hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
犬と猫の骨格筋由来因子マイオカインの分子構造と肥満に伴う変動の解析

運動強度の変更、または他のマイオカインについての調査が必要と考えられた。初年度我々は、イヌ骨格筋由来cDNAからのクローニングによってイリシンが転写レベルでイヌに発現していることを確かめた。さらに臓器発現分布を確認し、骨格筋以外のいくつかの臓器でもイリシンが発現していることを確認した。今年度は、市販のイリシンELISAキットのうち犬のイリシン測定にも利用できるキットが明らかとなり、それを用いて健常犬における血中イリシン濃度の基準値、日内変動の有無、運動負荷に対する反応をそれぞれ明らかにすることができた。分子レベルの解析から始めた犬のマイオカイン研究であるが、これによってin vivoでの動態を確かめるところまで進展し、臨床応用へも結びつけられる下地ができたと言える。また、これまでに確立した実験手法や得られた検体は、今後イリシン以外のマイオカインにも適応可能である。骨格筋からクローニングしたイヌFibroblast growthfactor (FGF) 21は630 bpの翻訳領域、209個のアミノ酸からなり、他の動物種と比較したところ74-90%の相同性を示した。臓器発現分布の解析では、16種類の臓器(肺、胃、十二指腸、空腸、回腸、大腸、肝臓、膵臓、腎臓、脾臓、視床下部、脊髄、骨髄、脂肪、骨格筋、皮膚)全てにおいて発現が確認された。ヒトFGF21のELISAキットのイヌにおける有用性を確かめた希釈直線性試験、同時再現性試験、添加回収試験の結果はいずれも良好であり、本キットはイヌFGF21の測定に有用であると考えられた。健常犬15頭における血中FGF21濃度は平均値0.21ng/mL、最大値1.1ng/mL、最小値0.011ng/mL、中央値0.051ng/mLであり、雌雄差および年齢差は見られなかった。日内および日差変動、食事の影響が見られなかったことから、採血にあたってこれらを考慮する必要はないと考えられた。イヌにおいて、マイオカインであるFGF21の血中濃度に運動が及ぼす効果を検証した。3頭のビーグル犬をヒト用トレッドミルを用いて最大速度7 km/hで計10分間、2週間毎日運動(2日間の休みを含む)させたところ、血中FGF21濃度は1頭では1週目に上昇傾向、他の1頭では2週目に僅かながら有意な低下が見られたが、全般的に大きな変動は認められなかった。今後、運動強度のより高い条件下で追試を試行う事が必要と考えられた。次に、さまざまな疾患を持つイヌで血中FGF21濃度を測定したところ、腫瘍、炎症、肝臓疾患群のいずれも健常群より有意に高値を示し、特に腫瘍と肝臓疾患での値が高かった。悪性度や予後との関連についてさらにデータを蓄積すれば、イヌにおける新たな臨床検査項目としての応用が期待される。イヌFibroblast growthfactor (FGF) 21の分子構造は他種と高い相同性を示し、調べた全ての臓器で発現していた。健常犬15頭における血中FGF21濃度は平均値0.21ng/mL(最大値0.011-1.1 ng/mL)で、雌雄差、年齢差、日内および日差変動、食事の影響は見られなかった。ビーグル犬を最大速度7 km/hで計10分間、2週間運動(2日間の休み)させたところ、大きな変動は認められなかった。臨床例で血中FGF21濃度を測定したところ、腫瘍、炎症、肝臓疾患群で有意に高値を示した。
磁気共鳴画像診断のための生体環境応答性高分子造影剤の設計

核磁気共鳴画像診断(MRI)法は、非侵襲的な診断法として、ますます診断法としての有益性を増している。特にMRI法による腫瘍性疾患の診断には、多くの期待が寄せられている。昨年度までに、MRI法の機能診断能を向上することを目的とし、疾患部位の生理的状況に応答し、画像強調能が制御される造影剤を新規に開発した。特に、疾病部位の水素イオン濃度や酸性多糖のような酸性マトリックス量に応答し、MRI強調能をOn-Offしうる新規の生体内微小環境応答性造影剤の研究・開発を行った。本年度は、担ガンマウスを利用したインビボ実験により、個体レベルでの造影剤機能の評価を行った。その結果、ガドリニウムイオンを担持するポリアニオン性高分子と弱塩基性高分子カチオンからなるポリイオン複合体型造影剤は、主要部位で造影シグナルが増強することが、ガン部位および正常部位への直接投与によって確認された。さらに、血中投与においても、ガン部位でのシグナルが増強され、腫瘍特異的な造影に有効であることが示唆された。一方で、造影剤の毒性の低減、および複合体サイズの最適化が今後改善すべき課題として残った。一方、現在のMRI法では、ある程度の大きさに成長した腫瘍の検出は可能であるが、その悪性度を判断することは困難である。このように、疾患部位の特定のみならず疾患の生理的状況の検出、いわゆる機能診断機能の向上が強く望まれる。本研究では、疾患部位の生理的状況に応答し、画像強調能が制御される造影剤を新規に開発することにより、MRI法の機能診断能を向上することを目的とした。特に、疾病部位の水素イオン濃度や酸性多糖のような酸性マトリックス量に応答し、MRI強調能をOn-Offしうる新規の生体内微小環境応答性造影剤の開発を行った。pHや酸性マトリックスを検知し水和等の物性の変化を誘起するシステムとして、ポリカチオン性高分子とポリアニオン性高分子から構成される高分子電解質複合体に着目した。この複合体中に、プロトン緩和時間短縮効果があるガドリニウムイオンを内包させることにより、pHや酸性マトリックスの量に応答し画像強調能が変化する新規造影剤が実現された。本研究では、疾病に伴う病巣の微小変化を高感度で認識するインテリジェント型造影剤を開発し、磁気共鳴画像診断の高精度化を計ことを目的とする。MRIの造影剤として利用されているガドリニウムイオン(Gd)をキレートするdiethylenetriamine-N, N, N, N, N-pentaacetic acid(DTPA)を繰り返し単位に有する高分子を合成し、ポリカチオンであるPoly[2-(dimethylamino)ethyl methacrylate]とポリイオンコンプレックスを形成させ、そのポリイオンコンプレックスの緩和能のpH依存性を評価した。緩和能のpH依存性は0.47TのBruker NMS 120 Minispec 0.47Tを用い40°Cで行った。高分子化造影剤のみではpH5から9の範囲において緩和能に大きな変化は見られず、R1 relaxivityは7.6L/mmol/secであった。それに対し、ポリイオンコンプレックスはpH5から7にかけて減少し、8からまた上昇するプロファイルを取ることが観察された。pH5から7においてはポリイオンコンプレックスの安定化に伴う脱水の為にGdイオンと水との相互作用が減少していることに起因していると考えられ、またpH8以降に増加においてはPoly[2-(dimethylamino)ethyl methacrylate]の脱プロトン化によるイオンコンプレックスの不安定化に起因していると考えられる。このように、ポリイオンコンプレックスのpHに依存した物性変化により、pHの変化を緩和能に変換できることが分かった。特にMR1法による腫瘍性疾患の診断には、多くの期待が寄せられている。

