hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
茎頂及び根端メリステム新生の共通基盤となる細胞増殖統御系

器官新形成が強い温度感受性を示すシロイヌナズナの突然変異体を用いた分子遺伝学的解析により、メリステム新生に先立つ細胞増殖統御について、シュート再生に際しrRNA生合成因子の不均一な発現低下が増殖域の限局化に関与すること、側根原基形成時の不等細胞分裂の終結にミトコンドリアmRNA代謝が関与することなどを明らかにした。また、細胞分裂と体積成長を関係づける独自の数理モデルに改良を加え、根端の成長プロフィールと適合することを示した。側根や不定根、不定芽の形成においては、予め定まってはいなかった場所で、秩序立った細胞増殖が始まり、メリステムが新たに形成される。またカルスからの器官再生では、既存の位置情報が損なわれた中で、細胞増殖の秩序が回復し、メリステムが生じる。本研究では、シロイヌナズナの器官再生に関わる温度感受性突然変異体(srd2、rid1、rrd1、rrd2、rid4、rid3、rpd2)について以下の解析を行い、それらを通して、こうしたメリステム新生の基層をなす、自律的細胞増殖統御系の解明を目指す。(1) srd2とrid1はメリステム新形成と脱分化の両方が強い温度感受性を示す点が特徴的な突然変異体であり、いずれの変異体でもメリステム形成不全は原基的な細胞増殖の持続と関係している。SRD2のsnRNA転写活性化への関与を一つの手掛かりとしてメリステム形成不全の原因の解析を進め、RID1の解析も合わせて、メリステム新生時の増殖制御機構を追究する。(2) rrd1、rrd2、rid4は細胞増殖全般に弱い温度感受性を示す一方、制限温度下で帯化根を形成する変異体である。この場合の帯化は、原基形成時に細胞増殖域の十分に限定されずメリステムが拡大することによる。これらの変異体の分子遺伝学的解析により、増殖域限定化の分子機構を明らかにする。(3) rid3とrpd2はメリステムの新形成に限って強い温度感受性を示し、他の変異体とは違った形で細胞増殖統御が乱れている。RID3は新規WD40タンパク質をコードしており、CUC-STM経路の遺伝子発現に関わっている。RID3の関わる分子事象とrpd2変異体の解析から、細胞増殖統御系の構成因子を同定していく。側根形成過程では、原基全域での活発な細胞分裂の後、分裂が休止する段階を経て、メリステム領域での分裂再活性化に至る。srd2およびrid1の場合、制限温度下では細胞分裂が休止しないまま持続し、根端メリステムが確立しない。SRD2がsnRNA転写活性化因子をコードしていることから、snRNA蓄積量と側根形成との関係に注目し、今年度は半同調的側根形成誘導系を用い詳細に解析した。その結果、原基全体で高レベルに保たれていたsnRNAが細胞分裂休止期に著しく低下すること、srdの原基では早い段階からsnRNA蓄積量がやや少なく、それが時間とともにさらに漸減していくことなどがわかった。rrd1、rrd2、rid4の温度依存的な帯化根形成に関しても、半同調的側根形成誘導系による解析を行い、原基形成初期における制限温度曝露が有効であること、初期細胞分裂域の拡大が帯化につながっていることなどを明らかにした。また、rrd1の温度感受性が、ポリA特異的リボヌクレアーゼ様タンパク質をコードするAt3g25430におけるナンセンス変異に起因することを突き止めた。シュート再生過程における茎頂メリステム新生に関しては、rid3関連で進展があった。rid3変異はシュート再生時のCUCI、STMの発現を高進するとともに、メリステム新生を妨げ、メリステム構築の場となるカルス表層の細胞塊を過度に成長させることがわかっていたが、miRNAによる制御を受けない変異CUCIを強制的に発現させたときに、カルス表層細胞塊の過剰成長とメリステム新生の阻害が見られたことで、rld3の形態学的表現型とCUCI発現異常との因果関係が示された。また、RID3過剰発現がstm変異体様の表現型をもたらすことを見出したが、この結果とrid3変異体の表現型から、RID3がCUC・STM経路の抑制的制御に働くことが明らかになった。シロイヌナズナの温度感受性変異体rrd1、rrd2、rid4は、制限温度下で帯化根を形成するという特徴をもつ。この帯化根形成に関して、半同調的側根形成誘導系を用いて定量的に解析し、側根原基形成開始時に細胞分裂領域が拡大し、拡大した分裂域を保ったまま原基が発達して帯化根となることを示した。また、rrd2の温度感受性の原因と思われる変異を、ペンタトリコペプチド(PPR)タンパク質遺伝子のAtlg32415に見出した。RID4もPPRタンパク質をコードし、RRD1がポリA特異的リボヌクレアーゼ様タンパク質をコードすることから、PPRタンパク質がガイドするRNA分解が細胞分裂域を制限する機構に関わっていると推論した。

メリステム新形成が温度感受性を示す変異体rid3については、シュート再生過程を中心に解析を行い、その結果からRID3がCUC-STM経路の遺伝子発現を負に制御し、メリステム新生につながる細胞増殖を調節していることが明らかになってきている。本年度は新たに、カルス表層でRID3とCUC1が互いに排除し合うような発現パターンを示すこと、CUC1高発現域にメリステム構築の元となる細胞塊が生じることなどが判明した。胚発生過程におけるRID3発現についても検討したが、初期には胚全域で一様に強かった発現が、発生段階が進むにつれてメリステム予定領域を中心に低下していくような変化が見られ、シュート再生時の発現パターンとの類似が窺われた。また、RID3がコードするWD40リピートタンパク質の細胞内局在を調べ、主に核に存在することを示す結果を得た。以上のほか、srd2、rpd2など、各種温度感受性変異について解析を進め、メリステム新形成に必要な細胞増殖統御とそれに関わる遺伝子機能を広く遺伝的に抽出した。側根形成過程では、活発な細胞分裂によって原基が発達した後、分裂が休止する段階を経て、メリステムの活動が始まる。シロイヌナズナの温度感受性変異体srd2およびrid1の場合、制限温度下ではこの切り替えがうまく進行せず、統制を欠いた細胞分裂が持続する。srd2の側根形成を詳細に調べた結果、snRNAの欠乏がオーキシン排出キャリア遺伝子PIN1の発現低下を引き起こして、極性軸の確立を妨げ、細胞増殖制御を乱すことがわかった。これはオーキシン極性輸送の制御がプレmRNAスプライシング能力に依存することを示唆するもので、これまでにない知見と言える。rRNAプロセッシングに欠陥があり、脱分化や細胞増殖活性化が温度感受性を示すrid2変異体から、制限温度下でのカルス形成を指標に抑圧変異体rid2 sriw1を単離した。興味深いことに、sriw1変異はrid2だけでなく、srd2やrid1のカルス形成の温度感受性も抑圧し、さらにsrd2とrid1の側根形態形成異常(メリステム形成不全)に関してもsriw1による抑圧が認められた。ポジショナルクローニングによりSRIW1遺伝子を同定し、NACファミリー転写因子のANAC082をコードしていることを突き止めた。これらの結果より、植物細胞の増殖制御システムにおいて、ANAC082はきわめて重要な位置を占めていると推測された。以上のほか、メリステム形成に関し特徴的な異常を示すrid3、rid4、rrd1、rrd2など各種温度感受性変異体の解析を進め、各変異体の責任遺伝子がメリステム新生に際してどのような細胞増殖統御に関与するかを明らかにした。メリステム新生に関わるシロイヌナズナの各種温度感受性突然変異体を用いて解析を進め、以下の結果を得た。rid2はrRNAの生合成に欠陥をもつ変異体で、sriw1はrid2の表現型を回復させることを指標に単離した抑圧変異体である。sriw1変異は、snRNA転写活性化因子の変異体srd2に導入した場合にも、脱分化やメリステム新生の温度感受性に関し抑圧効果を発揮した。分子遺伝学的解析により、sriw1変異体の抑圧能がNACファミリー転写因子ANAC082の機能欠損に起因することを突き止めた。
人工赤血球を用いた心停止中の心筋代謝保持の検討

