hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
成長ホルモン分泌促進を介するルーメンバイパス飼料の増乳効果

泌乳牛へのルーメンバイパス加工デンプン給与が血漿成長ホルモン濃度や乳量・乳成分などに及ぼす影響を検討する4つの実験を行い以下の結果を得た。1.泌乳牛のデンプン利用能を調べるために、泌乳初期牛に40日間、米粉デンプンを日量0.5-1.5kg給与し、乳量および第一胃内容物性状を調べた。デンプン1.0kg以上を摂取した牛の第一胃内プロピオン酸モル比は上昇、pHは低下し、日乳量は減少した。バイパス性デンプン給与日量は1.0kg以下が適切と判断された。2.泌乳初期牛に90日間、バイパスパルミチン酸、リノール酸Caおよび米粉をリノール酸Caで皮膜処理したバイパス性デンプンを1日4,000kcal相当量給与した。日乳量増加は給与熱量からの期待値にほぼ匹敵し、バイパス性デンプン給与が泌乳量をより高めることはなかった。3.泌乳中期牛に180日間、バイパス性デンプンを1日1kg給与すると、開始後約100日間は日乳量が泌乳進行に伴って低下せ、バイパス性デンプン給与が泌乳持続性を高める可能性が示唆された。試験期間中の血漿IGF-1濃度はバイパス性デンプン給与牛111.1ng/mlと材料給与牛が対照牛よりも有意に高く、グルコース濃度は給与前後とも定常値で推移し、NEFA濃度は試験開始より次第に低下し給与2ヶ月後からほぼ一定の値となった。4.泌乳中期牛15頭に60日間、バイパス性デンプンを給与し、血漿GH濃度、GH分泌刺激ペプチド(GHRP)負荷GH分泌反応を検討した。バイパス性デンプン給与牛の第一胃内pHとVFAs濃度は給与前後で変化せず血漿GHの日内平均濃度、GHパルス高、基礎濃度およびパルス数は増加する傾向が認められたが、GHRP負荷反応は対照牛と違いがなかった。これらの試験結果は、泌乳牛へのバイパス性デンプン給与が成長ホルモン分泌を高め、泌乳の持続性を高める可能性があることを示唆している。ルーメンバイパス処理加工したデンプンをヒツジに給与すると第一胃内低級脂肪酸濃度を上昇させずに、成長ホルモン(GH)分泌抑制が緩和されることが確かめられている。本研究では、このバイパス性デンプン給与によるGH分泌抑制緩和が乳牛の泌乳量に及ぼす影響を検討する試験を行った。泌乳日数80-130日の泌乳牛に米粉をリノール酸カルシゥムで皮膜処理したルーメンバイパス性デンプンを給与して泌乳量、乳成分(乳糖、蛋白、脂肪)および血中NEFA,グルコースおよびIGF-1濃度に及ぼす影響を検討した。泌乳開始80日目以降の牛にバイパス性デンプンを日量1kg給与またはバイパスリノール酸Ca500gとデンプン500gを給与すると、給与開始後約100日間の日乳量はバイパス性デンプン給与牛がバイパス飼料構成材給与牛や対照牛群より上回っており、バイパス性デンプンの給与により泌乳進行に伴う乳量低下の緩和がみられた。給与開始100日以後150日目まではバイパス性デンプン給与牛の乳量は材料給与牛のそれと同等の水準となり、その後は材料給与牛群の平均乳量よりも低下する傾向がみられ、試験期間を通算し、試験開始時の乳量を補正して比較するとバイパス性デンプン給与牛とバイパス飼料構成材給与牛の乳量は対照牛群よりそれぞれ18%,20%の増加となり、デンプンのルーメンバイパス加工に乳量増加効果のあるのは給与開始後およそ3カ月までと思われた。この間の乳成分の推移は、バイパス性デンプンおよびバイパス加工材料を給与した牛の乳脂肪含量は対照牛のそれよりも低下し、乳糖および乳蛋白質含量は試験期間を通じて変化がみられなかった。血漿グルコース濃度の試験期間中の推移にはバイパス性デンプンまたはその材料給与牛および対照牛の3者間に有意な差はみられず一定の値が維持されていた。試験期間中の血漿NEFA濃度は試験開始時に高く以後次第に低下する推移を示し、バイパス性デンプン給与による影響と思われる変化は認められなかった。試験期間中の血漿IGF-1濃度はバイパス性デンプン給与牛111.1ng/

mlと材料給与牛が対照牛よりも有意に高く、グルコース濃度は給与前後とも定常値で推移し、NEFA濃度は試験開始より次第に低下し給与2ヶ月後からほぼ一定の値となった。4.泌乳中期牛15頭に60日間、バイパス性デンプンを給与し、血漿GH濃度、GH分泌刺激ペプチド(GHRP)負荷GH分泌反応を検討した。バイパス性デンプン給与牛の第一胃内pHとVFAs濃度は給与前後で変化せず血漿GHの日内平均濃度、GHパルス高、基礎濃度およびパルス数は増加する傾向が認められたが、GHRP負荷反応は対照牛と違いがなかった。これらの試験結果は、泌乳牛へのバイパス性デンプン給与が成長ホルモン分泌を高め、泌乳の持続性を高める可能性があることを示唆している。乳牛に米粉をリノール酸Caで皮膜処理して給与すると、米粉デンプンは第一胃発酵を受けずに小腸から吸収される。このルーメンバイパス性デンプンを泌乳開始80日以降の牛に1日1kg給与すると約3ヶ月間までの乳量はバイパス飼料構成材料給与牛や対照牛の乳量よりも多いことが前年までの試験で確認されている。この乳量増加の原因の一つには、ルーメンバイパス飼料給与によりルーメン発酵に影響を与えずにエネルギー供給できるために牛における採食に伴う成長ホルモン分泌低下が抑制されることが挙げられる。本年度の研究では、バイパス性デンプン給与が泌乳牛の血中成長ホルモン(GH)・インスリン様成長因子(IGF-1)濃度に及ぼす影響を検討した。グラスサイレージ及びコーンサイレージを不断給与し配合飼料を乳量比例給与された泌乳開始約100日の泌乳牛群を3区に分け、試験区にはバイパス加工したデンプンを一日当たり体重比約0.2%相当量(1kg)給与し、材料区にはバイパス加工に用いたリノール酸Caと米粉を各0.5kg給与した。試験開始後25日目に血漿GHプロファイルを観察するために、24時間15分間隔で頸静脈カテーテルより採血し血漿GH濃度を測定した。バイパス性デンプン給与泌乳牛の一日の血漿GH平均濃度は5.5±2.0ng/mlで材料区や対照区よりも高い傾向がみられた。又、GHパルス頻度およびパルス幅には個体間の差が大きく処理間に明確な違いはみられなかった。一方、泌乳中期牛にバイパス性デンプン給与を6ヵ月続けた試験において1ヵ月毎に測定した血漿IGF-1濃度は試験区(111.1ng/ml)と材料区(120.7ng/ml)が対照区(89.4ng/ml)よりも有意に高かった。(P<0.05)血漿IGF-1濃度はGH分泌によって高められると共に、動物の栄養状態の高さに比例して上昇することが知られており、本研究におけるバイパス性デンプン給与牛の血漿GH濃度の動向と血漿IGF-1濃度とは必ずしも対応がみられず、デンプンのバイパス加工給与による採食後のGH分泌抑制解除の発現は確認できなかった。今後GH分泌刺激剤負荷反応などによる更なる検討が必要と思われた。リノール酸Caで皮膜処理をしてルーメンバイパス加工された米粉デンプンを乳牛に給与するとルーメン発酵に依らずに牛へのエネルギー供給を高めることができる。一方、成長ホルモン(GH)は強い増乳効果があり、ルーメン発酵で生産される低級脂肪酸が採食直後の血漿GH濃度を低下させることが知られている。このことから、泌乳牛に対するバイパス加工デンプンの給与は高い増乳効果が期待される。本研究では泌乳牛にバイパス加工デンプンを給与し、血漿GH濃度や成長ホルモン分泌刺激ペプチド(GHRP)負荷時のGH分泌反応と乳量・乳成分に及ぼす影響を検討した。
神経難病の発症機構

