hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
チタン合金の高サイクル疲労特性に及ぼす双晶変形の影響

研究代表者らは、これまでにTi-5% Al-2.5%SnELI合金鍛造材の引張特性と高サイクル疲労特性の室温以下での温度依存性を調査し、低温では静的強度(0.2%耐力、引張強度)は高くなるにもかかわらず、高サイクル疲労強度は低くなることを明らかにしている。疲労破壊起点部の方位解析や組織観察により、低温での高サイクル疲労強度の低下は双晶変形に起因していることが示唆された。本年度は、低温(77K)での引張試験あるいは疲労試験によって変形双晶を導入した後、室温にて荷重制御での疲労試験を行った。その結果、低温での損傷(変形双晶)は、室温での試験で検出できることが示唆された。ただし、本研究で対象としている双晶が非常に薄いため、観察する上では現状TEMによる観察を行わざるを得ない。そのため広範囲にわたる観察ができておらず、双晶量の定量的評価ができていない。この点は、余寿命評価法を確立する上で今後早急に解決したい課題である。一方、本年度は、本研究で主たる損傷と考える双晶について、その形成が抑制されると考えられる細粒材の低温での疲労特性の評価も行った。その結果、細粒材(平均粒径30μm)では、室温での疲労特性は粗粒材(本研究供試材,平均粒径80μm)とほぼ同程度であるものの、低温では粗粒材に比べて疲労特性が顕著に改善されることが判明した。低温で疲労破壊した細粒材の起点部(ファセット)の面方位を解析したところ、底面であることが確認された。この結果より、細粒材では、低温での双晶変形に伴ったき裂発生が抑制され、その結果疲労特性が改善されることが推察された。また、この結果は、本研究供試材の繰り返し荷重下において、双晶変形が主たる損傷因子となっていることを裏付けるものと考えられる。
油圧制動機構付装具による脳卒中片麻痺患者に対する歩行トレーニングの開発

片麻痺患者の歩行には,同年齢の筋力の20%程度しかない底屈筋及び背屈筋の筋力低下が大きく影響を及ぼしている.足関節の筋力低下は,立脚期に過度の下腿の前傾や後傾を生じさせるため,片麻痺患者の歩行中の膝関節角度に影響し,歩行効率を低下させる.したがって,下腿筋の筋力低下は歩行速度の回復を阻む重要な原因となっているのではないかと推測される.これに対して,下腿の支持性を下肢装具が補償できれば,歩行機能回復の促進に有効となる可能性がある.本研究の目的の一つめは,歩行中の前脛骨筋の機能である踵接地時の遠心性収縮を油圧制動装具で補償することにより,片麻痺患者の歩行にどの程度の歩行速度の変化を起こせるかを明確にすることである.さらに,二つめの目的として,油圧制動装具を効果的に使用するために必要な運動機能をトレーニングによって改善させることができるかを無作為割付による対照試験で明らかにすることである.油圧制動装具は片麻痺患者の歩行速度を15-20%程度増加させることが可能であった.この装具による歩行速度への利得は,装具使用により歩行中の腓腹筋筋活動量増加させることができるものにおいて顕著であり,底屈筋の筋力をよりよく発揮できることが重要であると考えられた.この結果を受けて,油圧制動装具を使用している片麻痺患者に対して2週間の自重負荷による下肢筋力トレーニングを行い,ストレッチのみを行った対照群と比較した場合のトレーニング前後の変化を調べた.その結果,対照群では変化を認めなかったにもかかわらず,筋力トレーニング群において足関節底屈筋力が有意に増加し,装具無しでの快適歩行速度,Timed up and go testの有意な増加を認めた.本研究の結果から,油圧制動装具を使用してトレーニングを行うことにより,片麻痺患者の歩行機能を向上させることができることが示唆された.片麻痺患者の歩行には,同年齢の筋力の20%程度しかない底屈筋及び背屈筋の筋力低下が大きく影響を及ぼしている.足関節の筋力低下は,立脚期に過度の下腿の前傾や後傾を生じさせるため,片麻痺患者の歩行中の膝関節角度に影響し,歩行効率を低下させる.したがって,下腿筋の筋力低下は歩行速度の回復を阻む重要な原因となっているのではないかと推測される.これに対して,下腿の支持性を下肢装具が補償できれば,歩行機能回復の促進に有効となる可能性がある.本研究の目的の一つめは,歩行中の前脛骨筋の機能である踵接地時の遠心性収縮を油圧制動装具で補償することにより,片麻痺患者の歩行にどの程度の歩行速度の変化を起こせるかを明確にすることである.さらに,二つめの目的として,油圧制動装具を効果的に使用するために必要な運動機能をトレーニングによって改善させることができるかを無作為割付による対照試験で明らかにすることである.油圧制動装具は片麻痺患者の歩行速度を15-20%程度増加させることが可能であった.この装具による歩行速度への利得は,装具使用により歩行中の腓腹筋筋活動量増加させることができるものにおいて顕著であり,底屈筋の筋力をよりよく発揮できることが重要であると考えられた.この結果を受けて,油圧制動装具を使用している片麻痺患者に対して2週間の自重負荷による下肢筋力トレーニングを行い,ストレッチのみを行った対照群と比較した場合のトレーニング前後の変化を調べた.その結果,対照群では変化を認めなかったにもかかわらず,筋力トレーニング群において足関節底屈筋力が有意に増加し,装具無しでの快適歩行速度,Timed up and go testの有意な増加を認めた.本研究の結果から,油圧制動装具を使用してトレーニングを行うことにより,片麻痺患者の歩行機能を向上させることができることが示唆された.片麻痺患者の歩行には,同年齢の筋力の20%程度しかない底屈筋及び背屈筋の筋力低下が大きく影響を及ぼしている。足関節の筋力低下は、立脚期に過度の下腿の前傾や後傾を生じさせるため、片麻痺患者の歩行中の膝関節角度に影響し、歩行効率を低下させる.したがって、下腿筋の筋力低下は歩行速度の回復を阻む重要な原因となっているのではないかと推測される.これに対して、下腿の支持性を下肢装具が補償できれば,歩行機能回復の促進に有効となる可能性がある.本研究の目的の一つめは,歩行中の前脛骨筋の機能である踵接地時の遠心性収縮を油圧制動装具で補償することにより、片瞬痺患者の歩行にどの程度の歩行速度の変化を起こせるかを明確にすることである。さらに、二つめの目的として、油圧制動装具を効果的に使用するために必要な運動機能をトレーニングによって改善させることができるかを無作為割付による対照試験で明らかにするととである。本年度までの結果、油圧制動装具は片麻痺患者の歩行速度を15-20%程度増加させることが可能であった。この装具による歩行速度への利得は、装具使用により歩行中の腓腹筋筋活動量増加させることができるものにおいて顕著であり、底屈筋の筋力をよりよく発揮できることが重要であると考えられた。片麻痺患者の歩行には,同年齢の筋力の20%程度しかない底屈筋及び背屈筋の筋力低下が大きく影響を及ぼしている。足関節の筋力低下は、立脚期に過度の下腿の前傾や後傾を生じさせるため、片麻痺患者の歩行中の膝関節角度に影響し、歩行効率を低下させる.したがって、下腿筋の筋力低下は歩行速度の回復を阻む重要な原因となっているのではないかと推測される.

