hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
肺高血圧症の早期診断における新規酸化ストレスマーカーの探索的検討

肺動脈性肺高血圧症(PAH)は予後不良の病態であり、その早期診断、治療が必要となるが、その診断に有用な血中のバイオマーカーはまだ確立されていない。PAHの成因には酸化ストレスが関与していることから、本研究では、グルタチオン化蛋白とPGC-1αの2つの酸化ストレスに関わる蛋白がその指標となるかをPAHモデル動物で検討した。しかし、対照群の動物と比べ、明らかな変化が認められず、この2つの蛋白はバイオマーカーとしては適さないと考えられた。本年度は、研究計画に沿ってまず基礎研究を行った。肺高血圧症動物モデルとして、VEGF受容体拮抗薬/低酸素飼育による肺高血圧ラットを用いた。本モデルを2回作成し、右室圧、右室・肺重量や右室径などは、対照群ラットと比較して、有意に増加しており、また組織では肺動脈壁の肥厚や一部にplexiform lesionを認め、肺高血圧症モデルとして妥当であることを確認した。このモデルの肺組織にて、肺高血圧症診断のバイオマーカー候補として考えていたグルタチオン化蛋白よびperoxisome proliferator-activated receptor-γcoactivator-1 protein-α(PGC-1α)の抗体を用いて免疫染色を行った。グルタチオン化蛋白は、主に気管支上皮に強く発現し、PGC-1αは気管支上皮、間質、肺動脈周囲の細胞に発現していた。そこで肺組織におけるPGC-1αmRNAの発現をRT-PCRにて検討したところ、対照群に比較して、有意にその発現は増加していた。しかしながら、上記の免疫染色では、PGC-1αの発現は明らかには肺動脈壁(平滑筋細胞)には認めず、また他部位の発現も対照群との差が軽度であり、本症の発症機序への関与についてさらなる検討が必要であると考えられた。そこで、現在、Immunoblotにて、同蛋白の発現を検索し、さらに低酸素曝露早期には発現が増加していることも推測されたため、低酸素曝露期間を短くしたラットにて検討している段階である。本年度も、昨年に引き続き基礎研究を行った。昨年度はVEGF受容体拮抗薬/低酸素飼育による肺高血圧ラットを用いて、peroxisomeproliferation-activated receptor-γcoactivator-1α(PGC-1α)の肺組織における発現を蛋白、mRNAレベルで検討したが、一定の発現の差異を認めることができなかった。本モデルラットは長期の飼育(10週間)が必要となる比較的、慢性のモデルであり、PGC-1αは肺高血圧症が発症していく早期の段階で発現が増加していることが考えられたため、3週間の低酸素飼育におけるラットモデルを作成した。3週間の飼育では、肺動脈圧の上昇や肺動脈壁肥厚は認められたが、10週間で作成されるモデルと比較すると、それらの変化の程度は軽度であった。この3週間の低酸素飼育のモデルで、PGC-1αの発現をImmunoblotやPCRにて検討したが、対照群と比べ、低酸素飼育群では発現の程度に差が大きく、有意な差異は認められなかった。Immunoblotに関しては、複数の抗体で検討もしたが、抗体による差異も認めなかった。PGC-1αの細胞内情報伝達において上流にあるAMPK-activated protein kinase (AMPK)に関しても検討を行ったが、AMPKのリン酸化は対照群、低酸素飼育群において、有意な差はなかった。また肺動脈平滑筋細胞を用いたin vitroの系でも、Platelet-derived growthfactorによるPGC-1αの発現やAMPKのリン酸化などの検討を行ったが、明らかな差異が見られなかった。以上の結果より、PGC-1αが肺高血圧症の発症・進展に関与することは証明できなかった。今後は、他の酸化ストレスマーカーであるグルタチオン化蛋白について研究を進める予定である。研究実績の概要でも述べたように、酸化ストレスマーカーの候補としていたPGC-1αに関しては、仮説の通りの研究結果が得られなかったことや、低酸素飼育用のチャンバーに不備があり、モデル動物の作成過程でラットをうまく飼育できない状況が数回あったことが要因として挙げられる。一昨年度からの研究では、VEGF受容体拮抗薬/低酸素飼育による肺高血圧ラットを用いて、peroxisomeproliferation-activated receptor γcoactivator-1α(PGC-1α)について解析を行ってきた。長期飼育(10週間)のモデルでは、PGC-1αの蛋白、mRNAレベルでの発現に差異を認めず、短期飼育(3週間)にても検討したが、有意な発現の差異は認められなかった。そのため、昨年度、PGC-1αの肺高血圧症の発症・進展の機序に関与が低いと考えられたと報告した。その後、再解析を行ったところ、3週間飼育モデルにて、PGC-1αの蛋白発現の増加している傾向が見られた。PGC-1αのImmunoblotでは、2つのバンドが検出されたが、特に高分子量のバンドの発現に差異が大きい傾向であった。この結果に関し、さらなる検討を行うことも考慮している。本研究では、PGC-1α以外の酸化ストレスマーカーとして、グルタチオン化蛋白を候補として挙げており、現在、その解析に取り組んでいる。ヒト肺動脈平滑筋細胞を用いて、低酸素刺激(1%酸素濃度)や肺高血圧発症の機序に関与するplateletderived growthfactor (PDGF)刺激を行い、グルタチオン化蛋白の検討を行ったところ、低酸素刺激4時間後よりグルタチオン化蛋白の発現の増加がみられた。

