hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
現代インドの贈与と異人歓待に関する人類学的調査研究：受容と排除の分水嶺からの考察

本研究は、贈与を通じて異人を歓待する習俗に見られる他者の受容と他者の排除の分水嶺を明らかにする人類学的フィールド調査を実施すると同時に、西洋出身の研究者が主導となり議論が重ねられてきた贈与論とホスピタリティ(歓待)に関する研究の系譜を批判的に検討することを目的とする。具体的には、西洋思想における贈与の観念を踏まえながら、現代のインド社会において異人として在り続ける現世放棄者ヒジュラへのダーナ(贈与)の慣習、巡礼地での喜捨の意義に関する考察を行い、異人を排除することなく享受する習俗としての歓待のあり方と、そこで創発する贈与の意義を明らかにした。本研究は、西洋の研究者たちによって作り上げられた南アジアの贈与ダーナに関する研究蓄積の再検討を行うこと、さらに、非西洋の側からダーナ研究に対する学術的貢献を果たすことを目的としている。その具体的な策として、ジェンダー研究において、これまで非西洋社会のセクシュアル・マイノリティとして注目を浴びてきたインドのヒジュラに焦点を当てて、そのヒジュラに対してダーナとして与えられる贈与について現地調査を行う。本研究の二年目においては、日本国内において研究発表を積極的に行った。まず、日本文化人類学会第47回研究大会(6月9日)では、「排他と歓待の分水嶺:ヒンドゥー女神寺院におけるヒジュラへの贈与行為に関する考察」というタイトルで、ヒジュラに対する贈与の意義についての研究発表を行った。そして、ヒジュラに関する研究成果を海外の研究者に向けて作成したペーパー'“Like will to Like" : Anomie of Childbirth and Anomic Group of Hijras of Gujarat, India'を、アムステルダム大学と京都大学との共催で行われた国際ワークショップ'ANOMIE IN ASIA' (11月16日ー17日)において発表した。また、年度末の3月には、インド、グジャラート州のバフチャラー女神寺院を再び訪れて、白の大理石によって建替えられた寺院の写真撮影を行い、さらに、ヒジュラに対するダーナ実践の現状や、女神寺院及び寺院周辺で生活する住民の環境変化等についての現地調査を実施した。本研究は、西洋のアカデミック主導によって形作られてきた南アジアの贈与ダーナに関する研究に対して、非西洋の側からの学術的貢献を果たすことを最終的な目標に掲げており、その具体的な策として、これまでジェンダー研究において非西洋のセクシャル・マイノリティ、あるいは「第三のジェンダー」として着目されてきたヒジュラに焦点を当てて、そのヒジュラに対するダーナ(贈与)の実践に着目した現地調査を行うものである。本研究計画の初年度においては、インドのヒジュラに関するこれまでの研究成果を西洋に向けて発信していくことに重点を置いてきた。その一つの活動として、マケドニア国のスコピエ市で開催されたサマースクール"Sexualities, Cultures and Politics: Queerness, Community and Capital: Towards New Alliances of the Political ( August 13-18, Skopje, Macedonia)に参加し、ジェンダー/セクシュアリティ研究に関する西洋での動向を掴むと同時に、海外の若い研究者たちとの意見交換を通じて、自らの研究の指針を定めることに努めた。また、2012年11月には、インドのブバネシュワール市において開催されたIUAES(国際人類民族科学連合)大会“Children and Youth in a Changing World,"において口頭発表を行い、南アジア地域研究に従事する海外の人類学者たちとの意見交換を行う機会にも恵まれた。その成果として、発表原稿に修正を加えた論文を群馬県立女子大学の紀要に掲載した。本研究は、西洋の研究者たちによって作り上げられた南アジアのダーナ(贈与)に関する研究蓄積の再検討を行い、その上で、西洋的な思想も踏まえて、アジアの側からダーナ研究に関する学術的貢献を果たすことを目的としている。その具体的な策として、ヒンドゥー女神寺院において、異人として存在するヒジュラに対して巡礼者が行う贈与の意義について考察する。ヒジュラとは、ジェンダー研究においてセクシュアル・マイノリティーの座を与えられてきた人々のことであり、贈与を受け取る立場にあることはこれまで看過されてきた。本研究の3年目では、現地調査を8月にフランスにおいて、3月にはインドで実施した。まず、フランスで実施した調査の目的だが、今日の西洋社会において、ジェンダー規範に抗した生き方がどのように受け入れられているのかを把握することにあった。ヨーロッパにおけるトランス・ジェンダーの歴史や現状について文献を収集し、そして、フランス国ブルターニュ地方において、性別変更した(変更する意思のある)人々へのインタビューを実施した。3月のインド、グジャラート州での調査は、ヒジュラという異人が受け入れられる習俗についての考察を深めるためることを目的に、グジャラートの一般家庭において、帰属を異にする人々を己の家に入れる場合の作法についての参与観察を行った。具体的には、共働きの中流家庭において、下流に属する人々を労働者として雇い入れる場合に、彼らと同じ空間を共有する上での秩序づけをどのように行っているのか、また、賃金の受け渡し以外に、物をあげる・もらうという行為をどのような場面で行い、それをどのように認識しているのかについての観察を行った。研究成果の発表としては、日本文化人類学会共催の国際学会において自ら企画したパネルにおいて論文を発表し、また、昨年度の国際ワークショップで発表した原稿を欧文雑誌に投稿した。

具体的には、西洋思想における贈与の観念を踏まえながら、現代のインド社会において異人として在り続ける現世放棄者ヒジュラへのダーナ(贈与)の慣習、巡礼地での喜捨の意義に関する考察を行い、異人を排除することなく享受する習俗としての歓待のあり方と、そこで創発する贈与の意義を明らかにした。現地調査を継続する傍ら、国際学会やワークショップの場において研究成果の発表を行い、さらに、その発表原稿をもとにした論文を欧文雑誌に投稿することができた。文化人類学国際学会での研究成果発表の経験をもとにして、今後は国内における研究成果の発表に力を入れる。そして、これまでの研究成果を新たな研究として発展させるための見通しについても検討を始める。自身の研究成果は、ジェンダー研究における位置付けは明確にできていると考えるが、今後は、ジェンダー研究以外、たとえば、宗教研究や移民研究に対する貢献としていかに展開することが可能かを検討する。産休のために海外調査の計画を一部削らざるを得ず、当初の目標は達成できていないが、その分、国内において積極的に研究発表を行った。当初の計画では、初年度は海外で開催される研究会、及び学会発表に臨むことに加えて、インドでの現地調査を実施する予定であった。しかし、医師による判断によってインドへの渡航を中止せざるを得なくなり、その計画は来年度に延期することにした。そのため、現時点での個人的な満足度は「やや遅れている」の区分に含まれる。しかし、今年度実施した海外での発表等を通じて、海外に研究成果を発信するための術を身につけることができたという点を考慮すれば、今後の研究はより充実したものになると考えている。海外渡航のための航空券が、当初考えていた額よりも安く購入することができたため。今年度からは乳幼児を抱えて海外調査に出る予定であり、乳幼児と共に滞在できる場所を調査地に選定する。例えば、インドのバフチャラー女神寺院のある村落は、衛生上長期滞在は難しいと考えられるため、都市部に滞在しながら日帰りで訪問する。また、西洋における海外調査に関しては、親類縁者の多いフランスを中心に実施する。今後の推進策としては、贈与に関する文献研究を行うと同時に、インド、グジャラート州にある女神寺院での贈与の実践に関する現地調査を実施する。現地調査に関しては、産休明け(平成26年3月)に実施する予定であるが、海外渡航が困難と医師に判断された場合には、来年度に延期する。図書購入費にあてる予定。研究費の使用に関しては、研究活動に必要となる備品の購入、そして海外渡航費用にあてることを計画している。
カルシウムダイナミクス異常説に基づく脊髄小脳変性症6型の病態解明

