hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
頭頸部腫瘍における蛋白ワクチンによる腫瘍破壊の免疫モニタリング

疎水化多糖類プルランとMAGE-A4組換え蛋白の複合体をワクチンとするがんワクチン臨床試験の免疫モニタリング解析を実施した。頭頸部腫瘍を含む16例において6回以上のワクチン反復投与を完了した。MAGE-A4抗体価はELISAでIgG抗体反応解析を行った。ワクチン前の抗体陽性は3例にみられ、自然免疫反応がみられることが判明し、反応が増強するものが1例、陰性例4例では2例が陽性化した。また、MAGE-A4以外への抗原拡大現象が存在することが観察された。本研究は、がんワクチン・CHP-MAGE-A4臨床試験にてワクチン投与を受けた頭頸部腫瘍例での末梢血と腫瘍組織(組織浸潤リンパ球)のMAGE-A4抗原特異的T細胞免疫モニタリングを行い、末梢血、組織侵潤リンパ球でのMAGE-A4以外の発現抗原(NY-ESO-1,SAGE)の抗原発現を観察し、抗原拡大現象(Antigen-spreading)を解析して、抑制的免疫反応解析(FOX p 3、PD1など)と、末梢血、腫瘍組織での抗原特異的免疫応答動態評価を行い、新しいワクチン療法開発の基盤データとするものである。本年度の実績は、新規抗原デリバリーシステムである疎水化多糖類プルランと癌抗原MAGE-A4組換え蛋白の複合体をワクチンとするがんワクチン臨床試験「MAGE-A4抗原を発現する難治性悪性腫瘍に対するCHP-MAGE-A4がんワクチン臨床研究」を実施した。これまで、頭頸部腫瘍を含む6例に実施し、3例においてがんワクチンを完了し、ワクチンの安全性の評価が可能であった。これら研究被験者より免疫モニタリング検体を採取し、リンパ球、血清の保存を行った。MAGE-A4抗体価測定をELISAで評価については、測定の信頼性を確認するために、陽性、陰性コントロールを使用した測定を実施した。MAGE-A4蛋白、NY-ESO-1蛋白、SAGE蛋白に対するIgG抗体反応を測定し、「陽性化」とその「血清タイター」の準備を実施した。Tリンパ球免疫モニタリングについては、ワクチン前、中、後の患者末梢血からリンパ球を分離した。本研究は、がんワクチン・CHP-MAGE-A4臨床研究においてワクチン投与を受けた頭頸部腫瘍などの例の末梢血と腫瘍組織(組織浸潤リンパ球)のMAGE-A4抗原免疫モニタリングを行い、末梢血、組織侵潤リンパ球でのMAGE-A4以外の発現抗原(NY-ESO-1,SAGE)の抗原発現を観察して、抗原拡大現象(Antigen-spreading)を解析し、抑制的免疫反応解析(FOXp3、PD1など)と、末梢血、腫瘍組織での抗原特異的免疫応答動態評価を行い、新しいワクチン療法開発の基盤データとするものである。これまで、頭頸部腫瘍を含む12例に対してワクチン投与を行い、5例において6回以上の反復投与を完了し、ワクチンの安全性の評価が可能であった。MAGE-A4抗体価測定系でのELISA評価については、測定の信頼性を確認するために、陽性、陰性コントロールを使用した測定を実施し、カット・オフ値を設定した。これを用いたMAGE-A4蛋白に対するIgG抗体反応について7例で解析を行った。ワクチン前の抗体陽性は3例にみられ、自然免疫反応がみられることが判明した。その内、ワクチン投与に伴い反応が増強するものが1例、陰性例4例では2例が陽性化した。これらより、本ワクチンはMAGE-A4抗原特異的免疫反応が約半数に誘導されることが判明した。さらに、MAGE-A4以外にNY-ESO-1抗原に対する抗体値が上昇する例をみられ、腫瘍破壊に伴うと考えられる抗原拡大現象が存在することが観察された。本年度の実績は、新規抗原デリバリーシステムである疎水化多糖類プルランと癌抗原MAGE-A4組換え蛋白の複合体をワクチンとするがんワクチン臨床試験「MAGE-A4

抗原を発現する難治性悪性腫瘍に対するCHP-MAGE-A4がんワクチン臨床研究」の実施症例の免疫モニタリング解析を実施した。これまで、頭頸部腫瘍を含む25例に対してワクチン投与(症例毎に1回投与量を100μg群、300μgに振分け)を行い、16例において6回以上の反復投与を完了し、ワクチンの安全性の評価が可能であった。これら被験者より免疫モニタリング検体を採取し、リンパ球、血清の保存を行った。MAGE-A4抗体価測定系でのELISA評価については、測定の信頼性を確認するために、陽性、陰性コントロールを使用した測定を実施し、カット・オフ値を設定した。これを用いたMAGE-A4蛋白に対するIgG抗体反応について解析を行った。解析例中ワクチン前の抗体陽性は3例にみられ、自然免疫反応がみられることが判明した。その内、ワクチン投与に伴い反応が増強するものが1例、陰性例4例では2例が陽性化した。また、投与量は300μgが100μgに較べて抗体反応陽性例が多かった。これらより、本ワクチンはMAGE-A4抗原特異的免疫反応が約半数に誘導されることが判明した。さらに、MAGB-A4以外にNY-ESO-1抗原に対する抗体値が上昇する例がみられ、抗原拡大現象が存在することが観察された。
神経膠腫の浸潤能におけるLPA産生酵素ATXの役割の解明