本抗体を用いたImmunoblotでは、複数のバンドが検出されたが、この理由として複数の蛋白がグルタチオンにより修飾されていた可能性がある。そこで蛋白の探索を、発現の差異が大きい分子量に相当する蛋白に注目し、検討を行っている。今までにAkt、ERK、AMPK系に関して検討したが、低酸素による有意な増加は認めなかった。現在は、転写因子のNF-κBを制御するIκBに注目し、検討している段階である。酸化ストレスマーカーの候補として、当初、解析したPGC-1αは仮説通りの結果が得られなかったこと、低酸素飼育用のチャンバーの不備にてチャンバーの交換が必要となったこと、また実験に従事していた大学院生の転勤などがあり、研究の進捗に遅れが生じている。本年度も、昨年度に引き続き、基礎研究を実施した。今までに、VEGF受容体拮抗薬/低酸素飼育による肺高血圧症ラットを用いて、peroxisomeproliferation-activated receptor γcoactivator-1α(PGC-1α)の蛋白、mRNAレベルの発現を長期飼育(10週間)、短期飼育(3週間)にて検討してきたが、有意な差は得られなかった。また昨年度、その後の再解析にて、3週間飼育モデルにて、PGC-1αの蛋白発現が増加している傾向が見られ、特にImmunoblotにて2つのバンドの高分子量の発現に差異が大きい傾向であり、さらなる検討を行うことも考慮していると報告したが、追加解析の結果ではやはり有意な差異は得られなかった。PGC-1αは発現量も少なく、その差異を検出し、肺高血圧症の診断に用いるのは難しいと考えられた。他の酸化ストレスマーカーであるグルタチオン化蛋白の解析では、上記の肺高血圧症ラットにて、蛋白発現をImmunoblotや免疫染色で検討した。我々が作成したグルタチオン化蛋白の抗体を用いたImmunoblotでは、複数のバンドが検出され、肺高血圧症モデルと正常ラットでの有意な差異は見られず、また免疫染色でも、気管支上皮細胞での発現が強く、肺動脈ではその発現が弱く、肺高血圧症モデルと正常群での有意な差異は見られなかった。ラットのみでなく、低酸素飼育によるマウスモデルでも検討を行ったが、有意な差異は認められなかった。グルタチオンはユビキタスなペプチドで、様々な蛋白を修飾すると考えられ、また可逆性のあるグルタチオニル化による変化などもあり、本研究の結果からは、肺高血圧症の診断に用いるのは困難であると考えられた。肺動脈性肺高血圧症(PAH)は予後不良の病態であり、その早期診断、治療が必要となるが、その診断に有用な血中のバイオマーカーはまだ確立されていない。PAHの成因には酸化ストレスが関与していることから、本研究では、グルタチオン化蛋白とPGC-1αの2つの酸化ストレスに関わる蛋白がその指標となるかをPAHモデル動物で検討した。しかし、対照群の動物と比べ、明らかな変化が認められず、この2つの蛋白はバイオマーカーとしては適さないと考えられた。
形状記憶材料の変形に対する熱・力学経路の影響

形状記憶材料の変形特性の研究として、TiNi形状記憶合金およびポリウレタン系形状記憶ポリマーの応力ーひずみー温度関係を、種々の熱・力学経路について調べた。得られた主要な結果は、次の通りである。1.TiNi形状記憶合金について:(1)マルテンサイト変態および逆変態に関して、繰返し変形を受けることにより変態応力は低下し、変態温度は上昇する。これらの変態応力および変態温度の繰返し特性は、応力ー温度平面上の変態線の繰返し挙動で規定できる。(2)R相変態に伴う応力ーひずみ関係は、形状記憶熱処理温度に依存する。熱処理温度が低いほど変態応力は高い。応力ー温度平面上の変態領域は、R相変態と逆変態に関してほぼ一致する。(3)マルテンサイト変態およびR相変態に伴う応力ーひずみー温度関係は本研究で提案した構成式により表される。(4)マルテンサイト変態に比較して、R相変態の逆変態で発生する回復応力は、低温で与える変態応力に比べて非常に大きい。R相変態に伴う応力ーひずみ関係は、繰返し変形でほとんど変化しない。2.ポリウレタン系形状記憶ポリマーについて:(1)形状回復性と形状固定性は負荷時の温度に依存して著しく異なる。したがって、形状記憶ポリマー素子の機械的性質の評価を行うためには、材料の変形特性の熱・力学経路依存性の研究が重要である。(2)低温で負荷した場合、加熱で生じる回復変形は中間点ガラス転移温度の近傍で大きくなる。高温でのクリープ変形にはクリープ限度が存在する。繰返しに伴うクリープ特性の変化は小さい。
液状化モデルを用いた脆性材料の粘弾塑性変形・破壊解析

本研究では、複合材料であるコンクリートの変形・破壊性状をミクロな立場から解析的に取り扱い、従来、実験的な情報の整理によってしか得られていないコンクリートの構成則を、理論的な立場から検討し、より汎用的な力学モデルを構築することを目的として、粘塑性サスペンション要素法を、粘弾塑性解析に拡張し、この新しい解析手法を用いた硬化コンクリートの変形・破壊性状のシミュレーションを行うとともに、実験的な検証によってその妥当性を確認した。本研究の成果は以下のようにまとめられる。1.粘弾塑性サスペンション要素解析手法の開発および拡張現有の2次元プログラムを3次元に拡張するとともに、細部に至る多数の境界条件を整備した。また、この結果を基づいて、多軸載荷・除荷、高速繰返し載荷、粗骨材の破壊、鉄筋による拘束などの条件にも適用可能な汎用的な機能をプログラムに付加した。2.入力データの整備1.で開発したプログラムに用いる入力データを得るために、既往の実験結果を整理した。3.コンクリートの応力-ひずみ曲線の解析および検証実験コンクリート円柱供試体の各種応力下における破壊挙動のシミュレーションを行た。また、小型の供試体を用いて同条件で実験を行い、解析結果と比較した。4.アコースティック・エミッション(AE)現象の解析および検証(谷川)1.および2の成果より、コンクリートの破壊過程で生じるAE弾性波の発生シミュレーションを行い、引張破壊とせん断破壊の差異、カイザー効果の機構などについて解析的な検討を行った。5.コンクリートの構成モデルの提案以上の研究結果を総括し、コンクリートの変形・破壊性状に与える影響要因を整理した上で、汎用的な力学モデルを構築するための基礎的な検討を行った。1.粘弾塑性サスペンション要素解析手法の開発現有の2次元プログラムを3次元に拡張するとともに、細部に至る多数の境界条件を整備した。以下に、主な修正点を列挙する。1-a)サスペンション要素の破壊条件:単純な摩擦降伏関する破壊条件を非線形に拡張した。1-b)繰返し載荷:衝撃の伝播を扱うために、弾性および塑性領域に関する繰返し挙動の再現を試みた。1-c)自由度の拡張:3次元問題に対応し、節点の回転を考慮し、大変形問題に適用した。2-a)モルタルマトリックスの構成則:引張およびせん断の破壊条件。2-b)骨材とマトリックスの付着特性:特に付着破壊後のすべり挙動。3.コンクリートの応力-ひずみ曲線の解析および検証実験1.および2の成果より、コンクリート円柱供試体の破壊挙動のシミュレーションを行い、載荷速度、供試体の形状および寸法、粗骨材の位置のバラツキなどの要因が、その破壊過程や応力-ひずみ曲線に与える影響を検討した。平成8年度には以下のような検討を行った1.解析手法の拡張

平成7年度の研究成果より、漸増載荷時のシミュレーションによって入力パラメータの定量化が可能であることが確認されたので、この結果を基づいて、多軸載荷・除荷、高速繰返し載荷、粗骨材の破壊、鉄筋による拘束などの条件にも適用可能な汎用的な機能をプログラムに付加した。2.繰返し応力下のコンクリートの変形挙動の解析および検証実験繰返し応力下のコンクリートの変形・破壊挙動を本解析手法を用いて検討し、同条件で実験的な検証を行った。3.コンクリートの構成モデルの提案以上の研究結果を総括し、コンクリートの変形・破壊性状に与える影響要因を整理した上で、汎用的な力学モデルを構築するための基礎的な検討を行った。
代謝関連分子により制御される炎症性サイトカイン産生誘導の新規分子機構の解明

