hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
湖沼深水層に特有の微生物ループの解明

支笏湖、十和田湖において、微生物の系統群集組成について調べた。また、昨年度に調査を行った田沢湖と池田湖について、細菌の系統群集解析を進めた。さらに、琵琶湖においてどの原生生物グループが細菌摂食者として重要なのか、現場蛍光ハイブリダイゼーション法(FISH)を用いて明らかにした。田沢湖については、515F-806Rプライマーを用いた16 Sアンプリコンシーケンスにより、細菌群集組成を決定した。優占系統は、表水層ではCyanobacteria、ProteobacteriaとBacteroidetesであり、この状態が水温躍層まで継続した。深水層に入ると、Bacteroidetesに代わってActinobacteriaが優占的となった。また、水深400mでは他の湖では検出されない古細菌Thaumarchaeota門の「SAGMCG-1」系統が優占していた。池田湖の細菌系統組成については、ショットガンメタゲノム法を用いた。現在、アセンブルが終わり、それぞれの水深から10 kbp以上のコンティグが約2500本得られた。支笏湖、十和田湖については、すでにシーケンス・リードは終了しており、アセンブルなどの解析をさらに進める。琵琶湖の原生生物による細菌摂食速度を測定した結果、表水層では6月に高い細菌摂食速度が得られ、摂食で死滅する細菌の回転率も6月が最も高かった(約15%)。これに対し、深水層における細菌摂食速度は9月から10月にかけて高く、その後いったん低下した後、再び2月から5月にかけて高くなった。深水層の細菌回転率もこれと同様の季節変動を示し、最大の回転率は10月の13%であった。琵琶湖において、どの原生生物グループが重要な細菌摂食者であるか、CARD-FISH法により検討した結果、ケルコゾア、カタブレファリス、ペディネリッズ、キネトプラスチドの鞭毛虫であると示唆された。平成29年度は、琵琶湖(滋賀県)、田沢湖(秋田県)、池田湖(鹿児島県)において、細菌の現存量及び群集組成について調べた。琵琶湖において、16S rRNA遺伝子アンプリコンシーケンスにより、表水層と深水層の細菌群集の比較を行った。その結果、両層を通じてBacteroidetesとActinobacteriaが優占した。深水層では、これに加えてChloroflexiやPlanctomycetes門の細菌も優占した。次世代シーケンサーを用いた原生生物群集解析の結果、ほぼ年間を通じて、深水層では渦鞭毛植物門(Dinophyta)が優占的であった。CARD-FISH法による特定原生生物グループの現存量の季節動態を検討した結果、細菌摂食者であるキネトプラスチド鞭毛虫は、水温成層期間中、深水層において現存量が高くなった。田沢湖の湖心部において水深5、50、100、200、400mからそれぞれ試水を採取した。田沢湖の細菌細胞密度は、1ミリリットル湖水当たり5万から18万細胞と、他の湖沼に比べてかなり低かった。また、ピコシアノバクテリアが多く観察された。515F-806Rプライマーを用いた16Sアンプリコンシーケンスにより細菌群集組成を決定した結果、水深200mまではシアノバクテリアが第一優占系統であった。一方、従属栄養細菌の細菌群集組成は、これまでに知られている他の大水深淡水湖の系統とは大きく異なった。また、水深400mでは他の湖では検出されない古細菌Thaumarchaeota門のSAGMCG-1系統が優占していた。池田湖においては、湖心部において水深5、50、100、150、200mからそれぞれ試水を採取した。池田湖の細菌数は1ミリリットル湖水当たり44万から146万細胞であった。池田湖の細菌群集組成については、現在解析中である。琵琶湖については、我々の研究グループがすでに効率的な調査体制を有していることから、継続的にデータが取れている。一方、田沢湖については、本研究のために急ごしらえの調査体制を組んだが、仙北市、田沢湖クニマス未来館および現地企業である藤原重機興業株式会社のご協力を得ることができ、今後についても問題無く調査できる体制を構築できたことは大変良いことであった。池田湖については、以前から鹿児島大学農学部の研究者にご協力をいただける体制はあったが、平成29年度は我々独自で調査を行った。その結果、我々だけでも問題無く調査ができる体制を構築できたので、今後の効率良い調査研究体制の確立に成功した。細菌および原生生物の現存量測定については、我々の研究室で平素利用しているDAPI法が、琵琶湖以外の湖沼でも有効であることが確認できた。また、これら微生物の群集組成解析については、琵琶湖については順調に進捗している。田沢湖については、細菌群集組成の解析は順調に進捗しており、原生生物の群集組成解析の結果が待たれる。池田湖については、昨年11月末に調査とサンプル採集を終えたばかりであるにもかかわらず、ショットガンメタゲノム法を用いる分析が進んでいる。現在、いくつかの水深から、1kbp以上のコンティグが数万本、10 kbp以上のコンティグが数千本得られている。平成30年度は、琵琶湖において、鞭毛虫による細菌に対する摂食圧を定量的に測定するが、平成29年度はすでに予備実験を実行した。

また、特定原生生物グループを特異的に検出するCARD-FISHプローブもすでに開発済みであり、かつこれらの実用性についてすでに試行を行った。その結果、少なくとも琵琶湖については、我々が開発したCARD-FISHプローブは有効であることが確認された。平成30年度は、これらのCARD-FISHプローブを、他の湖沼でも適用する。支笏湖、十和田湖において、微生物の系統群集組成について調べた。また、昨年度に調査を行った田沢湖と池田湖について、細菌の系統群集解析を進めた。さらに、琵琶湖においてどの原生生物グループが細菌摂食者として重要なのか、現場蛍光ハイブリダイゼーション法(FISH)を用いて明らかにした。田沢湖については、515F-806Rプライマーを用いた16 Sアンプリコンシーケンスにより、細菌群集組成を決定した。優占系統は、表水層ではCyanobacteria、ProteobacteriaとBacteroidetesであり、この状態が水温躍層まで継続した。深水層に入ると、Bacteroidetesに代わってActinobacteriaが優占的となった。また、水深400mでは他の湖では検出されない古細菌Thaumarchaeota門の「SAGMCG-1」系統が優占していた。池田湖の細菌系統組成については、ショットガンメタゲノム法を用いた。現在、アセンブルが終わり、それぞれの水深から10 kbp以上のコンティグが約2500本得られた。支笏湖、十和田湖については、すでにシーケンス・リードは終了しており、アセンブルなどの解析をさらに進める。琵琶湖の原生生物による細菌摂食速度を測定した結果、表水層では6月に高い細菌摂食速度が得られ、摂食で死滅する細菌の回転率も6月が最も高かった(約15%)。これに対し、深水層における細菌摂食速度は9月から10月にかけて高く、その後いったん低下した後、再び2月から5月にかけて高くなった。深水層の細菌回転率もこれと同様の季節変動を示し、最大の回転率は10月の13%であった。琵琶湖において、どの原生生物グループが重要な細菌摂食者であるか、CARD-FISH法により検討した結果、ケルコゾア、カタブレファリス、ペディネリッズ、キネトプラスチドの鞭毛虫であると示唆された。平成29年度は、上記の湖沼以外に、北海道の支笏湖と倶多楽湖の調査も計画していた。しかし、悪天候のために船が出航できなかった。平成30年度は、これら2湖沼の調査を行うとともに、中禅寺湖(栃木県)、西湖(山梨県)の調査も行いたいと考えている。さらに、平成29年度に調査を実施した湖沼についても、分析が上手く行かなかったサンプルの再採集やデータの再現性確認など、可能な限り調査を行いたい。平成29年度に調査を実施した湖沼については、まだ鞭毛虫とピコシアノバクテリアの解析が終わっていないため、平成30年度はこれら微生物の分析・解析を急ぐ。池田湖の細菌群集組成については、ショットガンメタゲノム法を用いた。先述の通り、試水を採集したそれぞれの水深から、1kbp以上および10 kbp以上のコンティグがそれぞれ十分な本数得られたので、ゲノムのbinningや遺伝子のアノテーション等の分析を今後実施する。また、鞭毛虫による細菌に対する摂食圧を定量的に測定する。
ヒト生体情報データに対する3相3元次元縮約解析法

