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ジルコノセン錯体を求核種とする新反応の開発

求核試薬としての反応活性の低いジルコノセン錯体を選択的炭素-炭素結合形成反応に利用すべく,各種触媒を用いて特色ある反応を見出した.特に,各種複素環化合物への反応を行い生理活性が期待される複素環誘導体の合成を温和な条件で達成し,炭素置換基導入における位置選択性に関する反応溶媒の影響を明らかにした.また光学活性配位子を用いた触媒反応により,ジルコノセン錯体も有効な不斉反応における求核試薬となることを明らかにした.求核試薬としての反応活性の低いジルコノセン錯体を選択的炭素-炭素結合形成反応に利用すべく,各種触媒を用いて特色ある反応を見出した.特に,各種複素環化合物への反応を行い生理活性が期待される複素環誘導体の合成を温和な条件で達成し,炭素置換基導入における位置選択性に関する反応溶媒の影響を明らかにした.また光学活性配位子を用いた触媒反応により,ジルコノセン錯体も有効な不斉反応における求核試薬となることを明らかにした.有機化学分野において基本的かつ非常に重要な炭素-炭素結合形成反応の新規反応の開発を目的として、求核性の乏しいジルコノセン錯体を求核種として利用する触媒反応の検討を行ってきている。特に、申請者が明らかにしてきている遷移金属触媒および不斉配位子を選択することによるエナンチオ選択的炭素-炭素結合形成反応は、有機ジルコノセン錯体の求核試薬としての有用性を示す一例である。22年度においては1.有機ジルコノセン錯体の中でもアシルアニオン供与体となるアシルジルコノセン錯体がライセルト型反応条件下、銅触媒を用いることにより含窒素芳香族複素環に効率よく位置選択的に求核的アシル化が進行することを明らかにした。また3,4-ジヒドロイソキノリンに触媒として金属を用いることなくBronsted酸を用いるとアシルジルコノセン錯体の求核的アシル化による炭素-炭素結合形成反応は生起せず、窒素アシル化体が得られ、D_2O処理すると1-位に重水素が導入されることを見出している。2.有機ジルコノセン錯体による上記ライセルト型反応のエナンチオ選択的反応を遂行するための銅触媒について検討した。さらに、これら不斉反応に利用できる種々新規不斉配位子の合成を目的として、光学活性なビスオキサゾール誘導体のアミノ酸誘導体からの合成について検討した。3. 2に記載したビスオキサゾール有機ジルコノセン錯体の反応と関係して、各種金属触媒を利用するオキサゾール骨格を含む各種複素管骨格の新規構築法について報告した。有機化学分野において基本的かつ非常に重要な炭素一炭素結合形成反応の新規反応の開発を目的として、求核性の乏しいジルコノセン錯体を求核種として利用する触媒反応の検討を行ってきている。23年度においては1.有機ジルコノセン錯体の中でもアルケニル基供与体となるアルケニルジルコノセン錯体が含窒素芳香族複素環化合物とライセルト型反応条件下、効率よく位置選択的に求核的アルケニル化が進行することを明らかにした。特に溶媒効果による位置選択性の逆転などの特徴を明らかにし報告した。3,4-ジヒドロイソキノリンにBronsted酸存在下、アシルジルコノセン錯体を反応させると炭素-炭素結合形成反応は生起せず、窒素アシル化体が得られD_2Oによる後処理をすると1-位に重水素が導入され、その反応機構の解明のための実験を行い、学会にて発表した。3.2に記載したビスオキサゾール有機ジルコノセン錯体の反応と関係して、超原子価ヨウ素試薬を利用するオキサゾール骨格を含む各種複素環の新規構築法について報告した。1.求核反応活性の低い有機ジルコノセン錯体(アルキルー、アルケニルーおよびアシルージルコノセンクロリド錯体)を用い、複素環化合物への求核試薬としての反応を行った。特に、前年度に申請者が明らかにしたアルケニルジルコノセン錯体を求核種とするキノリン等芳香族複素環化合物への位置選択的ライセルト型付加反応を利用する求核反応を各種誘導体に展開した。それら反応における位置選択性に対する反応溶媒、さらには用いる金属触媒により位置選択性が異なることを明らかにした。これらは、生理活性が期待できる複素環への炭素置換基の効率的な新たな導入法を可能にするものであり、キノリンあるいはピリジン骨格を有する誘導体の新たな構築法として意義あるものである。2.アシルジルコノセン錯体を求核種とする複素環化合物との反応の一環として、1と同様のライセルト型反応による求核的アシル化を目的としてキノリンとの反応を行い、アルケニルジルコノセン錯体を用いる場合と同様な結果を得た。一方、イソキノリンとアシルジルコノセン錯体との反応では、ライセルト型の反応に必要とされるアシル化剤を用いることなく反応が進行し、しかも触媒としてブレンステッド酸としてヘキサフルオロイソプロパノールを用いるのみで1,2ージヒドローN-アシル化体が生成することを見出した。

この反応におけるN-アシル基はアシルジルコノセン錯体由来であり、非常に特殊な反応を経由していると考えられた。この反応について重水素を含むヘキサフルオロイソプロパノールを用いて実験を行った結果、分子内アシル基の1,2-転移反応を含んでいることを明らかにした。今後、芳香族複素環への炭素置換基の新たな導入法として重要な知見を与えるものである。有機合成におけるジルコノセン錯体の低求核性の克服は時間を要したが、金属触媒あるいはBronsted酸の利用により一定の成果を上げたと考えている。ただし、予期しなかった反応結果に関する反応機構の解析には時間を要している。したがって、研究計画としてはおおむね順調と考える。24年度が最終年度であるため、記入しない。アシルジルコノセン錯体を用いた時に生起する異常反応につき、重水素化合物を用いる実験を行い反応機構の解析を行う。それらの結果を踏まえ、さらに効率の良いジルコノセン錯体の求核種としての有機合成への利用を模索する。また、不斉合成については十分満足のいく結果が得られたわけではなく、今後更なる不斉触媒配位子の検討をする。
コロイド科学的技法を用いた硝化・脱窒菌積層型バイオフィルムの設計

