hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
生物分子モーターの動的構造解析

3)粘菌ミオシンサブフラグメント1とF-アクチンの複合体のクライオ電子顕微鏡像の分解能が2nmに近づいた。ミオシンサブフラグメント1のくぼみなどが見えてきており、F-アクチンへの結合で形が変化する可能性が示唆された。本年度の「生物分子モーターの動的構造」班の成果は次のようなものである。1)ミオシンモータードメインの構造変化を1分子レベルで追跡するためのsingle-pairFRET(fluorescence resonance energy transfer)法の開発。1分子のミオシンモータードメインの2箇所を特異的な蛍光色素で標識し、標識分子ひとつから出る蛍光スペクトルを分光し、記録するための全反射照明顕微鏡を製作した。これを用いて、1分子のモータードメインのレバーアームスイングを可視化することを試みた。スイング前の状態とスイング後の状態に固定された変異ミオシンモータードメインをもちいてspFRETを観察したところ、明らかにスペクトルに変化がおこり、スイングがおこっていることが確認できた。今後は、ATP加水分解の時間経過とレバーアームスイングの時間経過との相関をとる実験をおこなう予定である。2)「新たな生物分子モーターの探索」班でクローニングした粘菌細胞の新規ミオシン、MyoMとMyoKはProcessiveモーターである可能性が強い。これを確かめる実験のため、これら新規ミオシンの発現系構築をおこなった。3)ダイニンの構造機能相関をあきらかにするため、組換えダイニンを発現させる系を構築した。このため細胞性粘菌からダイニン重鎖モータードメイン部分をクローニングし、粘菌発現ベクターに組み込み、粘菌細胞で発現させた。粘菌細胞内ではSDS電気泳動で十分確認できる量の、組換えダイニンモータードメインが発現していた。この組換えダイニンモーターの部分精製をおこなった。今後は、この大量発現系をもちいて、結晶化にもちいることができる量のダイニンモータードメインを精製する予定である。1)ミオシンモータードメインの構造変化を1分子レベルで追跡するための全反射型マルチカラー蛍光顕微鏡法の開発をおこなった。現在は、3-4色までの1分子の蛍光を10ミリ秒の分解能で検出することができるようになっている。これをもちいて、モータータンパク質の構造変化を1分子レベルで検出する試みをしている。2)これまでにクローニングした粘菌細胞の新規ミオシン、MyoMとMyoKはProcessiveモーターである可能性が強い。これを確かめる実験のため、これら新規ミオシンの発現系の作成をおこない、生化学的あるいは生物物理的測定をおこなう準備段階に入っている。3)細胞性粘菌からすべてのキネシン様たんぱく質の全長あるいは部分的cDNAをクローニングした。全長cDNAのとれたものについては、生化学的あるは生物理的測定が可能なように、大量発現系の構築をおこなっている。
共役性電子求引基の隣接位におけるキラルカルバニオンの発生と捕捉

(1)これまで立体化学的に極めて不安定なため発生が不可能と考えられてきた鎖状ニトリルのα-キラルカルバニオンの発生および炭素求電子剤による捕捉(er = 90:10)に成功した.(2)ヒドロキシアリルシランのBrook転位を経るSE2'型のプロトン化反応を利用し,電子求引性置換基Xが隣接位のキラルカルバニオンのラセミ化に及ぼす影響を半定量的に評価する方法を開発した前年度までにカルバモイル基がキラルカルバニオンのラセミ化を抑制するために極めて有効であり,光学活性ニトリルカルバニオンを発生させ求電子剤で捕捉可能であることが明らかになったので,本年度はカルバモイルオキシ基をウレイド基に置換した基質を検討した.ウレイド基は,DMPUがHMPAの代替試薬として用いられることからも分かるように高いキレーション能を有することが予測され,また,原料がアミノ酸から容易に合成可能であるという利点がある.フェニルアラニンから誘導した基質を用いて反応を検討したところ,THF中-100 °Cにおいて塩化ベンゾイル存在下LDAで処理した場合,81%,er = 96:4で立体反転成績体が得られた.興味深いことに,塩基として,LiHMDS, NaHMDS, KHMDSを用いた場合には立体保持成績体が得られた.これはNaHMDSなどの塩基性が弱い塩基を用い場合,塩化ベンゾイルが塩基に配位しながら脱プロトン化が進行するためと考えており,計算化学によってもそれを裏付ける結果が得られている.また,共役性電子求引基に隣接するキラルカルバニオンの立体化学的安定性の定量的評価法を開発する目的で,種々の電子求引基を有するα-シリルアルコールのSE2'プロトン化反応を検討した.その結果,(1)カルバモイルオキシ誘導体とシロキシ誘導体では反応機構が異なること,(2)カルバモイルオキシ基を有する基質では,電子求引基のα位にカルバニオンが発生している可能性が高いことが明らかになった.そこで,カルバモイルオキシ誘導体を用いて電子求引基が隣接位のカルバニオンのラセミ化の程度に与える影響を比較したところ,以下の序列でカルバニオンがラセミ化しやすいことがわかった.C(O)Ph> CO2Et >CONMe2 > CN >P(O)(OEt)2 > SO3p-Tol.(1)これまで立体化学的に極めて不安定なため発生が不可能と考えられてきた鎖状ニトリルのα-キラルカルバニオンの発生および炭素求電子剤による捕捉(er= 90:10)に成功した.(2)ヒドロキシアリルシランのBrook転位を経るSE2'型のプロトン化反応を利用し,電子求引性置換基Xが隣接位のキラルカルバニオンのラセミ化に及ぼす影響を半定量的に評価する方法を開発した有機リチウム化合物の求電子置換反応の立体過程を明らかにするために,二重結合とフェニル基と共役するアニオンを脱プロトン化によって発生させた後適当な求電子剤で捕捉する立体化学的研究を行った.立体化学的安定性を保持した状態で発生させることができるカルバニオンとしては限界と考えられてきた,キラルなベンジルカルバニオンよりはるかに不安定な(S,E)-1-phenylbut-2-en-1-yl diisopropylcarbamateから発生させたリチオカルバニオンの求電子置換反応の立体化学を,種々のエーテル系溶媒中,炭素求電子剤およびプロトン化剤を用いて検討した.その結果,(1)上記キラルカルバニオンはエーテル性溶媒中ー50°C,5分という条件ではラセミ化しない,(2)炭素求電子剤はinversionで,プロトン化剤はretentionで反応する割合が高いが,求電子剤および溶媒のリチウムイオンに対するキレーション能の違いによりその割合が変化する,ということが明らかになった.また,カルバモイル基を有するホモキラルなシアノヒドリン誘導体から,さらに不安定なα-ニトリルカルバニオンを発生させ,求電子置換反応の立体化学を検討した.この際問題となるのは,(1)脱プロトン化,(2)求電子置換反応,(3)塩基と求電子剤との反応,の相対速度なので,溶媒,添加物などの効果を詳細に検討したところ,Et2O-THF中シアノギ酸エチル存在下ー114°CにおいてLDAで処理すると,er = 90:10でエステル化体を立体反転で与えることが明らかになった.有機リチウム化合物の求電子置換反応の立体過程についての研究では,二重結合とフェニル基と共役するカルバニオンが予想以上に立体化学的に安定であり,炭素求電子剤はinversionで,プロトン化剤はretentionで反応するという興味深い知見が得られた.また,inversion/retentionの割合から,中間体の構造を含む立体過程について明らかにすることができ,これらの結果を学術論文として発表した(" Steric Course of the Electrophilc Substitution of a Lithiocarbanion Generatedfrom (S,E)-1-Phenylbut-2-en-1-yl Diisopropylcarbamate and Solvent Effects" Eur. J. Org. Chem. 2011, 6553-6557)また,これまで立体化学的に極めて不安定なため発生が不可能と考えられてきた鎖状ニトリルのα-キラルカルバニオンの発生および炭素求電子剤による捕捉に成功した.すなわち,O-カルバモイルシアノヒドリン誘導体を,Et2O-THF中シアノギ酸

