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小細胞肺癌におけるネスチンの臨床的意義および治療標的としての研究

抗癌剤治療の反応性に関しては進展型症例での検討を行っており、一次治療の反応性では両群間に差を認めていないが、二次治療ではネスチン陽性群において病勢制御率が有意に低下していた。この臨床的知見は、上述の細胞株を用いた検討と合致する所見と思われ興味深いと考えられた。研究協力者が平成27年度に転勤となり、当初見込んでいた研究協力が得られなくなったことが主な原因である。平成28年度末となり新たな研究協力者を加えることができたが、未だ遅れを十分に取り戻せていない状況である。また京都大学病院からの臨床検体の提供が予想以上に遅れたことも原因の1つと考える。小細胞肺癌におけるネスチンの臨床的意義を明らかにし、臨床現場への応用を目指して本研究を進めた。まずは、小細胞肺癌の増殖におけるネスチンの関与について検討した。小細胞肺癌細胞株を用いてそのネスチンノックダウン株を作成し、両者をマウスへ皮下移植したところ、腫瘍形成能は後者で有意に抑制された。故に、in vivoにおいても小細胞肺癌の増殖にネスチンが重要な役割を担うことが示された。次に、癌悪性形質として抗癌剤耐性とネスチンの関連について検討した。小細胞肺癌細胞株から複数の抗癌剤耐性株を樹立しネスチン発現を検討したところ、親株と比較し耐性株ではネスチン発現が総じて亢進していた。そこで小細胞肺癌細胞株にネスチンを過剰発現させたところ、3種の抗癌剤(シスプラチン、エトポシド、イリノテカン)全てに対して有意に耐性化した。以上により、小細胞肺癌の抗癌剤耐性化へのネスチンの関与が示唆された。更に、臨床検体を用いてネスチンの臨床的意義について検討した。名古屋市立大学病院の小細胞肺癌66例において、腫瘍組織でのネスチン発現を免疫染色法により検討した。36.4%(24例)において発現陽性であったが、陽性群と陰性群との間で、年齢・性別・喫煙歴・病型・血清ProGRPなどの患者背景には差を認めなかった。抗癌剤治療反応性は、一次治療では両群間で同等だったが、二次治療では陽性群で病勢制御率が低下する傾向にあった(58.3% vs 76.5%. P=0.42)。無増悪生存期間は、陽性群は陰性群と比べ、二次治療において有意に短かった(81日vs 117日. P=0.03)。これらの臨床的知見は、上述の細胞株を用いた研究結果に矛盾しないものと考えられた。ネスチンは小細胞肺癌における増殖能や抗癌剤耐性に関与することにより患者の治療反応性に影響を与える可能性があることが、本研究により示唆された。ネスチンは神経幹細胞に発現し中枢神経系発生に関わるVI型中間径フィラメント蛋白である。本研究では、ネスチンが小細胞肺癌の悪性形質や臨床転帰に及ぼす影響について検討した。ネスチンはin vivoにおける腫瘍増殖、さらに抗癌剤耐性にも関与していた。患者検体を用いてネスチン発現を免疫組織染色により検討したところ、二次治療における病勢制御率はネスチン陽性例でやや低い傾向にあった。さらに無増悪生存期間はネスチン陽性例で有意に短かった。本研究により、ネスチンは小細胞肺癌における抗癌剤耐性や臨床転帰へ影響を与える可能性が示唆された。
TLR情報伝達系によるウイルス増殖性の制御に関する研究

細胞の分裂や増殖を伴う活性化がウイルスの増殖性に如何なる影響を与えるかについて検討した。急性感染、持続感染のモデルをリンパ球系細胞、上皮系細胞で構築し、TLR情報伝達系をLPS,熱ショック蛋白、イミキモド等で活性化し細胞培養上清中の遊離ウイルス量を測定した。その結果、リンパ球系や単球系細胞に持続感染している麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、単純ヘルペスウイルス1型(HSV1)の遊離ウイルス量には大きな変化は認められなかった。しかし、上皮系細胞であるFL細胞をイミキモドで処理した場合は、インターフェロン非依存的にHSV1の増殖は有意に抑制された。TLR情報伝達系の活性化がウイルスの複製機能に及ぼす効果・影響を確定し、潜伏感染或いは、持続感染状態からの再活性化へTLR情報伝達系が関与している可能性を明らかにすることを目的とする。HSV-1(VR3)感染において増殖性に影響を与える因子としてSOCS3を確定した。つまり、VR3感染においてSOCS3が誘導される細胞ではウイルス増殖性が良く、これはSOCS3によりインターフェロン(IFN)情報伝達系が抑制されるためであることが判明した。一方、NF-kBの活性化がVR3の増殖性に与える影響を、ビタミンD3で分化させたTHP-1、U937のLPS刺激後のVR3増殖性の変化で検討したが、NF-kBの活性化の有無で大差は認められなかった。次に、THP-1,U937、TALL-1(T細胞系)へVR3株、U41欠損VR3(d-41)、U13欠損VR3(d-13)を感染させ持続感染系の成立を試みた。TALL-1へのVR3、d-13感染系では3回のクローニングの結果、安定な持続感染系が得られたが、d-41感染では常に未感染細胞が得られることから、非常に不安定な系であった。THP-1及びU937でもTALL-1と同様な結果が得られたがVR3感染系もやや不安定(死滅しやすい)であった。これらの持続感染系を用いて、LPS、熱ショック蛋白70(HSP70)によりNF-kBの活性化によりウイルスの増殖性が変化するかを検討中である。HSP70の刺激はd-13の増殖性を増加させる傾向がTHP-1系においてみとめられたが、TALL-1系では認められなかった。人単球由来細胞U937、THP-1はエンドトキシン(LPS)、細胞壁(CW)、熱ショック蛋白(HSP)に応答してNF-kBの活性化、サイトカインの誘導が認められる。そこで、これらの細胞株を用いて、人単純ヘルペスウイルス1型(HSV-1)、麻疹ウイルス(MeV)、ムンプスウイルス(MuV)、人パラインフルエンザウイルス2型(hPaV2)による持続感染系を作成した。HSV-1以外の持続感染系は極めて安定な系であり、培養上清中には常に10^4/ml程度のウイルスが認められた。HSV-1による持続感染系は不安定であり、維持が難しいが、ウイルスは10^410^5/ml程度のウイルスが産生される系である。MeV感染系ではLPSやCWの刺激においてもNF-kBの活性化はおこらず、IL-8,IL-6,TNF-α、RANTESの誘導が抑制される。しかし、産生ウイルス量には変化が認められなかった。MuV感染系ではIL-10の産生誘導が促進されているが、産生ウイルス量には変化は認められなかった。TLR情報伝達系への刺激による細胞活性化がウイルスの増殖に如何なる影響を与えるかについて検討してきた。これまでは、単球系培養細胞であるU937,THP-1細胞と、そのウイルス持続感染細胞(麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、単純ヘルペスウイルス1型)について検討した。その結果、持続感染細胞ではTLR情報伝達系の活性化が抑制され、またウイルスの複製も促進されることは殆ど認められなかった。今回、単純ヘルペスウイルス(HSV-1)は皮膚粘膜細胞や神経細胞での増殖性を示すことから、これらの細胞でのTLR7刺激においてHSV-1の増殖性に変化が生じるかどうかを検討した。FL細胞をTLR7のアゴニスト(リガンド)であるイミキモドで刺激をした。この刺激によってはIFN-α、IFN-β、IFN-λの誘導は認められず、また抗ウイルス因子やサイトカインの誘導も生じなかった。しかし、転写因子AP-1の活性化は認められた。イミキモド処理FL細胞へHSV-1を感染させた場合、HSV-1の増殖は著しく抑制された。イミキモドのTLR7刺激によって、シスタチンAとシスタチンCの誘導が認められた。シスタチンCに加えて、シスタチンAによるHSV-1の増殖抑制機能が判明した。
ヒトX染色体断片の操作によるデュシャンヌ型筋ジストロフィーモデルマウスの作成

