機能調節される可能性を示唆している(投稿準備中)。これらの研究結果をもとに次年度はαサブユニットのC端およ
酵母染色体テロメアの機能構造とその制御機構の解明

テロメアは真核生物線状染色体の末端を構成するDNA・タンパク質複合体であり、その構造維持は染色体の正常な機能にとって必須である。我々は分裂酵母、出芽酵母を材料に、テロメアDNAの維持機構の解析を行っている。今年度、出芽酵母においてテロメア関連タンパク質をエピトープタグ付加した形でかつ内在性プロモーターにより生理的レベルで発現する酵母細胞を構築し、さらにテロメア構造異常をもたらす遺伝的バックグラウンドでそれらのタンパク質を発現させ、その挙動を網羅的に解析し、関連タンパク質相互のネットワークを明らかにした。その結果、以下に示す重要な知見を得た。(1)ATMファミリータンパク質Mec1pは細胞周期のS期の時期に特異的にテロメアと結合し、他の時期はMec1pの代わりにTel1pがテロメアと結合している。両者のテロメア結合は拮抗的であり、Mec1pのキナーゼ活性の細胞周期変動によりテロメア結合が制御されている。(2)酵母のテロメア短縮変異株est2、yku70において、Mec1pが通常結合していない細胞周期上の時間帯にテロメアに結合している。(3)Mec1pのテロメア局在化はテロメラーゼ制御因子のテロメアローディングに重要である。このことから、Mec1pがテロメア複製のためのタンパク質複合体制御に関与することを示した。一方、分裂酵母を用いた解析では、taz1破壊株のテロメア末端の1本鎖突出はRad32依存的であるが、Rad32のヌクレアーゼドメインは必要でないことを示し、分裂酵母Nbs相同蛋白質nbs1の破壊株がrad50遺伝子やrad32破壊株と同様の表現型を示すことを明らかにした。また、RPAのlarge subunitをコードするrad11遺伝子の新たな突然変異を単離し、RPAがテロメア長の制御に関わることを示した。ヒト染色体不安定性症候群ATの原因遺伝子ATMと類似の構造を持つ分裂酵母rad3+およびtell+は、染色体テロメアの維持において重複した機能を持つことをすでに報告している。Rad3タンパク質は細胞周期チェックポイント制御において重要な機能を持ち、その機能はCds1,Chk1という二つのプロテインキナーゼの活性化を介していることが示されている。本研究では、Rad3タンパク質の多面的機能の理解のため、rad3+遺伝子の温度感受性変異を網羅的に検索した。そのうちの一つ、rad3-h4変異株は制限温度においてもチェックポイント機能は正常である一方で、弱いDNA損傷感受性を示した。このことは、Rad3タンパク質が細胞周期停止以外にもDNA修復の過程に直接的に関与している可能性を示している。この変異株に於いては、制限温度に移行後テロメアDNAの経時的な短縮が観察された。このことは、チェックポイント以外のRad3機能がテロメア長の維持に関与していることを示している。rad3-h4変異株では、テロメア長の長さが短縮するだけでなく、許容温度においてもテロメア近傍での遺伝子発現の抑制が部分的に解除されていた。このことは、rad3の欠損によりテロメア近傍のDNA構造が変化していることを示しており、ATM関連因子がテロメア近傍のDNA高次構造、あるいはヘテロクロマチン化を直接的に制御している可能性がある。テロメアは真核生物線状染色体の末端を構成するDNA・タンパク質複合体である。テロメア構造の維持が染色体の正常な機能にとって必須であることがすでに報告されている。我々はは分裂酵母を材料に、テロメアDNAの維持機構の解析を行っている。これまでにATM関連遺伝子rad3とtel1の二重欠損株においてテロメア長が極端に短くなり、細胞増殖能が低下することを報告している。本年度、rad3のテロメア特異的変異rad3-h4を有する株の解析を行い、1,ATM関連因子のテロメア維持機能と細胞周期チェックポイント制御機能は独立であること、2.rad3 tel1株に見られる株の生存率の低下は両機能が同時に失われたときにのみ観察されること、を見いだした。一方、テロメア複製の生化学的解析を進め、分裂酵母テロメアDNA末端の一本鎖部分は細胞周期(おそらくS期)特異的に3'末端の一本鎖が出現することを明らかにした。また、分裂酵母の新規遺伝子rad50の破壊株は、テロメアの長さの制御や、テロメアサイレンシングには関係ないが、野生型に比べて一本鎖部分突出が多いことから、Rad50はテロメアDNA末端の一本鎖部分の調節に関係している可能性が示唆された。