エチル存在下ー114°CにおいてLDAで処理したところ,er = 90:10でエステル化体を立体反転で与えた.この結果についても学術論文として発表した(" Enantioselective Trapping of an α-Chiral Carbanion of Acyclic Nitrile by a Carbon Electrophile" Chem. Commun., 2012, 48, 2897-2899).鎖状ニトリルのα-キラルカルバニオンの発生に成功したので,さらなる適用範囲の拡大を目指して,分子内反応や,求電子剤の種類を検討する.また,ニトリル以外のエステル,ケトンなどの共役性電子求引基に隣接するキラルカルバニオンの立体化学的安定性の定量的評価法の開発も併せて行う.研究の遂行に必要な反応剤,溶媒,クロマトグラフ資材,ガラス器具などの購入に使用する.
ピエゾ抵抗カンチレバーによる細胞接着力の計測

ピエゾ抵抗型力センサを用いて,液中の微小な力が計測可能なセンシングシステムを構築し,細胞の接着力を計測した.このシステムはナノニュートン(nN)以下の力分解能およびミリ秒以下の時間分解能をもつことと,細胞の接着面において接着力の計測が可能であることを特徴とする.実際にウシ大動脈由来平滑筋細胞(BAOSMC)の接着力を計測し,細胞がセンサに接触・接着してから薬剤によって剥がされるまでのダイナミクスを捉えることができた.BAOSMCは播種後にセンサ上に接着してから約2時間かけて接着力を増大させること,その間に力が急速に増大する時間帯と停滞する時間帯とがあることなどがわかった.BAOSMCの接着力が最大レベルに達した後に,消化酵素トリプシンを作用させて細胞をセンサから剥がしたところ,(トリプシンの滴下から)約1分後に力が低下し始め,約10秒間かけて力が消失した.接着力は徐々に低下するのではなく,瞬間的なステップ状の変化を何度か繰り返した.細胞は接着斑とよばれるタンパク質複合体を形成して,他の細胞や細胞外マトリクスに接着することが知られている.上記の研究結果は,接着力の生成が接着斑と細胞骨格との複雑な相互作用に起因していること,接着斑が分解する過程で接着力は徐々にではなく瞬間的に解放されることがわかった.こうした知見は,今後細胞運動の力学モデルを構築する上で,重要な情報になるものと期待される.27年度が最終年度であるため、記入しない。27年度が最終年度であるため、記入しない。生きた細胞の力や力学的性質,活動のダイナミクスを観察・計測するための方法論を確立するとともに,実験を行う上で必要なセンサーや電気回路などのツールを開発した.こうしたツールを用いて,単一細胞の活動を力学的に計測した.作製したセンサーはnNオーダーの分解能を示し,数十nNから数μNと考えられている細胞の力を計測するのに十分な性能である.センサー表面の材料やコーティング,接着剤,配線方法などを比較検討し,細胞の生育に適した条件を見出した.この結果,センサーのセンシング領域に細胞(ウシ平滑筋細胞)を接着・移動させることができるようになった.反射型微分干渉という顕微手法を用いることで,センサー上を移動する細胞の姿をリアルタイムで観察することもできるようになった.これまで顕微観察が中心であった細胞実験に,力の計測を組み合わせることで,細胞の動的性質をより詳細に調べることができるようになった.センサーから得られる信号には,細胞運動に由来する電圧変化だけでなく,電源ノイズや温度変化,培地の対流など,様々な現象が影響する.センサーに温度補償機構を設けたり,信号増幅のためにロックインアンプを用いたりすることにより,安定した信号が得られるようになった.本研究で細胞計測用に開発した力センサーはピエゾ抵抗型カンチレバーであるが,カンチレバー自身の共振を利用しているわけではないので,高速応答性に理論上の制約はない.そこで,データ収集のためのプログラムを作成し,10mHzから100kHz程度までの広帯域を含む時間応答が計測できるようにした.次年度には,広帯域の応答を計測し,細胞の力学的性質をより詳細に調べてゆく.ピエゾ抵抗型力センサを用いて,液中の微小な力が計測可能なセンシングシステムを構築し,細胞の接着力を計測した.このシステムはナノニュートン(nN)以下の力分解能およびミリ秒以下の時間分解能をもつことと,細胞の接着面において接着力の計測が可能であることを特徴とする.実際にウシ大動脈由来平滑筋細胞(BAOSMC)の接着力を計測し,細胞がセンサに接触・接着してから薬剤によって剥がされるまでのダイナミクスを捉えることができた.BAOSMCは播種後にセンサ上に接着してから約2時間かけて接着力を増大させること,その間に力が急速に増大する時間帯と停滞する時間帯とがあることなどがわかった.BAOSMCの接着力が最大レベルに達した後に,消化酵素トリプシンを作用させて細胞をセンサから剥がしたところ,(トリプシンの滴下から)約1分後に力が低下し始め,約10秒間かけて力が消失した.接着力は徐々に低下するのではなく,瞬間的なステップ状の変化を何度か繰り返した.細胞は接着斑とよばれるタンパク質複合体を形成して,他の細胞や細胞外マトリクスに接着することが知られている.上記の研究結果は,接着力の生成が接着斑と細胞骨格との複雑な相互作用に起因していること,接着斑が分解する過程で接着力は徐々にではなく瞬間的に解放されることがわかった.こうした知見は,今後細胞運動の力学モデルを構築する上で,重要な情報になるものと期待される.研究実施計画に記載された内容については,ほぼ達成したと考えている.研究実績として記載していないものに,細胞外マトリックスと蛍光染色がある.細胞外マトリックスのコーティングについては,センサー上に細胞が接着するために必要であると考えていた.しかし,実際に細胞を培養してみたところ,細胞外マトリックスの有無よりも,センサーチップ周辺の電気配線材料が接着性に強く影響していることがわかった.結果として,センサーチップと回路基板を金の配線でつなぐことにより,細胞外マトリックス等をコーティングせずとも,細胞がセンサーによく接着するようになった.蛍光染色については,微分干渉による観察が予想以上に優れていることから,その必要性が低下した.ただし,今後,より小さなセンサーを用いて細胞内の力分布が計測できるようになれば,細胞骨格の形状変化との対応を見るために蛍光染色が有用となることも予想される.

