hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
死後遺伝子検査の実践と課題の抽出

原因が特定できない乳幼児の突然死に対して、死後にゲノム解析から死因となった疾患を推定する死後遺伝子検査が普及し始めている。不整脈疾患や脂質代謝異常疾患が主な対象であり、今回の研究では法医解剖となった19例に実施し、2例に重大な心臓疾患を来しうる変異を検出できた。一方で、ゲノム解析なので、診断に加えて、残された家族への配慮が必要である。死後遺伝子検査を実施する中で、臨床医と遺伝カウンセラーにグリーフケアを含めて遺伝相談に当たってもらうことができた。病院内の異なる専門家が集まり役割分担をする中で、予期せず子供を失った家族に対応する体制の原型作りができたと考えている。チャイルド・デス・レビュー(CDR)とは、乳幼児を中心とした小児の突然死や事故に伴う外因死を様々な角度から検討し、再発予防を提言する社会制度である。今回の研究では、死因が十分に特定できず原因不明とせざるをえなかった突然死に対して、QT延長症などの遺伝性疾患に対して、次世代シークエンサーを用いた網羅的な解析を行い、死後遺伝学的検査を実行してゆく中で、遺族への対応、倫理的配慮等の課題を抽出し、小児科医・遺伝学者・遺伝カウンセラーらとの共同作業を実践し、死後遺伝子診断を実行性のあるものに確立してゆくことを目的としている。現在までに、法医解剖となった予期されない小児の突然死5例に対して、両親から書面による同意を得た上で、次世代シークエンサーを用いた網羅的な死後遺伝学的検査を実施してきた。その中で、1例に心筋症を発症する可能性のある変異をMYH7遺伝子に見出すことができた。今後は遺伝カウンセラーと相談しつつ、家族と対応を試みる予定であり、問題点を抽出できればと考えている。また、2016年3月に横浜で第22回SIDS乳幼児突然死予防学会学術首魁を主催し、CDRに関するシンポジウムを開催できた。虐待から託児中の急変など、社会的に問題となる事例にどう対応してゆけばよいのか活発な議論がなされた。特に、米国でも実施体制には、法的整備も含めて参考になった。わが国においても、制度として導入される必要性が高く、実践を通じて問題点の抽出を試みている。症例の収集およびその遺伝学的解析はおおむね順調に進行している。また、新たな変異を発見できたので、論文としてまとめる作業に入っている。本年度の実績としては、学会を主催しCDRに関するシンポジウムを開催することができたことが特筆できる。他国では、すでに導入されている制度なので、わが国における展開のリーダーシップをとってゆかねばならい。今回の研究では、死因が十分に特定できず原因不明とせざるをえなかった突然死に対して、QT延長症などの遺伝性疾患に対して、次世代シークエンサーを用いた網羅的な解析を行い、死後遺伝学的検査をまず確立してゆく。その過程の中で、遺族への対応、倫理的配慮等の課題を抽出し、小児科医・遺伝学者・遺伝カウンセラーらとの共同作業を実践し、死後遺伝子診断を実行性のあるものに確立してゆくことを目的としている。現在までに、法医解剖となった予期されない小児の突然死例に対して、次世代シークエンサーを用いた網羅的な死後遺伝学的検査を実施した。さらに、この遺伝学的診断の中で、遺伝カウンセラーにグリーフケアを依頼し、臨床心理士が遺族の対応に当たる実際例を体験することができた。今後はその数を増やして、家族への包括的な対応ができる体制作りができるようにしてゆかなければならない。わが国における乳幼児死亡は、数的にも各国と比較して低いとはいえず、CDRの活動を通して虐待から託児中の急変など社会的に問題となる事例にどう対応してゆけばよいのか問題解決につなげる努力が求められている。米国ではCDRの実施体制が法的にも整備され、社会の中で定着している現状があり、わが国においても、制度として導入される必要があり、その一翼を担ってゆきたいと改めて考えている。昨年度は平成28年3月に横浜で第22回SIDS乳幼児突然死予防学会を主催し、CDRに関するシンポジウムを開催できた。剖検事例から新たな変異を発見できたので、論文としてまとめる作業に入っている。本年度の実績としては、日本SIDS乳幼児突然死予防学会から示されている問診・チェックリストを利用して、乳幼児の急死例に対する疫学調査ができるように、学内の研究審査委員会から承認を得た上で、これまでの剖検例について統計をとっている。出生時体重、発育、異常の発見時刻、最終生存確認から異常発見までの時間、両親の喫煙といったSIDSで関心のある項目にある程度に法医学から報告ができるのではないかと考えている。チャイルド・デス・レビュー(CDR)とは、乳幼児を中心とした小児の突然死や事故に伴う外因死を様々な角度から検討し、再発予防を提言する海外で採用されている社会的な制度である。今回の研究では、死因が十分に特定できず原因不明とせざるをえなかった突然死に対して、遺伝性疾患を調べる死後遺伝学的検査を確立してゆくこと加えて、突然死が起こった状況について資料から疫学的解析を実施した。

現在までに、法医解剖となった予期されない小児の突然死例に対して、1例に心筋症を発症する可能性のある変異をMYH7遺伝子に見出すことができた。さらに、この遺伝学的診断の中で、遺伝カウンセラーにグリーフケアを依頼し、臨床心理士が遺族の対応に当たる流れを学内で確立することができた。後向き研究として東海大学医学部法医学領域における6年間の解剖例から、明らかな外因死を除いた1歳未満乳幼児急死39例を抽出し、剖検所見、状況等の情報や母子手帳等を資料として、問診・チェックリストの各項目を埋めてみた。死因としては、SIDS16例、不詳16例、肺炎2例、インフルエンザ2例等であった。全体像としては、平均5.1月齢で2ヶ月児が13例と最も多く、男児25例(64%)、女児14例(36%)であった。第2子以降が59%を占め、第1子より多かった。平均出生体重は3005±400 g、在胎週数は平均38.6±1.6、母親と父親の年齢は、26.5±6.1歳と28.8±7.8歳であった。全項目のうち、発見場所、発見者、異常発見時の時刻、発生時睡眠、添い寝等については9割以上で確認できたのに対して、寝具の柔らかさ、死亡時の部屋の暖房、普段の睡眠中の着衣、母親の育児ストレス、養育環境・態度の印象等については2割以下の回答率にとどまった。法医剖検が提供できる情報の範囲が明確化できたので、乳幼児突然死の解析に役立てることができると考えている。原因が特定できない乳幼児の突然死に対して、死後にゲノム解析から死因となった疾患を推定する死後遺伝子検査が普及し始めている。不整脈疾患や脂質代謝異常疾患が主な対象であり、今回の研究では法医解剖となった19例に実施し、2例に重大な心臓疾患を来しうる変異を検出できた。一方で、ゲノム解析なので、診断に加えて、残された家族への配慮が必要である。死後遺伝子検査を実施する中で、臨床医と遺伝カウンセラーにグリーフケアを含めて遺伝相談に当たってもらうことができた。病院内の異なる専門家が集まり役割分担をする中で、予期せず子供を失った家族に対応する体制の原型作りができたと考えている。現在、次世代シークエンサーの解析方法は確実に実施できる段階にきている。ただし、得られた変異の意味づけや疾患との関連性に関しては、まだまだ試行錯誤の段階なので、さらに簡便で確実な分析方法を開発してゆきたい。また、実務的には、家族対応について付属病院の遺伝診療室と連携をとっているが、症例の共有をはじめ、臨床検査科、小児科、内科と協力し、助言を得られるように体制を整えてゆきたい。現在、次世代シークエンサーの解析方法は確実に実施できる段階にきており、他科からの解析依頼を引き受けるところまで、技術的には安定した結果を出せるようになっている。ただし、得られた変異の意味づけや疾患との関連付けに関しては、データベースとの参照で目星をつけているが、まだまだ確実な判定には至らず、個々の論文を調べてゆくという時間がかかる作業に追われている。今後は、いかに簡便で時間のかからない分析方法を工夫してゆく必要性を強く感じている。また、実務的には、家族対応について当大学医学部付属病院の遺伝診療室が来年度よりグリーフケア外来を開始することとなり、法医解剖例になり子供を失った家族親も対象としてカウンセリングや診療を受けられる予定である。
Ｈｏｘ遺伝子の機能解析から探る棘皮動物の進化

