hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
大腸癌および炎症性腸疾患に関わるVDRの高次機能の解明

本研究では大腸特異的VDRKOマウスを作出し、炎症性腸疾患および炎症性発癌モデル実験をおこない、両疾患に対する大腸のVDRの機能解明をめざした。大腸特異的VDRKOマウスは炎症性発癌による死亡率が高かったが、生存したマウスについては両モデルともコントロールマウスとの差は認められなかった。これは両モデルにおいてコントロールマウスの大腸におけるVdr遺伝子発現が減少したためであると考えられた。一方コントロールマウスで高頻度に認められた脱肛および腸管の周辺組織への癒着は大腸特異的VDRKOマウスでは認められず、大腸のVDRがこれらの表現型に関与していることが示唆された。ビタミンDの生理作用はカルシウム代謝、細胞の増殖・分化など多岐にわたるが、これらの生理作用はビタミンD受容体(VDR)を介した標的遺伝子の転写制御により発揮される。現在までにビタミンDは大腸癌の発症リスクを低下させるという疫学的研究結果が報告されており、また自身のこれまでの研究によりVDR遺伝子欠損(VDRKO)マウスは野生型マウスに比べ炎症性腸疾患の症状が重篤化することが明らかになったが、いずれもその分子メカニズムについては不明な点が多く、カルシウム代謝を介した間接的な作用によるものか、大腸におけるVDRの直接作用によるものかは明らかになっていない。そこで本研究では大腸特異的VDRKOマウスの作出および解析を行うことにより、小腸や腎臓におけるカルシウム代謝調節を無視できる系において、大腸におけるVDRの高次機能の解明をめざす。現在までに所属大学における動物実験および遺伝子組み換え実験に関する一連の手続きが完了し、大腸特異的Cre発現マウスを米国のジャクソン研究所から購入後、また、大腸特異的VDRKOマウスの作出に必要なVDR floxマウスについては徳島大学における一連の手続きが完了後、学内のSPFの動物施設に導入するため体外受精によるクリーニングを行った。その際、大腸特異的Cre発現マウスの精巣上体から採取した精子およびVDR floxマウスから採取した卵をそれぞれ体外受精に供することにより、クリーニングと同時に大腸特異的Cre(tg/0)/VDR flox/+の遺伝子型をもつ仔マウスが得られた。本研究は研究実施期間である3年間のうちに大腸特異的VDRKOマウスの作出および解析を行うことにより、小腸や腎臓におけるカルシウム代謝調節を無視できる系において、大腸におけるVDRの高次機能の解明をめざすものであるが、当初使用を予定していた大腸特異的Cre発現マウスの系統は米国のジャクソン研究所において凍結胚で維持されているものの、凍結胚を直接購入することができず、ジャクソン研究所において凍結胚からの個体化後のマウスしか購入できないことが判明した。これでは当初予定していた計画よりも余計に時間も個体化費用もかかってしまうため、計画を変更し成体マウスで系統維持されている別の大腸特異的Cre発現マウスを用いることとした。また本学の動物施設導入のためのクリーニングの際には大腸特異的Cre発現マウスとVDRfloxマウスからそれぞれ精子と卵を採取し体外受精に供することで大腸特異的Cre(tg/0)/VDR flox/+の遺伝子型をもつ仔マウスが得られた。今後交配を進めていくことにより大腸特異的Cre(tg/0)/VDR flox/floxマウスの作出および解析が可能となることから、初年度である本年度は当初の計画通りおおむね順調に進展していると考える。本年度はまずタモキシフェン誘導性のCDX2P-CreERT(tg/0)/VDR flox/floxマウスを作出しタモキシフェン投与後4週におけるVDRの遺伝子発現を検討した。この結果、このマウスの小腸、腎臓におけるVDR遺伝子発現はコントロールであるVDR flox/floxマウスとの有意差が認められず、両組織におけるVDRの標的遺伝子であるS100gの遺伝子発現についても有意差は認められなかった。次に大腸におけるVDRの遺伝子発現を検討したところ、このマウスでは近位大腸におけるVDRの遺伝子発現量が有意に減少しており大腸特異的VDRKOマウスであることが判明したが、遠位大腸においてはVDRの遺伝子発現量は減少していたものの個体差が大きく有意差は認められなかった。次に大腸特異的VDRKOマウスとコントロールマウスの近位大腸における遺伝子発現の違いをマイクロアレイにより検討したところ、VDRの新規標的遺伝子候補がいくつか同定できた。本研究は研究実施期間である3年間のうちに大腸特異的VDRKOマウスの作出および解析を行うことにより、小腸や腎臓におけるカルシウム代謝調節を無視できる系において、大腸におけるVDRの高次機能の解明をめざすものであるが、現在までに大腸特異的VDRKOマウスの作出が完了し、近位大腸におけるVDRの新規標的遺伝子候補も同定できた。

また、大腸特異的VDRKOマウスへのアゾキシメタン(AOM)/デキストラン硫酸ナトリウム(DSS)投与による炎症関連大腸癌モデルを樹立し表現型解析をおこなっており、おおむね順調に進展していると考える。ビタミンDの生理作用はカルシウム代謝、細胞の増殖・分化など多岐にわたるが、これらの生理作用はビタミンD受容体(VDR)を介した標的遺伝子の転写制御により発揮される。現在までにビタミンDと大腸癌や炎症性腸疾患との関連が報告されているが、いずれもその分子メカニズムについては不明な点が多く、カルシウム代謝を介した間接的な作用によるものか、大腸におけるVDRの直接作用によるものかは明らかになっていない。そこで本研究では大腸特異的VDRKOマウスの作出および解析を行うことにより、小腸や腎臓におけるカルシウム代謝調節を無視できる系において、大腸におけるVDRの高次機能の解明をめざす。昨年度までに樹立したタモキシフェン誘導性の大腸特異的VDRKOマウスを用い、本年度はデキストラン硫酸ナトリウム(DSS)誘発腸炎モデル(Colitisモデル)およびアゾキシメタン(AOM)/DSS誘発炎症関連大腸癌モデル(Colitic Cancerモデル)実験を行った。この結果、大腸特異的VDRKOマウスの小腸、腎臓におけるVDRや標的遺伝子であるS100gの遺伝子発現および血中Ca,P濃度はコントロール群との有意差が認められなかった。Colitic Cancerモデルでは大腸特異的VDRKOマウスの方が死亡率が高かったが、コントロール群のマウスの遠位大腸におけるVDRの遺伝子発現量が大腸特異的VDRKOマウスと同程度まで減少しており、本研究ではColitic Cancerに対するVDRの高次機能の解明には至らなかった。しかしながら、コントロール群のマウスで高頻度で認められた脱肛および薬剤の腹腔内注射刺激によって誘発された腸管の周辺組織への癒着は大腸特異的VDRKOマウスでは認められず、大腸のVDRがこれらの表現型に関与していることが示唆された。本研究では大腸特異的VDRKOマウスを作出し、炎症性腸疾患および炎症性発癌モデル実験をおこない、両疾患に対する大腸のVDRの機能解明をめざした。大腸特異的VDRKOマウスは炎症性発癌による死亡率が高かったが、生存したマウスについては両モデルともコントロールマウスとの差は認められなかった。これは両モデルにおいてコントロールマウスの大腸におけるVdr遺伝子発現が減少したためであると考えられた。一方コントロールマウスで高頻度に認められた脱肛および腸管の周辺組織への癒着は大腸特異的VDRKOマウスでは認められず、大腸のVDRがこれらの表現型に関与していることが示唆された。今後、大腸特異的Cre(tg/0)/VDR flox/+の遺伝子型をもつマウス同士の交配により大腸特異的Cre(tg/0)/VDR flox/floxマウスの作出および解析を行うが、どのような組み合わせで交配させれば目的とする遺伝子型のマウスを効率的にかつ最小限の犠牲で得られるかをよく考え研究を進めていく予定である。
消化管内視鏡画像解析による客観的指標の構築と診断支援システムへの応用