コレラ毒素(CT)は免疫アジュバントとしてTh17応答などを誘導するが、その作用機構は不明である。我々は、CTとリポ多糖(LPS)の刺激により、炎症性サイトカインIL-1βの産生が相乗的に誘導されることを見出した。本研究では、この分子機構の解明を目指す。網羅的遺伝子発現解析(トランスクリプトーム)と網羅的代謝産物解析(メタボローム)の統合解析により、CT刺激によりアルギニン代謝経路が活性化し、CTとLPSの刺激によりヒスタミン合成経路が活性化していた。今回、IL-1β産生誘導における、これらの代謝経路の機能的意義を明らかにしたのでここに発表する。免疫増強剤、すなわち免疫アジュバントの作用機序を解明することにより、癌や感染症など、種々の炎症性疾患に対する新しい治療法の開発に貢献することが期待される。コレラ毒素(Cholera toxin:CT)は強力な粘膜免疫アジュバントとして知られているが、その作用機序は不明な部分が多い。我々は、マクロファージ細胞株において、CTがLPSと協調して炎症性サイトカインIL-1betaの産生を誘導すること、この誘導が既報と異なるユニークな機構であることを示唆する知見を得た。この分子機構を明らかにするため、網羅的遺伝子発現解析(トランスクリプトーム)と網羅的代謝産物解析(メタボローム)のオミックス解析を行った。その結果、CT刺激により、アルギナーゼ-1(Arginase I:ArgI)の遺伝子発現レベルの上昇、細胞内アルギニンレベルの低下、そしてアルギニン代謝産物であるオルニチンの増加が認められた。このことから、CT刺激した細胞においてArgIを介したアルギニン代謝経路が活性化していることが示唆された。本研究では、この細胞内代謝経路依存的なIL-1beta産生誘導機構を明らかにする。平成27年度ではこれらの細胞内代謝経路に関与する機能分子候補の検討を行った。その結果、ArgIの阻害剤の添加、あるいはsiRNAによるArgIのノックダウンにより、CTとLPSによる協調的なIL-1beta産生が障害されることを見出した。以上の結果から、CTとLPSによる協調的なIL-1beta産生誘導に、ArgIを介したアルギニン代謝経路が関与することが示唆された。現在、ArgIなどの種々候補分子の遺伝子欠損マウスの解析を進めている。本研究の目的は、CTによる細胞内代謝経路依存的なIL-1beta産生誘導機構を明らかにすることである。平成27年度ではアルギニン代謝に関与する機能分子の検討を計画していた。当初の計画通り、アルギニン代謝に関与する機能分子としてArgIを同定した。以上の観点から、本研究は概ね順調に進展していると判断している。コレラ毒素(Cholera toxin:CT)は、免疫増強剤(免疫アジュバント)としてTh17型免疫応答や、免疫グロブリン産生を誘導することが知られている。しかし、その分子機構については不明な部分が多い。我々は、マクロファージ細胞株において、CTとリポ多糖(LPS)の共刺激により、炎症性サイトカインIL-1βの産生が相乗的に誘導されることを見出した。また、CT単独刺激によりアルギナーゼ-1(Arginase I,ArgI)を介したアルギニン代謝経路が活性化されること、CTとLPSの共刺激によりヒスチジン脱炭酸酵素(Histidine decarboxylase:Hdc)を介したヒスタミン合成経路が活性化されることも明らかにした。そこで本研究では、これらの細胞内代謝経路がCTとLPSの共刺激によるIL-1β産生誘導に関与するかどうか、検討を行った。H27年度ではアルギニン代謝経路に関与する機能分子について、H28年度ではヒスタミン代謝経路に関与する機能分子について検討した。マクロファージ細胞株において、ArgIのsiRNAやアルギニン代謝経路の阻害剤の添加により、CTとLPSによるIL-1β産生誘導が顕著に障害された。しかし、ArgI遺伝子欠損マウス由来のマクロファージにおいて、CTとLPSによるIL-1β産生誘導は正常に認められた。また、Hdc遺伝子欠損マウス由来のマクロファージにおいても、CTとLPSによるIL-1β産生誘導は正常であった。以上の結果から、CTとLPSによるIL-1β産生誘導は、アルギニン代謝経路やヒスタミン代謝経路には依存しないことが示唆された。マクロファージ細胞株において、CTとLPSによる共刺激により、アルギニン代謝やヒスタミン代謝以外に種々の代謝経路が活性化していることを確認しており、今後は、それらの代謝経路について検討を進める予定である。平成28年度では、当初の計画通り、種々機能分子の遺伝子欠損細胞株および遺伝子欠損マウスを作成あるいは入手して、候補分子のin vitro(ex vivo)およびin vivoの検討を行う予定である。

in vitro(ex vivo)の解析として、マウス腹腔浸潤細胞や骨髄由来マクロファージなどの種々の組織のマクロファージを用いて、CTとLPSによるIL-1beta産生能を調べる。in vivoの解析として、CTとLPSを腹腔内に投与し、腹水または血清中のIL-1betaレベルを解析する。また、CTと抗原の経口投与による抗原特異的免疫グロブリン産生誘導やT細胞の活性化、抗腫瘍免疫応答の解析なども計画している。免疫学
若年性認知症者が企業での就業を継続できる仕組みの提案

