hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
炭素鎖フリーラジカルの電子構造と励起状態ダイナミクスの研究

C_nH、C_nN等に代表される炭素鎖を持つフリーラジカルは、これまで電波天文やマイクロ波分光で活発に研究されているが、その電子状態や電子励起状態の構造、ダイナミクスに関する研究は極めて限られていた。本研究では、このような炭素鎖フリーラジカルの励起状態のダイナミクスを明らかにすることをめざした。本計画で導入した色素レーザーを使用して、炭素鎖ラジカルHCCSに対して2台の色素レーザーを用いたSEP(stimulated emission puming)分光を行った。HCCSラジカルは電子基底状態、および電子励起状態ともに縮重した電子状態を取り、極めて複雑な振電相互作用(Renner-Teller効果)をしていることが知られているが、その基底状態の振電構造の解明ができた。SEP法は広く使われている分光法であるが、HCCSのようなラジカル種に適用された例は極めて少ない。星間分子として重要なCCSラジカルの可視域の電子遷移を初めて帰属し、電子基底状態に関し全く新しいデータを得るとともに、電子励起状態の更に詳しい情報を得るべく、全く新しい構成によるマイクロ波-レーザー2重共鳴法を開発し、S/Nの良い2重共鳴信号を得ることができた。この方法により、近赤外域まで観測範囲を広げ、このラジカルの電子励起状態の振電構造を明らかにした。また、これまで全く知られていなかった新しい炭素鎖ラジカルNC_3Oの電子遷移、および基底状態の純回転遷移をはじめて観測し、基底状態の直線性、電子励起状態の振電構造を明らかにした。その他に窒素原子を含む一連の炭素鎖ラジカル、HC_4Nラジカル、CHCHCNラジカル、H_2C_3Nラジカルの純回転遷移を観測した。C_nH、C_nHN等に代表される炭素鎖を持つフリーラジカルは、これまで電波天文やマイク口波分光で活発に研究されているが、その電子状態や電子励起状態の構造、ダイナミクスに関する研究は極めて限られていた。本研究では、このような炭素鎖フリーラジカルの電子スペクトルを観測し、その励起状態のダイナミクスを明らかにすることをめざした。本年度は、C_4HおよびC_4Dラジカルの近紫外域の電子遷移の詳しい解析を行い、励起状態の複雑な振電相互作用(Renner-Teller効果)に対する理解を得ることができた。また、このラジカルの励起状態では、背景となる状態密度の高い非発光状態との相互作用により、見かけの蛍光寿命が短くなり、2重指数関数的な蛍光の減衰を示すことが確認された。星間分子として重要なCCSラジカルの可視域の電子遷移を初めて帰属し、電子励起状態の分子定数を決定すると共に、分散蛍光を観測することで、これまで未知であったこの分子の電子基底状態の振動数を精密に決定することができた。更に、C_4Hと同様に励起状態のダイナミクスに興味がもたれるHCCSとHCCNラジカルの電子励起状態のスペクトルの系統的な観測を行い、励起状態および電子基底状態における複雑な振電相互作用の解明の糸口を得た。また、本年度は新たにスペクトル線幅0.02cm^<-1>の高分解能の色素レーザーを導入した。これにより、2重共鳴分光が可能になり、上記の各ラジカルの複雑な振電構造の解明に利用できる体制を整えることができた。本年度は、初年度に導入した色素レーザーを使用して、炭素鎖ラジカルHCCSに対して2台の色素レーザーを用いたSEP(stimulated emission puming)分光を行った。

HCCSラジカルは電子基底状態、および電子励起状態ともに縮重した電子状態を取り、極めて複雑な振電相互作用(Renner-Teller効果)をしていることが知られている。この振電相互作用の解明のための貴重なデータが得られた。SEP法は広く使われている分光法であるが、HCCSのようなラジカル種に適用された例は極めて少ない。昨年度、星間分子として重要なCCSラジカルの可視域の電子遷移を初めて帰属し、電子基底状態に関し全く新しいデータを得ていた。今年度は、電子励起状態の更に詳しい情報を得るべく、全く新しい構成によるマイクロ波-レーザー2重共鳴法を開発し、S/Nの良い2重共鳴信号を得ることができた。この方法は、マイクロ波スペクトルの観測されている他の炭素鎖分子の電子スペクトルの観測にも極めて有力な新しい方法である。この実験の成功は、本研究計画の遂行の極めて大きなステップになると考えている。C_nH、C_nN等に代表される炭素鎖を持つフリーラジカルは、これまで電波天文やマイクロ波分光で活発に研究されているが、その電子状態や電子励起状態の構造、ダイナミクスに関する研究は極めて限られていた。本研究では、このような炭素鎖フリーラジカルの励起状態のダイナミクスを明らかにすることをめざした。本計画で導入した色素レーザーを使用して、炭素鎖ラジカルHCCSに対して2台の色素レーザーを用いたSEP(stimulated emission puming)分光を行った。HCCSラジカルは電子基底状態、および電子励起状態ともに縮重した電子状態を取り、極めて複雑な振電相互作用(Renner-Teller効果)をしていることが知られているが、その基底状態の振電構造の解明ができた。星間分子として重要なCCSラジカルの可視域の電子遷移を初めて帰属し、電子基底状態に関し全く新しいデータを得るとともに、電子励起状態の更に詳しい情報を得るべく、全く新しい構成によるマイクロ波-レーザー2重共鳴法を開発し、S/Nの良い2重共鳴信号を得ることができた。この方法により、近赤外域まで観測範囲を広げ、このラジカルの電子励起状態の振電構造を明らかにした。
概日リズムの光センサー・メラノプシンの2つのサブタイプと機能シフト