分裂酵母ではテロメア機能の欠損をバイパスする機構として染色体の環状化が知られている。テロメアを持たない環状染色体保持株は、DNA損傷に対して超感受性を示し、これが相同組み換え系を介したゲノム修復の結果として生じる異常染色体によることを示唆した。このことは、ゲノム構造の複雑化と染色体の線状性との間に関係がある可能性を示している。今年度、まず分裂酵母テロメア末端の1本鎖が出芽酵母と同様にS期特異的に突出し、Ku70破壊株では細胞周期を通じて1本鎖が突出していることを明らかにした。また、Taz1破壊株ではRad50依存的にテロメア末端の1本鎖突出が検出され、Rad50変異で消失する突出はKu70との二重変異により再び観察された。

また、Rad50破壊株のHUやMMS感受性は、Ku70との2重破壊によって抑制された。これらの結果より、Rad50は薬剤によるDNA切断によって生じたDNA末端のプロセッシングに重要な役割を果たしており、Rad50非存在下ではKu70がDNA末端を保護することでプロセッシングを阻害する一方、rad50 ku70 2重破壊株では、未知のヌクレアーゼによってDNA末端のプロセッシングが起こり、DNA修復が可能になるというモデルを提唱した。一方、出芽酵母において細胞質性線状プラスミドが核内に移行しテロメアが付加する系をモデルとしてテロメアの新規付加機構を詳細に解析した。本年度、1.テロメア付加にはテロメラーゼ活性が必須であり、またテロメラーゼの負の制御因子はテロメア付加を抑制していること、2.Mre11、Kuがテロメア付加に対して正に働くこと、3.Tel1がテロメア付加に対して負に働くこと、また4.Mec1がテロメア付加に対して必須であることを明らかにした。本解析の結果は、内在性テロメア長の維持に働く因子間の相互関係と必ずしも一致しない。このことは新規にテロメア付加が起こる初発反応と、すでに存在するテロメアの維持反応とではそれぞれの因子の機能が異なる可能性を示している。テロメアは真核生物線状染色体の末端を構成するDNA・タンパク質複合体である。テロメア構造の維持が染色体の正常な機能にとって必須であることがすでに報告されている。我々は分裂酵母、出芽酵母を材料に、テロメアDNAの維持機構の解析を行っている。今年度、内在性のプロモーターより正常な機能をもつようにエピトープタグ(myc-tagあるいはHA-tag)を付加したATM(Tel1)およびATR(Mec1)を発現している出芽酵母株を作製し、細胞周期の各時期、または様々なテロメア異常変異株でのそれぞれのタンパク質のテロメア局在化をクロマチン免疫沈降法により解析した。その結果、Mec1pは細胞周期のS期の時期に特異的にテロメアと結合し、他の時期はMec1pの代わりにTel1pがテロメアと結合していることを明らかにした。さらに、種々の酵母変異株を用いた解析により、Tel1pの活性が低下した際にはMec1pのテロメアヘの結合が増強されること、逆にMec1pの活性が失われるとTel1pが細胞周期を通じてテロメアに結合していることが見いだされた。このことはTel1pとMec1pが相反的にテロメアに結合していることを示す。また、酵母のテロメア短縮変異株est2、yku70において、Mec1pが通常結合していない細胞周期上の時間帯にテロメアに結合していることがわかった。このことはテロメア短縮シグナルがMec1p(ATR)を介して伝達されていることを示している。細胞周期を同調した条件では、Mec1pのプロテインキナーゼ活性はS期をピークにして変動する。一方Tel1pの活性は細胞周期でさほど変動しない。さらなる解析でMec1pのキナーゼ活性はテロメア結合タンパク質のS期における置換に必須であることが明らかになった。このことから、Mec1pは複製終結のモニタリング、あるいはテロメア複製のための複合体のインテグリティー制御、のためにテロメアに局在化していることが考えられる。
特異的な電気二重層挙動の解明と高性能キャパシタへの展開

