hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
局所血流改善薬の歯周組織再生過程に及ぼす影響の解析

局所血流改善薬である塩化カルプロニウムが歯根膜細胞および血管内皮細胞に及ぼす影響について検索した。マウス歯根膜細胞株MPDL22におけるムスカリン受容体の5種類のサブセットM1-5のmRNAの発現をRT-PCRにて確認した。塩化カルプロニウム刺激によりMPDL22のアルカリフォスファターゼ活性、石灰化関連遺伝子(Runx2, etc)の発現上昇が認められた。また塩化カルプロニウム刺激によりマトリゲル培養中のヒト臍帯静脈血管内皮細胞(HUVEC)管腔形成の有意な促進が認められた。塩化カルプロニウムは、血管内皮細胞のムスカリン受容体を刺激することで局所の血流を改善することが知られているが、組織再生に重要な新生血管を形成する作用があるか否かを検討するため、ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVECs)を用いtube formation(管腔形成)の比較を行った。その結果10μg/ml塩化カルプルニウム刺激群において有意に管腔形成することが明らかとなった。また塩化カルプロニウム刺激により、血管新生において重要であるVEGFの発現を上昇させることが示された。以上の結果より組織再生において重要な血管新生作用が、塩化カルプロニウムに有する可能性が示唆された。次に歯周組織構成細胞である歯根膜細胞にムスカリン受容体が発現しているか否かRT-PCRにて検討をおこなった。その結果マウス歯根膜細胞株MPDL22においてムスカリン受容体のすべてのサブタイプがmRNAレベルで発現していることが明らかとなった。次に塩化カルプロニウムが歯周組織構成細胞の増殖、分化に及ぼす影響について調べた。MPDL22を塩化カルプロニウム存在、非存在下で培養を行ったが、細胞増殖能に明らかな影響は認められなかった。MPDL22を石灰化誘導培地(β-glycelophosphate, ascorbic acid含有10%FCS/α-MEM)のみ及び10μg/ml塩化カルプロニウム含有石灰化誘導培地にて培養し細胞分化誘導を行った。その結果、対照群と比較し塩化カルプロニウム刺激群において有意に骨関連遺伝子の発現が上昇し、アルカリフォスファターゼ活性の上昇が認められた。またアリザリン染色にて濃染した。以上の結果より塩化カルプロニウムはin vitroにおいて血管新生作用および歯根膜細胞の硬組織形成細胞への分化を促進する作用があることが明らかとなった。これは歯周組織の治癒過程において、組織の再生を促す可能性があることが示唆された。その結果10μg/ml塩化カルプルニウム刺激群において有意に管腔形成することが明らかとなり、組織再生において重要な血管新生作用が、塩化カルプロニウムに有する可能性が示唆された。これは歯周組織の治癒過程において、組織の再生を促す可能性があることが示唆される。本年度の実験結果より、塩化カルプロニウムはin vitroにおいて血管新生作用および歯根膜細胞が硬組織形成細胞への分化するのを促進する作用があることが明らかとなった。当初H24年度の実験計画において歯根膜内の血流量の比較を予定していたが、操作が煩雑であり安定した血流量を測定するには至っていない。しかしながら、HUVECsを用いた管腔形成の比較実験により、塩化カルプロニウム刺激により、管腔形成を促進することが明らかとなった。In vitroにおける結果であるが、塩化カルプロニウムは血管拡張するのみでなく、組織再生時に重要な血管新生を促進する可能性があるデータであり、今後in vivoにおいての検索を行う予定である。

また塩化カルプロニウムには歯根膜細胞に直接的に作用し硬組織形成細胞への分化を促進する作用があることが明らかとなった。これは組織の微小循環の改善により組織再生を推し進める作用に加え、歯周組織の治癒過程において歯根膜細胞の硬組織形成細胞への分化を促進し、歯周組織の再生を促す可能性が示唆され、おおむね順調に進展していると考えている。来年度の実験計画としてはH24年度にて塩化カルプロニウムがin vitroにて歯周組織再生を促進する可能性が示唆されたため、in vivoにおける実験を中心に行っていく予定である。申請時のH25年度の計画としては、ラット上顎左右側第一臼歯近心根口蓋側に3壁性骨欠損を作製し、塩化カルプロニウムの局所投与を行う。塩化カルプロニウム投与側、非投与側にわけ手術後7, 14, 21, 42日後ラット上顎骨をマイクロCTにて撮影、観察する。その後灌流固定し、上顎骨を摘出する。上顎骨はパラホルムアルデヒドにて固定後、EDTAを用いて脱灰し凍結切片を作製する。ヘマトキシリン-エオジン(HE)染色を施し、歯周組織の組織学的な観察を行い、組織再生の効果について解析する。また免疫組織化学染色にて炎症細胞の浸潤程度、von kossa染色にて再生骨量の検索を行いコントロール群と比較検討するものであり、次年度行っていく予定である。また歯槽骨の欠損の作製は煩雑であることから、以上の方法で安定した結果が得られない場合は、マウスの頭蓋骨に骨欠損を作製し、塩化カルプロニウムの局所投与を行い、治癒過程の観察を行う予定である。動物実験に関しては大阪大学歯学研究科等動物実験委員会の審査を経ることを厳守する。またin vitroにおいては、H24年度においては塩化カルプロニウムの刺激によりmRNAレベルで骨形成遺伝子の上昇が確認されたが、タンパクレベルにおいても上昇するか否か検索する予定である。また歯根膜細胞においてムスカリン受容体の発現が明らかとなったが、どの受容体に作用して効果を発揮しているのかを検索するため、ムスカリン受容体のinhibitorを用いて実験を行う予定である。今後の研究の推進方策に記載している通り、in vivoの実験を行うため、実験動物及び動物実験用器具の購入に使用する。またin vitroでの細胞培養に用いる試薬やプラスチック器具の購入に使用する。また得られた成果について学会での発表に研究費の使用を予定している。
バゾプレッシン産生細胞の複数支配に関する電顕免疫組織化学的研究