神経難病の発症機構の研究を遂行するため、59年度と同様、(1)痴呆の発症機構,(2)大脳基底核疾患の発症機構,(3)運動ニューロンの変性機序,(4)遺伝性代謝病と神経系障害,(5)視床下部自律系障害のメカニズム,(6)疼痛のメカニズム,(7)脳浮腫の発生機序,の7計画研究班を組織し、また公募研究班員21名を、これら7班に配属した。本研究班は、これらの7研究グループの間での情報交換、および研究成果報告、相互理解を実現するため、下記の事項を行った。(1)各班班長から成る班長会議、およびこれに学識経験者を加えた総括班会議を2回にわたって開催し、本研究プロジェクト全体にわたる研究方針の決定、およびそれを実現するための研究集会並びに出版事業の企画検討を行った。(2)各班員相互の理解を深め、情報の自由な交換を実現するため、広報の発行と会員名簿補遺の作製を行った。(3)神経難病研究の最先端の現況についての理解を深め、種々の異った研究分野相互の意見交換を行うため公開シンポジウムを開催した。また同様の目的のため、昨年度作製した参考文献の増刷を行い、新班員及び研究協力者に配布した。(4)各班々員の研究発表をまとめ、研究業績報告書を作製した。(5)各班員の発表論文目録を作製し、別刷資料の蒐集を行った。(6)最大の神経難病である筋萎縮性側索硬化症のワークショップ講演内容を印刷し、各研究者に配布した。(7)各研究班に共通する研究対象としての伝達物質、修飾物質に関するデータの集績を行った。
HIV プロテアーゼ二量体化機構の分子・原子レベル解析と新規の二量体化阻害剤開発

質量分析や結晶構造解析を用いて、ヒト免疫不全ウィルス(HIV)由来のプロテアーゼ(PR)が二量体を形成する過程の詳細を明らかにしようと試みた。HIVのプロテアーゼ阻害剤であるdarunavir (DRV)がPRの二量体形成をどのように阻害しているかを解明し、更にHIVがDRVに対する耐性を獲得する機構を解明する重要な知見を得た。本成果は、PRの二量体化を阻害し、薬剤耐性が出現し難い新規抗HIV薬開発を加速度的に進めると強く期待される。多剤併用療法によりHIV感染者の寿命は飛躍的に向上した。しかし近年、複数の抗HIV剤に対して交差耐性を示す多剤耐性株の出現が問題視されており、より強力な阻害剤の開発が急務となっている。本研究は、(1) HIVプロテアーゼ(PR)の二量体化メカにズム及び(2) darunavir (DRV)の持つPRの二量体化阻害(PDI)活性のメカニズムの解明を目的とする。更に、(3) HIVがDRV耐性を獲得する過程についても明らかにする。これらのデータを基により強力な新規抗HIV剤の開発へと進めようと試みた。平成24年度は以下の研究実績を得た。(1) PRの二量体形成に重要とされるアミノ酸残基を置換(T26A, R87K)したPR、又はPR末端領域のアミノ酸を削除したPR変異体(PR1-C-95A)を質量分析装置(ESI-MS)を用いて測定した。PRの二量体化は、まずT26及びR87の相互作用により二量体を形成、次いで末端領域の相互作用形成により二量体を安定化するという2ステップが必要である事を示した。(2) DRVのPDI活性に対する解析ESI-MSによりPDI活性を有するPR阻害剤であるDRVとPDI活性を持たないsaquinavir (SQV)及びnelfinavir (NFV)のPRに対する結合を解析した結果、DRVのみがPR単量体に結合する事が明らかとなった。このことから、DRVのPDI活性は、DRVのPR単量体に対する結合に依ることが示された。(3) HIVのDRV耐性獲得メカニズムの解析DRVに対して高度な耐性を有するPR変異体(DRV-RP20, DRV-RP30, PRDRV-RP51)とDRVの複合体の結晶化に成功し、構造解析によりこれら複合体の三次元構造を解析した。
市場変化と制度形成－戦間期日本における綿織物産地の発展－

本年度は、第一に、福井県大野郡勝山町所在の勝山機業兄弟合資会社という絹織物企業に注目し、同社の営業報告書の分析を通じて、長期にわたる持続的な企業成長の過程を記述するとともに、それを可能にした要因を明らかにした。そこで明らかになったことは、次の通りである。絹織物企業として最大級の規模をもち、同業他社と比較して相対的に高い収益率を挙げていた勝山兄弟社だったが、1910年代には原料生糸価格の予想を超えた上昇にたびたび悩まされた。これに対する効果的な対応は容易ではなかったが、この時期の資産の内訳の大部分が原料生糸であったことから、多くの原糸を持つことによって価格変動に対処しようとしていたことがうかがえる。1920年代には、新たに手がけたモスリン製品の価格が下落して販売が困難となり、多量の在庫を抱えるという事態に陥った。これに対して勝山兄弟社は、さらに新しい製品を開拓するという選択をおこなった。財務面では、初期の勝山兄弟社の成長を支えたのは地元の勝山銀行からの借入であったが、同銀行の経営破綻と経営陣の交代によってその持続は困難となった。その危機を社員の連帯責任による信用保証で克服し、以後、勝山兄弟社は地元の限定された数の投資家から継続的に増資資金の払込を得て、自己資本による成長を続けていった。これらの研究成果は、企業家研究フォーラム2015年度年次大会において口頭報告の形で発表した。また、『経営史学』(経営史学会)に「戦前日本の絹織物産地における企業成長-経営環境の変化と勝山機業兄弟合資会社の対応」として投稿し、「改稿のうえ、再投稿を求める」という審査結果を得た。第二に、これまでの研究成果をまとめ、博士論文「市場変化と企業ダイナミクスー戦前日本における絹綿織物業の発展」として東京大学大学院経済学研究科へ提出し、学位(博士、経済学)を得た。27年度が最終年度であるため、記入しない。本年度は、戦前日本における綿織物業の発展を産地綿織物業とならんで担った紡績兼営織布業についてとくに注目して研究を進めた。そこで明らかになったことは次の通りである。兼営織布は,主に輸出用綿布を生産する主体として,産地綿織物業とならんで日本の綿織物業の中で無視できない地位を占め,そのことは,多くの紡績企業の兼営織布への参入に支えられていた。具体的には以下のとおりである。明治末より昭和初期までの長期間にわたり、兼営織布は、生産額の面でみれば綿織物業全体の3割前後を占めつづけ、その比率は低減することがなかった。また、多くの紡績企業において、織布工程の設備投資を積極的にすすめる動きがあった。兼営織布は,単なる過剰綿糸の消費手段ではなく,それ自体が紡績会社に利益をもたらす事業部門という積極的役割を期待されていた。兼営織布は,大阪や愛知など綿布の集散地に多く立地し,生産規模の大きさを十分にいかせるような大量需要が見込める製品を中心に生産していた。兼営織布の労働生産性は綿織物業全体のそれよりも高く,数量ベースで見ると1920年代後半に顕著な上昇をみせた。兼営織布の生産性の上昇は,おもに資本労働比率の上昇によって支えられていた。そして,労働資本比率の上昇をもたらした織布部門での設備投資は,兼営織布の高い収益性によって支えられていた。兼営織布部門が大きい紡績会社ほど,高い収益性を実現することができた。これらの研究成果を論文にまとめ、「戦前日本における兼営織布の生産性と経営上の効果」として学術雑誌『社会経済史学』(社会経済史学会)に投稿し、「再投稿を強く勧める」との判定を得、現在、改訂作業中である。本年度は、第一に、戦前日本における綿織物業の発展を産地綿織物業とならんで担った紡績兼営織布業について、注目して研究を進めた。

