hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
精神科病院における社会的入院患者数減少に向けた退院支援評価指標の開発と実証

26施設に勤務する看護師1,277名を対象者として実施した無記名自記式質問紙調査)の結果から構築した「退院支援技術項目」に対する妥当性と有用性にフォーカスを当てたグループインタビュー(調査3...調査1において協力を得られた同じメンバーを対象者として90分実施)の結果を分析し、「退院支援評価指標」の構築に向けて検討した。加えて、この2年間に取り組んできた研究成果の一部を、平成24年10月2426日、山口市において開催された「第71回日本公衆衛生学会」において学会発表した。その際、精神科看護師だけではなく、他職種の参加者との意見交換や情報交換を行い、多くの示唆を得ることができた。今年度予定していたフォーカスグループインタビュー(2回開催)の実施にあたり、研究メンバーと対象者の時間調整が難しく、予定通りの日程が確保できなくなった。そのために、2回のフォーカスグループインタビューは実施できたが、その後予定していた調査の計画が遅れてしまった。24年度が最終年度であるため、記入しない。次年度は研究最終年にあたるため、当初予定していた精神科看護の5年以上のキャリアを持つ看護師を対象者としてのデルファイ法による「退院支援技術項目」の検証調査を取りやめることにした。その対応として、23年度に実施したフォーカスグループインタビューの分析結果を勘案し、既に構築した「退院支援技術項目」を再検討し、全国規模の量的調査にむけての準備を進めることにした。
音声の耐雑音性を生みだす聴覚特性の研究

8言語からなる多数の文音声サンプルを多変量解析の手法を用いて分析することにより,三つの因子を抽出し,音声における音の強さの変化が,言語によらず,わずか四つの周波数帯域における音の強さの変化で充分,表されることを明らかにした。これらの帯域における音の強さの情報だけを用いた合成音声を用いた実験から,帯域間のパワー変化の時間的順序が,音声知覚のうえで大きな役割を果たしていることなどが分かった。音声は一般に極めて頑健で,耐雑音性が高く,母語話者であれば極めて信号対雑音比の低い状態であっても,音声を聞き取ることができる。これは,ヒトの脳がわずかな手がかりと,それまでに学習した知識とをうまく利用し,能動的に知覚的世界を構築しているからこそ可能となることであると考えられる。本研究課題では,このような音声知覚に関する脳の仕組みについて,知覚心理学および聴覚生理学の立場から研究を行うことを目的としている。特に,以下の三つのテーマについて,研究を行う。(1)音声の知覚手がかり,特に音節端点の検出手がかりを,音声の音響分析,および雑音駆動音声を用いた知覚実験を通じて明らかにする。(2)高齢者および若年健聴者の聴力測定を通じて,聴力,背景雑音,部屋の残響特性と音声の聞き取りとの関係にっいて明らかにしていく。(3)聴覚の特性をうまく利用することにより,若年健聴者にとっても,高齢難聴者にとっても聴きとりやすく違和感の少ない音声強調処理技術の開発を行う。高齢者の聴力特性を規格化するための測定方法について,検討,調査を行い,高周波聴力の測定結果の再現性を調べる予備実験を行った。また,イギリス英語,日本語,フランス語,ドイツ語の音声データベースを用いて,自然な連続音声に共通する特徴を明らかにした。これらの音声を臨界帯域フィルターに通し,音声のパワー変化をフィルター出力ごとに計算して,チャンネル間の相関係数行列を求め,因子分析を行った。その結果,これら大きく異なる音声言語の間で共通する三つの因子および四つの周波数帯域が存在することが明らかになった。見いだされた周波数帯域は,音声言語,発話者の性別による境界周波数の違いが,たかだか1.5臨界帯域幅にしかならず,極めて共通性の高いものであった。このことは,音声言語を理解するためにヒトが用いている周波数帯域が,これらの音声言語の間で共通するものであることを示唆している。この成果を基に,イギリス英語の音素ラベル付き音声データベースを用いて,音素ごとの時間的中央点における各因子の因子得点がどのように分布するのかを調べたところ,音節の核となる母音と,それ以外の子音とがそれぞれ異なる因子の軸に沿って,きれいに分布する様子が見られた。それだけではなく,音節の開始から終了に至る音素変化の経路上に,従来の音声学の理論ではうまく扱うことができなかった/s/を含めて,母音,半母音,子音が音素の「ソノリティー」にしたがって,矛盾なく分布していることが確認された。今年度は「聴覚が音節端点を検出する仕組みの研究」に特に重点を置いて研究を進めた。具体的成果としては,英独仏日語に加えて,北京語,広東語,スペイン語についても分析を行い,従来得られた結果,すなわち,臨界帯域フィルターを通した音声のパワー変化について因子分析を行うことにより,言語間で共通する3因子が抽出され,この3因子によって音声を4帯域に分割できることを,もう一つのラテン語系言語であるスペイン語,音調言語である中国語も含めて確認することができた。このことには,従来の結果をさらに強固なものにしただけではなく,音調言語においても,非音調言語と同じ周波数帯域を用いて,音節の知覚に必要なパワー変化の情報が伝送されていることを示した意義がある。さらに雑音駆動音声を用いた知覚実験により,これらの帯域におけるパワー変化情報のうち,下から2番目の帯域の情報が,特に帯域周波数に対する依存性が強く,別の帯域のパワー変化と混合したり,交換することによって,音声全体の明瞭性が大幅に低下し,ほとんど聞き取りが不可能になることを見いだすことができた。このことから,音声のパワー変化の情報は,帯域によって周波数依存性が異なることが明らかとなり,今後,聴覚が音節端点を検出する仕組みについて考え,実験を行ううえで,必要不可欠な手がかりが与えられたことになる。また,若年健聴者において,残響による音声の聞き取りの低下がどのように生ずるのかを,小学校の教室における授業の聞き取りという実環境において調査し,予備的な結果を得た。音声の知覚手がかりを明らかにするため,昨年度までに得られた音声のパワー変化に対して因子分析を行った研究から得られた4周波数帯域を用いて,日本語101単音節を分析合成して雑音駆動音声を作成し,4周波数帯城のうち一つを除去することによってどのような異聴が生ずるのかを調べた。その結果,下の3周波数帯域は,それぞれ除去されることによって異なる母音への異聴を生じさせること,一番上の周波数帯域の除去によって子音の異聴が増加すること,また,一番下の周波数帯域の除去によって有声子音から無声子音への異聴が顕著に見られることが明らかとなった。

