hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ホスホリパーゼA2ファミリーのメンバーの新しい機能

ホスホリパーゼA2(PLA2)の受精への関与は以前より指摘されていたが、その実体はまったく不明のままである。精子に存在し高いCa^<2+>非依存性PLA2比活性を発揮するホスホリパーゼB/リパーゼ(PLB/LIP)のヒト精子における局在部位とアクロゾーム反応における役割を、インホームドコンセントの得られた健常者から採取した運動精子を用いて検討した。その結果、PLB/LIPは精巣で生殖細胞特異的に発現し、ヒト精子先体反応のメディエータのひとつとして働くことがわかった。本酵素のin vivoにおける役割をさらに詳しく解析するために、PLB/LIPのノックアウトマウスの作成を進めている。精巣には、またホスファチジン酸(PA)特異的PLA2(PA-PLA2)が存在する。本酵素はリパーゼの一つのサブファミリーに属する、新しいタイプのPLA2で、至適pH5.5付近でPAと同程度の比活性でエンドゾーム特異的脂質リゾビスホスファチジン酸(LBPA)も分解することを明らかにしてきた。本酵素は、モノアシルグリセロールも分解し、PLB/LIPと同様にリパーゼ活性を持つPLA2である。このように、多様な反応を触媒する酵素が生体内でどの基質に作用しているかを明らかにすることが必要である。これを解析するために、PA-PLA2のLBPA活性測定に有効に利用した高感度HPLC-ESI質量分析技術をさらに発展させて自動化脂質組成一斉分析装置のプロトタイプを作製し特許出願した。現在、この装置を用いてPLB/LIPとPA-PLA2のin vivoでの基質を検索している。また本装置は、脂質のメタボローム解析に応用可能であり、脂質代謝異常症マウスの病因解析を進めている。2.IB群PLA2の肺における機能を追求するために、マウス肺、胃、膵臓からIB群PLA2を精製してその性質を詳しく検討した。特異抗体を調製し、IB群PLA2の定量系として酵素抗体法を作成した。肺移植後の拒絶反応とIB群PLA2の関連を調べるためIB群PLA2ノックアウトマウスを用いて急性拒絶反応モデルを作成し、IB群PLA2の動態を検討中である。(1)バキュロウイルスを用いた小腸ホスホリパーゼB/リパーゼ(PLB/LIP)の高効率の発現系を確立した。同時に、発現酵素の2ステップ精製法を開発した。この方法で得たPLB/LIP活性ドメイン酵素を用いて現在、単結晶の成長条件を検索している。(2) α/βヒドロラーゼホールドに属する加水分解酵素の活性中心求核基としてSer、Asp、Cysの3種がある。PLB/LIPの活性中心求核基を野生型のSerから部位特異変異法によりAsp、Cysに置換すると完全に失活することがわかった。このことは、本酵素の活性発現にSer-His-Asp型のcatalytic triadが必要なことが示唆された。(3)精巣から新規のCa2+非依存性ホスホリパーゼA2(PLA2)を精製し性状解析を行なった。精製酵素はSDS-電気泳動法で単一バンドを示し分子量は63,000と推定された。本酵素は、ホスファチジン酸とホスファチジルグリセロールに特異的なPLA2活性とモノアシルグリセロール(MG)に特異的なリパーゼ活性の2つの活性を示した。それぞれの精製ステップでPLA2活性とMGリパーゼ活性の比はほぼ同じであった。したがって、本酵素は単一酵素でPLA2とMGリパーゼ活性を持つことがわかった。また、アラキドン酸含有MGを良い基質とする。本酵素は、細胞内情報伝達系の一員として最近注目を集めているジアシルグリセロールとホスファチジン酸を介するリゾホスファチジン酸合成系に関与する可能性があり現在その構造解析をすすめている。(1)小腸Ca非依存性ホスホリパーゼB/リパーゼ(PLB/LIP).PLB/LIPは,はじめてcDNAクローニングされた膜結合型PLA2で,4個の繰り返し配列とC末端の疎水性膜結合ドメインから構成されている。N末端より2番目の繰り返し配列部分のみがホスホリパーゼA2,リパーゼ,リゾホスホリパーゼ活性を触媒する活性ドメインである。これまでに、我々はCOS細胞発現系での部位特異変異法による解析から本酵素は新しいリパーゼファミリーに属する酵素であることを示した。さらに、バキュロウイルスを用いた高効率発現系を確立して産生された変異酵素を精製し、その蛋白化学的性質と触媒反応性を解析した。そして、PLB/LIPのcatalytic triadを形成する3残基は新規のモチーフ内に位置することを確証した。現在、本酵素の結晶化を進めている。PLB/LIPは、小腸の他にラット精子に特異的に発現しているが、マウスやヒト精子にも検出できた。免疫染色によりPLB/LIPは精子の頭部にあるアクロゾームに局在していることが確認されたので、その受精における役割を検討した。PLB/LIPの触媒基Serを特異的に修飾する不可逆性阻害剤であるmethyl arachidonyl fluorophosphonate(MAFP)あるいは抗PLB/LIP抗体でヒト精子を処理すると、精子が受精能を発揮するために必須のアクロゾーム反応(脱顆粒反応)が阻害されることが明らかとなった。ヒト精子にはCa依存性とCa非依存性PLA2活性が検出されるが、前者はMAFPや抗PLB/LIP抗体で全く阻害されず後者のみが阻害された。

これらの結果からPLB/LIPがアクロゾーム反応に関与することがわかった。(2)ラット精巣ホスファチジン酸(PA)特異的PLA2.ラット精巣には、PLB/LIPのほかにPA特異的なCa非依存性PLA2(PA-PLA2)活性が検出された。PA-PLA2とPLB/LIPの生殖臓器における機能を比較するために、この酵素を精製してその性状解析をした。PA-PLA2は、PAの2-位を特異的に切断し他のジアシルリン脂質やリゾPAをはじめリゾリン脂質を分解しない。MAFPで本酵素活性は、効率よく阻害された。部分一次構造解析から、PA-PLA2はSerを触媒基とする新しいタイプのPLA2であることが分かった。現在PA-PLA2cDNAをクローニング中である。また、血漿中のリゾPAの主要供給源であるヒト血小板にも精巣と同性状の比較的高いPA-PLA2活性が検出された。(3)PA代謝異常モデルマウス.グリコシルフォスファチジルイノシトール(GPI)アンカー蛋白質のGPI部分の合成第一段階を触媒するN-アセチルグルコサミン転移酵素を皮膚特異的ノックアウトするとPAが角層に蓄積されることを見い出した。皮膚でもPAを基質とした時、Ca非依存性PLA2活性が主に検出された。PA-PLA2と連携したPA代謝系の解析にこのノックアウトマウスは有用である。(1)ホスホリパーゼB/リパーゼ(PLB/LIP):膵外分泌不全モデルラットWBN/Kobを用いて、膵臓リパーゼ・PLA2分泌不全時における小腸刷子縁膜結合型PLB/LIPの脂質消化における役割について検討した。PLB/LIPのPLA2活性は、WBN/Kobラット消化管(腸液と粘膜)PLA2活性の半分以上を占め、膵外分泌不全時において膵PLA2の機能を代償することがわかった。PLB/LIPのヒト精子における局在部位とアクロゾーム反応における役割を解析中である。消化と受精におけるPLB/LIPの役割をさらに詳しく解析するために、PLB/LIPのノックアウトマウスを作成を進めている。マウスPLB/LIPのcDNAをクローニングしその配列情報をもとにBacクローンをスクリーニングしてBacDNAを得た。BacDNAからノックアウトに必要な断片をサブクローニングした。(2)ラット精巣ホスファチジン酸(PA)特異的PLA2(PA-PLA2):PA-PLA2の約10種のトリプシン切断ペプチドの部分一次構造解析からPA-PLA2は、新しいタイプのPLA2であることがわかった。このペプチドシークエンスを超微量解析するために、キャピラリー高速液体クロマトグラフィー/イオントラップ質量分析システム(LC/ESI/MS)を改良した。PA-PLA2は、酸性領域でPAを分解するため、エンドゾーム特異的脂質リゾビスホスファチジン酸(LBPA)の分解活性を検討した。LBPAは、クロマトグラフィー支持体による触媒作用によりアシル基が容易に2,3-転位してその構造が変化してしまうためTLCやHPLC等の方法では精製できない。
ミニマックスなベイズ予測分布の構成法とモデル選択への応用

