hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
薬理学的に重要なGPCRのシグナルバイアスの構造生物学的解析

Gタンパク質共役型受容体(GPCR)のリガンドには、Gタンパク質とアレスチンを介したシグナル伝達経路の一方を選択的に活性化するものが知られており、この現象を「シグナルバイアス」と呼ぶ。本研究では、薬理学的に重要なGPCRについて、メチオニンメチル基に由来するNMRシグナルを、通常のリガンドが結合した状態とバイアスリガンドが結合した状態で解析した。その結果、GPCRは不活性型構造に加えて複数の活性型構造をとること、複数の活性型構造の割合がGタンパク質およびアレスチンを介したシグナル伝達の強度を決定していることを明らかにした。1.バイアスリガンドが結合したβ2アドレナリン受容体(β2AR)の構造解析β2ARのメチオニンメチル基を選択的に13C標識し、その周囲を2H標識した上で、活性の異なる様々なリガンドが結合した状態でNMRスペクトルを測定した。Gタンパク質シグナルとアレスチンシグナルをともに活性化する通常のリガンドが結合した状態では、β2ARの細胞内側に位置するM215の化学シフトは、シグナル伝達活性に応じて直線的に変化した。一方で、アレスチンシグナルを選択的に流すバイアスリガンドが結合した状態では、M215の化学シフトは通常のリガンドとは異なる方向に変化した。このことは、β2ARの細胞内側が、複数の活性化構造を取り得ること、さらに、通常のリガンド結合状態とバイアスリガンド結合状態では、この複数の活性化構造の割合が異なることを示している。2.バイアスリガンドが結合したμオピオイド受容体(μOR)の構造解析β2ARと同様の方法を用いてμORのNMRスペクトルを測定した。通常のリガンドが結合した状態では、μORのM245に由来する2個のNMRシグナルが観測され、その量比がシグナル伝達活性に応じて変化した。一方で、Gタンパク質シグナルを選択的に流すバイアスリガンドが結合した状態では、同様に2個のシグナルが観測されたものの、その化学シフトが通常のリガンドと異なっていた。M245の化学シフトと、Gタンパク質・アレスチンシグナルの選択性の程度がよく相関していたことから、μORもβ2ARと同様に、複数の活性化構造を取り得ること、通常のリガンド結合状態とバイアスリガンド結合状態では、この複数の活性化構造の割合が異なることが明らかになった。当初の研究計画では、1年目でβ2ARの解析をおこなうとともに、μORの解析に着手し、2年目でμORの解析を完了して、両受容体の結果を合わせて考察する予定であったが、実際には、2年目に行う予定であったμORの解析も1年目に前倒しでおこなうことができた。このことから、当初の計画以上に研究が進展していると判断した。平成27年度までに、Gタンパク質共役型受容体であるβ2アドレナリン受容体とμオピオイド受容体について、特定のシグナル伝達経路を選択的に活性化するバイアスリガンドを含む、様々なリガンドが結合した状態のNMRスペクトルを取得した。その結果、膜貫通領域の構造平衡が、シグナル伝達の強度や選択性を決定していることを明らかにした。以上のように、当初の研究計画は概ね平成27年度までに完了したことから、平成28年度は、Gタンパク質共役型受容体のシグナル制御機構をより詳細に解析するため、以下の2項目を実施した。1.δオピオイド受容体のNMR解析δオピオイド受容体について、メチオニンメチル基を選択的に13C標識し、その周囲を2H標識することで、メチオニンメチル基を選択的に観測する方法を確立した。この方法を用い、μオピオイド受容体と同じ位置にメチオニンを変異導入した上で、リガンド依存的な化学シフト変化を観測した。その結果、μオピオイド受容体と同様の化学シフト変化がδオピオイド受容体でも観測できた。このことは、構造平衡によるシグナル伝達制御機構がGPCR一般に共通であることを示している。2.アラニン残基をプローブとした空間分解能の向上以上の解析は、メチオニンメチル基をプローブとして進めてきたが、メチオニン残基はGタンパク質共役型受容体の膜貫通領域に10残基程度しか存在せず、構造変化をとらえる上で、空間分解能が低いことが問題であった。そこで、新たにアラニンメチル基をプローブとすることとした。Gタンパク質共役型受容体の発現に必須な昆虫細胞発現系を用いて、アラニンメチル基を選択的に13C標識し、周囲を2H標識する方法を新規開発した(Minato et al., PNAS, 2016)。この方法をGタンパク質共役型受容体の解析に適用し、その有用性を示した。上述のように、当初の研究計画については、1年目に前倒しで完了したが、本研究をさらに発展させ、より詳細にシグナルバイアスが生じる機構を明らかにするために、2年目に実施する内容として、以下の項目を新たに設定した。1.δオピオイド受容体(δOR)のNMR解析δ

ORはμORと膜貫通領域の相同性が高い一方で、リガンド非存在下のシグナル伝達活性(基礎活性)やGタンパク質の選択性は両者で異なっている。そこで、β2AR、μORに加えてδORでも同様の解析をおこない、GPCRに一般的なシグナル伝達機構を明らかにする。2.アラニンをプローブとした空間分解能の向上これまでは、メチオニンメチル基をプローブとして構造解析を進めてきたが、メチオニン残基はGPCRの膜貫通領域に10残基程度と少ないことから、構造変化をとらえる上で空間分解能が低いことが問題となっている。そこで、メチオニンに加えてアラニンメチル基もプローブとすることで、高い空間分解能で構造変化をとらえることを目指す。構造生物学
純チタンの引張強度と疲労特性の向上を目指したECAP加工の最適化

