hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
細胞極性と遺伝子発現プログラムの可視化を基盤とした植物初期胚の体軸獲得機構の解明

高等生物は複雑な構造をもつが、それらは全て受精卵という単一細胞に由来する。高等植物の受精卵は高度な細胞極性をもち、その不等分裂によって異なる発生運命をもつ娘細胞を生じる。この際の軸性は成熟体の頂端-基部軸に相当するが、初期発生の過程で体軸が形成される仕組みについては現在でもほとんど分かっていない。シロイヌナズナのホメオボックス型転写因子をコードするWOX8(WUSCHEL RELATED HOMEOBOX8)遺伝子は受精卵で発現し、その不等分裂後には一方の基部側の娘細胞にのみ発現が受け継がれる。我々は、このようなWOX8の非対称発現を制御する複数のcis配列を同定し、それぞれに特異的に結合する因子を探索した。酵母oneハイブリッド法によるスクリーニングの結果、各cis配列に特異的に結合する転写因子の同定に成功し、これら転写因子群がWOX8発現のみならず、受精卵の細胞極性や初期胚の体軸形成に重要であることを見出した。現在までに酵母twoハイブリッド法によるスクリーニングをおこない、上記の転写因子群が胚に特異的な複合体を形成して働くこと、および受精後に特異的なタンパク質調節を受けることを示唆する結果を得ている。また、これら転写因子の変異体において、受精卵を蛍光マーカーで可視化し、単離して大規模発現解析をおこなうことで、これらの下流で体軸形成を担う実働因子の網羅的な探索を進めている。我々は、このようなWOX8の非対称発現は既知の軸性因子には依存しないこと、およびその発現は複数の異なるcis配列により冗長的に制御されることを見出した。これらのcis配列に結合する転写因子群を酵母oneハイブリッド法により同定し、詳細な機能解析を行った結果、これらの新規な転写因子群はWOX8遺伝子のcis配列へ直接結合して転写を活性化することで、WOX8の非対称発現を制御することが明らかとなった。これら転写因子群の欠損株ではWOX8遺伝子の発現だけでなく、受精卵の細胞極性や胚の軸性も損なわれたことから、これらは体軸形成と維持に必須の新規な制御因子群であることが明らかとなった。一般的に動物の体軸制御に重要な転写因子とは、雌組織または卵細胞で働く母性因子であることが知られている。一方、本研究で得られた転写因子は雌と雄のどちら由来でも機能し、受精直後に転写を誘導することで体軸形成を制御する新規なタイプの転写因子であることが明らかとなった。したがって、本研究は動物で一般的な母性因子による体軸形成とは異なった方法で植物の体軸形成がなされることを示した初めての例となった。我々は、このようなWOX8の非対称発現を制御する複数のcis配列を同定し、それぞれに特異的に結合する因子を網羅的に探索した。酵母oneハイブリッド法によるスクリーニングの結果、全てのcis配列について、各々に特異的な転写因子の同定に成功した。これら転写因子群の変異体のなかには、受精卵の細胞極性や初期胚の体軸が損なわれたものが複数見つかった。そこで、野生型と変異体の受精卵を単離して遺伝子発現を網羅的に比較することで、体軸形成の鍵因子を探索することを試みている。現在までに受精卵の蛍光標識に最適なマーカーを見出し、上記の変異体群を含め、受精卵に異常を示すさまざまな変異体への導入を完了した。現在はその蛍光を指標として顕微鏡下での受精卵単離を進めている。これらの転写因子は植物受精卵の極性を制御するものとして世界で初めての報告例であるため、このような遺伝子発現の比較により、受精卵極性を制御する因子が世界に先駆けて同定できると期待される。

我々は、このようなWOX8の非対称発現を制御する複数のcis配列を同定し、それぞれに特異的に結合する因子を探索した。酵母oneハイブリッド法によるスクリーニングの結果、各cis配列に特異的に結合する転写因子の同定に成功し、これら転写因子群がWOX8発現のみならず、受精卵の細胞極性や初期胚の体軸形成に重要であることを見出した。現在までに酵母twoハイブリッド法によるスクリーニングをおこない、上記の転写因子群が胚に特異的な複合体を形成して働くこと、および受精後に特異的なタンパク質調節を受けることを示唆する結果を得ている。また、これら転写因子の変異体において、受精卵を蛍光マーカーで可視化し、単離して大規模発現解析をおこなうことで、これらの下流で体軸形成を担う実働因子の網羅的な探索を進めている。
健常者における足アーチ高の標準値の確立に関する研究

1.アーチ高率の信頼性の検討と足趾筋力評価の妥当性の検討健常大学生20名を対象として,測定の練習を行ったトレーニング群(T群)と練習をしなかった非トレーニング群(NT群)に無作為に分け,値の一致度を検討した結果,両群ともに許容できる高い信頼性が得られたが,T群の舟状骨下端における測定値が最もばらつきが少なかった。健常大学生50名を対象として,足趾屈曲筋力と足趾踏力をデジタル握力計と足圧分布測定器で測定した結果,足趾屈曲力・足趾踏力・足圧分布測定値はいずれも高い相関を示し,再現性が高かった。2.就学前児童の足部調査について幼稚園児236名の足部調査を行った。その結果,年少児ほど扁平型のfootprintを呈する割合が高く,全体では44.9%であった。外反母趾20.1%,浮き趾73.7%にみられた。3.小学生の足部調査について1年生から6年生までの合計219名を対象として足部調査を行った。アーチ高率は,1112%であり,アーチ形成率が遅いことがわかった。扁平型のfootprintは,1年生の男子で44.4%と最も多かった。外反母趾は学年進行に伴って確実に増加し,5年生女子では平均14.3°,13°以上の児童は46.4%を占めた。6年生男子では53.6%が13°以上であった。内反小趾は,10°以上が5年生で50%,6年生で70%であった。浮き指は全体の45%の児童にみられた。4.中学生の足部調査について1年生から3年生までの合計103名を対象として足部調査を行った。アーチ高率は,1年生10.5±3.8%,2年生10.5±3.0%,3年生11.9±2.8%であった。扁平型のfootprintは,1年生18.8%,2年生11.1%,3年生12.9%であった。外反母趾角は学年進行に伴って大きくなり,3年生では52.9%が13°以上であった。内反小趾角は男女で差がなく,全体でみると3年生では64.3%が10°以上であった。従来から,中学生女子の4人に1人,男子では7人に1人が外反母趾であるといわれているが,今回の結果は,女子で54.7%(1.8人に1人),男子で35.0%(2.9人に1人)が外反母趾であり,過去の結果をはるかに上回っていた。