1.観測量と予測量の分布が異なる状況での予測分布の性質およびモデル選択規準の研究を行った論文が論文誌Statistica Sinicaに採択された.実用において観測量と予測量の分布が異なる状況はしばしば生じる.この論文では観測量と予測量の分布が異なる状況でのベイズ予測分布の性質を調べ,ベイズ予測分布に基づく情報量規準を導出した.2.関数予測の統計学的な定式化および良い関数予測方法の提案を行った.近年,観測量や予測量が関数の形で表現される関数データ解析とよばれる手法が注目されている.我々は関数予測の数理統計的な定式化を行い,真の関数がソボレフクラスとよばれる微分可能な関数族に含まれる場合に雑音が小さくなる極限のもとでの良い関数予測方法を提案した.我々の提案する関数予測方法は,真の関数の滑らかさなどという情報を観測から推定することができる非常に強力な方法となっている.また,縮小型事前分布の事後分布からの完全抽出を利用することで,提案手法の効率的な計算方法を構築した.結果をまとめ,論文誌に投稿し,現在リバイズ中である.3.ノンパラメトリックモデルにおける実用的な推定手法の考察を行った.ノンパラメトリックモデルはモデルに対して非常に弱い仮定しか置かないため,応用上非常に重要である.しかし,既存のノンパラメトリック手法の多くの理論保証は雑音の分散が小さくなるという極限に強く依存しているため,既存のノンパラメトリック手法の多くは現実的に機能しないのが現状である.我々は推定したい量のエネルギーと雑音の分散の比に着目し,この比に対する極限のもとで良いノンパラメトリック手法を考察した.特に,この極限のもとでは,推定したい量のエネルギーと雑音の分散の比に対して事前分布を導入したベイズ的手法がミニマックス最適であることを示した.28年度が最終年度であるため、記入しない。28年度が最終年度であるため、記入しない。「ミニマックスなベイズ予測分布の構成法とモデル選択への応用」というテーマのもと以下の三つの研究を行った.まず,観測量と予測量の分布が異なる状況での予測分布の性質およびモデル選択規準の研究を行った.実用において観測量と予測量の分布が異なる状況はしばしば生じる.この研究では観測量と予測量の分布が異なる状況でのベイズ予測分布の性質を調べ,ベイズ予測分布に基づく情報量規準を導出した.次に,関数予測の統計学的な定式化および良い関数予測方法の提案を行った.近年,観測量や予測量が関数の形で表現される関数データ解析とよばれる手法が注目されている.我々は関数予測の数理統計的な定式化を行い,真の関数がソボレフクラスとよばれる微分可能な関数族に含まれる場合に雑音が小さくなる極限のもとでの良い関数予測方法を提案した.我々の提案する関数予測方法は,真の関数の滑らかさなどという情報を観測から推定することができる非常に強力な方法となっている.最後に,ノンパラメトリックモデルにおける実用的な推定手法の考察を行った.ノンパラメトリックモデルはモデルに対する仮定が非常に弱いため,応用上非常に重要である.また,本研究のテーマであるモデル選択と深く関係する.既存のノンパラメトリック手法の理論保証は雑音の分散が小さくなるという極限に強く依存しているため,既存のノンパラメトリック手法の多くは現実的に機能しないのが現状である.我々は推定したい量のエネルギーと雑音の分散の比に着目し,この比に対する極限(Scale-ratio asymptotics)のもとで良いノンパラメトリック手法を考察した.特に,Scale-ratio asymptoticsのもとでは,推定したい量のエネルギーと雑音の分散の比に対して事前分布を導入したベイズ的手法がミニマックス最適であることを示した.当初の計画通り進捗した.予定した通り,パラメトリックモデルにおける予測だけではなくノンパラメトリックモデルにおける予測を取り扱うこともできた.また,ノンパラメトリックモデルにおける予測を考察することで,ノンパラメトリック統計に対して大きな貢献を行うことができた.1.観測量と予測量の分布が異なる状況での予測分布の性質およびモデル選択規準の研究を行った論文が論文誌Statistica Sinicaに採択された.実用において観測量と予測量の分布が異なる状況はしばしば生じる.この論文では観測量と予測量の分布が異なる状況でのベイズ予測分布の性質を調べ,ベイズ予測分布に基づく情報量規準を導出した.2.関数予測の統計学的な定式化および良い関数予測方法の提案を行った.近年,観測量や予測量が関数の形で表現される関数データ解析とよばれる手法が注目されている.我々は関数予測の数理統計的な定式化を行い,真の関数がソボレフクラスとよばれる微分可能な関数族に含まれる場合に雑音が小さくなる極限のもとでの良い関数予測方法を提案した.我々の提案する関数予測方法は,真の関数の滑らかさなどという情報を観測から推定することができる非常に強力な方法となっている.また,縮小型事前分布の事後分布からの完全抽出を利用することで,提案手法の効率的な計算方法を構築した.結果をまとめ,論文誌に投稿し,現在リバイズ中である.3.ノンパラメトリックモデルにおける実用的な推定手法の考察を行った.ノンパラメトリックモデルはモデルに対して非常に弱い仮定しか置かないため,応用上非常に重要である.しかし,既存のノンパラメトリック手法の多くの理論保証は雑音の分散が小さくなるという極限に強く依存しているため,既存のノンパラメトリック手法の多くは現実的に機能しないのが現状である.