コロイド科学の観点から、自然界のバイオフィルムを模倣した硝化菌と脱窒菌の複合バイオフィルムの人為的設計を試みた結果、次のような結論を得た。硝化菌と脱窒菌は熱力学的に共凝集しないことが分かった。自発的に凝集しない硝化菌と脱窒菌を人為的に共凝集させるには、ポリドーパミンが有効であることが分かった。さらに、ポリドーパミンを用いることで、硝化菌と脱窒菌の複合バイオフィルムの形成に成功した。生物学的脱窒法では、硝化と脱窒の2工程によりアンモニア態窒素を無害な窒素に変換する。しかし、硝化反応では好気的環境、脱窒反応では嫌気的環境が要求されるため、必然的に2つの反応槽が必要となる。自然界に形成されるバイオフィルムの上部層は好気状態、下部層は嫌気状態となっている。これは、一つのバイオフィルム内に異なる環境を創出できることを意味している。本研究では、コロイド科学の技法を駆使することで、自然界のバイオフィルムを模倣した硝化・脱窒菌の複合バイオフィルムを人為的に設計することを目的とした。平成25年度は、脱窒菌と硝化菌の複合バイオフィルムの形成について主に検討を行った。まず、硝化菌と脱窒菌の接触角の実測値から求めた表面張力に基づき、両者の付着による自由エネルギー変化を評価した結果、熱力学的に付着し難いことが分かった。また、硝化菌と脱窒菌の細胞混合溶液を振とうしたが凝集物は観察されず、実験面からも同様の結果が確認された。そこで、硝化菌と脱窒菌を人為的に付着させるために、第3物質の添加による付着促進について検討を行った。まず、脱窒菌をガラスビーズで破砕した溶液を硝化菌と脱窒菌の混合溶液に添加し、形成された凝集体をFISH法により解析を行ったが、脱窒菌が選択的に凝集していることが分かった。次に、アミノ基を備えたキトサン、ポリエチレンイミン、ドーパミンをそれぞれ細胞混合溶液に添加した結果、ドーパミンを加えて30分間処理すると、硝化菌と脱窒菌の付着が促進されることがFISH法により明らかとなった。この手法を用いて、平板担体上に形成した脱窒菌のバイオフィルムをドーパミン処理することで、脱窒菌と硝化菌の複合バイオフィルムの形成に成功した。平成24年度は、脱窒菌の担体上へのバイオフィルム形成について検討を行った。脱窒菌としてPseudomonas denitrificans、Paracoccus denitrificans、Bacillus firmus、Alcaligenes sp.、Pseudomonas fluorescensの5種類、菌体固定化担体としてポリエチレン、ポリプロピレン、テフロン、ポリスチレン、正帯電性ガラス、アクリル、負帯電性ガラスの7種類を用いて、生理食塩水下で菌体の付着実験を行ったところ、菌体の接触角の実測値から求めた付着による自由エネルギー変化と固定化担体に付着した菌体数との間には正の相関関係が認められ、菌体の付着による自由エネルギー変化は担体上のバイオフィルム形成の指標として利用できることが分かった。次に、担体上への菌体の付着率の高かったポリエチレンとPseudomonas denitrificansの組み合わせで、バイオフィルムを形成させたところ、約2日で厚み約15 μmの緻密なバイオフィルムを形成できることが分かった。脱窒菌の表面張力を実測し、担体への付着による自由エネルギー変化を計算することで、バイオフィルムが形成され易い条件選定を完了した。課題として、形成した脱窒菌のバイオフィルムによる硝酸性イオンの脱窒速度試験が挙げられる。脱窒菌と脱窒菌の複合バイオフィルムを人為的に作成し、共焦点レーザー顕微鏡を用いてバイオフィルムの形成過程を三次元解析するともに、硝化・脱窒一体型処理槽の実証試験をラボスケールで行う。平成24年度3月に発注した物品の納品が4月にずれ込んだため、次年度使用額333,406円が生じた。また、翌年度分として請求した助成金と合わせた使用計画は、物品費1,533,406円、旅費300,000円、人件費100,000円、その他100,000円の合計2,033,406円である。
脳梗塞グリア瘢痕におけるヒト特異的な組織修復・炎症制御機構の解明

脳梗塞への生体反応であるグリア瘢痕において、抗炎症作用を有するannexin A1 (ANXA1)蛋白がヒト脳梗塞グリア瘢痕のアストロサイトに発現亢進し、この反応がヒト固有のものである可能性が高いことを発見した。これを踏まえ、ANXA1のグリア瘢痕における密度や広がり・免疫担当細胞との位置関係やANXA1発現規定因子の調査、遺伝子改変マウスによる脳梗塞モデル作成などを通して、脳梗塞グリア瘢痕におけるANXA1の役割を探求するとともに、ヒトの脳梗塞における修復・炎症制御メカニズム及び他の動物との違いを解明して今後の脳梗塞治療法開発に発展させる基礎的研究を展開することを目指す。
重水素化ポリマー膜コーティングによる光ポンピング原子のスピン緩和防止技術の創出

アルカリ金属原子のスピン偏極を用いた光ポンピング原子磁気センサは、室温でSQUIDを超える感度が期待できるため、ベットサイドでも心臓や脳神経由来の微小磁場をモニタリングできる可能性がある。しかし、偏極スピンは原子がセル内壁に衝突すると緩和されてしまう問題点があった。そこで、もし原子セル内壁にスピン緩和防止の高性能コーティングを施すことができれば、偏極緩和を抑制できることになる。本課題では、アルカリ金属原子の電子スピンとコーティング内原子の核スピンとの双極子ー双極子相互作用の効果を最小限に抑えるため、磁気モーメントの小さい重水素核に注目し、申請者が独自に開発した逐次的表面化学反応による原子層堆積法を発展させて重水素化したポリマー薄膜の分子層堆積法を世界で初めて開発し、更には表面界面のダングリングボンドのOD基終端や重水素化したポリマー薄膜の膜厚を精密制御する事でスピン偏極の緩和を抑制し、ついには光ポンピング原子磁気センサの感度を向上させることを目標に研究が行われた。昨年度はエチレングリコール(EG)とTMAとの組み合わせから、有機無機ハイブリッドポリマー薄膜の分子層堆積を実現した。本年度はEGの代わりに全ての水素が重水素に置換されたEG-d6を用いて重水素化した、有機無機ハイブリッドポリマー膜コーティングを実現した。ルビジウム原子セルの内壁に同コーティングを施し、分光エリプソメーターにより評価したところ、コーティング薄膜が形成できていることが判明した。次に外部共振器型半導体レーザーを用いて、レーザー光は87RbのD2線のF=2からF`=3の共鳴周波数に合うように周波数384.22815 THz(780.2435 nm)に周波数安定化を施し、非線形磁気光学回転の精密測定システムを開発した。そして同システムによるスピン緩和時間の計測を実現した。平成30年度に実施予定であった、(1)原子セル内壁の至る所への重水素化ポリマー膜室温コーティング、(2)非線形磁気光学回転の精密測定システムによるスピン緩和時間の計測、のいづれに対しても成功した。今まで原子磁気センサ構造にして共鳴線幅からスピンの緩和時間を見積もっていただが、非線形磁気光学回転の精密測定システムの開発により、直接緩和時間を簡便に測定できるようになった。コーティング表面原子とスピン偏極原子の相互作用を制御し、重水素化ポリマー膜コーティングを最適化し、スピンの偏極緩和を抑制する。スピン緩和防止により光ポンピング原子磁気センサの大幅な感度向上が期待できる。最終的には、独自の重水素化ポリマー膜コーティングによる光ポンピング原子磁気センサの感度向上を実証する(世界初)。まずD2Oを酸化剤として重水素を含有する酸化アルミ膜の原子層堆積を実施した。D2Oを堆積チャンバー内に導入しOD基で表面を覆い、余剰のD2O蒸気を排気した。次にTMAを導入し、表面化学反応を誘導し、余剰のTMAを排気した。原料ガスの自発的な熱分解を抑えることができた。すでに水蒸気では実証済みで、重水蒸気に対しても室温で、極めて高精度に膜厚制御を実現した。また繰り返しTMAとD2O蒸気の交互供給で膜構造を形成していくが、D2O蒸気のガス導入時間で、余剰の重水素の含有量を制御できることを明らかにした。また、ポリマー膜の分子層堆積法の開発を世界に先駆けて実施した。エチレングリコール(EG)とTMAとの組み合わせから、有機無機ハイブリッドポリマー薄膜の分子層堆積を実現した。まず平成29年度に実施予定であった、D2Oを酸化剤として重水素を含有する酸化アルミ膜の原子層堆積を行った。また、もう一つ平成29年度に実施予定であった、ポリマー膜の分子層堆積法の開発を世界に先駆けて実施した。エリプソメーターの測定から、室温では材料ガス吸着の利用により内壁の至る所に一様に堆積できることを実証した。