小脳神経変性を再現する新たな脊髄小脳変性症6型(SCA6)モデルマウスを用いて、変異Ca_v2.1チャネルの神経細胞内への蓄積・封入体形成のメカニズム及びそれに伴うカルシウムの細胞質内流入の変化を解析した。その結果、変異チャネルはリソソーム内に封入体を形成し、リソソーム酵素の欠損により細胞死・封入体形成が加速すること。発症期においても変異チャネルは細胞膜には蓄積せず、チャネル機能には変化を及ぼさないことが明らかとなった。SCA6の病態においてエンドリソソーム系が重要な役割を果たすことが示唆された。本研究の目的は脊髄小脳変性症6型(SCA6)の病態発症機構として、プルキンエ細胞のCa_v2.1チャネル蓄積に伴うカルシウムダイナミクス異常に着目し、既存・新規SCA6マウスモデルの解析を通じて変異Ca_v2.1チャネルの輸送・分解・蓄積の異常及びその機構を明らかにし、病態生理学的意義を明らかにすることである。本年度の主な成果は以下の通りである。(1)SCA6-MPI-118QKIマウスプルキンエ細胞質内封入体はcathepsin BやLIMP2などのリソゾームマーカーと共局在したが、電顕上オートファゴソームの増加は認められずまたオートファジーの活性化のマーカーであるLC-II分子発現の変動は認められなかった。これらの結果はプルキンエ細胞封入体形成にエンドリソゾーム系が関与していることを示唆するものと考えられた。(2)変異Ca_v2.1発現の経時的変化や蓄積の過程をin vivoで明らかにするため、蛍光物質(Venus)を変異Ca_v2.1のC末端に融合させた蛍光レポーター(MPI-118Q-Venus)KIマウスの作製をすすめた。本年度はターゲティングコンストラクトの作製から相同組み替えES細胞の同定・マウスblastocystへの相同組み替えES細胞の注入を行ない、キメラマウスの作製を終えた。(3)cathepsin B KOマウスとSCA6 KIマウスとの交配により、2重変異(DMT)マウスを作製し、その行動学的・病理学的解析を開始した。現在までのところ、ロータロッド解析にてDMTマウスはSCA6 KIマウスと比較して運動機能障害が重篤となる傾向を認めている。(1)週齢の異なるSCA6-MPI-118QKIマウスよりプルキンエ細胞の分離培養を調整して、電気生理学的にプルキンエ細胞内へのカルシウム流入の程度を検討した。その結果、突起変性が始まる生後6週齢マウスプルキンエ細胞においても、カルシウム流入の程度は野生型マウスプルキンエ細胞と同程度であること。また変異チャネルの細胞膜への局在にも変化を認めなかったことからSCA6の病態発症期には変異チャネルの細胞膜への過剰な蓄積はおこっていないものと考えられた。(2)前年度に引き続き変異Ca_v2.1発現の経時的変化や蓄積の過程をin vivoで明らかにするため、蛍光物質(venus)を変異Ca_v2.1のC末端に融合させた蛍光レポーター(MPI-118Q-venus)KIマウスの作製をすすめた。その結果F1マウスの作出、さらにF1マウスとCAG-Creマウスの交配からヘテロマウスを得ることができた。(3)カテプシンBKOマウスとSCA6KIマウスとの交配により作製した2重変異(DMT)マウスの解析を進めた。その結果DMTマウスはSCA6KIマウスと比較して、小脳失調の発症が加速し、プルキンエ細胞変性の程度が悪化するとともに、リソソーム内の変異Ca_v2.1封入体形成も亢進していた。リソソーム機能が変異Ca_v2.1蓄積・分解やSCA6の病態に重要な役割を果たしていることが示唆された。(1)蛍光物質Venusを伸長ポリグルタミン鎖を有するCav2.1のカルボキシル末端に融合させた118Q-Venusチャネルを発現するノックインマウス(Sca6-118Q-Venus)について解析をすすめ、以下の結果を得た。i)イムノブロットにより118Q-Venusの脳内発現は確認できたが、生後7週齢脳切片を用いた解析では蛍光を確認できなかった。ii) Sca6-118Q-Venusマウスは約9ヶ月齢でに運動失調を発症した。病理学的解析ではプルキンエ細胞(PC)変性・118Q-

VenusのPC細胞質内凝集体形成が認められた。従って、Sca6-118Q-Venusマウスは変異チャネル分子をin vivoで可視化するためには有用ではなかったが、既存のマウスモデル(MPI-118Qマウス)と比較して、スプライスアクセプター変異を有さず、緩徐進行性のPC変性を再現するという点でより忠実にSCA6病態を再現していると考えられた。加えて、Sca6-118Q-Venusマウスでは、凝集体形成の検出が容易であり、その形成過程の解析を今後進める予定である。(2)オートファジーの活性化によりSCA6病態が改善するかどうか検討するために、mTOR経路依存的に、オートファジーを活性化する作用を有するRapamycinを、MPI-118Qマウスに週5回10 mg/kg x 4週間腹腔内投与し,その効果を検討した。Rapamycin投与群は非投与群と比較して、ロータロッド解析にて有為に協調運動障害に改善が認められたが、病理学的解析ではPC変性・凝集体形成に対して有効な効果は認められなかった。現在までに変異Ca_v2.1の蓄積や分解に関わる過程に関して、知見を得ることができた。さらに当初の予想とは異なるが、変異Ca_v2.1のプルキンエ細胞膜局在はSCA6の病初期には変化していないことなども判明しつつある。さらに蛍光レポーター付きSCA6ノックインモデルの作製をほぼ終えた。24年度が最終年度であるため、記入しない。ホモMPI-118Q-Venus KIマウスにおける蛍光タグ付き変異Ca_v2.1の細胞内局在の変化を経時的に解析することにより、SCA6における変異チャネルの発現・蓄積の過程を詳細に解明し、それらに関与する分子ついてのてがかりを得る。最終的には得られた知見を通じて変異Ca_v2.1の蓄積や分解に関与する分子をターゲットとした治療実験を開始する。
産婦人科領域におけるステロイドホルモン産生に関する分子生物学的研究

