hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
連邦国家インドの構造調整政策における中央と州政府財政の役割に関する研究

当研究の第1の課題は、インド経済の持続的経済成長に決定的に重要な1996-97年度と1997-98年度の経済政策を、中央・州政府の公共投資を中心に政策調和という視点から分析し、両財政の役割と成果を評価することである。第2の課題は、中央政府の消費税と州政府の売上税の付加価値税への移行過程を、両政府の税制調和という視点から検討し、特徴および問題点と財政、経済効果を、とくに先進州のマハラシュトラ州を事例として、評価することである。そこで、平成8年度の当研究の成果を基礎として、以下のことが明らかになった。(1)統一戦線政権は、構造調整政策の継続と州政府への地方分権を政策方針とした。持続的経済成長の最大の制約要因は財政赤字である。中央政府の財源移転に大きく依存する州政府財政の財政赤字は、中央政府と同様に削減困難で、その削減が最優先課題となった。1994年の第10次財政委員会報告は、現行の中央税収移譲制度に代わり全中央税収から州分与する選択移譲制度を提案した。これは、現行財源移転制度が限界に達したことを明らかにし、中央-州政府間財政関係を転換する契機となった。世界銀行の外圧を背景に中央政府も提案受入れを表明し、州政府側も支持している。残された問題は、州分与率と固定期間に関する州政府側の合意である。簡素で合理的な移譲制度提案は、財政赤字削減に必須の州政府での税制改革の重要性を再認識させた。(2)州政府財政は、中央政府の財源移転後も25州全て赤字でGDP比率3%に達しており、中央政府よりも財政整理と財政規律の確立が遅れている。税制改革とくに売上税改革は、マハーラーシュトラ、西ベンガル、アンドラ・プラデシュ、カルナ-タカ、タミル・ナ-ドゥの5州と首都デリーが売上税に代わる付加価値税の導入ないし導入の発表をしたに止まっている。州政府の財政規律の確立と税制改革が、喫緊の課題になった。当研究の第1の課題は、インド経済の持続的経済成長軌道への移行に重要な1996-97年度と1997-98年度の経済政策を、中央・州政府の公共投資を中心とする政策調和という視点から分析し、両政府財政の役割と成果を評価することである。第2の課題は、中央政府の消費税と州政府の売上税の付加価値税への移行過程を、両政府の税制調和という視点から検討し、特徴、問題点と財政、経済効果を、とくに先進州のマハラシュトラ州を事例として、評価することである。そこで、インドでは、第11回下院議員選挙の結果、1996年6月に統一戦線を母体とする連立政権のデベ・ゴウダ政権が成立した。この政権の1996-97年度の経済・財政政策の分析により、以下のことが明らかになった。(1)ゴウダ政権は、前ラオ政権の経済成長政策を継承したが、州政府への分権化を枠組みとして、年7%以上の経済成長率の維持を目標に、財政赤字削減、インフラ投資増加と雇用・貧困軽減を優先課題とした。支出政策では、農業開発と社会部門の支出増加が見られるが、インフラ部門公共投資の増加は見られない。租税政策では、消費税の付加価値税への移行を目指す織物部門へ修正付加価値税が拡張されたが、無税法人への最小代替税導入など改革の継続よりも増収を優先した改正となった。財政赤字削減は、削減策が限界に達しており、中長期的には計画経済体制を支えてきた行財政の構造改革が必須の課題になった。(2)州政府の経済・財政改革では、州政府と州公企業の財政赤字削減に大きな進展は見られない。また、州政府の売上税の付加価値税への移行では、マハラシュトラ州・タミルナド州とアンドラプラデシュ州・ケララ州では、異なるタイプの付加価値税が導入され、その他の州では導入が遅れている。(3)財政委員会勧告による中央・州政府間財源配分の変更などを含む州政府レベルでの経済・財政改革の分析が、当研究の平成9年度の課題となった。

残された問題は、州分与率と固定期間に関する州政府側の合意である。簡素で合理的な移譲制度提案は、財政赤字削減に必須の州政府での税制改革の重要性を再認識させた。(2)州政府財政は、中央政府の財源移転後も25州全て赤字でGDP比率3%に達しており、中央政府よりも財政整理と財政規律の確立が遅れている。税制改革とくに売上税改革は、マハーラーシュトラ、西ベンガル、アンドラ・プラデシュ、カルナ-タカ、タミル・ナ-ドゥの5州と首都デリーが売上税に代わる付加価値税の導入ないし導入の発表をしたに止まっている。州政府の財政規律の確立と税制改革が、喫緊の課題になった。
オートファジー不全を伴う慢性膵炎発症メカニズムの解明

遺伝性膵炎の原因遺伝子SPINK1をマウスSpink3 locusに置換し、SPINK1ノックインマウスを樹立した(Spink3SPINK1/SPINK1)。SPINK1の変異により、1SPINK1の機能低下、2SPINK1発現量の低下、の2つの可能性がin vitroの実験から明らかにされている。そこで、2を検証するために、Spink3SPINK1/SPINK1とSpink3+/-マウスとの交配によりSPINK1ヘテロノックインマウス(Spink3SPINK1/-)を作製し、SPINK1の発現量が約70%低下していることを確認した。このマウスの致死性は回避されるものの、生後4週齢において、慢性膵炎(膵腺房細胞の脱落、線維化、炎症細胞浸潤)を発症した。このマウスの膵炎発症過程において、オートファジーに由来する巨大な空胞の出現と、オートファジーの選択的基質であるp62タンパクの蓄積が見られた。つまり、SPINKの欠損、および発現低下はオートファジーの異常を引き起こすことで、膵炎を発している可能性が示唆された。さらにこのSpink3SPINK1/-マウスでは、膵腺房細胞がアポトーシスとネクローシスによって脱落していることが明らかとなったが、特にプログラムされたネクローシス(ネクロプトーシス)の実行因子であるRIP3を欠失させたマウス(Rip3-/- :Spink3SPINK1/-)を作製したところ、慢性炎症が抑制された。このことは、膵炎発症過程で見られる、オートファジー不全による細胞死がネクロプトーシスであることを示唆している。以上の結果から、急性膵炎、慢性膵炎の発症にはオートファジーが深く関与しており、特に両者に共に出現する巨大なオートリソソーム内で、なぜ分解が抑制され、トリプシノーゲンの異所性活性化が生じるのかを明らかにする必要があると考えられた。27年度が最終年度であるため、記入しない。遺伝性膵炎の原因遺伝子SPINK1のノックインマウスを樹立し、解析を行った。SPINK1ノックインマウスは正常に出生し、生後4週でヒト慢性膵炎と類似の病態が完成することが判明した。慢性膵炎を発症する過程で、1オートファジー不全、2p62の蓄積、3膵内トリプシン活性の亢進、4細胞死(アポトーシス、ネクローシス)を確認した。この結果は、オートファジー不全に伴うp62の蓄積とトリプシンの異所性(膵内)活性化が、細胞死を引き起こし、慢性膵炎の発症に深く関与することを示唆している。そこで、これらの要因がどのように関連しているのかを明らかにするため、1膵特異的Atg5欠損マウス、2カテプシンB欠損マウス(トリプシンの活性化を抑制するマウス)、3プログラムされたネクローシスの実行因子receptor-interacting protein kinase 3 (RIP3)欠損マウスとの二重変異マウスを解析した。評価指標として、膵内のオートファジー活性(LC3-II、p62、カテプシン活性)、膵内トリプシン活性、4週齢における慢性膵炎の重症度(線維化、炎症細胞の浸潤等)をSPINK1ノックインマウスと比較した。その結果、Atg5との二重変異マウスではその重症度に差が見られなかった。オートファジー不全と同様の原因と考えられた。カテプシンB欠損マウスとの交配では、トリプシン活性が上昇しており、このマウスにおけるトリプシノーゲンの活性化にはカテプシンBを介する以外の経路が働いていることを示唆している。Rip3との二重変異マウスでは、その重症度が抑制され、このネクローシスが膵炎発症に重要であることが判明した。