内視鏡技術の進歩によりさまざまな画像診断機器が開発され、その臨床的意義が徐々に明らかになってきている。コンピュータ支援診断(computer-aided diagnosis: CAD)は、コンピュータによって分析された定量的な数値を医師に提示することによって、診断の正確度を向上させることが期待されている。本研究では消化管内視鏡画像のコンピュータ画像解析を行い、病理組織診断を反映する定量化が可能である事を示し、CADの開発が可能である事を明らかにした。消化器内科大腸腫瘍NBI拡大内視鏡画像の定量化においてはbag-of-features枠組みのもとに行う画像認識コアシステムのハードウェア実装に関する検討を行った。リアルタイムFull HDの高解像度画像の処理にはFPGA実装による高速化と特徴量抽出に関して検討を行う必要があり、ハードウェア向け特徴量抽出アルゴリズムを開発するとともに次元数について検討を行った。シミュレーションによりその有効性を評価し、64次元アルゴリズムが最も高い精度が得られる事を明らかにした。胃癌BLI拡大内視鏡画像の定量化に関して胃癌部と非癌周囲部、微小発赤部との間に有意差を認めた。大腸腫瘍NBI拡大内視鏡画像の定量化においてはbag-of-features枠組みのもとで行う画像認識コアシステムを開発し腫瘍の組織型別の検討で有意差を認めた。胃腫瘍FICE拡大内視鏡画像の定量化に関しては胃癌部と非癌部との間に有意差を認めた。胃腫瘍BLI拡大内視鏡画像の定量化に関して胃癌部と非癌部との間に有意差を認めた。病理組織診断を反映して、非腫瘍部に比較して腫瘍部が高値になるようなコンピュータ診断に適した画像診断基準を設定し、画像データベースの作成を行う。構築した画像データーベースに対し画像認識コアシステムを用いて、高品質な「辞書」の作成を行い、最適な定量的な数値が提示できるようにする。また、画像認識コアシステムに関しては国際共同研究を行いさらに高精度な定量化が行えるよう改良を行う。これらの結果を基にハードウェア化による高速化を行い、リアルタイムで内視鏡画像の定量的評価を行う。これらの結果を基にハードウェア化を行い高速化を行う。平成25年度はこれまでの自動領域抽出アルゴリズムに関する研究成果を元にハードウェア化を行いリアルタイム画像認識システム構築を行う予定であった。しかしより高性能なリアルタイム画像認識システムの実現に関する新たな知見が得られたことより、平成25年度での新たに構築を行わずさらに十分成果が出た段階でそれに合わせたシステムの構築を行う事とした。そのため平成25年度はこれまで構築したシステムによる運用で研究の継続を行った事より、次年度使用額が生じた。画像データーベースの作成のため、画像記録装置(ハードディスクドライブ)を購入する。リアルタイム画像認識システムの構築のためコンピュータの購入を行う。分担研究者との打ち合わせや機器使用に関する打ち合わせなどに研究打ち合わせ旅費を使用する。研究代表者および研究分担者が国内会議に年2回、国際会議に年1回程度は研究発表を行う予定である。また、学術論文も1報以上発表する予定である。プログラム作成の一部を外部委託する。
人の知覚認知処理機構に基づく音声の時間的側面の数理モデル構築

本研究の目的は,音声の韻律情報の中から時間的側面に焦点を絞って,人が内的に用いる手がかりを特定し,その使われ方を理解し,人に代わって音声の時間情報の妥当性・自然性を定量的に評価するしくみを作ることであった。要素課題として(I)心理物理レベルの調査,(II)言語レベルの調査,(III)モデルの構築の3段階を設定した。本研究の大きな特徴は,評価対象が言語音声であるにもかかわらず,心理物理レベルの調査にも言語レベルと同等に重きを置いた点であった。たとえ意味が分からない言語であっても早口かどうかは分かることから,音声の時間的側面の処理には言語によらない過程が関わっていると想定できる。そのような言語に依存しない過程を最大限利用することで,言語処理に要するオーバーヘッドが小さく,また多言語への拡張が容易なシステムの基礎となる技術を目指した。主要な成果を以下に示す。(I)心理物理レベル:聴覚初期家庭の機能を模擬して音声のリズム参照点を検出するアルゴリズムを作成した。言語知識を一切用いないため,適用可能な言語の範囲に事実上制約がないという利点を有する。(II)言語レベル:日英語母語話者を対象に外国語音声のリズム単位の聞き取りが個別言語で用いられる単位(シラブルやモーラ)に依存することを実証した。これは,外国語学習法における韻律情報の与え方のデザインなどに大きな波及効果を持つ。(III)モデルの構築:日英語母語話者の英語音声を対象として時間的側面の自然性を自動評価するプロトタイプモデルを構築した。心理物理レベルの調査で得られた聴覚の機能を組み込むことで,英語母語話者の教師による主観的な評価に近づけることができた。これは,音声の妥当性・自然性評価における心理物理特性の重要性を示すとともに,本モデルのしくみが潜在的に持つ言語拡張性の高さを示す。本研究の目的は,音声の韻律要素の中から時間的側面の評価について,人間が内的に行う処理を模擬するモデルを構築することである。平成16年度は,海外共同研究者(カナダ,タイ)との協力体制を確立するとともに,言語に依存しない聴覚の基礎過程を扱う心理物理レベルと言語の違いに依存する処理を扱う言語レベルの2段階でモデル構築に着手した。さらに,モデルを検証するためのfMRIを用いた脳活動観測実験を立ち上げた。主要な結果は以下のとおりである。心理物理レベルでは,知覚的リズム形成の従来モデルであるラウドネスジャンプモデル(加藤,1999)を起点として,同モデルで前提としていた音韻セグメンテーションを一切必要としないモデルのデザインに取り組んだ。従来は予め与えられた音韻境界に知覚的リズムの参照点の候補を設定していたが,新モデルでは聴覚の特性を精密に再現することで,知覚的に特に目立つ音響的変化を予測し,それを参照点候補とする。予備的検討の結果,従来法では検出できない参照点候補の自動抽出が可能であることを確認した。言語レベルでは,時間長変動により辞書的意味が変わる日本語特殊拍を対象として,知覚特性に及ぼす母語の影響を調査した。カナダの共同研究者から研修研究員を迎え,特殊拍同定に対する発話速度の効果を調べた結果,母語話者では速度に比例した適応的な反応が見られるのに対し,非母語話者では固定的な反応が支配的であることが明らかになった。一方,音声の時間構造と他の韻律要素である高さ(FO)との相互作用を実験的に検討した結果,FOの時間変化パターンを平均的高さと形状の2変数で記述することで,話者の発話意図をモデル化できるとの見通しを得た。

