hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
人工骨髄の開発と実用化-ハイブリッド型免疫器官・人工骨髄造血巣誘導系の実用開発-

本研究は、脊椎動物の謎と言われた骨髄腔における造血の仕組みを解明し、これを臨床応用する事を目的とした。これは進化の第二革命期の上陸に際して、造血の場が原始脊椎動物の本来の腸管を離れ、骨髄腔に移動したとする三木成夫の「脾臓の発生」研究に基づいている。人工骨髄造血器の開発は、今日、臨床上緊急の課題である。研究代表者の西原は、合成ヒドロキシアパタイトを用いて実験的に骨髄造血巣を哺乳類の筋肉内に異所性に、間葉細胞から誘導することにすでに成功し、1994年の第32回日本人工臓器学会にてオリジナル賞1位を受賞した。本研究はこの研究成果を実用化する目的のもので、次の5種類の研究を実施した。(1)間葉細胞の遺伝子発現がstreaming potentialによること(2)造血巣を誘導する電極型の人工骨髄バイオチャンバーの作製と成犬への移植による造血誘導能の観察(3)系統発生における腸管造血から骨髄造血への変換の原因究明(4)進化のエポックとなる哺乳類、鳥類、両生類、軟骨魚類と無顎類の筋肉内への合成アパタイト人工骨チャンバーの移植と、造血巣誘導の有無の観察(4)牛由来のコラーゲン複合低温焼結アパタイト人工骨の開発と成犬およびドチザメへの移植による組織免疫と造血の関係の観察(5)人類特有の免疫疾患の原因が口呼吸であることを究明し、成犬と成猫による人類型免疫病のモデル作製研究以上の実験で異所性ならびに骨髄腔を持たない軟骨魚類における異種性の造骨と造血現象がすべてのアパタイトとチタン電極バイオチャンバーの移植により、すべての宗族に観察された。また、牛由来のコラーゲンは犬では明らかな細胞レベルの消化が観察されたが、サメでは円滑な類骨と造血巣の誘導が観察された。これらから骨髄造血の成立が、浮力に相殺された見かけ上の6分の1Gの水中から陸棲への変化に伴う1Gの作用によることが明らかとなった。また原始脊椎動物の組織は哺乳類の胎児蛋白に相当し、主要組織適合抗原を保ちないことが明らかとなり、胎児蛋白の成体型への変換が骨髄造血に伴う重力の作用によるとする結果が得られた。これらのことから組織免疫と感染免疫とアレルギーで混迷している現在の免疫学を統一的に理解できる新しい免疫学の考え方として「細胞レベルの消化・代謝・吸収」(三木)という新しい免疫学の概念を樹立することができ、同時に脊椎動物の進化の主要機序が解明され、画期的な成果が得られた。哺乳動物の筋肉内に移植した合成ヒドロキシアパタイトの人工骨チャンバーで認められた異所性の造骨を伴った造血現象は、試験研究で得られた画期的な成果であるが、この現象は、皮下に移植した時には起こらない。本年はこの現象が、筋肉内と皮下でいかなる違いがあるかを検討した。

筋肉内も皮下組織内も共に間葉系由来の細胞からなり、筋肉は体動の源の器官として収縮と伸展を繰り返す器官であるが、皮下組織は積極的に収縮伸展をしない。このことから、両組織間における造骨・造血現象の有無の違いは、液性の流動の有無によると考えられる。今日、骨の形成は流動電位(streaming potential)によると考えられている。本研究では、骨の形成のみならず、骨の改造も造血もすべてstreaming potentialの作用によるとする作業仮説を検証することを目的の一つとしている。組織や器官における細胞の分化やサイトカイン、骨基質などの物質の形成はすべて未分化間葉細胞の遺伝子の発現によることは論ずるまでもない。本年度は、streaming potentialによる一連の遺伝子の発現を明らかにする目的で研究を行った。チタンメッシュとアパタイト多孔体の二種類の人工骨に10μVの電流を流して皮下組織に移植し、筋肉内移植の所見と比較した。その結果、アパタイトでは皮下で筋肉内の所見と同様の造血と造骨が観察され、チタンメッシュでは著明な白血球造血が観察された。造血・造骨の現象と、間葉細胞と電流の関係とを明らかにする目的で、皮下にBMP(bone morphogenic protein)と共にアパタイトチャンバーを移植したがこの所見も、これらの組織所見と同様であった。これらのことから、間葉系組織内における造骨・造血の一連の現象がstreaming potentialによる未分化間葉細胞の遺伝子の発現によるBMPの誘導によることが明らかになった。そこで、合成アパタイトの生理食塩水流動下でstreaming potentialを観測し、水圧を変化させて発生する電位を測定した。一方、進化の過程では、骨髄造血が、陸樓による重力の影響下で生じた血圧の上昇で起こっていると考えられることから、骨髄腔をもたない軟骨魚類(サメ)と円口類(メクラウサギ)に人工骨髄チャンバーを移植した結果、哺乳類と同様に類骨と造血巣の誘導が認められた。これは、進化がラマルクの用不用説に従うことことを実験的に検証した画期的成果といえる。すなわち、造血と造骨は、遺伝現象とは別の重力や局所に作用する生体力学を引き金として起こる間葉細胞の遺伝子の発現で起こることを明らかにしたものである。次年度はこれをin vitroで行うと同時により有効な造血チャンバーの開発にあたる。本研究は、脊椎動物の謎と言われた骨髄腔における造血の仕組みを解明し、これを臨床応用することを目的とする。これは進化の第二革命期の上陸に際して、造血の場が原始脊椎動物本来の腸管を離れ、骨髄腔に移動したとする三木成夫の「脾臓の発生」研究に基づいている。人工骨髄造血器の開発は、今日、臨床上緊急の課題である。研究代表者の西原は、合成ヒドロキシアパタイトを用いて実験的に骨髄造血巣を哺乳類の筋肉内に異所性に、間葉系細胞から誘導することに既に成功し、1994年の第32回日本人工臓器学会においてオリジナル賞一位を受賞した。本研究はこの研究成果を実用化する目的のもので、次の5種類の研究を実施した。(1)間葉細胞の遺伝子の発現がstreaming potentiolによることを実験であきらかにした。(2)有効に造血巣を誘導する電極型の人工骨髄バイオチャンバーの設計と作製を行い、これらを成犬と成猫へ移植し、造血誘導能の観察を行った。(3)系統発生における腸管造血から骨髄造血への変換、すなわち骨髄造血の発生の原因が何であるかを解明する目的で、実験進化学手法を考案した。
順逆変換ニューラルネットによる特徴・変数選択とデータ復元