ラット視床下部室傍核のバゾプレッシン(VP)ニュ-ロンに対する種々のニュ-ロンの神経支配について、電顕免疫組織化学的手法を用いて追究した。始めに、包埋前PAP法と包埋後金コロイド法の組み合わせによる二重免疫染色法を用いて、カテコ-ルアミン(CA)の合成酵素であるド-パミン-β-水酸化酵素様陽性神経終末およびフェニルエタノ-ルアミンメチル基転移酵素様陽性神経終末の夫々が、VPの担体蛋白であるニュ-ロフィジンII(NPII)様陽性ニュ-ロンにシナプス様結合しているのを証明し、CAニュ-ロンのうちのアドレナリンまたはノルアドレナリンニュ-ロンによるVPニュ-ロンの神経支配を電顕免疫組織化学的に明らかにした。また、同様の方法を用いて、ニュ-ロペプチドY様陽性神経終末および心房性ナトリウム利尿ペプチド様陽性神経終末が夫々、NPII様陽性ニュ-ロンにシナプス様結合している事も明らかにした。ところで、包埋前PAP法と包埋後金コロイド法に用いられる試料は、加熱重合を必要とするエポキシ樹脂包埋試料であり、加熱による種々の抗原性の失活から、金コロイド法により検出できる抗原の種類は極めて少ない。そこで次に、低温重合が可能な樹脂であるロ-ウィクリルK4Mの包埋試料を用い、エポキシ樹脂による包埋試料で検出不可能な抗原の検出を試み、コリン性シナプス膜蛋白の一つであるシナプトフィジンが、下垂体後葉のVP性神経終末内微小胞に存在することを明らかにした。更に、抗原性の保持に関して最も優れていると思われる凍結超薄切片の金コロイド法への応用について検討し、種々の抗原の検出が可能であることを確認した。今後、ロ-ウィクリルK4Mの包埋の超薄切片および凍結超薄切片を用い、金コロイド法による多重電顕免疫染色法を応用して、個々のVPニュ-ロンに対する多種のニュ-ロンによる同時神経支配について追究していく。
金属ガラスの過冷却状態からの結晶化のその場電子顕微鏡観察

金属ガラスの昇温過程において生じる均一・不均一な変化を高分解能分析電子顕微鏡のその場観察と陽電子消滅による自由体積の変化を観察することで明らかにし、平衡相へ至るまでの変態のシークエンスを熱力学的・速度論的に明らかにすることが本研究の目的である。試料は傾角鋳造法で作成されたZr_<50>Cu_<40>Al_<10>金属ガラスを用いた。昇温速度40K/secで観測されたTgは約700Kである。この試料を473および673Kで等温保持したときの密度変化ならびに陽電子寿命変化はよい相関を示し、陽電子が自由体積近傍で消滅すること、また構造緩和に伴う自由体積の減少がその寿命に直接影響していることがわかった。またこの温度範囲では焼鈍温度が200Kも異なるにもかかわらずほぼ100sec後に自由体積の減少が起っている。これは内部摩擦法により測定されたこの温度領域における物質移動の活性化エネルギーが0.15eVと非常に低いことに対応している。一方、結晶化過程に関してはこのようにZr_<50>Cu_<40>Al_<10>金属ガラスの結晶化はスフェルライトと一般に呼ばれる球状の結晶相がCuを掃き出しながら成長することにより起こった。スフェルライトを構成する結晶相は斜方晶系(考えられる空間群:Pc2m,Pcm2_1,Pcmm)であるが、結晶化温度によってモフォロジーが大きく異なり、これは金属ガラス中の原子の易動度を反映しているものと思われる。さらに熱分析法によりガラス転位に要する活性化エネルギーを測定した。昇温速度を変えることによって求められた活性化エネルギーは5.22eVであり、これはガラス転移には数個の原子が同時に動くことが必要であることを示す。また恒温保持によるエンタルピー緩和量も測定した。緩和のキネティクスを示唆する拡張指数は0.5-0.6の間にあり、これは緩和過程に分布があることを示している。本年度は既存の電子顕微鏡(JEM-2000FX)にTVレートのカメラを付設し、その場観察を記録できる体制を整えた。またこの電子顕微鏡を用いて、その場観察実験を開始した。その成果の一部を2004年春の金属学会にて報告する。一方、大阪府立大学に存在する高分解能電子顕微鏡(JEM-2010)に温度制御装置を設置し、焦点ドリフトの低減に成功し、高分解能電子顕微鏡像を効率的に撮影でき、また、長時間のその場実験に耐える体制を整えた。さらに陽電子消滅によるフリーボリュームの測定体制を整えるためにガンマ線を検出できる半導体検出器を新たに設置した。以上の設備的更新を踏まえて、本年度は予備的試験としてこれまで報告のほとんどないTi-C系のアモルファス形成能を調べた。その結果、この系ではTiがCに10%程度固溶した領域で急冷法によりアモルファスが形成されることをまず明らかにし、次にその場観察実験により、この系での結晶化が約500_iCで起こることを見出し、さらにその反応が(1)数nmの粒状TiCの析出→(2)数100nmの大きさの2次再結晶粒の成長→(3)粗大粒の球状化という過程を経ることを示した。ここで2次再結晶は特定の<110>方位に向けて成長する。また、TiC 2次再結晶粒の成長速度を500-600_iCの温度範囲で測定し、アレニウスプロットすることにより成長が熱活性化過程によるものであること、そしてその活性化エネルギーが約130kJ/molであることを示した。本年度はZr-Cu-Al系ガラスの昇温中の緩和過程と結晶化過程をそれぞれ陽電子消滅法および透過電子顕微鏡で調べた。傾角鋳造法で作成されたZr_<50>Cu_<40>Al_<10>金属ガラスを673Kに等温保持し、陽電子寿命の変化を調べたところ密度が低下する時間域において陽電子寿命の減少が認められ、ガラス転移点以下で自由体積の減少していることが判明した。さらに同様の試料のドップラー拡がり実験結果はこの領域で原子配置の変化がないことを示唆し、自由体積の減少が原子の拡散等を伴わないものであることを明らかにした。一方、高温で焼鈍した試料に関しては陽電子寿命の減少に加えて原子配置の変化を示し、自由エネルギーの低下に伴い新しい結晶相が生成したことが強く示唆された。透過電子顕微鏡による結晶化過程の観察の結果、結晶は1000nm程度の大きさのスフェルライト(球状の結晶相の塊の総称をスフェルライトと呼ぶ)の成長によるものであることが明らかになった。このスフェルライトは半径方向に成長する斜方晶系に属する結晶から構成されることをつきとめた。この結晶相に関する過去の報告はなく、現時点で単位胞はa=0.892nm, b=0.550nm, c=1.06nmであり、ブラベー格子は単純格子であることを確認しているが、空間群の特定までには至っていない。また、このスフェルライトは半径方向に多数の積層欠陥を含みレッジ機構による成長を強く示唆する。さらにエネルギー分散型分光の結果、このスフェルライトの成長はCu原子の分配を伴うものであることが明らかになった。すなわち、スフェルライトの成長とともに掃き出されたCu原子はスフェルライト間に濃化し、別の結晶相を形成する。この結晶相はa=1.28nmのfcc格子に属し、τ3相として知られている平衡相ではないかと現在、考えている。

