hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
細胞内での相同組換え反応、1分子反応の解析

Rad51、Rad52は相同組換え反応の中心的な役割を担う蛋白質である。生体内においてDSBが修復される際、これらの組換え蛋白質が「反応の場(DSB)」においてどのような挙動を示すのかについて調べるため、出芽酵母のMAT遺伝子座をGFPで標識した。MAT遺伝子座へのDSB導入が制御可能な株を用い、GFPを指標にして解析することで、1つのDSB部位でおこるイベントを追うことができる。DSB修復時の組換え蛋白質の結合、解離、を蛍光抗体染色で調べ、DNAレベルの中間体形成のタイミングと比較した。その結果、相同組換え反応時にRad52が少なくとも3つのステップ-Rad51フィラメント形成前、フィラメント上、フィラメント解離後-で機能していることが分かった。さらに、この系を用いて、抗Rad51,Rad52抗体を用いたクロマチン免疫沈降法を行ったところ、DSBの両端でこれらの因子の分布が異なる事が示唆される結果が得られた。因子の分布の非対称性は非常に興味深く、現在はこの極性が何に起因するのかを検証している最中である。非対称分布のメカニズムが明らかにする事は、体細胞分裂のみならずさらに多くの因子の介在する減数分裂期の制御機構を解く鍵になる可能性があり、非常に重要な仕事であると考えている。また、このGFP標識系を用い{チェックポイント因子として知られるMec3とDdc2について1つのDSB上での挙動を調べた。出芽酵母ではDSB1つでチェックポイントが活性化することはないため、この系を用いれば、組換え反応に寄与するMec3、Ddc2の挙動が解析できると期待した。間接蛍光抗体法の結果からMec3とDdc2の結合、解離のキネティックスが異なる事が示され、クロマチン免疫沈降法の結果からはこれらの因子の分布にも極性がある事が示唆された。
発生におけるカスパーゼ活性の可視化と生体機能の遺伝学的解析

細胞死実行に中心的な役割を果たすカスパーゼは細胞死刺激を受けて活性化するシステインプロテアーゼである。カスパーゼの活性化ダイナミクスを感度よくモニターすることが出来れば、組織でのカスパーゼ活性化初期過程をも検出することができ、細胞死のみならずカスパーゼの発生における生理機能の解析が飛躍的に進むと期待される。本研究ではカスパーゼの活性化状態を生体レベルでリアルタイムに検出することによって、発生過程でのカスパーゼシグナルのダイナミクスを記載し、細胞死やカスパーゼの活性化によって引き起こされる生理現象を理解することを目標としている。活性化型カスパーゼの検出を生体内で生きたまま解析するための強力なプローブを、蛍光蛋白質を用いたFRET(蛍光共鳴エネルギー移動)を利用する方法を用いて構築した。我々はFRETのドナーにECFPを、アクセプターにVenusを用い、両蛍光たんぱく質にカスパーゼ切断至適配列DEVDを挿入した新規カスパーゼ3 indicator「SCAT3」を開発し、このペアを採用することで細胞内で安定的にカスパーゼ活性化の解析を可能にした。個体でのカスパーゼ活性化部位を調べる目的でUAS-Gal4システムにてSCAT3を発現するトランスジェニックショウジョウバエを作製した。カスパーゼ活性化因子Dapaf-1変異体ではショウジョウバエ小楯板の剛毛増加が観察されることからこの領域でカスパーゼの活性化が起こっていて、剛毛の発生に関与することが考えられた。そこで、Scabrous-Gal4を用いて剛毛前駆細胞でSCAT3を発現させたところ、翅成虫原基でのScabrous陽性細胞クラスターで弱いながらカスパーゼの活性化が検出された。翅成虫原基における死細胞をTUNEL法で観察するとScabrous陽性細胞クラスターには殆どシグナルが観察されず、Scabrous陽性細胞クラスター内でのカスパーゼ活性化は細胞死以外の機能を持っことが予想された。生体内で生きたまま分子の機能を解析するための強力な手段として蛍光蛋白質を用いたFRET(蛍光共鳴エネルギー移動)を利用する方法が注目されている。FRETを利用することで優れた時間・空間的分解能により目的分子の動態を解析することが出来る。我々はFRETのドナーにECFPを、アクセプターにVenusを用い、両蛍光たんぱく質にカスパーゼ切断至適配列DEVDを挿入した新規カスパーゼ3 indicator「SCAT3」を開発し、このペアを採用することで、初めて生きた細胞内で安定的にカスパーゼ活性化の解析を可能にした。さらにUAS-Gal4システムにてSCAT3を発現するトランスジェニックショウジョウバエを作製した。ショウジョウバエの発生は、胚期から幼虫に至るまで約20時間を要するが、これまでこうした長時間を、しかも生体においてFRET Imagingを試みた例は殆ど報告されていない。胚は厚みがあるため、共焦点レーザー顕微鏡による解析が欠かせないが、問題は長時間のイメージングに胚が耐えられるかにある。実際、一般に用いられているガルバノミラーを用いたシングルポイントスキャン型共焦点顕微鏡では、特に高N.A.のレンズを用いた際にはわずか数時間イメージングのみでindicatorは激しく退色する。我々はスピニングデイスクを用いたマルチポイントスキャン型を採用することにより、24時間以上生体内においてbleachingすることなく蛍光イメージングを行うシステムを構築した。さらに我々は以上のシステムと以下に示すSCAT3.1を発現した胚を用いて、生きた生体においてカスパーゼ活性化のリアルタイムイメージングを行っている。
加齢性黄斑変性症のモデル