本研究は,例外値を含むデータに対して頑健なパターン情報処理の実現を目指して,以下の二つを課題とするものである:(1)入力データの順逆変換すなわち次元圧縮と復元を行う階層型ニューラルネットを用いてデータ変数毎の確からしさを推定し有効な変数を選択する手法を検討すること,(2)その手法を,顔領域検出や個人識別など様々な画像ベースのパターン認識課題に応用すること.以下に平成17年度の研究成果を列挙する.画像の例外部分を補正可能な識別器:サングラスをかけた顔の画像のように対象物の一部が隠れた画像データが入力された場合でも,隠れ領域を自動的に検出して本来の画像を推定する仕組みをもった識別手法について研究した.この識別手法を,顔とそれ以外の画像の識別および個人識別の二種類のパターン認識課題に適用し,いずれにおいても,顔の一部が人工的なノイズやサングラス等で隠されていても識別率を低下させず良好な結果が得られることがわかった.本研究成果については,17年度中に論文一篇を学術雑誌に発表している(Takahashi and Kurita,2005).頑健な恒等写像学習による三次元形状復元:複数の画像の特徴点座標列からカメラの運動との形状を復元する問題は,コンピュータビジョンにおいて基本的かつ重要な問題である.本研究では,上述の研究から導かれた学習アルゴリズムをこの問題に適用し,特徴点の追跡を失敗した場合のようにデータ中に大きな誤差が含まれる状況でも,カメラ運動と物体形状を高精度に復元できることを明らかにした.本研究成果については,17年度中に学会発表を行い,学会論文集に論文一篇が掲載されている(藤木,高橋,栗田,2005).本研究課題の目的は,例外値を含むデータに対して頑健なパターン情報処理の実現を目指して,(1)入力データの順逆変換すなわち次元圧縮と復元を行う階層型ニューラルネツトを用いてデータ変数毎の確からしさを推定し有効な変数を選択する手法を検討すること,ならびに(2)その手法を、顔の一部が隠された状況での顔領域検出や個人識別など様々な画像ベースのパターン認識課題に応用すること,である.以下に平成15年度の研究成果を列挙する.顔の向きによらない個人識別:順逆変換ニューラルネットを用いて複数の識別器を統合する学習アルゴリズムを提案した.これによって,複数人物が様々な方向を向いた画像が向きの情報なしに与えられるような場合でも正しい個人識別が可能となることを示した.画像の例外部分を補正可能な識別器:画像の一部が隠されたデータが与えられてもその領域を自動的に検出し本来の画像を推定する仕組みをもった識別手法を提案した.顔とそれ以外の画像の識別および個人識別の二種類の課題のいずれでも,サングラスなどで顔の一部を隠しても識別率を低下させず良好な結果が得られることを示した.画像の縮小拡大による順逆変換:データから特徴を抽出しそこからデータを再構成する順逆変換としては,主成分分析によって次元圧縮と復元のための線形変換を構成する方法が一般によく用いられている.本研究では,この順逆変換過程を画像の縮小拡大に置き換えた新たなパターン認識手法を提案し,画像中の顔領域検出に有効であることを示した.本研究課題の目的は,例外値を含むデータに対して頑健なパターン情報処理の実現を目指して,(1)入力データの順逆変換すなわち次元圧縮と復元を行う階層型ニューラルネットを用いてデータ変数毎の確からしさを推定し有効な変数を選択する手法を検討すること,ならびに(2)その手法を,顔の一部が隠された状況での顔領域検出や個人識別など様々な画像ベースのパターン認識課題に応用すること,である.以下に平成16年度の研究成果を列挙する.画像の例外部分を補正可能な識別器:画像の一部が隠されたデータが与えられてもその領域を自動的に検出し本来の画像を推定する仕組みをもった識別手法について研究した.顔とそれ以外の画像の識別および個人識別の二種類の課題のいずれにおいても,サングラスなどで顔の一部を隠しても識別率を低下させず良好な結果が得られることがわかった.本研究成果については,16年度中に一篇の論文を発表し,さらに一篇が受理され印刷中である.頑健な恒等写像学習による三次元形状復元:複数の画像の特徴点座標列からカメラの運動と物体の形状を復元する問題は,コンピュータビジョンにおいて基本的かつ重要な問題である.本研究では,上述の研究から導かれた学習アルゴリズムをこの問題に適用し,特徴点の追跡を失敗した場合のようにデータ中に大きな誤差が含まれる状況でも,カメラ運動と物体形状を高精度に復元できることを明らかにした.本研究は,例外値を含むデータに対して頑健なパターン情報処理の実現を目指して,以下の二つを課題とするものである:(1)入力データの順逆変換すなわち次元圧縮と復元を行う階層型ニューラルネットを用いてデータ変数毎の確からしさを推定し有効な変数を選択する手法を検討すること,(2)その手法を,顔領域検出や個人識別など様々な画像ベースのパターン認識課題に応用すること.以下に平成17年度の研究成果を列挙する.画像の例外部分を補正可能な識別器:サングラスをかけた顔の画像のように対象物の一部が隠れた画像データが入力された場合でも,隠れ領域を自動的に検出して本来の画像を推定する仕組みをもった識別手法について研究した.この識別手法を,顔とそれ以外の画像の識別および個人識別の二種類のパターン認識課題に適用し,いずれにおいても,顔の一部が人工的なノイズやサングラス等で隠されていても識別率を低下させず良好な結果が得られることがわかった.本研究成果については,17年度中に論文一篇を学術雑誌に発表している(Takahashi and Kurita,2005).

頑健な恒等写像学習による三次元形状復元:複数の画像の特徴点座標列からカメラの運動との形状を復元する問題は,コンピュータビジョンにおいて基本的かつ重要な問題である.本研究では,上述の研究から導かれた学習アルゴリズムをこの問題に適用し,特徴点の追跡を失敗した場合のようにデータ中に大きな誤差が含まれる状況でも,カメラ運動と物体形状を高精度に復元できることを明らかにした.本研究成果については,17年度中に学会発表を行い,学会論文集に論文一篇が掲載されている(藤木,高橋,栗田,2005).
内分泌細胞の分泌顆粒内と細胞表層のマトリクス機能分子としてのグリココンジュゲイト

内分泌器においてマトリクス様分子としてグリココンジュゲイトが存在しそれらの存在形態が内分泌細胞を特徴づけるという観点に立ち、ラットの下垂体前葉の内分泌細胞の表層または細胞間と分泌顆粒とに特異的なグリココンジュゲイトがマトリクス様機能分子として存在する可能性を、主に光学・レーザー・電子顕微鏡レベルの免疫組織化学と画像解析により解析した。前葉の一部の細胞に特異反応を検出するモノクローン抗体は、グリコサミノグリカンを成分とする蛋白すなわち1つのグリココンジュゲイトを認識する。ゴールド標識による免疫電顕の手技により抗体の細胞内局在性を解析し、この抗体に対する抗原分子が、前葉の特定の腺細胞の分泌顆粒にかぎって存在することを結論した。このグリココンジュゲイトはこの腺細胞の分泌顆粒によってマトリクスである可能性がある。グリコサミノグリカンのうちコンドロイチン硫酸、ヘパラン硫酸、ケラタン硫酸に対する抗体を用いて、ラットの下垂体前葉細胞における分布を、パーソナルコンピュータによる画像解析により解析した結果、コンドロイチン硫酸を含有する腺細胞を認めた。先の抗体がコンドロイチン硫酸を含有するグリココンジュゲイトを認識することから、コンドロイチン硫酸含有細胞とモノクローン抗体免疫陽性細胞が同一の細胞であると考えられた。
毒素とエリシター：病原菌に由来する細胞死誘導因子の機能と病理学的役割の比較研究