本研究の目的は,音声の韻律要素の中から時間的側面の評価について,人間が内的に行う処理を模擬するモデルを構築することである。平成17年度は,言語に依存しない聴覚の基礎過程を扱う心理物理レベルと言語の違いに依存する処理を扱う言語レベルの2段階でモデル構築を推進した。また,海外共同研究者の一人をタイから招聘して情報交換を行うなど海外との協力体制維持を図った。主要な成果は以下のとおりである。心理物理レベルでは,予め与えられる知識に基づく音韻セグメンテーションを必要としない知覚的リズム形成のモデル構築に取り組んだ。従来モデル(*)では,母音種類の転換点のようなラウドネス(音の大きさ)の急峻な変化を伴わない部分をリズム参照点としてとらえていなかったが,人の音声処理においてはそのような部分もリズム形成の手がかりとして利用され得る。そこで,聴覚末梢における周波数分析機能を模擬し,その出力を利用することにより周波数帯域毎のレベル変化に基づく事象検出機能を実現し,新モデルに適用した。実音声を用いたシミュレーションの結果,従来法では検出できなかった母音種類の転換点のような参照点候補の自動抽出が可能であることが分かった。言語レベルでは,時間長変動により辞書的意味が変わる日本語特殊拍の非母語話者による知覚の特性とその訓練による変化を調査した。訓練により非母語話者の知覚特性は母語話者に近づくこと,一種類の特殊拍(長音)の訓練でも他種類の特殊拍の聞きとり(促音,撥音)に効果が般化することなどが明らかになった。なお,訓練と並行して訓練前後の脳活動の様子をfMRIにより観測した。次に,音声の時間構造と他の韻律要素である高さ(F0)との相互作用の検討では,発話内容の語に内在する意味に応じてF0の時間変化パターンを継続時間長と組み合わせて制御することにより,話者の発話意図を精度良く再現できることが分かった。*加藤他(1999).日本音響学会誌55,752-760.本研究の目的は,音声の韻律要素の中から時間的側面の評価について,人間が内的に行う処理を模擬するモデルを構築することである。言語に依存しない聴覚の基礎過程を扱う心理物理レベルと言語の違いに依存する処理を扱う言語レベルの2段階で研究を進めている。平成18年度は,2つのレベルでの研究活動を継続するとともに,これまでの成果を広報し今後の活動への指針を得るため,国際ワークショップを開催した。心理物理レベルでは,音声に関する知識を必要としない知覚的リズム形成のモデル構築を進めた。従来は扱うことが困難であった基本周波数の転換点のようなラウドネス(音の大きさ)の急峻な変化を伴わない部分をリズム参照点としてとらえる方法を提案した。言語レベルでは,英語学習者音声の時間的側面を評価するモデルの構築に着手し,発話速度正規化の効果を検証した。また,タイの研究協力者を早稲田大学に迎え,タイ語の時間構造のモデル化を試みた結果,音韻レベルの構造については言語共通の,音節以上のレベルでは言語固有の特徴を用いることにより,モデルの精度が上がるとの見通しを得た。
在宅脳卒中、患者の機能的予後

入院リハビリテーション後の在宅脳卒中患者251名を対象として、バ-セル・インデックスと老研式活動能力指標を組み合わせた12項目拡大ADL尺度を用いてその機能的状態をアンケート調査した。調査項目としてバ-セル・インデックスからADL8項(食事、移乗、整容、トイレ動作、入浴、歩行、階段昇降、更衣)、老研式活動能力指標からIADL4項目(バスや電車での外出、日用品の買い物、食事の用意、預貯金の出し入れ)であった。各項目で「自立」もしくは「できる」という場合に各々1点が与えられた。251名のうち、176名(このうち3名が死亡)から有効回答が得られた。死亡例を除外した173名を分析対象とした。平均年齢は61.6歳、退院から調査までの期間の平均は27.7月であった。退院時ADLが満点(8点)であったのが114名(65.9%)、7点以下が59名(34.1%)であり、平均得点は6.7点であった。したがって、約66%の者が退院時ADLが自立していた。拡大ADLの平均得点は8.3点であった。ADLとIADLに分けて検討すると、ADLとIADLが満点であったすなわち社会的自立であったのが46名(26.6%)、ADLが満点でIADLが3点以下すなわちADL自立であったのが50名(28.9%)、ADLが7点以下でIADLが3点以下すなわちADL介助であったのが77名(44.5%)であった。したがって、社会的自立とADL自立を合わせた96名(55.5%)が自立していた。機能的予後に生存分析を応用すると、退院時ADLが自立か介助かにかかわらず3/4の患者は少なくとも退院後2年目まで自立度を維持するが、3年目以降に急激に低下した。さらに、在宅における自立度(自立か介助)に関わる要因を検討すると、患者全体では退院時ADLばかりでなく、年齢、配偶者の有無、家族成員数および発症前社会適応状態など複数の要因が関連していた。また、退院時ADLが自立していた者では、家族成員数や発症前社会適応状態などが関連していた。すなわち、在宅脳卒中患者における機能の維持・向上には家族状況なども増えた治療的介入が必要であろう。
自然事象のイメージを膨らませ,理科の面白さや有用性を実感できるカリキュラム開発

○研究の目的理科は,小学校では興味関心が高いが,中学校ではその度合いが落ちる傾向にある。PISA調査でも「科学に関連した職業に就くための準備としての学校の有用性」が日本は低いという結果も出ている。中学校でも理科授業への関心が高まるような方策をとる必要性があると考える。そこで課題を「自然事象のイメージを膨らませ,理科の面白さや有用性を実感できるカリキュラム開発」と設定し,児童の自然を観る目を鍛えその面白さや追究する楽しさを十分に味わい,生活に即して自然事象をもう一度思考し,学びを納得できるような理科授業を構想,実践していくことを研究目的と考えた。○研究方法1昨年度の研究内容を見直し授業実践について論文にまとめることで成果と課題を明らかにした。2天竜川流域調査を実施し,自然の巧みさを感じられる5年「流水」に関する自作ビデオ教材を開発した。3学んだことを整理しながら科学的な知識や技能を活用し,生活にかかわらせて思考・判断できるカリキュラム構想と実践をした。(京都大学大学院教育学研究科西岡加名恵准教授主催の研修等への参加と連携)4自然概念についての自己意識分析を児童が行える「サイエンスアナライザー」を構想・実践した。○研究成果1京都大学大学院教育学研究科E.FORUM及び教育目標・評価学会での研修に参加し研究を深めるとともに6年「水溶液の性質」単元における授業実践や考察を「パフォーマンス評価(田中耕治編著)」にまとめ発表できた。このことを通して,学びを活用しながら子どもたちの思考力・判断力・表現力を育成できる「パフォーマンス課題」の実践研究ができた。また,他単元でも,授業実践を行うことができた。2天竜川流域調査を行い,5年「流れる水の働き」単元で使用できる自作ビデオ教材や写真を使った掲示資料を作成し,それらを活用して授業実践できたことで,子どもが学びを納得できた。3児童が自然概念についての意識分析を行える「サイエンスアナライザー」を実践し,学習前後の自然概念についての意識変化を学びの実感に結びつけることができた。
光スイッチ機構を持つ低分子量G蛋白質Rasの開発と細胞内情報伝達の光制御