デュシャンヌ型筋ジストロフイー(DMD)の原因遺伝子であるジストロフィンは,全長2.4MBにも及ぶ巨大な遺伝子であり,このような巨大な遺伝子を通常の遺伝子操作により細胞内に導入することは.ベクターに組み込む遺伝子サイズの制約によりきわめて困難である。本研究は,ヒト染色体の断片を転座させた人工染色体をマウス胚幹細胞に微小核融合法を用いて直接導入しヒト染色体の一部を保持したマウスを作成するという新しいアプローチにより,DMDのモデル動物の作成やDMD遺伝子治療のための染色体ベクターの開発のための基礎的な研究を目的としたものである。初年度の研究では,DMDモデルマウス作成やDMD遺伝子治療のための染色体ベクター作成の第一歩となるジストロフィン遺伝子を連結した人工染色体作成について研究を行った。ヒトジストロフィン遺伝子近傍の塩基配列の情報をもとに,ジストロフィン遺伝子領域(2.3Mb)だけをヒトX染色体より切り出し,入工染色体HAC-SC20に転座させた染色体ベクターHAC-SC20-dysを作成した。次年度では,ジストロフィン遺伝子だけが「ヒト」化した新しいモデルマウスの作成のための基礎的な研究を行った。1)エクソン23における点突然変異によりジストロフィン遺伝子が発現しない突然変異系統であるmdxマウスに由来するES細胞株mdx-1を新規に樹立した。2)このES細胞株は,高いキメラ形成能があることを確認し,GFP遺伝子で標識することによりキメラ個体を解析する実験系を確立した。3)ミクロセル融合法によりHAC-SC20-dysを導入することにより,本人工染色体ベクターを保持する多数のmdx-1ES細胞株を分離した。これらのES細胞株とmdxマウス胚盤胞を用いたキメラマウスを作成し,現在,その表現型を解析中である。本研究により,ヒトジストロフィン遺伝子のみが発現するマウス作成のための基本的な実験系が確立したと考えられる。Duchenne型(DMD)拾よびBecker型筋ジストロフィー(BMD)の原因遺伝子がX染色体短腕にあるジストロフィンとよばれる巨大な遺伝子(全長2.4Mb)であることが明らかにされてから筋ジストロフィーの研究は飛躍的に進展した。しかし,ジストロフィンの生理機能や筋ジストロフィーの発症期序には依然不明な点が多く,有効な治療法も全く開発されていないのが現状である。本研究は,最近の遺伝子操作技術,胚操作技術の発展やゲノムプロジェクトの進展を背景に,ヒト染色体を直接操作してDMDモデルマウスの作成やDMD遺伝子治療のための染色体ベクターの開発に発展させることを目標としている。本年度は,DMDモデルマウス作成やDMD遺伝子治療のための染色体ベクター作成の第一歩となるジストロフィン遺伝子を連結した人工染色体作成について研究を行った。ヒトゲノムプロジェクトの進展によりジストロフィン遺伝子付近の塩基配列の情報が蓄積され,テロメア側約2Mbの位置にGK(glycerol kinase deficiency)が,セントロメア側近傍にTCTE1L(t-complex-associated testis-expressed 1-like)があることが判明している。この情報をもとに,ジストロフィン遺伝子領域(2.3Mb)だけをヒトX染色体より切り出し,人工染色体HAC-SC20に転座させた染色体ベクターHAC-SC20-dysを作成することに成功した。現在,この人工染色体をヒト筋芽細胞やマウスES細胞内に導入することにより,ヒト細胞およびマウス個体内で安定にジストロフィン遺伝子が発現するかについて研究を進めている。本年度の研究結果は,今後,DMDの遺伝子治療やDMDモデルマウス作成に研究を発展させるための基礎となる実験系を確立したものと評価できると思われる。

デュシャンヌ型筋ジストロフィー(DMD)の原因遺伝子であるジストロフィンは,全長2.4MBにも及ぶ巨大な遺伝子であり,このような巨大な遺伝子を通常の遺伝子操作により細胞内に導入することは.ベクターに組み込む遺伝子サイズの制約によりきわめて困難である。本研究は,ヒト染色体の断片を転座させた人工染色体をマウス胚幹細胞に微小核融合法を用いて直接導入しヒト染色体の一部を保持したマウスを作成するという新しいアプローチから,DMDの究極的なモデル動物を作成することを目的としたものである。昨年度の研究により,ヒトX染色体のジストロフィン遺伝子領域を人工染色体HAC-SC20(ヒト第14染色体由来)に転座させた染色体ベクターHAC-SC20-dysを作成することに成功した。本年度は,ジストロフィン遺伝子だけが「ヒト」化した新しいモデルマウスの作成のための基礎的な研究を行い,以下の結果を得た。1)エクソン23における点突然変異によりジストロフィン遺伝子が発現しない突然変異系統であるmdxマウスに由来するES細胞株mdx-1を新規に樹立した。2)このES細胞株は,高いキメラ形成能があることを確認し,GFP遺伝子で標識することによりキメラ個体を解析するための実験系を確立した。3)ミクロセル融合法によりHAC-SC20-dysを導入することにより,本人工染色体ベクターを保持する多数のmdx-1 ES細胞株を分離した。現在,これらのES細胞株とmdxマウス胚盤胞を用いたキメラマウスを作成中であるが,ヒトジストロフィン遺伝子のみが発現するマウス作成のための基本的な実験系がほぼ確立したと考えられる。
光周波数追従式干渉形光ファイバセンサの開発

