hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
CD8+CD122+制御性T細胞を利用したがん免疫療法の開発

果たして、ヒトにもCD8+CXCR3+細胞は存在し、in vitroの実験によってヒトCD8+CXCR3+細胞は他のCD8+T細胞を抑制する効果があることがわかった。
樹木の開花・結実特性に関する定量的解析

森林の天然更新などといった森林生態系の動態を解明する上での基礎的研究として位置づけられる開花・結実特性に関した解析を生物季節学的および生態生理学的両見地より実施した。すなわち、生物季節学的見地においては、花芽形成過程、開花過程、結実過程の3つの過程に分離し、それぞれの過程における生存曲線を作成し、過程間での違いを明らかにした。その結果、花芽、花のほとんどが、果実となり、その割合は全花芽数の9割ほどであった。また、結実過程においては、果実重の成長はロジスティック曲線で近似され、果実内種子はほぼその曲線の上限値に果実重が達した時点で発芽能力を有することが明白にとなった。一方、生態生理学的見地からは、花芽形成過程、開花過程、結実過程におけるガス交換の日変化を測定することにより、各過程での光合成能力が見いだされ、その違いが明らかにされた。すなわち、光合成量/日暗呼吸量比は、花芽形成過程で17.2%、開花過程で5.1%、混合過程(花芽形成過程+開花過程+結実過程)で0.3%、結実過程で23.4-24.2%となった。以上の測定、解析結果により、花芽形成期間(4.9週間)、開花期間(3.1週間)、結実期間(18.4週間)中の転流量推定のためのコンパートメントモデルを開発し、それぞれの期間における樹木当たりの転流量の算出を試みた。その結果、転流量は花芽形成期間では、1.1kg d.wt tree_<-1>、開花期間では0.2kg d.wt tree_<-1>、結実期間では21.5kgd.wttree_<-1>と推定され、再生産期間(26.4週間)中、総計で22.8kgd.wttree_<-1>となった。すなわち、再生産期間中、樹木1本当たり23kgd.wtほどの乾物が他器官から再生器官に転流することが明らかとなった。
エラスチン成分に着目した項靭帯および黄色靭帯の力学的評価と靭帯骨化症の治療法探索

コラーゲンとエラスチンは,生体組織中に存在する代表的な線維性タンパク質である.従って,皮膚,血管,腱,靭帯などの軟組織の力学的特性も,コラーゲンとエラスチンの双方の組成や構造に強く依存する.コラーゲンは生体適合性,生分解性,免疫原性,細胞接着性などの性質において多くの利点を有する材料であり,組織工学や再生医療の分野でも非常に多く利用されている.更に純度の高いコラーゲンを容易かつ大量に精製する手法が確立されており,多くの動物の組織から生体由来のコラーゲン材料が作製されている.一方,不溶性タンパク質であるエラスチンを大量にかつ高純度で精製することは極めて困難である.このことに起因して,エラスチンを対象とした研究はコラーゲンと比べて著しく遅れているのが現状である.加えて,エラスチンの生化学的ならびに分子生物学的な基礎特性についても未解明な部分が多く残されており,医薬品や化粧品や再生医療の分野への応用も少ないのが現状である.そこで本研究では,魚類動脈球からのエラスチン成分を精製し,腱や靭帯などの生体軟組織を対象とした再生医療や組織工学分野への展開を視野に入れ,エラスチンで構成されたプレート状材料の作製を試みた.また,作製したエラスチン材料にインデンテーション試験を行うことで,材料のヤング率を測定した.これによって,材料を作製する際のエラスチン濃度と材料強度との関係が明らかになったことで,腱や靭帯の力学的特性を模倣する材料を作製できる可能性が示唆された.さらに,腱や靭帯中に存在する線維芽細胞を用いた培養実験において,エラスチン基材上での細胞増殖を確認することができた.これによって,本研究で作製したエラスチン材料が良好な生体適合性や細胞親和性を有することが示され,線維芽細胞を含有する腱や靭帯の再生用材料として利用できるのではないかと考えられた.腱や靭帯などの生体軟組織はコラーゲンだけでなく,エラスチン成分も多く含有しており,これらの組織における細胞機能や組織再生を検討していくためには,エラスチン材料を有効に利用するほうが合理的であると推察される.本研究では,エラスチン材料を用いて,腱や靭帯における損傷治癒や組織再生の促進効果を有する材料を開発していくことを最終目標としている.しかし,魚類動脈球由来エラスチン材料の生体適合性についての検討は行われていなかった.そこで,エラスチンを被覆した培養シャーレを作製し,これを用いて腱や靭帯中に存在する線維芽細胞の培養実験を行い,腱や靭帯における細胞外マトリックスとしてエラスチン材料が利用可能かどうかについて検討した.エラスチン溶液をポリスチレン製培養シャーレに注入した後,乾燥オーブン中に静置することで,培養容器の表面にエラスチン膜を被覆させた.作製したエラスチン被覆シャーレに,線維芽細胞を播種し,細胞形態の変化を観察した.その結果,多くの線維芽細胞がポリスチレン表面よりもエラスチン成分が被覆されている部分に接着している様子がみられた.従って,魚類由来のエラスチンをコートしたシャーレで線維芽細胞を培養することが可能であり,精製したエラスチンと線維芽細胞との接着性も良好であることが明らかになった.また,エラスチンを素材として作製したプレート状材料のヤング率を測定した結果,エラスチン含有濃度とヤング率の間には正の相関があることが確認された.このように,本研究で精製したエラスチンは,線維芽細胞との親和性が良好であるとともに,エラスチンを用いたプレート材料ではエラスチン含有率や架橋剤濃度を変更することでヤング率を調整できることが示されており,腱や靭帯の治癒促進や組織再生に有効な材料がエラスチンを用いて開発できるものと推察され,研究はほぼ順調に進んでいると判断される.魚類由来エラスチンを用いて作製したプレート状材料に対してインデンテーション試験を実施し,そのヤング率を計測した結果,エラスチン含有濃度とヤング率の間に正の相関が存在することが明らかになった.しかしながら,そのヤング率の値は腱や靭帯のものと比較して低値を示していた.黄色靭帯や項靭帯には,エラスチン成分だけでなくコラーゲン成分も含まれており,両成分がネットワーク構造を形成し,相互に作用し合うことによって,靭帯の力学的特性が決定されていると推察される.今後は,エラスチン成分とコラーゲン成分を混合させたハイブリッド材料の作製を行っていく予定である.このエラスチンとコラーゲンの複合化によって,より腱や靭帯に近い特性をもつ材料を作製できるのではないかと考えている.一方,エラスチン被覆シャーレを用いた培養実験では,細胞の増殖能だけではなく,細胞の遊走性評価や遺伝子発現解析を実施していくことを検討中である.これによって,生体内において腱や靭帯の組織再生や損傷治癒を促進させるエラスチン材料の作用機序を理解するために必要な基礎的知見を得ることができるものと推察される.さらに,エラスチン成分を含んだ材料を用いて,項靭帯および黄色靭帯に人為的に作成した損傷の修復を試みる予定である.一定期間,エラスチン材料を靭帯損傷部に埋入した後に組織を摘出し,引張試験や吸引負荷試験などの生体力学的検討およびエラスチン線維の形態観察などの組織形態学的検討を行うものとし,これらによって,未だ定量的には解明されていない靭帯修復機能におけるエラスチン成分の役割や力学的寄与度についてのデータを得るものとする.さらに,組織伸展性が低下する靭帯の疾患では,エラスチンの性状変化が病状を左右する重要な因子であると考えられ,エラスチン含有のバイオマテリアルを用いた治療法やアンチエイジング手法を新たに提案していく予定である.

