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フィールドワーク方法論の体系化―データの取得・管理・分析・流通に関する研究―

本プロジェクトでは,人文地理学者が培ってきた豊富なフィールドワークの経験や蓄積にもとづき,暗黙知とされてきたフィールドワークを体系的に考察することにより,方法論の「ホワイトボックス」化に挑んだ.研究そのものを遂行するノウハウや研究論文の論旨を組み立てる方法などに注意を払いつつ,データを系統的に取得・蓄積・管理・分析・可視化・伝達する汎用的な方法を探究した.さらに,GISデータ解析のポータルサイトを立ち上げ,時空間データベースの活用実験を行うとともに,空間解析を主体としたフィールドサイエンスの確立に向けて議論を重ねた.本研究の成果はウェブで公開した.本プロジェクトでは,人文地理学者が培ってきた豊富なフィールドワークの経験や蓄積にもとづき,暗黙知とされてきたフィールドワークを体系的に考察することにより,方法論の「ホワイトボックス」化に挑んだ.研究そのものを遂行するノウハウや研究論文の論旨を組み立てる方法などに注意を払いつつ,データを系統的に取得・蓄積・管理・分析・可視化・伝達する汎用的な方法を探究した.さらに,GISデータ解析のポータルサイトを立ち上げ,時空間データベースの活用実験を行うとともに,空間解析を主体としたフィールドサイエンスの確立に向けて議論を重ねた.本研究の成果はウェブで公開した.本年度は,地理学のフィールドワークにおける「データの取得と管理」の研究を3つのグループ(1.先行研究の探索,2.データ収集法の探求,3.取得データと地図・衛星画像・統計との結合)に分けて推進した.「1.先行研究の探索」では,欧米諸国ではフィールドワークをどのように位置付け研究や教育を推進しているかを探るとともに,実証研究の成果を体系的に整理する作業を行った.この作業は次年度も継続する計画である.「2.データ収集法の探求」では,日本の農村・都市,ブラジル,イタリアなどを対象に実際に地域調査を実施して,フィールドワークの有用性や問題点など,方法論的側面から調査を行った.データの取得方法,データの効率的な整理と管理,データの分析,地図化・可視化の方法などについて検討した.「3.取得データと地図・衛星画像・統計との結合」では,フィールドデータを含む多種多様なデータを関連づけて表示するプラットホーム(共通基盤整備)作りに取り組んだ.GPSとGISとRSとを駆使したデータ取得の方法を確立するとともに,その手法を実際のフィールドに適用し,その有用性を評価した.GPSにより位置と時間情報を取得し,調査者がその地点に関する地理情報をサーバに転送し自動的に空間データベース化するシステムを開発した.リアルタイムで生の情報が集約できるので,応用範囲は広い.取得データのデジタル化,ジオコーディング,ラベリング,さらにデータ管理のコンセプトなども検討した.本年度の研究成果は,ホームページを立ち上げ,随時公開している.1フィールドワークの考え方と方法論に関する研究:(a)農村景観と就業構造に着目し,データ収集方法,方法論の一般化,解釈・結論への展開などを体系化した.(b)エスニック地理学において,エスニック特有の偏見,差別を含むプライバシーとも関連づけながら地域調査の実践手法を整理・検討した.(c)ミクロ地域に限定し,景観の観察,土地利用調査および聞き取り調査によるデータの収集方法を探った.(d)筑波大学を事例として,大学院におけるフィールドワーク教育の実践と成果および課題の検討を行った.(e)実験実習・野外実習において実施される都市的土地利用調査について,継続的な活用を可能にするデータベースの作成手順を示すとともに,土地利用調査の活用方法を探った.(f)ブラジルを対象に海外におけるフィールドワークの方法論と課題を考察した.とくに日本での資料収集,都市部におけるデータ収集,現地(熱帯湿原)での調査法,安全対策に焦点を当てた.2 GISを活用した地理空間データベース構築に関する研究:(a)ブラジルアマゾンを対象に,GIS・GPS・リモートセンシングデータを活用して,汎用的な方法で大縮尺ベースマップを作成する方法を探求した.(b)フィールドワーク用クラウドGISシステムを構築し,土地利用調査での有用性を探った.(c)キャンパスGISのシステムを事例に,地理空間データの取得,管理,可視化,分析,解釈,流通に関する検討を行い,方法論の体系化を図った.さらに,地理空間情報共有サーバを稼働させ,データベースを活用する体制を整えた.空間データベースの利用方法,地域区分に関する概念的,技術的な課題を検討するため,外部講演者を招くセミナーを実施した.1)人文地理学におけるフィールドワーク方法論の体系化を目的に,社会文化地理学,都市地理学,観光地理学,農業地理学,文化地理学,農村地理学,海外地域研究などの分野に焦点をあて,現地調査のやり方,調査内容,被験者属性などに注目しながら、各領域における方法論の共通性と固有性について探究した.とくにフィールドワーク方法論のホワイトボックス化をはかるため,各分担者のこれまでの研究成果に基づき,データの標準化や規格化,方法論の一元化に重点的に取り組んだ.本年度は,GISとRSに通じた研究員を1名雇用し,フィールドワークに基づくデータ取得ソフトウェアの開発,WebGISの構築を行った.2)京都国際地理学会議(2013年8月開催)において,フィールドワーク方法論のセッションを企画し,研究分担者が研究発表を行った.その際,外国人識者を招聘し,本研究の成果を評価いただくとともに,今後の課題やフィールドワークの体系化に向けてのアドバイスを受けた.4)研究分担者による4年間にわたる研究成果を編集し,人文地理学研究の第34巻に特集号「フィールドワーク方法論の体系化」(253頁)として出版した.ここには17の論文を収録した.1)人文地理学における個別調査およびグループ調査を対象し,研究/教育に応用できる「転移性」と「通時性」を念頭に地域調査手法の一般化を試みた.