1.本年度は,(1)アーチ高率の信頼性の検討,(2)足趾筋力評価の妥当性の検討,(3)就学前児童を対象とした足部調査,について実施した。2.結果の概要(1)アーチ高率の信頼性の検討健常な大学生20名を対象として,舟状骨のマーキング練習を行ったトレーニング群(T群)と練習をしなかった非トレーニング群(NT群)に無作為に分け,舟状骨高の値の一致度を級内相関係数にて検討した。また,舟状骨下端および最突出部のいずれが一致度が高いかについても検討した。その結果,舟状骨か単および最突出部のいずれであってもT群・NT群ともに許容できる高い信頼性が得られたが,T群の舟状骨下端における測定値が最もばらつきが少ない傾向が示された。(2)足趾筋力評価の妥当性の検討健常者50名を対象として,足趾屈曲筋力と足趾踏力をデジタル握力計で測定し,足趾踏力は足圧分布測定器でも同様に測定した。なお,測定は別な日にも測定して再現性を確認した。その結果,足趾屈曲力と足趾踏力および足圧分布測定の値はいずれも高い相関を示し,いずれも高い再現性が得られたことから,足趾屈曲力によって簡易的に足趾での床を押す力を評価可能であることが示された。(3)就学前児童を対象とした足部調査について弘前市内の幼稚園1施設に協力をいただき,幼稚園児236名の足部調査および靴の調査を行った。同時に保護者の靴選びに対する認識についてアンケート調査した。その結果,年少児ほど扁平型のfootprintを呈する割合が高く,外反母趾7.6%,浮き趾73.7%にみられた。年少・年中・年長でアーチ高率の平均は,それぞれ,10.8%,10.2%,11.1%であった。靴は約半数が2E表示であったが,足のサイズ計測からは2Eが適しているものは1/4程度にすぎず,幅広の靴を履いている子どもが多かった。アンケート回収率は78.4%で,大きめのサイズの靴を選ぶという回答が多く,実際に適したサイズの靴を選択できていない可能性があり,これらが足部障害の発生因子となっていることが示唆された。1.本年度は,小学生を対象として,(1)下肢の静的及び動的アライメントの評価,(2)足部調査,について実施した。2.結果の概要弘前市内の小学校1施設に協力をいただき,1年生から6年生までの合計219名の両足438肢を対象として,下肢の静的及び動的アライメントを評価するとともに,足部調査を行った。(1)小学生における下肢の静的アライメント(SA)と動的アライメント(DA)について(2)小学生の足部調査について足長の成長は,1年生から5年生までが年間11.4cmで,4年生から5年生にかけて最大,5年生から6年生にかけて最小であった。足幅は,各学年とも年間でおよそ0.20.5cmの成長であり,学年進行につれて細長の足になっていく傾向がみられた。アーチ高率(舟状骨高/足長×100%)は,各学年で大きな差はなく,1112%であり,アーチ形成率が遅いことがわかった。扁平型のfootprintを示す児童の割合は,12年生で2829%と多く,特に1年生の男子では44.4%で最も多かった。外反母趾は学年進行に伴って確実に増加し,平均値が最も大きいのは5年生女子の14.3°で,13°以上の児童は46.4%を占めた。男子では6年生の53.6%が13°以上であった。内反小趾は,10°以上が5年生で50%,6年生で70%で,平均値では6年生が最も大きかった。浮き指は全体の45%の児童にみられた。1.本年度は,中学生を対象として,(1)足部形態計測,(2)足部変形(扁平足,外反母趾,内反小趾)調査,を実施した。2.結果の概要弘前市内の中学校1施設の協力のもと,1年生から3年生までの合計103名を対象として足部形態及び変形の調査を行った。(1)足部の形態計測について足長の平均値は,1年生234.7±13.9mm,2年生238.7±16.2mm,3年生239.2±15.4mmであり,1年生から2年生にかけて年間0.5cm程度の成長がみられるが,2年生から3年生にかけてはほとんど差がなかった。女子は男子に比べ2cmほど足が小さかった。
神経ペプチドによる、前胸腺を介した昆虫の脱皮・変態統御機構の解明

平成19年度は、前年度の成果を元に、カイコ前胸腺およびアラタ体に発現するGタンパク質共役型神経ペプチド受容体(神経ペプチドGPCR)のリガンドの同定とそれらの機能解析を進めた。前年度に同定した、前胸腺に発現する2種類の新規神経ペプチドGPCRのうちの1つは、これまで受容体が明らかにされていなかった前胸腺抑制ペプチドの受容体であることを突き止めた。さらに、時系列に沿ってこの受容体の前胸腺での発現パターンを詳細に検討した結果、他の前胸腺抑制因子であるmyosuppressinの受容体とは異なる発現パターンを有することを見出し、これら複数の抑制因子が個体成長の異なる時期に前胸腺に作用して、昆虫体液中における複雑なエクジソンの濃度変動を生み出している仕組みを明らかにした。一方、前年度に同定したアラタ体・側心体に発現する神経ペプチドGPCRのリガンド同定を進めた結果、長い間待ち望まれていたアラトトロピン受容体の同定に成功した。さらにアラタ体・側心体における詳細な発現解析を行った結果、意外なことに、このアラトトロピン受容体はアラタ体ではなく、側心体において強く発現していることが明らかになった。この事実を元に、アラトトロピンは実は側心体を介して間接的にアラタ体に作用している、という仮説を立て、実際に側心体のアラトトロピン受容体発現細胞にて産生され、アラタ体に直接作用してそのJH合成活性を調節する新規のペプチドを単離・精製することに成功した。このように、2年間の研究は予想以上の成果を伴って順調に進展してきた。今後はこうした研究成果を元に、他のモデル生物を用いて研究の幅を広げ、昆虫の脱皮・変態統御機構のさらなる解明を進めていきたい。研究計画に沿って、平成18年度はカイコ前胸腺活性制御ペプチドおよびその受容体の網羅的同定に取り組んだ。先ずはカイコゲノム情報からのGタンパク質共役型神経ペプチド受容体(神経ペプチドGPCR)候補遺伝子の網羅的同定を行い、既に知られていた8種類の神経ペプチドGPCRに加えて、約40種類の新規神経ペプチドGPCR候補遺伝子を同定することに成功した。また、同定した遺伝子の組織別発現解析を行い、前胸腺に発現する2種類の新規受容体候補遺伝子を発見した。一方、ペプチドリガンド側からのアプローチとして、ゲノム情報に基づいたペプチドリガンドの同定を進めると共に、Direct TOF-MSを用いて、前胸腺に投射する神経に存在する新規のペプチドを同定した。現在は、これらのペプチドと上記前胸腺発現受容体との対応付けを進めることで、神経ペプチドによる新たな前胸腺活性制御機構を明らかにしようとしている。さらに、新規神経ペプチドGPCR候補遺伝子の組織別発現解析の過程で、アラタ体と呼ばれるホルモン腺に強く発現する受容体候補遺伝子の同定にも成功している。アラタ体で産生される幼若ホルモンは、前胸腺で産生されるエクジソンと並んで昆虫の脱皮・変態を規定する極めて重要なホルモンであることから、現在アラタ体発現受容体のペプチドリガンドを同定し、その幼若ホルモン合成制御活性を解析している。このように、これまでの研究は予想以上の成果を伴って順調に進展している。今後も研究計画に沿って前胸腺活性制御ペプチドの機能解析を進めると共に、幼若ホルモン合成制御機構の解析も同時に進めることで、より広い視点から神経ペプチドによる昆虫の脱皮・変態統御機構を解析していけるものと考えている。
ライブイメージングと数理モデルを用いたTAK1の時間情報コード解析