そうした状況を見越して,すでに染色方法の検討を進めるとともに,遺伝子操作によって染色なしに蛍光観察が可能な細胞の培養も始めている.一方,計画に含まれていなかった内容として,広帯域の時間応答を計測できるセットアップの構築が挙げられる.これを用いて,次年度には細胞のダイナミクスや力学的性質をより詳細に解析できることが期待される.27年度が最終年度であるため、記入しない。【研究実績の概要】および【現在までの達成度】に記載したとおり,細胞の力や高周波応答を計測するための実験環境が整い,実際に生きた細胞の運動を調べることができるようになった.今後は,一般的な細胞の力学的性質や細胞種による違いを調べてゆく.具体的には,細胞が運動する際の力や振動を高い時間分解能で計測し,信号に含まれる特徴的なスペクトル応答を抽出する.また,可能であれば,そうした応答の生物学的根拠についても議論したい.これは必ずしも本研究課題における目的とは考えていないが,こうした細胞に対する測定結果を生物学的な知見につなげることで,より価値の高い研究成果にすることができる.そのために,自らも関連する研究動向を調査し,細胞の力学モデルを考案するだけでなく,細胞生物学に明るい研究者とも議論し,必要があれば協力してゆきたい.27年度が最終年度であるため、記入しない。
ハイブリッド型人工血管における人工素材一細胞間の相互作用に関する組織学的検計

我々は小口径人工血管の開存性を向上させるために、人工血管上に血管内皮細胞を移植する所謂ハイプリッド型人工血管の研究を行なってきた。平成3年度までは、あらかじめ採取培養増殖させたイヌ内皮細胞を内径7mmの人工血管に植えつけその生育状態をin vitroで観察する実験と、続いてこの内皮細胞を植えつけた人工血管を犬の腹部大動脈へ移植しin vivoにおける移植血管の組織学的変化を4か月まで経時的に検討する実験を行い、その成果はこれまで報告してきた。今年度は1、内径4mmの小口径人工血管を用いてsecdingされた内皮細胞が果たして開存率向上に貢献するか否か、2、ヒト内皮細胞を用いたin vitroの基礎実験で、人工血管上の内皮細胞の付着力を向上させるための要素は何か、内皮細胞の凍結保存により機能変化は生じるか、といったテーマを中心に検討を進め、臨床応用に向けての準備とした。(研究成果)1、直径4mmのイヌ内皮細胞のscedcdgraftを7本作成し、細胞を植えつけないcontrol graftと共にそれぞれ左右にイヌ頸動脈に移植し、3ケ月後に回収して比較検討した。controlgraftはすベて閉塞したのに対して、sccdedgraftは7本中2本開存した。開存したgraftを検討すると中央部では内皮細胞の一層構造が形成され薄い内皮下組織に支えられていたが、吻合部では内皮細胞層の下に厚い内皮下組織が形成され宿主管の肥厚した内膜へと連続しているのが観察された。又、閉塞したgraftの中には吻合部には器質化した硬い白色血栓があっても、中央部には新鮮な赤色血栓のみ観察されるものがあった。2、in vitroの拍動流循環回路を作成し、成人大伏在静脈より採取した内皮細胞をsccdingしたePTFEgraftを組み込んで90分間shear stressを加え、付着力に及ぼすseeding細胞濃度とseeding後移殖するまでのgraftの培養時間の影響を検討した。confluent濃度でseedingした場合は24時間培養で付着力が最大になりそれ以降は低下した。hypoconfluent濃度でseedingした場合は7日間培養して細胞がgraft上でconfluentになった時に最大の付着力を示した。3、成人大伏在静脈より採取した内皮細胞を用いて凍結保存の機能面へ及ぼす影響を調ベた。その結果、凍結保存されたヒト血管内皮細胞はPGI_2放出能、tPA産生能を維持していた。(考察)臨床においては末梢動脈血行再建の際に問題となる晩期閉塞の最大の要因は吻合部内膜肥厚であると言われている。今回我々の行なった実験では、細胞を移植しても吻合部とgraft中央部の組織学的反応が異なり、graft中央部では坑血栓性を得ても、吻合部では内膜肥厚が生じてくることが見いだされ、閉塞の原因になりうることが推定された。吻合部内膜肥厚の原因は平滑筋の過剰な増殖であるとされている。今後の研究の方向としてはseedingに加え、平滑筋の増殖をcontrolする方法を検討して行くことが大切であると思われる。一方、ヒト内皮細胞を用いた基礎実験で細胞は凍結保存にたえうること、一定の条件下ではseedingされたgraft上で十分な付着力を持つことが明らかになり臨床応用への発展が期待される。1.血管内皮細胞の採取および培養法;イヌの頚静脈を無菌的に採取し、この内腔にカヌレ-シヨンして、0.1%のcollagenase溶液を、37°Cで10分間作用させた後、静脈内腔を40ccのMediumー199で洗浄し、この洗浄液を遠沈し、得られた沈渣を初代細胞とした。血管平滑筋細胞等の混入は、血管の採取時の壁の挫滅、静脈採取から細胞採取までの保存時間、酵素濃度および作用時間、酵素作用後の内腔の洗浄の程度等いくつかの要素が関与し、完全に防止し難いが、上記の方法によって、ほぼ安定して、コンタミネ-ションの無い内皮細胞が得られた。培養液としては、Mediumー199に牛胎児血清20%,Hepesbuffered medium15mM,Lーglutamine4mM,heparine50u/ml,Endothelial cell growth supplement(Sigma #EO760)20μg/ml,に抗生剤を加えたものを使用し、37°C5%CO_2濃度下に静置培養し、隔日に培養液の交換を行った。この条件で、数世代にわたって安定した継代が可能であったが、継代による細胞の形質の変化の可能性等を考慮し、実験は、主として初代ないし代2代培養細胞を用いた。2.内皮細胞のポリエステル繊維上への生着についての検討;表面加工をしていないポリエステル繊維織布上への内皮細胞の生着性に関して、臨床で用いられている、woven Dacron(Cooley VeriーSoft^R、以下W.D.)とvelour woven Dacron、および、新しい素材である超極細ポリエステル繊維で作成した起毛性織布(以下SAM)において検討した。細胞間隙に捕捉させる形で撒き付けた内皮細胞は、予めfibronectin等で表面加工していないポリエステル繊維上にも扁平に広がり生着するのが観察された。また、高濃度に生着させた場合W.D.やSAMのように繊維間隙が狭い織布では、この間を埋める基質がないにも関わらず、繊維間を橋渡しするような形で人工織布上に一層の細胞層を形成して来るのが観察された。

