hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
網羅的遺伝子発現解析による難治性動的アロディニアの新規治療標的分子の探索と同定

帯状疱疹性疼痛マウスモデルの動的アロディニアの発生には,一次求心性線維ではなく脊髄後角ニューロンの興奮性増大の関与が示唆された。さらに網羅的遺伝子発現解析を行い,脊髄後角におけるP2X4受容体, P2X7受容体, S1P3受容体の発現増加,および浸潤性Tリンパ球が動的アロディニアに関与することを見出した。P2X4受容体, P2X7受容体, S1P3受容体およびTリンパ球が帯状疱疹性動的アロディニアの新規治療標的になる可能性がある。衣服が擦れるといった動的な機械刺激により痛みが生じる動的アロディニアは神経障害性疼痛の代表的症状であるが,有効な治療薬はない。本研究は,申請者らが独自に作出した帯状疱疹による動的アロディニアのマウスモデルを用いた網羅的遺伝子発現解析により,難治性動的アロディニアの新規治療標的分子を同定することを目的として実施した。麻酔下in vivo細胞外電位記録法を用いた実験から,患部皮膚節を支配する頸骨神経ではなく,腰髄脊髄後角深部広作動域ニューロンの興奮性の増大が動的アロディニアの発生に関与することが示唆された。脊髄後角での主な抑制性神経伝達物質はグリシンである。シナプス間隙の抑制性グリシン濃度を増加させる目的でグリシントランスポーター2阻害薬を脊髄くも膜下腔内に投与すると動的アロディニアが顕著に抑制されたことからも,脊髄後角レベルの興奮性伝達の亢進が重要であるとの考えが支持された。そこで,帯状疱疹後神経痛マウスの患側脊髄で発現変化する遺伝子をAffimetrix社のGeneChipを用いて網羅的に解析し,動的アロディニア関連遺伝子を探索した。健常群と比較し帯状疱疹後神経痛群では2,030個のプローブセットに発現変化がみられた。発現増加した遺伝子のうちATP受容体サブタイプであるP2X7受容体に注目し,さらに検討を進めた。定量的RT-PCRにより患側脊髄におけるP2X7受容体mRNA発現増加を確認した。選択的P2X7受容体拮抗薬の脊髄くも膜下腔内投与は,単回投与により急性の抗アロディニア効果,反復投与により持続性の抗アロディニア効果を示した。P2X7受容体免疫活性は脊髄後角ニューロンとアストロサイトでは観察されたが,ミクログリアでは観察されなかった。本年度の研究から,難治性動的アロディニアの治療標的分子として,脊髄後角ニューロンとアストロサイトに発現するP2X7受容体を新規に同定した。今年度は次のことを明らかにした。(1)マイクロアレイ解析から見出された動的アロディニア発生遺伝子候補であるP2X4受容体は帯状疱疹痛期の脊髄後角ミクログリアで著明に発現が増加し,P2X4受容体拮抗作用を有する抗うつ薬パロキセチンの脊髄くも膜下腔内投与により動的アロディニアが抑制されたことから,ミクログリアで発現増加するP2X4受容体が動的アロディニアの発生に関与することが示唆された。(2)ニューロン興奮性マーカーc-Fos,ミクログリアマーカーIba-1, CD68,アストロサイトマーカーGFAPの脊髄後角における発現を調べ,脊髄後角ニューロンの興奮が帯状疱疹痛期でのみ顕著に上昇していること,ミクログリアの活性化も帯状疱疹痛期で特に顕著であること,アストロサイトの活性化は帯状疱疹後神経痛期においても活性化状態が維持されていることを明らかにした。(3)動的アロディニア発生における脊髄後角でのMAPKの活性化(リン酸化)の関与を検討し,ERKとp38MAPKの活性化が帯状疱疹痛期の動的アロディニアの発生に関与し,JNKの活性化は帯状疱疹痛期と帯状疱疹後神経痛期の両時期の動的アロディニアの発生に関与することを明らかにした。(4)マイクロアレイ解析結果から脊髄後角へのTリンパ球の浸潤を示唆する遺伝子発現変化がみられたことから,動的アロディニア発生へのTリンパ球の関与を検討した。脊髄後角へのTリンパ球の浸潤が帯状疱疹痛期でより顕著に観察され,リンパ球遊走阻害薬FTY720の投与により動的アロディニアの発生が抑制されたこと,帯状疱疹痛期マウスの脾臓から分離したヘルパーTリンパ球を健常マウスに脊髄くも膜下腔内投与することで動的アロディニアが生じたことから,脊髄後角に浸潤するTリンパ球,特にヘルパーTリンパ球が動的アロディニアの発生に直接的に関与する可能性が示唆された。今年度は以下のことを明らかにした。

(1)P2X4受容体活性化による動的アロディニア発生メカニズム:昨年度ミクログリアで発現増加するP2X4受容体が動的アロディニアの発生に関与することを見出した。今年度はP2X4受容体活性化以降の動的アロディニア関連メカニズムを解析した。動的アロディニア発生初期からP2X4受容体拮抗薬を脊髄くも膜下腔内に繰り返し投与すると,動的アロディニアの発生が抑制された。P2X4受容体拮抗薬の投与はミクログリアマーカーIba-1およびミクログリア由来痛み関連遺伝子BDNFのmRNA発現増加を抑制しなかったが,Cl-排出ポンプであるK^+-Cl^-cotransporter (KCC2)のmRNA発現低下を抑制した。また,trkB-Fcキメラタンパク質を動的アロディニア発生初期から脊髄くも膜下腔内に繰り返し投与すると,動的アロディニアの発生が抑制され,KCC2のmRNA発現低下も抑制された。以上から,P2X4受容体の活性化はミクログリアの活性化プロセス自体には関与しないが,その活性化によりBDNFが放出され,trkB受容体活性化によってKCC2発現低下が生じるという動的アロディニア発生メカニズムが明らかとなった。(2)動的アロディニア発生におけるSlP3受容体の関与:マイクロアレイ解析から見出された動的アロディニア発生遺伝子候補のSlP3受容体の関与を検討した。脊髄後角におけるSlP3受容体mRNA発現が帯状疱疹期と帯状疱疹後神経痛期の両時期で増加した。脊髄くも膜下腔内にSlP3受容体拮抗薬を単回投与すると帯状疱疹期と帯状疱疹後神経痛期の両時期の動的アロディニアが抑制された。以上から,SlP3受容体が帯状疱疹期と帯状疱疹後神経痛期の両時期の動的アロディニアの発生に関与することが示唆された。
電波見守りセンサ

