hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
表在性膀胱癌に対するBCG膀胱内注入療法の再発防止機序に関する細胞化学的研究

表在性膀胱癌に対するBCG膀胱内注入療法の抗腫瘍効果および再発防止効果は臨床的に立証されているが、その作用機序はなお明らかでない。BCG膀注(Tokyo 172株、80mg/40ml生食、週1回8週)前後に、非腫瘍部粘膜多部位生検(multiple mucosal biopsy:MMB)をあらかじめ規定した7-9領域につき行ない、電顕的細胞化学的変化を調べた。対象は頻回再発あるいはMMBで随伴病変をもつ表在性膀胱癌患者とし、電顕的には標本をグルタールアルデヒドで前固定し、フエリチン標識Con Aと反応させたのちオスミウム固定、エポン包埋し、透過型電顕で観察した。45症例、49膀注療法前後に行なった87回のMMB標本502個を観察した。BCG膀注前には60%の症例において正常な移行上皮が観察され、表層細胞の腔面は斑と稜からなり、斑は非対称性単位膜(asymmetric unit membrane:AUM)で表面にCon A結合部位を欠く。残る40%の症例では微絨毛を認め、随伴病変と考えられた。上皮内、上皮下の細胞浸潤は少ない。BCG膀注終了約4週後には、粘膜に著しい浮腫と、上皮内、上皮下の細胞浸潤を認めた。浮腫は2-3カ月で消失するが、細胞浸潤は数カ月持続し、間質の類上皮肉芽腫は数年を経た症例についても認められた。表層細胞の腔面は、膀注直後には斑構造を失いAUMは認められず、微絨毛に覆われており、膜は対称性単位膜で表面にCon A結合部位が増加していた。表層細胞の変化を生検日までの間隔をかえ、また膀注後複数回生検例で調べた。AUMは膀注終了45日まででは出現率27%と下降し、46-90日34%、91-180日53%、181日以降85%と、6カ月以上かかって回復した。BCG膀注後の粘膜変化は抗癌剤膀注の際の細胞の崩壊脱落とは異なること、形態変化が長期におよぶことが明らかとなった。また臨床的検討により、BCG膀注後の再発癌に本療法第2コースが有効なこと、上部尿路癌にも適用できることを明らかにした。表在性膀胱癌に対するBCG膀注療法の再発予防効果はすでに証明されている。BCG膀注は通常経尿道的腫瘍切除術後に施行されるので、BCGは非腫瘍部粘膜に作用し、再発を阻止していると推定される。しかしBCG膀注後のヒト膀胱粘膜の変化、特に超微形態については観察が少ない。そこでBCG膀注前後に非腫瘍部粘膜多部位生検(multiple mucosal biopsy : MMB)を行ない、光顕所見と共に電顕的細胞化学的変化を調べた。[対象および方法]頻回再発あるいはMMBで随伴病変をもつ表在性膀胱癌患者にBCG膀注療法(Tokyo172株80mg/40ml生食、週1回、8週)を行なった。電顕的にはアルデヒド固定後フェリチン標識Con Aと反応させ、オスミウム後固定、エポン包埋し、透過型電顕で観察した。[結果]

35症例、38治療の前後に行なった74回のMMB標本434個を観察した。BCG膀注前のMMB標本は、約60%において移行上皮最外層細胞に特徴的な斑とその間の稜構造が認められた。斑は非対称性単位膜(asymmetric unit membrane : AUM)よりなる。残る40%は表面が微絨毛で覆われていた。上皮内、間質に浮腫、細胞浸潤は少ない。BCG膀注終了約1カ月後には斑は消失し、著しい上皮内浮腫が認められ、その後の生検では上皮内、間質の細胞浸潤が目立った。AUM出現率はBCG膀注前(n=30)60±32%、BCG終了後45日以内(n=16)30±37%、4690日(n=16)44±37%、91±180日(n=6)67±28%、181日以降(n=7)84±10%であり。表面構造への影響は長期におよぶことが示された。癌の非再発率はBCG1コース群(n=29)で2年69%、3年62%、BCG2コース以上(n=9)では2年49%であった。前後における生検所見とBCG療法後の再発との関係はなお明らかでない。[まとめ]BCG膀注後の膀胱粘膜の超微形態を調べ、斑の消失と回復過程を明らかにした。今後目標50症例を上回る観察を行ない、BCG後の再発危険因子の解明を行ないたい。表在性膀胱癌に対するBCG膀胱内注入療法の抗腫瘍効果および再発防止効果は既に臨床的に立証されている。表在癌を経尿道的に切除したのち予防的にBCG膀注療法を行ない、注入前後の膀胱粘膜の超微形態およびCon A結合部位の変化を調べた。対象は頻回再発あるいは非腫瘍部に随伴病変を持つ表在性膀胱癌患者とし、BCG膀注はTokyo 172株、80mg/40ml生食、週1回8週を1コースとし、膀注終了後一定期間をおいて膀胱粘膜多部位生検を行ない、電顕的に形態とCon A結合部位を調べた、平成7年度の研究により、BCG膀注前に認められた移行上皮表層細胞の斑および稜構造(正常形態)がBCG膀注後には消失し、代わって微絨毛が出現すること、斑に特徴的な非対称性単位膜(asymmetric unitmembrane:AUM)が消失することが判明した。引き続きBCG膀注終了日より生検日までの間隔をあけ、またBCG膀注後再発症例につき検索し、BCG膀注の長期的変化につき調べた。45症例、49膀注療法の前後に87回の粘膜生検を行ない、得られた502標本を観察した。BCG膀注後4週前後で行なわれた生検では、上皮内の著しい浮腫と、上皮内および上皮下の細胞浸潤が認められ、浮腫は2-3カ月で消失したが、細胞浸潤は数カ月持続した。間質の類上皮肉芽腫は数年後にも認められた。表層細胞の形態的回復をAUM出現率で表示すると、生検日45日以内では27.1±53%(n=3)、181日以上では85%(n=7)と、回復に6カ月以上を要することが明らかとなった。この変化は同一症例で複数回生検を行なった5症例にても確かめられた。BCG膀注療法の臨床的検討をも行ない、本療法は膀注後再発例についても有効であること、上部尿路移行上皮癌(表在性)にも効果のあること、副作用の発現率と膀注開始時期とは無関係であることを見出した。
電子デバイス用硬脆材基板のレーザ割断システムの構築