(1)2つのメラノプシンのちがいを生み出す分子基盤の解析トラフグは、2種類のメラノプシングループ(AとB)にそれぞれ2種類ずつを持つ。Bグループに属するメラノプシン4はGqのみを活性化するのに対して、Aグループのメラノプシン2は、Gqに加えてGiを活性化することを既に明らかにしていた。本年度はキメラ変異体を作製して、Giの活性化能をもたらす重要な部位を解析した。解析の結果、ヘリックス57を含む領域、特にヘリックス5と6とその間のループ(ループ3)がGiの活性化に重要であることを見出した。特に、ループ3のみの置換ではメラノプシン4のGi活性化能が増加しなかったことから、ヘリックス5と6を含む領域の構造変化も、Gi活性化に重要であることが示唆された。(2)トランスジェニックゼブラフィッシュの作製と解析メラノプシン2の上流配列制御下でGFP(メラノプシン2)を発現するトランスジェニック(Tg)ゼブラフィッシュの網膜からGFPを標識としてメラノプシン発現細胞(水平細胞)を競るソーターにより分画することに成功した。分画細胞をRT-PCRで解析した結果、メラノプシン2のmRNAとGiα1のmRNAを検出できた。すなわち、メラノプシン2は水平細胞において、Giを活性化していることが示唆された。また、Giが関わるシグナル伝達系で機能する分子として、PKAやコネクシンのmRNAも検出された。すなわち、ドーパミン依存的なギャップ結合の開閉をメラプシンからの光情報が制御している可能性が考えられた。(1) 2つのメラノプシンのちがいを生み出す分子基盤の解析トラフグに含まれる4種類のメラノプシンについて、それぞれの吸収極大を、495nm、482nm、470nm、467nmと決定した。またメラノプシン2は、Gqに加えてGiを活性化することを既に明らかにしていたが、本年の詳細な解析により、ウシロドプシンと比較してGiよりもGoをより高効率に活性化できることを見出した。20種類以上のキメラ変異体を作製し、それら変異発現タンパク質の分光学的解析により、2つのメラノプシンの吸収極大の差異の半分以上は、ヘリックス5と6が担っていることが示唆された。さらに、部位特異的変異体を用いた解析により、ヘリックス6に存在するN端から数えて269番目のアミノ酸残基が吸収極大の差異をもたらす残基として最も重要であることが示唆された。(2)トランスジェニックゼブラフィッシュの作製と解析機能を有するタンパク質の発現に成功しているメラノプシン2と4の上流配列を取得し、その制御下でGFP(メラノプシン2)あるいはRFP(メラノプシン4)を発現するトランスジェニック(Tg)ゼブラフィッシュを作製した。その結果、メラノプシン2プロモーター制御下で発現したGFPは網膜水平細胞で特異的に発現し、メラノプシン2は水平細胞に特異的に局在していることを示した。この局在は、in situ hybridizationによる報告と一致した。メラノプシン4については、現在、in situ hybridizationとの比較が行われているものの、F1ゼブラフィッシュが得られた。
上皮間葉移行の口腔腫瘍での役割

本研究は研究が進んでいる腎細胞癌でシグナル因子を探索し、その分子シグナルと病態について解析をおこなった。また口腔腫瘍については扁平上皮癌・角化嚢胞性歯原性腫瘍について解析をおこなった。腎細胞癌で注目したのはRANKLである。我々の調査では明細胞癌のように高い浸潤能をもつタイプで発現が多く見られた。またKakiのような腎癌培養細胞でRANKL遺伝子を強制発現させるとvivo,vitroとも癌細胞の移動性・浸潤性を高める結果となった。可能性がある下流因子としてMMPやsnailに焦点をあてて解析を進めている。角化嚢胞性歯原性腫瘍についてはケラチン発現の変化に注目した。多種のケラチンや関連因子を探索した結果、ケラチン17、19がこの腫瘍で特異的に上昇し、腫瘍性のない正角化型嚢胞との相違が明らかになった。扁平上皮癌においてはケラチン4、13が上皮異形成とともに特異な上昇を示す。これらはNotchシグナルとの負の相関の可能性もあることが組織学的解析からわかり、現在培養細胞を用いた実験検討をおこなっている。巨大色素性母斑細胞の治療に向けたE-cadherin発現の機能解析巨大色素性母斑症は美容的によくないだけでなく放置すると悪性黒色腫発生の母地にもなる。現在の治療は表面からの外科的切除によるが、深部母斑細胞除去は困難で限界がある。母斑細胞の分布には以前から上皮性因子が影響していると言われているので、E-cadherinの発現解析をおこなった。その結果症例では浅い部位の母斑細胞ほど細胞膜表面にE-cadherinが多く分布することがわかった。しかしこの膜表面の分布は光顕的に上皮細胞とは微妙に異なり、また初代培養するとE-cadherin陽性細胞はカテニン系が存在するにもかかわらず上皮様の敷石状接着しないことがわかった。免疫電顕法を用いて調べると実は母斑細胞表面のE-cadherin分布は接着装置ではなく表面から細く伸びる突起に斑点状に分布していることがわかった。あたかもセンサー様の分布なのでボイデンチェンバーを用いて、移動能に与える影響を調べてみた。その結果E-cadherin陽性母斑細胞が多いほど移動する細胞も多い結果になった。母斑細胞でE-cadherinは接着よりも細胞移動時の探索子として働く可能性があり、E-cadherin発現を制御することは治療面で重要な手法となるかもしれない(論文発表済み)。癌細胞の移動・浸潤に関係する新しい因子について近年上皮間葉移行という定義で定着していた細胞が移動を開始するメカニズムが注目されている。我々は腎癌細胞で特に骨転移を起こしやすい傾向に注目し、RANKL発現をおこなった。その結果腎癌培養細胞株2種類にRANKLを恒常的に発現するようにして、ヌードマウス移植をおこなったがいずれも骨組織内での増殖・浸潤には失敗した。しかし培養条件下ではこれらのRANKL導入細胞株では顕著な移動能の亢進が見られた。従来RANKLは破骨細胞誘導との関係が注目されているが、まったく異なる細胞移動能に影響している可能性がある。(現在投稿中)本年度は昨年度に続き腎癌の上皮-間葉転換(上皮-間葉移行に代わりこの用語がepithelial mesenchymal transitionの訳語として多くなったので、記載を変更する)とともに口腔扁平上皮癌の上皮-間葉転換についても解析をおこなった。1腎癌について我々は腎癌の型別で特に明細胞癌型に関して転移能が高いことに注目していて、昨年度はRANKLの関与について解析・発表をおこなってきた(文献)。本年度は細胞内特に転写調節に関わる因子に焦点をあてて、解析をおこなった。その結果snailと呼ばれる小型Zn finger型転写因子の発現が統計的に明細胞癌で高いことがわかり、培養細胞でその分子機能について探索をおこなった。明細胞型腎癌細胞株でsnailの発現が有意に高いものを選び、その細胞株に対してsnail siRNAを遺伝子導入で試みた。その結果発現が下降した細胞で移動能を調べたところ、vivo, vitro両方とも移動能が低下していた。細胞因子について調べてみるとMMP9の発現が有意に低下していた。一般にsnailの機能として細胞間接着因子のカドヘリン低下を促すことが知られている。

