hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
宇宙空間での高分子材料中の帯電現象地上模凝実験とその解析

このような測定装置はこれまでにはなく、全く新しく開発されたものであり、安定で再現性のあるデータが得られ、このコピーはMIT HVRLにもある。今回の国際学術研究ー大学間協力研究ーの補助金の援助により、1986ー1989年の3年間、この蓄積電荷分布測定装置を使用して、武蔵工大とMIT HVRLとの間で本研究を実施した。3.測定装置の特徴(a)高電圧パルス(300V/cm、90nsec)を電荷蓄積試料に印加して、パルス弾性波を励起される。この弾性波の伝播の時間波形が電荷の分布を示すものである。(b)電子線照射中から照射停止後にわたり蓄積電荷分布と減衰電荷分布の連続測定ができる。(c)信号波形歪を逆畳込み積分(デコンボリューション)データ処理を使用し補正している。またその結果は、CRT画面に標示できる。4.蓄積電荷(電子)分布の測定結果人工衛生の宇宙線照射による帯電現象を模凝するために、バン・デ・グラフ電子線加速器からの電子線を高分子材料(PMMA)に照射して、高分子材料に蓄積する電荷分布を測定した。さらに照射停止後の減衰する電荷分布も測定した。照射条件は次の通りである。照射電子線エネルギー:0.50、0.75、1.00、1.25Mev照射線量率:25kGy/h試料温度:27、40、60、80°C電荷の分布と経時変化ο(χ、t)のデータを得て、次の量の時間と空間分布を算出して、電荷の蓄積と減衰のモデルを討論できた。電界分布:E(χ、t)、移間度分布:μ(χ、t)、電荷トラップの深さエネルギー分布:φ(χ)、電気伝導度分布:ο(χ、t)5.まとめこれまでは絶縁材料中の電荷蓄積や減衰は、電圧/電流測定では得られず、モデル計算により推測していた。今回初めて、蓄積/減衰の電荷分布を直接に測定できるようになり、照射誘起電気伝導の量やモデルが具体的に理解できるようになった。
デートDV防止への取り組みと「暴力」観に関する日米比較研究

本研究プロジェクトでは、デートDVへの取り組み、とくにキャンパスでどのように取り組んでいるのかを調査することによって、日米の取り組みと暴力観を比較することが目的としていた。調査の結果、(1)アメリカのキャンパスの取り組みの中心を占めるのが学生寮であること、(2)これは学生寮があるという必要に迫られているからでもあるが、またさまざまな取り組みを浸透させやすくもしていること、(3)ただ啓蒙をおこなうのではなく、学生とセンターやNPOを結ぶ「リーダー」を育成し、学生の主体性を作り出すことが必要であること、(40プログラムは具体的であり、ただ一方的に「加害者」を批判したり、「被害者」の心がけを求めたりするものではなく、大部分の「傍観者」を暴力防止に巻き込んでいくのかに焦点があてられていること、(5)たんに暴力を防止するだけではなく、「正しい男性性」などの定義を変容させ、暴力を取り巻くメディア環境を含め、文化に多くの注意を払っていること、などが明らかになった。本研究は、ドメスティックバイオレンス(以下DVと略す)のなかでも、とくに結婚前の(主として)男女間で生起する「デートDV」に焦点をあて、量的・質的な調査を行い、多角的に検討するものである。「デートDV」を暴力として認識することを阻むものを理論的にも検討することを目標としている。本年度は主として以下の作業を行った。・7月末にアメリカのNPO団体Men Can Stop Rapeのボランティアの1人の来日にあわせて東京都内で団体の活動内容についてのインタビューを行い、活動内容とそこでどのような男性性の問題性が課題とされているのかについての紹介を受けた。・8月中旬に、米国カリフォルニア州のStanford大学を訪問し、Vaden Health Center内Health Promotion ServicesのCarole Pertofsky氏にインタビューを行い、スタンフォード大学内でのデートDV防止の取り組みについて調査をした。2001年の「配偶者からの暴力の防止及び被害者の保護に関する法律(いわゆるDV防止法)」の制定を受け、DVの理解は急速に深まったが、未婚者間の暴力はDV定義から取りこぼされてきた。近年はデートDVに関する啓蒙や実践が行われはじめているが、デートDV研究は、実践的なプログラムや、禁止行為に関するマニュアルなどの実践性ばかりに重点が置かれてきたきらいもある。本研究は、これらの先行研究や実践の意義をじゅうぶん認めたうえで、「デートDV」を暴力として認識することを阻むものを理論的にも検討することを目標とし、暴力に関する認識がどのように構築され、男性性がどのように暴力によって構築されているのか、デートDVを成立させるものは何かといった基礎的な問いを理論的・実証的に読み解くものである。アメリカではどのような取り組みが行われているのかを調査するため、まずアメリカのワシントンD.C.にあるNPO団体、「Men Can Stop Rape」を訪問し、デートDVへの取り組みについてインタビュー調査を行った。NPOがどのように学校などから委託を受け、どのようにリーダーを育てながら啓蒙活動をおこなっているのか、またキャンペーンのやり方など詳細に調査することができた。さらにコロンビア大学を訪問し、キャンパスにおけるデートDVほかの取り組みについてインタビュー調査を行った。折しも新入生の受け入れ期で、具体的にどのように学生にアプローチしているのかを知ることができた。本研究プロジェクトでは、デートDVへの取り組み、とくにキャンパスでどのように取り組んでいるのかを調査することによって、日米の取り組みと暴力観を比較することが目的としている。中西はカルフォルニア大学バークレー校での調査を続行した。8月には2人ともアメリカ社会学会に参加し、理論的な研修と実態の把握に努めた。また科研の最終年度になるにあたるため、今までの調査データの整理や、それぞれの調査結果を突き合わせ、総合的な把握を行った。その結果、(1)アメリカのキャンパスの取り組みの中心を占めるのが学生寮であること、(2)これは学生寮があるという必要に迫られているからでもあるが、またさまざまな取り組みを浸透させやすくもしていること、(3)ただ啓蒙をおこなうのではなく、学生とセンターやNPOを結ぶ「リーダー」を育成し、学生の主体性を作り出すことが必要であること、(4)プログラムは具体的であり、ただ一方的に「加害者」を批判したり、「被害者」の心がけを求めたりするものではなく、大部分の「傍観者」を暴力防止に巻き込んでいくのかに焦点があてられていること、(5)たんに暴力を防止するだけではなく、「正しい男性性」などの定義を変容させ、暴力を取り巻くメディア環境を含め、文化に多くの注意を払っていること、などの知見を得た。

とくに、リーダーを育成しながら地域の学校や大学、学生寮などでの学生の自主管理を行う手法は、日本の現状では導入は現状では難しいかもしれないが、NPOなどが主体となって事業を請け負い、学生たちの間に暴力防止プログラムを根付かせることは必要であると思われた。また、DVの加害者更生や被害者支援と同時に、「傍観者」にならないプログラムの具体的実践には得るものが多いと思われる。
CCK-A受容体ノックアウトマウスの作成