平成30年度は平成29年度に引き続き、若年性認知症を有する従業員への対応経験のある事業所への聞き取り調査を実施した。研究参加の募集は機縁法を用い、面接は施設の同意を得て人事担当または産業保健スタッフに行った。事業所の指定された場所で行い、時間は60-90分であった。半構成的面接法を用い、若年性認知症と診断された従業員に対して、症状に気づいてからの職場の対応や課題について尋ねた。面接結果は逐語録とし質的記述的に分析した。逐語録から、意味内容の類似性、差異性を検討し、サブカテゴリー、カテゴリーを抽出した。4県7事業所から聞き取りを行い、事業所の経験として7つのカテゴリーが抽出された。事業所の業種は製造業、保健衛生業、運輸交通業、人材派遣業などであった。抽出された経験は、<関わり方に戸惑う>、<受診勧奨や診断時の配慮>、<病名を伏せていることによる同僚の困惑>、<安心と安全を考慮した体制の構築>、<勤務が継続できるよう工夫>、<本人・家族との合意形成>、<日常生活の中での本人支援>であった。事業所では仕事内容の調整や、安心して働くための体制が整備されていた。一方で、診断名が伏せられた状態での同僚の困惑があり、社外と社内のシステムを利用した支援体制作りの必要性が示唆された。本結果は現在分析過程にあり、途中経過は第77回日本公衆衛生学会総会で発表した。また平成28年度、29年度に行った事業所調査結果については学術誌に投稿中である。予定していた調査結果を投稿し、公表する準備ができた。聞き取り調査は、企業の協力がえられにくい状況であるが8事業所からの聞き取りができ、学会発表準備を進めている。若年性認知症を有する従業員への対応経験について、学会発表及び論文投稿準備を進める。また、研究結果を基にした若年性認知症の従業員への支援に関するパンフレットを作成し、公表する。平成28年度は、若年性認知症の労働者に関する企業の実態調査を行った。3県の産業保健総合支援センターに対して、企業への調査用紙送付に関する研究協力を依頼し、同意の得られた1県で調査を実施した。対象県において労働者50人以上の事業所の、若年性認知症に対する認識と就労支援体制の現状、企業に必要な情報や社会的資源を明らかにする。また若年性認知症の就労者への対応経験がある事業所に聞き取り調査を行い、具体的な対応の状況と課題を明らかにすることを目的として調査を行った。対象企業の人事担当部署に依頼文および調査用紙を送付し、就労支援に関わる担当者への調査用紙への記入を依頼した。郵送留め置き式調査法を用い、回収は郵送により行った。調査項目は、1基本属性、2従業員が利用できる制度と職場内の連携、3若年性認知症に関する認識、4若年性認知症者の就労支援、5聞き取り調査への同意の有無である。14と5は別送にて回収した。対象企業1299箇所に送付し、322箇所から回答があった。回答者は衛生管理者、人事担当者が半数以上であった。事業所分類は本社が約5割であった。若年性認知症について知っていると回答したのは51.9%であり、検討されていたのは1.56%であった。若年性認知症または認知機能の低下を伴う者の雇用経験があったのは5箇所であった。今後調査結果の分析を進め学会等での報告を行う予定である。また、聞き取り調査への同意については、1箇所のみ同意の回答があった。他県の産業保健総合支援センターからの研究協力が得られず、調査は研究機関所在地の1県のみでの実施となったが、実態調査を実施し分析を行っている。平成28年度末の調査対象施設1292箇所に対して、平成29年度は葉書による督促を行い、回答数の総計は357となった(回収率27.7%)。そのうち、若年性認知症の従業員の就労経験がある事業所は計7(2.0%)であった。回答のあった全事業所の平均従業員数は50ー99人が46.2%、100-229人が34.3%であり、業種は多い順に製造業30.6%、保健衛生業17.7%、商業12.9%であった。雇用している障害者がいる63.8%、治療中もしくは障害者雇用されている従業員が利用できる事業所内の制度は短時間勤務48.6%、治療休暇制度34.1%であった。回答者は衛生管理者53.7%、人事管理者48.3%であり、若年性認知症について知っている49.6%、聞いたことはあるが理解していない44.3%、知らない6.1%であり、何らかの情報に接したことがある者がほとんどであった。若年性認知症について管理職及び一般従業員に研修や資料提示・周知を行っているのは5.2%、今後研修を行う予定があると解答した事業所は9.6%であり、企業内での取り組みはあまり行われていなかった。また、従業員が若年性認知症を発症した場合に雇用を継続する可能性は、51.4%が低いと回答した。可能性については、事業所の規模、治療中もしくは障害者雇用されている従業員が利用できる制度があること、職場内の連携などが有意に関係していた。

これらの結果は第76回日本公衆衛生学会総会にて発表し会場との意見交換を行った。また、若年性認知症の従業員の就労経験がある事業所には、職場内での対応について2例聞き取りを行った。事業所への調査を実施し、結果を第76回日本公衆衛生学会総会で報告した。聞き取り調査は倫理的な理由で情報提供が難しいという回答があり、対象は得にくい状況であるが数件でも実施が出来ており、貴重な情報が得られている。平成30年度は平成29年度に引き続き、若年性認知症を有する従業員への対応経験のある事業所への聞き取り調査を実施した。研究参加の募集は機縁法を用い、面接は施設の同意を得て人事担当または産業保健スタッフに行った。事業所の指定された場所で行い、時間は60-90分であった。半構成的面接法を用い、若年性認知症と診断された従業員に対して、症状に気づいてからの職場の対応や課題について尋ねた。面接結果は逐語録とし質的記述的に分析した。逐語録から、意味内容の類似性、差異性を検討し、サブカテゴリー、カテゴリーを抽出した。4県7事業所から聞き取りを行い、事業所の経験として7つのカテゴリーが抽出された。事業所の業種は製造業、保健衛生業、運輸交通業、人材派遣業などであった。抽出された経験は、<関わり方に戸惑う>、<受診勧奨や診断時の配慮>、<病名を伏せていることによる同僚の困惑>、<安心と安全を考慮した体制の構築>、<勤務が継続できるよう工夫>、<本人・家族との合意形成>、<日常生活の中での本人支援>であった。事業所では仕事内容の調整や、安心して働くための体制が整備されていた。一方で、診断名が伏せられた状態での同僚の困惑があり、社外と社内のシステムを利用した支援体制作りの必要性が示唆された。本結果は現在分析過程にあり、途中経過は第77回日本公衆衛生学会総会で発表した。また平成28年度、29年度に行った事業所調査結果については学術誌に投稿中である。予定していた調査結果を投稿し、公表する準備ができた。聞き取り調査は、企業の協力がえられにくい状況であるが8事業所からの聞き取りができ、学会発表準備を進めている。若年性認知症を有する労働者を経験した企業からの聞き取り協力について、同意を得られたのは1箇所であった。そのため、事例の聞き取り対象企業の選定方法を検討する必要がある。平成29年度は実態調査結果をまとめると同時に、聞き取りを行う対象企業の選定方法を再検討して、事例収集を行う。平成30年度は聞き取り調査を継続して行い、企業における支援の実情を質的にまとめて学会発表を行う。平成29年度調査終了分は論文投稿し公表する。若年性認知症を有する従業員への対応経験について、学会発表及び論文投稿準備を進める。また、研究結果を基にした若年性認知症の従業員への支援に関するパンフレットを作成し、公表する。調査協力予定をしていた機関からの協力が得られず、調査対象事業所数が半分以下となったため、次年度使用に繰り越しを行った。(理由)聞き取り調査の協力施設が得られなかったため、次年度使用に繰り越しをすることになった。(使用計画)聞き取り調査のための交通費、逐語録作成、学会発表、論文投稿等に使用する予定である。聞き取り調査の対象の獲得に時間を要し、事例ごとのまとめが実施途中である。次年度はわかりやすく、利用しやすい、若年性認知症の従業員への支援に関するパンフレットを作成し、事業所に公表する予定である。実態調査結果のまとめ、データ入力等に係る謝金、聞き取り調査に係る交通費、テープ起こし費、学会発表・論文投稿等に使用する予定である。
５－ＡＬＡ投与後蛍光観察による胃癌手術中の新しいリンパ節転移診断法の開発