TAK1は様々なストレスにより活性化し、炎症や免疫応答、細胞死を制御する因子として重要な役割を担っているが、このような多彩な生理機能の制御機構は明らかになっていない。一般に様々な細胞機能や疾患発症に関わるシグナル伝達は、細胞機能の情報を一過性や持続性、周期性などの時間パターンにコードすること(時間情報コード)により多彩な生理機能を制御する。本研究では、TAK1活性を検出するバイオセンサーによる1細胞でのライブセルイメージングと、TAK1活性化の数理モデル構築による解析により、TAK1活性の時間情報コードを明らかにする。
LPSによるB細胞の増殖活性に関与する細胞内リン酸化基質タンパク質の同定

LPSによるB細胞の増殖活性にかかわる細胞内シグナル伝達系を明らかにする目的で, LPS刺激後のB細胞の増殖反応と細胞内リン酸化反応について検討を行った結果,増殖反応がみられた場合には25kDaの基質タンパク質(p25)のチロシンリン酸化反応が誘導された.そこで, p25の性状解析を行った結果, p25はRanであること,また無刺激でも複数のp25のスポットが観察されることが明らかとなった.さらに, LPS刺激によりp25のチロシンリン酸化総量が増加し,且つその最も酸性側のスポットの量が増加することが明らかとなった.LPSによるB細胞の増殖活性にかかわる細胞内シグナル伝達系を明らかにする目的で, LPS刺激後のB細胞の増殖反応と細胞内リン酸化反応について検討を行った結果,増殖反応がみられた場合には25kDaの基質タンパク質(p25)のチロシンリン酸化反応が誘導された.そこで, p25の性状解析を行った結果, p25はRanであること,また無刺激でも複数のp25のスポットが観察されることが明らかとなった.さらに, LPS刺激によりp25のチロシンリン酸化総量が増加し,且つその最も酸性側のスポットの量が増加することが明らかとなった.1.P.gingivalis LPSは、C3H/HeNおよびC3H/HeJマウスB細胞に対し増殖活性を示した。その際、25kDaタンパク質(p25)を含む細胞内基質タンパク質のチロシンリン酸化反応が誘導された。一方、E.coli LPSは、C3H/HeNマウスB細胞に対してのみ増殖活性を示し、B細胞の増殖がみられた場合には、p25のチロシンリン酸化反応が誘導された。2.p25をさらに検討する目的で、LPSによる刺激・培養後のB細胞ライセートを二次元電気泳動(2D-PAGE)を用いて分離した。2D-PAGEにより得られた、p25の候補となるタンパク質スポット8個のうち2個のスポットは、飛行時間型質量測定(MALDI-TOF MS)とpeptide mass fingerprihting解析により、small GTPaseであるRanと同定された。3.抗Ran抗体を用いたウエスタンブロッティングからは、無刺激およびLPS刺激後のいずれの条件下においても、B細胞にRanは少なくとも4つのスポットとして存在することが明らかとなった。しかし、その総量と最も酸性側のRanの量がLPS刺激により増加した。以上の結果より、Ran総量の変動とRanのチロシンリン酸化の変動がLPSによるB細胞の増殖反応に関与している可能性が示唆された。本年度は,昨年度同定したLPS刺激後のB細胞の増殖過程で特異的にリン酸化が起こるチロシンリン酸化基質タンパク質,p25の性状について詳細に検討するとともに,サイトカイン産生との関連性について検討した.その結果1.抗p25抗体(抗Ran抗体)を用いた二次元ウエスタンブロッティングから,B細胞には無刺激で複数のp25のスポットが観察されること,LPS刺激によりその総量が増加し,且つその最も酸性側のスポットの量が増加することが明らかとなった.2.C3H/HeNおよびC3H/HeJマウスB細胞に対し増殖活性を示すP.gingivalis LPS,ならびにC3H/HeNマウスB細胞にのみ増殖活性を示すE.coli LPSを用いた検討から,上記のp25のスポットの変化は,LPS刺激後のB細胞の増殖反応と一致することが明らかとなった.3.LPS刺激後のB細胞内チロシンリン酸化反応阻害剤であるハービマイシン処理を行うと,いずれのマウスB細胞についても増殖反応およびp25のスポットの変動(総量および最も酸性側のスポット量の増加)が完全に抑制されたことから,p25のチロシンリン酸化が増殖反応に関与することが強く示唆された.4.LPSによるB細胞のサイトカイン産生との関連性について3種類のMAPキナーゼ(ERK1/2,p38,JNK)の阻害剤を用いて検討した結果,P.gingivalis LPS刺激後のp25のスポットの変動はサイトカイン(IL-6,TGF-β)産生と関与することが示唆された.これらの結果より,B細胞内チロシンリン酸化基質タンパク質,p25の総量および最も酸性側のスポット量の増加は,P.gingivalis LPSによるB細胞の増殖反応およびサイトカイン産生に関与していることが強く示唆された.
癌細胞のスタチン系薬剤感受性を決定する分子メカニズム―感受性マーカーの探索―

