hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
グルココルチコイド応答性遺伝子発現のHEXIM1を介した組織特異的制御機構の解析

骨格筋量の制御における副腎皮質グルココルチコイド作用の機構と生理的・病態生理的な意義を、ステロイドホルモンによる遺伝子発現制御を介した筋線維タンパク質分解機構と、栄養状態のセンシングを介した筋線維タンパク質合成機構のクロストークを基軸として解明した。さらに、ステロイド副作用である筋量・筋力低下(筋萎縮)と、これに伴う全身エネルギー貯留管理の破綻を是正する治療・予防法開発の分子基盤を構築した。【背景・目的】我々はこれまでに、核タンパク質HEXIM1が2つの全く異なる機構を介してグルココルチコイド応答性遺伝子発現を抑制することをin vitroで示してきた。すなわち、1.転写制御領域へのGRリクルートメントを抑制する。2.転写伸長因子P-TEFbの活性を抑制する。本年度は、in vivoにおいてHEXIM1がグルココルチコイド応答性遺伝子発現に与える影響を解析した。【方法・結果】心筋特異的に野生型HEXIM1または、P-TEFb活性を抑制しないがGRリクルートメントを抑制する変異型HEXIM1(150-158A)、を発現するトランスジェニック(TG)マウスを作成し、心臓から抽出したmRNAのデキサメタゾン(DEX)腹腔内注射依存的な発現変化をDNAマイクロアレイで解析した。解析に適当な発現量が観察された12,351遺伝子のうち、コントロールマウスでDEXによって2倍以上mRNA発現が上昇する遺伝子は444遺伝子あった。この444遺伝子のうち約79%の352遺伝子は野生型HEXIM1、150-158AいずれのTGマウスにおいてもDEXによる発現上昇が減弱されていたが、約9.7%の43遺伝子は野生型HEXIM1でのみ減弱され、約3.8%の17遺伝子はどちらのTGマウスでも減弱されなかった。【考案・結論】HEXIM1はin vivoにおいても、大部分の遺伝子のグルココルチコイド応答性発現活性化を減弱させることが確認された。また、標的遺伝子によってHEXIM1を介する2つの抑制機構の寄与が異なっていることが示唆された。副腎皮質グルココルチコイド(GC)の標的組織、とくに薬理量のグルココルチコイド製剤を投与した場合に起こりうる副作用が観察される組織として骨格筋に着目した。骨格筋はタンパク質の5075%を保持する人体最大の組織で、筋線維タンパク質の合成(同化)と分解(異化)のバランスによる筋量の制御は、筋力の維持だけでなくエネルギー源の貯留管理においても重要である。ステロイド副作用、飢餓(栄養不良)、糖尿病、敗血症、廃用などによる筋量、筋力の低下(筋萎縮)は、全身のエネルギー代謝調節に悪影響を及ぼすのみならず、運動機能の低下(ロコモティブ症候群)から転倒リスク上昇→骨折→長期臥床、代謝障害や感染症の合併→さらなる筋萎縮、という負のスパイラルを招く。本研究では、GCレセプター(GR)を鍵因子とした転写ネットワークが、異化亢進と同化抑制に貢献する分子機構をそれぞれ解明した。また、栄養を検知して同化を促進するリン酸化シグナルカスケードの鍵因子mammaliantarget of rapamycin (mTOR)が、GRを要的にしてその転写ネットワーク全体を抑制することを示した。異化と同化の鍵因子同士がお互いに抑制しあうことで、これらの下流システムの駆動がダイナミックに変換され、迅速に効率よく骨格筋代謝がスイッチされることを動物モデルにより実証した。GRとmTORは多様な組織の生理機構に必須であり、これらのクロストークの様々な組織、状況下における意義の解析には広範な波及効果が期待される。
緊急時に独居高齢者が自助できる自治体モデルの構築

独居高齢者は、救急搬送が必要な状態になっても、緊急時通報システム(以下、通報システム)を使用していない現状がある。この問題に対して申請者は、平成26年度より質的研究を行い、介入すべき問題点の概要を明らかにしている。自治体は、孤独死防止対策の中心的役割を担い、高齢者福祉施策として通報システム導入の推進を図っているが、自治体こそ、通報システムが設置されていても、独居高齢者は助けを呼べない・呼ばない現状にある実態について問題を把握し、高齢者の自助力を支援する施策について具体的に検討する必要がある。本研究は、緊急時に独居高齢者が自助できる自治体モデルを構築することを目的としている。都内23区のうち、独居高齢者の多い順に6つの区へ研究協力を依頼し、そのうち承諾の得られた3つの区において自記式質問用紙を用いて調査を行った。調査内容は、緊急時に独居高齢者が助けを呼べない・呼ばない現状に関するもので、緊急通報システムが使いづらいなどの物理的要因、救急車を呼ぶのを躊躇するなどの心理的要因であり、これまでの質的研究から発展させた調査票を用いた。結果、502名より回答を得た(回収率50%)。各区毎に、緊急通報システムを利用している独居高齢者の特性や、通報システムを使用しない・使用できない特性について分析を行い、概要を各区へ報告した。この問題に対して申請者は、平成26年度より質的研究を行い、介入すべき問題点の概要を明らかにしているところである。自治体は、孤独死防止対策の中心的役割を担い、高齢者福祉施策として通報システム導入の推進を図っているが、この自治体こそ、「通報システムが設置されていても、独居高齢者は助けを呼べない・呼ばない現状にある」実態について問題を把握し、高齢者の自助力を支援する施策について具体的に検討する必要がある。本研究は「緊急時に独居高齢者が自助できる自治体モデルを構築する」ことを目的としている。平成2829年度は、都内23区の独居高齢者を対象に、「助けを呼べない・呼ばない現状」に関するデータを得るために、これまでの質的研究から発展させた自記式質問用紙を用い、介入すべき問題点について、統計学的分析にて詳細を明らかにする予定である。平成28年度は、都内で協力の得られた3つの区役所より、本研究の対象者に該当する独居高齢者1000名へアンケート調査用紙を送付してもらった。回答数は502件であった。現在は、得られた回答のデータ入力を行っている段階である。今年度は、得られたデータを統計学的に分析し、通報システム機設置場所の物理的問題や、使用要領に関する知識不足の他、躊躇や遠慮などの心理的側面の詳細を明らかにする計画である。アンケート調査によるデータ収集は終了した。データ入力が終わり次第、統計学的分析に入ることができる。今年度の目標としている以下3つの点について、つまり、1通報システム機設置場所の物理的問題、2使用要領に関する知識不足、3躊躇や遠慮などの心理的側面の詳細については今年度上旬までに明らかにできると予測されるため、「おおむね順調に進展している」と判断した。本研究は、「緊急時に独居高齢者が自助できる自治体モデルを構築する」ことを目的として実施している。都内23区の独居高齢者を対象に、「助けを呼べない・呼ばない現状」に関するデータを得るために、これまでの質的研究から発展させた自記式質問用紙を用い、介入すべき問題点について、統計学的分析にて詳細を明らかにする。そののち、得られた結果と介入すべき問題点について、区議会等の機会を利用し、区ごと個別に結果報告を行う。孤独死防止の視点から、通報システムを使用出来ない自助の問題点を解決する施策を、高齢者福祉対策課の担当者と考案し明文化する計画である。都内23区の内、3つの区において区役所の協力を得て、これまでの質的研究から発展させた自記式質問用紙を用いて調査を行い、502名より回答を得た(回収率50%)。単純集計を行い、各区の特徴について3つの区役所へ報告を行った。各区毎に、緊急通報システムを利用している高齢者の特性や通報システムを使用しない・使用出来ない特性について議論を行った。現在は、統計学的分析を行っている最中である。