Glioblastomaをはじめとする神経膠腫(グリオーマ)は難治性の腫瘍であり、日本脳腫瘍統計によれば、WHO分類(グレード1-4)のグレード2に相当するびまん性星細胞腫の5年生存率は66%、グレード4の膠芽腫では7%にすぎない。神経膠腫が難治性の理由として、腫瘍が正常脳に浸潤性であること、また放射線、化学療法に耐性であることがあげられる。本研究は、これらを克服するために役立つ科学的基礎知識を集積する事を目的として行なわれた。グリオーマ細胞の浸潤性を規定する因子は種々のものが提案されているが、我々は、in vitroで細胞の運動性を刺激する因子として同定されていたlysophosphatidic acid(LPA)を産生する酵素autotaxin(ATX)が神経膠腫の浸潤性への関与を本研究で検討した。マウスグリオーマ細胞203GにATXをtransfecし、in vitroでの浸潤性を検討したところ、腫瘍細胞の運動性、浸潤性が亢進した。一方、脳腫瘍摘出組織において、ATXのmRNA発現を検討したところ、神経膠腫において、悪性度が増加するにつれて、ATXの発現が高いこと、良性脳腫瘍においては、低発現であること、また転移性脳腫瘍(がん脳転移)組織では発現の高い例は少ないことが判明した。また、グレード2の神経膠腫において、ATXの発現の高い例で早期に再発し、本酵素と悪性度の相関が示唆された。Autotaxin (ATX)がどのようにグリオーマ細胞の浸潤に関与しているかをまずin vitroで再度検証した。マウスグリオーマ203Gを親株とし、これにATXをtransfectionし、いくつかのstable transfectantを得た。これらの親株とtransfectantはin vitroでの増殖曲線等には差がなかった。しかしmotilityに関しては、transfectantはwound assayで、あきらかに運動能の亢進をみとめた。これらについては、さらにin vivoでの性格の差異を確認する実験を行なう一方、203Gをsyngeneic mouse皮下にinoculationした。腫瘍はなかなか生着しなかったため、nude mouseの皮下へのinculationを試みた。一部のmouseで皮下腫瘍を形成したが、well demarcatedであり浸潤性ではなかった。ATXのexpressionとin vivoでの浸潤性とが相関しないかと思われたが、組織所見等より、hostの免疫反応の関与が考えられた。TransfectしたATXはratATXc-DNAであり発現されたrat ATXに対してmouseの免疫反応が誘導された可能性が示唆された。Mouse ATXのtransfectantを作成し、それによるin vitro, in vivoの実験を次年度行なう予定である。一方臨床サンプルを用いて抗ATX抗体による免疫組織染色を試みているが、ホルマリン固定での染色条件が条件が一定せず、いまだ基礎実験の段階である。マウスグリオーマ細胞203GにATXをtransfectし、in vitroでの浸潤性を検討したところ、腫瘍細胞の運動性、浸潤性が亢進した。

一方、脳腫瘍摘出組織において、ATXのmRNA発現を検討したところ、神経膠腫において、悪性度が増加するにつれて、ATXの発現が高いこと、良性脳腫瘍においては、低発現であること、また転移性脳腫瘍(がん脳転移)組織では発現の高い例は少ないことが判明した。また、グレード2の神経膠腫において、ATXの発現の高い例で早期に再発し、本酵素と悪性度の相関が示唆された。
動きセンサ内蔵積木の試作と子供の遊び方分析への応用

無線加速度センサを埋め込んだ積み木遊び計測システムを構築した.このセンサを用いることで,個々の積木を識別した上で積み木遊びに重要な動きを精度良く取得できる.子供の積み木遊びの中で識別すべき動作を選定するため,保護者から事前に承諾を得た上で5人の幼児に予備実験を行い,8種類11パターンの動作を識別対象動作として選定した.さらに,情報デバイスであるスマートウォッチを多機能センサとして活用することで,より多くの遊びの内容を記述することができる新しい積木システムを提案した.また,ここまでの経験を活かして,積木の組立をメタファにしたVRを用いたインタラクティブコンテンツも試作した.子供の積み木遊びを計測するために,無線加速度センサを埋め込んだ積木遊び計測システムを構築した.このセンサを用いることで,個々の積木を識別した上で積み木遊びに重要な動きを精度良く取得でき,カメラ等での計測に比べて個体識別や遮蔽の問題が無いこと,さらに構造が簡単であるため頑丈な積み木とすることができる.色付きアクリル樹脂を用いて大小2種類の直方体積木をそれぞれ6個,計12個作製した.各積木に搭載のセンサは,夫々3軸の加速度や角速度を100 Hzで計測し,BluetoothによってホストPCにデータ送信する.これらは積木遊びにおける微細な動きも十分計測できる.子供の積木遊びの中で識別すべき動作は,保護者から事前に承諾を得た5人の幼児に対する予備実験を通して,8種類11パターンの動作を選定した.次に,選定した特徴量の積木遊び動作識別性能を評価するために実験を実施した.本研究では幼児などを対象とした遊戯療法場面を想定しているが,ここでは,大人による積木の動作データを取得し識別精度を検証した.実験では,2026歳の10人に対して,積木を用いて識別対象動作をそれぞれ繰り返し入力するように求めた.そのデータを元にして,グリッドサーチによりSVM (Support Vector Machine)パラメータを算出した上で,ランダム抽出10回交差検定を実施した.ウィンドウ幅0.64秒ごとの区間に分割し,特徴量を算出した.これらの特徴量を加速度データの三軸成分と大きさ成分について算出した40次元の特徴量ベクトルを用いて,SVMによる動作識別を行った.その結果,参加者別と参加者間のデータに対する平均識別率はそれぞれ86.1%と92.1%であった.学習データのサイズが異なるために単純比較はできないが,他人の動作を含む学習データであっても安定して高い平均識別率が得られた.積木遊びの最中の積木の動きを定量的に自動分析することができる実用的なシステムの構築を目指して,動きセンサ内臓積木を試作し,加速度データを利用した機械学習による遊びの動作識別について検討した.動作識別結果はまずまずであったが,再検討を要する事項もある.これらの結果をまとめ,研究会で発表することができ,多くの方々と議論できたことはよかった.昨年度試作した動きセンサが実装された積木を,実際の臨床心理の現場に持ち込み,遊戯療法の中で,評価実験を行った.また,子供の積木に対する遊び方をより詳細に測定し,遊びに見られるさらに詳しい動作認識につなげるため,スマートウォッチを利用した高機能積木を試作した.こスマートウォッチのモーションセンサ情報を用いることで遊び手の動作が認識できる他,そのマルチタッチスクリーンを積み木各面に拡張することで,積み木への指や他の積み木の接触と接続を認識することができる.そのプロトタイプを実装し,積み木への指の接触と積み木積み重ねの認識性能について検証するとともに,センサ情報から積み木遊びの内容を認識する手順について検討した.さらに,認識・推測結果を適切なグラフィックスとアニメーションを用いてわかりやすくPC画面に可視化する方法についても検討した.加えて,これらの経験を活かして,積木の組み立てをメタファにしたバーチャルリアリティを用いたインタアクティブコンテンツも試作した.ヘッドマウントディスプレイを用いたバーチャルリアリティ環境におけるデジタルコンテンツ探索操作インタフェースを提案し,このインタフェースの操作に「楽しさ」を取り入れるため,「身体性を伴うインタラクション」と「遊び心のあるインタラクション」の2つをインタラクションモデルとして設定し,ブロック遊びに基づいた操作方法やコンテンツ表現を取り入れた.無線加速度センサを埋め込んだ積み木遊び計測システムを構築した.このセンサを用いることで,個々の積木を識別した上で積み木遊びに重要な動きを精度良く取得できる.子供の積み木遊びの中で識別すべき動作を選定するため,保護者から事前に承諾を得た上で5人の幼児に予備実験を行い,8種類11パターンの動作を識別対象動作として選定した.さらに,情報デバイスであるスマートウォッチを多機能センサとして活用することで,より多くの遊びの内容を記述することができる新しい積木システムを提案した.また,ここまでの経験を活かして,積木の組立をメタファにしたVRを用いたインタラクティブコンテンツも試作した.実験・検討結果と研究会での議論を踏まえ,動きセンサを用いてさらに幅広い積木遊び中の動作を認識できる新しいシステムを設計し試作する.ヒューマンコンピュータインタラクション実験補助者の都合で一部減額が生じた.成果発表のための旅費の一部として使用予定である.
放射線治療における全身照射の高精度治療計画システムの構築