電極に形成される電気二重層の特異性に着目し、キャパシタの高性能化を果たした。まず、ナノカーボンの界面二重層の高速応答特性を活用し、超高速作動キャパシタの構築に成功した。また、イオン液体を含有する天然高分子ゲル電解質により、電極界面二重層のエネルギー障壁を大幅に低減し、高速作動キャパシタを実現した。また、電気二重層中にハロゲンレドックス種を蓄積できる条件を見出し、全く新しいキャパシタを提案した。課題「電極構造により発現する特異的二重層容量」:電位依存二重層容量成分の発現条件の把握:(概要)イオン液体のカチオンを混合塩として複数使用すると、カソーディックな分極で容量増加することを見出した。これは電気二重層の電場の中におかれた、サイズが小さく高電荷密度のカチオンが、優先的に内部ヘルムホルツ層に配向していることを意味し、この機構を考慮すると二重層容量の電位依存性が説明できることが明らかとなった。課題「イオン液体により構築される特異的二重層構造」:無溶媒イオン液体の特異的二重層容量の発現条件の把握:(概要)無溶媒イオン液体の静電容量と溶媒含有イオン液体の静電容量の差を観測し、これが電極材料にどのように依存するのか精査した。その結果、溶媒に依存するグループと依存しないグループに大別されることが分かった。容量依存の詳細な理由は検討中であるが、溶媒の存在が電荷分離に欠かせない電極構造と、不要な電極構造があると推測され、イオン液体特有の二重層構造の存在が示唆された。この情報を基に、電池系の電極界面についてもイオン液体電解液側から最適化を行った。これらの検討から、二重層構造の最適設計はキャパシタと電池の両者に応用可能であることが分かった。課題「新しい二重層容量発現機構を利用したデバイス化」:デバイス化のための基礎条件探索:(概要)上記の検討で用いた電解質に適用可能な各種電極材料の設計を行った。一方、電解液自身についてはイオン液体ゲル化系を発展させた。この検討の中でアルギン酸イオン液体ゲルが界面抵抗を減少させる、非水系イオン液体ゲル電解質として非常に優れており、高電圧作動可能かつ高速充放電可能なキャパシタが構築可能であることが分かった。イオン液体をゲル化することで,漏液防止あるいはデバイスのシート化が達成されると考えられるが,一般的にゲル化によるイオン伝導性の低下を排除できず,実用レベルに達しない.我々はアルギン酸をホストポリマーとし,イオン液体含浸させた新規ゲル電解質を開発し,電気二重層キャパシタ(EDLC)へ適用したところ,電極との親和性を改善でき,液相のイオン液体電解質を超える充放電特性を実現している.本年度では物性評価,特にイオン伝導性の評価を行ったところ,液相イオン液体のイオン伝導度とゲル電解質のそれはほぼ同程度であり,アルギン酸はイオン液体のホストとして非常に有効であることが示された.また,新たに天然高分子であるキトサン由来のゲル電解質の開発を行った.様々な電気化学測定から詳細に検討したところ,キトサン系ゲル電解質アルギン酸系を超える充放電特性が得られることが明らかとなった.また我々はこの度,レドックス種が電極側ではなく,電解液側に存在する新規な蓄電システムを提案するに至った.これまで,電解液のレドックス反応を利用した電気化学キャパシタについての提案は皆無である.これは電解液中のレドックス種が電解液中を拡散してシャトル反応を起こし,貯蔵した電荷が失われるからである.我々はレドックス反応種としてハロゲン化物イオンを用いることにより,シャトル反応を抑制するだけでなく,非常に高容量,高安定性の電気化学キャパシタの構築に成功した.正極における臭素のレドックス反応により,セル当たりの容量が飛躍的に向上していることが示唆された.同様にハロゲン化物イオンを含むイオン液体を電解質として用いた場合においても,同様に容量の増加が確認された.すなわち,この容量発現コンセプトは水系・非水系関係なく利用可能であることが判った.電気二重層キャパシタの諸特性は、電気二重層が形成される界面構造を最適化することで実現可能であり、基本的に容量は活物質の比表面積に大きく依存する。我々は高比表面積を有するポリエチレンテレフタレート(PET)由来の活性炭を開発し、その電気二重層キャパシタ挙動を評価した。開発したPET由来の活性炭の比表面積はグラム当たり3,600平方メートルであり、市販の活性炭に比べて倍近い比表面積を有する。本研究で作成したPET活性炭を電極活物質とした評価用キャパシタセルの放電容量レート特性を、市販の一般的な活性炭を用いたセルの特性と比較した。PET由来の活性炭を適用することで放電容量の大幅な増加が確認された。これは比表面積の増大によるものであるが、特筆すべきは、高い放電レートにおいてもその優位性は変わらなかった点である。