自治体は、孤独死防止対策の中心的役割を担い、高齢者福祉施策として通報システム導入の推進を図っているが、自治体こそ、通報システムが設置されていても、独居高齢者は助けを呼べない・呼ばない現状にある実態について問題を把握し、高齢者の自助力を支援する施策について具体的に検討する必要がある。本研究は、緊急時に独居高齢者が自助できる自治体モデルを構築することを目的としている。都内23区のうち、独居高齢者の多い順に6つの区へ研究協力を依頼し、そのうち承諾の得られた3つの区において自記式質問用紙を用いて調査を行った。調査内容は、緊急時に独居高齢者が助けを呼べない・呼ばない現状に関するもので、緊急通報システムが使いづらいなどの物理的要因、救急車を呼ぶのを躊躇するなどの心理的要因であり、これまでの質的研究から発展させた調査票を用いた。結果、502名より回答を得た(回収率50%)。各区毎に、緊急通報システムを利用している独居高齢者の特性や、通報システムを使用しない・使用できない特性について分析を行い、概要を各区へ報告した。今年度下旬には、得られた結果と介入すべき問題点について、協力の得られた区ごと、個別に結果報告を行う。今年度は、孤独死防止の視点から、通報システムを使用出来ない自助の問題点を解決する施策を、高齢者福祉対策課の担当者と考案し明文化するところまでを計画する。来年度は、明文化された改善施策案を集め、緊急時に独居高齢者が自助できる自治体モデルとして集約し、23区へフィードバックする。他区を参考にして更なる改善の余地がないか、各区で再検討してもらい、自治体モデルの概成とする。孤独死防止の視点から、通報システムを使用出来ない自助の問題点について、統計学的分析を終了させる。緊急通報システムを利用している高齢者の特性や通報システムを使用しない・使用出来ない特性については各区の担当者と話をしたため、統計学的分析と照らし合わせて、各区が解決するべき施策について考案する。その後、改善施策案を集め、緊急時に独居高齢者が自助できる自治体モデルとして集約する。データ入力の委託料金として計上していたが、入力業者との契約が年度末になったため。旅費が計画よりも少なかったため。来年度は成果報告のために旅費に多くの予算を使用する計画である。データ入力委託料金として使用する計画である。
遠赤外線干渉計を用いた高解像撮像による星形成現象の詳細研究

本研究の主目的は、世界初の宇宙遠赤外線干渉計を開発して、遠赤外線帯において1秒角スケールの高解像観測を行い、星生成領域、原始惑星系円盤、銀河核スターバーストなど、星間塵熱放射がきわめて重要な役割を果たしている天体について、星間塵温度分布を明らかにし、恒星誕生直前の原始星の温度構造、原始惑星系円盤の温度構造、および銀河核スターバースト現象を解明することである。この干渉計は、科学観測用大気球搭載装置としては世界的に見ても最も複雑かつ高精度なものであり、十分な検討・設計・シミュレーション・考察が重要である。このために、方式検討に相当時間をかけた結果、初フライトが当初予定から遅れてきたが、5年計画の4年目にはほぼ完成した。最終年度にブラジルで初フライトを行う計画であったが、装置の不具合のためフライトを延期した。このように、実際の気球フライトでの観測を行うことはできなかったが、世界初の気球搭載遠赤外線干渉計としてはほぼ完成した。新干渉計方式の発案、姿勢制御の高精度化、遠赤外線センサーの高感度化、クライオスタットの開発、軽量SiCミラーの開発など、世界に誇れる成果をあげることができた。さらには準備研究、関連研究として、「あかり」による遠赤外線観測の成功、系外惑星形成過程や星間塵に関する研究成果も順調に得られてきている。特に、系外惑星の形成過程として、原始惑星系円盤の重力不安定が有力であることを示せたことは、発見されてきた惑星の多様性と関係して重要であると考えられる。なお、JAXA宇宙科学研究本部の気球観測事業の一環として、H20年度にブラジルにて初フライトを行う予定であり、大きい研究成果が得られると期待している。本研究の主目的は、星生成領域、原始惑星系円盤、銀河核スターバーストなど、星間塵熱放射がきわめて重要な役割を果たしている天体について、秒角スケールの角分解能の撮像を行い、各天体において星間塵温度分布を初めて明らかにすることで、恒星誕生直前の原始星の温度構造、原始惑星系円盤の温度構造、および銀河核スターバーストの温度構造を明らかにすることである。その結果、いずれの天体についても、現在、理論的シミュレーションの結果を間接的な方法で検証するしかない星間塵雲の輯射輸送+密度構造を、直接的観測で明らかにすることができる。このためには、熱放射のピークが来る遠赤外帯において高解像撮像をする以外に、直接的に答えを得る方法が無く、遠赤外帯において初めて基線長20mの干渉計を開発し観測に用いる。本年度は以下の各項目を行った。A.遠赤外線干渉計光学系の設計、一部の基礎実験を行った。B.気球搭載望遠鏡システムの設計、一部製作気球望遠鏡構造システム製作を行った。C.センサー信号読み出しのための極低温電子回路を設計、試作を行った。D.遠赤外センサー(非圧縮型Ge:Gaアレイ3×20素子、及び圧縮型Ge:Gaアレイ5×20素子)の設計、一部試作試験を行った。E.センサー冷却システムの予備設計。また、気球フライト実験のための予備的観測フライト、新たなフライト候補の予備調査を行った。遠赤外帯において初めて基線長20mの干渉計(FITE : Far-Infrared Interferometric Telescope Experiment)を開発し観測に用いる。本年度はFITEの開発を進めるために以下の具体的項目について実行し成果を得た。A.干渉計光学系の詳細設計を行った。