本年度はFe基およびZr基の金属ガラスに関して、その結晶化過程を透過電子顕微鏡(TEM)と解明するとともに緩和過程を陽電子消滅法で詳細に調べた。まず、Fe基に関してはまずFe-Nb-B系の金属ガラスの形成能に及ぼすSiの効果を調べるため、熱分析、X線回折(XRD)、透過電子顕微鏡等を用いて実験を行った。Siの添加により結晶化が三段階にわかれることが判明した。これらの変態に要する見掛け上の活性化エネルギーをキッシンジャープロットにより見積もったところ、第一、第二、第三ピークがそれぞれ約250,740,500kJ/molという値を得た。ここで第一ピークの活性化エネルギーが小さい理由は過冷却状態からの変態では粘性流動の存在により、第二、第三段階の固相反応と比較して、拡散に伴う活性化エネルギーが小さいためであると推論した。また、初晶の結晶構造はFe_<23>B_6相であることがXRD,TEMから判明した。しかし一方でTEMによるその場実験中に出現した個々の結晶粒から得られた制限視野回折パターンは0.67nmの面間隔に相当する4回対称性を有する一連の回折スポットを呈し、必ずしも既存のFe_<23>B_6相によって初晶が説明されるわけではないことを見出した。これはブラベー格子がfccであるFe_<23>B_6相において、結晶化初期の段階では規則化が進んでおらず本来禁制である反射が出たのか、あるいは異なった結晶相であるのか、今後の検討が必要とされる。また、Fe基のもう一つの系としてFe-Nd-B系の結晶化初期段階に現れる長周期構造に関して高分解能透過電子顕微鏡(HRTEM)法を用いて詳細な検討を行った。この系では当該研究者らの研究でDO_3構造を基本とする長周期構造が出現することが電子線回折からわかっていたが、具体的な逆位相境界(APB)の構造に関しては不明であった。今回、高角度傾斜の制限視野法を用いることにより、従来言われていた一次元長周期構造が実は1/4a<111>APBと1/2a<100>APBを有する二次元長周期構造に起因していることを示し、次にHRTEM法により、これらのAPBの存在を実空間で明らかにした。さらに高速フーリエ変換による位相抽出を試み、これらのAPBが結晶化の際に出現するスフェルライトの外側に多く存在することをつきとめ、この系ではamorphous→A_2→長周期構造を有するDO_3→DO_3という反応順列に従って結晶化が起こることを明らかにした。本年度は陽電子消滅法を用いた構造緩和過程を詳細に検討することを最重点課題に置き、次のことを明らかにした。すなわち、Zr_<50>Cu_<40>Al_<10>はガラス転移温度が706K、結晶化温度が792Kであり、673Kにおける等温保持により密度が0.4%ほど上昇することがすでに横山らにより見出されているが、同様の試料の陽電子消滅によるlife timeは約12%減少し、密度変化が自由体積の減少によるものであることを直接的に明らかにした。また陽電子が消滅するサイト(自由体積近傍)の化学的環境を詳細に調べるためCDBスペクトルを測定した。構造緩和過程ではスペクトルに有意な変化は見られず、陽電子が消滅するサイト付近の化学的環境は自由体積の変化が起こっておらず、単純な体積の減少であることがわかった。現実には自由体積にもその大きさに分布があるはずであり、陽電子の消滅スペクトルをラプラス変換することによりライフタイムの分布そのものを観察することを試行的に行い、一定の分布があることを確認した。
川崎病におけるエクソソームmicroRNAの研究：新たな診断法、治療に向けて

本研究は、ヒト川崎病に類似した血管炎像を呈するCandia albicans water soluble-induced (CAWS)血管炎モデルマウスモデル、およびヒト川崎病患者の血清や尿を使用し、川崎病血管炎発生における炎症、免疫応答、その過程でのエクソソームの役割を明らかにすることにより、ヒト川崎病の病態解明、および治療手段を確立することである。1昨年度に引き続き、研究分担者の深澤が以前作製した、CAWS血管炎モデルマウスモデルおよびコントロール群の心臓のパラフィン固定標本を各10匹づつ使用し、エクソソーム関連蛋白の同定を試みた。また、各種炎症細胞の動態について、形態学解析を施行した。さらに、エクソソーム、DNAの同定のため、in situ hybridizationも施行した。3昨年度からは、これらの動物実験に加えて、新たにヒト川崎病患者5名の冠動脈標本を入手し、組織学的、免疫動態の解析に関する実験も並行して開始した。特にmacrophage phenotypeを免疫染色にて同定することにより、川崎病における血管炎発症メカニズムの解明を試みた。対照群としては成人の動脈硬化標本を使用した。M1のマーカーとしては、CD86, SOCS3を、M2のマーカーとしてはCD163, MRC1を使用した。その結果、川崎病ではM1 phenotypeが、成人動脈硬化病変ではM2 phenotypeが有意であることが判明した。1CAWS投与によりマウス血管炎を作成したが、個体ごとに血管炎の程度にばらつきがあり、CAWS作成を繰り返す必要があった。2昨年同様、マウス血管組織から、エクソソームを抽出し、その後の解析を試みたが、miRNAが微量であること、またmiRNAの変性が強く、再現性の高い結果が得られなかった。3ヒト川崎病患者の冠動脈標本に対し、macrophage phenotype M1/M2の免疫染色を行うにあたり、複数の抗体を使用してpreliminary studyを数回施行した。いずれの抗体も希釈倍率や前処理の条件が異なるため、適切な抗体、条件を確立するためにかなりの時間を要した。1追加でCAWSモデルマウスを作成し、組織、尿からmiRNAを抽出し、血清と同様にmiRNAの網羅的解析を行う。血清中のエクソソーム分画とそれ以外、心組織、尿を比較し、血管炎発症に関連するmiRNAを同定する。2同定されたmiRNAについて、CAWSモデルマウス惹起後の組織変化を評価する。