強塑性加工による結晶粒微細化と転位密度の増加による加工効果を利用して、商業用純チタンを医療用材料として適用可能な程度の高強度化(降伏応力および引張強さの向上)と最適な加工技術の指針を確立することが本研究の目的である。また現在医療用に多く用いられているTi-6Al-4V合金の構成元素であるAlやVの有害性を回避することが大切で、このため純チタンの高強度化は社会的にも強く望まれている。ECAP加工とその後の鍛造と引抜き加工によって結晶粒微細化を実現し、1GPaを超える強度を実現している。本年度は特に、加工プロセッシング後、および疲労変形後の微細組織をTEM, EBSDとX線解析を通じて評価し、よりよい疲労強度特性を実現するための最適な加工条件、すなわちECAP加工の際のパス回数、パスのルートの種類、そして加工後の焼鈍条件を見出すことを目指した。加工のパス回数が大きい場合は微細組織は加工ルートにほとんど依存しないこと、そして高サイクル疲労および低サイクル疲労特性も、加工ルートにはあまり影響を受けないことが判明した。したがって、もっとも単純な加工ルートA(パスごとに加工材を回転させない)が実用上最も簡便であり、推奨される。加工後の結晶粒径は150-300nm、大傾角粒界の占める割合は65%に達し、これらは加工によって与えられる変形量(相当ひずみ:8-30)および加工後の焼鈍条件を調整することによって達成可能であることを明らかにした。室温、応力比R=-1、応力波形サイン波、周波数10Hzの条件下で、引張-圧縮疲労試験を行った結果10^7サイクルの疲労限は約550MPaに達した。この値は通常の結晶粒の同一材料の250-300MPaに比べて2倍の値である。以上の結果から、ECAP加工後の鍛造加工および引き続いての引抜き加工は、純チタンの引張り強度や疲労強度等の機械的性質の向上に有効であることがわかった。強塑性加工による結晶粒微細化と転位密度の増加による加工効果を利用して,商業用純チタンを医療用材料として適用可能な程度の高強度化(降伏応力および引張強さの向上)と最適な加工技術の指針を確立することが本研究の目的である.また現在医療用に多く用いられているTi-6Al-4V合金の構成元素であるAlやVの有害性を回避することが大切で,このため純チタンの高強度化は社会的にも強く望まれている.従来の研究結果からの類推により最初に結晶粒微細化をECAP加工によって達成する.ここでは等軸晶を得るために最適のルートBcを採用し8回パスを400-450Cの条件で行った.塑性加工後においては比較的延性に富み室温で16%もの塑性ひずみが得られた.次に300Cで80%断面減少率の鍛造を行った.その結果降伏応力は940MPa,引張強さは1150MPaが達成された.これは同じ材料の冷間加工によって得られるそれぞれ,500MPaと700MPaに比べて格段の強度向上であり,Ti合金としてよく用いられる,Ti-6Al-4Vを上回る.さらに室温で,応力比,R=-1,応力波形サイン波,周波数10Hzの条件下で,引張-圧縮疲労試験を行った結果10^7サイクルの疲労限は約500MPaに達した.

この値は通常の結晶粒の同一材料の250-300MPaに比べて2倍の値である.以上の結果から,ECAP加工後の鍛造加工は純チタンの引張り強度や疲労強度等の機械的性質の向上に有効であることがわかった.強塑性加工による結晶粒微細化と転位密度の増加による加工効果を利用して、商業用純チタンを医療用材料として適用可能な程度の高強度化(降伏応力および引張強さの向上)と最適な加工技術の指針を確立することが本研究の目的である。また現在医療用に多く用いられているTi-6Al-4v合金の構成元素であるAlやVの有害性を回避することが大切で、このため純チタンの高強度化は社会的にも強く望まれている。ECAP加工とその後の鍛造と引抜き加工によって結晶粒微細化を実現し、1GPaを超える強度を実現している。本年度は特に、加工プロセッシング後、および疲労変形後の微細組織をTEM, EBSDとX線解析を通じて評価し、よりよい疲労強度特性を実現するための最適な加工条件、すなわちECAP加工の際のパス回数、パスのルートの種類、そして加工後の焼鈍条件を見出すことを目指した。加工のパス回数が大きい場合は微細組織は加工ルートにほとんど依存しないこと、そして高サイクル疲労および低サイクル疲労特性も、加工ルートにはあまり影響を受けないことが判明した。したがって、もっとも単純な加エルートA(パスごとに加工材を回転させない)が実用上最も簡便であり、推奨される。加工後の結晶粒径は150-300nm、大傾角粒界の占める割合は65%に達し、これらは加工によって与えられる変形量(相当ひずみ:8-30)および加工後の焼鈍条件を調整することによって達成可能であることを明らかにした。室温、応力比R=-1、応力波形サイン波、周波数10Hzの条件下で、引張一圧縮疲労試験を行った結果10^7サイクルの疲労限は約550MPaに達した。この値は通常の結晶粒の同-材料の250-300MPaに比べて2倍の値である。以上の結果から、ECAP加工後の鍛造加工および引き続いての引抜き加工は、純チタンの引張り強度や疲労強度等の機械的性質の向上に有効であることがわかった。
唾液腺腫瘍の分子病理学的診断基準の確立と治療への応用

唾液腺腫瘍は比較的稀だが形態学的に多様で診断難渋する例も多く、分子生物学的な病理診断基準の確立が望まれている。我々はSOX10という神経堤の分化および成熟にかかわる転写調節因子に着目した。免疫組織学的にSOX10は大唾液腺にも発現しており、非腫瘍性の筋上皮細胞と腺房から介在導管レベルの管上皮細胞にも発現していた。さらに唾液腺良性腫瘍、悪性腫瘍で検討したところ、SOX10の発現の有無により2つのサブタイプに分けられることが分かった。マウスモデルはSOX10が胎児期から成体期の大唾液腺腺房から介在導管で発現していた。SOX10は唾液腺腫瘍の組織形成を分析し理解するための新しい有用なマーカーとなる。唾液腺悪性腫瘍は稀であるが組織学的に多様で組織分類も数多く存在し、しばしば診断に難渋する。分子生物学的な情報を加味した上での組織診断の再構築が必要である。我々はSRY-related HMG-box 10(SOX10)蛋白に着目した。SOX10は神経堤の分化および成熟にかかわる転写調節因子である。大唾液腺組織においても発現があるとの報告があるが詳細については今まで論じられることはなかった。我々の免疫組織学的検討ではSOX10蛋白は非腫瘍性唾液腺の腺房から介在導管レベルのluminal, abluminal cellの両方に発現するが、腺状導管から集合管レベルでは発現がないことが分かった。今まで汎用されてきた上皮・筋上皮マーカー(p63、SMA, calponin, CK5/6, S100, GFAPなど)とは異なる特有の発現パターンを呈していた。また76例の悪性および14例の良性を含む唾液腺腫瘍による検討でSOX10は上述の上皮・筋上皮マーカーとは異なった発現パターンを示しており、SOX10陽性腫瘍(腺房細胞癌、上皮筋上皮細胞癌、筋上皮癌、腺様嚢胞癌、腺癌NOSの一部、多形腺腫、筋上皮腫)と陰性腫瘍(導管癌、粘表皮癌、オンコサイト癌、オンコサイトーマ、ワルチン腫瘍)に2分されることが分かった。形態学的に特定の組織型に分類が困難で腺癌NOSと診断されていた症例が、SOX10蛋白の発現の有無によってどちら側のlinegeに由来するものが分かり、特定の組織診断型に分類する一助となる。Sox10-Venusトランスジェニックマウスの胎児期から成体を用いた検討では、大唾液腺組織発生の各段階で腺房細胞から介在導管レベルでSOX10蛋白の発現が一貫して認められた。以上からSOX10は組織診断および組織発生を理解する上で実用的なマーカーで、組織診断の再構築のためにも有用である。1.唾液腺腫瘍の外科的切除症例を抽出、組織マイクロアレイ(TMA)の作成:当院での外科的切除検体データベースから、正常唾液腺検体20例、15種類の組織型を含む腫瘍検体100例を抽出した。外科切除の際の病理パラフィン標本からTMAを作成した。3.免疫染色の実施・評価正常組織および腫瘍のTMAに対して、HE染色を行って形態を確認し、免疫染色(筋上皮・基底細胞マーカーとしてSox10, S100, p63,GFAP、脂腺マーカーとしてEMA、上皮マーカーとしてCK14,CK15,CK19,ホルモン受容体としてエストロゲン受容体(ER),プロゲステロン受容体(PgR),アンドロゲン受容体(AR)、成長因子受容体としてEGFR,Her2など)を行った。また正常および各腫瘍組織でのSox10の発現パターンを解析したところ、Sox10は正常組織では腺房集合管において発現することが分かった。また腫瘍においては基底細胞・筋上皮細胞・腺房細胞が関与する腫瘍において(筋上皮腫、多形腺腫、腺様嚢胞癌、腺房細胞癌など)発現することが分かり、従来唾液腺腫瘍の診断に用いられてきたその他の抗体とは異なる独自の染色パターンであった。以上からSox10の診断を用いることは診断的価値があると考えられた。4.成長因子受容体遺伝子の増幅ならびに遺伝子変異の解析EGFR、Her2/neuについては、増幅を確認するため、FISHによる解析を行った。さらに免疫染色にて高発現が認められた症例において、パラフィンブロックからDNAを回収し、EGFRについてはエクソン19の欠失変異(del L747-A750)エクソン21の点突然変異(L858R)エクソン18の点突然変異(G719A)を解析した。またK-ras, H-rasについては、既知の遺伝子変異に対してDirect sequence法により変異の解析を行った。