系統地理学では,とくに,観光地理学,農業・農村地理学,都市地理学に焦点を当て,地域調査法の共通性と固有性を探った.海外地域研究においては,中国とブラジルを対象に,地域特性に応じた調査手法やデータ取得方法を考究した.2)アンケート・聞き取り調査などによって得られた地理情報を時空間データベースとして管理し,即座に空間可視化や空間分析を行えるGISソフトウェアの試作版を構築した.そして,筑波大学及び周辺地域を対象に,フィールドワークにより定性・定量データを網羅的に収集し,それらに位置情報を付与して空間データベース化を図り,構築したシステムの有効性を検証した.取得したデータは逐次追加されていくので,アーカイブとして残すことが可能になった.また,データは,取得した時間が付与されるので,時間軸を加えた時系列解析が容易である.3)大学教育における効果的なフィールドワーク方法論の教授法を探った.個人およびグループによる地域調査の意義や方法,手順,成果の公開方法などについて検討した.その成果の一部は,人文地理学研究33号(2013年)および地域研究年報35号(2013年)に報告として掲載した.4)本研究の遂行にあたって分担者間で定期的に会合をもつとともに,今年度は計5回の公開セミナーを実施した.今年度の研究成果は,ウェブ上で公開した(http://giswin.geo.tsukuba.ac.jp/sis/project/fieldgis/home_j.htm).また研究成果を関連学術雑誌に投稿した.本研究は,人文地理学者が培ってきた豊富なフィールドワークの経験や蓄積にもとづき,暗黙知とされてきたフィールドワークを体系的に整理することにより,方法論の「ホワイトボックス」化を行うことを課題としており,この目的に沿って着実に研究を推進してきた.25年度が最終年度であるため、記入しない。取得した地理情報の取得,保管,分析,流通を図るためにWebGISの試作版を構築したが,その有効性が確認できた.さらに各専門分野におけるフィールドワーク方法論のホワイトボックス化についても着実に成果を収めており,本研究はおおむね順調に進展している.ただし,フィールドワークによりデータを取得後,直ちにWebGIS化し,調査者間でデータを共有しながら,リアルタイムで分析結果を解釈可能にするGISシステムの開発は,当初計画では,平成24年度と25年度にまたがって実施する予定であった.しかし,実証実験をシームレスに行うには連続して実施するのが適切と考えられるので,調整金制度を活用して25年度にまとめて実施することにしたい.フィールドワークデータの管理・分析・可視化・流通に関する調査研究,実証実験に取り組む.既存データ(衛星画像,地図,DEM,統計など)と効果的にリンクする方策も検討する.最終的には,地域調査における作業の手順,分析・考察の方法,結論への導き方などについても研究者間で共通理解が得られるよう一般化を図る.25年度が最終年度であるため、記入しない。
細胞外マトリックス各成分から再構成した超分子構造体

コラーゲンタンパク質には多数の分子種が存在し、分子種に特異的な会合体を形成している。超構造と分子の構造の関係で未だ未解明のものにV型コラーゲンおよびV型コラーゲンと分子構造的に相同性の高いXI型コラーゲンがある。本年度はV型コラーゲンから再構成される会合体構造と分子構造の関係を明らかした。1),V型コラーゲンはヘパリンとの親和性の違いにより、α1(V)_2α2(V)の組成のものとα1(V)α2(V)α3(V)の組成のものに分離した.XI型コラーゲンは軟骨のペプシン処理により可溶化された画分から、ヘパリンとの親和性を利用して分離した。2),らせん部位だけからなるV型コラーゲン、XI型コラーゲンについて会合体形成能および会合体構造を検討した。これらの全てはどれも中性のpH,生理的な条件下で細い線維を形成した。V型コラーゲン線維が細いのは、そのらせん部位の特徴に依存することを証明し、このことの理由について新仮説を提唱した。それはコラーゲンらせん部位中のグルコシルガラクトースを結合したヒドロキシリジンが線維の径を限定するというものである。I型コラーゲン、II型コラーゲン、V型コラーゲンの2つの亜型の再構成線維の径の平均値はV型コラーゲン、II型コラーゲン、I型コラーゲンの順に大きくなる。糖鎖の結合したヒドロキシリジンはらせん構造の表面に突き出している推定される。糖鎖の結合したヒドロキシリジン残基の数はV型コラーゲンで最も多く、II型コラーゲンの方がI型コラーゲンより少し大きい。すなわち、再構成コラーゲン線維の径と糖鎖を結合したヒドロキシリジンの含量とは逆相関している。V型コラーゲンのどちらの亜型も適当な条件下ではI型コラーゲン線維と相同な横紋(67nmの周期)を有する線維を形成した。V型コラーゲン再構成線維のI型コラーゲン線維と際だったもう一つの特徴は線維に分岐がないことである。
法律婚をこえて実践される親密性と共同性の比較社会学的研究