第二に、福井県大野郡勝山町所在の勝山機業兄弟合資会社という絹織物企業に注目し、同社の営業報告書の分析を通じて、長期にわたる持続的な企業成長の過程を記述するとともに、それを可能にした要因を明らかにした。そこでは、1920年代に活発な製品開発がおこなわれたこと、また、財務危機をきっかけに自己資本を中心とした発展を指向するようになったことなどがわかった。本年度は、第一に、福井県大野郡勝山町所在の勝山機業兄弟合資会社という絹織物企業に注目し、同社の営業報告書の分析を通じて、長期にわたる持続的な企業成長の過程を記述するとともに、それを可能にした要因を明らかにした。そこで明らかになったことは、次の通りである。絹織物企業として最大級の規模をもち、同業他社と比較して相対的に高い収益率を挙げていた勝山兄弟社だったが、1910年代には原料生糸価格の予想を超えた上昇にたびたび悩まされた。これに対する効果的な対応は容易ではなかったが、この時期の資産の内訳の大部分が原料生糸であったことから、多くの原糸を持つことによって価格変動に対処しようとしていたことがうかがえる。1920年代には、新たに手がけたモスリン製品の価格が下落して販売が困難となり、多量の在庫を抱えるという事態に陥った。これに対して勝山兄弟社は、さらに新しい製品を開拓するという選択をおこなった。財務面では、初期の勝山兄弟社の成長を支えたのは地元の勝山銀行からの借入であったが、同銀行の経営破綻と経営陣の交代によってその持続は困難となった。その危機を社員の連帯責任による信用保証で克服し、以後、勝山兄弟社は地元の限定された数の投資家から継続的に増資資金の払込を得て、自己資本による成長を続けていった。これらの研究成果は、企業家研究フォーラム2015年度年次大会において口頭報告の形で発表した。また、『経営史学』(経営史学会)に「戦前日本の絹織物産地における企業成長-経営環境の変化と勝山機業兄弟合資会社の対応」として投稿し、「改稿のうえ、再投稿を求める」という審査結果を得た。第二に、これまでの研究成果をまとめ、博士論文「市場変化と企業ダイナミクスー戦前日本における絹綿織物業の発展」として東京大学大学院経済学研究科へ提出し、学位(博士、経済学)を得た。本研究課題が分析対象とする織物業は、産地織物業と紡績兼営織布部門に大別される。今回、紡績兼営織布部門の分析を行うことによって、これまで綿織物業史研究においてあまり詳しく検討されてこなかった、産地化ではない発展のあり方について検討することができた。この紡績兼営織布部門に関する研究は、論文にまとめて、『社会経済史学』に発表することができた。また、個別の機業家の経営文書を用いた経営分析をすることで、大量のマイクロデータを計量的に扱った場合とは異なる視角で戦前期の織物業の実態に迫ることができた。こちらの分析についても論文にまとめ、『経営史学』に投稿した。27年度が最終年度であるため、記入しない。今後は、今までもおこなってきた、全国各地における個別の機業家の経営文書の発掘を、引続き進めてゆく。また、それとともに、産地機業家にみられる、個人ではなく産地として組織された活動と、これまでみてきた個別の経営者としての機業家の行動との間にどのような関係があるかを明らかにしていきたい。この目的のために、機業家がどのようなときに個人としての利益を優先するか、また、どのようなときに組織立った行動をするのかについての実態を具体例にそくして明らかにしていきたい。研究の進展に必要な個別機業家の経営文書および取引先商社、銀行等の内部文書等、新出資料の発見がおくれているため。
単一分子分光・蛍光顕微鏡法による希土類化合物の光物性評価