コラーゲンとエラスチンは,生体組織中に存在する代表的な線維性タンパク質である.従って,皮膚,血管,腱,靭帯などの軟組織の力学的特性も,コラーゲンとエラスチンの双方の組成や構造に強く依存する.コラーゲンは生体適合性,生分解性,免疫原性,細胞接着性などの性質において多くの利点を有する材料であり,組織工学や再生医療の分野でも非常に多く利用されている.更に純度の高いコラーゲンを容易かつ大量に精製する手法が確立されており,多くの動物の組織から生体由来のコラーゲン材料が作製されている.一方,不溶性タンパク質であるエラスチンを大量にかつ高純度で精製することは極めて困難である.このことに起因して,エラスチンを対象とした研究はコラーゲンと比べて著しく遅れているのが現状である.加えて,エラスチンの生化学的ならびに分子生物学的な基礎特性についても未解明な部分が多く残されており,医薬品や化粧品や再生医療の分野への応用も少ないのが現状である.そこで本研究では,魚類動脈球からのエラスチン成分を精製し,腱や靭帯などの生体軟組織を対象とした再生医療や組織工学分野への展開を視野に入れ,エラスチンで構成されたプレート状材料の作製を試みた.また,作製したエラスチン材料にインデンテーション試験を行うことで,材料のヤング率を測定した.これによって,材料を作製する際のエラスチン濃度と材料強度との関係が明らかになったことで,腱や靭帯の力学的特性を模倣する材料を作製できる可能性が示唆された.さらに,腱や靭帯中に存在する線維芽細胞を用いた培養実験において,エラスチン基材上での細胞増殖を確認することができた.これによって,本研究で作製したエラスチン材料が良好な生体適合性や細胞親和性を有することが示され,線維芽細胞を含有する腱や靭帯の再生用材料として利用できるのではないかと考えられた.腱や靭帯などの生体軟組織はコラーゲンだけでなく,エラスチン成分も多く含有しており,これらの組織における細胞機能や組織再生を検討していくためには,エラスチン材料を有効に利用するほうが合理的であると推察される.本研究では,エラスチン材料を用いて,腱や靭帯における損傷治癒や組織再生の促進効果を有する材料を開発していくことを最終目標としている.しかし,魚類動脈球由来エラスチン材料の生体適合性についての検討は行われていなかった.そこで,エラスチンを被覆した培養シャーレを作製し,これを用いて腱や靭帯中に存在する線維芽細胞の培養実験を行い,腱や靭帯における細胞外マトリックスとしてエラスチン材料が利用可能かどうかについて検討した.エラスチン溶液をポリスチレン製培養シャーレに注入した後,乾燥オーブン中に静置することで,培養容器の表面にエラスチン膜を被覆させた.作製したエラスチン被覆シャーレに,線維芽細胞を播種し,細胞形態の変化を観察した.その結果,多くの線維芽細胞がポリスチレン表面よりもエラスチン成分が被覆されている部分に接着している様子がみられた.従って,魚類由来のエラスチンをコートしたシャーレで線維芽細胞を培養することが可能であり,精製したエラスチンと線維芽細胞との接着性も良好であることが明らかになった.また,エラスチンを素材として作製したプレート状材料のヤング率を測定した結果,エラスチン含有濃度とヤング率の間には正の相関があることが確認された.
ジーントラップ・マイクロアレイによるマウス・ゲノムの網羅的な機能解析

ヒトやマウスのゲノム・プロジェクトの進展によって、近年おびただしい数の遺伝子が見出されつつあるが、いかにして効率良く、迅速にそれぞれの遺伝子の機能を解明して行くかが、我々に残された今後の大きな課題となっている。2004年9月、国際的な共同研究計画「The Knockout Mouse Project」が発表された。遺伝子トラップと遺伝子ターゲティングの手法を組み合わせ、マウスES細胞中の全遺伝子を今後5年以内に破壊するべく、世界中の研究者に協力が呼びかけられたのである。まずその初期段階では、遺伝子トラップの手法を用い、ES細胞中のできるだけ多くの遺伝子を迅速に破壊することが提唱されているが、現在多くの研究者は、特に同細胞中で発現されていない遺伝子をランダムなトラップによって確実に不活性化することは困難だと考えている。今回我々は、新たに開発した手法「UPATrap」を利用してnonsense-mediated mRNA decay (NMD)と呼ばれるmRNAサーベイランス機構を抑制すれば、遺伝子トラップのこの問題点を完全に克服することができる、という事実を見出した。我々が開発した新手法は、「The Knockout Mouse Project」の遂行にとり大きな障害となっているステップを乗り越えるのに役立つと考えられる。この「UPATrap」法により、標的遺伝子のスペクトラムとベクターの挿入部位の両者に「偏り」が存在しない理想的な遺伝子トラップを行い、トラップされた遺伝子断片を用いてマイクロアレイを作製した。このようなマイクロアレイを利用すれば、おびただしい数の遺伝子の機能を効率良く、迅速に解明することが可能になる。
視覚情報処理における持続的な左右差についての統合的検討

