hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
骨髄間質細胞-未分化間葉系細胞-へのex vivo 遺伝子操作と細胞治療

筋ジストロフィーモデルマウス骨髄より間葉系細胞を採取・培養しヘルパーウイルス依存型アデノウイルスベクターを用いることで遺伝子操作が可能であることを示した。更に重要なことに、この細胞は遺伝子操作を加えずとも、筋ジストロフィーモデルマウスに移植を繰り返すことで明らかな治療効果をもたらすことを証明した。この細胞は骨格筋や骨再生に影響を与える多様な成長因子を発現しており、骨格筋の変性・壊死を軽減させるだけでなく、肥大させていることを見出した。本研究の目的は、根本治療法の無い致死的疾患であるDuchnne型筋ジストロフィーに対する根本治療法を開発することにある。その為に患者自身より採取した間葉系幹細胞を多数含む骨髄間質細胞をin vitroで増殖・骨格筋へ分化誘導をかけ、ヘルパーウイルス依存型アデノウイルスベクターHDAdvにて治療に有効と予想される遺伝子を多数導入し、静脈投与で自家移植し骨格筋機能を回復させるex vivo治療を目標に据えている。この治療方法を現実化する方法を本研究では動物実験にて探索する。1、平成20年度にて我々はマウス骨髄間質細胞より間葉系未分化幹細胞を分離できた。この細胞の表面マーカーをセル・ソーターで解析し、これまでに報告されたものとの同一性が確認された。またこれらの細胞にHDAdvを用いて遺伝子導入を行ったが、極めて効率良い感染と、非細胞毒性が確認され、今後の研究に安定した細胞採取と遺伝子操作が可能となった。2、これらの細胞を骨格筋への分化誘導に重要なMyoDを持つHDAdvも作製した。このベクターにはMyoDと同時にGFP、もしくはLacZ遺伝子が挿入され、これらのマーカー発現を見ることで、遺伝子操作された細胞が容易に同定出来るようになった。このベクターの開発は今後の研究を進めるにあたり、in vitroのみならず、移植後細胞の挙動を簡便かつ感度良くin vivoにて追跡可能とさせる重要な技術となった。3、本研究費にて購入した小動物麻酔装置を用いることで、安全かつ愛護的にマウス大腿骨より骨髄細胞を採取できるようになった。施術後もマウスは生存し、採取された骨髄間質細胞がin vitro培養された後のレシピエントになり、小動物を用いた自己移植実験が可能となり、免疫抑制剤未使用状況下での移植細胞の挙動を知ることが可能となった。本研究の目的は、根本治療法の無い致死的疾患であるDuchnne型筋ジストロフィー(DMD)に対する根本治療法を開発することにある。患者自身より採取した間葉系幹細胞を多数含む骨髄間質細胞をin vitroで増殖・骨格筋へ分化誘導をかけ、ヘルパーウイルス依存型アデノウイルスベクターHDAdvにて治療に有効と予想される遺伝子を多数導入し、静脈投与で自家移植し骨格筋機能を回復させるex vivo治療を目標に据えている。1、平成21年度にてDMDモデルマウス骨髄より間葉系未分化幹細胞培養を増殖させており、現在細胞表面マーカーを調べている。このベクターにはMyoDと同時にGFPが挿入され、これらのマーカー発現を見ることで、遺伝子操作された細胞が容易に同定出来るようになった。このベクターの開発は今後の研究を進めるにあたり、in vitroのみならず、移植後細胞の挙動を簡便かつ感度良くin vivoにて追跡可能とさせる重要な技術である。3、ヒト骨髄間質細胞を血液内科医師の協力の元採取、培養する許可を当院倫理委員会より得、既にヒト骨髄間質細胞を採取、培養することに成功している。研究計画にも述べたヒト骨髄間質細胞を用いた治療研究を22年度は展開できる状況である。1、平成21年度にてDMDモデルマウス骨髄より間葉系未分化幹細胞培養を増殖させており、細胞表面マーカーだけでなく、間葉系細胞に分化させ機能的他の性を示した。2、これらの細胞にGFP発現HDAdvを感染させ、効率良い遺伝子導入が可能であった。このマーカー発現を見ることで、遺伝子操作された細胞が容易に同定出来るようになった。3、1で採取・培養したマウス骨髄間質細胞をDMDモデルマウス腹腔内投与すると、運動機能や骨格変形が軽快するのみならず、著しい延命効果をもたらす驚くべき結果を得た。

この筋保護効果はこれまでに報告されていない骨髄間質細胞の全く新しい特性で、極めて安全な治療法になる可能性を示しており、今後更なる研究を要する。
細胞増殖因子からみた癌細胞と間質細胞との相互作用 -その分子機構-

HGFは正常組織では主に間質細胞によって産生・分泌されるが、種々のヒト悪性腫瘍(グリオーマ、肺小細胞癌、胃癌、大腸癌、食道癌など)ではHGF転写の多様性オートクリンループが存在し、癌細胞の遊走・浸潤促進に重要な役割を演ずることが示された。HGFのtwo-kringle variantに加えて、本年度ではHGF light chainのみをコードする新しいHGF異常転写産物が胃癌培養株HSC-39で発現していることが見いだされ、現在その機能について解析中である。またHGF誘導因子として、IL-1-alpha,IL-1-betaのみならず、PDGF,FGF(aFGF,bFGF)などの増殖因子も含まれることが明らかにされ、これらサイトカインと増殖因子がHGF/c-met系を介しての癌細胞-間質細胞相互作用を惹起させ、癌の悪性化に関与する可能性が示唆された。そして、本年度最も興味ある点は、HGF,EGF,PDGFなどの増殖因子によってチロシン・リン酸化されるp115の構造が明らかにされ、p115は増殖因子のシグナル伝達に普遍的な、そしてユニークな役割を果たす因子であることが示唆された。
新入消防職員の心理・脳科学的アセスメントの可能性について

