hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
レジデンシャル・ソーシャルワーク・インディケーターの開発

アウトカム指標を用いたパネル分析や複数のRSWerによるインディケーター使用結果のコレスポンデンス分析、さらにRSWerに対するインタビューからこれらの指標を用いることの有効性や効果が確認された。ソーシャルワークインディケーターの指標の一つであるProcess関連指標がほぼ明確になり、当初の計画通りに進展しているといえる。当初予定していた調査協力者全員にレジデンシャル・ソーシャルワーク・インディケーターへの入力を依頼することが出来なかったため、「おおむね順調に進展」とした。協力者として適切だと考えていた人たちが、職場が変わったり、職種が変わったりするという事態を想定していなかった。1実際にレジデンシャル・ソーシャルワーカーの毎日の業務に、この指標を当てはめて、いただいたデータの収集。2指標の実用性の度合いを確認、吟味すること。3得られたデータの分析。次年度は12012年度に予定していて得られなかったデータを補充すること。22013年は、より長期間にわたってデータ収集をし、期間の初期と期間の終期との変化の有無をみること。3得られた結果と施設の統計データ(サービス評価や利用者満足度等々)との相関関係や、エキスパートと新人との違い、または2人体制とそうでない施設との結果の違い等にも直目してデータの分析をすること。当初予定していた研究協力者によるデータの収集が次年度に実施されることになり、それに対する謝礼が次年度に発生するため。主として研究費の支出は研究協力施設および研究協力者への謝礼と交通費、会議等に当てる。主として研究費の支出は研究協力施設および研究協力者への謝礼と交通費、会議費等に当てる。
地域開発に連動した地震防災体制の構築-中国沿海域地域を例とした計画試案の提示

地域の産業・経済の発展は,地域の都市化・高密化を誘導し,災害誘発要因を蓄積する危険性を内包する。その一方,地域の発展による経済的な成功は,防災投資への裏付けを与え,防災体制を整備するための絶好の機会を提供する。この研究は,近年の発展が著しい中国を研究対象とし,1)産業・経済の発展に連動した防災体制の構築を,日本との技術交流を軸として展開し,2)それに基づく総合的な地震防災計画の立案に向けた基盤を準備することを目的として行われた。初年度には,日本側研究者を中国(北京)へ派遣し,1)防災体制構築のための背景となる,防災関連技術や各種の社会環境に関する中国側との情報交換(3日間の研究会を開催),2)新設の興行価値域をおもな対象とする構築環境の現地調査,3)防災体制の構築に関連する資料の収集を行った。次年度には,中国側研究者を日本へ招へいし,日本の防災体制と防災技術に関する現地調査(東京と神戸において実施)を行い,日本の防災情報システムに対する,中国への移転の可能性について考察した。最終年度には,日本側研究者を派遣へ派遣し,1)中国における都市計画分野からの地震防災へのアプローチの実状調査,2)震災からの復旧・復興による地域の構築環境と地震防災体制の変化に関する現地調査を行った。また,成果の取りまとめを行い,報告書を作成した。日本側研究者の中国への派遣を軸として、以下の調査研究を行った:1事例調査域の最終決定:北京とその近郊に位置する3箇所の経済再開発域において現地調査(踏査と現地関係者からの聞き取り)を行うことを決定した。2第1回ワークショップの開催:現地調査の直前に北京で開催し、(1)防災体制の構築戦略に関する討議(第1回)、(2)現地調査に関する情報交換、(3)調査票の作成を行った。3事例調査域での現地調査:事例調査域(1)自然環境、(2)構築環境、(3)開発環境、(4)既存の防災体制について調査した。4第2回ワークショップの開催:現地調査の直後に北京で開催し、(1)防災体制の構築戦略に関する討議(第2回)、(2)現地調査に関する取りまとめ方針を決定した。5追加資料の収集:第2回ワークショップの成果を踏まえ、中国側で実施した。6防災体制の構築戦略に関する詳細分析:中国での現地調査・資料収集の成果にもとづき、(1)事例調査域(北京とその近郊に位置する経済開発地域とその周辺)の災害環境と防災環境、(2)日本の防災技術を事例調査域に移転するさいに生じることが予想される問題点を抽出し、整理した。地域の産業・経済の発展は、地域の都市化・高密化を誘導し、災害誘発要因を蓄積する危険性を内包する。その一方、地域の発展による経済的な成功は、防災投資への裏付けを与え、防災体制を整備するための絶好の機会を提供する。本研究は、1)産業・経済の発展に連動した防災体制の構築戦略を、日本の防災技術の移転を軸として展開し、2)それにもとづく総合的な地震防災計画の試案を、急激な工業化の途上にある中国沿海部の都市群を例として提示することを目的とする。本年度は、中国側分担者(3名)の日本への招へいを軸として、つぎの調査研究を実施した:1)日本の防災体制・防災技術に関する現地調査中国側分担者(3名)と研究代表者が参加して、下記の機関・施設において、視察と聞き取りによる事例調査を行った。聞き取り調査では、1995年兵庫県南部地震の発生による状況の変化にとくに注目した。調査は、東京、神戸で行った。a)官公庁(東京都庁、東京消防庁、兵庫県庁)b)企業(企業の地震防災を、地域防災との関連にも注目して調査した)2)日本の防災体制・防災技術に関する現状の分析現地調査の終了後、東京で開催した。

収集した知見と資料を素材とし、日本の防災体制・防災技術の構造モデルを構築するための意見交換を行った、中国側分担者(3名)と日本側メンバー(代表者1名、分担者3名)が参加した。地域の産業・経済の発展は,地域の都市化・高密化を誘導し,災害誘発要因を蓄積する危険性を内包する。その一方,地域の発展による経済的な成功は,防災投資への裏付けを与え,防災体制を整備するための絶好の機会を提供する。この研究は,近年の発展が著しい中国を研究対象とし,1)産業・経済の発展に連動した防災体制の構築を,日本との技術交流を軸として展開し,2)それに基づく総合的な地震防災計画の立案に向けた基盤を準備することを目的とする。本年度は,日本側研究者の派遣(2回,各回2名)を軸として,以下の研究を行った:1)中国における都市計画分野からの地震防災へのアプローチの実状調査災害に対する恒久的な対策の展開には,都市計画との連携に留意した取り扱いが欠かせない。北京市を調査対象とし,北京市城市規画局および清華大学建築学院での聞き取りと資料収集によで,都市計画における地震への配慮の実状を調査した。2)震災からの復旧・復興による地域の構築環境と地震防災体制の変化に関する現地調査地震防災環境の改善には,地域の産業・経済基盤の整備のほか,地域の震災経験が強く関与し,直接的な動機付けを行うことが多い。この問題に関する現地調査を,中国における最近の地震(1996年麗江地震)を例として行った。3)報告書の作成研究の取りまとめを行い,報告書を作成した。報告書は:i)初年度(平成8年度)に中国で行った研究集会の記録,ii)次年度に日本で行った災害情報システムに関する実状調査の紹介,iii)研究期間を通じて行った中国の地震関連資料の紹介によって構成された。
放射光X線を用いた微生物産生多糖エステルにおける結晶形成機構の解明