本研究では,アレーアンテナの受信信号から固有値や固有ベクトルといった電波特徴量を抽出し,各状態・位置と,それら電波特徴量の関係を,各送受信機配置に対して実験により評価した.次に,その結果に基づき,電波特徴量に基づくサポートベクターマシーンを用いた状態識別法・位置推定法を提案した.また,位置推定に関して,すべての位置で学習(トレーニング)することは,事前の手間がかかり望ましくない.そのため,電波特徴量に基づき,学習していない位置もある程度の精度で推定できる位置推定法を提案した.以上の検討に基づき提案した電波センサによる状態識別精度・位置推定精度を,複数の実験により評価した.本研究では,カメラのようなプライバシー侵害が無く,また,人に何かを持たせたり,家に多くのセンサを設置せずに高齢者等の見守りが可能な電波センサの開発が目的である.平成25年度は,見守りに重要な転倒検出について検討した.まず,アレーセンサとドップラーセンサを用いて,アレーセンサから得られる複数の電波特徴量とドップラーセンサに基づく特徴量に基づく転倒検知法について検討した.その際,ドップラーセンサから見通し内にいる場合と,見通し外にいる場合について検討し,実験の結果,高い推定精度が得られることを確認した.また,アレーセンサのみを用いた転倒検知法についてもけんとうした.アレーセンサのみを用いた場合,見通し内及び見通し外の両方で,高い転倒検知精度を達成できることを実験により確認した.この方法は,転倒を転倒の前後を含めたシナリオとして学習し,機械学習によりう転倒を検知する方法である.さらに,学習したシナリオ以外の転倒も検知することを目指し,転倒をシナリオとして学習するのではなく,より短い時間長の観測窓を設定し,その窓をスライドさせていき,観測窓単位で転倒か否かを判定し,さらにその判定結果の出方によって転倒を検知する手法を提案した.提案手法は,任意のシナリオに対し,観測窓の時間長程度で転倒か否かを判定できるため,様々なケースに適用することができる.さらに,転倒を学習する環境や人と,実際に転倒を検知する環境や人が違う場合にも適用できる.提案法の有効性を,実験により評価し,その有効性を確認した,本研究では,アレーアンテナの受信信号から固有値や固有ベクトルといった電波特徴量を抽出し,各状態・位置と,それら電波特徴量の関係を,各送受信機配置に対して実験により評価した.次に,その結果に基づき,電波特徴量に基づくサポートベクターマシーンを用いた状態識別法・位置推定法を提案した.また,位置推定に関して,すべての位置で学習(トレーニング)することは,事前の手間がかかり望ましくない.そのため,電波特徴量に基づき,学習していない位置もある程度の精度で推定できる位置推定法を提案した.以上の検討に基づき提案した電波センサによる状態識別精度・位置推定精度を,複数の実験により評価した.本研究では,カメラのようなプライバシー侵害が無く,また,人に何かを持たせたり,家に多くのセンサを設置せずに高齢者等の見守りが可能な電波センサの開発が目的である.平成24年度は,まず,アレーセンサを用いて,アレーセンサから得られる複数の電波特徴量に基づく位置指紋法による位置推定法について検討した.位置指紋法で用いるトレーニングデータと実際に位置を推定する位置の差による影響を低減する方法についても検討し,実験の結果,高い推定精度が得られることを確認した.また,アレーセンサから得られる第1固有ベクトルに基づく位置指紋法と,人の行動を時系列データ(各要素は第1固有ベクトルの相関値)として捉え,それを低演算量で実行する,位置追尾法を提案した.教室での実験に基づき,低演算量で高精度に位置追尾ができることを示した.一方,ドップラーセンサーについても検討した.ドップラーセンサは,照射方向のターゲットの動きは精度よく検知できるが,それと直交する方向の動きに関しては感度が劣化する.実用的な転倒検知には,ターゲットの動く方向に依存せず,また,センサの故障や不具合に対応できることが要求される.そこで,複数のドップラーセンサのデータを統合,または取捨選択することで,耐障害性のある高精度な転倒検知を提案した.個々のセンサの照射方向が異なるように設置することで,1台のセンサを用いた場合よりも高精度な転倒検知を可能にする.また,センサで取得される電圧データから特徴量を取得する際の手法として,複合的手法と選択的手法の2通りを試みた.学習と識別には,SVMとk-NNを用いた.実験により提案法を評価,その結果,複数のセンサを用いることで,1台のセンサを用いる従来の転倒検知よりも10%転倒検知率を改善した.前年度の研究成果に基づき,電波特徴量に基づくサポートベクターマシーンを用いた状態識別法・位置推定法を提案した.送受信機配置や,サポートベクターマシーンへの入力情報,学習(トレーニング)について検討した.事前に識別したい重要な状態(例えば転倒)のクラスを定義し,それ以外に歩行,静止等の状態も学習アルゴリズムを修正し,対応できるようにした.また,位置推定に関して,すべての位置で学習(トレーニング)することは,事前の手間がかかり望ましくない.そのため,位置関係(距離)と電波特徴量の相関を評価し,電波特徴量とその統計量を有効に使う方法について検討した.以上の検討に基づき提案する電波センサによる状態識別精度・位置推定精度を実験により評価した.

実環境では,部屋の構造や人の違いなど,様々な要素が特性に影響を与えることが予想された.解決法として,複数人での学習を行うことにより,違う環境や,違う人の学習データでも,正しく識別できるようにした.また,位置についても,未学習位置の推定について,空間相関等を考慮したアルゴリズム検討した.実験の結果,提案行動識別法は,学習データと環境や対象の違う場合にも,優れた行動識別率を達成することを確認した.また,提案位置推定法は,学習データと違う位置に人がいる場合にも,優れた位置推定精度を達成することを確認した.情報通信工学当初の予定通り転倒検知手法を提案でき,順調に進んでいる.平成24年度にドップラーセンサについても検討を進められ,当初の予定より少し早く,全体としておおむね順調に進められている.今回の手法を様々な環境に適用できるよう,実験を含めて評価を進める予定である.平成24年度は,アンテナや周波数に関しての検討よりも,各種システムの検討を深く行ったため,それに関する費用が予定よりも少なかった.今後は,まずいくつかの用途に応じたアンテナや周波数,システムを検討する予定である.例えば,見守りでは,転倒検知が重要である.また,もし,呼吸等を検出できれば,病院や介護施設など,より様々な環境・場面での使用が期待される.アレーセンサの開発を依頼しており,それまではこれまでの装置を使って実験したため.新たに開発予定のアレーセンサを購入する予定である.次年度は,初年度購入した装置をベースにアンテナやD/A変換器の各種周波数対応に関する検討を進め,研究調査や,議論,研究成果発表の旅費等に使用予定である.
Akt‐Ralシグナルが細胞運動を調節するメカニズムの解明

