hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
着床不全に対するテーラーメイド細胞治療の開発

不妊症や不育症の一因となる着床不全、特に内膜機能不全に対する新しい治療法として、細胞を用いたテーラーメイド医療を着想し、その開発と実現化のための基礎的検討を通じて以下の成果を得た。1)マウス子宮内膜細胞の分離・培養技術および分化モデルの確立酵素処理および濾過操作により、マウス子宮から内膜細胞を分離し培養する方法を開発するとともに、性ホルモン処理等により内膜分化を誘導する系を確立した。2)構成性発現ウイルスベクターの構築と内膜細胞への遺伝子導入上記1)のシステムを用いて、至適遺伝子導入条件を探索した。レポーター遺伝子であるLacZあるいはGFPを発現するアデノウイルスを1)の内膜細胞に感染させたところ、約80-90%の細胞にGFPおよびLacZの強い発現を認めた。3)子宮内における移植遺伝子導入内膜細胞の動態LacZ導入細胞をマウス子宮へ移植したところ、移植後約1週間の時点において、子宮内にlacZ陽性細胞の存在が認められた。4)内膜機能不全マウス作製への基盤技術の開発細胞治療の有用性を検証するためには、内膜機能不全マウスの作製が必須である。任意の時間に内膜遺伝子を制御する方法として、超音波を用いて子宮内膜に遺伝子をin vivo導入する方法を開発し、従来のリポゾーム法などに比べて、極めて高い効率での遺伝子導入が可能となった。以上、本研究より、(1)内膜細胞への遺伝子導入、(2)内膜細胞の子宮内膜へのin vivo移植法、(3)in vivo内膜遺伝子制御法、に関する基礎的知見と基盤技術が得られた。今後の課題は、leukemia inhibitory factorなどの着床必須遺伝子を(3)の方法でノックダウンさせたマウスに、(1)によるノックダウンをrescueしうる遺伝子改変内膜細胞を、(2)の方法により移植する、という実験システムを用いて、着床不全に対する細胞治療の有用性を検証することである。我々が最終的に目指す、内膜機能不全に対するテーラーメイド細胞治療の戦略の妥当性を検証するために、本年度はマウスを用いて以下の成果を得た。1.内膜細胞の分離・培養技術の確立酵素処理および濾過操作によりマウス子宮から内膜細胞を分離し培養する方法を確立した。2.内膜細胞への遺伝子導入法の検討上記1.の分離・培養システムを用いて、至適遺伝子導入条件を探索した。まず、レポーター遺伝子であるLacZあるいはGFPを有するアデノウイルスを用いて、高力価のアデノウイルス液を作製した。続いて、1.の内膜細胞に感染させたところ、約80-90%の細胞にGFPによる強い蛍光発色を認めた。3.内膜細胞移植の経路・投与方法の検討-移植細胞のパッケージング方法および細胞移植法について-上記2.のGFP発現感染細胞をマトリゲルに浮遊させ、マウス子宮内腔に注入したが、拡散してしまうためその後の追跡が困難であった。組織修復過程にあわせて移植細胞を内膜組織に生着させる戦略を考え、化学的刺激や熱刺激などによる内膜組織損傷を与えてから、移植する方法を現在検討中である。一方、移植部位を内腔ではなく、注射針により内膜組織中に直接注入し、数日後に移植細胞の生着率(キメラ形成率)の評価に供した。4.移植残存細胞率(キメラ形成率)の検討上記3.の組織内移植を行った後、経時的に子宮内膜よりサンプルを採取し、GFP発現細胞の局在と比率をin situで検討したところ、移植部位周辺に強い蛍光を発する細胞群を認めた。

しかしながら、マウス子宮は自家蛍光バックグラウンドが非常に高く、正確な評価のために、現在LacZアデノウイルスを用いて同様の検討を行っている。またreal-time PCRを用いて、これらのレポーター遺伝子のmRNA発現の定量解析を行っている。内膜機能不全に対するテーラーメイド細胞治療の可能性について、本年度は以下の検討を行った。1)構成性あるいは誘導性の液性因子産生ベクターの構築ドキシサイクリンあるいは卵巣ホルモン誘導性ベクターは現在作成中であるが、構成性ベクターとしてはlacZを発現するアデノウイルスベクターを作成し、分離したマウス子宮内膜に約80%以上という高い効率でlacZ遺伝子の導入が可能であることを明らかにした。一方、in vivoでのドキシサイクリンによる誘導システムの構築に際して、ドキシサイクリンを子宮(内膜)に浸透させるdrug delivery systemの条件設定が必須である。われわれは、細胞移植ではなく、子宮特異的かつドキシサイクリン誘導性にCre recombinaseを内在性に発現するトランスジェニックマウスを作成し、これを用いて検討を行い、至適な投与濃度と投与方法を見いだした。2)上記1)を導入した遺伝子改変内膜細胞を移植された子宮内腔における外来性液性因子の動態・産生レベルの評価前年度の検討から、マウス子宮の自家蛍光のため、GFP導入細胞は移植実験には不適であった。そこで、上記1)のlacZ導入細胞を用いて行ったところ、移植細胞数や生着目数については検討中ではあるが、移植して約1週間後においては、移植を受けた子宮内膜内にlacZ陽性細胞の存在が認められた。3)内膜機能不全を原因とする不妊マウスに対する細胞治療の検討着床傷害モデルマウスを用いるアプローチも考慮したが、実験の容易性などから任意のタイミングで着床機能を欠落させることが可能なモデルマウスの作成を行った。その戦略として、超音波と造影剤を用いて子宮内膜に遺伝子を導入する方法を採用し、従来のリポゾーム法などに比べて、極めて高い効率で遺伝子導入することが可能なシステムを確立した。
高磁場ＭＲＩにおけるヒト全脳３Ｄ画像の不均一補正法の開発