惨事ストレスへの耐性に関するプロアクティブな予測を行うために、消防署に配属された新人消防職員を対象にして、1年の間隔をおいて、心理検査・神経心理学的検査・脳科学的な検査を継時的に行った。2回の検査を受けたのは、消防職員7名と対照群として男子大学生2名であった。各神経心理検査得点について,大学生と消防職員を比較するために,Mann-Whitney検定を行った結果,各神経心理学検査得点には有意な差はみられなかった。職場配属から検査実施までの間で,衝撃をうけた災害へ出動経験があった消防職員が存在したので,被災体験があった消防職員(N=4)と被災体験がなかった消防職員(N=3)の神経心理学的検査得点を比較するために,Mann-Whitney検定を行った。その結果,Tapping Span(逆)に有意差傾向がみられ(p=.057),被災体験があった消防職員は,被災体験がなかった消防職員よりも得点が低かった。Tapping Span(逆)以外の神経心理学的検査得点には,被災体験による有無により,有意な差はみられなかった。また、効率的な検査実施のために、タブレット方パソコンを使って、検査過程を自動化するソフトの開発も行った。なお、研究協力者のスケジュールの調整がつかず、平成23年5月に検査が延びたため、研究終了が延期された。惨事ストレスへの耐性に関する予測を行うために、新人の消防職員(対照群として男子大学生)に心理検査・神経心理学的検査・脳科学的な検査を継時的に行い、リアリティショックや惨事ストレスによる影響やこれらのストレスに対する耐性に関する検討を試みた。具体的な目的は以下の3点てあった。a)赴任まもない消防職員(以下新人消防職員)に年に1回ずつ継時的に、性格心理学的検査・神経心理学的検査・脳科学的検査(MRI)を行い、災害救援者の適正配置のために、どのような検査バッテリーが適切であるかを検証する。b)神経心理学・脳科学の立場から、災害救援者の惨事ストレス耐性を明らかにする。c)心的外傷と脳内部位(とくに海馬サイズ)の変化の関係を、事前事後測定によって確証する。本年度は継時的測定の第1回を実施した。筑波大学および昭和大学病院の研究倫理審査委員会で倫理審査を受けた後、消防関係者に研究協力を依頼した。その結果、新人消防職員7名、男子大学生2名の参加を得ることができた。研究協力者には、質問紙(デモグラフィック変数、(消防職員の場合には)消防学校での教育課程や校内での適応状態、外傷経験の有無と内容、IESRなど)、性格心理学的検査としてビッグファイヴ、神経心理学的検査として、Rey複雑図形(非言語性)、数唱およびタッピングスパン、PASAT(注意および遂行機能)、嗅覚検査を実施した。後日、脳科学的検査としてMRIを実施した。データを解析した結果、新人消防職員と男子大学生との間には、いずれの検査結果にも差が見られなかったが、消防職員における被災体験の有無については、1指標において有意傾向の差が認められた。
各種麻酔薬のサーカディアンリズムに与える影響(時計遺伝子レベルでの解析)

今回吸入麻酔薬のイソフルレンとベンゾジアゼピン系鎮静薬のトリアゾラムを用い、ラットとマウスにおける体内時計への影響を調べた。イソフルレンは各種時間帯で4時間もしくは8時間ラットに投与したが、行動リズムに位相変位を生じなかった。視交叉上核における位相の変化の有無を、分子レベルで検討するために、時計遺伝子mPer1の視交叉上核および大脳皮質での発現を麻酔中、麻酔後に検討した。マウスにおいては、投与終了後の視交叉上核(SCN)におけるmPer1 mRNA発現パターンに変動はなかったものの、投与中の発現量は上昇していた。このことはイソフルレンが位相変化は起こさないもののその発現機構に何らかの影響を与えることが考えられる。麻酔薬による低血圧や呼吸抑制などの影響を考え今回は1.5MACを用いたが、今後麻酔濃度や、投与時間を変えて詳しく見て行く必要がある。また、我々はトリアゾラムを腹腔内に投与して、行動の変化、Per1の発現を検討した。トリアゾラムはハムスターでは行動リズムの位相変位を起こすことが報告されているが、今回ラットを用い同様の実験を行ったところ、同じ結果は得られなかった。またトリアゾラム、PTZともにマウスにてSCNでのmPer1 mRNAの発現量には影響を与えなかったが、大脳皮質において、mPer1 mRNAの発現量の多い時間帯ZT16に投与した時には、トリアゾラム投与群では発現量の減少、PTZ投与群では上昇がみられた。大脳皮質におけるPer1にもサーカディアンリズムが存在する事が知られており、このような発現量の変化によって、大脳皮質のリズムに乱れが生じる可能性もある。このような大脳皮質でのサーカデイアンリズムの狂いが、老齢者においては、睡眠、覚醒のリズムを狂わせる可能性もあり今後老齢動物を用いた検討も予定している。この2年間の結果より、イソフルレンとトリアゾラムは視交叉上核および大脳皮質を含む視交叉上核以外の神経組織においてmPer1 mRNA発現量に影響を与えることが示唆された。今後、リズムの維持機構やmPer1以外の時計遺伝子への影響、そして他の麻酔、鎮静薬の効果などさらに実験を進めて行きたいと考えている。1吸入麻酔薬投与がラットの行動リズムに与える影響ラットを明期12時間、暗期12時間の明暗条件下で2週間飼育した後に恒暗条件下に移し、7-10日間後にイソフルレンを恒暗条件下で4時間もしくは8時間投与し、行動リズムを観察した。麻酔は25cmX3の透明な箱を用い、そこに50%酸素31と1.5MACのイソフルレンを加湿加温して吹き込んで行った。麻酔投与はCT(circadian time)4-12、CT16-24、CT2-6、CT6-10、CT14-18、CT18-22に行われ、その間、体温、呼吸ガス、血圧、心拍などをモニターした。どの時間帯においても、麻酔前後で有意な位相変位はみられなかった。2時計遺伝子Perl mRNA発現に対する吸入麻酔薬の影響

マウスを12時間ごとの明暗条件下で飼育した後に1と同様の方法でZT(zeitgeber time)4-12に麻酔を行い2時間置きにマウスを2匹ずつ潅流固定して脳の凍結切片を作成し、perl mRNAに相補的なRIで標識したアンチセンスプローブにてin situハイブリダイゼーションを行い、視交叉上核におけるmRNA発現量をMCID画像システムを用いて定量した。麻酔中のZT6、8、10、12においてperl mRNA量は上昇していた。しかし、麻酔翌日のperl mRNAでは発現量のピークは低下していたものの、コントロールのマウスと同じZT4とZT6にピークが存在し、体内時計の位相には大きな変位が生じていないと考えられた。さらに、ラットにおいて同じ時間帯に麻酔をかけ、麻酔中のZT8とZT12でラットを潅流固定し、同様に吸入麻酔薬の影響を見た。この場合にはコントロールと比べて、麻酔群では視交叉上核の腹外側部においてperl mRNA量の低下がみとめられた。今後この実験結果の検討を行うとともに、他の麻酔薬の効果を調べていく予定である。ベンゾジアゼピンはGABA_A受容体に結合して、GABAの作用を強めることにより、脳の高次の機能を抑制する。またほぼ100%の視交叉上核の細胞がGABAを合成しており、GABAがリズムを維持するのに重要であると考えられている。ベンゾジアゼピン系鎮静薬トリアゾラムは以前よりハムスターにて行動リズムの位相変位を起こすことが知られており、視交叉上核におけるmPer1 mRNAの発現の日内変動に影響を与えることが予想される。今回脳の神経活動を低下させるものとしてトリアゾラムを、上昇させるものとしてGABA_A受容体拮抗薬ペンチレンテトラゾール(以下PTZ)を用い、脳の神経活動と、脳の各部位におけるmPer1 mRNA発現パターン、体内時計の関係を調べた。1トリアゾラムがラットの行動リズムに与える影響ラットを12時間ごとの明暗条件下で飼育した後に11時間明暗の切り替えのタイミングを後ろに遅らせてJet lag状態をつくり出し、翌日にトリアゾラム75mg/kgを腹腔内投与してその後引き続き行動リズムを観察し続けた。ハムスターではトリアゾラムは新しい明暗条件への同調を促進することが知られているが、今回ラットではコントロール群と同じく56日を要した。2トリアゾラム、PTZのmPer1 mRNA発現に与える影響マウスを12時間ごとの明暗条件下で飼育した後にZT(zeitgeber time)4とZT 16にトリアゾラム75mg/kg、PTZ 50mg/kg腹腔内投与し、その10分後、30分後、60分後、120分後に潅流固定して脳の凍結切片を作成し、mPer1 mRNAに相補的なRIで標識したアンチセンスプローブにてin situハイブリダイゼーションを行い、視衣叉上核や大脳におけるmRNA発現量をMCID画像システムを用いて定量した。視交叉上核におけるmRNA発現量にはコントロール群、トリアゾラム群、PTZ群で差はなかったが、大脳において、ZT4で、トリアゾラム群では低下、PTZ群では上昇がみられた。
脂質の量と質が制御するオルガネラ恒常性の分子機構の解明

