hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
一酸化窒素とオキシダントストレスの相互作によるMOF発症のメカニズムの検討

NO産生の抑制は非IR肝での組織血流の低下およびoxidant stressを助長し,NOは虚血再灌流後の臓器血流の維持に重要な役割をもつものと考えられた.逆にNO産生の促進はIR肝のように酸素ラジカルが産生されている局所でのoxidant stressを増強し臓器障害を助長している可能性が示唆された.【目的】虚血再灌流障害における多臓器障害の原因として、NOとフリーラジカルの相互作用の関与が推測されている。本研究ではNO産生のレギュレーションにより虚血再灌流障害におけるオキシダントストレスの変動の変動と、ならびにその細胞障害のtargetとしてのpoly(ADP-ribose)polymeraseの関与について細胞内ATPの変動とを検討した。【方法】Wisterラットを用いその部分虚血再灌流(60分血虚、90分再灌流)モデルを作成した。NOの基質としてL-Arg(600mg/kg/時)、NO合成阻害剤としてL-NAME(20mg/kg/時)、対照として生食(5ml/kg/時)をそれぞれ虚血前10前より持続投与した。虚血再灌流終了後、非虚血再灌流肝(NIRL)および虚血再灌流肝(IRL)における組織中の還元型および酸化型glutathione濃度、ATP濃度を測定した。さらに各群にpoly(ADP-ribose)polymeraseの合成抑制剤であるbenzamideを投与し、その変動を比較検討した。【結果】NIRLでは組織中の還元型glutathione濃度とATP値はL-NAME群では低値を示し、酸化型glutathione濃度は3群間で差はなかった。IRLでは組織中の還元型glutathione濃度はL-NAME群では低値を示し、酸化型glutathione濃度はL-Arg群とL-NAME群では高値を呈し、ATP値は3群とも低値を示した。一方Benzamideの投与によりオキシダントストレスとATP値が改善する傾向を認めた。【まとめ】NOはフリーラジカルが過産生される局所ではオキシダントストレスを助長した。さらに虚血再灌流障害時におけるNOの細胞障害のtargetがこのpoly(ADP-ribose)polymeraseの活性化である可能性が示唆された。
特異点を持つシンプレクティック多様体上のラグランジアンファイブレーションの構造

ラグランジアンファイブレーションの底空間が非特異であり,かつ元のシンプレクティック多様体がある数値的条件を満たせば,非特異でなくても底空間は射影空間となることをしめした.また現在知られている具体例のうち二つの例外を除いてラグランジアンファイブレーションが存在するための必要十分条件を求めた.また底空間が非特異なラグランジアンファイブレーションの相対モジュライがモジュライの点に対応する層が可逆層であれば非特異であることを示した.ラグランジアンファイブレーションの底空間が非特異であり,かつ元のシンプレクティック多様体がある数値的条件を満たせば,非特異でなくても底空間は射影空間となることをしめした.また現在知られている具体例のうち二つの例外を除いてラグランジアンファイブレーションが存在するための必要十分条件を求めた.また底空間が非特異なラグランジアンファイブレーションの相対モジュライがモジュライの点に対応する層が可逆層であれば非特異であることを示した.本年度の研究成果は二つあり、一つは単位円盤上のアーベル多様体の族の相対コンパクト化、もう一つはflopの停止問題である。以下、各成果について順に述べる。相対コンパクト化とは、穴あき円盤上にsmoothな代数多様体の族があった場合、それを円盤全体の族に拡張する、というものである。はじめに与えられた族がアーベル多様体の族であった場合、この問題は1960年代からさかんに研究されており、いくつもの結果があるのだが、双有理幾何の立場から満足のいく解答は与えられていなかった。ここで以前からの結果の不満な点というのは二点あり、一つは得られた相対コンパクト化が射影的な族であるかどうかわからないという点、もう一点は単位円盤上のアーベル多様体の族が与えられたとき、その族を原点を除いた穴あき円盤上に制限することで穴あき円盤上のsmoothなアーベル多様体の族が得られるのだが、これを元にして相対コンパクト化を考えたとき、元の族との関係が全くわからない、という点である。本年度の研究で上記二点に対して満足のいく解答を与えることが出来た。結果を述べると、単位円盤上のアーベル多様体の族で切断を持ち、モノドロミーが巾単であるとき、それと双有理な族でsemistableかっ射影的であり、原点でのファイバーの双対グラフはトーラスと同相、またファイバーの各既約成分は皆同型でtoric多様体とアーベル多様体で構成されるものが存在することを示した。続いて二つめの結果について述べる。代数多様体の間の双有理射で例外集合の余次元が大きいもので、ある数値的条件を満たすものをflopと呼ぶ。本年度の結果はシンプレクティック多様体から出発するflopの無限列は存在しないことを示した。この結果は今後いくつかの応用が見込まれる。本年度はアーベル多様体のファイブレーションの退化について考察し,その最も単純な場合である単位円盤上のアーベル多様体のファイブレーションに対して,極小モデルを具体的に記述した.これにより,穴空き円盤上の射影的なアーベル多様体のファイブレーションがあった場合,それを単位円盤上のファイブレーションに射影的に延長し,なおかつ付け加えたファイバーの幾何的な性質がわかるようになった.これはラグランジアンファイブレーションの特異ファイバーの性質を知るのに有効であるのみならず,アーベル多様体をファイバーにもつファイブレーションを調べるのにも有用である.現在この結果をさらに一般化させ,穴空き円盤の直積の上に与えられたアーベル多様体のファイブレーションを多重円盤の上に射影的に延長し,その延長で追加したファイバーの幾何的特性を記述する,という結果にまとめつつある.また,その他,国内外のシンプレクティック多様体の成果について知見をとりまとめるため,2011年3月に国際研究集会を開催する予定であったが,自身の二ヶ月にわたる入院および震災の影響により中止せざるを得なくなり,改めて2011年8月に研究集会を開催した.この集会では,予定していた国外からの研究者に震災を理由に来日を断られてしまったことは明記しておきたい。この集会でシンプレクティック多様体の持つ特異点について新しい知見を得ることが出来た.本年度は研究実施計画で記述した3つの項目のうち,アーベル多様体をファイバーに持つ多様体の極小モデルの構成について考察するなかで,有理的なラグランジアンファイブレーションに結果を得た.シンプレクティック多様体からの正則でない有理射で,一般ファイバーがコンパクトであり,さらにそれがラグランジアン部分多様体になっているようなものを考える.このような状況で底空間の豊富な直線束の引き戻しを定義し,その数値的な性質を調べたところ,常に数値的に有効であることを示すことが出来た.応用として,ラグランジアンファイブレーションが2つあり,それらの底空間と元の空間の間同士に双有理変換が存在してファイブレーションと可換であったとする,このとき,底空間の間の双有理変換は同型写像となること,またBeauville教授によって提唱された問題,既約シンプレクティック多様体が複素トーラスと同型なラグランジアン部分多様体を含むとき,ラグランジアンファイブレーションが存在するか,について最終的な解答を与えることが出来た.以上の結果については現段階でpreprintが完成している.残り2つの項目については残念ながら予定どうりには進行しなかったが,双対ファイブレーションの構成については,その前段階となるsemi stable reductionと呼ばれる状態まで,はじめに与えられたアーベル多様体のファイブレーションが還元出来ることがわかった.本課題の目標は大きく次の三点であった.