白血病の治療法の一つに,白血球抗原適合ドナーからの造血幹細胞移植がある。造血幹細胞移植の前処置として患者に対し,全身に放射線を照射する方法(全身照射)が広く普及している。全身照射を実施する代表的な方法の一つに,患者を乗せた寝台が移動しながら放射線を照射する「移動寝台法」がある。現在の高精度化する放射線治療のなかにあって,移動寝台法は,致死量に近い量の放射線を全身に照射する最も危険な治療にも関わらず,人体内の臓器ごとの正確な線量の評価を行えていないのが実情である。本研究は,原子力分野で広く用いられてきたシミュレーションコードを応用することで,人体の各臓器に対する線量の評価を含め,全身照射における高精度治療計画システムを構築することを目的とした。シミュレーションコードには,あらゆる物質中での放射線の挙動を高精度に模擬できる汎用性の高いPHITS(Particle and Heavy Ion Transport code System)を用いた。本研究は,移動寝台法の特殊な治療体系の確立,実測値と計算値の比較による整合性の確認,人体の各臓器に対する線量評価の3段階により進めた。第1段階として,移動寝台法の特殊な治療体系の確立に成功した。第2段階として,実測値と計算値の比較によって,確立した治療体系が実測値を良好に再現していることを確認した。第3段階として,人体の各臓器に対する線量解析を試みた。体厚の違いにより,臓器線量は大きく異なり,全身に均等な放射線量が照射されていないことが明らかとなった。人体内の詳細な放射線量を明らかにすることは,予後の長い患者の各臓器の障害発生リスクの推定が可能となるため,本研究の社会的意義は大きい。
Ti合金における変形誘起相変態に起因した弾性率軟化現象の解明と生体材料への応用

骨折用プレート等の生体インプラント(埋入用)材料の応用において、チタン合金等の生体インプラント用材料の低ヤング率化が求められている。最近、低ヤング率化を実現したβ型チタン合金において、その弾性率が塑性変形およびそれに伴うオメガ変態(変形誘起オメガ変態)によって低下する可能性が明らかとなった。そこで、本研究では変形誘起オメガ変態に関連した弾性率軟化のメカニズムを明らかにし、新規な変形誘起オメガ変態理論を構築することで、塑性変形およびそれに伴うオメガ変態を考慮したチタン合金の低弾性率化のための新たな材料設計指針を構築する。
嗅覚系神経回路形成に関与する新規の軸索ガイダンス分子の探索

本研究においては、神経回路形成、特に軸索ガイダンスに関与する因子の単離同定を目的としてマウス嗅上皮組織断片を材料とするDifferential Display法を行った。そして本年度、部位特異的な発現パターンを示す遺伝子断片の単離および解析が行われ、さらにin situハイブリダイゼイション法を用いて単離遺伝子の発現パターン解析も試みられた。異なる発現パターンを示す遺伝子をDifferential Display法を用いて効率よく単離するためには、比較するmRNAの質が非常に重要となってくる。そこで本研究においては、嗅覚受容体の発現パターンにより分けられた嗅上皮の四つのゾーンのうち、ゾーン1とゾーン3、4の組織断片をmRNAの採取材料として選択した。ゾーン2を含まないように採取位置を設定することにより、確実に発現の差異を検出しうるmRNAの質を確保することに成功した。その結果、現時点で12種類の遺伝子断片を単離し、そのうち9種類が未知の配列を持つものであることが見いだされた。既知の遺伝子として、ケラチンの一種であるendoB、プロスタグランジンE2受容体サブタイプであるEP3、およびゾーン3、4に相当する部位においてはのみ発現していることがラットにおいて報告されているRYA3の3種類がいずれもゾーン3、4より見いだされた。特に、RYA3を単離できたことから、本研究においてDifferential Display法が確実に機能している傍証が得られた。現在、得られた未知遺伝子を発現している細胞種を同定するためにin situハイブリダイゼイション法を用いた発現パターン解析を試みている。今後、より多くの遺伝子断片を単離すべくDifferential Displayを行うとともに、嗅細胞において発現する遺伝子の全長配列の決定を行う。
数式処理の技法を用いた関数解析学的不等式の研究

本研究により,関数解析学的な即ち,非加換な不等式に関連する二つの結果が得られた。先ず最初に,一対の作用素の存在範囲をスカラーを中心とする作用素球で与えたときにその積の存在範囲を同じくスカラーを中心とする作用素球で与える事に成功した。これに関して,BASIC言語を用いた数値実験を行い,更に数式処理REDUCEやDERIVEを用いた数式処理のテクニックを用いて予想を立てた事が大いに役だった。この結果は,行列の積の数域を元の一対の行列の数域の積と関連づける事に発展し,報告にある様に,国際誌への投稿となった。また,特に複素平面で考えると,興味深い平面幾何の新たな問題を提起するのも,この結果の興味深い点であると思われる。羃に関する問題ですら,今まで話題になった事はなく,非常に大ざっぱな評価式が知られていたに過ぎない。数値解析学などの広い応用が考えられる。次に,非負定値作用素の対称関数平均の間に成り立つ筈の不等式に関わる非可換不等式として,電気工学で有名なデルタ・スター変換と呼ばれる等価回路定理が非可換な世界でも成り立つ事を研究期間も終わり頃になって発見し,証明を与える事が出来た。これは,非可換の世界では成り立たないと予測していたものであったが,数式処理REDUCEやDERIVE,MATHEMATICAなどの数式処理ソフトウェアを用いた予想を立てた事が大きく役だった。この結果は,自動的にその双対問題を提起する事になるが,これに関しては今後の課題としたい。岩手大学工学部の阿部の計算機利用に関する助言に拠るところも大である。
脳外傷者の自動車運転能力に関する脳科学的評価法の確立