本研究では、脂質の量や質の制御の場を臓器や細胞全体からオルガネラレベルに移し、オルガネラ脂質環境の恒常性維持機構を理解し、その破綻による“オルガネラリポトキシシティ"の分子メカニズムを解明し、肥満、脂肪肝、動脈硬化、がんなど、様々な病態の鍵となる脂質と責任因子を特定し、栄養制御や肥満病態の生体に還元して臨床応用の標的を定めることを目的とする。膜結合型転写因子であり、脂質代謝を制御するSREBPおよびCREBHの活性化(切断)機構におよぼす栄養状態の変化の影響を解析し、これら転写因子の活性化が栄養状態によりダイナミックに変化すること、またSREBP-CREBH間のタンパク相互作用があることを明らかにした。今後、各転写因子に結合する活性制御タンパクを同定し、栄養状態、特にオルガネラ脂質の変化に呼応するタンパク複合体形成モデルを明らかにする。また、転写因子SREBP-1の小胞体における活性化(切断)を制御する新規プロテアーゼを見出した。このプロテアーゼによるSREBP-1の活性化は脂肪酸の種類に大きく影響を受けることが明らかとなり、小胞体膜脂質環境がこの新規プロテアーゼの活性、構造、SREBP-1との相互作用におよぼす影響を今後明らかにする。一方、脂肪酸伸長酵素Elovl6の活性変化は細胞の脂肪酸組成を変化させ、ミトコンドリア機能に影響をおよぼすことが明らかとなった。Elovl6欠損マウス由来の褐色脂肪細胞、マウス線維芽細胞、ES細胞などではミトコンドリアの形態異常、complex I, II, VIの減少、エネルギー代謝の障害、細胞増殖・分化の異常が認められた。今後、リピドミクス解析により、ミトコンドリア機能を制御する脂質分子種とそのメカニズムを解析する。栄養状態による膜結合型転写因子の活性変化と脂質環境との関連、および細胞内脂肪酸組成と特定のオルガネラとの機能の関連を明らかにしているため。膜結合型転写因子SREBPおよびCREBHのに結合する活性制御タンパクを同定し、栄養状態、特にオルガネラ脂質の変化に呼応するタンパク複合体形成モデルを明らかにする。また、転写因子SREBP-1の小胞体における活性化(切断)を制御する新規プロテアーゼの活性、構造、SREBP-1との相互作用におよぼす脂肪酸の種類の影響を培養細胞およびリポソームを使って解析する。また、脂肪酸伸長酵素Elovl6の活性を変化させた褐色脂肪細胞、マウス線維芽細胞、ES細胞に対してリピドミクス解析を実施し、特にミトコンドリア機能を制御する脂質分子種とその分子メカニズムを解析する。
メーターモデュールと尺モデュールによる住宅の生産性に関する実証的研究

木造軸組構法の戸建小住宅におけるメーターモデュールと尺モデュールによる生産性の検討を行い、次の結論を得た。1.施工費:住宅A(910モデュール)、住宅B(Aをメーターモデュールで単純拡大)について、材料費(一部、材工一括)を比較した結果、今回の比較条件では、m^2単価ではA>Bで数%の開きとなった。モデュールが影響する主な材料は、木工事部分(軸組木材、合板、石膏ボード)、浴室ユニット、既成建具、既成部材(和室天井板、廻縁キット、外装サイディングなど)であり、部材ロスによりコストアップの一因となる。しかし、造作工事(材工一括で計上)の個所数はAとBで大差なく、労務費は同等である。すなわち、一般的に材料費より労務費の割合が大きいことから、m^2単価でみればコストダウンとなったと言える。2.設計:メーターモデュールにすると平面規模が拡大しやすく、また小規模な住宅ほど平面計画の自由度が狭まる。その場合、便所や廊下幅員のみメートル幅とし、その他の部分では6帖を2.5m×3.5mとするなど、間崩れが一般的に行なわれている。すなわち、メーターモデュールの実際は、50cmや25cmモデュールであることが多い。3.建材・部品:メーターモデュール専用の建材や部品が生産されているが、現時点では割高の場合があるため、適応しやすい関西間用が頻繁に利用されている。以上の1.3.については、計画時の論題をおおむね遂行できた。ただし、1.で予定していた住宅C(Aと同規模類似間のメーターモデュール)との比較について、平面の設定次第で木拾いなどが変わり不安定な結果が生じたため、結論に至らなかった。そのため、再度検討しなおす予定である。また、メーターモデュールによる影響が生じる部位や案件は拾い出せたが、コストダウン成立の要件や対策について明示する段階に至らなかったため、これを継続して整理する予定である。
肺動脈性肺高血圧症モデルマウスにおける内皮間葉転換の肺血管リモデリングへの作用