3相3元データは対象の集合,変量の集合,条件の集合の3つ組の関係を表現したデータである.このような3相3元データから2種類の次元縮約解析法の開発を行った.一つ目の研究では,被験者のクラスが与えられた際に,脳の領域,時点,被験者という3つ組の関係からクラス間で脳領域間の関連が異なるネットワークを検知するための新たな次元縮約クラスタリング法の開発を行った.二つ目の研究では,変量間のネットワーク構造が与えられ,3相3元データから,対象間の関係が非対称な非類似性データ,同一対象に対する多変量データを生成した際に非対称な関係性を容易に解釈することが可能である新たな非対称多次元尺度構成法の開発についても行った.以下それぞれの手法ごとに成果を示す.一つ目の解析手法では,クラス間の相関行列の差に対して,低ランクの相関行列の差とそのクラスタリング構造を同時に推定する新たな多変量解析手法を導入し,Majorizing関数を導出して効率的なアルゴリズムを開発した.本アルゴリズムは数値シミュレーションにより,クラスタリング結果の性能を確認し,実際のfMRIデータに対しても適用し,その有用性を確認した.二つ目の解析手法では,非対称非類似性データ,同一対象に対する多変量データ,変量間のネットワーク構造から対象間の非対称な関係性を視覚化し,ネットワークの係数を推定する手法の開発を行った.応募時に立てた研究計画と少し異なる形で研究を進めており,当初予定していた解析手法の開発が遅れているため.当初予定していた3相3元データに対するTucker3 modelとは異なるモデルに基づく次元縮約クラスタリング法の開発を行う.具体的には主成分型,因子型に基づく条件部分に関する負荷行列,変量に関する負荷行列に関する方法の目的関数は既に開発済であるが,当該数理的性質の検討や数値シミュレーション,実際のfMRIデータに関する検討を進める必要がある.また,同時にTuckerモデルに基づく次元縮約クラスタリング法との関係や比較等も進め,国際会議で発表することを予定している.さらに,平成30年度に開発した手法である「クラス間で脳領域間の関連が異なるネットワークを検知するための新たな次元縮約クラスタリング法」について国際会議で発表し,論文投稿を行うことを予定している.特に実際のfMRIデータに適用した結果を検討することで応用上活用することができるか等について検討し,発表することを予定している.3相3元データは対象の集合,変量の集合,条件の集合の3つ組の関係を表現したデータとなる.例えば,脳科学等の分野では,被験者を対象とし,脳領域を変量,時系列や実験の条件等を状況として3相3元データが観測される.このような3相3元データが与えられた際に解析上重要なことは変量や条件固有の要因を把握することにある.本研究では,3相3元データに対する既存の次元縮約クラスタリング法であるTucker3クラスタリング法等により,各クラスターの特徴を容易に解釈することは可能であるが,これらの手法は3相3元データに非常に強い仮定を置いていることから,誤った解釈を誘発してしまう可能性がある.そこで,当該仮定を緩めた次元縮約クラスタリング法を開発することが目的となる.本年度は当初の予定を変更し,平成30年度に開発予定であった因子分析に基づく次元縮約クラスタリング法の開発に着手した.具体的には3段階のアプローチによって手法を検討・開発した.いずれのアプローチも脳科学データを想定しており,3相3元データおよび対象のクラス情報が与えられた際に当該データに対してクラスタリング法と次元縮約法の同時分析法を適用する方法となる.1つめは,各条件に対応する多変量データの内積に対して,共通の分類構造と条件ごとに異なる低次元空間をそれぞれ同時に推定する方法を開発した.2つめは,1つめの方法を改良し,条件ごとの差を低次元空間上で容易に解釈することが可能な次元縮約クラスタリング法の開発を行った.3つめは,2つめの方法を精度の向上を目指し,条件間のデータの差ではなく,条件間のデータの差の内積に対してモデル化を行った.これらの方法はいずれも,既存の解析法を組み合わせるアプローチよりも分類結果において良いということを数値例によって検証して確認している.当初は主成分型の次元縮約クラスタリング法を提案する予定であったが,本年度は当初次年度に達成しようと計画していた次元縮約クラスタリング法の開発を進めた.新たに開発した解析方法の性能評価について,様々な要因のもとでの数値シミュレーションにより,検証を行った.また,実際のfMRIデータに対しても開発した解析手法を適用し,評価を行った.当該研究の達成度は次年度達成する目的と今年度達成する目的の時期が入れ替わったのみであることから,当該区分を選択した.3相3元データは対象の集合,変量の集合,条件の集合の3つ組の関係を表現したデータである.このような3相3元データから2種類の次元縮約解析法の開発を行った.一つ目の研究では,被験者のクラスが与えられた際に,脳の領域,時点,被験者という3つ組の関係からクラス間で脳領域間の関連が異なるネットワークを検知するための新たな次元縮約クラスタリング法の開発を行った.二つ目の研究では,変量間のネットワーク構造が与えられ,3相3元データから,対象間の関係が非対称な非類似性データ,同一対象に対する多変量データを生成した際に非対称な関係性を容易に解釈することが可能である新たな非対称多次元尺度構成法の開発についても行った.以下それぞれの手法ごとに成果を示す.

