hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
GPCRの1分子動態・機能連関の比較解析

Gタンパク質共役型受容体(GPCR)は低分子薬の約30%の標的になるなど、創薬において主要な位置を占めている。従来、GPCRの活性評価は下流の細胞応答の計測に依存してきたが、オーファン受容体では下流が未知の場合も多く、何を薬効評価の指標とすればよいか分からない。したがって、GPCR自体を計測して活性を定量する手法の開発が求められる。本年度は、昨年度までに計測した、代謝型グルタミン酸受容体(mGluR3)の生細胞内1分子イメージングの結果と、mGluRとは異なるファミリーに属するGPCR8種の1分子計測について論文発表・学会発表・プレスリリースを行った。本研究により、GPCRの拡散と機能の関係は多くのGPCRに広く共通しており、活性化したGPCRの動きは遅くなることが明らかになった。したがって、1分子イメージングによりGPCRの動きを見ることで新規化合物がGPCRにどのような作用を及ぼすか推定できると考えられる。さらに本年度は、昨年度まで作成した314種のHaloTag融合GPCRのうち、計24種に関しても1分子イメージングを行った。その結果、計測したすべてのGPCRでGタンパク質共役特異性に依らず、アゴニスト刺激依存的に拡散が遅くなることが示され、1分子イメージングを用いた薬効評価がより広範な受容体に適用できることが明らかになった。今後は、作成したすべてのGPCRについて1分子イメージングを行い、比較解析を行う予定である。また、本研究では、mGluR3とGタンパク質・クラスリン結合のそれぞれが異なる拡散状態変化に寄与することを示した。今後はGPCRの拡散動態と多様な機能状態との対応関係をさらに解析することで、単一計測でGPCRのシグナルバイアスを定量できる手法に昇華していきたい。現状、薬の標的分子となっているGPCRは全体の約6%に過ぎず、100種程度はリガンド未知のオーファン受容体である。我々は、過去に代謝型グルタミン酸受容体をモデルとして1分子イメージングを行い、細胞膜上での受容体の拡散係数が活性とよく相関することを明らかにした。しかしながら、活性化依存的な拡散の変化の背景にある生理的現象については不明な点が多い。本年度は、Gタンパク質を百日咳毒素で阻害した際に生じるmGluRの拡散状態の変化を定量した。その結果、インバースアゴニスト・アゴニスト存在下の双方で、mGluRの拡散が遅くなることが示された。特に拡散の変化はインバースアゴニスト存在下で著明であり、mGluRがGタンパク質と不活性状態においても結合した状態が存在し、この状態が速い拡散係数を持つことが示唆された。また、mGluRで同定した拡散・機能相関の一般性を検証するために、進化的に異なるファミリーに属する8種類のGPCRについて、同様に1分子計測を行った。アゴニスト依存的な拡散係数の変化を定量した結果、計測したすべてのGPCRで活性化依存的な拡散係数の低下が認められた。したがって、ホモロジーや下流のシグナル伝達経路を問わず、幅広いGPCRの活性を拡散係数という単一の指標で定量できることが示された。本研究は、1分子計測によるGPCRの薬理学・創薬につながる重要な一歩であると考えられたため、論文投稿・特許出願・国内外の学会での発表を行った。当初の計画では、平成28年度は、mGluR3と下流分子(Gタンパク質・βアレスチン)が相互作用している拡散の状態を定量し、過去の研究で認められた活性化依存的なmGluRの拡散係数の低下の背景を突き止める予定であった。我々はまず、百日咳毒素によるGタンパク質の阻害実験を行った。その結果、百日咳毒素処理により、著明にmGluR3の拡散が遅くなることが明らかになった。この変化はVehicle刺激や百日咳毒素のBオリゴマー刺激では認められなかったため、Gi/oの選択的な阻害に由来するものであることが示された。当初はアゴニスト存在下でのみ変化が見えることを期待して実験を行ったが、実際にはインバースアゴニスト存在下でより著明な変化が認められた。この結果は、不活性状態においてmGluR3がGi/oとプレカップルをしていることを示唆するものであり、活性化に伴うGPCR/Gタンパク質複合体からのGタンパク質の乖離が拡散係数の低下をもたらしていると推測された。また、拡散・機能相関の一般性の検証については平成29年度以降を予定していたが、HaloTag融合GPCRのcDNA調製が順調に推移したため、平成28年度中に8種類(ADRB2・HTR2A・HRH1・ADORA2A・FFAR4・CXCR4・F2R・GCGR)のGPCRについて1分子計測を行えた。その結果、計測したすべてのGPCRでアゴニスト依存的に拡散が遅くなることが判明し、受容体のアミノ酸配列やリガンドの化学的特性、下流のシグナル伝達系を問わず1分子イメージングを用いて幅広いGPCRの活性を定量できる可能性が示された。本研究成果は、GPCRに対する新たな化合物評価手法に応用できるため、平成28年度中に国内外の学会で発表を行った。また、同内容について特許出願、論文投稿を行った。

以上のように、本研究は順調に進捗している。Gタンパク質共役型受容体(GPCR)は低分子薬の約30%の標的になるなど、創薬において主要な位置を占めている。従来、GPCRの活性評価は下流の細胞応答の計測に依存してきたが、オーファン受容体では下流が未知の場合も多く、何を薬効評価の指標とすればよいか分からない。したがって、GPCR自体を計測して活性を定量する手法の開発が求められる。昨年度までに我々は、代謝型グルタミン酸受容体(mGluR3)の生細胞内1分子イメージングを行い、リガンド依存的な活性の変化と相関して拡散動態が変化することを示した。さらに、百日咳毒素によりGタンパク質との相互作用を阻害すると拡散が速いmGluR3の割合が増加することを明らかにした。本年度は、Gタンパク質とmGluR3の2色同時1分子計測を行い、両者の複合体の拡散動態を定量した。その結果、mGluR3は活性・不活性状態を問わずGタンパク質と短期間相互作用することが明らかになり、この相互作用は百日咳毒素により阻害されることが示された。また、Gタンパク質と相互作用中のmGluR3は速い拡散状態を採る確率が高いことが示され、昨年度の百日咳毒素による阻害実験から間接的に示唆された結果を直接的に検証できた。また、当初計画していたmGluRとは異なるファミリーに属するGPCR8種の1分子計測については昨年度中に完了したため、本年度は305種のGPCRについて蛍光標識用のHaloTagを融合したクローンの作製を行った。シームレスクローニングとランダムPCRを組み合わせてスクリーニングを行うことで、HaloTag融合GPCRの作製は順調に進み、計314種のGPCRについて1分子イメージングを可能な状況を構築できた。今後はGPCRの拡散機能相関の一般性をより幅広く検証していきたい。当初の計画では、GPCRの拡散・機能相関の一般性を検証する目的で、mGluR3を含む9種のGPCRの1分子イメージングを行う予定であったが、リガンド依存的に拡散動態が変化することの検証は昨年度中に完了した。本年度は、より幅広いGPCRでの検証を可能にすべく、新たに305種のGPCRの遺伝子を入手し、蛍光標識用のHaloTag融合cDNAを1分子イメージングに適した低発現量ベクターに挿入することを完了した。また、mGluR3については当初の予定通り、Gタンパク質との2色同時1分子イメージングを行い、Gタンパク質と複合体を形成した際にmGluR3は速い拡散状態をとる確率が上がることを直接的に明らかにした。特に、インバースアゴニストが飽和濃度存在する条件下でも、両者の複合体が形成されることが明らかになり、Class C GPCRに属するmGluRでもClass A GPCRと同様にGPCRとGタンパク質のプレカップリングが生じることが示された。
脳内グリア細胞による病態制御機構の光遺伝学的解析

