hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
3Dアニメーションを用いた運動表象の形成

運動を遂行する際には,今までの運動経験の中で構築されてきた動きに対する表象を適切な表象に再統合することにより運動プログラムを作成し,実行している.また,動きに対する表象は,空間的,時間的,あるいは筋感覚的に形成されることが明らかにされている.そこで,本研究では,表象の形成における外的情報(アニメーション)の有効性を分析し,さらにアニメーションを用いて運動の空間的・時間的・筋感覚的要素に関わる表象の形成について検討した.表象化の対象となる運動(器械運動の「後転倒立」に習熟したモデルのキネグラムをもとにアニメーションを作成し,それをもとに運動局面の構造を時間的・系列的な要因で変化させたアニメーションを外的情報として被験者である大学生に呈示した.アニメーションの速度を変化させた場合,空間的要素は速度が遅い方が表象化が容易であったが,時間的要素は速度が遅いと表象化が困難であった.筋感覚的要素においては,速度による違いは認められなかった.また,運動の各局面の速度を変化させた場合には,空間的要素では主要局面,時間的要素と筋感覚的要素は準備局面から主要局面前半の速度を遅くしたアニメーションが表象化において有効であった.時間当たりのフレーム数を変化させると,速度が実際の運動と同じ場合には,フレーム数が多いほど時間的要素が表象化されやすいが,空間的要素や筋感覚的要素には差がなかった.一方,速度が実際よりも遅い場合には,すべての要素においてフレーム数が多いほど表象化されやすく,この傾向は空間的要素において顕著であった.なお,こうした情報の呈示は,技能の習熟段階によってその有効性が異なると考えられる.また,内省報告によると,アニメーションによる情報呈示はビデオテープなどと比較して運動の構造が理解しやすく,筋の緊張などの筋感覚的要素が得やすい.運動を遂行する際には,今までの運動経験の中で構築されてきた動きに対する表象を適切な表象に再統合することにより運動プログラムを作成し,実行している.また,動きに対する表象は,空間的,時間的,あるいは筋感覚的に形成されることが明らかにされている.そこで,本研究では,表象の形成における外的情報(アニメーション)の有効性を分析し,さらにアニメーションを用いて運動の空間的・時間的・筋感覚的要素に関わる表象の形成について検討した.表象化の対象となる運動(器械運動の「後転倒立」に習熟したモデルのキネグラムをもとにアニメーションを作成し,それをもとに運動局面の構造を時間的・系列的な要因で変化させたアニメーションを外的情報として被験者である大学生に呈示した.アニメーションの速度を変化させた場合,空間的要素は速度が遅い方が表象化が容易であったが,時間的要素は速度が遅いと表象化が困難であった.筋感覚的要素においては,速度による違いは認められなかった.また,運動の各局面の速度を変化させた場合には,空間的要素では主要局面,時間的要素と筋感覚的要素は準備局面から主要局面前半の速度を遅くしたアニメーションが表象化において有効であった.時間当たりのフレーム数を変化させると,速度が実際の運動と同じ場合には,フレーム数が多いほど時間的要素が表象化されやすいが,空間的要素や筋感覚的要素には差がなかった.一方,速度が実際よりも遅い場合には,すべての要素においてフレーム数が多いほど表象化されやすく,この傾向は空間的要素において顕著であった.なお,こうした情報の呈示は,技能の習熟段階によってその有効性が異なると考えられる.また,内省報告によると,アニメーションによる情報呈示はビデオテープなどと比較して運動の構造が理解しやすく,筋の緊張などの筋感覚的要素が得やすい.
インフルエンザ菌の多剤耐性における排出蛋白の役割

インフルエンザ菌の抗菌薬に対する耐性機構には、β-ラクタム薬の標的部位であるペニシリン結合蛋白質(PBP)が変異した耐性菌BLNAR(β-lactamase-negative ampicillin -resistant H.influenzae)や排出ポンプによる耐性化などが知られている。私どもは、平成12年度の研究によりインフルエンザ菌(H.influenzae)のRND型AcrAB異物排出システムが、Macrolide系抗生物質をはじめいくつかの抗菌性化合物の排出に寄与している事を明らかにした。さらに同定されていなかったAcrAB様排出システムの外膜コンポーネントの探索を、インフルエンザ菌のGenome Databaseを利用して行い、大腸菌のAcrAB排出システムの外膜コンポーネントであるtolC遺伝子と37%の相同性を示す遺伝子(locus number HI1462)を発見し、これがインフルエンザ菌AcrAB排出システムの外膜コンポーネントであることを実験的に証明した。平成13年度はインフルエンザ菌の薬剤感受性にどの程度排出蛋白が関わりを持つのかを詳細に調べるために、acrA遺伝子がコードするHI0894蛋白、acrB遺伝子がコードするHI0895蛋白、そしてtolC遺伝子がコードするHI1462それぞれの特異抗体の作製に取りかかった。まずインフルエンザ菌の標準株ATCC10211から熱抽出でchromosomeを得てこれをPCR法の鋳型として用い、増幅した遺伝子を発現ベクターpProEX-Htaに組み込んだ。クローニングが成功したトランスフォーマント大腸菌を誘導物質であるIPTGで蛋白を過剰発現させ、菌体を破砕後、蛋白を抽出しCBB染色法、Western Immuno-blot法などで目的とする蛋白であるかを確認した。得られたAcrAおよびTolC様蛋白が共に不溶性であったため、8MUreaで溶解し、その蛋白をNi2+アフィニテイーカラムを用いて精製した。そして十分量精製した後、濃縮を行い、抗体作製の抗原蛋白とした。AcrB内膜蛋白に関しては、今回の条件では成功しなかった。平成14年度は作製した抗体を用いてATCC10211及び臨床分離株(48株)におけるAcrAの発現量を定量し、さらに感受性を寒天平板希釈法により求め、感受性と発現量との関連性を比較検討した。その結果、すべての株においてAcrAの推定分子量と思われる位置に発現を確認できた。この事よりこのインフルエンザ菌のAcrAB異物排出システムは構成的に発現している事が確認できた。臨床分離株(48株)中にAcrA過剰発現株が検出され、その株においてMacrolide系抗生物質に対する感受性の低下が見られた事によりAcrAB異物排出システムがMacrolide系抗生物質耐性の一因となっている可能性が示唆された。