本課題では,レーザを熱源とした熱応力割断加工において.加工中に応力分布をリアルタイムで観測する実験システムを改良し,赤外線光源外撮像素子とを組み合わせた観測光学系を新たに増設して従来は観測できなかった硬脆材基板にも提案システムを適用し得るようにする.第二年度は,光弾性観察によって得られる等傾線および等色線にもとづく応力分布解析手法を発展させた.温度計を内蔵したひずみゲージを特注し,ひずみとともに温度を測定し,測定ひずみを補正することでレーザ割断中に基板に生ずるひずみを実測し,この結果と光弾性によって得られる等色線を組み合わせることで進展中のき裂先端近傍の応力分布を明らかとした.また,複数の等傾線から主応力分布図を作成してき裂先端近傍の主応力方向を視認できるようにした.これら結果は,次年度開催される国際会議において発表を行うべく申し込み済みである.前年度に構築した実験装置を用いて実験を行い,データを収集した.データを処理して応力分布を図示する手法を提案し,光弾性係数の低いガラス基板に生じた熱応力分布を示して,その非対称性がき裂進展を湾曲させることを明らかとした.新たな基板材料を発注済みであり,入手次第実験を行って開発した実験,解析手法を有効性を新たな基板材料に対しても検証する予定である.本課題では,レーザを熱源とした熱応力割断加工において.加工中に応力分布をリアルタイムで観測する実験システムを改良し,赤外線光源外撮像素子とを組み合わせた観測光学系を新たに増設して従来は観測できなかった硬脆材基盤にも提案システムを適用し得るようにする.初年度は,新たな観察光源を増設するとともに赤外撮像素子を導入するとともに観測光学系を構築し,また,弾性波(Acoustic Emission)測定器を実験装置に組み込んだ.本装置は,今後,実験に供する.一方,可視光を観察光源とした実験系を使用したガラス基板の割断加工実験も並行して実施しており,事前検証によって顕かとしていた円弧状割断加工におけるき裂進展の逸脱現象を対象として調査した.レーザ割断加工実験において得た等傾線観察結果から,基盤内に生じている主応力方向分布図を得て,加工誤差(すなわちき裂の逸脱)の原因となる応力分布の非対称性を明らかとした.また,同実験における等径線連続観察によって,応力分布の非対称性がレーザ走査中に変動することを示し,これが原因となって加工誤差も加工中に変動することを明らかとした.さらに,基板材料の温度変化による光弾性係数の変動に起因する光弾性観察結果への影響を定量化するために,温度センサを内蔵したひずみゲージを使用した検証実験を実施し,その結果に基づいて影響を補償した観測結果を得るための手法について検討している.遠赤外線素子の仕様策定,光学系設計の打合せと製品納入に時間がかかったため,実験開始が遅れた.本課題では,レーザを熱源とした熱応力割断加工において.加工中に応力分布をリアルタイムで観測する実験システムを改良し,赤外線光源外撮像素子とを組み合わせた観測光学系を新たに増設して従来は観測できなかった硬脆材基板にも提案システムを適用し得るようにする.第二年度は,光弾性観察によって得られる等傾線および等色線にもとづく応力分布解析手法を発展させた.温度計を内蔵したひずみゲージを特注し,ひずみとともに温度を測定し,測定ひずみを補正することでレーザ割断中に基板に生ずるひずみを実測し,この結果と光弾性によって得られる等色線を組み合わせることで進展中のき裂先端近傍の応力分布を明らかとした.また,複数の等傾線から主応力分布図を作成してき裂先端近傍の主応力方向を視認できるようにした.これら結果は,次年度開催される国際会議において発表を行うべく申し込み済みである.前年度に構築した実験装置を用いて実験を行い,データを収集した.データを処理して応力分布を図示する手法を提案し,光弾性係数の低いガラス基板に生じた熱応力分布を示して,その非対称性がき裂進展を湾曲させることを明らかとした.遠赤外線光源を観察光とし,半導体基板材料の割断加工を実施し,初年度の成果を活用して応力分布解析を行う.新たな基板材料を発注済みであり,入手次第実験を行って開発した実験,解析手法を有効性を新たな基板材料に対しても検証する予定である.実験計画の遅れのため,学会発表(1回)を未実施で次年度に持ち越したため.次年度は,当初予定の海外国際学会に加えて国内学会発表を実施することとする.国際会議発表を申し込んでいるが開催がH31年度であるので旅費相当額はH31年度執行となった.
アルミニウム合金ダイカストに内在する破断チル層の音響可視化と強度評価

Al合金ダイカスト平板ADC12の超音波顕微鏡観察を行い,破断チル層の分布を観察した.その結果,破断チル層は音響画像中に明確に観察され,破断チル層の初期凝固面に形成される酸化膜は高輝度領域,また破断チル層の本体は低輝度領域として観察されることが分かった.この成果を基に,中央部近傍に破断チル層を内在させた試験片を製作し,引張試験及び疲労試験を実施した.その結果,破断チル層寸法の増大に従って,引張強さ及び疲労寿命は大きく低下していくことが分かった.特に,破断チル層が外部に露出している場合,破断チル層が試験片内部に存在する易合に比べて,引張強さ及び疲労寿命の低下割合が大きいことが明らかとなった.次いで,水袋を用い,引張試験中及び疲労試験中にその場超音波測定を行った.引張試験では,試験中に超音波を試験片内部に伝播させ,内部の破断チル層からの反射波を測定した.その結果,引張試験の途中で破断チル層からの反射波の向きが反転し,破断チル層が母相から剥離してき裂を生じたものと推定された.また,疲労試験では,所定の疲労回数ごとに疲労試験機を停止させ,破断チル層からの反射波を測定した.その結果,疲労試験中に破断チル層からの反射波の向きが反転する場合のあることが分かり,疲労過程中に破断チル層が母相から剥離してき裂を生じると推定された.引張試験中及び疲労試験中に破断チル層が母相から剥離してき裂を生じ,成長していくものと推定された.そこで,最終破断時のき裂寸法から,破壊パラメータを推定した.すなわち,引張試験では,破破断チル層面積から臨界応力拡大係数を評価し,破壊靱性値に近い値を得た.また,疲労試験では,破断面上に最終のき裂寸法を評価して臨界の応力拡大係数幅を求め,その最大値が引張試験で推定された臨界応力拡大係数の値に近い値を示すことを見出した.Al合金ダイカスト平板ADC12の超音波顕微鏡観察を行い,破断チル層の分布を観察した.その結果,破断チル層は音響画像中に明確に観察され,破断チル層の初期凝固面に形成される酸化膜は高輝度領域,また破断チル層の本体は低輝度領域として観察されることが分かった.この成果を基に,中央部近傍に破断チル層を内在させた試験片を製作し,引張試験及び疲労試験を実施した.その結果,破断チル層寸法の増大に従って,引張強さ及び疲労寿命は大きく低下していくことが分かった.特に,破断チル層が外部に露出している場合,破断チル層が試験片内部に存在する易合に比べて,引張強さ及び疲労寿命の低下割合が大きいことが明らかとなった.次いで,水袋を用い,引張試験中及び疲労試験中にその場超音波測定を行った.引張試験では,試験中に超音波を試験片内部に伝播させ,内部の破断チル層からの反射波を測定した.その結果,引張試験の途中で破断チル層からの反射波の向きが反転し,破断チル層が母相から剥離してき裂を生じたものと推定された.また,疲労試験では,所定の疲労回数ごとに疲労試験機を停止させ,破断チル層からの反射波を測定した.その結果,疲労試験中に破断チル層からの反射波の向きが反転する場合のあることが分かり,疲労過程中に破断チル層が母相から剥離してき裂を生じると推定された.引張試験中及び疲労試験中に破断チル層が母相から剥離してき裂を生じ,成長していくものと推定された.そこで,最終破断時のき裂寸法から,破壊パラメータを推定した.すなわち,引張試験では,破破断チル層面積から臨界応力拡大係数を評価し,破壊靱性値に近い値を得た.また,疲労試験では,破断面上に最終のき裂寸法を評価して臨界の応力拡大係数幅を求め,その最大値が引張試験で推定された臨界応力拡大係数の値に近い値を示すことを見出した.Al合金ダイカスト平板中に存在する破断チル層の寸法及び向きを,超音波顕微鏡を用いて検出するための技術を確立した.すなわち,破断チル層の酸化膜部分は音響画像中で高輝度領域,また破断チル層の本体部分は低輝度領域として観察されることを明らかにした.この技術を用いて所定の位置に破断チル層を内在させた試験片を製作し,曲げ試験及び引張試験を行い,それぞれの強度に及ぼす破断チル層の影響を定量的に明らかにした.特に,張試験において,破断チル層が引張方向に対して直交する方向に向いている場合,引張強さは破断チル層酸化膜の面積にほぼ比例して低下していくことを明らかにした.次いで,水袋を用い,引張試験中にその場超音波測定を実施した.すなわち,水袋中に探触子を挿入して試験片側面に押し付け,超音波を試験片内部の破断チル層酸化膜に集束させ,破断チル層からの反射波を引張試験中に測定した.その結果,破断チル層からの反射波の向きが引張試験の途中で逆転することを明らかにした.このことから,最終破断に先立って,破断チル層酸化膜が母相から剥離し,き裂を生じたものと推定した.その場超音波測定の結果より,破断直前には,破断チル層酸化膜にき裂が存在するとして,破壊力学的解析を行った.