我々は推定したい量のエネルギーと雑音の分散の比に着目し,この比に対する極限のもとで良いノンパラメトリック手法を考察した.特に,この極限のもとでは,推定したい量のエネルギーと雑音の分散の比に対して事前分布を導入したベイズ的手法がミニマックス最適であることを示した.本研究課題は本年度で終了であり,当初の予定通り研究を推進することができた.28年度が最終年度であるため、記入しない。28年度が最終年度であるため、記入しない。
男子不妊症の診断,治療法の開発:精子運動抑制因子を含めた原因遺伝子からのアプローチ

当研究は当初「国際学術研究」として申請・採択されたものであり、国外研究協力者のMcGill大学・Gagnon教授との共同研究により、精子運動抑制因子(SPMl)およびその前駆体のSemenogelin(Sg)を中心として研究を行い以下の知見を得た。(1)従来より精漿蛋白は精子のcapacitationに関与すると言われており、ヒト精子capacitationに対するSgの影響を検討した。ヒト臍帯血に含まれる分子量3KDa以下の低分子成分(FCSu)を用いてcapadtationを誘発した。Sgの存在によりヒト精子のhyperactivationが抑制されるのが観察されたが、運動精子を用いたアッセイ系の不安定さや、精子自動分析機による解析が困難で、明らかな濃度依存性は見いだせなかった。つぎにacrosome reactionを指標とした検討で、Sgは濃度依存性にヒト精子のcapacitationを抑制することが判明した。Xantine oxidaseを用いたケミルミネッセンスの測定から、その作用機序はO_2^-の生成抑制であることが明らかになった。また、Sgは精製精子とインキュベーションすることで分解を受け、その分解産物も同様にヒト精子のcapacitationを抑制することをも見いだした。この結果より、SgおよびSPMlは精子のcapacitationに関与していることが示唆された。(2)男子不妊症および正常男性の一部にSg遺伝子の欠失が見られたことから、この変異型蛋白の機能を解析中である。また、DNA二次元電気泳動法によりSg遺伝子のSNP検索を行っているが、現在のところSNPは確認されていない。(3)組換え型Sg(r-Sg)蛋白の発現に成功し、多量の高純度・高活性r-Sg蛋白の精製が可能になった。このr-Sgを抗原として作製した抗体は、天然型SgやSPMlとも特異的に反応した。男子不妊症の診断法と治療法の開発を目指し、基礎・臨床の両面から研究を行い、次のような知見が得られた。臨床研究平成10年度に引き続き、聖マリアンナ医科大学倫理委員会の承認のもとDNA収集を行い、現在約500名の男子不妊症患者ジーンバンクの構築を終えた。これらのDNAの解析として、精子運動抑制因子の前駆体であるSemenogelin遺伝子のDNA配列を検討したところ、患者5名で第2エクソンの一部に欠失がみられたが、精液所見との相関はなく、健常人にもみられる正常変異であると考えられた。また、精子形成能に重要な役割をすると考えられているY染色体上の3つのDNA多型を分析し、不妊患者および妊孕能のあるボランティア成人男性を4種類のハプロタイプに分類し、精液所見との関連について検討した。その結果、各ハプロタイプ間で精子濃度に差があることが判明し、また無精子症の起こり易さは特定のハプロタイプと関連していることを明らかにし、J、Hum Genetに発表した。今後更に症例数を増やしてハプロタイプと造精機能の関係について検討する。基礎的研究Semenogelin(Sg)の機能に関する研究として、Sgが精子のcapacitationを抑制するのかどうかを検討するため、予備実験にてcapacitation誘発物質とともに種々の濃度のSgを精しに加えたところ、濃度依存症にcapacitationを抑制する傾向が見られた。次年度はcapacitation誘発物質の種類を増やし、詳細な検討をおこなってゆく。また、r-Sgを抗原にしてモノクローナル抗体作成を試みているが、現在のところ特異性と力価の高いクローンが得られず、更にスクリーニング中である。男子不妊症の診断

法と治療法の開発を目指し、基礎・臨床の両面から研究を行い、次のような知見が得られた。臨床的研究平成11年度に引き続き、男子不妊症患者のDNA収集を行い、現在約600名のジーンバンク構築を終えた。このジーンバンクを用いてTwo dimensional gene scanning(TDGS)によりSemenogelin(Sg)遺伝子の検索を行っているが、multiple PCRに問題があり、現在のところ全エクソンを同時に検出することが出来ていない。今後primerのデザインや泳動条件を検討し、一枚のゲル上で全スポットの検出を目指す。また、前年度までの研究でSgIの第2エクソンに欠失のあった健常人について、精漿中Sg蛋白を分析したところ分子量の小さいSgIが検出され、現在この蛋白を精製し、変異蛋白の機能を解析中である。基礎的研究Sgの機能に関する研究として、精子capacitationに対する影響を検討したところ、Sgは濃度依存性にヒト精子のcapacitationを抑制することが判明した。その作用機序はO_2^-の生成抑制であり、Sgが精子によって分解された分解物も同様の作用を持つことなどを明らかにし、結果をJ.Androl.に投稿し、現在印刷中である。また神奈川県警察科学捜査研究所・佐藤博士との共同研究で、r-Sgを抗原にして作製した抗体を用い、精漿成分を特異的に検出することを目的としたアッセイ系の開発に成功し、その第一報をForensic Science Int.に投稿し、現在印刷中である。今後はモノクローナル抗体作成を引き続き行い、更にこのアッセイ系の感度および特異性を高めるよう開発を進める。
ウイロイド感染により誘導・抑制される宿主遺伝子の解析

ホップ矮化ウイロイド及びジャガイモspindle tuberウイロイドを各々キュウリとトマトに接種し、接種前及び接種後(28、35日目)の茎葉からmRNAを抽出し、ディファレンシャルディスプレイ法(以下DD法)により、各ウイロイド感染前後で発現レベルに違いの見られたmRNAを特定した。約200種類のプライマーの組み合わせでDD法を行ない、ウイロイド感染前後のmRNA発現レベルの比較を行なった結果、ホップ矮化ウイロイド/キュウリの系では20種類以上、ジャガイモspindle tuberウイロイド/トマトの系では30種類以上のバンドで増幅量に顕著な違いが確認された。その内で、ホップ矮化ウイロイド/キュウリの系では、感染後バンドの濃さが増加したもの、即ちmRNAの転写が活性化したと考えられたものが15種類、逆にウイロイド感染後バンドの濃さが減少したもの、即ちmRNA転写量が抑制されたと考えられたものが9種類検出された。一方、ジャガイモspindle tuberウイロイド/トマトの系では、感染後転写が活性化されたと考えられたものが20種、抑制されたと考えられたものが19種検出された。さらに、両ウイロイド/宿主間で共通に増幅量の違いが認められたものを中心に、増幅バンドを回収し、クローニング後、シークエンスを解析してデーターベース上でホモロジー検索を行なった結果、トマトpsbX mRNA、トマトVFNT Cherr Pto locus内のmRNA、シロイヌナズナDEAD mRNAなどと相補性を示すmRNAであることが確認された。今後、得られたcDNAをプローブとしてノーザン解析を行なって、ウイロイド感染による発現量の変化をより詳細に分析する予定である。
初期近代イギリスにおける自治都市の比較分析-「非公式」な経済社会の実態と影響-