ステロイドホルモンはコレステロールから合成される。ステロイドホルモンの合成に関し、StAR蛋白質はコレステロールのミトコンドリア外膜から内膜の輸送を促進する因子で、ステロイドホルモンの産生の律速段階を形成する。1.StAR遺伝子の発現の解析StAR遺伝子の発現の抑制機構に関してプロモーター解析により、StAR遺伝子の発現を制御する因子はRIP140であることが判明した。RIP140はDAX-1と結合し、またSF-1はRIP140およびDAX-1と結合することが判明した。RIP140の発現がStAR蛋白質の発現を制御することにより、ステロイドホルモンの産生を調節することを明らかにした。さらに、StAR遺伝子のプロモーター領域にダイオキシン応答配列を見出し、ダイオキシン受容体を介してStAR遺伝子のプロモーター活性を高めることを明らかにした。2.腫瘍局所におけるステロイドホルモンの産生婦人科悪性腫瘍である子宮内膜癌においてステロイドホルモンの産生に関与する遺伝子チトクロームP450遺伝子群とStAR遺伝子の発現を明らかにし、腫瘍局所のステロイドホルモン産生を明らかにした。ステロイドホルモンの産生にはStAR蛋白質およびStAR蛋白質のホモログであるMLN64の蛋白発現がステロイドホルモンの産生に重要であることを明らかにした。3.StAR蛋白質結合蛋白質の解析StAR蛋白質と結合する遺伝子をクローニングし、StAR蛋白質結合蛋白質(SBP)と命名した。SBPのステロイドホルモン産生組織における遺伝子の局在をin situハイブリダイゼーション法により同定した。SBPとGFP融合蛋白質を作成し、細胞内の局在を同定した。RNAsi法によりSBP遺伝子発現を抑制し、ステロイドホルモンの産生に与える影響を明らかにした。SBP1はステロイドホルモンの産生に関与することを明らかにした。StAR遺伝子のプロモーター領域の解析StAR遺伝子は卵巣、精巣、副腎でその発現を認める。ステロイド産生培養細胞をもちい、StAR遺伝子のレポーターアッセイをおこない、転写活性に関与する領域を明らかにした。卵巣、精巣、副腎の細胞株をもちい、転写活性のエレメントを解析し、副腎癌細胞ではプロモーター活性は転写開始点の上流300bpに含まれることが判明した。この領域にはSp1サイト、CCAATエンハンサー結合蛋白質α、エストロゲン受容体ハーフサイト、ステロール応答結合蛋白質のコンセンサスサイトを認める。StARプロモータ活性はSF-1とSp1が協調的に作用して、StAR蛋白質の発現を制御し、ステロイドホルモンの産生を制御することを明らかにした。StARの発現に関与する因子は転写活性を高めるSF-1と、転写活性を抑制するDAX-1だけである。DAX-1遺伝子は先天性副腎低形成の責任遺伝子である。イーストのtwo-hybridシステムの系でSF-1とDAX-1関連遺伝子のクローニングをした。クローニングした遺伝子についてStAR遺伝子プロモーター活性の影響を調べ、StAR遺伝子との発現に関与することが判明し、ステロイドホルモンの産生を制御することが判明した。クローニングした遺伝子はエストロゲン受容体のCo-factorであるRIP140と判明した。クローニングした遺伝子RIP140についてStAR遺伝子プロモーター活性の影響を調べ、StAR遺伝子との発現に関与することを明らかにし、ステロイドホルモンの産生を制御することを明らかにした。StAR遺伝子のダイオキシンによる影響StAR遺伝子のプロモーター領域の解析をし、ダイオキシン応答配列を遺伝子解析により明らかにした。

ダイオキシン受容体の発現を卵巣および精巣、副腎などステロイドホルモン産生臓器において解析し、ダイオキシン受容体がStAR遺伝子の発現に関与し、その作用はプロモーター領域に働き、StAR遺伝子のプロモーター活性を高めることにより、StAR遺伝子の発現を高めることを明らかにした。StAR遺伝子婦人科腫瘍における発現ステロイドホルモンの産生にはStAR遺伝子およびStARのホモログ遺伝子であるMLN64の発現が必須の因子である。ステロイドホルモンに感受性のある子宮体部癌で、StAR遺伝子の発現を調べ、StAR発現を明らかにした。コレステロールの合成ステロイドホルモンの合成はコレステロールからなされる。ステロイドホルモン合成の器質となる。コレステロールの合成を解析した。合成酵素の一つであるΔ5脱不飽和化酵素の組織発現を明らかにした。また、コレステロール合成酵素であるΔ5脱不飽和化酵素をクローニングし、遺伝子解析し、プロモーター活性を明らかにした。1.StAR遺伝子の発現の抑制と黄体機能の解析StAR遺伝子は卵巣でその発現を認め、ステロイドホルモンの産生は下垂体ホルモン(LHおよびFSH)の影響下にある。LHサージ後、黄体期にステロイドホルモンの産生は高まる。StAR遺伝子の発現の抑制機構に関してプロモーター解析により、StAR遺伝子の発現を抑制する因子はRIP140であることが判明した。RIP140の発現はcAMPにより、亢進することが判明した。発現はその後低下し、StAR遺伝子の発現と相関し、卵巣の黄体機能に関与することを明らかにした。転写因子は複雑な複合体を形成して遺伝子の転写活性を調整する。StAR遺伝子の発現に関与するSF-1およびDAX-1の関連遺伝子の同定したところエストロゲン受容体のCo-activatorであるRIP140が関与することが明らかになった。RIP140はDAX-1と結合し、SF-1はRIP140およびDAX-1と結合することが判明した。RIP140はSF-1とDAX-1との関連で、複合体を形成することが明らかになった。RIP140は組織発現はユビキタスに発現し、細胞内の局在は核内であることが判明した。SF-1と結合する蛋白質として16kDAのリン酸化蛋白質を新たにクローニングした。3.子宮内膜癌における腫瘍局所におけるステロイドホルモンの産生婦人科悪性腫瘍である子宮内膜癌について免疫組織染色により、StAR蛋白質の発現と局在を明らかにした。ステロイドホルモンの産生に関与する遺伝子P450遺伝子群とStAR蛋白質の発現をPCR法によりその発現を明らかにし、腫瘍局所のステロイドホルモン産生を明らかにした。4.StAR蛋自質結合蛋白質の解析StAR蛋白質と結合する遺伝子をクローニングすることに成功した。
ヒトiPS細胞を用いたファロー四徴症発生分化異常の解明