その結果,破断時の臨界応力拡大係数が求められたが,母相の破壊靭性値より低い値を示すこと,酸化膜寸法が小さな範囲では,酸化膜寸法の減少に伴って臨界応力拡大係数は低下傾向を示すことが分かった.これらの結果について,き裂の寸法効果,酸化膜の剛性の影響,などの点から考察を行った.Al合金ダイカスト平板の超音波顕微鏡観察を行い,破断チル層の分布を観察した。次いで,中央部近傍に破断チル層を内在させた試験片を製作し,疲労試験に供した。種々の応力振幅で疲労試験を行ってS-N線図を得たが,その疲労寿命は大きくばらついた。そこで,応力振幅65MPaの測定結果について,破断要因ごとに疲労寿命を整理した結果,破断チル層以外の微細組織を起点として破断した試験片では疲労寿命が長く,破断チル層を起点として破断した試験片では低疲労寿命を示すことがわかった。更に,破断チル層寸法に従って疲労寿命は低下していくこと,破断チル層が外部に露出している場合のほうが内部に破断チル層が存在する場合に比べて疲労寿命の低下割合が大きいこと,などが明らかになった。次いで,水袋を用い,疲労試験中にその場超音波測定を行った。すなわち,所定の疲労回数ごとに疲労試験機を停止させ,破断チル層からの反射波を測定した。その結果,粗大な破断チル層を内在する試験片で測定した破断チル層からの反射波ではその向きに変化は認められなかったが,これは超音波の測定間隔が広すぎたためと考えられた。そこで,測定間隔を短時間で測定した結果,試験片によっては疲労の途中でその向きが逆転する場合のあることが分かった。これより,疲労過程中に破断チル層が母相から剥離し,き裂を生じたものと推定した。超音波測定の結果より,疲労試験においても途中で破断チル層が母相から剥離してき裂を生じ,成長していくものと推定された。疲労試験中は一定の応力振幅であることから,最終破断時のき裂寸法は破断チル層寸法に依存せず,一定となるものと推定された。そこで,破断面から最終き裂寸法を評価し,臨界の応力拡大係数を求めた結果,先に引張り試験で求めた臨界応力拡大係数の値とほぼ同一の値を得た。
若狭湾産の低・未利用食用海藻に含まれる新規抗炎症性成分の探索・精製と性状解析

