hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ゲノムワイドな挿入変異を利用した疾患関連lncRNAの機能解析

がんの発症と悪性化には、ゲノムの変化とエピジェネティックな変化の両方が関与する。ゲノム変化は一旦起きると元に戻せないが、エピジェネティック変化は可逆的で、元の正常な状態に戻すことができる。悪性進展を司るエピジェネティック制御の分子機構を解明することで、この可逆性に着目した革新的ながん治療戦略を開発できる。また、lncRNAは、様々な生命現象や疾患において重要な役割を担うと期待される新しい制御因子である。申請者独自の研究資源である挿入変異データベースを利用して、がん悪性進展におけるlncRNAの役割を解明することは、学術的重要性を持つとともに、「がん分子標的」としての有用性の発見につながる。
主応力の回転を伴う直接せん断を受ける岩盤の破壊機構

前年度までの結果総括を進めるとともに、総括の過程で必要と判断された実験および計算を追加して行った。具体的内容は次の通りである。1.総括:前年度に国際誌投稿の準備を進めた論文1件につき、共著者であるオーストラリア・CSIRO Zhao博士と内容の再検討を進めながら、掲載決定に至った。その過程では石膏模型実験を追加して行った。また、イタリア・トリノにて開催の国際会議において、層状岩盤を想定した模型実験を中心として成果を発表した。2.実験:前年度までに行ってきた模型実験につき、さらに模型材料に変化を与えながら検討を進めた。また、主応力の回転について理想的な条件下での解釈が得られるよう、境界条件や載荷手順に対する変更も併せて行った。これらの実験から、境界条件と亀裂の発生・進展との関係についての知見が得られたが、多様な材料物性を包含して説明し得る一般性の整理には現時点では至っていない。今後も、次に挙げる計算の進行に従い、材料種や境界条件を変化させながら、追加の実験を行いたいと考えている。3.計算:新規開発した有限要素解析プログラムの当面の完成を見、結果の外部発表への準備を進めたが、その過程でプログラムに改善の余地が見つかったため、現時点では外部発表をその改善完了後まで見送りたいと考えている。プログラム再検討の過程では、上記の国際会議発表の後に、協力関係にあるイタリア・ミラノ工科大学Bolzon助教授と計算プログラム細部に関する打合せを行った。プログラム改善の内容は主に、前年度までにも行ってきた不連続面の取り扱いに関するアルゴリズム見直しであるが、同時に計算速度に関わる改良を進めている。改善期間には1年以内を見込んでいる。第一に、現有の載荷装置を用いて、不連続面を含む岩盤模型に対する傾斜荷重型直接せん断試験を行った。当初の計画では、当該年度においては複数種の材料に対する検討を始める予定であったが、実験を進める過程において不連続面模型の作製手法の工夫に成功したため、これまでに不連続面を含まない模型に対する結果が得られていた材料に対する実験を優先した。この実験の結果から、直接せん断を受ける不連続性岩盤の強度特性について、既往の破壊規準に関する理論に合致する解釈が得られた。次年度以降において、結果解釈の一般化のため、複数種の材料に対する検討を行う。第二に、亀裂の発生・進展を解析するための、離散ひび割れモデルによる有限要素法プログラムを開発した。その過程では、プログラム中で用いた解析手法の開発者である、イタリア・ミラノ工科大学ボルゾン助教授との詳細にわたる研究討議を行った。このプログラムの採用により、変位不連続の取り扱いにおいて、従来の解析法と比較して大幅な改善が見られた。ただし、不連続面上の摩擦を取り扱う方法については改善の余地が残っている。プログラム開発は、次年度においても継続して行う。第三に、新規で直接せん断装置を作製した。この装置は、現有の載荷装置と組み合わせて脆性材料の直接せん断試験を行うものである。材料内の一方向の面に対し、任意の傾斜角を持つ荷重およびこの荷重に垂直な拘束圧を与えることが出来る。ただし、一載荷過程での荷重の方向は一定である。当該年度にはこの装置の設計に時間を割き、装置の完成に至った。本報告書作成時点において、試運転を行っている。本報告書作成時点において、上記第一および第二の成果に関し、次年度早々の論文投稿3件を準備している。第一に、前年度に新規で作製した直接せん断装置を用い、石膏直方体の破壊試験を行った。当該年度には、最も単純な条件として、一定垂直応力の下での一面せん断試験を行った。この試験においては多チャンネル計測が可能なデータロガーを新規導入し、3方向ひずみゲージによる、せん断過程でのひずみ測定を行った。試験の結果から、最終的な破壊に至るまでの亀裂の発達過程と対応した、応力状態に関する知見が得られた。最終年度となる次年度へ向けて、次に記す数値解析との連携を進めるとともに、一定拘束圧の方向を変えた条件下における試験にも取り組みたいと考えている。第二に、前年度に開発した有限要素法プログラムにつき、問題点やアルゴリズムの改善とともに、亀裂面上の摩擦に関してモデルの変更を行った。その過程では、前年度同様に、基幹となっている解析手法の開発者であるイタリアミラノ工科大学Bolzon助教授との相互連絡を随時行った。ただし、当該年度においては、研究者の派遣および招聘は行わなかった。上記のプログラム改善により、摩擦を受けながら発達する亀裂の再現性につき、大幅な改善が見られた。次年度に向けては、外部への発表をも意識しながら、特にプログラム内でのプリ・ポスト処理の追加を進めたい。第三に、これまでに行ってきた石膏岩盤模型に対する傾斜荷重型直接せん断試験につき、JSPSプログラムにより招聘されたオーストラリアCSIRO Zhao博士の協力により、個別要素法による破壊解析を行った。当該年度においては個別要素法におけるモデル化に重点を置いた検討を行い、国際誌への投稿(投稿中)に至った。その過程では、不連続面を含まない模型に対する、別の条件を与えた実験を追加して行った。次年度に向け、さらに不連続面を含む場合の解析を行う予定である。

また、イタリア・トリノにて開催の国際会議において、層状岩盤を想定した模型実験を中心として成果を発表した。2.実験:前年度までに行ってきた模型実験につき、さらに模型材料に変化を与えながら検討を進めた。また、主応力の回転について理想的な条件下での解釈が得られるよう、境界条件や載荷手順に対する変更も併せて行った。これらの実験から、境界条件と亀裂の発生・進展との関係についての知見が得られたが、多様な材料物性を包含して説明し得る一般性の整理には現時点では至っていない。今後も、次に挙げる計算の進行に従い、材料種や境界条件を変化させながら、追加の実験を行いたいと考えている。3.計算:新規開発した有限要素解析プログラムの当面の完成を見、結果の外部発表への準備を進めたが、その過程でプログラムに改善の余地が見つかったため、現時点では外部発表をその改善完了後まで見送りたいと考えている。プログラム再検討の過程では、上記の国際会議発表の後に、協力関係にあるイタリア・ミラノ工科大学Bolzon助教授と計算プログラム細部に関する打合せを行った。プログラム改善の内容は主に、前年度までにも行ってきた不連続面の取り扱いに関するアルゴリズム見直しであるが、同時に計算速度に関わる改良を進めている。改善期間には1年以内を見込んでいる。
生体内関節の三次元運動力学的動態解析システムの開発と臨床応用