棘皮動物は左右相称動物に属しながら五放射相称という奇妙なボディープランをもつ。しかし、その体制がどのように進化したかは動物学の謎として残っている。Hox遺伝子複合体は左右相称動物の前後軸にそったパターン化を調節している。ウニ成体原基におけるその発現としらべることによって棘皮動物の前後軸を探り、3つの新知見を得た:(1)棘皮動物の祖先的な前後軸情報は成体の消化管(口-肛門)にあるらしい、(2) 5本の腕は軸ではなく口の周りの突起とみなすべきである、(3)五放射体制の形成には一部のHox遺伝子が軸情報としての機能を失い、放射状パターン化に転用されたらしい。本研究の全体構想は、棘皮動物の進化をHox遺伝子複合体の機能解析をとおして理解することである。棘皮動物は五放射相称という特異なボディープランをもち、その体制は幼生の成体原基でつくられる。複数のグループがウニ成体原基でのhox遺伝子発現をしらべてきたが、その情報はいまだに断片的である。申請者は直接発生種ヨツアナカシパンを材料として、WMISH法によって世界で初めてhox遺伝子発現の全貌を明らかにした。本研究はこの先進性を機能解析によって進展させ、五放射体制の発生メカニズムを明らかにするとともに、五放射の基礎の局在(外胚葉か中胚葉か)を特定することを目的としている。ヨツアナカシパン幼生の羊膜陥(成体外胚葉)においてhox1, hox5, otxが五放射状に発現する。一方、単離した動物半球は羊膜陥をつくり、そこでhox1とhox5が発現するが、otxは発現しない。その後、羊膜陥は細胞死を起こす。この観察はhox1とhox5の発現が自律的であることを示すとともに、成体原基において中胚葉から放出されるシグナルがotx発現と羊膜陥の成長維持に必要であることを示唆している。ゲノム解読されているウニStrongylocentrotus purpuratusからシグナル伝達遺伝子を選抜し、その配列を用いてヨツアナカシパン幼生のトランスクリプトーム情報をBLAST検索した。次にそのヨツアナカシパンbest hit配列を用いてStrongylocentrotus purpuratusゲノムをBLAST検索し、reciprocal best hitする53遺伝子を選抜した。これらの遺伝子の発現部位を解析することによって、外胚葉-中胚葉相互作用に関わる経路を検索している。本研究の全体構想は、棘皮動物の進化をHox遺伝子の機能解析をとおして理解することである。棘皮動物は五放射相称という特異なボディープランをもつ。複数のグループがウニ成体原基でのHox遺伝子発現をしらべてきたが、その情報はいまだに断片的である。申請者は直接発生種ヨツアナカシパンを材料として、WMISH法によって世界で初めてHox遺伝子発現の全貌を明らかにした。この研究成果は現在投稿中である。ヨツアナカシパン幼生の羊膜陥(成体外胚葉)においてHox1, Hox5, Otxが五放射状に発現する。一方、単離した動物半球は羊膜陥をつくり、そこでHox1とHox5が発現するが、Otxは発現しない。この観察はHox1とHox5の発現が自律的であることを示すとともに、成体原基において中胚葉から放出されるシグナルがOtx発現と外胚葉維持に必要であることを示唆している。連携研究者の和田はヨツアナカシパン幼生のトランスクリプトーム解析を進めている。ゲノムが解読されているウニStrongylocentrotus purpuratusからシグナル伝達遺伝子を選抜し、その配列を用いてヨツアナカシパン幼生のトランスクリプトーム情報をBLAST検索した。これらの遺伝子の発現部位を解析することによって、外胚葉ー中胚葉相互作用に関わる経路を同定する予定である。このボディープランの進化に複数の説が提案されているが、大別すると2つのシナリオに収束する:ヒトデの腕(歩帯)を「体軸」ととらえるか「付属突起」とみなすかである。報告者は直接発生種ヨツアナカシパンを材料として、WMISH法によって世界で初めてhox遺伝子発現の全貌を明らかにした。