本研究では、持続的な左右大脳半球機能差が生起する要因について検討するために、エビングハウス錯視に左右配置が与える影響に注目した。実験の結果、過大視されるエビングハウス錯視を右に配置すると、左に配置した条件に比べて、より大きく知覚されるということが確認された。さらに錯視図形を上下に配置した条件と、左右に配置した条件を比較した結果、錯視図形を左側に配置することで錯視量が減少するのではなく、錯視図形を右側に配置することで錯視量が増大することが示された。これらの結果は持続的な左右大脳半球機能差が課題目標に適合した空間周波数帯域の処理に起因する可能性を示唆するものである。平成25年度は、行動実験によってエビングハウス錯視で認められた持続的な左右差の確認を行った。検証には調整法とPEST法を用いた。刺激として、調整法では周囲の円の大きさ3種類(小(0.42゚)vs.大(2.94゚)vs.なし)、中央の円の大きさ3種類(小(1.25゚) vs.中(1.67゚) vs.大(2.08゚))、錯視図形の配置位置2種類(右vs.左(周囲の円が無い場合は比較される円の配置))の組み合わせで実験を行った。また、PEST法では中央の円の大きさを2.08°に固定し、周囲の円の大きさ3種類と錯視図形の配置の組み合わせで実験を行った。その結果、エビングハウス錯視の小さな円に囲まれた円を右に配置すると、同じ図形を左に配置した条件に比べてより大きく知覚されるということが確認された。特に、中央の円が直径視角2度のときに顕著であった。このようにエビングハウス錯視において左右配置が錯視量に影響を及ぼすことが示された。今後は、このような左右差の現象がなぜ生じるのかについて検討する。具体的には、左視野は右視野と比較して空間的注意の配分が多いという知見から、注意を多く向けることで左視野の方がより正確に大きさを判断できるという注意の異方性仮説と、相対的に低い周波数帯域で表現されている周囲の円が小さい条件の方が、低い周波数帯域に処理優位性を持つ左視野ー右半球に提示された時に正確に大きさを判断できるという空間周波数帯域仮説の二つの仮説について検証を行う。エビングハウスの円対比錯視は、中央の円と周囲の円の対比によって生じる錯視だが、その錯視量には様々な要因(円の大きさ、距離、数、類似性など)が影響を与えていると考えられている。本研究では錯視図形の配置に注目した。円対比錯視は左右に過大視と過少視の2種類の錯視を左右に配置して紹介されることが多いが、この左右配置が錯視量に影響を与える可能性を検討した。第1実験ではPEST法を用いて、左右どちらかに配置された錯視図形の主観的等価点を測定した。参加者には比較対象の円と錯視図形のどちらが大きいかを判断させた。その結果、過大視される円対比錯視を右側に配置したほうが左側に配置した時よりも錯視量が大きくなることが示された。第2実験では、第1実験で確認された現象が、左側に配置した時に錯視量が減少するのか、右側に配置したときに錯視量が増大するのかどうかを検討した。錯視図形を上下に配置した条件と、左右に配置した条件を比較した結果、錯視図形を右側に配置することで錯視量が増大することが示された。なお、第3実験として予定している空間周波数に関連する研究が、Cognitive Processing誌に採択され掲載された。この論文では、物体認識において定性的情報処理が必要な課題では高空間周波数帯域が、定量的情報処理が必要な課題では低空間周波数帯域が重要となるという知見を報告している。これまでの左右大脳半球機能差研究では、半視野瞬間提示法で得られた課題や刺激に応じた左右差を示す知見と、自由観察によって得られた主に右半球の優位性を示す持続的な左右差の知見がそれぞれ報告されてきた。本研究では新たに認められたエビングハウス錯視における持続的な左右差を対象として、左右差の基本的情報としての空間周波数情報処理の検討を加えることで、これまでの知見を整理し能動的な情報取得を行う左右大脳半球と視覚情報処理のモデルを構築することを目的として行われた。第1実験では、調整法とPEST法を用いてエビングハウス錯視における左右配置による錯視量の変化について検討した。まず、周囲の円の大きさ3種類、中央の円の大きさ3種類、錯視図形の配置位置2種類(右vs.左(周囲の円が無い場合は比較される円の配置))の組み合わせで、調整法を用いて実験を行った。次に、中央の円の大きさを固定し、周囲の円の大きさ3種類と錯視図形の配置の組み合わせでPEST法を用いて実験を行った。その結果、エビングハウス錯視の小さな円に囲まれた円を右に配置すると、同じ図形を左に配置した条件に比べて、中央の円がより大きく知覚されるということが確認された。第2実験では、第1実験で確認された現象が、錯視を左側に配置した時に錯視量が減少するのか、右側に配置したときに錯視量が増大するのかどうかを検討した。

これらの結果は、一般的な右半球の空間情報処理に対する優位性によって説明することは難しく、課題目標に適合した空間周波数帯域の処理に対する左右大脳半球機能差による説明が適切である可能性を示唆するものであった。今後異なる刺激や錯視においても同様の持続的な左右差が認められるかどうかを検討していきたい。本研究では、持続的な左右大脳半球機能差が生起する要因について検討するために、エビングハウス錯視に左右配置が与える影響に注目した。実験の結果、過大視されるエビングハウス錯視を右に配置すると、左に配置した条件に比べて、より大きく知覚されるということが確認された。さらに錯視図形を上下に配置した条件と、左右に配置した条件を比較した結果、錯視図形を左側に配置することで錯視量が減少するのではなく、錯視図形を右側に配置することで錯視量が増大することが示された。これらの結果は持続的な左右大脳半球機能差が課題目標に適合した空間周波数帯域の処理に起因する可能性を示唆するものである。予定していた実験を実施し学会発表を行った。また、第3実験の準備も順調に進んでいる。関連する研究がCognitive Processing誌に掲載された。認知心理学、認知神経科学なぜ右側に配置されると錯視量が増大するのかについて、検証を行っていく。左右大脳半球機能差の研究では、左視野に対する注意の偏向が報告されている。また、右半球ー左視野と左半球ー右視野それぞれにおいて異なる空間周波数帯域への処理優位性が報告されている。これらの先行研究の知見から、錯視量増大がどのような原因によって生じるのかを第3実験で検討する。平成25年度後半に産前産後休業、ならびに育児休暇を取得したため、予定していた2つの実験のうち、1つが終了しなかった。実験用のコンピュータの購入を次年度にしたために次年度使用額が生じた。平成25年度前半に得られた実験データを論文化し意見を得る。また研究実施計画に従って、現象の原因についての解明を試みるため、二つの仮説検証のための実験を行う。第3実験開始に合わせて実験用コンピュータを購入し実験を行う。また、国際学会での発表を予定している。平成25年度後半は産前産後休業ならびに育児休暇を取得したため研究の遂行が遅れた。平成25年度に行った実験のデータ分析と論文の英文校閲、掲載料等に使用する。また、平成25年度に実施予定であった実験2を実施する。
高速温度ディスプレイおよび温度変化を利用した触覚インタフェースの開発