繊維間隙の小さなSAMおよびwoven Dacronでは、ともに良好に細胞は捕捉されたが、起毛のない平織りものでは再び培養液中に流れ出てしまう為か、生着率は不良で、SAMにおいて最も良い生着が得られた。我々は小口径人工血管の開存性を向上させるために、人工血管上に血管内皮細胞を移植する所謂ハイプリッド型人工血管の研究を行なってきた。平成3年度までは、あらかじめ採取培養増殖させたイヌ内皮細胞を内径7mmの人工血管に植えつけその生育状態をin vitroで観察する実験と、続いてこの内皮細胞を植えつけた人工血管を犬の腹部大動脈へ移植しin vivoにおける移植血管の組織学的変化を4か月まで経時的に検討する実験を行い、その成果はこれまで報告してきた。今年度は1、内径4mmの小口径人工血管を用いてsecdingされた内皮細胞が果たして開存率向上に貢献するか否か、2、ヒト内皮細胞を用いたin vitroの基礎実験で、人工血管上の内皮細胞の付着力を向上させるための要素は何か、内皮細胞の凍結保存により機能変化は生じるか、といったテーマを中心に検討を進め、臨床応用に向けての準備とした。(研究成果)1、直径4mmのイヌ内皮細胞のscedcdgraftを7本作成し、細胞を植えつけないcontrol graftと共にそれぞれ左右にイヌ頸動脈に移植し、3ケ月後に回収して比較検討した。controlgraftはすベて閉塞したのに対して、sccdedgraftは7本中2本開存した。開存したgraftを検討すると中央部では内皮細胞の一層構造が形成され薄い内皮下組織に支えられていたが、吻合部では内皮細胞層の下に厚い内皮下組織が形成され宿主管の肥厚した内膜へと連続しているのが観察された。又、閉塞したgraftの中には吻合部には器質化した硬い白色血栓があっても、中央部には新鮮な赤色血栓のみ観察されるものがあった。2、in vitroの拍動流循環回路を作成し、成人大伏在静脈より採取した内皮細胞をsccdingしたePTFEgraftを組み込んで90分間shear stressを加え、付着力に及ぼすseeding細胞濃度とseeding後移殖するまでのgraftの培養時間の影響を検討した。confluent濃度でseedingした場合は24時間培養で付着力が最大になりそれ以降は低下した。hypoconfluent濃度でseedingした場合は7日間培養して細胞がgraft上でconfluentになった時に最大の付着力を示した。3、成人大伏在静脈より採取した内皮細胞を用いて凍結保存の機能面へ及ぼす影響を調ベた。その結果、凍結保存されたヒト血管内皮細胞はPGI_2放出能、tPA産生能を維持していた。(考察)臨床においては末梢動脈血行再建の際に問題となる晩期閉塞の最大の要因は吻合部内膜肥厚であると言われている。今回我々の行なった実験では、細胞を移植しても吻合部とgraft中央部の組織学的反応が異なり、graft中央部では坑血栓性を得ても、吻合部では内膜肥厚が生じてくることが見いだされ、閉塞の原因になりうることが推定された。吻合部内膜肥厚の原因は平滑筋の過剰な増殖であるとされている。今後の研究の方向としてはseedingに加え、平滑筋の増殖をcontrolする方法を検討して行くことが大切であると思われる。
Lonプロテアーゼによる緑膿菌のタイプIII病原蛋白分泌機構の制御に関する研究

代表的な日和見感染症原因菌である緑膿菌が病原性発現するためには、様々な病原因子が関与している。我々が昨年までの研究から、緑膿菌はLonプロテアーゼとLonと相同性の高いLonHを有しており、これらの欠損株において病原因子であるピオシアニン分泌が増加することを見出した。このうちLonによるピオシアニンの産生は、緑膿菌クオラムセンシング(QS)システムの一つRhlサーキットによって制御されることが示唆された。LonによるRhlサーキットの制御機構の詳細について検討した結果、LonはRhlサーキットの制御に関るもう一つのQSシステム、Lasサーキットを負に制御していることを見出した。Lasサーキット制御には制御因子LasR、AI産生因子LasIの二つの制御タンパク質が関与している。Lonによる制御がLasR、LasIのどちらを介するのかを明らかにするため、Lon欠損株にLasR欠損を導入し、作成した抗LasI抗血清を用いて細胞内LasI量を検討した。その結果、Lon欠損株ではLasIが顕著に増加しており、またLon・LasR二重欠損株でも顕著に増加していた。LonがLasIの安定性に関る可能性を考え、パルス・チェイス法によりLasI安定性を野生株およびLon欠損株で比較した。その結果、LonはLasIの細胞内安定性に関ることが明らかとなった。又、抗RhlR抗血清を作成し、野生株、Lon欠損株、LonH欠損株、Lon・LonH欠損株の細胞内量を比較した。その結果、LonH欠損株は野生株と同等であったが、Lon・LonH欠損株のRhlR量がLon欠損株よりも顕著に増加していた。このことから、LonHはLonと類似の機能を持つことが示唆された。以上の結果より、緑膿菌のLonはLasIの分解を介してQSシステムを負に制御する因子であり、タイプIII分泌蛋白質を含む多くの病原因子の制御に必須であり、又、LonHも弱いもののQS制御に関ることが明らかとなった。代表的な日和見感染症原因菌である緑膿菌は既存の抗菌薬に対して自然耐性などを示すことから、その性状を解明した上での有効な抗緑膿菌薬の開発が望まれている。我々は大腸菌やサルモネラのLonプロテアーゼが薬剤感受性に影響する因子また病原性発現制御因子であることを見出しており、緑膿菌のLonに着目した。本年度は緑膿菌における2種のLonの役割を明らかにする目的で、緑膿菌PAO1株染色体上のlonおよびlon2(PA0779)遺伝子各破壊株(Δlon株、Δlon2株)および両遺伝子破壊株(ΔlonΔlon2株)を構築し、性状解析を行った。まず各ストレスに対する役割を調べた。その結果、Δlon株はフィラメント化しUV、過酸化水素に感受性化したことから、Lonが大腸菌やサルモネラのLonと同様の役割を担うことが示された。続いてフルオロキノロン剤レボフロキサシン(LVFX)に対する感受性を検討したところ、野生株、Δlon2株は0.2μg/mlまで増殖できたが、Δlon株、ΔlonΔlon2株では0.05μg/mlで増殖できなくなり、LVFXに対して著しく感受性化していた。このことから緑膿菌LonはLVFX感受性に寄与することが明らかとなった。また病原性発現に関与するタイプIII分泌蛋白質ExoS、ExoTの分泌量を野生株と比較した結果、Δlon株でExoS、ExoT量が減少、Δlon2株でExoS量が減少していた。このことからLonおよびLon2はタイプIII蛋白質分泌機構の調節に関与することが示唆された。興味深いことにΔlon株、ΔlonΔlon2株ではクオラムセンシング(QS)で制御されるピオシアニンの分泌が顕著に増加しており、LonはQSの制御に関わることが示唆された。QSは緑膿菌の病原性発現調節で最も重要であることから、Lonによる制御を解明することは重要な知見が得られると考えられる。我々が昨年行った研究から、緑膿菌はLonプロテアーゼとLonと相同性の高いLonHを有しており、これらの欠損株において病原因子であるピオシアニン分泌が増加することを見出した。緑膿菌はクオラムセンシング(QS)によって多種の病原因子の遺伝子発現を調節しており、ピオシアニン産生もQSによって制御されている。そこで、LonおよびLonHがQS制御に関る可能性を考え、ピオシアニン同様QSによって制御されるヘモリシンの活性について鳥血液含有培地を用いて検討した。その結果、Lon欠損株およびLon・LonH二重欠損株の溶血活性は野生株と比較して顕著に増加していた。このことから、LonがQS制御に関ることが示唆された。ピオシアニンやヘモリシンの産生に関るQSシステムは、las、rhlである。QSを制御する因子の一つに細胞外に放出されるオートインデューサー(AI)があり、rhlのAIの量を比較したところ、野性株に比べてLon欠損株では顕著に増加していた。また、LonH欠損株は野生株よりも減少していたものの、Lon・LonH二重欠損株ではLon欠損株よりも顕著に増加していた。また、rhlの細胞内制御因子であるRhlR量を調べるため、His^6×RhlRを精製し、抗血清を作成した。