これに対して下腿の支持性を下肢装具が補償できれば,歩行機能回復の促進に有効となる可能性がある.本研究の目的の一つめは,歩行中の前脛骨筋の機能である踵接地時の遠心性収縮を油圧制動装具で補償することにより、片麻痺患者の歩行にどの程度の歩行速度の変化を起こせるかを明確にすることである。さらに、二つめの目的として、油圧制動装具を効果的に使用するために必要な運動機能をトレーニングによって改善させることができるかを無作為割付による対照試験で明らかにすることである。前年度までの結果、油圧制動装具は片麻痺患者の歩行速度を15-20%程度増加させることが可能であった。この装具による歩行速度への利得は、装具使用により歩行中の腓腹筋筋活動量増加させることができるものにおいて顕著であり、底屈筋の筋力をよりよく発揮できることが重要であると考えられた。この結果を受けて、本年度は、油圧制動装具を使用している片麻痺患者に対して2週間の自重負荷による下肢筋力トレーニングを行い、ストレッチのみを行った対照群と比較した場合のトレーニング前後の変化を調べた。その結果、対照群では変化を認めなかったにもかかわらず、筋力トレーニング群において足関節底屈筋力が有意に増加し、装具無しでの快適歩行速度、Timed up and go testの有意な増加を認めた。本研究の結果から、油圧制動装具を使用してトレーニングを行うことにより、片麻痺患者の歩行機能を向上させることができることが示唆された。
三次元ナノ構造によるプラズモン増強蛍光を利用したナノバイオセンサの構築

金属とシリカを組成とする三次元ナノ構造体を利用したナノバイオセンサを構築すべく研究を展開した。金薄膜(クロム薄膜を密着層)を蒸着したガラス基板上にメソポーラスシリカ薄膜を作製した。この際にメソ細孔の鋳型となる界面活性剤の含有率を減らすことで、細孔数を減少させた。この基板を焼成することで、界面活性剤が消失すると同時に細孔内にクロムが進入し、細孔が塞がれることおよびクロムが酸化状態にあることを、窒素吸着等温線測定およびXPS測定によって明らかにした。この酸化クロムーシリカ複合体薄膜をフッ酸水溶液で処理することでシリカ部分のみが選択的にエッチングされ、直径30-60nmの細孔ネットワーク構造(以降、メソポーラスネットワーク:MPNと呼ぶ)が薄膜全体に形成されていることを電界放射型電子顕微鏡観察および窒素吸着等温線測定によって確認した。このMPN内にMouse IgGが強く吸着保持され、さらにFITC標識化Anti-MouseIgGのみを選択に結合することがわかった。MPN薄膜を用いることでナノ空間における抗原抗体反応が可能であることを実証した。その際の蛍光強度は二次元平面基板を用いた場合の約30倍であり、極めて高感度な蛍光型バイオセンサとして応用可能なことを明らかにした。但し、この蛍光強度が表面プラズモンによる増強効果であると確定するには至っていない。また、MPN内での酵素反応は市販の96穴プレートに比べ約50倍の速さで進行し、極めて高感度かつ高速なELISA法によるタンパク質検出を実現した。以上のように、本研究で新規に開発したMNP薄膜は、これまでのバイオアッセイやセンサを飛躍的に進歩させる材料であることを実証しつつ、高感度なのバイオセンサの構築に成功した。生体分子種を高効率に捕集可能な3050nmの連続的な細孔空間を有する薄膜(極大メソ細孔薄膜)の作製方法が確立できれば、今後のナノバイオデバイス開発に大きく寄与できるものと考えられる。そこで、シリカメソ細孔を鋳型とした金属のナノ構造形成とそのプラズモン特性を利用したバイオセンサ開発に着手した。第一段階として、3050nmの細孔空間が三次元的に連続した新しいタイプのメソ細孔薄膜が作製可能であることを見いだした。この薄膜は、γイムノグロブリンなどの巨大な免疫系タンパク質(ストークス半径=約5nm)を強力に吸着捕集する能力を有すること、それらを抗原として同サイズの抗体が細孔外から細孔内に進入して結合すること(抗原一抗体反応)を確認した。さらに、その交差性は極めて低く、タンパク質分子間の相互作用の選択性が高いことが明らかとなった。細孔内において、タンパク質本来の高次構造が損なわれることなく機能していることを示唆している。この極大メソ細孔薄膜は、金属薄膜上に形成したメソポーラスシリカ薄膜を加熱後、フッ酸水溶液でシリカ成分をエッチングすることで得られ、残存した金属および金属酸化物を主成分として細孔が形成されているものと推定している。薄膜は光学的に透明であり、化学的にも安定であることから、各種デバイスに利用可能であると考えられる。イムノアッセイが可能なナノ空間(4060nm)を有する薄膜(メソポーラスネットワーク)の創製を目指すとともに、これを基板として用いた新規ナノバイオセンサを構築すべく研究を展開してきた。クロム薄膜を蒸着したガラス基板上にメソポーラスシリカ薄膜を作製した。

この酸化クロムーシリカ複合体薄膜をフッ酸水溶液で処理することでシリカ部分のみが選択的にエッチングされ、直径3060nmの細孔ネットワーク構造が薄膜全体に形成されていることを電界放射型電子顕微鏡観察および窒素吸着等温線測定によって確認した。このメソポーラスネットワーク内にMouse IgGが強く吸着保持され、さらにFITC標職化Anti-MouseIgGのみを選択に結合することがわかった。その際の蛍光強度は二次元平面基板を用いた場合の約30倍であり、極めて高感度な蛍光型バイオセンサとして応用可能なことを明らかにした。また、メソポーラスネットワーク内での酵素反応は市販の96穴プレートに比べ約50倍の速さで進行し、極めて高感度かつ高速なELISA法によるタンパク質検出を実現した。以上のように、本研究で新規に開発したメソポーラスネットワーク薄膜は、これまでのバイオアッセイを凌駕するセンサの開発に極めて有効である。
活性酸素産生癌遺伝子Nox1を標的としたRas・ヒト発癌機構の解析