本年は前年度に引き続き、人工赤血球を混和させた心筋保護液を使用し、従来の心筋保護液(GIKなど)と比較して、大動脈遮断中の心筋代謝に及ぼす効果を実験的に検討した。研究経過中、両群間において、乳酸/ピルビン酸比には有意差はみられなかった。心筋乳酸摂取率、心筋酸素摂取率は、両群とも大動脈遮断解除直後に有意に低下したが、人工心肺離脱30分後には回復し、群間に有意差は生じなかった。CK-MBにおいても、遮断解除後、両群共有意に上昇し、群間で有意差無く、同様の経過を示した。一方、高エネルギーリン酸は、人工心肺中から大動脈遮断解除直後にかけて、人工赤血球群では人工心肺前と比較してATP、ADPが保持されているのに対し、GIK群では、有意な低下を示した。人工心肺離脱30分後には、両群とも有意に低下した。この低下は、離脱後の出血などによる血行動態の不安定や血液ガスの不良によるものと思われた。一般的に、心筋代謝の測定には、従来より冠静脈洞血の乳酸、ピルビン酸値の測定などによって評価されてきたが、本研究では、血液からの心筋代謝と、心筋細胞からの心筋代謝の測定では結果を異にしていた。これは、低体温、人工心肺という特殊環境により、心筋代謝の測定値が、全身の代謝の変化の影響を受けたためかもしれない。今回の研究結果から、心筋細胞のエネルギー代謝の面からは、低温下でも酸素運搬能の優れた人工赤血球を混和した心筋保護液により、好気的心筋代謝が保持され、大動脈遮断中の心筋傷害が軽度になる可能性があることが示唆された。今後は、大動脈遮断時間を延長させ、その心筋保護効果の差を確認し、さらには実際の血液を混和した心筋保護液(blood GIK)と人工赤血球混和液においての比較も行って、有用性を確認していきたいと考えている。本年度は、犬を用いての人工心肺モデルを作製し、(人工赤血球を比較する意味で、)従来の心筋保護液(GIKなど)での心筋保護効果をみることにあった。仮説としては、晶質液中心では心筋冷却が保護効果の大部分を占めるため、時間の経過とともに細胞浮腫が進行し、心筋保護効果が減弱し、人工心肺後の心筋組織血流量が減少し、ATPも減少し、心筋傷害が起こっていることが予想された。これまで6頭の雑種成犬を使用し研究を行ったが、開胸操作、ヘパリンを使用しての体外循環に伴う出血、術操作などの侵襲が予想以上に大きい影響か、大動脈遮断時間が長い影響か、特に初期において、心停止後の人工心肺離脱が困難な症例が多く存在した。人工心肺離脱可能であったものは2頭であり、人工心肺前後の心筋組織血流量は、人工心肺後に減少している傾向が確認された。ATP測定においては、測定値のばらつきが大きく、現在のところ傾向を確認するには至らなかった。しかし、今までの研究で得られた知見としては、人工心肺離脱にあたり、一時的ページングや、大量のカテコールアミンを必要としたことから、現方法では、心筋傷害は重度であると考えられるということであり、優れた酸素運搬体である人工赤血球混和の心筋保護液での心筋保護効果が十分期待できることが予想される。今後は、大動脈遮断時間を当初の計画より短縮してコントロール実験を終了させ、その後、人工赤血球による心筋保護を試みる。さらに、以前の心筋傷害のパラメーターに加え、冠静脈洞からCK-MBの測定も行い、より多角的方面より、解析を行う。

今後は、大動脈遮断時間を延長させ、その心筋保護効果の差を確認し、さらには実際の血液を混和した心筋保護液(blood GIK)と人工赤血球混和液においての比較も行って、有用性を確認していきたいと考えている。
ウニ胚の細胞接着に関与するCa結合蛋白の研究