この過程で新しい像再生方式の発案に至ったため、現在発表準備中である(ただしFITEではこの新方式を適用する予定は無い)B.遠赤外センサー(非圧縮型Ge:Gaアレイ3×20素子、圧縮型Ge:Gaアレイ5×20素子)の設計、一部試作試験を行った。新しい手法で大規模の遠赤外線アレイを製作する見通しを得た。C.センサー冷却システムの詳細設計を行った。D.姿勢制御系で鍵となる姿勢センサーの試験を行い、市販のセンサーで十分な精度(0.1秒角rms)が達成できることを確認した。E.テストゴンドラによる3軸姿勢制御法の開発に取り掛かった。予備的な試験では1秒角の姿勢制御安定性を達成できる見込みである。F.気球搭載望遠鏡システムの設計、製作を一部行った。G.気球フライトの実施場所をインドからブラジルに変更した。理由はフライト後の回収確率がブラジルの方が高いと判断したためである。このためにブラジルの宇宙開発機関(INPE)に赴いて現地調査を行い、協定書締結作業を進めている。本研究の主目的は、星生成領域、原始惑星系円盤、銀河核スターバーストなど、星間塵熱放射がきわめて重要な役割を果たしている天体について、秒角スケールの角分解能の撮像を行い、各天体において星間塵温度分布を初めて明らかにすることである。遠赤外帯において初めて基線長20mの干渉計(FITE : Far-Infrared Interferometric Telescope Experiment)を開発し観測に用いる。本年度はFITEの開発を進めるために主に以下の具体的項目について実行し成果を得た。A.干渉計光学系の詳細設計を行った。新しい像再生方式を発案し、実験室実験によってこの方式の妥当性を証明した。現在発表準備中である。B.遠赤外センサー(非圧縮型Ge : Gaアレイ3×20素子、圧縮型Ge : Gaアレイ5×20素子)の試験を行った。新しい手法で大規模の遠赤外線アレイを製作可能であることを実証した。C.センサー冷却システムの機械設計を行い、製作に着手した。D.クライオスタットの製造を完了した。冷却性能試験結果も良好である。真空容器をステンレス製からアルミ合金製に変更したことにより、重量を160kgから100kg未満に軽量化することができた。E.超軽量平面鏡の製造を行った。一次鏡、2次鏡ともに60×45cmの楕円型平面鏡であり、合計4枚必要である。光学精度を満たしながら軽量化を達成するために新方式のSiC焼結鏡を開発し、製作した。温度環境試験を計画中である。F.テストゴンドラによる3軸姿勢制御法の開発・試験を行った。リアクションホイールのアンローディングのために重心移動による制御を採用した。試験の結果も良好であった。G.気球フライトの実施場所であるブラジルの宇宙開発機関(INPE)との間で現地調査、試験フライト、協定書締結を行った。
光応答膜タンパク質ASRの遺伝子発現調節機構の構造基盤

本研究はシアノバクテリアから発見された微生物型ロドプシンファミリーに属する光応答膜タンパク質ASRによる遺伝子発現の制御機構を明らかにするためにASRとASR transducer (ASRT)の試料調製法の検討及びそれらの間の相互作用解析を行った。遺伝子発現コンストラクトのデザイン及びナノディスクによる膜タンパク質の試料調製法を検討し、ASRと関連分子の個々の試料調製法を確立した。次にそれらの試料を用いて等温滴定カロリメトリー、閃光光分解測定、NMR法を用いて相互作用解析を行い、ナノディスクの系として初めてASRとASRTの間の相互作用を捉えることに成功した。ASRは真正細菌であるシアノバクテリアから発見された微生物型ロドプシンファミリーに属する光応答膜タンパク質である。ASRが光合成色素タンパク質の遺伝子発現を直接制御することが近年、明らかになったが、その構造基盤は全くの不明である。本研究はASRによる遺伝子発現の制御機構を明らかにするためにASRと関連分子との間の相互作用をNMR法により明らかにし、光応答膜タンパク質ASRによる光合成色素タンパク質の遺伝子発現調節の機構を明らかにすることを目的とする。ASRおよびASRTはすでにそれぞれ単独の結晶構造が報告されており、基本的な試料調製法が確立しているが、本研究の相互作用解析にそのまま用いるには現状問題がある。26年度はまずASRとASRTの相互作用解析に適した試料調製法の検討を行った。ASRとASRTそれぞれにおいて種々のコンストラクトをデザインし、その大腸菌組換え体を可視吸収測定、円偏光二色性測定、動的光散乱測定、閃光光分解測定、NMR、SDS-PAGEを用いて評価した。その結果、ASRTのC末端側のHis-tag等の人工配列の導入がASRTの多量体構造の安定性に大きな影響を与えることが明らかになった。一方で、N末端側に人工配列が導入されたコンストラクトのASRTにおいて多量体構造の安定性は野生型のASRTと同程度であった。人工配列の有無がASRとASRTの相互作用に影響を与えることがすでに報告されており、今回の結果はASRTの多量体構造がASRとASRTの相互作用に非常に重要であることを示唆する。また、ナノディスクを用いた試料調製法を検討した結果、安定なASRの試料調製に成功した。今後は上記で検討した試料調製法を用いて試料を調製し、等温滴定カロリメトリーを用いて相互作用の詳細を明らかにし、その複合体をNMRを用いて明らかにしたい。26年度において、まずASRとASRTに関する種々のコンストラクトをデザインし、相互作用解析に適した試料コンストラクトの検討を行った。27年度において、ナノディスクによる相互作用解析に適した試料調製法の検討を行った。等温滴定カロリメトリー、円偏光二色性測定、動的光散乱測定、閃光光分解測定を用いてASR、ASRT及びナノディスク膜骨格タンパク質のぞれぞれの最適なコンストラクを確立した。また、ナノディスクの系として初めてASRとASRTの間の相互作用を捉えることに成功した。ASRTに関しては過去の報告されているものとの比較からNMRスペクトルの主鎖帰属を行い、70%の帰属に成功した。一方、ASRについてはスペクトルが得られたものの試料の不安定さから帰属可能なスペクトルの取得には至っていない。ASRとASRTの相互作用解析を等温滴定カロリメトリー法、閃光光分解法およびNMRにより調べた。これらいずれの方法においても相互作用に関する再現性のあるデータの取得に至っていない。帰属および相互作用の解析のそれぞれにおいてASRの試料調製は界面活性剤によって可溶化する方法を用いている。しかしながら、界面活性剤を用いた試料調製法では界面活性剤の持つ特性により、それらの解析に不適合なことが考えられた。そこで、界面活性剤を用いない新たな膜タンパク質の調製法として近年、注目されているナノディスクを用いることとした。現在までにナノディスクによるASRの試料調製に成功し、また、界面活性剤に比べ非常に安定であることが明らかになった。今後はこの試料を用いてNMRによる解析を進める。