本研究では微生物が生産する高分子量直鎖状β1,3グルカンを対象とする。最近、β1,3グルカンを修飾することで熱可塑性かつ結晶性を有するβ1,3グルカンプロピオネートの作製が報告されたが、結晶化挙動や材料化などに関する報告はいまだ少ない。我々はβ1,3グルカンプロピオネートの結晶化挙動が特異な点に着目した。それは球晶成長過程では遅い結晶化速度を示すが、繊維化過程で非常に速い結晶化速度を示す点である。また、剛直なピラノース環を主鎖骨格として有しているにもかかわらず球晶構造を示すのは非常に珍しい。本研究では、(I)等温結晶化過程で形成される孤立球晶の特定部位観察、および、(II)溶融紡糸過程で発生する配向結晶の形成過程をリアルタイム観察し、これらの結果を比較することでβ1,3グルカンプロピオネートの特異な結晶化現象を解明することを目的とした。(I)に関しては、球晶構造の特定部位のみを選択的に測定する必要が生じた。このため、放射光施設のμビームX線を使用することにした。また、測定個所を特定するため、X線とほぼ同軸で観察可能な偏光顕微鏡を有するレイアウトの構築を行った。この結果、球晶におけるターゲットの個所にX線を打ち込むことが可能になりつつある。一方、偏光顕微鏡の測定において、サンプルと光軸を完全に垂直配置することが難しかった。現在、これらの再設計を行っている。測定結果から、球晶の中で結晶のねじれの有無などに関する情報が得られた。(II)に関しては、ダイヤモンド窓を取り付けた特殊ダイを設計・作製し、溶融紡糸過程におけるダイ内部の観察と吐出直後の繊維の観察を行った。この結果、溶融紡糸過程でほぼ結晶化が終了しており、結晶化がどのように進行するかが判明した。また、溶融温度と巻き取り速度を変化させることで、これら2つのパラメータが結晶化度に与える影響についても明らかとなった。本研究では、微生物や藻類などがバイオマスなどを原料として生産するβ1,3グルカンに着目した。β1,3グルカンは微生物産生多糖類の一種であり、ミドリムシなどは二酸化炭素から光合成で生産できることから非可食系バイオマスプラスチックということも出来る。このβ1,3グルカンをエステル化したβ1,3グルカンエステルは結晶性を有しており、繊維やフィルムなどへの材料化が期待される。一方、これらの結晶化挙動は珍しい。例えば、(1)エステル化されたものの一種であるβ1,3グルカンプロピオネートの主鎖骨格は剛直なピラノース環で構成されているにも係らず、球晶形態をとること。無配向性試料の結晶化時間が数十分も要する一方で、(2)繊維や延伸フィルムといった配向性試料では一瞬で結晶化が終了することなどである。本研究ではβ1,3グルカンプロピオネートの材料化に必須な、上記の(1)(2)のような特殊な結晶化の原因について大型放射光X線を用いて解明することを目的としている。本年度は、β1,3グルカンプロピオネートサンプルを大量に調製し、基礎物性の測定を行った。さらに、(1)球晶の形成過程について、偏光顕微鏡X線同時観察測定法のための装置設計および作製を行った。調製したサンプルの熱物性を測定した。さらに、等温結晶化過程における球晶形成観察などを行い、上記、偏光顕微鏡X線同時観察で用いるサンプルの球晶形成条件の洗い出しを終えた。偏光顕微鏡X線同時観察の整備を行った結果、当初穴あきミラーを使用することで、X線と偏光顕微鏡の光路軸を数度ずらす様に設計していたが、偏光顕微鏡像が予想よりも不明瞭に結像されてしまった。このため、現在、ビームストッパー周辺に偏光顕微鏡用光源を設置し、ほぼX線と同軸に偏光顕微鏡光路がなるような治具を設計中である。β1,3グルカンのエステル誘導体である、β1,3グルカンプロピオネートを大量に調製することができた。また、これらのNMR測定やDSC測定を行い、基礎物性を測定した。また、(1)のような球晶形成の原因を明らかにするために行う、「偏光顕微鏡X線同時測定」環境の構築を行った。この結果、取得される偏光顕微鏡図が不明瞭になるという問題が発生したため、現在、再設計および治具の作製を行っている。しかしながら、測定自体は可能であり、上記課題が解決しなくても実験は行う予定である。また、(2)の溶融紡糸過程の結晶化形成を測定するための、「X線測定用のダイヤモンド窓を備えた特注ダイ」の設計も始めた。こちらに関しては来年度に作製予定である。本研究では、微生物が生産するバイオマスの一種であるβ1,3グルカンに着目した。β1,3グルカンは多糖類の一種であり、食品添加物として大量に生産されているが、熱可塑性を有していないためプラスチックとしての利用がなされていなかった。近年、β1,3グルカンの水酸基を容易にエステルに置換したβ1,3グルカンエステルの合成が報告され、樹脂としての利用が検討されている。β1,3グルカンエステルのなかでもβ1,3グルカンプロピオネートは、結晶性の樹脂であり、高い融点と透明性を有していることなどから材料化が期待されるポリマーであるが、研究報告は多くない。β1,3グルカンプロピオネートの結晶化挙動に注目すると興味深い点がいくつかある。

(1)主鎖が剛直な多糖で形成されているにもかかわらず、等温結晶化により球晶構造を示す。さらに、このときの結晶化速度は非常に遅い。(2)熱延伸や溶融紡糸などのずりのかかる過程において結晶化は即時に完了し、このときに形成される結晶の配高度は非常に高い。結晶化速度や結晶化挙動の情報は、材料化において必要不可欠である。そこで、本研究では、放射光X線を用いて、(1)カードラン球晶の構造および形成機構の解明、および(2)溶融紡糸過程における結晶化挙動の観察を目的とした。また、これらの情報を基に、材料化として、繊維の作成を目指す。本年度は、(1)放射光X線を用いた球晶の観察を目的として、偏光顕微鏡X線同時観察測定法のための装置を再設計し、製作と実験を行った。この結果、偏光顕微鏡像とX線回折測定を同時に行うことが可能となった。また、(2)溶融紡糸装置をビームラインに持ち込み、溶融紡糸過程における吐出ダイ内部の観察および吐出後の繊維の観察を行うことに成功した。吐出ダイ内部の観察については「X線測定用のダイヤモンド窓を備えた特注ダイ」を設計し、作成したものを用いた。前年度に、大量合成したβ1,3グルカンプロピオネートを用いて実験を行った。昨年度、(1)のような球晶形成の原因を明らかにするために行う、「偏光顕微鏡X線同時測定」環境の構築を行った結果、偏光像が明瞭に取得できない問題が見つかった。このため、試料ホルダー周辺の再設計を行った結果、明瞭な偏光顕微鏡像を取得し、同時に広角X線測定を行う環境が構築することができた。現在、観察可能なサイズのβ1,3グルカンプロピオネート球晶を調整し、測定を行っている。また、(2)溶融紡糸過程の結晶化挙動の観察について、「X線測定用のダイヤモンド窓を備えた特注ダイ」を設計・作製し、実験を行った結果、ダイ内部および吐出直後の繊維の観察を行うことができた。この結果、β1,3グルカンプロピオネートの溶融紡糸過程における結晶形成初期過程の観察に成功した。現在、これらの結果について解析を行っている。本研究では微生物が生産する高分子量直鎖状β1,3グルカンを対象とする。最近、β1,3グルカンを修飾することで熱可塑性かつ結晶性を有するβ1,3グルカンプロピオネートの作製が報告されたが、結晶化挙動や材料化などに関する報告はいまだ少ない。我々はβ1,3グルカンプロピオネートの結晶化挙動が特異な点に着目した。それは球晶成長過程では遅い結晶化速度を示すが、繊維化過程で非常に速い結晶化速度を示す点である。また、剛直なピラノース環を主鎖骨格として有しているにもかかわらず球晶構造を示すのは非常に珍しい。本研究では、(I)等温結晶化過程で形成される孤立球晶の特定部位観察、および、(II)溶融紡糸過程で発生する配向結晶の形成過程をリアルタイム観察し、これらの結果を比較することでβ1,3グルカンプロピオネートの特異な結晶化現象を解明することを目的とした。(I)に関しては、球晶構造の特定部位のみを選択的に測定する必要が生じた。このため、放射光施設のμビームX線を使用することにした。また、測定個所を特定するため、X線とほぼ同軸で観察可能な偏光顕微鏡を有するレイアウトの構築を行った。この結果、球晶におけるターゲットの個所にX線を打ち込むことが可能になりつつある。一方、偏光顕微鏡の測定において、サンプルと光軸を完全に垂直配置することが難しかった。現在、これらの再設計を行っている。
液体メニスカスによる卵膜保護が可能とする魚卵の冷凍保存の実現