磁気共鳴診断装置は、臨床医学において必須の装置となっている。静磁場強度を高磁場化することによって、高感度、高解像度、高コントラストの画像が得られることが期待できる。しかし、高周波磁場の不均一分布により画像が不均一となるという問題があった。本研究では、この問題を克服するための方法を提案、改良し、3次元ヒト脳画像の不均一補正を行うための要素技術を開発した。具体的には、我々が提案してきた単一画像面での方法の改良を行い、複数面で適用できることを実証した。MRIでは、静磁場中で高周波磁場コイル(RFコイル)から高周波磁場(RF)を送信して磁化を励起する。そして、磁化の歳差運動によってRFコイルに誘導起電力が生じ、これが磁気共鳴信号(NMR信号)となって観測される。本年度、送信RF、すなわち送信B1の3次元分布を測定するために、マルチスライス位相差分布測定法を開発し、頭部模擬ファントムでの実験を行った。この方法で用いる2つの断熱パルススピンエコーシーケンスでは、互いの断熱パルスの周波数掃引方向を反転させる。スピンエコーシーケンスの90°パルスのパルス長を180°パルスのそれの2倍とした時、これらパルスシーケンスで得られた信号間の位相差は、送信B1強度の関数で表すことができるので、この関係を用いて、測定される位相差画像を算出し、位相差に対応するB1から送信B1分布を求める。このパルスシーケンスをマルチスライス化し、複数のスライス面からの情報を取得出来るようになった。楕円形上で製作し、塩濃度でRFコイル内の負荷を調整した頭部模擬ファントムを用いて、これらのパルスシーケンスを印加し、良好に信号が取得でき、画像化できることが確認できた。一方、上述の方法で得られた位相差画像では、送信B1強度が小さい領域では、ノイズの影響で測定される位相差が負となる領域が生ずることがある。しかし、位相差と送信B1の関係では、理論上位相差は正であるため、これまでこの位相差が負の領域の送信B1を0とするアルゴリズムとなっていた。これを克服するため、得られた送信B1分布の正の領域から送信B1分布を推定する基本アルゴリズムを提案し、2次元分布上での方式を開発した。空間2次元の多項式分布関数で、測定された送信B1分布をフィッティングする方法を試み、6次関数で良好にフィッティングできることを確認し、ヒト脳の2次元送信B1分布を求めることが出来るようになった。高磁場MRIでは、被検体由来の高周波(RF)磁場不均一性によって画像不均一性が生ずる。この画像不均一性を補正するためには、送受信兼用RFコイルの利用時でも、送信RF(B1+)、受信RF(B1-)の両分布を求める必要がある。そこで、本研究では、3D画像の不均一分布を補正することを目標として、B1+分布を測定し、得られたB1+分布から比率マップ法を用いてB1-分布を計算し、B1+分布、B1-分布を用いた画像不均一補正を行う方法を開発する。この中で、本年度は、3D B1+分布測定法を開発することを目標とした。このために、最初に3D B1+分布計測のためのパルスシーケンスの検討を行なった。測定時間の延長を防ぐために、繰り返し時間TRを短縮することが可能な「位相を用いたB1+計測法」を適用する。位相エンコードによる3D化ではなくて、マルチスライス化を行なうことで、全測定時間の延長を防ぐ設計とし、4.7 T MR装置上に組み込んだ。次に、得られる位相分布画像の計算法の開発を行った。この方法では、それぞれのパルスシーケンスで周波数掃印方向を逆転させた断熱パルスの1種であるhsパルスを用いた2つのスピンエコー画像を取得し、両画像の位相分布を計算する。90度パルス長を180度パルス長の1/2にした場合、得られる位相差からB1強度を求めることができる。この際、位相分布上では、360度以上に対して折り返しが生ずるため、これを巻き戻す処理(unwrap処理)が必要となる。現状では、このunwrap処理を半自動で行っていたが、大容量である3Dデータの扱いの際に、この半自動処理では煩雑であり、3D領域全体への適用が難しいことがわかった。これを解決すべく、本年度、このunwrap処理プロトコル検討を行なった。この結果、unwrap領域を中心に集めた後、処理を行うのが良いと考えている。本研究では、ヒト脳で測定することができないRFコイルの受信感度分布を算出するために、ヒト脳の送信高周波磁場分布データを測定する。この分布データに比率マップを乗じて、受信感度分布を算出する。従来、比率マップは、RFコイル内のボランティア頭部位置に関わらず同一マップ用いていた。今回、高周波磁場不均一分布の原因である波長短縮が頭部内だけで生ずることに着眼し、頭部位置のずれに応じて比率マップを平行移動する方法を組み込んだ。この結果、画像均一化補正が良好に行うことができ、ヒト脳画像をコントラストを損なうこと無く感度分布を均一化することができる様になった。ヒト脳内複数スライス面に対して、高周波磁場送信分布(B1+分布)測定を実施し、比率マップを用いて、高周波磁場受信分布(B1-分布)算出を試みた。一方、MASEシーケンスから得られた複数のTE画像に対して、T2解析を行い、M0画像を算出した。この画像では、B1-分布が乗ぜられていると考えられるため、上記で算出したB1-分布を用いた補正を行った。

この結果、均一化されたM0画像を得ることができた。複数面スライスにて、均一化されたM0画像の取得に成功し、本方法を3次元的に展開できることが確認できた。磁気共鳴診断装置は、臨床医学において必須の装置となっている。静磁場強度を高磁場化することによって、高感度、高解像度、高コントラストの画像が得られることが期待できる。しかし、高周波磁場の不均一分布により画像が不均一となるという問題があった。本研究では、この問題を克服するための方法を提案、改良し、3次元ヒト脳画像の不均一補正を行うための要素技術を開発した。具体的には、我々が提案してきた単一画像面での方法の改良を行い、複数面で適用できることを実証した。平成26年度に、3次元受信分布測定、3次元比率マップ法の実証後、ヒト脳3次元受信B1分布算出を行うことを計画していた。しかし、MR装置の機器冷却のための空調設備が故障し、修理完了までの実験中断となった。加えて、位置決定のための勾配磁場電源が故障し、実験不可の状況となった。このように多くの期間でMR装置が利用できず、実験が遂行できなかった。磁気共鳴医学次年度のH27年度の延長申請を行い認められたので、H27年度の研究計画として、ヒト脳3次元受信分布算出、ヒト脳3次元画像不均一補正法を開発し、ヒト脳内3次元画像均一化を実現する。本年度、3次元送信B1分布測定法の開発を目的として研究を進め、パルスシーケンスの開発、模擬試料での測定を行うことができ、これについてはおおむね順調に進めることができた。これに加えて、ノイズ影響で位相差が0以下になる領域に対する対策が必要なことがわかり、この方式の提案、開発を行った。この開発に注力したため、3次元受信分布測定、ヒト脳内3次元送信B1測定までには至らなかった。3D B1+分布測定の検討を通して、必須な位相分布計算での位相unwrap処理にて、これまで用いていた半自動処理を3D領域全体に適用するには煩雑であることがわかった。そこで、本年度は、この解決に注力することとし、、3Dデータセットの位相unwrap処理に向けたプロトコルの検討を行なうこととした。このため、研究に若干の遅れが生じている。加えて、位置決定のための勾配磁場電源が故障し、測定、実験不可の状態が長期間続いた。このように多くの期間でMR装置が利用できず、このため未使用額が生じた。次年度、3次元位相分布計算の高度化を行い、送信B1分布算出の高度化を行うと共に、3次元受信分布測定、3次元比率マップ法の実証を行い、ヒト脳3D受信B1分布算出を目指す。当初研究計画では次年度が最終年度となるが、上述に続いてヒト脳内の3D画像均一補正を実現することを目標として最終年度の延長申請を行う。これよって、本研究の目標であるヒト全脳3次元画像の不均一補正が実現できる。次年度、検討した位相unwrap処理法を用いたB1+分布計算法を構築する。
子どもと家族へのグリーフサポートにおけるコミュニティケアの検証と再構築の試み