海藻粗抽出液を用いた抗炎症活性測定結果(スクリーニング実験)をもとに、平成28年度および29年度は紅藻1種に注目し、大量採集および成分単離を試みた。その結果、2つの抗炎症活性成分を得た。しかし残念ながら、フラグメント解析の結果、第1および第2成分ともに既知成分であった。そこで平成29年度から平成30年度において、スクリーニング実験で一定の抗炎症活性を示し、これまで抗炎症性に関する報告の無い褐藻類1種および緑藻類1種を対象に実験を進めた。これらの海藻類が示した抗炎症活性を再確認し、更なる作用機序の解明および成分の分離・特定による有効活用を目標として、各試料の成分がNOおよびTNF-αの産生・放出にどのような効果を示すかを検討した。褐藻は、一定の濃度から障害性を示したが、障害性の無い濃度でNO産生抑制効果を示した。緑藻は、細胞に障害を与えず、NO産生抑制効果を示した。また各試料は、細胞培養上清中のTNF-α濃度を減少させる効果を示した。しかし、褐藻は、障害性を示す濃度から効果を示したため、TNF-αへの効果を明らかにすることができなかった。平成30年度、褐藻由来成分の炎症反応の上流における効果を検討し、また、褐藻および緑藻の活性成分の分離・精製条件を明らかにする実験に用いる試料を得るために、若狭湾内において、両種の採集に取り組んだ。しかし海洋環境の変化のためか、平成30年度においては、活性成分分離・精製条件の検討実験に用いる十分量の対象海藻類を採集できなかった。そこで、平成31(令和元)年度も対象海藻の採集に努め、活性成分の分離・精製条件を検討する予定である。これまでに90種以上の若狭湾産藻類を採集し、それらの抗炎症性に関してスクリーニングを行った。サンプリングおよびスクリーニング実験に関しては予定通り進捗している。しかし、新奇な抗炎症成分発見を期待して紅藻類に直目して成分の精製・構造解明に関する実験を試みたが、残念ながらこれまでに分離・同定した成分は既知のものであった。平成30年度において比較的強い抗炎症活性を有するとともに、これまでに抗炎症性に関して報告されていない二つの藻類について検討する予定であったが、何度もサンプリングにでかけたものの平成30年度中には対象海藻を十分に採集することができなかった。平成31(令和元)年度は、対象の褐藻類1種および緑藻類1種の採集に尽力し、平成30年度に採集した試料と合わせて実験に用いる。両種の粗抽出液を用いて、中圧カラムクロマトグラフィーおよびHPLC、ゲルろ過により成分の分離精製を進める。分離した成分について、LC/MSおよびLC/MS/MSを用いて構造を推定する。精製海藻抽出成分が新規化合物であると考えられるとき、および、既知化合物であるがその化合物に抗炎症があることが知られていない場合には、その抗炎症性の作用機序解明に取り組む。炎症状態のモデルとして、大腸菌LPSおよびマウスIFN-γにより刺激したマウスマクロファージ由来RAW264.7細胞を用いて以下の検討を行う。1)NOに加えてPG産生に影響するか否かの検討、2)iNOSおよびCOX-2に対する作用の検討、3)炎症誘発性サイトカインのmRNA発現に対する作用、4)転写制御因子に対する影響の検討、5)MAPKs経路に及ぼす影響の検討。以上の検討によって、LPSおよびIFN-γ刺激によって炎症状態となっているマウスマクロファージ系RAW264.7細胞において、海藻抽出成分がどのような作用機序で抗炎症性を発揮するのかを明らかにする。即ち、情報伝達系のカスケードに影響するのか、炎症メディエーター産生に関与する酵素群の転写制御因子に関与するのか、各種mRNAの発現量や安定性、または、酵素タンパク質の性状(存在量や安定性など)にどのような影響を及ぼすのかを検証する。海藻は、大型藻類の通称であり、藻体の色により緑藻、褐藻、紅藻に大別される。日本では1500種を超える海藻が確認されており、それぞれが異なる環境に適応しているため、含有成分の多様性が期待できる。しかしながら、海藻類を対象とした抗炎症性に関する知見は、海藻類の多様性・種数と比較して、十分に蓄積されているとはいえないのが現状である。そこで、新規抗炎症性化合物および既知化合物の新しい機能性の発見による低・未利用食用海藻類の健康機能性を有する食品としての有効利用と、その機能性がもたらすイメージ向上を目的として、若狭湾産海藻類の採集と粗抽出液を用いた抗炎症性の有無・強弱の検討を開始した。平成28年度までに、若狭湾の福井県沿岸域において、一般的に市場流通しない約90種類の海藻を採集し、それらの粗抽出液を用いて一酸化窒素(NO)産生阻害活性を指標に抗炎症性を検討した。その結果、ほとんど、または、全く市場流通しないが食用可能な4種の食用可能な海藻において、強い抗炎症性を有することが明らかとなった。それら4種の抗炎症性の強さは、極めて強い抗炎症性で知られているウコンと同等レベルであった。また、その他にも13種の食用可能な海藻において、比較的強い抗炎症性を認めた。平成28年度はさらに、強い抗炎症を示した紅藻の一種を大量に採取し、中圧カラムクロマトグラフィーを用いてその抗炎症成分の単離を試みた。

HPLCによる分離結果より、対象とした紅藻には少なくとも2つの異なる抗炎症成分が含まれていることが示唆された。4重極型高速液体クロマトグラフ質量分析装置(LC/MSおよびLC/MS/MS)の結果より、HPLCにより分離された一つのピークの成分は残念ながら抗炎症性が既に報告されている既知成分であった。平成28年度は、藻類由来の抗炎症成分の単離精製を行う予定であった。対象紅藻類の一種を大量に採集し、そのメタノールを用いた粗抽出液より抗炎症性を示す2つの成分の単離精製を行うところまではほぼ予定通りに進んだといえる。しかしながら、分子のフラグメント解析の結果より、残念ながら得られた2つ成分のうちの一方は、既知のものである可能性が高かった。また、今回検討した紅藻類から新規の抗炎症成分が得られない可能性があることから、別の一般的には市場流通しないが食用可能な若狭湾産藻類一種を大量に採集し、平成29年度以降の精製実験に備えている。前年度に紅藻1種に注目し、大量採集および成分単離を試みた結果、2つの活性ピークを得た。1つのピークはフラグメント解析の結果、既知成分であった。平成29年度にもう一方の第2ピークについてフラグメント解析を行った。しかし残念ながら第2ピークも既知成分であった。平成29年度は、スクリーニング実験において一定の抗炎症活性を示し、これまで抗炎症性に関する報告の無い褐藻類1種および緑藻類1種を対象に実験を行った。これらの海藻類が示した抗炎症活性を再確認し、更なる作用機序の解明および成分の分離・特定による有効活用を目標として、各試料の成分がNOおよびTNF-αの産生・放出にどのような効果を示すか、RAW264.7細胞を用いて検討した。褐藻は、一定の濃度から障害性を示したが、障害性の無い濃度でNO産生抑制効果を示した。緑藻は、細胞に障害を与えず、NO産生抑制効果を示した。そして、それぞれのNO産生抑制率から算出したIC50値は、褐藻0.026mg/ml、緑藻0.13mg/mlであり、褐藻の抑制効果が高い結果となった。また各試料は、細胞培養上清中のTNF-α濃度を減少させる効果を示した。しかし、褐藻は、障害性を示す濃度から効果を示したため、TNF-αへの効果を明らかにすることができなかった。今後、褐藻由来成分の炎症反応の上流における効果を検討し、また、分離・精製条件を明らかにすることが、作用機序解明や有効利用のために必要であろう。これまでに90種以上の若狭湾産藻類を採集し、それらの抗炎症性に関してスクリーニングを行った。サンプリングおよびスクリーニング実験に関しては予定通り進捗している。しかし、新奇な抗炎症成分発見を期待して紅藻類に直目して成分の精製・構造解明に関する実験を試みたが、残念ながらこれまでに分離・同定した成分は既知のものであった。平成30年度は、比較的強い抗炎症活性を有するとともに、これまでに抗炎症性に関して報告されていない二つの藻類について検討する。海藻粗抽出液を用いた抗炎症活性測定結果(スクリーニング実験)をもとに、平成28年度および29年度は紅藻1種に注目し、大量採集および成分単離を試みた。その結果、2つの抗炎症活性成分を得た。しかし残念ながら、フラグメント解析の結果、第1および第2成分ともに既知成分であった。
軟X線発光の偏光分光によるsp結合半導体の価電子緩和の研究

