hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
DNA特異的ADPリボシル化酵素ピエリシン-1のin ivo抗腫瘍活性

モンシロチョウに存在する分子量98,000の蛋白質、ピエリシン-1、は種々のがん細胞に対して細胞傷害活性を示す。そこで、in vivoにおけるピエリシン-1の抗腫瘍活性を調べる目的で、ピエリシン-1の実験動物に対する毒性の解析を行った後、移植がん細胞に対するピエリシン-1の抗腫瘍効果を調べた。ピエリシン-1を単回腹腔内投与した場合のBALB/cマウスに対するLD50値は約5μg/kg body weightであった。1x10^7個のHeLa細胞を6週齢BALB/c雌ヌードマウスの腹腔内に移植し、翌日、3μg/kg body weightのピエリシン-1を単回、腹腔内投与し、80日目にマウスを屠殺し解析した結果、ピエリシン-1非投与群では全例(10/10)に腫瘍が確認され、その平均重量は1.16gであった。一方、ピエリシン-1投与群では10例中3例に肉眼上腫瘍を認めなかった。また、1例では腹膜に2mmの小結節を認めたのみであった。ピエリシン-1投与群の平均腫瘍重量は0.56gであり、有意に低下していた。以上より、ピエリシン-1はHeLa細胞に対し、in vivoで抗腫瘍活性を示すことが分かった。続いて1,340頭のモンシロチョウさなぎからピエリシン-1の大量精製を行い、47.6mgの精製ピエリシンを得た。さらにピエリシン-1およびその酵素ドメインであるN末端断片の酵素的性質を解析したところ、C末端断片が存在すると、酵素活性が大きく低下する条件が認められた。N末端断片およびトリプシン活性化本酵素による転移反応のturnover numberは55および25、24時間反応における転移数は10^6レベルであり、単一分子によって細胞に致死レベルの付加体が生成し得ることを示した。モンシロチョウに存在する分子量98,000の蛋白質、ピエリシン-1、は種々のがん細胞に対してアポトーシスを誘導し、細胞傷害活性を示す。中でもヒト子宮頸部がんHeLa細胞は、50%増殖阻害濃度が0.043ng/mlと、最も高い感受性を示した。ピエリシン-1を単回腹腔内投与した場合のBALB/cマウスに対するLD_<50>値は約5μg/kg body weightであった。静脈内投与した場合も同様であった。皮下投与の場合の毒性は腹腔内の約1/50であった。続いて抗腫瘍効果を調べるため1x10^7個のHeLa細胞を6週齢BALB/c雌ヌードマウスの腹腔内に移植した。翌日、3μg/kgbody weightのピエリシン-1を単回、腹腔内投与した。腫瘍移植後80日目にマウスを屠殺し、腫瘍を採取し、その重量を計測した。その結果、ピエリシン-1非投与群では全例(10/10)に腫瘍が確認され、その平均重量は1.16gであった。

以上より、ピエリシン-1はHeLa細胞に対し、in vivoで抗腫瘍活性を示すことが分かった。モンシロチョウに存在する分子量98,000の蛋白質、ピエリシン-1、は種々のがん細胞に対して細胞傷害活性を有する。ピエリシン-1を腹腔内投与した場合のBALB/cマウスに対するLD_<50>値は約5μg/kg body weightであった。HeLa細胞を移植したヌードマウスにピエリシン-1を投与した群は、非投与群と比べて腫瘍発生頻度と腫瘍重量が低かった。以上のようにin vivo抗腫瘍活性を有するピエリシン-1の抗腫瘍活性をさらに解析する目的で、ピエリシン-1の大量精製を行った。すでに確立された方法を改変し、1,340頭のモンシロチョウさなぎから47.6mgの精製ピエリシンを得た。純度および比活性はこれまでに得られていたものと同じであった。つぎに、酵素ドメインを有する組換え蛋白質の抗腫瘍活性を解析するための基礎的研究として、ピエリシン-1およびその酵素ドメインであるN末端断片の酵素的性質を解析した。まずin vitroで発現したN末端断片およびSDS-PAGEで分離したN末端断片によるグアニン塩基のADPリボシル化をHPLC等で確認した。つづいてトリプシン活性化本酵素とN末端断片による、反応の至適条件と特異性を解析し、C末端断片の影響について考察したところ、N末端断片は中性ないし弱アルカリ性、生理的塩濃度および温度条件下で効率よくグアニン塩基のADPリボシル化を行ったが、C末端断片が存在すると、酵素活性が大きく低下する条件が認められた。N末端断片およびトリプシン活性化本酵素による転移反応のturnover numberは55および25、24時間反応における転移数は10^6レベルであり、単一分子によって細胞に致死レベルの付加体が生成し得ることを示した。
高信頼ステレオ視による3次元環境の記述

(1)[高信頼ステレオ]ステレオ視の中心課題である左右画像の対応点を求めるため、画像から特徴(エッジ)を抽出し、エッジの類似性によって照合する研究を行った。画面を重なりあう小領域(ウインドウ)に分割して、ウインドウ毎に対応の候補を求め、その距離の分布(局所ヒストグラム)から対応の信頼性を評価する方法を用いた。照合は一度に行わず、コントラストの強いエッジから先に行い、また確実に対応するウインドウ内の対応を先に決定し、その結果を考慮してよりあいまいな対応を決めていくという多段階処理の方法を開発した。しかし、ウインドウ内に不連続な面を含むと、対応が求めらない場合や、対応が誤って求められる場合が生ずる。そこで、不連続な面は面像でT字形接続点を生ずることを利用して不連続面の候補を求め、それを利用してステレオ視をやり直すように改良した。従来のステレオ視では左右のカメラの位置関係を既知としているが、実際にはずれがあり、そのための誤差が無視できない。そこで、左右の画像を用いて自動的に位置のずれを修正する方法を開発した。(2)[高信頼ステレオによるシ-ンの記述]ステレオ視から得られる3次元情報から、距離の不連続、急激な変化などの特徴を抽出し、その特徴から対応するシ-ンの幾何学的な記述を作った。さらに濃淡画像やカラ-画像と組み合わせて、より豊富な記述を得る方法を開発した。得られた結果の記述の信頼性は用いた3次元情報の誤差に依存する。そこで記述の信頼性を定量的に評価する方法を研究し、実験によってその妥当性を確かめた。また、シ-ンの記述から対象に関する知識を用いて物体を認識した。1.[高信頼ステレオ]ステレオ視の中心課題である左右画像の対応点を求めるため、画像から特徴(エッジ)を抽出し、エッジの類似性によって照合する研究を行った。照合は一度に行わず、コントラストの強いエッジから先に行い、また確実に対応するウインドウ内の対応を先に決定し、その結果を考慮してよりあいまいな対応を決めていくという多段階処理の方法を開発し、その有効性を実験的に示した。さらに、大きさの異なる複数のオペレ-タを用いて分解能の異なる複数のエッジ画像をつくり、それを利用する方法を研究した。それぞれの分解能のエッジどうしを照合して、距離の局所ヒストグラムをつくる方法と、各分解能のエッジ画像からそれぞれ距離を求めてからその結果を融合する方法を開発し、いずれの方法も単分解能のエッジだけを用いる方法よりすぐれていることが分かった。2.[高信頼ステレオによるシ-ンの記述]ステレオ視から得られる3次元情報から、距離の不連続、急激な変化、滑らかな変化などの特徴を抽出する方法を研究した。その結果、得られる特徴をステレオ視にフィ-ドバックすることが有効であることが分かった。とくに水平方向のエッジはステレオ視で距離を決定することが困難であるが、エッジの連続性やT字型エッジという特徴によって、近傍の既知のエッジとの空間的な関係を求めることが有効であることが分かった。従来の方法ではT字型エッジの検出が困難であるが、T字型エッジ特有のエッジパタ-ンを検出してから、その近傍にT字型エッジを探索する方法を開発した。1.[高信頼ステレオ]これまで、左右画像の対応点を求めるために、画面を重なりあう小領域(ウインドウ)に分割して、ウインドウ毎に特徴点の対応候補を求め、その距離の分布から対応の信頼性を評価する方法を開発した。