実現が期待されている魚卵の凍結保存を目的とし,卵膜の親水性を利用した液体メニスカスと凍害防御剤の卵内導入を組み合わせた新たな凍結保存法を提案し,メダカ卵を対象にその可能性を検証した.メニスカスにはトレハロース水溶液を用い,卵内凍結前に粥状に凍結して保護膜とした.また,卵内凍結による損傷を低減するために,グリセリン水溶液を二本のキャピラリー管を用いて置換注入する方法を開発した.その結果,解凍直後には卵膜を含め,卵内組織の保存が確認できた.しかし,解凍後1時間を経過すると組織変化が生じ,孵化を確認するまでには至らなかった.解凍後の迅速なグリセリン除去が今後の課題である.実現困難とされている魚卵の凍結保存を可能とすべく,卵膜の親水性を利用して液体メニスカスにより外表面を包み,緩慢冷却によってこれを粥状に凍結して細胞膜を固定する保護層とし,その後に全体を急冷する新たな凍結保存法を提案する.メニスカス溶液にはトレハロース水溶液などの細胞膜保護物質を用い,冷凍前に常温での脱水処理をあわせて施すことにより,魚卵内外での氷晶生成による機械的ストレスを抑制することが狙いである.平成27年度は,魚卵としてめだか卵を選定し,メニスカス形成のための基盤の選定,凍結前の事前脱水処理の検証,外部溶液の種類・濃度の検討,そして実際の冷却と解凍による孵化の検証を行った.まず,メニスカスを形成する基盤として,ステンレス板,ポーラスシリコン,Cytopを塗布したシリコン基盤を用い,卵を覆う最小液量を評価し,Cytop塗布シリコン面が2μLと最も少ない量で卵全体を薄く覆うことができたため,メニスカスとして最適と評価した.次いで,事前脱水量の評価を行ったところ,15%の脱水までは孵化率100%であるが,20%以上に脱水すると孵化率が低下したため,めだか卵に対する事前脱水量は15%と決定した.外部溶液については,トレハロース水溶液とグリセリン水溶液について孵化率を評価した結果,孵化率が100%となる25%トレハロース水溶液が最適であることがわかった.以上の準備の下,ー3°Cまでの緩慢冷却後に植氷によるメニスカス凍結を行った後,液体窒素を用いた急冷による卵内凍結を行った.毎分5°Cで昇温解凍したところ,孵化を実現するまでには至らなかった.やはり卵内への凍害防御剤の導入が必要と推察し,5%濃度グリセリンを卵内に注入して,凍結実験を行うこととした.しかしながら,課題も多く,以降の検討は次年度に行うこととした.なお,メニスカス凍結までの過程では,卵の機能は保たれており,孵化することが確認できている.本研究課題の目標は,めだか卵の冷凍保存を実現することであり,初年度においてはこれを実現するまでには至っていない.ただ,これは想定した結果であり,目的を達成するために損傷の原因を特定し,その解決策を見出していくことが学術的にも意味のある成果につながると考えている.平成27年度では,メニスカスを形成する基盤,予備脱水量,そしてメニスカス溶液の種類と濃度を決定し,その選択がめだか卵の生命機能に何も影響を及ぼすことのないことを確認できている.すなわち,100%の孵化率を得ている.また,最初の緩慢冷却とー3°Cにおけるメニスカス凍結を行うプロセスにおいては生命機能は維持できており,これまた孵化することを確認している.つまり,メニスカス凍結後の冷却による卵内凍結とその後の解凍において損傷が生じることが特定できたことになる.そこで,まず卵内凍結による損傷発生を抑えることを第一に考え,メニスカス凍結後にマイクロインジェクションにより凍害防御剤としてのグリセリン水溶液を注入することを開始している.ただし,注入針のサイズが大きすぎるようで,凍結したメニスカス膜が力学的安定性を保持して良い効果をもたらすものの,注入孔による損傷と防御剤の注入量についての検討が必要なことが明らかとなっている.以上のように,損傷の発生内容が明らかになりつつあることを考え,おおむね順調に進行していると判断した.実現困難とされている魚卵の凍結保存を可能とすべく,卵膜の親水性を利用した液体メニスカスと事前の脱水の脱水処理を組み合わせた新たな凍結保存法を提案する.メニスカス溶液にはトレハロース水溶液などの細胞膜保護物質を用い,凍結前に常温での脱水処理をあわせて施すことにより,魚卵内外での氷晶生成による機械的ストレスを抑制することが狙いである.現時点では,メニスカス凍結,すなわち外部溶液凍結時までは卵の生存が確認できているが,卵内凍結まで行った場合に,解凍後での生存は確認できていない.したがって,卵内凍結による損傷を改善するために,魚卵内に凍害防御剤を導入する必要であり,その可能性を追求することが課題と考えている.平成28年度は,魚卵としてメダカ卵を選定し,細胞膜透過型凍害防御剤の導入効果の検証とマイクロマニピュレータを用いたガラスキャピラリーによる新たな穿孔法を検討した.まず,卵内に凍害防御剤を導入するために,分子量の小さいグリセリンを含んだ水溶液に卵を浸漬させる膜透過導入方法を試みた.これにより,凝固点降下や凝固潜熱の低下などの現象から,凍害防御剤であるグリセリンは卵内に導入されていると考えられる.しかしながら,どれくらいの浸漬時間で卵内に導入されているのか,凍害防御剤の注入量などが今後検証すべき課題と考えている.