本研究では,高速に温度制御が可能な温度ディスプレイを開発し,高速な温度変化を提示することで情報伝達が可能なことを示した.温度ディスプレイと映像を組み合わせたアプリケーションを開発し,仮想対象物と接触したときに温度変化を提示することで,接触感覚の増強を行った.また,フィルムと回転体を用いることで,指先と対象物の間で滑りが発生しない滑り感覚が提示可能な触覚インタフェースを開発した.本研究では,高速に温度制御が可能な温度ディスプレイを開発し,高速な温度変化を提示することで情報伝達が可能なことを示した.温度ディスプレイと映像を組み合わせたアプリケーションを開発し,仮想対象物と接触したときに温度変化を提示することで,接触感覚の増強を行った.また,フィルムと回転体を用いることで,指先と対象物の間で滑りが発生しない滑り感覚が提示可能な触覚インタフェースを開発した.本研究は,高速に温度制御が可能な温度ディスプレイの開発,開発した高速温度ディスプレイを用いた人間の温度知覚特性の検証,温度ディスプレイを用いた触覚インタフェースの開発を目的としている.接触感覚とは,指先などの体の一部と対象物が接触した時に感じる感覚である.例えば指先が物体に触れた時,指先に力が加わることで物体に触れたことを知覚する.しかし,指と物体の温度や熱伝導率が異なるため,指と物体の間で熱の移動が発生し,指先表面の温度は変化する.薄い板に指を接触させ,板の裏側から温かい物体を接触させる状況を考える.板が固定されていて変形が無ければ,物体が接触しても指に力はかからない.しかし,板を介して熱が伝わるなら指先の温度は変化する.視覚的に物体の動きが確認できない状態で温度変化のみが提示されると,被験者はただ指先の温度が変化したことを感じる.これに対し,物体の動きは視覚的に確認できるが温度が提示されないと,物体が板に接触したことは確認できるが指先には何も感覚は生じない.本研究では,温度変化と視覚情報を合わせて提示することで,指先に物体との接触感覚を提示するための基礎実験を行った.温度提示のみ,映像提示のみ,及び映像提示と温度提示を組み合わせた実験を行い,映像提示と温度提示を組み合わせて行うことで,接触を判断するまでの遅れ時間に変化が見られること及び温度提示のみ行った場合とは異なる感触が指先に感じられることを確認した.本研究は,高速に温度制御が可能な温度ディスプレイの開発および開発,高速温度ディスプレイを用いた人間の温度知覚特性の検証,温度ディスプレイを用いた触覚インタフェースの開発を目的として実施した.開発した温度ディスプレイを用いて,温度変化を利用した情報伝達基礎実験を行った.情報提示部として指先を選択し,高速に加熱および冷却を行うことで,情報伝達が可能なことを確認した.触覚の一種である温度感覚は,他の作業を行っている状態でもその変化が知覚できることが確認できた.開発した高速温度ディスプレイと映像を組み合わせたアプリケーションを試作した.画像処理技術を利用して,被験者の手の映像をモニタに提示すると共に,被験者の手の位置情報を取得した.また,モニタ上に仮想対象物を提示した.被験者が手を動かし,仮想対象物と接触したときに温度ディスプレイを用いて温度を提示することで,接触感覚の増強を行った.温度の提示がない場合には,仮想対象物との接触は視覚でしか確認できないが,温度提示を同時に行うことで,仮想対象物との接触をより明確に知覚することができた.また,温度変化と合わせて触覚情報を提示するための触覚インタフェースの基礎技術として,フィルムと回転体を用いた滑り感覚の提示に関する基礎研究を実施した.指先と対象物の間で滑りを発生させることなく,滑り感覚の提示が可能であることを確認した.以上の通り,高速温度ディスプレイおよび温度変化を利用した触覚インタフェースの開発に関する研究を実施し,温度変化を利用した触覚提示や触覚インタフェースに関する様々な知見を得た.
近似ベイズ推論によるデータ解析法の漸近特性

高次元データの次元圧縮とクラスタリングのために、制約つき指数型分布族の混合モデルに対する変分ベイズ法による学習アルゴリズムを導出し、手書き数字認識の実データに応用し手法の有効性を検証した。また、イベントの発生を表す系列から変動する発生率を推定するモデルである変動二項過程に対し、局所変分法による近似推定法を導き、近似、推定精度を実験的に調べた。さらに局所変分法の情報論的な意味づけを行い、一般的な推定法の導出を行った。混合指数型分布を用いた変分ベイズ法によるクラスタリングと次元圧縮の同時最適化法について,MNIST手書き数字認識データに適用し,認識率を評価する数値実験を行った.その結果,先行研究において開発された混合正規分布に基づく手法に匹敵する認識結果を得られることや学習データ数が少ない時の次元圧縮の有効性が確認された.また,圧縮する次元数を変え実験を行い,手法の近似精度を与える変分自由エネルギーの評価を行った.学習データ数が少ないほど,より次元圧縮を行った方が,認識誤り率,自由エネルギーともに小さくなる傾向が見られ,自由エネルギーを次元数選択のための指標として用いることができることが示唆された.これらの結果は,高次元データが実質的に低次元の広がりを持ち,かつクラスタ構造を持つような実データ解析における上記同時最適化法の有効性を示している.また,神経スパイクの発火・非発火を表わすバイナリデータからの発火率関数の推定について,局所変分近似を用いたベイズ推定の近似アルゴリズムを導出し,周辺尤度の近似値を高速に計算する手法を提案した.一般に発火率推定における周辺尤度の計算は莫大な計算量が必要となるが,本手法では周辺尤度の上界と下界を与える精度評価付きの近似値を高速に求めることができる.数値実験により厳密に周辺尤度の計算を行う場合と比べ,はるかに高速であり,従来の近似手法に比べて,より高精度に周辺尤度の計算及び発火率の推定を行うことができることを示した.高次元データの次元圧縮とクラスタリングの同時最適化のために、制約つき指数型分布族の混合モデルに対する変分ベイズ法による学習アルゴリズムを導出した。人工データ及び手書き数字認識の実データを用いた数値実験により、手法の有効性を検証し論文誌に発表した。また、平滑化事前分布を用いた変動ポアソン過程及び変動ベルヌーイ過程の推定について、ベイズ推定を厳密に行うための転送行列法、及び事後確率最大化のための逐次最適化法を導出し論文を発表した。これらのモデルは神経科学におけるスパイク系列を含む、あるイベントの発生を表す系列からイベントの発生率を推定するモデルとして用いられている。しかしながら、ベイズ事後分布を解析的に計算することができないため、高速な計算には近似法が有効である。上記の手法は厳密計算を行うものであり、近似法の評価に用いることができる。実際に、同様のモデルに対する近似推定法を局所変分近似により導出しており、厳密計算との比較による近似精度の評価を行っている。局所変分近似による事後分布の近似では、周辺尤度の上界及び下界が目的関数となるが、これらを近似事後分布と真の事後分布間の情報量と関係付け、近似事後分布が分布間の情報量を最小化する分布の近似を与えていることを示した。また、上界と下界を結びつける効率的な手法を情報幾何学的考察に基づき構成した。他の応用として近赤外光断層撮影法における線形逆問題を扱い、変分ベイズ法を用いた階層ベイズ法の近似解法において事前分布の設定が推定結果に与える影響を調べた。
動脈灌流標本を用いた舌根沈下の中枢メカニズムの解明