本研究では、脳内グリア細胞の担う情報処理が、神経細胞間の信号伝達網にどのように影響するのかを調べる。また、脳病態時における神経活動の破綻に、グリア細胞からの信号がどのように関与しているのかを明らかにする。これまでの研究において、小脳バーグマングリア細胞からグルタミン酸が放出され、神経細胞が興奮し、小脳に依存した行動や学習が変化することを明らかにした(Sasaki, Beppu et al., 2012)。また、このようなグリア細胞ー神経細胞間の信号伝達は虚血時に過剰にはたらいていることを明らかにした(Beppu et al., 2014)。本研究においては、虚血ではなく健常な脳においても、グリア細胞からの信号が神経細胞の活動状態を左右しているのかを調べた。これまでシナプスでの神経伝達こそが、脳内情報処理の要であると考えられてきた。しかし本研究課題において、シナプス電流の一部はグリア細胞からのグルタミン酸成分であることを発見した。この結果は、グリア細胞からの信号がシナプスでの神経伝達を増強させていることを示している。このグリア細胞からのグルタミン酸放出のメカニズムを詳しく追及し、論文を投稿する準備を行っている。当初の計画では、胎児期の虚血における神経毒性が、成熟期の虚血時と同様のメカニズムで起きているのかを調べる予定であったが、別府氏は、虚血だけにとどまらず、他の脳病態における、グリア信号の関与も明らかにしていきたいと考えるようになった。本研究では、虚血ほど極端な状況ではないが、神経細胞が過剰な興奮状態になるてんかん発作に着目した。てんかん発作時において、上記の研究で明らかにしたグリア細胞によるシナプス伝達増強作用が、てんかん発作時にもはたらいていることを予想し、研究を進めている。28年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では、グリア細胞から神経細胞への信号伝達が、病態脳や正常脳においてどのような役割を担っているのかを調べる。これまで、神経細胞からの信号に応じてグリア細胞が活発に活動することは報告されてきた。しかし、グリア細胞の活動が神経活動に影響を及ぼしうるかは、明らかではなかった。そこで、以前の我々の研究において、グリア細胞の一種であるアストロサイト特異的に光感受性の陽イオンチャネル、channelrhodopsin(ChR2)を発現させた遺伝子改変マウスを用いて、光刺激によってグリア細胞の活動を引き起こした。その結果、グリア細胞からグルタミン酸が放出されて、神経細胞の活動が亢進することが明らかとなった。そして本年度の研究において、脳虚血時にグリア細胞の活動を光感受性のプロトンポンプ、archaerhodopsin(ArchT)を用いて抑制すると、グリア細胞からの過剰なグルタミン酸放出が抑制され、神経細胞での興奮毒性が弱まることを明らかにした。グリア細胞からのグルタミン酸放出が、虚血時の脳障害の程度を強力に左右することが示されたため、続いて、正常脳における生理的なグリア活動も、神経活動を調節するようなグルタミン酸放出を起こしているのかを調べた。小脳では、平行線維からプルキニエ細胞へ興奮性のグルタミン酸シナプスが形成されている。小脳の平行線維を電気刺激することで、興奮性後シナプス応答(EPSC)がプルキニエ細胞から記録されるが、小脳バーグマングリア細胞の活動をArchTによって抑制しておくと、EPSCの後半成分が減少することを発見した。この結果は、興奮性シナプス応答の一部に、グリア細胞からのグルタミン酸放出が加わっていることを示唆する。このように、神経細胞間のシナプス応答にグリア細胞が反応して、シナプス応答を増強させるような機能がはたらいていることを示した研究は、本研究が初めてである。本研究では、光遺伝学を用いてグリア細胞の活動を操作することにより、脳病態時におけるグリア細胞の関与を明らかにする。これまでの自身の研究において、脳内アストロサイト-神経細胞間にグルタミン酸を介した信号伝達が存在することを明らかにした(Sasaki, Beppu et al., 2012)。このようなグリア細胞ー神経細胞間の信号伝達は病態時にこそ過剰にはたらくのではないかと予想し、本研究課題において、虚血という病態時におけるグリアー神経信号の破綻が、神経細胞死の発端になっていることを明らかにした(Beppu et al., 2014)。次に、虚血といった病態時ではなく正常な神経伝達においても、グリア細胞からのグルタミン酸信号が神経の活動状態を左右しているのかを調べた。その結果、神経細胞間のシナプス応答の一部に、グリア細胞からのグルタミン酸信号が含まれていることを発見した(論文投稿中)。当初の計画では、胎児期における虚血時脳傷害が、成熟期の虚血と同様のメカニズムで起きているのかを調べる予定であったが、本研究代表者は、虚血だけにとどまらず様々な脳病態における、グリア信号の関与を明らかにしていきたいと考えるようになった。そこで、虚血ほど極端な状況ではないが、神経細胞が過剰に興奮状態になるてんかん発作に着目した。脳スライス標本を用いた実験において、光遺伝学などによるグリア細胞の活動操作が、神経細胞のてんかん様発火を抑制できることが示唆された。本研究を通して、光遺伝学を用いてグリア細胞の活動を制御することにより、虚血やてんかんといった脳病態時におけるグリア細胞の関与が明らかになりつつある。