以前当研究室で開発した人工膝関節を対象とした三次元動態解析システムを生体のあらゆる骨関節に適応できるようにするため、骨輪郭の抽出方法と奥行き誤差の補正方法を確立した。精度は2°、2mm以下であり、臨床的に使用可能と判断した。正常人を対象に外転位での回旋運動、挙上運動を動態解析し、様々な新しい知見を得た。更に骨関節のみの動態解析ではなく同時に筋電図解析を行うことで筋活動を含めた三次元運動力学的動態解析ができるシステムを新たに構築した。正常人、腱板断裂を対象にデータ収集を行い解析を進めている。当研究室で開発した人工膝関節用の動態解析システムを生体内の骨関節に応用するにあたり、2つの問題点があった。1)重なり合った骨輪郭の抽出:まだある程度の手作業は必要であるが、1枚の画像にかかる時間は60分から10分程度まで短縮できるようになった。2)奥行き誤差の改善:骨関節のCT画像から適切な関節間の距離(隙間)を算出し、registration後の関節の位置が同じ距離になるように補正することで、奥行き誤差の改善を図っている。人体骨模型を購入し、近日精度検証を行う予定である。正常肩の撮影はボランティアを含めて9名撮影し、4名の解析が終了している。異常肩は7例撮影したが、解析はまだ行っていない。当研究室で開発した人工膝関節用の動態解析システムを生体内骨関節動態解析に応用するために改良を続けている。1)重なり合った骨輪郭の抽出:ある程度方法は確立しており、1枚の画像につき約10分で輪郭抽出できるようになった。2)奥行き誤差の補正:骨関節のCT画像から適切な関節間距離(間隙)を算出し、奥行き補正するプログラムを作成した。3)精度検証:人体骨模型を用いて各骨毎の精度検証を行った。奥行き誤差が人工関節の時よりも大きく生じることが判明した。奥行き誤差の補正プログラムを用いることで関節での生じる誤差がどれだけ小さくなるかについても今度検証する予定にしている。正常肩については15例30肩の撮影を終え、5例10肩の動態解析がほぼ終了した。具体的には前方挙上、肩甲骨面挙上、側方挙上、外転0度、90度、135度、最大外転での回旋運動を撮影した。研究成果としては、上肢を挙上する方向を前方から側方へかえることによって肩甲上腕関節の接触域が骨頭の前方から後方へと変わることが明らかになった。また、外転0度、90度、135度、最大外転での回旋運動では肩甲上腕関節での外旋角度はどの外転角度でも一定であったのに対し、内旋角度は外転角度が増加するに従って減少し、その結果回旋範囲が減少することが判明した。またこの時の肩甲上腕関節の接触域は下垂位では骨頭下方の前後に広く分布したが、外転角度が増加するに従って骨頭の後方、最終的には結節間溝付近に限局するような動きを示した。これらの結果は学会でも報告した。異常肩については8例撮影しているが、解析は正常肩がある程度終了してから行う予定である。昨年予定していた精度検証であるが、骨模型の加工が終わりようやく1回目の検証が終了した。奥行き誤差補正の妥当性を今後検討する課題が残っている。筋電計の購入まで至っていない。1)当研究室で開発した人工膝関節用の動態解析システムを生体内での骨関節を対象として動態解析できるように改良を続けている。1-a)重なり合った骨輪郭の抽出:平成27年度に技術的には確立し、画像1枚当たり10分程度で輪郭抽出可能となった。1-b)奥行誤差の補正、精度検証:模擬骨を用いて精度実験を行い、平成28年度に解析結果が妥当であることを確認した。1-c)動態解析:正常肩については15例、30肩の撮影が終了し、7例14肩の動態解析がほぼ終了した。昨年度は主に上肢を外転0度、90度、135度、最大外転位で内外旋運動した時の動態について解析し、学会などで報告してきた。具体的には肩関節の並進運動については外転90度、135度では動きが小さいが、最大外転位では外旋で前方へ、内旋で後方へ有意に動くことが明らかとなった。また、肩関節安定化機構である関節包靱帯についてもSGHL、MGHLは下垂位外旋位で、AB of IGHLは外転90度外旋位で、PB of IGHLは最大外転内旋位でそれぞれ最大となることが明らかとなった。今後正常肩の解析がある程度終了した段階で、異常肩を対象に撮影、解析を進める予定である。2)筋電図による解析:昨年度に筋電図の器械を購入した。同時に導出できる筋が限られているため各動作においてどの筋の活動を測定するのが良いか、手技や条件などについて検討、試行錯誤している。導出筋、手技がある程度確立したら、動態解析との同時解析を行う予定である。平成27年度の奥行補正プログラムの作成と精度検証で予想以上に遅れが生じてしまった。昨年度から正常肩の撮影データを解析している。またそれに伴い筋電図の購入も遅れ、現在筋電図を用いた解析方法について試行錯誤している。目的:以前当研究室で開発した人工膝関節を対象とした三次元動態解析システムは人工関節のCADモデルをX線透視画像に重ね合わせ三次元位置を推定するものであった。