加齢に伴い、ヒトの網膜色素上皮細胞のリポフスチン顆粒の増加、Bruch膜の肥厚や構成成分の変化、脈絡膜毛細血管の萎縮などの変化がみられることが報告されている。今回の研究では、ラットの硝子体に蛋白分解酵素阻害剤であるE-64を注入するモデルを、注入回数や動物を固定するまでの時間を違えて作成し、網膜や脈絡膜に加齢に類似する変化を生じさせることを目的とした。電子顕微鏡で観察した結果、1回の薬剤注入では、網膜色素上皮にリポフスチン様顆粒が一過性に増加し、その他の変化を来たさなかったのに対して、数回の注入では、不可逆的な病理変化を来たした。すなわち、網膜色素上皮内にリポフスチン様顆粒の増加、オートファゴソームの増加、網膜色素上皮の萎縮、Bruch膜への線維芽細胞や周皮細胞突起の侵入、毛細血管の萎縮、さらには視細胞の萎縮など、ヒトにみられる加齢変化に類似する病理変化が観察された。なお、脈絡膜新生血管は観察されなかった。一般に、加齢黄斑変性症は、加齢変化の延長上に位置しているとも考えられていることから、これらの実験モデルの結果を基礎にさらに改良を加えれば、加齢黄斑変性症の動物モデルになる可能性が得られた。1.蛋白分解酵素阻害剤の硝子体注入実験リポフスチン等の顆粒が細胞内に尋常に増加した場合、細胞小器官やその周囲の組織にどのような影響を与えるかをみる実験を行った。白色ラットの硝子体へ蛋白分解酵素阻害剤であるE-64を注入することにより、網膜色素上皮にリポフスチン様顆粒が増加する。顆粒の増加は、ある時点までは可逆性であるが、蓄積が1週間以上続くと、網膜色素上皮の委縮、視細胞外節、内節の短小化、脈絡膜毛細血管の委縮を来たすことを見い出した。2.加齢と網膜色素上皮およびブルッフ膜の変化加齢に伴って、人眼では網膜色素上皮細胞内のリポフスチン顆粒、ブルッフ膜の厚さが増加する。その変化は直線的ではなく、一定の年齢に達するとプラトーに達することを見い出した。
都市整備過程把握のためのサイバーシティの構築に関する基礎的研究

本研究の目的は、ニューラルネットワーク(NNモデル)によって学習された都市の市街化過程を遺伝的アルゴリズム(GAモデル)を用いて時間的に進化させるサイバーシティを構築し、北海道の帯広当接圏を対象に都市開発プロジェクトが都市整備過程に与える影響を記述することである。サイバーシティという人工知能によって支援される都市空間の研究では、対象地域を開放系として扱い、ニューラルネットワークや遺伝的アルゴリズムといった「学習」・「進化」過程を取り込んで状態を記述するが、本研究では進化の部分に遺伝的アルゴリズムの新たな開発と応用を行なうことが特徴である。本年度の研究実績は、(ア)対象地域である帯広都市圏のデータ収集、(イ)2つのNNモデルを並列に並べた市街化過程を記述するモデルの構築、(ウ)GAによる進化モデルの構築、であり、具体は次のとおりである。(ア):対象地域である帯広都市圏において、昭和55年からの建物用途別土地利用データを50*50mのメッシュでコンピュータ入力し、ゾーニングに対応したポリゴンベースへのデータ編集と、地価データの精査を行なった。(イ):NNモデルの内、飽和度NNモデルは、22住区単位で完成させ、占有度NNモデルの構築についてもモデルを並列処理して解くアルゴリズムの開発を終えた。(ウ):GAモデルは、NNモデルとの統合を考えたNGLモデルの構築へと発展させる基礎的アルゴリズム構築を終了した。このモデルを用いて、市街化が同心円状に進展している帯広都市圏において平成2年から始まり平成9年に完成した鉄道高架事業を対象して、モデルの感度分析を行なって見た。その結果モデルの感度は比較的よく、来年度に予定している本問題設定でのサイバーシティ適用が可能か否かの最終吟味について、手ごたえが得られたと考えている。
HUSH complexの転写抑制機能とRNA結合能の関連の解明

本年度はin vitroの実験系を用いてHUSH complexとRNAの相互作用を解析することを優先的に行った。まず、in vitroでリコンビナントタンパク質を用いてHUSH complexの主な構成因子でこの複合体のクロマチン結合に必須であるMPP8のRNA結合能を解析したところ、MPP8がRNA結合能を持つことがわかり、このタンパク質のRNA結合に重要な領域を特定することもできた。これに加え、HUSH complexと共に働くヒストンメチル化酵素、SETDB1についても微弱ながらRNA結合能を持つことが分かった。また、ペプチドや再構成ヌクレオソームを用いて、RNA結合がMPP8やSETDB1のクロマチン結合に影響するのか否かを調べたところ、RNA存在下・非存在下において、これらの因子とヒストンH3テール又はヌクレオソームの結合に顕著な差は見られなかった。よって、in vitroの条件下において、RNA結合はMPP8やSETDB1のクロマチン結合に影響しないことが示唆された。次に、SETDB1のヒストンメチル化活性に対するRNAの影響をin vitroで解析したところ、RNAの存在下では、非存在下に比べてジメチルヒストンH3リジン9のレベルが上昇することがわかった。また、RNA添加によるこのヒストン修飾の上昇はMPP8を加えるとより顕著になったことから、RNAとMPP8が相乗的にSETDB1の酵素活性を制御する可能性が示された。さらに、細胞内でHUSH complex構成因子とRNAの相互作用をRNA免疫沈降で検討したところ、二つのHUSH complex構成因子に対する抗体でRNAを共免疫沈降することができた。よって、細胞内でもこれらの因子がRNAに結合していることを示唆することができた。まず、HUSH complex構成因子(TASOR, MPP8, PPHLN1)と共に働くヒストン修飾酵素のSETDB1のRNA結合能等をin vitroの実験系で調べるために、cDNAをヒト培養細胞から抽出したRNAから作成し、大腸菌や昆虫細胞を用いてリコンビナントタンパク質の発現・精製を試みた。大腸菌では全ての全長リコンビナントタンパク質の発現が低く精製が困難であったが、少なくとも昆虫細胞から全長リコンビナントMPP8とSETDB1を精製することができた。これらのリコンビナントタンパク質と短縮型リコンビナントMPP8を用いてRNA結合能の検討、RNA結合に重要なMPP8の領域の特定、RNA結合がMPP8とSETDB1のクロマチン結合や酵素活性に及ぼす影響の検討を行うことができた。TASORとPPHLN1については、全長リコンビナントタンパク質の発現や精製が非常に困難だった為、ヒト培養細胞内におけるRNAとの相互作用を確認することを優先的に進めることにした。すでにTASOR(とMPP8)に関しては、これらのタンパク質に対する抗体を用いてRNA免疫沈降を行い、RNAがTASORやMPP8(もしくはこれらを含む複合体)と共免疫沈降されることを確認している。PPHLN1については、抗エピトープタグ抗体を使用してRNA免疫沈降を行う必要があるため、EGFP/Flagタグを融合させたPPHLN1を発現する細胞株を樹立した。よって、計画事項の内容または順序を変更する必要はあったが、総合的には概ね良好に進んでいる。実験的に証明された高品質の抗体が登場したことやリコンビナントタンパク質の作成が非常に困難である等の理由から、当初の予定を変更し、次年度は以下の実験を実施することを予定している。-MPP8のRNA結合に重要と思われる領域の変異型リコンビナントMPP8を作成し、RNA結合の消滅もしくは減少をin vitroで検証する。RNA結合の消滅または減少を確認できたら、in vitroの実験系を用いてSETDB1のヒストンメチル化活性への影響を検討する。CRISPR/Cas9法等でヒト培養細胞で内在性のMPP8に同様の変異を導入することを試みる。-TASORとPPHLN1については、個々のタンパク質のRNA結合能をin vitroで解析することは困難であることが予測される。しかし、HUSH complexの主な構成因子を共発現することによってタンパク質の安定性や可溶化の向上が期待できることから、HUSH complexとしてのRNA結合能を検討するために昆虫細胞でこれらを共発現し、精製することを試みる。