植物と病原体間における相互作用の場で、病原菌由来の毒素は病原性因子として、一方、エリシターは非病原性因子として機能している。両者は植物細胞死の誘導因子という共通の作用を示すが、その病理学的意義・役割は全く逆である。本研究では、宿主特異的毒素およびエリシターを用いた比較研究を通して、necrotrophic病原菌の感染過程においては、両者により誘導される細胞死が菌の感染を有利に導き、毒素/エリシターともに病原性因子として機能することを明らかにした。また、両者により誘導される植物細胞における細胞死カスケードにおいては、その過程が同一ではない可能性を示した。植物-病原体相互作用の場において、菌の生産する毒素は病原性因子として、一方、エリシターは非病原性因子として機能する。両者は植物細胞死(プログラム細胞死)の誘導因子という共通の作用を示すが、その病理学的意義は全く正反対である。本研究では、毒素とエリシターという細胞死誘導エフェクター因子の意義と機能に関する比較検討を通して、両者の介在する植物-病原体相互作用の統一的理解を目指す。本年度は以下の検討を行った。申請者らが新たに見出した毒素感受性シロイヌナズナ変異体(Asc1欠失)(AAL毒素・病原菌感受性モデル植物)を活用し、エリシター/毒素による細胞死の病理学的意義を比較解析した。毒素/エリシターを前処理したシロイヌナズナ変異体にA. alternataを接種し、過敏感細胞死(プログラム細胞死)の影響を調査した結果、細胞死が誘導された後は本来感染できない非病原性A. alternataによる感染が誘導されることを明らかにした。また、同様の結果は毒素処理によっても再現された。これら植物組織においては、過敏感細胞死のマーカー遺伝子の発現が認められた。また、Nicotiana umbraticaにおいて,エチレンシグナル経路とAP2/ERF型転写因子であるModulator of AAL-toxin cell death(MACD1)が,AAL毒素細胞死に重要な役割を果たすことを示した。さらに、エフェクター分子(毒素)のヘテロロガス発現系を構築するため、A. alternata tomato pathotypeにおける毒素生合成遺伝子クラスター全領域の解析を進めた。以上の検討により、それぞれのエフェクター分子により誘導される宿主・非宿主の細胞死がnecrotroph菌感染に及ぼす影響を明確にでき、さらに、細胞死誘導過程の分子機構が明らかとなった。植物ー病原体相互作用の場において、菌の生産する毒素は病原性因子として、一方、エリシターは非病原性因子として機能する。本研究では、毒素とエリシターという細胞死誘導エフェクター因子の意義と機能に関する比較検討を通して、両者の介在する植物ー病原体相互作用の統一的理解を目指す。本年度は以下の検討を進めた。病原菌側の解析においては、INF1エリシター遺伝子をA. alternataに導入し、エリシター産生ネクロトロフ菌を作出した。さらに、エフェクター分子(毒素)のヘテロロガス発現系を構築するため、A. alternata tomato pathotypeにおける毒素生合成遺伝子クラスター全領域を構成する12遺伝子全てを導入、発現させた形質転換体を作出することに成功した。また植物側の解析に関しては、申請者らが新たに見出した毒素感受性シロイヌナズナ変異体(Asc1欠失)(AAL毒素・病原菌感受性モデル植物)およびサリチル酸、JAおよび各種シグナリング系の変異体を活用し、宿主・非宿主の細胞死がnecrotroph菌感染に及ぼす影響を明確にした。また、毒素感受性タバコおよびシロイヌナズナを利用した細胞死カスケードの解明に関して、遺伝子サイレンシング法および一過的発現法を用いて、毒素およびエリシター誘導性の細胞死カスケードの類似点・相違点を比較検討した。その結果、感受性細胞における毒素誘導性のプログラム細胞死に、エチレンシグナリング経路およびMAPKカスケードが関わることを明らかにした。

エリシターを前処理したタバコあるいはトマト植物にA. alternataを接種し、エリシター誘導性の過敏感細胞死(プログラム細胞死)の影響を調査した結果、細胞死が誘導された後は本来感染できない非病原性A. alternataによる感染が誘導されることを明らかにした。すなわち、necrotroph菌にとってエリシターは毒素と機能的に同義であることが示唆された。さらに本結果は、申請者らが新たに見出した毒素感受性シロイヌナズナ変異体(Asc1欠失)(AAL毒素・病原菌感受性モデル植物)を活用した解析よっても支持された。また、感受性細胞においてエチレンシグナリング経路およびMAPKカスケードが、AAL毒素誘導性のプログラム細胞死に関わることを明らかにした。一方、病原菌側に解析においては、エリシター分子のヘテロロガス発現系、すなわち、INF1エリシター産生ネクロトロフ菌(A. alternata)の作出に成功した。さらに、エフェクター分子(毒素)のヘテロロガス発現系を構築するため、A. alternata tomato pathotypeにおける毒素生合成遺伝子クラスター全領域の解析を進めた。以上の検討により、それぞれのエフェクター分子により誘導される宿主・非宿主の細胞死がnecrotroph菌感染に及ぼす影響を明確にでき、さらに、細胞死誘導過程の分子機構が明らかとなった。交付申請書に記載した研究目的および本年度の計画に照らし合わせて、ほぼ計画通りの検討を行い、予想される成果を得た。25年度が最終年度であるため、記入しない。今後は、本年度に得られた研究成果に基づき、エリシター/毒素分子のヘテロロガス発現系を利用した機能解析、また、シロイヌナズナの毒素感受性・細胞死変異体におけるnecrotrophicおよびbiotrophic病原体の感染行動の比較、さらに両エフェクター分子による細胞死誘導過程の分子解析を進める予定である。その結果、研究目的である「毒素とエリシターという細胞死誘導因子の意義と機能に関する比較検討を通して、両者の介在する植物-病原体相互作用を統一的に理解する」ことが可能になるとと期待される。今年度は、これまでに得られた研究成果に基づき、エリシター/毒素分子のヘテロロガス発現系を利用した機能解析、また、シロイヌナズナの毒素感受性・細胞死変異体におけるnecrotrophicおよびbiotrophic病原体の感染行動の比較、さらに両エフェクター分子による細胞死誘導過程の分子解析を進める予定である。その結果、研究目的である「毒素とエリシターという細胞死誘導因子の意義と機能に関する比較検討を通して、両者の介在する植物ー病原体相互作用を統一的に理解する」ことが可能になるとと期待される。
循環腫瘍細胞におけるEGFR耐性遺伝子変異同定に基づく肺癌個別化治療の開発