今回は生体のあらゆる骨関節に適応できるようにするため、骨輪郭の抽出方法と奥行き誤差の補正方法を確立することを第一の目的とした。更に骨関節のみの動態解析ではなく同時に筋電図解析を行うことで筋活動を含めた三次元運動力学的動態解析ができるシステムを新たに構築することを第二の目的とした。成果:骨輪郭の抽出方法については骨モデルの初期位置を手動で合わせることで不要な輪郭を削除できるシステムを開発した。これによりいかなる骨の重なりや筋電図のリード線のノイズを削除することで動態解析できるようになった。精度実験では鎖骨の測定誤差は0.3-1.6°、0.7-1.9mm,肩甲骨は1.0-1.4°、0.7-1.2mm、上腕骨は0.7-1.1°、0.8-1.4mmであり、臨床的にも使用可能な精度であった。正常人を対象に外転位での回旋運動を解析し、回旋可動域が外転90度以上で小さくなるが最大外転位でも45度の回旋が可能であること、外転位での回旋運動は80%以上を肩甲上腕関節が占めること、各関節包靱帯の関節安定性へ寄与するメカニズムが明らかとなった。また屈曲、肩甲骨面挙上動作を解析し、挙上角度が165度以上と未満で比較すると肩甲骨の外旋運動が異なるという新たな知見を得た。臨床では腱板断裂の患者を対象に進めている。腱板広範囲断裂では断裂程度が同じであっても挙上可能な症例と不可能な症例が存在する。解析した症例がまだ少ないため明確なことは言えないが、その差は挙上初期に骨頭が上方変位するか否かが関与すると考えている。また筋電図の解析も進めていくことで挙上できないメカニズムとその治療方法について新たな知見が得られる。以前当研究室で開発した人工膝関節を対象とした三次元動態解析システムを生体のあらゆる骨関節に適応できるようにするため、骨輪郭の抽出方法と奥行き誤差の補正方法を確立した。精度は2°、2mm以下であり、臨床的に使用可能と判断した。正常人を対象に外転位での回旋運動、挙上運動を動態解析し、様々な新しい知見を得た。更に骨関節のみの動態解析ではなく同時に筋電図解析を行うことで筋活動を含めた三次元運動力学的動態解析ができるシステムを新たに構築した。正常人、腱板断裂を対象にデータ収集を行い解析を進めている。精度検証のための模型購入にあたり、企業が非協力的であったため、購入後更なる改造が必要となった。システムがまだ改良の余地があり、少ない症例で何度か試行錯誤を繰り返しているため多少遅れている。関節での補正プログラムで生じる奥行き誤差を検証する予定にしている。方法はほぼ確立したので、並行して解析を進めていく。筋電計購入についても進める。動態解析については正常肩の解析を終了させる。異常肩については8例撮影しているが、本年度は撮影、解析を進めていく。筋電図については導出筋、手技を確立し、動態解析システムと同時評価を行う予定である。三次元動態解析早い時期に精度検証を行い、精度が担保できていることが確認できたら、本格的に解析を進めていく予定である。筋電計の購入を予定していましたが、まだ購入していません。動態解析と筋電図の同時解析の精度、再現性を検討、確認する必要があり、5名程度の実験を予定している精度検証で使用する人体骨模型を70100万と予想してましたが、30万強で安く購入したことが一番の理由と考えます。システムの改良と同時に筋電計の購入も進めていこうと考えています。
ユビキチンホメオスタシスの制御機構

ユビキチンは細胞内に豊富に存在するタンパク質であるが、細胞の環境や状態に応じて激しく変動し、適切な量になるように調節されている。ユビキチン量が過不足なく調節されていること(ユビキチンホメオスタシス)は、生命活動の維持に重要である。最近私達は、ユビキチンホメオスタシスの制御機構の一つとして、出芽酵母では細胞内のユビキチンレベルが、脱ユビキチン化酵素Doa4とそのインヒビターRfu1によって制御されているという新たな仕組みを発見した(Cell, 2009)。さらに今年度は、Doa4の正の制御因子であるBro1が、Doa4の負の制御因子であるRfu1のエンドソーム局在と熱ショック時の分解を直接結合することによって制御することを明らかにした(投稿中)。ユビキチンのホメオスタシスを維持する機構は未知の点が多く、さらに解明することも研究の目標である。VCP(酵母ではCdc48)はユビキチン関連シャペロンであるAAA+ ATPaseである。VCPの幾つかのコファクターの変異はユビキチンのホメオスタシスに影響を与えることが報告されている。そこでVCPとそのコファクターの機能を調べるために、哺乳類細胞を用いてミトコンドリアストレスの効果を調べた。前年度、哺乳類のParkin発現細胞ではミトコンドリアストレスによって正常型VCPはミトコンドリアに動くが、疾患型のVCPではミトコンドリアへの移行が著しく抑えられることが明らかにした。今年度はコファクターの機能を調べ、コファクターUfd1がVCPの移行に重要な働きをしていることを示唆する結果を得た。24年度が最終年度であるため、記入しない。ユビキチンは細胞内に豊富に存在するタンパク質であるが、細胞の環境や状態に応じて激しく変動し、適切な量に厳格に調節されている。ユビキチンの不足は、マウスでは不妊、肥満、神経変性変異を起こし、出芽酵母はストレス感受性になり胞子形成能を失う。一方、ユビキチンは過剰にあっても、出芽酵母では重金属に対して感受性になり、細胞に悪影響を与える。従ってユビキチン量が過不足なく調節されていること(ユビキチンホメオスタシス)は、生命活動の維持に重要である。最近私達は、出芽酵母において細胞内のユビキチンレベルが、脱ユビキチン化酵素Doa4とそのインヒビターRfu1によって制御されているという新たな仕組みを発見した(Cell,2009)。しかし、ユビキチンのホメオスタシスを維持する機構は、未知の点が多く、また細胞内でユビキチンの動態や局在がどのように変化し、それが細胞にどのような影響を与えるかについても不明な点が多く、これらの点を解明することが研究の目標である。今年度は、まず出芽酵母を用いてUfd3(Doa1)の働きを調べた。Ufd3はユビキチン関連シャペロンであるAAA+ ATPase VCP/Cdc48のコファクターであるが、Ufd3の欠損変異株では細胞内のユビキチンが減少する。この欠損変異株をMG132処理すると、ユビキチンの減少が部分的ながら抑えられ、ufd3欠損ではユビキチンがプロテアーソームによって積極的に分解されることが示唆された。また哺乳類細胞を用いてミトコンドリアストレスによる彩響を調べた。哺乳類のParkin発現細胞ではミトコンドリアストレスによってミトコンドリアがユビキチン化される。そのユビキチン化ミトコンドリアに対してVCP/Cdc48が移行するが、疾患型のVCPではミトコンドリアへの移行が著しく抑えられることが明らかになった。

ミトコンドリアストレスに関しての新たな発見に時間を取られ、Ufd3の欠損によりなぜユビキチンが減少するかについての解析がやや遅れた。Ufd3はエンドソームにも一部局在することから、ユビキチンの代謝は液胞系の分解が関与するのではないかと考えており、MG132処理の実験を考えつくのが遅かった。24年度が最終年度であるため、記入しない。ufd3の欠損でなぜユビキチンが減少するかについてさらに解析を進める。ポリユビキチンをコードする遺伝子UBI4とUFD3の2重変異株では温度感受性になるので、この株を利用してスクリーニングを行いたい。またミトコンドリアストレスに関しては、ユビキチンの動態変化をVCP/Cdc48の正常型と疾患型との関係を明らかにしたい。
C型肝炎ウイルス(HCV)の変異の解析とワクチン開発への考察

