hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
口腔扁平苔癬の上皮の細胞間コミュニケーションに関する研究

口腔扁平苔癬(以下OLP)は,口腔粘膜疾患の中でも比較的頻度が高い難治性疾患である.近年,胃粘膜上皮間ギャップ結合の強化作用を有するマレイン酸イルソグラジンの使用によるOLPの改善が報告されてきている.ギャップ結合を介する細胞間の双方向物質輸送は細胞間コミュニケーションと呼ばれ,さまざまな生理的役割を担っている.ギャップ結合の構成蛋白であるコネキシンは,種々の臓器,疾患で発現パターンが異なり,胃腸粘膜,肝臓等の報告はあるが,口腔粘膜における報告は少ない.また,発癌過程における細胞間コミュニケーションの機能低下やギャップ結合発現量の減少等も報告されている.そこでOLPの上皮におけるギャップ結合に着目し,コネキシン発現と増殖活性について免疫組織化学的に検討した.対象は,当科を受診し,臨床的・病理組織学的にOLPと診断され,生検時に凍結標本が得られた23例30病変とした.対照として,埋伏歯抜歯時または開窓術時に採取しえた臨床的に炎症所見のない口腔粘膜25例を使用した.OLP,対照両群において,コネキシン26,コネキシン32,コネキシン43,Ki67抗原に対する一次抗体を用い,コネキシンについて蛍光抗体法(間接法),Ki67抗原について酵素抗体法(間接法)にて染色した.その結果,両群ともに上皮にコネキシン32の発現はほとんど認められず,対照群と比較してOLP群のコネキシン26,43の発現が減弱する傾向がみられた.コネキシン26,43の染色程度をびらん部を除いた染色範囲で4段階に分けて点数評価(Cx score)したところ,OLPと対照群の比較で統計学的に有意差が認められた.Ki67については,OLP上皮のKi67陽性細胞率が正常粘膜より有意に高かった.Cx scoreとOLPの臨床視診型,リンパ球浸潤程度,上皮性異形成,Ki67陽性細胞率との間に明らかな関連は認められなかった.口腔扁平苔癬(以下OLP)は,口腔粘膜疾患の中でも比較的頻度が高い難治性疾患である.近年,胃粘膜上皮間ギャップ結合の強化作用を有するマレイン酸イルソグラジンの使用によるOLPの改善が報告されてきている.ギャップ結合を介する細胞間の双方向物質輸送は細胞間コミュニケーションと呼ばれ,さまざまな生理的役割を担っている.ギャップ結合の構成蛋白であるコネキシンは,種々の臓器,疾患で発現パターンが異なり,胃腸粘膜,肝臓等の報告はあるが,口腔粘膜における報告は少ない.また,発癌過程における細胞間コミュニケーションの機能低下やギャップ結合発現量の減少等も報告されている.そこでOLPの上皮におけるギャップ結合に着目し,コネキシン発現と増殖活性について免疫組織化学的に検討した.対象は,当科を受診し,臨床的・病理組織学的にOLPと診断され,生検時に凍結標本が得られた23例30病変とした.対照として,埋伏歯抜歯時または開窓術時に採取しえた臨床的に炎症所見のない口腔粘膜25例を使用した.OLP,対照両群において,コネキシン26,コネキシン32,コネキシン43,Ki67抗原に対する一次抗体を用い,コネキシンについて蛍光抗体法(間接法),Ki67抗原について酵素抗体法(間接法)にて染色した.その結果,両群ともに上皮にコネキシン32の発現はほとんど認められず,対照群と比較してOLP群のコネキシン26,43の発現が減弱する傾向がみられた.コネキシン26,43の染色程度をびらん部を除いた染色範囲で4段階に分けて点数評価(Cx score)したところ,OLPと対照群の比較で統計学的に有意差が認められた.Ki67については,OLP上皮のKi67陽性細胞率が正常粘膜より有意に高かった.Cx scoreとOLPの臨床視診型,リンパ球浸潤程度,上皮性異形成,Ki67陽性細胞率との間に明らかな関連は認められなかった.口腔扁平苔癬(以下OLP)における上皮細胞間のギャップ結合の構成蛋白であるコネキシン(connexin)の発現と病態との関わりについて,免疫組織化学的に検討した.九州歯科大学口腔外科学第二講座にて治療を行う患者から得られた,正常口腔粘膜組織と,OLPの生検組織より凍結切片を作製し,各組織におけるコネキシンの発現をしらべた.正常粘膜組織としては,埋伏歯抜歯時に切除した歯肉や,開窓術時に切除した頬粘膜などを用いた.得られた組織はOCT compound包埋後,ドライアイス+イソペンタンにて急速凍結して-80度で保存した.OLPの生検組織についてはホルマリン固定標本の病理組織検査にて確定診断を下した.凍結標本を教室保有のクリオスタットで5μm厚に薄切して凍結切片を作製し,コネキシン26,コネキシン32,コネキシン43に対する一次抗体を用いて蛍光抗体法(間接法)にて免疫染色を行った.染色終了後,教室保有の光学顕微鏡にて観察し,コネキシンの発現パターン,浸潤リンパ球や臨床所見との関わりについて検討した.染色結果より,正常口腔粘膜上皮,OLP上皮ともにコネキシン26,43の発現が認められ,コネキシン32の発現はほとんど認められなかった.また,染色程度を点数化して評価したところ,正常粘膜上皮と比較して,OLP上皮ではコネキシン43の発現が減弱する傾向が認められた.それから,OLP上皮の染色程度と臨床視診型,リンパ球浸潤程度,上皮性異形成との関連について検討したところ,明らかな関連は認められなかった.

口腔扁平苔癬(以下OLP)における上皮細胞間のギャップ結合の構成蛋白であるコネキシン(connexin)の発現と病態との関わりについて,免疫組織化学的に検討した.九州歯科大学口腔外科学第二講座にて治療を行う患者から得られた,正常口腔粘膜組織と,OLPの生検組織より凍結切片を作製し,各組織におけるコネキシンの発現をしらべた.正常粘膜組織としては,埋伏歯抜歯時に切除した歯肉や,開窓術時に切除した口腔粘膜などを用いた.得られた組織はOCT compound包埋後,ドライアイス+イソペンタンにて急速凍結して-80度で保存した.OLPの生検組織についてはホルマリン固定標本の病理組織検査にて確定診断を下した.凍結標本を教室保有のクリオスタットで5μm厚に薄切して凍結切片を作製し,コネキシン26,コネキシン32,コネキシン43に対する一次抗体を用いて蛍光抗体法(間接法)にて免疫染色を行った.染色終了後,教室保有の光学顕微鏡にて観察し,コネキシンの発現パターン,浸潤リンパ球や臨床所見との関わり等について検討した.昨年度より症例を追加し,その染色結果より,正常口腔粘膜上皮,OLP上皮ともにコネキシン26,43の発現が認められ,コネキシン32の発現はほとんど認められなかった.また,染色程度を点数化して評価したところ,正常粘膜上皮と比較して,OLP上皮ではコネキシン43の発現が減弱する傾向が認められた.それから,OLP上皮の染色程度と臨床視診型,リンパ球浸潤程度,上皮性異形成との関連について検討したところ,明らかな関連は認められなかった.今後さらに,Ki67抗体,CD3,CD4,CD8,CD45RA,CD45RO,γδTCR等に対する一次抗体を用いた染色と,コネキシン26,43のRNAプローブを用いたin situハイブリダイゼーションを行っていく予定である。
ヒト前立腺組織における線維芽細胞成長因子受容体の発現とその臨床的意義について

