hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
オオムギ高親和性硝酸イオン輸送系の機能発現機構解明にむけた組織細胞学的アプローチ

続いて、細胞膜から露出していると予測されるHvNRT2.1のC末端断片(HvNRT2.1c)およびHvNAR2.3の中央断片(HvNAR2.3cent)の相互作用をアフィニティーカラム法で解析したところ、両タンパク質断片がカラム内で相互作用することを明らかにした。さらに、HvNRT2.1の463番目のセリン残基がNAR2.3との結合に重要であることが示唆された。28年度は、植物細胞内におけるHvNRT2.1とHvNAR2.3の相互作用を解析するために、Yongらの方法に従いBiFC法による解析を行った。すなわち、HvNRT2.1のN末端と分割黄色蛍光タンパク質(YFP)のN末端側との融合タンパク質(nYFP:HvNRT2.1)とHvNAR2.3のC末端と分割YFPのC末端側との融合タンパク質(HvNAR2.3:cYFP)をタマネギ表皮細胞において同時に発現させた。タマネギ表皮細胞において再構成されたYFPによる蛍光が細胞膜上に観察されたことから、HvNRT2.1とHvNAR2.3が相互作用して細胞膜上に局在することが示唆された。本研究は、オオムギ根のHATSを構成する2つのトランスポータータンパク質(HvNRT2およびHvNAR2)の機能発現機構を組織細胞生物学的側面から明らかにし、低窒素条件下での作物の窒素利用効率の向上技術に寄与できる分子基盤を提示することを目的とする。期間内で明らかにしようと計画している具体的項目は、1)オオムギ根組織内におけるHvNRT2.1およびHvNAR2.3の局在性の解明、2)HvNRT2とHvNAR2の相互作用に関係するアミノ酸残基の解明、3)インタクト植物細胞内におけるHvNRT2.1とHvNAR2.3の相互作用の解析、の3項目である。以上の計画のうち、28年度は項目3)を行い、BiFC法によりHvNRT2.1とHvNAR2.3が相互作用して細胞膜上に局在することを示すことができたが、2つのタンパク質が細胞膜に配置されるためにお互いの存在が必要であるのかまで明らかにできなかったため、やや遅れていると判断した。本研究の目的は、オオムギ根における高親和性硝酸輸送系を構成する2つのタンパク質(HvNRT2.1およびHvNAR2.3)の機能発現機構について、組織細胞生物学的に明らかにすることである。2つのタンパク質は、硝酸吸収の際に根の細胞膜上において何らかの相互作用をして機能すると予想されている。26年度には、両タンパク質が根の皮層域における最も外側の細胞層の細胞膜に共通して存在していることを免疫組織化学的に明らかにした。27年度には、細胞膜から露出していると予測されるHvNRT2.1のC末端断片(HvNRT2.1c)およびHvNAR2.3の中央断片(HvNAR23cent)の相互作用をアフイニテイーカラム法で解析したところ、両タンパク質断片がカラム内で相互作作用することを明らかにした。さらに、HvNRT2.1の463番目のセリン残基が相互作用に重要であることが示唆された。28年度には、細胞内におけるHvNRT2.1とHvNAR2.3の相互作用をBiFC法で解析した。すなわち、HvNRT2.1と分割YFPとの融合タンパク質(nYFP:HVNRT2.1)およびHvNAR2.3と分割YFPとの融合タンパク質(HvNAR2.3:cVFP)をタマネギ表皮細胞において同時に発現させた。その結果、再構成されたYFPによる蛍光が細胞膜上に観察され、HvNRT2.1とHvNAR2.3が相互作用して細胞膜上に局在することが示唆された。
配水ネットワ-クのオンライン水需要量予測および最適圧力制御に関する研究

1.数値シミユレ-ションによる本オンライン水需要量予測手法の適応性、有効性および特性の検討。本オンライン予測手法を、予め節点水需要量の真値がはっきりしている模凝デ-タに適用してその有効性および特性の検討を行った。この場合、節点水需要量モデルとして周期関数モデルと自己回帰モデルの2種類を想定してシミュレ-ションを行ったが、特に、自己回帰モデルを用いた場合は、予測精度を向上させるためには、非線形用のカルマンフィルタ-理論を用いる必要があることを示した。2.福岡市の第9区画配水管網系に対する本予測手法の適用まず、福岡市の第9区画配水管網系に設置されている流量計、水圧計および圧力制御バルブからの実デ-タより、水需要量、水圧、管路流量の特性解析を行った。次いでこの解析結果を基に、節点水需要量を表す関数モデルとして周期関数モデル、自己回帰モデルおよび周期関数と自己回帰の混合モデルの3種類を想定し、本予測手法を実デ-タに適用し、節点水需要量、節点水頭および管路流量のオンライン予測を行った。その結果、周期関数と自己回帰の混合モデルを用いた場合に、実デ-タへの適合度および予測精度が高いことを示した。3.バルブ損失水頭を考慮した節点法による管網計算法圧力制御バルブを含む管網系の解析にあたっては、摩擦損失水頭のみならずバルブ損失水頭を考慮した管網計算法が必要となり、管網内のバルブの配置や設置数の変更に容易に対応できる管網計算法の確立が望まれる。ここでは、管網内にバルブが設置された場合にも節点数を増加させることなくバルブの有無に容易に対応できる管網計算法を提案し、そのプログラムを示した。1.配水ネットワークのオンライン需要量予測のための定式化および数値シミュレーション:配水ネットワークの流量連続条件と水頭閉合条件を満足する管網基礎式より流量・水頭・需要量および圧力制御バルブ等の非線形連立方程式を解き、これにオンライン状態推定法して優れているカルマンフィルター理論を適用し、需要量予測のための定式化を行った。次いで、本手法の適応性および有用性の検討のために、この手法を需要量や管網の種々の値を予め与えた、いわゆる素性のはっきりしたシミュレーションデータに対して適用した。この結果、本手法により需要量が精度良く予測され、同時に管路流量と節点水頭も精度良く予測されることが示された。また、カルマンフィルター理論における種々の初期値設定が予測精度に及ぼす影響や、予測精度向上のための観測量の設置数や設置箇所の設定についての考察を行った。2.実際の福岡市配水ネットワークに対する適用:現在福岡市では、市内の主要な配水管に水圧計、流量計、電動調整弁が取り付けられ、常時入力される水圧計、流量計からのセンサ情報をもとに電動調整弁の遠隔操作が行えるようになっており、ここでは系統別配水エリア等を考慮して20のブロックに計画区分されたうちの第9ブロックに対してこれらの実際のオンライン入力を用いて1.で確立された手法により需要量の予測を行った。なお、需要量を記述する式としては周期関数式、自己回帰式およびこれらの混合の式の3通りの式を想定した。この結果、いずれの式を採用した場合にも、観測流量が精度良く予測されるような需要量の予測値が得られ、この手法が実際のオンライン入力を用いる場合にも適用可能であることが確かめられた。今後、これらの3通りの式で記述した場合の需要量の予測値をどのようにして検証していくかが、研究を進めていく上での課題である。1.数値シミュレ-ションによる本オンライン水需要量予測手法の適応性、有効性および特性の検討本オンライン予測手法を、予め節点水需要量の真値がはっきりしている模擬デ-タに適用してその有効性および特性の検討を行った。

