hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
眼科疾患が両眼・単眼立体視に及ぼす影響に関する神経生理学的研究

一方、斜視群から正常立体視を有する被験者のみを抽出し、健常群と比較した場合にはこのような差異は認められず、斜視の疾患そのものではなく、両眼立体視の有無が3次元形態認知に影響を及ぼしている可能性が示唆された。単眼(陰影・肌理)での手掛りがあったとしても両眼立体視の有無により3次元形態認知では差異を認め、動きで構成された視覚刺激の場合には両眼立体視の影響が及んでいない結果となった。これらの差異は既に明らかになっている、脳内における各要素の3次元形態認知が処理されている領域、あるいはその領域間での情報処理による影響が関与していると考えられた。これらの結果は学会発表として2017年の日本神経眼科学会シンポジウムで、論文発表としてBr J Ophthalmol.に発表された。単眼でも様々な手掛り(陰影、肌理、動き、等)を用いて奥行知覚は可能であり単眼立体視と呼ばれる。単眼・両眼立体視は大脳皮質の異なってはいるが近接した視覚関連領域で情報処理が行われており、3次元形態認知に関連して相互に影響している可能性が考えられる。今回両眼立体視が障害される疾患の一つである斜視患者を対象に3次元形態認知を調べ、これら単眼性、両眼性の手掛りが3次元形態認知に及ぼす影響を検討した。41名の斜視患者、年齢をマッチさせた20名の健常人を被験者とした。斜視患者のなかで21名が両眼立体視を持ち、立体視有群、20名が立体視無群として分類した。被験者には陰影、肌理、動き、両眼視差の要素で構成された3次元形態の中でどの位置が最も手前に飛び出しているか(=頂点)を示してもらう課題を行った。図形の実際の頂点と被験者が示した点とで3次元的なerror vectorを算出した。刺激画像が提示されている平面を基底とした場合のerror vectorの矢状面成分(z成分)及び横断面成分(x-y成分)を別々に検討した。横断面成分は被験者の応答のうち、95%が含まれる楕円を算出し、各群での大きさを比較した。結果、陰影で構成された3次元形態認知で、立体視無群で健常群より矢状面成分の差が大きく、両眼視差で構成された場合では立体視有群で健常群より矢状面成分の差が大きかった。また横断面成分の検討では肌理で構成された場合に立体視有群、立体視無群双方ともに健常群より楕円が大きく、両眼視差で構成された場合に立体視有群で健常群よりも楕円が大きく、分布のバラつきが大きい結果となった。単眼での手掛りがあったとしても両眼立体視の有無により3次元形態認知に差異を認める結果となり、これらの差異は既に明らかになっていた脳内での領域間における機能的情報処理の影響が関与していると考えられた。斜視患者におけるデータをまとめ、論文として発表すると同時に、緑内障、黄斑変性の患者からもデータを収集する。また、ヘッドマウンド型視野計に視覚刺激及び課題制御プログラムを搭載することを目標とする。中途解析中、斜視患者では1次元の特徴抽出課題において、立体視の有無による反応時間の差異を認めた。斜視患者における1次元の特徴抽出におけるデータをさらにまとめ、学会発表、論文として発表することを目指す。英文校正費として使用予定であったが、英文校正の会社の入金システムの入れ替えのため年度末までに支払ができなかった。英文校正費として用いる。
Radio Signal Scavenging技術：新しい電波伝搬環境計測手法

本研究では,自らが電波発射を行わずに既存利用者が発射する電波を用いて電波伝搬特性を測定する手法を確立し,その応用について有効性を確認することを目指している.電波利用においては,開空間に向けて電波を送信しているため,本来用途のために受信されるエネルギーは,送信エネルギーに比べて何桁も小さなものとなり,それ以外のエネルギーは有効に利用されていない.捨てられている電波から信号波形の情報を取り出して有効利用するために本研究で提案する手法をradio signal scavengingと呼ぶ.本研究では,自らが電波発射を行わずに既存利用者が発射する電波を用いて電波伝搬特性を測定する手法を確立し,その応用について有効性を確認することを目指している.電波利用においては,開空間に向けて電波を送信しているため,本来用途のために受信されるエネルギーは,送信エネルギーに比べて何桁も小さなものとなり,それ以外のエネルギーは有効に利用されていない.捨てられている電波から信号波形の情報を取り出して有効利用するために本研究で提案する手法をradio signal scavengingと呼ぶ.
Tensor SOM Network：複雑な大規模複合データの包括的解析