さらに、細胞内でHUSH complex構成因子とRNAの相互作用をRNA免疫沈降で検討したところ、二つのHUSH complex構成因子に対する抗体でRNAを共免疫沈降することができた。よって、細胞内でもこれらの因子がRNAに結合していることを示唆することができた。まず、HUSH complex構成因子(TASOR, MPP8, PPHLN1)と共に働くヒストン修飾酵素のSETDB1のRNA結合能等をin vitroの実験系で調べるために、cDNAをヒト培養細胞から抽出したRNAから作成し、大腸菌や昆虫細胞を用いてリコンビナントタンパク質の発現・精製を試みた。大腸菌では全ての全長リコンビナントタンパク質の発現が低く精製が困難であったが、少なくとも昆虫細胞から全長リコンビナントMPP8とSETDB1を精製することができた。これらのリコンビナントタンパク質と短縮型リコンビナントMPP8を用いてRNA結合能の検討、RNA結合に重要なMPP8の領域の特定、RNA結合がMPP8とSETDB1のクロマチン結合や酵素活性に及ぼす影響の検討を行うことができた。TASORとPPHLN1については、全長リコンビナントタンパク質の発現や精製が非常に困難だった為、ヒト培養細胞内におけるRNAとの相互作用を確認することを優先的に進めることにした。すでにTASOR(とMPP8)に関しては、これらのタンパク質に対する抗体を用いてRNA免疫沈降を行い、RNAがTASORやMPP8(もしくはこれらを含む複合体)と共免疫沈降されることを確認している。PPHLN1については、抗エピトープタグ抗体を使用してRNA免疫沈降を行う必要があるため、EGFP/Flagタグを融合させたPPHLN1を発現する細胞株を樹立した。よって、計画事項の内容または順序を変更する必要はあったが、総合的には概ね良好に進んでいる。実験的に証明された高品質の抗体が登場したことやリコンビナントタンパク質の作成が非常に困難である等の理由から、当初の予定を変更し、次年度は以下の実験を実施することを予定している。-MPP8のRNA結合に重要と思われる領域の変異型リコンビナントMPP8を作成し、RNA結合の消滅もしくは減少をin vitroで検証する。RNA結合の消滅または減少を確認できたら、in vitroの実験系を用いてSETDB1のヒストンメチル化活性への影響を検討する。CRISPR/Cas9法等でヒト培養細胞で内在性のMPP8に同様の変異を導入することを試みる。-TASORとPPHLN1については、個々のタンパク質のRNA結合能をin vitroで解析することは困難であることが予測される。
TGFーβ受容体阻害薬による新規骨髄腫骨病変治療法の開発

多発性骨髄腫は、骨髄微小環境に依存した進展を示し広範な骨破壊性病変を形成する難治性の造血器悪性腫瘍である。骨髄腫骨病変部では、活性型TGF-βが多量に存在し骨形成を抑制していると考えられる。本研究結果から、TGF-βI型受容体(ALK5)阻害薬によるTGF-β作用の阻害は、骨髄腫において骨芽細胞分化を誘導し骨髄腫腫瘍進展を抑制することが示唆され、ALK5阻害薬が骨形成の回復と同時に骨髄腫の腫瘍進展を抑制する新たな分子標的治療法の開発につながり得ることが示された。本症の骨病変部では破骨細胞形成の亢進と同時に骨芽細胞分化が抑制され、骨破壊と急速な骨喪失が惹起されている。骨芽細胞分化の強力な抑制因子であるTGF-βは、骨基質内に多量に蓄えられており、骨吸収に伴い骨より動員され活性型となる。従って、破骨細胞による骨吸収が著明に亢進している骨髄腫骨病変部では、活性型TGF-βが多量に存在し骨形成を抑制していると考えられる。そこで、TGF-βI型受容体(ALK5)阻害薬によるTGF-β作用の阻害が多発性骨髄腫における骨芽細胞分化および腫瘍進展に及ぼす影響を検討した。得られた結果は以下に要約される。1. ALK5阻害薬は骨髄腫細胞上清による骨芽細胞分化の抑制を回復し、骨芽細胞分化を著明に促進した。3. ALK5阻害薬は骨髄腫動物モデルにおいて骨融解病変の形成と骨髄腫進展を抑制した。以上より、TGF-β作用の阻害は骨髄腫において骨芽細胞分化を誘導し骨髄腫腫瘍進展を抑制することが示唆された。骨髄腫でみられる骨芽細胞分化の抑制は、骨病変の形成のみならず骨髄腫細胞を成熟骨芽細胞による生存抑制から回避させている可能性がある。本研究で、ALK5阻害薬が骨形成の回復と同時に骨髄腫の腫瘍進展を抑制する新たな分子標的治療法の開発につながり得ることが示された。そこで、TGF-βI型受容体(ALK5)阻害薬によるTGF-β作用の阻害が多発性骨髄腫における骨芽細胞分化および腫瘍進展に及ぼす影響を検討し、以下の結果を得た。1.ALK5阻害薬は骨髄腫細胞上清による骨芽細胞分化の抑制を回復し、骨芽細胞分化を著明に促進した。3.石灰化結節を形成するまで成熟・分化した骨芽細胞は、その前駆細胞の骨髄間質細胞とは逆に骨髄腫細胞にアポトーシスを誘導した。4.ALK5阻害薬は、骨芽細胞分化を促進させより早期に骨芽細胞からの骨髄腫細胞に対する生存抑制活性の産生を誘導した。5.ALK阻害薬は骨髄腫動物モデルにおいて骨融解病変の形成と骨髄腫細胞の増殖を抑制した。
他人からの手、足(四肢)同種移植の実験的研究-キメリズムの成立と免疫寛容の導入-