本研究の目的は、ヒト悪性腫瘍の多段階発生機構における活性酸素産生遺伝子Nox1の媒介的役割をRas発癌モデルを用いて解明し、癌治療の方法的基礎を築くことにある。我々は、既にRas-MAPK経路によっで誘導されるNox1の産生するsuperoxideが、Rasの癌化形質に必要であることを明らがにした。この知見は、Nox1によって産生されるROSが、ヒト腫瘍形成においても、signal分子として、重要な媒介的役割を果たすことを示唆する。しかし、これに関しては憶測の域を出ておらず、またNox1作用の分子機構、情報伝達経路には未解明な部分が多い。こうした現状を踏まえ、本研究では1)ヒト癌におけるNox1ファミリーの媒介的役割の解明、2)Nox1によって産生されるROSの標的蛋白の同定、3)Nox1遺伝子発現の調節機構の解析を行った。研究項目1:Nox1 siRNA, Nox4 siRNAを作成し、Nox1を不活化すると、大腸癌細胞にアポトーシスが引き起こされ、またNgx4を不活化すると、メラノーマ細胞の増殖を抑制し、膵癌細胞のアポトーシスが引き起こされることが判明した。研究項目2:Nox1を導入した上皮細胞蛋白を5-IAF標識したのち、ToF-Mass分析を用い、ROSによって修飾をうける蛋白を探索した。その結果、分子量3090kDaの4つの細胞質蛋白が有意に修飾をうけることが判明した。現在、これらの蛋白群の癌化における機能的役割の検討を行っている。研究項目3:開発したEMSA5-IAF標識法を用い、大腸癌細胞よりRas-MAPKでリン酸化。活性化され、Nox1プロモーターに結合する82kDaと34kDaの2成分からなる。転写複合体を精製した。現在、ToF-Massで同定中である。以上の結果により、Nox1は、ヒト大腸癌の形成過程にも必須な癌関連遺伝子であり、また、腎臓で正常な生理機能を果たすファミリー遺伝子Nox4も、異所高発現又は活性化されることにより、細胞内ROS産生を高め、膵癌やメラノーマ発生を促進すると考えられる。本研究で、ヒト癌レベルでも、Noxファミリーの産生するROSの重要性が示されたといえる。困難を極めるROSの下流標的蛋白同定の研究で、幾つかの候補蛋白が単離されたことは、特筆すべきで今後の同定・機能解析の結果が強く待ち望まれる。最後に、Nox1遺伝子の、転写因子のサブユニット構造が解明されたことにより、この分野の研究が飛躍的に前進した。サブユニット蛋白の分子種の同定結果が待たれる。以上、Nox1を標的とした癌治療を模索する上で今後、Nox本体、及びその情報伝達分子の機能解明の重要性が深まったといえる。
表面再構成制御成長法によるSi上InSb量子井戸作成とその超高速FETへの応用

超高速・超低消費電力デバイスへの応用が期待されているInSbを用いたFET実現のため、表面再構成制御成長法というSi上のIn及びSb誘起表面再構成構造を利用して薄膜の面内回転を誘発させることで格子不整合を緩和するという新しい成長方法を用いて、InSb及びAlInSb薄膜を作製し、その特性評価を行った。Si(111)-√<7>×√<3>-In再構成を用いることで、100%回転したInSb及びAlInSb薄膜の成長に成功した。しかし、得られたAlInSb薄膜は正孔濃度が高く低抵抗だったため、試作したFETはトランジスタ動作しなかった。In誘起表面再構成構造上にSb原子を1原子層(ML)吸着させることによりInSb(2×2)構造(InSb単分子層)形成され、この上にIhSb薄膜を堆積させると、Si基板に対して30°回転して成長する。30°回転することにより、SiとInSbとの間の約19.3%もの大きな格子不整合が見かけ上約3.3%にまで緩和され、結晶性の良い膜が得られる。しかし、これまでに用いてきた4×1-Inや√3×√3-In表面相ではInの被覆量が少ないため、基板表面全体をInSb単分子層で覆うことができず、回転しない結晶も混在していた。そこで今年度は、In被覆量の多いSi(111)-2×2-In及び√7×√3-In表面相を用いたInSb薄膜のへテロエピタキシャル成長に関する研究を行った。2×2-In及び√7×√3-InのIn被覆量はそれぞれ0.75MLと1.2MLである。本来、0.75MLのIn原子があればInSb単分子層で基板表面全体を覆うことができるはずである。しかし、In表面再構成上へSb原子を吸着させた際にSi-In結合がSi-Sb結合に置き換わり、置換されたIn原子はSb上に現れる。この際、一部のIn原子は基板表面から脱離してしまうため、2×1-Sb再構成が形成される。この2×1-Sb再構成上ではInSb薄膜は回転しないため、0.75MLのIn被覆量を持った2×2-In再構成を介して作製したInSb単分子上のInSb薄膜は、回転しない結晶も含まれていた。しかし、√7×√3-In再構成を介して作製したInSb単分子層上のInSb薄膜の場合は、完全にSi基板に対して30°回転したInSb薄膜が得られた。これは、過剰なIn原子がSbとの置換反応によって脱離するIn原子を補う形で、2×1-Sb再構成によって覆われた領域を減少させたためである。上述のIn誘起表面再構成構造を用いた高品質薄膜の成長法は、現時点ではSi(111)基板上でのみ有効である。しかし、現代の半導体産業で使用されているのは(001)基板であり、また大面積のSi(111)基板はないため、我々の技術をデバイスメーカーに利用してもらうことを考えると、Si(001)基板を用いる必要がある。このため、リソグラフィー技術とKOHエッチング処理によりSi(001)基板上に(111)面を形成し、この(111)面に対して上述の成長法を利用できないか検討した。今年度はまず、KOHエッチングによるラインアンドスペース(LS)構造作製の条件出しを行った。昨年度は、Si(111)-√<7>×√<3>-In表面再構成を用いることで、Si基板に対して完全に30°回転したInSb薄膜を成長させることができた。このとき、成長したInSb膜の移動度は室温で17,000cm^2/Vsであった。今年度はまず、√<7>×√<3>-In表面再構成を用いて成長させたInSb薄膜の断面TEM像を観察し、結晶中の欠陥、転位の様子をSi(111)基板上に直接成長させた試料と比較し、大幅な転位の減少を確認した。また、更なる電子移動度向上を目指し、420□程度の高温成長を試みた。これまでは、InSb単分子層が分解するのか350□程度で膜を成長していた。そこで、InSb単分子層形成時のSb吸着量を23原子層に増やし、さらに、2層目の基板温度をグレーデッドに上昇させることで、420□という比較的高温で成長できるようになった。また、電子移動度は室温で20,000cm^2/Vsとなった。FETを作製するためには、InSbチャネル層をAIInSbバリア層で挟んだ量子井戸構造を作成する必要がある。