本研究の目的は,複雑なデータ構造を持つ大規模な複合データを包括的に解析・可視化する手法の開発である.キーアイデアは,本研究者が開発した非線形テンソル解析法"Tensor SOM"をネットワーク化することである.すなわち複数のTensor SOMを結合したTensor SOM Networkが本研究の中心である.複合データの構造はグラフ構造で表現が可能であり,しばしばEntity Relation (ER)図として表現される.本研究ではTensor SOMをデータ構造と同一のグラフ構造で結合したネットワークで結合する.これは非線形テンソル分解を構成要素とするベイジアンネットワークとみなすことができ,ベイジアンネットの情報伝播などの手法を利用することが可能である.3年間の研究期間内では以下の4点に取り組む計画である.(1) TensorSOMを結合したTensor SOM Networkの開発.具体的には(1-a)対等なデータ同士の水平的な結合法の開発,および(1-b)階層的なデータ間の垂直的結合法の開発に分けられる.(2) Tensor SOM Network内の情報伝播による複合データの横断的可視化法の開発.上述したベイジアンネットの手法を応用して,Tensor SOM Network全体を串刺しにした可視化法を開発する.(3)実際の大規模複合データへ応用し,現実課題で有用性を検証.(4)TensorSOMは自己組織化マップ(SOM)をベースとしているが,現代的な統計的機械学習で学習アルゴリズムの再構築を行い,より多様な解析対象を扱える連続潜在変数型のTensor SOM Networkを開発する.(1-a)対等な関係データ同士を水平的に結合する手法の開発に取り組んだ.これはマルチビューテンソルデータの非線形解析として位置づけられる.すなわち各々の関係データに関して相互情報量が最大となる低次元表現を得ることが目的となる.1年目においては,マルチビューデータの非線形次元削減法において,co-trainingアプローチによるメトリック推定法を開発した.さらに提案法をTensor SOM Networkにおける水平結合に適用した.これにより,単純なカップリングより有効な結合法が実現できた.なお,本手法とドロップアウト法を組み合わせることで,教師なし学習におけるより一般的なメトリック推定が可能になるという着想を得ており,並行して試行している.(1-b)一方,階層的な複合データを解析する垂直的結合についても並行して取り組んだ.本研究では和型の階層結合と,積型の階層結合の2種の結合法を開発した.これらはそれぞれ,情報幾何学的にはm型とe型に相当する.両者は異なる階層モデルを生成するため,用途に応じて使い分けるものである.また垂直的結合は次元削減法のマルチタスク学習とみなすことができる.これは教師なし学習のマルチタスク学習であり,困難な課題として知られている.本研究ではマルチタスク学習の観点でも研究に取り組み,少数サンプルからでも学習可能なマルチタスク次元削減法を実現した.(2)についても開発は順調に進んでおり,プロトタイプができている.(3)については,オンラインショップのデータを企業からデータを提供してもらい,実用レベルでの開発に着手したところである.また(4)についても並行して進めている.(4)は発展的なテーマであるものの,現在のところ順調に進んでいる.今年度以降は以下のように研究を推進する計画である.(1) (2) Tensor SOM Networkの学習アルゴリズムの完成.1年目に水平結合・垂直結合がそれぞれ実現できたため,それらを論文として完成させるとともに,それらを統合し,Tensor SOM Networkとして実現する.またマルチタスク次元削減法という観点でも,その理論と学習法について研究を深める.(2) (3)大規模な実データへの応用として,企業から提供を受けたデータを用いて現実課題での実装を行う.なお複数企業から共同研究やデータ解析での利用の申し出を受けており,実応用面でも順調に進行している.(4)カーネル平滑化を用いた統計的次元削減法を開発し,それを用いた非線形テンソル解析法を実現する.これは発展的テーマであるため,2年間かけて取り組む.上記に加え,以下の派生テーマに関して研究を検討し,可能であれば実施する.(5)複合関係データが与えられたとき,対応するTensor SOM Networkを自動的に生成する方法,(6)解析を容易にするユーザーインタフェースの開発.本研究の目的は,複雑なデータ構造を持つ大規模な複合データを包括的に解析・可視化する手法の開発である.キーアイデアは,本研究者が開発した非線形テンソル解析法"Tensor SOM"をネットワーク化することである.すなわち複数のTensor SOMを結合したTensor SOM Networkが本研究の中心である.複合データの構造はグラフ構造で表現が可能であり,しばしばEntity Relation (ER)図として表現される.本研究ではTensor SOMをデータ構造と同一のグラフ構造で結合したネットワークで結合する.これは非線形テンソル分解を構成要素とするベイジアンネットワークとみなすことができ,ベイジアンネットの情報伝播などの手法を利用することが可能である.3年間の研究期間内では以下の4点に取り組む計画である.(1) TensorSOMを結合したTensor SOM Networkの開発.具体的には(1-a)対等なデータ同士の水平的な結合法の開発,および(1-b)階層的なデータ間の垂直的結合法の開発に分けられる.(2) Tensor SOM Network内の情報伝播による複合データの横断的可視化法の開発.上述したベイジアンネットの手法を応用して,Tensor SOM Network全体を串刺しにした可視化法を開発する.(3)実際の大規模複合データへ応用し,現実課題で有用性を検証.(4)Tensor

SOMは自己組織化マップ(SOM)をベースとしているが,現代的な統計的機械学習で学習アルゴリズムの再構築を行い,より多様な解析対象を扱える連続潜在変数型のTensor SOM Networkを開発する.(1-a)対等な関係データ同士を水平的に結合する手法の開発に取り組んだ.これはマルチビューテンソルデータの非線形解析として位置づけられる.すなわち各々の関係データに関して相互情報量が最大となる低次元表現を得ることが目的となる.1年目においては,マルチビューデータの非線形次元削減法において,co-trainingアプローチによるメトリック推定法を開発した.さらに提案法をTensor SOM Networkにおける水平結合に適用した.これにより,単純なカップリングより有効な結合法が実現できた.なお,本手法とドロップアウト法を組み合わせることで,教師なし学習におけるより一般的なメトリック推定が可能になるという着想を得ており,並行して試行している.(1-b)一方,階層的な複合データを解析する垂直的結合についても並行して取り組んだ.本研究では和型の階層結合と,積型の階層結合の2種の結合法を開発した.これらはそれぞれ,情報幾何学的にはm型とe型に相当する.両者は異なる階層モデルを生成するため,用途に応じて使い分けるものである.また垂直的結合は次元削減法のマルチタスク学習とみなすことができる.これは教師なし学習のマルチタスク学習であり,困難な課題として知られている.本研究ではマルチタスク学習の観点でも研究に取り組み,少数サンプルからでも学習可能なマルチタスク次元削減法を実現した.(2)についても開発は順調に進んでおり,プロトタイプができている.(3)については,オンラインショップのデータを企業からデータを提供してもらい,実用レベルでの開発に着手したところである.また(4)についても並行して進めている.(4)は発展的なテーマであるものの,現在のところ順調に進んでいる.今年度以降は以下のように研究を推進する計画である.(1) (2) Tensor SOM Networkの学習アルゴリズムの完成.1年目に水平結合・垂直結合がそれぞれ実現できたため,それらを論文として完成させるとともに,それらを統合し,Tensor SOM Networkとして実現する.またマルチタスク次元削減法という観点でも,その理論と学習法について研究を深める.(2) (3)大規模な実データへの応用として,企業から提供を受けたデータを用いて現実課題での実装を行う.なお複数企業から共同研究やデータ解析での利用の申し出を受けており,実応用面でも順調に進行している.(4)カーネル平滑化を用いた統計的次元削減法を開発し,それを用いた非線形テンソル解析法を実現する.
敗血症性脳症時の睡眠・覚醒異常の解明―視交叉上核とメラトニン動態を探る―