スタチンは血中コレステロール値の低下作用以外に制がん作用を発揮することが報告され近年注目を集めている。しかしスタチンがどのような特徴をもつがん細胞に有効なのかはわかっていない。これまでに我々はスタチン感受性マーカー候補としてE-カドヘリンを同定してきた。本研究では,がん細胞のスタチン感受性がE-カドへリンの発現制御で変化するか否かを解析した。感受性株にE-カドへリン遺伝子を組み込んで発現させると,50%阻害濃度は約3.7倍増加し,スタチンに対する耐性の獲得がみられた。一方,耐性株がもつE-カドヘリンを抑制した結果,感受性が増強し,スタチン耐性の1因子としてE-カドヘリンの存在が強く示唆された。近年、スタチン系薬剤が血中コレステロール値の低下作用以外に制がん作用を発揮することが報告され、がん細胞に対する効果が注目され始めた。スタチンの制がん作用が注目される一方で、本薬剤に対する反応性は細胞種によりかなり差が存在する。これまでに我々はNCI-60細胞パネルを用いて、スタチン系薬剤の1つであるアトルバスタチンの制がん作用を検討してきた。スタチンの作用点がHMG-CoA還元酵素(HMGCR)であることから、当初はその発現量の差が感受性を左右する因子ではないかと考えたが、各がん細胞間に大きな差はみられず、がん細胞のスタチン感受性を決める因子は未だ不明な点が多い。HMGCRは7つの遺伝子変異が報告されているが、そのうちの2つ(rs17244841とrs17238540)はスタチンの感受性に関わることが知られている。本年度の研究では14種のがん細胞株(大腸、卵巣、乳腺、肺、前立腺、メラノーマ、脳から各2種類)について、スタチン感受性とHMGCRの遺伝子変異との関連性を検討した。DNAシークエンス法によりHMGCR遺伝子を解析した結果、HCT-116においてHMGCRの遺伝子変異があることが明らかとなった。しかし、この細胞はスタチンに対して耐性株でも感受性株でもない中間株であり、HMGCRの遺伝子型とがん細胞のスタチン感受性との間に相関を見出すことは出来なかった。一方、これまでの研究で我々はスタチン感受性マーカー候補タンパクとしてE-カドヘリンおよびビメンチンを同定してきた。本研究ではこれらのタンパクの発現をsiRNAにより制御することで、がん細胞のスタチンに対する感受性が変化するか否かを解析することを試みた。スタチン耐性株がもつE-カドヘリンをノックダウンすることにより、スタチン感受性が増強する傾向がみられ、スタチン耐性の1因子として、E-カドヘリンの存在が強く示唆された。HMGCR遺伝子の塩基配列の決定にあたり、CG繰り返し配列の多い領域ではPCRが予想通りにかからず数回のプライマー再設計が必要となったが、現在は解決済みであり、研究はおおむね順調に進展していると考えられる。スタチン系薬剤は血中コレステロール値の低下作用以外に、制がん作用を発揮する可能性があることが報告され、がん細胞に対する増殖抑制効果が注目されている。しかし、スタチンがどのような特徴を有するがん細胞に有効なのか、具体的な部分は未だ不明である。これまでに我々は、がん細胞が発現しているタンパク質を網羅的に解析し、スタチンが効かないがん細胞、すなわちスタチン耐性株にはE-カドヘリン(上皮系細胞に特有の細胞接着因子)が高発現していることを報告してきた。本研究課題では、これまでの成果を裏付けることを目的とし、E-カドヘリンを細胞に強制発現あるいは発現抑制することで、がん細胞のスタチン感受性が変化するか否かを検討した。E-カドヘリンをもたないスタチン感受性株にE-カドヘリンを強制発現させると、50%阻害濃度IC50が1.16 uMから4.30 uM(約3.7倍)に増加し、スタチンに対する耐性の獲得がみられた。逆に、スタチン耐性株がもつE-カドヘリンをsiRNAでノックダウンすると、耐性株はスタチンに対して感受性をもつようになり、E-カドヘリンの存在がスタチン感受性と強く相関するものと考えられた。一方、アトルバスタチン(脂溶性スタチン)で得られた上記の知見が他のスタチン系薬剤にもあてはまるか否かを調べた結果、ロスバスタチン(水溶性スタチン)では、がん細胞の増殖抑制効果が低下する傾向がみられた。これは水溶性スタチンの方が脂溶性スタチンよりも細胞膜透過性が低いことに起因すると考えられるが、HOP-92細胞株(肺由来)など、一部のがん細胞では、脂溶性・水溶性に関わらず同程度のIC50を示し、スタチンに強い感受性をもつ何らかの因子があることが示唆された。

スタチン系薬剤はその作用の強弱によりスタンダードスタチンとストロングスタチンに分類され、また化学性状の違いにより脂溶性スタチンと水溶性スタチンに分類される。各スタチン系薬剤はHMGCRを阻害し、メバロン酸経路を抑制するという点では共通であるが、作用の強弱、コレステロール合成阻害以外の作用、薬物動態に関連した相互作用などは薬剤によって違いが存在する。今後はアトルバスタチン(ストロングかつ脂溶性スタチン)で得られた知見が他のスタチン系薬剤全般に共通するのかを調べる。まず始めにストロングかつ水溶性スタチンであるロスバスタチンを解析対象とする。スタチンの制がん効果の評価は、細胞増殖曲線の変化とMTT試験により行う。さらに蛍光マーカーであるFilipin IIIを用いてコレステロールの染色を行うことで、メバロン酸経路阻害の程度を蛍光顕微鏡下で観察する。27年度が最終年度であるため、記入しない。腫瘍生物学27年度が最終年度であるため、記入しない。
グリア細胞アポトーシスのシグナルカスケードとその制御

アストロサイト、ミクログリア、神経細胞の細胞死発現の分子メカニズムを解明する目的で、これらの細胞死シグナルカスケードについて、薬理学的、分子生物学的に検討し以下の成績を得た。(1)アストロサイトのCa^<2+>パラドックス障害がアポトーシスを伴うことを明らかにし、そのメカニズムについて薬理学的検討を行なった。本細胞死は持続的な細胞内Ca^<2+>の増加によって引き起こされるが、その後のカスケードとして過酸化水素の産生、NF-kBの活性化が重要な役割を演じていた。また、本細胞死のシグナルカスケードには、カルパイン、カルシニューリン、カスパーゼ系、カテプシン系、MAPK系が関与していた。これらの細胞内分子の阻害薬は本細胞障害を抑制し、これらの分子が障害保護の薬物標的分子になりうることを示した。また、cyclic GMPシグナルの抗アポトーシス作用を明らかにし、アポトーシスシグナルとcyclic GMPシグナルのクロストークの可能性を示した。(2)β-アミロイド蛋白により培養ミクログリアがアポトーシスを引き起こすことを、ヘキスト染色及びDNAラダー形成により明らかにした。この障害過程にはNO産生が関与しており、NOS阻害薬は障害保護作用を示した。また、NO障害時にMAPKシグナルの変動が見られ、本シグナル系により障害制御が可能性を示唆した。さらに、本障害にはカテプシン系が関与していた。(3)神経細胞の生存維持にアストロサイトが重要な役割をしていること、またアストロサイトを介して神経細胞保護作用が発現されることを示した。アストロサイト、ミクログリア、神経細胞の細胞死発現の細胞特異的分子メカニズムを解明する目的で、これらの細胞死のシグナルカスケードについて、薬理学的、分子生物学的に検討し以下の成績を得た。(1)Ca^<2+>パラドックスによるアストロサイトのアポトーシスシグナルカスケードの解析:本研究では、アストロサイトのCa^<2+>パラドックス障害がアポトーシスを伴うことを明らかにし、そのメカニズムについて薬理学的検討を行った。(2)β-アミロイド蛋白によるミクログリアのアポトーシスシグナルカスケードの解析:β-アミロイド蛋白により培養ミクログリアがアポトーシスを引き起こすことを、ヘキスト染色及びDNAラダー形成により明らかにした。(3)シグナルカスケードの可視化:本プロジェクトについては、基礎的検討の段階である。アストロサイト、ミクログリア、神経細胞の細胞死発現の細胞特異的分子メカニズムを解明する目的で、これらの細胞死と細胞間相互作用について検討し以下の成績を得た。(1)Ca^<2+>パラドックスによるアストロサイトのアポトーシスシグナルカスケードの解析:本研究では、アストロサイトのCa^<2+>パラドックス障害がアポトーシスを伴うこと、脳虚血傷害に対して有効性を示す種々の薬物が本系において保護作用を示すことを明らかにし、そのメカニズムについて薬理学的検討を行なった。脳機能改善薬T-588はextracellular signal-regulated kinase(ERK)を活性化することで保護作用を示した。またイデベノンはnerve growthfactorの産生を引き起こし、ERK及びphosphoinositde-3-kinase(PI-3-K)を活性化することで保護作用を発現した。