5-アミノレブリン酸(5-ALA)はヘム合成の前駆体物質であり、内因性のアミノ酸である。癌細胞に投与すると蛍光物質であるプロトポルフィリンIX(PpIX)に代謝され蓄積する。この性質を用いて胃癌細胞株に5-ALAを投与するとPpIXの蛍光が観察された。また、EGFPを導入した細胞株を用いたマウスモデルに5-ALAを投与するとEGFPの蛍光を認めた部位にPpIXの蛍光が観察された。胃癌患者14名に5-ALAを内服してもらい、切除標本を用いたリンパ節の蛍光観察を行い、病理組織診断と比較すると、正診率は92.4%であり、ROC曲線では0.832と高い診断能を有することが分かった。5-ALA(5-アミノレブリン酸)はヘムの前駆体物質であり内因性の物質である。また、様々な食品にも含まれる生体にとって安全性の高いアミノ酸である。EGFPでラベルした癌細胞株を用いたマウスリンパ節転移モデルを作製し、250mg/kgの5-ALAを尾静脈より静脈注射し、転移リンパ節を観察すると、GFPの蛍光を認めるリンパ節にPpIXの蛍光が確認された。動物実験で5-ALAを用いた蛍光でリンパ節転移診断が可能な事が確認されたことと、5-ALAは脳神経外科領域・泌尿器科領域で臨床応用されていることから、当院倫理審査委員会の承認を得た後、臨床応用を行った。書面による同意を得た、術前にリンパ節転移が疑われる進行胃癌患者14例に対して、術前に5-ALAを内服してもらい切除標本に対して蛍光観察を行った。HE染色による病理診断との比較では、正診率が84%であった。いずれの症例でも明らかな副作用は認めなかった。偽陽性の原因としてはリンパ濾胞への集積が考えられた。リンパ濾胞はリンパ節の周囲に均等に並んでおり、また正円から楕円形であることよりその形態を加味すると、正診率92.4%となった。また、PpIXの蛍光は635nmにピークを有する赤色の蛍光であるため、R/(R+G+B)ratioを測定することで客観的な値を測定した。切除したリンパ節の蛍光画像を用いてR/(R+G+B)ratioを測定すると、転移リンパ節は優位に非転移リンパ節と比較し高値を示した。5-ALA(5-アミノレブリン酸)はヘムの前駆体物質で内因性のアミノ酸である。また、様々な食品にも含まれる安全性の高い物質である。これを投与すると癌細胞内で蛍光物質であるプロトポルフィリンIX(PpIX)に代謝され蓄積する。EGFPでラベルしたヒト胃癌細胞株MKN-45を用いた胃癌リンパ節転移モデルを作製し、5-ALAを尾静脈より250mg/kg投与し、4時間後に観察すると転移リンパ節でのEGFPの蛍光を認める部位に一致してPpIXの蛍光を認めた。HE染色を行うと転移である事も確認できた。5-ALAは脳外科領域や泌尿器科領域で、臨床応用され、また、脳グリオーマに対する術中診断薬として薬事承認された。そこで、本学倫理審査委員会の承認後、胃癌患者に術前に20mg/kgの5-ALAを内服してもらい、切除標本に対する蛍光リンパ節転移診断が有用であるかを病理結果と比較することで検討した。全14人中144リンパ節を対象とし、蛍光画像によるR/(R+G+B)比で診断した。その結果正診率は92.4%であり、ROC曲線では0.832と高い診断能を有することが分かった。転移巣が微小な例やコラーゲン線維が豊富なリンパ節では診断は困難であったり、リンパ濾胞が偽陽性となる症例も認めたが、その形態から診断する事が可能であった。今後はLinear unmixing法でコラーゲンなどの自家蛍光を取り除く事により診断能の向上を検討中である。(1)ヒト胃癌細胞株に5-aminolevulinic acid(5-ALA)を投与し、癌細胞内にPpIX蓄積することを確認する事を目的とした。MKN-45に10mMの5-aminolevulinic acid(5-ALA)を投与し、3時間後にPpIXの蛍光を認める事を確認した。また、BALB/cヌードマウスに移植した腫瘍も250mg/kgの5-ALAを静脈注射後で腫瘍にPpIX蓄積による蛍光が検出される事を確認していったところ、投与4時間後から9時間後で腫瘍に高いPpIXの蛍光が検出される事を確認した。

(2)5-ALAは内因性の物質であり、また、様々な食品にも含まれる生体にとって安全性の高いアミノ酸である。さらに、脳神経外科領域や泌尿器科領域で臨床応用されているため、臨床応用に向け当院倫理審査委員会の承認を得た。書面による同意を得た、術前にリンパ節転移が疑われる進行胃癌患者10例に対して、術前に5-ALAを内服してもらい切除標本に対して蛍光観察を行った。HE染色による病理診断との比較では、正診率が85%であった。いずれの症例でも明らかな副作用は認めなかった。今後は症例数を増やし、偽陽性、偽陰性の原因追究と、その解決策を探求していく。さらに、術中に切除する事無くリンパ節転移診断を行う方法を探るため、マウスモデルを用いて検討していく。5-ALAを投与する事により癌細胞株にPpIXが蓄積し、その蛍光を検出することができた。EGFPをラベルした癌細胞株をマウスに移植し、リンパ節転移モデルを作製すると、GFPの蛍光とPpIXの蛍光が一致する事が確認された。また、マウスモデルを用いて至適投与時間ならびに至適投与量を検討し、マウスでは投与後4時間以降、250mg/kgが良好な結果であることが確認された。マウスモデルで5-ALAを用いたリンパ節転移診断が簡便な方法ながら高い診断脳を有する事が確認された。この結果により臨床応用することとした。当院医学倫理審査委員会で承認された後、臨床研究も開始し、現在14例の症例に施行した。非転移リンパ節であってもリンパ濾胞にPpIXが集積する症例があったが、その形態により高い診断能を有する事が確認された。当初の計画では、マウスに対する動物実験のみ行う予定であたったが、臨床応用を開始し、その問題点と改善点を検討している点で計画時より進展しているものと考えられる。5-ALAを投与する事により胃癌細胞株にPpIXが蓄積し、その蛍光を検出することができた。さらに、マウスモデルに対する実験のみならず、当院医学倫理委員会で承認され、臨床研究も開始しているため、当初の計画以上に進展していると考えられる。動物実験では問題にならなかったが、実臨床では癌のヘテロゲナイティーにより、転移リンパ節での蛍光診断は100%とはならなかった。通常の蛍光観察のみでは正診率が84%であり、リンパ濾胞の形態を加味すると94.2%まで改善した。しかし、症例によっては蛍光強度が異なり、また、コラーゲン線維、脂肪組織などの自家蛍光によりPpIXの蛍光を視認する事が困難な事がある。そこで今後は、さらに症例を蓄積し、高感度CCDカメラを導入し、微小リンパ節転移診断の可能性についても検討する。Linear unmixing等を行う事で、その自家蛍光を取り除き、PpIXの蛍光のみを画像化できるように試みる。また、蛍光スペクトルを測定し、PpIX由来の蛍光と判断することでその診断能を高めることを目指す。微小リンパ節転移に関しては、通常のHE染色では診断困難となる可能性があり、RT-PCRも同時に行いその診断率を検討する。動物実験では問題にならなかったが、臨床研究では、(1)炎症がある症例のリンパ節は偽陽性となる事がある。その理由はリンパ濾胞へ集積するためである。また、(2)微小転移に関してもヒトでは線維組織による自家蛍光ニマスクされ、PpIXの検出が困難な事がある。今後は上記(1)に関しては形態により解決可能と考えられる。(2)に関してはlinear unmixingを行う事で解決可能と考える。
シンク器官におけるタンパク質リン酸化による機能発現制御機構の解析