我々はOtsuka Long Evans Tokushima Fatty(OLETF)ラットの膵臓にCCK-A受容体が欠損していることを明らかにした(Otsuki M et al.Am J Physiol 268 E531-536,1995.Tachibana I et al.Am J Physiol 270 G730-737,1996)。その後、OLETFラット遺伝子解析の結果からOLETFラットがCCK-A受容体遺伝子の構造異常のためにCCK-A受容体の発現が認められず、OLETFラットが自然発症のCCK-A受容体遺伝子ノックアウトマウスであるとの報告がなされたことから(Takata Y et al.BIochem Biophys Res Commun 213;958-966,1995)、OLETFラットの膵臓、脳および胃を用いてCCKおよびCCK-A受容体mRNAの発現について検討した。生後72週の雄性OLETFラットおよびコントロールとしてLong Evans Tokushima Fatty(LETO)ラットおよびWistarラットを実験に用いた。大脳よりacid-guanidium phenol chloroform法によりRNAを抽出し、CCKのmRNAの発現をNorthern blot analysisを用いて、CCK-A受容体mRNAの発現をreverse transcriptase polymerase chain reaction(RT-PCRを用いて検討した。OLETFラットのCCK-A受容体mRNAの発現は膵臓では認められなかったが、脳および胃では認められた。脳のCCKmRNAの発現はLETOラットおよびWistarラットと同程度に認められた。OLETFラットのCCK-A受容体mRNAの発現は膵臓では認められなかったが、脳および胃では認められたことからOLETFラットがCCK-A受容体遺伝子ノックアウトマウスであるとは言えず、今後OLETFラット遺伝子の詳細な解析を進める予定である。
卵細胞質の機能を制御する遺伝子の探査

機能不全のXY卵母細胞と正常なXX卵母細胞の遺伝子発現プロファイルを比較し、卵細胞質の機能に関与すると推察される遺伝子の抽出を行った。その結果、5倍以上の発現差を示す遺伝子として、BMP15等、既知の卵子形成に必須な遺伝子が抽出された他、これまで卵母細胞での機能が明らかにされていない遺伝子も抽出され、総遺伝子数は92あった。B6-Y.TIR性転換雌マウスでは、卵母細胞の発生という点において、B6-XX雌マウスと遜色ない表現型を示すにもかかわらず妊性がない。これまでに我々は、XY卵母細胞の第一減数分裂は正常に行われること、第二減数分裂以降の分裂に顕著な異常が現れること、この異常はXX卵細胞質にXY卵母細胞核を移植すると改善され産仔への発生支持能を獲得することを報告してきた。本研究では、XX卵母細胞とXY卵母細胞における遺伝子発現プロファイルを網羅的に比較・解析することにより、XY卵母細胞の異常の原因を考察することにした。その結果、XX卵母細胞とXY卵母細胞で20倍以上発現が変化している遺伝子は11、10倍以上発現が変化している遺伝子は32そして5倍以上発現が変化している遺伝子は197存在した。XY卵母細胞に異常が生じる一次的な要因は、Y染色体上の転写産物が卵子の発生・分化を阻害している、あるいはX染色体工の転写産物が不足していることが考えられる。そこで、性染色体上の遺伝子に着目してみると、XY1XY3で共通して20倍以上発現が変化している遺伝子のうち3遺伝子がY染色体工に位置し(Eif2s3y、Ddx3yおよびUbe1y1)、同様に3遺伝子がX染色体上に位置することが明らかとなった(Itm2a、Bex1およびWbp5)。興味深いことに、Itm2a、Bex1およびWbp5遺伝子は、いずれもXY卵母細胞においてXX卵母細胞より高発現していた。XY1XY3で共通して10倍以上発現が変化している遺伝子のうち性染色体に位置するものとしては、新たに1遺伝子(Fam199x;X染色体上に位置)が抽出され、これについては、XX卵母細胞でXY卵母細胞より高発現していた。XX卵母細胞の遺伝子発現強度の平均とXY1XY3のそれぞれの発現強度を比較し5倍以上発現が変化している遺伝子プローブの総数は492存在し、これらをIPAにて解析した。その結果、これらの遺伝子群は(スコアーの高い順に)Reproductive System Development and Function、Cell Death、Cellular Development、Cellular Movement、Cellular Assembly and Organizationに関するネットワークで機能することが明らかとなった。また、前年度までに、XX卵母細胞とXY卵母細胞における遺伝子発現プロファイルを網羅的に比較・解析した結果、XX卵母細胞とXY卵母細胞で5倍以上発現が変化している遺伝子がX染色体上に19、Y染色体上に5遺伝子存在することが明らかとなった。今年度は、XY卵母細胞の細胞質不全の原因がX染色体上の遺伝子の転写産物の不足によるものかY染色体上の遺伝子の転写産物が卵細胞質機能に悪影響を及ぼしているのか解析するために、細胞質移植を行うことにした。その結果、卵核胞期でXX卵母細胞にXY卵細胞質を移植し、成熟培養を行った場合、XX卵細胞質を移植した場合と比較して異常な第二減数分裂中期像が増えることが明らかとなった。一方、XY卵母細胞にXX卵細胞質を移植し成熟培養を行った場合は、XY卵細胞質を移植した場合と比較して、異常な第二減数分裂中期像を示す率に差が認められ無かった。以上より、Y染色体上の遺伝子の転写産物が卵細胞質機能に悪影響を及ぼしている可能性が高いことが示唆された。
植物におけるプリンおよびピリジンアルカロイドの分布、生合成、機能についての研究

