hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
植物の膜脂質転換が担う栄養欠乏ストレス耐性メカニズムの解明

植物はリン欠乏にさらされると、生体膜を構成するリン脂質の大半を糖脂質に転換し、膜に含まれるリンをより重要な生体内の代謝系に利用する。これは、リン欠乏ストレスに順応すべく植物が持っている膜脂質転換気孔であることが、申請者らのこれまでの研究により明らかになっている。しかし、平成29年度までの申請者らの研究により、このリン欠乏時の膜脂質転換は、実は窒素欠乏時にも必須であること、またその際には、膜脂質転換の活性化に伴う葉緑体膜構造の維持がストレス耐性に深く関わっていることが示唆された。そこで本研究では、シロイヌナズナの膜脂質転換の活性化や制御に関わる各種酵素遺伝子の変異体や過剰発現体を用いて、リンや窒素など栄養ストレス下の植物生育における膜脂質転換活性化の生理的意義およびその分子メカニズムの解明を目指している。1.膜脂質転換が活性化したシロイヌナズナ形質転換体の作出と栄養応答の解析平成30年度は、PAHと同様、リン欠乏時のリン脂質分解に寄与するNPC5形質転換体の作出に着手した。NPC5タンパク質のN末端またはC末端に蛍光タンパク質を付加した融合タンパク質を過剰発現するようなコンストラクトを作成し、シロイヌナズナの膜脂質転換変異体2種類およびNPC5自身のノックアウト変異体に導入を完了し、引き続き形質転換体の単離を行っている。2.膜脂質転換制御に関わる新規因子の探索・単離平成30年度は、PAHは窒素欠乏時だけでなく、リン欠乏時にも葉緑体膜構造の維持に寄与している可能性があるかどうか調べた。その結果、リン欠乏時と窒素欠乏時のPAHの役割は異なる可能性が示唆された。当初の予定通り、昨年度までに各種形質転換体の作出が終了したため。また、2については、網羅的遺伝子発現解析には着手できなかったが、その前に確認が必要であった基礎データが得られたため。1.膜脂質転換が活性化したシロイヌナズナ形質転換体の作出と栄養応答の解析平成31年度は、各種形質転換体の単離を完了し、それぞれのリン欠乏や窒素欠乏に対する応答について表現型および脂質組成を中心に野生株とそれぞれのバックグラウンドとなった変異体と比較解析する予定である。2.膜脂質転換制御に関わる新規因子の探索・単離平成31年度は、通常条件または窒素欠乏条件で生育させた野生株、pah1pah2およびPAH1OEを用いて網羅的遺伝子発現解析を行う。平成30年度中に行う予定であった網羅的遺伝子発現解析に必要な経費の一部が平成31年度(令和元年度)に持ち越されたため、次年度使用額が生じた。今年度は繰り越し分と合わせて、上記解析を進める予定である。
猟区制度は次世代型野生動物管理の有効なシステムとなりうるか?

徹底的なシカの管理捕獲が行われている西興部村猟区において、個体群の質的評価を行い、猟区制度による個体数管理が可能かについて検討した。その結果、当猟区のシカ個体群は高質個体群と位置付けられた。ただし、個体数密度は高く、増加傾向にあると考えられ、個体数調整捕獲が必要であるだろう。その際、猟区を細分化し、ユニットごとに管理指針を作成することが有効であると考えられる。猟区制度の評価を行うため、初年度は西興部村猟区におけるエゾシカの個体群生態学的基礎情報の収集を中心に行った。今後データの解析を行うことで、本猟区におけるエゾシカの生態学的特徴が明らかになると期待される。1.補殺個体データ;今猟期に捕獲された102頭すべての個体からデータ(性齢・体サイズ・繁殖状況)を収集した。妊娠判定が困難である、発情周期中妊娠初期の個体に関しては、卵巣の観察及び血中のプロジェステロン濃度を測定することで、妊娠の有無を推定することができた。年齢査定用に切歯も採取しており、猟区個体群の齢構成も今後明らかにしていく。2.生息数推定法の検討;春と秋にライトセンサスを行い、総個体数・群サイズ・群構成を記録した。また、猟期にはCPUE(単位努力量当たりの捕獲数)等の評価指数も記録している。電波発信機装着個体を増やした後は、マークリサイト法も取り入れる予定である。3.膣テレメ装着試験;膣テレメ装着中および脱落後の電波感度試験を行い、首輪型テレメとの併用により野生下での応用が可能と考えられた。また、飼育個体に10日間程度装着しシカへの影響を検討した結果、シカの行動を妨げることも膣内の負傷も見られなかった。現在も飼育個体・野生個体に装着しており、出産時までモニタリングを続ける予定である。これは日本で初めての試みである。4.成獣の生体捕獲および電波発信機装着;2月下旬から餌付を開始し、3月上旬から生体捕獲を試み、現在2頭に発信器を装着しモニタリングを続けている。今年は例年に比べ積雪量が極端に少なく、山に食べ物が十分にあるため捕獲に不可欠な餌付が出来ず、冬期の捕獲が困難であった。今後もアルパインキャプチャー罠等、他の手法も取り入れ捕獲を続ける予定である。初年度同様、西興部村猟区においてエゾシカの個体群生態学的基礎情報の収集、分析を進めている。最終年度にはこれをもとにして、猟区における個体数管理指針を提示する予定である。1、補殺個体データ;今猟期に捕獲された147頭すべての個体からデータ(性齢・体サイズ・繁殖状況)を収集し、昨年度と合わせて249頭となった。歯の萌出交換法と年輪法の組み合わせにより、現段階で170頭の年齢が明らかになり(最高齢16歳)、猟区個体群の齢構成が明らかになりつつある。2、生息数推定法の検討;年2回のライトセンサスおよび猟期中のSPUE・CPUEのモニタリングを行った。今後は補殺個体の齢構成を用い、コホート解析による生息数復元を行う予定である。3、生体捕獲および電波発信器装着; 08年4-5月に5頭の野生個体♀を捕獲し、電波発信器による行動圏・季節移動調査を継続している。道東地域と異なり、本猟区のシカの季節移動規模は小さいことが明らかになってきた。また、夏から秋にかけて48時間連続モニタリングを行い、農地利用状況を精査した。3月から餌付けを開始し、09年度の捕獲に備えている。4、膣テレメ装着;野生個体3頭と飼育個体4頭に膣テレメを装着した(国内初の試み)。飼育個体の観察から、出産直前に膣テレメが脱落することを確認した。また、野生個体でも出産期にあたる6月に膣テレメの脱落を確認し、回収した。脱落地点には出産の痕跡らしき跡が残っており、野生個体においても出産の検知が可能であると考えられた。ただし、新生子の発見には至らなかった。初期死亡率を明らかにするため、2009年に再度新生子の捕獲を試みる。H21年度は猟期が延長されたため(H22.4.15まで)、調査終了時点はまだ猟期中であるが、H22.3までに捕獲された133頭から個体データを収集した。また、電波発信器個体の追跡および膣テレメを用いた新生子の捕獲を行った。それらをまとめ、猟区のシカ個体群の状態を明らかにし、猟区におけるエゾシカ管理指針を検討した。1.繁殖情報;1歳以上のメス90頭中87頭の個体(96.7%)が妊娠していた。残り3頭は11月に捕獲された個体で、胚や胎子は確認できなかったが、黄体が1つ確認されたため発情周期中の可能性があり、受胎が遅い個体と考えられた。つまり、妊娠率はほぼ100%であった。