光合成により固定された炭水化物は、植物のシンク器官(特に貯蔵器官)へ送られ貯蔵物質として蓄積される。イネSPKは、登熟中期の未熟種子特異的に強く発現するカルシウム依存プロティンキナーゼである。今年度の研究で以下の結果が得られた。1.SPKはショ糖合成酵素をリン酸化する活性を有した。また、自己リン酸化活性が認められた。2.未熟種子粗抽出物の中に、少なくとも3種のタンパク質がSPKによりリン酸化されることが明らかとなった。免疫沈殿実験により、そのうちの2つはSPK自身とショ糖合成酵素であると考えられた。SPKはこれらを効率よくリン酸化することが明らかとなった。3.ショ糖合成酵素はN末端領域のセリンがリン酸化されて活性化されるとの報告がある。部位特異的置換により、このセリンを置換した変異型ショ糖合成酵素を作成した。SPKによるリン酸化反応は、変異型ショ糖合成酵素では認められなかったため、SPKはショ糖合成酵素をリン酸化し活性化する制御因子の一つであることが明らかとなった。4.レポーターアッセイやin situハイブリダイゼーションの結果、SPK遺伝子は、胚乳特異的な遺伝子発現が明らかとなった。アンチセンスSPKイネでは未熟種子のデンプン生合成が阻害されてショ糖が蓄積するが、SPKはデンプン生合成経路の初期反応であるショ糖合成酵素の活性化因子であり、アンチセンス植物では、この酵素の活性化が阻害されるためショ糖の段階でとどまったのであろうと考えられた。
甘味・うま味受容体T1Rファミリーの転写制御メカニズムの解明

味覚障害は高齢者に多い感覚器障害の一つであり、近年その患者数の増加が認められている。味覚障害の原因の一つとしては、味覚受容体遺伝子での亜鉛などが関わる転写制御機構の機能不全が推定される。しかしながら、味覚受容体遺伝子の転写制御機構は明らかになっていない。そこで、本研究では甘味、うま味受容体を発現している細胞株を用いて、甘味、うま味受容体遺伝子の転写制御領域の解析、およびエピジェネティク解析を行う。本研究により、甘味、うま味受容体の転写制御機構を明らかにし、味覚受容体の減少による味覚障害の発症機序の解明を試みる。
経皮吸収促進薬を利用した貼付型局所麻酔薬の開発ならびに臨床研究

市販の貼付用局所麻酔剤ペンレスTMは,鎮痛強度,持続時間が不足するため,帯状庖疹後神経痛(以下,PHNと略)やcomplex regional pain syndrome(以下,CRPSと略)などのアロディニア対策としての使用は難しい.先に開発した10%リドカイン水性ゲル(以下,L-ゲルと略)は,各施設で臨床応用されているが,L-ゲルは長時間連続貼付時に皮膚発赤,表皮剥離が問題となることがある.今回我々はL-ゲルと共に,アミド型局所麻酔剤を使用した10%ジブカインゲル(以下,D-ゲルと略)を用いて臨床応用を試みた.(1)基礎実験:健康なボランティアを対象として,擦過傷のない片側前腕にL-ゲル・D-ゲルをそれぞれ約0.3gを塗布した.1)pin-prick testによりanesthesia発現時間を測定した.両ゲルともに6090分を要した.2)テガダームTM貼付を2,5,12,24時間に設定した.除去後の効果持続,表皮の変化を測定した.両ゲルとも除去60分までは知覚低下(5/10以下)が持続した.除去時の表皮の状態は異なっていた(L-ゲル;表面凹凸のある白い隆起面,D-ゲル;薄い紅斑).L-ゲル除去後,表皮剥離が認められた.(2)臨床応用:12症例(PHN8,CRPS 4)のアロディニア改善を目的にL-ゲル(6)・D-ゲル(10)を患部に貼付した.12症例中4例(PHN 2,CRPS 2)は,時期を変えて両ゲルを使用し同一症例で比較した.貼付中アロディニアが半減したのは,L-ゲル2例(2/6),D-ゲル8例(8/10)であった.両ゲルを使用した4例のうち,2例(PHN 1,CRPS 1)はD-ゲル使用時のみアロディニアが半減した.1例(PHN)は鎮痛効果に差は無かったが,L-ゲル使用後水庖形成を生じ使用中止した.他の1例(CRPS)は共に無効であった.貼付後の発赤,表皮剥離,色素沈着は両ゲルともに認められた.結論:L-ゲルよりも,D-ゲルの方がアロディニア改善に有用と思われた.市販の貼付用局所麻酔剤ペンレスTMは,鎮痛強度,持続時間が不足するため,帯状庖疹後神経痛(以下,PHNと略)やcomplex regional pain syndrome(以下,CRPSと略)などのアロディニア対策としての使用は難しい.先に開発した10%リドカイン水性ゲル(以下,L-ゲルと略)は,各施設で臨床応用されているが,L-ゲルは長時間連続貼付時に皮膚発赤,表皮剥離が問題となることがある.今回我々はL-ゲルと共に,アミド型局所麻酔剤を使用した10%ジブカインゲル(以下,D-ゲルと略)を用いて臨床応用を試みた.(1)基礎実験:健康なボランティアを対象として,擦過傷のない片側前腕にL-ゲル・D-ゲルをそれぞれ約0.3gを塗布した.1)pin-prick testによりanesthesia発現時間を測定した.両ゲルともに6090分を要した.2)テガダームTM貼付を2,5,12,24時間に設定した.除去後の効果持続,表皮の変化を測定した.両ゲルとも除去60分までは知覚低下(5/10以下)が持続した.除去時の表皮の状態は異なっていた(L-ゲル;表面凹凸のある白い隆起面,D-ゲル;薄い紅斑).L-ゲル除去後,表皮剥離が認められた.(2)臨床応用:12症例(PHN8,CRPS 4)のアロディニア改善を目的にL-ゲル(6)・D-ゲル(10)を患部に貼付した.12症例中4例(PHN 2,CRPS 2)は,時期を変えて両ゲルを使用し同一症例で比較した.貼付中アロディニアが半減したのは,L-ゲル2例(2/6),D-ゲル8例(8/10)であった.両ゲルを使用した4例のうち,2例(PHN 1,CRPS 1)はD-ゲル使用時のみアロディニアが半減した.1例(PHN)は鎮痛効果に差は無かったが,L-ゲル使用後水庖形成を生じ使用中止した.他の1例(CRPS)は共に無効であった.貼付後の発赤,表皮剥離,色素沈着は両ゲルともに認められた.結論:L-ゲルよりも,D-ゲルの方がアロディニア改善に有用と思われた.市販の貼付用局所麻酔剤ペンレス^<TM>は鎮痛強度・持続時間が不足するため,帯状疱疹後神経痛(以下,PHNと略)や反射性交感神経性萎縮症(以下,RSDと略)などの疼痛コントロールへの応用が難しい.そのため各施設では10%リドカイン水性ゲル(以下,L-ゲルと略)による臨床研究が行われている.L-ゲルは長時間連続貼付時に皮膚発赤,表皮剥離が問題となることがあるため,我々はL-ゲルと共にアミド型局所麻酔剤dibucaineを用いた10%ジブカインゲル(以下,D-ゲルと略)を用いた臨床応用を試みた.使用材料:L-ゲル,D-ゲル,密封貼付用シール(テガダーム^<TM>).(1)基礎実験:健康なボランティアを対象.擦過傷のない片側前腕にL-ゲル・D-ゲルをそれぞれ約0.39を貼付.