申請者は、前年度までにセリンスレオニンキナーゼAktから低分子量Gタンパク質Ralを介したシグナル伝達が増殖因子刺激による細胞膜の伸展に必須なシグナル経路であることを明らかにした。RalはRasの下流で機能するとされる一方で、AktはPI3キナーゼ(以下PI3-K)の下流で働く。そこでRalの葉状仮足上での活性化はRas、PI3-Kどちらのシグナルが規定しているのかそれぞれのFRETプローブを用い調べた。またAkt活性のPI3-K以外の制御機構を調査した。その結果ホスホリパーゼCがAkt活性の制御に関与する可能性を見出した。そこでホスホリパーゼCの活性をモニターするFRETプローブを作製し、Akt活性の空間制御の関係を調べた。低分子量Gタンパク質Ralは細胞内シグナル伝達機構において癌遺伝子のRasの下流で働くスイッチ分子である。その役割は単に、Rasからのシグナルを中継するだけでなく、細胞内の複数のシグナルを統合したり、分岐したりしている。例えばRalAはRas、Rac、PI3-Kの3つのカスケードからシグナルが入力される。申請者は、このような複雑なシグナル伝達カスケードを明らかにするために蛍光共鳴エネルギー移動を応用したバイオセンサーを開発し解析を行った。申請者はこれまでにRasファミリーGタンパク質、リン酸化酵素、リン脂質等のFRETプローブを開発し、上皮増殖因子(EGF)刺激によりRasは形質膜上で緩やかな勾配を持った活性化を示すこと、またRalAは葉状仮足上で限局した活性化しか示さないことを明らかにした。本年度は、EGF刺激により、PI3-Kの代謝産物であるフォスファチジルイノシトール3リン酸(PIP3)は形質膜上で均一に分布すること、それに対しPIP3の代謝産物フォスファチジルイノシトール(3,4)2リン酸[PI(3,4)P2]は細胞辺縁でより高い分布を示すこと、またAktの活性化の局在とタイムコースがPI(3,4)P2の分布の変化と相関することを示し、RalAの限局した活性制御におけるPI(3,4)P2とAktの関与について考察を行い、RasとPI3-KシグナルはRalGEFで収束しRalAの活性の限局化につながることを明らかにした。申請者は、これまでFRET(蛍光共鳴エネルギー移動)を応用したバイオセンサーの開発を行い、低分子量Gタンパク質の空間制御が、細胞の形態変化に与える影響について調べてきた。前年度までに申請者はセリンスレオニンキナーゼAktと低分子量Gタンパク質RalのFRETによる解析から、(1)Aktが増殖因子刺激によって形成される葉状仮足上でRalを局所的に活性化すること(2)さらにAkt-Ralのシグナル伝達が増殖因子刺激による細胞膜の伸展に必須なシグナル経路であることを明らかにした。RalはRasの下流で機能するとされる一方で、AktはPI3キナーゼ(以下PI3K)の下流で働く。そこでRalの葉状仮足上での活性化はRas、PI3Kどちらのシグナルが規定しているのかそれぞれのFRETプローブを用い調べた。さらにRasとRalGEFの相互作用領域を2分子FRETで解析した。てその結果Ras,PI3K、RalGEFどちらの活性局在ともRalの活性局在は一致しなかった。これらの結果を会わせるとPI3Kの下流かつAktの上流でRalの活性局在が決定されることを示唆した。そこでAkt活性のPI3K以外の制御機構を調査した。その結果ホスホリパーゼCがAkt活性の制御に関与する可能性を発見した。そこでホスホリパーゼCの活性をモニターするFRETプローブを作製し、Akt活性の空間制御の関係を調べることにした。このプローブを使用した細胞運動メカニズムの解析は西岡らとの共同研究でおこない本年度に論文発表された。申請者は、現在ホスホリパーゼCによるAkt活性の空間制御メカニズムについて研究を進めているところである。
霊長類に見いだされたP117遺伝子の構造と機能

カニクイザルのα-グロビン遺伝子間領域に見いだされたP117プロセスト遺伝子は117個のアミノ酸をコードするオープンリーディングフレームとポリ(A)シグナル、ポリ(A)を有し、両端にダイレクトリピートが存在した。サザン、ノーザンハイブリダイゼーションの結果から、原猿類からヒトまで本来の遺伝子が存在し、発現しており、プロセスト遺伝子も広く存在していた。α-グロビン遺伝子間領域内のプロセスト遺伝子の存在頻度を17種のマカカ属サル、計385頭について調べた。タイ国出自カニクイザルでは0.64から0の頻度の地域もあり、隣接群においても頻度は異なっていた。アカゲザルではインド産0.56、中国産0.26であった。ニホンザルとセレベスマカク6種では全く挿入されていなかった。P117プロセスト遺伝子の塩基配列を決定し系統樹を作成したところ、コモンマーモセットとマントヒヒのP117が種の系統関係とは異なる位置にあった。プロセスト遺伝子の形成過程には、レトロウイルスに存在する逆転写酵素が関与するとされている。なぜP117の挿入頻度が群により異なり、塩基配列も種の系統関係と異なっているのか、今後さらにプロセスト遺伝子の塩基配列を本来のP117遺伝子と比較する事により、挿入時期及び機構について考察したい。P117タンパク質を遺伝子工学的に発現させた。P117プロセスト遺伝子のSmal分画をpGEX-5X-3ベクターのSmal部位にライゲーションし、E. coi JM109に形質転換した。IPTGの誘導をかけグルタチオン-S-トランスフェラーゼとの融合タンパク質を発現させた。超音波処理後、5M尿素で溶解後、透析し上清をグルタチオン・セファロース4Bにアフィニティー吸着させ、ファクターXaで切断した。目的のタンパク質以外に他のタンパク質のハンドもあったので、現在、純粋なP117タンパク質をさらに精製する方法を検討している。カニクイザルのalha-グロビン領域に見いだされたプロセスト遺伝子P117がいつ頃挿入されたかを検討するため各種霊長類のDNAよりP117をPCR法にて増幅した。ヒト、チンパンジー、テナガザル、カニクイザル、フサオマキザル、コモンマーモセット等では高濃度で増幅されたが、原猿類のスローロリス、ワオキツネザル、ツパイでは少量しか得られなかった。しかも原猿類では真猿類よりも若干長いバンドが得られ、プロセスト遺伝子としての存在の仕方が原猿類では異なることが示唆された。PCRで増幅されたDNAを低融点アガロースゲルで分離し、ガラスパウダーにて精製しFITCプライマーを用いてオートシークエンサーによる方法を検討したが、試料を多く必要とするため断念した。次にγ-^<32>P-ATPで末端ラベルしたプライマーを用いて手動で配列決定を行ったところ、ヒト上科、新世界ザルの塩基配列を決定することができた。新世界ザルのフサオマキザルはヒトと比べ13塩基短かった。またヒト上科のチンパンジー、テナガザルの塩基配列はカニクイザルのP117と非常によく一致していた。いずれもPCR法により増幅したDNAの配列を決定しているため、少量のDNAの混入によるものでないことを確認するため再度配列を決定しつつある。また、少量しか増幅されない原猿類の配列を有効に決定するため、ダイナビーズ法による1本鎖DNAの精製法を検討中である。さらにヒトおよびカニクイザルのDNAをEcoRI、BglII、XbaI等で切断しサザンハイブリダイゼーションを行うといずれにも二本バンドが検出された。