今回私どもは、インフルエンザ菌のAcrAB様排出システムによるマクロライド薬耐性についての検討を行う為に、まず、AcrAB様排出システム欠損株の作製を行い、さらに未だ同定されていないAcrAB様排出システムの外膜コンポーネントの探索を行った。インフルエンザ菌のGenome Databaseを利用して大腸菌のAcrAB排出システムの外膜コンポーネントであるtolC遺伝子と相同性をもつ遺伝子の検索を行った。その結果、tolC遺伝子と37%の相同性を示す遺伝子(locus number HI1462)を発見した。ここで検索したHI1462遺伝子は、大腸菌のAcrAB排出システムと相同性のあるHI0894遺伝子およびHI0895遺伝子と共に相同的組換えによりKanamycin耐性カセットの挿入を行い染色体上から欠損させ、HI0894,HI0895,HI1462遺伝子欠損株の作製を行った。これらHI0894,HI0895,HI1462遺伝子の欠損は、PCR法による遺伝子の増幅と膜画分のSDS-PAGEによるバンドの消失で確認することが出来た。マクロライド薬の薬剤感受性の比較を行うためにHI0894,HI0895,HI1462遺伝子欠損株と標準株を用いて最小発育阻止濃度(MIC)の測定を行った。その結果、これら欠損株は標準株と比べて14員環マクロライド薬(Erythromycin,Clarithromycin,Telithromycin,ABT-773)で816倍、15員環マクロライド薬(Azithromycin)では4倍、16員環マクロライド薬(Spiramycin,Josamycin,Leucomycin,Rokitamycin)では3264倍感性化していた。これらの結果より、インフルエンザ菌のAcrAB様排出システムは、すべてのマクロライド薬の排出に関与し、特に16員環マクロライド薬の基質特性が高いと考えられた。また、β-ラクタム薬やキノロン薬、テトラサイクリンなどは排出されなかったが、アミノグリコシド系抗菌薬であるGentamicinやDibekacinの排出を確認することができた。さらにHI1462遺伝子欠損株はHI0894,HI0895遺伝子欠損株と同様の薬剤感受性を示した。以上の結果から、HI1462遺伝子はAcrAB様排出システムの外膜コンポーネントであると考えられる。インフルエンザ菌の抗菌薬に対する耐性機構には、その標的部位であるPBP3の変異により耐性化したBLNAR(β-lactamase-negative ampicillin-resistant H. influenzae)や排出蛋白によるマクロライド薬に対する耐性化などが存在する。インフルエンザ菌には大腸菌のAcrAB排出システムと相同性を持つ排出蛋白が同定されており、このAcrAB様排出システムはErythromycin, Novobiocin, Rifampin, Ethidium bromide, Crystal violetなどの抗菌性化合物を排出することが報告されている。
診療情報の保護と有効活用－電子健康保険証とレセプトデータベースの導入を射程として

患者の診療情報の電子化に際して、患者の自己情報コントロール権の保障等のために法的整備が必要である。研究等への患者の診療情報の利用を推進するためには、比例原則、組織・手続的保障を備えた憲法適合的個別分野法の制定が必要となる。したがって、行政機関や民間企業の個人情報の取り扱いを監督し、場合によっては直接訪問し、実態調査や監督指導等を行う権限を有し、国民からの苦情処理や被害救済機能を担う独立したデータ保護機関が設置されなければならない。これらの視点からすると、2013年12月に成立した、がん登録等の推進に関する法律には、検討すべき課題があるように思われる。本研究課題の2年目においては、事実上、あらゆる診療情報のレコード・リンケージが可能なデンマークの実情および法システムを調査研究した。とくに、医療領域での診療情報の活用、それに関する患者および国民の理解の状況等に注目した。現地調査は、2013年2月10日から同年2月22日に行った。デンマークにおいては、個人データ処理法、国家統計法等の法律の整備により、たとえば糖尿病患者や高血圧患者の診療情報と整形外科領域にある骨粗鬆症に関するデータとのレコード・リンケージが可能であり、多くの学術論文が他の国々より早期に公表されており、疫学研究においては恵まれた環境を獲得している。デンマークでは、個人情報保護法制の歴史も長く、データ保護庁といった個人情報保護機関も充実している。そして、何よりも国民の行政に対する信頼があついといわれる。デンマークデータ保護庁に対しては、個人情報保護のためになされている方策を中心に聴き取り調査を行った。また、疫学研究者には、研究環境、とくに疫学研究における恵まれた研究環境に対する感想、および今後の課題等についての聴き取り調査を行った。オーフス大学のミヒャエル・ベート教授、ジョン・オールセン教授、シャルロット・デルマー教授、およびデンマークデータ保護庁のマーティン・ナイビ・ピーターセン部長には、多くのご配慮を賜り大変お世話になったことを特記して、感謝の意を表したい。帰国後、日本とデンマークとの社会システムの違い等を考慮しながら、わが国における診療情報の電子化に対する意見をまとめ、平成24年度の研究成果として、第14回日本医療情報学会看護学術大会で「診療情報の保護と有効活用ーレジスタベース研究を素材として」と題して発表する予定である(平成25年7月12-13日、札幌)。3年目においては、巨大な診療情報のデータベースを構築、運営しているアメリカ合衆国の状況を調査した。アメリカの現地調査は、2014年2月10日から同月21日に行った。まず、テキサスメディカルブランチ大学の保健政策学部情報資源管理責任者のシッシィ(Cissy A Yoes)部長を中心に、巨大データベースの管理について、個人情報保護のためになされている方策、運営状況、運営上の問題点を中心に聴き取り調査を行った。テキサス州では、高度な情報処理技術と豊富な予算を背景に、匿名化やセキュリティの強化のもとで、巨大な患者の診療情報データベースが管理・運営されていた。連邦、州、郡間のデータの集約・交換等も行われていた。ただ、欧州に存在するようなデータ保護機関はなく、データ主体からの苦情等を吸い上げる機関の必要性を感じた。帰国後、日本とアメリカとの社会システムの違い等を考慮しながら、わが国における診療情報の電子化に対する申請者の意見をまとめた。また、大学の行事の関係で、アメリカの現地調査とは時期が前後したが、これまでの研究成果をまとめ、2013年11月2日に日本赤十字九州国際看護大学の平成25年度後期公開講座で発表し、参加者と討議する機会をもった。学生や市民の生の意見を得ることができた。社会状況を反映してか、疫学研究等に診療情報を利用することの公益について理解することはできるが、それらの担当者を信頼することは難しいとの意見が多かった。初年度においては、わが国の法律に大きな影響を与えてきたドイツの状況の調査研究を目標にした。ドイツの現地調査は、2012年2月12日から同年2月22日に行った。まず、マインツのヨハネスグーテンベルク大学(UNIVERSITATSMEDIZIN der Johannes Gutenberg-Universitat Mainz)にて、疫学のマリア・ブレットナー(Maria Blettner)教授を中心に、電子健康保険証の現状、国民の理解、今後の展開、およびドイツにおける疫学研究の状況等について、研修を受け、多方面の関係者とミーティングを持った。その後、フライブルクのマックスプランク研究所で、医事法における電子健康保険証の位置づけについて検討した。当研究所の助手の伊藤嘉亮氏には、渡独前から、当該研究の趣旨を理解していただき、ドイツでの研究がスムーズにいくように多方面に手配していただいた。2010年8月に、電子健康保険証に関するドイツで初めての訴訟が提起された。患者が電子健康保険証の使用を拒否した場合でも、健康保険の給付が受けられるか否かが争われる。