これにより,この4周波数帯域におけるパワー変化が,音声の知覚上,重要な手がかりを提供していることが明らかとなった。さらに,聴力と聞き取りやすい音声との関係を調べるため,ノイズと残響がある実環境を模擬した実験室において,健聴者と高齢者がともに聞き取りやすいテレビ放送音源の信号処理方法について検討した。その結果,健聴者では1000-4000Hzの周波数帯域を増幅し,500Hz以下の周波数帯域を圧縮することによって,聞き取りやすさが改善することがわかった。しかし,高齢者では聴力レベルや補充現象の有無によって,処理方法に対する聞き取りやすさの評価に相違が認められ,最適な処理方法を決定できなかった。また,本研究計画で開発を進めている実時間音声強調方式のパラメーターを最適化する研究を行った。その結果,このシステムにおいて最適な子音強調量は,子音によって異なることが明らかとなった。臨界帯域フィルターを通した多言語音声のパワー変化を因子分析した結果,得られた因子をもとに,音声を4周波数帯域に分割することができる。この4周波数帯域におけるパワー変化が,音声知覚において果たす役割を明らかにするため,日本語単音節から20帯域(臨界帯域)および4帯域の雑音駆動音声を合成し,さらに4帯域の雑音駆動音声からいずれか一つの帯域を除去した音声を合成し,これらに原音声(男女各1名)を呈示する条件を加えて聴取実験を行った。単音節の同定結果(異聴表)から,子音の有声性,調音方法,調音位置,および母音の種類について結果をまとめ,伝達情報量の計算を行った。その結果,4帯域のうち,最も低い周波数帯域を除去することにより,子音の有声性,調音方法,調音位置のいずれにおいても顕著に伝達情報量が低下した。特に,子音の有声性に対する影響が甚だしかった。このことは,有声子音と無声子音の区別は,声帯波の出現する時点と破裂の出現する時点との時間差(有声開始時間)が手がかりとは限らず,最も低い周波数帯域とそれ以外の帯域との間で生ずる立ち上がりの時間差が手がかりとなり得ることを示している。調音方法や調音位置の知覚に関しても,破裂等の物理的手がかりが存在する高い周波数帯域よりも,低い周波数帯域と他の周波数帯域との相対的な時間的関係が重要であることを示していると考えられる。下から二番目の帯域を除去することにより,母音の種類の同定に関する伝達情報量が顕著に低下した。このことは下から二番目の周波数帯域とその上下の周波数帯域との間で生ずるパワーの時間的変化が母音の知覚にとって重要であることを示している。本年度はこれ以外にも,視覚刺激の系列再生課題に無関連な音声刺激(母語および非母語)がおよぼす影響,準実時間子音強調システムの実用化,雑音と残響および発話速度が音声聴取能力に及ぼす影響に関する研究などを実施した。これまでに行った,多言語音声を臨界帯域フィルターに通し,各フィルター出力のパワー変化を求め,因子分析を行う研究により,英独仏日中西語に共通する3因子,4帯域が導き出された。この4帯域を用いて,雑音駆動音声(音源を雑音に置き換えた合成音声)を合成し,各帯域の音声知覚における役割を調べる実験を行った。男性話者が発話した日本語単音節101音節を用いて,20帯域(臨界帯域)および4帯域の雑音駆動音声を合成した。
HTLV-I母児感染防止における抗原抗体反応の解析

HTLV-I母児感染において抗HTLV-I抗体がどの様に機能するのかについて、抗HTLV-I抗体陽性血清よりHTLV-I抗原と推定される合成蛋白を用い抗体分画を採取し、その特異的抗体による感染阻止効果についてin vitroの系により検討した。さらにこの実験系において、HTLV-Iの感染源細胞として樹立された細胞を用いた場合とHTLV-Iキャリアより分離される末梢血単核球を用いた場合との感染の差異によりin vitroにおける抗体の感染阻止作用を解析した。HTLV-I合成蛋白env gp46^<175-199>,gp46^<242-257>,p19^<100-130>それぞれにより採取した抗体分画を用いて検討した成績では、抗env gp46^<175-199>抗体、抗env gp46^<242-257>抗体には感染中和活性が存在していたが、抗p19^<100-130>抗体にはその作用は認めがたかった。しかし、HTLV-I抗原の発現抑制効果の成績は全く逆転した結果であったことから、この抗p19^<100-130>抗体のin vivoにおける阻止作用の役割について検討を進めた。その結果、抗p19^<100-130>抗体はHTLV-I感染細胞におけるHTLV-I蛋白の産生を抑制することにより感染を阻止することが推測された。この作用を最も強く持つ抗p19^<100-130>抗体について検討した結果、HTLV-I gag p19^<115-123>がヒトにおけるgag蛋白としての抗原部位であることが判明するとともに、この部位に対する抗体が先に述べた作用を有することが証明された。今後、この抗体の大量採取とin vivoにおける感染阻止実験によりその効果を確認する必要があると考えられる。HTLVーI母児感染の防止策について検討してきた成績より、抗原陽性で抗体陰性であった児について、長期の追跡を行った結果2才において抗原陽性であった児は68才においても抗原陽性であり、HTLVーIの消失は認めなかった。しかし、2才で抗原陽性抗体陰性の児においては、抗体陽性となった児はなく、また抗体陽性であった児については抗体の陰性化は認めなかった。このことより、幼児期におけるHTLVーI抗原と抗体の解離を認めた児の成長による解離の解消は認められず、この現象はさらに長年月持続すると考えられた。一方、成人女性において複数回HTVーI抗体の検索を受けた症例より、前回の検査時には陰性であったものが次回の検査で陽性になる割合は0.5%(10/2003)で、複数回検査を受けた例の中でしめる割合は8%(10/122)であった。この10例について検討すると、母親のみが陽性であった例は6例であり、HTLVーIの感染形態より考えこのような6例が、母児感染により幼児期に感染しても抗体陰性のまま推移し何らかの機転により抗体陽性に成ったものと思われる。以上のHTLVーIキャリア-より出生した児の追跡調査結果と成人における抗体陽転例の存在より、このような症例における感染源としての意味付けを明確にすることが重要であることが判明した。HTLV-I抗体陽性血清より、HTLV-I抗原と推定されるepitopeに相当する合成ペプチドを合成し、Affinity columnを作成した。このcolumnにより採取したHTLV-I抗体については、その特異性については採取に用いた合成ペプチドを抗原としたBLISAで、抗体価についてはMT-1を抗原としたIF法により測定し陽性と認められる最高希釈倍数をもってその抗体価とした。この抗体採取に用いたHTLV-I抗原