従って本来の遺伝子とプロセスト遺伝子も含めて少なくとも二組の遺伝子座があることが明かとなった。最も長い制限酵素断片を精製し、さらに各々の断片の制限酵素地図を作成中である。カニクイザルのα-グロビン遺伝子間領域に見いだされたP117プロセスト遺伝子は117個のアミノ酸をコードするオープンリーディングフレームとポリ(A)シグナル、ポリ(A)を有し、両端にダイレクトリピートが存在した。サザン、ノーザンハイブリダイゼーションの結果から、原猿類からヒトまで本来の遺伝子が存在し、発現しており、プロセスト遺伝子も広く存在していた。α-グロビン遺伝子間領域内のプロセスト遺伝子の存在頻度を17種のマカカ属サル、計385頭について調べた。タイ国出自カニクイザルでは0.64から0の頻度の地域もあり、隣接群においても頻度は異なっていた。アカゲザルではインド産0.56、中国産0.26であった。ニホンザルとセレベスマカク6種では全く挿入されていなかった。P117プロセスト遺伝子の塩基配列を決定し系統樹を作成したところ、コモンマーモセットとマントヒヒのP117が種の系統関係とは異なる位置にあった。プロセスト遺伝子の形成過程には、レトロウイルスに存在する逆転写酵素が関与するとされている。なぜP117の挿入頻度が群により異なり、塩基配列も種の系統関係と異なっているのか、今後さらにプロセスト遺伝子の塩基配列を本来のP117遺伝子と比較する事により、挿入時期及び機構について考察したい。P117タンパク質を遺伝子工学的に発現させた。P117プロセスト遺伝子のSmaI分画をpGEX-5X-3ベクターのSmaI部位にライゲーションし,E.coi JM109に形質転換した。IPTGの誘導をかけグルタチオン-S-トランスフェラーゼとの融合タンパク質を発現させた。超音波処理後、5M尿素で溶解後、1XPBSに透析し上清をグルタチオン・セファロース4Bにアフィニティー吸着させ、トロンビンで切断した。目的のタンパク質以外に他のタンパク質のバンドもあったので、現在、純粋なP117タンパク質をさらに精製する方法を検討している。
エピジェネティック制御を介した微生物二次代謝の活性化による新規天然物の創出

本研究は、エピジェネティック制御に関わる酵素の低分子阻害剤を微生物培養時に添加することで、微生物のゲノム上に存在する未利用性合成遺伝子を活性化し、多様な新規物質を創出することを目的としている。これまでの研究で、ヒストン脱アセチル化酵素の阻害剤であるSBHAやニコチンアミドが、多くの糸状菌の二次代謝活性化に有用であることを見出した。また、有効な阻害剤添加条件を用いて昆虫寄生糸状菌や植物内生糸状菌、Chaetomium属菌をスクリーニングし、顕著に二次代謝物の生産が活性化された株から、多様な構造を有する新規二次代謝物の取得に成功した。また、化合物の取得には至らなかったものの、数種のStreptomyces属放線菌をSBHAやDNAメチル化酵素阻害剤添加条件で培養すると、コントロールと比較して、二次代謝プロファイルに変化が生じることを見出した。また、放線菌を培養する際の液体培地の種類を変えると、各種エピジェネティック酵素阻害剤に対する感受性に違いが表れ、ケミカルエピジェネティクスを行う際には、薬剤の種類だけではなく、培地の組成も検討する必要があることが示された。また、糸状菌培養時に、真核生物のリボソームを標的とする抗生物質であるハイグロマイシンを添加することで、二次代謝物の生産性に変化が生じることを見出した。いくつかの糸状菌では、野生株ではほとんど生産されない化合物の蓄積が薬剤添加により顕著に増大しており、エピジェネティック制御を利用した天然物探索に加え、抗生物質添加による糸状菌の二次代謝活性化も展開することで、より多様な新規物質の創出につながることが示された。27年度が最終年度であるため、記入しない。近年,微生物のゲノム解読が行われ,従来の培養法では発現していない二次代謝物生合成遺伝子の存在が明らかとなった.本研究では,ヒストン脱アセチル化酵素(HDAC)やDNAメチル化酵素などの,エピジェネティック制御に関わる酵素の低分子阻害剤を用いて,微生物のゲノム上に存在する多様な二次代謝物生合成遺伝子を活性化し,様々な新規物質の取得を目指した.これまでに,HDAC阻害剤であるSBHAが,いくつかの糸状菌の二次代謝を活性化させるのに有効であることを見出しているが,それでも糸状菌に存在する生合成遺伝子の一部しか活用できていないため,より多くの遺伝子発現を誘導できる条件の探索を行った.昆虫寄生糸状菌や植物内生糸状菌,Chaetomium属菌等を,様々な酵素阻害剤添加条件で培養し,HDAC阻害剤であるニコチンアミドが,多くの糸状菌の二次代謝を活性化させるのに有効であることを見出した.また特に顕著な活性化を示した数種の植物内生糸状菌を大量培養し,阻害剤添加により蓄積が増大した化合物として,様々な新規物質の取得にも成功した.SBHAとニコチンアミドは異なるHDAC阻害の作用機序を示すことから,同種の糸状菌においても異なる二次代謝プロファイルの変化が期待でき,糸状菌の天然物探索研究において,これらをそれぞれ適用することで,より多様な新規物質の創出につながる可能性が示された.また有用物質生産微生物である放線菌では,機能は明らかになっていないものの,DNAメチル化酵素やヒストン様タンパク質など,真核生物のエピジェネティック制御に関わる因子に相当するものが存在している.そこで種々の放線菌を,糸状菌において有効性が確認されたSBHAやニコチンアミドを用いて培養し,二次代謝物生産に与える影響を検討した.しかし二次代謝プロファイルの変化はほとんどみられなかったため,現在異なる手法の検討を行っている.本研究は、エピジェネティック制御に関わる酵素の低分子阻害剤を微生物培養時に添加することで、微生物のゲノム上に存在する未利用性合成遺伝子を活性化し、多様な新規物質を創出することを目的としている。HDAC阻害剤であるニコチンアミドの添加条件が,SBHAとともに多くの糸状菌に対し有効であることを見出し,その条件を用いて様々な新規物質の取得に成功した.