そこで、不連続な面は画像でT字形接続点を生ずることを利用して不連続面の候補を求め、それを利用してステレオ視をやり直すことを研究した。不連続な面があれば、そこでのエッジのコントラストは左右の画像で異なることを考慮して、条件をゆるめることによって対応をとる方法を得た。また、水平エッジではステレオ視の対応を求められないが、その両端が他のエッジと接続していて、不連続でないことをT字形エッジに基づいて確かめてから内挿すればよいことが分かった。従来のステレオ視では左右のカメラの位置関係を既知としているが、実際にはずれがあり、そのための誤差が無視できない。そこで、左右の画像を用いて自動的に位置のずれを修正する方法を開発した。2.[高信頼ステレオによるシ-ンの記述]ステレオ視から得られる3次元情報から、距離の不連続、急激な変化などの特徴を抽出し、その特徴から対応するシ-ンの幾何学的な記述を作った。さらに濃淡画像やカラ-画像と組み合わせて、より豊富な記述を得る方法を開発した。得られた結果の記述の信頼性は用いた3次元情報の誤差に依存する。そこで記述の信頼性を定量的に評価する方法を研究し、実験によってその妥当性を確かめた。また、シ-ンの記述から対象に関する知識を用いて物体を認識した。
新規NFκB相互作用分子による転写制御機構の解明

転写因子NF-κBは,炎症やアポトーシスといった様々な生命現象に関与する重要な転写因子である。本研究では,NF-κBの活性制御についてさらに解析を進めるために,NF-κBサブユニットの一つp65をbaitにyeast two hybridスクリーニングを行い,新規相互作用分子としてAKIP 1を得,その作用機構について解析を行った。まず,p65とAKIP1と結合することを,in vitroとin vivoで証明し,さらにAKIP1を強発現させることによりNF-κBの核移行が促進されることを明らかにした。また,AKIP 1によりPKAcによるp65のSer276のリン酸化が亢進しており,この機構にはリン酸化が関与することが考えられた。また,NF-κB依存性転写を行う代表例としてHIV-1 LTRによる転写活性化についてルシフェラーゼアッセイで調べたところ,AKIP 1の過剰発現によりTNFによるHIV-LTRの転写活性が増強された。さらに,siRNAによってAKIP 1をノックダウンすることにより,LTRの転写活性は阻害され,NF-κBの転写活性化にAKIP 1が必要であることが明らかになった。以上の結果から,AKIP 1はPKAcによるp65のリン酸化を通じてNF-κB転写活性を正に制御することが示唆された。本分子はNF-κBの活性を負に制御する分子であるとも報告されているため,AKIP 1が刺激や細胞腫などの環境に応じてNF-κBの転写活性を正にも負にも作用するマスター分子である可能性があることが考えられる。今後慎重に検討を進める必要がある。さらにNF-κBの制御機構を解析するために新規NF-κB阻害化合物の探索を行い,ホオノキに含まれるマグノロールがNF-κBの核移行を阻害し転写活性を抑えることを明らかにした。転写因子NF-κBの活性制御機構を解析するために、NF-κBのサブユニットの一つp65(Rel A)N末をbaitにしてyeast two hybridスクリーニングを行った。そのうち、複数クローンが独立に得られた分子(AKIP1,FKBP4)について、相互作用の確認と機能解析を行った。まず、AKIP1については、in vitro、in vivoでp65と結合する事を確認し、ルシフェラーゼアッセイを用いた機能解析の結果から、AKIP1はNF-κBの転写活性を正に制御する事が明らかになった。しかしながら、昨年の11月にGaoたちにより本分子がp65と結合しNF-κB活性を負に制御すると報告されたため、現在、我々の結果と異なる点について検討を行っている。他方、FKBP4については、p65とin vivoで結合する事と、本分子がNF-κBの転写活性に必須の分子である知見が得られつつあり、現在さらに検討を行っている。また、新たなNF-κB阻害剤の探索と新規IKKβ阻害剤であるACHPの白血病細胞に対する効果を検討た。まず、新規NF-κB阻害剤として、香木に含まれるマグノロールがIκBの分解抑制を介さずに、NFBの核移行を阻害し抗NF-κB活性を持つことを明らかにした。他方、ACHPについては、白血病細胞にて見られる恒常的なNF-κB活性化を阻害し、細胞をアポトーシスに導くことを明らかにした。NF-κの恒常的な活性化が見られる悪性腫瘍においてNF-κB阻害剤の治療的有効性を示す結果と考えられ、後、我々が見いだしたNF-κB阻害剤の治療効果についても検討していく予定である。
神経障害性疼痛に対する新しい電気刺激治療の確立

