hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
屋外空間デザインの実現化を目的とした熱環境評価・設計支援手法の開発

本研究は、熱収支・気流連成シミュレーション手法をベースとして、居住域レベルの屋外空間を対象とした熱環境予測評価設計へのフィードバックを包括的に行う設計支援ツールの開発を目的としている。1.これまで開発してきた熱収支・気流連成シミュレーション手法が屋外空間の熱環境評価に有効であるかを確認する目的で、熱帯地域であり都市化による熱環境悪化が問題視されるフィリピン・メトロマニラ地域を対象にケーススタディを行った。現状をモデル化したケースと緑化・通風を考慮したケースに適用した結果、熱気の移流や樹木による日射遮蔽効果等が再現され、手法としての有効性が確認された。本研究は、平成12年度開催の国際シンポジウム"Japanese-German Symposium on Urban Climatology"にて発表が行われた。2.本研究で開発される設計支援ツールは、各設計段階に適した予測手法を適用できることが特徴である。本支援ツールを構成する顕熱の熱収支シミュレーションについて、屋外空間のデザインが検討でき、かつ設計者とのデータ共有が出来るように、3D-CADによる形状入力予測結果の出力が行えるシミュレーションシステムを構築した。また、居住域レベルに熱的影響を及ぼす庇、パーゴラ、樹木の樹冠形状等の空間構成材料を再現可能なメッシュ分割の検討を行い、熱モデルの組込みを行った。3.構築された熱収支シミュレーション手法を複雑な屋外空間デザインを有する住宅地に適用し、形状再現性の検討および各種予測結果出力による熱放射環境の評価方法について検討を行った。その結果、3D-CADを用いた出力により評価者の自由な視点からデザインの熱的検討が実施できたことから、予測結果の設計へのフィードバックまでを考慮した本手法の有効性を確認した。以上2つの成果は、来年度4月の日本建築学会計画系論文報告集に掲載される予定である。1.これまで開発してきた熱収支・気流連成シミュレーション手法が屋外空間の熱環境評価に有効であるかを確認する目的で、熱帯地域に属し熱環境の悪化が問題視されるフィリピン・メトロマニラ地域を対象にケーススタディを行った。現状を考慮したケースと緑化・通風を考慮したケースについて適用した結果、熱気の移流現象や樹木による日射遮蔽効果等が再現され、手法としての有効性が確認された。本成果は、今年度開催された国際シンポジウム"Japanese-German Symposium on Urban Climatology"にて発表が行われた。2.本研究で開発される設計支援ツールは、各設計段階において適した予測手法を適用できることが特徴である。なかで顕熱の熱収支シミュレーションについて、屋外空間のデザインが検討でき、かつ設計プロセスとのデータの共有が行えるよう3D-CADに着目し、3D-CADによる形状入力計算結果の出力が行えるシミュレーションシステムを構築した。また、居住域レベルに熱的な影響を及ぼす庇、パーゴラ、樹木の樹冠形状等の空間構成材料を再現可能なメッシュ分割の検討を行い、熱モデルの組込みを行った。3.構築された熱収支シミュレーション手法を複雑な屋外空間デザインを有する住宅地に適用し、再現性の検討及び各種出力による熱放射環境の評価方法について検討を行った。その結果、3D-CADを用いた出力により評価者の自由な視点からデザインの熱的な検討が行えたことから、計算結果の設計へのフィードバックまでを考慮した本手法の有効性を確認した。以上二つの成果については、来年度に開催される日本建築学会大会にて発表する予定である。1.設計実務ベースでの使用に耐えうる対話型形式の支援・評価ツールの構築:空間形状のCADベース入力、予測評価結果のプレゼンテーション設計へのフィードバックを目的として、既存のCADをベースにした

3次元ベクターデータによる入力システムの開発、既存グラフィックルーチンを改良して3次元CADへのフィードバックを行う支援システムの構築を行った。設計者に対して分かり易くインパクトのある対話型支援システム構築のために、CADデータベース、グラフィックベースでやり取りが出来るシステムを開発した。2.3D-CADを用いた全表面温度の予測手法の詳細検討:3D-CADを用いた全表面温度の予測手法について、予測精度の向上に資するため、空間構成要素の熱的扱いに関する具体的検討を行った。樹木形状及び葉密度に関して、3D-CADデータとして扱い、その空間分布を明らかにした。また、建物の表面温度の再現性に関する検討を行い、問題となる個所の扱い及び解決方法を示した。3.実際の建築計画や熱環境対策の検討プロジェクトに本支援・評価手法を適用:本支援・評価手法を実際の建築計画に適用し、熱的に良好な屋外空間デザインの提案を行った。また、3D-CADベースの予測評価システムを用い、行政と共同で熱環境対策に有効な手法の検討を行った結果、有効な熱環境対策の定量化を実現した。これより、設計支援ツールとしてのみならず、行政ツールとしての可能性・有効性も確認した。
ファージを用いたトマト青枯病菌Ralstonia solanacearumの制御

トマト青枯病は、全国各地で多発しているRalstonia solanacearumを病原菌とする難防除土壌伝染性病害である。本研究では、これまで全く考慮されてこなかったR.solanacearumに対するファージを土壌から分離し、ファージの土壌接種によるトマト青枯病の抑制効果、ファージの遺伝学的性質を解明するとともに病原菌と近縁の各種細菌に対する範囲(溶菌スペクトル)を明らかにすることを目的とした。今年度、土壌への青枯病菌とファージの接種時期、トマト種子の播種時期を様々に変化させてファージの青枯病防除に対する効果的なファージ接種時期を検討した結果、ファージの土壌接種によっては、完全に青枯病を防除できる方策を見出すことはできなかったが、トマトの播種数日前にファージを土壌接種することにより、トマトの生存個体数を増加させることが可能であることが明らかとなった。加えて、愛知県農業総合試験場長久手本場から過去にトマト青枯病が発生した圃場を含む各種圃場から土壌を採取し、全国から収集された青枯病菌21株に対するファージ計17株を分離するとともに、その宿主範囲を検定した。その結果、最大14株の青枯病菌に感染する宿主特異性の低いファージから、21株中2株にのみ感染する宿主特異性の高いファージを取得した。各ファージの宿主範囲を青枯病菌のBiovarとrep-PCR解析による類別結果を対比させて考察した結果、宿主範囲は必ずしも系統関係の近縁性と一致しないことが判明した。本研究では、これまで全く考慮されてこなかったR.solanacearumに対するファージを土壌から分離し、ファージの遺伝学的性質を解明するとともに病原菌と近縁の各種細菌に対する感染範囲(溶菌スペクトル)を明らかにすることを目的とした。今年度、トマト連作圃場からR.solanacearum YU1株に対するファージKF1株を分離した。トマト青枯病菌が下層土でもよく生残できることから、冠水に伴うKF1株の土壌中の移動性を検討した結果、堆肥を多量に投入し土壌孔隙の良く発達した土壌での移動性は高かったが、化学肥料を連用し容積重の大きい土壌ではKF1株はほとんど土壌に吸着されて、下層への移動が認められなかった。本結果から、前もって耕起し、土壌孔隙を発達させた土壌にKF1株を散布するのが、下層土のトマト青枯病菌の制御に有効と判断した。
軟骨基質の細胞内輸送機構の解明