グリア細胞の活動操作による脳病態の改善に向けて、どのような手法でグリア細胞の活動を制御すれば、実際の臨床応用につなげられるのかをさらに追究していきたいと考えている。本研究課題では採用1年度目において、グリア細胞から神経細胞への興奮性の信号伝達が、虚血時の神経興奮毒性を引き起こす原因であることを明らかにした。採用1年度目から2年度目にかけては、虚血といった病態時だけでなく、正常な神経伝達が行われる過程においても、グリア細胞からのグルタミン酸信号がシナプス伝達を増幅させていることを明らかにした。また、虚血にとどまらず、てんかんという病態においても、神経細胞の過剰な発火が、グリア細胞の活動操作によって抑制できるのかを調べており、このてんかん発作抑制メカニズムを現在明らかにしている。当初は、虚血だけに着目して研究を行う予定であったが、虚血、てんかん、生理的条件下におけるグリア機能を調べるまでに発展できたことから、本研究は当初の計画以上に進展していると考えられる。本研究では、脳内グリア細胞の担う情報処理が、神経細胞間の信号伝達網にどのように影響するのかを調べる。また、脳病態時における神経活動の破綻に、グリア細胞からの信号がどのように関与しているのかを明らかにする。これまでの研究において、小脳バーグマングリア細胞からグルタミン酸が放出され、神経細胞が興奮し、小脳に依存した行動や学習が変化することを明らかにした(Sasaki, Beppu et al., 2012)。また、このようなグリア細胞ー神経細胞間の信号伝達は虚血時に過剰にはたらいていることを明らかにした(Beppu et al., 2014)。本研究においては、虚血ではなく健常な脳においても、グリア細胞からの信号が神経細胞の活動状態を左右しているのかを調べた。これまでシナプスでの神経伝達こそが、脳内情報処理の要であると考えられてきた。しかし本研究課題において、シナプス電流の一部はグリア細胞からのグルタミン酸成分であることを発見した。この結果は、グリア細胞からの信号がシナプスでの神経伝達を増強させていることを示している。このグリア細胞からのグルタミン酸放出のメカニズムを詳しく追及し、論文を投稿する準備を行っている。当初の計画では、胎児期の虚血における神経毒性が、成熟期の虚血時と同様のメカニズムで起きているのかを調べる予定であったが、別府氏は、虚血だけにとどまらず、他の脳病態における、グリア信号の関与も明らかにしていきたいと考えるようになった。本研究では、虚血ほど極端な状況ではないが、神経細胞が過剰な興奮状態になるてんかん発作に着目した。てんかん発作時において、上記の研究で明らかにしたグリア細胞によるシナプス伝達増強作用が、てんかん発作時にもはたらいていることを予想し、研究を進めている。平成26年度の当初の研究計画では、虚血時における過剰なグルタミン酸が、グリア細胞から放出されているのかを同定し、その放出メカニズムを調べることまでであった。実際には、虚血時におけるグリア細胞からの過剰信号メカニズムを解明しただけでなく、正常時のグリア活動においても、類似したメカニズムによって興奮性シナプス応答を亢進させる機能が備わっていることを発見した。さらに、このようなグリア細胞によるシナプス増強作用のメカニズムについても詳しく調べている。
諸外国における調査個票(ミクロデータ)の多角的結合的利用の経験-その制度的組織的状況にかんする調査研究-

1996-1998年度にかけて統計審査会の答申『統計行政の新旧中長期構想』(1985年と95年)が提起した1)データリンケージ計画、2)ミクロデータの公開、3)行政記録による統計作成等の方針を受けて、研究課題をつぎのように設定し、各回の状況の文献調査・実態調査とデータ解析実験を行った。(一)ミクロデータの法規定と匿名化措置およびミクロデータの公表・利用形態(二)統計調査間マッチング様式と調査様式・機構(三)行政記録による統計調査の補完様式とセンサス代替様式(行政→統計レジスター)(四)(一)(三)にたいする被調査者の権利保護のための法律的制度的措置と管理・運用の実態。この研究課題は、わが国では経験と研究がほとんど蓄積されていない領域であるから、本計画研究班では、ミクロデータの公開と利用に関する基本的な課題について、欧米諸国における先進的な経験を詳細に調査・分析し、ミクロデータが公開されるための法律的技術的な方向性とその社会的基盤が何であるかを析出した。その結果、法的技術的条件としては、旧来の統計目的外利用と区別されるミクロデータ規定、事実上の匿名性概念とその技術的定式化を明らかにした。また、ミクロデータ公開の社会的な条件(Data-Culture)としては、(1)ミクロ分析が高い公共性を備えていることと、(2)政府統計だけでなく、社会調査のミクロデータ共有システムを先進諸国は創出していることであって、それが、データと保護運動の強まりにもかかわらず、ミクロデータの科学研究利用ファイル(Scientific Use File)化、さらにはPublic Use File化を推進させてきた基本的な要因であると考えられる。そのような視点から具体的政策提言を行った。本研究プロジェクトの課題は、先進主要国におけるミクロ標本データの開示状況、および調査個票データ行政個別情報の多角的結合的利用にかんする組織化・制度化の動向を分析し、国際的な視野から、統計作成活動が肥大化し、「統計大国」と形容されているわが国の統計政策の将来方向を提示することである。研究課題が、わが国では統計審議会の答申『統計行政の新旧中長期構想』(総務庁統計局統計基準部監修)において提起されているが、ほとんど研究の蓄積や実践的な経験がなされていない新しい分野であるために、文字通り諸外国の先進的な経験を調査・紹介することが、本研究プロジェクトにおける初年度の基本的な課題であった。そのために、本研究のスタッフと、研究協力者平井文三(九州大学法学部)は、調査対象国をアメリカ、ドイツ、フランス、日本、韓国およびオーストラリアと設定して、(1)行政・統計レジスターの制度的組織的条件、(2)ミクロデータの開示の実情と社会的技術的条件、および(3)統計調査間のデータリンケージの制度的技術的条件について、その実態と動向にかんする文献収集と資料調査を実施した。そして、研究事項(1)(3)にかんする公刊・未公刊の文献資料を系統的に整理し、研究課題の全体的な輪郭と研究の方向性を概括するとともに、部分的に調査対象国における実地調査を実施した。その成果は、日本統計学会、総務庁統計局ミクロデータ利活用研究会および本重点領域主催の福岡国際シンポジウム)において基礎報告として発表することによって、国内外の関係機関との連携を確保し、本研究プロジェクトにとって欠くことができない本格的な実地調査(次年度に予定)の足掛かりを得た。本計画班の研究は、統計審議会の答申『統計行政の新旧中長期構想』を基点として、研究課題を(1)ミクロデータの開示の実情、(2)統計調査間のデータリンケージの動向、および(3)行政・統計レジスターの展開と設定し、それぞれの技術的組織的側面と制度的社会的側面にかんする文献・資料調査を実施した。