一つ目の解析手法では,クラス間の相関行列の差に対して,低ランクの相関行列の差とそのクラスタリング構造を同時に推定する新たな多変量解析手法を導入し,Majorizing関数を導出して効率的なアルゴリズムを開発した.本アルゴリズムは数値シミュレーションにより,クラスタリング結果の性能を確認し,実際のfMRIデータに対しても適用し,その有用性を確認した.二つ目の解析手法では,非対称非類似性データ,同一対象に対する多変量データ,変量間のネットワーク構造から対象間の非対称な関係性を視覚化し,ネットワークの係数を推定する手法の開発を行った.応募時に立てた研究計画と少し異なる形で研究を進めており,当初予定していた解析手法の開発が遅れているため.本年度進めた研究課題についてまとめるため,開発手法の性能評価の残りを進める.具体的には,数値シミュレーションでは低次元数を小さく設定することでクラスタリング結果が良好であることを確認したが,実際のデータでも同様の傾向であるか等について検証する必要がある.また,解の不定性があることから当該問題についても回転等を用いて評価を実施する.次に当初,最初の年度で開発予定であった3相3元データに対する主成分型の次元縮約クラスタリング法の開発を進め,効率的なアルゴリズムの開発も同時に行う.また,本年度開発した解析手法との比較を数値シミュレーションや実データを用いて検討を行う.当初予定していた3相3元データに対するTucker3 modelとは異なるモデルに基づく次元縮約クラスタリング法の開発を行う.具体的には主成分型,因子型に基づく条件部分に関する負荷行列,変量に関する負荷行列に関する方法の目的関数は既に開発済であるが,当該数理的性質の検討や数値シミュレーション,実際のfMRIデータに関する検討を進める必要がある.また,同時にTuckerモデルに基づく次元縮約クラスタリング法との関係や比較等も進め,国際会議で発表することを予定している.さらに,平成30年度に開発した手法である「クラス間で脳領域間の関連が異なるネットワークを検知するための新たな次元縮約クラスタリング法」について国際会議で発表し,論文投稿を行うことを予定している.特に実際のfMRIデータに適用した結果を検討することで応用上活用することができるか等について検討し,発表することを予定している.統計科学関連図書を購入する予定であったが,本学業務のため当該図書を購入することが間に合わなかった.よって当該助成金が次年度へ持ち越しとなった.使用用途は変わらない為,翌年度分として請求した助成金は統計科学関連図書を購入するために使用する予定である.平成30年度に予定していた計画通りに,モデルの開発等が進まなかったため,当初予定していた国際会議の取りやめ等により生じた.当該研究についての進捗結果については,令和元年度に国際会議で発表し,大規模数値シミュレーションを実施するための計算機器を購入する予定である.
歯周病原性菌と口腔レンサ球菌とのバイオフイルム形成に関与する遺伝子群の包括的探索

本研究では,口腔常在菌Streptococcus gordoniiのランダムノックアウトライブラリを用い,分子生物学的手法に基づく混合バイオフイルムのスクリーニング方法を新規開発することにより,S. gordoniiのどの様な分子が歯周病原性菌Porphyromonas gingivalisとの混合バイオフイルム形成過程に関与するのかを明らかにした.まず,ニトロセルロース膜を用いた混合バイオフイルムの大量スクリーニング法を用いて約1000株のS. gordoniiランダムノックアウト株のスクリーニングを終了した.スクリーニング終了時点で,単一菌種バイオフイルム形成能は有するがP. gingivalisとの混合バイオフイルム形成能が欠如しているS. gordonii19株が選出された.これらの株において,ノックアウトされている遺伝子をArbitary-Primed PCR法を用いて同定し,混合バイオフイルム形成に関与する10遺伝子を明らかにしたところ,これらの遺伝子群はその推定機能により以下のような4つのグループに大別された.i)菌体内および菌体間シグナル伝達(cbeおよびspxB),ii)細胞壁生合成と菌体表層凝集素タンパク質の構造維持(murE, msrAおよびatf),iii)莢膜生合成(pgsAおよびatf),iv)生理機能(gdhA, ccmAおよびntpB).さらに,同定された遺伝子について,各々に特異的ノックアウト株およびコンプリメント株を作成し,P. gingivalisとの混合バイオフイルム形成能を野生株と比較したところ,全ての特異的ノックアウト株において形成能の低下が認められ,またそれらのコンプリメント株では形成能の回復が確認された.本研究では,口腔常在菌Streptococcus gordoniiのランダムノックアウトライブラリを用い,分子生物学的手法に基づく混合バイオフイルムのスクリーニング方法を新規開発することにより,S. gordoniiのどの様な分子が歯周病原性菌Porphyromonas gingivalisとの混合バイオフイルム形成過程に関与するのかを明らかにした.まず,ニトロセルロース膜を用いた混合バイオフイルムの大量スクリーニング法を用いて約1000株のS. gordoniiランダムノックアウト株のスクリーニングを終了した.スクリーニング終了時点で,単一菌種バイオフイルム形成能は有するがP. gingivalisとの混合バイオフイルム形成能が欠如しているS. gordonii19株が選出された.これらの株において,ノックアウトされている遺伝子をArbitary-Primed PCR法を用いて同定し,混合バイオフイルム形成に関与する10遺伝子を明らかにしたところ,これらの遺伝子群はその推定機能により以下のような4つのグループに大別された.i)菌体内および菌体間シグナル伝達(cbeおよびspxB),ii)細胞壁生合成と菌体表層凝集素タンパク質の構造維持(murE, msrAおよびatf),iii)莢膜生合成(pgsAおよびatf),iv)生理機能(gdhA, ccmAおよびntpB).さらに,同定された遺伝子について,各々に特異的ノックアウト株およびコンプリメント株を作成し,P. gingivalisとの混合バイオフイルム形成能を野生株と比較したところ,全ての特異的ノックアウト株において形成能の低下が認められ,またそれらのコンプリメント株では形成能の回復が確認された.本研究では、口腔常在菌Streptococcus gordoniiのランダムックアウトライブラリを用い、分子生物学的手法に基づく混合バイオフイルムのスクリーニング方法を新規開発することにより、S.gordoniiのどの様な分子が歯周病原性菌Porphyromonas gingivalisとの混合バイオフイルム形成過程に関与するのかを明らかにすることを目的としている。今年度の研究により、我々はニトロセルロース膜を用いた混合バイオフイルムの大量スクリーニング方法を新規開発し、その再現性を確認した。また同法を用い、約1000株のS.gordoniiランダムノックアウト株のスクリーニングを終了した。スクリーニング終了時点で、単一菌種バイオフイルム形成能は有するがP.gingivalisとの混合バイオフイルム形成能が欠如しているS.gordonii 19株が選出された。これらの株において、ノックアウトされている遺伝子をArbitary-Primed PCR法を用いて同定し、混合バイオフイルム形成に関与する10遺伝子を明らかにした。これらの遺伝子群は、その推定機能により以下のような4つのグループに大別された。i)菌体内および菌体間シグナル伝達(cbeおよびspxB),ii)細胞壁生合成と菌体表層凝集素タンパク質の構造維持(murE,msrAおよびatf),iii)莢膜生合成(pgsAおよびatf),iv)生理機能(gdhA,ccmAおよびntpB)。さらに、同定された遺伝子について、各々に特異的ノックアウト株およびコンプリメント株を作成し、P.gingivalisとの混合バイオフイルム形成能を野生株と比較したところ、全ての特異的ノックアウト株において形成能の低下が認められ、またそれらのコンプリメント株では形成能の回復が確認された。昨年度の研究では、口腔常在菌Streptococcus gordoniiのランダムノックアウトライブラリを用い、S.gordoniiのどの様な分子が歯周病原性菌Porphyromonas gingivalisとの混合バイオフイルム形成過程に関与するのかを明らかにした。同定されたこれらの遺伝子群は、その推定機能により以下のような4つのグループに大別された。i)菌体内および菌体間シグナル伝達(cbeおよびspxB),ii)