コーヒー植物では、プリンヌクレオチドとピリジンヌクレオチドから派生するカフェインとトリゴネリンを生成する。またマメ科植物ではトリゴネリンが生合成される。この研究では、まず二種のコーヒー種、Coffea arabicaとCoffea canephoraの果実を用い、成長と成熟の課程をステージAGに区分し、各時期でカフェインとトリゴネリンの生合成を、遺伝子発現、酵素活性の変動、In situでの代謝という3つのレベルの研究により調べた。[^<14>C]アデニンからのカフェインの生合成は、ステージBEでみられたが、カフェイン合成の鍵となる7-メチルキサントシンシンターゼ(CmXRS1)とカフェインシンターゼ(CCS1)の二つの遺伝子の発現はステージAGで見られ、果皮よりも種子で強かった。カフェイン生合成は転写レベルでの制御が主要なものであるが、極めて若い果実(ステージA)では、カフェイン合成の遺伝子発現はあるもののプリンヌクレオチドがもっぱらエネルギー代謝や核酸合成に使われ、二次代謝へのプリンの供給が少ないためにカフェイン生合成が見られなかったと結論された。一方、NADに由来するトリゴネリンの合成は成長時期に関連なく、果皮で特に強い合成が見られた。マメ科のヤエナリやミヤコグサを用いて、NADサイクルとトリゴネリン合成の関連が調べられた。トリゴネリンは、NADの分解産物として生じたニコチン酸だけでなく、De novo経路で生じたニコチン酸モノヌクレオチドから直接合成される経路もあることが示された。また、ミヤコグサの根や根粒にはトリゴネリンを分解する経路もあることが示唆された。しかし、トリゴネリンが窒素の貯蔵物質であるとの明解な結果は得られず、トリゴネリンの合成は根などの成長阻害を引き起こすニコチンアミドやニコチン酸の解毒反応であることが主な役割であることが示唆された。数種の植物において蓄積されるプリンおよびピリジンアルカロイドは、ヌクレオチド由来の二次代謝産物である。これらのアルカロイドは、化学防御やアレロパシーにおいて重要な役割を果たしている。しかし、カフェインを除いて、これらの化合物についての生合成や代謝についての研究はほとんどなされていない。コーヒー実生において、カフェインは主に葉と子葉に局在した。根や茎の老いた部分ではカフェインは,ほとんど検出されなかった。一方,トリゴネリンは実生のすべての部分に存在した。テオブロミンとカフェインは若い葉と,芽を含む若い茎でのみ合成され、根や老化した子葉では生合成は認められなかった。すなわち、カフェインの生合成と蓄積は地上の組織(葉、子葉、茎)に限定され、一方トリゴネリンは、実生のすべての部分で合成され局在していることが明らかになった。これら二つのアルカロイドの異なった働きについて考察した。次に、コーヒー植物の葉と果実におけるトリゴネリンの生合成を、ピリジンヌクレオチドのde novo合成経路の中間産物である[^3H]キノリン酸とNADの分解産物である[^<14>C]ニコチンアミド、[^<14>C]ニコチン酸を用いて調べた。

トレーサ実験から、ピリジンヌクレオチドサイクル(ニコチンアミド→ニコチン酸→ニコチン酸モノヌクレオチド(NaMN)→ニコチン酸アデニンジヌクレオチド(NaAD)→NAD→ニコチンアミドモノヌクレオチド(NMN)→ニコチンアミド)がコーヒー植物で働いていることが示唆され、トリゴネリンはこのサイクルで形成されるニコチン酸から合成されることが示された。また,トリゴネリンは果皮で合成され、種子に転流されると考えられた。コーヒー植物では、プリンヌクレオチドとピリジンヌクレオチドから派生するカフェインとトリゴネリンを生成する。またマメ科植物ではトリゴネリンが生合成される。今回は、Coffea arabicaとCoffea canephoraの果実を用い、成長と成熟の課程をステージAGに区分し、各時期でカフェインとトリゴネリンの生合成を調べた。コーヒー果実を用いたトレーサー実験からin situでの生合成能を確かめ、次にそれを制御する機構を関連する遺伝子発現と酵素活性の変動から解明することを試みた。[^<14>C]アデニンからのカフェインの生合成は、ステージBEで検出されたが、カフェイン合成の鍵となる7-メチルキサントシンシンターゼ(CmXRS1)とカフェインシンターゼ(CCS1)の遺伝子の発現はステージAGで見られ、果皮よりも種子で強かった。カフェイン生合成は転写レベルでの制御が主要なものであるが、極めて若い果実(ステージA)では、カフェイン合成の遺伝子発現はあるものの二次代謝へのプリンの供給が少ないためにカフェイン生合成が見られなかったと思われる。一方、トリゴネリンの合成は成長時期に関連なく、果皮で特に強い合成が見られた。マメ科のヤエナリやミヤコグサを用いて、NADサイクルとトリゴネリン合成の関連が調べられた。トリゴネリンは、NADの分解産物として生じたニコチン酸だけでなく、De novo経路で生じたニコチン酸モノヌクレオチドから直接合成される経路もあることが示された。また、ミヤコグサの根や根粒にはトリゴネリンを分解する経路もあることが示唆された。ある種の植物では、ヌクレオチドに由来する二次代謝産物であるカフェイン(1,3,7N-メチルキサンチン)とトリゴネリン(1N-メチルニコチン酸)が生産される。カフェインについては、チャやコーヒー植物中で、プリンヌクレオチドから、キサントシン、7-メチルキサントシン、7-メチルキサンチン、テオブロミンを経由してつくられることが明らかにされている。一方、トリゴネリンについては、マメ科植物で発見されてから、かなりの植物で見つかり、植物のさまざまな生理現象との関連が推測されているが、その代謝レベルについての研究は、ほとんどなされていなかった。この研究では、カフェインとトリゴネリンを蓄積する植物を実験材料として、両アルカロイドの植物体での分布(器官および細胞内)、転流、生合成、蓄積、分解について詳細に比較検討した。カフェイン生合成に関して、コーヒー果実の成熟時の含量の変化、鍵酵素であるN-メチルトランスフェラーゼ遺伝子の発現、^<14>Cで標識されたカフェインの前駆体の代謝から、若い時期の果実の種子においてメチルキサンチンシンターゼ、カフェインシンターゼ遺伝子の強い発現がみられ生合成能が高いことから、種子に蓄積される多量のカフェインは、種子内での遺伝子の発現、生合成によるが示唆された。一方、トリゴネリンの合成能は、果実の果皮の部分で高く、果皮で合成されたものが種子に輸送されるものと思われた。トリゴネリンの生合成に関しては、コーヒーのほか、より扱いやすい実験材料であるマメ科植物であるヤエナリやミヤコグサでも研究を進めた結果、NADの分解で生じるニコチンアミドやニコチン酸からつくられ、ピリジンヌクレオチドサイクルの活性に連動することが示された。
発達障害をもつ労働者を支える産業看護職による支援方法の開発