特に、疾病部位の水素イオン濃度や酸性多糖のような酸性マトリックス量に応答し、MRI強調能をOn-Offしうる新規の生体内微小環境応答性造影剤の研究・開発を行った。本年度は、担ガンマウスを利用したインビボ実験により、個体レベルでの造影剤機能の評価を行った。その結果、ガドリニウムイオンを担持するポリアニオン性高分子と弱塩基性高分子カチオンからなるポリイオン複合体型造影剤は、主要部位で造影シグナルが増強することが、ガン部位および正常部位への直接投与によって確認された。さらに、血中投与においても、ガン部位でのシグナルが増強され、腫瘍特異的な造影に有効であることが示唆された。一方で、造影剤の毒性の低減、および複合体サイズの最適化が今後改善すべき課題として残った。
HIV外被糖蛋白gp120の立体構造変化による中和逃避及び中和抵抗性に関する研究

HIVのエンベロープタンパク(Env)を標的とし、感染を抑制する抗体を誘導するワクチン開発が求められている。しかし、HIVはEnvを変異させ、中和抗体から逃避することができる。変異が引き起こす中和抗体逃避メカニズムを詳細に解明することは、ワクチン開発を行う上で重要である。我々は、これまでにHIVの抗gp120-V3領域中和抗体(抗V3抗体)からの逃避に関する研究を行ってきた。V3領域はHIVが標的細胞に感染する際、受容体との結合に重要な領域であり、この領域を標的とした抗体には強い中和能があることが知られている。抗V3抗体を用い、この抗体から逃避するような中和抵抗性ウイルスを誘導したところ、エピトープ以外の領域であるV2領域の数アミノ酸変異で逃避できることが分かった。そこで、本年度はV2領域変異が引き起こす中和抵抗性メカニズムを詳細に解析した。site-directed mutagenesis法を用い、gp120のV2領域の変異を組み合わせたウイルスを作製し、中和感受性に影響を与える変異を探索したところ、L175P変異が抗V3抗体に対する感受性を20000倍以上上げることが分かった。その変異はウイルス膜上に存在する三量体gp120の立体構造に影響を与え、中和感受性を変化させる働きがあることがわかった。つまり、HIVは感染に最も重要と考えられるV3領域を守るため、エピトープ以外のV2領域に変異を入れることにより三量体構造を変えてエピトープを隠し、中和抗体のプレッシャーから逃れることが分かった。本研究により、今後、中和抗体誘導ワクチンを開発するためには、(1)V2領域の変異に左右されないエピトープを標的とした抗体の誘導、(2)V2領域が変異しても、隠れたエピトープを露出させる方法の探索、などが必要であることが示された。
近年におけるウシの繁殖性低下は経済形質の選抜によるものか

肉用牛では産肉形質と繁殖形質の両面からの育種改良が必要であるが、両形質が同時に調査された報告はない。そこで本研究では、産肉形質のDNAマーカーが繁殖形質に対する影響を調査した。DNAマーカーは、SCD、FASN、DGAT1、EDG1、PLAG1遺伝子の合計5つの多型を対象とした。集団に対する多型解析および統計解析の結果、SCD、DGAT1、PLAG1、EDG1マーカーで一部の繁殖形質との関連が認められた。これらの結果は、産肉形質関連遺伝子マーカーが産肉形質だけでなく、繁殖形質と関連していることを示唆していた。供試動物は兵庫県繁殖雌牛集団を対象とし、兵庫県内で2009年、2010年、2011年に飼養されている兵庫県繁殖雌牛集団から選抜を行った434個体を対象とした。これらの個体は、繁殖3形質(初産月齢、分娩間隔、子牛生産指数)、および枝肉6形質(枝肉重量、ロース芯面積、バラ厚、皮下脂肪厚、歩留まり、脂肪交雑基準値)の情報を有する。分析対象としたウシの経済形質に影響する遺伝子型多型は、SCD遺伝子、FASN遺伝子、DGAT-1遺伝子、CW-1遺伝子、EDG-1遺伝子の多型とした。各遺伝子多型におけるアリル頻度は、SCD遺伝子多型では、A型が0.942、V型が0.058、FASN遺伝子多型ではG型が0.994、C型が0.006、DGAT-1遺伝子多型ではK型が0.910、A型が0.089、CW-1のPLAG1遺伝子多型では11型が0.554、9型が0.446を示し、いずれも優良アリルが高い遺伝子頻度を示した。一方で、EDG-1遺伝子多型では、T型が0.271、G型が0.729で、優良アリルではないアリルに高い遺伝子頻度が偏る傾向が観察された。各経済形質関連遺伝子の効果を測定するために、遺伝子型判定の結果をもとに最小2乗法を用いた分散分析を行った。SCD遺伝子多型では、対象形質のなかで有意差が見られるものは認められなかった。DGAT-1遺伝子多型においては、初産月齢(P=0.0499)、ロース芯面積(P=0.046)、脂肪交雑基準値(P=0.001)で有意な差が観察された。EDG-1遺伝子多型においては、皮下脂肪厚において有意水準を満たす結果が観察された(P=0.030)。CW-1内のPLAG1遺伝子多型においては、枝肉重量でP<0.001という有意差が観察され、脂肪交雑基準値においても有意な差が観察された(P=0.010)。黒毛和種などの肉用牛の育種改良は、産肉形質に関しては大幅に改良が進んできているが、繁殖能力の低下が問題視されている。しかし、産肉形質と繁殖形質は調査する個体が異なるため、両形質が同時に調査された報告はない。そこで本研究では、黒毛和種繁殖雌牛2集団を用いて、産肉形質のDNAマーカーが、繁殖形質に対する影響を調査した。産肉形質に対するDNAマーカーとして、SCD遺伝子内のc.878T>C多型、FASN遺伝子のg.841G>C多型、DGAT1遺伝子のK232A多型、EDG1遺伝子のg.1471620G>T多型、DGAT-1遺伝子のK232A多型、CW-1領域内に存在するPLAG1遺伝子のss319607405マイクロサテライト多型の合計5つの多型を対象とした。集団に対する多型解析および統計解析の結果、SCDマーカーにおいて兵庫県集団では対象形質との関連は認められなかったが、岐阜県集団では初産月齢、バラの厚さ、脂肪交雑基準値で有意な差が認められた。全ての形質でAアリルが形質に好ましいアリルであった。FASNマーカーにおいて岐阜県集団では、対象形質との関連は認められなかった。DGAT1マーカーにおいては兵庫県集団では初産月齢、ロース芯面積と脂肪交雑基準値で有意な差が認められた。岐阜県集団では初産月齢、枝肉重量とバラの厚さで有意な差が認められた。PLAG1マーカーにおいては兵庫県集団では枝肉重量と脂肪交雑基準値で有意な差が認められた。岐阜県集団では初産月齢、枝肉重量、ロース芯面積と脂肪交雑基準値で有意な差が認められた。EDG1マーカーにおいて、兵庫県集団では対象形質との関連は認められなかったが、岐阜県集団では初産月齢、ロース芯面積、バラの厚さ、脂肪交雑基準値との関連が認められた。兵庫県集団では過去に報告のあった脂肪交雑基準値との関連が認められなかった。