固体中原子の内殻を励起すると、突然生じた正孔の影響によって外殻電子には様々な緩和が起こることが希土類元素のf電子系でよく知られている。ところが、価電子帯が局在性の弱いs電子とp電子の混成軌道から成るsp結合半導体(sp電子系)においても価電子の再配置を示唆する結果が得られていた。層状結晶であるh-BNのB1sノーマル発光に比べてスペクテータ発光ではπ発光成分が著しく減少したのである。このπ発光異常は、生成された内殻正孔のクーロン引き込み効果によってπ軌道電子再配置が起きる結果生じるものと解釈した。そこで本研究ではsp結合半導体における価電子再配置を主に軟X線発光の偏光分光実験によって実証することを目的とした。偏光分光を実施するため、回折格子にMo/B_4C多層膜を蒸着し、その性能を評価した結果、入射角45°のとき184eVの1次回折効率は3.1%を記録した。また、99.1%の偏光能を有することも確認した。発光偏光分光計にこの多層膜回折格子を搭載し、h-BNのB1s発光について分解能が不十分ながらσ発光とπ発光成分ごとにスペクトルを得ることができた。一方、h-BNのN1s発光スペクトルを測定し、これまでのB1s励起と同様なπ発光異常が現れることが確認できた。また、π電子再配置モデルが予言しているX線光電子スペクトルのB1s主ピークに伴うサテライトピークの確認を行った結果、期待されるエネルギーより僅かずれた位置に小さなピークが確認できた。発光の偏光分光による実証は完了しなかったが、これらの結果からsp電子系における価電子再配置による緩和を実証するという本研究の当初の目的は概ね達成された。最近高温超伝導体として注目されているMgB_2はh-BNと構造がよく似ており、本研究で開発した発光偏光分光計が超伝導発現機構の解明に貢献できるものと期待される。固体中の原子の内殻を励起すると、突然生じた正孔の影響によって外殻電子にはshake-up効果を始めとする様々な緩和が起こる。その顕著な例がf電子系であるが、価電子帯が局在性の弱いs電子とp電子の混成軌道から成るsp結合半導体(sp電子系)においても価電子の再配置を示唆する結果が軟X線発光分光の研究から得られている。そこで本研究はh-BNを始めとするsp結合半導体における内殻励起に伴う価電子の再配置を、主に軟X線発光の直線偏光分光実験によって実証していく。先ず軟X線発光の直線偏光分光実験を実施するため、多層膜回折格子を基礎にした軟X線偏光分光計の設計を完了した。装置の製作は本研究所機械工場で始められている。はじめはB1s発光(約180eV)に絞って研究を行うため、回折格子に蒸着する多層膜としてMoとB_4Cの組み合わせを選んだ。シミュレーションの結果、全積層数が80層のときピーク反射率と半値幅の兼ね合いが良好であることが分かった。マグネトロンスパッタ装置を用いてSiウェハー上にMo/B_4C 81層膜を試し蒸着し、放射光を用いて評価した結果、入射角45^○のとき184eVで16%のピーク反射率を確認した。この結果を基に、回折格子に多層膜を蒸着する準備を整えた。

これと並行して、h-BNのB1s吸収端で観測されたπ発光異常がπ軌道電子の再配置であることを実証するため、π電子再配置モデルが予言しているX線光電子スペクトル(XPS)のB1s主ピークに伴うサテライトピークの確認を行った。その結果、期待されるエネルギーより僅かながらずれた位置に小さなピークが確認できた。これについては更に検討を行っている。本研究はh-BNを始めとするsp結合半導体における内殻励起に伴う価電子の再配置を、主に軟X線発光の直線偏光分光実験によって実証することを目的とする。先ず軟X線発光の偏光分光実験を実施するため、前年に購入した島津製のラミナー型回折格子を基板として、この上にMo/B_4C多層膜(50周期)をマグネトロンスパッタ装置を用いて蒸着した。この多層膜回折格子の性能を放射光によって評価した結果、入射角45°のとき184eVのs偏光成分の1次回折効率は3.1%を記録した。また、p偏光成分は0.017%であり、入射光の直線偏光度を考慮して99.1%の偏光能を有することを確認した。また、0次光ピークの強度を抑えることに成功し、選んだラミナー型回折格子の溝深さが適切であったことも実証した。このように高いエネルギー領域で偏光子を兼ねた回折格子を実現したのはこれが初めてである。本研究所機械工場で製作された発光偏光分光計にこの多層膜回折格子を搭載して光学調整を行い、前年度に購入した軟X線スペクトル検出器を取り付けた。この分光計を用い、放射光励起によってh-BNのB1s発光を測定し、分解能が不十分ながらσ発光とπ発光成分ごとにスペクトルを得ることができた。また、TiB_2についても測定を行った。これらの実験と並行して、h-BNのN1s発光スペクトルを測定し、これまでのBサイト励起と同様な効果が現れることが確認できた。前年の光電子分光の結果も合わせて議論を行い、sp電子系における価電子の再配置を示すという本研究の当初の目的は概ね達成された。
トランスサイレチン細胞外分泌抑制を標的としたアミロイドニューロパチー治療薬の開発