その発現パターンは、(1)棘皮動物の祖先的な前後軸情報は、腕ではなく(変態後に後体腔にそって時計回りに伸びる)成体の消化管にある一方、(2)放射状に発現するhox遺伝子は軸の役割を失い、棘皮動物あるいはウニの新規構造(棘や歯)のパターン化に転用されたらしいことを示唆する。すなわち、放射状に発現するhox1, hox3, hox5遺伝子の調節機構の解明が、棘皮動物の進化を解く鍵となると着想した。赤道面で切断した動物半球と植物半球の発生形態と遺伝子発現は、それぞれの自律性と相補性の両面を示す。動物半球の表現型と遺伝子発現は、成体原基において中胚葉から外胚葉に向けて複数のシグナルが放出されることを示唆する:(1)自律的なhox1とhox5の発現を放射化するシグナル、(2)otx発現を誘導するシグナル、(3)羊膜外胚葉の発生を維持するシグナル、である。一方、植物半球はプルテウス型の幼生へと発生したが、対照のように棘をつくらず、変態しなかった。つまり、外胚葉ー中胚葉間の双方向のシグナル伝達が成体原基形成に必須であると考えられる。実際、初期幼生をU0126で処理すると、対照と同様にプルテウスへと発生し、羊膜陥は中胚葉を被った。しかし、hox3発現は、棘原基すべてで抑制され、歯嚢原基での抑制は21時間を境に部分的に解除された。この時間差は、原基でのhox3の発現時期・順序と矛盾しない。したがって、外胚葉シグナルは中胚葉でMAPK径路をへてhox3を活性化すると予想される。進化発生学モルフォリノオリゴによるhox遺伝子ノックダウンの表現型が得られていない。体腔でlinearに発現する5つのhox遺伝子は成体の消化管の部域化を調節する位置情報を与えていると予想している。成体の消化管の分化は変態後に始まり、口-食道-腸-大腸-肛門が完成するまで数週間要する。変態後の稚ウニの飼育方法を確立する必要がある。一方、ヨツアナカシパン幼生のトランスクリプトーム情報を用いたシグナル伝達関連遺伝子の検索は予定どおり進んでおり、それらの発現をWMISHで解析している。受精卵へのモルフォリノオリゴ注入によってHox遺伝子ノックダウンを試みたが、これまで顕著な表現型が得られていない。シグナル伝達関連遺伝子のWMISH検索によってfgfaが羊膜陥外胚葉で発現していることを見いだした。そこで、FGFシグナル径路阻害剤U0126で経時的に処理した胚の表現型を形態とマーカー遺伝子発現によって解析した。発生初期(原腸胚まで)から処理した胚では幼生骨片の形成と伸長が阻害された。成体原基形成期(プリズム幼生以降)に処理すると、羊膜陥は対照胚と同様に形成されたが、歯嚢と棘の形成が阻害され、それらのマーカーであるhox3の発現も消失/減少した。この観察は、外胚葉から中胚葉へのFGFシグナリングが幼生だけでなく成体の骨形成を調節していることを示唆している。今後、fgfaとfgfrの全長cDNAを単離し、TALEN法によってそれぞれのノックアウト胚を作成し、その表現型を形態とFGFシグナリング下流遺伝子発現から解析することを計画している。次年度は、トランスクリプトーム解析と発現解析から成体原基における外胚葉と中胚葉の相互作用経路の同定を進める。
臨床検査データベースの標準化に関する研究

臨床検査データベースの構築には医療情報の中での位置づけを考慮して,多面的に利用出来るように構築するとともに,他施設との互換性を配慮する必要がある。臨床検査データベースが標準化していると他施設にデータを迅速,正確に送信でき,患者の転医,救命・救急,旅行先での不時の診療に対応でき,メリットは極めて大きい。しかし,日本における臨床検査データベースの現状は各施設が独自に構築しているため,データの互換性がなく,上記に条件を満足していないので,実地診療で多大の支障を来している。この日本における現状を共同で調査研究し,その問題点を分析することにより,臨床検査データベースの統一的な標準案のあり方を探った。一方,中国においては臨床検査システムにコンピュータ導入が今後急速に行なわれると考えられるので,日本の撤を踏まないためにも現段階で,中国の代表的大学病院の臨床検査部門における臨床検査データべースを共同調査するとともに,データベースの標準化の必要性を啓蒙教育し,中国における全国統一的な標準化を図ることが,中国の近代医療の向上に貢献しうると考えられる。以上の観点から,本共同研究を開始し,所期の成果を挙げることができた。研究経過[派遣による実績]平成2年度は日本側研究者3名が中国に赴に,先ず北京医科大学ついで,日本側研究者に中国側研究者が同行して,北京市内の協和医科大学,中国友好病院において,また上海では上海第一医科大学と長征病院において,平成3年度は日本側研究者1名が中国側研究者2名とともに西安医科大学,および南京医学院において,平成4年度は日本側研究者1名と,中国側研究者2名が中山医科大学第一病院,中山医科大学第二病院,広州医科大学において,臨床検査システムを調査した。未だ中国では臨床検査がシステム化されていないので,職員に対してシステム化およびデータベース統一,すなわち標準化の重要性を講演して,本共同研究の意義を周知させた。この教育活動によりデータベース標準化の重要性が彼らに理解され,我々の所期の目的は達せられたと考える。[招聘による実績]平成2年度は中国側研究者2名を招聘し,日本における臨床検査データベースの現状を共同調査した。東京医科歯科大学,東京大学,三菱油化検査センターを調査対象とした。平成3年度は中国側研究者3名が来日し,東京医科歯科大学,自治医科大学,SRL検査センターを,平成4年度は中国側研究者1名が来日し,東京医科歯科大学,神戸大学,京都大学を調査した。日本においては臨床検査がシステム化されており,コンピュータが導入され各病院に臨床検査データベースはあるが,病院間における互換性がなく,データベースの相互利用に支障を来たしているなど,その問題点を把握することが出来,一層,データベース標準化の重要性を認識できたと中国側研究が評価していた。今後の展望以上,3年間の共同研究を通して,中国人医師,検査技師にデータベース標準化の重要性が理解された考えられる。中国では病院へのコンピュータ導入が今後急速に行なわれると考えられるので,中国におけるこの分野の発展に寄与すると確信している。また,わが国を含め,先進諸国で不可能な医療データベース統一が実現すれば患者の受ける恩恵は計り知れないと考えられる。北京医科大学では本共同研究が極めて重要な意義を持つものと捉え,今後の継続研究を要望して研究代表者の椎名晋一を平成4年から北京医科大学客員教授に任命して教育,研究の支援を要請している。従って,本研究は今後も継続し,発展することが期待される。