本研究では希土類化合物の蛍光顕微鏡観察による発光メカニズム解明を目的とする。去年度の研究では、単一単結晶のトリボルミネッセンス(結晶を粉砕した際に発光する現象)を定量的に評価し、この現象のメカニズムを解明することを目的としている。具体的には原子間力顕微鏡のプローブで印加圧力を測定しながら結晶を粉砕し、生じた発光を蛍光顕微鏡で観察する。去年度ではこの目的を達成するために、1)蛍光顕微鏡の技術の習得、2)試料作成の条件の最適化、3)希土類間エネルギー移動の理論シミュレーションを行った。蛍光顕微鏡の技術の習得のために、高効率発光を示す安定な試料においてその観察を行い、単一分子分光に成功した。これによって、実験を行うために必要な試料の条件や測定系のセットアップに関する知見および限界等を得た。トリボルミネッセンス測定においては、希土類配位高分子を石英基盤に微単結晶として作成するための条件出しを行った。また、作成した試料に対して結晶への印加圧力と同時に発光を測定した。その結果、現条件では試料側の都合で発光が観測されなかった。希土類間エネルギー移動のトリボルミネッセンスへの影響を明らかにするために、希土類間エネルギー移動の理論シミュレーションを試みた。その結果、エネルギー移動に起因した励起状態ダイナミクスを明らかにし、その可視化に成功した。この結果については光化学討論会においてその研究を報告した。1)蛍光顕微鏡および単一分子分光法の技術の習得について:本研究課題を実施するにあたって蛍光顕微鏡や単一分子分光法の技術を習得する必要である。ここでは、量子収率が高く発光寿命が長いPerylene-bis-dicarboximideの蛍光顕微鏡観察を行った。低濃度では単一分子の発光が観察されたため、ここで分光器を使用することにより単一分子分光に成功した。2)原子間力顕微鏡+蛍光顕微鏡の測定装置におけるトリボルミネッセンス評価について:本測定系では基板上に試料の微単結晶(粒径100nm程度)を作成する必要がある。ここで、スピンコートとドロップキャストを中心に条件模索を行った。用いる溶液の試料濃度や、溶媒、また溶媒の組み合わせの条件も検討した。得られた基板上の試料は単結晶ではなく、圧力を印加しても発光は観測されなかった。今後、再沈殿も行う予定である。3)希土類間エネルギー移動のシミュレーションについて:今後、EuとTbを混ぜた配位高分子において、各希土類の発光強度がフォトルミネッセンスとトリボルミネッセンスにおいて異なることを解明する。ここでは、TbからEuへのエネルギー移動効率が異なる可能性に着目し、シミュレーションを行うことを考えた。まずはエネルギー移動のシミュレーションを、理論的に扱いやすいYbについて行ったところ、定常励起やパルス励起による励起状態ダイナミクスの可視化に成功した。この成果に関しては光化学討論会にて発表した。今後の推進方策としては1)トリボルミネッセンス測定に用いる試料の微単結晶作成法の確立、および2)Tb/Eu混合配位高分子におけるトリボルミネッセンスシミュレーションを中心に行う予定である。1)トリボルミネッセンス測定に用いる試料の微単結晶作成法の確立:石英基盤に適切な粒径の配位高分子の微単結晶を作成するために再沈殿法を行う予定である。再沈澱を行うにあたって、溶媒の溶解性について検討する。微単結晶が得られた場合、それで蛍光顕微鏡+原子間力顕微鏡のトリボルミネッセンス観察を行う。2)Tb/Eu混合配位高分子におけるトリボルミネッセンスシミュレーション:光音響分光、吸収スペクトル、発光スペクトルを通して、放射・無放射・エネルギー移動の速度定数を算出し、レート方程式によってTb/Eu混合配位高分子のトリボルミネッセンスをシミュレーションする。ここでは、MATLABを用いて行列法でTb/Euの分布をランダムに配列し、レート方程式を自動的に立てて計算するプログラムを作成する。これによって、エネルギー移動がいかにトリボルミネッセンスに影響し得るかを検討する。以上の方策によって得られた結果は学会や論文にて発表する予定である。

ここでは、量子収率が高く発光寿命が長いPerylene-bis-dicarboximideの蛍光顕微鏡観察を行った。低濃度では単一分子の発光が観察されたため、ここで分光器を使用することにより単一分子分光に成功した。2)原子間力顕微鏡+蛍光顕微鏡の測定装置におけるトリボルミネッセンス評価について:本測定系では基板上に試料の微単結晶(粒径100nm程度)を作成する必要がある。ここで、スピンコートとドロップキャストを中心に条件模索を行った。用いる溶液の試料濃度や、溶媒、また溶媒の組み合わせの条件も検討した。得られた基板上の試料は単結晶ではなく、圧力を印加しても発光は観測されなかった。今後、再沈殿も行う予定である。3)希土類間エネルギー移動のシミュレーションについて:今後、EuとTbを混ぜた配位高分子において、各希土類の発光強度がフォトルミネッセンスとトリボルミネッセンスにおいて異なることを解明する。ここでは、TbからEuへのエネルギー移動効率が異なる可能性に着目し、シミュレーションを行うことを考えた。まずはエネルギー移動のシミュレーションを、理論的に扱いやすいYbについて行ったところ、定常励起やパルス励起による励起状態ダイナミクスの可視化に成功した。この成果に関しては光化学討論会にて発表した。今後の推進方策としては1)トリボルミネッセンス測定に用いる試料の微単結晶作成法の確立、および2)Tb/Eu混合配位高分子におけるトリボルミネッセンスシミュレーションを中心に行う予定である。1)トリボルミネッセンス測定に用いる試料の微単結晶作成法の確立:石英基盤に適切な粒径の配位高分子の微単結晶を作成するために再沈殿法を行う予定である。再沈澱を行うにあたって、溶媒の溶解性について検討する。微単結晶が得られた場合、それで蛍光顕微鏡+原子間力顕微鏡のトリボルミネッセンス観察を行う。2)Tb/Eu混合配位高分子におけるトリボルミネッセンスシミュレーション:光音響分光、吸収スペクトル、発光スペクトルを通して、放射・無放射・エネルギー移動の速度定数を算出し、レート方程式によってTb/Eu混合配位高分子のトリボルミネッセンスをシミュレーションする。ここでは、MATLABを用いて行列法でTb/Euの分布をランダムに配列し、レート方程式を自動的に立てて計算するプログラムを作成する。これによって、エネルギー移動がいかにトリボルミネッセンスに影響し得るかを検討する。以上の方策によって得られた結果は学会や論文にて発表する予定である。
交錯する宗教と演劇-16・17世紀の日英文化の比較研究

本年度は二年間プロジェクトの二年目に当った。資料収集の各分野の研究者との情報・意見交換も続けたが、それに加えて初年度に発表した四本の論文を更に仕上げてとりまとめる作業に取り組んだ。西洋の宗教改革時代においては、エリザベス朝廷演劇は中世の道徳劇や受難劇より世俗化され堕落した文化の象徴としてピューリタンに非難され検閲された。日本においても社寺から離れた興行として一時独立した能楽も世俗化された芸術として認識されたし、そして政治的動機は異なるが、レパトリが幕府の圧力に応じて操作された。両文化においてそのレパトリ操作や評論流布のプロセスを解明することによって、比較思想史を試みた。その解明のために代表作における聖典の引用・翻案を分析するのがひとつの方法ではあるが、より史的な成果を得るために、まず(1)レパトリ全体の特徴を分析すること(古典として評価されている現行作品と廃止された作品の比較分析等)、そして(2)聖職者による演劇評論(イギリス側ではピューリタンの一派であるクエーカーのロンドン本部の議事録等、日本側では僧や儒学者の注釈等)を分析し比較した。思想史の試みは近代西洋的な概念から出発して遡及的に過去を解釈し決定してしまう危険性がある。そういった過ちを避けるために、もっとも効果的と思われる文学理論=脱構築論とフェミニスト唯物論の効果性を確認するという問題意識をもって適用しながらその限界をためすこととした。文学研究の細分化のため、文化学系と言語学系が分離されがちになり、前者は質的、後者は量的な部分を強調されて、最近多くの研究成果にそのために偏りが現れているように思われる。本研究ではそのバランスの修正を目指して、文学理論を基本にしながらコーパス言語学を導入することにより従来の文学理論の限界の解明も試みた。本年度は二年間プロジェクトの初年度に当たるが、まずは資料収集と各関係分野の研究者との情報・意見交換から作業に取り組んだ。(1)資料収集イギリス側は主にフレンズ・ハウス図書館、アメリカ側は主にハバフォード大学付属図書館の協力を得て多くの入手困難な資料を提供して貰っているが、前者には17世紀までさかのぼるクエーカー歴代運営委員会の議事録の検索・抜粋して貰ったことと、後者からは「クエーカー・ヒストリー」という学術雑誌の全巻の総索引を大阪大学付属図書館に寄贈して貰ったことが特記に値する。アメリカの「クエーカー芸術関係者の会」と「クエウーカー・ユニヴァサリスト・フェロ-シップ」、イギリスの「クエウーカー・ユニヴァサリスト・グループ」という団体とも活発的な情報・意見交換を行い始めて、その発行物を提供して貰っている。日本関係の資料については国立国会図書館、国立能楽堂の図書閲覧室および調査養成部、そして法政大学の能楽研究所で資料収集を行った。特に何世紀前から上演されなくなった能の「番外曲」の発掘作業は時間がかかりそうだが、有意義な成果が期待される。(2)学会活動海外の国際学会では口頭研究発表を3回行った。昨年8月には国際比較文学会(オランダ・ライデン大学開催)で能における女性の表象、特に神と人間の差異について発表した。10月には能「女郎花」(おみなめし)についての円卓式シンポジウム(ピッツバーグ大学開催)に参加した。12月には17世紀19世紀の東アジアにおける儒教をテーマとした学会(シンガポール国立大学開催)で世阿弥の伝書に現れる儒教思想について発表した。(その際、ハーバード大学の世界比較宗教研究所の共同研究員と話し合えて特に貴重な意見交換が出来た。)日本国内では、今年の3月に国際日本文化研究センターの共同研究会で新作能と復曲能の宗教性について口頭発表を行った。それぞれの機会を得て多くの知的な刺激を受けた。