上皮増殖因子受容体チロシンキナーゼ阻害剤に耐性化を来した肺癌患者の血液にて循環腫瘍細胞(CTC)の測定を行い、同時に回収されたCTCのDNAから耐性遺伝子変異T790Mの有無に基づいて、その後の個別化治療を行う臨床試験を行った。6例解析した段階で、CTCの陽性率が極めて低く、CTC-DNAからのT790Mの同定も困難と判断され、本試験は終了となった。本研究は、肺癌治療において大きな問題となっている上皮増殖因子受容体チロシンキナーゼ阻害剤(EGFR-TKI)に対する耐性化を、末梢血中から回収した循環腫瘍細胞(CTC)における耐性化遺伝子変異の同定によって判別し、その結果に基づいて適切な治療薬を選択する肺癌個別化治療の開発を目的としている。初年度は、パイロット試験としてEGFR-TKI耐性化を来したと想定される肺癌患者から得た末梢血中から、Cell Tracksオートプレップ(オーソ・クリニカル・ダイアグノスティック社)にてCTCを回収することを試みた。すなわち、EGFR-TKIゲフィチニブ治療を長期間続けた後に画像上の増悪を認めた患者から文書同意を得て20mlの血液を採取しCTCの測定を行った。その結果、7.5mlあたり数個のCTCが確認され、上記システムによって進行肺癌患者におけるCTC測定が可能であることを確認した。その後、同じ末梢血から回収されたCTCのDNAを抽出し、それらからPNA-LNA PCRクランプ法にて耐性EGFR遺伝子変異T790Mを同定することを試みた。同患者は上記採血後に行った異なるEGFR-TKIエルロチニブによる治療が臨床的に奏効したことから、T790Mは陰性であることが予想されたが、回収されたDNA量が少なく解析が困難であった。現在、より多くのCTCを回収すべく上記Cell Tracksオートプレップシステムの改良を試みるとともに、より多くの肺癌患者における本治療戦略の妥当性を検証するための臨床試験プロトコールを計画している。本年度は、上記Cell Tracksオートプレップシステムの改良を試みるとともに、採血量を40mlと増やしたうえでより多くのCTC回収を目指し、さらに肺癌患者における治療戦略として本法の妥当性を検証するための臨床試験プロトコールを開始した。現時点で5例の患者からの検体を解析しているが、CTCは2例に認めたものの、それらのCTC-DNAからT790Mの解析は困難であった。目標症例数を目指して、本臨床試験は引き続き継続されている。前年度に引き続き、前向き臨床試験としてEGFR-TKI耐性化を来したと想定される肺癌患者(EGFR-TKIゲフィチニブ治療を長期間続けた後に画像上の増悪を認めた患者)から文書同意を得て40mlの血液を採取し、Cell Tracksオートプレップ(オーソ・クリニカル・ダイアグノスティック社)にてCTCの測定を行った。CTCが検出できた場合には同じ末梢血から回収されたCTCのDNAを抽出し、それらからPNA-LNA PCRクランプ法にて耐性EGFR遺伝子変異T790Mを同定し、その有無に基づいてEGFR-TKIエルロチニブによる再治療を行う個別化治療の有用性を検討する予定であった。

しかし6例について解析した段階で、CTCが検出できたのが3例(3個/7.5mlが1例と1個/7.5mlが2例)で、いずれのCTC-DNAからもT790Mの同定は困難であった。この間、他の研究から肺癌症例の末梢血におけるCTC量は乳がん等と比べてわずかであることが報告され、一方で血中循環腫瘍DNAからT790Mを同定できる高感度検査法の開発が進んだことから、本試験は終了することとした。本課題の対象となる肺癌患者は、治療抵抗性の病態のため全身状態が容易に悪化しやすく、臨床試験に参加できる状態である割合が当初の予想よりも低いためと思われる。24年度が最終年度であるため、記入しない。引き続き、末梢血中の循環腫瘍細胞中のバイオマーカーに基づいた個別化治療の臨床試験を進め、その成否を科学的に解析する。そして、本法の日常臨床における実施可能性や応用に際しての課題について十分な検討を行う。
破骨細胞融合時の情報交換：その構造と機能