干渉形光ファイバセンサ(OFS)では、被測定量の変化を光ファイバで構成される干渉計ア-ムの光路長の変化に変えて、干渉計で検出する。干渉計を用いる計測法においては、通常、測定値が干渉縞の移動量で与えられるので、その分解能は1/10干渉縞程度に制限される。このような干渉形のセンサで分解能を上げるためには、1以下の干渉縞の移動を高精度かつ高安定に計測する新しい方法の開発が不可避である。本研究では、干渉計における信号光と参照光の位相差が常に一定になるように、光源の光の波長(光周波数)を追従させながらその周波数を計測する新しい方法の原理を実証し、精度および安定度の限界を明らかにし、実用的な干渉形OFSの新しい方式を確立することを目的として、以下の各項を実施した。1.光周波数追従式干渉形光ファイバセンサの原型モデルの設計、2.同センサの期待精度、安定性限界の理論的検討、3.光周波数追従式干渉型光ファイバセンサの動作原理の実証、4.同センサの原型モデルの製作、5.原型モデルによる特性測定の実施。その結果、(1)光周波数追従式光ファイバセンサが原理的に可能であること、(2)期待精度は例えばcmの変位に対して8ないし9桁で、サブナノメ-タの分解能が容易に達成できること、が理論的・実験的に確認できた。これらの結果の一部については、学会で既に発表済みであり、また、本研究の取りまとめを今秋英国で開かれるセンサとその応用に関する国際会議で発表する予定である。
TGF-βスーパーファミリーのシグナル伝達機構

TGF-βスーパーファミリーシグナルは他の様々なシグナルとのクロストークが報告されておりWntシグナルもその1つである。そこで、Wntシグナルの構成因子の1つであるAdenomatouspolyposis coli (APC)の結合因子として同定され、癌抑制因子として働いていると考えられているDorosophila discs large tumor suppression protein(DLG)の生体での機能を明らかにすることを目的とし、研究を行ってきた。これまでの本研究室の研究によりSfrp2がDLGのターゲット遺伝子であり、転写因子であるRunxにより転写が調節されている事が解明された。そこで実際に生体内でもこの分子メカニズムが重要である事を示すためにDLGノックアウトマウスの組織でSfrp2の発現の変化を検討したが、明らかな差は観られなかった。その他、DLGノックアウトマウス由来のMEF細胞ではWntシグナル構成因子であるβ-cateninの発現が上昇し、細胞運動能が亢進していた。この現象がSfrp2の発現量の差によるのか、またはAPCなど他の分子を介した現象なのかは今後の課題である。さらに、DLGノックアウトマウスで異常の観られる心臓の細胞を培養し、細胞運動能を検討したが、野生型との間で明らかな差は観られなかった。今年度はヒトリンパ節のcDNAライブラリー用いて7.4X10^6クローンのスクリーニングを行いシーケンスを行った結果、すでにDLG結合タンパク質として報告されているMitochondrial ribosomal protein S34やAPCの他複数の新規DLG結合タンパク質の候補が得られた。その中からGST結合型タンパク質を用いたin vitroでのDLGとの結合が確認されたRhoA特異的なguaninenucleotide exchange factor(GEF)であるNeuroepithelial cell transforming gene 1(NET1)との結合の機能解析を進めていくことにした。Yeastで取れてきたcDNAのシーケンスの結果から2種類のNET1のvariantの可能性が考えられたことから両方のvariantの全長cDNAを作成して293T細胞に強制発現させ、内因性のDLGとの結合を確認した。またNET1がDLGのPDZ領域と結合していることをGST結合型DLGタンパク質を用いてin vitroで確認した。そこで、Wntシグナルの構成因子の1つであるAdenomatous polyposis coli(APC)の結合因子として同定され、癌抑制因子として働いていると考えられているDorosophila discs large tumor suppression protein(DLG)の生体での機能を明らかにすることを目的とし、研究を行っている。そこで実際に生体内でもこの分子メカニズムが重要である事を示したいと考えた。DLGノックアウトマウスでは腎臓や心臓で異常が観られる。そこで、異常が観られたDLGノックアウトマウスの組織でSfrp2の発現の変化を免疫染色により検討したが、明らかな差は観られなかった。その他、DLGノックアウトマウス由来のMEF細胞ではWntシグナル構成因子であるb-cateninの細胞間での発現が上昇している事や、b-cateninのタンパク質が安定化している事が明らかになった。さらに、Wounding assayによりDLGノックアウトマウス由来のMEF細胞はmigration能が亢進していた。この現象がSfrp2の発現量の差によるのか、またはAPCなど他の分子を介した現象なのか現在解析中である。
単細胞緑藻カルテリアの細胞内リケッチアからミトコンドリア共生の初期進化過程を探る

申請者は、単細胞緑藻Carteria cerasiformts NIES-425における細胞内共生リケッチア、通称"MIDORIKO"を用いて、バクテリア分裂装置遺伝子の細胞内共生に伴うホスト核への水平伝播過程を解明し、ミトコンドリアの進化初期段階を推測することを目的としている。平成25年度は以下(l)(2)を実施した。ホスト核に転移した分裂装置遺伝子の探索に用いるため、MIDORIKOゲノムDNA配列の解読を試みた。高速シーケンサによるsingle-endシーケンスのde novoアセンブルとアノテーションの結果、コンティグから原核生物性の1255 CDS、3 rRNA、35 tRNAを同定し、バクテリアの分裂と細胞壁合成に関わるDCWクラスター群遺伝子を予測CDS中から同定した。またアセンプルの精度を上げるため、paired-endシーケンスデータの追加と条件検討を行っており、コンティグ長を延ばすことに成功している。(2)ホストゲノムへ水平伝播したMIDORIKO分裂・細胞壁合成関連遺伝子配列の発見ゲノム情報が既知である群体性緑藻Volvox carteriにおいて細胞内バクテリアの分子同定を行い、MIDORIKOにごく近縁なリケッチア科バクテリアを発見した。DAPI染色とゲノムPCRによる調査から、MIDORIKOを保有する株は9株中1株であることが判明した(Kawafune et al, 2014 Phycologia)。更にゲノムデータベース検索及びゲノムPCRの結果、リケッチアを保有しない8株のゲノムから、MIDORIKO DCWクラスター群遺伝子ORFの全長または一部が発見された。MIDORIKOからV. carteriゲノムへと分裂装置遺伝子DNA配列が転移した事が示され、V. cateriでは過去、MIDORIKOの共生と共生体遺伝子水平伝播が生じたことが示唆された。(抄録なし)申請者は、単細胞緑藻Carteria cerasiformis NIES-425における細胞内共生リケッチア、通称"MIDORIKO"を用いて、バクテリア分裂装置遺伝子の細胞内共生に伴うホスト核への水平伝播過程を解明し、ミトコンドリアの進化初期段階を推測することを目的として研究を行っている。平成24年度は以下(1)(2)を実施した。(1)緑藻細胞内リケッチアMIOORIKOの高圧凍結・凍結置換固定を使用した透過電子顕微鏡観察従来リケッチアの観測に用いられてきた化学固定法は、MIPORIKOのホストC.cerasiformisでは細胞内バクテリアの微細構造を保存できないという問題があった。そこでより鮮明な像を得るため、高圧凍結・凍結置換法を使用したMIDORIKO透過電子顕微鏡観察を行った。結果、MIDORIKOは近縁なRickettsia属と類似の細胞構造を有しており、食包膜に覆われず直接ホスト細胞質中に存在するというミトコンドリアと同様の膜トポロジーを持つことを明らかにした(Kawafune et al. 2012. Protoplasma, Published online)。(2)MIDORIKOゲノムの解読による分裂装置遺伝子の同定MIDORIKOゲノムからホスト核に転移した分裂装置遺伝子の探索に用いるため、MID(7RIKOゲノムの解読を試みた。ホスト細胞破砕物から、条件検討の結果遠心分画でMlpeRIKOをホストの核・葉緑体・ミトコンドリアから分離することに成功した。抽出したMIDORIKOゲノムDNAのsingle-endシーケンスをillumina GAIIxにより行い、十分量のリードを得た。現在、リードのdenovoアセンブル及びアノテーションを行っており、これまでに分裂と細胞壁合成に関わるDCWクラスター群遺伝子配列を予測している。