細胞壁生合成と菌体表層凝集素タンパク質の構造維持(murE,msrAおよびatf),iii)莢膜生合成(pgsAおよびatf),iv)生理機能(gdhA,ccmAおよびntpB)。さらに、これらの10遺伝子について、各々に特異的ノックアウト株およびコンプリメント株を作成し、P.gingivalisとの混合バイオフイルム形成能を野生株と比較したところ、全ての特異的ノックアウト株において形成能の低下が認められ、またそれらのコンプリメント株では形成能の回復が確認された。今年度の研究においては、これらの遺伝子のうち、細菌のシグナル伝達に関与していると推測されるcbeおよびspxBに着目し、S.gordoniiのcbe特異的ノックアウト株およびspxB特異的ノックアウト株において、デンタルプラーク形成過程の中間に介在し重要な役割を果たす紡錘菌Fusobacterium nucleatum存在下においてもP.gingivalisとの混合バイオフイルム形成能が低下しているかどうかを調べた。その結果、S.gordonii野生株に比較して、cbe特異的ノックアウト株のP.gingivalisとの混合バイオフイルム形成能はF.nucleatum存在下においても有意に低いことが示された。
学術連携による原子・分子・光物理学研究の新展開

研究計画に基づく以下の項目14を実施した。新分野の創成を目標として新たに項目5も実施した。1.「AMO」研究の動向調査と将来像の検討:本科研費採択に先駆けて実施された新分野創成に関わる検討が結実して、日本学術会議より声明「新分野の創成に資する光科学研究の強化とその方策について」が8月31日に公表された。また、その一環として「光科学研究の最前線」が刊行された。ただし、本科研費による支出はない。2.「AMO」研究の情報提供拠点:次のホームページを開設した。(項目3参照)また、項目1の「光科学研究の最前線」から、「AMO」、特に光科学を中心とした分野における研究者の情報が得られる。3.最先端「AMO」研究を紹介する公開講演会:第2回AMO討論会を理化学中央研究所に於いて6月17,18日の両日実施。4.「AMO」シンポジウム:春の物理学会(松山)に於いてシンポジウム「超精密計測が拓く原子・分子・光(AMO)科学の最先端」を実施予定。「AMOの研究の原状と展望を解説する。5.特定領域科研費申請:将来展望を目的とした研究会「極限の光計測・制御と物質の物理へ向けて」(8月2日電通大)、「超精密光計測が拓く新しいAMO科学」(10月29日電通大)、「原子の光励起・電離理論の現状と展望」(11月19日東大)などを実施した結果、特定領域研究「超精密光計測の拓く新しい原子・分子・光(AMO)科学」を申請した。
肝再生,肝発癌におけるB型肝炎ウイルスの役割;その分子機構の研究

昭和62年度にひきつづき、無症候性B型肝炎ウイルス(HBV)キャリアに発症した肝癌例の肝癌細胞と非癌肝細胞における染色体へ組込まれたHBVゲノム並びにこの標的細胞DNAについて比較解析した。肝癌細胞ではHBVゲノムは2つの不完全分子が逆向きに接合した型で組込まれており、この標的細胞DNAは、DNAデータバンクを用いたコンピュータ解析により、ヒトゲノム高頻度反復配列のひとつ、アルファサテライトDNAのうちいわゆるアルファダイマーであることが判明した。外来性遺伝子が細胞のアルファサテライトDNAに組込まれた場合、細胞染色体の再変性が効率にひき起こされることはよく知られた事実であり、本DNAクローンにおいてDHBV近傍のアルファサテライトDNAは増幅・再変成を示していた。一方、非癌肝細胞においてはHBVゲノムは肝癌細胞におけるそれと同様、2つの不完全分子が逆向きに接合していたが、標的細胞DNAは非反復配列でありこの再変成は認められなかった。さらに、肝癌澤,非癌肝細胞の核母細胞を対象にノザン法にて組込まれたHBVゲノムの形質発現につい検索したところ、肝癌細胞においてはHBV特異mRNAは検出されず、非癌肝細胞ではいわゆるs-mRNAを検出した。HBVゲノム各ORF[_<s]>の構造やメチル化のパターンは、両者間で相違が認められないことから肝癌細胞におけるHBV形質発現抑制は近傍アルファサテライトDNAの位置効果・ヘテロクロマチン化によるものと判断した。以上より、HBV組込みに伴う細胞DNAの再変成が肝癌細胞成立に重要なステップであり、HBVの産生蛋白は鴨癌細胞成立・維持には不必須であることが推察された。また、HBV組込みの標的細胞DNAの性状解析がHBVの肝発癌機構解明に必要であることが示唆された。20才台の無症候性B型肝炎ウイルス(HBV)キャリアに発症した肝癌例の肝癌細胞・非癌肝細胞より,それぞれ組込まれたHBV DNAを含む染色体断片をクローニングし,制限酵素マッピング,さらに塩基配列決定により,組込まれたHBV DNAの構造を解析した.その結果,肝癌細胞のクローンではHBV DNAは2つの分子が互いに逆向きに接合しており, 1つの分子はC領域からX領域にかけて,他の分子はS領域からX領域にわたる構造を有していた.後者では内部に変異はなかったが,前者においてはC領域内に255塩基対の欠失が生じていた.宿主染色体との接合部は両者共同一, X領域内であり,さらに隣接する染色体DNAも少なくとも150塩基にわたり両側方向,互いに逆向きに同一であった.一方,非癌肝細胞のクローンにおいては, 2つのHBV DNA分子が同じ向きに接合しており, 1つの分子はC領域からX領域にかけて,もう1つの分子はC領域の一部であった.両者共,内部には変異は認められなかった.肝癌細胞クローンの構造は, HBV DNAが組込み後隣接する宿主染色体を巻き込んで増幅・組替えを起こすことを示唆する知見である.また,非癌肝細胞クローンの変異構造は,現在まで同様の報告はなく,向後,肝細胞においても, HBV DNAの組込みにより染色体の変異が起こっているか否かについて検討する予定である.尚,両クローンのHBV DNAに隣接する宿主DNAの塩基配列と,既知の遺伝子塩基配列の相同性は,現在DNAデータバンクを用いたコンピューター解析にて検索中である.また,肝癌細胞に特徴的なHBV transcriptsについても解析し,組込まれたHBV DNAの転写・発現についても検索中である.昭和62年度にひきつづき、無症候性B型肝炎ウイルス(HBV)キャリアに発症した肝癌例の肝癌細胞と非癌肝細胞における染色体へ組込まれたHBVゲノム並びにこの標的細胞DNAについて比較解析した。
TCRとそのリガンド、及び、それらの分子間相互作用の物理化学的解析