Rasは、低分子量G蛋白質の1つで、細胞の増殖・分化、遺伝子発現、細胞間接着などの重要な細胞機能の調節を行っている。Rasの構造とその生体分子機械としての分子機構は良く研究されているので、その仕組みを巧みに利用して外部刺激で制御することができれば、細胞機能の人工的な調節が可能になる。本研究では、RasとRasの制御因子の機械的な仕組みに光応答性のフォトクロミック分子を光スイッチ(制御ナノデバイス)として導入して、Rasの機能を光可逆的に制御することを目的としている。最終年度では、これまでに得られた実験結果を元に、最適化されたSOSペプチドと新規Ras阻害ペプチドにアゾベンゼン誘導体を導入してRasのGDP-GTP交換反応を光可逆的に制御することに成功した。最適化SOSペプチドに二価架橋性アゾベンゼン誘導体ABDMを分子内架橋することにより、ペプチドの二次構造が著しく安定した。また、ABDMの光異性化に伴う構造変化によって、ペプチド二次構造が分的に変化することが確認された。ABDMを導入したペプチドは、SOSと競合阻害し、Rasのヌクレオチド交換反応を阻害することが確認された。またABDM-ペプチドは、Cis-Trans異性化に伴い有意に阻害活性が変化することが示された。これらのことから、フォトクロミック分子を導入したペプチドを用いて、Rasのヌクレオチド交換因子SOSのRasへの結合を光可逆的に制御することにより、RasのGDP-GTP交換反応を間接的にコントロールできることが示された。また、新規ペプチド阻害剤KRpep-2dの分子内S-S結合部位に水溶性スルホン化アゾベンゼン誘導体ょを導入して光可逆的にRasのGDP-GTP交換反応を光可逆的に制御できることが示された。また、GTP加水分解に関係するアミノ酸の変異は細胞の癌化を誘導することが分かっている。Rasの構造と生体分子機械としての機構は良く研究されているので、その仕組みを巧みに利用して外部刺激で制御することができれば、細胞機能の人工的な調節が可能になる。本研究ではRasの機械的な仕組みとRasの制御因子に光応答性のフォトクロミック分子を制御ナノデバイスとして導入し、光可逆的にRasの機能を制御することを目的としている。本研究計画では、Rasを分子機械として捉え、その機械的な仕組みにフォトクロミック分子を制御ナノデバイスとして導入し、光可逆的にRasの細胞情報伝達を制御することにより、細胞機能を調節することを目的としている。Ras自体の分子機械的仕組とRasの制御因子であるGAPやGEFの機能部位、さらにRas特異的な低分子化合物の阻害剤にフォトクロミック分子を導入して、Rasの情報伝達の機能を光可逆的に制御することを試みた。1.低分子量G蛋白質Rasの制御因子であるグアニンヌクレオチド交換因子(GAP)の一つであるSOSのRas結合部位類似配列を持つ合成ペプチドに光スイッチ機構を導入して光可逆的にRasの機能を制御する基礎実験を行った。アゾベンゼン誘導体で分子内架橋されたSOSのRas結合部位ペプチドの二次構造を光可逆的に変化することに成功した。2. Rasの機能部位に反応性のシステインを導入した変異体を調製して、フォトクロミック分子であるアゾベンゼン誘導体を導入して、RasのGTPase活性とGEFによるGDP-GTP交換反応を光可逆的に制御できることを示した。研究期間内に実施する次の6項目の研究計画のうち1, 2, 3, 4に関して、予備的な実験も含めて具体的に実施することができた。そして、今後研究を進める上で重要な知見を得ることができている。1.機能部位にシステインを持つRas変異体およびRas制御因子GAPとGEF変異体の調製2.フォトクロミック分子のデザインと合成3.フォトクロミック分子のRas,GAP,GEF変異体への導入と光可逆的活性制御4.GEFのRas結合部位合成ペプチドのデザインとフォトクロミック分子の導入5.Ras特異的阻害剤へのフォトクロミック分子の導入6.細胞レベルでのRasの光可逆的制御Rasは、低分子量G蛋白質の1つで、細胞の増殖・分化、遺伝子発現、細胞間接着などの重要な細胞機能の調節を行っている。1.昨年度使用したSOS αH helixペプチドを改変した最適化ペプチドを調製し、二価架橋性アゾベンゼン誘導体ABDMを修飾した。そして、ABDM修飾したペプチド(SOS-ABDM)が実際に光異性化し、ペプチドの二次構造に変化を与えるかどうかを吸光スペクトルおよびCDスペクトルで確認した。蛍光標識GDPアナログNBDを利用して、最適化SOSペプチド-ABDMがwild type SOSと競合阻害することが明らかになった。2.細胞への効果を調べる実験を行った。

Rasの細胞情報伝達の制御を調べるために、よく知られているRAS/MAPKカスケードであるRAS/RAF/MEK/ERK経路を利用した。HeLa細胞にSOS-ABDMを作用させ、EGF刺激した後にERK1/2とpERKの割合をWestern blotで検出を行った。コントロール実験では、EGF刺激によってHeLa細胞内のRasが活性化して下流のMAPK/ERK経路が活性化し、ERKがリン酸化が観察された。これに対して最適化SOSペプチド-ABDMを加えるとERKのリン酸化の割合が減少した。このことから、SOSペプチド-ABDMが細胞へ応用可能であることが示された。当初の研究計画であったSOSペプチドに二価架橋性アゾベンゼン誘導体を導入して、ペプチドの二次構造を光可逆的に変化させる方法の基盤を確立することができた。この方法により初年度のペプチドのアミノ酸配列を最適化したペプチドでも同様に導入することができた。さらに、細胞内でのRASの情報伝達機能を制御できる可能性を示す予備的な実験結果を得ることができた。今回、Rasの細胞内での機能を見るために利用したRAS/RAF/MEK/ERK情報伝達経路は、古典的なRAS/MAPKカスケードであり、おもに増殖因子による刺激を核に伝え、細胞の増殖・分化・細胞死に関わるものである。活性化したRASがRAFを活性化し、RAFが下流のMEK1/2の2つのセリン残基をリン酸化し、MEK1/2がERK1/2のスレオニン残基・チロシン残基をリン酸化することによりシグナルが伝達される。活性化したERK1/2は核の中に移行してELK-1、Sap-1などの転写因子を活性化するとともに、細胞質でRSK(ribosomal S6 kinase)やMNK(MAP kinase interacting kinase)をリン酸化する。今回の実験で、アゾベンゼン誘導体を導入したSOSペプチドは、細胞内でERKのリン酸化を阻害する事が示された。これらの結果は、実際にフォトクロミックSOSペプチドが細胞レベルでRASの情報伝達に影響を与えることを示しており、本研究計画の最終的な目的を達成できる可能性を強く示唆している。本研究では、RasとRasの制御因子の機械的な仕組みに光応答性のフォトクロミック分子を光スイッチ(制御ナノデバイス)として導入して、Rasの機能を光可逆的に制御することを目的としている。1.効率の高い光可逆性を示すフォトクロミック誘導体架橋SOSペプチドの調製効果的にRasの機能を制御するためにRasへの親和性が高い最適化したSOSペプチドのデザインと合成を行った。これまでに用いてきたペプチド1のN末とC末に親水性のアミノ酸であるアルギニンを導入したペプチド2, 3そして4を合成した。ペプチド2: RRFCGIYRLEALKACEAN-NH2,ペプチド3: RRFCGIYLTNALKTCEGN,ペプチド4:RRFCGIYLTNALKTCEGNRR-NH22.新規水溶性二価架橋性アゾベンゼン誘導体(WSAB)のSOSペプチドへの導入これまで用いてきたアゾベンゼン誘導体は、疎水性が強く導入したペプチドの水溶液への溶解度に問題があった。
糖尿病性血管病変の成因-グリケーション最終産物による内皮細胞機能の修飾