1機能的近赤外分光法による自動車運転中の脳神経基盤の解明;機能的近赤外分光法を用いて、健常成人を対象に、ドライビングシミュレーターによる運転中の脳血流動態を計測し、自動車運転に関与する脳神経活動部位として、特に左右前頭葉、右頭頂葉、左頭頂葉が重要であると結論した。2脳損傷者の自動車運転再開への臨床的指導手順の確立;脳外傷者を始めとする脳損傷者の自動車運転再開に向けた支援の手順を構築し妥当性を検討した。すなわち、神経学的診察の後、脳MRI所見および神経心理学的検査、ドライビングシミュレーターでの運転能力を確認し、以上の条件が満たされた場合に、教習所にて実車運転能力の評価を行う。東京慈恵会医科大学研究倫理委員会および東京慈恵会医科大学附属第三病院に本研究の内容を説明し、臨床研究許可の承認を得た。現在、自動車運転を希望する脳外傷者の抽出を行っている。現状では、10名ほどをリクルートした。同時に、神経心理学的検査及び脳画像検査を進めている。(1)簡易型ドライビングシミュレータを用いて、まず、健常者20名に対し、単純課題および自動車市街地走行時の前頭葉血流の変化を計測した。その結果、以下の結論を得た。1単純課題に比し、市街地走行では前頭葉血流は優位に、いずれの部位でも増大した。2自動車運転中、前頭前野は左右差なく、いずれの部位でも、血流の増加を確認した。3これらの結果は、前頭葉損傷者の運転においては、MRI等の画像所見から、慎重にアドバイスすべきであることを示唆している。4一方、前頭葉損傷者が自動車運転を再開する場合、米国で一部、実施されているような、「限定的」運転の制度が導入すべきではないかと思われる。すなわち、運転地域の限定、運転時間帯の限定などである。以上の内容は、今後、学会発表をしていく予定である。(2)同ドライビングシミュレータを用いて、数名の脳損傷者にも、上記と同様の計測を行った。まったく問題なく運転をこなす例では、前頭前野の血流増加のパターンは健常者と類似していた。今後、(1)のデータをもとに、脳損傷者への計測を進めていく方針である。(3)障害者の自動車運転に関する論文は、「自動車運転再開支援を行った脳損傷者の特徴と事故についてリハ医学51(2):138 -143,2014」においてまとめた。研究発表は、第23回バイオレオロジーリサーチフォーラム(東京大学、2014/12/02)において行い、自動車運転中の脳血流の変化について、当該研究の成果を報告した。(1)ドライビングシミュレーターを使用し、健常者18名の運転中の前頭葉血流動態を機能的近赤外分光法(fNIRS)にて測定した。単純な運転場面と市街地運転を比較し、後者で血流の増加が有意差をもって明らかとなった。(2)脳外傷者をはじめとする脳損傷者において、ドライビングシミュレーターを使用し評価を行い、データを蓄積した。(3)平成27年度は、さらにon-road評価として、国立障害者リハビリテーションセンターとの連携を行った。今後、病院での運転評価と実際の運転評価との比較を行っていく。(4)脳外傷者の自動車運転評価および支援について、国立障害者リハビリテーションセンターとの連携を強化し、新たな支援のながれを構築していく。当初の研究計画のとおり、健常者での評価が終了したので、今後は、脳外傷者の評価に進んでいる。さらに、前述したように、国立障害者リハビリテーションセンターとの連携によって、脳外傷者の自動車運転支援の流れを構築していく。本研究の目的は、自動車運転に必要な認知機能を同定し、脳損傷者の自動車運転に役立てることである。自動車運転には、運動機能、視覚機能の他に、認知機能として、計画能力、注意の維持、選択、分配、転換機能、ワーキングメモリー、遂行機能、視空間認知機能、短期記憶、長期記憶、展望記憶、道具の操作能力、感情のコントロール能力、自己認識能力を必要とすることが今までの研究で明らかとなった。これらの能力が保持されるためには、両側前頭葉、右頭頂葉を始めとする左右の大脳半球の広範な機能が健全である必要がある。したがって、本研究は、平成28年度、脳損傷者が運転再開を希望する場合、前提条件として、医学的に安定し、日常生活が自立しており、社会性が保持されていること等を確認し、その後、脳画像所見と神経心理学的検査結果を参考として、ドライビングシミュレーターによる運転能力評価を行った。そしてこれらで問題がない場合には、近隣の自動車教習所において実車による運転能力評価を行った。前述したように、自動車運転に必要な脳機能について明らかにできたので、当該年度、脳損傷者の実際の運転再開にむけてのドライビングシミュレーターによる運転能力評価を行い、近隣の自動車教習所において実車による運転能力評価を行った。平成29年度は、脳損傷後に運転能力評価を行い、そして、実車運転への手順を構築した。すなわち、まず、安全運転のための必要条件(医学的に安定、日常生活の自立、障害の理解、代償方法を習得、感情面の安定)が備わっていることを確認し、次いで、脳MRI所見から、左右の大脳半球、特に両側前頭葉、右頭頂葉に損傷があっても、限局し小病変であることを確認する。広く大脳皮質が損傷されている例では運転はできない。ついで、神経心理学的検査を行い、基準値を概ね下回ってないことを確認する。そして、以上の条件が満たされた場合に、教習所にて実車運転能力の評価を依頼する。