平成3年度は中国側研究者3名が来日し,東京医科歯科大学,自治医科大学,SRL検査センターを,平成4年度は中国側研究者1名が来日し,東京医科歯科大学,神戸大学,京都大学を調査した。日本においては臨床検査がシステム化されており,コンピュータが導入され各病院に臨床検査データベースはあるが,病院間における互換性がなく,データベースの相互利用に支障を来たしているなど,その問題点を把握することが出来,一層,データベース標準化の重要性を認識できたと中国側研究が評価していた。今後の展望以上,3年間の共同研究を通して,中国人医師,検査技師にデータベース標準化の重要性が理解された考えられる。中国では病院へのコンピュータ導入が今後急速に行なわれると考えられるので,中国におけるこの分野の発展に寄与すると確信している。また,わが国を含め,先進諸国で不可能な医療データベース統一が実現すれば患者の受ける恩恵は計り知れないと考えられる。北京医科大学では本共同研究が極めて重要な意義を持つものと捉え,今後の継続研究を要望して研究代表者の椎名晋一を平成4年から北京医科大学客員教授に任命して教育,研究の支援を要請している。従って,本研究は今後も継続し,発展することが期待される。1.日本側研究者3名が中国に赴き先ず北京医科大学の臨床検査システムについて調査した。まだシステム化されていなかった。一方、大学職員を集めてもらいデ-タベ-ス統一、すなわち標準化の重要性を講演して、本共同研究の意義を周知させた。2.ついで、日本側研究者に中国側研究者が同行して、北京市内の協和医科大学、中日友好病院において、また上海では上海第一医科大学と長征病院において臨床検査システムを調査した。また、各病院でデ-タベ-ス統一の重要性について講演し、中国人医師の医療情報についての意識革命を行なった。この教育活動によりデ-タベ-ス標準化の重要性が彼らに理解され、我々の所期の目的は達せられたと考える。3.中国では病院へのコンピュ-タ導入が今後急速に行なわれると考えられるので、中国におけるこの分野の発展に寄与すると確信している。4.中国側研究者2名が来日し、日本における臨床検査デ-タベ-スの現状を共同調査した。調査病院として東京医科歯科大学、東京大学、三菱油化検査センタ-を対象とした。日本においては臨床検査がシステム化されており、コンピュ-タが導入され各病院に臨床検査デ-タベ-スはあるが、病院間における互換性がなく、デ-タベ-スの相互利用に支障を来たしているなど、その間題点を把握することが出来、一層、デ-タベ-ス標準化の重要性を認識できたと評価していた。研究の進捗状況はほぼ計画通りである。【派遣による実績】1.日本側研究者1名が中国に赴き先ず、北京医科大学と中日友好病院のデ-タベ-ス統一の作業進行状況を調査した。2.次いで、日本側研究者に中国側研究者2名が同行して、西安医科大学、および南京医学院において、臨床検査システムを調査した。また、
肥満による脂肪細胞のインスリン抵抗性・中性脂肪合成能低下のメカニズムの解明

独自開発のプロモーター解析手法であるin vivo Ad-luc法を活用して脂肪酸合成酵素(FAS)遺伝子のプロモーター解析を行った結果、肥満動物の脂肪組織ではFAS遺伝子のプロモーター活性が低下しており、肥満・インスリン抵抗性の病態において、FAS遺伝子の発現が転写レベルで抑制されていることを明らかにすることができた。メタボリックシンドロームの病態の根幹をなす、肥満に伴うインスリン抵抗性の本質は、肥満に対するネガティブフィードバック機構であると考えられる。肥満時の肥大化した脂肪細胞にはインスリン抵抗性のひとつの表れとして、脂肪酸合成酵素(FAS)を始めとするlipogenic genesの発現の低下があることを我々は以前、マイクロアレイ解析等により見出し、報告した。このlipogenic genesの発現低下は脂肪細胞のインスリン抵抗性の結果であるとともに糖取り込み低下の原因にもなっているものと考えられ、肥大脂肪細胞の重要な特徴のひとつと言える。この現象の発生機序を解明することが、本研究のテーマである。本年度の研究成果として、脂肪組織にアデノウイルスによるFASプロモータールシフェラーゼレポーター遺伝子の導入を行い、in vivo imaging system(IVIS)によってFAS遺伝子のin vivoプロモーター解析を行ったところ、肥満動物の脂肪組織ではFAS遺伝子のプロモーター活性が低下しており、FAS遺伝子の発現が転写レベルで抑制されていることを明らかにすることができた。さらに、FAS遺伝子のプロモーター領域の各部位を詳細にin vivoプロモーター解析により調べることで、FAS遺伝子のインスリン作用による活性化メカニズム、および肥満・インスリン抵抗性下における抑制のメカニズムを解明することを目指して解析中である。本年度の研究成果として、脂肪組織にアデノウイルスによるFASプロモータールシフェラーゼレポーター遺伝子の導入を行い、in vivo imaging system (IVIS)によってFAS遺伝子のin vivoプロモーター解析を行ったところ、肥満動物の脂肪組織ではFAS遺伝子のプロモーター活性が低下しており、FAS遺伝子の発現が転写レベルで抑制されていることを明らかにすることができた。さらに、FAS遺伝子のプロモーター領域の各部位を詳細にin vivoプロモーター解析ならびにelectromobihty shift assayにより調べることで、EAS遺伝子のインスリン作用による活性化メカニズム、および肥満・インスリン抵抗性下における抑制のメカニズムを解明することを目指して解析中である。
cAMPによる開口分泌制御におけるcAMP compartmentの意義