2.死亡情報:膣テレメを用いて捕獲した新生子について、1年目の春の生存を自動撮影装置により確認した。VITと自動撮影装置の組み合わせの応用により、新生子の初期死亡情報が得られることが明らかになった。電波発信器追跡個体(成獣)はすべて期間を通して生存していた。3.移出入情報;H20に5頭、H21に8頭の計13頭(内1頭オス)に電波発信器を装着し、追跡を行った。その結果、1年を通して猟区内に生息していた個体が10頭、季節的に猟区内外を行き来していた個体が3頭であった。本猟区のシカの行動圏は比較的狭いといえる。また移動経路から、本猟区のシカの季節移動は分散行動と関係している可能性が考えられた。4.個体群の状況:3年間のライトセンサス等の結果から、個体数は増加傾向にあると考えられた。体格の小型化は見られず、妊娠率も高いことから、今後個体数のさらなる増加が予想される。シカの行動圏が狭いことから、猟区をより細かいユニットに区切った管理手法を検討した方が良い。また、猟区におけるガイドハンティングだけでは、個体数管理を行うのは困難であり、個体数調整を目的とした捕獲を行う必要があると考えられた。
近代日本における「女中」像の変遷に関する歴史社会学的研究

最終年にあたる平成12年度は、国内外の「女中」に関する文献の収集・整理とまとめをおこなった。本年度は、昨年度に引き続き、女中の教育に力を入れていた戦前期のわが国最大の婦人団体「愛国婦人会」の社会事業に関する文献を集中的に集めるとともに、「女中と家事労働」という視点からも文献収集をおこなった。こうした作業を通して、(1)愛国婦人会が1920年代に、都市の女中難を緩和する策として、女中を対象とした無料の夜間女学校を設立したこと、(2)同会が1930年代には、農村救済策のひとつとして、農村子女を都市へ女中として送り込む活動を組織ぐるみでおこなっていたこと、(3)戦後も高度成長期の初めごろまでは、都市と農村の生活のレベル差が大きく、女中養成のための機関や教育プログラムが存在していたことなどが明らかになった。これらの成果は、2001年1月13日に開催された家族動向研究会(代表山根真理愛知教育大学助教授)公開シンポジウムで口頭発表(演題:「女中の歴史と家事」)するとともに、2001年3月発行の『関西国際大学研究紀要』第2号に論文(タイトル:(「愛国婦人会の〈女中〉をめぐる社会事業--両大戦間期を中心に」(関西国際大学『研究紀要』)としてまとめている。なお、3年間の最終的な研究成果は、平成13年度中に、研究代表者の単著(『〈女中〉イメージの生活社会学』世界思想社)として公刊する予定である。初年度である本年度は、基礎的な研究として、おもに国内の「女中」に関する文献の収集・整理をおこなった。扱った文献は、家政書を中心とする単行本、新聞、雑誌、調査統計などに及ぶが、とくに雑誌については、明治・大正・昭和戦前期をカバーする女性向けの数誌をテキストとして選び、「女中」およびそれに類する言葉の移り変わりや、「女中」という言葉が使われる文脈の変化を、都市化・産業化などとの関連でくわしく検討した。こうした作業を通して、(1)1910年前後に「下婢」「下女」から「女中」への言葉のシフトがある。(2)1960年代に一般化した「お手伝いさん」という言葉が、すでに1920年代より一部の女性雑誌で使われていた。(3)1910年代後半から20年代にかけて「女中」が社会問題化した、などの知見が見いだされた。これらの成果は、研究代表者の単著として、「『婦女新聞』にみる女中問題の変遷」(『関西国際大学短期大学部研究紀要』第13号、1999年3月)、「戦前期の『婦人之友』誌にみる女中像の展開--〈お手伝〉の登場をめぐって」(日本生活学会『生活学論叢』第4号、1999年8月発行予定)、「〈女中〉イメージの変遷」(『近代日本文化論』第8巻、岩波書店、1999年刊行予定)にまとめている。また本年度は、来年度・再来年度におこなう面接調査の予備的な段階として、戦前期に住み込み女中として働いた経験のある女性にインタビューをおこなった。現在、インタビューの結果を参考にして、チェックリスト作成の作業をすすめているところである。もっとも、女中の生活実態を明らかにするには、被用者のみならず雇用者側の視点も欠かせない。そこで来年度は、女中を雇っていた家庭の女性にも、面接調査をおこなう予定である。中間年にあたる平成11年度はまず、昨年度に引き続き、国内外の「女中」に関する文献の収集・整理をおこなった。本年度は、雑誌や新聞、家政書のみならず、女中の教育に力を入れていた女性団体、とくに愛国婦人会の動向に関する文献を集め、女中が消えゆくプロセスを追うため、カバーする時代も1960年代までに広げることにした。こうした作業を通して、(1)愛国婦人会をはじめとする女性団体が、大正から昭和にかけて、組織ぐるみで女中の養成・斡旋に力を入れようとしていたこと、(2)戦後も高度成長期の初めごろまでは、住み込み女中を置く家庭が少なくなかったこと、(3)高度成長期を境にして家庭から女中が消えていったことなどが明らかになった。これらの成果は、研究代表者の単著として、「戦前期の『婦人之友』誌にみる女中像の展開ー〈お手伝〉の登場をめぐって」(日本生活学会『生活学論叢』第4号、1999年9月)、「〈女中〉イメージの変遷」(岩波書店『近代日本文化論ー第8巻女の文化』2000年2月刊)、「近代日本における〈主婦〉イメージの形成」((財)兵庫県長寿社会研究機構家庭問題研究所『家族研究』第3巻、2000年3月発行予定)に、論文としてまとめている。本年度はまた、女中として働いた経験のある女性、女中を雇っていた家庭の女性(明治・大正・昭和ひとけた生まれ)数名にも、面接調査をおこなった。彼女たちのライフヒストリーをくわしく聴き取るなかで、住み込み女中が、たんなる口減らしや小遣い稼ぎの労働ではなく、「行儀見習い」的な性格を持っていたことが、あらためて確認された。