これらを通して、運転能力の適否を評価することにしている。自動車教習所との連携は、on-the-road評価として、off-the-road評価にて運転に支障をきたす重大な障害がない場合に、off-the-road評価に続いて行われる。医療機関は、教習所との綿密な打ち合わせの後、役割分担、責任の所在を明確にする。運転再開においては、運動障害および高次脳機能障害が阻害要因となることから、詳細な評価が必要であり、運転再開が可能な場合は、丁寧な指導が求められる。以上の手順を構築し、実際に運転を希望する脳損傷患者を対象に、データを集計し、学会発表、論文作成を行った。1機能的近赤外分光法による自動車運転中の脳神経基盤の解明;機能的近赤外分光法を用いて、健常成人を対象に、ドライビングシミュレーターによる運転中の脳血流動態を計測し、自動車運転に関与する脳神経活動部位として、特に左右前頭葉、右頭頂葉、左頭頂葉が重要であると結論した。2脳損傷者の自動車運転再開への臨床的指導手順の確立;脳外傷者を始めとする脳損傷者の自動車運転再開に向けた支援の手順を構築し妥当性を検討した。すなわち、神経学的診察の後、脳MRI所見および神経心理学的検査、ドライビングシミュレーターでの運転能力を確認し、以上の条件が満たされた場合に、教習所にて実車運転能力の評価を行う。健常者20名に対し、単純課題および自動車市街地走行時の前頭葉血流の変化を計測した。以上のデータは、今後、脳損傷者に対し、同様の計測を行う上で、コントロールデータとなりうる。(1)脳外傷者の自動車運転評価を、脳外傷の重症度、画像所見、神経心理学的検査およびドライビングシミュレーターにて行う。(2)以上の評価結果と実際の運転能力との照合を行う。(3)国立障害者リハビリテーションセンターとの連携によって、脳外傷者の自動車運転支援の流れを構築していく。最終年度は、以上の脳損傷者の運転再開の流れを、さらに組織化し、症例を増やしていく。現在までのところ、症例は30症例程度に蓄積された。今後、さらに、学会発表、論文執筆を進める。複合領域脳損傷者を対象に、単純課題および自動車市街地走行時の前頭葉血流の変化を計測する。わせて、神経心理学的検査および脳画像(MRI/CT)との照合を行う。初年度において、当大学および病院での倫理委員会での承認を得た。それを踏まえて、簡易型ドライビングシミュレーターおよびNIRS測定装置の解析ソフトを導入した。さらに、実験にエントリーされる脳外傷者を選択する段階まで到達した。国際学会の発表が遅れたので、次年度に持ち越す。今後、脳外傷者の評価にあたり、さらに経費がかさむと予想された。脳損傷者の自動車運転再開のための評価を行うための費用を要する。今後、さらに脳損傷者を対象に、本研究を推進する必要がある。(1)国際学会での発表(2)脳外傷者での運転評価の拡充(3)実車運転評価神経心理学的検査、画像所見評価、データベースの集積、ドライッビングシミュレータの維持管理費、その他、消耗品購入を計画している。簡易型ドライビングシミュレーターを使用し、健常者および脳外傷者の運転中の脳血流動態を機能的近赤外分光法(fNIRS)にて測定する。
総合型地域スポーツクラブにおける障害者に対応可能な人材育成プログラム開発

本研究では、総合型地域スポーツクラブにおける障害者に対応可能な人材育成プログラム開発に向けたマネジメント課題を展望することを目的とした。具体的には、障害者スポーツ事業を実施している福岡県と高知県の総合型地域スポーツクラブ4クラブを対象に育成プログラムを開発・実践・評価した。その結果、2日間(講義4時間と実技4時間)の講習会を開発・実践することができた。また、プログラムの各種評価により明らかにされたマネジメント課題は、1「他組織との連携による経営資源の調達」、2「講習会に向けたプロモーション」、3「障害当事者との交流」、4「講習会後の資格取得や活動場所確保」などであった。平成26年度は、福岡県の総合型地域スポーツクラブ(以下、「総合型クラブ」とする)において既に障害者スポーツ事業を導入している2つの事例を選定し、総合型クラブが自前で人材育成できるプログラムを大学・行政・クラブの連携により開発・実践し、そのプロセスを参与観察調査により明らかにすること、そして、プログラム開発関係者およびプログラム参加者の意識変容をアンケート調査により明らかにすることを目的とした。具体的には、1.定性的方法(連携組織代表者によるプログラム開発会議を実施し、その会議に際してビデオ等を用いて開発プロセスを詳細に記録していくことや、プログラム実践においても同様に実践プロセスを詳細に記録していくこと)と、2.定量的方法(プログラムの開発・実践に携わった連携組織代表者、および、同プログラムの参加者の意識調査をすること)を組み合わせた各種調査を実施することで目標達成を目指した。その結果、選定した1つの事例地域においては、連携組織代表者との協議による「アダプテッド・スポーツ・ボランティア養成プログラム」を開発・実践することができた。具体的には、講義は「(1)アダプテッドスポーツの捉え方」、「(2)障害者スポーツの資格と特徴」、「(3)これからの地域スポーツ環境を考える」、「(4)レクリエーションの捉え方」といった4つの講義を設定し、実技は「(1)風船バレー」、「(2)卓球バレー」、「(3)ボッチャ」、「(4)フライングディスク」といった種目を設定した2日間のプログラムを開発することができた。また、参加者が同プログラムを契機に継続して総合型クラブスタッフとして活躍する動きも見られた。しかしながら、もう1つの事例地域においては、同プログラムを開発・実践することができなかった。この事例地域においては、平成27年度の実践を再度設定し、確実にプログラムを実践できるように調整を進めていく。平成27年度は、高知県の総合型クラブで既に障害者スポーツ事業を導入している2つの事例を選定し、総合型クラブが自前で人材育成できるプログラムを大学・行政・クラブの連携により開発・実践し、そのプロセスを参与観察調査すること、また、プログラム開発関係者および参加者の意識変容をアンケート調査すること、さらに、平成26年度に実施した福岡県での追実践を行い、継続課題を明らかにすること、そして、昨年度未実施であった福岡県の1事例のプログラムを開発・実施することを目的とした。その結果、高知県の2つ及び福岡県の1つの事例地域において、「アダプテッド・スポーツ・ボランティア養成プログラム」を開発・実践することができた。具体的には、「1.アダプテッドスポーツの捉え方」「2.障害者スポーツの資格と特徴」「3.これからの地域スポーツ環境を考える」「4.レクリエーションの捉え方」といった4つの講義(各1時間)と「1.車いすバスケット」「2.風船バレー」「3.卓球バレー」「4.ボッチャ」「5.フライングディスク」「6.ビームライフル」等の種目実技(1日当たり2時間)を設定し、2日間のプログラムを開発できた。また、福岡県の1つの事例地域において追実践できた。具体的には、連携組織代表者との協議により、講義をビデオ視聴(上映)した講習会を開発し、事例クラブが自前で講習会を開催するための取組を促すことができた。高知県の2つ及び福岡県の1つの事例地域において連携組織代表者との協議による「アダプテッド・スポーツ・ボランティア養成プログラム」を開発・実践することができた。また、福岡県の1つの事例地域において追実践をすることができた。しかしながら、当初の計画では、福岡県のもう1つの事例地域において、追実践を行う計画であったが、平成27年度に1回目のプログラム開発・実施が進められたことから、未実施となっている。平成28年度は、昨年度(H27)、高知県の総合型クラブで既に障がい者スポーツ事業を導入している2つの事例地域において開発・実践した「アダプテッド・スポーツ(AS)ボランティア育成プログラム」を継続実践(申請者らの介入なしでの追加実践)し、その追加実践後にクラブマネジャー等に対するインタビュー調査を行い介入後の継続課題を明らかにすること、また、福岡県においても継続実践が未実施であった1つの総合型クラブにおいて高知県同様の実践・調査を行うこと、さらに、両県の各2事例(合計4事例)における実践(開発実践と継続実践)から得られたデータを基に、同プログラムの全体的な評価を行う場(会議)を両県で設定し、その評価プロセスを参与観察調査により明らかにすることを目的とした。