全体の進捗度についてはNMR解析の部分に関してやや遅れているため、総評として「やや遅れている」とした。蛋白質科学27年度はASR、ASRTおよびプロモーター配列のNMRによる相互作用解析行う。まずはASRとASRTの間の相互作用解析を行う。15N標識ASRT試料に対して非標識ASRを滴定することで、化学シフト摂動法および転移交差緩和法によりASRT上のASRとの相互作用部位を特定する。また、その逆に15N標識ASR試料に対して非標識ASRTを滴定することで、同様にASR上のASRTとの相互作用部位を特定する。ASRとASRT分子間の原子間距離情報を得るためにASRに常磁性スピンラベルを入れる。スピンラベル試薬はすでにASRのNMR解析で実績のあるMTSLを用いる。MTSLはSH基特異的な試薬であるのでASRの膜外ループにCys残基を変異導入することでASRをスピンラベル化する。スピンラベルが導入されたASRとASRTの複合体のNMR測定により、常磁性緩和効果による距離情報を取得する。Cys残基の導入部位が異なる数種類のスピンラベル化ASRを用いたNMR測定から構造計算に必要な距離情報を収集し、複合体の構造を決定する。ASR-プロモーター配列、ASRT-プロモーター配列および3者複合体の解析も上記と同様な方法で行う。当初の予定より研究の進捗にやや遅れが生じ、NMR解析で用いるための安定同位体標識試薬およびレーザー装置の購入を27年度に延期したため。当初の予定通りに、安定同位体標識試薬およびレーザー装置の購入に使用する。
グリセリン酸化用高性能電極触媒の開発と直接型グリセリン燃料電池への応用

(1) PtとAg修飾Pt(Ag/Pt)電極上でのglycolate(GC)とoxalate(OX)(炭素数2)とformate(FO)(炭素数1)のサイクリックボルタモグラム(CV)(30°C)においてGCの酸化電流は非常に小さかったが、Ag/Pt電極では大幅に増大し、AgはGC酸化活性を大きく改善することが分かった。OXとFOの存在下でのPtとAg/Pt電極のCVは非存在下とほぼ等しかったので、両分子ともPtとAg/Pt電極上ではほとんど酸化されなかったと考えられる。Pt電極上では両分子とも吸着しなかったのに対し、Ag/Pt電極ではPt表面上に非常に安定に吸着していることが示唆された。(2) CーC結合の開裂が起こりうるglycerate(GR)とmesoxalate(MX)の酸化活性と生成物分布に関する知見を得るため、PtとAg/Pt電極を用いたGRあるいはMXを含むアルカリ水溶液の定電位電解(60°C)を行った結果、両分子ともAg/Pt電極の方がPt電極より同じ電解時間での酸化電気量が大きいことが分かった。(3) GRの定電位電解では、Pt電極での主生成物はtartronate(TN)で、OXとFOも副生した。TN生成の電流効率(CE(TN))はOX生成のそれの約6倍であった。Ag/Pt電極でも生成物分布は同じであったが、CE(TN)はやや減少し、CE(OX)がやや増加した。以上の結果よりCーC結合の開裂が起こることは分かったが、TN、OX、FOのいずれもPtおよびAg/Pt電極上でほとんど酸化されなかったことから、これ以上のcarbonateへの完全酸化は難しいと予想される。(4) MXの定電位電解では、Pt電極での主生成物はOXで、少量のFOが副生した。この結果よりCーC結合の開裂が起こっていると考えられる。OXとFO生成の電流効率の合計は約67%であったが、残りはOXとともに生成するcarbonateによると考えられる。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。今年度得られた成果をまとめると以下のとおりである。1.Pt、Pd、Au、Ag電極のグリセリン含有KOH水溶液中でのグリセリン酸化(GOR)活性をサイクリックボルタンメトリーにより調べた結果、GOR電流の立ち上がり電位(E)はPt < Pd < Au < Ag、GOR電流密度(j)はAu > Pt > Pd >> Agの順になった。また、貴金属以外の金属電極としてFe、Ti、Cu電極のGOR活性を調べた結果、Fe電極では、E値はPd電極とほぼ一致したが、j値は非常に小さかった。Ti電極はGOR活性をほとんど示さず、Cu電極では、CuOへの酸化電位付近でGOR電流が観測された。2.グリセリン酸化中間体含有KOH水溶液中でPd電極のサイクリックボルタモグラムを測定した結果、glycerate、mesoxalateの酸化電流密度が最も大きかったが、tartronateの酸化電流密度は非常に小さかった。これに対して、dihydoxyacetoneとhydroxypyruvateの酸化電流密度は高過電圧になるほど大きくなった。3.赤外反射吸収分光分析より、Pd電極での低過電圧における主生成物はdihydroxyacetone、Ag修飾Pd電極ではglyceraldehyde、glycerateであると示唆された。また、高過電圧では、Pd電極、Ag/Pd電極ともに第2級炭素に結合したOH基の酸化が進行した。さらに、Pd電極を用いて-0.1 V vs. Hg/HgOで定電位電解を行い、今年度購入した液体クロマトグラフを用いてGOR生成物を定性分析したところ、複数の生成物が検出され、glycerateが最も多く生成していることがわかった。本年度の研究実施計画の13に記載した項目は概ね実行し、上記のような成果が得られたから今年度得られた成果をまとめると以下のとおりである。2.MesoとGlyのPt上での酸化生成物を赤外反射吸収分光法で調べた結果、Mesoでは、-0.1 V付近からC-C結合開裂が起こり、OxalateやformateなどのC1およびC2化合物の吸収バンドが観察され、吸光度も電位の増加とともに増大した。Glyでは、-0.5 V付近から酸化反応が開始してMesoの生成量が増大し、-0.2 Vより正電位側では、Mesoが消費され、C1およびC2化合物が生成した。3.表面が(100)面からなる立方体あるいは直方体構造をもつPdナノ粒子の作製に成功した。これらのPdナノ粒子を0.1 M HClO4水溶液中、1.2 V vs. RHEで電位保持すると、頂点や稜からPdが酸化溶解し、(110)面が出現した。このとき、GOR酸化電流はより負電位側から流れ始め、GOR活性が向上した。4.Pd電極表面にAgを修飾(被覆率0.66)したとき、GOR開始電位は負電位側にシフトし、ピーク電流密度も増大した。-0.1 V vs. Hg/HgOでの定電位電解において、Pd電極ではGlyが主生成物であったが、Ag修飾Pd電極ではglycolateが主生成物であり、C-C結合開裂は促進された。