アルカリ金属原子のスピン偏極を用いた光ポンピング原子磁気センサは、室温でSQUIDを超える感度が期待できるため、ベットサイドでも心臓や脳神経由来の微小磁場をモニタリングできる可能性がある。しかし、偏極スピンは原子がセル内壁に衝突すると緩和されてしまう問題点があった。そこで、もし原子セル内壁にスピン緩和防止の高性能コーティングを施すことができれば、偏極緩和を抑制できることになる。本課題では、アルカリ金属原子の電子スピンとコーティング内原子の核スピンとの双極子ー双極子相互作用の効果を最小限に抑えるため、磁気モーメントの小さい重水素核に注目し、申請者が独自に開発した逐次的表面化学反応による原子層堆積法を発展させて重水素化したポリマー薄膜の分子層堆積法を世界で初めて開発し、更には表面界面のダングリングボンドのOD基終端や重水素化したポリマー薄膜の膜厚を精密制御する事でスピン偏極の緩和を抑制し、ついには光ポンピング原子磁気センサの感度を向上させることを目標に研究が行われた。昨年度はエチレングリコール(EG)とTMAとの組み合わせから、有機無機ハイブリッドポリマー薄膜の分子層堆積を実現した。本年度はEGの代わりに全ての水素が重水素に置換されたEG-d6を用いて重水素化した、有機無機ハイブリッドポリマー膜コーティングを実現した。ルビジウム原子セルの内壁に同コーティングを施し、分光エリプソメーターにより評価したところ、コーティング薄膜が形成できていることが判明した。次に外部共振器型半導体レーザーを用いて、レーザー光は87RbのD2線のF=2からF`=3の共鳴周波数に合うように周波数384.22815 THz(780.2435 nm)に周波数安定化を施し、非線形磁気光学回転の精密測定システムを開発した。そして同システムによるスピン緩和時間の計測を実現した。平成30年度に実施予定であった、(1)原子セル内壁の至る所への重水素化ポリマー膜室温コーティング、(2)非線形磁気光学回転の精密測定システムによるスピン緩和時間の計測、のいづれに対しても成功した。今まで原子磁気センサ構造にして共鳴線幅からスピンの緩和時間を見積もっていただが、非線形磁気光学回転の精密測定システムの開発により、直接緩和時間を簡便に測定できるようになった。ルビジウム原子セルの作製技術は既に開発済みなので、原子セル内壁の至る所へのポリマー膜の室温コーティングを実施する。そして、ポリマー膜の一様な室温コーティングを行ったルビジウム原子セルに対して、非線形磁気光学回転による精密測定システムを用いたスピン緩和時間の計測を実施する。外部共振器型半導体レーザーを用いて、レーザー光は87Rbの共鳴周波数に合うように周波数ロックし、PI制御により周波数安定化を施す。レーザー光はアイソレータ、アパーチャーを通過して、偏光ビームスプリッター(PBS)に入射する。直前のλ/2板の回転により、入射光の一部は波長計に分岐されるが、直進したレーザー光は、グラントムトンプリズム、λ/2板を通過し、直線偏光としてポンプ光およびプローブ光として利用される。
スフィンゴリン脂質の挙動解明に向けた効果的なツール分子の開発とその利用

近年、生体内情報伝達物質として注目を集めているスフィンゴ脂質は、異細胞の認識、アポトーシス、細胞増殖、リン酸化酵素の活性化などの生体内現象に関与するばかりでなく、細胞膜における情報伝達ドメインとしてラフトの形成においても注目されている。本研究は、共通の原料から多様なスフィンゴリン脂質類縁体の十分な量を供給できる統一的で効率よい合成法の確立、それら合成品のツール分子としての有効性の検証と利用ならびに展開を目的とした。その結果、(1)オレフィンクロスメタセシスを用いることにより、多様なスフィンゴ脂質に対する合成法を確立した。次いで、(2)代表的な天然のスフィンゴ脂質である、スフィンゴシン、セラミド、スフィンゴシン1-リン酸、スフィンゴミエリン(SM)の効率よい合成を達成した。また、(3)主鎖末端に蛍光標識基を組み込んだスフィンゴシン1-リン酸(S1-P)の合成、および加水分解されるリン酸エステルの酸素原子をCH_2に置き換えた類縁体の合成に成功した。この新規分子は、細胞に対し基質と同様に認識されることが北海道大学生命科学分野の共同研究者によって確かめられ、魅力的なツール分子として期待されている。さらに、(4)SMの主骨格とホスホコリン部をつなぐ酸素原子をCH_2、S、NH、NMeに置換した類縁体の合成を、各々セリンおよびメチオニンを原料として達成した。生命物理分野の共同研究者であるフィンランドのSlotteグループにより、これらの脂質二重層膜の形成がなされ、それらのゲル層から液晶相への相転位温度がSMとの比較において測定された結果、硫黄類縁体は膜安定性を増大させ、メチレンおよび窒素類縁体は減少させる事が判明した。これらの結果は、SMの上記酸素原子のラフトドメイン形成における重要性を示唆するものであり、スフィンゴミエリンの物性解明に貢献することができた。スフィンゴ脂質は細胞膜におけるラフトの形成、異細胞認識、アポトーシス、細胞増殖などに関与し大きな注目を集めている。本研究は、スフィンゴ脂質の挙動解析に向けた有機合成化学からのアプローチとして、効果的なツール分子の創製、効率よい合成法の確立、十分な量の供給を目的としている。本年度は以下の成果を上げることが出来た。すなわちまず、効率よい合成法の確立を目指して、スフィンゴ脂質主鎖のトランスオレフィン部で切断し2つのセグメントに分け、この両者をそれぞれ独立に合成し、それらを組み合わせて多様な望むスフィンゴ脂質の合成を計画した。検討の結果、(1)オレフィンクロスメタセシスを用いることにより、炭素鎖の異なる誘導体を始めとし、多様なスフィンゴ脂質に対する合成法を確立した。次いで、(2)メタセシスの原料となる両セグメントの合成法を確立した。特に、ホスホコリンを持つアミノアルコール部に対して、セリンを原料とし高立体選択的なケトンの還元を含む合成ルートを確立した。そこでこれらの合成法を用いて、(3)代表的な天然のスフィンゴ脂質である、スフィンゴシン、セラミド、スフィンゴシン1-リン酸、スフィンゴミエリンの効率よい合成を、開発した共通の方法により達成した。また、(4)主鎖末端に蛍光標識基を組み込んだスフィンゴシン1-リン酸(S1-P)の合成に成功した。これの細胞内挙動が研究協力者によって検討された結果、開発した蛍光標識化S1-Pは本来の基質であるS1-Pと同様に認識されることが明らかになった。さらに、(5)蛍光標識化S1-Pにおいて、加水分解されるリン酸エステルの酸素原子をCH_2に置き換えた類縁体の合成にも成功した。この合成品は、先に開発した分子同様、細胞に対して基質と同様に認識されることが研究協力者によって確かめられ、魅力的なツール分子として大いに期待されている。