そこで、表面再構成制御成長法を用いて、Si基板に対して30°回転した高品質なAIInSb層の成長を試みた。AI組成が増加するにつれて、最適な成長温度が上昇するため、まずは低Al組成のAllnSb層を成長し、その上に高AI組成のAIInSb層を成長する2段階成長法を用いた。得られたAllnSb層を用いてInSb量子井戸構造を作製し、デバイス特性を測定したが、AIInSb層のキャリア濃度が高く、ソースドレイン間の電流をゲート電圧で制御できなかった。昨年度は、表面再構成制御成長法を用いて作製したA1InSb層を利用して、量子井戸構造を作製しデバイス特性の測定を行ったが、A1InSb層のキャリア濃度が高く、ソース・ドレイン間の電流をゲートで夏で制御できなかった。この原因は、界面付近で発生した転位によるものと考えられる。そこで今年度は、界面付近転位を減少させるため、1層目の成長レートを下げることでマイグレーションを促進し、グレインサイズを大きくする試みを行った。A1InSb層の成長は比較的難しいため、InSbの成長で同様の試みを行った。1層目の蒸着レートを従来の6分の1に下げたところ、表面性、結晶性、電気的特性が改善した。特に電子移動度は38,000cm^2/Vsと従来の薄膜の2倍の値が得られた。今後、同様の成長方法がA1InSb薄膜の成長に応用できるか確認が必要と考えられる。表面再構成制御成長法が応用できないSi(001)基板上へのInSb薄膜のヘテロエピタキシャル成長を試みた。1000Aの酸化膜が付いたSi(001)基板にリソグラフィー及びRIEによりライアンドスペース構造を形成し、その後KOH溶液による異方性エッチングによりV字型の(111)面を形成した。この(111)面にInSb単分子層を形成してInSb薄膜を作製したところ、InSb単分子層のない場合と比較して、結晶性の優れた膜が得られた。また、InSbを用いた立体構造を有する縦型デバイス実現のため、GaAs基板上へのInSbナノワイヤーの成長を試みた。GaAs基板上に直径40nmの金コロイド粒子を塗布し、聴講真空中で620°Cでアニール後InSbの400から500°Cの温度範囲で蒸着を行った。これにより、基板温度400°C、In及びSbの蒸発レートがそれぞれ87A/h、2680A/hのとき、最長で3.5μm程度のInSbナノワイヤーを成長することに成功した。
中東の難民女性の法・社会的地位と労働からみるジェンダー関係

本研究の最終年度となる2018年度は、以下の研究を行った。(1)基本文献の収集・整理・読み込み:中東出身の移民・難民に関する資料、およびジェンダーの視点から同テーマを分析する資料が出版されるようになっている。2018年度も、前年度に引き続き、難民のジェンダー問題に関する文献の収集および読み込みを行った。(2)現地調査:2017年度はノルウェーから難民行政経験のある研究者を日本に招聘し、研究会を実施した。2018年度は、2019年2月26日から3月4日の日程で本研究代表者がノルウェーの首都オスロ、南部の都市モスを訪問し、イラクやシリア出身の難民女性および男性を対象に聞き取り調査を行った。本研究代表者のノルウェーにおける調査は、本研究開始前を含めて今回で4度目となるが、今回の調査の最大の成果は、2011年の「アラブの春」以前にノルウェーに移住した難民(家族統合制度による渡航者を含む)への聞き取り調査をも実施できたことであった。というのも、2015年のヨーロッパへの大規模な難民流入に乗じてノルウェーに到着した庇護申請者らは、すでにノルウェーから退去命令が出た者や、現在でもノルウェーに滞在していても滞在期間が浅いため受入国における定着の様子が十分にわからないという問題があったからである。本現地調査を通じて、2015年以前と以降の難民・庇護申請者女性のネットワークが存在することが明らかになった。このインフォーマルなネットワークを通じて、定着後の難民が精神的・ときには物質的に新参の難民・庇護申請者を支援する仕組みも出現していることが明らかになった。(3)本研究成果の一部は、「ノルウェーにおけるアラブ人庇護申請女性らの戦略」『中東協力センターニュース』第43巻12号(2019年3月)pp. 18-25.として発表した。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。研究期間開始時より、関連文献・資料の収集およびそれらの読み込みを行い、また継続している。2017年8月には、ノルウェーのオスロおよびヒューダルにおいて、主に難民女性を対象に現地調査を行った。現地調査では、パレスチナ、シリア、イラク、アフガニスタンから難民としてノルウェーに移動してきた女性を対象に、移動までの経済・社会状況、移動の経験、そして移動後の法的・社会的地位について聞き取り調査を行った。2017年9月には富山市でアウトリーチ活動を行い、2018年1月にはシンガポール国立大学で開催された国際会議にて現地調査に基づく研究発表を行った。なお、国際会議については出席がかなわなかったため、代読にて発表した。本研究は、中東からヨーロッパに移動した移民・難民女性を対象に、彼女らの移動の経験や移動後の法的・社会的地位について調査研究を行うものである。8月の現地調査では、協力者の協力を得て、難民キャンプに滞在し、複数の女性やその家族の意見を聴取することができた。今後は、すでに獲得したインフォーマントへの調査の継続と、インフォーマントの増加を行う必要がある。これらに基づく研究成果の一部は、すでにアウトリーチ活動や国際会議(国際会議については代読)で公表することができた。また、ノルウェー政府での難民審査・支援経験を有する有識者を日本に招聘し、ノルウェーにおける難民の受け入れについて学術的かつ経験に基づく貴重な情報を入手することができた。最終年度となる平成30年度は、引き続き現地調査を通じてデータ収集に努めるとともに、研究成果の公表に力を入れる。英語論文の執筆・公表を通じて、最終的な研究成果とする予定である。
精神遅滞児の問題行動に関する研究

県内の1養護学校に在籍する小学部1年から高等部3年までの精神発達遅滞児84名(男子57名、女子27名)について、問題行動の縦断的変化を1991年4月から1994年3月まで観察し、以下のような知見を得た。(1)日常生活に関わる食事、排泄、睡眠における問題行動は、偏食、夜尿、起床困難、浅眠を除いて、DQとの相関が高く、加齢に伴って軽減した。(2)年齢的に2次性徴があり、対人場面での関わりが増す中学部にピークのある問題行動として、遺尿、多動、集中困難、自傷行為などがあり、それらはてんかん発作や性格など生物学的要因の影響を強くうけていた。(3)自閉症に多い問題行動として、パニック、自傷行為、チック、性器いじりがあり、自傷は高等部でやや軽快するものの、いずれも難治であった。(4)こだわりは、自閉症のみでなく、自閉症でない精神発達遅滞児においても、しばしばみられ、母子分離や母親の性格など、母親とのかかわりという環境要因が深く関与していた。(5)言語面で2語文以上獲得していないと、異食、頻尿、睡眠障害、寡動、パニックなどさまざまな問題行動が持続しやすく、周囲からのかかわりも環境要因として重要であると考えられた。(6)脳波異常とてんかん発作は、さまざまな問題行動の危険因子であり、思春期になって問題行動が増加する場合、脳波検査を行う必要があると考えられた。(7)問題行動の軽減のためには、発達早期からDQを偏りなくのばしたり、適応行動をましていくような働きかけが重要であり、かつ有効であると推察された。
間葉系幹細胞からの前顆粒膜細胞の誘導 -体外培養系での卵子獲得を目指して-