そして、将来的には、電子健康保険証が患者のプライバシーを侵害しないかがドイツ連邦憲法裁判所で問われることになるであろうと、推測されている。渡独時にはまだ、判決が下されていなかった。帰国後、日本とドイツとの社会システムの違い等を考慮しながら、わが国における診療情報の電子化に対する申請者の意見をまとめ、研究初年度の研究成果として、2012年3月30日、日本薬学会第132年回(札幌)において、「診療情報の保護と有効活用ー電子健康保険証の導入を射程として」(30P2-pm175)と題して報告した。電子医療記録システムからの患者データの2次利用は、臨床研究のために莫大な利益を提供する。しかし、これらのデータを活用しながら、患者のプライバシーを保護するための措置には、多くの課題がある。デンマーク個人データの処理に関する法律(2000年5月31日の法第429号)は、データ保護の詳細な規定を用意している。本法は、個人情報を含むデジタル化されたレジスタの設立と使用が、個々の市民の法律上の権利を侵害しないような方法で行われていることを確認する。他方で、データ処理が専ら統計学的もしくは科学的研究のために行われるときは、データ主体の同意がなくてもそのセンシティブな個人データを処理することができる、と規定する(10条)。デンマーク国家統計局に関する法律(2000年6月22日の法第599号)は、統計目的のために行政情報資源を使用することを許可する重要な法的基盤を提供する。本法は、統計目的のためにデータを再収集するのではなく、既存の行政情報資源を活用することこそが理にかなっていることを強調する。すべてのデータは、経済的に効率的であり、回答者の負担を最小にし、コストを削減する方法で収集されるべきであるとの方針である。デンマーク統計局は、経済・商務省の下にある行政組織であるが、独立して統計を掌る中央機関である(1条)。統計局には、すべての行政レジスタへの完全なアクセス権が保証されており(6条)、一定の要件を満たす研究者には、レジスタベースの研究を促進するために、統計局自らがレジスタから編集したオーダーメイドのデータセットへのアクセス権を提供する。統計目的のためにレジスタの情報資源を利用することの前提は、それに関する国民の幅広い支持を得ることであり、デンマーク国民はデンマーク統計局に強い信頼を持っている。以上のように、デンマークの状況を把握できた。ドイツにおける電子健康保険証の概要を知ることができた。電子健康保険証に対しては、医師をはじめとする医療従事者の対応が極めて慎重であった。彼らは、データ保護のコンセプトの改良と電子健康保険証に関する議論の活発化を求めている。ドイツ連邦医師会は、現在のデータ保護のコンセプトでは医師の職業倫理に基づく医師と患者の信頼関係とは相いれず、医師の守秘義務を守るだけの十分なデータ保護がない、個人主体の人道的医学がこれまで実証してきた医療コンセプトを破壊する、と主張する。今後、医師等の守秘義務の再考が必要である、と感じた。
近世略縁起集目録の編纂

昭和59年度文部省科学研究費200万円によって、東北大学付属図書館,彰考館,宮内庁書陵部,慶応義塾図書館,国立国会図書館,三康図書館,東洋大学哲学堂文庫,都立中央図書館,内閣文庫,日本大学付属図書館,故萩原竜夫氏所蔵略縁起集,無窮会東洋文化研究所付属図書館,早稲田大学付属図書館,早稲田大学付属図書館,上田市立図書館花月文庫,西尾市立図書館岩瀬文庫,蓬左文庫,神宮文庫,天理図書館,竜谷大学図書館,大阪府立中之島図書館朝日文庫・石崎文庫の調査および資料収集を行い、かなりの成果をえた。今回は以上の各図書館の再調査により、所在文献目録を作成することが主たる目的であるが、残念ながら未だに所期の目的は達成されていない。たゞ成果は多大なものがあったと自負している。前回文献撮影ができなかった彰考館所蔵資料は、国文学研究資料館にコピー可能のフィルムのあることを発見し、必要な資料を入手することができた。また大洲市立図書館所蔵矢野玄道収集略縁起集や,西尾市立図書館その他の略縁起集・単冊略縁起を始めとして、自己撮影による大量の複写を行うことができた。新発見の略縁起集は、市販古書の略縁起集や大洲市立図書館所蔵資料以外にない。所期の目的とするところではないが残念である。所在文献目録も完成にいたっていないが、完成次第武蔵野書院が出版するとの約束をえている。木村久美子・田子直子両名の協力によって資料の大まかな整理も完了した。また久野俊彦の協力によって所在文献目録の作成も進行している。また私自身は、日本電気パーソナルコンピューターPC9801ソM2を利用して、ワープロー太郎-データベースマネージメントdBasc【III】によるデータベース化を計画している。成果は都留文科大学紀要次27号に発表の予定である。調査未熟のための自己負担による再調査も覚悟の上で、一日も早い所在文献目録の完成を急いでいる。
タコ網膜早期受容体電位に及ぼす揮発性麻酔薬の作用-麻酔機序に関して-

膜蛋白質に対する麻酔薬の作用に関して、網膜の早期受容体電位(ERP)測定することによってロドプシンの光照射に伴う分子構造変化に及ぼす揮発麻酔薬の影響を調べた。イイダコの眼球を摘出して得られた眼杯標本を海水潅流しながら、塩化銀電極を用いて硝子体側と強膜側から電位を誘導した600nmの順応光照射下において紫色閃光を照射すると正のERPが得られ470nmの順応光照射下で橙色閃光照射すると負のERPが得られた。両ERPの幅は、揮発性麻酔薬ハロセンおよびエンフルレンによって濃度依存的に抑制れた。正および負のERPはそれぞれロドプシン蛋白がロドプシンからメタドプシンへの構造変化およびその逆の変化に伴って発生する電位であること判っている。以上の研究結果は、ERPの麻酔薬による抑制がロドプシン分に対する麻酔薬の直接作用の結果であることを示唆した。イイダコの網膜ERPに対する揮発性麻酔薬の作用を検索して行くうちに麻酔薬感受性が日内変動することが判ってきた。すなわち、正午から夕方にけては麻酔薬感受性が減少し、夜間から早朝にかけては感受性が増大するとう傾向がみられた。夜間から早朝にかけては正、負のERP振幅が2%およ3.5%のエンフルレンによって濃度依存的に低下したが、昼間から夕方にかては麻酔薬によるERPの変化はみられなかった。この現象についての原因不明である。膜蛋白質に対する麻酔薬の作用に関して、網膜の早期受容体電位(ERP)を測定することによってロドプシンの光照射に伴う分子構造変化に及ぼす揮発性麻酔薬の影響を調べた。イイダコの眼球を摘出して得られた眼杯標本を海水で潅流しながら、塩化銀電極を用いて硝子体側と強膜側から電位を誘導した。600nmの順応光照射下において紫色閃光を照射すると正のERPが得られ、470nmの順応光照射下で橙色閃光照射すると負のERPが得られた。両ERPの振幅は、揮発性麻酔薬ハロセンおよびエンフルレンによって濃度依存的に抑制された。正および負のERPはそれぞれロドプシン蛋白がロドプシンからメタロドプシンへの構造変化およびその逆の変化に伴って発生する電位であることが判っている。以上の研究結果は、ERPの麻酔薬による抑制がロドプシン分子に対する麻酔薬の直接作用の結果であることを示唆した。イイダコの網膜ERPに対する揮発性麻酔薬の作用を検索して行くうちに、麻酔薬感受性が日内変動することが判ってきた。すなわち、正午から夕方にかけては麻酔薬感受性が減少し、夜間から早朝にかけては感受性が増大するという傾向がみられた。このため、ERPに対する厳密な麻酔薬の影響をみるためには、日内変動についてさらに詳細に検討する予定である。
大腸上皮の癌化に伴う管腔形成異常メカニズムの解明