前立腺の成長および増殖には線維芽細胞成長因子(FGF)が関与していることが明らかになりつつある。前立腺肥大症(BPH)および前立腺癌(PC)組織においてFGFが存在し、またそのmRNAの発現が認められるという報告もある。しかし、前立腺におけるFGF受容体の研究はほとんど行われていない。そこで、FGF受容体遺伝子のひとつであるflg geneのヒト前立腺におけるmRNAの発現、およびこの遺伝子産物の抗体を用いてFGF受容体タンパク質の発現と、さらに正常、BPHおよびPC組織におけるFGF受容体の局在と意義について検討した。その結果、PCR法を用いて正常およびBPH組織におけるFGF受容体mRNAの発現を比較すると、BPH組織では正常の約5倍と有意に多いmRNAの発現が認められた。また、ウエスタンブロッティング法を用いて、FGF受容体タンパク質の発現を調べたところ、正常およびBPH組織において分子量約140kDaと80kDaの2本のバンドの発現を認めた。さらに作成したFGF受容体の抗体を用いて前立腺におけるFGF受容体の局在について免疫組織化学的に検討すると、おもに基低細胞が陽性に染色された。この前立腺基底細胞の役割はまだ明らかにされておらず、FGFが間質に存在し、また今回の研究で明らかになったようにFGF受容体が基底細胞に存在するならば、この基底細胞はFGF-FGF受容体系を介した上皮-間質間コミュニケーションに重要な働きをもっているものと思われる。(Prostate印刷中)現在、PC組織におけるFGF受容体の発現と局在について検討中である。PC組織では、分化度によって発現と局在が異なるが、高分化型腺癌に強く発現する傾向にあると思われる。今後さらに症例を増やして分化度、異型度による発現の違いと予後との関連について検討してゆく計画である。
ニトロソニウムカチオンに対して認識能を持つ金属発光型ボックス分子の合成と機能化

二酸化窒素に代表されるNOx類は、地球温暖化、有害化学物質の形成、あるいは、酸性雨の原因にもなっている。また、これらは生理学的にも、非常に関心が寄せられている物質である。一方、非共有結合的な弱い相互作用を介した分子会合体形成に焦点を当てた超分子化学は、非常に関心が寄せられている新しい分野である。本研究では、ランタノイド錯体特有の発光部位を有するボックス型ホスト分子を設計し、超分子化学的概念に基づいた窒素酸化物(ゲスト分子)に対する新規な分子センシングシステムの構築、すなわちゲスト分子が結合することにより、強い発光を示す系の構築を目指す。さらに、ホスト分子の固定化による機能性材料としての応用、化学反応試薬としての適用を目的とした。金属発光の励起部位としての芳香環部位とNO^+結合に対するカチオン-π相互作用を考慮した芳香族部位をあわせ持つ構造が基本となる。17年度は、ベンゼン環、ナフタレン環などの芳香族類を有する化合物群の合成を行い、それらの機能性を評価した。18年度では、長鎖アルキル鎖を有する化合物、及び、ポルフィリン環を有する化合物の合成を行ない、ランタノイド金属(例えば、塩化ユーロピウム)を用いて錯化することにより、目的としているボックス型ホスト分子を得た。長鎖アルキル基を持つ化合物では、興味あることに、鎖長に依存した錯体構造の違いをX線構造解析等により確認した。一方、ポルフィリン環を有する化合物では、ポルフィリン環部分に種々のアミン化合物やフラーレン類が、特異的に結合することを見出した。さらに、蛍光スペクトルを詳細に検討することにより、ポルフィリン環とフラーレンの間でのエネルギー移動も確認できた。アミド結合を有する類似の錯体型ホスト分子の合成にも成功し、水素結合を利用した種々のゲスト分子の結合挙動についても明らかにした。具体的には、ベンゼン環、ナフタレン環などを適当なスペーサー部位を介して繋いだ化合物を合成した。次に、π電子豊富な環境を提供できるボックス状分子とするために、とプラットホーム部分を有する化合物を得る。ここでは、このプラットホームとして、四置換芳香族(ベンゼン誘導体)を選択した。ついで、芳香族部位にアセチル基を導入し、トリフルオロ酢酸エチルとの反応により、目的としているホスト化合物の合成を行なった。次に、ランタノイド金属(例えば、塩化ユーロピウム)を用いて錯化を行い、目的としているボックス型ホスト分子を得た。これらホスト分子は、動的に柔軟であり、種々のコンフォメーションをとる可能性がある。適切なホスト分子として機能させるためには、このコンフォメーション特性を明確にする必要がある。そこで、温度可変NMR、X線構造解析等により、分子の動的構造に対する知見を得た。

また、これらは生理学的にも、非常に関心が寄せられている物質である。一方、非共有結合的な弱い相互作用を介した分子会合体形成に焦点を当てた超分子化学は、非常に関心が寄せられている新しい分野である。本研究では、ランタノイド錯体特有の発光部位を有するボックス型ホスト分子を設計し、超分子化学的概念に基づいた窒素酸化物(ゲスト分子)に対する新規な分子センシングシステムの構築、すなわちゲスト分子が結合することにより、強い発光を示す系の構築を目指す。さらに、ホスト分子の固定化による機能性材料としての応用、化学反応試薬としての適用を目的とした。金属発光の励起部位としての芳香環部位とNO^+結合に対するカチオン-π相互作用を考慮した芳香族部位をあわせ持つ構造が基本となる。17年度は、ベンゼン環、ナフタレン環などの芳香族類を有する化合物群の合成を行い、それらの機能性を評価した。18年度では、長鎖アルキル鎖を有する化合物、及び、ポルフィリン環を有する化合物の合成を行ない、ランタノイド金属(例えば、塩化ユーロピウム)を用いて錯化することにより、目的としているボックス型ホスト分子を得た。長鎖アルキル基を持つ化合物では、興味あることに、鎖長に依存した錯体構造の違いをX線構造解析等により確認した。一方、ポルフィリン環を有する化合物では、ポルフィリン環部分に種々のアミン化合物やフラーレン類が、特異的に結合することを見出した。さらに、蛍光スペクトルを詳細に検討することにより、ポルフィリン環とフラーレンの間でのエネルギー移動も確認できた。アミド結合を有する類似の錯体型ホスト分子の合成にも成功し、水素結合を利用した種々のゲスト分子の結合挙動についても明らかにした。
可塑性を示す青枯病菌の病原性をプライミングするクオラムセンシングの謎に迫る

