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養育行動の生物学的基盤　～ニホンザルを用いての検討～

このような学会参加では、自身の研究を広めるだけでなく、様々な研究分野における最新の知見に触れ、情報収集を行うことができた。本年度は、さまざまな実験を進めることを最優先に研究活動を行った。昨年度から継続して行っている選好注視法の実験では、妊娠前後期のニホンザルメスを中心に多くの個体で実験を実施した。出産期は56月であり、交配させた時期から出産予定日を割り出し、その前後で選好注視法を実施した。妊娠個体は神経質なため、移動式の選好注視測定装置ではなく、個別ケージの前にモニターを設置し乳児カテゴリーの画像とアダルトカテゴリーの画像を対呈示して視線配分を測定した。その際、出産予定日1か月前から対象個体の尿のサンプリングも併せて行った。尿中のオキシトシン濃度を測定することが目的で、選好注視における実験結果と内分泌動態の関連について調べるために実施した。また、選好性とは別に、乳児に対する視覚的な注意について調べるために、新たな実験も行った。前述の選好性の実験では、画像の呈示時間を長く設定し、その間の視線配分を計測していたが、本実験では、画像の呈示時間を短く設定し、選択的な注意の捕捉がみられるかを検討した。Dot-probe課題という手続きを新たに導入し、ニホンザル向けに一部改変して実施した。Dot-probe課題では、まず実験動物は、タッチパネルに呈示されるドットをより素早くタッチするように訓練される。反応速度や正答率が安定してきた後、ドットが出現する直前に任意のオトナ画像と乳児の画像を対呈示し、ドットへの反応速度を記録した。どちらかの画像に対する選択的な注意がみられる場合には、ドットへの反応速度に影響がみられることが期待された。メスニホンザル3頭を対象に、この課題を実施した結果、乳児カテゴリーの画像への視覚的な注意の捕捉効果が示唆された。この実験は、刺激画像の種類を変更して現在も継続中である。この他、博士論文を執筆したり、上述の実験のデータの分析を積極的に行った。26年度が最終年度であるため、記入しない。今年度は、視覚対呈示法に加え選好注視法を用いて研究を行ってきた。論文を一本掲載することができたという点は満足しているが、研究の目的である養育行動の生物学的な基盤を探るため、より様々な社会経験を持つ個体を用いることや生理学的な指標を取り入れることを目標にさらに研究を深めていきたい。今年度は、30頭以上の個体を対象に多様な刺激を用いて行動実験を行うことができた。様々なライフステージにおけるメスを対象に、行動実験及び、尿のサンプリングをし、内分泌動態と行動との関連を調査する足がかりができたのは、来年度につながる大きな成果と言える。また、修士の際に行った研究の一部も論文にまとめることができた。次年度も、引き続き妊娠前後期のメスの行動実験及び採尿を続け、個体数を増やして結果を論文にまとめられるよう邁進するのみである。前年度の研究をふまえ、本年度は可動式ケージを用いて所内にいる数多くの個体を対象に実験を行う予定である。霊長類研究所には、様々な社会経験を持つニホンザルがいるため、個体のヒストリーをそろえて群間比較することが可能である。昨年度に設計した可動式ケージを用いることによって、研究室の所有しているニホンザルがいる建物以外の飼育舎にも出張して実験ができるため、研究の幅が広がるだろう。
培養細胞からの電気・光学的信号を検出するためのマイクロデバイス

本研究では、マイクロ流体デバイスの応用の一つとして、細胞を計測するデバイスを取扱う。半導体微細加工技術を利用すると数十ミクロン百ミクロン程度のサイズの流路を製作することができるが、細胞のサイズは概ね十ミクロン数十ミクロンであるため、このような流路を用いれば細胞一つ一つを独立に流路内に導入することが可能である。細胞を、その性質に応じて分離する方法として蛍光標識を用いるFACS (Fluorescent Assisted Cell Sorting)が一般に用いられているが、装置が大型化することや、細胞を再利用する際の蛍光標識の影響が明らかでないことなど、いくつかの問題も指摘されている。本研究では、微小流路の近傍に同様のサイズの電極構造を集積化し、交流電界を加えることによって、細胞一つ一つについて、その電気的な特性(主としてインピーダンス)を計測することを目指す。これまでに数十メガヘルツまでの計測は試みられているが、本研究ではギガヘルツオーダーまでの計測を試み、細胞だけでなく細胞内小器官や分子レベルの計測についても、その可能性を探る。研究初年度である平成15年度は、主として計測に用いるデバイスの設計を行うと同時に、インピーダンス計測に必要な回路系などの準備を行う。具体的には、シリコーンゴムの1種であるPDMS(Polydimethylsiloxane)を用いて流路を製作し、その流路内部あるいは近傍に電極構造を作り込む方法について検討を加える。PDMSは型とりによって容易にマイクロ構造を形成できることから、近年では広くマイクロ流体デバイスの製作に用いられているが材料の柔軟性等によって、例えば金属薄膜製の電極をパターニングすることが困難であった。これに対して、PDMSとガラス基板との組合せ等、単なるマイクロ流体デバイスとは異なる構造を考えることによって、細胞計測に適したデバイス設計を行うことが平成15年度の目標である。
意識構造と栄養素摂取量に対応したサプリメント利用に関する教育プログラムの構築