バフンウニ胞胚をCa,Mg-欠除人工海水で処理すると,細胞凝集活性をもつ細胞凝集因子複合体が抽出される.これをDEAEセルロースに吸着させ, 0.5MNaClで溶出すると,細胞凝集活性をもつ糖蛋白部分が多糖部分から分離して溶出される.これをSepharose 4B,トヨパールなどによって精製した.この蛋白はCa^<2+>の存在下で細胞凝集活性を示すが,それ自体Ca結合蛋白であることが,放射性Ca_<2+>を用いた実験で示された. Ca^<2+>との結合はpH依存性で, pH8で極大となり, pH4以下では,ほとんど結合活性を示さない.また海水のpH(pH8)におけるCaの解離定数は3.1x10^<-4>Mである.このpHプロフィールからγ-カルボキシルグルタミン酸(Gla)の関与が推定されたが,アミノ酸分析の結果0.5%のGlaが含まれることがわかった.また, Cd^<2+>, War-farinなどのGla阻害剤が正常な細胞接着を妨げることから, Glaが直接細胞接着に関与していることが示唆された.一方,同位元素で標識したCa結合蛋白の,解離細胞への結合のpHプロフィールを, Ca_<2+>の存在下,非存在下で解析した結果,この蛋白はCa^<2+>を介さない別の機構によって解離細胞に結合していることが示された.また,バフンウニ胞胚はWGAによって種特異的に解離することが明らかにされ,この蛋白はCa結合活性と同時にレクチン活性をもつことが示唆された.ハプテン阻害実験を試みたところ,このCa結合蛋白による解離細胞の再凝集はGlcNAcによって特異的に阻害された.また,この蛋白はWGAによる血球凝集反応を競合的に阻害した.さらに,解離細胞から単離されたWGAリセプターは, Ca結合蛋白と相互作用し,細胞接着に異常を引き起こすことが明らかにされた.従って,この蛋白はCa結合活性と同時に, GlcNAcを認識するレクチン活性を同一分子内にもち,この両者の働きによって細胞と細胞とを結合させているものと考えられる.バフンウニ胞胚をCa,Mg-欠除人工海水で処理すると,細胞凝集活性をもつ細胞凝集因子複合体が抽出される.これをDEAEセルロースに吸着させ, 0.5MNaClで溶出すると,細胞凝集活性をもつ糖蛋白部分が多糖部分から分離して溶出される.これをSepharose 4B,トヨパールなどによって精製した.この蛋白はCa^<2+>の存在下で細胞凝集活性を示すが,それ自体Ca結合蛋白であることが,放射性Ca^<2+>を用いた実験で示された. Ca^<2+>との結合はpH依存性で, pH8で極大となり, pH4以下では,ほとんど結合活性を示さない.また海水のpH(pH8)におけるCaの解離定数は3.1×10^<-4>Mである.このpHプロフィールがらγ-カルボキシルグルタミン酸(Gla)の関与が推定されたが,アミノ酸分析の結果0.5%のGlaが含まれることがわかった.また, Cd^<2+>, WarfarinなどのGla阻害剤が正常な細胞接着を妨げることから, Glaが直接細胞接着に関与していることが示唆された.一方,同位元素で標識したCa結合蛋白の,解離細胞への結合のpHプロフィールを, Ca^<2+>の存在下,非存在下で解析した結果,この蛋白はCa^<2+>を介さない別の機構によって解離細胞に結合していることが示された.また,バフンウニ胞胚はWGAによって種特異的に解離することが明らかにされ,この蛋白はCa結合活性と同時にレクチン活性をもつことが示唆された.ハプテン阻害実験を試みたところ,このCa結合蛋白による解離細胞の再凝集はGlcNAcによって特異的に阻害された.また,この蛋白はWGAによる血球凝集反応を競合的に阻害した.さらに,解離細胞から単離されたWGAリセプターは, Ca結合蛋白と相互作用し,細胞接着に異常を引き起こすことが明らかにされた.従って,この蛋白はCa結合活性と同時に, GlcNAcを認識するレクチン活性を同一分子内にもち,この両者の働きによって細胞と細胞とを結合させているものと考えられる.バフンウニ胞胚をCa,Mg-欠除人工海水で処理すると,細胞凝集活性をもつ細胞凝集因子複合体が抽出される.これをDEAEセルロースに吸着させ, 0.5MNaClで溶出すると,細胞凝集活性をもつ糖蛋白部分が多糖部分から分離して溶出される.これをSepharose 4B,トヨパールなどによって精製した.この蛋白はCa^<2+>の存在下で細胞凝集活性を示すが,それ自体Ca結合蛋白であることが,放射性Ca_<2+>を用いた実験で示された. Ca^<2+>との結合はpH依存性で, pH8で極大となり, pH4以下では,ほとんど結合活性を示さない.また海水のpH(pH8)におけるCaの解離定数は3.1x10^<-4>Mである.このpHプロフィールからγ-カルボキシルグルタミン酸(Gla)の関与が推定されたが,アミノ酸分析の結果0.5%のGlaが含まれることがわかった.また, Cd^<2+>, War-farinなどのGla阻害剤が正常な細胞接着を妨げることから, Glaが直接細胞接着に関与していることが示唆された.

一方,同位元素で標識したCa結合蛋白の,解離細胞への結合のpHプロフィールを, Ca_<2+>の存在下,非存在下で解析した結果,この蛋白はCa^<2+>を介さない別の機構によって解離細胞に結合していることが示された.また,バフンウニ胞胚はWGAによって種特異的に解離することが明らかにされ,この蛋白はCa結合活性と同時にレクチン活性をもつことが示唆された.ハプテン阻害実験を試みたところ,このCa結合蛋白による解離細胞の再凝集はGlcNAcによって特異的に阻害された.また,この蛋白はWGAによる血球凝集反応を競合的に阻害した.さらに,解離細胞から単離されたWGAリセプターは, Ca結合蛋白と相互作用し,細胞接着に異常を引き起こすことが明らかにされた.従って,この蛋白はCa結合活性と同時に, GlcNAcを認識するレクチン活性を同一分子内にもち,この両者の働きによって細胞と細胞とを結合させているものと考えられる.関東地方沿岸で採集したバフンウニを主な実験材料として使用した(採集旅費使用)。1.活性蛋白の精製と分析バフンウニ胞胚をCa,【Mg^-】欠除人工海水で処理すると、上清に細胞凝集活性をもつ細胞凝集因子複合体が遊離してくる。これをDEAEセルロースに吸着させ、0.5M NaClで溶出すると、細胞凝集活性をもつ糖蛋白部分が多糖部分から分離して溶出される。これをSepharose 4B,トヨパールおよび高速液クロによって精製した。精製標品は分子量約1000,000酸性の糖蛋白(pI=3)で、2.5%の中性糖,5.0%のアミノ糖,1.6%のシアル酸を含んでいる(高速液クロ用蛍光検出器,カラム,注射器,分子量マーカーを使用)。この蛋白はCaの存在下で細胞凝集活性を示すが、それ自体Ca結合蛋白であることが、放射性Caを用いた実験で示された。Caとの結合はpH依存性で、pH8で極大となり、pH4以下では、ほとんど結合活性を示さない。また海水のpH(pH8)におけるCaの解離定数は3.1x10-4Mである。このpHプロフィールからγ-カルボキシルグルタミン酸(Gla)の関与が推定されたが、アミノ酸分析の結果0.5%のGlaが含まれることが判った。また、Cd,WarfarinなどのGla阻害剤が正常な細胞接着を妨げることから、Glaが直接細胞接着に関与していることが示唆された。3.リセプターの分離解離細胞のTriton X-100抽出物から、この蛋白のリセプターと考えられるWGA反応性糖蛋白を検出し、分離,精製を進めている(ブチル・トヨパール,カラムを使用)。
カリブ文学におけるエコフェミニズムの可能性