身近な人と死別する子どもへの支援については、近年地域での子どものグリーフ・サポートを行っている団体や活動も増えつつあり、地域でのグリーフ・サポートの活動の効果も報告されてきている。しかし、それらの活動についての検証は十分とはいえない。そこで、遺族である子どもとその家族への地域(コミュニティ)におけるグリーフサポートの現状及びその内容や課題、また当事者のニーズを踏まえた機能しているのか、新たなニーズはないのかなど包括的な検証を行い、当事者、社会の人々が求める学校も含めた地域(コミュニティ)での子どもと家族へのグリーフ・サポートのあり方を明らかにすることを目的としている。
有用植物色素成分の大量生産および高選択的変換・分離に関する工学的基礎の構築

本申請課題では,植物細胞培養による色素生産から選択的な色素の分離・精製までを一貫したプロセスとして検討し,これに伴う工学的諸問題の究明とその解決を図ってきた.具体的には,以下のような知見を得た.1.種々の植物から得られた毛状根に関し,培養条件,培養操作と生成色素成分,色素生産量の関係を明らかにし,高効率な色素生産を可能とする培養手法を確立した.対象とした細胞と色素は次の通りである.セイヨウアカネ毛状根:アリザリンとその配糖体およびルシジンとその配糖体.レッドビ-ト毛状根:ベタニジンとその配糖体.2.一般に,植物色素は細胞内の液胞中に含まれ,また,植物細胞は堅固な細胞壁で囲まれており,細胞内に蓄積した色素を効率的に抽出する必要がある.そこで,培養中の酸素飢餓にすると細胞内の色素が培地中に漏出されることを見出し,培養操作と色素回収率の関係を工学的観点から詳細に検討し,合理的な色素回収手法を確立した.3.得られた色素混合物から,目的成分のみを高選択的に分離する反応系を検討した.すなわち,酵素の基質特異性を利用し,目的成分の配糖体のみを加水分解する酵素を検索する.セイヨウアカネから得られるアリザリン配糖体やルシジン配糖体などが酵素反応系に供給されると,選択的に加水分解されアリザリンを得る.アリザリンは通常親油性であるため,有機溶媒による抽出操作により容易に分離しうる.未反応のルシジン配糖体については,別の酵素あるいは酸によって加水分解する.このように,抽出操作を伴う酵素反応により,目的とする色素成分の変換と分離を同時に達成するシステムを構築した.以上のように,本申請課題は,植物由来の有用色素の生産と変換・分離に関する工学的基礎の構築を行った.得られた研究成果は,植物細胞培養による工業規模での色素生産に対し,大いに寄与しうるものと期待される.本申請課題では,植物組織培養における有望な材料として注目されている毛状根を用い,化学合成が困難なベタシアニン系,アントラキノン系色素の大量生産および高選択的変換の達成を目的とし,本年度は,植物由来の代表的かつ有用な色素として,レッドビ-ト毛状根が生産するベタシアニン系色素,セイヨウアカネ毛状根が生産するアントラキノン系色素を取り上げ,植物細胞による色素生産の効率化に関する検討を行い,以下のような結果を得た.1.レッドビ-ト毛状根の色素含有量は,細胞内のリン濃度に大きく依存することを明らかとした.さらに,レッドビ-ト毛状根の増殖に伴う色素生産特性を明確にするため,速度論モデルを構築した.色素含量は,毛状根長さ方向に沿って位置依存性が観測された.この毛状根長さ方向に沿った色素含量変化や細胞内リン濃度の効果を考慮した毛状根の色素生産速度式を導出し,ファーメンターを用いた毛状根培養における色素生産過程を速度論的に表現した.2.セイヨウアカネ植物の根部は,アントラキノン系有用色素アリザリンの配糖体(Al-P)および構造の類似したルシジン配糖体(Lu-P)を含む.通常の液体培地で培養した場合,Lu-Pを優先的に生成するが、培地中の浸透圧を増加させるためマンニトールを添加し培養を行うと,顕著なAl-P生成量の増加が認められた.また,Al-PおよびLu-Pの比生産速度に対するマンニトール濃度の影響を考慮した分枝増殖モデルに基づいて,セイヨウアカネ毛状根による色素生成の培養過程を説明できた.3.植物細胞内に生成・蓄積された色素の効率的な回収を行うため,種々の溶媒による植物細胞からの色素抽出を行った.セイヨウアカネ根部から,クロロホルムと水酸化カリウム水溶液の2相系抽出により,アリザリンとルシジンおよびそれらの配糖体を,それぞれの相に分別抽出できた.本申請課題では,植物細胞培養による色素生産から選択的な色素の分離・精製までを一貫したプロセスとして検討し,これに伴う工学的諸問題の究明とその解決を図ってきた.具体的には,以下のような知見を得た.1.種々の植物から得られた毛状根に関し,培養条件,培養操作と生成色素成分,色素生産量の関係を明らかにし,高効率な色素生産を可能とする培養手法を確立した.対象とした細胞と色素は次の通りである.セイヨウアカネ毛状根:アリザリンとその配糖体およびルシジンとその配糖体.レッドビ-ト毛状根:ベタニジンとその配糖体.2.一般に,植物色素は細胞内の液胞中に含まれ,また,植物細胞は堅固な細胞壁で囲まれており,細胞内に蓄積した色素を効率的に抽出する必要がある.そこで,培養中の酸素飢餓にすると細胞内の色素が培地中に漏出されることを見出し,培養操作と色素回収率の関係を工学的観点から詳細に検討し,合理的な色素回収手法を確立した.3.得られた色素混合物から,目的成分のみを高選択的に分離する反応系を検討した.すなわち,酵素の基質特異性を利用し,目的成分の配糖体のみを加水分解する酵素を検索する.セイヨウアカネから得られるアリザリン配糖体やルシジン配糖体などが酵素反応系に供給されると,選択的に加水分解されアリザリンを得る.アリザリンは通常親油性であるため,有機溶媒による抽出操作により容易に分離しうる.未反応のルシジン配糖体については,別の酵素あるいは酸によって加水分解する.