サプリメントの利用に関する栄養教育プログラム構築を目的として、1517年度にかけてサプリメントの利用と価値観、摂取栄養量との関係を把握した結果、サプリメント利用の要因は体調不良と食生活の自己評価の低さであり、食生活の自己評価の低さにはファッション、栄養、健康情報などが連動していた。一方、陰膳方式による食事試料の分析、食事記録の解析からは、サプリメント利用者の食生活が非利用者の食生活より評価できないとはいえず、自らの食事内容を正しく評価できていないことが示された。これらの結果をうけて、17年度はさらにサプリメントを利用している女子大学生18名を対象に栄養教育介入試験を行った。まず、サプリメントによる栄養素の補給が必要であるか否か、あるいはどの程度必要であるかの問いかけを行った。次いで「栄養成分の知識」あるいは「価値観」とサプリメントの利用行動との関係を対象者自身が分析し、その後3ヶ月間、目標達成確認を行った。その結果、対象者の「栄養成分の知識」の向上は、サプリメントの利用を中止するのではなく、適正利用の方向へ意識づけるものであった。しかしながら、様々な要因により不規則な生活を余儀なくされた場合にはサプリメントに依存する方向となった。一方、「食事、生活習慣に対する価値観」への介入は、多くの対象者が「食事内容とサプリメントの利用は関連していない」と捉えているために関連づけるための期間(より多い介入回数)が必要となるものの、食事そのものを重視することとなり、過度な利用につながらなかった。これらのことから、今後の栄養教育にあたっては、「栄養成分の知識」のみではなく、「価値観」を含めた指導が重要であると考えられた。なお、サプリメント利用者は家族との精神的つながりを強く意識していることから、家族を巻き込んだ栄養教育が効果的であるといえた。サプリメントの市場規模は拡大の一途にあり、その利用は食生活状況のみでなく心的状況(価値観)から決定される。本研究は個人の価値観とサプリメント利用状況の関係を把握し、かつ、サプリメント利用者の摂取栄養量と利用サプリメントの関連を捉え、サプリメント利用に関わる教育プログラム構築を目的としている。15年度は、様々な属性の対象者にサプリメントの利用状況、食生活状況、食意識、価値観について調査・解析(クロス集計、探索的因子分析等)を行ない、サプリメント利用者の特徴の明確化を試みた。その結果、若年女性の約半数、若年男性の約2割がサプリメントを利用しており、必ずしも都市部での利用度が高いとはいえなかった。サプリメント利用の直接的要因は、体調不良と食生活の自己評価の低さであったが、その背景として家族との精神的つながりを強く意識していることが認められ、そのことは家族が購入したサプリメントの利用につながっていた。なかでも女子高校生では、家族との強い精神的つながりと自分自身に対する自信が精神的余裕となり、この余裕がファッション・映画等などの余暇関連情報への関心、得られた情報に連動した食生活の評価につながっていると推察された。一方、スポーツサプリメントは食生活状況・体調が良好である若年男性が家族以外の勧めによって利用し、その利用は約半数に達していた。また、サプリメント利用者から陰膳方式で収集した食事試料についての栄養成分量の実測(現在までの分析:60食分)では、総脂肪量、脂肪酸組成、各ステロール量に利用者と非利用者で顕著な差は認められず、食生活に対する不安感がサプリメントの利用を促すという意識は適正な自己評価とはいえないのかもしれないことが示された。この食事試料分析および最終的考察は16年度にかけて行う計画であり、現在、脂溶性・水溶性ビタミンについての分析を進めている。サプリメントの市場規模は拡大の一途にあり、その利用は食生活状況と価値観から決定される。本研究はサプリメントの利用と価値観、摂取栄養量との関係を把握し、サプリメント利用に関わる教育プログラム構築を目的としている。16年度はサプリメント利用者が実際に摂取している食事の特徴を明確化することを目的とし,サプリメント利用者,非利用者から陰膳方式で収集した食事試料の栄養成分量(脂溶性成分)を実測(摂取サプリメントを除く)し,食事記録の解析も行った。食事分析の結果,総脂肪酸摂取量(サプリメント利用者:33.5g/日,サプリメント非利用者:34.3g/日)に差は認められなかったが,飽和脂肪酸摂取量はサプリメント利用者で有意に低かった。SMP比,n-6/n-3比は,食事記録からの計算値ではサプリメント利用者の方が食事摂取基準推奨値に近かったが実測値に差が認められず,これはサプリメント利用者のPUFA摂取量(特にn-3系PUFA)が計算値よりも実測値で有意に低いためであった。また,ステロール類の摂取量にサプリメント利用者とサプリメント非利用者で差は認められなかった。しかし,コレステロールの実測値は計算値よりも低く,サプリメント利用群では計算値の64.4%,サプリメント非利用群では計算値の74.7%であった。さらに食事記録からの計算値ではカロテンの摂取量はサプリメント利用者が有意に多かった。また、サプリメント利用者は摂取食品数が多く,特に果物・海藻・野菜類,魚料理の摂取頻度が高かった。加えて、調理方法も多様でありそのため揚げ物の摂取回数も多かった。脂溶性成分は調理過程で溶出するために計算値と実測値に差が生じるが,サプリメント利用者の食生活は多様であり,このことが自らの食事内容を正しく評価できないことにつながりサプリメント利用に結びついているのではないかと考えられた。

サプリメントの利用に関する栄養教育プログラム構築を目的として、1517年度にかけてサプリメントの利用と価値観、摂取栄養量との関係を把握した結果、サプリメント利用の要因は体調不良と食生活の自己評価の低さであり、食生活の自己評価の低さにはファッション、栄養、健康情報などが連動していた。一方、陰膳方式による食事試料の分析、食事記録の解析からは、サプリメント利用者の食生活が非利用者の食生活より評価できないとはいえず、自らの食事内容を正しく評価できていないことが示された。これらの結果をうけて、17年度はさらにサプリメントを利用している女子大学生18名を対象に栄養教育介入試験を行った。まず、サプリメントによる栄養素の補給が必要であるか否か、あるいはどの程度必要であるかの問いかけを行った。次いで「栄養成分の知識」あるいは「価値観」とサプリメントの利用行動との関係を対象者自身が分析し、その後3ヶ月間、目標達成確認を行った。その結果、対象者の「栄養成分の知識」の向上は、サプリメントの利用を中止するのではなく、適正利用の方向へ意識づけるものであった。しかしながら、様々な要因により不規則な生活を余儀なくされた場合にはサプリメントに依存する方向となった。一方、「食事、生活習慣に対する価値観」への介入は、多くの対象者が「食事内容とサプリメントの利用は関連していない」と捉えているために関連づけるための期間(より多い介入回数)が必要となるものの、食事そのものを重視することとなり、過度な利用につながらなかった。これらのことから、今後の栄養教育にあたっては、「栄養成分の知識」のみではなく、「価値観」を含めた指導が重要であると考えられた。なお、サプリメント利用者は家族との精神的つながりを強く意識していることから、家族を巻き込んだ栄養教育が効果的であるといえた。
溶液内の遷移金属錯体・クラスターの安定性とダイナミックスに関する講究