次に卵内への直接的な凍害防御剤の注入方法として,マイクロマニピュレータを用いたガラスキャピラリーによる新たな穿孔法を検討した.液体メニスカスを応用し,-3°Cでの植氷による液膜凍結後に,-3°Cの状態を10分間程度維持し,卵膜も凍結させた後に針の挿入を行うことで,比較的容易に針を卵に挿入することができた.また,針を挿入する際に卵の形状が保たれていることからも,液体メニスカスの新たな有効性を確認することができた.実際の凍害防御剤の注入及びその影響の検討は次年度に行うこととした.本研究課題の目標は,メダカ卵の凍結保存を実現することであるが,現時点ではメニスカス凍結すなわち外部溶液凍結まででは卵の生存は確認できているものの,卵内凍結後の生存は確認できていない.したがって,卵内凍結時の氷晶成長による損傷を改善するために,卵内に凍害防御剤を導入することが課題と考えている.平成28年度では,グリセリン水溶液に卵を浸漬することによる細胞膜透過型凍害防御剤の導入効果の検証と,マイクロマニピュレータを用いたガラスキャピラリーによる新たな穿孔法を検討した.まず,卵をグリセリン水溶液に浸漬後,示差走査熱量計を用いて,凍結・解凍までの操作を行ったところ,卵内凍結温度の低下や凝固潜熱の減少が観測された.また,卵内氷晶形成状況を顕微鏡観察したところ,グリセリン浸漬後の卵は凍結後に光の透過性が減少したことから,氷晶は微細であったと考えられる.この結果により,凍害防御剤であるグリセリンは卵内に導入されていることが確認できた.しかし,解凍後での卵の生存が確認できておらず,卵内凍結を改善するためには,やはり直接的な凍害防御剤の注入が必要と考える.なお,卵内への直接的な凍害防御剤の注入には,マイクロマニピュレータを用いたガラスキャピラリーによる操作があるが,メニスカスがない状態で針を挿入しようとすると,弾力のある卵膜によって針の押し付け面が凹むだけで上手く刺さらない.そこで,液体メニスカスを応用し,-3°Cでの植氷による液膜凍結後に,-3°Cの状態を10分間程度維持し,卵膜を凍結させた後に針の挿入を行うことにより,比較的容易に針を卵に挿入することができた.また,針を挿入する際に卵の形状が保たれていることからも,液体メニスカスの新たな有効性を確認することができた.今後は実際に卵内への凍害防御剤の注入を行い,その効果を検証する必要があると考えられる.魚卵の凍結保存を可能とすべく,卵膜の親水性を利用した液体メニスカスと事前の脱水処理を組み合わせた新たな凍結保存法を提案し,その可能性を検証している.メニスカスにはトレハロース水溶液を用い,卵内凍結前に外部メニスカスを粥状に凍結して保護膜とし,内外での氷晶生成による機械的ストレスを抑制することが狙いである.これまでに,メダカ卵を用いて,メニスカス凍結,すなわち外部凍結までは卵は生存しているが,卵内凍結を行った場合に,解凍後での生存は確認できていない.そこで,卵内凍結による損傷を低減するため,細胞膜透過型凍害防御剤であるグリセリンを卵内に導入することを考え,その方法と効果をした.まず,グリセリン水溶液に卵を浸漬させる膜透過導入法を試みた.溶液濃度および浸漬時間による卵内凍結温度の変化を示差走査熱量計(DSC)で計測し,凝固点降下や凝固潜熱の低下などから実際に卵内に含まれるグリセリン量を把握した.
運動遂行に伴う感覚情報処理機構の解明－脳磁図を用いた研究－

運動遂行時に脳から発生する磁界反応を解析することにより,運動遂行時の体性感覚情報処理機構の神経基盤を明らかにすることを目的とした.まず,随意運動時および他動運動時の脳活動を比較し,他動運動時の脳活動の特徴を明らかにした.次に,機械的触覚刺激時のピン数やピン間隔と脳活動との関係を明らかにした.さらに,他動運動時の運動範囲を変えることにより,他動運動直後に観察される脳磁界反応の変化を解析した.これらを通して,他動運動直後には一次運動野,一次体性感覚野だけでなく,二次体性感覚野や後頭頂皮質が活動していることが明らかになり,運動遂行に伴う体性感覚情報処理に関する神経基盤の一部を解明することができた.運動遂行時に脳から発生する磁界反応を解析することにより,運動遂行時の体性感覚情報処理機構の神経基盤を明らかにすることを目的とした.まず,随意運動時および他動運動時の脳活動を比較し,他動運動時の脳活動の特徴を明らかにした.次に,機械的触覚刺激時のピン数やピン間隔と脳活動との関係を明らかにした.さらに,他動運動時の運動範囲を変えることにより,他動運動直後に観察される脳磁界反応の変化を解析した.これらを通して,他動運動直後には一次運動野,一次体性感覚野だけでなく,二次体性感覚野や後頭頂皮質が活動していることが明らかになり,運動遂行に伴う体性感覚情報処理に関する神経基盤の一部を解明することができた.運動遂行時における体性感覚情報処理機構を明らかにすることを目的として次の実験を行った.<実験1>自発運動時に大脳皮質から検出される脳磁界反応のうち,運動感覚を反映していると考えられている運動誘発脳磁界第一成分(運動直後の最も大きな波形)を誘発している感覚受容器を明らかにするために実験を行った.対象は健常成人9名であり,脳磁界の計測には306チャネル全頭型脳磁界計測装置(Neuromag)を使用した.示指伸展自発運動時の運動関連脳磁界反応を計測し,さらに,示指伸筋のみを単独で収縮させるために,ワイヤー電極を利用したモーターポイント刺激を行い,体性感覚誘発脳磁界の計測も行った.その結果,運動誘発脳磁界第一成分とモーターポイント刺激時に誘発される磁界反応は全く同じものであることが明らかとなった.すなわち,運動直後の運動感覚は主動作筋の筋紡錘の活動を反映しているものと推察することができた.<実験2>6名の健常男性を対象として,自発運動時と他動運動時の脳磁界反応を比較した.その結果,自発運動時に観察される運動関連脳磁界反応は,全ての被験者の左感覚運動領域で著明に観察された.運動関連脳磁界波形の中で最も振幅が大きかったのは,運動直後に観察される運動誘発磁界第一成分であり,ピーク潜時は30.1±4.8ミリ秒であった.一方,他動運動時においても,左感覚運動領域で著明な磁界反応が観察され,振幅が最も著明であったのは他動運動開始後37.6±8.0ミリ秒であった.電流発生源をみると,自発運動直後の運動誘発磁界第一成分は正中神経刺激後約20ミリ秒後に観察される波形(N20)の電流発生源よりも内側に位置していた.一方,他動運動時に最も強く反応した際の電流発生源は,N20の電流発生源とほぼ同様であり,運動誘発磁界第1成分よりも外側であった.運動遂行時における体性感覚情報処理機構を明らかにすることを目的として次の実験を行った.随意運動時および他動運動時に大脳皮質から検出される脳磁界反応を計測・解析した.対象は健常成人13名であり,脳磁界の計測には306チャネル全頭型脳磁界計測装置(Neuromag)を使用した.示指伸展運動を課題として,随意運動時に誘発される磁界反応と他動運動時に誘発される磁界反応を比較検討した.その結果,随意運動直後の運動誘発脳磁界第一成分(運動後約30ms)と他動運動直後に誘発される第一成分(運動後約30ms)の電流発生源およびピーク潜時が同様であることが明らかになった.すなわち,随意運動直後の運動感覚は主動作筋のみではなく拮抗筋の筋紡錘の活動も反映している可能性が考えられた.また,他動運動時には随意運動時には観察されない短潜時第二成分が他動運動後約80msで観察された.マルチダイポール解析およびMinimum Norm解析の結果,この成分は高次運動野である運動前野および補足運動野(6野)の活動に加え一次体性感覚野(3b野)の活動を含んでいる可能性が高いことを明らかになった.また,随意運動を伴う動的触覚刺激(能動的触覚刺激)と他動的に動く触覚刺激(他動的な動的触覚刺激)および単純触覚刺激を与えた際の脳磁界反応を比較した.対象は健常成人10名であった.その結果,単純触覚刺激の際には刺激後60msあたりで著明な磁界反応が観察され,電流発生源は一次体性感覚野(3b野)であった.一方,能動的触覚刺激時および他動的な動的触覚刺激時ともに,刺激後35msあたりで著明な磁界反応が観察され電流発生源はどちらも4野の可能性が高かった.