epitopeは、env gp46^<175-199>,gp46^<242-257>,gag p19^<100-130>の3種であるが、それぞれにより採取された抗体は他の抗原epitpeとは全く反応せず、Western blottingによる検討では、当該抗原が泳動されているバンドとのみ反応した。また、p19^<100-130>に対する抗体を採取した場合では、採取後の血清のWestern blottingによる検討において、p19バンドは全く検出出来ず、抗p19抗体は単一の抗体(mono-clonal)なものであることが判明した。上記の如く採取した各分画を用いて、synchitium cell formationの抑制と抗原発現の抑制効果について検討した。synchitium cell formationの抑制においては、抗env gp46^<175-199>抗体とgp46^<242-257>抗体にその活性が認められたが、抗gag p19^<100-130>抗体にはその作用は全く無かった(抗env gp46^<175-199>抗体では抗体価64倍以上で100%抑制が、gp46^<242-257>抗体では抗体価64倍で46%抑制)。一方、培養系を用いた抗原発現抑制効果について検討した成績では、抗env gp46^<175-199>抗体とgp46^<242-257>抗体にはどのような抗体価であってもその作用は全く認められなかったが、抗gag p19^<100-130>抗体を添加して培養した場合には、抗体価20倍以上では抗原の発現は完全に抑制された。以上の成績より、今後抗gag p19^<100-130>抗体のin vitroにおけるHTLV-Iキャリアー末梢血リンパ球よりの感染阻止作用について検討を進めたい。HTLV-I母児感染において抗HTLV-I抗体がどの様に機能するのかについて、抗HTLV-I抗体陽性血清よりHTLV-I抗原と推定される合成蛋白を用い抗体分画を採取し、その特異的抗体による感染阻止効果についてin vitroの系により検討した。さらにこの実験系において、HTLV-Iの感染源細胞として樹立された細胞を用いた場合とHTLV-Iキャリアより分離される末梢血単核球を用いた場合との感染の差異によりin vitroにおける抗体の感染阻止作用を解析した。HTLV-I合成蛋白env gp46^<175-199>,gp46^<242-257>,p19^<100-130>それぞれにより採取した抗体分画を用いて検討した成績では、抗env gp46^<175-199>抗体、抗env gp46^<242-257>抗体には感染中和活性が存在していたが、抗体p19^<100-130>抗体にはその作用は認めがたかった。しかし、HTLV-I抗原の発現抑制効果の成績は全く逆転した結果であったことから、この抗p19^<100-130>抗体のin vivoにおける阻止作用の役割について検討を進めた。その結果、抗p19^<100-130>抗体はHTLV-I感染細胞におけるHTLV-I蛋白の産生を抑制することにより感染を阻止することが推測された。この作用を最も強く持つ抗p19^<100-130>
新遺伝子RFTの脳腫瘍悪性化機構の解明並びに分子標的としての治療法と診断法の開発

(目的)我々は過去にFGF-2のpromotor領域に結合する転写因子としてRFT-Aを発見した。加えて、神経膠腫細胞株U87-MGはRFT-Aを欠失しており、RFT-Aの高発現でapoptosisを招くことを報告した(参考資料参照)。しかし、FGF-2を添加することによりこのapoptosisが抑制できるわけではなく、RFT-Aの生物学的機能が他に存在することが示唆された。そこで我々はRFT-Aを発現するretrovirusを作成し、RFT-Aのその他の生物学的機能を検討した。(方法)RFT-Aを発現するretrovirusをU-87MGに導入し、それにより発現が誘導、または抑制される遺伝子、蛋白、細胞周期変化をwestern blot analysis、定量PCR、FACSで解析した。(結果)U-87MGはretrovirusによるRFT-Aの強制発現により遺伝子導入48時間後からapoptosisを来す細胞の出現が認められた。さらに、western blot analysisではG1-S期進行制御分子の発現量の変化が認められた。(考察)これらのことから、RFT-AはFGF-2の転写だけでなく細胞周期に関与する因子に影響していると考えられる。神経膠腫において、RFT-Aの発現が低下することによりG1-S期進行制御分子の発現異常が生じ、細胞周期の異常を来している可能性が示唆された。塩基性線維芽細胞増殖因子(以下FGF-2と略す)は、正常の発生分化また創傷治癒において厳格に発現調節を受けているが,一方,脳腫瘍のみならず,胃癌、肝細胞癌、白血病など様々な悪性腫瘍において高発現し,オートクリン或いはパラクリン機構を介して悪性化に関与しており,その発現調節のメカニズムを、FGF-2のプロモーターレベルで解明することが重要になってきている。我々が,FGF-2の転写に腫瘍抑制遺伝子P53が関与することを発表して以降、R.Morrison,M.Stachowiak,E.R.Levinらが相次いでFGF-2プロモーターの解析データーを発表している。こうした状況の中,我々は、FGF-2転写調節因子RFTのクローニングに成功した。このRFT遺伝子はサイレンサー活性を持つ転写因子で,脳腫瘍細胞に導入するとアポトーシスを誘導することがわかっている。この脳腫瘍抑制遺伝子とでも言うべき遺伝子は,脳腫瘍において変異型が多く発現しており,FGF-2の発現をderegulateしている。現在までにポリクローナル抗体を作成し発現を検討しているが,本抗体が変異型をも認識するためRNAレベルでの検討が必要となる。そこでreal-time PCRを用いて各isoformの発現量を定量しようとしており、現在その条件設定が終了したところである。このシステムではわずかのRNA量で各isoformの発現量が定量化されるので、現在細胞株での発現量を測定するとともに、手術摘出標本より抽出したRNAをもちいて悪性度との相関等検討している。我々が,FGF-2の転写に腫瘍抑制遺伝子P53が関与することを発表して以降、R. Morrison, M. Stachowiak, E.. R. Levinらが相次いでFGF-2プロモーターの解析データーを発表している。そこで本年度はreal-time PCRを用いて各isoformの発現量を定量しようとしており、WA fromとA' formの区別に成功した。現在B formの区別を行うべく条件設定を施行している。