こうした作業を通して、(1)愛国婦人会が1920年代に、都市の女中難を緩和する策として、女中を対象とした無料の夜間女学校を設立したこと、(2)同会が1930年代には、農村救済策のひとつとして、農村子女を都市へ女中として送り込む活動を組織ぐるみでおこなっていたこと、(3)戦後も高度成長期の初めごろまでは、都市と農村の生活のレベル差が大きく、女中養成のための機関や教育プログラムが存在していたことなどが明らかになった。これらの成果は、2001年1月13日に開催された家族動向研究会(代表山根真理愛知教育大学助教授)公開シンポジウムで口頭発表(演題:「女中の歴史と家事」)するとともに、2001年3月発行の『関西国際大学研究紀要』第2号に論文(タイトル:(「愛国婦人会の〈女中〉をめぐる社会事業--両大戦間期を中心に」(関西国際大学『研究紀要』)としてまとめている。なお、3年間の最終的な研究成果は、平成13年度中に、研究代表者の単著(『〈女中〉イメージの生活社会学』世界思想社)として公刊する予定である。
S/Se処理による化合物半導体表面/界面の構造制御に関する研究

SやSe等のカルコゲンを用いて化合物半導体の表面を処理すると,界面における原子/電子構造が著しく改善されることが知られており注目されている.同処理による結果を一般化し,広く活用するためには,安定化の機構を明らかにすることが必要で,多くの研究が試みられてきた.第一原理による理論計算で,GaAs表面においてGa-S/Se結合が形成されると,バンドギャップ内準位が著しく低減することが示され,光電子分光等による結果と良く対応することもあって,安定化機構の本質であると期待されてきた.しかし,これら解析の基礎となるS/Se-Ga-2x1構造等の配列構造は,電子線回折では測定されるものSTM観察には成功しておらず,原子レべルでの配列構造を疑問視する意見も出され始めていた.実際,理論計算の結果は,基礎となるモデルに強く依存するため,安定化機構の解明に於て,処理表面の原子構造を明らかにすることが急務である.我々は,本研究において,探針の先端をFIM(電界イオン顕微鏡)により制御したFI-STMを用いて,Se処理を施したGaAs表面で,Seのダイマーによる,2x1,2x3等の構造の観察に成功した.2x3構造は、Ga原子のブリッジサイトとオントップサイトに交互にSe原子が吸着してダイマー構造を取ることによって形成される.通常は,オントップサイトへの吸着はエネルギーが高く,ブリッジサイトのみが考察の対象になるが,Seではダングリングボンドあたり2.5個の電子が余るため,GaAs-2x4構造等と同様,表面再構成によってエネルギーの緩和が引き起こされたものと考えられる.また,2x1構造の部分の凹凸は0.01nm程度と小さく,これまでSTM観察が困難であった理由と思われる.以上の結果により,カルコゲン原子による表面処理が,原子レベルで表面を制御する有望な処理であることが示されたと共に,今後,理論計算と併せて,上記機構を一般化し,化合物半導体表面/界面の構造制御に関する試みが大きく発展することが期待される.SやSe等のカルコゲンを用いて化合物半導体の表面を処理すると,界面における原子/電子構造が著しく改善されることが知られており注目されている.同処理による結果を一般化し,広く活用するためには,安定化の機構を明らかにすることが必要で,多くの研究が試みられてきた.第一原理による理論計算で,GaAs表面においてGa-S/Se結合が形成されると,バンドギャップ内準位が著しく低減することが示され,光電子分光等による結果と良く対応することもあって,安定化機構の本質であると期待されてきた.しかし,これら解析の基礎となるS/Se-Ga-2x1構造等の配列構造は,電子線回折では測定されるものSTM観察には成功しておらず,原子レべルでの配列構造を疑問視する意見も出され始めていた.実際,理論計算の結果は,基礎となるモデルに強く依存するため,安定化機構の解明に於て,処理表面の原子構造を明らかにすることが急務である.我々は,本研究において,探針の先端をFIM(電界イオン顕微鏡)により制御したFI-STMを用いて,Se処理を施したGaAs表面で,Seのダイマーによる,2x1,2x3等の構造の観察に成功した.2x3構造は、Ga原子のブリッジサイトとオントップサイトに交互にSe原子が吸着してダイマー構造を取ることによって形成される.通常は,オントップサイトへの吸着はエネルギーが高く,ブリッジサイトのみが考察の対象になるが,Seではダングリングボンドあたり2.5個の電子が余るため,GaAs-2x4構造等と同様,表面再構成によってエネルギーの緩和が引き起こされたものと考えられる.また,2x1構造の部分の凹凸は0.01nm程度と小さく,これまでSTM観察が困難であった理由と思われる.以上の結果により,カルコゲン原子による表面処理が,原子レベルで表面を制御する有望な処理であることが示されたと共に,今後,理論計算と併せて,上記機構を一般化し,化合物半導体表面/界面の構造制御に関する試みが大きく発展することが期待される.
家政学という「近代的な知」の形成

(1)韓国に2回、調査旅行をし、戦後の家政学の変容を明らかにするための資料収集をした。(2)戦前、日本の女子高等教育機関で家政学を学んで、帰国後、女学校の教員として役割を果たした朝鮮女性たちが、植民地支配から解放された後の米軍政期には、女子教育における家庭科教育を新しく立て直す主役を担い、また、女性団体活動を通じて、家政学的知や家政学的ジェンダー論を社会に普及しつづけた。(3)戦後の韓国において、以上のような役割を果たした女性知識人たちの意識は、米軍政期、そして、1950,60年代をへて、大きく変化していった。女性知識人たちは、米軍政期において、戦前の良妻賢母というジェンダー意識を決して廃棄することなく、持ち続けていたが、民主主義的な独立国家の建設という時代的課題を踏まえて、戦前よりは、女性の社会的役割(女性という立場からの社会的役割・貢献)を強調する、いわゆる「開かれた良妻賢母」論を展開した。しかし、朝鮮戦争の勃発後、特に、1960年代には、独裁政権下における社会停滞が見られ、女性知識人たちの議論も女性の家庭内役割を中心とするジェンダー論へ回帰していった。ただ、1960年代の資料分析は、まだ、途中であって、以上のような議論に、今後、修正の余地が全くないとはいえない。(4)彼女たちは「家庭科」教科書や家政書を執筆し、そして主な女性雑誌に投稿した。本年度には、特に、これらの雑誌記事の集めや内容分析に研究の重点をおいた。(5)19世紀から20世紀初期におけるアメリカ家政学の分析のため、コーネル大学に所蔵されている家政学関連書籍を中心に調査を集めてきた。
三角級数論の記述集合論的研究