四肢移植は、移植片が抗原性の強い骨髄や皮膚を含んだ複合体であり内臓器移植よりも生着が困難である。加えて、非生命維持器官であるため免疫抑制剤の長期投与はその重篤な副作用の発現を考えると許されるものではない。本実験の目的は、他人からの手、足(四肢)同種移植に対する免疫学的寛容を獲得することである。実験動物はドナーとしてGFPラット(outbred Wistar)とLacZラット(inbred DA)を用い、レシピエントとしてLewisラット(MHC expression, RT1^1)を用いた。実験モデルは、四肢移植はこれまで私達が用いてきた右後肢同所性移植モデルを(1997,1999)を用いた。四肢移植モデルについて、皮膚は下腿中央部で円周上に切開、その他の構成部は大腿骨中央部で切断する。recipientに作成した同様の右後肢欠損部に移植片を挿入、大腿骨はキルシュナー鋼線で固定、坐骨神経、大腿動静脈を手術用顕微鏡で神経血管吻合、筋肉、皮膚を縫合する。免疫抑制剤はFK506(Prograf)を使用し、その投与量は1mg/kg/dayとした。移植四肢の評価法は、1)拒絶判定;移植肢の拒絶判定は、四肢移植では皮膚拒絶が肉眼的に判断された腫脹を伴う発赤が24時間継続した時点、その他の移植は組織学的に判断する。2)軟x線撮影;移植肢は1週間おきに軟x線撮影を行い、新生骨の形成、骨癒合を観察する。4)組織所見;HE染色を各構成体に行い、拒絶の評価を行う。評価の段階には我々が報告したrejection grading scaleを用い(1998,2000)、統計学的処理を行い各群間の有意差を判定した。キメリズムの評価は、移植後、1,6,12,24,48週に屠殺し胸腺、骨髄、肝臓、脾臓、リンパ節、血液など各リンパ器官を採取し、ドナーであるGreen Fluorescent Protein-Transgenic Rat細胞またはLacZRat細胞の遊走について観察した。実験動物はドナーとしてGFPラット(outbred Wistar)とLacZラット(inbred DA)を用い、レシピエントとしてLewisラット(MHC expression, RTl^l)を用いた。

移植四肢の評価法は、1)拒絶判定;移植肢の拒絶判定は、四肢移植では皮膚拒絶が肉眼的に判断された腫脹を伴う発赤が24時間継続した時点、その他の移植は組織学的に判断する。2)軟x線撮影;移植肢は1週間おきに軟x線撮影を行い、新生骨の形成、骨癒合を観察する。4)組織所見;HE染色を各構成体に行い、拒絶の評価を行う。評価の段階には我々が報告したrejection grading scaleを用い(1998,2000)、統計学的処理を行い各群間の有意差を判定した。キメリズムの評価は、移植後、1,6,12,24,48週に屠殺し胸腺、骨髄、肝臓、脾臓、リンパ節、血液など各リンパ器官を採取し、ドナーであるGreen Fluorescent Protein-Transgenic Rat細胞またはLacZ Rat細胞の遊走について観察した。四肢移植は、移植片が抗原性の強い骨髄や皮膚を含んだ複合体であり内臓器移植よりも生着が困難である。加えて、非生命維持器官であるため免疫抑制剤の長期投与はその重篤な副作用の発現を考えると許されるものではない。本実験の目的は、他人からの手、足(四肢)同種移植に対する免疫学的寛容を獲得することである。実験動物はドナーとしてGFPラット(outbred Wistar)とLacZラット(inbred DA)を用い、レシピエントとしてLewisラット(MHC expression, RT1^1)を用いた。実験モデルは、四肢移植はこれまで私達が用いてきた右後肢同所性移植モデルを(1997,1999)を用いた。四肢移植モデルについて、皮膚は下腿中央部で円周上に切開、その他の構成部は大腿骨中央部で切断する。recipientに作成した同様の右後肢欠損部に移植片を挿入、大腿骨はキルシュナー鋼線で固定、坐骨神経、大腿動静脈を手術用顕微鏡で神経血管吻合、筋肉、皮膚を縫合する。免疫抑制剤はFK506(Prograf)を使用し、その投与量は1mg/kg/dayとした。
オニバスなど絶滅危惧植物の発芽・栽培実験とこれらの体験学習を通じての環境教育

佐賀市内のオニバスを佐賀大学噴水池に移植栽培し2003年度に549個,2005年度に200個の種子を採集した.これらの種子使って実験室で種種の条件で栽培した.以下にその研究の概要を箇条書きにする.1,野外観察により富栄養な水質と底土があり,年間を通して流れが緩やかで,水位が安定している場所を好んでオニバスが生育していることが判明した.2.農薬,河川の清掃などによってオニバスは,絶滅の危機へと追い込んでいると思われた.3.オニバスの移植栽培は適した水質と底土さえあれば比較的簡単に行え,種子も採集することが判明した.4.オニバスの発芽は低温処理と珠孔の蓋の除去を行い,水温を2026°Cに保てば,発芽率を約10%に上げることができた.佐賀市内のオニバスを佐賀大学噴水池に移植栽培し2003年度に549個,2005年度に200個の種子を採集した.これらの種子使って実験室で種種の条件で栽培した.以下にその研究の概要を箇条書きにする.1,野外観察により富栄養な水質と底土があり,年間を通して流れが緩やかで,水位が安定している場所を好んでオニバスが生育していることが判明した.2.農薬,河川の清掃などによってオニバスは,絶滅の危機へと追い込んでいると思われた.3.オニバスの移植栽培は適した水質と底土さえあれば比較的簡単に行え,種子も採集することが判明した.4.オニバスの発芽は低温処理と珠孔の蓋の除去を行い,水温を2026°Cに保てば,発芽率を約10%に上げることができた.オニバス(スイレン科、佐賀県絶滅危惧II類種)は、直径2mに近い巨大な葉を水面に浮かべるアジア特産の水草である。ハスに似ていて植物体に鋭い刺があるため、オニバス(鬼蓮)と名付けられる。直径1cmほどの種子は5月ごろ発芽し、その年の秋には一生を終える一年生の浮葉植物。日本では特に成長が盛んな6月から8月の23ヶ月間で、1mを越す大きな葉になる。葉の成長が、24時間で25cm広がったという記録もある。このような壮大な成長力の動因はなんであろうか?芽生えから、まず針状の第1葉が伸びてくる。第2、第3葉と矢じり型の沈水葉(写真2)が出て、ふつう第4葉から浮葉になる。初期の浮葉は細長く、刺もないが、あとから展開する浮葉ほど円形に近づき、10数枚目の葉から鋭い刺のある葉になる。この時期に一斉に消えて密度低下をもたらしている原因は何であろうか?オニバスの花には、水中で開花せずに自家受粉して種子をつくる閉鎖花と水面上に出て開花する紅紫色の開放花がある。閉鎖花は6月下旬9月上旬ごろに見られ、結実がよい。一方、開放花は89月ごろに見られ、結実が悪い。そのため、オニバスの種子生産の大半は閉鎖花による。閉鎖花の受粉は「つぼみ」が水面に達する以前におこっているが、開放花でも、開花したときには殆どが受粉を完了しており、昆虫が受粉の媒介をする可能性は殆どないといわれている。このことはオニバスでは他家受粉の可能性が失われていることを意味する。それにしても両者の花の形態に根本的な差はないのに開放花の結実が悪いのはどうしてだろうか?秋に成熟した種子が翌春、発芽することもあるが、翌々春あるいは数年後に発芽するなどオニバスの種子の休眠期間は一定しているわけではない。1994年は猛暑、異常乾燥の年であったが、佐賀平野の数ヶ所のクリークでオニバスが大発生した。その後、ほとんどの場所で消失したが、幾つかの場所では2003,2004年度と発芽開花した。オニバスの種子は、いったい、どんな刺激が引き金となって発芽を開始するのか?疑問の存在ばかり解明した。以上のような概説は宮脇博巳(2005)で発表した。2003年春に佐賀市内より根採集したオニバス2株を佐賀大学内の人口池に移植し,2003年10月28日から11月25日の約1ヶ月間の間に550個の種子を採集した.その後発芽実験を繰り返したが,結果は,第17回国際植物会議ウイーン大会で以下のタイトルでポスター発表された.要約は以下の通りである。1.富栄養な水質と底土があり,年間を通して流れが緩やかで,水位が安定している場所がオニバスの生育適地である.2.私たち人間の開発による生育地の激減が,オニバスを絶滅の危機へと追い込んでいる.3.オニバスの栽培は適した水質と底土さえあれば比較的簡単に行え,種子も採集することができる.4.オニバスの発芽は低温処理と珠孔の蓋の除去を行い,水温を2026°Cに保てば,発芽率を飛躍的に上げることができる.
微量汚染物質処理のための膜分離活性汚泥法へのバイオオーグメンテーション