一方,放線菌については,二次代謝物生産に影響を与える条件を確立できなかったため,条件検討を続ける予定である.27年度が最終年度であるため、記入しない。引き続き有効性を見出したエピジェネティック酵素阻害剤であるSBHAやニコチンアミドを用いて様々な糸状菌をスクリーニングし,多種多様な新規物質の取得を行う.本研究により得られた新規物質については,抗ウイルス活性や,各種がん細胞に対する薬理活性を検討し,新規医薬品リード化合物の発見を目指す.また,最近,糸状菌培養時に,真核生物のリボソームを標的とする抗生物質であるハイグロマイシンを添加することで,二次代謝物生産に変化が生じることを見出した.従って,引き続きエピジェネティック制御を利用した天然物探索を進めるとともに,抗生物質添加による糸状菌の二次代謝活性化についても検討する.27年度が最終年度であるため、記入しない。
遺伝子改変モデル動物での炎症性サイトカインによる「血管炎」の病態制御機構の解明

本研究は、大動脈に炎症をきたす高安動脈炎と肺動脈に炎症を来す肺動脈性肺高血圧症(PAH)のモデル動物を作製することを目的とする。interleukin-6(IL-6)とIL-21が上記疾患の病態形成で重要だと仮説をたてて、これらを大動脈内皮又は肺胞上皮で過剰発現するトランスジェニック(TG)マウスの作製を試みた。大動脈内皮での過剰発現にはBMX遺伝子プロモーター下で、PAHモデルマウス系での肺胞上皮特異的過剰発現にはドキシサイクリン誘導性にSP-C遺伝子プロモーター下にIL-6とIL-21のcDNAを組み込んだTGマウス作製を進めたが、これまで各組織で十分な過剰発現が掛からず条件検討中である。1IL-6およびIL-21のトランスジェニックマウス作製による肺高血圧症モデル動物作出と解析:研究代表者らはこれまで低酸素誘発性肺高血圧症マウスで抗IL-6受容体モノクローナル抗体MR16-1によるIL-6シグナル阻害がその病態形成を抑制する結果を見出した(Proc Natl Acad Sci U S A. 2015 May 19; 112(20): E2677-86.)。IL-6の下流でIL-21が肺高血圧病態の形成に重要な役割を同定した。このIL-6/IL-21のシグナル軸が肺高血圧症の病態形成の促進因子であることを2つの系統の肺胞上皮細胞特異的トランスジェニック(Tg)マウスを作製して検証する事を本年度は行った。pTRE-Tight-vectorに、マウスIL-6, IL-21cDNAを組み込んで、Tet-Onのシステムに基づくTgマウスを作製した。一方で、肺胞上皮特異的に遺伝子発現をするSurfactant protein C (SPC)プロモーター下にrt-TA遺伝子を組み込んだTGマウスを入手して、pTRE-Tight-mIL-6, pTRE-Tight-mIL-21マウスと交配している。これらのマウスでドキシサイクリン誘導性にIL-6、IL-21が肺組織で発現誘導されることを確認した。2IL-6およびIL-21のトランスジェニックマウス作製による高安動脈炎モデル動物作出の試み:大動脈レベルの内皮細胞でIL-6およびIL-21シグナルを発現させるTGマウスを作出する目的で、現在までにBMXプロモーター下にrt-TA遺伝子を発現するTGマウス作製のためのコンストラクトを作製している。今後、TGマウス作製のためのインジェクションをする予定である。予定していた肺胞上皮特異的なIL-6, IL-21のTGマウス作製までたどり着いており、これらのマウスを用いて今後は低酸素誘発性肺高血圧症の表現型解析をする予定である。また、大動脈での炎症を起こす高安動脈炎のモデル動物作製のために、現在BMXプロモーター下流にrt-TA遺伝子を発現するTGマウスを作製中である。これらと、本年作出したpTRE-Tight-mIL-6, pTRE-Tight-mIL-21マウスとを交配して今後大動脈での炎症が誘導されるかを確認する予定である。研究代表者らは低酸素誘発性肺高血圧症マウスの系で抗IL-6受容体モノクローナル抗体MR16-1によるIL-6シグナル阻害がその病態形成を抑制する結果を報告した(PNAS 112(20), E2677, 2015)。IL-6の下流でIL-21が肺高血圧症病態の形成に重要で、マクロファージのM2極性化に関わる可能性を報告した。このIL-6とIL-21による炎症性サイトカインシグナル軸が肺高血圧症の病態形成に関わるか検証する目的で、pTRE-Tight-vectorにマウスIL-6, IL-21cDNAを組み込んでTet-OnシステムによるTgマウスを作製した。予備的にpTRE-Tight-IL-6, pTRE-Tight-IL-21vectorとrtTA発現ベクターをHEK293細胞にトランスフェクトしてドキシサイクリンを投与すると有意にIL-6およびIL-21の遺伝子発現が誘導された。これらのTgマウスを肺胞上皮特異的に遺伝子発現するSP-Cプロモーター下にrt-TA遺伝子を組み込んだTGマウスと交配して、ダブルTGマウスでドキシサイクリン負荷してIL-6およびIL-21の過剰発現の誘導が肺組織でみられるか確認したが期待した誘導が見られなかった。原因としてSP-CrtTATGマウスでのrtTA発現が低下していることが疑われた。現在は肺胞上皮で機能するCCSP1プロモーター下にrtTAを発現するマウスと交配し直しており、今後CCSP1-rtTA-TGと交配して肺高血圧症が誘導されるかを検討する。同じく、大動脈とその第1分枝に狭窄・拡張を来す自己免疫性大型血管炎の高安動脈炎モデル動物の作出を、大動脈内皮に発現するBmx遺伝子のプロモーター下にrtTA遺伝子を発現するTGマウスを作出した。今後、上記のIL-6, IL-21マウスと交配して大動脈炎が誘導されるか検討する予定である。

interleukin-6(IL-6)とIL-21が上記疾患の病態形成で重要だと仮説をたてて、これらを大動脈内皮又は肺胞上皮で過剰発現するトランスジェニック(TG)マウスの作製を試みた。大動脈内皮での過剰発現にはBMX遺伝子プロモーター下で、PAHモデルマウス系での肺胞上皮特異的過剰発現にはドキシサイクリン誘導性にSP-C遺伝子プロモーター下にIL-6とIL-21のcDNAを組み込んだTGマウス作製を進めたが、これまで各組織で十分な過剰発現が掛からず条件検討中である。低酸素誘発性肺高血圧症モデルマウスを作製して、IL-6, IL-21過剰発現の影響を検討する。また、IL-6/IL-21二重TGマウスの交配による作出も試みて、肺高血圧症の自然発症が誘導されないか、検討する。また、BMX-rtTA-TGマウスを作製して大動脈の炎症モデル作製の方は、大動脈特異的な過剰発現が得られるか、慎重に検討していく。循環器内科学、血管病学、炎症性サイトカインの生物学
咀嚼運動からみた食品テクスチャーパラメータの生理学的意味づけ