破骨細胞は、単核細胞の融合により形成される多核細胞であり、その機能は骨を分解することである。その細胞融合に関与する構造として、我々は新規のアクチン超構造体を報告してきた。本研究では、その構造の構成タンパク質の空間配置を決定し、前駆体であるPodosome beltとの違いを明らかにした。また、その構造保持に関与するシグナル伝達経路を解明した。アクチンの動態を観察し、超構造体内で内向きのアクチン流動が起きている事を発見した。これらの知見を統合し、破骨細胞間の接着に働く力の釣り合いを考察した。本研究により、アクチン超構造体は、破骨細胞同士の融合時の接着に寄与することが示された。我々が発見したアクチン超構造体(zipper-like structure)の破骨細胞融合における関与を検討するため、その構造と機能を解析した。実験系として、マウスマクロファージ様培養株細胞RAW264.7細胞をRNAKL(Receptor activator of nuclear factor-kB ligand)で刺激して、破骨細胞を分化誘導した。予備実験から、Cx43(コネクシン43)が細胞接触部に蓄積することが分かっていた。Real-time PCRの結果から、Cx43のmRNA量はRAW264.7細胞を用いた破骨細胞分化に伴って、変化しなかった。同細胞へEGFP-Cx43プラスミドの導入を試みたが、相関電子顕微鏡解析に供するには充分な導入効率が得られなかった。破骨細胞のアクチン細胞骨格は、ネットワークを形成する情報伝達シグナルにより制御されることが知られている。そこで、同ネットワークを撹乱する各種薬剤を用いて、破骨細胞の多核化に対するアクチン細胞骨格の役割を検討した。RANKLでRAW264.7細胞を刺激し、3日目(単核細胞の状態)に各種薬剤を添加し、4日目に形成される多核細胞を評価した。アクチン繊維の安定化剤であるJasplakinolideは、小さい破骨細胞を生じさせた。Src阻害剤SU6656とダイナミン阻害剤Dynasoreは、Zipper-like structureの形成を阻害し、小さい破骨細胞を生じさせた。SmallGTPase Rhoの阻害剤Y27632は大きな破骨細胞を生じさせたのに対し、Rhoの活性化剤Rho activator IIは小さな破骨細胞を生じさせた。また、Rac1とRhoはZipper-like structureの中心部、すなわち2個の破骨細胞の接触部に局在することが判明した。M-CSFによる刺激は、癌遺伝子c-Srcを介してRac1の活性化とRhoの不活性化を引き起こし、Podosome beltおよびzipper-like structureの形成を調節していると考えられた。これらの結果より、アクチン細胞骨格の変化は破骨細胞の融合に必須の因子ではないものの、大きな破骨細胞の融合の際に促進的に働くことが示唆された。アクチン超構造体(zipper-like structure)の破骨細胞融合における役割を明らかにするため、その構造を解析した。マクロファージ様培養株細胞RAW264.7細胞から誘導した破骨細胞様細胞へEGFP-actinを導入しアクチンの動的構造を生細胞観察した。その結果、二つの細胞接触面から細胞体側へ対称的なアクチンの流れ(Retrograde actin flow)が観察された。その流速は、3.3 μm/minであった。免疫蛍光抗体法を用いた観察から、ポドゾーム内の張力応答分子と考えられるZyxinタンパク質が細胞接触面に蓄積することが判明した。また、張力発生に関与する収縮タンパク質Nonmuscle myosin IIがzipper-like structureの外側に局在する事が分かった。以上の知見から、zipper-like structureにおいてアクチンの重合反応が細胞を押し付ける力を発生し、それに釣り合う力の発生にアクトミオシン系の収縮が関与する可能性が示された。これらの実験結果および考察は、破骨細胞融合におけるzipper-like structureの役割の理解を大いに進めるものであった。また、固定細胞を用いてポドゾームを構成するタンパク質群の分布を、ポドゾームクラスター、ポドゾームベルト、zipper-like structure間で比較した。特定のタンパク質の局在がそれぞれの構造を特徴づけることが分かった。F-アクチンの密度分布を解析した結果、ポドゾームの集団的行動(Collective behavior)がより高度な、そして大きな超構造体を形成する要因であるとの新しい知見が得られた。この研究を推進すれば、細胞内における小器官形成の一つのモデルを提示できると考えられる。申請者は、破骨細胞の融合時に出現する新規のアクチン超構造体(Zipper-like structure)を既に報告した。この構造体の特性を明らかにするために、ポドゾーム構成タンパク質の配置を共焦点レーザー顕微鏡を用いた免疫蛍光法で決定した。その結果、Vinculin, Paxillin,Zyxin, Non-muscle myosin IIAの空間配置は、前駆体であるポドゾームベルトにおける配置と大きく異なる事が判明した。また、EGFP-actinを導入したRAW264.7細胞を用いた生細胞観察から、Zipper-like structure内では、非対称的な内向きのアクチン分子の流動が起きている事を発見した。このアクチン流動は持続的であり、破骨細胞で見られる他のアクチン構造(podosome cluster, podosome ring, podosome belt)では観察されなかった。方向性を持ったアクチン流動は張力を発生することから、Zipper-like structure内でのアクチン流動は、2つの細胞同士を密着状態に保持する機能があると推察した。

アクチンの分枝伸長を阻害する薬剤であるCK-666は、Zipper-like structureを破壊したことから、同構造はアクチン重合に依存した散逸構造であると考えられた。また、CK-666は、破骨細胞の融合を低下させたことから、破骨細胞融合にアクチンの分枝伸長が関与することが示された。以上の結果より、Zipper-like structureは、ポドゾーム構成タンパク質の再配置により、新たに方向性を持つアクチン流動を生み出し、破骨細胞融合を促進すると推論した。破骨細胞は、単核細胞の融合により形成される多核細胞であり、その機能は骨を分解することである。その細胞融合に関与する構造として、我々は新規のアクチン超構造体を報告してきた。本研究では、その構造の構成タンパク質の空間配置を決定し、前駆体であるPodosome beltとの違いを明らかにした。また、その構造保持に関与するシグナル伝達経路を解明した。アクチンの動態を観察し、超構造体内で内向きのアクチン流動が起きている事を発見した。これらの知見を統合し、破骨細胞間の接着に働く力の釣り合いを考察した。本研究により、アクチン超構造体は、破骨細胞同士の融合時の接着に寄与することが示された。本年度は、zipper-like structureの動的構造を明らかにする目的で、アクチンの動的構造を調べ望外の結果を得た。予想通りzipper-like structure内でアクチン由来の蛍光強度は重合および脱重合に起因すると考えられる特有の周期を持つ振動を示した。驚くべき事にアクチンはzipper-like structure内で一方向性に流動していた。この現象は、他細胞で見られるlamellipodia内でのretrograde actin flowあるいは細胞底面で観察されるactin waveと類似していた。この知見は新規であり、想定していた研究達成度を遥かに上回った。また固定細胞においてzipper-like structureを免疫抗体染色法を用いた共焦点レーザー顕微鏡で解剖学的に3次元再構成する実験に着手した。この実験から、zipper-like structureの基本構造は2.9μmの高さを持ち、放射軸(radial)に沿った4.2 μmのアクチン中心部が接線軸(tangential)に繰り返し構造を持つ事が判明した。研究は予定通りに進行したが、Z軸方向の解像度が低く、満足する結果が得られなかった。今後、他の方法を模索してより高解像度の3次元像を得る必要がある。細胞生物学zipper-like structureの中心部構造はアクチンが豊富過ぎるため、従来の透過電顕あるいは走査電顕観察では無構造に見え、有用な情報が得られない。
超高圧X線CTを用いた肺腫瘍の定位放射線治療法

放射線治療用ネットワークシステムに、超高圧X線CT装置を接続することにより、超高圧X線CT画像と治療計画用CT画像をオンラインで扱うことが可能となった。超高速CTを用いて、肺腫瘍が、生理的呼吸状態でどのような位置的変動を示すかを解析した。この結果を超高圧X線CTで観察される肺腫瘍の大きさと比較し、超高圧X線CTで得られる、呼吸移動を含めた肺腫瘍標的容積描出の精度を検証した。また、熱可塑性プラスチックを用いた、肺腫瘍の定位放射線治療用の簡易固定装置を開発し、臨床例とボランティアにおける固定精度を検証した結果、ほとんどの場合、±5mm以下の誤差範囲にとどまることが分かった。多発転移性肺腫瘍の患者において、十分なインフォームドコンセントを行ったあと、腫瘍径3cm以下のものに定位照射を行った。定位照射の直前に、診断用CTを用いてマークされた腫瘍の存在範囲を、簡易固定装置を装着したまま、超高圧X線CTを撮影し、位置決めの誤差を評価した。必要に応じた再位置決めのあと、照射野は、超高圧X線CT画像で得られた開度に、ヘリカルCT撮影で得られた呼吸性移動分と機械的誤差の±3mmを足したものとした。線量、分割法は、ガンマナイフの経験をもとに、単回照射、腫瘍辺縁線量20-25Gy、照射法はコプラナ原体照射であった。治療対象は、15症例、22腫瘍で、1例は原発性肺腫瘍であった。14例の転移性腫瘍の原発巣は、肝臓癌5例、肺癌3例、大腸癌2例、胸腺腫瘍2例、食道癌1例、悪性黒色腫1例であった。治療部位は、胸壁/胸膜が10部位、肺や22部位であった。照射長は20mm-90mmで、40mmが最頻であった。20Gyあるいは30Gyの分割照射が7症例、7部位で併用された。照射後、定期的にCT撮影を行い、腫瘍に対する縮小効果と正常肺の障害を観察した。一次効果が判定できた21部位については、CR13部位、PR6部位、NC2部位で、ほぼ全例に効果を認めた。生存期間は最長82ヵ月で、中間値8ヵ月であった。障害については、肺野内腫瘍へ分割照射を併用した3例において放射線肺炎を一次的に見たのみであった。2例で剖検が得られ、組織学的効果と定位照射の照準精度について評価を行った結果、腫瘍部位にのみ放射線の殺細胞効果がみられ、周囲の正常肺の病理学的変化がほとんどみられないことが確認された。これは、定位照射の全体的精度がin vivoで照合されたことを意味する。転移性胸部腫瘍に対する定位放射線治療は、良好な一次効果と、許容できる障害頻度を示し、治療期間の短縮を可能とする優れた治療法である。