糖尿病性血管病変の成因を究明する目的で、血管内皮細胞・血管平滑筋細胞に対する強力な増殖因子である繊維芽細胞増殖因子(FGF)に焦点を当て、FGFとそのファミリーに属するアンドロゲン誘導性増殖因子(AIGF)の作用機構に関する解析を行なった。まずFGFファミリー増殖因子の受容体であるFGF receptor 1(FGFR1)遺伝子の5'上流をクローニングし、そのプロモーター領域を決定した。さらにFGF receptor 1遺伝子の転写活性が、リガンドであるFGFやAIGFにより促進されることを明らかにした。スラミンはFGFの受容体への結合を阻害するのみならず、FGFR1の転写活性も抑制することにより抗FGF作用を発揮することを示した。またFGFの細胞増殖作用発現のためには、細胞膜や細胞外基質のヘパラン硫酸の存在が必要であることを、オートクリン機構により増殖が調節される系で初めて明らかにした。bFGFには4種の異なった翻訳産物が存在することが報告されているが、下垂体腫瘍においても4種の亜分子種が発現していることを報告した。次に血管内皮細胞や血管平滑筋細胞におけるグリケーション最終産物(AGE)受容体の発現を、RT-PCR法により解析した。competitive PCR法による定量では両方の細胞においてほぼ同等の発現を認めた。すなわち血管平滑筋細胞におけるAGE受容体の発現を初めて明らかにした。AGE受容体の発現量は、リガンドやFGFなどの増殖刺激で有意な変化を示さなかった。また、内皮細胞や平滑筋細胞を培養条件下にAGEで処理すると、そのDNA合成、PDGF-B鎖やVEGFの発現には明らかな変化を認めなかった。
鼻アレルギー及び慢性副鼻腔炎におけるサイトカイン・細胞接着分子の動態

鼻の代表的炎症疾患である、慢性副鼻腔炎および鼻アレルギー患者の鼻・副鼻腔粘膜局所でのサイトカインならびに、細胞接着分子の発現について検討を行った。さらに、気道ウイルス感染が、これらの発現に及ぼす影響についても検討した。1. Polymerase chain reaction法を用いた検討により、慢性副鼻腔炎患者の上顎洞粘膜には、種々のサイトカインや細胞接着分子の遺伝子発現が認められた。IL-1α、IL-1βは特に急性増悪期に発現が認められた。副鼻腔粘膜に存在するT細胞が、このようなサイトカインの発現や、病態形成に重要な役割を果たしていると考えられた。さらに、細胞外マトリックスが、このようなT細胞の持続的活性化に関与していることが示唆された。2.鼻アレルギー患者の鼻粘膜でのサイトカインについての検討では、特異抗原やサブスタンスPの接種により、種々のサイトカイン遺伝子の発現が認められた。これらのサイトカインは、細胞接着分子の発現を介して細胞浸潤を誘導し、遅発相の発現への関与が示唆された。また、ニューロペプタイドの1つであるサブスタンスPも、免疫調節性サイトカインの発現を介して、アレルギー反応に関与していることが示唆された。3. Respiratory syncytialvirus (RSウイルス)接種により、鼻粘膜でTh-1、Th-2サイトカインも含め種々のサイトカインの発現が認められることが、in vivo、in vitroにおいて確認された。しかし、同じウイルスでもその抗原の違いにより、誘導されるサイトカインは大きく異なった。各種サイトカイン、細胞接着分子の遺伝子検出のためのpolymerase chain reaction(PCR)法を確立し、その感度、特異性について検討を行い良好な結果を得た。本法を用いて、慢性副鼻腔炎、鼻アレルギー患者から採取した手術標本よりRNAを抽出し、サイトカイン、細胞接着分子の遺伝子発現の検討を行った。1.慢性副鼻腔炎・上顎洞粘膜におけるサイトカイン遺伝子の発現を検討したところ、特に炎症性性格の強いIL-6、IL-α,TNF-αは検討した症例全例に認められた。一方、IL-1α、IL-1βは急性増悪期の症例で発現する傾向があった。IL-5、IFN-γなどT細胞由来のサイトカイン遺伝子の発現も高率に認められ、組織学的にも活性化Tリンパ球の存在が多数認められた。さらに、これらの細胞の浸潤に関与するICAM-1、VCAM-1、ELAM-1といった接着分子も高頻度に上顎洞粘膜に認められた。このように、慢性副鼻腔炎では種々の炎症性サイトカインの発現が認められるが、そのネットワークの形成に活性化Tリンパ球の関与が考えられた。2.鼻アレルギー患者の鼻粘膜では抗原投与後、好酸球をはじめとして好中球、リンパ球等の浸潤が認められ病態の形成に関与するが、免疫組織学的にもこれら炎症細胞の浸潤に関与する種々の接着分子の発現が血管内皮細胞に認められた。鼻アレルギー患者の鼻粘膜を、in vitroにて抗原により刺激したところ、種々のサイトカイン遺伝子の発現亢進が認められたが、これらサイトカインが接着分子の発現、ひいては炎症細胞の浸潤、活性化に直接関与していると考えられた。鼻の代表的疾患である鼻アレルギー、及び慢性副鼻腔炎での免疫機構の研究のため、培養系を用いて検討を行った。1.手術により採取した鼻粘膜より上皮細胞の分離・培養を行い、in vitroにてRSウイルスの接種を行ったところ、IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-αの産生がELISA法にて確認された。これらサイトカイン産生に及ぼす各種薬剤の影響を検討したところ、ニューマクロイド(ロキシスロマイシン)やホスフォマイシンでは添加により、濃度依存的に産生の抑制が認められた。サイコサポニンの添加は、10ng/ml前後をpeakにサイトカイン産生の亢進作用が認められた。2.慢性副鼻腔