ファロー四徴症(TOF)患者手術により摘出される胸腺組織より線維芽細胞を分別培養し、それを用いてiPS細胞誘導を試みた。何種類かの誘導法を用いて施行したが、誘導効率はどれも高く、十分量のiPS細胞コロニーの形成を確認した。山中4因子OSKM(Oct3/4,SOX2,Klf4,L-Myc)以外にも、Jarid2, Prdm14, Sall4a, Essrb1も組み合わせて導入を行ったが、有意な差異は認めなかった。得られたiPS細胞を用いて心筋細胞群誘導も施行したが、高効率に心筋細胞群に誘導された。得られた心筋細胞群にTOF特異的な遺伝子変異等の異常は現在までのところ見つかっていない。昨年度研究実績として、ファロー四徴症手術により一部切離される胸腺組織(約10g程度)より線維芽細胞分別に成功した。組織を切離後直ちにcold PBSに浸漬し乾かないようにし、手術室より実験室に移送する。組織は安全キャビネット内で細切し、400mg程度を10cm細胞培養皿に接着させ20%FBS/DMEM+抗生剤を含む培養液で培養開始し、数代継代し完全に株化させ、total 1 x 107に到達したところで凍結保存しiPS細胞誘導用とした。エピソーマルベクターを用いた皮膚由来線維芽細胞を用いたヒトiPS細胞誘導では十分な経験があるため、それとほぼ同様の実験法にて誘導準備を進めているが、患者年齢も低くiPS細胞誘導の可能性は高いと考えている。ただし、極めて細胞の増殖能が高く、皮膚由来のそれと同じ細胞数で行うか否かは検討中であり、未分化細胞中に高発現する;C-Myc, Nanog, Jarid2, Prdm14, Sall4a, Essrb1, Lin28などの遺伝子導入も考慮中である。胸腺組織(約10g程度)より線維芽細胞分別では、大きな問題は生じなかったが、培養液の選定で時間を要した。この間、得られた線維芽細胞の遺伝情報を元に間葉系細胞であることの確認を行い、iPS細胞誘導用として問題はないことを確認した。上述したように、まずは皮膚由来線維芽細胞を用いたヒトiPS細胞誘導を用いて行う予定だが、今までにない間葉系組織なので、分担研究者である千本松が最近成功した心臓由来線維芽細胞のiPS細胞誘導法も誘導候補の1つとして施行予定である。本年夏までに、iPS細胞誘導を実行し、iPS細胞作製を目指す。iPS細胞の品質確認は当然行われるが、可能であれば年度内中に、中胚葉誘導(心筋細胞群)を行い、ファロー四徴症発症メカニズムの確認を開始したいと考えている。(目的)小児心臓外科手術において、ファロー四徴症手術の際、術野確保のため一部破棄される胸腺組織を用いて、1)胸腺線維芽細胞の分離培養法を確立する。2)その胸腺線維芽細胞を用いて、human iPS細胞誘導法を確立する。3)更に誘導された胸腺由来human iPS細胞を用いて中胚葉(脈管系臓器)誘導を確立する。4)iPS細胞、誘導された中胚葉(心筋細胞群)の、遺伝子発現を含めたepigenomeを解析し、TOF発生メカニズムを解析する。(実施計画)切離剥離された胸腺組織(約10g程度)より分別培養された初代線維芽細胞は、培養系が確立され、十分に確保された。予備実験として将来の臨床応用を考慮し、エピソーマルベクターを用いたnon-integration methodとして3つのベクター(pCXLE-OCT3/4-shP53, pCXLE-HSK, pCXLE-HUL)を用いたiPS細胞誘導を行い、十分量のiPS細胞コロニーは確保出来ることは確認出来た。そのiPS細胞の品質としてq-PCRによる代表的な未分化遺伝子(OCT3/4、SOX2, NANOG, KLF4, C-Myc)の発現を確認したが、正常組織から誘導されたiPS細胞と比較しても有意な差異は認めず、中胚葉分化誘導(心筋分化誘導)においても心筋細胞群が誘導された。ここまでの段階で正常組織から誘導されたiPS細胞との差異は認めてないため、RNA-seqやwhole genomeを用いたDNA損傷のレベルの確認を行う予定である。上述したように、胸腺-初代線維芽細胞-iPS細胞誘導-中胚葉誘導の予備実験は成功し、正常組織からのiPS細胞との有意な差異は認めていない。むしろ、小児患者であるため初代線維芽細胞の成長は早く、iPS細胞誘導に於いても十分なコロニー形成は生じ、中胚葉誘導も認める。すなわち、iPS細胞として良質であり、少なくとも中胚葉誘導は起こることは確認出来ており、iPS細胞として一連のスクリーニングでは異常は認めていない。その為現在パイロットスタディとしてRNA-seqやwhole genomeを用いたDNA損傷のレベルの確認を進めている。小児心臓外科手術の際、十分な術野確保の為一部の胸腺組織が切離剥離されて除去される。そこでファロー四徴症(TOF)患者手術の際、切離剥離された一部の胸腺組織より患者胸腺由来初代線維芽細胞をexplant法を用いて分別培養し、それを用いてヒトiPS細胞誘導法を確立する。Non-integration methodを用いた(エピソーマルベクターに組み込まれた山中因子を電気穿通法を用いて導入する)

高効率な誘導法の確立後、誘導されたiPS細胞の品質評価を行い、更にそのiPS細胞より中胚葉誘導として心筋細胞群を誘導し、それらの評価よりTOF発症メカニズムの解析することがこのプロジェクトの目的である。その結果間葉系線維芽細胞であってもその元となる組織によりiPS細胞誘導性はかなりの変動を示すが、胸腺線維芽細胞からのヒトiPS細胞誘導法は確立され、十分量のヒトiPS細胞コロニーは取得された。具体的には1x106の線維芽細胞から100から数百のヒトiPS細胞コロニーが誘導された。またその細胞を用いた心筋細胞群誘導も成功し、beating、トロポニンやGATA4, βMHC等の心筋特異的マーカーの有意な上昇も確認されたが、TOF患者特異的な発現パターン等は認められなかった。そこでTOF患者のゲノムの評価として、RNA-seqによるwhole genome evaluationを行い点突然変異の評価、そしてdigital PCRを用いた遺伝子コピー変異の評価、epigenomeの評価としてDNA-methylation arraysによるメチル化の評価、そしてDNA損傷評価としてγH2AXの発現量を指標にして誘導されたTOF patient-derived iPS細胞の品質の評価を施行中であるが、現在まで大きな差異には至っておらず、研究を継続していく予定である。ファロー四徴症(TOF)患者手術により摘出される胸腺組織より線維芽細胞を分別培養し、それを用いてiPS細胞誘導を試みた。何種類かの誘導法を用いて施行したが、誘導効率はどれも高く、十分量のiPS細胞コロニーの形成を確認した。山中4因子OSKM(Oct3/4,SOX2,Klf4,L-Myc)以外にも、Jarid2, Prdm14, Sall4a, Essrb1も組み合わせて導入を行ったが、有意な差異は認めなかった。得られたiPS細胞を用いて心筋細胞群誘導も施行したが、高効率に心筋細胞群に誘導された。得られた心筋細胞群にTOF特異的な遺伝子変異等の異常は現在までのところ見つかっていない。先天性心疾患患者から作製したiPS細胞が疾患解析ツールとして極めて有用であることをこのプロジェクトで確認する。そのため、手術破棄臓器ー線維芽細胞分別ーiPS細胞誘導ー分化誘導(中胚葉誘導)ー心筋細胞群の遺伝子の検証法を確立させる。そして先天性疾患を有した患者から誘導したiPS細胞と、先天性疾患を有さない患者より誘導されたiPS細胞の比較検討を行い、品質としてどのような差異を認めるか検討する。同時にこのようなiPS細胞より分化誘導がかかるか否か(先天性心疾患より中胚葉誘導を検討課題とする。)も必ず行っていく検討課題である。興味深いことに、TOF患者の胸腺組織を用いたiPS細胞誘導、心筋細胞群誘導(中胚葉誘導)は成功している。少なくとも現時点では何ら変化は示していない。TOFは,肺動脈狭窄(漏斗部狭窄)、心室中隔欠損、右心室肥大、大動脈騎乗の4つの奇形を合併している先天性心疾患であるが、その多くは染色体異常が存在せず原因不明であるため、当然の帰結かも知れない(染色体異常が存在しないため)。その為パイロットスタディとしてRNA-seqやwhole genomeを用いたDNA損傷のレベルの検討やepigenomicな評価を行って行く予定であるが、問題点として中胚葉誘導は十分である点にある。細胞形成レベルには問題はなく、その後の器官形成に問題が存在している可能性はある。
新規カスケード反応を基盤とする複雑な分子構造を持つ天然物の全合成研究