当初の予定通りに今年度の研究を進めることができ、結果を得ることができたため。1.各発生段階のマウスの解析Sox10-Venusトランスジェニックマウスを用いて、唾液腺の発生が最も進むE11-E13を中心に、胎児期から出生後、成体時までのマウス唾液腺について組織学的な解析を行う。また各段階において免疫組織化学的に発現の状態をみる。具体的にはエストロゲン受容体(ER),プロゲステロン受容体(PgR),アンドロゲン受容体(AR)などのホルモン受容体、EGFR, PDGFR, Her2などの成長因子受容体、既知の筋上皮・基底細胞マーカーであるp63, S-100, GFAP、脂腺マーカーであるEMA,アディポネクチン,上皮マーカーであるサイトケラチン(CK)、CK14, CK15, CK19等、その他の未分化細胞のマーカーと比較し、唾液腺発生の系統樹の作成を試みる。2.結果のまとめおよび発表該当なし
認知学習と精神疾患における大脳基底核神経回路機構の解析

本課題は多くの精神神経疾患でみられる認知行動障害の神経基盤の解明を目的としている。そこでタッチスクリーン認知学習測定装置を用いて、タッチスクリーンに表示されるキュー(CS)と報酬を関連づけさせるパブロフ型条件付け認知学習課題を行った。野生型マウスに対して、報酬と関連づけさせるキュー(CS+)と無報酬と関連づけさせるキュー(CS-)をランダムに提示すると、セッションを繰り返す毎にCS+へのアプローチ行動(sign-tracking)が増加した。一方、キューに接近することなく報酬に向かう行動(goal-tracking)は減少した。これらの結果は、タッチスクリーンによる認知学習課題によって、マウスにタッチスクリーンに表示される報酬と関連づけたキューに対するパブロフ型条件付け認知学習が成立していることを示している。このパブロフ型条件付け認知学習の神経回路機構を調べるために、側坐核、背側線条体内側部、背側線条体外側部のそれぞれに、大脳基底核神経回路の直接路あるいは間接路に特異的な可逆的神経伝達法を適用した。側坐核の直接路を遮断すると、sign-trackingの増加およびgoal-trackingの減少がみられなくなった。それに対して側坐核の間接路遮断の影響は見られなかった。また、背側線条体内側部あるいは背側線条体外側部における直接路あるいは間接路の遮断の影響はなかった。これらの結果から、パブロフ型条件付け認知学習に側坐核の直接路が特異的に関与することが示された。次に、側坐核の下流の神経核である腹側淡蒼球について神経回路機構を調べた。DREADD法による刺激あるいは可逆的神経伝達阻止法による神経伝達遮断を行なったが、パブロフ型条件付け認知学習に影響を与えなかった。一方、DREADD法による腹側淡蒼球の神経細胞刺激により忌避学習が障害された。認知学習、特にパブロフ型条件付け認知学習と忌避学習における大脳基底核神経回路機構の一部を明らかにすることができ、論文発表を行うことができた。精神神経疾患モデルマウスのパブロフ型条件付け認知学習と忌避学習を調べる。これによって、大脳基底核のどの神経回路に異常があるかが推定できる。認知学習行動下での同定した神経回路の神経活動イメージングをin vivo顕微鏡あるいはファイバーフォトメトリーによって行う。
高齢者施設における臭気の評価・管理手法に関する研究

高齢者施設内の臭気の測定について、施設内の居室および汚物処理室に、ニオイセンサー、温湿度計、二酸化炭素濃度計を設置し、連続モニターを行うことで1日の臭気の発生状況を把握した。また、テナックスTA、ユニカーボンB、カーボシーブSIIIの吸着剤を充填した吸着管を用いて室内の臭気をポンプで3時間程度吸引し、室内の低濃度臭気をサンプリングした。施設内の臭気は不快感があっても低濃度であることより、そのままでは測定不可能なため、サンプリング試料をもとに、濃縮した臭気試料を作成し、一旦臭気を濃縮することで三点比較式臭袋法を用いて臭気濃度を測定した。臭気濃度を測定するための濃縮の程度について検討した結果、高齢者施設の臭気に関しては、200倍300倍に濃縮すると適切な評価ができることが明らかになった。臭気対策として、光触媒ユニットの入った空気清浄機、粉末の消臭剤(化学吸着)、液体消臭剤(分解)等を使用して、その効果を検討した。居室で実施した結果、光触媒を用いた空気清浄機では、一人部屋のように比較的狭い空間では効果が認められた。四人部屋になると、臭気成分を分解する面積を広く確保することができる液体消臭剤を、床面に塗布した場合に効果が認められた。汚物処理室は、空間が狭く、空気が対流しやすい状況が多いため、粉末の消臭剤300gを容器に入れて、棚に置いておいた場合でも効果が認められた。粉末消臭剤は、臭気成分を吸着させるものであることから、約3ヶ月で飽和状態に達している可能性が認められ、約3ヶ月ごとに取り替えを行う必要があることが明らかとなった。施設内の臭気は不快感があっても低濃度であることより、そのままでは測定不可能なため、サンプリング試料をもとに、約300倍500倍に濃縮した臭気試料を作成し、一旦臭気を濃縮することで三点比較式臭袋法を用いて臭気濃度を測定した。その結果、居室の臭気濃度は820であることが明らかとなった。また、汚物処理室は常時臭気濃度20程度であり、不快感も高かった。臭気成分では、居室では、n-カプロン酸、ノネナールの濃度が高く、汚物処理室では酢酸、イソ吉草酸の濃度が高い他、インドールも検出された。施設内の各場所における臭気の許容レベルの検討については、においは場所や感じる人の立場によって許容できるレベルも異なるが、一般に臭気の低減除去を行う時には、順応していない外来者を想定した評価を基準に行うため、外来者を想定して許容レベルを求めた。施設内の各場所でサンプリングした試料を濃縮し、そこから5段階程度に希釈した試料を作成し、施設内の各場所の許容レベルを検討した。その結果、居室では臭気濃度7程度、汚物処理室では臭気濃度5程度であることを確認した。今後は、今年度の研究で得られた各場所の臭気レベル、許容レベルをもとに、具体的な対応策を検討していく予定である。
超音波による動脈硬化の定量計測に関する研究