以上の結果から、急性膵炎、慢性膵炎の発症にはオートファジーが深く関与しており、特に両者に共に出現する巨大なオートリソソーム内で、なぜ分解が抑制され、トリプシノーゲンの異所性活性化が生じるのかを明らかにする必要があると考えられた。1膵特異的Atg 5欠損マウス、2膵特異的p62欠損マウスおよび膵特異的p62過剰発現マウス、3カテプシンB欠損マウスとの二重変異マウスを計画していたため、1、3は解析が終了し、まもなく投稿を予定している。2は本年度(平成27年度)に行う。オートファジー制御化合物の探索(単離腺房細胞を用いたex vivo解析)は、現在膵腺房細胞の培養系を構築している段階である。今年度、化合物スクリーニングを行うシステムを用いて、化合物をスクリーニングし、オートファジーの制御化合物を探索する計画である。27年度が最終年度であるため、記入しない。本年度は、これまでのin vivo研究に加え、in vitroの培養系を構築し、オートファジー制御化合物の探索を行う。膵腺房細胞の細胞株は存在しないため、マウスの胆管からコラゲナーゼを膵内に逆流させ、細胞を単離する。この単離腺房細胞(GFP-LC3(+))の培養液中にコレシストキニンを加え、オートファジーを誘導する。オートファジーの定量はGFPを指標にするが、あらかじめ、用意している化合物(共同研究者から供与していただく)を加えておき、GFP蛍光が増強、または減弱する化合物をスクリーニングする計画である。また、同時に腺房細胞内トリプシン活性も測定する。
遺伝子導入動物による生殖と生殖器官の分化を制御している遺伝子の解析

本補助金は下記プロジェクトの立ち上げ、遂行に大きく寄与した。(1)マウス卵巣分化:1-1.gdf-9遺伝子-/-マウス卵巣の卵胞成熟障害と卵胞顆粒膜細胞の生育異常の機構:GDF-9-/-による障害をより直接的に引き起こしている候補遺伝子発現異常として、生殖細胞分化に必須とされるc-kitリガンド(steel factor)遺伝子の発現上昇、顆粒膜細胞の接着性に関わるヒアルロン酸合成酵素の発現低下等を発見報告した。1-2.卵巣顆粒膜・夾膜、精巣セルトリ・ライデッヒ細胞特異的に発現するdax-1遺伝子発現制御領域下にcreを連結、導入しTGマウスを作成した。ブルーマウスにより生殖腺間質細胞特異的creの発現を確認した。(2)オキシトシン・オキシトシン受容体(otr)システム:2-1.LoxP依存誘導型otr遺伝子ミュータントマウス(flxotr/flxotr)を作成し、これをホモに持つ雌マウスより生まれた全仔マウスが出産後36時間で死亡する事を見出した。otr遺伝子itron3中に挿入されたneo遺伝子によるotr遺伝子の発現低下による乳汁射出の著しい低下の為と推定し、現在詳細を解析中である。2-2.flxotrマウスからotr-/-マウスを作成し、雄雌ともに生存可能である事を見出した。親にotr遺伝子欠損をヘテロ、又はホモに持つ持つ仔マウスは出生直後の仔マウス致死の頻度が高く遺伝的障害が出ていると思われ、解析中である。(3)MTA-1遺伝子:生殖腺(卵巣、乳腺)由来のがんの悪性化・転移性との強い相関性が指摘されるMTA-1遺伝子の細胞増殖への関与、転移との相関性、GATAエレメント依存性の転写活性化能等について報告した。オキシトシン受容体(OTR)遺伝子の破壊マウス作成実験:条件遺伝子破壊(conditionalknockout)システムを用いたKOマウス作成を計画し、実施した。阪大の木村博士が得た129SvEv系統のマウス由来ゲノミックライブラリーよりマウスOTR遺伝子を持つラムダファージを入手し、これよりマウスOTR遺伝子を取得した。これを出発材料としてloxP型KOベクターであるpLoxPneo3.repairを骨格に3つのloxP,neo耐性遺伝子、5′armと3′arm、loxPに挟まれたnockin用ゲノム(エクソン2,3)、HSV-tk遺伝子の各断片からなる全長18.5kbのKOベクターを作成した。現在、マウスに此のベクターをES細胞に導入した際にゲノムとの間で起きる相同組み替え後の遺伝子をサザンプロットで確認するためのプローブを確認中である。このKOベクターは共同研究者のMartin M.Matzuk博士の研究室でES細胞への導入を行い、解析中である。胚発生時でのOTR遺伝子の機能を明らかにするための実験として、Martin M.Matzuk博士の研究室の助教授であるChester Brown博士が作成した、合成ステロイドの一種でのみ構造変換を起こし活性型cre活性を示す変異型ステロイドレセプター/creの融合タンパク遺伝子を、任意の体組織で一様な発現のみられるROSA26発現ユニットと組み合わせたマウスシステムで行う準備を進めている。Stcel panda変異マウス卵巣の解析:卵巣でのc-kitリガンドの発現が低下したSteelpanda変異マウスの卵巣解析に関しては1998年5月に3つがい入手したヘテロザイゴートより若干のSteel panda