来年度も継続してこの研究活動に更に励んで成果を出したく思う。研究者は今までは宗教色が濃い能楽が、中世・近世日本の為政者によって政治的目的のために利用されてきた文化制度としての側面を究明し、その成果をYokota-Murakami 1997で発表した。その際、より史的な成果を得るために、作品だけではなく、伝書、舞事の型付、囃子の手付、特殊演出の小書、幕府に提出する書上などを参照した。今回のプロジェクトの場合も同じように、劇作品に現れる聖典の引用だけではなく、団体の議事録等を分析することとした。中心コーパスとして、イギリス側ではクエーカーの全国組織=ロンドン年会の議事録と文通を分析の対象とした。議事録は1738年より約20年毎改版されているものである。日本側では、ジャンルは異なるが、能楽伝書を分析の対象とした。目的はこの資料において特にform/substanceや体・用のような二元論的な概論のキーワードの語用変遷を究明することであった。それぞれの文化のコーパスとして異なるジャンルを扱うのは非因習的ではあるが、クエーカーは教会も教義も持たない団体という点から考えれば、宗教性という要因は決定的な違いとして憚る必要はないと判断した。それより、「道」の理念、聖典のレトリック、助言のレトリック、目的とする読者層の幅等、有意義な比較が出来る要因が多いと判断した。ジャンルが異なるのに類似したキーワードが多いのはなぜかというのが一つの出発点でもあった。言うまでもなく、類似したキーワードの設定が大事であり、一方的に日本のキーワードを西洋哲学の概念にはめ込んだリするのが間違いである。それぞれの文化の中のそれぞれの思想の歴史的変遷を、それぞれの状況を比較しながらたどるのが基本的なスタンスであった。本研究では、一見では中世・近世日英の主流思想において二元論的な対にみえる概念を反対語としてではなく、むしろ流動的な関係を表すキーワードとして認識することにより、より史的な文化理解を目指した。演劇起源論だけではなく、脱構築論や唯物論等も部分的に見直すことにより、この分野における研究の発達に役立つことが出来ることが研究者の願いである。
インスリンシグナリング遺伝子を用いた犬猫の肥満・糖尿の早期診断法の開発

犬や猫で近年著しく発生が増えている肥満・糖尿病の早期診断法の開発を試みた。インスリンシグナル伝達に関与する遺伝子(IRS-1, IRS-2, PI3K)は肥満早期から発現が低下した。血中コレステロール分画やアディポネクチンレセプター発現量も肥満、糖尿病発症に伴い有意に変動した。インスリンシグナリング遺伝子、コレステロール分画、アディポネクチンおよびそのレセプター量は犬や猫の肥満、糖尿病の早期診断マーカーとして有用であることが示唆された。21年度は、犬猫の肥満・糖尿病の早期診断法の開発のために、肥満の病態の基となるインスリン抵抗性発現につながるインスリンシグナル伝達メカニズムの変動について検討することを目的として研究を進めた。その結果、以下の成果を得た。1.猫では犬に比べ、組織(白血球、肝臓、脂肪組織など)におけるインスリンシグナル伝達に関わる因子としてインスリンレセプター基質2(IRS-2)、ホスファチジルイノシトールキナーゼ(PI3-K)などのmRNA発現が有意に低いことが明らかとなった。2.肥満した動物ではインスリンシグナル伝達に関わる物質のmRNA発現量(特にIRS-2,PI3-K)が有意に低下することが明らかとなった。また、猫ではその傾向が顕著であった。3.IRS-2ノックアウトマウスに高脂肪食を給与すると、早期に肥満を呈し、顕著なインスリン抵抗性を示した。肥満したマウスでは、インスリンシグナル伝達に関わる物質のmRNA発現量が低下するだけでなく、アディポネクチン、レジスチンなど脂肪細胞から分泌されるアディポカインの量も有意に変動した。4.肥満、糖尿病となった犬では、末梢リンパ球サブセットが変化し、免疫機能の低下が示唆された。以上のことから、肥満および糖尿病動物では、インスリンシグナル伝達に関わる物質やアディポネクチンなどアディポカインの遺伝子発現量が有意に変動すること、またこれらの変化は、血糖値や中性脂肪値など従来の血液代謝マーカーの変動に先行して現れることが明らかとなり、これら物質は肥満、糖尿病の早期の診断マーカーとして有用性であることが示唆された。22年度は、犬猫のメタボリックシンドローム(MS)の診断基準を作成し、これを基にした発生率の調査を行った。MSの診断基準にインスリンシグナル伝達に関与する遺伝子IRS-2, PI3 kinaseを加えるとより早期にMSの診断が可能であることが明らかとなった。以下の成果を得た。1.過体重を基盤とし、高脂血症、高血糖、脂肪肝の3条件のうち2つ以上に該当するものをMSと判定する基準を作った。これを基に都内の獣医師の協力を得て、発生率の調査を行った結果、犬猫それぞれ健康と診断される動物のうち1213%がMSと判定されることとなった。また、MS動物ではアディポネクチン濃度が有意に低下しており、アディポネクチンはMSや肥満の判定に有力なマーカーとなることが明らかとなった。2.犬と猫の血中のコレステロール分画の測定を行った。犬では肥満するとα2分画(HDL-1コレステロール)の割合が増加、猫ではβ分画(LDLコレステロール)の割合が増加することが明らかとなった。これらの変化は肥満の初期に見られるので、コレステロール分画の変動は犬猫において肥満の早期診断マーカーとして有用であることが示唆された。3.乳腺腫瘍を発症した犬で、血中アディポネクチン濃度が低下している個体が多くみられることが明らかとなった。加齢に伴いアディポネクチンが低下することも明らかとなった。人で閉経後の女性で肥満すると有意に乳癌の発生率が高まることが報告されており、犬でも加齢に伴い、肥満すると乳腺腫瘍の発生率が高まり、その診断マーカーとしてアディポネクチンが有用であると考えられた。4.肥満した猫で、人と同様、インスリン抵抗性に関与する複数の遺伝子にSNPのある可能性が示唆された。これらの解析をさらに進めることにより、肥満の遺伝子診断が可能になると考えられた。23年度は、肥満した犬および猫の血中コレステロール分画の変動とインスリンシグナル伝達に関与する遺伝子IRS-2,PI3kinaseおよびアディポネクチンレセプターの発現量との相関を調べることにより、これらの肥満や糖尿病の早期診断マーカーとしての利用の可能性を検討した。1.犬と猫の血中のコレステロール分画を電気泳動法により測定した。これらの変化は肥満の初期から見られるので、コレステロール分画の変動は犬猫において肥満の早期診断マーカーとして有用であることが示唆された。2.肥満した動物で血中アディポネクチン濃度が顕著に低下し、末梢白血球中のアディポネクチンレセプターmRNA発現量も変動する。インスリン欠乏の1型糖尿病でこれらの変動はさらに大きくなることから、これらの変化量が肥満、糖尿病のよい診断マーカーとなることが示唆された。3.肥満した猫で、人と同様、インスリン抵抗性に関与する複数の遺伝子にSNPのあることが示唆された。