このシステムではわずかのRNA量で各isoformの発現量が定量化されるので、普及させることが可能である。脳腫瘍細胞株での発現量を測定するとWA fromは存在しないことが定量化され、手術摘出標本より抽出したRNAをもちいて悪性度との相関等検討している。腎癌と正常腎においては、WA fromとA' formの発現比率に変化はなく、このことはRFT遺伝子が脳腫瘍の悪性化において重要であることを示唆している。方法・結果:RFT遺伝子にはdifferential splicingによりWA-form, A'form, B formの三種類が存在している。しかしながら、FGF-2の転写を抑制するのはWA formのみであり、あんらかのシグナルによりsplicingが制御され、脳腫瘍においてFGF-2を高発現しているものと推測される。そこで、Real-time PCRを用いたhybriprobe法により各isoformの定量化が可能となるシステムを作成した。また、腫瘍細胞において各isoformを定量した。脳腫瘍細胞株ではWA:A':B=0:3:1、非脳腫瘍細胞ではWA:A':B=1:3:1であった。また、正常人ならびにU251MGによりRFT遺伝子のゲノムをクローニングし、differential splicingの有無について検討した。結論:脳腫瘍においてRFT遺伝子はdifferential splicingによりWA formの発現が抑制されており、FGF-2の無秩序な高発現をもたらし悪性化に関与している可能性が示唆された。そのメカニズムをさらに解明することにより、新たな治療法の開発につながるものと考える。
Wnt・Rhoシグナルを分子標的とした骨髄腫の間質細胞接着依存性抗癌剤耐性の克服

近年、血液腫瘍に対する化学療法や分子標的療法は目覚ましい進歩をとげたが、骨髄腫や難治性白血病などでは、腫瘍細胞を骨髄から完全に排除することが出来ず、治癒を得ることは困難である。その理由として、骨髄間質と腫瘍細胞の相互作用で惹起される薬剤耐性の関与が想定されているが、その分子機構は明らかとなっていない。本研究ではWntが細胞接着や増殖を制御することに着目し、血液腫瘍におけるWntの発現と抗癌剤耐性への関与を解析した。各種細胞株でのWntの発現を検討した結果、骨髄腫細胞株においてWnt3の発現が検出され、その発現量は骨髄腫細胞のstroma細胞への接着性と相関していた。高接着性の骨髄腫細胞株の共培養でDoxorubicnに対する薬剤耐性は、stroma細胞非存在下に比し有意に上昇したが、抗integrinβ1、Wnt inhibitorあるいはWnt3 siRNAを用いることによって解除された。これらの結果より、骨髄腫において、Wnt3経路はintegrinβ1依存性薬剤耐性を惹起するために重要な役割をしており、新規治療の分子標的になる可能性が示唆された。多発性骨髄腫に対する標準的化学療法は一時的には奏功することが多いものの、腫瘍細胞を完全に排除することが出来ず、治癒を得ることは極めて困難である。その理由として、骨髄stroma細胞と腫瘍細胞の相互作用によって惹起されるde novoの抗癌剤耐性の関与が想定されているが(Cell adhesion mediated drug resistance, CAM-DR)、その分子機構は完全には明らかとされていない。本研究ではWntが細胞接着や増殖を制御する因子であることに着目し、血液腫瘍におけるWntの発現と抗癌剤耐性への関与を解析した。まず、各種細胞株でのWntの発現と、ストローマ細胞への接着性を比較解析した後に、Doxorubicn処理後のstroma細胞存在・非存在下における生細胞数を算定することで、薬剤耐性を検討した。その結果、今回検討した4種の骨髄腫細胞株すべてにおいてWnt3の発現が検出され、その発現量は骨髄腫細胞のstroma細胞への接着性と相関していた。高接着性・骨髄腫細胞株のうちの1つであるARH-77とstroma細胞の共培養でDoxorubicinに対する薬剤耐性は、stroma非存在下に比し有意に上昇したが、抗integrinβ1抗体あるいはWntinhibitorであるsFRP-1によって約70%まで解除されたものの、抗integrinα4抗体で解除されなかった。さらにWntシグナルの下流を、Rho kinase inhibitor Y27632の添加により遮断すると、CAM-DRはstroma非存在下のレベルまで解除された。これらの結果より、骨髄腫において、Wnt3/RhoA経路はintegrinβ1依存性CAM-DRを惹起するために不可欠な役割をしている可能性が示唆された。今後、どのintegrinα鎖が用いられているか基礎的検討をすすめるとともに、Fasudilなど人体に投与可能なRho kinase inhibitorを用いる他、抗integrinに関する検討を進める予定である。多発性骨髄腫細胞は骨髄から完全に排除することが困難で、治癒を得ることは難しい。その理由として、骨髄stroma細胞と腫瘍細胞の相互作用によって惹起されるCell adhesion mediated drug resistance,CAM-DR)という薬剤耐性機構が想定されている。申請者は昨年度までに、骨髄腫細胞株においては、Wnt-RhoA-ROCKシグナル伝達系を介して、ストローマ細胞への接着性と薬剤耐性が増強されることを見出した。今年度は、Fasudilなどヒトに投与可能なROCK inhibitorや、抗integrinペプチドを用いたin vitroの検討を行うと共にin vivoの骨髄腫動物実験モデルの確立を試みた。その結果、Fasudilの活性型:OH-Fasudil10μMを作用させることで、doxorubicinおよびmelpharanに対するCAM-DRはほぼ完全に解除されることが明らかとなった。また、抗integrin α4,5,6および抗integrin β1抗体を作用させても、骨髄stroma細胞とWnt3高発現細胞株であるKMS5およびARH77との接着性に変化を認めなかった。

ところが、抗RGDペプチドであるGRGDSあるいはcRGDfVで約50%の骨髄腫細胞がストローマ細胞との接着性を失い、さらに、GRGDSとcRGDfVをコンビネーションで用いると、約90%の骨髄腫細胞がストローマ細胞から乖離することが明らかとなった。さらに、GRGDSあるいはcRGDfVペプチド存在下でdoxorubicinに対するCAM-DRをMTTアッセイで解析した結果、著名に薬剤耐性が解除されることが明らかとなった。In vivoでの検討を行う目的で、KMS5細胞をGFP発現レトロウイルスベクターを用いてラベルし、尾静脈から静注投与したところ、骨髄、卵巣および肝に腫瘍浸潤を形成するモデルが確立できた。
アレルギー予防・治療に対するＩｇＡ免疫複合体ワクチンの開発