咀嚼運動からみた食品テクスチャーの生理的意味を明らかにするために、寒天およびゼラチンゲルをモデル食品に使用して検討を行った。モデル食品のテクスチャーは、テクスチュロメーターで測定した。被験者に顎および口腔領域に異常の認められない成人男女各7名ずつを選定し、テクスチャーの異なる食品を咀嚼した際の一連の咀嚼運動様式を、POLYTRON 1000(新潟大学歯学の装置を借用)を使用してX線ビデオ撮影し、画像解析した。モデル食品の硬さが増加するに伴い、ヒトの咀嚼様式は舌と硬口蓋による圧縮から、歯列による咬断へと変化した。圧縮から咬断へと変化する硬さの閾値は、寒天ゲルで0.08kg、ゼラチンゲルで0.03kgであり、歪の大きいゼラチンゲルの方が、咬断開始の閾値は小さかった。また、圧縮から咬断への変化点となる食品の破断応力は、150250g/cm^2の範囲であった。ヒトが摂取した食品のテクスチャーを認知するメカニズムについて、以下の事実が明らかとなった。ヒトは、食品を補捉すると直ちに舌によって食品を切歯乳頭部近傍に押しつけてわずかに圧縮(変形率:18%)することにより、摂取した食品のテクスチャーを認知した。続いて、やわらかい食品の場合には、そのままの位置で舌と硬口蓋による圧縮粉砕を行った。一方、食品が硬い場合には、舌によって食品を臼歯または大臼歯などの歯列部位に移送し、そこで咬断粉砕を行った。以上のことより、ヒトは摂取した食品のテクスチャーを切歯乳頭部近傍の感覚受容器により認知し、その認知された情報に応じて、咀嚼運動様式を圧縮粉砕または咬断粉砕にと変化させていることが推察された。食品テクスチャーの違いによってヒトの咀嚼運動様式は大きく変化するため、口腔外で機器により食品テクスチャーを測定する場合には、ヒトが行うと予測される咀嚼運動を模した方法で、条件設定を行う必要があると考察された。
硫化水素による実験的肺高血圧治療と内因性硫化水素産生系の解析

一酸化窒素(NO)は、肺高血圧と肺高血圧血管病変の発生を抑制する。硫化水素も、生体内で産生させる生理活性物質で、NOと同様の作用を持つ。NOは硫化水素の産生を高めると報告されているので、本研究では、硫化水素を産生させるNaHSをモノクロタリン誘起肺高血圧ラットと慢性低酸素暴露肺高血圧ラットに腹腔内投与(予防実験として単回連日投与、治療実験としてオスモポンプによる持続投与)して、肺高血圧および肺高血圧血管病変に対する、発症予防効果および治療効果を調べた。予想に反して、高濃度NaHS投与(12mg/day=500μg/hr 3日間持続投与)により、正常ラットの肺NO合成酵素の発現が低下した。我々はこれまで、内因性NOを高める操作は肺高血圧の発症を抑制することを報告してきた。NOの標的物質として、H2Sの存在はすでに報告されているが、肺動脈や肺高血圧でのH2Sの動態は不明である。NOドナーであるSNP(構造上NOを含み、NOを放出する)存在下にラットの摘出腸間膜動脈や大動脈を培養すると、H2S産生が増加した(Zhao W, et al. EMBO J 20: 6008-16, 2001)。つまり、NOはH2S産生を高める。これまで報告されてきたNOの肺高血圧や肺高血圧血管に対する作用はH2S産生を介する可能性もあると言える。硫化水素ナトリウム(NaHS)は、体内に投与すると分解されH2Sを放出するH2Sドナーである。硫化水素(H2S)は血管内皮細胞などで産生される生理活性物質でNOと共通の生理作用を持つ。我々は慢性低酸素暴露肺高血圧(CHPH)ラットの肺高血圧血管病変に対するNaHS投与による抑制効果について調べた。SDラットを低酸素暴露(CH)チャンバー(1/2気圧、10%酸素)で14日間飼育し、3群に分けた。(1)空気下飼育群(Air/Veh群)(2) CH+NaHS非投与群(CH/Veh群)(3) CH+NaHS投与群(CH/H2S(+)群)。1NaHSをCH 815日目の7日間3mg/kg/日腹腔内投与、14日目でカテーテルを挿入し、15日目覚醒下で血圧を測定した。結果として、H2S投与によりmPAPとRVHに影響はなかった。今回の実験条件ではNaHSの腹腔内投与でCHPHに対する抑制効果は認められなかった。硫化水素(H2S)は、血管内皮細胞で、cystathionine β-synthase (CBS)やcystathionine γ-lyase (CSE)という内因性のいわば硫化水素合成酵素により産生される生理活性物質である。一酸化窒素(NO)と類似の作用を持ち、血管拡張や抗炎症効果を持つ。NOによる肺高血圧の発症抑制効果はすでに報告されているが、NOが内因性H2S産生を高めるという報告もある。本年度は、ラットにおける慢性低酸素(1/2気圧、10%酸素)暴露肺高血圧モデルを用いて、硫化水素ドナーであるNaHS投与による肺高血圧発症の抑制効果を調べた。低酸素暴露開始1日前からNaHS(14μmol/kg/日)の腹腔内投与を開始し、14日継続した。14日目に肺動脈カテーテルを留置し、15日目に覚醒下で肺動脈圧測定・右心室肥大・末梢肺動脈での筋性血管出現率・中膜肥厚を指標にNaHSによる肺高血圧の発症抑制効果を調べた。空気下コントロールラットの平均肺動脈圧は、19.9±0.5mmHg(n=6)より37.5.9±2.9mmHg(n=4)投与慢性肺高血圧ラットでは、39.7±1.2mmHg(n=8)であった。右心室重量/(心室重量+中隔)比は、それぞれ、0.26±0.01、0.42±0.02、0.44±0.02であった。本年度の実験では、慢性低酸素曝露肺高血圧の発症は、NaHS投与により、抑制できなかったが、悪化もしなかった。来年度は、投与量や投与法を変えた実験が必要である。硫化水素は(H2S)一酸化窒素と類似の作用を持ち、血管拡張や抗炎症効果を持つ。27年度は、硫化水素ドナーであるNaHS投与による肺高血圧発症後の治療効果を調べた。1モノクロタリン肺