炎患者の上顎洞より採取した粘膜よりリンパ球を分離・培養したところ、IL-5、IL-6、IFN-γのサイトカイン遺伝子の発現が、polymerase chain reaction法により認められた。さらに、これらリンパ球を、ラミニンやフィブロネクチンをcoatingしたプレート上で培養したところ、サイトカインの発現持続が認められた。3.鼻粘膜上皮の線毛運動に及ぼすサイトカインの影響をin vitroにてphotoelectrical法により検討を行ったところ、TNF-α、IL-6により濃度依存的に線毛運動の障害が認められかつそれぞれの中和抗体により障害が改善されたことから、線毛運動へのこれらサイトカインの影響が考えられた。また、ロキシスロマイシンの併用により、サイトカインによる線毛運動障害に対して阻止作用が認められた。*培養系を用いての検討(in vitroでの鼻粘膜でのサイトカイン発現と薬剤の影響についての検討):手術にて採取したハウスダスト(HD)鼻アレルギー患者鼻粘膜を細切後、95%O_2下に培養した。12時間後にRNAを抽出し、サイトカイン遺伝子の発現をpolymerase chain reaction法により検討した。HD抗原の接種によりIL-4、IL-5をはじめ、種々のサイトカイン遺伝子の発現亢進が認められたが、トシル酸スプラタストの添加によりIL-5/IFN-γ遺伝子発現比の減少が1μg-ml以上の濃度で認められた。アゼラスチンは10μg/ml以上の濃度では細胞障害性が認められ、1μg/ml以下の濃度ではサイトカイン遺伝子発現への影響は明らかではなかった。*動物モデルを用いての検討(in vivoでのRSウイルス感染によるサイトカイン産生):BALB/cマウスに、RSウイルスの2種類の糖蛋白(G糖蛋白、F糖蛋白)でprime後に、RSウイルスの経鼻接種を行い、その後の肺、鼻粘膜組織でのRSウイルスの増殖,ならびにサイトカイン産生について検討した。いずれの糖蛋白の免疫にても、その後のRSウイルス接種による肺でのウイルス増殖は、対照とした非免疫マウスに比べ著明に抑制された。一方、鼻粘膜でのウイルス増殖の抑制は免疫群でも明らかではなかった。肺胞洗浄液中のサイトカインは、G糖蛋白でprimeしたマウスではTh2、Th1サイトカインがいずれも高濃度に認められ、一方、F糖蛋白でprimeしたマウスでは、主にTh1サイトカインの高い産生が認められた。鼻腔洗浄液中のサイトカイン産生は低値であった。肺組織にはG糖蛋白でprimeしたマウスでは、好酸球、リンパ球の著しい浸潤が認められた。同じウイルスでも、抗原の違いによりサイトカインの産生パターン、病理変化に著しい差が認められることが明らかになった。
新しい多成分ラジカルカップリング反応の開発

本研究では、有機テルル化合物からの可逆的な炭素ラジカル生成法を利用した新しいラジカル反応の開発について検討を行ない、グループ移動型のイミドイル化反応、リビングラジカル重合、連続的なラジカルカップリング反応などの新しい反応を見出した。さらに、反応機構の理解と反応設計を目的として理論計算による反応解析を行った。その概略を示した。1.グループ移動型のイミドイル化反応の開発有機テルル化合物とイソニトリルとのラジカル的なイミドイル化反応を検討した結果、グループ移動型のイミドイル化反応を初めて見出し、この反応が極めて高い一般性を持つことを明らかにした。さらに、理論計算による反応解析を行った結果、イミドイル化反応の反応経路をすべて明らかにすると共に、反応の進行が熱力学的要因により支配されていることを明らかにした。2.リビングラジカル重合系の開発アルケンをラジカル受容体として用いることにより、有機テルル化合物のグループ移動型反応と生成物における炭素-テルル結合の開裂、アルケンの挿入を繰り返すことでリビングラジカル重合が進行することを明らかにした。本反応は有機テルル化合物を開始剤とする初めての重合系である。生成物のポリマーにおける炭素-テルル結合のラジカル的及びイオン的な変換を用いることで、ポリマー末端に様々な官能基を持つポリマーが効率よく得られることを明らかにした。3.連続的なラジカルカップリング反応炭素-炭素結合生成を連続的に行う新しいラジカルカップリング反応の開発を行った。すなわち、シリルテルリドとカルボニル化合物,アルキンとのラジカルカップリング反応の後、生成物のビニル炭素-テルル結合からのスズラジカルを用いたラジカル生成とアルケンとのカップリングにより、立体選択的に三置換アリルアルコール類が合成できることを明らかにした。新しい多成分カップリング反応の開発は有機合成において重要な課題である。この目的のためには、各反応素過程の本質的な理解が不可欠である。そこで本研究では、ラジカル活性種を用いる多成分カップリング反応に着目し、その素過程としてイミドイル化反応について、類似の反応であるカルボニル化反応と比較しながら合成的および理論的に反応性の違いについて詳細な検討を行った。すなわち、有機テルル化合物から可逆的に生成する炭素ラジカルとイソニトリルとの反応を検討したところ、イミドイル化反応が類似の反応であるカルボニル化反応に比べて合成的な適用範囲が広いことを明らかにした。特に、アシルラジカルやグリコシルラジカルなどの安定ラジカルとの反応に優れており、イソニトリルが一炭素の増炭反応に有用な反応試薬であることを明らかにした。さらに、イミドイル化反応とカルボニル化反応の違いについて理論計算を行ったところ、反応性の違いが動力学的な要因にあるのではなく、生成するイミドイルラジカルとアシルラジカルの安定性の違いによっており、イミドイル化反応が実質上非可逆的に進んでいることを明らかにした。さらに、ラジカル反応を用いたカルボニル炭素での炭素-炭素結合生成反応の開発を目指して検討を行った結果、シリルテルリド、カルボニル化合物、イソニトリルによる熱的な三成分カップリング反応を見出した。この反応では中間体との間にいくつかの平衡が存在するが、イミドイル化反応が非可逆的であるため最も安定なカップリングタイが得られたことが示唆された。その概略を示した。
正常眼圧緑内障モデルマウスを用いた神経保護、網膜再生の研究