C型肝炎ウィルス(HCV)の遺伝子構造が明らかにされ、診断面では各種第二世代のHCV抗体の開発により十分な感度で血清診断が可能となった。我々も独自にHCVの遺伝子のクローニングを行い、コア抗原と非構造蛋白(NS3領域)との複合抗原を用いた高感度の新しいHCV抗体検出系を開発した。1.HCV遺伝子の免疫スクリーニングによるクローニングC型肝炎患者血清よりAGPC法によりRNAを抽出し、ランダムプライマーを用いてλgtII-cDNAライブラリーを作成し、患者(急性C型肝炎患者回復期および慢性C型肝炎)血清を抗体として用いクローニングを行った。患者プール血清よりスタートしたひとつのcDNAライブラリーから幸運にも構造蛋白領域をコードするクローン2個を含むHCVの各領域の特異的cDNAクローンを得た。2.新しい高感度HCV抗体検出系の開発コア領域をコードするS29抗原とNS3領域をコードするS4抗原の混合抗原を用いたELISAによるHCV抗体測定系はきわめて高感度であり、現在開発されている第二世代HCV抗体検出系(アボットII)と同等以上の感度、特異性を有し、臨床応用が期待される。HCVはRNAウィルスであり、変異が多いことが指摘されている。このHCVの変異は、急性肝炎からの慢性化への機序をはじめとして、C型肝炎の種々の病態に関与している可能性だけでなく,HCV抗体検出系の確立にも重要な意味を有する。したがって、本研究では、HCV変異性の検討を、HCV genomeの種々の領域を用いたPCR法や、HCV抗体測定系を用いて行なった。(1)HCV変異性の検討(PCR法):PCR法に際して、用いるプライマ-によりHCV・RNAの検出率が異なった。NSー5領域に比して、非翻訳領域と用いるとHCV・RNAの検出率は高く、非翻訳領域は変異が少ないことが確認された。また、PCR法自体も従来のRT法よりもnested法の方が検出率が高かった。(2)HCV変異性の検討ーワクチン開発への考察:研究代表者がクロ-ニングによりえているHCV遺伝子のいくつかの領域を用いて、HCV抗体測定系を作製し、中和拡体の有無等について検討した。コア領域由来のS29,NS3領域由来のS4,さらにはこのS29+S4に対する拡体の存在とC型肝炎患者血清を用いて測定した。S29+S4では従来のロア領域に由来するNー14抗体測定系よりもはるかに高率にl/a95%にHCV拡体が検出された。中和抗体の存在については急性C型肝炎について次年度更に検討をすすめたいC型肝炎ウィルス(HCV)の遺伝子構造が明らかにされ、診断面では各種第二世代のHCV抗体の開発により十分な感度で血清診断が可能となった。
ウイルスによる植物の抵抗性システムの回避と利用の分子機構

Red clover necrotic mosaic virusの複製酵素成分タンパク質と相互作用する宿主タンパク質を免疫沈降/質量分析解析により多数同定し、それらのウイルス複製における機能解析を行った。その結果、RCNMVは、シャペロンであるHsp70,Hsp90、膜輸送系に関わるARF1、ホスファチジン酸(PA)の産生に関わるホスホリパーゼD(PLD)などを利用し宿主膜を改変してウイルスRNA複製工場を形成すること、また、複製複合体にはウイルス抵抗性に必要な宿主タンパク質も含まれていたことからウイルスは抵抗性因子も複製の制御に利用してウイルスRNA複製を行うことが分かった。ウイルスRNA複製複合体に含まれる候補宿主タンパク質の分離・同定エピトープタグ付加p27を用い、RCNMV感染葉の膜画分に含まれるRCNMV RNA複製複合体を精製し、質量分析を行った。その結果、Hsp70とHsp90などのシャペロンをはじめsmall GTPaseであるArf1など多くの宿主タンパク質を同定した。興味深いことに,本画分をBlue Native PAGEで分画した後に得られたRNA複製複合体(480kDa)にはこれらのシャペロンタンパク質やArf1は検出されなかった。これらのことからHsp70、Hsp90、Arf1は、RNA複製複合体形成過程で重要な働きをするタンパク質であることが示唆された。ウイルスゲノムRNAに結合する宿主タンパク質の分離・同定RNA1の3'非翻訳領域(UTR)のadenine-rich領域にpoly(A)結合タンパク質(PABP)が結合することを明らかにした。PABPの結合を阻害するRNA変異は、キャップ非依存的翻訳活性を阻害した。また,ファージMS2の外被タンパク質(MS2CP)結合配列とMS2CP融合PABPを用いたテザードアッセイから,RNA13'-UTRのadenine-rich領域へのPABPの結合がキャップ非依存的翻訳活性で重要であることが明らかとなった。ウイルスタンパク質の機能ドメインの同定タンパク質問相互作用とRNA複製複合体(480kDa)形成、及びRNA結合に必要なp27のドメインとアミノ酸を同定した。Biomolecular fluorescence complementation法を用いた解析から、Arf1はRCNMV複製酵素成分タンパク質のひとつであるp27とER膜上で結合することを証明した。ARF1のGDP結合型からGTP結合型への変換を阻害するBrefeldin A (BFA)により、タバコBY2プロトプラストにおけるRCNMVのRNA複製が著しく阻害された。さらに,BFAはp27のER膜への局在および複製酵素複合体の蓄積を阻害した。以上のことから、ARF1はp27によりRCNMV複製の場へリクルートされ、複製酵素複合体の形成、維持において重要な役割を担っていることが示唆された.植物プラスセンスRNAウイルスであるRed clover necrotic mosaic virus (RCNMV)の複製酵素タンパク質と相互作用する候補宿主タンパク質について、さらに免疫沈降/質量分析解析を行い、新たなタンパク質を多数同定することに成功した。そこにはphospholipase D (PLD)、Tm1、AGO2などが含まれていた。これまでの研究でp27と結合する宿主タンパク質としてシャペロンタンパク質であるHSP70,HSP90及び膜輸送系に関わるsmall GTPaseであるARF1を同定し、HSP70とHSP90はRCNMV RNA複製複合体形成過程で重要な役割を担うこと、Arf1はp27によりER膜にリクルートされ小胞体膜改変,すなわちRNA複製場の構築に重要であることを既に報告してきた。今回、p27はERとゴルジ間のCOPI/COPII輸送経路に加え、さらにゴルジ系から細胞膜への膜輸送系にも影響することが分泌マーカータンパク質を用いた実験から分かった。PLDはホスファチジン酸(PA)の産生に関わる酵素である。PLDノックダウン植物ではRCNMVに対する感受性が低下すること、また、RCNMV感染は植物組織中のPA量を増大させることが分かった。さらに外部からPAを加えるとin vitroおよびin vivoいずれにおいてもRCNMV RNA複製が促進された。これらの結果からPLDとその産物であるPAはRCNMVの複製に必須の因子であることが示唆された。RNAサイレンシング関係では、RCNMV感染によりAGO2の発現が誘導されること、AGO2ノックダウン植物ではRCNMVに対する感受性が増大することから、AGO2はRCNMVに対する抵抗性に関わっていることが示唆された。p27と結合する宿主タンパク質としてシャペロンタンパク質であるHSP70,HSP90及び膜輸送系に関わるsmall GTPaseであるARF1を同定し、その後、これらのタンパク質の細胞内局在がRCNMVRNAの合成場所と一致することを確かめた。HSP70とHSP90はRCNMV RNA複製複合体形成過程の異なったステップで働くことが明らかとなった。特に、HSP90がRNAとの会合ステップで重要な役割を担うことが分かったのは重要な成果の一つである。複製補助タンパク質であるp