高血圧モデルでは、モノクロタリン投与後14日から16日まで、2低酸素曝露肺高血圧モデル(1/2気圧、10%酸素)では、慢性低酸素曝露開始後12日から14日まで、NaHSをオスモポンプを用い、20μg/時(H2S 20)、100μg/時(H2S100)、500μg/時(H2S500)で、両モデル3群に腹腔内投与し、肺動脈圧と右心室肥大の計測を行い、肺組織を採取した。1モノクロタリンモデルでは、平均肺動脈圧(mmHg)(対照群、H2S20, H2S100, H2S500)は、27.0±2.1、228.7±0.9、32.8±4.3、28.6±1,3 ; RVH(右心室重量/(左心室+中隔)重量比)は0.33±0.02、0.33±0.01、0.36±0.01、0.33±0.01で群間に有意差を認めなかった。2慢性低酸素曝モデルでは、平均肺動脈圧、32.8±2.5、35.9±2.1、32.8±4.3、34.0±1,6 ; RVH 0.46±0.01、0.42±0.02、0.52±0.03、0.46±0.02で群間に有意差を認めなかった。27年度は、肺高血圧が発症した後に治療としてNaHSを投与する実験であり、26年度は、肺高血圧が発症する以前からNaHSを投与する予防効果を検討した。結果として、本研究における実験条件では、肺高血圧発症における、NaHSの発症予防効果および治療効果を見出すことはできなかった。しかし、最終的結論を出すには今後、予防実験においては、別の投与量のよる実験が必要であり、治療実験では、投与開始時期や投与期間を変えた実験が必要である。麻酔集中治療学前年度の結果は、肺高血圧の発症抑制作用を検討する計画であり、NaHSの1日1回の単回投与では、肺高血圧の抑制効果は明らかではなかった。本年度は、投与法を変更し、低酸素曝露開始7日後からNaHSの投与を開始し、肺高血圧に対する治療効果を検討した。今回の投与期間、投与速度では、明らかな抑制効果は認められなかった。これまでの結果は、NaHSの投与法で肺高血圧抑制効果が認められない投与条件が明らかになりつつあると言える。今後は、更に濃度を変更するとともに、投与法を持続法に変更し、さらに別の肺高血圧モデルでの検討を加えることにより、NaHSの肺高血圧発症への影響が明らかになると考えられる。NaHSの14μmol/kg/日投与では、肺高血圧の発症を予防できないことが、明らかとなり、別の投与方法を検討する必要があることが判明した。NaHSの投与量を持続投与に変更した実験を行う。ALZETポンプで20、100、50μg/時各濃度でCH 1215日目の3日間腹腔内持続投与する。慢性低酸素曝露とは異なる、モノクロタリン誘起肺高血圧モデルを用いて、NaHSによる肺高血圧発症抑制効果を調べる。効果を認めた、H2S投与法・濃度において、肺組織の分子生物学的解析を行う。NaHSの投与量の変更を行い、慢性低酸素暴露肺高血圧ラットでの肺高血圧発症抑制効果を調べる。さらに、効果がない場合、オスモポンプを用いた、持続投与を行う。肺動脈圧、右心室肥大への効果が明らかでない場合にも、当初の計画では、硫化水素が肺高血圧発症を抑制する投与条件を明確にし、その投与法において、肺組織の一酸化窒素合成酵素、硫化水素合成酵素などのタンパクやmRNA解析、免疫組織染色を行う計画であったが、今年度までに、肺高血圧の発症を明らかに抑制する投与法が、確定していない。そのため、これらに分子生物学的検討を行う試薬うキットの購入を本年度に行わなかったため、次年度の使用が発生した。しかし、効果のない投与法は、明らかとなりつつあるので研究は進行している。これまでの成果として、効果のない投与法は、明らかとなりつつあるので、次年度はさらに投与法を変更し、さらに異なる肺高血圧モデルでのH2Sによる肺高血圧抑制効果と、肺組織における分子生物学的検討をおこなう。ラットの購入、分子生物学的検討のための試薬、消耗品などの購入を行う。
水面上単分子膜ドメインのマランゴニー成長不安定性に関する研究

1.水面上単分子膜に対する局所レーザー加熱により初期化され、ブリュースター角顕微鏡の視野内に成長する単一の非平衡方向性成長ドメインは一般に高密度の樹枝状ドメインを形成し、主として2種類の分岐構造に分類されることが見出された。1つはフラクタル状のドメイン構造であり、2番目は主枝に対して一方の副枝が選択的に成長する、非対称な樹枝状成長ドメインである。後者の副枝成長における対称性の破れは副枝の成長方向に隣接する他の樹枝状結晶の成長方向ならびに速度と密接な相関を有することが分かった。2.さらに樹枝状成長はしばしば、隣接するドメインの接近によりトリガーされ、多様な成長界面不安定性を示すことが見出された。この成長界面不安定性の結果として、湾曲したドメイン形状の過渡的成長や波状ドメイン境界の成長に代表されるような、相対するドメイン間での成長方向変調現象が見出された。3.以上の結果から、マランゴニー流動に基づいた非平衡成長ドメインの形成過程において観察される、非平衡方向性成長ドメインの対称性の破れや成長界面不安定性は、これらの樹枝状成長ドメインが高密度で成長し、かつ、このような樹枝状ドメインが複数、同時に成長するため、過飽和したLE相中の両親媒性分子の競合的な捕獲現象が生じること、さらにドメインを構成する水面上単分子膜分子間での相対的な配向方向に依存する静電反発相互作用が本質的な要因であると考えられる。すなわち、このような相対するドメイン間での分子の競合的捕獲、ならびにドメイン境界間での静電反発相互作用がマランゴニー流動に起因する非平衡樹枝状ドメインの成長率に大きな影響を与え、変調ドメインパターンを生じるということが明らかになった。1.研究の第1段階として、赤外レーザー光をブリュースター角顕微鏡視野内に導入し、水面上単分子膜を融解し、非平衡ドメインの核形成・成長を初期化するための光学系をデザインし、光ピンセットによる局所レーザー加熱により形成される非平衡成長ドメインフロントの成長モードをトラッキングするためのブリュースター角顕微鏡+光ピンセットシステムを構築した。また、これと平行して、単分子膜の相状態を同定するための表面圧-分子占有面積曲線をコンピュータ上に取り込み、データ解析を行えるようにした。2.研究の第2段階として、水面上単分子膜の固相膜に対して光ピンセットにより局所レーザー加熱を行った場合に生ずるであろうさまざまな成長モードの探索とそれらのモードの観察を行った。その結果、固相膜の融解後、数秒内で顕微鏡視野内にマランゴニー不安定性に起因すると思われる明確な非平衡成長ドメインの方向性成長が観察された。さらに、これらの成長.ドメインの主枝間、あるいは副枝間で互いに向かい合う方向で2つのドメインの枝が成長する場合に、これまでには報告されていない、強いドメイン間の相関が特徴的な成長パターンとして観察された。1.水面上単分子膜に対する局所レーザー加熱により成長する単一の非平衡成長ドメインは一般に高密度の樹枝状ドメインを形成し、主として2種類の分岐構造に分類されることが見出された。後者の副枝成長における対称性の破れは副枝の成長方向に隣接する他の樹枝状結晶の成長速度と密接な相関を有することが分かった。この成長方向不安定性の結果として、湾曲したドメイン形状の成長や波状ドメイン境界の成長に代表されるような相対するドメイン間での成長方向変調現象が見出された。