家族性アミロイドポリニューロパチーの新規治療薬の開発を最終目的とし,「変異トランスサイレチン(TTR)の特異的細胞外分泌抑制および細胞内クリアランスの促進」を可能にする小胞体内TTR四量体形成阻害剤の創薬シーズの探索を行った.バーチャルスクリーニングにより約250万種類の化合物から候補化合物を選別し,TTR分泌抑制能を示す2種類の化合物(うち1種類は四量体形成阻害能を示す)を同定した.また,低分子化合物ライブラリーを用いた候補化合物の探索を行うためのTTRの四量体形成能を評価するハイスループットスクリーニング系を構築した.本研究では,家族性アミロイドポリニューロパチーの新規治療薬の開発を最終目的とし,「変異トランスサイレチン(TTR)の特異的細胞外分泌抑制および細胞内クリアランスの促進」を可能にする小胞体内TTR四量体形成阻害剤の創薬シーズ探索を計画している.本年度は,バーチャルスクリーニングにより選別した単量体に結合し,四量体形成を阻害する可能性が高い化合物(リードライク化合物40種類(200万種類中),フラグメントライク化合物18種類(50万種類中))から入手可能な18化合物について検討を行った.変異TTRを恒常的に発現する細胞に各種化合物を処理し,細胞外分泌量の変化を指標にスクリーニングを行った.その結果,変異TTRの細胞外分泌を抑制する化合物として2種類を同定した.次に,変異TTRの四量体形成能を評価する精製タンパク質を用いた新規in vitroアッセイ法を構築し,上記化合物の四量体形成阻害能を調べた.その結果,分泌抑制作用を示した2種類の化合物は四量体形成阻害能を有していること,また,その四量体形成阻害能と分泌抑制作用に相関がみられることが明らかになった.したがって,上記2化合物は変異TTR分泌抑制を標的とした家族性アミロイドポリニューロパチー治療薬のリード化合物となり得ると考えられる.今後,化合物の最適化により細胞,個体レベルでの有効性・安全性の評価を行い,臨床応用可能な化合物の開発を行う予定である.家族性アミロイドポリニューロパチーの新規治療薬の開発を最終目的とし,「変異トランスサイレチン(TTR)の特異的細胞外分泌抑制および細胞内クリアランスの促進」を可能にする小胞体内TTR四量体形成阻害剤の創薬シーズの探索を行った.バーチャルスクリーニングにより約250万種類の化合物から候補化合物を選別し,TTR分泌抑制能を示す2種類の化合物(うち1種類は四量体形成阻害能を示す)を同定した.また,低分子化合物ライブラリーを用いた候補化合物の探索を行うためのTTRの四量体形成能を評価するハイスループットスクリーニング系を構築した.本研究では,家族性アミロイドポリニューロパチーの新規治療薬の開発を最終目的とし,「変異トランスサイレチン(TTR)の特異的細胞外分泌抑制および細胞内クリアランスの促進」を可能にする小胞体内TTR四量体形成阻害剤の創薬シーズ探索を計画している.今年度は,小胞体に発現する約50遺伝子のsiRNAライブラリーを作製し,変異TTRの細胞外分泌を抑制する分子の探索を行った.その結果,変異TTRの細胞外分泌を顕著に抑制する分子の同定には至らなかった.したがって,小胞体内でのTTR四量体形成は複数の分子が協同して行っている可能性が示唆された.また,変異TTR(本来,非糖鎖付加タンパク質)の細胞内クリアランスの詳細な分子機構の解析を行い,変異TTRの糖鎖非依存的小胞体関連分解(ERAD)経路に関わる分子群を同定した.さらに,細胞は糖鎖非依存的ERAD経路が飽和あるいは障害を受けた場合でも,ミスフォールド状態のTTRを翻訳後にN型糖鎖修飾することにより,新たな分解経路(糖鎖依存的ERAD経路)を介して,異常タンパク質を効率的に排除する機構を有していることを見出した.したがって,四量体形成阻害剤により分泌阻害された変異TTRは,細胞内に蓄積することなく,上記機構により効率的にクリアランスされ得ることが示唆された.また,化合物ライブラリースクリーニングについては,バーチャルスクリーニングにより単量体に結合し,四量体形成を阻害する可能性が高い化合物をリードライク化合物から40種類(200万種類中),フラグメント化合物から18種類(50万種類中)を選別した.現在,構築したELISAを用いた96wellフォーマットの分泌評価系を用いて薬効評価を行っている.本年度中にsiRNAライブラリースクリーニングを終了し,化合物ライブラリースクリーニングに向けて,評価系の構築,バーチャルスクリーニングによる化合物の選別も終了しているため.また,変異TTRの小胞体関連分解機構の解明により,申請者が開発を目指す治療法の安全性を証明することができたため.次年度は,化合物ライブラリースクリーニングを中心に行う.バーチャルスクリーニングにより選別した化合物の薬効評価を精製タンパク質,細胞レベルで行い,最終的にヒト変異TTRを発現するトランスジェニックマウスを用いて変異TTRの分泌抑制作用を評価する予定である.また,九州大学化合物ライブラリー創薬先端研究・教育基盤センターを利用して,東京大学創薬オープンイノベーションセンターが提供する既知薬理活性物質を用いた網羅的探索(利用申請済み)も同時に行い,効率的なシーズ探索を目指す.次年度に行う化合物ライブラリースクリーニングは培養細胞を用いたELISAベースの評価系のため,研究費の大部分はTTR ELISA kitや細胞培養関連の消耗品類の購入に充てる予定である.
有機遷移金属錯体の固相特異的光反応

我々は、さきに固体状態でβ-シアノエチル或いはβ-メトキシカルボニエチルコバロキシム錯体が光照射によりα-体に異性化することをみいだした。別途合成したα-体の結晶に光照射してもβ-体を生成しないことから本異性化(β→α)は不可逆反応であると考えられた。しかしながら、標準濃度(1%KBr disk)に於ける光反応ではα/β比が一定値に漸近する傾向がみられること、また別途合成したα体がα→β異性化し得ないような結晶構造をとっている可能性も考えられること等から、逆反応の可能性を完全に否定し去ることはできなかった。本研究では、まず、この問題点解決のために、低濃度条件下で長時間光照射を行い、経時変化を徹底的に追跡した。その結果、図で【R_1】=【R'_1】=C【H_3】、Y=【R_2】=H、X=CN、【R_1】=C【H_3】、【R'_1】=Ph、Y=【R_2】=H、X=CNの錯体の場合、異性化とともに系内に生成するC【H_3】CH CNラジカルが平面配位子のメチルからHを引抜いてC【H_3】C【H_2】CNを生成する反応が同時にゆっくりと進行していることが解った。一方、平面配位子が【R_1】=【R'_1】=Phの錯体では引抜き易いHがないためC【H_3】C【H_2】CNの生成反応は進まない。また、光照射7.5時間後この系より単離された錯体のNMRには、原料のβ-体のシグナルが完全に消失していることが解り本異性化の不可逆性が実証された。更には、【R_1】=C【H_3】、【R'_1】=PH、Y=【R_2】=H、X=OHの光学活性錯体[A]、【R_1】=【R'_1】=C【H_3】、【R_2】=H、X=Y=CooCH、B=/-Phenylethylamin(/-PEA)[C];【R_1】=【R'_1】=C【H_3】、【R_2】=H、X=Y=CN、B=/-PEA[D]の光学活性錯体を合成することができた。[A]の光反応ではアセトアルデヒドの生成が確認された。また、[C]のX線照射ではラセミ化は起らないが光反応によりラセミ化が進行することが認められた。また、M=Rh、【R_1】=【R'_1】=C【H_3】、Y=【R_2】=H、X=CNの錯体でもβ→α異性化が起ることが確認された。
常識哲学と可謬主義の展開に関する研究