本研究は、従来の脈波速度法の開発と臨床に携わってきた研究者らとの共同研究を進めることにより、新しい超音波による動脈局部硬化度計測法の確立と実用化を進めた。とくに、動脈の局部的な硬化度が測定できることは、人体の動脈硬化度分布図を得ることを可能とすると考えられるが、実際の老化現象の研究用としての新しい超音波計測・診断装置の製作のために遭遇する問題点の検討と、実際に多くの患者に対して適用・評価を行ってさらに信号処理の面でも新しいアイデアを取り入れて、従来にない全く新しい循環器系の定量的精密計測・早期診断法として、本動脈局部硬化度計測法を完成させた。まず、人口心臓を用いた模擬循環系を構築し、シリコーンゴムなどの人口管における圧力波の伝搬特性と力学的特性(縦弾性率)との対応関係を基礎的に解明した。特に初期段階の斑点状の動脈硬化モデルを水槽内に構成し、その管壁上の振動伝搬特性(速度・減衰特性)など所的特性を複数の加速度ピックアップで計測・評価した結果、局所で弾性の変化が存在することがわかった。次に動脈壁上の微小振動伝搬特性の非侵襲的計測装置を用いて、実際に動脈硬化症の患者や正常者に関する局所的特性の評価を行った。本装置では、十数μmの振幅で拍動する心臓近傍の大動脈壁も含め、壁上を伝搬する振幅数十μmの微小振動を1KHzまでの周波数帯域にわたって高精度に非侵襲計測できるため、空間分解能を上げることができ、局所的な力学的特性評価が可能となったと言える。とくに、血管の弾性率の局所的変化の測定法と結果に関して、従来法の脈波速度法による動脈硬化度の測定結果との対比を行って、従来法よりも高精度であることを示した。今後、各種の動脈疾患に関する診断・治療の分野に貢献して、新しい生命科学の領域を開拓する予定である。
高度技術社会における情報ネットワーク技術の展望と評価

1)情報ネットワーク技術のインパクトの評価の一端として、電子メイルに的を絞り、企業組織における電子メイルの導入・利用状況およびその影響を調査分析した。先ずは、企業225社の情報システム部門にアンケート調査を行いその概況を調べた。その中から利用に関して先進的な企業を11社選び、詳細なインタビュー調査を行った。多くの企業で、(1)情報の共有、(2)コミュニケーションの促進、(3)業務効率化等の面で効果が上がっているとの回答があった。近い将来には、業務のネットワーク化(情報の共有化、共同作業など)が推進されリエンジニアリングに積極的に利用されると予想される。2)上記調査の他、マルチメディアの動向、とくに米国における進展状況の調査、インターネットの中で行われている各種サービスの状況についても調査した。3)情報ネットワーク技術が社会に与えるインパクトの実態を調査した。とくに、ネガティブなインパクトについて事例を調べ、その対策を検討した。今年度は、日本オペレーションズ・リサーチ学会の「情報ネットワーク研究部会」と合同で毎月1回の研究会を開いた。また、9月に合宿研究会を開き、各種調査のまとめを行うと共に、成果報告書の内容についても議論した。315ページの大部の成果報告書をまとめた。また、1月に科研費総合研究(A)の「情報・通信ネットワークに関する性能評価モデルの総合的研究」(代表橋田温)のグループと合同でシンポジウムを開催した。費目の内、消耗品が予定より大幅に増えたのは、アンケート分析のため統計関係のソフトを購入したためである。また、上記の合同シンポジウムの報文集代の一部を負担したため、その他の費目が予定より多くなっている。毎月1回、日本OR学会ネットワーク研究部会との合同で研究会を開催し、企業情報ネットワークの現状と問題点や将来動向、情報ネットワーク技術およびネットワーク基盤の将来予測、映像通信の将来と社会に与えるインパクト、ネットワーク・マネジメントの現状と問題点等について調査し、議論した。また、8月3、4日および11月24、25日に合宿研究会を開き、ネットワークの投資計画、Private NetworkとPublic Networkの経済性および効率性の比較、情報ネットワーク技術・サービスの社会の及ぼすインパクト計量のための問題の構造化と歴史的背景の整理、企業組織における情報ネットワーク技術活用の現状と問題点分析のための枠組み等について検討した。情報ネットワーク技術利用の新動向としての、グループウェアやテレコミューティングの実態について調査した。1月21日23日には、OR学会待ち行列研究部会等との合同で、「情報通信ネットワークに関する性能評価の総合的研究」に関するシンポジウムを開催した。およそ70名の参加した。ネットワーク広帯域化に向けての問題点、情報ネットワーク技術・サービスの普及過程、情報ネットワーク投資の総合評価、不平衡双方向型ネットワークサービスの総合性能評価と今後の問題等について報告がなされた。このシンポジウムの内容については、報文集の形でまとめられている。今年度は、情報・通信ネットワーク技術のサービスに関して、ユーザーの利用上の観点からアンケート調査を含め広く調査を行った。アンケート調査は各通信メディアに対する利用者の"メンタル・モデル=サービス・イメージ"を探ることを目的とした。まず、予備的な調査として、研究グループ内でサービスの機能(技術的属性)の面から同時性、迅速性、処理可能性、同報性、記録性、相互作用性などの面からメディアの特徴付けを行い、調査対象とするメディアを絞った。その上で、各種メディアに対する利用者のイメージ、利用の仕方、代替特性について調査した。各種メディアの中で、電子メールが身近さ、パーソナル性、記録性、時間に対する自由性、同時性、大量性などの点で複数の旧メディアのもつ特性と新しい機能を併せもっていることが注目され、まだ評価は安定していないが、際だった特徴をもっていることが示された。また、ユーザーの認知、活用目的に、利用可能性などによって将来の普及状況が変わってくると思われる点でも他のニューメディアと異なった特徴があることが分かった。そこで、つぎのステップとして、公的ネットワークおよび各企業ネットワークにおける電子メールの利用状況、今後の動向、利用に際する社会的問題などについて、研究会の場で関係者を招きながら議論したり企業の担当者に面接の上で調査を進めている。今回は、上記アンケートの調査を行うための調査費をその他・謝金の費目で計上していた。実施上では、アンケート調査のデータ解析や図式化のための各種ソフトが必要となり、旅費・その他費目等を振り替えて購入した。また、各月の研究会と合宿研究会(10/31、11/1)においてアンケート結果の検討の他に、ネットワークマネジメントとリスクの問題、グループウェアなどについて検討した。これらについてはこの重点領域で出版する英文レポートと今年度の研究成果報告で報告される。