細胞内でのタンパク質輸送で中心的な役割を果たすゴルジ体において機能するgiantinの生体における発現を調べた結果、軟骨細胞を含む多くの細胞で発現していることが明らかになった。また、giantin欠損軟骨細胞においてもゴルジ体は正常に形成されることが示された。giantin欠損個体の軟骨では、II型コラーゲンとフィブロネクチンの量は正常個体と変わらなかったのに対し、アグリカンとリンクプロテインは著しく減少しており、11型コラーゲンは増加していた。以上のことから、giantinは特定の軟骨基質の分泌において極めて重要な役割を果たすと考えられた。表記研究課題を達成するため、平成26年度は下記の研究を進めた。1.軟骨基質の細胞内輸送におけるGiantinの役割の解析小胞繋留因子Giantinの軟骨基質の細胞内輸送における役割を明らかにするために、正常ラットおよびGiantinを欠損するOCDラットから繊維芽細胞および軟骨細胞を単離して単層培養を行い、アグリカンおよびリンクプロテインの発現を免疫蛍光法により検出することを試みるとともに、GFP融合リンクプロテイン発現するコンストラクトを導入し、その発現を調べた。その結果、単層培養では内因性のアグリカンおよびリンクプロテインの発現量が非常に低く、正常個体由来の軟骨細胞においてもアグリカンおよびリンクプロテインのシグナルがほとんど検出されなかった。GFP融合リンクプロテイン発現コンストラクトの導入実験では、正常およびOCDラット由来のどちらの繊維芽細胞においても、FPのシグナルは観察されなかったが、軟骨細胞では正常およびOCDラット由来のどちらの細胞においてもGFPのシグナルが観察された。2.レクチカンファミリーの分泌におけるGiantinの役割の解析細胞外基質のレクチカンファミリーの分泌におけるGiantinの必要性を明らかにするために、OCDラット胎仔の頭部切片を作成し、レクチカンファミリーに属するバーシカン、ブレビカン、ニューロカン、アグリカンの免疫染色を行った。その結果、OCDラットの頭部の軟骨組織において、アグリカンの減少が確認され、長管骨以外の軟骨組織においてもアグリカンの減少が生じていることが明らかになった。一方、バーシカン、ブレビカンおよびニューロカンの発現に関しては、OCDラットと正常ラットの間で顕著な差は認められなかった。新鮮凍結切片を用いた免疫染色によりのGiantinのin vivoでの発現を調べた。その結果、正常個体では、軟骨細胞だけでなく、繊維芽細胞や内皮細胞など、ほぼ全ての細胞でGiantinの発現が認められた。一方、OCDではGiantinのシグナルは認められず、以前のウェスタンブロット解析と一致した結果が得られた。また、Giantinとともにゴルジ体における輸送小胞の繋留に関わるGM130は、正常組織においてGiantinと共局在することが認められ、OCDの組織においても正常個体と同様にほぼ全ての細胞でGM130の発現が認められた。組織学的および免疫組織学的解析の結果、OCDの軟骨ではサフラニンO染色の染色性が低下とアザン染色の染色性の増強が認められ、酸性ムコ多糖の減少と膠原線維の増加が生じていることが示された。またOCDの軟骨では正常個体の軟骨と比較して11型コラーゲンの著しく強いシグナルが観察された。肋軟骨から単離した軟骨細胞の浮遊培養を行い、細胞外基質の染色を行った。その結果、正常個体の軟骨細胞では細胞同士が緩く結合した凝集塊が形成されたのに対し、OCDの軟骨細胞は細胞同士が密に結合した凝集塊を形成した。また、いずれの浮遊細胞の凝集塊でもアグリカンを含む複数の細胞外基質のシグナルが観察された。ほぼ全ての細胞がGiantinを発現しているが、Giantinを欠損するOCDラットは胎齢早期に致死とならず、骨軟骨など限られた臓器・器官の異常を呈することから、Giantinが細胞特異的な機能を有していることが示された。また、OCDの軟骨では11型コラーゲンのシグナルの増強が認められたことから、Giantinはアグリカンの輸送に必須なだけではなく、他の軟骨基質の輸送もしくは産生のバランスを保つ役割を有していることが示唆された。Giantinはゴルジ体における輸送小胞の繋留に関わる小胞繋留因子の一つであり、その機能を喪失したOCDラットでは軟骨基質の減少を伴う骨軟骨形成不全症を呈することが明らかにされている。しかし、Giantinが関与する細胞内輸送系と輸送される分子との関係に関しては不明なままである。本研究では軟骨基質および細胞外基質のレクチカンファミリーの細胞内輸送におけるGiantinの機能を明らかにすることを目的とした研究を進めている。本年度の遺伝子導入実験の結果から、軟骨基質の輸送には軟骨細胞が有すると考えられている特別な細胞内輸送系が重要であることを示唆する結果が得られた。

また、アグリカン以外のレクチカンファミリーのメンバー(バーシカン、ニューロカン、ブレビカン)に関しては、OCDラットにおいても減少している像は認められなかったことから、Giantinは軟骨組織におけるアグリカンの分泌には重要であるが、他のレクチカンファミリーの分泌には必須ではないと考えられた。軟骨基質の輸送において軟骨細胞が有すると考えられる細胞内輸送系が重要である事を示唆する結果、およびアグリカン以外のレクチカンファミリーの分泌には、Giantinが必須ではない事を示す結果が得られた事から、本年度の達成度は(2)おおむね順調に進行している、と判断した。動物遺伝学軟骨細胞の単層培養では、正常個体の細胞であってもアグリカンおよびリンクプロテインの発現量が非常に低く、その動態を可視化することが困難であった。そのため、単層培養と比較して軟骨基質の発現量が最大100倍程度まで上昇する3D培養を行い、Giantinを欠損するOCDラット由来の軟骨細胞における軟骨基質の動態を調べる予定である。これまでに正常個体由来のアルギン酸ハイドロビーズを用いた軟骨細胞の3D培養およびビーズからの細胞の回収と免疫染色の条件検討が終わっているので、OCDラットからの軟骨細胞の単離が出来しだい、3D培養および、軟骨基質と小胞輸送に関わる細胞内小器官のマーカー分子を用いた免疫染色を行う予定である。軟骨細胞の3D培養により、Giantinの欠損が軟骨細胞の輸送に及ぼす影響が認められれば、Giantinと相互作用する分子をノックダウンし、その影響を調べる事により、Giantinと協同して細胞内輸送系で働く分子の軟骨基質の輸送における役割明らかにする。また、積み荷輸送体を同定するためのプルダウンアッセイに使用するコンストラクトの構築を行い、当該実験を進める予定である。GFP融合リンクプロテインを発現するコンストラクトの他に、GFP融合アグリカンを発現するコンストラクトを構築し、トランスフェクションを行う計画であったが、アグリカンmRNAのサイズが大きく、全長cDNAのクローニングが出来ず、GFP融合アグリカンのコンストラクトの構築およびトランスフェクションの実験が出来なかったために、次年度に繰り越す研究費が生じた。本年度の研究結果から、Giantinの欠損が軟骨基質の輸送に及ぼす影響を調べるには過剰発現させた軟骨基質よりも内因性の軟骨基質の動態を調べた方が良いと考えられたため、次年度は当初の計画には無かった軟骨細胞の3D培養を行う予定である。そのため、繰り越した予算は軟骨細胞の3D培養に用いる試薬などの購入に充てる計画である。
ケロイド発生におけるWntシグナル分子機構の解明と新しい分子標的治療に関する研究

