hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ナビゲーションタスクの手続き探索仮説にもとづく脳シンボル処理のモデル化

脳の高次機能の典型は推論や言語といわれている.これらはいずれもシンボル処理と言われている.しかし脳におけるシンボル処理の実体および計算理論についてはほとんど判っていない.我々はこの問題に対して脳における機能部品の組み合わせモデルを提唱し,本年度は計算機シミュレーションによるその実現と評価を試みた.例題としては地図世界のナビゲーションを使用した.シミュレーションでは,感覚入力,場所の認識,場所に対応した行動の記憶,その行動の生成,さらに各場所に対応した行動の探索的学習(強化学習)という個々の機能を実現する機能部品をニューラルネットによって構築し,その組合せを探索するメタ学習機構を可変長の遺伝的アルゴリズムを用いて実現した.評価課題では,環境の地図の記憶を保持する能力を持たない学習エージェント(基礎エージェント)と環境地図を学習する機能部品を持つ学習エージェント(進化エージェント)を用意し,両者の学習結果を比較する実験を行なった.その結果,基礎エージェントは早期に最適と思われる行動を獲得するが,進化エージェントは持っている機能部品をフルに使用して環境のを学習して予測をするようになるには10世代程度が必要であることが判った.この結果より,予測という推論につながる機能を持つ学習動作もまた提案したモデルで獲得が可能てあることが示され,いわゆるシンボル的な行動もまた本モデルの枠内で説明できる可能性が出てきた.脳の高次機能の典型は推論や言語といわれている.これらはいずれもシンボル処理と言われている.しかし脳におけるシンボル処理の実体および計算理論についてはほとんど判っていない.我々はこの問題に対して脳における機能部品の組み合わせモデルを提唱し,本年度は計算機シミュレーションによるその実現と評価を試みた.例題としては地図世界のナビゲーションを使用した.シミュレーションでは,感覚入力,場所の認識,場所に対応した行動の記憶,その行動の生成,さらに各場所に対応した行動の探索的学習(強化学習)という個々の機能を実現する機能部品をニューラルネットによって構築し,その組合せを探索するメタ学習機構を可変長の遺伝的アルゴリズムを用いて実現した.評価課題では,環境の地図の記憶を保持する能力を持たない学習エージェント(基礎エージェント)と環境地図を学習する機能部品を持つ学習エージェント(進化エージェント)を用意し,両者の学習結果を比較する実験を行なった.その結果,基礎エージェントは早期に最適と思われる行動を獲得するが,進化エージェントは持っている機能部品をフルに使用して環境のを学習して予測をするようになるには10世代程度が必要であることが判った.この結果より,予測という推論につながる機能を持つ学習動作もまた提案したモデルで獲得が可能てあることが示され,いわゆるシンボル的な行動もまた本モデルの枠内で説明できる可能性が出てきた.
バイオフィルム形成因子の全ゲノム探索を足掛かりとした肺MAC症の難治化機序の解明

非結核性抗酸菌は低酸素条件下において特異的にバイオフィルムを形成する(Totani T. Sci Rep. 2017;7:41775)。今回、トランスポゾン(Tn)変異導入システムによる、ゲノム全体を網羅した変異株の作成と、次世代シーケンス技術を併用したTransposon sequencingにより、バイオフィルム形成における必須遺伝子の探索を試みた。Mycobacterium intracellulareに対してTnを導入し、変異株プールを作成した。この変異株プールから対数増殖菌およびバイオフィルム菌を作成しゲノムDNAを抽出した。次世代シーケンシングとBowtie2によるマッピングより、Tn挿入個所の同定と挿入リード数の算出を行った。条件特異的必須遺伝子の同定を、TRANSIT softwareを利用したresampling解析で行った。さらに、検出した遺伝子に対して、KEGGデータベースを用いたパスウェイ解析を行った。その結果、57遺伝子において、Tn挿入数が有意に減少していた。これらの中には、糖質代謝(糖新生ならびにトレハロース合成反応)、アミノ酸代謝(分岐鎖アミノ酸分解、メチオニン合成)、脂質代謝(トリアシルグリセロール合成、コレステロール分解を含めた広範な代謝系が検出された。Transposon sequencingにより、バイオフィルム形成における代謝経路の再構築が示唆された。次年度は、サンプル数を増やして上記結果の正確性を高めること、および上記代謝系遺伝子に対して、遺伝子欠損株を作成し、バイオフィルム形成に対する影響を直接的に証明する。今年度は、非結核性抗酸菌に対するトランスポゾンシーケンシングにより、生存必須遺伝子をリストアップすることができた。次年度は、検体数を増やして今年度の結果の正確性を高める。また、遺伝子欠損株を作成し、これを使ってバイオフィルム形成への影響を直接的に証明する。遺伝子欠損株を作成する必要が生じたため。また、生体感染における必須遺伝子同定実験として、マウスの購入を検討しているため。
熱による放射性薬剤の送達制御に基づく腫瘍特異的小線源療法および内用療法の開発