3ヒト川崎病患者の冠動脈標本におけるmacrophage phenotypeと免疫応答に関する免疫組織学的解析を、患者数をさらに増やして行う。1分担研究者の深澤が以前作成したCandida albicans water soluble -induced (CAWS)血管炎マウスモデル、およびコントロール群の心臓のパラフィン固定標本を各5匹分づつ使用し、各種炎症細胞(リンパ球、好中球、組織球)の動態について、形態学的解析を施行した。2HE染色にて、リンパ球、好中球などの炎症細胞とともに多数の組織球浸潤も観察された。さらに、CD68免疫染色で、これらの組織球浸潤程度を評価した。また、エクソソームに関連する蛋白の発現を同定するため、各種免疫染色を試みた。3以前作成した、CAWSモデルマウスの保存血清から、超遠沈を行い、エクソソーム分画とそれ以外の分画を行った。エクソソームは、電顕にて形態的な同定を行った。4マウス血清中のエクソソーム分画とそれ以外の分画からそれぞれmiRNAの抽出を試みた。各マウス1匹ごとに、抽出しようとしたが、十分な量のmiRNAが得られなかった。そのため、5匹を1つの検体として、コントロール群と血管炎活動期群からmiRNA抽出を行い、miRNA Ready-to-Use PCR,Mouse&Rat panel I+II(Exiqon)を用いてReal time-PCRに基づくmiRNAの網羅的解析を試みた。1免疫染色における抗体の濃度、設定条件など、様々な条件を色々試したが、納得できる結果が得られず、かなりの時間を要した。2マウス血清中のエクソソーム由来のmiRNAは極めて微量なため、検出に苦労した。Agilent 2100Bioanalyzerを用いて、品質検定を行ったが、評価に値する質、量が得られず、同実験を数回繰り返した1CAWS投与によりマウス血管炎作成を施行したが、個体ごとに病変程度にかなりばらつきがあり、CAWSを再度作成し、予備実験から血管炎モデル作成を行う必要が生じた。2in situ hybridizationを行ったが、予想通りの結果がでず、条件を変えるなど、かなりの時間を要した。3血清からのエクソソーム分画とそれ以外の分画からのmiRNAが微量で品質検定に手間取り、網羅的解析を行う予定であった心組織、尿からのmiRNAの検出までに至らなかった。

3昨年度からは、これらの動物実験に加えて、新たにヒト川崎病患者5名の冠動脈標本を入手し、組織学的、免疫動態の解析に関する実験も並行して開始した。特にmacrophage phenotypeを免疫染色にて同定することにより、川崎病における血管炎発症メカニズムの解明を試みた。対照群としては成人の動脈硬化標本を使用した。M1のマーカーとしては、CD86, SOCS3を、M2のマーカーとしてはCD163, MRC1を使用した。その結果、川崎病ではM1 phenotypeが、成人動脈硬化病変ではM2 phenotypeが有意であることが判明した。1CAWS投与によりマウス血管炎を作成したが、個体ごとに血管炎の程度にばらつきがあり、CAWS作成を繰り返す必要があった。2昨年同様、マウス血管組織から、エクソソームを抽出し、その後の解析を試みたが、miRNAが微量であること、またmiRNAの変性が強く、再現性の高い結果が得られなかった。3ヒト川崎病患者の冠動脈標本に対し、macrophage phenotype M1/M2の免疫染色を行うにあたり、複数の抗体を使用してpreliminary studyを数回施行した。いずれの抗体も希釈倍率や前処理の条件が異なるため、適切な抗体、条件を確立するためにかなりの時間を要した。1新たにCAWSモデルマウスを作製し、組織、尿からmiRNAを抽出し、血清と同様にmiRNAの網羅的解析を行う。血清中のエクソソーム分画とそれ以外、心組織、尿を比較し、血管炎発症に関わるmiRNAの同定を行う。2同定されたmiRNAについて、CAWSモデルマウス惹起後の変化の確認を行う。3同定されたmiRNAの心組織の局在をみるため、in situ hybridizationを行う1追加でCAWSモデルマウスを作製し、組織、尿からmiRNAを抽出し、血清と同様にmiRNAの網羅的解析を行う。3他施設からの協力を得て、ヒト川崎病患者の冠動脈生検検体の症例を増やし、マクロファージなどの免疫系細胞の動態を解明すべく、免疫染色を中心とした組織学的解析を継続して行う。1追加でCAWSモデルマウスを作成し、組織、尿からmiRNAを抽出し、血清と同様にmiRNAの網羅的解析を行う。血清中のエクソソーム分画とそれ以外、心組織、尿を比較し、血管炎発症に関連するmiRNAを同定する。2同定されたmiRNAについて、CAWSモデルマウス惹起後の組織変化を評価する。3ヒト川崎病患者の冠動脈標本におけるmacrophage phenotypeと免疫応答に関する免疫組織学的解析を、患者数をさらに増やして行う。
看護基礎教育における疫学の教育目標の具体化と教育方法の改善・開発に関する研究

地域住民ないし入院患者を出発点とした健康状態の推移に着目し、各段階の看護と疫学の内容と役割・機能について独自なモデルを考案した。また、クリッカー活用の考察、研究代表者の疫学授業でのミニッツペーパーを通じた学生の習得困難内容の分析、OPPAを活用した授業改善を行った。加えて、ルーブリックを疫学授業で試行的に作成した。さらに、各種の学会参加から、学生の多様な心理的特質の知見を得て授業に反映させるとともに、看護分野での疫学活用の限界も目立った。欧州公衆衛生学会では、Global Health、Advocacy、健康格差等が重視されていることは、我が国の研究の今後を考える上で意義深かった。疫学の教育目標の大きな枠組みとして看護過程をおき、「保健師に求められる実践能力と卒業時の到達目標と到達度」の卒業時の到達目標から疫学と関連が深い小項目を抽出し、既に作成した「疫学のミニマム・エッセンシャルズ」との対応を整理した。特に、応用領域の設定では、公衆衛生看護に限定せず、量的研究の対象である臨床看護も視野に入れた整理を行った。また、アクティブ・ラーニングの内外の資料の広範な収集、関係学会への参加、主要な研究者への訪問等を通じて、わが国での取り上げの経緯や中央教育審議会等による定義、学習法としての特性等についてまとめた。この過程で、従来の教育実践で活用されてきた工夫(文殊カード、大福帳等)、イメージマップ等による学生の理解の可視化等とともに、新しい動向としてルーブリック(rubric)の活用、インストラクショナルデザインの応用等に関する知見を収集した。