MMPの機能は多様であるが、上皮細胞に関しては基底膜構造の破壊と細胞外基質に捕捉されていた各種増殖因子の放出が知られている。今回の結果はsnailが上皮-間葉転換で広範な影響を及ぼすことを示している。この結果は現在投稿準備中である。2口腔扁平上皮癌について扁平上皮癌についてはさまざまな因子が上皮-間葉転換に関係していると推測されるが、我々はNotchシグナルに注目している。我々は現在口腔扁平上皮癌の症例についてNotch発現を調べているが、癌化した上皮ではNotch1発現が全層性に低下することがわかってきた。またこのNotch発現低下と呼応してケラチン発現に大規模な変化が起こることがわかった。特にkeratin14,17などの発現が上昇することがわかってきた。ケラチンは細胞分化マーカーとしての取り扱いが多いが、デスモソームとの構造関連で細胞接着性にも重要な関連があることが知られている。サイトケラチンに関してはデスモソーム中の接着因子デスモグレインとの結合を妨げることでdominant negativeの効果を狙い、この部分を欠失したkeratin14遺伝子を口腔癌細胞に遺伝子導入している。予備的な結果ではこれらの遺伝子導入細胞株は形態に変化を起こしているので、その変化についても検討している。本研究は研究が進んでいる腎細胞癌でシグナル因子を探索し、その分子シグナルと病態について解析をおこなった。また口腔腫瘍については扁平上皮癌・角化嚢胞性歯原性腫瘍について解析をおこなった。腎細胞癌で注目したのはRANKLである。我々の調査では明細胞癌のように高い浸潤能をもつタイプで発現が多く見られた。またKakiのような腎癌培養細胞でRANKL遺伝子を強制発現させるとvivo,vitroとも癌細胞の移動性・浸潤性を高める結果となった。可能性がある下流因子としてMMPやsnailに焦点をあてて解析を進めている。角化嚢胞性歯原性腫瘍についてはケラチン発現の変化に注目した。多種のケラチンや関連因子を探索した結果、ケラチン17、19がこの腫瘍で特異的に上昇し、腫瘍性のない正角化型嚢胞との相違が明らかになった。扁平上皮癌においてはケラチン4、13が上皮異形成とともに特異な上昇を示す。これらはNotchシグナルとの負の相関の可能性もあることが組織学的解析からわかり、現在培養細胞を用いた実験検討をおこなっている。
水産加工製品(笹かまぼこ)の生産プロセスにおける現状のフロー解析と、ゼロエミッション化の検討

研究目的水産加工製品(笹かまぼこ)の製造過程で発生するエミッションを、製品加工工程ごとに捉えるとともに、その質的特徴を把握することは現行エミッションの質的転換や、エミッション削減を考えていく基礎データとして大切になっていく。本研究は水産加工製品のエミッションを巡る最適な将来像を考える上で必要な現状の把握と、現行の再資源(飼料/肥料)化過程の現状把握とを通し、生産プロセスに関わるエミッションの量的、質的特徴を調査に基づき考察したものである。研究方法および成果石巻市の主要な水産加工製品である「笹かまぼこ」製造工程から発生するエミッションを評価するため、原料から製品に至る過程の物質フローとエミッションの質的内容に関して調査を主体とした分析に基づき検討した。その結果原料となる魚の種類や大きさによって異なるが、おおむね製造工程に従う原料の減少分=発生エミッションについて、次のような量的変化を認められた。原料(100%)→1次処理(頭切り落としと肉採り):減量約50%→水さらし&さらし仕上げ:減量約2530%→1次製品すり身=原料魚の1825%しかし、質的側面から各工程毎の評価に行うことは難しく、図1、表1に示すように工場全体から排出されるエミッションについてもその変動は大きかった。そこで水産加工団地全体からのエミッション評価を行った。工場からのエミッションは水産加工排水処理場へ流れ、挟雑物除去(スクリーン)水溶性タンパク&油分除去(浮上分離)生物処理(長時間活性汚泥処理)が行われる。各処理過程から排出されるエミッションは、スクリーン挟雑物を除き、処理に多大な時間とエネルギーが必要となる。表2表5に現行浮上分離汚泥(スカム/フロス)の再資源化工程毎のエミッションの量的変化と質的変化を示す。鯖が主体の廃水受け入れ時、浮上分離汚泥約8トンから最終的に油760kgと飼料45kgを得られるが、約7.1トンの残りは1/81/10に煮つめられ主に肥料として引き取られている。一方、生物処理汚泥は食品成分試験法に従う粗タンパクを4547、発酵後4851%程度含んでいた。業種の特徴として製品化される部分が原料の1/5程度と著しく少なく、発生するエミッションも大きい。また、原料の輸入化が進み約89割が輸入となっている。エミッションの削減や国土への負荷削減を考えると、1次製品輸入や船上処理の促進が最も効果的であろう。しかし、沿岸水産関連従事者の生活や我が国の本質的な食料問題を考えると、他の産業からのエミッション転換の可能性なども考慮し、現行処理のうち、効率の悪い部分を沿岸魚の増産や生息環境保全に結び着く方向で考える必要もある。
社会的行動に障害をきたす認知症の発症メカニズムの解明

認知症の中でも、アルツハイマー病は認知機能障害を呈する老年性認知症で、Aβの凝集物と過剰にリン酸化されたタウタンパク質の蓄積物を特徴的な病理所見として認められる。我々は自然に近い条件下でアルツハイマー病様の病理と認知機能障害を呈するモデル動物として、チリ原産の齧歯類デグーに着目した。デグーは、過剰発現などの遺伝子改変を行うことなく、野生型でヒトの発症過程と同様にAβやタウが蓄積することが確認されている。また、デグーは個体間でのコミュニケーション能力が非常に高く、社会性の検討にも有用なモデルである。アルツハイマー病を始めとしたタウオパチーの発症機構を解明するために、ヒトの発症に近いデグーの脳内におけるタウの発現様式を明らかにし、デグー型のタウタンパク質のアミノ酸配列を同定しその特質をアイソフォームごとに解析した。若齢と老齢のデグーの脳を単離し、抗タウ抗体を用いてウエスタンブロットにてタウの発現様式およびリン酸化度合を検討した。このことより、若齢個体に比べて老齢のデグーではリン酸化タウの増加が認められた。更に、デグー脳破砕液から単離したmRNAを逆転写して得られたcDNAを用いて、タウアイソフォームのクローニングを行った。発現していたタウの配列をサンガー法により同定し、NCBIデータベースに登録した。また、同定したタウとリピート配列を一部削除し作成したタウのアイソフォームとを使って、細胞形態に対する影響を検討した。各アイソフォームをそれぞれ非神経細胞であるCOS7細胞に発現させ、細胞の形態を観察した。当初の予定通り、タウのアイソフォームの配列を取得し、細胞形態における影響を検討した。また、デグー脳内で発現するタウの凝集度合やリン酸化度合について検討した。今後は神経細胞系統の細胞、例えばマウス神経芽細胞腫であるNeuro2Aなどを用いて、タウのアイソフォーム間の細胞形態に対する影響を検証する。また、社会性に深く関係しているシナプス関連分子とタウの各アイソフォームとの相互作用を検討する。効率の良い実験を心掛けたため、消耗品費を当初の予定より抑えることができたため
低周波動揺に対する座位人体の応答モデルの構築に関する基礎的研究