3.以上の結果から、マランゴニー流動に基づいた非平衡成長ドメインの形成過程において観察される、非平衡方向性成長ドメインの対称性の破れや成長方向不安定性は、これらの樹枝状成長ドメインが高密度で成長し、かつこのような樹枝状ドメインが複数個、同時に成長するため、過飽和したLE相中の両親媒性分子の競合的な捕獲現象が生じること、さらにドメイン間での静電反発相互作用が本質的な要因であると考えられる。すなわち、このような相対するドメイン間での分子の競合的捕獲、ならびにドメイン境界間での静電反発相互作用がマランゴニー流動に起因する非平衡樹枝状ドメインの成長率に大きな影響を与え、変調ドメインバターンを生じるということが明らかになった。
MDS,白血病化Fanconi貧血における骨髄移植前処置法の開発

MDS・白血病化Fanconi貧血における骨髄移植前処置の検討【方法】18名のFanconi貧血患者の末梢血リンパ球を分離し、CY血清(代謝物濃度として0.4μg/ml、0.8μg/ml)を添加し、48時間処理後染色体分析を行い染色体断裂牽観察した。同様にAra-C(1X10-^6M)を添加し6時間、24時間、48時間処理を行ったリンパ球と、Flu-Ara-A(1X10-^6M、2X10-^6M、1X10-^5M)を添加し48時間処理を加えたリンパ球の染色体分析を行った。FA患者4例と健康成人3例の末梢血リンパ球に同様の薬剤処理を加え、高感度水溶性ホルマザンを生成する新規テトラゾリウム塩WST-8を発色基質として用いたCell Counting Kit-8による細胞毒生試験を行った。上記の分析結果をふまえて、骨髄異型性症候群9名、急性骨髄性白血病4名のFanconi貧血患者の造血幹細胞移植の検討を行った。【結果】(1)Fanconi貧血患者ではCY濃度依存性に染色体断裂も増加し個体差も大きいが、健常人では濃度に関係なく断裂はほとんどみられない。断裂の種類もgapやbreaks以外の重症度の高い断裂の占める割合が大きい。(2)Ara-C処理では処理時間が長くなるに従い、Fanconi貧血患者の方が染色体断裂が増加する傾向にあるが、健常人と同等の患者もいた。断裂の種類はgapsやbreaksといった軽度のものが多い。(3)nudarabine処理ではFanconi患者、健常人ともに濃度による染色体断裂の増加は少なく、両者の差はみられない。断裂の種類はほとんどがgapsやbreaksであった。(4)MTT法による細胞毒性試験では、CY処理でFanconi貧血患者の方がより毒性が高い傾向が認められたが、Ara-C, fludarabine処理では健常人との間に差はみられなかった。(5)症例毎のCYの投与量調節とAra-Cとfludarabineの前処置を用いることにより、8/13例が生存している。【考察】移植前処置に用いる薬剤として、今回検討を行ったAra-Cとfludarabineの2薬剤では細胞毒性も比較的軽度であり、Fanconi貧血の前処置薬剤として十分使用が可能と思われる。FA患者末梢血リンパ球における染色体断裂による抗癌剤感受性試験Fanconi貧血28例に対し,MMC,DEB,CYおよびAra-Cの染色体断裂試験を行い,白血化との関連や前処置法について検討した.Fanconi貧血患者の末梢血リンパ球を分離し,PHA刺激下,CY血清(0.04-0.8μg/ml)およびDEB(0.1μg/ml)添加後48時間培養,MMC(0.01μg/ml)添加後24時間

培養,Ara-C(1X10^<-6>M)添加後6,24,48時間培養後に染色体分析を行い,染色体断裂の重症度を検討した.末梢リンパ球におけるCYの染色体断裂試験では個体差が大きくDEBの断裂の重症度とよく相関したが,白血化との相関は認めなかった.Ara-Cの染色体断裂試験を10例のFanconi貧血患者に行ったところ,gapやbreakなどの軽度の断裂が多く,aberrationも健常人と大きな差は認めない例が多かったが,一部重症の断裂を示す例もみられた.断裂の程度は6-24時間培養で最も重症度が高く,48時間培養では健常人と同様に,断裂が軽症化した.CYの至適投与量を症例毎に求め17例の症例に前処置としてCY20-120mg/kgの投与を行った. MDSの3例に前処置に,Ara-C8-12g/m^2を加えた.CYの投与量を調節することで粘膜障害が重症化する症例は,再移植例以外には認められず,HLA不一致群では拒絶が問題であり,CY投与量の増量を考慮する必要があった.Ara-Cは前処置の強化に使用しうる薬剤であり,今後,放射線照射に代わり前処置として使用できる可能性がある.Fanconi貧血の移植前処置法の検討/Fludarabineに対する染色体脆弱試験FludarabineはAra-Aにふっ素を導入しさらにリン酸エステル化した薬剤でnonmyeloablative stem cell transplantationとして注目を浴びている。【目的】Fanconi貧血患者のfludarabineに対する染色体断裂の重症度とMTT法を用いた細胞増殖能を測定し,同薬剤が移植前処置に使用可能か否かを検討した.【方法】Fanconi貧血患者3例と健常成人3例のPHA刺激下末梢血リンパ球のCY血清,Ara-C,fludarabine添加による染色体断裂の重症度を検討した.同じリンパ球に上記薬剤を加えてMTT法にて細胞増殖能を測定した.【結果】FA患者ではCY濃度依存性に断裂も増加し個体差も大きいが,健常人では濃度に関係なく断裂はみられない.Ara-C処理ではFA患者,健常人ともにAra-Cの濃度依存性に断裂は増加するがFA患者では回復は遅く,48時間後でも断裂の増加を示すものもあった.しかし,fludarabine処理ではFA患者,健常人ともに濃度に関係なく断裂はほとんどみられず,MTT法でも細胞増殖能は健常人と差を認めなかった.【考察】FA患者の非血縁造血細胞移植の前処置として,Ara-Cとともにfludarabineは有用な薬剤であることが示唆された.Fludarabineを前処置用いたFanconi貧血の同種骨髄移植FludarabineはAra-Aにふっ素を導入しさらにリン酸エステル化した薬剤でnonmyeloablative stem cell transplantationとして注目を浴びている。【目的】Fanconi貧血患者のfludarabineに対する染色体断裂の重症度とMTT法を用いた細胞増殖能を測定し,同薬剤が移植前処置に使用可能か否かを検討した後、移植前処置として用いた。【方法】Fanconi貧血患者のPHA刺激下末梢血リンパ球のCY血清,Ara-C,fludarabine添加による染色体断裂の重症度を検討した.同じリンパ球に上記薬剤を加えてMTT法にて細胞増殖能を測定した.【結果】fludarabine処理ではFA患者,健常人ともに濃度に関係なく断裂はほとんどみられず,MTT法でも細胞増殖能は健常人と差を認めなかった.【症例1】8歳女児。