円周群のボレル部分群や解析部分群の構造について研究から次の結果を得た。2以上の任意の可算順序数αに対して,真のΣ^c_α部分群が存在する。3以上の任意の可算順序数αに対して、真のП^o_α部分群が存在する。真のΣ^1_1部分群の存在も同様に確認された。またボレル部分群の生成元については、次の結果を得た。距離化可能な位相群の任意のK_σ部分群は、コンパクト部分集合によって生成される。コンパクト距離化可能位相群のΣ^o_α部分群は、△^o_α部分集合によって生成される。これらの結果はより強い次の形で成立することが予想される。コンパクト距離化可能位相群のΣ^1_1部分群はП^o_з部分集合によって生成される(予想)。この予想の類似の結果は、W以上のフィルターとその生成元についてはすでにZafrmyによって証明されているが、群に対する結果を得るためには、円周群の場合に限っても、新しいアプローチが必要だと思われる。自由群のボレル構造について研究し、次の結果を得た。ポーランド空間X上の自由群F(X)にGraevの距離を与えたものは、その完備化(これはポーランド群になる)の中でF_σであり、一般にはG_δではない。Xが離散空間でない限り、Graevの距離は決して完備にならないが、あるポーランド群の中でF_σ部分集合となることから、F(X)のボレル構造は標準的であることがわかる。またポーランド群X上の自由位相群(Graevの意味での)は一般に距離化可能ですらないが、そのボレル構造はやはり解析的である。Xがポーランド空間のボレル集合(又はΣ^1_1集合)なら、自由位相群F(X)のボレル構造は標準的(又は解析的)であることも、同様にして示された。
N,N'-ジアセチルキトビオース受容体タンパク質の基質認識機構の解明

1)NgcEタンパク質の結晶構造解析.平成14年度に大量発現系と精製系を確立したNgcEタンパク質(N-アセチルグルコサミンおよびN,N'-ジアセチルキトビオース結合タンパク質)について,結晶化条件の検討を行った.その結果,条件の1次,二次スクリーニングを経て,2.1Aの解像度でX線の反射をする質の良い結晶を得ることができた.また,大腸菌メチオニン要求性変異株を用いて,メチオニン残基をセレノメチオニンで置き換えたNgcEタンパク質を過剰発現し,精製した.セレノメチオニンでラベルされたNgcEタンパク質の結晶が類似条件下で得られ,2.0Aの解像度の反射を得た.2)キトビオース結合タンパク質活性測定系の確立.ABC輸送系の受容体タンパク質の基質特異性を調べるための簡便法として,ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay)に基づいた方法の確立を行った.基質は,N,N'-ジアセチルキトビオース{(GlcNAc)_2}あるいはN,N',N''-テトラアセチルキトトリオース{(GlcNAc)_3}の還元末端をAPEA(aminophenylethylamine)のエチルアミノ基と反応させ、その後,得られたAPEA誘導体のアミノフェニル基とBSA(牛血清アルブミン)中のアミノ基とをグルタルアルデヒドをリンカーとしてカップリングすることによって合成した.BSAへのGlcNAc残基の導入の確認は,WGA(wheat germ agglutinin:GlcNAc残基を特異的に認識するレクチン)を用いて行った.本方法の有効性を,既に基質特異性がプラズマ共鳴装置を用いて決定されているNgcEタンパク質を用いて検討したところ,これらの基質を用いた測定方法が,基質特異性の決定に有効であることが確認された.1)NgcEタンパク質の結晶構造解析.平成14年度に大量発現系と精製系を確立したNgcEタンパク質(N-アセチルグルコサミンおよびN,N'-ジアセチルキトビオース結合タンパク質)について,結晶化条件の検討を行った.その結果,条件の1次,二次スクリーニングを経て,2.1Aの解像度でX線の反射をする質の良い結晶を得ることができた.また,大腸菌メチオニン要求性変異株を用いて,メチオニン残基をセレノメチオニンで置き換えたNgcEタンパク質を過剰発現し,精製した.セレノメチオニンでラベルされたNgcEタンパク質の結晶が類似条件下で得られ,2.0Aの解像度の反射を得た.2)キトビオース結合タンパク質活性測定系の確立.ABC輸送系の受容体タンパク質の基質特異性を調べるための簡便法として,ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay)に基づいた方法の確立を行った.基質は,N,N'-ジアセチルキトビオース{(GlcNAc)_2}あるいはN,N',N''-テトラアセチルキトトリオース{(GlcNAc)_3}の還元末端をAPEA(aminophenylethylamine)のエチルアミノ基と反応させ、その後,得られたAPEA誘導体のアミノフェニル基とBSA(牛血清アルブミン)中のアミノ基とをグルタルアルデヒドをリンカーとしてカップリングすることによって合成した.BSAへのGlcNAc残基の導入の確認は,WGA(wheat germ agglutinin:GlcNAc残基を特異的に認識するレクチン)を用いて行った.本方法の有効性を,既に基質特異性がプラズマ共鳴装置を用いて決定されているNgcEタンパク質を用いて検討したところ,これらの基質を用いた測定方法が,基質特異性の決定に有効であることが確認された.
機能性レセプターを用いたフラビン人工触媒系の構築

反応に有利に働く因子を適切な位置に配置できる分子はアポたんぱく機能を有する分子であり、人工酵素構築の重要な要素の一つである。フラビン酵素では、補酵素、基質、加速因子が非共有結合で活性中心に集積されて触媒機能が発揮される。われわれはアポ酵素モデルとして機能性フラビンレセプター分子を開発し、高酸化活性フラビンの反応部位近傍に非共有結合で機能因子を集積する系が人工フラビン酵素構築の基本戦略とした。チミンレセプターである2、6-ジアミノピリジン誘導体はイソアロキサジン環のウラシル部位と三重水素結合しフラビンレセプターになることを見出したが、会合定数が小さいため反応条件での錯形成率が低く、アポ酵素モデルとしては限界がある。会合定数をあげるため水素結合の数を増やしたレセプターとしてグアニジニウムイオンを持つメラミン誘導体を開発した。高酸化活性フラビンである6-ザフラビンと5重水素結合が可能なため会合定数は著しく向上した(140, 000M^<-1>、クロロホルム中)。このレセプター分子を用いて、フラビンの反応性は水素結合によって制御されることを見出した。即ち、N (1)-位に水素家合する場合はN (5)-位を攻撃する反応を促進し、N (5)-位への水素結合はC (4a)-位を攻撃する反応を加速することを見出した。更にチミン部をもつチアゾリウム触媒によるピルビン酸の酸化的脱炭酸の反応に応用すると、グアニジニウム部位は基質引き寄せとカルボニル基への求核攻撃を酸触媒として助け、このレセプター分子はアポ酵素モデルとなることを見出した。アポ酵素機能をもつフラビン人工酵素の構築を目指して、水素結合により高酸化活性フラビンを捕捉するフラビンレセプター分子を開発した。2、6-ジアミノピリジン誘導体はフラビンのウラシル部位と水素結合することによりレセプター分子となるが、3個の水素結合ため会合定数が小さいという欠点があった。そこで高酸化活性フラビンである6-アザフラビンと5個の水素結合が可能であるグアニジニウムイオンを有するメラミン誘導体を設計、合成した。6-アザフラビンと5重水素結合の形成を分光学的に確認し会合定数を求めた。クロロホルム中の6-アザフラビンに対する会合定数は10^<4->10^<51>M^<-1>で強力なフラビンレセプターになることがわかった。フラビン酵素の多彩な機能はイソアロキサジン環のヘテロ原子への水素結合により制御されていると考えられているので、6-アザフラビンの酸化還元活性に及ぼすレセプター分子の効果を速度論的に調べた。6-アザフラビンによるNADHモデル化合物の酸化反応においては、レセプター分子の効果はほとんどなかったが、4個の水素結合が可能なベンゾジプテリジン(BDP)による酸化では、大きな加速効果が見られた。この結果はNADHモデル化合物の酸化においては、N(5)-位への水素結合は重要ではなく、N(1)-位の水素結合が加速因子になることを示唆している。それに対し、フラビンによるチオールの酸化はチオールがC(4a)-位を攻撃する機構で進行するのでN(5)-位への水素結合は加速因子として働く。事実グアニジニウムイオンを有するメラミン誘導体のレセプターは6-アザフラビンによるチオールの酸化を加速することがわかった。このレセプターはアポ酵素モデルとみなすことができ、さらに反応に有利に働く機能因子をレセプターに導入すれば、高次触媒系の構築の有力な構成因子となると考えられる。アポ酵素機能を持つ触媒系はレセプター分子が触媒基と基質を適切な位置に集積させることができ、かつ触媒基、基質の活性化や遷移状態の安定化できることが望ましい、フラビンレセプターの開発を目指して、種々のグアニジニウムイオンを有するメラミン誘導体を合成し、フラビン類とのクロロホルム中での会合定数を測定した。