27は通常ゴルジ装置と共局在するArf1と結合し、RCNMV RNA複製の場である小胞体膜へArf1をリクルートして,複製酵素複合体の形成とその維持において重要な役割を担っていることが分かった.p27によるArf1を介した小胞体膜改変,すなわちRNA複製場の構築が示唆された.以上の成果はそれぞれJ.Virol.に掲載され、HSP関係の論文はスッポトライト論文として紹介された。RNAサイレンシング関係の研究では、RCNMV感染によってDCL3 mRNAの蓄積量が特異的に増大することを明らかにした。また、新たな複製酵素複合体の質量分析解析により、RCNMV複製酵素タンパク質がDCL2、AGO1、AGO2と相互作用する可能性が示唆された。本研究の目的は植物RNAウイルスの複製機構を明らかにすることである。申請者らはマメ科植物を主な宿主とするプラスセンスRNAウイルスであるRed clover necrotic mosaic virus (RCNMV)をモデルウイルスとして用い、RCNMVの複製酵素成分タンパク質であるp27とp88と相互作用する候補宿主タンパク質を免疫沈降/質量分析解析により多数同定してきた。これまでの研究から、p27と結合する宿主タンパク質としてHSP70,HSP90及び膜輸送系に関わるsmall GTPaseであるARF1を同定し、HSP70とHSP90はRCNMV RNA複製複合体形成過程で重要な役割を担うこと、Arf1はp27によりER膜にリクルートされ小胞体膜改変,すなわちRNA複製場の構築に重要であることを既に報告してきた。また、ホスファチジン酸(PA)の産生に関わる酵素であるホスホリパーゼD(PLD)とその産物であるPAが複製に必要あることを示唆する結果を得てきた。昨年度は、PLDαがp88と植物細胞で相互作用すること、また少なくともPLDαはp88と直接結合することをin vitro実験で証明することに成功した。さらにRCNMV感染により植物で蓄積が増大するPAと推定された脂質が真にPAであることをLC-MS解析で証明した。これらの結果からPLDとその産物であるPAがRCNMVの複製において不可欠な役割を担っていることを証明できた。26年度が最終年度であるため、記入しない。植物病理学26年度が最終年度であるため、記入しない。ウイルスRNA複製複合体構成タンパク質の解析とウイルスRNAゲノムに結合する宿主タンパク質の解析で得られた候補タンパク質が実際にRCNMV感染とRNA複製で重要な働きをしていることが明らかとなったことで、概ね順調と自己評価する。特に、RCNMVの複製酵素成分タンパク質p27と相互作用する宿主因子としてADP-ribosylation factor 1 (ARFI)を同定できたことは.ウイルスによる細胞膜修飾機構を明らかにしていく上で重要な布石となると考える。
プラスチドゲノム装置の分子構築と不連続進化仮説に関する研究

2年間にわたり,プラスチドゲノム装置の不連続進化仮説を検証するために実験を行い,以下の結果を得た。1.ヒメツリガネゴケのT7ファージタイプRNAポリメラーゼの細胞内局在について,さらに詳しく検討し,このRNAポリメラーゼがすべてミトコンドリアに局在することを,免疫ブロット,GFP融合タンパク質,転写活性のタゲチトキシン感受性などにより証明した。被子植物では,このように元来ミトコンドリアの酵素であったものから,遺伝子重複によって葉緑体の酵素が生まれたと推定された。2.葉緑体包膜のDNA結合タンパク質PENDの細胞内局在を,安定な形質転換体を用いた実験により調べ,基本的には葉緑体に局在すること,傷害を受けた細胞では,細胞核にも局在することなどを確認した。葉緑体の傷害情報を細胞核に伝達する役割を持つ可能性が考えられた。3.エンドウでは,亜硫酸還元酵素(SiR)が,葉緑体核様体の主要DNA凝縮タンパク質である。エンドウのSiRのcDNAを単離し,構造を決めた。ヒメツリガネゴケではエンドウと同様に,SiRが核様体の主要構成成分であったが,紅藻とシアノバクテリアでは,核様体からSiRが検出されたものの,主要成分とは考えられなかった。進化の過程で,葉緑体核様体の主要DNA結合タンパク質が,置き換えられたことになる。4.葉緑体の転写活性に,タンパク質のリン酸化が関わっていることを明らかにした。5.ゲノム進化を解析するソフトウェアの開発を行い,これを用いてシアノバクテリアから植物にもたらされた遺伝子群の同定を行った。シアノバクテリアには多数の転写因子が存在し,遺伝子発現の制御に関わっているが,その細胞内共生によって生じた真核藻類プラスチドでは,ほとんどの転写因子が失われている。陸上植物になって,新たに細胞核からプラスチドに転写因子が送り込まれたように思われる。この不連続進化仮説を検証するために実験を行い,以下の結果をえた。1.T7ファージタイプRNAポリメラーゼをコードするcDNAを,ヒメツリガネゴケから2個単離し,それらの産物がミトコンドリアに輸送されることがわかった。詳細な系統解析の結果,これらは,被子植物の葉緑体・ミトコンドリア両タイプの酵素とは側系統にあたり,従って,葉緑体のNEPと呼ばれる酵素の起原は,蘚類と維管束植物の分岐以降のかなり新しい時期であることがわかった。2.エンドウで単離された葉緑体包膜のDNA結合タンパク質PENDのホモローグを,シロイヌナズナ,アブラナ,イネで同定し,これらがすべて,葉緑体の他,細胞核にも輸送されることを確かめた。3.葉緑体核様体を構成する主要DNA凝縮タンパク質である亜硫酸還元酵素が,ヘパリン処理によってはずれ,それに伴い,転写活性が著しく増加することを明らかにした。クロマチン同様,核様体もDNAの凝縮状態によってグローバルな活性調節を受けていることを示す結果である。4.エンドウとキウリから,エチオプラスト核様体を単離し,葉緑体核様体との違いを調べた。エンドウでは,構成タンパク質に大きな違いがあり,また,転写活性が著しく低かった。また,ヒメツリガネゴケとシアニジオシゾンの葉緑体核様体と,シアノバクテリアであるAnabaenaの核様体を単離し,タンパク質構成と転写活性を測定した。今後更に詳しい比較をする。前年度に引き続き,プラスチドゲノム装置の不連続進化仮説を検証するために実験を行い,以下の結果を得た。1.ヒメツリガネゴケのT7ファージタイプRNAポリメラーゼの細胞内局在について,外国から異なる結果が報告されたため,さらに詳しく検討した。