今年度は、日本オペレーションズ・リサーチ学会の「情報ネットワーク研究部会」と合同で毎月1回の研究会を開いた。また、9月に合宿研究会を開き、各種調査のまとめを行うと共に、成果報告書の内容についても議論した。315ページの大部の成果報告書をまとめた。また、1月に科研費総合研究(A)の「情報・通信ネットワークに関する性能評価モデルの総合的研究」(代表橋田温)のグループと合同でシンポジウムを開催した。費目の内、消耗品が予定より大幅に増えたのは、アンケート分析のため統計関係のソフトを購入したためである。また、上記の合同シンポジウムの報文集代の一部を負担したため、その他の費目が予定より多くなっている。
マラリア原虫で検出されたサリチル酸が誘導する新規シグナル経路の探索

本研究では原虫類が産生する植物ホルモンの新規同定を行った。その結果、マラリア原虫ではサリチル酸が高濃度に蓄積しており、近縁の原虫類に見られない独自のホルモンであることが判明した。サリチル酸の過剰量添加はマラリア原虫の生育速度、生活環等に影響を与えなかった。またサリチル酸生合成酵素群はin silicoで検出されず、その合成系が既知の経路と大きく異なることが示唆された。そこで機能解析にあたり、熱帯熱マラリア原虫Plasmodium falciparum 3D7に細菌由来のサリチル酸分解酵素遺伝子を導入し、サリチル酸欠乏原虫を作出した。この変異原虫は野生株と比較して増殖速度などに大きな差は認められなかったが、マラリア原虫が産生することが知られている炎症物質Prostaglandin E2 (PGE2)の産生量が有意に減少していた。このことからサリチル酸とPGE2合成系の関係性、宿主免疫系を改変している可能性が示された。この可能性を検証するため、ネズミマラリア原虫P. berghei ANKAを用い、同様に欠乏原虫を作出した。C57BL/6nマウスを用いた感染試験の結果、サリチル酸欠乏原虫ではマウス致死活性が有意に上昇しており、脳組織検査、色素漏出試験の結果、脳マラリアの重症度が有意に亢進していることが確認された。PGE2は炎症性サイトカインを介した脳マラリア発症への関与が知られている。そこで感染マウス血中でのPGE2、および各種サイトカインの定量を行ったところ、サリチル酸欠乏原虫では血中PGE2濃度が減少し、また炎症性サイトカイン産生が亢進していた。以上から、サリチル酸は宿主のPGE2および炎症性サイトカイン濃度を変化させ、宿主免疫を改変する機能を持ち、マラリアの重症度決定に関与している可能性が示唆された。26年度が最終年度であるため、記入しない。これまで我々は、原虫類が産生する植物ホルモンの新規同定を行ってきた。サリチル酸生合成酵素群はin silicoで検出されず、その合成系が既知の経路と大きく異なることが示唆された。そこで機能解析にあたり、熱帯熱マラリア原虫Plasmodiumfalciparumに細菌由来のサリチル酸分解酵素遺伝子を導入した。得られた変異株は内生サリチル酸量が半分以下に低下し、サリチル酸欠乏原虫の作出に成功した。この変異原虫は野生株と比較して増殖速度などに大きな差は認められなかった。また、培地中にサリチル酸を添加する実験においても、サリチル酸は原虫増殖に影響を与えず、サリチル酸が原虫の基本的な生存以外の機能を持っていることが示唆された。そこで、マラリア原虫が産生することが知られている炎症物質Prostaglandin E_2 (PGE_2)を定量したところ、産生量が有意に減少していた。このことからサリチル酸がPGE_2合成系に関与し、宿主免疫系を改変している可能性が示された。この可能性を検証するため、ネズミマラリア原虫P. bergheiを用い、同様に欠乏原虫を作出した。欠乏原虫の表現型はin vitro培養系の結果と大きく異なり、感染試験におけるマウス致死活性が有意に上昇していた。脳組織検査、色素漏出試験の結果、脳マラリアの重症度が有意に亢進していることが確認された。PGE_2は炎症性サイトカインを介した脳マラリア発症への関与が知られている。以上から、サリチル酸はPGE_2を介し、宿主免疫を改変する機能を持ち、マラリアの重症度決定に関与している可能性が示唆された。

そこで感染マウス血中でのPGE2、および各種サイトカインの定量を行ったところ、サリチル酸欠乏原虫では血中PGE2濃度が減少し、また炎症性サイトカイン産生が亢進していた。以上から、サリチル酸は宿主のPGE2および炎症性サイトカイン濃度を変化させ、宿主免疫を改変する機能を持ち、マラリアの重症度決定に関与している可能性が示唆された。26年度が最終年度であるため、記入しない。初年度は、サリチル酸欠乏原虫の動物感染モデル確立、基本的な臨床症状の観察を目標として研究を行った。結果としてこれらは順調に達成され、サリチル酸欠乏が病態形成に及ぼす影響が明らかになった。以上から、本研究は概ね順調に推移していると考えられる。これまでの研究から、原虫のサリチル酸が病態形成に及ぼす影響について明らかになった。脳マラリアの病態形成においては、炎症性サイトカインが中心的機能を担うことが知られている。また、プロスタグランジンE_2は炎症性サイトカインの上昇を抑制し、脳マラリアの発症を抑えることも報告されている。今後は、これらサイトカインの網羅的な検出を通じ、脳マラリア発症に関与する因子の同定を予定している。
Angiopoietin-Tie2システムによる血管安定化・不安定化機構の解明