一般的に、高比表面積の活性炭を適用した場合、電極自身の電気伝導性あるいは複雑な細孔構造による高レート時の大幅な容量低下が起こるが、このPET由来の活性炭では見受けられず、活性炭においてきわめてまれな、電解質イオン拡散に有利な最適な細孔構造と二重層形成最適場の両立が実現していると考えられる。さらに、本年度では、ハロゲン化物を活性種に用いるキャパシタ系を前年度の水溶液系から非水溶液系に展開した。臭素イオンを含むイオン液体を電解液として用いた電気化学キャパシタセルの充放電は、水系と同様正極電位の上昇および充放電時における電位の停滞が観測され、臭素化物を含まない単純な電気二重層キャパシタに比べて大幅に容量が増加した。すなわち、電解液由来のハロゲンを用いたレドックスキャパシタは非水系においても適用可能であり、高出力かつエネルギー密度向上を可能とする理想的な電気化学キャパシタが提供できることが明らかになった。
フェリ磁性体を用いた熱アシストスピン注入磁化反転

本年度は昨年度に引き続き,極短パルスレーザーによるGdFeCoアモルファス合金膜の磁気ダイナミクス計測,TbFeアモルファス合金を用いた磁気トンネル素子の試作,CoFeB系スピン注入素子の作製とスピン注入磁化反転の確認を行った.(1)1psecのパルス幅の極短パルスファイバレーザー光源を用いた偏光解析装置を作製し,GdFeCo膜の磁気ダイナミクス計測を行った.観測試料はSiN(150nm)/GdFeCo(30nm)/CuAl(100nm)を熱酸化膜付きSi基板上に成膜したものでGdFeCoの組成を変化させた.1.5mJ/cm^2以上のポンプ光を試料に照射することで1psec程度の時間領域で磁化が減少し,その後歳差運動を行いながら緩和していく過程を分解能1psec程度で観測することができた.歳差運動周期は磁場の増大に伴い減少し,緩和定数は磁気補償点近傍で大きくなる結果を得た.(2)Tb_<17>Fe_<83>(20nn)/CoFeB(1nm)/Al-O(1.6nm)/CoFeB(1nm)/Tb_<13>Fe_<87>(20nm)をマグネトロンスパッタリング法により作製し,光リソグラフィーとArイオンエッチングにより磁気トンネル接合に微細加工した.Al層の酸化条件を最適化することで,10μm^2程度の素子で約12%の磁気抵抗変化を得た.現在CoFeB層とTbFe層との交換結合が不十分であるため,今後これを改選することで,大きな磁気抵抗変化が期待される.本年度は,スピン注入素子として多種の金属材料成膜を可能とする8元スパッタリング装置の作製(現有装置の改良)と,これを用いたCoFeB系磁気トンネル接合の作製,スピン注入素子の試作を行なった.また,フェムト秒レーザーを用いた磁化ダイナミクス測定装置を作製した.(1)新規の8元スパッタリング装置によりTa(5nm)/MnIr(20nm)/CoFe(2nm)/CoFeB(2nm)/Al-O(1.6nm)/CoFeB(10nm)/Ta(5nm)という構成のトンネル接合を作製した.Al-O層はAl層を成膜後、酸素RFプラズマにより酸化し,投入電力,酸化時間を変化させ,トンネル磁気抵抗特性を測定することで最適化した.トンネル接合と同一構成の薄膜を作製し、AFMによる表面観察を行ない,成膜条件を調整することで,表面ラフネスが0.3nm以下で層間結合を示すループシフトが1 Oe程度の非常に平坦な薄膜が作製できることが分かった.磁性層に軟磁気特性にCoFeBを用いたため,CoFe系にくらべやや小さいが,23%程度の磁気抵抗変化率が再現性良く得られた.(2)Ta(5nm)/Cu(5nm)/CoFeB(1.5nm)/Cu(6nm)/CoFeB(10nm)/Ta(5nm)を作製し,電子ビーム露光,ECRプラズマを用いたArイオンエッチングによりスピン注入用微細加工素子を作製した.エッチング後層間絶縁膜を成膜し,レジスト剥離後100nm x 200nmの素子が作製できていることを確認した.この素子に上部電極を成膜し,磁気抵抗効果を測定し,MR値0.5%程度と,垂直方向に電流を流す場合のMR効果として十分な値を得た.(3)フェムト秒レーザーを用いた偏光解析装置を作製した.レーザー光は材料を励起するポンプ光と磁化方向を観測するプローブ光に分け,プローブ光に光学遅延を設け磁気ダイナミクスを測定した.ポンプ光によりガラス基板上に作製したGdFeCo合金膜を十分昇温可能であることが分かった.現在ポンプ光の周期が80MHzと高速であり,試料の励起後の冷却が不十分であるため,パルスピッカーによりポンプ光を間引く必要があることが分かった.本年度は昨年度に引き続き,極短パルスレーザーによるGdFeCoアモルファス合金膜の磁気ダイナミクス計測,TbFeアモルファス合金を用いた磁気トンネル素子の試作,CoFeB系スピン注入素子の作製とスピン注入磁化反転の確認を行った.