本研究の目的は、治療用βー線放出核種の高いがん集積性と正常組織における不必要な被曝の低減を同時に達成しうる新たな小線源療法および内用療法を確立することにある。つまり、熱をトリガーとして凝集する化合物群を構築し、その放射性標識体について、インビボにおけるがん選択的な熱制御により、高いがん集積性及びがん縮小効果の達成を目指す。凝集前の化合物群は比較的速やかな生体クリアランスを示すように設計することにより、副作用の低減に繋がることから、上記に示す目的を達成できるものと考える。平成30年度は以下の結果を得た。(1)温熱療法との併用療法温熱療法の適用温度が約42°Cであることから、体温では分散状態を保ち、42°Cで確実に凝集するポリオキサゾリン誘導体を用いた検討を行った。前年度までのIn-111標識体を用いた検討については論文として報告した。今年度は、Y-90標識体を新たに合成し、がん組織の加温処置との組合せによる治療効果について評価し、非処置群や加温処置のみを実施した群と比較して高いがん縮小効果を認めた。(2)近赤外光照射による局所発熱を利用したがん特異的治療法存在部位の不明ながんを対象とした新たながん治療法の確立を目的とする。金ナノロッドをがん組織に集積させた後、近赤外レーザー光を照射することにより、がん組織内温度を約43°Cに制御した。その状態で放射性標識POZを投与すると、がん組織に有意に高く集積することを明らかとした。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。本研究の目的は、治療用ベータ-線放出核種の高い腫瘍集積性と正常組織における不必要な被曝の低減を同時に達成しうる新たな小線源療法および内用療法を確立することにある。つまり、熱をトリガーとして凝集する化合物群を構築し、その放射標識体について、インビボにおける腫瘍選択的な熱制御により、高い腫瘍集積性及び腫瘍縮小効果の達成を目指す。今年度は以下の結果を得た。(1)インジェクタブル小線源療法用薬剤の開発室温では分散状態を保ち、体温で凝集するポリマー(ポリオキサゾリン)を母体化合物として、そのインジウム-111標識体を合成し、腫瘍内投与後に腫瘍内に長期間高く放射能が保持されることを示した。また、投与条件を最適化した後、イットリウム-90標識体を用いて治療実験を実施した結果、高い抗腫瘍増殖効果を示し、また生存率の有意な延長を認めたことから、新たな小線源療法用薬剤となることを示した。(2)温熱療法との併用療法温熱療法の適用温度が約42°Cであることから、体温では分散状態を保ち、42°Cで確実に凝集するポリオキサゾリン誘導体を用いて、そのインジウム-111標識体を合成した。腫瘍部位を加温しながら、インジウム-111標識ポリオキサゾリン誘導体を静脈内投与した結果、加温条件下、腫瘍集積性が約1.8倍向上することを示した。平成28年度は、ポリオキサゾリンの熱応答凝集特性に着目し、その放射標識体を用いて以下の検討を行った。(1)イットリウム-90標識ポリオキサゾリンを用いる新規小線源療法の開発イソプロピルオキサゾリンとプロピルオキサゾリンを用いて、凝集温度が25°Cのポリオキサゾリン誘導体を合成し、その放射標識体について、腫瘍内投与後の放射能滞留性を評価した。その結果、凝集温度が体温以上のポリオキサゾリン誘導体と比較して、本プローブは腫瘍内に長期間高く滞留することを認めた。また、イットリウム-90標識体を用いて治療実験を実施した結果、投与放射能量依存的な腫瘍増殖抑制効果と生存期間の有意な延長を示した。また、正常組織にはダメージが認められなかったことから、イットリウム-90標識ポリオキサゾリン誘導体を用いる新たな小線源療法の可能性を示した。(2)放射標識ポリオキサゾリンと温熱療法の組み合わせによる新たな内用療法の開発エチルオキサゾリンとイソプロピルオキサゾリンを用いて凝集温度が約38°Cのポリオキサゾリン誘導体を合成した。そのインジウム-111標識体について、腫瘍加温時および非加温時における腫瘍内放射能集積を比較した結果、加温時に腫瘍への集積が約1.8倍増加することを示した。また、腎臓を除く他の正常組織と比較して約23倍高い集積を認め、腫瘍特異的な集積性を示したことから、本手法を用いることにより、高い治療効果と副作用の低減を達成できる可能性が示された。本研究の目的は、治療用ベーター線放出核種の高い腫瘍集積性と正常組織における不必要な被曝の低減を同時に達成しうる新たな小線源療法および内用療法を確立することにある。つまり、熱をトリガーとして凝集する化合物群を構築し、その放射性標識体について、インビボにおける腫瘍選択的な熱制御により、高い腫瘍集積性及び腫瘍縮小効果の達成を目指す。平成29年度は以下の結果を得た。

(1)温熱療法との併用療法温熱療法の適用温度が約42°Cであることから、体温では分散状態を保ち、42°Cで確実に凝集するポリオキサゾリン誘導体を用いた検討を行った。前年度の検討において、加温により腫瘍集積性が約1.8倍向上することを示したが、今年度は、ポリマーの腫瘍集積性に与える、投与ポリマー量および加温時間の影響について調査し、最適な条件を見出した。また、腫瘍内のポリマーの局在に関して、インビボ共焦点蛍光顕微鏡を用いて評価した結果、加温条件でのみ腫瘍血管の近傍でポリマーが凝集していることを明らかとした。(2)近赤外光照射による局所発熱を利用した腫瘍特異的治療法存在部位の不明ながんを対象とした新たながん治療法を確立を目的とする。金ナノロッドに対する光照射により発熱する熱を利用して、ポリオキサゾリン誘導体の腫瘍集積性の向上を目指す。今年度は、金ナノロッドに近赤外レーザー光を照射し、溶液あるいは腫瘍内温度が42°C付近になる条件を見出し、その条件で、ポリオキサゾリン誘導体が凝集することを確認した。平成29年度は、ポリオキサゾリンの放射性標識体および蛍光標識体を用いて以下の検討を行った。(1)放射性標識ポリオキサゾリン誘導体と温熱療法の組合せによる新たな内用療法の開発:凝集温度が約38°Cの放射性標識ポリオキサゾリン誘導体を用いて、腫瘍集積性に対する投与ポリマー量および加温時間の影響を評価した結果、ポリマー量は約4nmol、加温時間は1時間が最適な条件であった。また、プローブ型インビボ共焦点蛍光顕微鏡を用いて、蛍光標識ポリオキサゾリン誘導体の腫瘍内局在を観察した結果、非加温時においては大部分のポリマーが血管内に存在していた一方で、加温時にはポリマーの凝集体が観察され、またその多くが血管の近傍に存在していた。(2)近赤外光照射による局所発熱を利用した腫瘍特異的治療法:金ナノロッドに対して近赤外レーザー光を照射し、その金濃度および光照射強度に応じて温度が変化することを示した。また、金ナノロッドを腫瘍組織内に投与し、近赤外レーザー光を照射することで腫瘍内温度が約42°Cとなる条件も見出した。上記の通り、本研究課題は順調に進展していると評価できる。本研究成果は国内学会にて3件報告した。前年度の小線源療法に関する研究成果は論文報告した。本研究の目的は、治療用βー線放出核種の高いがん集積性と正常組織における不必要な被曝の低減を同時に達成しうる新たな小線源療法および内用療法を確立することにある。つまり、熱をトリガーとして凝集する化合物群を構築し、その放射性標識体について、インビボにおけるがん選択的な熱制御により、高いがん集積性及びがん縮小効果の達成を目指す。凝集前の化合物群は比較的速やかな生体クリアランスを示すように設計することにより、副作用の低減に繋がることから、上記に示す目的を達成できるものと考える。平成30年度は以下の結果を得た。前年度までのIn-111標識体を用いた検討については論文として報告した。今年度は、Y-90標識体を新たに合成し、がん組織の加温処置との組合せによる治療効果について評価し、非処置群や加温処置のみを実施した群と比較して高いがん縮小効果を認めた。(2)近赤外光照射による局所発熱を利用したがん特異的治療法存在部位の不明ながんを対象とした新たながん治療法の確立を目的とする。
大腸癌の抗癌剤感受性を予測するバイオマーカーの同定と臨床的応用