本研究では、経頭蓋直流電気刺激(tDCS)による感覚機能、疼痛閾値の変化を検討した。tDCSは、健常人および神経障害性疼痛患者を有する脳梗塞患者の感覚閾値を変化させ、疼痛閾値を変化させる可能性がある事が示唆された。また既存の電気刺激治療である経皮的末梢神経電気刺激(TENS)も運動療法と併用する事で神経障害性疼痛患者に有用である可能性が示唆された。平成27年度では、神経障害性疼痛患者での有効性を確認するために、pilot studyにより刺激方法と痛みの定量的評価の評価方法など実験手法の確立に従事した。神経障害性疼痛患者の痛みをPain Vision PS-2100で評価した研究は少なく、どの程度正確に評価できるか不明であったため、熱傷後の複合性局所疼痛症候群患者に対してPain Vision PS-211の痛み度および痛み対応電流で日内および日間の疼痛の推移を繰り返し評価した。その結果、本人の自覚的痛み強度(Visual Analog Scale:VAS)と痛み度および痛み対応電流は概ね同様の推移を示し、痛みの変化を把握できる事が確認できた。これまでの研究は、神経障害性疼痛患者に対するtDCSを実施する上で有用なpilot studyであり、神経障害性疼痛患者の痛みや痺れはPain Vision PS-2100の痛み度や痛み対応電流を評価することで把握可能である事、さらに感覚機能の評価も同時にした方がtDCSの有効性を検討する上で有用な情報が得られると考えられた。平成27年度はすぐに神経障害性疼痛患者を対象にtDCSの効果を検証する予定であったが、刺激方法および評価方法の習熟と再現性および正確性を確保するために、網羅的文献検索および健常者や神経障害性疼痛患者を対象としたpilot studyが必要と考え、当初の予定に先立って実施した。そのため、当初の研究計画とやや遅れている。経頭蓋直流電気刺激(tDCS)の刺激方法を確立するために、それによる感覚機能の変化を健常者で観察した。健常男性3名に対し、両側一次運動野に電極を設置し、1mAの強度でanodal-tDCS、cathodal-tDCSとsham刺激を実施した。感覚機能評価として、触覚閾値および最小電流閾値を評価した。その結果、3名中2名でanodal-tDCSによる触覚閾値と最小電流閾値の低下傾向を認めたが、その変化の程度にばらつきを認め、安定した刺激方法の検討が必要となった。関連学会に参加し、tDCS刺激強度を2mAにすると、その効果がより増強するという情報を得たため、健常男性4名に対し、同様の方法で刺激強度を2mAに変更し、感覚機能評価を実施した。その結果、4名中3名でanodal-tDCSによる触覚閾値と最小電流閾値の低下を認めた。左手関節より遠位に神経障害性疼痛を発症した脳梗塞患者1名に対してtDCSを行い、感覚機能評価(最小電流閾値)と疼痛評価(痛み対応電流)の変化を評価した。デザインとして、毎日、両側一次運動野に電極を設置し、刺激条件をanodal-tDCS 2mAまたはSham刺激のいずれかを無作為に行い、盲検化された評価者が評価する、N of 1 trialを実施した。その結果、anodal-tDCSを施行した4日中3日で最小電流閾値の低下を認め、4日中2日で痛み対応電流の低下を認めた。さらに、経時的に左手関節、手指の運動機能の改善も認めた。これまでの研究でtDCSは、健常人および神経障害性疼痛患者の感覚閾値を変化させ、疼痛閾値を変化させる可能性がある事が推察された。その一方で、いずれも介入効果のばらつきが大きく、症例数を増やし、どのような特徴を有する症例に有効なのか更なる検討が必要であると考えられた。また、当研究課題と類似した研究の情報を収集するために関連する学術大会に積極的に発表参加し、評価方法の見直し、刺激方法の見直しを実施する予定である。疼痛医学補助事業の誠実な執行に努めた結果、当初計画より経費の使用が節約できたことにより未使用額が生じた。当該未使用額を次年度に持ち越して追加の消耗品等購入する。
代数多様体の分岐被覆

当研究のテーマは代数多様体のGalois分岐被覆,特にGalois群が非可換有限群であるのもの効果的な,つまり具体的に実行可能な構成方法を与えることとその方法を用いてできる代数多様体の研究であった.このテーマに関し今年度得られた成果は以下の通りである.これらはすべて論文On dihedral Galois coveringにおいて研究したことや,それ以前の研究をより発展させたものである.2.dihedrla Galois coveringの手法を用いて新しい6次曲線のZariski pairをいくつか構成した.さらにそれを用いれば無限個の系列がえられるのではないかという見通しも立っている.Zariski pairに関してはZariski以来殆ど研究されていないようであったがここにきて一気に研究が進みつつある.3.Perssonが定義したmaximizingsexticに関しそれに沿って分岐するdihedralGalois coveringについて研究した.特に曲線が既約な場合はGalois群が3次対称群であるような分岐被覆が存在するための十分条件を与えた.これらの曲線Cは,P^2での補空間P^2\Cの基本群が非可換群となるような有理曲線の例となっている.このような曲線の組織的な研究は去年度からの続いた研究目的であり,それに関し,ひとつのまとまった結果がえられたと言える.これらの結果のうちいくつかは城崎での代数幾何学シンポジウムで報告した.2,3の結果に関する論文は現在準備中である.4.2面体群以外の有限群例えば4元数群をGalois群に持つGalois被覆については,関数体のGalois拡大を標準的に構成する部分でdihedral Galois coveringとかなり異なることがわかった.この部分をうまくクリアするべく研究中である.当研究のテーマは代数多様体のGalois分岐被覆,特にGalois群が非可換有限群であるのもの効果的な,つまり具体的に実行可能な構成方法を与えることとその方法を用いてできる代数多様体の研究であった.このテーマに関し今年度得られた成果は以下の通りである.これらはすべて論文On dihedral Galois coveringにおいて研究したことや,それ以前の研究をより発展させたものである.2.dihedrla Galois coveringの手法を用いて新しい6次曲線のZariski pairをいくつか構成した.さらにそれを用いれば無限個の系列がえられるのではないかという見通しも立っている.Zariski pairに関してはZariski以来殆ど研究されていないようであったがここにきて一気に研究が進みつつある.3.Perssonが定義したmaximizingsexticに関しそれに沿って分岐するdihedralGalois coveringについて研究した.特に曲線が既約な場合はGalois群が3次対称群であるような分岐被覆が存在するための十分条件を与えた.これらの曲線Cは,P^2での補空間P^2\Cの基本群が非可換群となるような有理曲線の例となっている.このような曲線の組織的な研究は去年度からの続いた研究目的であり,それに関し,ひとつのまとまった結果がえられたと言える.これらの結果のうちいくつかは城崎での代数幾何学シンポジウムで報告した.2,3の結果に関する論文は現在準備中である.4.2面体群以外の有限群例えば4元数群をGalois群に持つGalois被覆については,関数体のGalois拡大を標準的に構成する部分でdihedral Galois coveringとかなり異なることがわかった.この部分をうまくクリアするべく研究中である.
溶液内素過程の化学反応ダイナミックス

