hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
in vitro肝組織再構築システムによる肝炎モデルの開発

肝組織の新たな細胞ソースとして増殖性を有する肝前駆細胞に着目した。本研究では実際に臨床応用を考えた際には行う事の出来ない化学薬品を用いた手法ではなく、ヒトへの応用が可能な門脈結紮により肝再生を誘発し肝臓内に肝前駆細胞増殖させ、コラゲナーゼ灌流法により単離し、限界希釈法で精製を行い肝前駆細胞の調製をおこなった。この肝前駆細胞を細胞ソースとし、閉鎖循環式バイオリアクターを用いて肝組織形成をおこなった。肝前駆細胞を用いることで初代培養肝細胞と比較して顕著な細胞生存の改善が見られた。遺伝子発現解析においても、肝前駆細胞は2次元単純培養では観られなかった成熟肝細胞のマーカーであるトリプトファン・ジオキシゲナーゼを、さらに胆管上皮細胞のマーカーであるサイトケラチン19も発現していた。組織学的な解析により、作製した肝組織は2核の肝細胞と胆管の形成が確認された。また、今回作製したin vitro肝組織の移植へ向けた検討をおこなった。移植した細胞挙動のより簡便な解析を可能とするため、赤色蛍光タンパク質発現マウスから胎仔繊維芽細胞を調製し、緑色蛍光タンパク質発現マウスより門脈結紮法により肝前駆細胞の調製をおこなった。この蛍光タンパク質発現細胞を各々用い作製した肝組織を、70%部分肝切除を行った野生型マウスの皮下と腸間膜上に移植した結果、マウス生体内で作製した肝組織が生着していることが確かめられ、肝組織内への血管侵入も観察された。比較実験としておこなったマトリゲル抱埋では、血管の新生が観られなかった。このことから、作製したコラーゲン細線維マトリックスはコラーゲン細線維に沿って血管の新生が誘導されやすいマトリックスであることが確認され、その移植へ向けた検討として前進したと考えられる。初代培養肝細胞は機能維持や培養そのものが困難であることが知られている。肝臓の再構築を目指した本研究では、肝細胞分化系譜の制御、非実質細胞の適正な場所へのリクルート、さらに培地中の溶存酸素や栄養の供給と代謝物(老廃物)の除去を可能にするような細胞外環境を設計していくことが重要であると考え、肝細胞が生体内でおかれている環境を簡便に模倣したin vitro肝組織を構築し、生体内で見られる生理的応答の再現を目指す。まず、生体類似結合組織である線維芽細胞含有コラーゲン繊維マトリックスの構築により、肝細胞の極性の回復と高密度培養可能な手法の確立を行った。閉鎖循環式バイオリアクターを用いた灌流法によって、コラーゲン含有培養液、時間差をもって初代培養肝細胞、初代培養胎仔線維芽細胞を導入するだけで、短時間の形成は困難とされていた生体内に近い高密度のコラーゲン繊維マトリックスの構築を実現したin vitro肝組織構築を達成した。さらに、初代培養肝細胞の機能維持においても上記の培養手法が有効であることを示した。しかしながら、これまでの一般的な培養の報告同様にこの培養手法を用いても初代培養肝細胞は長期の培養が難しかった。上記の問題から、新たな細胞ソースとして増殖性を有する肝前駆細胞に着目した。これまでに化学薬品等により誘導したOval細胞や小型肝細胞が増殖性正常肝細胞として知られていたが、我々は実際に臨床応用を考え化学薬品を用いない門脈結紮による肝再生における肝前駆細胞を調製に成功した。この肝前駆細胞は、肝細胞と胆管上皮細胞に分化可能な肝幹細胞である。上記培養システムにおいて、この肝前駆細胞を細胞ソースとした研究を行った。肝前駆細胞を用いることで顕著な改善が見られた。
胃癌の潜在的腹膜播種の診断法の確立と播種治療による細胞障害とアポトーシスの解明

1.進行胃癌の潜在性腹膜播種の診断の確立(1)術中洗浄細胞診(Papanicolau法)による診断漿膜浸潤陽性胃癌171例に対し術中洗浄細胞診を施行し,肉眼的に播種陰性と判断した例の29.2%の例に細胞診が陽性である事が明らかとなり,多変量解析によって洗浄細胞診の結果は重要な予後規定因子の一つである事が明らかとなった。(2)免疫染色による細胞診の診断洗浄細胞診施行例51例にCEA,と糖鎖抗原(CA19-9,STN,SLX)を用いた免疫染色を通常のPapanicolau染色に加えて施行した。その結果,Class3,4 (疑診)と診断した症例4例がClass5の確定診断を得る事ができた。しかし,本法によって陰性の中に新たに陽性と診断したものはなく,診断率の向上に寄与しなかった。洗浄細胞診施行例25例に対し,分子生物学的手法(RT-PCR法)を用いてCEAmRNAを洗浄液から抽出し,その発現から潜在する播種の診断を試みた結果,細胞診陰性と診断した14例中に2例CEAの発現が認めら診断率の向上が認められた。以上の研究結果から,胃癌の潜在性腹膜播種に対する洗浄細胞診を用いた診断はPapanicolau染色,免疫染色およびCEAmRNAの発現を総合的に見ることでより高い診断率を得る事ができると考える。2.腹膜播種の治療による細胞障害とアポトーシスの解明(1)胃癌細胞株に対するCDDP,5-FUの投与法の違いによる抗腫瘍効果と細胞形態変化MKN-1.MKN-28,MKN-45,MKN-75に対し5-FU単独,CDDP単独および5-FU+CDDP併用投与し抗腫瘍効果を観察した結果,併用により抗腫瘍効果の増強と併用法としてCDDPを5-FUの後に投与した方が抗腫瘍効果が一層高い事が明らかとなった。形態変化は5FU単独では形態変化は軽微であったが,核小体の染色性が若干減少したCDDP単独では細胞と核の膨大がみられ,核の断片化(Apoptosis)が見られた。5FU+CDDP併用の細胞および核の変化は5FU,CDDPの単独投与の中間の変化を示した。(2) CDDPとCaffeine併用による抗腫瘍効果CDDPとCaffeineの併用による抗腫瘍効果をSTKM-1胃癌培養細胞を用いて観察した結果,CaffeineはApoptosisを誘導することによって,抗腫瘍効果の増強に関与していることが明らかとなった。(A)進行胃癌の腹膜播腫性転移の診断の確立漿膜浸潤胃癌を対象に術中洗浄細胞診を行い,通常のPapanicolou染色,免疫組織(CEA,CA19-9,STN)染色にて癌の陽性率を確かめた。現在,23例に細胞診を施行し,8例(34.8%)に細胞診陽性を見た。通常の染色と,免疫組織染色の間に差を認めていない。