今年度特にイソアロキサジン環への水素結合による反応性制御に焦点を当て、フラビンの酸化活性に及ぼすレセプター分子の水素結合の効果を速度論的に検討した。その結果、イソアロキサジン環N(1)-位への水素結合はN(5)-位を攻撃して進行する反応を加速すること、N(5)-位への水素結合はC(4a)-位を攻撃して進行する反応を加速することを見出した。この結果はレセプター分子を添加することにより、フラビンの反応性が制御されたはじめての例で今後の触媒系設計の重要な指針となる。またグアニジニウムイオンをもつメラミン誘導体たFMNを特異的に認識することを見出した。即ち水溶性のFMNをこのレセプターを用いるとクロロホルム層に抽出できるが、リボフラビンは抽出できない、これはイソアロキサジン環ウラシル部位とリン酸部位への水素結合による分子錯体は疎水性であるためである。単離した分子錯体の組成はNMRよりFMN:レセプター比は1:1であった。更に他の触媒系への拡張としてチミン部を持つチアゾリウムイオンによるピルビン酸の酸化的脱炭酸に及ぼす上記レセブターの効果を検討した結果、グニニジウムイオンはピルビン酸アニオンのカルボニル部位に水素結合するために、レセプター添加による大きな加速効果が見られた。
中枢神経系のタキキニン受容体サブタイプの研究とこれに基づいた薬物開発

中枢タキキニン受容体サブタイプの特性を解明し、それに基づいて有用なタキキニン作用薬または拮抗薬のスクリーニングを行なった。1.電気生理学的実験:テトロドトキシン存在下に新生ラット摘出脊髄標本にタキキニンを適用し、前根より脱分極を記録し用量反応曲線を得、これに対する拮抗薬の効果を定量的に求めた。末梢組織標本と異なり、NK-1拮抗薬はニューロキニンA(NKA)による応答に対しより高い親和性を示した。一方サブスタンスP(SP)による反応は高濃度においては却って拮抗薬存在下で増強された。2.生化学的分析:NKAによるアセチルコリン放出はNK-1拮抗薬によって抑制され、一方SPによる放出は抑制されなかった。これは電気生理の結果とよく一致し、以上より脊髄においてNKAに感受性の高いNK-1サブタイプの存在が示唆された。3.遺伝子クローニング:脊髄において特異的なサブタイプが存在することが電気生理・生化学的実験から示唆されたので、RT-PCRを用いた遺伝子クローニングを行なった。得られたDNA断片はほとんどがNK-1とNK-3で、NK-2は少量であった。新しいサブタイプはまだ見いだせていない。4.大脳初代培養系による検討:生後3-4日のラットの大脳皮質神経細胞を単離し、グリア細胞をフィーダーとして数週間培養した。この初代培養系を用いてパッチクランプ法でタキキニンの作用を観察したが、明らかな応答は得られなかった。5.スクリーニング:分子モデリングによって設計、合成された化合物を最初にIM-9培養細胞系を用いてスクリーニングした。この中からSP結合阻害活性の高いものを脊髄標本を用いてさらに検討したが電気応答に対して有効なものは得られていない。
CD26分子の新型コロナウイルス感染症（MERS）への役割及び新規治療法開発

MERSコロナウイルスの受容体はCD26であるが、さまざまなCD26単クローン抗体を用いてMERSの感染に関与するCD26ドメインを同定した。Adenosine Deaminaseの結合ドメインと反応する2F9抗体は完全にウイルスの侵入を抑制し,ヒト化CD26抗体も有意に感染を抑制した。このことから2F9及びヒト化CD26抗体はMERS感染症への治療候補である。MERSウイルスはヒトCD26陽性JurkatT細胞株に感染しアポトーシスを生じるが、このことからMERS感染によりCD26陽性T細胞がアポトーシスを生じ減少し免疫不全を生じる可能性を示唆した。2F9抗体はMERS-CoV-SI-FcのCD26への結合をほとんどすべて抑制し、1F7及びヒト化CD26抗体は約40%その結合を抑制した。さらに試験管内で施行した実際のMERS-CoV感染実験についても2F9はほとんど完全にその感染を抑制し、更に1F7及びヒト化CD26抗体も部分的に抑制した。2F9抗体はCD26のADA(Adenosine deaminase)の結合ドメインと反応し(aa358の近傍)、更に1F7とヒト化CD26抗体はほぼ同一のエピトープと反応(aa248 to 358)することを明らかにした。MERS-CoVのCD26への結合ドメインは主としてCD26のADA結合ドメインを中心として、さらに1F7やヒト化CD26抗体が認識するドメインであることは結晶構造解析からも明らかにされており我々の結果をサポートした。またこれらの抗体はMERS-CoV感染症の新規治療法となる可能性を示した。MERS-CoVはCD26陽性Jurkat細胞株に感染し、アポトーシスを生じて細胞を壊すという結果も得ている。MERSコロナウイルス感染症(MERSーCoV)は、中東地域で発生している重症呼吸器感染症で、有効なワクチンや治療法は存在しない。MERSーCoVの受容体はCD26の為、異なるCD26エピトープと反応するCD26単クローン抗体及びヒト化CD26抗体を用いてMERSーCoV感染に関与するCD26ドメインの解析を行った。2F9抗体はCD26のADA(Adenosine deaminase)の結合ドメインと反応し(aa358の近傍)、すべての感染を抑制し、2F9抗体とは異なるエピトープと反応するヒト化CD26抗体は(aa248 to 358)部分的に感染を抑制した。このようにMERSーCoVは主としてCD26のADA結合ドメインに結合することを明らかにした。MERSーCoVはヒトCD26陽性JurkatT細胞株に感染しアポトーシスを生じるが、このことからMERS感染によりCD26陽性T細胞がアポトーシスを生じ減少し免疫不全を生じる可能性を示唆した。次にMERSーCoVはマウスにおいてその感染は成立しない。そこでヒトCD26トランスジェニック(Tg)マウスをテキサス大学のDr.Tsengのグループと共同して作成を行ない、これら抗体の感染抑制実験を行った。CD26はDPPIVという酵素を含みインスリン分泌を調節するGLPーIがその基質のため、DPPIV酵素の高発現によりGLPーIが切断され不活性化され、マウスは低インスリン分泌となり高血糖症状が生じ、マウスコロニーを増やすことが困難であった。その中でline52は継代に成功でき、当マウスはMERS感染が成立し、急性呼吸器感染症を生じて数日以内に死亡することを確認した。このCD26Tgのマウスを用いて上記の抗体がMERS感染防御や治療に用いうるかの可能性を検討する予定で、現在継代して感染実験に必要なマウスを数多く得るという状態であるMERSコロナウイルスの受容体はCD26であるが、さまざまなCD26単クローン抗体を用いてMERSの感染に関与するCD26ドメインを同定した。MERS-CoVの受容体はCD26分子であることが明らかになっているが、我々はCD26分子のエピトープを大きく6つに分けることができるCD26単クローン抗体をすでに有しており、これらの抗体を用いてMERS-CoVがCD26に結合する詳しいドメインを決定した。本研究において2F9抗体が反応するCD26のADA結合ドメイン及び1F7とヒト化CD26が反応するaa248から358の部位にMERS-CoVが結合することを明らかにした。この結果はMERS-CoVとCD26との結晶構造解析とほぼ同様の結果であり、我々のCD26抗体を用いての詳しいCD26ドメイン解析が正しいことを支持した。さらにこれらの抗体は現在有効なワクチン及び治療法の存在しないMERS-CoV感染症の予防及び治療にも用いうる可能性を示唆した。本業績に基づいて我々は「MERSコロナウイルス感染予防治療剤」という名称で順天堂大学から特許出願も行っている。以上より本研究はおおむね順調に進展しているといえる。医歯薬学2F9、1F7及びヒト化CD26抗体は試験管でのMERS