8月21日(火)から8月28日(火)には、8日間ほどBritishLibraryにて資料調査をした。また、ロンドンの移民コミュニティを訪問し、インタビューなどを行って録画した。10月19日(金)から10月23日(火)まで夏休み期間に収集した資料をもとにして、ガイアナ出身でロンドン在住のポーリン・メルヴィルの作品をエコフェミニズムの観点から分析し、その結果をまとめて、ロンドン大学のバークベックカレッジで開催された国際学会、International Conference on Ecocriticism and Environmental Studiesで“Reading Pauline Melville's The Migration of Ghosts"という題目の発表をした。科研費のおかげでロンドン大学の図書館と大英図書館にて3回も調査のための時間を取ることができた。今年はハイチ文学について調べ、ハイチ出身のマリー・ショウブとエドウィッジ・ダンティカの作品の分析を行い、女性をめぐる社会的、政治的な背景についても調査をする予定であったが、当初の予定通りに調査は完了し、国際学会であるSociety for Caribbean Studies 42nd Annual Conferenceでその成果が発表できた。さらにそれをまとめて発表する予定だった都留文科大学研究紀要第89集にも、研究結果をReading Haitian Literature from Postcolonial and Ecocritical Perspectivesとしてまとめることができた。さらに次年度に調査する予定であったポーリン・メルヴィルの作品についても調査を進め、国際学会であるInternational Conference on Ecocriticism and Environmental Studiesで発表することができた。学会発表などが刺激となって、世界各国の研究仲間と歓談することもできて、大変に有意義な時間を過ごすことができた。今後の計画としては、ポーリン・メルヴィルとジャメイカ・キンケイドの作品を読み、自然観とジェンダーを軸に作品分析を行う。最終年度として、カリブ女性作家によるナラティブから、ポストコロニアル批評や環境批評に貢献できる視座を見定め、分析した結果を整理する。今年度と同じように学会でその成果を発表し、論文を提出する。ポストコロニアリズムとエコクリティシズムという文学批評の分野は、これまで別々に発達してきたものだが、近年では互いの視点を取り入れた研究が目指されている。その中でもカリブ文学は、ポストコロニアリズムとエコクリティシズムを結びつけて分析をするのに最適な分野と言われている。というのも、帝国主義と環境問題は、共に最も貧しいものを搾取しているという点で共通しているからであり、カリブ地域の文学は両者の影響を強く受けているからである。本年度の研究では、ポストコロニアリズムとエコクリティシズムについて概説し、カリブ出身の思想家や作家が自然をどう捉えているかについてまとめ、ハイチにおける文学作品がどのように人間と環境の搾取に対峙してきたかについて考察した。International Conference on Ecocriticism and EnvironmentalStudiesでは、Caribbean Dialogue on Ecocriticismではカリブ文学と環境批評のつながりについてまとめ、多民族研究学会の「プロットとプランテーション:ハイチ文学にみるポストコロニアリズムとエコクリティシズム」では、カリブのプランテーション経済の中で奴隷が自分たちの野菜を育てることができた小さな庭(プロット)は、植民地主義への抵抗の実践であり、小説というプロットも同様であることを指摘した。その上で、ハイチの文学、特にマリー・ショウブの作品が植民地主義やそれ以降の政治体制を女性であることを踏まえてどのように批判したかを分析した。都留文科大学の紀要論文である「カリブ文学からみるポストコロニアリズムとエコクリティシズム」には、以上の調査をまとめて報告した。初年度は、研究の枠組みともなる理論を中心に分析をおこない、環境批評を中心に、Eduard Glissant, Alejo Carpentier, V.S. Naipaulの著作を読み終える。カリブ文学の文脈での環境批評について調べ、理論的な枠組みを考えるのと同時に、カリブ文学の自然と女性の表象について調べることであった。以上の調査はほぼ予定通りにこなすことができた。国際学会(The 41th Annual Conference of the Society for Caribbean Studies)で成果を発表する予定であったが、代わりにInternational Conference on Ecocriticism and Environmental Studiesに参加して、"Caribbean Dialogue on Ecocriticism"を発表することができた。国内でも、文学・環境学会では日程が合わずに発表は断念したが、多民族研究学会で発表することができた。紀要論文である「カリブ文学からみるポストコロニアリズムとエコクリティシズム」では初年度に計画していた調査の成果をまとめることができた。

さらに次年度に調査する予定であったポーリン・メルヴィルの作品についても調査を進め、国際学会であるInternational Conference on Ecocriticism and Environmental Studiesで発表することができた。学会発表などが刺激となって、世界各国の研究仲間と歓談することもできて、大変に有意義な時間を過ごすことができた。次年度は文学作品の分析を中心に研究を進める。ハイチ文学について調べ、ハイチ出身のマリー・ショウブとエドウィッジ・ダンティカの作品の分析を行う。また女性をめぐる社会的、政治的な背景についても調査をする。上記の作家の作品についてはすでに読み始めており、国際学会(The 41th Annual Conference of the Society for Caribbean Studies)で成果を発表する予定である。また、2週間程度の海外調査を目指している。最終年度はポーリン・メルヴィルとジャメイカ・キンケイドの作品を読み、自然観とジェンダーを軸に作品分析を行う。最終年度として、カリブ女性作家によるナラティブから、ポストコロニアル批評や環境批評に貢献できる視座を見定め、分析した結果を整理する。今年度と同じように学会でその成果を発表し、論文を提出する。今後の計画としては、ポーリン・メルヴィルとジャメイカ・キンケイドの作品を読み、自然観とジェンダーを軸に作品分析を行う。勤務先の業務などのために、予定していたよりも調査期間が短くなり、予定した旅費は消化できなかった。繰越額は次年度の調査費用と書籍購入費用、学会参加費に当てる予定である。
全ゲノムをカバーするBACクローンDNAマイクロアレイを用いた癌関連遺伝子の探索