腹腔洗浄液からのRT-PCR法によるCEAのmRNAの発現は症例の蓄積を行っているところである。(1)CDDPと5FUの併用による抗腫瘍効果:CDDPと5FUを72時間同時投与するとCDDPまたは5FU単独投与よりは有意に高い抗腫瘍効果を示した。しかし,CDDP投与後に5-FUを投与た場合には単独投与よりも抗腫瘍効果の増強はなかった。(2)MKN-74培養細胞化学療法による形態変化とKi-67の発現:5FU単独で処理した場合には,細胞の形態や核のPI染色性は変化がなかったが,核小体のKi-67染色性は若干減少した。CDDP単独で処理した場合には細胞と核の膨大が認められ、核の断片化(apoptosis?)が見られた。一方,5FUとCDDPの併用により,細胞および核の大きさ,核の断片化やKi-67への染色性は5FU単独処理とCDDP単独処理の効果の中間の所見をとった。以上の結果からCDDPと5FUの併用は両者の特徴を備えた形態変化が見られる。また,治療効果は投与法の工夫が必要であることがあきらかとなった。さらに,CAFFEINEを加え,細胞障害の研究を進める。(A)進行胃癌の腹膜藩種性転移の診断の確立漿膜浸潤胃癌を対象に術中洗浄細胞診を行い,通常のPapaniclou染色(Pap染色),免疫組織(CEA,CA19-9,STN)染色にて癌の陽性率を確かめた。平成8年度に加え現在,40例に細胞診を施工しPap染色では,13例(32.5%)にClass Vの細胞診陽性,2例にClass IIIの結果を得た。Pap染色に免疫染色を加えても陽性率の向上は少なかった。前年度にCDDPと5-FUの併用による抗腫瘍効果の増強とMKN-74の形態変化について報告した今回,MKN-1とMKN-28について化学療法による形態変化,ApoptosisとKi-67の発現をLaser Scanning Cytomertyを用いて観察した結果,以下のことが明らかとなった。(1)Ki-67陽性率はMKN-1では5FU単独で処理した場合には,僅かに減少を示したが,CDDP単独処理では39%に,CDDP/5-FUでは34%に減少した。MKN-28では抗癌剤の種類によらず僅かに減少傾向を示した。(2)Ki-67抗原の増加を認めた細胞では,細胞周期と関係なく抗原が核内に顆粒状に存在した。(3)CDDP単独では核の断片化が見られたが,CDDP/5-FUでは断片化は少なくなったが核の膨化が見られた。STKM-1培養細胞を用いて行ったがCaffeineはApoptosisを誘導して抗腫瘍効果の増強が起こることが明らかとなった。進行胃癌の腹膜播種性転移の診断の確立進行胃癌を対象に術中洗浄細胞診を施行し,通常のPapanicolau染色に加えCEA,CA19-9,SLXの免疫染色をおこなった結果,細胞診疑診例には有効である点に関しては,昨年までの研究により明らかにした。今年度は,症例を更に増やし51例を対象に,従来の細胞診,免疫染色に加え,洗浄液内にCEAのmRNAを抽出しRT-PCR法を用いて,分子レベルでの播種の診断をおこなった。まず,コントロールとして培養細胞(KATO III)を用いて検索感度を調べた結果,細胞数100個でも検索可能であることが明らかとなった。また,実際の症例では51例中20例が通常の細胞診陽性であったが,CEAのmRNAの検索により陽性例はすべて131bpの部位にバンドを認め,さらに細胞診陰性を診断した31例中に新たに3例が陽性と診断した。
Quality of lifeを重視した頭頸部癌の形態・機能保存治療に関する研究

1.病理組織学的研究昨年までの研究に症例を追加し、総計喉頭癌80、口腔癌60、下咽頭癌50、下顎癌36例について結果を総括した。喉頭癌では声門上癌と声門癌とで声帯固定がおこる病理組織学的機序を明らかにした。口腔癌で腫瘍径、深達度、下皮下浸潤、リンパ節転移の相互関係を明らかにした。下咽頭癌については喉頭を保存できるか否か、という観点から喉頭内浸潤について検討し、コンピュータ断層撮影(CT)所見と対比し、CTによる診断アルゴリズムを作製した。上顎癌については、集学治療の進歩を念頭において、術前化学療法と照射の効果を検討し、予後との関係を明らかにした。2.機能に関する研究昨年までの研究に症例を追加して結果を総括した。喉頭癌でレーザー手術後の発声機能を27例、半切後の呼吸、嚥下、発声機能を64例、水平部切後の機能を38例で明確した。下咽頭癌では喉頭保存手術後の嚥下機能を22例、咽喉頭摘出後の嚥下機能を26例で研究した。口腔癌では構音機能を74例で、嚥下機能を88例で手術侵襲別に比較検討した。中咽頭癌については構音機能を20例、嚥下機能を66例について、手術侵襲別に比較検討した。3.治療法の研究病理組織学的研究、機能に関する研究の結果をふまえて、頭頸部の癌に対するレーザー手術、根治手術後の再建手術、術後のリハビリテーションの適応、方法を研究した。そしい、患者のquality of lifeを向上させるいくつかの方法を考案した。4.研究成果のまとめ3年分の研究成果をまとめ、報告書を作成した。現在印刷、製本中である。1.病理組織学的研究.喉頭癌,口腔癌,中下喉頭癌,上顎癌の手術標本を病理組織学的に検討し,次の結果を得た.(1)声門癌では甲状披裂筋の4分の1以上に浸潤があると声帯運動が制限され,4分の3以上に浸潤があると声帯は固定する.(2)声門上癌では披裂部に浅い浸潤があると声帯運動は制限され,深い浸潤があると声帯は固定する.(3)喉頭,口腔,中下喉頭,上顎の癌の浸潤範囲はCT,MRIでかなり正確に予測できる.2.機能に関する研究.(1)喉頭癌で喉頭を保存する治療を行った場合の発声機能は,放射線,レ-ザ-手術,喉頭部分切除術の順に良い.(2)舌癌,口腔底癌では舌を半側以上切除すると,構音機能,嚥下機能の障害が大きい.(3)中咽頭癌では切除部位によって構音障害のおこり方が異なる.(4)下咽頭癌に対して喉頭を保存する手術を行ったあとの嚥下機能は,適切な再建手術を行うとよく保たれる.3.治療法の研究.(1)副鼻腔癌の頭蓋内進展例に対しては,クラニオ・フェイシャル・レゼクションが良い成績をあげている.(2)遊離腹直筋皮弁による再建が,口腔,中咽頭の癌の広範切除後に有用である.(3)舌半側以下の切除では,再建をしなくても構音機能,嚥下機能はよく保たれる.(4)音声治療,言語治療は癌の術後の機能障害の治療に有用である.1.病理組織学的研究喉頭癌標本30個、口腔癌標本20個、中・下咽頭癌標本10個、上顎癌標本10個について病理組織学的に検討した。