30年度は、哲学の常識の関係について特に研究を行なった。常識は、とてもさまざまな信念をそこに含んでおり、しばしばその内部においても対立する信念が潜在的に存在しうるものである。そしてそれらを包括的に正しいものとして認めるのか、あるいは一部の常識を特に正しいものとして受け入れるために別の常識的な信念を否定するという選択肢なども考えられる。そのため、常識哲学といっても、常識をあらかじめ知識の基礎として引き受けるのか、あるいは常識を批判的に検討し、常識に新しい考え方をどのようにして取り入れていくのかを取り組むという選択肢もありうる。このような考え方を出発点として、常識に深くコミットしているとしばしば評価されてきたバークリとリードの哲学において、常識がどのように位置付けられているのかを再検討することで、常識と哲学の関係がどのようなものでありうるのかを考察した。バークリ自身は、しばしば常識の擁護を主張しながらも、同時に彼の哲学は非常に常識的ではないものとして考えられることがあった。一方、トマス・リードは、自明なものを判断する能力として常識を捉え、その常識をわれわれの知識体系の第一原理に組み込んだ哲学者であり、常識の原理は、我々の知識体系の基礎となるものとして権威を与えられている。このような点から、リードの認識論が基礎付け主義と可謬主義の二つの要素を含んでいるとしばしば指摘されるが、ここにどのような問題点があるのかを指摘し、このようなリードの常識哲学と対比しながら、バークリ的な常識哲学の可能性を明らかにした。本年度は、近代を代表する常識を重視した哲学者であるリードとバークリの哲学を比較検討することによって、常識と哲学との関係を研究し、その成果を論文として発表した。その際、20世紀のプラグマティストであるウィリアム。ジェイムズや科学哲学者のカール・ポパーの立場なども参照にすることで、通時的な観点から常識の哲学における位置付けを考察することができた。これまでの近代を中心にした哲学における常識の役割の研究をさらに深めつつ、現代のプラグマティストの立場などもさらに参照しつつ、この常識の問題を軸にして考察する。特にリチャード・ローティと科学哲学者ポパーの立場を比較しながら、常識と哲学の関係、信念と知識の関係などを研究する。28年度は、常識哲学の代表者であり、スコットランド常識学派の代表者と言われるトマス・リードの認識論的枠組みを検討し、われわれの常識的信念が哲学においてどのような位置付けにあるものとして捉えられるのかということを研究した。リードは外界の直接知覚の理論を提示しているが、それによってわれわれが外界を直接に知覚しており、また外界が実在しているという常識的な信念がたんに確保されるわけではない。むしろ、常識の原理として、外界や他者が実在しているという信念が第一原理として措定されていることが、リード哲学における重要な地位を占めている。しかし、実はリードが懐疑主義に至ると批判している観念説にも、実は同じような構造があることを、特に観念説の代表者であるロックの考えと対比させることによって明らかにした。つまり、ロックは知覚表象説を採用することにより、われわれが外界に直接アクセスすることができないという理論を提示している。そしてこれは、当時、しばしば懐疑主義に至るものであると考えられた。しかし、当時の科学的なものの考え方をベースに認識論を展開しているロックは、そもそも外界が実在しているということを議論の前提とし、その中で知覚表象説を展開しているのである。そのため、実は、リードとロックは、ともに、外界が存在するということが正当化されるのかどうかということにその認識論を向けているのではなく、その前提の枠内で認識論を展開しているのである。これは、両者が、全面的な懐疑によって認識論を構築しようとしたデカルトとは異なる立場にあり、その点で両者には大きく共通するものがあることを明らかにした。常識哲学の研究には、近代のリードを始めとする近代の哲学者の議論の再考察が不可欠であり、その点について、概ね順調に進展していると言える。本年度は、近代の常識哲学の代表的哲学者であるスコットランドの哲学者トマス・リードの常識についての議論を中心的に研究した。リードは、その主著『人間の知的能力試論』の中で、常識を自明な命題を知る判断能力として位置付け、蓋然的な第一原理と必然的な第一原理を設定し、知識の基礎とした。特に、蓋然的な第一原理に基づく知識観は、デカルトのように同じく第一原理をさだめてそこから知識の体系を構築しようとする哲学者と類似した側面を持ちながら、一方で、その知識観については、大きな変更を行なっている。それは可謬的な知識観である。リードは、常識を自明な知識を理解する判断力として捉え、そこから導き出される命題を第一原理として捉えている。そしてその第一原理と偶然的な第一原理と必然的な第一原理にわけるが、本年度はとくにその中の偶然的な第一原理に注目し、リードのその思想における問題点を詳細に検討した。さらに、上述したように、常識哲学は、しばしばその可謬主義的な知識観と結びつくが、本年度は、リードと同じく常識に強い敬意を払い、可謬主義的な知識観を展開しているカール・ポパーの知識観ととりあげ、リードの可謬主義と対比させた。リードとポパーという二人の哲学者は、同じく可謬主義者でありながら異なる側面を有している。その違いを考察しつつ、上述したリード哲学が持つと考えられる問題点をどのように捉えることができるのかということを明らかにした。

古典的な常識哲学の代表者であるリードの常識についての言及を考察し、それによってリードの可謬主義の内実について明らかにするとともに、現代の可謬主義哲学者であるポパーの議論を対比させ、われわれの知識観における常識の役割について明らかにした。30年度は、哲学の常識の関係について特に研究を行なった。常識は、とてもさまざまな信念をそこに含んでおり、しばしばその内部においても対立する信念が潜在的に存在しうるものである。そしてそれらを包括的に正しいものとして認めるのか、あるいは一部の常識を特に正しいものとして受け入れるために別の常識的な信念を否定するという選択肢なども考えられる。そのため、常識哲学といっても、常識をあらかじめ知識の基礎として引き受けるのか、あるいは常識を批判的に検討し、常識に新しい考え方をどのようにして取り入れていくのかを取り組むという選択肢もありうる。このような考え方を出発点として、常識に深くコミットしているとしばしば評価されてきたバークリとリードの哲学において、常識がどのように位置付けられているのかを再検討することで、常識と哲学の関係がどのようなものでありうるのかを考察した。バークリ自身は、しばしば常識の擁護を主張しながらも、同時に彼の哲学は非常に常識的ではないものとして考えられることがあった。一方、トマス・リードは、自明なものを判断する能力として常識を捉え、その常識をわれわれの知識体系の第一原理に組み込んだ哲学者であり、常識の原理は、我々の知識体系の基礎となるものとして権威を与えられている。このような点から、リードの認識論が基礎付け主義と可謬主義の二つの要素を含んでいるとしばしば指摘されるが、ここにどのような問題点があるのかを指摘し、このようなリードの常識哲学と対比しながら、バークリ的な常識哲学の可能性を明らかにした。本年度は、近代を代表する常識を重視した哲学者であるリードとバークリの哲学を比較検討することによって、常識と哲学との関係を研究し、その成果を論文として発表した。その際、20世紀のプラグマティストであるウィリアム。ジェイムズや科学哲学者のカール・ポパーの立場なども参照にすることで、通時的な観点から常識の哲学における位置付けを考察することができた。近代のイギリス経験論者の一人であるバークリもまた、ロックなどの知覚表象説が懐疑主義に至ることを論じ、それを回避するために観念論を展開した。バークリの議論は、しばしば常識に反するものとして捉えられていたが、バークリ自身は、自らの議論が常識と強く一致することを強調している。そういう意味で、バークリもまた常識哲学を主張しようとしたと考えられる。バークリの考えは、のちのリードなどに大きな影響を与えているが、リードとバークリは、ともに常識的な信念をそれぞれの哲学の中で重要視しているように見えるが、実際に、両者における常識的な信念の扱いが同じであるのか、あるいはどのように違うのかということを明らかにしたい。本年度で取り上げたカール・ポパーの可謬主義についてさらに検討し、常識がその中でどのような地位にあるのかを検討する。
無細胞再構成実験系を用いたRab3A系によるシナプス小胞形成機構の解明