変異マウスを得たので、これより卵巣を取得し、ins ituハイブリダイゼーションを行った。この結果、予備的な結果ではあるが、Steel panda変異マウス卵巣の卵胞でGDF-9の発現も低下している可能性が示唆された。GDF-9の昆虫細胞による生産:sf-9細胞よりマウスGDF-9遺伝子を持つベクターヴィールスか生産され、これが感性性を持つことも確認したが、現在までに活性型のGDF-9が培地中へ分泌された可能性については確認できていない。本年度はニワトリFSH-R卵胞刺激ホルモン受容体遺伝子上流域の転写制御領域研究で他グループが哺乳類の同遺伝子上流域転写制御領域研究にて見いだした転写因子結合モチーフとは全く異なる新しい転写因子結合配列の存在を明らかにした。一方、米国NIH支所のNIEHSのMishina's Lab.でテトラプロイド解析法とキメラ解析法に必要な技術を学び、またこの解析に必要な微小針の作成法等を収得することが出来た。滞在期間が短かったため、有効な最終結果は得られなかったが、期間中に得た技術・知識を元に今後当研究室において解析システムを立ち上げ、既に取得しているLGR4遺伝子ヘテロ欠損マウスとOTR遺伝子へテロ欠損マウスをもとに両遺伝子のホモ欠損マウス胚由来ES細胞を取得し、胚発生時における両遺伝子欠損の機能解析を行う予定である。また共同研究としてアメリカヒューストンベイラー医学大学のMartin M.Matzuk博士と行ってきた卵巣卵母細胞特異的に発現するGDF-9遺伝子の欠損マウス卵巣の解析に関する研究を発表し、さらにアクチビンβCとβの両遺伝子欠損マウス解析研究の結果をまとめ、投稿した。本補助金は下記プロジェクトの立ち上げ、遂行に大きく寄与した。(1)マウス卵巣分化:1-1.gdf-9遺伝子-/-マウス卵巣の卵胞成熟障害と卵胞顆粒膜細胞の生育異常の機構:GDF-9-/-による障害をより直接的に引き起こしている候補遺伝子発現異常として、生殖細胞分化に必須とされるc-kitリガンド(steel factor)遺伝子の発現上昇、顆粒膜細胞の接着性に関わるヒアルロン酸合成酵素の発現低下等を発見報告した。1-2.卵巣顆粒膜・夾膜、精巣セルトリ・ライデッヒ細胞特異的に発現するdax-1遺伝子発現制御領域下にcreを連結、導入しTGマウスを作成した。ブルーマウスにより生殖腺間質細胞特異的creの発現を確認した。(2)オキシトシン・オキシトシン受容体(otr)システム:2-1.LoxP依存誘導型otr遺伝子ミュータントマウス(flxotr/flxotr)を作成し、これをホモに持つ雌マウスより生まれた全仔マウスが出産後36時間で死亡する事を見出した。otr遺伝子itron3中に挿入されたneo遺伝子によるotr遺伝子の発現低下による乳汁射出の著しい低下の為と推定し、現在詳細を解析中である。2-2.flxotrマウスからotr-/-マウスを作成し、雄雌ともに生存可能である事を見出した。親にotr遺伝子欠損をヘテロ、又はホモに持つ持つ仔マウスは出生直後の仔マウス致死の頻度が高く遺伝的障害が出ていると思われ、解析中である。(3)MTA-1遺伝子:生殖腺(卵巣、乳腺)
外生菌根共生における地下部菌糸体ネットワークと転流ドメインの形成機構の解明

外生菌根共生は、菌根から土壌中に伸展する根外菌糸体によって支えられている。そこで本研究では、実際の森林における菌根菌種の多様性と分布を調べるとともに、根外菌糸体に着目して、菌根共生系内の養分転流と根外菌糸体間の相互作用を、分離菌株を接種したマツ苗によるトレーサー実験等により調べた。その結果、(1)天然更新しているコメツガ実生では、根系内の菌根菌種の多様性は高く、多くの菌種が固まって分布すること、(2)転流の駆動力が根外菌糸体全体で発生していること、(3)子実体が強いシンク能をもつこと、(4)同一クローンの根外菌糸体は、接触すると比較的速やかに結合してより広範な根外菌糸体ネットワークを形成すること、(5)菌糸体間の結合に伴って転流のドメインも拡大することが明らかになった。また、これらの結果をもとに、森林における菌根菌動態に関して、「頻繁な根外菌糸体の修復」の可能性を指摘するとともに、「外生菌根菌ギルド」という新たな概念を創出した。外生菌根共生系では,個々の菌根から物理的に連絡した菌糸が伸長して、土壌中に菌糸体が発達する。本研究では,初発菌糸体間の相互作用と養分転流に着目し,菌糸体レベルでの菌根菌の実像に迫る。(1)菌糸体ネットワークの形成過程:(1)八ヶ岳山麓のシラビソ・コメツガ林で、シラビソ、コメツガ実生に共生する菌根菌の種構成について調べた。その結果、多数の菌根菌種が共生しているが、実生ごとにその構成が異なることがわかった。来年度は、それらの菌根菌種の微細分布を調べる。(2)光合成産物の転流ドメイン:(1)コツブタケ菌によるアカマツ菌根苗二本を,両者の菌糸体が接するように根箱で並置栽培した。二週間後、片方の苗に放射性同位元素を含む^<14>CO_2をパルスで光合成により吸収させた後,経時的オートラジオグラフィー法により,光合成産物の転流経過を調べた。その結果、双方の菌株が同じ場合には、菌糸が融合して転流ドメイン(^<14>C-光合成産物が行き渡る菌糸体領域)が拡大するが、異なる菌株の場合には、転流ドメインはラベルした苗の菌糸体内に限定され、隣接する苗の別の菌株による菌糸体内には拡大しないことがわかった。このことは、実際の森林でも、.菌根菌の菌糸間の作用によって、地下での転流ドメインが大きく変動する可能性を示唆している。(2)同菌株に感染した菌根苗で、両菌糸体の接触部の長さを実験的に3cmまで狭めても、^<14>Cの転流は隣の菌糸体への全域に及び、ほとんど影響を受けなかった。このことは、菌糸体内の^<14>Cの移動は、ほとんど抵抗が無く、一部に転流した^<14>Cは、菌糸体全体に容易に広がることを示している。(1)菌糸体ネットワークの形成過程:八ヶ岳山麓のシラビソ・コメツガ林で、岩上に平面的に発達するコメツガおよびシラビソ実生の根系から採集したすべての外生菌根について、ITS領域のDNA配列から菌根を形成している菌種を同定し、その微細分布を調べた。その結果、それぞれの菌種が、10cm以下の小さな範囲で固まって分布する傾向があることがわかった。これらの結果は、「様々な外生菌根菌種が土壌中に存在し、それらが偶発的に実生に感染すると、その菌根を中心として、その菌の感染が広がり、パッチ状の感染域を形成する。同時に、それらのパッチ同士では、互いに排除しあう作用が働く」ことを示唆している。(2)光合成産物の転流ドメイン:コツブタケ菌によるアカマツ菌根苗二本を,両者の菌糸体が接するように根箱で並置栽培した。二週間後、片方の苗の菌糸体に放射性同位元素33Pを含むリン酸を吸収させた後,経時的オートラジオグラフィー法により転流経過を調べた。