我々は,ヒト臨床検体を用い,腸管上皮幹細胞ならびに大腸がん上皮細胞の3次元培養法(オルガノイド培養)を開発した.本研究計画では樹立した大腸がんオルガノイドを用いて,上皮細胞の管腔構造形成の異常メカニズムの解明を目的としている.平成24年度は大腸がん症例数を増やし,様々な臨床ステージの大腸がんのオルガノイド培養を樹立した.また,マウスへの異種移植により,in vivoでの管腔形成の評価が可能になった.こうした技術開発より,ヒト腸管上皮の管腔形成異常をin vitro,in vivoの双方で解析するシステムが確立された.さらに,オルガノイドの遺伝子変異の網羅的解析により,管腔構造形成異常を誘導する遺伝子について解明していきたい.ウィルスベクターなどの遺伝子操作技術が向上し,より自由度の高い,オルガノイドの遺伝子操作が可能になった.正常上皮細胞からの人工大腸がん誘導,細胞周期・幹細胞の蛍光可視化が実現しつつあり,今後,こうした技術を基に,腸管上皮細胞の時空間的な動態を数理学的モデルも含めて解明していきたい.25年度が最終年度であるため、記入しない。25年度が最終年度であるため、記入しない。我々は,ヒト臨床検体を用い,腸管上皮幹細胞ならびに大腸がん上皮細胞の3次元培養法(オルガノイド培養)を開発した.本研究計画では樹立した大腸がんオルガノイドを用いて,上皮細胞の管腔構造形成の異常メカニズムの解明を目的としている.平成24年度は大腸がん症例数を増やし,様々な臨床ステージの大腸がんのオルガノイド培養を樹立した.また,マウスへの異種移植により,in vivoでの管腔形成の評価が可能になった.こうした技術開発より,ヒト腸管上皮の管腔形成異常をin vitro,in vivoの双方で解析するシステムが確立された.さらに,オルガノイドの遺伝子変異の網羅的解析により,管腔構造形成異常を誘導する遺伝子について解明していきたい.ウィルスベクターなどの遺伝子操作技術が向上し,より自由度の高い,オルガノイドの遺伝子操作が可能になった.正常上皮細胞からの人工大腸がん誘導,細胞周期・幹細胞の蛍光可視化が実現しつつあり,今後,こうした技術を基に,腸管上皮細胞の時空間的な動態を数理学的モデルも含めて解明していきたい.我々は,ヒト臨床検体を用い,腸管上皮幹細胞ならびに大腸がん上皮細胞の3次元培養法(オルガノイド培養)を開発した.本研究計画では樹立した大腸がんオルガノイドを用いて,上皮細胞の管腔構造形成の異常メカニズムの解明を目的としている.平成24年度は大腸がんの症例数を増やし,様々な臨床ステージの大腸がんのオルガノイド培養を樹立した.また,免疫不全マウスへの異種移植により,in vivoでの管腔形成の評価が可能になった.こうした技術の開発により,ヒト腸管上皮の管腔形成異常をin vitro,in vivoの双方で解析するシステムが確立された.患者由来のがんは症例毎に管腔形成が異なっており,遺伝子変異パターンによる管腔形態制御が示唆された.オルガノイドの遺伝子変異の網羅的解析により,管腔構造形成異常を誘導する遺伝子について解明していきたい.また,ライブイメージングが導入され,1週間程度までのオルガノイドのリアルタイムーメージングを確立した.本技術を利用して,より正確な管腔形成動態が観察可能となった.ウィルスベクターなどの遺伝子操作技術が向上し,より自由度の高い,オルガノイドの遺伝子操作が可能になった.ヒト正常腸管上皮細胞からの人工大腸がんの誘導,細胞周期・幹細胞の蛍光可視化が実現しつつあり,今後,こうした技術を基に,腸管上皮細胞の時空間的な動態をその制御メカニズムとともに解明していきたい.ヒト臨床検体から大腸がんオルガノイドを樹立し,順調に症例数を増やしている.ほぼ全ての症例でオルガノイドが樹立可能であり,その管腔構造形成は症例により多様であった.また,ヒトの大腸上皮の発がん過程における管腔構造形成異常を解析するため,正常腸管上皮細胞に遺伝子変異を導入し,人工的な大腸がんのモデルを構築しつつある.こうたオルガノイドは免疫不全マウスへ異種移植を行い,in vivoにおける管腔形成についても解析している.大腸がんは患者組織標本,オルガノイド構造,異種移植後の組織構造,ともに同様な管腔形成を示しており,現在までに確立した研究システムが腸管上皮の管腔形成異常を解明する上で,有用であることが示唆された.さらに,in vitroにおけるオルガノイドの管腔形成のより詳細な解析を行うため,細胞増殖と同期した蛍光蛋白(FuCCi)をオルガノイドに導入し,細胞周期と管腔形成を同時にライブイメージングする技術基盤を完成させた.また,幹細胞を蛍光蛋白により可視化するためのベクター構築を達成している.こうした技術により,細胞増殖と幹細胞の動態を含めた管腔構造変化の時空間的解析システムが完成しつつある.現在までに構築してきた基盤技術である,in vitroオルガノイドとin vivo異種移植システムに加えて,次世代シークエンサーによる遺伝子変異解析を行い,管腔形成異常に寄与する遺伝子変異の同定を試みる.また,正常上皮オルガノイドからトランスフォーメーションした人工的な大腸がんモデルを用い,Forward geneticsを用いた管腔形成異常を制御する遺伝子の機能を解明したい.幹細胞と細胞増殖動態の蛍光蛋白による可視化とオルガノイド管腔形成のライブイメージングを統合し,正常上皮と大腸がんの管腔形成の時空間的変化を数理学的に解析したい.25年度が最終年度であるため、記入しない。
細胞質分裂の分子機構