その結果、各県1事例の地域において「ASボランティア育成プログラム」の継続実践を行い、その追加実践プロセスを明らかにすることができた。具体的には、昨年度(H27)までに開発・実践した「講義(4時間)と実技(4時間)を2日間かけて実施した養成プログラム」を連携組織代表者との協議により、講義(4時間)の部分をビデオ視聴(上映)に改編した講習会を実施し、事例地域の総合型クラブが自前で講習会を開催するための取り組みを促すことができた。また、両県の各2事例地域における実践から得られたデータを基に開発・実施に関わった方々との全体評価会議を開催し、その評価プロセスを明らかにすることができた。具体的には、総合型クラブが自主的に実践できる規模や、参加者の満足度、同プログラム修了者がクラブのスタッフとして携わる様になったことなど、質・量ともに一定の評価(効果)を示していることが明らかとなった。一方で、日本障がい者スポーツ協会の認定資格との整合性や、一定規模の参加者の確保など、今後さらなる充実に向けての課題も明らかにすることができた。福岡県の2事例地域においては、連携組織代表者との協議を経て「アダプテッド・スポーツ・ボランティア養成プログラム」を開発でき、それを実践し、さらに、申請者の介入なしに同プログラムを開催するといった継続追加実践も完了することができ、その実施プロセスに関する各種データを収集することができている。また、高知県では2事例地域において同プログラムを開発・実施し、その内、1事例地域では継続追加の実践を完了することができている。さらに、両県におけるこれまでの実践プロセスで収集された各種データを基に全体的な評価会議を開催することができている。しかしながら、高知県における1事例地域での継続追加実践が未実施(参加希望者を得られなかったため)となっている。また、当初の計画では、これまでの実践をすべて完了させ、その内容を整理した報告書の作成を行う予定であったが、上記の未実践の事例地域があることから、未作成となっている。平成29年度は、昨年度(H28)実施予定であった高知県(1クラブ)での「アダプテッド・スポーツ・ボランティア養成プログラム」の継続追加実践(講義をビデオで実施する2回目の講習会)を試みるとともに、これまでの実践データ(福岡県2クラブ、高知県2クラブの合計4クラブでの8回の実践データ)をまとめた報告書を作成することを目的とした。まず、高知県(1クラブ)での「アダプテッド・スポーツ・ボランティア養成プログラム」の実践だが、当該クラブからの参加者を募ることができず、実施することができなかった。よって、実施できなかった要因を分析する為にクラブ関係者へのヒアリング調査を実施した。その結果、これまで同プログラムの開発・実施を進めてきたクラブマネジャーの移動があり別のスタッフが窓口となり細部(同プログラムの意義等)
拡散モデルによる薬物の肝潅流実験デ-タ解析[高速逆ラプラス変換の応用]

肝臓は腎臓と並んで薬物を体内から除去するための重要な処理臓器である。薬物と肝臓との相互作用(肝局所動態)を速度的に解明する手法はその数値的取扱いの制約から、大幅に後れていた。我々は高速ラプラス逆変換(FILT)と最小二乗法を組み合わせた解析プログラムMULTI(FILT)をFORTRAN77で開発した。つぎにクロマト理論を基礎にTwoーcompartment(非平衡分配)拡散モデルを構築して肝局所動態解析に適用した。以下は今年度の研究成果である。薬物として、βーラクタム抗生物質の1つであるcefiximeを取り上げた。この薬物は有意に腸肝循環(Enterohepatic Circulation)をおこすことが知られている。まず局所動態で重要な生理パラメ-タである潅流速度のcefiximeの肝局所への影響を調べた。潅流速度を6.4,11.3,14.1,16.3ml/minと変えたところ血液部体積V_B、補正拡散定数D_cは直線的に増加、分配比k'は単調に現象した。また分布容積V_Hは単調に増加した。通過率F_Hは潅流速度によらず90ー100%の値となった。これらの現象は潅流速度の増加とともに、血液部の断面積Aが増加することにより統一的に説明できた。つまり肝臓は血液流速の変化したがって、フレキシブルのその体積を変化させていることが予想できる。また推定されたパラメ-タを用いてシミュレ-ションしたところ、相対分散値σ^2/t^^ー_H^2は通常血液流速(約15ml/min)で極大となっていることがわかった。これは通常流速で血液が最適な混合状態となり、肝組織と血液が十分に接触していることを意味する。つぎに現在cefiximeの肝細胞を経て胆汁排泄する過程の新しい速度論モデルを構築した。このモデルをcefiximeの胆汁中排泄時間経過にMULTI(FILT)により当てはめたところ、肝細胞内拡散過程が律速であることが推定された。
近赤外線経皮エネルギー伝送による筋電義手用低侵襲完全埋め込み型インターフェイス