スフィンゴ脂質の中でもスフィンゴミエリン(SM)は、細胞膜における情報伝達ドメイン(ラフトドメイン)の主成分であると共に、その代謝物は様々な生体内情報伝達物質として作用し注目を集めている。本研究は、スフィンゴ脂質の挙動解析に効果的なツール分子の創製、それらの効率よい合成法の確立、十分な量の供給を目的としている。昨年度は、多様なスフィンゴ脂質および類縁体合成が可能な統一的合成法を確立し、主に天然のスフィンゴ脂質の合成を達成した。本年度はこの確立した合成法を用いて、(1)スフィンゴシン1-リン酸(S1-P)の蛍光標識化イオウ類縁体の合成を実現した。この類縁体は、S1-P同様に認識されたがCH_2類縁体とは異なりリン酸化酵素を活性化させずS1-P代謝酵素の阻害剤としての利用が期待された。次いで、(2)確立した方法により合成したセラミドに対し、ホスホコリン部導入によるSMの合成法を検討した結果、保護基の利用によりスケールアップ可能な改良合成法を確立することができた。さらに次の段階として、(3)やはり確立した合成法を用い、SMにおいて主骨格とボスホコリン部をつなぐ酸素原子をCH_2,S,NH,NMeに置換した類縁体の合成を、各々セリンおよびメチオニンを原料として達成することができた。そこで、これらの類縁体に対し、まずSM代謝酵素に対する阻害活性を検討したが、顕著な阻害作用は認められなかった。その一方、これらを生命物理分野の共同研究者に提供しSMと比較したところ、脂質二重層膜における物性変化としてゲル層から液晶相への相転位温度に明らかな差異が認められた。すなわち、分子内水素結合が弱まった結果としてホスホコリン頭部の配向性が変化したと推定された。これらの結果は、SMの上記酸素原子のラフトドメイン形成における重要性を示唆するものと推定される。
細胞骨格間架橋蛋白質の微量検出法とその制御解析法の開発

神経伝達物質放出およびホルモン分泌という細胞機能における細胞骨格関連蛋白質の役割を新たな手法で解析するため以下の検討を行った。神経終末においてシナプシンIは、神経の脱分極に伴って燐酸化され、アクチン・チュ-ブリンに結合する蛋白質である。急速凍結ディ-プエッチ法と免疫電顕により、シナプシンIはシナプス小胞とアクチン線維またはシナプス小胞と微小管を結ぶ架橋構造として観察された。すなわち、シナプシンIはシナプス前部のシナプス小胞上に存在し、非興奮時にはアクチン線維との架橋によりシナプス小胞をアクチン線維に保持する役割を果たしている。神経の脱分極によりシナプス前部にCa^<2+>が流入すると、キナ-ゼIIの活性化によるシナプシンIの燐酸化がアクチンとの架橋を阻害し、シナプス小胞はアクチン線維から遊離され、シナプス前膜に結合し神経伝達物質の放出が起こると考えられる。副腎髄質細胞の検討では、カルパクチンIは急速凍結ディ-プエッチ法と免疫電顕により細胞膜と細胞膜に近接するクロマフィン顆粒に球状構造として存在し、分泌刺激時には、両者のヒモ状の架橋構造として存在することが観察された。すなわち、カルパクチンIは、Ca^<2+>・燐脂質依存性に構造変化を起こしクロマフィン顆粒と細胞膜を架橋すると考えられ、エクトサイト-シスの際の細胞膜・分泌小胞の結合・融合に必須である可能性が示された。このように、生化学的手法と超微細形態学的手法を併用することにより、神経伝達物質放出やホルモン分泌と言った重要な細胞機能において、微量にしか存在しない細胞骨格関連蛋白質による制御機構を解析することが可能となった。細胞骨格は多彩な細胞運動性の普遍的物質基盤として近年注目を集めている。我々は限られた種類の細胞骨格系が多様な機能を有することを説明する要因として、細胞骨格機能制御蛋白質に注目し、これまでに約15種類の細胞骨格関連カルモデュリン結合蛋白質を発見または同定してきた。平成元年度は本試験研究の援助により、細胞骨格と分泌顆粒膜間を架橋する蛋白質、シナプシンIをカルパクチンIについて各種の超微細形態学的手法を導入して検討を行った。シナプシンIはシナプス部に存在し、神経細胞の脱分極に伴ってリン酸化される分子量86/180kDaの蛋白質である。我々は急速凍結ディ-プエッチ法を免疫電顕法によりシナプシンIが神経終末において、シナプス小胞とアクチン線維またはシナプス小胞を微小管を結ぶ微細線維として存在することを明らかにした。今回の知見より、我々は神経細胞の脱分極に伴ないシナプシンIがリン酸化されると、シナプス小胞はアクチンまたは微小管より遊離し、可動性を得るものと考えている。カルパクチンIは、Ca^<2+>依存性にリン脂質と結合する蛋白質である。最近カルパクチンIは、副腎髄質細胞のクロマフィン顆粒を凝集することが見出され、エクソサイト-シスへの関与が推定されてきた。我々は、低角度回転蒸着法、免疫電顕法、急速凍結ディ-プエッチ手法により、カルパクチンIの分子形態と機能を解析した。その結果、カルパクチンIは通常は直径約10μmの球状分子であること、副腎髄質細胞膜内側面に局在していることを、分泌刺激によりそのコンクオメ-ションを変化させ、細胞膜とクロマフィン顆粒膜間を架橋するヒモ状の構造となることを見出した。今後は培養細胞系を用いて、各種超微細形態学的手法を応用しながら、細胞骨格間架橋蛋白質の局在とその機能を解析していく予定である。