本研究では、アンジオポエチン1(Ang1)-Tie2受容体シグナルが安定な血管を構築する分子機序について解析した。Ang1-Tie2シグナルは、核転写因子βカテニンを介してDelta-like 4(D114)の発現を誘導し、Notch受容体シグナルを活性化すること、またこのD114-Notchシグナルが血管を支える基底膜の形成を惹起し、血管構造を安定化することを明らかにした。さらに、Ang1-Tie2シグナルは、Rap1低分子量G蛋白質を介して、アクチン細胞骨格系を再編し、内皮細胞同士の接着を強めることで、血管のバリア機能を増強することを発見した。Angiopoietin-1(Ang1)は、血管内皮細胞に発現するTie2受容体を介して、血管安定化と血管新生の相反する機能を制御する。これまでに申請者は、細胞間接着存在下においてAng1は、Tie2のトランス結合を形成し血管安定化シグナルを活性化すること、一方細胞間接着非存在下においてAng1は、Tie2を細胞外マトリックスにアンカーし、血管新生シグナルを誘導することを報告した。平成22年度は、トランス結合したTie2が血管安定化を亢進するメカニズムについて解析を行った。その結果、トランス結合したTie2は、Notch受容体のリガンドであるdelta-like4(D114)の発現を誘導し、Notchシグナルを活性化することを発見した。Ang1/Tie2シグナルがD114を誘導するメカニズムとして、AKTによるglycogen synthase kinase-3の不活性化と、それに伴うβ-cateninの転写活性化能の亢進が重要であることを示した。また、細胞間接着を有する内皮細胞では、Notchシグナルが活性化しており、ポジティブフィードバック機構としてD114の発現を誘導する。Ang1/Tie2シグナルは、β-cateninを介してこのNotchシグナルによるD114の発現を増強し、それによりNotchシグナルのさらなる活性化を惹起することが分かった。また、Ang1/Tie2シグナルは、Notchシグナルを介して基底膜の形成を誘導し、それにより血管構造を安定化することが明らかになった。Ang1/Tie2シグナル、D114/Notchシグナルは共に血管安定化に重要であるが、これまで両シグナルの相互作用については全く知られていなかった。本研究は、Ang1/Tie2シグナルとD114/Notchシグナルの相互作用をはじめて明らかにしたものであり、大変重要な知見であると考える。これまでに申請者は、細胞間接着存在下においてAng1は、Tie2のトランス結合を形成し血管安定化シグナルを活性化すること、一方細胞間接着非存在下においてAng1は、Tie2を細胞外マトリックスにアンカーし、血管新生シグナルを誘導することを報告した(Nat.Cell Biol.2008)。また、Ang1/Tie2受容体シグナルは、血管内皮細胞に特異的に発現する細胞間接着因子Vascular endothelial-cadherin(VE-cadherin)を増強することで、血管構造を安定化する。われわれはこれまでに、Ang1/Tie2受容体シグナルによるVE-cadherin接着機能の増強にRap1低分子量G蛋白質が関与することを示唆する知見を得ている。そこで、平成23年度は、Ang1/Tie2シグナルの下流で機能するRap1が、如何にVE-cadherin接着を増強するのか解析した。その結果、Rap1は細胞間接着部位に沿ってアクチン繊維の束を形成すること、そしてこのアクチン繊維がα-/β-cateninを介してVE-cadherinを細胞間接着部位にアンカーし、内皮細胞間接着を増強することを示した。さらに、この分子メカニズムについて解析を進め、Rap1は、細胞間接着部位でRhoファミリーG蛋白質の1つであるCdc42を活性化し、それによりミオシンリン酸化酵素の1つであるMRCKを細胞間接着部位にリクルートすること、細胞間接着部位に移行したMRCKは、細胞間接着部位でミオシンIIを活性化し、細胞間接着に沿ってアクチン繊維の束を形成することを明らかにした。今後、Rap1はCdc42を活性化する機構の解析を進める。本年度は、Ang1/Tie2シグナルが、血管構造を安定化するメカニズムを解析し、以下の研究成果を得た。これまでに我々は、Ang1/Tie2シグナルが低分子量G蛋白質Rap1を介して内皮細胞間接着を増強することを示している。本年度は、Rap1が内皮細胞間接着を増強する機構を解析した。

その結果、Rap1は細胞間接着部位でCdc42を活性化し、ミオシンリン酸化酵素MRCKを細胞間接着部位にリクルートすること、さらに、MRCKは、細胞間接着部位でミオシンIIを活性化し、細胞間接着部位に沿ってアクチン繊維を形成することで、細胞間接着を増強することを明らかにした。また、Rap1は、Cdc42のグアニンヌクレオチド交換因子であるFGD5を介して、Cdc42を細胞間接着部位で活性化することを示した(J. Cell Biol. in revision)。我々は以前、Ang1/Tie2シグナルがDelta-like 4(Dll4)/Notchシグナルを介して血管を安定化することを、in vitroの培養内皮細胞系を用いて示した(J. Biol. Chem. 2011)。本年度は、血管内皮細胞で特異的に細胞周期バイオセンサーFucciを発現するゼブラフィッシュを用いて、Dll4/Notchシグナルが血管構造を安定化する機構を解析した。その結果、Dll4/Nocthシグナルは、内皮細胞の細胞周期を負に制御し、細胞増殖を抑制することで、血管構造を安定化することを明らかにした(現在投稿中)。平成23年は、Ang1/Tie2受容体シグナルが血管内皮細胞間接着を増強する分子メカニズムの解明を目標に研究を進め、上述したように、その機構の一部を明らかにすることが出来た。しかし、本年度は、Ang1/Tie2受容体シグナルがNotchシグナルを介して基底膜を形成し、血管構造を安定化する機構についても解析を進めたが、結論を出すまでには至らなかった。24年度が最終年度であるため、記入しない。平成23年度に引き続き、Ang1/Tie2受容体シグナルが血管内皮細胞間接着を増強する分子メカニズムの解析を進める。特に、Rap1がCdc42を活性化する機構について検討、また、Rap1の下流で機能するアクチン制御因子の同定も試みる。さらに、Ang1/Tie2受容体シグナルがNotchシグナルを介して基底膜を形成し、血管構造を安定化する機構を明らかにするため、培養細胞を用いた解析に加え、モデル動物としてゼブラフィッシュを用いて解析を進める。これにより、生体でAng1/Tie2シグナルが血管構造を安定化・不安定化する分子メカニズムの解明を目指す。
新奇グアニン修飾アンチセンス核酸を利用したRNA構造・機能制御法の開発