癌の浸潤範囲の推定にはCT,MIRなどの画像情報、ファイバスコピ-などによる視診とくに諸部位の動きの観察、が有用であり、これらによって相当正確に浸潤範囲を推定するアルゴリズムが確立されつつある。2.機能に関する研究喉頭癌を放射線で治療すると機能障害は最も少ない。乾燥感が最大の問題であった。レ-ザ-治療後には軽度の発声障害があった。喉頭垂直部分切除後には中等度の発声障害があり、またときに呼吸困難で気管口を開いておく必要があった。声門上水平切除ではときに誤嚥があるほかには機能障害はほとんどなかった。口腔癌のレ-ザ-治療後にはほとんど機能障害はなかった。口腔癌と中咽頭癌の広範切除、再建後には種々の程度の構音障害と嚥下障害がおこった。障害の程度と切除範囲との関係を検討し、切除範囲から障害の程度を予測することが、ある程度可能とった。3.治療法の研究初期の喉頭癌、口腔癌、中咽頭癌に対するレ-ザ-治療の適応と方法を確立できた。口腔・中咽頭の広範切除後には、遊離腹直筋筋皮弁または有茎大胸筋筋皮弁による再建法が有用であることを示した。下咽頭癌の広範切除後には、遊離空腸を用いる再建法に工夫を加え、嚥下機能の改善をはかった。発声、構音、嚥下の障害に対するリハビリテ-ションの方法に、いくつかの改良を加えた。1.病理組織学的研究昨年までの研究に症例を追加し、総計喉頭癌80、口腔癌60、下咽頭癌50、下顎癌36例について結果を総括した。喉頭癌では声門上癌と声門癌とで声帯固定がおこる病理組織学的機序を明らかにした。口腔癌で腫瘍径、深達度、上皮下浸潤、リンパ節転移の相互関係を明らかにした。下咽頭癌については喉頭を保存できるか否か、という観点から喉頭内浸潤について検討し、コンピュータ断層撮影(CT)所見と対比し、CTによる診断アルゴリズムを作製した。上顎癌については、集学治療の進歩を念頭において、術前化学療法と照射の効果を検討し、予後との関係を明らかにした。2.機能に関する研究昨年までの研究に症例を追加して結果を総括した。喉頭癌でレーザー手術後の発声機能を27例、半切後の呼吸、嚥下、発声機能を64例、水平部切後の機能を38例で明確にした。下咽頭癌では喉頭保存手術後の嚥下機能を22例、咽喉頭摘出後の嚥下機能を26例で研究した。口腔癌では構音機能を74例で、嚥下機能を88例で手術侵襲別に比較検討した。中咽頭癌については構音機能を20例、嚥下機能を66例について、手術侵襲別に比較検討した。3.治療法の研究病理組織学的研究、機能に関する研究の結果をふまえて、頭頸部の癌に対するレーザー手術、根治手術後の再建手術、術後のリハビリテーションの適応、方法を研究した。そして、患者のquality of lifeを向上させるいくつかの方法を考案した。4.研究成果のまとめ3年分の研究成果をまとめ、報告書を作成した。現在印刷、製本中である。
公共広場の景観デザインに関する研究

公共広場の事例をできるだけ意匠設計や立地条件の異なる広場(アメリカ、フランス、イタリアの諸都市の広場,京都市域における立地条件が異なる公共広場)を対象として抽出し、意匠調査(デザインサーベイ)と文献資料調査を行った。とくに、(1)意匠設計に対する考え方(配置・レクリエーション施設要素・素材)、(2)公共広場が立地する環境条件との関係性(周囲景観へのおさまり)、(3)緑地(植栽)系統のモデルパターン、(4)利用実体調査(動線調査)(5)デザイン評価に関する調査分析を行い、データシートの作成をカード型データベースに整理することができた。また、公共広場のデザインを進める上で、環境との関係を考慮した平面構成の秩序化の方法論を求めるために、上記で収集したアメリカの広場のうち、モダニズムの代表的な作品を対象の平面図への分析を試みた。その結果、軸やグリッドの基線を共有化することによって、両者の関係づけがなされる例が見られた。例えば、ニューヨークの近代美術館の例のように、建築物の柱のグリッドに対応して、広場やファニチュアや舗装のモジュールなどが割り当てられている例が見られた。また、外部環境の建築物等の中心線上に、広場の中心が揃えられており、両者の対比的な関係が強調される場合が観察できた。このような分析をもとに、平面構成からみた環境と広場の関係として5つの類型が得られた。最後に、これらの研究の成果を整理し、学会誌へ発表した。
台風撹乱を受けた落葉広葉樹林の撹乱前後のタワーフラックスの変化とCO2収支の解明

地球温暖化に伴い台風の大型化が予想され、森林のCO_2収支を評価する上で、台風被害の影響を無視できない。そこで森林が台風攪乱を受けた場合、攪乱前と同じCO_2吸収機能を発揮できるか研究した。台風被害を受ける前後の森林生態系のCO_2収支を計算したところ、風害前は光合成による吸収量が土壌や枯死木による放出量を上回っていた。風害後は両者が逆転し、森林生態系としてCO_2の放出に変化することが明らかとなった。本研究では、台風撹乱を受けた落葉広葉樹林の撹乱前後で、森林生態系炭素収支がどのように変化するかを、タワーフラックス観測、要素フラックス測定とプロセスモデル及び生態学的純生産量(NPP)推定手法を駆使して明らかにする地球温暖化に伴い台風の大型化が予想され、森林のCO_2収支を評価する上で、台風被害の影響を無視できない。本研究では、台風撹乱を受けた落葉広葉樹林の撹乱前後で、森林生態系炭素収支がどのように変化するかを、タワーフラックス観測、要素フラックス測定とプロセスモデル及び生態学的純生産量(NPP)推定手法を駆使して明らかにすることを目的とする。本年度は上層林冠木、ササ群落、下層木本群落の台風撹乱3年後のNPPを明らかにする。レーザーライダーによる撹乱強度を20m^2メッシュ上で数値化し、上層林冠木のNPPの変化を調べたところ、撹乱強度の増大と共に上層林冠木NPPは減少し、その範囲は16MgCha^<-1>y^<-1>であった。撹乱されていない場所でのNPPは、撹乱以前のNPPと同様であった。幹の増加量を葉量で除した生産効率は、撹乱頻度によって変化していなかった。このことは激害区の残存木に、光環境の改善による生産効率の上昇が未だ(3年間では)見られないことを意味する。ササ群落では撹乱以前のNPPが0.5MgCha^<-1>y^<-1>であったが、撹乱3年後には相対光強度の高い場所(45%)で6MgCha^<-1>y^<-1>を示し、上層林冠木のNPP減少を補填する可能性が示唆された。下層木本群落は基本的にササ群落の下部にあり、撹乱以前のNPPは0.6MgCha^<-1>y^<-1>と少なかった。撹乱後萌芽更新などが見られる場所では若干のNPPの増大が見られるが、群落レベルでは1.2MgCha^<-1>y^<-1>とNPPの絶対値は小さかった。タワーフラックス観測では、台風撹乱前のNEP(生態系純生産量4MgCha^<-1>y^<-1>)が台風撹乱後に減少する(-1MgCha^<-1>y^<-1>)ことが明らかとなった。本年度はタワーフラックスを引き続き観測し、土壌呼吸速度の撹乱後の変化を明らかにする。さらに環境条件を面的に拡張するために、レイザーライダーによる撹乱強度の情報と環境条件との対応関係を明らかにする。2006年及び2007年の森林生態系炭素収支(NEE)は、森林生態系からの炭素の放出(それぞれ約-1.3MgCha-1y-1及び-1.2MgCha-1y-1)と観測された。風倒木被害激害区において風倒後低下した土壌呼吸は年ごとに回復し、2007年は2003年の約9割程度まで回復した。多地点広域調査(3.2ha)による土壌呼吸の温度特性は風倒前後でほとんど変わらず、風倒被害による土壌呼吸への影響は局所的であり、タワーサイト全体での土壌呼吸量は風倒前後でほとんど変化していないと考えられた。したがってNEEの減少は、倒木等からの炭素の放出、または総生産量の減少がその原因として考えられた。レイザーライダーによる撹乱強度(70%以上林冠が低くなったレーザーポイント)の400m2内に占める割合を撹乱強度(%)と定義した。撹乱強度は曇天日及び晴天日の光環境条件、また温度湿度の森林内の分布を非常に良く表現できることが明らかとなった。しかし土壌面より下部の環境条件は撹乱強度と相関関係を示さず、これはササ群落の繁茂による効果であると考えられた。