1.必ずしも非特異とは限らないシンプレクティック多様体はいつラグランジアンファイブレーションを持つか?2.持った場合の底空間は射影空間となるか?3.新しいラグランジアンファイブレーションはどのようにして構成出来るか?24年度はこれらの問題に対し,部分的ではあるが解答を与えることが出来た.それを各項目について記す. 1.海外の研究者の結果と合わせることによって,現在知られている非特異な既約シンプレクティック多様体のうち二つの例外を除いてラグランジアンファイブレーションを持つための必要十分条件を与えた. 2. 1.と同じく,二つの例外を除いてすべてのラグランジアンファイブレーションの底空間が射影空間となることを示した.また,底空間が非特異である場合にはすでに射影空間となることは知られていたが,この命題の新しい別証明を与え,特異点がある場合にも同じ主張が成立することを示した. 1,2の結果を受けて,これからは残った例外に対しての研究が望まれる. 3.非特異なシンプレクティック多様体上のラグランジアンファイブレーションに対して,相対的な層のモジュライ空間は元のラグランジアンファイブレーションのすべてのファイバーが既約が被約であれば,やはり非特異であり,シンプレクティック多様体となることを示した.このファイバーに関する条件はかなりきついものなので,これを緩める方向に研究を進展させたい.また以上の成果は得たものの,論文等での発表が遅れており, 25年度はその作業に傾注する予定である.2011年1月に脳膿瘍という病気でおおよそ二ヶ月近く入院,その前後の体調不良で研究が出来なかった.24年度が最終年度であるため、記入しない。これまでの三年間の研究で当初の研究目標である,ラグランジアンファイブレーションの構造および新たな例の組織的な構成についてはすくなくとも証明のアイディアの形では得ることができている.が,得られた結果を論文の形でまとめる過程に遅れが目立っているため,最終年度はこの部分に力を入れて実行する.24年度が最終年度であるため、記入しない。
α_2-アドレナリン受容体作動薬による牛の腰椎硬膜外麻酔に関する研究

ヒトおよびウシの臨床現場で広く応用されているα_2-アドレナリン受容体作動薬による硬膜外麻酔の鎮静・鎮痛効果の発現機序については、不明な点が多く残されている。本研究では、未だ明らかにされていないウシの脊髄および硬膜外腔周辺組織におけるα_2-アドレナリン受容体の分布状態を明らかにする目的で、radioligand binding assay法により検索した。その結果、α_2-アドレナリン受容体作動薬によるウシの硬膜外麻酔の鎮静・鎮痛効果の作用部位および発現機序の解明され、申請者が従来から行ってきた研究の最終目的であるα_2-アドレナリン受容体作動薬によるウシの硬膜外麻酔法の確立に重要な知見となった。Radioligand binding assayは、従来から犬の脳内および血小板内におけるα_2-アドレナリン受容体についての研究を進めておられる鳥取大学農学部日笠喜郎教授の指導を受けた上で行った。α_2-アドレナリン受容体の分布状態を[^3H]yohimbineを用いて検索した結果,α_2-アドレナリン受容体はウシの頚椎、胸椎、腰椎や仙椎脊髄の灰白質または白質に部位の差がなく存在する事が確認できた。しかし、灰白質でのα_2-アドレナリン受容体のBmaxは白質の2倍程度であった。また,[^3H]clonidineを用いて腰椎脊髄の灰白質、白質や腹・背根を検索した結果、いずれの場所でもα_2-アドレナリン受容体の存在が確認された。この結果より腰椎硬膜外腔に注入されたα_2-アドレナリン受容体作動薬による鎮痛効果は,脊髄,背根,腹根,および神経節に分布するα_2-アドレナリン受容体に作動して発現することが強く示唆された.この研究成果は第137回日本獣医学会(平成16年4月、東京)にて発表する予定である。また、申請者が従来から行ってきた研究の最終目的であるα_2-アドレナリン受容体作動薬によるウシの硬膜外麻酔法が確立され、その概要を第67回日本獣医麻酔外科学会(平成15年9月、帯広)、第136回日本獣医学会(平成15年10月、青森)で発表し、第23回世界牛病学会(平成16年7月、カナダ)でも発表する予定である。
普遍的なLESを実現するSGS応力方程式型モデリングの研究

本研究では平面乱流噴流を解析対象として、申請者が過去に実施した研究(科研費基盤研究(C)15K05817、H2729)により取得したRe = 3000、10000、30000のDNSデータベースを活用しながらSGS応力輸送方程式型のLESモデリングを実現することを目指す。平成30年度では、平面乱流噴流のDNSデータを利用したアプリオリテストを実施することにより、SGS応力に関する輸送方程式中に含まれる速度相関項や圧力・速度相関項についてモデリングを行った。より具体的には、DNSデータに対して空間フィルタリングを施すことで相関項を計算し、レイノルズ数(Re)への依存性、また、フィルタ幅(つまりLESの格子解像度)への依存性も確認しながら、相関項の主要な性質を調査した。このアプリオリテストにより、SGS応力の非等方成分も無視できない役割を果たしている可能性が示唆された。また、RANSにおけるレイノルズ応力輸送方程式に関する先行研究を参考にしながら、それらの先行研究で提案されている相関項のモデルとアプリオリテストの結果を比較し、最小限の修正(係数の調整など)で既存モデルの考え方が適用可能であることを明らかにした。上記のLESモデリングに関する成果に加えて、さらに詳細にReへの依存性を評価するため、Re = 1500、7000、16500の条件について追加のDNSを実施し、DNSデータベースの拡張を行った。追加のDNSにより得られたデータベースは平面乱流噴流のRe依存性を正しく理解するために有用な情報となることが期待される。当初の研究計画として挙げた、平面乱流噴流のDNSデータを利用したアプリオリテストを実施し、SGS応力輸送方程式に含まれる相関項について評価とモデリングを実施できた。また、DNSデータベースを拡充するため、新たなRe条件(Re = 1500、7000、16500)についてDNSを実施することが出来た。得られたデータベースは平面乱流噴流のRe依存性を正しく理解するために有用な情報として活用されることが期待できる。以上の成果から、本年度は当初の目標を計画通りに全て達成し、順調に進展していると考える。次年度では、SGS応力輸送方程式に対する安定な数値解法の構築を目指す。SGS応力の輸送方程式には移流・拡散・生成項が含まれるが、通常、安定性に影響を及ぼすのは生成項のみである。反応流においては、化学反応によって生じる化学種濃度の変化に関する特性時間は生成レートをモル濃度により微分した量で評価されるが、この特性時間が流れ場の特性時間よりもかなり短い場合、方程式系を安定に解くことが難しくなる。SGS応力輸送方程式についても同様の特性時間を評価することが出来るため、空間フィルタリングを施したDNSデータを利用して特性時間を評価する。この評価においては、フィルタ幅を変化させながら特性時間にどのような傾向がみられるかを留意する。さらに、特性時間の短い項に対するケアとして、反応流の解析で用いられる手法、例えば点陰解法などにより特性時間の短さが緩和されるかを検証しながら、SGS応力方程式の安定な時間積分法を構築する。