ケロイドの発生機序は未解明であり、治療法も確立していないのが現状である。cDNAマイクロアレイ法の結果、ケロイドにおいてWntシグナル関連遺伝子であるβ-cateninの高発現が認められた。そこで、ケロイド由来線維芽細胞(KF)およびケロイド組織におけるβ-cateninの発現をmRNA、蛋白レベルで検討し、正常真皮由来線維芽細胞(NF)および正常真皮組織と比較検討した。ケロイドにおいて、β-cateninの高発現を確認した。次に、Wntシグナルにおいてβ-cateninに対して抑制的に作用するAxin遺伝子について、同様に検討したところ、ケロイドにおける発現低下が認められた。以上より、Wntシグナルの活性化とケロイド発生との関連性が示唆された。Wntシグナルとコラーゲン合成能の関連性をするために、KFとNFにおいて、β-cateninを作用させてExtracellular matrix(ECM)関連遺伝子であるCOL1A2、FN1遺伝子の発現変化を検討した。KFとNFにおいてCOL1A2、FN1遺伝子の発現上昇を認めた。さらに、KFとNFにおいて、β-cateninを作用後に細胞増殖能を検討したところ、両方の細胞で細胞数の増加が確認された。以上より、ケロイド発生においてWntシグナルの関与が示唆された。現在、Wntシグナル関連遺伝子の抑制因子などを作用させ、KF、NFの変化を検討中である。ケロイド発生とβ-catenin(Wntシグナル伝達経路)の関係を明らかにする事を第一の目的とし、ケロイド分子病態の解明と新しい標的治療法の確立を最終目的としてこの研究を開始した。平成15年度は、ケロイドにおけるβ-cateninの発現解析を行った。1.手術摘出標本よりケロイド凍結標本作成し、免疫組織学的染色を試行して、β-cateninの発現を検討した。30症例中、28症例(93%)にて線維芽細胞の核内および細胞質内に陽性反応を認めた。2.手術摘出組織よりケロイド由来、正常真皮由来の培養線維芽細胞を樹立してtotal RNA、タンパクを抽出してケロイド部位および正常真皮部位におけるβ-cateninの発現をRT-PCR、ウエスタンブロット法により解析した。mRNAレベルでは20例中17例(85%)で、またタンパクレベルでは、20例中19例(95%)でケロイドにおけるβ-cateninの子高発現が認められた。以上の結果より、ケロイド部では、正常真皮部と比較してβ-cateninの発現が強かった。このことがケロイド発生にかかわっている可能性は高いと考える。[目的]ケロイドの発生機序は未だ解明されておらず、われわれはケロイド原因遺伝子の解明および新治療法の確立を目指して分子レベルの解析を行ってきた。DNAマイクロアレイ法によるケロイド原因遺伝子の解析を手始めに、ケロイド発生と細胞周期との関係を追及し、癌関連遺伝子であるCdc25A遺伝子の発現がケロイドにおいて上昇していることを明らかにした。これまで行ってきた研究を発展させて、本研究では、マイクロアレイ解析の結果、ケロイドで発現上昇を認めた癌関連遺伝子β-cateninに着目しケロイド発生との関連性について検討した。[方法]平成16年度はケロイドにおけるWntシグナル関連分子、すなはちWnt(β-cateninの上流)、Axin(β-cateninを抑制する)等の発現をRT-PCRおよびウエスタンブロット法によって解析した。コントロールとして、正常真皮および正常真皮由来線維芽細胞においても同様の解析を行い比較検討した。手術摘出組織を凍結保存および培養し、mRNA、タンパク抽出を行い、それらをサンプルとして各遺伝子発現を解析した。[結果]mRNAレベルではケロイドにおいてWnt遺伝子発現が30例中20例において増強していた。ケロイド30症例中22例(73%)にタンパクレベルでWnt発現上昇認めた。また、19例(63%)にAxin発現の減少を認めた。以上より、ケロイドにおいてWntシグナルが動いていることが予測され、ケロイド発生との関連性が示唆された。[目的]ケロイドの発生原因は未だ不明であり、確実な治療方法も確立されていないのが現状である。われわれはケロイド原因遺伝子の解明および新しい治療法の確立を目指して、分子レベルの解析を行ってきた。cDNA

マイクロアレイ解析により、ケロイドと正常皮膚を比較して、ケロイドにおいて2倍以上の発現変化が認められた遺伝子群(ケロイド関連遺伝子群)をピックアップし、その中から、癌関連遺伝子の一つであるβ-cateninに着目して、ケロイド発生との関連性について解析を行った。平成15年から16年度の研究結果より、ケロイドにおけるβ-cateninの上昇が確認され、さらに、Wntシグナルにおいて、β-cateninの上流に位置するWnt遺伝子の発現もケロイドで上昇していることが明らかになった。[方法]平成17年度は、正常真皮由来線維芽細胞にβ-cateninを作用させて、細胞増殖能と、コラーゲン代謝能の変化について検討した。コラーゲン代謝能は、プロコラーゲンタイプ1産生能の測定を行い評価した。[結果]正常真皮由来線維芽細胞にβ-cateninを作用させると、細胞数の増加が認められた。さらに、プロコラーゲンタイプ1産生量も増加した。[まとめ]現在、Wntシグナル関連遺伝子に対する抗体をケロイド由来線維芽細胞に作用させ、増殖能とコラーゲン代謝能に対する抑制効果について検討中である。この結果が明らかになれば、ケロイドにおけるβ-cateninの過剰発現を抑制し、その結果、新しい分子標的ケロイド治療薬の開発につながる可能性が示唆される。
博物館資料の保存環境としての木質空間の特性