今年度は、事実婚経験者6名にインタビューを実施した。20代から70代まで幅広い世代の対象者に調査が実施できたことにより、事実婚経験者の世代的差異や個人史的変化を知ることができたことは大きな収穫であった。特に、若年層の事実婚実践者が、自らの関係をあまり「事実婚」と語らないのに対し、年長世代ほど「事実婚」であることを強調する傾向が見られた。おそらく事実婚実践者の経験・苦悩等は、その時代の家族・結婚をめぐる社会規範に大きく左右される。皆婚規範が強い社会、あるいは、婚前同棲がスティグマ化されている社会状況では、実践者は自らの関係を「事実上の結婚」、すなわち「普通の結婚」であると強調することを要請される。一方、家族規範が弛緩・多様化しつつある近年は、同居関係を「結婚」に枠づける必然性は低下しているように思われる。同居生活をしている若年層のカップルたちは、従来型の結婚に懐疑的である一方で、「子どもは結婚してから産むべきだ」という嫡出規範は強く内面化している傾向がみられた。以上の調査をもとに、事実婚・同棲を分析した論文を執筆中である。また、8月にオランダにて、インタビュー調査とフィールド調査を実施した。知人の紹介により、アムステルダムとライデンの2つの都市でオランダ人男性と日本人女性のカップル5組に同棲や結婚、子育て、親子関係、仕事等について聞き取り調査を実施した。この結果、家族をめぐる制度、人々の意識、ワーク・ライフ・バランスの内実について多くの知見を得ることができ、日本との比較文化研究に向けて大きな収穫となった。さらに、アムステルダムで開催されたAmsterdam Gay Pride 2016に参加し、視察・取材・資料収集をおこなった。今回は、パイロット調査であったが、次年度はオランダで同性カップルのインタビュー調査を実施する予定である。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。1.法律婚をこえたカップルの比較社会的研究/「法律婚をこえて実践される親密性と共同性」について。第一に、昨年度に関東社会学会の機関誌に投稿した論文「事実婚カップルはなぜ『結婚』するのか」(松木洋人氏・本多真隆氏との共著)が修正を経て8月に刊行された。この論文は、これまでに実施した事実婚カップルのインタビュー調査をもとに彼ら/彼女らが「法律婚」ではないが「事実婚」として自らの関係を「結婚」と呼ぶことの意味を探究した研究である。分析によって事実婚カップルが「結婚」という語彙をめぐって差異化と同一化の複雑な実践をおこなっていることを示した。第二に、この論文を発展的に議論した分析を、関西家族社会学研究会、日本家族社会学会にて報告した。これらの報告では、前述の論文では対象から外した同棲カップルも対象に加え、日本における非法律婚カップルの多様性に迫ったものである。対象者の数は25名であり、対象者の語りを通じて現代日本における結婚に付与された意味を明らかにした。今年度は新たに事実婚当事者3名へのインタビュー調査を実施した。2.結婚の歴史的研究/今年度もこれまで継続的に実施してきた結婚仲人の歴史的研究をおこなった(青弓社から『結婚仲人の近代』として2016年内に刊行予定)。明治から現代までの「結婚仲人」に関わる広範な文献資料を収集し分析をおこなった。仲人を通じて戦前・戦後日本の結婚観の歴史的変化を見ることは、現在の家族観・結婚観を探究する研究において不可欠な作業に位置づけられる。3.博士論文の発展的研究/上記の研究と並行し、博士論文で展開した「家族主義と個人主義の歴史社会学」の研究についても調査を実施した(晃洋書房と出版に向け調整中)。上記の研究に比べると、より理論的・思想史的な傾向の強い研究である。これも、法律婚をこえた親密性と共同性の可能性・あり方を考えるための作業の一環である。1年目の研究は、ほぼ予定通り進展したと考えている。従来からの課題であった修士論文および博士論文の出版に向けての執筆作業も並行して行っていたため、時間がとられるところもあったが、前者は歴史的な比較の観点から、後者は理論的な観点から本研究課題と深く関連するものであり、同時並行して取り組んだことには大きな意義があると考えている。本研究課題に関連した研究データとしては、これまでに収集したインタビュー調査データにもとづき、その分析や考察をおこない学会誌の投稿論文や学会発表のかたちで公開することに精力を注いだ。それと同時に、2月には新たな追加のインタビュー調査によるデータ収集も行っている。この追加調査は、1年目と2年目の研究をつなぐものであり、それをもとに2年目の研究が本格的に展開することができると考えている。

一方、家族規範が弛緩・多様化しつつある近年は、同居関係を「結婚」に枠づける必然性は低下しているように思われる。同居生活をしている若年層のカップルたちは、従来型の結婚に懐疑的である一方で、「子どもは結婚してから産むべきだ」という嫡出規範は強く内面化している傾向がみられた。以上の調査をもとに、事実婚・同棲を分析した論文を執筆中である。また、8月にオランダにて、インタビュー調査とフィールド調査を実施した。知人の紹介により、アムステルダムとライデンの2つの都市でオランダ人男性と日本人女性のカップル5組に同棲や結婚、子育て、親子関係、仕事等について聞き取り調査を実施した。この結果、家族をめぐる制度、人々の意識、ワーク・ライフ・バランスの内実について多くの知見を得ることができ、日本との比較文化研究に向けて大きな収穫となった。さらに、アムステルダムで開催されたAmsterdam Gay Pride 2016に参加し、視察・取材・資料収集をおこなった。今回は、パイロット調査であったが、次年度はオランダで同性カップルのインタビュー調査を実施する予定である。1年目は、異性愛の非法律婚カップルを対象に調査を進めたが、今後は共同生活する同性愛カップルにも調査を実施する。すでに申請者の知り合いの同性カップルやクイア研究者を通じて何組かに調査依頼を出した。欧州を中心に2000年以降多くの国で同性婚が法制化されているが、日本社会には今なおいかなる法的保障も存在しない。その意味でも、法の外で実際に生活を営む数多くの同性カップルの生活実態についての検討は今後ますます重要になる。同性愛のカップルはいかなる問題を抱えており、いかなる政策・保障を必要としているのか。法律婚や異性愛カップルとの比較やかれらの「家族」「結婚」観を探究することで、現代の親密性・共同性について考察していく。さらに、二人暮らしではないカップルの共同生活の調査を進める。欧米の調査では、同棲カップルが2人で生活しているとは限らず、他の成人と同居することも多いことを明らかにしている。同棲カップルといえば、独立した世帯を形成しているイメージが強いが、これは必ずしも適切なイメージとはいえない。日本でもシェア居住のなかで暮らすカップルが増えつつある。近年シェア居住の研究が増えつつあるが、その中のカップルを調査した研究は存在していない。かれらへのインタビューを通じて性愛関係のみを基盤としないカップルの生活実践を明らかにしていく。以上の調査を実施し、家事の分担、家計の共同、育児・介護等のケア関係、家族・親族関係などがどのように考えられており、実践されているのかを調査し、法律婚をこえて実践される親密性と共同性の現代的特徴を探究する。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。
生殖補助医療：走化性による新規精子選別法を目指したマウス精子による検討