グアニン塩基に富む一本鎖核酸分子は、グアニン塩基間の特異的なHoogsteen型水素結合を介して特徴的なグアニン四重鎖構造を形成することが知られている。近年、グアニン四重鎖構造は転写、翻訳等の細胞内の遺伝子発現過程で重要な機能を発揮していることが明らかにされつつある。本研究では、人為的にグアニン四重鎖構造を誘起する新たなアンチセンス核酸の構造修飾法を開発し、遺伝子発現に対する効果を解析した。これまでに申請者は、RNA中への人為的なグアニン四重鎖構造の誘起を達成する、新奇アンチセンス核酸(グアニン修飾アンチセンス核酸:g-AS)を開発した。G-ASはアンチセンス領域がRNAと配列特異的な二本鎖形成をすると同時に、RNA中に存在する連続するグアニン塩基とともに、安定なRNA-DNAへテログアニン四重鎖構造を形成する。本年度はg-ASのRNAウイルス機能阻害への有用性を確認するために、HIV-1ウイルスのcentral polypurine tract(塩基配列4581-4756)と呼ばれるプリン塩基が高頻度に出現する領域を標的としたアンチセンスを設計し、逆転写酵素阻害試験により評価した。これまでに、HIV-1による後天性免疫不全症候群(AIDS)発症に重要な役割を果たしているnefタンパク質をコードする領域を標的としたg-AS設計を行い、逆転写酵素による複製阻害活性を達成した。今回、HIVゲノム中に高頻度にプリン塩基が認められる領域であるcentral polypurine tract領域においても、HIV-1ゲノムとの相補鎖形成だけを利用した16塩基長のアンチセンス核酸(AS-1)と比較して、グアニン塩基を導入した修飾アンチセンス核酸(g-AS1)では、DNAへの逆転写反応を効率よく阻害することが分かった。逆転写反応の伸長停止産物の大部分は、mRNAに存在するグアニン連続配列の3'側で認められたこと、さらに円二色性スペクトル解析、融解温度測定からグアニン四重鎖構造形成を示唆する特徴的なスペクトル変化が認められたことから、g-AS1内のグアニン領域とRNA配列中のグアニン領域が安定なRNA-DNAへテロ四重鎖構造を形成していることが分かった。本結果から、ゲノム配列中の様々な領域を標的としてグアニン修飾アンチセンス核酸を設計出来ることを明らかにした。最近我々は、RNA鎖中にグアニン四重鎖構造の誘起を達成する、アンチセンス核酸を設計することに成功した。本年度は、アンチセンス核酸の遺伝子発現への展開を試みた。mRNAの5'末端にはそれ自体はタンパク質には翻訳されない非翻訳領域(untranslated region: UTR)と呼ばれる塩基配列が存在し、遺伝子の翻訳過程に重要な機能を担っていると考えられている。データベース探索により、ガン抑制遺伝子として知られるMSH2遺伝子のmRNAの5'-UTR配列内部にグアニン四重鎖を形成する候補配列が確認できた。さらに本配列内の1つのグアニン塩基について一塩基変異多型(SNP)が存在することが分かった。MSH2の5'-UTR内に存在するグアニン塩基に富む領域が四重鎖を形成することを酵素化学的手法により明らかにした。さらに、当領域のグアニン塩基のSNP変異により、グアニン四重鎖構造形成能が大幅に低下することを明らかにした。続いて、mRNAの5'-UTRに存在する四重鎖形成配列内のSNP変異による下流遺伝子の翻訳量の変化を調べるために、MSH2遺伝子、及びそのSNP変異体の5'-UTR配列下流にルシフェラーゼ遺伝子を融合した人工遺伝子を創製し、翻訳量の変化を解析した。次に、グアニン修飾アンチセンス核酸により翻訳量を制御できるかどうかを検討した。MSH2の5'-UTRのSNP変異を含む領域に相補的な二重鎖形成能のみを有するアンチセンス核酸を設計し、遺伝子翻訳に対する影響を検討したが、遺伝子発現に対する影響は認められなかった。一方、グアニン修飾アンチセンス核酸では1 uMでほぼ完全に翻訳が抑制されることが分かった。本結果より、グアニン修飾アンチセンス核酸はRNA構造中に四重鎖構造を誘起することにより、非翻訳領域にもグアニン四重鎖構造を誘起することによりタンパク質への翻訳過程も阻害できることが明らかにした。「新奇グアニン修飾アンチセンス核酸を利用したRNA構造・機能制御法の開発」では、申請者が独自に開発したアンチセンス核酸の修飾法を利用して、RNAの機能発現に重要な役割を果たしていることが近年明らかにされつつあるグアニン四重鎖構造を、RNA構造中に誘起する方法論を確立し、RNA構造変化に伴う機能の制御を目的とした。前年度までに、MSH2遺伝子中に存在するタンパク質に変換されない非翻訳領域(5'-UTR)のグアニン塩基に富む領域がグアニン四重鎖構造を形成することにより下流の遺伝子発現が大きく変化することを明らかにした。さらに、MSH2の5'-UTR中のグアニン塩基に富む領域中には一塩基多型(SNP)が存在し、グアニン塩基が他の塩基に変換されることによりグアニン四重鎖形成が阻害され、下流の遺伝子発現が亢進されることも明らかにし、本領域に対して人為的に四重鎖を導入できるように設計したアンチセンス核酸により、MSHの5'-UTR配列下流に融合したルシフェラーゼ遺伝子の翻訳量が低下することも示した。

しかしながら昨年度設計したアンチセンス核酸では、一塩基変異体のみならず変異が存在しない野生型MSH2についても遺伝子発現抑制効果が認められたため、本年度は、昨年度開発したアンチセンス核酸の配列修飾により、MSHの5'-UTRのSNPを見分け、遺伝子発現が亢進されるSNP型配列のみを標的としたアンチセンス核酸の開発を目指した。グアニン塩基の修飾位置等を様々に変化させたアンチセンス核酸を合成し、その遺伝子発現抑制効果を野生型、SNP型に対して調べたところ、アンチセンスの5'塩基に適当なリンカーを介してグアニン塩基を導入したアンチセンス核酸により、遺伝子発現が亢進したSNP型に対してより効果的に遺伝子発現を抑制することができた。グアニン塩基に富む一本鎖核酸分子は、グアニン塩基間の特異的なHoogsteen型水素結合を介して特徴的なグアニン四重鎖構造を形成することが知られている。近年、グアニン四重鎖構造は転写、翻訳等の細胞内の遺伝子発現過程で重要な機能を発揮していることが明らかにされつつある。本研究では、人為的にグアニン四重鎖構造を誘起する新たなアンチセンス核酸の構造修飾法を開発し、遺伝子発現に対する効果を解析した。前年度はRNAウイルスの複製を効果的に阻害するアンチセンス核酸の設計指針を確立することができた。本年度は、昨年度得られた実験結果をもとにグアニン修飾核酸のRNAからタンパク質への翻訳過程の人為的制御を目標に研究を行った。mRNA配列中の非翻訳領域に形成されるグアニン四重鎖構造が遺伝子発現に重要な機能を有することが近年報告されている。本年度研究により、非翻訳領域中のグアニン塩基の一塩基多型がグアニン四重鎖形成に重要な役割を果たすこと、さらにアンチセンス核酸を利用してグアニン四重鎖形成を誘導することで一塩基多型により亢進した翻訳量を効率良く制御できることを明らかにした。本研究により創成したアンチセンス核酸は、グアニン四重鎖を誘導するという機構により遺伝子発現を効果的に制御することができる非常にユニークなものである。本年度の研究結果は、想定した目標をおおむね達成できたものであると考えている。生物有機化学前年度、本年度を通じてグアニン塩基が連続する領域に人為的にグアニン四重鎖を導入し、遺伝子の複製、翻訳過程を効果的に制御できることを明らかにした。来年度は、さらに効率良く遺伝子発現を制御できるようなアンチセンス分子へと展開していきたい。申請者は最近、連続するグアニン四重鎖構造がグアニン四重鎖ユニット間相互作用を通じて強力に安定な高次構造体を形成することを最近申請者は見出した。本構造体を人為的に制御出来れば、さらなるアンチセンス核酸の応用が可能となる。このような視点から、さらに高活性なアンチセンス核酸創成を目標として研究を展開していきたい。また、細胞実験への展開を視野に入れ、核酸分解性酵素耐性能を付与できるようなアンチセンス核酸の化学修飾法の開発研究にも挑戦したい。アンチセンス核酸は標的遺伝子のmRNA、あるいはRNAウイルスなどの塩基配列が既知であれば、原理的には論理的な分子設計が可能になる点で非常に有用であり、細胞の機能解析、機能制御を行う上でアンチセンス核酸は非常に有用な候補分子であると考えられる。ゲノム配列解析は、解析装置の能力の劇的な向上に伴い大きく進展したことから、ゲノムを標的とすることで効率的な創薬が可能になると期待される。
間欠的人工血液潅流による超長期肝保存法の開発とドナ-肝の分割利用法の検討