本年度の活動で得られた成果の一部は以下の通りである。(1)かご型球状錯体MnL2n(n=2から12)に対して量子力学モデル(QMHM)による計算を完了し、一般化ボルンモデルに基づく溶媒和効果の検討を行った。対アニオンの効果などについても考慮しながら、現実の系におけるこれら錯体の相対的安定性を議論した。(2)東京大学佃研究室で観測されているAlnC2-の構造探索を行い、サイズ毎の安定構造について調査した。Distance geometryに基づく探索アルゴリズムを開発することによって、広域な構造探索を可能とした。量子力学モデル(QMHM)の利用や、より簡便な経験ポテンシャルの利用によるエネルギー評価も検討したが、最終的には小サイズのクラスターについてCCSD法などの高精度計算法と比較しながら汎用の密度汎関数理論を用いた。n=11までで最安定構造の他に準安定構造(異性体)を900以上見つけ出すことに成功した。(3)相互作用する分子の集合過程を記述する上で、自由度数が多くなると3D-SSSV法などの時間依存分布関数を通じた取り扱いが困難である。そこで自己集合系を対象に粗視化モデルを新たに作成し、形成経路を特徴付ける試みを行った。具体的には分子動力学計算を行ってエネルギー面の大域的探索を行った。得られた構造群をクラスタリングを用いて分類して遷移過程を特徴付けることで反応経路を浮き彫りにした。(4)分子の構造は三次元の直交座標系を用いて規定されるが、Z-matrixなどの内部座標でも表現される。一般に後者には恣意性や冗長性がある。そこで対称座標を導入することでこれら複数の座標表現を結びつけ、冗長性を取り除くプログラムコードを開発し、具体的な分子へ適用した。(5)液体の静的構造に着目し、基本測度理論を利用しながら古典的な密度汎関数理論の構築に取り組んだ。本課題では、(A)物理化学的に見通しの良い、分子の電子状態を記述する量子化学の方法論、(B)溶媒和や、拡散に代表される物質輸送現象を解析的・代数的に扱う統計力学理論を二つの柱として掲げている。前者においては、個別の系の性質を精査しながら、量子力学モデル(QMHM)や汎用の量子化学計算を適用している。含炭素アルミニウムアニオンクラスターの研究が完了するなど順調に進捗している。後者に関しては、液体構造を精度よく計算するためにより第一原理的な立場から方法論の構築に取り組んでいる。さらに(A)と(B)二つの観点の統合を目指し、分子やその集団がとりうる構造、輸送現象などダイナミクスを記述する方法について調査を進めている。前項の(A)については、これまで取り組んできた量子力学モデル(QMHM)を用いて遷移金属錯体の計算に関して、溶媒和効果を含む相対的な安定性について得た結果の取りまとめを進める。また分子の電子状態を記述する上で、実験との直接的な比較を行いやすい物理量を対象とした方法論の開発に取り組む。具体的にはNMR化学シフト(磁気遮蔽)を取り上げ、溶媒和に伴う電子状態の変化をより定量的に議論できる基盤整備を目指す。さらに前年度含炭素アルミニウムアニオンクラスターの研究において用いたdistance geometryに基づく探索アルゴリズムは、クラスターのように個別の原子が単位となって集合している系の構造探索には有効であるので、一般の多原子分子への拡張を検討する。(B)については、より体系的でより高精度の記述ができる分子性液体の統計力学理論が必要であることから、古典的密度汎関数理論に基づく研究を継続し、多原子分子からなる液体の静的構造(分布関数)の精密化を図り、構造とダイナミクスに対する理解を深める。本研究課題では、我々がこれまでに開発してきた理論を発展させながら、遷移金属を含む錯体やクラスターの溶液中の安定性やダイナミクスを調べている。本年度は(A)量子化学モデルを用いて八面体カプセル型の遷移金属錯体を、また(B) 3D-RISM法や3D-SSSV法を用いて液体分布を調べるとともに新規方法論開発を行った。(A)遷移金属を含む系の計算は広く行われるようになりつつあるが、3ー4つ以上の遷移金属を含む複核錯体は、一般に計算負荷が大きい。そこで分担者・井内らによって開発された量子化学モデルハミルトニアンの方法に基づいて、こうした錯体をターゲットとした計算を行った。具体的にはPdイオンと配位子をモデル化したピリジン(Py)からなる[PdPy4]2+における配位子置換反応について通常の密度汎関数理論(DFT)による計算を行い、この結果を1kal/mol程度の差異で再現できるようにモデルのパラメータを決定した。ついでこのモデルを用いて八面体カプセル型錯体を構成する10種類以上の過渡種について計算を行った。DFT計算と比較した誤差の絶対値はやや大きくなるものの、全体のエネルギーに対しては数パーセント程度であり、十分な精度で幅広い化学種の計算が可能となった。(B) 3D-SSSV法や、拡散律速反応を記述する理論など、溶液内分子のダイナミクスを記述するための統計力学理論、とりわけ相互作用点表示に基づく液体の積分方程式理論について、これまでの発展を総括した。また三次元空間における拡散方程式を数値的に安定に解く技術を確立した。また二次電池で重要となるグラファイト近傍の電解質を構成するイオンと溶媒の構造について明らかにした。当初掲げていた量子化学モデルハミルトニアンの方法は、通常の量子化学計算と同程度の精度で広範な化合物に適用できることが分かった。実際の計算も効率よく、複雑な反応過程を調べる上で有用である。

分子の溶媒和・動態に関わる(B)については、実際上の問題点も明らかにすることが出来た。本年度の活動で得られた成果の一部は以下の通りである。(1)かご型球状錯体MnL2n(n=2から12)に対して量子力学モデル(QMHM)による計算を完了し、一般化ボルンモデルに基づく溶媒和効果の検討を行った。対アニオンの効果などについても考慮しながら、現実の系におけるこれら錯体の相対的安定性を議論した。(2)東京大学佃研究室で観測されているAlnC2-の構造探索を行い、サイズ毎の安定構造について調査した。Distance geometryに基づく探索アルゴリズムを開発することによって、広域な構造探索を可能とした。量子力学モデル(QMHM)の利用や、より簡便な経験ポテンシャルの利用によるエネルギー評価も検討したが、最終的には小サイズのクラスターについてCCSD法などの高精度計算法と比較しながら汎用の密度汎関数理論を用いた。n=11までで最安定構造の他に準安定構造(異性体)を900以上見つけ出すことに成功した。(3)相互作用する分子の集合過程を記述する上で、自由度数が多くなると3D-SSSV法などの時間依存分布関数を通じた取り扱いが困難である。そこで自己集合系を対象に粗視化モデルを新たに作成し、形成経路を特徴付ける試みを行った。具体的には分子動力学計算を行ってエネルギー面の大域的探索を行った。得られた構造群をクラスタリングを用いて分類して遷移過程を特徴付けることで反応経路を浮き彫りにした。(4)分子の構造は三次元の直交座標系を用いて規定されるが、Z-matrixなどの内部座標でも表現される。一般に後者には恣意性や冗長性がある。そこで対称座標を導入することでこれら複数の座標表現を結びつけ、冗長性を取り除くプログラムコードを開発し、具体的な分子へ適用した。(5)液体の静的構造に着目し、基本測度理論を利用しながら古典的な密度汎関数理論の構築に取り組んだ。本課題では、(A)物理化学的に見通しの良い、分子の電子状態を記述する量子化学の方法論、(B)溶媒和や、拡散に代表される物質輸送現象を解析的・代数的に扱う統計力学理論を二つの柱として掲げている。前者においては、個別の系の性質を精査しながら、量子力学モデル(QMHM)や汎用の量子化学計算を適用している。含炭素アルミニウムアニオンクラスターの研究が完了するなど順調に進捗している。後者に関しては、液体構造を精度よく計算するためにより第一原理的な立場から方法論の構築に取り組んでいる。さらに(A)と(B)二つの観点の統合を目指し、分子やその集団がとりうる構造、輸送現象などダイナミクスを記述する方法について調査を進めている。(A)の量子化学モデルハミルトニアンについては、サイズの異なる自己集合型錯体や均一触媒反応などへの展開を行う。特に前者に関しては溶媒和をも考慮した安定性を議論する。(B)3D-SSSVやこれまでに開発してきた輸送現象用の積分方程式は非常に有用である一方で、拡散による分子の移動に対する原点の定義や初期条件など、自己集合過程に適用する際の実際上の考慮点が明らかになってきた。
絶滅危惧種ヘイケイヌワラビ(イワデンタ科;シダ植物)の保全生物学