収縮環形成のシグナル伝達系の因子の候補、低分子量Gタンパク質Rhoに関しては、分裂酵母Rho1が隔壁部に局在すること、Rho2の過剰発現が細胞形状変化や細胞壁の厚化を引き起こすこと、rho3、rho4遺伝子の破壊は細胞極性の異常や分裂異常を引き起こすことを見いだした。もう1つの候補であるミオシン軽鎖のリン酸化については、まずHeLa細胞から3種類のミオシン軽鎖遺伝子を単離した。次にリン酸化ミオシン軽鎖を特異的に認識する抗体を作製し、分裂期のHeLa細胞を染色したところ収縮環が染色された。またミオシン軽鎖のMLCK部位をリン酸化するキナーゼとしてMAPKAK2を同定した。ウニ卵の染色体分離と細胞質シグナル伝達の時間的関係をコルヒチンの顕微注入により調べた。テトラヒメナのEF1_αとF-アクチン結合タンパク質p60が分裂溝に存在することを見い出した。またテトラヒメナの分裂面決定に関与するp85の遺伝子の全塩基配列を決定した。ウニ卵の分裂溝に局在するアクチン調節タンパク質ABP40がアクチン繊維切断活性を持つことを明らかにした。さらにウニ卵の新規のF-アクチン結合タンパク質として見い出したp60とp150が分裂溝に濃縮されることを見た。またアフリカツメガエル卵の分裂に必須なアクチン調節タンパク質XACに結合する5種のタンパク質を見い出し、その1つがWDリピートを持つことを明らかにした。アフリカツメガエル卵のCa放出がIP3を介して行われることを示した。アクチン繊維を細胞膜に結合せさると考えられるERMファミリータンパク質は細胞膜タンパク質の塩基性に富む領域に結合することをICAM-2,IL-2についても確かめた。クラミドモナスのアクチン変異株を単離した。この株は細胞質分裂を正常に行った。1.分裂シグナル伝達(2)ウニ卵に^<32>P-正リン酸をとりこませ、in vivoでリン酸化されるタンパク質を検索した。またラベル卵から分裂溝を単離して解析し、複数の分裂溝特異的リン酸化タンパク質を同定した。(3)In vivoで^<32>Pラベルした卵から免疫沈降したミオシン軽鎖、あるいは卵を急速固定してから2次元電気泳動で分離したミオシン軽鎖は分裂時期によらずミオシン軽鎖キナーゼ(MLCK)によりリン酸化される部位がリン酸化されていた。ウニ胚のMLCK遺伝子のクローニングを行なった。またMLCKが自己リン酸化により活性低下を起こすことを見いだした。(4)分裂面の位置決定に関与すると思われるTetrahymena p85の局在を明らかにし、p85遺伝子のクローニングを行なった。(5)分裂シグナルと分裂装置微小管の関係を深めるため、画像処理蛍光顕微鏡を構築し、微小管数の検出法を開発した。2.収縮環の構造と形成(1)ウニ卵単離分裂溝に局在するタンパク質としてEF1αとEF1βを同定した。(2)分裂溝構成タンパク質の微細構造上での同定のために、分裂溝に局在する可能性のあるタンパク質の抗体を調整中である。(3)ERMタンパク質を昆虫細胞で、CD43,CD44を大腸菌でそれぞれ発現精製し、これらの結合をin vitroで示し、結合部位を特定した。3.分裂必須タンパク質の検索Xenopusの分裂停止変異を抑制する細胞質成分として2つのタンパク質に候補を絞った。また卵割溝収縮異常致死卵を産む変異雌を新たに発見した。REMI法により細胞性粘菌の細胞質分裂停止変異株を作成した。Genetagging法によりクラミドモナスの細胞質分裂停止変異株を作成した。収縮環形成のシグナル伝達の候補、低分子量Gタンパク質Rhoに関しては、分裂酵母rhol^+遺伝子の破壊やRhoを失活させるC3酵素の遺伝子導入を行い、rhol^+が必須であることを見いだした。もう1つの候補であるミオシン軽鎖のリン酸化については、分裂中のウニ卵細胞内ではCキナーゼ部位のリン酸化はみられず、ミオシン軽鎖キナーゼ部位のリン酸化のみが検出された。同時にミオシン軽鎖キナーゼの精製を行い、2成分の酵素を精製した。シグナル伝達の構造的基盤と考えられる星状体微小管は終期に初めて表層に届き、赤道部で交差すること、微小管が短いと分裂溝が形成されないことなどが分かり、微小管がシグナルを仲介するという考えを支持した。分裂変異遺伝子の解析は、テトラヒメナのp85遺伝子のクローニングを行い、このタンパク質がCa^<2->/CaMキナーゼIIのCaM結合部位、EFlaのC末端部分、アクチンの一部、Ser/Thrキナーゼの配列などと相同性を持つ、多機能タンパク質であることが分かってきた。細胞性粘菌からREMI法で得た変異遺伝子はRasGAPをコードしていることが分かった。アフリカツメガエル卵の変異タンパク質の解析も進み、このタンパク質がゲル濾過で2000kDを示すことが分かった。また分裂におけるアクチン調節タンパク質コフィリンはアフリカツメガエル卵の分裂期には脱リン酸化型(アクチンと結合能を持つ)になっており、分裂溝の先端部分に局在すること、卵内にコフィリンそのものや抗体を注入するといずれの場合も細胞質分裂が阻害されることが分かり、このタンパク質が重要な役割を持つことが判明した。アクチン繊維を細胞膜に結合させると考えられるERMファミリータンパク質は細胞膜タンパク質の塩基性に富む領域に結合することが分かった。