細胞骨格は、多彩な細胞運動性の普遍的物質基盤として近年注目を集めている。我々は、限られた種類の細胞骨格系が多様な機能を有することを説明する要因として、細胞骨格機能制御蛋白質に注目し、これまでに約15種類の細胞骨格関連カルモデュリン結合蛋白質を発見または同定してきた。本年度は、神経ネットワ-ク形成に重要な神経細胞成長円錐の運動性及び基質接着性における細胞骨格系蛋白質の同定及び機能について検討した。NGFによって分化誘導し神経細胞様に形質転換したPC12細胞の成長円錐を観察したところ、成長円錐の基質接着部にカルスペクチン、Ca^<2+>非感受性αーアクチニン及び神経細胞分化に関与すると考えられているsrc遺伝子産物(pp60^<cーsrc>)が局在していた。これに対し、成長円錐先端部(filopodia)には、Ca^<2+>感受性αーアクチニンとアクチンが局在することが明らかになった。また、本細胞にA23187を添加するとfilopodiaの伸長が促進し、反対にCa^<2+>拮抗剤ではfilopodiaが退縮することが観察され、filopodiaの運動性にCa^<2+>による制御系が関与することが示された。以上の結果から、成長円錐の細胞あるいは基質接着性にはカルスペクチン、Ca^<2+>非感受性αーアクチニンの細胞膜裏打ち蛋白質とpp60^<cーsrc>が関与し、filopodiaの運動性には、Ca^<2+>感受性αーアクチニンとアクチンが関与していると考えられる。本研究は、細胞骨格関連蛋白質による種々の細胞機能の制御機構の分子機作を生化学的手法と超微細形態学的手法を併用した新たな解析法で明かにすることを目指してきた。本年度は、カルパクチンIに注目し、分泌顆粒が細胞膜に結合する過程を副腎髄質細胞を対象に検討した。カルパクチンIは、アネキシンファミリ-に属する蛋白質で36KDaの重鎖と10KDaの軽鎖からなり、Ca^<2+>依存性にリン脂質と結合する。また、カルパクチンIは、リポゾ-ムや副腎髄質クロマフィン顆粒をCa^<2+>依存性に凝集させることが知られている。そこでカルパクチンIの分子形態及びエクソサイト-シスにおける副腎髄質細胞内の局在変化を電子顕微鏡を用いて詳細に検討した。精製されたカルパクチンIは、直径約10nmの球状分子として存在する。カルパクチンIによりリポゾ-ムをCa^<2+>存在下に凝集させると、球状構造とともに近接した2つのリポゾ-ム間に長さ約7nmの細いヒモ状の架橋構造が認められた。副腎髄質細胞では、細胞膜内側面に多数の球状構造が認められ、アセチルコリンによる分泌刺激を加えるとクロマフィン顆粒と細胞膜との間に細いヒモ状の架橋構造が観察された。さらに免疫電顕法でもカルパクチンIが細胞膜内側面に局在することが確認され、特に、細胞膜と近接するクロマフィン間に強い免疫反応性が認められた。以上の結果から、カルパクチンIは、Ca^<2+>・リン脂質依存性に構造変化を起こし細胞膜とクロマフィン顆粒間との架橋を行なっていると考えられる。このようにカルパクチンIがエクソサイト-シスにおける細胞膜と分泌顆粒との結合さらには膜の融合の過程に必須の役割を果たしている可能性が示された。
日常的防災教育プログラムの開発に関する研究

本研究の目的は,災害時に必要とされる諸能力を学校教育で育成される諸能力に含んで育成できる防災教育プログラムを開発することにある。主に東日本大震災時と熊本地震時の行動事例を収集し,災害時に有効な行動を検証した。また,小中学校での特別教育の事例を収集し,学校教育で育成すべき能力の絞り込みを行った。その上で,小中学生について災害時の自己効力感と学校教育で育成すべき4つの力ー前に踏み出す力,考え抜く力,伝える力,チームで働く力ーとの関連を検討した。結果として,災害時の自己効力感とチームで働く力との関連が強くみられ,関係性の育成を重視する防災教育プログラムの有効性が示唆された。本研究の目的は、災害時に必要とされる諸能力(状況に応じた情報収集力と判断力、主体的な行動力および協働的意識など)の向上を、家庭、学校、職場、さらには地域社会における日常的な活動に無理なく取り入れる方策について検討し、行動コスト(手間感や負担感)を意識することなく実践できる防災教育プログラムを開発することにある。本年度は、主に小中学校で実施される防災教育やキャリア教育などの特別教育を中心にして、防災教育プログラムの事例を広く収集し、災害時における主体的な取り組みを重視する観点から、防災教育課題の整理・分析を実施した。また、被災経験を持つ個人や団体が主催するワークショップなどへの参加や取材を通じて、それらの主催者がこれまで蓄積してきた災害時に有効な行動事例を収集し、災害時に日常での備えがどのように活かされるのかを探ることで、日常と非日常との接合点を探り、防災教育課題を検討した。その他、直接的な取材や訪問、面接やインタビューでは収集しきれない事例については、Web上での事例収集を行い、事例の量的な補足を行った。具体的には、Web上で公開されている小・中学校の防災教育やキャリア教育などの特別教育を対象に、Web上で入手できる限りの概要や詳細について収集し、それらを整理・分析し、日常的な文脈で取り組むことの出来る防災教育課題を検討した。さらに、さまざまな個人や組織、機関や団体が開発した防災ゲームや防災トレーニングプログラム、防災ハイキングプログラムや防災キャンププログラムなどの事例も収集し、日常的な文脈で取り組むことの出来る防災教育課題を検討した。本研究の目的は、災害時に必要とされる諸能力(状況に応じた情報収集力と判断力、主体的な行動力および協働的意識など)の向上を、家庭、学校、職場、さらには地域社会における日常的な活動に、無理なく取り入れる方策について検討し、行動コスト(手間感や負担感)を意識することなく実践できる防災教育プログラムを開発することにある。今年度は、引き続き小中学校で実施される防災教育を中心に、教育プログラムの事例を収集し、主体的な取り組みを支援する観点から、教育課題の詳細な整理・分析を実施した。また、阪神・淡路大震災以来、これまで蓄積してきた災害時の行動事例に加えて、東日本大震災での人々の生活記録から非日常の中において、日常での備えがどのように活かされるのかを探るとともに、発災時からの行動についても生活記録を分析することで、日常と非日常との接点を探り、教育プログラムの課題を検討した。こうして抽出した教育課題は、前年度の研究における被災地内外の小中学校での収集事例から抽出した教育課題と統合的に検討し、日常的な教育・研修プログラムに組み込む話題や課題を作成した。今後、課題の種類をグループワークのアイスブレーキングに使用できるレベルから、仮想訓練レベル、PBL(Problem Based LearningまたはProject Based Learning )レベルなどの水準に整理する。特に、この課題の整理については、既存の教育・研修プログラムとのマッチングを行う必要がある。小中学校では、教育指導要領によって各学校が各教科で教える内容や時間数が規定されている。そのため、防災教育プログラムを実施する際の時間は、学活や体育、道徳の時間、総合学習の時間などが多く、またどの時間で実施するかは、各学校の工夫に任されている。この実態から、われわれが当初に想定していたものよりも、小中学校における時間の制約がかなり大きいことがわかった。そのため、各小中学校では、研究校に指定されているなどの特殊な事情がなければ、防災教育に時間を割り当てることはかなり難しく、防災教育を実施しようするのであれば、かなりの工夫が必要となる。本研究の目的は、災害時に必要とされる諸能力(状況に応じた情報収集力と判断力、主体的な行動力および協働的意識など)の向上を、家庭、学校、職場、さらには地域社会における日常的な活動に、無理なく取り入れる方策について検討し、行動コスト(手間感や負担感)を意識することなく実践できる防災プログラムを開発することにある。今年度は、東日本大震災における被災者について、震災前後の生活記録と行動記録を入手し、それを分析することで、日常での備えと非常時における行動との関連についてプログラムに織り込む事柄を抽出した。また、発災後の行動については、熊本地震の被災地における事例を収集し、事前の防災対策との関連を調べた。そこでは、特に避難所の運営において、われわれが開発した訓練プログラムの有用性が見いだせたが、既存のプログラムでは実施時の行動コストが高いため、行動コストをより低減する方策として、訓練プログラムのローテク化が必要となった。このほか、防災および発災時の行動に関連して、災害の規模はもとより、対策を立てる側の規模(具体的には、自治体の人口、学校の生徒数、職場の人数など)が大きく影響している。そのため、都会と田舎や中心市街地と周辺地域では、必要とされる基本的な行動パタンが同じではなく、防災対策と発災後の行動において、共通解と個別解が見いだされる。そのため、こうした基本的な行動パタンの相違をどのようにプログラム化するのかについては、さらなる検討が必要になった。