特に人で糖尿病関連遺伝子として知られるTCF7L2遺伝子は猫でも糖尿病発症に関与することが示唆された。これらの解析をさらに進めることにより肥満の遺伝子診断が可能になると考えられた。4.犬や猫で代謝産物を網羅的に解析するメタボロミクスを進めている。この手法の応用により、betaineやcholineが、肥満や糖尿病など糖脂質代謝異常の時に犬の血中に有意に増加することが明らかとなり、新たな診断マーカーとしての可能性が示唆された。また、定量性PCRを応用してmRNA発現量を測定することにより乳腺腫瘍や糖尿病時にAMP kinaseや癌抑制遺伝子がこれらの疾病の早期診断マーカーとして利用できることが明らかとなった。
機能時の義歯床における応力解析とそのシミュレーションモデルの開発

細菌、歯科材料の開発は目覚ましい発展を遂げている。歯科補綴領域においても、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、4-META接着性レジン、光重合レジンなどの床用材料が開発されている。しかし、これらの新素材の特性を床用材料として十分に活用するためには、単に素材の機械的特性について検討するだけではなく、義歯床という構造体としての特性を力学的に解析し、それに適した試験方法について検討を行う必要がある。また、機能時の義歯床における応力分布状態は、床用材料の選択、顎堤の形態や状態、あるいは対咬関係などによってさまざまで複雑であることが示唆される。臨床的にも義歯床に加わる荷重状態を正しく把握することは義歯床の破折といった問題を防ぐばかりでなく、義歯装着時の残存歯、床下支持組織の状態を良好に保つ上で重要である。そこで本研究では、機能時の義歯床における応力分布の解析と、合理的な義歯床の設計および義歯床用材料として開発された新素材の試験方法を確立するためのシミュレーションモデルの開発について基礎的な検討を行った。すなわち、使用される床用材料により大別されるレジン床および金属床について機能時を想定した一様曲げモーメントを全部床義歯に負荷し、構造体としての義歯床の剛性、強度およびひずみ分布を求め、義歯床を構成する素材の機械的特性が機能んときの義歯床に及ぼす影響について検討を行った。当研究の成果は、研究成果報告書に論文として掲載した。シミュレーションモデルの開発については基礎的な研究で得られた結果と臨床結果とを比較検討するため、全部床義歯装着者を対象に、その旧義歯および新義歯にひずみゲージおよび小型圧力を用いてひずみと分布を計測し、解析を行っている。また、機能時の負荷状態を再現する装置の開発に向けて、現在、擬似粘膜の検討を行っている。最近、歯科材料の開発は目覚ましい発展を遂げている。歯科補綴分野においても、ポリスルホン,ポリエーテルスルホン,4-METAレジン,光重合レジンなどの床用材料が開発されている。そこで、これら新素材の特性を構造体としての義歯床に十分に活用するため、本研究では床用材料の最適な試験方法の確立と試験装置の開発を目指している。昭和61年度では、機能時、義歯床に働く応力状態を想定した4点曲げ試験法を用いて、圧印床、鋳造床およよびレジン床義歯の機械的特性に関する研究を行なった。(論文投稿予定)すなわち、4-META含有の接着性レジン保持装置を省略した圧印床義歯に応用した場合と、接着力を期待しない鋳造床およびレジン床義歯との剛性および強度に関する比較検討を行なった。その結果、接着性レジンを応用した圧印床義歯では、剛性および強度は鋳造床義歯とレジン床義歯との中間的特性を示した。しかし、圧印床義歯では破壊がレジン接着面から生じ、レジンが圧印床表面から完全に剥離した。これは保持装置を付与した鋳造床義歯では生じない結果を示しており、臨床例においてもレジン剥離が見られることから、接着性レジンを応用した圧印床義歯ではレジン保持装置の付与が望ましい結果を得た。また、被験者の口腔内において、新・旧義歯にひずみゲージおよび咬合力計を装着し、機能時義歯床に働く応力状態を測定した。次年度においても引き継き測定を行ない、症例数を増やし、義歯床に働く応力状態をパターン化する。さらに検討を重ね、義歯床に働く応力状態をシミュレートしたモデルの開発を目指す。