この場合、節点水需要量モデルとして周期関数モデルと自己回帰モデルの2種類を想定してシミュレ-ションを行ったが、特に、自己回帰モデルを用いた場合は、予想精度を向上させるためには、非線形用のカルマンフィルタ-理論を用いる必要があることを示した。2.福岡市第9区画配水管網系に対する本予測手法の適用まず、福岡市の第9区画配水管網系に設置されている流量計・水圧計および圧力制御バルブからの実デ-タより、水需要量・水圧・管路流量の特性解析を行った。次いでこの解析結果を基に、節点水需要量を表す関数モデルとして周期関数モデル、自己回帰モデルおよび周期関数と自己回帰の混合モデルの3種類を想定し、本予測手法を実デ-タに適用し、節点水需要量・節点水頭および管路流量のオンライン予測を行った。その結果、周期関数と自己回帰の混合モデルを用いた場合に、実デ-タへの適合度および予測精度が高いことを示した。3.バルブ損失水頭を考慮した節点法による管網計算法圧力制御バルブを含む管網系の解析にあたっては、摩擦損失水頭のみならずバルブ損失水頭を考慮した管網計算法が必要となり、管網内のバルブの配置は配置数の変更に容易に対応できる管網計算法の確立が望まれる。ここでは、管網内にバルブが設置された場合にも節点数を増加させることなくバルブの有無に容易に対応できる管網計算法を提案し、そのプログラムを示した。
MAPキナーゼ情報伝達系と細胞周期制御のインターフェイス分子の解析

本研究では、受精のシグナルがMAPキナーゼ情報伝達系を経由してDNA複製開始につながる全経路を明らかにしようとした。そのストラテジーとしては情報のながれる上流からと下流からの両方向からこれらの接点にあたるところの分子の探索を行った。第一には情報伝達系からのシグナルの流れを下り、受精の信号を細胞周期の制御機構(この場合DNA複製の開始)を操作するためのシグナル転換装置(これをとよぶ)に迫ろうとするもので、第二には、これとは逆にDNA複製装置のについて、受精までの間にどのような状態でDNA複製開始が停止しているかを明らかとし、受精のシグナルが入ったあとに複製装置が起動するために必要な分子(この分子に制御に情報伝達系が連結されている可能性が高い)を同定しようとした。その結果、第一の方法ではMAPキナーゼ情報伝達の下流にはp90Rskという蛋白質キナーゼが関与していることが明らかになり、第二のアプローチからは情報伝達のつながっているDNA複製装置の構成要素はCdc45という2重鎖DNAの巻き戻しとDNAポリメラーゼαの複製起点への導入に必要とされる蛋白質であるとことが明らかとなった。これらの結果によりインターフェイス分子の同定には至らなかったものの、DNA複製を制御するこれまでにしられていない新規のチェックポイントの解析の途を開いたものと考えられ、さらに、Cdc45とp90Rskのあいだをつめることにより、もう一歩で、いまだどの生物でも知られていない受精のシグナルがMAPキナーゼ情報伝達系を経由しDNA複製開始につながる全経路を解明できるところまで到達できた。脊推動物の成熟未受精卵は減数第二分裂中期に停止して受精を待つ。この場合、神経周期停止因子であるc-MosはMAPKを介し細胞周期をM期で停止させている。しかし、受精前の細胞周期停止の時期は、脊椎動物でもイヌでは減数第一分裂前期であり、昆虫では第一分裂中期、ウニでは減数分裂完了後のG1期というように、動物の間で異なる。申請者らは減数分裂を完了したG1期で細胞周期を停止するヒトデ卵を材料として、細胞周期を停止させる因子の実体を解明しようと試みた。その結果、意外なことにヒトデにおいても脊椎動物と同様にKが細胞周期のG1停止をもたらすことがわかった。最近、Mosの下流でMAPKはp90RSKと複合体を形成し、情報伝達のための一つの単位(モジュール)を形成していることが判明してきた。このモジュールがヒトデにおいてはG1期での停止に、脊椎動物ではM期での停止に連結されており、情報がそれぞれDNA複製装置と分裂後期の開始の制御の異なる実行因子に流れていると予測される。このようなモジュールの繋ぎ換えは進化の中で何度も起こり、その結果、現在の真核生物に見られるようにMAPKカスケードは種々の情報を媒介するに至ったと予想される。本研究はこのモジュールと細胞周期の間にあるインターフェイスに当たる分子を同定することである。脊椎動物ではMosは、受精の刺激によりカルシウム-CaMKIIという経路で分解に至るが、本研究の結果、ヒトデの場合には受精に刺激によりカルシウムが卵細胞室内に放出される点とMosが分解する点は同じであるが、ヒトデのMosはCaMKIIの阻害によっても分解を免れない事がわかった。この結果はカルシウムシグナル伝達系とMAPKシグナル伝達系という非常によく保存された情報伝達系同士の連結が、非常にフレキシブルで動物種により多様である可能性が出てきた。未受精卵の細胞周期を停止させるMAPKの下流は脊椎動物ではp90RskがMAPKにより活性化され、p90Rskはさらにその下流のBub1をリン酸化し、スピンドルチェックポイントを活性化して減数分裂を第二分裂中期に停止させるとされている。ヒトデの未受精卵のG1期停止にはMAPKの下流でp90Rskが機能していることは、p90Rskにたいする抗体を未受精卵に微小注射することにより、DNA複製が開始することから明らかとなった。

しかし、ヒトデの場合にはG1期に停止するので、p90Rskの下流は分裂中期に停止させる機能をもつスピンドルチェックポイントの複合体に接続されているとは考えられない。では、ヒトデではどのようなところにp90Rskのシグナルが接続されると予測されるのか?ヒトデの未受精卵はG1期に停止している。このG1期というのは、酵母の"Start"や哺乳類の培養細胞の「制限点」とは異なり、G1期の中でもDNA複製開始に非常に近い段階である。それは、このG1期停止の段階を調べるために、Cdk2,Cdc7,Cdc45,PCNA, MCMなどの多数の複製開始にかかわる分子をクローニングしてその抗体を作成し、ヒトデのG1期に停止している未受精卵のクロマチンにどのような蛋白質が結合しているのかを調べた。その結果、未受精卵の状態でもすでにMCMはクロマチンに結合しており、受精後約25分でCdc45がクロマチンに移行し、約30分でPCNAが現れ、これとほぼ同時にBrdUの取り込みが見られることからDNA複製が開始したと判断できる。この結果からヒトデの未受精卵のG1期停止はPreRCをすでに形成しているが、Cdc45はクロマチンに移行していない状態、すなわちPreIC形成の手前でDNA複製を停止していることが明らかとなった。
在宅COPD患者のヘルスリテラシーを高めるCOPDマネジメントプログラムの構築