これらのことから,単純触覚刺激と異なり,対象物が動くような触覚刺激や,自ら探索するような能動的触覚刺激時には一次運動野と一次体性感覚野の両者が協働的に活動していると考えられた.(1)随意運動時および他動運動時に大脳皮質から検出される脳磁界反応を計測・解析した.脳磁界の計測には306チャネル全頭型脳磁界計測装置を使用した.示指伸展運動を課題として,随意運動時に誘発される磁界反応と他動運動時に誘発される磁界反応を比較検討した.その結果,随意運動直後の運動誘発脳磁界第一成分(運動後約30ms)と他動運動直後に誘発される第一成分(運動後約30ms)の電流発生源およびピーク潜時が同様であることが明らかになった.また,他動運動時には随意運動時には観察されない短潜時第二成分が他動運動後約80msで観察された.マルチダイポール解析の結果,この成分は一次体性感覚野,一次運動野,補足運動野,および後頭頂小葉の活動を含んでいる可能性が高いことを明らかになった.また,120ms以降では両側の二次体性感覚野の活動も観察された.(2)他動運動後200ms以内に複数箇所の脳活動が認められたため,他動運動刺激と単発磁気刺激を組み合わせて,他動運動が一次運動野の興奮性に及ぼす影響を検討した.その結果,他動運動後180ms200msの間に一次運動野の興奮性が減弱していることがあきらになった.(3)随意運動を伴う動的触覚刺激(能動的触覚刺激)と他動的に動く触覚刺激(他動的な動的触覚刺激)および単純触覚刺激を与えた際の脳磁界反応を比較した.その結果,単純触覚刺激の際には刺激後60msあたりで著明な磁界反応が観察され,活動部位は一次体性感覚野であった.一方,能動的触覚刺激時および他動的な動的触覚刺激時ともに,刺激後35msあたりで著明な磁界反応が観察され活動部位はどちらも4野の可能性が高かった.これらのことから,単純触覚刺激と異なり,対象物が動くような触覚刺激や,自ら探索するような能動的触覚刺激時には一次体性感覚野だけでなく一次運動野も協働的に活動していると考えられた.当初の計画通り順調に推移している.24年度が最終年度であるため、記入しない。当初の計画通り,24年度以降は運動と感覚の相互作用を検討するとともに,一時的に体性感覚を軽度鈍麻させた際の運動関連誘発磁界を計測・解析し,運動感覚に寄与する表在感覚の役割を明らかにする.24年度が最終年度であるため、記入しない。
睡眠時のLH分泌パターンによる視床下部性第二度無月経の病態分類とその臨床的意義

目的:視床下部性第二度無月経の重症度、予後を知る目的で日中および夜間のLH分泌パターンによる分類を検討した。研究方法:33名の視床下部性第二度無月経症例を対象として、日中覚醒時および夜間睡眠時に10分毎に4時間採血した。結果:LH分泌パターンから4型に分類しえた。即ち、日中、夜間共にパルスのないもの(Group1)、夜間にのみ23パルスのみられるもの(Group2)、夜間には数回パルスがみられるも、日中には1回しかパルスの無いもの(Group3)、日中、夜間とも数回パルスのあるもの(Group4)である。血清estradiol値はいずれも30pg/ml以下であり、血清prolactinは4group間で差異は認められなかったが、LHの基礎値とLHパルスの振幅はGroup1からGroup4へと増加した。夜間血清melatonin値はGroup1で著しく高値であり、夜間のLHパルス頻度と負の相関を示した。これらの成績は視床下部性無月経が思春期前期へも後退であることを示している。6か月後の卵巣機能の改善率はGroup1:0%,Group2:25%,Group3:80%,Group4:67%であった。LHパルスの反復検査症例でもこの重症度分類の改善に伴い卵巣機能は回復を示した。結論:今回の分類は視床下部は第二度無月経の重症度を良く反映しており、予後を予知するに有用なものである。研究方法:33名の視床下部性第二度無月経症例を対象として、日中覚醒時および夜間睡眠時に10分毎に4時間彩血した。6か月後の卵巣機能の改善率はGroup1 0%,Group2 25%,Group3 80%,Group4 67%であった。LHパルスの反復検査症例でも今回の重症度分類の改善に伴い卵巣機能は回復を示した。結論:今回の分類は視床下部性第二度無月経の重症度を良く反映しており、予後を予知するに有用なものである。〈目的〉視床下部性無月経では下垂体卵巣系の機能は保たれており、GnRHの律動的分泌障害が存在すると推測される。そこで高感度測定法を用いて視床下部性第二度無月経症例の律動的LH,FSH,PRL分泌パタ-ンを日中覚醒時のみならず夜間睡眠時においても調べ、視床下部性第二度無月経の病態分類を試みると共にその臨床的意義について検した。〈方法〉16歳から27歳の視床下部性第二度無月経13例(原発性5例)に対して、日中覚醒時および夜間睡眠時に各々4時間連続採血し、10分毎の分画における各種下垂体ホルモンを測定した。なお、測定の変動係数の3倍以上の増加をもってピ-クを形成したときpulseと定義した。〈成績〉1)LHのパルス頻度によって日中、夜間ともにパルスが見られない思春期前型(1群)、夜間のみパルスが見られる思春期型(2型)、日中パルスの少ない移行型(3型)、日中夜間共にパルスがある成人型(4型)に分類が可能であった。