中胚葉から副腎や性腺への分化過程において、Wilms Tumor 1やSteroidogenic Factor 1(以下SF-1)といった転写因子が重要な役割を担うと推測されているが、中胚葉から卵巣とくに顆粒膜細胞が分化発生するメカニズムは、未だ明らかでない。近年、ヒト胎児の周辺組織である羊膜から、高い分化・増殖能を有する幹細胞を作製できることが報告されている。また、霊長類のカニクイザル・モデルにおいて、生殖細胞が胎齢11胚の初期羊膜より誘導されることも明らかになっている。我々は、ヒト羊膜由来の間葉系幹細胞(以下hAMMSC)を用いて、前顆粒膜細胞を効率よく分化誘導するプロトコールを確立し、その分子メカニズムを解明することを目的とした。同意が得られた産婦の娩出胎盤より羊膜を採取し、間葉系幹細胞の表面マーカ(陽性: CD105, CD90, CD73,陰性: CD45, CD34, CD11b,CD79A, HLA-DR))を用いてセルソーティングし、ヒト羊膜由来の間葉系幹細胞を分離・培養系を確立した。このhAMMSCが骨芽細胞や脂肪細胞に分化する多分化能を有することを確認した。アデノウイルスによるSF-1遺伝子導入により、hAMMSCをステロイドホルモン関連酵素遺伝子を複数発現する細胞へと分化させることに成功した。今後は、卵巣分化に重要とされる他の転写因子などを単独あるいは組み合わせて遺伝子導入し、そのときの遺伝子発現の特徴から顆粒膜細胞を分化誘導するために必要な遺伝子(群)の同定を試みる予定である。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。これまで我々は、顆粒膜細胞株(KGN細胞)に転写因子SF-1/Ad4BPを導入し、cAMP処理することにより成熟顆粒膜細胞を分化誘導する系を構築した。今回は、ヒト羊膜から間葉系幹細胞を分離し、in vitroで顆粒膜細胞の分化過程を再現できる系を確立することを試みた。患者の同意を得て分娩時に採取した胎盤から羊膜を採取し、コラゲナーゼ処理したのち、間葉系幹細胞のマーカーであるCD105, CD90, CD73でセルソーティングして間葉系幹細胞(hAMMSC)を分離した。hAMMSCに、転写因子SF-1/Ad4BPをアデノウイルスを用いて遺伝子導入したところ、細胞は多くのステロイドホルモン産生系の遺伝子(StAR, P450scc, HSD3β2, P450C17, HSD17β3, P450C21)を発現する細胞に分化した。一方、hAMMSCは、顆粒膜細胞のマーカであるFSHRやCYP19A1(アロマターゼ)は発現していなかった。羊膜は、ヒトへの侵襲を伴うことなく安価かつ多量に入手可能であるというメリットがあり、更に、hAMMSCは比較的長期間の培養と保存が可能であることから、今回確立した系は、顆粒膜細胞をin vitroで分化誘導する第一歩として、大きな成果であると考えられる。ヒト羊膜細胞からin vitroで間葉系幹細胞からステロイド産生細胞を分化誘導する系を確立する当初の目的を果たしたことから、順調に進展していると考えられる。SF-1導入にcAMP刺激を加え顆粒膜細胞への分化誘導を試みる。cAMP刺激により、分化が黄体細胞まで一気に進んでしまう場合は、cAMP刺激の濃度を調整したり、顆粒膜細胞の分化に抑制的に作用する卵子由来の成長因子GDF9・BMP15を添加することで、黄体細胞→顆粒膜細胞への脱分化を試みる。顆粒膜細胞で特異的に発現する転写因子FOXL2は、ステロイド関連酵素の遺伝子において、プロモーター活性を抑制する。そこで、アデノウイルスを用いて転写因子SF-1とFOXL2を導入する。

マーカー遺伝子の発現が確認されれば、その遺伝子発現パターンを、DNAマイクロアレイを用いて、既存の顆粒膜細胞株(KGN細胞)と網羅的に比較し、細胞の分化状況を検証する。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
ネットワークの耐故障性を考慮したグラフ構造の解析とアルゴリズムの設計

本研究では、グラフ理論、グラフアルゴリズムについての理論的な研究である。ネットワークにおける資源配置問題の中から、支配集合問題と完全独立全域木問題を取り上げ、それらの問題を解決するためのアルゴリズムの設計、または数学的な解析を行った。支配集合問題では、特に双方向支配問題についてのアルゴリズムを設計した。具体的には、ラウンドダイグラフと呼ばれるグラフと、局所トーナメントと呼ばれるグラフに対して、効率的なアルゴリズムを設計した。完全独立全域木とは、ネットワークの通信路に故障が発生しても、通信が行えるようにする方法の一つである。これに対して、全域木が存在するための数学的な新しい十分条件を与えた。ネットワークにおける配置問題の研究として,グラフの支配集合問題と,グラフにおける完全独立全域木の構成についての研究を行った.24年度における成果について説明する.グラフの支配集合問題については,特に有向グラフの双方向支配集合問題について研究を行った.この問題は,グラフをサイクルを持たない単純なグラフに限定してもNP完全になることを示す事ができた.そこで,グラフを区間グラフにサイクルが生じないように向け付けを与えたものに限定した場合,動的計画法によって多項式時間で最小の双方向支配集合を求めるアルゴリズムを設計することができた.また,グラフを局所完全ダイグラフと呼ばれるダイグラフに限定した場合も,多項式時間で最小解を求めることができた.これら二つの成果について発表を行った.さらに,木に向き付けを与えた有向グラフにおいては,動的計画法とは異なる手法で最小解を求めることができることが分かった.また,ラウンドダイグラフと呼ばれるダイグラフにおいても最小解を求めるアルゴリズムを設計することができた.これら二つの結果は現在投稿中である.グラフの完全独立全域木とは,グラフ中に複数の全域木を,それらの全域木が頂点間の内素なパスを生成するというように構成する問題である.この問題について,グラフが2個の完全独立全域木を持つための十分条件を証明する事ができた.この結果は現在Journal of Graph Theoryへ投稿中である.他にも区間グラフやハイパーキューブでの完全独立全域木の構成について一定の成果を得ており,次年度中に投稿する事が可能である.この問題は,効率の良いアルゴリズムを設計する事が難しいため,これらの成果には価値ある結果だと思われる.研究期間を通して、ネットワークにおける配置問題を、グラフ理論上の問題へとモデル化し、その数学的性質や効率的なアルゴリズムを設計することを目的として研究を行った。ネットワークの配置問題の中から、特にグラフの支配集合問題と、グラフにおける完全独立全域木の構成についての研究を行い、いくつかの成果を得た。25年度の成果は、支配集合問題について1編、完全独立全域木について1編の論文が、国際誌に掲載決定となった。まず有向グラフにおける双方向支配問題について、対象とするグラフをラウンドダイグラフと呼ばれるグラフクラスに限定し、その上で効率のよい多項式時間アルゴリズムを設計することができた。グラフの持つ構造がよく研究されているグラフとして、局所トーナメントと呼ばれている特別なクラスがあり、多くの研究者の注目を集めている。ラウンドダイグラフはその局所トーナメントに含まれるグラフである。また、完全独立全域木については、与えられたグラフが2つの完全独立全域木を持つための十分条件を示すことができた。この条件は決して実用的に意味があるものとはなっていないが、数学的に良く記述されており、同分野の研究者の興味を集め、今後の発展が期待される。残念ながら現在までに査読が終わっていないが、木構造のグラフの辺に向きを与えた有向グラフにおいえて、最適な支配集合を求める線形時間アルゴリズムを設計した結果をまとめて、国際誌に投稿中である。今年度に行った研究のテーマは,おもに二つである.一つは有向グラフ(ダイグラフ)の支配集合についての研究であり,もう一つは完全独立全域木の構成に関する研究である.支配集合問題とは,ネットワーク上の各ノードが隣りあうノードからサービスを受けることができるように,ネットワーク上へ資源を配置することと対応する.有向グラフの双方向支配集合という問題は,これまであまり研究されていない比較的新しい問題である.その中で,対象をラウンドダイグラフと呼ばれるグラフへ限定し,その最適な支配集合を求める効率的なアルゴリズムを設計し,その成果を発表することができた.その後,頂点が重みを持つラウンドダイグラフでの最小重み双方向支配集合を求めるアルゴリズムへ拡張した.この成果は論文としてまとめ,現在投稿中である.グラフにある条件を満たす全域木を構成する問題は,ネットワーク上の通信やアルゴリズムの設計において,基本的な問題である.全域木を利用したルーティングを行うと,通信を行うアルゴリズムが単純になるという利点があるが,一方で経路上に1カ所でも故障が発生するとメッセージが目的地まで送信できなくなってしまう.そこで,途中が重複しない経路を構成できるように複数の全域木を構成することが目的である.これまでの研究で,単純なグラフでも全域木を構成するアルゴリズムは計算困難になる事が示されている.そこで今年度は,全域木が構成可能であるための単純な十分条件を示すことを目標とした.