本年度はタワーフラックスを引き続き観測し、粗大有機物の分解による炭素放出量を明らかにする。2008年の森林生態系炭素収支(NEE)は、引き続き森林生態系からの炭素の放出(-2.49MgCha^<-1>y^<-1>)と観測された。強度被害地から軽微被害地まで、台風撹乱に起因した粗大有機物量を調べた結果(ラインセンサス)、5年間の分解率は18.95%±2.5%であった。分解定数(k)は0.0445±0.007であり、これまでの報告と矛盾しなかった。昨年度実施したLIDARによる撹乱強度に関する情報から、本研究林の倒木分解量及び幹・枝の呼吸量の推定を試みた。LIDARによる撹乱強度とラインセンサスによる台風後の粗大有機物量の間には強い比例関係が認められた。観測タワーを中心とし、片側100m(P100)、200m(P200)、300m(P300)の方形区を仮定し、その中の平均撹乱強度から被害木量を計算した。被害率に風倒以前の幹・枝呼吸速度(2.24MgCha^<-1>y^<-1>)を乗じた値を、撹乱による呼吸量減少分とした。また被害木量に年間の分解率を乗じた値を風倒被害木から発生した分解呼吸量とした。この計算からP100では風倒以前の幹・枝呼吸による炭素放出量に対して風倒後は16.3%増加し、同様にP200,P300ではそれぞれ13.3%,9.6%増加すると計算された。従って台風撹乱後のNEEの変化は、風倒被害木の分解呼吸量の増加によってもたらされる可能性が高いと考えられた。本研究では、台風撹乱を受けた落葉広葉樹林の撹乱前後で、森林生態系炭素収支がどのように変化するかを、タワーフラックス観測、要素フラックス測定とプロセスモデル及び生態学的純生産量(NPP)推定手法を駆使して明らかにすることを目的とする。本年度は最終年度であるため、地上部観測(生態学的・生物観察的)手法、およびタワーフラックスによる手法を比較し、台風撹乱が森林生態全体の炭素収支に与えた影響を明らかにする。台風撹乱以前のNEPは地上部観測・タワーフラックス観測ともにプラスであり、森林生態系に炭素を2-3MgC/ha/yearの速度で吸収していた。またモデルにより計算された森林群落総生産量(GPP)は13.1MgC/ha/yearであった。台風撹乱によって森林総合研究所北海道支所の落葉広葉樹林の9%が全壊した。撹乱が激しい森林におけるGPPは12.6MgC/ha/yearであり、樹木倒壊による炭素吸収量の損失分をササの生長が補償していた。一方樹木枯死木からの炭素放出量(呼吸量)は1MgC/ha/yearであり、台風擬乱以前に比べて土壌を除いた地上部からの炭素放出量は44%増大した。また土壌からの炭素放出量も台風撹乱以前に比べて34%増大した。台風撹乱のNEPは呼吸量の増大に起因して-1.1-2MgC/ha/yearとなり、これはフラクスタワー観測の結果と一致した。台風撹乱によって森林生態系の基礎代謝量が増大し、炭素が放出に転じていると結論された。
高齢者介護作業負担軽減をめざした移乗介助補助具の有用性と適用方法に関する研究

実験に先立って介護職場の安全衛生対策と健康管理の現状をわが国の既存資料に基づいて明らかにした。実験研究において、(1)車椅子からベッドへの移乗介助における補助用具の効果、(2)ベッド上での各種起き上がり介助法についての介助者負担および患者安心感、(3)看護職による介助作業における(1)・(2)の結果の再現性、(4)各種上方移動介助における作業負担、(5)各種上方移動介助における患者身体変位等について検討した。その結果、(1)車椅子からベッドへの移乗介助において、介助者の上体傾斜角・作業強度感・作業選好、患者の安心感を要約すると、介助者・患者両者にとってムーブの使用が最も良好な結果を示した。(2)ベッド上での5種類の起き上がり介助法については、「補助用具使用・右膝ベッド上置・回旋引き起こし」が介助者側の負担と好ましさ及び患者側の安心感において最良であった。(3)看護職を被験者としての介助作業者の評価尺度値は、学生を介助作業者とした実験(1)・(2)とほぼ同様な結果になった。但し学生が介助作業者の場合に比べ、看護職による介助の方が患者評価値は良好な傾向となった。(4)6種類の上方移動介助では作業者の作業強度感や作業選好が、移動用具使用の2作業で最良であり、補助具不使用の2作業で最悪であった。患者側の評価もこの作業者の結果と概ね同様であった。(5)6種類の上方移動介助における患者の長軸方向移動距離は、補助具不使用作業で有意に多作業条件よりも長く、補助具不使用では患者・ベッド間の摩擦抵抗が大きく作業者にとって力の発揮や調節が困難であることが推察された。補助具有用性については、さらに生理学的・生体力学的指標による部分的な評価検討によっても概ね一貫性のあることが見出された。介助作業負担軽減をめざした補助用具の有用性と適用方法の指針作成に向け、今回の研究では有用な成果が得られたと判断する。平成13年度は改良型介護ベルトの試作と、ベルトによる作業負担軽減効果の実験的検討を行うことをめざして取り組んだ。内容としては、(1)改良型介護ベルトの設計・製作:介護ベルトの設計として、取手の傾き及び、把持部の太さを数段階に設定したものの製作に取り組んでいる。(2)機器については、6D-モーションモニターシステム用の床反力計が測定上必要であるため、研究費により購入した。但し、米国での製造、わが国への移送、国内でのコンピュータ機器による条件設定の過程で、当初の予想以上に時間を要した。(3)実験条件の詳細の設定については、近年のバイオメカニクスの立場からの文献を中心に再検討を進めた。(4)実験計画について再検討した。(5)介護労働者の健康に関わる労働条件・労働衛生対策について総括的検討を行い、日本産業衛生学会・産業衛生学雑誌において発表し、Industrial Health誌にも関連論文(印刷中)を発表した。以上の取り組みを経て、改良型介護ベルトを用いた移乗介助実験(車椅子・ベッド間)を準備した。その内容としては、(1)介護技術の事前の教育・訓練を経た学生を被験者(作業者)して確保。(2)看護学生もしくは一般人を高齢者役(全介助を想定)として確保。(3)要因条件(独立変数)として、移乗介助補助具(本年は改良型介護ベルトと従来の介護ベルト)、ベッド高さ、被介護者要因、作業者要因等を設定。