集団に対する多型解析および統計解析の結果、SCD、DGAT1、PLAG1、EDG1マーカーで一部の繁殖形質との関連が認められた。これらの結果は、産肉形質関連遺伝子マーカーが産肉形質だけでなく、繁殖形質と関連していることを示唆していた。・供試動物:平成26年度には兵庫県における黒毛和種の繁殖雌牛集団各434頭を対象とし試料収集を行い、DNA抽出を終了した。・個体のデータ収集:これらの個体の繁殖記録及び血縁情報を収集し、繁殖性指標に関する遺伝的能力を推定した。繁殖性指標としては、1) 4歳時生産子牛数(子牛生産指数)、2)初産月齢、3)分娩間隔、の3つ、および基本枝肉6形質(枝肉重量、皮下脂肪厚、バラ厚、ロース芯面積、歩留、脂肪交雑評点)のデータを収集し基本統計量を整理した。これら繁殖形質と産肉形質との間を血統情報で連結し、制限付き最尤法により遺伝相関を含めた遺伝的パラメータを推定した。・候補遺伝子多型の解析:対象とするDNAマーカーは、EDG1(脂肪交雑)、SCD、SREBP-1、FASN、FABP4、LXRα(脂肪酸組成)、DGAT1(皮下脂肪厚、ロース芯面積)、CW1-3(枝肉重量)、ELOVL5(枝肉重量、皮下脂肪厚、推定歩留)など合計11遺伝子・多型である。平成26年度は特にSCD、SREBP-1、FASN、DGAT1、CW1を対象として解析を終了した。・遺伝子多型と繁殖・産肉形質との関連解析:各経済形質関連遺伝子の効果を測定するために、遺伝子型判定の結果をもとに最小2乗法を用いた分散分析を行った。DGAT-1遺伝子多型では初産月齢とロース芯面積、脂肪交雑基準値で有意な差が観察された。EDG-1遺伝子多型では皮下脂肪厚、CW-1のPLAG1遺伝子多型では枝肉重量と脂肪交雑基準値においても有意差を検出した。・現在までの達成度:これら研究の進捗状況は研究計画通りに進んでおり、おおむね順調に進展していると判断した。動物遺伝育種学・供試動物:平成27年度には岐阜県における黒毛和種の繁殖雌牛集団から約500頭を対象とし試料収集を行い、DNA抽出を行う予定である。現在の所、530頭の血液試料を取集済みである。・個体のデータ収集:岐阜県集団においても同様に、個体の繁殖記録及び血縁情報を収集し、繁殖性指標に関する遺伝的能力を推定する。繁殖性指標は、1) 4歳時生産子牛数(子牛生産指数)、2)初産月齢、3)分娩間隔、および基本枝肉6形質(枝肉重量、皮下脂肪厚、バラ厚、ロース芯面積、歩留、脂肪交雑評点)の基本統計量とする。これら繁殖形質と産肉形質との間を血統情報で連結し、制限付き最尤法により遺伝相関を含めた遺伝的パラメータを推定する。特に平成26年度に解析が終了しているSCD、SREBP-1、FASN、DGAT1、CW1を中心として解析を進め、終了次第、他遺伝子多型についても解析を進める。・遺伝子多型と繁殖・産肉形質との関連解析:各経済形質関連遺伝子の効果を測定するために、遺伝子型判定の結果をもとに最小2乗法を用いた分散分析を行う。兵庫県集団では、遺伝子多型と繁殖形質の間に効果が認められたのはDGAT-1遺伝子多型であり、対象繁殖形質は初産月齢であった。岐阜県集団においても同様の効果が認められるかを検証する。他の遺伝子多型についても、両集団の比較を行い、最終的にこれらの遺伝子多型が繁殖形質に効果を有するものであるかどうかを検証する。
クローン病における小腸特異的細菌の探索と感受性遺伝子TNFSF15の関連性の解明

難治性炎症性腸疾患(IBD)の一つであるクローン病は生活の質(QOL)を大きく低下させる慢性疾患で、本邦で患者数が急増している疾患であることから、早急な対応が必要である。これまでクローン病における腸内細菌叢研究は主に糞便を用いて解析されてきたが、クローン病の病変の主座は小腸であり、小腸細菌叢が病態に大きく関与していることが示唆される。本研究では小腸内視鏡で採取した小腸サンプルを用いて小腸細菌叢を解析し、クローン病の病態に関わる細菌を特定する。さらに、これらの細菌が腸管免疫系に与える影響やそのメカニズム(TNFSF15/DR3シグナル等の関与)について明らかにする。
超高齢者の高血圧治療管理基準値の設定