膵β細胞においてcAMPシグナルは、インスリン顆粒の細胞内から細胞膜へのリクルートメントと細胞膜への融合を促進することでインスリン分泌を増強することが明らかになった。またcAMPセンサーEpac2は細胞膜近傍のインスリン顆粒プールのサイズを増やすことでインスリン分泌増強の第1相を担っていた。さらにこのようなEpac2の機能には、Epac2の細胞膜への局在が必要であったことから、細胞膜近くに存在するcAMPつまり、cAMP compartmentがEpac2を介したインスリン分泌増強に重要であることが示された。(1)膵β細胞におけるcAMP compartmentの存在を明らかにする目的で、Epac2のN末端をCFPで、C末端をYFPで標識したFRET(Fluorescence Resonance Energy Transfer蛍光共鳴エネルギー移動)プローブを作製した。このEpac2FRETプローブをインスリン分泌細胞株MIN6に導入発現させ、forskolinで刺激したところ、細胞内cAMPレベルの上昇を感知したことから、このプローブはFRETプローブとして機能することが証明された。(2)蛍光タンパク質Venusで標識したヒトプレプロインスリン(インスリンVenus)を初代培養膵β細胞に導入し、インスリン分泌顆粒の動態(ダイナミクス)を全反射蛍光顕微鏡を用いて解析する方法を確立した。(3)インスリンVenusを用いて、種々の刺激によるインスリン分泌顆粒の開口分泌過程を詳細に検討したところ、分泌顆粒動態の特性によりold face、resting newcomer、restless newcomerの3種類の様式に分類された。Ca^<2+>単独刺激ではold faceが主要な開口分泌の様式で、グルコース刺激では一過性の早期相および持続的な後期相のいずれも大部分はrestless newcomerによる開口分泌であった。開口分泌に重要なcAMPシグナルによるインスリン分泌顆粒動態について解析したところ、cAMP単独刺激によって顆粒の細胞膜へのrecruitmentは促進されたが、fusionは殆ど惹起されなかった。しかしながら、グルコース刺激と組み合わせると、fusion部位の増加とともにrestless newcomerが顕著に増加した。(1)細胞膜に局在出来ないEpac2変異体を発現させた膵β細胞において、8-Bromn-cAMPによるインスリン分泌増強は細胞膜に局在する野生型Epac2を発現させた細胞と異なり誘導されなかったことから、Epac2は細胞膜に局在することで、cAMP cnmpartrnentと相互作用し、インスリン分泌を制御することが予想された。(2)膵β細胞内のcAMP compartmentに関与する分子群を明らかにするために、細胞膜の分画を行ったところ、EDac2はある種の分画に特異的に存在するのに対し、PKAはこの分画とともに他の分画にも存在していたことから、Epac2とPKAは同様なcAMP compartmentに存在する可能性が予想された。(3)インスリン分泌顆粒動態に対するcAMPの効果とcAMPによるインスリン開口分泌制御におけるEpac2/Rap1シグナルの役割について全反射型蛍光顕微鏡を用いて検討した。8-Bromo-cAMP前処置により、グルコースによるインスリン分泌の第1相、第2相ともに膜融合の頻度が増加し、インスリン分泌の増強効果がみられた。また、この増強は、による第1相の膜融合頻度の増強はほとんど認められなかった。一方、第2相の増強は野生型のβ細胞と同程度であった。また、インスリン分泌細胞株においてRap1の活性化を検討したところ、グルコース単独刺激でRap1は活性化されなかったが、8-Bromo-cAMP,8-pCPT-2'-O-Me-cAMP、GIPおよびGLP-1刺激で活性化された。またH-89存在下、Ran1の活性化は抑制されなかった。従ってcAMPによるインスリン分泌制御において、Enac2/Ran1シグナルはイン1スリン分泌の第1相の増強に関与することが明らかになった。(1) Epac2をインスリン分泌細胞株MIN6に発現させ、8-Bromo-cAMPとグルコースで刺激すると、インスリン分泌は16.7mMグルコースではなく、5.6mMグルコースでのみ有意に誘導された。この結果は、食事後、血中グルコース濃度が上昇しはじめたときに、Epac2が関与すること示唆している。また、Epac2は細胞膜に局在することから、5.6mMグルコースによる惹起される代謝シグナルは、細胞膜付近でEpac2の存在するcAMP compartmentと相互作用しインスリン分泌を誘導することが明かになった。(2)またEpac2が存在するcAMP compartmentの構成分子を明らかにするために、cAMPアナログ8-Bromo-cAMPで刺激したMIN6細胞を用いて、Epac2の下流シグナルを担うRap1と結合する分子のスクリーニングを行った。未刺激の細胞と比較して、SDS電気泳動で認められた特異的バンドは下流シグナルを担うと推測される。
地域における社会情報のシステム化に関する社会学的研究

1.本研究調査の目標と範囲を限定するために、行政施策やその他で一般に用いられている社会情報や地域情報化施策等の用語例を検討し、とくに「地域情報」ないし「地域情報化」と「地域社会情報」の概念を吟味した。2.地域情報化の諸相と行政の対応を究明するために、中央各省庁の最新の情報化施策の概要とともに主に東北地区の地方自治体における地域情報化への取り組みについて検討した。3.地域情報システム化の典型事例として、高齢者への新しいサポートシステムづくりの一環として試行されている保健・医療・生活情報の電算化による統合化施策の進捗状況と問題点をいくつかの典型地点について、資料収集と聴取調査を行った。とくに宮城県登米町と釜石地区の事例を対象として、それらの地域住民への浸透度、住民の対応行動と意識などについて集中的な現地調査を実施し分析した。4.近未来の情報化社会の担い手のサンプルとして、東北学院大学、東北大学、岩手大学の学生を対象として、情報化社会へのイメージ、新しい情報媒体へのアクセス、認知・処理能力などの情報リテラシーの度合などとともに、プライバシー保全や情報公開などの情報規範意識についも、広範なサーベイ調査を実施した。これらの現地調査によって、地域における新しい社会情報システムの適切な構築と運用のためには、進展著しいハードな機器や設備に比して、遅滞しがちなソフトな情報制度の整備と運用する人材の養成が緊急に必要であることが痛感された。そしてさらに新しいコミュニティの在りようとしの「地域社会情報システムの存立」のためには、何よりも地域住民の情報リテラシーや情報の発信能力の確保、そしてその基盤としての地域住民の主体的な参加意欲と支持の存在が不可欠の前提であると言えよう。地域住民の生活や公共的サービスにかかわる分野での新しい社会情報システムの導入経過と、その実施にともなう諸問題を、次のような地点での事例を対象として、主にソフトな面に焦点を当てながら実証的に調査研究した。1.岩手県沢内村および大阪府松原市における保健・医療・福祉のネットワーク化を指向した地域包括保健医療福祉システム構築の進展状況と問題点2.山形県米沢市、岩手県釜石市、秋田県男鹿市における新たな地域メデアとしてのCATVおよび災害情報システムの構築経過と住民のニーズの実態、3.宮城県登米町および山形県米沢市における高齢者へのサポートシステムの電算化と住民カードシステムの構築の実態と住民の対応、4.仙台市における新しい地域社会情報システムの稼働状況とそれらにともなう個人情報の保護や情報公開のための施策の進捗状況、これらの現地調査によって新しい社会情報システムのハードな側面での著しい進展にもかかわらず、対応すべきソフトな情報制度の整備が伴わず、作成されているものもほとんど形式的なものにとどまっていること。とくに地域住民の対応や意識の実態をみると、これらの新しい情報媒体へのアクセス、情報リテラシーや処理能力、参加と学習意欲、プライバシー保全感覚、情報公開要求などの規範意識などにおいては、いづれのケースにおいても著しい遅滞やズレがあることが判明した。したがって、これらの社会情報の開発・保存・制御の機構整備のためには、なによりもこのようなソフトな面での社会的調整の方策の探究が緊急の課題となっていると言えよう。1.地域における社会情報のシステム化の諸相を探るため、郵政省のテレトピア構想などを始めとする中央省庁の施策の目的、事業内容、地域指定などの概要を検討するとともに、おもに東北地区の地方自治体における地域情報化への取り組みについて、広範な資料収集と分析を行った。2.これらの新しい情報システムへの人々の対応行動と意識の実態を究明するため、近未来の情報化社会の主要な担い手となる若者のサンプルとして、東北学院大学、東北大学、岩手大学の学生を対象として、質問紙票を用いたサ-ベィ調査を実施した。とくに情報社会へのイメージと、新しい情報メディアへの接触やアクセスの実態、認知・処理能力などの情報リテラシー確保の度合とともに、プライバシー保全感覚と情報公開への要求などの規範意識等をも分析した。