ヒト大腸癌細胞株7種の遺伝子発現レベルが抗腫瘍性白金錯体(3種)のIC50値と負の相関を示したのは8種、逆に正の相関は48種であった。また、シスプラチンのIC50値は、DNA修復関連酵素の発現量と比較的高い正の相関を示し、5-FUのIC50値は一部の薬物トランスポータ発現と正の相関を示した。一方、抗腫瘍性白金錯体に低感受性の細胞で高い発現を示した蛋白は200種、逆に低い発現は156種の蛋白であり、これらには鉄イオンの恒常性維持や重金属の解毒に関与する蛋白質が含まれていた。ヒト大腸癌細胞株(Caco-2、DLD-1、HCT-15、HCT116、LS180、SW620及びWiDr細胞)のmRNA発現についてマイクロアレイによる網羅的発現解析を実施した。さらに、得られた網羅的遺伝子発現データとシスプラチン(CDDP)、カルボプラチン(CBDCA)及びオキサリプラチン(L-OHP)に対する感受性との関連性について検討した。その結果、検討した約48,000遺伝子のうち、99遺伝子の発現がCDDPのIC_50値と負の相関(r<-0.757)を示した。また、CBDCA及びL-OHPのIC_50値と遺伝子発現量が負の相関を示した遺伝子数は、それぞれ89(r<-0.755)及び89(r<-0.756)であった。さらに、いずれの薬物のIC_50値とも負の相関を示した遺伝子は8種に絞り込まれた。一方、220、463及び260遺伝子の発現量が、それぞれCDDP(r>0.755)、CBDCA(r>0.755)及びL-OHP(r>0.756)のIC_50値と正の相関を示した。さらに、IC_50値と遺伝子発現量が、いずれの薬物においても正の相関を示したのは48種であった。なお、これら薬物の感受性等への影響が既に報告されている遺伝子は、今回抽出した遺伝子群には認められなかった。従って、本結果は、癌細胞の抗癌剤感受性を予測できる新規の遺伝子群が存在している可能性を示唆している。今後、これら遺伝子の抗癌剤感受性における機能的役割を明らかにすることにより、抗癌剤感受性を予測するための有用なバイオマーカーになることが期待される。本研究の目的は、大腸癌化学療法で汎用される抗癌剤、すなわち抗腫瘍性白金錯体及び5-フルオロウラシル(5-FU)に焦点を絞り、抗癌剤感受性と相関するバイオマーカー候補を網羅的に探索し、抗癌剤感受性を効果的に予測できる癌細胞由来のバイオマーカーを同定することである。前年度に得られた網羅的遺伝子解析結果に基づいて、YES-1とPIM-2遺伝子の機能的役割について検討したが、抗腫瘍性白金錯体に対する感受性規定因子としての寄与は低いことが示唆された。そこで、抗癌剤の細胞内動態に影響する酵素類及びトランスポータ類に絞り込み検討した結果、シスプラチンのIC_<50>値は、DNA修復関連酵素BRCA1及びBRCA2 mRNA発現量と比較的高い正の相関を示した。しかしながら、他の抗腫瘍性白金錯体の場合、今回検討した因子の中に、抗癌剤感受性と関連性を示すものは認められなかった。一方、5-FUのIC_<50>値は、トランスポータであるMRP2及びMRP5 mRNA発現量と正の相関を示すことが明らかとなった。以上の結果より、シスプラチン及び5-FU感受性は、それぞれ異なる因子の影響を受けることが示された。これらの情報を基に、抗腫瘍性白金錯体に高い感受性を示す細胞と低い細胞の蛋白発現を網羅的に解析した結果、両細胞で1648種の蛋白発現を確認できた。そのうち、高感受性細胞と比較して、低感受性細胞で高い発現(>2倍)を示した蛋白は200種類であり、逆に低い発現(<1/2)を示した蛋白は156種類であった。抽出された蛋白には、鉄イオンの恒常性維持に関与するGLRX5や重金属の解毒に関与するGSTなどが含まれていた。今後、これらの抗癌剤感受性に及ぼす影響を検討することにより、抗癌剤感受性予測のための新たなバイオマーカーの発見につながるものと考えている。
アフラトキシン生合成機構に関する研究

アフラトキシンは主としてAspergillus parasiticusやA. flavus等のカビが二次代謝産物として生産するマイコトキシンであり、発ガン性及び急性毒性を有することが知られており、穀物のアフラトキシン汚染は世界的に深刻な問題となっている。効果的なアフラトキシン防除法を開発するために、アフラトキシン生合成に関わる酵素遺伝子の研究は極めて重要である。アフラトキシン生合成はゲノム中でクラスターを形成して存在しており、75kb程度の範囲に関連遺伝子が集中している。本研究ではAspergillus parasiticusを材料として、アフラトキシン生合成に関連が未同定なクラスター周辺の2種の遺伝子sugRとorfAについて、生合成経路への関与を明らかにするために、相同遺伝子組換えを利用した遺伝子破壊株の作出を試みた。その結果、両遺伝子とも破壊株を得ることに成功した。両遺伝子のアフラトキシン生産への関連性の検討は今後の課題である。またもう一つの課題として、上記遺伝子クラスターの全長を除去した菌株作出を試みた。遺伝子クラスターの両端に隣接するDNA断片をそれぞれマーガー遺伝子の両端に配置した遺伝子破壊用DNA断片をPCR法を用いて構築し、このDNA断片を用いた組換え処理を行い、組換え体を選抜した。その結果、遺伝子クラスターを完全に失った菌株を得ることができた。この破壊株は完全にアフラトキシンを生産していないことを確かめた。アフラトキシンは特定のカビが生産する自然界で最も発ガン性の高い物質であり、さらに強力は急性毒性を有している。アフラトキシンによる穀物汚染は世界的に深刻な問題となっているが、未だアフラトキシン汚染の有効な防御法は得られておらず、汚染穀物のほとんどが廃棄されている。そこで、効果的なアフラトキシン汚染の防御法を開発するための基礎的知見として、アフラトキシン生合成機構を解明することを目的としている。そのために、カビによるアフラトキシン生産は培養条件に依存して生産されたり、されなかったりするため、制御機構を生化学的及び分子生物学的な手法を用いて解析する。平成17年度は、PCRや遺伝子破壊等、分子生物学的手法を習得する事を中心に研究を進めた。アフラトキシン遺伝子クラスターに隣接する機能が未知であるsugR遺伝子の破壊を試みた。まず、sugR遺伝子プライマーを遺伝子情報に基づいて設計し、カビのDNAをテンプレートとしてPCRを行い、PCR産物を精製した。次に選択マーカーとPCR遺伝子断片をPCRを利用してつなげ、遺伝子破壊ベクターを構築した。一方、カビからプロトプラストを調製し、破壊ベクターを形質転換し、薬剤耐性を利用して形質転換株を選抜した。得られた形質転換株からDNAを調製し、PCRを利用して、目的とする遺伝子破壊株の選択を試みた。形質転換効率が低く、遺伝子破壊株は得られておらず。18年度もさらに技術の向上に努め、目的とする破壊株を得て、アフラトキシン生産性との関連を検討する予定である。アフラトキシンは特定のカビが生産する自然界で最も発ガン性の高い物質であり、また強力な急性毒性を有している。カビによるアフラトキシン生産は培養条件に依存的であり、その制御機構全体の解明により汚染防除策を創出できる可能性がある。そこで本研究は、効果的なアフラトキシン汚染の防御法を開発するための基礎的知見として、生産制御機構を生化学的及び分子生物学的な手法を用いて解析し、アフラトキシン生合成機構を解明することを目的としている。平成18年度は、17年度に続いて、カビの遺伝子破壊を行った。アフラトキシン生産カビAspergillus parasiticusのゲノムに存在するアフラトキシン遺伝子クラスターに隣接し、機能が未知であるsugR遺伝子とort遺伝子についてアフラトキシン生産制御への関連性を明らかにするため、これらの遺伝子の破壊実験を行った。orf遺伝子プライマーを遺伝子情報に基づいて設計し、カビのDNAをテンプレートとしてPCR反応を行い、PCR産物と選択マーカーを連結して遺伝子破壊用断片を構築した。カビからプロトプラストを調製し、破壊ベクターを形質転換し、薬剤耐性を利用して形質転換殊を選抜した。得られた形質転換株からDNAを調製し、PCR法を利用して目的とする遺伝子破壊株の選択を試みた。その結果、sugR遺伝子破壊株とorb遺伝子破壊株が得られた。これらの破壊株は宿主であるアフラトキシン生産菌と比較して形態的に大きな変化は見られなかったが、アフラトキシン生産性にわずかな変化が見られた。19年度は、同領域に存在するsugR劇遺伝子とort遺伝子を含んだ4種の遺伝子についてRT-PCRを行い、発現の変化を詳細に調べる予定である。