「24時間パルスオキシメーター装着による酸素飽和度のモニタリングと労作による酸素低下に対する患者の認識」の研究を現在、調査中である。対象者は、呼吸器内科に通院中のCOPD患者で、日常生活は各自のペースで行っている。週に数回は外来で呼吸リハビリテーションを受けている。実際に調査を行うと、24時間の間に4%ODIが100回以上ある患者もみられた。また、本人の自覚症状としては、息苦しさを感じていたが、そのように頻回に低酸素状態になっているとは認識はなかった。息苦しさを自覚するときは、口すぼめ呼吸を行うが、それ以外はつい忘れていことが多いという意見が聞かれた。対象者が、低酸素状態になっていることを認識できていない場合は、低酸素状態を回避するような対処行動、すなわち、行動をやめて呼吸を整えたり、口すぼめ呼吸をしたり、身体の緊張をゆるめるようなリラクゼーションをとるという具体的な行動にはつながらないことがわかった。また、予防的に、低酸素状態になるような行動を避ける、あるいはゆっくりと行動する、呼吸を意識し整えながら行動することが必要であるという意識も低いことがわかった。現在調査を継続しているので、調査を終了して、割合や関連等を分析予定である。呼吸リハビリテーションに通院している熱心な患者でも、知っている知識を日常生活に応用することは難しいので、自分がCOPDを患っているということを知らない人であれば、多少の息苦しさを自覚しても適切な行動をとることは全くできないであろうと容易に推測できた。科研申請時に考えていた労作による低酸素状態とその酸素低下の認識を調査するために文献検索を行った。その後、倫理委員会の承認を得て、予備調査を行った。申請時には、今までに研究に協力を得られた施設での入院患者を対象に調査することを考えていた。しかし、入院中はトイレや食事に行くなどの病棟内での行動が主であること、慢性期の入院は急性増悪によって起こる場合が多いので、呼吸状況が平素の状態ではないことが推測された。自宅で日常生活を送っている患者を対象にする方が結果を今後、COPD患者の生活指導、自己管理に広く使えるのではないかと考え直した。そこで、申請時に調査協力を得られていた施設では対象者を得ることが難しいと判断し、協力施設を新たに検討する必要が出た。呼吸リハビリテーションの実践をされている研究協力者の紹介で、外来通院中のCOPD患者を紹介してもらえる施設を探すことが出来た。予備調査で、24時間パルスオキシメーターの装着時の不具合について調べた。患者によって末梢の循環不全があるためか、波形が時々途切れてモニタリングがうまく出来ていないことがあった。また、入浴時の酸素飽和度については、是非知りたいと考えていたが、機械がぬれることを対象者が気にかかり、波形がうまく取れていないこともあった。これらのトラブルに関しては、フクダ電子のサポートを受け、現在、調査を進行中である。「24時間パルスオキシメーター装着による労作性低酸素状態のモニタリングと労作による酸素低下の患者の認識」に関する調査を継続し、3ヶ月を目安に終了する。その後、COPD患者のヘルスリテラシーに関する調査を行うため、現在の調査を進行しながら文献調査と研究計画書作成・倫理審査申請を行う予定である。申請者らは先行研究でCOPD患者が病気や自己管理に必要な知識や認識などが非常に不足していることを明らかにした。そこで、本研究はCOPD患者がなぜ自己管理の認識が低いのか、日常生活で呼吸を意識して行動しているのかなどを明らかにし、その結果をもとに、COPD患者のヘルスリテラシーの向上をはかり、地域で支えるCOPDマネジメントプログラムを構築することを目的に取り組む。平成29年度は1.COPD患者の病気や自己管理に対しての知識・認識が不足していることへの関連要因の調査を行う計画をあげた。本調査に取り掛かる前にヘルスリテラシーに関する文献検討を行った。さらに、COPD患者のヘルスリテラシーと比較するために、高齢者ふれあいサロンの運営にボランティアで参加している高齢者にヘルスリテラシーに関する調査を行った。その結果、「健康や病気の情報を普段どこから得ますか」の質問の答えで多かったのはテレビ、研修会・講演会、家族・友人から、専門職からの順であった。また、「信頼して実行する情報源はどれか」という質問に対しては全体の回答者がかなり少なくなり「専門職から」と「研修会・講演会」からの順に多かった。この結果から情報は収集するが、どれも信用しているわけではなく実行にはつながっていないことが多いことがわかった。さらに、急性増悪を起こしている患者へのプレ調査(インタビュー1名)を実施した。COPD患者は病気のことを軽く(生命に危険を及ぼすことはない病気)考えて、喫煙を続けていた。仕事が忙しかったこともあり、特に自分から病気のことを知ろうとする行動にはつながらず、労作性呼吸困難がかなりひどくなるまでその状態が続いた。このことから、「喫煙」という嗜好・嗜癖を肯定し継続することの優先度が高く、身体的症状が強くなるまでは、情報へのアクセスが少ないことが考えられた。平成29年度は、急性増悪を起こしている患者10名へのインタビューを行う予定であったが、対象を「急性増悪を2回以上起こしている患者」に焦点を当ててよいのかを再度検討するためにプレ調査を実施した。その結果、患者の病気への認識や情報への関心の程度などが把握できたため、インタビューを個別に行うよりは、インタビュー結果を基にヘルスリテラシーに関する調査票を作成し、COPD患者に調査をすることを計画中である。