作成した抗血清を用いて細胞内量を比較したところ、Lon欠損株およびLon・LonH二重欠損株では野生株と比較して顕著に増加しており、又LonH欠損株では減少していた。このことから、LonおよびLonHは緑膿菌のQSの一つrhlサーキットの制御に関っていることが明らかとなった。QSはタイプIII分泌システムの制御に関ることが報告されていることから、LonおよびLonHはQS制御を介してタイプIII分泌システム制御を行うことが考えられる。代表的な日和見感染症原因菌である緑膿菌が病原性発現するためには、様々な病原因子が関与している。我々が昨年までの研究から、緑膿菌はLonプロテアーゼとLonと相同性の高いLonHを有しており、これらの欠損株において病原因子であるピオシアニン分泌が増加することを見出した。このうちLonによるピオシアニンの産生は、緑膿菌クオラムセンシング(QS)システムの一つRhlサーキットによって制御されることが示唆された。LonによるRhlサーキットの制御機構の詳細について検討した結果、LonはRhlサーキットの制御に関るもう一つのQSシステム、Lasサーキットを負に制御していることを見出した。Lasサーキット制御には制御因子LasR、AI産生因子LasIの二つの制御タンパク質が関与している。Lonによる制御がLasR、LasIのどちらを介するのかを明らかにするため、Lon欠損株にLasR欠損を導入し、作成した抗LasI抗血清を用いて細胞内LasI量を検討した。その結果、Lon欠損株ではLasIが顕著に増加しており、またLon・LasR二重欠損株でも顕著に増加していた。LonがLasIの安定性に関る可能性を考え、パルス・チェイス法によりLasI安定性を野生株およびLon欠損株で比較した。その結果、LonはLasIの細胞内安定性に関ることが明らかとなった。又、抗RhlR抗血清を作成し、野生株、Lon欠損株、LonH欠損株、Lon・LonH欠損株の細胞内量を比較した。その結果、LonH欠損株は野生株と同等であったが、Lon・LonH欠損株のRhlR量がLon欠損株よりも顕著に増加していた。このことから、LonHはLonと類似の機能を持つことが示唆された。以上の結果より、緑膿菌のLonはLasIの分解を介してQSシステムを負に制御する因子であり、タイプIII分泌蛋白質を含む多くの病原因子の制御に必須であり、又、LonHも弱いもののQS制御に関ることが明らかとなった。
一次元遷移金属錯体における強い電子格子相互作用、電子間相互作用と光物性

・強相関一次元金属錯体系の光励起状態の研究ハロゲン架橋Ni錯体について、電場変調反射スペクトルの測定を行った。様々なNi錯体に共通して、最低励起子の高エネルギー側に一光子遷移禁制な励起子準位を観測した。この錯体系について三次の非線型光学定数を見積もったところ、10e-4から10e-8esuという大きな値であることがわかった。この値は、従来非線形光学定数が大きいと言われていたポリジアセチレンやポリシランのそれに比べて三桁以上大きい。また、一次元の銅酸化物についても、同様な測定から大きな三次の非線型光学定数(10e-8esu)を観測した。以上から巨大な非線形光学応答は、強相関一次元系に共通した特徴であると結論された。さらに、光伝導の励起エネルギー依存性の測定を行って、電場変調反射測定の結果から求められた励起準位構造と比較した。バンド幅が大きい物質ほど光伝導が電荷移動吸収帯の低エネルギー領域から立ちあがり、また奇と偶の電荷移動励起状態の分裂幅が小さくなることがわかった。このことは、バンド幅の増加とともに励起子効果が減少すると考えて定性的には理解できる。また、Ni-C1系では励起子発光が観測された。この発光の励起エネルギー依存性についても測定したが、その結果は、発光過程とキャリアヘの解離過程が競合していることを示している。・一次元遷移金属錯体における価数不安定性と相転移の研究ハロゲン架橋複核Pt錯体、R4[Pt2(POP)4I]について、カウンターイオンRを変化させた様々な錯体の偏光反射、ラマン、帯磁率を測定し、これらが、モットハバード相、電荷分極相、スピンパイエルス相の三つの相をとることを明らかにした。
「文芸の共和国」としてのプランタン=モレトゥス出版工房の総合的研究--第二期