研究では、溶液内やタンパク質における化学反応を自由エネルギー面に基づいて調べるための方法論の開発と応用を行った。まず自由エネルギー面に基づいて化学反応を議論する為、RISM-SCF法、LRFE-SCF法、RISM-MP2法などを開発した。次に、気相・液相中における光励起緩和過程のメカニズムを調べることを目的として、最低エネルギー円錐交差(conical intersection)の配置をMS-CASPT2レベルで直接定量的に求めるための方法を開発した。最後に、電子分極の効果を顕に含むタンパク質の一般分子力場をcharge response kernel(CRK)に基づいて構築し、それをMet-Enkephalin分子の統計分布などに応用した。さらに、CRKに基づいた分子動力学計算を行い、通常の液体とイオン液体の動的な性質の違いについて議論を進めた。溶液内での化学反応やタンパク質場における反応のダイナミックスを解明することは、現在の理論化学研究の最も重要な課題の一つである。これら凝集系における化学反応を取り扱うためには、反応場としての溶媒やタンパク質の熱揺らぎの効果を取り入れた反応の自由エネルギー面の構築が不可欠であり、更に、溶質分子や反応部位に対する反応場の揺らぎに起因するダイナミックな応答を記述する動力学的方法の確立が不可欠である。本研究では、複雑な溶液、生体内反応の動力学に対して見通しの良い描像を与える反応経路ハミルトニアンをab initio電子状態計算に基づいて構築する理論的方法を発展させ、溶液内光化学反応や生体内反応、特にプロトン移動や電子移動反応のダイナミックスを明らかにすることを目的としている。平成18年度は、以下の研究を行った。(1)9H-アデニンの水溶液中での励起状態の極めて速い無輻射失活の機構を明らかにするため、水およびアセトニトリル中での基底状態および4個の励起状態の間の円錐交差の構造とエネルギーをRISM-SCFに基づく線形応答自由エネルギー法を用いて求めた。(2)プロトン移動と結合した電子移動反応の速度を求める理論的方法を開発し、アセトニトリル中でのユビキノールとフェノキシラジカルの反応に適用した。(3)QM/MM法に対する線形応答自由エネルギー法を開発し、水溶液中での化学反応および酵素反応(chorismate mutase)に適用した。酵素反応については、水溶液中での反応と比較することにより、タンパク質酵素の役割について論じた。(4)3D-RISM-SCF法に対して効果的な計算方法を提案し、水溶液中での励起エネルギーの溶媒シフトを求めた。この新しい方法の有用性を示した。(5)RISM-SCF/MP2自由エネルギーに対する解析的エネルギー勾配法を開発し、エーテル中でのGrignard反応に適用した。本研究課題に関連して、(1)RISM-SCF法についての新しい方法の開発、(2)溶液内化学反応の機構とダイナミックス、(3)QM/MM法を用いた複雑分子系の自由エネルギー面上での反応経路の決定法の開発と酵素反応への応用、および(4)charge response kernel法を用いた分極可能力場モデルの開発と分子シミュレーションについて研究を行った。(1)では、先ず、溶質・溶媒間の短距離相互作用を記述するため、溶媒分子の相互作用点上に有効ポテンシャルを定義し、それを用いて溶質・溶媒電子間交換相互作用を表す方法の開発を行った。更に、3次元RISM-SCF法を用いて水溶液中でのpyrroleとindoleのRydberg励起状態のエネルギー準位に対するに対する溶質・溶媒電子間の交換相互作用の役割について解析を行った。(2)では、溶液内でのproton-coupled electron transfer反応の機構とダイナミックスを取り扱うため、反応の自由エネルギー面を溶媒からの外部ポテンシャルを用いて表現する方法の提案を行い、反応速度を量子動力学法により評価する方法の定式化を行った。この方法をアセトニトリル中でのubiquinolとphenoxyl radical間の反応に適用し、異常な速度同位体効果を示す理由について考察を行った。(3)の課題では、chalcone isomeraseの酵素反応を取りあげ、実験的に示唆されている2つの反応経路を比較し、活性化エネルギーを見積もった。(4)では、MP2法に基づくCRKモデルを構築する方法を開発し、アセトニトリル、メチレンクロライド、アセトン液体の低周波数領域での赤外とラマンスペクトルを分子動力学法により計算し、スペクトルの形状を決める上での電子分極の役割について論じた。平成20年度は、前年度に引き続き溶液、タンパク質内での化学反応とダイナミックスについての研究を行った。新しい課題として、ミオグロビン中での一酸化炭素分子の拡散過程の経路と自由エネルギー面の研究について纏め、論文として公表した。この研究を行うに際して、meta dynamics法による新しい自由エネルギー面の構築法の開発を行った。

また、代表的な有機金属化合物であるGrignard試薬のエチルエーテル溶媒中での化学平衡とアセトンとの化学反応の機構について本研究課題で開発を行ったRISM-MP2法により研究を行った。結果、Grignard試薬の2量体について従来考えられてきた環状構造ではなく、線形の構造が安定であることを見いだし、この線形2量体が化学反応においても本質的な役割を果たすことを見いだした。本研究課題で提案している他の取り組み、例えば、MS-CASPT2法による円錐交差点の最適化法の開発などは順調に進んでいる。本研究では、溶液内やタンパク質における化学反応を自由エネルギー面に基づいて調べるための方法論の開発と応用を行った。このような凝縮相中の化学反応では、溶質と溶媒、あるいは基質とタンパク質の相互作用を適切に考慮することが不可欠となる。また、溶媒やタンパク質は統計的に揺らぎながら様々な配置を取るため、エネルギーでなく自由エネルギー面に基づいて化学反応を議論するのが望ましい。そのような方法として、これまでRISM-SCF法(分子性液体の積分方程式と電子状態理論を結合した方法)、あるいはLRFE-SCF法(線形応答自由エネルギーと電子状態理論を結合した方法)を開発し、その応用を行ってきた。平成21年度は、森によって作成されたRISM-MP2法の解析的自由エネルギー微分のプログラムを用いて、有機金属触媒の一つであるGrignard試薬のジエチルエーテル中での平衡およびアセトンとの反応メカニズムをまず調べた。その結果、従来想定されていたcyclic dimerではなくlinear dimerを経由する反応メカニズムの方が優先的に起こることなどが分かった。次に、気相・液相中における光励起緩和過程のメカニズムを調べることを目的として、最低エネルギー円錐交差(conical intersection)の配置をMS-CASPT2レベルで直接定量的に求めるための方法を開発した。これをメタノール中レチナールシッフ塩基などに適用し、円錐交差が溶媒から受ける影響について議論した。最後に、電子分極の効果を顕に含むタンパク質の一般分子力場をcharge response kernel (CRK)に基づいて構築し、それをMet-Enkephalin分子の統計分布などに応用した。さらに、CRKに基づいた分子動力学計算を行い、通常の液体とイオン液体の動的な性質の違いについて議論した。
マイクロ化味覚・嗅覚融合センサの開発