本研究では、膜分離活性汚泥法(MBR, membrane bioreactor)を用いる排水処理装置に対してバイオオーグメンテーションを適用することの実現可能性を検証する。バイオオーグメンテーションとは、汚濁物質を除去するために外部から有用な微生物を導入する手法であり、難分解性物質を含む排水処理のための活性汚泥法においても効果が期待できる。従来の標準活性汚泥法においては、導入菌が処理水と共に流亡してしまうといった問題点が挙げられていたのに対し、MBRでは分離膜によってすべての活性汚泥微生物を処理槽内に留めることができ、より効果的なバイオオーグメンテーションが実現可能だと考えられる。昨年度までの研究では、難分解性物質4-tert-ブチルフェノール(4-t-BP)が流入する二台のラボスケールMBRのうち、一方に4-t-BPを資化可能なSphingobium fuliginis OMI(OMI株)を導入するバイオオーグメンテーション試験を行い、導入したOMI株が一カ月程度残存し4-t-BPの分解能力も保持されることを明らかにした。本年度は、その成果を国際学会において発表するとともに、査読論文として投稿を行った。一方で、導入したOMI株が一カ月程度で外部に流出し効果を発揮しなくなった原因として、ろ過膜表面にバイオフィルムが形成される「バイオファウリング」という現象が示唆されたことから、本年度には実規模MBRを対象として「バイオファウリング」発生のメカニズムを解明するための微生物群集解析も実施した。その成果は、査読論文として投稿を行い、出版も決定している。29年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では、膜分離活性汚泥法(MBR, membrane bioreactor)という方式で合成下水を処理するラボスケールリアクターに対して、バイオオーグメンテーションを適用することの実現可能性を検証する。ここで、バイオオーグメンテーションとは、下水中の難分解性物質の分解等を企図して、これに資する有用な微生物を外部から排水処理リアクターへ導入することをいう。この際、導入された微生物が、排水処理リアクターに土着の微生物によって深刻な淘汰や阻害を受けた場合、企図された機能を発揮することができない。したがって、導入された微生物がその後どのような動態を示すかについての知見を得ることが研究の最終目的である。本年度の実績としては第一に、フラスコスケールの試験によってSphingobium fuliginis OMI(OMI株)の有用性を実証した点が挙げられる。OMI株は難分解性有機物4-tert-ブチルフェノール(4-t-BP)を単一の炭素源として増殖することが可能な微生物であり、研究計画の段階より、排水処理リアクターに導入すれば4-t-BP分解の機能を付与することができると予想していた。しかしながら、これまでにOMI株の4-t-BP分解が確認されたのは、4-t-BPのみを炭素源とした場合などに限られており、下水に含まれているような易分解性有機物が混在する環境下においても4-t-BPが分解されることは確認されていなかった。そこで、4-t-BPと易分解性の有機物が混在する環境下においてOMI株を培養したところ、このような条件でも4-t-BPの分解が確認されることが明らかになり、OMI株をバイオオーグメンテーション試験に用いることができる可能性を示せた。また第二に、試験に用いるラボスケール排水処理リアクターの運転を試験的に開始し、実験に際して必要な備品や操作方法の知見を得ることができた。バイオオーグメンテーションに用いる微生物の検討については、これをほぼ終えることができた。排水処理リアクターに導入する微生物の候補であったOMI株に対してフラスコスケールでの試験を行い、易分解性の有機物が混在する条件下においても4-t-BPを分解しうることが実証できたことで、その有用性を確認することができた。次いで、バイオオーグメンテーション試験を実施する際や、その結果を考察する際に必要となる、OMI株についての基礎的な知見については、フラスコスケールの試験によって収集を続けている。本年度に得ることができた知見としては、たとえば、OMI株の基質利用特性が挙げられる。ここでは、消費された基質の炭素重量に対する増殖した菌体重量の比である菌体収率という値を用いて、本研究で用いる合成下水中の易分解性有機物と4-t-BPの利用特性を比較した。その結果、合成下水中の易分解性有機物を基質としてOMI株を培養した場合の菌体収率は4-t-BPのおよそ概ね二倍であり、やはり易分解性有機物のほうが菌体の増殖用いやすいことが明らかとなった。上記のようなフラスコスケールの試験と並行して、ラボスケールの排水処理リアクターについても、試験的な運転を開始した。その結果、生物処理槽内のpH変動が激しくpH調整のための備品と試薬を必要とすることや、当初計画していた合成下水の濃度が低く生物処理槽内の微生物濃度を充分に高めることができないことなど、計画の問題点が明らかになり、それらに対処することとなった。明らかになった問題点に対する処置は概ね終えることができたが、ろ過膜の目詰まり(ファウリング)など、対応しきれていないトラブルも若干残っており、さらなる知見の集積が必要と考えている。