本研究は敗血症性脳症において、睡眠・覚醒をつかさどる神経核の機能異常の解明と共に睡眠・覚醒サイクルを制御すると考えられる視交叉上核への影響を明らかにすることである。最初の課題は、視交叉上核により制御されている松果体からのメラトニン放出が安定して測定できるマイクロダイアリシス法を確立することであった。従来の方法は、上矢上静脈洞からの出血や松果体までの距離が長く手技的に問題であった。我々の新手法は、マイクロダイアリシスガイドカニューラを松果体右上方から角度17°にてアプローチするもので、特殊な回路を必要とせず出血の危険性もない。この方法でラットにおける暗期(20時8時)のメラトニン分泌量を測定したところ、1日目0.30±0.38、2日目0.21±0.20、3日目0.15±0.16、4日目0.15±0.15(pmol、平均±標準偏差)の放出がみられた。一方、明期(8時20時)ではメラトニン分泌量は1日目0.07±0.10、2日目0.02±0.02、3日目0.01±0.01、4日目0.01±0.01(pmol)とごく微量であった。我々の開発した新メラトニン測定法は、従来の方法による結果とほぼ同じであり、今後の睡眠・覚醒研究に有効と考えられた。次に、この手法を用いて敗血症性脳症時の暗期メラトニン放出を検討した。敗血症性脳症モデルとしては、脳内での炎症を媒介する蛋白であるHigh mobility group box 1蛋白(HMGB1)脳室内投与モデルを用いた。HMGB1を1μg/5μl脳室内投与すると、1日目および2日目のHMGB1投与群の暗期メラトニン放出量は生理食塩水投与群に比較しどちらも有意に抑制された(P<0.01二元配置分散分析)が、3、4日目の放出量は影響されなかった。以上の結果より、敗血症性脳症時にはメラトニン放出が抑制され睡眠・覚醒に影響を及ぼすことが示唆された。松果体から分泌されるメラトニンは、日内変動や睡眠覚醒パターンと密接に関わっている。in vivoでのメラトニンの連続測定は睡眠覚醒のメカニズムを研究する上で重要な意味を持つ。我々は以前、HMGB1脳室内微量投与により覚醒期が減少し、non-REM睡眠が増加することを報告した。そこで、HMGB1脳室内微量投与後のメラトニン分泌の変化を検討するために、新しいメラトニン測定手法の確立を試みた。正中上方から松果体へのアプローチでは、上矢状静脈洞が近接しており、出血によるダメージのリスクが高いという欠点があった。真横からのアプローチでは、松果体までの距離が長い事、特殊な回路および透析プローブが必要であるという欠点があった。どちらの方法も、測定を確立するまでに時間を要する欠点があった。今回、我々は、上記の手法を見直し、新手法による生体内マイクロダイアリシス法を確立した。方法としては、雄Wisterラット(9週齢、330-380g)を使用した。右上方17度より松果体へアプローチをした。明期(8:0020:00)と暗期(20:008:00)は12時間毎に設定した。潅流液は、リンゲル液を使用した。サンプルは30分毎に採取し、メラトニン分析には高速液体クロマトグラフィーを用いた。結果としては、、4日間(n=8)および5日間(n=6)のメラトニン連続測定に成功した。我々の松果体左上方アプローチは従来の方法に比べ、松果体までの距離が短いため比較的失敗が少なく、出血によるダメージも少なかった。本研究の手法により測定したメラトニン分泌量は従来のデータと同程度であったため、代替できると判断した。結論として、我々が開発した新メラトニン測定法は今後の睡眠・覚醒研究に有効と考えられる。メラトニンの連続測定の実験系の確立に予定より時間がかかった。従来の測定方法では、安定して測定するのに、時間がかかると思われたために、当初の予定とは異なり、新規のメラトニン測定の実験系を検討した。新規の実験系による連続測定の検証に時間がかかり、5日間の連続測定の目処は立った。当初の連続測定の精度を上げるために、さらなる改良が必要と思われた。脳波の連続測定は、改良により、以前より測定精度が向上した。

一方、明期(8時20時)ではメラトニン分泌量は1日目0.07±0.10、2日目0.02±0.02、3日目0.01±0.01、4日目0.01±0.01(pmol)とごく微量であった。我々の開発した新メラトニン測定法は、従来の方法による結果とほぼ同じであり、今後の睡眠・覚醒研究に有効と考えられた。次に、この手法を用いて敗血症性脳症時の暗期メラトニン放出を検討した。敗血症性脳症モデルとしては、脳内での炎症を媒介する蛋白であるHigh mobility group box 1蛋白(HMGB1)脳室内投与モデルを用いた。HMGB1を1μg/5μl脳室内投与すると、1日目および2日目のHMGB1投与群の暗期メラトニン放出量は生理食塩水投与群に比較しどちらも有意に抑制された(P<0.01二元配置分散分析)が、3、4日目の放出量は影響されなかった。以上の結果より、敗血症性脳症時にはメラトニン放出が抑制され睡眠・覚醒に影響を及ぼすことが示唆された。敗血症性脳症を来している患者では睡眠・覚醒リズムに大きな障害を生じている。メラトニン産生は視交叉上核によって厳格に調節されているので、メラトニン産生は視交叉上核の機能の間接的指標となり得る。メラトニンの連続測定の精度を改善した後、松果体に設置したマイクロダイアリシスにより、リアルタイムに測定したメラトニン産生がどのように変化するかを検討し、敗血症性脳症の視交叉上核への影響を検討する。敗血症性脳症モデルは、これまで行ってきたHMGB1脳室内投与にて作成し、敗血症性脳症群とする。また、生理食塩水脳室内投与群をコントロール群とする。5日間連続でメラトニン測定、脳波・筋電図測定を行い、メラトニン産生、睡眠・覚醒サイクルへの経時的影響を明らかにする。メラトニン測定は、高速液体クロマトグラフィーで測定を行う。睡眠・覚醒サイクルはSleepSign Ver.3.0(既存)にて解析する。さらに、鎮静法による差違(プロポフォール・デクスメデトミジン・ミダゾラム)および時間修正作用のあるメラトニンMT1・2受容体作動薬投与の睡眠・覚醒サイクルへの効果を明らかにする。ラット購入費用、薬剤購入費用、シリンジ購入費用等が主な支出であったが、最終収支では、若干の誤差が生じ、次年度使用額が生じてしまった。実験は継続中のため、ラット購入費、薬剤費、透析プローブ等に使用する予定である。
嗜好食品ががん化、老化、発達障害を予防する―メチルキサンチン誘導体を中心として―