1.ヘイケイヌワラビ産地の現状調査兵庫の集団では植生を含む現状調査を行った。林相は常緑カシ類、ブナなどが混在するアスナロ林であり、植生学的には、照葉樹林とブナ林の境界にあたる。15m平方のコドラート(下辺が谷から13m)を設定した。ヘイケイヌワラビ(ヘイケ)23株・タニイヌワラビ(タニ)41株・アキイヌワラビ(ヘイケとタニの雑種、アキ)35株を多く含むコドラート外を含めると、ヘイケは計49株を確認できた。ヘイケイヌワラビの葉身長は最大で32cmで、10cm未満の株も1割程度含まれる。7月上旬では葉を展開しきっておらず、しっかりとした成葉となるのは7月下旬であった。現地での胞子嚢の成熟は悪く、今年度は現地個体から十分量の胞子を得られなかった。猛暑による現地の乾燥のためかもしれない。さらに全国のヘイケの産地(鳥取・広島・島根・山口)7ヶ所について、現地調査・聞き取り調査を行った。鳥取・広島の各1集団は現存が確認できない。鳥取・広島の各1集団は10株未満で、極めて危険な状態にある。島根の2集団はともに100株以上の個体があり、比較的良好な状態にある。山口の集団は40株程度である。2.酵素多型による調査兵庫20個体、島根10個体について、電気泳動法により、AAT/HK/PGI/PGMで解析可能なザイモグラムが得られたが、まったく単型であった。3.胞子からの増殖兵庫県産の栽培株から11月に得られた胞子を、1/2000ハイポネックスを含む寒天培地播種した。2024時間照明の状態で1週間程度で発芽して、2ヶ月で幅10mm程度の前葉体が形成された。現段階では造精器のみ観察されている。少なくとも前葉体は容易に成長する。今後の継続観察を要する。
東アジアからの越境汚染を中心とした大気中ガス状・粒子状有機硝酸の動態解明

粒子状有機硝酸(PONs)は二次有機エアロゾル(SOA)の中で重要な側面を持つ可能性が指摘されているが、現在までの研究例は極めて少ない。本研究ではまずPONs連続測定装置を開発し、その後能登半島珠洲においてPONsとガス状有機硝酸(GONs)の同時連続観測を実施、特に大陸からの越境汚染による影響を中心としたPONsとGONsの動態を明らかにする。平成30年度では引き続き、能登半島珠洲においてPONsの連続観測を行った。また、同時にGONs、O3、CO、NOx、総反応性窒素酸化物(NOy)、全硝酸(T.NO3)の連続観測も行った。これらの観測については大きなトラブルもなく、観測開始から平成30年度末まで概ね1年以上のデータを蓄積することができた。平成29年11月から平成30年10月までに測定されたGONs、PONsの平均濃度はそれぞれ0.370、0.017 ppbvであり、PONs/GONs濃度比は4.6%であった。PONs濃度は全般的に非常に低く、多くの期間で検出下限前後の値であった。そのため、現時点で季節変動などの議論を行うことは困難である。一方、散発的にPONs濃度の上昇がみられ、特に平成30年3月下旬において最大0.3 ppbv程度のPONsが観測された。PONsの濃度上昇が見られた期間はGONsやNOy、T.NO3、O3、CO濃度も上昇した。一方、NOx濃度の上昇は見られなかったことから、この高濃度イベントは長距離輸送の影響によるものと考えられる。また、同時観測を行っていた長崎県福江島におけるNOy、T.NO3の濃度変動、後方流跡線解析や天気図の結果より、この高濃度イベントは、アジア大陸由来の汚染物質が移動性高気圧の周回流によって日本に越境輸送された結果であると考えられる。アジア大陸からPONsが越境輸送される事例を観測により明らかにしたのは本研究が初めてである。申請書に記載していた平成30年度の実施計画は、能登半島珠洲におけるPONsおよびGONs濃度の連続観測を実施し、(1) PONs濃度レベルについての知見を得ること、(2)有機硝酸のガス・粒子分配比についてのデータを得ること、(3)大陸からの越境汚染が起こっているイベントを抽出し、その解析を行うことであった。(1)、(2)については、平成29年11月より1年以上のデータを蓄積しており、順調にデータ・知見を得ている。(3)についても、現在までの観測において大陸からの越境汚染が起こっているイベントが見られており、現在順調に解析を進めている。以上のことから、本申請研究は現時点でおおむね順調に進展していると考えられる。PONs、GONs濃度の連続観測については、順調にデータを蓄積できているので、平成31年(令和元年)度においても継続する予定である。今年度が最終年度となるが、2年分のデータを蓄積することを目標とし、早くとも令和元年10月末までは観測を継続する予定である。研究実績の概要にも記載したが、PONs濃度は全般的に低く、今後データを積み重ねてもPONsの季節変動を議論することが困難である可能性がある。その場合は越境汚染など高濃度イベントに注目したデータ解析を中心に行う予定である。大気中の二次有機エアロゾル(SOA)はPM2.5の中でも主要な成分の一つであり、その動態解明は重要な課題である。その中でも、粒子状有機硝酸(PONs)はSOAの中で重要な側面を持つ可能性が指摘されているが、現在までの研究例は極めて少ない。本研究では、先行研究で開発したガス状有機硝酸(GONs)連続測定装置を応用し、PONs連続測定装置を開発することが最初の目的である。また、開発した装置を能登半島珠洲に設置し、PONsとGONsの同時連続観測を実施、特に大陸からの越境汚染による影響を中心としたPONsとGONsの動態を明らかにすることが最終目的である。平成29年度においてはまず、能登半島珠洲におけるPONsの連続観測を開始するために、熱分解ーキャビティ減衰位相シフト分光法によるPONs連続測定装置の開発を行なった。GONsや二酸化窒素などPONs測定の干渉となる気体成分を除去するための活性炭デニューダー以外は、ほぼGONs測定装置と同じ原理のため、活性炭デニューダーの最適化について行った。活性炭デニューダーについては、気体成分の除去効率がほぼ100%であること、PONsの透過効率が90%以上であること、連続観測に耐えうるのに十分な、数ヶ月以上の破過容量を有することを確認した。平成29年11月初頭より、本装置によるPONsの連続観測を開始した。現在まで大きなトラブルは生じていないが、平成29年度終了時点では、大規模な越境汚染イベントが観測されず、また、解析するのに十分なデータが揃っていないため、詳細な解析については進んでいない。一方、活性炭デニューダーをより小型で扱いやすいものにするため、活性炭素繊維シートを用いた活性炭デニューダーの開発についても現在行っている。こちらについても、従来の活性炭デニューダーとほぼ同等の性能が得られることを確認した。平成29年度の実施計画は、PONs連続測定装置を構築し、能登半島珠洲においてGONsとPONsの同時連続観測を開始することであった。それについては、予定より早く平成29年11月初頭から実施することができた。また、現時点で連続観測に支障をきたす大きなトラブルは生じていない。