研究代表者の親族の介護、学内組織の改編および新設に伴う研究代表者の業務量の増加、連携協力者の身内の不幸および業務の多忙により、遅れている。そのため、本年度が補助期間の最終年度であったが、補助事業期間について一年間の延長申請を行った。本研究の目的は,災害時に必要とされる諸能力の向上を,家庭,学校,職場,さらには地域社会における日常的な活動に,無理なく取り入れる方策について検討し,行動コスト(手間感や負担感)を意識することなく実践できる防災教育プログラムを開発することにある。今年度は,主に,学校教育の中で育成される力と災害自己効力感の関係を検討した。この関係を検討する背景には,人が環境に適応するために必要とする能力は教育を通じて育成できるのではないかとの考えがあるため,災害時に必要とされる能力も学校教育で育成される諸能力と関連づけて育成すべきであると考えた。対象者はWeb調査にモニター登録をしている関西圏と関東圏の小中学生800名(男女400名ずつ)で,自己評価式のアンケート調査を実施した。対象の学年は小学校5年生から中学校2年生で,各学年200名ずつであった。調査項目は,学校教育において育成される15の基礎力と災害自己効力感尺度で構成し,日常的に育成される基礎力と災害時に必要とされる自己効力感についての関連性を量的に検討した。結果として,一般的な災害自己効力感は,自己対応力(6項目)と対人資源活用力(5項目)の2因子から構成されるが,小中学生のデータで分析したところ,自己対応力の3項目が曖昧な位置づけになった。そのため,保護者のもとで生活する小中学生と一般的な成人における自己対応力とは区別して検討する必要がある。そこで,曖昧な位置づけとなった3項目を除き,小中学生の自己対応力と対人資源活用力について,学校教育で育成される4つの力との関連を検討した。この4つの力は,考え抜く力,伝える力,チームで働く力,前に踏み出す力とされている。結果として,小中学生の災害自己効力感とチームで働く力との関連が強くみられ,関係性を重視する教育への応用が示唆される。本研究の目的は,災害時に必要とされる諸能力を学校教育で育成される諸能力に含んで育成できる防災教育プログラムを開発することにある。主に東日本大震災時と熊本地震時の行動事例を収集し,災害時に有効な行動を検証した。また,小中学校での特別教育の事例を収集し,学校教育で育成すべき能力の絞り込みを行った。その上で,小中学生について災害時の自己効力感と学校教育で育成すべき4つの力ー前に踏み出す力,考え抜く力,伝える力,チームで働く力ーとの関連を検討した。結果として,災害時の自己効力感とチームで働く力との関連が強くみられ,関係性の育成を重視する防災教育プログラムの有効性が示唆された。本年度の目的は、防災教育プログラムの事例を広く収集し、災害時に主体的な取り組みを重視する観点から防災教育課題の整理・分析を行うことにあり、この点についてはおおむね目的を達したと考えている。
住宅の火災安全性の評価法と設計法の開発に関する研究

1.住宅安全評価法の開発住宅の避難の安全性を評価するための「論理型」モデルの開発を行った。避難の安全性の確保という目標を達成するための要素(要因)間の相互関係や階層関係に着目したツリ-構造を基本論理とするモデルで,要素間の論理積や論理和を計算することにより,システムとしての成功確率を求め,それによって安全性を評価するモデルで,超高層住宅にも低層戸建住宅にも適用できる,極めて汎用性の高いモデルである.このモデルを用いてケ-ススタディを行ったところ,スプリンクラ-の設置,バルコニ-もしくは避難器具の設置,さらには警報装置の設置が有効なことが明らかとなった。2.住宅火災死者発生パタ-ンの分析過去5年間に京都,大阪,神戸の各都市で発生した住宅火災で,死者の発生した事例を収集し,その死者発生パタ-ンを「行動無余裕型」「行動不自由型」「機会逸失型」「退路喪失型」に分類し,それぞれについて死者発生要因を整理した。この結果は,1の「住宅安全評価法」に組みこんだ.3.住宅安全化シナリオの作成高層住宅等の防災計画書を収集し,そこに示されている防災対策を整理分析することにより,早期避難型,安全経路確保型,延焼拡大防止型などに住宅安全化をはかるシナリオを整理した。この結果についても,1の「住宅安全評価法」に反映させた.4.住宅安全性能の基準化安全評価法を用いたケ-ススタディ結果を参考に,住宅種別ごとに要求される安全性能と,それを満すための要件の整理を行った。ただし,まだこの作業は継続中であり,今後の課題として残されている。
もう１つのグローバル化と民法学の課題──「規範空間」の統御を目指して