旅客船に代表される動揺環境における車いすのユーザビリティ(使用性能)を正確に予測・評価するためには,「動揺環境⇒車いす⇔座位人体」系の力学的モデルを構築する必要がある。このとき,人体を完全な剛体として扱うことはできないので,低周波動揺に対する座位人体の動力学的な応答を実験によって計測,解析した。本研究による成果は以下の通りである。(1)低周波動揺に対する座位人体の応答の計測座位人体の力学的モデルの構築に必要となる情報を得るために,人間を被験者とした動揺暴露実験を行った。船体運動を模擬できる動揺シミュレータを用いて,横揺れに対する座位人体の応答をビデオカメラに録画した。被験者に加える動揺特性を系統的に変化させて,周波数応答特性を調べた。(2)座位人体の動力学的ファクターの計測座位人体の力学的モデルを構築する際に必要となる動力学的なファクター(質量,重心位置,慣性主軸,慣性モーメント等)を計測するための装置を開発した。高齢者や身体障害者等の車いす使用者への生理的・心理的負担をできるだけ小さくするために小型ロードセルを用いた計測システムを開発し,車いすおよび座位人体の質量および重心位置を精度良く求めることが可能となった。(3)動揺環境における座位人体のモデリング動揺中の座位人体の動きをビデオカメラに録画し,人体重心位置の動きを作図法によって解析・推定した。脊椎の運動モードには力学的ファクターの個人差のみならず疲労度や緊張度といった生理的・心理的状態が大きく影響するということがわかった。旅客船等の実環境を想定した座位人体の厳密な応答モデルを構築するためには,身長・体重等の人体特性値に加え,そのときの生理的・心理的状態を考慮する必要がある。動揺環境における車いすのユーザビリティ(使用性能)を正確に評価するためには,「動揺環境⇒車いす⇔人体」系の力学的モデルを構築する必要がある。このとき人体を完全な剛体として扱うことはできないが,低周波動揺に対する応答を動力学的に解析するための実験・解析を試みた。本年度の研究成果は以下の通りである。(1)低周波動揺に対する人体応答の観察・計測人体モデルの構築に必要となる情報を得るために,人間を被験者とした動揺暴露実験を行い,人体の応答を調べた。動揺シミュレータを横揺れさせ,キャビン内に着座した人体の運動をビデオカメラで録画した。被験者に加える動揺特性(振幅・周波数)を系統的に変化させ,周波数応答特性を求めた。(2)人体の動力学的ファクターの計測人体の力学モデルを構築する際に必要となる動力学的なファクター(質量,重心,慣性主軸,慣性モーメント等)を計測するための装置を開発した。高齢者や身体障害者に代表される車いす使用者への生理的・心理的負担をできるだけ小さくするために,小型ロードセルを用いた重心動揺計を設計・製作し,人体重量の計測及び傾斜法による重心位置の推定を行った。今後は慣性モーメントも容易に計測できるように拡張する予定である。(3)動揺環境における人体重心の推定本研究で開発した重心動揺計では静的な重心位置の推定しか行えないので,(1)の画像計測結果と(2)の静的に計測した重心位置とから動揺中の人体の重心位置を推定した。次年度は,さらに被験者数を増やして結果の妥当性を確認すると共に,人体応答モデルの構築を目指したいと考えている。
組織損傷時の生体内環境に着想を得たエクソソーム生産用の幹細胞培養環境設計

本研究では培養環境が間葉系幹細胞(MSC)の分泌する小胞体(エクソソーム)の機能に及ぼす影響を明らかにすることを目指している。物理的及び化学的観点から培養基材を設計し、その環境内でMSC由来エクソソームの生産を試みる。具体的には物理的なアプローチとしてハイドロゲルの弾性率に着目し、化学的観点からはタンパク質あるいはペプチドを固定化することで基材の機能化を試みる。ハイドロゲルの物性やタンパク質の種類及びその濃度と得られるエクソソームの機能との相関を明らかにすることで、エクソソーム生産を目的としたMSC培養環境の設計指針を提案することを目標としている。平成30年度は、培養基材として用いるハイドロゲルの基礎的物性の評価を行った。MSCをゲル内で包括培養する際、高分子溶液のゲル化時間が重要となる。我々がこれまでに開発したハイドロゲル作製法では、高分子水溶液のゲル化中に懸濁した細胞が自然沈降することで、その密度がゲル内で不均一になるという課題があった。そこで高分子間架橋反応を触媒する酵素の活性化をより効果的に進行させることが予測される系を考案した。その結果、劇的にゲル化時間を短縮することに成功しており、上記の問題を克服するとともに細胞包括材料作製法として有用なゲル化法を見出した。本研究ではエクソソーム生産用の間葉系幹細胞培養基材の設計指針の提案を目指している。平成30年度は初年度であったため、本研究で最も重要である、培養基材として利用するハイドロゲルの物性評価を中心に研究を行った。具体的には高分子水溶液のゲル化時間に着目し、従来のゲル作製法を改良することで、劇的にゲル化時間を短縮することに成功している。改良したゲル作製法は細胞包括に適したゲル化時間を有していることから、エクソソーム生産用の培養基材だけでなく、細胞の三次元培養系に利用可能なゲル化システムとして期待できる。以上から、本研究はおおむね順調に進展していると判断した。平成30年度に、細胞包括に適したゲル化システムを構築することが出来た。平成31年度以降は、間葉系幹細胞(MSC)の機能に影響を及ぼすタンパク質やペプチドを固定化することで細胞培養基材として利用可能な機能性ハイドロゲルの作製を試みる。具体的には細胞接着因子及び血管内皮細胞増殖因子を固定化したハイドロゲルを作製し、そのゲル内でMSCを培養することでエクソソームの生産を試みる。回収したエクソソームを血管内皮細胞に作用させ、血管様管腔形成等を評価する予定である。当該年度の研究は、ハイドロゲルの作製に係る消耗品の購入を予算の範囲内で計画に沿って実行することができた。タンパク質/ペプチド等の固定化による機能性ゲル基材の作製は行わなかったため、それに関連した消耗品の支出が不要となった。次年度以降、エクソソームの生産に用いる培養基材の作製や分析に有効活用するため、次年度使用額とした。
頚髄損傷者の生活習慣病予防におけるスポーツ効果の検討