博物館の収蔵庫は,安定した相対湿度を得るために内装材料に吸放湿性の高い木材や,それに近い性能を有した材料が使用されることが多い.わが国においてこうした伝統は古く,その代表的なものが正倉院の校倉宝庫である.収蔵庫内の収納物は木製の箱に収められ,2重あるいは3重の木材に包まれる.本研究によって,校倉および内部に納められた唐櫃内部の温湿度を,年間を通じて正確に記録することができた.その意義は誠に大きく,木製空間を用いた伝統的な保存環境の状態を改めて認識することが可能になった。現代の収蔵庫は,ファイバーボードなどの人造木材,セラミックス系調湿ボードなど調湿機能をもつと考えられる内装材を使用したものや,コンクリートの躯体の表面に内装材料を張り込まない状態の収蔵庫など,様々なタイプのものが存在する.一般的には,さらに空調設備を導入することによって積極的な温湿度調節を図ることが多い.こうした様々な収蔵庫に対しても,それら内部の温湿度環境の測定を実施し,内装材に使用される調湿材と空調設備が温湿度環境に与える効果を検証するための多くの事実を把握することができた.木材その他の調湿材を多用した収蔵庫において,有機酸,アルデヒド類,窒素酸化物,アンモニアなどに関する濃度測定を実施しながら,収蔵庫とその内部の空気成分との関係について検討した.外気中の二酸化窒素に対する一酸化窒素の割合が,木材を多用した収蔵庫内部では逆転して一酸化窒素の割合が増大するため,木材の存在が影響を及ぼしていると推定される.木質空間内部における相対湿度の変動,空気汚染物質濃度の挙動を定量的に把握するために,1)博物館施設の温湿度環境及び空気環境のモニタリング,2)相対湿度変動による木材及び漆皮膜の膨張伸縮と破断に関する実験,3)相対湿度安定化に対する内装材料の能力の評価,4)木質材料による空気浄化の機構解明,5)木質材料から放出される空気汚染物質と腐食などの実験を分担して実施することとした.平成11年度に関しては,収蔵庫内の相対湿度変動および空気汚染物質の組成に対する木質材料の影響を定量化するために,博物館施設をフィールドにして温湿度のモニタリングを実施した.結果を3年間集積してみないと明確なことはいえないが,木質環境の特性と文化財の保存環境とに密接な関連性を見いだせる可能性がある.博物館の収蔵庫は,安定した相対湿度を得るために内装材料に吸放湿性の高い木材や,それに近い性能を有した材料が使用されることが多い.わが国においてこうした伝統は古く,その代表的なものが正倉院の校倉宝庫である.収蔵庫内の収納物は木製の箱に収められ,2重あるいは3重の木材に包まれる.本研究によって,校倉および内部に納められた唐櫃内部の温湿度を,年間を通じて正確に記録することができた.その意義は誠に大きく,木製空間を用いた伝統的な保存環境の状態を改めて認識することが可能になった。現代の収蔵庫は,ファイバーボードなどの人造木材,セラミックス系調湿ボードなど調湿機能をもつと考えられる内装材を使用したものや,コンクリートの躯体の表面に内装材料を張り込まない状態の収蔵庫など,様々なタイプのものが存在する.一般的には,さらに空調設備を導入することによって積極的な温湿度調節を図ることが多い.こうした様々な収蔵庫に対しても,それら内部の温湿度環境の測定を実施し,内装材に使用される調湿材と空調設備が温湿度環境に与える効果を検証するための多くの事実を把握することができた.木材その他の調湿材を多用した収蔵庫において,有機酸,アルデヒド類,窒素酸化物,アンモニアなどに関する濃度測定を実施しながら,収蔵庫とその内部の空気成分との関係について検討した.外気中の二酸化窒素に対する一酸化窒素の割合が,木材を多用した収蔵庫内部では逆転して一酸化窒素の割合が増大するため,木材の存在が影響を及ぼしていると推定される.木質空間内部における相対湿度の変動・空気汚染物質の挙動を定量的に把握するために、鳥取市歴史博物館、徳島県立博物館、正倉院、石川県立博物館、東京国立博物館、福島県立博物館、道立帯広美術館などの博物館施設における温湿度環境、および空気環境のモニタリングの実施を計画した。東京国立博物館では平成10、11、12年度に関しては、館内の温湿度環境データのデータベース化を進めており、他の施設においても同様な活動が始まりつつある。現在測定及び解析が進行中ではあるが、木質環境における相対湿度の安定性は他と比較して高いことがあきらかになりつつある。近年木材に変わる材料として製造されているセラミック系調湿ボードなども、木材と比較して遜色ない性能を備えていることが明らかになりつつある。空気環境に関しては大阪府公害監視センターの協力により、有機酸およびアルデヒド類、NOx、SOxなどの平均濃度を定量できるディフュージョンサンプラーの開発が進み、実用的な方法として収蔵庫や展示場などで安全な測定が可能になった。電気的な駆動を伴う装置あるいは液体を使用する装置を長期間収蔵庫内に持ち込むことは、作品への配慮から遠慮されてきた。従って、こうした空間における空気環境の長期的なモニタリングはほとんど存在しないが、ディフュージョンサンプラーの開発によって本研究では新たな知見が得られつつある。中でも有機酸濃度の比較は使用される木材の種類や建築後の経過時間などによって大きく異なるように観察され、今後収蔵施設としての条件を確立するために注目すべき要素である。研究最終年度にあたって,2回のミニ研究集会の開催と調査・研究の取りまとめを行った.

1回目のミニ研究集会は,道南ブロック博物館協議会の会員と併せ約30名の出席を得,北海道地域の博物館施設における保存,正倉院校倉宝庫の温湿度測定の結果,環境保全計画などについて討議を行った.収蔵庫内の環境測定を実施し,現状を正確に把握することが急務であると認識が得られた.2回目は岩手県立博物館において県立博物館関係者と併せて8名の出席を得,コンクリート製建造物の老朽化と内部環境の推移について,施設見学を実施しながら詳しく検討した.長期間に渡る測定データが果たす役割の大きさを実感することができた.調査としては,博物館施設の内部温湿度環境の測定を継続した.ただし,今年度実施分は測定開始時期が遅れたため,今年度測定分は平成14年1月から3月までの間になり,測定対象施設は帯広美術館,福島県立博物館,石川県立美術館,正倉院校倉宝庫,東京国立博物館,鳥取市歴史博物館,徳島県立博物館,大分県歴史博物館など8機関になる.測定方法は小型温湿度データロガーを各施設に配布して行っている.東京国立博物館では,収蔵庫の内装材として導入した珪藻土系の調湿パネルと用いた空間,人造木材を用いた空間,ヒノキを用いた空間,コンクリートのままの空間,また展示室に設置した展示ケース内,美術品輸送に用いる梱包ケース内などを対象にした内部の温湿度あるいは空気成分の測定を実施した.
現代リベラリズム論における政治的アイデンティティー観の変容と「少数派の権利」:ロールズ以降のアメリカを手がかりとして