単純な直鎖状の分子構造からο-キノジメタンの生成、6π-電子環状反応、続く分子内Diels-Alder反応を経てtricyclo[3.2.1.0^<2, 7>]octane構造へと変換するカスケード反応の開発を試みた。ところが、目的の化合物は得られず反応途中に望まない8π電子環状反応が進行した8員環化合物が得られた。しかしながら8員環生成物は有機合成化学的に有用な分子構造であり、この反応も有用な反応である。種々検討の結果、8員環化物の収率を向上させることができた。有機合成において、中間体を単離することなく、途中で反応剤を加えず、同一の反応条件で異なる反応を連続的に行う反応をカスケード反応と呼ぶ。カスケード反応は、複数の反応を1段階で行うために工程数が短縮でき、中間体の単離・精製に関する手間やコストを削減できる。本研究は、単純な直鎖状の分子構造からo-キノジメタンの生成、6π-電子環状反応、続く分子内Diels-Alder反応を経て複雑なtricyclo[3.2.1.0^<2,7>]octane構造へとわずか1段階で変換するカスケード反応を開発し、その反応を鍵段階とした抗腫瘍性物質Salvileucalin Bの効率的な合成法を確立することを目的とする。申請者は単純な直鎖状の分子骨格からtricyclo[3.2.1.0^<2,7>]octane骨格へと1段階で変換する新規カスケード反応の開発を試みた。モデル化合物を用いてカスケード反応の検討を行ったところ、o-キノジメタンの生成後、望む6π-電子環状反応ではなく8π電子環状が進行した化合物が得られた。立体的な効果を利用した幾何異性体制御により8π電子環状を抑制しようと試みたが、8π電子環状を制御することは出来なかった。しかしながら、o-キノジメタンの生成、8π電子環状というカスケード反応は当初目的としていた反応ではなかったが、5-8-6や6-8-6などの縮環化合物合成への展開が期待でき有用である。カスケード反応によるtricyclo[3.2.1.0^<2.7>]octane骨格の構築は達成できなかったが、歪んだtricyclo[3.2.1.0^<2,7>]octane骨格を分子内Diels-Alder反応により構築することは有機合成化学上意義深い。現在、分子内Diels-Alder反応によるtricyclo[3.2.1.0^<2,7>]octane骨格を検討中である有機合成において、中間体を単離することなく、同一の反応条件で異なる反応を連続的に行う反応をカスケード反応と呼ぶ。カスケード反応は、複数の反応を1段階で行うために工程数が短縮でき、中間体の単離・精製に関する手間やコストを削減できる利点を持つ。本研究は、単純な直鎖状の分子構造からo-キノジメタンの生成、6π-電子環状反応、続く分子内Diels-Alder反応を経て複雑なtricyclo[3.2.1.0^<2.7>]octane構造へとわずか1段階で変換するカスケード反応を開発し、その反応を鍵段階とした抗腫瘍性物質SalvileucalinBの効率的な合成法を確立することを目的に開始した。昨年度、単純な直鎖状の分子骨格からtricyclo[3.2.1.0^<2.7>]octane骨格構築を意図してカスケード反応の開発を試みたところ、o-キノジメタンの生成後、望む6π-電子環状反応ではなく8π電子環状が進行した化合物が得られるということを発見した。23年度、申請者はこの8員環形成反応を有機合成化学的に有用なものにするべく、o-キノジメタンを生成する際の脱離基、フッ素源、反応溶媒、反応温度ならびに反応濃度等の反応条件を種々検討することにより反応効率を高めることに成功した。この方法は、従来の8員環形成反応では合成が難しい基質に対しても適用可能である。生理活性天然物には5-8-6や6-8-6などの縮環化合物合成が存在する。本手法はそのような生理活性天然物合成への展開が期待でき有用である。また、分子内Diels-Alder反応によるtricyclo[3.2.1.0^<2.7>]octane骨格構築を基盤とした抗腫瘍性物質SalvileucalinBの合成についても併せて検討中である。
生体応用を志向したPeT型新規光制御パーオキシナイトライト供与剤の開発

光誘起電子移動を応用した可視光で制御可能なONOO^-発生剤を開発するために、当研究室で開発された紫外光制御型ONOO^-ドナーであるP-NAPと、様々な置換基を有するBODIPYを連結させた化合物群の合成を行った。また、比較対象化合物としてP-NAPと連結させていないBODIPYのみの化合物群の合成も行った。合成した化合物群の蛍光を測定したところ、BODIPY構造のみの化合物群と比べ、P-NAPを連結させた化合物群は蛍光が減弱しており、光誘起電子移動が起こっていることが示唆された。また、合成した化合物群を用いて、Fe-MGD錯体を用いたESRスピントラッピング法にて、嫌気的条件下における光照射に対するNOの発生を確認したところ、可視光照射によってNOを放出していることが確認された。また、このNO放出能はBODIPYの電子密度によって異なっており、期待される光誘起電子移動に従った反応機構でNOの放出が起こっていることが示唆された。さらに好気的条件下で光照射を行うとこのシグナルは確認されなかったことから、同時にO_2^-が発生してFe-MGDよりも早くNOと反応し、ONOO^-が発生していることが示唆された。これまでの研究で、合成した化合物群は可視光照射によって、NOと0_2^-を発生していることが示唆された。これまで、このような可視光照射によってNOとO_2^-の発生を制御できる化合物は前例がなく、光毒性を考慮する必要のない、新たなケミカルツールもしくは光線力学療法剤として活性酸素種の研究に大きく貢献できると考えられる。当初の計画では、初年度にONOO^-の特徴的な反応であるニトロ化を確認できる化合物を見出す予定であったが、まだそのような化合物を開発できていないため。代表者が見出した紫外光制御型ONOO^-ドナーであるP-NAPと蛍光団を連結させた化合物群は光照射によってNOを発生しうることが確認されたが、ONOO^-の特徴的な反応であるニトロ化は確認することができなかった。この理由として、合成した化合物群の水溶性が低く、共溶媒にONOO^-と反応しうる有機溶媒であるDMFを多く用いている、発生したONOO^-が元の化合物と反応してしまっていることが考えられる。今後は、水溶性と、ONOO^-と反応できないように立体障害を向上させた化合物の合成を行っていく。
相対論的な領域を含む磁気駆動されるフレア現象の統一的な理解