本年度の研究実施計画の14に記載した項目のうち、Pt電極についてはほぼ実行し、上記のような結果が得られたが、酸化中間体の構造が非常に似ていることもあり、高速液体クロマトグラフィーによる生成物の定性・定量に非常に手間取ったため、Rh電極についての実験が次年度送りになってしまった。今年度得られた成果は以下のとおりである。1.Pt電極上にAg原子層を修飾することにより酸化電流の立ち上がり電位は負電位側にシフトし、酸化電流密度も増大した。このことからAg原子層修飾によってグリセリン酸化反応(GOR)に対する触媒活性の向上することが分かった。また、炭素数3のGOR中間酸化生成物の酸化活性もAg原子層の修飾により向上した。2.PtとAg修飾Pt(Ag/Pt)電極を用いるグリセリンを含むアルカリ水溶液の定電位電解酸化の結果、Ag/Pt電極の方がGOR電流の時間による低下が抑えられ、優れた耐被毒性を有することが分かった。また、液体クロマトグラフィーによるGOR生成物の定性・定量の結果、PtおよびAg/Pt電極とも、主生成物としてGlycerate、Lactateが検出され、Ag修飾によりLactateの選択率が増大した。GlycerateはGlyceraldehyde(GA)の酸化生成物であることから、グリセリンの末端の水酸基がまず酸化されることが分かった。また、LactateはGAやDihydroxyacetone(DHA)の加水分解生成物であり、グリセリンの中間酸化生成物ではない。赤外反射吸収分光法(IRAS)による解析では、印加電位によらずLactateの生成は認められなかったので、これは予期せぬ結果であった。3.アルカリ水溶液中にGAならびにDHAを溶かすと、すぐに加水分解反応が開始し、Lactateが生成した。この結果とIRASの結果から、グリセリンの電解酸化で生成したGAが撹拌により電極からすばやく離れることによって、Glycerateの生成が起こり難くなり、代わりにLactateへの反応が進行したのではないかと考え、電解時に溶液を撹拌するのを止めたところ、Glycerteの選択率が増大し、Lactateの選択性が低下することが分かった。グリセリンの定電位電解酸化の結果、IRASから予想されるGOR中間生成物以外にLactateが主生成物として得られた。これは、当初予期したものではなかったため、この原因を明らかにするための実験を追加した。このため、当初の予定よりやや遅れる結果となった。しかしながら、追加実験より、(1)グリセリンの2電子酸化生成物であるGAはアルカリ水溶液中ですばやく加水分解してLactateを生成した、(2)薄い電解液相でのGOR挙動を調べるIRASでは、Lactateの生成が認められなかった、という結果が得られた。以上の結果から、電極上でGAのGlycerateへのさらなる酸化反応が起こる前に、GAが溶液沖合へ拡散した場合には、加水分解によってLactateが生成するという仮説を立てた。この仮説に基づき、電解液の撹拌を止めて定電位電解酸化を行ったところ、Lactateの生成は抑えられ、Glycerateの生成量が増えるという結果が得られた。(1) PtとAg修飾Pt(Ag/Pt)電極上でのglycolate(GC)とoxalate(OX)(炭素数2)とformate(FO)(炭素数1)のサイクリックボルタモグラム(CV)(30°C)においてGCの酸化電流は非常に小さかったが、Ag/Pt電極では大幅に増大し、AgはGC酸化活性を大きく改善することが分かった。
修復とヘテロクロマチンとのカップリング機構

これまでに、ヘテロクロマチンタンパク質HP1と直接相互作用するHPB66、HBAT1を見いだし、それらと損傷応答に必要な53BP1との関係を明らかにすることを目的とした。本課題は他課題採択のためルール上6月末日に中止となった。それまでに、以下の結果を得た。HP1、HPB66、HBAT1などのヘテロクロマチン因子がどのようにして53BP1の集積に関与しているのかについて理解するために、HP1、HPB66、HBAT1および53BP1の間の物理的な相互の結合を明らかにした。具体的には、それぞれのタンパク質遺伝子にタグを付加したコンストラクトを作製し、安定発現株を作製した。それぞれのタンパク質から免疫沈降されるタンパク質を、相互に抗体で確認した。また、質量分析計による免疫沈降産物の網羅的な探索も行った。その結果、HP1とHBAT1は直接相互作用すること、HPB66はHBAT1を介してHP1と結合することを見いだした。また、53BP1の損傷部位への集積に、HPB66、HBAT1が必要であることを明らかとした。従って、ヘテロクロマチンタンパク質HP1とHBAT1-HPB66との相互作用がヘテロクロマチン領域での損傷応答に重要な役割をしていることが示唆された。25年度が最終年度であるため、記入しない。
１次元ヘリウム系における超流動量子相転移の臨界現象

1次元ナノ細孔中4Heは,希薄な(薄膜)領域から加圧液体領域までの広い密度範囲において,朝永-ラッティンジャー(TL)液体特有の超流動応答が観測されており,1次元量子系の物性を調べるのに適した系と考えられている.本研究課題は,圧縮率や超音波吸収係数・音速の測定により,超流動が消失する量子臨界点近傍の臨界現象を探索・解明することを目的としている.申請時は,高圧領域の非超流動液体相を研究対象と考えていた.しかし,その後,希薄(薄膜)側でも面密度の増加により非超流動から超流動相への量子相転移が起こる可能性が報告されたことから,薄膜領域まで研究対象を拡張することとした.今年度は,まず,圧縮率の測定に従来の手法を適用できる希薄領域を測定対象とし,圧縮率,比熱,超音波測定を行った.圧縮率は,超流動が現れる面密度(nc)で極小を持つことが明らかになった.一方,比熱の温度依存からは,ncの低密度側で圧縮率が減少に転じる面密度で,流体相が消失し,全てガラス的な固体となることが示唆された.さらに,超音波測定からも,比熱の温度依存と矛盾しない結果が得られた.以上から,ncより高面密度側ではガラス的固相の上に液相が形成され,その液相で超流動が発現していると考えられる.この結果は,nc近傍の物性が量子揺らぎの効果を考慮せずに説明されうることを示唆している.このように,nc付近の振る舞いを複数の物理量を用いて総括的に調べた研究は,本研究が初めてであり,重要な知見が得られた.今年度は,もともと予定していた加圧領域ではなく,非常に希薄な(薄膜)領域における量子臨界現象の有無について調べた.そのため,高圧領域における圧縮率測定系の整備が遅れ,次年度に持ち越された.一方,薄膜領域の圧縮率,比熱,超音波測定の結果から,超流動が現れる面密度(nc)近傍の物性について,重要な知見を得た.このことから,総括的にはおおむね順調に進展していると考えられる.次年度は,まず,超音波測定をより高圧の領域に拡張し,量子臨界現象の探索を行うことを予定している.平行して,圧縮率の測定系の構築を行う.また,今年度の比熱・圧縮率から得られた知見を論文にまとめ,出版したいと考えている.1次元ナノ細孔中4Heは,希薄な(薄膜)領域から加圧液体領域までの広い密度範囲において,朝永-ラッティンジャー(TL)液体特有の超流動応答が観測されており,1次元量子系の物性を調べるのに適した系と考えられている.本研究課題は,圧縮率や超音波吸収係数・音速の測定により,超流動が消失する量子臨界点近傍の臨界現象を探索・解明することを目的としている.申請時は,高圧領域の非超流動液体相を研究対象と考えていた.しかし,その後,希薄(薄膜)側でも面密度の増加により非超流動から超流動相への量子相転移が起こる可能性が報告されたことから,薄膜領域まで研究対象を拡張することとした.今年度は,まず,圧縮率の測定に従来の手法を適用できる希薄領域を測定対象とし,圧縮率,比熱,超音波測定を行った.圧縮率は,超流動が現れる面密度(nc)で極小を持つことが明らかになった.一方,比熱の温度依存からは,ncの低密度側で圧縮率が減少に転じる面密度で,流体相が消失し,全てガラス的な固体となることが示唆された.さらに,超音波測定からも,比熱の温度依存と矛盾しない結果が得られた.以上から,ncより高面密度側ではガラス的固相の上に液相が形成され,その液相で超流動が発現していると考えられる.この結果は,nc近傍の物性が量子揺らぎの効果を考慮せずに説明されうることを示唆している.このように,nc付近の振る舞いを複数の物理量を用いて総括的に調べた研究は,本研究が初めてであり,重要な知見が得られた.今年度は,もともと予定していた加圧領域ではなく,非常に希薄な(薄膜)領域における量子臨界現象の有無について調べた.そのため,高圧領域における圧縮率測定系の整備が遅れ,次年度に持ち越された.一方,薄膜領域の圧縮率,比熱,超音波測定の結果から,超流動が現れる面密度(nc)近傍の物性について,重要な知見を得た.このことから,総括的にはおおむね順調に進展していると考えられる.次年度は,まず,超音波測定をより高圧の領域に拡張し,量子臨界現象の探索を行うことを予定している.平行して,圧縮率の測定系の構築を行う.また,今年度の比熱・圧縮率から得られた知見を論文にまとめ,出版したいと考えている.今年度は希薄な領域を対象とした超音波実験から,重要な結果が得られていたので,圧縮率の測定も希薄領域に特化して詳細に行った.希薄領域では,既存の測定手法が適用できるため,当初予定していた高圧領域用の装置系の構築に必要ナオシロスコープや勤続材料の購入を取りやめた.これらの測定機器および材料は次年度,測定系の構築を行う際に購入する.
ＡＦＭによる高分子２次元膜中の分子鎖回転半径の直接観察