1本研究の目的は、ロールズ以降の「正義論・リベラリズム論争」の展開に関し、その鍵概念としての、「少数派としての文化を維持していく権利(minority cultural rights)」を手がかりとして、多面的・総合的な考察を加えることにある。2そのためまず、本年度は、90年代初頭以降、今日まで続く、「少数派の権利」論に対する多様な諸批判のうち、ロールズらリベラル第一世代、完全自由主義、共同体論という主要な3類型に関し、それら各々に対するリベラル第二世代からの再反論とも対応させつつ、議論の再構成・批判的検討を行った。その結果、前年度に行った、論争の80年代末までの経緯に関する分析と合わせ、論争の全体像を一応完成させることが出来た。またその過程で、「少数派の権利」論に対する理論的正当化・非正当化の根拠は従来想定されていたよりも遥かに多様であり、かかる理論的多様性は、各論者の具体的な政策論的立場にも少なからぬ差異と多様性をもたらしているという、新たな知見を得た。3更に、本年度は、「リベラリズム論争」の諸成果の、日本社会への適用可能性を解明するため、今日の日本におけるリベラリズム研究の現状を、体系的に整理するとともに、そこにおける議論の構造の特質を、既に本研究の過程で見い出された、アメリカ・ヨーロッパにおけるそれと比較し、リベラリズム論争の諸成果のうち日本にも普遍化可能な部分を析出する作業を行った。その結果、本研究では、日本リベラルの少数派擁護論の中には、西洋リベラルの新しい「少数派の権利」概念により親近的な議論と、西洋リベラルのより古典的な普遍的人権概念により適合的な諸要求が混在し、両者の自覚的な区別や関連づけが不可欠であるとの新たな知見を得た。1本研究の目的は、ロールズ以降の「正義論・リベラリズム論争」の今日的展開に関して、その鍵概念としての、「少数派としての文化を維持していく権利(minority cultural rights)」を手がかりとして、多面的・総合的な考察を加えることにある。2そのためまず、本年度は、「リベラリズム論争」の諸議論のうち、リベラル第二世代が台頭した、80年代末までの議論を主たる素材として、政治的少数者のアイデンティティー擁護を巡る問題が、同論争の最も中心的な問題として主題化されるに至った経緯を、ロールズらリベラル第一世代、キムリカらリベラル第二世代、共同体論、完全自由主義等の諸論者のテキストに即しつつ具体的に再構成した。その結果、少数派としての権利に関わる諸要求のうち、最も主要なものと従来見なされてきた、エスニシティー集団の権利と、ジェンダー集団の権利の間には、従来想定されていたよりも、より大きな対立・緊急関係が存在するという新たな知見を得た。3更に、本研究では、今日の「リベラリズム論争」に対する、政治思想史上の位置づけを解明するため、その政治的アイデンティティー論・権理論の内容を、戦間期アメリカ・ヨーロッパのリベラリズム論におけるそれと比較検討した。その結果、今日のリベラリズム論と戦間期の議論には、主としてエスニシティー集団に対する集合的権利概念の是認という側面で共通性が見られるものの、両者の議論には、例えばその社会経済的前提条件や、ジェンダー集団に対する見解の差異等、なお重要な差異も存在するという、新たな知見を得ることが出来、この点については、次年度以降の研究中でなお解明を進める予定である。
誘導パラメトリック蛍光ホログラフィ

誘導パラメトリック蛍光ホログラフィは2つの四光波混合光(信号光と参照光)の干渉縞から3次元イメージングを行う手法である。前年度の信号検出感度の検討結果から、この手法は高出力レーザーを必要とし、生物試料のイメージングは困難であることがわかった。そこで、ホログラフィと同様に二光束干渉法を用いた高感度な四光波混合顕微法を提案した。本手法は干渉縞から増強された信号をフーリエフィルタリングで抽出する。そしてこの抽出処理をスキャン毎に行い、低ノイズの像を取得する。本手法は最も感度の高いショットノイズ限界近くまで感度を上げることができ、生物試料のイメージングも可能となる。以下に実験結果を述べる。感度定と生物試イメージング:実験では広帯域フェムト秒レーザーを用い、そのスペクトルの一部をポンプ光、ダンプ光として用いた。両光をマッハツェンダー干渉計に入射し、干渉計の両アームに設置されたスライドガラスから信号光と参照光を発生させ、その干渉縞をCCDで検出した。そして抽出した増強信号と雑音の比(SNR)を求めた結果、ショットノイズ限界に迫る感度を達成していることがわかった(ショットノイズ限界から4-5dBだけSNRが低い)。また、生物試料としてタバコBY-2細胞をイメージングし、クリアな像を取得した。非線形位相イメージング:本手法は干渉縞から物質固有の非線形感受率に依存する非線形位相を抽出することができ、細胞内の物質識別も可能である。そこで本手法を用いて非線形位相信メージングを行い、物質識別の可能性を検討した。実験では試料としてHE染色されたマウス腎細胞を用いた。結果、核で3次の非線形感受率に由来する非線形位相変化を検出した。さらに位相変化の原因となる物質を調べたところ、ヘマトキリンによることが判明した。この結果から非線形位相イメージングを行うことで細胞内の物質識別の可能性を見出した。本研究で得られた成果として以下の2点が挙げられる.(1)可干渉性の確認提案法は,試料と参照物質から生じる四光波混合光(以下は信号光と参照光と記述)を干渉させ空間的な干渉縞をCCDで検出する.しかし,信号光と参照光の空間的な干渉縞をCCDで検出した例は私が知る限りでは存在しない.ゆえに,信号光と参照光の空間的な干渉縞が形成されることを確認する必要がある.実験では,四光波混合に必要なポンプ光(中心波長:775nm,パルス幅:<100fs,平均強度:440mW)とダンプ光(1050nm,<100fs,50mW)を合波し,マッハツエンダー干渉計に入射した.干渉計の両アームにはスライドガラスが設置され,一方は試料,他方は参照物質である.このとき生じた信号光,参照光の波長は616nmであった.信号光,参照光を高感度CCD面上で重ね合わせ,干渉縞検出を試みた.結果,同心円の干渉縞が確認され,干渉縞が形成されることがわかった.(2)信号検出感度の検討本研究ではイメージングを行う対象は細胞内の生体高分子などの微小物体であり,信号光が微弱である.ゆえに,微小物体から生じた信号光による干渉縞が検出可能であるか検討する必要がある.ここでは例として微小物体のサイズを1.5μmと仮定し,(1)の実験で用いたCCDで干渉縞が検出可能であるかを調べた.結果,高繰り返し周波数(76MHz)のポンプ,ダンプ光を用いた場合,CCDの1ピクセル当りに入射する信号光のフォトン数が1個を下回り,これでは干渉縞を検出できないことがわかった.一方,再生増幅器と光パラメトリック増幅器を用いて低繰り返し周波数(1kHz)としたとき,1ピクセルあたりのフォトン数が10_6個となり,高コントラストの干渉縞が検出可能であることがわかった.これより,提案法は再生増幅器と光パラメトリック増幅器が必要であることがわかった.誘導パラメトリック蛍光ホログラフィは2つの四光波混合光(信号光と参照光)の干渉縞から3次元イメージングを行う手法である。