本研究では、味覚・嗅覚センサのマイクロ化を行った.具体的には下記の成果が得られた.1)システムの小型化味覚センサシステムをFlow Injection Analysis法に基づいてシステムの小型化を行なった.これに伴い,サンプル量も従来の1/20に減少させることができた.2)受容膜表面構造の解析走査型プローブ顕微鏡をもちいて受容膜の表面構造を調べた.その結果,味の相互作用(苦味抑制剤の効果他)を視覚的に確認することができた.3)マイクロ化味覚センサの開発半導体微細加工技術を用いて味覚センサ電極部の微小化を行った.走査型プローブ顕微鏡により,味物質と脂質膜電極表面の相互作用の状態を観察した.電極材料としてガラス基板上にAg, Au, Pt等の各種電極をスパッタリングで形成し,応答感度および耐久性において電極形成の最適条件を求めた.さらの脂質膜の電極上の形成条件についても同様の観点から検討し,これまでのものと同等の感度および耐久性を有するセンサデバイスを作成できた.4)マイクロ化匂いセンサの開発同様に界面電位制御型匂いセンサの微小化を行なった.匂い物質の吸着部にはAuをガラス基板に蒸着したものを用いた.また、走査型プローブ顕微鏡により匂い吸着表面および吸着サイトの構造解析を行った.5)データベースの構築官能検査を実行し,センサの測定結果と官能検査の結果を照らし合わせ,ワイン及び日本酒の品質やおいしさの評価のためのデータベースを作成した.食品(ワイン,日本酒,茶,野菜類)の風味,品質,おいしさを構築する指針となった.6)嗅覚生理学実験ラットの匂い刺激に対する反応を測定した.この結果,人間において個々の特性を考慮した感性データベース作成のための知見が得られた.本研究では、味覚・嗅覚センサのマイクロ化を行った.具体的には下記の成果が得られた.1)システムの小型化味覚センサシステムをFlow Injection Analysis法に基づいてシステムの小型化を行なった.これに伴い,サンプル量も従来の1/20に減少させることができた.2)受容膜表面構造の解析走査型プローブ顕微鏡をもちいて受容膜の表面構造を調べた.その結果,味の相互作用(苦味抑制剤の効果他)を視覚的に確認することができた.3)マイクロ化味覚センサの開発半導体微細加工技術を用いて味覚センサ電極部の微小化を行った.走査型プローブ顕微鏡により,味物質と脂質膜電極表面の相互作用の状態を観察した.電極材料としてガラス基板上にAg, Au, Pt等の各種電極をスパッタリングで形成し,応答感度および耐久性において電極形成の最適条件を求めた.さらの脂質膜の電極上の形成条件についても同様の観点から検討し,これまでのものと同等の感度および耐久性を有するセンサデバイスを作成できた.4)マイクロ化匂いセンサの開発同様に界面電位制御型匂いセンサの微小化を行なった.匂い物質の吸着部にはAuをガラス基板に蒸着したものを用いた.また、走査型プローブ顕微鏡により匂い吸着表面および吸着サイトの構造解析を行った.5)データベースの構築官能検査を実行し,センサの測定結果と官能検査の結果を照らし合わせ,ワイン及び日本酒の品質やおいしさの評価のためのデータベースを作成した.食品(ワイン,日本酒,茶,野菜類)の風味,品質,おいしさを構築する指針となった.6)嗅覚生理学実験ラットの匂い刺激に対する反応を測定した.この結果,人間において個々の特性を考慮した感性データベース作成のための知見が得られた.食の多様性,高品質化,大量生産に伴い,その味,香り,品質,安全性の客観的評価手法の早急な確立が強く望まている.本研究はこのような状況を踏まえ,世界ではじめて味と匂い(香り)の計測を可能とするマイクロ化味覚・嗅覚融合センサの開発を目指すものである.当研究グループではこれまでにマルチチャンネル膜電位計測型味覚センサや界面電位制御型匂いセンサの開発をしており,味や匂いの客観的計測を実現してきた.以上の背景に立ち,本研究では,半導体微細加工技術を用いてサンプル量がマイクロリットルオーダーで測定可能な味覚・嗅覚融合センサを開発する.併せて清酒等の官能評価値をデータベース化し,センサ出力との対応から品質評価を行なう.ここで得られた知見・ノウハウは他の食品へも応用可能であり十分な普遍性を有する.具体的には下記の成果が得られた.(1)システムの小型化味覚センサシステムをFlow Injection Analysis法に基づいてシステムの小型化を行なった.これに伴い,サンプル量も従来の1/20に減少させることができた.(2)受容膜表面構造の解析走査型プローブ顕微鏡をもちいて受容膜の表面構造を調べた.その結果,味の相互作用(苦味抑制剤の効果他)を視覚的に確認することができた.(3)味・匂い(香り)センサによる食品の測定試作電極を用いて,茶・清酒等の測定を行い,官能検査と合わせて味と匂いおよび風味に関する評価データを得た.1)マイクロ化味覚センサの開発半導体微細加工技術を用いて味覚センサ電極部の微小化を行った.走査型プローブ顕微鏡により,味物質と脂質膜電極表面の相互作用の状態を観察した.電極材料としてガラス基板上にAg,Au,Pt等の各種電極をスパッタリングで形成し,応答感度および耐久性において電極形成の最適条件を求めた.さらの脂質膜の電極上の形成条件についても同様の観点から検討し,これまでのものと同等の感度および耐久性を有するセンサデバイスを作成できた.