細胞の生死にかかわるとされるNF-kBp50欠損マウス(KOマウス)は、正常眼圧緑内障(NTG)モデルマウスともいうべき性質を備えている。アポトーシス関連因子であるカルシニューリン阻害剤であるタクロリムスの網膜神経節細胞(RGC)保護、再生について研究を進めた。年齢依存性にRGCが減少するKOマウスにタクロリムスを長期間腹腔内投与したところ、RGC数、軸索数の減少は見られず、タクロリムスが神経保護に関与していることが示された。また、タクロリムスを長期投与したKOマウスでは、RGCの増殖が認められた。網膜障害-再生モデルにおいては、bFGFの発現が多く認められた。以上より、NTGモデルマウスを用いた実験によってタクロリムスの神経保護、再生の可能性が示唆され、bFGFがキー物質であることが示唆された。研究目的:正常眼圧緑内障(NTG)モデルマウスというべき性質を備えたNF-kBp50ノックアウトマウス(KO)を持ちいて、タクロリムス(Tac.)の網膜神経節細胞(RGC)保護、再生について研究を進めている。研究実施計画に基づき、RGCが減少してくると思われる4ヶ月齢のワイルドタイプマウス(WT)、KOマウスそれぞれにTac.を6ヶ月間腹腔内投与を行い、HE染色した網膜切片を用いてRGC数、電子顕微鏡を用いて軸索数を計測し検討した。10ヶ月齢のWTでは軸索、RGC数に変化はなく、同月齢のKOではWTに比して40%程度のRGC数の減少が認められた。タクロリムスを投与したKOではRGC数、軸索数の減少は見られず、自然経過においてタクロリムスが神経保護に関与していることが示された。神経保護、再生に関わると思われる物質を調べるため、RT-RCR,ERISA法をもちいて、各種成長因子の発現(bFGF、NGF、Wnt3)について検証した。タクロリムスを投与したKOマウス、もしくはマウス硝子体内にN-メチル-D-アスパラギン酸(NMDA)を投与した網膜障害-再生モデルにおいて、bFGFの発現が多く認められた(KO+Tac.;150pg/ml,WT+NMDA+Tac.;135pg/ml, control;20-30pg/ml)。したがって、NTGモデルマウスを用いた実験によってTac.の神経保護、再生の可能性が示唆され、bFGFがキー物質であることが示唆された。研究目的:正常眼圧緑内障(NTG)モデルマウスというべき性質を備えたNF-kBp50ノックアウトマウス(KO )を用いて、タクロリムスの網膜神経節細胞(RGC)保護、再生について研究を進める。研究実地計画に基づき、ワイルドタイプマウス(WT),KOマウスそれぞれにタクロリムスを一か月腹腔内投与を行い、HE染色した網膜切片を用いてRGC数、視神経横断面積、電子顕微鏡による軸索数を計測し検討した。視神経横断面積は、WT,p50KOともにタクロリムス投与群、非投与群で有意な差は認められず、p50KOにおいてRGC,軸索数ともにタクロリムス投与群では非投与群よりも有意にRGC細胞減少が抑制された。得られた資料を用いて、神経保護、再生に関わるNF-kBp50, p65, BAX, PAX6, Chx-10の抗体を用いて免疫染色を行い、網膜細胞との二重染色を行った。PAX6, Chx-10などの再生にかかわるホメオボックス遺伝子は、PKCα(双極細胞の標識)との二重染色陽性を示し、網膜再生に双極細胞が鍵であることが示唆された。信州大学緑内障外来において、タクロリムスの点滴、内服使用歴があり、NTGの診断がなされている患者を医療記録より検索、タクロリムス使用期間における視野欠損の進行、視神経繊維厚を測定した。タクロリムス投与期間において、該当する患者における視野欠損進行、神経線維厚の減少は認められず、タクロリムスの神経保護効果が示唆された。p50KOに対してタクロリムスを投与し、その試料を免疫染色などで解析する実験はおおむね順調である。網膜再生においても一定の結果を得ることができた。p50KOと、CFPにより特異的にRGCを可視化したトランスジェニックマウス(CFPマウス)との交配を試みているが、トランスジェニックマウスとノックアウトマウスの交配は難易度が高く、十分な個体を得て解析するまでには至っていない。CFP/p50KOマウスが得られれば、網膜再生、神経保護の分野において飛躍的に情報が得られると考えている。

網膜の保護、再生に関与すると思われる標的遺伝子をマイクロアレイにて同定後、RT-PCRを行いmRNAレベルの発現状態を観察する。WT,KO,タクロリムスの長期投与を行ったp50KOの網膜からmRNAを抽出し、DNAマイクロアレイを行い、標的遺伝子の増減を調べる予定である。p50KO/CFPマウスが得られれば、ライブにてRGCの様子を観察できるため、網膜保護、再生分野において飛躍的に情報が得られる。引き続き手続きを進める予定である。DNAマイクロアレイ解析の総合受託会社に依頼した場合、一試料あたり3050万円、3試料分がかかると考えられる。動物購入、輸送費が約30万円、維持費が20万円ほどかかると考えられる。23年度は当初計画で見込んだよりも安価に研究が完了したため、少額ではあるが次年度使用額が生じた。
新規創薬に向けた、ＣＣＮ２／３の協調作用による軟骨の発生・分化調節機構の解明

CCN2はCCNファミリーに属し、軟骨細胞の増殖分化を調節する因子である。一方CCN3の軟骨細胞での機能は未だ不明な点が多い。そこで本研究ではCCN3の軟骨分化における機能およびCCN2との相互作用について解析した。そして、CCN3が軟骨分化予定域に発現しており、CCN2とCCN3が結合することを見いだした。また、肢芽由来の未分化な細胞でCCN3が増殖とプロテオグリカン合成を促進し初期軟骨分化の調節に関与していることが示唆された。さらに、これらCCN3の機能はERK1/2経路を介していることを見出した。以上より軟骨の再生療法開発にCCN2およびCCN3が有用であるとの示唆を得た。軟骨組織再生因子の1つとして期待されているCCN2は様々な生理活性物質と結合し、多彩な機能を発揮するタンパク質であり、内軟骨性骨形成の各段階に関与する因子である。これまでの検討により、申請者らは同一の遺伝子ファミリーのメンバーであるCCN2とCCN3が軟骨の発生段階で協調的に作用していることを示してきた。そして、昨年度のCCN2、CCN3の発現時期と分布パターン解析の結果から、肋軟骨、四肢骨成長板軟骨等各種軟骨組織において発生の初期段階で6つのCCNメンバー中、CCN3が最も早期に強発現していることを見出した。この結果を受け、本年度は初期軟骨分化過程におけるCCN2とCCN3両者の作用とその分子メカニズムについて検討した。方法としては、胎生11.5日のマウス胎仔肢芽より調整した細胞の高密度培養系にリコンビナントCCN2, CCN3を添加する、あるいは両者をそれぞれ標的とするsiRNAを用いてノックダウンすることにより評価した。その結果CCN3は成熟した軟骨細胞の増殖分化を抑制する一方で、初期分化段階ではCCN2と同様に軟骨細胞の増殖とプロテオグリカン合成を促進することを見出した。さらに、軟骨細胞の増殖ではCCN2,CCN3ともにERK1/2経路の活性化を促進し、ERK経路阻害剤の添加によりCCN2, CCN3の増殖促進効果が消失することが明らかとなった。そして両者を共に作用させると、ERK1/2経路の活性化と増殖促進効果がさらに高まることを見出した。最終年度は、軟骨の初期分化段階にあるE10.5マウス胎仔の肢芽のパラフィン包埋切片および肢芽より調整した細胞を用いた遺伝子発現解析およびmicro mass培養系を用いた解析から、CCN2およびCCN3の動態、機能について以下の結果を得た。まずE10.5マウスの肢芽の切片を用いて、CCN2およびCCN3の免疫染色と軟骨基質を検出する染色を行った結果、この時期ではCCN2は検出されなかったがCCN3は肢芽全体に発現が見られ、アルシアンブルーおよびサフラニンOの染色性は微弱であった。次いで、同時期から新生仔までの肢芽を破砕してRNAを調整し、リアルタイムPCR法にてCCNファミリーメンバーの発現解析を試みた結果、E10.5でCCN3の発現がみとめられたが、他のメンバーは検出限界以下であった。そしてCCN3の発現上昇に伴ってCCN2の発現がみられはじめた。以上から、軟骨基質の産生が乏しい、初期分化段階にある軟骨細胞でCCN3が他のメンバーに先駆けて発現し、続いてCCN2が発現することが示された。そこで、この時期のCCN3の機能を解析するためにmicro mass細胞培養系にリコンビナントCCN3を添加する系、およびsiRNAにてCCN3をノックダウンする系にて比較検討したところCCN3の添加でアルシアンブルーの染色性が顕著に増加し、ノックダウンにより染色性が低下した。また、昨年度の解析でCCN3の添加によりERK1/2の活性化が上昇したことから、他のMAPKについても検討したところ、p38, JNKでは変化は見られず、CCN3はERK1/2の活性化に関与していることが明らかとなった。そこでERK1/2経路の肢芽細胞の増殖、分化への関与について検討するためMAPK阻害剤を用いて解析した結果、CCN3の肢芽細胞の増殖促進およびプロテオグリカン産生促進にはERK1/2経路が関与していることが明らかとなった。初年度はマウス胎児を用いて、種々の軟骨組織のパラフィン包埋切片および組織破砕サンプルと初代軟骨細胞におけるCCN2とCCN3の発現・分布パターンを解析した。そして、機能の重複等が予想される他のCCNファミリーメンバーについても同様に解析を行った。(1)軟骨原器の現れる胎生9.5日から18.5日