収縮環形成のシグナル伝達系の因子の候補、低分子量Gタンパク質Rhoに関しては、分裂酵母Rho1が隔壁部に局在すること、Rho2の過剰発現が細胞形状変化や細胞壁の厚化を引き起こすこと、rho3、rho4遺伝子の破壊は細胞極性の異常や分裂異常を引き起こすことを見いだした。もう1つの候補であるミオシン軽鎖のリン酸化については、まずHeLa細胞から3種類のミオシン軽鎖遺伝子を単離した。次にリン酸化ミオシン軽鎖を特異的に認識する抗体を作製し、分裂期のHeLa細胞を染色したところ収縮環が染色された。またミオシン軽鎖のMLCK部位をリン酸化するキナーゼとしてMAPKAK2を同定した。ウニ卵の染色体分離と細胞質シグナル伝達の時間的関係をコルヒチンの顕微注入により調べた。テトラヒメナのEF1_αとF-アクチン結合タンパク質p60が分裂溝に存在することを見い出した。またテトラヒメナの分裂面決定に関与するp85の遺伝子の全塩基配列を決定した。ウニ卵の分裂溝に局在するアクチン調節タンパク質ABP40がアクチン繊維切断活性を持つことを明らかにした。さらにウニ卵の新規のF-アクチン結合タンパク質として見い出したp60とp150が分裂溝に濃縮されることを見た。またアフリカツメガエル卵の分裂に必須なアクチン調節タンパク質XACに結合する5種のタンパク質を見い出し、その1つがWDリピートを持つことを明らかにした。アフリカツメガエル卵のCa放出がIP3を介して行われることを示した。アクチン繊維を細胞膜に結合せさると考えられるERMファミリータンパク質は細胞膜タンパク質の塩基性に富む領域に結合することをICAM-2,IL-2についても確かめた。クラミドモナスのアクチン変異株を単離した。この株は細胞質分裂を正常に行った。
細胞内における化学的翻訳後修飾導入技術の開発

本研究では、我々が独自に考案・開発した「リガンド指向型トシル(LDT)化学」を発展させ、生細胞内の特定の蛋白質にさまざまな合成プローブや翻訳後修飾を導入するための化学ラベリング技術基盤を構築することを目的とした。具体的にはまず、LDT化学の蛍光イメージングへの応用に挑戦し、LDT化学が細胞内在性蛋白質への蛍光色素修飾とその相互作用の生細胞内蛍光可視化に適用できることを実証した。本研究では更に、LDT化学と遺伝子工学を融合したアプローチを展開し、対象蛋白質へのCys変異導入によって高速・高効率な蛋白質ラベリングが実現できることを実証した。我々が最近開発した「リガンド指向型トシル(LDT)化学」は、生きた細胞内の標的(天然)蛋白質を選択的かつその機能を損なわずに化学修飾することのできる画期的な手法である。本手法は、細胞内蛋白質の機能解析のための強力なツールとしての応用展開が期待されるが、現時点ではまだ幾つかの課題も残されている。まず、反応速度が遅く、ラベル化部位を任意に指定することが難しい。どのような求核性アミノ酸が反応しうるかについても知見が乏しい。また、本手法はこれまでに赤血球への応用には成功しているが、より一般的な培養細胞への応用についてはまだ十分検討されていない。本研究では、これらの課題に取り組み、細胞内の対象蛋白質の望みの部位に望みの機能性プローブや翻訳後修飾を高速・高効率に導入可能な汎用性の高い細胞内蛋白質化学ラベル化基盤を確立することを目的としている。本年度はまず、天然FKBP12を標的として、ラベル化剤構造のチューニングによってラベル化特性の改善が可能かどうかを検討した。多数のラベル化剤を新規に合成・評価した結果、リガンドとトシル基の間のスペーサー構造を最適化することで、ラベル化速度、収率、そして特定のアミノ酸に対する反応選択性を飛躍的に向上させることに成功した。また、LDT化学では、His、Tyr、Gluといった求核性アミノ酸が反応しうることが明らかとなった。本年度は更に、LDT化学を活用した細胞内蛋白質間相互作用の光クロスリンクに挑戦した。最適化したスペーサー構造を基本骨格として、光架橋剤であるジアジリン基をFKBP12に導入するためのラベル化剤を新たに開発した。それを用いることで、HeLa細胞に内在するFKBP12にジアジリンを化学修飾し、ラバマイシンの存在下で形成されるFRBとの複合体を光クロスリンクによって共有結合的に捕捉・検出することに成功した。本研究では、申請者が開発した「リガンド指向型トシル(LDT)化学」を発展させ、細胞内の望みの部位に望みの機能性プローブや翻訳後修飾を高速・高効率に導入可能な汎用性の高い細胞内蛋白質ラベル化基盤を確立することを目的としている。当該年度は、LDT化学と遺伝子工学を融合したアプローチに取り組み、対象蛋白質のリガンド結合ポケット周辺に高求核性アミノ酸Cysを変異導入したものに対するLDT化学を検討した。FKBP12を対象モデル蛋白質として採用し、リガンド結合ポケットのすぐ近くおよび少し離れた部位にCysを導入(single mutation)した変異体を30種類ほど作成した。それらのFKBP12変異体と蛍光ラベル化剤シリーズ(C5スペーサー)をさまざまな組み合わせで反応させ、in vitroでのラベル化効率をSDS-PAGE/in-gel蛍光検出により系統的に評価した。一連のスクリーニング実験の結果、リガンド結合ポケットのすぐ近傍にあるThr86をCysに置換した変異体は天然型FKBP12よりもおよそ2倍の反応初速度とラベル化収率を示すことが明らかとなった。現在、次なるステップとして、このFKBP12(T86C)の細胞内ラベリング効率について評価を進めている。また上記の実験と並行して、細胞内在性FKBP12の蛍光ラベリングとlive-cellイメージングにも取り組んだ。天然型FKBP12に最適化したラベル化剤(ピペラジンスペーサー)を用いることで、細胞内在性FKBP12に緑色蛍光色素OregonGreenを高選択的に標識することに成功した。また、このOregonGreenラベル化FKBP12はラパマイシンの存在下でFRBと赤色蛍光蛋白質の融合蛋白質とヘテロ二量化し、その生細胞内での複合体形成をFRETイメージングにより可視化することに成功した。本研究では、申請者が開発した「リガンド指向型トシル(LDT)化学」を発展させ、細胞内の対象蛋白質の望みの部位に望みの機能性プローブや翻訳後修飾を高速・高効率に導入可能な汎用性の高い細胞内蛋白質化学ラベル化基盤を確立することを目的としている。昨年度は、天然FKBP12を対象としたLDT化学を展開し、ラベル化剤の改良によってラベル化効率を改善することに成功した。