従来の標準活性汚泥法においては、導入菌が処理水と共に流亡してしまうといった問題点が挙げられていたのに対し、MBRでは分離膜によってすべての活性汚泥微生物を処理槽内に留めることができ、より効果的なバイオオーグメンテーションが実現可能だと考えられる。本年度の研究では、難分解性物質を処理する二台のラボスケールMBRを運転し、一方をバイオオーグメンテーション実施系、他方をコントロール系として、処理成績の比較を行った。昨年度に引き続き4-tert-ブチルフェノール(4-t-BP)を処理対象の難分解性物質として定め、導入菌としてこれを単一炭素源として資化可能なSphingobium fuliginis OMI(OMI株)を用いた。その結果、コントロール系では汚泥が馴養され4-t-BPの分解が開始されるまで一カ月程度を要したのに対し、バイオオーグメンテーション系ではOMI株導入から一週間程度で流入水中の4-t-BPが検出下限以下まで分解されることが確認された。またOMI株のC23O遺伝子の定量を行ったところ、バイオオーグメンテーションの後、一カ月程度に亘ってOMI株がリアクター内に残存することも明らかになった。以上のことから、MBRへのバイオオーグメンテーション適用は有望な手法であると結論することができ、今回の成果は次年度の国際学会にて発表することを予定している。現在までには、4-t-BPを用いたラボスケールMBRに対するOMI株のバイオオーグメンテーション試験が完了し、その効果を検証することができている。実験には、二台のMBRと平膜モジュールを用いた。種汚泥には大阪府内の下水処理場より採取した余剰汚泥を用い、連続式で合成下水を供した。水理学的滞留時間および汚泥滞留時間はそれぞれ12時間および50日とした。水温とpHはそれぞれ30°C、6.0-7.0で制御した。活性汚泥浮遊物濃度は75日のスタートアップ期間において、8,000 mg/Lまで増加させた。スタートアップ期間の後、それまでの合成下水に10-20 mg/Lの4-t-BPを混入させ始めると同時に、LB培地で培養したOMI株を10 mg-cell/Lの割合で一方のMBRに添加した(オーグメンテーション系)。他方のMBRにはバイオオーグメンテーションの操作は行わなかった(コントロール系)。各MBRからの処理水に含まれる4-t-BPの経時変化を見たところ、オーグメンテーション後1日目から4日目にかけて、4-t-BP濃度は双方のリアクターで次第に増加しており、コントロール系ではさらに続けて上昇して流入水の水準にまで達した。39日目以降では、コントロール系の処理水に含まれる4-t-BPは検出下限値以下(< 1 mg/L)となった。このような推移は、4-t-BPへの活性汚泥の馴養には概ね一カ月程度必要となることを示唆している。一方、オーグメンテーション系については、処理水中に含まれる4-t-BPの濃度は7日目から35日目まで常に検出下限値以下となっていた。しかしながら、36日目以降の処理水からはしばしば4-t-BPが5 mg/L以上の水準で検出されていた。
蝸牛発生の制御機構解明と聴覚再生医療への応用

聴覚を司る哺乳類蝸牛は、規則性に富む美しい器官で細胞分化や組織構築の異常が観察しやすい一方、その発生過程は非常に複雑で未だ決して十分には解明されてない。難聴の多くは蝸牛有毛細胞に再生力がないことに起因し、再生医療の応用が期待されているが、そのためにもまず蝸牛有毛細胞発生の知識が重要である。本研究は蝸牛有毛細胞を含む感覚上皮発生の分子メカニズムの解明を目的し、生体内および試験管内の培養蝸牛においてヘッジホッグシグナル伝達系、Fgfシグナル伝達系およびNotchシグナル伝達系を操作することで、それぞれのシグナル伝達系の蝸牛感覚上皮発生における役割と相互作用を明らかにした。本研究は哺乳類蝸牛を研究対象とし、実験はマウスを用い、シグナル伝達系を複数操作し蝸牛感覚上皮発生各時期における関与・相互作用をみる実験を行なった。生体内での操作は遺伝子改変マウスによって行い、試験管内の培養蝸牛での操作は遺伝子導入(プラスミドベクターを電気穿孔法で)あるいは培地に薬品を添加することで行なった。ヘッジホッグシグナル伝達系に関する遺伝子改変マウス培養蝸牛にNotchシグナル伝達系、FGFシグナル伝達系を操作する薬品を添加した実験により得られた結果の一部は、これまでの研究結果に統合して論文発表した。( Tateya T etal. Development. 2013Sep;140(18):3848-57.)また、Notchシグナル伝達系に関する遺伝子改変マウス培養蝸牛にヘッジホッグシグナル伝達系、FGFシグナル伝達系、BMPシグナル伝達系のそれぞれを操作する薬品を添加する実験も行なった。その研究結果の一部は学会発表を行なった。研究は哺乳類蝸牛を研究対象とし、(1)蝸牛感覚上皮発生過程において、複数のシグナル伝達系の関与や相互作用につき解明すること、および(2)前項のシグナル伝達系の下流因子のなかから、前駆細胞を増殖停止へ進める鍵、さらに増殖停止した前駆細胞を分化へと進める鍵、および有毛細胞と支持細胞また内有毛細胞・外有毛細胞の別を決定する鍵となる因子を同定することを目的にしている。実験はマウスを用い、最初の2年ではシグナル伝達系を複数操作し蝸牛感覚上皮発生各時期における関与・相互作用をみる実験を施行する。生体内での操作は遺伝子改変マウスによって行い、試験管内の培養蝸牛での操作は遺伝子導入(プラスミドベクターを電気穿孔法で)あるいは培地に薬品を添加する。内耳発生ヘッジホッグシグナル伝達系を促進させると、蝸牛感覚上皮前駆細胞から有毛細胞・支持細胞への分化が遅れることがわかった。このヘッジホッグシグナル伝達系の作用は、FGFシグナル伝達系阻害薬および抗FGF20抗体によってキャンセルされた。このことより、ヘッジホッグシグナル伝達系による前駆細胞維持効果はFGFシグナル伝達系特にFGF20を介することが示唆された。一方、Notchシグナル伝達系を促進させると、有毛細胞数が減少するが、支持細胞はさほど増加せず、多くは前駆細胞の状態で留まっていることがわかった。Notchシグナル伝達系と他のシグナル伝達系の組み合わせによる効果については、現在実験を進めているところであるが、おおむね予想通り進んでいる。シグナル伝達系を複数操作し蝸牛感覚上皮発生各時期における関与・相互作用をみる実験を継続する。また、有毛細胞あるいは支持細胞への分化を進める鍵であると考えられているNotchシグナル関連因子については発現レベルが変動している可能性があり、遺伝子改変マウスを用いてその発現レベルを追い、さらには光刺激で発現制御が可能なベクターを培養蝸牛に導入して発現レベル変動の意義を調べていきたい。
分割の確率モデルとベイズ的データ解析への展開