筋電義手を制御するための良質な筋電信号を得るため、皮下に完全に埋め込んで筋電信号を計測する装置を開発した。装置には体外から近赤外光を照射することで電力を供給し、電池交換を不要とした。また記録電極に従来の金属ではなくカーボンナノチューブをコーティングした繊維を用いることで、電極が破損することなく長期間の埋め込み記録が可能な装置を開発することに成功した。装置をラットの皮下に埋め込み実験を行ったところ、良好な結果を得た。本研究の目的は、筋電義手のための体内埋め込み型インターフェイスを設計し、安全でヒトへの実用に適した装置を完成することである。研究実施計画に基づき平成20年度は、体内に埋め込む超小型の生体アンプおよび無線送信機と、体外に設置する無線受信機および近赤外光エネルギー供給装置の設計,製作を行った。この装置の開発意義と特徴は、1)電極を直接骨格筋に埋め込むため個々の筋の活動を正確に計測でき、筋電義手の正確で細かな制御が可能となる、2)完全に体内に埋め込んだ装置に近赤外光による経皮的発電で電力を供給するため、バッテリー交換のための再手術が不要になる、3)無線通信で筋電情報を送信するため危険な接続コネクタの体外露出がない、4)超小型化によって最小限の低侵襲手術での埋め込みを可能とする、等である。試作した装置に白金線電極を取り付け、これを実際にラットの大腿筋と皮下に埋め込んで実験した。無麻酔でトレッドミルを用いて歩行運動を誘発したところ、目論見どおり歩行パターンに同期した筋電信号を取得することに成功した。この成功によって、本研究の目指すインターフェイスの、電極以外の基礎技術は一応確立されたことになる。現在はこの技術を基にさらに研究を発展させ、非金属生体適合材料を用いた長寿命埋め込み電極の開発、生体内長期埋め込み実験による装置の耐久性や性能維持の試験と評価、複数のインターフェイス埋め込みによるマルチチャンネル記録の試み等の研究を推進しているところである。平成21年度の研究は実施計画どおりに進めることができ、一部予想を上回る研究成果を上げることもできた。1.電極の開発:以前は金属線を骨格筋内埋め込み電極として用いたが、金属疲労による破損が生じて長期間にわたる記録はできなかった。そこで本年度は非金属材料を用いた電極の開発を重要課題として研究を進めた。電極材料として、当初カーボンブラックをフィラーとした衣料用の導電性繊維を用いたが、電気抵抗値が高く金属のような電極性能を得ることが出来なかった。その後、カーボンナノチューブをコーティングした導電性繊維を入手しその特性を調べたところ、生理食塩水中で金属電極に匹敵する低抵抗値を示すことがわかった。これを記録電極として用いたところ、ラットを用いた数ヶ月間の生体内埋め込み実験においても切断破壊されることなく電極性能を維持するという良好な結果を得た。現在この電極の耐久性および生体適合性の試験を目的とした長期埋め込み実験を継続中である。2.複数筋からの筋電記録:昨年度のもう一つの課題は、複数の骨格筋からの同時記録であった。このために2つの方法を試みた。一つはすでに開発に成功していた1チャンネルの筋電インターフェイスを2つの筋に埋め込み同時記録を行う方法である。そのために2チャンネルのコントロール装置を新たに作成し、ラットの歩行に同期した後肢筋電の記録を試みた。これは比較的簡単に達成できた。もう一つの方法として、筋内に埋め込む体内ユニットの他チャンネル化を試みた。複数の記録電極からの信号を、アナログマルチプレクサを用いて多重信号化し、それをパルス幅変調して体外に無線通信する装置を設計した。体外での実験で通信に成功し、現在埋め込みにむけて小型化、省電力化を試みている。装置の試作と評価はラットを用いた動物実験でおこなった。平成22年度は本課題研究の最終年度であるが、ほぼ実施計画どおりに進めることができた。1)埋め込み回路の改良:体内埋め込み型筋電インターフェイスによる筋電の無線記録に成功した後、その耐久性を向上させ長期記録を実現させる改良を行った。従来の装置の故障原因を調べたところ、その原因がフォトダイオードの起電力消失にあることが判明した。これはフォトダイオードパネル素子の機械的強度が不足しているためであり、装置全体を透明な樹脂製のハードケース内に封入することで体内における装置の耐久性を向上させることが出来た。現在長期記録試験が進行中であるが、記録可能期間の延長を確認している。2)多チャンネル筋電インターフェイスの開発:複数の骨格筋からの筋電の同時記録は、本研究の到達目標の一つであり、今年度はインターフェイスを多チャンネル化し、複数の記録電極対からの信号を多重信号処理して無線通信する埋め込み装置を試作した。

すなわち、体内装置では8チャンネルのマルチプレクサを用いて筋電信号を多重化し、これをパルス幅変調によって体外装置に無線送信する。送受信には赤外線光通信を用いる。体外装置では受け取った信号をデマルチプレクサで復調し、元の筋電波形を得る。このシステムで、8チャンネル各8KHzの周波数特性で筋電信号を送受信することができた。
圧縮率の違いを利用した層状化合物の創製

近年1GPaを超える圧力を使った無機化合物合成が一般的になりつつあるが、どのような化合物がどのような圧力で合成できるのかということに関しては明確な指針がないのが現状である。本研究はイオンの圧縮率(すなわち硬さ・柔らかさ)というパラメータを利用することによって、高圧合成法を使った新しい層状化合物の設計指針を打ち出そうとするものである。そのために、高圧合成を用いた様々な層状物質の合成を行う。またメカニズム解明のためのin-situ実験を行う。
膵癌におけるゲノムの不安定性と膵液を用いたその臨床診断的応用

これまで,私は,膵液中K-ras癌遺伝子点突然変異の検索による膵癌診断の有用性について報告してきた(Jpn J Cancer Res 84:961,1993;Pancreas 12:18,1996)。また,新しくacridinium esterをラベルしたプローブを用いた化学発光によるK-ras変異型の簡便な検出法を開発し(Jpn J Cancer Res(in press)),臨床診断法としてその有用性が期待されている。しかし,これらの診断率は6580%前後で100%ではなく,また病理学的には良性とされる腺腫の粘液産生膵腫瘍にも陽性例が存在している。そのため,癌化後に変異が生じるとされているp53癌抑制遺伝子のexon58に関してnon-radioisotopic PCR-SSCP法にて膵液について検索したところ,粘液産生膵腫瘍や慢性膵炎症例には変異はみられず,一方,膵癌症例では45%にp53変異がみられ,さらに,K-ras変異陰性でp53変異陽性の症例もみられ,膵液中のK-rasとp53の遺伝子変異の検索を組み合わせることで,膵癌の診断効率を高めることが期待された。最近,新たな発癌に関連する遺伝子異常として,DNAミスマッチ修復遺伝子(hMSH2,hMLH1,hPMS1,hPMS2,GTBP)の変異が同定され,遺伝性非腺腫症性大腸癌などの原因とされ,microsatellite instability(MI)によるDNAの不安定性と発癌との関連が重要視されている。今回,膵臓癌におけるDNA不安定性の発現頻度を検索した。通常型膵癌5例を対象に,方法は,ホルマリン固定パラフィン包埋された切除膵組織よりmicrodissection法にて,癌部と非癌部のDNAを抽出し,DNAミスマッチ修復異常を反映するmicrosatellite領域(D2S123,D18S58,BAT40,BAT26,D9S63,D9S146,D17S513)のそれぞれに対するプライマーを作成した。これらのプライマーを用いてPCRを行ない,その後グラジエントゲル電気泳動と銀染色により検討した。これらの領域のうち,2つ以上の異常を異常がみられるものについてreplication error(RER)陽性と判定した。5例中3例(60%)にRER陽性であった。K-rasは,5例すべてに陽性であり,p53については現在検索中である。今後,症例数を蓄積して引き続き検討する予定である。また膵液を用いたMIの検討も行う予定であり,K-rasおよびp53の遺伝子異常との関連性ならびにその臨床診断的意義についても明らかにして行く方針である。
頚髄損傷患者における3DAC画像を用いた軸索再生の可視化と臨床機能との相関解析