申請者らは,母乳中には食物アレルゲンが特異的IgAとの免疫複合体として存在していることを発見し,「母乳は本来食物アレルギー予防の天然の飲むワクチンである」との独創的仮説を提唱してきた。本研究ではヒト唾液から調製した天然のIgA免疫複合体および人工的にIgAにオボアルブミンを結合させた仮性免疫複合体をマウスに経口投与し,IgAの免疫複合体が直接の寛容誘導因子としてワクチン作用を持つことを証明した。また,プロバイオティクスによるこの寛容誘導補強効果を明らかにした。申請者らは,母乳中には食物アレルゲンが特異的IgAとの免疫複合体として存在していることを発見し,「母乳は本来食物アレルギー予防の天然の飲むワクチンである」との独創的仮説を立て,これまでにこれを支持する結果を蓄積してきた。本研究ではこの仮説の応用として,動物にアレルゲンとIgAとの免疫複合体を投与し,経口免疫寛容が誘導されるか否かを調べることにより,新たなドラッグデリバリーシステムの構築,アレルギー予防法・治療法の開発を目指している。本年度は昨年の成果に基づき,仮性IgA免疫複合体の投与実験とプロバイオティクの効果について検討した。[結果1]当研究室で確立したマウスモノクローナルIgAに食物アレルゲンとして卵白オボアルブミンを化学的に結合させ仮性免疫複合体を調製した。これをマウスに経口投与したのち,そのマウスにおけるオボアルブミンに対するIgE産生,アレルギー性下痢誘発に対する影響を解析した。仮性複合体投与による両者の抑制傾向はみられたが,統計的に有意な効果を出すに至らなかった。今後条件を整えて再実験したい。[結果2]昨年度選択した,マウス脾臓細胞培養系においてIgA産生を活性化する乳酸菌を母マウスに経口投与した結果,母乳中のIgA免疫複合体が増加し,その母乳を飲んだ仔マウスの母乳による経口免疫寛容が補強された。この結果,雑食性のヒトにおいても母親に対するプロバイオティクス手法により母乳の寛容誘導効果を補強できることが明らかとなった。具体的には,様々な形態のアレルゲン・IgA免疫複合体を調製し,これをマウスに経口投与した後,血清中のアレルゲンに対するIgE産生能の低下から,経口免疫寛容の成立を検討する。また,このときのサイトカインレベルなどからそのメカニズムを明らかにする。計画1.予定通り,ヒト唾液から調製した天然のIgA免疫複合体をマウスに経口投与することにより,マウスに卵白タンパク質に対する経口免疫寛容を誘導できることを明らかにした。計画2.特異的モノクローナルIgAは作製できなかった。このため,既得の非特異的IgAに化学的に抗原を結合させた人工的IgA免疫複合体をマウスに経口投与することにした。計画3.マウスの餌中の卵タンパク質含量を25%まで落とすと,これ以上で見られた経口免疫寛容の誘導が見られなくなることから,プロ・プレバイオティクス手法により,生体内のIgA免疫複合体を増やし,その効果を増強させる実験系を確立できた。大学に於ける職務(学科主任,研究科委員長)に予想以上に時間をとられたため。2013年度は学科主任を外れるため,研究に邁進する予定である。本年度は少し遅れ気味なので,当初予定をクリアするために密度を濃くして研究に邁進する。このため,時間のかかる抗原特異的モノクローナルIgAの作製を中止して,IgA免疫複合体の応用(人工的複合体の投与実験)を先行する。なお,海外のグループから,母マウスを経鼻的にオボアルブミンアレルギーにすると母乳中にオボアルブミンのIgG免疫複合体が分泌されるとの報告が出されている。当研究室には既得のオボムコイド特異的モノクローナルIgGがあるので,これを用いた経口免疫寛容誘導実験を行い,上記の代替として免疫複合体のアレルギー予防・治療への応用範囲の拡大に繋げたい。下記の通り,経費支出に大きな変更はない。繰り越し分に関しては,遅れを取り戻すために研究を濃縮して使用する。研究遂行に必要な分析機器などの研究設備は既にすべて整っており,消耗品費・アルバイト学生のための人件費などが必要である。消耗品費は主に動物およびその餌,食物アレルゲン及び免疫複合体定量のための特定原材料表示用消費者庁認定通知法アレルゲン定量ELISAキット,サイトカイン定量キットの購入,モノクローナル抗体作製のための細胞培養費などに使用する。
エピタクシアル成長させた金属歪超格子の磁性と原子スケール界面構造

遷移金属(TM)と貴金属(NM)とを組み合わせた2元系人工格子および3元系人工格子について,NM層上に成長する様々なTM層の界面構造,成長様式などをRHEEDの連続観察を通して系統的な評価を行い,磁気特性を調べ,両者の関連について考察した.特に,歪みを内包した金属人工格子,′′金属歪超格子′′を作製し,人工格子の界面構造を歪みという点に注目してナノスケールで調べ,磁性との関連を明らかにした.積層順を変えた2種類の[M1/Co/M2](M1,M2=Cu,Au)3元系人工格子の界面構造の研究では,Coに対してAuとCuの原子半径が異なることを利用して,積層順を変えることにより,意図的に界面構造が異なり,内包する歪量が異なる人工格子の作製に成功した.この人工格子の磁気特性の研究では,Cu/Co/Au人工格子はAu/Co/Cu人工格子に比べて垂直磁気異方性が強くなることを明らかにした.この積層順による異方性の違いが内包する歪み量による違いで説明できることを示し,意図的に界面での歪み構造を制御することで,磁気異方性を制御することに成功した.遷移金属(TM)と貴金属(NM)とを組み合わせた2元系人工格子および3元系人工格子について,NM層上に成長する様々なTM層の界面構造,成長様式などをRHEEDの連続観察を通して系統的な評価を行い,磁気特性を調べ,両者の関連について考察した.特に,歪みを内包した金属人工格子,′′金属歪超格子′′を作製し,人工格子の界面構造を歪みという点に注目してナノスケールで調べ,磁性との関連を明らかにした.積層順を変えた2種類の[M1/Co/M2](M1,M2=Cu,Au)3元系人工格子の界面構造の研究では,Coに対してAuとCuの原子半径が異なることを利用して,積層順を変えることにより,意図的に界面構造が異なり,内包する歪量が異なる人工格子の作製に成功した.この人工格子の磁気特性の研究では,Cu/Co/Au人工格子はAu/Co/Cu人工格子に比べて垂直磁気異方性が強くなることを明らかにした.この積層順による異方性の違いが内包する歪み量による違いで説明できることを示し,意図的に界面での歪み構造を制御することで,磁気異方性を制御することに成功した.強磁性元素と非磁性元素とを組合わせて,界面近傍の歪み分布を制御した金属人工格子を作製し,RHEEDおよびHREMを用いて,人工格子の界面構造を歪みという点に注目してナノスケールで調べ,磁性との関連を明らかにすることを目的とした.Cu/Co,Pt/Co,Ta/Gd人工格子を,超高真空スパッタリング装置により基板温度室温にて作製した.人工格子に担当する膜厚の,Cu,Pt,Coを組み合わせた二層膜,それぞれの単層膜もあわせて製作した.Cu/Co人工格子の研究ではFCC,HCP構造を持つ膜をMgO基板上にエピタクシアル成長させ,結晶方位関係,結晶成長モードを明らかにした.FCC構造,HCP構造の人工格子はいずれも反強磁性結合を示し,結合の強さはスペーサーCuの膜厚とFCCかHCPという構造に依存した.Pt/Coの研究では,以前の研究で垂直磁気異方性の発現と界面近傍での歪み分布の様子を明らかにしているが,本研究では,高分解能電子顕微鏡で断面観察した結果,歪みを緩和させるために膜厚と平行方向に周期的に小傾角粒界が発生することが明らかになった.Ta/Gdの研究では,TaをMgO(100),(110)基板上にエピタクシアル成長させることができ,さらにその上にGdをエピタクシアル成長させることができ,方位関係を明らかにし,磁気特性を明らかにした.Ta/Gdの2層膜では,磁化は,水平方向の方が垂直方向に比べ容易であった.磁場が[100]と[110]とでは変わらなかった.磁性金属人工格子の磁気特性は磁性層の界面構造と密接な関係があると考えられ、磁気的性質のメカニズムを明らかにし、特性の向上を図る上で、人工格子の界面補造を詳細に調べることが非常に重要となる。本研究では、MBE法により作製した、遷移金属-貴金属系2元系人工格子[TM/NM][TM/TM](TM=Fe,Co,Ni,Cu,NM=Au,Ag)について、NM層上に成長する様々なTM層の界面構造、成長様式などをRHEEDの連続観察を通して系統的な評価を行い、磁気特性を調べ、両者の関連について考察した。(a)(TM=Fe):Fe/Au系,Fe/Ag系ともにFeはbcc-Fe(110)配向で、3つのドメインを形成した。(b)(TM=Co,Ni):TM/Au系ではTMの格子間隔は積層とともに連続的に減少し、バルク値に漸近したのに対して、TM/Ag系では不速続的にバルク値に変化した。AuとAgの原子半径は、ほぼ同じであり、CoおよびNiに対して約13%の格子のミスマッチが存在する。従って、TM/Au系ではTM層は界面付近で大きく歪み、TM層の積層とともに歪みが緩やかに開放されたのに対して、TM/Ag系においては、TM層内に歪みは生じずに界面付近にミスフィット転位が集中した結果、前述の様な格子間隔変化を示したと考えられる。(c)(TM=Cu) :Cu/Au系ではCuの格子間隔は積層とともに連続的に変化したのに対して、Cu/Ag系ではCu層の格子間隔は不連続的に変化した。