平成29年度に、青枯病菌OE1-1株のゲノムデータを基に作製した44個のヒスチジンセンサーカイネース遺伝子欠損株のクオラムセンシング能を解析した結果、phcS遺伝子欠損株(ΔphcS)、vsrA欠損株(ΔvsrA)およびRSc1601遺伝子(phcK遺伝子)欠損株(ΔphcK)のQS能が著しく低下することが明らかになった。さらに、レスポンスレギュレータ遺伝子欠損株の中で、phcQ遺伝子欠損株(ΔphcK)とRsc0672遺伝子(phcW遺伝子)欠損株(ΔphcW)のクオラムセンシング能が著しく低下した。そこで、phcS遺伝子とvsrA遺伝子の欠損株を作製するとともに、それぞれの欠損株のトランスクリプトームをRNA-seq法により解析し、それらの値をヒートマップ解析に供試した。さらに、それぞれの欠損株のクオラムセンシング能を、細胞凝集能、運動能、トマト植物での挙動およびトマト植物への病原性などのフェノタイプにより解析するとともに、クオラムセンシングにより産生が誘導される主要な菌体外多糖EPS Iとラルフラノンの産生能を解析した。その結果、青枯病菌OE1-1株のクオラムセンシングは、PhcS/VsrAとPhcKによるphcA遺伝子の発現制御およびPhcAによる遺伝子の発現制御からなるPhcA経路と、PhcBによるクオラムセンシングシグナルmethyl 3-hydroxymyristate産生とPhcS/VsrAによるmethyl 3-hydroxymyristate感知およびPhcQとPhcWによる遺伝子発現制御からなるPhcQ/PhcW経路から構成されており、クオラムセンシングによる病原力遺伝子の発現制御には、PhcA、PhcQおよびPhcWすべてが必要であると推察された。青枯病菌OE1-1株のゲノム解析の結果から、センサーカイネースをコードしていると推定された44個遺伝子のうち、QSシグナル3-hydroxymyristate(3-OH MAME)の受容センサーカイネースをコードするとされているphcS遺伝子とともに、vsrA遺伝子とRSc1351遺伝子が、QSに関わることが明らかとなった。さらに、レスポンスレギュレータ遺伝子欠損株のスクリーニングから、phcQ遺伝子とRSc0671遺伝子がQSに関与すると考えられた。そこで、3-OH MAME産生能欠損株、phcS遺伝子欠損株とともに、vsrA遺伝子欠損株、RSc1351遺伝子欠損株、phcQ遺伝子欠損株およびRSc0672遺伝子欠損株のトランスクリプトーム解析を、RNA-Seq法にて行い、QSの起動に関わるシグナル伝達系を推察した。さらに、QSにより産生が誘導される産物について、omics解析を行い、ラルフラノン化合物とEPS Iが、QSにより機能化する転写制御因子PhcAの機能化をフィードバック制御するとともに、レクチンLecMが菌体外に分泌された3-OH MAMEの安定化に関わることを明らかにした。3-OH MAME産生能欠損株とラルフラノン産生能欠損株は、細胞間隙から導管への侵入することができず、病原力を失った。一方、主要な菌体外多糖EPS I産生能欠損株とlecM遺伝子変異株は、細胞間隙から導管へ侵入することができたが、病原力を示すことはなかった。これら本年度の成果から、青枯病菌のQS起動に関わるシグナル伝達系の全貌が明らかになった。さらに、QSとそれにより産生が誘導されるラルフラノンが導管への侵入能と病原性に関わる機能分化に関与することとともに、LecMとEPS Iが、導管への侵入後の病原性への可塑性をプライミングする機構に関わることが明らかとなった。平成29年度の研究計画は、「QSシグナル受容とQSに関わる2成分制御系の道程と機構解明」と「QSにより制御される遺伝子発現系の解明」であったが、QS起動に関わるシグナル伝達系とそれらの遺伝子発現系の全貌を明らかにすることができた。さらに、QSとラルフラノンが導管への侵入能と病原性に関わる機能分化に関与するとともに、LecMとEPS Iが、導管への侵入後の病原性への可塑性をプライミングすることを明らかにし、それぞれの産生能欠損株と親株であるOE1-1株のトランスクリプトーム解析の結果を基に、QS、ラルフラノン、LecMおよびEPS Iが発現に関与するライブラリーを構築することができ、平成30年度の研究を遂行できる準備が整った。

その結果、青枯病菌OE1-1株のクオラムセンシングは、PhcS/VsrAとPhcKによるphcA遺伝子の発現制御およびPhcAによる遺伝子の発現制御からなるPhcA経路と、PhcBによるクオラムセンシングシグナルmethyl 3-hydroxymyristate産生とPhcS/VsrAによるmethyl 3-hydroxymyristate感知およびPhcQとPhcWによる遺伝子発現制御からなるPhcQ/PhcW経路から構成されており、クオラムセンシングによる病原力遺伝子の発現制御には、PhcA、PhcQおよびPhcWすべてが必要であると推察された。平成29年度の研究成果を基に、「QSによるプライミング機構の解明」を目標に、まず、「プライミングライブラリーの構築」を行う。すなわち、マッシュルーム型バイオフィルム(mBF)から離脱した遊離細胞において、Phcライブラリー遺伝子の中で、QS起動時と同様に発現が制御されるライブラリー(プライミング候補ライブラリー)を構築する。プライミング候補ライブラリー各遺伝子の欠損株の導管への移行能と病原性を解析する。それらの株のmBF形成能を解析する。根から接種した場合には、導管への移行と病原性に関与し、mBF形成と導管へ直接接種した場合の病原性に関与しないプライミングライブラリーとする。本ライブラリーを用いて、「プライミングライブラリー遺伝子の発現の時系列解析」を行う。すなわち、mBF形成過程での、プライミングライブラリー遺伝子それぞれの発現を時系列的に解析する。以上の結果を総括して、「プライミングライブラリー遺伝子の発現の制御ネットワークの解明」を行う。レスポンスレギュレーター組み換えタンパク質とPhcA組み換えタンパク質を用い、ゲルシフトアッセイにより、プライミングライブラリー各遺伝子のプロモーターの制御機構を明らかにする。さらに、プライミングライブラリー各遺伝子の欠損株のトランスクリプトーム解析を行い、QSを介したプライミングライブラリー遺伝子の制御ネットワークを解明する。
薬剤耐性難治性卵巣癌における上皮間葉転換誘導腹膜播種の克服に向けた新機軸