前年度までの検討にてwild typeマウスを用いて、内皮間葉転換(EndMT)の解析を行ってきた。同マウスでは内皮形質が残存したEndMT(partial EndMT)をSMA陽性の内皮細胞(SMA+/CD31+CD45-)として検出し、肺動脈性肺高血圧症(PAH)モデルであるSugen/Hypoxiaマウスで同細胞群が増加することを示した。また、この細胞は増殖能が亢進し、幹前駆細胞マーカーであるCD34やCD133の発現が亢進していることから、内皮前駆細胞(EPCs)様の特徴を有していたが、細胞の起源は骨髄由来ではなく組織常在性の細胞であった。一方、内皮形質を消失し、完全に間葉系細胞に転換した細胞(complete EndMT)については、細胞の追跡が不可能であるため、内皮細胞マーカーであるTie-2陽性細胞にGFPが発現した遺伝子改変マウスを用いて細胞追跡を行った。Sugen/HypoxiaマウスでもHypoxia単独マウスでもcomplete EndMTは認められ、両モデルにおける内膜病変の有無を考慮すると、前述のpartial EndMTが叢状病変を含めた内膜病変形成に関与することが示唆された。今後はこれらの細胞の機能解析を追加し、病態解明を目指す。研究実績の概要で記載した通り、肺高血圧モデルマウスを用いてフローサイトメトリーを中心とした解析を進めている。モデル間で肺血管を構成する細胞、特に内皮細胞の細胞動態に差異が認められ、病態に関与する因子であると想定している。昨年度、新たに遺伝子改変マウスを導入し、細胞追跡の解析を追加できているため、おおむね予定通りの進捗状況と判断している。現在までの解析結果として、肺血管内皮細胞の増殖能、発現マーカー、形質変化に注目して2つの動物モデル間の特徴が判明した。この結果を踏まえ、傷害を受けた内皮細胞のサイトカイン産生、肺組織全体の炎症反応等を追加解析すると共に、活性化された内皮細胞の機能をin vitroでも検討していく。肺動脈性肺高血圧症(PAH)の病態には、過剰な肺血管収縮に加え、肺血管リモデリングとして線維化やangiogenesisが関与するとされるが、詳細なメカニズムは不明である。肺血管構成細胞の変化として、内皮間葉転換(EndMT)を含めた細胞形質の変化が挙げられるため、低酸素暴露マウスやSugen5416+低酸素暴露マウスといった肺高血圧モデルマウスを用いて解析を行った。上記モデルマウスの肺を摘出し、細胞分散後にフローサイトメトリーを行った。CD31+CD45-の細胞を内皮細胞とし、同細胞群の内で平滑筋細胞マーカーであるSMAも陽性となる細胞をEndMT細胞とした。2種類のモデルマウス間でEndMT細胞の検出割合は異なり、よりヒトPAHの病態に近いとされるSugen+低酸素マウスでEndMTが高い割合で維持されていた。これらのEndMT細胞はBrdU取り込みによる細胞増殖能評価にて高い増殖能を示し、CD34やCD133等の幹前駆細胞マーカーの発現割合が高かった。また、骨髄細胞にGFPが発現したキメラマウスを作成し、フローサイトメトリーにて同細胞群の由来を解析したところ、EndMT細胞は骨髄由来ではなく、組織常在性の細胞であることを同定した。以上の結果より、組織常在性の内皮前駆細胞(EPCs)様の細胞がEndMTを起こし形質変化させることで肺血管のリモデリングが進行する可能性が示唆された。フローサイトメトリーにて解析した上記結果は、組織の免疫染色でも同様の結果が得られており、EndMT細胞の局在は末梢肺動脈から毛細血管に有意であった。実験手技については、これまで行ってきた研究手技を中心に行っているため、条件検討等による時間の消費はなかった。当研究室では臨床・基礎実験ともに肺高血圧症の研究を行ってきたため、研究方針に関しても適宜相談できる環境となっている。肺血管構成細胞の反応として、内皮間葉転換(EndMT)を含めた細胞形質の変化が挙げられるため、低酸素曝露マウスやSugen5416+低酸素曝露マウス等の肺高血圧症モデルマウスを用いて解析を行った。これらのマウスの肺を摘出し、細胞分散後にフローサイトメトリーを行った。CD31+CD45-の細胞を内皮細胞と定義し、同細胞群の内で平滑筋細胞マーカーであるSMAも陽性となる細胞をEndMT細胞とした。2種類のモデルマウス間で内皮細胞増殖のタイミングや程度は同様であったが、EndMT細胞の検出はSugen+低酸素モデルで高率であった。また、内皮細胞におけるTnf-αやIL-10といった炎症性サイトカインの発現は同モデルマウスで有意に高く、ヒトのPAHに現状最も近いとされるSugen+低酸素モデルの内膜病変形成に関与することが示唆された。さらにEndMT細胞はCD34やCD133等の内皮前駆細胞マーカーが高発現することを既に報告しているが、前述のTnf-αの発現は90%以上で陽性であり、BrdUの取り込み率で評価した細胞増殖能はnon-EndMT細胞の約3倍まで上昇していた。一方、in vitroでの検討で、Sugen+低酸素刺激は内皮細胞の血管新生能を抑制し、内皮細胞の機能不全を示唆した。

これらの結果よりEndMTは内皮前駆細胞様の形質を獲得させるが、一部機能不全を伴うことで異常な内膜病変を形成する可能性が考えられた。当初計画していたモデルマウス間での細胞動態の比較はフローサイトメトリーにて解析し、発現マーカーやサイトカイン産生の評価を進めてきた。in vitroでの血管新生能解析も順調に施行できており、H29年度の後半は遺伝子改変マウスの準備も行えたことから、予定通りの進捗状況と言える。実験手技は当研究室内でこれまで行われてきたものであるため、条件検討での時間の消費は最小限であった。当研究室内の他グループでも肺血管内皮細胞・肺高血圧に注目した研究を行っているため、グループ間での検討でも適宜修正可能である。前年度までの検討にてwild typeマウスを用いて、内皮間葉転換(EndMT)の解析を行ってきた。同マウスでは内皮形質が残存したEndMT(partial EndMT)をSMA陽性の内皮細胞(SMA+/CD31+CD45-)として検出し、肺動脈性肺高血圧症(PAH)モデルであるSugen/Hypoxiaマウスで同細胞群が増加することを示した。また、この細胞は増殖能が亢進し、幹前駆細胞マーカーであるCD34やCD133の発現が亢進していることから、内皮前駆細胞(EPCs)様の特徴を有していたが、細胞の起源は骨髄由来ではなく組織常在性の細胞であった。一方、内皮形質を消失し、完全に間葉系細胞に転換した細胞(complete EndMT)については、細胞の追跡が不可能であるため、内皮細胞マーカーであるTie-2陽性細胞にGFPが発現した遺伝子改変マウスを用いて細胞追跡を行った。Sugen/HypoxiaマウスでもHypoxia単独マウスでもcomplete EndMTは認められ、両モデルにおける内膜病変の有無を考慮すると、前述のpartial EndMTが叢状病変を含めた内膜病変形成に関与することが示唆された。今後はこれらの細胞の機能解析を追加し、病態解明を目指す。研究実績の概要で記載した通り、肺高血圧モデルマウスを用いてフローサイトメトリーを中心とした解析を進めている。モデル間で肺血管を構成する細胞、特に内皮細胞の細胞動態に差異が認められ、病態に関与する因子であると想定している。昨年度、新たに遺伝子改変マウスを導入し、細胞追跡の解析を追加できているため、おおむね予定通りの進捗状況と判断している。肺高血圧モデルマウスにおいて、内皮間葉転換(EndMT)の存在を確認し、フローサイトメトリーによる定量化を施行してきた。一部の細胞表面マーカー等を解析することで幹前駆細胞様の特徴をもつことが想定されたが、その機能は不明であるため、酸化ストレスやアポトーシスを含めた細胞死等の解析・他の肺血管構成細胞への作用解析を進める予定である。また、トランスジェニックマウスを用いて、EndMT細胞が最終的に間葉系細胞に変化するのか内皮細胞へ戻るのかを検討する予定である。肺高血圧モデルマウスを用いて、内皮間葉転換(EndMT)の定量化、局在を検討してきたが、wild typeマウスの検討では内皮細胞マーカーと間葉系細胞マーカーが共陽性となる細胞の検出のみ可能であった。完全に間葉系細胞に転換した細胞の定量化も行うために、内皮細胞マーカーであるTie-2陽性細胞にGFPが発現したトランスジェニックマウスを用い、形質転換した細胞の追跡を行う予定である。これらの細胞群はGFPの発現から単離することも可能であり、機能解析も追加する。
サイトカインによる細胞の増殖,分化の制御とシグナル伝達