(1)1psecのパルス幅の極短パルスファイバレーザー光源を用いた偏光解析装置を作製し,GdFeCo膜の磁気ダイナミクス計測を行った.観測試料はSiN(150nm)/GdFeCo(30nm)/CuAl(100nm)を熱酸化膜付きSi基板上に成膜したものでGdFeCoの組成を変化させた.1.5mJ/cm^2以上のポンプ光を試料に照射することで1psec程度の時間領域で磁化が減少し,その後歳差運動を行いながら緩和していく過程を分解能1psec程度で観測することができた.歳差運動周期は磁場の増大に伴い減少し,緩和定数は磁気補償点近傍で大きくなる結果を得た.(2)Tb_<17>Fe_<83>(20nn)/CoFeB(1nm)/Al-O(1.6nm)/CoFeB(1nm)/Tb_<13>Fe_<87>(20nm)をマグネトロンスパッタリング法により作製し,光リソグラフィーとArイオンエッチングにより磁気トンネル接合に微細加工した.Al層の酸化条件を最適化することで,10μm^2程度の素子で約12%の磁気抵抗変化を得た.現在CoFeB層とTbFe層との交換結合が不十分であるため,今後これを改選することで,大きな磁気抵抗変化が期待される.
核移植技術を用いたマウス胎子期生殖細胞のキメラ形成能に関する研究

胎子から取り出した生殖細胞をドナー細胞として核移植を行ったところ、120個の再再構築2細胞期胚が作出できた。それらの胚をさらに1晩培養後に分裂した胚105個を受精卵由来48細胞期胚と集合したところ、90%が胚盤胞へ発育し、18匹の偽妊娠受胚雌に移植した。ついで、10.514.5日目に開腹したところ、それぞれ、54%100%の胚が回収された。そのうち、正常に発育していると判定されたものは、5672%であった。GPI分析の結果、10.5日目の分析では、正常胚のうち1例の胎盤と胎膜にそれぞれドナー細胞の寄与がみとめられ、既に死滅した胚においても1例で寄与が見られた。12.5日目の分析では、2例の胎盤に寄与がみられ、死滅胚のうち3例にドナー細胞の寄与が見られた。14.5日目の検査でも、胎盤、胎膜にそれぞれ1例ずつ、ドナーの寄与がみられた。しかしながら、移植後分娩させたマウスにキメラは含まれていなかった。11.5日齢の生殖細胞を用いた場合も、14.516.5日齢の細胞を用いた場合と同様に、受胎産物にキメリズムをみることができた。しかしながら、胎子への寄与はみられず、胚体外組織にのみその寄与がみられた。また、死滅した受胎産物で高率に寄与していたことから、14.516.5日齢の細胞の場合と同様に、ドナー由来細胞が発育の過程で何らかの理由により脱落していったかあるいは、発育を阻害していることが示唆された。また、本実験では用いた日齢のドナー細胞の遺伝情報を完全に「初期化」することができなかったことが明らかであり、今後、ドナー細胞を「初期化」する方法の改善や、この「初期化」現象の機構について解明する必要があると考えられる。
ユーラシア・北米のハスカップ野生遺伝資源の多様性解析と評価に関する研究

ハスカップを対象に、DNAマーカーを使用した遺伝的多様性およびフローサイトメーターによる倍数性変異およびDNA含量の変異について解析を行った。中国東北部およびロシアのハスカップを解析したところ、中国のハスカップは二倍体、ロシアのハスカップからは二倍体と四倍体に加え、五倍体が見つかった。AFLPマーカーによる多型解析の結果、概ね地理的分布と種の分類を反映したクラスターが形成された。葉緑体ゲノムの解析を加えると、中国東北部および極東ロシアのハスカップは遺伝的多様性に富んでいると考えられた。ハスカップはベリー類として貴重な遺伝資源の一つであるが、世界的にその全体像は把握されておらず、環境変動下でその野生遺伝資源が失われつつあるのが現状である。野生種のハスカップ(Lonicera caerulea)は北半球の温帯から亜寒帯に分布し、倍数性の変異があることが知られている。本研究ではロシア・カナダ・中国の研究機関の協力を得て、ユーラシアおよび北米のハスカップの分布域と倍数性変異を明らかにする計画である。また、分子マーカーを用いた系統分類を行い、各地域のハスカップの類縁関係と多様性について解析を行い、遺伝資源の保全と育種素材としての利用のためのデータを蓄積して公開することを目的としている。平成24年度は、中国黒竜江省東北農業大学、黒竜江省森林工業総務局の協力を得て、中国東北部のハスカップ自生地調査を行った。黒竜江省・長春において自生するハスカップを探索し、自生地の地理情報とともに葉のサンプリングを行った。