3.宮城県登米町における高齢者への新しいサポートのシステムづくりの一環としての、保健・生活情報一元化の行政施策進捗状況と、それらの地域住民への浸透度を解明するため、住民各層の生活構造の実態とともに、これらの新しい情報システムについての認知度とニーズ、対応行動とプライバシーの保全や情報公開などの規範意識等に関して、現地における学生調査員による戸別聴取調査と面接調査を実施した。4.米沢、男鹿、釜石の各地区におけるCATVの稼働状況、とくに釜石地区における医療・保健・生活情報に関する新しい統合情報システムの構築と住民ニーズとの対応についての集中的な聴取調査とアンケート調査を実施した。これらの現地調査によって、地域における新しい社会情報システムの適切な運用のためには、対応すべきソフトな情報制度の整備や、運用する人材の確保とともに、一般の地域住民の支持と参加意欲の醸成も必要不可欠であることが判明した。
中赤外レーザーを用いたエネルギー機能材料におけるフォノンの生成変換過程の制御

中赤外自由電子レーザー光源(KU-FEL: Kyoto University Free-Electron Laser)を利用した新しいフォノン分光を着想し、その確立を目指している。エネルギー生成・貯蔵の過程における損失となる熱を制御し、統一的に理解し、より革新的な材料開発に生かすことをめざして、波長可変な中赤外レーザー光源を用いて固体における個々のフォノンモードを自由に選び、励起し、観測できる、新たな分光法を確立することを目的とする。メチルアンモニウム鉛ヨウ化物(CH3NH3PbI3)および塩化物(CH3NH3PbCl3)におけるCH3NH3+カチオンの内部振動モードのKU-FELによる一光子励起に着手した。同振動モードによキャリアの散乱により、この化合物における励起子からの高効率な電荷分離メカニズムを明らかにし、同化合物の光電変換効率の高さの原因を解明することを目指している。チタン酸ストロンチウム(SrTiO3)の赤外不活性なモードを一光子励起するべく、格子歪みを導入したLaまたはNbイオンドープの多結晶試料を作成し、間接遷移型バンドギャップの半導体においてフォノン励起と併せた光学遷移によってはじめて観測が可能となるようなフォトルミネッセンス光の観測を利用して、ラマン散乱測定よりも高感度かつ簡便に格子振動励起の実証が可能となる。また、単結晶ダイヤモンドにおける赤外不活性な振動モードの、KU-FELを用いた二光子励起による選択励起に成功した。このモードはホウ素ドープ・ダイヤモンドにおける超伝導の発現に関与するため、特定のフォノンモードが物性に及ぼす影響の解明と共に、赤外不活性モードの励起により選択励起が可能な光学過程が増大する。FEL照射時にのみ、このモードのアンチストークス・ラマン散乱光が観測された。散乱光強度のFELのエネルギー依存性より二光子励起と考えられる。単結晶ダイヤモンドにおける赤外不活性なT2g振動モードの、二光子励起による選択励起に成功した。極低温に冷却した試料に目的のフォノンの波長に調整したFEL光照射で選択的にフォノンを励起した。Nd:YAGレーザー(532 nm)をプローブ光とし、アンチストークスラマン散乱(ASRS)光として励起フォノンを検出した。1,332 cm-1のT2gモードを二光子励起するため、FELを666 cm-1に対応する波長に調整し、極低温(7 K)で単結晶ダイヤモンドに照射した。その結果、FEL照射時のみ1,300 cm-1付近でASRS光が観測された。また、ASRS光強度がFELのエネルギーに対して二次の応答を示すことから、T2gモードの二光子励起に成功したと考えられる。目的とする波数からの赤色偏位は極度の集光による観測面の破壊によるものであることが示唆された。この成果を原著論文として投稿準備中である。上述のダイヤモンド以外の化合物についての中赤外レーザーの一光子励起による選択励起を継続しつつ、ダイヤモンドについては選択励起条件の最適化による試料面の非破壊での測定、ホウ素ドープダイヤモンドにおける同様の赤外不活性なモードの中赤外レーザー二光子選択励起、さらに、その成果を踏まえた超伝導発現メカニズムにおけるフォノンの役割、および、中赤外レーザー光励起による特定フォノンの選択励起によって誘起される超伝導発現条件の緩和の可能性を検討する。

Nd:YAGレーザー(532 nm)をプローブ光とし、アンチストークスラマン散乱(ASRS)光として励起フォノンを検出した。1,332 cm-1のT2gモードを二光子励起するため、FELを666 cm-1に対応する波長に調整し、極低温(7 K)で単結晶ダイヤモンドに照射した。その結果、FEL照射時のみ1,300 cm-1付近でASRS光が観測された。また、ASRS光強度がFELのエネルギーに対して二次の応答を示すことから、T2gモードの二光子励起に成功したと考えられる。目的とする波数からの赤色偏位は極度の集光による観測面の破壊によるものであることが示唆された。この成果を原著論文として投稿準備中である。上述のダイヤモンド以外の化合物についての中赤外レーザーの一光子励起による選択励起を継続しつつ、ダイヤモンドについては選択励起条件の最適化による試料面の非破壊での測定、ホウ素ドープダイヤモンドにおける同様の赤外不活性なモードの中赤外レーザー二光子選択励起、さらに、その成果を踏まえた超伝導発現メカニズムにおけるフォノンの役割、および、中赤外レーザー光励起による特定フォノンの選択励起によって誘起される超伝導発現条件の緩和の可能性を検討する。
ウイグル語との対照による日本語の活用・接辞の発生論的研究