マウス胎児の頭部、胸郭、四肢等の切片を野生型及びCCN2欠損マウスから作成し、メッケル軟骨や、下顎頭、肋軟骨、四肢の軟骨分化過程におけるCCNファミリータンパク質の分布パターンと、CCN2欠損により生じる障害を、HE染色や軟骨基質を標的とした特殊染色等、組織化学的手法にて詳細に解析した。その結果、CCN2欠損マウスでは長管骨において軟骨分化の遅延が観察された。正常軟骨組織においては他のCCNファミリーメンバーが胎生14日以降から見られるのに対しCCN3は胎生12日から発現しており初期軟骨分化に関与する可能性が示された。(2)胎生11.5日目の肢芽、18.5日目の肋軟骨、4週齢マウスの骨髄より初代細胞を採取し軟骨分化誘導培養にて得たRNAサンプルと各組織を破砕して得たRNAサンプルから発生・分化段階依存的なCCNファミリー遺伝子の発現パターンの変化をリアルタイムPCR法にて解析した。その結果、各軟骨組織においてCCN3が初期分化段階で強発現していることを見出した。(3)これまでに我々は、MAPK経路を介した骨芽細胞の増殖と分化過程におけるCCNファミリータンパク質の作用と、軟骨細胞の増殖および最終分化過程におけるCCN2の作用について明らかにし報告してきた。そこで、次年度に予定しているCCNメンバーの機能解析とその発現メカニズム解析の準備段階として、現在、分化段階の異なる種々の軟骨組織の切片を用いてリン酸化ERK,p38,JNKの分布について検討している。本年度に行うと計画した実験を順調に実施し、昨年度と本年度の結果をまとめCCN2とCCN3の発現時期と分布および軟骨細胞に対する機能について第54回歯科基礎医学会にて報告し、現在論文執筆、投稿準備中であり、順調に研究が進展しており現在までの達成度は十分といえる。本年度に軟骨細胞分化におけるCCN2とCCN3の機能解析に関連して、関節軟骨細胞に対するCCN3の機能を解析し軟骨基質産生を促進することを明らかにした研究、および骨芽細胞分化におけるCCNタンパク質の機能を解析した研究を含む3編の論文を国際誌に発表している。こうした一連のCCNタンパク質研究過程で組織の免疫染色に有効な抗体の選別や、より効率的な初代細胞の調整、培養実験の最適化を本研究を進めながら平行して行ってきた。以上のことから当初の研究計画通り未分化間葉系細胞から軟骨細胞への初期分化と、軟骨細胞の最終分化という軟骨の全分化過程におけるCCN2およびCCN3とその他のCCNファミリーメンバーの発現時期とタンパク質の分布について詳細な解析を行うことができ順調に研究が進展しており、現在までの達成度は十分といえる。本年度の結果をふまえ、CCN2とCCN3の協調作用についてさらに解析を進めるために以下の計画で研究を進める。(1)初期分化段階の肢芽細胞、および肋軟骨由来成熟軟骨細胞よりタンパク質を抽出し、CCN2およびCCN3の特異抗体を用いて免疫沈降ウエスタンブロット解析を行い分化段階における両者の結合性を明らかにする。(2)リコンビナントタンパク質およびsiRNAを組み合わせて、CCN2およびCCN3が互いの機能に促進的あるいは抑制的に関与しているのかどうかを細胞増殖、プロテオグリカン合成等について評価する。そして、ERK1/2, p38MAPK, JUNKの活性化に作用するのか、培養軟骨細胞の免疫染色、リン酸化ERK1/2, p38MAPK, JUNKのウエスタンブロット解析、さらに各種MAPK阻害剤による、各種経路の関与の確認を行う。
閉鎖水域における下水道の効果とその評価

研究グループは、本年度2回の合同検討会を持ち分担研究者間の情報交換とそれぞれの作業目標の設定、進行状況の報告を行った。第1回の検討会では、「下水道技術の進歩と今後の課題」(松井),「小規模下水道の課題と展望」(市川),「流域下水道の発想とその展開」(盛岡),「水は自然を巡る」(楠田),「海苔の生産からみた水質汚濁の評価」(丸山),「児島湖の現況とその問題点」(青山),「水質データの統計解析」(河原)の報告を基に、日本の下水道が抱える諸問題の検討を行った。第2回の検討会では、「下水道の歴史」(市川),「初期流域下水道(猪名川・寝屋川)の成立過程」(盛岡),「沿岸海域におけるエコシステムの保全」(丸山)の報告に加えて、岡山県児島湖流域下水道終未処理場建設現場視察、山手村公共下水道(小規模下水道)視察を行った。分担課題の本年度進行状況は以下の通りである。閉鎖水域保全のために、N,P除去を行う生物処理技術の動向調査。日本の下水道の歴史的検討と現行の「広義下水道」の位置づけ。流域下水道(寝屋川、猪名川)の成立経緯。半閉鎖的水域(博多湾)における下水道の役割評価。児島湖流域の農村部汚濁負荷発量と低減方法。児島湖水質変化の予測シミュレーション。養殖海苔(Porphyra Sp.)を利用した下水処理水の影響評価。昭和61年度もひきつづき研究を進めるために分担者問の情報交換を行っている。