分割の確率モデルはノンパラメトリック・ベイズ統計などを通してデータ解析の基礎になります。基本であるDirichlet過程を例として説明します。サイズの分布はPoisson-Dirichlet分布と呼ばれ、ある測度値拡散過程の定常分布です。逐次抽出は中華料理店過程と呼ばれます。得られる標本は分割の確率過程の定常分布です。様々な数学的な問題に関わりますが、主に確率論の枠組みで議論されていて、データ解析の視点が不足していると考えています。本課題では、確率論と代数的枠組みの融合を手がかりに、モデルの探求と計算機を援用したデータ解析の方法の提案を目指してきました。30年度は本課題の最終年度で、これまで得られた成果を含めた内容をモノグラフの形で出版しました(Partitions, Hypergeometric Systems, and Dirichlet Processes in Statistics, Springer)。本書籍は5章からなり、5章がデータ解析の方法論に関する新規性の高い内容ですが、その一つのハイライトが昨年度見出した任意のトーリックモデル(離散データの統計モデルのクラスでグラフィカルモデルを含む)やランダムヤング図形からの直接抽出のアルゴリズムです。このアルゴリズムはセル(変数の組み合わせ)の期待値を計算することを繰り返しますが、その期待値がGelfandらにより定義されたA超幾何多項式になります。その効率的な評価について計算代数の観点から高山信毅氏と検討しました。分割の確率モデルはNonparametric Bayes統計や分類に関わるデータ解析の基礎となり,Dirichlet過程と呼ばれるモデルが良く知られています.様々な特徴付けが可能ですが,サイズの分布はPoisson-Dirichlet分布と呼ばれ,ある測度値拡散過程の定常分布です.それを母集団とする標本はEwens分割と呼ばれ,自然数分割の確率過程であるKingman's Coalescentの定常分布でもあります.周辺の研究は拡がりがありますが,主に確率論の視点から議論され,データ解析の視点がほとんどありません.本課題は,確率論と代数的枠組みを融合することで,モデルを探求するとともに計算機を援用したデータ解析の方法論の提案することを目指しています.27年度は,モデルの探求とデータ解析の双方の成果を得ました.上述の拡散過程とcoalescentはマルコフ過程の意味で双対です.前世紀末にLambda-coalescentとよばれる自然数分割の確率過程のクラスが提案され,de Finetti測度を選ぶことで様々な過程を導出できることが指摘されました.上述の拡散過程に関する古典的結果に直交多項式による推移確率密度の展開がありますが,本研究では,ある単純なLambda-coalescentの双対の跳躍過程の推移確率密度の双直交展開を超函数により陽に与えました.Lambda-coalescentに関連した推移確率密度を陽に与えた初めての例です.また,Bell多項式により特徴付けられる自然数分割のクラスであるGibbs分割の統計的推測について,Bell多項式がGel'fandらにより提唱されたA超幾何多項式であることに着目して考察しました.A超幾何イデアルとNewton polytopeの性質が簡明であることから,様々な顕著な性質を具体的に得ることができました.研究実績の概要に述べたモデルの探求については,国際会議"Stochastic Process and Applicatoins"と研究集会「無限粒子系と確率場の諸問題」で発表するとともに,論文が受理されました.データ解析については,統計関連学会連合大会と研究集会「官庁統計データの公開における諸問題の研究と他分野への応用」で発表しました.成果の論文は,論文が1編受理され,さらに1編を直近に投稿する予定です.分割の確率モデルはノンパラメトリック・ベイズ統計などを通してデータ解析の基礎になります.様々な特徴づけが可能ですが,最も基本的なDirichlet過程を例として説明します.サイズの分布はPoisson-Dirichlet分布と呼ばれ,ある測度値拡散過程の定常分布です.逐次抽出は中華料理店過程と呼ばれます.得られる標本は分割の確率過程であるCoalescentの定常分布です.様々な数学的な問題に関わりますが,主に確率論の枠組みで議論されていて,データ解析の視点がほとんどありません.本課題では,確率論と代数的枠組みの融合を手がかりとして,モデルの探求と計算機を援用したデータ解析の方法の提案を目指しています.28年度は,理論とデータ解析の方法に関わる成果を得ました.偏Bell多項式により特徴付けられる交換可能性を持つ広いクラスに関わる統計的推測について,Gel'fandらにより定義されたA超幾何系との関係に着目して考えました.この種の問題は母数空間が複雑で,例えば最尤推定量の存在定理のような理論的な結果を得ることが難しいです.そこで,十分統計量による条件付分布を考察することにしました.その規格化定数は偏Bell多項式で,性質が良く分かっているA超幾何多項式です.さらに,Newtonポリトープと分割ポリトープとの対応と,その情報幾何を用いて,最尤推定量が存在しないことを示すことができました.さらに,曲指数型分布族の最尤推定について,Paffian系とよばれる超幾何函数の隣接関係から従う関係式を用いて,holonomic勾配法と呼ばれる数値計算の手続きを得ました.今年度は,昨年度後半から今年度前半に得られた成果を論文にまとめて投稿するとともに,その周辺について,統計関連学会連合大会,数学会年会,国内外の研究集会,ワークショップ,研究セミナーで講演しました.国際的な研究交流も始め,今後の研究の方向性についても様々なアイディアがあります.