癌細胞における癌関連遺伝子の増幅や欠失を検出するため、100種類の癌関連遺伝子、106種類の癌関連領域をカバーする506個のBACクローンを単離し、BAC-DNAマイクロアレイを作製した。これらのアレイを用いて検定標品に扁平上皮癌由来のA431細胞ゲノムを使用し、コントロールとして用いた正常リンパ芽球細胞株と比較したところ、FISH法等で示されていたEGF受容体遺伝子の増幅を再現性良く検出できた。さらに乳癌や膵臓癌、腎細胞癌などの細胞株についても同様の検討を行ったところ、いくつかの細胞で増幅を認める遺伝子を見い出すことができた。これらの遺伝子増幅の結果はFISH法でも確認できた。全ゲノムをカバーするBAC-DNAマイクロアレイを作製するため、慶應BACクローンの収集を行った。21番、22番染色体をカバーするBACクローンの単離はほぼ完了した。また、8番染色体については約4000個のクローンを得たので、それぞれのクローンの末端シーケンスを解読して8番ドラフトシークエンス上へ配置している。さらに4万個のBACクローンの末端シークエンシングを行い、ヒトドラフト、ヒト完成シークエンスに対して末端シーケンスを照合することにより、全ゲノムを網羅的にカバーするBACクローンの整列化を進めている。ゲノムBAC-DNAマイクロアレイの検出感度を高めるため、ニトロセルロース膜固定化スライドガラス上にBAC-DNAを固定し、高いS/N比で検出する手法を確立した。さらに、金属粒子を用いた標識法を導入することにより、蛍光色素を使う方法と比べ高感度の検出を可能にした。その結果一桁低いプローブ濃度でも同等のS/N比のシグナルを検出できた。本研究ではヒト疾患、特に多因子疾患における遺伝的要因の同定を全ゲノムを対象に行い、多様な病態をゲノムの変化と関連づけて分子レベルで解明するための方法を開発し、遺伝子診断への早期応用を目指している。本年度の成果を以下に述べる。1.癌関連遺伝子BACクローンの単離:慶応BACライブラリーよりmyc,ras,p53など206種類の癌関連遺伝子をカバーするヒトゲノムBAC、507クローンを同定した。引き続き、新たな癌関連遺伝子のBACクローンの収集も随時進める。2.LOH領域BACクローンの単離:8番染色体は既にそのほとんどをカバーするヒトゲノムBACクローンを得ており、現在コンティグを作製している。引き続き17番、18番染色体でマップされているSTS/ESTマーカー1,000種類を用いてDH法によりBACクローンを単離する。3.マイクロアレイの作製:上記206種類の癌関連遺伝子のBAC、507クローンのDNAを大量調製し、BAC DNAマイクロアレイを作製した。4.マイクロアレイによるCGH法の確立:上記癌関連遺伝子BAC DNAマイクロアレイの評価のために、EGFレセプター遺伝子の増幅がみられるA431細胞と正常リンパ芽球細胞株のゲノムDNAをCGH法により比較した。A431細胞におけるEGF受容体遺伝子の増幅を再現性良く確認でき、その増幅の度合いはFISH法による結果と一致した。5.増幅/欠失領域の解析:各癌関連遺伝子とその周辺をBACクローンのコンティグとしてカバーし、マイクロアレイによるCGH法を用いることで、増幅あるいは欠失の程度と位置の詳細解析が可能であることを示した。今後、上記206遺伝子についてそれらの詳細解析を進める。
トランスポーター遺伝子群の突然変異および多型と健康リスク

体内で生体の重要な物質の輸送には多くの輸送蛋白が関与している。我々は輸送体の変異および健康影響に注目した。2.Lysinuric protein intolerance患者が極めて多く見つかる岩手県北部の遺伝疫学をR410X変異が創始者変異であることを見出し実際にマススクリーニングを行なった。また、重要な機能を担う蛋白の異常を、遺伝疫学および動物実験で検討した。3.遺伝疫学では、Osler-Rendu-Weber病,のう胞腎、新たな疾患である甲状腺腫について、トランスポーターの検討を行った。4.重要な機能を担う蛋白の変異については、プロインスリンの変異について、生化学的手法で正常型に比べて強い疎水域が蛋白表面に露出することによっと膵臓内のβ細胞でERストレスを引きおこす機序のを検討した。その結果を基に動物実験でβ細胞のインスリン分泌不全について検討した。歴史的、文化的な隔離により多くの遺伝性疾患の頻度は大きく異なる。今後、わが国における遺伝疫学の展開とともに、遺伝子群の突然変異の結果生じる蛋白質における構造異常と病態の関連の解明が望まれる。生体内重要な物質の輸送にはトランスポーターが関与している。我々は我が国においてヘテロ保因者の多いカルニチンのトランスポーターであるOCTN2、塩基性アミノ酸および他の有機カチオンの輸送体であるy+/LAT1、中性アミノ酸のトランスポーターの3つの変異について検討した。1.OCTN2の変異:今回日本全国の病院から送られて来た3症例の薬剤起因性の低カルニチン血症を示す症例について検討した。これらの3症例とも小児期に抗痙攣薬の服用で神経障害を発症しており低カルニチン血症を示していた。しかしOCTN2の分析により変異は認められなかった。次いでヘテロ保因者が高齢期に心肥大のリスクが高まることを疫学的観察していたが、モデル動物を用い加齢の影響を検討したところ、ヘテロマウスではヒト同様心筋症を認めた。2.y+/LAT1ヘテロ保因者:岩手県東北部においてヘテロ保因者のマススクリーニングを行いR410Xの変異の頻度を求めたところ、約1%と高頻度にヘテロ保因者を見いだした。ヘテロ保因者において加齢との相互作用について現在倫理審査を待って行う予定にしている。3.中性アミノ酸トランスポーター:連鎖解析の結果、5番染色体に責任遺伝子を見いだした。現在候補遺伝子の配列決定を行っている。4.健康政策としてマススクリーニングの評価:y+/LAT1ヘテロ保因者の創始者変異が高頻度に認められたため、単一の遺伝子変異の検出でよく費用は約80円と廉価である。岩手県東北部では4万人に1名の割合でLPIを持った新生児が生まれると考えられるため、約320万円で1名の患者を早期発見でき極めて効率のよい方法である。1.まず、塩基性アミノ酸の輸送体であるSLC7A7に関して検討を行い、Intron-exon構造を含めたGene structureを明らかにした。さらに、SLC7A7の異常により生じる疾患であるLysinuric protein intolerance患者の遺伝子変異を検索した。3.遺伝疫学では、0sler-Rendu-Weber病,のう胞腎、新たな疾患である甲状腺腫について、トランスポーターの検討を行った。4.重要な機能を担う蛋白の変異については、プロインスリンの変異について検討し、動物実験でべータ細胞のインスリン分泌不全について検討した。5.歴史的、文化的な隔離により多くの遺伝性疾患の頻度は大きく異なる。
キセノンを用いた新規炭素材料の作製法の開発と細孔評価法の創製