フローサイトメトリーによって倍数性を解析したところ、調査した中国東北部の個体全てが2倍体であり、日本で多数を占める4倍体とは異なるものであった。日本のハスカップの2倍体は、北海道東部の釧路湿原周辺にのみ自生しており、そのDNA含量の変異は2.4%程度であるが、中国のハスカップ2倍体は、約15%のDNA含量の変異があった。また、Amplified Fragment Length Polymorphism(AFLP)による系統解析を行ったところ、中国と日本のハスカップは地理的分布を反映してクラスターを形成した。このことは、ハスカップの分子系統解析においてAFLPが有用な手法であることを示唆するものである。野生種のハスカップは北半球の温帯から亜寒帯に分布し、倍数性の変異があることが知られている。本研究では、分子マーカーを用いた系統分類を行い、各地域のハスカップの類縁関係と多様性について解析し、遺伝資源の保全と育種素材としての利用のためのデータを蓄積して公開することを目的としている。中国では、黒竜江省の伊春および勃利等でサンプリングを行った。国内のハスカップについては、現在までの自生地調査で得られたコレクションを利用し、北海道全域と栃木県日光のサンプルを実験に用いた。以上のサンプルについて、フローサイトメーターで倍数性の検定を行った。その結果、国内のハスカップのほとんどが4倍体であったのに対し、中国東北部に自生していたものはすべて2倍体であった。また、日本における2倍体間のDNA含量の幅は2.36%であるのに対し、中国で得られたサンプルでは7.02%から8.66%と、高い変異幅を示すことがわかった。中国のハスカップがより多くのDNA含量の変異を有することが明らかとなった。次に、日本および中国におけるハスカップの類縁関係を調査するため、AFLP法による多型解析を行った。150系統以上のサンプルについて、450以上のAFLP多型について近隣結合法等による系統解析を行った。その結果、中国と日本の由来を別とするハスカップサンプルの2つのクラスター、そしてさらに細かい地域のクラスターというように、概ね地理的距離を反映した結果を示した。一方、日本の栃木県由来系統の中に北海道よりも中国の系統に近いものが存在することを示す結果が得られるなど、ハスカップの分布と伝播を考察する上で興味深い知見が得られた。ハスカップ(Lonicera caerulea)はベリー類として貴重な遺伝資源の一つであるが、世界的にその全体像は把握されておらず、環境変動下でその野生遺伝資源が失われつつある。本研究では、分子マーカーを用いた系統解析を行い、各地域のハスカップの類縁関係と多様性について研究を行うこと目的としている。AFLP法による系統樹は5つのクラスターに分かれることが分かった。この解析結果は、概ね種と自生地を反映していたが、複数の種を内包したクラスターや異なるクラスターに分かれたL. edulisなど、さらに解析が必要な部分も見出された。ハスカップは日本では北海道を中心に分布し、本州の高山にも一部分布している。日本では北海道特産のベリー(小果樹)として栽培されているが、遺伝資源としての評価は途上にある。本研究では、日本とユーラシア地域のハスカップを対象に、分子マーカーによる系統解析、フローサイトメトリーによるDNA含量の差違について研究を進めた。ピーマンを内部標準にしたフローサイトメトリーによる相対DNA含量の比較では、2倍体の最小値を示すLonicera boczkarnikovaeと最大値を示すL. edulisに有意な差違があった。同様に、4倍体の最小値を示すL. altaicaと最大値を示すL. emphyllocalyxが明らかとなった。

これらの種は、DNA含量により識別可能であることが示唆された。また、AFLP法による系統解析を行うために、ベリー類の一つであるキイチゴをトレーニング集団としてAFLP法の手法開発を行った。制限酵素とプライマーのセットを至適化し、AFLPマーカーによって種を識別できることが分かった。AFLP法をハスカップに応用し、前年度よりもサンプル数を増やして系統解析を進めた。NJ法によって系統樹を作成したところ、9つのクラスターに分かれた。ロシア由来の8種と中国由来のA. altaicaは二つのクラスターに内包され、これらは近縁であることが推測された。日本と中国の野生種は6つのクラスターに分散し、その関係性を明瞭に推定することは難しかった。倍数性の影響を受けない葉緑体DNAの解析の結果、26塩基を一単位とする反復配列を見出すことができた。