-CoV感染実験においてその感染を抑制したが、モデル動物でのMERS-CoV感染実験で感染抑制を示すかどうか検討する必要がある。CD26はマウスでその遺伝子はヒトCD26の85%とそのホモロジーは高いが、ヒトCD26と反応するCD26単クローン抗体はネズミCD26とは反応しない。つまり遺伝子のホモロジーは高いがヒトCD26単クローン抗体はマウスCD26とは反応せず、MERS-CoVはマウスにおいてはその感染は成立しない。そこでヒトCD26を発現させたCD26トランスジェニックマウスをテキサス大学のDr.Tsengのグループと共同してその作成を行うことにした。ヒトCD26トランスジェニックマウス作成過程においてCD26はDPPIVという酵素を含みインスリン分泌を調節するGlucagon-like Peptide I(GLP-I)がその基質であり、高発現によりGLP-IがDPPIV酵素により切断され不活性化されるため、当初は低インスリン分泌となり高血糖症状が生じて、継代してマウスコロニーを増やすことに困難を生じた。しかしその中でline52は継代に成功することができた。更に当マウスを用いてMERS-CoV感染も成立し、感染後多量の炎症性サイトカインが産生され急性呼吸器感染症を生じて数日以内に死亡していくことを確認した。このCD26トランスジェニックマウスを用いて2F9、1F7及びヒト化CD26抗体がMERS感染防御あるいは治療に用いうるか検討して、本抗体の治療応用の可能性を検討する予定である。本年度プロジェクトでCD26トランスジェニックマウスが完成したため、このマウスを使ってテキサス大学と共同で大掛かりなMERSコロナウィルス感染実験を行う計画をたてた。この実験の経費に使用するため、本年度の予算を持ち越すことにした。CD26トランスジェニックマウスを用いてテキサス大学と共同でMERSコロナウィルスを感染させ、ヒト化CD26抗体、1F7CD26抗体、2F9CD26抗体及びコントロール抗体を投与日時を変えて投与し、これら抗体が試験管内での作用と同様にMERSコロナウィルス感染予防及び治療に有効かどうか検討する。
自己免疫性心筋炎における心筋細胞障害の機序と、拡張型心筋症への進展過程の解明

ヒト巨細胞性心筋炎の動物モデルであるラット自己免疫性心筋炎の発症機序、治療法を検討した。また、心筋炎から拡張型心筋症への進展機序を解明するため、実験的自己免疫性心筋炎の慢性期所見を検討した。抗原感作によって心筋炎を発症させたラットの脾細胞とリンパ節細胞を各種マイトジェンの存在下に培養した後、正常同系ラットに静注した。その結果コンカナバリンAで培養したリンパ球(T細胞)で心筋炎をトランスファーすることができ抗体やB細胞では疾患転嫁はできなかった。したがって、実験的自己免疫性心筋炎の発症にはT細胞が重要な役割を担っている(研究発表8)。次に、実験的自己免疫性心筋炎の病巣浸潤細胞の特徴をフローサイトメトリーを用いて検討した。病巣浸潤リンパ球はCD4陽性T細胞が主体であり、alphabetaT細胞受容体を発現していた。また、浸潤T細胞はインターロイキン2受容体やLFA-1を強く発現していた(研究発表4)。実験的自己免疫性心筋炎に対するサイクロスポリン、プレドニゾロン、アスピリンの効果を検討し、サイクロスポリンの心筋炎発症抑制効果が優れていることが示された(研究発表3)。また、既に発症した実験的自己免疫性心筋炎に対してはFK506が治療効果があることが示された(研究発表1)。各種免疫抑制剤の実験的自己免疫性心筋炎に対する予防効果と治療効果についてまとめると、サイクロスポリンとFK506が優れていた(研究発表6)。実験的自己免疫性心筋炎を発症させたラットを4カ月後まで観察した。激しい心筋炎は第6週までに治癒するが、慢性期に心臓は拡大し、組織学的には広範な線維化病変をみとめ、ヒト拡張型心筋症に類似する心病態を呈した(研究発表5)。今後、この実験的自己免疫性心筋炎をさらに解析することによって、(1)巨細胞性心筋炎の発症機序の解明と治療法な開発、(2)心筋炎から拡張型心筋症への進展機序の解明、(3)慢性心筋炎や特発性心筋炎などの心筋炎の病態解析に新たな知見が得られるものと考えられる(研究発表2,7)。
トランジスタ構造を用いた単一カーボンナノチューブのテラヘルツ光応答特性の解明