本科研費の成果は、卵巣癌における薬剤の獲得耐性化そのものが種々のEMT関連分子やmicroRNAの発現抑制を介して腹膜播種を増加させる負のスパイラル現象を解明したことである。本科学研究費課題において得られた最大の知見はマウス腹膜播種モデルにおけるAD-miR-200ba/429(アデノウイルスベクター)の投与が、顕著に腹膜播種を抑制し生存率の延長に寄与した。これらの結果によって、miR-200ファミリーの腹膜中皮への発現が腫瘍-中皮間の微小環境に変化を誘導し、腹膜播種の抑制の治療ターゲットとなり得る可能性が示唆された。本科研費の目的は、卵巣癌における薬剤の獲得耐性化そのものが種々のEMT関連分子やmicroRNAの発現抑制を介して腹膜播種を増加させる負のスパイラル現象を解明することである。研究初年度にあたる本年度の研究成果は予備研究の確認とともに以下の通りである。1. TGF-betaによるEMTを誘導させた中皮細胞(CAM)では正常中皮細胞と比較して種々の卵巣癌細胞株との接着能が亢進した。2.中皮-腫瘍の共培養において、CAMとの共培養では腫瘍細胞の増殖能およびMMP2/9プロモーター活性が有意に亢進した。3. CAMでは正常中皮と比較してendogenousなmicroRNA-200b、200aおよび429 (miR-200ba/429)の発現抑制が観察されたが、exogenousにこれらmicroRNAを添加すると上記、1-3の効果がキャンセルされた。4.中皮におけるmiR-200ba/429のoverexpressionが、腫瘍の接着能および、増殖能を顕著に抑制した。5.ファイブロネクチン(FN1)の3'UTRに対するluciferase reporter assayおよび、発現解析、FN1自身の機能阻害などの結果から、miR-200ba/429が直接FN1の発現を抑制することで、TGF- beta誘導性、腫瘍の転移浸潤能の亢進効果がキャンセルされた。6. in vivoでmiR-200ba/429の腹膜播種抑制効果を検討するために、アデノウイルスベクター(AD-miR-200ba/429)を作成した。腹膜播種モデルのヌードマウスへAD-miR-200ba/429を投与したところ、顕著に腹膜播種が抑制された。研究次年度にあたる本年度の研究成果は以下の通りである。1)昨年度からの継続研究であった動物モデルにおけるmiR-200ba/429の腹膜播種抑制効果の検討であるが、マウス腹膜播種モデルにおけるAD-miR-200ba/429(アデノウイルスベクター)の投与が、顕著に腹膜播種を抑制し生存率の延長に寄与した。本年度はそれらのデータの確証をとり、論文化につなげることができた(Sugiyama K: Mol Cancer Ther 2014)。この結果、改めてmiR-200ファミリーの腹膜中皮への発現が腫瘍-中皮間の微小環境に変化を誘導し、腹膜播種の抑制の治療ターゲットとなり得る可能性が示唆された。2) EMT関連細胞骨格蛋白として我々はFascinに注目している。Fascinはアクチン繊維(F-actin, actin filament)結合(binding)及び結束(bundling)蛋白である。以下の知見を得た。a) Fascinは細胞内においては、アクチン構造(filopodia, microspike, invadopodia, lamellipodia, stress fiber)上に局在していた。b)卵巣癌細胞株におけるFascinの発現解析では、一般的にmesenchymal phenotypeを示す細胞株において高発現していた。c)それらの細胞株(HEおよびES-2)において、Fascinをknock downした結果、細胞浸潤能の低下が観察された。さらにFascin強制発現卵巣癌細胞では、コントロールと比較してgelatin分解能と浸潤能が有意に亢進していた。婦人科腫瘍学本年は動物実験まで終了し、これらの結果によって、miR-200ファミリーの腹膜中皮への発現が腫瘍-中皮間の微小環境に変化を誘導し、腹膜播種の抑制の治療ターゲットとなり得る可能性が示唆されるという結果が得られた。現在、本年度の結果をもとに論文作成を行うことができた(現在投稿中)。したがって、概ね順調に進展しているといえる。

中皮細胞が不死化されていないため、その都度のprimary cultureで得られ、研究に使用されている。研究の効率化のためにも不死化細胞を作成する。
生活習慣病を基礎とする慢性腎臓病抑制対策に関する基礎的検討

生活習慣病と慢性腎臓病は心血管病の独立危険因子であるが、その共通病因については不明であった。本研究では、この原因の一つに、糖分解物であるメチルグリオキサールが、酸化的細胞・組織障害メカニズムに関与している可能性を示した。さらに、その代謝や分解は核酸代謝に影響を与える可能性があることが示唆され、尿酸代謝との関連について作業仮設を提示した。検体収集と各種物質の測定慢性腎臓病患者の空腹時血清サンプルを200検体採取・収集。メチルグリオキサール(MGO)ならびに3-deoxyglucosone(3DG)の測定を終了した。ジカルボニル物質の測定は、既報の方法にしたがい0-フェニレンジアミン誘導体化反応を行った後にLC/MS法にて測定した。さらに、空腹時血糖、血中インスリン値からHOMA-IRを求めた。その他、中性脂肪、HDLコレステロール、C反応性蛋白等を測定し、これらの要因と腎機能との関連について検討を行った。解析結果:以下に主な解析結果を示す。(1)血中MGO濃度は腎機能の低下に伴い有意に増加したが、3DGでは有意の変化は認められなかった。(2)インスリン抵抗性の指標であるHOMA-IRは腎機能の低下に伴い増加する傾向が認められた。(3)さらに、HOMA-IRで2.0以上を呈する例の割合は、CKDステージ13と比較してステージ45の例では増加していた。(4) HDLコレステロールと腎機能との間には明らかな関連は観察されなかったが、中性脂肪値は腎機能の低下に伴い上昇していた。意義・重要性に関して検体収集と各種物質の測定慢性腎臓病患者の空腹時血清サンプルを200検体採取・収集。さらに、患者のその後の臨床経過を確認し、各種イベント(心疾患,脳卒中,死亡)に関して調査した。1.血中MGO濃度は腎機能の低下に伴い有意に増加したが、3DGでは有意の変化は認められなかった。2.インスリン抵抗性の指標であるHOMA-IRは腎機能の低下に伴い増加する傾向が認められた。3.メタボリック因子に関して、HOMA-IRで2.0以上を呈する例の割合は、CKDステージ13と比較してステージ45の例では増加していた。中性脂肪値は腎機能の低下に伴い上昇していた。4.血中MGOはイベント発生に対する独立寄与因子となっていた。意義・重要性に関して現在までの検討結果より、腎機能の低下は、血中MGO濃度の増加ならびにインスリン抵抗性の増大と関連している事が確認された。さらに、実際の臨床イベントと密接に関連していることが前向き観察調査から確認されたことより、今回の結果は、MGOの増加がインスリン抵抗性増大、心脳血管病や死亡のリスク増大に関与している可能性を示唆する内容である。今後、MGOを抑制することが治療の目標、あるいはサロゲートマーカーとなりうる可能性を示唆するものと考えられる。メチルグリオキサールとその酸化的分解物であるギ酸の細胞障害性に関する検討前年度までの検討にて、メチルグリオキサールが慢性腎臓病と生活習慣病に共通する病因因子となっている可能性が示唆された。メチルグリオキサールは生体においてグリオキサラーゼ酵素系により乳酸に解毒されるが、酸化的環境下ではギ酸に分解されることが示唆されている。そこで、その臨床的意味を検討するために、培養細胞を用いて、メチルグリオキサールとギ酸の細胞障害性について検討した。用いた細胞はヒト組織球セルラインである。メチルグリオキサールは濃度依存性に酸化的細胞障害を惹起したが、内因性過酸化水素消去処置にてその障害性は抑制された。一方、ギ酸は濃度依存性に細胞バイアビリティーを増加させたが、内因性過酸化水素消去処置にてその効果は抑制された。また、ギ酸の細胞バイアビリティー増加効果はテトラヒドロ葉酸投与で増強、葉酸拮抗剤で減弱したことより、ギ酸の細胞バイアビリティー増加にはプリン代謝系が関与していることが示唆された。意義と重要性に関して本検討結果より、毒性メチルグリオキサールからギ酸へ分解が促進されるのは生体にとって解毒作用を有するものであり合目的的と考えられた。この際には、プリン代謝系が促進されることから、尿酸生成を促す可能性も考えられた。最近、血中尿酸濃度と心血管系イベントとの関連が指摘されているが、この背景に糖の酸とメチルグリオキサールの酸化的分解が関わっている可能性も考えられる。
糖鎖合成効率の向上を目指した生理活性糖鎖ミミックの創製