顕微授精法(ICSI)を用いた体外受精では、一つの精子で授精が可能である。ICSIでは自然妊娠で働くであろう生理的選択は起きず、ICSIの施行者が1個の精子を選択することになる。この問題に対処するため、本研究では高度な精子選択法の開発を目指した。選別された精子の遺伝的正常性を解析するために、数種の解析法と染色体解析のために必要なマウスICSI法の技術習得を試みた結果、問題なく実施可能になった。一方、本研究では哺乳類精子の走化性を精子選別に利用できるかどうか検討したが、今回用いた解析法では明らかな走化性を検出することはできなかった。近年、生殖補助医療(ART: Assisted reproductive technology)は急速な発展を遂げた。特に、受精法の発展は著しく、媒精に供する精子数を劇的に減じ、顕微授精(ICSI)を用いた場合では1つの精子で受精卵を得ることができる。高度化した受精法にはそれに適した高度な精子の選別方法が必要となるが、確実に適正な精子を選別する方法はない。より高度に遺伝子異常精子を排することを目的とした新規の精子選別方法を開発するために本研究は計画された。当該年度までの研究により、Xenopus精子の走化因子であるallurinの組替タンパク質の精子誘因活性解析が終了し、allurinが有する低濃度領域での精子誘因活性の発現に重要な部分がN末端付近に存在することが示唆された。この成果は現在、論文執筆中である。また、当該年度の後期には、次のステップであるマウス精子の走化性解析を目指した実験を開始した。本研究を計画した当初は、マウス精子の解析にXenopus精子の解析法を適用する予定であったが、活性化を促した後の精子を解析したところ、大幅に解析方法を変更する必要があることが明らかになった。本研究では精子の走化性解析法が精子の選別法を兼ねるため、この解析法の開発は本研究の根幹をなすものである。そのため、現在、新規の解析チャンバーの開発を含めて、その検討を実施しているところである。今後、この解析法が確立したのちに、コメットアッセイ法またはsperm chromatin dispersion testにより、速やかに分離した精子の遺伝子断片化を解析する予定である。本研究は生殖補助医療における精子選別法の開発を目指して計画された。顕微授精では任意に選ばれた一つの精子を用いて卵を受精させる。精子はその形態や運動性により選択されるが、その他の指標は無いに等しい。哺乳類精子の走化性については不明な点が多い。そこで研究代表者がこれまでに研究対象としていたアフリカツメガエルの精子走化因子、allurinに注目した。allurinはCRISPファミリーに属するタンパク質である。CRISPファミリーは精子形成や受精の過程で重要な役割を持つタンパク質群で、ゲノム中ではクラスターを形成している。このタンパク質群は哺乳類のゲノム中にも存在し、これらの異常は精子の受精能を著しく害することが推測される。マウス精子に対するallurinの誘因活性はTow Chamber Assay法では誘因傾向が安定せず、この方法での精子の選別は困難であると判断した。次にマイクロピペット法で走化活性を検討したところ、明らかな誘因活性を検出するに至らなかったものの、この過程で精子の正の走流性を観察することができた。この特質は正しい運動機構と形態を保っていなければ維持できない特質であると考えられ、走流性を利用することで現状の目視による選別よりも有用な方法を確立できる可能性がある。そこで、精子の走流性の文献的調査を行ったところ、精子の走流性は100年以上も前に報告されていたが、その後の報告はほとんどなく、その詳細はまったく明らかになっていなかった。しかし、2013年に走流性に関する論文が発表されていた。精子走流性に関しては、本研究計画において想定されていないため、文献調査のみ行ったが、新たな精子選別法に応用可能な特性であり、今後の発展が期待される。研究代表者は走化性とカルシウムの関係をまとめた論文において、今回注目した走流性に関する見解をまとめ、本研究の成果の一つとして発表した。現在、Xenopus精子の走化因子であるallurinの組替タンパク質や合成ペプチドに対するXenopus精子の走化性を分析している。

予備実験の結果では、allurinのN末端付近には精子誘因活性の調節に関与する部分が予想された。また、allurinの活性部位がC末端に存在するとの報告を受け、この部分の合成ペプチドを作成し、逆相HPLCにて精製した。この精製した合成ペプチドに対するXenopusの走化性を解析する予定である。現在はXenopus精子の走化性解析法の確立に注力している。さらに、次のステップであるマウス精子の走化性解析を目指した準備を開始した。マウス精子の解析にはXenopus精子の解析にはない操作が要求される。精子の調整後、活性化を促した後の精子を解析サンプルとするため、その条件を調査中である。また、調査の末、遺伝子の異常を検出するための方法として、まずはコメットアッセイ法を検討することを決定した。現在、コメットアッセイ法の準備が整い、Xenopus精子を用いて方法の最適化を行っている。現在、本研究は二年が経過した。平成23年9月に研究代表者は所属機関を変更したため、研究環境が一変し、実験室の改装や実験機器の選定、購入など研究環境が整うまでに時間を要した。研究代表者の所属機関の変更に伴う研究環境の整備等による初年度の研究の遅れは当該年度における研究の進展で万全ではないものの、徐々にその遅延を取り戻しつつある。また、研究環境の変化ゆえか否かは定かではないが、Xenopus精子走化性のアッセイ系が現在非常に不安定である。Xenopusの走化因子であるallurinの組換えタンパク質の解析は終了したものの、今後、本研究の要所となるマウス精子の解析を行う必要がある。本研究を計画した当初は、マウス精子の解析にXenopus精子の解析法を適用する予定であったが、活性化を促した後のマウス精子をこの方法で解析したところ、マウス精子の選別に必要な精度と感度を得るには、解析方法を大幅に変更する必要があることが明らかになった。これらの事実と、本研究計画において、精子走化活性の解析法は精子の選別を兼ねている事を考慮し、研究代表者は解析法の開発を第一に解決すべき課題と判断し、現在、解析法の確立をめざし、鋭意実験を遂行中である。平成23年9月に研究代表者は所属機関が変更した。そのため、研究環境が一変し、研究機器、備品、試薬等、すべてにおいて見直しが必要となった。実験室の改装や実験機器の選定、購入など研究環境が整うまでに時間を要した。また、研究実施機関の事務の方々の献身的な援助を得られたが、動物実験計画の承認、動物実験室の申請と承認などの事務手続きには相応の時間が費やされた。これらの手続きは必要不可欠な事象であるが、本研究の進捗に大きく影響した事実は否めない。これらを要因として、現在、当初の研究計画よりも実験の進行が大幅に遅延している。現在の研究実施機関では、生殖医療に携わる医療スタッフらとともに研究遂行が可能になった。そのため、本研究課題の成果の実用化を考慮した議論を日常的に行うことができる。
走査型マイクロインジェクション顕微鏡の要素技術開発