その結果、光合成産物と同様に、接する菌株が同菌株の場合には、菌糸が融合して転流ドメインが拡大し、異なる菌株では一方の菌株内に限定されることがわかった。(3)転流駆動力:子実体を発生したウラムラサキ菌によるアカマツ菌根苗を用い、子実体への光合成産物およびリン酸の転流パターンを、トレーサ実験によって調べた。その結果、子実体には、強いシンク能があること、また主に、固定したばかりの光合成産物が転流することがわかった。外生菌根共生系では、個々の菌根から物理的に連絡した菌糸が伸長して、土壌中に菌糸体(初発菌糸体)が発達する。本研究の目的は、初発菌糸体間の相互作用と養分転流に着目し、菌糸体レベルでの菌根菌の実像に迫ることである。1.菌糸体ネットワークの形成過程:昨年度までに、岩上に平面的に発達するコメツガ実生に菌根を形成している菌種が、10cm以下の小さな範囲でパッチ状に分布する傾向があることを明らかにした。今年度は、この点を別の実生でも確認するとともに、個々の菌種について、それが作る菌根の分布の偏りを統計的に検定した。その結果、パッチ状に分布する菌種の他に、比較的広く分布する菌種も混在していることが分かった。2.転流駆動力:コツブタケ菌によるアカマツ菌根苗を根箱栽培して、根外菌糸体を平面的に発達させた。根外菌糸体を人工的に切断した後、宿主からの光合成産物がどのように根外菌糸体内で転流するかを、経時的にオートラジオグラフィーで追跡し、根外菌糸体内のシンク能分布を推定した。その結果、根外菌糸体内での光合成産物の転流パターンは、切断によってほとんど影響を受けないことが分かった。このことから、(1)光合成産物は、根外菌糸体内を縦横あらゆる方向に転流すること、(2)菌糸体内のあらゆる部分が等しく比較的均一な光合成産物に対するシンク能をもっていることが推定された。3.根外菌糸体内のアミノ酸転流:根外菌糸体の養分転流のパターンの一つとして、根外菌糸体に^<14>C-アミノ酸を添加し、その転流パターンを、経時的オートラジオグラフィーによって調べた。その結果、添加部から菌根に向かって、ほぼ直線的にアミノ酸が移動することが分かった。このことから、菌根がアミノ酸に対して、極めて強いシンク能をもつことが推定された。
総括反応モデルを用いた乱流火炎伝ぱDNSのための衝突頻度因子の解析的検討

「総括反応モデルを用いた乱流火炎伝ぱDNSのための衝突頻度因子の解析的検討」の研究を行うため、まず、予混合乱流火炎の伝ぱの数値シミュレーションを行うためのプログラムの開発を行った。プログラムは燃焼モデル以外の仮定をできるだけ少くするために、乱流モデルは用いず格子間隔をコルモゴロフスケール以下とした直接数値シミュレーションとし、また混合気組成、温度変化に応じた物性値の変化などを考慮できるものとした。科学反応については、一段不可逆な総括反応モデルとした。このプログラムを用い、メタン空気予混合気の火炎伝ぱの数値シミュレーションを行った。そこでは総括モデル中の衝突頻度因子を、漸近解析的手法により求めシミュレーションに用いた。得られた予測結果から求めた燃焼速度と実験による実測の燃焼速度との比較から、層流燃焼速度に基づき漸近解析により求めた燃焼速度は、必ずしも実測値とは一致しなかった。求められた頻度因子の値を漸近解析での値から変化させて数値計算を行うと、火炎の厚さや挙動が変化する結果が得られた。シミュレーションにおいては、この総括モデル中の反応の速度を律している衝突頻度因子が、シミュレーションそのものの精度を決定する重要な因子であることが明らかとなった。また、混合気の当量比や燃料の拡散係数などの特性値を変化させながら、シミュレーションを行った結果、漸近解析的手法のみからではその影響を考慮できない因子があることが明らかとなった。
NAD依存性ヒストン脱アセチル化酵素SIRT1の心筋細胞における役割

1.胎仔心臓と不全心におけるSIRT1の細胞内局在1)発生初期(E12.5)と生後10週の心臓におけるSIRT1の細胞内局在を免疫組織染色法により同定した。SIRT1はE12.5では核に局在していたが、10週では細胞質に分布していた。心臓を核分画と細胞質分画に分けてWestern blottingで調べた実験でも同様の結果が得られた。2)拡張型心筋症モデルハムスター(TO-2ハムスター)を用い、不全心におけるSIRT1の細胞内局在を調べた。33週の心不全発症時にはTO-2ハムスターでは核に局在していたが、wild typeではマウスと同様に細胞質に分布していた。2.SIRT1の核-細胞質間移行COS7細胞にGFP融合SIRT1を一過性発現させると核に局在する。このCOS7細胞にL929細胞を加えてポリエチレングリコール処理を行なうと細胞融合が生じ、1つの細胞に2種類の核が存在するheterokaryonとなる。このheterokaryonを調べるとL929細胞の核にもGFP融合SIRT1が存在し、SIRT1が核-細胞質間を移動することが明らかとなった。3.SIRT1の核内移行シグナル(NLS)と核外移行シグナル(NES)の同定SIRT1のアミノ酸配列の解析およびSIRT1の欠失変異体・点変異体の細胞内局在の変化の分析により、SIRT1には2つのNLSと2つのNESが存在することが確認された。4.SIRT1によるアポトーシス抑制C2C12細胞に過酸化水素を加えるとアポトーシスが生じるが、核にSIRT1を一過性発現させた細胞ではアポトーシスが抑制される。NLSあるいはヒストン脱アセチル化酵素(HDAC)活性を持つアミノ酸配列に点変異を導入したクローンには抗アポトーシス効果はみられず、SIRT1によるアポトーシス抑制には核局在性とHDAC活性が重要であることが示された。SIRT1のアミノ酸配列の解析およびSIRT1の欠失変異体・点変異体の細胞内局在の変化の分析により、SIRT1には2つのNLSと2つのNESが存在することが確認された。
分裂酵母のユビキチン経路全体像の把握とプロテオーム構築

既に分裂酵母から同定していた4種のE2に加えて、ゲノム配列の公開された部分からE2の保存ドメインを指標に検索し、新たに9種のE2遺伝子を同定し、その遺伝子とcDNAを分離した。我々以外から発表されているもの1種を含めて、14種を得た。これは出芽酵母のE2分子種の数に既に越えるもので、分裂酵母のE2分子種は出芽酵母のそれを最終的に上回ることになる。これらの遺伝子の遺伝子破壊による機能の探索を行った。分裂酵母のE2分子種の機能的分化は、標準と見做されがちな出芽酵母のそれとは分裂期制御や性変換、不稔性、DNA修復機構など細胞増殖の基本機能に関わる局面でさまざまに様相を異にすることが判明した。これは細胞の基本的な機能を制御しているかなりのユビキチン経路が出芽酵母とは表現型として異なっており、分裂酵母でE2経路の再検討の必要性をさらに強調するものであった。
シグナル因子の固定化配置を応用する幹細胞培養系の開発