日本産業衛生学会産業看護部会の会員1,649人を対象に、産業看護職による発達障害者等(疑いも含む)支援の実態調査を実施(調査時期2018年2月)した結果について整理した。381人から回答を得た(回収率23.1%)。発達障害者等の支援経験がある者は約70%であった。支援の従事者は保健師、産業医、人事労務担当者、発達障害者等の直属の上司が50%前後であり、連携機関は医療機関が最も多く、地域障害者職業センター等の専門機関は10%前後に留まり、いずれの機関とも連携していないのは19.6%であった。事業場としての支援内容で多かったのは、メンタルヘルスに関する指針の策定であった。個別支援の内容は、約半数が管理監督者や同僚からの相談に関する対処や助言、人事労務担当者との連携、日常的な支援ニーズのアセスメント、適正配置や具体的な作業内容に関する助言等であった。約50%の回答者は、個別支援技術の不足及び発達障害者等を職場で支援する必要性に関する理解不足を挙げいた。発達障害者等に対する適切な配置や作業内容、職場の管理監督者に対する助言等の具体的な支援内容に関する課題があり、発達障害者支援専門機関による後方支援体制及び事業場として発達障害者等支援体制構築の必要性が示唆された。実態調査の対象者の内、承諾を得られた10名の産業看護職に対して、2018年810月に支援のプロセス及び課題の詳細を明らかにすることを目的に面接調査を実施した。産業看護職の支援は、発達障害者等に自分の特性を理解して自己管理能力を高めて行動すること、家族の協力や専門支援機関を有効活用すること、職場が特性に応じた適性配置と業務を準備して環境調整し、職場での危機を予測して予防的な対応を可能にすることであった。発達障害者等の健康管理、人事労務管理及び職場管理の役割分担を明確化する事業場の支援体制構築の課題が示唆された。平成28年度は、産業看護職による発達障害者支援の現状と課題を明らかにするための質問紙調査内容の検討及びプレテストを実施した。研究者らの先行研究により産業看護職を対象とした支援の実際についての面接結果から得られた「問題の全体像を明確化する技術」、「支援体制を構築する技術」、「本人の自己管理能力を高めるための支援技術」、「環境を調整する技術」、「職場を支援する技術」及び産業看護職の相談体制整備に関する知見を基盤として、発達障害をもつ労働者の事業場における支援体制、産業看護職による支援体制整備に関わる内容、個別支援内容、支援技術向上に向けた内容、支援に対する困難等に関する内容を中心として構成された項目を作成し、4名の産業看護職及び3名の保健師によるプレテストを実施して調査票を作成した。先行研究から得られた知見を質問紙の項目として構成するにあたり、連携研究者及び協力者による検討に時間を要したため質問紙調査の進行が遅れている。平成29年度は、産業看護職による発達支援の現状と課題を明らかにするための質問紙調査を実施し、更に平成30年度に実施予定である面接調査に向けての研究候補者の選定を行った。日本産業衛生学会産業看護部会員1,649名を対象として、郵送による質問紙調査を行い、381名から回答を得た(回収率23.1%)。質問内容は、対象者の属性、事業場の規模、産業保健スタッフの構成、発達障害者(以下、疑いを含む)の支援経験の有無、支援に関わるスタッフ、支援の契機、支援方針の決定に関与するスタッフ、連携する関連機関、支援体制の内容、看護職が関与する支援体制整備の内容、看護職による個別支援の内容、看護職による支援技術向上のための内容、看護職による支援に対する困難である。結果については、現在分析中である。調査時には、平成30年度に予定される面接調査に向けての協力者を募り、45名から同意を得て候補者の選定を行っている。面接調査では看護職による発達障害者支援における困難の詳細を把握し、課題の明確化に向けて取り組む予定である。質問紙調査対象を日本産業衛生学会産業看護部会員としたが、当該学会による名簿の使用許可を得るのに予測以上の時間を要した。

実態調査の対象者の内、承諾を得られた10名の産業看護職に対して、2018年810月に支援のプロセス及び課題の詳細を明らかにすることを目的に面接調査を実施した。産業看護職の支援は、発達障害者等に自分の特性を理解して自己管理能力を高めて行動すること、家族の協力や専門支援機関を有効活用すること、職場が特性に応じた適性配置と業務を準備して環境調整し、職場での危機を予測して予防的な対応を可能にすることであった。発達障害者等の健康管理、人事労務管理及び職場管理の役割分担を明確化する事業場の支援体制構築の課題が示唆された。平成29年度は質問紙調査を実施する。本調査は、同時に現地調査の候補者選定も含めるため、産業看護職の面接調査を実施して、支援の実態と産業看護職の求める支援を明らかにする。本結果に基づき、支援ガイドラインのアセスメントツール及び対応マニュアルの試案についての作成に着手する予定である。平成30年度は平成29年度実施の質問紙調査の結果及び本年度実施する面接調査により、産業看護職による発達障害者支援の現状と課題を明らかにする。更に、支援ガイドラインの試案の検討を行う予定である。質問紙調査の進行が遅れ、平成28年度計画をしていた調査が終了していないため。研究の進捗状況が遅れ、面接調査が次年度へ繰り越しとなったため旅費等について当該年度は未使用である。平成30年度に面接調査を実施するため、旅費及び謝金等の支出計画を予定している。平成29年度に質問紙調査を終了し、現地調査も実施するため、平成28年度予定していた経費を繰り越して使用する計画である。
生体イメージングと数理を融合した表現型解析に基づく遺伝疾患解明へのアプローチ

疾患に関連する遺伝的多型の解析には,遺伝・環境因子と表現型との量的関係性を明らかにする必要があります.そのためにはモデル生物を利用した方法論の発展が重要です.本研究では,生きたまま個体全身に渡って器官特異的イメージングが可能なモデル動物であるメダカを利用し,系統間の表現型比較解析を可能とする画像解析技術との融合を図ることで,疾患に関わる遺伝背景の解明に向けた新規のアプローチを展開します.疾患に関連する遺伝的多型の解析には,遺伝・環境因子と表現型との量的関係性を明らかにする必要があります.そのためにはモデル生物を利用した方法論の発展が重要です.本研究では,生きたまま個体全身に渡って器官特異的イメージングが可能なモデル動物であるメダカを利用し,系統間の表現型比較解析を可能とする画像解析技術との融合を図ることで,疾患に関わる遺伝背景の解明に向けた新規のアプローチを展開します.
皮膚免疫担当細胞のアトピー性皮膚炎発症に果たす役割の解明