年度当初に予定していた事項はほぼ達成できたが、バクテリア分裂装置遺伝子の同定は現在行っている最中であり、その結果を利用したバクテリア分裂装置の免疫染色を併用した透過電子顕微鏡観察は実施できなかったため。(1)緑藻細胞内共生リケッチア"MIAORIKO"ゲノム完全解読を行い、その結果を利用して(2)免疫染色を併用した透過電子顕微鏡観察によるバクテリア分裂装置の観測と、(3)ホスト核に転移したMIDORIKO分裂遺伝子配列の探索を行う。現在次世代シーケンサから得られているMIDORIKOゲノムのsingle-endリード由来のコンティグは、ATリッチかつリピートを多く含んでいるため、リード数が十分であるにも関わらず完全解読は困難であることが予想された。よって、MIDORIKOゲノム完全解読のためにpaired-endシーケンスと、さらに必要ならばmate-pairシーケンスを実施する予定である。(抄録なし)
ゲノム修復における動的クロマチン構造変換

染色体や核内蛋白質などにより構築される細胞核高次構造は、クロマチン構造を反映し、転写、修復、複製などのDNA代謝の制御に重要な役割を果たしていると考えられているが、修復と動的クロマチン構造の関連については、修復が行われる場所を含めて詳細は不明である。相同組換え修復(HR)は、DNA二本鎖切断や損傷複製フォークなど様々なゲノム損傷を正確に修復する生命意味に必須のゲノム修復機構である。本研究では、分子細胞生物学的手法を用いてRAD51が集積する束状核内領域がHR factoryである可能性を検証する。ついで、HR Factory構築メカニズムを解明するために、束状領域に集積しないRAD51変異体を用いたクロマチン構造関連因子を中心としたインタラクトーム解析を行う。これらの研究を通して、ゲノム修復における動的クロマチン構造の生物学的意義の解明に取り組む。平成29年度までに、H2A,Z-2複合体の解析やH2A,Z-2変異体を用いた紫外線マイクロ照射法などによる解析からRAD51と同様にH2A,Z-2の動態がSUMO化修飾機構により制御されていること、H2A,Z-2自体がSUMO化されていることを明らかにし、論文発表した。さらに、損傷誘導によりRAD51が集積するHR Factoryについて、その核内領域を超解像顕微鏡を用いて詳細に検討するとともに、その領域について生化学的特徴の解析を進めることで、ゲノム修復での動的クロマチン構造変換の生物学的意義の解明に取み、現在論文投稿準備中である。29年度が最終年度であるため、記入しない。相同組換え修復(HR)は、DNA二本鎖切断や損傷複製フォークなど様々なゲノム損傷を正確に修復する生命維持に必須のゲノム修復機構である。我々は、HR経路で中心的役割を果たす修復蛋白質RAD51の核内動態の解析を行い、RAD51がDNA合成期に核内フォーカスを形成すること、損傷部位に集積して核内フォーカスを形成すること、さらに核内フォーカス形成にSUMO化修飾機構やヒストンH2A.Z-2などが関わることなどを明らかにしてきた。そして、過剰発現されたGFP-RAD51により可視化された束状領域は、正常状態ではRAD51が備蓄され、損傷誘導時にはRAD51が動的になるとともに損傷DNAが移動してHRが行われるHR factoryであることを見出している。RAD51動態制御や損傷クロマチン構造変換には、SUMO化修飾機構やヒストンH2A.Z-2が関わっている可能性が予備的実験などから示されている。そこで本研究では、ゲノム修復制御における動的クロマチン構造変換の生物学的意義の解明のため、HR factoryでのSUMO化修飾を中心とした蛋白質翻訳後修飾機構とH2A.Z-2の役割を中心に検討を行う。平成28年度は、H2A.Z-2の動態制御にSUMO化修飾機構が関与していることを明らかにした。H2A.Z-2複合体の解析やH2A.Z-2変異体を用いた紫外線マイクロ照射法などによる解析から、RAD51と同様にH2A.Z-2の動態がSUMO化修飾機構により制御されていることを明らかにすることができた。本年度は、H2A.Z-2の動態制御に、H2A.Z-2自体かあるいは相互作用する因子がSUMO化されている可能性を検証する。さらに、損傷誘導によりRAD51が集積するHR factoryについて、その核内領域を超解像顕微鏡を用いて詳細に検討するとともに、その領域についての生化学的特徴の解析を進めることで、ゲノム修復での動的クロマチン構造変換の生物学的意義の解明に取り組む。
水中で機能するπ－ベンジルパラジウムを利用したベンジル位C-H結合の直接的変換法

水を溶媒とすることによって「不活性なベンジルアルコール」から水中で機能するπーベンジルパラジウム錯体を調製し、様々なベンジル化反応へ応用する。本法は、有機溶媒を用いた従来法では達成することができない革新的な分子変換手法であり、創薬を指向したビルディングブロックの構築に貢献する。さらに、化学物質を合成する際に必要な限りある資源・エネルギーおよび反応工程の無駄を無くし、創薬研究を持続的に発展させるための高い原子効率かつ廃棄物削減(副生成物は水のみ)を実現する環境調和型合成法である。
多孔質体理論に基づく，土砂災害発生モデルの提案