光反応性ゼラチンを介して種々のシグナル分子を培養基材表面に固定化した。その表面上で幹細胞を培養し、その分化状態が制御できるかを検討したところ、固定化するマトリックス分子や増殖因子によって、幹細胞の多能性維持、分化誘導などの可能性が示唆された。LIFは未分化維持、activinは量に応じた異なる胚葉系細胞への分化、そしてVEGFは直接マウスiPS細胞からのCD31陽性細胞への誘導が可能であった。培養基材などに増殖因子、サイトカインなどのシグナル分子を固定化することで、細胞の分化や組織形成の誘導に効果があるか、またその条件を示すことを目的としている。因子固定化の手法としてまず、(1)光反応性のヒトゼラチンを作製した。この修飾型ゼラチンは、トランスジェニックカイコによって生産された組み換えタンパク質に光反応性基を導入したものである。シグナル因子と混合して、UV照射することにより、基材-ゼラチン-因子間が共有結合される。この手法で多数種の因子類を、アレー状に個別のスポットとして、培養基材に活性を持った状態で固定化させることが可能となった。また、(2)培養用ポリスチレンの他に、アパタイトやチタンなどの医用材料への因子類の固定化も検討した。その場合は、これら材料への結合性をもつペプチド配列を因子類に連結させて融合タンパク質とする手法をとった。因子類の培地への添加では容器内の環境が一様になるのに対し、スポットアレー状に因子類を固定化すると、容器内に異なる環境区画を作り出すことが可能となる。これによって細胞の因子への反応性を比較することができるだけでなく、それら因子によって異なる刺激をうけた細胞同士がどのような相互作用を行うかを観察する手段が提供されると期待される。これまで主に(1)の手法で種々の増殖因子を固定化し、ヒト血管内皮細胞と平滑筋細胞の共培養に及ぼす効果の検討を行い、VEGFまたはFGFが固定化された区画において、内皮細胞が分岐した毛細血管様構造を形成する可能性が見いだした。この現象は一方の細胞だけではおこらず相互作用の結果と考えられた。また、ヒト骨髄単核球から選別された接着性の細胞に対して、これら血管新生因子が、内皮細胞への分化を誘導する可能性が示された。今年度は(1)固定化用基材としての修飾型マトリックス物質の有効性検証と、(2)シグナル因子の固定化手法の確立および培地条件の検討を進めた。(1)固定化基材:光反応性ヒトゼラチンをUV照射で固定化した培養器において、間葉系幹細胞の増殖が促進されることを見いだした。また、同様に光反応性基を導入したヒアルロン酸(高分子および低分子タイプ)を作成し、それらを固定化した培養器のES細胞増殖への効果を検証した。低分子型が、未分化状態での増殖に有効であること、さらには血管内皮細胞への分化誘導において、その効率が高まることを見いだした(シグナル因子は固定化ではなく、培地に添加)。修飾型マトリックス物質が幹細胞培養に有効である可能性を示した。(2)シグナル因子の固定化:因子類は光反応性ゼラチンと混合することで容器上に固定化が出来る。多数の因子固定化スポットを作るための装置を作製した。これによってウェル内に、複数種の因子を、異なる用量、また異なる種類を組み合わせて固定化が可能となった。異なる環境区画が同一容器内に作れるため、多数の条件を比較しやすい。また固定化区画のサイズや相互の位置関係を変えることも可能で、今後の解析に必要な種々条件をつくれるものと考える。ES細胞は、専用の培地では盛んに増殖したあと2週間程度で死滅したが、アクチビンと増殖因子(FGF,VEGFなど)をあわせて固定化したウェルでは、基礎培地でも長期生存する細胞が出現。基礎培地は低血清濃度で、増殖因子等を添加していないため、固定化された因子が効果を示したものと推定される。また細胞は、リング状の形態をとるものが多くみられ、内皮細胞の管状構造を模倣している可能性もあると考えている。本研究の目的は、マトリックス物質や、増殖因子、サイトカインなどのシグナル因子を培養基材等に固定化することが、幹細胞の培養に有効な手法であるかを明らかにすることである。このため、種々の因子類を、アジドフェニル基を導入したゼラチンと混合し、基材上にスポットして乾燥後、UV照射する時間を調節し、同一容器内にアレー状に固定化した。このような培養器に、ES細胞、iPS細胞を培養し以下のような結果が得られた。1)未分化維持に有効な因子類の固定化。LIF及びMCP1(CCl2、ケモカイン)をそれぞれ単独よりも、あわせて固定化することが、ES細胞の未分化維持に有効であった。2)Activin固定化の効果。

BMP4,FGF2,PDGF,EGF,VEGF,HGFなどとあわせて固定化した領域において、ES細胞の分化状態をFoxA2(内胚葉系)およびSMA(中胚葉系)で検討した。培養後3から12日の間でみたところ、FGF2はactivinの効果を抑制したが、それ以外の因子との共存ではactivinの内胚葉系への分化促進効果が認められた。また、Activin固定化領域外に移動した細胞は中胚葉系の分化傾向を示し、activinの影響を受ける時間が内胚葉分化に影響している可能性を示唆した。3)Actvinなしの条件。多数の因子類(17種類)を固定化して効果を検証し、VEGFが血管内皮細胞への分化を促進していることを、CD31を指標として確認した。「まとめ」本研究により、種々の因子類の組み合わせ方によって、未分化維持あるいは、内胚葉・中胚葉系それぞれへの分化を制御できる可能性が見いだされ、培養基材開発の手がかりを得た。「今後」実用的な培養法とするためには、固定化領域で細胞が同調して分化する条件や、異なる細胞の相互作用を誘発させるための因子配置形状、培地組成の影響などが検討課題である。基材となるマトリックス物質の固定化条件の検討はほぼ終了。シグナル因子類を多数種、異なる条件で固定化配置する手法が確立でき、培養液等の条件もほぼ絞り込めた。このため、今後は、ES細胞への効果の検証を集中的に行える段階に達している。24年度が最終年度であるため、記入しない。最終の目標は、固定化して有効な因子の条件(種類と濃度、組み合わせおよび配置)を明らかにすること。問題としては、検討条件が多く画像データの解析に時間がかかる点。今期の予備結果から考えて、ES細胞から内皮細胞への分化誘導条件について集中して検討する方針である。他の細胞への分化誘導、あるいは未分化状態でのES細胞(可能ならばiPS細胞も)増殖への効果検討も念頭に置くが、共同研究として、外部の協力を頂くことも考えている。
環境機能と治水機能の両立を目的とした河川環境の健全度診断法に関する研究