本研究ではAspergillus parasiticusを材料として、アフラトキシン生合成に関連が未同定なクラスター周辺の2種の遺伝子sugRとorfAについて、生合成経路への関与を明らかにするために、相同遺伝子組換えを利用した遺伝子破壊株の作出を試みた。その結果、両遺伝子とも破壊株を得ることに成功した。両遺伝子のアフラトキシン生産への関連性の検討は今後の課題である。またもう一つの課題として、上記遺伝子クラスターの全長を除去した菌株作出を試みた。遺伝子クラスターの両端に隣接するDNA断片をそれぞれマーガー遺伝子の両端に配置した遺伝子破壊用DNA断片をPCR法を用いて構築し、このDNA断片を用いた組換え処理を行い、組換え体を選抜した。その結果、遺伝子クラスターを完全に失った菌株を得ることができた。この破壊株は完全にアフラトキシンを生産していないことを確かめた。
絶滅危惧種の生体外モデル「Body on a Chip」の開発

本研究の目的は、iPS細胞作製技術とマイクロ流体テクノロジーを駆使し、絶滅危惧種の生理的・病理的機能を模倣した生体モデル「Body on a Chip(BoC)」を開発である。具体的には、A.絶滅危惧種iPS細胞の作製、B.作製したiPS細胞から目的組織への分化誘導法の確立、C.絶滅危惧種iPS細胞由来分化細胞を導入したBoCの開発、である。本研究が達成できれば、これまで困難であった絶滅危惧種たちに特異的な疾患メカニズムの解明と、その有効な治療法の開発が可能になり、保全活動への貢献が期待できる。本研究では、絶滅危惧種に効果的な薬剤や治療法を開発するために、絶滅危惧種iPS細胞の作製と、それを用いた生体モデル「Body on a Chip」の開発が目的である。本研究を達成するために以下の実験項目を掲げる。A.絶滅危惧種iPS細胞の作製B.マイクロ流体デバイスを用いた絶滅危惧種iPS細胞から組織細胞への分化誘導法の開発C.絶滅危惧種iPS細胞由来分化細胞を導入した「Body on a Chip」の開発A.絶滅危惧種iPS細胞の作製:現在絶滅危惧種を含めた5種の動物から得られた細胞を使用する。作製の際には、絶滅危惧種の遺伝子を得ることが困難であるため、代わりにヒトのリプログラミング遺伝子(OCT4, SOX2, KLF4, L-MYC, LIN28及びp53 shRNA)を使用した。これらの遺伝子は種を超えて保存されており、実際にはゴリラの体細胞をヒトの遺伝子でリプログラミングしiPS細胞を作製した報告もある。遺伝子導入には、外来遺伝子がゲノムに挿入される危険性の少ない方法(エピソーマルベクター法やmRNA導入法など)を使用している。得られた細胞を確認するために、幹細胞マーカーの発現の確認(遺伝子発現解析、フローサイトメトリーによる細胞表面マーカー発現解析、など)、細胞増殖能の確認、分化能の確認(生体外における胚様体形成試験、免疫不全マウスへの移植による奇形腫形成試験)、核型試験(Gバンド分染法、FISH解析法)、などを行う。絶滅危惧種iPS細胞の作製:現在絶滅危惧種を含めた5種の動物から得られた線維芽細胞を使用し、それにヒトiPS細胞作成時に使用されるリプログラミング因子を用いて、動物由来のiPS細胞の作成に取り組んでいる。またBoCの基となるマイクロ流体デバイスの改良にも取り組んでおり、こちらも順調に進んでいる。動物由来のiPS細胞の作成に関しては、既に数種類試験している。これからはiPS細胞としての評価を行っていく。また、得られたiPS細胞を用いて、目的の組織細胞(例えば肝臓様細胞)などへの分化を試みる。また動物種の病気に対して効果的な薬剤を同定する行う上で、「機能的な組織細胞の使用」は必須である。そこで本項では、絶滅危惧種iPS細胞から機能的な組織細胞へと分化誘導に必要な3次元細胞外環境を同定する。マイクロ流体デバイスは、従来のマクロな細胞実験系では困難であった、3次元的な細胞外環境因子の厳密制御を可能にし、よって組織細胞の高機能化も可能になる。環境を同定する際の細胞指標として、各組織の機能性タンパク質の発現量を定量的に観察する。申請者は、これまでに3次元細胞外微小環境を同定するためのマイクロ流体デバイスの開発に成功しており(Kamei et al., Biomed. Microdev. 2015)、本申請ではそれを応用する。最後に、絶滅危惧種iPS細胞由来3次元微小組織を連結したin vitro生体モデルBoCの開発する。項目Bにおいて、各組織に最適化した3次元細胞外環境を基にBoC用マイクロ流体デバイスをデザインし、BoC内でも組織細胞が本来持つ機能を発現する環境を創出する。幹細胞工学、ナノ・マイクロ工学当該年度では、iPS細胞を作製することを実験研究計画として盛り込んでいた。しかし、我々の予定以上にiPS細胞の作製に関する実験が進んだため、必要な経費を最低限にすることができた。次年度では、より詳細なiPS細胞の未分化性の確認実験をする必要があるので、そのために使用する。また、近年のiPS細胞研究から、iPS細胞のステージにはnaiveとprimeの2つのステージがあることが明らかとなってきた。しかし、動物種のiPS細胞がどちらのステージになっているかは、不明である。そこで、本研究ではそれについても明らかにする。
光電脈波波形比較法による辺縁性歯周炎診断装置の開発