アトピー性皮膚炎(Atopic dermatitis; AD)は慢性的な痒みを伴う炎症性皮膚疾患である。表皮角化細胞に発現するフィラグリン遺伝子の変異とAD有病率に相関関係を持ち、さらに角層の外層部ではフィラグリンの分解産物であるアミノ酸とその誘導体が天然保湿因子(Natural moisturizing factor; NMF)として角層の水分量とpHの維持に働く。多くのサイトカインは,細胞表面のサイトカイン受容体に結合し下流のJAK-STAT経路の活性化を介してその生理作用を発現させる。JAK阻害薬は強力な抗炎症作用を示し,免疫・炎症性疾患の新薬として期待されているが,これまでJAK阻害薬の表皮に対する作用は検討されておらず,バリア機能への効果は不明である。そこで、JAK阻害薬によるTh2サイトカインシグナルの抑制作用が皮膚バリア機能の改善に繋がるとの仮説を立て,表皮角化細胞のフィラグリン産生および皮膚バリア機能に対するJAK阻害薬(JTE-052)の効果について検討を行った。Th2サイトカイン(IL-4およびIL-13)は,フィラグリンを含む表皮分化関連遺伝子の発現を低下させ、JTE-052を添加することによって,これら遺伝子発現の低下は改善した。さらに, JTE-052はTh2サイトカイン添加により低下したプロフィラグリンタンパクおよびフィラグリン単体の産生を蛋白レベルで促進した。これらの結果は,JTE-052がTh2サイトカインによって抑制される表皮分化を改善させ,フィラグリンタンパクの産生を促進することを示唆する。さらにJTE-052は,免疫不全マウスに移植したヒト皮膚組織に対してもフィラグリン産生を促進した。これらの結果から,JTE-052は表皮角化細胞に作用し,AD患者での低下した皮膚バリア機能を改善する可能性が示された。27年度が最終年度であるため、記入しない。インターロイキン17A (Interleukin-17A, IL-17A)は主にTh17細胞から分泌される炎症性サイトカインの一つで、慢性関節リウマチや乾癬などの疾患の病態に関与している。我々はこれまでに、AD患者の末梢血中のTh17細胞のパーセンテージが疾患重症度と相関すること、また急性期病変部におけるIL-17A産生細胞が慢性期病変部や健常皮膚と比較して増加していることを報告してきた(Koga et al, JID, 128, 2625-2630, 2008)。このことから、IL-17AはADの病態に関与していることが示唆されるが、その詳細なメカニズムは不明であった。そこで、報告者はADにおけるIL-17Aの果たす役割を検討することを目的とし、IL-17A欠損マウス、マウスADモデルを用いて検討を行った。ハプテン反復塗布モデルにおいて、IL-17A欠損マウスは野生型マウスと比較して耳介腫脹の軽減を認めた。さらに、IL-17A欠損マウスは、組織スコアの低下、血清中の抗原特異的IgE/lgGI産生の低下、所属リンパ節でのIL-4産生の低下を認めた。IL-17A欠損マウスの皮膚局所ではTh2誘導に重要なケモカインであるTSLP (thymic stromal lymphopoietin)やCCL17 (TARC)の産生低下を認めた。IL-17Aは、in vitroにおいてTh2細胞のIL-4産生を促進した。このことからIL-17Aがハプテン反復塗布モデルにおいてTh2誘導に促進的に作用していることが示唆された。次に、IL-17A欠損マウスと刊aky tailマウス(C57BL/6にバッククロスしたもの)を交配し、naky tailマウスでのIL-17Aの果たす役割を検討した。Flaky tai1マウスは、フィラグリン遺伝子異常を有し、皮膚炎や血清中のIgE上昇を自然発症するマウスである(Moniaga CS et al. Am J Pathol. 2010)。lL-17A欠損flakytailマウスは、flaky tailマウスと比較して、皮膚炎の軽減やクリニカルスコアの低下、血清中のIgE産生の低下を認めた。以上から、IL-17AはマウスADモデルにおいてTh2誘導に促進的に作用することが証明された(J Invest Dermatol. 2014 Feb 30)。皮膚免疫担当細胞のアトピー性皮膚炎に果たす役割の解明を目指し、昨年度はTh17細胞およびγδT細胞から産生されるIL-17Aに注目して研究を進め、IL-17Aが複数のマウスADモデルにおいてTh2誘導に促進的に作用することを証明した(Nakajima et al., JID, 2014)。IL-17Aは、Th17関連疾患だけではなく、これまでTh2型皮膚炎症性疾患として考えられてきたADの新規治療ターゲットとなり得ることが期待される。すでに国内でもADの治療薬として抗IL-17A抗体投与の臨床試験が開始されているが、その成果に期待が持たれる。更に今年度、我々はこれまで報告されているマウスADモデルが、ヒトADとどの程度相関しているのか、複数のマウスADモデルを用いて、AD様皮膚炎を発症しているマウス皮膚をサンプリングし、その解析を行った。これらサンプルからmRNAを抽出しmRNAレベルでどの程度の相関が見られるか解析を行っていく予定である。同時にヒトAD病変部・非病変部からのサンプリングも行い、同様にmRNAを抽出し、解析を行っていく予定である。

サンプルは既に採取を終了しており、mRNA抽出、cDNA作製も完了している。アトピー性皮膚炎(Atopic dermatitis; AD)は慢性的な痒みを伴う炎症性皮膚疾患である。表皮角化細胞に発現するフィラグリン遺伝子の変異とAD有病率に相関関係を持ち、さらに角層の外層部ではフィラグリンの分解産物であるアミノ酸とその誘導体が天然保湿因子(Natural moisturizing factor; NMF)として角層の水分量とpHの維持に働く。多くのサイトカインは,細胞表面のサイトカイン受容体に結合し下流のJAK-STAT経路の活性化を介してその生理作用を発現させる。JAK阻害薬は強力な抗炎症作用を示し,免疫・炎症性疾患の新薬として期待されているが,これまでJAK阻害薬の表皮に対する作用は検討されておらず,バリア機能への効果は不明である。そこで、JAK阻害薬によるTh2サイトカインシグナルの抑制作用が皮膚バリア機能の改善に繋がるとの仮説を立て,表皮角化細胞のフィラグリン産生および皮膚バリア機能に対するJAK阻害薬(JTE-052)の効果について検討を行った。Th2サイトカイン(IL-4およびIL-13)は,フィラグリンを含む表皮分化関連遺伝子の発現を低下させ、JTE-052を添加することによって,これら遺伝子発現の低下は改善した。さらに, JTE-052はTh2サイトカイン添加により低下したプロフィラグリンタンパクおよびフィラグリン単体の産生を蛋白レベルで促進した。これらの結果は,JTE-052がTh2サイトカインによって抑制される表皮分化を改善させ,フィラグリンタンパクの産生を促進することを示唆する。さらにJTE-052は,免疫不全マウスに移植したヒト皮膚組織に対してもフィラグリン産生を促進した。これらの結果から,JTE-052は表皮角化細胞に作用し,AD患者での低下した皮膚バリア機能を改善する可能性が示された。昨年度、IL-17Aというサイトカインに着目してADの病態で果たす役割について検討を行ってきたが、今年度は、マウスADモデルがヒトADとどれほどの相関を持っているのかを検討することとし、研究を進めてきた。複数のマウスADモデルからのサンプル採取、およびヒトAD病変部・非病変部からのサンプリングを行い、mRNA抽出およびcDNA作製を完了した。27年度が最終年度であるため、記入しない。来年度は、マウスADモデルがmRNAレベルでどれほどヒトADと相関しているのか、引き続き解析を行っていく予定である。また、皮膚免疫担当細胞に関連する注目すべき分子の候補が得られれば、さらにその分子についてマウスADモデルでの検討およびヒトサンプルでの検討を行っていく予定である。IL-17Aのマウスアトピー性皮膚炎モデルにおける役割の検討を行い、その成果を国際誌に発表できたため、おおむね順調に進んでいると考える。平成26年度:平成25年度に得られた知見をもとに、リンパ組織や皮膚局所での細胞動態を二光子顕微鏡などを用いて明らかにする。平成27年度:ヒトアトピー性皮膚炎患者サンプルを用いてこれまでに得られた知見を確認し、新たな治療戦略を探索する。
対格の実現に関わる認知スキーマの日独対照研究