IL-3及びGM-CSFレセプターは各々に固有なα鎖と共通のβ鎖から構成される。高親和性αβレセプターは血球細胞だけではなく線維芽細胞でも増殖シグナルを伝達しうるので血球細胞に特異的な分子は必ずしも必須ではない。またα鎖細胞外ドメインとβ鎖細胞内ドメインからなるキメラレセプターはβ鎖と複合体を形成しシグナルを伝達しうる。即ちβ鎖の細胞内ドメインが多量体を形成し、シグナル伝達能を担うものでありα鎖細胞内ドメインの役割はβ鎖細胞内ドメインの多量体化を促進する。またc-fosやc-jun遺伝子発現とc-myc遺伝子発現及びDNA複製に必要なレセプターβ鎖の細胞内領域が区別され,その細胞内シグナル伝達経路は異なる。前者はShc,Ras,Raf,MAPKが関与しハービマイシンにより阻害されないが後者はチロシンキナーゼ阻害剤に感受性である。PMAとCa^<2+>シグナルに応答し,ヘルパーT細胞におけるGM-CSF発現を制御するNF-CLEOは,その構成成分としてIL-2発現に関与するNF-ATを含む。ヒトJurkat細胞からこの因子を精製し、アミノ酸配列を部分決定しそれに対応する3種のcDNAクローンを単離した。またIL-3プロモーターに結合する新たなZn^<2+>フインガー転写因子cDNAをクローニングした。Th2サブセット特異的なIL-4とIL-5の発現はcAMPによって促進され、Th1特異的なIL-2は反対に抑制される。IL-4とIL-5プロモーターの活性化に関与するNF-PとNF-IL-5Pを同定し、これらがやはりNF-AT様の性質を持つことを示した。NF-IL-5PはcAMPシグナルにより活性化されるがIL-2のNF-ATは逆に抑制される。これらの知見から各種のNF-AT様モチーフを通して作用する種々のNF-AT様因子が各サイトカインに特有な発現パターンに寄与する。
社会的構成理論に基づくボランティア現象の分析

本研究は、阪神・淡路大震災以後、急速に社会的認知を獲得しつつある「ボランティア」について、それがいかなる意味を帯びた営みとして社会的に構成され、定着しつつあるのかについて、社会的構成主義、社会的表象理論の立場から検討したものである。具体的には、第1に、近年、社会心理学の領域において注目を集めている、社会的構成主義、および、社会的表象理論の精緻化を試みた。その結果、森羅万象の素朴な実在性を徹底して懐疑する「強い構成主義」の立場に立つ必要性を明らかにした(杉万・矢守・渥美,1997;Wagner&Yamori,1999)。第2に、近年のボランティア現象の実相を把握するための実証的な研究を実施した。具体的には、阪神・淡路大震災時に活動した多くのボランティアの活動記録を収集、かつ、その一部については当事者に対してインタビュー調査を実施した(八ッ塚・矢守,1997)。その結果、(1)日本における「ボランティア現象」は、巨大災害という形で日常性を解体され、その再構成を迫られた一般民衆、および、専門家が従事した現実構成作業の一環であったこと、(2)その際、「ボランティア」は、一方では、---例えば、被災した人々の物質的損害以外の領域を「心のケア」という言葉で標的にするように---震災前には社会的に表象化(言語化)されていなかった領域を実体化する営みと連動しているが、他方では、---例えば、一部の工学者が、「ボランティア」というコンテキストに仮託する形で、広く民衆と一体となった災害復旧計画事業に従事したように---現象の全体性に回帰し、従来の表象化(言語化)を還元する営みとも親近性をもっていること、すなわち、世界の社会的構成という観点に立ったとき、「ボランティア現象」とは相反する2つの運動の融合物であったこと---これらのことを明らかにした(矢守,1999)。本研究は、阪神・淡路大震災以後、急速に社会的認知を獲得しつつある「ボランティア」について、それがいかなる意味を帯びた営みとして社会的に構成され、日本社会に定着しつつあるのかについて、社会的構成主義、社会的表象理論の立場から検討しようとするものである。本年度は、第1に、社会的構成主義、社会的表象理論に関する理論的・方法論的検討を行なった。具体的には、社会的構成主義については、その代表的論者であるK.Gergenの著書「Toward Translation in Social Knowledge」について検討し、その成果の一部を訳書「もう一つの社会心理学:社会行動学の転換へ向けて」(杉万・矢守・渥美,1997)として刊行した。さらに、社会的表象理論については、主唱者の一人であるW.Wagnerが主宰するゼミナールに研究代表者自らが参加し、最近の理論的動向(とくに、社会的表象理論と従来型の認知社会心理学との接点と差異)について検討した。第2に、近年のボランティア現象の実相を把握するための基礎的な調査を実施した。具体的には、(1)阪神大震災時における既成組織(一般企業、半官半民の団体、大手NGO団体など)のボランティア活動に関する聞き取り調査を行ない、日本社会におけるボランティアのあり方を、5つのタイプに類型化して整理した(八ッ塚・矢守,1997)。(2)各種のボランティア活動記録の網羅的整理・検討を通して、日本社会における「ボランティア」は、理念主導の欧米型の「volunteer」とは異なり、震災によって、(一時的に)崩壊した近代科学技術、近代的社会システムに対する信頼の回復・再生過程に現れた一種の社会的技術であることを指摘した(矢守,1998(印刷中))。その結果、(1)日本における「ボランティア現象」は、巨大災害という形で日常性を解体され、その再構成を迫られた一般民衆、および、専門家が従事した現実構成作業の一環であったこと、(2)その際、「ボランティア」は、一方では、---例えば、被災した人々の物質的損害以外の領域を「心のケア」という言葉で標的にするように---震災前には社会的に表象化(言語化)されていなかった領域を実体化する営みと連動しているが、他方では、---例えば、一部の工学者が、「ボランティア」というコンテキストに仮託する形で、広く民衆と一体となった災害復旧計画事業に従事したように---現象の全体性に回帰し、従来の表象化(言語化)を還元する営みとも親近性をもっていること、すなわち、世界の社会的構成という観点に立ったとき、「ボランティア現象」とは相反する2つの運動の融合物であったこと---
オーキシンによる細胞周期制御の分子機構の解析