2個のメチオニンコドンのうち,第一のものから強制的に翻訳された産物は確かに葉緑体に輸送されたが,細胞内ではこの位置から翻訳されることはほとんどなく,結果として,このRNAポリメラーゼはすべてミトコンドリアに局在することを,免疫ブロット,GFP融合タンパク質,転写活性のタゲチトキシン感受性などにより証明した。2.葉緑体包膜のDNA結合タンパク質PENDの細胞内局在について,安定な形質転換体を用いた実験により調べ,基本的には葉緑体に局在すること,傷害を受けた細胞では,細胞核にも局在することなどが分かった。葉緑体の傷害情報を細胞核に伝達する役割を持つ可能性が考えられた。3.亜硫酸還元酵素(SiR)が葉緑体核様体の主要DNA凝縮タンパク質であることについてはエンドウを用いてすでに明らかにしているが,ヒメツリガネゴケ,単細胞紅藻およびシアノバクテリアからも核様体を単離して,比較検討した。ヒメツリガネゴケではエンドウと同様に,SiRが核様体の主要構成成分であったが,紅藻とシアノバクテリアでは,核様体からSiRが検出されたものの主要成分とは考えられなかった。また,エンドウのSiRのcDNAを単離し構造を決めた。4.二次元電気泳動により,核様体に含まれるSiRと葉緑体全体に存在するSiRとでは等電点が大きく異なることが分かった。この原因について,葉緑体のリン酸化酵素を新たに取得して詳しく検討したが,葉緑体の転写活性にはリン酸化が関わっているものの,SiRの等電点はリン酸化では説明できないことが分かった。5.ゲノム進化を解析するソフトウェアの開発を行い,これを用いてシアノバクテリアから植物にもたらされた遺伝子群の同定を行った。
英語を話す意思(WTC)への刺激要因と阻害要因の調査

本研究は、トライアンギュレーション手法(量的・質的調査を有機的に組み合わせる方法)を用いて、今まで全く未開拓分野であった日本の中学生の英語授業における「英語を話す意思」であるWillingness to Communicateという心理状態を多角的に探るものである。本研究によって3つの目的を達成する。目的1は、タスクベースドラーニング(Task Based Learning ,以下, TBL)を中学校の英語コミュニケーション活動時に導入し、学習者が自らの意思で他者と英語で対話する機会を作り、活動時、どのような学習者の個人的要因(英語能力・情意性質・過去の経験)が「英語を話したい」、「英語を話したくない」を左右するのか明らかにすることである。目的2は、国内では前例が少ない「再生面接法(stimulated recall interview)」を用いて、学習者を取り巻く外部的環境(仲間、グループ、教員、タスク)の中からWTC刺激因子・WTC阻害因子を明らかにすることである。目的3は、上記の研究結果を体系的にまとめ、日本のEFL(English as a foreign language)と英語圏のESL英語学習者の間には、どのような相違点があるのか、文化的・政治的土壌や教室環境の観点から明らかにしていく。分析から、日本の教育現場で英語によるコミュニケーションを実施する場合、どのような動機づけ育成が必要となるかを提言していくことである。平成30年度:【量的・質的データの収集】まず、平成30年度4月から8月までは、先行研究を基に質問肢・TBL授業など研究に必要なものを調査協力と作成した。9月から12月までは、研究対象校にてTBL授業を実践し、質的・量的データを入手した。量的データ入手後は、不備がないか確認後、SPSSに入力し、データ化した。質的データは、「授業参与観察」と「stimulated recall interview (再生面接法:半構造化面接(semi-structured interview:タスク後48時間以内に調査対象者に心理を回想してもらう)」により入手した。入手したすべての面接と観察記録は、研究代表者が数か月かけて言語データに置き換えて保存した。さらに、八島智子教授が主催する研究会にて、研究結果を発表し、検討を行った。【量的データ分析】「記述統計」「正規分布検定」「相関分析」「重回帰分析」などを用いて、WTCの影響要因を探る予定である。また、授業導入期と後期間の学習者の変化は、二元配置分散分析などで行う。結果をすべてグラフ・表で表した。【質的データ分析】インタビューから収集したデータをすべて記録し、厳重に保管した。記録したデータは、ストラウス・コービン版グラウンデッド・セオリー・アプローチ(Strauss, A., & Corbin, H., 1990)によりコード化し、調査対象者のWTCに関する心理・行動パターンを抽出した。【結果発表】1.成果を論文としてまとめあげて、TESOL QuarterlyやSystemなどの国際ジャーナルに投稿したい。

記録したデータは、ストラウス・コービン版グラウンデッド・セオリー・アプローチ(Strauss, A., & Corbin, H., 1990)によりコード化し、調査対象者のWTCに関する心理・行動パターンを抽出した。【結果発表】1.成果を論文としてまとめあげて、TESOL QuarterlyやSystemなどの国際ジャーナルに投稿したい。一年目に予定していたデータ収集ならびにデータ入力をパソコンソフトなどで効率的に行えたため人件費(アルバイト代)が不要となり、結果として残額が生じた。残額分を早期に得られた成果発表の用途に使いたい。具体的には、国際学会発表、論文執筆のための校閲・学会発表用旅費の支出へ当てたい。
Gene Cutterを用いたC型肝炎ウイルス感染症の遺伝子治療