16世紀にアントウェルペン(アントワープ)に移住したフランス人によって作られた、ヨーロッパ随一の印刷・出版工房を中心として、「文芸の共和国」をキーワードに、広い視野で文学・芸術を見るという目的は、一定の成果を収めることができた。プランタンが出版した『フランドル語・フランス語対照ことわざ辞典』にラブレーの短文が引用されていることを新たに発見した。アントウェルペンで活動したブリューゲル(《フランドルのことわざ》の作者だ)とラブレーとが、「ことわざ」を媒介として、間接的ながらつながった。このことをブリューゲル展のカタログで日本語と英語で発表し、確実な反響を得たのが一例といえよう。また、本研究の実践態として、この10年間、ラブレーの翻訳に傾注してきたわけだが、2012年に『第五の書』を上梓して、この苦しい作業を終えたのも、大きな成果だと思う。そして、この《ガルガンチュアとパンタグリュエル》全5巻の翻訳に対して、「第64回読売文学賞」「第18回日仏翻訳文学賞」という2つの価値ある賞を受けることができた。研究者としては、科研費による研究の意義をしっかりと確認することができた。16世紀から17世紀にかけて、商都アントウェルペンを拠点として全ヨーロッパを、さらには新大陸をも視野に収めて、壮大な出版活動を展開したプランタン=モレトゥス工房について、創業者クリストフ・プランタンの書簡集の繙読、出版物の具体的な検討、プランタンの出身地フランスでの足跡の調査などを進めているわけだが、今年度の最大の成果は、ゲント生まれのカトリック知識人・大学教授のフートハルスが1568年に刊行した『フランドル語・フランス語対照ことわざ辞典』(近代版は存在せず)の調査によって、ラブレーへの言及を数カ所発見したことである。これは小なりといえども、新発見なのである、ラブレー受容の研究に、一定程度の貢献をはたすことができた。それと同時に、フランスの偉大な物語作家・ユマニストとフランドルの偉大な画家・版画家ブリューゲルとが、「ことわざ」によって、間接的な形で結びついているというか、「ことわざ」が支配する言語・図像空間に同居していたことが、あらためて確認できたと思う。プランタンが幼少時を過ごしたとされるリヨンにも、久しぶりに赴き、調査をおこなったものの、当初の予測どおり、史料面での裏付けを得ることはできず、「世界文化遺産」となった旧市街を訪ねて、写真撮影などをおこない、往時を想像するにとどまった。残念ながら、これまたプランタンゆかりの土地とされるノルマンディのカーンCaenに行く余裕はなく、次年度まわしとなった。関連実績としては、モンテーニュ『エセー4』(白水社)を刊行することができた(全7巻のうち)。《フランス・ルネサンス文学集》全3巻(白水社)の訳稿もほぼ出そろったところである。今後、2011年年度中の刊行開始に向けて、具体的な編集作業に着手したい。16世紀から17世紀にかけて、フランドルの商都アントウェルペンを拠点として、ヨーロッパのみならず新大陸をも視野に収め、しかも17世紀には、かのルーベンスの工房とも協力して、壮大な出版活動を展開した、プランタン=モレトゥス出版工房について、書簡集の繙読や、出版物の具体的な調査などを継続しておこなっている。また、未公刊のプランタンの『家事日記』も、写真撮影をおこなって、解読を継続しているが、正直な話、こちらについては難読というしかない。昨年度の発見である、フートハルス『フランドル語・フランス語対照ことわざ辞典』(プランタン、1568)におけるラブレーへの言及に関しては、2010年開催の「ブリューゲル版画の世界」展(Bunkamuraほか)のカタログに論文を寄せたわけだが、拙訳のラブレー『第五の書』の解説でも、ラブレーの影響に関する新発見として、一節を設けている(2012年5月刊行予定)。関連研究ではあるが、『第五の書』をもって、渡辺一夫以来の新訳を完成することができて、『本の都市リヨン』(晶文社)、『ラブレー周遊記』(東大出版会)と合わせて、ラブレー研究を集大成することができた。また、プランタンへの言及があるモンテーニュ『エセー』については、現在、その第5巻目を、鋭意翻訳中である(2012年刊行予定)。

資料収集のために、2度、フランスに赴き、プランタンの生地といわれるToursにも久しぶりに行ったが、具体的な史料が残っているというわけではないらしかった。Caenは、またしても行きそびれてしまい、次年度の課題となった。印刷職人の心性に関しては、18世紀パリのものではあるが、ニコラ・コンタ『逸話集』の解読・研究を准め、ようやく翻訳を終えた(水声社より刊行を予定)。最終年度には、これまでの成果を具体化することができた。申請者はアントウェルペンのプランタン=モレトゥス印刷博物館およびその所蔵文書を、主たる研究対象としたわけだが、プランタンが出版した、フートハルス著『フランドル語・フランス語対照ことわざ辞典』(1568)において、いくつかのことわざの典拠としてラブレーと明記されていることを新たに発見し、このことを、拙訳『第五の書』の解説でも論じた。『第五の書』自体が、新作ではなく、ラブレーをめぐる「パラテクスト」と解釈できるからである。そして本邦初公開の『パンタグリュエルの滑稽な夢』(1565)なども付録として、邦訳『第五の書』を上梓することで、フランドルの画家ブリューゲルとのある種の「間テクスト性」をも明るみにだすことができた。そして、これまでの数次にわたる「科研」の実践態として2005年より精力を注いできたラブレー《ガルガンチュアとパンタグリュエル》全5巻(筑摩書房)の日本語訳を完成することができたわけで、これはヨーロッパの古典をわが国において継承していく上で、大きな成果であると誇っていいと信じている。事実、このラブレーの翻訳・註解に対して、読売新聞社より、第64回「読売文学賞、研究・翻訳部門」を受賞する栄誉にも浴したのである。以上の研究のほかにも、プランタン=モレトゥスが所蔵する1595年版『エセー』(グルネー嬢手沢本)を参照した、『エセー』の新訳も順調に進行し、2013年2月に『エセー5』を刊行することができた。残るのは、プランタンの『家事日記』や『書簡集』から得た知見を盛り込んで、彼の生涯とその知のネットワークを描き出すことだと、気力を新たにしている。プランタンの『家事日記』の解読には難渋しているが、それ以外は、大体予想した成果は達成している。深く関連する、ラブレーの翻訳はついに完成し、モンテーニュ『エセー』も、あと3巻を残す段階となったわけで、こちらに比重を置いて考えるならば、(1)と評価しても、過大ではないのかもしれない。24年度が最終年度であるため、記入しない。プランタン=モレトゥス出版工房は「世界遺産」となったにもかかわらず、わが国ではまだまだ知られざる存在であるから、本研究を基礎にして、ぜひともクリストフ・プランタンの伝記のような著作を世に問いたいと考えている。文書解読がメインの研究であり、長期的な視野で評価していただきたいし、可能ならば、第三期もおこないたいと願っている。
ブタ凍結乾燥精子のDNA断片化低減と修復機構の解明による産子作製