これは、定位照射の全体的精度がin vivoで照合されたことを意味する。転移性胸部腫瘍に対する定位放射線治療は、良好な一次効果と、許容できる障害頻度を示し、治療期間の短縮を可能とする優れた治療法である。超高圧X線CTのタングステン酸カドミウムシンチレータ素子、コネクタケーブルを更新することで、アーチファクト減少を図り、既存の人体ファントムを用いて、画質向上を確認した。また、同人体ファントムを用いて、剛体での位置決め精度を検証した。既開発の放射線治療用ネットワークシステムに、超高圧X線CT装置を接続したこれにより、設備備品である高性能パーソナルコンピュータに、超高圧X線CT画像と治療計画用CT画像をオンライン転送することに成功した。また、治療寝台上で撮影した超高圧X線CT画像を治療計画装置に転送して、治療計画用CT画像として、直接利用することで、寝台の乗り降りによる体位の誤差が解消されることを検証した。さらに、位置決め後の起高圧X線CT画像上に重ね合わせ表示された実際のビ-ム幅の変化を、ビデオキャプチャボードにより、動画として高性能パーソナルコンピュータ(備品)上に取り込み、肺腫瘍とビ-ム幅との位置関係を解析、保存するシステムを開発した。肺腫瘍が、生理的呼吸状態でどのような位置的変動を示すかを、撮像時間が0.75秒の超高速CTにより、解析した。撮影情報(ビデオ入力)を高性能パーソナルコンピュータに転送して、時間軸に合わせた3次元再構成を行うことで、呼吸運動のコンピュータシミュレーションを作成して、照射中の変動の程度を定量した。この結果を超高圧X線CTで観察される肺腫瘍の大きさと比較し、超高圧庄X線CTで得られる、呼吸移動を含めた肺腫瘍標的容積描出の精度を検証した。熱可塑性プラスチックを用いた、肺腫瘍の定位放射線治療用の簡易固定装置を開発した。臨床例とボランティアにおける、固定精度を、撮像時間が0.75秒のヘリカルCTを用いた検証した結果、ほとんどの場合、±5mm以下の誤差範囲にとどまることが分かった。これは、呼吸同期法やActive breathing control(ABC)法と比較した結果、同程度であった。多発転移性肺腫瘍の患者において、十分なインフォームドコンセントを行ったあと、腫瘍径3cm以下のものに定位照射を行った。定位照射の直前に、診断用CTを用いてマークされた腫瘍の存在範囲を、簡易固定装遣を装着したまま、超高圧X線CTを撮影し、位置決めの誤差を評価した。必要に応じた再位置決めのあと、照射野は、超高圧X線CT画像で得られた開度に、ヘリカルCT撮影で得られた呼吸性移動分と機械的誤差の±3mmを足したものとした。線量、分割法は、ガンマナイフの経験をもとに、単回照射、腫瘍辺縁線量20-25Gyとした。照射後、定期的にCT撮影を行い、腫瘍に対する縮小効果と正常肺の障害を観察した。2例において、剖検が得られ、組織学的効果と定位照射の照準精度について評価中を評価中である。肺腫瘍を含む体幹部腫瘍への定位照射法として、ライナックのガントリをC-armで支持し、歳差状に入射するビームと多分割コリメータの運動を連動させた、集光原体照射法を開発した。ファントムを用いて、線量分布特性を、従来の方法と比較した結果、腫瘍と中-低線量域との相似性が3次元的に保たれる点で、とくに優れていた。定位照射の直前に、診断用CTを用いてマークされた腫瘍の存在範囲を、簡易固定装置を装着したまま、超高圧X線CTを撮影し、位置決めの誤差を評価した。
首都圏における短時間強雨の発生と地表面被覆の空間構造との関係に関する地理学的研究

本研究では,首都圏における短時間強雨の発生と都市地表面状態との関係について解析し,以下の結果を得た。1.首都圏における夏季強雨頻度分布の特徴として,都心北部,都心南部および京浜に強雨頻度の極大域が認められる。京浜の強雨域は,北西方から連なる強雨頻度極大帯の延長上に位置しており,ここを南東進してきた降水域による強雨と考えられる。一方,都心北部や都心南部では,その近傍で強雨域が短時間に発生・発達する傾向があり,都心域における特徴的な強雨の発現形態と考えられる。2.強雨の発現頻度には顕著な局地性が認められ,東京都区部の西部(中野下北沢付近)と北部(板橋区南部)に極大があり,前者は東風時,後者は南風時に特に高頻度となる。これらの地域は新宿や池袋などの高層建築物群風下側に位置しており,建築物群が形成する大きな地表面粗度による下層風の収束が強雨発現の局地性に関わっていることが示唆される。3.建築物形状を再現できる2.5m間隔地表面高度データ(DSM)を用いた天空率の算出方法を提示し,東京都区部全域について天空率を求めた。任意点における天空率の空間代表性は乏しく,都市ヒートアイランドと天空率との関係を考察するためには,天空率のスケールアップが必要である。1km四方の天空率ヒストグラムから得られた東京都区部の代表的な天空率は,0.50.6(都心部),0.80.95(周辺部),0.951(東京湾岸・河川敷)である。4.DSMを用いて東京都区部における空気力学的パラメータ(ゼロ面変位および空気力学的粗度)を算出し,風速の対数分布に基づいて地表面粗度に関係する水平・鉛直風速分布の評価を行った。新宿目黒付近や池袋付近などに大きな上昇流が現れ,上昇流域は風向によって変化する。この結果は上記2と整合し,強雨頻度の局地性は高層建築物群が形成する地表面粗度と強く関係すると考えられる。本年度は,東京都建設局雨量観測所,JR東日本雨量計,気象庁アメダスなどの時間降水量をデータベース化し,稠密な時間降水量資料に基づいて東京都心域における強雨頻度分布の空間構造を把握した.また,東京都都市計画局の土地利用・建物現況調査GISデータなどによる建築物階数の資料から,強雨頻度分布と都市の幾何学的構造との関連性を予察的に考察した.都区部を中心とした都心域における強雨頻度(時間降水量20mm以上を観測した226事例)の解析から,都心(東京駅周辺)の強雨頻度は特に高くなく,都区部北部から東京・埼玉県境沿いと新宿の西方から北東方向にかけて強雨発現の高頻度帯が存在することがわかった.強雨発現の23時間前における東京(大手町)の風向によって,東風,南風および北風の事例に分類し,風向別の強雨発現頻度を検討した.東風・南風時に共通して東京・埼玉県境沿いに高頻度帯が存在するが,東風時には都心部西側から西に向かって強雨頻度が増大し,新宿西方に強雨頻度の極大が現れる.南風時には池袋北方に強雨頻度の極大があり,高島平光が丘団地付近の極大も顕著となる.北風時には渋谷霞が関以南で強雨頻度が大きい.異なる空間スケールで平滑化した建築物高度(階数)の分布について,風の吹走方向別に建築物高度の変化割合(勾配)を求め,東風・南風・北風時における強雨頻度分布との比較を行った.