すなわち、ERKおよびPI-3-K系がアストロサイトの生存シグナルとして重要であることが示された。(2)神経細胞死に対するアストロサイトの保護的役割:β-アミロイド蛋白(Aβ)により培養神経細胞がアポトーシスを引き起こすことを確認した。本細胞障はアストロサイト培養液(astrocyte-conditioned medium,ACM)により保護された。この保護作用はERKキナーゼ阻害薬により拮抗された。これらの成績は、アストロサイト由来因子がERKシグナル系を介して神経細胞のAβ毒性に対して保護的に作用することを示している。(3)シグナルカスケードの可視化:本プロジェクトについては、昨年同様に基礎的検討の段階である。神経細胞の生存・維持におけるグリア細胞の重要性から、神経細胞死の保護をグリア細胞の機能制御の面から考えることが可能である。本研究では、アストロサイト、ミクログリアの細胞死発現の細胞特異的分子メカニズムについて検討し以下の成績を得た。[1]培養ミクログリアにおいて血清除去によりアポトーシスが起こることを見出した。この細胞死のシグナルとしてp38MAPKが重要な役割を演じていること、そしてBAXの発現が関わっていることが明らかとなった。[2]培養アストロサイトでのCa^<2+>パラドックスあるいは過酸化水素暴露によるアポトーシスが脳循環・代謝改善薬であるイブジラストにより抑制されることを見出した。さらに、イブジラストのアストロサイトでの抗アポトーシス作用がcyclic GMPホスホジエステラーゼ阻害によるcyclic GMP量の増加とそれに引き続くG-キナーゼ活性化によることを示した。[3]培養アストロサイトでの過酸化水素暴露によるアポトーシスに対する一酸化窒素(NO)の作用を解析し、NOが低濃度では細胞保護作用また高濃度では細胞障害作用を示すことを示した。この細胞保護作用には、cyclic GMP/G-キナーゼが関与していた。[4]Cyc1ic GMPシグナルの保護作用のメカニズムについてラット脳より精製したミトコンドリアを用いて検討し、cyclic GMPがG-キナーゼ依存的にミトコンドリアのmembrane transition poreの開口を抑制することを明らかにした。
平安時代における『万葉集』訓読本文の研究－私家集を中心として

平安時代の私家集『赤人集』について、『万葉集』との関連を視点として、他の歌集及び歌論書などの和歌関係資料に所載の本文を調査し、その結果を校本としてまとめた。当該校本は電子データで作成し、平成26年度中をめどに、和歌文学研究者の在籍する機関への寄贈を予定している。また、研究成果に関連する研究論文を2本公表した他、専門の研究会で研究発表を1本行った。24年度は、23年度に続いて『赤人集』の校本作成および諸書に記載の訓読本文の調査を行った。冷泉家時雨亭叢書の該当部分、また国文学研究資料館の紙焼き写真を中心に校本の作成に当たった他、文庫の調査は、内容が不明であった今治市立河野美術館蔵の『柿本朝臣・山部宿禰歌集』の実地調査を行った。その成果を研究論文「近世期の人麻呂・赤人の一面ー河野美術館蔵『柿本朝臣・山部宿禰歌集』についてー」(『東京成徳短期大学紀要』第46号)として公表した。藤田は、『赤人集』の本文調査・本文校合を行い校本作成を継続した。作業に若干の遅れが生じているが、必要な実地調査が24年度で終了したので、25年度は校本作成に全力を傾注し、所期の目的を完成さたい。なお、藤田は所属変更に伴い研究分担者から外れるが、自らの研究に資するために引き続き計画の遂行に協力する。朝比奈は、『赤人集』伝本の本文と万葉集の訓、および諸書に記載されている赤人歌の訓読本文を一覧するデータ入力を継続中である。これについても、下記の新出伝本の調査に時間を割いたため、若干の遅れが生じている。また、重要な成果として新出の『赤人集』伝本を発見したことが特筆される。予備的な調査によれば、当該写本は江戸初期の筆写と見られ、流布本(正保板本)に先立つ本文を有していると思われる。本研究計画にとって、貴重な発見であるため、その内容を公表すべく、精査を開始した。藤田、朝比奈共同で、同様の性格を持つ静嘉堂文庫本、内閣文庫本、真田本、桃園文庫本との比較対照を行う準備をしている。今後、研究計画を遂行する上での留意点として、研究計画の内、遅れている部分に力を注ぎ、計画の順当な進行を図ることが挙げられる。23年度は、『赤人集』の校本作成を中心に活動した。冷泉家時雨亭叢書の該当部分、また国文学研究資料館の紙焼き写真を中心に校本の作成に当たった他、文庫の調査は、書誌情報が不明であった東奥義塾高校図書館(青森県弘前市)、及び国文学研究資料館に資料がない東海大学図書館蔵桃園文庫本(3本、神奈川県平塚市)を対象として行なった。24年度は、23年度の調査研究を踏まえて『赤人集』の校本作成および諸書に記載の訓読本文の調査を行った。また、文庫の調査は、内容が不明であった今治市立河野美術館蔵の『柿本朝臣・山部宿禰歌集』の実地調査を行った。その成果を研究論文「近世期の人麻呂・赤人の一面ー河野美術館蔵『柿本朝臣・山部宿禰歌集』についてー」(藤田洋治、朝比奈英夫『東京成徳短期大学紀要』第46号)として公表した。25年度は、『赤人集』本文の精査・校合及び、勅撰集、歌学書等に所載の訓読本文の調査を進め、校本の作成を続行した。24年度中に調査対象・範囲の見直しを行った結果、『赤人集』本文の校合の対象を主要な伝本に絞ること、訓読本文の調査を室町前期(およそ宗祇の頃)までの資料とすることによって調査対象・範囲が当初計画の3分の2程度に絞り込み研究計画の適正な進行が図られた。また、新出の『赤人集』伝本の調査結果を「歌仙歌集本『赤人集』の一伝本ー新出伝本の本文とその位置づけー」(朝比奈英夫、藤田洋治『京都光華女子大学研究紀要』第51号)として公表した。当該伝本の調査の過程で明らかになった知見をもとに、研究発表を行った(藤田洋治「赤人集歌仙歌集本系統の本文について」、平安文学の会、3月29日、大妻女子大学)。藤田は24年度まで研究分担者であったが、25年度は所属変更のため分担者から外れた。このため、研究代表者(朝比奈)の単独研究となり、藤田は研究協力者として引き続き本文校合等を担当し計画実行を補助した。冷泉家時雨亭叢書の該当部分、また国文学研究資料館の紙焼き写真を中心に校本の作成に当たった他、文庫の調査は、書誌情報が不明であった東奥義塾高校図書館(青森県弘前市)、及び国文学研究資料館に資料がない東海大学図書館蔵