歯肉の炎症では局所循環系の変調を伴うので、脈波の変化として病状を検出できる可能性がある。本研究は発炎した歯肉微小領域より光電脈波を導出し、正常波形との相違から炎症の性状を推定しようとするものである。まず、予備実験で脈波を検出する各種条件を定めた。光源は25W白熱電球を安定化電源にて点灯して用いた、。直径50μmの光ファイバ-を照射および採光の2系統各100本用い、光源、測定部および光センサ-間を連結した。測定部では照射および採光のファイバ-が互いにランダムになるように配置した。透過光光電脈波は口蓋側より、反射光光電脈波は唇側より光を当て、いずれも唇側より脈波を導出した。光センタ-としてはS/N比が最も良好であったCdSe素子を用いた。得られた脈波は同時に記録した心電図のQRSスパイクで同期をとり1020回の平均加算処理を行なった。まず、光ファイバ-束と歯肉間の最適な位置関係を調べ、ついで外来診療室にて患者より脈波を導出し、歯周治療前、治療中、治療後の波形を比較して、各種診査指標との関連性を追求した。光ファイバ-束と歯肉間の距離が小さい程、波形上のdicrotic notchは鮮明に記録された。反射光光電脈波を記録する際には、歯肉表面を光不透過性の白色被膜で覆う方法で良好な結果が得られた。外来診療室では、アルミフォイルを用いて測定部周辺を遮光すれば室内灯点灯状態でも脈波検出が可能であった。現在、実験的歯肉炎の症例で暗室下で脈波の導出および解析を行なうとともに、外来患者にて初期治療あるいは動的歯周治療中の脈波の相違を解析中である。慢性辺縁性歯周炎の患者では、正常歯肉を持つ人に比べ歯肉より得られる光電脈波の振幅は小さく、そのdicrotic notchはより不鮮明である傾向が見られた。今年度の研究予定は、反射光光電脈波の導出を容易にし外来診療室での記録を行なえるようにすること、更に導出した脈波の詳細な分析をすること、および健常者の歯肉に実験的歯肉炎を生じさせその前後における脈波の変化を観察することなどであった。現在脈波は臨床的に健全なヒトの上顎前歯部唇側付着歯肉から導出を行なっている。導出に用いる光センサーは直径2mmの同筒状のものであり、内部に照射用および採光用の2系統の光ファイバーが封入されている。センサー先端と測定部との位置関係を一定に保つため、あらかじめ作製したアダプターを当該歯に取り付けた上で、センサーをこれに固定した。照射光にはタングステンランプを25Wの直流安定化電源によって点燈したものを用い、採取した反射光は光源電セルを介して電気信号に変換、増幅したのちデータレコーダに収録し、後刻分析を行なっている。脈波は、外来診療室で室内灯を点燈した状態での導出、記録が可能である。反射光光電脈波を唇側から導出すると共に、口蓋側歯肉に同じ光源から誘導した光を照射し透過光光電脈波をあわせて導出し、これらの比較を行なった。その結果、これらの脈波は共に心拍に同期しており、またその波形はDicrotic Notchを有するいわゆる動脈波波形であった。現在健常者の歯肉に実験的歯肉

炎を生じさせその前後における脈波の変化を観察しつつある。今後は炎症歯肉からの記録を行ない、健全歯肉から得た脈波との比較を行なう他、更に歯ブラシによる歯肉マッサージ、咀嚼、口腔内温度の変化、全身の循環系などが及ぼす影響についても検討していく予定である。今年度の研究予定は、センサ-と歯肉間の最適な位置関係を求めること、および外来診療室にて歯周疾患を有する患者より脈波を導出し、歯周治療前、治療中、治療後における波形を分析、各種診査指標との関連性を追求することであった。まず、最適な導出条件を求めるために暗室下で歯肉表面より光を当て、光検出用ファイバ-束と歯肉との距離を変化させながら臨床的に健康な上顎前歯唇側付着歯肉よる反射光光電脈波を導出した。その結果、光ファイバ-束と歯肉との距離が小さい程波形のdicrotic notchが鮮明になることがわかった。また、歯肉内に一旦入射した光成分が再び歯肉表面より出て検出されるのを除去するため、歯肉表面を光不透過性の白色被膜で覆ったところ、被膜で覆わずに光ファイバ-束を歯肉に近づけた場合と同様の波形が得られた。この結果をもとに、外来診療室で脈波の導出を試みたところ、アルミホイルを用い測定部周辺を遮光して導出すれば、室内灯点灯状態で脈波検出が可能であり、アダプタ-の作成等事前の準備が整っていれば検査に要する時間はごく短いものであった。現在、実験的歯肉炎を惹起させた例で暗室下で脈波の導出を試みると同時に、外来診療室で初期治療中および動的歯周治療中の歯周疾患者を被験者として脈波の導出にあたっている。慢性辺縁性歯周炎の患者では、歯肉から得られる光電脈波は正常歯肉の場合よりも振幅が小さく、そのdicrotic notchも不鮮明な傾向が認められた。
インプラントの咬合力・咬合感覚に関する研究