Cu/Au系は全率固溶型であるために界面に混合層が形成され、混合層の組成の変化によって格子間隔が連銃的に変化したと考えられる。他方、Cu/Ag系は2相分離型であるため、混合層が形成されず、不連続的な変化を示したと考えられる。(d)Co/Cu:バルクのCoは室温でhcp構造をとるが、Cu上にエピタクシアル成長させたCoは、非平衡なfcc構造をとることがわかった。
マスキング・パラダイムを用いた視覚反応時間課題における無意識的情報処理

本研究では、先行-後続刺激間隔SOAを変化させることにより、後続刺激による先行刺激のマスキング(無知覚)効果を操作し、そのときの反応時間及び知覚体験の変化からそれらの情報処理過程を検討した。逆向マスキング(メタコントラスト)刺激の制御にはパソコン及びAVタキストを用い、成人被験者にキー押し反応時間課題及び刺激弁別課題を行なわせた。その結果、反応は後続刺激ではなく先行刺激に対して行なわれたことがわかり、また先行刺激の知覚体験は生じていなかったことが認められた。この知覚マスキング効果については多くの先行研究と一致する結果であったが、SOAの変化に対する反応時間と知覚体験の応答は必ずしも連動していないことがわかり、運動反応が知覚体験の結果に基づいて処理実行されるのではなく、並列的あるいはカスケード的に処理されているものと推察された。体性感覚刺激による逆向マスキング実験も実施したが、同様の結果が得られた。すなわち、知覚体験に関しては、先行刺激の刺激強度を感覚閾値、感覚閾値の1.2倍、2倍にすると知覚体験は明らかに異なってくるが、反応時間は知覚体験の程度に連動しなかった。さらに、関連実験として行なった狙準動作による反応時間課題においても同様の結果が認められた。この実験では、視覚刺激のサイズ、輝度コントラスト、呈示位置を操作し、刺激に対する指上げ反応動作課題及びタッチモニター上の刺激に対する狙準動作課題の2つを用いた。実験の結果、指上げ課題と狙準動作課題の反応時間の差分(狙準動作に特殊化された運動準備時間)は刺激サイズや輝度コントラストの違いには影響を受けず、呈示位置の違いのみに影響されることが明らかとなった。以上の結果から、運動準備過程は刺激の知覚体験処理に基づいて生じるのではなく、両者は並列的な処理を受けている可能性が示唆された。脳波データも並行して測定したが、明確な知覚体験処理を裏付けるには至らず、この面からの検討は今後の課題として残された。本研究計画では、先行刺激と後続刺激の刺激強度および時間間隔を変化させることにより、マスキング効果(先行刺激が後続刺激により知覚できなくなる効果)の強弱などを操作し、そのときの反応時間の変化と脳内情報処理の途中経過を事象関連電位によって検討することを目的とした。そのために、パソコンを用いて刺激出力の制御を行い、刺激をタッチモニターに出力し、それに対する反応動作を行なわせる実験システムを構築し、あわせて、同時に脳波の測定も行うこととした。現在、刺激の検出、知覚、反応動作に関する分析をも可能とするシステムを構築中である。しかし、この実験システム構築に際して、短時間の間隔でモニターに視覚刺激を連続呈示することについてはパソコンにおける技術的制約と限界があり、実験条件が比較的限られてしまう。これを補う意味で、視覚刺激の実験と並行して、視覚刺激に代えて電気刺激を用いる体制感覚による実験もできるようにシステムを構築し、一部予備的な実験を実施した。これにより、刺激のマスキングと知覚体験をコントロールすることが視覚刺激よりも容易に行なえることが可能になり、体性感覚刺激による実験も並行して行なうこととした。この予備的な実験の結果、マスクされた先行刺激には知覚体験が生じなくても、反応はその先行刺激への反応となっていることが示された。これはすでに論文にまとめ学術雑誌に投稿し、掲載されることが決まった。これらの新しい展開により、当初の研究目的がさらに効果的に達成できることとなった。