これまでの土壌雨量指数に用いられる「タンクモデル」は,時間的不連続性の問題や,土壌流出による土壌内部構造の変化を考慮せず,被害の危険性を十分表現しているとは言えない.大量の降水があった数日後の土壌状況の予測には,土壌内の水分量を計算するとともに,土壌成分の流出による一時的な土壌強度低下などが考えられ,その危険性を指標が正確に表現している状況にない.多孔質体概念の同友により,土壌の流出や,内部構造による流出速度の影響を加味した土壌内浸透モデルの構築により,適切な防災情報提供を目指す.これまでの土壌雨量指数に用いられる「タンクモデル」は,時間的不連続性の問題や,土壌流出による土壌内部構造の変化を考慮せず,被害の危険性を十分表現しているとは言えない.大量の降水があった数日後の土壌状況の予測には,土壌内の水分量を計算するとともに,土壌成分の流出による一時的な土壌強度低下などが考えられ,その危険性を指標が正確に表現している状況にない.多孔質体概念の同友により,土壌の流出や,内部構造による流出速度の影響を加味した土壌内浸透モデルの構築により,適切な防災情報提供を目指す.
シリコン検出器上に直接形成されたCMOS回路の高速熱窒化法による耐放射線化の研究

高エネルギー物理学における将来の高輝度衝突型加速器実験への応用を目的として、シリコン・ストリップまたはピクセル検出器をそれらの読み出し回路とともに同一シリコン・ウェハー上に作り込むための基礎技術の開発を行った。これらの読み出し回路は荷電粒子やガンマ線による放射線被爆を受けるため、その性能は、放射線量の累積によって必然的に劣化をきたすものである。この劣化を一定の許容され得るレベルに維持するための技術が耐放射線化の技術である。本研究では特にCMOS集積回路についてゲート酸化膜の耐放射線化を主要な観点として研究を開始した。まず、高速熱窒化法による耐放射能化に着目し、1.2ミクロンCMOSプロセスについてこれを適用し一定の耐放射性の向上を確認することができた。しかし、1.2ミクロンCMOSプロセスにおける酸化膜厚みによる制限及び半導体プロセス条件による制約があることから、あわせて、微細化の方向を目指すことが有効であることが判明した。そこで、シリコンストリップ検出器用に設計された多チャンネルCMOS前置増幅回路を制作し、その機能試験、及び雑音性能において飛躍的な改善を得ることができた。これは0.8ミクロプロセスを採用したことによる直接的な成果である。具体的には1.2ミクロンプロセスによるCMOS前置増幅回路の雑音性能との比較で入力容量の増加に対する雑音電子数の増加を半分以下(10e/pF)にすることができたことである。これは、本集積回路の具体的応用の可能性を拡大するものとして期待することができる。さらに、放射照射後の雑音性能の劣化については、照射後の雑音特性を単位照射量あたり雑音スロープの増加量は1.2ミクロンプロセスによるCMOS前置増幅回路との比較において1/10以下(0.06e/pF/krad)となっていることが判った。これは、本集積回路が過酷な放射線環境においても有用性を維持することができることを示すものである。高エネルギー物理学における将来の高輝度衝突型加速器実験への応用を目的として、シリコン・ストリップまたはピクセル検出器をそれらの読み出し回路とともに同一シリコン・ウェハ-上に作り込むための基礎技術の開発を作った。本年度は読み出し回路として、低消費電力及び高集積化の観点から、CMOS回路に特定してその放射線損傷に関する特性評価および大規模集積回路の試作開発を行った。耐放射線性についてはシリコン・ウェハ-上に作りこまれた1.2ミクロンおよび0.8ミクロン・プロセスのテスト・トランジスターをコバルト照射することによってガンマー線による特性劣化を調査した。これらテスト・トランジスターには高速熱窒化法による素子も含まれており、今後の開発の方向を決める上で重要な役割を果たした。即ち高速熱窒化法によれば放射線損傷による特性の劣化を格段に改善できることは確認できたが、同時に素子の標準特性の、高速熱窒化法によらない場合との、あわせ込みに未だ難点があり、設計の再利用を困難なものとしている。そこで高速熱窒化法に先立って実用規模のCMOS全置増幅器アレー回路の設計を0.8ミクロン・プロセスによって行うこととし、これによって相当程度の耐放射線性を確保するとともに、製造上の品質の安定性を担保することとした。すでにこの集積回路については評価用のサンプルを入手し、予備的な試験において、動作確認及び線形性、信号対雑音比等の性能確認を終了している。これらの試験において性能の確認されたサンプルを用いて、さらに、耐放射線特性の評価を行うことを予定している。

前年度は読み出し回路として、低消費電力及び高集積化の観点から、CMOS回路に特定して、単体トランジスターの放射線損傷に関する特性評価および大規模集積回路の予備的開発を行った。これらのテストサンプルについて詳細な耐放射線特性の評価をおこなったところ、初期特性のわずがなずれが放射線照射によって拡大され、放射線耐性のばらつきを支配している可能性が明らかになった。この初期特性は回路が作り込まれたウェハー上の位置との相関が認められることから半導体プロセスに何らかの原因が求められる。特に、耐放射線性の向上のために微細化プロセスを採用したこと、高速熱窒化法によってゲート酸化膜の耐放射線性を改善したこと、また回路構成上、高抵抗ポリシリコンを用いたダンピング抵抗を積分回路に挿入し低周波の擾乱に対する対策をほどこしたことなどが間接的かつ相互に影響していることが考えられる。ウェハー面内での回路特性の均一化は将来の実用的な規模のピクセル検出器を実現するためには必須の要件である。そこで、今年度はウエハー面内での素子特性の均一化をめざして、ばらつき特性を確認し、さらに、半導体体プロセスの最適化を行うこととした。高エネルギー物理学における将来の高輝度衝突型加速器実験への応用を目的として、シリコン・ストリップまたはピクセル検出器をそれらの読み出し回路とともに同一シリコン・ウェハー上に作り込むための基礎技術の開発を行った。昨年度の懸案であったウェハー面内での素子特性の均一化の問題について、半導体プロセスの観点から改良を加えた結果、一定の改善を得ることができた。本改良に基づいて、シリコンストリップ検出器用に設計された多チャンネルCMOS前置増幅回路を制作し、その機能試験、及び雑音性能において飛躍的な改善を得ることができた。これは0.8ミクロンプロセスを採用したことによる直接的な成果である。具体的には1.2ミクロンプロセスによるCMOS前置増幅回路の雑音性能との比較で入力容量の増加に対する雑音電子数の増加(以下、雑音スロープと言う)を半分以下(具体的には、10e/pF)にすることができたことである。これは、本集積回路の具体的応用の可能性を拡大するものとして期待することができる。さらに、耐放射線耐性についてセシウム137からのガンマ線を用いて雑音性能の劣化について調査した。照射後の雑音特性を単位照射量あたりの雑音スロープの増加量は1.2ミクロンプロセスによるCMOS前置増幅回路との比較において1/10以下(具体的には、0.06e/pF/krad)となっていることが判った。これは、本集積回路が高輝度衝突型加速器実験における過酷な放射線環境においても有用性を維持することができることを示すものである。
オキシトシン分泌を制御する延髄ノルアドレナリン神経:グルタミン酸受容体による修飾