(4)測定項目(従属変数)として、床反力・作業動作・姿勢に基づくバイオメカニカルな評価、作業者の作業強度感(BorgのCR-10)、ベルトの選好評価、被介護者の快適度、安全感等を採用。(5)以上の内容に基づき、実験計画法に基づく研究デザインを組み、統計学的検討を行い、結果を総括する。平成14年度は介助補助具を含む各種の介護技術が作業者および患者に与える影響について実験的検討を行い、介護技術・補助具の有用性について解明することをめざした。介護者として看護学生、看護師(介護教育関係者、介護の必要な病棟勤務者)、患者役として看護学生が、事前説明・同意の手続きに基づき、実験に参加した。作業内容として、(1)仰臥位からベッド上座位への起き上がり、(2)車椅子からベッドへの座位移乗の2種類を設定した。(1)の作業については5種類、(2)については3種類の新旧介護技術を設定した。測定項目は、介助作業姿勢・動作および床反力(6Dモーションモニター)、介助者の肩腰部の表面筋放電(筋電計)、介助者役の作業強度感(BorgのCR-10)、患者役の安心感等とした。実験用に木製のベッドと椅子を作成した。以上の実験の結果、看護学生を介護者とする実験では、(1)仰臥位からベッド上座位への起き上がりにおいて、特定の新しい介助用具・技術の使用によって作業者の負担感が有意に低下した。この方法では患者の安心感も最良であった。(2)車椅子からベッドへの座位移乗では、介助用具の使用により作業者の最大躯幹前傾角度を有意に減少させることができ、作業者の負担感も軽減した。しかし、介助用具により患者の安心感に差が生じた。以上の結果は今後、産業衛生学会等に発表する予定である。また、筋放電量に関する解析を現在進めつつあり、その結果も含めて学術雑誌への投稿を予定している。平成15年度は対象作業内容を各種上方移動介助として、介助補助具を含む各種の介護技術が作業者および患者に与える影響について実験的検討を行い、介護技術・補助具の有用性について解明することをめざした。介護者および患者役として看護学生が事前説明・同意の手続きに基づいて実験に参加した。各種上方移動介助内容として、補助用具を用いない作業2種、補助用具を用いる作業4種の合計6種類の作業技術を設定して比較検討した。測定項目は、介助作業姿勢・動作および床反力(6Dモーションモニター)、介助者の上腕二頭筋、僧帽筋、脊柱起立筋、大腿直筋の表面筋放電(筋電計)、介助者役の作業強度感(BorgのCR-10とRPE)、患者役の安心感等とした。実験用に木製のベッドを用いた。以上の実験の結果、補助用具を使用しない作業において作業者の作業強度感が高く、低摩擦式の移動シートを用いた場合に全身的評価、各局所部位の評価ともに作業強度感が最低となった。また、患者の自覚的評価に基づく作業の順位は介助者の作業選好順位とほぼ類似した結果となった。以上より、今回検討した介助補助具の使用により介助者・患者両者の自覚的評価が好転すると判断された。この結果は今後、産業衛生学会や国際学会等に発表する予定である。現在、筋放電量および動作・姿勢に関する解析を進めており、その結果も含めて学術雑誌への投稿を予定している。
新材料による緑色半導体レーザの基盤技術の開拓

InP基板上のBeZnTe/ZnSeTe超格子活性層材料の検討を進めた。従来のBeZnSeTe活性層を用いた場合、活性層とバリア層(クラッド層)との界面において、組成制御のための成長中断が必要であり、これが界面での結晶性を劣化させ、素子特性に悪影響を及ぼしていた。そこで、BeZnSeTeの代わりにBeZnTe/ZnSeTe超格子を用いることで成長中断を無くし、素子特性への影響を削減する新たな手法を開発した。更に、この超格子のもう一つの特長として、簡便な組成制御性が挙げられる。即ち、超格子中の各層厚を変えるだけで、基板との格子整合を保ったまま超格子全体における等価的な組成が制御できる。本研究では、BeZnTe/ZnSeTeの各層厚を4分子層(ML)/2MLから1ML/20MLに変化させた超格子を分子線エピタキシー(MBE)法を用いて作製し、特性を評価した。室温でのフォトルミネッセンス(PL)測定により、ピーク波長が480nmから589nmの単峰性発光が得られた。また何れの発光もBeZnSeTeと比べ24倍程度の発光強度が得られた。BeZnSeTeでは、光励起により低しきい値レーザ発振が得られていることから、BeZnTe/ZnSeTe超格子においてもより優れた発振特性が得られると期待される。更に、BeZnTe/ZnSeTe超格子においてBeZnSeTeと比べ優れた特性が見出された。BeZnSeTeではBe組成を0.3以上にすると間接遷移になり、発光特性が急激に劣化する。一方、BeZnTe/ZnSeTe超格子では等価的なBe組成が0.32においてもピーク波長480nmの強い青緑色発光が得られ、直接遷移が維持されていることが分かった。このことから、超格子では、直接遷移から間接遷移へ変化するBe組成がBeZnSeTeよりも高く、より短波長化が可能であることが示された。本年度は、光励起発振特性よりBeZnSeTeのレーザ活性層材料としての性能を評価し、また電流注入のための検討を行った。具体的な内容を以下に示す。1. BeZnSeTe活性層の両側をMgSe/BeZnTe超格子クラッド層で挟んだダブルヘテロ(DH)構造を作製し、光励起による発振特性を評価した。活性層の組成を変えることでピーク波長が538nm(緑色)、548nm(黄緑色)、570nm(黄色)のレーザ発振が得られた。このときのしきい値励起光強度は2636kW/cm^2であった。また、発振特性の温度依存性を測定したところ、何れの波長でも350K以上の高温においても安定した発振が得られた。しきい値励起光強度よりしきい値キャリア濃度を見積り、これと導波路解析により求めた共振器損失を用いて電流注入型レーザのしきい値電流密度を見積もった。その結果、波長538nmから570nmにおいて1kA/cm^2以下の低しきい値電流密度が見積もられた。これより、BeZnSeTeが活性層材料として優れた特性を有していることが明らかとなり、緑色から黄色域において低しきい値の高性能レーザが実現できる可能性が示された。2.光励起発振測定で用いたDH構造を基に電流注入型素子を作製し、特性を評価した。素子構造は、MgSe/ZnCdSe超格子nクラッド層、BeZnSeTe活性層、MgSe/BeZnTe超格子pクラッド層とした。更に、活性層とnクラッド層間のタイプIIヘテロ障壁を緩和するために超格子周期を除々に変化させたMgSe/ZnCdSeグレーデッド超格子を導入した。n及びp側に電極を形成した素子に電流を注入したところ550nmから560nmの黄緑色発光が得られた。これによりレーザ発振に向けた基礎的な条件が整った。1. BeZnSeTe活性層材料の高品質化を進めた。BeZnSeTe成長時において、Teの分子線供給量を調整し、II/VI供給比を1/1に近づけることでフォトルミネッセンス発光特性が改善されることが分かった。2. MgSe/ZnCdSe超格子nクラッド層材料において、ZnCdSe層を意図的にマイナスに歪ませることでMgSe層の格子歪(約+0.7%)が相殺され、高品質な結晶が得られることが分かった。また、ZnCdSe層をマイナスに歪ませるためにはCd組成を格子整合条件より下げる必要があるが、これによりZnCdSe層の禁制帯幅が増加し、超格子全体のワイドバンドギャップ及びタイプIIヘテロ障壁の緩和にも効果的であることが分かった。3. III-V族層とII-VI族層との界面の二次イオン質量分析(SIMS)を行った結果、酸素不純物濃度が高いことが分かった。これはInP基板の表面酸化膜除去が充分に行われず、酸化物が表面に残留していることが原因と考え、酸化膜除去をより高い基板温度で行うこととした。これにより界面での酸素濃度が低下し、結晶の高品質化が成された。