一方、現時点では解析するのに十分なデータが揃っておらず、詳細な解析については進んでいないため、当初の計画以上に進展しているとまでは言えず、おおむね順調に進展している状況と考えられる。粒子状有機硝酸(PONs)は二次有機エアロゾル(SOA)の中で重要な側面を持つ可能性が指摘されているが、現在までの研究例は極めて少ない。本研究ではまずPONs連続測定装置を開発し、その後能登半島珠洲においてPONsとガス状有機硝酸(GONs)の同時連続観測を実施、特に大陸からの越境汚染による影響を中心としたPONsとGONsの動態を明らかにする。平成30年度では引き続き、能登半島珠洲においてPONsの連続観測を行った。また、同時にGONs、O3、CO、NOx、総反応性窒素酸化物(NOy)、全硝酸(T.NO3)の連続観測も行った。これらの観測については大きなトラブルもなく、観測開始から平成30年度末まで概ね1年以上のデータを蓄積することができた。平成29年11月から平成30年10月までに測定されたGONs、PONsの平均濃度はそれぞれ0.370、0.017 ppbvであり、PONs/GONs濃度比は4.6%であった。PONs濃度は全般的に非常に低く、多くの期間で検出下限前後の値であった。そのため、現時点で季節変動などの議論を行うことは困難である。一方、散発的にPONs濃度の上昇がみられ、特に平成30年3月下旬において最大0.3 ppbv程度のPONsが観測された。PONsの濃度上昇が見られた期間はGONsやNOy、T.NO3、O3、CO濃度も上昇した。一方、NOx濃度の上昇は見られなかったことから、この高濃度イベントは長距離輸送の影響によるものと考えられる。また、同時観測を行っていた長崎県福江島におけるNOy、T.NO3の濃度変動、後方流跡線解析や天気図の結果より、この高濃度イベントは、アジア大陸由来の汚染物質が移動性高気圧の周回流によって日本に越境輸送された結果であると考えられる。アジア大陸からPONsが越境輸送される事例を観測により明らかにしたのは本研究が初めてである。申請書に記載していた平成30年度の実施計画は、能登半島珠洲におけるPONsおよびGONs濃度の連続観測を実施し、(1) PONs濃度レベルについての知見を得ること、(2)有機硝酸のガス・粒子分配比についてのデータを得ること、(3)大陸からの越境汚染が起こっているイベントを抽出し、その解析を行うことであった。(1)、(2)については、平成29年11月より1年以上のデータを蓄積しており、順調にデータ・知見を得ている。(3)についても、現在までの観測において大陸からの越境汚染が起こっているイベントが見られており、現在順調に解析を進めている。以上のことから、本申請研究は現時点でおおむね順調に進展していると考えられる。現時点では計画通りに進んでいるため、平成30年度においても当初計画通りに進める予定である。具体的には、能登半島珠洲における連続観測を前年度から引き続いて行う。PONsとGONsの同時観測により、有機硝酸のガス・粒子分配についての知見を得る。また、大陸からの越境汚染が起こっている事例を抽出し、珠洲で同時に観測を行っている種々の大気汚染物質との関係性について調べる。
合成ペプチドを抗原とする抗HTLV-I抗体の新しい超高感度測定法の実用化

HTLV-I感染を防ぐために、血清中の抗HTLV-I抗体が検出されているが、従来法には種々の難点がある。それらを解消するために、合成ペプチドを抗原とする新しい超高感度検出法(免疫複合体転移検出法)を開発した。2,4-ジニトロフェニル化ウシ血清アルブミン-合成ペプチド結合物、抗HTLV-I IgG、合成ペプチド-β-D-ガラクトシダーゼ結合物の3者からなる免疫複合体を、抗2,4-ジニトロフェニル基IgG不溶化固相から抗ヒトIgG γ鎖IgG不溶化固相へ移し換え、最後の固相に結合したβ-D-ガラクトシダーゼ活性を測定した。用意した9種類の合成ペプチドから3種類の合成ペプチド(Ac-Cys-envgp46(188-224),Ala-Cys-env gp46(237-262),Cys-gag p19(100-130))を選んだ。これらを抗原とすることにより、ELISA、凝集法、ウエスタンブロット法、免疫蛍光法と同等か、それら以上の感度と特異性が得られた。特異性は、これら可溶性の合成ペプチドの過剰量を被検血清に添加して確認するとともに、2つないし3つの合成ペプチドに対する抗HTLV-I IgGを証明することにより向上させることができた。この方法は血清ばかりでなく、尿中、恐らく唾液中の抗HTLV-I IgGの検出にも有効であることが分った。また、従来は、免疫反応を小試験管内で行ない、固相としての小ビーズをピンセットで試験管から試験管へ移し換え、シグナルとしての蛍光強度を蛍光光度計で1つ1つ測定していたので、carryoverによる偽陽性を回避できず、多くの検体のテストも困難であった。そこで、マイクロプレートと蛍光プレートリーダーの利用を試みた。その結果、ピンセットを使う必要がなくなり、carryoverによる偽陽性を皆無とすることができた。また、蛍光プレートリーダーを使うことにより、感度を低下させることなく96検体を1分40秒で測定することができるようになった。このように、多数検体のテストを容易に実用化できる見通しを得たが、現在、固相の形を一層実用的に改良しつつある。HTLV-Ienv gp46のN端半分に相当する部分合成ペプチド:Cys-Arg-env gp46(188-209)、2.Ac-Cys-env gp46(188-224)、3.Arg-env gp46(228(Cys)-250)、4.Ala-Cys-env gp46(237-262)、5.env gp46(253-276(Cys))、6.env gp46(276(Cys)-288)、7.env gp46(277-289(Cys))、8.gagp19(100-130)、9.pol(487-507)-CysがHTLV-I感染の診断のための抗HTLV-I IgGの検出にどれだけ抗原として有効か検討した。申請者らが独自に開発した新しい超高感度免疫複合体転移酵素免疫測定法を用いた。