なお,マスクの作成にはEB露光装置,マスクの修正や微小領域の加工には収束イオンビーム装置といった既存の装置を用いた.2)マイクロ化匂いセンサの開発同様に界面電位制御型匂いセンサの微小化を行なった.匂い物質の吸着部にはAuをガラス基板に蒸着したものを用いた.また、走査型プローブ顕微鏡により匂い吸着表面および吸着サイトの構造解析を行った.3)センサの組み込みフローインジェクション式の測定システムを構築し,開発した微小化味覚センサおよび微小化匂いセンサを組み込み、微量サンプルによる測定の自動化を可能とした.4)マイクロ化融合センサを用いた食品の測定実際の食品(清酒)の味と香りを味センサおよび匂いセンサで計測し,それらの数値化を行った.5)データベースの構築官能検査を実行し,センサの測定結果と官能検査の結果を照らし合わせ,ワイン及び日本酒の品質やおいしさの評価のためのデータベースを作成した.食品(ワイン,日本酒、野菜類)の風味,品質,おいしさを構築する指針となった.6)嗅覚生理学実験ラットの匂い刺激に対する反応を測定した.この結果、人間において個々の特性を考慮した感性データベース作成のための知見が得られた.
抗体医薬リツキシマブ投与によるインフュージョンリアクション発症メカニズムの解明

「研究の目的」インフュージョンリアクションは、一般的にモノクローナル抗体製剤(抗体医薬)の投与後に発現する急性期の有害事象を言う。近年は、癌治療をはじめとして分子標的薬が増加しており、なかでも抗体医薬はその中心的役割を担っている。このため、抗体医薬投与直後に発現する副作用の予測は非常に重要になってきている。本研究では、抗体医薬投与直後に発現する副作用を未然に防ぐ手段を確立するために、薬剤投与直後に副作用を発現した患者の遺伝子多型を解析することによりインフュージョンリアクションリスク因子を明らかにし、ハイリスク患者を予測可能な評価系の確立を最終的な目的とする。「研究実施計画」インフュージョンリアクションの発症原因を、遺伝子多型について、薬理遺伝学的・薬物動態学的手法を駆使することによって明らかにする。【研究の具体的内容】インフュージョンリアクションは、CD20陽性のB細胞性非ホジキンリンパ腫などの治療薬であるリツキシマブによって誘発される重要な副作用である。リツキシマブ誘発性インフュージョンリアクションを発症した患者のゲノムDNAサンプルを用いたケース-コントロール関連解析を行い、その発症リスクと関連する遺伝的要因を明らかにした。【意義】現在解明されていないFcRn遺伝的多型の影響などのリスク因子を明らかにしたことで、リツキシマブ誘発性インフュージョンリアクションの予防および有効性の個人差を考慮した最適な使用が可能となることが期待される。【重要性等】リツキサンによる本研究を抗体医薬に一般化し、抗体医薬を最初にヒトへ投与する臨床試験前に行う「前臨床試験」に応用可能であることが期待される。抗体医薬であるリツキシマブ投与後にインフュージョンリアクションを発症した患者由来の末梢血を採取し、臨床検査データの検証を行って来た。現在までの状況から、リツキシマブ投与後にインフュージョンリアクションを発症した患者由来の末梢血のみを採集し、健常人データと比較することに加え、リツキシマブ投与後にインフュージョンリアクションを発症しなかった患者から採集した血液を収集することとし比較検討するためのサンプル収集を進めている。また、電子カルテ情報から収集可能な臨床検査データについて患者個人名を匿名化したのちに転記し、インフュージョンリアクションとの因果関係を検証している。さらに、解析結果からリスク因子となることが推定されたHLAタイプに再現性があるか多施設で検証中である。現在は、リツキシマブ投与後にインフュージョンリアクションを発症しなかった患者から採集した血液を収集することが比較対象として重要なため、琉球大学医学部附属病院、名古屋市立大学病院、名古屋大学医学部附属病院においてサンプルを収集中である。遺伝子多型解析は、SH2D1A遺伝子変異およびXIAP遺伝子変異などの免疫応答の異常に関与することが示唆されている遺伝子解析に先立ち、HLA遺伝子型の同定を中心に解析している。遺伝子解析は、主に理化学研究所において実施している。ゲノムDNAの抽出は、B型、C型肝炎等の抗体陽性の恐れのある患者検体を理化学研究所に搬入できないため、琉球大学医学部附属病院で行い、必要に応じて外部検査機関を利用して抽出している。臨床検体は、琉球大学医学部附属病院、名古屋大学医学部附属病院、名古屋市立大学病院から順調に収集している。2017年度に実施した研究の成果【背景】インフュージョンリアクションは、一般的にモノクローナル抗体製剤(抗体医薬)の投与後に発現する急性期の有害事象を言う。近年は、分子標的薬による治療が増加しており、抗体医薬はその中心的役割を担っている。【具体的内容】本研究では、リツキシマブ投与直後に発現する副作用を未然に防ぐ手段を確立するために、薬剤投与直後に副作用を発現した患者の1遺伝子解析、2HLAタイプ解析、3併用薬・治療レジメンを網羅的に解析することによりリツキシマブによるインフュージョンリアクションのリスク因子を明らかにし、リツキシマブを含む抗体医薬のリスク回避策を作成することを最終的な目的とする。【意義・重要性】ヒトにおけるインフュージョンリアクションを正確に評価するインビトロ試験系は存在しない。マウスやラットなどの実験動物を用いた系は、コストや簡便さの点で有用であるものの、ヒトと比較した場合に大きな種差が存在する。このため、抗体医薬TGN1412の治験で起こったような予期せぬ副作用が問題となっている。さらにインフュージョンリアクションを評価する場合には、治療および予防に用いる薬物の有無・投与量、人種差および環境因子による影響が無視できないことが予想される。インフュージョンリアクションのリスク因子を明らかにすることで、副作用予防となることが期待される。さらに、インフュージョンリアクション評価系を開発することによって、リツキシマブを含む抗体医薬を最初にヒトへ投与する臨床試験前に行う「前臨床試験」に応用可能であることが期待される。臨床検体は、琉球大学医学部附属病院、名古屋大学医学部附属病院、名古屋市立大学病院から収集している。症例数は当初計画通りにおおむね順調に収集されている。