近年の観測の発展によって、今日磁場中性子星であるマグネターでのフレア現象が観測されるようになり、その観測的特徴の太陽フレアとの類似性から、磁気リコネクションと呼ばれる物理過程で駆動されている可能性が示唆されている。報告者のこれまでの研究では太陽フレアにおける理論研究を応用することで、マグネターのような相対論的なパラメータ領域を包括するフレア現象を説明するような理論モデルの構築を目指した。本研究は次のように段階的に行った。(1)マグネターフレアによる加熱と放射冷却のつりあいから、スケーリング即を導出してエネルギー輸送課程を理解する、(2)超強磁場中での量子物理過程を考慮し、磁気リコネクションの数値計算を行ってエネルギー解放過程を理解する、(3)量子物理過程を考慮したフレアの数値計算を行って、マグネターフレアを説明できる包括的な理論モデルを構築する。この理論モデルを通して、太陽以外の様々な天体で観測されるフレア現象を包括的に理解することを目指すものであった。本年度では報告者は前年度に引き続いて上記内容の(1)、(2)の内容を論文にまとめることに尽力した。ここで行った研究内容については、国内外の様々な研究集会において発表を行い議論を重ねることで学術雑誌への論文投稿を目指しているところである。また(2)の内容として、強磁場中で重要となるシンクロトロン放射冷却を考慮した相対論的磁気リコネクション過程に関する数値計算を行い、相対論効果の重要性を議論した論文を現在投稿中である。29年度が最終年度であるため、記入しない。近年の観測の発展によって、強磁場中性子星であるマグネターでのフレア現象が観測され、その観測的特徴の太陽フレアとの類似性から、磁気リコネクションと呼ばれる物理過程で駆動されている可能性が示唆されている。本研究では、太陽フレアの理論研究を応用して、マグネターのように相対論的なパラメータ領域を包括するフレア理論モデル構築を目指す。本研究は次のように段階的に研究を進める。(1)マグネターフレアによる加熱と放射冷却のつりあいから、スケーリング則を導出してエネルギー輸送過程を理解する、(2)超強磁場中での量子物理過程を考慮し、磁気リコネクションの数値計算を行ってエネルギー開放過程を理解する、(3)量子物理過程を考慮したフレアの数値計算を行って、マグネターフレアを説明できる包括的な理論モデルを構築する。この理論モデルを通して、太陽以外の様々な天体で観測されるフレア現象を包括的に理解することを目指す。本年度、申請者は上記内容の(1)に関連した強磁場中性子星マグネターにおけるナノフレアモデルの構築に取り組んだ。申請者はマグネターの表面温度が一般的な中性子星よりも高いことに注目し、なんらかの磁気エネルギー解放過程と放射冷却のつり合いでこのように表面が高温に保たれていると考えた。そこで申請者は太陽でのナノフレア加熱モデルをマグネターに応用することで、エネルギー解放のタイムスケールなどの物理量を推定するスケーリング則を導出することに成功した。また申請者は上記内容の(2)に関連して、輻射場の時間発展を考慮した相対論的輻射磁気流体計算コードの開発に、共同研究者の国立天文台所属の高橋博之特任助教と取り組み概ねこれを完了した。今後は上に述べたような大規模の数値計算に取り組む予定である。本年度、申請者は強磁場中性子星マグネターにおけるナノフレアモデルの構築に取り組んだ。これはマグネターの表面温度が一般的な中性子星よりも高いことに注目し、なんらかの磁気エネルギー解放過程と放射冷却のつり合いでこのように表面が高温に保たれてような理論モデルを構築したものである。申請者は太陽でのナノフレア加熱モデルをマグネターに応用することで、エネルギー解放のタイムスケールなどの物理量を推定するスケーリング則を導出することに成功した。また申請者は輻射場の時間発展を考慮した相対論的輻射磁気流体計算コードの開発に、共同研究者の国立天文台所属の高橋博之特任助教と取り組み概ねこれを完了した。今後はマグネターにおける磁気エネルギー解放過程の大規模の数値計算に取り組む予定である。

また(2)の内容として、強磁場中で重要となるシンクロトロン放射冷却を考慮した相対論的磁気リコネクション過程に関する数値計算を行い、相対論効果の重要性を議論した論文を現在投稿中である。特別研究員二年目の今年度は、前年度に行った研究を発展させて強磁場中のプラズマで重要になると予想される量子物理過程および、シンクロトロン放射冷却を考慮したマグネターフレアの大規模な数値計算に取り組む。申請者は前年度、共同研究者である国立天文台所属の高橋博之特任助教と、輻射場の時間発展を考慮した輻射磁気流体計算コードを開発した。このコードを用いたマグネターフレアについての数値計算の結果を用いて、前年度の研究内容である観測と理論を結びつけるスケーリング則を数値的に検証し、強磁場による量子物理過程がどのように既知のフレア描像を変化させるかを調べることで、相対論的なパラメータ領域を含むフレア理論を構築することを目指す。これに際して、国内外の共同研究者と密接に議論を行う予定である。数値計算に関する技術的な内容に関しては、高橋博之特任助教、マグネター加熱に関する理論的な内容についてはモンタナ州立大学所属の鶴田幸子教授と行う予定であり、これらを通して本年度では包括的なマグネターフレアの理解を目指す。29年度が最終年度であるため、記入しない。
タンパク質発現のための無細胞タンパク質合成系