本研究では、走査型マイクロインジェクション顕微鏡の実現に向けて、次に挙げる3つの要素技術の開発を行った。(1)インジェクション時にピペットを細胞膜に貫通させる時の動作制御。(2)インジェクション時の細胞への物質注入の確度を上げるために、ピペット内壁の清浄度を非破壊評価する方法として、ナノピペットを2つの真空槽の間に設置して、その真空コンダクタンスの押し圧依存性から評価する方法の開発。(3)イオン選択膜を内包するナノピペットの開発と、走査型ピペット顕微鏡で用いる白金電極の電解研磨法の確立。本年度は、走査型マイクロインジェクション顕微鏡の要素技術開発のひとつとなっているガラスナノピペットの真空コンダクタンス計測によるピペットの非破壊評価法の開発のため、東北大学多元物質科学研究所の高桑教授の下で、様々な内径のガラスピペットについて真空コンダクタンスの計測を行った。この真空コンダクタンスの計測において、計測時にピペット内に塵が侵入してピペットが詰まるということがしばしば起こっていたが、ピペットの先端からガスを導入するように逆向きの流れで真空コンダクタンスを計測することでこの問題を解決した。更に、コンダクタンス計測には微小流量測定が必要となるが、そのような微小流量を既存の機器で計測することは困難であった。そこで我々は、計測時に下流の真空排気を止めて溜め込み式にすることで、微小流量の計測を可能にした。以上の改良により、真空コンダクタンスの直接計測が可能となり、ピペット内部の清浄度がこの計測によって判断できることがわかった。以上の結果を理論的に解析するために、広島大学クロマチン動態数理研究拠点の菅原博士の下で、拡散方程式を用いた理論解析を進めている。また、ピペットのタップ・ツイスト動作を行うシステムについては、静岡大学工学部機械工学科の岩田教授との連携により、この動作が可能となるアクチュエータを購入して製作を進めている。最後に、ピペット先端外壁のコーティングについては、東北大学多元物質科学研究所の高桑教授との連携で、低速電子顕微鏡による評価を進めている。ピペット先端と内壁の状態を非破壊評価する手法の開発については、着実に進んでいて、成果をまとめる状況にある。ピペットのタップ・ツイスト動作を行うシステムの製作については現在進行形であり、倒立型光学顕微鏡への装置のセッティングを進めている。本年度は走査型マイクロインジェクション顕微鏡の要素技術のひとつとなっているガラスナノピペットの真空コンダクタンス計測によるピペットの非破壊評価法について、雑誌「Japanese Journal of Applied Physics」に報告を行った。また、共同研究者の東北大学多元物質科学研究所の高桑研究室で共同開発した真空コンダクタンス計測装置を基にして、ドライポンプを1台購入して工学院大学ナノ化学研究室で装置の作製を行った。現在本装置の始動のための準備を行っている。また、要素技術開発として、電極となる白金イリジウム線の交流電解研磨の周波数依存性と、セシウムイオンを選別できるナノピペットプローブの開発も行った。交流電解研磨では、100 Hz,1000 Hz, 10000 Hzでの電解研磨を行って研磨後の電極先端の形状を電子顕微鏡で確認して、先端の清浄・安定度を走査トンネル顕微鏡探針として使用して確認した。その結果、1000 Hzの交流を用いた場合が最適な研磨となることがわかり、その交流電解研磨の機構についてモデルの提案を行った。また、セシウムイオン選別ナノピペットプローブの開発については、カリウムとの選択係数が-0.8-2.1、ナトリウムとの選択係数が-0.1-0.9という負の選択係数が得られたことから、セシウムイオンと他のイオンとの選別はできていることが確認されたが、更に選択係数の値をよくするための研究を進めている。また、ピペットのタップ・ツイスト振動動作については、静岡大学工学部機械工学科の岩田研究室との連携で進めているが、本装置を工学院大学ナノ化学研究室で作製する準備を進めており、倒立型光学顕微鏡の上での動作確認を進めている。ナノピペットを評価するための真空コンダクタンス計測については着実に進んでいるが、ピペットのタップ・ツイスト振動動作についてはまだ不十分な点があり、現在進行中である。一方、別の要素技術開発として電極の交流電解研磨とイオン選別ナノピペットの開発については進んでおり、学術雑誌への報告の準備も進めている。最終年度は、走査型マイクロインジェクション顕微鏡の要素技術のひとつとなっているガラスナノピペットの真空コンダクタンス計測によるピペットの非破壊評価法について、これまでは東北大学多元物質科学研究所高桑研究室で計測を行っていたが、工学院大学ナノ化学研究室にて真空コンダクタンス計測装置を立ち上げて、真空コンダクタンス計測が工学院大学において出来るようになった。また、要素技術開発としてイオン選別ナノピペットプローブの確度を上げるための研究を行い、イオン選択膜の成分の配合率を変えることと、イオン選択膜作製過程に一工程を加えることによって、その確度を向上させることができた。さらに、電極となる白金イリジウム線の交流電解研磨において、適切な状態で研磨を自動的に終了する装置の開発を行った。そしてこの研究の副産物として、交流電解研磨によって白金微粒子が作製されることと、その微粒子の形状や粒径が交流電解研磨の周波数だけでなく、研磨される電極の形状にも依存することを見出した。このことは、触媒開発において有用な知見となることが期待される。そしてピペットのタップ・ツイスト振動動作については、既にタップ動作を行うための機構はあるが、これに回転動作を加えてツイスト動作をさせる際の微小回転振動において、130 Hzでの動作を実現することができた。これにより本振動操作が実現された。

以上のように、走査型マイクロインジェクション顕微鏡を実現させるための要素技術開発は成功を収めた。この成果により、次段階である走査型マイクロインジェクション顕微鏡の開発に着手できるようになった。本研究では、走査型マイクロインジェクション顕微鏡の実現に向けて、次に挙げる3つの要素技術の開発を行った。(1)インジェクション時にピペットを細胞膜に貫通させる時の動作制御。(2)インジェクション時の細胞への物質注入の確度を上げるために、ピペット内壁の清浄度を非破壊評価する方法として、ナノピペットを2つの真空槽の間に設置して、その真空コンダクタンスの押し圧依存性から評価する方法の開発。(3)イオン選択膜を内包するナノピペットの開発と、走査型ピペット顕微鏡で用いる白金電極の電解研磨法の確立。装置製作を2016年度中に完成させて、HeLa細胞などの観察を行えるようにする計画である。本年度から卒研生2名が加わり、これまで単独で行ってきた研究が加速するものと考えている。更に、学外だけでなく学内での研究連携によってより研究が進むものと期待している。細胞へのインジェクションについては、本研究を遂行できる場所を検討している。また、本年度から卒研生が4名となり、更に本研究が加速するものと期待している。表面物理化学
ネフローゼ・腎炎発症における糸球体上皮細胞発現分子リン酸化カスケードの解析