また、学生に十分な学修時間を確保させる上で、4年間を通じた大学・学部・学科における有機的なカリキュラム構成を再検討することの重要性を認識した。一方、形成的評価として、クリッカーを用いて得られた学生の理解度を踏まえて授業の進行を調整したことに対する学生の反応を探り、文献等で報告されているクリッカーの使用方法の情報を収集整理し、事前的・形成的・総括的評価における活用のあり方を考察した。さらに、疫学学習の困難性をもたらす要因の抽出のための研究では、研究代表者が行った疫学授業において、毎回の授業終了時にミニッツペーパーの提出を求め、寄せられた授業に対する意見(肯定的、否定的)や内容の不明点をまとめ、質問等への回答を含む「看護疫学ニュース」を作成して次回の授業の頭で配布し、授業の補完に活用した。これを通じて、学生が習得困難を感じる学習内容を全ての授業範囲にわたり把握でき、困難性をもたらす要因について分析した。疫学の教育目標の具体化に関して、新たにルーブリックの有用性に着目し、研究代表者が担当する疫学授業の進行に伴い作成を試行するとともに、昨年度に続き臨床看護における看護過程と疫学との関連に関する整理を深めた。加えて、地域住民を出発点とする場合(母集団は健康な集団)と入院患者を出発点とする場合(母集団は非健康な集団)における健康状態の推移からみた疫学の役割について独自にモデル化し、看護における疫学を人の健康像の変化から統合して位置づけたことは、看護における疫学研究の枠組みの明確化に寄与する成果だと考えられる。また、アクティブ・ラーニングに関する最新知見を得るための内外の学会等への参加を通じて、新しい授業技法である反転授業、初等中等教育におけるOPPAが有望な方法として注目された。このうちOPPAについて未だ高等教育における実践事例に乏しい所、担当する2大学の疫学授業を通じて活用し、その成果を現在まとめている。そして、学生のeラーニングへの継続的な関与を内発的に促すための情報検索・学習者用リンク・確認クイズ・掲示板での意見交換・eポートフォリオを複合的に組み合わせた効果的な仕掛けづくりの検討に取り組んだ。一方、通常の授業では改善が難しい強固な考え方(誤概念)への対応が教育研究のテーマとしてあることを知り、統計学との関連も深い疫学においても苦手意識に起因する同様の事象に着目する必要性を認めた。さらに、学生が考えるよい授業の構成要素として、学生が社会問題や現実との関連を重視していることを踏まえた演習問題の作成を行うとともに、既存尺度の積極的な活用、横断研究における母集団からの無作為抽出の重要性、メタアナリシスの妥当な位置づけ、同一患者を対象とした場合の複数の看護師による看護診断の一致性について既存研究があることに基づくスクリーニングの意味づけを、疫学の教育内容に盛り込んだ。3年間の研究を通じて、地域住民(健康)ないし入院患者(疾病)の各々を出発点とした場合の健康状態の推移に着目し、各段階における看護と疫学の内容と役割・機能について独自なモデルを考案したが、看護における疫学研究の枠組みの明確化に高く寄与する成果だと考えられる。Active Learningに関しては、初年度は各評価段階におけるクリッカー活用について考察した。また、OPPA、Instructional Design、反転授業等が注目された。そして、研究代表者の疫学授業でミニッツペーパーの提出を求め、学生が習得困難な学習内容を分析した。次年度は、OPPAが未だ高等教育での実践事例に乏しい所、担当授業で活用し授業改善へ結びつけた。さらに、Rubricの有用性に着目し、疫学授業の進行に伴い試行的に作成した。3年間を通じて関連学会に積極的に参加したが、心理学的知見として、情緒的支援が生徒の構造方略により理解困難性を増大させかねないこと、グループ学習で自尊感情の向上が期待できること、女子は男性に比べて内容分離型の動機が高く対人関係的な要素が大きいこと、興味対象関連の知識のみが急速に増加するという知見等が意義深かった。

一方、看護研究においては、クリティカルケア分野において介入研究でランダム化の無視、実態調査、後ろ向き、prospective、prospective等の意味の不明確さが目立ったこと、多重比較の発想に乏しいこと、標本の大きさの設計等に限界が指摘された。これに対し、慢性期看護では横断研究の枠組みが優位であり、交絡の影響への言及は殆ど見当たらなかった。なお、最終年度の欧州公衆衛生学会への参加から、Global Health、Advocacy、健康格差等が特に我が国より重視されていることは、今後の方向性を考える上で意義深かった。引き続き、これら研究内容の詳細な検討を継続したい。地域住民ないし入院患者を出発点とした健康状態の推移に着目し、各段階の看護と疫学の内容と役割・機能について独自なモデルを考案した。また、クリッカー活用の考察、研究代表者の疫学授業でのミニッツペーパーを通じた学生の習得困難内容の分析、OPPAを活用した授業改善を行った。加えて、ルーブリックを疫学授業で試行的に作成した。さらに、各種の学会参加から、学生の多様な心理的特質の知見を得て授業に反映させるとともに、看護分野での疫学活用の限界も目立った。欧州公衆衛生学会では、Global Health、Advocacy、健康格差等が重視されていることは、我が国の研究の今後を考える上で意義深かった。(1)疫学の教育目標の具体化は、昨年度に続き臨床看護における看護過程と疫学との関連に関する整理を深められた。加えて、公衆衛生看護および臨床看護を共通の枠組みで捉えるため健康状態の推移に着目し、この変化に疫学の役割を関連づける観点は、学生に疫学の内容をより理解しやすくする上で、効果的なモデルということができる。そして、学生の理解には馴染み深い事例を利用することが重要であることから、看護職として直面する問題に関わる疫学研究を授業内容に盛り込んだ。さらに、ルーブリックづくりを試行した。(2)関連する適切な学会等への参加を通じて、アクティブ・ラーニングに関し、知識構成型ジグゾー法、反転授業、OPPAに注目した。そして、OPPAについては担当する疫学授業において、毎回の授業で活用し、その成果を整理しつつある。また、学生のeラーニングへの継続的な関与を内発的に促すための効果的なサイトづくりの検討を始めた。(3)先に述べたOPPAへの記入内容から、学生が理解困難とする授業内容を整理し、説明ないし演習の実施により適宜フィードバックしつつ、翌年度の授業内容の改善へと結びつけることにした。(4)疫学授業におけるクリッカーの組織的な活用については、初年度の研究において、一定の成果を得ており、本年度は新たな検討は行わなかった。公衆衛生看護学収集したOPPAの情報について、学生の理解の深化や授業効果の評価、授業設計上の課題の抽出等を行う。また、反転授業のための教材開発を、可能な限り進める。誤概念について、学生自身による学習内容の可視化、間違った回答についてその原因を考えさせるため、学生が困難を抱える(誤答しやすい)内容について適切に演習問題を作成し、何らかの手段でその原因に気づく工夫を考案し、正しい理解へ導くことを着実に行う教育方法を検討することにしたい。