反復の回数により、ハプロタイプIIVに分類し、各地域のハスカップを解析した。ハプロタイプIIが最も広範に分布しており、北海道のハスカップもほとんどがハプロタイプIIだった。本州と北海道のハスカップはハプロタイプが異なることが分かった。これまでの研究でハスカップに倍数性変異があることを見出し、二倍体から五倍体の変異があることが分かった。AFLP法による系統解析の際に、この倍数性の影響をどのように処理をするかが難しい課題として残っていた。そこで、倍数性の影響を受けない細胞質ゲノムに着目し、葉緑体ゲノムを解析したところ、26塩基を一単位とする反復配列による多型を見出すことができ、その結果、これまで不明瞭だった母系を中心として系統関係を倍数性の影響を受けずに可視化することができた。この手法を適用することで、ユーラシアのハスカップの系統関係の全容を明らかにできることが期待される。一方、計画していたロシアへの渡航(植物調査)がレベル1の渡航注意の状態のため中止を余儀なくされている。このため、予定していたロシア域のハスカップの調査が進められない状況にある。海外の共同研究者へのサンプル送付依頼を行うなどの方法でサンプルの調達を進めており、研究期間を延長することにより当初目標としていたユーラシアのハスカップの系統関係を明らかにしたいと考えている。ハスカップ(和名:クロミノウグイスカグラ)は、日本では主に北海道に自生し、ベリー類の一つとして営利生産されている。本種は、ユーラシアから北米にかけて分布していることが分かっている。倍数性も二倍体と四倍体があることが報告されている。本研究では、ハスカップの遺伝的多様性を解析するために、分子マーカーによる系統解析を行った。北海道のハスカップは多くが四倍体であるが、北海道東部には二倍体も分布している。四倍体に比べて遺伝的構成が比較的シンプルな二倍体を対象に、北海道東部の野生集団の遺伝的多様性をAFLP法(Amplified Fragment Length Polymorphism)を用いて解析した。ハスカップは伏条更新と呼ばれる栄養繁殖の形態も知られているが、AFLPによる解析結果では、自生地で密接した個体間でもクローンは認められなかった。
寄生虫感染においてIgE抗体産生を誘導するT細胞集団の機能と寄生虫抗原の影響

1.線虫感染により,IgE抗体の主要産生部位である腸間膜リンパ節(MLN)におけるCD4^+細胞の増加およびCD8^+細胞の減少を認めた.感染前後を通じてIgE反応性の低いFischer(F)-344ラットではIgE反応性の高いBrown norway(BN)ラットよりCD8^+細胞の割合が高かった.2.感染前F-344ラットでBNより高いIFN-γの産生が認められた.また,感染に伴いMLN細胞によるIFN-γ産生は抑制された.これらMLN細胞によるIFN-γ産生の違い,変化は相対的なCD8^+T細胞数と一致していた.さらに,IFN-γ産生はラットにおいてもCD8^+T細胞が中心となっていることを確認した.3.MLNにおけるIL-3,IL-4,IL-5mRNAの発現は感染により両系統で顕著に増加し,ラットにおいてもTh2細胞が誘導されることを示した.BNラットでは感染前後を通じてF-344ラットより高いIL-3,IL-4,IL-5の発現が認められた.しかし,IL-2,IL-10およびIFN-γの発現に一定の変化は認められなかった.4.特異的IgE抗体の標的である成虫由来の分泌排出抗原および単離精製したシステインプロテアーゼは,Con A刺激によるMLN細胞のIFN-γ産生を濃度依存的に抑制した.さらに,この抑制は細胞毒性によるものではないことが確認された.これら結果は,線虫感染におけるIgE抗体産生にはラットにおいてもT細胞集団のタイプ2細胞への機能的変化を伴うことを明らかとし,線虫由来の刺激物質が直接T細胞に作用している可能性を示している.1.線虫感染により,IgE抗体の主要産生部位である腸間膜リンパ節(MLN)におけるCD4^+細胞の増加およびCD8^+細胞の減少を認めた.感染前後を通じてIgE反応性の低いFischer(F)-344ラットではIgE反応性の高いBrown norway(BN)ラットよりCD8^+細胞の割合が高かった.2.感染前F-344ラットでBNより高いIFN-γの産生が認められた.また,感染に伴いMLN細胞によるIFN-γ産生は抑制された.これらMLN細胞によるIFN-γ産生の違い,変化は相対的なCD8^+T細胞数と一致していた.