イギリス近世は、19世紀の急激な工業化に先駆けて地域振興を担う中核都市の勢いが顕在化し、都市化が進む注目すべき時代である。本年度は、都市自治体(コーポレーション)が非公式な経済活動や社会関係を、住民参加型の司法と行政に支えられた市民社会へ取り込む役割を担っていたことこそ、イギリス型都市自治の特色であったとする仮説をもとに、公共政策の発信源としての役割を果たし、地方の経済拠点として都市再生を成し遂げた諸都市に残る一次史料の分析を行った。まず、人口構成の面から非市民や移住民の生活実態を把握するため、都市住民の世帯構造の調査と分析を進め、中心市街地と郊外地区との間の都市空間比較を行った。その結果、市内に常態化する経済格差と流動性の高い人口動態のメカニズムの存在を裏付ける証拠を得ることができた。一方、経済面では、行政監視の外で住民個人が結ぶ社会関係やヴォランタリー・アソシエーションにおいて実践される相互扶助に人々が多くを依存していた様子も示された。その結果、地方の拠点経済を潤したのは、野放図に広がる市場原理でもなければ硬直的な行政サービスや中央政府主導の施策でもなく、定住民と移住民との間の信用関係と産業と技術の地道な集積であったことが明らかになりつつある。しかも、これら人口の動きと経済・社会のあり方はいずれも都市自治の礎となるべく福祉、環境、公共サービスの実践とそれを支える思想に著しく影響したこともわかってきた。本研究ではイギリス近世の都市づくりの事例から、自治都市の本質が、家父長的政府や自治体によって管理された閉鎖的政治共同体の支配にあるというよりは、開放的な経済社会とそれを前提とする風通しのよいガバナンスに由来することが一層明確になった。こうした発見から、初期近代イギリス都市研究において「公式」・「非公式」という2つの世界の相互作用に注目し、都市型社会の成熟過程を分析する新たな方法の有効性を示すことができた。本研究は、自治都市の非公式な領域に関する調査、分析をもとに、自治都市の持つ経済社会組織の実態とその影響を明らかにし、初期近代イングランドにおける都市化の様相を解明することを目的とする。本年度は「公式」・「非公式」という概念を用いて、両者の相互作用から自治都市経済社会の実態を分析する方法の妥当性を検証するため、研究動向のサーヴェイと史料調査を行った。自治都市特有の経済領域に着目して「公式」・「非公式」という二つの相反する観点から史料を分析した結果、両者が重複する社会空間を浮き彫りにすることができ、さらに都市空間理論を援用しつつ社会組織の実態に接近する分析手法の確立が、初期近代イングランドにおける都市化のメカニズムを解明するために有効であることがわかった。本年度は、初期近代イギリスにおける都市化の様相を解明することを目的に、昨年度の研究動向のサーヴェイと史料調査から得られた仮説をもとにして、自治都市特有の経済関係や社会組織の成り立ちを「公式」・「非公式」という2つの相反する観点から検証する方法の妥当性を確認した。当該時期イギリス都市の市場取引は、人口増加や度重なる食糧危機により深刻化した経済問題を背景に、中央政府及び市自治体の厳しい監視の下に置かれていた。また、大勢の貧しい移入民を受け入れる大都市に典型的な格差社会の広がりは、治安維持と住民統治の強化を促す政策を導いた。そうした公的措置の一方で、都市経済を潤したのは住民と移住民との間の商取引であり、市自治体の管轄圏を越えて周辺地域に広がる信用のネットワークであった。これらを裏付けるために、市議会議事録や裁判記録を詳細に解析した結果、自治都市の経済は、公共政策の波に晒され、制度化が進む一方、行政監視の外で住民個人が結ぶ「非公式」な社会関係に支えられていたことが明らかになりつつある。しかもそこには、多数の非市民とともに、本来良好な自治体運営を担うべき市民も少なからず含まれていたのである。また、これらを踏まえ、イギリスの自治都市を市自治体によって管理された排他的政治共同体ではなく、「公式」・「非公式」両者間の相互作用によって形成される開放的な経済社会として捉える方が適切であることを提起した。

本研究ではイギリス近世の都市づくりの事例から、自治都市の本質が、家父長的政府や自治体によって管理された閉鎖的政治共同体の支配にあるというよりは、開放的な経済社会とそれを前提とする風通しのよいガバナンスに由来することが一層明確になった。こうした発見から、初期近代イギリス都市研究において「公式」・「非公式」という2つの世界の相互作用に注目し、都市型社会の成熟過程を分析する新たな方法の有効性を示すことができた。
上り坂歩行運動による脳の乳酸代謝活性化効果の検証