インプラントにおいては、天然歯と異なり歯根膜を有さないため、上部構造に与えるべき咬合接触や咬合面形態も天然歯や従来の歯冠修復物とは異なると考えられる。そこで、インプラント上部構造咬合面の各部位における咬合力の測定、咬合感覚の測定を行うことにより咬合面上に咬合を付与すべき部位を模索することを目的として研究を行った。被験者を増やして研究を行い、データを解析したところ、下顎第一大臼歯部インプラントの咬合力には各測定点間で有意差は認められず、上顎第一大臼歯では中央が頬側と比較して有意に高い結果となった(p<0.05)。このことから、インプラントでは咬合面上の部位による荷重負担能力に差はなく、上顎第一大臼歯歯は頬側よりも中央の荷重負担能力が高いことが示唆された。また、咬合感覚を調査して得られたVASは上下顎共に各測定点間で有意な差は認められず、咬合力との相関も認められなかった。このことから、インプラントは咬合面のどの部位でも比較的安定した咬合力と咬みやすさを得られる一方、上下ともに咬合感覚を得にくくなる分、天然歯よりも歯周組織やインプラント対合歯に対する影響を自覚しづらくなる可能性が示唆された。上下顎天然歯を被験歯とした先行研究では、機能咬頭および中央が非機能咬頭よりも咬合力が高く咬みやすいという結果であった。実際の臨床上ではインプラント上部構造のチッピングや対合歯の破折等の報告も多い。咬合力が発揮できてしまうインプラントだからこそ咬合接触の与え方をさらに模索する必要があると考える。研究結果の解析が終了し、学会発表は終えることができた。今後は論文作成に取り掛かるが、実験方法が煩雑で被験者数を増やすのに時間がかかったこともあり、遅れが生じてしまった。今後はこれまでの研究成果をまとめたうえで、論文作成を行う予定である。東京医科歯科大学歯学部付属病院インプラント外来患者を被験者として、先行研究との比較ができるよう、第一大臼歯にインプラント単独植立による補綴がなされている部位を被験歯と定め、咬合力及び咬合感覚、主機能部位、咬合接触状態について測定を行った。具体的には、被験者の現在の口腔内状況、咬合接触状態を記録するために全顎における印象採得及び咬合採得を行った。咬合採得では50μm以下の咬合接触域を抽出した。咬合力の測定に関しては、先行研究と同様にオクルーザルテーブルを作製し、そのうえで咬合力計を用いて、咬合力を咬合平面に垂直に作用させた。同時に咬合感覚をVisual Analogue Scale(VAS)を用いて測定した。咬合力及び咬合感覚は、被検者の被験歯ごとに測定を行った。また、歯科用ストッピングを用いて、主機能部位の測定も行った。天然歯の咬合力及び咬合感覚に関しては、力を作用させる部位によって異なることがこれまでの研究により明らかにされている。同様の結果がインプラント補綴されている歯にもいえるのか、咬合面内の複数部位を作用点として測定した。以上のインプラント補綴のされた歯の咬合力・咬合感覚と、補綴されていない天然歯のものとの比較、およびそれらと主機能部位や咬合接触関係との関連を調査するために、現在測定したデータを整理している。データの整理が終わり次第、次年度には学会発表を行う。必要であれば随時被験者、および測定項目を増やす予定である。被験歯を第一大臼歯、インプラントの単独植立としたため、被験者の数が絞られていること、咬合力の測定が煩雑であり、測定項目も多いことから、一度に多くの測定ができないことで、データ数を増やせていないことが原因であると考えている。また、当初上顎と下顎同数で比較予定であったが、上顎の第一大臼歯へのインプラント補綴症例が圧倒的に少なく、被験者の数を増やせていない事もその一因であると考えている。

実際の臨床上ではインプラント上部構造のチッピングや対合歯の破折等の報告も多い。咬合力が発揮できてしまうインプラントだからこそ咬合接触の与え方をさらに模索する必要があると考える。研究結果の解析が終了し、学会発表は終えることができた。今後は論文作成に取り掛かるが、実験方法が煩雑で被験者数を増やすのに時間がかかったこともあり、遅れが生じてしまった。できる限り被験者数を増やす方向ではあるが、上顎の被験者が増えない場合、下顎の症例に絞ってデータを集める。一定数そろったところで学会での発表を行いたいと考えている。今後はこれまでの研究成果をまとめたうえで、論文作成を行う予定である。データ分析用の機器および学会費用に使用予定。被験者を増加することに時間がかかったため学会発表、および論文作成をおこなうことが遅れ、学会発表及び論文作成にかかる費用が残存してしまったため。今後学会発表および論文作成に使用していく予定。
17世紀フィレンツェ派の研究－ヤコポ・ヴィニャーリを中心に

1本年度は本研究の最終年度にあたるため、ヤコポ・ヴィニャーリの総作品目録を作成した。それに伴い、今年度は2度フィレンツェに足を運んで、作品の調査と複製写真の購入、また古文書調査を引き続き行った。とりわけ、サン・サルヴィ美術館館長ファウスタ・ナヴァッロ女史に連絡を取り、同館の収蔵庫で調査をすることができた点は特筆すべきことであった。その中からいくつかの作品がヴィニャーリに再帰属できることがわかり、総目録に反映させた。最終的には、174点(198作品)の目録に、作品の基本データ、解説、研究史を盛り込んだ。ヴィニャーリの作品目録は1973年にフランカ・マストロピエッロが作成しているが、本目録は数、質ともにそれを凌駕するものである。2本研究の重要な柱である17世紀フィレンツェにおける美術作品の展示において大きな役割を担ったのが、フィレンツェのサン・ベネデット・ビアンコ信心会であった。この信心会には多くの芸術家も所属し、宗教教育が熱心に行われており、その団体の動向を確認することはヴィニャーリ研究においても必要であると判断したため、ヴィニャーリとサン・ベネデット・ビアンコ信心会、そしてその会長を務めたドメニコ・ゴーリ、さらには、ゴーリが所属していたサンタ・マリア・ノヴェッラ修道院との具体的な関係を探る研究を行った。具体的には、フィレンツェ国立文書館とサンタ・マリア・ノヴェッラ修道院文書館で古文書資料の読解にあたり、三者の接点を探るとともに、先に述べたサン・サルヴィ美術館の収蔵庫に眠る諸作品の帰属、来歴を同定した。3前年度に行った成果(素描研究、作品展示に関わる研究)も踏まえて、博士論文を執筆し、平成24年度3月に神戸大学より博士号(文学)を授与された。1、ピサ、サルヴィアーティ文書館での調査により、フィレンツェのあるサンタントニオ同信会会員が、祝祭の日のみ聖堂内を飾っていた作品を特定した。またその展示が行われたのは、1646年1月17日であったことがほぼ確定した。この発見によって、F.アラマンニが注文したヴィニャーリの《聖アントニウスの死》は1645年頃制作され、同信会内に飾られた可能性が高いことが分かった。その他の美術作品の展示の事例として、メディチ家の葬儀においても作られたアッパラート(簡易装飾)の制作には、ヴィニャーリが制作に関わっていたことが新たに分かった。2、フィレンッェ、ウフィツィ美術館版画素描室において、17世紀フィレンツェ派の素描の複製図版を大量に撮影し、版画との類似点を分析している。その結果、テンペスタ版画の単なる模倣から始まり、それを徐々に創造へと高めたことをうかがわせる素描群が出てきた。また素描を基にして、絵画作品の作者を同定するという意外な成果も得ることができた。3、ヴィニャーリの注文主であった、ジノーリ、ジェリーニ、ストロッツィに関する未刊行史料を調査し、その中から支払い記録を見つけ出すことができた。それらの調査によって、従来提示されてきた説(例えば、現在エルミタージュ美術館にあるヴィニャーリの作品が元ジェリーニ家所有のものであるというもの)が明確に否定された。そのほかにも、フィレンツェ国立美術館の収蔵庫にある17世紀ドスカーナ派に帰属される一枚の作品が、様式分析の結果ヴィニャーリの真筆であることが明らかになった(口頭にてG.パリアルーロの承諾済)。その他にも、ヴィニャーリとその弟子カルロ・ドルチとの影響関係(ドルチのヴィニャーリ工房在籍時期やヴィニャーリに見られるドルチの影響)についても、文書調査や作品分析の結果、新たな事実が分かった。