高齢者長期縦断疫学(SONIC)研究における、70,80,90歳の対象者における認知機能障害やフレイルなど老年症候群をアウトカムにすることで健康寿命延伸のための各年代の高血圧治療管理基準を明らかにすることを目的とした。解析の結果、70歳ではSBPが高いほどに、90歳ではSBPが低いほどに認知機能が低下していた。SBPが低い程認知機能が高くなる傾向は、降圧薬服用をしていない非フレイル群のみにしか認められず、降圧薬を服用しているフレイル群においてはDBPが低い程に有意に認知機能が低くなる傾向が認められた。超高齢者およびフレイル者での過降圧は認知機能の低下をもたらす可能性が示唆された。加齢は多くの病気の最大の発症要因である。血圧は一般的に加齢によって上昇するとされ、高齢者では高血圧患者が増加する。しかしながら特に75歳以上の後期高齢者や85歳以上の超高齢者における高血圧治療の有効性を示した成績は少なく、特に超高齢者の血圧管理基準を明確に示した研究エビデンスは非常に乏しい。そこで本研究では超高齢者の血圧管理基準を明確にすることを目的にしている。本年度は本研究課題の核となる高齢者長期縦断疫学研究(健康長寿-SONIC-研究)の70(±1)歳、80(±1)歳、90(±1)歳のベースライン情報を基に血圧値と身体的フレイルの指標である歩行速度(8フィート歩行時)ならびに握力の関連を男女別に横断的解析により検討した。その結果、80歳男性の降圧薬コントロール群において、拡張期血圧<70mmHgの対象群の握力が平均24.2kgだったのに対し、70-80mmHg群26.9kg、80-90群27.4kg、90-100群29.2kgと拡張期血圧値が高くなるにつれて有意に握力が高いという結果が得られた。収縮期血圧においても同群では、<120mmHg群で24.5kgに対して収縮期血圧上昇に伴い平均握力は高く160以上で28.3kgと有意に高い傾向を示していた。この男性での関連性は有意差はないものの降圧薬無し群でも認められた。80歳の女性や歩行速度では同様の関係は認められず、70歳、90歳の年齢群でも明らかではなかった。本結果より断面解析のデータではあるが、80歳程度の後期高齢者において、過降圧はフレイルをもたらす可能性が示唆された。今後は各年代3年ごとに調査を行っている縦断データを用いて血圧コントロールとフレイル、認知機能、要介護認定などや従来からの心血管イベントをアウトカムにした関連解析を進めて行くことにより、後期高齢者、超高齢者の血圧管理基準を提案していく方針である。申請時の予定通り、データ集計ならびにデータベースの構築、統計解析を行った。本年度は本研究課題の核となる高齢者長期縦断疫学研究(健康長寿-SONIC-研究)の70(±1)歳、80(±1)歳、90(±1)歳のベースライン情報を基に血圧値と、軽度認知機能障害まで検知できるMOCA日本版(MoCA-J)を指標に認知機能との関連を検索したところ以下のような成績を得た。・MoCAーJ平均得点は70歳23.5±3.3点、80歳21.8±3.8点、90歳18.1±4.7点であった。傾向検定の結果、70歳においてSBPが高いほどMoCA-J得点は低く、逆に90歳ではSBPが低いほどMoCA-J得点は低いという傾向が有意にみられた。・降圧薬内服有無で層別して分析した場合、内服群にのみ同様の傾向が認められた。80歳では関連性は認められなかった。DBPでは全ての年代にMoCA-J得点との関連は認められなかった。・70歳では先行研究で示されている通り血圧が高いほどに認知機能が低いという関連性が認められたが、80歳においてはその関連性はなくなり、90歳では血圧が低いほどに認知機能が低くなるという逆の関連性が認められたことから、80歳以降の高齢者での過降圧は認知機能の低下をもたらす可能性が横断的解析で示唆された。本結果より断面解析のデータではあるが、年代で血圧値が認知機能に及ぼす影響は異なるが、特に80歳後期高齢者、90歳以降の超高齢者において、過降圧は認知機能障害をもたらす可能性が示唆された。超高齢者を含む高齢者の血圧管理基準値を示すエビデンスは一定していない。本研究では平成29年度にアウトカムを認知機能低下とし、血圧値との関連性を縦断的に検討した。高齢者長期縦断疫学(SONIC)研究に参加した地域住民70±1歳、90±1歳を対象とした。会場にて問診、血圧測定および軽度認知障害に鋭敏なMoCA-Jによる認知機能検査を実施した。ベースライン・追跡調査時に欠損値のなかった70歳593名、90歳68名を分析した。

ベースライン収縮期血圧(SBP)を、119未満,120ー139,140ー159,160mmHg以上に分類し3年後MoCAーJ得点低下量との関連を検討した。ベースライン平均血圧は70歳140/79mmHg, 80歳146/77, 90歳140/72であり、3年後に認知機能が低下した者は70歳37.9%、90歳41.2%であった。認知機能低下者の割合は、SBPレベル別に比較した場合に差はなく、ベースライン認知機能と3年後低下量にも相関は認められなかった。ベースライン横断解析では70歳においてSBPが高いほど認知機能は低く、逆に90歳ではSBPが低いほど認知機能は低いという有意な傾向がみられたが、90歳で3年後認知機能が低下した者の変化量については、ベースラインSBPが高い程に認知機能低下量が大きくなる傾向が有意に認められた。70歳ではこれらの関連はみられなかった。超高齢者ではSBPが高いほど認知機能は高いが、その3年後に認知機能が低下した者における低下量は、ベースライン血圧値が高い程に大きいことが明らかとなった。本研究結果には追跡の脱落率が30%程度あることがバイアスとして影響しているため慎重に結果を解釈する必要があると思われた。高齢者長期縦断疫学(SONIC)研究における、70,80,90歳の対象者における認知機能障害やフレイルなど老年症候群をアウトカムにすることで健康寿命延伸のための各年代の高血圧治療管理基準を明らかにすることを目的とした。解析の結果、70歳ではSBPが高いほどに、90歳ではSBPが低いほどに認知機能が低下していた。SBPが低い程認知機能が高くなる傾向は、降圧薬服用をしていない非フレイル群のみにしか認められず、降圧薬を服用しているフレイル群においてはDBPが低い程に有意に認知機能が低くなる傾向が認められた。超高齢者およびフレイル者での過降圧は認知機能の低下をもたらす可能性が示唆された。平成27年度はほぼ計画通りに研究が進んだ。平成28年度以降は追跡データの収集とデータベースの構築、統計解析を進める予定である。平成28年度もほぼ計画通りに研究が進んだが、各年代3年後、6年後の追跡データのクリーニングを急ぎ、平成29年度は追跡データを用いたさらなる血圧値とフレイル、認知機能などの関連性の解析を進める予定である。老年医学英語論文にまとめるところまではまとめが進まなかったためそれにかかる費用が必要なかった。さらに93歳調査の参加人数が予想を下回ったため調査用費用も少なく済んだため次年度へ繰り越すこととした。英語論文にまとめるところまではまとめが進まなかったためそれにかかる費用が必要なかった。さらに平成27年度の93歳調査の参加人数が予想を下回ったため調査用費用も少なく済んだため次年度へ繰り越した分があり、平成28年度も使い切らずにさらに次年度に繰り越すこととした。平成28年度は学会発表や論文作成費用を見積もっているためそれらに使用する。平成29年度は学会発表や論文作成費用、追跡データ解析を行う必要があるためそれらに使用する。
ミツバチのダンス言語能力の神経基盤に関する研究