このように,抽出操作を伴う酵素反応により,目的とする色素成分の変換と分離を同時に達成するシステムを構築した.以上のように,本申請課題は,植物由来の有用色素の生産と変換・分離に関する工学的基礎の構築を行った.得られた研究成果は,植物細胞培養による工業規模での色素生産に対し,大いに寄与しうるものと期待される.本申請課題では,植物由来の代表的かつ有用な色素として,アントラキノン系およびベタシアニン系色素を取り上げ,これらの色素を生産する植物細胞として,セイヨウアカネ毛状根,レッドビ-ト毛状根等を用いた.色素生産の効率化および高選択的変換の達成を目的とし,本年度は,以下のような結果を得た.1.レッドビ-ト毛状根のベタシアニン系色素含有量は,単通カラムリアクター内の培養において,細胞内リン濃度,培地の液空塔速度,空隙率に大きく存在することを明かとした.さらに,毛状根長さ方向に沿った色素含量変化や細胞内リン濃度の効果を考慮した毛状根の色素生産速度式を導出し,ファーメンターを用いた毛状根培養における色素生産過程を速度論的に表現した.2.セイヨウアカネ毛状根の増殖およびアントラキノン系有用色素アリザリンの配糖体生産に及ぼす培地浸透圧の影響を検討した.通常の液体培地で培養した場合,毛状根は活発に増殖するが,色素はあまり生産されない.また,培地中の浸透圧を増加させるためマンニトールを添加して培養を行うと,逆に増殖は阻害されるが,色素生産量が増加することが分った.これらの知見をもとに,培地中の浸透圧を制御した二段階反復培養により,効率的な色素生産が可能であることを示した.3.セイヨウアカネ毛状根に含まれるアントラキノン系色素配糖体に対し,特異的に加水分解する酵素の検索と選定を行ったところ,Trichoderma viride由来のメイセラーゼが高い活性を示し,かつ熱安定性に優れていることが分かった.また,有機溶媒による生成物の選択的抽出操作を組み込んだ回分反応系にて,酵素変換を行うことにより,酵素反応の際に生じる生成物阻害を軽減できることを明らかとした.さらに,酵素反応速度が,生成部阻害を考慮したMichaelis-Menten式により表現し,連続生産のための流通操作における転化率と滞留時間の関係を良く説明することができた.平成8年度の成果を踏まえて,アントラキノン系色素,ベタシアニン系色素の大量生産および高選択的変換の達成めざし以下のような検討を進めた.1.植物毛状根により生成される色素類について,含有される色素の生成に対し鍵となる色素生成酵素活性を中心に検討した.その結果,レッドビ-ト毛状根のベタシアニン系色素には,生成過程の酵素であるチロシナーゼの活性と色素生成の間に相関を得た.一方,セイヨウアカネ毛状根のアントラキノン系色素には,目的物質のアリザリン生成は,アリザリン配糖体からの生成であることを見出し,加水分解する酵素(β-グルコシダーゼやキシラーゼ)活性が重要であることが分かった.2.毛状根増殖のための培養条件の検索を行った結果,接種の際に毛状根を切断するといったストレスを与えることにより,植物ホルモンのオーキシン類の発現が促され,毛状根の発根が生じ,その結果培養中の増殖速度が上昇することが分かった.さらに切断のする長さや部位について検討を行った結果,切断間隔が5mmでセイヨウアカネ毛状根については,毛状根すべての部位において,レッドビ-ト毛状根については,先端から20mmまでにおいて切断ストレスの効果が有効であることが分かった.この効果の利用により,毛状根の増殖速度を上昇させ色素生産を増加させることができた.
NO合成酵素の妊娠中毒症病態形成への関与に関する分子生物学的検討

研究目的:(1)妊娠中毒症の動物モデルの作成。(2)妊娠中毒症における胎盤組織障害へのNOおよびフリーラジカルの関与の解明。研究方法:(1)Wistar系妊娠ラットに妊娠10日目からNOS inhibitorであるL-NAME(L-NAME群n=10)または生理的食塩水(saline群n=14)をosmotic pumpにより持続投与した。妊娠21日目に開腹し、血液・胎仔・臓器(胎盤、母獣肝臓・腎臓)を採取し、それぞれを血算・フィブリノゲン定量、体重計測、HE染色ならびにPTAH染色に用いた。(2)妊娠14週未満の中絶胎盤絨毛(n=8)および妊娠22週以降の妊娠中毒症症例(n=4)と正常例(n=7)の娩出胎盤を用いてcNOSおよびiNOSのmRNAの発現をNorthern blot法により、比較検討した。解析ではP<0.01を有意とした。結果:(1)L-NAME群ではsaline群に比較し、妊娠21日目で(1)平均29.5mmHgの血圧上昇、(2)白血球増多、(3)14.5%のヘマトクリット上昇、(4)血小板数減少、(5)フィブリノゲン減少、(6)蛋白白増加、(7)平均0.99g(24%)の胎仔発育遅延、(8)胎盤絨毛間腔の狭小化、ならびに9)肝小葉間静脈および腎糸球体へのフィブリン沈着が認められた。(1)cNOSのmRNAについては全ての症例に発現が認められたが初期、妊娠中毒症、正常の各群間に有意の差を認めなかった。iNOSのmRNAについては発現が確認できなかった。結論:(1)L-NAMEの持続的投与によって臨床的・血液学的・病理組織学的に妊娠中毒症に類似した病態が作成された。したがって、NO生成の異常(減少、阻害)が中毒症の病態形成に密接に関与する可能性が示唆された。(2)成績は不十分であり、方法論的に再検討を要すると考えられた。
海運業の現代的変貌と海事私法のあり方に関する総合的研究

本研究は、便宜置籍船の一段の増加、国際的な競争の激化など最もグローバリゼーションが進展した産業分野である現代の海運業の実態に照らしてあるべき海事私法の姿を模索しようとするものである。海事私法は、海上運送契約の規整、船舶衝突、座礁等による不法行為責任、環境汚染責任の規整、造船金融や貿易金融などの金融取引的側面の規整、海上における様々なリスクに関わる保険の規整などの多様な側面に及んでいるが、いずれの側面においても海運業における新たな実務の発展などにより伝統的な規整を見直す必要に迫られている。本研究では、海運業の現代の実情を十分に把握した上で、上記の各側面に関する法的な規整のあり方について検討を加え、これを後掲の論文等にとりまとめた。とりわけ、国際海上貨物運送契約に関しては、1924年船荷証券条約、1968年の同条約改正議定書、1980年の国連海上物品運送条約が並立し、それぞれ批准国があり国際的なルールの統一が実現されていない状況下で、国連商取引法委員会において改めて統一をめざす新条約の制定作業が進行中であり、本研究の参加者である藤田友敬は日本政府代表として毎回の国際会議に参加してきたが、本研究における成果は大いに国際会議での審議にも反映され、また逆に国際会議での審議により得られた知見は本研究全体にも有益に反映された。このほかにも、船舶の航行の安全に密接に関わる水先人制度、海上保険などはわが国でも立法的な解決を迫られており、本研究参加者の研究は大きな貢献をするものとなっている。また、近く商法典の現代化の一環として海商法の現代化作業が見込まれるが、本研究ではそのための基礎となる多くの知見を蓄積することができたものと考えている。4年次計画の初年度に当たる平成14年度においては、本研究の目的を達成するための基礎作業として、(1)海運業と海運実務の実情の調査、(2)国内外の海事法に関する文献・資料収集等による基礎的知見の蓄積、(3)海事法の関連法分野の最新動向に関する文献・資料集等による基礎的知見の蓄積に努めた。とりわけ、国連商取引法委員会(UNCITRAL)で進行している新たな国際海上物品運送に関する条約の作成作業については、平成14年度内にも国際会議が2度開催され、国際会議に毎回日本代表として出席している藤田友敬を中心に、主要論点についての検討を継続的に行ってきた。この作業は、現時点における世界の海事私法の取り巻く経済的・社会的環境とともに、海事私法に関わる各国および各利害関係企業・団体等の考え方を知る上できわめて有益であり、条約の作成作業というだけにとどまらずわが国における海上運送契約法の解釈論あるいは立法論に多くの示唆を与えるものとなっている。このほかに、本研究の研究分担者は、上記(1)(3)の作業を基礎に、海事私法の主要な側面における現状に関する研究に努め、船荷証券の電子化などの電子商取引、海上保険、海上環境汚染、海運に関する通商問題、海事国際私法、陸海空それぞれの運送形態と運送人の責任法制のあり方などについて論文にとりまとめる作業を行った。これらは、平成15年度には公表される見通しであり、それらを基礎にさらに平成15年度以降の研究により分析を深化していくこととしている。4年計画の2年目に当たる平成15年度においては、海運業と海運実務の調査の継続、内外の海事法およびこれに関連する法分野に関する資料の収集・分析を継続するとともに、中間報告的な趣旨で、これまでの海事法の主要問題に関する研究成果を論文としてとりまとめる作業を行い、これを落合誠一=江頭憲治郎編集代表・海法大系(商事法務研究会、2003年)に掲載した。