海外調査に行く時期が当初の予定より遅れたため、17世紀フィレンツェ派の素描の複製図版を入手することができなかったため。平成24年度5月より3ヶ月ほどイアリアに調査に行き、史料調査、図像分析に一区切りをうつ。その後は調査の結果得られた内容を随時発表し、博士論文を執筆していく予定である。平成23年度は調査に集中したため、成果発表ができなかった。今年度は海外も含め積極的にせいかを発表していきたい。
種特異的プライマーを用いたPCR法による植物芽内からのうどんこ病菌の検出

うどんこ病菌は、一般的には閉子のう殻で越冬するとされている、しかし、サルスベリうどんこ病菌(以下サルスベリ菌と称す)は、サルスベリの芽の中で越冬するとされている。したがって、芽の中のうどんこ病菌を検出することで菌の芽内への感染時期や芽への感染頻度に関する知見が得られ、本病菌の生活史を明らかに出来、発生予察の可能も期待できる。そこで、サルスベリ菌の種特異的プライマーを用いた、PCR法によるサルスベリの芽内からのうどんこ病菌の検出法を検討した。その結果、1)種々のうどんこ病菌の5.8Sを含むITS領域の塩基配列を検討し、4種類のサルスベリ菌(Uncinuliella australiana)の種特異的プライマーを作製した。2)うどんこ病菌を対象とした場合には、サルスベリ菌の場合だけPCRにより増幅し、種特異的プライマーの特異性は検証できた。しかし、3)サルスベリから分離した、付着または内在性の菌類を対象とした場合には、サルスベリ菌以外でもPCRで増幅し、種特異的プライマーは特異的でなかった。この結果は、アーニリング温度を変えても、変わらなかった。そこで、4)制限酵素Xhol Iを用いて、サルスベリ菌とサルスベリに付着または内在性の菌類との増幅産物DNAのバンドの位置や切れ方を比較した結果、サルスベリ菌のDNAのみが制限酵素処理後のDNAバンドの位置が異なっており、本法が有効であることを示した。5)プライマーSA2/SA3の検出限界は、0.0025pgであった。6)サルスベリからのDNA抽出は困難であったが、Hepeseによる洗浄法とDneasy Plant MiniKitを用いたDNA抽出法によって可能であった。さらに、7)うどんこ病罹病と無病のサルスベリ芽からのうどんこ病菌の検出を行う予定であったが、うどんこ病無病のサルスベリを育成できずに、今後の課題として残った。1サルスベリとミズキ類植物うどんこ病菌の種特異的プライマーの作成サルスベリとうどんこ病菌と同属のUncinuliella属あるいはそれらと近縁と考えられる12種類の植物に発生するうどんこ病菌のrDNAの塩基配列を解析するとともに、他のうどんこ病菌の遺伝子解析の結果とも考えあわせて、サルスベリうどんこ病菌の種特異的プライマーを作成した。なお、ミズキ類植物うどんこ病菌については分類学上の問題があり、種特異的プライマーを作成する前に、それら菌の遺伝子解析から分類学的提案を行った。2作成したプライマーを用いた植物芽中のうどんこ病菌の検出方法の開発作成したサルスベリうどんこ病菌の種特異的プライマー4種類について、(1)近縁のUncinulaとUncinuliella属うどんこ病菌、(2)サルスベリ葉上から分離される糸状菌類12種類を対象として、特異性の検討をおこない、4種類とも種特異的であることを明らかにした。しかし、サルスベリの芽からのDNAの抽出とPCRの適切な条件が見つからず、それらプライマーの特異性の検討を終えておらず、まだ種特異的プライマーを用いたサルスベリ芽中からのうどんこ病菌の検出に至っていない。3自然発生下でのサルスベリうどんこ病菌の発病経過

サルスベリうどんこ病の発病経過を調査し、葉の展開が旺盛に始まる5月上旬には、展開した葉での発病が認められないが、伸長する新芽のみがうどんこ病に感染している場合があること、周辺の展開葉への発病の拡大がなかなか進展しないことなどを明らかにし、越冬後に伸長する新芽の中での感染新芽の割合は極めて低いものの新芽の中で越冬の可能性を示した。1作成したサルスベリうどんこ病菌の種特異的ブライマーの特異性および検出限界の検討種特異的プライマーの特異性を検討するために、サルスベリうどんこ病菌を含む50種類以上の植物に発生するうどんこ病菌のrDNAのITS領域における塩基配列を解析し、サルスベリ上の付着糸状菌12種類を対象として、特異性を検討した結果、対象としたうどんこ病菌ではPCRの増幅産物は認められず、一方いくつかの付着糸状菌ではPCRの増幅産物バンドが検出されたが、バンドの位置および増幅程度がサルスベリ菌の場合とは明らかに異なることから、作成したプライマーがサルスベリうどんこ病菌に特異的であると判断された。2作成したプライマーを用いた植物芽中のうどんこ病菌の検出方法の開発サルスベリからの芽からのDNAの抽出とPCRによる増幅の可能性を知るための予備的検討として、サルスベリの葉を対象に、ISOPLANT(DNA分離キット)を適用したが、PCRによる増幅が認められなかった。次に、DNA精製用のキアゲン力ラムを用いて検討した結果、良好な結果を得ることが出来た。現在、サルスベリうどんこ病の発病葉と無病葉を対象として、特異的プライマーの特異性を検討している。3自然発生下でのサルスベリうどんこ病菌の発病経過サルスベリうどんこ病の発病経過および芽内への感染を明らかにするために、自然発生下での発病経過の調査およびポット栽培したサルスベリでの接種試験を予定したが、昨年度は本病の発生程度が少なく、充分なデータを得ることが出来なかった。1作成したサルスベリうどんこ病菌(サルスベリ菌)の種特異的プライマーの特異性および検出限界の検討:特異性を高めるためにPCRのアニリング温度について検討した結果、1)アニリング温度を58°Cから73°Cの間であげても特異性は改善されなかった。しかし、2)2回かけていたPCRを1回にすると、増幅しなくなる菌類があり、PCRの増幅回数の減少により特異性が高まった。また、制限酵素Xho Iを用いたPCR-RFLPを検討し、サルスベリ菌の検出に本制限酵素は有効なことを明らかにし、種特異的プライマーとXho I処理の組み合わせは、サルスベリ菌の特異的検出に有効であることを示した。さらに、サルスベリ菌の検出限界について検討した結果、プライマーの組み合わせによっても異なるが、サルスベリ菌のDNA濃度が、275μg/m1有れば検出できることを明らかにした。2自然条件下でのうどんこ病菌の芽内への感染と発病経過:サルスベリからのDNA抽出は、キアゲンカラムを用いる方法が有効なことを先に明らかにした。本法を自然条件下で発病したサルスベリうどんこ病発葉に適用し、その後、1)そのまま種特異的プライマーを用いてPCR増幅したが、サルスベリ菌のDNAは増幅されなかった。そこで、2)先にキレックス法でサルスベリ菌DNAの抽出を試みた後に、キアゲンカラムを用いる方法を検討したが、PCRが阻害され、サルスベリ菌のDNAは増幅しなかった。以上の結果、サルスベリ菌検出のためには、発病葉を用いたPCR増幅条件をさらに検討する必要が明らかとなった。
小学校における遊びの相互行為を規制する構造と「隙間的遊び」の関連に関する研究