実際に,これまで知られていなかった新しい特徴付けと,いくつかの十分条件を示す事ができた.また,対象とするグラフをコーダルグラフに限定し,連結度と完全独立全域木の関係について明らかにすることができた.これら結果は今年度中に発表する事ができなかったが,来年度すぐ(2012年5月)に一部を発表する予定である.グラフの支配集合問題と完全独立全域木の構成について研究を進めることを,目標としている.支配集合問題では,対象とするグラフを木,区間グラフ,局所完全ダイグラフといった,ある特別なクラスに限定して効率の良いアルゴリズムを設計する事を目的としている.今年度までに,これらのグラフについては一定の成果を得ており,その一部を発表することができた.残りも論文としてまとめ,現在投稿中で査読の結果を待っている状態である.これについては,おおむね順調に研究を進めることができている.また,今年度からブロードキャスト支配という問題について考察を始めている.これについてはまだ目立った成果が出ていない.次年度中には,最初の成果を発表したいと考えている.完全独立全域木についても,一つの成果を論文としてまとめて投稿した状態にある.まだ未発表であるが,知られていない成果として区間グラフにおける完全独立全域木の構成について成果を得ている.次年度にまとめて一つの成果として発表することを考えている.以上のことから,おおむね目標とする課題はクリアしていると判断している.おおむね順調に進展し,計画していた目的を達成できた.支配集合問題については,計画にあった多重支配についての研究に着手することができなかった.これは,双方向支配について,当初予定していなかったグラフを対象としてアルゴリズムを設計することを始めたためである.これにより今年度に成果があったラウンドダイグラフの結果を一般化することができるため,多少計画を変更することになった.完全独立全域木については,予想以上の成果があったと思う.論文としてまとめるには至っていないが,すぐに論文の作成に取りかかることができる状態にある.またこの問題についてハイパーキューブについて考察することを計画し,実際に着手したが予想以上に理論的な困難さがあり,思ったよりも進まなかった.これは来年度も引き続き継続する必要がある.基本的には今年度までに行ってきた研究を継続する.支配集合問題と完全独立全域木問題では,どちらも区間グラフを対象とした成果を得ている.これをより拡張したcircular-
高等学校において軽度発達障害が疑われる生徒の教育的援助ニーズの調査研究

高校進学率が98%を超えており、発達障害を抱えた生徒が高等学校に進学していることが予測される。平成19年度から特別支援教育が推進されているが、幼稚園及び高等学校での遅れが指摘されている。その理由として、高等学校においては、発達障害が疑われる生徒の教育的援助ニーズの理解が不十分であることが考えられる。本研究は発達障害が疑われる生徒が多く在籍する高校で教育的援助ニーズを調査して、高等学校の特別支援教育の推進に寄与しようとするものである。調査の結果、生徒は「授業をわかりたい」「いい成績をとりたい」などの「学習面のサポート」、「友達とよい関係を築きたい」「友達と楽しくすごしたい」などの「対人関係面のサポート」、「自分に合った仕事を知りたい」「就職先をみつけたい」などの「進路・就職面のサポート」を求めていることがわかった。また、教員への聞き取りから、「学習面のサポート」が困難であるという意識をもっていることがわかった。また、発達障害が疑われる生徒の中には入学の時点で2次障害と考えられる反抗挑戦性障害の症状を呈している者がおり、入学後の援助が困難な状況にあることがわかった。高等学校での特別支援教育を推進する上で、学習指導方法や学習内容などの検討を含めた、学習面への援助のあり方が今後の課題であると考えられた。また、2次障害が起こらないように、小中学校での早期発見と適切な教育的援助が行われることが期待される。
ゴミ燃焼プラントのエネルギー極限利用