1)pin-prick testにより無痛が得られる時間を測定...L-,D-ゲルともに6090分.2)貼付を2,5,12,24時間に設定.除去後の鎮痛効果持続・表皮の変化を測定...L-,D-ゲル共に除去後60分までは知覚低下(5/10以下)持続.L-ゲルは,ゲル貼付面積よりも広い知覚低下域が認められた.除去時の表皮の状態は異なっていた(L-ゲル:表面凹凸のある白い隆起,D-ゲル;薄い紅斑).L-ゲル貼付跡は抜去数日後表皮の剥離がみられた.貼付によるかゆみ,痛みの出現はなかった.(2)臨床応用:1)右下肢RSDの患者の足部にL-ゲル,D-ゲル約29を別々に約10時間貼付:L-ゲル:除去後約4時間で鎮痛効果消失,D-軟膏;除去後10時間以上鎮痛効果(painscore5/10以下)を認めた.2)PHNの患者にL-ゲル(2例),D-ゲル(2例)を使用.L-ゲル;2例とも貼付時の鎮痛効果を得たが,1例はかゆみ出現のため1週間以上の連用は不能であった.D-ゲル;数回の連用で抜去後も疼痛緩和が得られた.市販の貼付用局所麻酔剤ペンレスTMは,鎮痛強度,持続時間が不足するため,帯状疱疹後神経痛(以下,PHNと略)やcomplex regional pain syndrome(以下,CRPSと略)などのアロディニア対策としての使用は難しい.先に開発した10%リドカイン水性ゲル(以下,L-ゲルと略)は臨床応用されているが,L-ゲルは長時間連続貼付時に皮膚発赤,表皮剥離が問題となることがある.今回我々はL-ゲルと共に,アミド型局所麻酔剤を使用した10%ジブカインゲル(以下,D-ゲルと略)を用いて臨床応用を試みた.(1)基礎実験:健康なボランティアを対象.擦過傷のない片側前腕にL-ゲル・D-ゲルをそれぞれ約0.3gをテガダームTMを用いて密封貼付した.1)pin-prick testによりanesthesia発現時間を測定した.両ゲルともに6090分を要した.2)貼付を2,5,12,24時間に設定.除去後の効果持続,表皮の変化を測定した.両ゲルとも除去60分までは知覚低下(5/10以下)が持続した.除去時の表皮の状態は異なっていた(L-ゲル;表面凹凸のある白い隆起面,D-ゲル;薄い紅斑).L-ゲル除去後,表皮剥離が認められた.(2)臨床応用:12症例(PHN8,CRPS4)のアロディニア改善を目的にL-ゲル(6),D-ゲル(10)を患部に貼付した.12症例中4例(PHN2,CRPS2)は,時期を変え両ゲルを使用し同一症例で比較を行した.貼付中アロディニアが半減したのは,L-ゲル2例(2/6),D-ゲル8例(8/10)であった.両ゲルを使用した4例のうち,2例(PHN1,CRPS1)はD-ゲル使用時のみ疼痛が半減した.1例(PHN)は鎮痛効果に差はなかったが,L-ゲル使用後水疱形成を生じ使用を中止した.他の1例(CRPS)はともに無効であった.貼付後の発赤・表皮剥離・色素沈着は両ゲルともに認められた.結論:L-ゲルよりも,D-ゲルの方がアルディニア改善に有用と思われた.
イリジウム酸化物におけるワイル電子による異常電磁気応答の探索

1)自発的対称性の破れによる異常な電荷・熱輸送および光学応答の探索Nd2Ir2O7,(Nd0.5Pr0.5)2Ir2O7において、反強磁性転移温度直下の狭い温度領域で生じるワイル半金属相でベリー位相による異常ホール効果を観測した。正味の自発磁化はIrサイトあたり1ミリmu_B程度の極めて小さい値であるが、異常ホール伝導度は強磁性半導体と同程度であることが分かった。理論計算の結果、自発磁化成分ではなく反強磁性の秩序パラメータによってベリー位相が決まっていることが明らかになった。2)強相関ディラック電子の量子現象探索超高圧合成法を用いて、強相関ディラック半金属であるペロフスカイト型イリジウム酸化物CaIrO3の単結晶合成に成功した。希釈冷凍機を用いて低温磁場下での磁気輸送特性の測定を実施した。その結果、0.12Kにおいて60,000cm2/Vsを超える高い移動度を示すディラック電子が生じていることを示した(既知のバルク酸化物半導体の中では最大の値)。また、磁気抵抗にディラック線ノードバンドに固有の2種類のシュブニコフドハース振動が現れることが分かった。電子相関効果を正確に取り込んだバンド計算を行ったところ、実験結果を整合することが分かった。同系列のSrIrO3においてIrをSnで部分的に置換する事で半金属・絶縁体転移が生じる事を示した。ここでは多結晶試料を超高圧合成法を用いて合成した。光学伝導度の測定によって転移に伴って1eVのスケールで電荷ダイナミクスが変化することを明らかにした。1)自発的対称性の破れによる異常な電荷・熱輸送および光学応答の探索Nd2Ir2O7,(Nd0.5Pr0.5)2Ir2O7の単結晶育成が順調に進み、反強磁性相における磁気輸送特性の評価が実施できた。特に反強磁性転移温度直下のワイル半金属相で異常ホール効果が生じることを検出することに成功した。2)強相関ディラック電子の量子現象探索精密物性測定が可能な高品質のペロフスカイト型イリジウム酸化物AIrO3(A=Ca,Sr)の合成が順調に進み、磁気輸送特性の評価を実施できた。パイロクロア型Eu1-xCaxIr2O7においてフィリング制御方モット転移の近傍でワイル半金属相の探索を行う。また、ワイル半金属相、常磁性ゼロギャップ相における熱輸送特性の評価を推進する。ペロブスカイト型CaIrO3において電子相関効果による電子状態の制御、カイラル異常などの異常な電磁気応答の探索を推進する。具体的には磁気輸送特性の圧力依存性を調べることで静水圧によって一電子バンド幅を制御した際のディラックバンドの変化を明らかにする事を計画している。また、パルス強磁場中での磁気輸送特性を調べることで量子極限における量子輸送の知見を得ることを計画している。