本研究は小学生の集団遊びの様子を相互行為の観点から理解するために、隙間的遊びの概念を検討することから始めた。隙間的遊びは主たる活動(授業、掃除等)の中にごく短い時間出現する遊び行為を指す。隙間的遊びの概念は相互行為としての遊びの境界線をとらえ、また、子どもと大人との関係において遊びを位置づけるのに有効であると考えられた。小学校における観察調査によって得られたデータ(エピソード単位で検討された)により、次のような知見が得られた。隙間的遊びは(1)主要な活動に対する異化である。(2)相互行為の道具として利用される。(3)相互行為からの潜在的逸脱である。(4)そこには子ども-教師間の不均衡な参加がみられる。(5)子ども同士に共振現象がみられる。このような特徴を検討する中で、隙間的遊びは授業等の非遊び活動にのみ位置づくものではなく、遊び活動そのものの中にも現れる現象であると考えられるようになった。そこで、観察対象として本来の目的である集団遊びを新たに加え、そこでのエピソードの分析を進めた。分析の枠組みとして、相互行為の核であるルーティンを設定し、それとの関連で隙間的遊びを位置づけた。また、参加者の行為が相互的に達成されるプロセスを成員カテゴリー化の概念を用いて分析した。その結果、小学生の遊びは拡散的な会話場において焦点化された相互行為と周辺的相互行為によって構成されているという特徴がみられた。それをもとに参加者の志向と相互承認の関連で遊びの境界が構成されるとする共時的モデルが作られた。それから、参加者個人の側からとらえた遊びの相互達成に関する通時的モデルが検討された。この二つのモデルは子どもの遊びを相互行為レベルで研究するための枠組みとなりえるだろう。具体的にはエピソードの事後的構成や隙間的遊びをめぐる重層的なの相互行為の進行などを説明する手がかりとして期待される。本年度の研究は小学校における集団の遊びにみられる相互作用過程を観察・記録・分析する手続きについての検討を中心に行った。集団の遊びの特性上、参加メンバーの活動範囲が広く、動きが予測しにくい為、映像記録のみで遊びの全体をとらえるのは不可能である。また、隙間的遊びを把握する上からも、遊びにおける主要なエピソードの抽出手続きが必要とされる。そのため映像記録観察記録のみをデータとするのではなく、観察と併用することでひとまとまりの相互作用を取り出す方法が適当であると思われる。その際問題となる観察者の視点の恣意性に関しては引き続き検討を要する。手要なエピソードを抽出する手続きは、観察された遊びがどのような構造を持っているのかという認識に基づいて行われる必要がある。ここで言う構造とは遊びの名称がメンバーに予想させるさるようなある種の目的とそれに向けた一連の手続きを主として指している。それを一応「ルーティン」と呼ぶことにする。ルーティンは、明示的であるか否かに関わらず、メンバーが遊びの場に立ったときに相互に確認している相互作用の大まかな枠組みだと言える。このルーティンとの対比によって隙間的遊びが説明される事になるのだが、儀式的行為のようにそれ全体がひとまとまりのルーティンである場合に近い遊びもある一方で、より小さな単位のルーティンが積み重なっている場合も観察される。それらをどのように取り扱うかは次年度以降の課題のひとつである。また、ルーティンのあり方に何らかのパターンがあるとすればそれが性別や交友集団・活動集団と言った集団類型と相関が見られるのかといった問題についても検討中である。前年度までの研究において隙間的遊びをルーティンとの関係(距離、逸脱、復帰等)で理解する方法についていくつかの問題を検討してきた。

本年度はルーティンを構成するために遊びの参加者が相互に達成するカテゴリー化の働きについて検討を行った。参加者の発話や行動(表情や視線、姿勢といったものも含まれる)がカテゴリー化の重要な要素となる。ただし、単独の発話や行動がそれ自体で意味を持つのではなく、それに対する他の参加者の態度という相互的プロセスの中で一定のカテゴリーを対象とすることが可能となる。遊びは他の社会的行為と比べて、カテゴリー化の作用が明確でない場面も多く見られる。そのため遊びの参加者を特定の社会的カテゴリーもしくは社会集団に位置づけることによってのみカテゴリー化を説明することは困難である。子どもの遊びにおけるカテゴリー化の根拠は特定母集団の規範によって支持される部分と、観察者からは恣意的に持ち出されたように見える要求との混合物である。両者の区別は必ずしも明確ではないが、後者を達成するためにはより多くの威信やテクニックが必要となる。そのため子どもの特性によりカテゴリー化へのかかわりは大きく異なってくる。そのような資源はカテゴリー化の協同達成にととまらず、カテゴリー化を巡る駆け引きにも関係している。また、様々な基盤から引き出されるカテゴリー化の正当性は、子どもたちを取り巻く社会的環境となんらかの関係があると予想される。遊びの中にニュースで繰り返されるフレーズを持ち込むようなわかりやすいものから、相互作用の中で繰り返される選択の背景にあるものまで、これら遊びの外部構造がどのように影響しているかを具体的な場面に即して検討する必要がある。集団遊びにおける「隙間的遊び」が、どのような形で相互行為としての遊びの外部と関わっているのかを考える際には、遊びの境界自体の特性を考慮する必要がある。それは、観察者の恣意を排除することが可能であるという前提に立つ作業ではなく、遊びを把握する枠組みを固定化せず、変化や逸脱という遊びの特徴に焦点をあてるものである。隙間的遊びは当初、一連の相互行為の中に短時間出現する、基盤となる遊びとは異なった性質を持つ遊びの様態を記述する為に構想された。しかし、具体的な遊びの場面を分析していくと、隙間的遊びが、基盤となる遊びの流れに挿入される側面だけにはとどまらないことが明らかになった。それは単一のルーティンを分析単位とするのではなく、複数のルーティンが相互に影響し合ってより大きな遊びの流れを構成するというレベルでも検討される必要がある。すなわち、特定ルーティンを中核とする単一の遊びの中に、隙間的遊びがくさびとして出現するのは、背景に隠れてはいるが、同時に進行している別のルーティンに属する遊びの現れであるという捉え方が求められるのである。拡散的な会話場の概念は、観察者にとって予想外の広がりをもつ相互行為場面を把握しようとする。その際、参加者にとってはある種の予期が不可欠となる。遊び場面においても、ゲームという単一ルーティンに収斂する予期ではなく、全く別のルーティンへの対応を可能にする予期が必要となる。