本研究ではnephrinを含むスリット膜構成分子のリン酸化が蛋白尿発症に関与することを明らかにした。具体的には以下の3つが重要な成果である。1) nephrinリン酸化によりPLC-γ1の活性化と結合が起こり、細胞内Ca制御に関与する、2) TRPC6チャネルの活性化をnephrinが調節し細胞内Ca濃度の変化が生じる、3)、podocyteの骨格蛋白であるNMMHC-IIA分子の変異により、NMMHC-IIA分子の発現が生じ巣状糸球体硬化症を発症する。ネフローゼ症候群における尿中への蛋白漏出には糸球体上皮細胞足突起を結合するスリット膜が重要な働きを担っており、スリット膜が蛋白漏出の濾過障壁となっていることが知られている。これまでの私達の独自の研究から、スリット膜構成分子であるnephrin、nephlが細胞間の接着分子として機能するだけでなく、その細胞内領域のチロシン残基のリン酸化により細胞内シグナル伝達に関与していること、および、そのリン酸化が病態(蛋白尿)に関与することを明らかにしてきた(Harita et a1.J Biol Chem 2008)。1.Nephrin細胞内旗域/CD8のキメラ蛋白を作成し、HEK293T細胞に発現させ、anti-CD8抗体を作用させることによりnephrinの細胞内領域めリン酸化を誘導させた。2.Nephrinが上記の操作により特定のチロシン残基(Tyr-1204)のリン酸化を受けるとPLC-γ1がTyr-1204特異的にリン酸化Nephrinに結合する。3.リン酸化nephrinに結合したPLC-γ1は活性化され、細胞内inositol 1,4,5-trisphosphateを上昇させるとともに、細胞内Ca濃度を増加させた。これら一連の現象は、nephrin細胞内領域のリン酸化が細胞細胞内Ca濃度の制御に関与することを示すとともに、糸球体上皮細胞障害にも関与することを示唆する。現在、ヒトでの蛋白尿発症における糸球体上皮細胞細胞内Ca濃度との関連を別の実験系を用いておこなっている。本年度は、昨年度からひきつづきスリット膜蛋白(Nephrin,Neph1)のリン酸化とそれに引き続くpodocyteでの情報伝達について解析をおこなった。Nephrinのリン酸化によりPLC-γの結合・活性化がおこり、細胞内Caの増加がおこることを見いだした(J Biol Chem 2009)。さらに、他のシグナル伝達経路を介してTRPC6チャネルの活性化を生じるという新しいメカニズムの解明もおこなった(論文投稿中)。特筆すべきは、こうしたシグナル伝達の最終的なtarget分子と想定され、また、巣状糸球体硬化症(FSGS)発症のkey moleculeであるNMMHC-IIAのpodocyteの局在と病態への関与の解析を遺伝性腎炎(Epstein/Fechtner症候群)の患者解析で明らかにしたことである(Kidney Inter 2010 Mar 3, pubmed online)。2008年にgenome-wide-association解析から、特発性FSGS発症と連関する分子としてMYH9遺伝子でコードされるNMMHC-IIA分子が同定された(Nat Genet 2008)。私達は、以前よりMYH9遺伝子に変異があり、異常NMMHC-IIAを発現する患者解析をおこなってきた。これらの患者の一部は進行性腎炎を呈するが、私達ははじめて1)この進行性腎炎の病理がFSGSであること、2)患者においてはpodocyteに発現しているNMMHC-IIA分子の発現低下をみることをあきらかにした。私達は、20082009年度までに次の事項を明らかにしてきた。1)スリット膜構成分子nephrin、neph1が細胞間の接着分子としての機能の他に、細胞内領域のチロシン残基のリン酸化によりpodocyte内のシグナル伝達をおこし、蛋白尿発症に関与すること(J Biol Chem 2008)。2) nephrinリン酸化がPLC-γ1の結合と活性化により、細胞内Caシグナル制御に関与していること(J Biol Chem2009)を明らかにした。3年間の研究を通じて、nephrin, neph1の細胞内領域のリン酸化が様々なシグナル伝達およびpodocyte機能、蛋白尿発症に関与していることを明らかにすることができた。
環境と遺伝子の相互作用が人格形成に与える影響