古代日本語の助詞や助動詞というものの意味は分かりにくく、どうしても現代日本語の枠でしか理解できない。ところがウイグル語の分析を通じて、その日本語の枠を取り外して考えることができるようになる。例えば、『万葉集』にたくさん現れる副助詞「し」は一般的には「強調」としか考えられて来なかった、ウイグル語との対照によって、「指示」の意味であった可能性があることに気づく。その方向を進めてゆくと、回想の助動詞「き」の連体形や形容詞の語尾「し」などとの関連があり得ることもにも気づくのである。また『万葉集』の助詞「い」も強調と呼ばれているが、ウイグル語の中では[si]は母音終止のものに、[i]は子音終止のものに付く。日本語の「し」「い」ももともとはそういう相関関係にあった可能性もある。現代語の時制についても、現在・過去に大別され、現在形が将来形も兼ねるという枠が共通し、連体形と終止形の文法的機能に重なるところがあることなど、類型的な一致が見られる。これらは共時的・通時的に、体系的に考察してからでなければ結論は出せないのであるが、日本語を見る視点を大きく変化させることができる。文法に関してだけではなく、句読点が、古くは概念として区別がなかったであろうという推察なども、やはり日本語で日本語を考えていては気づかないものである。今年度の目的としては、現代ウイグル語に見られる接辞の具体的な接尾法を、古代日本語における接尾法と比較して、古代日本語の接辞の性格を見直すことである。今年度はまだ基礎的研究の段階なので、ウイグル語の文例集の中から、特徴的な用例を抽出し、万葉集を中心とした古代日本語の文例をコンピューターに入力し、比較対照しつつあるという段階である。スキャナーを使用した作業については、予想よりも読み込み精度が悪く、長時間の手作業が必要であったことや、プログラムの作成をC言語からクイック・ベーシックに変更したことから、作業は予定よりも遅れている。しかし、作業の途中であっても、例えば、ウイグル語における指定詞〔-si〕〔-i〕は、古代日本語の副助詞といわれる〔-si〕〔-i〕との類似を見せ、古代日本語の副助詞〔-si〕〔-i〕が、そのような指定詞に似た文法的機能を持つ接辞であった可能性を示唆する。同時に、ウイグル語の〔-si〕〔-i〕は所有格助詞と相関するのであるが、その場合には古代日本語の連体格助詞「の」「が」が主格に変じて行く現象を連想させる、というような成果も出て来つつある。これからは、両言語の用例を更に細かく分析し、対照して行く必要がある。本年度は現代ウイグル語の文構造の分析を重点的に行った。これまでは中国語や英語の文法を通して、ウイグル語を理解していたが、これを日本語の文法概念に合わせて分析できるように、日本語版のウイグル語文法書を作成した(現在は最も重要な動詞の部分のみである)。この結果、[i][si]の問題以外にも、受け身・使役の構文の類似と相違点が日本語の接辞の発達を論じる上で、大きな発言力を持っているらしいこと、形容詞を作る接辞や動詞を作る接辞などの、品詞の転換をする接辞類が、日本語よりも豊富であり、この接辞の整理が古代日本語の分析には重要な糸口になることも推定できた。更に、構文的な問題としては、「することが...」という複句中の体言句を作る方式が日本語の動詞連体形の本来の働きを探る上で、示唆に富む特徴を持っていることも分かった。日本語の特徴という点からは、やはり四段活用が大きな問題になることが確認された。四段活用の発生過程の解明こそ、日本語のルーツを探る大きなポイントになる。古代ウイグル語の分析が中途半端に終わっていることが、次年度の大きな課題である。この原因は二つある。

一つは、協力者の阿不都熱西堤氏が招聘教授としてドイツに赴き、氏の協力が十分に得られなかったこと、もう一つは、大学改革の流れの中で、助手が廃止されたために、教官の事務量が膨大な量となり、夏休みまではその事務をこなすのに多くの時間を割かねばならなかったため、資料をパソコンに入力する作業が殆ど進まなかったためである(事務にかなり習熟したので、次年度はもう少し作業が進むことと思われる)。初めの二年間は、現代ウイグル語の例文を、1800例集め、日本語ウイグル語対訳文例集を作成し、パソコンに入力した。また、中国のウイグル語文法書の記述にあわせた文法の概説書を作成した。そして、文例集の各用例を丁寧に分析し、インフォルマントに発音してもらって、現代ウイグル語の特徴を把握した。しかし、古代ウイグル語の分析はついに完成しなかった。研究協力者の阿不都熱西提氏が、ドイツで教鞭を取るという変化などもあり、氏の協力が途中でなくなってしまったことが大きな原因である。現在日本国内で、単独でできることは、古文献の文献学的研究であって、文法の分析まではできない。古代ウイグル語の文法が記述できる人間が居ないのである。自習で古代ウイグル語の文法を記述することは時間がかかりすぎる上に、不正確なものしか期待できない。幸い、平成8年度には、満洲語を母語とする研究者の協力を得ることができるようになり、満洲語の文例集も作成し、日本語・・ウイグル語・満洲語の比較研究へと発展した。そして満洲語(シボ語)の対訳文例を加えて、三言語の対訳文例集を作成した。一般言語学的な常識として、言語の親縁関係は、音韻対応がなければ証明できないということになっているが、モンゴル語と満洲語のように疑う余地もなく近い関係にある言語でも、その音韻対応の成果は芳しくない。アルタイ系言語には音韻対応の方法は適用できないらしい。一方、語順や文法は変化しやすいというのが定説であるが、アルタイ語系言語と朝鮮語・日本語とは異常なほど文法が似ている。これを偶然の所産と考えることは難しい。印欧語族に属する言語の中に、語順が変化してしまったものがあることを根拠に、文法・語順は親縁関係の証拠にならないとされるが、他のほとんどの言語では大きくは変わっていないのである。むしろ、この点からも、文法や語順などが、言語の親縁関係に発言力があるだろうという推定も可能になる。ウイグル語を初めとするアルタイ語系言語に見られる現象が、日本語にも存在しており、受身・使役を示す接辞の順番、接辞の種類も似たところが多い。使役や受身という特殊な語法が、どうして似ているのか、受身の接辞が自動詞を作るという現象、使役の接辞が他動詞を作るという現象など、これらのウイグル語の特徴はそのまま日本語にもあてはまるのである。こういう細部に臻類似点が共通していることを確認するならば、日本語をアルタイ語全体の中から見直して行く作業はこれからも重要な視点であることは確信できる。
環境刺激によるクロマチン動態制御機構の解明