外因系血液凝固系の開始反応機構

過去3年間にわたる研究成果は以下の通りである。なお、成果報告の重複をさけるため、平成2年度については、当該年度のまとめの用紙に記した。(1)IX因子の第2EGF様ドメインの機能IX因子Fukuoka(血友病B)は、正常に比べ抗原量64%、酵素活性3%の先天性機能異常症である。IX因子FukuokaのXIa因子及びVIIa因子、RVVーXによる断片化様式は、いずれも正常IX因子と同じであった。従って、活性低下の原因は、活性化の際に切断されるアミノ酸残基の置換ではなく、別の位置にあると考え、IX因子Fukuokaの構造解析を行なった。その結果、IX因子Fukuokaの構造異常は、第2EGF様ドメイン内のAsnー92→Hisの置換にあることが判明した。次に、IXa因子Fukuokaのエステル基質に対する水解活性を正常分子と比較し、さらに精製X因子とVIII因子を用いた再構成系実験を組み、正常と異常IXa因子のX因子活性化能を調べた。異常IXa因子のエステル基質に対する水解活性は、正常分子と殆ど同じであり、従ってIXa因子Fukuokaの活性部位は正常と同じ様に形成されていることが判った。さらにX因子活性化の時間曲線及びVIII因子の濃度依存性を、それぞれ正常と異常IXa因子で比較した結果、IXa因子FukuokaのX因子活性化能は、正常に比べ顕著に低下していることが明らかとなった。そこで、異常IXa因子のX因子に対するKm値とVmax値を求めた所、IXa因子FukuokaのKm値は正常分子の約1/10でX因子に対する親和性は低下していなかったが、Vmax値は正常のそれの約1/10であった。以上の如く、IX因子Fukuokaの第2EGF様ドメイン内でのAsnー92→His置換は、エステラ-ゼ活性に影響を及ぼさないので、この異常分子の活性低下の原因は、Asnー92→Hisの置換により、VIII因子/X因子との相互作用が低下したためと考えられる。従って、IX因子の第2EGF様ドメインは、VIII因子ないしX因子との相互作用部位である可能性が強く示唆される。(2)VIIa因子の高感度活性測定法の開発VIIa因子はCa^<2+>及びリン脂質存在下で、組織因子(TF)と分子複合体を形成し、天然基質であるIX因子ないしX因子を活性化する。分子レベルでのVIIa因子とTFの相互作用については、まだ殆ど解明されてないが、その理由のひとつは、VIIaーTF複合体の活性を直接測定できる適当な合成基質がないからである。そこで、我々はZーArgーpーnitrob enzyl ester(ONb)基質の水解を高感で定量する方法を検討するとともに、新しいペプチド基質の開発を試みた。また、この測定法を用いて、VII因子のエステラ-ゼ活性に及ぼすTFの影響を調べた。VIIa因子の活性測定法は、未分解の基質(ZーArgーONd)と水解によって生成するpーnitrobenzyl alcoholを、オ-トサンプラ-と直結した0.1%TFAー45% CH_3CN(isocratic)系のCosmosi 3C18(2.6×50mm)カラムを用いた逆相HPLCにより分離し、基質の水解量は280nmでのpーnitro benzyl alcoholのpeak heightから定量した。先ず、VIIのエステラ-ゼ活性測定の反応条件を調べた結果、VIIa因子によるこれら基質の水解は、TF濃度依存的に促進されることが明らかとなった。この結果は、かつてNemersonらがVIIa因子のエステル基質水解は、TFの存在下で影響されないという報告と異なった。また、このTFによるVIIa因子のエステラ-ゼ活性増強効果は、ウシ脳から精製したTF及びヒトのreTFでも再現できた。IXa因子及びXa因子も、これらエステル基質に対して水解活性を示すが、TFによる活性の増強効果はなかった。従って、TFによるエステラ-ゼ活性の増強効果は、VIIa因子特有のものと考えられた。以上の結果は、TFがVIIaのセリンプロテア-ゼ領域の結合する可能性を示唆する。一方、VIIaのTF結合部位を明らかにする目的で、VIIaをαーキモトリプシン処理することにより、γーカルボキシグルタミン酸(γーGla)ドメインを除去した誘導体、及びVIIa由来のγーGlaドメイン含有EGF断片を調製した。これらの誘導体を用いて拮抗実験によりVIIaとTFとの相互作用部位を検索した結果、γーGla含有EGF領域にTFとの結合部位のあることが明らかとなった。目下、さらに各種のVIIa由来断片を調製しつつ、VIIaーTF結合部位の同定を行っている。

次に、IXa因子Fukuokaのエステル基質に対する水解活性を正常分子と比較し、さらに精製X因子とVIII因子を用いた再構成系実験を組み、正常と異常IXa因子のX因子活性化能を調べた。異常IXa因子のエステル基質に対する水解活性は、正常分子と殆ど同じであり、従ってIXa因子Fukuokaの活性部位は正常と同じ様に形成されていることが判った。さらにX因子活性化の時間曲線及びVIII因子の濃度依存性を、それぞれ正常と異常IXa因子で比較した結果、IXa因子FukuokaのX因子活性化能は、正常に比べ顕著に低下していることが明らかとなった。そこで、異常IXa因子のX因子に対するKm値とVmax値を求めた所、IXa因子FukuokaのKm値は正常分子の約1/10でX因子に対する親和性は低下していなかったが、Vmax値は正常のそれの約1/10であった。以上の如く、IX因子Fukuokaの第2EGF様ドメイン内でのAsnー92→His置換は、エステラ-ゼ活性に影響を及ぼさないので、この異常分子の活性低下の原因は、Asnー92→Hisの置換により、VIII因子/X因子との相互作用が低下したためと考えられる。