本研究により、キセノンを用いた無定型炭素材料内の細孔の解析法を確立した。また、キセノンを用いて炭素材料の表面の調製が行えることを示した。さらに、酸化黒鉛と金属錯体を原料として用いることにより、白金,パラジウム,ルテニウムの金属ナノ粒子がグラフェン表面に均一に分散した新しい多孔質グラフェン材料を作製することに成功し、特許出願した。この炭素材料は燃料電池の酸素還元触媒としての特性に優れるなどの特徴があることを示した。本研究では、当初の目的として、(1) Xe NMRを用いた炭素材料の細孔解析法を確立させること、および(2)キセノンを用いた新規炭素材料合成という分野を創り出すこと、の2つを目指したものである。具体的なアプローチとしてアモルファス炭素(ハードカーボン)と新規層状炭素化合物を取り上げて、研究を進めている。石油系原料や樹脂系原料など、多くの種類の前駆体から作製されたハードカーボンについて実験を行った結果、ハードカーボン前駆体である樹脂をキセノンガス中で焼成することによって、通常の窒素ガス下で作製した標準的なサンプルと比較して比表面積が大きく、表面性が異なる材料ができることが発見された。このようにして作製されたハードカーボンにキセノンを吸着させ、石油ピッチやフェノール樹脂を前駆体とする複数のハードカーボンについてキセノン測定を行うことにより、焼成温度の上昇に伴うハードカーボン内の細孔構造の変化を明らかにした。本実験結果については、現在論文投稿中(K. gotoh, et.al)である。また、上記のアモルファス炭素のみならず、新規炭素材料においても、研究に顕著な進展がみられている。本研究実施者は、酸化グラファイトと金属錯体を原料として用いることにより、金属ナノ粒子がグラフェン表面に均一に分散した多孔質炭素材料を作製することに成功し、これについて特許を申請、論文がアクセプト(K. gotoh, et.al.Carbon)されている。この炭素は燃料電池の酸素還元触媒特性に優れるなどの特徴が既に発見されており、さらなる触媒特性が見込まれるものとなっている。次年度は、開発されたこの炭素材料や他の炭素材料についてキセノンNMRによる評価を行い、各種炭素材料の表面状態についての研究を進めていくことを予定している。以上のように、本研究においては、当初の目的を初年度にて大部分達成しただけでなく、産業利用にも期待される新規炭素材料め開発にも成功し、さらなる物性研究を進めている。活性炭やリチウムイオン電池負極材料などとして注目されている難黒鉛化炭素(ハードカーボン)は、黒鉛層からなる部分と外部からのアクセスが困難な内側の細孔部からなるといわれているが、この内部細孔は既存のガス吸着等温線測定などの測定方法では観測が困難であった。本研究実施者は初年度の研究で、この細孔構造を明らかにするために、サンプルに時間をかけてキセノンを導入し、その吸着されたキセノンを固体核磁気共鳴法で検出することにより、細孔内の環境を調べる方法を考案した。本年度において、いくつかの構造の異なるハードカーボンについて実験を行った結果、ハードカーボン前駆体樹脂をキセノンガス中で焼成することによって、通常の窒素ガス下で作製した標準的なサンプルと表面性が異なる炭素材料ができることが明らかとなった。ハードカーボンにキセノンを吸着させたサンプルについてキセノン核磁気共鳴測定を行うことにより、焼成温度の上昇に伴う内部の細孔構造の変化を明らかにした。本研究により、活性炭の細孔など、今まで外側とつながった「開孔」と呼ばれる部分の細孔の解析のみに用いられてきたキセノンの核磁気共鳴法が、一部の「閉孔」にも適応でき、その細孔の大きさや表面についての情報が得られることを示すことができた。また、上記の当初目的の研究のほかに、初年度の新規炭素材料の研究段階において、酸化黒鉛を出発物質とするグラフェン薄膜からなる新しい炭素化合物を開発することに成功していた。よって、本年度(第二年度)は、新たに「酸化黒鉛を出発物質とする新たな多孔質グラフェン材料の開発」も研究目的に加え、研究を遂行した。酸化黒鉛と金属錯体を原料として用いることにより、白金,パラジウム,ルテニウムの金属ナノ粒子がグラフェン表面に均一に分散した材料を作製することに成功し、特許出願した。この炭素は燃料電池の酸素還元触媒特性に優れるなどの特徴があることをすでに出版された論文にて報告したが、さらなる触媒特性が見込まれるため、今後もこの材料についての評価,研究の結果が期待される。以上のように、本研究においては、キセノンを用いた炭素材料の解析や表面の調製という当初の目的を達成しただけでなく、産業利用にも期待される新規炭素材料の開発にも成功するという、顕著な成果を挙げることができた。
研究開発人材の政治スキルとイノベーションとの関係に関する研究

初年度に先行研究のレビューを包括的に行った。とりわけ、政治スキルに関する文献のサーベイを集中的に行った。その結果として、本研究の作業仮説を導出することができた。暫定的な仮説を踏まえた場合、政治スキルの結果変数に対する影響(直接的および間接的)を想像できるまでに至った。2018年に注目したのが、第一に政治スキルを構成する4つの下位概念であった。先行研究の多くは下位概念をまとめて政治スキルと結果変数を図るのだが、下位概念のレベルで見た場合、結果変数との関連性にどのような違いがありうるかを念頭にレビューを行った。下位概念間の成果変数ごとに対する影響の強弱が考えられる。こうした点を考慮しながら、研究の仮説を考えている。第二に政治スキルのキャリア成功認識を媒介する要因である。とりわけ、組織的支援認識と上司の支援認識である。お互いに類似性を持つ概念であるが、厳密には政治スキルとの関係性に違いがありうる。そのため、結果変数に対する影響の度合いも強弱に違いが出る可能性があると考え、文献レビューを行った。本研究はインタビュー調査をもとにアンケート調査を計画している。2018年度には先行研究のレビューを包括的に行った。とりわけ、政治スキルに関する文献のサーベイを中心に行った。その結果として、本研究の暫定的な仮説を導出することができた。現在まで整理できた内容は、政治スキルが結果変数への影響を直接的および間接的に明確に分類したことである。特に、間接効果においては、媒介変数と調節変数とに分けて因果関係に関する文献をまとめた。作業が順調に進んでおり、アンケート調査を1年前倒しで実施したほうがいいと判断した。まだ、研究開発人材の特性と政治スキルにとの関連性や、研究開発現場における政治スキルの現れ方に対するレビューは残っている。2019年度は当初の予算計画を前倒しして、2020年度実施分を申請した。今回の予算交付額の変更は、実施スケジュールに関するものであり、研究計画の大幅な修正を伴うものではない。その代わり2019年度に予定していた定性的調査は1年後ろ倒しで実施する。変更後の2020年度予算(40万円)は、定性的調査に加え、本年度に実施するアンケート調査の分析を進めるために使用する。経費は、研究協力者と韓国現地で作業を進めるのに主に使用されるため、韓国出張費用が大部分を占める。よって、当初の研究計画で想定した活動が中心であり、減額しても研究目的全体を達成する上で支障は生じない。2019年度上期には作業仮説の精緻化を図るべく、文献レビュー作業を進める。とりわけ、組織レベルの結果変数と政治スキルに関する因果関係について集中的に作業を進める予定である。アンケート調査の作成とデータの収集は2019年度下期に韓国の調査会社を通じて実施する。2019年度にアンケート調査では、研究開発人材の政治スキルと研究開発における成果との関係について調査する。

2019年度上期には作業仮説の精緻化を図るべく、文献レビュー作業を進める。とりわけ、組織レベルの結果変数と政治スキルに関する因果関係について集中的に作業を進める予定である。アンケート調査の作成とデータの収集は2019年度下期に韓国の調査会社を通じて実施する。2019年度にアンケート調査では、研究開発人材の政治スキルと研究開発における成果との関係について調査する。当初予定していた機材の購入(統計処理用パソコンおよび統計ソフト)と旅費(国内出張2回)を予算執行していないため、次年度使用額が494,663円生じた。まだ、アンケート調査を実施していないため、機材は購入する予定である。国内出張は今後必要におじて使用する予定である。場合によっては韓国出張に当てる可能性もある。
ドム語(パプア・ニューギニア)とその周邉の諸言語の調査・研究