各国を規律する法は、情報化が進んだ結果、以前とは比べものにならない程、容易に知ることができるようになった。その結果、フォーラムショッピングの日常化現象が生じている。そこに作出されているのは、法実務家によって、資本に奉仕するべく作られた規範空間である。そこでは、各国の民法上のルールは、公序良俗に関するルール(例、代理母契約の禁止)も含めて空洞化してしまう危険性がある。このような事態に対処するため、国際公序の観念が徐々に承認されつつあり、たとえば投資仲裁においても種々の民法概念が用いられている。規範空間においては、デバイスとしての民法の汎用性がその制御に一役買っている。予定通り、ウィーンにおいて開催された国際比較法アカデミー大会に出席し、グローバル化社会における法学教育について報告し、グローバル社会の動向に対応するために創設された日本のLS制度につき、最新の状況と成果を世界に対して発信した(7月ー業績参照)。また、慶應義塾大学において開催された「グローバル時代における法学教育」に関するシンポジウムにおいては、午後のセッションにつき司会を務めた(11月)。さらに、アジアにおける規範空間に向けて、アジア法の現状と課題を明らかにする論文を執筆した(3月ー業績参照)。今年度は、11月にパリで開催される世界比較法学会運営委員会への参加を予定していたが、直前に起こった同時多発テロの影響で、出張自体を取りやめざるをえなかった。そこで、数人の研究仲間と構想を具体化すべく議論をすることとしていただけに残念であった。昨年度から、顕著な進展が見られないでいただけに、その機会を逸したことは残念であった。ただし、研究に密接に関係することとして、シカゴ大学のサマースクールに参加し、そこで各国の研究者(の卵)とも知り合いとなった。そこでは、ロー・エンド・エコノミックスを学んだに過ぎないが、グローバル化を語る際には、アメリカ法に思考方法を十分に理解しておく必要があり、そのための基礎的素養を身に付ける場として極めて貴重であった。なお、4月以降になってからの話であるが、慶應義塾大学において、International Dispute Resolution Lecture seriesの一環として、4月27日に、シンポジウムが開催された。そこにおいて、パネラーとして、PACL(アジア共通契約法ー別の科研費の研究テーマ)について語るとともに、投資仲裁の意味と問題性について、TPPに即して報告し、一定の評価を得た。今後は、5月にドイツで開催されるアンリカピタン協会の大会、「グローバル化」に参加して、仏語圏の法律家と議論をすることになっている。また、2018年に福岡で世界比較法学会の中で「新たな比較法」のセッション担当者となったことから、併せて、打ち合わせを行う予定である。元々のテーマの困難性に加えて、上記のように、パリでのテロの影響を直接に受けた。慶應LLM(グローバル法専攻)の創設に向けて、多くの時間が取られた。しかし、海外からの学生が多く集まることになれば、多くの刺激を得ることができるとともに、今後の研究環境は教育との有機的関連の下、飛躍的に改善するだろう。4月には、慶應義塾大学において行われたInternational Dispute Resolutionに関するシンポジウムにおいて、パネラーとして登壇し、「TPPにおける投資紛争解決条項の危険性」について、報告を行った。そこでは、アジアの実務者との交流を深めることができた。5月には、ドイツ(ミュンスター・ベルリン)で開催されたアンリ・カピタン協会の世界大会に出席した。そこでの全体テーマは「グローバル化」であり、(1)「法源」、(2)「人」、(3)「投資」、(4)「通信」に焦点を当てて報告と議論が行われた。私は、とくに投資仲裁の問題性を指摘した。なお、それに続いてイタリアのトリノを訪問し、2018年に福岡で行われる国際比較法学会において座長を務める「比較法」(グローバル法と密接不可分に関係するテーマ)に関して、事前の打ち合わせを行った。9月には、シカゴ大学ロースクールから4名の教授を迎えて、「約款」に関する共同セミナーを行った。法のグローバル化の中心には英米法があることは否定できないので、これまでもっぱら大陸法を学んできた私にとっては、そのイロハを学ぶことがてきたことは貴重な出来事であった。なお、慶應義塾大学法科大学院においては、2017年4月に開講すべく、今年度は、LLMコースの準備に注力した。それ自体は研究そのものではないが、いわばグローバル法の実践計画であり、いかにしてグローバル法を教えるかについて、考えさせられる一年であった。企業実務についての調査を予定していたが、いろいろなルートを通じてアプローチしたにもかかわらず、予想以上に守秘義務などの壁が厚く、この方向での研究が実際には困難であることが判明してきた。資本のグローバルな動きは、仲裁人による法の非民主的な発展の動きと呼応しており、その間のメカニスムの研究の必要性を感じた。

民法予定していたアプローチ方法につき、今のところ実施できる見通しが立たないことから、アプローチの仕方を変更する必要に迫られてきているように思われる。規範空間の捉え方自体も、私人が任意に形成する一種の自生秩序と、国際的・国内的規範との対立として捉えて、実態を念頭に置きつつも、理論的な検討をより中心に据えて研究を進めていくことが大切ではないかと考えるに至った。そのため、この分野における先人の業績を謙虚に学ぶとともに、フランスの研究仲間など、第一級の研究者から直接ヒアリングすることを実施したい。11月にパリ出張を予定していたが、同時多発テロのため取りやめとなったため。今後は、5月にドイツで開催されるアンリカピタン協会の大会、「グローバル化」に参加して、フランス語圏のグローバル法に関する見方を理解するとともに、今後の方向性について議論を重ねたい。
グルココルチコイドによるイヌ骨格筋におけるインスリン抵抗性および筋萎縮の病態解明

・グルココルチコイドとしてプレドニゾロンを長期投与したイヌにおいて、骨格筋断面積がCT解析および生検材料の組織学的検査において減少することを前年度に明らかにしたが、この際に生じる骨格筋内での遺伝子発現の変化について解析した。解析したグルココルチコイド応答性遺伝子の中でもGrb10の発現量増加が著しく、Grb10を介したインスリンシグナリングの抑制が、イヌにおけるグルココルチコイドによる筋萎縮の原因の1つである可能性が考えられた。Grb10の発現増加は同時にインスリン抵抗性の原因にもなり得るが、本モデルにおいては糖負荷試験における糖耐性低下は明確でなく、糖代謝への影響については明らかではなかった。・イヌ初代培養骨格筋を用いて、グルココルチコイドの作用を検討した。イヌ初代培養骨格筋は安定して筋管細胞へと分化誘導された。分化した培養筋管細胞にグルココルチコイドとしてデキサメサゾンを添加すると、筋管細胞径は有意に減少した。このことから、デキサメサゾン添加によってグルココルチコイド筋萎縮の病態が再現されたと考えられた。本実験系を用いて、グルココルチコイド添加による骨格筋での蛋白合成の抑制と、ユビキチン・プロテアソーム系およびオートファジーによる異化亢進の病態について解析を進めている。またこれらの病態を誘導するグルココルチコイド応答性遺伝子について、in vivoでの試験と同様に解析中である。定量PCR系において特異的な増幅が得られない遺伝子があり、当初の予定よりもやや進捗は遅れている。培養イヌ筋管細胞を用いた蛋白合成の抑制および異化亢進の病態について、定量PCRおよびウエスタンブロッティング等の手法によって解析を進める。またグルココルチコイド応答性遺伝子の発現解析をもとに、筋萎縮やインスリン抵抗性の原因として有力な分子の候補を決定し、遺伝子のノックダウン等による因果関係についての評価を行う。・グルココルチコイドとしてプレドニゾロンを長期間投与したイヌにおいて、筋肉の断面積および体積が減少することを確認した。また顕微鏡レベルにおいても筋繊維の萎縮が生じていることを明らかにした。さらにその筋萎縮が神経障害によるものでないことを電気生理学的検査および病理学的検査によって確認した。現在筋肉組織からRNAを採取し、グルココルチコイドによって誘導される、筋萎縮に関連する遺伝子の発現量について解析中である。プレドニゾロンの長期的投与の前後において糖負荷試験を実施したが、両者の結果に有意な差は検出されず、in vivoにおけるグルココルチコイドによるインスリン抵抗性誘導にはさらなる条件検討が必要であることがわかった。・イヌ初代培養骨格筋を購入し、筋管細胞へと安定して分化誘導する系を確立した。筋管細胞から蛋白質およびRNAを抽出し、分化誘導とグルココルチコイドによって誘導される遺伝子の発現量の関係について解析中である。さらに今後は培養筋管細胞にグルココルチコイドとしてデキサメサゾンを作用させ、細胞形態、糖取り込み能、上記遺伝子の発現量変化、蛋白レベルでの変化を解析し、筋萎縮およびインスリン抵抗性の病態について検討する予定である。・グルココルチコイド応答遺伝子の発現解析のため、定量PCR系の確立を行った。現在目的とする14遺伝子のうち、8遺伝子の増幅を確認できた。現在残りの遺伝子について引き続きPCR条件の検討を行っている。プライマーの設計などの増幅条件について再検討するほか、必要に応じてSYBR Green法からプローブ法への変更について検討する。グルココルチコイド投与したイヌ骨格筋組織における遺伝子発現量解析についてさらに進める。また培養イヌ骨格筋細胞においてもグルココルチコイドによる筋萎縮やインスリン抵抗性のマーカーについて測定するとともに、グルココルチコイド応答性遺伝子発現の変化を解析する。これらをもとに、筋萎縮やインスリン抵抗性の原因として有力な分子の候補を決定し、遺伝子のノックダウン等による因果関係についての評価を行う。