従って、IX因子の第2EGF様ドメインは、VIII因子ないしX因子との相互作用部位である可能性が強く示唆される。(2)VIIa因子の高感度活性測定法の開発VIIa因子はCa^<2+>及びリン脂質存在下で、組織因子(TF)と分子複合体を形成し、天然基質であるIX因子ないしX因子を活性化する。分子レベルでのVIIa因子とTFの相互作用については、まだ殆ど解明されてないが、その理由のひとつは、VIIaーTF複合体の活性を直接測定できる適当な合成基質がないからである。そこで、我々はZーArgーpーnitrob enzyl ester(ONb)基質の水解を高感で定量する方法を検討するとともに、新しいペプチド基質の開発を試みた。また、この測定法を用いて、VII因子のエステラ-ゼ活性に及ぼすTFの影響を調べた。VIIa因子の活性測定法は、未分解の基質(ZーArgーONd)と水解によって生成するpーnitrobenzyl alcoholを、オ-トサンプラ-と直結した0.1%TFAー45% CH_3CN(isocratic)系のCosmosi 3C18(2.6×50mm)カラムを用いた逆相HPLCにより分離し、基質の水解量は280nmでのpーnitro benzyl alcoholのpeak heightから定量した。先ず、VIIのエステラ-ゼ活性測定の反応条件を調べた結果、VIIa因子によるこれら基質の水解は、TF濃度依存的に促進されることが明らかとなった。この結果は、かつてNemersonらがVIIa因子のエステル基質水解は、TFの存在下で影響されないという報告と異なった。また、このTFによるVIIa因子のエステラ-ゼ活性増強効果は、ウシ脳から精製したTF及びヒトのreTFでも再現できた。IXa因子及びXa因子も、これらエステル基質に対して水解活性を示すが、TFによる活性の増強効果はなかった。従って、TFによるエステラ-ゼ活性の増強効果は、VIIa因子特有のものと考えられた。以上の結果は、TFがVIIaのセリンプロテア-ゼ領域の結合する可能性を示唆する。
乳管ネットワークを利用した低侵襲乳癌治療法の開発と評価

切除せずに治す、乳癌に対する新しい低侵襲治療法としての乳管内抗癌剤注入治療の、抗腫瘍効果の機序解析と、新規乳癌治療薬の乳管内治療効果を評価した。乳管内投与した抗癌剤Doxilは乳管外へも浸透し、早期浸潤性乳癌の抗腫瘍効果も期待できた。また、乳管内投与したDoxilはリンパ流にも入ることがわかり、リンパ管内浸潤腫瘍の治療も期待できた。さらに、新規抗癌剤Abraxaneの乳管内治療による乳癌治療効果と乳癌発生予防効果が認められた。この乳腺の解剖学的特徴である乳頭から続く乳管ネットワークを利用し,乳癌およびその発生母地である乳管上皮細胞へと抗腫薬剤を到達させる新しい発想に基づいた低侵襲治療法の治療効果とその効果の発現機序解析を研究の目的とした。乳管内にDoxi1または5-FUを注入すると,乳癌治療効果および予防効果が見られた。これら抗ガン剤注入後の経時的な乳腺組織の変化を病理組織で調べたところ,Doxilでは,終末乳管に炎症があり小葉の再生が認められなかった。5FUでは炎症は軽微にしか認めず,終末小葉構造は保たれていた。抗ガン剤を使った早期の乳癌局所療法が,乳房の形態を保ちながら施行できる可能性があり,臨床応用の可能性が高くなった。Doxil注入後にもし小葉の上皮再生が起こらないとすると,Doxilの乳管内治療により,乳癌high Risk patientsの乳癌発生予防ができる可能性がある。前年度までに行った動物実験で乳癌に対するDoxilの乳管内治療効果が認められた。20年度は1)乳管内投与した抗癌剤のリンパ管及びリンパ節内への薬剤集積を調べ、リンパ性転移に対する治療への応用を検討した。また2)Doxil以外の新規抗腫瘍薬剤の乳管内治療による抗腫瘍効果の検討を行った。1)マウスにある片側5個の乳頭より、それぞれの乳管内注入したICG試薬(緑色)を肉眼的および赤外線観察カメラシステム(PDE)にて観察し、リンパ管の経路、および所属リンパ節(センチネルリンパ節)を同定した。(ICGに赤外線を当てると蛍光(赤外線)を発しリンパ流の流れが同定できる)Doxilを乳管内投与し、一定時間後にセンチネルリンパ節を摘出し、リンパ節内Doxil濃度を測定すると、反対側のリンパ節内濃度と比較し、Doxilのリンパ節内集積が有意に上昇していた。即ち乳管内投与した抗癌剤は乳癌に対する抗腫瘍効果を発揮すると共にリンパ流にも乗ってリンパ管から所属リンパ節へと抗癌剤が移動する事がわかり、現在乳房温存術後に標準治療として施行されているリンパ管内に遺残している可能性のある乳癌細胞に対する放射線治療に代わる、新たな治療法となりうる可能性を示した。2)タキサン系薬剤に、ナノ粒子アルブミンを接着させた薬剤Abraxaneの乳管内治療における有効投与量を自発乳癌マウスを用いた乳癌治療実験で調べた。Abraxaneの静脈内投与と比較し、Abraxaneの乳管内治療は有意に高い乳癌治療効果を認めた。局所滞在性の高い薬剤による乳管内乳癌治療の有用性を示した。
セーフガード制度の妥当基盤-国際経済法秩序における自由化概念の現代的意味

3年目の本年は、主に2つの研究課題を設定し、それぞれ以下のような成果をえた。まず、GATT体制下のセーフガード制度の理論的な把握のために不可欠である一般国際法上の事情変更原則について研究し、以下の論証を行った。(1)同原則の法的根拠をめぐって、いまなお実行上及び学説上多大な見解の相違があるということ、(2)しかし、同原則に関する実行及び学説の歴史的な検討、また国際法委員会における法典化作業の検討によれば、同原則は古くから、そしていまなお、国内契約法上の事情変更原則と同様に合意当事国(者)の合理的な期待の実現を目的とした法原則として理解されるということ、(3)この点、同原則は2国間の契約的関係の総体としての性格を有していたGATT体制においても適用可能な法原則であったと考えられ、GATT体制下のセーフガード制度は同原則の特別法に相当する制度として理解されるということ。次に、本研究の主題であるGATT/WTO体制下のセーフガード制度の歴史的な展開と意義について研究し、以下のような理論枠組みを構築した。