本研究では,目覚ましい開発・発展を遂げている新素材のうち義歯床用材料に着目し,それらの特性を構造体としての義歯床に十分活用するための最適な負荷方法および臨床に即したモデルの開発を目指す.昭和62年度では,機能時,義歯床に働く応力状態を想定した4点曲げ試験法を用いて,レジン床,鋳造床およびレジン床義歯の機械的特性に関する検討を行った.すなわち,新素材として取り上げられた義歯床用4-META接着性レジンとステンレススチールとの接着強度に関する機械的特性を,構造体としての義歯床について鋳造床およびレジン床との比較検討を行った.(高山義明:接着性レジンを応用した圧印床義歯の機械的特性に関する研究補綴誌, 31(4):195200, 1987)また,口蓋部床用材料が義歯床の機械的特性に及ぼす影響について(論文投稿予定)検討を行った.その結果,口蓋部床は義歯床全体の剛性強度に及ぼす影響が比較的少ないが,剛性,強度が著しく高い床用材料を用いることにより義歯床全体の機械的特性は向上することが示唆された.まこ,光弾性ひ膜法により口蓋部全体の応力分布状態にについて解析,検討中である.臨床実験としては,被験者を対象に実験義歯を作製,装着し,旧義歯と比較検討を行った.測定は電気抵抗線ひずみゲージ(3軸),自家製小型圧力センサーを用いて行い,機能時の義歯床に作用するひずみ,主応力方向およびその時の咬合力について解析,検討中である.さらに, MRIを用いて機能時の義歯床の動態について三次元的に計測,検討中である.本研究では,目覚ましい開発・発展を遂げている新素材のうち義歯床用材料に着目し,それらの素材の機械的特性を構造体としての義歯床に十分活用するための最適な負荷方法を検討するとともに,口腔内における機能時の義歯床の応力状態を口腔外で再現するモデルの開発に向け基礎的な検討を行った。昭和63年度では,咬合時,義歯床に加わる負荷状態を想定した一様曲げモーメントを,全部床義歯試験体に負荷し,義歯床の口蓋部に用られる床用材料が義歯床の機械的特性に及ぼす影響について(高山義孝:口蓋部床用材料が上顎全部床義歯の機械的特性に及ぼす影響,口病誌,55(3):471478,1988.)研究成果を発表した。また,荷重状態にある義歯床の前歯部および口蓋部全域の変形を計測,解析を行うため,光弾性皮膜法およびひずみゲージによる測定法を採用した。その結果,義歯床口蓋部全体のひずみ量は,剛性の高い床用材料を用いた義歯床ではひずみの集中は,緩和される。ひずみ集中は,前歯部,切歯乳頭部を含む義歯床前方部に部に生じる。さらに,光弾性皮膜法は強化現象を考慮することにより,義歯床全体のひずみ分布が定性的に求められるばかりではなく,定量的測定を行うための適切なひずみゲージ貼付位置を決定する上で有効であることが示唆された。本研究成果は現在投稿準備中である。シミュレーションモデルの開発についてはこれまでに得られた基礎的な結果と実際の臨床結果とを比較検討するため,全部床義歯装着者を対象に,その旧義歯および新義歯にひずみゲージおよび小型圧力センサを取り付け,機能時の義歯床におけるひずみ分布を計測し,解析を行っている。
肺扁平上皮癌に対するＦＧＦＲ抑制ベクター遺伝子治療

肺扁平上皮癌の治療として,FGFR抑制ベクターによる癌遺伝子治療の研究を行った.肺癌におけるFGFR family発現の臨床的解析を行った.FGFR1だけでなくFGFR2も治療ターゲットになりうると考え, FGFR2発現抑制ベクターをアデノウィルスベクターで作製した(Ad-shFGFR2).FGFR2高発現細胞株A549でin vitro実験を行った.Ad-shFGFR2によりFGFR2のノックダウン効率を認めた.しかし,MTTアッセイでは腫瘍増殖抑制効果は十分とは言えなかった.FGFR2が単独のドライバー遺伝子ではない可能性もあり,他の候補とのco-transfectionも行っている.我々は肺扁平上皮癌に対する新しい治療として,FGFR抑制ベクターによる癌遺伝子治療の研究を行っている.まず我々は非小細胞肺癌におけるFGFR familyの発現に関する包括的臨床的解析を行った.FGFRfamily遺伝子の全4種類(FGFR1, FGFR2, FGFR3, FGFR4)について,その遺伝子発現量をreal-time RT-PCRで定量した.その結果,FGFR1の遺伝子発現はEGFR遺伝子とKras遺伝子がともに野生型である肺癌で有意に高かった.また,FGFR2の遺伝子発現もEGFR遺伝子とKras遺伝子がともに野生型である肺癌で有意に高かった.更にFGFR2は,腺癌と比べて扁平上皮癌で有意に遺伝子発現量が高かった(投稿中).これらの結果は,免疫組織学法による蛋白発現でも同様な所見がえられた.そのため,我々はFGFR1だけでなくFGFR2も肺癌における治療ターゲットになりうると考え, FGFR2発現抑制ベクターをアデノウィルスベクターで作製した.まず合成shRNAをRNA polymerase III系プロモーターを搭載したプラスミドベクターに組込み,shRNA発現プラスミドベクターを作製し,COS-TPC法でshRNA発現アデノウィルスベクター(Ad-shFGFR2)を作製した.そしてこのAd-shFGFR2を用いて,FGFR2高発現肺癌細胞株A549に対してin vitroの遺伝子治療実験を行った.Ad-shFGFR2により遺伝子発現と蛋白発現でFGFR2に対して約85%のノックダウン効率を認めた.しかしながら,MTTアッセイでは,このAd-shFGFR2による腫瘍細胞増殖抑制効果は未だ十分とは言えなかった.そのため現在我々は更に強力なFGFR2発現抑制ベクターを作成に取り組んでいる.同時に,FGFR1発現抑制ベクターの作成にも取り組んでいる.in vitro及びin vivoの遺伝子治療実験を行った.まずFGFR2高発現癌細胞株に対して,FGFR2抑制ベクターによるin vitro遺伝子治療実験を行い、real-time RT-PCRによるFGFR遺伝子発現定量とWestern BlotによるFGFR蛋白発現定量によりノックダウン効率を評価した.そして,MTTアッセイによる腫瘍細胞障害性定量と,フローサイトメーターによる細胞周期解析により,FGFR2抑制ベクターの抗腫瘍効果を評価する.更に実験動物におけるin vivo遺伝子治療実験も精力的に行った.ヌードマウスに,FGFR2高発現癌細胞株または外科的切除腫瘍組織を移植し,担癌モデルの作製を作製し、ベクター投与法としては,まず腫瘍内への直接注入法を,次に気道内吸入法を検討した.real-time RT-PCRによる標的遺伝子発現の定量と免疫組織化学法とWestern Blotによる標的蛋白発現の定量により,FGFR2抑制ベクターのノックダウン効率の評価をした.そして,腫瘍体積の定時的測定,免疫組織化学法によるKi67増殖指数と血管新生の評価,TUNEL法によるアポトーシス評価などを行い,更に肺・肝臓への遠隔転移や生命予後の検討も行い,FGFR2抑制アデノウィルスベクターによる抗腫瘍効果を総合的に評価できた。.そして,ELISAによるサイトカイン発現定量で生化学的・免疫学的評価も行い,臨床応用可能なFGFR2抑制アデノウィルスベクターの開発を目指してゆく。肺扁平上皮癌の治療として,FGFR抑制ベクターによる癌遺伝子治療の研究を行った.肺癌におけるFGFR family発現の臨床的解析を行った.FGFR1だけでなくFGFR2も治療ターゲットになりうると考え, FGFR2発現抑制ベクターをアデノウィルスベクターで作製した(Ad-shFGFR2).FGFR2高発現細胞株A549でin vitro実験を行った.Ad-shFGFR2によりFGFR2のノックダウン効率を認めた.しかし,MTTアッセイでは腫瘍増殖抑制効果は十分とは言えなかった.FGFR2が単独のドライバー遺伝子ではない可能性もあり,他の候補とのco-transfectionも行っている.これまで我々は肺癌の治療に有効と思われる癌関連分子を同定しながら,それらをターゲットとした癌遺伝子治療の基礎的研究を行ってきた.その中で最近我々は,肺扁平上皮癌においてfibroblast growth factor receptor (FGFR)の腫瘍内過剰発現が特異的にみられ,腫瘍のプログレッションを促進することをみいだした.そこで本研究で我々は肺扁平上皮癌に対する新しい治療として,FGFR抑制ベクターによる癌遺伝子治療の研究を行う.本研究計画において,まず我々は非小細胞肺癌におけるFGFR familyの発現に関する包括的な臨床的解析を行った.FGFRfamily遺伝子の全4種類(FGFR1, FGFR2, FGFR3, FGFR4)について,その遺伝子発現量をreal-time RT-PCRで定量した.その結果,FGFR1の遺伝子発現はEGFR遺伝子とKras遺伝子がともに野生型である肺癌で有意に高かった.また,FGFR2の遺伝子発現もEGFR遺伝子とKras遺伝子がともに野生型である肺癌で有意に高かった.更にFGFR2は,腺癌と比べて扁平上皮癌で有意に遺伝子発現量が高かった(投稿中).この結果は,免疫組織学法による蛋白発現でも同様な所見がえられた.