本研究では、天然由来糖鎖に準じた機能を有する糖鎖ミミックを簡便かつ、迅速に得る技術を確立し、生理機能を有した糖鎖ミミックを創製すること最終目標としている。まず、糖鎖の鎖上構造をミミックした分子の創製を目指し、シアル酸含有三糖の内部ガラクトースをジオールで置き換えたミミック分子の骨格構築法を確立した。続いて、生体内では、多くの糖鎖はクラスターを形成することによって糖鎖相互作用の強度ならびに選択性を増強していることから、糖質分子を担体に導入し、多量化することで糖鎖クラスター環境をミミックした分子を調整し、レクチンや細胞との相互作用を解析した。糖鎖は、生体内における複雑な生命現象において多彩な役割を担うものの、多様で複雑な構造を有するため、その化学合成は容易ではなく、また、その構造の不均一さから天然からの単離精製も困難であるため、その機能解明は十分には進んでいない。本研究では、糖鎖機能解明研究の飛躍を目指し、天然由来糖鎖に準じた機能を有する糖鎖ミミックの創製を目的としている。これまでに、アミノエチルリンカーを介しクラスター化したマンノースユニット多量体とマンノース認識レクチンであるコンカナバリンAとの相互作用を沈殿形成および担体とした発光性ナノ粒子の発光強度変化により評価し、レクチンとの特異的な相互作用を検出することに成功している。平成25年度には、ガラクトース、シアル酸についても、アミノリンカーを導入した単糖ユニットを合成し、これを有機低分子やナノ粒子を担体としてクラスター化した。現在、これらの糖ユニットクラスターを用い、レクチンや細胞との相互作用解析を進めている。続いて、シアル酸含有糖鎖ミミックの合成研究を行った。当初は、シアル酸誘導体のアノマー位にリンカーを介して導入したメチルチオメチル基をチオグリコシドに見立てグルコサミン誘導体とカップリングすることで、目的とする糖鎖ミミック構造を得る計画であったが、カップリング反応がうまく進行しなかった。そこで、メチルチオメチル基をグルコサミン誘導体の4位に導入し、これとプロパンジオールをアノマー位に導入したシアル酸誘導体とでカップリング反応を行うことで、目的のミミック構造の構築に成功している。最終脱保護の後、合成したシアル酸含有糖鎖ミミックとシアル酸認識レクチンとの相互作用解析を行う予定である。糖鎖は、多様な生命現象において重要な役割を担う生体関連分子であるが、複雑な構造を有するため、その化学合成は容易ではなく、また、その構造の不均一さから天然からの単離精製も困難であるため、その機能解明は十分には進んでいない。本研究では、糖鎖機能解明研究を飛躍させるため、天然由来糖鎖に準じた機能を有する糖鎖ミミックを簡便に得る手法の開発を目指した。平成24年度には、以下の課題について研究を実践した。1、Oxy-Michael反応を用いたアノマー位修飾反応の検討、2、糖付加発光ナノ粒子の作成とそれを用いたレクチンアッセイ法の開発、3、Neu5Acα2-3(or α2-6)Galβ1-4GlcNAcβ1ミミックの合成研究。課題1に関しては、アノマー位に遊離水酸基を有する糖ユニットに対し、ニトロエタノールと酸試薬により発生させたニトロエチレンを作用させ、Oxy-Michael反応によりニトロ基を導入後、還元することで、効率的にアミノエチルリンカーを導入する手法を確立した。課題2については、課題1の手法によりアミノ基を導入したマンノースユニットをナノ粒子やクエン酸等の担体に導入しクラスター化した後、マンノース認識レクチンであるコンカナバリンAとの相互作用を沈殿形成および発光強度の変化により評価した。結果としては、マンノース付加ナノ粒子を用いることで、レクチンとの特異的な相互作用を検出することに成功している。また、レクチンだけではなく、特定の標的細胞と高い親和性を有する糖ユニットのスクリーニング法の開発も試みた。糖ユニットクラスターと細胞との相互作用を細胞凝集を指標に評価する手法を検討し、糖ユニットクラスターによりRAW 264.7細胞の凝集が誘起されることを確認した。課題3については、糖受容体、糖供与体ユニットの合成を完了しており、カップリングの後、レクチンとの相互作用評価を行う。糖鎖は、生命現象において多彩な役割を担う生体関連分子として、注目を集めているが、多様で複雑な構造を有する糖鎖の化学合成は容易ではなく、また、その構造の不均一さから天然からの単離精製も困難であるため、その機能解明は十分には進んでいない。本研究では、天然由来糖鎖に準じた機能を有する糖鎖ミミックを簡便かつ、迅速に得る技術を確立し、生理機能を有した糖鎖ミミックを創製すること目指した。生体内では、多くの糖鎖はクラスターを形成することによって糖鎖相互作用の強度ならびに選択性を増強している。