舌根沈下は、閉塞性睡眠時無呼吸症候群などのさまざまな換気障害を引き起こすリスク要因であるが、その成因の詳細は未だ不明である。そこでラット動脈灌流標本を用いて高炭酸ガス負荷時の舌筋を含む上気道筋の活動を解析した。その結果、高炭酸ガス負荷によって記録したすべての上気道筋運動神経で前吸息相に活動が出現し、その振幅が増大した。また上気道筋の前吸息相の活動は、強制呼気の指標である腹直筋活動と相関した。高炭酸ガス負荷におけるこのような上気道筋群の活動は、声門開大前に気道を十分拡張させて換気を促進すると考えられる。舌根沈下は、これらの調節メカニズムが何らかの原因でうまく機能しなくなったものと推察される。舌根沈下に関与する中枢機構を解明するため、今年度は、除脳ラット灌流標本を用いて舌根沈下の実験モデルを開発するための実験を行った。生後3-4週齢のWistarラットを用いて、イソフルレン麻酔下にて横隔膜直下で下半身を離断し、上丘の前端で除脳を行い、下行大動脈の断端からカテーテルを挿入し、送液ポンプを用いて人工脳脊髄液を灌流し、除脳ラット灌流標本を作製した。頸神経、舌下神経、反回神経の活動を横隔神経の活動と同時に記録し、麻酔薬であるソムノペンチルもしくはプロポフォールや鎮静薬であるデクスメデトミジンの灌流液中への投与による効果を調べた。ソムノペンチルおよびプロポフォールは、濃度依存性に吸息活動の振幅を減弱させ、呼吸頻度を低下させた。ソムノペンチル(50 μg/ml)、プロポフォール(40 μg/ml)の投与で呼吸は完全に消失した。このような麻酔薬による吸息活動の振幅の減弱は、舌下神経において、横隔神経よりも低濃度で起こっていた。一方、反回神経の活動の減弱は、他の神経に比べて起こりにくかった。デクスメデトジンは呼吸抑制を起こしにくいことが知られているが、20 μg/mlの投与で呼吸が完全に消失した。以上の結果から、麻酔薬や鎮静薬は呼吸抑制を起こすが、舌筋を支配する舌下神経の活動は、他の呼吸に関係する神経の活動よりも麻酔薬の影響を受けやすいことが示唆された。本研究では、舌根沈下への麻酔薬の影響を調べるため、コントロールの状態で麻酔薬投与の必要がない除脳ラット灌流標本での実験モデルの開発が必須である。本年度は、まず、除脳ラット灌流標本で安定して呼吸を出し、頸神経、舌下神経、反回神経など複数の神経で呼吸性活動を記録することに成功した。ここで記録された呼吸性活動は、すでに報告されている除脳ラット灌流標本での呼吸性活動と類似しており、二酸化炭素濃度を上げた時の変化なども過去の報告と類似しているため、適切な呼吸状態の標本を得られていると思われる。さらに、複数の麻酔薬や鎮静薬の呼吸に対する影響を調べ、舌筋を支配する舌下神経と他の呼吸に関連する神経とで、麻酔薬による影響が異なるという知見を得た。複数の麻酔薬が、舌下神経に対して、より低濃度で作用するという結果は、全身麻酔導入時の換気不能・挿管不能の原因を考える上で、重要な知見であると思われる。このように、舌根沈下のメカニズムを知る上で有用なモデルを得られたことから、本研究課題はおおむね順調に進展していると評価できる。舌根沈下に関与する中枢機構を解明するため、今年度は、除脳ラット灌流標本を用いて高二酸化炭素負荷を行ったときの舌筋の運動神経である舌下神経を含めた上気道の開大筋運動神経の活動パターンの変化を解析する実験を行い、特に強制呼息の指標となる腹直筋の運動神経活動との関連についても解析を行った。舌下神経活動のほかに、舌骨下筋を支配する第1ー2頸神経、声門内転筋および外転筋を支配する反回神経、課員等収縮筋を支配する上喉頭神経、腹直筋運動神経の活動を横隔神経の活動と同時に記録した。炭酸正常状態(5%CO2)では、頸神経と舌下神経が上喉頭神経と反回神経にわずかに先行して活動した。高炭酸ガス血症(8%CO2)では、記録したすべての上気道筋運動神経で前吸息相に活動が出現し、その振幅が増大した。また上気道筋の前吸息相の活動は、強制呼気によって出現した腹直筋活動と相関することが明らかとなった。高炭酸ガス血症におけるこのような上気道筋群の活動は、声門開大前に気道を十分拡張させて換気を促進すると考えられる。また、各筋の活動調節メカニズムの基礎を解析するために、ラット閉口筋運動ニューロンの樹状突起へのグルタミン酸性入力の発育変化や、同ニューロンに対するプレモーターニューロンの入力様式の解析を行った。その結果、生後2-5日齢の閉口筋運動ニューロンでは樹状突起にNMDAスパイクが出現したが、生後9-12日齢では消失し、プレモーターニューロンからの入出力ゲインが低下することが明となった。

舌根沈下は、閉塞性睡眠時無呼吸症候群などのさまざまな換気障害を引き起こすリスク要因であるが、その成因の詳細は未だ不明である。そこでラット動脈灌流標本を用いて高炭酸ガス負荷時の舌筋を含む上気道筋の活動を解析した。その結果、高炭酸ガス負荷によって記録したすべての上気道筋運動神経で前吸息相に活動が出現し、その振幅が増大した。また上気道筋の前吸息相の活動は、強制呼気の指標である腹直筋活動と相関した。高炭酸ガス負荷におけるこのような上気道筋群の活動は、声門開大前に気道を十分拡張させて換気を促進すると考えられる。舌根沈下は、これらの調節メカニズムが何らかの原因でうまく機能しなくなったものと推察される。平成28年度は、平成27年度に確立した除脳ラット灌流標本での舌根沈下モデルを用い、舌根沈下に関わる中枢部位の検討を行う。超高感度タンパク質カルシウムセンサー(GCaMP)をアデノ随伴ウイルスベクターを用いて脳幹に遺伝子導入し、舌根沈下に伴って活動性を変化させるニューロンの存在部位を検索する。この方法で、舌根沈下の誘発時に活動が低下する脳部位が明らかになれば、その部位にGABAA受容体刺激薬のmuscimolを注入して同部位のニューロンの活動性を低下させ、舌下神経の活動低下が起こるかどうかを確かめる。また、同部の電気凝固による破壊でも同様の効果が観察されるかについても確かめる。これらの実験により、舌根沈下に関わる中枢を明らかにしていく。吸啜、咀嚼、嚥下を中心とした摂食行動の神経生理
家畜,実験動物の分子遺伝学的解析を目的とした哺乳類の比較染色体地図の構築