反応流においては、化学反応によって生じる化学種濃度の変化に関する特性時間は生成レートをモル濃度により微分した量で評価されるが、この特性時間が流れ場の特性時間よりもかなり短い場合、方程式系を安定に解くことが難しくなる。SGS応力輸送方程式についても同様の特性時間を評価することが出来るため、空間フィルタリングを施したDNSデータを利用して特性時間を評価する。この評価においては、フィルタ幅を変化させながら特性時間にどのような傾向がみられるかを留意する。さらに、特性時間の短い項に対するケアとして、反応流の解析で用いられる手法、例えば点陰解法などにより特性時間の短さが緩和されるかを検証しながら、SGS応力方程式の安定な時間積分法を構築する。国内在庫の不足により、購入予定であったポスト処理用サーバーを年度内に調達することが不可能となったため、今年度中の調達を断念した。当該サーバーは次年度の早い段階で購入予定である。
ウォ-タ-フロントの地震防災に関する研究

液状化による地盤の側方流動の事例分析の結果、次の知見が得られた。(1)液状化による地盤の側方流動は、砂丘あるいは自然堤放などの微高地より砂丘間低地および旧河道などの低地に向って生じている。しかしながら、地盤の側方流動量と地表面勾配の間には明確な相関性は認められない。これは側方流動が液状化地盤の流体的挙動によって生じていることを示唆しているものである。液状化地盤が流体であれば流体表面の傾きは流動量に直接影響を与えず、流動速度のみに影響を与えることになる。このことは側方流動の対策を考える上で極めて有用な情報を提供していると考えられる。(2)地盤は側方流動量は液状化層の厚さと密接な相関性を有する。しかし、液状化層の勾配、液状化層の深さなどその他の要因との相関性は認められない。ウォ-タ-フロントの地盤と構造物の液状化対策方法の関する事例調査および模型振動実験を行い、以下の知見を得た。(3)地中壁を液状化地盤中に構築することにより、地盤の側方流動を防止することが可能であるが、この場合の地中壁は必ずしも剛性の高いものである必要はなく、ビニ-ルシ-トあるいはジオテキスタイルシ-トのような剛性の低い膜壁でも側方流動を十分に防止することが可能である。(4)側方流動地盤が基礎杭および埋設管路等の地中構造物に及ぼす外力は、液体の抗力であり、流動速度にほぼ比例する。また、液状化した地盤は粘性流体的な挙動を示す。このことは側方動の解析方法を開発する上で有用な知見と情報を提供していると考えられる。(1)既往地震による国内外の埋立て地盤の液状化と側方移動など地盤変状の発生地点を調査した。また液状化発生地点の土質資料及び埋立て工事資料を収集し、液状化のし易さと土質条件及び埋立て後の年数との関係について考察した。(2)1989年ロマ・プリエタ地震、1987年千葉県東方沖地震など既往地震による埋立地の地震観測記録を収集し、地震動の増幅特性、地盤ひずみの特性を調査した。またこれらの調査結果をもとに、地盤応答の数値解析手法の問題点について基礎的な考察を行った。(3)ウォ-タ-フロントの地震時の安全性に関し、1596年に海没したとされる別府湾「瓜生島」について、付近海底の音波探査及び埋立地で土質調査を行い、島の存否及び海没の原因について考察した。この結果「瓜生島」が実存し、砂地盤の液状化に起因した大規模な地すべりによって海没した可能性が大きいことが明らかにされた。(4)平面水槽を用いたウォ-タ-フロントの模型実験により、緩勾配護岸より遡上した津波の挙動と、ビルなど構造物と津波の相互作用について調査した。本実験により、親水性を重視した緩勾配護岸でも適切な消波上の設置及び建物の配置に留意すれば、津波に対して安全なウォ-タ-フロントを建設することが可能であることが判明した。(5)1989年ロマ・プリエタ地震によるガス、水道、電力等のライフライン施設の被害を調査し、ウォ-タ-フロントの地形・土質条件の特質を考慮したライフライン施設の耐震上の問題点を明らかにした。特に、都市機能の損失と復旧に影響を与えたライフラインの施設間の相互作用について調査した。平成2年度の研究実績の概要は以下の通りである。(1)非線型地盤モデルを用いた埋立て地盤の地震応答解析により、ウォ-タ-フロントに想定される地震動の一般的特性を明らかにした。

また、前年度に実施した埋立て地盤の地震観測記録および常時微動観測記録の分析結果と本年度の応答解析結果を総合して、埋立て地盤における標準的な耐震設計外力について提言を行った。(2)既往の液状化判定手法を整理・分析し、埋立て地盤の土質特性を考慮した液状化判定手法を提案した。提案された手法を用い、東京湾の代表的埋立て地盤について液状化の可能性を検討した。さらに液状化の可能性の高い埋立て地盤については、液状化層の厚さおよび傾斜度等にもとづいて地盤の側方移動量および沈下量の予測を行った。(3)前年度実施した数値解析結果をもとに、海底地盤のすべりなど耐震安定性の判定手法を提案し、東京湾の埋立地の海底地盤2例について適用することにより、手法の実用性、簡便性を確認した。(4)前年度実施した津波の遡上実験結果をもとに、遡上領域の推定手法の提案を行った。本手法を用い、駿河湾の代表的埋立て地盤について東海地震による遡上領域を解析して、各種建物およびライフライン施設への影響を検討した。(5)軟弱地盤の地震応答特性、液状化による地盤変状、海底地盤のすべりおよび津波の遡上を同時に考慮したライフライン施設の被害予測手法について基礎的な検討を行った。また、ウォ-タ-フロント内における各種ライフライン施設の相互作用とその定量的評価手法についても予備的な検討を実施した。液状化による地盤の側方流動の事例分析の結果、次の知見が得られた。(1)液状化による地盤の側方流動は、砂丘あるいは自然提防などの微高地がら、地盤の側方流動量と地表面勾配の間には明確な相関性は認められない。これは側方流動が液状化地盤の流体的挙動によって生じていることを示唆しているものである。液状化地盤が流体であれば流体表面の傾きは流動量に直接影響を与えず、流動速度のみに影響を与えることになる。このことは側方流動の対策を考える上で極めて有用な情報を提供していると考えられる。(2)地盤の側方流動量は液状化層の厚さと密接な相関性を有する。しかし、液状化層の勾配、液状化層の深さなどその他の要因との相関性は認められない。ウォ-タ-フロントの地盤と構造物の液状化対策方法に関する事例調査および模型振動実験を行い、以下の知見を得た。(3)地中壁を液状化地盤中に構築することにより、地盤の側方流動を防止することが可能であるが、この場合の地中壁は必ずしも剛性の高いものである必要はなく、ビニ-ルシ-トあるいはジオテキスタイルシ-トのような剛性の低い膜壁でも側方流動を十分に防止することが可能である。(4)側方流動地盤が基礎杭および埋設管路等の地中構造物に及ぼす外力は、流体の抗力であり、流動速度にほぼ比例する。また、液状化した地盤は粘性流体的な挙動を示す。このことは側方流動の解析方法を開発する上で有用な知見と情報を提供していると考えられる。
生きた細胞内における内在性mRNAの定量による遺伝子発現機構の解明