さらに、生体内糖鎖の多くは不均一であり、クラスター形成下で多様性の高い「糖鎖生体分子社会」を作り出して、糖鎖依存的な動態や機能を微妙に調節している。そこで、糖質分子を担体に導入し、多量化することで糖鎖ミミックを構築することとした。用いる担体としては、ポリマーでコートしたナノ粒子といった高分子担体とクエン酸のような有機小分子担体とをそれぞれ用い、これに糖質分子を導入した糖鎖ミミックを調整し、前年度までにレクチンや細胞との相互作用を解析した。本年度は、糖鎖の鎖上構造をミミックした分子の創製を目指した。3糖以上のオリゴ糖については、内部単糖はレクチン認識において比較的重要性が低く、適度な親水性と結合長を有していれば他の構造で置換しても問題ないとの仮定で、内部単糖をエチレングリコールもしくはプロパンジオールで大胆に置き換え、効率的に構築可能でかつ、機能を有したオリゴ糖アナログの創製を目指した。具体的には、N-結合型糖鎖やガングリオシドのシアル酸を含む非還元末端構造(Neu5Acα2-6Galβ1-4GlcNAcβ1-やNeu5Acα2-3Galβ1-4GlcNAcβ1)を設定し、内部のガラクトースを適切なジオールに置き換えた。現在、ミミック骨格の構築を完了しており、今後、機能評価を試みていく。天然物化学、糖化学、有機合成化学Oxy-Michael反応によるアノマー位への官能基導入反応の開発を行い、マンノース、ガラクトース、シアル酸のアノマー位へアミノリンカーを導入した単糖ユニットを合成し、これを有機低分子やナノ粒子を担体としてクラスター化した。マンノースについては、得られた糖ユニット多量体とマンノース認識レクチンであるコンカナバリンAとの相互作用を評価し、レクチンとの特異的な相互作用を検出することに成功している。シアル酸含有糖鎖ミミックについては、カップリング反応が良好には進行せず、合成ルートの変更が必要であったため、当初の計画より遅れてしまったが、メチルチオメチル基を4位に導入したグルコサミン誘導体とプロパンジオールをアノマー位に導入したシアル酸誘導体とのカップリング反応により、目的のミミック構造の構築に成功している。Oxy-Michael反応を用いた糖のアノマー位への官能基導入反応の開発については計画通り完了しており、マンノース、フコース、ガラクトース等の単糖について本反応が有効であることを確認している。また、前述の手法により合成した糖ユニットをナノ粒子やクエン酸等の担体に導入した糖ユニットクラスターを作成し、レクチンとの特異的な相互作用の検出にも成功している。また、レクチンだけではなく、細胞そのものと糖ユニットとの相互作用評価にも挑戦し、糖ユニットクラスターによりRAW 264.7細胞の凝集が誘起されることを確認した。シアル酸含有糖鎖ミミックの合成については、糖受容体、糖供与体ユニットの合成が完了しており、カップリングの後、レクチンとの相互作用評価を行っていく予定であり、研究はおおむね順調に進展していると思われる。シアル酸含有糖鎖ミミックの合成を完了させた後、Neu5Ac2-3Gal認識レクチンであるMaackia amurensis AgglutininやNeu5Ac2-6Gal認識レクチンであるSambucus sieboldiana Agglutininを用いて、ELLA法や蛍光偏光法などにより、レクチンとの結合能および特異性を評価し、有用な糖質リガンドの探索を行う。
眼内薬物投与による網脈絡膜疾患に対する治療の研究

前年度の研究では、レボフロキサシンの経口投与後の眼内動態および摘出眼杯網膜電図(ERG)を用いたレボフロキサシンの眼毒性について検討した。今年度はレボフロキサシン硝子体内注入のウサギ網膜に及ぼす影響を電気生理学的および組織学的に検討した。レボフロキサシン200または500μgの硝子体内注入では白色、有色ウサギともにERG各波に変化はみられなかったが、1000または2000μgの硝子体内注入では一過性に律動様小波振幅の低下がみられた。視覚誘発電位および組織学的検討ではいずれの注入量においても変化はみられなかった。.レボフロキサシン200または500μgの硝子体内注入はウサギ網膜に明らかな影響を与えないことが示された。そこでレボフロキサシン500μg硝子体内注入後の眼内動態について検討した。注入後のレボフロキサシンの硝子体内濃度は有色および白色ウサギともに同様な動態を示し、主要な細菌性眼内炎の起因菌のMIC_<90>を少なくとも24時間は凌駕する。その他のメラニン非含有組織内のレボフロキサシン濃度は、白色ウサギと有色ウサギとの間に有意な差はみられなかった。虹彩毛様体および網膜色素上皮・脈絡膜のメラニン含有眼組織内では、レボフロキサシン濃度は有色ウサギでは白色ウサギに比し測定したいずれの時点でも有意に高く、1週間後における有色ウサギの網膜色素上皮・脈絡膜には10μg/g以上のレボフロキサシンが検出された。レボフロキサシンがメラニン含有眼組織内に高濃度に移行し蓄積することが明らかになった。本年度はフルオロキノロン剤の中からレボフロキサシンを選択して種々の検討を行った。まず同薬剤を白色および有色家兎に全身投与(経口投与)し、1時間6時間後の眼内移行を検討した。その結果、白色家兎では投与1時間後に最も多くレボフロキサシンが眼内に移行してその後は時間経過とともに減少したのに対し、有色家兎では16時間後で眼内移行はほぼ同程度であった。全身投与後の眼組織ごとのレボフロキサシン濃度の測定から、メラニン含有組織(虹彩毛様体および脈絡膜)への移行が白色家兎に比し有色家兎で有意に高く、レボフロキサシンのメラニンに対する親和性の高いことが眼内動態に強く影響していることが判明した。また、レボフロキサシンの網膜におよぼす影響を摘出眼杯網膜電図(ERG)を指標として検討した。この検討にあたってはレボフロキサシンの光学異性体(DR-3354)との比較を行い、光学異性体間で網膜へおよぼす影響に差異があるかどうかについても検討した。その結果レボフロキサシンでは500μM灌流で、DR-3354では300μM灌流で律動様小波の振幅の低下がみられた。ERGに変化をきたさない薬物濃度はDR-3354に比してレボフロキサシンで高く、光学異性体間で網膜への影響に差が認められた。また、レボフロキサシンのERGに変化をきたさない濃度は他のフルオロキノロン剤に比して高く、レボフロキサシンの網膜に対する毒性が低いことが推測された。一方、ウイルス性眼感染症や眼内悪性腫瘍に対して用いられるインターフェロンの網膜におよぼす影響を摘出眼杯ERGを指標として検討した。インターフェロンβ5,000および10,000IU/mlの15分間の灌流で摘出眼杯ERGに変化はみられず、これらの濃度のインターフェロンβの眼内灌流は臨床的にも許容されうる濃度であると考えられた。

今年度はレボフロキサシン硝子体内注入のウサギ網膜に及ぼす影響を電気生理学的および組織学的に検討した。レボフロキサシン200または500μgの硝子体内注入では白色、有色ウサギともにERG各波に変化はみられなかったが、1000または2000μgの硝子体内注入では一過性に律動様小波振幅の低下がみられた。c波にはいずれの濃度においても変化はみられなかった。視覚誘発電位および組織学的検討(光顕および電顕)ではいずれの注入量においても変化はみられなかった。レボフロキサシン200または500μgの硝子体内注入はウサギ網膜に明らかな影響を与えないことが示された。次にレボフロキサシン500μg硝子体内注入後の眼内動態について^<14>C-レボフロキサシンを用いて検討した。注入後のレボフロキサシンの硝子体内濃度は有色および白色ウサギともに同様な動態を示し、主要な細胞性眼内炎の起因菌のMIC_<90>を少なくとも24時間は凌駕する。その他のメラニン非含有組織内のレボフロキサシン濃度は、白色ウサギと有色ウサギとの間に有意な差はみられなかった。虹彩毛様体および網膜色素上皮・脈絡膜のメラニン含有眼組織内では、レボフロキサシン濃度は有色ウサギでは白色ウサギに比し測定したいずれの時点でも有意に高く、1週間後における有色ウサギの網膜色素上皮・脈絡膜には10μg/g以上のレボフロキサシンが検出された。レボフロキサシンがメラニン含有眼組織内に高濃度に移行し蓄積することが明らかになった。
乳癌における癌幹細胞と転移に関する研究