抗原提示細胞は、細胞外に存在するタンパク質を取り込み、酸性小胞に於いて分解し、その分解断片をMHC class II (MHC II)へ結合させる。MHC IIは、生合成後、Ii鎖と結合し、Ii鎖の一部(CLIP)をペプチド収容溝に収納する。酸性小胞内の低いpHはこのCLIPと抗原ペプチドの交換に必須であると考えられている。本研究では、酸性pHがどの様な熱力学的、構造的要因でペプチド交換に必要なのか明らかにするために、ペプチド/MHCII複合体のpHに依存した安定性を熱力学的に解析した。また、ペプチド自体の配列のペプチド/MHCII複合体の安定性への寄与について検討した。用いたタンパク質はMHC II I-E^k、MHC II I-A^b、及び、IgMである。これらのタンパク質の熱変性曲線を示唆走査型熱量測定計(DSC)、及び、円偏光二色性測定計(CD)を用いて測定した。DSC、CDともに、MHC IIにおいては、pH5の酸性環境下の方がpH7の中性環境下より安定であった。ところが、IgMは中性環境下においてより安定であった。予測は、MHCIIが酸性環境下で不安定であろうというものであった。ペプチド交換の起こるpHでは分子がより開いていると考えられたためである。またpHの低下による安定性の獲得はおもにエンタルピーが寄与することが判った。さらにペプチドの一残基置換が安定性に大きく影響を及ぼすことが判った。これらの結果より、(1)酸性pHにおける安定化はMHC IIに特有の性質であることが示唆される。本来の働きは、ペプチド獲得後のT細胞への提示であり、それ以前の分解を防ぐためと考えられる。(2)酸性pHでエンタルピックに安定化するということは、ペプチド収容溝以外の部分が相互作用を増すことを示唆する。(3)ペプチドはMHC IIを構成するタンパク質の一部としてフォールディングに寄与することが示唆される。TCRとそのリガンドの解析を行うに当たり、本年度はリガンドつまりMHC分子の物性の解析を行った。MHC class II分子は専門的抗原提示細胞のみが持つ分子で、抗原ペプチドをヘルパーT細胞に提示する。抗原提示細胞は、細胞外に存在するタンパク質を取り込み、酸性小胞に於いて分解し、その分解断片をMHCII分子へ結合させる。MHCII分子は、生合成時、インバリアント鎖と結合しており、インバリアント鎖の一部(CLIP)はMHCII分子のペプチド収容溝に埋もれている。酸性小胞内の低いpHはこあCLIPと抗原ペプチドの交換に必須であると考えられている。本研究では、酸性pHがどの様な構造的要因でペプチド交換に必要なのか明らかにするために、ペプチド/MHCII複合体のpHに依存した安定性を熱力学的に解析した。MHCII分子として、ヘモグロビンペプチド(64-76)とリンカーを介して共有結合したIE^Kを用い、測定機器として示差走査型熱量計を用いた。その結果、酸性pHではペプチドMHCHII複合体のTm値は中性よりも大きく、安定であることが分かった。その安定性は主にエンタルピーの寄与によるものであった。また抗原ペプチドのアミノ酸を1残基変えたアンタゴニストペプチドと安定性を比較したところアゴニストペプチド複合体のTm値の方が大きく、それはエントロピーの寄与によるという結果を得た。以上のごとくこれまでの研究で、ペブチドMHCII

複合体はペプチド交換をおこす酸性pHでより安定な構造をとり、またペプチド残基の変異は分子の柔軟性に影響を及ぼすことを示唆した。このような知見が、実験的に示されたことは初めてである。昨年度、mouse MHCclass II分子(MHC II)I-E^kの安定性の熱力学的測定を行い、それまでの予想を覆す結果を得た。今年度は、それを確認するため、I-E^k分子のアイソタイプであるI-A^b、及び、コントロールとしてIgMを用いて、示差走査型熱量計(DSC)による測定と、円偏光二色性(CD)による測定で安定性の解析を行った。MHC IIは専門的抗原提示細胞のみが持つ分子で、抗原ペプチドをヘルパーT細胞に提示する。抗原提示細胞細胞は、細胞外に存在するタンパク質を取り込み、酸性小胞に於いて分解し、その分解断片をMHC IIへ結合させる。MHC IIは、生合成後、インバリアント鎖(Ii鎖)と結合し、Ii鎖の一部(CLIP)をペプチド収容溝に収納する。酸性小胞内の低いpHはこのCLIPと抗原ペプチドの交換に必須であると考えられている。またコントロールとして用いたIgMは、細胞表面で受容体として働き、抗原を結合した後、その抗原ペプチドをMHC IIに提供するため、同様に酸性小胞に移行する分子である。本研究では、酸性pH及びCLIPが如何にペプチド交換に関わってくるのか明らかにしたいと考える。MHC II I-A^b-CLlPとI-A^b-E_αを作製し、DSCを行ったところ、I-E^k同様に、I-A^bにおいてもpH5の酸性環境下の方がpH7の中性環境下より安定であった。また、抗原ペプチドであるE_αと暫定的ペプチドであるCLIPの比較では、CLIPを結合したものの方が、Tmが低かった。さらに、CDで熱安定性をIgMと比較した。I-A^bにおいては、DSC測定と同様の結果が得られたが、IgM分子は、5量体及び単量体においてpH7の中性環境下の方が、pH5の酸性環境下の方より安定であった。これらの結果は、酸性環境下でのMHC IIの安定性は、このタンパク質の持つ特異的な特性であることを示唆した。
プレッシャーと運動パフォーマンスに関する心理・生理・行動連関の総合的研究