近年自然災害が急増する中で,河川における洪水氾濫被害の低減を目指した河川整備が重要となる.しかし,生物の生息・生育環境の創出や親水性の高い水辺環境の創出を目的とした河川整備についても行う必要がある.そこで本研究では,治水安全度と環境機能の両立を目指し,河川環境の健全度診断法を確立していくことを目的とする.研究初年度である平成20年度は室内における実験的研究,実河川における観測などを行った.開水路流に関しては,洪水時における植生群落を有する流れ,側岸凹部を有する流れ,洪水氾濫流に関して検討を行った.河道内の植生群落は河川環境の形成において重要な役割を担っている一方,治水安全度上のマイナス面を有する.このため,植生群落の配置の違いによる流動抵抗特性について検討し,その抵抗特性を植生域と非植生域との境界における乱れ特性や運動量輸送特性を明らかにすることで説明した.また,河道側岸に沿う湾状の死水域は多様な生態系や親水性の高い水辺環境を創出するといった機能を有している.このため,流下方向に連続的に側岸凹部を有する開水路流れにおいて,凹部のアスペクト比を変化させたときの抵抗特性について検討し,水面変動特性や運動量輸送特性を明らかにした.さらに,洪水氾濫の被害を低減するため,河道内の洪水氾濫流の挙動を知る必要がある.このため,洪水氾濫流の二次流特性および運動量輸送特性に関して検討した.また,実河川において河川生態系の保全を目的として,絶滅危惧種に指定された植生ヒラモに関する物理的最適生息環境に関する検討を行った.これにより,ヒラモの生息には,砂礫河床であり,比較的水深が浅く,流速が相対的に大きい流況が望ましいことが明らかになった.これらの研究成果は治水および河川環境に考慮した研究内容であり,得られた知見を今後河川環境の健全度診断法の確立に活かしていく.近年自然災害が急増する中で,河川における洪水氾濫被害の低減を目指した河川整備が重要となる.しかし,生物の生息・生育環境の創出や親水性の高い水辺環境の創出を目的とした河川整備についても行う必要がある.そこで本研究では,治水安全度と環境機能の両立を目指し,河川環境の健全度診断法を確立していくことを目的とする.研究初年度である平成20年度は室内における実験的研究,実河川における観測などを行った.開水路流に関しては,洪水時における植生群落を有する流れ,側岸凹部を有する流れ,洪水氾濫流に関して検討を行った.河道内の植生群落は河川環境の形成において重要な役割を担っている一方,治水安全度上のマイナス面を有する.このため,植生群落の配置の違いによる流動抵抗特性について検討し,その抵抗特性を植生域と非植生域との境界における乱れ特性や運動量輸送特性を明らかにすることで説明した.また,河道側岸に沿う湾状の死水域は多様な生態系や親水性の高い水辺環境を創出するといった機能を有している.このため,流下方向に連続的に側岸凹部を有する開水路流れにおいて,凹部のアスペクト比を変化させたときの抵抗特性について検討し,水面変動特性や運動量輸送特性を明らかにした.さらに,洪水氾濫の被害を低減するため,河道内の洪水氾濫流の挙動を知る必要がある.このため,洪水氾濫流の二次流特性および運動量輸送特性に関して検討した.また,実河川において河川生態系の保全を目的として,絶滅危惧種に指定された植生ヒラモに関する物理的最適生息環境に関する検討を行った.これにより,ヒラモの生息には,砂礫河床であり,比較的水深が浅く,流速が相対的に大きい流況が望ましいことが明らかになった.これらの研究成果は治水および河川環境に考慮した研究内容であり,得られた知見を今後河川環境の健全度診断法の確立に活かしていく.
微細組織塊3次元可視化装置と仮想解剖システムを用いた発生学的研究

我々自身が15年をかけて樹立し,維持してきた自然発生鎖肛ブタ家系を有し,継続維持の努力を重ねている.ブタ胎齢20日60日における総排泄腔より直腸と泌尿生殖系への分離による発生過程を中心に個体発生に関する研究をなお続けている.結論としては,総排泄腔の発生学的分離不全が即ち鎖肛である.系統発生学的には水中あるいは水辺の生活を行っていた爬虫類が,陸上生活を強いられて哺乳類に進化して行ったという経過のなかで,排尿と排便の完全な分離と共に,性機能の分離もはたした.哺乳類の進化のなかでこれらの機能は全く後戻りしていない.我々はこのストーリーを3次元画像として語る過程にある.連続切片組織像の画像上の処理,解析が今回の研究における基本であり,ここより出発しえ画像上での仮想断面における解剖,分析作業を行いたい.しかし未だ全く到達点に達してはいない.連続組織切片を作成し,染色により分別する方法以外の直接的な方法での立体像作成を目指して来た.初期胎仔組織は極めて組織間での密度差が少なく,各種レーザー光,X線などによる顕微鏡システムで組織間のコントラストをつけることは極めて難しい.この点単色放射光を用いることが現時点で,最良の方法と考えられる.特に放射光位相差三次元CTは我々の目的に最も近い存在と考えている.我々の施設では,高エネルギー物理学研究所での単色放射光を用いる方法に可能性がもっとも大きく,放射光顕微鏡への基礎的研究を行ったが,位相型X線CT装置についても,資料サイズの点でなお目的を達するには至らなかった.我々自身が15年をかけて樹立し,維持してきた自然発生鎖肛ブタ家系を有し,継続維持の努力を重ねている.ブタ胎齢20日60日における総排泄腔より直腸と泌尿生殖系への分離による発生過程を中心に個体発生に関する研究をなお続けている.結論としては,総排泄腔の発生学的分離不全が即ち鎖肛である.系統発生学的には水中あるいは水辺の生活を行っていた爬虫類が,陸上生活を強いられて哺乳類に進化して行ったという経過のなかで,排尿と排便の完全な分離と共に,性機能の分離もはたした.哺乳類の進化のなかでこれらの機能は全く後戻りしていない.我々はこのストーリーを3次元画像として語る過程にある.連続切片組織像の画像上の処理,解析が今回の研究における基本であり,ここより出発しえ画像上での仮想断面における解剖,分析作業を行いたい.しかし未だ全く到達点に達してはいない.連続組織切片を作成し,染色により分別する方法以外の直接的な方法での立体像作成を目指して来た.初期胎仔組織は極めて組織間での密度差が少なく,各種レーザー光,X線などによる顕微鏡システムで組織間のコントラストをつけることは極めて難しい.この点単色放射光を用いることが現時点で,最良の方法と考えられる.特に放射光位相差三次元CTは我々の目的に最も近い存在と考えている.我々の施設では,高エネルギー物理学研究所での単色放射光を用いる方法に可能性がもっとも大きく,放射光顕微鏡への基礎的研究を行ったが,位相型X線CT装置についても,資料サイズの点でなお目的を達するには至らなかった.雌雄の新生仔鎖肛ブタの手術的処置を中心として鎖肛ブタ家系の維持、継続に努めている。2250日令のブタ胎仔を人工流産により得て、基本的に6μm矢状断連続切片の作成を続けている。これら二次元切片像より三次元立体構築画像を得る作業を行い、仮想解剖システム構築にむけての方策を模索している。微細組織塊可視化には光CT、レザーCT、放射光CTを手段として考えているが、組織の細切は行わずにそのまま三次元測定する方法を検討している。30日令のブタ胎仔標本を用い、セルイジン固定標本を60μm,100μm,20μm厚切片とした。ハロゲン白色光を用いて落射型倒立顕微鏡で分光測定を行ったが、620635nmの波長範囲で吸光度をプロットすると種々の組織を含めて直線に乗っており、適切な範囲と考えられる。試料にダメ-ジを与えず、高出力のものが望ましい。現状では入手可能なHeNeレーザー(633nm)に限定されるが、現有の検出器より高いダイナミックレンジを持つものを求め、S/N比も向上させなければならない。実際には冷却型CCDカメラ、イメージインテンシファイア-が良いものであろう。今回空間分解能および焦点深度を高めるためには共焦点光学系が適していることが示されている。X線元としての放射光は高輝度、波長可変性、準平行性などの非常に優れた特徴を持つが、これを単色放射光とすれば空間分解能は更に優れたものとなる。筑波大学臨床医学系のグループは高エネルギー研究所医学利用ビームラインAR-NE5Aを用いて放射光CTを作成するべく検討を続けているが、なお空間分解能は1mm程度である。放射光顕微像CTを作成するべく検討を始めたが、現在分解能の限界は10μmであることが明らかになった。なお我々の研究には不十分と言わざるを得ないが、放射光利用が問題解決への最良の道の一つと考える。鎖肛ブタ家系の継続維持の為の努力が続いている。鎖肛ブタ胎仔の矢状断連続切片の作成を続けている。2260日令における泌尿生殖器系、総排泄腔、直腸の発生を中心に個体発生学的研究を継続している。これに更に系統発生学的系統を加えている。連続切片組織像より、コンピューター画像上での任意の仮想解剖像構築を目指した作業を続けている。