桃園文庫本(3本、神奈川県平塚市)を対象として行なった。藤田は、『赤人集』の本文調査・本文校合のための校本を作成し、伝本ごとの収録和歌数および、収録和歌ごとの諸伝本の本文の校異を網羅するための調査用紙の作成を行った。この用紙が完成すれば、現在知り得る現存伝本すべての本文が一覧できることになる。全ての和歌をデータ化しつつある状態で、24年度には、完成の予定であるが、このために、国文学研究資料館に2回、また詳細な書誌情報を調査するために、長野・真田記念館の伝本と佐賀県肥前松平文庫の伝本の調査を行なう予定である。朝比奈は、『赤人集』の主要な伝本の本文と万葉集の伝本の種々の訓、また歌学書や勅撰集、私撰集、他の私家集にも所載された和歌の本文を一覧するため、フォーマット作成しデータを入力中である。藤田、朝比奈の調査結果を併せることにより、ほぼ予定する研究の内容が明らかになると思われる。今後、研究計画を遂行する上での留意点として、他家集の本文に新資料が出現していること、歌学書の本文異同の調査に意外な時間が取られることが挙げられる。調査の進行を踏まえて当初計画で設定した調査対象と範囲について再検討した結果、多数の伝本が属する歌仙家集系統、西本願寺本系統で調査の必要度が低い伝本が含まれること、諸書に記載の訓読本文の調査対象を江戸初期までとしていることが、計画の進行を遅らせている要因であるとの判断に至った。また、新出写本の調査に予定外の時間を割くことになったため、校本や本文データの作成に遅れが生じることになった。調査対象のうち、東海大学桃園文庫蔵本など写真撮影が許されない資料は、筆記による作業を行っているため、調査に予定よりも多くの時間をかけることになった。また、他家集の本文に新資料が出現しているため調査範囲の見直しが必要になること、対象としている歌学書の本文異同について調査に意外な時間が取られていることなどが挙げられる。24年度に続いて、『赤人集』本文の精査・校合及び、勅撰集、歌学書等に所載の訓読本文の調査を進める。24年度中に調査対象・範囲の見直しを行った結果、『赤人集』本文の校合の対象を主要な伝本に絞ること、訓読本文の調査を室町前期(およそ宗祇の頃)までの資料とすることを決めた。これによって調査対象・範囲が当初計画の3分の2程度に絞り込まれるので、研究計画の適正な進行が図られ、かつ的確で有効な成果を期待することができる。また、新出の『赤人集』の調査結果を公表する。調査の過程で明らかになった知見は、朝比奈、藤田がそれぞれ研究論文という形にまとめ公表する。なお、研究分担者(藤田)の所属変更により、研究代表者(朝比奈)の単独研究になるが、藤田は自らの研究の一環として引き続き本文校合を担当し計画実行を補助する。平成23年度に続いて、『赤人集』本文の精査・校合及び、勅撰集、歌学書等の所載歌も調査を並行して進める。研究の進行状況によって、調査対象の見直し等を適宜、行い、研究計画の適正な進行を図る。調査結果を『赤人集』の校本としてまとめるべく、その体裁と内容を検討し、完成を視野に入れて作業を進める。必要とされる実地調査を終えたため旅費は6回の研究会分とし、成果の公表についても電子書籍とすることで経費を圧縮する。これによって、使途を校本作成と本文データ入力に集中する。その謝金として、400,000円を計上する。使途として、本文データ入力に複数の協力者を短期雇用し、その謝金として、1件あたり1.5時間×260件×830円として概算330,000円、校本作成補助に1件あたり0.3時間×260件×830円として概算70,000円を予定する。物品費等として100,000円を計上し、『赤人集』を含む私家集研究に必備の資料を購入する。
間質性肺炎を伴うヘルマンスキー・パドラック症候群の遺伝子異常の解析

Hermansky-Pudlak症候群(H-P症候群)での高率な間質性肺炎(IP)発症に着目し、H-P症候群の原因遺伝子(HPS遺伝子)をポジショナルクローニングによってクローニングし、HPS-1遺伝子の全遺伝子配列を明らかとした。その後、世界各地のH-P症候群患者の遺伝子を多数解析し、10個所の遺伝子変異部位を同定した。この成績から、各国における遺伝子異常の分布のパターンを明らかにしつつある。本邦症例ではexon 5、13に変異が存在することを明らかとした。しかし、約半数のH-P症候群患者ではHPS-1遺伝子には異常がなく、他の遺伝子座に異常が存在する可能性が示唆された。また、多数の呼吸器疾患症例及び正常者についてSSCP-PCRを用いた変異遺伝子の解析を行った結果、特発性間質性肺炎患者の過半数がexon 15における遺伝子多型(Pro491Arg変異)を有することが明らかとなった。これは正常者や他の呼吸器疾患患者と全く異なる所見であり、exon15における遺伝子多型が肺線維化と関連する可能性が高いことを示す成績と考えられた。HPS-1蛋白の機能に関しては既知の遺伝子と相同性が極めて低く、十分に明らかとすることは出来なかったが、細胞内小器官における蛋白輸送に関連する可能性が推測される。抗HPS-1蛋白抗体を作成し、melanocyteやマクロファージ細胞株でHPS-1蛋白局在部位を検討したところ、trans Golgi network(TGN)での局在が認められた。本蛋白がadaptor protein-3(AP-3)のサブユニットの一部と関連する可能性を示唆する成績も得られている。今後は更に、モデルマウスであるpale ear、pearlマウスなどを用いて肺線維化機転における役割を明らかにしていきたい。Hermansky-Pudlak症候群(以下HPS)はoculocutaneus albinism、血小板機能異常による出血傾向、骨髄及びその他の臓器におけるセロイド様物質の沈着を3主徴とし、常染色体劣性遺伝を示す家族性疾患である。HPSはプエルトリコ、スイスでの多発に加え、本邦における報告も確認されている。本邦及びプエルトリコの症例では、高率に間質性肺炎を発症して死亡するが、スイス症例では間質性肺炎を発症せず天寿を全うするという特徴に着目した。すなわち、HPS遺伝子の解析から、間質性肺炎発症遺伝子あるいはそれに関連した遺伝子異常を同定することが目的とした。全国の大学病院・市中病院の協力で10例の剖検症例より肺組織の一部を集積し、末梢血より採取しえたゲノムDNAと共に解析に供した。polymorphic microsatellite PCRマーカー(D10S677、D10S110、D10S184など)を用いてHPS症例のDNAをテンプレートとしてPCRを行ったところ、共同研究者である米国ウィスコンシン大学のSpritz教授らによって報告されているプエルトリコ、スイス症例に認められる染色体10q23.1-q23.3と同一部位における遺伝子異常の存在が確認された。さらにpositional cloning法により、本邦症例、プエルトリコ、スイス症例の一部よりHPS関連遺伝子を同定し、その遺伝子異常の存在も確認した。しかし、その異常は各国症例ごとに異なっていた。本邦症例で認められたpoint mutation(Ala 441でのframe shift)はプエルトリコ症例、スイス症例では認められなかった。本邦症例の全例での遺伝子同定もまだその過程にある。本遺伝子の機能的意義付けとともに、遺伝子異常が間質肺炎発症にどのような役割を演じているかについては、次年度以降の検討課題である。Hermansky-Pudlak症候群(以下HPS)の原因遺伝子のcDNA同定を昨年度中に行った。