嗜好食品にはカフェイン、テオフィリンやテオブロミンなどのメチルキサンチン誘導体を成分にもつ食品が数多くある。本研究では、カカオ多くに含まれるメチルキサンチン誘導体、テオブロミンの生体へ与える影響を動物や細胞を用いて検討した。テオブロミン刺激により(悪性度の高い)神経膠芽腫細胞において細胞死を誘導するシグナルの活性化、および細胞増殖に関与するシグナルの抑制が観察された。一方、マウスの行動性学習能力がテオブロミン入り飼料の摂取により促進することが明らかとなった。また、脳内では脳機能促進を司る脳由来神経栄養因子の上昇が観察された。近年、mammallian Target of Rapamycin (mTOR)の活性化ががん化や老化の促進、一部の精神発達障害に関与することが明らかとなった。私たちは様々なメチルキサンチン誘導体がmTORを抑制することを世界に先駆けて見出している。このことは、メチルキサンチン誘導体を成分に持つ嗜好食品の摂取が、がん化や老化、そして精神発達障害の予防やQOL等の改善に有効であることを示唆している。平成25年度は小動物用の飼料にメチルキサンチン誘導体(テオブロミン)を配合した飼料を製造した。次にそのテオブロミン配合飼料と通常の飼料の摂取による(1)小動物の摂食量、(2)体重、(3)血漿パラメーターの相違を検討した。その結果、今回使用したテオブロミン配合飼料では通常の飼料の摂取のラット群とで明らかな相違は認められなかった。かつ本結果は、メチルキサンチン誘導体(テオブロミン)配合飼料の作成や投与方法などについても示唆を与えるものである。また、テオブロミンによるヒト神経膠芽腫への影響を検討した。その結果、テオブロミンはヒト神経膠芽腫細胞の増殖を抑制することを世界で初めて明らかにした。かつ、テオブロミンがヒト神経膠芽腫細胞内でmTORシグナルを抑制することも明らかにした。以上から少しずつではあるが、嗜好食品に含まれるメチルキサンチン誘導体の生体への作用が明らかにされつつある。平成26年度も前年度と同様に動物実験を行った。小動物用の飼料にメチルキサンチン誘導体(テオブロミン)を配合した飼料を製造し、そのテオブロミン配合飼料と通常の飼料の摂取による血中テオブロミン濃度等を検討した。その結果、今回使用したテオブロミン配合飼料では摂取開始10日後にはすでに血中テオブロミン濃度の上昇を認め、摂取開始20日以降はほぼ同レベルの血中濃度を維持することが明らかとなった。この結果はメチルキサンチン誘導体(テオブロミン)の長期投与時のテオブロミン投与量や投与方法などについて示唆を与えるものである。また、本年度より招聘した「ヒトの生理学的研究」で業績のある研究分担者を中心としてヒト研究の準備が整えられている。以上から少しずつではあるが、嗜好食品に含まれるメチルキサンチン誘導体、特にテオブロミンの細胞レベルから生体レベルまでの作用が明らかにされつつある。平成27年度も継続して動物実験を行った。小動物用の飼料にメチルキサンチン誘導体(テオブロミン)を配合した飼料を製造し、そのテオブロミン配合飼料と通常の飼料の摂取による脳内テオブロミン濃度と記憶行動等を検討した。脳内テオブロミン濃度の測定はテオブロミン配合飼料開始30日後に、記憶行動については3レバータスク試験をテオブロミン配合飼料開始30日後から実施した。テオブロミン配合飼料開始30日後の脳内でテオブロミンが検出できたがその濃度は血中濃度比し約10分の一であった。3レバータスク試験ではタスクの達成が普通食と比べ有意に早かった。このことはテオブロミンが脳へ移行し、かつ、学習能力に少なからず影響することを示している。また、ヒト研究においてもダークチョコレートとホワイトチョコレートの摂取比較を検討している。以上から、平成27年度も嗜好食品に含まれるメチルキサンチン誘導体、特にテオブロミンの細胞レベルから生体レベルまでの作用が明らかにされつつある。平成27年度は動物研究のさらなる推進、ヒト研究の実施、学会発表など、おおむね順調に進展していると考える。

近年、mammallian Target of Rapamycin (mTOR)の活性化ががん化や老化の促進、一部の精神発達障害に関与することが明らかとなった。私たちは様々なメチルキサンチン誘導体がmTORを抑制することを世界に先駆けて見出している。このことは、メチルキサンチン誘導体を成分に持つ嗜好食品の摂取が、がん化や老化、そして精神発達障害の予防やQOL等の改善に有効であることを示唆している。平成28年度も継続して動物実験を行った。小動物用の飼料にメチルキサンチン誘導体(テオブロミン)を配合した飼料を製造し、そのテオブロミン配合飼料と通常の飼料の摂取による脳内での脳由来神経栄養因子(BDNF)とcAMPなどを検討した。テオブロミン配合飼料開始30日後の脳内でcAMPおよび脳由来神経栄養因子(BDNF)が増加することが明らかとなった。cAMPの下流にあるprotein kinase A(PKA)の活性化と転写因子CREBの活性化も確認できた。以上からcAMP-PKA-CREB-BDNFのシグナル伝達系が惹起されたことが推察される。一方、ヒトでのダークチョコレートとホワイトチョコレートの摂取比較は、ダークチョコレート摂取群で前腕部および大腿部での皮膚温が有意に上昇した。このことは、テオブロミンやカカオポリフェノールがヒトの温熱反応に影響を及ぼすことを示唆している。以上から、平成28年度も嗜好食品に含まれるメチルキサンチン誘導体、特にテオブロミンの生体への作用が明らかになった。嗜好食品にはカフェイン、テオフィリンやテオブロミンなどのメチルキサンチン誘導体を成分にもつ食品が数多くある。本研究では、カカオ多くに含まれるメチルキサンチン誘導体、テオブロミンの生体へ与える影響を動物や細胞を用いて検討した。テオブロミン刺激により(悪性度の高い)神経膠芽腫細胞において細胞死を誘導するシグナルの活性化、および細胞増殖に関与するシグナルの抑制が観察された。一方、マウスの行動性学習能力がテオブロミン入り飼料の摂取により促進することが明らかとなった。また、脳内では脳機能促進を司る脳由来神経栄養因子の上昇が観察された。平成26年度は動物研究のさらなる推進、ヒト研究の立ち上げなど、おおむね順調に進展していると考える。今後も研究対象を細胞、動物及びヒトとし、メチルキサンチン誘導体を成分にもつ食品の摂取が“がん化"、“老化"、“精神発達障害"の予防やQOL等の改善に有効であるか否かを明らかにするとともに、その作用機序を解明していく。本研究の成果は、少子高齢化社会に突入した我が国において、「子供から大人まで、食育を通した健康維持戦略」のたたき台として大きく貢献することが期待されると思われるため、邁進する。28年度が最終年度であるため、記入しない。予防生理学今後も研究対象を細胞、動物及びヒトとし、メチルキサンチン誘導体を成分にもつ食品の摂取が“がん化"、“老化"、“精神発達障害"の予防やQOL等の改善に有効であるか否かを明らかにするとともに、その作用機序を解明していく。
弱い配位系の動的解析