今後は、刺激認知の終了時点の同定として刺激評価系の指標であるP300についても分析し、無意識的な知覚(マスクされる先行刺激)、意識的知覚(自覚的に知覚される後続刺激)、および反応準備過程・反応出力のそれぞれの情報処理の時間関係を明らかにする実験を計画している。本研究では、先行-後続刺激間隔SOAを変化させることにより、後続刺激による先行刺激のマスキング(無知覚)効果を操作し、そのときの反応時間及び知覚体験の変化からそれらの情報処理過程を検討した。逆向マスキング(メタコントラスト)刺激の制御にはパソコン及びAVタキストを用い、成人被験者にキー押し反応時間課題及び刺激弁別課題を行なわせた。その結果、反応は後続刺激ではなく先行刺激に対して行なわれたことがわかり、また先行刺激の知覚体験は生じていなかったことが認められた。この知覚マスキング効果については多くの先行研究と一致する結果であったが、SOAの変化に対する反応時間と知覚体験の応答は必ずしも連動していないことがわかり、運動反応が知覚体験の結果に基づいて処理実行されるのではなく、並列的あるいはカスケード的に処理されているものと推察された。体性感覚刺激による逆向マスキング実験も実施したが、同様の結果が得られた。すなわち、知覚体験に関しては、先行刺激の刺激強度を感覚閾値、感覚閾値の1.2倍、2倍にすると知覚体験は明らかに異なってくるが、反応時間は知覚体験の程度に連動しなかった。さらに、関連実験として行なった狙準動作による反応時間課題においても同様の結果が認められた。この実験では、視覚刺激のサイズ、輝度コントラスト、呈示位置を操作し、刺激に対する指上げ反応動作課題及びタッチモニター上の刺激に対する狙準動作課題の2つを用いた。実験の結果、指上げ課題と狙準動作課題の反応時間の差分(狙準動作に特殊化された運動準備時間)は刺激サイズや輝度コントラストの違いには影響を受けず、呈示位置の違いのみに影響されることが明らかとなった。以上の結果から、運動準備過程は刺激の知覚体験処理に基づいて生じるのではなく、両者は並列的な処理を受けている可能性が示唆された。脳波データも並行して測定したが、明確な知覚体験処理を裏付けるには至らず、この面からの検討は今後の課題として残された。
抗ケラチン・モノクロナール抗体のエピトープ解析

本年度は、中間径フィラメント蛋白質であるケラチンに対する数種類のモノクロナール抗体を作成し、その免疫組織化学的特性をふまえ、それぞれのモノクロナール抗体の認識するエピトープの解析を行った。作成した抗体、MAb24、MAb26、MAb32、MAb61はそれぞれラットやウシの表皮細胞において分化特異的なケラチンの発現を示し、さらに、ヒトやウマの表皮サイトケラチンをも認識した。以下、ヒトの表皮組織におけるこれらの認識するサイトケラチンの免疫組織化学的分布について記載する。MAb24表皮基底細胞層および顆粒層細胞が陽性となったが、その中間層である有棘細胞層は陰性であった。すなわち、このMAb24の認識するエピトープは基底細胞層で発現するが、有棘細胞層で一度消失し、さらに、顆粒層細胞において再び出現するエピトープである。MAb26この抗体により、有棘細胞層および顆粒細胞層が陽性となったが、基底細胞層における陽性反応は検出されなかった。このことは、未分化な基底細胞が有棘細胞や顆粒細胞へ分化するに伴い発現のみられるエピトープであることを示す。MAb32この抗体は、基底細胞層、有曲細胞層および顆粒細胞層の全ての細胞に陽性反応を示し、特に、基底細胞層においてその陽性反応は強かった。このMAb32の認識するエピトープは細胞の分化に関わらず常に発現のみられる領域であるが、分化に伴い徐々にその発現量を減少させていることが示された。MAb61この抗体は上記した3種の抗体に比較して極めて細胞特異的な抗体である。すなわち、このMAb61は表皮基底細胞のみに発現されるサイトケラチン・エピトープを認識する抗体であり、有棘細胞および顆粒細胞へ分化すると速やかに発現の停止されるエピトープである可能性がある。また、表皮細胞では基底細胞のみが細胞増殖能を持つとされていることから、細胞増殖活性や分化抑制制御などと強い関連性が示唆された。以上、表皮細胞の分化制御にサイトケラチンの異なるエピトープの発現が強い関連性を示すという研究実績が得られた。
融体凝固制御法による高Tc超伝導線材の研究

本研究では、酸化物超伝導体の線材化法として、酸化物を半溶融状態あるいは融点直下の加工しやすい高温状態で押出し加工を行い,押出し条件の制御により緻密で配向組織を有した酸化物超伝導線材を作製し,J_Cを改善することを目的としている。本年度は,Bi系酸化物およびTl系酸化物をAgシ-スに充填し,大気中融点直下で押出し加工を行い,その後,圧延によりテ-プ化し,熱処理を行うことにより超伝導テ-プ材を作製した。Bi系では、押出し材の組識はC面が押出し方向に平行に配向した組織を示し,また,テ-プ仕後は,C面がテ-プ表面に平行に配向した組織を示した。77Kでのテ-プ材のJ_Cは,押出し比が増加する伴い増大し,押出し比いで5900Alcm^2の値が得られた。これは,押出し比の増加に伴い,組織の緻密化と配向化が進行したためと考えられる。また,テ-プ化の過程で中間圧延と熱処理を加えることにJ_Cは向上し,9100A/cm^2が得られた。今後は、押出し条件を検討することにより,さらにJ_Cの向上を目指す予定である。Tl系では,押出し材の組織は2212相,2223相および超伝導性を示さない未同定相からなり,配向化は見られないが,緻密化が観察された。押出し時の温度が高いほど超伝導相の体積率は増加するが,1133K以上では、液相が介在するためポ-ラスな組織で,未同定相の割合も増加した。テ-プ化後,熱処理した試料では,1123Kで熱処理した場合に最も良好な超伝導性が得られており,その超伝導の開始温度および電抵抗温度はそれぞれ120Kおよび98Kであり,また77KでのJ_Cは2600A/cm^2であった。この系では、組織の最適化を図ることにより,さらに超伝導性が向上するものと考えられる。
連想記憶ニューラルネットモデルにおける局所場の統計的性質と新しい型の相転移