さらに共同研究者である米国ウィスコンシン大学のSpritz教授らによって全遺伝子の同定・解析が完了したことを受けて、今年度は現在までに我々が集積した10例の日本人HPS症例の遺伝子異常に関して継続して検討を行った。しかし、既に報告されたHPS遺伝子の異常部位には明らかな異常を検出できていない。これは我が国のHPS症例が、現在HPS2遺伝子と仮称されている第二のHPS関連遺伝子の異常に起因している可能性を示唆する。さらに、今後も新たな遺伝子異常部位に関する検討を続ける予定である。今年度は、HPS遺伝子異常あるいは遺伝子多型と間質性肺炎発症との関連に関する検討を行った。当科入院症例より既に抽出・保存してある約200例のゲノムDNAを用いて、exon11からexon15に関してPCR-SSCP法による遺伝子多型の存在の有無を検討した。exon15にはアジア人種は白人に比して高率に遺伝子多型が存在する(アジア人種:約20%、白人:数%)ことが明らかとなってきた。さらに、健常者や肺癌、肺気腫、その他の炎症性肺疾患やサルコイドーシス・過敏性肺臓炎などの間質性肺疾患症例では全て、exon15における遺伝子多型の頻度はほぼ同率の20%程度であったのに対して、間質性肺炎症例では過半数(約60%)の症例でこの遺伝子多型が存在し、有意に高値(p<0.002)であることが現在までの検討で明らかとなった。こうした所見の存在が間質性肺炎発症にどの様に影響を与えるかは現在の所明らかとはなっていない。しかし、HPS蛋白に対するモノクローナル抗体もほぼ準備が整いつつあり、次年度はHPS蛋白の機能解析と共に、HPS遺伝子多型の存在が間質性肺炎発症に及ぶす影響に関しても検討する予定である。昨年度までの本研究に基づくヒトHPS遺伝子の遺伝子クローニングの成績に基ずいて、本年度は下記の検討を行った。即ち、世界各地のHrmansky-Pudlak症候群患者の遺伝子を多数解析することにより、少なくとも10個所における遺伝子変異部位を同定した。この成績から、各国における遺伝子異常の分布のパターンを明らかにしつつある。本邦症例ではexon5、13に変異の存在があることを明らかとした。更に、約半数のHrmansky-Pudlak症候群患者においては我々がクローニングしたHPS-1遺伝子には異常が認められず、他の遺伝子座に異常が存在する可能性が示唆された。また、多数の呼吸器疾患症例及び正常者についてSSCP-PCR法とその後に独立クローンを分離して変異遺伝子の解析を行った。その結果、特発性間質性肺炎患者の過半数がexon15における遺伝子多型(Pro491Arg変異)を有することが明らかとなった。これは正常者やその他の呼吸器疾患患者と全く異なる所見であり、exon15における遺伝子多型が肺線維化と関連する可能性が高いことを示す成績と考えられた。HPS-1蛋白の機能に関しては、未だ十分に明らかとすることは出来なかったが、細胞内小器官における蛋白輸送に関連する可能性が推測されている。
超臨界二酸化炭素中でのバイオプロセスの新展開:環境調和型デラセミ化反応の開発

デラセミ化反応は、ラセミ体の化合物を光学活性体へ変換する反応である。光学活性化合物は医薬品中間体として必要で、それらを環境に負荷をかけずに合成する方法は非常に重要であり、原子収率が100%であるデラセミ化反応の開発は急務である。そこで、本研究では、アルコール脱水素酵素によりデラセミ化反応を行う方法の開発を行った。溶媒としては、酵素反応では通常、水が用いられることが多い。しかし、水中での反応では、生成物の抽出が困難であったり、有機溶媒を使用したりすることが必要であるので、本研究では、超臨界二酸化炭素を溶媒として利用した。超臨界二酸化炭素は、抽出溶媒としては実用プロセスに用いられており、生体触媒反応のための溶媒としても、注目されている。本年度は、超臨界二酸化炭素中でのデラセミ化反応により、光学活性体の大量合成を行うために、超臨界二酸化炭素流通式装置の構築、酵素の大量発現、固定化、実用化に向けた検討を行った。その結果、超臨界二酸化炭素流通式装置を用いる生体触媒による物質変換に適した生体触媒の固定化法を見いだすことが出来た。また、超臨界二酸化炭素中での反応の実用化には、時間および体積あたりの収率が非常に重要である。そのためには、高活性な生体触媒が必要である。酵素を大量発現するためには、生化学的性質の解明する必要であるが、本研究で使用している酵素は、その単離精製が非常に困難である。そこで、本研究では、酵素を単離精製せずに、酵素の遺伝子を抽出し、酵素を大腸菌で大量発現させることを試みた。以上の研究を行い、これらの結果により、超臨界二酸化炭素中でのデラセミ化反応の研究が進み、持続的社会の構築に貢献できた。環境に負荷がかからない光学活性体の効率的合成法の開発は、持続的社会を構築するために、重要な課題である。そのため、本研究では、ラセミ体のアルコールから光学活性なアルコールを合成するために、効率的で環境にやさしい方法の開発を目的としている。私達は、これまでに、超臨界CO_2中でのアルコール脱水素酵素によるケトンの不斉還元反応や、リパーゼによる立体選択的アセチル化反応に成功している。しかし、これらの反応にも欠点がある。不斉還元反応においては、ケトンを出発原料とし、その合成がアルコールよりも困難な場合もある。また、リパーゼの反応においては、不斉収率100%で生成物を得るには、化学収率は50%が最高となる。そこで、本研究では、ラセミ体アルコールを化学収率100%で光学活性アルコールに変換するために、生体触媒によるデラセミ化を検討した。生体触媒としては、チチカビ(Geotrichum candidum IFO 5767)を用いる検討を行った。最初に、脂肪族アルコールや1-phenylethanol誘導体等の二級アルコールのデラセミ化反応を水中において検討した。休止菌体および乾燥菌体を用いたところ、休止菌体の方が得られたアルコールの不斉収率は高かった。また、超臨界CO_2中における反応の検討も行った。このことにより、有機溶媒を使わずに、有用物質である光学活性体を効率的に合成でき、グリーンケミストリーを発展させることができた。
魚肉貯蔵・加工中の4-ヒドロキシアルケナール生成抑制,特に畜肉のそれとの関連