高分子錯体に独特な弱い配位系を対象に,その相互作用を動的に把え,高分子錯体の基礎知見を確立することが目的である.錯体部周辺環境を構成する高分子のコンホメーション変化に伴う弱い配位錯体系の動力学を,固相および溶液状態において理論と実験の両面から解明するとともに,歪錯体,大環状錯体, π配位錯体において,錯体部を標識とした動的解析に新しい方法論を駆使して,高分子錯体に特有な動的相互作用を明らかにする. 62年度は次の成果を得た.(1)リン脂質集合体や高分子マトリックスに配向固定されたポルフィリン鉄錯体を対象とし,主として高速分光法を活用して動的挙動を解析,ヘモグロビンと似た弱い配位系として特徴づけた.また,酸素結合様式が, end-on/bent型と確認した.(2)ポリイメドやPMMA中での,テトラフェニルポルフィリンの極低温レーザー光観察により,ホール形成能,安定性がマトリックス高分子のゆらぎや自由体積分布に支配されていることを明らかにした.(3)水溶液中の電解質,糖やアミノ酸の錯体について局所構造解析法を確立し,溶質-溶質および溶質-溶媒相互作用を分子動力学の立場から考察した.(4)高分子ポルフィリン錯体,金属酵素モデルの歪んだ微細構造と電子状態のゆらぎを, ESスペクトルの極低温からの温度変化として測定する方法を確立,その線形解析から弱い動的相互作用に関する情報を整理した.(5)5, 6族遷移金属触媒による置換アセチレンの重合反応において,モノマーの立体および電子効果を弱いπ配位錯体のリビング特性と相関づけた.63年度はさらに,高分子錯体の弱い配位構造が,高分子部の高次構造とどのように相互作用しているか,解明をすすめる計画である.高分子錯体に独特な弱い配位系を対象に,その相互作用を動的に把え,高分子錯体の基礎知見を確立することが目的である.錯体部周辺環境を構成する高分子のコンホメーション変化に伴う弱い配位錯体系の動力学を,固相および溶液状態において理論と実験の両面から解明するとともに,歪錯体,大環状錯体, π配位錯体において,錯体部を標識とした動的解析に新しい方法論を駆使して,高分子錯体に特有な動的相互作用を明らかにする. 62年度は次の成果を得た.(1)リン脂質集合体や高分子マトリックスに配向固定されたポルフィリン鉄錯体を対象とし,主として高速分光法を活用して動的挙動を解析,ヘモグロビンと似た弱い配位系として特徴づけた.また,酸素結合様式が, end-on/bent型と確認した.(2)ポリイメドやPMMA中での,テトラフェニルポルフィリンの極低温レーザー光観察により,ホール形成能,安定性がマトリックス高分子のゆらぎや自由体積分布に支配されていることを明らかにした.(3)水溶液中の電解質,糖やアミノ酸の錯体について局所構造解析法を確立し,溶質-溶質および溶質-溶媒相互作用を分子動力学の立場から考察した.(4)高分子ポルフィリン錯体,金属酵素モデルの歪んだ微細構造と電子状態のゆらぎを, ESスペクトルの極低温からの温度変化として測定する方法を確立,その線形解析から弱い動的相互作用に関する情報を整理した.(5)5, 6族遷移金属触媒による置換アセチレンの重合反応において,モノマーの立体および電子効果を弱いπ配位錯体のリビング特性と相関づけた.63年度はさらに,高分子錯体の弱い配位構造が,高分子部の高次構造とどのように相互作用しているか,解明をすすめる計画である.
放射断層撮影法を応用した生体内PD-1全身動態の可視化

マウスのPD-1に結合する抗PD-1抗体に結合させる核種ついて基礎的検討を行った。抗体に使用するポジトロン核種の候補として、当初の候補であった89Zr(半減期78時間)に換え、既に本所で精製法が確立していた64Cu(半減期13時間)とPD-1の結合が可能が検討した。高精製度64Cuは64Ni(p,n)核反応により製造した。陽イオン交換樹脂を用いる事で精製精度の向上と精製時間の短縮が可能となった。次に64Cuと抗PD-1抗体の結合について検討した。抗PD-1抗体はFab部で結合させ安定性の評価を行い、リン酸緩衝溶液中およびマウス血清中で、48時間での結合安定性を確認している。試薬中の64Cu-PD1の含有率は、リン酸緩衝液中:87%に対し、マウス血清中:85%であり、マウス投与に際して十分な安定性を得られたものと考える。更に、64Cu今年度は、昨年度安定性評価を行った64Cuで標識した抗PD-1抗体を用いて、マウス生体内のPD-1発現細胞の動態測定を行った。まず正常なマウスでの局在を検討するためにC3H/Heマウスに尾静脈より投与し、その後の64Cu標識抗PD-1抗体の分布をPET撮像により測定した。64Cu標識抗PD-1抗体は肝臓に多く分布し、更に脾臓並びに腸管リンパ節に分布していることが示された。一方で、筋肉や腹部への分布が少ないことから、腫瘍移植モデルでの実験に差し障ることがないと判断できた。マウス扁平上皮癌由来のSCCVII細胞を下肢に移植し、腫瘍生着後、64Cu標識抗PD-1抗体の生体内分布を解析した。64Cu標識抗PD-1抗体は、正常マウスと同じく肝臓、脾臓、腸管リンパ節に多く分布していた。さらに、下肢に移植された腫瘍にも比較的多く分布していることが確認できた。更に、64Cu結合後の抗PD-1抗体が生物活性を保持していることをcell binding assayで確認した。現在、64Cuを用いた標識薬について、in vivoでの予備実験について着手している。PETによる放射断層撮影法で評価可能な画像が取得できる1回投与量を検討中である。64Cuのγ線のエネルギーは1.35 MeVでγ線放出割合は1%であり、PETでの撮影に際して最適な投与量の決定、および安全性の確認が次のステップとなる。64Cuを用いたPD-1の標識のin vivoでの評価の目途がついており、おおむね順調に進展いている。

64Cu標識抗PD-1抗体は、正常マウスと同じく肝臓、脾臓、腸管リンパ節に多く分布していた。さらに、下肢に移植された腫瘍にも比較的多く分布していることが確認できた。PD-1標識抗体のマウスに対する安全性・有効性を評価する。まずはPETによる放射断層撮影法で評価可能な画像が取得できる1回投与量を確認する。マウス種間における薬剤耐用性に差がないかも確認する予定である。画像評価が可能であると確認できた後、薬剤投与後のマウスについて、4週間までを目途に毎日観察し、安全性を確認する。上記の検討の後、正常マウスと腫瘍を移植したマウスにおけるPD-1の分布の違いを評価する。時間的資金的猶予がある場合、さらに腫瘍を移植したマウスにおいて、抗PD-1抗体を投与した場合のマウス生体内PD-1分布の継時的変化を観察し、腫瘍の反応と体内のPD-1動態の変化について関連を評価する。当初、抗体に使用するポジトロン核種の候補として、64Cu、89Zrの使用可能性を考え研究を進めた結果、64Cuについてはin vivoでの使用に目途がついた。89Zrを用いた標識薬の安定性を評価するよりも、64Cuでのin vivoでの安全性を優先して評価する方針としたため、89Zrを用いた標識薬の評価にかかると想定していた費用分の差額が生じた。
硬肉モモ果実におけるエチレン生合成抑制機構の解明