頚髄損傷者の生活習慣病予防のためのスポーツの効果を検証する目的で,車いすマラソンおよびウイルチェアラグビー中の活動量および日常生活での活動量と栄養摂取状況を調査し,全ての被験者でスポーツ活動中には日常生活よりも有意に高い活動が行われていることを確認した.栄養摂取量の調査から,各被験者ともに必要エネルギー量は充足されているものの,脂肪過多,蛋白質,ビタミンC,鉄は不足傾向にあることを確認した.エネルギーの出納という観点から各被験者ともに均衡がとれており,重度の身体機能障害によって日常生活での活動量の低下があっても,スポーツに参加することで生活習慣病のリスクを低下できる可能性を確認した.【平成26年度研究実績】重度障害者が実際に行っているスポーツ活動を体力医学的観点から詳細に評価する目的で,外傷性頚髄損傷者(以下,頚損者)7名(男性,37.7±6.3歳,T51:3名,T52:4名)を対象に,大分国際車いすマラソン競技中の活動量の測定および身体計測を行った.その結果,4名の頚損者(36.3±7.4歳,T51:1名,T52:3名)がハーフマラソンを完走し,3名の頚損者(39.7±5.1歳,T51:2名,T52:1名)がリタイアした.完走できた4名の頚損者が競技中に消費したカロリー総量は心拍数ベースで平均398.8±105.6Kcalであった.また,全被験者の平均活動量(Mets)は2.93±0.45Metsで,完走者4名の平均活動量は2.85±0.59Mets,平均完走タイムは84.0±11.1分であった.これらの結果から,ハーフマラソン競技に参加する頚損者は競技中に生活習慣病を予防するために必要な運動量を満たしていることが分かった.しかし,頚損者のハーフマラソン中の平均活動量は3Metsに満たないことも明らかになり,頚損者の生活習慣病予防のためには運動継続時間が重要な意味を持つことが示唆された.一方,本研究計画申請時に平成26年度調査の項目として設定していた頚損者(同一被験者)の日常生活での活動量の測定は実施できていない.このことについては,日常生活中の活動量の測定に加え,日常生活での摂取カロリーの調査を追加して行うための調査方法等の準備に時間を要したためである.平成26年度に第34回大分国際車いすマラソン大会においてレース中の身体活動量(加速度・心拍数)を測定した7名のうち,同意の得られた6名の被験者に対して平成27年度に3日間の日常生活活動量および栄養摂取調査(カロリー,蛋白質,脂質,ビタミンC,鉄)を実施した.また,データの追加を目的に第35回大分国際車いすマラソン大会で4名の被験者の測定を計画し,3名の被験者に対してレース中の身体活動量の測定を実施した.さらに,3名の被験者のうち,同意の得られた2名に対して日常生活活動量および栄養摂取調査を実施した.平成26年度,27年度の調査を通じて得られた被験者8名(T51/T52:2名/6名,年齢:36.8±7歳,身長:171.4±5.8cm,BMI:19.4±3.8)の結果をまとめ,第25回日本障害者スポーツ学会で以下の内容を報告した.被験者8名のうち,5名は完走したが3名はリタイアした.加速度から求めたレース中の消費カロリーは,平均176kcal(2.3METs)であった.レース中の活動量は日常生活活動よりも有意に高値を示した(p<0.01).また,日常生活でも運動日(41.7±29.0 mG/counts)は非運動日(13.6±6.5 mG/counts)に比較して有意に高い加速度(活動量)を示した(p<0.01).栄養摂取調査では,各被験者ともに必要エネルギー量は充足しているものの(96.9%),脂質過多(129.0%)を認め,タンパク質(74.7%),ビタミンC(85.1%),鉄(86.9%)は不足傾向を認めた.本研究計画申請時に平成27年度の調査項目として計画していた車いすラグビー選手を対象とした調査は実施できていない.このことについては,平成26年度,27年度に実施した車いすマラソンランナーにおける調査対象の居住地が西日本各地に分散しており日常生活での活動量の調査に手間を要したこと,追加の調査として実施した栄養摂取量調査を優先したためである.しかし,平成26年度,27年度に車いすマラソンランナーにおける被験者10名の測定が完了しており,追加の調査として設定した日常生活での栄養摂取調査も8名に対して実施できている.さらに,被験者8名を対象に結果を取り纏め中間報告も実施できた.平成28年度には,ウイルチェアラグビー選手5名(C6-C8:3名,他,年齢:28.6±8.6歳,BMI:9.3±3.8)を対象に,ウイルチェアラグビー中の身体活動量(加速度・心拍数)および日常生活における活動量を調査した.さらに,同意の得られた3名に対して3日間の日常生活活動量および栄養摂取量の調査(カロリー,蛋白質,脂質,ビタミンC,鉄)を実施した.加速度から求めたウイルチェアラグビー中の消費カロリーは104.0±31.5kcal(1.8±0.6Mets)であった.

平成26,27年度に実施した車いすマラソン競技者における調査結果と同様に,ウイルチェアラグビー中の身体活動量(162.7±46.7mG/counts,107.6±9.2bpm)は,同被験者の日常生活活動量よりも高いことを確認した.栄養摂取量の調査結果も平成26,27年度に実施した車いすマラソン競技者の結果同様に各被験者ともに必要エネルギー量は充足しているものの(97.9%),脂質過多(115.1%)を認め,タンパク質(74.0%),ビタミンC(71.7%),鉄(89.6%)は不足傾向にあることを確認した.平成26-28年度に得たこれら頚髄損傷者・他の調査結果から,頚髄損傷者はスポーツに参加することで日常生活での低い活動量を増加させているが,生活習慣病予防に有効とされる中等度(36Mets)の運動は実施できていないことが明らかになった.一方,調査対象となった頚髄損傷者・他の栄養摂取量は健常者と比べて低いが活動に対する必要エネルギー量は充足していることが確認できた.従って,エネルギーの出納という観点からは均衡がとれており,重度の身体機能障害による日常生活での活動の低下があってもスポーツに参加することで生活習慣病のリスクを低下できる可能性が確認できた.頚髄損傷者の生活習慣病予防のためのスポーツの効果を検証する目的で,車いすマラソンおよびウイルチェアラグビー中の活動量および日常生活での活動量と栄養摂取状況を調査し,全ての被験者でスポーツ活動中には日常生活よりも有意に高い活動が行われていることを確認した.栄養摂取量の調査から,各被験者ともに必要エネルギー量は充足されているものの,脂肪過多,蛋白質,ビタミンC,鉄は不足傾向にあることを確認した.エネルギーの出納という観点から各被験者ともに均衡がとれており,重度の身体機能障害によって日常生活での活動量の低下があっても,スポーツに参加することで生活習慣病のリスクを低下できる可能性を確認した.本研究計画申請時に平成26年度調査の項目として設定していた頚損者(同一被験者)の日常生活での活動量の測定は実施できていない.このことについては,日常生活中の活動量の測定に加え,日常生活での摂取カロリーの調査を追加して行うための調査方法等の準備に時間を要したためである.平成28年度は平成27年度に実施できなかった車いすラグビー選手を対象にスポーツ活動中の活動量調査および日常生活における活動量の調査,栄養摂取量調査を実施する.被験者を同一チームの頚髄損傷者とすることで被験者の居住地も限定され十分に調査実施可能と考えている.上記調査は12月までに完了し,平成26年度,27年度に行った調査結果と併せて今年度中に全調査結果の取り纏めを行う.さらに,第26回日本障害者スポーツ学会で報告する.理学療法学【平成27年度実施項目】平成26年度未実施の重度障害者(頚髄損傷者:頚損者)7名の日常生活中の活動量の測定を行う.併せて,各被験者の写真撮影法および聞き取り調査法による日常生活での摂取カロリーの測定を行う.また,当初の計画通り,車いすラグビーを対象に頚損者のスポーツ活動中の活動量および被験者の身体計測を行う.さらに,追跡調査として平成26年度調査に協力いただいた頚損者7名を対象に車いすマラソン中の活動量の測定を試みる.平成27年度は当初計画していた車いすラグビー選手を対象とした調査を実施できていない.そのため,平成28年度は平成27年度に実施できなかった車いすラグビー選手を対象にスポーツ活動中の活動量調査および日常生活における活動量の調査,栄養摂取量調査を実施する.被験者を同一チームの頚髄損傷者とすることで被験者の居住地も限定され十分に調査実施可能と考えている.
テナガショウジョウバエ性的二型の分子機構：体サイズと内分泌支配の関係について