無細胞タンパク質合成系では,生細胞を用いた発現系で問題となる生体維持機構の制約を受けにくく,しかも,系自体を人為的に改変することにより,目的タンパク質の発現に最適化したり,生細胞を用いた発現系では調製不可能なタンパク質を調製することが可能である.このような無細胞系の特色を利用した発現技術として,コドンとtRNAの対応関係を巧妙に利用することにより,タンパク質上の特定の位置に特定の(20種のアミノ酸とは限らない)アミノ酸を,特異的に導入する方法がある.ところがこの方法では,極めて少量(μgオーダー)のタンパク質しか得られず,タンパク質の機能構造研究への利用は極めて困難であった.この技術を利用して,タンパク質の特定の残基のみを安定同位体標識することができれば,これまでは解析が困難であった,分子量が数万以上のタンパク質,及びタンパク質間相互作用を,NMRを用いて迅速に解析することが可能になり,構造生物学が更に進展すると期待されるが,極めて少ない合成量が大きな問題であった.そこで,研究代表者がこれまでに開発してきた無細胞大量発現技術と,tRNAの大量調製技術を組み合わせ,更に,これまでの無細胞系に関する知見を基に各種反応条件を検討することにより,この部位特異的タンパク質安定同位標識技術を実用化することに成功した.この技術を用いて,Rasタンパク質の標的分子との相互作用を担うエフェクター領域にある32位のチロシン残基のみに,^<15>N標識が導入されたRasタンパク質を,mgオーダーで調製してNMRスペクトルを測定することに成功した.無細胞タンパク質合成系では,生細胞を用いた発現系で問題となる生体維持機構の制約を受けにくく,しかも,系自体を人為的に改変することにより,目的タンパク質の発現に最適化したり,生細胞を用いた発現系では調製不可能なタンパク質を調製することが可能である.このような無細胞系の特色を利用した発現技術として,コドンとtRNAの対応関係を巧妙に利用することにより,タンパク質上の特定の位置に特定の(20種のアミノ酸とは限らない)アミノ酸を,特異的に導入する方法がある.ところがこの方法では,極めて少量(μgオーダー)のタンパク質しか得られず,タンパク質の機能構造研究への利用は極めて困難であった.この技術を利用して,タンパク質の特定の残基のみを安定同位体標識することができれば,これまでは解析が困難であった,分子量が数万以上のタンパク質,及びタンパク質間相互作用を,NMRを用いて迅速に解析することが可能になり,構造生物学が更に進展すると期待されるが,極めて少ない合成量が大きな問題であった.そこで,研究代表者がこれまでに開発してきた無細胞大量発現技術と,tRNAの大量調製技術を組み合わせ,更に,これまでの無細胞系に関する知見を基に各種反応条件を検討することにより,この部位特異的タンパク質安定同位標識技術を実用化することに成功した.この技術を用いて,Rasタンパク質の標的分子との相互作用を担うエフェクター領域にある32位のチロシン残基のみに,^<15>N標識が導入されたRasタンパク質を,mgオーダーで調製してNMRスペクトルを測定することに成功した.
運動・スポーツ行動への動機づけを規定する挑戦と快情動の精神生理学的研究

揺らぐ心を見える化し,個人差の影響を排除した汎用性のある指標によって生理的覚醒反応を一般化して即時評価・即時還元することができれば,競技ストレス状況における最適覚醒状態の理解や確立に寄与し,ひいてはパフォーマンス予測が可能となると考える.一般的にストレス評価は心拍数の増減で語られることが多いが,心拍数は緊張感のみを語るものではない.血行力学的な心臓血管系応答は身体の需要に応じて適応的でしなやかに振る舞う.本研究ではこの心臓血管系応答に着目し,ストレス状況をひとがどのように,認知し,感情が生起し,対処しようとした変化であるのかを精神生理学的に検討する.揺らぐ心を見える化し,個人差の影響を排除した汎用性のある指標によって生理的覚醒反応を一般化して即時評価・即時還元することができれば,競技ストレス状況における最適覚醒状態の理解や確立に寄与し,ひいてはパフォーマンス予測が可能となると考える.一般的にストレス評価は心拍数の増減で語られることが多いが,心拍数は緊張感のみを語るものではない.血行力学的な心臓血管系応答は身体の需要に応じて適応的でしなやかに振る舞う.本研究ではこの心臓血管系応答に着目し,ストレス状況をひとがどのように,認知し,感情が生起し,対処しようとした変化であるのかを精神生理学的に検討する.
タンパク質多型が内因性物質の生理活性発現に及ぼす影響の分析化学的研究

近年、アルブミンの218位アミノ酸配列が異なる遺伝的バリアントの発現率が高い家系群において、甲状腺ホルモンであるチロキシン(T4)濃度が高くなるhyperthyroxinemia症が頻発することが報告された。また、体内にはL体とD体のT4が共存し、異なる活性を示すことやL体の存在割合が多いが病態時にはL/D比が変動することが知られている。しかしながら、血漿中の低濃度の非結合型T4濃度を簡便に精度よく測定できる結合分析法は無く、新規分析法の確立が望まれていた。本研究の目的は、T4とアルブミンをモデルケースに選び、申請者が開発した高性能先端分析(HPFA)法を利用して血漿中の非結合型T4濃度を簡便に定量するための分析法を確立するとともに、結合分析に適用することにある。まず、HPFAカラムと濃縮カラム、分析用HPLCカラムを組み込んだオンラインHPFAシステムを構築し、T4が共存する試料中の非結合型濃度を高感度検出できる分析法を確立した。更に、光学分離用HPLCカラムを組み込むことにより、光学異性体ごとの非結合型濃度測定に成功した。この新規システムを用いて結合分析をおこなったところ、T4はL体もD体もヒト血漿アルブミン分子上のワルファリン結合部位(サイトI)とジアゼパム結合部位(サイトII)上で互いに競合的に結合し、アロステリック効果は見られないことが判明した。次に、電気化学検出器(ECD)を組み込んだ新規オンライン分析システムを新たに構築し、ヒト血漿中のT4並びにその関連物質であるトリヨードチロニン(T3)並びにリバーストリヨーロチロニン(rT3)の非タンパク結合型濃度を高感度に精度良く同時測定することに成功した。本システムは、hyperthyroxinemia症のような遺伝病に及ぼすタンパク質多型の結合多様性の影響解明に貢献すると期待される。(1)甲状腺ホルモンであるチロキシン(T4)のような内因性物質と血漿タンパク質との結合研究を行う上で必要となる簡便で高感度な新規結合分析法を開発するために、高性能先端分析(HPFA)法を組み込んだオンラインHPLCシステムを構築したところ、血漿試料を前処理なしに直接注入するというきわめて簡便な操作により血漿中のチロキシン(T4)ならびにその関連物質であるトリヨードチロニンやリバーストリヨードチロニンの低濃度の非結合型濃度(2.37pM16.4pM)を同時定量できる結合分析システムを確立することに成功した。これには濃縮サブシステムの導入と高感度で選択性も高い電気化学検出器(本科学研究費補助金にて購入)を使用することにより共存物質の検出妨害を防ぐことができた点が大きく寄与している。(2)アルブミンバリアントとT4との強い担互作用の立体選択的結合解析を通してタンパク質多型の結合多様性の影響を解明することを目的として、上記分析システムを使用してアルブミンとT4光学異性体間の結合解析を行った。その結果、結合定数がどちらの光学異性体とも1.01×10^6M^<-1>、HSA分子上の結合部位は2個所であり、L体T4とD体T4間で正常アルブミンとの結合性に大きな差は無いことが判明した。さらに、ワルファリン(アルブミン分子上の結合サイトI)とジアゼパム(アルブミン分子上の結合サイトII)を用いた競合実験の結果、両光学異性体とも、アルブミン分子上のどちらのサイトにも結合することが判明した。