硬肉モモ果実成熟期におけるエチレン生成抑制は、エチレン生合成の鍵酵素であるPpACS1の転写制御シス領域ではなく、更に上流にあることが明らかとなった。マイクロアレイ解析により、オーキシン等他の植物ホルモンが、果実成熟期におけるPpACS1の発現制御に関与していることが明らかとなった。硬肉のモモは、成熟に伴い溶質のモモと同様な果皮色の変化や糖度の上昇等が認められるが、エチレン生成の上昇や果肉硬度の急激な低下は見られない。これまでの解析から硬肉のモモではACC合成酵素アイソジーンの一つであるPpACS1の発現が果実成熟期に抑制されているため、成熟期に達してもエチレン生成が起こらず軟化しないことが明らかとなっている。本年度は硬肉、溶質品種からPpACS1上流領域ゲノムクローンの単離と塩基配列の決定を行い、硬肉及び溶質間での変異の有無について検討した。溶質モモ`あかつき'幼葉から抽出したゲノムDNA用いてインバースPCR法によりPpACS1の上流域を含む部位を単離し、開始コドンより3kbpほど上流の塩基配列を決定した。更に`あかつき'から得られた塩基配列情報を基に溶質モモ`川中島白桃'、硬肉モモ`おどろき'、`まなみ'、`有明'の幼葉からそれぞれ抽出したゲノムDNAを用いて、PpACS1の上流領域を増幅後、各品種3クローンずつ塩基配列決定した。その結果同じ品種内でもクローンによって数カ所異なる塩基配列が認められた。品種による配列の違いを比較すると2.6kbp中数10箇所ほど違いが見られたが、硬肉モモ、溶質モモ間での特徴的な違いは認められなかった。塩基配列の違いは主にTの連続配列中の数の相違(2-3数塩基)や、硬肉、溶質に関係なく1塩基の相違などであった。データベース情報から、既に報告されているシス配列と一致する配列も多数見つかったが、果実成熟時期に関するものは認められなかった。以上の結果より成熟時期特異的にPpACS1の発現が抑制される原因はプロモーター領域ではなく、転写因子を含めた更に上流域にあることが推測された。これまでの解析から硬肉のモモではACC合成酵素アイソジーンの一つであるPpACS1の発現が果実成熟期に抑制されているため、成熟期に達してもエチレン生成が起こらず軟化しないことが明らかになっており、また、果実成熟時期特異的にPpACS1の発現が抑制されている原因箇所は、転写因子より上流に変異が生じていると推測されている。そこで、本年度は成熟期特異的にPpACS1の発現を制御する因子を探索するため、マイクロアレイを用いた網羅的解析を行った。最初に、マイクロアレイを作製するために、モモのESTデータベースGDR(Genome Database for Rutaceae)を利用してプローブの設計を行った。マイクロアレイ解析で用いるサンプルを選定するために、溶質のモモ'あかつき'果実の収穫適期前後の果実について、エチレン生成量を調査した。エチレン生成量について7月7,10日に収穫した果実ではガスクロの検出限界以下であったが、13日に収穫した果実において、わずかに検出され、19日を期に急激に増加した。そこで、PpACS1の発現を制御する因子を探索するために、その発現量が増加する前後として、7月7日、13日、19日、22日の溶質モモ果実から抽出したRNAを用いた。更に、PpACS1が発現している溶質品種と比較するために、PpACS1の発現が抑制されている硬肉モモ品種'まなみ'、'おどろき'、'有明'の成熟果実から抽出したRNAを用い、マイクロアレイ解析を行った。これまでの解析から硬肉のモモではACC合成酵素アイソジーンの一つであるPpACS1の発現が果実成熟期に抑制されているため、成熟期に達してもエチレン生成が起こらず軟化しないことが明らかとなっているが、その発現抑制機構については解明されていない。成熟期特異的にPpACS1の発現を制御する因子を探索するため、モモマイクロアレイを作製し溶質および硬肉モモ果実由来RNAを用いて実験を行った。アレイデータの解析から、PpACS1の発現様式は、オーキシンによって発現が誘導される遺伝子のホモログ(Aux/IAA, ILR, SAUR等)のものと良く一致し、これら遺伝子の発現は、溶質モモでは成熟期に増加するが、硬肉モモ果実では抑制されていた。このことは硬肉モモにおいて、内生オーキシン(IAA)含量が減少している可能性を示唆していた。そこで、硬肉モモ果実に合成オーキシン剤である1-ナフチル酢酸(NAA)処理を行ったところ、PpACS1が誘導されエチレン生成が起こり、軟化することが明らかになった。

以上のことから硬肉モモのオーキシン応答性は正常であるが、供給(生合成または輸送)に問題が生じている可能性が考えられた。また、エチレン処理を行って軟化させた硬肉モモではオーキシン誘導性遺伝子の発現量は増加しなかった。
HIV-1プロテアーゼライブラリーをもちいた多剤耐性獲得の解析

耐性ウイルス出現による抗ウイルス剤に対する感受性低下は、HIV感染者の臨床治療上解決しなくてはならない重要な問題のひとつである。プロテアーゼ阻害剤耐性は、主として薬剤の標的分子であるプロテアーゼに変異が蓄積し、薬剤のウイルス増殖抑制効果が減じることで起きる。複数の抗ウイルス剤治療の結果、蓄積してくる変異の組み合わせにより、複数の薬剤に耐性獲得することがしばしば起きる。この過程の解析は十分なされたとはいえない。本研究の目的はHIV-1 proteaseライブラリーというユニークな実験手法をもちいて多剤耐性現象を解析することである。耐性関連変異は、すでに20種類以上が報告されており、その組み合わせも多様性に富んでいる。耐性ウイルスの出現によってHAARTの中断(STI, structured treatment interruption)をするケースでは、治療中断によってどんな耐性ウイルスが変異が安定に保持されるのか、またどんな変異が急速に失われていくのかについて予想するのは困難である。そこでHIV-1領域限定ライブラリーを用いて、薬剤非存在下で継代し、各変異の出現頻度を調べ、1耐性関連変異それぞれの変異の安定性を出現頻度の半減期として求めた。こうしたデータは耐性ウイルスの出現によるSTI後の病態予測に役立てることができる。いままでいくつかの変異をもつウイルスについての知見はあるが、多様な組み合わせを同時に評価する実験系はなかった。HIV-1領域限定ライブラリーを用いると各々の変異についてあらゆる変異の組み合わせについても同時に評価することが可能なる点で新しいアプローチになると考えられる。
イメージ描画と風景構成図の統計的画像処理による社会的認知研究