脂質酸化由来有毒4-ヒドロキシアルケナール(魚肉では4-ヒドロキシヘキセナール: HHE、畜肉では4-ヒドロキシノネナール: HNE)の生成機構の違いについて検討した。脂質酸化を促進または抑制する化合物の添加および種々の調理法によるHHEおよびHNE生成量の変動を経時的に調べた。魚肉および畜肉中の多価不飽和脂肪酸やミネラル量の違いや筋肉タンパク質に対するHHEおよびHNEの反応性の違いが生成機構の差異の原因と考えられた。1. α-トコフェロール,βカローンおよびアスコルビン酸の添加試験を行った。α-トコフェロール添加はブタ肉中の4-ヒドロキシノネナール(HNE)およびタイ肉中の4-レドロキシヘキセナール(HHE)の生成を抑制した。ブリ肉においては明確な結果は得られなかった。α-トコフェロール添加はマロンアルデヒド(MA)生成を促進した。βカロテン添加は魚肉のMAおよびHHEの生成を促進したが,ブタ肉のHNEについては0.1%添加区ではその生成が抑制されたが0.2および0.5%添加区ではその生成が促進された。MAについては全ての添加区でその生成は促進した。アスコルビン酸添加により,ブリ肉中のMAの生成は抑制される傾向を示した。タイ肉中のMAの生成はアスコルビン酸添加による明確な傾向は見られなかった。アスコルビン酸添加はブタ肉中のMA生成を促進した。ブリ肉中のHHE生成は抑制したが,タイ肉中のHHE生成には影響を及ぼさなかった。他方ブタ肉中のHNE生成は抑制された。2. HHE, HNEおよびMA生成に及ぼすFeイオンの影響を調べるために,キレート剤のEDTAとNaCl添加及びヘモグロビン(Hb)添加試験をおこなった。EDTA添加は畜肉におけるHNEおよびMAの生成を抑制したが,魚肉においてはHHEおよびMAの生成に影響を及ぼさなかった。ヘモグロビン添加はブタ肉中のHNEおよびMA生成に殆ど影響を及ぼさなかったが,魚肉中のHHEおよびMA生成を促進した3.加熱処理がHHEとHNEに及ぼす影響について,180°でフライ実験をおこなった。フライにすることにより豚肉ではHNEの生成が促進した。魚肉については明確な答えが出ないので現在再検討を行っている。1.フライ、蒸しおよび焼きの調理方法が魚肉・畜肉の4-ヒドロキシアルケナール(魚肉では4-ヒドロキシヘキセナール:HHE,畜肉では4-ヒドロキシノネナール;HNE)およびマロンアルデヒド(MA)生成に及ぼす影響について検討した。魚肉に関しては宮崎県内での養殖事情によりタイおよびブリまたはカンパチを使用した。フライ:ブタにおいてHNE・MA含量は有意に増加した。タイとカンパチにおいてHHE・MA含量は有意に増加した。焼き:ブタでHNE含量は有意に増加したが,MA含量には有意な差は見られなかった。タイでHHE・MA含量は有意に増加した。カンパチでMA含量は有意に増加したがHHEには有意な差は認められなかった。蒸し:ブタでHNE含量は有意に増加したがMA含量には有意な差は認められなかった。カンパチでHHE・MDA含量は有意に増加した。脂肪酸含量の変化については各実験共に明確な差は認められなかった。2.Feイオンの影響を調べる目的で,ヘミンとFe添加およびFeをキレートすると考えられるカテキンの添加実験を行った。ヘミンおよびFe添加により,ブタでHNE・MA含量が有意な増加傾向を示し,ブリおよびタイでHHE・MA含量が有意な増加傾向を示した。カンパチおよびタイ肉中のHHE・MA含量は、エピカテキンガレート添加によりその増加が抑制された。ブタ肉ではエピカテキンガレート添加によるHNE・MAの生成抑制は明確ではなかった。3.以上の実験結果,特に調理実験結果から,魚肉と畜肉の4-ヒドロキシアルケナール生成の差に筋肉中の脂肪酸含量の差が関与している可能性が示唆された。1、アスコルビン酸添加が魚肉・畜肉の4-ヒドロキシアルケナール(魚肉では4-ヒドロキシヘキセナール:HHE,畜肉では4-ヒドロキシノネナール;HNE)およびマロンアルデヒド(MA)生成に及ぼす影響について検討した。アスコルビン酸添加はカンパチ肉中のHHE含量を減少させたが,タイ肉およびブタ肉ではHHEまたはHNE含量への影響は無かった。また、各食肉でアスコルビン酸添加はMA含量を増加させた。したがって、アスコルビン酸は脂質過酸化を促進させる面を持つことも考えられる。このことから、魚肉・畜肉をアスコルビン酸を豊富に含む食品と一緒に保存する際などには注意する必要があると思われる。2、カンパチ、タイおよびブタ肉の脂質過酸化におよぼすFeイオンおよびヘミン添加の影響について検討した。魚肉のHHE量はヘモグロビン、ヘミン、Fe添加区では増加の傾向がみられた。

ブタ肉のHNE量は時間の経過による目立った変化はみられなかった。魚肉においては特に7日目にMA含量が増加する傾向が見られた。ブタ肉においては脂質自体が魚肉より少なかったにもかかわらず、3日目以降MA含量の大きな増加が見られた。ヘミン添加によりカンパチ肉のHHE含量はcontrolの7日目に有意に増加している他は、すべての区間で有意差は見られなかった。ブタ肉においてはHNEはすべての区間で有意差は見られなかった。3、電子レンジ加熱により魚肉および畜肉中のHHEおよびHNE含量の変動は認められなかった。4、魚肉および畜肉中の多価不飽和脂肪酸量およびFe含量の違いや筋肉タンパク質に対するHHEおよびHNEの反応性の違い等が関与している事を示唆している。魚肉においてはHHEの生成を抑制するために、促進の要因の除去および抗酸化物の添加が効果的であることを示している。
生体の光合成による光エネルギー変換とその利用

1.光化学系【I】および【II】の反応中心と酸素発生に関与しているポリペプチド構成を明らかにし、それらのアミノ酸配列についての研究が進んだ。また電荷分離に関与する色素や電子伝達成分との組み合わせ、立体的な配置などについての理解が深まった。また、光化学反応中心【II】および細菌の光化学反応中心の環元側で第一、第二の電子受容体として機能しているキノンの状態と反応についての研究が進んだ。2.光合成膜のエネルギー化機構とATP生産について反応の微環境や反応に関与する分子の相互関係などを解析することによって、エネルギー変換と電場の形成と消失、【H^+】の輸送などと局部的な反応環境の変化との関係や、それらによる反応の制御を明らかにした。さらに、【C_4】植物の光合成による有機物合成における律速条件を解析し、高いエネルギー効率での物質合成の最適化のための検討をおこなった。3.光合成電子伝達系に依存する水素発生系の開発と光合成を利用した光電池の開発のための基礎研究として、光合成細菌の反応中心複合体とヒドロゲナーゼの構造解析がおこなわれ、人工的光水素発生系の構築の検討がされた。また、より高い効率での光エネルギー変換系の開発のための分子生物学的アプローチの可能性が示された。4.バクテリオロドプシンによって構成されている高度好塩菌の紫膜における光駆動性プロトン・ポンプの機構をアミノ酸残基の化学修飾によって解析した。5.光エネルギー変換系としてのラン藻機能の利用の試みとして、光エネルギー変換系と共役したグルタチオンの生産や水素発生などが示された。また、クロマトフォアマイクロカプセル界面におけるATPの光による生産系の開発が進められた。