本研究は日独両言語における対格目的語の実現する認知的メカニズムをコーパス分析を基にして明らかにしようとするものである。研究年度である平成15年度・16年度を通して、理論的枠組みの構築と実際的作業の道筋を確定した後、ドイツ語と日本語のコーパスにおいて、対格と前置詞句の対立、対格と予格の対立を示すサンプルを多数収集して、関与的要因を観察することを実施した。その上で、両言語の格表示においては、表される事態によって影響を蒙る<人間>の表示がドイツ語では義務的であるのに対し、日本語では動詞や形容詞の意味内容に抱合されている場合が多く、この<経験主>の表示の差が両言語の構文の成り立ちに影響を与えている。(Seino(2004)"Die Experiencer-Codierung im Deutschen und im Japanischen"において発表)。これらの具体的な成果のほかに、ドイツ語と日本語の文で、対格と予格・前置詞句と含むデータを大量に収集してデータベース化した(そのうちドイツ語分の一部を成果報告書に収集した)。研究初年度である平成15年度は,理論的枠組みの構築と実際的作業の道筋を確定した後,ドイツ語のコーパスにおいて,対格と前置詞句の対立,対格と与格の対立を示すサンプルを多数収集して,関与的要因を観察することを実施した。具体的には,平成15年4月7月の期間において,Usage-Based Modelの手法についての理論的枠組みに対する理解を深めるとともにコーパス分析の手法,特に,実際的なコーパス分析ソフト・データベースソフトの使用法を習熟することに費やした。8月9月にかけて,Spiegel誌等のCD-ROMコーパスおよびIDSでWeb公開されている書き言葉と話し言葉のコーパスを用い,対格と与格および対格と前置詞格が対立する構文を許す動詞の用例を検索,収集した。また,8月末の日本独文学会語学ゼミナールにおいて研究発表を行った。続く,10月から平成16年2月までの間に,収集した用例をデータベースソフトFile MakerおよびMicrosoft Access)に用いて,各文成分の意味素性を分析し,データベース化した。3月上旬には熊本大学文学部言語学講座および独語独文学講座でコーパス分析の手法について意見交換現在は,さらに不足するデータのチェックおよび日本語の用例収集を開始したところである。平成16年度は,前年度に収集したドイツ語データを整理し,不足しているデータを追加した。特に,接触・打撃動詞および心理動詞を中心に分析を精密化した。この作業は1年間継続して行ったが,特に,4月8月の期間に集中して行った。この期間に,"Pladoyer fur gebrauchsbasierte Satzsemantik"と題する論文を執筆し,8月に脱稿した(平成17年3月に出版)。この論文では,従来の結合価理論が,補足成分と添加成分の区別を中心課題とするが,それに成功していないことを述べた後コーパスの頻度に基づいた新しい結合価理論の必要性を述べた。これは現在の研究の理論的枠組みを提示したものである。9月12月の期間は,ドイツ語の収集事例に意味的に対応する日本語の動詞の事例を主にCD-ROMから収集してリスト化するととともに,ドイツ語と日本語の対格の実現に関わる認知スキーマの抽出,記述を行った。平成17年1月10日に東京外国語大学ドイツ語科の在間教授のゼミナール,および,1月15日,16日に京都産業大学で開催された語学研究会「Universale Syntax und Semantik fuer Sprachvergleiche」において,成果の一部を発表した。この発表において,他の参加者から有益な示唆を得て,現在,最終的な資料の整理記述の精密化を行っている。また,昨年度の研究成果の一部を田中慎氏との共著で言語学の国際誌"Linguistics"に投稿していた論文が採択された旨の通知を3月上旬に受けた。現在その最終的な語句の調整を行っている。
胆石形成のキ-ポイント-regulation proteinの解析

(1)胆汁中ムチン蛋白のSDS-PAGE分析胆汁中ムチン蛋白を同定する目的でSDS-PAGEを行った。感染胆汁と非感染胆汁とでは含有蛋白質の分子量の分布が大きく異なっていたが、69KD,46KD,30KD近傍の分子量帯を持つ蛋白質は両者に共通して認められた。この3つの分子量帯に現在着目している。(2)胆石中ムチン蛋白の分析胆石粉末から蛋白質を抽出する方法として、コレステロールをクロロホルム・エーテルで除去する方法、EDTAを用いてビリルビンを除去する方法、ムチン構造をアセチルシステインで解離する方法など、単独あるいは組み合わせて試みている。しかし、胆石薄切標本でみられた様に胆石中ムチンは網目状で存在しており複雑に絡まったムチンを抽出するだけではSDS-PAGEゲルを通過しない。現在これらのムチンcomplexを単体に分離抽出することに挑んでいるが今だ成功していない。引続き分離精製して、胆汁中で認められた69KD,46KD,30KDの3者の蛋白質が特異的に多く含まれているかどうか検討したい。もしそうであればregulation proteinの解明は近い。
不死化顎関節円板クローン細胞による顎関節のバイオエンジニアリング技術の基盤的開発