本研究では、植物ホルモンであるオーキシンが細胞周期制御因子の発現調節に果たす役割について検討した。その結果、細胞周期の中心的な制御因子であるサイクリン依存性キナーゼ(CDK)のうち、G2/M期の進行に重要な役割を持つCDKB2の蓄積が、オーキシンシグナルの下流において、転写レベルでの制御に加え、タンパク質分解および安定性の制御によって調節される可能性を見出した。植物の地下部を構成する根系の形成は土壌中の栄養源の分布や生育温度の変化など、環境によって大きく影響を受ける。根の成長は主に根端分裂組織における細胞増殖の制御に依存している。今年度は、根の形成および伸長の過程における細胞増殖の制御機構を明らかにすることを目的として、シロイヌナズナの根の成長過程における細胞周期制御因子の解析を行った。シロイヌナズナの細胞周期を制御する中心的な因子として、A型およびB型のサイクリン依存性キナーゼ(CDKAおよびCDKB)が知られている。CDKBはG2/M期の移行を制御していると考えられ、さらにB1型(CDKB1)とB2型(CDKB2)に分類される。これらCDKそれぞれの転写及びタンパク質レベルの発現をモニターするレポーターラインを用い、低温や高塩濃度条件といった根の伸長が抑制されるようなストレス条件下における発現の変化を観察した。その結果、根の伸長の抑制に伴ってCDKB2タンパク質の蓄積が顕著に抑制されることが見出された。この際CDKAやCDKB1の発現レベルはほとんど変化せず、またCDKB2の転写レベルでの変化は少ないことから、CDKB2がストレス条件下においてタンパク質レベルで制御されていることが示唆された。また、このようなストレス条件におかれた植物体の根端ではDR5-GUSの発現が減少することから、オーキシンシグナルの競合阻害剤によりCDKB2のGUSレポーター系統を処理したところ、CDKB2が転写レベルよりも早いタイミングでタンパク質分解系により制御されていることが明らかとなった。これらの結果から、環境の変化に応答した根の伸長制御には、オーキシンによるCDKB2の制御が関与する可能性が示唆された。昨年度までに、環境ストレス条件下ではCDKAやCDKB1の発現レベルはほとんど変化しないが、CDKB2についてはタンパク質レベルの分解制御を受けていることを示唆する結果を得た。今年度はCDKB2のタンパク質レベルの安定性を分解アッセイによって調べた。根の粗抽出液を大腸菌で発現させたGST-CDKB2タンパク質と共にインキュベートしたところ、早期に分解されることがわかった。この分解はMG132処理により阻害され、またGSTタンパク質そのものは分解されないことから、CDKB2はプロテアソーム依存的な分解制御を受け、またそれを促進する何らかの因子が根に存在することが示唆された。また、これまでに根端分裂組織においては、オーキシンシグナルの抑制によりCDKB2タンパク質がタンパク質レベルでの分解制御を受けることを示唆する結果を得ている。そこで、オーキシンシグナルの下流で働くPLTがCDKB2の発現制御に関わっているかどうか検討した。その結果、PLT2の異所的な発現に応じてCDKB2の発現領域が顕著に拡大することがわかった。以上の結果より、CDKB2の蓄積量の調節には、オーキシン-PLT経路を介した転写レベルの発現制御とタンパク質レベルの分解制御が関わることが示唆された。これまでに、環境ストレス条件下ではCDKAやCDKB1の発現レベルはほとんど変化しないが、CDKB2についてはタンパク質レベルの分解制御を受けていること、また根端分裂組織におけるCDKB2の蓄積量の調節には、オーキシン-PLT経路を介した転写レベルの発現制御とタンパク質レベルの分解制御が関わることを明らかにしてきた。今年度は、オーキシンシグナルの抑制により、CDKB2と共にG2/M期進行の促進に働くサイクリン(CYC)B1およびCYCB2のタンパク質蓄積量も減少することを見出した。この現象にもプロテアソームによるタンパク質分解制御が関与する。これらの結果から、オーキシンシグナルの抑制により、複数の分裂制御因子のタンパク質分解が同時に促進されることで、細胞周期の進行が抑制される機構が存在することが示唆された。さらに、オーキシンシグナルがS期進行に及ぼす影響についても調べた。EdUの取り込み活性を指標として、S期にある細胞の可視化を行ったところ、オーキシンシグナルを抑制することにより、S期に入る細胞が減少することがわかった。

以上の結果から、オーキシンシグナルは、CDKB2に加え他の分裂期制御因子の安定性を制御することでG2/M期の移行を制御するだけでなく、S期への進行の制御にも関わることにより、根端分裂組織における細胞増殖の活性を総合的に調節していることが示唆された。実験の遂行がほぼ予定通り進んだ。また、これまでの成果をまとめた論文も投稿準備中である。24年度が最終年度であるため、記入しない。CDKB2のオーキシンに応答したタンパク質レベルの分解制御についてさらに詳細な解析を行う。
最適性をもつ視覚復号型秘密分散法の代数的な構成法に関する研究