本年度は、1)DNA損傷ストレスに応答するクロマチンリモデリング因子とエピジェネティクス因子の解析、2)クロマチンの核内配置を制御メカニズムの解析、3)エピジェネティクス・ライブイメージング法の開発を進めたので、以下に研究実績の概要を示す。1)DNA損傷ストレスに応答するクロマチンリモデリング因子とエピジェネティクス因子クロマチンリモデリング因子RAD54はDNA損傷応答時に細胞核内でDNA修復フォーサイを形成する。共免疫沈降および質量分析により同定したRAD54相互作用因子であるヒストン脱メチル化酵素に注目して解析を進めた。2)クロマチンの核内配置を制御メカニズムシロイヌナズナの細胞核では、ヘテロクロマチンであるセントロメア・クロマチンが核膜周縁部に分散配置する。この分散配置に関与している複合体を同定した。この複合体は核膜を貫いて細胞質側のアクチン繊維と相互作用する。一方、核質側ではコンデンシンを介してセントロメア・クロマチンと相互作用する。各因子の変異体のHi-C解析を進めて、この複合体が全ゲノムレベルでDNA間の相互作用に影響を与えることがわかった。3)エピジェネティクス・ライブイメージング法の開発ヒストン修飾に結合するミントボディの発現ラインの作成を進めた。発現ラインはプロモーターを代えることで、細胞質と核質両方に発現するラインの取得ができた。また、ミントボディを用いた免疫沈降により、細胞群や組織特異的なクロマチンIPが可能になった。原著論文を6報出版することができ、研究成果が雑誌表紙に採用されたから。環境刺激を受けるとクロマチンにエピジェネティックな変化が引き起こされる。その変化を制御する分子メカニズムを、植物のDNA損傷ストレス感受性を利用することで、ヒストン修飾やクロマチンリモデリングに関与する植物のクロマチンの動態制御因子を同定し、その機能を明らかにする。また、環境刺激を記憶する細胞群を、クロマチン動態変化のライブイメージング解析や光学的細胞操作による機能阻害によって特定する。これにより脳がない植物における自律分散型の環境記憶システムのメカニズムをエピジェネティクス制御の側面から明らかにする。特に、環境刺激によって、クロマチン動態制御因子が核内のクロマチン構造を変化させるメカニズムを、クロマチン配置とエピジェネティクス制御の面から解析する。植物のDNA損傷ストレス(放射線や薬剤)感受性を利用して、ヒストン修飾酵素群やクロマチンリモデリング因子群の中から同定下植物のクロマチンの動態を制御する因子の解析を進めた。この因子のインタラクトーム解析を免疫沈降による相互作用因子同定により同定した。さらに、LacO/lacI挿入によるクロマチン特異的部位の3次元解析、mintbodyやTGVを利用したクロマチン動態解析をおこなった。1)相同染色体クロマチンの核内配置を制御するクロマチンリモデリング因子の同定DNA損傷応答におけるクロマチン動態を解析するために、クロマチン蛍光タグシステムlacO/LacI-EGFPシステムを用い、シロイヌナズナ細胞核における相同染色体座を可視化した。2)クロマチンの核内配置を制御する核内複合体の解析シロイヌナズナの細胞核では、ヘテロクロマチンであるセントロメア・クロマチンが核膜周縁部に分散配置する。コンデンシン変異体において、セントロメア・クロマチンが細胞核の片方に偏在して局在する現象を観察した。3)ゲノム編集を用いたクロマチンライブイメージング法の開発核内のクロマチン配置は環境ストレスに対するゲノムメンテナンスや発現制御に関与する。核内のクロマチン配置の研究は、主にFISH法によって行われてきたが、固定や変性等の処理が必要なため、元の構造の保存性の問題や時空間的な解析が難しいなど問題点があった。そこで、ゲノム編集技術特異的なクロマチンを可視化するTGV法を行った。シロイヌナズナ受精卵をライブイメージングする系を立ち上げ、これまでに、細胞骨格の微細構造の観察と特異的な阻害剤投与実験が可能であることを確認した。シロイヌナズナのTGV系の立ち上げに成功し、植物クロマチン・ライブイメージングの道が開けたから。また、シロイヌナズナ受精卵をライブイメージングする系を立ち上げ、これまでに、細胞骨格の微細構造の観察と特異的な阻害剤投与実験が可能であることを確認することに成功したため。その変化を制御する分子メカニズムを、植物のDNA損傷ストレス感受性を利用することで、ヒストン修飾やクロマチンリモデリングに関与する植物のクロマチンの動態制御因子を同定し、その機能を明らかにすることを目的に研究を推進した。シロイヌナズナの細胞核では、ヘテロクロマチンであるセントロメア・クロマチンが核膜周縁部に分散配置する。この分散配置にコンデンシンが関与していることを見出した。このコンデンシンと核膜関連因子が形成している複合体の同定を進めた。クロマチン配置が環境応答と密接に関係していることを示した。核内のクロマチン配置は環境ストレスに対するゲノムメンテナンスや発現制御に関与する。そこで、ゲノム編集技術であるTAL effector(TALE)を用いてセントロメア、テロメア、rDNAのクロマチンを可視化するTALE-FP法によりクロマチンをライブイメージングすることに成功した。さらに、ヒストン修飾を直接ターゲットとしたエピジェネティクス・ライブイメージング法の開発を試みた。液性免疫システムを持たない植物内で、抗体が正常にフォールディングしてヒストン修飾を認識するか不明であった。蛍光標識したFab領域を培養細胞にマイクロインジェクションしたところ、ヒストンのメチル化とリン酸化を生きた細胞内で検出することができた。

さらに、H3K9ac認識抗体のScFv領域に蛍光タンパク質を結合させたmintbody遺伝子を培養細胞に形質転換して安定発現ラインを構築した。さらに、受精の前後におけるエピジェネティック状態の変化を調べるために、シロイヌナズナの卵細胞と受精卵をライブイメージングする系を立ち上げた。また、さまざまなエピジェネティック状態マーカーを作出し、受精前後の変化の判定に適したものを選抜した。当初の予定や計画に従い、植物のクロマチン動態制御因子の同定および、エピジェネティクス・イメージングの開発を進めることができたから。環境刺激により、細胞核のクロマチンにエピジェネティックな変化が起こることが知られている。その変化を制御する分子メカニズムを、植物のDNA損傷ストレス感受性に注目して、ヒストン修飾やクロマチンリモデリングに関与する植物のクロマチンの動態制御因子を同定し、その機能を明らかにすることを目的に研究を推進した。シロイヌナズナのセントロメア・クロマチンはヘテロクロマチンとして、核膜周縁部に配置している。この分散配置にコンデンシンや核膜裏打ちタンパク質が関与していることを見出した。このコンデンシンと核膜関連因子が形成している複合体の同定を進めて、クロマチンの配置メカニズムの解明を目指し、複合体の同定に成功した。この複合体の変異体を用いて、セントロメア・クロマチンの動態をライブイメージングにより研究し、複合体によるクロマチン動態制御モデルを作成した。さらに、スイスのチューリッヒ大学とHi-C解析の共同研究を実施して、各変異体のクロマチン高次構造解析を行った。また、植物の個々の細胞のヒストン修飾変化をライブで解析するめたに、ヒストン修飾アミノ酸を直接ターゲットとしたエピジェネティクス・ライブイメージング法を開発した。H3K9ac認識抗体のScFv領域に蛍光タンパク質を結合させたmintbody遺伝子を培養細胞に形質転換して安定発現ラインを構築した。イメージングの他に、免疫沈降によりヒストン修飾ヒストンを特異的に単離することができた。論文成果が出ており、当初の予定通り進捗しているから。本年度は、1)DNA損傷ストレスに応答するクロマチンリモデリング因子とエピジェネティクス因子の解析、2)クロマチンの核内配置を制御メカニズムの解析、3)エピジェネティクス・ライブイメージング法の開発を進めたので、以下に研究実績の概要を示す。1)DNA損傷ストレスに応答するクロマチンリモデリング因子とエピジェネティクス因子クロマチンリモデリング因子RAD54はDNA損傷応答時に細胞核内でDNA修復フォーサイを形成する。共免疫沈降および質量分析により同定したRAD54相互作用因子であるヒストン脱メチル化酵素に注目して解析を進めた。2)クロマチンの核内配置を制御メカニズムシロイヌナズナの細胞核では、ヘテロクロマチンであるセントロメア・クロマチンが核膜周縁部に分散配置する。