調査研究では、欧米諸国においては、データリンケージの典型的な形態であるレジスター統計問題が大きな展開を見せていたために、研究が、課題(3)に傾斜したことを反省し、本年度は研究課題をつぎのように再確認し、本格的な考察を展開した。(一)ミクロデータの開示状況、(二)統計調査間の個票データの結合様式,とくに調査機構の類型/調査形態とマッチング様式、(三)行政記録による統計作成の補完様式とセンサス代替様式(行政→統計レジスター)(四)調査個票の公表・利用形態(五)(一)(四)にたいする被調査者の権利保護にかんする法律的制度的措置と管理・運用の実態それを要括すると、ミクロデータを一般に公開する課題は、調査個票が被調査者のプライバシーにかかわり、その秘密保護が統計調査が成り立つ決定的な前提条件であるだけに、ミクロデータの匿名化と提供にかんする法律的行政的な手続きはもとより、ミクロデータの利用を受容する社会的な条件(Data-Culture)を考察することが重要である。そして、(1)ミクロ分析が高い公共性を備えていることと、(2)政府統計だけでなく、社会調査のミクロデータの共有システムを創出したことが、データ保護運動の強まりにもかかわらず、ミクロデータのScientific Use File化、さらにはPublic Use File化を推進させてきた基本的な要因であることを洞察している。本計画研究では、研究課題を、統計審議会の答申『統計行政の新旧中長期構想』(1985年と95年)が提起した1)データリンケージ計画、2)ミクロデータの公開や3)行政記録による統計作成等の方針を受けて、つぎのように設定した。(一)ミクロデータの法規定と匿名化措置およびミクロデータの公表・利用形態(二)統計調査間のマッチング様式と調査様式・機構(三)行政記録による統計調査の補完様式とセンサス代替様式(行政→統計レジスター)(四) (一)(三)にたいする被調査者の権利保護のための法律的制度的措置と管理・運用の実態研究課題は、わが国では経験と研究がほとんど蓄積されていない領域であるから、本計画研究では、ミクロデータの公開と利用にかんする基本的な課題について、欧米諸国における先進的な経験を調査・分析し、ミクロデータが公開されるための法律的技術的な方向性とその社会的基盤を析出した。それは、法的技術的条件としては、旧来の統計目的外利用と区別されるミクロデータ規定、事実上の匿名性概念とその技術的定式化を明らかにしたことである。また、ミクロデータ公開の社会的な条件(Data-Culture)は、(1)ミクロ分析が高い公共性を備えていることと、(2)政府統計だけでなく、社会調査のミクロデータの共有システムを創出したことであって、それが、データ保護運動の強まりにもかかわらず、ミクロデータのScientific Use File化、さらにはPublic Use File化を推進させてきた基本的な要因であると考えられる。
ヒトピルビン酸キナ-ゼcDNAを用いた遺伝子治療法の基礎的研究

遺伝性溶血貧血の遺伝子治療法の確立を目的として,先ずヒトもしくはマウス血液細胞中への、ヒトL型ピルビン酸キナ-ゼ(PK)cDNAの導入をはかった。すなわち,レトロウィルスベクタ-(pMNSM)DNAにヒトL型PK cDNAを挿入し,LPKレトロウィルスプラスミドpMNーPKLを作製した。次にpMNSMーPKL DNAもしくはpMNSMDNAを各々別に,パッケ-ジング細胞株GP+env Amー12中にリン酸カルシウム法にて導入させた。細胞株はamphotropic細胞株であるが,この細胞株より得られたウィルス液の力価は1×10^4/ml低値であった。そこで、GP+86というecotropic細胞株に各DNAを導入し、それぞれのDNAに対応するecotropic細胞株とamphotropic細胞株を共培養することで,約1×10^6/mlと高力価のウィルス産生細胞株(ヘルパ-細胞)を得ることができた。このヘルパ-細胞染色体には明らかにpMNSMーPKL DNAが組み込まれていた。しかも、ヒトL型PKがmRNAレベルならびに蛋白質のレベルで発現していることが確認できた。次にこのヘルパ-細胞培養上清とNIH3T3細胞、FDCPー2(マウス白血病細胞株),HEL,KU812(ともにヒト白血病細胞株)の各細胞を共培養することで,これらの細胞をレトロウィルスで感染させた。被感染細胞染色体にはやはり,pMNSMーPKL DNAの組み込みがみとめられ、さらにヒトL型PK mRNAの発現がノザン法ならびにRTーPCR法で確認された。現在、マウス骨髄幹細胞(Lyn^ー,cーkit^ー)の濃縮をFACSにておこない,この細胞に上記と同様の方法でPMNSMーPKL DNAを導入し,マウスに骨髄移植を行い、生着した血球細胞中にヒトL型PK mRNAの発現をみとめるか否かを検討中である。この一連の研究結果は、PK異常に伴う遺伝性溶血性貧血の遺伝子治療法確立の為に大変重要な示唆を与えてくれるものである。
網羅的なグアニジン含有アミノ酸合成を基盤とした高難易度枝分かれペプチドの合成研究

枝分かれ状のペプチド抗生物質「スタロバシンI」は、メチシリン耐性菌に対しても強力な抗菌活性を示す新規作用機序を有する。本研究では、1N,O-アセタールを介したかさ高い特殊アミノ酸同士の連結、2高度に酸化されたグアニジン含有特殊アミノ酸の効率的合成、3特殊アミノ酸が連続するペプチド鎖の伸長、といった課題を解決し、世界初の全合成を達成する。また、独自に合成した特殊アミノ酸の立体異性体や構造類似化合物を用いて類縁体合成へ展開し、詳細な構造活性相関を解明する。
神経細胞の運命決定および動態設御における細胞外マトリックス・リモデリングの役割

悪性転換抑制遺伝子として発見されたRECKがマウス胎児では神経前駆細胞(NPC)に高発現しており、その欠損によってNPCの分裂低下と早期分化が起こることを見出した。この現象の解析から、ReckがADAM10によるNotchリガンドのsheddingを抑制することが分かった。また、神経筋投射が起こる胎生後期の横隔膜において、神経筋接合部(筋細胞側の二次襞)に急速なReckの蓄積が起こることを見出した。1)膜結合型MMP制御因子RECKを欠損したマウスは、胎生10.5日(E10.5)前後で血管の発達不全を呈して死ぬことが明らかとなっている。そこで、E10.5以降のマウス発生におけるRECKの役割を明らかにするために、正常マウス胎児を用いた免疫組織化学的検索を行った。その結果、E13.514.5胎児の筋肉においてRECKの高い発現が認められた。興味深いことに、RECK抗体による染色像は、筋肉発生に関わるbHLHファミリー(MRFファミリー)転写因子の内、MRF4の局在と良く一致し、MyoDの局在とは異なっていた。培養細胞を用いた実験から、RECK遺伝子の発現がMRF4により活性化されMyoDにより抑制されること、RECKの強制発現が筋管形成を抑制すること、逆にMMPの強制発現が筋管形成を促進することなどが見出された。これらの結果より、RECKがmyogenic regulatory factorsによる特異的な発現制御を受け、筋肉発生の初期には抑制的、後期には促進的な役割を果たすことが示唆された。また、これまでMRFファミリーの各メンバーは、in vivoでの発現の時期や場所が異なるだけで、生物活性は互いに似ていると考えられてきたが、RECKの制御に関しては全く逆の活性を示すことが分かった。2)がん抑制遣伝子Rbを欠損したマウスに発生する甲状腺腫瘍において、従来がん遺伝子として知られていたN-rasが、がん抑制因子として働くことを、多重変異マウスを用いて明らかにした。3)細胞骨格制御タンパク質Sept4が、正常な形態と活動性を持った精子の形成に必須であることを見出した。胎生期の野生型マウス中枢神経系におけるRECKの発現部位は、神経幹細胞(あるいは神経前駆細胞)とされるNestin陽性細胞とほぼ一致する。RECK欠損マウスは、血管発生の異常を伴う胎生致死形質(E10.5)を示すが、大脳皮質においては神経細胞の減少および早期分化が観察された。これに符合して、神経幹細胞のself renewal能の著しい低下も観察された。これらの表現型はNotchシグナル伝達経路を構成する遺伝子群が欠損したマウスの表現型と酷似していたため、RECK欠損マウスにおけるこの経路の異常について解析を進めた(村口輝行、高橋智聡ら、未発表)。また、E10.5以降の神経発生や成体の神経系におけるRECKの役割を明らかにする目的でコンディショナルRECK欠損マウスの作成を進めた(糸原重美博士らとの共同研究、未発表)。その他の成果として、RECKの軟骨分化における役割(近藤俊哉ら)、膜結合型プロテアーゼの制御における役割(三木、高橋ら)などを明らかにした。また、共同研究において、脳の慢性低還流に伴う白質病変にMMP-2が重要な役割を演ずること(中治、富本ら)、細胞骨格系タンパク質Sept4がパーキンソン病に代表されるa-synuclein関連神経変性疾患に対して抑制的に働く可能性(猪原、木下ら)、Rb欠損によって起こる甲状腺濾胞傍細胞腫瘍においてN-rasが抑制因子として働くこと(高橋、Ewenら)、神経分化や機能に関わる低分子量Gタンパク質Rap1がRalGDSファミリーの一員であるRgl3を介して単量体アクチン活性化因子profilin IIと結合すること(Xu、北山ら)などが示された。神経細胞の移動や突起伸長などの挙動を支える重要な要素として細胞外マトリックス(ECM)があるが、従来の研究はECM受容体やそのシグナル伝達機構などに重点が置かれたものが多かった。申請者らは、神経分化を含む多くの生命現象に関わることが知られているRASシグナル伝達系の機能的標的遺伝子としてRECKを発見し、この遺伝子がECMリモデリングの主要な推進役であるマトリックス・メタロプロテアーゼ(MMP)の膜結合型制御因子をコードすることを見出した。本課題では、RECK欠損マウスの解析を通して、神経回路構築におけるECMおよびECMリモデリングの役割に洞察を加えることを目的として研究を進めている。その分子機構を解析する中で、RECKがADAM10によるNotchリガンドのsheddingを抑制することが見出された(村口輝行、高橋智聡ら、Nat. Neurosci.)。