本研究では一本のCNTを活性層とする単一CNTトランジスタを測定試料とし、THz光照射時にCNT内で誘起される光電流を読出し、そのスペクトル解析をすることで単一レベルでのCNTのTHz分光を行った。特に本研究では異なる長さのCNT素子を作製し、それらのTHz応答特性のCNT長依存性を系統的に調べた。その結果、共鳴ピークエネルギーの下限が,閉じ込め長さをナノギャップ電極間隔とした場合のサブレベル間隔によって制限されていることがわかる。このことから、単一CNTのTHz共鳴ピークはCNTのサブレベル準位間に対応するエネルギーに対応する位置に出現し、そのエネルギーはCNT長に強く依存することを見出した。さらに位相緩和時間は、CNT内の電子の外部電極へのトンネル時間によって支配され、CNT内での不純物散乱やフォノン散乱による散乱時間は10 ps以上であることがわかった。また、単一CNT素子作製にあたり、従来品より高出力な超音波分散装置を用いた溶液分散法の条件最適化を行い、本手法の最適条件は1時間の超音波分散処理直後に基板上に溶液塗布することであることを見出した。実際に、本手法を用いてCNT素子の作製を行った結果、極めて清純なCNT素子のみでしか観測されない4重縮退を反映した伝導特性の観測に成功した。さらに、2層CNTに対して本手法を適用することでチャネル長150 nmの2層CNT素子の作製を行った。その結果、単一電子伝導領域内に等間隔(0.9 meV間隔)に複数本の伝導度ピークラインの観測に成功した。150nm長の単層CNTの伸縮振動モードはおよそ0.7 meVであり、実験値と良い一致を示す。このことから、この伝導度ピークラインは2層CNTの内殻もしくは外殻のCNTの伸縮振動モードが起源である可能性が示唆される。
マルチキャリア無線信号の光ファイバ一括無ひずみ伝送の研究

ブロードバンド移動通信システムを広く導入する上の問題の解決策として、伝送損失が小さい光ファイバ無線(ROF: Radio over Fiber)を用いた簡易な前進基地局の導入が期待されている。しかし光ファイバ前進基地局を新世代ブロードバンド移動通信システムで用いる場合、電気光変換器の非線形によってマルチキャリア無線信号が歪むという技術課題があった。また、前進基地局へ光ファイバを介して電力を供給する可能性について検討する必要があった。本研究では包絡線パルス変調送信による光無線信号伝送方式と光ファイバ給電による電力供給前進基地局構成法を提案し、その性能を解析および実験で確認した。新代移動通信システムの展開に必須である光ファイバ無線前進基地局技術として、E_0/0-E変換での非線形の影響を受けない包絡線パルス幅変調(EPWM)送信法に基づく光無線信号伝送方式の実現を目指し、平成23年度は提案法の基本動作確認を行った。(1)提案したEPWM光無線伝送方式のプログラム上での実現・E-O変換器としてMZ調器を用いた場合の非線形性を、実デバイスの入出力特性の測定結果から求め、これを数式でモデル化した。・EPWM送信機の構成要素をシミュレーションプログラムで実現し、E-O変換非線形モデルを含めた光伝送系と組合せてシミュレーションを行い、基本動作を確認した。(2)提案方式と従来方式の非線形に対する影響の基本解析・OFDM信号を入力信号とした場合の非線形光伝送路での出力信号のパワースペクトルをシミュレーションにより求め、非線形の影響を把握した。・EPWM送信機での量子化雑音の帯域内電力と、帯域外電力を算出し、ACLRを求めて評価指標とした。(3)伝送実験系(STEP1)の構築(研究分担者)・伝逼実験系のSTEP1を構築し、提案したEPWM光無線伝送方式の基本動作を確認した。またE-O変換器としてMZ調器と、直接変調レーザダイオードの2種類のデバイスの試験ができるように準備した。(4)研究成果の発表国際会議3件、国内学会4件などに方式提案発表と性能評価の発表を行い、成果を積極的にアピールした。新世代移動通信システムの展開に必須である光ファイバ無線前進基地局技術として(a)E-O/O-E変換での非線形の影響を受けない包絡線パルス幅変調(EPWM)送信法に基づく光無線信号伝送方式の研究と(b) 1本の光ファイバで電力と無線信号を同時に伝送できる前進基地局構成法の研究を行う。EPWM送信法は飽和高周波電力増幅器で非線形の影響を受けることなく高効率な送信が可能であるが、その適用範囲を光信号伝送の領域に拡張することは世界でも例がない独創性の高い技術であり、そのインパクトは大きい。平成25年度は以下を行った。(1)提案方式と従来方式の非線形に対する影響の詳細解析:直接DFBレーザダイオード変調器の非線形性の影響を詳細に検討し、この特性を精確に記述できる非線形特性モデルを提案した。次に既提案の量子化雑音キャンセル法の効果を実験で確認し量子化雑音をBPFとの組合せで十分抑えられることを明らかにした。(2)無線信号と高出力レーザ信号との多重伝送法の検討:光無線信号と高出力レーザ信号を多重伝送するため、高出力レーザ信号波長に830nm帯、光無線信号波長に1550nm帯を用いて波長多重方式による実験を行い、レーザ出力が2Wにおいて光無線信号を確実に分離できることを確認した。(3)伝送実験系の拡張(STEP2)と多重伝送実験の実施・評価:(2)に基づいてEPWM光無線伝送実験系(STEP2)を構築し、電力同時伝送の無線信号特性への影響がないことを確認し、提案法の基本的な有効性を確認した。(4)さらに大電力の光給電を可能とするため、通信用の小コアと電力伝送用の大口径クラッドで構成されるダブルクラッド光ファイバを用いた無線信号と高出力レーザ信号の同時伝送実験を行い、4W出力においても多重伝送可能なことを確認した。新代移動通信システムの展開に必須である光ファイバ無線前進基地局技術として、E-O/O-E変換での非線形の影響を受けない包絡線パルス幅変調(EPWM)送信法に基づく光無線信号伝送方式の実現を目指し、平成24年度は提案法の基本動作確認を引き続き実施するとともに、詳細な検討を実施した。さらに無線信号と高出力レーザー信号との同時伝送実験を行った。(1)提案方式と従来方式の非線形に対する影響の詳細解析前年度に引き続き、光変調器と光検波器の非線形性の影響を詳細に検討するとともに、既提案の量子化雑音キャンセル法の効果を実験で確認した。(2)無線信号と高出力レーザー信号との多重伝送法の検討無線信号と高出力レーザー信号を多重伝送するため、まず波長多重方式を検討した。