本研究では、成人の顎骨低形成の病態解明のため、リラキシンの変形性顎関節疾患への関与を検討することを、第一の目的とした。in vitroにおいて、不老不死化マウス顎関節円板由来細胞に対して、リラキシン処理し、線維芽細胞様クローン細胞において、RXFP1/2およびMM9/13の発現量が増加した。また小児の顎骨低形成の病態を解明するため、小児OSAにおける顎骨低形成に着目した。病態の主徴である間欠的低酸素下にて成育したラットのX線解析の結果、低酸素曝露による下顎骨を主体とする顎顔面骨劣成長が見られた。下顎頭の骨微細構造をCT解析すると、骨密度の上昇が認められ、関節部における骨代謝の変調が示唆された。顎関節を構成する骨および軟骨細胞は、増殖および分化の過程において、低酸素状態への感受性が高く、関節疾患の発症時や増悪時における、臓器内での酸素環境の変化が報告されている。小児期の睡眠時無呼吸症候群の発症が報告されており、臨床研究から小児性睡眠時無呼吸症候群の患者は小下顎症を呈することが明らかとなり、顎関節の軟骨および骨の低成長がその病態の一つであると考えられている。初年度において、顎関節低成長の病態解明を目的として、動物モデルの確立を図り、成長期における夜間の間欠的低酸素曝露と顎関節の低成長の解明を行った。小児性睡眠時無呼吸症候群を想定した成長期ラットを用いた間欠的低酸素モデルの解析から、1鼻腔気道を囲む上中顔面部の低成長、2咽頭気道を囲む下顎骨の低成長について骨形態計測により明らかとなり、マイクロCTを用いた顎関節の骨微細構造の解析から、疾患モデルにおける関節軟骨下の骨密度の変調が認められた。顎顔面の軟骨性成長と顔面および頸部の骨格筋が関連することから、骨格筋が間欠的低酸素曝露から受ける影響について検証するため、上部気道筋であるオトガイ舌骨筋における低酸素反応についても検証するとともに、全身の骨格筋との影響の比較も行った。実験に先立ち、低酸素誘導因子HIF-1を介したオートファジー関連因子の誘導と骨格筋成長遅延を仮説とした。結果、HIF-1αの上昇とHIF-2αの低下とともに、オートファジー因子BNIP3の誘導が生じ、また、筋細胞分化因子のmyogenineとMyoDの発現低下、筋細胞のミトコンドリア代謝因子であるPGC-1αと呼吸因子のComplex IVがともに低下し、間欠的低酸素曝露下における筋細胞機能の低下の可能性が示唆された。顎関節罹患者における睡眠呼吸障害の高い罹患率に着目し、呼吸障害における間欠的低酸素曝露と軟骨を介した顎骨成長との関連について検討するため、8週齢雄性SDラットを用いた間欠的低酸素曝露動物モデルにおける(1)顎骨成長、(2)関節頭部のリモデリングに関して、第一に形態学的およびCT解析を実施した。その結果、(1)生後7週齢から10週齢までの成長期における低酸素曝露群において、形態学的解析により、鼻骨および下顎骨の低成長が有意に生じること、さらに、(2)下顎頭軟骨層近傍において骨密度の上昇が認められた。軟骨層近傍における膜性骨化を成長様式の中心とする顎骨と、軟骨内骨化を成長様式の中心とする四肢骨との比較を行った結果、その影響を顎骨において、より顕著であることが判明した。さらに、顎骨とともに気道を構成し、低酸素環境に密接に関わる(3)鼻上顎複合体、(4)上部気道筋における形態および代謝系の変化に関して解析を行った。その結果、(3)鼻上顎複合体の多くを占める硬組織気道の体積の減少が生じ、鼻中隔軟骨およびその近傍組織を対象とした炎症及び成長関連因子の定量PCRから、eNOS(血管内皮型NOS)の発現低下が認められた。また、(4)上部気道筋である舌骨筋を対象に、炎症および細胞死の関連因子の定量PCRを行った結果、炎症系サイトカインであるIL-1β、TGFαおよびiNOS(誘導型NOS)の発現上昇が認められ、また、BNIP3の発現上昇から筋組織におけるオートファージ変性の誘導の可能性が示唆された。7週齢SD系雄性ラット(n=10)を用い、IH群と対照群の2群に分けた。飼育チャンバー内の酸素濃度が1時間に20サイクルの間隔で4-21%に連続的に変化する間欠的低酸素状態を実験的に再現し、1日8時間、間欠的低酸素下でラットを飼育し実験モデルを作製した。IH群は間欠的低酸素下、対照群は通常大気下で飼育し、実験開始3週間後(10週齢時)に屠殺を行い、下顎の第一臼歯歯槽骨根管中隔に対し、マイクロCT撮影による骨微細構造解析を行った。統計学的解析には、Mann-Whitney Utestを用いて群間比較を行った(P<0.05)。

本モデルにおいては、IH群の体重は対照群と比較し有意に小さな値を示したものの、脛骨長径を測定したところ体重との相関係数は低い値を示し、全身骨への影響は少ない事が示唆された。しかし、マイクロCTによる骨微細構造の計測から、歯槽骨においては骨密度(BMD)およびbone volume/tissue volume(BV/TV)の有意な増加が認められた。機序の探求として、顎骨サンプルのPCR解析を行った結果、VEGF及びHIF-1のmRNA発現上昇が認められた。本研究では、成人の顎骨低形成の病態解明のため、リラキシンの変形性顎関節疾患への関与を検討することを、第一の目的とした。in vitroにおいて、不老不死化マウス顎関節円板由来細胞に対して、リラキシン処理し、線維芽細胞様クローン細胞において、RXFP1/2およびMM9/13の発現量が増加した。また小児の顎骨低形成の病態を解明するため、小児OSAにおける顎骨低形成に着目した。病態の主徴である間欠的低酸素下にて成育したラットのX線解析の結果、低酸素曝露による下顎骨を主体とする顎顔面骨劣成長が見られた。下顎頭の骨微細構造をCT解析すると、骨密度の上昇が認められ、関節部における骨代謝の変調が示唆された。共同研究者との協力体制の下、計画の詳細やその実施に関して、随時、ディスカッションを実施しながら遂行された。歯科矯正学最終年度である平成27年度は、これまでの解析計画の実施とともに、結果に関する学会発表および論文発表を実施する方策である。実験モデルを確立し、X線解析、組織学的解析および生化学解析を実施した。実験モデル作製の用意のため、平成26年度に実施予定の一部の実験計画を行っていないためである。小児性睡眠時無呼吸症候群における顎関節低成長に着目した動物モデルの解析とともに、培養実験モデルによる間欠的低酸素暴露と軟骨、骨、および筋細胞の増殖、分化との因果関係について生化学的に実証する。平成26年度に実施していない実験計画を、平成27年度に実施予定である、その際に使用する計画である。所属研究機関内動物実験センターの工事等により実施できなかった実験計画が生じたから。所属研究機関内動物実験センターの工事終了後、昨年度に実施できなかった実験計画の実施に使用する。
定量プロテオミクスを用いた血液脳関門中枢作用型タンパク質輸送機構の解明