遺伝子の染色体上での配置は種間で保存されていることから、各種動物の染色体とマウス,ヒトの染色体の対応関係が正確に明らかとなれば、ヒト,マウスで大量に蓄積されている染色体上の遺伝子の位置に関する情報が利用可能となり、各種動物の遺伝学的な解析は大きく発展する。そこで本研究は、種間で保存されている配列を用いた染色体地図を作製することにより,各種動物とマウス,ヒトの染色体地図の対応を明らかとする哺乳類の比較染色体地図を構築し、これら動物の種々の形質の分子遺伝学的解析のための研究基盤を確立することを目的とした。これまでの研究により,遺伝性疾患等の特定の遺伝的形質を支配する遺伝子が存在することが明らかとされている,ウシの第1、6、27、28染色体,カニクイザルの第1、2、6、11染色体,第6染色体,マウスの第1、7、15染色体、ラットの第7、10、12染色体上の特定の領域を中心に比較染色体地図を構築することを試みた。連鎖解析により連鎖地図を作成するとともに,放射線雑種細胞法を用いた物理地図の作成を行った結果,これらの染色体における機能的遺伝子を含む染色体地図が作成された。その結果,ウシの第6染色体はヒトの第4染色体と広範な領域にわたって遺伝子の配置が保存されているが、中央部において遺伝子の配置が逆転していることが明らかとなった。また、第28染色体の末端領域は,ヒトの第10染色体と対応していることが明らかとなった。カニクイザルにおいても第1染色体はヒトの第1染色体と遺伝子の配置が保存されているが、一部で遺伝子の配置が逆転していること、第2染色体はヒトの第7染色体と第21染色体が融合したような形態となっていることが明らかとなった。また、ラットでは第7染色体および第12染色体がそれぞれマウスの第15染色体および第5染色体、ヒトの第12染色体および第7染色体との正確な対応関係が明らかとなった。これらの結果はこれら動物での遺伝性疾患等の原因遺伝子の解析のために有用であると考えられる。哺乳類の種間では、各染色体上での遺伝子の配置が部分的に保存されていることから、哺乳類の各種動物の染色体とマウス,ヒトの染色体の対応関係が正確に明らかとなれば、ヒト,マウスで大量に蓄積されている染色体上の遺伝子の位置に関する情報が他の動物にも利用可能となり、各種動物の遺伝学的な解析は大きく発展するものと思われる。そこで本研究は、種間で保存されている配列を用いた染色体地図を作製することにより,各種動物の染色体地図とマウス,ヒトの染色体地図の対応を明らかとする哺乳類の比較染色体地図を構築し、これら動物の種々の形質の分子遺伝学的解析のための研究基盤を確立することを目的とした。本研究では,特にこれまでの研究により,遺伝性疾患等の特定の遺伝的形質を支配する遺伝子が存在することが明らかとされている,ウシの第1,第6染色体,カニクイザルの第2,第11染色体,イヌの第10染色体,ラットの第10,第12染色体上の特定の領域を中心に比較染色体地図を構築することを試みた。マイクラサテライトマーカーを用いた連鎖解析により連鎖地図を作成するとともに,放射線雑種細胞法(RH法)を用いた物理地図の作成を行った結果,これらの染色体における機能的遺伝子を含む染色体地図が作成された。

その結果,ウシの第1染色体,第6染色体の当該領域は,それぞれヒトの第3染色体,第4染色体と対応していること,カニクイザルの第11染色体はヒトの第10染色体に対応し,第2染色体はヒトの第7染色体と第21染色体が融合したような形態となっていることが明らかとなった。これらの結果はウシやカニクザルにおいて報告されている遺伝性疾患の原因遺伝子の解析のために有用であると考えられる。哺乳類の種間では、各染色体上での遺伝子の配置が部分的に保存されていることから、哺乳類の各種動物の染色体とマウス,ヒトの染色体の対応関係が正確に明らかとなれば、ヒト,マウスで大量に蓄積されている染色体上の遺伝子の位置に関する情報が他の動物にも利用可能となり、各種動物の遺伝学的な解析は大きく発展するものと思われる。そこで本研究は、種間で保存されている配列を用いた染色体地図を作製することにより,各種動物の染色体地図とマウス,ヒトの染色体地図の対応を明らかとする哺乳類の比較染色体地図を構築し、これら動物の種々の形質の分子遺伝学的解析のための研究基盤を確立することを目的とした。本研究では,特にこれまでの研究により,遺伝性疾患等の特定の遺伝的形質を支配する遺伝子が存在することが明らかとされている,ウシの第27,第28染色体,カニクイザルの第1,第2染色体,第6染色体,マウスの第7,第15染色体、ラットの第7染色体上の特定の領域を中心に比較染色体地図を構築することを試みた。マイクラサテライトマーカーを用いた連鎖解析により連鎖地図を作成するとともに,放射線雑種細胞法(RH法)を用いた物理地図の作成を行った結果,これらの染色体における機能的遺伝子を含む染色体地図が作成された。その結果,ウシの第27染色体,第28染色体の当該領域は,それぞれヒトの第4染色体,第10染色体と対応していること,カニクイザルの第2染色体はヒトの第7染色体と第21染色体が融合したような形態となっていることが明らかとなった。また、ラットの第7染色体とマウスの第15染色体、ヒトの第12染色体との正確な対応関係が明らかとなった。これらの結果はウシ、カニクザル、ラットにおいて報告されている遺伝性疾患の原因遺伝子の解析のために有用であると考えられる。遺伝子の染色体上での配置は種間で保存されていることから、各種動物の染色体とマウス,ヒトの染色体の対応関係が正確に明らかとなれば、ヒト,マウスで大量に蓄積されている染色体上の遺伝子の位置に関する情報が利用可能となり、各種動物の遺伝学的な解析は大きく発展する。そこで本研究は、種間で保存されている配列を用いた染色体地図を作製することにより,各種動物とマウス,ヒトの染色体地図の対応を明らかとする哺乳類の比較染色体地図を構築し、これら動物の種々の形質の分子遺伝学的解析のための研究基盤を確立することを目的とした。これまでの研究により,遺伝性疾患等の特定の遺伝的形質を支配する遺伝子が存在することが明らかとされている,ウシの第6、27,第28染色体,カニクイザルの第1,第2染色体,第6染色体,マウスの第7,第15染色体、ラットの第7染色体上の特定の領域を中心に比較染色体地図を構築することを試みた。連鎖解析により連鎖地図を作成するとともに,放射線雑種細胞法を用いた物理地図の作成を行った結果,これらの染色体における機能的遺伝子を含む染色体地図が作成された。その結果,ウシの第6染色体はヒトの第4染色体と広範な領域にわたって遺伝子の配置が保存されているが、中央部において遺伝子の配置が逆転していることが明らかとなった。また、第28染色体の末端領域は,ヒトの第10染色体と対応していることが明らかとなった。
多孔質担体集積基板を利用した単一細胞の網羅的な遺伝子発現解析法の開発