また、ラベル化剤のスペーサー構造を選ぶことでラベル化部位を変えられることを実証した。一方、天然蛋白質を対象とした場合にはラベル化反応の高効率化やラベル化部位のピンポイントでの指定というのは限界があることも明らかとなった。そこで本年度は、新しい戦略として、LDT化学と遺伝子工学を融合するというアプローチを検討し始めた。この戦略では、遺伝子工学を用いて対象蛋白質のラベル化したい部位に高求核性アミノ酸「システイン(Cys)」を変異導入し、そのCys変異体に対するLDT化学を展開する。まず、FKBP12表面のさまざまな位置にあるアミノ酸をCysにモノ置換した変異体を多数作製した(大腸菌による発現と精製)。次に、作製したFKBP12変異体と合成ラベル化剤シリーズ(蛍光色素標識用)をそれぞれさまざまな組み合わせでin vitroで反応させ、ゲル電気泳動/in-gel蛍光検出によりラベル化反応の効率を系統的に評価した。一連の実験を通じて、Cysの変異導入位置とラベル化剤スペーサー構造を適切に選ぶことで、ラベル化反応の高速・高効率化が実現できることを確認した。本年度は、当初予定していたDHFRのラベル化までは評価できなかったが、FKBP12を対象とした実験が極めて順調に進んだ。上記のように、FKBP12のラベル化においては、精製蛋白質を用いたin vitro系から細胞系まで評価することができ、LDT化学の基本特性に関する重要な知見を数多く得ることができた。また、動物細胞内での蛋白質間相互作用の光クロスリンクにも成功し、ケミカルバイオロジー研究におけるLDT化学の威力と実用性を示すことができた。一連の成果は、JACS誌に掲載された。25年度が最終年度であるため、記入しない。本年度は、当初の予定通り、LDT化学と遺伝子工学を融合するという新しいアプローチの有効性を実証することができた。これは、汎用的な細胞内蛋白質ラベル化法の確立へ向けた極めて重要な成果であり、次年度の研究のための大きな基盤を築くことができた。上記のように、ラベル化剤の構造最適化によってラベル化特性を大きく改善できることが明らかとなった。しかし、ラベル化剤構造の最適化には大変骨の折れる試行錯誤を要し、その成否は標的蛋白質にも大きく依存する。また、ラベル化剤構造のチューニングだけでは、もう一つの重要な課題である「ラベル化部位を任意に指定してそこに化学修飾を施す」というのは依然として難しい。そこで次年度は、LDT化学と遺伝子工学を融合するというアプローチを検討する。ラベル化したい部位に高求核性アミノ酸であるシステイン(Cys)を変異導入し、そのCys導入蛋白質に対するLDT化学を展開する。今後は、本年度確立した「Cys変異体に対するLDT化学」というアプローチを大きく発展させる。まずは、この戦略が細胞内でも実際に有効であることを実証する。また、得られた結果をもとにラベル化剤の分子構造を更に改良し、細胞内ラベリングやラベル化後のリガンド断片の排出がより高効率に進行する新しいラベル化剤基本設計の確立を目指す。一連の実験を通じて、さまざまな蛋白質をより自在かつ精密に化学修飾・機能化することのできる革新的な細胞内蛋白質ラベル化技術の創出を目指す。
フォロワーの視点を重視したリーダーシップの研究

本研究の成果としては、まず、フォロワーの視点に基づいて最新のリーダーシップ研究を渉猟し、その動向と課題および今後の展望について4本の研究論文を上梓した。次に、実証研究に関しては、既存のI.S.T社フィールドワークによる事例研究の論文を1本、東海バネ工業株式会社の事例研究の論文を1本。さらに、現在分析中であるが、フォロワーシップ行動とフォロワーが有する時間展望の関係性を調査した定量的研究がある。また、これらの成果を広く社会一般に普及させるために、2冊の一般書を公刊することができた。最後に、学会発表については、リーダーシップに関する共同研究によるもので海外での発表が2回、国内学会の発表を1回行った。今年度は、リーダーシップ研究においてフォロワーシップおよびフォロワー主体アプローチの既存研究を渉猟することを中心におこなった。その成果として、『まとめ役になれる!リーダーシップ入門講座』として出版した。この書籍は、学問の世界だけでなく学生および一般社会人に至るまで理解できるように平易な解説を心がけ、広く世間にリーダーシップに関する情報の提供とその重要性について意識の喚起を促した。すでにデータ収集済の株式会社I.S.Tの企業家研究に関しては、データの整理を行い、論点を整理して、現在論文の執筆中である。なお、企業家に関する研究として、「戦前に学ぶ経営とリーダーシップ松永安左エ門「折れないリーダーシップ」」を研究の成果として上梓した。現在進行中のプロジェクトとして、日本版フォロワーシップ測定尺度の開発を行っている。リーダーシップに関しては、すでに多くの研究成果が発表されている一方で、フォロワーシップに関してはほとんどない。フォロワーの存在を理解するうえでも、フォロワーシップの研究は不可欠であり、現在既存研究の整理を行い日本版フォロワーシップ尺度の原案を作成中である。なお、フォロワーシップに関しては、「リーダーシップにおけるフォロワーの責任」という論文を執筆し、フォロワーシップの重要性を主張している。日本型フォロワーシップ尺度の開発に加えて、株式会社I.S.Tの比較対象の事例を探索しており、現在候補企業の絞り込みを行っている。候補の絞り込みが完了次第、調査先と交渉に入り、調査を実施する予定である。本年度は、リーダーシップ・スタイルに関してクイズの開放によって測定する新たな測定方式に関する神戸大学経営学研究科の高橋潔教授そして滋賀大学経済学部の服部泰宏准教授との共同研究の成果を経営行動科学学会(日本型人的資源の測定論-創造性・組織文化・リーダーシップに関する日本発のメジャメント・メソッドの探求-)で発表を行った。クイズを通じてリーダーシップ・スタイルを判定するという方式は、今後の展開としてビジネス・パーソン以外にも学生や公務員にも適用できる可能性がある。また、フォロワーシップの視点からも展開が出来る。この点に関しては、本研究のこれまでの成果を反映させることも可能である。フォロワーの視点を重視したリーダーシップ研究においては、株式会社I.S.Tの創業から事業成長に至るプロセスを創業者および創業初期のメンバーの語りを通じて明らかにする研究成果として、「研究開発型企業の創業から発展への軌跡」『商学論集』第56巻第1号関西大学商学会1-19頁において発表した。一方、フォロワーシップの視点から東海バネ工業株式会社の企業変革事例の研究を、「フォロワーシップの観点からみる東海バネ工業株式会社のマネジメント」『ビジネス・インサイト』No74.8-11頁において発表した。この論文では、これまでのフォロワーシップ理論の体系的整理を行い、東海バネ工業の事例に適用したフォロワーシップを論じた嚆矢となる研究である。また、リーダーシップの理論研究として、リーダーシップをリーダーとフォロワーの相互作用の観点から明らかにする相互作用アプローチの諸研究を渉猟した理論研究を「リーダーシップ論における相互作用アプローチの展開」『商学論集』第56巻第3号41-53頁において発表した。本論文では、VDLやLMXといった相互作用アプローチの主要研究を詳細に渉猟し、その理論的発展性を考察したという理論的貢献を果たしている。リーダーシップ研究においてフォロワーの視点からのアプローチに諸研究、具体的にはリーダーシップの相互作用アプローチ、フォロワーのリーダーシップ認知、暗黙のリーダーシップ論、リーダーシップの幻想という主要な4つのアプローチの先行研究を渉猟し論文に体系化した。その結果から、フォロワーシップの重要性が導き出され、フォロワーシップに関連する諸研究を渉猟し、そこからフォロワーの視点からのリーダーシップ研究の知見を踏まえたフォロワーシップ尺度を開発した。フォロワーシップの尺度に関しては、特性を図るだけではなく、行動特性を決定づける主要な要因として時間展望の概念に着目し、フォロワーシップのスタイルと時間展望の概念を測定する尺度を開発した。フォロワーシップ尺度の測定については、パイロット段階ではあるが実施するところまで進捗した。ただし、調査分析は今後になる。具体的な研究実績としては、先行研究を渉猟した論文として、関西大学商学論集に「暗黙のリーダーシップ理論がフォロワーのリーダーシップ認知に及ぼす影響」、「リーダーシップの幻想に関する研究の発展と展望」の2本を発表した。学会発表としては、国際時間展望学会において「Testing the Zimbardo Time Perspective Inventory: Japanese Validation Study」を神戸大学の高橋教授、滋賀大学の服部准教授と共同で発表した。