視覚復号型(k,n)秘密分散法(以下(k,n)-VSSSと略記する)は,白黒2値画像に対して有効な秘密分散法の1つである.(k,n)-VSSSでは,基本行列と呼ばれる特別な性質をもつ2つの行列を用いて,秘密画像をシェアと呼ばれるn枚の画像に暗号化する.シェアが透明なシートに印刷されていれば,任意のk枚のシェア(2【less thanor equal】k【less than or equal】n)を重ねれば秘密画像が復元でき,逆にどのk-1枚以下のシェアからも秘密画像の情報が全く漏れない.基本行列の性能は,通常,k枚のシェアを重ねたときに復号できる画像(復元画像)の鮮明さをによって評価される.特に,相対差と呼ばれるパラメータαを最大化することが重要視されていた.本研究では,今年度,秘密画像の黒画素が,復元画像において完全に黒に復元できる場合の(k,n)-VSSS(以下(k,n)-PBVSSSと呼ぶ)を考察した.黒画素が完全に黒画素として復元されることにより,復元画像は鮮明になる.本年度の重要な成果として,あるクラスの行列を総n次多項式と同一視する規則のもとで,(k,n)-PBVSSSの基本行列が,あるn次元線形空間の格子点集合として捉えられること,また任意の格子点から(k,n)-PBVSSSの基本行列が構成できることを示した点にある.この成果により,与えられたk,nに対して,(k,n)-PBVSSSの基本行列を構成することが大変容易になった.また,本研究では,相対差αを最大化する(k,n)-PBVSSSの基本行列についても調べた.(k,n)-PBVSSSの基本行列としては,従来はBlundoらによって基本行列が1つ与えられているにすぎなかったが,本研究の成果を利用することによって,Blundoらによって与えられた基本行列が,任意の2【less than or equal】k【less than or equal】nに対してαを最大化する意味で最適であることを示すことに成功した.視覚復号型(k,n)秘密分散法((k,n)-Threshold Visual Secret Sharing Scheme,以下では(k,n)-VSSSと略記する)は,白黒2値画像に対して有効な秘密分散法の1つである.(k,n)VSSSでは,基本行列という特別な性質をもつ行列を用いて,秘密画像をシェアと呼ばれるn枚の画像に暗号化する.シェアが透明なシートに印刷されていれば,任意のk枚のシェア(2【less thanor equal】k【less than or equal】n)を重ねれば秘密画像が復元でき,逆にどのk-1枚以下のシェアからも秘密画像の情報が全く漏れない.基本行列の性能は,通常,シェアの重ね合わせによって得られる画像の鮮明さを表すパラメータαの大きさで評価される.最大のαをもつ基本行列を求める方法は,特殊な場合を除いて陽に求めることはできず,一般の場合には線形計画法によるアプローチがあるだけであった.本研究では,線形計画法とは異なるアプローチから,最大のαをもつ基本行列を求める方法を考えた.実際,本研究では,総n次多項式と同一視できる行列の集合を考え,その行列の集合の中で(k,n)-VSSSの基本行列を構成する.すでに,(k,n)-VSSSの基本行列は,あるn-k+1次元の線形空間の格子点に対応することがわかっている.しかしながら格子点は無限個あるので,無限個の格子点の中から,いかに最適な基本行列に対応する格子点を見出すかが問題となっていた.本研究の最大の成果は,有限個の格子点の探索で,最適な基本行列を求めるアルゴリズムを開発したことにある.開発したアルゴリズムは初等的であり,実際にはn-t+1元の連立1次方程式の解を((n+1)/(t+1))回求めれば,得られた解を用いて最適な基本行列が構成できる.nが10程度の実用的な範囲であれば,このアルゴリズムは極めて高速に動作する.開発したアルゴリズムは秘密画像の黒画素が完全に復元できる場合にも適用できる.黒画素が完全に復元できる(k,n)-VSSSの基本行列の1つは,以前から知られているが,本研究の成果により,n【less than or equal】12の範囲では,得られていた基本行列がαを最大にするという意味で最適であることを実験的に示すことができた.視覚復号型(k,n)秘密分散法(以下(k,n)-VSSSと略記する)は,白黒2値画像に対して有効な秘密分散法の1つである.(k,n)-VSSSでは,基本行列と呼ばれる特別な性質をもつ2つの行列を用いて,秘密画像をシェアと呼ばれるn枚の画像に暗号化する.シェアが透明なシートに印刷されていれば,任意のk枚のシェア(2【less thanor equal】k【less than or equal】n)を重ねれば秘密画像が復元でき,逆にどのk-1枚以下のシェアからも秘密画像の情報が全く漏れない.基本行列の性能は,通常,k枚のシェアを重ねたときに復号できる画像(復元画像)の鮮明さをによって評価される.特に,相対差と呼ばれるパラメータαを最大化することが重要視されていた.

本研究では,今年度,秘密画像の黒画素が,復元画像において完全に黒に復元できる場合の(k,n)-VSSS(以下(k,n)-PBVSSSと呼ぶ)を考察した.黒画素が完全に黒画素として復元されることにより,復元画像は鮮明になる.本年度の重要な成果として,あるクラスの行列を総n次多項式と同一視する規則のもとで,(k,n)-PBVSSSの基本行列が,あるn次元線形空間の格子点集合として捉えられること,また任意の格子点から(k,n)-PBVSSSの基本行列が構成できることを示した点にある.この成果により,与えられたk,nに対して,(k,n)-PBVSSSの基本行列を構成することが大変容易になった.また,本研究では,相対差αを最大化する(k,n)-PBVSSSの基本行列についても調べた.(k,n)-PBVSSSの基本行列としては,従来はBlundoらによって基本行列が1つ与えられているにすぎなかったが,本研究の成果を利用することによって,Blundoらによって与えられた基本行列が,任意の2【less than or equal】k【less than or equal】nに対してαを最大化する意味で最適であることを示すことに成功した.
ELISA PSAmRNA、PSMmRNAによる血中前立腺癌細胞の検出