現在basal typeやtriple negativeのような予後不良、乳癌症例に対する治療標的が注目されている。BER2陰性乳癌細胞ではc-MYCの過剰発現を認めており、MYCの上流蛋白Notchが注目されている。癌幹細胞は放射線抵抗性を示すなど根治のために重要な治療標的のひとつとして考えられている。Notchは幹細胞の細胞周期促進シグナルとして知られており、治療標的候補としての意義が注目される。【1】Notch1およびNotch3発現の臨床病理学的意義とHER2/neu蛋白との関係について明らかにする。【2】Notch1およびNotch3が乳癌の新しい治療標的となりうるか否かについて明らかにする。【1】方法:2002年-06年までに当科で手術が行なわれた浸潤性乳癌48例を対象とした。方法:モノクローナル抗体パラフィン包埋標本にて免疫染色法HER2とNotch1、Notch3の発現を調べた。結果:HER2(-)症例において、Notch1, Notch3ともに強陽性例が有意に多くみられた。また、Notch3強陽性の症例に有意にn(+)症例が多かった。【2】方法:乳癌株化細胞MCF7を対象に以下の実験を行った。CD44にて乳癌幹細胞の多くを分離した。Notch1およびNotch3をsiRNAで抑制し、放射線感受性の変化を調べた。Notch抑制により増殖能に変化を及ぼすのはCD44(+)細胞かあるいはCD44(-)細胞か?Notch抑制により放射線感受性に変化を及ぼすのは、CD44(+)細胞か、あるいはCD44(-)細胞か?結果:乳癌幹細胞分両において、Notch3抑制,により増殖能が抑制され、放射線感受性が高まった。Notch3が、治療抵抗性を規定する幹細胞分画において重要な役割を担っていることが明らかとなった。Notchは、HER2陰性かつリンパ節転移陽性乳癌に多く発現していた。特に、Notch3は治療抵抗性を規定する乳癌幹細胞分画において治療標的になりうることが明らかとなった。われわれは、「転移を形成するのは癌幹細胞である」ことを証明したいと考えている。乳腺においてはLineage^-/CD44^+/CD24^<-/low>が癌幹細胞のマーカーであると報告されている(Proc Natl Acad Sci U S A 2003,Cancer Res 2005)。これらのマーカーを指標にして幹細胞をより多く含む細胞集団を得ることができる。実際に、われわれは乳癌細胞株および乳癌臨床検体を用いてこの方法により得られた細胞集団はin vitroにおいて有意に増殖能が高く、in vivoにおいても有意に腫瘍形成能が高いことを確認した。また、CD24に加わる新規癌幹細胞マーカーとしてCD166を候補に挙げ、検討を進めているところである。CD166陰性の細胞集団の方がCD166陽性の細胞集団に比べ、in vitroにおいて有意に増殖能が高く、in vivoにおいても有意に腫瘍形成能が高いことを確認した。また、われわれは大腸癌における予後予測マーカーとしてPLS3を同定した。PLS3高発現症例は、低発現症例に比べ有意に脈管侵襲、多臓器転移が多く、予後不良であることがわかった。興味深いことに大腸癌細胞株にPLS3を導入し過剰発現させることで、EMT(上皮細胞-間葉系細胞変換)を誘導できることがわかった。現在、乳癌細胞株および臨床検体においても同遺伝子を導入することでBMTを誘導しうるかを検討しているところである。さらには、乳癌細胞株および乳癌臨床検体を用いて癌幹細胞に対してEMTを誘導し、誘導群と非誘導群の転移能について検討を進めていきたい。

Notchは、HER2陰性かつリンパ節転移陽性乳癌に多く発現していた。特に、Notch3は治療抵抗性を規定する乳癌幹細胞分画において治療標的になりうることが明らかとなった。
感染におけるマトリックスメタロプロテアーゼの活性化と病態増悪機構

今回の研究により、生体にとって外来性である細菌性プロテアーゼがマトリックスメタロプロテアーゼ(MMP)を活性化することを見出した。精製した3種類のMMP-1,-8,-9に対する、様々な病原細菌性プロテアーゼの活性化能を検討した結果、サーモライシン系に属する緑膿菌エラスターゼ、コレラ菌プロテアーゼ、そしてサーモライシンの3種類の細菌性プロテアーゼは、トリプシンと同等もしくはそれ以上のMMPの活性化能を有することがわかった。MMP-1,-8,-9の分子量は、活性化に伴いいずれも約1020kDa低分子化した。一方、セラライシン系である緑膿菌アルカリプロテアーゼ、セラチア菌56Kプロテアーゼ、およびチオールプロテアーゼであるセラチア菌73Kプロテアーゼでは活性化は認められなかった。細菌感染症は他の炎症病態と比べ、細菌性プロテアーゼという宿主にとって外来性のプロテアーゼが関与するという点で特異的な病態である。我々は、細菌性プロテアーゼによってブラジキニン産生カスケードの活性化や、免疫グロブリン、補体系といった感染防御に重要な生理活性物質の分解がもたらされ、感染病態が増悪されることを報告してきた。MMPの活性化物質は炎症増悪因子として従来より注目されているが、サーモライシン系の細菌性プロテアーゼはほかにもLegionella,Enterococcus,Staphylococcusなどの幅広い細菌属により産出されることから、この知見は細菌感染病態における組織破壊機序を考える上で、これまでになく重要であると考えられる。さらに最終年度は、細菌感染に伴った炎症反応によって生ずる一酸化窒素(NO)および活性酸素(スーパーオキサイド、O2^-)の反応生成物であるパーオキシナイトライト(ONOO^-)によるMMPの活性化メカニズムの解析を行った。その結果、ONOO^-は、グルタチオン(GSH)存在下でヒト好中球由来のMMP-8およびMMF-9、さらにヒト線維芽細胞由来のMMP-1を著明に活性化した。HPLCおよびtime-of-flight mass spectrometerによりONOO^-とグルタチオン(GSH)の反応産物の解析を行ったところ、比較的安定な反応産物としてニトログルタチオン(GS-NO^2)が同定され、さらに、別途に化学合成したauthenticなGS-NO^2はMMPを強く活性化した。このことは、ONOO^-とGSHの反応こより生じるGS-NO^2が、MMPのautoinhibitory domain内のPRCGVPD配列中のシステイン残基を攻撃し、MMP活性化をもたらすことを示唆している。以上の知見は、細菌感染病巣において、病原体より産生されるフロアーゼのみならず宿主側因子であるNOや活性酸素が、MMPの活性化を介して組織破壊を増強させ、細菌感染病態に深く関わっていることを示している。