平成30年3月にアメリカカンザス州トピカ市のStrmont Vail Hospitalで呼吸器のNPの診療時にシャドーイングを行い、患者のヘルスリテラシーに看護師がどの様に関わっているかをみた。患者への情報提供の方法や場所などが日本とは異なり、今後の「医療従事者の患者教育に対する認識・行動と外来における患者教育の実態調査」を行う際の調査項目検討に生かすことができると考えられる。「24時間パルスオキシメーター装着による酸素飽和度のモニタリングと労作による酸素低下に対する患者の認識」の研究を現在、調査中である。対象者は、呼吸器内科に通院中のCOPD患者で、日常生活は各自のペースで行っている。週に数回は外来で呼吸リハビリテーションを受けている。実際に調査を行うと、24時間の間に4%ODIが100回以上ある患者もみられた。また、本人の自覚症状としては、息苦しさを感じていたが、そのように頻回に低酸素状態になっているとは認識はなかった。息苦しさを自覚するときは、口すぼめ呼吸を行うが、それ以外はつい忘れていことが多いという意見が聞かれた。対象者が、低酸素状態になっていることを認識できていない場合は、低酸素状態を回避するような対処行動、すなわち、行動をやめて呼吸を整えたり、口すぼめ呼吸をしたり、身体の緊張をゆるめるようなリラクゼーションをとるという具体的な行動にはつながらないことがわかった。また、予防的に、低酸素状態になるような行動を避ける、あるいはゆっくりと行動する、呼吸を意識し整えながら行動することが必要であるという意識も低いことがわかった。現在調査を継続しているので、調査を終了して、割合や関連等を分析予定である。呼吸リハビリテーションに通院している熱心な患者でも、知っている知識を日常生活に応用することは難しいので、自分がCOPDを患っているということを知らない人であれば、多少の息苦しさを自覚しても適切な行動をとることは全くできないであろうと容易に推測できた。科研申請時に考えていた労作による低酸素状態とその酸素低下の認識を調査するために文献検索を行った。その後、倫理委員会の承認を得て、予備調査を行った。申請時には、今までに研究に協力を得られた施設での入院患者を対象に調査することを考えていた。しかし、入院中はトイレや食事に行くなどの病棟内での行動が主であること、慢性期の入院は急性増悪によって起こる場合が多いので、呼吸状況が平素の状態ではないことが推測された。自宅で日常生活を送っている患者を対象にする方が結果を今後、COPD患者の生活指導、自己管理に広く使えるのではないかと考え直した。そこで、申請時に調査協力を得られていた施設では対象者を得ることが難しいと判断し、協力施設を新たに検討する必要が出た。呼吸リハビリテーションの実践をされている研究協力者の紹介で、外来通院中のCOPD患者を紹介してもらえる施設を探すことが出来た。予備調査で、24時間パルスオキシメーターの装着時の不具合について調べた。患者によって末梢の循環不全があるためか、波形が時々途切れてモニタリングがうまく出来ていないことがあった。
「リソソーム・液胞系」タンパク質分解による細胞の環境適応機構の分子基盤

真核生物のモデル生物である出芽酵母を用い、液胞によるタンパク質分解機構が外界からの環境ストレス応答や細胞内で生じた異常タンパク質のクリアランスに重要な役割を果たしていることを示し、その過程に関わる因子を明らかにした。具体的には外界栄養条件に応じたモノカルボン酸輸送体の細胞膜からの除去、折り畳みに異常がある分泌タンパク質の除去機構について解析した。1.異常タンパク質の液胞におけるクリアランス機構ERAD基質として知られている出芽酵母のカルボキシペプチダーゼYの変異体(CPY*)にインベルターゼを融合することにより、CPY*が小胞体での分解を回避し、Vps10依存的に液胞で分解されることが明らかとなった。また、野生型のCPYもVps10依存的に液胞へ輸送され、液胞でペプチダーゼとして機能するが、CPY*とCPYのVps10による認識機構は異なることが実験により示された。さらに、CPY*を認識するがCPYを認識できない、あるはその逆にCPYを認識するがCPY*を認識できないVps10の変異体を得ている。2.外界環境の変化に伴う細胞膜タンパク質の液胞による選択的ターンオーバーの制御機構出芽酵母のモノカルボン酸輸送体Jen1は転写レベル、翻訳後レベルでグルコースによるカタボライト抑制を受ける。出芽酵母の遺伝子破壊株ライブラリーを用い、Jen1タンパク質のターンオーバーに関与する遺伝子をスクリーニングした。本年度は約1/3を解析し終わった。Jen1は出芽酵母の唯一のモノカルボン酸輸送体であり、モノカルボン酸のアナログであるフルオロピルビン酸に対してJen1依存的に毒性を示す。酵母細胞を変異減処理することにより、フルオロピルビン酸耐性変異株を単離し、そのうちのいくつかはJEN1遺伝子そのものに変異が生じており、Jen1タンパク質は小胞体に蓄積していた。3.オルガネラ・プロテオミクスによる「リソソーム・液胞系」タンパク質分解の総合理解の試み本年度は出芽酵母から液胞の単離精製のための条件検討を行った。1.異常タンパク質の液胞におけるクリアランス機構小胞体関連分解(ERAD)で分解されるカルボキシペプチダーゼYの変異体(CPY*)にインベルターゼを融合したCPY*-InvはERADを回避し、Vps10依存的に液胞で分解された。Vps10は1579アミノ酸からなる一回膜貫通型タンパク質であり、野生型のCPYを始めとする液胞加水分解酵素のレセプターとして機能することが知られている。しかし、Vps10によるCPYとCPY*-Invの認識機構は異なっていた。さらに、CPYの液胞への輸送が特異的に低下するVps10変異体を数種取得した。これらの変異点を解析した結果、1000-1070番目のアミノ酸残基領域に集中してアミノ酸置換が起こっており、この領域がCPYの認識に関わることが示唆された。出芽酵母の遺伝子破壊株ライブラリーを用い、グルコースに依存したJen1タンパク質の分解に関与する遺伝子をスクリーニングした結果、エンドサイトーシス(END3, END4, SLA1, SAC6など)、液胞への輸送(VAM7, VPS8, VPS16, VPS41など)、エンドソームからゴルジ体への輸送(VPS35, YPT6, VPS63など)、ユビキチン代謝(DOA4)など膜タンパク質の代謝に関わることが知られていた遺伝子の他に糖鎖修飾(MNN11)や脂質修飾(SWF1)に関わる遺伝子が関与することが示された。3.オルガネラ・プロテオミクスによる「リソソーム・液胞系」タンパク質分解の総合理解の試み野生型および液胞プロテアーゼ欠損株から液胞を単離し、構成タンパク質を解析したところ、プロテアーゼ欠損株特異的に検出されるタンパク質が多数見出された。今後これらを同定する。
身体観と身体管理に関する質的研究