テーマは、海洋環境汚染、海上物品運送契約に基づく運送人の責任、貿易・海上運送とEDI、海上保険、海運と通商問題、海事国際私法であり、広く海事法の主要分野をカバーするものとなっている。いずれも国際的な海事法の動きの激しい分野であり、わが国が国際的な法の発展に強い影響力を持つ分野もあれば、わが国独自の国際的貢献はあまりない分野もあり、わが国の海事法のおかれている問題点を浮き彫りにする結果となっている。研究期間の後半にあたる平成16年度、17年度においては、これまでの成果を基礎に、さらに研究を深化させ、わが国の海事法のあり方についての提言をとりまとめていくこととしたい。平成15年度においては、国連商取引法委員会(UNCITRAL)で継続中の国際海上物品運送契約に関する新条約の作成作業を行う国際会議に引き続き本研究のメンバーである藤田友敬が参加し、国際会議の前後には研究会を開催し同会議の作業の進行について分析しわが国にとっての課題を検討した。また、平成15年度には、万国海法会の国際コロキアムがフランスで開催されたが、本研究のメンバーである落合、江頭、山下、および藤田が参加し、海上物品運送契約、海上保険、共同海損など現在の重要課題について国際的な意見交換を行った。その成果は、次年度以降の研究に反映される。4年間の研究期間の第3年目に当たる平成16年度においては、第1年目・第2年目における海運業および海運実務の実情分析の作業を踏まえて、海事私法に関する国際的・国内的な立法論的な検討作業に着手し、関係の図書・資料の収集・整理とそれらにより得られた情報の分析を各研究分担者が行い、全員の研究会により相互に情報交換・批判的検討を行った。また、国際的な海事私法上の重要な課題が審議された2004年6月の万国海法会(CMI)バンクーバー国際会議に落合、山下、藤田の3名が参加し、海事法の国際的な最先端の動向についての情報・意見交換を図るとともに、資料を収集した。具体的な検討課題としては、平成15年度までと同様に、国連商取引委員会(UNCITRAL)で継続して行われている国際海上物品運送契約に関する条約草案の作成作業へのわが国の対応が中心となった(わが国の政府代表として、研究分担者の藤田友敬が参加している)。この作業の中間報告的なものであるが、条約草案でも最も重要な論点である運送人の責任に関する論点について藤田友敬が論文にとりまとめた。また、陸・海・空といった各種運送契約における運送入の責任に関する立法論的な検討を落合誠一が論文としてとりまとめた。さらに、海洋環境保護に密接に関連する油濁事故賠償・補償制度の課題について落合誠一が、海上保険契約に関する国際的なルール形成の問題について山下友信が、それぞれ論文としてとりまとめた。これらの基礎作業を基に、研究計画の最終年度である平成17年度には立法論的な検討の成果をとりまとめることとしている。4年計画の本研究の最終年次である平成17年度には、当初の計画に従い、前年度までの研究成果を踏まえて、主として海事私法の分野における立法的検討を行い、その結果を研究代表者及び研究分担者が論文等にとりまとめた。内容としては、第1に、海上の安全及び環境保全に関わる分野では、水先法の改正問題の検討を行った。水先法の改正問題としては、規制緩和の観点からの強制水先の範囲の縮小が行われたが、その半面で港湾における船舶の安全及び環境保全をどのように確保するかという課題、及び水先人の民事責任のあり方等の問題を多面的に検討した。
遺伝子及びプロテオーム解析による小児白血病におけるメトトレキサート等の毒性解明

小児急性リンパ性白血病ならびに悪性リンパ腫は、近年、化学療法が確立し、80%以上が寛解に至る。寛解導入時に高用量のメトトレキサートが使用されるが、その肝障害のために治療が中断、中止を余儀なくされる場合があり、臨床上問題となっている。また、寛解導入時に使用されるアスパラギナーゼでは、急性膵炎が問題となっている。そこで、これらの副作用に関与する遺伝子型について検討した。対象は、神戸大学医学部附属病院にて治療した小児急性リンパ性白血病および悪性リンパ腫の患者とした。血液あるいは頬粘膜を採取し、常法に従い、ゲノムDNAを抽出した。肝障害やメトトレキサート体内動態・薬効に関与する候補遺伝子、ならびに急性膵炎に関与すると考えられる遺伝子をリストアップし、それらの遺伝子型はダイレクトシークエンス法にて決定した。その結果、メトトレキサートの肝障害にはReduced folate carrier1のG80AおよびGlutathione S-transferase M1のPositive/Nullの遺伝子多型が関与すること、メトトレキサートの消失にはMethylenetetrahydrofolate reductaseのC677T遺伝子多型が関与することが示唆された。また、アスパラギナーゼを含む薬剤性膵炎に関与する遺伝子型を同定することはできなかった。これらの結果は、小児急性リンパ性白血病ならびに悪性リンパ腫における化学療法の適正化に寄与するものと考える。小児急性リンパ性白血病ならびに悪性リンパ腫において、methotrexate大量療法が施行されるが、しばしば骨髄抑制、肝障害等の発現により、治療を延期、中断を余儀なくされる。本研究においては、あらかじめ遺伝子診断により肝障害の発現を予測することを目的として、小児急性リンパ性白血病ならびに悪性リンパ腫患者の遺伝子解析を行い、各種遺伝子の遺伝子型と肝障害発現との相関を検討した。また、leucovorinの追加投与の指標となる投与後48時間後のmethotrexate濃度と遺伝子型との相関を検討した。検討した遺伝子型それぞれ単独では肝障害との有意な相関は認められなかった。Glutathione S-transferase M1の遺伝子を持ち、かつreduced folatecarrier 1のG80Aの遺伝子型がAAの患者において、有意に肝障害の発現頻度が高いことが示唆された。さらに、methylenetetrahydrofolate reductaseのC677Tの遺伝子型がTTの患者において、leucovorinの追加投与が必要である基準のmethotrexate濃度が1μM以上を示す頻度が有意に高いことが示唆された。一方、寛解導入時にアスパラギナーゼを投与するが、急性膵炎を発症患者がいる。急性膵炎の発症は生存に関わる重篤な副作用であるため、アスパラギナーゼの治療を中止せざるを得ない。その発症を予め予測することができれば、はじめからアスパラギナーゼの無いプロトコールで治療することが可能である。そこで、本年度においては、急性膵炎を頻発した患者の遺伝子配列を検討することにより、膵炎関連遺伝子多型を探索することを目的とした。急性膵炎はトリプシンの過剰分泌が原因とされており、トリプシンの生成に関わる遺伝子PRSS1、SPINK1、クロライドイオンに関与する遺伝子CFTRのExon部分について、ダイレクトシークエンス法により全配列を調べた。その結果、数種の遺伝子多型を確認できたが、膵炎発症にかかわる遺伝子多型を見つけることはできなかった。
契約締結補助者利用者の責任と権利