4. BeZnSeTe活性層をMgSe/BeZnTe超格子で挟み、pクラッド層にNドープMgSe/BeZnTe超格子、nクラッド層にClドープMgSe/ZnCdSe超格子を用いたLED構造を作製し、電流注入により評価したところ、室温においてピーク波長552nmの黄緑色発光を得た。しかし、発光強度は低く、素子抵抗も高いため、クラッド層のドーピング濃度やクラッド層から活性層へのキャリア注入構造の改善が必要であることが示された。(1) BeZnTe/ZnSeTe超格子活性層を提案した。BeZnTe/ZnSeTe超格子を用いることで、従来活性層とバリア層の成長において必須であった成長中断を大幅に削減でき、結晶性やデバイス特性の向上が見込まれる。ここでは先ずBeZnTe/ZnSeTe超格子をInP基板上に作製し評価した。BeZnTe層を1分子層、ZnSeTe層を9分子層とした超格子において室温フォトルミネッセンス(PL)測定を行ったところ中心波長579nmの黄色発光が観測された。また、従来のBeZnSeTe層の場合と比べ約4.4倍の発光強度が得られ、活性層として優れた発光特性を有していることが分かった。(2) MgSe/ZnCdSe超格子nクラッド層とバリア層間のタイプIIヘテロバリアを抑制するためのMgSe/ZnCdSe超格子グレーデッド構造を改良した。グレーデッド構造全体の層厚を増加させることで階段状のエネルギーバンドの傾斜を緩やかにして電子の注入効率の向上を目指した。改良したグレーデッド構造を用いて発光素子を作製し、特性を評価した。活性層は(1)で述べたBeZnTe/ZnSeTe超格子、nクラッド層はMgSe/ZnCdSe超格子、pクラッド層はMgSe/BeZnTe超格子とした。電流注入により評価したところ波長584nmにおいて良好な黄色発光が得られた。これはグレーデッド構造の改良による電子注入効率の改善と超格子活性層を用いた効果によると考えられ、レーザ発振に向けた特性向上が得られた。(3)レーザのストライプ構造について検討した。酸化インジウムスズをストライプ状に施すことで電流狭窄と横方向光閉じ込めが可能な新たな構造を提案し、導波路解析により検討した。この構造により横モード制御が可能であることが分かった。InP基板上のBeZnTe/ZnSeTe超格子活性層材料の検討を進めた。従来のBeZnSeTe活性層を用いた場合、活性層とバリア層(クラッド層)との界面において、組成制御のための成長中断が必要であり、これが界面での結晶性を劣化させ、素子特性に悪影響を及ぼしていた。そこで、BeZnSeTeの代わりにBeZnTe/ZnSeTe超格子を用いることで成長中断を無くし、素子特性への影響を削減する新たな手法を開発した。更に、この超格子のもう一つの特長として、簡便な組成制御性が挙げられる。即ち、超格子中の各層厚を変えるだけで、基板との格子整合を保ったまま超格子全体における等価的な組成が制御できる。本研究では、BeZnTe/ZnSeTeの各層厚を4分子層(ML)/2MLから1ML/20MLに変化させた超格子を分子線エピタキシー(MBE)法を用いて作製し、特性を評価した。室温でのフォトルミネッセンス(PL)測定により、ピーク波長が480nmから589nmの単峰性発光が得られた。また何れの発光もBeZnSeTeと比べ24倍程度の発光強度が得られた。BeZnSeTeでは、光励起により低しきい値レーザ発振が得られていることから、BeZnTe/ZnSeTe超格子においてもより優れた発振特性が得られると期待される。更に、BeZnTe/ZnSeTe
慢性自殺傾向を呈す自殺ハイリスク者に対する継続的地域支援のための基礎研究

わが国の自殺予防対策は、自殺ハイリスク者を早期に発見して専門的支援につなぐ「入口の支援」から、リスクの高い人を継続的に支援する対策へと重心を移す必要がある。本研究は、慢性の自殺傾向を抱えた自殺ハイリスク事例に対して、地域保健現場で長期間にわたって継続的に支援していくための方法の確立を目指す基礎的研究である。本研究は大きく2つの要素で構成される。一つは、長期的支援で課題となる、自殺リスクのアセスメント精度向上を目指した、自殺生起メカニズムの理論的精緻化である。もう一方は、自殺ハイリスク者の地域支援に携わる支援者が、プロセス評価を用いて支援の質の改善を行えるよう、支援モデルを構築することである。
腎血管におけるα_1-アドレナリン受容体の加齢変化-分子生物学的ならびに形態学的検討