1. HCVgenecutterはHCV RNAを塩基配列特異的に切断するribozyme RNAの部分と、これを肝細胞特異的に取り込ませるキャリアー(asialoorosomucoid-poly-L-lysine ; ASOR-PLL)の部分からなる。ビオチン化した合成RNA (poly-C)とASOR-PLLの複合体をラットに静注したところ、ビオチン化poly-Cは肝細胞にのみ検出され、キャリアによるgene cutterの肝細胞特異的な取り込みが確認された。3. HCV感染培養ヒト肝細胞をラットの脾臓に移植し、動物実験モデルを作製した。HCV gene cutterを静注後10分で脾臓を摘出し、固定包埋後、パラフィン切片上でin-situ RTを行った。この結果、HCV gene cutterを静注したラットではHCV RNAのRTは起こらず、静注しなかったラットではRTが確認された。以上の成績は、HCV gene cutterにより、ラットの脾臓に移植されたヒト肝細胞にribozymeを導入することが可能であり、さらに、ribozymeによりHCV RNAが切断されたことを示す。4.肝細胞内の標的の存在する部位へribozymeをより効率良く送り込むことを目的に、ポリマーベクターを開発した。テキサスレッド標識Oligo-DNAとポリマーベクターとの複合体による検討では、導入は肝細胞特異的であり、さらに、細胞質へのOligo-DNA導入が証明された。1. HCV gene cutterはHCV RNAを塩基配列特異的に切断するribozyme RNAの部分と、これを肝細胞特異的に取り込ませるキャリアー(asialoorosomucoid-poly-L-lysine ; ASOR-PLL)の部分からなる。1.HCV gene cutterはHCV-RNAを塩基配列特異的に切断するribozyme RNAの部分と、これを肝細胞内に特異的に取り込ませるキャリアーであるasialoorosomucoid-poly-L-lysine(ASOR-PLL)の部分からなる。このような構造の複合体が生体内での分解を免れて肝細胞中に特異的に導入されるかを検討するため、ラットを用いた動物実験を行った。すなわち、ビオチン化した合成RNA(poly-C)とASOR-PLLの複合体をラット下大静脈より静注したところ、ビオチン化poly-Cが肝細胞に検出され、腎臓や脾臓には検出されなかった。この結果より、合成RNAを肝細胞特異的に取り込ませることが可能であると考えられた。2.ribozyme RNAは生体内でRNA分解酵素により分解され易い。この点を改善するため我々はribozyme RNAの一部をDNAに変換したら5′-DNA-RNA-DNA-RNA-DNA-3′構造のハイブリッドribozymeを作製した。1.HCV感染ヒト肝細胞脾内移植ラットを用いた遺伝子治療実験:HCV感染ヒト肝細胞を脾臓に移植したラットにHCV gene cutterを静注し、in vivoでHCV gene cutterの効果を検討した。HCV gene cutter静注後10分で脾を摘出し、固定包埋後、パラッフィン切片上でin situ RT(逆転写)を行った。HCV gene cutterを静注したラットではHCV RNAの逆転写が起きず(静注しなかったラットでは逆転写された)、移植肝細胞内HCV RNAが切断されていることが証明された。この結果は、動物実験レベルでもHCV gene cutterが肝細胞内に導入され、リボザイムによってHCV RNAが配列特異的に切断されたことを示している。2.HCV gene cutterのDrug deliverysystemの開発:HCV genecutterを臨床的に使用するためには遺伝子導入のための新しいベクターの開発が必要である。このため、今までベクターとして使用したASOR-PLLをさらに発展させ、よりシンプルで有機合成可能なポリマーベクターの開発を共同で開始した。このポリマーベクターは、アシアロ糖蛋白受容体に認識される最小限の糖鎖とポリカチオンから構成される。平成8年度中にin vitroでのHCV gene cutter導入と肝細胞内のHCV RNA切断効果を検討する予定である。

将来的には、このポリマーベクターを用いたHCV gene cutterの効果と安全性をHCV感染チンパンジーで検討し、ヒトでの臨床試験へ結び付けたいと考えている。HCV gene cutterは肝細胞特異的に取り込まれ,HCV RNAを特異的に切断破壊する。本年度は、肝細胞内の標的の存在する部位へribozymeを効率良く送り込むことを目的に、ポリマーベクターの開発を行った。ガラクトース残基を有するスチレン誘導体であるN-P-ビニルベンジル-D-ラクトンアミド(VLA)のポリマー(PVLA)を肝細胞に対する標的リガンド鎖とし、これと、生体膜親和性の官能基を末端に有するリジンオリゴマーとを重合させた共重合体をポリマーベクターとした。このポリマーベクターは核酸と結合し、血清中で核酸を保護した。次に、テキサスレッド標識Oligo-DNAとポリマーベクターとの複合体を形成させ、標的細胞特異的な取り込みを共焦点レーザー顕微鏡にて観察した。導入は肝細胞のみに認められ、細胞質へのOligo-DNA導入が証明された。また、細胞質内分布ではEndosomeの他に、細胞質内に核酸が放出されたことを示す蛍光も認められ、ポリマーベクターは標的細胞指向性の遺伝子キャリアーとして使用可能であることが判明した。この結果は第55回日本癌学会総会の遺伝子治療のワークショップにて報告した。現在、さらに効率良くribozymeの効果を発揮させることを検討中である。
コーパスを利用した日本語述語形式の発達に関する学習者言語研究と日本語教育への応用