脊髄損傷患者を対象として,MRIの拡散テンソル解析を用いることで脊髄全体の損傷程度の回復と臨床機能の回復に経時的な相関があることが報告された.しかしながら,神経路単位での評価は行われておらず,また,軸索再生は数値を介しての推定のみの報告であり,実際の生のMRI画像で可視化した報告はない.本研究では,頚髄損傷患者を対象とし,生の拡散強調画像から構成される三次元不等方性コントラスト(3DAC)画像を用いることで軸索の回復が神経路単位で観察可能であるか,その回復と感覚系および運動系に分けた臨床機能の回復に相関が見られるか調査することとした.脊髄損傷患者を対象として,MRIの拡散テンソル解析を用いることで脊髄全体の損傷程度の回復と臨床機能の回復に経時的な相関があることが報告された.しかしながら,神経路単位での評価は行われておらず,また,軸索再生は数値を介しての推定のみの報告であり,実際の生のMRI画像で可視化した報告はない.本研究では,頚髄損傷患者を対象とし,生の拡散強調画像から構成される三次元不等方性コントラスト(3DAC)画像を用いることで軸索の回復が神経路単位で観察可能であるか,その回復と感覚系および運動系に分けた臨床機能の回復に相関が見られるか調査することとした.
オキシトシン受容体遺伝子ノックアウトマウス作製による受容体機能の解析

本研究申請後KimuraらによりマウスOTR遺伝子の塩基配列が発表された。このため、発表された塩基配列をもとにPCRプライマーを作成して得たcDNAより129SvEvマウス由来のOTR遺伝子を得た。得られた遺伝子断片とpGKhprt/MCA1tkベクターとからターゲティンベクターコンストラクトを作成した。しかし、米国の知人より米国NIHの研究所でOTR遺伝子のノックアウトマウス作成に成功したこと、しかしOTR遺伝子-/-のhomozygousミュータントマウスは胚発生途中で死亡すること(early embryonic death)等の情報が得られた。そのため我々は研究計画を再編することとし、改めて、条件遺伝子破壊:conditional knockoutシステムを用いたKOマウス作成を計画した。条件遺伝子破壊法は、欠損させたい遺伝子の前後にLoxPという短い配列を挿入させた配列を持つベクターをES細胞に導入、相同組換えによりゲノム上の当該遺伝子と交換する。そしてテトラサイクリン等による外部からの誘導システムや組織特異的なプロモータシステムにより、P1ファージ由来のDNA組換え酵素creを細胞内で適宜誘導発現させて、発生後の様々なタイミングでの目的遺伝子欠損や、組織特異的な目的遺伝子の欠損を誘導し、解析するというものである。また、この情報交換を通じ、世界で始めてOTR受容体遺伝子のクローニングに成功した、大阪大学医学部の木村博士と本研究を共同研究として開始、続行することとした。1998年度は木村博士より入手したOTR遺伝子を持つラムダファージを用い、正確な制限酵素地図を作成した後、LoxP型KOベクターであるpLoxPneo3.repairを骨格に3つのloxP.neo耐性遺伝子、5′armと3′arm、loxPに挟まれたnock in用ゲノム(エクンン2.3)、HSV-tk遺伝子の各断片からなる全長18.5kbのKOベクターを作成した。このKOベクターをE14TG2a EScellに導入し相同組替えを起こしたクローンのスクリーニングを行っている。胚発生時でのOTR遺伝子の機能を明らかにするための実験としては、変異型ステロイドレセプターとcreの融合タンパクが合成ステロイドの一種でのみ構造変換を起こし活性型cre活性を示す系が開発されているが、これを体組織のどこでも一様に発現のみられるROSA26と言う発現ユニットに連結したシステムを持つマウスを米国テキサス州ヒューストンのMartin M.Matzuk博士とChester Brown博士が共同で作成しており、この使用に関しての承諾が得られいる。また子宮平滑筋でのOTR遺伝子破壊に関しては大阪大学の三輪岳志博士が平滑筋特異的アクチンプロモータにcre遺伝子を連結したシステムを持つトランスジェニックマウスを作成しており、本実験への導入に関しての承諾を得ている。

研究実績の概要:平成9年度DNAデータベースにマウスのオキシトシン受容体遺伝子の塩基配列が発表されたので、この配列を用いてプライマーを作成し、PCRによって129SvEv系統のマウス由来ゲノミックライブラリよりオキシトシン受容体遺伝子のゲノミックDNAのスクリーニングを行った。得られた遺伝子配列を用いてhprt遺伝子をマーカーとしたPGKhprt/MCA1tkベクターに挿入し、ターゲティンベクターコンストラクトを作成した。この作業を行っている間に、米国NIHの研究所でオキシトシン受容体遺伝子のノックアウトマウスを作成したと言う情報が知人より伝えられた。しかし此の情報によると、オキシトシン受容体遺伝子-/-のマウスでは発生途中で死亡する(early embryonic death)とのことであり、この実験計画を練り直す必要が生じた。今後conditional knockout(条件遺伝子欠損)を行なう計画に切り替えることとした。すなわち、欠損させる遺伝子領域をloxP配列で挟み込んだターゲティングベクターを作成し、これをES細胞に導入するためにデザインしたターゲティングベクターを作成中である。此のベクターを導入したES細胞よりマウスへテロザイゴ-ト個体が得られたら、Tc制御プロモータを用いた誘導可能なcre発現ベクターを導入したトランスジェニックマウスとのハイブリッドを作成して、発生の各段階でのオキシトシン受容体遺伝子の不活化を行なう予定である。本研究申請後KimuraらによりマウスOTR遺伝子の塩基配列が発表された。このため、、発表された塩基配列をもとにPCRプライマーを作成して得たcDNAより129SvEvマウス由来のOTR遺伝子を得た。得られた遺伝子断片とpGKhprt/MCA1tkベクターとからターゲティンベクターコンストラクトを作成した。しかし、米国の知人より米国NIHの研究所でOTR遺伝子のノックアウトマウス作成に成功したこと、しかしOTR遺伝子-/-のhomozygousミュータントマウスは胚発生途中で死亡すること(early embryonic death)等の情報が得られた。そのため我々は研究計画を再編することとし、改めて、条件遺伝子破壊:conditional knockoutシステムを用いたKOマウス作成を計画した。条件遺伝子破壊法は、欠損させたい遺伝子の前後にLoxPという短い配列を挿入させた配列を持つベクターをES細胞に導入、相同組換えによりゲノム上の当該遺伝子と交換する。そしてテトラサイクリン等による外部からの誘導システムや組織特異的なプロモータシステムにより、P1ファージ由来のDNA組換え酵素creを細胞内で適宜誘導発現させて、発生後の様々なタイミングでの目的遺伝子欠損や、組織特異的な目的遺伝子の欠損を誘導し、解析するというものである。