今日の取引社会においては、大量の取引がおこなわれており、また、取引内容が複雑になっている。そのため、各人が自らの契約を締結することが困難であることも珍しくなくなり、各種の契約締結補助者が盛んに利用されるようになっている。本研究は、そのような契約締結補助者を利用した者が負うべき責任と、その者に認められる権利について検討した。また、この利用者の責任及び権利と密接に関係する、補助者の責任と権利、取引相手の権利義務についても、あわせて検討した。これらの検討の主な内容とその成果は、次の通りである。第1に、ドイツにおける類似の議論であるWissenszurechnungについて、比較法的検討をした。報告書掲載の第1論文「民法101条の規律-契約締結に第三者を用いた場合における意思表示の効力に影響を与える事情の判断」は、その成果である。第2に、この比較法的検討を受けて、代理人、受任者、受寄者、遺言執行者、信託受託者について、とくにその事務執行の在り方について検討した。報告書掲載の第3論文「受託者及びこれに類似する者の自己執行義務について」は、その成果である。第3に、契約締結を委ねた者が、その地位を悪用してゆだねられていない事柄をおこなった場合における補助者利用者の責任について検討した。報告書掲載の第2論文「民法478条による取引保護について」と、第4論文「民法94条2項及び民法110条の類推適用による不動産登記名義に対する正当な信頼の保護-最高裁平成18年2月23日第一小法廷判決(最高裁HP)-」は、その成果である。本研究は、取引が大量化し、内容も複雑になった今日の取引社会において不可欠となった、契約締結補助者を用いた者が負うべき責任と、この者に認められるべき権利について検討することを課題としている。この課題に取り組むために、本年度は、主として以下の二つの作業をおこなった。第一に、法人が契約を締結する場合における補助者利用の形態と、それに応じて法人に認められるべき責任の分析をおこなった。補助者利用の形態としては、補助者のおこなう行為として、代理、契約に関する重要情報の提供および入手、締結行為そのものの実行などがあり、利用される補助者としては、(1)法人の構成員及び従業員、(2)法人が直接・間接に委託した者、(3)法人から委託されたわけではないが事実として法人のために活動した者などがある。補助者のおこなう行為のいかんにかかわらず、(1)と(2)では、補助者の行為及び主観的態様について、法人は代理の法理の類推により責任を負うべきであると考えられるが、(3)については、復代理法理を類推すると法人は責任を負わなくてよいことになり、必ずしも適当とはいえない。そこで、この問題については、次年度以降になお検討することとした。また、補助者がある事実を知っているときに、それを法人に帰責できるかという問題全般において、どのような場合をもって事実を「知る」といいうるかについて慎重に検討を要すると考えるに至った。この点も、次年度に検討する。第二に、本に関連する問題として、ドイツにおけるWissenszurechnungに関する議論状況を、ドイツに出向いて調査し、また、有益と考えられる資料を収集した。ただし、この問題は、本研究課題全般に関連するため、その分析はまだ完了していない。これも、来年度以降に継続しておこなう。なお、本研究の中間的な成果として、銀行等の法人が補助者を用いて債権者でない者に弁済した場合に、どのような要件のもとで法人は免責を受けられるかについて検討した論文(「民法478条による取引保護」後掲「研究発表」欄参照)を公表した。この課題に取り組むために、本年度は、主として次の三つの作業をおこなった。

第一に、前年度ドイツにおいて収集したWissenszurechnungの問題に関する資料について、分析を進めた。その結果、当初は有力な手がかりが存在しないと考えていた私法上の既存の制度について、その精緻な分析が本研究課題にとっても相当有力な示唆を与えると考えるに至った。第二に、これを受けて、代理人、受任者、受寄者、遺言執行者、及び信託受託者について、これらの者が委ねられた事務の執行(契約の締結である場合と、事実行為である場合を含む)を第三者にさらに委ねた場合の法律関係を、現行法の規定をもとに分析した。その成果として、研究発表欄に掲げた論文「受託者の自己執行義務についての序章的考察」を発表した。第三に、法人が契約締結補助者を利用する場合について、法人の善意・悪意の意味の検討とその責任法理の探求をおこなった。ただし、この検討及び探求は、本研究課題の最終目的であり、本年度においてはまだ完結しておらず、次年度の継続的課題となる。なお、この検討及び探求の中間的成果を、研究発表欄に掲げた『民法の基礎1総則(第2版)』の「法人」の章の加筆・修正に活かした。本研究は、取引が大量化し、内容も複雑になった今日の取引社会において不可欠となった、契約締結補助者を用いた者が負うべき責任と、この者に認められるべき権利について検討することを課題としている。この課題に取組むために、本年度は、主として次の3つの作業を行った。(1)本研究課題に密接に関連する問題であるドイツにおけるWissenszurechnungに関する議論状況を分析した。これによって、法人の場合にはその種の法人に通常要求される組織を備えていることが要求され、その組織において得られた認識は現実の行為者の知るところにならなかったとしても法人の認識として帰責されるとの知見を得た。(2)代理人、受任者、受寄者、遺言執行者及び信託受託者について、これらの者が事務の執行を第三者にさらに委ねた場合の法律関係を分析した。とくに、信託受託者については、改正信託法案と改正信託業法案で第三者に信託事務を委託した受託者の責任が異なるが、これは、信託業法は法人受託者を対象とする法であるため、(1)に述べた法人の特別の帰責の現れであると分析した。また、代理人に法律行為の締結を委ねた本人の責任と権利を再検討し、そこで得られた成果を、研究発表欄に掲げた『民法の基礎2物権』の「占有」の章中の代理占有の記述に活かした。(3)法人が契約締結補助者を利用する場合における法人の責任と権利について、(2)に関連して法人たる信託受託者が第三者に信託事務を委託した場合をモデルに検討した。
アルベルトゥス・マグヌスにおける知性論と幸福概念の関係について