本研究では、抗体医薬投与直後に発現する副作用を未然に防ぐ手段を確立するために、薬剤投与直後に副作用を発現した患者の遺伝子多型を解析することによりインフュージョンリアクションリスク因子を明らかにし、ハイリスク患者を予測可能な評価系の確立を最終的な目的とする。「研究実施計画」インフュージョンリアクションの発症原因を、遺伝子多型について、薬理遺伝学的・薬物動態学的手法を駆使することによって明らかにする。【研究の具体的内容】インフュージョンリアクションは、CD20陽性のB細胞性非ホジキンリンパ腫などの治療薬であるリツキシマブによって誘発される重要な副作用である。リツキシマブ誘発性インフュージョンリアクションを発症した患者のゲノムDNAサンプルを用いたケース-コントロール関連解析を行い、その発症リスクと関連する遺伝的要因を明らかにした。【意義】現在解明されていないFcRn遺伝的多型の影響などのリスク因子を明らかにしたことで、リツキシマブ誘発性インフュージョンリアクションの予防および有効性の個人差を考慮した最適な使用が可能となることが期待される。【重要性等】リツキサンによる本研究を抗体医薬に一般化し、抗体医薬を最初にヒトへ投与する臨床試験前に行う「前臨床試験」に応用可能であることが期待される。臨床検体は、琉球大学医学部附属病院、名古屋大学医学部附属病院、名古屋市立大学病院からの収集を継続するが、症例数が当初計画通りに集まらないことが想定されてきている。今後は、上記3施設に加えて、琉球大学医学部附属病院の関連病院を中心に倫理審査委員会の承認の上で症例を収集することも検討する。【今後の推進方策】インフュージョンリアクション発症患者末梢血収集が重要であるため、研究分担者である名古屋市立大学の松永、名古屋大学医学部附属病院の安藤、琉球大学医学部附属病院の益崎・中村が所属する病院の患者から倫理審査委員会の承認事項に基づき収集を継続する。連携研究者について、理化学研究所の莚田が遺伝子解析を担当し、名古屋市立大学医学部附属病院の飯田が、インフュージョンリアクション発症患者および発症していない患者血液の収集およびCTCAEに従った副作用グレードの判定を行う。当該助成金が生じた状況平成28年度に、リツキサン投与患者の血液を採取し、一定数量が集まった段階で遺伝子解析する計画であったため、未使用額が生じた。臨床サンプルの収集は、患者治療の動向に左右されることから、予測が困難である。2017年度に計画していた臨床サンプル等が当初の予想よりも回収・調製・輸送量が少なかった。2018年度には、この不足分を補うように計画している。翌年度分として請求した助成金と合わせた使用計画についてリツキサン投与患者の血液のゲノム抽出と遺伝子解析を次年度に行うこととし、未使用額はその経費に充てることとしたい。
新規タンパク性アジュバントの開発

Myeloid-related protein 14(MRP14)は好中球やマクロファージ(MΦ)などに発現するタンパク質である。本研究では、MRP14の免疫活性化能やアジュバント能について検討した。大腸菌組換え体として作製したMRP14はin vitroにおいて強いMΦ活性化を示し、その活性にはTLRの関与が示唆された。また、インフルエンザワクチンとともにマウスに接種することにより、抗体産生を増強することが明らかとなった。以上のことから、MRP14は新規タンパク性アジュバントとして有用であることが示唆された。本年度計画の一つが、大腸菌でのMRP14産生条件の検討である。これまで、6xHisタグ融合タンパク発現ベクター(pET28a)を用いてMRP14の作製を行っており、純度の高いタンパクを得ていた。本年度はタグなしMRP14の作製を目標として、切断・精製系が確立しているGST融合タンパク(pGEX-6P)として発現した後に、PreScission proteaseによる切断・精製を試みた。しかしながら、高い発現量ならびに精製度は得られず、他のシステムが必要であると考えられた。現状では、Hisタグ系において1Lあたり70 mgの精製MRP14を達成できたことから、当面はこのシステムを維持することが妥当であると考えられた。並行して、MRP14の構造活性相関解析のため、立体構造に基づきN末端側とC末端側の二つのEF handドメインを組換え体として作製しており、次年度にマクロファージ系株化細胞を用いた解析を行う予定である。それとともに、本年度はin vivoにおけるアジュバント活性解析の第一歩として、インフルエンザワクチンモデルを用いてマウスを用いた解析を行った。ワクチン単回投与モデルにおいて、ワクチン抗原単独群と比べてMRP14 10 μg追加群ならびに50 μg追加群では高い抗体価が得られた。MRP14のアジュバント効果はワクチン低用量の時により顕著であり、MRP14 10 μgにおいても単独群と比較して3倍の抗体価上昇が確認された。本年度計画の一つは、MRP14の構造活性相関解析のため、立体構造に基づきN末端側とC末端側の二つのEF handドメインを組換え体として作製することであった。そこで、まずこれら2つのドメインをコードする遺伝子をpET-28aベクターにクローニングした。次に、これらベクターを大腸菌(Rosetta2)に導入してHis-tagタンパク質としての産生を試みたところ、発現量が非常に低くNi-NTAでの精製が困難であった。マクロファージ活性化能や動物におけるアジュバント能を試験するには、LPSなど大腸菌由来の成分が混入しないよう高い精製度が求められるため、様々な発現・精製条件を検討したが研究期間中に達成することができなかった。MRP14はその高い免疫活性化能にもかかわらずこれまで研究があまり行われていないが、本研究のようにdeletion mutantsの作製が困難であることが一因とも考えられる。昨年度までの研究からMRP14は生体内でMRP14陽性マクロファージの集簇を誘導することが明らかにされていた。このことから、MRP14による免疫活性化には集簇マクロファージによるMRP14の分泌というpositive feedbackが関与することが考えられる。このメカニズムの一端を明らかにするためMRP14ノックアウトマウスの作製を行い、MRP14のアジュバント効果が内因性MRP14に依存するかについて検討を行うことにした。CRISPR/Cas9システムを用いてMRP14ノックアウトマウスの作製に成功したが、繁殖に想定以上の時間を要したため、MRP14の投与実験は完了していない(2016年5月以降に必要数が確保できる見通し)。本年度目標の一つであるタグなしMRP14の作製についてはさまざまな試行をおこなったものの、高い発現量と純度を達成することができなかった。その結果、プロジェクトの進行が遅れてしまい、結果として本目標を断念せざるを得なかった。しかしながら、この項目は将来的な製品開発を目指したものであり、基礎研究を行う上での重要性は低いため、研究全体に与える影響は小さいと考えられる。実際には、Hisタグタンパクとしては、非常に高い発現量と純度を達成できており、コスト的にも問題の無いタンパク質アジュバントとしての可能性は大きく見出された。当初計画では、本年度はin vitro系を用いたMRP14による抗原提示細胞活性化メカニズムの解明を行う予定であった。しかし、deletion mutantsの作製を計画に追加したため、本年度はin vitro解析を後にまわし、次年度計画であったin vivoにおけるアジュバント活性解析を先行し、10 μgという低用量でも活性が見られるといった良好な結果が得られた。このように、当初計画からの変更点がいくつかあったが、研究全体としてはおおむね順調に進展していると言える。