ゴミ燃焼エネルギーの高効率利用のためにはダイオキシン類や塩素化ベンゼンなど有害物質の生成抑制が不可欠である。その方法として、ゴミ予備乾燥による脱水処理燃焼、300°C域の煙道内壁加圧法(ガス噴霧)による浮遊カーボン系物質(フライアッシュを含む)の壁面付着防止が効果的である。一方、水蒸気は300°C域かつ多孔質SiO_2-Al_2O_3系耐火物表面で有害物質前駆体の塩素化を促進し、有害物質の生成を加速させる。研究目的:実機都市ごみ燃焼炉におけるde novo合成の模擬実験【実験室規模の燃焼炉、温度800°C、PVC粉末の燃焼排ガスを、約300°Cに保持した多孔質耐火物製反応管に導入するde novo合成実験】を行い、de novo合成による有害なダイオキシン類およびベンゼン濃度の増加量を測定する。本研究で提案した「煙道内壁面加圧法による有害物質の生成抑制」すなわち多孔質内壁面圧上昇法【多孔質内壁面に小さな穴を開けたパイプ郡を埋め込み、そのパイプ郡にN_2ガス、空気あるいは水蒸気を送り内壁面圧を上昇させ、多孔質壁面へ有害なダイオキシン類やベンゼンの生成源である浮遊カーボン系物質(浮遊C*)の付着を防止し、de novo合成を抑制】により、有害物質がどの濃度まで抑制できるかを基礎的に検証し、ごみ燃焼プラントのエネルギー極限利用に寄与できる方法とデータを提供する。研究成果:de novo合成実験(約300°C)では、排ガスの滞留時間が同じ場合、多孔質反応管を用いた場合のダイオキシン類濃度はSUS製反応管を用いた場合の値の4倍にも増加した。少量(4Ncm^3/min・cm^2)のN_2ガスを用いた多孔質内壁面圧上昇法により、多孔質壁面への浮遊C^*付着を抑制するとde novo合成によるダイオキシン類濃度はN_2ガスを付加しない場合の値の1/3に減少した。この実験から煙道におけるde novo合成の主因は、浮遊C^*が多孔質壁面に付着し300°Cの温度域に長時間滞留することであると確認できた。現在、N_2ガス流量の影響について調査中である。一方、同流量の水蒸気ガスを用いた場合、ダイオキシン類濃度はN_2ガスを使用した場合の値と比較して3倍に増加した。現在、SUS製反応管に水蒸気を付加してde novo合成実験を行い、de novo合成に及ぼす水蒸気の影響を調査中である。研究目的:実機都市ごみ燃焼炉におけるde novo合成の模擬実験【実験室規模の燃焼炉、温度800°C、PVC粉末の燃焼排ガスを、約300°Cに保持した反応管に導入するde novo合成実験】を行い、有害なダイオキシン類の増加量を測定する。本研究で提案した「煙道内壁面加圧法による有害物質の生成抑制」すなわち多孔質内壁面圧上昇法により、有害物質がどの濃度まで抑制できるかを基礎的に検証し、ごみ燃焼プラントのエネルギー極限利用に寄与できる方法とデータを提供する。研究成果:平成21年度は、主としてde novo合成に及ぼす水蒸気の影響について調査した。(1)水蒸気によるダイオキシン類生成濃度増加の原因を調べるため、約300°Cに保持したSUS製反応管に16g/minの水蒸気を付加してde novo合成実験を行った結果、1/3のde novo合成時間にも関わらずダイオキシン類濃度は2倍に増加した(生成速度は6倍に増加)。水蒸気添加量とダイオキシンの前駆体物質である2,4,6-トリクロロフェノールの生成濃度との間には強い正の相関があり、この2,4,6-トリクロロフェノールを介したダイォキシン類の生成、特にPCDDs生成量の増加が判明した。現在、煙道排ガス急冷のために通常行われている水噴霧はダイオキシン類生成の一因であると言える。(2)上記の結果から、燃焼過程におけるダイオキシン類生成濃度に及ぼす燃焼物質中の水分含有量の影響も非常に大きいと考えられるため、含水率の異なるNaCl含有小麦粉水和物粉末試料の燃焼実験を行った。3月末には排ガス中のダイオキシン類濃度の分析結果が判明する。ダイオキシン類生成濃度と含水率との間にも正の相関があれば、燃焼ごみの予備乾燥脱水がダイオキシン類生成抑制に効果的な方法であると言える。都市ゴミや産業廃棄物などに含有されている資源・エネルギーの高効率利用のためには、環境に配慮したゴミ発電が非常に重要である。この発電はCO_2排出削減にも直結する。これらエネルギーの極限利用には、ゴミ燃焼処理過程ならびに排ガス冷却過程で生成するダイオキシン類や塩素化ベンゼンなどの有害物質の生成および排出抑制が不可欠である。排出抑制対策には多額の経費とエネルギーを必要とするため、有害物質の生成抑制が非常に重用である。

本研究では、それらの有害物質の生成を極力抑制する方法として多孔質耐火物壁内部からN_2ガスあるいは水蒸気を添加する「煙道壁面加圧法による有害物質の生成抑制」を提案し、その基礎実験として、ダイオキシン類生成濃度に及ぼす水蒸気(主な水蒸気源は、食品廃棄物中水分、排ガス急冷用水噴霧)の影響を800°Cの高温燃焼実験と多孔質耐火物煙道を模擬した300°C域のデノボ合成実験により調査した。800°Cの高温ゴミ燃焼実験では、水蒸気濃度上昇により浮遊C^#(浮遊C^#とは、ダイオキシン類や塩素化ベンゼンなどの前駆体物質を含有する微粒子である。)が増加し、それに伴いダイオキシン類生成濃度も増加した。燃焼排ガス導入による300°C域のデノポ合成実験では、多孔質耐火物壁内部からのN_2ガス添加により、壁面への浮遊C^#の付着が抑制されダイオキシン類濃度は半減した。一方、壁内部からの水蒸気添加は、高温(300°C域)および耐火物中(SiO_2-Al_2O_3系耐火物)での水蒸気の分解により、ダイオキシン類濃度が水蒸気濃度に比例して急増した。すなわち水蒸気は有害物質の塩素化に触媒的作用を示す。以上のことから、有害物質生成抑制によるエネルギーの高効率利用のためには、都市ゴミ予備乾燥による脱水処理(熱源は排ガス熱で十分)、高温域(700°C以上)での排ガス中浮遊物質の遠心分離・再燃焼による浮遊C^#削減、排ガス急冷のための水の使用抑制が非常に重要である。
癌細胞におけるゲノム不安定性とセントロメアＤＮＡ低メチル化状態との関連について