(1)2国間通商条約によって規律された19世紀及び20世紀の国際自由貿易秩序においては、事情の予見されなかった発展による国内産業への損害は事情変更原則の適用を通じた条約の終了により対処されていたということ、(2)GATT体制下においても国際自由貿易秩序は依然として2国間の契約的関係の総体としての性格を有し、事情の予見されなかった発展による国内産業への損害の救済について規律したGATT19条は事情変更原則の特別法としての性格を有していたということ、(3)GATT体制からWTO体制への移行にともない国際自由貿易秩序は自由貿易の実現を目的とした公法的秩序としての性格を色濃くし、セーフガード制度もセーフガード協定の成立にともない経済効率性の増大を目的とした実体的な権利規定へと変容したということ。今後前者の成果を研究論文にて発表し、後者の成果を博士論文にまとめる予定である。1年目の本年は、特に一般セーフガード制度の制度趣旨に関する理論研究及びWTO紛争解決手続における同制度の解釈実行の分析・評価に力を注いだ。具体的には、以下の3つの研究課題を設定し、以下のような成果を得た。まず第1に、セーフガード制度の存立の背景である国際自由貿易体制そのものの国際法規範としての規制原理について、特にGATT体制からWTO体制への移行にともなう規律構造の変容の意義の解明を中心として、動態的な視点から分析した。その結果、GATT体制はその脆弱な規律構造から「共存の国際法」あるいは「契約法パラダイム」によって理解されるべき国際法秩序であったのに対して、WTO体制は「協力の国際法」あるいは「刑事法パラダイム」によって理解されるべき国際法秩序へと変容したことが導出された。第2に、セーフガード制度の制度趣旨について、上記国際自由貿易体制の規制原理の理解をモチーフとして、特にGATT19条及びセーフガード協定の規定構造とその成立の歴史的文脈の相違に着目して、実証的に分析した。その結果、GATT19条セーフガード制度が事情変更原則という国内契約法上の原則のアナロジーによって理解されるべき制度であったのに対して、セーフガード協定に基づく新たなセーフガード制度は経済効率性の概念に依拠した第1次規範へと変容したことが導出された。そして第3に、セーフガード制度の制度趣旨に関する上記研究の成果をもとに、WTO体制成立以来提出されたそれぞれ8件及び6件に及ぶパネル報告と上級委員会報告の内容及び意義について分析・評価した。その結果、それらパネル報告及び上級委員会報告にみられる極めて厳格な解釈実行は、セーフガード制度の制度趣旨の変容の必然的な帰結であり、実定法規の規定内容及びその制度趣旨に忠実な解釈実行として肯定的に評価されるべきことが導出された。2年目の本年は、特に3つの課題について研究し、それぞれ以下のような成果を得た。第1に、近年世界的に急増しているFTAにおけるセーフガード制度について、とりわけGATT/WTOセーフガード制度との比較という観点から実証的な比較研究を行った。その結果、GATT/WTOセーフガード制度とは異なるFTAのセーフガード制度の独自の存立基盤、規定構造、及び中心的機能が明らかとなり、とりわけ両制度におけるリバランシング措置の位置づけの相違等に関する検証を通じて、GATT/WTOセーフガード制度の意義の理解についても重要なフィード・バックが得られた。第2に、「GATT19条セーフガード制度は事情変更原則という一般国際上の原則の個別具体的な発現である」という命題の論証の前提として、一般国際法としての事情変更原則について、その実行、学説、法典化作業、及び解釈実行を研究した。その結果、事情変更原則とはそもそも条約締結国の合理的期待の保護を目的とした条約解釈原則であったこと、それが法典化作業において「平和的変更」という理論的な妥当性の疑わしい国際公共政策を目的とした条約終了原則として制定法化されたこと、それゆえその後の裁判実践において同原則が形骸化されてきた一方、近年柔軟な解釈態様による原初的な制度目的の実現の試みとみられる解釈実行が表れてきたことが導出された。最後に、「国際自由貿易体制の『公法秩序化』にともなう事情変更原則としてのGATT19条セーフガード制度の妥当基盤の喪失」という命題に関連して、近年現代国際法の理論的かつ実践的問題として注目を集める「国際法のフラグメンテーション」について研究した。

その結果、「契約法パラダイム」ともいうべき伝統的な国際法の文脈において醸成されてきた条約法(解釈規則や「重大な違反」等)が国際法の「公法秩序化」にともないその妥当性を限定される傾向にあること、本研究における上記の命題がその一事例として位置づけられることが導出された。3年目の本年は、主に2つの研究課題を設定し、それぞれ以下のような成果をえた。まず、GATT体制下のセーフガード制度の理論的な把握のために不可欠である一般国際法上の事情変更原則について研究し、以下の論証を行った。(1)同原則の法的根拠をめぐって、いまなお実行上及び学説上多大な見解の相違があるということ、(2)しかし、同原則に関する実行及び学説の歴史的な検討、また国際法委員会における法典化作業の検討によれば、同原則は古くから、そしていまなお、国内契約法上の事情変更原則と同様に合意当事国(者)の合理的な期待の実現を目的とした法原則として理解されるということ、(3)この点、同原則は2国間の契約的関係の総体としての性格を有していたGATT体制においても適用可能な法原則であったと考えられ、GATT体制下のセーフガード制度は同原則の特別法に相当する制度として理解されるということ。次に、本研究の主題であるGATT/WTO体制下のセーフガード制度の歴史的な展開と意義について研究し、以下のような理論枠組みを構築した。(1)2国間通商条約によって規律された19世紀及び20世紀の国際自由貿易秩序においては、事情の予見されなかった発展による国内産業への損害は事情変更原則の適用を通じた条約の終了により対処されていたということ、(2)GATT体制下においても国際自由貿易秩序は依然として2国間の契約的関係の総体としての性格を有し、事情の予見されなかった発展による国内産業への損害の救済について規律したGATT19条は事情変更原則の特別法としての性格を有していたということ、(3)GATT体制からWTO体制への移行にともない国際自由貿易秩序は自由貿易の実現を目的とした公法的秩序としての性格を色濃くし、セーフガード制度もセーフガード協定の成立にともない経済効率性の増大を目的とした実体的な権利規定へと変容したということ。今後前者の成果を研究論文にて発表し、後者の成果を博士論文にまとめる予定である。