妊娠初期の微細な体内構造をもつ胎仔の解剖構造を連続組織切片法以外の方法で検討して来た。組織間のコントラストの少ない胎仔組織塊より顕微鏡像レベルでの連続断層像を得る方法の前段階として、拡大断層像を得るための方法を検討した。投影型X線顕微鏡:走査型電子顕微鏡(日立製S-2500CX)の試料部分を生物研究用に改造した装置である(明治大学理工学部三井研究室による)。30日令50日令のホルマリン固定したブタ胎仔を無処置にしてそのまま試料として用いた。1020KeV,710min.の条件で撮像を行ったが、十分な拡大率、分解能などは得られなかった。標本の厚さ、各種染色法などの工夫に成功しない限り、X線CTの可能性はなお得られない。高エネルギー研究所のみならず、日本では更に数カ所での放射光施設が建設予定となっており、単色放射光を利用できる可能性が大きくなってきた。筑波大学臨床医学系の放射線グループでは最近開発し、利用している位相型X線CTが現段階では顕微鏡像CTを作成するのに最も優れた方法である事を確認している。しかし未だ試料サイズ、空間分解能、計測時間などの理想的なレベルには至っていないので、さらなる進歩が期待される。しかし放射光の利用がわれわれの問題を解決するのに最善の方法と考える。15年をかけて独自に樹立し、維持してきた自然発生鎖肛ブタ家系を有し、継続維持の努力を重ねている。ブタ胎齢2060日における総排泄腟より直腸と泌尿生殖系への分離による発生過程を中心に個体発生に関する研究をなお続けている。さらに系統発生学について研究を進めて来た。結論としては、総排泄腟の発生学的分離不全が即ち鎖肛である。系統発生学的には水中あるいは水辺の生活を行ってていた爬虫類が、陸上生活を強いられて哺乳類に進化して行ったという経過のなかで、排尿と排便の完全な分離と共に、性器能の分離もはたした。哺乳類の進化のなかでこれらの機能は全く後戻りしていない。我々はこのストーリーを3次元画像として語る過程にある。連続切片組織像の画像上での処理、解析が今回の研究における基本であり、ここより出発して画像上での仮想断面における解剖、分析作業を行いたい。しかし未だ目的とした到達点に達したものとは言いがたい結果である。連続組織切片を作成し、染色により分別する方法以外の方法での立体像作成を目指して来た。初期胎仔組織は極めて組織間での密度差が少なく、各種レーザー光、X線などによる顕微鏡システムで組織間のコントラストをつけることは極めて難しい。この点単色放射光を用いることが現時点で、最良の方法と考えられる。われわれの施設では、高エネルギー物理学研究所および放射線医学総合研究所の単色放射光を用いる方法に可能性がもっとも大きく、放射光顕微鏡への基礎的研究を行ったが、位相型X線CT装置についても、資料サイズの点でなお目的を達するには至らなかった。
視触覚を用いた能動的感覚運動統合システム

人間の手は、触覚センサとしての機能にアクチュエータとしての機能がうまく融合された、優れたセンシングシステムである。センサである手を動かすといった能動的な情報獲得動作は、触運動と呼ばれ、触覚の機能の拡大ばかりでなく、能動的動作を共通の情報とした視触覚の融合を形成する上で重要な役割を担っている。本研究は、研究代表者等が従来より行ってきた触覚センサの研究をベースに視覚情報を加えることによって、視覚情報と触覚情報とを運動系の情報と統合させること、すなわち触運動の介在による視覚-触覚-運動系の統合を工学的に実現しようとするものである。具体的には、このような系を理論的に考察し、能動的センシングを基本としたアーキテクチャ並びに認識アルゴリズムを実現した上で、実際にそれらに基づいた視触覚融合システムを実現することを目指す。さらにこのような実システムでの評価実験を通して、感覚運動統合系の情報処理機能を理論的・実験的に明らかにすることを目指すものである。前年度までに感覚運動統合系の構造を理論的に考察し、能動的センシングを基本としたセンシングアーキテクチャ並びに認識アルゴリズムを提案・設計し、具体的にシステムを完成させた。また具体的な対象物を想定した認識実験を開始した。平成9年度は、前年度に引き続き、具体的な対象物の認識実験を行い、能動的センシングの役割を明らかにするとともに、感覚運動統合系の情報処理機能を明らかにした。具体的には、1)性能向上のため、DSPボードを強化した。2)引き続き具体的な対象物を設定した認識実験を行い、提案したアーキテクチャ並びにアルゴリズムの評価を行った。3)認識実験の結果に基づき、システムの評価を行い、能動的センシングの役割並びに感覚運動統合系の情報処理機能を明らかにした。
養護教諭の非言語的メンタルケア技法への心理・生理的フィードバックの試み