本研究では、上り坂・歩行運動が乳酸代謝と脳由来神経栄養因子(BDNF)に及ぼす効果については検証した。実験は雄性SDラットを用いて対照群、平坦歩行群、上り坂歩行群に分けて実施した。上り坂・歩行群はトレッドミルの傾斜40%に対して、平坦歩行群は傾斜を設定しない条件とした。両歩行群の速度を分速13 mとし、時間を30分から90分負荷した。運動終了直後に血液、脳を採取し、乳酸、グルコース、グリコーゲン、BDNFタンパク質発現量を分析した。血中と脳内における乳酸濃度は、対照群と比べて、30分と90分の上り坂歩行群で有意に高い値を示したが、対照群と平坦歩行群との間には有意差が見られなかった。脳グリコーゲンは、全ての群間で有意差が見られなかった。脳内におけるBDNFは、30分の上り坂歩行に対してすべての群間に有意な差異は見られなかったが、90分の上り坂歩行運動終了後5時間では、有意に増加した。本研究の結果から、一過性の上り坂歩行運動による脳のBDNF発現効果は、運動の時間依存的に急性に増加することが示唆された。さらに、本研究では、乳酸が運動誘発性のBDNF発現増加の鍵因子となるか否かを検討するために乳酸投与実験を実施した。乳酸投与群のラットに、頸静脈に挿入したカテーテルから乳酸ナトリウムを1週間、単回投与した結果、脳内のBDNFの増加は認められなかった。この結果から、運動誘発性のBDNF発現量の増加は乳酸以外の因子の検証に加えて、乳酸濃度や単回数などの実験的手法を再度検討する必要があると考えられる。本研究は、上り坂歩行運動が脳の乳酸産生量を増加させるか、否かを実験的に検証した。上り坂歩行群にはトレッドミルの傾斜を40%に設定にして、運動を負荷させた。平坦歩行群は傾斜を設定しない条件とした。運動群のトレッドミル運動速度を分速13 mとし、運動時間を30分とした。運動終了直後に血液、骨格筋、脳を採取し、骨格筋と脳における乳酸とグリコーゲンの濃度を分析した。脳の採取は運動直後に、頭部にマイクロ波を照射(5kW、1.7秒)して、脳内のすべての酵素を失活させた後に行った。上り坂運動群は、速筋線維の比率の高い筋群において、グリコーゲンの減少が顕著であった。血中乳酸濃度は、対照群と比べて、上り坂歩行群で有意に高い値を示したが、対照群と平坦歩行群との間には有意差はなかった。これらの結果から、上り坂運動では、速筋比率の高い筋群でグリコーゲンを消費した結果、血中の乳酸産生量が増加したと考えられる。また、脳内の乳酸濃度は、対照群と比べて、上り坂歩行群で有意に増加したが、対照群と平坦歩行群との間には有意差は認められなかった。頚静脈血への乳酸投与実験から、血中と脳内の乳酸との間には、正の相関関係が認められている。上り坂歩行運動により増加した脳内の乳酸は、血中由来の乳酸が脳内に取り込まれた結果、脳内で増加したと推測される。本研究の結果から、上り坂歩行運動は、同速の平坦運動に比べて、速筋を動員して、血中と脳内の乳酸を増加させることを実証した。本年度に計画した実験内容を検証することができたので、研究は概ね順調に進展している。本研究では、上り坂歩行運動が脳内の乳酸産生量やモノカルボン酸輸送担体(MCT)に及ぼす時間依存的効果を検証した。上り坂歩行群にはトレッドミルの傾斜40%で運動を負荷させた。運動速度は、上り坂・平坦歩行群ともに、分速13 mとし、運動時間は30分から90分とした。運動終了直後に血液、骨格筋、脳を採取し、各組織における乳酸とグリコーゲン濃度を分析した。脳組織は運動直後に、頭部にマイクロ波を照射(5kW、1.7秒)して、脳内すべての酵素を失活させた後に採取した。上り坂歩行群における血中乳酸濃度は、30分から90分にかけて、対照群と比べて、有意に上昇した。しかしながら、平坦歩行群は対照群と比べて、有意な差を示さなかった。脳内グリコーゲンは両運動群ともに、運動の時間依存的な影響は見られなかった。さらに、脳内の乳酸代謝活性化を検討するため、免疫組織化学染色法を用いて、鍵輸送タンパクとなるMCT2発現の局在を検討した。ニューロンのマーカー抗体とMCT2タンパク質抗体を用いて、脳の連続切片で観察したところ、MCT2はニューロン特異的に発現していることを確認した。次に、上り坂歩行がニューロン特異的なMCT2の発現効果に及ぼす効果を検証した結果、上り坂歩行群では、時間依存的に増加する傾向が見られた。

運動終了直後に血液、脳を採取し、乳酸、グルコース、グリコーゲン、BDNFタンパク質発現量を分析した。血中と脳内における乳酸濃度は、対照群と比べて、30分と90分の上り坂歩行群で有意に高い値を示したが、対照群と平坦歩行群との間には有意差が見られなかった。脳グリコーゲンは、全ての群間で有意差が見られなかった。脳内におけるBDNFは、30分の上り坂歩行に対してすべての群間に有意な差異は見られなかったが、90分の上り坂歩行運動終了後5時間では、有意に増加した。本研究の結果から、一過性の上り坂歩行運動による脳のBDNF発現効果は、運動の時間依存的に急性に増加することが示唆された。さらに、本研究では、乳酸が運動誘発性のBDNF発現増加の鍵因子となるか否かを検討するために乳酸投与実験を実施した。乳酸投与群のラットに、頸静脈に挿入したカテーテルから乳酸ナトリウムを1週間、単回投与した結果、脳内のBDNFの増加は認められなかった。この結果から、運動誘発性のBDNF発現量の増加は乳酸以外の因子の検証に加えて、乳酸濃度や単回数などの実験的手法を再度検討する必要があると考えられる。今後の研究として、一過性の上り坂歩行運動により脳内のモノカルボン酸産生量やモノカルボン酸輸送担体(MCT)の発現が脳領域特異的に効果を惹起するか否かを同一運動強度での平坦歩行運動と比較して、検証する予定である。今後の研究として、一過性の上り坂歩行運動が脳内のモノカルボン輸送担体や脳栄養由来因子に及ぼす時間依存効果とその効果における鍵因子を検証する予定である。再実験による実験動物数と薬品や抗体を含めた物品を購入したことで使用額が生じた。当該研究において、実験動物や薬品などの消耗物品を中心に使用する予定である。当該研究において、実験動物や薬品などの物品を中心に使用する予定である。
昆虫の殺虫剤耐性遺伝子の探索とその指標性に関する研究

多様な環境汚染に対して潜在的な耐性機構を保持していると考えられるユスリカについて耐性に関連している遺伝子を検索し、耐性機構を解明することと遺伝子発現を指標とした環境影響評価法を開発することを目的として以下の研究を行った。1.殺虫剤耐性ユスリカの育種前年度に引き続き殺虫剤に高感受性のセスジユスリカを合成ピレノイド系殺虫剤エトフェンクロップスに耐性化させる実験を進めた。今年度は、耐性の度合いを強めるために処理濃度を高くした。10,20,30、あるいは40ug/lのエトフェンクロップスで日間処理した後2日間餌を与えることを繰り返した結果、LD_<50値>値は対照群の約4倍上昇した。2.野外から採集したユスリカの耐性度平成10年11月につくば市の小河川からセスジユスリカの卵塊を採集し、3令(幼虫についてLC50を測定した。いずれの河川のユスリカも高感受性ユスリカの約4倍のLC50値を示した。この結果は、殺虫剤散布が行われていない時期にも耐性となっている事を示しており、耐性化機構が遺伝的に安定なものである可能性が推定された。3.ユスリカmRNAのDifferential display法の検討これまでに確立した方法を用いて3-4令のユスリカ幼虫から分離したmRNAを用いてDifferential display法の条件を検討した。RNA逆転写反応によってはDlAとし、primerを用いてPCR反応により増幅させた。試料濃度0.01ug、アニーリング温度40度、35サイクルの反応で良いことが明らかになった。また、アガロース電気泳動の染色は、ethidium bromideよりもSYBR-Green 1の方が10倍以上がかんどの高かった。現在、1.で耐性化したユスリカと無処理のユスリカのmRNAを用いて比較検討している。多様な環境汚染に対して潜在的な耐性機構を保持していると考えられるユスリカについて耐性を関連している遺伝子を検索し、耐性機構を解明することと遺伝子発現を指標とした環境影響評価法を開発することを目的としている。このために、初年度は以下の研究を行った。1.殺虫剤耐性ユスリカの育種日光市湯元から採取したセスジユスリカの50%致死濃度(LD_<50>)は、カ-バメイト系のフエノキシカルブで310μg/l、合成ピレノイド系のエトフェントロップスで23μg/l、有機リン系のフェンチオンで12μg/lであった。これらの値から都市部に生息しているユスリカに比べて使用したユスリカは感受性が50-800倍高いことが明らかとなった。次に、エトフェントロップスとフェンチオンの30%致死濃度で3日間処理し検討した結果LD_<50>は各々3倍と10倍となり耐性が発現した。今後、殺虫剤処理を繰り返すことによりさらい耐性を高める計画である。2.ユスリカからのmRNAの抽出法の検討殺虫剤耐性遺伝子を検索する第一歩として、ユスリカからmRNAの抽出法を検討した。Isogenにより幼虫からRNAは効率よく抽出された。mRNAが分解せずに抽出されたかを検討するために、グリオキザ-ル処理後アガロース電気泳動で検討した結果、分解を妨げなかったように見えた。そこで、ホルムアルデヒド処理後電気泳動を行った結果、分解していないことが判明した。今後、耐性と高感受性のユスリカを用いてmRNAを抽出してcDNAライブラリーを作成し、殺虫剤耐性遺伝子を検索する計画である。1.殺虫剤耐性ユスリカの育種前年度に引き続き殺虫剤に高感受性のセスジユスリカを合成ピレノイド系殺虫剤エトフェントロップスに耐性化させる実験を行った。6,10,15,20μg/lのエトフェントロップスに各々1日間漬けあいだの2日間は餌を与えた。この様に濃度を少しづつ上げることによって、生存率が大幅に上昇した。また、50%致死濃度も上昇した。今後さらに濃度を上げると共に耐性が次世代に保持されるかを検討する。2.耐性化にともなって発現が増加する遺伝子の検索前年度に確立したユスリカからのRNA分離法を改良し、ディファレンシャルデイスプレイ法により予備的にヒ酸により発現が亢進する遺伝子の検索を行った。ヒ素は9時間目までユスリカ体内の含量が増加し、濃度に依存して含量は高かった。ユスリカ体内における存在形態は、モノメチル、ジメチル体として主に存在し、メチル化酵素の存在と誘導が示唆された。今後、耐性と高感受性ユスリカを用いて殺虫剤とヒ素にたいして発現が亢進する遺伝子の検索を進める予定である。