1.5kmスケールで平滑化した場合には,東風時に新宿東側および皇居西側の上昇勾配が大きく,池袋周辺では明瞭でない.南風時には池袋南側において新宿付近と同程度に大きな上昇勾配が認められる.また,渋谷霞が関付近の上昇勾配は,南風時よりも北風時に大きくなる.風向別の強雨頻度極大域は高層建築物群の分布とある程度の対応関係が指摘されるが,さまざまな地表面状態パラメータについて今後調べる必要がある.本年度は短時間強雨の発生と地表面被覆の空間構造との関係について,以下の2つの観点から解析を進めた.1.短時間強雨の発生に至る降水域の挙動昨年度までにデータベース化した空間的に稠密な時間降水量データを基に,強雨発現頻度が高い東京都区部の北部(板橋足立)と西部(中野世田谷)について,強雨発生時前後における時間降水量分布の推移を調べた.都区部の北部・西部ともに,その場所で突然強雨の中心が出現する場合が多く認められた.一方で,東京・埼玉の都県境を東進してきた降水域が都区部北部で発達することも多い.しかし,都区部西部においては,東京・埼玉の都県境を東進してきた降水域の接近時に,新たに発生した強雨域として認められる場合も多い.今後降水の発生・発達域を抽出し,その地域性を検討したい.2.都市における地表面パラメータの解析都市域における重要な地表面パラメータとして,都市ヒートアイランド現象とも関連が深い天空率と地表面粗度を取り上げ,東京都区部全域における空間分布の解析を進めた.パラメータの算出にあたり,建築物等の形状を再現できる格子間隔2.5mの地表面高度データ(数値地表モデル)を使用した.天空率については計算が終了し,地表面粗度の算出を行っているところである.天空率は都市の放射環境に関するパラメータとして都市の気温分布などとの関係が議論されてきた.しかし,本解析から,ある点で測定された天空率が代表する範囲はきわめて小さいと考えられ,都市気温分布などとの対応を考えるためには天空率の「スケールアップ」が必要と考えられる.そこで,1km四方における天空率ヒストグラムを解析した結果,都心部の代表的な天空率は0.50.6であり,周辺に向かって小さい天空率を残しつつ0.80.95の領域が増加し,東京湾岸の埋め立て地や河川敷では0.95以上の値となることが明らかにされた.強雨の発現と地表面状態との関係を明らかにすることを目的とし,昨年度の研究結果として得られた強雨頻度分布と建築物分布との対応を,さらに定量的に評価することを試みた。建築物を含む2.5m間隔の地表面高度データ(DSM)を用いて,Macdonald et al.(1998)とRaupach(1992, 1994, 1995)の方法を比較しつつ,東京都区部における地表面の空気力学的パラメータ(ゼロ面変位Z_dおよび空気力学的粗度Z_o)を求めた。また,風速の対数分布に基づいて,予察的に空気力学的パラメータの空間分布に起因する水平風速や上昇風速分布の評価を行った。得られた結果は以下のようにまとめられる。1.地表面の空気力学的パラメータ(Z_dとZ_o)を求める基礎となる幾何学的形状パラメータ(Z_Hやλ_F,λ_p)は,DSMデータによって十分な精度で算出できる。2.Macdonald et al.(1998)の方法では,河川沿いのZ_oが周囲に比べて過大(Z_dが過小)になることから,空気力学的パラメータの算出にはRaupach(1992, 1994, 1995)の方法が妥当と判断される。3.得られたZ_dとZ_oを基に,高度250mで風速10m/s一様として上昇風速を求めると,新宿や霞が関付近で0.2m/s程度となり,風向によって上昇流域に差異が現れる。
食物による自己免疫の制御-慢性関節リウマチおよび関節炎モデルの解析

A。慢性関節リウマチ患者における摂取栄養素と病態の解析平成8年度の慢性関節リウマチ患者の食事調査による摂取栄養素解析の結果、動物性脂質比上昇、食物線維不足、多価不飽和脂肪酸/飽和脂肪酸比率低下の傾向があきらかとなり、栄養素の偏りと疾患活動性、患者疲労度指数との関連を認めた。さらに患者血清中のインターロイキン-1(IL-1)、インターロイキン-2(IL-2)、インターロイキン-8(IL-8)、インターロイキン10(IL-10)、インターフェロンγ(IFN-γ)腫瘍壊死因子(TNF-α)の各サイトカイン濃度と疾患活動性・栄養素摂取状況との相関について解析した。その結果、患者疲労度とIL-8、日常活動指数とIL-8、INF-γ、TNF-αとの間に有意の相関がみられた。さらに、蛋白質摂取量とIL-1、脂質エネルギー比率とIL-8、多価不飽和脂肪酸/飽和脂肪酸比率とTNF-との間にも有意の相関を認めた。この事は栄養と慢性関節リウマチ患者病態や免疫能が実際に強く関連する事を示唆する。B。関節炎モデルマウスにおける腸管免疫系の解析慢性関節リウマチの動物モデルとしてタイプIIコラーゲンで誘発されるマウス関節炎を用い、食事・栄養の腸管免疫系に与える影響とそのメカニズムを検討した。平成7、8年度の研究により総カロリー制限および自己抗原(タイプIIコラーゲン)持続経口投与の併用により関節炎が抑制されることを見いだした。平成9年度は経口免疫による関節炎抑制のメカニズムを解析した。腸管免疫系を含む腸内環境の変化が関節炎の調節につながるという仮説のもとに、抗原提示細胞として最も重要な樹状細胞に注目した。樹状細胞を腸管より分離しその機能を解析した結果、経口免疫をおこなうことにより抗原刺激された腸管樹状細胞が自己免疫反応抑制的に作用するTh2タイプヘルパーT細胞の優先的な誘導をおこなうことが明かとなった。慢性関節リウマチなどの自己免疫疾患に対する免疫栄養療法の開発へ向け研究を進めたい。A。B。
古典的不斉源からの脱却による高エナンチオ選択的触媒反応の実現