本研究は、現代日本における人びとの身体観、身体との向き合い方を探究することを目的とし、現代人の身体と身体管理に関する「知識」「常識」のあり方を、一般に流通する健康に関する雑誌や書籍等にみられる言説および身体管理に関心を持つ人びとへのインタビューからとりだした。その結果、2つの対照的な身体観として、「客体としての身体」観と「主体としての身体」観を析出した。その上で、特に後者の身体観とその含意について、現代社会のあり方、諸問題を問いなおしていく1契機として議論した。1.研究目的・課題:本研究全体の課題、(1)身体に関する日常知へのアプローチ、(2)身体への諸個人の向き合い方、身体に対する意識、身体管理に関する実際的な活動へのアプローチのうち、(1)を中心に研究を行った。その趣旨は、現代人の身体観・意識と活動に作用し、またそれを反映する日常知として、現代生活に広く流通する身体・健康関連情報が、身体に関していかなる「知」を現代人に提供しているのか、またそこから現代人の身体に関するいかなる「常識」や「考え」を読み解くことができるかを質的分析によって浮かび上がらせることである。2.研究方法:(1)文献研究、1)国内外の関連研究の検討、2)身体に関する現代の日常知の構成を検討するため、身体に関する諸研究の検討、を行い、(2)身体に関する日常知の分析として、日常生活における身体管理に関する実用的情報の検討、具体的には、健康関連書籍(実用書)および月刊誌を対象として、その内容の検討・質的分析を行った。3.研究成果:以下が明らかになった。(1)身体をめぐる諸問題は、医療、健康、美容、再生産問題等、社会学において様々な角度から扱われているが、身体に関する日常知および当事者の主観的意味に即した身体研究は新しい課題であること。(2)現代社会に流通する身体に関する日常知は、パラダイムの異なる多様な知の混交・並存状況にあること。(3)それらの知は、異なる身体観を背景として、しばしば相互に矛盾あるいは対立する知識として現代社会に流通しており、人びとはそれらを断片的に受容し消費していると考えられること。現代人は自身の身体について体系だった理解の枠組みを持ちづらくなっていると思われること。次年度はこれらの成果を踏まえ、日常知が、現代人が自身の身体を理解する上でいかなる形で機能しているか、人びとへの質的調査によってさらに追求していく。本研究の目的は、現代日本における人びとの身体観、身体に関する意識と身体への向き合い方を探究し、その社会的意味を問い、問題提起していくことである。昨年度の作業(身体に関する日常知へのアプローチとして、主に文献研究から、現代社会に流通する身体に関する日常知の様相、その特徴の把握を試みた)を踏まえ、本年度は、身体への諸個人の向き合い方、身体に対する意識、身体管理に関する実際的な活動へのアプローチとして、自己の身体管理にかかわり様々な知識と技術を身につけ具体的な実践を行っている人びとを対象に、質的・半構造化インタビュー調査を行った。対象者は、身体管理に関して非近代西洋医学的な知・技術を身につけ実践している人びと(ヨガ、気功法、アロマテラピー等々)を機縁式で選んだ。主な質問項目は、(1)身体のために行っている実践・活動の内容詳細、実態、およびそれらを行うようになった経緯、(2)自己の身体の状態について意識すること、感じていること、(3)身体管理に関する情報接触、知識、(4)現代社会、現代人の健康、身体管理に関する問題意識等である。得られたデータを文字化し、身体への向き合い方、身体観について分析に着手した。その結果、自己の身体に対する関わり方として大きく2通り(2方向)の関係が浮かび上がってきた。1つは、自己による身体への操作的、道具的な関わり方、もう1つは、逆に身体の方が主導的な、自己と身体の関係である。インタビューでは、とりわけ後者の関係に基づく身体観が浮かび上がってきた。この知見を踏まえ、来年度さらにインタビューを行いデータを充実させ、分析を進めていきたい。<本研究の目的と課題>本研究は、現代日本における人びとの身体観、身体に関する意識と身体への向き会い方を探究し、その社会的意味を人びとの主観的意味に即して捉えていく。そこから、現代社会における身体の置かれた状況を人びとのリアリティの側から批判的に検討していくことを目指すものである。その方法として、1)現代生活に広く流通する身体・健康関連情報を対象とし、身体に関していかなる「知識」が流通し、そこから現代人の身体に関するいかなる「常識や「考え」を取り出すことができるかを、主として言説の質的分析によって浮かび上がらせる、2)自己の身体管理にかかわり何らかの実践を行っている人びとを対象にインタビュー調査を実施し、当事者の身体への意味づけ、身体のとらえ方を探っていく、以上の2つを課題とした。<研究を通して得られた主な知見とその意義>私たちは自分自身を含め周囲のものを意味づけ、その意味に基づいて行為している。身体についても同様である。

ここでは、身体と身体管理に関する日常的な知識と語りへの接近を通して、身体への2つの対照的なアプローチを析出した。1)身体を、何らかの刺激を加えることによって望ましい状態に向けていくような客体として捉えるようなアプローチ(「客体としての身体」観)、2)身体をそれ自体として私たちに何かを語りかけてくる主体として捉えるようなアプローチ(「主体としての身体」観)である。前者では身体は、働きかけの対象として、その持ち主である主体に対して従属的であり、後者では、身体がその待ち主に対して働きかけてくる、その意味で身体の方が主、それに応える側である自己の方が従属的である。本研究では、後者の身体観に、現代社会における身体の扱い方、ライフスタイルを含め、現代社会のあり方を問いなおしていくひとつの契機があると考える。
rTMSの脳卒中後うつ改善効果と神経可塑性関連物質との関係性の調査

14日間のリハビリテーション治療と反復経頭蓋磁気刺激治療(rTMS)の併用療法を行った62名と、14日間のリハビリテーション治療のみ行った33名について、治療前後のうつ状態の評価をBeck depression inventoryにて行い、治療前後の血液検体を採取した。採取した血液検体を用いて、NMDA受容体関連物質である、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、L-セリン、D-セリンの血中濃度測定を行った。その結果、いずれの治療群でも治療前後で有意にうつ状態は改善していた。NMDA受容体関連物質の治療前後の変化として、リハビリテーション治療とrTMSの併用治療を行った群では、リハビリテーション治療のみを行った群に比して、血中のD-セリンが減少していた。リハビリテーション治療とrTMSの併用治療を行った群ではグルタミン、グルタミン酸、グリシンが減少傾向にあり、リハビリテーション治療のみを行った群では増加していた。リハビリテーション治療とrTMSの併用治療を行った群では血中のL-セリンは増加し、リハビリテーション治療のみを行った群では減少していた。当初の予定よりも早く論文投稿を行うことができた。反復経頭蓋磁気刺激治療(rTMS)によって、NMDA受容体関連物質以外の血中バイオマーカーに対して、どのような影響を及ぼすのか検証したい。今年度は、はじめに脳卒中後うつに関する評価法について検討した。脳卒中後うつ患者の選定基準として、当初、Zung Self Depression Scaleにおいて40点以上である者を脳卒中後うつ状態とすることとした。慢性期脳卒中患者80名について、Zung Self Depression Scaleでうつ状態を評価したところ、平均値は27.8±7.2で40点以上は4名であった。このため、Zung Self Depression Scaleでは感度が低く、研究対象者が得られ難いことが判明した。そこで、10点以上でうつ状態と判定されるBeck depression inventoryを使用して、慢性期脳卒中患者80名のうつ状態を評価したところ、平均値は6.5±6.0で10点以上は17名であった。この結果、脳卒中後うつ状態評価のためにBeck depression inventoryを使用することによって、比較的軽症の脳卒中後うつも研究対象に組み入れることができると考えられた。また、脳卒中後うつに対する反復経頭蓋磁気刺激治療(rTMS)の施行方法について検討した。一般的にうつ病患者では背外側前頭前野に対してrTMSを施行することが多いが、一次運動野へrTMSを施行しても血中の脳由来神経栄養因子が増加することが判明しているため脳卒中後うつの改善効果が期待できると考えた。実際に、Beck depression inventoryを評価法として脳卒中後うつと判定される研究対象者17名に対して一次運動野へのrTMSを施行したところ、治療前後でBeck depression inventoryの有意な改善を認めた。また、研究対象者全例で治療前後の血液検体を採取し凍結保存することができた。初年度の時点で、脳卒中後うつ患者17名に対して反復経頭蓋磁気刺激治療(rTMS)を施行することができており、血液検体も採取できている。次年度には目標症例数に達する見込みであり、凍結保存している血液検体の測定も予定している。脳卒中後うつ患者に対する反復経頭蓋磁気刺激治療(rTMS)を継続し、症例数の更なる確保を図る。目標症例数の検体採取がおおむね順調に進められており、次年度には血液検体について血清濃度測定を行うことができると考えられるので、それに伴う諸費用が必要となる。具体的には吸光マイクロプレートリーダー、神経可塑性関連物質のELISA測定キットを購入し、神経可塑性関連物質の血中濃度測定を予定している。本研究成果について、すでに英語論文を作成し、投稿している。当該年度中に出版費を使用する見込みでいたが、論文投稿後の査読に時間を要しており、出版費を使用することなく持ち越しとなってしまった。論文の査読が完了し、出版するにあたって使用する予定である。
生細胞イメージングに基づく情報の流れの推定