10,20,30、あるいは40ug/lのエトフェンクロップスで日間処理した後2日間餌を与えることを繰り返した結果、LD_<50値>値は対照群の約4倍上昇した。2.野外から採集したユスリカの耐性度平成10年11月につくば市の小河川からセスジユスリカの卵塊を採集し、3令(幼虫についてLC50を測定した。いずれの河川のユスリカも高感受性ユスリカの約4倍のLC50値を示した。この結果は、殺虫剤散布が行われていない時期にも耐性となっている事を示しており、耐性化機構が遺伝的に安定なものである可能性が推定された。3.ユスリカmRNAのDifferential display法の検討これまでに確立した方法を用いて3-4令のユスリカ幼虫から分離したmRNAを用いてDifferential display法の条件を検討した。RNA逆転写反応によってはDlAとし、primerを用いてPCR反応により増幅させた。試料濃度0.01ug、アニーリング温度40度、35サイクルの反応で良いことが明らかになった。また、アガロース電気泳動の染色は、ethidium bromideよりもSYBR-Green 1の方が10倍以上がかんどの高かった。現在、1.で耐性化したユスリカと無処理のユスリカのmRNAを用いて比較検討している。
大型板鰓類の生殖状態を反映した繁殖生理特性の理解とその応用

大型板鰓類の多くは国際的な保護対象種とされており、今後は飼育下における持続的な繁殖が重要になると想定される。効率的な繁殖には、個体ごとの生殖状態を把握することが重要となる。本課題では、血液を利用し大型板鰓類の各生殖状態における繁殖生理特性を明らかにし、繁殖に適した個体の判別指標を確立することを目指した。成熟した雌トラフザメの卵胞サイズの周年変化および産卵期、血中の性ステロイドホルモン量の変動を明らかにした。これらの結果から血中の性ステロイドホルモンの変動が卵胞発達や繁殖期の予測指標となることを示した。加えて、サメ類においてもビテロジェニンが卵胞発達の指標になりうることが示唆された。ジンベエザメやマンタに代表される大型板鰓類の多くは国際的な保護対象種とされている。そのため、今後は保護計画の策定のみならず、飼育下における持続的な繁殖が重要になる。大型板鰓類は性成熟に時間を要し、また繁殖周期が複数年にまたがることもあるため、効率的な繁殖には、個体ごとに生殖状態を把握することが重要となる。そこで本研究では、非致死的で経時的に採取が可能な血液を利用することで、大型板鰓類の各生殖状態における繁殖生理特性を明らかにし、繁殖に適した個体の判別指標を確立することを目的とした。具体的には、板鰓類の血中のビテロジェニン量、性ステロイド量および卵胞サイズの関係から雌の生殖状態を反映する繁殖生理特性を明らかにし、繁殖適切個体の判別指標を確立することを目指す。本年度は、飼育下における成熟した雌トラフザメの卵胞サイズの周年変化および産卵期、血中の性ステロイドホルモン量の周年変動を明らかにすることができた。これらの結果から血中の性ステロイドホルモンの変動が卵胞発達や繁殖期の予測指標となる可能性が示唆された。加えて、公開されているジンベエザエ,ゾウギンザメのゲノム配列およびトラザメのビテロジェニンアミノ酸配列を参照し、各種ビテロジェニンの共通のアミノ酸配列部分14残基をターゲットとした抗体の作製を試みた。作製した抗体をトラザメ血漿を用いたウェスタンブロットによって評価したところ雌特異的に反応することを確認した。1.トラフザメの卵胞サイズの周年変化および産卵期、血中の性ステロイドホルモン量の周年変動を明らかにすることができた。これらの結果から血中の性ステロイドホルモンの変動が卵胞発達や繁殖期の予測指標となる可能性を提示することができた。2.血中のビテロジェニン量の半定量解析に使用するサメ類ビテロジェニン抗体を作製することができた。今後、作製した抗体の精製を行った後ウェスタンブロッティングにより血中ビテロジェニン量の半定量解析を実施する。3.オオテンジクザメおよびイタチザメのサンプルを計画通り取得することができている。本年度は、飼育下における成熟した雌オオテンジクザメの卵胞サイズの周年変化および、血中の性ホルモン量の周年変動を明らかにすることができた。複数の妊娠個体が確認され、妊娠個体と非妊娠個体で性ホルモンの変動パターンを比較することができた。その結果、オオテンジクザメは妊娠如何を問わず性ホルモンは類似した変動パターンを示すことが明らかとなった。4月まで低値で推移していた血中のエストラジオール17βとテストステロン濃度は56月に掛けて上昇し、10月に向けて徐々に減少していた。また、本年度には、一度も排卵を行わなかったと思われる個体が1個体存在し(卵胞サイズは他個体と遜色なし)、その個体の血中性ホルモン濃度は周年に渡って低値から変動が認められなかった。これらの結果から性ホルモンが排卵に影響を及ぼしている可能性が考えられた。研究期間を通して、飼育下における雌トラフザメの繁殖周期を明らかにした。併せて、血中の性ホルモンの変動パンターンを明らかにし、各生殖状態と比較することができた。その結果、血中の性ホルモンの変動が卵胞発達の予測指標や産卵期の指標となる可能性が示された。加えて、公開されている軟骨魚類のゲノム配列を参照し、ビテロジェニン(Vg)の共通のアミノ酸配列部分を抗原としVg抗体を作製した。雌トラフザメの血中Vg量の相対的な季節変化をウェスタンブロンティング法により調べた結果、発達した卵胞維持されている4月はシグナル強度が強く、卵胞が退縮した直後の8月にはそのシグナルはほぼ消失した。以上のことから血中Vg量は卵胞サイズを反映している可能性が示唆された。以上得られた成果は、これまで判断が難しいとされていた雌の大型板鰓類の生殖状態を評価する指標になると考えられ、今後、板鰓類の飼育下繁殖の効率化を目指していく上で重要な情報になると期待される。