本研究は、養護教諭が保健室来室者への支援過程において日々実践している非言語的メンタルケア技法の有効性を検証し、その科学的根拠を明らかにするものである。技法は、コミュニケーション能力、自己表現形成能力の育成を目的とした技法(コラージュ制作・粘土造形・語らい・ストレッチング・パロ:メンタルコミットメントロボ・心の色等)について、コントロール群と実践前後の生理的変化、心理的変化から解析した。その結果、今回試みた技法は、児童生徒のストレス緩和において有効である結果が得られ、養護教諭が日々実践している活動の意義を科学的視点から支持する根拠と捉えられた。養護教諭は学校において児童生徒の身体的健康とともに心の健康を支援し、その支援過程において様々な非言語的メンタルケア技法を実践している。そこで本研究は、養護教諭の経験知や経験的主観に因る現在の実践技術の効果を科学的に評価し、その有効性を検証するものである。本年度は、来室した児童生徒のストレス緩和のために養護教諭が行っている休養またその時に付随して行われる技法の効果について検討した。被験者に体位(椅子に座る・ベットに横になる・立位)と条件(ストレス:負荷・毛布の使用・時間経過等)を課し、実践前後及び経過中のストレス応答の変化(唾液:アミラーゼ・コルチゾール・DHEA・slgA・CgA)(2)心理的変化(POMS短縮版)(3)アナログスケールによる自己評価より検証した。その結果、休養の体位と条件を見てみると、ストレス応答物質の量が減少したのは、「座位+毛布」「横位+毛布」であり、増加したのは、「座位のみ」「横位のみ」であった。またさらにこれらを時間の経過で見てみると、開始後20分後に顕著な変化が現れた。また、これらの変化は個々の対象者間で見ると個体差が大きかった。したがって個体差も影響要因であった。また、体験後の自己評価では、休養の効果が高いのは「横位+毛布」「座位+毛布」であり、ここでは精神の安定・安心感、ぬくもりの獲得・思考の整理が見られた。なお、心理検査においては、今回時間ごとに頻回におこなったこと、対象人数等により明確な結果が得られず、今後の検討事項である。今回は、養護教諭が行う非言語的メンタル技法のひとつである休養とその条件に視点を当て検証した結果、休養の体位と条件によってその有効性に差異があること、さらに、身体の反応における時間経過にも影響することが示唆された。本研究は,養護教諭の経験知や経験的主観に因る現在の実践技術の効果を科学的に評価し,その有効性を検証するものである。本年度は,児童生徒のコミュニケーション能力や自己表現能力の育成の目的で,保健室において実践されている技法や実践可能な技法について心的影響や生理的有効性を解析検証した。検証した技法は,「コラージュ制作」「粘土制作」「パロ(メンタルコミットメントロボット)との触れ合い」である。これらの3技法について,実践前後の(1)ストレス応答の変化(唾液:アミラーゼ・コルチゾール・s-IgA・クロモグラニンA)(2)心理的変化(STAIによる心理テスト(3)アナログスケールによる自己評価,より検証した。メンタルコミットメントロボットパロは,STAIによる状態不安尺度,ストレス応答物質反応ではコルチゾールの変化が見られた。さらに,自己評価では前後比較の3項目に変化が見られた。次にコラージュ制作では,STAIによる不安尺度の変化は見られなかったが,ストレス応答物質反応ではアミラーゼとコルチゾールに,また,自己評価では2項目において変化が見られた。粘土制作においては,STAIによる状態不安尺度,ストレス応答物質反応ではコルチゾールにおいて変化が見られた。さらに,自己評価では1項目に変化が見られた。以上の結果より,今回試みた技法が,児童生徒のストレス緩和において心理的・生理的に有効であることを示唆する結果を得た。したがって,養護教諭が日々実践している活動の意義を科学的視点から支持する根拠となると考えられる。養護教諭は学校において児童生徒の心身の健康保持を支援しており、その過程において養護教諭自身の経験知や経験的主観に因る様々な非言語的メンタルケア技法を実践している。本研究はその実践技術の効果を検証するものである。今回検証した技法は、養護教諭が日々実践している非言語的メンタル技法におけるコミュニケーションづくりの「会話・語らい」「パロ(メンタルコミットメントロボット)との触れ合い」およびストレス緩和の目的で行っている「ストレッチング」の3技法である。これらの3技法について実践前後の変化、コントロール群との比較変化を、(1)ストレス反応の変化(唾液:アミラーゼ・コルチゾール・s-IgA・クロモニングラムA)(2)心理的変化(STAIによる心理テスト(3)アナログスケールによる自己評価(楽しい・気持ちが軽くなった・元気が出た)より検証した。その結果、「ストレッチング」は、ストレス反応の変化、STAIによる心理的変化さらに自己評価の全てにおいて変化が見られた。

また、「会話・語らい」・「パロ(メンタルミットメントロボット)との触れ合い」においては、STAIによる心理的変化と自己評価に有意な変化が見られた。よって試みた技法は児童生徒のストレス緩和において心理的・生理的に有効であることが示唆された。
スタチンナノファイバーを用いた局所異所性の骨再生に関する研究

生体吸収性ナノファイバーと自己の骨髄間質細胞と組み合わせることで、マウスの皮下に著明な異所性骨形成を誘導することに成功した。また高脂血症治療薬として世界中で広く使用されているスタチンをこのファイバーより徐放させることにより、生体内で骨形成がより促進されることが確認された。骨組織の形成をほぼ確実かつ著明に示す今回の実験結果から、この新しい手法が今後大型骨欠損の骨再生に対して適応できる可能性が示唆された。これまでわれわれは生体吸収性ナノファイバーを用いた薬剤徐放化システムを開発してきた。そこで、今回骨再生治療を目的として、細胞の内因性BMP-2を誘導することで知られるスタチンを徐放させるナノファイバーの開発をし、それを足場材料として未分化間葉系幹細胞(MSCs)と組み合わせることで骨再生を試みた。本年度では、研究実施計画に基づき、以下の2点について検討を行った。1.スタチンナノファイバーの骨再生における使用条件の最適化in vitroで、スタチンの種類(脂溶性・水溶性)及び濃度を様々に設定し、statinによるMSCsの骨分化誘導能を(1)Alkaline Phosphatase活性などの骨マーカー(2)Cell counting kitを用いた細胞増殖能の二点を測定することでその影響を検討し、スタチンナノファイバーに混入するスタチンの種類、配合率等の決定を行った。2.細胞(MSCs)とスタチンナノファイバーの接着に関する最適条件の検討まず播種細胞数、播種法を様々に設定し、Cell counting kitを用いてファイバー上の接着細胞数を確認することで、播種細胞数及び効率的な細胞播種法の決定を行った。また、電子顕微鏡像を用いてスタチンナノファイバーに対する緊密な細胞接着状況を確認した。スタチンナノファイバーと細胞の詳細な使用条件が決定されたことで、今後の遺伝子、タンパク質発現の解析、さらに移植実験における骨再生の確認のための基盤を築いたこれらの基礎実験の意義は大きいと考える。今回骨再生治療を目的として、細胞の内因性BMP-2を誘導することで知られるスタチンを徐放させるナノファイバーの開発をし、それを足場材料として骨髄間質細胞(BMSCs)と組み合わせることで骨再生を試みた。前年度に行ったスタチンナノファイバーの骨再生における最適化(スタチンの種類、濃度・配合率、細胞播種法等)に基づき、活性化シンバスタチンを0.025wt%の濃度で作製したスタチンナノファイバーに細胞を播種し、シンバスタチンの、細胞とナノファイバー間における初期接着・増殖に対する影響を評価したところ、シンバスタチン非含有ナノファイバーと比較して、ほぼ同等の初期細胞接着数及び細胞増殖率を確認することができた。またマウスの背部皮下にBMSCsを播種したスタチン非含有ナノファイバー及びスタチンナノファイバーを移植し、6,12週後に取り出したものをX線写真にて評価したところ、ともに強い不透過像を認めた。さらに移殖後12週の組織からRNAを抽出し、骨関連遺伝子の発現をRealtime-PCRにより定量したところ、スタチン非含有群と比較して、スタチン含有群では骨関連遺伝子の発現が上昇する傾向が見られた。さらに取り出した組織切片をHE染色及びBSP(Bone Sialo protein)免疫染色を行い、画像解析ソフトにて評価したところ、スタチン非含有群と比較して、スタチン含有群においては、骨形成率及びBSP陽性細胞率が有意に上昇する傾向が見られた。異所性に骨様組織の形成をほぼ確実に示す今回の実験結果から、この新しい足場材料が、骨形成を目的とした骨髄間質細胞の足場としては有用であり、今後大型骨欠損に対する骨再生に応用できる可能性が示唆された。