767例の健常人において、Monoamine oxidase A遺伝多型は新奇性追求に有意な主効果を与え、報酬依存における遺伝型と母親からの愛情要素の交互作用は報酬依存に有意な影響を与えていた。また、590例の健常人において、serotonin transporter遺伝形と母親からの過保護要素の交互作用が報酬依存に有意な影響を与えていた。現在これらの結果の公表の準備中である。また、本研究の一環として行った研究において、養育環境、対人関係過敏性、社交性ー自律性、認知・態度の歪みの関係を包括的に検討した。これらの結果を計5編の論文にて公表した。「環境と遺伝子の相互作用が人格形成に与える影響」平成24年度は研究計画に基づき対象の募集を行った。具体的には、山形大学の学生および関連病院のスタッフより研究参加について文書で同意を得られ精神的・身体的に健康な男女約1,000例を募集した。精神疾患の有無のスクリーニングをStructured Clinical Interview for DSM-IVを用いて行った。TCIを用いて人格特徴の評価を行い、PBIを用いて両親から受けた養育態度を評価した。また、採血を行った後、QIAamp Blood Kit(Qiagen、Japan)を用いてDNAを抽出し、-20°Cで冷凍保存した。平成25年度も引き続き対象の募集を行っていく予定である。また、平成24年度には得られた結果を解析し計3編の英語論文にて公表した。「環境と遺伝子の相互作用が人格形成に与える影響」本研究は、人格形成における遺伝的要因と養育環境の相互・相関作用を検討するため、健常日本人約1,000例を対象に、人格と幼少時期に受けた養育態度をそれぞれTemperament and Character Inventory(TCI)、Parental Bonding Instrument(PBI)を用いて評価し、神経伝達物質遺伝形をPCR法を用いて同定する。得られた結果より、人格形成における遺伝的要因と養育環境の相互・相関作用を検討することを目的としている。平成25年度は研究計画に基づき対象の募集、人格・養育環境の評価、DNA抽出、遺伝多形の同定、統計解析を行った。その結果、767例の健常日本人において、Monoamine oxidase A遺伝多型は新奇性追求に有意な主効果を与え、報酬依存における遺伝型と母親からの愛情要素の交互作用は報酬依存に有意な影響を与えていた。平成26年3月これらの結果の公表の準備中である。また、本研究の一環として行った研究において、養育環境、対人関係過敏性、社交性ー自律性、認知・態度の歪みの関係を包括的に検討し、これらの結果を計3編の論文と2回の講演会にて公表した。「環境と遺伝子の相互作用が人格形成に与える影響」本研究は、人格形成における遺伝的要因と養育環境の相互・相関作用を検討するため、健常日本人約1,000例を対象に、人格と幼少時期に受けた養育態度をそれぞれTemperament and Character Inventory(TCI)、Parental Bonding Instrument(PBI)を用いて評価し、monoamine oxidase A遺伝形とserotonin transporter遺伝形を、PCR法を用いて同定する。平成23年度は研究計画に基づき対象の募集を行った。平成24年度も引き続き対象の募集を行っていく予定である。本研究において統計学的に必要な症例数は約600例以上であるため、600例を最低募集人数としていた。平成25年3月時点で対象数は850例と研究計画に記載した以上の対象数が集まっており、当初の計画以上に進展していると判断した。平成24年3月時点で対象数は767例に達しており、研究計画に記載した以上の対象数が集まっており、当初の計画以上に進展していると判断した。研究計画に従って、平成25年度も平成24年度に引き続いて対象の募集、人格特徴と養育環境の評価、DNAの抽出を行う。また、学会に参加し資料収集・情報交換を行う予定である。

研究計画に従って、平成24年度も平成23年度に引き続いて対象の募集、人格特徴と養育環境の評価、DNAの抽出を行う。また、学会に参加し資料収集・情報交換を行う予定である。該当なし。本研究は、多人数の対象者の血液からDNAを抽出するため、採血物品(採血針、採血管)、DNA抽出用試薬等の消耗品を必要とする。また、人格特徴全般と養育環境をそれぞれTCI、PBIで評価するための複写の経費や、文献などの資料収集のための経費が必要である。平成24年度には学会に参加し、資料収集、情報交換を行う予定である。従って、平成24年度は研究費をこれらの目的に使用する予定である。
種形成の分子機構の総括

特定領域研究「種形成の分子機構」は「生物の多様性が如何にして獲得されたのか?」という生物学における最も大きな問題を分子レベルで解き明かしていく事を目標としてきた。この問題は進化論が発表されて以来、多くの研究者が興味を持ち続けてきたテーマでもあるが、実際の研究方法を見出すことにおいて困難を極めていた。そこで我々は植物から昆虫、脊椎動物など様々な生物種を用い、統合的な視点から種の分化という問題に取り組んできた。この研究領域は平成19年度には終了していたが、その研究成果の取りまとめのために、本年度も期間を延長して研究を実施した次第である。本年度において、我々はこれまでに研究を続けてきたヴィクトリア湖シクリッド研究に関して次その生態調査で集めた膨大なシクリッドの生体情報を体系的にまとめあげ、「ヴィクトリア湖南部のシクリッド-種形成の現場]としてカラー図版を出版した。この図版は生きた状態のシクリッドカラー写真が1000枚以上掲載され、総ページ数が250を超えており次可能な限りの情報を組み込んである。この図版はシクリッド研究者だけでなく多くの進化生物学者にとって重要な意味合いをもつだろう。また、我々の視覚研究の内容が2008年のNature誌に掲載され、さらには、News and Viewsにも紹介されるなど、本特定領域研究で実施してきたこれまでの研究を世界に向けて発信することができたのではないかと考えている。特定領域研究「種形成の分子機構」総括班は本特定領域内の活性化を図る目的で平成15年1月31日に東京工業大学すずかけ台キャンパスにて、第1回班会議を開催した。評価委員・計画研究代表者・分担者および各研究室に所属する大学院生、合計で約40名の参加があった。研究代表者および分担者から研究の進行状況についての報告があり、活発な議論がなされた。まず、本特定領域および計画研究A01代表者・岡田典弘(東工大教授)から本特定設立の経緯の説明がなされ、続いてカワスズメ科魚類を用いた研究の進展の報告がされた。シクリッドの系統内での色覚に関する遺伝子が多様化しており、種の形成時に大きく関与していることが示唆されており、現在実験的証明を進めている。また、シクリッドの網羅的な遺伝子情報の解析の進展について報告された。計画研究A02代表者・堀道雄(京大教授)らは、生物の持つ左右性が高等生物全体に広く存在し生物の多様化に関与している可能性を報告し、その多様化の機構を分子メカニズムの立場で解明していく取り組みについて報告した。計画研究A03代表者・小熊譲(筑波大教授)はショウジョウバエの性的隔離に関与する「求愛歌」認識に関する遺伝子のマッピングの進行状況の報告を行った。A04代表者・石田直理雄(産総研グループ長)からはショウジョウバエの生殖的隔離に影響を及ぼしている時計遺伝子の機能解析の進展の報告があった。計画研究A05代表者・長谷部光泰(基生研教授)からはシロイヌナズナ人工4倍体を作成し形態観察から、倍数化による巨大化は細胞数の増加より細胞サイズの増大で引き起こされているという結果、及びマイクロアレイ解析でい<つかの巨大化原因遺伝子候補を見つけた成果の報告があった。計画研究A06代表者荻原保成(横浜市大助教授)からは、パンコムギの葉緑体DNAの全塩基配列を決定し、葉緑体ゲノム全体をイネ科のコムギ・イネ・トウモロコシで比較して、葉緑体ゲノムの進化の様相を明らかにしたこと、さらに葉録体ゲノムのSSRを分子進化の指標にした、との報告があった。特定領域研究「種形成の分子機構」総括班は本特定領域内の活性化を図る目的で平成16年2月2日に東京工業大学すずかけ台キャンパスにて第2回班会議を開催した。始めに領域代表より平成16年度の計画研究についての説明があり、「種の形成」を論じる上で集団遺伝学が不可欠であることから、九州大学舘田教授を代表者とする計画班を新設することの説明があった。続いて研究代表者および分担者から研究の進行状況についての報告があり、活発な議論がなされた。計画研究A01代表者・岡田典弘(東工大教授)からカワスズメ科魚類を用いた研究の進展の報告がされた。シクリッドの種の形成時に大きく関与していることが示唆されている色覚関連遺伝子の機能解析の結果が報告され、また、シクリッドの顎部形態多様化に関わる遺伝子解析の進展について報告された。計画研究A02代表者・堀道雄(京大教授)らは、生物の持つ左右性に関わる遺伝子のスクリーニングの進展に関してした。計画研究A03代表者・小熊譲(筑波大教授)はショウジョウバエの性的隔離に関与する「求愛歌」認識に関する遺伝子のマッピングの進行状況及びアナナスショウジョウバエのゲノムプロジェクトに関しての紹介をした。A04代表者・石田直理雄(産総研グループ長)からはショウジョウバエの生殖的隔離に影響を及ぼしている時計遺伝子に関して、マイクロアレイを用いた解析に関する報告があった。計画研究A05代表者・長谷部光泰(基生研教授)からはシロイヌナズナの生殖的隔離にかかわる花粉管ガイダンスのための受容体単離の進行状況の報告がなされた。計画研究A06