侵害刺激を動物に加えると下垂体後葉からのオキシトシン分泌が促進する。この反応は、延髄腹外側部のA1ノルアドレナリン神経が伝達することを明らかにしてきた。平成10年度は、視索上核におけるノルアドレナリン放出がNMDA受容体の活性化により抑制されていることを、NMDA受容体のアンタゴニストと脳内微量透析法を用いた実験により明らかにした。本年度は、このNMDA受容体による抑制的制御が、生理的刺激によるノルアドレナリン放出においても働いているかを検討した。ラットをウレタン麻酔し、経咽頭的に視索上核を露出し、直視下に視索上核内に脳内微小灌流用プローブを刺入した。人工脳脊髄液を灌流し、灌流液を10分或いは5分間隔に採取し、灌流液中のノルアドレナリン濃度を電気化学検出器付のHPLCで定量した。侵害刺激による視索上核内でのノルアドレナリン放出が、NMDA受容体により、抑制されているか検討した。侵害刺激として、ラットの足掌部皮膚表面を電気刺激した。この侵害刺激を2時間間隔で、2回繰り返した。2回目の侵害刺激を加える30分前から、プローブを通じ、視索上核内にNMDA受容体のアンタゴニストであるMK801あるいはその偽薬を投与した。侵害刺激は、再現性よく、視索上核におけるノルアドレナリン放出を増加させた。MK801を投与すると、視索上核のノルアドレナリン放出の基礎値が増加した。侵害刺激に対する視索上核内でのノルアドレナリン放出はMK801を局所投与した群においては偽薬投与群に比較し、より大きく増加した。以上のデータから、生理的にも、NMDA受容体は、ノルアドレナリン放出を抑制していることを示唆された。オキシトシン分泌細胞が存在する視索上核は、延髄ノルアドレナリン神経の強い投射を受けている。このノルアドレナリン神経は侵害刺激あるいはコレシストキニン投与後に観察されるオキシトシン分泌を伝達すると考えられている。一方、視索上核には、NMDA受容体が存在する。しかし、視索上核のノルアドレナリン放出がNMDA受容体による制御を受けているか不明である。本年度は、視索上核におけるノルアドレナリンの放出をマイクロダイアリシス法で測定し、ノルアドレナリン放出が視索上核のNMDA受容体により修飾されるか検討した。動物は、ウィスター系雄ラットを用いた。ウレタン麻酔下で経咽頭的に視索上核を露出し、直視下に視索上核内にマイクロダイアリシスプローブを刺入した。人工脳脊髄液を視索上核内に灌流し、灌流液を10分間隔で採取した。灌流液中のノルアドレナリン量を、電気化学検出器付きのHPLCで定量化した。NMDAあるいはNMDA受容体アンタゴニストを視索上核内に、プローブを通じて投与した。0.5mMのNMDAを視索上核内に投与すると灌流液中のノルアドレナリン量は減少した。NMDAに対する抑制反応はノルアドレナリン取り込み阻害剤のdesipramine存在下でも観察できた。NMDA受容体アンタゴニストMK801あるいはAP5を投与すると灌流液中のノルアドレナリン量が増加した。これらのデータは、視索上核におけるNMDA受容体はプレシナプス的にノルアドレナリン放出を抑制していることを示唆している。
人種隔離関連法による南アフリカ植民都市空間の実効的再編過程に関する研究

本研究は、南アフリカの内陸植民都市を対象として、その空間の形成、変容、再編過程を明らかにしたものである。主な対象都市は19世紀のボーア人の内陸移動にともない1838年に建設されたピーターマリッツバーグであり、その空間変容の実態を臨地調査に基づき明らかにした。また、比較対象として、ケープ植民地の拡大にともない1785年に建設されたグラーフ・ライネを比較対象都市として分析・考察を行った。いずれも明確なグリッド・パターンの都市形態を入植以来維持しているが、街区内部は農耕から居住・商業に適するよう敷地が細分化され、人口増加とともに多人種が混住する過程などを明らかにした。本年度は、主に南アフリカ内陸植民都市であるピーターマリッツバーグにおいて史資料収集および臨地予備調査を行った。調査施設は、State Archives、Surveyor General、Town Planning Office(GISSection)である。State Archivesで入手した1906年の調査地図("New Map of the City ofPietermaritzburg")と入植初期の1845年の敷地割図を基に街区変容の分析・考察を行った。ピーターマリッツバーグは、1838年に建設されたボーア人集落であり、当初は1区画erf (450ftΧ150ft)を基本単位として10区画で1つの街区を構成し、厳格なグリッド・パターンによって集落が形成された。1845年のイギリスによるナタール併合後、19世紀後半はグリッド・パターンの都市形態を維持したまま、居住や商業に転用するため、街区内部に細い街路が加えられ敷地が細分化されている。1906年の地図は、カラー印刷されており、全ての街区(約400)をデジタルカメラで撮影した。レンガ造建築、波形鉄板建築、空地、公園・植栽に色分け分類されており、鉄道、ドラム、川、橋、小橋、道路、郵便ポストの記号が表示されている。建物の詳細な外形まで描かれており、入植直後の農耕区画から街区内部が細分化され、半世紀間め急激な人口増加にともなって住宅が建て詰まっていることが読み取れる。1845年の時点で、現在のグリッド・パターンの都市形態はほぼ完成しており変化がない一方で、それぞれの街区内部は細分化され、半世紀間で激しく変容している。本年度は、昨年度に引き続きピーターマリッツバーグの現地調査を行うと共に、比較分析のために同じく南アフリカ内陸植民都市であるグラーフ・ライネに関しても史・資料収集を行った。主な調査機関は、National Archives(Cape Town)とSAHRA(South African Heritage Resources Agency)である。ピーターマリッツバーグに関しては、昨年度の現地調査で入手した1906年の古地図データを基に全街区の変容過程について分析考察を行った。さらに、本年度の現地調査で入手した1986年に行われた全棟調査の記録資料を基にさらに詳細に街区変容について分析考察を行った。また、昨年度の現地調査過程で比較分析の対象都市として浮上したグラーフ・ライネに関しての史・資料収集も行った。入手した1823年のG.トンプソンによる詳細な古地図資料を基に街区構成について分析考察を行った。建設当初のグラーフ・ライネの集落はピーターマリッツバーグの1/15程度であり、東西150ft.×南北220ft.の街区が7分割されたものが1区画erfとなっている。グラーフ・ライネの1街区の大きさは、ピーターマリッツバーグの1区画の約半分であり、共通の寸法体系が読み取れる。G.トンプソンによる測量地図に記載されているスケールは当時のオランダ植民地で広く使われていた計画寸法であり、1 Rhine Yard=3 Rhine feet=3×0.3148m=0.9444mである。グラーフ・ライネの人口は18世紀末から19世紀にかけて急増するが、19世紀を通じてあまり変化がない。建設当初の農耕グリッドは現在でも維持されている一方で、街区内部は居住や商業に適するよう細分化されている。ピーターマリッツバーグと異なり、敷地の細分化の過程でクルドサックなど囲い込み型の街区が形成されているのが特徴である。
惑星探査ローバ搭載小型X線回折装置の開発