近年、mRNAを標的にした遺伝子発現調節が精力的に研究されるなか、生細胞に内在するmRNAを検出することは、遺伝子発現機構の解明に必須の課題である。本研究では、生細胞内における特定の内在性mRNA発現量を計測することにより、その動態をリアルタイムに追跡する技術開発を目指した。内在性mRNAの標識には蛍光性アンチセンスプローブを用い、蛍光顕微鏡により生きた単一細胞内のプローブを定量的に解析することで、標的mRNAの濃度を算出した。本研究の目的は、生細胞内における特定の内在性mRNA発現量を計測することにより、その動態をリアルタイムに追跡することである。内在性mRNAの標識には蛍光性アンチセンスプローブを用い、生きた細胞内に導入したプローブと標的mRNAとのハイブリダイゼーションのカイネティクスを定量的に解析することにより標的mRNAの濃度が求まると考えた。今年度は、蛍光相関分光法(FCS)を用いて、生きた細胞内に導入したアンチセンスプローブの拡散の速さについて詳細な解析を行った。生きたCOS-7細胞に蛍光標識アンチセンスプローブをマイクロインジェクションにより導入し、細胞に内在するc-fos mRNAとハイブリダイズさせた後に、細胞質においてFCS測定を行った。FCSによる解析の結果、アンチセンスプローブは細胞内において、異なる拡散時間を有する2成分として存在した。2成分の由来は、mRNAとの結合型及び解離型であると考えられた。実際、mRNAと結合しないセンスプローブは同条件において、早い拡散時間の成分のみであったことから、アンチセンスプローブは標的mRNAと結合していることが確認された。さらに、種々の濃度のアンチセンスプローブを導入して同様の実験を行い、細胞内に導入したプローブの濃度に対する結合型濃度をプロットした。これに対してフィッティングすることにより、c-fos mRNAとアンチセンスプローブとの結合反応の解離乗数(Kd)を算出した。個々の細胞内におけるアンチセンスプローブとc-fos mRNAとの結合型・解離型濃度の比と、上記に決定したアンチセスプローブの結合解離定数(Kd)から、個々のCOS-7細胞に発現しているc-fos mRNAの濃度を求めたところ、99.2から752nMの範囲でばらついており、その平均は274nM±123nM(178細胞)であった。昨年度までに、アンチセンス人工核酸を用いた内在性mRNAの定量法を開発した。まず生きた細胞内に導入した蛍光性アンチセンスプローブと細胞に内在する標的mRNAとのハイブリダイゼーションのカイネティクスを蛍光相関分光法(FCS)で定量的に解析することにより、アンチセンスプローブの標的mRNAとの結合率を測定した。この結合型・解離型濃度の比と、プローブの結合解離定数(K_d)を用いて、個々のCOS-7細胞に発現しているc-fos mRNAの濃度を算出した。その結果、c-fos mRNAの発現量は99.2から752 nMの範囲でばらついており、その平均は274 nMであった。本年度は、mRNAの検出と定量に用いるアンチセンスプローブの生細胞内における運動性に間する検討を蛍光褪色後回復法(FRAP)により行うとともに、開発した方法を用いて生きた単一細胞内における内在性mRNAのリアルタイムプロファイリングを行った。FRAPによる検討の結果、アンチセンスプローブは生細胞内において自由に運動しており、標的mRNAに関しても停止している成分は検出されなかった。このことは前年度までに開発したmRNA定量法が妥当であることを示している。さらに、内在性mRNAのリアルタイムな追跡として、これまで検出が困難であった初期遺伝子c-Fosの早い応答のリアルタイムイメージングを試みた。COS7細胞に蛍光アンチセンスプローブを導入し、薬物により標的遺伝子c-Fosを誘導したところ、細胞質において内在性c-fos mRNAの発現誘導を追跡することに成功した。
白血病幹細胞の細胞周期とエピゲノム制御を標的とした治療法の探索