動物界では、性的二型の特徴として、体サイズの変化、オスの体の一部の形態が発達・変形する例がしばしば観察される。モデル生物、キイロショウジョウバエ(Drosophila melanogaster)では体サイズがメスよりオスの方がわずかに小さいのに対し、近縁種テナガショウジョウバエ(Drosophila prolongata)では前肢にオス特異的な形態変化が観察され、体サイズもメスよりオスの方が明確に大きい。本研究では、オスの性的二型の特徴が分子機構で成り立ち、進化してきたのかを解明することを目的とし、D. prolongataを用いて、オス特異的な形態変化に伴う、体サイズの制御機構を解析する。昨年度は、D. prolongataとD. melanogaster、両種における基礎的な発生過程を詳細に比較し、D. prolongataのオスの幼虫期の延長、成長率増加による体全体の細胞数の増加が、D. prolongataオス巨大化の要因であることを明らかにした。しかしながら、どのような遺伝子、シグナル伝達経路によりそのメカニズムが制御されているのかは不明である。そこで本年度は、D. prolongataオス巨大化に関わる遺伝子を特定するため、D. prolongataとD. melanogaster、両種の雌雄におけるRNA seq解析を行った。特に、幼虫期間の決定を制御するエクダイソン経路、幼虫期における成長速度を制御するインスリン/IGF経路の構成因子に着目し、現在解析を行っている。本年度は、D. prolongataとD. melanogaster、両種における基礎的な発生過程を詳細に比較するため以下の解析を行い、D. prolongataのオス巨大化のメカニズムの一端を明らかした。2.D. prolongata、D. melanogaster両種における各発生ステージ(胚発生期、幼虫期、蛹期)を詳細に解析し、D. prolongataオスのみ明確に約1日の幼虫期の延長が見られることを明らかにした。以上の研究により、D. prolongataのオスの幼虫期の延長、成長率増加による体全体の細胞数の増加がオス巨大化の要因であることが明らかになった。本年度の研究により、D. prolongataのオス巨大化のメカニズムの一端を明らかにすることができた。当初の計画では、本年度中に遺伝子発現解析も行う予定であったが、すでに遺伝子発現解析を行うための全てのサンプリングは終了しており、おおむね順調に進展していると言えよう。本年度の研究により、D. prolongataのオスの幼虫期の遅延、成長率増加による体全体の細胞数の増加がオス巨大化の要因であることを明らかにした。そこで、今度、幼虫期間の決定を制御するエクダイソン経路、幼虫期における成長速度を制御するインスリン/IGF経路の構成因子に着目して、遺伝子発現解析を行うことで、D. prolongataのオス巨大化の分子メカニズムを解明する。
摂食・嚥下障害患者に安全に経口摂取させるための科学的根拠に基づいた代償姿勢の検討

嚥下障害を持つ患者に対して、リクライニングの姿勢で食べさせることがよいとされている。しかし、実際にはリクライニングの姿勢により誤嚥を起こす患者も存在する。よって、姿勢の変化が嚥下圧に影響を及ぼすかを研究した。その結果、リクライニングをかけることにより食道入口部の安静時圧が増加するため、重力の影響で食道が開きにくくなる可能性が示唆された。摂食・嚥下障害が疑われる患者に対して、安全に経口摂取を行うに当たって代償姿勢の科学的な根拠を見出すためには、摂食・嚥下障害の精査の妥当性の担保が必要となる。摂食・嚥下障害の精査には嚥下造影検査および嚥下内視鏡検査の二つが存在し、我々は過去に嚥下造影検査の検者内および検者間一致率を検討することで検査の妥当性を確認した(戸原ら,2005)。本年度は嚥下内視鏡検査の検者内および検者間一致率を検討し、一致率は嚥下造影検査に劣るものではないこと、特に検者内一致率が高いことを確認した(Tohara et al.2010)。また、嚥下時の喉頭挙上に寄与する筋肉には舌骨上筋群があげられ、これらは実際に神経筋疾患や脳血管疾患の影響で麻痺することも考えられるが、同部に対する手術の影響で嚥下障害が起きるのかを検討するために、腫瘍などにより舌骨上筋群を変則的に切除した症例に対して、摂食・嚥下障害がどの程度発生するのかを嚥下造影検査を用いて検討した。その結果、舌骨や喉頭の安静時の位置は低下するものの、嚥下障害を実際に引き起こす程度の影響は及ぼさないことを確認したため、同様の症例には代償姿勢の適用は必要ないと考えられた(Hirai et al.2010)。また、嚥下時の代償姿勢の検討として、球麻痺患者の食塊の咽頭通過足を嚥下造影検査を用いて検討したところ、過去には検束の咽頭を食塊が通過すると考えられていたが、患側を通過する症例があること、また時間経過とともに通過側が変化する症例があることが確認された(三串ら2010)。その他、嚥下圧を測定するシステムを完成し、健常者に対して嚥下圧測定を行い、摂食時の姿勢をリクライニングさせることで一方向的に圧力が上がる、もしくは下がるものではないことを確認したため、来年度以降の研究を継続する予定である。摂食・嚥下障害を持つ患者に対して安全に食べさせる姿勢として、座位ではなくリクライニングの姿勢が推奨されてきた。有用な方法ではあるものの、実際には座位のほうが誤嚥が生じない患者も存在するにもかかわらず、盲目的に安易にこのような代償姿勢で食事をしている症例が存在するため、リクライニングの姿勢が嚥下機能にどのような影響を及ぼすかを検討した。食道入口部は通常閉じており、嚥下時に開大する。リクライニングの姿勢がこの食道入口部の圧にどのような影響を及ぼすかを検討した。その結果、健常男性に対して評価を行ったところ、食道入口部の安静時(食事以外の時)の圧力はリクライニングを行うことにより、有意に増加することがわかった(中山ら,2011,Nakayama et al,2012)。また、嚥下時の食道入口部の圧力は大まかに3つの波形にわけられる。最初にあらわれるE波(elevation wave)は喉頭挙上時に圧センサーが持ち上げられるために発生する陽性波、HSP波(hypopharyngeal suction pump wave)は嚥下時に食道入口部が開大するために起こる陰性波、Ch波(constriction nwave)は嚥下中に咽頭が収縮するために起こる陽性波である。健常男性に対しての検討結果では、有意ではないが上記のHSP波がリクライニングにより増加(陰性波がえられなくなる)ことがわかった。以上より、リクライニングにより喉頭にかかる重力の方向が下方ではなく背側に向くため、嚥下時に喉頭が前方に移動するのを妨げる可能性があると考えられた。
Gq共役型受容体の膜電位依存性に関する研究