神経回路網において、シナプスを介した神経細胞間の情報伝達が脳の高次機能に関与している。この神経細胞間の情報伝達は神経伝達物質の放出により行われているが、神経細胞内で神経伝達物質を運ぶシナプス小胞の形成機構についてはほとんど明らかにされていない。以前の研究により、シナプス小胞を前シナプス膜に運ぶ役割を担っている低分子量Gタンパク質Rab3の活性化因子であるRab3-GEFがシナプス小胞のサイズの決定に関係していることが明らかになっている。また、これまでの解析によりシナプス小胞の一部は形質膜からのエンドサイトーシスによって形成されることがわかっている。しかし、シナプス小胞の形成がどのようにして制御されているのか、シナプス小胞の形成はRabの活性化と関係するのかは不明である。そこでRabの活性化とエンドサイトーシスによって形成される小胞の量や大きさとの関係を形質膜を用いた無細胞再構成実験系を調べた。その結果、上皮細胞の形質膜ではRabの活性化によって小胞の形成がコントロールされていることが明らかになった。形質膜上のc-Metと呼ばれる受容体にHepatocyte growthfactor(HGF)が結合することにより低分子量Gタンパク質Rasが活性化される。活性化されたRasはRab5-GEFであるRIN2と結合する。それによりRIN2がRab5を活性化し、小胞形成を促進することが明らかになった。HGFを作用させるとエンドサイトーシスが促進されることやRab5の活性化でエンドサイトーシスが促進されることが分っていた。しかし、それらの関係については不明であった。今回の解析によりRas-RIN2-Rab5というシグナル伝達がエンドサイトーシスの促進に関係することを明らかにした。このようなシグナル伝達系は神経系にも存在していると考えられるため、シナプス小胞の形成制御の機構の解明においても重要である。シナプス小胞は、神経終末のエンドソームとシナプス形質膜から形成されると考えられている。そこでラット脳組織からシナプス小胞の供与膜であるそれぞれの膜画分を単離し、神経の細胞質画分とATP, GTPを加えて加温することで反応させた。その結果、シナプス形質膜からシナプス小胞のマーカーであるシナプトフィジンおよび小胞輸送に関わる低分子量G蛋白質Rab3A陽性の小胞の形成が認められた。また、同時にシナプス小胞以外のエンドサイトーシス小胞、特に神経終末に存在する細胞間接着分子カドヘリン陽性のエンドサイトーシス小胞も形成されることが分かった。シナプス小胞の形成機構を解析するには、シナプス小胞とエンドサイトーシス小胞の形成を区別する必要があると思われた。そこで、まずカドヘリンのエンドサイトーシス小胞の形成機構をしらべた。カドヘリンのエンドサイトーシス小胞の供与膜(シナプス小胞供与膜ではない)であるラット肝臓のアドヘレンスジャンクション画分を単離した。その画分に神経の細胞質画分とATP, GTPを加えて加温することで反応させ、カドヘリン陽性のエンドサイトーシス小胞を形成させて、エンドサイトーシス小胞の形成機構を解析した。その結果、カドヘリンのエンドサイトーシス小胞は、低分子量G蛋白質Rac, Cdc42およびその両方に結合する蛋白質IQGAP1がアクチン細胞骨格を介して制御していることが分かった。この制御機構がシナプス小胞形成と共通であるかどうか調べたが、カドヘリンエンドサイトーシス小胞形成の制御因子によるシナプス小胞形成への影響は認められなかった。一方、シナプス小胞形成の制御因子であるRab3Aもカドヘリンのエンドサイトーシス小胞形成には影響を与えなかった。以上のことから、エンドサイトーシス小胞形成の分子機構とシナプス小胞形成の分子機構は異なることが分かった。私共のこれまでの研究により、シナプス小胞を前シナプス膜に運ぶ役割を担っている低分子量Gタンパク質Rab3の活性化因子Rab3-GEFがシナプス小胞のサイズの決定に関係していることが分かっている。私共は、Rab3系はシナプス小胞が前シナプス膜に運ばれた後に神経伝達物質を放出する過程(エキソサイトーシス)にも関わっており、エキソサイトーシスの機構の違いによってシナプス小胞の形成機構が違うのではないかと考え、エキソサイトーシスについて解析を行った。エキソサイトーシスはSNAREと呼ばれるタンパク質複合体によって制御されている。Rab3もSNAREに結合することが知られている。私共は、SNAREに結合し、エキソサイトーシスを制御するタンパク質トモシンがRab3関係しており、エキソサイトーシスのコントロールにおいて重要ではないかと考え、トモシンについて詳細な解析を行った。その結果、以下の成果を得た。1.トモシンはSNARE複合体の構成タンパク質の一つであるシンタキシンに結合することでエキソサイトーシスを抑制する。2.トモシンは神経細胞内のcAMP濃度が上昇し、PKAが活性化されるとPKAによってリン酸化されシンタキシンから外れる。それによってエキソサイトーシスが促進される。

以上の結果からRab3系とエキソサイトーシスとの関連を詳細に解析し、SNARE制御のタンパク質トモシンにより神経伝達物質放出がコントロールされていることを明らかにした。神経回路網において、シナプスを介した神経細胞間の情報伝達が脳の高次機能に関与している。この神経細胞間の情報伝達は神経伝達物質の放出により行われているが、神経細胞内で神経伝達物質を運ぶシナプス小胞の形成機構についてはほとんど明らかにされていない。以前の研究により、シナプス小胞を前シナプス膜に運ぶ役割を担っている低分子量Gタンパク質Rab3の活性化因子であるRab3-GEFがシナプス小胞のサイズの決定に関係していることが明らかになっている。また、これまでの解析によりシナプス小胞の一部は形質膜からのエンドサイトーシスによって形成されることがわかっている。しかし、シナプス小胞の形成がどのようにして制御されているのか、シナプス小胞の形成はRabの活性化と関係するのかは不明である。そこでRabの活性化とエンドサイトーシスによって形成される小胞の量や大きさとの関係を形質膜を用いた無細胞再構成実験系を調べた。その結果、上皮細胞の形質膜ではRabの活性化によって小胞の形成がコントロールされていることが明らかになった。形質膜上のc-Metと呼ばれる受容体にHepatocyte growthfactor(HGF)が結合することにより低分子量Gタンパク質Rasが活性化される。活性化されたRasはRab5-GEFであるRIN2と結合する。それによりRIN2がRab5を活性化し、小胞形成を促進することが明らかになった。HGFを作用させるとエンドサイトーシスが促進されることやRab5の活性化でエンドサイトーシスが促進されることが分っていた。しかし、それらの関係については不明であった。今回の解析によりRas-RIN2-Rab5というシグナル伝達がエンドサイトーシスの促進に関係することを明らかにした。このようなシグナル伝達系は神経系にも存在していると考えられるため、シナプス小胞の形成制御の機構の解明においても重要である。