ポリコーム複合体1とHoxは白血病幹細胞の活性維持にも必須である。従って、申請者の研究グループが見出したこれらの因子によるGemininの発現制御機構が白血病幹細胞の活性をも支持していることが予想されたため、まず急性白血病のモデルとしてMLL-AF9、Hoxa9+Meis1a、慢性白血病のモデルとしてBCR-ABLの各遺伝子をGeminin-EYFPノックインマウスの骨髄由来の未分化造血細胞に、レトロウイルスベクター又はレンチウイルスベクターにより導入し、致死的放射線照射を施したマウスに移植し白血病を発症させ、Geminin-EYFPの発現強度を調べた。次に、Geminin-EYFPノックインマウスを用いた骨髄細胞白血病発症モデルマウスから白血病幹細胞の分画を回収し、この細胞を次世代シークエンサーにかけて、Gemininの発現動態と相関して特異的な発現動態を示す遺伝子を同定した。そして、申請者が確立しているGemininに対するshRNA発現レトロウィルスを用いてGemininの発現、白血病幹細胞のGemininの発現を制御し、標的遺伝子の発現を解析することで、この遺伝子がGemininの制御下にあることを検証した。またMLL-AF9やHoxa9+Meis1aによる自己複製能や静止期維持など白血病幹細胞の活性を付与する分子イベントにおいてのGemininの直接的、あるいは間接的な標的遺伝子を同定した。併せて細胞生物学的手法では細胞周期制御因子について、免疫染色やDuolink法によって細胞周期の同定を行なった。一方で、白血病幹細胞特異的なCP-Gemininの過剰発現誘導法を開発し、その白血病再発予防効果を急性骨髄性白血病(AML)治療モデルマウスとヒトAML細胞異種移植モデルにて検証を行った。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。次に、この白血病マウスの骨髄細胞を採取し、それぞれの白血病幹細胞分画とされている細胞群を、Geminin-EYFPの発現強度により分取した。さらに、Geminin-EYFPノックインマウスを用いた骨髄細胞白血病発症モデルマウスから白血病幹細胞の分画を回収し、この細胞を次世代シークエンサーにかけて、Gemininの発現動態と相関して特異的な発現動態を示す遺伝子を同定した。白血病の発症・進行は、白血病幹細胞と呼ばれるごく少数の細胞集団によって支持されていることが近年明らかにされつつある。白血病幹細胞は自己複製能とともにすべての白血病細胞を生み出す能力を持ち、静止期を維持することによって薬剤抵抗性を持つことが知られている。本研究は、未だ実現しない白血病幹細胞を標的とした治療法の探索を目的として研究を遂行している。そこで治療法の開発には、細胞周期制御(特にG0-G1制御)とエピゲノム制御の理解が重要であると考え、その両方を制御するタンパク質であり、静止期と活動期の白血病幹細胞を分画するマーカーでもあるGemininに着目し、Gemininの発現動態を可視化することのできるGeminin-EYFPノックインマウスを用いて、本年度は静止期にある白血病幹細胞の性状の同定を行った。急性白血病のモデルとしてMLL-AF9、Hoxa9+Meis1a、慢性白血病のモデルとしてBCR-ABLの各遺伝子をGeminin-EYFPノックインマウスの骨髄由来の未分化造血細胞に、レトロウイルスベクター又はレンチウイルスベクターにより導入し、致死的放射線照射を施したマウスに移植し白血病を発症させ、Geminin-EYFPの発現強度を調べた。次に、この白血病マウスの骨髄細胞を採取し、それぞれの白血病幹細胞分画とされている細胞群を、Geminin-EYFPの発現強度により分取し、生化学的・細胞生物学的に解析を行うことができた。来年度は白血病幹細胞特異的なCP-Gemininの過剰発現誘導法を開発し、その白血病再発予防効果を急性骨髄性白血病(AML)治療モデルマウスにて検証を行い、本研究の知見をもとに新たな白血病治療法の開発に向けた分子基盤の確立を目指したいと考えている。以上、研究計画は概ね順調に進めることが出来ていると考える。従って、申請者の研究グループが見出したこれらの因子によるGemininの発現制御機構が白血病幹細胞の活性をも支持していることが予想されたため、まず急性白血病のモデルとしてMLL-AF9、Hoxa9+Meis1a、慢性白血病のモデルとしてBCR-

ABLの各遺伝子をGeminin-EYFPノックインマウスの骨髄由来の未分化造血細胞に、レトロウイルスベクター又はレンチウイルスベクターにより導入し、致死的放射線照射を施したマウスに移植し白血病を発症させ、Geminin-EYFPの発現強度を調べた。次に、Geminin-EYFPノックインマウスを用いた骨髄細胞白血病発症モデルマウスから白血病幹細胞の分画を回収し、この細胞を次世代シークエンサーにかけて、Gemininの発現動態と相関して特異的な発現動態を示す遺伝子を同定した。そして、申請者が確立しているGemininに対するshRNA発現レトロウィルスを用いてGemininの発現、白血病幹細胞のGemininの発現を制御し、標的遺伝子の発現を解析することで、この遺伝子がGemininの制御下にあることを検証した。またMLL-AF9やHoxa9+Meis1aによる自己複製能や静止期維持など白血病幹細胞の活性を付与する分子イベントにおいてのGemininの直接的、あるいは間接的な標的遺伝子を同定した。併せて細胞生物学的手法では細胞周期制御因子について、免疫染色やDuolink法によって細胞周期の同定を行なった。一方で、白血病幹細胞特異的なCP-Gemininの過剰発現誘導法を開発し、その白血病再発予防効果を急性骨髄性白血病(AML)治療モデルマウスとヒトAML細胞異種移植モデルにて検証を行った。今後は白血病幹細胞特異的なCP-Gemininの過剰発現誘導法を開発し、その白血病再発予防効果を急性骨髄性白血病(AML)治療モデルマウスにて検証を行い、本研究の知見をもとに新たな白血病治療法の開発に向けた分子基盤の確立を目指したいと考えている。まずGeminin発現操作法として作製した膜透過型リコンビナントGemininタンパク質のCP-Gemininのマーカー特異的細胞導入法の予備実験として、ストレプトアビジンにCP-Gemininをケミカルカップリングさせ、これをビオチン化抗Sca-1抗体と結合させる(Sca-1-Ab-CP-Geminin複合体)。この複合体をマウスに投与し(腹腔内もしくは経静脈)、この複合体が骨髄の造血幹細胞・多能性前駆細胞分画へ集積することを、免疫染色やフローサイトメーターにて確認するとともに、CP-Gemininの過剰発現により、造血幹細胞や前駆細胞活性が障害される至適投与経路、投与量、投与間隔を決定する。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
拘縮の発生メカニズムと運動・物理療法の効果に関する実験的アプローチ