ダンスを踊る蜂は採餌を行った餌場の位置をダンスにより伝達する。この際彼女らは採餌飛行の問に経験したオプティカル・フロー(視野を横切った視覚情報)量をもとに餌揚までの「距離」を、太陽に対する相対的な位置を感知する太陽コンパスをもとに餌場の「方向」を算出し、ダンスの尻振りの「時間」と「角度」に変換して表す。このようにダンスの発現には、採餌過程で得た感覚情報を統合し、ダンスに変換する過程が必要であると考えられる。昨年見出した、採餌蜂の脳における特異的な神経活動が、採餌過程における感覚情報の統合に関わっている可能性を検討した。この際、採餌行動の違いがダンス行動の違いとして表されることを利用して、ダンス行動とkakusei発現の関係を調べ、採餌蜂のどのような行動成分が脳の活動量と関連があるかを検討した。まず、近くの餌場に通った蜂が踊る「円ダンス」を踊る蜂と、比較的遠くの餌場に通った蜂が踊る「尻振りダンス」を踊る蜂、それぞれの脳におけるkakusei発現パターンを調べたところ、尻振りダンスを踊る蜂よりも円ダンスを踊る蜂において、有意に高いkakusei発現細胞数密度がキノコ体においてのみ認められた。これは近くの餌場に通った蜂の脳で、より多くの数のキノコ体神経細胞が活動していることを示している。さらに、様々に異なったダンスをビデオ撮影し、ダンスの示す餌場までの「距離」の成分と各脳領野におけるkakusei発現量との関係を解析した。その結果、キノコ体におけるkakusei発現量はダンスの示す「距離」と負に相関していた。以上の結果は、採餌蜂の行動の中でも、巣から餌場までの「距離」に関連した行動成分がキノコ体における神経活動と関連していることを示しており、キノコ体における採餌飛行の際の感覚情報の統合がダンスコミュニケーションの発現に重要な役割を担っている可能性を示唆している。1.新規初期応答遺伝子kakuseiを用いた、新たな神経活動のマッピング法の確立ミツバチのダンス言語に関わる脳領野を探索する目的で、私は初期応答遺伝子を用いたミツバチ脳の神経活動のマッピングを行うことを計画した。これまでに、私は、新規初期応答遺伝子kakuseiを同定し、本遺伝子が麻酔からの覚醒に伴って発現量が増加するということを見出してきた。私は、本遺伝子が神経興奮のマーカーとして用いることができるのではないかと考え、以下の2点について検討を行った。(1)kakuseiの発現を検出できるか(2)神経興奮に応答してkakuseiが発現するか。その結果、非常に少ないkakuseiの発現を高感度in situハイブリダイゼーション法によって検出する実験システムを確立した。また、その上で、光の照射による自然な神経活動刺激により、ミツバチの視覚中枢である視葉において、kakuseiの発現が誘導されるということを確認した。以上の結果から、私はミツバチの脳での神経活動を検出する、新たな実験系の確立ができたと判断した。2.ミツバチのダンス言語に関わる脳領野の探索次に、本実験系を用い、ミツバチのダンス言語に関わる脳領野の探索を行った。まず、通常、ミツバチは暗い巣の中におり、行動を観察しながらの採取ができないので、今回、新たに、透明なプラスチックを用いた観察巣箱を作成した。次に、そのような巣箱から、ダンスを踊るダンス蜂、ダンスに追従する追従蜂、ダンス行動に関わらない対照群として育児蜂、を採取し、それぞれの脳でのkakuseiの発現を調べた。その結果、ダンス蜂の脳のキノコ体の小型ケニヨン細胞において多くのkakuseiの発現が認められた。このことは、キノコ体小型ケニオン細胞がダンス行動の過程に関与していることを示唆している。1.前年度に引き続き、ダンスを踊るミツバチの脳における神経の活動を調べた。具体的には、・ダンスを踊っているミツバチとダンスを踊る前段階のミツバチにおいて、脳における神経活動のパターンを比較した。この際には、昨年度に開発した、新規初期応答遺伝子kakuseiを用いた。その結果、ダンスを踊っているミツバチと、踊る前段階のミツバチにおいて、神経活動のパターンに違いは認められなかった。この結果は、ダンスを踊っているミツバチの脳において見られた神経活動は、ダンスそのものというよりは、それ以前の「ダンスに必要な情報を統合する段階」に関わっている、ということを示唆している。・次に、上記段階において認められた神経活動が、「ダンスに必要な情報を統合する段階」の中でも、どのような行動素過程に関係しているかということを調べた。そこで、ミツバチの視覚経験の関与を検証した。その結果、視覚経験において見られた神経活動のパターンとダンスを踊るミツバチに見られるパターンが異なっていることを明らかにした。2.転写因子Foxp2の発現解析ヒト言語障害家系の遺伝学的解析より、言語能力に関わりがあることが報告された遺伝子Foxp2のミツバチホモログを同定し、発現解析を行った。Foxp2は哺乳類・鳥類における解析より、音声学習に関わりのあることが示唆されている。ミツバチのダンス言語も、聴覚を介した情報伝達であることから、その関わり、特にFoxp2の関わる神経回路を調べる目的で、その発現を解析した。具体的には、・Foxp2のミツバチホモログを同定した。・各発生段階における発現をRT-PCRにより調べたところ、生後1週間で発現量が約2倍になるが、その後は分業等に応じた発現量の変化はないということがわかった。

・さらにin situ hybridization法により、Foxp2発現細胞の局在を調べたところ、視葉付近に発現細胞のクラスターがあることを見出した。ダンスを踊る蜂は採餌を行った餌場の位置をダンスにより伝達する。この際彼女らは採餌飛行の問に経験したオプティカル・フロー(視野を横切った視覚情報)量をもとに餌揚までの「距離」を、太陽に対する相対的な位置を感知する太陽コンパスをもとに餌場の「方向」を算出し、ダンスの尻振りの「時間」と「角度」に変換して表す。このようにダンスの発現には、採餌過程で得た感覚情報を統合し、ダンスに変換する過程が必要であると考えられる。昨年見出した、採餌蜂の脳における特異的な神経活動が、採餌過程における感覚情報の統合に関わっている可能性を検討した。この際、採餌行動の違いがダンス行動の違いとして表されることを利用して、ダンス行動とkakusei発現の関係を調べ、採餌蜂のどのような行動成分が脳の活動量と関連があるかを検討した。まず、近くの餌場に通った蜂が踊る「円ダンス」を踊る蜂と、比較的遠くの餌場に通った蜂が踊る「尻振りダンス」を踊る蜂、それぞれの脳におけるkakusei発現パターンを調べたところ、尻振りダンスを踊る蜂よりも円ダンスを踊る蜂において、有意に高いkakusei発現細胞数密度がキノコ体においてのみ認められた。これは近くの餌場に通った蜂の脳で、より多くの数のキノコ体神経細胞が活動していることを示している。さらに、様々に異なったダンスをビデオ撮影し、ダンスの示す餌場までの「距離」の成分と各脳領野におけるkakusei発現量との関係を解析した。その結果、キノコ体におけるkakusei発現量はダンスの示す「距離」と負に相関していた。以上の結果は、採餌蜂の行動の中でも、巣から餌場までの「距離」に関連した行動成分がキノコ体における神経活動と関連していることを示しており、キノコ体における採餌飛行の際の感覚情報の統合がダンスコミュニケーションの発現に重要な役割を担っている可能性を示唆している。
小児用製剤への応用を目指した、調剤機器を用いた顆粒剤調製法の構築

自転公転式ミキサーを用いた造粒法を確立するために、造粒物の製剤特性に及ぼす造粒プロセスパラメータの影響を明らかとする。次いで本法を用いた、錠剤の粉砕、粉体の混和、造粒、コーティング、乾燥の一連の顆粒剤化プロセスを構築し、目標製剤にあった最適プロセスを選択するための指標と範囲を探索する。さらに、本法を用いた機能性顆粒剤、例えば、腸溶性顆粒、遮光コーティング、易嚥下性顆粒、徐放性顆粒など調製を試み、調製された臨床現場製剤を新たな小児用製剤の一つとして提供することを目標とする。
ロドプシンーポルフィロプシン視覚系におけるレチノイド代謝とその制御