継続して、中世知性論の基本構造を特に「知性のうちなる存在」という問題を中心に検討した。一昨年度の研究においては13世紀におけるアヴェロエス受容がもたらした当該問題の生成過程を確認することができ、本年度は当該問題の全体像を把握するために14世紀における問題の深化を特に個別的な問題に対する思想家たちの対応を中心に調査した。具体的には、志向性と呼ばれる心的性質が関与する錯覚現象および信念文の分析についての中世後期のモデル化を、特に検討した。このモデル化の結果、中世哲学において西欧哲学史上初めて、心の作用・機能という側面と、当該作用の対象・所与として心に提示される物という側面との間の、精緻な区別が行われたがより一層明らかとなった。研究成果は横田蔵人、「錯覚と志向性の存在論」、中世哲学会、『中世思想研究』、第50号、pp.33-48、2008年、および、横田蔵人、「ウィリアム・オッカムにおける知識の「対象」について」、関西哲学会、『アルケー』、2009年(掲載予定)において公開された。これらは唯名論者オッカムを資料にして研究課題となっている問題への応答を検討し、問題の連続と展開を確認したものである。また、上記の研究と平行して、サールやチザムといった現代哲学者のテクストの調査を進めた結果、中世哲学と、現代英米哲学において活発な議論を呼んでいる志向性の問題との間に、深い親近性があることが確認された。本研究はアルベルトゥスの知性論を主に中期著作『デ・アニマ註解』に基づき、(1)同註解の構成素材となっている歴史的諸源泉の推定作業を行うこと、(2)ならびに、歴史的コンテクストにおける中世知性論の特色を明らかにすることを目的としている。本年度補助金は、主に、上記の研究を遂行するための文献の購入費に当てられた。(1)歴史的遡源研究に関連して、アルベルトゥスの知性論のうち特に「知性単一説」と呼ばれる問題に関連するテクストを、13世紀中から後半におけるイスラム思想の継受という観点から、アヴェロエス『デ・アニマ大註解』ならびにアヴィセンナ『治癒の書の霊魂論』等と対比し、アルベルトゥスが前者の立場から後者の立場へと移行するに至った諸理由の解明を行った。この研究の成果は「知性のうちなる存在-アルベルトゥス・マグヌス-」論文として公表された。(2)歴史的コンテクスト研究に関連して、中世思想に「知的対象の存在論」と言うべき独特な問題領域が存在することを認識し、これに相当するものとしてアルベルトゥスをはじめとする13、14世紀のテクスト読解を幅広くおこなった。補助金の大部分はこのための資料収集に当てられた。作業は目下継続中であるも、成果の一部については「esse repraesentatum obiecti sit idem realiter cum forma repraesentante?」として口頭発表された。口頭発表において提示された見解は今後一層の発展が期待されるものであり、また、国内に類例のない研究領域を開削することができた。来年度には成果を研究論文として公刊する予定である。昨年度に引き続き、中世知性論の基本構造を特に「知性のうちなる存在」という問題を中心に検討した。昨年度の研究においては13世紀におけるアヴェロエス受容がもたらした当該問題の生成過程を確認することができたが、本年度は当該問題の全体像を把握するために14世紀における問題の深化を調査した。中世におけるイスラム哲学流入の結果、「心」の認識プロセスについてのより詳細なモデル化への道が開かれたことは昨年度報告において述べたとおりであるが、本年度の研究によって次のことが明らかになった。すなわち、このモデル化の結果、中世哲学において西欧哲学史上初めて、心の作用・機能という側面と、当該作用の対象・所与として心に提示される物という側面との間の、精緻な区別が行われた事、すなわち、今日「志向性」と呼ばれる問題が「誕生」したという事である。研究成果は「フィクトゥム再考-オッカムの初期概念論について」論文(『中世哲学研究』)において公開され、また「錯覚と志向性の存在論オッカムによるアウレオリ批判をめぐって」論文(『中世思想研究』)において公開予定(査読中)である。

研究成果は横田蔵人、「錯覚と志向性の存在論」、中世哲学会、『中世思想研究』、第50号、pp.33-48、2008年、および、横田蔵人、「ウィリアム・オッカムにおける知識の「対象」について」、関西哲学会、『アルケー』、2009年(掲載予定)において公開された。これらは唯名論者オッカムを資料にして研究課題となっている問題への応答を検討し、問題の連続と展開を確認したものである。また、上記の研究と平行して、サールやチザムといった現代哲学者のテクストの調査を進めた結果、中世哲学と、現代英米哲学において活発な議論を呼んでいる志向性の問題との間に、深い親近性があることが確認された。
昆虫概日時計ペースメーカーニューロンのシナプス前・後神経要素の同定とその構造解析

本研究では,概日時計を構成するニューロンネヅトワークの構造を明らかにすることを目的として,概日時計ペースメーカーニューロン(以下,CPNと略記)のシナプス前および後要素の検索・同定を行った。ショウジョウバエやルリキンバエでは,CPNが視葉副視髄で入力を受け,前大脳背側部で出力していると考えられている。本研究ではこれら2つの領域に注目して,免疫電顕法等を用いてCPNとシナプス結合するニューロンの特定を試み,以下の結果を得た。1.ルリキンバエには,ショウジョウバエのCPNであるs-LNvsに相同と考えられるニューロン(Pt-PDF/LN)が存在する。Pt-PDF/LNは,副視髄で網膜外光受容器(Pt-eyelet)からシナプス入力を受け,前大脳背側部でPLニューロンにシナプスを介して出力していることが明らかになった。Pt-eyeletは複眼後縁部に位置する網膜外光受容器であり,PLニューロンは,側心体やアラタ体へ投射し,短日低温条件で卵巣発達を抑制するニューロンと考えられている。本研究の結果は,光周時計と概日時計の相互作用を調べるうえで,重要な知見を提供するものである。2.ショウジョウバエのCPNであるs-LNvsは,前大脳背側部において神経ペプチドPDFの局所的放出による出力のほかに,`速い'伝達物質を介するシナプス出力をしていることが明らかになった。この結果は,s-LNvsからの時計情報の出力はもっぱらPDFを介する,という従来の考え方に対して,s-LNvsの機能を解明するうえでは,シナプスを介した速い出力も考慮に入れなくてはならないことを示した重要な知見である。さらに,s-LNvsが前大脳背側部でシナプス入力を受けていることも確認された。これは,前大脳背側部においてs-LNvsの出力が,他の時計ニューロンなどによって修飾されている可能性を示唆するものである。本研究は,昆虫の概日時計ペースメーカーニューロンのシナプス前・後要素を特定し,概日時計の入出力神経回路網の構造を明らかにすることを目的とする。本年度は,ルリキンバエを実験動物として用い,網膜外光受容器(Pt-eyelet)が概日時計ペースメーカーニューロン(PDF/LN)にシナプス結合することを証明するために,細胞内色素注入法と金コロイド標識-IgGを用いるpost-embedding免疫電顕法を併用して両要素を弁別標識し,電子顕微鏡下で両者のシナプス結合関係を調べた。Pt-eyeletは,複眼後縁部の網膜と視葉板の間に位置し4個の光受容細胞から構成される網膜外光受容器である。Pt-eyeletにはニューロビオチンを細胞内注入し,PDF/LNは色素拡散因子(PDF)抗体を用いて標識した。Pt-eyeletの軸索は視髄前方部にある付属視髄とよばれる領域に投射する。終末部は複雑な細胞質突起を有し,隣接する終末部との嵌合がみられた。さらに,昆虫の視細胞終末部に特徴的な`capitate junction'に類似した構造も観察された。Pt-eyelet終末部は多数の細分枝をもち,分枝末端部がシナプスボタンとなり,非標識の細繊維やPDF抗体陽性の繊維に出力シナプスを形成していた。PDF抗体陽性繊維では暗調の大型有芯小胞(径92±19.6nm,n=81)に特異的な標識がみられ,有芯小胞の開口放出を示すΩ形の細胞膜小窩も観察された。さらに,PDF抗体陽性