ゼラチン粒子凝集法(PA)で強陽性の血清40例、PAで弱陽性、ウエスタンブロツト法(WB)で陽性の血清20例、PAが弱陽性、WBで陰性、あるいはPAで陰性の血清40例、PAで弱陽性、WBで不確定あるいは陰性の血清6例、PAで弱陽性、免疫螢光法(IF)で陽性の血清58例、PAで弱陽性、IFで不確定あるいは陰性血清37例、PAで陽性の血清31例に対応する29例の10倍濃縮尿をテストした結果、特に有効であった2.、4.、8.の3つの合成ペプチドのうち少なくとも2つの合成ペプチドで同じ結果が得られることを判定基準とすると、従来法(PA,WB,ELISA法)と同等あるいはそれ以上の確からしさでHTLV-I感染を診断できる見通しが得られた。また、従来法のうち免疫螢光法の結果ともほぼ一致することが分かった。そればかりでなく、免疫螢光法あるいは従来確認テストとして使われているWB法では不確定か陰性として従来見逃されてきた血清のなかに、複数の合成ペプチドに対して反応し、陽性として拾い上げることができる血清のあることがわかつた。さらに、血清と比べてIgG濃度が千分の1から3万分の1と格段に低い尿に対しても、合成ペプチドを抗原とする超高感度免疫複合体転移測定法が、かなりな程度に役立つことが明かとなった。合成ペプチドを抗原とする、抗HTLV-I IgGの新しい超高感度検出法(免疫複合体転移検出法)の開発、実用化には、抗原として用いる合成ペプチドの選定と実用的操作法の確立が必要であった。昨年度までに、従来法と同等か、それ以上の感度と特異性で抗HTLV-I IgGを検出するための合成ペタチドを3種類選定することができたので、今年度は、実用的操作法の確立を試みた。昨年度までは、固相として直径3.2mmのポリスチレンビーズを使って小試験管内で免疫反応を行ない、ポリスチレンビーズを試験管から試験管へ移すためにピンセットを使っていた。高シグナルを示すサンプルと免疫反応を行なったポリスチレンビーズを移し換えるために使ったピンセットは、洗浄しないとcarryoverにより、次の陰性サンプルが前の高シグナルの約200分の1のシグナル、次の陰性サンプルが約800分の1のシグナルを示すようになり、偽陽性となることがわかった。このcarryoverは、ピンセットの先端を非常に注意深く洗浄しない限り避けられないこともわかった。また、ポリスチレンビーズに結合したβ-D-ガラクトシダーゼ活性を表わす蛍光強度を分光蛍光光度計により、1サンプルづつ測定していた。ピンセットによるポリスチレンビーズの移し換えと蛍光光度計による蛍光強度の測定が多数検体の抗HTLV-I IgGの測定を困難にしていた。これらの難点を解消するために、マイクロプレートと、蛍光プレートリーダーの利用を試みた。その結果、ピンセットを使う必要がなくなったので、carryoverを除去できると同時に、感度を低下させることなく、96検体の蛍光強度を1分40秒で測定することができることもわかり、多数検体の測定がある程度容易となった。しかし、ポリスチレンビーズをマイクロプレートからマイクロプレートへ移し換えるための方法を、感度を低下させることなく更に簡便化するための試みが終了していない。殊に、ポリスチレンビーズに代わる固相の試作が今後の課題である。
抜歯窩修復過程におけるcPLA_2の役割

抜歯窩の修復機転に必須の破骨細胞は細胞融合により多核化し骨吸収能を得る。細胞融合の際には個々の細胞の膜構造の変化が重要であり、本研究では細胞膜リン脂質の代謝に関わる細胞質型ホスホリパーゼA_2(cPLA_2)に注目し、細胞融合・多核化への関与について検討を行った。マウス筋原細胞C2C12にcPLA2阻害剤であるAACOCF_3並びにMAFPを作用させ低血清下で培養し、3核以上に多核化した細胞数を対照と比較した。cPLA_2の働きを阻害すると濃度依存的に多核化細胞数は減少した。同様にcPLA_2siRNAによってその発現を阻害しても多核化細胞数は減じた。2.分化誘導時におけるcPLA_2とアクチンの細胞内局在の変化。マウスマクロファージ細胞RAW264.7のRANKL添加による分化誘導前後のcPLA_2とアクチンの細胞内局在について共焦点レーザー顕微鏡にて観察した。分化誘導前、両者は細胞質中に広く分布しているが、分化誘導後は共に細胞膜近傍に局在を変化させた。C2C12細胞についても同様の挙動を示した。RAW264.7細胞にcPLA_2阻害剤を作用させRANKLの共存下で培養し、3核以上に多核化した細胞数を対照と比較した。またその際の骨吸収能試験を行い吸収窩の面積を比較した。cPLA_2の働きを阻害すると濃度依存的に多核化細胞数は減少し、吸収窩の面積も狭小化した。cPLA_2siRNAによる発現阻害でも同様の結果が得られた。以上から、cPLA_2は細胞融合時の細胞骨格の変化に深く関わっており、細胞の融合・多核化現象に必要であることが示唆された。これらの結果の一部を第47回日本歯科放射線学会総会・学術大会(2006年5月東京)にて報告した。平成17年度は破骨細胞とcPLA2の関係、特にcPLA2の作用を減じた際に見られるマウス細胞の破骨細胞分化誘導の変化についての検討を行った。1.cPLA2阻害剤による破骨細胞への分化誘導阻害。RAW264.7細胞にcPLA2阻害剤であるAACOCF_3並びにMAFPを作用させ、RANKLの共存下で培養し、3核以上に多核化した細胞数をコントロールと比較した。またOsteologic MultiTestSlideを用い同細胞にAACOCF_3並びにMAFPを作用させ、RANKLの共存、非共存下で起こる吸収窩の面積の違いを比較した。cPLA2の働きを阻害すると濃度依存的に多核化細胞の数は減少し、吸収窩の面積も狭小化した。更に新生児マウスcalvariaを器官培養し、破骨細胞への誘導刺激を行って培養液中に放出される遊離カルシウム量をOCPC法にて測定したところ同様の変化が見られた。1.と同様にcPLA2 siRNAをRAW264.7cellにトランスフェクションした上でRANKLの共存下で培養し、3核以上に多核化した細胞数をコントロールと比較した。またOsteologic MultiTestSlideを用い同細胞にcPLA2 siRNAを作用させ、RANKLの共存、非共存下で起こる吸収窩の面積の違いを比較した。この際ISOGEN法でtotal mRNAを回収し、Oligo dT primerを用いた逆転写反応でcDNAを合成した後に、SYBR Green法によるreal-time PCR法を行い、cPLA2の発現量について確認した。その結果cPLA2の発現を阻害すると多核化細胞の数は減少し、吸収窩の面積も狭小化することを確かめることができた。