本研究では、動物細胞を対象とした非侵襲的なイメージング解析から侵襲的な遺伝子発現解析までを同時・多平行に行える網羅的細胞解析技術の確立を目指し、多孔質担体集積基板を利用した細胞の高密度集積技術、mRNA回収技術、及び遺伝子発現解析技術を開発・統合することを目的とした。昨年度までの研究から、基板上に網羅的に集積した細胞集団の中から、キャピラリーを用いて一細胞を回収し遺伝子発現を解析する手法を開発している。本研究期間ではこの手法を応用してイヌ血液等の臨床サンプルを用いた研究活動を実施し、血中腫瘍細胞の同定法の開発を試みた。この結果、イヌ腫瘍同定用の候補遺伝子を選別することができた。本手法とは別のアプローチとして、多孔質担体モノリスシリカを用いた細胞からのmRNA精製技術の開発も並行して進めた。これまでに、このモノリスシリカを集積化した基板を作製し、細胞からmRNAを抽出できることを実証している。本研究期間では、基板上に捉えた細胞のイメージング解析を行った後に、基板上で細胞を溶解し、モノリスシリカを介してmRNAを回収して遺伝子発現解析を行う技術までを確立した。また、本研究課題を進める中で、厳密に制御された微細貫通孔を介して細胞をフィルトレーションすることにより、細胞の大きさや変形能の違いに基づいて細胞集団を分離出来ることを発見した。このサイズ選択的な細胞回収法を応用して、全血から白血球や腫瘍細胞を特異的に分離回収できる可能性が示唆されている。これらの技術を組み合わせることにより、様々な細胞を含む血液などのサンプルから特定の細胞を選別し、イメージング解析により細胞表面の表現型を解析した後に、遺伝子発現解析によって個々の細胞の表現型をより詳細に評価する技術を確立することができると考えられる。本研究では、動物細胞を対象とした非侵襲的なイメージング解析から侵襲的な遺伝子発現解析までを同時・多平行に行える網羅的細胞解析技術の確立を目指し、多孔質担体集積基板を利用した細胞の高密度集積技術、mRNA回収技術、及び遺伝子発現解析技術を開発・統合することを目的としている。本研究期間では、細胞集積化技術を用いた血液からのCD34陽性造血幹細胞の検出と単一細胞の選択的分離、及びこれに続くmRNA発現解析の手法について開発を行った。また、本技術を応用して血液からの抗原特異的な細胞傷害性T細胞の検出について検討した。具体的には、サイトメガロウイルスやメラノーマペプチドに特異的な細胞傷害性T細胞を細胞集積基板上で検出し、キャピラリーを用いて単一細胞を分離して、個々の細胞の有するT細胞レセプターβ鎖遺伝子のレパトア解析を行った。本手法を用いることで、特定細胞の検出と選別が容易になり、レパトア解析に必要な単一細胞を生体サンプルから簡易に獲得することができた。以上の研究内容では、網羅的に集積した細胞集団の中から一細胞を回収し遺伝子発現を解析する方針を採用しており、これを利用することでT細胞レセプター遺伝子のような発現量が決して多くはない遺伝子からシークエンス解析が可能なレベルまで遺伝子増幅が行えることを見出した。本手法とは別のアプローチとして、多孔質担体モノリスシリカを用いた細胞からのmRNA精製技術の開発も並行して進めている。本研究期間では、このmRNA抽出効率の向上を第一の目的として検討実験を進めた。その結果、基板の作製条件等を検討することにより、mRNAの回収に安定性が得られてきている。以上の成果から、細胞の非侵襲イメージング解析から侵襲的な遺伝子発現解析までを網羅的かつ同時・多平行に行える新技術を開発するための基盤技術を築くことができた。
遺伝性ニューロパチーの病態分子生物学的研究

末梢神経系のミエリン蛋白と遺伝性ニューロパチーの関係を検討すると共に、ミエリン形成細胞であるシュワン細胞の増殖分化の研究を進め、アポトーシスが起こることを明らかにした。1)Charcot-Marie-Tooth病1Aの原因遺伝子/蛋白であるPASII/PMP22に対する特異抗体を作成し、この蛋白が未梢神経ミエリン形成期に軸索に接着したシュワン細胞に発現することを確認した(文献1)。遺伝子導入細胞による機能解析の結果、PASII/PMP22蛋白の発現によって細胞接着は促進されないが、細胞増殖が抑制されることを確かめ、この抑制作用はミエリン形成の障害となる可能性を示した。Charcot-Marie-Tooth病Xの原因となるConnexin32は未梢神経系でランビエ絞輪に局在することを確かめた(文献1)。共同研究によって、PO蛋白の新しい変異(Lys131Arg)がCharcot-Marie-Tooth病1Bの原因となることを明らかにし(文献2)、P2蛋白が特異的に減少しているが、P2遺伝子には異常のない遺伝的ニューロパチーの例(文献3)を報告した。2)発育過程のラット坐骨神経において、増殖期のシュワン細胞がアポトーシスを起こすことが確認され、そのピークは生後3日目であった。シュワン細胞のnativeな培養系によって、解析した結果、増殖期のシュワン細胞の生存は神経軸索との接着に依存することが明らかとなった。このアポトーシスによって、ミエリン形成時に軸索とシュワン細胞が1対1の対応するための細胞数の調整が行なわれる可能性が示唆された(文献4)。3)中枢神経系のミエリン形成細胞であるオリゴデンドログリアの発生、分化について、形態学的、免疫組織学的研究を行ない、ミエリン形成の過程の解析を行なった(文献5、6)。
免疫微小環境解析による加齢性EBV関連B細胞リンパ増殖異常症の病因・病態解明

加齢性EBウイルス(EBV)関連B細胞リンパ増殖異常症(AR-EBVLPD)は、高齢者において発症する予後不良なリンパ増殖性疾患です。免疫老化・加齢に伴う免疫不全が病因として推定されていますが、発症メカニズムは不明です。本研究ではAR-EBVLPDについて、免疫微小環境等が、免疫不全関連リンパ増殖異常症(I-EBVLPD)やEBV陰性びまん性大細胞型B細胞リンパ腫とどのように異なるかを中心に解析を行います。これらの解析により特にAR-EBVLPDやI-EBVLPDの発症に関連する分子病態の解明を目指します。
海藻中のポリフェノール化合物の安定性ならびに酸化還元性に関する研究