また、体内にはL体とD体のT4が共存し、異なる活性を示すことやL体の存在割合が多いが病態時にはL/D比が変動することが知られている。しかしながら、血漿中の低濃度の非結合型T4濃度を簡便に精度よく測定できる結合分析法は無く、新規分析法の確立が望まれている。本研究の目的は、T4とアルブミンをモデルケースに選び、申請者が開発した高性能先端分析(HPFA)法を利用して血漿中の非結合型T4濃度を簡便に定量するための分析法を確立するとともに、結合分析に適用することにある。平成16年度は、まず、光学分離カラムを組み込んだオンラインHPFAシステムを構築し、L体とD体のT4が共存する試料中の非結合型濃度を各光学異性体ごとに定量できる分析法を確立した。この新規システムを用いて結合分析をおこなったところ、T4はL体もD体もヒト血漿アルブミン分子上のワルファリン結合部位(サイトI)とジアゼパム結合部位(サイトII)上で互いに競合的に結合し、アロステリック効果は見られないことが判明した。次に、電気化学検出器(ECD)を組み込んだ新規オンライン分析システムを新たに構築し、ヒト血漿中のT4並びにその関連物質であるトリヨードチロニン(T3)並びにリバーストリヨーロチロニン(rT3)の非タンパク結合型濃度を高感度に精度良く同時測定することに成功した。本システムは、hyperthyroxinemia症のような遺伝病に及ぼすタンパク質多型の結合多様性の影響解明に貢献すると期待される。
VEGF阻害が浸潤形質を誘導する分子メカニズムの解明

VEGFシグナル阻害により腫瘍に浸潤形質が誘導される。hypoxia inducible factor(HIF)は低酸素応答を司る転写因子である。マウス膵島腫瘍モデルを用いてHIF-1αとVEGFの重複KOを作成したところ、VEGF単独KOで見られた腫瘍の浸潤形質が著しく低下していた。VEGF欠損腫瘍ではE-cadherinの発現が低下していたが、重複KOでは野生型腫瘍と同等であった。以上から血管新生阻害によってもたらされる浸潤形質には、HIFが重要であり、E-cadherinの発現変化が関与している可能性がある。VEGFシグナル阻害による転移・浸潤形質の誘導の分子メカニズムを明らかにすることを目的として、まず、血管新生阻害がもたらす還流不全による低酸素の役割を明らかにする。hypoxia inducible factor(HIF)は低酸素応答を司る転写因子であり、血管新生阻害による浸潤形質の誘導に重要な役割を果たしている可能性がある。HIF-1およびHIF-2は常酸素下では分解され、低酸素下では安定化し、HIF-1βと結合することによって転写因子として機能する。HIF-1とHIF-2は高い相同性を持つが、最近その標的遺伝子が異なり、異なる反応を制御していることが示された。21年度はHIF-1α,およびHIF-1βの膵島特異的ノックアウトマウスとVEGFノックアウトRIP-Tag2マウスとの交配を行うことにより、HIF-1の機能を検討した。重複ノックアウトマウス(VEGF/HIF-1αDKO, RIP-Tag2,)はVEGF単独ノックアウトマウスと比較して長命であった。形態学的な解析を行った結果、VEGF単独ノックアウトマウスで見られた腫瘍の浸潤形質が重複ノックアウトマウスでは著しく低下していることが明らかになった。そこで、浸潤形質に関与したHIF-1α下流遺伝子の同定を試みた。RIP-Tag2腫瘍の浸潤形質にはE-cadherinやNCAMなどの接着因子が関与していることが既に遺伝的に証明されている。VEGF欠損腫瘍ではE-cadherinの発現が低下していたので、重複ノックアウトマウスでE-cadherinの発現の変化を検討したところ、E-cadherinの発現は野生型腫瘍と同等であった。膵島β細胞はE-cadherinとN-cadherinが同時に発現していることが知られているが、VEGF欠損腫瘍ではN-cadherinの発現も低下していた。E-cadherin低下とN-cadherinの低下は相補的な関係であった。以上から、VEGF KOによる浸潤形質にはHIFと接着因子の発現が重要な役割を果たしていることが明らかになった。VEGFシグナル阻害による転移・浸潤形質の誘導の分子メカニズムを明らかにすることを目的として、まず、血管新生阻害がもたらす低酸素の役割に注目した。昨年度までにHIF-1α膵島特異的ノックアウトマウスとVEGFノックアウトRIP-Tag2マウスとの交配を行うことにより、HIF-1の機能を検討した。重複ノックアウトマウス(VEGF/HIF-1αDKO,RIP-Tag2,)はVEGF単独ノックアウトマウスと比較して長命であった。VEGF単独ノックアウトマウスで見られた腫瘍の浸潤形質が重複ノックアウトマウスでは著しく低下していることが明らかになった。当該年度は接着因子の発現の変化や浸潤形質の出現が短期的な低酸素応答であるかどうかを、最近我々が開発した初代培養細胞を用いて検討した。短期間の低酸素暴露では接着因子の発現変化は観察されなかった。低酸素によるHIFの活性化がと浸潤形質を伴う低酸素耐性クローンの選択に関与した可能性がある。本研究ではVEGFシグナル阻害による転移・浸潤形質の誘導の分子メカニズムを明らかにすることを目的として、血管新生阻害がもたらす低酸素の役割に注目してきた。

VEGF単独ノックアウトマウス(VKO)で見られた腫瘍の浸潤形質が重複ノックアウトマウス(DKO)では著しく低下していることが明らかになった。そこで、浸潤形質に関与したHIF-1α下流遺伝子の同定を試みた。VKO腫瘍ではE-cadherinの発現が低下していたので、DKOでE-cadherinの発現の変化を検討したところ、E-cadherinの発現は野生型腫瘍と同等であった。樹立した細胞株や最近我々が開発した方法による初代培養細胞では短期間の低酸素暴露では接着因子の発現変化は観察されなかった。低酸素によるHIFの活性化が浸潤形質を伴う低酸素耐性クローンの選択に関与した可能性がある。昨年度はHIF単独ノックアウトマウス(HKO)の増殖や浸潤に関する解析を行った。VEGFやHIFのノックアウトはCre/loxシステムを利用しているが、Cre発現マウスのみ、との交配で、RIP-Tag2マウスの腫瘍形成が促進されることが判明した。しかし、HKOの表現型はRIP-Tag2・Cre発現マウスと同じであったので、VEGF存在下の腫瘍形成にHIFは重要ではないことが明らかになった。以上の結果を総合して論文投稿し、現在revise中である。