免疫学次年度は、従来の計画通りin vivoでのアジュバント活性評価ならびにin vitroにおける抗原提示細胞活性化メカニズムの解明を行う。本年度は近年アジュバントの重要性が話題となっているインフルエンザワクチンモデルを導入することによってMRP14の有用性を明らかにしてきたが、次年度は当初の計画通り、細胞性免疫がその防御に重要であるLeishmania major原虫感染を用いて評価を行う。また、in vitro系においてはマウスマクロファージ株化細胞Raw264.7を用いて、MRP14の詳細な性状解析を行う。現在作製中のdeletion mutantsを用いてMRP14の構造活性相関解析を行うとともに、TLRシグナリングを中心とした活性化シグナルについて解析を行う。また、本アジュバントの幅広い動物への応用性を検討するため、当初計画通り対象動物をイヌ・ネコ・ウシ・ブタとして、末梢血由来単核細胞を用いて、TNF-αの産生を指標とした活性化能試験を行う。前述のとおり、本年度は当初計画を変更してマウスを用いたin vivo評価を先行させて、in vitro解析を次年度に行うこととした。in vitro解析には、複数種の動物それぞれについてサイトカイン定量キットが必要であり経費を必要とする。このように本年度の計画変更が当初見積りよりも執行額が少なかった理由である。研究計画に変更はあったが、単に項目の順番変更であり本年度に研究を実行する予定である。そのため、前述のとおり未執行の経費については次年度に行うin vitro解析に使用する。
ドメインスワッピングを利用したタンパク質の超分子化技術の開発と機能化

ウマcyt cを高タンパク質濃度で酸性モルテングロビュール状態から中性状態へフォールディングさせるとドメインスワップした多量体が形成すること、cyt cのヘム軸配位子であるMet80は2量体の安定性にはほとんど影響を与えないことを明らかにした。好熱菌cyt c552では、ヒンジループ変異体に2種類の2量体が存在すること、大腸菌高発現系でもドメインスワッピングが起こることが示された。ドメインスワップした2量体1つと単量体2つから構成される紅色硫黄細菌cyt c′の4量体を構築した。ドメインスワッピングを利用して異なる2つのヘム活性部位を有する人工ミオグロビン2量体の構築にも成功した。ウマシトクロムc(cyt c)はエタノールで処理すると、C末端領域のαへリックスを分子間で交換してドメインスワッピングする。本研究では、高イオン濃度下、ウマcyt cを高タンパク質濃度で酸性モルテングロビュール状態から中性状態へフォールディングさせると、多量体が形成することを見出した。得られた2量体は、C末端αヘリックスをプロトマー間で交換し、これまでに報告した2量体と同じドメインスワップ構造を有していた。125 mMClO4ーを含む酸性溶液中のcyt cモルテングロビュール状態では、cyt c分子の約25%がお互いに相互作用し、凝集していることがX線小角散乱測定により示唆された。一方、cyt cを125 mMClO4ーを含む酸性モルテングロビュール状態から中性状態へフォールディングさせると、cyt c分子の約11%がドメインスワップ2量体として得られた。これらの結果は、cyt cのモルテングロビュール状態での凝集体が一定の割合でドメインスワップ多量体に折れ畳まることを示しており、ドメインスワップした多量体を形成するための相互作用はモルテングロビュール状態で既に存在することが示唆された。ミオグロビン(Mb)がアルコール添加により分子間で同じ構造領域をドメインスワッピングして二量体を形成することを利用し、Mbの分子表面を精密設計することにより、異なる2つのヘム活性部位を有する人工Mb二量体を作製することに初めて成功した。さらに、Mb 2量体の一酸化炭素結合挙動を明らかにした。Mbの単量体と2量体で、活性部位構造が類似していても、タンパク質構造の変化により一酸化炭素の結合特性が異なることが判明した。研究代表者らはこれまでに、好熱性水素細菌由来シトクロム(cyt) c552がエタンール添加、凍結乾燥、再溶解の操作により多量体を形成し、2量体はドメインスワッピングしていることを報告したが、3量体以上の高次多量体の形成量はウマcyt cに比べて少なかった。本研究では、cyt c552の高次多量体形成量が少ない原因が、cyt c552のヒンジループが短く、プロトマー間で立体障害が生じるためと推測し、ヒンジループ中のAla18とLys19の間にグリシン残基3つを挿入することによりヒンジループを伸長させた変異体(insG3変異体)を作製した。insG3変異体に対して野生型と同様のエタノール処理を行ったところ、高次多量体の形成量が増大した。さらに、insG3変異体には2種類の2量体が存在し、主成分の2量体ではN末端領域、副成分の2量体ではC末端領域がそれぞれプロトマー間でドメインスワッピングしていることを明らかにした。表面の疎水性を減らしたinsG3/W57K変異体を用いて多量体を作製し、透過型電子顕微鏡で観測したところ、直径7-10 nmの環状構造の像が得られた。Cyt c552を大腸菌内で発現させたところ、ドメインスワッピングによりN末端領域のαヘリックスを交換した2量体が得られ、生体内でもドメインスワッピングが起こることが示された。また、野生型cyt c552と安定性を低下させた4種類の変異型cyt c552について大腸菌内で形成される多量体量を比較したところ、タンパク質の安定性が低下するほど高次多量体の形成量が減少することが明らかとなった。また、4ヘリックスバンドル構造を有するcytcb562がドメインスワッピングにより2量体を形成することも明らかにした。Cyt c552のドメインスワッピングには、N末端領域を交換する場合とC末端領域を交換する場合の2種類が存在することを明らかにし、大腸菌内でcyt c552がドメインスワッピングすることも示した。さらに、cyt cb562がドメインスワッピングにより2量体を形成することを明らかにした。これらの研究成果をそれぞれ学術論文に報告した。ウマシトクロム(cyt) cのドメインスワップ2量体および3量体では、メチオニン(Met)80がヘム鉄から解離する。そこで、cyt cのドメインスワッピングにおけるMet80のヘム鉄配位の役割を調べるため、Met80をアラニンに置換したヒトM80A cyt cを作製した。M80A cyt cの単量体および2量体は野生型cyt cの単量体および2量体と類似した2次構造を有することがCDスペクトルから示唆された。M80A cyt c 2量体の示差走査熱量曲線には、野生型cyt c 2量体と同様、単量体への解離による負のピークが観測された。M80A cyt c 2量体の解離温度は61°Cで野生型cyt c 2量体と同じ温度であったが、エンタルピー変化はー14