代表者荻原保成(横浜市大助教授)からは、パンコムギの種形成の要因となる異質倍数体における遺伝子プロファイリングに関する報告があり、染色体ごとの遺伝子発現の違いの検出法の紹介があった。また、総括班事務局より平成15年9月に行った国際シンポジウムの成果報告及び平成16年度開催のシンポジウムに関する連絡があった。特定領域研究「種形成の分子機構」総括班は本特定領域内の活性化を図る目的で平成17年2月3日に東京工業大学すずかけ台キャンパスにて第3回班会議を開催した。評価委員・計画研究代表者・分担者および各研究室に所属する大学院生、合計で約40名の参加があり、各班の代表者より以下のような研究報告があった。それぞれの発表の中で、活発な議論がなされた。A01代表者岡田典弘(東工大教授)では、本年度、日本人研究者としては初めてアフリカ・ビクトリア湖の現地調査を行った。また、シクリッドの生殖前隔離に関与していると思われる体表模様に関して、ゼブラフィッシュでの原因遺伝子の単離に成功したので、現在シクリッドでの遺伝子解析を進めている。A02代表者堀道雄(京大教授)らは、シクリッドの近縁種の共存機構の解析により、共存種の近縁度は低く色彩の類似は収斂であることを示した。計画研究A03代表者・小熊譲(筑波大教授)はアナナスショウジョウバエとパリドーサショウジョウバエの生殖前隔離には、300Hz付近のピークの相対的な大きさが、求愛歌の種特異性を決めているパラメータであることを明らかにした。A04代表者・石田直理雄(産総研グループ長)は交尾行動抑制に関る分子機構に間して卵形成遺伝子の関与を示した。A05代表者・長谷部光泰(基生研教授)らは、花粉特異的に発現するMADS-box遺伝子の3重遺伝子破壊体を作出したところ、花粉の湿潤耐性能力が顕著に劣っていることがわかり、種形成に重要な遺伝子であると示した。A06代表者荻原保成(京都府大教授)らは開花時期のずれに関与するCONSTANS (CO)のゲノム相同領域を解析を行った。A07代表者舘田英典(九州大教授)らは、自然淘汰や集団の地理的構造の役割を明らかにするために、ビクトリア湖シクリッドと東南アジア熱帯林のフタバガキ科樹木について集団遺伝学的解析を進めた。本年度の総括班では、当初予定していたシンポジウムの開催を変更して、シクリッド研究グループ(A01,A02,A07)のアフリカ調査の支援を行った。これは、ビクトリア湖の現地調査が、今後の研究の発展に重要な位置を占めるとの判断であり、これらの成果と合わせて、次年度のシンポジウムで本特定の研究成果を発表予定である。特定領域研究「種形成の分子機構」総括班は平成18年2月3日に東京工業大学すずかけ台キャンパスにて第4回班会議を開催した。評価委員・計画研究代表者・分担者および各研究室に所属する大学院生、合計で約40名の参加があり以下のような研究報告があった。A01代表者岡田典弘(東工大教授)では、本年度、2、3度目のアフリカ・ビクトリア湖の現地調査を行った。また、視覚遺伝子LWSとその周辺領域の配列をシクリッド種間で比較し、集団遺伝学的解析を行った。その結果、集団が分かれる際にLWSに分断選択圧が働いていたことが明らかとなった。
宇宙環境での切削現象の研究

高真空宇宙環境での切削加工を模擬するために、真空チャンバー内に設置する旋削形式の切削実験装置を試作した。試作装置の最低到達圧力は3×10^<-6>Torrであり、宇宙基地程度のLEOでの真空環境を模擬している。試作装置を用いて、アルミ合金A6061、純チタンJIS2種、SS41材の切削実験を行ったところ以下の結果が得られた。なお、切削速度は、アルミ合金で200および300m/min、純チタンで100m/min、SS41材で120m/minとし、送りは、いずれの場合も0.07mm/revとした。使用チップは、いずれの場合も、ノーズ半径0.4mmのJIS KIO相当超硬スローアウェイチップである。1.切削主分力切削主分力はバイト下部の圧電ロードセルにより検出した。アルミ合金の切削における切削主分力は、大気中と真空中でほぼ同程度である。純チタンは、大気中に比べて、真空中での切削主分力が1040%程度小さいが、SS41材では、真空中での切削主分力が逆に3070%大きい。2.表面あらさアルミ合金と純チタンの切削では、大気中と真空中での表面あらさ(Rmax)に大差はないが、チタンの場合、真空中での工具刃先形状の仕上面への転写が、大気中に比べて良好である。SS41材の場合は、真空中での表面あらさが大気中に比べて明らかに悪くなる。3.切削温度切削温度は刃先に埋めこんだ熱電対により検出した。アルミ合金と純チタンでは、大気中と真空中での切削温度に大差はないが、SS41材では、真空中の方が、大気中に比べて20%程度、切削温度が高くなる。