また、Reckが出生直前の横隔膜において、神経筋接合部の二次ひだに集積することが見出された(川嶋ら、J. Neurochem.)。また、共同研究において、細胞骨格系タンパク質Sept4がパーキンソン病に代表されるalpha-synuclein関連神経変性疾患に対して抑制的に働くこと(猪原、木下ら、Neuron)、神経分化や機能に関わる低分子量Gタンパク質Rap1がRa1GDSファミリーの一員であるRg13を介して単量体アクチン活性化因子profilin IIと結合すること(Xu、北山ら、Cell Signalling)などを明らかにした。RECK遺伝子は、ECMリモデリングの主要な推進役であるマトリックス・メタロプロテアーゼ(MMP)の膜結合型制御因子をコードし、ショウジョウバエからヒトまで単一遺伝子として保存されている。RECKの機能解析は、ECM役割解明にも役立つと考えられる。Reckはマウス胎生中期(E14)には骨格筋線維表面に強く発現されているが、培養筋芽細胞ではその発現が低く、強制発現によって筋管形成が阻害されることから、基底膜形成を伴う筋線維の成熟期に発現が高まるものと考えられた(越前谷らOncogene 2005)。今回、成体マウスの免疫組織化学検索から、Reckが神経筋接合部のシナプス後部二次襞に多く局在し、この集積が胎生終期(-E18)に起こることを見出した(川嶋らJ. Neurochem. 2008)。この他、精製RECKタンパク質が鈴状の2量体形成しMMP7によるfibronectinの分解を阻害すること(大村らJBC 2009)、また、Reck欠損線維芽細胞の解析から、Reckが接着斑(focal adhesion)と運動保針性の安定化に必要であることなどを見出した(森岡らOncogene 2009)神経細胞の移動や突起伸長などの挙動を支える重要な要素として細胞外マトリックス(ECM)がある。我々は、神経分化を含む多くの生命現象に関わることが知られているRASシグナル伝達経路の機能的標的遺伝子としてRECKを発見し,これがECMリモデリングの主要な推進役であるマトリックス・メタロプロテアーゼ(MMP)の膜結合型制御因子をユードすることを見出した。本研究課題では、Reck変異マウスに見られる神経系の異常とそのメカニズムの解明を通して、神経回路構築におけるECMおよびECMリモデリングの役割に洞察を加えることを目的としている。これまでの研究から、発生初期マウスの神経管においてReckはADAM10によるNotchリガンドのsheddingを抑制し、神経分化の抑制と神経前駆細胞の増殖をもたらされること、また、出生直前のマウスでは神経筋接合部の成熟に伴ってReckがこの部位に集積することが見出されている。平成21年度は、RECKタンパク質の性状、細胞レベルでの機能、RECK遺伝子の発現制御機構などについて成果を発表した。すなわち、RECKタンパク質は釣り鐘状の2量体を形成し、MMP7によるfibronectin分解を阻害する。また、RECKは細胞移動のdirectional persistenceにとって重要であることが示唆された。さらに、RECKの発現が細胞密度、血清濃度、酸素濃度などによる制御を受けること、またその際に働く分子経路を明らかにした。
乳タンパク質由来細胞増殖分化調節物質の検索とその活性構造相関及び作用機作の解明

1.「牛乳カゼインおよびその酵素分解物中の細胞増殖調節機能因子の検索」については次のような知見が得られた。即ち1)牛乳κ-カゼインを酵素トリプシンで短時間分解して得られたペプチドについて、それぞれBALB/c3T3細胞に対する細胞増殖促進能を検索した結果、いくつかのペプチドに活性が見られた。そのうちP-23についてはアミノ酸配列がκ-CN(f35-46)と判明し、P-25についてはN末端領域が判明した。2)牛乳αsl-カゼイントリプシン分解ペプチド中にBALB/c3T3細胞の増殖を抑制するペプチドが存在することが判明した。そのアミノ酸配列はαsl-CN(f165-193)と同定された。2.「牛乳カゼイン由来細胞増殖機能因子の作用機構の解明」については次のような知見が得られた。即ち前述の細胞増殖促進活性ペプチドP-25が、細胞内情報伝達に重要な役割を果たしていると考えられている細胞内チロシンキナーゼの活性を促進していることが判明した。3.「培養細胞を用いた消化管細胞増殖分化因子検索系の構築」については次のような知見が得られた。小腸上皮細胞の増殖分化調節に神経伝達物質である神経ペプチドが関与しているのではないかという考えのもと、未分化小腸上皮細胞株IEC-6において代表的な神経ペプチド、サブスタンスPの受容体が発現しているかを解析した。その結果通常培養下のIEC-6にサブスタンスP受容体のmRNAが発現していることを示唆する結果が得られた。
極性上皮細胞における有機イオントランスポータの細胞膜局在化機構の解明