本研究では,動物モデルを用い, (1)拘縮の発生メカニズム, (2)拘縮に対する運動・物理療法の効果検証,といった二つのテーマに関する実験的アプローチを行った.前者の成果としては,拘縮の進行に筋内コラーゲンの分子間架橋結合の増加が関与する可能性が提示できた.また,後者の成果としては,不動の過程で持続的他動運動や超音波を実施すると筋内膜コラーゲン線維の可動性減少といった拘縮の一病態が抑制される可能性が提示できた.本研究では,動物モデルを用い, (1)拘縮の発生メカニズム, (2)拘縮に対する運動・物理療法の効果検証,といった二つのテーマに関する実験的アプローチを行った.前者の成果としては,拘縮の進行に筋内コラーゲンの分子間架橋結合の増加が関与する可能性が提示できた.また,後者の成果としては,不動の過程で持続的他動運動や超音波を実施すると筋内膜コラーゲン線維の可動性減少といった拘縮の一病態が抑制される可能性が提示できた.【目的】拘縮症例の多くに骨格筋の伸張性低下を認めるが,ラット足関節の拘縮モデルを用いた自験例でも不動4週までは関節可動域制限の50%以上が下腿三頭筋の変化に由来していた.つまり,骨格筋は拘縮の責任病巣の中心であり,骨格筋の伸張性低下の要因を探ることは拘縮の発生メカニズムの解明につながると思われる.これまで,骨格筋の伸張性低下には筋内膜コラーゲン線維の配列変化が関与すると報告してきたが,その他にもコラーゲン分子間架橋の形成状態やI・III型コラーゲンの比率の変化なども関与する可能性があり,本年度はこの点を検討した.加えて,拘縮やそれに伴って起こる廃用性筋萎縮に対する運動・物理療法の効果も検討した。【方法】ギプスを用いラット足関節を最大底屈位で1,3週間不動化したヒラメ筋を材料とし,比較対照は週齢を合わせた無処置のラットヒラメ筋とした。筋内コラーゲンを中性塩,酸ペプシンに溶解し,溶解し得ない不溶性コラーゲン濃度を比較した.また,電気泳動法にてI・III型コラーゲンを同定し,その比率を比較した.一方,同モデルのヒラメ筋に伸張刺激や冷・温刺激を負荷し,拘縮と筋線維萎縮に対する効果を特別な治療介入を行わない群と比較した.【結果および考察】不溶性コラーゲン濃度は不動1週では対照と有意差はないが,不動3週では有意な増加を認めた.つまり,不動期間が長期化すると分子間架橋が形成されたコラーゲンが増加し,これは拘縮の進行に関与すると思われた.一方,I型コラーゲンに対するIII型コラーゲンの比率は不動1・3週とも対照より有意に増加していたが,拘縮の進行とは関連が低く,線維化のメカニズムへの関与が推察された.次に,伸張刺激によって拘縮や筋線維萎縮の回復は促進され,運動療法の効果が明らかとなった.また,冷・温刺激ともに筋線維萎縮の進行抑制に効果があり,今後はこれらのメカニズムについても検討する必要がある.【目的】拘縮の臨床症例の多くに骨格筋の伸張性低下を認め、実験動物モデルの結果でも骨格筋は拘縮の責任病巣の中心とされている。つまり、骨格筋の伸張性低下の要因を探ることは拘縮の発生メカニズムの解明につながると思われ、中でも骨格筋の伸張性を司る筋膜の主要構成成分であるコラーゲンの変化が重要と考えられる。昨年の結果では、拘縮発生時には骨格筋内コラーゲンに分子間架橋形成やIII型コラーゲンの増加が認められたが、拘縮の進行との関連性は明らかにできていなかった。そこで、本年度は不動期間の長期化に伴う拘縮の進行と骨格筋内コラーゲンの変化との関連性を検討した。【方法】ギプスを用いラット足関節を最大底屈位で1、2、3、4、8週間不動化したヒラメ筋を材料とし、比較対照は週齢を合わせた無処置のラットヒラメ筋とした、検索はヒラメ筋に含有する総コラーゲン量とペプシンによっても溶解されない不溶性コラーゲン量、電気泳動法ならびに試料の凍結横断切片の免疫組織化学染色によって同定したI・III型コラーゲンとし、拘縮の程度は足関節背屈可動域で評価した。【結果】足関節背屈可動域は不動期間が長期におよぶほど減少したが、総コラーゲン量とIII型コラーゲンは不動後早期より増加を認めた。しかし、不溶性コラーゲン量は不動後3週で増加し、4、8週でも同様に増加していた。【考察】以上の結果から、骨格筋の不動はIII型コラーゲンを主体としたコラーゲン含有量の増加を招くものの、この変化は拘縮の進行とは関連性が低いことが明らかとなった。つまり。不動後早期から認められるコラーゲン含有量の増加は線維化の発生を意味し、その本態はIII型コラーゲンの増加ではないかと推察される。一方、不溶性コラーゲン量は拘縮が顕著となる不動1ヶ月前後から認められることから、分子間架橋結合の形成が拘縮の進行に関連している可能性が示唆された。これまで、骨格筋由来の拘縮の発生メカニズムに筋内膜を構成するコラーゲン線維の可動性減少が関与していることを明らかにしてきたが、本研究ではこの点をパラメータとし、超音波(US)治療による拘縮の進行抑制効果を検証した。

予備実験として、ラットヒラメ筋にUS照射(条件:1MHz、1W/cm^2)ならびにその疑似照射を15分間行い、筋内温度の変化を調べた。その結果、US照射前34.3°Cであった筋内温度は、照射7分後には40.6°Cに達し、照射終了まで約40°Cを保っていた。なお、疑似照射による筋内温度の変化は認められなかった。次に、ギプスを用いラット足関節を最大底屈位で4週間不動化する過程で、上記の条件で1日15分間(週5回)、ヒラメ筋にUS照射を行うUS群と同頻度で疑似照射を行うSham群、不動のみの不動群、ならびに無処置の対照群を設定した。実験終了後、拘縮の程度を足関節背屈可動域で評価した結果、US群は対照群より有意に低値であったが、Sham群や不動群よりも有意に高値を示した。また、ヒラメ筋の筋内膜におけるコラーゲン線維配列を走査電子顕微鏡で観察した結果、US群は対照群と類似し、筋線維の長軸方向に対して縦走していたが、疑似照射群や不動群は横走していた。以上の結果から、US治療は不動によって惹起される筋内膜のコラーゲン線維の可動性減少を抑制し、このことが拘縮の進行抑制にっながったのではないかと推察された。ただ、今回の条件のUS照射では温熱効果の影響も含まれており、今後はUS特有の機械的振動のみの効果についても検証する必要がある。
ディスコメンシュレーション格子形成の動力学

1.Rb_2ZnCl_4系物質におけるディスコメンシュレーション格子(DC格子)形成の動的過程を、整合・不整合相転移(CーIC相転移)の進行に伴う分極と誘電率の時間変化を追跡することにより調べた。その結果得られた相転移の描像は以下のようなものである。C相からIC相への転移の際は、6枚のDCからなる核が次々と発生・成長することによって結晶が埋められていってDC格子が形成されるが、その後さらに発生してくるDCによってDC格子の核子間隔は狭くなって最後平衡状態の格子が完成する。IC相からC相への転移の際は、DCが6枚づつ消減して、DC格子の間隔は次第に広くなるが、ある間隔まで広くなると、C相領域が現れてくる。その後さらにDCの数が減少するにつれてC相領域が広がり、遂に完全にC相へ転移する。不整合系の自由エネルギーに基いて、DC格子の安定性を考察した結果、上記の相転移の描像は理論的にも妥当なものであることを示すことができた。2.Rb_2ZnCl_4系と異なる系に属するチオ尿素の8倍整合相と不整合相の間の相転移におけるDC格子形成過程を、同様の方法で調べた結果、この系のDC格子も同じ過程で形成・消減することが明らかとなった。3.1次のCーIC相転移におけるDCの核発生過程をより詳しく調べる目的で、K_2ZnCl_4の処女結晶について、相転移が進行中の誘電率の時間変化を測定した。また相転移の各段階で試料を室温まで急冷して、腐食法等によって分域構造を観察した。その結果次のモデルに到達した。DCの核は、まず結晶中にほぼ等間隔に並んだある種の欠陥の位置に発生し、それが成長して6枚のDCのクラスターができる。それ以後各クラスターは横方向に一定速度で成長する。この成長は、各クラスターの一番外側のDCに沿って新しい核が発生・成長することによって行われる。このモデルは、1次のCーIC転移ではDC間に引力が働くことからも妥当なものである。1.Rb_2ZnCl_4及びK_2SeO_4の電場誘起整合・不整合相転移に伴う分極と誘電率の時間変化を,補助金で購入したディジタルストレージスコープを用いて詳細に調べ,ディスコメンシュレーション(DC)格子は以下の過程で形成されると結論した.すなはち整合相の中に6枚のDCからなる核が発生し,成長することによって等間隔に並んだ6枚のDCができる.次々と発生するDCによって結晶は埋められていき, DC格子ができ上る.その後さらに発生してくるDCによって, DC密度は増大し, DC格子の格子間隔は狭くなって整合相への転移が完了する.以上の相転移のモデルは, 1次の相転移を行う系の自由エネルギーに関する考察から,理論的にも妥当なものであることを示すことができた.2.RB_2CL_4やK_2ZnCl_4におけるDCの発生,消滅は6枚1組で起こらねばならぬことが理論的に結論される.