ビテロジェニン抗体を用いたウェスタンブロッティングによるトラフザメの血中ビテロジェニン量の半定量解析を実施する。この半定量解析とこれまでに得られている結果を統合し生殖状態を反映した判別指標の確立に繋げる。H28年度に計画通り採取することができたオオテンジクザメおよびイタチザメのサンプルの解析を着実に実施する。魚類生殖生理学抗体作製に際し外部委託を行ったが、期間限定のキャンペーンが適用されたため、また、抗体の精製までを委託する予定であったが、精製キットを購入し自ら精製することでコストが安くなると判明したため、当初の予定金額を下回る金額で抗体作製が可能となった。抗体精製キットの購入に充てる予定である。
品質駆動型の情報源統合のための知識発見・獲得手法に関する研究

本課題では,ネットワーク上に存在する大量のデータを有効に活用するため,品質に着目した情報源の統合について研究を行った.特に,P2P(peer-to-peer)ネットワークにおける情報の流通のためのトレーサブルなレコード交換のフレームワーク,ネットワーク上に存在するテキスト情報の集約および情報抽出,集約した情報を適切にユーザに提示するための配信技術の開発などを行った.本課題では,ネットワーク上に存在する大量のデータを有効に活用するため,品質に着目した情報源の統合について研究を行った.特に,P2P(peer-to-peer)ネットワークにおける情報の流通のためのトレーサブルなレコード交換のフレームワーク,ネットワーク上に存在するテキスト情報の集約および情報抽出,集約した情報を適切にユーザに提示するための配信技術の開発などを行った.本年度は,以下の3つのサブテーマに関して研究を行った.1.データベースと連携した大規模文書情報源からの情報抽出:ネットワーク上に存在する大量の文書群から,ユーザの興味ある情報をレコード形式で抽出するアプローチを提案し,実験に基づいて評価を行った.ユーザが与えたデータベース中のサンプルデータに基づいて抽出処理を行う点が特徴である.2.新規性に基づく時系列文書のクラスタリングとその可視化システムの開発:インターネット上を配信されるニュース記事などにおいては,新規に得られた記事の方がより重視され,記事が古くなるほど価値が逓減していくという性質がある.また,新しい記事が次から次へと配信されるという性質もある.このような背景を踏まえて,本研究では新たな支書クラスタリングのアプローチを提案し,評価を行った.また,この文書クラスタリング手法の出力結果を可視化し,ユーザにニュース記事のトレンド分析機能を提供するT-Scrollシステムの開発も行い,被験者を用いた実証実験を行った.3.P2Pネットワーク上のトレーサブルなレコード交換システム:P2P(peer-to-peer)ネットワークにおいては,柔軟な情報交換サービスが提供されているが,交換される情報の信頼性については十分な保証がない.そのため,本研究では,データベース技術を基盤とした情報交換の新たなアプローチを提案した.各ピア上のデータベースに修正・交換履歴を蓄積することで,情報の出所などをトレーサブルにすることがその特徴である.Datalogに基づく再帰的問合せ機能について検討を行った.本研究では,ネットワーク上に分散した情報源を統合活用し,有効な知識を発見・獲得するための基盤となる技術開発を行う.前年度からの繰り越しとして,「P2P環境におけるトレーサブルな情報交換に関する研究」について,トレーサビリティに関する基本技術の開発を継続して行った.本研究課題では,各コンピュータ(ピア)がサーバにもクライアントにもなりうるP2P(peer-to-peer)ネットワーク上で,情報を柔軟に交換し,知識の蓄積・活用を図るためのフレームワークを開発している.特に,情報の信頼性を重視し,手元にある情報が元々はどこのピアから提供され,どのように流通したかを知ることが可能となる,トレーサビリティ機能の実現を目指した.トレーサビリティ機能により,交換された情報が信頼に足るということがわかり,得られた知識を有効に活用することが可能となる.本研究では,昨年度の繰り越しとして,特に,トレーサビリティ機能の中心となる問合せ処理技術に焦点を当てて研究を進めた.問合せ処理のアルゴリズムを精緻化し,具体的なアルゴリズムの導出を行い,また,一般化により応用対象を広めることに成功した.また,従来の考えていたのは,問合せが発行されてから実行が開始されるアドホックな問合せであったが,今回,問合せ自体を登録しておき,状況の変化に応じて継続的にモニタリング処理を行う,連続的処理,すなわちイベント駆動型問合せについても,体系化を行い,問合せ処理方式の開発を進めた.本研究では,ネットワーク上に分散した情報源を統合活用し,有効な知識を発見・獲得するための基盤となる技術開発を行った.本年度は,具体的には以下の内容について研究を行った.(1)P2P環境におけるトレーサブルな情報交換に関する研究:各コンピュータ(ピア)がサーバにもクライアントにもなりうるP2Pネットワーク上で,情報を柔軟に交換し,知識の蓄積・活用を図るためのフレームワークを開発した.特に,情報の信頼性を重視し,手元にある情報が元々はどこのピアから提供され,どのように流通したかを知ることが可能となる,トレーサビリティ機能の実現を目指した.トレーサビリティ機能により,交換された情報が信頼に足るということがわかり,得られた知識を有効に活用することが可能となる.(2)リレーショナルデータベースにおけるキーワード検索に関する技術:近年では,リレーショナルデータベース中に大量のテキストデータが蓄積されるようになってきている.そこで,リレーショナルデータベース中のテキストデータを対象としたキーワード検索が近年重要なトピックとなっている.本研究においては,特に,リレーショナルデータベースに対してキーワード問合せを事前に登録しておき,データベースに対して更新が発生したとき条件にマッチするデータが得られたら速やかに配信する,連続的問合せおよび分散配信の技術に焦点を当てた.(3)P2P環境における広告技術に関する研究:P2Pモバイルネットワークにおいて,何らかの情報を求めつつ移動するユーザと,ユーザに対して何らかの情報を提供する広告者のマッチングを図る技術を開発した.広告を題材にしたが,分散環境における知識交換などの応用分野も有する.
ゼロ電場駆動高性能有機フォトリフラクティブ材料の創製