ブタ精子の凍結乾燥を行うとDNAの断片化が起きる。この断片化はトレハロースにて軽減できるが、処理の有無で受精・胚発生に影響を及ぼさない。DNAの断片化の修復を引き起こす遺伝子が発現する可能性がある。そこで、成熟卵への注入後に6種のDNA修復遺伝子発現を確認したが、断片化されたDNAによって遺伝子発現が誘導されないことが示唆された。一方、卵の成熟が進むにつれ、いくつかの遺伝子でその発現が進展した。卵の成熟中にDNA修復遺伝子の発現量が増加することで、顕微授精卵において凍結乾燥精子のDNAの断片化が修復される可能性が示された。また、顕微授精卵を移植したが妊娠には至らなかった。本研究課題の目的(現在までの達成度の欄に記述)に従い、以下の実験を実施した。1.これまでの成果として、トレハロースのDNA断片抑制効果に関する実験を行った。7.5ないし15 mM添加で有意な抑制効果が得られた。顕微授精後の正常受精(前核)率ならびに胚盤胞発生率に差がなかった。このことは、卵そのものにDNA修復効果があると可能性があることが示唆された(Thi Men et al., Theriogenology 2013;80: 1033-44)。3.受精卵(胚)移植実験:トレハロース処理凍結乾燥精子を顕微注入し、約10時間後に借り腹雌豚に移植を行った。4頭に移植したが、いずれも妊娠に至らなかった。そこで、今年度は、成熟段階以前の卵、すなわち、卵胞より採卵直後の卵核胞期の卵(GV卵)、やや減数分裂が進行した卵核胞後期の卵(GV-L卵)、卵核胞崩壊後で成熟が進行段階にある第一減数分裂中期の卵(M-I卵)と、第二減数分裂中期の成熟卵(M-II卵)で、これら6遺伝子の発現を調べたところ、UDGの発現がM-I卵ならびにM-II卵で、XPCの発現がM-II卵でそれぞれ他の成熟段階の卵(GV卵GV-L卵ならいびにGV卵M-I卵)に比べ有意にアップレギュレートしていた。さらに、MSH2およびRAD21遺伝子においても成熟が進行するにつれて発現量が増加する傾向が認められた。これらの結果から、凍結乾燥精子を顕微授精された受精卵においては、卵の成熟培養中にDNA修復遺伝子が蓄積するか、あるいはDNA修復遺伝子の発現量が増加する可能性が示唆された。これらの成果はAnimal Science Jornalに受理された。昨年度にひきつづき顕微授精卵の移植実験を行った。15 mMトレハロース処理の凍結乾燥精子を顕微注入し、10時間後に借り腹雌豚に移植を行った。3頭に移植したがいずれも妊娠に至らなかった。前年度の4頭に加え計7頭でネガティブな結果が得られた。本研究では、超低温保存が不必要な遺伝資源の保全法の可能性として、家畜(ブタ)における精子の凍結乾燥保存に関する研究を行う。1)凍結乾燥の際に生じる精子DNA断片化の軽減を目的に、適切な凍結乾燥用の溶液の添加物を選択しその効率化を図る。次に、2)精子注入卵における断片化DNAの修復機構、とくに修復機構に関与する遺伝性発現について調べる。さらには、3)世界初となる家畜の凍結乾燥精子からの産子作製を目指す。平成25年度は、1)の目的に従い、トレハロースの効果についての知見を得た。さらに昨年度は2)のDNA断片化を修復する6つの候補遺伝性についてはRT-PCRに検索を行ったが、発現量に差がなかった。そこで本年度は、初期の計画にはなかった追加実験を行い、卵の成熟が進行するにつれ特定のDNA修復遺伝子の発現量が増加する可能性が示唆され、論文発表も行ったことから、研究はおおむね順調に進捗していると判断した。一日得で、3)の顕微授精卵(胚)の移植実験については成功例を示せなかったことから、最終年度で引き続きチャレンジする。これらの成果はAnimal Science Journalに受理された。昨年度は、ひきつづき顕微授精卵の移植実験を行った。15 mMトレハロース処理の凍結乾燥精子を顕微注入し、10時間後に借り腹雌豚3頭に移植を行った。いずれも妊娠の継続は認められなかった。本年度についても、ひきつづき顕微授精卵の移植実験を行った。15 mMトレハロース処理の凍結乾燥精子を顕微注入し、8もしくは12時間後に借り腹雌豚2頭づづ(計4頭)に移植を行った。

いずれも妊娠の継続は認められなかった。ブタ精子の凍結乾燥を行うとDNAの断片化が起きる。この断片化はトレハロースにて軽減できるが、処理の有無で受精・胚発生に影響を及ぼさない。DNAの断片化の修復を引き起こす遺伝子が発現する可能性がある。そこで、成熟卵への注入後に6種のDNA修復遺伝子発現を確認したが、断片化されたDNAによって遺伝子発現が誘導されないことが示唆された。一方、卵の成熟が進むにつれ、いくつかの遺伝子でその発現が進展した。卵の成熟中にDNA修復遺伝子の発現量が増加することで、顕微授精卵において凍結乾燥精子のDNAの断片化が修復される可能性が示された。また、顕微授精卵を移植したが妊娠には至らなかった。本研究では、超低温保存が不必要な遺伝資源の保全法の可能性として、家畜(ブタ)における精子の凍結乾燥保存に関する研究を行う。1)凍結乾燥の際に生じる精子DNA断片化の軽減を目的に、適切な凍結乾燥用の溶液の添加物を選択しその効率化を図る。次に、2)精子注入卵における断片化DNAの修復機構、とくに修復機構に関与する遺伝性発現について調べる。さらには、3)世界初となる家畜の凍結乾燥精子からの産子作製を目指す。平成25年度は、1)の目的に従い、トレハロースの効果についての知見を得た。さらに2)のDNA断片化についての次年度につながる前段階の知見を得たことから、研究はおおむね順調に進捗していると判断した。3)の顕微授精卵(胚)の移植実験については成功例を示せなかったことから、次年度以降にチャレンジする。平成28年度の研究実施計画引き続き、高発生能を示す胚が得られることを確認し、レシピエント豚に受精卵もしくは胚移植を行い、産子作製を目指す。産子作製が成功したら論文発表を行う。家畜繁殖学平成27年度の研究実施計画精子のDNAが高度に断片化されている場合、この精子が注入された場合に、実際にDNAの修復に関わる種々の遺伝子が卵において発現するかどうかを検討する。具体的には、単鎖での断片化に関するもの(UDG、XPC、MSH2遺伝子、Wood et al., 2001)、複鎖での断片化に関するもの(XRCC6、RDA51遺伝子)、さらには断片化ではないが直接の遺伝子損傷に関するもの(MGT遺伝子)について、実際に断片化した精子(DNase-I処理により断片化を人為的に亢進させた精子)を成熟卵に注入して、RT-PCRを行い遺伝子発現を解析する。また、発現量が高まってる場合は、siRNAにて発現を抑え、受精率・胚発生率などへの影響を調べる。高発生能を示す胚が得られることが確認されたら、レシピエント豚に受精卵もしくは胚移植を行い、産子作製を目指す。H28年度の研究実施計画引き続き、さらに高発生能を示す胚を作製することに注力し、それらをレシピエント豚に受精卵移植もしくは胚移植を行い、産子作製の効率化を目指す。予定していた特定の試薬の使用を行わなかったため。初年度(平成26年度)は、研究実施前にはより高額の機器・試薬が見こまれたが、研究を開始したところ、予定よりその額が下回った。次年度に使用する。当初予定では、平成2728年度の2ヶ年で、前述の遺伝子発現実験ならびに胚移植実験を行う予定でいたが、遺伝子発現実験に関しては平成26年に一部内容を先行させた。遺伝子発現実験に関しては平成27年度に注力し年度内での実験の完結を目指す。
環境統合型生産システムの構築に関する国際比較研究