我々はK_2ZnCl_4を不整合相から整合相へ転移させ,分域構造の時間変化を腐触法と粉末法で調べ, 6枚のDC(分域壁)からなる転位の存在,及びそのような転移間でDCの組替えが起って次第にDCの数が減少する過程を観察することができた.3.NaNO_2の不整合相内の二状態間の緩和を,光照射による温度ジャンプ法で調べ,数100秒の時間で緩和することを見出した.また緩和は単純な指数関数的な緩和でなく,平衡状態に近づけば近づくほど無限に長くなる(核発生の活性化エネルギーが無限に大きくなる)ようなものであり,定性的には川崎の理論と一致することを確認した.4.DC格子のスピノーダル分解については,未だ実験的確証を得るに至っていない.今後さらに理論的,実験的検討を加える.1.K_2ZnCl_4におけるディスコメンシュレーション格子の形成過程K_2ZnCl_4における整合相(C相)から不整合相へ、相転移過程を詳しく知る目的で、処女結晶に温度ジャンプによるC-IC相転移を行わせたところ、誘電率は長時間にわたって時間に比例して増加した。転移が510%進行した段階で急冷した試料の分域構造を腐食法、粉末法、レプリカ法などで観察したところ、分域壁によると思われる数μm間隔の縞模様が結晶全面に観測された。この試料をTc直下のC相内で数時間アニールすると、縞模様はほとんど消失した。完全にIC相に転移した試料を急冷して分域構造を観察すると、上と同様の縞模様が観察された。しかしこの縞模様はTc直下のC相内で数日間アニールしても完全には消滅しないで、最終的には6枚のDCからなる転位を随所に含む興味ある分域模様が観察された。以上の結果を説明するために提案されたモデルは次のようなものである。C相からIC相への転移の過程では、結晶中にほぼ一定間隔に並んだある種の欠陥にストリップルが核発生し、それが成長して6枚のDCからなるクラスターが数μm間隔で並ぶ。それ以後各クラスターは横方向に一定速度で成長する。この成長は新たなストリップルが各クラスターの一番外側のDCに沿って核発生・成長することによって行われる。このモデルは、C-IC転移が1次の場合、DC間には引力が働くこちとから妥当なものと考えられる。2.チオ尿素におけるDC格子形成の動的過程チオ尿素の8倍整合相から不整合相へ転移する際のDC格子の形成過程を、分極と誘電率の時間変化を追跡することによって調べた。その結果、Rb_2ZnCl_4やK_2SeO_4などに対して提案したわれわれの理論は、この物質のDC格子形成過程にも適用できることが明らかとなった。
刺激選択性の起源：新奇視覚カテゴリ獲得に伴う神経―行動連関の縦断的変化の解明

本研究では、高次視覚カテゴリにおける「刺激選択性の起源」を明らかにすることを目的に、長期的な学習による高次視覚カテゴリ獲得過程の縦断的行動・MRI測定を行う。多くの既存の研究は、カテゴリ選択的領域の活動を指標として実験条件による変化を測定するばかりで、「その選択性がどのように獲得されたのか」という根本的な問いには全く答えていない。そのため、本研究では1) MRIと行動による1年間の縦断的測定と、2)機能(fMRI)と構造(拡散強調MRI [dMRI]/構造MRI [sMRI])のマルチモーダルMRI測定という学術的独自性の高い2点の方法によって、この問題の解決を試みる。
単結晶タービン翼補修技術の開発

単結晶タービン翼の補修技術では、クリープ強度の低下を避けるためにも同一材を用いることが求められる。このため、補修時の割れとともに、補修部の結晶粒界生成を抑制し、簿材と連続した単結晶化を図ることが重要である。また、タービン翼の補修必要部分は何らかの機械的損傷を受けており、残留ひずみが存在している。このため、補修部近傍の適切な応力制御と補修条件の適切化が必要となる。本研究では、この残留ひずみにより補修後の熱処理時に補修部に再結晶や変質域を生じ、疲労寿命を著しく低下させることを確認し、その生成機構を詳細に検討した。その結果、変質域は異結晶域であること、補修部の変質域に疲労破壊が粒界に沿って生じ、疲労寿命の低下は単結晶中に生じる方位境界の破壊抵抗が小さいためであることを明らかにした。また、粒界強化元素を含む耐食コーティングにより疲労強度低下を軽減できることを示した。また、タービン翼補修時に把握の必要な変質域の有無を非破壊的に検出方法を検討し、これが十分可能であることを示した。単結晶タービン翼の補修技術では、クリープ強度の低下を避けるためのも翼母材と同一材を用いることが求められる。このため、補修時の割れとともに、補修部の結晶粒界の生成を抑制し、母材と連続した単結晶化を図ることが重要である。まず前者の割れ防止には、補修部近傍の熱応力発生を適正なレベル以下にとどめることが必要となる。また、後者の単結晶化では、入熱量を適正レベルにコントロールし、補修部の溶融プール深さ、溶融凝固界面の形状、溶融部の凝固条件などを制御することにより、溶融部をエピタキシャル凝固させる必要がある。そこで、単結晶母材に電子ビームを照射し、その出力を変化させることにより、溶融プール深さと凝固時の過冷度の異なった試料の作成を試みた。これら試料の組織観察結果、プール中央部に母材と連続してエピタキシャル成長した柱状晶、主としてビーム外周部で等軸晶が成長することを確認した。これらの結果を説明するため、固相側で高温度勾配、液相側で過冷却が存在する状況でのデンドライト成長モデル解析を行った。その結果、柱状晶一等軸晶遷移条件は過冷度と溶融プール深さをパラメータとして記述できることが分かった。このため、補修時の割れとともに、補修部の結晶粒界生成を抑制し、母材と連続した単結晶化を図ることが重要である。また、後者の単結晶化では、入熱量を適正レベルにコントロールし、補修部の溶融プールの深さ、溶融凝固界面の形成、溶融部の凝固条件などを制御することにより、溶融部をエピタキシャル凝固させる必要がある。そこで、単結晶母材に電子ビームを照射し、溶融プール深さと凝固過冷度の異なる試料作成を行った。これら試料の組織観察結果、プール中央部では母材と連続してエピタキシャル成長した柱状晶、主としてビーム外周部では等軸晶が成長することが分かった。タービン翼の補修部は何らかの機械的損傷を受けており、残留ひずみの存在が知られている。そこで、予ひずみ付加試料の加熱時に生じる再結晶粒成長挙動を検討した。その結果、予ひずみが一定量を超えると、凝固時に生成したミクロ偏析部に沿った優先的な再結晶が生じ、単結晶化が阻害されることが分かった。さらに、肉盛り補修凝固時にも補修部の残留ひずみが大きい場合には、凝固組織自身はエピタキシャル成長するものの、凝固後の冷却過程で非溶解部から再結晶の生じることが分かった。タービン翼の補修必要部分は何らかの機械的損傷を受けており、残留ひずみが存在している。