本研究は、定量プロテオミクスを用いて、血液脳関門(BBB)を透過する新たなタンパク質を同定し、その輸送機構の解明および脳への高分子deliverysystem(DS)の構築への応用を目的としている。本年度は、本研究で同定した新たなBBB透過性タンパク質であるクレアチンキナーゼ(CK)に関して、BBBにおけるCKアイソザイム依存的な輸送活性の違いの解明と、BBBにおけるCK輸送担体の同定に取り組んだ。CKをキャリアとした脳への高分子DSを構築する上では、より輸送活性の高いCKアイソザイムを選択することが重要である。そこで、大腸菌を用いて細胞質型のCKである脳型(CK-BB)及び筋肉型(CK-MM)のリコンビナントタンパク質を合成し、ヒト脳毛細血管内皮細胞株hCMEC/D3(D3細胞)を用いてTranswell上に構築したin vitroBBBの透過性(血液から脳方向)を解析した。その結果、CK-BBおよびCK-MMの双方で、僅かに有意ではないものの4°Cに比較して37°Cで透過速度が増加する傾向が見られた。また血液方向からD3細胞内への内在化活性を解析したところ、CK-BBおよびCK-MMの双方で、4°Cに比較して37°Cで有意に内在化速度が増加した。興味深いことに、37°CにおけるCK-MMの内在化速度は、CK-BBに比較し10倍以上高いことが明らかになった。本結果から、BBBにはCKの輸送機構が存在し、CK-MMにより親和性の高い機構であることが示唆された。さらに本年度はCK輸送担体の同定を目的に、マウス胎児線維芽細胞株(MEF-1)およびそのLRP-1欠損株(PEA13)を用いて、CK-MMの取込み実験を行った。その結果、PEA13ではMEF-1に比較し有意に内在化活性が低いことが明らかとなり、BBBにおけるCKの輸送の一部にLRP-1が関与する可能性が示唆された。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。本研究は、定量プロテオミクスを用いて、血液脳関門(以下BBB)を透過する新規のタンパク質を同定し、その輸送機構の解明および脳への高分子DDSの構築を目的としている。本年度は、脳細胞質タンパク質のin vitroBBB透過実験の網羅的プロテオーム解析においてBBB透過候補分子として同定されたキナーゼAについて、in vivoにおけるBBB透過性の証明及びBBBにおける輸送特性の解明に着手した。さらにin vivoにおけるBBB透過タンパク質のスクリーニング法の確立に着手した。キナーゼAをマウスに静脈内投与後、30 min6 hにおける全脳抽出物対血漿中濃度比を算出した結果、経時的な増加が検出された。さらに、キナーゼA投与後のマウスの大脳を脳実質画分と脳血管画分に分画し、経時的な各画分対血漿中濃度比を算出した結果、脳実質画分での増加率が、全脳抽出物画分での増加率と近似したことから、キナーゼAは脳血管へと蓄積せず、脳実質内へと移行することが速度論的に示された。また、タンパク質のbiotinラベル技術とSWATH法を組み合わせることでin vivoにおけるBBB透過タンパク質のスクリーニング法を構築した。本スクリーニング系を用い大脳及び肝臓タンパク質の透過実験を行った結果、キナーゼAを含む複数のBBB透過タンパク質が同定された。キナーゼAのBBB透過性は既に実証済みであることから、スクリーニング系の確からしさが証明され、新たなBBB透過タンパク質の候補が同定された。また、ヒト不死化脳毛細血管内皮細胞(hCMEC/D3細胞)への取り込み活性の評価を行ったところ、キナーゼAの取り込みは既存のBBB透過分子transferrinに匹敵する取り込み活性を示し、さらに少なくとも数十uMまで取り込み活性の飽和が見られないことが明らかになった。本年度は、計画していた「BBB透過候補タンパク質のin vivo BBB透過速度の解明及びin vivoにおけるBBB透過タンパク質のスクリーニング系の確立」について達成した。本研究は、定量プロテオミクスを用いて、血液脳関門を透過する新規のタンパク質を同定し、その輸送機構の解明および脳への高分子deliverysystemの構築を目的としている。本年度は、キナーゼAの血液脳関門における輸送機構解明にむけたさらなる解析と、脳内高分子deliverysystemの構築にむけたキナーゼAのリコンビナントタンパク質の合成に取り組んだ。血液脳関門におけるキナーゼAの細胞内取込み機構が、既知の血液脳関門透過タンパク質と同様にエンドサイトーシスを介することを証明するため、各種阻害剤共存下でのヒト血液脳関門モデルhCMEC/D3細胞へのキナーゼAの細胞内取込み量を解析した。その結果、キナーゼAの細胞内取込み量はクラスリン依存的およびカベオラ依存的エンドサイトーシス阻害剤の共存下において優位に減少した。また、血液中から血液脳関門へと取込まれたキナーゼAが脳側へと輸送されることを証明するため、transwell上に培養したhCMEC/D3細胞によるin vitro血液脳関門の透過性を解析した。その結果、キナーゼAは37°C条件においてapical側からbasolateral側へと透過することが示され、さらにその透過量は4°C条件において20%以下に低下した。以上の結果から、血液脳関門にはキナーゼAの輸送分子が存在し、既存の血液脳関門透過タンパク質と同様に、受容体介在型トランスサイトーシスの機構を介し輸送されることが示唆された。

また、本年度は、キナーゼAの輸送機構を高分子delivery systemの構築へと応用する計画の一端として、生体内に存在するキナーゼAの4種のサブタイプの中から、より血液脳関門における輸送活性の高いサブタイプを同定することを目的に、各サブタイプのリコンビナントタンパク質の合成に成功している。本年度は、計画していた「キナーゼAの細胞内取込みがエンドサイトーシス機構を介することの証明、キナーゼAのin vitro血液脳関門透過性の証明、キナーゼAサブタイプのリコンビナントタンパク質の合成」について達成した。本研究は、定量プロテオミクスを用いて、血液脳関門(BBB)を透過する新たなタンパク質を同定し、その輸送機構の解明および脳への高分子deliverysystem(DS)の構築への応用を目的としている。本年度は、本研究で同定した新たなBBB透過性タンパク質であるクレアチンキナーゼ(CK)に関して、BBBにおけるCKアイソザイム依存的な輸送活性の違いの解明と、BBBにおけるCK輸送担体の同定に取り組んだ。CKをキャリアとした脳への高分子DSを構築する上では、より輸送活性の高いCKアイソザイムを選択することが重要である。そこで、大腸菌を用いて細胞質型のCKである脳型(CK-BB)及び筋肉型(CK-MM)のリコンビナントタンパク質を合成し、ヒト脳毛細血管内皮細胞株hCMEC/D3(D3細胞)を用いてTranswell上に構築したin vitroBBBの透過性(血液から脳方向)を解析した。その結果、CK-BBおよびCK-MMの双方で、僅かに有意ではないものの4°Cに比較して37°Cで透過速度が増加する傾向が見られた。また血液方向からD3細胞内への内在化活性を解析したところ、CK-BBおよびCK-MMの双方で、4°Cに比較して37°Cで有意に内在化速度が増加した。興味深いことに、37°CにおけるCK-MMの内在化速度は、CK-BBに比較し10倍以上高いことが明らかになった。本結果から、BBBにはCKの輸送機構が存在し、CK-MMにより親和性の高い機構であることが示唆された。さらに本年度はCK輸送担体の同定を目的に、マウス胎児線維芽細胞株(MEF-1)およびそのLRP-1欠損株(PEA13)を用いて、CK-MMの取込み実験を行った。その結果、PEA13ではMEF-1に比較し有意に内在化活性が低いことが明らかとなり、BBBにおけるCKの輸送の一部にLRP-1が関与する可能性が示唆された。本研究では、新規のBBB透過タンパク質としてキナーゼAのin vivoにおけるBBBの透過が証明でき、さらにin vitro BBBモデル細胞を用いた解析から、脳への新規のDDS経路としてその輸送機構が有望である可能性を示した。そこで、今後はキナーゼAの輸送を担う輸送分子の解明及びそれを利用した脳内への高分子DDSの構築を行う。本研究ではこれまで、定量プロテオミクスを用いたスクリーニング解析において同定されたキナーゼAが、新規の血液脳関門透過タンパク質であることを証明している。さらにキナーゼAの輸送機構が脳への新規の高分子deliverysystem経路として有望である可能性を示すことができた。