癌細胞の特徴としてセントロメアDNAの低メチル化が知られているが、その意義は完全には理解されていない。本研究は、細胞の癌化とセントロメアDNAメチル化動態との相関性の解明を目的とした。培養細胞への癌遺伝子の強制発現では癌化誘導に伴ったセントロメアDNAの脱メチル化は認められなかったが、由来組織別の細胞スクリーニングにより悪性黒色腫でペリセントロメアの脱メチル化を見出した。一方でこの脱メチル化によるペリセントロメア由来のRNAは確認できず、逆に高メチル化状態であったセントロメア由来のRNAを確認したことから、これら領域からの転写にDNAメチル化以外の制御メカニズムが関わる可能性が示唆された。本研究では正常細胞、癌細胞のセントロメア領域のDNAメチル化状態を調べることで、細胞の悪性形質獲得と、セントロメアのDNAメチル化状態の変化との相関性を解明することを目的としている。細胞の癌化過程に伴うセントロメアDNAメチル化状態の変化を調べる対象として、Dox依存的に癌遺伝子(E6E7,MYC, RAS)を発現誘導することが可能なヒト子宮頚部角化細胞(HCK1T)を用いた。癌化誘導によりin vitroでの細胞増殖速度の上昇、ヌードマウス皮下での造腫瘍を確認した。解析対象のセントロメアとして、染色体の動原体部分に配置されているα-satelliteおよびセントロメア近傍のヘテロクロマチン領域のSatellite2を用いた。in vitroでの癌化誘導前でα-satelliteは約66%のCpGサイトがメチル化されていた。癌化誘導10日後、20日後、30日後、40日後および50日後で癌化誘導有りの細胞と無しの細胞とのDNAメチル化状態を比較した結果、両者の間に顕著な差は認められなかった。この様な傾向はSatellite2、in vivoで造腫瘍させた組織を用いた解析でも同様であった。なお、腫瘍塊の大きさとDNAメチル化状態に相関性は認められなかった。論文で報告されているような癌細胞と正常細胞でのセントロメアDNAのメチル化状態の差は、本実験では再現することはできなかったが、この原因として、細胞が由来する組織の違いや、臨床検体であるかライン化された細胞かとの違いが考えられた。そこで、次年度では様々な組織に由来する癌細胞株を用い、セントロメアDNAが低メチル化状態を示す癌細胞をスクリーニングする。また、本年度からセントロメアにおけるDNAメチル化の機能解析を行うことを見越し、セントロメア特異的にDNAメチル化を導入する実験系の開発に着手した。本研究では各種組織由来の正常細胞、前癌細胞、癌細胞のセントロメア領域のDNAメチル化状態を調べることで、細胞の悪性形質獲得と、セントロメアのDNAメチル化の状態の変化との相関性を解明することを目的とした。本年については、癌細胞試料の準備およびDNAメチル化を検出する実験系の確立に主眼を置いて研究を実施した。本研究では、ヒト子宮頚部角化細胞に、子宮頸癌の原因の一つであるヒトパピローマウイルスに含まれるE6、E7、細胞の癌化に関わるMYC、RASを含む遺伝子カセットを導入した細胞を使用し、これを実験に用いることとした。この細胞はTet-offシステムによって、ドキシサイクリン(DOX)依存的に遺伝子カセットに含まれる複数の癌遺伝子を発現誘導することが可能な細胞であり、DOX+で発現抑制がかかり、DOX-で発現誘導が行われる。この細胞を用い、in vitroでの癌化誘導の再現性の確認を行った。その結果、癌遺伝子の発現誘導を行った6日後から9日後にかけてDOX-で維持している細胞において、DOX+で維持された細胞と比較して細胞の増殖速度の増加が観察され、DOX依存的に細胞の増殖速度が上昇した。今後はこれら細胞において実際に癌遺伝子の発現上昇が認められるかどうかをウェスタンブロットで確認していく。実際の癌細胞ゲノムを用いる前に、セントロメアが低メチル化状態である精子ゲノム、高メチル化状態である非癌細胞ゲノム(HEK293)をコントロールとして検出系の立ち上げを行った。その結果、セントロメアのa-satellite配列、セントロメア近傍のSatellite-2配列において、精子ゲノムで低メチル化、非癌細胞ゲノムで高メチル化状態である結果を得ることができた。今後は癌化誘導を行ったHCK1T細胞を用いてセントロメアおよびレトロトランスポゾン配列のDNAメチル化状態の解析を行う。【セントロメアDNAが低メチル化を示す癌細胞のスクリーニング】胎児肺細胞、咽頭癌、結腸上皮細胞癌、肺扁平上皮癌、グリア芽腫、気道上皮癌、胃癌、乳癌、子宮頸癌、悪性黒色腫に由来する19ラインの癌細胞を解析対象とした結果、いずれの癌細胞もばらつきはあるものの、セントロメアを構成するAlpha satelliteは高メチル化状態を示した。

一方、ペリセントロメアを構成するSatellite2ではグリア芽腫と悪性黒色腫で低メチル化状態の傾向を示し、特に悪性黒色腫では調べた5ラインの細胞全てで低メチル化状態を示した。次に悪性黒色腫におけるセントロメア由来転写産物の検出を行った。その結果、高メチル化状態を示したalpha-satelliteで転写産物を認めた一方で低メチル化状態を示したSatellite2からは転写産物を認めなかった。以上から、これらの転写制御にDNAメチル化以外のメカニズムが関わる可能性が示唆された。【セントロメア特異的にDNAメチル化を導入する実験系の確立】セントロメアDNAの低メチル化状態の機能解析を見据えて、セントロメア特異的にDNAメチル化を導入する実験系を開発することとした。セントロメアが低メチル化状態を示すマウス卵子をモデル細胞として用い、Minor satelliteに結合するCENPBタンパクのDNA結合ドメインと、バクテリア由来のDNAメチル化酵素であるSssIの融合タンパク質発現ベクターを細胞内に導入した。核内DNAメチル化イメージングとバイサルファイトシーケンスの結果からセントロメアへのDNAメチル化導入を示唆する結果を得たが、同時に他のゲノム領域へのDNAメチル化導入も認められ、オフターゲットの少ない手法の開発が今後必要となると考えられた。発がん本研究では、研究対象とする癌細胞について、1癌の由来組織別によるセントロメアのDNAメチル化状態の比較、2発癌モデルを用いた癌細胞と非癌細胞とのセントロメアのDNAメチル化状態の比較、3「進行度合い」の違いによるセントロメアのDNAメチル化状態の比較を目標として掲げた。平成25年度については、細胞の癌化に伴ってセントロメアDNAが低メチル化状態になる様子を人為的に癌化誘導が可能な細胞を用いて再現しようと試みた。しかし、予想に反して癌化誘導の有無で、セントロメアDNAのメチル化状態に大きな変化は認められなかった。このため、分子生物学的な解析の対象となる細胞を準備することができずに研究が遅れることの原因となった。次年度は研究室で保管している癌細胞株を網羅的に使用し、セントロメアが低メチル化状態を示す細胞のスクリーニングを試みることから、低メチル化状態を示す細胞の選定は時間の問題であると考えられる。また、これと同時並行してセントロメア領域特異的にDNAメチル化を導入する実験系の確立を行っており、概ね良好な結果が出始めている。これらの実験系を組み合わせることにより、セントロメアにおけるDNAメチル化の意義に直接的に答えることができる実験をスピーディーに行えることから、研究の遅れは十分に取り戻せる範囲であると考えている。本研究では、研究対象とする癌細胞について、1癌の由来組織別によるセントロメアのDNAメチル化状態の比較、2発癌モデルを用いた癌細胞と非癌細胞とのセントロメアのDNAメチル化状態の比較、3「進行度合い」の違いによるセントロメアのDNAメチル化状態の比較を行っていく。初年度については、これら解析対象となる細胞の準備およびDNAメチル化の検出系の立ち上げを行った。研究者の所属研究室ではこれらの培養系および分子生物学的解析を行うためのインフラが十分ではなかったため、これらの準備に多くの時間を割くこととなった。