その結果、変質域は異結晶域であること、補修部に変質域に疲労破壊が粒界に沿って生じ、疲労寿命の低下は単結晶中に生じる方位境界の破壊抵抗が小さいためであることを明らかにした。また、粒界強化元素を含む耐食コーティングにより疲労強度低下を軽減できることを示した。また、タービン翼補修時に把握の必要な変質域の有無を非破壊的に検出方法を検討し、これが十分可能であることを示した。
口腔細菌による動脈硬化発症における先天性免疫因子gp-340の関与

口腔細菌による動脈硬化発症において、先天性免疫因子gp-340が関与する可能性を調べた。これまで、ヒト動脈内皮細胞の炎症誘導に関与することが認められているStreptococus mutansを主に用いた。細菌を各種ヒト血管内皮細胞に作用させたところ、gp-340の遺伝子発現が上昇した。タンパク発現については、内皮細胞において対照と比較してやや強い発現を認めたが、培養上清中のレベルは検出限界以下であった。また菌と内皮細胞の共培養時は、菌体の凝集が観察された。これらの結果から、口腔細菌の刺激によって血管内皮細胞からgp-340が誘導され、内皮細胞の炎症を生じる可能性が示唆された。これまでに動脈硬化病巣から検出されている口腔レンサ球菌の一種であり、申請者らがヒト動脈内皮細胞(HAEC)の炎症を強く誘導することを確認したStreptococcus mutansの各血清型(c, e, f)2株ずつを用いて研究を行った。2.gp-340のmRNA発現レベルが高かったS. mutans OMZ175を用いて、同様にHAECと共培養した後、HAECを回収し、gp-340のタンパク発現レベルを調べた。抗gp-340抗体を用いた共晶点レーザー顕微鏡観察では、対照に比してS. mutans OMZ175と共培養したHAECは、gp-340の局在を示す蛍光強度がやや強いことが認められた。また、HAECを溶解し、遠心分離によって得た上清を用いて、ドットブロットを行ったところ、対照との差は認められなかった。3.以上の結果から、S. mutansとの共培養によりHAECにおけるgp-340の発現は、mRNAレベルでは顕著に上昇したが、タンパクレベルでの発現は十分ではないことが認められた。Streptococcus mutansによる動脈硬化誘発に関与するgp-340の作用を調べるために、前年度はヒト動脈内皮細胞(HAEC)を用いた。その結果、数株のS mutansは、HAECにおけるgp-340のmRNA発現レベルを上昇させたが、タンパクレベルでの発現は十分に確認できなかった。そこで本年度は、別種類の内皮細胞としてヒト冠状動脈内皮細胞(HCAEC)を用いて同様の実験を行った。2.gp-340のmRNA発現レベルが高かったS. mutans、S. sobrinus、および他の口腔レンサ球菌やP. gingivalisを用いて、HCAECと共培養した後、HCAECを回収し、gp-340のタンパク発現レベルを網羅的に調べた。抗gp-340抗体を用いた共晶点レーザー顕微鏡観察では、いずれの菌株も対照に比して蛍光強度に顕著な差は認められず、十分なgp-340のタンパク発現は認められなかった。3.以上の結果から、S. mutansおよび他の口腔細菌との共培養によりHCAECにおけるgp-340の発現は、mRNAレベルでは上昇したが、タンパクレベルでの発現はHAECと同様に十分ではないことが認められた。S. mutansによる血管内皮細胞からのgp-340の発現誘導を確認し、S. mutansの内皮細胞への付着・凝集に及ぼすgp-340の作用を検討する予定で研究を行ってきた。これまで動脈硬化症の発症部位を想定して、まず大動脈血管内皮細胞(HAEC)を用いたが、gp-340のタンパクレベルでの発現が弱かったため、他の内皮細胞として心臓の冠状動脈内皮細胞(HCAEC)を用いて実験を行った。gp-340のmRNAレベルの発現上昇は認められたものの、タンパクレベルでの発現はやはり弱く、その機能を調べるに至らなかった。さらにS. mutansに限らず、これまで動脈硬化病巣から検出されている他種口腔レンサ球菌や歯周病細菌を用いて同様の実験を行ったが、gp-340のタンパクレベルでの発現は十分ではなかった。これらの理由から、達成度としては半ばであり、使用する血管内皮細胞、刺激に用いる口腔細菌についてさらなる検討が必要である。Streptococcus mutansによる動脈硬化誘発に関与するgp-340の作用を調べるために、これまでヒト動脈内皮細胞(HAEC)、ヒト冠状動脈内皮細胞(HCAEC)を用いた。そこで本年度は、別種類の内皮細胞としてヒト微小血管内皮細胞(HMVEC)を用いて同様の実験を行った。2.gp-340のmRNA発現レベルが高かったS. mutans OMZ175を用いて、HMVECと共培養した後、HMVECを回収し、gp-340のタンパク発現レベルを調べ、以下の結果が得られた。1)gp-340は分泌型のタンパクであるが、培養上清中にはほとんど検出されなかった。2)蛍光顕微鏡観察では、HMVEC細胞体に十分なgp-340のタンパク発現は認められなかった。しかし、S. mutansOMZ175菌体の凝集塊にgp-340の存在が認められた。3)菌体との共培養後、培地中の菌体を回収したところ、Dot blot法でgp-340の定量が可能であることが示された。3.gp-340のmRNAとタンパクの発現レベルを経時的に調べたところ、48時間共培養後に、いずれも高い発現を示すことが認められた。