小腸や腎臓などの極性上皮細胞では、血管側側底膜と管腔側刷子縁膜に機能特性の異なる有機イオントランスポータが局在し、薬物輸送の方向性(吸収・分泌)の決定に重要な役割を果たしている。しかし、これら有機イオントランスポータの細胞膜局在化機構については未だ不明な点が多い。本研究では、薬物トランスポータとしてペプチドトランスポータ(PEPT1)を選択し、蛍光蛋白質(EGFP)との融合蛋白質として極性上皮細胞LLC-PK_1に安定発現させ、PEPT1の細胞膜局在化機構について検討を加えた。PEPT1のC末端側アミノ酸3残基(PDZドメインによって認識されうる配列:PDZ-interacting domain)を欠失させた場合、主にライソゾームと側底膜に局在が認められ、主に頂側膜に発現している野生型とは明らかに異なっていた。従って、PEPT1のPDZ-interacting domainが細胞膜局在に関与していることが考えられ、その機構について詳細に解析した。パルス-チェイス法と細胞表面ビオチン化により生合成後のPEPT1の細胞膜発現挙動について検討したところ、PEPT1変異体も野生型と同様に頂側膜へ輸送されるものの、頂側膜に発現後の消失が野生型に比べて速く、速やかに内在化していることが明らかとなった。以上の結果より、PEPT1のC末端側3残基を欠失させることによって、選別過程や輸送過程には影響が認められないものの、頂側膜における保持機構に影響することが示唆された。PEPT1と相互作用するPDZ蛋白質は現時点では不明であるが、PEPT1のPDZ-interacting domainを介した蛋白質相互作用によって頂側膜においてPEPT1が保持されるものと考えられる。本研究では、薬物トランスポータとして有機アニオントランスポータ(OAT-K2)とペプチドトランスポータ(PEPT1,PEPT2)を選択し、蛍光蛋白質(EGFP)との融合蛋白質として極性上皮細胞(MDCK, LLC-PK_1)に安定発現させ、各トランスポータの細胞内動態について検討を加えた。OAT-K2のN末端側にEGFPを融合させMDCK細胞に発現させた場合、EGFPのシグナルは観察されず、OAT-K2のC末端側を認識する抗体を用いた検討から、OAT-K2は細胞内でプロセシングを受け、約40kDの蛋白質として頂側膜に発現していることが判明した。また、OAT-K2のN末端側はプロテアソームにより速やかに分解されることが示唆された。さらに、EGFPとPEPT1およびPEPT2との融合蛋白質、またこれらのC末端側アミノ酸3残基(PDZドメインによって認識されうる配列)を欠失させた変異体をLLC-PK_1細胞に発現させた場合、PEPT2では変異の影響は認められずともに頂側膜に局在したのに対し、PEPT1では変異体の細胞内への局在が認められた。従って、PEPT1はPDZドメインを有する蛋白質との蛋白質間相互作用を介して頂側膜局在が決定されている可能性が推察された。現在、PEPT1の生合成後の細胞内挙動について検討を行い、PDZ蛋白質との相互作用が細胞膜局在を決定する機構について解析を進めている。
脳幹から脊髄内痛覚受容神経回路網への下行性修飾:in vitro脳幹脊髄標本を用いた検討

本研究においては、若齢ラットin vitro脳幹・脊髄標本に膜電位感受性色素を用いた光学的神経活動イメージング法を応用し、脳幹から脊髄に至る痛覚情報神経処理機構の全容を解明することを目的とした解析を行った。まず脊髄レベルにおける痛覚情報神経処理機構について、脊髄スライス標本に光学的イメージング法を応用し、麻酔臨床で頻用されている局所麻酔薬が脊髄後角神経機構に及ぼす作用をニューロンネットワーク機構のレベルで解明することに成功した。すなわち、局所麻酔薬リドカインとブピバカインについての実験的検討により、これら局所麻酔薬は濃度依存的に脊髄後角神経回路網におけるシナプス伝達を選択的に遮断すること、その作用は脊髄後角浅層(laminae I-II)よりも深層(laminae III-IV)においてより顕著であることを明らかにした。本研究成果は第82回日本生理学会大会(平成17年5月、仙台市)などで発表予定であり、また、英文原著論文として発表するため現在その原稿を準備中である。次いで、脊髄レベルにおける痛覚情報神経処理機構に対する脳幹からの下降性修飾について解析を行った。若齢ラットより脳幹および脊髄を一塊として摘出した。記録用チェンバー内において摘出脳幹脊髄標本の腹側脳幹部が上向き水平になるように置き、脳幹・脊髄移行部で標本を緩やかに曲げ、脊髄(下部頚髄)の横断面が上向き(水平)になるよう固定した。この脊髄(下部頚髄)の横断面における神経活動を光学的イメージング法により解析しうるシステムを完成させた。現在、脳幹部(中脳、橋、延髄)への各種刺激(電気刺激、化学刺激)に対する脊髄後角神経機構への影響を解析中である。今後、新しい鎮痛方法を開発することを念頭に、脳幹からの脊髄痛覚神経機構に対する抑制作用を増強するため薬理学的検討を追加する予定である。脳幹部からの下行性修飾が脊髄後角の痛覚関連細胞に及ぼす影響を細胞レベルで詳細に検討するため、まずin vitro脳幹脊髄標本を用いた実験系を確立した。具体的には、エーテルによる深麻酔下で幼若ラット(36日齢)から脳幹・脊髄を摘出。標本を酸素化(95%O_2、5%CO_2)人工脳脊髄液(組成in mM):125NaCl,4KCl,2CaCl_2,1 MgSO_4,0.5 NaH_2PO_4,26 NaHCO_3,30glucose, pH7.4)により27°Cで連続的に灌流し、維持する。本標本においては、頚髄前根より呼吸神経出力を8時間以上にわたって記録可能であり、組織生存性には問題がないことを確認した。さらに脊髄後角ニューロン群の応答性につき、膜電位光計測法(Okadaら,2001)を適用した解析を行うため、横断面にスライスした標本を膜電位感受性色素(di-4-ANEPPS)で染色し、高速高感度光計測システム(MiCAM01)を用いて、後根刺激に対する後角部各領域の膜電位応答を動画像として計測することに成功した。この方法により脊髄後角神経回路網における後角多細胞間の相互作用が解析可能となった。そこで臨床上で頻繁に用いられている局所麻酔薬のlidocaine, bupivacaineを1,10,100μMの各濃度で人工脳脊髄液中に溶解し、脊髄後角神経回路網における作用の解析を試みた。その結果後根電気刺激による反応がシナプス前に比べてシナプス後で強く抑制されていることから、これらの局所麻酔薬が神経伝達レベルで作用していることが示唆された。今後はこの実験系を用いることで、現在用いられている各種鎮痛薬の機序の解明及び、脳幹部をターゲットとする新しい薬理学的鎮痛法開発が可能になると予想される。本研究においては、脳幹から脊髄への下行性神経修飾機構、および脊髄レベルにおける痛覚関連ニューロン機能を、神経回路網レベルで検討することを目的とした。そのため、平成14年度には、in vitro脳幹脊髄標本およびin vitro脊髄標本を対象とした高速光計測システムによる膜電位イメージングの方法論を確立した。in vitro脳幹脊髄標本では、標本の生存性について、脳神経(舌下神経根)あるいは脊髄神経(頚髄C4前根)よりの呼吸神経活動モニターを行うことにより確認を行った。平成15年度には、この計測法とin vitro標本とを組み合わせた方法論を応用して、痛覚神経回路網機能に関し、以下の解析を行った。1.麻酔科臨床において使用されている局所麻酔薬であるリドカインとブピバカインに注目し、それらの脊髄後角内痛覚神経回路網への作用を解析した。この解析により、リドカインとブピバカインは、作用の強さと持続時間に差があるものの、ともに後角内痛覚神経回路網においてシナプス伝達を抑制すること、その作用は浅層(lamina I-II)よりも深層(lamina III-IV)において、より強く認められることを明らかにした。この研究成果は、英文原著論文として発表すべく、現在、原稿を準備中である。2.最近、神経科学の分野で注目されている細胞外ATPの神経回路網機能への修飾作用に着目し、脊髄後角内の痛覚神経回路網機能に対する細胞外ATPの作用を解析した。細胞外ATPは,後角神経回路網の神経活動に対し、P_2X受容体を介する直接的な増強および分解産物アデノシンを介する抑制の二面的な作用を有すること、細胞外ATPによる神経活動増強作用は浅層部におけるよりも深層部においてより強く発揮されることを認めた。