移植のための肝保存時間の延長を目的とする本研究では、先ず肝の生存活性を評価するより良い指標としてDNA損傷と修復、ミトコンドリア機能および高温負荷後の機能温存(温度抵抗性)の意義を検討した。次いで肝保存時間の延長策として、冷却保存中に常温潅流を挿入し、代謝老廃物の除去と組織の酸素化による活性化を試みた。以下に、ラット肝を用いたそれらの成績を示す。1.肝実質細胞の核DNA損傷は、EC液中では保存12時間で、UW液中では48時間から増大した。また、EC液中で48時間保存するとDNA損傷は修復されなかった。これは、細胞膜損傷からみた生存活性の変化に先行して認められ、より有効、鋭敏な生存活性の指標と思われた。肝の非実質細胞のDNA損傷は実質細胞のそれより先行してみられ、肝の保存期間を規定する重要な因子と考えられた。2.肝実質細胞ミトコンドリア機能はEC液でもUW液でも比較的良好に維持された。しかし、これらの肝細胞に40°Cの高熱を負荷してからミトコンドリア機能を検索すると、EC液中では、UW液中保存に比べATP生成能は著明に低下した。これは、移植後の肝の機能発現と関連し、保存期間の良好な指標と考えられた。3.UW液中に冷却保存中、UW液で常温潅流を挿入したところ、肝実質細胞、非実質細胞とも生存活性の改善はみられなかった。また、肝実質細胞の蛋白合成能は潅流により軽度の改善がみられた。一方、ミトコンドリア機能は、潅流により有意にATP生成能が亢進したが、これは冷却保存中に肝内に蓄績した呼吸阻害物質の除去によるものと思われた。しかし、酸素運搬能の小さいUW液の潅流では流量が過大になり組織障害を惹起する可能性が示唆された。そこで、人工血液を用いて潅流すると、結果にバラツキはあるが潅流々量を低下させても機能が温存され、肝保存時間の延長が期待された。これらの実験を、豚肝およびその二分割肝を用いて検討中であり、同様な成績が得られている。移植肝の生着には、細胞レベルでの核DNA損傷度が関与する。そこでUniversity of Wisconsin(UW)液およびEuroーCollins(EC)液に低温漬保存した肝のviabilityを、肝実質細胞ならびに非実質細胞の核DNA損傷度とDNA修復能,蛋白合成能から検討した。その結果以下のことが明らかになった。1.肝実質細胞の核DNA損害は,細胞膜が破綻する前から生じ、EC液保存では12時間から、UW液保存では48時間から増大した。また、EC液保存48時間ではDNA修復が行われない程のDNA損傷が生じていた。2.肝実質細胞の蛋白合成能は、EC液保存では24時間から、UW液保存では48時間から低下した。すなわち膜の破綻が生ずる前から個々の細胞の機能が低下していた。3.肝非実質細胞の核DNA損害度は、実質細胞のそれに先行して増大し、低温浸漬保存では非実質細胞の障害が保存時間を規定する一因子である。

また、移植肝の血流再開後にかかる負荷を想定し、低温浸漬保存肝から分画したミトコンドリアに高温負荷を加え、そのATP生成能の変化から動的な保存肝エネルギ-生成能の評価を行った。その結果まずEC液では保存12時間から高温負荷によるATP生成能の低下率が増大し、48時間保存では高温負荷によりATP生成能が消失した。これに対してUW液では保存24時間から高温負荷によるATP生成能の低下率が増大し、12時間、48時間でEC液と比較し、負荷に対する抵抗性が有意に高く保たれていた。本法により負荷に対するミトコンドリア機能の予備力を容易に推定でき、エネルギ-生成能の面から移植肝としての適性をより的確に判断しうる。以上の研究結果は、本研究すなわち長期保存のための間欠的肝潅流の行うべき時間やその方法(流量、圧、潅流液等)に多くの示唆を与える基礎的な研究実績となるものである。移植臓器は、通常冷却下に保存され、その限界は保存液によって異なる。前年度の研究からEC液に比べてUW液が明らかに勝れていたがそれでも24時間が保存の限界とされる。そこで、この時間の延長を意図して保存期間中に常温下潅流を挿入した。すなわち、1群は摘出ラット肝を、36時間、0°CのUW液に保存した後、肝実質細胞と非実質細胞の生存活性(膜保存性)、肝実質細胞の蛋白合成能、ミトコンドリア機能を検討した。2群は17時間の同様な保存の後、今回購入した臓器潅流装置を用いて、UW液又は人工血液で60分間潅流した後再び18時間、冷UW液に保存した後同様な点を検索した。その結果、UW液潅流では、1.細胞生存活性は、実質細胞、非実質細胞とも改善や悪化はみられなかった。2.蛋白合成能は、潅流群で高値を示したが有意ではなかった。3.ミトコンドリア機能は、呼吸調節、ATP生成能とも潅流群で有意に高値を示した。この改善は、冷却保存途中の潅流により、蓄積していた呼吸阻害物質の除去ができた結果で、ミトコンドリア自体の改善とは断定できない。4.肝細胞の蛋白合成能の改善はみられないが、ミトコンドリア機能の改善がみられることから、UW液による保存中の潅流には多少の保存時間延長効果が期待される。しかし、酸素運搬能を増加させるために、UW液の酸素分圧を異常に高くしたり、潅流量を過大にする必要があり、そのために肝の組織障害を惹起する危険がある。一方、人工血液を用いた群では成績にバラツキはあるがUW液の場合より潅流量が少なく、肝の諸機能が温存され、臓器保存時間の明らかな延長が期待された。本実験はラット肝を用いたもので、潅流装置の大きさとのアンバランスがあって困難であったが豚肝では比較的容易で、その分野肝についてラット肝と類似の成績が得られている。