高分子単分子膜は、高機能膜として広く研究されているが、膜中で分子鎖がどのようにパッキングしているかという高分子膜にとって最も基本的な点が現在でも明確ではない。本研究では、poly(methyl methacrylate)(PMMA)と各種ポリアクリレート(PA)の混合単分子膜を検討し、PMMAが様々な種類のPAと分子相溶した混合単分子膜を形成することを見出した。また、少量のPMMAをPA単分子膜に可溶化させると可溶化したPMMA鎖を原子間力顕微鏡で直接観察可能であり、その回転半径のPMMA,およびマトリックスPAの分子量への依存性を評価し、単分子膜中の分子パッキングについて検討した。高分子単分子膜は、高性能薄膜として広く研究されているが、膜中で分子鎖がどのようなコンフォメーションを取っているかという高分子単分子膜の最も基本的な点が現在でも必ずしも明確ではない。本研究では、各種相溶性ブレンド単分子膜を用いて、単分子膜中での高分子鎖の挙動を系統的に評価し、2次元膜中での高分子鎖の構造、およびその支配因子を明確化することを目的に研究を行っている。平成24年度は、以下の結果を得た。(1)ポリメチルメタクリレート(PMMA)/ポリノニルアクリレート(PNA)系は、低ガラス転移温度(Tg)のPNA単分子膜に可溶化した高TgのPMMA孤立鎖を凸状に観察可能であることを見出しているが、その逆組成であるPMMA単分子膜に少量のPNAを添加した系を原子力顕微鏡(AFM)観察し、PMMA単分子膜中にPNA鎖が凹状に観察できることを見出した。サブnm程度の幅しかないPNA分子が凹状に観察できることは、通常のAFMの観察機構では容易に理解できない。孤立鎖が可視化されるメカニズムについて、今後明らかにしたいと考える。(2)PMMAが、ポリメチルアクリレート、ポリエチルアクリレート、ポリブチルアクリレート(PBA)、ポリオクチルアクリレートといずれも相溶した単分子膜を形成し、PM漁少量添加系で、いずれの場合もPMMAよりTgの低い各種ポリアクリレートに可溶化したPMMA孤立鎖をAFM観察可能であった。可溶化したPMMA(数平均分子量21万)の回転半径は、2628nmと誤差範囲で一定であり、マトリックスの種類に依存しないことが明らかとなった。(3)PMMA/PBA系を用いて、PMMA少量添加系でPMMA分子鎖の広がりを系統的に検討を行ったところ、通常の分子量では相溶系であるが、分子量がそれぞれ100万を超える高分子量体領域では、分子鎖が凝集し、相分離を示すことがわかった。これらの相転移挙動から2次元状態の相溶性が3次元状態とどのように異なるか、解析を進めたいと考える。(1)Poly(methyl methacrylate)(PMMA)/poly(ethylene oxide)(PEO)ブレンド単分子膜の相溶性を表面圧ー面積(π-A)曲線、AFMを用いて検討した。両者は、以前のπ-A曲線の検討では相溶系だと考えらえていたが、検討の結果、非相溶系であることが明らかになった。PMMAドメインは、一般的な海島構造ではなく、小さな島状ドメインが連結した特異な数珠状の相分離構造をとる。この構造は、圧縮速度を極端に遅くすると通常の海島ドメインに転移することから非平衡な相分離構造であり、PMMAが凝集膜、PEOが膨張膜であるために膜の粘度が大きく異なるために生じる特異な構造であると推定している。ガラス転移温度の異なる相溶ブレンド単分子膜を観察すると低ガラス転移温度の単分子膜に可溶化された高ガラス転移温度ポリマーの分子鎖を観察することができる。従って、同一のポリマーであってもガラス転移温度の低いオリゴマーに高分子量のポリマーを可溶化させれば可溶化したポリマーの分子鎖を観察できる。本年度は、オリゴマーに可溶化させた高分子量体の回転半径を評価し、2次元の良溶媒中の広がりと比較することを目的に検討を行った。立体規則性の異なるatacticおよびisotactic poly(methyl methacrylate) (at-, it-PMMA)で検討を行い、それぞれの回転半径はPMMA分子量の0.73乗、0.72乗に比例し、2次元の良溶媒に予想される値、0.75に近いことがわかった。26年度が最終年度であるため、記入しない。化学26年度が最終年度であるため、記入しない。

PMMAが各種ポリアクリレートと可溶性の単分子膜を形成し、各種ポリアクリレート単分子膜中での分子鎖の広がりを評価できたこと、PMMA/PNA系でPNA少量添加でPMMAに可溶化したPMMA鎖の広がりを定量的に評価できたこと、いずれも2次元膜中での分子鎖の状態を知るために有用な新知見であり、順調に研究が進展しているものと考える。各種相溶系高分子ブレンド単分子膜を用いて、分子回転半径の評価を進めてきた。また、その過程でブレンド単分子膜の形成過程や相溶性に関する新たな知見も得られ、高分子の2次元状態である高分子単分子膜に関する知見が深まっている。26年度が最終年度であるため、記入しない。当初の計画通り、構造の大きく異なるブレンド系に広げて検討を進める予定である。ガラス転移温度(Tg)の異なる相溶ブレンド単分子膜を観察するとTgの差により、単分子膜に可溶化された分子鎖を観察することができ、各種ブレンド系で分子鎖の広がりを系統的に検討してきた。オリゴマーは高分子量体とはTgが異なるため、可溶化した高分子量体を観察可能と考えらえる。オリゴマーをマトリックスとした場合、分子鎖の広がりは2次元の良溶媒中の広がりに相当すると考えらえる。H26年度は、高分子量体/オリゴマーブレンド系で分子鎖の広がりを評価し、2次元の良溶媒中での広がりと比較検討する。当初の計画通り、検討を進める予定であり、大きな変更は予定していない。本研究においては、日常的に使用するカンチレバーの費用が占めるウェイトが大きい。H25年度は、LB実験の比重が高く、カンチレバーの消費が抑えられたため、次年度への繰り越しが生じた。H26年度頭に、新たにAFM用空気ばね式除振台を導入する予定であり、その費用に充てるとともに、本年度検討予定のオリゴマー等の購入費用に充当する。
新規遺伝子編集ツールを用いた遺伝病患者由来細胞がん細胞の作製