そこで本手法を用いて非線形位相信メージングを行い、物質識別の可能性を検討した。実験では試料としてHE染色されたマウス腎細胞を用いた。結果、核で3次の非線形感受率に由来する非線形位相変化を検出した。さらに位相変化の原因となる物質を調べたところ、ヘマトキリンによることが判明した。この結果から非線形位相イメージングを行うことで細胞内の物質識別の可能性を見出した。
高齢者胃癌の組織学的多様性と対応する遺伝子変化の関連解析

高齢者は組織学的多様性を示す胃癌が多い。胃癌は加齢とともに、遺伝子のスイッチに相当するメチル化によって生じるマイクロサテライト不安定性を示す癌が増加する。胃癌のなかでも充実型低分化腺癌が最も高率にこの変化を示す腫瘍であった。この充実型低分化腺癌は80歳以上女性の幽門部に多く発生し、分化型成分を高率に併存した。胃癌ではKRAS遺伝子変異、BRAF遺伝子変化の比率は低いものの、充実型低分化腺癌では他の胃癌より高率であった。これらの臨床病理像、遺伝子変異から、充実型低分化腺癌は特異な組織型であることが明らかになった。高齢者胃癌の連続切除例420例464病変について,マイクロサテライト不安定性(microsatellite instability, MSI)と年齢との関連を検討した.その結果,MSIの比率は65-74歳8.5%,75-84歳18.4%,85-96歳35.3%であり,加齢とともに有意に増加した.MSIを示す胃癌の特徴は,高齢,女性,幽門部発生との関連がみられた.組織型では,充実型低分化腺癌(43.0%),乳頭腺癌(32.5%)で有意に高率であった.MSIを示す早期癌では分化型成分が優位であったが,MSIを示す進行癌では差がなかった.これらの結果から高齢者胃癌のうち,充実型低分化腺癌に注目し検討した.低分化腺癌54例(充実型低分化腺癌31例,非充実型低分化腺癌6例,印環細胞癌17例)を対象として,粘液形質,ミスマッチ修復遺伝子発現,p53発現を免疫組織学的に,マイクロサテライト不安定性, KRAS変異,BRAF変異を分子病理学的に検討した.また,Epstein-Barrウイルス(EBV)の関連はEBERのin situ hybridization法で検討した.充実型低分化腺癌ではマイクロサテライト不安定性が52%,MLH1蛋白発現減弱が58%の症例で認められ,非充実型低分化腺癌・印環細胞癌と比較し,有意に高率であった(P < 0.05).EBVは充実型低分化腺癌症例の2例に陽性像を認めるのみであった.低分化腺癌におけるKRAS変異はcodon 12変異が2症例,codon 13変異が3症例で認められたが,組織型との関連は認められなかった.MSIを示す充実型低分化腺癌は高齢,女性,幽門部発生,分化型成分の併存,MLH1蛋白発現減弱と関連がみられた.以上の結果より,高齢者胃癌はMSIと関連する腫瘍の占める割合が増加することが示唆された.胃癌において加齢とともにマイクロサテライト不安定性を示す癌の比率が増加すること,組織型として充実型低分化腺癌が最もマイクロサテライト不安定性の比率(43%)が高いことを明らかにした.平成26年度は,マイクロサテライト不安定性が高率にみられる充実型低分化腺癌の臨床病理学的特徴を明らかにするために以下のような実験をおこなった.高齢者に発生した未分化型進行胃癌78例(充実型低分化腺癌31例,非充実型低分化腺癌22例,印環細胞癌25例;男性42例,女性36例,年齢分布5899歳,中央値77歳)を対象とした.通常の臨床病理学的事項に加え,ミスマッチ修復系蛋白質発現,粘液形質,p53発現を免疫組織学的に,マクロサテライト不安定性,KRAS変異,BRAF変異を分子病理学的に検討した.また,特殊な充実型低分化腺癌であるEpstein-Barrウイルス(EBV)関連胃癌との異同を検討するために,EBV感染についてin situ hybridization法で検討した.充実型低分化腺癌ではマイクロサテライト不安定性が52%,MLH1蛋白質発現減弱が58%に認められ,非充実型低分化腺癌・印環細胞癌と比較し有意に高率であった(p < 0.0001).EBV感染は充実型低分化腺癌の2例に認められるのみであった.KRAS変異は11例,BRAF変異は3例にみられたが,組織型との関連性は認められなかった.マイクロサテライト不安定性を示す充実型低分化腺癌は,高齢,女性,幽門部発生,MLH1蛋白質発現減弱,p53陰性との関連が認められた.また,マイクロサテライト不安定性示す充実型低分化腺癌は粘膜内または辺縁部に分化型成分を併存する率が有意に高かった(p = 0.02).以上の結果より,充実型低分化腺癌は腺腔形成に乏しいという点で非充実型低分化腺癌,印環細胞癌と類似しているが,臨床病理学的,分子病理学的観点からは異なる腫瘍と考えられた.高齢者胃癌の連続切除例420例464病変について、マイクロサテライト不安定性(microsatellite instability, MSI)と年齢との関連を検討し、胃癌において加齢とともにMSIを示す癌の比率が増加すること、組織型として充実型低分化腺癌が最もMSI高率(43%)であることを明らかにした。次に、マイクロサテライト不安定性が高率にみられる充実型低分化腺癌の臨床病理学的特徴を明らかにするため未分化型進行胃癌78例(充実型低分化腺癌31例、非充実型低分化腺癌22例、印環細胞癌25例;男性42例、女性36例、年齢分布58-99歳、中央値77歳)について、臨床病理学的、分子病理学的に検討した。