これまで描画や風景構成法は、解釈における客観性が乏しいという問題ががあったため、本研究では、社会的認知を測定するための投影的方法ついての統計的画像解析技法を提案した。本研究では、(1)画像の走査と分割、(2)濃度ヒストグラム法(GLHM)、空間濃度レベル依存法(SGLDM)、濃度レベル差分法GLDM)などのテクスチャー解析、(3)特異値分解、(4)フーリエ解析、(5)風景構成画や描画の心理的解釈という手続きである。我々は、今回提案した統計的画像解析で分析を行い、心理過程を考察した。併用した不安や抑うつに関する心理テストなどからも、これらの画像特徴との関係性があることがわかった。本研究は、物や樹木や風景などのイメージ描画と風景構成図の統計的画像処理による、社会的認知研究の方法論の開発とその妥当性研究を行い、広義の「社会的認知」に関する知見を得ることを目的としている。本研究では、従来あまり客観性がないとされてきたイメージ描画や風景構成法の妥当性や信頼性について、特異値分解、EMアルゴリズム、ウェーブレット解析、フーリエ解析、フラクタル解析、独立成分分析などの画像解析手法を用いて検証する手法を開発している。また、開発された手法を用いて、臨床現場での風景構成図や描画の解析、精神疾患患者や貧困者や外国人への偏見の問題、会社などの組織における対人認知研究などに応用を行っている。本年度は、昨年度のデータ解析をおこなうと同時に、長野市内の精神病院において、医師の協力を得て、統合失調症患者の樹木画の収集を行い、この描画についての画像解析を行った。また、本調査においては、心理テストとの相関分析や、医師、臨床心理士、ソーシャルワーカーなどの専門家のケース分析による妥当性を検討している。本研究の結果は、国内の学会で発表する予定である。また、昨年は、研究についての学会発表を行い、本研究に関連した研究を学会誌や書籍などを通じて発表を行った。本研究は、面接や調査を通じた、物や樹木や風景などのイメージ描画と風景構成図の統計的画像処理による、社会的認知研究の方法論の開発とその妥当性研究を行い、広義の「社会的認知」に関する知見を得ることを目的としている。本研究では、調査や面接を通じて、従来あまり客観性がないとされてきたイメージ描画や風景構成法の妥当性や信頼性について、特異値分解、フーリエ解析などの画像解析手法を用いて検証する手法を開発することを目的とした。本研究では、国内の一般成人および精神病院の患者を対象者として樹木法と人物図による描画と生活一般についての言語記述を求めた。この方法に加えて、SDS,YG,STAI、BDI、意思決定スタイル、社会的認知スタイルなどについての質問紙調査を行い、社会や人間関係の社会的認知に関する質問紙調査を行った。これらのデータをまず、研究開発した分析法で描画と言語プロトコルデータを分析し、特徴次元を抽出した。描画像および風景構成図は、スキャナーを用いて計算機画像として取り込み、画像をいくつかに分割して、画像情報に特異値分解などの統計解析を実施する方法を開発した。特異値分析では,描画の集合を画像の各ピクセルの濃度値(0:白から255:黒)を要素とする行列と見なして特異値分解の手法を適用することを試みた。行が「画像データにおけるピクセルの位置(以下描画座標と記述する)」に対応し、列が「対象者の描いた描画」に対応する行列を作成し、特異値分解を行った。また、描画と風景構成図の離散フーリエ変換も行い、これらの分析結果と臨床心理学者、精神医学者の評価結果との比較を行い、考察した。これらの研究の成果の一部は、学会発表や研究論文に発表されている。本研究は,物や樹木や風景などのイメージ描画と風景構成図の統計的画像処理による,社会的認知研究の方法論の開発とその妥当性研究を行い,広義の「社会的認知」に関する知見を得ることを目的としている。本研究では,調査や面接を通じて,従来あまり客観性がないとされてきたイメージ描画や風景構成法の妥当性や信頼性について,特異値分解,フーリエ解析などの画像解析手法を用いて検証する手法を開発することを目的とした。本研究では,精神病院の患者を対象者として樹木法による描画を求めた。この方法に加えて,SDS,YG,意思決定スタイル,社会的認知スタイルなどについての質問紙調査を行い,社会や人間関係の社会的認知に関する質問紙調査を行った。これらのデータについて,研究開発した分析法で描画分析し,特徴次元を抽出した。描画像は,スキャナーを用いて計算機画像として取り込み,フーリエ解析などの統計解析を実施した。フーリエ解析では,描画像を各ピクセルの濃度値(0:白から255:黒)を要素とする行列と見なして手法を適用し,特徴次元の抽出を行った。

また,風景構成法についても,価値観やイメージを測定する新しい測定法を考案して,多次元尺度による解析や統計的画像解析の手法を用いた分析の方法を提案した。本研究では,データ解析を行うと同時に,昨年度に続き長野市内の精神病院において医師の協力を得て,統合失調症患者の樹木画の収集を行った。また本調査においては,心理テストとの相関分析や医師,臨床心理士,ソーシャルワーカーなどの専門家のケース分析による妥当性を検討している。本研究の結果の一部はは,国内の学会で発表されている。社会心理学、行動計量学、意思決定論精神病院での調査等も順調に実施でき、今後も計画ができており、概ね計画は順調に進展していると言える。調査や面接を実施する予定の病院や集会所等とのコンタクトもとれたが、現地の業務上の理由で、データ収集にやや時間がかかっているがおおむね順調に研究は進展している。精神病院や各地の公共施設等での描画を用いた調査を行い、これらのデータの特異値分解、ウェーブレット解析、フーリエ解析、テクスチャー解析、フラクタル解析、独立成分分析などの画像解析手法を用いて検証する手法をさらに開発していく。また、開発された手法を用いて、臨床現場での風景構成図や描画の解析、精神疾患患者への治療や社会問題の解決にある程度資するように、専門家へのヒアリングを行い、意見交換を行って、今後の研究を行っていく予定である。今後は、本研究での調査を改善し、実行をするために、各地の研究機関や文書館などでの資料収集を行うとともに、集中的に精神病院等で面接調査を実施する予定である。また描画および風景構成画の画像分析については、画像の取り込み方法の改善、それから新しい分析手法の開発、分析の安定性などのチェックを行う。また、臨床心理学者や精神医学者、ソーシャルワーカーとの連携をよりとれるようにした調査を行っていく予定である。また、学会での特別セッションなども企画する予定である。精神病院での調査の実施が、先方の予定の都合で伸びてしまい、それにともなって分析に関するアルバイト費や分析用の用品や消耗品などの使用が伸びたため。描画の画像分析に関するアルバイト費や分析用の用品や消耗品、資料費などへの使用を行う予定である。これまで従来に購入したスキャナーでの分析を行っていたが、解像度の問題や精度について問題があるので、画像データの取り込みを改善するためのスキャナー等の機器を購入する予定である。また、画像解析ソフトの購入、面接調査のための旅費、調査補助員謝金、調査対象者謝金、文献購入、それから研究成果発表のための学会出張などを予定している。
抗リン脂質抗体による血栓形成機序の分子病態学的解析