2)LH基礎値は1、2群では昼夜共低く、3群では夜間に有意な上昇が見られ、4群では昼夜ともある程度のレベルを示した。また、LHRHに対する反応性は3、4群で良好であった。3)FSHでは各群共に昼夜の差は見られなかった。4)PRLパルス頻度は各群で、夜間に増加が見られ、PRL基礎値は夜間で上昇するが、3、4群で著明な上昇を認めた。また、TRHに対するPRLの反応は3、4群で増強する傾向を示した。5)E_2基礎値は1、2群では極めて低いが、3、4群では1、2群に比して高い値を示した。6)3群の4例中1例、4群の4例中2例で6カ月以内に病態の改善がみられた。〈結論〉視床下部性第二度無月経の根底をなす原因はLHパルスの減少であり、日中覚醒時と共に夜間睡眠時のLH分泌パタ-ンにより従来診断し得なかった本病態の重症度分類が可能であった。この病態分類は予後を知る上でも1つの指標となり得る。gonadotropin分泌パターンを日中覚醒時、夜間睡眠時に調べ、視床下部性第二度無月経の重症度分類を試み、その予後及びmelatoninとの関係を検討した。<方法>視床下部性第二度無月経27症例を対象とし、採血は午前0時及び午後0時より4時間にわたり、10分毎の分画で採血した。血中LH,FSHは高感度のimmunofluorometric assayを用いて測定し、血中melatoninは昼間採血開始時の12:00、夜間採血開始時の0:00にRIAで測定した。<結果>(1)LHの分泌パターンをパルス頻度によってパルスの見られないもの(1群)、夜間のみパルスが見られるもの(2群)、夜間はパルスが見られるものの、日中のパルスが少ないもの(3群)、日中、夜間ともにパルスが見られるもの(4群)に分類可能であった。(2)これら4群におけるLH基礎レベル、パルスの振幅は1群、2群、3群、4群の順の増加し、FSH基礎レベル、パルスの振幅もLHとほぼ同様の成績であった。(3)GnRHに対するgonadotropinの反応性は1群から4群に進むに従い良好になる傾向が認められるものの、3、4群でも低反応を示すものもあり、GnRHテストのみでこの病態分類を診断するのは不十分と思はれた。(4)melatonin値は昼間では各群間に差を認めなかったが、夜間では1群で異常高値を示し、2群、3群、4群の順に減少し、夜間LHパルス頻度との間には負の相関を認めた。(4)検査後少なくとも6ヶ月間に病態が改善し、第一度無月経、無排卵周期症となったものは1群で7例中0例、2群で8例中2例、3群で5例中4例、4群で9例中6例であった。<まとめ>昼夜間のLHパルス頻度による本分類は視床下部性第二度無月経の重症度をよく反映し、予後とも密接な関係を示した。GnRHテストでこの病態を診断するのは困難であり、また、この分類にmelatoninが関与している可能性が示唆された。
ウエルシュ菌α毒素によるIL-8分泌メカニズムの解明

ガス壊疽の主要な病原因子であるα毒素の受容体探索、及び毒素によるサイトカイン遊離機構について解析を行い、α毒素は、チロシンキナーゼ関連受容体のTrkAを活性化していることを世界で初めて明らかにすることができた。また、本毒素による炎症性サイトカイン(IL-8やTNFα)の遊離にTrkA受容体の下流に存在するERK1/2→NF-κB経路がサイトカインの発現に密接に関与し、さらにp38 MAPKがサイトカインのmRNAの安定化に重要な働きを演じていることも明らかとなった。これらの研究結果は、α毒素による炎症に対する新たな治療戦略につながるものと期待できる。【目的】ウエルシュ菌によるガス壊疽の原因毒素であるα毒素は、血液内に移行すると溶血やサイトカインストーム、そして、肝臓や肺への著しい好中球の集積を引き起こす。所属する研究室は、好中球の浸潤に密接に関与するIL-8に注目し、α毒素処理細胞からのIL-8遊離メカニズムについて解析を行ってきた。また、本毒素による好中球の活性酸素産生作用に三量体GTP結合タンパク質Giを介した内因性PLCの活性化とチロシンキナーゼ関連受容体であるTrkAの活性化が関係していることを明らかにしてきた。そこで、α毒素によるIL-8の遊離とTrkAの関係を検討した。【方法・結果】TrkA阻害剤(K252a)及びsiTrkA処理細胞にα毒素を作用させた場合、毒素によるIL-8遊離は有意に抑制された。また、TrkAノックダウンA549細胞への毒素の結合を分析した結果、毒素の結合の有意な低下が認められたことから、本毒素によるIL-8遊離へのTrkAの関与が明らかとなった。そこで、Cy3ラベルα毒素とAlexa488ラベル化TrkA抗体の局在を共焦点レーザー顕微鏡で観察したところ、両者の共局在が認められた。次に、TrkAは、ガングリオシドの一つであるGM1と隣接していることが報告されていることから、GM1の蛍光ラベル体であるBODIPY-GM1とCy3ラベルα毒素の局在を共焦点レーザー顕微鏡で観察したところ、GM1と本毒素の共局在が認められた。また、ノイラミニダーゼ処理細胞からのIL-8遊離の抑制が認められたことから、α毒素の細胞への結合にGM1のシアル酸が関与していることが判明した。【考察】α毒素は、GM1とTrkAの局在領域を認識し結合後、一連のMAPKシグナルを活性化することによりIL-8遊離を惹起すると推察される。21年度の解析によりα毒素がGM1へ結合することが判明したため、毒素のGM1結合部位の探索を行った。【方法・結果】ボツリヌス神経毒素は、ガングリオシド結合領域(H...SXWY...G)を有することが報告されている。ウエルシュ菌α毒素も、ガングリオシドGM1と結合することから、その結合ドメインの有無を検索すると、α毒素分子のNドメイン(触媒ドメイン)とCドメイン(結合ドメイン)を結ぶループ領域にこのドメインの存在が判明した。そこで、この領域のアミノ酸残基を置換した変異毒素について結合を検討した結果、W84AとY85Aは、IL-8遊離の有意な低下を示した。次に、表面プラズモン共鳴法を用いて種々の変異毒素のGM1リポソームへの結合親和性を検討すると、IL-8遊離の場合と同様、W84AとY85Aは、GM1リポソームへの結合親和能が低下した。従って、毒素のGM1への結合に84位のTrpと85位のTyrの重要性が明らかとなった。【考察】α毒素の84位Trp残基と85位Tyr残基は、GM1を認識し結合後、一連のMAPKシグナルを活性化することによりIL-8遊離を惹起すると推察される。【目的】ウエルシュ菌によるガス壊疽の原因毒素であるα毒素は、血液内に移行すると溶血やサイトカインストーム、そして、最終的に致死を引き起こす。我々は、α毒素によるさまざまな炎症反応、及び、細胞毒性反応にチロシンキナーゼ関連受容体のTrkA、及び、そこに隣接するガングリオシドGM1aが重要な働きを演じている事を平成21-22年度の研究で明らかにしてきた。そこで、平成23年度は、ガングリオシドの合成に重要な酵素をノックダウンさせた細胞を作製し、α毒素とガングリオシドの関係について解析した。