本研究においては、若齢ラットin vitro脳幹・脊髄標本に膜電位感受性色素を用いた光学的神経活動イメージング法を応用し、脳幹から脊髄に至る痛覚情報神経処理機構の全容を解明することを目的とした解析を行った。まず脊髄レベルにおける痛覚情報神経処理機構について、脊髄スライス標本に光学的イメージング法を応用し、麻酔臨床で頻用されている局所麻酔薬が脊髄後角神経機構に及ぼす作用をニューロンネットワーク機構のレベルで解明することに成功した。すなわち、局所麻酔薬リドカインとブピバカインについての実験的検討により、これら局所麻酔薬は濃度依存的に脊髄後角神経回路網におけるシナプス伝達を選択的に遮断すること、その作用は脊髄後角浅層(laminae I-II)よりも深層(laminae III-IV)においてより顕著であることを明らかにした。本研究成果は第82回日本生理学会大会(平成17年5月、仙台市)などで発表予定であり、また、英文原著論文として発表するため現在その原稿を準備中である。次いで、脊髄レベルにおける痛覚情報神経処理機構に対する脳幹からの下降性修飾について解析を行った。若齢ラットより脳幹および脊髄を一塊として摘出した。記録用チェンバー内において摘出脳幹脊髄標本の腹側脳幹部が上向き水平になるように置き、脳幹・脊髄移行部で標本を緩やかに曲げ、脊髄(下部頚髄)の横断面が上向き(水平)になるよう固定した。この脊髄(下部頚髄)の横断面における神経活動を光学的イメージング法により解析しうるシステムを完成させた。現在、脳幹部(中脳、橋、延髄)への各種刺激(電気刺激、化学刺激)に対する脊髄後角神経機構への影響を解析中である。今後、新しい鎮痛方法を開発することを念頭に、脳幹からの脊髄痛覚神経機構に対する抑制作用を増強するため薬理学的検討を追加する予定である。
小児の難治性糸球体腎炎におけるHicー5の役割解明

本研究ではHic-5の糸球体発現と糸球体細胞機能(増殖、接着、遊走等)への影響の有無を検討した。ヒト小児及びラット腎炎組織でHic-5の糸球体内発現が亢進し、メサンギウム細胞増殖やECM蓄積と相関がみられ、Hic-5が腎炎進展に関与する可能性が示された。培養メサンギウム細胞では、TGF-βがHic-5の発現を亢進させ、siRNAによるHic-5の発現抑制はECMリモデリングを抑制した。以上からHic-5は腎炎進展に関与し、その制御による治療応用が期待された。平成20年度は、小児の難治性糸球体腎炎やラット進行性腎炎においてHic-5の糸球体での発現と局在を明らかにし、糸球体細胞増殖や細胞外基質(ECM)増加との関連性の有無を明らかにすることが目的であり下記の研究成果が得られた。1)ヒト及びラット腎炎でのHic-5の免組織化学的検討小児の進行性腎疾患(IgA腎症、紫斑病性腎炎、巣状糸球体硬化症)の症例そやそれらと同様の組織像を呈するラット進行性腎炎モデル(片腎Thy-1腎炎)の腎組織を用いて、Hic-5の発をした。ヒト腎炎組織及びラット進行性メサンギム増殖性腎炎の0日,3日,1,2,4,8,14週の組織で腎炎糸球体ではHic-5の発現が亢進し、メサンギウム細胞増殖やECM蓄積との相関がみられ、Hic-5が腎炎進展に関与する可能性が示された。さらに、ヒトとラットの臨床データに関して尿蛋白ともHic-5は相関し臨床病像とも関連した。2)増殖因子刺激下での細胞培養実験や抗酸化剤を用いた動物実験でのHic-5の発現我々は、ヒト及びラットメサンギウム細胞の培養細胞を用いて、TGF-β等の増殖因子がHic-5の発現を亢進させるかを検討した。TGF-βは、濃度依存性及び時間依存性にHic-5の発現を亢進させた。また、ラットの腎炎モデルにアンジオテンシン阻害剤や抗酸化剤を使用して活性酸素を抑制することによりHic-5の発現が低下したことから腎炎進行因子がHic-5の発現に影響することが明らかとなった。以上のから、Hic-5が進行性腎炎の重要な指標となるばかりでなく、治療標的となる可能性が考えられた。尚、これらの研究成果を米国腎臓学会で発表した。平成21年度は、小児の難治性糸球体腎炎やラット進行性腎炎においてHic-5の糸球体での発現の役割をさらに追求することが目的であり下記研究成果が得られた。1)ヒト及びラット腎炎での免疫組織化学的検討小児の進行性腎疾患(IgA腎症、紫斑病性腎炎、巣状糸球体硬化症)の症例やそれらと同様の組織像を呈するラット進行性腎炎モデル(片腎Thy-1腎炎)の腎組織を用いて、Hic-5の発現が活性化メサンギウム細胞マーカーであるα平滑筋アクチンの発現と相関し腎炎の活動期に強く発現することが判明した。2)増殖因子刺激下での細胞培養実験でのHic-5の発現ヒト及びラットメサンギウム細胞の培養細胞を用いて、線維化促進因子であるTGF-βが、濃度依存性及び時間依存性にHic-5の発現を充進させることを明らかにしてきたが、強力な増殖因子であるPDGF-BBは、逆にHic-5の発現を低下させた。また、共焦点顕微鏡を用いてHic-5の発現が細胞接着部位でパキシリンなどと協調して作用する可能性があることが分かった。3)腎臓の発生での検討腎臓の発生において未分化なメサンギウム細胞は腎炎活動期のメサンギウム細胞と同様に活性化状態にあるが、Hic-5の発現も未分化なメサンギウム細胞にみられることからHic-5は腎炎と同様に腎発生にも役割を果たす事が明らかとなった。以上の成果から、Hic-5が進行性腎炎の重要な指標となるばかりでなく、治療標的となる可能性が考えられた。尚、研究成果を米国腎臓学会等で発表した。平成22年度の目的は、小児の難治性糸球体腎炎やラット進行性腎炎においてHic-5の糸球体発現の役割を別の観点から発展させ追求することであった。腎炎進展でみられるHic-5の発現と役割が腎臓の発生過程でも共通しているかを確認し、Hic-5の腎炎進展での役割を検討した。腎臓の発生において未分化なメサンギウム細胞は腎炎活動期のメサンギウム細胞と同様に活性化状態にあるが、Hic-5の発現は未分化メサンギウム細胞にみられ、この発現はHic-5と構造が類似するパキシリンや関連蛋白であるFAK、ILKの発現と全く異なるものであった。