近年多くの腫瘍でヘッジホッグ(HH)シグナル伝達系の亢進が発症に関わっていることが明らかとなりつつあり、このシグナル伝達を標的とする分子標的薬の開発が待たれるところである。本研究では基底細胞癌、髄芽腫などの好発を特徴とする遺伝性疾患である母斑基底細胞癌症候群由来細胞からiPS細胞を作製し、免疫不全マウスの皮下に移植した。その結果得られた奇形腫内には正常iPS細胞では決して見られない髄芽腫様の組織が出現した。この髄芽腫様組織を使用することで、生体内での薬効解析や、薬剤スクリーニングが可能となると考えられた。本研究では高発癌を特徴としPTCH1を責任遺伝子とする優性遺伝病である母斑基底細胞癌症候群(NBCCS)患者由来細胞を用いて、残存している正常アレルに遺伝子編集ツールであるCRISPR/Cas9システムを利用してセカンドヒットを導入したiPS細胞を作製し、マウスに移植後、腫瘍形成能を解析することを目的とした。まず遺伝子導入効率が高く遺伝子編集も比較的容易であることを確認済みのヒト子宮頸癌由来細胞株HeLaを用いて、PTCH1遺伝子内に存在するSNP部位を標的とした遺伝子編集を行った。SNP部位特異的に設計した標的配列を含むCRISPR/Cas9発現ベクターを遺伝子導入後、限界希釈を行い、得られたクローンからゲノムDNAを抽出し、標的部位を塩基配列決定したところ、標的としたアレルでのみ遺伝子編集が行われたことが確認された。複数のNBCCS患者に由来する線維芽細胞に4因子(OCT3/4、SOX2、KLF4、c-MYC)をコードしたセンダイウイルスを感染させ、iPS細胞株を樹立した(国立成育医療センター研究所との共同研究)。これらのiPS細胞株のうち、残存アレルの変異導入確認が容易なことから、PTCH1遺伝子座を含む約1.1 Mbの領域を欠損した症例のiPS細胞株を用いて遺伝子編集を試みた。CRISPR/Cas9発現ベクターを複数種類構築し、遺伝子導入後、得られたクローン細胞を解析したところ、標的配列によって遺伝子編集効率に大きな差があることが明らかとなった。最も効率よく編集を行えた標的配列では解析した21クローン中5クローンで編集されていたのに対し、効率が悪い配列では379クローン解析して編集されたクローンはなかった。PTCH1遺伝子には複数の選択スプライシングアイソフォームが存在するため、現在それら全てのアイソフォームの発現を消失させる標的配列を設計中である。平成27年度は、遺伝子導入の効率が高く、クローン化も容易なヒト子宮頸癌由来HeLa細胞を用いて遺伝子変異導入の基礎実験を行う予定であった。HeLa細胞のPTCH1遺伝子におけるSNP部位のうち1アレルをNBCCS患者における突然変異を生じたアレルと見立てて標的配列を設計し、遺伝子導入を行ったところ、実際にアレル特異的な遺伝子編集が可能であることが確認され、平成27年度の研究計画が達成された。そこで次年度の研究計画であるNBCCS患者由来細胞を用いた遺伝子編集を前倒しして行った。本研究課題の最終目標はNBCCS患者由来細胞からセカンドヒットとなる遺伝子変異を導入したiPS細胞を樹立し、マウスに移植して腫瘍形成能を確認することである。NBCCS患者由来線維芽細胞から樹立されたiPS細胞(国立成育医療センター研究所との共同研究)に対して、変異導入を試みたところ、標的配列に依存するもののiPS細胞でも遺伝子変異導入が比較的容易に行えることが確認されたことから、当初の研究計画よりも大幅に進展していると評価した。近年多くの腫瘍でヘッジホッグシグナル伝達系の亢進が発症に関わっていることが明らかとなってきた。このシグナル伝達を標的とする分子標的薬がオーダーメイド医療として注目されており、臨床応用が始まっている薬剤も存在するが、多くの患者で副作用が強いため使用を中断せざるを得ない等問題点が多く、新たな薬剤、あるいは変異型に特化した標的薬の開発が待たれている。こうした薬剤開発や作用機序解明の基盤となる腫瘍モデルの構築を目指し、本研究ではPTCH1を疾患責任遺伝子とし、基底細胞癌、髄芽腫などの好発を特徴とする常染色体優性遺伝疾患である母斑基底細胞癌症候群患者由来細胞からiPS細胞を樹立した。連結不可能匿名化されたNBCCS患者4症例に由来する線維芽細胞に4因子(KLF4、SOX2、OCT3/4、c-MYC)を搭載したセンダイウイルスベクター感染させ、複数クローンのiPS細胞を樹立した。樹立したiPS細胞における未分化マーカー遺伝子の発現を定量的逆転写PCRで、多能性幹細胞表面マーカーと未分化マーカーの発現を免疫組織化学染色で確認した。また、胚様体形成を介したin vitro分化多能性検定を行い三胚葉への分化を免疫組織化学染色で確認した。さらに、G-bandingによる核型解析で樹立したiPS細胞が正常核型を有していること、Sort TandemRepeat解析によりすべて患者由来であることを確認した。また樹立したiPS細胞は患者と同じPTCH1遺伝子変異を保持していた。iPS細胞の免疫マウスの皮下への移植で形成された奇形腫には髄芽腫様組織が認められ、そのゲノムを解析したところ、PCTH1遺伝子のヘテロ接合性の消失が認められた。また、使用した症例のいくつかを対象としてPTCH1遺伝子変異部位の周辺にCRISPR/Cas9システムを使用してセカンドヒットを導入したiPS細胞を作製した。