さらに,IFN-γ産生はラットにおいてもCD8^+T細胞が中心となっていることを確認した.3.MLNにおけるIL-3,IL-4,IL-5mRNAの発現は感染により両系統で顕著に増加し,ラットにおいてもTh2細胞が誘導されることを示した.BNラットでは感染前後を通じてF-344ラットより高いIL-3,IL-4,IL-5の発現が認められた.しかし,IL-2,IL-10およびIFN-γの発現に一定の変化は認められなかった.4.特異的IgE抗体の標的である成虫由来の分泌排出抗原および単離精製したシステインプロテアーゼは,Con A刺激によるMLN細胞のIFN-γ産生を濃度依存的に抑制した.さらに,この抑制は細胞毒性によるものではないことが確認された.これら結果は,線虫感染におけるIgE抗体産生にはラットにおいてもT細胞集団のタイプ2細胞への機能的変化を伴うことを明らかとし,線虫由来の刺激物質が直接T細胞に作用している可能性を示している.平成6年度の研究は、IgE抗体産性能の異なるBrown-norway(BN)とFischer-344系統ラットを用いたin vivoの実験系を中心に,ほぼ当初の予定どうり行われた.その概要および結果は以下のとうりである:1.Nippostrongylus.brasiliensis感染,非感染ラットから脾臓、腸間膜リンパ節細胞を採取してCD4^+およびCD8^+T細胞数をフローサイトメトリーにより調べ、線虫感染に伴い特にIgE反応性の低いF-344ラットで著しいCD8^+T細胞の割合が減少することを明らかとした.さらにIgE反応性の高いBNラットでは感染の前後を通じてCD8^+T細胞の割合がF-344ラットに比べて有為に低値を示した.2.上記1.で得られた細胞を培養し、培養上清中のIgE,IgG2a抗体およびIFN-g産性をELISAにより測定した.IgE抗体産生は両系統ともに線虫感線により誘導されたが,産出量はBNラットで有為に高かったが,IgG2a抗体は逆にF-344ラットで高値を示した.また,この研究から両系統ともにIgE抗体産生は主として腸間膜リンパ節で,IgG2a抗体は脾臓と腸間膜リンパ節の療法で産生されていることが明らかとなった.IFN-g産生は感染前F-344ラットでより高値を示したが,感染に伴い両系統ともにその産生は抑制された.このIFN-g産生の抑制はリンパ球をコンカナバリンAで刺激したときにも確認された.3.線虫感線前後のリンパ節細胞におけるT細胞由来サイトカインmRNAの発現をb-アクチンを内部コントロールとした逆転写-PCR法により比較すた.その結果,マウスおよびヒトとで言われるTh2細胞由来のサイトカインのmRNA発現がラットにおいても線虫感線により誘導されることを明らかとした.ラット系統間における違いについては目下検討中である.

平成7年度の研究は,IgE抗体産生能の異なるBrown norway(BN)とFischer(F)-344系統ラットを用いたin vivoでのサイトカインmRNA発現とin vitroでのIFN-γ産生の詳細な解析を中心に行われた.その概要および結果は以下のとうりである.1.Nippostrongylus brasiliensis(Nb)感染前後の腸間膜リンパ節細胞(MLN)におけるT細胞由来サイトカインmRNAの発現をβ-アクチンを内部コントロールとした逆転写-PCR法により比較した.感染により1-2週目をピークとしたIL-3,IL-4,IL-5の発現が増加したが,IL-2,IL-10およびIFN-γの発現に一定の変化は認められなかった.また、IgE反応性の高いBNラットでは感染前後を通じてIL-3,IL-4,IL-5のmRNA発現がF-344に比べ有意に高いことを明らかとした.2.感染前後のラットMLNからCD4^+,CD8^+T細胞を分離培養し,それぞれの細胞集団におけるIFN-γの産生を調べた.IFN-γ産生はいずれの系統においてもCD8^+T細胞が中心となっていることを明らかとなった.さらに系統間ならびに感染前後におけるCD8^+T細胞によるIFN-γの産生の差は明確ではなく,むしろIFN-γ産生は相対的なCD8^+T細胞数の違いと一致していた.3.T細胞に作用する抗原を特定する目的でNb成虫からシステインプロテアーゼ(Cys P)を単離精製し,それが特異的IgEの標的となっていることを明らかとした.また,分泌排出抗原およびCys PがCon Aによって誘導されるMLN細胞のIFN-γ産生を濃度依存的に抑制すること,^3H-チミジンの取り込みからの抑制が細胞毒性にるものではないことを見出した.