本年度は,ヒト動脈におけるα_<1a>-アドレナリン受容体並に同mRNAのsubtypeの性質、量や局在を調べた。標本は腎細胞癌並に腎盂腫瘍症例で腎摘をする際に摘出した腎動脈(29症例分)を用いた。腎動脈標本は主動脈部と分岐動脈部に分けてそれぞれの実験に供した。受容体については張力実験で、またmRNAについては分子生物学的手法(RNase protection assayとin situ hybridization法)で検討した。従来ヒト動脈のα_1-アドレナリン受容体はα_<1b>-subtypeが優位と考えられていたが、腎動脈の張力実験からはα_<1A/L>-受容体が優位であった。即ちα_<1A>-アドレナリン受容体の特異的阻害剤であるKMD-3213や塩酸tamsulosinによる検討では、容量依存症にノルアドレナリンによる収縮を阻害した(α_<1A>-subtype)。またprazosinに対する親和性は低く、pA_2=8.8であった(α_<1L>-subtype)。RNase protection assayとin situ hybridization法によるmRNAの検討では、α_<1a>-subtypeが主であった。mRNAの局在はいずれも動脈中膜の平滑筋層であった。腎動脈の部位による受容体並びにmRNAの比率差は認められなかった。しかし、α_1-受容体mRNAの量はα_<1a>-subtypeでも50fgから1,000fg程度であり、次いでα_<1d>-subtypeが多く認められた(100fg以下)。α_<1b>-subtypeはほとんど検出されなかった。これらのmRNAの量はいずれもヒト前立腺に比べて少なく、約1/100量であった(Nasu,K.,Moriyama,N.,et al.,Br.J.Pharmacol119:797-803,1996)。このことより前立腺肥大症で使用するα_<1A>-アドレナリン受容体阻害剤でも低血圧、特に起立性低血圧をを起こしうることが示唆された。なお、年齢のよる差は症例数の関係で統計的処理ができなかったために割愛した。本年度は主に、ヒト腎癌患者より得られた腎血管を用いて、α_1受容体各サブタイプに対するプローブを用い、in situハイブリダイゼーションで腎血管内の各サブタイプの局在を検討した。手術時一塊として得られた摘出腎から腎血管を採取し、ただちにOCT compoundに包埋し、-80°Cで保存した。また一部は分子生物学的材料としてただちに液体窒素にて凍結し-130°Cで保存した。標本は30歳代80歳代まで各年代それぞれ34例ずつ採取した。次いで、α_1-アドレナリン受容体サブタイプ(1a,1b,1d)のRNA probesを作成し、先の腎血管標本について、in situハイブリダイゼーションを行なった。方法を次に略記した。ii)腎血管組織を10μmに薄切後、4%パラフォルムアルデヒドで固定し凍結切片を作製した。iii)プロテナースK(50μg/ml)および、acetylation処理し、除蛋白、非特異反応の除去を行った。iv)

RNA probesで45°C15時間ハイブリダイゼーションを行った。v)RNase処理の後Dig-ELISA法により反応部位を検出した。腎血管ではα_1-アドレナリン受容体の全サブタイプのmRNAが特に平滑筋に認められた。血管の太さによる局在の変化はあまりなかった。全体的にはα_<1a>-アドレナリン受容体の発現が強く、α_<1b>-アドレナリン受容体は弱かった。糸球体には若干の陽性所見を認めた。近位尿細管や遠位尿細管上皮の胞体にはこれらの受容体の発現は少なかった。本年度は、ヒト動脈における、α_<1a>-アドレナリン受容体並に同mRNAのsubtypeの性質、量や局在を調べた。標本は腎細胞癌並に腎盂腫瘍症例で腎摘をする際に摘出した腎動脈(29症例分)を用いた。腎動脈標本は主動脈部と分岐動脈部に分けてそれぞれの実験に供した。受容体については張力実験で、またmRNAについては分子生物学的手法(RNase protection assayとin situ hybridization法)で検討した。従来ヒト動脈のα_1-アドレナリン受容体はα_<1b>-subtypeが優位と考えられていたが、腎動脈の張力実験からはα_<1A/L>-受容体が優位であった。即ちα_<1A>-アドレナリン受容体の特異的阻害剤であるKMD-3213や塩酸tamsulosinによる検討では、容量依存性にノルアドレナリンによる収縮を阻害した(α_<1A>-subtype)。またprazosinに対する親和性は低く、pA_2=8.8であった(α_<1L>-subtype)。RNase protection assayとin situ hybridization法によるmRNAの検討では、α_<1a>-subtypeが主であった。mRNAの局在はいずれも動脈中膜の平滑筋層であった。腎動脈の部位による受容体並びにmRNAの比率差は認められなかった。しかし、α_1-受容体mRNAの量はα_<1α>-subtypeでも50fgから1,000fg程度であり、次いでα_<1d>-subtypeが多く認められた(100fg以下)。α_<1b>-subtypeはほとんど検出されなかった。これらのmRNAの量はいずれもヒト前立腺に比べて少なく、約1/100量であった(Nasu,K.,Moriyama,N.,et al.,Br.J.Pharmacol 119:797-803,1996)。このことより前立腺肥大症で使用するα_<1A>-アドレナリン受容体阻害剤でも低血圧、特に起立性低血圧を起こしうることが示唆された。なお、年齢による差は症例数の関係で統計的処理ができなかったために割愛した。
尿路上皮がん診断における高感度尿中分子マーカーの開発

膀胱癌に高頻度に生じる遺伝子変化として、第9、17染色体の欠失およびFGFR3遺伝子の点突然変異が挙げられる。本研究では膀胱癌患者尿から上記遺伝子変化の高感度な検出法を確立し、臨床的有用性を検討した。遺伝子変化はパイロシークエンス法を用いて定量した。膀胱癌組織116例を対象とした検討では、上記遺伝子変化は99症例に認めた。同症例尿では87例に遺伝子変化を認めた。一方、20症例の健常者尿にこれらの遺伝子変化を認めなかった。すなわち本定量系を用いることで感度75.0%、特異度100%の精度で尿からの膀胱癌診断が可能であった。尿細胞診では同症例尿での検出感度は44.0%であった。これらの結果より、本定量系は尿から膀胱癌を診断する優れたツールになり得ることが示唆された。本研究は膀胱癌患者尿から高感度、高特異度に上記遺伝子変化を検出し、膀胱癌診断における臨床的有用性を検討した。尿中剥離細胞は微量であり、また癌細胞以外に炎症細胞や様々な組織由来の細胞が混在する。本検討で用いた遺伝子解析法は、上記染色体上の一塩基多型を利用し、対立遺伝子を区別することでそれぞれのコピー数を定量する原理に基づく。定量には対立遺伝子の比を1%単位で定量可能であるパイロシークエンス法を用いた。染色体欠失の判定基準は健常人末梢血リンパ球20例のデータから得られた対立遺伝子のばらつきから3SDを超えた症例を欠失ありと判定した。FGFR3遺伝子変異は、異常遺伝子が2%検出された症例を変異ありと判定した。膀胱癌組織116例を対象とした検討では、上記遺伝子変異は99症例に認めた。また腫瘍のステージ別での検出感度は尿細胞診察ではTa:30.8%、T1: 56.4%、T2<: 54.2%であったのに対し、本定量系ではそれぞれ、67.3%、82.1%、79.1%であり、全ステージにおいて尿細胞診より高感度の結果を得た。非筋層浸潤膀胱癌は高頻度の再発が問題であり、現状での術後経過観察には侵襲性の高い膀胱鏡検査が必須である。今後大規模な前向き研究を行うことにより、膀胱鏡無しに再発診断可能となる遺伝子検査法としての確立を目指す。24年度が最終年度であるため、記入しない。
パーキンソン病患者iPS細胞由来ニューロンを用いた新たなマウスモデルの創出