以上の知見は、細菌感染病巣において、病原体より産生されるフロアーゼのみならず宿主側因子であるNOや活性酸素が、MMPの活性化を介して組織破壊を増強させ、細菌感染病態に深く関わっていることを示している。細菌性プロテアーゼの病原性発現メカニズムの解析を行った。本年度は、特に各種細菌性プロテアーゼによるヒトmatrix metalloproteinase(MMP)の活性化のメカニズムの解明を中心に解析を進めた。あわせて、マウスのVibrio vulnificus敗血症モデルを用いて、ブラジキニンアンタゴニストの治療実験を行った。その結果、各種細菌性プロテアーゼのうち、サーモライシンファミリーに属するコレラ菌プロテアーゼ、緑膿菌エラスターゼがMMPの強い活性化能を有することがわかった。また、これらプロテアーゼは、これまで報告のなかったMMPのアミノ酸残基を認識して、限定分解により特異的にMMPの活性化をもたらしていることがわかった。従って、病原性細菌の産生するいくつかの細胞外プロテアーゼは、宿主のMMPの活性化を介して細菌の生体内侵入を容易にし、その病原性に寄与する可能性が示された。一方、V. vulnificus敗血症モデルにおいて、ブラジキニンアンタゴニストが本菌の血行性播種を抑制し、著明な生存率の改善をもたらした。以上の知見は、細菌性プロテアーゼが宿主の内因性プロテアーゼを活性化し、組織破壊や病原細菌の生体内侵入を容易にしていることを示唆している。これまで我々は、病原細菌の産生するいくつかのプロテアーゼが、マトリックスメタロプロテアーゼ(MMP)を限定分解し、特異的に活性化することを明らかにしてきた。MMPは、細胞外マトリックス(コラーゲンなど)の改変をもたらす酵素群であり、本酵素の過剰な活性化は強い組織破壊や血管系の破綻をもたらすことが知られている。そこで本年度の研究においては、A群レンサ球菌のプロテアーゼ毒素のヒト好中球プロコラゲナーゼ(MMP-8)に焦点をあて、劇症型A群レンサ球菌感染病態解析を行った。その結果、A群レンサ球菌由来のSPE-B/チオールプロテアーゼと菌体表層プロテアーゼが相乗的に作用して、マトリックスメタロプロテアーゼを活性化することが明らかとなった。本菌の産生する2つのプロテアーゼは、宿主のMMPの活性化を介して組織破壊を促進し、菌体の組織的侵入を容易にし、重要な病原因子として作用しているものと思われた。あわせて、細菌感染に伴った炎症反応によって生ずる一酸化窒素(NO)および活性酸素(スーパーオキサイド、O_2^-)の反応生成物であるパーオキシナイトライト(ONOO^-)によるMMP-8の活性化メカニズムの解析を行った。その結果、パーオキシナイトライトはMMP-8を活性化し、さらにその活性化はグルタチオンの添加により著明に増強された。この際の活性化はMMP-8とグルタチオンの不可逆的な結合によりもたらされていた。この知見は、細菌感染病巣において、病原体より産生されるプロテアーゼのみならず宿主側因子であるNOや活性酸素が、MMPの活性化を介して組織破壊を増強させ、細菌感染病態に深く関わっていることを示している。
国際的なコーパスの開発と分析(CIPED)

本研究における第一件目の成果は建設業におけるインタビュー、各種文書を含む様々なデータを収集したことである。国際的な環境で発生する多様な技師の談話の録音データは集積され、国際的建設業におけるコミュニケーションデータコーパスとなる。過去三年間に収集したデータは、アジアおよびヨーロッパ諸国で収集された、設計段階から建設過程を含めたものとなっている。収集データ内容は小規模プロジェクト、国際的大規模プロジェクトを含む、多様な組織から多数の技術者が参加したもので、英国その他の国際的建設現場における非言語コミュニケーションの使用、国際設計ミーティングの意見対立時における論証的理解等の発見がみられる。本研究の第二件目の目的である研究成果の学術出版については、2011年にJournalofEnglishforSpecificPurposesにおいて最優秀賞を受賞した。本研究の第三件目の目的は、本研究成果を東京大学大学院の生徒および国内の技術者のコミュニケーション能力向上教育に使用することであるが、この目的についても既に成果をあげており、内容は東京大学大学院社会基盤学科教授陣対象の講義、技術者を対象としたワークショップに使用され、学術記事として出版された。現在、日本で国際的な場でのデータを含む英語コーパス教材で有力なものはなく皆無に等しい。国際的にも従来の応用言語学の研究では、ネイティブスピーカー同士の会話に焦点を当てたものが多く、国際的な英語コミュニケーション問題の研究は少数である。しかし現状、実際に世界で使われる英語の80%はノンネイティブスピーカー同士の会話であり、この割合はより増加し世界英語の広がりは進んでいる。このことから国際ビジネスシーンで活躍する人材の多い工学系研究科社会基盤学専攻で国際ラミュニゲーションカを向上させる講義を行う申請者がここで開発しているコーパス教材は、これらの現場で活用・改良が可能である。従来のビジネス英語の研究は記述書類などの研究が中心で、会話の研究は限定されていたが、申請者がビジネスで使われる生の英語を録音、研究することで、大学内での教育、研究及び企業内の人材育成の場でも活用できるデータベースCIPEDが構築可能となり、日本人のビジネス・コミュニケーション能力と国際社会での活躍を向上できる。22年度は国内外の企業等において国際ビジネス英語の音声録音を行った。この際、話し手の地位、コミュニケーションを必要とする話題などのコンテクストに関するデータも同時に収集、これらの音声テータにおける固有名詞はすべて仮名に置き換えられた(個人情報問題を解決するため)。コンテクストに関する情報はその後データベースに組み込まれ、分析可能なコーパスとなる。データ収集基準は次の通り:(1)仕事の場で発生したコミュニケーション及び仕事に関わる話題を含むコミュニケーション、(2)ノンネイティブスピーカー同士、またネイティブとノンネイティブスピーカーの間のコミュニケーション、(3)基本的に英語でのコミュニケーション。以上の基準のもと今後も世界中でかなりのテータ収集が可能である。これまで建設などエンジニアリング業界において多くデータが収集された。このことから国際ビジネスシーンで活躍する人材の多い工学系研究科社会基盤学専攻で国際コミュニケーション力を向上させる講義を行う申請者がここで開発しているコーパス教材は、これらの現場で活用・改良が可能である。従来のビジネス英語の研究は記述書類などの研究が中心で、会話分析・研究は限定されていたが、申請者がビジネスで使われる生の英語を録音、研究することで、大学内での教育、研究及び企業内の人材育成の場でも活用できるデータベースCIPEDが構築可能となり、日本人のビジネス・コミュニケーション能力と国際社会での活躍を向上できる。この際、話し手の地位、コミュニケーション、異文化背景などを必要とする話題のコンテクストに関するデータも同時に収集、これらの音声データにおける固有名詞はすべて仮名に置き換えられた(個人情報問題を解決するため)。以上の基準のもと今後も世界中でかなりのデータ収集が可能である。