総合的に判断して,おおむね順調に進展していると考えています.分割の確率モデルはノンパラメトリック・ベイズ統計などを通してデータ解析の基礎になります.基本であるDirichlet過程を例として説明します.サイズの分布はPoisson-Dirichlet分布と呼ばれ,ある測度値拡散過程の定常分布です.逐次抽出は中華料理店過程と呼ばれます.得られる標本は分割の確率過程の定常分布です.様々な数学的な問題に関わりますが,主に確率論の枠組みで議論されていて,データ解析の視点が不足していると考えています.本課題では,確率論と代数的枠組みの融合を手がかりに,モデルの探求と計算機を援用したデータ解析の方法の提案を目指しています.29年度は,特にデータ解析の方法に関わる成果を得ました.サンプラーは,相似検定や事後分布からの抽出など,データ解析の多くの局面で欠かせません.正規化定数の計算が現実的でない問題についてはマルコフ連鎖モンテカルロ法(MCMC)を用いるのが標準的です.しかし,MCMCには,定常分布に達していることを保証することが難しいこと,自己相関の存在など,原理的に避けられない欠点があるので,正規化定数の計算が可能であれば,直接抽出する方が望ましいです.本研究では,計数データの標準的なモデルである対数アフィンモデルから交換可能な標本を抽出して得られる分布を十分統計量で条件付けて得られる分布について,正規化定数を数え上げの計算を避けて計算することで,直接抽出のアルゴリズムを導出しました.それが可能な理由は,上記の分布の規格化定数はGel'fandらにより定義されたA超幾何多項式になりますが,それらの超幾何函数として漸化式を組み合わせて用いることで数え上げを避けられるからです.差分holonomic勾配法と呼ばれる数値計算法の例になっています.今年度は,一昨年度後半から昨年度前半に得られた結果(研究実績の概要でのべたアルゴリズムを含む)を論文として投稿し,刊行されました.その周辺について,数学会年会,国内外の研究集会,研究セミナー,市民講演会で講演しました.本課題の成果をモノグラフにまとめ,国際的な交流も続けています.総合的に判断して,おおむね順調に進展していると考えています.分割の確率モデルはノンパラメトリック・ベイズ統計などを通してデータ解析の基礎になります。基本であるDirichlet過程を例として説明します。サイズの分布はPoisson-Dirichlet分布と呼ばれ、ある測度値拡散過程の定常分布です。逐次抽出は中華料理店過程と呼ばれます。得られる標本は分割の確率過程の定常分布です。様々な数学的な問題に関わりますが、主に確率論の枠組みで議論されていて、データ解析の視点が不足していると考えています。本課題では、確率論と代数的枠組みの融合を手がかりに、モデルの探求と計算機を援用したデータ解析の方法の提案を目指してきました。
実験動物の大腸発がんにおけるβ-カテニン経路の異常と炎症関連酵素発現との関係

AOM誘発大腸発がんモデルを用い、大腸がん及び前がん病変におけるβ-カテニン経路の異常及び炎症関連酵素の発現を調べ、これらの因子の発がん過程における役割及び相互の関連性を検討した。また、培養細胞系を用いてβ-カテニンとK-rasの炎症関連酵素発現への関与や他のがん関連遺伝子産物発現への影響を検討した。1.AOM誘発ラット大腸発がん系では、異型を伴うACFの段階から、β-カテニン遺伝子の変異が高頻度に検出され、β-カテニンの細胞内局在変化は、腫瘍では全例で認められた。一方、K-ras遺伝子の変異は過形成性ACFで高頻度に検出され、K-rasの活性化がACFの形成に関与していることが示唆された。腫瘍におけるK-ras遺伝子の変異頻度は、大きい腫瘍では比較的高かったが、小さい腫瘍では低く、K-ras遺伝子の活性化は腫瘍の増殖にも関与していると考えられた。AOM誘発マウス大腸がんでは、β-カテニン遺伝子変異は10例中全例に、K-ras遣伝子変異は1例に検出された。β-カテニン経路の異常は腫瘍化に必須であるが、K-ras遣伝子の変異は必須ではないと考えられた。2.AOM誘発ラット大腸発がん系では、iNOSの上皮細胞での発現は、異型を伴うACFの段階から認められ、β-カテニンの異常と同様、腫瘍化におけるごく初期から起きることがわかった。iNOSは高分化型の腺管構造を呈する腫瘍細胞の内腔側細胞膜近傍に局在していた。COX-2の上皮細胞における発現はACF及び腺腫では認められなかった。がん組織では間質細胞でのCOX-2の発現が増加し、更に、高分化型の腺管構造を呈するがん細胞の細胞質においても発現が認められた。3.K-ras遣伝子の変異がIL-1βやLPS刺激存在下でiNOSの発現を誘導し、発がんに重要な役割を果している可能性が示唆された。(1)β-カテニン及びその他のがん関連遺伝子の変異の検索・解析AOM誘発ラット大腸発がん系では、異型を伴うACFの段階から、β-カテニン遺伝子の変異が高頻度に検出され、β-カテニンの細胞内局在変化は、腫瘍では全例で認められた。AOM誘発マウス大腸がんでは、β-カテニン遺伝子変異は10例中全例に、K-ras遺伝子変異は1例に検出された。β-カテニン経路の異常は腫瘍化に必須であるが、K-ras遺伝子の変異は必須ではないと考えられた。(2)炎症関連酵素等の発現に関する検討AOM誘発ラット大腸発がん系では、iNOSの上皮細胞での発現は、異型を伴うACFの段階から認められ、β-カテニンの異常と同様、腫瘍化におけるごく初期から起きることがわかった。

がん組織では間質細胞でのCOX-2の発現が増加し、更に、高分化型の腺管構造を呈するがん細胞の細胞質においても発現が認められた。なお、はっきりした内腔を持つ腺管構造を呈さなくなった中分化型腺がん部分では、iNOS及びCOX-2のがん細胞での発現が見られず、これらの酵素のがん細胞での発現に、がん細胞の分化度が関与している可能性が示唆された。β功テニンとKi-ras及び炎症関連酵素の発がん過程における役割及び相互の関連性を明らかにすることを目的として、培養細胞系を用いてβ-カテニンとKi-rasのこれらの酵素発現への関与についてを検討した。1.正常培養細胞へのβ-カテニン及びKi-ras遺伝子の変異体の導入大腸がん組織や大腸がん細胞株のRNAを用いてRT-PCR法を行うことによりβ-カテニン及びKi-ras遺伝子の変異体のcDNAを単離した。次に、ラット小腸上皮由来正常培養細胞にこれら変異体のcDNAを導入して過剰発現させ、iNOS及びCOX-2の発現誘導についてWestem blotting法により検討した。Ki-ras遺伝子のコドン12番の変異体(K-rasAsp12)を導入した細胞では、IL-1βやLPS刺激時のiNOSの発現が顕著に誘導されることが明らかとなった。β-カテニン変異体導入細胞では顕著な結果が得られなかったが、Ki-ras遺伝子に比べて導入効率が低いと考えられたので、今後、更に検討する必要がある。3.iNOS遺伝子のプロモーター領域の解析ラット大腸がん細胞におけるiNOS発現に関与するプロモーター領域について解析するため、レポーター遺伝子アッセイ系及びゲルシフトアッセイ系を構築した。詳細については現在解析中である。以上のことより、Ki-ras遺伝子の変異がIL-1βやLPS刺激存在下でiNOSの発現を誘導し、発がんに重要な役割を果している可能性が示峻された。