【方法・結果】ガングリオシドは、大きくacシリーズに分類され、GM1aは、aシリーズに属している。そこで、bとcシリーズのガングリオシドの合成に関与するα2,8-sialyltransferase(ST)と各シリーズのシアル酸付加(GM1a合成)に重要な酵素であるβ1,4-N-acetylgalactosaminyltransferase(Ga1NAcT)をノックダウンさせたA549細胞、ST-KD細胞、及び、Ga1NAcT-KD細胞をそれぞれ作製し、α毒素の各細胞に対する結合性、及び、毒素処理によるIL-8遊離に対する影響について検討した。その結果、Ga1NAcT-KD細胞では、コントロール細胞と比較してα毒素の結合性、及び、IL-8遊離が約70-80%抑制されたが、ST-KD細胞ではどちらもコントロールレベルであった。【考察】α毒素は、aシリーズのガングリオシド、特に、GM1aに対し高い親和性を持つ事が推察され、さらに、毒素のGM1aの結合にシアル酸が重要な役割を演じていることが強く示唆された。
非放射性in situ ハイブリッド法による癌遺伝子に基づく癌の診断と分類

Enxyme-immuno-histo-in situ hybridization(EIHISH)は3日で結果が得られるのでその利点を利用して急速な技術改良が行われた.プローブ標識に関してはDNP基を化学的に導入する従来の方法から紫外線照射によってプローブそのものをハプテン化する物理的標識法(チミンニ量体化法)に発展した.そして細胞内へ通過しやすいプローブサイズが決定された.標本側については非特異的染色の少い固定法,細胞内の標的核酸を露出させるためのプロテイナーゼK処理の濃度,ハイブリダイゼイションの温度,洗浄時の塩濃度などそれぞれの段階で細かい条件設定がなされた.現在のEIHISHの感度はオートラジオグラフィーの感度に近づいており,この技術は細胞生物学の分野では既に実用段階に入っている.臨床医学の分野でも白血病細胞と腫瘍組織のスタンプ標本に関しては現在の技術レベルで実用化が可能である.しかし病理組織学への応用にはもう少し技術的改良が必要と思われる.EIHISHで良い結果を得るための標本としては新鮮凍結切片が最も良いが細胞形態が良くない.一方,パラフィン切片は細胞内形態は良いが感度が低下する.これらのことから主な問題点は標本作製の側にあると考えられる.今後,標的核酸の分解が最も少ない新鮮凍結切片の利点と細胞内形態の良いパラフィン切片の利点を合わせ持つ標本の作製技術の開発が重要であろう.EIHISHでは非特異的反応の占める割合が酵素抗体法より高いため実際の診断に用いるのはまだ無理である.しかし癌遺伝子DNAをプローブとして癌の診断と分類を実験的に行った今回の研究結果では,あと少しの技術的改良を加えば実用可能域に達することが示された.Enxyme-immuno-histo-in situ hybridization(EIHISH)は3日で結果が得られるのでその利点を利用して急速な技術改良が行われた.プローブ標識に関してはDNP基を化学的に導入する従来の方法から紫外線照射によってプローブそのものをハプテン化する物理的標識法(チミンニ量体化法)に発展した.そして細胞内へ通過しやすいプローブサイズが決定された.標本側については非特異的染色の少い固定法,細胞内の標的核酸を露出させるためのプロテイナーゼK処理の濃度,ハイブリダイゼイションの温度,洗浄時の塩濃度などそれぞれの段階で細かい条件設定がなされた.現在のEIHISHの感度はオートラジオグラフィーの感度に近づいており,この技術は細胞生物学の分野では既に実用段階に入っている.臨床医学の分野でも白血病細胞と腫瘍組織のスタンプ標本に関しては現在の技術レベルで実用化が可能である.しかし病理組織学への応用にはもう少し技術的改良が必要と思われる.EIHISHで良い結果を得るための標本としては新鮮凍結切片が最も良いが細胞形態が良くない.一方,パラフィン切片は細胞内形態は良いが感度が低下する.これらのことから主な問題点は標本作製の側にあると考えられる.今後,標的核酸の分解が最も少ない新鮮凍結切片の利点と細胞内形態の良いパラフィン切片の利点を合わせ持つ標本の作製技術の開発が重要であろう.EIHISHでは非特異的反応の占める割合が酵素抗体法より高いため実際の診断に用いるのはまだ無理である.しかし癌遺伝子DNAをプローブとして癌の診断と分類を実験的に行った今回の研究結果では,あと少しの技術的改良を加えば実用可能域に達することが示された.我々はプローブのDNA塩基配列内に存在するチミン(T)に紫外線を照射し、チミンダイマーを形成させ、組織切片とのin situ hybridizationの後、チミンダイマーに対する特異的抗体でDNAプローブの局在を検出する新しい方法を開発した。ニトロセルロース上にpBR322 DNAを焼きつけT-Tダイマー化pBR322 DNAをプローブとしてDot blot hybridizationを行なったところ1pgまで検出され、in situ hybridizationでmRNAを検出するのに十分な検出感度であった。DNAのT-Tダイマー化に必要な紫外線量は30006000ジュール/mであるが平均的な至適量は5000ジュール/mであった。このチミンダイマー法により種々の遺伝子DNAをプローブとしてin situhybridizationを行なった。DNAプローブと組織(あるいは細胞)の組み合わせは次の通りである。C-myCがん遺伝子:ヒト胸腺腫およびrat testis,K-rasがん遺伝子:肺癌細胞T883,胎盤型アルカリフォスファターゼcDNA:子宮頚部癌,成長ホルモンcDNA:ラット下垂体,Herpes simplex type1DNA;Vero cell,PCNA/cyclin cDNA:rat testis。いずれの症例においても従来のDNPラベル法に比べて非特異的に染まる細胞が著しく減少し、チミンダイマー法の特異性の高いことが示された。特にc-mycに関してはin situ hybridizationによるmRNAの局在だけでなく、合成ポリペプチドを免疫して得た抗c-myc抗体を併用し、c-mycの遺伝子産物の局在も同時に検索した。その結果、抗体陽性組織(細胞)とin situ hybridization陽性組織(細胞)とは極めて高い一致をみた。
恒温脊椎動物の精子形成の温度感受性の比較