一方,FGFR3とFGFR4の遺伝子発現量は,FGFR1とFGFR2に比べて低いものであった.そのため,我々はFGFR1だけでなくFGFR2も肺癌(特に扁平上皮癌)における治療ターゲットになりうると考えている.現在FGFR2発現抑制ベクターを既にアデノウィルスベクターで作製済みである.今後in vitro及びin vivoの遺伝子治療実験を行ってゆく予定である.これまでの実験成果により,H520がFGFR1高発現肺癌細胞株であり,A549がFGFR2高発現肺癌細胞株であることが判明しており,in vitro及びin vivoの遺伝子治療実験に使用するモデル細胞は既に確立している.更に,我々はこれまでshRNA発現アデノウィルスベクターの作成に精力的に取り組んでおり,技術的には習熟している.そのため,本研究計画の目標であるFGFR発現抑制ベクターの作成は,必ず完成できると考えている.研究計画の第一段階であるFGFR発現に関する包括的臨床解析はほぼ終了している.現在,FGFR2発現抑制アデノウィルスベクターも既に作製済みである.今後も我々は更に強力なFGFR2発現抑制ベクターを作成し,in vitro及びin vivoの遺伝子治療実験を行ってゆく予定である.そして,FGFR2高発現癌細胞株に対して,FGFR2抑制ベクターによるin vitro遺伝子治療実験を行う.real-time RT-PCRによるFGFR遺伝子発現定量とWestern BlotによるFGFR蛋白発現定量によりノックダウン効率を評価する.そして,MTTアッセイによる腫瘍細胞障害性定量と,フローサイトメーターによる細胞周期解析により,FGFR2抑制ベクターの抗腫瘍効果を評価する.更に実験動物におけるin vivo遺伝子治療実験も精力的に行う.ヌードマウスに,FGFR2高発現癌細胞株または外科的切除腫瘍組織を移植し,担癌モデルの作製を作製する.ベクター投与法としては,まず腫瘍内への直接注入法を,次に気道内吸入法を検討する.real-time RT-PCRによる標的遺伝子発現の定量と免疫組織化学法とWestern Blotによる標的蛋白発現の定量により,FGFR2抑制ベクターのノックダウン効率の評価する.そして,腫瘍体積の定時的測定,免疫組織化学法によるKi67増殖指数と血管新生の評価,TUNEL法によるアポトーシス評価などを行い,更に肺・肝臓への遠隔転移や生命予後の検討も行い,FGFR2抑制アデノウィルスベクターによる抗腫瘍効果を総合的に評価する.そして,ELISAによるサイトカイン発現定量で生化学的・免疫学的評価も行い,臨床応用可能なFGFR2抑制アデノウィルスベクターの開発を目指してゆく.
マウス角膜移植モデルを用いた末梢神経再生機序の解明

マウス全層角膜移植モデルを神経再生の評価系として確立した。移植片内への神経再生は非常に緩徐で、移植片内ではわずかに神経線維が認められるに過ぎないことが明かになったが、Sema3A阻害薬の投与により神経断端からの活発な神経再生が観察できた。また神経再生の程度を統計的に比較するため、再生神経の総延長を数値化する方法を確立した。まず、実験の基礎となるマスウにおける角膜移植を、野生型マスウを用いて行い、安定した角膜移植術の手技を習得した適切な手術操作と術後の抜糸を行い、またドナーとレシピエントに同腹のマウスを用いることで、特に免疫抑制を行うことなく、移植片が高率に生着し透明治癒することを確認した。次にGFPマスウを用いて角膜移植実験を行い、keratocyteおよび三叉神経の再生を観察した。術後およそ3週で、移植片がレシピエント由来のGFP陽性角膜皮細胞に覆われた。この時期の角膜実質および角膜上皮の性質を調べるために、切片を筰裂し、cytokeratinのK12、K14、K15、K19、Ki67およびvimentinの特異的抗体を用いて免疫染色を行った。移植片接合部の実質ではvimentinが強発現しており、線維芽細胞が増殖しながら瘢痕治癒している様子が見られた。上皮においては、本来角膜輪部基底部で発現し角膜上皮幹細胞の間接的なマーカーになり得ると考えられる、K15、K19が発現していた。これは創傷治癒の過程で、接合部に上皮幹細胞が移動してきたか、あるいは接合部周囲の上皮幹細胞の性質を獲得しているようにも思われた。この結果を、ARVO annual meetingで発表した。続いて5週後には、GFP陽性の神経線維とkeratocyte様の樹枝状細胞が移植片内に進入する様子が観察され、移植片内に出現したkeratocyte様の樹枝状細胞の多くは神経線維に伴っており、三叉神経が実質幹細胞のnicheに関与しているという仮説が具体性を持ったように思われた。最終的に術後9週までの観察を行ったが、この段階で移植片中央部まで神経線維は進展し、やはり神経線維に沿って樹枝状細胞が認められた。しかし生理的な神経線維の走行やkeratocyteの分布に比べ、未だ粗で単純であるため、この後さらに長期間経過を観察する必要があると思われた。マウス角膜移植モデルにおいて、GFP陽性の神経線維とkeratocyte様の樹枝状細胞が移植片内に進入する様子が観察され、移植片内に出現したkeratocyte様の樹枝状細胞の多くは神経線維に伴っており、三叉神経が実質幹細胞のnicheに関与しているという仮説が具体性を持ったように思われた。続いて、神経再生を促進させ得ると考えられるSema3A阻害薬を用いた予備実験を行った。全層角膜移植を行ったマウスに対し、Sema3A阻害薬を定期的に結膜下注射で投与することにより、術後3週という早期に神経断端からの活発な神経再生を観察する事ができた。またコントロールと統計的に比較するため再生神経の程度を定量化する必要があるが、フラットマウントしたグラフト内の神経線維を蛍光顕微鏡で撮影し、撮影した写真で神経線維の蛍光をトレースすることによって、再生神経の総延長を数値化する方法を確立した。さらに、再生神経の機能を評価する方法として、角膜知覚を測定した。臨床で用いられる角膜知覚計によって、マウスにおいても知覚測定が可能であることを確認した。