本研究は月惑星表面探査用ローバーに搭載される岩石分析装置の基礎開発である。岩石にX線を照射し、発生する蛍光X線を分析して元素組成を、回折X線の幾何学的位置を同定して鉱物組成を同時に測定しようとするものである。開発要素としては、衛星・ローバーに搭載できるX線発生装置、蛍光X線・回折X線検出器、岩石試料搬送・セッティング装置と装置制御とデータ収集の電子回路がある。本研究期間では最も開発に新しい要素の要求されるX線発生装置とX線検出器の開発、および、コンパクトな電子回路の製作検討を行った。1.X線発生装置としては小型軽量でかつ、2次X線を発生するのに必要なフラックスが取れることが要求される。H14年度に引き続き検討した後、医用X線源として使用される3cm×5cmの大きさでフィラメント加熱電子照射型のX線発生管を振動に耐えられるよう補強などを施したものを試作・試験し、まずは、搭載可能であることを確かめた。近年開発が進んでいる新素材カーボンナノチューブをフィラメントに替わって電子発生効率の優れた有用性を使用できることも確かめることができた。2.H14年度の検討の結果、検出器としてはフォトダイオードアレイよりもX線に感度を持つ空乏層の厚いCCDの方が適していた。CCDでも冷却が十分、低消費電力で行えることがわかったためであり、CCDのもつ2次元検出能力を回折X線像同定に利用でき、有利である。3.電子回路を軽量・コンパクトにすることはFPGAなどの利用により十分可能である。実際にFPGAにプログラムを書き込む手法を習得した。本研究では近い将来実現しようとする固体惑星探査で必要不可欠であるローバーによる岩石鉱物精査に使用されるX線分析装置の開発を行う。開発要素として検討、開発が必要なものは、照射X線を発生するX線発生装置、回折X線検出器、回折装置へ採集岩石試料を粉砕・整形や搬送を行うプレパレーションメカニズムの3点がある。これらの性能が目的にかなうことを前提として小型・軽量であるとともにリモートセンシングであるからほとんど自動で稼動する必要がある。本年度重点的に行った開発研究は、(1)X線発生装置の検討と設計と(2)回折X線検出器の試作・試験である。(1)直径1cm、長さ10cmのマイクロX線チューブに人工衛星打上時振動環境に耐えられるように保持機構を新たにデザインした。またX線チューブに印加する高圧力電圧を発生する宇宙仕様の電源を策定した。月惑星表面着陸時に舞い上がる砂塵への対策も必要である。(2)検出器には当初フォトダイオードアレイを使うことを検討したが、X線が検知できるCCDの方が回折線のみならず、エネルギー分析も同時に可能であるため採用することとした。当初はCCDの稼動には-40°C以下の低温条件が必要なためフォトダイオードの使用を想定していたが、冷却の可能性が出てきたのでCCDを使用してX線回折(XRD)とX線分光(XRS)の試験を行った。結果は同時測定が可能であることを示し、検出器部は開発できたと確信できるに至った。

H14年度に引き続き検討した後、医用X線源として使用される3cm×5cmの大きさでフィラメント加熱電子照射型のX線発生管を振動に耐えられるよう補強などを施したものを試作・試験し、まずは、搭載可能であることを確かめた。近年開発が進んでいる新素材カーボンナノチューブをフィラメントに替わって電子発生効率の優れた有用性を使用できることも確かめることができた。2.H14年度の検討の結果、検出器としてはフォトダイオードアレイよりもX線に感度を持つ空乏層の厚いCCDの方が適していた。CCDでも冷却が十分、低消費電力で行えることがわかったためであり、CCDのもつ2次元検出能力を回折X線像同定に利用でき、有利である。3.電子回路を軽量・コンパクトにすることはFPGAなどの利用により十分可能である。実際にFPGAにプログラムを書き込む手法を習得した。
遺伝子診断により発症前診断を受けた家族性腫瘍患者および家系員の看護支援

【目的】発症前診断を受けた家族性腫瘍患者の看護支援方法を探索するために、(1)家族性大腸腺腫症患者の大腸全摘後の排泄障害に対する対処方法、(2)遺伝相談外来における発症前診断前後の看護師の役割、(3)米国の遺伝看護の状況を明確化する【方法】(1)家族性大腸腺腫症患者5名に対しインタビューを行い、排泄障害に対する対処方法について質的分析を行った(2)遺伝相談外来にて家族性腫瘍患者の発症前診断前後の看護に携わる国内外の看護師3名に対して、インタビュー調査を行い、看護師の役割を明確化した(3)米国の遺伝看護教育および遺伝カウンセリングの実態調査を行った【結果】(1)患者自身の対処方法は、[症状をアセスメントする][体の状態に合わせた行動をとる][親の体験を参考にする][症状にまつわる感情の調節をする][予防的方略を模索する][社会復帰への手がかりを見つける]、以上6つであった。(2)看護師の認識していた役割は、[臨床経験のバックグラウンドを生かした関わりをする][他事例の体験を紹介する][精神的なサポートを行う][治療や検査、症状コントロールにも関わる][各診療間の繋ぎをする]、以上の5つであった。(3)アイオワ州では1976年よりRegional Genetic Consultation Serviceが提供されていた。この中では、利用者の増加に伴い家族性腫瘍の発症前診断については、電話にて行っているケースもみられた。また、米国の遺伝看護教育は、学部教育の段階から系統的に行われていた。【考察】日本の遺伝看護の状況は、予防的措置にまつわる問題の対処法を模索する患者と、数少ない遺伝看護を担う看護師の役割が対応していない現状が明らかとなった。したがって、このような臨床状況を踏まえ、遺伝看護教育の充実および遺伝相談システムの確立をしていくことが急務といえる。本年度の目的は、家系員への遺伝情報開示の意志決定過程の1つである患者の体験に焦点をあて、看護支援方法を明らかにすることである。以下の2点を計画し研究を進めた。1.家族性大腸腺腫症患者の予防的手術後の患者の体験や、患者を中心とした症状マネジメントの方略の明確化2.海外のがん予防医学の現状とそれに関わる看護師の役割に関する内容把握家族性大腸腺腫症患者5名を対象に、症状マネジメントの概念枠組み(The Model of Symptom Management : MSM)を用いて質的記述的研究を行った。結果は、MSMの中の症状体験の中には、自分自身の体験のみでなく、過去に自分と同じように予防的手術を受けた親の体験が潜在的にあり、それを土台に自分の症状体験を捉えていることが明らかとなった。これは、家族性腫瘍患者の症状体験の特徴であり、患者自身の症状マネジメントの方略にも影響を及ぼしていた。海外調査では、Oncology Nursing Society 29th Annual Congress April 29-May 2,2004・Anaheim, CAに参加し、がん予防スクリーニングやリスクアセスメント後のカウンセリングについての米国の現状を調査した。ここでは、看護師が家族をシステムとして捉え、家系員の感情的な反応にも注意を払うことの必要性が示されていた。今年度の研究調査からは以上の結果が得られたが、次年度は家系員への遺伝情報開示の意志決定過程の中の、「家系員への遺伝情報開示のプロセス」に焦点をあてた調査を行い、家系内の複数の罹患者に対して看護者が介入する方法を構造化する予定である。
口腔がん微小環境内のがん幹細胞と腫瘍関連マクロファージの機能解析と新たな治療戦略