動名詞、動詞連続、節連鎖、および指示詞や人称といった直示にかかわる形式の用法についてデータの整理と分析を行った。その結果、1)述語複合体内部に配置されると考えられる無標の名詞項の性質の記述が可能になった。2)動詞連続が、意味タイプ別に異なる振る舞いを示すこと、その振る舞いを踏まえることで動詞連続内部の配列の説明が可能になることが明らかになった。3)節連鎖が述語の法の違いによって結びつきの強さの程度にも違いが出ることがわかった。4)直示を腫瘍なはたらきとする指示詞が非直示的に用いられる場合の用法や、他の場所表現との相関の記述ができた。5)動詞に示される主語の人称・数が人称詞との一致ではないこと、談話レベルで決められることが明らかになった。以前からの研究に上記の統語法の分析を加え、一貫した方針によって全体を書き下ろしたドム語文法を論文として提出した("A Grammar of the Dom language")。その他、つぎの研究発表がある。1)ドム語は表記の伝統のない言語であるが、ドム人のほぼすべてが第二言語として話すトク・ピシンにはある程度確立された標準と、それに基づいた多くの出版物がある。ドム人の話す、ドム語に強く影響されたトク・ピシンとその表記にまつわる問題点と表記に関する一般論をまとめた(「トク・ピシンの表記に關する考察」)。2)ドム語のおかれた社会的背景ともっとも主要な言語特徴をまとめた("La lingvo de lapopolo dom en Papuo-Novgvineo")。3)動名詞や動詞連続のような構成を擬似的に作り出すなど、ドム語の形式的な「嗜好」について「ことばが分ける二つ、組合せる二つ」として2月11日に日本言語学会主催シンポジウムで発表した。パプア・ニューギニア、シンブー州において二箇月の現地調査を行なった。現地では1.テキストの蒐集2.引用、条件法などを含む重文・複文に関する文法事項の調査3.現地の初等学校や教会で講義するなどの交流を通じ現地への成果の還元を行なった。オーストラリア、メルボルンのラ・トローブ大学、言語類型論研究センターを訪問した。そこで1.資料蒐集や2.パプア諸語の研究者たちとの情報交換を行なったほか、トーン、命令法、引用に関する口頭発表を行ない、これを通じてこれらのテーマについて議論した。特にアレクサンドラ・アイケンバルト先生に文法記述全面に亙る指導をいただいた。トーンに関しては、ドム語では音節に対するピッチ・メロディーの有標性階層と語に対するピッチ・メロディーの有標性階層とが異なることを明かにし、プロソディーの研究において調値付与の対象と調値付与の領域の区別が重要であることを指摘した。命令法に関しては、命令法にとどまらず命令の戦略として使われる文法形式全般の記述を行ない、逆に命令以外の戦略で使われる命令法にも言い及んだ。特にドム語の形態法に欠ける態との関聯で、命令法が使役の戦略として使われることや、禁止表現がシンブー諸方言の同定に用いられることなどドム語特有の現象を指摘した。引用に関しては、ドム語の引用標識の文法化の様相、引用節内における法の変換、人称・数の振る舞いを記述し、話法変換に関わる変数が一見ばらばらに動くこと、そのため伝統的な考え方による直接話法対間接話法という二項対立が再考されなければならないこと、しかし、変数の値には共起制限があり、独特の秩序をなしていることを指摘した。またメルボルン大学とキャンベラのオーストラリア国立大学においても資料蒐集と研究者たちとの情報交換の目的で短期間訪問した。パプア・ニューギニア、シンブー州ドム地域において二箇月間、ドム語の指示詞と引用、動詞連続を中心に統語論、意味論の現地調査を行った。ドム語において指示詞は空間直示を主たる機能とする、形態統語的な範疇をなしている。この品詞は12の語からなる閉じた類であり、話し手からの距離と相対的高さによる空間分節にそれぞれの語が対応していることがわかった。直示以外の機能として共有知識や主題性、文脈指示の機能があることや、動詞に後続する場合にも名詞に後続する場合と同じ役割を果たしていると解釈できることが明らかになった。周辺の言語にも同様の指示詞の体系を持つものがあることが調査によって明らかになった。ドム語の引用構文を調べることで、直接引用、間接引用の記述は二項対立を前提とするのでなく関与するパラメーターそれぞれの振る舞いを記述しなければならないことがわかった。動詞連続の後行要素が補助動詞的役割を果たし、アプリカティブ、アスペクト、エヴィデンシャリティを表すことがあり、否定を表す要素も歴史的にはこのような動詞連続後行要素に由来すると思われる。この四つの要素のはたらきや形式的特徴を調べた結果、意味的な階層が形式の配列に密接な関係があることなどが明らかになった。ドム語の意味論、動詞連続、エヴィデンシャリティについて研究を進め、その一部を「ドム語の「見る」と「聞く」」としてオセアニア学会大会で発表した(2005年3月21日)。また、無文字社会であったドム語共同体について社会的・言語的(特に音韻論)に考察を深め、表記の実態の調査結果とローマ字表音表記の限界、ありうべき表記の提案を「ドム語とトク・ピシンの表記に關する考察」として東京外国語大学で発表した(2005年3月4日)。

動名詞、動詞連続、節連鎖、および指示詞や人称といった直示にかかわる形式の用法についてデータの整理と分析を行った。その結果、1)述語複合体内部に配置されると考えられる無標の名詞項の性質の記述が可能になった。2)動詞連続が、意味タイプ別に異なる振る舞いを示すこと、その振る舞いを踏まえることで動詞連続内部の配列の説明が可能になることが明らかになった。3)節連鎖が述語の法の違いによって結びつきの強さの程度にも違いが出ることがわかった。4)直示を腫瘍なはたらきとする指示詞が非直示的に用いられる場合の用法や、他の場所表現との相関の記述ができた。5)動詞に示される主語の人称・数が人称詞との一致ではないこと、談話レベルで決められることが明らかになった。以前からの研究に上記の統語法の分析を加え、一貫した方針によって全体を書き下ろしたドム語文法を論文として提出した("A Grammar of the Dom language")。その他、つぎの研究発表がある。1)ドム語は表記の伝統のない言語であるが、ドム人のほぼすべてが第二言語として話すトク・ピシンにはある程度確立された標準と、それに基づいた多くの出版物がある。ドム人の話す、ドム語に強く影響されたトク・ピシンとその表記にまつわる問題点と表記に関する一般論をまとめた(「トク・ピシンの表記に關する考察」)。2)ドム語のおかれた社会的背景ともっとも主要な言語特徴をまとめた("La lingvo de lapopolo dom en Papuo-Novgvineo")。3)動名詞や動詞連続のような構成を擬似的に作り出すなど、ドム語の形式的な「嗜好」について「ことばが分ける二つ、組合せる二つ」として2月11日に日本言語学会主催シンポジウムで発表した。
脂質バイオロジーから見るナトリウム利尿ペプチドのNASH抑制効果の検討