触媒的不斉合成とは右手と左手の関係にある分子の片方のみを効率的に合成する手法である。この方法は数十年にわたり日本の得意とする研究分野であり、野依不斉水素化をはじめ多くの重要な研究が日本の研究者によって実現されてきた。しかしながら、この分野においても中国をはじめとする国々の台頭が著しい。本研究では分子デザインを基盤とする新たな触媒的不斉合成法を確立することで、同分野での新たな国際競争力の獲得を目指す。
膀胱がんに対する磁性ナノ粒子を用いた温熱治療の開発とその治癒メカニズムの解明

私たちは、磁性ナノ粒子を用いたがん病巣のみを特異的に加温できる新しい治療法を開発し(MCL Thermotherapy)、様々ながんに対する治療効果を報告してきた。今回、膀胱がんに対してMCL Thermotherapyの有効性を検討した。MCLは細胞親和性が高く膀胱細胞への有意な吸着が証明された。また直接の腫瘍縮小効果のみならず、免疫誘導サイトカインを介した、腫瘍免疫の増強を認めた。MCL thermotherapyは免疫治療の感受性の高い膀胱がんに対して有効な治療法であることが証明された。浸潤性膀胱がんの標準的治療は尿路変更術を必要とし、患者のQOLを著しく低下させている。そのため新たな膀胱温存治療の開発は急務となっている。私たちはこれまでに、新たながん治療法の開発を目的に、磁性ナノ粒子(Magnetic cationic Liposome:MCL)を用いたがん病巣のみを特異的に加温できる新しい治療法を開発し(MCL Thermotherapy)、前立腺がんをはじめ様々ながんに対する治療効果と強い腫瘍免疫の誘導を報告してきた。一方、がん免疫治療もその分子機構が明らかにされ、膀胱がんにおける免疫治療の感受性の高さが明らかにされている。今回これまでの研究成果を踏まえて、MCL膀胱内注入療法とがん免疫治療の併用による、浸潤性膀胱がんに対する新たな膀胱温存治療法を開発することを目的とする。私たちはまず『ヒト膀胱がん細胞株におけるMCLの吸着の検討』を行った。当研究室にて保管しているヒト膀胱がん由来の4つの細胞株(RT4, RT112, 5637, T24)におけるMCLの吸着および取り込みを走査型電子顕微鏡にて確認した。MCLは正電化しているため、負電化している細胞との吸着は良好であった。次いで、『高温度暴露によるヒト膀胱がん細胞株における免疫誘導サイトカインの検討』を行った。免疫誘導サイトカインであるIFN-γおよびIL-2の発現量の増加を確認した。そして浸潤性膀胱がん動物モデルの作成し、『膀胱がん皮下腫瘍に対するMCL Thermotherapyの治療効果の検討』を行った。MCL Thermotherapyにより、膀胱がん皮下腫瘍は確実に縮小した。高容量のMycobacterium bovis bacillus Calmette-Guerin(BCG)を膀胱内に注入することによるBCG膀胱内注入療法は臨床的有効性が最も確立したがんに対する免疫治療であり、高リスク表在性膀胱がんの標準的治療となっている。しかしながら、生菌を使用していることから全身への菌播種の危険性を回避することはできない。私たちは正電荷リポソーム包埋型磁性ナノ粒子(Magnetic Cationic Liposome: MCL)を発熱体とする新たな温熱治療(MCL Thermotherapy)を開発し、前立腺がんをはじめ様々ながんの増殖抑制効果を報告してきた。その研究で私たちは、MCL ThermotherapyのMHC分子を介した強い抗腫瘍免疫の誘導を見出した。本研究ではMCLを膀胱内に注入し高リスク表在性膀胱がんに対する新たな保存的根治的治療法の開発をすることが目的である。私たちは、これまでに新たながん治療の開発を目的に、MCL Thermotherapyの基礎研究を一貫して行ってきた。ラット前立腺がん皮下移植モデルでの抗腫瘍効果、ヒト前立腺がん細胞株の腫瘍完全退縮効果、さらにラット前立腺がん頭頂骨モデルおよび、大腿骨転移モデルにおける強い腫瘍免疫活性の誘導を明らかにし、その過程でHSP70の発現とCD8陽性Tリンパ球誘導サイトカインであるIFN-γ,IL-2の発現増強が免疫賦活に関与することを証明した。これらの研究成果を踏まえて、膀胱がんが免疫治療に対して感受性が高いことから、局所制御に優れているMCL Thermotherapyとがん転移巣の制御に優れているがん免疫治療を融合させ、全身治療に応用することはできないかと考えた。MCL Thermotherapyとがん免疫治療を併用することにより、浸潤性膀胱がんに対する新たな膀胱温存根治治療の開発を目的とする。0.05%のBHBNの自由飲水により高リスク非浸潤性膀胱がん(上皮内がん)マウスを作成した。膀胱がんマウスにおいては4週から26週にかけ、過形成、異形成、上皮内がん、浸潤がんと進行していく。発がんマウスの作成に時間を要したため、結果的にやや遅れている。さらに、BALB/c Slc-nu/nuにT24:1×106 cells/100 μlを背中の左右に皮下移植し、モデルマウスを作成予定であるが、生着率が悪く、時間を要している。膀胱がん皮下移植モデルを作成、両背部に移植し、片側のみをMCL Thermotherapyにて治療した。MCL未治療の腫瘍は免疫賦活により縮小した。交番磁場を2日おきに照射し、がん細胞由来のサイトカインの誘導およびCD4+Tリンパ球のTh1,Th2,Th17,Tregへの分化誘導を検討した。MCL治療群において、IL-2,IFN-γの誘導がwestern blotting/ELISA法にて確認された。さらに免疫染色にてTh1への強い分化誘導が確認できた。抗TGF-β抗体および抗IL-6抗体を用いて、Th17およびTregの発現が低下することはwestern blotting/ELISA法にて確認され、同抗体を用いることで、MCL治療の免疫効果の増強が認められた。作成した浸潤性膀胱がんマウスを1無治療群2MCL膀胱注入群3MCL膀胱注入+交番磁場照射群4MCL膀胱注入+交番磁場照射+がん免疫治療群(抗TGF-β抗体,抗IL-6抗体)に分類した。