近年多くの腫瘍でヘッジホッグ(HH)シグナル伝達系の亢進が発症に関わっていることが明らかとなりつつあり、このシグナル伝達を標的とする分子標的薬の開発が待たれるところである。本研究では基底細胞癌、髄芽腫などの好発を特徴とする遺伝性疾患である母斑基底細胞癌症候群由来細胞からiPS細胞を作製し、免疫不全マウスの皮下に移植した。その結果得られた奇形腫内には正常iPS細胞では決して見られない髄芽腫様の組織が出現した。この髄芽腫様組織を使用することで、生体内での薬効解析や、薬剤スクリーニングが可能となると考えられた。申請者の研究室では遺伝子編集ツールとしてのCRISPR/Cas9システムの発表後、いち早くCRISPR/Cas9システムの中心となるベクターを入手し、ヒト細胞株(HeLa、NIH3T3等)を用いて基礎的実験を行ってきた。使用した細胞株は比較的遺伝子導入効率の高い(90%)細胞株が中心であった。しかしながら本研究課題で用いているiPS細胞は遺伝子導入効率は決して高くなく(30%)、同一の標的配列を用いても変異導入されたクローンが得られる確率はHeLaに比べて低いことが確認された。現在のところ標的配列から編集効率の差を判断する方法は発表されておらず、使用する標的配列で効率よく遺伝子編集が行えるかどうかは、実際に遺伝子導入を行ってみるよりほかない。標的配列を1つずつ確認していては研究期間内の目標達成が難しいと思われる。そこで複数十数種類程度の標的配列を設計し、今後の実験に供する予定である。癌平成27年度研究計画で予定していたHeLa細胞を用いた遺伝子編集の基礎実験が早期に終了し、NBCCS患者由来iPS細胞を用いた遺伝子編集を前倒しで行った。当初予定の実験にかかる費用が抑えられた一方で、iPS細胞の継代・維持に使用する培地・試薬類はHeLa細胞で使用するものと比べ高額(培地500 mlで35,000円等)なものが多く、購入するには足らない残額は次年度使用額としてそれらの培地・試薬類の購入に充てた方が効率がよいと判断した。iPS細胞はHeLa細胞に比べ同一の標的配列を使用しても遺伝子編集効率が低いことが確認された。そのため、複数十数種類の標的配列を設計・使用し、研究を遂行する予定である。その分iPS細胞の継代・維持に必要な試薬・培地量が増加することが考えられるため、これらの購入に充てる予定である。
ダイオキシン受容体の標的遺伝子サイレンシング解除にCREMが関与する機構の研究

これまで、CYP1A1プロモーター領域に、Sp1、CREMという因子が転写の状態にかかわらず常に結合していることを明らかにしてきた。さらに、転写が抑制されているときには、HDAC1というヒストン脱アセチル化酵素が結合し、ヒストンアセチル基転移酵素活性を持つCBPが結合する結果を得た。また、Re-ChIPアッセイ法を行い、転写が起きていないときには、Sp1とHDAC1の結合が観察され、転写が開始されるとこの結合が外れることが示された。Sp1のSer-59は脱リン酸化されることで、標的遺伝子の転写が亢進することが知られている。TCDD処理により活性化されたPP2AがSp1のSer-59の脱リン酸化を引き起こし、CYP1A1の転写が活性化される機構が考えられた。ダイオキシン受容体(Ahレセプター)のリガンド結合によらない、CREMを介した新しい経路による標的遺伝子の転写活性化の初期過程を、分子生物学の手法を用いて明らかにすることが本研究の目的である。Ahレセプターの標的遺伝子であるCYP1A1の転写開始前には、ヒストンデアセチラーゼ(HDAC)と複合体を形成し、クロマチンのヒストンを脱アセチル化状態にしていることが予想された。そこで、ヒト肝癌細胞HepG2細胞に、ダイオキシン(TCDD)あるいは、リガンド非依存性にAhレセプターを転写因子として活性化するオメプラゾール(OP)による処理を加えてCYP1A1の誘導をかけるときに、HDAC阻害剤を加えた実験を行った。用いたHDAC阻害剤の2つの種類、トリコスタチンA(TSA)または酪酸ナトリウム(NaBut)によって異なる結果が得られた。TCDD処理では、CYP1A1の誘導がTSAでもNaButでも促進されたのに対して、OPによってCYP1A1の誘導をかけた場合には、NaButによるHDACの阻害で転写の誘導発現が促進されなかった。これは、HDAC阻害剤の阻害特異性によるHDAC6,10の阻害効果の違いが、この原因の一つと考えられた。即ち、誘導物質の違い(TCDDかOP)によって、サイレンシング解除に関与しているHDACの種類が異なることを示唆している。遺伝子CYPIAlの発現は、外来異物であるTCDDやベンゾ[a]ピレンがダイオキシン受容体(AhR)に結合することにより、AhRが核内へ移行し、ARNTと二量体を形成、XRE配列への結合により起こる。これまで、CYPIAlプロモーター領域に、Sp1、CREMという因子が転写の状態にかかわらず常に結合していることを明らかにしてきた。さらに、転写が抑制されているときには、HDAC1というピストン脱アセチル化酵素が結合し、ヒストンアセチル基転移酵素活性を持つCBPが結合する結果を得た。CREMあるいはSp1がHDAC1と、CREMとCBPが相互作用している可能性を検証するために、抗Sp1抗体、抗HDAC抗体、抗CREM抗体、抗CBP抗体を組み合わせることにより、Re-ChIPアッセイ法を行った。最初にSp1抗体で免疫沈降し、10mM DTTを加え15分間室温でインキュベートして抗体を失活させる。その後、HDAC1抗体を加えて再度免疫沈降し、DNAを回収してPCRを行う。その結果、転写が起きていないときには、Sp1とHDAC1の結合が観察され、転写が開始されるとこの結合が外れることが示された。一方、CREM-CBPは、転写がOFFのときには結合しておらず、ONになると結合することが示された。このことから、Sp1からHDAC1が外れることによって、CBPが呼び込まれるものと考えられた。これにともなって、転写の本体ともいえるRNAポリメラーゼIIが、プロキシマル・プロモーターに呼び込まれ結合することも、Re-ChIPアッセイ法によって明らかにされた。遺伝子CYP1A1の発現は、外来異物であるTCDDやベンゾ[a]ピレンがダイオキシン受容体(AhR)に結合することにより、AhRが核内へ移行し、ARNTと二量体を形成、XRE配列への結合により起こる。さらに、転写が抑制されているときには、ヒストン脱アセチル化酵素1(HDAC1)が結合し、活性化されるとヒストンアセチル基転移酵素活性を持つCBPが結合するという結果を得た。

しかし、Sp1は転写が開始される前後で同じようにクロマチンに結合しており、転写調節に関与する機構が不明であった。そこで、Sp1のリン酸化状態が転写開始の前後で変化している可能性を検討した。Sp1のSer-59は脱リン酸化されることで、標的遺伝子の転写が充進することが知られており、この部分のリン酸化がTCDDなどの転写誘導物質で、どのように変化するかリン酸化部位特異的抗体で検討した。その結果、TCDD処理ではリン酸化レベルが対照に比べ約20%に減少していることが明らかとなった。さらに、PP2A特異的阻害効果を持つオカダ酸(50nM)を用いてSp1のSer-59のリン酸化状態を調べると、TCDD処理した細胞においては対照に比べて減少は大幅に抑えられていた。以上の結果より、TCDD処理により活性化されたPP2AがSp1のSer-59の脱リン酸化を引き起こし、CYP1A1の転写が活性化される機構が考えられた。