具体的には2つの信号の分離のための波長帯、波長間隔、使用する分波・合成器の選択と挿入損失の見積り、光ファイバの選定等を行い、候補となる部品を手配し、実験系を構築し、基本特性を実験により取得した。本研究は、新世代移動通信システムの展開に必須である光ファイバ前進基地局用伝送技術として、(a) E-O/O-E変換器での非線形の影響を受けない包絡線パルス幅変調(EPWM)送信法に基づく光無線信号伝送方式の研究と(b)1本の光ファイバで電力と無線信号を同時に伝送できる前進基地局構成法を研究するものであり、平成26年度は以下のとおり詳細な検討を実施して無線信号と高出力レーザ光との同時伝送方法の改良を行った。(1)EPWM送信法の送信回路の信号処理部をFPGAに実装し、IEEE 802.11pおよびLTE-OFDM信号を発生させた結果、これまでに計算機シミュレーションで得た特性と比較して劣化が小さいことを確認した。(2)高出力レーザ光の電力利用効率を高めるため、受光器の等価回路をモデル化し、無線信号電力に応じたレーザ送信出力をEPWM送信法で得た振幅信号で制御する方法を検討し、シミュレーションにて動作を確認した。(3)EPWM光無線信号と高出力レーザ光を光波長多重する実験系を構築した。26年度が最終年度であるため、記入しない。無線通信、無線回路26年度が最終年度であるため、記入しない。平成23年度は提案法の基本動作確認を行うことが目標であり、以下の全てを実施できている。(1)提案したEPWM光無線伝送方式のプログラム上での実現(2)提案方式と従来方式の非線形に対する影響の基本解析(3)伝送実験系(STEP1)の構築、(4)研究成果の発表E-O/O-E変換での非線形の影響を受けない包絡線パルス幅変調(EPWM)送信法に基づく光無線信号伝送方式の提案法の基本的な有効性を確認した。さらに、光給電技術について独自の技術を発展させ、高い実用性を示す実証実験にも成功している。無線信号と高出力レーザー信号との多重伝送法の検討については、平成24年度内に基本検討を実施し、平成25年度から実験を開始する予定であったが、何度内に実験系が構築でき、実験が開始できた。研究は当初計画どおり進展しており、次年度以降も当初計画に沿って実行可能と考えられる。今後は、光給電技術と包絡線パルス幅変調(EPWM)送信法を融合した光ファイバ無線伝送の詳細な性能評価を実施し、本研究の有効性を確定する。研究が予想以上の進展を見せているので、次年度は実験結果に基づく詳細な検討を進め、成果の発表にも力を注ぎたい。
コンディショナルノックアウト技術を用いた不完全変態昆虫の翅形成メカニズムの解明

非相同末端結合によるノックインを試みた結果、フタホシコオロギにおいて初めてノックインに成功し、マーカー遺伝子をゲノムに組み込むことができた。現在コンディショナルノックアウト実現のためにpiggyBacのコンポーネントが組み込まれたノックインベクターを作製し、コオロギゲノムへ導入している。また、次世代シークエンサーのPacBio RSIIを用いてゲノム解析を進めており,これまでに約5Gbのシークエンスデータが得られ,Gap closing解析を行っている。不完全変態類昆虫のモデル種であるフタホシコオロギを用いて,孵化後発生システムを解明することを目的とする。明らかにされつつあるゲノム解析の成果と新規ゲノム編集技術を利用することで,新たにコンディショナルノックアウト作製技術を開発し,翅形成過程における分子メカニズムを明らかにする。本年度はまず、コンディショナルノックアウト系統作製技術の開発を行った。コオロギにおいては既にCRISPR/Cas9システムを用いて,ゲノムの標的配列特異的に変異を導入することに成功しているが、標的遺伝子のシス調節領域の配列が長い場合や配列の特定が困難な場合が多く,変異導入だけではコンディショナルノックアウト系統を作製することはできない。そこで,ゲノム中からシス調節領域があると考えられる配列を抜き出す実験系の確立を試みた。標的にはactin遺伝子を用いた。ショウジョウバエの報告を参考にして実験を行ったが,標的配列をゲノム上から抜き出すことには成功したが、効率が非常に低く実用性がないものだった。そこで、新たにノックイン技術を用いたコンディショナルノックアウト法を考案した。まず本年度は、考案した方法を実践するためにノックイン技術の確立を行った。その結果、コオロギのHOX遺伝子であるabd-A, Ubxを標的としてGFP遺伝子をノックインすることに成功し、HOX遺伝子の発現をGFPによって可視化することに成功した。今回確立されたノックイン技術は,コンディショナルノックアウト法だけでなく、様々な研究に応用できると期待される。現在は,考案した新たなコンディショナルノックアウト法の確立に取り組んでいる。平行して翅形成に関わる遺伝子の同定を行ったが,期待されたような結果が得られていない。そこで計画書に予定していた通り,トランスクリプトーム解析を行い、翅形成に関連する遺伝子の同定を行っていく予定である。フタホシコオロギではこれまでにCRISPR/Cas9システムを用いて,標的ゲノム領域へ特異的に変異を導入することに成功している。標的遺伝子を時間・空間特異的にックアウトするためには,対応するシス調節領域を破壊する必要があるが,標的遺伝子の配列が長い場合やシス調節領域の特定が困難である場合が多く,単純な変異導入ではコンディショナルノックアウト系統を作製することはできない。そこで,ゲノム中からシス調節領域を大きく抜き出す実験系の確立を試みた。標的にはactin遺伝子を用いてショウジョウバエの報告を参考として実験を行ったところ,標的配列をゲノム上から抜き出すことには成功したものの,効率は大変低く実用性はなかった。そこで,新たにノックイン技術を応用したコンディショナルノックアウト法を考案した。ノックイン技術に関してはゼブラフィッシュの報告を参考とし,非相同末端結合によるノックインを試みた。条件検討の結果,フタホシコオロギにおいて初めてノックインに成功し,マーカー遺伝子をゲノムに組み込むことができた。このノックイン技術を用いてコオロギのHOX遺伝子であるabd-A, UbxにGFP遺伝子を組み込み,これらの遺伝子の発現をリアルタイムイメージングすることに成功した。現在,コンディショナルノックアウト実現のためにpiggyBacのコンポーネントが組み込まれたノックインベクターを作製し,コオロギゲノムへ導入しているところである。また,これまでHiseqを用いてゲノム解析を進めてきたが,コオロギにおいては発生に関わる遺伝子の5'側がGCリッチであることが多く,配列が明らかではない遺伝子も多い。そこで,新たにlong readの次世代シークエンサーのPacBio RSIIを用いてゲノム解析を進めている。これまでにシークエンスデータは得られており,現在Gap closing解析を行っている。当初の計画とは異なり、コンディショナルノックアウト技術においては、予定していた方法では困難であり,未だ確立されていないため。しかし、コオロギにおいてノックイン技術の確立に成功したため,新たに考案したコンディショナルノックアウト技術は,早い段階で確立できると考えられる。また、翅形成に関わる遺伝子の同定においては,RNAiでは期待されたような結果が得られていないが、トランスクリプトーム解析のための準備を進めている。分子生物学確立に成功したノックイン技術を用いて,コンディショナルノックアウト技術を確立する。具体的には、ヒートショックタンパク質を標的としてcas9やトランスポゼースをノックインすることで,熱誘導性のコンディショナルノックアウト技術を確立する。また、トランスクリプトーム解析を行い翅形成に関わる遺伝子を同定する。その後、同定された遺伝子に対して,コンディショナルノックアウトを行い、機能を詳細に解析する。また、同定された遺伝子に対して,GFP遺伝子などの蛍光タンパク質をノックインし、ライブイメージングによって発現を詳細に観察する予定である。RNAiによる解析において予定していたような表現型が得られなかったために,必要となる消耗品の購入を取りやめたため。