ポリフェノール化合物の分布を調べるため、緑藻、褐藻、紅藻の食用海藻からカテキンならびにその他のフラボノイド類を有機溶媒により抽出を行い、高速液体クロマトグラフにより測定を行った。この結果、陸上植物に比べて異なる成分を多く含むことが明らかになり、それらの抗酸化性に関しても作用機構が相違することが予測された。この抗酸化性の発現に関して、一般に報告されている茶やワインと比較したところ、これら陸上植物では抗酸化性を発現する成分が、酸化されて化学形を変えているのに対し、海藻から抽出された成分は現存の測定方法では形をかえておらず、両者には異なった成分もしくは作用機構が働いていることが推測された。これまでの研究成果は、2000年8月に行われたインドネシアにおける"The JSPSInternational Symposium on Fisheries Science in Tropical Area"で"Polyphenolic compoundsfrom seaweed:Distribution and first approach to findout useful effectas antioxidant"の表題で講演すると共に、2000年9月のドイツにおける"20th International Conference on Polyphenols"で"Antioxidant activity of polyphenolic compounds from seaweed and tea in oil emulsion model"の表題で発表を行い、現在論文作成中である。さらに、これら作用機構解明の一端として、鉄や銅などの酸化触媒に対するキレート形成効果に視点を置いて、海藻成分に茶やワインと同様のキレート形成効果があるのかなどを現在検討している。これまでのポリフェノール化合物の分布に関する研究は,主に陸上食物ならびにその加工品について行われ,水中に生息する海藻に関する報告はほとんど見当たらない。そこで食品由来のポリフェノール化合物の健康に対する効果を明らかにするため,研究例の少ない海藻などの水産植物における分布ならびに含量を測定した。食用ならびに非食用海藻(緑藻、褐藻、紅藻)からカテキンならびにその他のフラボノイド類を有機溶媒による抽出を行い、分布を調べた。この分析にはダイオードアレイ検出器を付属した高速液体クロマトグラフィーを用いて行い、それぞれの保持時間と吸収スぺクトルから化合物の種類を同定し、含量を求めた。これにより,海仁は野菜、果実などと全く異なるフラボノイド組成を持つことが明らかとなった。メタノール抽出によりポリフェノール粗抽出液を調製し、これを銅触媒によって酸化促進させた脂質エマルジョンに添加して、過酸化脂質を測定した。ポリフェソール粗抽出液により過酸化脂質の上昇が抑制され,抗酸化性を確認することができた。同時に溶液中に残存するポリフェノール化合物の成分変化を高速液体クロマトグラフィーで定量し,その残存率を求めた。同様の実験で,茶では特異的に減少したフラボノイド成分が海藻では減少せず、茶ポリフェノールと異なる抗酸化性が存在することが認められました。
高等植物の根の形態形成を制御する新規転写制御機構の構造的研究

植物の根の内部構造を決める2つのタンパク質SHRとSCRが、転写因子JKDと形成する三者複合体構造を決定した。SHRとSCRはヘテロ二量体を形成し、SHRの凹んだ溝にJKDがはまり込んでいた。このSHRに識別されるJKDの配列をSHR結合モチーフと命名した。JKDとよく似た転写因子は16種類あり、BIRDファミリーと呼ばれる。この中の13種がSHR結合モチーフをもち、SHR-SCR複合体と結合することがわかった。このことから、これらの相互作用を通してSHR-SCR複合体が複数の転写因子からなるネットワークを活性化することで、根の内部構造形成に必要な遺伝子を活性化する分子メカニズムが解明された。動物,植物,微生物などの多細胞生物にとって,細胞運命決定は普遍的で不可欠なプロセスである.動物細胞は原腸陥入のように,細胞がしばしば移動して器官形成が行われるが,細胞壁を持つ植物の細胞は移動することができない.そのため,植物では細胞の非対称分裂と分化による細胞運命は密接な関係のもと,厳密に制御されている.本研究では根端分裂組織の形態形成(パターン形成)において中心的な役割を果たすGRASファミリータンパク質SCR, SHRの立体構造解析を行い,原子レベルで形態形成を司る未知の転写制御機構を明らかにすることを目的としている.本年度はSCR, SHR複合体の結晶化に成功した。得られた結晶を用いて大型放射光施設SPring-8でのX線回折実験を行い、得られたデータを解析することで複合体の精密な立体構造を決定するに至った。本構造は高等植物で重要な役割を果たすGRASドメインの世界初の立体構造であり、得られた立体構造から生物学的な意義について機能解析を現在進めている。SCR, SHRは植物体内で転写活性化を行う分子として機能しているため、転写活性化に関与する分子との相互作用解析および活性解析を進めた。SCR, SHRと相互作用する転写因子MGPについて、種々のコンストラクトを作成して、in vitroでの相互作用解析を行った結果、相互作用領域を絞り込むことに成功した。これと並行してSCR, SHR, MGPの三者複合体の結晶化スクリーニングを行った結果、いくつかの結晶を得た。これらの結晶についてX線回折実験を行った結果、MGPの電子密度を観測することができなかった。そのためMGPと同様にSCR, SHRと相互作用するJKDについても同様に結晶化実験を進めている。多細胞生物では,1つの受精卵や幹細胞などの未分化細胞が“非対称に"細胞分裂を繰り返すことで,生じた娘細胞は異なる運命を辿り,胚発生や器官形成など経て,調和のとれた多細胞集団としての個体を生み出す.そのため,非対称分裂,分化後の娘細胞の細胞運命の調律は全ての多細胞生物において極めて重要である.特に植物細胞は細胞壁を有しており、細胞が移動できないため、細胞分裂・分化の運命は厳密に制御されている。本研究では植物の根の分化過程において,幹細胞性の維持,娘細胞の非対称分裂や運命決定において中心的な役割を担うGRASファミリータンパク質に属するSCR, SHRの構造生物学的研究によって、原子レベルで形態形成を司る未知の制御機構を明らかにすることを目的としている。昨年度までにSCR, SHR複合体の立体構造決定を行った。本年度はさらにZnフィンガー型転写因子MGPまたはJKDとの複合体について結晶化を行った。得られた結晶を用いて放射光施設SPring-8でのX線回折実験を行った。昨年度の研究では結晶中の転写因子の電子密度を観測することができなかったが、種々のコンストラクトを用いたスクリーニングの結果、1つの組み合わせで良好なデータを取得することができ、収集した回折データを解析することで複合体の立体構造決定に成功した。この結果を受けて立体構造情報をもとに機能解析実験を進めた。変異体を作成して、生化学実験から複合体形成に必要な残基を同定した。また、JKD, MGPのDNA結合について生物物理学的手法によって定量的な解析を行った。立体構造情報からの機能推定を現在進めている。多細胞生物では、受精卵や幹細胞などの未分化細胞が"非対称に"分裂を繰り返すことで生じた娘細胞は異なる運命をたどり、胚発生や器官形成などを経て、調和のとれた多細胞集団としての個体を生み出す。そのため、非対称分裂、分化後の娘細胞の細胞運命の調律はすべての多細胞生物において極めて重要である。特に細胞壁を持つ植物の細胞は移動することができないため、細胞の非対称分裂と分化による細胞運命は密接な関係のもと厳密に制御されている。本研究では植物の根の分化過程において幹細胞性の維持、娘細胞の非対称分裂や運命決定において中心的な役割を担うGRASファミリータンパク質に属するSHR、SCRの構造生物学的研究によって、原子レベルで形態形成を司る未知の制御機構を明らかにすることを目的としている。本研究においてGRASファミリータンパク質SHR、SCR複合体の立体構造をX線結晶構造解析によって明らかにした、その結果、GRASドメインどうしの特異的な認識機構の一端を明らかにした。また生物物理学的解析によって、GRASファミリータンパク質にはヘテロ二量体、ホモ二量体、単量体として存在しているものがあることを明らかにした。また、植物特有の転写因子IDDファミリータンパク質の1つJKDとSHR、SCRの三者複合体の立体構造を明らかにした。IDDファミリーはN末端に4つのZnフィンガーを有するが、立体構造解析によりJKDのZnフィンガーはSHRによって特異的に認識されていることが明らかになった。