無脊椎動物の視物質クロモホアとして見い出された、レチナ-ル、デヒドロレチナ-ル、3ーヒドロキシレチナ-ル、4ーヒドロキシレチナ-ルの四種レチノイドは網膜内レチノイド代謝経路の中で極めて近縁のものであるとの仮説に基づき、レチノ-ル(A_1)、デヒドロレチノ-ル(A_2)、3-ヒドロキシレチノ-ル(A_3)の三種を持つザリガンの網膜でのレチノイド代職、A_1からA_3,A_2への転換反応を調べた。1.A_3の存在状態と温度による量的変化ー長期低温下においた動物網膜の貯蔵型エステル中にA_3は存在し、HPLC溶出パタ-ン,相対蛍光強度、UVスペクトルより11ーシス形3ーヒドロキシレチノ-ルと同定した。動物を高温条件下に移すとA_2と同じ時間経過で減少消失した。逆の場合A_2は時間と共に増加したがA_3は一定の低いレベルを維持した。これらの結果およびA_3はクロモホアとしては使われていないことから、A_3はA_14らA_2が作られる反応の中関体であると考えられた。2.網膜レチノイド代謝酵素の性質ークロモホア生成に関与する二酵素レチニスエステル加水分解酵素とレチノ-ル脱水素酵素を持に基質特異性に注目して調べた。両酵素とも11ーシス形に強い特異性を示したが、A_1とA_2の間では基質特異性はなかった。クロモホア中の高いA_2含量は酵素の基質特異性によるものではなく、加水分解後A_1がA_2に転換される反応が推定された。3.A_1からA_2への転換ー[ ^3H]ーレチノ-ルと網膜ホモゲネ-トをインキュベ-トは、抽出レチノイドを分取し放射能を測定した。A_2ピ-クに時間と共に増加する放射活性を認めた。A_3ピ-クは一定の低い値を維持した。以上の結果より、A_1はA_2に転換されることが分かり、A_3はこの転換反応の中間体であることが示唆された。本研究により上記仮説の一経路、A_1→A_3→A_2については強く支持されたと考えられる。ロドプシンとポルフィロプシンの二重視物質を持つザリガニ網膜中に新たに見出された極性の高いレチノイドについて、その同定・存在様式・温度による変動について調べた。高速液体クロマトグラフィ-(HPLC)による分析・蛍光強度測定・吸収スペクトル決定の結果、この極性レチノイドはハ-シス形3-ヒドロキシレチノ-ルであると結論した。これは遊離の形では存在せず、加水分解後に現れるので、網膜内では脂肪酸エステルとして存在している。このエステルはHPLC上では特定できず、広い極性範囲の分画から回収されるので、網膜内では数種のモノエステルおよびジェステルとして存在すると考えられる。3-ヒドロキシレチノ-ルは網膜内に貯蔵されている全レチノ-ル類の39%をしめるが、そのアルデヒド体は全く存在しないので視物質発色団には使われていない。

動物を長期低温飼育後高温条件に移すと、3-ヒドロキシレチノ-ルはデヒドロレチノ-ルとほぼ同じ時間経過で減少消失した。動物を高温から低温条件に移すと、デヒドロレチノ-ルと3-ヒドロキシレチノ-ルが共に出現したが、前者はゆっくり増加してゆくのに対し後者は一定の低いレベルを保ったままであった。これらの結果から、3-ヒドロキシレチノ-ルは視物質クロモホアの前駆体ではなく、レチノ-ルからデヒドロレチノ-ルへの転換反応の中間体であり、レチノ-ルから3-ヒドロキシレチノ-ルへの反応が温度によって制御されると思われる。この他、クロモホア生成に関与する二種の酵素(レチニルエステル加水分解酵素とレチノ-ル脱水素酵素)の活性をとらえ、それらの基礎的性質を調べた。ロドプシンとポルフィロプシンの二種視物質を持つフザリガニ網膜中に存在するレチノイドのエステル体は、視物質クロモホアの前駆体と考えられるが、視物物組成とエステル組成の間には大きな食い違いがある。そこで、貯蔵エステルからクロモホア生成までに関与すると予想されるレチニルエステル加水分解酵素とレチノ-ル脱水素酵素の性質を特に基質特異性に注目して調べた。エステル加水分解酵素は、レチニル[ ^3H]ーパルミテ-トを基質とし遊離パルミチン酸量を測定し、脱水素酵素はレチノ-ル又はデヒドロレチノ-ルを基質としヒドロキシルアミン存在下で生成するオキシム量を測定して調べた。エステル加水分解酵素はpH5とpH8に活性の極大を示しpH8の活性が11ーシス形基質に特異性があった。酵素は少なくとも二種存在し、pH8で活性を示すものがクロモホア生成に関与すると考えられる。拮抗実験の結果、この酵素はデヒドロレチニルエステルに基質特異性があった。レチノ-ル脱水素酵素はpH8に単一の活性極大を示し、11ーシス形レチノイドに特異性を示したが、レチノ-ルとデヒドロレチノ-ルの間で基質特異性は見られなかった。レチニルエステルを出発基質としレチナ-ルオキシムを最終産物とした全反応系では、11ーシス形に対し極度に特異的であったが、レチノ-ルとデヒドロレチノ-ルの間では特異性がなかった。両酵素とも、視物質の存在するラブド-ム分画に高い比活性が確認された。以上の結果から、今回活性が測定された両酵素がクロモホア生成に関与するものである事は明らかであるが、視物質組成とエステル組成の食い違いはこれら酵素の基質特異性からは説明できない。レチニルエステルが加水分解をうけた後、3ーヒドロキシンレチノ-ルを経てデヒドロレチノ-ルに変化する反応が視物質組成を決定すると考えられる。昨年度の研究結果より、網膜内で貯蔵レチニルエステルが加水分解された後、さらに脱水素反応を受けて視物質クロモホアが生成されるが、レチノ-ルの一部はデヒドロレチノ-ルに転換されると予想され、網膜中に見い出された3ーヒドロキシレチノ-ルはこの転換反応の中間体であろうと考えられた。そこで、[11,12(n)^3H]ーレチノ-ルを用いて[ ^<3H>]のデヒドロレチノ-ルと3ーヒドロキシレチノ-ルへの移行を調べた。昨年度の結果から、網膜レチノイド代謝酵素群は11ーシス形に高い特異性を持つことが分ったので、レチノクロ-ムの光異性化酵素作用を利用して11ーシス形[ ^3H]ーレチノ-ルを作成した。酵素試料には全網膜木モゲネ-トを用い、NADPH存在下、pH8で一定時間(通常3時間)微弱光下でインキュベ-ト後、全レチノイドを抽出、HPLCで一定量づつ分取し、液体シンチレ-ションカウンタ-で放射能を測定した。この結果、リ-シス形デヒドロレチノ-ルに放射活性が見い出され、この放射活性はインキュベ-ション時間と共に増加した。勢処理した試料では活性消失、またNADPHなしでは低下するなどの事から、P450と連関するモノオキシゲネ-スが関与する反応と考えられる。トランス形デドロレチノ-ルの放射活性は極微量であった。3ーヒドロキシレチノ-
三角格子ボロン・ナノチューブの探索とナノスケール・デバイスの可能性