全身性エリテマトーデス(SLE)などにみられる抗カルジオリピン抗体をはじめとする抗リン脂質抗体は、脳梗塞、心筋梗塞、肺梗塞などの血栓塞栓症や習慣流産などの原因物質と考えられているが、血栓症発症の分子機構は明らかでない。最近、aPLの対応抗原はリン脂質そのものではなく、プロトロンビンやプロテインC、プロテインS、アネキシンVなどのリン脂質結合性の血漿蛋白質であり、特に血栓症の発症頻度が高いといわれる抗カルジオリピン抗体(aCL)の真の対応抗原はβ2-glycoprotein I(β2GPI)であることが明らかにされた。我々は本年度、抗カルジオリピン抗体、すなわち抗β2GPI抗体の血栓形成における作用機序の解明を目的とし、β2GPIとその抗体の血液凝固系およびプロテインC凝固制御系に及ぼす影響を検討した。その結果、抗β2GPIモノクローナル抗体のうち、β2GPIの第IIIおよび第IVスシドメインを認識するCof-20,-21,-22がループスアンチコグラント様活性を示し、これらは固相化リン脂質へのβ2GPIの結合を促進した。こうした抗体によるリン脂質膜上でのβ2GPIのクラスタリングは、プロトロンビナーゼ複合体構成因子のリン脂質への結合を阻害してin vitroではループスアンチコアグラント様活性を示し、またほぼ同様の機構でプロテインC凝固制御系を阻害することが示唆された。さらに、in vivo血管内では内皮細胞膜上などでのクラスタリングにより、細胞膜の流動性が低下し、あるいは抗体のFc受容体を介して細胞機能に障害を与え、さらに一層のトロンビン生成を促進する可能性が考えられた。
インフルエンザ感染後肺炎球菌2次感染におけるエピジェネティック制御機構の解明

インフルエンザ感染後肺炎球菌2次感染マウスモデルを作成し、8-12週齢Ezh2 cKOマウス及び対照マウスに対して、非致死量のインフルエンザウイルス(A/PR8;H1N1) 5 pfuを経鼻投与、7日後に肺炎球菌(血清型3型)1.0×10^4 cfuを経鼻投与する実験系を確立した。Ezh2 cKO群で対照群と比較し有意に生存率が低下することを繰り返し確認した。また、肺炎球菌感染24時間後の気管支肺胞洗浄(BAL)液総細胞数及びマクロファージ数がcKO群で有意に上昇し、24時間後のBAL液中のIL-1βがcKO群で有意に上昇した。さらに、Flow cytomertyを用いて肺内免疫担当細胞の検討を行ったところ、肺炎球菌感染18・36時間後の肺NK細胞がEzh2 cKO群で有意に増加しており、インフルエンザ感染後肺炎球菌2次感染におけるNK細胞の関与の可能性が考えられた。同感染モデルにおけるNK細胞の関与をさらに検討するため、肺炎球菌感染前にNK1.1中和抗体を投与してインフルエンザ感染後肺炎球菌2次感染マウスの生存率を評価したところ、有意差は認めないもののNK1.1中和抗体投与群でEzh2 cKOマウスの生存率が改善傾向を示すことを繰り返し確認した。Ezh2 cKO群の生存率低下の一因としてNK細胞の関与が考えられ、インフルエンザ感染後肺炎球菌2次感染マウスモデルにおいて、Ezh2がNK細胞関連遺伝子群の発現調節に寄与している可能性が示唆された。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。インフルエンザ感染後肺炎球菌2次感染マウスモデルを作成し、8-12週齢Ezh2 cKOマウス及び対照マウスに対して、非致死量のインフルエンザウイルス(A/PR8; H1N1) 5 pfuを経鼻投与、7日後に肺炎球菌(血清型3型)1.0×10^4 cfuを経鼻投与した。同感染モデルにおけるNK細胞の関与をさらに検討するため、肺炎球菌感染前にNK1.1中和抗体を投与してインフルエンザ感染後肺炎球菌2次感染マウスの生存率を評価したところ、有意差は認めないもののNK1.1中和抗体投与群でEzh2 cKOマウスの生存率が改善傾向を示していた。Ezh2 cKOマウスを用いたインフルエンザ感染後肺炎球菌2次感染マウス実験において、その標的細胞集団の一つとしてNK細胞が考えられたが、標的遺伝子の特定には至らなかった。そのため、各細胞の遺伝子発現解析をリアルタイムPCR法さらにはRNA-sequence法により網羅的に解析することまでできていない。<1> Ezh2 cKOマウス用いたインフルエンザ感染後

肺炎球菌2次感染実験研究協力者である中山俊憲教授(千葉大学大学院医学研究院免疫発生学)より供与を受け、当研究室で既に飼育しているEzh2 cKOマウス及び対照マウスでインフルエンザ感染後肺炎球菌2次感染マウスモデルを作成し、1生存率、2体重推移、3肺内肺炎球菌量(コロニー数)、4気管支肺胞洗浄液中の細胞数及び細胞分画、5気管支肺胞洗浄液及び血清中の各種サイトカイン発現量(ELISA法やリアルタイムPCR法)、6肺内免疫担当細胞分画及び表面マーカー発現(マウス肺を単細胞とし、各種細胞表面カーカー抗体で染色後にFlow cytometryで評価)、7肺病理組織、を両群で比較検討する。また、予備実験で有意差があったマクロファージやNK細胞、及び感染免疫に重要な好中球に着目し、Flow cytometryでソート後、8各細胞の遺伝子発現解析をリアルタイムPCR法さらにはRNA-sequence法により網羅的に解析し、Ezh2により影響を受ける遺伝子を同定し評価する。<2>インフルエンザ感染後肺炎球菌2次感染におけるEzh2の標的遺伝子の探索上記実験においてEzh2 cKO群で発現が上昇する遺伝子はEzh2の標的遺伝子と考えられるため、各標的候補遺伝子プロモーター領域におけるEzh2及びH3K27me3の発現をChIP assayで検討する。研究協力者である中山俊憲教授が最近報告している方法(Tumes DJ, Nakayama T et al. Immunity. 2013)を参考にし、ChIP-sequence法によりEzh2が作用する標的遺伝子を網羅的に探索し、Ezh2の役割を解明する。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。