本研究は,面接研究,質問紙調査研究,実験研究を通して,プレッシャーが運動パフォーマンス遂行時の心理面,生理面,行動面に及ぼす影響を総合的に検討することを目的とした。不安と生理的覚醒水準の増加は,すべての研究において確認された。また,面接や質問紙調査で報告された力みや運動協応などの行動面の変化も,実験研究における筋放電量の増加傾向やキネマティクスの変化として確認された。プレッシャーが競技者の心理、生理、行動面に及ぼす影響を探索的に調べることを目的とした。過去にプレッシャーを体験したことのあるテニスプレイヤー7名を被調査者として、それぞれ約30分の半構造化面接を行った。被調査者はいずれもA級に属し、4名は国体等の全国大会経験者であった。基幹質問項目はプレッシャーがかかる状況、その時の心理的および生理的変化やプレイの変化などであった。ボイスレコーダーで録音した音声をテクストデータに変換した後、3名の研究者がKJ法(川喜田,1967)を用いて分析を行った。切片化したテクストデータを323のラベルに分類し、類似したラベルを集めて39の表札を作成した。それらの表札には、「対戦相手が格下の時にプレッシャーがかかる」「団体戦の方がプレッシャーがかかる」応援がすごくてプレッシャーを感じた」などのプレッシャーがかかる状況に関するもの、「相手が好調に見える」「コートの見え方が変わる」「配球を考えられなくなる」「マイナス思考になる」などの心理的変化に関するもの、「ドキドキする」「手足が震える」「腹痛が起こる」「脚がつる」などの生理的変化に関するもの、ダブルスでペアとのコミュニケーションが減る」「ウォーミングアップを入念にする」などの行動的変化に関するものがあった。また、テニスのプレイに関する行動的変化として、「ポーチに出られなくなる」「ネットに出なくなる」「足が動かなくなる」「姿勢が棒立ちになる」「安全なコースを狙う」「サーブは入れにいく」「サーブでネットが増える」「振れなくなる」「手打ちになる」「球が遅くなる」「回転がかかりすぎる」「スライスが増える」「ガシャる」などがあった。これらの変化から、プレッシャー状況においては、成功から失敗に対する注意バイアスが生じ、失敗を回避しようとする行動的変化が生じることが推察された。本年度の研究の目的は、前年度に行った質的研究によって帰納的に分析された要因をこれまでのプレッシャー研究で明らかとなっている要因に加え、量的研究である質問紙調査によって一般化可能なプレッシャー関連要因を明らかにすることであった。プレッシャーに関する心理、生理、行動的側面から見た原因、症状、対処法を含む105項目の質問およびパーソナリティに関する17項目の質問から成る質問紙を大学生競技者270名から回収し、そのうちプレッシャーによりパフォーマンスが低下した経験を持つと回答した者200名を対象として主因子法、プロマックス回転を用いた因子分析を行った。その結果、12因子が抽出され、累積寄与率は55.1%であった。それらの因子は、1.運動制御の失調、2.身体浮遊感・脱力感、3.公的自己意識の増加、4.集団雰囲気の悪化、5.心理的緊張、6.内向的性格、7.安全な方略の選択、8.身体発熱感、9.身体疲労感、10.意識的制御、11.試合前のコンディションの悪さ、12.試合前のコンディションの良さ、であった。第1因子の「運動制御の失調」は、動きのかたさ、動きの縮小、力みなどの要因を含み、プレッシャーの先行研究で不足していた動作解析の重要性が浮き彫りになった。また、第7因子の「安全な方略の選択」についても、従来のプレッシャー研究では調べられていない。また、第11因子と第12因子から、プレッシャーによるパフォーマンスの低下は、試合前のコンディションが悪い場合だけでなく良い場合においても発現することが明らかとなった。次年度以降においては、動作解析を含む実験研究により、プレッシャー下の心理、生理、行動的要因の関係性を明らかにする。本年度は、本研究期間の先行年度において実施したプレッシャー体験者の言語報告の分析に基づき、それらのプレッシャー体験の現象を実験において客観的データとして検証するための研究に取り掛かる年度であった。一昨年度は、半構造化面接によって得たプレッシャー体験者の言語報告を質的に分析した。そして昨年度はそこで明らかになった現象を質問項目に含めた質問紙を用いて、プレッシャー体験時の要因を因子分析によって明らかにした。本年度はそれらの分析で明らかになった現象を実験的に検証するために、実験課題や従属変数の選定を目的とした予備実験を複数行い、本実験のデータ収集に着手することを目的とした。なお、先行研究におけるプレッシャー実験の問題点として、実験参加者数の少なさによるプレッシャー強度の個人差やプレッシャー下におけるパフォーマンス変化の個人差などがあり、それらの問題を解決するために本年度と来年度の2年間を通して60名以上の実験参加者を測定し、事後的な群分けによる詳細な分析を行うことが計画されている。

予備実験の結果に基づき、的を狙った正確投を実験課題として選び、生理的指標として心拍数、心理的指標として日本語版UWIST気分チェックリスト、行動的指標として肩・肘・手首の関節間の補償的変動などのキネマティクス変数や上腕・前腕の筋放電量と四肢内共収縮率を用いることとした。現在までに次年度も含めた全体の約4分の1の実験参加者の測定を行い、次年度も計画通り実験を継続することによって事後的な群分けに基づいた心理・生理・行動的側面の関係性を分析する。本研究の目的は一過性の心理的ストレッサーであるプレッシャーが運動スキル遂行時の心理,生理,行動的側面にどのような影響を及ぼすのかについて包括的に調べることであり,本年度においては,それらの影響を実験的に調べることであった。実験室実験で負荷されるプレッシャーの強度が比較的弱いことから,実験で用いた変数の選択は,実際の競技場面で負荷されるプレッシャー強度の下で生起する変化について,競技者から主観的報告を求めて調べる初年度と2年目の研究に基づいて行った。初年度は半構造化面接による質的研究を行い,2年目はその結果を反映させた質問紙調査を行った。それらの研究結果に基づき,本年度の実験においては心理指標として状態不安,生理指標として脈拍数,行動指標としてパフォーマンスおよび運動学的変数を測定した。実験では38名の実験参加者に非利き手による的を狙った下手投げ課題を行わせ,プリテスト(10試行),習得(120試行),ポストテスト(10試行),プレッシャーテスト(10試行)を行わせた。ポストテストからプレッシャーテストにかけて脈拍数は約6拍毎分上昇し,状態不安得点は約14点上昇したが,パフォーマンスとして測定した的に対する投球の正確性得点は,有意な変化を示さなかった。ポストテストからプレッシャーテストにかけての変化量においては,脈拍と正確性得点(r=.17),脈拍と状態不安得点(r=.19)は弱い正の相関を示したが,状態不安得点と正確性得点は有意な相関を示さなかった。心理的指標の測定として用いる質問紙の選定に複数の予備実験での試用が必要であったことから若干の遅れが生じた。24年度が最終年度であるため、記入しない。事後的な群分けが可能な人数まで実験参加者を継続して増やす。ま左、実験データに見合った心理・生理・行動的変数の関係性の分析に用いる多変量解析の選定を行う。
DNA不安定性の立場から見た伝性神経疾患の分類に関する研究