ペロブスカイト型CaIrO3において電子相関効果による電子状態の制御、カイラル異常などの異常な電磁気応答の探索を推進する。具体的には磁気輸送特性の圧力依存性を調べることで静水圧によって一電子バンド幅を制御した際のディラックバンドの変化を明らかにする事を計画している。また、パルス強磁場中での磁気輸送特性を調べることで量子極限における量子輸送の知見を得ることを計画している。
胸腺プロテアソームによるＴ細胞の正の選択機構の解明

これまで免疫プロテアソーム発現マウス胎仔由来線維芽細胞(MEF)と胸腺プロテアソーム発現MEFを用いて胸腺プロテアソームがもつタンパク質切断活性の評価および胸腺プロテアソームが作り出すMHCクラスI結合ペプチドレパトアを解析することで、胸腺プロテアソームがTCRと弱い相互作用を有するペプチドレパトアを産生することでT細胞の正の選択を正常に誘導することを示唆した。実際にマウスの胸腺から精製したcTECからMHCクラスI結合ペプチドを精製し、質量分析を用いてペプチドのアミノ酸配列を同定することで、野生型マウスおよびβ5tノックアウトマウス間で抗原提示されているペプチドの違いに迫ることを試みた。この実験は実際にマウスの生体内でT細胞の正の選択に関わるペプチドを直接同定することを目的としており、本研究課題の最終目的であるT細胞の正の選択の分子メカニズムの解明に大きく寄与する。現在、解析に用いるcTECの精製、MHCクラスI結合ペプチド精製の条件検討を終え、最終的な解析に向けてcTECを回収している段階である。また条件検討の段階で野生型マウスおよび胸腺プロテアソーム欠損マウスのcTEC上のMHCクラスI結合ペプチドを高い精度で100本程度同定している。一方で上記のMEFより精製したMHCクラスI結合ペプチドに関して定量を行い、両MEF間において定量値として5倍以上の差が見られる胸腺プロテアソーム発現細胞特異的および免疫プロテアソーム発現細胞特異的MHCクラスI結合ペプチドを同定している。今後、これらのペプチドに蛍光基質を付加した合成ペプチドの作製や化学的な修飾の付加により胸腺プロテアソーム特異的活性測定用基質および阻害剤の作出を試みる。28年度が最終年度であるため、記入しない。胸腺プロテアソーム特異的に含まれる触媒サブユニットであるβ5t欠損マウスではCD8+T細胞の正の選択が正常に行われず、CD8+T細胞が野生型マウスに比べて20%程度まで著減する。胸腺プロテアソームは正の選択が行われる場である胸腺皮質上皮細胞(cTEC)に特異的に発現しており、β5t欠損マウスのcTECにおいては胸腺プロテアソームの代わりに免疫プロテアソームが発現している。このことは胸腺プロテアソームと免疫プロテアソームが作り出すペプチドレパトアは異なっており、胸腺プロテアソームが作り出すペプチドレパトアのみが正の選択を可能にすることを示唆する。このため本研究においては胸腺プロテアソームが作り出すペプチドレパトアが有するモチーフを明らかすることは最重要課題である。本課題を達成するためには最終的にマウスの胸腺よりcTECを精製し、実際にその細胞表面上のMHC class I結合ペプチドを野生型マウスとβ5t欠損マウスで比較を行うことが必須であるが、1匹のマウスよりcTECは10,000個程度しか得られず、従来型の質量分析装置では解析が実現しなかった。しかし、orbitrap型の高感度な質量分析装置を用いてマウスから単離したcTEC500,000個よりMHCクラスI結合ペプチドの同定を試みたところ、400本程度のペプチドを検出することができた。T細胞は自己と非自己を識別することにより、生体を様々な異物から守っている。このT細胞の自己と非自己の識別の教育は胸腺におけるT細胞の分化過程で行われる。胸腺は皮質と髄質に大別することができる。胸腺皮質上皮細胞(cTEC)では正の選択により、自己を識別可能な有用な胸腺細胞を選別し、続く胸腺髄質上皮細胞(mTEC)では負の選択により、自己を強く認識する自己反応性の胸腺細胞を排除する。これら二つの過程によりT細胞は自己と非自己の識別を確立する。cTECでは胸腺プロテアソームと呼ばれるcTECのみで発現するMHCクラスI結合ペプチド産生酵素が正の選択に必須の役割を担っている。正の選択は胸腺細胞のT細胞受容体(TCR)とcTECにより抗原提示されるペプチドとの相互作用に基づき行われると考えられており、胸腺プロテアソームが作り出すペプチドレパトアが正の選択に必須の役割を果たしていることが示唆される。これまで胸腺プロテアソームを発現するMEF作製し、これを用いて胸腺プロテアソームが作り出すペプチドレパトアの解析を徳島大学、東京都医学研究所との共同研究により進めてきた。この結果、胸腺プロテアソームが、TCRと相互作用すると想定される部位に特殊なアミノ酸を有するMHCクラスI結合ペプチドを産生することが明らかになった。またこの胸腺プロテアソームが作り出す特殊なペプチドのモチーフはMHCクラスI、ペプチド、TCRの3者の相互作用を弱めること、そしてこれがT細胞の正の選択を促進することを明らかにした。この研究成果は免疫の基本原理である自己と非自己の本質に迫るものである。これらの研究成果をまとめて共同筆頭著者としてNature Communicationsに論文発表した。胸腺プロテアソームがその特殊な触媒活性により、TCRとの弱い親和性を有するペプチドレパトアを作り出すこと、そしてこれがT細胞の正の選択を促進することを明らかにすることができたため。これまで免疫プロテアソーム発現マウス胎仔由来線維芽