また、書籍として日本実業出版社より「最強のリーダーシップ理論集中講義」という一般社会人や学生を対象としたリーダーシップの解説本を出版した。研究報告および論文が公表できており、一定の成果が出ていることから研究はおおむね順調に進展していると思われる。24年度が最終年度であるため、記入しない。今後の研究については、現在日本版フォロワーシップ尺度の開発を行っており、尺度の完成を目指すということがある。一方、理論研究についても、リーダーシップにおけるフォロワー主体アプローチの研究展開を渉猟し理論研究としてまとめることが課題である。また、フォロワーシップ研究についても現在までの研究展開を整理したうえで、開発中のフォロワーシップ尺度の調査結果を反映させた研究成果の発表に向けて研究を進めていく。
頭蓋底正中部骨格原基の初期形成の場として，口窩天井部に注目した解析

頭蓋底骨格の正中部分は軟骨性骨格として,頭部発生の比較的初期から形成される。本研究課題では,口窩天井部での軟骨原基形成の詳細や構成する細胞の発生系譜,制御する分子群の解明を目指している。本年度は以下の実験を行った。1.ニワトリ胚口窩天井で発現する分子と頭蓋底軟骨原基形成:口窩天井で発現する分子のうち,Bmp3bについて解析するため,これを安定して発現する細胞株を確立した。効果を確認するために肢芽や顔面隆起に移植を行なったが,微小な変化にとどまっている。一方,口窩天井部で軟骨形成に先行して発現する転写因子としてFoxf1に注目し,ニワトリレトロウィルスRCASを用いたin vivo解析を試みたが,発現させた個体が骨格形成以前に致死となり,解析ができていない。ゼブラフィッシュ受精卵にmRNAを導入して過剰発現の効果を検討した結果,篩骨板の融合不全などが観察された。2.ニワトリ全胚培養系の確立:2.5-3.0日胚の口窩天井領域の発生運命地図の作成のために,全胚培養系の確立を試みた。いくつか条件を検討した結果,より初期胚の全胚培養法であるNew culture法を改変して,最終的に2.5日胚を4.5日胚程度になるまで発生・維持することが可能となり,この系を使って口窩天井部の標識と以降の追跡が可能であることも確認できた。3.マウス胚での口窩天井の形態変化:E10.5E12.5胚での口窩天井部の形態変化を調べた。E10.5では口窩天井部と脳胞底部の間は1-2層の間葉細胞が分布するだけだったが,E11.5胚では口窩天井前部では背腹方向に厚みを増し,鼻中隔となる膨らみとなった。後部では厚くはならず,増殖の不均一性が示唆された。ニワトリ胚で発現していたFoxf1は,軟骨形成部位の一部でしか重複せず,軟骨原基の不均一性が示唆された。実験自体は概ね順調で,実験に応じた実験結果も出ているが,一方で遺伝子発現操作胚の生存率が非常に低く解析が難しい場合があったこと,また実験結果によってはそれ以降に予定していた実験を見直す必要が生じるなど,全体に時間がかかる問題があり,全体としてはやや遅れ気味ではある。1.口窩天井で発現する分子と頭蓋底軟骨原基形成については,Bmp3bの機能解析ができていない。発現細胞移植部位の検討などを行なっており,期間内には機能について何らかの情報が得られるものと考えている。口窩天井部で梁軟骨に先行して発現するFoxf1については,ニワトリ胚での過剰発現系では,発現させた個体が骨格形成以前に致死となり,解析が遅れている。ゼブラフィッシュ胚ではfoxf1 mRNA導入により頭蓋底軟骨形成への影響を確認できており,Foxf1は軟骨形成に対して機能を持っていることは強く推察されるが,その検証には従来とは別のアプローチが必要と考えられる。2.前年度,確立できなかった全胚培養系については,今年度は目的とする2.5日胚の培養系がおおむね確立できた。次に解決する問題点として,4.5日胚までしか培養ができないこと,培養した頭顔面形態にやや歪みが観察されることなどが明らかになった。今後,軟骨形成が明瞭になる発生段階まで進行させるため,従来法に付加する形で新しい視点での培養条件の検討が必要となる3.マウス胚での口窩天井の形態変化:この課題については,正中部の形態変化が起こる時期とその形状についての知見が得られたので,おおむね予定通りである。残りの期間で,E10.5E11.5の詳細な形態変化を調べるために,全胚培養系を用いた解析が必要と考えている。1.口窩天井で発現する分子と頭蓋底軟骨原基形成:Bmp3bとFoxf1の機能解析を進める。Bmp3bについては,発現細胞を口窩天井に移植した時の頭蓋底軟骨形態の変化を調べる。一方,口窩天井部で発現するFoxf1については,従来通りのin vivoでの解析は行うが,並行して培養系を用いて発現細胞の形状や軟骨分化への影響を調べ,Foxf1が軟骨形成やその領域特異性形成に置ける役割について,情報を得たい。併せて,口窩天井部では他のFox遺伝子も発現することが報告されているので,頭蓋底軟骨形成とFox遺伝子群の発現部位との関連を調べる。2.ニワトリ胚の全胚培養系を用いた系譜解析:18年度に確立できた2.5日胚の培養系を用いて,口窩天井部の系譜解析を進める。現段階では,4.5日胚までしか培養ができないが,初期に形成される軟骨については発生系譜・発生起源を知ることができると考えている。一方,軟骨形成が明瞭になる発生段階まで進行させるため,培養時に胚を載せる寒天床の形状や,培地の条件について従来法に付加する形で検討する。これについては,過去に同様の視点で行われた実験があるので,これを参考に改良を進める。3.マウス胚での口窩天井の形態変化:これまでの解析で,E10.5E11.5の間に顔面の大きな変化があることがわかった。この期間に起こる形態変化の詳細を調べるために,全胚培養系を用いた解析が必要なので,第一に全胚培養系を確立させる。