本研究では、既存の学習者コーパス及び日本語コーパスを用いて、日本語学習者の産出する述語形式のうち丁寧体動詞の発達に関する実態調査を行うと同時に、母語の異なる学習者グループ間、あるいは習熟度の高いレベルの学習者と日本語母語話者との比較を含む対照中間言語分析を行った。その結果、一般に日本語学習者の習熟度が上がると助動詞マスを含む標準的丁寧体動詞のパラダイムの使用が減少するのに対して、助動詞ノダや「普通体動詞+です」といった非標準的丁寧体動詞のパラダイムの使用が増加すること、日本語母語話者と比べて、韓国語母語話者は丁寧体動詞をより少なく使い、中国語・英語母語話者はより多く使うことが分かった。平成26年度の研究計画は「文献調査と通時コーパスを用いた検証」であった。当該年度は、学習者言語のうち、丁寧体動詞述語のパラダイム(肯定・否定、及び、過去・非過去形を含む)を対象として、共時コーパス(KYコーパス)と通時コーパス(C-JAS)を使ってその発達段階を調査した。その結果は、Horiuchi (2014a, b:平成26年度の研究成果欄を参照)という2つの査読論文(英語)として出版された。上記2論文では、共時的・通時的コーパスといった異なる種類の学習者コーパスデータを用いたが、両者に共通して見られる学習者言語の特徴を明らかにし、その背後の要因を分析した。具体的には、「ます、ません、ました、ませんでした」という標準的なパラダイムの他に、学習者の母語によらず彼らの学習歴や習熟度が上がるにつれて、「(する)です、(しない)です、(した)です、(しなかった)です」のような「普通体+です」の形式のパラダイムを発達させるという興味深い事実が明らかになった。上記のような新しい事実の発掘はもちろんのこと、上記2論文では、近年問題になっている日本語母語話者の否定丁寧体の分化(「ません」系と「ないです」系)との比較も行い、特にこれらに関する先行研究の成果を踏まえた分析を行っている。以上が平成26年度の主な研究業績だが、一部研究計画を変更し、習得にも時間がかかり、且つ、今後このコーパス分析プロジェクトの進展に必要と思われる統計分析の基礎を学ぶため、関連するワークショップ、研究会、学会などに参加し、自らの研究能力を高める努力を行った。また、学習者コーパス分析の技術を高めるために、エディタを使ったテキストデータの処理、形態素解析、Excelを使ったデータ処理などについても学んでいる。更に、コーパス分析技術と表裏の関係にあるコーパス開発の技術についても学習中である。平成27年度の科研費実施状況報告書の「今後の研究の推進方策」に記したように、今年度の研究計画は「通時学習者コーパス」「共時学習者コーパス」「母語話者コーパス」を並行的に用いて対象となる述語形態の頻度とバリエーションを調査することであった。本年度はこれらのコーパスを用いて丁寧体動詞(動詞のマス形)の諸形式の頻度とバリエーションについてデータ収集とその処理を行ってきた。まだ、分析には至っておらず、業績・成果は出ていないが、通時コーパスについては、C-JASを用いて、被験者6人・8期分のデータについて、6人全体・母語別・学習者別にそれぞれ「ます、ました、ません、ませんでした、ましょう、まして」といった活用形諸形式の頻度、及び、終助詞・接続助詞類などを伴う形式の頻度を調べた。また、母語話者コーパスについては、BCCWJを用いて話し言葉に近い「Yahoo!知恵袋」「Yahoo!ブログ」といったサブコーパスでマス形動詞の諸活用形式及びバリエーションの頻度を調べた。更に、テ形動詞に関してもその後接形式ごとに頻度を調べている。以上のコーパスデータに加えて、共時コーパスのKYコーパスを用いて、初級・中級・上級・超級のレベル別及び母語話者別に同様のマス形動詞のデータを収集すれば、本科研費プロジェクトの最終目標となる対照中間分析の基礎データの収集は完了する。現状では、まだこのデータ収集は完了していない。今年度は以上の基礎データ収集の他に、データに基づく日本語教育のための語彙・文法研究会で出版予定のシリーズ本『現場に役立つ日本語教育研究シリーズ第5巻コーパスから始まる例文作り』の「状況・場合を表す表現」の章を脱稿したり、統計学やRを使った統計分析に関する講座を受講したりした。研究実績の概要でも述べたが、平成27年度は基礎データの収集作業にとどまってしまった。大きな理由として、予想以上に基礎データ収集に時間がかかってしまったこと、上記のシリーズ本の論文完成に予想以上に時間がかかったこと、及び、次年度のための分析技術向上を目標とした統計分析・統計用プログラミング言語Rの習得に時間をとられてしまったことが挙げられる。本研究は、交付申請書に記したように、1)コーパスを用いて、日本語学習者の産出する述語形式の発達を調査し、従来第二言語習得研究で提案されてきた仮説を検証すること、2)対照中間言語分析と呼ばれる手法で習熟した学習者と日本語母語話者のコーパスデータの比較を行うこと、3)以上の成果を日本語教育に還元すること、の三点を目的とし、平成28年度の研究実施計画としては、「母語話者コーパスを用いた対照中間言語分析」と「研究成果の報告」を行うことになっていた。

日本語丁寧体動詞の習得と発達に関して、平成28年度はおおむね上記の3つの目的を果たすべく、母語話者コーパスとの比較を含む対照中間言語分析に関する報告を以下の学会で発表した(3)と4)は発表が採択されたもの)。1)「コーパスに基づく日本語学習者の丁寧体動詞の使用実態の分析」2016年待遇コミュニケーション学会秋季大会(2016年10月29日、於:早稲田大学)、2)「英語母語話者の日本語丁寧体動詞の使用実態:コーパスに基づく分析」2017AATJ Annual Spring Conference (March 16, 2017, The Sheraton Centre Hotel, Toronto, Canada)、3)「韓国語を母語とする日本語学習者の丁寧体動詞の習得と発達:対照中間言語分析の観点から」2017年度日本語教育学会春季大会(2017年5月21日、於:早稲田大学)、4)「中国語母語話者の日本語丁寧体動詞の発達:コーパスに基づく分析」2017The 11th OPI International Symposium (2017年8月5日、台湾淡江大学)本研究では、既存の学習者コーパス及び日本語コーパスを用いて、日本語学習者の産出する述語形式のうち丁寧体動詞の発達に関する実態調査を行うと同時に、母語の異なる学習者グループ間、あるいは習熟度の高いレベルの学習者と日本語母語話者との比較を含む対照中間言語分析を行った。その結果、一般に日本語学習者の習熟度が上がると助動詞マスを含む標準的丁寧体動詞のパラダイムの使用が減少するのに対して、助動詞ノダや「普通体動詞+です」といった非標準的丁寧体動詞のパラダイムの使用が増加すること、日本語母語話者と比べて、韓国語母語話者は丁寧体動詞をより少なく使い、中国語・英語母語話者はより多く使うことが分かった。研究実績の概要でも述べたが、平成26年度の研究計画は、丁寧体動詞述語に関して言えば、ほぼ達成できたのではないかと思う。ただ、学習者言語の発達に関する文献調査を後回しにし、統計分析やコーパスデータ処理技術等のコーパス分析手法の基盤に関する学習を優先した点や、通時的コーパスだけではなく共時的コーパスを用いた分析を行った点に関して言えば、計画を一部変更したと言える。しかし、この優先した部分は今年度以降どの道必要な過程であり、文献調査という計画の一部を後回しにした分、共時的コーパスの分析といった今年度以降の計画の一部を先取りしたとも言える。また、コーパス調査の精度を高めるのに必要な統計分析や、母語話者コーパスの代表である「現代日本語書き言葉均衡コーパス」(BCCWJ)のデータ検索ツール「中納言」やExcelを使ったコーパスデータ分析技術の習得は順調に行ってきた。平成28年度は最終年度となる為、少なくとも収集してきた基礎データに基づく分析を行い、第2言語学習者のマス形動詞の発達に関する対照中間分析を行う。特に、学習者と母語話者のマス形動詞の用法の違い、学習者別及びレベル・時期別のマス形動詞の用法の違いを明らかにできると考える。また、同様の分析はテ形動詞の発達についても行う予定である。今年度上半期には、主要な基礎研究の結果の分析を行い、下半期には学会発表、専門誌への投稿を行う予定である。言語学、日本語教育平成27年度の研究計画は「共時コーパスを用いた検証」、平成28年度の研究計画は「母語話者コーパスを用いた対照中間言語分析」となっているが、「研究実績の概要」「現在までの達成度」の項で述べたように、研究計画の一部が遅れていたり先取りされていたりするため、当初の年次計画を縦割りに再構成する。