DNA不安定性の示標として、培養線維芽細胞を用い、種々の線量のX線および紫外線を照射した後の細胞生存率をコロニー形成試験により検討した。対象は、毛細血管拡張性失調症,コツケイン症候群,色素性乾皮症,結節性硬化症および神経線維腫症の正常部および腫瘍部由来の細胞、ウイルソン病,メンケス病,真性小頭症,眼脳肝腎症候群,原因不明の小人症等である。対照として、各年令の正常児者および非遺伝性疾患の剖検例から得られた培養細胞を用いた。一部の細胞についてはさらにX線照射後のDNA単鎖切断の再結合能、照射後のDNA,RNAの複製,再合成の回復などを検討した。(成績)X線感受性において毛細管拡張性失調症がもっとも高感受性を示した。しかし、典型的臨床像を示しながらコロニー形成能が正常の境界の感受性を示す例が見出された。この例は亜型と考えられた。結節性硬化症および神経線維腫症の細胞は大多数が正常の感受性を示したが、腫瘍部由来細胞に高感受性を示すものがあった。腫瘍形成と関係する変異と考えられ、疾患の一つの性質と考えられる。なお、X線照射後のDNA単鎖切断の再結合が結節性硬化症において特に急速層で促進していた。紫外線感受性においては、色素性乾皮症がもっとも過敏で、ついで、コツケイン症候群であった。臨床的に典型的とみられながら正常の細胞生存率を示す例があったが、照射後のDNA,RNA合成の回復は著しく遅れていたのでこれも亜型と考えられた。結節性硬化症,その他の細胞では高感受性はみられなかった。原因の確定しがたい神経疾患に対して、DNA不安定性に関係する各種の検査を併行することは、診断精度の向上と亜型の分類に有用と結論された。
遺伝性腎炎におけるIV型コラーゲンα5鎖の異常と皮膚生検診断の可能性

X連鎖型Alport症候群(遺伝性腎炎)の病因はIV型コラーゲンのα5鎖[α5(IV)]の遺伝子異常であることが明らかになっているが、現在、本症に対する遺伝子診断の確率は高くない.したがって、抗体を用いた蛋白レベルでの診断が臨床上有用である.これまでの研究で我々は合成ペプチドをラットに免疫してα5(IV)に対する特異的単クローン抗体を作成し、正常では糸球体基底膜に分布しているα5(IV)がX連鎖型Alport症候群の男性患者の腎組織では欠如していることを明らかにした.加えて,本症の腎組織ではα3(IV),α4(IV)の蛋白レベルでの異常があり、さらに最近、α6(IV)蛋白の異常が存在することも知られている。一方、本症の家系の女性保因者ではα5(IV)は腎組織でモザイク状分布をしめす.この研究では、α5(IV)とα6(IV)に対する単クローン抗体を用いて正常皮膚組織10検体と本症男性患者(3家系3人)の腎と皮膚組織を免疫組織学的に検討した.その結果、正常ではα5(IV)とα6(IV)は皮膚の表皮基底膜に存在するが、患者ではα5(IV)とα6(IV)は全く陰性であった.患者の腎組織においてもこれらは陰性であった.また、本症家系内の女性保因者(2家系3人)では表皮基底膜でのモザイクパターンが認められた.このことから、X連鎖型Alport症候群では腎と皮膚に共通してα5(IV)とα6(IV)の蛋白レベルでの異常があることが明らかになった.X連鎖型Alport症候群の患者のみならず保因者の診断において、皮膚組織でのα5(IV)染色は腎生検診断と同様に有用であり、かつ、より簡昜であると考えられる。特に、尿所見が軽微なために腎生検が躊躇される女性患者(保因者)の検出に有用である.X連鎖型Alport症候群(遺伝性腎炎)の病因はIV型コラーゲンのα5鎖[α5(IV)]の遺伝子異常であることが明らかになっているが、現在、本症に対する遺伝子診断の確率は高くない.したがって、抗体を用いた蛋白レベルでの診断が臨床上有用である.これまでの研究で我々は合成ペプチドをラットに免疫してα5(IV)に対する特異的単クローン抗体を作成し、正常では糸球体基底膜に分布しているα5(IV)がX連鎖型Alport症候群の男性患者の腎組織では欠如していることを明らかにした.加えて,本症の腎組織ではα3(IV),α4(IV)の蛋白レベルでの異常があり、さらに最近、α6(IV)蛋白の異常が存在することも知られている。特に、尿所見が軽微なために腎生検が躊躇される女性患者(保因者)の検出に有用である.本研究では、遺伝性腎炎(AIPORT症候群)におけるIV型コラーゲンα5鎖、α5(IV)の蛋白レベルでの異常を明らかにする目的で5α(IV)に対する特異的単クローン抗体(H51)を作成し、X-連鎖型遺伝性腎炎患者から生検で得られた腎組織でのα5鎖の異常を証明した。〈成績〉(1)α5(IV)のNC1ドメイン・ペプチドを合成し、単クローン抗体(H51)を作成した。この抗体はペプチド・マッピングによりIV型コラーゲンα1α4鎖とは反応せず、α5(IV)に特異的であることが明らかになった。(2)正常ヒト組織でのα5(IV)の分布をH51を用いて蛍光抗体法で観察したところ、ヒト腎では糸球体基底膜、ボ-マン嚢、集合管に認められた。(3)X連鎖型遺伝性腎炎の男性患者10人の腎組織ではα5(IV)は認められなかった.(4)良性家族性血尿5人、微小変化群ネフローゼ10人の腎組織ではα5(IV)染色は正常パターンであった。〈結語〉以上の成績から、X連鎖型遺伝性腎炎の男性患者では腎基底膜中のα5(IV)の蛋白レベルでの異常があり、蛍光抗体法によるα5(IV)染色は本症の診断に有用であると考えられる。

X連鎖型Alport症候群(遺伝子腎炎)の病因はIV型コラーゲンのα5鎖[α5(IV)]の遺伝子異常であることが明らかになっているが、現在、本症に対する遺伝子診断の確率は高くない.したがって、抗体を用いた蛋白レベルでの診断が臨症上有用である.これまでの研究で我々は合成ペプチドをラットに免疫してα5(IV)に対する特異的単クローン抗体を作成し、正常では糸球体基底膜に分布しているα5(IV)がX連鎖型Alport症候群の男性患者の腎組織では欠如していることを明らかにした.加えて、本症の腎組織ではα3(IV),α4(IV)の蛋白レベルでの異常があり、さらに最近、α6(IV)蛋白の異常が存在することも知られている。一方、本症の家系の女性保因者ではα5(IV)は腎組織でモザイク状分布をしめす.この研究では、α5(IV)とα6(IV)に対する単クローン抗体を用いて正常皮膚組織10検体と本症男性患者(3家系3人)の腎と皮膚組織を免疫組織学的に検討した.その結果、正常ではα5(IV)とα6(IV)は皮膚の表皮基底膜に存在するが、患者ではα5(IV)とα6(IV)は全く陰性であった.患者の腎組織においてもこれらは陰性であった.また、本症家系内の女性保因者(2家系3人)では表皮基底膜でのモザイクパターンが認めらた.このことから,X連鎖型Alport症候群では腎と皮膚に共通してα5(IV)と6α(IV)の蛋白レベルでの異常があることが明らかになった.X連鎖型Alport症候群の患者のみならず保因者の診断において,皮膚組織でのα5(IV)染色は腎生検診断と同様に有用であり,かつ,より簡昜であると考えられる。特に、尿所見が軽微なために腎生検が躊躇される女性患者(保因者)の検出に有用である.
雄性配偶子の「なりたち」と「はたらき」の分子基盤