またグルココルチコイド応答性遺伝子の発現解析をもとに、筋萎縮やインスリン抵抗性の原因として有力な分子の候補を決定し、遺伝子のノックダウン等による因果関係についての評価を行う。
Angiogeninの活性阻害剤N65828による口腔癌分子標的治療への展開

Angiogenin(ANG)は、リボヌクレアーゼ活性を有する唯一の血管新生蛋白で、血管内皮細胞のみならず癌細胞内で核に移行し、リボソームRNAの転写促進を介して腫瘍血管新生作用と同時に癌細胞自身への直接的な増殖作用を有する。ANGがその生物活性を発揮するためには、リボヌクレアーゼ活性を有することと、ANGが核に移行することが必須である。本研究では、ANGのリボヌクレアーゼ活性部位に対する小分子阻害剤N65828[8-amino-5-(4'-hydroxybiphenyl-4ylazo)naphthalene-2-sulfonate]の口腔癌に対する抗腫瘍効果とそのメカニズムを明らかにし、新規口腔癌治療薬としての応用・展開の可能性を検証することを目的とした。(研究の成果)1.新たに合成したN65828を4%DMSO含むPBSに溶解した。ANG活性はイーストtRNAに対するANGのリボヌクレアーゼ活性により測定した。その結果、N65828のANGに対するリボヌクレアーゼ活性阻害作用を確認できた。2. N65828の口腔癌細胞に対する抗腫瘍作用の検討: N65828のHSC-2およびHSC-3細胞に対する増殖抑制作用を、MTTアッセイで測定した。10-100μMの濃度で増殖抑制効果をin vitroで確認できた。3.口腔癌細胞におけるN65828によるANGの核移行阻害作用の検討: HSC-2とおよびHSC-3細胞に対して1μg/mlのANGのみ添加したものと、N65828処理後ANGを添加したものをそれぞれ作製し検討した結果、N65828によるANGの核移行阻害作用が認められた。以上より、N65828の口腔癌に対する抗腫瘍効果がin vitroで確認された。新規に合成したN65828は、ANGのリボヌクレアーゼ阻害活性が低く、また口腔癌細胞に対する増殖抑制作用も低く、実験を次に進めることができなかった。N6582が十分に溶解していなかったことが確認され、来年度は、in vivoの実験を中心に行い、遅れた分を取り戻す予定である。本研究では、ANGのリボヌクレアーゼ活性部位に対する小分子阻害剤N65828 [8-amino-5-(40-hydroxybiphenyl-4ylazo)naphtha-lene-2-sulfonate]の口腔癌に対する抗腫瘍効果とそのメカニズムを明らかにし、新規口腔癌治療薬としての応用・展開の可能性を検証することを目的とした。本年度は、in vitroの実験を中心に行った。1. N65828の合成とリボヌクレアーゼ活性阻害作用の確認:N65828の受託合成はケミカルソフト開発研究所(三重)に依頼した。しかし、受託合成したN65828では、10μMで有意なANGのリボヌクレアーゼ活性阻害作用を示すことを確認できなかった。2. N65828の口腔癌細胞に対する増殖抑制作用の検討:N65828のHSC-2およびHSC-3細胞に対する増殖抑制作用を、MTTアッセイで測定したが、10-100μMの濃度でも有意な増殖抑制効果をin vitroで確認することができなかった。以上のように、新規に合成したN65828は、ANGのリボヌクレアーゼ阻害活性が低く、また口腔癌細胞に対する増殖抑制作用も低く、その原因を究明中である。また、その原因究明に時間を要し、実験が進まなかった。原因の1つとして、N6582が十分に溶解していなかった可能性が考えられる。

3.口腔癌細胞におけるN65828によるANGの核移行阻害作用の検討: HSC-2とおよびHSC-3細胞に対して1μg/mlのANGのみ添加したものと、N65828処理後ANGを添加したものをそれぞれ作製し検討した結果、N65828によるANGの核移行阻害作用が認められた。以上より、N65828の口腔癌に対する抗腫瘍効果がin vitroで確認された。新規に合成したN65828は、ANGのリボヌクレアーゼ阻害活性が低く、また口腔癌細胞に対する増殖抑制作用も低く、実験を次に進めることができなかった。N65828が、十分溶解し、所定の濃度になっていることを確認して実験を行う必要がある。すなわち、N65828を、0.1N-NaOH水溶液で一旦溶解して、DMSOを添加後にリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で所定濃度に希釈し、さらにpH6.8のリン酸緩衝液を加えpH7.4に調整し、再度、ANGのリボヌクレアーゼ阻害活性を確認する。N6582が十分に溶解していなかったことが確認され、来年度は、in vivoの実験を中心に行い、遅れた分を取り戻す予定である。新規に合成したN65828は、ANGのリボヌクレアーゼ阻害活性が低く、また口腔癌細胞に対する増殖抑制作用も低く、実験を次に進めることができなかったため、次年度使用額が生じてしまった。平成29年度にできなかったin vitroの実験に加え、平成30年度ではin vivoの実験を行う予定である。新規に合成したN65828はANGのリボヌクレアーゼ阻害活性が低く、また口腔癌細胞に対する増殖抑制作用も低く、実験を次に進めることができなかったため次年度使用額が生じてしまった。問題が解決されたため、平成30年度に実施できなかった動物実験に加え、令和元年度に予定した実験を行っていく予定である。