細胞は、細胞外刺激の時系列に埋め込まれている様々な情報を、いくつものシグナル経路を利用して選択的に処理していると考えられる。複雑かつ時々刻々と変化する環境情報から、細胞がいかに臨機応変な情報処理をおこなえているかの理解を目的として、細胞性粘菌の細胞運動についての、細胞内シグナル因子の局在や活性を、高精度の時空間系列データを取得し、加えて、微小流路観察系を用いた誘因物質濃度の時空間的制御によって、様々な入力刺激にたいする、応答パターンを特徴づけた。その結果、シグナル伝達経路の上流と下流の間の関係に、倍変化応答、適応性、時間応答についてのフィルター特性などが明らかになった。細胞外cAMPの濃度を時間と空間で自在に変更できる微小流路をもちいて制御し、Ras結合ドメインに蛍光タンパクを結合したRBD-FPを粘菌に発現させ、Rasの一過的な活性化(膜局在)を測定した。その結果、細胞外cAMPの絶対濃度にたいして、Rasの活性化のピーク値が変化すること、またマイクロモル濃度領域では、適応後のRas活性が元のレベルにまで戻らず、細胞外cAMPの絶対濃度に依存する形で上昇することがわかった。この不完全な適応の度合いと細胞外cAMPとの間の関係を解析したところ、シグモイド的な入出力関係を示し、かつEC50などの比較からは、cAMPレセプターのリン酸化が示す入出力関係に近い関係をもっていることが示された。絶対濃度がシグナル伝達経路でどのようにエンコードされているかを解析するため、MAPキナーゼERK2, Akt/PKBの活性を可視化測定するためのプローブを作成中である。また、複数のRasのシグナルを見分けるため、Raichu-Rasの改良版を作成し、その動作の検討を重ねている。また、Rasと下流のアクチン重合を同時測定するために、これまで利用してきたLimEΔコイルにかわり、酵母のアクチン結合部位由来のLifeActの導入をおこなった。ファロイジン染色などとの一致がよりすぐれていることが確認されたため、PHドメインやRBDとの蛍光タンパク融合型プローブとの同時発現する各種の安定発現株を作出した。解析手法においては、情報理論的な観点からの統計解析に詳しい専門家グループと定期的な議論を進め、現実的な手法の検討を重ねた。バッファーとcAMP溶液を二股チャンネルからそれぞれ送液して層流を形成し、拡散によって2層流の境界にcAMP濃度勾配を作成させるための微小流路系の設計および作成をおこなった。これまでにY字型のジャンクションによる勾配形成に加え、天井が低くかつ流路幅の狭いチャンネルについて2層のPDMSをもちいたデザインについて、試行錯誤しながら条件検討をおこなった。これらのデバイス下において、濃度勾配が時間に定常状態を実現できる条件、さらに圧力制御装置とシリンジポンプからの流量を時間的に制御し、操作的に定義された濃度ゆらぎの摂動を加える方法を検討した。特に、秒スケールの変動の分解能と、2桁以上の濃度レンジの精度が実現を目指した。活性型Rasに選択的に結合するヒトのRaf-1タンパク質のRas結合ドメイン(RBD)に赤色蛍光タンパク質RFPを融合させたもの、ならびに、アクチン結合ペプチドにGFPを融合させたRFPRaf-1RBDの両方を共発現させた細胞を用い、膜付近における蛍光輝度値分布を計測した。同時に、青色蛍光分子をcAMP溶液と混合し、細胞外cAMP濃度の指標とした。これによって、活性型RasとF-actin、細胞外cAMPそれぞれの空間分布を3波長で経時的に測定するための条件出しをおこなった。また、Ras以外に、細胞内cAMPとアクチンの同時測定系についても、データ取得を進めた。さらに、細胞内の入力として、オプオジェネクティクスを用いてRasの活性型を調節する系の開発を進め、その条件出しを進めた。微小流路にバッファーとcAMP溶液を二股チャンネルからそれぞれ送液して層流を形成し、拡散によって2層流の境界にcAMP濃度勾配を作成した。この状況のもとで、細胞先端を特徴付ける、活性型Rasに選択的に結合するヒトのRaf-1タンパク質のRas結合ドメイン(RBD)に赤色蛍光タンパク質RFPを融合させたもの、ならびに、アクチン結合ペプチドにGFPを融合させたRFPRaf-1RBDの両方を共発現させた細胞生粘菌株を用い、一方向的に運動している様子のタイムラプス測定により、膜付近における蛍光輝度値分布を計測した。同時に、青色蛍光分子ATTO425をcAMP溶液と混合し、細胞外cAMP濃度の指標とした。前年度まで問題となっていた勾配の揺らぎについては、サンプル調整、デバイス調整の工程の詳細を改良し、ほぼ問題のないところまで改善できた。また、Ras以外に、Racとの同時測定系を立ち上げ、データ取得と相関解析を進めた。その結果、ある一定の条件においては、細胞の運動やアクチンとの連動はRas活性よりもRacの方が強いことが明らかになった。また、上流と下流の関係については、観察している断面以外のデータがないことからくる不完備さが問題としてあり、3次元データの取得のための条件出しを進めた。データ取得に当初計画で想定していた以上の手間を要したため。