アナログニューラルネットの連想記憶能力は、ニューロン間のシナプス相互作用を学習則にもとづいてどの様にとるかということだけではなく、ニューロンの入出力関係を表わす伝達関数の形にも大きく依存するわけであるが、自己無憧着なシグナルノイズ解析(SCSNA)と呼ぶ独自に開発した方法を用いて記憶容量と伝達関数の形の間の相関を調べた。並列分散型の連想記憶モデルの本質がとらえられる点で、ヘブの局所学習則の仮定が行なわれることが多いが,そのような場合には,ニューラルネットの平衡状態としての性質である記憶容量には各ニューロンのつくる非ガウス的な局所場分布が重要な役割を果すものであることがわかり、伝達関数の形がSCSNAの枠組の中でどの様に局所場分布に影響を与え記憶容量を決定するに至るかという点が明らかにされた。特に非単調伝達関数の場合には、非ガウス局所場分布の起源である「出力比例項」のために,単調な伝達関数の場合に比べ記憶容量の大巾な増大がもたらされるだけではなく、局所場ノイズの凝縮に伴なう相転移現象がおこり、スーパーリトリーバル相と呼ぶ特異な相が出現し、局所学習則の下であっても誤差のない完全記憶想起が実現されることになる点についても、その条件等も含めて系統的な理解をすることが可能になった。
胃癌の遺伝子不安定と浸潤能多発例、家族集積例の分子病理学的検討

胃癌の遺伝子不安定性とその病理学的特徴について、以下の諸点を明らかにした。1.多発胃癌(独立した二重癌、20例、40病変)Replication errorをしらべたところ、対象としてとった40例の単発胃癌にくらべて、病変あたりの頻度が高く、さらに両病変にともにおこる確率が期待値よりはるかに高かった。多発胃癌患者の癌感受性の上昇が推定された。2.家族集積性胃癌31病変について、組織型、深達度、年齢を合致させた、家族歴のない胃癌と対照させて遺伝子不安定性を検討した結果、胃癌の深達度とこの遺伝子不安定性との相関があり、早期胃癌で比較した場合のみ、家族集積性群で、より高頻度にみとめられた。家族集積性胃癌の一部は早期から遺伝子不安定性を獲得するものであると推定された。3.HNPCC型の家族集積性胃癌の遺伝子不安定性をもった症例の標的遺伝子の変化をしらべたところ、TGF βType II receptor、MSH3などは、HNPCCにみられるのと同様にRERが多数のIociでみられる症例で、とくに変化していた。しかし、RERそのものの頻度は従来の報告とそれほど変わらず、全体として、RER型の家族集積性胃癌は少なく、とくに浸潤性entityあるいは機構が考えられた。
神経型ゴーシェ病のモデルマウスの開発と治療に関する研究

ゴーシェ病の中枢神経症状に対する病態解明と治療法の開発を目的として新たなゴーシェ病のモデルマウスの開発を行う。マウスのグルコセレブロシダーゼ遺伝子に変異を導入したターゲティングベクターを作成した。方法は、1)日本人に多いL444P変異、F213I変異を導入したマウスの作成、2)L444P変異のホモマウスは出生直後に死亡するが、コンディショナルノックアウトを組み合わせることにより、このマウスの出生直後の死亡を防ぐ。即ち重症ではあるがある程度の期間生存できるマウスを作成する。3)得られた変異マウスについて症状、酵素活性、脂質の蓄積などについて評価する。4)神経症状を徐々に発症し、生存期間が比較的短くなるようなマウスが得られた場合、治療を試み、その有効性を明らかにする18年度から19年度にかけてマウスグルコセレブロシダーゼのゲノムに変異を導入したノックインマウスを作成する。ターゲティングベクターの作成にはBAC recombineering systemを用いた。まず、マウスグルコセレブロシダーゼ遺伝子を含むBACを基にしてそめイントロン領域へ両端をCre配列で挟んだネオマイシン耐性遺伝子を挿入した。次に、このBACに一塩基置換となる変異(3018T→A)を導入した。この変異は、ヒトグルコセレブロシダーゼのF213I変異に相当する。このBACのグルコセレブロシダーゼ遺伝子を含む領域をプラスミドにrecombineeringを用いて大腸菌内でサブクローニングすることでターゲッティングベクターを得た。このベクターを制限酵素で切断し直鎖化した後、マウスES細胞へ電気穿孔法を用いて導入する。ジェネティシン含有培地で培養することにより組み替えを起こしたES細胞を得ることができる。方法は1)日本人に多いL444P変異,F213I変異を導入したマゥスの作成,2)L444P変異のホモマウスは生直後に死亡するが,コンディショナルノックアウトを組み合わせることにより,このマウスの生直後の死亡を防ぐ。3)得られた変異マウスについて症状,酵素活性,脂質の蓄積などについて評価する。4)神経症状を徐々に発症し,半年程度で死亡するようなマウスが得られた場合,治療を試み,その有効性を明らかにする。平成18年度から19年度にかけてマウスグルコセレブロシダーゼのゲノムに変異を導入したノックインマウスを作成する。BACrecombineering systemを用いてマウスグルコセレブロシダーゼ遺伝子を領域を含むBACに遺伝子変異(3018T→A)を導入した。このBACを改変することにより,ターゲティングベクターを作成した。これによりマウスグルコセレブロシダーゼ遺伝子にCre配列で挟んだネオマイシン耐性遺伝子及び一塩基置換となる変異(3018T→A)を導入したターゲッティングベクターを作成した。平成19年度は,このベクターをマウスES細胞へ電気穿孔法を用いて導入した。方法は、1)日本人に多いL444P変異、F213I変異を導入したマウスの作成、2)L444P変異のホモマウスは生直後に死亡するが、コンディショナルノックアウトを組み合わせることにより、このマウスの生直後の死亡を防ぐ。4)神経症状を徐々に発症し、半年程度で死亡するようなマウスが得られた場合、治療を試み、その有効性を明らかにする。18年度から19年度にかけてマウスグルコセレプロシダーゼのゲノムに変異を導入したクーゲティングベクターを作成した。クーゲティングベクターの作成にはBAC recombineering systemを用いた。まず、マウスグルコセレプロシダーゼ遺伝子を含むBACを基にしてそのイントロン領域へ両端をCre配列で挟んだネオマイシン耐性遺伝子を挿入した。この変異は、ヒトグルコセレプロシダーゼのF213I変異に相当する。このBACのグルコセレプロシダーゼ遺伝子を含む領域をプラスミドにrecombineeringを用いて大腸菌内でサブクローニングすることでクーゲッティングベクターを作成した。20年度はこのベクターの配列の確認を行った。また、マウスES細胞へ導入するための準備として細胞培養の準備を行った。