その結果、充実型低分化腺癌は腺腔形成に乏しいという点で非充実型低分化腺癌・印環細胞癌と類似しているが、臨床病理学的、分子病理学的観点からは異なる腫瘍と考えられた。この充実型低分化腺癌は高齢女性の幽門部に発生しやすく、高率にMSIを示すことが明らかになった。また組織学的検討結果より、この充実型低分化腺癌は分化型癌として発生し、進行とともに分化傾向に乏しくなり、充実型低分化腺癌として発育するようになると推測された。そこで、この腫瘍の遺伝子変異に注目し、KRAS遺伝子(コドン12、コドン13)、BRAF遺伝子の変異について詳細に検討した。その結果、充実型低分化腺癌ではKRAS遺伝子変異が31例中5例(16.1%)、BRAF遺伝子変異が31例中1例(3.8%)にみられ、胃癌で報告されているこれらの遺伝子変異の頻度(KRAS 4.2%、BRAF 0.14%)より高率であった。この結果から、充実型成分化腺癌は遺伝子変異の点からも特異な組織型であることが示唆された。この遺伝子変異は組織型に関連する現象であるのか否かは今後明らかにすべき課題と考える。高齢者は組織学的多様性を示す胃癌が多い。胃癌は加齢とともに、遺伝子のスイッチに相当するメチル化によって生じるマイクロサテライト不安定性を示す癌が増加する。胃癌のなかでも充実型低分化腺癌が最も高率にこの変化を示す腫瘍であった。この充実型低分化腺癌は80歳以上女性の幽門部に多く発生し、分化型成分を高率に併存した。胃癌ではKRAS遺伝子変異、BRAF遺伝子変化の比率は低いものの、充実型低分化腺癌では他の胃癌より高率であった。これらの臨床病理像、遺伝子変異から、充実型低分化腺癌は特異な組織型であることが明らかになった。予定していた症例数の解析を終了し,充実型低分化腺癌の臨床病理学的特徴については研究成果を学会発表し,論文作成中である.さらに,充実型低分化腺に関する分子病理学的研究を進める予定である.病理学充実型低分化腺癌の次にマイクロサテライト不安定性が高率にみられた乳頭腺癌についても検討を加える.さらに,早期癌症例を用いて,マイクロサテライト不安定性を示す症例の初期像を検討する.現在予定してた50例を超える症例数の解析が終了したが,あと30例を追加する予定である.ミスマッチ修復遺伝子のメチル化との関連については次年度の課題としたい.平成25年度に病院・研究所が移転し,一時期実験が滞る事態が生じたが,新施設に移転してから研究環境が整い,研究は順調に進んでいる.移転直後に買い揃えた試薬に余裕があったために,平成26年度には試薬などの購入にかける費用が抑制された.30例の症例を追加した後,充実型低分化腺癌の特徴に関する論文を仕上げる予定である.ここで明らかになったマイクロサテライト不安定性を示す充実型低分化腺癌の分子病理学的特徴を平成26年度は中心に解析を進める.また,充実型低分化腺癌の次にMSI陽性率が高かった乳頭腺癌についても検討を加える.さらに,早期癌の外科切除例,内視鏡的切除例を用いて,MSI陽性胃癌の初期像を検討する.平成25年度に得られた成果を学会で発表し,同じ分野の研究者と意見交換し,その議論を踏まえて論文としてまとめる予定である.平成27年度からは実験補助職員を雇用し,さらに積極的に解析を進めていく予定である.平成25年度は病院・研究所の新築,移転に伴い,数か月間実験が滞る事態が生じた.
高移動度InAs系ヘテロ構造を用いた極微構造の作製と新機能デバイス探索

昨年度に引き続き、InAs/AlGaSb極微構造の磁気電子輸送に関する研究を進めた。開放型量子ドット構造における電子波伝搬、干渉効果のゲート制御ついて研究を行った。MBE成長したInAs/AlGaSbヘテロ構造を、光露光および選択ウエットエッチングにより、開放型量子ドット構造および量子ドット列構造に加工した。この系では、低温における電子の平均自由行程が34μmに達することから、デバイスの寸法をサブミクロンの大きさにした場合、十分にバリスティック輸送が期待できる。開放型ドット構造の4.2Kにおける磁気輸送特性を、測定電流値を変化させて磁気抵抗振動を測定した。磁気抵抗振動については、開放型単一ドットとドット列構造を比較し、フーリエ解析と相関関数により振動の周期性を調べた。大きな振動周期の振動は古典的な粒子の運動により説明でき、また極めて短周期の振動は電子波干渉によるものと分かった。また得られた結果から、位相緩和時間を見積もり、種々のInAsヘテロ構造デバイスと比較した。InAs/AlGaSbヘテロ接合量子細線、量子ドット構造などのデバイスの位相緩和時間は、4.2Kにおいて20ピコ秒から50ピコ秒になることが見積もられた。4.2KにおけるInAsヘテロ構造の位相緩和時間は、GaAsヘテロ構造に比べて大きい値が得られることが分かった。加工プロセスを進展させ、ゲート制御によって量子ドットのサイズ制御も可能になり、今後、開放型量子ドットに関する新しい知見を得るこの干渉効果が観測できることから、今後の実験においてはInAsの特徴をより反映した量子カオスの観測に十分に期待がもてる。以上の結果は、The 12^<th> International Conference onNonequilibrium Carrier Dynamics in Semiconductors (HCIS-12,Santa-Fe, USA)およびAPS meeting 2002 (Indianapolis, America)において報告した。微細加工されたInAs/AlGaSbヘテロ構造の磁気電子輸送に関する研究を進めており、本年度は量子ドット構造における電子波伝搬とその干渉効果について研究を行った。MBE成長したInAs/AlGaSbヘテロ構造を、光露光および選択ウエットエッチングにより、開放形量子ドット構造および量子ドット列構造に加工した。この系では、低温における電子の平均自由行程は34μmに達することから、微細構造をサブミクロンの大きさに作製した場合、十分にバリスティック輸送が期待できる。開放形ドット構造の4.2Kにおける磁気輸送特性から、測定電流値を変化させて磁気抵抗を低磁場で測定したところ、これまでSiやGaAsでは見られたことのない大きな周期のコンダクタンス振動が、4.2Kという比較的高い温度で観測された。この振動周期は、古典的な粒子の運動により、入射と反射に相当するサイクロトロン軌道の大きさを考えることで説明することがわかった。また、極めて短い周期をもつ磁気抵抗の揺らぎも観測された。この揺らぎは測定電流値を変化させても再現性があり、かつ電流値を減少させれば振幅は大きくなり、量子ドット構造の境界条件を反映した電子波干渉効果の現れであると考えられる。このような実験結果は、GaAs系ではmK領域での測定でしか観測されていなかったが、InAs系においては、より高い温度で電子波の干渉効果を観測できることがわかった。InAs系ヘテロ構造の優位性を示すとともに、デバイス構造をさらに微細化して、スピンー軌道相互作用が大きい条件で極低温の実験ができれば、InAsの特徴をより反映した量子カオスの観測が可能になる。
カルパイン阻害剤による砂ネズミ全脳虚血後の遅発性神経細胞死の予防