マウスを中心とした雄性配偶子の「なりたち」と「はたらき」に関して研究を行い,次のような研究成果が得られた。(1)多機能タンパク質ADAM1aは精巣精細胞の粗面小胞体と精子細胞膜に限定局在しており,子宮から輸卵管への精子移動に関与する分子群の機能制御を精子形成または成熟過程で行っていることが明確になった。また,ADAM1bが精子と卵子の結合や融合に関与していないことが明確となった。ADAM1b欠損と同時にADAM2も精子膜上で欠損するため・ADAM1b/ADAM2複合体ファーテリンが精子と卵子の融合で機能していないことを証明できた。以上の結果から,ファーテリンは,受精での直接的な配偶子間相互作用ではなく,ADAM3などの受精に必須の精子タンパク質を精細胞小胞体から精子表面へ移行させるような機能をもっていることが示唆された。(2)マウス精子膜上でGPIアンカーしている新規ピアルロニダーゼHya15を同定し,その構造と機能を明らかにした。ヒアルロニダーゼPH-20と比較すると,Hya15も細胞膜にGPIアンカーしていたが,ほぼ半分くらいが精子アクロソームに局在していた。また,PH20欠損マウスの精子抽出液を用いた卵丘細胞塊の分散を調べた結果,Hya15が精子の卵丘細胞塊通過で中心的な役割を果たしていることが示唆された。(3)TESP5欠損マウスの解析を行い,その欠損オスマウスは正常な産仔産生能を有していたが,体外受精試験では,その精子の透明帯結合,精子と卵子の融合,および受精はいずれも著しく低率であった。しかし,TESP5欠損オスマウスを交尾させ,子宮より回収した精子で体外受精を行わせると,ほぼ正常な受精能を回復した。したがって,精子の子宮通過が受精能獲得などで重要であることが示唆された。マウスを中心とした雄性配偶子の「なりたち」と「はたらき」に関して研究を行い,以下のような成果を得た。(1)精細胞の細胞質に局在するポリAポリメラーゼTPAPの機能に関する解析を行い,TPAPはCPSF160と,またCPSF160はCPEB2とそれぞれ相互作用していることが明らかになった。また,TPAPが制御するTAF10の特異的な核輸送システムを調べ,TAF10にKIF2AとPABP1が結合していることも見いだされた。特に,KIF2AのmRNAはTPAP欠損マウスでポリA鎖伸長が不完全であり,タンパク質量も激減していたことから,TPAPがKIF2Aの翻訳を制御することによってTAF10核移行に関与していることが示唆された。(2)精子の卵丘細胞層通過で機能するPH20欠損マウスの解析で示唆された新規ヒアルロン酸分解酵素を精子から精製し,その分子がPH20と約60%の相同性を有するHya15であることを明確にした。また,ADAM1aとADAM1bの局在と前駆体のプロセシング,および機能について調べ,ADAM1aは精細胞の粗面小胞体だけに存在しており,ADAM2やADAM3の分泌に関与している可能性が見いだされた。ADAM1aは精巣上体精子には存在しないため,子宮からの精子離脱に関与する分子群の機能制御を精子形成または成熟過程で行っている可能性が見いだされた。(3)卵子活性化と初期胚発生に関与する

精子由来のタンパク質の検索を行い,精子赤道部に存在するPLCζのmRNAを未受精卵に注入すると,約6時間後に雌性前核形成が認められた。また,PLCζmRNAを半数体球状精細胞とともに未受精卵へ注入することによって,産仔が正常に誕生することも確認した。マウスを中心とした雄性配偶子の「なりたち」と「はたらき」に関して研究を行い,次のような研究成果が得られた。(1)細胞質mRNAポリA鎖伸長に関与する精巣特異的ポリAポリメラーゼTPAPがTAF10とKIF2Cの核移行を制御していることが明らかになった。TPAP欠損マウスでの精子形態形成で機能する半数体特異的遺伝子の転写の減少は,KIF2CのポリA鎖伸長制御で生じるTAF10核移行不全が原因であると結論した。(2)精子膜タンパク質TESP5とADAM1bのノックアウトマウスの解析を行い,これらのふたつのタンパク質が受精に必須の分子でないことが判明した。特に,TESP5精子は体外受精系では受精能がないにもかかわらず,自然交配によって野生型と同等の産仔産生能を有していた。TESP5欠損オスマウスを交尾させ,子宮より精子を回収して体外受精を行わせるとほぼ正常な受精能を回復することから,精子の子宮通過が受精能獲得などで重要であると考えられた。また,ADAM1b欠損マウス精子は野生型精子と比べてほぼ50%の体外受精率であったが,そのほかでは同等の機能をもっていた。さらに,ADAM1b欠損によってADAM2も精子表面で欠損していたので,これらのタンパク質の細胞表層への移行には小胞体での複合体形成が必須であると考えられた。(3)卵子活性化に関与すると思われる精子PLCζの解析を行い,卵子活性化への応用ではアミノ末端から110残基を欠く変異タンパク質が有用であることを明らかにした。また,卵子活性化と初期胚発生に関与するほかの精子タンパク質(約30個)の機能解析を行ったが,それらの受精直後から雌雄前核の融合まででの明確な結果は得られなかった。(1)精子膜タンパク質ADAM1bのノックアウトマウスの解析を行い,ADAM1bが精子と卵子透明帯との結合や卵子との融合に関与していないことが明確となった。ADAM1b欠損と同時にADAM2も精子膜上で欠損するため,従来から考えられてきたADAM1b/ADAM2複合体ファーテリンが精子と卵子の融合に必須でないことを証明できた。ADAM1a欠損マウスの解析結果も含めて考察すれば,ファーテリンは,受精での直接的な配偶子間相互作用ではなく,ADAM3などの受精に必須の精子タンパク質を精細胞小胞体から精子表面へ移行させるような機能をもっていることが示唆された。(2)マウス精子膜上でGPIアンカーしている新規ヒアルロニダーゼ(Hyal5と命名)を同定し,その構造と機能に関して検討を加えた。従来のヒアルロニダーゼPH-20と比較すると,Hyal5も細胞膜にGPIアンカーしていたが,ほぼ半分くらいがアクロソームに局在していた。また,Hyal5遺伝子は精巣特異的に発現しており,マウス6番染色体上でPH20遺伝子から約60キロ塩基対離れて存在していた。さらに,PH20欠損マウスの精子抽出液を用いた卵丘細胞塊の分散を調べた結果,Hyal5が精子の卵丘細胞塊通過で中心的な役割を果たしていることが示唆された。(3)TESP5欠損マウスの解析を行い,その欠損オスマウスは正常な産仔