マウスを用いた検討、培養細胞を用いた検討により、ナトリウム利尿ペプチドは肝臓に直接作用し、脂肪酸合成関連遺伝子発現の低下、脂肪酸酸化関連遺伝子発現の上昇を介して肝臓における脂肪蓄積に対して抑制的に作用する可能性が示された。また、ナトリウム利尿ペプチドは脂肪酸合成とは独立してマウス肝臓の膜リン脂質に影響する可能性が示唆された。これらの検討により、ナトリウム利尿ペプチドが非アルコール性脂肪肝炎の形成におけるfirst hit、second hitをともに阻害する可能性が考えられた。本年度は、研究計画に従い、野生型マウス(Wt)と脳性ナトリウム利尿ペプチド(BNP)過剰発現トランスジェニックマウス(BNP-Tg)を用い、その代謝プロファイル、特に肝臓における表現型の検討を行った。また、ヒト培養肝細胞ラインであるHepG2を使用して、酸化ストレスによる細胞ダメージに対するナトリウム利尿ペプチドの作用を検討した。通常食負荷時にはWtとBNP-Tgで体重や体内の脂肪量、摂食量などに変化を認めず、肝臓の重量や脂肪含有量で明らかな差を認めなかった。60%脂肪食を負荷した際には、BNP-TgはWtに比較して明らかな体重増加の抑制を認め、同時にBNP-Tgでは脂肪肝の抑制も認めた。この際、BNP-Tgの肝臓ではWtに比較して脂肪酸不飽和化に関与するScd-1などの遺伝子発現が上昇しており、薄層クロマトグラフィーを用いた検討では、BNP-Tgで不飽和脂肪酸を側鎖に含む脂質が全体的に増加していることが推察されたが、この点に関しては未確定である。一方、BNP-TgとWtに対して四塩化炭素を投与して肝線維化の程度を確認したところ、BNP-Tgで肝線維化は有意に抑制されていた。しかしながら、両者の肝臓の脂質に関しては薄層クロマトグラフィーを用いた検討では有意な差は認められなかった。また、HepG2に対して、ANP、BNP、CNPの3種類のナトリウム利尿ペプチドを添加した際のメタボローム解析をGC/MSにて行ったところ、特にCNPで数種類の脂肪酸の低下傾向を認めたが、この点に関しては未確定であり、今後さらに検討を行う予定である。なお、過酸化脂質を含む脂質の解析に関しては、特に過酸化脂質の測定の困難さなどの問題もあり、現段階で網羅的な解析手法は確立できていないが、この点に関しては来年度もさらに検討を行う予定である。前年度は、主として脳性ナトリウム利尿ペプチド(BNP)過剰発現トランスジェニックマウス(BNP-Tg)を使用した検討を行ったが、BNP-Tgでは肝逸脱酵素(AST, ALT)の軽度の上昇が見られることが判明した。BNP-TgでのBNP過剰発現において、SAPプロモーターを使用しているために、BNP-Tgでは定常状態においても肝臓に何らかの異常が生じている可能性が考えられた。このため、遺伝子改変動物ではなく、より臨床応用に近いモデルであるナトリウム利尿ペプチド投与モデルにて解析を行うこととした。投与実験においては、BNPと共通の受容体を介して類似の生物学的作用を発揮する心房性ナトリウム利尿ペプチド(ANP)の腹腔内投与を行った。murine ANPを浸透圧ポンプを使用して1.5μg/kg体重/分の容量で腹腔内投与を行ったところ、血圧の低下、尿中cGMPの上昇を認め、ANPの作用が確認された。マウスに高脂肪食を6週間負荷した後に、1週間のANP投与を行ったところ、ANP投与群(A群)ではVehicle投与群(V群)との間に体重、肝重量、肝脂肪含有量には有意な差は認めなかった。両群の肝臓の脂質を抽出して薄層クロマトグラフィーを行ったところ、フォスファチジルコリン(PC)に差を認めたため、PCに関してLC-MS/MSにてより詳細な解析を行った。その結果、複数の分子種においてA群とV群で差を認めた。A群で上昇が大きかったものとしてはPC(20:2,20:4)、PC(18:1,20:5),PC(18:2,22:4)などがあり、逆に低下したものとしてはPC(20:2,22:6)、PC(16:0,17:0),PC(19:0,20:3)などがあった。全体的には、A群ではV群に比較してPC中の2重結合数が多い傾向にあった。これらの結果より、ナトリウム利尿ペプチドが食餌誘導性脂肪肝の細胞膜組成を変化させる可能性が示唆された。内分泌・代謝過酸化脂質の定量的解析など、本年度中には遂行できない部分もあったが、培養細胞を用いた検討など、来年度に行う予定であった検討を本年度中に一定の段階まで行うことができたため、総体としては概ね順調に進展していると考えている。過酸化脂質の質量分析機を使用した網羅的解析手法を検討し、その手法を用いて、145%または60%高脂肪食負荷時のWtとBNP-Tgの肝臓の過酸化脂質の変動の解析、2四塩化炭素やメチオニンコリン欠損食負荷時のWtとBNP-

Tgの肝臓の過酸化脂質の変動の解析、等をまずは行う予定である。マウスで起こった変化が他の動物種でも起こりうるかどうかを評価するため、ラットを用いた検討を同様に行う。ただし、ナトリウム利尿ペプチドの過剰発現トランスジェニックラットは保持していないため、遺伝子改変動物ではなく、ANPおよびBNP投与を行う。ANP、BNPのラットへの投与は浸透圧ポンプを用いて腹腔内投与、もしくは静脈投与を行う予定であるが、NPの浸透圧ポンプによるラットへの腹腔内投与に関しては確立しているが、大量のNPを必要とするため、可能ならば条件検討の上、静脈内投与を行うことを検討する。ANP、BNP投与ラットに対して高脂肪食負荷やメチオニンコリン欠乏食負荷を行い、肝臓における過酸化脂質の変動を評価する。また、ナトリウム利尿ペプチドの肝細胞における酸化ストレスの抑制作用を検討するため、ヒト培養肝細胞HepG2にANP・BNPを添加したうえで過酸化水素を負荷し、Annexin V assayなどの方法によってナトリウム利尿ペプチドの酸化ストレスによる細胞障害への影響を評価する。本年度は学会出張などが想定していたよりも少なく、またマウス管理費用なども予定より少なかったため、次年度使用分が生じたと考えている。来年度は質量分析機などの共通機器の使用が増加することが予想され、また、来年度に使用予定であるラットに関してはマウスよりも購入費用や管理費が割高になることから、次年度使用額に関してはこれらの費用に充当する予定である。