砂ネズミの両側総頸動脈を5分間閉塞させ一過性前脳虚血を作成すると虚血後3日より海馬CA1領域の錐体神経細胞に選択的な細胞死(遅発性神経細胞死)が観察される。この発生にカルシウム依存性プロテアーゼのカルパインが関与していると考えられ、それをカルパイン阻害剤を使い調べた。[方法]実験系は次の4つよりなり実験動物には砂ネズミを使用。1)虚血前30分に選択的カルパイン阻害剤(N-acetyl-Leu-Leu-norleucinal)をリポソームに包埋し大腿静脈内投与で海馬CA1神経細胞の遅発性神経細胞死が予防できるか?2)虚血時カルパインにより神経細胞骨格のフォドリンが分解されるが選択的カルパイン阻害剤はこの分解を阻止するか?(免疫組織染色とウエスタン・ブロットで検討)3)選択的カルパイン阻害剤は本当に海馬神経細胞内に取り込まれるか?(選択的カルパイン阻害剤に蛍光物質のFITCをラベルし投与、レーザー顕微鏡でその蛍光を調べる)4)カルパインの内因性阻害物質のカルパスタチンは虚血時どのように変動するか?(カルパスタチンの免疫組織染色とウエスタン・ブロットで検討)について調べた。[結果]1)選択的カルパイン阻害剤は用量依存性に海馬CA1神経細胞の遅発性神経細胞死を予防したが60mg/mgで約1/2しか生存させえなかった。2)選択的カルパイン阻害剤はフォドリンの分解を用量依存性に抑制し60mg/mgでほぼ完全に抑制した。3)海馬神経細胞内にFITCの蛍光を認めた。4)カルパスタチン発現は虚血後海馬CA1神経細胞で直後一過性に上昇するが24時間以後には減少した。[考察]選択的カルパイン阻害剤は脳虚血による遅発性神経細胞死を予防するがカルパイン活性を100%抑制する量でも神経細胞死は50%しか予防できず、その発生原因にはカルパイン活性化以外のメカニズムも関与している可能性が示唆された。また内因性阻害物質のカルパスタチンは虚血後発現が一過性に増大するがその後減少しカルパインの活性化を抑制しきれないと考えられた。研究分担者西道により選択的カルパイン阻害剤のN-acetyl-Leu-Leu-norleucinalをphosphatidyl choline,cholesterol,sulfatide in chloroform-methanolで作製したliposomeに4-12mg/mlの濃度になるよう封入。これを研究代表者の横田により砂ネズミの大腿静脈より20,40,60mg/kgのdoseとなるように注入。30分後にエーテル麻酔下に両側総頚動脈を露出、これを5分間閉塞し再灌流し前脳虚血を作製。このときheating blanketとlampで体温、脳温を36-37°Cに保った。再灌流後7日目に砂ネズミを灌流、固定し脳を摘出、これをパラフィンに包埋した。海馬を通る5μmの冠状切片を作製、cresyl-violetで染色、CA1神経細胞の生存数を計測しカルパイン阻害剤を投与しない群、虚血を負荷しない正常群と比較した。カルパイン阻害剤投与群では用量依存性にCA1神経細胞死が予防できた。

今までの我々が示した虚血時にカルパインが活性化されることと総合すると虚血によるCA1神経細胞死発生にカルパインが深く関与すると考えられた。研究分担者西道の作製した選択的カルパイン阻害剤N-acetyl-leu-leu-norleucinalのliposome包埋液を横田により砂ネズミに前投与し,その後脳虚血を負荷し海馬でのカルパイン活性の抑制を免疫組織染色とイムノブロットで調べた。具体的にはカルパイン阻害剤は20,40,60mg/kgを虚血30分前に砂ネズミ大腿静脈より注入。30分後両側総頚動脈を5分間閉塞し再灌流し一過性前脳虚血を作製した。虚血後4時間,1日,7日後に砂ネズミを灌流固定しカルパインにより特異的に分解された神経細胞骨格のフォドリンに対する抗体を用い免疫組織染色を行った。フォドリンのカルパインによる分解はカルパイン阻害剤の投与量に比例し減少を認めた。またイムノブロットは現在進行中である。現在の所昨年の結果と合わせカルパイン阻害剤による虚血性神経細胞死の予防効果が確認されつつある。平成8・9年度までの結果で砂ネズミで選択的カルパイン阻害剤N-acetyl-leu-leu-norleucinalをリポソームに包埋して虚血前に経静脈的投与する事により海馬CAl神経細胞の虚血性細胞死を予防でき、かつカルパインよる神経細胞骨格のフォドリン分解が防止できる事が免疫組織学的に証明できた。本年度は後者の結果を裏づけるためリポソーム包埋カルパイン阻害剤投与後4時間、7日目に海馬を摘出し免疫ブロットを行いフォドリン分解が抑制される事を定量した。カルパイン阻害剤投与群は非投与群と比較し阻害剤投与後4時間、7日目ともに有意にフォドリン分解が低下していた。このことからカルパイン阻害剤が海馬神経細胞でカルパイン活性を抑制していることが定量的に示された。またカルパイン阻害剤が実際に海馬CAl細胞に取り込まれているのを確認するためリポソーム包埋カルパイン阻害剤に蛍光物質FITCをラベルし、正常砂ネズミ群(偽手術施行)と虚血群に偽手術または虚血30分前に同剤を投与、偽手術または虚血30分後脳を摘出、クリオスタットで海馬薄切片を作製、共焦点レーザー顕微鏡でその切片を観察した。正常・虚血群ともに海馬CAl神経細胞に明瞭なFITCの蛍光を検出できカルパイン阻害剤が神経細胞に取り込まれていることを実証できた。以上より選択的カルパイン阻害剤N-acetyl-leu-leu-norleucinalは砂ネズミの一過性前脳虚血による海馬遅発性神経細胞死を神経細胞に実際に取り込まれカルパインによる細胞骨格分解を抑制することにより、その死を予防することが証明された。
昆虫インスリン様分子の遺伝子クローニング

免疫学的、生化学的手法により、昆虫でのインスリン様分子の存在が示唆されてすでに時久しい。しかし、遺伝子レベルでの直接的な証明はカイコ脳ホルモン、ボンビキシン遺伝子の構造解明により初めてなされた。研究代表者は、カイコにおけるインスリン様ペプチドであるボンビキシンの機能を探る目的で、生理学的な解析が可能なエビガラスズメ、および強力な遺伝解析の可能なショウジョウバエからボンビキシン様遺伝子の単離を試みた。これまでに単離した数十クローンに及ぶカイコ・ボンビキシン遺伝子およびエリサン・ボンビキシン様遺伝子の塩基配列の解析から得られた情報を基に、最も保存されている部域に対するプライマーを合成し、エビガラスズメDNAを鋳型にPCRを行った。特異的に増幅されたDNA断片のうち、目的の長さである約200塩基対を持つものを、プラスミドベクターに組込み塩基配列を解析した。解析した約10クローンの内、1クローンのみがボンビキシン様ペプチドをコードし得る配列を有していた。このクローンをプローブとして、脳cDNAライブラリーをスクリーニングすることにより、3個のエビガラスズメ・ボンビキシン様ペプチド(ABRP)遺伝子クローンを得た。これらクローンは塩基配列の相同性から、A、B二つのファミリーに分類可能であった。ファミリー間の相同性は59%と低かった。また、これらのcDNAをプローブとしたゲノムサザンおよびin situハイブリダイゼーションから、ABRP遺伝子もボンビキシン遺伝子と同様に、多重遺伝子族を形成し脳中央部に存在する4対の神経分泌細胞で合成されていることが明らかとなった。ショウジョウバエ・ボンビキシン様遺伝子も上記と同様の方法で単離を試み、現在、特異的に増幅されたDNA断片のうち、目的の長さである約200塩基対を持つものを、プラスミドベクターに組込み解析中である。