腫瘍組織再現能をもち、抗癌剤や放射線への抵抗性を有し、再発・転移の最大原因と考えられているがん幹細胞(Cancer stem cell: CSC)に注目した新たな口腔癌に対する治療法の開発を目指した研究である。CSCは「静止期」と呼ばれる冬眠状態にとどまっており、細胞増殖をほとんど行っていない。そのため、従来の癌細胞の増殖抑制を目的とした治療では、静止期に維持されているCSCに効果を発揮できない。従って、CSCを静止期から増殖期に移行させる治療の開発が直近の課題となっている。本研究は、口腔癌微小環境内におけるCSCとCSCを静止期から増殖期に移行させる重要な鍵を握ると思われる腫瘍関連マクロファージ(Tumor associated macrophage: TAM)との相互作用を解析する。さらに、CSCにおけるPI3K/Akt/mTOR経路とTAMにおける活性経路の双方からアプローチし、治療抵抗性を示す口腔癌に対する新たな治療法の開発を目指している。現在までに、In vitroの実験でマウス由来の扁平上皮癌株(SCC7)およびヒト由来リンパ節転移口腔扁平上皮癌(Oral squamous cell carcinoma: OSCC)細胞株(HSC-3)とリンパ節非転移OSCC細胞株(HSC-2)を用いたIn vitroでスフェロイド形成能を持つCSCの分離培養実験を継続中である。一方In vivoの実験では、マウス由来の扁平上皮癌株(SCC7)を2×107/mlに調整し、C3Hマウスの口腔内(舌、歯肉)もしくは咬筋内に移植し、口腔癌浸潤モデルマウスの作製に成功し、また、同様に高リンパ節転移OSCC細胞株においても、無胸腺マウスの口腔内(舌、歯肉)もしくは咬筋内に移植し、口腔癌リンパ節転移モデルマウスの作製にも成功している。平成30年4月、東京医科大学口腔外科学分野から日本歯科大学生命歯学部口腔外科学講座に転職し、研究環境が大きく変わったことで研究に大幅な遅れが生じた。日本歯科大学生命歯学部口腔外科学講座の主な研究はインプラント表面性状に関する研究等であり、着任して直ちに細胞培養を行う研究環境の整備に取りかかり、その後順調に培養実験を稼働させるのに時間を要した。また、研究の内容としてはCD44陽性腫瘍細胞とCD44陰性腫瘍細胞との分取は可能であったが、Rho kinase阻害剤を添加したES細胞用の無血清培地を使用してCD44陽性腫瘍細胞に対してスフェロイド形成能を有する状態にすることができなかったことが、研究を停滞させた大きな原因であった。現在、研究分担者と原因を追究中である。そのため、平成30年度の研究計画を平成31年度に行うことになり、このような理由から平成30年度の研究経費の大部分は平成31年度に繰り越すこととなった。研究分担者と共同で培地等の改良を行い、In vitroでスフェロイド形成能を持ったCD44発現CSCの単独培養を試みる。Western blot法およびreal-time PCRを用いて、CSC特性としてのCD44発現、Nanog等の幹細胞に特有な遺伝子発現、血清添加培地でCD44陰性の上皮性腫瘍細胞への分化能を有しているかを検討する。さらに免疫不全マウスに移植し、原発口腔癌と区別できない腫瘍形成を有しているかも検討する。そして液性因子(IL-6, MFG-E8)やmTOR阻害剤(Rapamycin)によるCSC activation抑制効果を解析する。一方In vivoでは、マウス由来の扁平上皮癌株(SCC7)の口腔癌浸潤モデルマウスと口腔癌リンパ節転移モデルマウスをそれぞれコントロール群、CSF-1R阻害剤投与群、mTOR阻害剤投与群の3群、計6群で抗腫瘍効果、リンパ節転移抑制効果、CSC activation抑制効果と予後(生存日数)について比較検討を行う。CSF-1R阻害剤(PLX3397)、mTOR阻害剤(Rapamycin)によるTAM発現の解析については、F4/80およびCD163,CD204,CSF-1R(CD115)の発現を免疫組織化学染色法およびin situ hybridization法を用いて行う。mTOR阻害剤投与群、CSF-1R阻害剤投与群、コントロール群の3群でTAM局在や発現強度について比較検討する。また、腫瘍微小環境内におけるVEGF-C,COX-2,NF-κB,CSF-1,TNF,IL-6, MFG-E8,CD44,CD133の発現について免疫組織化学染色法およびin situ hybridization法を用いて評価する。平成29年度の計画では、リンパ節転移OSCC細胞株(HSC-3)とリンパ節非転移OSCC細胞株(HSC-2)を用い、転移細胞株と非転移細胞株間でのCSF-1, NF-κB ,COX-2,VEGF-C発現、CD44(陽性、陰性)腫瘍細胞発現について検証した後、スフェロイド形成能を持つCSCを分離培養する予定であったが、細胞培養からの分離培養が上手くいかず、スフェロイド形成能を持ったCD44発現CSCを得られていない。平成29年度の計画では、リンパ節転移OSCC細胞株(HSC-3)とリンパ節非転移OSCC細胞株(HSC-2)を用い、転移細胞株と非転移細胞株間でのCSF-1, NF-κB ,COX-2,VEGF-C発現、CD44(陽性、陰性)腫瘍細胞発現についての検証までは、順調に遂行した。