さらに、Hic-5の活性化誘導分子である活性酸素とその産生機構NADPHオキシダーゼの発現も調べたが、実際にHic-5の発現だけでなく活性酸素も腎発生で重要な役割を果たしていることが明らかとなった。このことからHic-5やHic-5誘導因子である活性酸素の適切な調整が腎臓発生に重要であるだけでなく、腎炎進展を抑制しうる重要な機構であることが推測された。また、本年の計画として同様に行ったsiRNAを用いたHic-5の発現制御実験では、Hic-5発現は細胞接着分子の機能に影響しコラーゲンゲル収縮に関与することが明らかとなり(未発表データ)、今後Hic-5ノックアウトマウスを用いて腎炎モデルでの検討を進めている。尚、研究成果は国際小児腎臓病学会等で発表した。現在までの判明した結果は、国際学会雑誌等に投稿中である。
幼若期ストレスによる食欲制御メカニズムの破綻

本研究の目的は、幼若期に形成されるPrRP産生ニューロンーオキシトシン産生ニューロンーセロトニン作動性ニューロン回路が、幼若期ストレスによって可塑的に変化し、将来の摂食行動を規定しているという仮説の検証を行うことである。まず、成体においてPrRP産生ニューロンーオキシトシン産生ニューロン回路が摂食を抑制するかを検討した。PrRP遺伝子欠損マウスとオキシトシン受容体遺伝子欠損マウスでは、野生型と比較して一回摂食量が暗期特異的に増大していた。また、一回摂食量を決定する末梢の満腹物質であるコレシストキニン(CCK)を投与すると、野生型では視床下部室傍核、視索上核、分界条床核に存在するオキシトシン産生ニューロンが活性化されたが、PrRP遺伝子欠損マウスではこの活性化が抑制された。これらのことから、暗期においてCCKはPrRP-オキシトシン系を介して満腹信号を伝達している可能性が示唆された。更に、成体においてオキシトシン産生ニューロンーセロトニン作動性ニューロン回路が摂食を抑制するかを、オキシトシン受容体遺伝子座にVenusをノックインしたマウスを利用して検討した。摂食あるいはCCK投与によって、オキシトシン受容体を発現するセロトニン作動性ニューロンの活性化が確認された。一方で、母仔分離ストレスによって、仔のオキシトシン産生ニューロンが活性化されることを明らかにした。昨年度の結果とあわせると、幼若期ストレスによるオキシトシン系の活性化が将来の肥満に影響を与える可能性が示唆された。さらに、PrRP産生ニューロンーオキシトシン産生ニューロンーセロトニン作動性ニューロン回路を詳細に明らかにする目的で、PrRP産生ニューロンあるいはオキシトシン産生ニューロンを部位・時間特異的に破壊できるトランスジェニックラットを作製した。24年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では、幼若期に形成されるPrRP産生ニューロン-オキシトシン産生ニューロン-セロトニン作動性ニューロン回路が、幼若期ストレスによって可塑的に変化し、将来の摂食行動を規定しているという仮説の検証を行う。まず、成体においてPrRP産生ニューロン-オキシトシン産生ニューロン回路が摂食を抑制するかの検討を行った。24時間絶食後の明期あるいは暗期に再摂食させると、視床下部室傍核および視索上核のオキシトシン産生ニューロンが活性化された。しかし、PrRP遺伝子欠損マウスでは再摂食後のオキシトシン産生ニューロンの活性化が抑制された。一方で、コレシストキニンを投与すると、野生型マウスでは血中へのオキシトシン分泌が増大するが、PrRP遺伝子欠損マウスではその上昇が抑制された。これらのことからコレシストキニンはPrRP-オキシトシン系を介して摂食を抑制する可能性が示唆された。さらに、視索上核のオキシトシン産生ニューロンにPrRP受容体が発現していることを確認した。視索上核片を単離し、PrRPで処理をするとオキシトシンの放出が増大した。よって、視索上核のオキシトシン産生ニューロンにPrRPが働き、摂食を抑制する可能性が示唆された。一方で、幼若期ストレスによるオキシトシン放出の増大が将来の摂食行動へ与える影響をみるため、生後5日間マウスにオキシトシンを投与した。成熟後の雄では、オキシトシン投与群で体重が増加した。摂食量に変化はないが、酸素消費量が減少しており、これが体重増大の原因と考えられた。一方、雌では体重に変化はなかったが、摂食量が減少していた。しかし、酸素消費量も減少していたため、体重に変化がなかったと考えられる。

さらに、PrRP産生ニューロンーオキシトシン産生ニューロンーセロトニン作動性ニューロン回路を詳細に明らかにする目的で、PrRP産生ニューロンあるいはオキシトシン産生ニューロンを部位・時間特異的に破壊できるトランスジェニックラットを作製した。24年度が最終年度であるため、記入しない。生後5日間オキシトシンを投与した雄マウスにおける体重増加の表現型は週齢が進んでから現れたため、その解析が多少遅れ気味であるが、全体的にはおおむね順調に進んでいる。成体におけるPrRP産生ニューロン-オキシトシン産生ニューロン-セロトニン作動性ニューロン回路が摂食を抑制するかについて、阻害剤の局所投与、遺伝子欠損動物、部位特異的にPrRP産生ニューロンあるいはオキシトシン産生ニューロンを破壊できる遺伝子改変ラットなどを駆使して、ニューロンの活性化や遺伝子発現、神経内分泌、摂食行動を指標に検証を進める。また、幼若期ストレスによるPrRP産生ニューロン-オキシトシン産生ニューロン-セロトニン作動性ニューロン回路の変容について、母子分離ストレスによる遺伝子発現の変化とニューロンの活動を検討する。一方で、幼若期にオキシトシンを投与したマウスの脳内の遺伝子発現を検討し、上記の回路を含めてどの様な変化が起こっているのかを検討する。