複雑かつ時々刻々と変化する環境情報から、細胞がいかに臨機応変な情報処理をおこなえているかの理解を目的として、細胞性粘菌の細胞運動についての、細胞内シグナル因子の局在や活性を、高精度の時空間系列データを取得し、加えて、微小流路観察系を用いた誘因物質濃度の時空間的制御によって、様々な入力刺激にたいする、応答パターンを特徴づけた。その結果、シグナル伝達経路の上流と下流の間の関係に、倍変化応答、適応性、時間応答についてのフィルター特性などが明らかになった。シグナル伝達系の一部の部分についての入出力関係の同定が進んでおり、計画通りの研究が遂行できている。シリンジポンプによる送液において、不可避的に生じる速度ゆらぎによって勾配が時間にゆらぐ。このゆらぎと細胞の走化性応答との間の関係の測定を進めている。解析がやや予定より遅れているものの、濃度勾配を高い定量性で推定するには、光学系、流路系の双方において綿密な条件出しが必要であり、これについて技術的な知見を蓄積してきている。昨年度までの測定と解析を発展させ、昨年度導入の100倍レンズ、さらに今年度導入予定のピエゾステージによって膜付近における蛍光輝度血の3次元的な分布を経時的に追跡する。また波長の重なりの問題があったAttoに変えて、昨年度導入の640nmレーザーを用いて、近赤外領域のAlexaを用いたイメージぐに切り替えることで、cAMP刺激の可視化と、細胞内反応の可視化の重なりを最低限に抑える工夫を重ねる。これまでの解析の限界であったデータの不完全性を克服すべく、受容体直下の3層のシグナル伝達の関係を、様々な刺激下で定量化したデータを得る。Ras, Rac, PI3K, Scar/WAVEについてデータ取得を重ね、3次元的な細胞運動の出力がいかに上流から下流へのシグナルの受け渡しによって形作られているかを、情報量による特徴づけを行う。細胞生物物理学初年度度は空間的な一様刺激の解析、次年度の定常勾配化でのシグナル因子の空間分布と細胞膜上の各位置における、測定解析に引き続き、第3年度は勾配の時間的にゆらぎと方向検出についての関係、ならびにオプトジェネティクスによる摂動について、詳細な解析をすすめる。勾配の検出限界についての予備的なデータもできてきており、この視点と情報のエンコーディングとの関係に注目し、研究を進める。バクテリアの走化性における関連研究にも注目し、定式化の参考とする。シグナル伝達系の一部の部分についての入出力関係の同定が進んでおり、計画した研究が遂行できている。入出力関係の同定には、幅広い対象の探索が必要であり、これについては新たなプローブ導入を試みているものの、時間を要する作業であることと、人的リソースの確保が年度の遅い段階までできなかった。そこで、解析手法に関する検討を前倒しして進め、また現在あるプローブでできる解析を優先しておこなった。データの解析を進めるうちに、細胞の3次元的なデータを取る必要性が明らかになってきた。そのためには、高速の電動ステージが必要となるが、すぐに導入するには高額のため他の実験を圧迫してしまうことが予想され、翌年度の支出状況を見極めながら導入を計画することとした。解析に用いるデータ取得の条件出しに時間がとられており、予定していた顕微鏡まわりの改変や細胞の改変の計画を次年度にまわしたため。
アメフラシ消化管神経集網のニューロン回路と中枢-末梢神経系連関の解析

アメフラシ消化管運動において、中枢神経節内の同定ニューロンによる神経支配機構の研究は多く行われているが、消化管に内在する神経集網の活動や機能は殆ど調べられていない。そこで本研究では消化管の各部位毎に特徴的に分布する神経集網の末梢ニューロン群について研究を行ない、以下の主要な成果を得た。1、咀嚢、咀嚢と砂嚢の境界の環状神経束、砂嚢の各ニューロン群は同調的バースト活動を示した。highMg^<2+>溶液による砂嚢上の化学シナプス阻害で、同調的バーストの発生頻度と個々のバースト活性が減少した。咀嚢と環状神経束での化学シナプス阻害ではバースト活性の減少のみが起った。これらの事から同調的活動リズムの起源が砂嚢上のニューロン群にある事を明らかにした。2、この同調的バースト活動が砂嚢の括約的運動を惹き起こしている事、即ち、従来もっぱら筋原性と考えられてきた消化管運動に神経原性のものが含まれている事を明らかにした。3、咀嚢から砂嚢上のニューロンで記録される同調的バースト活動とともに、それとは異なる周期の同調的バースト活動が咀嚢及び環状神経束から記録された。食物を一時的に貯留する咀嚢を膨張させると、それらのバースト活動頻度が共に上昇した。腸管神経系の2つの同調的バースト活動のリズムを制御する自己受容反射回路がある事が示唆された。4、砂嚢の自律運動には、砂嚢に内在する末梢ニューロン群の自発的バースト放電に起原する神経原性運動と、筋肉の歩調取り電位に伴う筋原性運動が区別された。砂嚢に対するアセチルコリンの興奮性効果が報告されているが、その作用部位は不明であった。アセチルコリン投与で、末梢ニューロンのバースト頻度と筋肉の歩調取り電位の頻度が共に上昇した。アセチルコリン受容体は末梢ニューロンと筋細胞上に存在し、共に砂嚢の自律運動の促進性作用を担う事が示された。アメフラシ消化管において、中枢神経節内の同定ニューロンによる神経支配機構の研究は多く行われているが、消化管に内在する神経集網の活動や機能は殆ど調べられていない。そこで本研究では消化管の各部位毎に特徴的に分布する神経集網の末梢ニューロン群の活動と機能、その神経回路について研究を行なった。1、細胞内色素注入により、末梢ニューロンの軸索走行を調べた結果、そ嚢に砂嚢までのびる軸索を持つ下向性ニューロン、砂嚢にそ嚢までのびる軸索を持つ上向性ニューロンが存在する事を明らかにした。2、そ嚢、そ嚢と砂嚢の境界の環状神経束、砂嚢の各ニューロン群は同調的バースト活動を示した。そ嚢と環状神経束での化学シナプス阻害ではバースト活性の減少のみが起った。これらの事から、同調的活動リズムの起源は砂嚢上のニューロン群にある事を明らかにした。3、この同調的バースト活動が砂嚢の括約的運動を惹き起こしている事、即ち、従来もっぱら筋原性と考えられてきた消化管運動に神経原性のものが含まれている事を明らかにした。4、中枢神経系を除いた消化管のみの標本において、食物が一時的に貯留するそ嚢を微小バルーンにより膨張させると、このバースト活動の発生頻度が上昇し個々のバーストの活性も上昇した。