われわれは,環境経営を現実にするため,環境技術の革新,それを活用する企業の理念、その環境経営を支える社会の連携が不可欠であることを明らかにしてきた。今回の研究で地域経済の落ち込みを実感して,地域経済の再生と環境経営の実践の両立を目指した。そのために以下の重要さが明らかとなった。第1に,企業や行政等の地域のプレイヤーが地域資源の強みを共有すること,第2に、現実に地域資源の実態に合わせて,具体的に環境経営の理念を各プレイヤーに付与すること,第3に、当該地域外とも有効なネットワークを構築することである。以上によって,環境経営の実現,その企業経営の確立,地域経済の発展につながることを明らかにした。平成25年度の研究については,まず「生産システムに関する実態調査」としては,本科研費研究の母体である生産システム研究会メンバー個々のものに加えて,研究会としてはかねてから環境経営を進めてきたといわれている長野県飯田市を訪問して,同市の研究機関,企業,行政に対してインタビュー調査を行った。具体的には,NPO法人しんきん南信州地域研究所,オムロン飯田(株),エコトピア飯田(株),夏目光学,多摩川精機(株),飯田市地球温暖化対策課,工業課である。もちろん,環境経営が十二分に行われているとは言えないものの,地域ぐるみでいかにして環境への意識を根付かせていくのかを,企業,行政,地域社会が一緒に取り組んでいるようだった。われわれの交付申請書の「研究の目的」に記載した,企業理念,環境技術,地域社会との協働の三位一体を内容とする「環境統合型生産システム」を想起させる姿であった。また飯田市は環境経営だけではなく,いかにして地域経済を維持発展させるかを考えて,具体的な事業主体を設けて航空宇宙産業プロジェクトを進めており,生産の実態をもたないと環境経営をも実践できないという基本的な点に気づかせてくれた。大変貴重な経験だった。次に,「理論研究・政策研究」については,毎月,研究会を開催して,上述した調査旅行のことや研究会メンバーから報告してもらって議論を深めてきた。最後に,「調査・研究成果の公表」については,上述した飯田市調査について報告書としてまとめようとしており,大阪市立大学経営学会のディスカッションペーパーとすることを予定している。平成26年度の研究については,平成25年度の飯田市調査から問題意識として持つようになった,地域経済の発展と環境経営の有機的連関を深めようと取り組んだ。具体的には,「生産システムに関する実態調査」として,本科研費研究の母体である生産システム研究会メンバー個々による調査に加え,研究会として北海道網走市周辺を訪れ,林業,漁業において,どのように環境適合的な経営,取組みを行っているのかの調査を行った。具体的には,丸玉産業,佐呂間漁業協同組合,金印わさび株式会社オホーツク工場である。環境経営としての取り組み自体は発展途上だと考えるものの,意識それ自体の高さには大変感じ入るところがあった。今回の網走調査をはじめとした調査は,以上の問題意識を強めさせるものであった。今年度は引き続き,こうした問題意識に磨きをかけることができるように取り組んでいきたい。次に,「理論研究・政策研究」では,1カ月に1回というペースで開催してきた生産システム研究会において,上記のような問題意識をめぐる,大変活発な議論を行った。「調査・研究成果の公表」については,間もなく飯田市調査報告書がまとまり,製本化して関係各方面に配布して議論をする予定である。網走調査についても遅くない時期にまとめることができると考える。本研究に携わる研究者の数名は,具体的に著作物にまとめて発表している。本研究は,環境経営を現実たらしめるためには、環境技術の革新だけではなく、それを活用する企業の理念、その環境経営を支えうる社会の連携が重要であり、その結果として企業経営が持続しうるという点に鑑みて,「環境技術・企業理念・社会との連携」を軸に分析をするものである。この枠組みを「環境統合型生産システム」と規定して,平成25年度から取り組んできた。共同研究としては,ものづくりの中心である中国の杭州市と天津市を対象として調査研究を行った。つまり,製紙業が120社程集積する杭州市と先進的なエコタウン事業を展開している天津市の実態を調査するものだった。もちろん,これまでの中核的調査地である日本の飯田市とはすぐには比較することは難しいものの,杭州市では地場産業的に製紙業が展開し,天津市では廃棄物取扱業者が歴史的に多く存在していたという理由からこの地域の中核事業として静脈産業が展開していた。改めて,これらの調査から,第1に、地域の構成主体(ステイクホルダー)が、地域資源の強みを共有すること,第2に、その上で、実践的課題として、環境経営の理念を地域資源の実態に合わせてブレークダウンして展開していること,そして第3に、環境経営の各サイトが地域外のサイトも含めて如何にネットワークを構築し、事業ベースに乗せていくのかということが明らかとなった。なお,今回の研究を進める過程で,地域経済の創生という点が改めて議論された。というのは,地域社会を対象に研究を進めるなかでこの点に気がついたのである。以上のような意味で、平成27年度の調査も環境統合生産システムを考える上で、非常に有意義な年度となった。上述の共同研究以外に,本研究に携わる研究代表者,分担研究者は個々の問題意識にしたがって興味深い研究を行い,ほぼ月1回に開催していた「生産システム研究会」において,報告して議論して,複数の興味深い論文を作成した。