本年度は、まず、我々が発見し他のグループのBNナノチューブ作製法と本質的に異なるLi蒸気下での熱処理(1200°C、約10時間)を用いて、アモルファス・ボロンとBNの混合粉末を出発原料としたBNナノチューブ生成の再現性の鍵となる条件を探索した。1)BNナノチューブが発見される試料において共通しているのは、BNレイヤーが絡まった組織である。そこで、この組織が作製できる条件を探索した。Liを用いず、アモルファス・ボロンを窒素ガス中で熱処理したところ、BNは生成したが、BNレイヤーが絡まった組織は、生成されなかった。したがって、Li蒸気下での熱処理が本質的である。2)グラファイトをLi蒸気下で熱処理するという同じ方法で、原料粉末にSiを混ぜることにより、カーボン・ナノチューブが生成された。しかし、SiとBNの混合粉末を出発原料としたLi蒸気下での熱処理では、BNレイヤーが絡まった組織は観測されなかった。したがって、Siの存在は本質的ではなく、アモルファス・ボロンを原料にすることが本質的である。3)これまでの方法では、石英管を二重に真空封入しても、漏れ出たLi蒸気により外側の石英管まで変質して封入が破られることが度々あった。そこで、Li蒸気を封じ込めるための最も内側のステンレス容器を改良し、Liの量を減らし、石英管の封入が破られないようにすることにより、BNレイヤーが絡まった組織を再現性良く作製することに成功した。4)原料粉末のアモルファス・ボロンとBNを混合しないで、隔てた状態でステンレス容器内に置いた場合、BNレイヤーが絡まった組織やBNナノチューブが、アモルファス・ボロン側に生成した。さらに、BNの代わりにAlNを用いても同様の結果となった。これらのことから、BNレイヤーが絡まった組織やBNナノチューブは、Li蒸気下でアモルファス・ボロンが窒化することにより生成すると考えられる。この方法を用いることにより、BN生成物を原料BNから分離して収集することも可能となった。次に、上記の知見を基に、三角格子ボロン・ナノチューブの探索とBNナノチューブ等を用いたナノスケールデバイスの可能性を検討している状況である。本研究の目的は、三角格子ボロン・ナノチューブの探索と、BNナノチューブ等によるナノスケールデバイスの可能性の検討である。本年度は、我々が発見し、他のグループのナノチューブ作製法と本質的に異なるリチウム蒸気下での熱処理を用いて、アモルファス・ボロンおよびβ菱面体晶ボロンを出発原料として、BNナノチューブの生成条件の調査と新たなナノ構造の探索を行った。まず、生成条件として、10^<-6>torr程度以上の真空度、リチウム蒸気、1200°C10時間程度の等温保持時間が必要であることが明らかになった。次に、出発材料に混ぜるh-BNの替わりにAINを使った場合は、BNナノカプセルが生成し、BNナノチューブやその母体と考えられるアモルファス・ボロン周囲のBN層状構造は生成されなかった。一方、アモルファス・ボロンの替わりにシリコンを用いた場合は、シリコン周囲にBN層状構造は生成しなかったが、るつぼに使っているステンレス管からの混入物の周囲にはBN層状構造が生成していたことから、h-BNはLiによって分解されるが、BとNがバラバラになってしまうのではなく、BNダイマー以上の単位で気相拡散し、アモルファス・ボロン等の周囲に選択的に層状構造を生成し、その一部からナノチューブが成長するものと考えられる。出発原料として、β菱面体晶ボロンを用いた場合に、3つの新奇構造を発見した。一つは、h-BN粒子の[1010]方向に、アームチェア型のBNチューブが密集して覆っているものである。この結果は、アームチェア型のBNチューブがその先端にB原子とN原子が交互に配置しているため極めて安定に成長するというモデルと一致している。二つ目は、h-BNシ一トに300°の回位を導入してできる円錐を入れ子状に重ねたものであると考えられる構造である。三つ目は、太さが100nm程度、長さが数十μmにもなるBNの棒状組織である。棒の途中は、中心が中空になりチューブ化していた。

そこで、Li蒸気を封じ込めるための最も内側のステンレス容器を改良し、Liの量を減らし、石英管の封入が破られないようにすることにより、BNレイヤーが絡まった組織を再現性良く作製することに成功した。4)原料粉末のアモルファス・ボロンとBNを混合しないで、隔てた状態でステンレス容器内に置いた場合、BNレイヤーが絡まった組織やBNナノチューブが、アモルファス・ボロン側に生成した。さらに、BNの代わりにAlNを用いても同様の結果となった。これらのことから、BNレイヤーが絡まった組織やBNナノチューブは、Li蒸気下でアモルファス・ボロンが窒化することにより生成すると考えられる。この方法を用いることにより、BN生成物を原料BNから分離して収集することも可能となった。次に、上記の知見を基に、三角格子ボロン・ナノチューブの探索とBNナノチューブ等を用いたナノスケールデバイスの可能性を検討している状況である。
HIVアクセサリー遺伝子Vprによるゲノム不安定性の分子機構