また、砂嚢内壁の咀嚼歯を傾けるとバースト発生頻度の低下と個々のバースト活性の減弱が起こった。消化運動リズムを制御する自己受容反射回路が消化管の末梢ニューロン群内に存在することが示唆された。消化管には「第二の脳」などとも呼ばれる神経系が内在し、その自律的制御を司っていると考えられるが、その詳細には不明な点が多い。アメフラシの消化管において、中枢神経節(口球神経節)内の同定ニューロンによる神経支配機構の研究は多く行われているが、消化管に内在する末梢ニューロン群の活動や機能は殆ど調べられていなかった。本研究では消化管の各部位毎に特徴的に分布する末梢ニューロンの活動と機能、その神経回路について調べた。本年度は主に神経伝達物質と消化管運動反射回路に関わる以下の成果を得た。1、中枢神経系を切除した標本で、咀嚢から砂嚢上のニューロンで砂嚢上のニューロンに起源すると考えられる周期的な同調的バースト活動が記録された。一方、咀嚢及び咀嚢-砂嚢間の環状神経束から、それと異なる周期の同調的バースト活動が記録された。食物を一時的に貯留する咀嚢を膨張させると、それらのバースト活動頻度が共に上昇した。腸管神経系の2つの同調的バースト活動のリズムを制御する自己受容反射回路がある事が示唆された。2、砂嚢に対するアセチルコリンの興奮性効果が報告されているが、その作用部位は不明である。砂嚢の自律運動には括約的な収縮と部分的な収縮が区別され、各々、砂嚢に内在する末梢ニューロン群の自発的バースト放電に起原する神経原性運動と、筋肉の歩調取り電位に伴う筋原性運動であった。アセチルコリン投与で、末梢ニューロンのバースト頻度と筋肉の歩調取り電位の頻度が共に上昇した。アセチルコリン受容体は末梢ニューロンと筋細胞上に存在し、共に砂嚢の自律運動の促進性作用を担う事が示された。
子宮胎盤形成不全症の新たな治療～骨髄由来内皮前駆細胞の血管形成と新規抗凝固薬～

骨髄由来血管内皮前駆細胞(EPC)移植治療による反復流産予防効果の検討を行った。外的にEPCを移植することで妊娠初期における胎盤の血管形成を促進し、流産を防止するという仮説を立て以下の検討を行った。1末梢血中のEPC数についての検討、2胎盤のreal time PCR比較についての検討、3培養EPCの増殖能と遊走能についての検討、4EPC投与による流産率低下についての検討。結果は、正常妊娠群、流産群のどの群においても循環血中のEPC(CD34陽性細胞)の数に違いを認めなかった。Real time PCRでは、流産群でIGF-2、sFlt-1、VEGFが有意に上昇していた。PlGFは、PCRで両群間で有意な差を認めなかった。sFlt-1処理をした培養EPCでは、有意に増殖能と遊走能が低下していた。反復流産モデルマウスの流産をEPCを投与することで流産を減少させた。EPCの胎盤への取り込みは、正常妊娠群よりも流産群で有意に取り込みが多いという結果であった。流産群における血管周囲径は正常群より有意に小さかった。EPC投与で流産群の血管構造をほぼ正常レベルまで構造を改善した。結論として再発性流産のハイリスク患者自身より培養したEPCを妊娠初期に移植することで、胎盤形成期の新生血管を正常化し、流産を防止する可能性が示唆された。今後、流産に対するEPC治療の実現のためには、胎盤における血管形成の異常メカニズム及び胎盤に集積したEPCの細胞生物学的役割を探索し、有効性と安全性の確認を行なうことが重要であると考えています。CBA/Jマウスの骨髄から採取したEPCを、CBA/J×DBA/2マウスに静脈内投与し(コントロール群にはPBSを投与)し、18日後に流産率、胎盤重量、生存胎仔の体重を比較し、不育症の改善効果を検討した。また、Qtrackerによる細胞染色システムを用いて、投与するEPCを蛍光プローブであるDiIにより赤色に染色することで、投与されたEPCの存在部位を確認できるため、EPC群とコントロール群の胎盤におけるEPCの存在を蛍光免疫染色で比較検討した。さらに、両群の胎盤における血管新生をCD34による免疫組織化学染色で比較検討し、EPCの血管新生作用を検証した。不育症マウスにEPCの投与を行っており、流産改善予防効果を検証できているため。ES細胞またはiPS細胞由来血管内皮前駆細胞を用いた流産・妊娠高血圧腎症モデルマウスに対する治療効果とそのメカニズムの検討妊娠高血圧腎症は、妊娠20週以降に高血圧と蛋白尿を認める症候群で、子癇発作、常位胎盤早期剥離、胎児発育不全などの重篤な合併症を引き起こす。しかし、効果的な治療法が対症療法しかなく、根本的な治療は、妊娠の終了しかないため、治療法の開発は急務である。当グループでは、CBA/J(♀)×DBA/2(♂)の掛け合わせによって出来る流産・妊娠高血圧腎症モデルマウスに骨髄から分化させた血管内皮前駆細胞を投与することで流産率を改善することを報告した。しかし、一つの個体を治療するのに複数の個体から骨髄を採取することが必要であり、将来の細胞移植治療への応用時に妨げとなるため、本研究では、ES細胞またはiPS細胞から血管内皮前駆細胞を分化誘導し、マウスへ投与することで流産率、血圧や蛋白尿について非投与群・骨髄から採取した群と比較検討する。免疫応答を考慮し、母体のCBA/JマウスからまずES細胞を樹立し、樹立したES細胞の解析を行い、ES細胞の証明を行った。またES細胞から血管内皮前駆細胞を分化誘導させ、流産モデルマウスへ投与することで、流産率が有意に低下していることを確認した。今後は、流産率を低下かせたメカニズムを検討し、論文作成を予定している。これまでの研究によりCBA/JマウスからのES様細胞に樹立することに成功し、樹立したES様細胞が真にES細胞であると検証する実験(in vitroでの3胚葉への分化、核型解析)に成功した。また樹立したES様細胞およびヒトiPS細胞から血管内皮前駆細胞への分化誘導条件を確立でき、血管内皮前駆細胞を大量に調整し、流産・妊娠高血圧腎症モデルマウスへ移植し、流産率の有意な低下を確認した。今後は、流産率を低下させたメカニズムの検証する予定である。以上の実験の結果をみながら論文作成を開始する。

sFlt-1処理をした培養EPCでは、有意に増殖能と遊走能が低下していた。反復流産モデルマウスの流産をEPCを投与することで流産を減少させた。EPCの胎盤への取り込みは、正常妊娠群よりも流産群で有意に取り込みが多いという結果であった。流産群における血管周囲径は正常群より有意に小さかった。EPC投与で流産群の血管構造をほぼ正常レベルまで構造を改善した。結論として再発性流産のハイリスク患者自身より培養したEPCを妊娠初期に移植することで、胎盤形成期の新生血管を正常化し、流産を防止する可能性が示唆された。今後、流産に対するEPC治療の実現のためには、胎盤における血管形成の異常メカニズム及び胎盤に集積したEPCの細胞生物学的役割を探索し、有効性と安全性の確認を行なうことが重要であると考えています。不育症マウスにEPCの投与を行っており、流産改善予防効果を検証できたため、そのメカニズムについて検討していく。これまでの研究によりCBA/JマウスからのES様細胞に樹立することに成功し、樹立したES様細胞が真にES細胞であると検証する実験(in vitroでの3胚葉への分化、核型解析)に成功した。また樹立したES様細胞およびヒトiPS細胞から血管内皮前駆細胞への分化誘導条件を確立でき、血管内皮前駆細胞を大量に調整し、流産・妊娠高血圧腎症モデルマウスへ移植し、流産率の有意な低下を確認した。今後は、流産率を低下させたメカニズムの検証する予定である。