繊維には抗体陰性の小型シナプス小胞もみられ,非標識細繊維への出力シナプス部にシナプス小胞の集合が観察された。以上の結果から,Pt-eyeletは付属視髄でPDF/LNに直接シナプス出力すること,さらに,PDF/LNは付属視髄内でPDFペプチドを放出するとともに未同定のシナプス後要素に出力シナプスを形成していることが明らかとなった。今年度はキイロショウジョウバエを実験動物として,概日時計ペースメーカーニューロン(PDF/LN)においてPDFと共存する神経伝達物質の検索を行うとともに,PDF/LNの出力領域である前大脳背側部におけるシナプス結合関係の解析を行った。PDF/LNの神経繊維は,脳の側方後縁部に沿って上向し,キノコ体傘部の外側境界に沿って転回した後,前大脳側葉皮層の直下を正中方向に走向し,脳間部へ上向する内側触覚葉-脳経路(iACT)の背側部近傍に終わる。キノコ体傘部外側近傍,および,iACT背側部近傍を走行するPDF/LN繊維の微細構造を電子顕微鏡で観察した。その結果,PDF/LNはPDFを含む大型有芯小胞をexocytosisにより局所放出するとともに,PDF/LN繊維を取り囲む微小突起に対して,シナプス小胞を介しても出力していることが確認された。グルタミン酸トランスポーターGAL4系統(301OK-Gal4 X UAS-GFP)をPDF抗体で免疫染色し,GFP発現とPDF免疫活性の分布を比較したところ,付属視髄に近接するPDF/LN細胞体とその神経繊維で両者がともに検出された。このことから,PDF/LNではPDFとグルタミン酸が共発現しており,出力シナプス部にみられる小型小胞にはグルタミン酸が含まれている可能性が考えられる。また,iACT背側部近傍領域に終末するPDF/LN繊維の連続超薄切片(厚さ80nm,42枚)をもとに三次元構築をおこなったところ,PDF/LNからの出力シナプスに加え,PDF/LNへの入力シナプスも確認された。以上の結果から,PDF/LNは前大脳背側部においてPDFの局所的放出による出力のほかに,おそらくグルタミン酸を介するシナプス出力をしていると考えられる。さらに,シナプス後要素としても未同定ニューロンからのシナプス入力を受けていることが明らかとなった。今年度は,キイロショウジョウバエを用いて,1.PDF陰性ペースメーカーニューロン(LNd, DN)の微細構造の観察と生理活性物質の検索,2.PDF陽性ペースメーカーニューロン(PDF/LNv)の前大脳背側部における入力・出力シナプスの分布密度の解析,また,ルリキンバエを用いて3.三次元立体構築による副視髄の構造解析を行い,以下の新たな知見を得た。1.PER抗体陽性のLNdおよびDNの細胞体には,少数の電子密度の高い有芯小胞(DCVs)が散在して観察され,神経ペプチドの産生が推測された。PER抗体とコレストキニン(CCK8)抗体を用いて二重免疫染色を行い,電顕観察を行ったが,CCK8抗体のDCVsへの特異的な反応は確認されなかった。グルタミン酸トランスポーターGAL4系統(301OK-Gal4/UAS-GFP)をPER抗体で免疫染色したところ,前大脳背側部のグルタミン酸トランスポーターを発現している細胞体で,PER抗体陽性の核が確認された。グルタミン酸を伝達物質とするDNが存在すると考えられる。2.PDF陽性軸索の三次元構築を,昨年度のiACT背側部終末領域(T領域)に続いて,前大脳背側部を走行する軸索の中央域(M領域)で行い,入力・出力シナプスの分布密度を求めた。
新規生物活性物質探索系の構築をめざす柴胡桂枝湯の抗癲癇作用機構の逆転遺伝学的解析

1.当研究室でdifferential hybridizationの手法によって選別し、クローニングされた、けいれん誘発剤ペンチレンテトラゾール(PTZ)の刺激によって転写が増強あるいは抑制される遺伝子群(20個)についてシークエンスを行った。このうち、特にSEZ17は、Xenopus卵母細胞に注入した場合、PTZ応答を誘発することからけいれん関連遺伝子であることが予想されたため詳細に検討した。2.SEZ17の3'UTRにおける繰り返し配列中にマウスの系統によって異なる変異点が存在することを見いだし、種々のマウスの当該配列のdirect sequenceを行った。さらに、SSCP法による上記の変異の同定方法を検討し、ヘテロ2重鎖の泳動パターンの違いに基づく新しい変異検索方法を開発した。一方、3'UTRに見いだしたこの変異によって、異なる翻訳制御が行われていることをXenopus oocyte発現系を用いCATアッセイによって証明した。3.SEZ17のゲノムのシークエンス(約9.5Kb)及び解析を行った。この範囲には、2つのエキソンが存在したが、開始コドンを含む5'端部分はさらに上流に存在することがわかった。4.SEZ17、SEZ4について各々2ヵ所、SEZ8については1ヵ所の抗原ペプチドを設定して、その合成、精製、配列の確認を行った。これらのペプチド抗原をウサギに注射して抗体を作成した。現在は、上記の抗体を用いて翻訳産物の単離、構造決定に関する検討を行っている。またこれらのけいれん関連遺伝子の発現に柴胡桂枝湯加芍薬がどう影響しているかについて今後、明らかにしていく予定である。