研究実績の概要血中PSA mRNAの測定が盛んに行われているが、いまだにその臨床的意義は不明である。その理由はRNAの抽出、RT-PCR,PCR産物の電気泳動と複雑な過程が必要であり、primerの設定をはじめ各施設により方法がまちまちであるためである。primerの設定PSA遺伝子は1466bpであり、4つのIntronと5つのExonで形成されている。1466bpのPSAcDNAを網羅するように8種類のprimerを設定した。前立腺癌LNCaP、PC-3、DU145、腎癌5、膀胱癌2、精巣腫瘍2の合計12種類の培養細胞を用いてRT-PCRでPCR産物の有無を検討した。primer4のみが3種類の前立腺癌細胞のみに680bp(172-851)のPCR産物を認め、さらにSouthern blotで確認した。(lnt J ∪rol6,526-531,1999)。また、Subcloningにて、この領域の遺伝子変異がほとんどないことを確認した(日泌尿会誌,90,220,1999)。ELlSA PSA mRNAの検出感度をさらにあげるために、磁気ビーズを用いて血中より癌細胞を抽出する改良をおこなった(第59回日本癌学会総会記事p118,1999)。前立腺癌は診断時にすでに60%に転移が認められる。米国では毎年27,000人が前立腺癌により死亡しており、男性の癌死の第2位を占めている。一般に前立腺癌の臨床診断が病理組織学診断をunderstageする確率は40%以上である。血中のPSA messenger RNA(mRNA)の陽性が癌浸潤と相関するとの仮定のもとに、より正確な臨床stage診断法の開発を試みた。Reverse transcriptase-polymerase chain reaction(RT-PCR)は、mRNAからreverse transcriptaseによりcDNAを合成し、さらにcDNAよりDNA polymeraseによりDNAを増輻する方法で微量のmRNAの検出に応用されている。一方前立腺特異抗原(prostatic specific antigen:PSA)は正常前立腺細胞に発現し前立腺癌でも高率に発現し転移性腫瘍組織ではPSA,PAPの発現が前立腺原発であることの証明に利用され、また、血清PSA、PAPの測定が、前立線癌のマーカーとして利用されている。PSA、PAPのcDNAはすでに決定されており、今回PSAを産生するヒト前立腺癌細胞であるLNCaPよりISOGEN-LSを用いてtotal RNAを抽出し逆転写酵素によりcDNAを合成し、PSAの遺伝子配列の一部に相補的なoligonucleotideをPCRの伸長用primerとしRT-PCRを行い、アガロースゲル電気泳動によりPSAのcDNAの塩基配列より予測される増幅されたDNA断片を観察した。さらに、internal probeを用いてSouthern blot hybridizationにより目的とするDNA断片の増幅であることを確認した。mRNAによるPSA陽性細胞の検出は非常に鋭敏で、末梢血単核球106個に混入された場合、LNCaP細胞1個まで検出可能であった。ELISAによる血中PSA mRNAを検出する系を確立した。今後は大量の検体を短時間に測定できりELISA法を用いての検討を行う。大量の検体を検査Centerに運びmRNAを検出、定量するために安価に各病院から検体を検査Centerに運ぶ必要がある。mRNAは-70°Cで保管しなければ壊れてしまうが、細胞は常温でもこわれない。そこで、全血のままで検体を運んでもmRNAが検出可能である事を確認した。血中PSA mRNAの測定が盛んに行われているが、いまだにその臨床的意義は不明である。

前立腺癌LNCaP,PC-3,DU145,腎癌5,膀胱癌2,精巣腫瘍2の合計12種類の培養細胞を用いてRT-PCRでPCR産物の有無を検討した。primer4のみが3種類の前立腺癌細胞のみに680bp(172-851)のPCR産物を認め、さらにSouthern blotで確認した。(Int J Urol 6,526-531,1999)。また、Subcloningにて、この領域の遺伝子変異がほとんどないことを確認した(日泌尿会誌,90,220,1999)。ELISAPSA mRNAの検出感度をさらにあげるために、磁気ビーズを用いて血中より癌細胞を抽出する改良をおこなった(第59回日本癌学会総会記事p118,1999)。
制憲期・再建期における合衆国憲法の基礎理論

本研究は、南北戦争および修正条項追加という事象が、アメリカの国家構造(主権概念を含む)ならびに憲法秩序に与えた影響を大局的に観察し、この時期に憲法秩序の変動はあったのか否かを解明することを目的としたものである。2年という研究期間では残念ながら網羅的な資料の読み込みができたとは言い難いが、現時点での小括としては、憲法秩序のパラダイムシフトともいいうる状況は、内戦や憲法修正という事象からさえも、容易に生じうるものではなかった、と判断している。アメリカ再建期の憲法理論について、主に検討を行った。アメリカ再建期とは、合衆国憲法修正14条という、アメリカ憲法中で最も重要な条文の1つが追加された時期にあたる。本条項の追加が、アメリカ憲法秩序に及ぼす影響に関心をもったのが、この時期に着目した動機である。実際の研究にあたっては、まず、南北戦争・再建期がアメリカの国家構造ならびに憲法秩序に与えた影響を大局的に観察し、何らかの憲法秩序の変動はあったのか否かを解明することを「研究の目的」として掲げた。これへのアプローチの方法として、連邦最高裁の判決、当時の連邦議会議事録、講演などをたどることとした。こうした「目的」に対して、憲法秩序の変動ありやなしやについての明確な結論は得られていない。本研究期間内に収集した資料の分析が遅滞しているためである。この一次資料を足がかかりに、これを更に読み解き、分析する作業を、引き続き行っていくつもりである。ただ、そうした確固とした結論は得られないまでも、本研究課題を進めるうち、わが国におけるアメリカ憲法学研究において、先行研究の少ないこの時期について、注目し解析すべきポイントは明らかになったと考える。それは、合衆国再建期の主権論の考察を通じて、共同体を維持するための「排斥」の理論と、今日においても論争のある公私区分論の関係性を探ることである。「若手研究B」の期間内に収集させていただいた資料とこの新たな課題を基礎に、さらにアメリカ憲法学に関する考察を深めていきたい。本年度は、アメリカ再建期の憲法理論について、主に検討を行った。再建期は、合衆国憲法修正14条という、憲法中で最も重要な条文が追加された時期にあたる。この時期、本条項の追加により、憲法秩序の変動は起きたのか、起きたとすれば、それはどの程度の変化であり、現代の憲法解釈に、どのような影響を及ぼしているのか。これらを、連邦最高裁判決や連邦議会議事録を辿り明らかにすることが研究開始当初の課題であった。ただ研究自体、遅滞しており、上記のような問いに、答えを出すにはまだ至っていない。原意や歴史を重要視する学者たちの先行研究を整理し、かつ、先に掲げた一次文献を読み解く作業を、引き続き行う予定である。しかし、いくつか新たに得られた視角もある。それは、当時において、公私区分論が、共同体を維持するための「排斥」の理論として用いられていることである。今後は、この視角を念頭に、更に多角的に、南北戦争・再建期がアメリカの国家構造ならびに憲法秩序に与えた影響について、考察を深めていきたい。また、主権概念を考察する過程で、主権者人民を作り上げる「公教育」へと関心が広がった。公教育もまた、今日において公私区分論にかかわる新たな問題(「新しい公共」)を提起している分野である。主権者教育論の萌芽は、既に合衆国憲法制定期にみられるところであったが、再建期には、それがどこまで進歩・発展したか。当初の研究課題の中で論じられる限りにおいて、検討を行いたい。資料収集のため現地に出向くなど予定していたが、本研究課題以外の研究および学内業務が重なり、平成24年度はまとまった日数の確保が困難であった。そのため、取り寄せ可能な資料しか入手できず、研究がやや遅れる結果となっている。合衆国再建期の主権論の考察から、公私区分論という今日でも論争のあるテーマが、共同体を維持するための「排斥」の理論として用いられていることが明らかとなった。パソコン等、高額の備品の購入予定はない。引き続き、物品では主に書籍を購入する予定である。入手不可能な古書、資料等については、現地に出向き、図書館を利用しなければならないため、旅費として使用させていただきたい。