Gタンパク質共役型受容体はリガンド結合により活性化されるが、幾つかの受容体ではリガンドに対する親和性が膜電位に依存して変化することが報告されている。これまで、機能解析法の問題からGq共役型受容体の膜電位依存性についての研究は少なかった。我々は、Gq共役型受容体により機能制御を受けるイオンチャネルの機能解析および受容体とGqタンパク質の相互作用についての光学的解析から、代謝型プリン受容体P2Y1Rを介するシグナリングが膜電位依存性を示すことを見出した。また、膜電位依存性には、P2Y1Rの膜貫通部位に位置する荷電性アミノ酸が重要であることも明らかにした。本研究は、細胞のシグナル伝達において重要な役割を担うGq共役型受容体の膜電位依存性の解明を目的としている。この目的のもと、電気生理学的実験用のセットアップにてGqシグナル活性化を評価するシステムの導入と電位依存性が示唆されているGq共役型受容体のクローニングを行った。まず、Gqシグナル活性化は膜脂質成分であるPIP2に結合するタンパク質を基に開発されたセンサーの蛍光共鳴エネルギー遷移(FRET)効率の計測により評価した。その結果、Gq共役型受容体であるムスカリン型受容体1型を刺激すると、3%程度のFRET効率の減少が認められた。この変化量は、濃度作用解析を行うには非常に小さい値であった。また、クローニングしたαアドレナリン受容体とセロトニン受容体2A型では、作用薬を最大濃度を投与しても有意なFRET変化は認められなかった。以上の結果から、既存のFRETセンサーではGqシグナルの活性化を感度よく検出することが出来ないということが明らかとなった。一方、我々は、2ポアカリウムチャネルの一種がGqシグナル活性化により電流の増加を示すことを、新たに見出した。上記の各Gq共役型受容体によりチャネル電流画像化することも確認しており、濃度作用関係の解析にも用いることができると考えている。この評価系を用いて、各受容体におけるGqシグナリングの膜電位依存性についての定量的な解析を行う予定である。本研究はGq共役型受容体の膜電位依存性の解明を目的としている。そのためには、異なる膜電位に保持した状態での受容体の機能解析が必要となる。研究計画に記載した方法では、受容体機能の解析が十分に出来なかったため、新たな解析系を模索していたところ、2ポアカリウムチャネルの一種であるKCNK13チャネルがGq共役型受容体により活性化されることを見出した。そこで、複数のGq共役型受容体によるKCNK13チャネル電流増加作用について解析を行った。電位依存性が確認されているムスカリン性アセチルコリン受容体M1Rでは、膜電位を0 mVに保持したときの方が-80 mVに保持したときより作用薬に対する高い感受性を示した。一方、アドレナリン受容体alpha1B-ARやセロトニン受容体5-HT2ARでは、膜電位に依存した作用薬感受性の変化はみられなかった。さらに、代謝型プリン受容体であるヒトP2Y1Rを試したところ、この受容体が脱分極時の方が過分極時より作用薬であるADPbSに対する感受性が高いことを見出した。この電位依存性は、マウスP2Y1Rでも見られ、ATPや2MeSADPを作用薬としても用いても再現された。以上により、膜電位依存性を示すGq共役型受容体を明らかにすることが出来た。Gq共役型受容体によるKCNK13チャネル電流増加作用を調べることで、受容体の膜電位依存性を解析できることを見出し、研究を進展させることが出来た。M1Rの電位依存性を確認するとともに、他の受容体も調べ、P2Y1Rが膜電位依存性を持つことを明らかにした。P2Y1Rについては、巨赤芽球でのカルシウムイメージングから脱分極時に作用薬に対する感受性が高くなるとの知見が得られていたが、今回、作用薬の濃度と作用の関係を詳細に解析することでP2Y1Rの電位依存性を明らかにできたと考えている。我々は、2ポアカリウムチャネルの一種であるKCNK13チャネルがGq共役型受容体により活性化される点に着目し、複数のGq共役型受容体によるKCNK13チャネル電流増加作用について解析を行った。一方、アドレナリン受容体α1-ARやセロトニン受容体5-HT2ARでは、膜電位に依存した作用薬感受性の変化はみられなかった。さらに、代謝型プリン受容体であるヒトP2Y1Rを試したところ、低濃度の作用薬で電流増加、高濃度の作用薬で電流減少という二相性の濃度作用曲線が得られた。この濃度作用曲線は、膜電位を脱分極に保持すると低濃度側にシフトしたことから、P2Y1Rが膜電位依存性を有することが示唆された。P2Y1Rシグナリングの膜電位依存性を調べるために、受容体とGqタンパク質の会合をFRET効率の変化でとらえる実験を異なる膜電位固定下で行ったところ、-80mVと+40mVでのEC50には2倍程度の差があることが明らかとなった。EC50の差は、作用薬をATPや2MeSADPでも観察された。

さらに、受容体の膜貫通部位に位置する荷電性アミノ酸残基に家電を変化させる変異体を複数作成し機能解析を行ったところ、作用薬への感受性を消失させずに、膜電位依存性を消失させる変異体を見出した。これらの結果は、該当するアミノ酸残基がP2Y1Rの膜電位依存性に大きく寄与することを示すものと考えられた。Gタンパク質共役型受容体はリガンド結合により活性化されるが、幾つかの受容体ではリガンドに対する親和性が膜電位に依存して変化することが報告されている。これまで、機能解析法の問題からGq共役型受容体の膜電位依存性についての研究は少なかった。我々は、Gq共役型受容体により機能制御を受けるイオンチャネルの機能解析および受容体とGqタンパク質の相互作用についての光学的解析から、代謝型プリン受容体P2Y1Rを介するシグナリングが膜電位依存性を示すことを見出した。また、膜電位依存性には、P2Y1Rの膜貫通部位に位置する荷電性アミノ酸が重要であることも明らかにした。Gqシグナル活性化の評価系をどうするのかという点では当初の計画から変更を余儀なくされたが、新たな実験系はより定量性が高いことが期待されるためおおむね順調な進展であると考えている。また、セロトニン受容体2A型やアドレナリンα受容体1型などのGq共役型受容体をクローニングし、カルシウムイメージングや全反射照明系を用いた実験から基礎的なGq応答性についても検討することができた点は今後の研究に有用であると考えている。LED光源の導入により、Gqシグナル活性化をFRETセンサーにより定量的に測定するということが困難であることが明らかになったことも、一つの成果と考えている。なお、LED光源を用いて、我々が開発したムスカリン受容体のFRETコンストラクトのFRET効率を計測したところ、作用薬投与によるFRET効率の減少が認められた。このことから、構造変化をレポートするFRETコンストラクトについては、電気生理学的実験との併用により受容体レベルでの膜電位依存性の検討が可能出ることも確認した。濃度作用曲線の作成には長時間の記録が必要となるが、LED光源はON/OFFを制御できるため、褪色の影響を抑えることができることを明確にできた点も今後の研究の進展に重要であると考えている。神経伝達物質やホルモンに対する感受性が細胞の興奮状態(膜電位)により異なるという性質は、生理学的にも重要な意味を持つ。また、薬剤の作用が膜電位により変化するということは、興奮性の高い細胞に効きやすい、あるいは、効きにくいという状況が予想されるため、薬理学的にも重要な問題である。そこで、P2Y1Rを中心に電位依存性の構造基盤を解明する研究を進めたいと考えている。また、他のGq共役型受容体の膜電位依存性についての解析も行い、電位依存性を示す受容体と電位依存性のない受容体の比較などから、Gq共役型受容体に共通する電位依存性の構造基盤について検討を行う予定である。分子細胞生理学Gqシグナリングの膜電位依存性とは、濃度作用曲線が脱分極時と過分極時に大きく異なるということであり、筋細胞や神経の興奮性により神経伝達物質に対する感受性が変化するということを示唆している。また、電位依存性が受容体に由来するのか、それとも下流に位置するG蛋白質や効果器である酵素に依存するのかについても十分な情報はない。
不安心理に対応した英語表現授業によるアサーティブ学習ストラテジーの構築