平成17年度においては、抜歯窩の修復機転に必須の破骨細胞の機能におよぼす細胞質型ホスホリパーゼA_2(cPLA_2)の働きについて調べた。マウスマクロファージ細胞RAW264.7が破骨細胞に分化誘導される際、cPLA_2を特異的阻害剤ならびにRNA干渉によってその機能や発現を抑制すると、その分化誘導も抑制され、細胞の多角化現象が見られなくなった。そこで平成18年度は個々の細胞が融合し多角化する際のcPLA_2と、細胞骨格をつかさどるアクチンの関係について検討を加えた。1.cPLA_2阻害剤による筋原細胞の分化誘導阻害。マウス筋原細胞C2C12にcPLA_2阻害剤であるAACOCF_3並びにMAFPを作用させ、低血清下で培養し、3核以上に多核化した細胞数をコントロールと比較した。cPLA_2の働きを阻害すると濃度依存的に多核化細胞の数は減少した。cPLA_2siRNAをC2C12にトランスフェクションした上で低血清下にて培養し、3核以上に多核化した細胞数をコントローノレと比較した。その結果cPLA_2の発現を阻害すると多核化細胞の数は減少した。3.cPLA_2とアクチンの分化誘導時における細胞内局在の変化。RAW264.7細胞の分化誘導前後のcPLA_2とアクチンの細胞内局在について、モノクローナルcPLA_2抗体とポリクローナルアクチン抗体を用いて二重染色し、共焦点レーザー顕微鏡にて観察した。分化誘導前、2つのタンパクは細胞質中に広く分布しているが、分化誘導後にはともに細胞膜近傍に局在を変化させた。C2C12細胞についても同様の挙動を示した。以上のことから、cPLA_2は細胞の融合・多角化現象に必要であり、細胞融合時の細胞骨格の変化に深く関わっていることが示唆された。以上の結果の一部を第47回日本歯科放射線学会総会・学術大会(2006年5月東京)にて報告した。
蛍光EXAFS、X線CTR測定によるIII/V族半導体接合界面での原子配列の解析

半導体ヘテロ接合作製技術は光デバイスや高速デバイスを作製する上での基礎となる技術であるが、デバイスの高機能化の要求に従い、ますますその重要性を増している。本研究は、要求されるヘテロ成長層の膜厚が原子層レベルに達したことと対応し、原子層レベルで薄膜の組成や界面の組成分布などを把握する技術を開発し、さらには得られる知見を利用して原子層レベルで良く構造制御の行われた結晶成長を実現することを目的とした。本年度は、蛍光EXAFSとX線CTR法による半導体ヘテロ界面評価を行った。OMVPE法で作製したInP/InPAs(1ML)/InP,InP/InGaAs(1ML)InP試料を対象とし、ヘテロ層の組成とその前後での組成分布を明らかにする研究を行った。特に、X線CTR法では極めて良好な結果を得、ヘテロ界面近傍の1原子層ごとの組成分布が評価できることが明らかになった。試料中のAs原子の総量はX線CTR法とは独立にAs原子の蛍光X線収量から測定が可能であるが、そうして得られた値と、X線CTR法から得られた1原子層ごとのAs組成を積分して得た値が良い一致を見せた。この結果は、本研究で得たAs原子の分布が信頼性の高いものであることを示唆している。InP/InPAs/InP界面では、ヘテロ層作製時の成長中断時間の大小に応じてAsヘテロ層からのAs原子の離脱が発生すること、あとから成長するInP層中に残留するAs量の制御も成長中断時間の最適化で可能であることが明かとなった。さらにInP/InGaAs/InP層中では、Ga原子もInP層側に分布している可能性を示唆する興味深い結果を得た。
黄斑病変の画像診断と組織学的証明、基礎的研究

平成12年度に引き続いて、黄斑部疾患の組織学的研究による病態解明の為、インドシアニングリーン蛍光眼底造影(ICG造影)と光干渉断層計(OCT)を用いた研究を行った。ICG造影でみられる脈絡膜新生血管は造影所見からGassのI型とII型の判別は困難なことが多いが、OCTを用いることによって病型の判別が容易となった。ICG造影における組織学的な色素の局在については、2001年7月のICG蛍光造影研究会における『ICG造影の読影』のシンポジウムで永井が講演・報告した。さらに組織学的な造影剤の局在と対比する為にOCTを用いると、脈絡膜新生血管の存在部位のICG色素の局在とOCTの反射像とには相関性があり、網膜色素上皮下に発育するI型新生血管と網膜下に発育するII型新生血管との判定が容易となった。またICG造影では鮮明な造影所見が得られなかった判定不明瞭な新生血管もOCTを用いると明瞭に新生血管の像を捉えることもあり、OCTの有用性が確認された。今回の実験系から、脈絡膜新生血管の病型分類を行う上で、二次元的なICG造影と三次元的なOCTを組み合わせて行うと確実な診断を行うことができ治療方針を決定する上で有用であることが確認された。黄斑部疾患の組織学的な研究による病態の解明の為、インドシアニングリーン蛍光眼底造影(ICG造影)と光干渉断層計(OCT)を用いた研究を行なった。ICG造影はこれまでのフルオレセイン蛍光眼底造影に比べて脈絡膜新生血管の検出に大きく貢献し、その治療成績を高める上で大きく貢献した。さらに、OCTを導入することで網脈絡膜の断面を観察でき、脈絡膜新生血管の立体的な観察が可能となった。今回、実験動物(有色ラット)を用いて実験的網脈絡膜障害モデル眼を作成し、これにICG造影を行ない、また同時に摘出眼におけるICG色素の組織内における局在を証明した。さらにOCTにより網脈絡膜の断層撮影を行なって病変部位の観察を行なって造影所見との対比を行なった。今後は、当初の計画にそって実験的脈絡膜新生血管を実験動物に作成して同様の実験を行ない脈絡膜新生血管の本態の解明に取り組む予定である。
生体活性ガラスと再生促進因子を応用した根尖部歯周組織再生療法の開発