哺乳類精子形成は腹腔(38度)よりも低温環境(34度)で進行する。低温で進行することが正常な精子形成に必要と言われてきたが、精子形成と温度の関係を正確に検証することは技術的に不可能であった。本研究では、マウス精巣器官培養系を用いることによってそれを実現した。昨年度までに、温度のみの影響で精子形成障害が引き起こされること、今まで漠然と高温障害と言われてきた現象が、分化段階ごとに異なる温度閾値が存在する複合現象であることを明らかにした。本年度は昨年度に引き続き、様々な温度環境下で精巣片の培養を行ない、それぞれの温度で各分化段階の生殖細胞が受ける障害の詳細な記載を完了した。特に、36度で培養した場合、生殖細胞は円形精子細胞までしか分化しないことを新たに見出した。また、昨年度までに見出していた、減数分裂の進行に温度が与える影響に特に注目して解析を行い、腹腔の温度(37度と38度)では染色体の対合過程に障害が生じることを示唆する結果を得た。この染色体対合不全を伴う精子形成障害は、トランスポゾン活性が異常に上昇する変異体の表現形に類似していることに注目し、高温ではトランズポゾンの異常上昇が起こると言う仮説を立て、これを検証した。トランスポゾンの発現やそれによって起こるDNA二重鎖切断の頻度を解析した結果は、高温精子形成障害におけるトランスポゾンの関与を否定するものであった。これは、高温による精子形成障害、特に染色体対合不全に至る未知のメカニズムが存在することを示唆するもので、興味深い。これらの成果は、哺乳類精子形成が低温で進行する生物学的意義の解明に深く寄与すると考えている。平成30年度までに行った予備的な実験の結果、以下のような示唆が得られていた。134度で精巣片を5週間培養した場合、生殖細胞は最終段階の伸長精子細胞まで分化する。237度の場合、最も分化した生殖細胞は後期精母細胞となる。338度の場合、最も分化した生殖細胞は初期精母細胞となる。440度の場合、全ての生殖細胞が失われる。そこで平成30年度は上記に加えて、36度環境で同様の実験を行なった。その結果、最も分化した生殖細胞は円形精子細胞であった。これにより、温度のみの影響で精子形成障害が引き起こされることがより詳細に明らかとなった。高温条件が減数分裂に与える影響を詳細に調べるために、染色体スプレット法を用いて解析を行った。その結果、37度と38度の高温環境下で培養した精母細胞には染色体対合不全が生じることを示唆するデータを得た。生殖細胞においてトランスポゾンを抑制する機能を失った変異マウスは染色体対合不全をもたらすことがよく知られている。そこで高温環境下の染色体対合不全はトランスポゾンによるDNA損傷が原因とする仮説を立てた。この仮説を検証するために、生殖細胞での発現がよく知られているレトロトランスポゾン(LINE1)の発現を34度、37度、38度で培養した精巣片で免疫染色法を用いて調べた。その結果、LINE1の発現に温度依存性がないことを示唆する予備データを得た。さらに温度依存的な精母細胞におけるトランスポゾンによるDNA損傷の有無を検証するために、DMC1 foci(減数分裂期のDNA損傷マーカー)の数を定量し、比較した。その結果、34度、37度、38度のいずれの温度環境においてもDNA損傷の程度に違いがないことを示唆するデータを得た。これらの結果は高温環境がもたらす染色体対合不全にトランスポゾンによるDNA損傷が関与しないことを示唆した。平成30年度までの成果により、哺乳類の精子形成は温度のみの影響で精子形成障害が引き起こされることが証明されたと考えている。さらに、わずか1度の温度差が、明確に異なる精子形成障害を引き起こすことは興味深い。平成31年度はこれらの成果を受け、引き続き温度変化に応答して精子形成を停止させるメカニズムの探索を行う。既知の温度センサータンパク質分子で、わずか1度の温度差を感受できるものは知られていない上に、温度センサーとして機能するTrpv1, Tripv4変異体及びこれらの2重変異体を用いた解析の結果は、これらが精子形成の構音障害における温度センサーとして機能していないことが示唆している(未発表データ)。そこで計画に従い、哺乳類と鳥類の精巣を様々な温度で培養した時の網羅的な遺伝子発現プロファイルをオーソログ解析により比較することで、哺乳類精子形成の温度感受性を引き起こす新規分子メカニズムの解明に挑戦する。また昨年度までに、特定の温度によって引き起こされる精子形成障害の特徴の詳細な記載を達成した。本年度はこれらの結果を土台とすることで、温度のみの影響で生じる精子形成障害と類似した異常を示す変異マウスを検索する精度は昨年度よりも向上することが期待される。その結果、該当した変異マウスの原因遺伝子と高温精子形成障害の関係を評価したい。また本年度までに得た新たな知見を発表する科学論文を投稿する。多くの哺乳類の精巣は陰嚢内(34度)にあり、腹腔温(38度)よりも4度程度低く保たれている。マウスでは精巣を手術で腹腔へと引き上げた人工停留精巣において、精子形成は停止する。このため、高温環境では精子形成が障害されると考えられてきた。しかし、人工停留精巣の実験は温度以外の要因の排除が不可能であり、その精子形成障害の原因が高温環境であるかは、必ずしも明らかになっていない。

一方、哺乳類同様に恒温脊椎動物である鳥類の精巣は腹腔内にあるため、「鳥類の精子形成は高温環境で進行する」という考えが定説である。しかし、鳥類特有の呼吸器(気嚢)により精巣は冷却されており、気流を阻害すると精子形成が障害を受けるという報告もあり、この定説は再検討の余地を残している。従来、これら恒温脊椎動物の精子形成と温度の関係を正確に検証することは不可能であった。しかし、本研究では、近年開発された精巣器官培養系を用いることによって実現した、温度のみを変化させた時に精子形成に及ぼす影響の評価を行っている。本年度は、1.精巣器官培養を用いて、温度の違いがマウスおよび鳥類の精子形成に与える影響を解析する計画で研究を遂行した。その結果、マウス精子形成は、温度のみの影響で精子形成障害が引き起こされることを証明する実験結果を得た。また今まで漠然と高温障害と言われた現象が、分化段階ごとに異なる温度閾値が存在する複合現象であることが明らかとなった。一方鳥類精子形成は、定説通り高温環境下でも進行することを示唆するデータを得た。本研究は、哺乳類精子形成が低温で進行する生物学的の解明に深い洞察を与えると考えている。本年度は、哺乳類精子形成が温度のみの影響で障害を受けるかを、器官培養を用いて詳細に解析した。平成29年度までに行った予備的な実験の結果、以下のような示唆が得られていた。134度(実測に基づく精巣温)で精巣片を5週間培養した場合、生殖細胞は最終段階の伸長精子細胞まで分化する。238度(実測に基づく腹腔温)場合、最も分化した生殖細胞は初期精母細胞で、伸長精子細胞と円形精子細胞が失われる。337度の場合、最も分化した生殖細胞は後期精母細胞となる。440度の場合、全ての生殖細胞が失われる。これらにより、温度のみの影響で精子形成障害が引き起こされることが証明された。1定常呼吸時のウズラの精巣温は41.5度であり、腹腔温は42度である。2気嚢を破壊すると、精巣温は腹腔温と同等の温度(42度)になる。3気嚢を破壊した個体の精巣の生殖細胞は伸長精子細胞まで分化する。4開発中のニワトリ精巣器官培養系において、42度で精巣片を3週間培養した際、生殖細胞は減数分裂を開始する。以上の結果は、鳥類では高温条件下でも精子形成が進行することを示唆するものであった。平成29年度は、以下のような結果を得た。マウス精巣培養条件を最適化し、上記の実験を再試行した。その結果、上記の予備的結果が正しいことが確認された。さらに高温条件が減数分裂に与える影響を詳細に調べるために、減数分裂期染色体スプレット法を用いて解析を行った。その結果、38度で培養した時の最も分化の進んだステージは第一減数分裂前期のザイゴテン期(相同染色体の対合が進行途上にある段階)であり、37度では、ザイゴテン期の次のパキテン期(相同染色体の対合が完了し、相同組み替えが起こる段階)まで進行していた。この結果は、わずか1度の温度差が、明確に異なる精子形成障害を引き起こすことを意味する。哺乳類精子形成は腹腔(38度)よりも低温環境(34度)で進行する。