HIV-1感染者6例の末梢血でのmetaphase spreadを作製し観察したところ、全例でpremature sister chromatid separation (PCS)を認めた。また野生型Vprを有するウイルスと欠失したウイルスを健常人末梢血単核球細胞に感染させるとVpr依存的にPCSが認められた。さらにVpr発現細胞では解析した細胞の約半数のにPCSが認められたことから、HIV-1感染で認められるPCSはVprに依存している事が示された。またVprによるPCSでは、コヒーシン蛋白質(SCC1/Rad21)を始めとする複数のキネトコア構成蛋白質(INCENP、Aurora-B、CENP-F)が失われていた。VprはM期染色体の特にセントロメア領域に染色性を認め、CENP-Aと結合する事を見出した。一方、Vprの結合蛋白質であるヒストンアセチル化酵素p300の局在も、同様にセントロメア領域に認めた。さらにヒストンメチル化酵素suv39h1がVpr発現早期から消失傾向を示した。Vpr/p300複合体の凝縮染色体のセントロメア局在により、メチル化ヒストンで結合するヘテロクロマチン蛋白質(HP1α)の遊離やヒストンメチル化酵素suv39h1の消失により、メチル化/アセチル化のバランスが破綻していることが示唆される。また、p300siRNAによりHP1αの消失およびPCSが抑制された。この事実は、クロマチンのアセチル化、引き続き生じるHP1αの消失が引き金となって、セントロメアおよびコヒーシン領域に至るキネトコア構成タンパク質群が失われ、結果としてPCSが誘導されていることが考察される。今回見いだされた現象がHIV感染者で高頻度に認められる悪性リンパ腫の病因を理解するための手がかりを与えるものと思われる。また、Vprによるクロマチンのアセチル化が、ウイルス感染や複製においてどのような役割を担っているかを明らかにすることも重要である。HIVアクセサリー遺伝子Vprは染色体断裂、小核形成及び遺伝子増幅という一連のゲノム不安定性を誘発する。本研究はVprによるこの様なゲノム不安定性誘発機構を明らかにしながら正常細胞でのゲノム維持機構とその破綻による癌化機序を明らかすることを目的としている。In vitroの実験系により、サイクリンB及びセクリンのいずれにもVprが結合すること、さらにVprとこれら蛋白質の結合には典型的なD-boxのアミノ酸配列として知られているRxxLGモチーフが重要であることを明らかにした。またサイクリンBのユビキチン化はCdc20及びCdh1どちらのAPC活性によっても誘導され、VprのC-末ペプチド(C45)の添加により阻害されるのに対し、セクリンのCdc20によるユビキチン化はVprにより阻害される一方、Cdh1によるユビキチン化は阻害されないことを示した。また、Vpr発現細胞であるMIT-23細胞を用いた解析から、Vpr発現により急速にCdh1/APC活性が誘導されることを見い出した。次に、Vprのこれらタンパク質機能に及ぼす影響について検討したところ、Vprを10日間発現させた状態では、サイクリンBの分解とM期の進行遅延がともに認められた。一方、セクリンは全く異なる挙動を示し、Vpr発現下では、M期開始時期当初から蛋白質発現は認められなかった。さらに、タイムラプスによる画像解析により、Vpr発現細胞では、anaphaseを経ずにG1期に突入する細胞が存在すること、また染色体の構造解析の結果、姉妹染色体が分裂期に進行する前から分離した状態になっている様子が捉えられた。

以上の事から、VprによるAPC活性の調節異常により誘発されるセクリン-セパリン-コヘシンの機能的連関の破綻とサイクリンBの分解遅延によるM-期進行遅延がVprのゲノム不安定性誘発の分子基盤の一つになっている可能性が示唆された。エイズ症例では、高率に悪性腫瘍が発症する。即ち、B細胞性悪性リンパ腫は、健常人の60倍から280倍の危険率で発症することが試算された。さらにHIVを試験管内で、不死化したB細胞株に感染させるとヌードマウスに造腫瘍性を示すようになること、HIV遺伝子であるTatやNef遺伝子産物が、細胞をトランスフォームさせることが報告され、HIV自身が癌ウイルスの特徴を備えていることが示唆されるに至った。申請者は、Vpr遺伝子の発現システムを樹立し、Vpr発現後に高率に染色体の異数倍体が生じることを見出した。本研究では、Vprによるゲノム不安定性誘発の機序を明らかにすることを試みた。まず、VPR発現下での染色体の動きをtime-lapse解析により観察するため、Vpr発現細胞にヒストンーGFP(green fluorescent protein)をコードするプラスミドを導入し、新たに細胞株を樹立した。この細胞株では、顕微鏡直視下に染色体の動きが観察できる。詳細な解析の結果、VPR発現下では染色体のmidplateへの集結が著明に遅延するのに加えて、染色体の3極分離や不均等分配が観察された。さらに、MPM-2やリン酸化ヒストンH3の発現は、非分裂期の細胞にも認められた。以上のことから、VPRによるゲノム不安定性の機序として、染色体分離異常が考えられること、その際、細胞周期制御因子のリン酸化による調節が攪乱されている可能性が示唆された。今後VPRの標的因子を明らかにし、染色体分離を統御する新規遺伝子産物を同定したいと考えている。特に、Vpr遺伝子産物がサイクリンBなどに認められるD-boxに結合することを見出した。びD-boxに結合するVpr側の領域を明らかにし、これを用いたtwo-hybridシステムにより、Vpr結合因子の同定を今後試みる予定である。HIVアクセサリー遺伝子VPRは、細胞周期G2/M期におけるチェックポイント機構の破綻を誘発し、染色体の数の異常を引き起こす。本研究ではVPRによるゲノム不安定性誘発の機序を明らかにすることにより、正常細胞でのゲノム維持機構を明らかにすることを目的としている。VPR発現下での染色体の動きを観察するとlagging chromosomesが誘導されること、またVPRによりウイルスRNAの転写が亢進することから、ヘテロクロマチン蛋白質1(以下HP1)に着目して解析した。その結果、VPRの発現によりHP1がキネトコアから消失していること、またこれに伴って娘染色体の結合を保持するコヘシン(Rad21/SCC1)も消失すること、さらにCENP-Fの染色性も著明に障害されていることを見出した。一方、HP1がクロマチンに結合するために必須なヒストンH3 N-末端9番目のリジン(H3-K9)のメチル化が顕著に阻害され、代わりにアセチル化が亢進していた。
乳幼児を対象とした食育のための実証的研究:食行動にみる社会的認知の発達に注目して

母親が食べる食物や母親の食行動にたいする子どもの反応と、母子間交渉の発達を明らかにするため、主として月に1度の母子観察を継続しておこなった。具体的には、同じ16組の母子ペアに毎月実験室を訪問してもらい、母親に食物を手渡したさいの母子間の交渉を観察した。観察時、子どもは536ケ月齢の間であった。その結果、子どもにおける食物要求行動のバリエーションや発声頻度が、発達にともない増加する傾向が明らかになった。また、子どもの行動を、非食物を提示した場合と比較したところ、食物に特異的な行動が生後5ケ月齢の時点で既に見られることが示された。さらに、同様の手法で既に収集・蓄積していたチンパンジーの資料と比較したところ、ヒトの子どもでのみ観察される行動があることや、食物への要求行動の発達的推移に種間で違いのあることが明らかになった。子どもにたいする母親の行動は両種の間で異なっており、そうした子どもをとりまく食事時の社会的環境の違いがまた、子どもの行動に違いをもたらしている可能性が示された。食行動の発達に注目した従来の縦断研究では、実験者が各家庭を訪問し、日常の食事場面を観察するという手法が用いられてきた。しかしこれでは、母子間交渉の媒介となる食事内容を統制することができず、食物の違いによる影響を排除して縦断的にデータを比較することが難しい。本研究では、交渉の媒介となる食物を統制して縦断的観察をおこなうことで、はじめてそれが可能となった。食物にたいする子どもの反応や母子間交渉の発達を詳細に捉えることができた。これらの成果については、日本家政学会第59回大会、第4回子ども学会議、日本発達心理学会第19回大会をはじめ、さまざまな分野の学術集会やシンポジウムで随時公表をおこなった。