ラット根尖病変モデルにPSリポソーム(PSL)を応用した結果、早期にBMP-2およびALPの発現が亢進されたことより、破壊された根尖部歯周組織の治癒が促進された可能性が推察された。また、生体活性ガラス(bioactive glass以下BAG)とPSLを併用することにより、骨欠損部では活発な新生骨の形成が認められたことより、骨窩洞内への生体活性ガラスと再生促進因子(PSL)の応用は消失した骨組織の再生を誘導する可能性が推察された。ラットの下顎第一臼歯遠心根を抜髄、開放することにより、自然感染による根尖病変の成立を計った。術後7日目に、根管内にPSリポソーム(PS)または生理食塩液(SALINE)を貼薬した。その後、3日および7日目に、根尖病変部におけるサイトカイン(IL-1βおよびTGF-β1)の発現、骨吸収因子であるRANKLおよびTRAPの発現、骨形成因子であるBMP-2およびALPの発現ならびにマクロファージ、破骨細胞および骨芽細胞の動態について組織化学的に解析した。PS群では、SALINE群に比較して、ED1陽性を示すマクロファージの浸潤が多く観察された。PSおよびSALINEの両群において、サイトカイン(IL-1βおよびTGF-β1)の発現は乏しかった。また、RANKLおよびTRAPの発現、破骨細胞数は、両群において少数ではあったが、ややSALINE群の方が多く観察された。一方、骨形成因子であるBMP-2およびALPの発現において、PS群はSALINE群に比較して、優位に多く観察された。また、PS群の根尖病変はSALINE群に比較して縮小し、骨面では骨芽細胞が層状に配列すると伴に、新生骨の活発なリモデリング像が観察された。以上のことより、PS群ではSALINE群に比較して、BMP-2およびALPの発現が亢進されることにより、破壊された根尖部歯周組織の治癒が促進された可能性が推察された。また、PSリポソームは炎症性骨吸収を制御すると同時に骨組織の再生を促進する可能性が示唆された。一方、ラット頭蓋冠骨欠損部に骨補填材とPSリポソームを併用することにより、骨欠損部の変化についてμ-CTを用いて経時的に解析を行っている。対照とするハイドロキシアパタイト(HAP)とPS埋入群では、HAPの周囲に新生骨組織様の不透過像が観察された。現在、生体活性ガラスとPS埋入群の試料採取を行っている。本研究では、ラット根尖病変の実験系を確立し、歯根尖周囲骨欠損部に、生体活性ガラスと再生促進因子であるPSリポソーム(ホスファチジルセリンで作製したリポソーム)を応用することにより、破壊された骨創腔に及ぼす生体活性化ガラスおよびPSリポソーム併用療法の修復機構に関して、多角的かつ総合的に解析を行うことを目的としている。今年度は、PSリポソームの根尖性歯周炎の抑制効果について検討した。また、PSリポソームの作用メカニズムを明らかにする目的でマクロファージならびに破骨細胞に対する作用に関して検討した。実験方法として、ラットの下顎第一臼歯遠心根を抜髄、開放することにより、自然感染による根尖病変の成立を計った。その後、3日および7日目に、根尖病変部におけるサイトカイン(IL-1βおよびTGF-β1)の発現、骨吸収因子であるRANKLおよびTRAPの発現、ならびにマクロファージ、破骨細胞および骨芽細胞の動態について組織化学的に解析した。その結果、PS群では、SALINE群に比較して、ED1陽性を示すマクロファージの浸潤が多く観察された。一方、PS群の根尖病変はSALINE群に比較して小さく、骨面では多数の骨芽細胞が層状に配列した所見が観察された。以上のことより、PS群はSALINE群に比較して、炎症性サイトカイン及び骨吸収活性化因子の発現を抑制することにより、根尖部歯周組織の破壊を制御している可能性が示唆された。細胞質リン脂質であるホスファチジルセリンで作成したリポソーム(PSリポソーム)はミクログリア/マクロファージに貪食された後、プロスタグランジンE2(PGE2)の産生を促す。この際、PSリポソームは誘導型酵素であるシクロオキシゲナーゼ-2を誘導しないが、プロスタグランジン合成酵素であるmPGES-2を誘導することによりPGE2の産生を促すことが最近明らかになった。

一方、生体活性ガラス(bioactive glass以下BAG)は、骨伝導能があり、骨芽細胞の活性を高めることや破骨細胞増加の抑制により骨補填材としての期待が寄せられている。そこで今回、ラット頭蓋冠骨欠損モデルを用いて、PSリポソームと生体親和性に富むBAGが骨窩洞内の骨形成に及ぼす影響についてμCTを用いて検索した。その結果、無添加のコントロール群では実験期間を通して骨欠損部に硬組織形成は認められなかった。BAG群では、処置後2週齢骨欠損部において、BAG周囲に硬組織の形成像はほとんど認められなかった。処置後4週齢では、BAGを核にして、新規の硬組織様石灰化物が少数、散在性に認められた。8週齢では、骨欠損部にBAGを中心にして不透過性の亢進した像が多数認められた。一方、BAG + PSリポソーム添加群では処置後4週目から骨欠損部にBAGを中心にして不透過性の亢進した骨形成像が認められた。また、根尖切除部の骨創腔内にPSリポソームとBAGを填入することにより、処置後4週目では活発な骨形成像が観察され、窩洞内は新生骨組織により満たされていた。以上のことより、PSリポソームとBAGとの併用により、骨窩洞内の骨形成が促進される可能性が示唆された。医歯薬学現在、ラット根尖病変の実験系を確立するとともに、Nishikawaらの方法(J Biochem Chem 1990; 265, 5226-5231)を基にしたPSリポソームの作製も習熟している。根管内にPSリポソームを填入、留置することにより、根尖病変中におけるマクロファージならびに骨芽細胞および病変部の骨組織のリモデリングについて、アルカリフォスファターゼ活性の発現状態やBMP-2発現細胞の局在について解析を行った。また当初、作製したPSリポソームの効果は、冷室保存で数週間は維持されると考えられたが、現在ではより効果的に使用するために、作製後3日以内に使用することで研究を進めている。さらに、頭蓋冠骨欠損動物モデルの作製法を確立し、対照とするHAPとPSリポソーム埋入群のμ-CT撮影およびRNAサンプルの採取を終了している。また、BAGをPSリポソームとともに填塞することにより、経時的に標本を採取し、試料作製を行っている。現在、ラット根尖病変の実験系を確立し、Nishikawaらの方法(J Biochem Chem 1990; 265, 5226-5231)に従い作製したPSリポソームの作用メカニズムを明らかにする目的で、根管内にPSリポソームを填入することにより、根尖病変中におけるマクロファージならびに破骨細胞に対する作用に関して検討した。また現在、骨芽細胞および病変部の骨組織のリモデリングについて、アルカリフォスファターゼ活性の発現状態やBMP-2発現細胞の局在について解析を進めており、作製したPSリポソームの効果は、冷室保存で数週間は維持されることが明らかになった。さらに、骨欠損動物モデルを作製し、平均粒子径2545μmのBAGをPSリポソームとともに填塞することにより、経時的に標本を採取し、試料作製を行っている。1)平成25年度と同様の方法で骨欠損動物モデルを作製する。2)根尖部歯周組織再生の環境整備、スペースメーキングを目的として、PSリポソームを骨創腔内に貼付後、異なる粒子径のBAGを留置することにより、再生促進因子併用療法の歯周組織誘導・再生効果について、平成25年度と同様の解析を行う。3)BAGの性状の違いが骨組織形成に及ぼす影響について検索することを目的として、再加熱処理を施して多孔体としたBAGを使用し、HAPとの比較研究を行う。