我々はパーキンソン病(PD)の解明の為に、ヒトPD患者由来の異常折りたたみαシヌクレイン蛋白質をマウスに投与することで、よりヒトに近いPDの病態再現及び解明を目指す。平成30年度は、PD患者由来TH陽性神経細胞のマウス黒質への移植を予備的に行い、移植3か月後に解析を行ったが、殆ど移植細胞の生着を認めなかった。この結果について、移植細胞のin vitroでの解析の結果、PARK4患者由来TH陽性細胞はシヌクレインの蓄積を認めるが、分化後4週目をピークに減少していることが判明した。また、本邦で確認された点変異シヌクレインより作成した凝集体をマウス黒質に投与したところ緩徐進行性のリン酸化シヌクレイン陽性の凝集体形成と黒質TH陽性細胞の減少というパーキンソン病の病理学的特徴の再現に部分的に成功した。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。平成29年度は、我々はαシヌクレインのduplicationであるPARK4患者由来iPS細胞を取得し、ドパミン神経細胞へと分化誘導する事で患者由来の病的なドパミン神経細胞の作成を行った。分化誘導時の培養方法に関しても検討を行い振盪培養法でαシヌクレインの発現が増加することを見出した。また、生化学的解析にてコントロール細胞と比してPARK4患者由来ドパミン神経細胞はαシヌクレインの発現増強を確認した。それらPARK4患者由来ドパミン神経細胞のマウス黒質への移植実験を行い、移植細胞の生着を確認した。更にPD患者由来の異常折りたたみαシヌクレイン蛋白質を取得する新たなアプローチとして、RT-Quic法を用いてPD患者由来のαシヌクレイン凝集体の増幅を試みた。PD患者由来の髄液をサンプルとして大腸菌由来の組み換えαシヌクレインと反応させることでPD患者由来αシヌクレイン凝集体の増幅に成功した。また、異常折りたたみαシヌクレイン蛋白質の伝搬機構に関する解析に関してはSH-SY5Y細胞にαシヌクレイン凝集体を導入後にグリア細胞由来のKG1C細胞の共培養を行った。本来αシヌクレインを発現していないKG1C細胞内にαシヌクレインの存在を免疫染色法で確認した。これらの結果よりneuron to gliaでのαシヌクレイン凝集体伝播の可能性が見出された。分化誘導時の培養方法に関して検討を行い振盪培養法でαシヌクレインの発現が増加することを見出したまた、予備実験としてコントロールiPS細胞から分化誘導させたドパミン神経細胞の移植実験を行い、その実験手技に関する条件検討および手技の確立を行った。PARK4患者由来iPS細胞由来ドパミン神経細胞へマウス黒質への移植実験を行い、移植細胞の生着を確認した。更に新たなアプローチとして、RT-Quic法を用いてPD患者由来のαシヌクレイン凝集体の増幅を試みた。PD患者由来の髄液をサンプルとしてPD患者由来αシヌクレイン凝集体の増幅に成功した。また、SH-SY5Y細胞にαシヌクレイン凝集体を導入後にグリア細胞由来のKG1C細胞の共培養を行った。この様に平成29年度の進捗状況は順調であると考える。
発生時計を利用した神経細胞「誕生日」の意味づけ

本研究では、代表者が開発した新規技術「神経細胞の誕生日タグづけ法」を用いて当該領域の研究を推進した。これは発生時計のコア遺伝子を利用して、神経分化にコミットした細胞特異的に遺伝子組換えを誘導するシステムである。神経細胞の形質に及ぼす「誕生日」の影響を、様々なレベルで解析できるので、当該領域の推進する研究に役立つと期待される。本年度は、この未発表の新規技術を領域会議で紹介し、新規共同研究の開拓をめざした。さらに、代表者自身のグループの研究として、二次嗅覚系と網膜視覚系に着目した研究を行なった。1.「神経細胞の誕生日タグづけ法」を領域会議で紹介し、このマウスを通した共同研究を推進した。本研究期間中に3件の依頼を受けてマウス系統を分譲し共同研究を開始することができた。2.二次嗅覚系については、早生まれの僧帽細胞と遅生まれの房飾細胞を区別して標識することに成功した。とりわけ遅生まれの房飾細胞は、これまでの知見とは異なり、極めて限局した2箇所のみを標的としていることが明らかとなった。さらに誕生日の時間解像度をあげて、嗅球神経細胞を細かく分類し、投射パターンの違いを解析中である。3.網膜神経節細胞は、細胞生理学的観点から最も分類が進んだ神経細胞である。複数の誕生日タグづけマウス系統を使い、網膜神経節細胞の分類を行なった。その結果、誕生日によって異なる神経細胞が標識され、各々が異なる標的に投射することが明らかになってきた。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では、代表者が開発した新規技術「神経細胞の誕生日タグづけ法」を用いて当該領域の研究を推進する。1.「神経細胞の誕生日タグづけ法」を領域会議で紹介したところ、領域内研究者から1件の「神経細胞の誕生日タグつけマウス」の提供依頼があり、マウスと関連情報を提供して領域内共同研究を開始することができた。2.二次嗅覚系については、早生まれの僧帽細胞と遅生まれの房飾細胞を区別して標識することに成功し、全く異なる投射域を持つことを明らかにした。今後は時間解像度をあげて、嗅球神経細胞を誕生日によりさらに細かく分類し、投射パターンの違いを解析する。3.網膜神経節細胞は、細胞生理学的観点から最も分類が進んだ神経細胞であるが、これに「神経細胞の誕生日タグづけ法」を応用して誕生日による分類を行なった。得られた予備的な成果を当新学術領域の海外連携若手ワークショップで発表したところ、有益なアドバイスをいただき議論をすることができた。期待していたレポーター遺伝子がうまく働かなかったりなど、研究計画の変更が必要となる場面もあったが、概ね計画通りに研究を進めている。実験データを効率的に収集して論文発表につとめたい。