カルバゾールを側鎖に有するアクリレートブロックとフルオレン誘導体及びジシアノピビニルアニリン単位を有するアクリレートブロックからなるブロック共重合体を合成した。合成したポリマーは2つのガラス転移温度を示し、ミクロ相分離構造をとっていることが示唆された。このポリマーのフォトリフラクティブ(PR)特性を2光波結合実験により評価したところ、ゼロ電場において4cm^<-1>の利得係数を示し、ゼロ電場駆動可能な材料となることがわかった。電子供与体であるカルバゾール単位と電子受容体であるフルオレノン単位が相の界面で電荷移動錯体を形成し、光誘起電荷移動が起こり空間電場を形成したものと考えられる。一方、ニトロビニルアニリン単位とチオキサンテン単位を有するコハク酸エステルを合成した。合成物は再結晶により精製可能であるが、一度融点以上にあげ、融解させたのち急冷することで安定な分子状ガラスを形成した。また、両単位ともに633nmにおいて透明であるが、分子ガラスはこの波長で20cm^<-1>程度の吸収を示した。チオキサンテン単位は、電子輸送性であるとともに電子受容体であるため、電子供与体であるアニリン単位と電荷移動錯体を形成していると考えられる。2光波結合実験の結果、ゼロ電場で44cm-1という高い利得係数を得ることができた。この錯体の場合、光電荷の発生が効率的に起こり電荷の拡散により空間電荷が形成したものと考えられる。以上のように界面での電荷移動や光電荷の拡散を利用することでゼロ電場駆動可能なフォトリフラクティブ素子を作製することができた。これまでの有機フォトリフラクティブ材料のほぼ全てが高い電圧(30-50V/μm程度)を素子の駆動のために必要とした。種々のアプリケーションを考えても、ゼロ電場駆動素子の開発はこの分野における大きなブレークスルーとなる。高いガラス転移温度(Tg)を有するフォトリフラクティブ(PR)高分子や分子状ガラスを合成した。いずれの場合でも電荷輸送部位と電気光学活性部位を同一分子中に含む材料であり、加工性、薄膜の形態上の安定性に優れていた。電気光学活性部位の配向をTg以上のポーリングにより行い、電界を印可したまま室温程度にまで温度をさげることで電気光学部位の配向の固定化を行った。双極子の配向による内部電界を利用することで、外部電場を印可することなくPR特性が発現することを分子状ガラスに関して確認した。しかしながら材料のTgは60°C程度であり、色素の脱配向による回折効率の経時的減少が著しかった。より高いTgの材料を合成する必要があると考えられる。それと同時にPR特性の温度依存性を分子状ガラスに関して調べた。回折効率は温度に対して最大値を示した。温度上昇に伴い電気光学活性部位の運動性が増加し、外部もしくは空間電場に対する配向性の向上が期待できるが、過度の分子運動性や暗導電性の増加による空間電場の減少が原因となって回折効率が減少していくと考えられる。応答速度に関しては2つの時定数を実験的に定め議論した。空間電場形成のための速い成分は、温度の上昇に伴い減少した。遅い成分は形成した空間電場に対しての色素の再配向によるものと考えた。高分子-体型の材料に対しては予備実験として可塑剤を添加しPR特性を評価した。トリアリールアミンを主鎖に含む高分子では光導電性が増加し速い応答を示すことがわかった。上記の高分子は150°C以上のTgを持ち経時安定性に優れたゼロ電場PR特性が期待できる。ポーリング条件の検討を行っている。
転写因子AML1(PEBP2αB)の転座型異常による白血病発症の分子機構

成体型造血の初期発生において重要な働きを担う転写因子複合体、PEBP2(CBF)、のDNA結合サブユニットはAHL1(PEBP2αB/RUNX1)遺伝子によってコードされるが、これは、ヒト急性白血病症における遺伝子変異のもっとも高頻度の標的となる細胞性がん遺伝子であることが知られている。当該研究ではAHL1による造血制御作用の分子基盤や、染色体相互転座によって形成される融合型AML1遺伝子産物の造血器腫瘍発生における役割について、マウスES細胞を用いた実験システムや遺伝子改変マウスの解析によって検討し、下記の結果を得た。1.AML1の造血発生における生物活性はその転写活性化ドメインに依存するが、転写抑制ドメインには依存しないことを、造血レスキュー実験によってin vitroだけではなくin vivoにおいても明らかにした。2.AHL1の遺伝子座には近位と遠位の2つのプロモータが存在し、それぞれ固有の第1コーディング・エクソンをもちいてAML1bとAML1cの2つのアイソフォームが産生されるかたちでその発現が制御される。当該研究においてマウスAML1cアイソフォームの新規クローニングに成功した(GenBank : AF345649)。そして、AML1bとAML1cは、造血初期発生過程においてそれぞれ異なった転写制御を受けていることを明らかにした。3.t(8;21)転座によるAML1-MTG8融合遺伝子をノックインさせたES細胞クローンはキメラマウス個体において定常造血に貢献することができた。しかしながら、このノックインES細胞はキメラマウスの正常ライフスパン内では白血病化を生じず、この融合遺伝子は造血器腫瘍発生において必要となるものの、十分とはならないことが示された。AML1遺伝子は、ヒト白血病における染色体転座の最も高頻度の標的であり、造血発生制御に関与する転写調節因子をコードしている。AML1あるいはその融合型白血病遺伝子産物の生物活性には、それ自身の受ける転写調節が重要となる。一方、融合型白血病遺伝子であるAML1-MTG8は、その発現のみでは白血病発生に不十分であることが示唆されている。そこで当該研究ではこれらの点について以下の検討を行った。1.選択的スプライシングによって産生されるマウスAML1cアイソフォームのcDNAを5'-RACE法によって新規にクローニングした。2.マウスES細胞をin vitroで分化させるES細胞の実験システムを用いてその造血初期発生における発現パターンを解析したところ、遠位プロモータによって制御されるAML1cアイソフォームはオートレギュレーションを受けて発現し成体型造血発生と関連していた。一方、近位プロモータから読み取られるAML1bアイソフォームは胚型造血と一致した発現パターンをとり、この両者は異なった発現制御を受けていた。3.AML1-MTG8遺伝子を片方のAML1遺伝子座にノツクインさせたES細胞と、対照として、同じノックインベクターがランダムにインテグレーションしたES細胞とを用いて複数のキメラマウスを作成した。4.多くのキメラマウスにおいて、AML1-MTG8ノックインES細胞クローンは末梢血に貢献していることがGPI解析で示されたものの、これらの細胞はキメラマウスの正常ライフスパン内では白血病化をほとんど生じなかった。5.AML1-MTG8ノックインES細胞をもつキメラマウスに対して、白血病の化学誘発実験を施行中である。次年度はこれらの検討を継続し、AML1-MTG8がどのような発現調節を受けるのか検討するとともに、この融合遺伝子による白血病発生過程の解析を行う予定である。成体型造血の初期発生において重要な働きを担う転写因子複合体、PEBP2(CBF)、のDNA結合サブユニットはAML1(PEBP2αB/RUNX1)遺伝子によってコードされるが、これは、ヒト急性白血病症における遺伝子変異のもっとも高頻度の標的となる細胞性がん遺伝子であることが知られている。