高専生の外国語学習に伴う不安心理の内部構造を明らかにした。学習者は教室内の人間関係に不安を感じているが学習が進むと「コミュニケーションは練習すれば上達する」一方「座学の授業形式の方が良い」と考えることが分かった。ソーシャルスキルについては視察調査から社会性育成の支援体制や技術への示唆を得られた。それらを基に学習者が自ら英語でコミュニケーションを行う頻度を高める事を目的とし外国の高校と2つの協働プロジェクトを行った。学習者のやる気や期待が不安を上回る内容にし,内容に役立つ基礎・話し合い・発表活動,ソーシャルスキルのメタ活動を併せて行うことで,学習者は動機を維持しつつ積極的に参加できた。平成27年度は主に、1)外国語学習や対人場面で起こる不安心理とコミュニケーションスキルに関する情報収集、2)学習者の不安心理に関する調査方法の検討と確立、3)調査の実施、4)調査結果の分析と考察、5)調査結果の発表、という5つの点について成果を上げることができた。1では、臨床心理や外国語学習、ソーシャルスキル、コミュニケーション等、学習者の不安心理に関わる多方面の分野の論文や書籍を収集し、またアサーティブネスについての研修に参加することによって、多くの知見を得ることができた。これにより、外国語学習における不安心理とその対処法について体系的及び多面的なアプローチを行うことができるようになり、その知見を実際の調査や今後の実践に役立てることができる。2では、テーマについて実証的研究を行うため、個々の調査と分析について具体的な方法を検討し計画した。3では2をもとに、次年度に不安心理に即した教授法の開発を達成するための下準備として、2・4・5年生と海外渡航経験者に対し、不安心理についての実態調査を行った。4ではその結果を統計を用いた量的分析及び質的分析を行なった。統計分析のソフトウェアを入手したことにより、これまでとは格段に異なる様々な分析や、それを見込んだ調査計画を立てることが可能となった。また、4において対象の学習者が持つ外国語不安の構成要素について分析したデータをもとに考察を行い、その結果をまとめたものを学会で発表した(5)。第二言語習得と教授スキルに関する文献をある程度集めることができた。また、アサーティブネスについての研修会に参加する機会が得られたことで、実践的なトレーニング方法や指導テクニックについて学ぶことができた。しかし、アサーティブネスとコミュニケーション学は社会科学の中でも比較的新しい分野であるため、この二つに関する理論的な文献については今後さらに収集する必要がある。また、平成27年度に集めた情報を踏まえ、今後はソーシャルスキルに関する文献にも注目していく予定である。収集した先行研究や文献をもとにして具体的な調査計画をデザインし、それに沿った調査項目を作成した。また調査にあたり、調査対象校(本校)の生命・倫理委員会の審議を経て、心理カウンセラーとの連携や調査者の同意書をはじめとした一連の必要な対応を構築することができた。実施した調査から得られたデータの分析にあたっては、統計処理に必要なソフトウェアを購入し、実証的研究に必要なデータ解析を行うことができるようになった。27年度は300名以上の対象者に対し調査を行うことができたが、今後更にデータを収集するにあたり、調査項目と調査対象者数が多いため入力作業の効率化が必要なことが分かった。データを分析し、その結果をまとめて国内で2つの学会発表を行うことができた。しかし論文にまとめるのに十分な時間をとることができなかったので、平成28年度はそれを論文としてまとめていく必要がある。外国語学習者が目標言語でのコミュニケーションを行う際に感じる不安感は、一般的に誰しもが感じる漠然とした不安感や、不安感についての学習者の個人的な性格特性とは別に、「外国語不安」あるいは「コミュニケーション不安」という、外国語を使ったコミュニケーションあるいは授業活動といった特定の状況下において繰り返し体験される不安感として認知されている。平成28年度は、工学系の学科に所属する日本人の英語及びドイツ語学習者を対象として、学習者が外国語でのコミュニケーション能力を習得する過程における阻害要因の一つである不安心理(コミュニケーション不安)について、その構成要素とコミュニケーションへの態度に関する調査を行った。英語学習者については特に、調査研究だけでなく授業活動、グローバルプロジェクトを通した試行的な実践活動を行う事が出来た。調査については、収集したデータを分析した結果、中学校を卒業した段階での英語学習者は、先行研究に見られるような外国語不安と中学校までの英語の授業活動で典型的な活動そのものに対する不安・苦手意識を持っている一方で、学習内容そのものについては難しさを感じていないということがわかった。また、学習者の不安心理を取り除き自己肯定感を増進させるための心理的支援についての調査としては、スウェーデンの教育機関や移民の社会的支援に関するいくつかの施設の視察調査を行い、支援システムや技術について、専門家や当事者から多くの貴重な情報を得ることができた。まず、対象である英語学習者の外国語不安の構成要素について、学習開始直前及び2ー7年後の心理的状況を横断的方法にて調査分析を行い、その結果を国内学会で口頭発表した。英語学習者のコミュニケーション能力を育成しコミュニケーションへの持続的な動機づけを行うために、それに伴う不安を取り除き自己肯定感を高めるための教授法や支援技術・教材の開発が必要となる。現在は授業の中で英語コミュニケーション活動を定期的に行うとともに勤務校の国際交流委員会と連携し、英語母語話者や第二言語としての英語話者と英語でのコミュニケーションを通じて作業を行う複数のプロジェクトを運営実践した。またその開発の基礎として、スウェーデンの各教育施設の視察調査を行った。